(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原特異的免疫反応の誘導による哺乳動物の経皮ワクチン接種のための抗原製剤を含む皮膚用器具の使用であって、該抗原製剤が、乾燥形態であり且つアジュバントを欠くこと、そして、該皮膚用器具が、０．２〜５cm2の面積を有し、哺乳動物の無傷の皮膚に適用されるとき、器具の表面の１cm2あたり２〜１００mm3の範囲の容積及び０．０２〜１mmの高さを持つ凝縮コンパートメントを形成する、そのまま使用できる密封皮膚用器具であることを特徴とし、該器具は器具の表面の１cm2あたり０．１μg〜５００μgの範囲の量の該抗原製剤を含み、そして該器具は６〜７２時間皮膚に保持され、
無傷の皮膚への前記抗原製剤を含む器具のアジュバントを伴わない適用は、前記哺乳動物におけるＩｇＧ型抗体の産生を特徴とする抗原特異的免疫応答をもたらす、抗原製剤を含む皮膚用器具の使用。
【請求項２】
凝縮コンパートメントの壁が、１０g/m2/24h未満の水蒸気透過率を有する材料を含むことを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
凝縮コンパートメントが、凝縮コンパートメント内、且つ表皮の外表面上で、適用の１時間後に少なくとも５０％の水化率増大を誘導することができることを特徴とする、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
器具が、接着手段によって皮膚上に保持されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
抗原製剤が、粉末形態であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
抗原製剤が、この表面における接着剤の不在下で、化学的または物理化学的力によって器具の表面に保持されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
抗原製剤が、静電力またはファン・デル・ワールス力によって器具の表面に保持されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
そのまま使用できる器具が、表面１cm2あたり２０μg〜３００μgの範囲の量の抗原製剤を含むことを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
そのまま使用できる器具が、表面１cm2あたり２０μg〜１００μgの範囲の量の抗原製剤を含むことを特徴とすることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項１０】
抗原製剤が、少なくとも１つのペプチドまたはポリペプチド型の抗原、または異なる化学型の構成成分を伴うポリペプチドコンジュゲートを含むことを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の使用。
【請求項１１】
少なくとも２個のそのまま使用できる器具を、各適用を７〜３０日の間隔を空けて、対象に連続適用することを含むことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の使用。
【請求項１２】
各々の適用について、そのまま使用できる器具を、６〜４８時間、皮膚に保持することを特徴とする、請求項１〜１１のいずれかに記載の使用。
【請求項１３】
そのまま使用できる器具を、４８時間、各適用を１５日間の間隔を空けて少なくとも３回連続適用することを含むことを特徴とする、請求項１〜１２のいずれかに記載の使用。
【請求項１４】
前記凝縮コンパートメントは０．１mmの高さを持つことを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚経路を介してワクチンをデリバリーする方法およびシステムの開発に関するものである。さらに詳細には、本発明は、経皮ワクチン接種のための凝縮コンパートメントを含む器具の使用に関するものである。さらに本発明は、いかなる皮膚処置も行わずに有効な免疫反応を獲得させる経皮ワクチン接種のプロトコールに関するものである。本発明はさらに、任意の哺乳動物、好ましくはヒトに使用して、任意の型の抗原に対する予防的または治療的免疫反応を誘導することができる。
【０００２】
病原体の大多数は粘膜または皮膚を通って身体に侵入する。故に、皮膚、例えば粘膜は、病原体を検出し自身を防護するために必要な全ての仕組みを持っている。この防衛線は特に、専門の、常在する抗原提示細胞（ＡＰＣ）の分担を含む。正常状態の下で表皮に存在するＡＰＣは、ランゲルハンス細胞（ＬＣ）、骨髄から誘導される樹状細胞（ＤＣ）のみである。抗原を捕捉した後、活性化したＬＣは流入領域リンパ腺内に遊走し、そこで強力な全身免疫反応を開始する。したがって皮膚は、より効果的なワクチン開発のための、伝統的な注射による投与経路の潜在的代替手段となる。さらに、皮膚の免疫システムは、自己免疫疾患、アレルギーおよびことによると癌といったような様々な疾患における寛容の誘導の理想的標的ともなり得る。
【０００３】
しかしながら、皮膚の最上層である角質層（ＳＣ）は、流体、大分子（ポリペプチドおよびタンパク質）、粒子、そして微生物の侵入に対してさえ有効な物理化学的障壁である。多岐にわたる技術を試行して、皮膚経路を介した、即ち皮膚への抗原適用による、有効な免疫反応を獲得する努力がなされてきた。これらの技術は全て、例えば軽度または中等度の摩耗（粘着テープの適用後またはサンドペーパーを使用）による、超音波またはマイクロニードルの適用による、角質層の物理的劣化を含んでいる。これら様々な技術は多かれ少なかれ、抗原適用に先立つ工程として、免疫細胞を含む皮膚表面層（表皮）へのその侵入および免疫反応の誘導を促進することに対する有効性を示してきた。例えば、抗原と、コレラ毒素（ＣＴ）またはE. coliの不安定毒素（ＬＴ）といったアジュバントの、前もって摩耗させた皮膚への同時適用は、免疫抗体反応を生じさせるのに有効であることが示されている（Glenn GM, Rao M, Matyas GR, Alving CR.「コレラ毒素により可能となった皮膚免疫付与」Nature. 1998. 391:851；Glenn GM, Scharton-Kersten T, Vassell R, Matyas GR, Alving GR. 「抗原およびアジュバントとしての細菌ＡＤＰ−リボシル化外毒素による経皮免疫付与」Infect Immun. 1999. 67:1100-6）。これに対して、抗原適用前に皮膚を水化しただけでは、その後の密封処置のある無しに拘わらず、特異的抗体反応が誘発されることはなかった。抗体反応は、皮膚が前もって処置され、角質層の物理的攪乱が導かれている場合、または抗原が強力なアジュバント（ＣＴまたはＬＴ）と同時投与されている場合にのみ実現される。
