(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
スタチンを有効成分として含有するPlGF誘導促進剤であって、前記スタチンはプラバスタチンまたはアトルバスタチンから選択され、前記スタチンがプラバスタチンの場合、前記PlGF誘導促進剤は妊娠雌性動物、非妊娠雌性動物およびヒト臍帯血管内皮細胞のいずれかにおいてPlGFの発現を誘導するために用いられ、前記スタチンがアトルバスタチンの場合、前記PlGF誘導促進剤はヒト臍帯血管内皮細胞においてPlGFの発現を誘導するために用いられる、PlGF誘導促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はsFLT1を胎盤特異的に発現する妊娠高血圧症候群等の疾患のモデル動物及び当該モデル動物の製造方法に関する。また本発明は妊娠高血圧症候群等の疾患の治療剤の候補化合物のスクリーニング方法および妊娠高血圧症候群等の疾患を治療するための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
妊娠高血圧症候群は、胎盤機能不全を起源として、妊娠女性のおよそ5〜7％において観察される（Lancet. 2006 Apr 1;367(9516):1066-74, WHO analysis of causes of maternal death: a systematic review（非特許文献１））。妊娠高血圧症候群は母体および乳児の病的状態および死亡の主な原因であるが、確立された治療は唯一妊娠を終了させて胎盤を取り出すことである。ゆえに、適切な動物モデルを生成することは、病因を理解して、治療薬を開発するために非常に臨床的に意義が深い。Maynardらは、母体血液中の可溶型FLT1（sFLT1）の増加とVEGFおよびPlGF（placental growth factor、胎盤由来VEGF様タンパク質）の減少が妊娠高血圧症候群の女性に見られることを報告している（J Clin Invest. 2003 Mar;111(5):649-58, Excess placental soluble fms-like tyrosine kinase 1 (sFlt1) may contribute to endothelial dysfunction, hypertension, and proteinuria in preeclampsia.（非特許文献２））。sFLT1は、VEGF受容体の可溶型であり、VEGFおよびPlGF機能に拮抗することから、血管新生シグナル伝達の障害によって、血管内皮の機能障害および妊娠高血圧症候群を引き起こすと考えられている（N Engl J Med. 2004 Feb 12;350(7):672-83. Circulating angiogenic factors and the risk of preeclampsia.（非特許文献３））。このことは、sFLT1を発現するアデノウイルスベクター（AdV-）を妊娠ラットに全身投与すると、高血圧症、タンパク尿、および妊娠高血圧症候群の古典的病変である糸球体硬化症を示した事実にも支持される（J Clin Invest. 2003 Mar;111(5):649-58., Excess placental soluble fms-like tyrosine kinase 1 (sFlt1) may contribute to endothelial dysfunction, hypertension, and proteinuria in preeclampsia. Long-term maternal cardiovascular function in a mouse model of sFlt-1-induced preeclampsia.（非特許文献２））。しかし妊娠高血圧症候群ではsFLT1が出産まで発現するのに対し、モデル動物におけるsFLT1発現は一過性であった。さらに従来のモデル動物では、sFLT1が原因臓器である胎盤ではなく母体（主に肝臓）において産生されるために出産により病態が改善しない。すなわち従来のモデル動物は、出産により病態が改善する妊娠高血圧症候群のモデルとして不完全であった。
また胚盤胞期胚にレンチウイルスベクターを感染させると、母体や胎児に遺伝子導入されることなく胎盤のみに遺伝子導入できることが証明されている（非特許文献４，５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】WO2007/020786
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Lancet. 2006 Apr 1;367(9516):1066-74, WHO analysis of causes of maternal death: a systematic review
【非特許文献２】J Clin Invest. 2003 Mar;111(5):649-58, Excess placental soluble fms-like tyrosine kinase 1 (sFlt1) may contribute to endothelial dysfunction, hypertension, and proteinuria in preeclampsia.
【非特許文献３】N Engl J Med. 2004 Feb 12;350(7):672-83. Epub 2004 Feb 5, Circulating angiogenic factors and the risk of preeclampsia.
【非特許文献４】Nat Biotechnol. 2007 Feb;25(2):233-7.Complementation of placental defects and embryonic lethality by trophoblast-specific lentiviral gene transfer.
【非特許文献５】Genesis. 2009 Dec;47(12):793-8., Placenta-specific gene activation and inactivation using integrase-defective lentiviral vectors with the Cre/LoxP system.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は上述の課題を鑑みてなされたものである。本発明は、臨床実態に近い妊娠高血圧症候群等の疾患のモデル動物及び当該モデル動物の製造方法を提供することを課題とする。また本発明は、当該モデル動物を用いた妊娠高血圧症候群等の疾患の治療剤の候補化合物のスクリーニング方法、及び妊娠高血圧症候群等の疾患の治療剤等を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するため本発明者らは、レンチウイルスベクターを用いて、マウス胎盤においてヒトsFLT1を特異的に発現させる非ヒト動物の作成を試みた。その結果本発明者らは、当該モデル動物が妊娠中に高血圧症、胎盤機能不全、子宮内胎児発育遅延（IUGR）、糸球体硬化症、タンパク尿を示し、その症状が分娩後に改善するという、ヒトの臨床実態にきわめて近い症状を示すことを見出した。
さらに本発明者らは、このモデル動物にプラバスタチン（PS）の投与を試みた。その結果、プラバスタチンがsFLT1に拮抗する胎盤由来増殖因子（PlGF）の発現を誘導して、sFLT1に起因する妊娠高血圧症候群、胎盤機能不全、子宮内胎児発育遅延、糸球体硬化症およびタンパク尿の症状を改善することを見出した。また本発明者らは、プラバスタチンがPlGFの胎盤以外での異所発現を誘導することを見出した。
本発明はこのような知見に基づくものであり、以下の発明に関する。
〔１〕sFLT1が胎盤特異的に発現していることを特徴とする非ヒト哺乳動物。
〔２〕妊娠高血圧症候群、胎盤機能不全、子宮内胎児発育遅延、糸球体硬化症およびタンパク尿からなる群より選択される少なくとも１つの疾患の症状を呈する、〔１〕に記載の非ヒト哺乳動物。
〔３〕以下（ａ）から（ｃ）を含む工程によって得られる、〔２〕に記載の非ヒト哺乳動物；
（ａ）非ヒト哺乳動物の胚盤胞の透明帯を除去する工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られた胚盤胞の栄養外胚葉特異的に、sFLT1をコードする核酸を導入する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた胚盤胞をレシピエントに移植する工程。
〔４〕以下（ａ）から（ｃ）の工程を含む、非ヒト哺乳動物の製造方法；
（ａ）非ヒト哺乳動物の胚盤胞の透明帯を除去する工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られた胚盤胞の栄養外胚葉特異的に、sFLT1をコードする核酸を導入する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた胚盤胞をレシピエントに移植する工程。
〔５〕以下（ａ）から（ｃ）の工程を含む、妊娠高血圧症候群、胎盤機能不全、子宮内胎児発育遅延、糸球体硬化症およびタンパク尿の症状を改善させる物質のスクリーニング方法；
（ａ）〔１〕から〔３〕のいずれかに記載の非ヒト哺乳動物を取得する工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られた非ヒト哺乳動物に被検物質を投与する工程、及び
（ｃ）被検物質を投与しない場合と比較して、妊娠高血圧症候群、胎盤機能不全、子宮内胎児発育遅延、糸球体硬化症およびタンパク尿の少なくとも１つの症状を改善させる物質を選択する工程。
〔６〕スタチンを有効成分として含有する妊娠高血圧症候群、胎盤機能不全、子宮内胎児発育遅延、糸球体硬化症およびタンパク尿からなる群より選択される少なくとも１つの疾患の治療に用いるための医薬組成物。
〔７〕PlGFまたはPlGFをコードする核酸を有効成分として含有する妊娠高血圧症候群、胎盤機能不全、子宮内胎児発育遅延、糸球体硬化症およびタンパク尿からなる群より選択される少なくとも１つの疾患の治療に用いるための医薬組成物。
〔８〕スタチンを対象に投与する工程を含む、妊娠高血圧症候群、胎盤機能不全、子宮内胎児発育遅延、糸球体硬化症およびタンパク尿からなる群より選択される少なくとも１つの疾患の治療方法。
〔９〕PlGFまたはPlGFをコードする核酸を対象に投与する工程を含む、妊娠高血圧症候群、胎盤機能不全、子宮内胎児発育遅延、糸球体硬化症およびタンパク尿からなる群より選択される少なくとも１つの疾患の治療方法。
〔１０〕妊娠高血圧症候群、胎盤機能不全、子宮内胎児発育遅延、糸球体硬化症およびタンパク尿からなる群より選択される少なくとも１つの疾患の治療に用いるための医薬組成物の製造におけるスタチンの使用。
〔１１〕妊娠高血圧症候群、胎盤機能不全、子宮内胎児発育遅延、糸球体硬化症およびタンパク尿からなる群より選択される少なくとも１つの疾患の治療に用いるための医薬組成物の製造におけるPlGFまたはPlGFをコードする核酸の使用。
〔１２〕妊娠高血圧症候群、胎盤機能不全、子宮内胎児発育遅延、糸球体硬化症およびタンパク尿からなる群より選択される少なくとも１つの疾患の治療に用いるためのスタチン。
〔１３〕妊娠高血圧症候群、胎盤機能不全、子宮内胎児発育遅延、糸球体硬化症およびタンパク尿からなる群より選択される少なくとも１つの疾患の治療に用いるためのPlGFまたはPlGFをコードする核酸。
〔１４〕妊娠高血圧症候群、胎盤機能不全、子宮内胎児発育遅延、糸球体硬化症およびタンパク尿からなる群より選択される少なくとも１つの疾患の治療のためのスタチンの使用。
