(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号：１〜配列番号：３のいずれかで表されるアミノ酸配列から構成された群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドは、細胞成長促進能を有することを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記ペプチドは、酸化ストレスによる細胞死滅を抑制することを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
前記ペプチドは、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）２の活性を抑制することを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
前記ペプチドは、コラーゲン分解を抑制することを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項６】
前記ペプチドは、ヒアルロン酸分解を抑制することを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項７】
前記ペプチドは、メラノソーム移動を抑制することを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項８】
前記ペプチドは、脂肪細胞での脂肪生成を抑制することを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項９】
前記ペプチドは、血管生成を抑制することを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項１０】
請求項１から請求項９のうち何れか一項に記載のペプチドを有効成分として含む皮膚状態改善用化粧料組成物。
【請求項１１】
前記皮膚状態の改善は、しわ改善、皮膚弾力改善、皮膚老化防止、皮膚保湿改善、傷除去、皮膚再生または美白であることを特徴とする請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
請求項１から請求項９のうち何れか一項に記載のペプチドを有効成分として含む皮膚状態改善用薬剤学的組成物。
【請求項１３】
前記皮膚状態の改善は、傷除去または皮膚再生であることを特徴とする請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
（ａ）請求項１から請求項９のうち何れか一項に記載のペプチドと、
（ｂ）ヒアルロン酸と、
を含む皮膚フィラー。
【請求項１５】
請求項１から請求項９のうち何れか一項に記載のペプチドを有効成分として含む肥満の予防または治療用薬剤学的組成物。
【請求項１６】
請求項１から請求項９のうち何れか一項に記載のペプチドを有効成分として含む炎症の予防または治療用薬剤学的組成物。
【請求項１７】
請求項１から請求項９のうち何れか一項に記載のペプチドを有効成分として含む癌の予防または治療用薬剤学的組成物。
【請求項１８】
請求項１から請求項９のうち何れか一項に記載のペプチドを有効成分として含むＭＭＰ−活性関連疾患の予防または治療用薬剤学的組成物であって、前記ＭＭＰ−活性関連疾患は、関節炎、糖尿病性網膜症、肥大性瘢痕、乾癬、粘膜及び上皮組織の潰瘍、自己免疫による炎症、基底膜の分解と関連した疾病である狼瘡、自己免疫性神経障害、筋細胞破壊、緑内障または過度な血管新生であることを特徴とする組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マトリックスメタロプロテアーゼの活性を抑制するペプチド及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
マトリックスメタロプロテアーゼ（Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ；以下、ＭＭＰと称する）は、コラーゲン、プロテオグリカン、及びゼラチンのような巨大生分子を分解させることができるエンドペプチダーゼ類の酵素であって、大きくコラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、ストロメリシン、及び膜型ＭＭＰに分類される。マトリックスメタロプロテアーゼは、いずれも前駆酵素の形態で発現された後、一部が切られることで活性化される（非特許文献１〜３）。
【０００３】
コラゲナーゼは、三重螺旋形癲癇性コラーゲンとゼラチンなどに作用し、線維芽細胞コラゲナーゼ、好中球コラゲナーゼ、及びコラゲナーゼ−３の３種が知られており、第Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ型のコラーゲン細線維（Ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｆｉｂｒｉｌｓ）を切断すると報告されている（非特許文献４〜５）。また、これら３種のコラゲナーゼは、互いに約５０％以上の配列同一性を有すると知られている（非特許文献６〜７）。
【０００４】
ＭＭＰは、全ペプチド部位、触媒性部位、及びＣ−末端部位の３つの部位に区分される。ＭＭＰは、いずれも活性のない潜伏型で生成分泌された後、Ｎ−末端の全ペプチド部位の８０個のアミノ酸が切られており、このＰＲＣＧＶＰＤ配列を有する部位のシステインが除去されながら活性化される（非特許文献８）。該活性化されたＭＭＰは、天然抑制剤であるＭＭＰ組織阻害剤（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）と結合して活性が抑制されると知られているが、この結合は、触媒性部位によって調節される（非特許文献９）。さまざまな形態のＭＭＰは、基質特異性を有しており、正常な細胞にも、細胞外マトリックス（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ）や他のコラーゲン構造を分解しなければならない必要性がある時、代謝過程で発現される。ＭＭＰによって媒介される疾患としては、動脈硬化症、中枢神経系の炎症疾患、アルツハイマー、皮膚老化、リウマチ性関節炎、骨関節炎、角膜潰瘍、骨疾患、タンパク尿症、腹大動脈瘤疾患、外傷性関節損傷による退行性軟骨損失、神経系の髄鞘脱落疾患、肝硬変、腎糸球体疾患、胚胎膜の未成熟破裂、炎症性腸疾患、歯根膜疾患、老化と関連した黄斑変性、糖尿性網膜病症、増殖性硝子体網膜病症、未成熟網膜病症、円錐角膜、シェーグレン症候群、近眼、眼科腫瘍、角膜移植拒否、血管新生、癌の浸潤と転移などがある。リウマチ性関節炎と骨関節炎は、自己免疫異常が原因であるが、病気が進行しながら、関節軟骨の細胞外マトリックスが破壊される。このような関節炎及び関節外傷でストロメリシンが主な酵素として認識され、プロコラゲナーゼを活性コラゲナーゼに切替えるのに重要な役割を行うと明らかになっている。したがって、ＭＭＰ活性を抑制することによって、関節炎進行を阻むことができ、前記ＭＭＰは、浸透性白血球または線維芽細胞、または外在的に微生物から由来されると報告されている。
【０００５】
また、炎症媒介体の刺激によって分泌されたコラゲナーゼ及び細菌から分泌されたコラゲナーゼは、歯周組織の基質であるコラーゲンを分解して歯茎退縮を発生させ、次第に進行して歯周疾患を引き起こす。炎症を起こした歯茎から分離された線維芽細胞コラゲナーゼ及びストロメリシンの活性が確認され、酵素のレベルは、観察された歯齦炎の程度と相互関連することが確認された（非特許文献１０）。
【０００６】
