(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Rag2遺伝子及びJak3遺伝子がともに欠損した免疫不全マウスの胚を、GSK3阻害剤及びMEK阻害剤の存在下で培養して得られる胚性幹細胞。
【請求項２】
受託番号がNITE BP-1297で示される、請求項１に記載の胚性幹細胞。
【請求項３】
エストロゲン受容体遺伝子及びジフテリアトキシン遺伝子が導入された、請求項１又は２に記載の胚性幹細胞。
【請求項４】
細胞中に内在する成長ホルモン遺伝子がヒト由来のものに置換された、請求項３に記載の胚性幹細胞。
【請求項５】
さらに、細胞中に内在する薬物代謝酵素遺伝子がヒト由来のものに置換された、請求項４に記載の胚性幹細胞。
【請求項６】
細胞中に内在する薬物代謝酵素遺伝子が、Cyp3a11、Cyp3a13、Cyp3a25及びCyp3a41からなる群から選択される少なくとも１つである請求項５に記載の胚性幹細胞。
【請求項７】
請求項３〜６のいずれか１項に記載の胚性幹細胞を用いて作出された、トランスジェニックマウス。
【請求項８】
抗エストロゲン剤の投与により肝細胞障害を引き起こす、請求項７に記載のマウス。
【請求項９】
請求項７又は８に記載のマウスにヒト由来肝細胞を移植するとともに、抗エストロゲン剤を投与して当該マウス由来肝細胞を除去したことを特徴とする、肝臓がヒト化されたマウス。
【請求項１０】
ヒト由来肝細胞が、肝臓疾患を有する患者由来のものである請求項９に記載のマウス。
【請求項１１】
請求項１０に記載のマウスからなる、ヒト肝臓疾患モデルマウス。
【請求項１２】
Rag2遺伝子及びJak3遺伝子がともに欠損した免疫不全マウスの胚を、GSK3阻害剤及びMEK阻害剤の存在下で培養することを特徴とする、免疫不全マウス由来の胚性幹細胞の製造方法。
【請求項１３】
請求項７又は８に記載のマウスに抗エストロゲン剤を投与することを特徴とする、肝臓障害モデルマウスの作出方法。
【請求項１４】
請求項７又は８に記載のマウスにヒト由来肝細胞を移植するとともに、抗エストロゲン剤を投与してマウス由来肝細胞を除去することを特徴とする、肝臓がヒト化されたマウスの作出方法。
【請求項１５】
ヒト由来肝細胞が、肝臓疾患を有する患者由来のものである、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫不全マウスから採取された胚性幹細胞（ＥＳ細胞）及び肝臓がヒト化されたマウスに関する。
【背景技術】
【０００２】
肝臓は、代謝、排出、解毒、体液の恒常性の維持などにおいて体内の中心的役割を担う臓器である。肝臓は生体内で唯一再生する臓器であり、全重量の約８０％を切除しても、元の重量にまで再生する能力を有することが知られている。
肝臓の機能は多岐にわたることから、肝臓では多数の遺伝子が発現するが、その分、肝臓で発現する遺伝子の異常による遺伝病が多数存在する。
肝疾患等により肝機能に異常が生じた場合、肝臓移植以外に有効な治療法がない場合もある。このため、発症初期の段階でヒト血中代謝産物の予測の必要性が高くなった。血中代謝産物や肝機能を適切に予測するためには、肝臓をヒト化した動物の開発が必要である。
従来、ヒト肝臓のモデルマウスの作製に関し、例えば、Ｈｅｃｋｅｌらは、アルブミン（Ａｌｂ）プロモータにｕｒｏｋｉｎａｓｅ型のプラスミノーゲンアクチベーター（Ｐｌａｕ）遺伝子を連結したコンストラクト（Ａｌｂ−Ｐｌａｕ）が導入されたトランスジェニックマウス（Ｔｇ（Ａｌｂ−Ｐｌａｕ）について報告した（非特許文献１：Ｈｅｃｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ６２：４４７−４５６，１９９０））、しかしながら、このマウスは生後４日目までに腸管等の出血で死亡するため実験に使用することができない。これに対し、Ｔｇ（Ａｌｂ−Ｐｌａｕ）の中で、生き残る個体の系統の樹立に成功し、肝細胞が分裂中にＡｌｂ−Ｐｌａｕ遺伝子を欠損した肝細胞によって肝臓が再生された例が報告されている（非特許文献２：Ｓａｎｄｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ６６：２４５−２５６，１９９１）。また、メタロチオネインプロモーターにｌａｃＺ遺伝子を連結したコンストラクトが導入されたマウス、すなわち、ドナーとなる肝細胞をマーカー遺伝子であるｌａｃＺで標識したトランスジェニックマウス（Ｔｇ（ＭＴ−ｎＬａｃＺ）マウス）の成体肝細胞をＴｇ（Ａｌｂ−Ｐｌａｕ）に移植し、成功した例がある（非特許文献３：Ｒｈｉｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３：１１４９−１１５２，１９９４）。
さらに、免疫不全マウスにヒト肝細胞の移植を行った例がある。例えば、Ｒａｇ２−／−遺伝子欠損免疫不全マウスに対し肝細胞を移植し、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の感染実験を行った例（非特許文献４：Ｄａｎｄｒｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３３：９８１−９８８，２００１）、あるいはＴｇ（Ａｌｂ−Ｐｌａｕ）と免疫不全マウスであるＳＣＩＤを交配し、免疫不全となったＳＣＩＤマウス（Ｔｇ（Ａｌｂ−Ｐｌａｕ））にヒト肝細胞を移植し（Ｔｇ（Ａｌｂ−Ｐｌａｕ）；ＳＣＩＤ））、Ｃ型肝炎ウイルスの感染実験を行った例（非特許文献５：Ｍｅｒｃｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．７：９２７−９３３，２００１）などがある。
さらに、Ｔａｔｅｎｏらは、肝臓に障害を持つアルブミン  エンハンサー／プロモーター  ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベータートランスジェニックマウス（ｕＰＡマウス）とＳＣＩＤマウスとを掛け合わせ、どちらの形質もホモ接合体であるｕＰＡ／ＳＣＩＤトランスジェニックマウスを作製した（非特許文献６：Ｔａｔｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ  １６５：９０１−９１２，２００４）。この報告では、ヒト肝細胞のＴｇ（Ａｌｂ−Ｐｌａｕ；ＳＣＩＤ）への移植法の改良について記載されており、Ｆｕｔｈａｎ処理によってヒト肝細胞からの補体の影響を排除して高キメラでも死亡率を低下させている。
さらに、Ｒａｇ２遺伝子を欠損した免疫不全マウスをモデルとして遺伝子治療への可能性を実証した研究も報告されている（非特許文献７：整形・災害外科「分子レベルからみた整形外科疾患シリーズＩＶ体細胞クローン技術と再生医療」Ｖｏｌ．４５，ＮＯ．１１，ＰＡＧＥ．１０４０−１０４１，２００２）。
しかし、これらのモデルマウスでは、宿主であるマウスの肝臓細胞が残り、１００％の細胞がヒト由来の細胞に置換された肝細胞モデルではない。また、必ずしもヒト由来細胞が再生されるわけではなく、ヒト由来の細胞を移植せざるを得ない。さらに、マウス由来の肝臓細胞が残存していると、ヒトの肝機能の検証が不十分となる。
他方、生殖系列へ伝達するＮＯＧマウス由来ＥＳ細胞株の樹立のため、分化シグナル阻害剤（ＰＤ０３２５９０１、ＣＨＩＲ９９０２１）を用いることで、ＥＳ細胞を樹立する試みもなされている（非特許文献８：日本実験動物学会総会講演要旨集  Ｖｏｌ．５８ｔｈ，Ｐａｇｅ  ２１０，２０１１）。
しかしながら、ＮＯＧマウスは繁殖が難しい点で、実験用に多数のマウスを得ることが困難である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｈｅｃｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ６２：４４７−４５６，１９９０
【非特許文献２】Ｓａｎｄｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ６６：２４５−２５６，１９９１
【非特許文献３】Ｒｈｉｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３：１１４９−１１５２，１９９４
【非特許文献４】Ｄａｎｄｒｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３３：９８１−９８８，２００１
【非特許文献５】Ｍｅｒｃｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．７：９２７−９３３，２００１
【非特許文献６】Ｔａｔｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ  １６５：９０１−９１２，２００４
【非特許文献７】整形・災害外科「分子レベルからみた整形外科疾患シリーズＩＶ体細胞クローン技術と再生医療」Ｖｏｌ．４５，ＮＯ．１１，ＰＡＧＥ．１０４０−１０４１，２００２
【非特許文献８】日本実験動物学会総会講演要旨集  Ｖｏｌ．５８ｔｈ，Ｐａｇｅ  ２１０，２０１１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、免疫不全マウスから採取された胚性幹細胞（ＥＳ細胞）及び肝臓がヒト化されたマウスを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、Ｒａｇ２遺伝子及びＪａｋ３遺伝子がともに欠損した免疫不全マウスの胚から、ヒト肝細胞移植に最適なマウスを作出することが可能な胚性幹細胞が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の通りである。
（１）Ｒａｇ２遺伝子及びＪａｋ３遺伝子がともに欠損した免疫不全マウスの胚を、ＧＳＫ３阻害剤及びＭＥＫ阻害剤の存在下で培養して得られる胚性幹細胞。
（２）受領番号がＮＩＴＥ  ＡＢＰ−１２９７で示される、（１）に記載の胚性幹細胞。
（３）エストロゲン受容体遺伝子及びジフテリアトキシン遺伝子が導入された、（１）又は（２）に記載の胚性幹細胞。
（４）細胞中に内在する成長ホルモン遺伝子がヒト由来のものに置換された、（３）に記載の胚性幹細胞。
