(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
赤痢菌外膜タンパク質(OMP)及び赤痢菌LPS分子を含み、さらに赤痢菌以外の種に由来する抗原を含む免疫原性組成物。
【請求項２】
LPSがTLR4経路アゴニストである、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
OMPがTLR2経路アゴニストである、請求項1に記載の組成物。
【請求項４】
赤痢菌ハウスキーピング遺伝子産物を含まない、請求項1に記載の組成物。
【請求項５】
酸性のpIを有する、請求項1に記載の組成物。
【請求項６】
30〜180nmの粒子直径サイズを有する、請求項1に記載の組成物。
【請求項７】
粒子が4℃で3ヶ月間安定な直径を有する、請求項1に記載の組成物。
【請求項８】
LPSとOMPとの比率が0.6:1.3〜0.8:1.1である、請求項1に記載の組成物。
【請求項９】
LPSとOMPとの比率が0.9:1である、請求項1に記載の組成物。
【請求項１０】
赤痢菌がシゲラ・フレクスネリ(S.flexneri)である、請求項1に記載の組成物。
【請求項１１】
さらなる抗原を含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項１２】
抗原が呼吸器合胞体ウイルス(RSV)又はインフルエンザウイルスに由来する、請求項1に記載の組成物。
【請求項１３】
樹状細胞中の以下の遺伝子:IL6、CSF2、CSF3、CXCL10のうちの一つ以上を上方調節することができる、請求項1に記載の組成物。
【請求項１４】
医薬組成物を形成するための薬学的に許容し得る賦形剤をさらに含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項１５】
赤痢菌株を増殖させること、
赤痢菌細胞を破壊すること、並びに
任意選択で、一以上の遠心分離ステップ及び界面活性剤可溶化ステップを含むプロセスによって、外膜タンパク質(OMP)及びLPSを含む画分を単離すること、
さらに、赤痢菌以外の種に由来する抗原を準備すること
を含む、赤痢菌外膜タンパク質(OMP)及び赤痢菌LPS並びに赤痢菌以外の種に由来する抗原を含む免疫原性組成物を調製するための方法。
【請求項１６】
細胞を超音波処理によって破壊するステップ、
細胞膜タンパク質をN-ラウロイルサルコシンによって可溶化するステップ
のうちの一以上をさらに含む、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
赤痢菌細胞を37℃で増殖させるステップ、
細胞を室温で30分間、2,770gで遠心分離するステップ、
上清を廃棄するステップ、
10mM Hepes中にペレットを再懸濁するステップ、
5×45秒間、43AMPで(電気)超音波処理するステップ、
室温で20分間、1,700gで遠心分離し、ペレットを廃棄するステップ、
4℃で60分間、100,000gで遠心分離し、上清を廃棄するステップ、
1% N-ラウロイルサルコシン中にペレットを再懸濁するステップ、
4℃で60分間、100,000gで遠心分離し、上清を廃棄するステップ、
10mM Hepes中にペレットを再懸濁するステップ、
5×45秒間、43AMPで超音波処理するステップ、
MgCl2を添加し、濾過する(0.2μm)ステップ
を含む、請求項15又は16に記載の方法。
【請求項１８】
医薬における使用のための、赤痢菌外膜タンパク質(OMP)及び赤痢菌LPS分子を含み、さらに赤痢菌以外の種に由来する抗原を含む組成物。
【請求項１９】
ワクチンアジュバントとしての使用のための、赤痢菌外膜タンパク質(OMP)及び赤痢菌LPS分子を含み、さらに赤痢菌以外の種に由来する抗原を含む組成物。
【請求項２０】
粘膜ワクチンアジュバントとしての使用のための、赤痢菌外膜タンパク質(OMP)及び赤痢菌LPS分子を含み、さらに赤痢菌以外の種に由来する抗原を含む組成物。
【請求項２１】
赤痢菌感染又は疾患ではない感染又は疾患に対するワクチンとしての使用のための、赤痢菌外膜タンパク質(OMP)及び赤痢菌LPS分子を含み、さらに赤痢菌以外の種に由来する抗原を含む組成物。
【請求項２２】
赤痢菌以外の種に由来する抗原を含む免疫原性組成物のためのアジュバントの調製における、赤痢菌外膜タンパク質(OMP)及び赤痢菌LPS分子の使用。
【請求項２３】
赤痢菌以外の種に由来する抗原を含む免疫原性組成物のための粘膜アジュバントの調製における、赤痢菌外膜タンパク質(OMP)及び赤痢菌LPS分子の使用。
【請求項２４】
赤痢菌感染又は疾患ではない感染又は疾患に対するワクチンの調製における、赤痢菌外膜タンパク質(OMP)及び赤痢菌LPS分子の使用。
【請求項２５】
赤痢菌外膜タンパク質(OMP)、赤痢菌LPS分子及び赤痢菌以外の種に由来する抗原を含む、免疫応答を補助するための組成物。
【請求項２６】
感染性因子に対する免疫応答を惹起するための組成物であって、該感染性因子による感染又は疾患に対して免疫応答を惹起することができる、赤痢菌以外の種に由来する抗原を含み、赤痢菌外膜タンパク質(OMP)及び赤痢菌LPS分子をも含む組成物。
【請求項２７】
感染性因子による感染を治療/軽減/改善するための組成物であって、該感染性因子による感染又は疾患に対して防御的な免疫応答を惹起することができる、赤痢菌以外の種に由来する抗原を含む医薬組成物と、赤痢菌外膜タンパク質(OMP)及び赤痢菌LPS分子を含む医薬組成物を含む組成物。
【請求項２８】
感染性因子が細菌又はウイルスである、請求項26又は27に記載の組成物。
【請求項２９】
請求項1から14のいずれか一項に記載の組成物を含む、赤痢菌ではない感染を治療又は軽減又は改善するための組成物。
【請求項３０】
組成物が鼻内経路により送達される、請求項25〜29のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３１】
同時に又は連続的に送達するための、赤痢菌外膜タンパク質(OMP)、赤痢菌LPS分子及び赤痢菌以外の種に由来する抗原を含むキット。
【請求項３２】
赤痢菌外膜タンパク質(OMP)及び赤痢菌LPS分子の有効量を含む、対象におけるアミロイド沈着又はアルツハイマー病を予防及び/又は軽減するための組成物。
【請求項３３】
アミロイド沈着又はアルツハイマー病を予防及び/又は軽減するのに使用するための、請求項32に記載の組成物。
【請求項３４】
アミロイド沈着又はアルツハイマー病を予防及び/又は軽減するための薬剤の製造における、請求項32に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫原性組成物及び免疫刺激組成物などの組成物、前記組成物を作製するための方法、ワクチン並びにワクチンを作製するための方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
プロテオソームは一般に、髄膜炎菌外膜タンパク質の疎水性の膜性多分子調製物である。プロテオソームアジュバント化ワクチンは、二つの臨床プログラムにおいて約2,000人の対象に投与されてきた。高い安全性、免疫原性及び有効性の記録にも拘らず、プロテオソーム調製のための髄膜炎菌(Neisseria meningitides)野生型株8047の使用には、封じ込めの増強が必要である(BL-3)。
【０００３】
第一世代のプロテオソームは元々、髄膜炎菌外膜タンパク質(OMP)を含み、ワクチンアジュバントとして用いられた。
【０００４】
赤痢菌(Shigella)ワクチンプロトリン（Protollin）は、髄膜炎菌由来外膜タンパク質をシゲラ・フレクスネリ(Shigella flexneri)由来LPSと組合せて含む(Jonesら、Vaccine. 2004 Sep 9; 22(27-28): 3691-7を参照されたい)。
【０００５】
組合せた髄膜炎菌OMP/リポ多糖を生成するプロテオソーム製造プロセスは、WO2009132244に開示されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
代替的な免疫原性組成物及び免疫刺激組成物が医薬及び医薬用アジュバントとして依然として求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一態様において、本発明は、赤痢菌外膜タンパク質(OMP)及び赤痢菌LPS分子を含む組成物に関する。
【０００８】
一態様において、本発明は、
赤痢菌株を増殖させるステップ、
赤痢菌細胞を破壊するステップ、並びに
好適には、一以上の遠心分離ステップ及び界面活性剤可溶化ステップを含むプロセスによって、外膜タンパク質及びLPSを含む画分を単離するステップ
を含むプロセスによって製造される組成物に関する。
【０００９】
一態様において、本発明は、
赤痢菌株を増殖させるステップ、
赤痢菌細胞を破壊するステップ、並びに
好適には、一以上の遠心分離ステップ及び界面活性剤可溶化ステップを含むプロセスによって、外膜タンパク質及びLPSを含む画分を単離するステップ
を含む、免疫原性組成物を調製するための方法に関する。
【００１０】
一態様において、本発明は、医薬における使用のための、赤痢菌外膜タンパク質(OMP)及び赤痢菌LPS分子を含む組成物に関する。
【００１１】
一態様において、本発明は、ワクチンアジュバントとしての使用のための、赤痢菌外膜タンパク質(OMP)及び赤痢菌LPS分子を含む組成物に関する。
【００１２】
一態様において、本発明は、赤痢菌感染又は疾患に対するワクチンとしての使用のための、赤痢菌外膜タンパク質(OMP)及び赤痢菌LPS分子を含む組成物に関する。
【００１３】
一態様において、本発明は、感染性因子により引き起こされる感染又は疾患の予防のための、
1 前記感染性因子に対する免疫応答を惹起することができる抗原、並びに
2 赤痢菌外膜タンパク質(OMP)及び赤痢菌LPS分子
を含む組成物に関する。
【００１４】
一態様において、本発明は、医薬における、赤痢菌外膜タンパク質(OMP)及び赤痢菌LPS分子を含む組成物の使用に関する。
【００１５】
一態様において、本発明は、ワクチンアジュバントの調製における、赤痢菌外膜タンパク質(OMP)及び赤痢菌LPS分子を含む組成物の使用に関する。
【００１６】
一態様において、本発明は、赤痢菌感染又は疾患に対するワクチンの調製における、赤痢菌外膜タンパク質(OMP)及び赤痢菌LPS分子の使用に関する。
【００１７】
一態様において、本発明は、感染性因子により引き起こされる感染又は疾患の予防のための薬剤であって、感染性因子に対する免疫応答を惹起することができる抗原を含む薬剤の調製における、赤痢菌外膜タンパク質(OMP)及び赤痢菌LPS分子を含む組成物の使用に関する。
【００１８】
一態様において、本発明は、赤痢菌外膜タンパク質(OMP)及び赤痢菌LPS分子を含む組成物の個体への送達を含む、アジュバント化された免疫応答を惹起する方法に関する。
【００１９】
一態様において、本発明は、任意選択でアジュバント化された場合、感染性因子に対する免疫応答を惹起することができる抗原、並びに赤痢菌外膜タンパク質(OMP)及び赤痢菌LPS分子を含む組成物を含む組成物を、それを必要とする個体に送達することを含む、感染性因子に対する免疫応答を惹起する方法に関する。
【００２０】
一態様において、本発明は、任意選択でアジュバント化された場合、感染性因子による感染又は疾患に対して防御的な免疫応答を惹起することができる抗原、赤痢菌外膜タンパク質(OMP)及び赤痢菌LPS分子を含む組成物を含む組成物を、それを必要とする個体に送達することを含む、感染性因子により引き起こされる感染又は疾患を治療又は軽減する方法に関する。
【００２１】
一態様において、本発明は、同時的又は連続的送達のための赤痢菌外膜タンパク質(OMP)及び赤痢菌LPS分子を含むキットに関する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】粒径により評価した安定性を示す。
【図２】電子顕微鏡による観察を示す。
【図３】SDS-PAGE/クマシーブルー染色によりSFOMP、プロトリン（Protollin）及びV2プロテオソーム中の主要タンパク質を示す。
【図４】SFOMPが細胞に基づくアッセイにおいて用量応答性活性化を誘発するTLR1-2及びTLR4経路アゴニストを含むことを示す。
