(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の立体配座の第１のタンパク質中の１つ又は複数の残基原子を含む残基のパッキング特性を定量化する、コンピュータによって実行される方法であって、
（ａ）前記第１のタンパク質の前記１つ又は複数の残基原子と、前記第１のタンパク質の１つ又は複数の周囲原子と、の間のそれぞれの距離に基づいて、前記第１のタンパク質の１つ又は複数の緊密接触電位の合計(Nlig)を計算する工程と、
（ｂ）前記１つ又は複数の周囲原子に曝される前記第１のタンパク質の前記１つ又は複数の残基原子の第１の接触面積(SAlig)を計算する工程であって、当該工程（ｂ）は、（ｉ）前記１つ又は複数の残基原子の溶媒接近可能表面積の合計(SA_tot)をコンピュータで計算することと、（ｉｉ）前記第１のタンパク質の存在下で、前記１つ又は複数の残基原子の溶媒接近可能表面積(SASA_lig)をコンピュータで計算することと、（ｉｉｉ）式SAlig=SA_tot-SASA_ligの数値を求めることと、を含み、
（ｃ）前記第１のタンパク質の前記１つ又は複数の緊密接触電位の合計を前記第１の接触面積で割ることによって第１の緊密接触面密度（CCSD）を計算する工程と、
を含み、
前記方法が、（１）クロック、（２）メモリ、及び（３）プロセッサを備えるコンピュータシステム上で実施され、
前記方法の各工程が前記プロセッサを利用して実施される、方法。
【請求項２】
前記緊密接触電位のうちの少なくとも１つがそのドメインのサブセットにおいて連続している、請求項１に記載のコンピュータによって実行される方法。
【請求項３】
前記工程（ｃ）の後に前記ＣＣＳＤを正規化する工程をさらに含む、請求項１又は２に記載のコンピュータによって実行される方法。
【請求項４】
前記第１の接触面積が約１０Å２より大きい、請求項１〜３のいずれか１項に記載のコンピュータによって実行される方法。
【請求項５】
前記第１のＣＣＳＤが約０．２５Å−２未満である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のコンピュータによって実行される方法。
【請求項６】
前記第１のＣＣＳＤを減衰させる工程をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のコンピュータによって実行される方法。
【請求項７】
前記第１のタンパク質が分子に結合されて複合体を形成する、請求項１〜６のいずれか１項に記載のコンピュータによって実行される方法。
【請求項８】
前記分子が第２のタンパク質である、請求項７に記載のコンピュータによって実行される方法。
【請求項９】
前記第１のタンパク質がリガンドであり前記第２のタンパク質がレセプターである、又は前記第１のタンパク質がレセプターであり前記第２のタンパク質がリガンドである、請求項８に記載のコンピュータによって実行される方法。
【請求項１０】
前記１つ又は複数の周囲原子が、１つ又は複数のリガンド原子、並びに１つ又は複数のレセプター原子から選択される、請求項９に記載のコンピュータによって実行される方法。
【請求項１１】
前記第２のタンパク質の前記立体配座を変更して第２の立体配座の前記第１のタンパク質を得る工程と、前記第２の立体配座の前記第１のタンパク質に関して工程（ａ）から（ｃ）を繰り返す工程をさらに含む、請求項８〜１０のいずれかに記載のコンピュータによって実行される方法。
【請求項１２】
前記第１のタンパク質の前記立体配座を変更して第２の立体配座の前記第１のタンパク質を得る工程と、前記第２の立体配座の前記第１のタンパク質に対して工程（ａ）から（ｃ）を繰り返す工程をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のコンピュータによって実行される方法。
【請求項１３】
前記第１のタンパク質の前記立体配座を変更する工程が、（ｄ）決定論的又は確率論的シミュレーションを実施して前記第１のタンパク質の立体配座空間を探索する工程と、（ｅ）前記第１又は第２のタンパク質を変異させる工程と、（ｆ）第２のリガンドを前記第１のタンパク質に結合する工程とから選択される１つ又は複数の工程を含む、請求項１２に記載のコンピュータによって実行される方法。
【請求項１４】
タンパク質相同モデルを構築する、コンピュータによって実行される方法であって、
（ａ）第１の立体配座のタンパク質又はタンパク質複合体に対して、請求項１〜１０のいずれかに記載のコンピュータによって実行される方法を実施して第１のＣＣＳＤを得る工程と、
（ｂ）前記タンパク質又はタンパク質複合体の決定論的又は確率論的シミュレーションを実施して、第２の立体配座の前記タンパク質又はタンパク質複合体を得る工程と、
（ｃ）前記第２の立体配座の前記タンパク質又はタンパク質複合体に対して、前記先行の実施工程（ａ）で選択された前記コンピュータによって実行される方法を実施して第２のＣＣＳＤを得る工程と、
（ｄ）前記タンパク質又はタンパク質複合体の１つ又は複数の残基に関して前記ＣＣＳＤが改善した場合、前記第２の立体配座の前記タンパク質又はタンパク質複合体を受け入れる工程と、
を含み、
タンパク質相同モデルを構築する前記方法が、（１）クロック、（２）メモリ、及び（３）プロセッサを備えるコンピュータシステム上で実施され、
前記方法の各工程が前記プロセッサを利用して実施される、方法。
【請求項１５】
決定論的又は確率論的シミュレーションを実施する前記工程が、分子動力学シミュレーションを実施する工程を含む、請求項１３又は１４に記載のコンピュータによって実行される方法。
【請求項１６】
決定論的又は確率論的シミュレーションを実施する前記工程が、モンテカルロシミュレーションを実施する工程を含む、請求項１３又は１４に記載のコンピュータによって実行される方法。
【請求項１７】
複数の主鎖原子に対するタンパク質主鎖の自由度のモンテカルロサンプリングと、複数の側鎖原子に対する離散化側鎖の自由度のモンテカルロサンプリングとを実施する工程を含む、請求項１６に記載のコンピュータによって実行される方法。
【請求項１８】
親タンパク質を元にして変異タンパク質を設計する方法であって、
（ａ）前記親タンパク質に対して、請求項１〜１０のいずれかに記載の前記コンピュータによって実行される方法を実施して第１のＣＣＳＤを得る工程と、
（ｂ）前記親タンパク質の１つ又は複数の残基を変異させて前記変異タンパク質を得る工程と、
（ｃ）前記変異タンパク質に対して、前記先行の実施工程（ａ）で選択された前記コンピュータによって実行される方法を実施して第２のＣＣＳＤを得る工程と、
（ｄ）前記第１のＣＣＳＤと比べた前記第２のＣＣＳＤが、前記親タンパク質と比して、同等の又は改善した前記変異タンパク質の安定性を示す場合に、前記変異タンパク質を作る工程とを含む、方法。
【請求項１９】
親タンパク質複合体を元にして変異タンパク質複合体を設計する方法であって、
（ａ）前記親タンパク質複合体に対して、請求項７〜１０のいずれかに記載の前記コンピュータによって実行される方法を実施して第１のＣＣＳＤを得る工程と、
（ｂ）前記親タンパク質複合体の１つ又は複数の残基を変異させて前記変異タンパク質複合体を得る工程と、
（ｃ）前記変異タンパク質複合体に対して、前記先行の実施工程（ａ）で選択された、前記コンピュータによって実行される方法を実施して第２のＣＣＳＤを得る工程と、
（ｄ）前記第１のＣＣＳＤと比べた前記第２のＣＣＳＤが、前記親タンパク質複合体と比して、同等の又は改善した前記変異タンパク質複合体の安定性を示す場合に、前記変異タンパク質複合体を作る工程とを含む、方法。
【請求項２０】
タンパク質に選択的に結合するリガンドを作る方法であって、
（ａ）第１のリガンドに結合した前記タンパク質を含む第１の複合体に対して、請求項１〜１０のいずれかに記載の前記コンピュータによって実行される方法を実施して第１のＣＣＳＤを得る工程と、
（ｂ）第２のリガンドに結合した前記タンパク質を含む第２の複合体に対して、前記先行の実施工程（ａ）で選択された前記コンピュータによって実行される方法を実施して第２のＣＣＳＤを得る工程と、
（ｃ）前記第１のＣＣＳＤと比べた前記第２のＣＣＳＤが、前記第１の複合体と比して、同等の又は改善した前記第２の複合体の安定性を示す場合に、前記第２のリガンドを作る工程とを含む、方法。
【請求項２１】
請求項１〜１７のいずれかに記載の、前記コンピュータによって実行される方法を実施するための命令を含むコンピュータ可読媒体。
【請求項２２】
クロックと、メモリと、請求項１〜１７のいずれかに記載の、前記コンピュータによって実行される方法を実施するための命令を含むプロセッサとを備えるコンピュータシステ
ム。
【請求項２３】
第１の立体配座のレセプタータンパク質中の１つ又は複数の残基原子を含む残基のパッキング特性を定量化する、コンピュータによって実行される方法であって、
前記レセプタータンパク質は、リガンドに結合し、
前記方法は、
（ａ）前記レセプタータンパク質の前記１つ又は複数の残基原子と、１つ又は複数の周囲原子と、の間のそれぞれの距離に基づいて、前記レセプタータンパク質の１つ又は複数の緊密接触電位の合計(Nrec)を計算する工程と、