ＭＭＰは、さまざまな中枢神経系（ＣＮＳ）の発病と関連がある。ＭＭＰは、炎症性の単核球細胞を中樞神経に流入させて、ミエリンを破壊させるか、血液脳関門（Ｂｌｏｏｄ−Ｂｒａｉｎ  Ｂａｒｒｉｅｒ）を破壊させ、アルツハイマー疾患では、アミロイドβタンパク質の蓄積に関与すると推定されている（非特許文献１１）。また、ＭＭＰは、アルツハイマー疾患の脳で正常の脳よりも、その濃度が高いと報告されており（非特許文献１２）、脳脊樺液でのゼラチナーゼＢレベルは、多発性硬化症及びその他の神経性疾患と関連しており（非特許文献１３）、アミロイドβタンパク質を分解して蓄積させることにも寄与すると報告されている（非特許文献１４）。
【０００７】
また、ＭＭＰは、皮膚老化を誘導するので、これを抑制すれば、しわ治療及び予防作用を期待することができ、ＭＭＰは、また基底膜分解作用として血管新生、癌の浸潤と転移とを促進させる。したがって、ＭＭＰは、基底膜の分解を通じて癌の浸潤と転移とに非常に重要な役割を行うだけではなく、これにより、媒介される疾患が非常に多様なので、これを抑制することができる薬剤の開発が要求されている。しかし、このような抑制剤は、長期間の使用時に安全に使用して初めて、理想的な治療剤として使うことができるので、ＭＭＰ活性抑制剤として毒性が少ない製剤の開発が要求されている。
【０００８】
また、ＭＭＰによって媒介される多様な疾患の効果的な治療のために、ＭＭＰ抑制剤についての研究が活発に進められており、ＭＭＰ抑制剤の開発は、多様な疾患の治療に効果的に使われる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｂｏｎｄ，Ｊ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７５，５６５−５７４（１９８５）
【非特許文献２】Ｃｈｅｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｃｈｅｎ，Ｗ．Ｔ．，Ｃｅｌｌ，４８，１９３〜２０３（１９８７）
【非特許文献３】Ｈａｒｒｉｓ，Ｅ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｌ  Ｒｅｌ  Ｒｅｓ，４，４９３−５１２（１９８４）
【非特許文献４】Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｇ．Ｉ．，ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１，６６００−６６０５（１９８６）
【非特許文献５】Ｆｉｎｉ，Ｍ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６，６１５５−６１６５（１９８７）
【非特許文献６】Ｂｏｒｋａｋｏｔｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，１，１０６−１１０（１９９４）
【非特許文献７】ＥＭＢＯ，Ｊ．，１３，１２６３−１２６９（１９９４）
【非特許文献８】Ｖａｎ  Ｗａｒｔ，Ｈ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，５５７８−５５８２（１９９０）
【非特許文献９】Ｍｕｒｐｈｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，９６１２−９６１８（１９９２）
【非特許文献１０】Ｏｖｅｒａｌｌ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ  Ｒｅｓ．２２，８１−８８（１９８７）
【非特許文献１１】Ｙｏｎｇ，ＶＷ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２１（２），７５−８０（１９９８）
【非特許文献１２】Ｌｅａｋｅ  Ａ，Ｍｏｒｒｉｓ  ＣＭ，＆  Ｗｈａｔｅｌｅｙ  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ  ２９１（３），２０１−３（２０００）
【非特許文献１３】Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２，８３９〜８４１（１９９３）
【非特許文献１４】Ｂａｃｋｓｔｒｏｍ  ＪＲ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １６（２４），７９１０−９（１９９６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者らは、マトリックスメタロプロテアーゼの活性を抑制する優れたペプチドを開発するために努力してきた結果、多種のペプチドを製造及びスクリーニングするに至った。その結果、多くのペプチド候補物質のうち、コラーゲン分解抑制効果、酸化ストレスによる細胞死滅抑制効果、マトリックスメタロプロテアーゼ２の活性抑制効果、及びヒアルロン酸分解抑制効果などの生理活性に優れるだけではなく、安定性及び皮膚透過率に優れたペプチドを選別することによって、本発明を完成した。
【００１１】
したがって、本発明の目的は、以下の一般式１で表されるペプチドを提供することである：
［一般式１］
Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｓｅｒ−Ｘａａ６
【００１２】
本発明の他の目的は、前記ペプチドを有効成分として含む皮膚状態（ｓｋｉｎ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）改善用化粧料組成物を提供することである。
【００１３】
本発明のさらに他の目的は、前記ペプチドを有効成分として含む皮膚状態改善用薬剤学的組成物を提供することである。
【００１４】
本発明の他の目的は、前記ペプチド及びヒアルロン酸を含む皮膚フィラー（ｆｉｌｌｅｒ）を提供することである。
【００１５】
本発明のさらに他の目的は、前記ペプチドを有効成分として含む肥満の予防または治療用薬剤学的組成物を提供することである。
【００１６】
本発明の他の目的は、前記ペプチドを有効成分として含む炎症の予防または治療用薬剤学的組成物を提供することである。
【００１７】
本発明のさらに他の目的は、前記ペプチドを有効成分として含む癌の予防または治療用薬剤学的組成物を提供することである。
【００１８】
本発明の他の目的は、前記ペプチドを有効成分として含むＭＭＰ−活性関連疾患の予防または治療用薬剤学的組成物を提供することである。
【００１９】
本発明の他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、特許請求の範囲及び図面によってより明確になる。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明の一様態によれば、本発明は、以下の一般式１で表されるペプチドを提供する：
［一般式１］
Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｓｅｒ−Ｘａａ６
前記一般式１中、Ｘａａ１は、Ｓｅｒ、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＩｌｅであり、Ｘａａ２は、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、ＧｌｙまたはＡｌａであり、Ｘａａ３は、Ｌｙｓ、ＴｙｒまたはＰｈｅであり、Ｘａａ４は、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、ＧｌｙまたはＡｌａであり、Ｘａａ５は、Ｇｌｎ、ＳｅｒまたはＴｈｒであり、Ｘａａ６は、Ｇｌｙ、ＰｒｏまたはＬｙｓである。
【００２１】
本発明者らは、マトリックスメタロプロテアーゼの活性を抑制する優れたペプチドを開発するために努力してきた結果、多種のペプチドを製造及びスクリーニングするに至った。その結果、多くのペプチド候補物質のうち、コラーゲン分解抑制効果、酸化ストレスによる細胞死滅抑制効果、マトリックスメタロプロテアーゼ２の活性抑制効果、及びヒアルロン酸分解抑制効果などの生理活性に優れるだけではなく、安定性及び皮膚透過率に優れたペプチドを選別することによって、本発明を完成した。