【図５】鼻内投与されたSFOMPアジュバント化preF抗原がRSV感染からマウスを防御することを示す。
【図６】パイロットアジュバント試験のためのSFOMP研究ロットを調製するためのプロセスを示す。
【図７】SFOMPを用いるヒト樹状細胞のマイクロアレイ分析を示す。
【図８】鼻内投与されたSFOMPアジュバント化preF抗原が血清及び肺中和抗体を惹起することを示す。
【図９】3mgのスプリット抗原及び5mgのアジュバントの2回のIN免疫後のBALB/cマウスにおける抗A/ニューカレドニアHAI応答を示す。
【図１０】3mgのスプリット抗原及び5mgのアジュバントの2回のIN免疫後のBALB/cマウスにおける抗A/ニューカレドニア血清IgG応答を示す。
【図１１】3mgのスプリット抗原及び5mgのアジュバントの2回のIN免疫後のBALB/cマウスにおける抗A/ニューカレドニア肺IgA応答を示す。
【図１２】SfOMP、プロトリン及びV2プロトリンの間の差異を示し、LPS/OMP比を示す。
【図１３】C57BL/6マウスにおけるSFOMP(1μg/マウス)又は1μg用量のシゲラ・フレクスネリリポ多糖(LPS)の腹腔内注射の24時間後の脳内の自然（免疫）活性化（innate activation）を示す。
【図１４】SFOMP又はシゲラ・フレクスネリLPSと、ヒトマウスミクログリア細胞系(CHME)とのインキュベーション後にin vitroで測定されたAβ42食作用を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、赤痢菌などの細菌由来の免疫原性組成物及び免疫刺激組成物に関する。
【００２４】
一態様において、本発明は、赤痢菌外膜タンパク質(OMP)及び赤痢菌LPS分子を含む組成物に関する。
【００２５】
一態様において、本発明の組成物は、シゲラ・フレクスネリ株BS103から産生される、本明細書ではSFOMP(Shigella Flexneri Outer Membrane Protein preparation)と呼ぶ外膜調製物である。本発明者らは、この組成物がWO2009132244に記載のように作製されたプロトリン及びプロテオソームと同様、LPS及びOMPを含有するが、両者と比較して特定の利点を有する、すなわち、低い封じ込めを要する無毒株から産生され、1回の発酵から、従って、1回のプロセスから製造することができ、そしてB群髄膜炎菌PSに対する有害な免疫応答の危険性が理論的に排除されると決定した。SFOMPはまた、髄膜炎菌LPS/OMPの組合せと比較して増強された防御効果を示す。
【００２６】
本発明の組成物は、細胞性(T細胞)若しくは体液性(B細胞)、又はその組合せであってよい適応(特異的)免疫応答をプライミングする、促進する、活性化する、惹起する、刺激する、増加させる、追加する、増幅する、又は増強することができる「免疫原性組成物」であり得る。好ましくは、適応免疫応答は、ウイルスの中和(ウイルス感染性の低下又は消失)を含んでもよい防御的なものである。免疫原の代表例は、微生物抗原(一種以上のRSV抗原又は一種以上のインフルエンザ抗原など)である。この態様において、組成物は予防剤及び/又は治療剤として直接使用することができる。
【００２７】
一態様において、本発明の組成物は、ヒトなどの哺乳動物に投与された場合、免疫応答を増強する、好適には別の抗原に対する免疫応答を増強する「免疫刺激組成物」であってよい。免疫刺激組成物は、哺乳動物の粘膜及び/又は適応免疫応答及び/又は細胞性及び/又は体液性免疫応答及び/又は自然免疫応答を増強することができる。例えば、免疫刺激組成物は、特定の抗原と同時投与された場合に抗原に対する哺乳動物の免疫応答を増強することができる。この態様において、組成物は予防剤又は治療剤のアジュバントとして用いることができる。
【００２８】
本発明の組成物は従って、例えば、ワクチンのためのアジュバントとして、又はワクチン自体として有用であり得る。
【００２９】
本発明の組成物は、赤痢菌LPSを含む。本明細書で用いられる「LPS」は、天然の(単離された、若しくは天然構造を用いて合成的に調製された)又は改変されたリポ多糖をいう。LPSの定義に含まれるのは、10以下の単糖サブユニットからなるグリカン鎖を有するリポ糖を意味することが当業界で一般的に理解されるリポオリゴ糖(LOS)である。LPSはまた、10を超える単糖サブユニットを含むグリカン鎖を有するリポ多糖も包含する。
【００３０】
リポ糖は、解毒された形態(すなわち、リピドAコアが除去された形態)にあるか、又は解毒されていない形態にあってもよい。
【００３１】
リポ糖は、内因性(すなわち、OMP調製物と共に天然に含まれる)であってもよく、外因的に調製された(すなわち、OMP調製物とは異なる赤痢菌培養物から調製された、若しくは合成的に調製された)リポ糖に由来するOMP調製物と混合するか、若しくは組合せてもよく、又はその組合せであってもよい。そのような外因的に添加されたLPSは、OMP調製物が作製されたものと同じ赤痢菌株又は異なる赤痢菌株に由来するものであってよい。一態様において、内因性LPSを含む組成物が好ましい。
【００３２】
組成物は、外膜タンパク質(OMP)を含む。組成物は、1、2、3、4またはそれ以上のOMPを含んでもよい。赤痢菌外膜タンパク質は、好適には赤痢菌種の外膜に付着している、又は結合していることが見出された任意のタンパク質、好適には細菌の外側に露出され、従って、細菌に感染した場合にヒトの免疫系にとって可視的であると考えられるドメインを有するタンパク質である。
【００３３】
本明細書におけるOMPに対する言及は、その抗原の欠失、挿入及び置換突然変異などの天然のOMPの変異体、又は本明細書に記載のその抗原の他の特定の変異体、又は(抗原がポリペプチドである場合)、好適には免疫原性である、そのポリペプチドに対して80%以上、好適には少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するポリペプチドを含む。
【００３４】
一態様において、組成物は内膜タンパク質を含まない。
【００３５】
別の態様において、赤痢菌OMP及び赤痢菌LPSは単離されている。「単離された」とは、赤痢菌OMP及び赤痢菌LPSが、細胞質細胞膜タンパク質、及び/又はDNA、及び/又は脂質ラフトの一種以上から部分的に、又は実質的に、又は完全に分離されていることを意味する。
【００３６】
別の態様において、組成物は内膜タンパク質を少なくとも70%、少なくとも80%、又は少なくとも90%実質的に含まない。
【００３７】
OMPは、シゲラ・フレクスネリOMP1b、若しくはOMP3a若しくはOMPX、又はその組合せであってよく、一態様においては、三種全部の抗原を含む。
【００３８】
本発明の一態様において、外膜タンパク質は酸性のpIを有する。各タンパク質のpIは、4.47〜5.30の範囲であってよい。
【００３９】
一態様において、本発明の組成物は、TLR2及び/又はTLR4経路アゴニスト活性を有し、一態様においては、TLR2又はTLR4アゴニストにより刺激される細胞内の一種以上の成分を活性化することができる。一態様において、組成物のTLRアゴニスト活性はin vitroで評価される。
【００４０】
一態様において、LPSはTLR4経路アゴニストである。別の態様において、OMPはTRL-2経路アゴニストである。一態様において、本発明のLPS組成物は、実施例4に開示される技術を用いて好適に評価してTLR4アゴニスト活性を有する。「TLRアゴニスト」又は「TLR経路アゴニスト」とは、直接的リガンドとして、又は内因性若しくは外因性リガンドの生成を介して間接的に、TLRシグナリング経路を介するシグナリング応答を引き起こすことができる成分を意味する。
【００４１】
別の態様において、外膜タンパク質は、実施例4に開示される技術を用いて好適に評価してTLR-2アゴニスト活性を有する。
【００４２】
一態様において、組成物は赤痢菌のハウスキーピング遺伝子産物を含まない。
【００４３】
一態様において、組成物は0.6:1.3の間のLPS:OMP重量比を有する。この比は、0.8:1.1、例えば、0.9:1であってよい。
【００４４】
組成物の総タンパク質含量は、Lowryなどのアッセイ又はビシンコニン酸(BCA)タンパク質アッセイキット(Peirce)により測定することができる。
【００４５】
一態様において、赤痢菌株は、シゲラ・フレクスネリであるが、他の赤痢菌株を用いてもよい。一態様において、これらの因子は低いBL1又はBL2封じ込めレベルで取り扱うことができる。
【００４６】
一態様において、組成物は以下の遺伝子:IL6、CSF2、CSF3、CXCL10のうちの一種以上を上方調節することができる。遺伝子の上方調節は、好適には、同じ細胞をPBSと接触させた場合に認められるその遺伝子発現レベルと比較した場合の、本発明の組成物と接触させた場合の、細胞、好適には樹状細胞中での遺伝子発現の増加である。一態様において、発現の増加は、PBSに関して認められるものよりも少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも40倍、少なくとも50倍、少なくとも60倍、少なくとも70倍、少なくとも80倍、少なくとも90倍、又は少なくとも100倍高い。遺伝子発現を評価するための好適な方法は、実施例7に与えられる。
【００４７】
本発明の組成物は、好適には測定可能な直径を有する膜封入された粒子状構造であるベシクル中に含有されたOMP及び/又はLPSを含んでもよい。
【００４８】
OMP及びLPSは、ホスファチジルエタノールアミン(PE)、ホスファチジルグリコール(PG)、ホスファチジルコリン(PC)、ホスファチジルセリン(PS)、ホスファチジルイノシトール(PI)、及びカルジオリピン(CL)、好適にはホスファチジルエタノールアミン(PE)及びホスファチジルグリコール(PG)などのリン脂質と共に存在してもよく、リン脂質は精製プロセスの結果として赤痢菌に由来するか、又はOMP若しくはLPSに添加することができる。
【００４９】
本発明の一態様において、組成物は直径30〜180nmの粒径を有する粒子を含む。一態様において、組成物は、直径200nm以下の粒径を有する粒子を含む。粒子の大きさは、例えば、散乱光の測定により測定することができる。
【００５０】
本発明の一態様において、粒子は粒径の測定により決定して、4℃で3ヶ月間安定である。
【００５１】
本発明の組成物はまた、界面活性剤を含んでもよい。
【００５２】
一態様において、本発明の組成物は、20μmのフィルターを通して濾過可能である。
【００５３】
一態様において、組成物はOMP及びLPSに加えて抗原を含む。
【００５４】
一態様において、赤痢菌OMPタンパク質又はLPSを含む本明細書に記載の抗原に対する言及は、細胞性及び/又は体液性の、単独で又は別の物質と組合せて、又は別の物質に連結若しくは融合されて、免疫応答を刺激する任意の因子又は物質をいう。抗原は、細菌若しくはウイルスなどの外来微生物、又はそれらが産生する物質、限定されるものではないがペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物、糖タンパク質、グリコサミノグリカン及び上記の二種以上の複合体に由来するか、又はそれらであることが多い。抗原は、長さが少なくとも約5アミノ酸、10アミノ酸、15アミノ酸、20アミノ酸以上のペプチド、ポリペプチド若しくはタンパク質又はその断片であってよい。抗原は化学的合成又は分子生物学技術により人工的に製造することができる。人工抗原は、その防御のために免疫応答が刺激された疾患を引き起こす潜在的な結果なしに、曝露又は複数回の曝露に際して免疫応答を惹起するように設計されることが多い。抗原は、「担体」ポリペプチド及びハプテン、例えば融合タンパク質、又は別の組成物に融合若しくは連結(化学的に若しくは別の方法で)された担体ポリペプチドを含んでもよい。抗原を、プロモーターに機能し得る形で連結された抗原のコード配列を含む簡単な裸のDNA、例えば、単純な発現カセットであってよい免疫化ベクター中で組換え発現させることができる。
【００５５】
一態様において、組成物は単純な混合によって一種以上の抗原で製剤化される。
【００５６】
さらなる抗原は、赤痢菌又は赤痢菌以外の種に由来するものであってよい。
【００５７】