（ｂ）前記１つ又は複数の周囲原子に曝される前記レセプタータンパク質の前記１つ又は複数の残基原子の第１の接触面積(SArec)を計算する工程であって、当該工程（ｂ）は、（ｉ）前記リガンドの存在下で、前記１つ又は複数の残基原子の溶媒接近可能表面積の合計(SASA_lig)をコンピュータで計算することと、（ｉｉ）前記レセプタータンパク質及び前記リガンドの存在下で、前記１つ又は複数の残基原子の溶媒接近可能表面積(SASA_lig+rec)をコンピュータで計算することと、（ｉｉｉ）式SArec=SASA_lig-SASA_lig+recの数値を求めることと、を含み、
（ｃ）前記レセプタータンパク質の前記１つ又は複数の緊密接触電位の合計を前記第１の接触面積で割ることによって第１の緊密接触面密度（CCSD）を計算する工程と、
を含み、
前記方法が、（１）クロック、（２）メモリ、及び（３）プロセッサを備えるコンピュータシステム上で実施され、
前記方法の各工程が前記プロセッサを利用して実施される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
[0001]  本願は、参照により組み込まれる２０１０年９月２４日出願の米国特許出願第６１／３８６，４０６号の優先権を主張する。
【０００２】
[0002]  本発明の分野は、タンパク質の構造的特徴付け、特に連続溶媒の存在下での残基パッキングの特性に関し、また所与の構造物に伴う自由エネルギーの計算に関する。
【背景技術】
【０００３】
[0003]  医療目的に役立つように最適化された「バイオベター（biobetter）」又は生物学的薬剤の設計により、ヒト及び動物の健康の大幅な向上の機会がもたらされる。生体分子は極めて複雑であり、その構造及び働きは、構造及び環境に関わる多数の原子間力によって支配される。
【０００４】
[0004]  他の人たちにより生物学的薬剤中の接触部が計算されたが、圧倒的な計算資源を用いずに計算を実現するために重要な情報が無視された。Ｐａｔｔａｂｉｒａｍａｎ他のＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ、１９９５年、８：３３４頁に説明されている一方法では、その閉塞面法は基本的に、特定の残基に対する重み付け相対閉塞表面積（溶媒に曝されないことを意味する）である。この方法は、所与の残基の総表面積を離散化することから開始する。所与の面素は、他のタンパク質原子の表面が所与の面素の法線ベクトルの方向で２．８Å以内にある場合、閉塞されていると考えられる。閉塞面と関連付けられる面積は、閉塞する原子がどれだけ近くに位置しているかによって重み付けされ、合計に加えられる。この合計は、残基の総表面積で割られる。表面積を重み付けすることにより、閉塞面が十分にパッキングされている場合には合計が大きくなる。一方、こうして得られた計量は、全残基のパッキング特性を別の残基の環境中で特徴付けるが、このことは、残基が溶媒に曝されることが増えるにつれ計量が小さくなることを暗示する。
【０００５】
[0005]  過去に用いられた方法及び歴史は、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２０００年、２９９：４８７頁中のＦｌｅｍｉｎｇ及びＲｉｃｈａｒｄｓの論文で十分総説されている。以前の諸方法では、パッキング特性の幾何学的感覚が別の残基の環境中で得られた。
【０００６】
[0006]  最適化された生物学的医薬品への筋道を確立するためには、結合及び安定性の関連熱力学的特性により密接に関連する、より情報を提供する手法が必要とされる。
【０００７】
[0007]  したがって、タンパク質立体配座情報に到達する改善された方法が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
[0008]  緊密接触面密度（CCSD）法は、タンパク質の特定の残基がどれだけ十分にパッキングされているかについて、（１）異なる型の残基の間で移動可能な量で、かつ（２）結合又はフォールディングなどの特定の過程の熱力学に対するパッキングの寄与と関係がある量を与えるやり方で定量化することを目的とする。パッキングの特性は、残基と残基の接触部の一部又は全部が溶媒との接触部に置き換えられた基準状態と関係があると考えられる。したがって、ＣＣＳＤ量は、複雑な物理的依存性を考慮に入れずに、遍在する分散相互作用（原子間の引力相互作用）と関係付けられる。
【０００９】
[0009]  定性的な面では、ＣＣＳＤ法によりユーザは以下の質問に答えることができる。
１．現在のフォールディングにおいて、ある領域が、すべての残基間接触部が連続溶媒との接触部に置き換えられたフォールディングと比較して、どれだけ十分にパッキングされているか？
２．現在の結合構成において、リガンドとレセプター間の界面でのリガンドの領域が、すべてのリガンド−レセプター接触部が連続溶媒との接触部に置き換えられたリガンドのアポ形態と比較して、どれだけ十分にパッキングされているか？
【課題を解決するための手段】
【００１０】
[0010]  したがって一態様では、本発明は、第１の立体配座の第１のタンパク質中の１つ又は複数の残基原子を含む残基のパッキング特性を定量化する、コンピュータによって実行される方法を提供し、この方法は、（ａ）１つ又は複数の残基原子と１つ又は複数の周囲原子との間の距離に基づいて１つ又は複数の緊密接触電位を計算する工程と、（ｂ）１つ又は複数の周囲原子に曝される１つ又は複数の残基原子の接触面積を計算する工程と、（ｃ）１つ又は複数の緊密接触電位の合計を接触面積で割ることによって緊密接触面密度（CCSD）を計算する工程とを含み、（１）クロック、（２）メモリ、及び（３）プロセッサを備えるコンピュータシステム上で実施され、この方法の各工程はそのプロセッサを利用して実施される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】[0011]接触線を示す試験分子（11、Sanalyze）、リガンド（13、Sligand）及びレセプター（12、Sreceptor）の原子モデルの図である。
【図２】[0012]Ｄｏｃｋｇｒｏｕｎｄ  ３．０（商標）ベンチマーク複合体中のレセプター−リガンド界面のすべての残基型に対して計算されたＣＣＳＤの正規化ヒストグラムである。すべての残基型が同様の大きさを有し、そのほとんど全部が０．０〜０．２Å−２の範囲内にある。ｙ軸はＣＣＳＤ／オングストローム−２、ｘ軸は残基型であり、右側のスケールは母集団である。
【図３】[0013]ベンチマーク複合体中のリガンドのすべての残基型に対するレセプター接触面積の正規化ヒストグラムである。ｙ軸は接触面積／オングストローム２、ｘ軸は残基型であり、右側のスケールは母集団である。
【図４】[0014]インスリンレセプター複合体（IR_11）中の界面残基に対するＣＣＳＤを分子力学軌跡内のフレーム番号の関数として示すグラフである。０．２５Å−２より高い値はどれも０．２５として報告されている。ｙ軸は軌跡フレーム、ｘ軸は残基であり、右側のスケールはＣＣＳＤ／オングストローム−２である。
【図５】[0015]インスリンレセプター複合体の界面のリガンド残基に対するレセプター接触面積を分子力学軌跡内のフレーム番号の関数として示すグラフである。ｙ軸は軌跡フレーム、ｘ軸は残基であり、右側のスケールは接触面積／オングストローム２である。
【図６】[0016]分子力学軌跡内のすべてのフレームについての、インスリンレセプター複合体の界面のすべてのリガンド残基型に対する接触面積とＣＣＳＤの間の相関関係を示すグラフである。
【図７】[0017]１／Ｓの指数関数的減衰を示すグラフであり、ここでＳは接触面積である。
【図８】[0018]実施例５による、３．６Åの近接カットオフと、減衰パラメータ値が０の減衰係数とを使用して計算されたＣＣＳＤ＿ｒｅｃｅｐｔｏｒ値を示すグラフである。ｙ軸はＣＣＳＤ＿ｒｅｃｅｐｔｏｒであり、ｘ軸は表７に示された残基指標である。
【図９】[0019]実施例５による、３．６Åの近接カットオフと、減衰パラメータ値が１５の減衰係数とを使用して計算されたＣＣＳＤ＿ｒｅｃｅｐｔｏｒ値を示すグラフである。ｙ軸はＣＣＳＤ＿ｒｅｃｅｐｔｏｒであり、ｘ軸は表７に示された残基指標である。
【図１０】[0020]実施例５による、減衰パラメータ値が２５の減衰係数を使用して計算されたＣＣＳＤ＿ｒｅｃｅｐｔｏｒ値を示すグラフである。ｙ軸はＣＣＳＤ＿ｒｅｃｅｐｔｏｒであり、ｘ軸は表７に示された残基指標である。
【図１１】[0021]アルファ減衰＝０で実行されたｒｅｐｅａｔ＿１  ＩＲのバックラブ軌跡解析のグラフである。ｙ軸はＣＣＳＤ＿ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｘ軸は解析された残基である。それぞれの残基で、最も左の棒は平均、中央左の棒は標準偏差、中央右の棒は最大値、最も右の棒は最小値である。
【図１２】[0022]アルファ減衰＝２５で実行されたｒｅｐｅａｔ＿１  ＩＲのバックラブ軌跡解析のグラフである。ｙ軸はＣＣＳＤ＿ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｘ軸は解析された残基である。それぞれの残基で、最も左の棒は平均、中央左の棒は標準偏差、中央右の棒は最大値、最も右の棒は最小値である。