〔１５〕妊娠高血圧症候群、胎盤機能不全、子宮内胎児発育遅延、糸球体硬化症およびタンパク尿からなる群より選択される少なくとも１つの疾患の治療のためのPlGFまたはPlGFをコードする核酸の使用。
〔１７〕スタチンを有効成分として含有するPlGF誘導促進剤。
〔１８〕スタチンを対象に投与する工程を含むPlGFの誘導方法。
〔１９〕PlGF誘導剤の製造におけるスタチンの使用。
〔２０〕PlGFの誘導に用いるためのスタチン。
〔２１〕PlGFの誘導のためのスタチンの使用。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】胎盤特異的sFLT1発現によって生成された妊娠高血圧症候群モデルを示す図及び写真である。（a）妊娠高血圧症候群モデルマウスを生成するためのスキームを示す。透明帯の除去後、胚盤胞にヒトsFLT1 (hsFLT1)を発現するレンチウイルスベクター（LV-hsFLT1）を形質導入した後、偽妊娠雌性動物に移植した。形質導入された栄養外胚葉（TE）細胞系列は、胎盤の主成分を提供し、hsFLT1を持続的に発現する。内細胞塊、ICM。（b）E13.5で表記の組織から採取したゲノムDNA（gDNA）およびmRNAをそれぞれ、PCRおよびRT-PCRに供した結果を示す写真である。Actbを対照として用いた。pl、胎盤；fe、胎児；ut、子宮；li、肝臓。（c-f）hsFLT1の濃度（cおよびd）、血圧（e）、および尿中アルブミン対クレアチン比（f）を妊娠雌性動物において測定した結果を示すグラフである。（c）妊娠18日目（E18.5）の母体血液中で循環するhsFLT1の濃度は、形質導入のために用いたLV-hsFLT1量に依存した。（d）母体中で循環するhsFLT1は妊娠中に増加した。（e）高血圧症は、LV-hsFLT1量に依存してE16.5およびE18.5で観察された。血圧は胎盤の出産後に正常化した。PD、出産後。（f）尿中アルブミン対クレアチニン比は、対照LV-EGFP群よりLV-hsFLT群において有意に高かった（P<0.05）。
【図２】プラバスタチン（PS）がPlGFのアップレギュレーションによって妊娠高血圧症候群を改善することを示すグラフである。（a）胎盤特異的hsFLT1発現によって誘導された高血圧症は、プラバスタチンによって改善された。プラバスタチン（5μg）を、表記の日から始めて雌性動物に毎日腹腔内投与した。（b）母体血液中のhsFLT1、マウスVEGF(mVEGF)、およびマウスPlGF (mPlGF)濃度をE18.5で測定した。（c）E18.5の胎盤から抽出したmRNAを定量的RT-PCRによって解析した。（d）ウイルスベクター処理していない非妊娠および妊娠雌性マウスに、プラバスタチン（5μg）をE7.5から始めて毎日投与した。母体血液中mPlGFの濃度をE18.5で測定した。（e）HUVEC細胞をスタチン含有培地にて培養し、24時間後に上清におけるヒトVEGF(hVEGF)およびヒトPlGF (hPlGF)濃度を測定した。293T細胞を対照として用いた。
【図３】プラバスタチンまたはLV-mPlGF処置による妊娠高血圧症候群における胎盤形成およびIUGRの回復を示す写真及びグラフである。（a-d）胎盤特異的hsFLT1過剰発現は、胎盤の血管形成障害およびIUGRを引き起こした。（a）胎盤における血管形成障害はプラバスタチン処置またはPlGF発現によって回復した。胎盤をE13.5で採取して、PECAM1発現細胞を抗CD31抗体によって染色した。上部パネルにおける白いボックスを下のパネルにおいて拡大した。（b-d）胎児および胎盤をE18.5で帝王切開によって採取した。（b）生存仔。（c）胎盤。写真は母親側胎児側（下部）から撮影した。（d）胎児および胎盤の重量。
【図４】妊娠18日目の雌から採取した腎臓の切片をHE染色した結果を示す写真である。処理については各写真の左上に示す。コントロールに対し（左上）、胎盤特異的なhsFLT1過剰発現により腎臓糸球体の縮小がみられる（右上）。妊娠7日目からプラバスタチン投与（左下）、もしくは胎盤特異的にmPlGFを過剰発現させることで（右下）、病変が回復した。
【図５】プラバスタチン（PS）投与もしくは胎盤特異的mPlGF過剰発現による血圧変化を示すグラフである。野生型の妊娠マウスにプラバスタチンを妊娠7日目から18日目まで投与しても血圧は変化しない（実線）。また胎盤特異的にmPlGFを過剰発現させても血圧は変化しない（点線）。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明は、sFLT1（soluble fms-like tyrosine kinase-1）が胎盤特異的に発現していることを特徴とする非ヒト哺乳動物に関する。本発明の非ヒト哺乳動物は、好ましい態様において、sFLT1を恒常的に発現する。本発明の非ヒト哺乳動物では、sFLT1の発現は胎盤特異的であるが、胎盤由来のsFLT1は母体の血液中を循環する。胎盤では母体由来の血管と胎児由来の血管が非常に入り組んだ構造を取っており（ラビリンス層）、そこでは母体と胎児の血流は混ざることなく、ガスやホルモン、栄養分や廃棄物を交換する。一部の母体血管内には胎児由来の細胞が浸潤することも知られている。胎盤の胎児由来細胞で作られたsFLT1は細胞外に分泌されるので、それが胎盤内の母体血管を通して集められ、臍の緒を介して母体血液中を循環する。
本発明の非ヒト哺乳動物は、妊娠高血圧症候群、胎盤機能不全、子宮内胎児発育遅延、糸球体硬化症、タンパク尿などの疾患の症状を示す。また、sFLT1の発現は胎盤特異的であるが、胎盤由来のsFLT1は母体の血液中を循環する。さらに、出産後にこれらの疾患の症状の改善を示すなど、ヒトの病態によく似た経過をたどる。つまり本発明の非ヒト哺乳動物は、好ましい態様において、胎盤を有する間、妊娠高血圧症候群、胎盤機能不全、子宮内胎児発育遅延、糸球体硬化症、タンパク尿などの疾患の症状を示す。そして出産に伴い胎盤が体外へ出されると、これらの症状の改善を示す。このような本発明の非ヒト哺乳動物は、妊娠高血圧症候群、胎盤機能不全、子宮内胎児発育遅延、糸球体硬化症、タンパク尿などの疾患のモデル動物として有用である。また本発明の非ヒト哺乳動物は、妊娠高血圧症候群、胎盤機能不全、子宮内胎児発育遅延、糸球体硬化症、タンパク尿などの疾患の治療や予防のための薬剤の候補化合物のスクリーニング方法に利用することができる。
本発明の好ましい態様において、妊娠高血圧症候群、胎盤機能不全、子宮内胎児発育遅延、糸球体硬化症、タンパク尿などの疾患はsFLT1に起因する。
【０００９】
FLT1(膜型fms様チロシンキナーゼ1）は、Vascular endothelial growth factor(VEGF)や、placental growth factor(PlGF)の特異的受容体として知られる膜型タンパク質である。一方、sFLT1（可溶性fms様チロシンキナーゼ1）は膜貫通ドメインを持たないFLT1であり、Vascular endothelial growth factor(VEGF)やplacental growth factor(PlGF)の特異的受容体として知られる可溶型タンパク質である。本発明のsFLT1は全長のFLT1から膜貫通ドメインの全部又は一部が除去され、可溶性を示し、ダイマーを形成することが可能な限り限定されない。膜貫通ドメインの除去の原因としては、タンパク質の切断、mRNAの切断、あるいはエクソンの使い分けなどが挙げられるがこれらに限定されない。
SOSUIを利用して特定されたヒトFLT1の膜貫通ドメインの塩基配列およびアミノ酸配列を配列番号：１９および２０に示し、マウスFLT1の膜貫通ドメインの塩基配列およびアミノ酸配列を配列番号：２１および２２に示すが、膜貫通ドメインの配列はこれらに限定されない。
このように当業者であれば、例えばSOSUI（http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/）など公知のプログラムを利用して、様々な動物種由来のFLT1における膜貫通ドメインを容易に特定することが出来る。
また当業者であれば、公知の文献をもとに膜貫通ドメインを特定することが可能である。例えば、Flt-1は細胞外に第1から第7の７つの免疫グロブリン様ドメインを有するが、sFlt-1はこれら７つのドメインのうち第１から第６のドメインと、イントロン１３の５’領域によってコードされる31アミノ酸を有することが知られている（Shibuya, Cell Structure and Function, 26, 25-35 (2001)）。またイントロン１３の５’領域によってコードされる31アミノ酸は哺乳動物の間で高度に保存されていることが知られている。さらに、膜貫通ドメインはFLT遺伝子のエクソン16にコードされており、実際にヒトFLT1のエクソン16を欠失させると可溶型になることが知られている（Molecular and Cellular Biology, January 2005, p. 346-354, Vol. 25, No. 1, Membrane Fixation of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 1 Ligand-Binding Domain Is Important for Vasculogenesis and Angiogenesis in Mice）。
当業者であれば、このような情報をもとに、ヒトやマウス、その他の哺乳動物のsFLT1を取得することが可能である。
【００１０】
例えばヒトsFLT1をコードする核酸として以下が挙げられるがこれらに限定されない。
(1) GenBank: U01134.1より特定される塩基配列（配列番号：１に記載の塩基配列）を有するDNA
(2) NCBI Reference Sequence: NM_002019.4より特定される塩基配列から膜貫通ドメインの塩基配列が除去された塩基配列を有するDNA
またヒトsFLT1タンパク質として以下が挙げられるがこれらに限定されない。
(3) 上記(1)、(2)に記載のDNAによってコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質
(4) GenBank: U01134.1やGenBank: AAC50060.1より特定されるアミノ酸配列（配列番号：２に記載のアミノ酸配列）を有するタンパク質
(5) NCBI Reference Sequence: NP_002010.2より特定されるアミノ酸配列から膜貫通ドメインのアミノ酸配列が除去されたアミノ酸配列を有するタンパク質
【００１１】
また本発明のsFLT1はヒト由来のsFLT1に限定されない。本発明のsFLT1には、チンパンジー、マウス、ラット、犬、牛、馬、豚、羊等由来のsFLT1が含まれる。これらの動物由来のsFLT1もまた、全長FLT1から膜貫通ドメインが除去された構造を有する。
【００１２】
チンパンジー由来のsFLT1をコードする核酸としては、NCBI Reference Sequence: XM_509605.2より特定される塩基配列から膜貫通ドメインの塩基配列が除去された塩基配列を有する核酸が挙げられるがこれに限定されない。またチンパンジー由来のsFLT1タンパク質としては、当該核酸によりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質や、NCBI Reference Sequence XP_509605.2より特定されるアミノ酸配列から膜貫通ドメインのアミノ酸配列が除去されたアミノ酸配列を有するタンパク質などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００１３】