（５）さらに、細胞中に内在する薬物代謝酵素遺伝子がヒト由来のものに置換された、（４）に記載の胚性幹細胞。
（６）細胞中に内在する薬物代謝酵素遺伝子が、Ｃｙｐ３ａ１１、Ｃｙｐ３ａ１３、Ｃｙｐ３ａ２５、及びＣｙｐ３ａ４１からなる群から選択される少なくとも１つである（５）に記載の胚性幹細胞。
（７）前記（１）又は（２）に記載の胚性幹細胞を用いて作出されたマウス。
（８）前記（３）〜（６）のいずれか１項に記載の胚性幹細胞を用いて作出された、トランスジェニックマウス。
（９）抗エストロゲン剤の投与により肝細胞障害を引き起こす、（８）に記載のマウス。
（１０）前記（７）に記載のマウスにヒト由来肝細胞を移植するとともに、抗エストロゲン剤を投与して当該マウス由来肝細胞を除去したことを特徴とする、肝臓がヒト化されたマウス。
（１１）ヒト由来肝細胞が、肝臓疾患を有する患者由来のものである（９）に記載のマウス。
（１２）前記（１０）に記載のマウスからなる、ヒト肝臓疾患モデルマウス。
（１３）Ｒａｇ２遺伝子及びＪａｋ３遺伝子がともに欠損した免疫不全マウスの胚を、ＧＳＫ３阻害剤及びＭＥＫ阻害剤の存在下で培養することを特徴とする、免疫不全マウス由来の胚性幹細胞の製造方法。
（１４）前記（８）に記載のマウスに抗エストロゲン剤を投与することを特徴とする、肝臓障害モデルマウスの作出方法。
（１５）前記（８）に記載のマウスにヒト由来肝細胞を移植するとともに、抗エストロゲン剤を投与してマウス由来肝細胞を除去することを特徴とする、肝臓がヒト化されたマウスの作出方法。
（１６）ヒト由来肝細胞が、肝臓疾患を有する患者由来のものである、（１５）に記載の方法。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、ヒト肝細胞移植に最適なマウスの確立のための胚性幹細胞が提供される。本発明の胚性幹細胞は、肝機能に関する種々のヒト遺伝子を導入することができ、ヒト化肝臓モデルマウスを樹立させることができる。従って、本発明の胚性幹細胞から樹立されたマウスは、ヒト肝細胞移植に利用でき、１００％のヒト化を可能とする点で極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
図１は、変異型ｌｏｘを示す図である。
図２は、Ｄｒｅ／ｒｏｘシステムを示す図である。
図３は、ヒト成長ホルモン遺伝子をＥＳ細胞に導入するための置換ベクターの構築図である。
図４は、ヒト薬物代謝酵素遺伝子をＥＳ細胞に導入するための置換ベクターの構築図である。
図５は、ジフテリアトキシン遺伝子のＥＳ細胞への導入からマウス肝細胞死までの経過を説明する図である。
図６は、ヒト肝細胞をマウスの胚に移植する部位を示す図である。
図７は、ヒト肝細胞を移植したマウスの胚を示す図である。
Ｓ１：麻酔薬の腹腔内投与を示す図、Ｓ２：腹部を切開し胎児を腹腔外に露出した図
Ａ：細胞を注入しようとする卵黄嚢静脈、Ｂ：細胞注入部位（黄色の矢印）、Ｃ：青色の色素を注入した後の肝臓（青く見える）、Ｄ：摘出した肝臓（左は青色色素注入後の肝臓、右は色素を注入していない肝臓）
図８は、ｉＰＳ細胞から分化誘導した肝細胞を示す図である。
図９は、ｉＰＳ細胞から分化誘導した肝細胞を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．概要
本発明は、Ｒａｇ２遺伝子及びＪａｋ３遺伝子をともに欠損した免疫不全マウスから樹立された胚性幹細胞であり、この胚性幹細胞から、肝臓がヒト化されたマウスを確立したというものである。
本発明においては、免疫不全マウスから採取した胚をＧＳＫ３阻害剤及びＭＥＫ阻害剤の存在下で培養することにより、ＥＳ細胞を樹立することに成功した。
Ｒａｇ２及びＪａｋ３を欠損したＢＡＬＢ／ｃマウス（ＢＡＬＢ／ｃ；Ｒａｇ２−／−；Ｊａｋ３−／−：  「ＢＲＪマウス」という）は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞及びＮＫＴ細胞を欠損し、ＢＡＬＢ／ｃの遺伝的背景を有する免疫不全マウスである。このマウスにヒトの細胞を移植すると、その細胞はマウス体内で生着するため、作製されたマウスは、細胞レベルではヒト化されたマウスということになる。
しかしながら、このようなヒト化マウスは、宿主であるマウス由来の細胞が残存するため、臓器がヒト由来のものにすべて置き換わったわけではなく、当該臓器の機能解析や研究を行う上では必ずしも最適化されたマウスであるとは限らない。また、最適化マウスを作製するには、種々の遺伝子改変を行う必要があるが、マウス個体を用いて行うことはできない。
そこで本発明においては、１００％の細胞がヒト化された肝臓を有するマウスを樹立するため、ヒト化に最適の遺伝子改変マウスを樹立する。この遺伝子改変マウスは、個体発生の初期からヒト化を目指すべく鋭意検討を行った結果、ＢＲＪマウスより胚性幹細胞（以下「ＥＳ細胞」という）を樹立することに成功した。そのＥＳ細胞を用いてキメラマウスを作製し、生殖系列に伝わる生殖キメラマウスの作製にも成功した。次に、長期間にわたり肝臓機能を維持させるとともに安全性を確認するため、ヒト正常肝臓を有するマウスを樹立する。さらに、肝臓疾患を有するヒト患者と同じ症状の疾患モデルを樹立するとともに病態を解析するために、ヒト変異肝臓を持つマウスを樹立する。さらに、汎用性の高い新規治療法を開発するためにヒト疾患に対し最適化されたモデルマウスを樹立する。
２．ＢＲＪマウスの作製
使用される免疫不全マウスは、Ｒａｇ２遺伝子及びＪａｋ３遺伝子がともにノックアウトされたマウスであり、すでに確立されたマウスである（Ｏｎｏ  Ａ，Ｈａｔｔｏｒｉ  Ｓ，Ｋａｒｉｙａ  Ｒ，Ｉｗａｎａｇａ  Ｓ，Ｔａｕｒａ  Ｍ，Ｈａｒａｄａ  Ｈ，Ｓｕｚｕ  Ｓ，Ｏｋａｄａ  Ｓ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ  ｉｎｔｏ  ＢＡＬＢ／ｃ  ａｎｄ  Ｃ５７ＢＬ／６  ｓｔｒａｉｎ  ｏｆ  ｒａｇ−２／ｊａｋ３  ｄｏｕｂｌｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ．Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０１１：５３９７４８，２０１１）。
このマウスはＲａｇ２遺伝子欠損マウスとＪａｋ３遺伝子欠損マウスとの交配により得ることができる。
Ｒａｇ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｇｅｎｅ）２遺伝子は、未熟なリンパ球に発現して免疫グロブリン遺伝子及びＴ細胞受容体の再構成に必須の機能を有し、Ｔ細胞及びＢ細胞の成熟に不可欠の遺伝子である。
このＲａｇ２遺伝子がノックアウトされたマウスの作製手法、及び当該遺伝子についての詳細は、Ｓｈｉｎｋａｉ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．１９９２  Ｍａｒ  ６；６８（５）：８５５−６７、Ｃｈｅｎ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４  Ａｐｒ；６（２）：３１３−９などに記載されているが、一般には当分野において周知の方法、例えば、ターゲッティングベクターを用いる方法により、作製することができる（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９８９）２４４，１２８８−１２９２）。この方法は、マウスＥＳ細胞におけるＲａｇ２遺伝子とターゲッティングベクター上の遺伝子との相同組換えを利用したものである。
Ｊａｋ３（Ｊａｎｕｓ  ｋｉｎａｓｅ  ３）は、非受容体型チロシンキナーゼであり、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１受容体に共通する共通γ鎖の細胞内領域に会合して共通γ鎖を介したシグナルを細胞内に伝達するという機能を有するタンパク質である。共通γ鎖、Ｊａｋ３を介するシグナルはＮＫ細胞に必須のシグナルであるので、この経路が傷害されるとＮＫ細胞が欠損することになる。すなわち、Ｊａｋ３遺伝子をノックアウトすると、ＮＫ活性を消失させることができる。
Ｊａｋ３遺伝子及び共通γ鎖遺伝子についての詳細は、Ｐａｒｋ  ＳＹ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．１９９５  Ｄｅｃ；３（６）：７７１−８２、Ｓｕｚｕｋｉ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００  Ｆｅｂ；１２（２）：１２３−３２などに記載されており、これらの文献を参照して、Ｊａｋ３遺伝子が欠損し、ＮＫ活性が消失したマウスを得ることができる。
なお、Ｒａｇ２欠損（−／−）マウス及びＪａｋ３欠損（−／−）マウスは、熊本大学生命資源研究・支援センターから入手することもできる。これらのマウスと、市販のＢＡＬＢ／ｃマウスとを戻し交配することにより、Ｂａｌｂ／ｃマウスと同一系統の遺伝的背景を有するＢＡＬＢ／ｃ  Ｒａｇ２欠損（−／−）マウス及びＢＡＬＢ／ｃ  Ｊａｋ３欠損（−／−）マウスをそれぞれ得ることができる。
Ｒａｇ２遺伝子及びＪａｋ３遺伝子の両者が欠損したダブルノックアウトマウスの作製は、まず、ＢＡＬＢ／ｃ  Ｒａｇ２欠損マウスとＢＡＬＢ／ｃ  Ｊａｋ３欠損マウスとを交配してＦ１を得、次にＦ１同士を交配してＦ２マウスを得る。そして、この中からＲａｇ２欠損（−／−）及びＪａｋ３欠損（−／−）の両欠損マウス（ＢＲＪマウス）を選択すればよい。ＢＲＪマウスの選択手法として、例えばＲａｇ２およびＪａｋ３の両方の遺伝子を欠損していることをＰＣＲ法またはサザンブロット法で確認することができる。
３．ＥＳ細胞の樹立
本発明のＥＳ細胞は、上記のようにして得られたＢＲＪマウスから採取した胚をＧＳＫ３阻害剤及びＭＥＫ阻害剤の存在下で培養することにより、得ることができる。
まず、受精後のＢＲＪ雌マウスから受精卵又は２細胞期胚を培養することにより得るか、あるいは胚盤胞を直接得る。受精は自然交配、または体外受精法による。体外受精では、メスマウスを過剰排卵させ得た卵子と、オスマウスから採取した精子とを培養することにより行う。
次に、採取した胚盤法または内部細胞塊を、動物細胞の培養用培地中、ＧＳＫ−３阻害剤及びＭＥＫ阻害剤の存在下で約１〜３週間、好ましくは１４−１８日培養する。
