(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光色素が含まれる液体が導入される流路を具備し、前記蛍光色素が発した光を外部から観測可能とされた構成を具備するマイクロ流路チップであって、
前記流路の内壁に、酸化亜鉛（ＺｎＯ）又は酸化チタン（ＴｉＯ２）を主成分とする平均粒径１０〜５００ ｎｍの微粒子が焼結して構成された微粒子層が形成されたことを特徴とするマイクロ流路チップ。
【請求項２】
前記流路は、前記蛍光色素に対して発せられる励起光に対して透明な基板内に形成された溝を用いて構成されたことを特徴とする請求項１に記載のマイクロ流路チップ。
【請求項３】
前記流路内における液体中に電界が印加される構成とされたことを特徴とする請求項１又は２に記載のマイクロ流路チップ。
【請求項４】
前記蛍光色素に対して発せられる励起光の波長は４００〜５００ｎｍの範囲であり、前記微粒子の平均粒径は４００〜５００ｎｍの範囲であることを特徴とする請求項１から請求項３までのいずれか１項に記載のマイクロ流路チップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電気泳動において被分析試料が混合されたバッファ液を泳動させる等の用途に用いられるマイクロ流路チップの構造に関する。
【背景技術】
【０００２】
電気泳動法は、例えば、被験者から採取された微量の血液からＤＮＡや癌の発現タンパク質等を分析する際に極めて有効である。電気泳動法においては、蛍光色素が添加された試料（血液等）が、ゲルを含むバッファ液に混合される。その後、この液体が、微細な断面積をもつ流路（マイクロ流路）の一端側に投入され、流路の両端間に電圧が印加されると、帯電した分子は電界によって流路中を徐々に他端側に移動するが、この移動速度は、分子量が大きな分子ほど遅くなる。このため、一定時間経過後には、長い流路において分子毎に到達位置（泳動距離）が異なる。【０００３】
この泳動距離を求めるために、試料には特定の蛍光色素が混合され、この蛍光色素は分析対象となる分子やＤＮＡ等に担持される。この蛍光色素は、励起光が照射されることにより、この励起光よりも長い特定の波長（色）の蛍光を発するため、一定時間経過後の流路内におけるこの蛍光の分布を調べることにより、泳動距離を測定することができる。これによって例えば試料に含まれる分子の組成分析やＤＮＡ解析等を行うことが可能である。このため、高感度の分析を行うためには、微細な流路中における蛍光を高精度で検出する技術が必要である。【０００４】
この電気泳動法の感度を向上させるために、特許文献１には、光散乱機能をもつ回折格子で流路を覆い、蛍光色素が発した蛍光の検出効率を高めた構成とする技術が記載されている。ただし、この方法においては、特に流路を含む分析装置を小型化することは困難である。【０００５】
これに対して、特許文献２に記載の方法では、マイクロ流路を含んだ分析装置の構成は従来と同様とし、バッファ液に対してＺｎＯ粉末（ＺｎＯ微粒子）を混合することによって、蛍光の強度を実質的に高めることが記載されている。この場合、ＺｎＯ粉末に起因して形成されたコロイド粒子で励起光が多重散乱され、蛍光色素分子に照射される励起光の強度が実質的に高まる。また、ＺｎＯの禁制帯幅に対応する光は紫外光となるため、蛍光色素に対する励起光やその蛍光がＺｎＯ微粒子に吸収されることもない。このため、蛍光色素から発せられる蛍光の実質的強度を高めることができる。この方法によって、例えば従来の２倍以上の検出感度を得ることができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００５−１７２７７３号公報