マウス由来のsFLT1をコードする核酸としては、GenBank: BC029674.1より特定される塩基配列を有する核酸、NCBI Reference Sequence: NM_010228.3より特定される塩基配列から膜貫通ドメインの塩基配列が除去された塩基配列を有する核酸が挙げられるがこれらに限定されない。またマウス由来のsFLT1タンパク質としては、当該核酸によりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質や、NCBI Reference Sequence: NP_034358.2より特定されるアミノ酸配列から膜貫通ドメインのアミノ酸配列が除去されたアミノ酸配列を有するタンパク質などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００１４】
ラット由来のsFLT1をコードする核酸としては、NCBI Reference Sequence: NM_019306.1より特定される塩基配列から膜貫通ドメインの塩基配列が除去された塩基配列を有するDNAが挙げられるがこれに限定されない。またラット由来のsFLT1タンパク質としては、当該核酸によりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質や、NCBI Reference Sequence: NP_062179.1より特定されるアミノ酸配列から膜貫通ドメインのアミノ酸配列が除去されたアミノ酸配列を有するタンパク質などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００１５】
犬由来のsFLT1をコードする核酸としては、NCBI Reference Sequence: XM_534520.2より特定される塩基配列から膜貫通ドメインの塩基配列が除去された塩基配列を有する核酸が挙げられるがこれに限定されない。また犬由来のsFLT1タンパク質としては、当該核酸によりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質や、NCBI Reference Sequence: XP_534520.2より特定されるアミノ酸配列から膜貫通ドメインのアミノ酸配列が除去されたアミノ酸配列を有するタンパク質などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００１６】
牛由来のsFLT1をコードする核酸としては、NCBI Reference Sequence: XM_001249768.2より特定される塩基配列から膜貫通ドメインの塩基配列が除去された塩基配列を有する核酸が挙げられるがこれに限定されない。また牛由来のsFLT1タンパク質としては、当該核酸によりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質や、NCBI Reference Sequence: XP_001249768.2より特定されるアミノ酸配列から膜貫通ドメインのアミノ酸配列が除去されたアミノ酸配列を有するタンパク質などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００１７】
馬由来のsFLT1をコードする核酸としては、NCBI Reference Sequence: XM_001492325.2より特定される塩基配列から膜貫通ドメインの塩基配列が除去された塩基配列を有する核酸が挙げられるがこれに限定されない。また馬由来のsFLT1タンパク質としては、当該核酸によりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質や、NCBI Reference Sequence: XP_001492375.1より特定されるアミノ酸配列から膜貫通ドメインのアミノ酸配列が除去されたアミノ酸配列を有するタンパク質などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００１８】
豚由来のsFLT1をコードする核酸としては、NCBI Reference Sequence: XM_001925740.1より特定される塩基配列から膜貫通ドメインの塩基配列が除去された塩基配列を有する核酸が挙げられるがこれに限定されない。また豚由来のsFLT1タンパク質としては、当該核酸によりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質や、NCBI Reference Sequence: XP_001925775.1より特定されるアミノ酸配列から膜貫通ドメインのアミノ酸配列が除去されたアミノ酸配列を有するタンパク質などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００１９】
羊由来のsFLT1をコードする核酸としては、GenBank: AF233077.1より特定される塩基配列から膜貫通ドメインの塩基配列が除去された塩基配列を有する核酸が挙げられるがこれに限定されない。また羊由来のsFLT1タンパク質としては、当該核酸によりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質や、GenBank: AAF60281.1より特定されるアミノ酸配列から膜貫通ドメインのアミノ酸配列が除去されたアミノ酸配列を有するタンパク質などが挙げられるがこれらに限定されない。
本発明においてsFLT1をコードする核酸は、「sFLT1をコードするDNA」および「sFLT1をコードするRNA」を含む。
【００２０】
本発明において妊娠高血圧症候群とは、妊娠20週以降、分娩後12週までに高血圧が見られる場合、または高血圧に蛋白尿を伴う場合のいずれかで、かつこれらの症状が単なる妊娠の偶発合併症によるものではないものをいう。妊娠高血圧症候群が進行すると、胎盤機能不全、子宮内胎児発育遅延、糸球体硬化症およびタンパク尿を引き起こす。
【００２１】
本発明のsFLT1を胎盤特異的に発現する非ヒト哺乳動物は、以下（ａ）から（ｃ）を含む工程によって作製することができる。
（ａ）非ヒト哺乳動物の胚盤胞の透明帯を除去する工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られた胚盤胞の栄養外胚葉特異的に、sFLT1をコードする核酸を導入する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた胚盤胞をレシピエントに移植する工程。
本発明においてレシピエントは非ヒト哺乳動物であることが好ましい。
このような工程によって得られる非ヒト動物は、妊娠高血圧症候群、胎盤機能不全、子宮内胎児発育遅延、糸球体硬化症、タンパク尿などの疾患の症状を示す。
【００２２】
本発明の非ヒト哺乳動物の作製においてはまず、胚盤胞を得る。胚盤胞とは哺乳類の初期発生で卵割期の終わった胚をいう。哺乳類の卵は無黄卵で全割し割球の集塊を形成するが、32細胞期には集塊の外側を包む栄養外胚葉と内側の内部細胞塊に分かれる。内部細胞塊は将来胎児の体となり、栄養外胚葉は将来胎盤へと分化する。本発明の方法においては、sFLT1をコードする核酸は胚盤胞の最外層を形成する栄養外胚葉細胞に特異的に導入される。
【００２３】
胚盤胞の由来する動物としては、非ヒト動物が挙げられる。非ヒト動物としては、特にこれらに制限されるものではないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスター、犬、猫、牛、馬、豚、ヤギおよび羊などが挙げられる。
【００２４】
胚盤胞は以下の方法によって作製することが出来る。例えば、任意の非ヒト哺乳動物から卵子と精子を回収し、当業者に公知の手法で受精させる。得られた受精卵を当業者に公知の手法、例えばkSOM培地にて96時間培養することによって、胚盤胞を作製することが出来る。また、当業者が通常行う方法（例えば、Manipulating the mouse embryo, a laboratory manual, 3rd edition, p201-203, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載の方法）に従い、動物から直接取り出すことによって胚盤胞を得てもよい。
【００２５】
本発明の非ヒト哺乳動物の作製においては次に、上記によって得られた胚盤胞の透明帯を除去する。胚（着床前初期胚）はウイルス等の感染防御のために、その周囲が細胞外マトリックスである透明帯に覆われている。本発明においては、この透明帯を除去する。
【００２６】
透明帯の除去は公知の方法によって行うことが可能である。例えば、酸性処理、酵素処理、または物理的処理などによって行うことが可能である。酸性処理の一例としては、酸性タイロードによる処理（Manipulating the mouse embryo, a laboratory manual, 3rd edition, p485-486, Cold Spring Harbor Laboratory Press）が挙げられる。例えば、酸性タイロード液（pH2.3〜2.5）をマイクロピペットに予め吸引しておき、固定した胚に緩やかに吹き付けて透明帯の一部を溶解する。あるいは、酸性タイロード液の液中に胚を浸漬して透明帯を溶解する。
【００２７】
酵素処理の方法による透明帯の除去は、Pronaseによる処理(Calbiochem 537088, Sigma P5147)等が挙げられる。例えば、Pronase 0.5%液中で、透明帯が溶けるまで胚を放置する。透明帯が溶けた後、胚を培地で良く洗うことにより、透明帯が除去された胚盤胞を得ることが出来る（Manipulating the mouse embryo, a laboratory manual, 3rd edition, p731, Cold Spring Harbor Laboratory Press）。
【００２８】
さらに本発明における透明帯の除去は、物理的な方法によって行ってもよい。物理的な除去方法としては、胚を固定してマイクロピペットにより透明帯の一部分を切開する透明帯切開法（Hum. Reprod., 5:7-13, 1990）、レーザー（Hum. Reprod., 15:1061-1064, 2000）やピエゾマイクロマニピュレーター（Developmental Biology, 250:348-357, 2002）による透明帯の切開や開孔あるいは菲薄化を行う方法等が挙げられる。
透明帯の除去は上記の方法によって行うことが可能である。しかし本発明における透明帯の除去方法はこれらに限定されず、透明帯を除去することが可能なあらゆる方法が含まれる。
【００２９】
本発明の非ヒト哺乳動物の作製においては次に、透明帯が除去された胚盤胞にsFLT1をコードする核酸を導入する。透明帯が除去された胚盤胞にsFLT1をコードする核酸を導入する方法は特に限定されるものではないが、１つの好ましい態様として、sFLT1をコードする核酸を有するベクターを胚盤胞に導入する方法が挙げられる。
【００３０】
胚盤胞に導入するsFLT1をコードする核酸を有するベクターとしてはウイルスベクターが挙げられる。ウイルスベクターとしては、DNAウイスルベクターやRNAウイルスベクターが挙げられる。DNAウイスルベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどが挙げられるがこれらに限定されない。またRNAウイルスベクターとしては、レンチウイルスベクター(Molecular Therapy 2003, 8;666-673)などのレトロウイルスベクター(Molecular Therapy 2003, 8;666-673)が挙げられる。また後述するように、HVJリポソーム、Lipofectamineなどの核酸導入試薬を用いることも可能である。HVJ（hemagglutinating virus of Japan：センダイウイルス）-リポソームは、細胞融合を起こすウイルスであるHVJの融合蛋白の活性と、DNA結合蛋白質HMG-1を利用して、リポソームに封印した遺伝子やオリゴヌクレオチドを効率よく生体の各臓器へ導入できるベクターである。