ＧＳＫ−３（グリコーゲンシンターゼキナーゼ３）は、セリン／スレオニンプロテインキナーゼであり、グリコーゲンの産生やアポトーシス、幹細胞の維持などにかかわる多くのシグナル経路に作用する酵素である。ＧＳＫ−３阻害剤としては、ＣＨＩＲ９９０２１（入手先：和光純薬）、６−Ｂｒｏｍｏｉｎｄｉｒｕｂｉｎ−３−ｏｘｉｍｅ（ＢＩＯ）（入手先：和光純薬）などが挙げられる。ＧＳＫ−３阻害剤の培地中への添加量は、０．１〜１０μＭ（マイクロモラー）、好ましくは０．３〜３μＭである。ＧＳＫ−３阻害剤の培地中への添加時期は特に限定されるものではないが、胚盤法の培養開始時から添加することが好ましい。
ＭＥＫ阻害剤は、ＭＡＰ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｋｉｎａｓｅ（ＭＥＫ）活性を阻害し、ＥＲＫ１／ＥＲＫ２の活性化を抑制するプロテインキナーゼ阻害剤である。ＭＥＫ阻害剤としては、例えばＰＤ０３２５９０１（入手先：和光純薬）、Ｕ０１２６（入手先：Ｐｒｏｍｅｇａ）などが挙げられる。ＰＤ０３２５９０１阻害剤の培地中への添加量は限定されるものではなく、例えば３μＭである。
培養条件は限定されるものではなく、例えば約３７℃、５％ＣＯ２の雰囲気中で行う。継代培養は３〜４日間隔で、マウス胚繊維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダー上又はコラゲナーゼＩでコーティングしたプレート上で行ってもよい。
培地としては、例えばＧＭＥＭ培地（Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ  Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ＤＭＥＭ（ダルベッコの改変イーグル培地）、ＲＰＭＩ１６４０培地培地などが挙げられる。培養培地には、ＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、β−メルカプトエタノール、非必須アミノ酸、グルタミン酸、ピルビン酸ナトリウム及び抗生物質（例えばペニシリン、ストレプトマイシン等）などから選択し、適宜添加することができる。
所定期間培養後、ＥＤＴＡ又はコラゲナーゼＩＶを含む培地でインキュベートすることによりＥＳ細胞を回収する。回収されたＥＳ細胞は、必要によりフィーダー細胞の存在又は非存在下で培養することにより複数回継代することもできる。なお、フィーダー不含条件での内部細胞塊の培養は、ＭＥＦで馴化された培地中で行なうことができる。
培養されたＥＳ細胞は、一般にそれらのマーカー遺伝子を用いて同定することができる。ＥＳ細胞のマーカー遺伝子としては、例えばＯｃｔ３／４、アルカリ性ホスファターゼ、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ＧＤＦ３、ＲＥＸ１、ＦＧＦ４などが挙げられる。マーカー遺伝子又は遺伝子産物の存在は、ＰＣＲやウエスタンブロッティング等の任意の手法により検出すればよい。
また、本発明のＥＳ細胞が目的のものであるか否かは、ＢＡＬＢ／ｃであるかどうかをＳＮＰマーカーの検出により、Ｒａｇ２欠損およびＪａｋ３欠損であるかどうかは、ＰＣＲまたはサザンブロット法による解析により確認することもできる。例えば、マウスのＳＮＰのデータベースがｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｓｎｐ／ｍｏｕｓｅに公表されており、このデータベースを用いてＳＮＰ情報を照合すればＢＡＬＢ／ｃであることを確認でき、Ｒａｇ２およびＪａｋ３遺伝子が欠損していれば、本発明のＥＳ細胞であると判断する。
このようにして得られたＥＳ細胞は、「ＢＲＪ８」と称し、２０１２年３月２３日付（受領日）で、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  ＮＩＴＥバイオテクノロジー本部  特許微生物寄託センター）にブダペスト条約に基づき国際寄託した。その受領番号は、「ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−１２９７」である。
上記ＥＳ細胞の詳細情報は以下の通りである。
ＧＳＫ阻害剤およびＭＥＫ阻害剤によるＥＳ細胞の樹立法については既に論文が公表されているが、得られたＥＳ細胞は、元の系統の遺伝的性質を受け継いでおり、それぞれ特有の特徴を含んでいる。免疫不全マウスは種々の系統が存在するが、もともとの遺伝的背景に加え、それぞれ異なった遺伝子変異を有しているので、系統ごとに固有の特徴を有している。例えば、報告のあるＮＯＧマウスは、ＮＯＤ系統に、ＳＣＩＤおよびＩＬ２  ｒｅｃｅｐｔｏｒのｃｏｍｍｏｎ  ｇａｍｍａ（ＩＬ２Ｒ−γ）遺伝子の欠損を持つものである。ＮＯＤマウスは、もともと補体を欠損している。ＳＣＩＤの原因遺伝子は、Ｐｒｋｄｃ（ＤＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ，ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｓｕｂｕｎｉｔ）であり、この遺伝子は、免疫グロブリン遺伝子やＴ細胞リセプターの再構成に必要な遺伝子である。従って、この遺伝子に変異があると、Ｂリンパ球やＴリンパ球ができなくなる。また、ＩＬ２Ｒ−γはＩＬ−２，ＩＬ−４，ＩＬ−７，ＩＬ−９，ＩＬ−１５及びＩＬ−２１などのインターロイキンのリセプターを構成する共通の分子である。従って、この分子が欠損すると、これらのインターロイキンを介したシグナルが伝わらなくなり、免疫応答ができなくなる。総合すると、補体、Ｂリンパ球、Ｔリンパ旧の欠損に加えて、マクロファージや樹状細胞の機能低下もみられ、免疫不全状態がより重症となる。しかし、重度の免疫不全であることから正常マウスでは全く問題にならない日和見感染病原体ですら場合によって致死的に働いたり、胸腺腫が高率に起こる。
一方、ＢＲＪマウスは、ＢＡＬＢ／ｃマウスという系統にＲａｇ２およびＪａｋ３の遺伝子が欠損したものであり、移植した細胞の生着率が良いことで知られている。Ｒａｇ２はＰｒｋｄｃと同様に免疫グロブリン遺伝子やＴ細胞リセプターの再構成に必要な遺伝子で、また、Ｊａｋ３はＩＬ２Ｒ−γの下流に存在する遺伝子であり、従って、これらの遺伝子の欠損により重症の免疫不全状態となる。ただし、ＢＲＪは飼育および繁殖が比較的容易である。
予備実験において、従来使用されるＧＭＥＭ−ＫＳＲ培地を用いてＥＳ細胞の樹立を試みたが、増殖の非常に悪い株しか樹立できず、この株を用いてキメラマウスを作製しても５０％程度のキメリズムしか得られず、ｇｅｒｍｌｉｎｅにも寄与しなかった。これに対し、本発明においては、ＥＳの未分化状態維持のために有効とされるＧＳＫ３のインヒビターとＭＥＫのインヒビターを培地に加えることで、目的とするＥＳ細胞を樹立することができた。本発明のＥＳ細胞は、増殖力が高く、キメリズムも高い。その理由は、従来法を用いて作製されたＥＳ細胞と比較して、未分化状態をよく保っているからである。ＥＳ細胞の分化に働く重要なシグナルの一つは、ＦＧＦ４からＦＧＦリセプターを介するＥＲＫ／ＭＥＫの経路である。すなわち、ＥＲＫは分化のシグナルとして働く。また、ＧＳＫ−３はβ−カテニンをリン酸化することでＷｎｔシグナルを刺激し、分化を誘導する。従って、強力なＭＥＫインヒビターであるＰＤ０３２５９０１とＧＳＫ３インヒビターの２つのインヒビター（２ｉ）を用いることにより、本発明のＥＳ細胞は分化を抑制し多分化能を維持することができる。
４．遺伝子改変
ヒト化に最適の遺伝子改変マウスを樹立するには、成体になったマウスではなく、ＥＳ細胞の段階で内在遺伝子をヒト型に置換するか、あるいはヒト遺伝子をＥＳ細胞に導入した後、その遺伝子改変及び／又は遺伝子導入ＥＳ細胞からマウスを作出する必要がある。
そこで本発明において、ＥＳ細胞に目的の遺伝子を導入し、あるいはＥＳ細胞に内在する遺伝子をヒトの遺伝子に置き換えるため、バクテリオファージ由来の組換えシステムであるＣｒｅ−ｌｏｘＰシステム、ビブリオ菌由来の組換えシステムであるＶＣｒｅ−Ｖｌｏｘシステム、Ｃｒｅのホモログを利用した組換えシステムであるＤｒｅ／ｒｏｘシステム、あるいはこれらの組換えシステムを改変したシステムによる相同組み換えを利用する。
１ｏｘＰ（ｌｏｃｕｓ  ｏｆ  ｃｒｏｓｓｉｎｇ（Ｘ−ｒｉｎｇ）ｏｖｅｒ，Ｐ１）は３４塩基（５’−ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴ  ＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ−３’）からなる配列であり（配列番号１）、５’末端から１３塩基（逆反復配列１という）、及び３’末端から１３塩基の配列（逆反復配列２という）が、それぞれ逆反復配列を構成し、「ＧＣＡＴＡＣＡＴ」により示される８塩基のスペーサーと呼ばれる配列が上記逆反復配列１及び２に挟まれている（図１）。「逆反復配列」とは、スペーサーを境界として一方の側の配列が、他方の側の配列と、互いに向き合う方向に相補的であるような配列を意味する。
Ｃｒｅ（ｃａｕｓｅｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）とは、遺伝子組換えを起こさせる組換え酵素（リコンビナーゼともいう）を意味し、上記反復配列を認識し、スペーサー部の「ｃａｔａｃａ」を粘着末端とする切断様式で切断する。
ところで、バクテリアの中では、２カ所の１ｏｘＰ間で組換えが起こり、挿入または削除反応が起こる（図１）。哺乳類細胞で挿入反応を起こすことができれば、後に任意の遺伝子を挿入できるので、応用性は格段に広がる。哺乳類細胞では核が大きいため、一旦削除されたｌｏｘＰを持つ環状ＤＮＡは拡散してしまい、挿入反応は殆ど観察されない。
そこで、本発明者は、挿入反応を起こすために１ｏｘＰ配列に変異を導入し、一旦遺伝子がゲノムに挿入されると挿入された遺伝子は削除できない（ゲノムから脱離しない）ようにすることを考え、このため複数種類の変異型１ｏｘＰ（ｌｏｘ６６、ｌｏｘ７１、ｌｏｘ５１１、ｌｏｘ２２７２）を設計した（図１）。これらの変異型１ｏｘＰは公知である（ＷＯ０１／００５９８７号公報、特開２００７−１００号公報）。