一態様において、抗原は、それに対してヒト又は動物により生じる免疫応答が感染又は疾患に対する防御を提供することができる抗原であり、好ましくは、ワクチン抗原である。一態様において、抗原はウイルス、細菌、真菌又は原生動物などの微生物に由来する。一態様において、抗原は、ヒト抗原、又は花粉抗原などの植物抗原、又はインフルエンザウイルス、マラリア原虫、HIV、カバノキ花粉、DerP1、草花粉、RSV、分類不能なインフルエンザ菌(H.influenzae)及びモラクセラ菌(Morexella)から選択される抗原である。
【００５８】
好適な抗原としては、インフルエンザ抗原が挙げられる。
【００５９】
インフルエンザウイルス抗原又はその抗原調製物は、いくつかの商業的に適用可能なプロセスのいずれかにより製造することができる。前記インフルエンザウイルス又はその抗原調製物は、従来の孵化卵法から、卵中でインフルエンザウイルスを増殖させ、回収された卵由来尿膜腔液を精製することにより得ることができる。あるいは、インフルエンザウイルス又はその抗原調製物は、ウイルスを増殖させるか、又は組換えインフルエンザウイルス表面抗原を発現させるための細胞又は細胞培養物を用いて細胞培養誘導することができる。ウイルスを増殖させるための好適な細胞基質としては、例えば、MDCKなどのイヌ腎臓細胞、若しくはMDCKのクローンに由来する細胞、MDCK様細胞、Vero細胞を含むAGMK細胞などのサル腎臓細胞、好適なブタ細胞系、又はワクチン目的のためのインフルエンザウイルスの産生にとって好適な任意の他の哺乳動物細胞型が挙げられる。好適な細胞基質としては、ヒト細胞、例えば、MRC-5細胞又はPer.Co細胞系も挙げられる。好適な細胞基質は、細胞系に限定されない;例えば、ニワトリ胚線維芽細胞などの一次細胞及びニワトリ若しくはアヒル細胞系などの鳥細胞系(例えば、それぞれニワトリ若しくはアヒル胚性幹細胞に由来するEB14若しくはEB24などのEBx細胞系)も含まれる。好適な昆虫細胞は、Sf9、Sf2又はHi5である。別の細胞は、例えば、組換えインフルエンザA抗原のための酵母細胞(サッカロミセス・セレビシア(Saccharomyces cerevisiae)若しくはピチア・パストリス(Pichia pastoris))、又は植物である。
【００６０】
一実施形態においては、本発明による使用のためのインフルエンザウイルス又はその抗原調製物は、スプリットインフルエンザウイルス又はそのスプリットウイルス抗原調製物であってよい。代替的な実施形態においては、インフルエンザ調製物は、不活化全ウイルス若しくは精製HA及びNA(サブユニットワクチン)などの別の型の不活化インフルエンザ抗原、又はインフルエンザビロソームを含んでもよい。さらなる実施形態においては、インフルエンザウイルスは、生弱毒化インフルエンザ調製物であってよい。本発明による使用のためのスプリットインフルエンザウイルス又はそのスプリットウイルス抗原調製物は、好適には、ウイルス粒子が界面活性剤又は他の試薬により破壊され、脂質エンベロープを可溶化した不活化ウイルス調製物である。スプリットウイルス又はそのスプリットウイルス抗原調製物は、好適には、可溶化濃度の有機溶媒又は界面活性剤を用いる、感染性であるか、又は不活化された全インフルエンザウイルスの断片化並びにその後の可溶化剤の全部又は大部分及びウイルス脂質材料の一部又はほとんど全部の除去により調製される。スプリットウイルス抗原調製物とは、スプリットウイルス成分の抗原特性の多くを保持しながら、スプリットウイルスと比較してある程度の精製を受けていてもよいスプリットウイルス調製物を意味する。例えば、卵中で製造される場合、スプリットウイルスは卵に夾雑しているタンパク質を枯渇させることができるか、又は細胞培養物中で製造される場合、スプリットウイルスは宿主細胞夾雑物を枯渇させることができる。スプリットウイルス抗原調製物は、二種以上のウイルス株のスプリットウイルス抗原成分を含んでもよい。スプリットウイルスを含有するワクチン(「インフルエンザスプリットワクチン」と呼ばれる)又はスプリットウイルス抗原調製物を含有するワクチンは一般に、残留マトリックスタンパク質及び核タンパク質及び時には脂質、並びに膜エンベロープタンパク質を含有する。そのようなスプリットウイルスワクチンは通常、ウイルス構造タンパク質のほとんど又は全部を含有するが、それらが全ウイルス中に生じるのと同じ割合である必要はない。市販のスプリットワクチンの例は、例えば、FLUARIX(商標)、FLUSHIELD(商標)、又はFLUZONE(商標)である。スプリットフルーは、トリ-w-ブチルホスフェート、若しくはTween(商標)と組合せたジエチルエーテル(「Tween-エーテル」スプリッティングとして知られる)などの溶媒/界面活性剤処理を用いて、又は界面活性剤若しくはタンパク質溶解酵素若しくは胆汁塩、例えば、デオキシコール酸ナトリウムなどの他のスプリッティング剤を用いることにより製造することができる。スプリッティング剤として用いることができる界面活性剤としては、陽イオン性界面活性剤、例えば、セチルトリメチルアンモニウムブロミド(CTAB)、他のイオン性界面活性剤、例えば、ラウリルサルフェート、タウロデオキシコレート、又は非イオン性界面活性剤、例えば、Triton X-100(例えば、Linaら、2000, Biologicals 28, 95-103に記載のプロセスにおける)及びTriton N-101を含む上記のものなど、又は任意の二種以上の界面活性剤の組合せが挙げられる。スプリットワクチンの調製プロセスは、様々な組合せのいくつかの異なる濾過及び/又は他の��離ステップ、例えば、超遠心分離、限外濾過、ゾーン遠心分離及びクロマトグラフィー(例えば、イオン交換)ステップ、並びに任意選択で、例えば、熱、ホルムアルデヒド若しくはβ-プロピオラクトン若しくは紫外線を用いる不活化ステップ、又はスプリッティングの前若しくは後に実行することができるその任意の組合せを含んでもよい。スプリッティングプロセスは、バッチ式、連続的又は半連続的プロセスとして実行することができる。スプリット免疫原性組成物のための好ましいスプリッティング及び精製プロセスは、WO 02/097072に記載されている。本発明による好ましいスプリットフルーワクチン抗原調製物は、製造プロセスから残っている残留量のTween 80及び/又はTriton X-100を含むが、スプリット抗原の調製後にこれらのものを添加するか、又はその濃度を調整することができる。一実施形態においては、Tween 80及びTriton X-100の両方が存在する。抗原調製物から生じる、ワクチン用量中のこれらの非イオン性界面活性剤の最終濃度の好ましい範囲は、
-Tween 80: 0.01〜1%、又は約0.1%(v/v)
-Triton X-100: 0.001〜0.1%(w/v)、又は0.005〜0.02%(w/v)である。あるいは、インフルエンザウイルスは全ウイルスワクチンの形態であってもよい。
【００６１】
この形態は、新しい株のインフルエンザウイルスに対してスプリットウイルスワクチンを上手く製造することができるかどうかについての不確実性を回避するため、パンデミックの状況ではスプリットウイルスワクチンよりも有利であることが証明され得る。いくつかの株では、スプリットウイルスを製造するのに用いられる従来の界面活性剤がウイルスを損傷し、それを使用不可能にする場合がある。スプリットワクチンを製造するために異なる界面活性剤を使用し、及び/又は異なるプロセスを開発する可能性は常に存在するが、これには時間がかかり、パンデミックの状況では利用可能ではないことがある。全ウイルス手法を用いた場合のより高い確実性に加え、好適なスプリットワクチンを調製するのに必要な追加の精製ステップの間にかなりの量の抗原が失われることから、ワクチン製造能力もスプリットウイルスよりも高い。
【００６２】
別の実施形態においては、インフルエンザウイルス調製物は、精製サブユニットインフルエンザワクチンの形態にある。サブユニットインフルエンザワクチンは一般に、二つの主要な外被タンパク質であるHA及びNAを含有し、それらは特に若いワクチン被接種者において一般に反応原性が低い（less reactogenic）ため、全ビリオンワクチンと比較してさらなる利点を有し得る。サブユニットワクチンは、組換え生産するか、又は破壊されたウイルス粒子から精製することができる。市販のサブユニットワクチンの例は、例えば、AGRIPPAL(商標)、又はFLUVIRTN(商標)である。特定の実施形態においては、サブユニットワクチンは、ヘマグルチニン(HA)、ノイラミニダーゼ(NA)、又はM2に由来する、好適にはHAに由来するものなどの少なくとも一種の主要外被成分から調製される。好適には、それらはインフルエンザ構造タンパク質HA、NA、Matrix 1(M1)及びM2のうちの少なくとも二種の組合せ、好適には、任意選択でM1を含む、HAとNAの両方の組合せなどの、二種以上の抗原の組合せを含む。好適には、インフルエンザ成分は、組換えDNA技術により製造される、すなわち、生組換えベクター(ワクシニア)若しくは組換えサブユニットタンパク質(バキュロウイルス/昆虫細胞、哺乳動物細胞、鳥細胞、酵母、植物若しくは細菌)などの組換えDNA操作の結果生じる核酸から得るか、又はそれから発現される。好適な昆虫細胞はスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)(Sf9)昆虫細胞又はトリコプルシア・ニ(Trichoplusia ni)から開発されたHigh Five(Hi5)昆虫細胞(Invitrogen)であり、好適なバキュロウイルスはオートグラファ・カリフォルニカ(Autographa californica)核多角体病ウイルス(AcNPV)(Baculogold, Becton Dickinson, PharMingen)又はいわゆるバクミド(Bacmid)系である。
【００６３】
一実施形態においては、インフルエンザウイルス調製物はビロソームの形態にある。
【００６４】
ビロソームは、ビロソームのリン脂質二重層膜中に挿入された、真正コンフォメーションで機能的ウイルス外被糖タンパク質HA及びNAを保持する球形の単層ベシクルである。市販のビロソームワクチンの例は、例えば、INFLEXAL V(商標)又はINVA VAC(商標)である。
【００６５】
別の実施形態においては、サブユニットインフルエンザ成分は、ウイルス様粒子(VLP)又はカプソマー、好適には植物により作られるか、又は昆虫細胞により作られるVLPの形態で発現される。VLPはその天然形態で抗原を提示する。VLPサブユニット技術は、インフルエンザタンパク質に完全に基づくものであってよく、又はマウス白血病ウイルス(MLV)などの他のウイルスに依ってもよく、従って、MLV gagタンパク質などの非インフルエンザ抗原を含んでもよい。好適なVLPは、任意選択で、他のインフルエンザ又は非インフルエンザタンパク質、例えば、M1及びHA、HA及びNA、HA、NA及びM1又はHA、NA及びMLV gagと共に、少なくとも一種、好適には少なくとも二種のインフルエンザタンパク質を含む。それを植物細胞又は昆虫細胞中で製造することができる。VLPはまた、例えば、二種の季節株(例えば、H1N1及びH3N2)又は一種の季節株及び一種のパンデミック株(例えば、H3N2及びH5N1)から作製されたVLPなどの二種以上のインフルエンザ株に由来する抗原を担持してもよい。
【００６６】
従って、一実施形態においては、本発明に従う免疫原性組成物及びその使用は、卵又は細胞培養物上で増殖させたインフルエンザウイルスに由来するインフルエンザウイルス抗原又はその抗原調製物を含む。別の実施形態においては、前記インフルエンザウイルス抗原又はその抗原調製物は、全ウイルス、スプリットウイルス、ビロソーム又はHA、NA、M1、M2から選択される一種以上の精製抗原を含む。別の実施形態においては、前記精製抗原は、哺乳動物、鳥又は昆虫細胞中で増殖されたインフルエンザウイルスから調製される。具体的には、精製抗原は組換え生産される。それらはウイルス様粒子の形態にあってもよい。
【００６７】
インフルエンザウイルス株は、古典的な再集合体技術又は逆遺伝子技術により製造された再集合体株であってよく、再集合体ウイルスはヘルパーウイルスの存在下又は非存在下でレスキューされる。これらの技術は当業界で周知である。
【００６８】
