(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列から成る、骨形成または血管新生促進用ペプチド。
＜配列番号１＞
Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ
【請求項２】
前記配列番号１のアミノ酸配列がＢＭＰ７に由来する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記ペプチドが骨芽細胞の分化またはＶＥＧＦの発現を促進する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
前記ペプチドが骨形成および血管新生促進活性を有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
請求項１のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項５のポリヌクレオチドを含む組み換えベクター。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項のペプチド、前記ペプチドをコードするポリヌクレオチド、または前記ポリヌクレオチドを含む組み換えベクターを有効成分として含む、骨疾患または虚血性疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項８】
前記骨疾患は骨粗しょう症、骨関節炎、骨折および骨形成不全症よりなる群から選ばれる一つ以上の疾患である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記虚血性疾患は虚血性壊死、虚血性脳血管疾患、虚血性腎臓疾患、虚血性肺疾患、四肢の虚血性疾患、虚血性心臓疾患、脳卒中、脳梗塞、心筋梗塞、虚血性心不全および閉塞性動脈硬化症よりなる群から選ばれる一つ以上の疾患である、請求項７に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨形成または血管新生促進用ペプチドおよびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨（ｂｏｎｅ）は、身体の物理的支持体であって、必要な骨量と構造を保存する役割を果たし、カルシウムの血中濃度維持に重要な役割を果たす。骨は、骨吸収および骨形成の両者とも盛んに行われ、代謝的な観点からバランスが取れる動的状態を保つ。このような骨吸収と骨形成のバランスが崩れると、骨吸収量が骨形成量より多くなり、骨密度または骨量の減少を引き起こし、骨強度が保たれない状態である骨粗しょう症を引き起こすおそれがある。
【０００３】
骨粗しょう症（ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ）は、症状が進展するにつれて骨が弱くなるため、小さい衝撃にも骨折し易い。骨粗しょう症の他にも、骨関連疾患としては骨関節炎（ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）および骨欠損疾患などがあるが、骨関節炎は、関節の軟骨が損傷しながら局所的に退行性変化が現れる疾患であって、退行性関節炎ともいう。
【０００４】
骨欠損疾患は、人体の様々な部位に現れうるが、その主原因として、骨折損失を伴う急性外傷、手術中の組織除去による骨損失を伴う急性外傷、骨切除（ｂｏｎｅ  ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ）を伴う慢性感染、分節性骨欠損を伴う慢性癒着不能（ｎｏｎｕｎｉｏｎ）などを挙げることができる。
【０００５】
このような骨疾患の治療に関連して全世界的に約１，３００億ドル以上の市場が形成されており、その規模は引き続き増加するだろうと予想されるため、世界各国の研究機関と製薬会社では骨疾患治療剤の開発に多くの投資を行っている。
【０００６】
現在、骨粗しょう症治療剤として用いられている物質としては、ビスホスホネート製剤（アレンドロネート、エチドロネートなど）、ホルモン製剤（ラロキシフェン）、ビタミンＤ製剤、カルシトニン製剤およびカルシウム製剤などがあり、最近、骨生成効能のある副甲状腺ホルモン製剤であるフォルテオＴＭなどが市販されている。
【０００７】