また本発明においては、Ｖｌｏｘと呼ばれるシステムも利用することができる。Ｖｌｏｘとはビブリオ菌由来の組換えシステムであるＶＣｒｅ−Ｖｌｏｘであり（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｅ．，Ｎａｋａｙａｍａ，Ｍ．ＶＣｒｅ／ＶｌｏｘＰ  ａｎｄ  ＳＣｒｅ／ＣｌｏｘＰ：ｎｅｗ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２０１１，１−１１）、Ｖｌｏｘ４３Ｌ、Ｖｌｏｘ４３Ｒ、Ｖｌｏｘ２２７２などが利用可能である（図１）。
１ｏｘＰ及び変異型１ｏｘＰ並びにＶｌｏｘシステムの塩基配列を以下に示す（図１）。
0005871412.tif 000002
さらに本発明においては、Ｄｒｅ／ｒｏｘシステムを採用することができる（図２）。
Ｄｒｅとは、Ｄ６−部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼであり、下記ｒｏｘ部位の配列を認識する酵素である（Ｓａｕｅｒ，Ｂ．ａｎｄ  ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ，Ｎｕｃｉｃ  Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．３２：６０８６−６０９５，２００４）。このリコンビナーゼ及びｒｏｘ認識配列を利用した組換えシステムをＤｒｅ／ｒｏｘシステムと呼ぶ。このシステムはＣｒｅ−ｌｏｘシステムと密接に関係しているが、認識するＤＮＡ特異性が異なっている。
ｌｏｘ及びｒｏｘの塩基配列を以下に示す（図２）。
0005871412.tif 000003
本発明においては、前記の通りヒト正常肝臓を有するマウスを樹立することを目的としており、さらに、肝臓疾患モデルマウスを樹立することも目的とする。そこで、本発明においてはマウス肝細胞の細胞質において毒素を発現させてマウス肝細胞死を誘導できるよう、ＥＳ細胞に遺伝子操作を行う。また、ヒト正常肝臓を有するマウスを作出するにはヒト肝細胞を移植して増殖させる必要があることから、ＥＳ細胞において、マウス成長ホルモン遺伝子をヒトの成長ホルモン遺伝子で置換する。また、薬物代謝などの機能を解析するため、マウス薬物代謝酵素遺伝子をヒトの薬物代謝酵素遺伝子で置換する。
肝細胞死を導入したマウスは肝機能を消失するので、このマウスは肝臓障害モデルとして利用できるほか、ヒト正常肝細胞を移植することで、肝臓がヒト化されたマウスを得ることができる。
図３は、マウス成長ホルモン（ＧＨ）遺伝子をヒトＧＨ遺伝子に置換するための相同組み換えベクターの構築図である。
また、図４は、薬物代謝酵素遺伝子であるＣｙｐ遺伝子をヒトＣｙｐ遺伝子に置換するための相同組み換えベクターの構築図である。
マウス遺伝子から上記ヒト遺伝子への置換は、ＷＯ０１／００５９８７号公報に記載の遺伝子トラップ法に準じて行なうことができる。例えば、前記の通り作製されたベクターを用い、２段階の遺伝子トラップを行う。
第１段階は通常の遺伝子トラップ法である。この通常の遺伝子トラップでは、ＥＳ細胞に前記トラップベクターを導入し、ＥＳ細胞内に本来的に存在する内在性遺伝子をトラップする。これにより、ＥＳ細胞中の内在性遺伝子は破壊される。次に、ヒト遺伝子をプラスミド（置換ベクター）上でｌｏｘ配列（例えば１ｏｘ６６等）の下流につなぎ、第２段階の遺伝子トラップを行う（図３、４）。
第２段階の遺伝子トラップでは、１ｏｘ６６の下流に連結されたヒト遺伝子（ｈＧＨ、ｈＣｙｐ等）をＥＳ細胞に導入する。これにより、第１段階で導入されたトラップベクターの１ｏｘ７１部位が、第２段階で導入したベクターのｌｏｘ６６との間で組換えを起こし、「（ｌｏｘ７１／６６）−（ヒト遺伝子）−（ｌｏｘＰ）」で構成されるカセットを含む改変した遺伝子を導入できる。なお、ヒト遺伝子とｌｏｘＰとの間には、ピューロマイシン耐性遺伝子（ｐｕｒｏ）を連結することができる。
この方法によれば、内在性マウス遺伝子をヒト遺伝子で置換することができる。図３及び４に置換アレルの図を示す。
ここで、図３及び４において、Ｅｘ１、Ｅｘ２、Ｅｘ３及びＥｘ４は、それぞれマウス成長ホルモン遺伝子およびマウスＣｙｐ３ａ１３遺伝子のエキソン１〜４を表し、ｐＡはポリＡ配列を表し、ＦｒｔはＦＬＰの認識部位、ＰＧＫ−ｎｅｏはＰＧＫプロモーターが連結されたネオマイシン耐性遺伝子、Ｐ−ｐｕｒｏは、ＰＧＫプロモーターが連結されたピューロマイシン耐性遺伝子を表す。
５．キメラマウスの作製
キメラマウスの作製は標準的な方法で行うことができる。
まず、上記樹立されたＥＳ細胞、又は遺伝子が導入若しくは置換されたＥＳ細胞を、８細胞期胚と凝集させるか、あるいは胚盤法に注入する。このようにして作製された胚をキメラ胚というが、このキメラ胚を偽妊娠仮親の子宮内に移植して出産させることによりキメラマウスを作製する。
例えば、キメラ胚の作製は、まず、ホルモン剤により過排卵処理を施した雌マウスを、雄マウスと交配させる。その後、所定日数後に卵管又は子宮から初期発生胚を回収する。回収した胚に、ＥＳ細胞を凝集または注入し、キメラ胚を作製する。
ここで、「胚」とは、個体発生における受精から出生までの段階の個体を意味し、２細胞期胚、４細胞期胚、８細胞期胚、桑実期胚、胚盤胞などを包含する。８細胞期胚を用いる場合には受精から２．５日目に、胚盤胞を用いる場合には受精から３．５日目にそれぞれ卵管又は子宮から初期発生胚を回収することができる。
ＥＳ細胞と胚を用いて集合体を作製する方法として、マイクロインジェクション法、凝集法などの公知手法を用いることができる。「集合体」とは、ＥＳ細胞及び胚が同一空間内に集まって形成する集合体を意味し、ＥＳ細胞が胚に注入された形態、胚を個々の細胞にばらして、ＥＳ細胞とともに凝集する形態のいずれをも意味する。
マイクロインジェクション法を採用する場合は、回収した胚に、ＥＳ細胞を注入して細胞の集合体を作製する。また、凝集法を採用する場合は、ＥＳ細胞を、透明帯を除去した正常胚にふりかけて凝集させればよい。
一方、仮親にするための偽妊娠雌マウスは、正常性周期の雌マウスを、精管結紮などにより去勢した雄マウスと交配することにより得ることができる。作出した偽妊娠マウスに対して、上述の方法により作製したキメラ胚を子宮内に移植し、その後出産させることによりキメラマウスを作製することができる。
このようなキメラマウスの中から、ＥＳ細胞移植胚由来の雄マウスを選択する。選択した雄のキメラマウスが成熟した後、このマウスを純系マウス系統の雌マウスと交配させる。そして、誕生した子マウスに、ＥＳ細胞に由来するマウスの被毛色が現れることにより、多能性幹細胞がキメラマウスの生殖系列へ導入されたことを確認することができる。
６．ヒト化マウスの作製
（１）ヒト化に最適の遺伝子改変マウスの作製
遺伝子が導入又は置換されたＥＳ細胞を用いて樹立されたトランスジェニックマウス、すなわち遺伝子改変マウスは、後述するとおり、１００％ヒト化した肝臓を持つマウスの樹立のための基本となるマウスである。
拒絶反応の回避のためには、ＮＯＪマウスのＥＳ細胞又はＢＲＪマウスのＥＳ細胞を用いる。
（ｉ）ＮＯＪ（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／Ｊａｋ３−／−）マウス：Ｃ３，Ｔ，Ｂ，ＮＫ，ＮＫＴ欠損
ＮＯＪマウスの作製は、ＮＯＤマウスとＳＣＩＤマウスを交配し、ＮＯＤの遺伝的背景にＳＣＩＤ遺伝子変異を導入する。さらに、Ｊａｋ３欠損マウスとも交配することにより、ＮＯＤの遺伝的背景にＳＣＩＤおよびＪａｋ３遺伝子欠損を持つマウス（ＮＯＪマウス）が得られる。このマウスでは、補体であるＣ３が欠損し、またＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞も欠損しているマウスである。
（ｉｉ）ＢＲＪ（ＢＡＬＢ／ｃ；Ｒａｇ２−／−；Ｊａｋ３−／−）マウス：Ｔ，Ｂ，ＮＫ，ＮＫＴ欠損
本発明においては、上記ＮＯＪマウスのほかにＢＲＪマウスを使用することができる。ＢＲＪマウスは、ＢＡＬＢ／ｃマウスの遺伝的背景にＲａｇ２およびＪａｋ３遺伝子欠損を導入したマウスであり、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞が欠損している。ＮＯＪマウスと比較し、繁殖が容易で、多数のマウスを生産できる。
（２）肝臓障害モデルマウスの作製
肝臓障害モデルマウスは、抗エストロゲン剤の投与により、毒素を発現させてマウス肝細胞を除去する（死滅させる）ことで、肝機能が失われた障害モデルマウスを作製することができる。
マウス肝細胞の死滅のために、また、マウス肝細胞の細胞質においてＤｒｅ−ＥＲＴ２を発現させるために、以下のコンストラクト１及び２を作製する。Ｄｒｅ−ＥＲＴ２とは、Ｄｒｅ組換え酵素遺伝子と、ほ乳類体内で産生されるエストロゲンが結合しないように改変した変異型エストロゲンレセプター遺伝子とを連結したベクターである。
コンストラクト１：
ＣＡＧ−ＡＴＧ−ｒｏｘ−ＥＧＦＰ−ｒｏｘ−ＤＴ−Ａ
コンストラクト２：
ＳＡＰ−Ｄｒｅ−ＥＲＴ２
コンストラクト１は、ＣＡＧプロモーターの直下に、（ｉ）ＡＴＧ、（ｉｉ）ｒｏｘで挟まれたＥＧＦＰ、及び（ｉｉｉ）ＤＴ−Ａ（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  ｔｏｘｉｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ａ）を接続したものである。
ＥＧＦＰの開始コドンとｒｏｘ上流のＡＴＧはフレームが合うように設計する。また、ＤＴ−Ａの開始コドンは除去し、ｒｏｘ上流のＡＴＧとフレームが合うように設計する。
コンストラクト２は、肝細胞特異的な血清アミロイドＰ成分（ｓｅｒｕｍ  ａｍｙｌｏｉｄ  Ｐ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ：ＳＡＰ）のプロモーター直下に、Ｄｒｅ−ＥＲＴ２を接続したものである。
これらのコンストラクト１及び２を本発明のＥＳ細胞に共導入することにより、タモキシフェン投与後部位特異的組み換えがおこり、肝細胞特異的にジフテリア毒素が発現して細胞死を誘導することができる。