【００３１】
これらのベクターの中で好ましいベクターは、レンチウイルスベクターである。レンチウイルスはレトロウイルスの一属であり、ヒト、サル、ネコ、ウシの免疫不全ウイルスである。ウイルスの遺伝子構造はレトロウイルスとしての基本の構造遺伝子（gag、pol、env）のほか、数種類の調節遺伝子を有する。レンチウイルスを改変して作製したレンチウイルスベクターは、外来遺伝子を染色体に組み込むことが出来るため、導入遺伝子の長期発現が期待でき、さらに他のレトロウイルスベクターとは違い核移行シグナルを有するため非分裂細胞への遺伝子導入が可能である。
【００３２】
本発明において使用されるレンチウイルスベクターには、少なくともLTR、RRE、GAGを有する全てのレンチウイルスベクターが含まれる。本発明の非ヒト哺乳動物の作製に用いられるレンチウイルスベクターは、最低限このような条件を有していればよいが、プラスアルファとして別の遺伝子、例えばdeltaU3、PPT、WPREを有していてもよい。このようなレンチウイルスベクターもまた、本発明の方法において用いられるレンチウイルスベクターとして好ましいウイルスベクターである。
【００３３】
本発明において使用されるレンチウイルスベクターの特に好ましい態様はLTR (deltaU3)、GAG、RRE、PPT、WPREを有するレンチウイルスベクターである。このような構造を有するレンチウイルスベクターの代表例は、文献Molecular Therapy 2003, 8;666-673に開示されたGFPウイルスベクターのGFP部分を目的cDNAと置き換えたベクターである。このベクターの構造および構築方法は上記文献に開示されている。
【００３４】
本発明において、sFLT1をコードする核酸の胚盤胞への導入量やタイミングは特に限定されるものではないが、sFLT1が導入された胚盤胞を移植されたレシピエントが妊娠高血圧症候群の症状を呈する程度の量やタイミングで導入することが好ましい。投与量としては、好ましくは10-1000 ng-p24/ml、より好ましくは20-500 ng-p24/ml、さらに好ましくは100-500 ng-p24/mlが挙げられるがこれらに限定されない。またsFLT1をコードする核酸を胚盤胞に導入するタイミングとしては、着床前とすることが好ましい。
【００３５】
sFLT1をコードする核酸を有するレンチウイルスベクターの胚盤胞への感染は、例えば、sFLT1をコードする核酸を有するレンチウイルスベクターを含む溶液と透明帯が除去された胚盤胞を混合し、４〜５時間放置することによって行う。この方法によって、sFLT1をコードする核酸を有するレンチウイルスベクターを、栄養外胚葉に特異的に導入することが可能である。
【００３６】
また、透明帯が除去された胚盤胞へのsFLT1をコードする核酸の導入は、核酸導入試薬を作用させることによって行ってもよい。本発明における核酸導入試薬とは、sFLT1をコードする核酸を胚盤胞に導入することが可能な、あらゆる試薬を指す。このような核酸導入試薬の例としては、これらに限定されるものではないが、(Lipofectoamine 2000, Invitrogen) (Effectene, Qiagen) (FuGene, Roche) が挙げられる。
【００３７】
本発明においてsFLT1をコードする核酸には、sFLT1をコードするDNAおよびsFLT1をコードするRNAが含まれるが、これらに限定されない。導入されるsFLT1をコードする核酸の形態は、DNA、RNA、cDNA、mRNAもしくは人工核酸などの形態であってよい。またDNA、RNA、cDNA、mRNAには、それらの誘導体も含まれる。人工核酸としては、これらに限定されるものではないが、例えば、糖鎖の構造が修飾されたDNA、RNA、cDNA、mRNA、もしくはそれらの誘導体が含まれる。また導入されるsFLT1をコードする核酸は裸のDNAであっても、ベクターに導入されたものであってもよい。ベクターを使用する場合には、当業者であれば適宜目的のそれを設計し、使用することが可能である。本発明において使用されるベクターは、導入されるsFLT1をコードする核酸に加えて、発現宿主において機能する転写開始領域や転写終結領域など、sFLT1をコードする核酸の発現をより効率的に行うためのポリヌクレオチド領域を含んでいてもよい。
【００３８】
sFLT1をコードする核酸は、当業者であれば容易に入手することが可能である。一例としては、種々の生物学的サンプル、例えば胎盤組織や、トロホブラスト幹細胞およびその分化細胞などを原料として、その物理化学的性質等に基づいて天然より単離することができる。また、公知の配列情報に基づき、化学的に合成してもよい。
【００３９】
sFLT1をコードする核酸には、種々の動物の相同性遺伝子も含まれる。ここで「相同遺伝子」とは、種々の動物において、上記配列番号：１に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは当該ポリヌクレオチドの転写、翻訳産物と同等の生物学的機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドをさす。
【００４０】
相同遺伝子を単離するための当業者によく知られた方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Southern, E. M., Journal of Molecular Biology, Vol. 98, 503, 1975）やポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術（Saiki, R. K., et al. Science, vol. 230, 1350-1354, 1985, Saiki, R. K. et al. Science, vol.239, 487-491,1988）が挙げられる。即ち、当業者にとっては、sFLT1をコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号：1に記載の塩基配列）もしくはその一部をプローブとして、またsFLT1をコードするポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、種々の動物細胞、組織（例えば胎盤組織やトロホブラスト幹細胞およびその分化細胞など）からsFLT1をコードするポリヌクレオチドを単離することは通常行いうることである。また公知のデータベースから相同遺伝子の配列を入手してもよい。
【００４１】
このような相同遺伝子をコードする核酸を単離するためには、通常ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行なう。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は当業者であれば、適宜選択することができる。一例を示せば、25％ホルムアミド、より厳しい条件では50％ホルムアミド、4xSSC、50mM Hepes pH7.0、10×デンハルト溶液、20μg/ml変性サケ精子DNAを含むハイブリダイゼーション溶液中、42℃で一晩プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、42℃で一晩保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後の洗浄における洗浄液および温度条件は、「1xSSC、0.1% SDS、37℃」程度で、より厳しい条件としては「0.5xSSC、0.1% SDS、42℃」程度で、さらに厳しい条件としては「0.2xSSC、0.1% SDS、65℃」程度で実施することができる。このようにハイブリダイゼーションの洗浄の条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性を有するDNAの単離を期待しうる。但し、上記SSC、SDSおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、6M 尿素、0.4％ SDS、0.1×SSCの条件下では、より相同性の高いDNAを単離できると期待される。高い相同性とは、アミノ酸配列全体で少なくとも50％以上、好ましくは70％以上、さらに好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の配列の同一性を指す。また、変異体における、変異するアミノ酸数は、通常、30アミノ酸以内であり、好ましくは15アミノ酸以内であり、より好ましくは5アミノ酸以内、さらに好ましくは3アミノ酸以内であり、よりさらに好ましくは2アミノ酸以内である。
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムBLAST（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990、Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993）を用いて判定することができる。
【００４２】
本発明におけるsFLT1をコードするポリヌクレオチドは、特に制限されるものではないが、好ましくはヒト、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスター、犬、猫、牛、馬、豚、ヤギおよび羊に由来するポリヌクレオチであり、特に好ましくはヒトに由来するポリヌクレオチドである。
【００４３】
本発明における非ヒト動物の製造方法においては最後に、上記の胚盤胞をレシピエントに移植する。本発明においてレシピエントは、非ヒト動物であることが好ましい。またレシピエントは胚盤胞が由来する動物と同一の動物、もしくは同種の動物であることが好ましい。胚盤胞のレシピエントへの移植は当業者が通常行いうることである（Manipulating the mouse embryo, a laboratory manual, 3rd edition, p263-271, Cold Spring Harbor Laboratory Press、牛の胚移植、ハーフェツ  家畜繁殖学  第5版、監訳  吉田茂雄  正木淳二  入谷明、西村書店  1992年）。本発明において製造される非ヒト動物は、特にこれらに制限されるものではないが、例えばマウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスター、犬、猫、牛、馬、豚、ヤギおよび羊などが挙げられる。
【００４４】
本発明の方法によってsFLT1をコードする核酸が胚盤胞の栄養外胚葉に特異的に導入されたか否かは、導入遺伝子を増幅するPCR法やEGFP、lacZなどのレポーター遺伝子の発現を蛍光・発色などの方法より検出するなど、当業者に公知の方法を用いることによって判定することが出来る。
【００４５】
本発明はこのような工程を含む、sFLT1を胎盤特異的に発現する非ヒト哺乳動物の製造方法に関する。また本発明は、sFLT1をコードする核酸が栄養外胚葉細胞に特異的に導入された胚盤胞の製造方法に関する。
【００４６】
また本発明は、以下（ａ）から（ｃ）の工程を含む妊娠高血圧症候群、胎盤機能不全、子宮内胎児発育遅延、糸球体硬化症およびタンパク尿からなる群より選択される少なくとも１つの疾患の症状を改善させる物質のスクリーニング方法に関する。