【００２２】
さらに詳しく説明すれば、本発明者らは、コンピュータを利用した類似検索（Ｈｏｍｏｌｏｇｙ  Ｓｅａｒｃｈ）とドッキング方法などを通じて、既に知られている仮想のマトリックスメタロプロテアーゼとの結合可能部位を選定し、予測された部位のアミノ酸配列を最適化して、候補ペプチドを合成した。選定された多数のペプチドは、２−クロロトリチルレジンにＦｍｏｃ−アミノ酸を利用した固相合成を行った後、トリフロロ酢酸を用いてレジンから取り外した後、無水エーテルで所望のペプチドを収得した。合成したペプチドは、精製及び分析過程を経て含量と純度とを点検した後、多様な生物学的テストを経て、最も生理活性に優れたペプチドをスクリーニングすることによって、本発明のペプチドを選別した。
【００２３】
本発明のペプチドにおいて、前記Ｘａａ１は、Ｓｅｒ、ＭｅｔまたはＴｙｒであり、Ｘａａ２は、ＩｌｅまたはＬｅｕであり、Ｘａａ３は、Ｌｙｓ、ＴｙｒまたはＰｈｅであり、Ｘａａ４は、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＶａｌであり、Ｘａａ５は、Ｇｌｎ、ＳｅｒまたはＴｈｒであり、Ｘａａ６は、Ｇｌｙ、ＰｒｏまたはＬｙｓであることを特徴とするペプチドであることが望ましく、より望ましくは、配列表の配列番号：１〜配列番号：３で構成された群から選択されるペプチドであることを特徴とするペプチドである。
【発明の効果】
【００２４】
本発明の特徴及び利点を要約すれば、次の通りである：
（ａ）本発明のマトリックスメタロプロテアーゼの活性を抑制するペプチドは、直接的なマトリックスメタロプロテアーゼの活性を抑制して、皮膚状態の改善に非常に優れた効能を発揮する。
（ｂ）本発明のペプチドを含む組成物は、ヒアルロン酸分解酵素の活性抑制、脂肪細胞での脂肪生成抑制、及び血管形成抑制などの優れた生理活性があって、抗肥満、抗癌、及び抗炎症などの多様な疾病の治療に利用可能である。
（ｃ）本発明のペプチドは、サイズが小さいために、皮膚透過度に非常に優れている。
（ｄ）前述した本発明のペプチドの優れた活性及び安定性は、医薬、医薬外品、及び化粧品に非常に有利に適用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１Ａ】本発明のペプチドを各濃度別に処理した後、ヒト皮膚線維母細胞での細胞成長効果を示すグラフである。
【図１Ｂ】本発明のペプチドを各濃度別に処理した後、線維芽細胞の細胞成長効果を示すグラフである。
【図２】本発明のペプチドを処理した後、線維芽細胞の細胞成長効果を示す顕微鏡写真である。
【図３Ａ】本発明のペプチドの酸化ストレスによる線維芽細胞の死滅抑制効果を示すグラフである。
【図３Ｂ】紫外線（ＵＶ）をヒト皮膚線維母細胞に処理して細胞死滅を誘導した後、本発明のペプチドを処理して、紫外線（ＵＶ）による細胞死滅抑制効果を示す顕微鏡写真である。
【図３Ｃ】本発明のペプチドによるＥＲＫのリン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）を通じて、図３Ｂの効果が表われるということを示すデータである。
【図４Ａ】本発明のペプチドを各濃度別に処理した時、マトリックスメタロプロテアーゼ２（ＭＭＰ２）の活性抑制を示すゼラチンザイモグラフィーデータである。
【図４Ｂ】本発明のペプチドを各濃度別に処理した時、線維芽細胞でマトリックスメタロプロテアーゼ２（ＭＭＰ２）の活性抑制を示すゼラチンザイモグラフィーデータである。
【図４Ｃ】本発明のペプチドを各濃度別に処理した時、メタロプロテアーゼ２（ＭＭＰ２）の活性を直接的に抑制することを示すゼラチンザイモグラフィーデータである。
【図５Ａ】メタロプロテアーゼ２（ＭＭＰ２）によるコラーゲン分解を促進させた後、本発明のペプチドを濃度別に処理した時、コラーゲン分解が抑制されることを示すデータである。
【図５Ｂ】ＩＧＦ−１によってコラーゲンの発現を誘導した後にメタロプロテアーゼ２（ＭＭＰ２）を処理してコラーゲン分解を促進させた後、本発明のペプチドを濃度別に処理した時、コラーゲン分解が抑制されることを示すデータである。
【図６Ａ】本発明のペプチドを処理した時、ヒアルロン酸の分解を抑制することを示すゼラチンザイモグラフィーデータである。
【図６Ｂ】フィラー製品にヒアルロン酸分解酵素を入れて人為的に分解を誘導した後、各ペプチドを濃度別に処理した時、フィラー製品のヒアルロン酸分解が抑制されることを時間別に示すデータである。
【図６Ｃ】フィラー製品にヒアルロン酸分解酵素を入れて人為的に分解を誘導した後、各ペプチドを濃度別に処理した時、フィラー製品のヒアルロン酸分解が抑制されることを時間別に示すデータである。
【図６Ｄ】フィラー製品にヒアルロン酸分解酵素を入れて人為的に分解を誘導した後、各ペプチドを濃度別に処理した時、フィラー製品のヒアルロン酸分解が抑制されることを時間別に示すデータである。
【図６Ｅ】フィラー製品にヒアルロン酸分解酵素と配列表の配列番号：２のペプチドを添加後、ラットの背中の皮膚に注射して、１日〜７日おきにフィラー製品が長期間皮膚内に留まっているかに対する効果を検証した結果、配列表の配列番号：２のペプチドをフィラー製品に入れて注射した試料が、フィラー製品のみを注射した製品に比べて、ヒアルロン酸分解抑制効果が卓越したことを確認することができ、生体内で長期間保持されることを確認することができた。
【図７Ａ】本発明のペプチドを処理した時、本発明のペプチドがメラノソーム移動を抑制することによって、美白効果に優れているということを示すデータである。
【図７Ｂ】本発明のペプチドを処理した時、メラノソーム移動を抑制することを細胞形状に示すデータである。
【図８】本発明のペプチドによって炎症関連タンパク質の発現が抑制される抗炎症機能を示すＲＴ−ＰＣＲデータである。
【図９】本発明のペプチドを処理した時、脂肪合成を抑制することを示すデータである。
【図１０】本発明のペプチドを処理した時、血管生成細胞であるＨＵＶＥＣに処理した時、血管生成を抑制することを示すデータである。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本明細書で、用語“ペプチド”は、ペプチド結合によってアミノ酸残基が互いに結合されて形成された線形の分子を意味する。本発明のペプチドは、当業界に公知の化学的合成方法、特に、固相合成技術（ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）によって製造可能である（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−５４（１９６３）；Ｓｔｅｗａｒｔ，ｅｔ  ａｌ．，ＳｏｌｉｄＰｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ．ｅｄ．，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．：Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，１１１（１９８４））。
【００２７】
本発明のペプチドは、アミノ酸配列の一部位を選定し、その活性を増加させるために、Ｎ−末端またはＣ−末端に変形を誘導することができる。このような変形を通じて、本発明のペプチドは、生体内投与時の半減期を増加させた高い半減期を有しうる。
【００２８】
また、本発明のペプチドのＣ−末端は、ヒドロキシ基（−ＯＨ）、アミノ基（−ＮＨ２）、アザイド（−ＮＨＮＨ２）などに変形されており、ペプチドのＮ−末端は、アセチル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、ホルミル基、パルミトイル基、ミリスチル基、ステアリル基、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で構成された群から選択される保護基が結合されている。