【図１３】[0023]アルファ減衰＝０で局所ランダムウォークを使用する短い主鎖立体配座サンプリングに基づいて実行したバックラブ軌跡解析のグラフである。ｙ軸はＣＣＳＤ＿ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｘ軸は解析された残基である。それぞれの残基で、最も左の棒は平均、中央左の棒は標準偏差、中央右の棒は最大値、最も右の棒は最小値である。
【図１４】[0024]アルファ減衰＝２５で局所ランダムウォークを使用する短い主鎖立体配座サンプリングに基づいて実行したバックラブ軌跡解析のグラフである。ｙ軸はＣＣＳＤ＿ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｘ軸は解析された残基である。それぞれの残基で、最も左の棒は平均、中央左の棒は標準偏差、中央右の棒は最大値、最も右の棒は最小値である。
【図１５】[0025]近接カットオフ＝４．０及びアルファ減衰＝０に対するＣＣＳＤ＿ｒｅｃｅｐｔｏｒ値を示すグラフである。ｙ軸はＣＣＳＤ＿ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｘ軸は表７に示された残基指標である。
【図１６】[0026]近接カットオフ＝４．０及びアルファ減衰＝１５に対するＣＣＳＤ＿ｒｅｃｅｐｔｏｒ値を示すグラフである。ｙ軸はＣＣＳＤ＿ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｘ軸は表７に示された残基指標である。
【図１７】[0027]近接カットオフ＝４．５及びアルファ減衰＝０に対するＣＣＳＤ＿ｒｅｃｅｐｔｏｒ値を示すグラフである。ｙ軸はＣＣＳＤ＿ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｘ軸は表７に示された残基指標である。
【図１８】[0028]近接カットオフ＝４．５及びアルファ減衰＝１５に対するＣＣＳＤ＿ｒｅｃｅｐｔｏｒ値を示すグラフである。ｙ軸はＣＣＳＤ＿ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｘ軸は表７に示された残基指標である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
[0029]  本明細書では、様々な配置及び環境でのタンパク質中の残基パッキングを定量化する方法について説明する。
【００１３】
[0030]  一態様では、本発明は、第１の立体配座の第１のタンパク質中の１つ又は複数の残基原子を含む残基のパッキング特性を定量化する、コンピュータによって実行される方法を提供し、この方法は、（ａ）１つ又は複数の残基原子と１つ又は複数の周囲原子との間の距離に基づいて１つ又は複数の緊密接触電位を計算する工程と、（b）１つ又は複数の周囲原子に曝される１つ又は複数の残基原子の接触面積を計算する工程と、（ｃ）１つ又は複数の緊密接触電位の合計を接触面積で割ることによって緊密接触面密度（CCSD）を計算する工程とを含む。例示的な諸実施形態では、この方法は、（１）クロック、（２）メモリ、及び（３）プロセッサを備えるコンピュータシステム上で実施され、この方法の各工程はそのプロセッサを利用して実施される。
【００１４】
[0031]  図１を参照して、Ｓａｎａｌｙｚｅが、ＣＣＳＤに関して解析されるべき各残基に分類された試験原子（本明細書では「残基原子」とも呼ばれる）（１１）の組であるとする。各距離は、これらの残基原子のいずれかと、残基原子の付近の原子である周囲原子との間で測定することができる。どの距離を測定するかは、以下で説明するユーザ定義カットオフによって決定することができる。
【００１５】
[0032]  周囲原子の例には、残基原子と同じ分子の一部であるもの、及び別の分子の一部であるものが含まれる。例えば、Ｓｌｉｇａｎｄが、リガンド又はリガンドの一部を構成する原子（１３）の組であるとする。Ｓｒｅｃｅｐｔｏｒが、任意選択により存在し得るレセプター、又はレセプターの一部を構成する原子（１２）の組であるとする。これらの原子の３つの組及びその緊密接触が図１に（１０）で示されている。このように、Ｓｌｉｇａｎｄ及びＳｒｅｃｅｐｔｏｒは周囲原子の例である。いくつかの実施形態では、Ｓａｎａｌｙｚｅはレセプターのサブセットである。いくつかの実施形態では、Ｓａｎａｌｙｚｅはリガンドのサブセットである。
【００１６】
[0033]  「レセプター」及び「リガンド」という用語は一般に、互いに結合する任意の２つの分子を指す。いくつかの事例では、これらの用語は交換可能である。レセプターとリガンドは互いに結合して複合体を形成し得る。例示的な実施形態では、レセプター−リガンド対のうちの少なくとも１つのメンバーはタンパク質である。例示的な諸実施形態では、レセプター−リガンド対のレセプターとリガンドの両方がタンパク質である。いくつかの実施形態では、レセプターがタンパク質である。いくつかの実施形態では、リガンドがアミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、糖類、多糖類、脂質及び小分子（例えば、分子量＜５００Ｄ）から選択される。例示的な諸実施形態では、タンパク質は抗体又は抗原である。
【００１７】
[0034]  図１で、原子（１１）Ｓａｎａｌｙｚｅは同じ残基の一部であり、原子（１２）は、Ｓｒｅｃｅｐｔｏｒのメンバーであり、原子（１３）はＳｌｉｇａｎｄのメンバーである。図１の原子の外殻の黒さは、その影付きの表面領域が曝される原子の組を示し、最も濃い黒（２０）がリガンドにもレセプターにも曝されないことを、中間域の黒（２１）がリガンドだけに曝されることを意味し、最も薄い黒（２２）がリガンドにもレセプターにも曝されることを示す。
【００１８】
[0035]  影付き接続線（２５）は距離閾値ｒｃ未満の間隔を示し、この距離閾値未満では２つの原子が緊密接触していると考えられる。距離ｒｃは、２つの原子上の様々な点の間、例えば一方の中心から他方の中心まで、又は一方の表面から他方の表面までとすることができる。距離カットオフは、タンパク質中の典型的な最小の原子−原子間隔に基づいて選択される。したがって、例示的な諸実施形態では、カットオフは、典型的なタンパク質原子（例えば、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＨ）のファンデルワールス半径の２倍であるか、またはわずかに超えなければならない。
【００１９】
[0036]  Ｎｌｉｇ及びＮｒｅｃが、それぞれ試験原子とリガンド原子及びレセプター原子とのすべての対の間の緊密接触電位の合計（下記参照）であるとする。ＳＡｌｉｇ及びＳＡｒｅｃが、それぞれリガンド及びレセプターに曝される試験原子の表面積であるとすると、次式の比
【００２０】
【数１】
0005937077.tif 000002
がＣＣＳＤになる。いくつかの実施形態では、ＣＣＳＤは、約０．５０、０．４５、０．４０、０．３５、０．３０、０．２５、０．２０、０．１５又は０．１０Å−２未満である。例示的な諸実施形態では、ＣＣＳＤは約０．２５Å−２未満である。
【００２１】
[0037]  これらの表面積は「接触面積」と呼ばれることがあり、レセプター接触面積は、レセプターに曝される試験残基原子上の面積を指し、リガンド接触面積は、リガンドに曝される試験残基原子上の面積を指す。例示的な諸実施形態では、Ｅｄｅｌｓｂｒｕｎｎｅｒ及びＫｏｅｈｌのＣｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｏｍｅｔｒｙ、２００５年、５２：２４３〜２７５頁に記載されている、体積及び表面を計算する解析方法が使用される。プローブ原子の半径は１．４Åである。実際面では、言及した２つの表面積は以下の操作により計算される。
１．真空中の所与の残基型の溶媒接近可能表面積の合計、ＳＡ＿ｔｏｔを計算する。
２．リガンド環境の存在下で所与の残基の溶媒接近可能表面積、ＳＡＳＡ＿ｌｉｇを計算する。
３．リガンド及びレセプター環境（該当する場合）の存在下で所与の残基の溶媒接近可能表面積、ＳＡＳＡ＿ｌｉｇ＋ｒｅｃを計算する。
４．図１を参照すると次の式、ＳＡ＿ｒｅｃ＝ＳＡＳＡ＿ｌｉｇ（２０＋２２）−ＳＡＳＡ＿ｌｉｇ＋ｒｅｃ（２０）及びＳＡ＿ｌｉｇ＝ＳＡ＿ｔｏｔ（２０＋２１＋２２）−ＳＡＳＡ＿ｌｉｇ（２０＋２２）を公式化することができる。多くて３つのＳＡＳＡ計算が、２つの接触表面積を計算するのに必要である。
【００２２】
[0038]  これらの方法は、１つ又は複数の緊密接触電位を計算することを含む。いくつかの実施形態では、距離ｒａｂだけ隔てられた２つの原子ａとｂの緊密接触電位は、
【００２３】
【数２】
0005937077.tif 000003
であり、ここでｄは小さい非ゼロオフセット、ｒｃは距離カットオフすなわち閾値である。これは、小さい構造的摂動に対して数Ｎｌｉｇ及びＮｒｅｃを安定にするために電位が連続的になっていることを除いて、緊密接触部の数を数えるのとほぼ厳密に同じである。記号Ｂは、同じ残基のどちらかのメンバーである原子ａ及びｂを指し、あるいは、直接結合されている（1-2結合）か、１つの仲介原子を介して結合されている（1-3結合）か、または２つの仲介原子を介して結合されている（1-4結合）かのどれかである原子ａ及びｂを指す。オフセットの典型的な値は約０．２Åである。他のオフセットには、約０．０５、０．１、０．１５、０．２５、０．３及び０．３５Åが含まれる。オフセットを設定するための基準は経験的なものでよく、適用の際に無関係と考えられるべき小さな構造的摂動の範囲に基づくことができる。当技術分野で知られている他の緊密接触電位もまた適切であり得る。