（ａ）本明細書に記載のsFLT1を胎盤特異的に発現する非ヒト哺乳動物を取得する工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られた非ヒト哺乳動物に被検物質を投与する工程、及び
（ｃ）被検物質を投与しない場合と比較して、妊娠高血圧症候群、胎盤機能不全、子宮内胎児発育遅延、糸球体硬化症およびタンパク尿からなる群より選択される少なくとも１つの疾患の症状を改善させた物質を選択する工程。
本発明のスクリーニング方法によって得られる物質は、妊娠高血圧症候群、胎盤機能不全、子宮内胎児発育遅延、糸球体硬化症およびタンパク尿からなる群より選択される少なくとも１つの疾患の治療剤の候補化合物となり得る。従って妊娠高血圧症候群、胎盤機能不全、子宮内胎児発育遅延、糸球体硬化症およびタンパク尿からなる群より選択される少なくとも１つの疾患の症状を改善させる物質のスクリーニング方法は、妊娠高血圧症候群、胎盤機能不全、子宮内胎児発育遅延、糸球体硬化症およびタンパク尿からなる群より選択される少なくとも１つの疾患の治療剤の候補化合物のスクリーニング方法と表現することも出来る。
【００４７】
本発明のスクリーニング方法においてはまず、本明細書に記載のsFLT1を胎盤特異的に発現する非ヒト哺乳動物を取得する。このような非ヒト哺乳動物は上述の方法によって取得することが出来る。
次に、被検物質を本発明のsFLT1を胎盤特異的に発現する非ヒト哺乳動物に投与する。被検物質としては、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチドなどの単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等を挙げることができるがこれらに限定されない。
本発明のsFLT1が胎盤特異的に発現する非ヒト哺乳動物への被検化合物の投与は、例えば、経口的または非経口的に行うことができるが、それらに限定されない。被検化合物がタンパク質である場合には、例えば、当該タンパク質をコードする遺伝子を有するウイルスベクターを構築し、その感染力を利用して、本発明の遺伝子改変非ヒト哺乳動物に当該遺伝子を導入することも可能である。
本発明のスクリーニング方法においては、最後に、被検物質が妊娠高血圧症候群、胎盤機能不全、子宮内胎児発育遅延、糸球体硬化症およびタンパク尿からなる群より選択される少なくとも１つの疾患の症状を改善させたか否かを判定する。そして、被検物質を投与しない場合と比較して、妊娠高血圧症候群、胎盤機能不全、子宮内胎児発育遅延、糸球体硬化症およびタンパク尿からなる群より選択される少なくとも１つの疾患の症状を改善させた物質を選択する。例えば、胎盤のPlGFのmRNA量又は母体のPlGFの血液中濃度が増加した場合に、被検物質が妊娠高血圧症候群、胎盤機能不全、子宮内胎児発育遅延、糸球体硬化症およびタンパク尿からなる群より選択される少なくとも１つの疾患の症状を改善させたと判定される。PlGFのmRNA量はノザンブロットや定量RT-PCR、マイクロアレイ解析により測定することが出来る。また血液中濃度はウエスタンブロットやELISAにより測定することができる。
あるいは、血圧測定や尿中のアルブミン／クレアチニンを測定し、これらの値が減少した場合、被検物質が妊娠高血圧症候群の症状を改善させたと判定される。さらに腎臓の病理切片の観察により糸球体硬化症を改善させたと判定される場合や、胎盤の病理切片の観察により血管形成不全を改善させたと判定される場合、減少した胎児や胎盤の重量が回復した場合に、症状を改善させたと判定される。
【００４８】
また本発明は、スタチンを有効成分として含有する妊娠高血圧症候群、胎盤機能不全、子宮内胎児発育遅延、糸球体硬化症およびタンパク尿からなる群より選択される少なくとも１つの疾患を治療するための医薬組成物（治療剤）に関する。また本発明は、PlGF（placental growth factor）またはPlGFをコードする核酸を有効成分として含有する妊娠高血圧症候群、胎盤機能不全、子宮内胎児発育遅延、糸球体硬化症およびタンパク尿からなる群より選択される少なくとも１つの疾患を治療するための医薬組成物（治療剤）を提供する。
本発明者らは、高脂血症の治療薬として知られるスタチンを本発明者らが開発した非ヒトモデル哺乳動物に投与した結果、妊娠高血圧症候群、胎盤機能不全、子宮内胎児発育遅延、糸球体硬化症およびタンパク尿の症状が改善することを確認した。またスタチン投与によりPlGFの発現が誘導されることを確認した。従って、スタチンやPlGF、PlGFをコードする核酸（DNA、RNA）は妊娠高血圧症候群、胎盤機能不全、子宮内胎児発育遅延、糸球体硬化症およびタンパク尿の治療薬として有用と考えられる。
【００４９】
スタチンは、ヒトおよびsFLT1が胎盤特異的に導入された非ヒト動物において、以下の効果を有する。
・sFLT1の母体血液中濃度を有意に減少させる。
・VEGFの母体血液中濃度に影響を与えない。
・PlGFのmRNA量を有意に誘導する。特に胎盤において約5倍に増加する。
・PlGFの母体血液中濃度を有意に誘導する。
・胎盤形成障害を回復する。
・子宮内胎児発育制限を回復する。
・高血圧を改善する。
・腎機能障害を改善する。
またスタチンは、野生の妊娠雌性動物および非妊娠動物において、循環中のPlGFを有意に増加させる。また正常な妊娠雌性動物において血圧を低下させない。
またプラバスタチンとアトルバスタチンは、ヒト臍帯血内皮細胞（HUVEC）においてPlGFの産生を誘導する。
またPlGFは、sFLT1が胎盤特異的に導入された非ヒト動物において、以下の効果を有する。
・母体血液中のsFLT1を減損させて高血圧症を改善する。
・腎機能障害を改善する。
・胎盤形成障害を回復する。
・子宮内胎児発育制限を回復する。
【００５０】
スタチン（HMG-CoA還元酵素阻害薬）は、HMG-CoA還元酵素の働きを阻害することによって、血液中のコレステロール値を低下させる薬物の総称である。スタチン系薬剤として、メバスタチン（別名コンパクチン、化学名：[(1S,7S,8S,8aR)-8-[2-[(2R,4R)-4-hydroxy-6-oxooxan-2-yl]ethyl]-7-methyl-1,2,3,7,8,8a-hexahydronaphthalen-1-yl] (2S)-2-methylbutanoate、[(1S,7S,8S,8aR)-8-[2-[(2R,4R)-4-hydroxy-6-oxooxan-2-yl]ethyl]-7-methyl-1,2,4a,7,8,8a-hexahydronaphthalen-1-yl] (2S)-2-methylbutanoate、[8-[2-(4-hydroxy-6-oxooxan-2-yl)ethyl]-7-methyl-1,2,3,7,8,8a-hexahydronaphthalen-1-yl] 2-methylbutanoateなど）
アトルバスタチン（化学名：(-)-Monocalcium bis{(3R,5R)-7-[2-(4-fluorophenyl-5-isopropyl-3-phenyl-4-phenylcarbamoyl-1H-pyrrol-1-yl]-3,5-dihydroxyheptanoate}trihydrateなど)、
シンバスタチン（化学名：(1S,3R,7S,8S,8aR)-8-{2-[(2R,4R)-4-Hydroxy-6-oxotetrahydro-2H-pyran-2-yl]-ethyl}-3,7-dimethyl-1,2,3,7,8,8a-hexahydronaphthalen-1-yl 2,2-dimethylbutanoateなど）、
セリバスタチン（化学名：(E,3R,5S)-7-[4-(4-fluorophenyl)-5-(methoxymethyl)-2,6-di(propan-2-yl)pyridin-3-yl]-3,5-dihydroxyhept-6-enoic acidなど）
ピタバスタチン（化学名：(＋)-monocalcium bis{(3R,5S,6E)-7-[2-cyclopropyl-4-(4-fluorophenyl)-3-quinolyl]-3,5-dihydroxy-6-heptenoate}など）、
プラバスタチン（化学名：Monosodium(3R,5R)-3,5-dihydroxy-7-{(1S,2S,6S,8S,8aR)-6-hydroxy-2-methyl-8-[(2S)-2-methylbutanoyloxy]-1,2,6,7,8,8a-hexahydronaphthalen-l-yl}heptanoate）、
フルバスタチン（化学名(±)-(3RS ,5SR ,6E )-Sodium-7-［3-(4-fluorophenyl)-1-(1-methylethyl)-1H -indol-2-yl］-3,5-dihydroxy-6-heptenoateなど）、
ロスバスタチン（化学名：Monocalcium bis((3R,5S,6E)-7-{4-(4-fluorophenyl)-6-isopropyl-2-[methanesulfonyl(methyl)amino] pyrimidin-5-yl}-3,5-dihydroxyhept-6-enoate) など）、
ロバスタチン（化学名：[(1S,3R,7S,8S,8aR)-8-[2-[(2R,4R)-4-hydroxy-6-oxooxan-2-yl]ethyl]-3,7-dimethyl-1,2,3,7,8,8a-hexahydronaphthalen-1-yl] (2S)-2-methylbutanoate）など）
などが知られている。
メバスタチン以外のスタチンは、当業者であれば特表2009-538831の記載に従い合成することが可能である。またメバスタチンについては、当業者であれば、例えばJournal of Lipid Research Volume 33, 1992に記載の方法により入手することが可能である。あるいは、プラバスタチンはCayman chemical、アトロバスタチンはTronto Research Chemicalsから購入することも可能である。さらに、処方薬として多くの製薬会社より入手することが可能である。
【００５１】
また、PlGF遺伝子及び当該遺伝子によりコードされる蛋白質は公知である。例えばマウスPlGF遺伝子および当該遺伝子によりコードされる蛋白質はGenBank: BC016567.1として、ヒトPlGF遺伝子および当該遺伝子によりコードされる蛋白質はGenBank: BC001422.2として知られている。マウスPlGF遺伝子の塩基配列を配列番号：3に、当該遺伝子によりコードされる蛋白質を配列番号：4に示す。ヒトPlGF遺伝子の塩基配列を配列番号：5に、当該遺伝子によりコードされる蛋白質を配列番号：6に示す。
PlGF遺伝子及び当該遺伝子によりコードされる蛋白質はチンパンジー、ラット、犬、牛、馬、豚、羊などにおいても知られている。各々のアクセッション番号を以下に示す。
NCBI Reference Sequence
チンパンジー    ：遺伝子XM_001158223.1     タンパク質XP_001158223.1
ラット          ：遺伝子NM_053595.2        タンパク質NP_446047.1
犬              ：遺伝子XM_849639.1        タンパク質XP_854732.1
牛              ：遺伝子NM_173950.2        タンパク質NP_776375.1
馬              ：遺伝子XM_001491442.1     タンパク質XP_001491492.1
Gnenbank