インフルエンザウイルスが細胞由来である場合、ワクチンの腫瘍原性を最小化するために、残留する宿主細胞DNAの量を低レベルまで減少させる。宿主細胞DNAは通常、ワクチン用量あたり10ngを超えず、好適には用量あたり1ng未満、100pg未満、50pg未満又は25pg未満である。残留DNAレベルを評価するのに用いられる有効な方法は、例えば、ブロッティング技術又は定量的PCR、例えば、サザンブロット、スロットブロット、Molecular devicesからのThreshold(商標)システムである。
【００６９】
一実施形態においては、インフルエンザ調製物は、低レベルのチオマーサル（thiomersal）の存在下で、又はチオマーサルの非存在下で調製される。別の実施形態においては、得られるインフルエンザ調製物は、有機水銀保存剤の非存在下で安定であり、特に、該調製物は残留チオマーサルを含まない。特に、インフルエンザウイルス調製物は、チオマーサルの非存在下で、又は低レベルのチオマーサル(一般的には5μg/ml以下)で安定化されたヘマグルチニン抗原を含む。具体的には、Bインフルエンザ株の安定化は、αトコフェロールスクシネート(ビタミンEスクシネート、すなわち、VESとしても知られる)などのαトコフェロールの誘導体により実施される。そのような調製物及びそれらを調製するための方法はWO 02/097072に開示されている。
【００７０】
本発明は、パンデミック間（interpandemic）、パンデミック、又はプレパンデミックのインフルエンザ株を含むワクチンで実施することができる。ワクチンは、その時点での循環株と厳密に一致していないインフルエンザウイルス株を含んでもよく、例えば、「インフルエンザドリフト変異体」、すなわち、「抗原ドリフト」と呼ばれるプロセスを介して、一般集団間で再び流行を引き起こすのに十分に変化した新規株、に対して有効である。
【００７１】
好適には、免疫原性組成物又はワクチン組成物中に含まれるインフルエンザウイルス株は、パンデミック間(季節)株、すなわち、前の流行に由来するものと関連する循環インフルエンザウイルス、又はパンデミックの発生と関連するか、若しくはパンデミックの発生と関連する可能性を有する株(本明細書では「プレパンデミック株」と呼ぶ)である。パンデミック間株の混合物、パンデミック株の混合物又はその両方の混合物など、多価組成物中に異なる株が含まれていてもよい。
【００７２】
パンデミック間株は、例えば、限定されるものではないが、H1N1、H1N2、H3N2又はBなどのパンデミック間期に地球規模で循環する株である。市販のインフルエンザワクチンは、一種のインフルエンザB株及び二種のインフルエンザA株(H1N1、H3N2)を含む三価混合物である。従って、好適な組成物は、適切なインフルエンザ季節株の三種のWHO推奨株、通常は二種のインフルエンザAウイルス株及び一種のインフルエンザB株から調製された抗原を含有する。ほとんどの場合、標準的な0.5mlの注射用量は、一元放射免疫拡散法(SRD)(J.M. Woodら、An improved single radial immunodiffusion technique for the assay of influenza haemagglutinin antigen: adaptation for potency determination of inactivated whole virus and subunit vaccines. J. Biol. Stand. 5(1977) 237〜247; J. M. Woodら、International collaborative study of single radial diffusion and Immunoelectrophoresis techniques for the assay of haemagglutinin antigen of influenza virus. J. Biol. Stand. 9 (1981) 317〜330)により測定して、各株に由来する(少なくとも)15μgのヘマグルチニン抗原成分を含有する。別の好適な組成物は、三種の古典的な株及びさらなるB株(Commun Dis Intell 2006, 30, 350〜357)又はさらなるH3N2株(Vaccine 1992, 10, 506〜511)などの四種のインフルエンザ株を含有する。
【００７３】
本発明における使用のための別の好適な組成物は、単独、一種以上の季節(すなわち、パンデミック間)株と組合せた、又はそれに加えた、一価パンデミック又はプレパンデミック組成物の形態の、パンデミックインフルエンザ株、又はパンデミックと関連することが疑われるインフルエンザ株を含む。パンデミック株又はプレパンデミック株は、例えば、鳥又は豚起源に由来する。
【００７４】
パンデミック、又はパンデミックインフルエンザ株と関連するインフルエンザ疾患の発生を引き起こす能力を与えるインフルエンザウイルス株の特徴は、(i)インフルエンザウイルスが完全に新しいウイルス(例えば、現在循環中の株のヘマグルチニンと比較して新しいヘマグルチニン)をもたらす主要な変化を生じていること;(ii)新しいウイルスがヒトに対して病原性であること、及び(iii)新しいウイルスがヒトからヒトへ伝染可能であること、である。新しいヘマグルチニンは、前の季節に循環した株とは完全に異なるサブタイプで予測不可能なレベルで出現し、その結果得られる抗原は、「抗原シフト」と呼ばれる現象を介してヒトにおいて以前に循環していた株の対応するタンパク質とは20%〜50%変化し、そして「集団免疫」を回避し、パンデミックを確立するウイルスをもたらす。従って、新しいHAは、H2など、長期間、おそらく数十年にわたってヒト集団中で見られなかったものである。又は、それはヒト集団中で以前は循環していなかったヘマグルチニン、例えば、鳥類種(鳥)に見出されるH5、H9、H7若しくはH6であり得る。いずれの場合も、集団の大部分、又は少なくとも大きい割合、又はさらには集団全体が、以前にその抗原に遭遇しておらず、それに対して免疫学的にナイーブである。現在、ヒトにおいてパンデミックを引き起こす可能性があるものとしてWHOによって同定されているインフルエンザAウイルスは、高病原性H5N1型鳥インフルエンザウイルスである。従って、本発明におけるパンデミックワクチンは、好適にはH5N1ウイルスを含む。本発明の組成物中への含有のための二つの他の好適な株は、H9N2又はH7N1である。
【００７５】
好適には、本発明における使用のためのワクチンは、インフルエンザAウイルスについて同定された以下の16種のHAサブタイプ(H1〜H16)のいずれか一つ及び/又は9種のNAサブタイプ(N1〜N9)のいずれか一つを含む。好適には、ワクチンはHA及びNA部分を含むが、ワクチンは組換え起源に由来する抗原を含んでもよく、この場合、それはHAのみであってよく、又はそれはHA、NA、M1及びM2のうちの一種以上の任意の組合せであってもよい。好適には、三種の季節株(例えば、H1N1、H3N2、B)が存在する。好適には、四種の季節株(例えば、H1N1、H3N2、二種のB株;若しくはH1N1、B、二種のH3N2株)の群又は一種のパンデミック(例えば、鳥)株と三種の季節株(例えば、H1N1、H3N2、B)の群に由来する四種の株が存在する。好適なA株は、限定されるものではないが、H1N1などのパンデミック間株である。
【００７６】
H3N2、及びパンデミック株又はパンデミックと関連することが疑われる株は、例えば、H5、H2、H7、H9又はH10サブタイプのうちの少なくとも一種を有する株、特に、H2N2、H5N1、H5N2、H5N3、H5N8、H5N9、H7N1、H7N2、H7N3、H7N4、H7N7、H9N2及びH10N7である。所与のサブタイプ内で、異なる変異体が可能であり、例えば、H5サブタイプ内では、以下の変異体:  クレード1、クレード2、クレード3などが可能である。
【００７７】
好適には、HAは少なくとも三種、少なくとも四種のインフルエンザ株に由来する。二種の異なる系列(B/ヤマガタ又はB/ビクトリアなど)に由来する一種又は二種のB株が含まれていてもよい。
【００７８】
特定の実施形態においては、免疫原性組成物は、(i)「一価」インフルエンザ組成物と呼ばれる単一のインフルエンザ株に由来するヘマグルチニン(HA);又は(ii)「多価」インフルエンザ組成物と呼ばれる二種以上のインフルエンザ株に由来するHAを含有する。
【００７９】
本発明による使用のための好適な多価組成物は、限定されるものではないが、パンデミックと関連するか、若しくはパンデミックと関連することが疑われる二種の株、例えば、H5若しくはH2などの二種のインフルエンザウイルス株に由来するヘマグルチニン(HA)を含む二価組成物；任意選択で、二種のA株、及び限定されるものではないが、B/ヤマガタ若しくはB/ビクトリアなどの一種のB株に由来する三種のインフルエンザウイルス株に由来するHAを含む三価組成物；四種のインフルエンザウイルス株に由来するヘマグルチニン(HA)を含む四価組成物；又は五種のインフルエンザウイルス株に由来するヘマグルチニン(HA)を含む五価組成物である。好適な四価組成物は、二種のA株及び異なる系列に由来する二種のB株(B/ヤマガタ又はB/ビクトリアなど)に由来するヘマグルチニンを含む。あるいは、四価組成物は、三種のA株(任意選択で、H1N1、H3N2、及びパンデミックと関連するか、又はパンデミックと関連することが疑われる一種のA株)及び一種のB株(B/ヤマガタ又はB/ビクトリアなど)に由来するヘマグルチニンを含む。別の代替的な四価組成物は、四種のパンデミック間A株、又は少なくとも一種がパンデミックと関連するか、若しくはパンデミックと関連することが疑われる四種のA株、例えば、鳥株、例えば、H5 + H2 + H7 + H9に由来するヘマグルチニンを含む。具体的には、パンデミック二価(例えば、H5 + H2)又は三価又は四価(例えば、H5 + H2 + H7 + H9)などの多価アジュバント化パンデミック組成物は、パンデミックインフルエンザA脅威（threats）サブタイプに対する先制免疫及び脅威サブタイプに対する持続的プライミングの利点を提供する。場合により、そのようなパンデミックワクチンを季節性ワクチンと組み合わせることができる。多価組成物はまた、6、7、8、9又は10種のインフルエンザ株などの5種を超えるインフルエンザ株を含んでもよい。二種のB株を多価季節性組成物中で用いる場合、それらは好適には二つの異なる系列(任意選択で、B/ビクトリア及びB/ヤマガタ)に由来するものであってよい。少なくとも一種の前記B株、好適には両方のB株は、循環中の系列に由来する。そのような組成物は子供に対して特に好適である。
【００８０】
好適には、株あたりのHAは通常、一元放射免疫拡散法(SRID)により測定して、株あたり15μgのHAである。あるいは、株あたりのHAは、少量のHA(任意選択で、株あたり10μg以下のHA)であってもよい。好適には、株あたりのHAは、約5μg以下、約2.5μg以下である。HAの前記少量は、以下に詳述されるように(表1及び表2及び記載の特定のパラメータを参照されたい)、有効性に関する国際的な、例えば、EMEA又はFDAの基準などの拘束力のある薬局方の要件を満たすワクチンの製剤化を可能にするという前提で、実行可能な程度に少ないものであってよい。株あたりのHAの量は、ヒトワクチン用量あたり3.8μgの少なさであってよく、又はさらには用量あたり1.9μgの少なさであってもよい。0.5mlのワクチン用量が好適に用いられる。有利には、本発明によるワクチン用量、特に、限定されるものではないが、低HA量ワクチンを、一般に用量あたり約0.5、0.7又は1mlである従来の注射用スプリットフルーワクチンよりも少量で提供することができる。本発明による低用量は、好適には用量あたり500μl以下、典型的には300μl以下及び好適には約200μl以下である。鼻内投与のためには0.2mlの用量が好適であり、鼻孔あたり0.1mlの二画分で投与することができる。元のバルクサンプル中のHA濃度に応じて、又は鼻内若しくは経皮経路により与えられるより少ない用量を用いる送達経路に応じて、又は標的集団(例えば幼児はヒト成人用量の半分を受けてよい)に応じて用量のわずかな調整を日常的に行うことができる。
【００８１】