【００２４】
[0039]  いくつかの実施形態では、カットオフｒｃは２．８Å以上である。いくつかの実施形態では、ｒｃは２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９及び５．０Åから選択される距離以上である。いくつかの実施形態では、ｒｃ＋ｄは２．８Å以上である。いくつかの実施形態では、ｒｃ＋ｄは２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９及び５．０Åから選択される距離以上である。例示的な諸実施形態では、ｒｃは約３．６Åである。例示的な諸実施形態では、ｒｃ＋ｄは約３．８Åである。
【００２５】
[0040]  したがって、例示的な諸実施形態では、本方法は、緊密接触原子の数ではなく緊密接触部の数を数えること、すなわち定量化すること（例えば緊密接触電位により）を含む。他のいくつかの原子に近いある原子については、緊密接触部の数が緊密接触原子の数と異なることがある。例えば、図１の原子（１３）は、解析されるべき原子の組内の２つの原子に近い。したがって、この原子では１ではなく２をＮｌｉｇに加える。
【００２６】
[0041]  例示的な諸実施形態では、本方法は原子組に関して対称である。例えば、ＳａｎａｌｙｚｅとＳｒｅｃｅｐｔｏｒが図１で交換された場合、接触部の数は同じままであるが接触原子の数が変わる。これはまた、対でのファンデルワールス電位とおおむね似ている定義でもある。
【００２７】
[0042]  例示的な諸実施形態では、本方法はＣＣＳＤを正規化することを含む。こうすることでＣＣＳＤ値が残基型の間で比較可能であることを保証することができる。例示的な諸実施形態では、標準スコアすなわちＺスコアもまた計算され、これは次式のように定義される。
【００２８】
【数３】
0005937077.tif 000004
ここで、μは所与の残基型での平均ＣＣＳＤ値、σは標準偏差、ｘは特定のＣＣＳＤ値である。Ｚを計算することは、「生の」ＣＣＳＤデータを翻訳するのに役立つ。平均及び標準偏差は、ベンチマーク構造物の大きい組についてＣＣＳＤを計算することによって得られる（次の各項の表１及び表２参照）。正規化ＣＣＳＤは、例えばヒストグラムを構築するのに有用なことがある。
【００２９】
[0043]  平均及び標準偏差は二次内挿によって得られる。要約すると、所与の減衰パラメータ及びプローブ半径について、平均及び標準偏差が３つの異なる緊密接触カットオフに対して計算される（例えば、３．６、４．０及び４．５Å）。これらの平均及び標準偏差は、わずかに非線形であることが見出される。二次形式は３つの点に適合しており、３つの点の間に内挿するのに用いられる。この構成が、３つの固有値と等しいカットオフ距離に対して平均及び標準偏差が厳密に正しいことを暗示することに注意されたい。
【００３０】
[0044]  いくつかの実施形態では、本方法はＣＣＳＤを減衰させることを含む。ＳＡｌｉｇ→０又はＳＡｒｅｃ→０などの特定の極限において、ＣＣＳＤに特異点が生じる。後者の極限は、その接触部が非常に小さくなり得るのでより関連があるものであるのに対して、他のリガンド残基との接触部はその極限にまれにしか近付かない。多項式特異点を減衰させる標準的な方法は、次式の指数関数的減衰である。
【００３１】
【数４】
0005937077.tif 000005
ここでβは、パラメータ化されなければならない数値減衰パラメータである。βがより小さいと減衰がより大きくなる。減衰パラメータを次式のように再公式化することが一般的である。
【００３２】
【数５】
0005937077.tif 000006
その結果、より大きい値がより大きい減衰を意味することになる。減衰の結果が図７に示されている。減衰パラメータαの値は０より大きくすることができ、好ましい諸実施形態では、約１０、２０、３０、４０及び５０の上限を有する。αの例示的な値は約２０〜約２５である。
【００３３】
[0045]  いくつかの実施形態では、本方法は複合体に対して実施され、その場合、複合体のメンバーの１つが変更されて、立体配座的に変更された結合パートナーを含む第２の複合体が得られる。次に、本方法は、結合パートナーの１つに対して繰り返される。これらの実施形態のいくつかでは、一方の結合パートナーの配列又は立体配座を変更することにより、他方の結合パートナーの立体配座が変化することがある。したがって、いくつかの実施形態では、１つの方法が、第１又は第２のタンパク質の立体配座を変更して、第２の立体配座の第１のタンパク質を得ること、及びこの第２の立体配座の第１のタンパク質に対して本方法の諸工程を繰り返すことをさらに含む。
【００３４】
操作
[0046]  例示的な諸実施形態では、本明細書の方法は、コンピュータモデリングのソフトウェア一式内のより大規模なシステムの１つ又は複数のコンピュータを使用して機械的に実施される。いくつかの実施形態では、スクリプトが、入力構造物に対して、また場合により軌跡フレームに対してアドオンを呼び出す。この新規のアドオンは次に、溶媒接近可能表面積アドオン「ＳＡＶｏｌｕｍｅＡｒｅａ」を使用して、密接原子を得るための様々な表面積及び接触部の数、ならびに接触電位を評価するためのデータ源からの距離測定値を計算する。アドオンは、パイソン辞書のうちの３つのパイソン辞書を返し、そのうちの１つは次のようである。
｛’ｌｉｇａｎｄ’：｛Ａ／２１．ＡＬＡ：０．４，Ａ／２２．ＩＬＥ：０．５，．．．｝、
’ｒｅｃｅｐｔｏｒ’：｛Ａ／２１．ＡＬＡ：０．２，Ａ／２２．ＩＬＥ：’Ｎ／Ａ’，．．．｝｝
【００３５】
[0047]  第１のレベルのキー、リガンド及びレセプターは、その量がそれぞれリガンド内の接触部に対するものか、それともレセプターに対するものかを知らせる。第２のレベルのキーは組内の残基対象である。３つの辞書では、これらの残基キーに対応する値はＣＣＳＤ、接触表面積及び接触電位から選択される。接触表面積がゼロである場合、対応するＣＣＳＤ値は「Ｎ／Ａ」である。
【００３６】
[0048]  この方法はまた、全くレセプターを用いずに実践することもでき、この場合、返される辞書は第１のレベルの１つのキーを有するだけである。
【００３７】
コンピュータシステムにおける実施
[0049]  説明した方法は、プロセッサ、メモリ（又はデータ記憶システム）及びクロックを含むコンピュータシステム上で実行されるコンピュータプログラムとして実施することができる。コンピュータプログラムは、特定の動作を行うために、または特定の結果をもたらすためにコンピュータ内で直接又は間接的に使用できる命令の組である。コンピュータプログラムは、コンパイル又は解釈された言語を含む任意の形式のプログラミング言語で書くことができ、独立型のプログラムとして含む、あるいはモジュール、構成要素、サブルーチン、関数、手順、又は計算環境で使用するのに適した他のユニットとして含む、任意の形で配置することができる。したがって、これらの方法は、本方法の諸工程を実施するようにプログラムされたコンピュータシステム上で実施される。
【００３８】
[0050]  プロセッサは、コンピュータシステムの動作を制御するために使用される。プロセッサは１つ又は複数の構成要素を備える。複数構成要素プロセッサでは、１つ又は複数の構成要素が、他のものに対して隔てて置かれることもあれば単一ユニットとして構成されることもある。さらに、プロセッサは、マルチプロセッサ構成体などの２つ以上の処理ユニットを有する形で具現化することができ、このような構成体ならびに単一プロセッサをベースとする構成を一括して指すことを理解されたい。プロセッサの１つ又は複数の構成要素は、デジタル回路、アナログ回路、又は両方を定義する電子的形態であり得る。プロセッサは、ソフトウェア命令、ハードワイヤード状態機械、又はこれらの組合せに応答するプログラム可能な形態とすることができる。
【００３９】
[0051]  当業者には、本明細書に開示されたいずれかの方法を実施するための命令を含むプロセッサが、このような命令を含まないプロセッサとは物理的に異なることは理解されよう。言い換えると、いかなる所与のプロセッサも、本明細書に開示されたいずれかの方法を実施するための命令を含むには物理的に変換されなければならない。
【００４０】
[0052]  その多くの機能の中で、プロセッサと組み合わせたメモリは、処理が行われるときにデータを記憶するために使用される。少し例を挙げると、メモリには、１つ又は複数のタイプの固体メモリ、磁気メモリ又は光学メモリが含まれ得る。非限定的な例として、メモリには固体電子ランダムアクセスメモリ（RAM）、先入れ先出し（FIFO）の形態、又は後入れ先出し（LIFO）の形態などの順次アクセスメモリ（SAM）、プログラム可能読出し専用メモリ（PROM）、電子的プログラム可能読出し専用メモリ（EPROM）、又は電子的消去可能プログラム可能読出し専用メモリ（BEPROM）；光学ディスクメモリ（DVD又はCD-ROMなど）；磁気符号化ハードディスク、フロッピー（登録商標）ディスク、テープ、又はカートリッジ媒体；あるいはこれらのメモリタイプの組合せが含まれ得る。加えて、メモリは揮発性、非揮発性、又は揮発性、非揮発性の形態の混成組合せでもよい。メモリにはさらに、取外し可能メモリが含まれてよく、これらのメモリは、非揮発性電子メモリユニット、光学メモリディスク（DVD又はCD-ROMなど）；磁気符号化ハードディスク、フロッピー（登録商標）ディスク、テープ、又はカートリッジ媒体；あるいはこれら又は他の取外し可能メモリタイプの組合せの形とすることができる。