【００２９】
前述したアミノ酸の変形は、本発明のペプチドの安定性を大きく改善する作用を行う。本明細書で、用語“安定性”は、インビボ安定性だけではなく、貯蔵安定性（例えば、常温貯蔵安定性）も意味する。前述した保護基は、生体内のタンパク質切断酵素の攻撃から本発明のペプチドを保護する作用を行う。
【００３０】
本発明の望ましい具現例によれば、本発明のペプチドは、ヒト皮膚線維母細胞（ｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｄｅｒｍａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）及び線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）で細胞の成長を促進させ、酸化ストレス（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ）による細胞死滅を抑制する。また、直接的に細胞に紫外線（ＵＶ）を照射して細胞死滅を誘導した後、本発明のペプチドを処理した時、細胞死滅を抑制する機能を有する。さらに、本発明のペプチドは、マトリックスメタロプロテアーゼの活性を直接的に抑制する機能を有するだけではなく、マトリックスメタロプロテアーゼによるコラーゲン分解を本ペプチドによってコラーゲン分解が抑制される機能を有する。また、本発明のペプチドは、皮膚美白に重要なメラノソーム移動（ｍｅｌａｎｏｓｏｍｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）抑制効果に優れている。このような結果は、本発明のペプチドが皮膚状態改善に非常に優れた効能を有するということを意味する。
【００３１】
本発明の他の様態によれば、本発明のペプチドを有効成分として含む皮膚状態改善用化粧料組成物を提供する。
【００３２】
本発明の他の様態によれば、本発明のペプチドを有効成分として含む組成物を対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与する段階を含む皮膚状態改善方法を提供する。
【００３３】
本発明の望ましい具現例によれば、本発明において、皮膚状態の改善は、しわ改善、皮膚弾力改善、皮膚老化防止、皮膚保湿改善、傷除去、皮膚再生または美白である。
【００３４】
本発明のさらに他の様態によれば、本発明のペプチドを有効成分として含む皮膚状態改善用薬剤学的組成物を提供する。
【００３５】
本発明の望ましい具現例によれば、本発明において、皮膚状態の改善は、傷除去または皮膚再生である。
【００３６】
本発明の他の様態によれば、本発明のペプチド及びヒアルロン酸を含む皮膚フィラーを提供する。
【００３７】
本発明の他の様態によれば、本発明のペプチド及びヒアルロン酸を含む組成物を対象に投与する段階を含む皮膚ピーリング方法を提供する。
【００３８】
本発明のペプチドは、ヒアルロン酸分解酵素の活性を抑制させることによって、フィラー製品に適用した時、フィラー製品の長期間安定性を向上させるのに優れた効果を見せる。
【００３９】
本発明のさらに他の様態によれば、本発明のペプチドを有効成分として含む肥満の予防または治療用薬剤学的組成物を提供する。
【００４０】
本発明のさらに他の様態によれば、本発明のペプチドを有効成分として含む組成物を対象に投与する段階を含む肥満の予防または治療方法を提供する。
【００４１】
本発明のペプチドは、歯周細胞に処理した時、炎症関連タンパク質の発現が抑制される抗炎症効果に優れた効能を表わす。
【００４２】
本発明のさらに他の様態によれば、本発明のペプチドを有効成分として含む炎症の予防または治療用薬剤学的組成物を提供する。
【００４３】
本発明のさらに他の様態によれば、本発明のペプチドを有効成分として含む組成物を対象に投与する段階を含む炎症の予防または治療方法を提供する。
【００４４】
本発明のペプチドは、脂肪細胞に処理した時、脂肪合成を抑制する機能が卓越して、肥満の予防または治療に利用される。
【００４５】
本発明のさらに他の様態によれば、本発明のペプチドを有効成分として含む癌の予防または治療用薬剤学的組成物を提供する。
【００４６】
本発明のさらに他の様態によれば、本発明のペプチドを有効成分として含む組成物を対象に投与する段階を含む癌の予防または治療方法を提供する。
【００４７】
本発明のペプチドは、血管内皮細胞でチューブ形成（ｔｕｂｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を抑制することによって、血管生成を抑制する機能を有するために、多様な癌の治療に応用可能である。
【００４８】
本発明のさらに他の様態によれば、本発明のペプチドを有効成分として含むＭＭＰ−活性関連疾患の予防または治療用薬剤学的組成物であって、前記ＭＭＰ−活性関連疾患は、関節炎、糖尿病性網膜症、肥大性瘢痕、乾癬、粘膜及び上皮組織の潰瘍、自己免疫による炎症、基底膜の分解と関連した疾病である狼瘡、自己免疫性神経障害、筋細胞破壊、緑内障または過度な血管新生であることを特徴とする組成物を提供する。
【００４９】
本発明のさらに他の様態によれば、本発明のペプチドを有効成分として含む組成物を対象に投与する段階を含むＭＭＰ−活性関連疾患の予防または治療方法であって、前記ＭＭＰ−活性関連疾患は、関節炎、糖尿病性網膜症、肥大性瘢痕、乾癬、粘膜及び上皮組織の潰瘍、自己免疫による炎症、基底膜の分解と関連した疾病である狼瘡、自己免疫性神経障害、筋細胞破壊、緑内障または過度な血管新生であることを特徴とする方法を提供する。
【００５０】
本発明のペプチドは、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の活性抑制、コラーゲン分解抑制、ヒアルロン酸分解抑制、メラノソーム移動を抑制、脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ  ｃｅｌｌ）での脂肪（ｌｉｐｉｄ）生成抑制、及び血管生成抑制などの多様な生理活性を有することによって、これと関連した疾病治療に有用に利用される。
【００５１】
また、本発明のペプチドは、他のタンパク質よりも分子量が遥かに小さいために、皮膚浸透率に非常に優れている。したがって、本発明の組成物を局所的に皮膚に塗布する場合、皮膚状態を効果的に改善することができる。
【００５２】
したがって、本発明のペプチドは、多様な分野の医薬品及び化粧品の用途に適した形態で利用することができ、本発明の組成物は、薬剤学的組成物と化粧品組成物とに製造可能である。
【００５３】
本発明の望ましい具現例によれば、本発明の組成物は、（ａ）前述した本発明のペプチドの薬剤学的有効量；及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む薬剤学的組成物である。
【００５４】
本明細書で、用語“薬剤学的有効量”は、前述したペプチドの効能または活性を果たすのに十分な量を意味する。
【００５５】
本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常利用されるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微小結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム、及びミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分以外に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含みうる。適した薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈｅｄ．，１９９５）に詳しく記載されている。