すなわち、非ステロイド性の抗エストロゲン剤として、例えばタモキシフェン（Ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）は、エストロゲンレセプターに、エストロゲンと競合的に結合し、抗エストロゲン作用を示すことによって抗腫瘍活性を有する物質である。Ｄｒｅ−ＥＲＴ２を発現させたヒト化マウスにタモキシフェンを投与すると、タモキシフェンによりＤｒｅ−ＥＲＴ２が核に移行する。２つのｒｏｘ間における組換えが起こり、ジフテリアトキシン遺伝子のプロモーターが機能する。これにより、毒素ＤＴ−Ａが発現し、マウスの肝細胞が死滅する（図５）。
タモキシフェンの投与回数及び投与時期は、肝細胞を死滅できる限り特に限定されるものではないが、例えば以下のように行なう。
タモキシフェンをエタノール溶解し、その溶液をｓｕｎ  ｆｌｏｗｅｒ  ｏｉｌ（Ｓ５００７，Ｓｉｇｍａ）で希釈し、濃度を７ｍｇ／ｍｌに調整する。この溶液を用いて、成体に１０５ｍｇ／ｋｇ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔになるように４日間連続腹腔内投与する。
（３）肝細胞がヒト肝細胞に置換されたヒト化マウスの作製
肝細胞がヒト肝細胞に置換されたマウスは、上記の通り抗エストロゲン剤の投与によりマウス肝細胞を除去するとともに、ヒト肝細胞をマウスに移植することにより、肝細胞がヒト肝細胞に置換されたヒト化マウスを得ることができる。
ヒト正常肝臓を持つマウスを樹立することは、長期間に渡る肝臓機能の維持と、安全性を確認するために必要である。
（ｉ）マウス成長ホルモン遺伝子がヒト遺伝子に置換されたＥＳ細胞の作製
移植後のヒト肝細胞が増殖できるようにするために、マウス成長ホルモン遺伝子をＥＳ細胞の段階でヒト遺伝子に置換する。
具体的には、前記の通りＥＳ細胞の遺伝子置換を２つのステップで行う。
第１のステップにおいて、ＳＡＰ−Ｄｒｅ−ＥＲＴ２およびＣＡＧ−ｒｏｘ−ＥＧＦＰ−ｒｏｘ−ＤＴ−Ａを導入したＢＲＪ  ＥＳ細胞（ＢＲＪ  ＥＳ：ＳＡＰ−Ｄｒｅ−ＥＲＴ２；ＣＡＧ−ｒｏｘ−ＥＧＦＰ−ｒｏｘ−ＤＴ−Ａとよぶ）を用いて相同組換えを行い、マウス成長ホルモン遺伝子を開始コドンのところで破壊するとともに、この領域にｌｏｘ７１−ＰＧＫ−ｎｅｏ−ｌｏｘＰが組込まれたＥＳ細胞（ＢＲＪ  ＥＳ：：ＳＡＰ−Ｄｒｅ−ＥＲＴ２；ＣＡＧ−ｒｏｘ−ＥＧＦＰ−ｒｏｘ−ＤＴ−Ａ；Ｇｈｎｅｏ）を樹立する。
第２のステップにおいて、このＥＳ細胞と置換ベクターを用い、ｎｅｏ遺伝子の代わりにヒト成長ホルモン遺伝子ｃＤＮＡが組込まれたＥＳ細胞（ＢＲＪ  ＥＳ：ＳＡＰ−Ｄｒｅ−ＥＲＴ２；ＣＡＧ−ｒｏｘ−ＥＧＦＰ−ｒｏｘ−ＤＴ−Ａ；ＧｈｈＧＨ）を樹立できる。
このようにして樹立されたＥＳ細胞を用いて、ヒト成長ホルモンを産生するマウスを得ることができる。
（ｉｉ）マウス肝細胞及び未分化肝細胞の除去
タモキシフェンの投与回数及び投与時期は上記と同様である。
（ｉｉｉ）移植するヒト肝細胞の作製
移植するヒト肝細胞は、ｉＰＳ細胞から誘導することができる。
ヒト肝細胞は、ヒトｉＰＳ細胞から、支持細胞や細胞外マトリックスを用いて効率的な内胚葉及び肝臓分化誘導方法を確立することができる。
ｉＰＳ細胞は、Ｏｃｔ、Ｓｏｘ、Ｋｌｆ、Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎなどのファミリーメンバーを含む３〜６個の転写因子（核初期化因子）をコードする遺伝子を体細胞に導入することにより誘導することができる（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２，３０８１−９（２００７）；Ｆｕｓａｋｉ  Ｎ，Ｂａｎ  Ｈ，Ｎｉｓｈｉｙａｍａ  Ａ，Ｓａｅｋｉ  Ｋ，Ｈａｓｅｇａｗａ  Ｍ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ−ｆｒｅｅ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｖｅｃｔｏｒ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ，ａｎ  ＲＮＡ  ｖｉｒｕｓ  ｔｈａｔ  ｄｏｅｓ  ｎｏｔ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｈｏｓｔ  ｇｅｎｏｍｅ．Ｐｒｏｃ  Ｊｐｎ  Ａｃａｄ  Ｓｅｒ  Ｂ  Ｐｈｙｓ  Ｂｉｏｌ  Ｓｃｉ．２００９；８５（８）：３４８−６２．）。
Ｏｃｔファミリーメンバーとしては、例えばＯｃｔ３／４、Ｏｃｔ１Ａ、Ｏｃｔ６などが挙げられ、Ｏｃｔ３／４が好ましい。
Ｓｏｘ（ＳＲＹ関連ＨＭＧボックス）ファミリーメンバーとしては、例えばＳｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ７、Ｓｏｘ１５などが挙げられ、Ｓｏｘ２が好ましい。
Ｋｌｆ（Ｋｒｕｐｐｅｌ様因子）ファミリーメンバーとしては、例えばＫｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ５などが挙げられ、Ｋｌｆ４が好ましい。
Ｍｙｃファミリーメンバーとしては、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎ−Ｍｙｃ、Ｌ−Ｍｙｃなどが挙げられ、ｃ−Ｍｙｃが好ましい。
Ｎａｎｏｇは、胚盤胞の内部細胞塊で最も高く発現し、分化細胞では発現しないホメオボックスタンパク質である。
Ｌｉｎファミリーメンバーとしては、例えば未分化ヒトＥＳ細胞のマーカーであるＬｉｎ２８が挙げられる。
より具体的には、転写因子としては、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃの組み合わせが好ましいが（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．ａｎｄ  Ｙａｍａｎａｋａ，Ｓ．，Ｃｅｌｌ  １２６，６６３−６７６（２００６））、その他にも、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４の組み合わせ、あるいはＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びＬ−Ｍｙｃの組合せも使用することができる。
体細胞としては、例えば皮膚細胞、肝臓細胞、繊維芽細胞、リンパ球などが挙げられる。
体細胞への遺伝子導入法は、例えばリポフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、ウイルスベクターによる導入などが挙げられ、特に限定されるものではない。ウイルスベクターとしては、例えばレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスなどが挙げられる。市販のベクター、例えばセンダイウイルス（ＤＮＡＶＥＣ）を利用することもできる。
ベクターを用いる場合、導入する遺伝子が発現し得るように、プロモーター及びエンハンサーなどの調節配列と機能し得る形で連結することもできる。プロモーターとしては、例えばＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーターなどがある。これらのベクターはさらに、薬剤耐性遺伝子（例えば、ピューロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子等）などのポジティブ選択マーカー、ネガティブ選択マーカー（例えば、ジフテリア毒素Ａフラグメント遺伝子またはチミジンキナーゼ遺伝子など）、ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）、ターミネーター、複製起点などを含めることができる。
体細胞（例えば、０．５×１０４〜５×１０６細胞／１００ｍｍディッシュ）を、約３７℃にて、ＭＥＦフィーダー上またはフィーダー不含の条件で、上記核初期化因子を含むベクターをトランスフェクトして培養すると、約１〜４週間後にｉＰＳ細胞が誘導される。
培地としては、例えばＧＭＥＭ培地（Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ  Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ＤＭＥＭ（ダルベッコの改変イーグル培地）、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＯＰＴＩ−ＭＥＭＩ培地などが挙げられる。培養培地には、ＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ａｃｔｉｖｉｎ−Ａ、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、レチノイン酸、デキサメサゾン、β−メルカプトエタノール、非必須アミノ酸、グルタミン酸、ピルビン酸ナトリウム及び抗生物質（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシンなど）などから選択し、適宜添加することができる。
所定期間培養後、ＥＳ細胞の培養のときと同様に、ＥＤＴＡ又はコラゲナーゼＩＶを含む培地でインキュベートすることにより細胞を回収する。フィーダー不含条件では、細胞をマトリゲルコーティングプレート上、ＭＥＦで馴化された培地中で行なうことができる。
ｉＰＳ細胞からヒト肝細胞へは、３つの段階を経て分化誘導するのが一般的である。原則として、
（ａ）多能性幹細胞から内胚葉系への誘導、
（ｂ）内胚葉系から未熟肝細胞への誘導、及び
（ｃ）未熟肝細胞から成熟肝細胞への誘導である。
上記（ａ）においてはａｃｔｉｖｉｎ  ＡやＷｎｔシグナルが、（ｂ）においてはＦＧＦやＢＭＰが、そして（ｃ）においてはＨｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、Ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ、Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅが重要と考えられている。