その中で、ビスホスホネート製剤は、吸収率に劣るうえ、食道炎を誘発させるため、朝食の前に十分な水と共に服用しなければならず、一定の時間以上横になるのが禁止されるなど、その服用方法が非常に複雑である。ホルモン製剤は、一生服用しなければならず、長期投与する場合、乳癌、子宮癌および血栓症などの副作用が現れる。ビタミンＤ製剤は高価で効果が確かでなく、カルシトニン製剤も高価で投与方法が難しい。カルシウム製剤は、副作用は少ないものの、治療よりは予防効果に局限される。
【０００８】
最近、商用化された副甲状腺ホルモン製剤であるフォルテオＴＭは、骨生成効能があるため、骨吸収抑制に限定された既存の薬物の欠点を補完することができるという利点はあるが、長期間にわたって毎日注射で投与しなければならず、非常に高価であるため、その使用が制限的であるという問題点がある。したがって、骨粗しょう症の根本的な治療のために、バランスよく骨量の増加と骨の質を改善させて実質的に骨折の危険を低めることが可能な薬物および新規治療法の開発が求められる。
【０００９】
一方、虚血性疾患（ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）は、体の各器官に血流を供給する血管に多様な形態の病理学的異常が発生し、局所的に正常的血流の障害をもたらす疾患をいう。血管による血液の供給は傷の治癒または組織の再生に必須な現象であるといえるが、動脈硬化症状、心筋梗塞および狭心症などの疾病は円滑でない血液供給が原因となっている。
【００１０】
血管新生を用いて生体疾患を治療することを血管新生療法というが、既にＶＥＧＦなどの血管新生因子は重症の局所貧血のための治療剤として使われている。
【００１１】
また、ＦＧＦ、上皮成長因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＥＧＦ）および血小板誘導内皮成長因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＰＤＥＧＦ）などの血管新生因子も臨床治療のために研究されている。ところが、これらの因子は、タンパク質として分離・精製することが難しく、高価であって臨床適用に困難さがある。
【００１２】
このような背景の下で、本発明者は、骨疾患だけでなく、血管新生療法にも使用することができ且つ経済的に生産することができる、低分子量を有する治療剤の開発のために鋭意努力した結果、ＢＦＰ４（ｂｏｎｅ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ４）が骨芽細胞の分化だけでなく血管新生も促進することができることを見出し、本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、配列番号１のアミノ酸配列を含む、骨形成または血管新生促進用ペプチドを提供することにある。
【００１４】
本発明の他の目的は、前記ペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供することにある。
【００１５】
本発明の別の目的は、前記ポリヌクレオチドを含む組み換えベクターを提供することにある。
【００１６】
本発明の別の目的は、前記ペプチド、前記ペプチドをコードするポリヌクレオチド、または前記ポリヌクレオチドを含む組み換えベクターを有効成分として含む、骨疾患または虚血性疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上記目的を達成するための一つの様態として、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を含む、骨形成または血管新生促進用ペプチドを提供する。
【００１８】
配列番号１
Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ
本発明において、「骨形成」は、骨が発生する過程を意味し、骨芽細胞による骨基質形成とその石灰化現象を含む。
【００１９】
本発明において、「血管新生」は、血管が新しく形成される過程、すなわち、新しい血管が細胞、組織または器官内に発生することを指すもので、新しい血管が生成される場合（ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）および既存の血管から新しい血管が延び出す場合（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）の両方とも含む。
【００２０】
本発明において、「骨形成または血管新生の促進」は、短時間で骨形成または血管新生が起こるようにするのはもとより、骨形成または血管新生を誘導することも含む。