豚              ：遺伝子FJ177137.1         タンパク質ACI24003.1
羊              ：遺伝子AY157708.1         タンパク質AAN77495.1
本発明の薬剤における「PlGFをコードする核酸」としては、「PlGFをコードするDNA」および「PlGFをコードするRNA」を挙げることが出来る。「PlGFをコードするDNA」の形態としては、特に制限はなく、ゲノムDNA、cDNA、合成DNA、またはそれらのDNAを含むベクターであってもよい。
【００５２】
また、本発明の医薬組成物（治療剤）における「PlGF」は、天然のタンパク質の他、公知の遺伝子組み換え技術を利用した組換えタンパク質として調製することができる。また、本発明の医薬組成物（治療剤）における「PlGF」は、その由来する生物に特に制限はない。ヒトの疾患の治療や予防に用いる場合には、好ましくは哺乳動物由来であり、最も好ましくはヒト由来である。天然のタンパク質は、例えばPlGFが発現していると考えられる胎盤等の組織の抽出液に対し、PlGFに対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いる方法により調製することが可能である。
【００５３】
一方、組換えタンパク質は、当業者においては公知の方法により、例えば組換えポリペプチドとして調製することができる。組み換えポリペプチドは、例えば、PlGFをコードする核酸を、適当な発現ベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に導入して得た形質転換体を回収し、抽出物を得た後、イオン交換、逆相、ゲル濾過などのクロマトグラフィー、あるいはPlGFに対する抗体をカラムに固定したアフィニティークロマトグラフィーにかけることにより、または、さらにこれらのカラムを複数組み合わせることにより精製し、調製することが可能である。
また、PlGFをグルタチオン S-トランスフェラーゼ蛋白質との融合ポリペプチドとして、あるいはヒスチジンを複数付加させた組み換えポリペプチドとして宿主細胞（例えば、動物細胞や大腸菌など）内で発現させた場合には、発現させた組み換えポリペプチドはグルタチオンカラムあるいはニッケルカラムを用いて精製することができる。
【００５４】
上記ベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ベクターを大腸菌（例えば、JM109、DH5α、HB101、XL1Blue）等で大量に増幅させ大量調製するために、大腸菌で増幅されるための「ori」をもち、さらに形質転換された大腸菌の選抜遺伝子（例えば、なんらかの薬剤（アンピシリンやテトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコールにより判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すれば特に制限はない。ベクターの例としては、M13系ベクター、pUC系ベクター、pBR322、pBluescript、pCR-Script等が挙げられる。また、cDNAのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、pGEM-T、pDIRECT、pT7等が挙げられる。PlGFを生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主をJM109、DH5α、HB101、XL1-Blue等の大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、lacZプロモーター（Wardら, Nature (1989) 341, 544-546；FASEB J. (1992) 6, 2422-2427）、araBプロモーター（Betterら, Science (1988) 240, 1041-1043 ）、またはT7プロモーター等を持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にpGEX-5X-1（ファルマシア社製）、「QIAexpress system」（キアゲン社製）、pEGFP、またはpET等が挙げられる。
また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。ポリペプチド分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。
【００５５】
大腸菌以外にも、例えば、PlGFを製造するためのベクターとしては、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、pcDNA3 (インビトロゲン社製)や、pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322)、pEF 、pCDM8 ）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Bac-to-BAC baculovairus expression system」（ギブコBRL社製）、pBacPAK8）、植物由来の発現ベクター（例えばpMH1、pMH2）、動物ウイルス由来の発現ベクター（例えば、pHSV、pMV、pAdexLcw ）、レトロウイルス由来の発現ベクター（例えば、pZIPneo）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Pichia Expression Kit」（インビトロゲン社製）、pNV11、SP-Q01）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、pPL608、pKTH50）等が挙げられる。
【００５６】
CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばSV40プロモーター（Mulliganら, Nature (1979) 277, 108）、MMLV-LTRプロモーター、EF1αプロモーター（Mizushimaら, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322）、CMVプロモーター等を持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、G418等）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13等が挙げられる。
また、in vivoでポリペプチドを産生させる系としては、例えば、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。この動物または植物にPlGFをコードする核酸を導入し、動物または植物の体内でPlGFを産生させ、回収する。
動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシを用いることができる（Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993）。また、哺乳類動物を用いる場合、トランスジェニック動物を用いることができる。
例えば、PlGFをコードする核酸を、ヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生されるポリペプチドをコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝子を含むDNA断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ移植する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から、PlGFを得ることができる。トランスジェニックヤギから産生されるポリペプチドを含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ebert, K.M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702）。
【００５７】
また、昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。カイコを用いる場合、PlGFをコードする核酸を挿入したバキュロウイルスをカイコに感染させることにより、このカイコの体液からPlGFを得ることができる（Susumu, M. et al., Nature (1985) 315, 592-594）。
【００５８】
さらに、植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。タバコを用いる場合、PlGFをコードする核酸を植物発現用ベクター、例えばpMON 530に挿入し、このベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）に感染させ、本タバコの葉よりPlGFを得ることができる（Julian K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138）。
【００５９】
これにより得られたPlGFは、宿主細胞内または細胞外（培地等）から単離し、実質的に純粋で均一なポリペプチドとして精製することができる。ポリペプチドの分離、精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせればポリペプチドを分離、精製することができる。
なお、本発明のPlGFを精製前又は精製後に適当な蛋白質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり部分的にペプチドを除去することもできる。蛋白質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼ等が用いられる。
【００６０】
本発明の医薬組成物（治療剤）が投与される対象は哺乳動物である。哺乳動物としては、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスター、犬、猫、牛、馬、豚、ヤギおよび羊などが挙げられるがこれらに限定されない。
上記治療剤は、経口、非経口投与のいずれでも可能であるが、好ましくは非経口投与であり、具体的には、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などが挙げられる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる。
PlGFをコードする核酸を生体内に投与する場合には、レトロウイルス、アデノウイルス、センダイウイルスなどのウイルスベクターやリポソームなどの非ウイルスベクターを利用することができる。投与方法としては、in vivo法およびex vivo法を例示することができる。
【００６１】
本発明の治療剤自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化した薬剤として投与を行うことも可能である。例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で使用できる。また、例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、ベヒクル、防腐剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
【００６２】