但し、上記（ｂ）及び（ｃ）のステップは適宜ＤＭＳＯやレチノイン酸、ＦＧＦ４やｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅおよびに代替することが可能である。
ヒト肝細胞の移植時期は、胎生１５．５日目、または生後８週前後の成体マウスである。
ヒト肝細胞の移植細胞数は、１０５から１０６個であることが好ましい。
ヒト肝細胞の移植ルートは、胚の場合は卵黄嚢静脈（ｙｏｌｋ  ｓａｃ  ｖｅｓｓｅｌ）から注入して移植する（図６、７）。成体の場合は、脾臓内に注入する。
（ｉｖ）ヒト肝細胞の増殖
マウス成長ホルモン遺伝子がヒト成長ホルモン遺伝子に置換されたＥＳ細胞を用いて樹立されたマウスは、ヒト成長ホルモンを産生することができる。このヒト成長ホルモンが、移植したヒト肝細胞に働き、その成長を促し、正常なサイズのヒト肝臓を持つヒト化肝臓マウスを樹立できる。
マウス肝細胞がすべて（１００％）ヒト肝細胞に置き換わったことの確認、すなわちマウス肝細胞が存在しないことの確認は、マウス肝臓で発現する遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲ法等により解析することで行なうことができる。
（４）ヒト化肝臓マウスの評価
肝臓がヒト化されたことは、以下の事項を単独で又は適宜組み合わせて検査することで確認することができる。
（ｉ）肝機能の検証
肝機能を検証するための検査項目としては、例えば以下の項目が挙げられる。検査期間は限定されるものではないが、１年以上行なうことが好ましい。
タンパク関連：総タンパク、ＡＬＢ，ＴＴＴ，ＺＴＴ，ＣＲＰ，Ｈａｐｔｏｇｌｏｂｉｎ，Ｃ３，Ｃ４
非タンパク性窒素成分：全ビリルビン，直接ビリルビン
糖質：グルコース
脂質：トリグリセリド、総コレステロール、  ＨＤＬ−コレステロール、ＬＤＬ−コレステロール、ＡｐｏＡＩ  ＡｐｏＣＩＩ
酵素：乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、アスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ（ＧＯＴ））、アラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ（ＧＰＴ））、γ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、アミラーゼ（ＡＭＬ）
その他：カルシウム、Ｆｅ、無機リン酸
ＩＣＧ検査：インドシアニン・グリーン（ＩＣＧ）を経静脈的に投与し、血中のＩＣＧ濃度を経時的に測定し、肝臓の色素排泄機能を検査する。ＩＣＧは血中のリポ蛋白に結合して肝に輸送され、類洞を通過する間に肝細胞に摂取され、抱合を受けることなく胆汁に排泄されるので、肝細胞ではなく、肝臓全体の臓器としての機能を解析できる。
ＣＴ検査：肝臓の形態的な変化を検査する。
（ｉｉ）薬物代謝
ＰＣＲ  ａｒｒａｙ法を用いて、以下の薬物代謝関連酵素を解析する
・チトクローム  Ｐ４５０：ＣＹＰ１１Ａ１，ＣＹＰ１１Ｂ１，ＣＹＰ１１Ｂ２，ＣＹＰ１７Ａ１，ＣＹＰ１９Ａ１，ＣＹＰ１Ａ１，ＣＹＰ１Ａ２，ＣＹＰ１Ｂ１，ＣＹＰ２１Ａ２，ＣＹＰ２４Ａ１，ＣＹＰ２６Ａ１，ＣＹＰ２６Ｂ１，ＣＹＰ２６Ｃ１，ＣＹＰ２７Ａ１，ＣＹＰ２７Ｂ１，ＣＹＰ２Ａ１３，ＣＹＰ２Ｒ１，ＣＹＰ２Ｓ１，ＣＹＰ２Ｂ６，ＣＹＰ２Ｃ１８，ＣＹＰ２Ｃ１９，ＣＹＰ２Ｃ８，ＣＹＰ２Ｃ９，ＣＹＰ２Ｄ６，ＣＹＰ２Ｅ１，ＣＹＰ２Ｆ１，ＣＹＰ２Ｗ１，ＣＹＰ３Ａ４，ＣＹＰ３Ａ４３，ＣＹＰ３Ａ５，ＣＹＰ３Ａ７，ＣＹＰ４Ａ１１，ＣＹＰ４Ａ２２，ＣＹＰ４Ｂ１，ＣＹＰ４Ｆ１１，ＣＹＰ４Ｆ１２，ＣＹＰ４Ｆ２，ＣＹＰ４Ｆ３，ＣＹＰ４Ｆ８，ＣＹＰ７Ａ１，ＣＹＰ７Ｂ１，ＣＹＰ８Ｂ１．
・アルコールデヒドロゲナーゼ：ＡＤＨ１Ａ，ＡＤＨ１Ｂ，ＡＤＨ１Ｃ，ＡＤＨ４，ＡＤＨ５，ＡＤＨ６，ＡＤＨ７，ＤＨＲＳ２，ＨＳＤ１７Ｂ１０（ＨＡＤＨ２）．
・エステラーゼ：ＡＡＤＡＣ，ＣＥＬ，ＥＳＤ，ＧＺＭＡ，ＧＺＭＢ，ＵＣＨＬ１，ＵＣＨＬ３．
・アルデヒドデヒドロゲナーゼ：ＡＬＤＨ１Ａ１，ＡＬＤＨ１Ａ２，ＡＬＤＨ１Ａ３，ＡＬＤＨ１Ｂ１，ＡＬＤＨ２，ＡＴＤＨ３Ａ１，ＡＬＤＨ３Ａ２，ＡＬＤＨ３Ｂ１，ＡＬＤＨ３Ｂ２，ＡＬＤＨ４Ａ１，ＡＬＤＨ５Ａ１，ＡＬＤＨ６Ａ１，ＡＬＤＨ７Ａ１，ＡＬＤＨ８Ａ１，ＡＬＤＨ９Ａ１．
・フラビン含有モノオキシゲナーゼ：ＦＭＯ１，ＦＭＯ２，ＦＭＯ３，ＦＭＯ４，ＦＭＯ５．
・モノアミンオキシゲナーゼ：ＭＡＯＡ，ＭＡＯＢ．
・プロスタグランジン−エンドペリオキシドシンターゼ：ＰＴＧＳ１，ＰＴＧＳ２．
・キサンチンデヒドロゲナーゼ：ＸＤＨ．
・ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ：ＤＰＹＤ．
（ｉｉｉ）肝細胞機能のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの検証
肝細胞は、内胚葉由来であるので、内胚葉系および肝細胞で発現する遺伝子の経時的な発現、グリコーゲンの蓄積、チトクローム酵素の発現等を調べることで、ヒト肝臓の機能を有するか否かを検証することができる。
内胚葉系および肝細胞で発現する遺伝子の経時的な発現は、Ｏｃｔ３／４，Ｔ，Ｇｓｃ，Ｍｉｘｌ１，Ｆｏｘａ２，Ｈｅｘ，Ｈｎｆ４ａ，Ｈｎｆ６，Ａｆｐ，Ａｌｂ，Ｔｔｒ，αＡＴ等で検証できる。その検証手法は、例えば一般的なノザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ウエスタンブロット法である。
肝細胞の分泌能力は、ＡＬＢ，ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ，ａｌｐｈａｌ−ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ，ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎの培養液中の濃度測定で検証できる。その検証手法は、例えば一般的なウエスタンブロット法あるいはＥＩＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｉｍｍｕｎｏ  ａｓｓａｙ）法である。
グリコーゲンの蓄積は、ＰＡＳ（ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ａｃｉｄ−Ｓｃｈｉｆｆ）染色で検証できる。過ヨウ素酸はグルコース残基を選択的に酸化してアルデヒドを生成し、シッフ試薬によって赤紫色に変色する。
チトクローム酵素の発現は、主要な５つであるＣＹＰ３Ａ４，ＣＹＰ１Ａ２，ＣＹＰ２Ｃ９，ＣＹＰ２Ｃ１９及びＣＹＰ２Ｄ６の解析で検証できる。その検証手法は、例えば一般的なノザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ウエスタンブロット法である。
（５）ヒト患者由来の肝細胞により置換された肝臓疾患モデルマウスの作製
本発明のマウスに、ヒト患者由来の肝細胞を移植するとともに、抗エストロゲン剤を投与してマウス由来肝細胞を除去することにより、ヒト肝臓疾患モデルマウスを得ることができる。
ヒト変異肝臓を持つマウスを樹立することは、ヒト患者と同じ症状の疾患モデルの樹立と病態解析のために必要である。そして、ヒト疾患最適化モデルが樹立され、汎用性の高い新しい治療法を開発するために利用することができる。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。なお、ｉＰＳ細胞からの肝細胞の誘導、ヒト家族性アミロイドポリニューロパチーの患者、ヒトプロピオン酸血症の患者からのｉＰＳ細胞の樹立、誘導したヒト肝細胞を用いてのマウスへの移植実験等に関して、倫理委員会、動物実験委員会、第２種組換えＤＮＡ実験安全委員会に申請し、すべて認可された。
【実施例１】
【０００９】
ＥＳ細胞の樹立
本実施例では、ヒト肝細胞移植に最適なヒト化最適マウスの確立のため、ＢＲＪマウス胚からＥＳ細胞株の樹立を行い、マウス系統も確立した。
（１）ＢＡＬＢ／ｃ；Ｒａｇ２−／−；Ｊａｋ３−／−（ＢＲＪ）マウスの樹立とそのＥＳ細胞株の樹立
Ｒａｇ２欠損及びＪａｋ３欠損マウスを交配して、ダブル欠損マウスＢＲＪを樹立した（Ｏｎｏ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０１１；５３９７４８，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／５３９７４８１））。樹立されたＢＲＪマウスを用いて、体外受精を行い、６４個の胚盤胞胚を得、従来用いているＧＭＥＭ−ＫＳＲ培地（１４％  ＫＳＲ，１％ＦＢＳ，１０００Ｕ／ｍｌ  ＬＩＦ  ｉｎ  ＧＭＥＭ）にて培養を行い、樹立を試みたが、増殖の非常に悪い２系統しか樹立できなかった。
これらを用いてキメラマウスを作製したが、５０％程度のキメリズムしか得られず、ｇｅｒｍｌｉｎｅにも寄与しなかった。そこで、ＥＳの未分化状態維持のために有効とされるＧＳＫ３のインヒビターのＣＨＩＲ９９０２１とＭＥＫのインヒビターのＰＤ０３２５９０１を培地に加え（ＧＭＥＭ−ＫＳＲ−２ｉ培地）、再度ＥＳ樹立を試みた。
具体的には、体外受精にてＢＲＪの胚を採取した。胚盤胞６４個をＫＳＯＭ培地で胚盤胞になるまで４日間培養し、４８ｗｅｌｌ（ゼラチンコートのみ）に１つずつ胚を入れた。使用培地はＫＳＲ−ＧＭＥＭ−２ｉ培地である。その培地組成として、Ｇ−ＭＥＭ（Ｇｌａｓｇｏｗ  ｍｉｎｉｍｕｍ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ）の中に、１Ｘ  ＭＥＭ  ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ，０．１ｍＭ  β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，１ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ，１％  Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ），１４％  ＫｎｏｃｋｏｕｔＴＭ  ＳＲ（ＫＳＲ），１１００  ｕｉｎｔｓ／ｍｌ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ（ＬＩＦ），２μＭ  ＰＤ０３２５９０１及び３μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１が含まれている。培養期間は１４日間行ない、途中で培地を２回交換した。１４日後から１８日後にかけて、ＩＣＭが増えてきたｗｅｌｌからフィーダー細胞つきの２４ｗｅｌｌに植え継ぎを行った。さらに、順次、１２ｗｅｌｌ、６ｗｅｌｌ、６−ｃｍ  ｄｉｓｈへと植え継ぎを行い、最終的に、増殖速度及び形態とも全く問題のないＥＳ株を２８系統樹立することが出来た。