【００２１】
本発明において、「ペプチド」は、アミド結合で連結されたアミノ酸からなるポリマーであり、前記アミノ酸はＬ型またはＤ型である。本発明のペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列に他のアミノ酸やペプチドなどが融合したペプチドであって、骨形成または血管新生促進活性を示す限り、本発明の範囲に含まれる。
【００２２】
前記アミノ酸は、天然アミノ酸、合成アミノ酸、並びに天然アミノ酸と類似の方式で作用するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を含む。天然アミノ酸は遺伝子コードによってコードされるアミノ酸であり、アミノ酸類似体は天然アミノ酸のように水素、カルボキシ基、アミノ基およびＲ基に結合したα炭素を有する化合物であって、変形Ｒ基（例えば、ノルロイシン）または変形ポリペプチド骨格を持つことができる。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般な化学構造とは異なる構造を持つが、天然アミノ酸と類似の方式で作用する化学化合物を意味する。
【００２３】
本発明は本発明に係るペプチドの相同体を含む。前記「相同体」とは、機能的同等物であって、配列番号１を含むペプチドと実質的に同質の生理活性を示すペプチドをいう。「同質の生理活性」とは、少なくとも６０％以上の、好ましくは７０％、さらに好ましくは９０％以上のアミノ酸配列相同性を有することをいう。
【００２４】
前記配列番号１のアミノ酸配列は、ＢＭＰ７に由来することができ、好ましくはＢＭＰ７のｐｒｏｄｏｍａｉｎに由来する。ＢＭＰは骨形成過程を誘導する因子として知られているが、これらは自然界に極小量として存在する。また、ＢＭＰは高分子量の化合物であって、組み換えＢＭＰの製造は多くの費用がかかり、そのタンパク質的特性のため、物性および投与の観点から医薬としては多くの制約がある。ところが、本発明のペプチドは、１５個のアミノ酸を含む低分子量の化合物であって、経済的に生産することができ、骨形成効果において、ＢＭＰ７と同等以上の効果を持っている。
【００２５】
好ましくは、本発明のペプチドは骨芽細胞の分化またはＶＥＧＦの分化を促進することができる。
【００２６】
好ましくは、本発明のペプチドは骨形成および血管新生促進活性を有するペプチドである。
【００２７】
本発明の一実施例では、アリザリンレッド（ａｌｉｚａｒｉｎ  ｒｅｄ）染色によって骨芽細胞の分化程度を確認した結果、骨芽細胞の分化を促進するにあたり、本発明のペプチドがＢＭＰ７よりさらに優れた効果を持っていることを確認した（図２）。また、マウスを用いた動物実験の結果、ＢＭＰ７を処理した部位より本発明のペプチドを処理した部位で骨形成が確然に多く行われていることを確認した（図８）。したがって、本発明のペプチドは骨疾患の予防および治療のために有用に使用できる。
【００２８】
一方、ＶＥＧＦは、非常に強力な血管新生因子として知られており、ＶＥＧＦの過発現は血管新生を刺激する。本発明の一実施例では、前記ＶＥＧＦがＢＭＰ７より本発明のペプチドによってさらに多く発現されたことを確認し（図９）、マウスを用いた動物実験の結果、マトリゲルに血管が形成されたことを確認した（図１０）。したがって、本発明のペプチドは虚血性疾患の予防および治療のために有用に使用できる。
【００２９】
本発明のペプチドは、公知のペプチド合成法または形質転換された宿主細胞を培養することにより製造することができる。本発明のペプチドを、形質転換された宿主細胞を培養して製造する場合、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組み換えベクターを宿主細胞に導入して形質転換した後、前記形質転換体を培養して生産することができる。前記形質転換体を培養する方法は、本発明のペプチドを生産するために、当業界における公知の任意の方法を適切に選択して用いることができる。
【００３０】
他の様態として、本発明は、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびこれを含む組み換えベクターを提供する。
【００３１】