注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばD-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート80TM、HCO-50と併用してもよい。
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
【００６３】
また、患者の年齢、症状により適宜投与量を選択することができる。例えば、一回につき体重1kgあたり0.0001mgから1000mgの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、例えば、患者あたり0.001〜100000mg/bodyの範囲で投与量を選ぶことができる。しかしながら、本発明の薬剤はこれらの投与量に制限されるものではない。
なお本発明の治療剤、特にプラバスタチンは、高血圧症の初期より毎日投与することが好ましい。より具体的には、例えばヒトの場合、妊娠２０週よりあるいはそれよりも前より、毎日投与することが好ましい。また例えばマウスの場合、好ましくは１３日目より、より好ましくは10日目より、さらに好ましくは7日目より毎日投与することが好ましい。
また本発明の治療剤は、高血圧発症前から毎日投与することがさらに好ましい。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００６４】
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
１．方法
プライマーおよびPCR
ヒトsFLT1 (hsFLT1) cDNAを、プライマー5’-aaggatccgccgccatggtcagctactgggac-3’（配列番号：７）および5’-ttctcgagttaatgttttacattactttgtgtg-3’（配列番号：８）によってHUVEC（Kurabo）からRT-PCRによって増幅した。マウスPlGF (mPlGF) cDNAを、プライマー5’-aagaattcgccaccatgctggtcatgaagctgttc-3’（配列番号：９）および5’-ttctcgagtcacgggtggggttcctcag-3’（配列番号：１０）によってE13.5胎盤からRT-PCRによって増幅した。図１bにおいて、プライマー5'-aagtgtgacgttgacatccg-3'（配列番号：１１）および5'-gatccacatctgctggaagg-3'（配列番号：１２）をmActbの増幅に、5'-ggctgagcataactaaatctgcc-3'（配列番号：１３）および 5'-ggaatgacgagctcccttccttca-3'（配列番号：１４）を hsFLT1の増幅に用いた。図２cにおいて、プライマー5'-catccgtaaagacctctatgccaac-3'（配列番号：１５）および5'-atggagccaccgatccaca-3'（配列番号：１６）をmActbの増幅に、5'-tgctgggaacaactcaacag-3'（配列番号：１７）および 5'-cctcatcagggtattcatcca-3'（配列番号：１８）をmPlGFの増幅に用いた。【００６５】
レンチウイルスベクター
HIV-Iに基づく自己不活化レンチウイルスベクタープラスミドpLV-EGFPは既に記述された（Nat Biotechnol. 2007 Feb;25(2):233-7.）。他のレンチウイルスベクタープラスミドpLV-hsFLT1およびpLV-mPlGFは、EGFP cDNAをhsFLT1およびmPlGF cDNAにそれぞれ交換することによって調製した。水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質シュードタイプレンチウイルスベクターを生成して、p24 gag抗原濃度を既に記述されているように測定した（Nat Genet. 2000 Jun;25(2):217-22.）。【００６６】
マウスおよびレンチウイルス形質導入
野生型B6D2F1雌性動物を、妊娠雌馬の血清ゴナドトロピン（5単位）の腹腔内注射の48時間後にヒト絨毛ゴナドトロピン（5単位）によって過剰排卵させた後、野生型B6D2 F1雄性動物と交配させた。交尾後1.5日目の雌性動物から2細胞から4細胞期胚を採取して、kSOM培地（erbach BOR 1994）において2日間インキュベートして、胚盤胞を得た。酸性タイロード液（Sigma, Nicolson JCB 1975）において透明帯を除去して、このように調製した透明帯を含まない胚盤胞を、レンチウイルスベクターを含有する培地5μlにおいて個々に4時間インキュベートした。形質導入された胚盤胞を3回洗浄した後、偽妊娠ICR雌性動物に移植した。本発明者らは、それぞれの子宮角に胚盤胞10個を移植した。動物実験は全て、大阪大学・微生物病研究所・動物実験委員会によって承認された。【００６７】
スタチン
プラバスタチンナトリウム塩（Cayman Chemical）を100％エタノールに溶解してストック溶液とし（1mg/ml）、滅菌PBSによって用時希釈、（25μg/ml）、特に指示していなければE7.5から開始して、5μg/匹でE18.5まで毎日腹腔内注射した。
アトルバスタチン（Tronto Research Chemicals Inc）を100%メタノールに溶解してストック溶液とし（25mg/ml）、滅菌PBSにて用時希釈した（12.5μg/ml）。
HUVEC細胞には、それぞれを培地にて1μMもしくは10μMに希釈して添加した。【００６８】
血液および尿試料
血液試料を凝固させて遠心して血清試料を調製した。hsFlt1、mVEGFおよびmPlGFの濃度をELISAキットによって製造元の説明書（R&D system）に従って測定した。アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）およびアラニントランスアミナーゼ（ALT）を、Fuji dry-chem 3500V and dri-chemスライド（Fuji Film.co）によって測定した。尿試料をE18.5に採取した。尿アルブミンおよびクレアチニン濃度を、Fuji dry-chem 3500V and dri-chemスライド（Fuji Film.co, Tokyo Japan）を用いて測定した。【００６９】
血圧の測定
血圧は、テールカフ法（Softron Ltd,Tokyo,Japan）によって測定した。マウスを小さいケージにおいて麻酔せずに軽く固定して、行動、心拍数、および血圧を安定化させた後にその血圧を測定した。安定化後、収縮期圧および拡張気圧の双方を、安定化が乱れるまで少なくとも5回記録した。上記のように測定した収縮期圧および拡張気圧の双方の平均値を、さらなる統計分析のために用いた。【００７０】
胎盤の組織病理学
屠殺したマウスから採取した胎盤を4％パラホルムアルデヒド（PFA）/PBSにおいて12時間固定した後、さらなる染色に供した。抗CD31抗体染色は既に記述された。簡単に説明すると、PFA固定試料をPBSによって4時間すすぎ、4℃で40％、70％、100％メタノールに連続的に浸した。厚さ5μmで調製した切片を抗マウスCD31抗体（BD bioscience）によって染色して、Alexa Fluor 488共役ヤギ抗ラットIgG（Molecular Probes）によって可視化した。組織の形態学的変更を、Ehrlichヘマトキシリン・エオジン染色を用いて分析した。試料を従来の顕微鏡（DM5500 B；Leica）を用いて可視化して、画像をAdobe Photoshop CS3ソフトウェア（Adobe Systems）を用いて処理した。【００７１】
スタチンの効果としてのPlGFのインビトロ発現
HUVECおよびHEK293T細胞をそれぞれ、6ウェルプレートにおいて2×104個および1×105個/ウェルで播種して、5％CO2下で37℃でインキュベートした。培地を、24時間後にスタチンを含むまたは含まない新しい培地に交換した。さらに24時間後に採取した培地を1000×gで遠心して、上清をELISAに供した。【００７２】
統計分析
値は全て、平均値±s.e.m.として表記する。本発明者らは、両側の対応のないStudent’s t-検定によって群の間で比較した。本発明者らはP値<0.05を有意とみなした。【００７３】
２．結果
妊娠高血圧症候群の新規動物モデルを開発するために、本発明者らは、妊娠期間を通してマウス胎盤においてhsFLT1を特異的に発現させた（図1）。本発明者らは以前に、胚盤胞の栄養外胚葉細胞にレンチウイルス（LV）ベクターを形質導入すると、胎盤特異的遺伝子組み込みおよび発現が起こることを示している（Nat Biotechnol. 2007 Feb;25(2):233-7.）。この方法に従って、本発明者らは、透明帯を含まない胚盤胞にhsFLT1を発現するLVベクター（LV-hsFLT1）を形質導入して、それらを偽妊娠雌性動物に移植した（図1a）。特に指示されていなければ、実験を通して胚盤胞にレンチウイルスベクターを100 ng-p24/mlで形質導入した。本発明者らが予想したように、PCRおよびRT-PCR分析により、LV-hsFLT1トランスジーンの組み込みおよび発現は胎盤特異的であったが（図1b）、胎盤由来hsFLT1は、母体の血液中を循環することが証明された（図1cおよびd）。【００７４】
母体の血液中におけるhsFLT1の濃度は、胚盤胞の形質導入時のレンチウイルスベクターの量と相関した（図1c）。LV-hsFLT1を100 ng-p24/mlで形質導入すると、母体における循環中のhsFLT1濃度は妊娠中に徐々に増加して、胎児日齢（E）18.5日で平均値5.84±1.26 ng/mlに達したが（図1d）、これはヒト患者のsFLT1濃度（平均4382 pg/ml）に匹敵する（N Engl J Med. 2004 Feb 12;350(7):672-83., Circulating angiogenic factors and the risk of preeclampsia.）。hsFLT1の上昇後、収縮期圧と共に拡張期圧はE16.5で有意に上昇して、妊娠の残りの期間持続した（p<0.05、図1e）。血圧は分娩後速やかに正常値となり、これは胎盤の出産後のヒトの回復を模倣することに注意すべきである。高血圧症状はまた、LV-hsFLT1を20 ng-p24/mlで処置した群においても観察されたが、4 ng-p24/mlを処置した群では観察されなかった（図1e）。LV-hsFLT1形質導入胎盤を保有する妊娠雌性動物はまた、糸球体硬化症（図4）およびタンパク尿（図1f）も示した。これらのデータは、hsFLT1の胎盤特異的過剰発現が、妊娠高血圧症候群動物モデルを提供することを示した。【００７５】
次に本発明者らは、本発明者らのモデルマウスを用いて、HMG-CoAレダクターゼ阻害剤であるプラバスタチンの妊娠高血圧症候群に及ぼす治療効果を検査した。スタチンは一般的に、高コレステロール血症のための薬物として用いられるが、最近、スタチンが血管内皮細胞に対して保護効果を有することが報告されている（Pharmacol Ther. 2009 Apr;122(1):30-43. Epub 2009 Jan 23, Statins and cardioprotection--more than just lipid lowering?、Circulation. 2002 Feb 12;105(6):739-45., Statins have biphasic effects on angiogenesis.）。その上、プラバスタチンの投与は、胎盤の機能障害を改善して、自然流産モデルマウスにおける流産を予防した（Blood. 2009 Apr 23;113(17):4101-9. Epub 2009 Feb 20., Pravastatin prevents miscarriages in mice: role of tissue factor in placental and fetal injury）。予防／治療効果を決定するために、本発明者らは、10 mg/60 kgなどのヒト治療的用量と同等であるプラバスタチン5μg/匹を腹腔内に投与した。プラバスタチンをE10.5またはそれより初期から毎日投与すると、高血圧症に対する予防／治療効果が観察された（図2a）。E13.5から投与しても同様に血圧を減少させたが、有意ではなかった。プラバスタチンは、正常な妊娠雌性動物において血圧低下性ではないことに注意すべきである（図5）。糸球体硬化症およびタンパク尿も同様に、処置マウスにおいて改善された（図4および表1）。表1中のP値はすべてコントロールとのｔ検定による値である。【００７６】