【特許文献２】特開２００８−２３３０５１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献２に記載の方法においては、ＺｎＯ粉末が所定濃度で混合されたバッファ液を使用することが必要になる。ここで、バッファ液の粘度等は試料に応じて調整することが必要となり、個々のバッファ液に対してその都度ＺｎＯ粉末を混合する作業が必要となった。すなわち、作業が非常に煩雑となった。【０００８】
また、実際の電気泳動測定は、作業が自動化された装置を用いて行われ、流路内の蛍光の分布が自動的に測定される場合が多い。この際に、ＺｎＯ粉末の混合の状況はバッファ液の種類（粘度等）によって異なり、バッファ液が変わった場合には蛍光の度合いも変わるため、その都度装置の調整を行うことが必要となるため、実質的には測定を自動化して行うことは困難であった。【０００９】
更に、粘度の高いバッファ液に対しては、再現性よく均一にＺｎＯ粉末を混合することは容易ではない。このため、高い検出感度を一様に再現性よく得ることは困難であった。【００１０】
このため、簡易な手法で、流路中で発せられる蛍光を一様に高い検出感度で再現性よく検出することは困難であった。【００１１】
本発明は、かかる問題点に鑑みてなされたものであり、上記の問題点を解決する発明を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、上記課題を解決すべく、以下に掲げる構成とした。
本発明のマイクロ流路チップは、蛍光色素が含まれる液体が導入される流路を具備し、前記蛍光色素が発した光を外部から観測可能とされた構成を具備するマイクロ流路チップであって、前記流路の内壁に、酸化亜鉛（ＺｎＯ）又は酸化チタン（ＴｉＯ２）を主成分とする平均粒径１０〜５００ ｎｍの微粒子が焼結して構成された微粒子層が形成されたことを特徴とする。
本発明のマイクロ流路チップにおいて、前記流路は、前記蛍光色素に対して発せられる励起光に対して透明な基板の表面に形成された溝を用いて構成されたことを特徴とする。
本発明のマイクロ流路チップは、前記流路内における液体中に電界が印加される構成とされたことを特徴とする。
本発明のマイクロ流路チップにおいて、前記蛍光色素に対して発せられる励起光の波長は４００〜５００ｎｍの範囲であり、前記微粒子の平均粒径は４００〜５００ｎｍの範囲であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は以上のように構成されているので、簡易な手法で、流路中で発せられる蛍光を一様に高い検出感度で再現性よく検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の実施の形態となるマイクロ流路チップの構成を示す平面図（ａ）及び断面図（ｂ）、その一部拡大断面図（ｃ）である。
【図２】ＺｎＯ微粒子、ＴｉＯ２微粒子を添加した場合における臭化エチジウム（ＥＢ）、ＤＮＡ混合液からの発光スペクトルを実測した結果である。
【図３】ＺｎＯ微粒子を添加した場合における量子収率の増加率とＺｎＯ微粒子の平均粒径の関係を測定した結果である。
【図４】六角柱系のＺｎＯ結晶内で形成される回廊波を模式的に示す図である。
【図５】ＺｎＯ微粒子層が内壁に形成された試料におけるＺｎＯからの蛍光を撮影した結果である。
【図６】ＺｎＯ微粒子層が内壁に形成されない試料（比較例）におけるＳＹＢＲ  ＧＯＬＤからの蛍光を撮影した結果である。
【図７】ＺｎＯ微粒子層が内壁に形成された試料（実施例）におけるＳＹＢＲ  ＧＯＬＤからの蛍光を撮影した結果である。
【図８】比較例（ａ）と実施例（ｂ）のマイクロ流路チップを用いてＤＮＡの電気泳動を行った際の蛍光の検出強度である。
【図９】ＴｉＯ２微粒子層が内壁に形成されない試料（比較例）におけるＳＹＢＲ  ＧＯＬＤからの蛍光を撮影した結果である。