【０００４】
その後、別の研究が、液体形態で動物の皮膚上に１〜２４時間の範囲で配置する、ワクチン製剤を適所に維持する密封システムの利用が、動物およびヒトの免疫反応を誘導させるものの、これは皮膚を処置した後だけであることを示した。しかしながら、０〜２４時間の接触時間で誘導された反応は、質的に、そして／または量的に異ならない。
【０００５】
ＷＯ２００４／０３０６９号の出願では、PosIntroまたはISCOMシステムを利用して、抗原および免疫刺激化合物を含有する乾燥形態の組成物によって免疫反応が誘導されると予想された。
【０００６】
国際出願ＷＯ２００７／１２２２２６号では、免疫反応を得るための皮膚パッチの使用もまた提唱された。しかしながら、この文書に記載された方法はアジュバントを使用している。
【０００７】
したがって、物理的または物理化学的前処置（サンドペーパー、エタノール、アセトン、粘着テープ、グリセロール）または強力なアジュバント（ＬＴまたはＣＴ）もしくはその他の促進化賦形剤を使用せずに抗原特異的抗体反応が検出されることはない。
【０００８】
本発明は、アジュバント（ＣＴまたはＬＴ）を使用するまたは皮膚を前処置もしくは穿孔する必要無しに、経皮的に抗原特異的免疫反応を誘導できる方法を初めて記載するものである。より詳細には、本発明は、凝縮コンパートメントを形成させる条件下で皮膚に適用される乾燥ワクチン製剤の使用に基づく、アジュバントの不在下でも有効な経皮ワクチン接種の方法を記載する。本発明は、皮膚水化の創出および維持がＳＣの攪乱を導き、それが抗原を通過させることを示す。さらに、このデリバリーシステムの下で蓄積された水分は、乾燥ワクチン製剤を再度水化させて可溶化し、皮膚との接触に至らせる。本発明者等は、これまでに記載された様々な経皮システムとは対照的に、本発明が、（ＣＴまたはＬＴ型の）いかなるアジュバントの同時投与もせずに、そして皮膚のいかなる前処置（摩耗または穿孔）も行わずに、免疫原特異的抗体反応を誘発させることを、前臨床試験において示した。特に注目すべきことには、本発明は積極的処置を何ら行うことなく、皮膚における大分子（主にポリペプチドおよびタンパク質）の移動を可能にするが、このことは先行技術では記載されたことがなかった。実施例に記載するとおり、本発明方法を利用するワクチンを３回適用した後に特に強い免疫反応が観察される。
【０００９】
したがって本発明の１つの目的は、哺乳動物、好ましくはヒトの経皮ワクチン接種のための組成物を製造するためのワクチン製剤の使用であって、該ワクチン製剤が、アジュバントを欠く乾燥形態であること、そして、それが、皮膚に接触した時に該ワクチン製剤を含む凝縮コンパートメントを形成する皮膚用器具によって哺乳動物の皮膚に適用されることにより投与されることを特徴とする、ワクチン製剤の使用に存するものである。
【００１０】
本発明のさらなる目的は、皮膚の前処置またはアジュバントの同時投与を行わない、抗原を含有するワクチン製剤の投与を意図する組成物を製造するための皮膚投与器具の使用に存するものであり、該皮膚投与器具は、アジュバント化合物を含まない乾燥形態のワクチン製剤を含み、そして、皮膚に接触すると該ワクチン製剤を含む凝縮コンパートメントを形成し、それにより、表皮への抗原侵入、およびアジュバントまたは皮膚前処置の不在下での免疫反応誘導を可能にする。
【００１１】
本発明のさらなる目的は、皮膚の前処置またはアジュバントの同時投与を行わずに抗原を含有するワクチン製剤を投与するための皮膚投与器具の使用に存するものであり、該皮膚投与器具は、アジュバント化合物を含まない乾燥形態のワクチン製剤を含み、そして、皮膚に接触すると該ワクチン製剤を含む凝縮コンパートメントを形成し、それにより、表皮への抗原侵入およびアジュバントまたは皮膚前処置の不在下での免疫反応誘導を可能にする。
【００１２】
本発明のさらなる目的は、哺乳動物に抗原特異的免疫反応を誘導する方法に存するものであり、その方法は、アジュバント化合物を含まない、抗原を含む乾燥形態のワクチン製剤を含む皮膚投与器具を、皮膚の前処置を行わずに哺乳動物の皮膚に適用することを含み、その器具は、皮膚に接触すると該ワクチン製剤を含む凝縮コンパートメントを形成し、その適用時間は、表皮への抗原侵入およびアジュバントまたは皮膚前処置の不在下での免疫反応誘導をさせるに充分である。
【００１３】
本発明のさらなる目的は、皮膚経路を介して抗原特異的免疫反応を誘導する方法に存するものであり、その方法は、局所皮膚の水化の創出および維持、ならびにその水化された皮膚に、アジュバント不含乾燥ワクチン製剤を、抗原の侵入および免疫反応誘導をさせるに充分な時間接触させる事を含む。
【００１４】
本発明のさらなる目的は、対象においてタンパク質抗原に対する全身免疫反応を誘導する方法に関するものであり、その方法は、裏打ち（backing）を含む皮膚用器具によって該対象に経皮的に該抗原を投与することを含み、該裏打ちの末梢部分は皮膚と共に密閉チェンバーを作り出すように適合させてあり（ここで、この裏打ちは、皮膚に接触するとチェンバー内で該抗原をその表面に保持する）、抗原は、該器具が皮膚に適用された後に裏打ちから除去され、その後経皮的に対象にデリバリーされ、その投与は、対象において全身免疫反応の誘導を導く。
【００１５】
１つの特別な態様では、この皮膚用器具の裏打ちの末梢部分は、湿潤皮膚上で粘着性を有する。
【００１６】
本発明の別な態様では、皮膚用器具による抗原投与の後に誘導される全身免疫反応は、ホルモン反応を包含する。
【００１７】
１つの好ましい態様では、皮膚用器具を皮膚に適用した後にチェンバー内で凝縮物が形成され、この凝縮物が、抗原の動きおよび皮膚デリバリーを惹起または増大させる。特に、この凝縮物は発汗によって形成され得る。
【００１８】
本発明のさらなる目的は、対象においてタンパク質抗原に対する全身免疫反応を誘導する方法に関するものであり、ここで、該抗原は乾燥形態または粒子形態である。より詳細には、この抗原は、静電力および／またはファン・デル・ワールス力によって接着剤なしで支持体に付着させるか、または支持体上の粘着性被覆剤によって付着させることができる。
【００１９】
好ましくは、抗原は、噴霧／乾燥法によって支持体に適用できる。この抗原は液体に溶解または分散させることもでき、その場合は抗原を、吸着剤の入った容器に入れた支持体上に保持する。
【００２０】