【００５６】
本発明の薬剤学的組成物は、経口または非経口、望ましくは、非経口で投与し、非経口投与である場合には、筋肉注入、静脈内注入、皮下注入、腹腔注入、局所投与、経皮投与などで投与することができる。
【００５７】
本発明の薬剤学的組成物の適した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因によって多様に処方されうる。一方、本発明の薬剤学的組成物の望ましい投与量は、１日当たり０．０００１〜１０００μｇである。
【００５８】
本発明の薬剤学的組成物は、当業者が容易に実施することができる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／または賦形剤を用いて製剤化することによって、単位容量の形態で製造されるか、または多容量容器内に内入させて製造可能である。この際、剤型は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液または乳液の形態であるか、エクストラクト剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤の形態でもあり得るが、分散剤または安定化剤をさらに含みうる。
【００５９】
本発明の望ましい具現例によれば、本発明の組成物は、（ａ）前述した本発明のペプチドの化粧品学的有効量（ｃｏｓｍｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）；及び（ｂ）化粧品学的に許容される担体を含む化粧品組成物である。
【００６０】
本明細書で、用語“化粧品学的有効量”は、前述した本発明の組成物の皮膚改善効能を果たすのに十分な量を意味する。
【００６１】
本発明の化粧品組成物は、当業者で通常製造される如何なる剤型にも製造可能であり、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、石鹸、界面活性剤−含有クレンジング、オイル、粉末ファンデーション、乳濁液ファンデーション、ワックスファンデーション、及びスプレーなどに剤型化されうるが、これらに限定されるものではない。より詳細には、柔軟化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、スプレーまたはパウダーの剤型に製造可能である。
【００６２】
本発明の剤型が、ペースト、クリームまたはゲルである場合には、担体成分として、動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、澱粉、トラガント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルクまたは酸化亜鉛などが利用される。
【００６３】
本発明の剤型が、パウダーまたはスプレーである場合には、担体成分として、ラクトース、タルク、シリカ、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムまたはポリアミドパウダーが利用され、特に、スプレーである場合には、さらにクロロフルオロハイドロカーボン、プロパン／ブタンまたはジメチルエーテルのような推進体を含みうる。
【００６４】
本発明の剤型が、溶液または乳濁液である場合には、担体成分として、溶媒、溶解化剤または乳濁化剤が利用され、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコールまたはソルビタンの脂肪酸エステルがある。
【００６５】
本発明の剤型が、懸濁液である場合には、担体成分として、水、エタノールまたはプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル、及びポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微小結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガまたはトラガントなどが利用される。
【００６６】
本発明の剤型が、界面−活性剤含有クレンジングである場合には、担体成分として、脂肪族アルコールサルフェート、脂肪族アルコールエーテルサルフェート、スルホスクシン酸モノエステル、イセチオン酸、イミダゾリウム誘導体、メチルタウリン、サルコシン酸、脂肪酸アミドエーテルサルフェート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体またはエトキシル化グリセロール脂肪酸エステルなどが利用される。
【００６７】
本発明の化粧品組成物に含まれる成分は、有効成分としてのペプチドと担体成分以外に、化粧品組成物に通常利用される成分を含み、例えば、抗酸化剤、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料、及び香料のような通常の補助剤を含みうる。
【実施例】
【００６８】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明する。これら実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって、本発明の範囲が、これら実施例によって制限されないということは、当業者にとって自明である。
【００６９】
合成例１：ＳＩＰＣＫＬＱＳＧ（配列表の配列番号：１）の合成
クロロトリチルクロライドレジン（Ｃｈｌｏｒｏ  ｔｒｉｔｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｒｅｓｉｎ；ＣＴＬ  ｒｅｓｉｎ、Ｎｏｖａ  ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃａｔ  Ｎｏ．０１−６４−００２１）７００ｍｇを反応容器に入れ、メチレンクロライド（ＭＣ）１０ｍｌを加えて３分間撹拌した。溶液を除去し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１０ｍｌを入れて３分間撹拌した後、再び溶媒を除去した。反応器に１０ｍｌのジクロロメタン溶液（ＤＣＭ）を入れ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（Ｂａｃｈｅｍ，Ｓｗｉｓｓ）２００ｍｍｏｌｅ及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）４００ｍｍｏｌｅを入れた後、撹拌してよく溶かし、１時間撹拌しながら反応させた。反応後、洗浄し、メタノールとＤＩＥＡ（２：１）とをＤＣＭに溶かして１０分間反応させ、過量のＤＣＭ／ＤＭＦ（１：１）で洗浄した。溶液を除去し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を１０ｍｌ入れて３分間撹拌した後、再び溶媒を除去した。脱保護溶液（２０％のピペリジン（Ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ）／ＤＭＦ）１０ｍｌを反応容器に入れ、１０分間常温で撹拌した後、溶液を除去した。同量の脱保護溶液を入れ、再び１０分間反応を保持した後、溶液を除去し、それぞれ３分ずつＤＭＦで２回、ＭＣで１回、ＤＭＦで１回洗浄して、Ｇｌｙ−ＣＴＬレジン（Ｒｅｓｉｎ）を製造した。新たな反応器に１０ｍｌのＤＭＦ溶液を入れ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（Ｂａｃｈｅｍ，Ｓｗｉｓｓ）２００ｍｍｏｌｅ、ＨｏＢｔ２００ｍｍｏｌｅ及びＢｏｐ２００ｍｍｏｌｅを入れた後、撹拌してよく溶かした。反応器に４００ｍｍｏｌｅのＤＩＥＡを分画で２回にわたって入れた後、あらゆる固体が溶けるまで最小限５分間撹拌した。