本発明のインフルエンザ医薬は、好適にはワクチンに関する特定の国際基準を満たす。インフルエンザワクチンの有効性を測定するための標準が国際的に適用される。血清学的変数は、インフルエンザワクチンの毎年のライセンシング手順に関連する臨床試験のためのヒトでの使用に関する欧州医薬品審査庁(European Agency for the Evaluation of Medicinal Products)の基準(CHMP/BWP/214/96、欧州医薬品委員会(Committee for Proprietary Medicinal Products(CPMP)）  インフルエンザワクチンに関する要件の協調についての注記:1997, CHMP/BWP/214/96 circular No 96-0666: 1〜22)に従って評価される(表3)。その要件は成人集団(18〜60歳)と高齢者集団(60歳を超える)とで異なる(表3)。パンデミック間インフルエンザワクチンの毎年の再登録のためには、少なくとも一つの評価(血清変換係数、血清変換率、血清防御率)がワクチンに含まれるインフルエンザの全ての株について欧州の要件を満たすべきである。1:40以上のHI力価の割合は、これらの力価が防御の最良の相関であると予想されるので、最も関連すると見なされる[Beyer Wら、1998 Clin Drug Invest.;15:1〜12]。
【００８２】
非循環株から誘導されたインフルエンザワクチンに関する特定の基準がない中で、欧州医薬品庁の委員会(European Medicines Agency's Committee)により発行された「Guideline on dossier structure and content for pandemic influenza vaccine marketing authorization application. (2004年4月5日のCHMP/VEG/4717/03、又はより最近では2007年1月24日のEMEA/CHMP/VWP/263499/2006のwww.emea.eu.intで利用可能な表題「Guidelines on flu vaccines prepared from viruses with a potential to cause a pandemic」)」で規定されるように、パンデミック候補ワクチンは、ワクチンの二回投与後に、抗原刺激を受けていない成人又は高齢対象において、存在するワクチンのために設定された現在の三つの基準の全てを好適に満たすのに十分な免疫応答を(少なくとも)惹起し得るものであるべきことが期待される。EMEAガイドラインはこの状況を、パンデミックの場合、集団は免疫学的にナイーブであり、従って、パンデミック候補ワクチンは季節性ワクチンに関するCHMP基準の三つ全てを満たすべきであると考えられると記載している。ワクチン接種前に血清陰性対象であることを証明するための明確な要件は必要とされない。しかしながら、プレパンデミックワクチンに関するガイドラインは、以前に免疫学的にナイーブな集団の初回免疫に用いられるワクチンについて、パンデミックへの備えに用いられるインフルエンザワクチンは、好ましくは一回又は多くとも二回の投与後に高い血清防御率を誘導するべきであることを期待している。ガイドラインCPMP/BWP/214/96に定義された三つの基準の全部(血清防御率、GMT増加及び応答率)が満たされるべきである。
【００８３】
本発明における使用のための組成物は、表1に記載されるように、好適には組成物中に含まれる株に関する少なくとも一つのそのような基準(認可を得るには一つの基準で十分である)、好適には防御に関する少なくとも二つ、又は典型的には少なくとも三つの基準の全てを満たす。
【表１】
0006045499.tif 000002
【００８４】
70%の血清防御率は、毎年の季節性インフルエンザワクチンのために満たされることが通常必要とされる三つの基準のうちの一つとして欧州医薬品委員会(CHMP)によって定義されており、CHMPはまた、パンデミック候補ワクチンもこれを満たすように期待している。しかしながら、数学的モデリングによって、集団レベルで特定のドリフト株に対して30%だけ有効であるワクチンも、パンデミックの規模を減じるのを助けるには有益であり、パンデミック株に対する感染に対する30%の有効性(罹患率の30%の低下)を有する(プレパンデミック)ワクチンを用いるパンデミックワクチン接種キャンペーン(30%の交叉防御)は臨床攻撃率を75%効率的に低下させ、結果として集団内の罹患率/死亡率を低下させることができることが示された(Fergusonら、Nature 2006)。
【００８５】
米国FDAは、パンデミックインフルエンザワクチンの許可のために必要な臨床データ（Clinical Data Needed to Support the Licensure of Pandemic Influenza Vaccines）に関するドラフトガイダンス(CBERドラフト基準)(Office of Communication, Training and Manufacturers Assistance (HFM-40), 1401 Rockville Pike, Suite 200N, Rockville, MD 20852-1448から、又は電話番号1-800-835-4709若しくは301-827-1800により、又はhttp://www.fda.gov/cber/guidelines.htmでインターネットから入手可能)を公表し、その提唱された基準もCHMP基準に基づく。FDAはわずかに異なる年齢カットオフ点を使用する。好適な評価項目は同様に、1)1:40を超えるHI抗体力価を達成する対象のパーセント、及び2)ワクチン接種後のHI抗体力価の4倍の上昇として定義される血清変換率、を含む。結果には幾何平均力価(GMT)が含まれるべきであり、そのデータは点推定値だけでなく、血清変換の発生率の95%信頼区間の下限も含むべきであり、1:40を超えるHI力価の42日目での発生率は標的値を超えなければならない。従って、これらのデータ及びこれらの評価の点推定値の95%信頼区間(CI)を提供するべきである。FDAドラフトガイダンスは、両方の目標を満たすことを要求している。これらのFDAにより公表された基準を表2にまとめる。
【表２】
0006045499.tif 000003
【００８６】
従って、本発明の一態様においては、上記の防御に関する少なくとも一つの基準、好適には二つの、好適には三つ全部の基準を満たす、インフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導することができるワクチン組成物が提供される。具体的には、一回の投与後にワクチン中に存在する株又は全部の株について、以下の基準のうちの少なくとも一つが満たされる。従って、アジュバントが本明細書で定義される通りである、単回用量の鼻内インフルエンザワクチン、又は低用量インフルエンザワクチンも提供される。
【００８７】
ワクチン接種すべき集団は、子供、成人及び高齢者である。ワクチン接種すべき標的集団は、集団全体、例えば、健康な若い成人(例えば、18〜50歳若しくは18〜60歳)、高齢者(典型的には、60歳を超える年齢)又は幼児/子供/青年（infants/children/adolescents）である。標的集団は、特に、ナイーブであるか、又は免疫不全にあるか、又は免疫抑制にあってもよい。免疫不全又は免疫抑制にあるヒトは一般に、健康な成人と比較して、抗原、特に、インフルエンザ抗原に対してあまり良好に応答することができない。特定の態様においては、ワクチンは鼻内投与される。典型的には、ワクチンは、好適には肺中に吸入されることなく鼻咽頭領域に局所投与される。ワクチン製剤を肺に進入させることなく、又は実質的に進入させることなく、鼻咽頭領域に送達する鼻内送達デバイスを使用することが望ましい。本発明によるワクチンの鼻内投与のための好適なデバイスは、スプレーデバイスである。好適な市販の鼻スプレーデバイスとしては、Accuspray(商標)(Becton Dickinson)が挙げられる。ネブライザーは、肺中に容易に吸入される可能性があり、従って、鼻粘膜に効率的に到達しない非常に微細なスプレーを生成する。従って、ネブライザーは好ましくない。鼻内使用のための好適なスプレーデバイスは、デバイスの性能が使用者によって印加される圧力に依存しないデバイスである。これらのデバイスは、圧力閾値デバイスとして知られる。閾値圧力が印加された場合にのみ、ノズルから液体が放出される。これらのデバイスにより、規則的な液滴サイズを有するスプレーがより容易に達成される。本発明で使用するのに好適な圧力閾値デバイスは、当業界で公知であり、例えば、参照により本明細書に組み入れられるWO91/13281及びEP311863B及びEP516636に記載されている。そのようなデバイスはPfeiffer GmbHから市販されており、Bommer, R. Pharmaceutical Technology Europe, Sept 1999にも記載されている。好適な鼻内デバイスは、1〜200μm、好適には10〜120μmの範囲の液滴(液体として水を用いて測定)を生成する。10μmより小さい場合は吸入の危険性があり、従って、10μmより小さ
い液滴が約5%以下であるのが望ましい。120μmを超える液滴はより小さい液滴と同様には拡散せず、従って120μmを超える液滴は約5%以下であるのが望ましい。
【００８８】
二回用量（bi-dose）送達は、本発明によるワクチンと共に使用するための鼻内送達系のさらに好適な特徴である。二回用量デバイスは単回ワクチン用量の二つのサブ用量を含有し、一つのサブ用量はそれぞれの鼻孔への投与のためのものである。一般に、二つのサブ用量は単一のチャンバー中に存在し、デバイスの構造によって一度に単一のサブ用量の効率的な送達を可能にする。あるいは、単回用量（mono-dose）デバイスを、本発明によるワクチンを投与するために用いることができる。
【００８９】
かくして、本発明は、一態様において、インフルエンザに対する単回用量鼻内ワクチン接種のためのワクチン製剤の製造における、本明細書に定義された非生インフルエンザウイルス抗原調製物及びアジュバントの使用を提供する。ワクチンは単回用量形式又は二回用量形式(一般に、それぞれの鼻孔につき、任意選択でそれぞれ0.1mlの一回のサブ用量)で投与することができる。
【００９０】
別の態様においては、本発明は、別の態様において、インフルエンザに対する免疫化のための粘膜ワクチンの製造における、本明細書に定義された低用量の非生インフルエンザウイルス抗原及びアジュバントの使用を提供する。本発明のワクチンは単回用量として投与することができるが、その成分を同時に又は異なる時間に一緒に同時投与することもできる(例えば、インフルエンザ抗原を個別に、好適にはアジュバントの投与と同時に投与することができる)。二回の注射を投与する場合、単一の投与経路に加えて、二つの異なる投与経路を用いることができる。例えば、アジュバント化インフルエンザ抗原の1回目の投与(例えば、初回用量)をIM(又はID)投与し、2回目の投与(例えば、追加用量)をIN(又はID)投与することができる。さらに、本発明のワクチンを初回用量のためにIM投与し、追加用量のためにIN投与することができ、又その逆でもよい。
【００９１】
さらなる態様において、本発明は、鼻内スプレーデバイス及び単回用量のインフルエンザウイルスワクチンを含む医薬キットを提供する。好適には、単回用量インフルエンザワクチンは、非生の、任意選択でスプリットウイルスワクチンである。好適には、デバイスはワクチンの二回のサブ用量のための、任意選択でそれぞれ0.1mlのワクチンの二回のサブ用量のための二回用量送達デバイスである。
【００９２】
一態様において、組成物はさらに、医薬組成物を形成するための薬学的に許容し得る賦形剤を含む。一態様において、本明細書で用いられる「賦形剤」とは、組成物の本質的活性の原因とならない組成物に添加される任意の物質を指す。賦形剤を用いて、例えば、活性成分の安定性、稠度又は送達性を増加させることができる。本明細書で用いる場合、賦形剤は、希釈剤又は担体を含んでもよい。
【００９３】
本発明は、
赤痢菌株を増殖させること、
赤痢菌細胞を破壊すること、並びに
内膜タンパク質からの外膜の分離を含むプロセスによって外膜タンパク質及びLPSを含む画分を単離すること
を含む、免疫原性組成物を調製するための方法に関する。
【００９４】
一態様において、プロセスは一以上の遠心分離ステップを含む。
【００９５】
一態様において、プロセスは界面活性剤可溶化ステップを含む。
【００９６】
一態様において、内膜タンパク質からの外膜の分離は、細胞質内膜タンパク質の選択的可溶化によって実現される。
【００９７】
本発明は、本発明のプロセスによって作製される生成物に関する。