本発明のさらなる目的は、アジュバント化合物を含まない皮膚用器具によって、ワクチン製剤を哺乳動物の非処置皮膚に約４８時間適用することを特徴とする、哺乳動物における免疫反応誘導のための医薬品を製造するための乾燥形態のワクチン製剤の使用に関するものである。
【００２１】
本発明のさらなる目的は、アジュバント化合物を含まない皮膚用器具によって、ワクチン製剤を哺乳動物の非処置皮膚に約４８時間適用することを特徴とする、哺乳動物における免疫反応誘導のための乾燥形態のワクチン製剤の使用に関するものである。
【００２２】
本発明のさらなる目的は、アジュバント化合物を含まない皮膚用器具によって、乾燥形態のワクチン製剤を哺乳動物の非処置皮膚に約４８時間適用することを含む、哺乳動物において免疫反応を誘導する方法に関するものである。
【００２３】
本発明のさらなる目的は、裏打ちを含む皮膚用器具に関するものであり、該裏打ちの末梢部分は皮膚と共に密閉チェンバーを作り出すように適合させてあり（ここで、この裏打ちは、皮膚に接触するとチェンバー内で該抗原をその表面に保持する）、抗原は、該器具が皮膚に適用された後に裏打ちから除去され、その後経皮的に対象にデリバリーされる。
【００２４】
本発明のさらなる目的は、対象の皮膚に適用された後に凝縮コンパートメント（該コンパートメントはアジュバント化合物を含まない乾燥形態のワクチン製剤を含む）を形成する皮膚投与器具を含むことを特徴とする、ワクチン組成物に関するものである。
【００２５】
本発明は、無傷の皮膚上で（即ち、前もって穿孔または物理的および／または化学的に摩耗していない）、そしてアジュバントを使用せずに、免疫反応が経皮的に誘導され得るという予期せぬ発見から導かれた。この効果は、乾燥形態のワクチン製剤を使用して、そして、それを、皮膚にそして／または適当な時間適用すると凝縮コンパートメントを形成する器具によって適用することで得られる。
【００２６】
特定の作用メカニズムに拘束される訳ではないが、皮膚層の水化が角質層の角質細胞の膨潤および細胞間隙の脂質ドメイン間の水分子の統合をさせると提唱されている。この水化は、皮膚のホメオスタシスの攪乱を誘発し、特に、産生されるサイトカインプロファイルの変化、ランゲルハンス細胞の形態および表現型の変化、または、表皮の単核球数の増加をもたらす。
【００２７】
皮膚の障壁の役割にも拘わらず、生理的条件下で、身体と大気との間に、皮膚を通って大気へと向かう水の流動が引き起こされる。この流動は不感水分喪失（ＩＷＬ）という名称で知られている。凝縮コンパートメントを利用する本発明方法は、皮膚の一部を周囲媒質から隔絶することに寄与する。この現象の際、身体と大気の間の水蒸気の交換が乱され、それが、該コンパートメントへの水分の蓄積、そしてさらに、表皮全体、特に物質吸収に対して主たる障壁を形成する角質層の、水化増大を導く。本発明者等の成果は、ヒトにおいて、凝縮コンパートメント除去後に測定される非常に強い水の流動が、皮膚表面に蓄積された水の蒸発を反映していることを示唆する。時間と共にこの器具の凝縮コンパートメントは、コンパートメント容積の水蒸気の飽和（ＩＷＬに由来する）、次いで凝縮を導き、平衡状態に達する。適用初期には周囲の空気が入っているため、この容積は水蒸気で飽和していない。この空気がいったん飽和に達すると、気相状態の水が凝縮して液体水の形態になる。この凝縮は、残存する水の流動によって皮膚から提供され得る。このような状態の下で平衡状態に達し、その結果、耐水性器具の下部に水が蓄積される（図１Ｂを参照されたい）。
【００２８】
したがって本発明は、任意の型の抗原と共に使用でき、そのまま使用できる器具の製造に適合し、そしていかなる皮膚の処置も必要としない方法を提起することにより、先行技術の皮膚ワクチン接種法の不都合を解消できる。表皮において誘導される強力な水化は、角質層およびその表面への水分蓄積と相まって、水分存在下でのワクチン分子および皮膚間の分配係数の調節、角質細胞の膨潤、または細胞間脂質相の組織化の破壊を可能にする。この改変は、皮膚表面に存在する脂質に活性成分を溶解させ、皮膚を穿孔または摩耗させる必要なしに皮膚を通ってそれを侵入（受動拡散によって）させる。
【００２９】
本発明は、凝縮コンパートメントを形成する任意の皮膚投与器具を用いて実施できる。これは好ましくはパッチまたはドレッシングの器具、好ましくはパッチである。本発明の器具は典型的には受動拡散を伴う経皮型のものであり、即ち、それは皮膚の穿孔または摩耗を引き起こす手段を含んでいない。それは、密封パッチ型の器具、例えば特許出願ＷＯ０２／０７１９５０号に記載のVIASKIN（登録商標）技術を用いて製造される静電気パッチであるのが有利である。
【００３０】
本発明の意義において、「コンパートメント」という語は、該器具を皮膚上に適用した後に皮膚および器具の裏打ちの間に作られる空間を指し、この裏打ちは皮膚に付着せず、それにより、皮膚上に少量の水分を蓄積させる余地を残す（例えば図１Ａおよび１Ｂを参照されたい）。得られる結果は、皮膚による該コンパートメント方向への液体の自然な移送によって、適用されている間、或る程度の水化を維持する、凝縮コンパートメントの使用が、大分子抗原の通過および特異的反応の誘導を可能にするということを示す。これらの結果は、満足できる反応を得るために特別なアジュバントおよび皮膚の処置に頼る必要を強調する先行技術のデータを考慮すると、特に驚くべきものである。
【００３１】
１つの好ましい態様では、この器具は、皮膚に接触すると器具の表面１cm2あたり１〜３００mm3の容積を持つ凝縮コンパートメントを形成するような器具である。この容積は、約０．０１mm〜３mmのコンパートメント高に相当する。１つの好ましい態様では、コンパートメントの容積は、器具の表面１cm2あたり２〜２００mm3、より好ましくは器具の表面１cm2あたり２〜１００mm3の間に含まれ、約０．０２〜１mmの高さに相当する。この器具の拡散皮膚面積は当業者によって適合させることができ、典型的には約０．２〜５cm2、より一般的には０．５〜３cm2である。
【００３２】
凝縮コンパートメントの壁（器具の裏打ち）が完全に不浸透性である必要はない。逆に、この蒸発が、コンパートメント内の液体水の存在による、飽和した水蒸気雰囲気の維持を妨げない限り、ポリエチレン類の場合のように、常温常圧条件で若干の水蒸気透過性が許容できる。
【００３３】
或る特別な態様では、凝縮コンパートメントの壁は、１５g/m2/24h未満、好ましくは１０g/m2/24h未満、例えば約９g/m2/24hほどの透過率を持つ材料を含む。
【００３４】