【図１０】ＴｉＯ２微粒子層が内壁に形成された試料（実施例）におけるＳＹＢＲ  ＧＯＬＤからの蛍光を撮影した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の実施の形態に係るマイクロ流路チップの構成は、特許文献２に記載されたものと同様である。しかしながら、その流路の内面に微粒子が固定されている点が異なり、代わりに、使用されるバッファ液中には微粒子は混合されない。すなわち、このマイクロ流路チップを使用して電気泳動を行うに際しては、バッファ液として一般に使用されているものをそのまま使用することができる。
【００１６】
図１は、このマイクロ流路チップ１０の構成を示す平面図（ａ）そのＡ−Ａ方向の断面図（ｂ）、その断面の破線で囲まれた箇所の拡大図（ｃ）である。このマイクロ流路チップ１０の幾何学形状は、特許文献２に記載のマイクロチップと同様である。このマイクロ流路チップ１０は、平面形状が略長方形状の透明な板状体１１を基体としている。その大きさは、設計に応じて適当な値を選択可能であるが、例えば、縦方向の長さは１０〜１２０ｍｍ程度、横方向の長さは１０〜１２０ｍｍ程度、厚みは０．５〜５ｍｍ程度である。
【００１７】
板状体１１の内部には、溝形状の導入チャネル１２及び分離チャネル１４が形成されている。導入チャネル１２と分離チャネル１４とは、交差部１６において、直角に交差している。つまり、導入チャネル１２及び分離チャネル１４は、十字架状の平面形状をなして交差している。
【００１８】
導入チャネル１２の上下両端には、板状体１１の表面が略円形状に掘り下げられた試料リザーバ１２ａ及びアウトレット１２ｂがそれぞれ接続されている。また、分離チャネル１４の両端には、同様に板状体１１の表面が略円形状に掘り下げられたバッファ注入口１４ａ及びバッファ貯留孔１４ｂが接続されている。また、板状体１１の表面には、ガラス等で形成された蓋３０が接合されている、導入チャネル１２、分離チャネル１４はこの蓋３０で覆われ、試料リザーバ１２ａ、アウトレット１２ｂ、バッファ注入口１４ａ、及びバッファ貯留孔１４ｂの箇所では蓋３０は開口されている。
【００１９】
導入チャネル１２は、マイクロ流路チップ１０の表面に形成された均一な幅と深さとを有する流路が蓋３０で覆われて構成される。この導入チャネル１２は、分離チャネル１４と交差する直線的な交差溝部分と、この溝部分の両端部分が、それぞれ逆方向に交差溝部分と直交する方向に屈曲して直線的に延在する端部の溝部分とを有している。
【００２０】
電気泳動を行う際には、導入チャネル１２には、電気泳動用バッファ液（以下、単に「バッファ液」と称する）が充填される。なお、このバッファ液の詳細については後述する。導入チャネル１２は、試料リザーバ１２ａに導入された試料を交差部１６にまで移送させるために用いられる。
【００２１】
導入チャネル１２の全長は、電気泳動分析に必要十分な量の試料を交差部１６にまで移送できる長さとされ、通常は２〜３０ｍｍの範囲であり、例えば７ｍｍ程度とされる。
【００２２】
導入チャネル１２の幅（溝の長手方向に垂直な幅）は、通常は５０〜１００μｍ程度であり、例えば１００μｍ程度である。その深さ（溝の深さ）は通常は１０〜１００μｍ程度であり、例えば約３０μｍ程度である。
【００２３】
試料リザーバ１２ａ及びアウトレット１２ｂの平面視における直径は、通常は０．０５ｍｍ〜５ｍｍであり、例えば３ｍｍ程度である。この直径は試料導入のしやすさを考慮して適宜設定される。
【００２４】
分離チャネル１４は、均一な幅と深さとを有する流路が蓋３０で覆われて構成されている。分離チャネル１４は、交差部１６において導入チャネル１２に直角に交差しており、導入チャネル１２よりも全長が長く形成されている。分離チャネル１４には、バッファ液が充填される。分離チャネル１４は、交差部１６に存在する試料をバッファ貯留孔１４ｂに向けて電気泳動させるために用いられる。分離チャネル１４の長さ（図１中のバッファ注入孔１４ａ及びバッファ貯留孔１４ｂ間の長さ）は、分析対象の物質の分子量等に応じた泳動距離の差がこの中で確認できる程度の長さに設定され、例えば約４．５ｃｍ程度とする。
【００２５】