【００９８】
一態様において、プロセスは二以上の遠心分離ステップを含む。
【００９９】
一態様において、プロセスは、好適には、細胞を5×45秒間及び/又は5×60秒間、45AMPで超音波処理によって破壊することを含む。別の態様においては、細胞をホモジェナイゼーション又は他の機械的手段によって破壊することができる。
【０１００】
一態様において、プロセスは、遠心分離、濾過、深層濾過又は陰イオン交換クロマトグラフィーから選択される少なくとも一つの方法によって破壊された赤痢菌細胞の細胞混合物から細胞破片を除去することを含む。
【０１０１】
別の態様において、外膜タンパク質及びLPSを含む画分の単離は、遠心分離、濾過、深層濾過又は陰イオン交換クロマトグラフィーから選択される一以上のステップを含む。
【０１０２】
一態様において、プロセスは、細胞破壊のため、及び形成し得る凝集物を破壊するための二つの超音波処理ステップを含み、均質な組成物を作製する。
【０１０３】
一態様において、プロセスは、細胞膜タンパク質をN-ラウロイルサルコシンによって可溶化することを含む。用いることができる代替的な界面活性剤としては、ラウリルジメチルベタイン(LDB)、デオキシコール酸ナトリウム(DOC)、ラウリルジメチルアミンオキシド(LDAO)、セチルトリメチルアンモニウムブロミド(CTAB)、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、N-ラウロイルサルコシン、オクチル硫酸ナトリウム、Triton、Trizma(登録商標)ドデシル硫酸、Nonidet(商標)P40、ペンタエチレングリコール及び誘導体、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン40ステアレート、サポニン、TWEEN(登録商標)20及び関連物質、デカノイル-N-メチルグルカミド(Mega-10)、3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-2-ヒドロキシ-1-プロパンスルホナート(CHAPSO)、ソルビタンモノラウレート(Span-20)、ポリオキシエチレン[23]ラウリルエーテル(BRIJ)並びにジメチルオクチルホスフィンオキシド(APO)のうちの一つ以上が挙げられる。本発明のいくつかの態様においては、OMPに基づく免疫刺激剤の可溶性を維持するために、約200ppm以下の界面活性剤のみが用いられる。
【０１０４】
特に、本発明は、赤痢菌を37℃で増殖させ、細胞を室温で30分間、2,770gで遠心分離し、上清を廃棄し、ペレットを10mM Hepes中に再懸濁し、5×45秒間、43AMPで超音波処理するステップを含む、組成物を調製する方法を提供する。再懸濁液を室温で20分間、1,700gで遠心分離し、ペレットを廃棄し、上清を4℃で60分間、100,000gで遠心分離する。上清を廃棄し、ペレットを1% N-ラウロイルサルコシン中に再懸濁した後、4℃で60分間、100,000gで遠心分離する。上清を廃棄し、ペレットを10mM Hepes中に再懸濁し、5×45秒間、43AMPで(電気)超音波処理し、MgCl2を添加し、濾過する(0.2μm)。
【０１０５】
本発明の一態様においては、前記赤痢菌は遺伝子操作された細菌である。細菌を遺伝子操作して、特定のタンパク質を過剰発現させる、及び/又は少なくとも一種の他のタンパク質を過少発現させることができる。部位特異的突然変異誘発、又はコード遺伝子の一部若しくは全部の破壊若しくは欠失などの当業界で公知の様々な方法によって細菌を遺伝子操作することができる。また、選択的増殖条件下で培養した場合、外膜タンパク質などの特定のポリペプチドを過剰発現又は過少発現するように細菌を遺伝子操作することもできる。さらに、及び当業界で理解されるように、細菌のゲノム中への特定のコード配列の付加により、又は発現ベクターにより、細菌を遺伝子操作することができる。
【０１０６】
一態様において、赤痢菌株は、シゲラ・フレクスネリ（S. flexneri）、任意選択で、シゲラ・フレクスネリ2a BS103である。他の赤痢菌種及びシゲラ・フレクスネリ株を用いてもよい。
【０１０７】
一態様において、赤痢菌株は、BL1又はBL2条件下で増殖させることができる非病原性株である。一態様において、本発明の組成物をBL1又はBL2条件下で製造することができる。
【０１０８】
一態様において、赤痢菌種は野生型赤痢菌と比較して低下した病原性（virulence）又は毒性を有する。好適には、赤痢菌種をBL1又はBL2施設中で増殖させ、操作することができ、BL3以上の施設を必要としない。一態様において、株の病原性及び/又は毒性を、遺伝子操作により改変する。別の態様においては、病原性及び/又は毒性が低下した株を選択する。一態様において、株はLPS突然変異を有する。
【０１０９】
一態様において、本発明は、医薬における使用のための赤痢菌外膜タンパク質(OMP)及び赤痢菌LPS分子を含む組成物に関する。
【０１１０】
一態様において、本発明は、ワクチンアジュバントとしての使用のための赤痢菌外膜タンパク質(OMP)及び赤痢菌LPS分子を含む組成物に関する。
【０１１１】
一態様において、本発明は、粘膜ワクチンアジュバントとしての使用のための赤痢菌外膜タンパク質(OMP)及び赤痢菌LPS分子を含む組成物に関する。
【０１１２】
一態様において、本発明は、赤痢菌感染又は疾患に対するワクチンとしての使用のための赤痢菌外膜タンパク質(OMP)及び赤痢菌LPS分子を含む組成物に関する。
【０１１３】
一態様において、本発明は、感染性因子により引き起こされる感染又は疾患の予防のための、
1 感染性因子に対する免疫応答を惹起することができる抗原、並びに
2 赤痢菌外膜タンパク質(OMP)及び赤痢菌LPS分子
を含む組成物に関する。
【０１１４】
一態様において、本発明は、
1 抗原、並びに
2 赤痢菌外膜タンパク質(OMP)及び赤痢菌LPS分子
を含む組成物に関する。
【０１１５】
一態様において、本発明は、医薬における使用のための赤痢菌外膜タンパク質(OMP)及び赤痢菌LPS分子を含む組成物に関する。
【０１１６】
一態様において、本発明は、アジュバントの調製における、赤痢菌外膜タンパク質(OMP)及び赤痢菌LPS分子を含む組成物の使用に関する。
【０１１７】
一態様において、本発明は、粘膜アジュバントの調製における、赤痢菌外膜タンパク質(OMP)及び赤痢菌LPS分子を含む組成物の使用に関する。
【０１１８】
一態様において、本発明は、赤痢菌感染又は疾患に対するワクチンの調製における、赤痢菌外膜タンパク質(OMP)及び赤痢菌LPS分子の使用に関する。
【０１１９】
一態様において、本発明は、感染又は疾患に対するワクチンの調製における、赤痢菌外膜タンパク質(OMP)及び赤痢菌LPS分子の使用に関する。
【０１２０】
一態様において、本発明は、感染性因子により引き起こされる感染又は疾患の予防のための薬剤であって、感染性因子に対する免疫応答を惹起することができる抗原を含む薬剤の調製における、赤痢菌外膜タンパク質(OMP)及び赤痢菌LPS分子を含む組成物の使用に関する。
【０１２１】
一態様において、本発明は、赤痢菌外膜タンパク質(OMP)及び赤痢菌LPS分子を含む組成物を個体に送達することを含む、アジュバント化免疫応答を惹起する方法に関する。
【０１２２】
一態様において、本発明は、感染性因子に対する免疫応答を惹起する方法であって、感染性因子に対する免疫応答を惹起することができる抗原並びに赤痢菌外膜タンパク質(OMP)及び赤痢菌LPS分子を含む組成物を含む組成物を、それを必要とする個体に送達することを含む方法に関する。
【０１２３】
一態様において、本発明は、感染性因子により引き起こされる感染又は疾患を治療/軽減/改善する方法であって、感染性因子による感染又は疾患に対して防御的な免疫応答を惹起することができる抗原を含み、赤痢菌外膜タンパク質(OMP)及び赤痢菌LPS分子を含む医薬組成物を、それを必要とする個体に送達することを含む方法に関する。
【０１２４】
一態様において、本発明は、感染性因子が細菌又はウイルス、例えば、インフルエンザ、若しくはRSVである方法に関する。
【０１２５】
一態様において、本発明は、感染又は疾患に対して防御的な免疫応答を惹起することができる抗原がRSV F/G又はインフルエンザHA/NAである方法に関する。別の態様においては、抗原はハウスダスト、ダニ、草花粉、ブタクサ花粉、ネコ、樹木、カビ及び食品に由来する。
【０１２６】
用いられる抗原は、少なくとも微生物全体又は破壊された微生物であってよい。微生物はウイルス、細菌、菌類及び原生動物から選択することができる。抗原はインフルエンザウイルスであってよい。抗原は、少なくとも一種のヘマグルチニンを含んでもよい;それは一価又は三価であってもよい。さらに、抗原は、癌抗原などのヒト抗原、インフルエンザウイルス、マラリア原虫、HIV、カバノキ花粉、DerPI、草花粉、RSV、分類不能なインフルエンザ菌及びモラクセラ菌の群に由来する断片及び/又は変異体及び/又はハイブリッド抗原を含んでもよい。抗原は組換え抗原若しくは合成抗原及び/又はハイブリッド/キメラ抗原であってもよい。
【０１２７】
一態様において、本発明は、本明細書に開示される組成物を、それを必要とする個体に送達することを含む、赤痢菌による感染を治療/軽減/改善する方法に関する。
【０１２８】
一態様において、本発明は、医薬組成物が鼻内経路又は他の粘膜経路により送達される方法に関する。
【０１２９】
本発明の免疫刺激組成物及び免疫原性組成物、並びにワクチンを、存在する疾患のための治療剤として、又は疾患の発生若しくは悪化を予防的に防止するために用いることができる。
【０１３０】
一態様において、本発明は、同時に、実質的に同時に、又は連続的に送達するための赤痢菌外膜タンパク質(OMP)及び赤痢菌LPS分子を含むキットに関する。
【０１３１】
本発明の組成物及び/又は免疫原性組成物を、経口、鼻内、舌下、直腸、筋肉内、静脈内、腹腔内、粘膜、腸内、非経口及び吸入から選択される経路により投与することができる。粘膜経路は、経鼻、経口咽頭、眼内又は経尿生殖器粘膜である。
【０１３２】
別の態様において、哺乳動物への前記組成物の投与は、ウイルス及び細菌感染を含む感染に対する自然免疫応答を誘導する。
【０１３３】
抗原を提供する場合、組成物中の抗原の量は免疫応答又は免疫刺激効果を誘導する量として好適に選択される。そのような量は、用いられる特定の成分に応じて、またそれらを提供する方法に応じて変化する。一般に、それぞれの用量は1〜100μg、好適には5〜50μg、及び最も典型的には5〜25μgの範囲のタンパク質抗原又はOMV調製物を含むことが期待される。
【０１３４】
特定の組成物のための最適量は、対象における好適な免疫応答の観察を含む標準的な試験によって確認することができる。
【０１３５】
本発明の組成物の初回投与後、対象は十分に間隔を空けて一回又は数回の追加投与を受けてもよい。
【０１３６】
ワクチンの有効性は、様々なアッセイにより評価することができる。動物モデルにおける防御アッセイが当業界で周知である。
【０１３７】
本発明のさらなる態様は、好適には両方とも病原性生物の無毒株に由来する外膜タンパク質(OMP)及びLPS分子を含む免疫原性組成物であって、好適には該病原性生物に対する免疫応答を惹起することができる組成物に関する。
【０１３８】
異なる態様において、本発明は、本発明のプロセスに従って作製された、任意の好適な種に由来する外膜タンパク質(OMP)及びLPS分子を含む免疫原性組成物に関する。一態様において、好適な種は、
(1)原核生物、例えば、限定されるものではないが、