本発明のポリヌクレオチドは、ヌクレオチドモノマー（ｍｏｎｏｍｅｒ）が共有結合によって長く鎖状に繋がっているヌクレオチドのポリマーであって、一定の長さ以上のＤＮＡ（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）またはＲＮＡ（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）鎖であって、本発明に係るペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【００３２】
本発明のポリヌクレオチドは、コドンの縮退性（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）により、或いは前記ペプチドを発現させようとする生物で好まれるコドンを考慮して、コード領域から発現するペプチドのアミノ酸配列を変化させない範囲内でコード領域に様々な変形が行われてもよく、コード領域を除いた部分においても遺伝子の発現に影響を及ぼさない範囲内で様々な変形または修飾が行われてもよい。すなわち、本発明のポリヌクレオチドは、これと同等の活性を有するペプチドをコードする限り、一つ以上の核酸塩基が置換、欠失、挿入またはこれらの組み合わせによって変異でき、これらも本発明の範囲に含まれる。
【００３３】
本発明の組み換えベクターは、細胞内に導入して本発明のペプチドを発現させるための手段であって、プラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクターなど公知の発現ベクターを使用することができる。ベクターは、ＤＮＡ組み換え技術を用いた任意の公知の方法によって当業者が容易に製造することができる。
【００３４】
別の様態として、本発明は、本発明のペプチド、前記ペプチドをコードするポリヌクレオチド、または前記ポリヌクレオチドを含む組み換えベクターを有効成分として含む、骨疾患または虚血性疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【００３５】
また、別の様態として、本発明は、前記薬学的組成物を、骨疾患または虚血性疾患が発病した或いは発病する可能性のある個体に投与する段階を含む、骨疾患または虚血性疾患の予防または治療方法を提供する。
【００３６】
本発明において、用語「予防」とは、本発明の薬学的組成物の投与によって骨疾患または虚血性疾患を抑制させる或いは発病を遅延させる全ての行為を意味し、用語「治療」とは、本発明の薬学的組成物の投与によって骨疾患または虚血性疾患による症状を好転させる或いは有益に変更する全ての行為を意味する。
【００３７】
本発明において、用語「個体」とは、骨疾患または虚血性疾患が発病した或いは発病する可能性のあるヒトを含む全ての動物を意味する。前記骨疾患は、骨粗しょう症、骨関節炎、骨折および骨形成不全症よりなる群から選ばれる一つ以上の疾患でありうる。前記虚血性疾患は、虚血性壊死、虚血性腎臓疾患、虚血性肺疾患、四肢の虚血性疾患、虚血性心臓疾患、脳卒中、脳梗塞、心筋梗塞、虚血性心不全、狭心症および閉塞性動脈硬化症よりなる群から選ばれる一つ以上の疾患でありうる。
【００３８】
本発明の薬学的組成物の投与経路は、目的組織（骨欠損部位など）または細胞に到達することができる限り、ある一般な経路によって投与できる。本発明の薬学的組成物は、目的に応じて腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、肺内投与、直腸内投与、細胞内直間接投与によって投与できる。このために、本発明の薬学的組成物は、活性物質が標的細胞へ移動することが可能な任意の装置によって投与できる。
【００３９】
本発明の薬学的組成物は、許容可能な担体を含むことができる。薬学的に許容される担体を含む前記薬学的組成物は、経口または非経口の様々な剤形であってもよい。製剤化する場合には通常の充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を用いて調製される。経口投与のための固形製剤には錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれる。このような固形製剤は、一つ以上の化合物に少なくとも一つの賦形剤、例えば澱粉、炭酸カルシウム、スクロースまたはラクトース、ゼラチンなどを混ぜて調製される。経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、よく使用される単純希釈剤である水、流動パラフィンの他にも、様々な賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれうる。非経口投与のための製剤には、滅菌した水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁溶剤としてはプロピレングリコール（ｐｕｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オーリブ油などの植物性油、オレイン酸エチルなどの注射可能なエステルなどが使用できる。坐剤の基剤としてはｗｉｔｅｐｓｏｌ、マクロゴール、ｔｗｅｅｎ６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用できる。
【００４０】
本発明の薬学的組成物は、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤、滅菌した水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤および坐剤よりなる群から選ばれるいずれか一つの剤形を持つことができる。
【００４１】
本発明の薬学的組成物は、治療的有効量または薬学的に有効な量で投与する。用語「治療的有効量または薬学的に有効な量」は、医薬的治療に適用できる合理的なベネフィット／リスク比で疾患を治療するに十分な量を意味し、有効用量の水準は個体の種類、重症度、年齢、性別、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路、排出比率、治療期間、同時使用される薬物を含む要素、およびその他の医薬分野によく知られている要素によって決定できる。
【００４２】
本発明の薬学的組成物は、骨疾患または虚血性疾患の治療のために単独で、或いは手術、ホルモン治療、薬物治療および生物学的反応調節剤を用いる方法と併用して投与できる。
【発明の効果】
【００４３】
本発明の骨形成促進用ペプチドは、低分子量のペプチドであって、経済的に生産することができるうえ、骨芽細胞の分化を促進して速い骨形成を誘導することができるという効果がある。よって、本発明のペプチドは骨疾患の予防または治療のために有用に使用することができる。
【００４４】
また、本発明の血管新生促進用ペプチドは、ＶＥＧＦの発現によって血管新生を誘導することができるという効果がある。よって、本発明のペプチドは、虚血性疾患の予防または治療のために有用に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】ＢＦＰ４のアミノ酸配列、構造、分子量および電荷値を示す。
【図２】アリザリンレッド染色によって確認したＢＦＰ４の骨芽細胞分化促進効果を示す写真である。
【図３】ＢＦＰ４が細胞毒性を有しないことを示すグラフである。
【図４】ＢＦＰ４によるＡＬＰの活性およびカルシウム濃度の増加を示すグラフである。
【図５】ＢＦＰ４によるＲｕｘ２、オステオカルシンおよびＡＬＰ遺伝子の発現を示すウエスタンブロット写真である。
【図６】ＢＦＰ４による骨芽細胞の分化に関連した細胞表面マーカーＣＤ４４およびＣＤ５１の発現をＦＡＣＳ分析によって確認した結果である。
【図７】ＢＦＰ４によるＣＤ４４およびＣＤ５１の発現を蛍光顕微鏡で確認した結果写真である。
【図８】ＢＦＰ４によってマウスの移植部位で骨が形成されたことを示す写真である。
【図９】ＢＦＰ４によるＶＥＧＦの発現を示すウエスタンブロット写真である。
【図１０】マトリゲルを用いた動物実験の結果、ＢＦＰ４によってマトリゲルに血管が形成されたことを示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
以下、本発明を実施例によってさらに詳細に説明する。但し、下記実施例は本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容を限定するものではない。
【００４７】
実施例１．ＢＦＰ４の合成
配列番号１のアミノ酸からなるペプチドは、公知の方法によって人為的に合成可能であるが、本実験のためには（株）ペプトロン（韓国）に依頼して製造した。下記のアミノ酸配列を有するペプチドをＢＦＰ４（ｂｏｎｅ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ４）と命名した。
【００４８】
＜配列番号１＞
Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ
前記合成されたＢＦＰ４の構造を商用プラグラムを用いて確認した結果、図１に示すように、１８２６．１の分子量を有する１５個のアミノ酸配列を持つα−ヘリックス構造を持っていることを確認した（図１）。
【００４９】
実施例２．骨芽細胞および骨芽細胞分化培地の準備
１０％ＦＢＳ入りのＤＭＥＭに、１×１０４個のＢａｌｂ／ｃ  ｍｏｕｓｅ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌからクローニングされた中間葉幹細胞が入るように分注した後、約３７℃の温度を維持する、５％の二酸化炭素が含有された大気中で約３日間培養し、本実験に使用される骨芽細胞として前記中間葉幹細胞を準備した。
【００５０】
骨芽細胞分化培地（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ、ＯＤＭ）を、５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸、１０−８Ｍデキサメタゾンおよび１０ｍＭベータ−グリセロリン酸塩などが添加されたＤＭＥＭに製造した。
【００５１】
実施例３．ＢＦＰ４の骨芽細胞分化促進効果の確認
中間葉幹細胞が骨芽細胞に分化するとカルシウムが蓄積されるので、アリザリンレッド（ａｌｉｎｚａｒｉｎ  ｒｅｄ）染色によってミネラリゼーションを測定することにより、骨芽細胞の分化程度を確認した。すなわち、骨芽細胞に分化が促進されるほど、アリザリンレッドによって染色される部分が多くなるので、骨芽細胞分化培地にアリザリンレッドを入れてＢＦＰ４を処理した後、アリザリンレッドの染色程度から骨芽細胞の分化程度を確認することができる。このために、骨芽細胞分化培地に骨芽細胞、すなわち中間葉幹細胞を移して３日間培養した後、ＢＦＰ４またはＢＭＰ７を０．００１μｇ／ｍＬ、０．０１μｇ／ｍＬ、０．０５μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬずつ添加して２日間さらに培養した。その後、培養された中間葉幹細胞を、氷で冷却させた７０％エタノールで１時間固定し、アリザリンレッド−ｓ（ａｌｉｚａｒｉｎ  ｒｅｄ−ｓ）溶液で約１０分間染色してカルシウムの沈着程度を確認し、図２に示した。
【００５２】
その結果、図２に示すように、０．０１μｇ／ｍＬのＢＦＰ４を添加した細胞で最も強く染色されることを確認することができ、特に、ＢＭＰ７より本発明のＢＦＰ４によってさらに強く染色されることを確認することができた（図２）。このような結果は、ＢＦＰ４がＢＭＰ７よりさらに優れた骨芽細胞分化効果を持っていることを示す。
【００５３】
実施例４．ＢＦＰ４の細胞毒性の確認
カルシウム蓄積に効果がある濃度でＢＦＰ４の細胞毒性有無を確認し、図３に示した。このために、ＭＴＴ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を用いて、会社から提供する方法に従って分析を行った。
【００５４】
その結果、図３に示すように、ＢＦＰ４が骨芽細胞の分化を促進する濃度で細胞毒性を示さないことを確認することができた（図３）。
【００５５】
実施例５．ＢＦＰ４によるＡＬＰの活性およびカルシウム濃度増加の確認
骨芽細胞の分化で発現される骨芽細胞特定酵素であるアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の活性およびカルシウムの濃度をＤＡＬＰ−２５０  ＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｇｅｎｔａｕｒ）およびＤＩＣＡ−５００  ＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍ  Ｃａｌｃｉｕｍ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｇｅｎｔａｕｒ）を用いて確認し、図４に示した。
【００５６】
その結果、図４に示すように、ＢＦＰ４が０．０１μｇ／ｍＬおよび０．１μｇ／ｍＬ濃度であるとき、ＡＬＰの活性およびカルシウムの濃度が有意的に増加することを確認することができた（図４）。
【００５７】
実施例６．ＢＦＰ４による骨芽細胞特異遺伝子発現の確認
ＢＦＰ４による骨芽細胞特異遺伝子であるＲｕｎｘ２、オステオカルシンおよびアルカリホスファターゼ遺伝子の発現を確認し、図５に示した。このために、ペプチドを処理した細胞からＲＮＡを抽出し、ＤＮＡを合成した後、前記遺伝子の発現程度をＰＣＲを行って電気泳動によって測定した。