【００４１】
[0053]  プロセッサ及びメモリは、特定用途向け集積回路（ASIC）によって補足すること、又はそれに組み込むことができる。コンピュータのプロセッサに読み込まれ、したがって物理的に変換され、実行され、又は実行の前にさらに処理されると、プログラムの命令は、本明細書に記載された様々な動作をプログラム可能コンピュータに実行させる。プロセッサとメモリは通常、バスで接続される。
【００４２】
[0054]  クロックは、システム内の時間事象に対して使用される。理解されるように、クロックは、プロセッサの中に組み込むことができ、あるいは独立型の構成要素とすることができる。さらに、クロックはハードウェア及び／又はソフトウェアをベースとするものにできる。
【００４３】
[0055]  ユーザとの対話を行うために、本発明は、ユーザに情報を表示するための例えば陰極線管（CRT）又は液晶ディスプレイ（LCD）モニタなどの表示デバイスを備えるコンピュータシステム上で実施することができる。ユーザは、例えばキーボード、タッチスクリーン、あるいはマウス又はトラックパッドなどのポインティングデバイスを介して入力することができる。
【００４４】
[0056]  本明細書に記載されたそれぞれ異なる態様及び実施形態は、データサーバなどの後置構成要素、アプリケーションサーバ又はインターネットサーバなどのミドルウェア構成要素、あるいはユーザインターフェース、インターネットブラウザ又はこれらの任意の組合せを有するクライアントコンピュータなどの前置構成要素を含むコンピュータシステムで実施することができる。システムのこれらの構成要素は、デジタルデータ通信の任意の形式又は媒体によって接続することができる。
【００４５】
[0057]  本システム及び本方法は、様々な構成のハードウェア上で実施することができる。したがって、いくつかの実施形態では、計算処理は、コンピュータクラスタの各ノード上、分散形計算システム内、又はグラフィック処理ユニット上で並行して、これらの構成体が当技術分野で理解されているように実施される。
【００４６】
[0058]  一態様では、本発明は、本明細書に記載されたいずれかの方法を実施するコンピュータシステムを提供する。一実施形態では、コンピュータシステムは、クロックと、メモリと、本明細書に記載されたいずれかの方法を実施するための命令を含むプロセッサとを備える。
【００４７】
[0059]  一態様では、本発明は、第１の立体配座の第１のタンパク質中の１つ又は複数の残基原子を含む残基のパッキング特性を定量化するコンピュータシステムを提供し、このコンピュータシステムは（１）クロックと、（２）メモリと、（３）その方法を実施するための命令を含むプロセッサとを備え、この方法は、（ａ）１つ又は複数の残基原子と１つ又は複数の周囲原子との間の距離に基づいて１つ又は複数の緊密接触電位を計算する工程と、（ｂ）１つ又は複数の周囲原子に曝される１つ又は複数の残基原子の接触面積を計算する工程と、（ｃ）１つ又は複数の緊密接触電位の合計を接触面積で割ることによって緊密接触面密度（CCSD）を計算する工程とを含む。例示的な諸実施形態では、この方法はＣＣＳＤを減衰させる工程をさらに含む。
【００４８】
[0060]  本明細書に開示されたコンピュータプログラムは、コンピュータ可読記憶システムに格納することができる。記憶システムの例には、それだけには限らないが、ＣＤ、ＤＶＤ、及びブルーレイディスク（ＢＤ）などの光学ディスク；光磁気ディスク；磁気テープ及び内蔵ハードディスク及び取外し可能ディスクなどの磁気媒体；ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ及びフラッシュメモリなどの半導体メモリデバイス；ＲＡＭ；及び他のタイプのメモリが含まれる。
【００４９】
[0061]  コンピュータ可読記憶システムは、コンピュータプログラムを含むように物理的に変換され得る。当業者には、本明細書に開示されたいずれかの方法を実施するための命令を含むコンピュータ可読記憶システムが、このような命令を含まないコンピュータ可読記憶システムとは物理的に異なることが理解されよう。言い換えると、いかなる所与のコンピュータ可読記憶システムも、本明細書に開示されたいずれかの方法を実施するための命令を含むには、物理的に変換されなければならない。本明細書に開示されたいずれかの方法を実施するための命令などのコンピュータ実行可能命令を含むコンピュータ可読記憶システムは、記憶システムと対話するコンピュータに１つの処理又は方法を実施させるために物理的に構成される。当業者には、本明細書に開示されたいずれかの方法を実施するためのコンピュータ実行可能命令を含むコンピュータ可読記憶システムが、汎用コンピュータによってアクセスされ読み込まれると、汎用コンピュータが専用コンピュータに変換されるであろうことが理解されよう。
【００５０】
[0062]  したがって、一態様で本発明は、本明細書に開示されたいずれかの方法を実施するためのコンピュータ実行可能命令を含むコンピュータ可読記憶システムを提供する。一実施形態では、コンピュータ可読記憶システムは、第１の立体配座の第１のタンパク質中の１つ又は複数の残基原子を含む残基のパッキング特性を定量化する方法のためのコンピュータ実行可能命令を含み、この方法は、この方法の各工程を実施するようにプログラムされたコンピュータ上で実施され、（ａ）１つ又は複数の残基原子と１つ又は複数の周囲原子との間の距離に基づいて１つ又は複数の緊密接触電位を計算する工程と、（ｂ）１つ又は複数の周囲原子に曝される１つ又は複数の残基原子の接触面積を計算する工程と、（ｃ）１つ又は複数の緊密接触電位の合計を接触面積で割ることによって緊密接触面密度（CCSD）を計算する工程とを含む。例示的な諸実施形態では、この方法はＣＣＳＤを減衰させる工程をさらに含む。
【００５１】
適用例
[0063]  本明細書に記載された方法及びシステムには、いくつかの有用な生物学上の適用例がある。特に、これらの方法及びシステムは、改善された安定性、パッキング、又は結合パートナーに対する結合親和性などの改善された特性を有する任意の数の分子を設計するのに使用することができる。
【００５２】
[0064]  一態様では、本発明は、親タンパク質を元にして変異タンパク質を設計する方法を提供し、この方法は、（ａ）親タンパク質に対して、本明細書に記載のコンピュータによって実行される方法を実施して第１のＣＣＳＤを得る工程と、（ｂ）親タンパク質の１つ又は複数の残基を変異させて変異タンパク質を得る工程と、（ｃ）変異タンパク質に対して、先行の実施工程（ａ）で選択されたコンピュータによって実行される方法を実施して第２のＣＣＳＤを得る工程と、（ｄ）第１のＣＣＳＤと比べた第２のＣＣＳＤが、親タンパク質と比して、同等の又は改善した変異タンパク質の安定性を示す場合に、変異タンパク質を作る工程と、を含む。
【００５３】
[0065]  「タンパク質」とは、生理学的諸条件下で明確な三次元構造を通常有する任意のポリペプチドである。「変異」タンパク質とは、その配列中に、参照「親」タンパク質を元にして１つ又は複数の変異（例えば、挿入、欠失及び置換）を含むタンパク質である。例示的な諸実施形態では、変異タンパク質は、親タンパク質のアミノ酸（又は残基）の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％又は２０％を置換することを特徴とする。いくつかの実施形態では、親タンパク質は野生型タンパク質である。
【００５４】
[0066]  一態様では、本発明は、親タンパク質複合体に対して変異タンパク質複合体を設計する方法を提供し、この方法は、（ａ）親タンパク質複合体に対して、本明細書に記載のコンピュータによって実行される方法を実施して第１のＣＣＳＤを得る工程と、（ｂ）親タンパク質複合体の１つ又は複数の残基を変異させて変異タンパク質複合体を得る工程と、（ｃ）変異タンパク質複合体に対して、先行の実施工程で選択された、コンピュータによって実行される方法を実施して第２のＣＣＳＤを得る工程と、（ｄ）第１のＣＣＳＤと比べた第２のＣＣＳＤが、親タンパク質複合体と比して、同等の又は改善した変異タンパク質複合体の安定性を示す場合に、変異タンパク質複合体を作る工程とを含む。
【００５５】
[0067]  一態様では、本発明は、タンパク質に選択的に結合するリガンドを作る方法を提供し、この方法は、（ａ）第１のリガンドに結合したタンパク質を含む第１の複合体に対して、請求項１〜１０のいずれかに記載のコンピュータによって実行される方法を実施して第１のＣＣＳＤを得る工程と、（ｂ）第２のリガンドに結合したタンパク質を含む第２の複合体に対して、先行の実施工程（ａ）で選択されたコンピュータによって実行される方法を実施して第２のＣＣＳＤを得る工程と、（ｃ）第１のＣＣＳＤと比べた第２のＣＣＳＤが、第１の複合体と比して、同等の又は改善した第２の複合体の安定性を示す場合に、第２のリガンドを作る工程とを含む。