(a)ストレプトコッカス(Streptococcus)、スタフィロコッカス(Staphylococcus)、ボルデテラ(Bordetella)、コリネバクテリウム(Corynebacterium)、マイコバクテリウム(Mycobacterium)、ナイセリア(Neisseria)、ヘモフィルス(Haemophilus)、アクチノミセテス(Actinomycetes)、ストレプトミセテス(Streptomycetes)、ノカルジア(Nocardia)、エンテロバクター(Enterobacter)、エルシニア(Yersinia)、ファンシセラ(Fancisella)、パスツレラ(Pasturella)、モラクセラ(Moraxella)、アシネトバクター(Acinetobacter)、エリシペロトリックス(Erysipelothrix)、ブランハメラ(Branhamella)、アクチノバチルス(Actinobacillus)、ストレプトバチルス(Streptobacillus)、リステリア(Listeria)、カリマトバクテリウム(Calymmatobacterium)、ブルセラ(Brucella)、バチルス(Bacillus)、クロストリジウム(Clostridium)、トレポネマ(Treponema)、エシェリキア(Escherichia)、サルモネラ(Salmonella)、クレブシエラ(Kleibsiella)、ビブリオ(Vibrio)、プロテウス(Proteus)、エルウィニア(Erwinia)、ボレリア(Borrelia)、レプトスピラ(Leptospira)、スピリルム(Spirillum)、カンピロバクター(Campylobacter)、シゲラ(Shigella)、レジオネラ(Legionella)、シュードモナス(Pseudomonas)、エアロモナス(Aeromonas)、リケッチア(Rickettsia)、クラミジア(Chlamydia)、ボレリア(Borrelia)及びマイコプラズマ(Mycoplasma)の属のメンバー、並びにさらに、限定されるものではないが、A群連鎖球菌、B群連鎖球菌、C群連鎖球菌、D群連鎖球菌、G群連鎖球菌、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)、化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)、ストレプトコッカス・アガラクチエ(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・ファカリス(Streptococcus faecalis)、ストレプトコッカス・ファシウム(Streptococcus faecium)、ストレプトコッカス・デュランス(Streptococcus durans)、淋菌(Neisseria gonorrheae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis)、ジフテリア菌(Corynebacterium diptheriae)、ガルドネレラ・バジナリス(Gardnerella vaginalis)、マイコバクテリウム・ツベルクロシス(Mycobacterium tuberculosis)、マイコバクテリウム・ボビス(Mycobacterium bovis)、マイコバクテリウム・ウルセランス(Mycobacterium ulcerans)、マイコバクテリウム・レプラ(Mycobacterium leprae)、アクチノミセテス・イスラエリ(Actinomyctes israelii)、リステリア・モノシトゲネス(Listeria monocytogenes)、ボルデテラ・ペルツシス(Bordetella pertusis)、ボルデテラ・パラペルツシス(Bordatella parapertusis)、ボルデテラ・ブロンキセプチカ(Bordetella bronchiseptica)、大腸菌(Escherichia coli)、シゲラ・ジセンテリア(Shigella dysenteriae)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘモフィルス・エジプチウス(Haemophilus aegyptius)、ヘモフィルス・パラインフルエンザ(Haemophilus parainfluenzae)、ヘモフィルス・デュクレイ(Haemophilus ducreyi)、ボルデテラ(Bordetella)、サルモネラ・ティフィ(Salmonella typhi)、シトロバクター・フレウンジ(Citrobacter freundii)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、プロテウス・バルガリス(Proteus vulgaris)、エルシニア・ペスチス(Yersinia pestis)、クレブシエラ・ニューモニア(Kleibsiella pneumoniae)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcessens)、セラチア・リクファシエンス(Serratia liquefaciens)、ビブリオ・コレラ(Vibrio cholera)、シゲラ・ジセンテリ(Shigella dysenterii)、シゲラ・フレクスネリ(Shigella flexneri)、シュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、フランシセラ・ツラレンシス(Franscisella tularensis)、ブルセラ・アボルティス(Brucella abortis)、バチルス・アントラシス(Bacillus anthracis)、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)、クロストリジウム・ペルフリンゲンス(Clostridium perfringens)、クロストリジウム・テタニ(Clostridium tetani)、クロストリジウム・ボツリナム(Clostridium botulinum)、トレポネマ・パリダム(Treponema pallidum)、リケッチア・リケッチ(Rickettsia rickettsii)及びクラミジア・トラコミティス(Chlamydia trachomitis)の種若しくは群のメンバーを意味する細菌、
(b)限定されるものではないが、アルケオバクター(Archaebacter)などの古細菌、並びに
(2)単細胞又は繊維性真核生物、例えば、限定されるものではないが、原生動物、真菌、サッカロミセス(Saccharomyces)、クルベロミセス(Kluveromyces)、若しくはカンジダ(Candida)の属のメンバー、及びサッカロミセス・セレビシア(Saccharomyces ceriviseae)、クルベロミセス・ラクティス(Kluveromyces lactis)、又はカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)の種のメンバー、
の群より選択される。
【０１３９】
異なる態様において、本発明は、直接的に、又は別の成分に対するアジュバントとして、疾患の治療又は予防において使用するための、少なくとも一つの赤痢菌外膜タンパク質を含む組成物に関する。
【０１４０】
さらに別の態様において、本発明は、本明細書に記載の組成物を用いる対象の治療を含む、対象におけるアミロイド沈着又はアルツハイマー病を予防及び/又は軽減する方法、並びにアミロイド沈着又はアルツハイマー病を予防及び/又は軽減するのに使用するための本発明の組成物に関する。一態様においては、組成物は本明細書の実施例6に記載のように作製されたSFOMPである。
【０１４１】
本発明者らは、βアミロイド1-42の食作用におけるヒトミクログリア細胞の活性が、本明細書の実施例6に記載のように作製されたSFOMP組成物により上昇することを決定した。SFOMPは、βアミロイドのみの送達と比較した場合、ヒトミクログリア細胞によるβアミロイド1-42ペプチドの食作用のレベルを特異的に上昇させる(27%の細胞がβアミロイドを含むのに対し、SFOMPを用いる場合、56%の細胞がβアミロイドを含む)。
【０１４２】
さらに、Sfomp(マウス1匹あたり5μg用量のLPS)は、PBSと比較した場合、C57BL6マウスにおける血液中の系列陰性（lineage negative）CD11b陽性単球の割合を3倍増加させることができる。これらの細胞は、βアミロイドを貪食することができる脳におけるミクログリアの発達において重要であると考えられる。
【０１４３】
本明細書で用いられる「アミロイド」は、体内に沈着する任意の不溶性繊維性タンパク質凝集物を包含する。アミロイド沈着は、器官特異的(例えば、中枢神経系、膵臓など)又は全身的であってよい。
【０１４４】
本発明のこの態様に従えば、沈着するアミロイド生成タンパク質としては、βタンパク質前駆体、プリオン、[α]-シヌクレイン、タウ、ABri前駆体タンパク質、ADan前駆体タンパク質、アミリン、アポリポタンパク質AI、アポリポタンパク質AII、リゾチーム、シスタチンC、ゲルソリン、タンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、カルシトニン、ケラトエピテリン、ラクトフェリン、免疫グロブリン軽鎖、トランスサイレチン、Aアミロイドーシス、[β]2-ミクログロブリン、免疫グロブリン重鎖、フィブリノゲンα鎖、プロラクチン、ケラチン、及びメジンが挙げられる。アミロイド沈着は、それ自体として、又は別の疾患(例えば、多発性骨髄腫、慢性感染、若しくは慢性炎症性疾患)の結果として起こり得る。
【０１４５】
従って、本発明の方法をさらに用いて、アミロイド生成タンパク質の沈着と関連するか、又はその結果生じる症状又は疾患を有する対象を治療することができる。そのような症状としては、限定されるものではないが、アルツハイマー病、びまん性レヴィー小体病、ダウン症候群、遺伝性アミロイド性脳出血、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、致死性家族性不眠症、家族性英国型認知症、家族性デンマーク型認知症、家族性角膜アミロイドーシス、家族性角膜ジストロフィー、甲状腺髄様癌、インスリノーマ、2型糖尿病、分離心房性アミロイドーシス、下垂体アミロイドーシス、大動脈アミロイドーシス、形質細胞障害、家族性アミロイドーシス、老人性心アミロイドーシス、炎症関連アミロイドーシス、家族性地中海熱、透析関連アミロイドーシス、全身性アミロイドーシス、及び家族性全身性アミロイドーシスが挙げられる。
【０１４６】
アルツハイマー病の治療又は予防は、本発明の好ましい特徴である。
【０１４７】
この態様において、本発明は、対象における疾患を予防又は治療する方法に関する。一態様において、予防又は治療のための対象は、アミロイド沈着を特徴とする疾患の症候を有すると既に診断されていてもよい。一態様において、治療のための対象は、アミロイド沈着を特徴とする疾患の症候を有すると未だ診断されていない。
【０１４８】
一態様において、本発明は、アミロイドタンパク質の沈着物に対する効果に関し、別の態様においては、疾患の状態と関連する行動、特に、アルツハイマー病と関連する行動の予防又は軽減に対する効果に関する。
【０１４９】
一態様において、本発明の方法及び組成物は、アミロイドタンパク質沈着と、疾患と関連する行動、例えば、アルツハイマー病と関連する行動との両方に対する効果を有するが、別の態様においては、本発明の方法及び組成物は、アミロイド沈着のレベル又は行動のレベルで効果を有する。
【０１５０】
一態様において、アルツハイマー病の重篤度の予防又は軽減は、記憶の喪失の予防又は軽減を含む。さらなる態様において、本発明は、記憶力の改善に関する。記憶は空間記憶であってもよい。
【０１５１】
一つのさらなる態様において、本発明は、アミロイドβの食作用の改善のための本明細書に開示される組成物の使用に関する。
【０１５２】
一態様において、本発明は、ミクログリア細胞活性の刺激のための本明細書に開示される組成物の使用に関する。
【０１５３】
一態様において、本発明は、抗原、例えば、ポリペプチド若しくはその一部又は模倣体、例えば、βアミロイドと組合せた、赤痢菌外膜タンパク質(OMP)及び赤痢菌LPS分子を含む組成物の使用に関する。βアミロイドを用いる場合、少なくとも5アミノ酸を有する、アミノ酸1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10のいずれかで開始し、アミノ酸6、7、8、9、10、11、12、13、14又は15で終結する断片などのN末端断片を用いることができる。
【０１５４】
特許出願及び付与された特許を含む、本出願における全ての参考文献の教示は、参照により本明細書に完全に組み入れられるものとする。本出願が優先権を主張する特許出願はいずれも、刊行物及び参考文献に関して本明細書に記載された様式でその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【０１５５】