前記の材料は、例えばポリマー、コポリマー、プラスチック、セラミック、任意の生体適合性材料（例えばグラファイト）などから選択できる。生体適合性ポリマーの例は特に、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリカーボネート、ポリエステル（ＰＥＴ）、セルロースプラスチック類（ＣＡ、ＣＰ）、塩化ポリビニル（ＰＶＣ）、ポリメチル−メタクリラート（ＰＭＭＡ）、ポリウレタン（ＰＵＲ）、シリコーン類（ＰＴＦＥ）またはポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）である。生体適合性コポリマーの一例は、特にエチレン−酢酸ビニルコポリマー（ＥＶＡ）である。
【００３５】
本発明に適合する水蒸気透過率（ＭＶＴＲ）を有するポリマーの例として、特にCoTran（登録商標）9706（ＭＶＴＲ＝２６．４g/m2/24h）、CoTran（登録商標）9720（ＭＶＴＲ＝９．４g/m2/24h）およびCoTran（登録商標）9722（ＭＶＴＲ＝７．９g/m2/24h）を記載できる。
【００３６】
１つの好ましい態様では、凝縮コンパートメントは、本質的に円形の、そして直径が約２〜１００mm、好ましくは約５〜７０mmのポリマーディスク（裏打ち）によって形成され（例えばポリエチレン製）、それが、ディスクの外径と本質的に同じ外径と、１〜５０、好ましくは約２〜２０mmの内径を有する、生体適合性材料でできた（例えばポリエチレン製）環の上に固定（例えば接着）されている。このディスクおよび環の厚さは例えば約０．０１〜２mmであり、それがコンパートメントの高さを０．０１〜２mmに規定し、或る点においては裏打ちの柔軟性が皮膚と裏打ちとの接触を規定するとは言え、コンパートメントの容積は小さいが決してゼロではない。ディスクは任意の適当な手段で環に固定できる。典型的にはこの環は、それをディスクに付着させるために、粘着性であるか、または粘着性にする。
【００３７】
図１Ａに示すように、本発明の器具の１つの具体的なプロトタイプは、
−  表面１cm2あたりの凝縮コンパートメントの容積に応じて、約０．０１〜２mmの変動する直径および高さを持つ生体適合性材料でできた環［１］。図１Ａに示す態様では、この環は、少なくとも皮膚との接触を意図する外表面が粘着性である；
−  環に付着させた（例えば接着剤による）、コンパートメント（乾燥形態の活性成分が入っている）の天井として働く生体適合性材料製ディスク［２］。ディスクの表面は、典型的には直径が少なくとも５mmである。ディスク（裏打ち）のＭＶＴＲ（水蒸気透過）は好ましくは１０g/m2/24hを下回る。
−  環の粘着面を保護するリリースライナー［３］は、皮膚に適用する前に剥離することが意図されている。このライナーは、該器具の適用前にはコンパートメントがシールされているよう、コンパートメントを覆うディスクであるのが有利である。
【００３８】
この器具により形成されるコンパートメントは、水化特性を有する凝縮コンパートメントである。水化特性は、器具の凝縮コンパートメント下部の表皮の完全性に作用して、表皮の水化率の増大（有利なのは、皮膚への適用の最初の１時間から３０％〜１００％、より正確には５０％〜７０％の範囲）を誘導する能力を産む。好ましくは、凝縮コンパートメントの水化特性は、表皮の外表面上、且つ該器具の凝縮コンパートメント内において、適用の最初の１時間から４０％〜１００％までの範囲、さらに好ましくは５０％を上回る相対的水分増加を誘導させるような特性でなければならない。
【００３９】
１つの好ましい態様では、この器具を凝縮コンパートメントの水密性を確保する手段によって皮膚に保持する。この目的のために、強い粘着性を有するゴム、ポリマーまたはプラスチック型の材料を包含する任意の接着手段を利用できる。
【００４０】
本発明は、無傷の皮膚、即ち前もって特別な処置を何ら受けていない皮膚に対してもワクチン接種ができる利点を有する。本発明の意義において「皮膚の処置」とは、少なくともその皮膚の表面層の少なくとも部分的な破壊を導く、任意の摩耗または穿孔処置を意味する。
【００４１】
また、本発明のさらなる利点は、たとえアジュバントを同時投与しなくとも主要な免疫反応の獲得が可能であることである。本発明の意義において「アジュバント」という語は、皮膚への抗原侵入を促進し、該抗原に対する免疫反応を増大させる、皮膚に対する物理化学的および／または生物学的作用を有する任意の化合物を意味する。本明細書で定義するようなアジュバントは、物理化学的および／または生物学的作用を通じて角質層を攪乱することにより表皮の透過性を悪化させ、それにより、該抗原の通過および表皮の免疫活性細胞とのその接触を実現する化合物である。アジュバント化合物の例は特に、コレラ毒素（ＣＴ）またはＬＴ毒素（E-coliの熱不安定毒素）である。他の例には、Paul等により記載された（Paul A, Ceve G, Bachhawat BK. 「超変形薬物担体による、巨大タンパク質を用いた経皮的免疫付与」Eur. J Immunol. 1995, 25(12):3521-4）トランスファーソームがあり、これは膜内への抗原の輸送を可能にする。
【００４２】
本発明は任意の乾燥形態のワクチン製剤を用いて実施できる。「ワクチン製剤」という語は、抗原要素を含む任意の製剤を指す。それは、典型的には１以上の抗原（例えばペプチド、ポリペプチド（またはタンパク質）、脂質および／または糖質型の）、または、これらの化合物の単純な混合物もしくは化学的コンジュゲートを含有する製剤である。１つの好ましいワクチン製剤は、１以上の抗原分子：５００Da以上の分子量を有する分子、殆どの場合は予防的もしくは治療的ワクチン活性もしくは目的を有する１５００Da以上のポリペプチドおよびタンパク質、または、表皮に対する局所（治療的）作用を意図する５００Da以上の分子量を有する分子、を含む。典型的には、このワクチン製剤は、少なくとも１つのペプチドまたはポリペプチド型の抗原を含有する。例えばそれは、細菌抗原、ウイルス抗原、腫瘍抗原など、例えばＦｌｕウイルスの抗原、肝炎ウイルス（／またはＣ）の抗原、Haemophilus Influenzaeの抗原、呼吸器合胞体ウイルスの抗原、Salmonella（Shigella）、もしくは結核（Tiphy）の抗原、または自己免疫疾患、癌、アルツハイマー病、アレルギーなどに特徴的な抗原であってよい。このワクチン製剤はさらに、薬学的用途に適合させた賦形剤もしくは媒質、またはサイトカインのような免疫調節活性を持つ化合物、トールレセプターのリガンド化合物などを含有させることができる。
【００４３】
このワクチン製剤は「乾燥形態」、即ち脱水形態、特に粉末、粒子、凝集塊、ケーキ、乾燥させた形態などで使用する。乾燥形態は、凍結乾燥または単純な蒸発によって得られる。
【００４４】
