(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療に使用される、ＰＣＮＡ相互作用モチーフを含むオリゴペプチド化合物であって、  前記ＰＣＮＡ相互作用モチーフが、配列番号１８に記載の配列であり、
前記オリゴペプチド化合物が、
２１〜７０個のアミノ酸を含み、かつ
配列番号１２５に記載の核局在化シグナル配列、及び配列番号７３に記載の細胞透過シグナル配列を含み、かつ
前記オリゴペプチド化合物におけるＰＣＮＡ相互作用モチーフの少なくとも１つが、前記シグナル配列よりもＮ末端側に位置する、
ＰＣＮＡ相互作用モチーフを含むオリゴペプチド化合物。
【請求項２】
異常な又は不要な細胞成長を伴う障害若しくは病態の治療に又は細胞増殖抑制療法を伴う治療に使用される、ＰＣＮＡ相互作用モチーフを含むオリゴペプチド化合物であって、  前記ＰＣＮＡ相互作用モチーフが、配列番号１８に記載の配列であり、
前記オリゴペプチド化合物が、
２１〜７０個のアミノ酸を含み、かつ
配列番号１２５に記載の核局在化シグナル配列、及び配列番号７３に記載の細胞透過シグナル配列を含み、かつ
前記オリゴペプチド化合物におけるＰＣＮＡ相互作用モチーフの少なくとも１つが、前記シグナル配列よりもＮ末端側に位置する、
ＰＣＮＡ相互作用モチーフを含むオリゴペプチド化合物。
【請求項３】
異常な又は不要な細胞成長を伴う障害若しくは病態の治療に又は細胞増殖抑制療法を伴う治療に使用される薬物の製造における、ＰＣＮＡ相互作用モチーフを含むオリゴペプチド化合物の使用であって、
前記ＰＣＮＡ相互作用モチーフが、配列番号１８に記載の配列であり、
前記オリゴペプチド化合物が、
２１〜７０個のアミノ酸を含み、かつ
配列番号１２５に記載の核局在化シグナル配列、及び配列番号７３に記載の細胞透過シグナル配列を含み、かつ
前記オリゴペプチド化合物におけるＰＣＮＡ相互作用モチーフの少なくとも１つが、前記シグナル配列よりもＮ末端側に位置する、
ＰＣＮＡ相互作用モチーフを含むオリゴペプチド化合物の使用。
【請求項４】
少なくとも１つの薬理学的に許容される担体又は賦形剤と共に、ＰＣＮＡ相互作用モチーフを含むオリゴペプチド化合物を含む、医薬組成物であって、
前記ＰＣＮＡ相互作用モチーフが、配列番号１８に記載の配列であり、
前記オリゴペプチド化合物が、
２１〜７０個のアミノ酸を含み、かつ
配列番号１２５に記載の核局在化シグナル配列、及び配列番号７３に記載の細胞透過シグナル配列を含み、かつ
前記オリゴペプチド化合物におけるＰＣＮＡ相互作用モチーフの少なくとも１つが、前記シグナル配列よりもＮ末端側に位置することを特徴とする、医薬組成物。
【請求項５】
経口、非経口、局所、直腸、生殖器、皮下、経尿道、経皮、鼻腔内、腹腔内、筋肉内及び／又は静脈内投与に、及び／又は吸入による投与に適した形態で与えられる、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
（ｉ）ＰＣＮＡ相互作用モチーフを含むオリゴペプチド化合物であって、
前記ＰＣＮＡ相互作用モチーフが、配列番号１８に記載の配列であり、
前記オリゴペプチド化合物が、
２１〜７０個のアミノ酸を含み、かつ
配列番号１２５に記載の核局在化シグナル配列、及び配列番号７３に記載の細胞透過シグナル配列を含む、ＰＣＮＡ相互作用モチーフを含むオリゴペプチド化合物、及び
（ｉｉ）細胞増殖抑制剤、
を備える、キット。
【請求項７】
前記（ｉ）オリゴペプチド化合物、及び（ｉｉ）細胞増殖抑制剤が、異常な又は不要な細胞成長を伴う障害若しくは病態の治療において又は細胞増殖抑制療法を伴う治療において同時に、連続して又は別々に使用される複合調製物として提供される、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
異常な又は不要な細胞成長を伴う障害若しくは病態の治療において又は細胞増殖抑制療法を伴う治療において細胞増殖抑制剤と併用される、ＰＣＮＡ相互作用モチーフを含むオリゴペプチド化合物であって、