疑いを回避するために、本明細書中の用語「含む(comprising)」、「含む(comprise)」及び「含む(comprises)」は、いかなる場合も、任意選択でそれぞれ用語「からなる(consisting of)」、「からなる(consist of)」及び「からなる(consists of)」と置換可能であることが本発明者らによって意図される。本明細書及び特許請求の範囲で用いられる単語「含む(comprising)」(並びに「含む(comprise)」及び「含む(comprises)」などのcomprisingの任意の形態)、「有する(having)」(並びに「有する(have)」及び「有する(has)」などのhavingの任意の形態)、「含む(including)」(並びに「含む(includes)」及び「含む(include)」などのincludingの任意の形態)、又は「含有する(containing)」(並びに「含有する(contains)」及び「含有する(contain)」などのcontainingの任意の形態)は、包括的又は制約のないものであり、追加の記載されていない要素又は方法ステップを排除しない。
【０１５６】
本開示の「ワクチン組成物」に関する本明細書の実施形態はまた、本開示の「免疫原性組成物」に関する実施形態にも適用可能であり、その逆も同様である。
【０１５７】
全ての数値における用語「約」(又は「およそ」)は5%の変動を許容する、すなわち、約1.25%の値は1.19%〜1.31%を意味する。
【０１５８】
特許請求の範囲及び/又は本明細書において用語「含む(comprising)」と共に用いられる場合、単語「一つ(a)」又は「一つ(an)」の使用は「一つ(one)」を意味し得るが、「一以上(one or more)」、「少なくとも一つ(at least one)」及び「一又は一より多い(one or more than one)」の意味とも一致する。特許請求の範囲における用語「又は(or)」の使用は、選択肢のみを指すことが明示されていないか、又は選択肢が相互に排他的でない限り、「及び/又は(and/or)」を意味するように用いられるが、本開示は選択肢のみ並びに「及び/又は」を指す定義を支持する。本明細書を通じて、用語「約」は、ある値が測定、その値を決定するのに用いられる方法に関する誤差の固有の変動、又は試験対象間に存在する変動を含むことを示すために用いられる。
【０１５９】
本明細書で用いられる用語「又はその組合せ」とは、この用語に先行する列挙された項目のあらゆる順列及び組合せをいう。例えば、「A、B、C、又はその組合せ」は、A、B、C、AB、AC、BC、又はABCの少なくとも一つ、また、特定の文脈において順序が重要である場合、BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC、又はCABを含むことが意図される。この例で続けると、明確に含まれるのは、BB、AAA、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABBなどの一以上の項目又は用語の反復を含む組合せである。当業者であれば、文脈から他の意味であることが明らかでない限り、典型的には任意の組合せにおける項目又は用語の数に制限はないことを理解できる。
【０１６０】
本明細書に開示され、特許請求された全ての組成物及び/又は方法は、本開示を考慮すれば過度の実験を行うことなく作製及び実行することができる。本開示の組成物及び方法を特定の実施形態に関して説明してきたが、本開示の概念、精神及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の組成物及び/又は方法並びに方法のステップ又は一連のステップに変更を加えることができることが当業者には明らかである。当業者には明らかな全てのそのような同様の置換及び改変は、添付の特許請求の範囲により定義される本開示の精神、範囲及び概念の範囲内にあると見なされる。本明細書に記載の特定の実施形態は、例示のために示されるものであり、本開示の限定として示されるものではないことが理解される。本開示の原理的特徴は本開示の範囲から逸脱することなく様々な実施形態において用いることができる。当業者であれば、日常的なものを超えない試験を用いて、本明細書に記載の特定の手順に対するいくつかの等価物を認識するか、又は確認することができる。そのような等価物は、本開示の範囲内にあると考えられ、特許請求の範囲により包含される。本明細書に記載の全ての刊行物及び特許出願は、本開示が属する業界の当業者の技術レベルを示唆するものである。全ての刊行物及び特許出願は、あたかもそれぞれ個々の刊行物又は特許出願が具体的かつ個別的に参照により組み入れられると示されたのと同程度まで、参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【０１６１】
本開示の態様はいずれも、そのような特徴の組合せがさもなければ文脈から明らかでない限り、本開示の任意の他の態様と組合せることができる。
【０１６２】
本開示を以下の非限定的な実施例を参照することによりさらに説明する。
【実施例１】
【０１６３】
粒径により評価されるSFOMPの安定性、及び粒子の特性評価
SFOMP粒子を実施例6のプロセスに従って作製し、平均直径を散乱光の測定により経時的に評価した。図1。
【０１６４】
粒径は3ヶ月間にわたって4℃で安定であった。
【０１６５】
表3に示すように、平均タンパク質:LPS比は(0.7〜1.1):1で変化した。
【表３】
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【実施例２】
【０１６６】
電子顕微鏡観察(EM)
実施例6に従って作製したSFOMP粒子のEMによって、抗シゲラ・フレクスネリLPS抗体結合により測定して、シゲラ・フレクスネリが粒子の外膜中にLPSを含むことが示される。図2。
【実施例３】
【０１６７】
SDS-PAGE/クマシーブルー染色によるSFOMP、プロトリン及びV2プロテオソーム中の主要タンパク質
SFOMP粒子は実施例6のプロセスに従って作製し、標準的な技術を用いるゲル電気泳動により、V2プロテオソーム及びプロトリン(後者は、例えば、米国特許出願公開第2003/0044425号に開示された通り、髄膜炎菌のOMP及び赤痢菌のLPSを含む)と比較した。
【０１６８】
図3に示される通り、SFOMP中のOMPは、プロトリン及びV2プロテオソーム中のOMPとは異なる。SFOMP調製物はOMP1b、OMP3a及びOMPXを含む。表4。
【表４】
0006045499.tif 000005
【実施例４】
【０１６９】
SFOMPは細胞に基づくアッセイにおいて用量応答性活性化を誘発するTLR1-2及びTLR4経路アゴニストを含有する
HEK細胞をSFOMP、プロトリン並びにV1及びV2プロテオソームで処理した。V1プロテオソームは髄膜炎菌のOMPのみを含有するが、V2プロテオソームはさらにLPSも含有する。プロトリンは髄膜炎菌のOMPとシゲラ・フレクスネリのLPSを含有する。
【０１７０】
NFκBは、SFOMPを用いる処理によって用量依存的にTLR1-2ヒト胚性腎(HEK)細胞中で活性化される、SFOMPがTLR1-2アゴニストを含むことを示している。図4。
【０１７１】
NFκBは、SFOMPを用いる処理によって用量依存的にTLR4 Hek細胞中で活性化され、SFOMPがTLR-4アゴニストを含むことを示している。
【実施例５】
【０１７２】
鼻内投与されたSFOMPアジュバント化preF抗原はRSV感染からマウスを防御する
マウスに、RSFタンパク質F及びV2プロテオソーム又は実施例6に従って作製されたSFOMPをD0及びD21に鼻内にワクチン接種した。次いで、マウスをRSVウイルスで47日目にチャレンジし、51日目に犠牲にした。チャレンジしたマウスの肺ホモジェネートを試験して、ウイルスのLD50値を見た。
【０１７３】
結果を図5に示す。
【０１７４】
SFOMP単独ではRSV感染に対して有効ではなかったが、F抗原のみ及びV2プロテオソームと比較した場合、防御を有意に改善した。
【実施例６】
【０１７５】
パイロットアジュバント試験のためのSFOMP研究ロットの調製
用いた細胞は、37℃で250rpで3時間振とうしながら増殖させたシゲラ・フレクスネリ2a BS103(GMP細胞バンク)であった。細胞を室温で30分間、2,770gで遠心分離し、上清を廃棄した。ペレットを10mM Hepes中に再懸濁した。細胞を5×45秒間、43AMPで超音波処理した。細胞を室温で20分間、1,700gで遠心分離し、ペレットを廃棄した。上清を4℃で60分間、100,000gで遠心分離し、上清を廃棄した。ペレットを1% N-ラウロイルサルコシン中に再懸濁した。懸濁液を4℃で60分間、100,000gで遠心分離し、上清を廃棄した。ペレットを10mM Hepes中に再懸濁し、5×45秒間、43AMPで超音波処理した。MgCl2を添加し、濾過(0.2μm)を実行した。得られた組成物を本明細書ではSFOMPと呼ぶ。図6。
【実施例７】
【０１７６】
SFOMPを用いるヒト樹状細胞のマイクロアレイ分析
樹状細胞における遺伝子発現を、ヒト樹状細胞のマイクロアレイ分析によって評価した。結果を図7に示す。SFOMPはPBS緩衝液で処理した樹状細胞と比較して、樹状細胞中の特定の遺伝子の上方調節及び下方調節を引き起こすことができる。
【実施例８】
【０１７７】
鼻内投与されたSFOMPアジュバント化preF抗原は血清及び肺の中和抗体を生じさせる
1μgのRSV preF抗原を3又は0.3μgのSFOMPと組合せて、マウスに鼻内送達した。中和抗体が得られた(図8)。
【実施例９】
【０１７８】
3mgのスプリット抗原及び5mgのアジュバントの二回のIN免疫化後のBALB/cマウスにおける応答
3mgのインフルエンザスプリット抗原及び5mgのSFOMPアジュバントの二回の鼻内免疫化後にマウスにおける免疫応答を評価した。HA並びにIgG及びIgAに対する幾何平均抗体力価を評価した。インフルエンザニューカレドニアA株を用いてスプリット抗原を作製した。幾何平均力価(GMT)を決定した。SFOMP+抗原は、PBSのみ又は抗原のみと比較した場合、有意に改善された応答を与えた(図9、10及び11)。
【０１７９】
図12はSfOMP、プロトリン及びV2プロトリンの間の差異、並びに例示的なLP/OMP比を示す。
【実施例１０】
【０１８０】
C57BL/6マウスにおけるSFOMP(マウス1匹あたり1μg)又は1μg用量のシゲラ・フレクスネリのリポ多糖(LPS)の腹腔内注射の24時間後の脳内の自然（免疫）活性化（innate activation）。図13。
【０１８１】
活性化は、in situハイブリダイゼーションにより測定されるTLR2 mRNAの存在により表される。脳室領域周辺の黒色の沈着物は、TLR2 mRNAが陰性対照(A)と比較してSFOMP(B)を注射したマウスの脳中に存在することを示している。シゲラ・フレクスネリのLPSを注射したマウスからの脳は、脳の実質、皮質及び脳室領域内でも活性化が示されることを示す(C)。in situハイブリダイゼーションマイクログラフにおけるTLR2に対するIba1免疫組織化学は、TLR2 mRNAが主にミクログリア細胞中に存在することを示している(Iba1+細胞)。
【実施例１１】
【０１８２】
SFOMP又はシゲラ・フレクスネリのLPSと共にヒトマウスミクログリア細胞系(CHME)をインキュベートした後にin vitroで測定されたAβ42食作用。図14。Aβ42ペプチドをHi-Lyte Fluo488(Anaspec Inc.)で標識し、1μg/mlで用いた。24時間の時点で、SFOMPと共にインキュベートした後の細胞の56%、又は陰性対照(Aβ42ペプチドのみ)と比較して75%のレベルで、Aβ42の取り込みが観察される(図14A)。それらの取込み後のAβ42ペプチドは、リソソーム(lysotracker red)内に位置し、Aβ42ペプチドが貪食されたことを示す。SFOMPインキュベーション後の代表的な写真を示す(図14B)。矢印はAβ42ペプチドとリソソームマーカー(lysotracker)との共局在を示す。
【図１】
0006045499.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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