ここで、試料が電気泳動する距離、すなわち交差部１６からバッファ貯留孔１４ｂまでの間の分離チャネル１４の長さは「分離長」と定義される。このとき、分離長の長さは、典型的には１〜５ｃｍ程度であり、例えば約３ｃｍ程度とする。分子量等の分解能を高めるためには分離長は長い方が好ましいが、泳動時間が長くなるために、測定に時間を要する。このため、測定の対象や求められる分解能等に応じてこの長さは適宜設定される。
【００２６】
分離チャネル１４の幅及び深さは、前記の導入チャネル１２と同様であり、バッファ注入口１４ａ及びバッファ貯留孔１４ｂの大きさは、前記の試料リザーバ１２ａ及びアウトレット１２ｂと同様である。
【００２７】
また、バッファ液が導入チャネル１２と分離チャネル１４に導入された状態において、導入チャネル１２中と分離チャネル１４中のバッファ液中に電位勾配（電界）が形成されるような構成とされる。このため、図示を省略しているが、試料リザーバ１２ａ、アウトレット１２ｂ、バッファ注入口１４ａ、バッファ貯留孔１４ｂ内には、それぞれに電圧を印加できる電極が設けられている。
【００２８】
板状体１１の材料としては、上記の構造（導入チャネル１２、分離チャネル１４等）を内部に形成することができ、その内壁に後述する微粒子層２０を形成することができ、かつバッファ液等に侵されない材料で構成される。例えば、ポリメタクリレート、石英ガラス、ホウケイ酸ガラス、ソーダガラス、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ジメチルシロキサン、ポリエチレンテレフタレート等を用いることもできる。なお、板状体１１は、照射される励起光（可視光）に対して透明である方が、図１における下面側から励起光を照射することができるために、好ましい。
【００２９】
断面の拡大図である図１（ｃ）に示されるように、このマイクロ流路チップ１０においては、板状体１１の内部に形成された分離チャネル１４を構成する流路の内面に、酸化亜鉛（ＺｎＯ）又は酸化チタン（ＴｉＯ２）を主成分とする平均粒径１０〜５００ｎｍの微粒子が焼結された微粒子層２０が形成されている。微粒子の平均粒径は、例えばＪＩＳＺ８９０１に記載の方法で測定される。ＺｎＯやＴｉＯ２は、禁制帯幅が大きく、試料に添加された蛍光色素に対する励起光やこの蛍光色素が発する蛍光（どちらも可視光）に対して透明であり、かつ屈折率が大きいためにこの光を散乱させる効果が大きいために、好ましく用いられる。また、ＺｎＯはウルツ鉱型、ＴｉＯ２はルチル型等の結晶構造をもち、どちらの微粒子の表面も、光を多重反射させやすい形態となっている。
【００３０】
微粒子層２０を形成するためには、例えば、まずこの微粒子が溶媒等と混合された塗布液が作成される。具体的には、例えば純水とポリアクリル酸とを混合した水溶液中にこの微粒子からなる粉末を混合して超音波を印加する。その後、この塗布液を図１の形態に加工された板状体１１の表面に塗布し、例えば１００℃程度の低温で乾燥させた後に、３００℃程度の温度で焼成して焼結させる。この塗布から焼成までの工程を所望の回数繰り返すことによって、表面に形成された微粒子層２０の厚さを調整することが可能である。この場合には、微粒子は、分離チャネル１４だけでなく導入チャネル１２、試料リザーバ１２ａ等の内面にも固定されるが、この場合においても電気泳動を行う際に問題とはならない。あるいは、試料リザーバ１２ａ等の内面ではこの微粒子を除去する必要がある場合には、例えば分離チャネル１４のみをフォトレジスト層で覆った後にウェットエッチングを施すことによって、分離チャネル１４以外の箇所における微粒子を除去することも可能である。あるいは、図１における蓋３０も接合した状態において、流路中に上記の塗布液を流し、その後に焼成を行うことによって、微粒子層２０を形成することも可能である。この場合には、図１に示されるように、流路に面した蓋３０の内面にも微粒子層２０を形成することができる。また、微粒子層２０の厚さは、分離チャネル１４内における泳動に影響を及ぼさない程度で、かつ後述する蛍光の検出感度が最も高くなるように適宜設定される。この膜厚の調整も、上記の塗布液を用いた場合には、塗布液の濃度や塗布回数によって容易に行うことが可能である。