（２）ＢＲＪ  ＥＳ細胞株を用いたキメラマウス作製とＢＲＪ  Ｒａｇ２−／−；Ｊａｋ３−／−マウス系統の樹立
樹立できたＥＳ株のうち８つのセルラインを用い、Ｂ６メスとＢＤＦ１オスの交配により得られたモルラ胚とアグリゲーションを行うことで、キメラマウス作製を行った（表１）。
３つのＥＳライン（ＢＲＪ−５，ＢＲＪ−６及びＢＲＪ−８）で得られた１００％キメラから、生殖系列への伝達を確認した（表２）。
なお、得られたＥＳ細胞のうち、８番目のセルラインを「ＢＲＪ８」と称し、２０１２年３月２３日付（受領日）で、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  ＮＩＴＥバイオテクノロジー本部  特許微生物寄託センター）にブダペスト条約に基づき国際寄託した。その受領番号は、「ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−１２９７」である。
【表１】
0005871412.tif 000004
【表２】
0005871412.tif 000005
【実施例２】
【００１０】
マウス肝細胞死の誘導
（１）マウス肝細胞死の誘導のためのコンストラクトの作製
肝細胞を特異的に死滅できる遺伝子改変マウスを作製するため、２種類のコンストラクトを作製した。
コンストラクト１（ＣＡＧ−ＡＴＧ−ｒｏｘ−ＥＧＦＰ−ｒｏｘ−ＤＴ−Ａ）はＣＡＧ  ｐｒｏｍｏｔｅｒの直下に、ＡＴＧ、ｒｏｘで挟まれたＥＧＦＰ、及びＤＴ−Ａ（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  ｔｏｘｉｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ａ）を接続している。
ＥＧＦＰの開始コドンとｒｏｘ上流のＡＴＧはフレームが合うように設計した。また、ＤＴ−Ａの開始コドンは除去しｒｏｘ上流のＡＴＧとフレームが合うように設計した。
コンストラクト２（ＳＡＰ−ＤｒｅＥＲＴ２）は肝細胞特異的な血清アミロイドＰ成分（ｓｅｒｕｍ  ａｍｙｌｏｉｄ  Ｐ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ：ＳＡＰ）のプロモーター直下にＤｒｅ−ＥＲＴ２を接続している。加えて、ＳＡＰ  ｐｒｏｍｏｔｅｒの上流にはｐｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子を接続している。
具体的手法は以下の通りである。
（１−１）コンストラクト１
コンストラクト１は、以下のように作製した。
（ｉ）ｐ６ＳＥＡＺをＰｓｔＩ、ｐＳＰ−ｒｏｘ２をＫｐｎＩで制限酵素処理し、Ｔ４  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）でブラントエンドにした。その後、ＥｃｏＲＩで制限酵素処理を行い、ライゲーションし、ｐＳＰ−ｒｏｘ−ＥＧＦＰ−ｒｏｘを作製した。
（ｉｉ）ｐＳＰ−ｒｏｘ−ＥＧＦＰ−ｒｏｘとｐＢＳＫ−ａｔｇ−ｒｏｘ２（合成ＤＮＡ，Ｂｉｏｍａｔｉｋ社）をＥｃｏＲＩとＳｍａＩで制限酵素処理を行い、ライゲーションし、ｐＢＳＫ−ａｔｇ−ｒｏｘ−ＥＧＦＰ−ｒｏｘを作製した。
（ｉｉｉ）ｐＢＳＫ−ａｔｇ−ｒｏｘ−ＥＧＦＰ−ｒｏｘとＰ７１ｈＡＸＣ−ＤＴをＢａｍＨＩとＰｓｔＩで制限処理を行い、ライゲーションし、ｐＢＳＫ−ａｔｇ−ｒｏｘ−ＥＧＦＰ−ｒｏｘ−ＤＴ−Ａを作製した。
（ｉｖ）ｐＣＡＧＧＳ−ＥＧＦＰをＫｐｎＩで、ｐＢＳＫ−ａｔｇ−ｒｏｘ−ＥＧＦＰ−ｒｏｘ−ＤＴ−ＡをＳｐｅＩで制限酵素処理し、Ｔ４  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）でブラントエンドにした。その後、ＨｉｎｄＩＩＩで制限酵素処理を行い、ライゲーションをしＣＡＧ−ａｔｇ−ｒｏｘ−ＥＧＦＰ−ｒｏｘ−ＤＴ−Ａを作製した。
（１−２）コンストラクト２
コンストラクト２は、以下のように作製した。
（ｉ）ｐｋＳＡＰ−ＤｒｅＰＰをｔｅｍｐｌａｔｅとし、開始コドンからストップコドン手前までをＰＣＲで増幅した。Ｒｅｖｅｒｓｅ  ＰｒｉｍｅｒにはＢａｍＨＩｓｉｔｅを付加した。
0005871412.tif 000006
ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒと上記のＰＣＲ産物をライゲーションし、Ｔ  ｅａｓｙ−Ｄｒｅを作製した。
（ｉｉ）ｐｋＳＡＰ−ＤｒｅＰＰとＴ  ｅａｓｙ−ＤｒｅをＳａｌＩとＥｃｏＲＩで制限酵素処理をし、ライゲーションを行い、Ｔ  Ｅａｓｙ  ＳＡＰを作製した
（ｉｉｉ）前記Ｔ  Ｅａｓｙ  ＤｒｅとＴ  ｅａｓｙ−ＳＡＰをＳａｃＩＩとＮｏｔＩで制限酵素処理をし、ライゲーションを行い、Ｔ  ｅａｓｙ−ＳＡＰ−Ｄｒｅを作製した。
（ｉｖ）Ｔ  Ｅａｓｙ−ＳＡＰ−ＤｒｅとｐｋＳＡ−ＣｒｅｍＥＲＴ２ＰＰを用いて、ＢａｍＨＩとＮｏｔＩで制限酵素処理し、ライゲーションを行い、Ｔ  ｅａｓｙ−ＳＡＰ−ＤｒｅｍＥＲＴ２を作製した。
（ｖ）ｐｋＳＡＰ−ＤｒｅＰＰとＴ  ｅａｓｙ−ＳＡＰ−ＤｒｅｍＥＲＴ２をＳａｌＩとＮｏｔＩで制限酵素処理し、ライゲーションを行い、ｐＫＳＡＰ−ＤｒｅＥＲＴ２を作製した。
（ｖｉ）ｐＫＳＡＰ−ＤｒｅＥＲＴ２をＳｐｅＩで、ｐＦＰａｃｐａＦ２をＫｐｎＩで制限酵素処理を行い、Ｔ４  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）でブラントエンドにした。その後、ｐＫＳＡＰ−ＤｒｅＥＲＴ２をＳａｌＩ、ｐＦＰａｃｐａＦ２をＸｈｏＩで制限酵素処理を行い、ライゲーションをしＰｕｒｏ−ＳＡＰ−ＤｒｅＥＲＴ２を作製した。
（２）エストロゲン受容体遺伝子及びジフテリアトキシン遺伝子のＥＳ細胞への導入
ヒト遺伝子を挿入時に、効率よく発現させるための条件検討を行った（Ｌｉ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．２０：１９１−２００，２０１１．ＤＯＩ  １０．１００７／ｓ１１２４８−０１０−９３８９−２２）。
ＰＧＫ−ｐｕｒｏｍｙｃｉｎカセット及びＩＲＥＳの有無により、どの組み合わせのときが最も発現効率が良いかを解析した。
相同組換えベクターを用いて、通常の方法（Ｚｈａｏ，Ｇ．，Ｌｉ，Ｚ．，Ａｒａｋｉ，Ｋ．，Ｈａｒｕｎａ，Ｋ．，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｋ．，Ａｒａｋｉ，Ｍ．，Ｔａｋｅｙａ，Ｍ．，Ａｎｄｏ，Ｙ．ａｎｄ  Ｙａｍａｍｕｒａ，Ｋ．Ｉｎｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｒｕｍ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ａｔ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ  ｌｏｃｕｓ．Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １３：１２５７−１２６８，２００８．）によりあらかじめマウスｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ（Ｔｔｒ）遺伝子の第１エクソンを破壊した。このとき第１エクソンのＡＴＧが破壊され、その部分にｌｏｘ７１−ＰＧＫ−ｂｅｔａ−ｇｅｏ−ｌｏｘＰ−ｐｏｌｙ  Ａ−ｌｏｘ２２７２が組込まれた標的組換えクローンを得た。
次いで、２種類の置換ベクターを作製した。置換ベクター１は、ｌｏｘ６６−ｈＴＴＲ  ｃＤＮＡ−ｐｏｌｙＡ−Ｆｒｔ−ＰＧＫ−ｐｕｒｏ−Ｆｒｔ−ｌｏｘＰを含んでいる。置換ベクター２は、ｌｏｘ６６−ＩＲＥＳ−ｈＴＴＲ  ｃＤＮＡ−ｐｏｌｙＡ−Ｆｒｔ−ＰＧＫ−ｐｕｒｏ−Ｆｒｔ−ｌｏｘＰを含んでいる。これらの置換ベクターをそれぞれ標的組換えクローンに、Ｃｒｅ発現ベクターとともに電気穿孔法にて導入した。
その結果、ｌｏｘ７１／６６−ｈＴＴＲ  ｃＤＮＡ−ｐｏｌｙＡ−Ｆｒｔ−ＰＧＫ−ｐｕｒｏ−Ｆｒｔ−ｌｏｘＰクローン（Ｉ（−）Ｐ（＋）と略称）及びｌｏｘ７１／６６−ＩＲＥＳ−ｈＴＴＲ  ｃＤＮＡ−ｐｏｌｙＡ−Ｆｒｔ−ＰＧＫ−ｐｕｒｏ−Ｆｒｔ−ｌｏｘＰクローン（Ｉ（＋）Ｐ（＋）と略称）を得た。この２つのクローンはいずれもＰＧＫ−ｐｕｒｏを持つが、Ｉ（−）Ｐ（＋）はＩＲＥＳを持っていない。
この２つのクローンにＣＡＧ−ＦＬＰを電気穿孔法にて導入し、Ｆｒｔ間のＰＧＫ−ｐｕｒｏを削除し、Ｉ（−）Ｐ（−）およびＩ（＋）Ｐ（−）クローンを作製した。
上記４つのＥＳクローンからマウスを作製し、発現解析を行ったところ、Ｉ（−）Ｐ（＋）での発現が最も高く、Ｉ（−）Ｐ（−），Ｉ（＋）Ｐ（＋），Ｉ（＋）Ｐ（−）の順に発現が低下することが分かった。また、Ｉ（−）Ｐ（＋）の場合は、肝臓でのヒトＴＴＲ（トランスチレチン）の発現は、コントロールマウスにおけるマウスＴｔｒ（トランスチレチン）の発現レベルとほぼ同じであることが分かった。
その結果、ＰＧＫ−ｐｕｒｏｍｙｃｉｎが存在し、ＩＲＥＳが存在しない組み合わせが、挿入したヒト遺伝子の発現効率が最も良いことを明らかにした。
【実施例３】
【００１１】
ヒト成長ホルモン遺伝子による置換
相同組換えベクターを用いて、実施例２と同様に通常の方法によりあらかじめマウスｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ（Ｇｈ）遺伝子の第１エクソンを破壊した。このとき第１エクソンのＡＴＧが破壊され、その部分にｌｏｘ７１−ＰＧＫ−ｂｅｔａ−ｇｅｏ−ｌｏｘＰ−ｐｏｌｙ  Ａ−ｌｏｘ２２７２が組込まれた標的組換えクローンを得た。次いで、置換ベクターを作製した。置換ベクターは、ｌｏｘ６６−ｈＧＨ  ｃＤＮＡ−ｐｏｌｙＡ−Ｆｒｔ−ＰＧＫ−ｐｕｒｏ−Ｆｒｔ−ｌｏｘＰを含んでいる。この置換ベクターを標的組換えクローンに、Ｃｒｅ発現ベクターとともに電気穿孔法にて導入した。