【００５６】
[0068]  一態様では、本発明は、タンパク質相同モデルを構築する、コンピュータによって実行される方法を提供し、この方法は、（ａ）第１の立体配座のタンパク質又はタンパク質複合体に対して、本明細書に記載のコンピュータによって実行される方法を実施して第１のＣＣＳＤを得る工程と、（ｂ）タンパク質又はタンパク質複合体の決定論的又は確率論的シミュレーションを実施して、第２の立体配座のタンパク質又はタンパク質複合体を得る工程と、（ｃ）第２の立体配座のタンパク質又はタンパク質複合体に対して、先行の実施工程（ａ）で選択されたコンピュータによって実行される方法を実施して第２のＣＣＳＤを得る工程と、（ｄ）タンパク質又はタンパク質複合体の１つ又は複数の残基に対してＣＣＳＤが改善した場合に、第２の立体配座のタンパク質又はタンパク質複合体を受け入れる工程とを含む。例示的な諸実施形態では、タンパク質相同モデルを構築する方法は、（１）クロック、（２）メモリ、及び（３）プロセッサを備えるコンピュータシステム上で実施され、この方法の各工程はそのプロセッサを利用して実施される。
【００５７】
[0069]  いくつかの実施形態では、決定論的又は確率論的シミュレーションを実施する工程は、分子動力学シミュレーションを実施する工程を含む。確率変数を含まないシミュレーションモデルは決定論的として分類される。決定論的モデルは既知の組の入力を有し、この入力は固有の組の出力になる。生物学上の適用例では、分子動力学シミュレーションなどの決定論的シミュレーションは、通常には常微分方程式に基づく。これらのシミュレーションは当技術分野でよく知られており、Ａｄｃｏｃｋ及びＭｃＣａｍｍｏｎのＣｈｅｍ  Ｒｅｖ、２００６年、１０６：１５８９〜１６１５頁で再検討されている。
【００５８】
[0070]  確率論的シミュレーションは、入力として１つ又は複数の確率変数を利用する。いくつかの確率論的方法が当技術分野で知られており、これには例えば、モンテカルロ法及びメトロポリスモンテカルロ法が含まれる。モンテカルロ法では計算アルゴリズムのクラスを形成し、このアルゴリズムは、その結果を計算するのに繰り返しランダムサンプリングに依拠する。これらの方法は多様であるが、通常は（１）あり得る入力の領域を定義する工程と、（２）その領域にわたる確率分布から無作為に入力を生成する工程と、（３）これらの入力に対して決定論的計算を行う工程と、（４）その結果をまとめる工程とを含む。例えば、Ｓｏｂｏｌ  Ｉ．Ｍ．のＡ  Ｐｒｉｍｅｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｍｏｎｔｅ  Ｃａｒｌｏ  Ｍｅｔｈｏｄ．Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、ＦＬ：ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９９４年を参照されたい。モンテカルロシミュレーションにおけるメトロポリス基準は、温度依存性エネルギー関数条件付きを導入し、これは、詳細な平衡に追従して状態の均衡サンプリングを実現する。Ｍｅｔｒｏｐｏｌｉｓ他のＴｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ、１９５３年、２１：１０８７〜１０９２頁を参照されたい。
【００５９】
[0071]  したがって、いくつかの実施形態では、決定論的又は確率論的シミュレーションを行う工程は、モンテカルロシミュレーションを実施する工程を含む。
【００６０】
[0072]  いくつかの実施形態では、本方法は、複数の主鎖原子に対するタンパク質主鎖の自由度のモンテカルロサンプリングと、複数の側鎖原子に対する離散化側鎖の自由度のモンテカルロサンプリングとを実施することを含む。
【００６１】
[0073]  本発明はまた、本明細書に開示された方法により作製されるタンパク質、タンパク質複合体、リガンド、及び他の分子を提供する。
【実施例】
【００６２】
[0074]  緊密接触面密度（CCSD）法の試験及び検証では、ある結合パートナーに面する、また場合によりアミノ酸鎖中の他の残基を伴う、残基の領域のパッキングの特性が定量化された。本方法は、単一構造物又は軌跡に対して用いることができる。各実施例では、関連パラメータの値は、ｒｃ＝３．６Å、ｄ＝０．２Åであった。接触面積は上述の通りに計算された。
【００６３】
[0075]  高分解能タンパク質複合体構造体の展開Ｄｏｃｋｇｒｏｕｎｄ  ３．０（商標）ベンチマークデータベースが、タンパク質−タンパク質界面の残基型ごとのＣＣＳＤの分布に関する統計を得るために使用される。Ｄｏｃｋｇｒｏｕｎｄ（商標）プロジェクトは、このような技法の開発のための資源を提供するように、ならびにタンパク質界面についての我々の知識を向上させるように設計されている。Ｄｏｃｋｇｒｏｕｎｄ（商標）の背景については、Ｄｏｕｇｕｅｔ  Ｄ他の「ＤＯＣＫＧＲＯＵＮＤ  ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ｆｏｒ  ｓｔｕｄｙｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ」、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２００６年１１月、２２（２１）：２６１２〜２６１８頁と、Ｇａｏ  Ｙ他の「ＤＯＣＫＧＲＯＵＮＤ  ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  ｄａｔａｂａｓｅｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ：Ｕｎｂｏｕｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｄｏｃｋｉｎｇ」、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、２００７年９月５日；６９（４）：８４５〜８５１頁と、Ｌｉｕ  Ｓ他の「Ｄｏｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｏｃｋｉｎｇ  ｄｅｃｏｙ  ｓｅｔ」、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２００８年、２４（２２）：２６３４〜２６３５頁とを参照されたい。
【００６４】
[0076]  同じ構造体が、リガンドだけのパッキングについてのデータを得るために使用された。
【００６５】
（実施例１）
残基型分布
[0077]  ＣＣＳＤは、Ｄｏｃｋｇｒｏｕｎｄ  ３．０（商標）データセット中のリガンドのすべての界面残基について計算され、残基型ごとのデータに分解された。その正規化ヒストグラムは図２に示されている。スペクトルの白色末端の方の色は大きい母集団を意味し、黒色末端の方の色は小さい母集団を意味する。
【００６６】
[0078]  表１に、ＣＣＳＤ分布の統計がデータ点のサブセットに対して示されており、ＣＣＳＤ値は、厳密にゼロよりも大きく、また厳密に０．２５Å−２よりも小さい。
【００６７】
【表１】
0005937077.tif 000007
【００６８】
[0079]  数値は、異なる残基に対して比較可能な大きさであり、それによって本発明の方法の利点の１つ、すなわち異なる型の残基の間で比較可能なパッキング特性の定量化が実証される。
【００６９】
[0080]  ＬＥＵ、ＩＬＥ、ＭＥＴ及びＰＲＯなどのいくつかの残基は、残りのものよりいくぶん小さい平均値を有する。最初の３つは疎水性残基であり、界面のコアを占めることが知られている。これらはまた脂肪族側鎖を有し、この脂肪族側鎖により、界面のコアを占めることがやはり知られているが典型的なＣＣＳＤ平均値を与えた３つの残基型であるＰＨＥ、ＴＹＲ及びＴＲＰから差別化される。
【００７０】
[0081]  タンパク質界面におけるＬＥＵ、ＩＬＥ及びＭＥＴに対するより低いＣＣＳＤの値は、これらの側鎖が芳香族側鎖と比較して十分にパッキングすることが概して困難であるという指標になり得る。最後に、ＰＲＯは界面によくあるものでなく、通常はフォールディングにおいて特別な位置を占めて、多くの場合に例外的な残基であることが多い。
【００７１】
[0082]  図３に、接触面積の分布が参照用に示されている。ＣＣＳＤ値は、別のリガンド残基によるリガンド残基のパッキングを計算することによって得られる。
【００７２】
[0083]  表２には、それぞれの残基型の統計が、１−５以上を含む接触部だけが数えられるシナリオで示されている。表３には、１−３以上を含む接触部だけが数えられた場合の同じ統計が示されている。
【００７３】
【表２】
0005937077.tif 000008
【００７４】
【表３】
0005937077.tif 000009
【００７５】
[0084]  これらの傾向は、数値的には大きく異なるが、結合接触部を取り扱う２つのやり方の間で非常に類似している。
【００７６】