前記ＰＣＮＡ相互作用モチーフが、配列番号１８に記載の配列であり、
前記オリゴペプチド化合物が、
２１〜７０個のアミノ酸を含み、かつ
配列番号１２５に記載の核局在化シグナル配列、及び配列番号７３に記載の細胞透過シグナル配列を含む、ＰＣＮＡ相互作用モチーフを含むオリゴペプチド化合物。
【請求項９】
放射線療法のための増感剤として使用される、ＰＣＮＡ相互作用モチーフを含むオリゴペプチド化合物であって、
前記ＰＣＮＡ相互作用モチーフが、配列番号１８に記載の配列であり、
前記オリゴペプチド化合物が、
２１〜７０個のアミノ酸を含み、かつ
配列番号１２５に記載の核局在化シグナル配列、及び配列番号７３に記載の細胞透過シグナル配列を含む、ＰＣＮＡ相互作用モチーフを含むオリゴペプチド化合物。
【請求項１０】
放射線療法のための増感剤として、異常な又は不要な細胞成長を伴う障害若しくは病態の治療、又は放射線療法を伴う治療に使用される、請求項９に記載のオリゴペプチド化合物。
【請求項１１】
新規な細胞増殖抑制剤をｉｎ  ｖｉｔｒｏで同定する方法であって、請求項１に記載のオリゴペプチド化合物を細胞又は細胞培養物に投与することを含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの同定方法。
【請求項１２】
請求項１に記載のオリゴペプチド化合物を含有するリポソーム。
【請求項１３】
ＰＣＮＡと相互作用可能なオリゴペプチド化合物であって、
前記オリゴペプチド化合物が、
配列番号１８に記載の配列を含み、
２１〜７０個のアミノ酸を含み、かつ
配列番号１２５に記載の核局在化シグナル配列、及び配列番号７３に記載の細胞透過シグナル配列を含み、
前記オリゴペプチド化合物におけるＰＣＮＡ相互作用モチーフの少なくとも１つが、前記シグナル配列よりもＮ末端側に位置する、
オリゴペプチド化合物。
【請求項１４】
配列番号１８に記載の配列を有するＰＣＮＡ相互作用モチーフを有する又はこれを含むペプチドをコードする核酸分子であって、
前記ペプチドが、
２１〜７０個のアミノ酸を含み、かつ
配列番号１２５に記載の核局在化シグナル配列、及び配列番号７３に記載の細胞透過シグナル配列を含み、
前記ペプチドにおけるＰＣＮＡ相互作用モチーフの少なくとも１つが、前記シグナル配列よりもＮ末端側に位置する、
核酸分子。
【請求項１５】
請求項１４に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１６】
前記オリゴペプチド化合物が、配列番号１１２に記載の配列を含む、請求項１、２、４〜１０、及び１２〜１５のいずれか一項に記載のオリゴペプチド化合物、核酸分子、ベクター、医薬組成物、キット、又はリポソーム。
【請求項１７】
前記オリゴペプチド化合物が、細胞増殖抑制剤と共に同時に、別々に又は連続して使用される、請求項１、２、４〜１０、１２、１３、及び１６のいずれか一項に記載のオリゴペプチド化合物、医薬組成物、キット、又はリポソーム。
【請求項１８】
前記オリゴペプチド化合物が融合タンパク質又はアプタマーの一部である、請求項１、２、４〜１０、及び１２〜１７のいずれか一項に記載のオリゴペプチド化合物、核酸分子、ベクター、医薬組成物、キット、又はリポソーム。
【請求項１９】
前記細胞増殖抑制剤が、アクチノマイシンＤ、ＢＣＮＵ（カルマスティン）、カルボプラチン、ＣＣＮＵ、カンプトテシン（ＣＰＴ）、カンタリジン、シスプラチン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ＤＴＩＣ、エピルビシン、エトポシド、ゲフィニチブ、ゲムシタビン、イフォサミド、イリノテカン、イオノマイシン、メルファラン、メトトレキサート、メチルメタンスルホネート（ＭＭＳ）、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）、ミトザントロン  