或る特別な態様では、このワクチン製剤は粉末形態である。
【００４５】
もう一つの特別な態様では、このワクチン製剤は、該器具の表面、典型的にはコンパートメントの裏打ちに、この表面に接着剤がない場合は化学的または物理化学的力によって保持されている。好ましくはこのワクチン製剤は、該器具の表面、典型的にはコンパートメントの裏打ちに、静電力またはファン・デル・ワールス力によって保持されている。
【００４６】
１つの通常の態様では、該器具は、０．１μg/cm2〜５００μg/cm2、好ましくは１cm2あたり２０μg〜３００μg、さらに好ましくは１cm2あたり２０μg〜１００μgの量のワクチン製剤を含む。当業者は、目的、病理、処置の期間、対象などに関連してこの量を適合させる事ができる。
【００４７】
本発明は、アジュバントおよび皮膚処置の不在下であっても著明な免疫反応を誘導することができる。本発明は、任意の種類の病原体（ウイルス、寄生虫、細菌、タンパク質など）、腫瘍細胞または自己抗原に対する予防的または治療的ワクチン接種に、または、アレルギー患者の処置に利用できる。与えられた結果は、抗原特異的反応、特にＩｇＧ型抗体反応の誘導を示す。
【００４８】
免疫反応の強度は、器具の適用時間の調節、および／または反復適用の実施によって適合させる事ができる。実施例で説明するように、僅か６時間の間このワクチンを３回適用した後に誘導される免疫反応は、適用時間２４時間で観察された反応と同等である（実施例２）。本発明者等は、たとえ事前の皮膚処置が無くアジュバントの同時投与が無くても、例えば６時間〜２４時間の範囲での水化維持が免疫反応発現に充分であることを示した。
【００４９】
さらに本発明者等は、適用時間を４８および７２時間に延長した（実施例５）。得られた結果は、４８時間という時間が驚くべき結果を示している。と言うのは、抗体特異的反応が、２４時間の適用時間の場合と比較して、ほぼ一桁増大したのである。４８時間を超えて継続された適用、例えば７２時間の適用時間は、抗体反応のさらなる増大に寄与しないように見える。
【００５０】
１つの好ましい態様では、本発明は、少なくとも２個、好ましくは少なくとも３個の器具を、各適用を約７〜３０日間、好ましくは１０〜２０日間、典型的には約１５日間の間隔を空けて、対象に連続適用することを含む。
【００５１】
好ましくは各々の適用について、この器具を、約６〜７２時間、好ましくは約６〜４８時間、さらに好ましくは約４８時間、皮膚に保持する。
【００５２】
免疫反応を誘導する１つの特に好ましいプロトコールは、器具を、約４８時間、各適用を約１５日間の間隔を空けて少なくとも３回連続適用することを含む。
【００５３】
前記において「約」という表現は、与えられた値と比較して±１０％の変動を指す。
【００５４】
本発明はさらに、該ワクチン製剤が乾燥形態であり、且つこれを約４８時間の期間で１回またはそれ以上、好ましくは約４８時間の期間を反復して適用する場合に、無傷の皮膚への皮膚ワクチン接種によって主要な抗体反応が得られることを示す。
【００５５】
本発明は任意の哺乳動物における任意の抗原に対するワクチン接種に利用できる。それは子供または成人に利用でき、本質的に非侵襲性であり、そしてアジュバントの使用を必要としない。
【００５６】
本発明のその他の局面および利点は、例示的且つ非限定的と考えるべきである以下の実施例を読む時に明白となるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１Ａ】凝縮コンパートメントを有する皮膚用器具の概略図：［１］生体適合性材料でできた環、［２］ディスク上の両面接着剤により付着している「裏打ち」ディスク、［３］接着剤を保護し、適用前に剥離されるリリースライナー。
【図１Ｂ】凝縮コンパートメントにおける水蒸気の流れの概略図。
【図２】凝縮コンパートメントを含む器具を使用する、アジュバントの同時投与を伴わない、皮膚経路を介した、無傷の皮膚への抗原特異的抗体免疫反応の誘導。
【図３】凝縮コンパートメントを含む器具を皮膚に６時間または２４時間適用した後の、皮膚経路を介した抗オボアルブミン抗体免疫反応の誘導。
【図４】時間の関数としての、該コンパートメントに侵入した水蒸気量および凝縮した水の量の比率：■コンパートメントに蓄積された水の量、および、◆コンパートメント内で凝縮した水の量。
【表１】
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【図５】凝縮コンパートメントを含む器具の適用時間に関連する、様々な表皮の層（上層、上層および中層、表皮全体）の水化パーセンテージの増大。
【図６】凝縮コンパートメントを含む器具の適用時間に関連する、皮膚表面に蓄積された水の量の増大。
【図７Ａ】凝縮コンパートメントを有する器具の皮膚適用時間を延長することによる、経皮的に誘導される抗オボアルブミン抗体免疫反応の増強。
【図７Ｂ】凝縮コンパートメントを有する器具の皮膚適用時間を延長することによる、経皮的に誘導される抗オボアルブミン抗体免疫反応の増強。
【図８】パッチ型システムと比較した、アジュバントまたは皮膚の穿孔もしくは摩耗処置を伴わない、皮膚経路を介した、強力な免疫原特異的抗体免疫反応の誘導。
【図９】アジュバントを使用せず低用量の抗原を使用する、皮膚経路を介した抗ＴＴ抗体免疫反応の誘導。
【図１０】凝縮コンパートメントを有する器具の皮膚適用時間延長に比例する、皮膚ホメオスタシスの破壊に関連する表皮肥厚の誘導。
【図１１】凝縮コンパートメントを有する器具の皮膚適用時間延長に比例する、皮膚への抗原侵入および樹状細胞によるその処理の誘導。
【図１２】凝縮コンパートメントを有する器具の皮膚適用時間延長に比例する、表皮ランゲルハンス細胞の活性化に関連する、これらの細胞のネットワークにおける変化の誘導。
【図１３】腫瘍抗原の入った凝縮コンパートメントを有する器具を皮膚に２４時間適用した後の、この抗原を発現している細胞をインビトロで標的とすることのできる、腫瘍抗原に特異的な抗体産生の誘導。
【図１４】呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）抗原の入った凝縮コンパートメントを有する器具を皮膚に４８時間適用した後の、幼若マウスにおけるＲＳＶ感染に対する部分的防御の誘導。
【００５８】
実施例
実施例１
凝縮コンパートメントを含む皮膚用器具の製造
凝縮コンパートメントを有する皮膚適用器具を、所望のコンパートメント高を与える形状の環で覆い両面を粘着性にした（厚さ＝０．７mm）ポリエチレンフィルム（３Ｍ）を裏打ちとして使用して製造した。よってこの器具は、皮膚上に１cm2の拡散表面、そしてこの皮膚を通って拡散した空気のための７０mm3の膨張コンパートメントを有する。