溶かしたアミノ酸混合溶液を脱保護されたレジンがある反応容器に入れ、１時間常温で撹拌しながら反応させた。反応液を除去し、ＤＭＦ溶液で３回５分ずつ撹拌した後、除去した。反応レジンを少量取ってカイザーテスト（Ｎｉｈｙｄｒｉｎ  Ｔｅｓｔ）を用いて反応程度を点検した。脱保護溶液で、前記のように同様に２回脱保護反応させて、Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−ＣＴＬ  Ｒｅｓｉｎを製造した。ＤＭＦとＭＣとで十分に洗浄し、もう一度カイザーテストを行った後、前記と同様に、下記のアミノ酸付着実験を行った。選定されたアミノ酸配列に基づいて、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ、及びＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）順に連鎖反応させた。Ｆｍｏｃ−保護基を脱保護溶液で１０分ずつ２回反応させた後、よく洗浄して除去した。無水酢酸とＤＩＥＡ、ＨｏＢｔを入れて１時間アセチル化を行った後、製造されたペプチジルレジンをＤＭＦ、ＭＣ及びメタノールでそれぞれ３回を洗浄し、窒素空気を徐々に流して乾燥した後、Ｐ２Ｏ５下で真空に減圧して完全に乾燥した後、脱漏溶液［トリフルオロ酢酸（Ｔｒｉｆｌｕｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）９５％、蒸留水２．５％、チオアニソール（Ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ）２．５％］３０ｍｌを入れた後、常温で時々振りながら２時間反応を保持した。フィルタリングを行ってレジンを濾し、レジンを少量のＴＦＡ（Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉ���  ａｃｉｄ）溶液で洗浄した後、母液と合わせた。減圧を用いて全体ボリュームが半分程度残るように蒸留し、５０ｍｌの冷たいエーテルを加えて沈澱を誘導した後、遠心分離して沈澱を集め、２回さらに冷たいエーテルで洗浄した。母液を除去し、窒素下で十分に乾燥して、精製前、ＮＨ２−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＣＯＯＨペプチド１を０．７ｇ合成した（収率：９３％）。分子量測定器を用いて測定時、分子量９３２（理論値：９３２．１２）が得られた。他の配列番号：２、配列番号：３のペプチドも、前記のような方法で合成を進行した。
【００７０】
【表１】
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【００７１】
試験例１：合成ペプチドを活用したヒト皮膚線維母細胞の成長効果能の分析
合成例１で合成された各配列のペプチドに対する成長因子の類似効能及び抑制効能を分析するために、リジノらの方法（Ｒｉｚｚｉｎｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８：４２６６（１９８８））を参照して、ヒト皮膚線維母細胞を利用したＳＲＢ（Ｓｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂ、Ｓｉｇｍａ）比色法で測定した。
【００７２】
ヒト皮膚線維母細胞をそれぞれ２５０ｍｌ容量の組織培養用フラスコを用いて５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ、Ｓｉｇｍａ）と１％ＭＳＣＧＳ（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、Ｓｃｉｅｎｃｅ，アメリカ）とを含むＭＳＣＭ（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｍｅｄｉｕｍ、Ｇｉｂｃｏ，アメリカ）で培養した。該培養された細胞株を１％トリプシン溶液で培養容器の底から取り外した後、遠心分離して細胞沈殿物のみを集めた。培養された細胞株を１％トリプシン溶液で培養容器の底から取り外した後、遠心分離して細胞沈殿物のみを集めた。これをＦＢＳが含有されていないＭＳＣＭ培養液に再び懸濁した後、９６ウェル組織培養用平板に、各ウェル当たり３×１０３細胞になるように入れ、２４時間３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。２４時間後、血清を完全に除いた同じ培養液で培地を交換した後、標準を取るための空試料及び合成ペプチドを蒸留水に滅菌状態で溶かした後、１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、及び１０μｇ／ｍｌの濃度で７２時間を前記と同じ条件で培養した。該培養が完了した後、培養上澄み液を除去し、エタノールを用いて細胞を固定化した後、細胞固定が終わった後、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓａｌｉｎｅ）で３回洗浄した。洗浄溶液を除去した後、比色ＳＲＢ溶液で処理し、１％酢酸で十分に洗浄を行った後、顕微鏡で細胞を観察して、生存細胞の状態を観察し、紫外線５９０ｎｍで吸光度を測定して、細胞の生存状態を測定した。
【００７３】
図１Ａ及び図１Ｂから分かるように、本発明の配列表の配列番号：１（配列１）〜配列番号：３（配列３）のペプチドは、ヒト皮膚線維母細胞と線維芽細胞との成長を濃度−依存的に大きく促進した。また、図２から分かるように、本発明の配列表の配列番号：１〜配列番号：３のペプチドの処理が、線維芽細胞の成長を濃度−依存的に誘導することによって、細胞の形状及び形態が大きく変化したことを顕微鏡を通じて確認することができる。
【００７４】
試験例２：合成ペプチドの酸化ストレスによる細胞死滅抑制効果
合成例１から合成された配列が、酸化ストレスによる細胞死滅抑制効果を見せるかを観察するために、線維芽細胞であるＮＩＨ３Ｔ３細胞と、ヒト皮膚線維母細胞とを用いて実験を進行した。前記２つの細胞を前述したような方法で培養し、９６ウェル組織培養用平板に、各ウェル当たり３×１０３細胞になるように入れ、２４時間３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。該培養後、血清を完全に除いた同じ培養液で培地を交換し、細胞に酸化ストレスを与えるために、メナジオン（ｍｅｎａｄｉｏｎｅ、Ｓｉｇｍａ）を１５μＭの濃度で細胞に処理した。次いで、各ペプチドを濃度別に処理して、４８時間培養して細胞の死滅を観察した。細胞の死滅は、前記細胞増殖実験と同様に、ＳＲＢ試薬を通じて生きている細胞を染色した後、５９０ｎｍで吸光度を測定して確認した。
【００７５】
図３Ａは、線維芽細胞に１５μＭのメナジオンを処理して、酸化ストレスを与えた後、本発明のペプチドを濃度別（１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０００ｎｇ／ｍｌ）に処理して、細胞死滅抑制効果を観察したデータであり、本発明のペプチドを濃度別に処理した時、酸化ストレスによる細胞死滅を抑制することが見られる。
【００７６】
図３Ｂは、本発明のペプチドによる酸化ストレスによる細胞死滅抑制効果をヒト皮膚線維母細胞を用いて観察したデータである。各ペプチドを濃度別に処理した後、紫外線（ＵＶ）をそれぞれ２０ｍＪ／ｃｍ２、３０ｍＪ／ｃｍ２の強度で照射した後、細胞の状態を確認した。細胞は、ＳＲＢ試薬を用いて染色し、光学顕微鏡を用いて細胞の状態を確認した。結果から分かるように、２０ｍＪ／ｃｍ２と３０ｍＪ／ｃｍ２との強度で細胞に紫外線（ＵＶ）を照射した時、細胞の死滅が誘導されることを観察し、各ペプチドを濃度別に処理した時、紫外線（ＵＶ）による細胞の死滅を抑制することを観察することができた。
【００７７】