メルカプトプリン、オキサリプラチン、パクリタキセル（タキソール）、ＰＡＲＰ−１阻害剤、タキソテール、テモゾロミド（ＴＺＭ）、テニポシド、トポテカン、トレオスルファン、ビノレルビン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、５−アザシチジン、５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン及び５−フルオロウラシルから選択される、請求項６〜８及び１７のいずれか一項に記載のオリゴペプチド化合物、医薬組成物又はキット。
【請求項２０】
前記細胞増殖抑制剤がアルキル化剤である、請求項６〜８及び１７のいずれか一項に記載のオリゴペプチド化合物、医薬組成物又はキット。
【請求項２１】
前記障害が過剰増殖性障害であり、又は前記治療が骨髄除去である、請求項２、７、８、１０、及び１６〜２０のいずれか一項に記載のオリゴペプチド化合物、又はキット。
【請求項２２】
前記過剰増殖性障害が、悪性、前癌性又は非悪性の腫瘍性障害、炎症、自己免疫障害、血液障害、皮膚障害、ウイルス誘導性の過剰増殖性障害、骨髄異形成（myelodyplastic）障害又は骨髄増殖性障害から選択される、請求項２１に記載のオリゴペプチド化合物、又はキット。
【請求項２３】
前記過剰増殖性障害が、癌、良性腫瘍、乾癬性関節炎、関節リウマチ、炎症性腸疾患、乾癬、ライター症候群、毛孔性紅色粃糠疹、過剰増殖性変異型の角質化障害、再狭窄、糖尿病性腎症、甲状腺過形成、グレイヴズ病、前立腺肥大症、Ｌｉ−Ｆｒａｕｍｅｎｔｉ症候群、糖尿病性網膜症、末梢血管疾患、子宮頸部上皮内癌、家族性腸ポリープ症、口腔白板症、組織球増殖症、ケロイド、血管腫、過剰増殖性動脈狭窄、炎症性関節炎、過角化症、関節炎を含む丘疹鱗屑性発疹、疣贅、及びＥＢＶ誘導性疾患、瘢痕形成、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ、ループス）、重症筋無力症、非悪性過形成、肉芽腫、意義不明の単クローン性高ガンマグロブリン血症（ＭＧＵＳ）、新生物性髄膜炎、真性赤血球増加症、硬化性粘液水腫、丘疹性ムチン沈着症、アミロイドーシス及びヴェグナー肉芽腫から選択される、請求項２１に記載のオリゴペプチド化合物、又はキット。
【請求項２４】
炎症の治療において用いる、請求項１、４、６、７〜１０、１２、１３及び１６〜２２のいずれか一項に記載のオリゴペプチド化合物、医薬組成物、キット又はリポソーム。
【請求項２５】
癌の治療において用いる、請求項１、４、６、７〜１０、１２、１３及び１６〜２３のいずれか一項に記載のオリゴペプチド化合物、医薬組成物、キット又はリポソーム。
【請求項２６】
前記癌が、膀胱癌、前立腺癌、及び血液学的癌（例えば、多発性骨髄腫又は白血病）から選択される少なくとも１種である、請求項２５に記載のオリゴペプチド化合物、医薬組成物、キット又はリポソーム。
【請求項２７】
前記オリゴペプチド化合物が、配列番号１１２に記載の配列を含む、請求項３又は１１に記載の使用、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏでの同定方法。
【請求項２８】
前記オリゴペプチド化合物が、細胞増殖抑制剤と共に同時に、別々に又は連続して使用される、請求項３、１１、及び２７のいずれか一項に記載の使用、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏでの同定方法。
【請求項２９】
前記オリゴペプチド化合物が融合タンパク質又はアプタマーの一部である、請求項３、１１、２７、及び２８のいずれか一項に記載の使用、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏでの同定方法。
【請求項３０】