【００３１】
この微粒子として、ＺｎＯを主成分とするＺｎＯ微粒子について説明する。ＺｎＯ微粒子とは、平均粒径が１０〜５００ｎｍ程度のＺｎＯで構成された微粒子であり、特開２００５−６０１４５号公報に記載されたように、バルクのＺｎＯとは異なる性質をもつ。その製造方法も、この公報に記載されている。この微粒子は、ガス中蒸発法で製造することができる。ここでは、その図１に示されるように、チャンバー内において亜鉛（Ｚｎ）で構成されたターゲットが設置される。チャンバー内を酸素を含む減圧雰囲気とした中で、このターゲットと近接して真空中に設置された電極とこのターゲット間でアーク放電を発生させることによって、ターゲット表面からＺｎを蒸発させる。蒸発したＺｎは、雰囲気中の酸素によって酸化されてＺｎＯとなり、チャンバーの内壁に粒子となって付着し、これがＺｎＯ微粒子となる。ターゲットの原料としては、濃度の高くない亜鉛インゴット、たとえば４Ｎ（純度９９．９９％）を用いることができる。このような純度の低い安価なインゴットを用いた場合であっても、ＺｎＯ微粒子においては、高品質なＺｎＯ結晶が得られる。
【００３２】
具体的には、チャンバー内の雰囲気として、例えば酸素ガスと窒素ガスを空気と同様の４：１のモル比としたものを用いることができる。このガス雰囲気を、アーク放電を生じやすい２０×１０３Ｐａ程度に減圧する。この際、ＺｎＯ微粒子の特性（粒子径等）は、雰囲気のガス成分、圧力、アーク放電の電流値等によって制御することが可能である。ただし、この方法で製造されたＺｎＯ微粒子に対して更にボールミル等の処理の粉砕処理を行うことによって、更に粒径を小さくすることも可能である。
【００３３】
ＴｉＯ２微粒子については、通常製造、市販されているものを適宜使用することが可能である。
【００３４】
次に、バッファ液について説明する。このバッファ液は、親水性のゲルを含んだ水溶液として調製されるものであり、一般的に電気泳動に使用される液である。
【００３５】
この親水性ゲルの材料物質としては、電気泳動に一般的に用いられる物質を適宜選択することができるが、特に、各種のセルロース誘導体が好適である。より具体的には、セルロース誘導体としては、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、カルボキシルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＭＣ）又はヒドロキシプロピルメチルセルロースが好適である。なお、このゲルを構成する材料として、これらを適宜混合したものを用いてもよい。
【００３６】
これらの材料物質を溶解する水としては、超純水又は脱イオン水などを用いることができるが、特に超純水が好適である。なお、この水としては、これらを適宜混合したものを用いてもよい。
【００３７】
また、バッファ液のｐＨは、電気泳動分離すべき試料の種類により適宜調整される。より具体的には、試料がタンパク質の場合には、母液のｐＨを２〜９の範囲内の任意好適な値、より好ましくは６．８〜８．６の範囲内の任意好適な値に調整する。また、試料がペプチドの場合には、母液のｐＨを２〜１１の範囲内の任意好適な値、より好ましくは２．５〜３．１の範囲内の任意好適な値に調整する。更に、試料が核酸の場合には、母液のｐＨを６．８〜９．２の範囲内の任意好適な値、より好ましくは７．５〜８．５の範囲内の任意好適な値に調整する。ただし、ＺｎＯ微粒子は、強酸性下（およそｐＨ３以下）で、バッファに溶解するおそれがある。そのため、試料としてペプチドを用いる際には、できるだけ中性（ｐＨ≒７）に近いｐＨのバッファを用いることが好ましい。これらの点については、通常知られる電気泳動の場合と同様である。