[0085]  表１と表２の比較で、１−５以上を含む接触部だけがリガンド内で数えられる場合（表２）、ＣＣＳＤの大きさは、レセプターとの非結合接触部だけが数えられる場合（表１）のＣＣＳＤの大きさと非常に類似していることが示される。この観察は、多くの生体分子力場では１−２、１−３接触部間の非結合相互作用を計算せず、１−４非結合相互作用を有意に評価するという事実に適合する。
【００７７】
（実施例２）
パッキングの改善及び悪化
[0086]  Ｒａｃ／ｐ６７ｐｈｏｘタンパク質−タンパク質複合体（PDB Accession Record 1E96、DockGround 3.0（商標）データセットの一部でもある）が、いくつかの選択された位置での残基交換の調査及びその後の構造解析によってＣＣＳＤの能力をさらに示すために使用され、構造解析では、パッキング特性が構造物の３次元グラフィックレンダリングによって評価された。別のタンパク質である鎖Ｂと接触する、Ａ／２６．ＡＳＮ及びＡ／３１．ＧＬＵと示された鎖Ａ内の位置ＡＳＮ２６及びＧＬＵ３１は、高いＣＣＳＤを有することが見出された。やはり界面にある位置Ａ／２７．ＡＬＡは、低いＣＣＳＤを有することが見出された。いくつかの交換が行われ、周囲の残基が再パッキングされた。交換された位置の残基に対するＣＣＳＤが計算され、その結果が表４に示されている。
【００７８】
【表４】
0005937077.tif 000010
【００７９】
[0087]  すべての場合が構造上の意味をなすこと、ならびに変異の後に失われる、又は獲得される極性及び非極性の接触部がＣＣＳＤ法によって合理的に定量化されることが確認された。どちらの場合も衝突が大きな値の原因ではなかった。
【００８０】
（実施例３）
軌跡解析：インスリンレセプター「ＩＲ＿１１」
[0088]  インスリンレセプター（PDB Accession Record 2DTG）からのＩＲ＿１１タンパク質−タンパク質複合体のシミュレーションの分子動力学軌跡解析において、複合体の部分的破壊分解が起こることが知られている。Ａｍｂｅｒ９９力場がタンパク質に対して使用され、ＴＩＰ３Ｐが水に対して使用された。シミュレーションは、ＮＰＴアンサンブルにおいて、２．０ｆｓの時間工程で、周期的境界条件及び１２Å非結合カットオフで実行された。
【００８１】
[0089]  解析を時間がかからないものにするために、３０番目ごとのフレームだけがサンプリングされて、合計が６５９フレームになった。
【００８２】
[0090]  図４にＣＣＳＤが、界面残基に対する軌跡フレームとの関数として図示されている。最大値は０．２５Å−２に設定されている。
【００８３】
[0091]  Ｂ／３６．ＬＹＳに対するＣＣＳＤ値が図４に、Ｂ／３５．ＧＬＮとＢ／３８．ＰＨＥの各軌跡フレーム軸の間にある標示のない軌跡フレーム軸に沿って示されている。Ｂ／３６．ＬＹＳに対するデータは、一貫して高い値を示す。レセプターに対する構造及び接触面積のより綿密な検査で（図５参照）、Ｂ／３６．ＬＹＳがレセプターとの塩橋接触部だけを有することが示される。したがって、この結果は、Ｂ／３６．ＬＹＳが得たレセプターとの小さい接触部が非常に十分にパッキングされた接触部であるという意味で正しい。
【００８４】
[0092]  Ａ／５３．ＧＬＹに対するＣＣＳＤ値が図４に、Ａ／５２．ＴＲＰとＡ／５４．ＡＳＰの各軌跡フレーム軸の間にある標示のない軌跡フレーム軸に沿って示されている。Ａ／５３．ＧＬＹは、ゼロから非常に高くまで動く大幅な変動を示す。これは、Ａ／５３．ＧＬＹが緊密接触部を有するのと接触部を全く有さないのとの間で変動することを示すものである。これは、グリシンのサイズが小さいことを考えると理にかなった挙動である。
【００８５】
[0093]  この解析の興味深い副作用は、複合体の破壊分解が非常に明白になることである。左から１番目のバンドの接触部は、軌跡内の数フレーム後に見えなくなるか、又は薄くなる。
【００８６】
[0094]  図６に、軌跡内のすべてのフレームについての、レセプターとの界面のすべての残基型に対する接触面積とＣＣＳＤの間の相関関係が示されている。
【００８７】
[0095]  これは、例外的に高いＣＣＳＤが数値不安定さの結果であることを示す。したがって、約１０〜１５Å２未満の接触面積から得られたＣＣＳＤ、又は約０．２５〜０．３０Å−２より大きいＣＣＳＤは、場合により、パッキング特性について提供する情報が少ないことがある。数値不安定さの影響を軽減するために、特に接触面積が小さい場合には、ＣＣＳＤを減衰させることが有利であり得る。
【００８８】
[0096]  これらのデータはまた、小さな構造上の変動に対するＣＣＳＤの安定性についての情報を与える。ほとんどの場合で、接触面積が非常に小さく、かつＣＣＳＤが減衰されていない場合を除いて、ＣＣＳＤは定性的に安定である。
【００８９】
[0097]  したがって本方法は、構造の目視検査と一致して、パッキングの特性を定量化するのに有用であると示されたことになり、それによって、接触を改善又は悪化する変異を特定することが可能になる。
【００９０】
（実施例４）
[0098]  パッキングの特性は、遍在する分散相互作用すなわちロンドン力と関係がある。より密にパッキングされた構造物はより強い相互作用を伴い、したがって、２つのタンパク質間のより大きい結合親和力を、又は非フォールディング状態に対して改善されたフォールディング状態の熱力学的安定性を一般に暗示することが予想される。ＣＣＳＤ計量は、実験から得た親和力データと確かに相互に関連していることが示された。
【００９１】
[0099]  一組のタンパク質複合体が、残基を選択的に変異させること、及び結合親和力の変化を測定することによって、広範囲にわたって実験的に調査された。これらの複合体は、レセプター細胞外ドメインを有する複合体としてのヒト成長ホルモン（PDB Accession Record 1A22）、アンギオジェニン複合体を有するリボヌクレアーゼインヒビター（PDB Accession Record 1A4Y）、バルナーゼ−バルスター複合体（PDB Accession Record 1BRS）、免疫タンパク質ＩＭ９を有する複合体としての大腸菌コリシンＥ９デオキシリボヌクレアーゼドメイン（PDB Accession Record 1BXI）、ウシ膵臓トリプシンインヒビターと複合体を形成したウシキモトリプシン（PDB Accession Record 1CBW）、インヒビターシチメンチョウオボムコイド第３ドメインを有するαキモトリプシン（PDB Accession Record 1CHO）、抗イディオタイプ抗体Ｅ５．２を有するイディオタイプ抗体Ｄ１．３（PDB Accession Record 1DVF）、抗体−抗原複合体Ａ６抗原結合性フラグメント−インターフェロンγＲ１−１０８（PDB Accession Record 1JRH）、βラクタマーゼインヒビタータンパク質を有するＴＥＭ−１βラクタマーゼ（PDB Accession Record 1JTG）、抗原−抗体複合体、ニワトリ卵白リゾチームを有する抗ニワトリ卵白リゾチーム抗体Ｄ１．３（PDB Accession Record 1VFB）、抗体−抗原複合体、ニワトリ卵白リゾチームを有する抗リゾチームＨｙＨＥＬ−１０（PDB Accession Record 3HFM）である。このようにして、実験的な観察可能なもの（ΔΔＧ値）が得られる。親和力データは別々の出版物で入手可能であるが、Ｈａｎｄｅｌ及び共同研究者によってまとめられた。Ｃｈｏｗｄｒｙ，Ａ．Ｂ．；Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｋ．Ａ．；Ｈａｎｅｓ，Ｍ．Ｓ．；Ｖｏｏｒｈｉｅｓ，Ｍ．；Ｐｏｋａｌａ，Ｎ．；Ｈａｎｄｅｌ，Ｔ．Ｍ．のＪ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．，２００７年，２８：２３７８頁。全体で、５４１個の変異についての実験データが考察された。
【００９２】
[00100]  高品質インシリコ（in silico）タンパク質再パッキング技術を使用して、変異による構造上の変化が５４１個すべての変異について予測された。ＣＣＳＤは構造ごとに計算され、ＣＣＳＤが熱力学的な観察可能なΔΔＧを予示するという仮説を考査するために、野生型の構造と比較したＣＣＳＤの変化が実験から得た親和力と関係付けられた。
【００９３】
[00101]  表５に、ΔΔＧとＣＣＳＤ  Ｚスコアの変化との間の順位相関が、相関係数に対して推定されたＰ値と共に示されている。温変異体は−０．６ｋｃａｌ／モル未満のΔΔＧを有すると定義され、冷変異体は０．６ｋｃａｌ／モルより大きいΔΔＧを有すると定義されている。
【００９４】
【表５】
0005937077.tif 000011
【００９５】
[00102]  表５で、順位相関は非ゼロであり、Ｐ値は表５で非常に小さい。その結果、ＣＣＳＤ  Ｚスコアの値は、実験で観察可能なΔΔＧを予示する。
【００９６】
[00103]  ＣＣＳＤ  Ｚスコアが熱力学的な観察可能なものを予示することをさらに立証するために、混同行列（又は分割表）が表６に示されている。この混同行列は、ＣＣＳＤ  Ｚスコアがどれだけ適切に所与のインシリコ変異を「結合親和力を増大」及び「結合親和力を低下」の２つのカテゴリに分類できるかを示す。本発明者らは、ＣＣＳＤ  Ｚスコアの正の値を結合親和力の増大の予測、負の値を低下の予測と定義する。