図３Ｃは、本発明のペプチドによる酸化ストレスによる細胞死滅抑制効果のシグナルを観察するために、ウェスタンブロッティング（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ）を行った結果である。その結果、本発明のペプチドを各時間別（１５分、３０分、６０分）に処理した時、ＥＲＫ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅｓ）のリン酸化が促進されることを確認することができた。
【００７８】
結果的に、本発明の配列表の配列番号：１〜配列番号：３のペプチドは、ヒト皮膚線維母細胞及び線維芽細胞で酸化ストレスによって誘導される死滅を抑制することを確認することができ（図３Ａ及び図３Ｂ）、この効果は、各ペプチドによるＥＲＫのリン酸化促進によって来る効果であることをウェスタンブロッティングを通じて確認した（図３Ｃ）。
【００７９】
試験例３：合成ペプチドによるマトリックスメタロプロテアーゼ２の活性抑制効果
前記合成された配列ペプチドに対するゼラチンザイモグラフィー（ｇｅｌａｔｉｎ  ｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ）を用いてマトリックスメタロプロテアーゼ２の活性抑制効果を観察した。マトリックスメタロプロテアーゼ２の活性抑制効果の検証のために、マトリックスメタロプロテアーゼ２が存在する時、各ペプチドによるマトリックスメタロプロテアーゼ２の活性抑制効果と線維芽細胞を利用したマトリックスメタロプロテアーゼ２の活性抑制効果とをそれぞれ観察した。
【００８０】
直接的なペプチドのマトリックスメタロプロテアーゼ２の活性抑制効果の観察のために、マトリックスメタロプロテアーゼ２と、本発明のペプチドとを濃度別（０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ）に混合して、常温で１時間反応した後、ゼラチンザイモグラフィーを施行して、マトリックスメタロプロテアーゼ２の活性を測定した。ゼラチン（２ｍｇ／ｍｌ）を基質としたタンパク質電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を施行した後、２．５％トリトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）に３０分処理して、再び緩衝剤（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．２Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）で２４時間３７℃で処理した。該処理後、ゲルは、クマシーブリリアントブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｂｌｕｅ）Ｒ２５０（Ｓｉｇｍａ）で染色し、脱色バッファ（５％メタノール、７．５％酢酸、蒸留水）で処理した。次いで、ゼラチン加水分解によって表われるバンドを観察することによって、マトリックスメタロプロテアーゼ２の活性を観察した。
【００８１】
線維芽細胞を利用したペプチドのマトリックスメタロプロテアーゼ２の活性抑制効果の観察のために、線維芽細胞を２４ウェル組織培養用平板に、各ウェル当たり３×１０４細胞を２４時間培養した。細胞を無血清培地で２４時間培養した後、本発明のペプチドをそれぞれの濃度別に（１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０００ｎｇ／ｍｌ）２４時間処理した。培養が完了した細胞を底から取り外して遠心分離して上澄み液のみを回収した後、ゼラチンザイモグラフィーを用いて細胞内のマトリックスメタロプロテアーゼ２の活性を確認した。
【００８２】
結果的に、本発明のペプチドを濃度別に処理した時、マトリックスメタロプロテアーゼ２の活性が抑制されることをゼラチンザイモグラフィーを通じて確認することができる（図４Ａ及び図４Ｃ）。また、ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞を利用したペプチドのマトリックスメタロプロテアーゼ２の活性抑制観察でも、各ペプチドを濃度別に処理した時、前記のような結果を確認することができた（図４Ｂ）。
【００８３】
試験例４：ペプチドによるマトリックスメタロプロテアーゼ２のコラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）分解抑制効果
ヒト皮膚線維母細胞を２４ウェル組織培養用平板に、各ウェル当たり３×１０４細胞で２４時間培養した。次いで、５％血清が含有された培地を入れて４２時間培養し、マトリックスメタロプロテアーゼ２  ２０ｎｇ／ｍｌとペプチドとで６時間処理した。細胞を遠心分離して上澄み液のみを回収した後、コラーゲンキット（ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｋｉｔ）を用いてコラーゲンの合成量を確認した。また、前記のような培養条件でＩＧＦ−１（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｔｙｐｅ１）を入れてコラーゲン合成を人為的に誘導した後、マトリックスメタロプロテアーゼ２とペプチドとを入れて４時間培養した後、コラーゲン分解を抑制するかに対する観察をコラーゲンキットを用いて進行した。
【００８４】
図５Ａでは、各ペプチドが、マトリックスメタロプロテアーゼ２（ＭＭＰ２）による誘導コラーゲン分解を抑制する機能を有するかに対する実験を進行した結果を表わす。マトリックスメタロプロテアーゼ２を処理した時、細胞内でコラーゲンの分解が誘導されることを確認し、各ペプチドを同時に処理した時、コラーゲン分解が抑制されることを確認することができた。また、ＩＧＦ−１を細胞内に処理して、コラーゲン合成を誘導した後にマトリックスメタロプロテアーゼ２と各ペプチドとを処理した時、コラーゲン分解抑制効果を観察した時、各配列ペプチド３種いずれもでコラーゲン分解抑制効果を確認することができた（図５Ｂ）。
【００８５】
試験例５：合成ペプチドのフィラー製品内のヒアルロン酸分解抑制効果の観察
販売されているフィラー製品内に人為的にヒアルロン酸分解酵素を１００μｇの濃度で入れて、フィラー製品内のヒアルロン酸の分解を誘導した後、２００μｇのペプチドを処理して、７日間観察することによって、フィラー製品内のヒアルロン酸分解効果を確認した（図６Ａ及び図６Ｂ、図６Ｃ、図６Ｄ）。ＧＰＣカラムを利用した分析方法とラット（ｒａｔ）を利用したインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）実験とを進行した。対照群として、フィラー製品内にヒアルロン酸分解酵素を利用し、処理群としては、フィラー製品内にヒアルロン酸分解酵素及び各ペプチドを処理したものを利用した。ラット皮膚に注射して生体内にフィラーを注射した時、ペプチドによるフィラー内のヒアルロン酸の分解抑制効果を観察した（図６Ｅ）。
【００８６】
試験例６：合成ペプチドによるメラノソーム移動抑制効果の観察
メラノソーム移動を観察するために、ＨａＣａＴ角質細胞を用いてファゴサイトーシス試験（Ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ  ａｓｓａｙ）を進行した。ファゴサイトーシスのための物質としては、蛍光（ｆｌｕｏｒｏｓｃｅｎｃｅ）物質が張り付いた生粒子（ｂｉｏｐａｒｔｉｃｌｅ）を利用した。９６ウェル組織培養用平板に、各ウェル当たり３×１０３細胞になるようにして、２４時間培養後、無血清培地で６時間培養する。引き続きファゴサイトーシスを誘導するために、１μｇ／ｍｌのトリプシンを処理し、１μｇ／ｍｌのペプチドを４８時間処理した。その結果、蛍光顕微鏡を通じて生粒子が角質細胞内にファゴサイトーシスされることを確認した。
【００８７】