【００３８】
バッファ液における親水性ゲルの濃度は、０．０１〜３ｗｔ％の範囲内の任意好適な値とすることが好ましい。この濃度は、主に、分離すべき物質の分子量等を考慮して決定される。
【００３９】
また、試料において使用される蛍光色素は、分析対象となる物質に応じて適宜選択することができる。この際、蛍光色素の励起光によって微粒子層２０を構成する微粒子（ＺｎＯ、ＴｉＯ２）が励起されない（微粒子が蛍光を発しない）ようなものを用いることが好ましい。例えば、ＤＮＡ分析を行うに際しては、蛍光色素として、ＤＮＡと結合しやすい臭化エチジウムや同様の特性をもつ蛍光色素（例えば商品名ＳＹＢＲ  ＧＯＬＤ  ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を好ましく用いることができる。臭化エチジウムは、波長４７０ｎｍの光で励起されることによって波長５８０ｎｍの蛍光を発する。ＳＹＢＲ  ＧＯＬＤは、波長４５０〜４９０ｎｍの光で励起されることによって、波長５１５ｎｍの蛍光を発する。このため、これらの各々を用いた場合においては、その蛍光の波長の光を検出することによって、分離チャネル１４中のＤＮＡ分布等を観測することができる。
【００４０】
特許文献２に記載の技術において使用されるバッファ液においては、ＺｎＯ微粒子が混合されたのに対して、このマイクロ流路チップ１０を用いて電気泳動を行う場合には、ＺｎＯ微粒子をバッファ液に混合する必要はない。このため、従来より電気泳動に用いられているバッファ液をそのまま用いることができる。
【００４１】
特許文献２に記載の場合と同様に、上記のバッファ液を導入チャネル１２と分離チャネル１４に、被分析試料を試料リザーバ１２ａにそれぞれ導入し、導入チャネル１２中と分離チャネル１４中において電位勾配を発生させれば、長い分離チャネル１４中において、例えばＤＮＡ鎖長に応じた泳動距離の分布が発生する。この際、ＤＮＡと結合した上記の蛍光色素を励起するための励起光を分離チャネル１４に照射すれば、蛍光色素が蛍光を発する。
【００４２】
この際、分離チャネル１４の内面に形成された微粒子層２０における多数の微粒子でこの励起光が多重反射されるために、試料に含まれる蛍光色素がこの励起光を吸収する割合が高くなる。このために、発せられる蛍光の強度も高くなる。この定性的効果については、特許文献２に記載の技術と同様である。しかしながら、後述するように、このマイクロ流路チップ１０を用いた場合に、より高い蛍光強度を観測することができる。
【００４３】
また、特許文献２に記載の技術においては、バッファ液中の微粒子の分布が均一でない場合には、観測される蛍光の分布には、測定対象のＤＮＡ等の分布だけでなく、この微粒子の分布も影響を与えるため、ＤＮＡ等の分布を正確に算出することが困難となる。このため、バッファ液に微粒子を均一に混合することが必要となる。しかしながら、実際には粘度の高いバッファ液に対して再現性よく均一に微粒子を混合することは困難である。
【００４４】
これに対して、上記のマイクロ流路チップ１０を用いる場合には、従来より使用されているバッファ液をそのまま用いることができる。また、分離チャネル１４の内壁に微粒子層２０を形成することは前記の製造方法により、容易である。更に、この作業はこのマイクロ流路チップ１０の製造時に１回のみ行えばよい。また、仮に微粒子の分布が不均一となったとしても、この分布は微粒子が固定されている限りにおいて不変である。このため、この微粒子の分布を算出し、測定された蛍光分布からこの微粒子の分布を考慮して補正し、より正確なＤＮＡの分布を算出することも可能である。
【００４５】
すなわち、このマイクロ流路チップ１０を用いれば、流路からの蛍光を高精度で検出することができるために、高精度の電気泳動測定が可能となる。また、その使用も容易であり、測定の再現性も良好となるため、自動化した測定も容易に行うことができる。