【００９７】
【表６】
0005937077.tif 000012
【００９８】
[00104]  表６は、組内のすべての変異のうち、１５．４％が結合親和力を改善すると実験的に判定され、これらのうちの０．０８５／０．１５４＝５５．２％が結合親和力を増大するとＣＣＳＤ  Ｚスコアによって予測されていることを示す。言い換えると、本方法の統計的感度は、この特定のデータセットに対しては５５．２％である。この統計的特異度は０．５４９／０．８４６＝６４．９％であることが見出され、これはＣＣＳＤ  Ｚスコアが、結合親和力をそのように低下させる変異をどれだけ適切に正しく予測するかの指標になる。したがって、１から統計的特異度を引いたもので割った感度と定義される尤度比は１．５７になる。
【００９９】
[00105]  これらの結果により、
１．ＣＣＳＤ  Ｚスコアは実験で得た親和力と相互に関連し、したがって、１組の変異がこの計量により順位付けられる場合、負／正のΔΔＧ値を有する変異のより高い百分率が、ランダム推測と比較して、分布のより上方／下方の百分率に見出されることになり、
２．ＣＣＳＤ  Ｚスコアは、所与の変異が結合親和力を増大させるか、それとも低下させるかをランダムな統計的精度よりもよい精度で予測する。
【０１００】
[00106]  これらの結果は、ＣＣＳＤ  Ｚスコアが、タンパク質工学に関連する熱力学的特性（変異による結合のΔΔＧ）と関連し、したがって、構造誘導の、合理的な、計算タンパク質工学の精度を改善し、コストを低減することができることの強力な証拠である。
【０１０１】
[00107]  実施例５、６及び７は、減衰係数に特に注目してｃｃｓｄ＿ｒｅｃｅｐｔｏｒ値の変化についての解析を提示する。以下のモデルが解析に用いられ、全モデルに対して減衰パラメータのアルファ減衰が０から３０まで変えられた。
１．「Ｒｅｐｅａｔ  １〜５」：Ｆｃ：ＦＣＲ複合体のＣＨ３ドメインの側鎖及び主鎖の立体配座の広範な反復ランダムウォークサンプリングにより生成されたＦｃ：ＦｃＲ（IIIaF）複合体の４つの相同モデル；４つのモデルの唯一の違いは、ランダムウォークサンプリングで使用される擬似乱数発生器に用いられる乱数のシードである。４つのモデルは「ｒｅｐｅａｔ＿１」、「ｒｅｐｅａｔ＿２」、「ｒｅｐｅａｔ＿３」、及び「ｒｅｐｅａｔ＿５」と標示される。
２．「Ｒｅｐｅａｔ＿ｃ１〜５」：サンプリングが全Ｆｃ中の側鎖及び主鎖に対して行われたことが唯一の違いである、モデル１と同じ手順を用いて生成されたＦｃ：ＦｃＲ（IIIaF）複合体の５つの相同モデル。５つのモデルは「ｒｅｐｅａｔ＿ｃ１」、「ｒｅｐｅａｔ＿ｃ２」、「ｒｅｐｅａｔ＿ｃ３」、「ｒｅｐｅａｔ＿ｃ４」及び「ｒｅｐｅａｔ＿ｃ５」と標示される。
３．バックラブ軌跡：以下から得られた構造の２つのアンサンブル。
（ａ）上記のｒｅｐｅａｔ＿１のモデルを生成するために使用されたランダムウォークからの約１００個のスナップショット、及び
（ｂ）Ｆｃ：ＦｃＲのＣＨ３ドメイン内の位置Ａ／３６６、Ａ／３９２、Ａ／３９４、Ｂ／３５１、Ｂ／３６８、Ｂ／３９７、Ｂ／４０５及びＢ／４０７の付近の残基位置に限られたランダムウォークを用いる短い主鎖立体配座サンプリングから得られた５つのスナップショット。
【０１０２】
[00108]  タンパク質中の１つ又はいくつかの主鎖セグメントの主鎖立体配座を効率的にサンプリングするために用いられる方法の詳細は、Ｂｅｔａｎｃｏｕｒ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．、２００５年、１２３：１７４９０５頁に見出すことができる。
【０１０３】
（実施例５）
個々のＩＲモデルで減衰を用いたＣＣＳＤ＿ｒｅｃｅｐｔｏｒ変化の解析
[00109]  図８、９及び１０は、それぞれ減衰パラメータ値が０、１５、及び２５である減衰係数を使用して計算されたＣＣＳＤ＿ｒｅｃｅｐｔｏｒ値を示す。減衰係数は、減衰を用いないデータと比べて明確な改善を示す。予想されるように、低いｂｕｒｉｅｄ＿ｓａｓａ（３６４、３５７、３６８、（３９９））を有する埋込み界面残基は、低減された変化を示す。低いｂｕｒｉｅｄ＿ｓａｓａを有する残基に対するＣＣＳＤ＿ｒｅｃｅｐｔｏｒ値は、減衰係数の増大に伴って全体的に低減される。提案される最良の減衰値は２０〜２５である。この値において、データは、高いＣＣＳＤ値に伴う明確な外れ値の低減を示し、より小さい残基のいくつかに対し低くなったＣＣＳＤ値は、親和力に対する重要性が疑わしいので許容される。重要なことには、高いスコアリングホットスポット（４０７）は、減衰係数の影響を受けない。
【０１０４】
【表７】
0005937077.tif 000013
【０１０５】
（実施例６）
バックラブ軌跡上のＣＣＳＤ＿ｒｅｃｅｐｔｏｒ変化の解析
[00110]  構造物の２つのアンサンブルのバックラブ軌跡が、２つの減衰パラメータ０及び２５を使用して解析された。この構造物のアンサンブルは、（ａ）上記のＲｅｐｅａｔ＿１のモデルを生成するために使用されたランダムウォークからの約１００個のスナップショット、及び（ｂ）Ｆｃ：ＦｃＲのＣＨ３ドメイン内の位置Ａ／３６６、Ａ／３９２、Ａ／３９４、Ｂ／３５１、Ｂ／３６８、Ｂ／３９７、Ｂ／４０５及びＢ／４０７の付近の残基位置に限られたランダムウォークを用いる短い主鎖立体配座サンプリングから得られた５つのスナップショット、から得られた。
【０１０６】
[00111]  この解析の結果は図１１〜１４に示されている。アルファ減衰係数２０及び２５では明確な改善が示され、ＩＲ再パッキングバックラブ軌跡の解析は個々の再パッキングの解析と類似であった。一方、パッキングワークフローアイデンティティ再パッキングのバックラブ軌跡では、ごくわずかのＣＣＳＤ値の変化が示されている。アルファ減衰係数は、ＣＣＳＤ値を概算できるが、パッキングワークフロー／バックラブ自体に起因してアーチファクトのいくつかがありそうである。
【０１０７】
（実施例７）
個々のＩＲモデルでの近接カットオフ＝３．６、４．０、４．５、及びアルファ減衰＝０、１５の変化に伴うＣＣＳＤ＿ｒｅｃｅｐｔｏｒ変化の解析
[00112]  レセプターに対するＣＣＳＤが、変化させたカットオフ値及び減衰パラメータを用いて得られた。０及び１５の減衰パラメータで、３．６Åのカットオフ値を使用した結果が図８及び図９に示され、４．０Å及び４．５Åのカットオフ値に対する結果が図１５〜１８に示されている。カットオフ距離にかかわらず、全体のＣＣＳＤプロファイルは非常に類似している。アルファ減衰と一緒に＞４．０Åに増大されたカットオフでは、３．６Åカットオフデータの情報を失うことなく予測可能性が改善する。指数関数的減衰により、人為的に大きい変化の問題が低減し、２０〜２５の範囲内の値が最適のようである。ＣＣＳＤは、３．６Åと４．０Åの距離カットオフの間でいかなる顕著な違いも示さない。このことだけに基づくと、異なるカットオフを用いて多数のＣＣＳＤ計算をすることに何らかの付加的な利益があるかどうかは不明である。
【０１０８】
[00113]  ＣＣＳＤで観察される変化の一部は、その点において構造が非常に可撓性であるならば、真の変化である。ＣＣＳＤは、これらの顕著な構造上の変化に対して変化しないほど粗雑には設計されていなく、それゆえに同様に変化を示すことになる。問題は、タンパク質の構造的に可撓性のある領域が、パッキングワークフローでの短いバックラブ軌跡において、そのままでは適正にモデル化されないことである。それゆえに、これはＣＣＳＤ計量自体の問題ではない。
【０１０９】
[00114]  本明細書で用いた冠詞「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈により特に明示しない限り複数の指示対象を排除しない。接続詞「又は（or）」は、文脈により特に明示しない限り相互排他的ではない。用語「含む（include）」は非網羅的な例を指すために用いられる。
【０１１０】
[00115]  あらゆる添付書類中のものを含め、本明細書で引用されたすべての参照文献、出版物、特許出願書、発行特許、受入記録及びデータベースは、参照によりその全体がすべての目的のために組み込まれる。
【図１】
0005937077.tif 000014
【図２】
0005937077.tif 000015
【図３】
0005937077.tif 000016
【図４】
0005937077.tif 000017
【図５】
0005937077.tif 000018
【図６】
0005937077.tif 000019
【図７】
0005937077.tif 000020
【図８】
0005937077.tif 000021
【図９】
0005937077.tif 000022
【図１０】
0005937077.tif 000023
【図１１】
0005937077.tif 000024
【図１２】
0005937077.tif 000025
【図１３】
0005937077.tif 000026
【図１４】
0005937077.tif 000027
【図１５】
0005937077.tif 000028
【図１６】
0005937077.tif 000029
【図１７】
0005937077.tif 000030
【図１８】
0005937077.tif 000031