【００５９】
様々な水蒸気透過率（ＭＶＴＲ）を有する幾つかのポリマー、特にCoTran（登録商標）9706（ＭＶＴＲ＝２６．４g/m2/24h）、CoTran（登録商標）9720（ＭＶＴＲ＝９．４g/m2/24h）およびCoTran（登録商標）9722（ＭＶＴＲ＝７．９g/m2/24h）を使用した。
【００６０】
実施例２
いかなるアジュバント化合物および皮膚の穿孔または摩耗処置も伴わない、皮膚経路を介した抗原特異的抗体免疫反応の誘導
乾燥形態の、オボアルブミンモデル抗原（ＯＶＡ）、破傷風毒素（ＴＴ）、腫瘍抗原または市販抗インフルエンザワクチンを含み容積が１０mm3/cm2である以外は実施例１に従って製造した、凝縮コンパートメントを含む皮膚投与器具を、適用前日に剃毛および脱毛した雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝６〜１０）の背部に２４時間適用した。初回適用の２および４週間後に適用を更新した。抗抗原ＩｇＧ型抗体総量を、最終適用の２週間後にサンプリングした動物の血清で、ＥＬＩＳＡによりアッセイした。図２に示す結果は、抗原特異的抗体力価で表す。各動物の血清について、これは、４５０nmで測定された吸光度が非処置マウスの血清で測定されたカットオフ値に等しい希釈の逆数である。得られた結果は、アジュバントを使用しなくても強力な抗原特異的免疫反応が誘導されることを示す。
【００６１】
実施例３
無傷の皮膚に６または２４時間適用した後の、アジュバント化合物を使用しない、皮膚経路を介した抗オボアルブミン抗体免疫反応の誘導
乾燥形態のＯＶＡ（１００μg）を含み容積が１０mm3/cm2である以外は実施例１に従って製造した、凝縮コンパートメントを含む皮膚投与器具を、適用前日に剃毛および脱毛した雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝１０）の背部に６または２４時間適用した。初回適用の２および４週間後に適用を更新した。抗抗原ＩｇＧ型抗体総量を、最終適用の２週間後にサンプリングした動物の血清で、ＥＬＩＳＡを用いてアッセイした。図３に示す結果は、抗原特異的抗体力価で表す。各動物の血清について、これは、４５０nmで測定された吸光度が非処置マウスの血清で測定されたカットオフ値に等しい希釈の逆数である。得られた結果は、６または２４時間の適用時間で強力な抗原特異的免疫反応が誘導されることを示す。
【００６２】
実施例４
凝縮コンパートメントにおいて利用可能な水の量および物理的状態の研究
皮膚は、生理的な量の水蒸気を蒸発させる。この蒸発は不感水分喪失−ＩＷＬとして表される。それは、凝縮コンパートメント内の水蒸気量の増加を引き起こす。するとその蒸気量増加は、コンパートメント内部の水蒸気分圧の上昇を引き起こす。３５℃においては圧力５３．７５mbarからコンパートメントは飽和状態となる。この圧を超えると蒸気は液体水へと凝縮し、皮膚表面に堆積して凝縮コンパートメントを満たすことができる。また、凝縮コンパートメントの組成物において、本実施例で使用される裏打ちのポリマーは完全に不浸透性ではなく、その水蒸気透過率（ＭＶＴＲ）により規定される或る量の蒸気を脱出させる。
【００６３】
したがってこのシステムでは、第一に水蒸気の形態でコンパートメントに侵入する水量、そして第二にポリマーフィルムを通る透過または凝縮のいずれかによってコンパートメントから無くなる水の量、の間に平衡が存在する。
【００６４】
これら種々の量を以下のように評価した：
Ｑ１＝ＩＷＬ＊Ｓ＊ｔ
Ｑ２＝ＭＶＴＲ＊Ｓ’＊ｔ
Ｑ＝Ｑ１−Ｑ２
Ｐ＝ｎＲＴ／Ｖ
［式中、Ｑ１＝任意の時刻においてコンパートメントに侵入する蒸気の質量；Ｑ２＝ポリマーから脱出する水蒸気の量；Ｑ＝コンパートメントに残存する水蒸気の量；Ｐ＝コンパートメント内の圧力；Ｓ＝皮膚を通る水蒸気の放出表面；Ｓ’＝ポリマーを通る水蒸気の放出表面；ｔ＝時間］。
【００６５】
２０時間の凝縮コンパートメント適用前後の水量を、無毛ラットの背部からサンプリングした皮膚のＩＷＬ測定によりアッセイした。この測定は、器具を適用しなかった皮膚領域との比較によって行った。皮膚フラグメントをフランツ拡散セルにマウントした。受取りコンパートメントでは、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４）を使用して皮膚を生理的状態と同程度の水化状態に維持する。フランツセルの準備が整ったならば、これらを３７℃の温水浴に入れ、温度を生理的流動の温度と平衡化するため、他の何らかの操作をする前に２時間保持する。
【００６６】
図４に示す結果は、蒸気の形態でコンパートメントに加えられた水が、器具の適用後、かなり速やかに凝縮し始めることを示す。これらの結果はこのシステムの初期および最終データを表しているが、それによれば、２０時間後に算出された水蒸気および液体水の量は、各々、液体水１．０８mg/cm2および水蒸気形態０．３mg/cm2である。実験中の目視検査では、水が皮膚表面に液体形態で蓄積するように見える。
【００６７】
実施例５
凝縮コンパートメントを有する器具の適用後の、様々な表皮層（上層、上層および中層、表皮全体）の水化パーセンテージの経時的増大
Hydrascan（登録商標）は、Dermscan（登録商標）により開発された、皮膚の水化を測定する機器である。この測定原理は一時的熱移動（ＴＴＴ）に基づいている：熱検出機の近傍にある刺激装置により一定の熱パルスが発生し、表皮を通じて伝播する。皮膚温の各変化は、皮膚の水分量に比例する（Girard P., Beraud A. and Sirvent A.「ヒト対象における皮膚水化のインビボ測定のための補完的三技術の研究：ＮＭＲ分光法、一時的熱移動およびコルネオメトリー  −  乾性皮膚および化粧品への応用」Skin Research and Technology, 2000, 6:205-213）。測定値はmW/℃で記載する（これは熱伝導であり、二点間のｔ℃の相違に関連する、これら二点間の熱を伝導する能力の尺度である）。この装置は、３つの層：表皮の上層、中層および深層を区別することにより表皮の水化を測定することができる。
【００６８】
この研究は１群１５名のボランティアで実施した：１８〜５０歳の女性、白人、普通肌。７０mm3の凝縮コンパートメントを有する器具を２８℃で前腕に適用。Hydrascan測定を随時（０時間目、１時間目、２時間目、３時間目および４時間目）使用して水化動態測定を実施した。凝縮コンパートメント下部の表皮の水化測定をこれら各々の時刻に行い、凝縮コンパートメントを適用しなかった皮膚領域の測定値と比較した。得られた結果を図５に示すが、これは、適用の１時間目から凝縮コンパートメント内の水化率が増加すること、そしてこの水化が長時間維持され得ることを示している。