【００４６】
実際に、前記の微粒子の分散液を臭化エチジウム（蛍光色素）、ＤＮＡ試料と混合し、励起波長４８０ｎｍの場合における発光強度の測定を行った。ここで、微粒子としては平均粒径が２００ｎｍのＺｎＯ微粒子と平均粒径が８０ｎｍのＴｉＯ２微粒子を用い、分散液は、これら各々の微粒子２０ｍｇを１ｍｌの純水に超音波ホモジェナイザで分散させて作成した。この分散液１５０μｌに、臭化エチジウム（ＥＢ）：６７５μｌ、ＤＮＡ：６７５μｌを加えて測定を行った。この場合に得られた発光強度スペクトルを図２に示す。ここで、微粒子を加えない純水を添加した場合の結果も同時に示す。ただし、ここで、ＺｎＯ微粒子、ＴｉＯ２微粒子を添加した場合の結果の再現性は良好ではなく、この結果は、発光が最強となった場合の結果である。この結果より、ＺｎＯ微粒子、ＴｉＯ２微粒子のどちらを用いた場合でも光が増強され、特に波長６２０ｎｍ程度ではこれらの微粒子を添加しない場合と比べて最大で１０倍程度の光強度が得られることが確認できる。すなわち、上記の微粒子としては、ＺｎＯの粒子、ＴｉＯ２微粒子が共に有効である。
【００４７】
また、上記の試料（ＺｎＯ微粒子を用いた場合）における平均粒径と量子収率との関係を調べた結果を図３に示す。ここで、縦軸は微粒子の添加のない場合の量子収率で規格化した値を示している。この結果から明らかなように、ＺｎＯ微粒子添加による増感の効果は、平均粒径が励起光の波長とほぼ等しい４００〜５００ｎｍの場合に高くなる。ＺｎＯの屈折率は２．０程度であることを考慮すると、この場合には、ＺｎＯ微粒子における励起光の波長は、ＺｎＯ微粒子の外周の約１／６となる。このため、図４に示されるように、励起光は、六角柱系のＺｎＯ結晶内で回廊波を構成すると考えられる。これによって、特にＺｎＯ微粒子表面で電界が増強され、これによって蛍光強度が増強されると考えられる。このため、臭化エチジウムやＳＹＢＲ  ＧＯＬＤのように、４００〜５００ｎｍの波長の励起光が用いられる場合には、平均粒径が４００〜５００ｎｍの微粒子を用いることが特に好ましい。
【００４８】
（実施例）
まず、実際に上記のマイクロ流路チップを製造した。ここでは、図１の形態に機械加工され、蓋が接合された状態の流路の内面に、ＺｎＯ微粒子からなる微粒子層を形成した。ここでは、純水１８ｍｌ、ポリアクリル酸ナトリウム２ｍｌに対して平均粒径が２００ｎｍのＺｎＯ微粒子を２０ｍｇ添加し、超音波を印加して混合した塗布液を用いた。この塗布液を流路中に流し、１００℃で乾燥を行った後に、３００℃で焼成し、ＺｎＯ微粒子を流路（分離チャネル等）内に固定した。この作業を２回行うことによって、微粒子層を形成した。
【００４９】
図５は、この状態で波長３６５ｎｍの紫外光を照射した際のＺｎＯ微粒子が発した波長約４００ｎｍの蛍光を撮影した結果である。これより、ＺｎＯ微粒子が均一に流路内に固定されていることが確認できる。なお、発色物質として使用するＳＹＢＲ  ＧＯＬＤの励起光となる波長４５０〜４９０ｎｍの光を照射した場合には、蛍光は全く観測されなかった。この結果より、ＺｎＯが発する蛍光がＳＹＢＲ  ＧＯＬＤからの発光に対して影響を与えることはないことが確認された。
【００５０】
次に、微粒子層を形成しない状態（比較例）でＳＹＢＲ  ＧＯＬＤを含むバッファ液を流路に投入し、励起光となる波長４５０〜４９０ｎｍの光を照射した際の、波長５１５ｎｍの蛍光（緑色）の発光を撮影した結果を図６に示す。また、微粒子層を上記の通り流路に形成した状態（実施例）で同様の撮影を行った結果を図７に示す。この結果より、微粒子層の存在によって、一様に蛍光が増強されていることが確認できる。前記の結果より、この発光にＺｎＯ自身が発した光は含まれていないため、この結果は、ＳＹＢＲ  ＧＯＬＤが発した蛍光自体が微粒子層によって増強されたことを示す。しかも、微粒子を直接バッファ液に混合した場合と異なり、蛍光の増強の再現性も良好であった。
【００５１】