図７Ａ及び図７Ｂから分かるように、本発明のペプチドによってメラノソーム移動が抑制されることを確認することができた。
【００８８】
試験例７：合成ペプチドによる歯周細胞での抗炎症効果
前記合成例から合成されたペプチドに歯周炎細胞での抗炎症効果を観察するために、ヒト歯周靱帯線維母細胞（Ｈｕｍａｎ  ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ  ｌｉｇａｍｅｎｔ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｃｅｌｌ、ＡＴＣＣ，ＵＳＡ）を用いて実験を進行した。ヒト歯周靱帯線維母細胞を６ウェル組織培養用平板に、各ウェル当たり５×１０１細胞を２４時間培養した。歯周細胞に炎症を誘導するために、１０μｇ／ｍｌの濃度でＬＰＳ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ／シグマ，ＵＳＡ）を処理した後、本発明のペプチドを１μｇ／ｍｌの濃度で共に処理して、４時間培養した後、対照群と誘発物質、そして、誘発物質とペプチドとを処理した培養細胞からｍＲＮＡを抽出して、ＩＬ−６、ＩＬ−１ｂｅｔａ、ＣＯＸ−２のプライマーを用いて逆転写重合酵素連鎖反応を行った。使った各プライマーのヌクレオチド配列は、次の通りである：ＩＬ−６（正方向５’−ａｇａｇｇａｇａｃｔｔｃａｃａｇａｇｇａ−３’、逆方向５’−ａｔｃｔｃｔｃｔｇａａｇｇａｃｔｃｔｇｇ−３’）、ＩＬ−１ｂｅｔａ（正方向５’−ｃｃｇｔｇｇａｃｃｔｔｃｃａｇｇａｔｃａ−３’、逆方向５’−ｇａｔｃｃａｃａｃｔｃｔｃｃａｇｃｔｇｃ−３’）、ＣＯＸ−２（正方向５’−ｃｃｃｃｃａｃａｇｔｃａａａｇａｃａｃｔ−３’、逆方向５’−ｃｃｃｃａａａｇａｔａｇｃａｔｃｔｇｇａ−３’）、Ａｃｔｉｎ（正方向５’−ｇａｔｃｔｃａａａｇａｃａａｃｃａａｃｔａｇｔｇ−３’、逆方向５’−ｃｔｃｃａｇｃｔｇａａｇａｃｔｃｃｔｃｃｃａｇ−３’）。
【００８９】
図８から分かるように、ヒト歯周靱帯線維母細胞にＬＰＳで炎症を誘導した時、炎症性サイトカインであるＩＬ−６、ＩＬ−１ｂｅｔａ、ＣＯＸ−２の発現が増加することを観察することができ、本発明のペプチドを同時に処理した時には、前記の３種の炎症性サイトカインの発現が顕著に抑制することを確認することができた（図８）。
【００９０】
試験例８：合成ペプチドによる脂肪細胞での脂肪生成抑制効果
前記合成例から合成されたペプチドに対する脂質生成（ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ）抑制効果を観察するために、脂肪前駆細胞（Ｐｒｅ−ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）である３Ｔ３−Ｌ１細胞（ＡＴＣＣ，ＵＳＡ）を用いて実験を進行した。パッセージ８（ｐａｓｓａｇｅ８）である脂肪前駆細胞３Ｔ３−Ｌ１を２４ウェル組織培養用平板に、各ウェル当たり３×１０４細胞を２４時間培養した。対照群には、脂肪前駆細胞を脂肪細胞に分化させるために、ＤＭＩ培地（０．５ｍＭ  ＩＢＭＸ、０．２５μＭデキサメタゾン（Ｄｅｘａｍｅｔａｓｏｎｅ）、及び１μｇ／ｍｌインシュリン（ｉｎｓｕｌｉｎ））を利用した培養を進行し、処理群には、ＤＭＩ培地に、各ペプチドを１μｇ／ｍｌの濃度で処理した。引き続き１０日間培養して分化を誘導した。
【００９１】
図９から分かるように、ＤＭＩ培地で１０日間培養した後、顕微鏡を通じて観察した時、対照群は、脂肪前駆細胞が脂肪細胞に分化されることを確認し、細胞上に脂肪が生成されることを確認することができた。一方、各ペプチドを処理した群では、脂肪生成が対照群に比べて顕著に減ることを確認することができた。
【００９２】
試験例９：合成ペプチドによる血管生成抑制効果
前記合成されたペプチドによる血管生成抑制効果を観察するために、血管内皮細胞であるＨＵＶＥＣ（Ｈｕｍａｎ  Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  Ｖｅｉｎ  ＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌＣｅｌｌｓ、ＡＴＣＣ，ＵＳＡ）を利用したチューブ形成を観察した。マトリゲル凝固（Ｍａｔｒｉｇｅｌ  ｓｏｌｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）のために、９６ウェル組織培養用平板に、各ウェル当たり５０μｌずつ添加して、３７℃で３０分間放置した後、固められたマトリゲルに０．２％血清を含んだ培地（Ｎｏｎ−ｇｒｏｗｔｈ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ｍｅｄｉｕｍ）を加えて、ＨＵＶＥＣ細胞を培養する。この際、各ペプチドを１μｇ／ｍｌの濃度で共に処理して、３７℃で培養する。５時間以後に、光学顕微鏡を用いてチューブ形成を観察する。
【００９３】
図１０から分かるように、対照群と比較した時、各ペプチドを処理することによって、チューブ形成が抑制されることを確認することができる。これは、合成された各ペプチドが血管形成抑制効果があるということを示す。
【００９４】
実施例１：ナノ化ペプチドの製造
前記合成例から得たペプチドを５０ｍｇを正確に秤量した後、蒸留水５００ｍｌに十分に撹拌して溶解した。配合体溶液をレシチン５ｇ、オレイン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍｏｌｅａｔｅ）０．３ｍｌ、エタノール５０ｍｌ、及び若干の乳状と共に混合した後、蒸留水で総量を１ｌに合わせた後、マイクロフルイダイザーで高圧を用いて乳化させて、サイズ１００ｎｍ程度のナノソームを製造した。該製造されたナノソームは、最終濃度が約５０ｐｐｍで単独あるいは複合的に化粧品製造用として使われた。
【００９５】
剤型例１：柔軟化粧水
前記実施例１から製造されたペプチドナノソームを含み、下記の組成からなる柔軟化粧水を一般的な化粧水製造方法によって製造した。
【表２】
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【００９６】
剤型例２：栄養クリーム
前記実施例１から製造されたペプチドナノソームを含み、下記の組成からなる栄養クリームを一般的な栄養クリーム製造方法によって製造した。
【表３】
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【００９７】
剤型例３：栄養化粧水
前記実施例１から製造されたペプチドナノソームを含み、下記の組成からなる栄養化粧水を一般的な化粧水製造方法によって製造した。
【表４】
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【００９８】
剤型例４：エッセンス
前記実施例１から製造されたペプチドナノソームを含み、下記の組成からなるエッセンスを一般的なエッセンス製造方法によって製造した。
【表５】
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【００９９】
以上、本発明の特定の部分を詳しく記述したが、当業者において、このような具体的な技術は、単に望ましい具現例であり、これにより、本発明の範囲が制限されるものではない点は明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物とによって定義される。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
本発明は、マトリックスメタロプロテアーゼ活性抑制ペプチド及びその用途に関連する分野に適用されうる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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