【００５８】
その結果、図５に示すように、ＢＦＰ４によって骨芽細胞特異遺伝子が発現されることを確認することができた（図５）。
【００５９】
実施例７．ＢＦＰ４による骨芽細胞分化細胞表面マーカー発現の確認
中間葉幹細胞が骨芽細胞に分化されながら現れる特定の表面タンパク質ＣＤ４４、ＣＤ５１の発現に及ぼすＢＦＰ４の影響をＦＡＣＳ分析によって測定し、図６に示した。
【００６０】
その結果、図６に示すように、ＢＦＰ４を骨芽細胞分化培地に添加すると、骨芽細胞に分化される過程中に中間葉幹細胞で発現される細胞表面マーカーＣＤ４４が強く発現されたことを確認した。特に、ＢＦＰ４を０．１μｇ／ｍＬ入れたときにＣＤ４４の発現がより強く現れることを確認した。また、骨芽細胞の分化で発現されるＣＤ５１もＢＦＰ４を添加した場合にさらに強く発現されることを確認することができた（図６）。
【００６１】
実施例８．ＢＦＰ４による細胞表面マーカーＣＤ４４とＣＤ５１発現の確認
ＢＦＰ４による細胞表面マーカーＣＤ４４とＣＤ５１の発現を蛍光顕微鏡を介して観察し、図７に示した。このために、骨芽細胞分化過程中に細胞が生きていることを確認するために、ＤＡＰＩ染色、およびＣＤ４４、ＣＤ５１に結合して赤色を帯びるＣＤ４４、ＣＤ５１抗体を用いて蛍光顕微鏡で観察した。
【００６２】
その結果、図７に示すように、細胞でＣＤ４４およびＣＤ５１が発現された。特に、骨芽細胞分化培地にＢＦＰ４と共に入れた場合、ＣＤ４４およびＣＤ５１が強く発現されることを確認することができた（図７）。
【００６３】
実施例９．ＢＦＰ４による生体内骨形成促進効果の確認
ＢＦＰ４が生体内で骨形成を促進するかを確認するために、マウスを用いた動物実験を行った（ｎ＝６）。まず、中間葉幹細胞の分化を誘導するために、ＯＤＭを３日にわたって２回処理した後、２回目にＯＤＭを添加するときにＢＭＰ７またはＢＦＰ４を処理し、２４時間経過後に細胞を収集して同数の細胞数を測定した後、マウスの背部分にコラーゲンを支持体として用いて移植した。移植後４週目と８週目にＸ−ｒａｙを用いて骨形成を比較し、図８に示した。
【００６４】
その結果、図８に示すように、４週目にＢＦＰ４を処理した部位に骨が形成されることをＸ−ｒａｙ上で観察することができた。また、８週目の結果写真から、ＢＭＰ７を処理した部位よりＢＦＰ４を処理した部位で骨形成が確然に多く行われていることを確認することができた（図８）。このような実験結果は、骨芽細胞の分化において、ＢＦＰ４が従来の骨芽細胞の分化を促進すると知られているＢＭＰ７より著しく優れる効果を持っているので、ＢＦＰ４を骨疾患の予防および治療のために有用に使用することができることを示す。
【００６５】
実施例１０．ＢＦＰ４によるＶＥＧＦ発現の確認
ＢＦＰ４の血管新生効果を確認するために、ＶＥＧＦの発現に及ぼすＢＦＰ４の影響を観察した。このために、ペプチドを処理した細胞からタンパク質を抽出した後、タンパク質電気泳動を行い、しかる後に、ＶＥＧＦ抗体を用いて発現を測定した。
【００６６】
その結果、図９に示すように、ＢＦＰ４によってＶＥＧＦの発現が増加した。特に、ＶＥＧＦがＢＭＰ７よりＢＦＰ４によってさらに多く発現されることを確認することができた（図９）。
【００６７】
実施例１１．ＢＦＰ４による生体内血管新生効果の確認
ＢＦＰ４による生体内血管新生を確認するために、マトリゲルを用いたマウス動物実験を行った。このために、ペプチドを処理した細胞を獲得した後、マトリゲルと共によく混合し、マウスの背に移植させた後、８週目にマウスの背からマトリゲルをさらに摘出して血管新生を観察した。
【００６８】
その結果、図１０に示すように、８週目に確認した結果、マトリゲルに血管が形成されることを確認した。特に、ＢＭＰ７に比べてＢＦＰ４による血管新生効果がさらに優れることを確認することができた（図１０）。
【図２】
0006025002.tif 000002
【図３】
0006025002.tif 000003
【図４】
0006025002.tif 000004
【図６】
0006025002.tif 000005
【図７】
0006025002.tif 000006
【図９】
0006025002.tif 000007
【図１０】
0006025002.tif 000008
【図１】
0006025002.tif 000009
【図５】
0006025002.tif 000010
【図８】
0006025002.tif 000011
【配列表】
0006025002000001.app