【００６９】
実施例６
凝縮コンパートメントを有する器具の適用後の、長時間にわたる皮膚表面の水化の増大
この研究は１群１５名のボランティアで実施した：１８〜５０歳の女性、白人、普通肌。７０mm3の凝縮コンパートメントを有する器具を２６℃で前腕に適用。Tewameter（登録商標）210（Courage and Khazada Electronic Gmbh., Koln, ドイツ国）を用いて不感水分喪失（ＩＷＬ）の測定を行った。凝縮コンパートメント下に、したがって皮膚上に蓄積された水量の決定を、該器具を取り除いてから９０秒間、毎秒記録されたＩＷＬ測定値を用いて算出した。各測定時刻について曲線下面積を算出した。測定は、凝縮コンパートメント適用後、０時間目、１時間目、２時間目、３時間目および４時間目に行った。得られた結果を図６に示すが、これは、処置の間に皮膚表面に蓄積される水量が増加することを示している。
【００７０】
実施例７
皮膚への適用時間を延長することによる、経皮的に誘導される抗オボアルブミン抗体免疫反応の増強
乾燥形態のＯＶＡ（１００μg）またはＴＴ（１００μg）を含み容積が１０mm3/cm2である以外は実施例１に従って製造した、凝縮コンパートメントを含む器具を、適用前日に剃毛および脱毛した雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（図７Ａではｎ＝６、図７Ｂではｎ＝１０）の背部に２４または４８時間適用した。二つの異なるレジメンに従いこの適用を更新した：
プロトコール１：初回適用の２および４週間後（図７Ａおよび７Ｂ）
プロトコール２：初回適用の２、７、９、１４、２１および２８日後（図７Ｂ）
抗ＯＶＡ ＩｇＧ型抗体総量を、最終適用の２週間後にサンプリングした動物の血清で、ＥＬＩＳＡによりアッセイした。図７Ａおよび７Ｂに示す結果は、抗原特異的抗体力価で表す。各動物の血清について、これは、４５０nmで測定された吸光度が非処置マウスの血清で測定されたカットオフ値に等しい希釈の逆数である。得られた結果は、４８時間の適用時間で特に著明な抗体特異的反応を示す。
【００７１】
実施例８
パッチ型システムと比較した、いかなるアジュバント化合物および皮膚の穿孔または摩耗処置も伴わない、皮膚経路を介した、免疫原に特異的な強力な抗体免疫反応の誘導。
乾燥形態のモデル免疫原、コレラ毒素（ＣＴ）を含み容積が１０mm3/cm2である以外は実施例１に従って製造した、凝縮コンパートメントを含む皮膚投与器具を、適用前日に剃毛および脱毛した雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝１０）の背部に２４時間適用した。初回適用の２および４週間後に適用を更新した。加えて、普通の絆創膏で覆った、液体形態の免疫原を吸着させたガーゼで構成されるパッチ型システムを、前記器具と同じ条件で雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスの背部に適用した。抗抗原ＩｇＧ型抗体総量を、最終適用の２週間後にサンプリングした動物の血清で、ＥＬＩＳＡを用いてアッセイした。図８に示す結果は、抗原特異的抗体力価で表す。各動物の血清について、これは、４５０nmで測定された吸光度が非処置マウスの血清で測定されたカットオフ値に等しい希釈の逆数である。
【００７２】
結果は、パッチ型システムと比較して、凝縮コンパートメントを有する皮膚投与を利用した場合、強力な免疫原特異的免疫反応が誘導されることを示す。
【００７３】
実施例９
アジュバント化合物を使用せず低用量の抗原を使用する、皮膚経路を介した抗ＴＴ抗体免疫反応の誘導
乾燥形態のＴＴ（１０または１００μg）を含み容積が１０mm3/cm2である以外は実施例１に従って製造した、凝縮コンパートメントを含む皮膚投与器具を、適用前日に剃毛および脱毛した雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝１０）の背部に２４または４８時間適用した。初回適用の２および４週間後に適用を更新した。抗抗原ＩｇＧ型抗体総量を、最終適用の２週間後にサンプリングした動物の血清で、ＥＬＩＳＡを用いてアッセイした。図９に示す結果は、抗原特異的抗体力価で表す。各動物の血清について、これは、４５０nmで測定された吸光度が非処置マウスの血清で測定されたカットオフ値に等しい希釈の逆数である。
【００７４】
結果は、１００μgを含み且つ２４時間適用した、凝縮コンパートメントを有する皮膚投与器具、および１０μgを含み且つ４８時間適用した、凝縮コンパートメントを有する皮膚投与器具について、同等の抗原特異的抗体力価が誘導されることを示す。
【００７５】
実施例１０
縮コンパートメントを有する器具の皮膚適用時間の延長に比例する、表皮肥厚の誘導
乾燥形態のＯＶＡ（１００μg/cm2）を含み容積が１０mm3/cm2である以外は実施例１に従って製造した、凝縮コンパートメントを含む皮膚投与器具を、適用前日に剃毛および脱毛した雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝８〜１６）の背部に、０、２４または４８時間適用した。凝縮コンパートメント下の皮膚領域をサンプリングし凍結した。この試料から得られた皮膚切片をヘマルン−エオシンで染色した。図１０の結果は、倍率２００倍の顕微鏡下での観察を示す。
【００７６】
結果は、ＯＶＡを含む凝縮コンパートメントを有する皮膚投与器具の適用が表皮の肥厚を誘導し、それが２４時間の適用後に可視的となり、４８時間の適用後に大きくなることを示す。
【００７７】
実施例１１
凝縮コンパートメントを有する器具の皮膚適用時間延長に比例する、皮膚への抗原侵入および樹状細胞によるその処理の誘導
−  乾燥形態のAlexa 488（Ａ４８８）と結合させたＯＶＡ（１００μg/cm2）を含み容積が１０mm3/cm2である以外は実施例１に従って製造した、凝縮コンパートメントを含む皮膚投与器具を、適用前日に剃毛および脱毛した雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝１０〜２０）の背部に、６、２４または４８時間適用した。凝縮コンパートメント下の皮膚領域をサンプリングした。真皮から表皮を分離（０．５％トリプシン）した後、表皮細胞を機械的再懸濁によって、そして真皮細胞を酵素消化（コラゲナーゼ／ＤＮアーゼ）によって単離した。細胞懸濁液中および樹状細胞の間にＯＶＡ−Ａ４８８が検出されたが、この細胞は、フローサイトメトリーによりＣＤ１１ｃマーカーを用いて同定された（FACscalliburおよびCell questソフトウェア）。図１１に示す結果は、各細胞懸濁液（表皮および真皮）の全細胞および樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋）の中の、蛍光細胞（ＯＶＡ−Ａ４８８＋）のパーセンテージで表す。