その結果、マウスのＧｈ遺伝子がヒトＧＨ遺伝子で置換されたＥＳクローンを得た。
【実施例４】
【００１２】
ヒト薬物代謝酵素遺伝子による置換
通常の方法によりあらかじめ相同組換えベクターを用いて、マウスＣｙｐ３ａ１３遺伝子の第１エクソンを破壊した。このとき第１エクソンのＡＴＧが破壊され、その部分にｌｏｘ７１−ＰＧＫ−ｂｅｔａ−ｇｅｏ−ｌｏｘＰ−ｐｏｌｙ  Ａ−ｌｏｘ２２７２が組込まれた標的組換えクローンを得た。次いで、置換ベクターを作製した。置換ベクターは、ｌｏｘ６６−ｈＣＹＰ３Ａ４  ｃＤＮＡ−ｐｏｌｙＡ−Ｆｒｔ−ＰＧＫ−ｐｕｒｏ−Ｆｒｔ−ｌｏｘＰを含んでいる。この置換ベクターを標的組換えクローンに、Ｃｒｅ発現ベクターとともに電気穿孔法にて導入した。
その結果、マウスのＣｙｐ３ａ１３遺伝子が、ヒトＣＹＰ３Ａ４遺伝子で置換されたＥＳクローンを得た。
【実施例５】
【００１３】
肝臓ヒト化マウスの作製
ヒトｉＰＳ細胞からのヒト肝細胞の分化誘導方法をほぼ確立し、マウス肝細胞死の誘導のためのコンストラクトの作製も行った。
（１）  ヒトｉＰＳ細胞からの肝細胞の分化誘導
ヒトｉＰＳ細胞から、支持細胞や細胞外マトリックスを用いて効率的な内胚葉および肝臓分化誘導方法を構築した。
分化肝臓細胞の純化および分化誘導効率の評価のために、アルブミン−レポーター遺伝子導入ヒトｉＰＳ細胞株を樹立し、分化誘導方法の開発に利用した。培養基材に関しては、支持細胞（フィーダー細胞）であるＭ１５細胞、人工基底膜（ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  Ｂａｓｅｍｅｎｔ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ：ｓＢＭ）、Ｃｅｌｌ−ａｂｌｅなどを利用した。
ｉＰＳ細胞からヒト肝細胞に分化させるために、初日から９日目までは４，５００ｍｇ／ｌ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ＤＭＥＭ培地を用いて培養した。このＤＭＥＭ培地は以下を含む：ｉｎｓｕｌｉｎ（１０ｍｇ／ｌ），ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ（５．５ｍｇ／ｌ），ｓｏｄｉｕｍ  ｓｅｌｅｎｉｔｅ（６．７ｍｇ／ｍｌ），ＡＬＢＵＭＡＸ  ＩＩ（２．５ｍｇ／ｍｌ），１００ｍＭ  ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ，２ｍＭ  Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，５０ｍｇ／ｍｌ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、１００μＭ  β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）。
次いで、９日目から１１日目まではレチノイン酸（１０−６Ｍ）を加えて培養した。
最後に、１１日目から３０日目まで２，０００ｍｇ／ｌ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ＤＭＥＭ培地に移し替えて培養することにより肝細胞へと分化させた。このとき使用したＤＭＥＭ培地には以下を含む：１０％  ＫＳＲ，１００ｍＭ  ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ，２ｍＭ  Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，５０ｍｇ／ｍｌ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、１００μＭ  β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｏｒ（１０ｎｇ／ｍｌ），Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ（１ｍＭ），Ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（１％），ａｎｄ  Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ（１ｍＭ）。
（２）ｉＰＳ由来ヒト肝細胞の移植方法の検討
肝臓をヒト化するために必要な、マウス肝臓に効率よくｉＰＳ由来肝細胞を導入する方法の確立を目的として、ｉＰＳ由来ヒト肝細胞を胎生期１７日目のマウス胎仔の羊膜上に存在する血管（ｙｏｌｋ  ｓａｃ  ｖｅｓｓｅｌ）を経由して導入する方法の予備実験を行った（図６、７）。
（Ａ）色素（ｂｌｕｅ−ｄｙｅ）および（Ｂ）ＧＦＰ発現ベクターを封入したグリセロールミセルを胎生期１７日目の羊膜上に存在する血管に導入し、その導入効率を確かめた。
その結果、注入物は肝臓に集中して局在し、かつ肝臓全体に散在することを確認した。また、この処置を行った後も胎児の生存や分娩に影響はなく、（Ａ）、（Ｂ）とも肝臓に効率よく導入された新生児マウスが誕生した。
上記（１）の項で作製した肝細胞を移植に用いた。
Ｍ１５上及びｓＢＭ上で分化誘導した肝細胞を図８に示す。
次に、大量の肝細胞を誘導するため、Ｃｅｌｌ−ａｂｌｅ（東洋合成、東京）という培養プレートを用いて培養した。
その結果、やはり３０日間の培養で、大量に肝細胞に分化誘導することができ、また、スフェロイド形成が行われた（図９）。
いずれの培養方法においても、培養１０日目にＳｏｘ１７陽性の内胚葉が、培養２０日目にＡＦＰ陽性の未熟な肝臓細胞が、培養３０日目にはＡＬＢＵＭＩＮ陽性の成熟肝細胞が分化誘導された。
分化誘導された成熟肝細胞の機能評価として、グリコーゲンの蓄積をＰＡＳ染色で、解毒能をインドシアニングリーン（ＩＣＧ）染色を行った。
その結果、分化誘導した肝臓細胞が目的の機能を持っていることが分かった。
また、肝臓細胞はマウス特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ解析によりマウス遺伝子の発現を認めないことから、１００％がヒト由来のものであることが分かった。
【実施例６】
【００１４】
変異ヒト化肝臓マウスの樹立
本実施例では、ＦＡＰ及びＰＡのモデルマウスの繁殖を行った。
（１）ヒト患者からの変異肝細胞の誘導
（ｉ）家族性アミロイドポリニューロパチー（ＦＡＰ）：樹立済み
ＦＡＰは、トランスサイレチン（ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ：ＴＴＲ）遺伝子の点突然変異により引き起こされる常染色体優性遺伝病である。例えば、ＦＡＰでは、トランスサイレチンのアミノ酸配列において、３０番目のアミノ酸がバリンからメチオニンに置換されている（Ｖａｌ３０Ｍｅｔ）。このＶａｌ３０Ｍｅｔ変異を持つ患者から採取した線維芽細胞を用いてｉＰＳ細胞を樹立した。
そして、このｉＰＳ細胞から、これまでに述べた方法と同じ方法で、肝細胞へ分化誘導できることが分かった。
（ｉｉ）ヒトプロピオン酸血症（ＰＡ）の患者からのｉＰＳ細胞の樹立
ＰＡは、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ（ｐｒｏｐｉｏｎｙｌ  ＣｏＡ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ：ＰＣＣＡ）遺伝子の異常により引き起こされる常染色体劣性遺伝病である。例えば、ＰＡでは、ＰＣＣＡのアミノ酸配列において、５２番目のアルギニンがトリプトファンに置換されている（Ａｒｇ５２Ｔｒｐ）。この変異を持つ患者から採取した線維芽細胞を用いてｉＰＳ細胞を樹立した。そして、このｉＰＳ細胞から、これまでに述べた方法と同じ方法で、肝細胞へ分化誘導できることが分かった。
（２）変異ヒト化肝臓マウス（ＦＡＰ及びＰＡのモデルマウス）の樹立
変異ヒト化肝臓マウスの樹立は、ヒト化肝臓マウス（正常人由来のｉＰＳから誘導した肝細胞を移植して作製したマウス）の作製方法と同様に、ＦＡＰおよびＰＡ患者由来のｉＰＳ細胞から分化誘導して得た肝細胞を本発明のマウスに移植することにより樹立することができる。
【産業上の利用可能性】
【００１５】
本発明により、免疫不全マウス由来のＥＳ細胞が提供される。本発明のＥＳ細胞を用い作製された胚にヒト肝細胞移植することにより、肝臓がヒト化されたマウスを作出することができ、ヒトの肝機能を調べることができる。
【受託番号】
【００１６】
微生物の表示：「ＢＲＪ８」
受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−１２９７
原寄託日（受領日）：２０１２年３月２３日
国際寄託当局：独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター  〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  ＮＩＴＥバイオテクノロジー本部  特許微生物寄託センター
【配列表フリーテキスト】
【００１７】
配列番号１〜１５：合成ＤＮＡ
［配列表］
0005871412.tif 000007
0005871412.tif 000008
0005871412.tif 000009
0005871412.tif 000010
0005871412.tif 000011
0005871412.tif 000012
0005871412.tif 000013
【図１】
0005871412.tif 000014
【図２】
0005871412.tif 000015
【図３】
0005871412.tif 000016
【図４】
0005871412.tif 000017
【図５】
0005871412.tif 000018
【図６】
0005871412.tif 000019
【図７】
0005871412.tif 000020
【図８】
0005871412.tif 000021
【図９】
0005871412.tif 000022