次に、実際に、（１）微粒子層を形成しないマイクロ流路チップ（比較例）と、（２）上記の微粒子層を形成したマイクロ流路チップ（実施例）と、を使用し、島津製作所製ＤＮＡ１０００キットを用いて、ＤＮＡに関する電気泳動を行った結果について説明する。ここで、バッファ液としては、微粒子が添加されていない一般に使用されているものをそのまま用いており、特許文献２に記載の実験Ａにおけるものと同様である。
【００５２】
図８は、この場合の泳動時間（泳動距離に対応）と蛍光強度（ＤＮＡの検出感度に対応）の実測値である。ここで、図８（ａ）は比較例であり、（ｂ）は実施例である。図８（ａ）の結果は、特許文献２の実験Ａと同一である。実施例においては比較例の５倍以上の感度が得られている。また、実施例においては、縦軸（蛍光強度）において大きな値が得られていると同時に、検出された蛍光強度の半値幅が小さくなっていることも確認できる。この半値幅は、分子量やＤＮＡ鎖長の分解能に対応する。すなわち、検出感度が向上していると同時に、分解能も向上している。分解能が向上する理由は、流路からの光取り出し効率が上がり，励起光が照射された場所の光が効率良く検出されて，取り出されなかった光の多重反射による励起部以外での発光が少なくなるためである。  
【００５３】
特許文献２においては、特許文献２における実施例の結果が実験Ｃとしてその表３等に記載されており、その検出感度は比較例（実験Ａ）の２．４倍程度であった。従って、本願の実施例においてはこれよりも更に高い検出感度が得られている。この理由は、微粒子が内壁に分散された方が、微粒子が液中に分散された場合よりも励起光が多重散乱されやすくなるためであると考えられる。
【００５４】
以上より、実施例のマイクロ流路チップを用いれば、従来と同様のバッファ液等を用いて高精度の電気泳動測定を行うことができることが確認された。
【００５５】
次に、ＺｎＯ微粒子の代わりにＴｉＯ２微粒子を用いた場合の実施例について説明する。ここでは、前記のＺｎＯ微粒子の代わりに、平均粒径が８０ｎｍのＴｉＯ２微粒子を用い、図７と同様の測定を行った。ＴｉＯ２微粒子をコーティングしなかった場合の発光を図９に、ＴｉＯ２微粒子をコーティングした場合の結果を図１０に示す。ＴｉＯ２微粒子をコーティングした場合においても、発光強度が増大していることが確認できる。
【００５６】
なお、上記の例では、蛍光色素としてＳＹＢＲ  ＧＯＬＤを用いたが、臭化エチジウムを用いた場合でも同様の結果が得られた。また、上記の例ではＤＮＡ分析において本発明の実施例であるマイクロ流路チップを用いたが、電気泳動法の原理より、他の分子の分析においても、上記のマイクロ流路チップが有効であることは明らかである。
【００５７】
また、微粒子層を流路の内壁に形成する方法についても、上記のような水溶液を用いた方法に限定されず、任意である。微粒子の存在が分子の泳動に影響を与えない限りにおいて、同様の効果を奏することは明らかである。
【００５８】
また、上記の例では、このマイクロ流路チップが電気泳動に使用された例について記載したが、流路中に存在する液体中の蛍光色素から発せられる蛍光を検出する際においては、上記の構成が有効であることは明らかである。このため、上記のマイクロ流路チップの用途は特に電気泳動に限定されない。この際、例えば流路の液体中に電界を発生させるための電極は必ずしも必要ではない。
【符号の説明】
【００５９】
１０  マイクロ流路チップ
１１  板状体
１２  導入チャネル
１２ａ  試料リザーバ
１２ｂ  アウトレット    
１４  分離チャネル
１４ａ  バッファ注入口  
１４ｂ  バッファ貯留孔
１６  交差部  
２０  微粒子層
３０  蓋
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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