【００７８】
この結果は、幾らかの表皮および真皮細胞がＯＶＡ−Ａ４８８＋であること、そして、それらの比率が、ＯＶＡ−Ａ４８８を含む凝縮コンパートメントを有する皮膚投与器具の適用時間延長と共に増加することを示す。これらＯＶＡ−Ａ４８８＋細胞の一部は樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋）であり、同様に、ＯＶＡ−Ａ４８８＋樹状細胞のパーセンテージは、凝縮コンパートメントを含む皮膚投与器具の適用時間延長と共に増大する。
【００７９】
−  乾燥形態の、Alexa 488（Ａ４８８）と結合させたＯＶＡ（１００μg/cm2）を含み容積が１０mm3/cm2である以外は実施例１に従って製造した、凝縮コンパートメントを含む皮膚投与器具を、適用前日に剃毛および脱毛したブタ（ｎ＝１）の背部に２４時間適用した。
【００８０】
凝縮コンパートメント下の皮膚領域をサンプリングした。真皮から表皮を分離（０．５％トリプシン）した後、表皮細胞を機械的再懸濁によって、そして真皮細胞を酵素消化（コラゲナーゼ／ＤＮアーゼ）によって単離した。細胞懸濁液中及び樹状細胞の間にＯＶＡ−Ａ４８８が検出されたが、この細胞は、フローサイトメトリーによりＳＬＡ−IIマーカーを用いて同定された（FACscalliburおよびCell questソフトウェア）。図１１に示す結果は、各細胞懸濁液（表皮および真皮）の全細胞および樹状細胞（ＳＬＡ−II＋）の中の、蛍光細胞（ＯＶＡ−Ａ４８８＋）のパーセンテージで表す。
【００８１】
この結果は、ＯＶＡ−Ａ４８８を含む凝縮コンパートメントを有する皮膚投与器具適用の２４時間後に、幾らかの表皮および真皮細胞がＯＶＡ−Ａ４８８＋であることを示す。これらＯＶＡ−Ａ４８８＋細胞の一部は樹状細胞（ＳＬＡ−II＋）である。
【００８２】
図１１に示す結果は、凝縮コンパートメントを含む皮膚投与器具が、皮膚への抗原侵入および樹状細胞によるその処理を促進することを示す。
【００８３】
実施例１２
凝縮コンパートメントを有する器具の皮膚適用時間延長に比例する、表皮ランゲルハンス細胞のネットワーク変化の誘導
乾燥形態のＯＶＡ（１００μg）を含み容積が１０mm3/cm2である以外は実施例１に従って製造した、凝縮コンパートメントを含む皮膚投与器具を、適用前日に剃毛および脱毛した雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５）の背部に、０、２４または４８時間適用した。凝縮コンパートメント下部の皮膚領域をサンプリングし凍結した。試料から得られた皮膚切片に、ＣＤ２０７マーカーを使用してランゲルハンス細胞が同定された。図１２に示す結果は、倍率２００倍の顕微鏡下でなされた観察を示す。
【００８４】
結果は、ＯＶＡを含む凝縮コンパートメントを有する皮膚投与器具の適用が表皮のランゲルハンス細胞のネットワークの改変を誘導し、それが２４時間の適用後に可視的となり、４８時間の適用後に大きくなることを示す。この現象はこれらの細胞の活性化に特徴的である。
【００８５】
実施例１３
腫瘍抗原を含む凝縮コンパートメントを有する器具を皮膚に２４時間適用した後の、この抗原を発現する細胞をインビトロで標的とすることのできる、腫瘍抗原に特異的な抗体産生の誘導
乾燥形態の腫瘍抗原を含み容積が１０mm3/cm2である以外は実施例１に従って製造した、凝縮コンパートメントを含む皮膚投与器具を、適用前日に剃毛および脱毛した雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝６）の背部に、２４時間適用した。初回適用の２および４週間後に適用を更新した。抗抗原ＩｇＧ型抗体総量を、最終適用の２週間後にサンプリングした動物の血清で、ＥＬＩＳＡによりアッセイした。この動物の血清を、腫瘍抗原を発現する細胞と共にインキュベートした。マウス抗Ｉｇ蛍光抗体を用いて標識した後、フローサイトメトリー（FACscalliburおよびCell questソフトウェア）によって細胞上に腫瘍の抗抗原抗体の固定が検出された。図１３の結果は、細胞数に関連した蛍光強度を示すヒストグラムの形で示す。
【００８６】
この結果は、腫瘍抗原を含む凝縮コンパートメントを含む皮膚投与器具を使用して経皮的に免疫されたマウスの血清中に含まれる抗腫瘍抗原抗体が、該腫瘍抗原を発現する細胞のインビトロ認識を示すことを示す。
【００８７】
実施例１４
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）抗原を含む凝縮コンパートメントを有する器具を皮膚に４８時間適用した後の、幼若マウスにおけるＲＳＶウイルス感染に対する部分的防御の誘導
乾燥形態の呼吸器合胞体ウイルス抗原を含み容積が１０mm3/cm2である以外は実施例１に従って製造した、凝縮コンパートメントを含む皮膚投与器具を、幼若ＢＡＬＢ／ｃマウス（７日齢）の背部に４８時間適用した。この抗原を、対照として、アジュバントと共に鼻腔経路により投与した。経鼻的ワクチン接種の２３日後にウイルス試験を行った。ウイルスＲＮＡのアッセイは、感染の５日後にサンプリングした肺について実施した。図１４に示す結果は、リファレンス遺伝子と比較し正の対照（非ワクチン接種個体）に対して標準化した、肺におけるウイルスＲＮＡの相対量で表す。
【００８８】
結果は、ＲＳＶ抗原を含む凝縮コンパートメントを有する器具を皮膚に４８時間適用した後の、幼若マウスにおけるウイルスロードが、非処置幼若マウスに比較して二分の一に低下したことを示す。
【図１Ａ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図８】
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【図９】
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【図１４】
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【図１Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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