【表１】
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【００７７】
次の実験において、本発明者らは、プラバスタチンがsFLT-1誘導高血圧症をどのように改善するかを調査した。sFLT1は、VEGFおよびPlGFと相互作用してその血管新生機能に拮抗することから、本発明者らは、E18.5でのこれらの因子の胎盤のmRNA量および母体の血液中濃度を測定した（図2bおよびc）。プラバスタチンをE7.5から始めて毎日投与した。LV-hsFLT形質導入胎盤を保有する雌性動物において、プラバスタチンはhsFLT1 mRNA量に影響を及ぼさなかったが、循環中のhsFLT1は、5.84±1.26から0.99±0.65 ng/mlへと有意に減少した（n＝5、P<0.001）。得られたhsFLT1濃度は、正常血圧の妊娠女性の濃度（平均1642ng/ml  N Engl J Med. 2004 Feb 12;350(7):672-83., Circulating angiogenic factors and the risk of preeclampsia.）以下であった。mVEGFは、mRNAおよびタンパク質レベルで変化しなかった（44.7±22.3から35.5±13.6 pg/ml、n＝6、P＝0.36）。興味深いことに、mPlGFは、プラバスタチン処置によって有意に誘導された（60.3±12.6から116.6±13.2 pg/ml、n＝7、P<0.001）。これと一致して、mPlGFの胎盤mRNAは、プラバスタチン処置後に約5倍に増加した（図2c）。【００７８】
プラバスタチン誘導PlGFがインビボでsFLT1を中和するか否かを決定するために、本発明者らは、胚盤胞にLV-hsFLT1およびLV-mPlGFを形質導入することによって、胎盤においてmPlGFをhsFLT1と同時に発現させた（図2aおよびb）。予想されたように、mPlGFの過剰発現は、母体血液中のhsFLT1を減損させて（図2b）、高血圧症を改善した（図2a）。LV-mPlGF形質導入単独は、いかなる血圧低下効果も示さなかった（図5）。高血圧症に加えて、タンパク質尿症および糸球体硬化症も同様にmPlGFによって改善された（表1および図4）。これらのデータは、プラバスタチン誘導PlGFがsFLT1を中和して、インビボで妊娠高血圧症候群の症状を改善するという考え方を支持する。【００７９】
LVベクターまたはsFLT1の影響がなくともプラバスタチンがPlGFを誘導するか否かを決定するために、本発明者らは、野生型雌性動物にプラバスタチンを投与した。循環中のmPlGFは妊娠雌性動物において、52.4±20.2 pg/mlから152.0±19.7 pg/mlへと有意に誘導された（n＝4、P<0.001、図3a）。驚いたことに、mPlGFはまた、非妊娠雌性動物においても0 pg/mlから29.8±13.2 pg/mlへと誘導された（n＝5、P<0.01、図3a）。本発明者らが知る限り、これは、プラバスタチンの治療用量がインビボでPlGF発現を誘導するという最初の報告である。次に、本発明者らはプラバスタチンが血管内皮細胞でのPlGF産生を誘導するかどうかを検査した。プラバスタチンのみならずアトルバスタチンも、ヒト臍帯血管内皮細胞（HUVEC）においてPlGF産生を誘導した。対照ヒト胎児腎（HEK293）細胞は、スタチン処置によってPlGFを産生しなかった（図3b）。スタチンは血管機能障害にとって有効であることが報告されているが、そのメカニズムはなおも不明である（Pharmacol Ther. 2009 Apr;122(1):30-43. Epub 2009 Jan 23., Statins and cardioprotection--more than just lipid lowering?）。本発明者らのデータは、PlGFの異所発現が、血管内皮細胞機能障害に及ぼすスタチンの保護効果を説明する可能性があることを示唆している。【００８０】
本発明者らの胎盤特異的遺伝子操作法を利用して、本発明者らは最後に、胎盤形成および胎児生育に及ぼす過剰なsFLT1の局所効果を評価した。E13.5で観察したところ、抗CD31抗体によるPECAM1の免疫染色により、LV-hsFLT1形質導入胎盤において抑制された血管床発達が明らかとなった（図3a）。E18.5で帝王切開を行ったところ、LV-hsFLT1処置雌性動物からの胎盤および胎児はLV-EGFP処置対照群より小さかった（図3b〜d）が、着床率および生児出生は同等であった（表2）。胎盤形成障害およびIUGFは、プラバスタチン処置および胎盤特異的mPlGF発現によって回復した（図3）。これらのデータはまた、スタチン誘導PlGFがsFLT1を中和して、本発明者らの妊娠高血圧症候群モデルにおける胎盤形成障害およびIUGRを回復するという考え方を支持する。【００８１】
【表２】
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【００８２】
これまでの試験から、VEGFが高血圧症を改善することが示されている（Hypertension. 2007 Oct;50(4):686-92. Epub 2007 Aug 27., Recombinant vascular endothelial growth factor 121 attenuates hypertension and improves kidney damage in a rat model of preeclampsia.）。しかし、本発明者らの系において、プラバスタチンの治療効果は、VEGFよりむしろPlGFに依存する。この考え方はまた、組み換え型PlGFが、アデノウイルスによって発現されたsFLT1によって誘導された高血圧症を改善するという事実によっても支持される（Hypertension. 2009 Nov;54(5):1129-35. Epub 2009 Sep 28., Effect of recombinant placental growth factor 2 on hypertension induced by full-length mouse soluble fms-like tyrosine kinase 1 adenoviral vector in pregnant mice.）。PlGFのVEGFR1媒介血管拡張効果を除外することができないが（Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2008 Mar;294(3):H1381-7. Epub 2008 Jan 11.,Placental growth factor is a potent vasodilator of rat and human resistance arteries.）、本発明者らのデータは、sFLT1に対するPlGFの直接の拮抗効果が、プラバスタチン処置の際の重要な要素であることを示唆した。【００８３】
スタチンの臨床応用に関して、催奇形性は、妊娠女性にとって主な懸念である。FDAはスタチンをカテゴリーXに分類して、第一トリメスターでスタチンを処方しないことを強く主張している。しかし、最近のいくつかの試験から、第一トリメスターであっても、スタチンが安全である可能性があることが示された（Reprod Toxicol. 2008 Oct;26(2):175-7. Epub 2008 Jul 1., Prenatal exposure to HMG-CoA reductase inhibitors: effects on fetal and neonatal outcomes., Br J Clin Pharmacol. 2007 Oct;64(4):496-509. Epub 2007 May 15., Risk of congenital anomalies in pregnant users of statin drugs., Pregnancy outcomes after maternal exposure to simvastatin and lovastatin., Reprod Toxicol. 1996 Nov-Dec;10(6):439-46., Postmarketing surveillance of lovastatin and simvastatin exposure during pregnancy）。本発明者らも、本実験に用いたプラバスタチン処置雌性動物に由来する仔においていかなる奇形も認めなかった。大規模および正確な形態学的試験が必要であるが、スタチンは、世界中の多数の妊娠女性および乳児を病的状態および死亡から救うために、妊娠高血圧症候群の予防／改善にとって非常に有望な候補物質であるはずである。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明により、sFLT1を胎盤特異的に発現する妊娠高血圧症候群のモデル動物及び当該モデル動物の製造方法が提供された。従来の妊娠高血圧症候群のモデル動物は、原因因子を母体で過剰発現することにより作製されており、疾患モデルとして不完全である。一方本発明のモデル動物では、妊娠継続による胎盤成長に伴い高血圧症状が現れ、分娩による胎盤脱落により高血圧症状が改善される。
具体的には、本発明のモデル動物は従来のモデル動物と比較し、次のような利点を有する。
（１）好ましい態様においてレンチウイルスベクターを使用することで、一過性ではなく妊娠期間を通じて恒常的にsFLT1発現する。
（２）従来はsFLT1を母体に遺伝子導入して主に肝臓で発現させていたのに対し、本発明の方法では、母体に遺伝子導入することなく胎盤のみに遺伝子導入して発現させている。そのため従来はできなかった、ウイルスベクター感染が母体に及ぼす直接的な影響を排除することが可能となった。また、母体でsFLT1遺伝子が発現することによる直接的な影響を排除することが可能となった。
（３）従来法ではsFLT1が母体全体に発現するので出産に関係なく病態が維持されるのに対し、本発明の方法では胎盤特異的に発現させるので出産後は病態が改善する。ヒトでも同じ経過をたどることから、患者病態をより反映したモデルと言える。
更に本発明において、スタチンによって妊娠高血圧症候群、胎盤機能不全、子宮内胎児発育遅延、糸球体硬化症およびタンパク尿の症状が改善されることが明らかとなった。現時点で、妊娠高血圧症候群の治療法としては、分娩もしくは帝王切開による胎盤除去しか存在しない。全妊婦の5-7%と言われる妊娠高血圧症候群の治療薬としてスタチンが効能追加されれば、経済効果が大きい。さらに緊急帝王切開による産科の負担や、早期帝王切開による新生児ICUなどの負担も軽減できることから、経済的効果も大きい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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