前記細胞増殖抑制剤が、アクチノマイシンＤ、ＢＣＮＵ（カルマスティン）、カルボプラチン、ＣＣＮＵ、カンプトテシン（ＣＰＴ）、カンタリジン、シスプラチン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ＤＴＩＣ、エピルビシン、エトポシド、ゲフィニチブ、ゲムシタビン、イフォサミド、イリノテカン、イオノマイシン、メルファラン、メトトレキサート、メチルメタンスルホネート（ＭＭＳ）、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）、ミトザントロン  メルカプトプリン、オキサリプラチン、パクリタキセル（タキソール）、ＰＡＲＰ−１阻害剤、タキソテール、テモゾロミド（ＴＺＭ）、テニポシド、トポテカン、トレオスルファン、ビノレルビン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、５−アザシチジン、５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン及び５−フルオロウラシルから選択される、請求項２８に記載の使用。
【請求項３１】
前記細胞増殖抑制剤がアルキル化剤である、請求項２８に記載の使用。
【請求項３２】
前記障害が過剰増殖性障害であり、又は前記治療が骨髄除去である、請求項３、及び２７〜３１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３３】
前記過剰増殖性障害が、悪性、前癌性又は非悪性の腫瘍性障害、炎症、自己免疫障害、血液障害、皮膚障害、ウイルス誘導性の過剰増殖性障害、骨髄異形成（myelodyplastic）障害又は骨髄増殖性障害から選択される、請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
前記過剰増殖性障害が、癌、良性腫瘍、乾癬性関節炎、関節リウマチ、炎症性腸疾患、乾癬、ライター症候群、毛孔性紅色粃糠疹、過剰増殖性変異型の角質化障害、再狭窄、糖尿病性腎症、甲状腺過形成、グレイヴズ病、前立腺肥大症、Ｌｉ−Ｆｒａｕｍｅｎｔｉ症候群、糖尿病性網膜症、末梢血管疾患、子宮頸部上皮内癌、家族性腸ポリープ症、口腔白板症、組織球増殖症、ケロイド、血管腫、過剰増殖性動脈狭窄、炎症性関節炎、過角化症、関節炎を含む丘疹鱗屑性発疹、疣贅、及びＥＢＶ誘導性疾患、瘢痕形成、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ、ループス）、重症筋無力症、非悪性過形成、肉芽腫、意義不明の単クローン性高ガンマグロブリン血症（ＭＧＵＳ）、新生物性髄膜炎、真性赤血球増加症、硬化性粘液水腫、丘疹性ムチン沈着症、アミロイドーシス及びヴェグナー肉芽腫から選択される、請求項３２に記載の使用。
【請求項３５】
炎症の治療において用いる、請求項２７〜３３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３６】
癌の治療において用いる、請求項２７〜３４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３７】
前記癌が、膀胱癌、前立腺癌、及び血液学的癌（例えば、多発性骨髄腫又は白血病）から選択される少なくとも１種である、請求項３６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の薬剤、医薬組成物、及び治療、特に過剰増殖性疾患、又は実際に細胞増殖抑制療法を必要とする、若しくは細胞増殖抑制療法に対して反応性がある任意の病態の治療等において細胞の増殖又は成長を低減又は防止することが望まれる又は好都合である任意の治療におけるそれらの使用に関する。本発明は、増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）と、ＤＮＡ修復、維持及び細胞周期の調節にかかわる様々なタンパク質との間の新規の相互作用の特定、並びにこのような相互作用に関与する新規のペンタペプチドモチーフ（本発明者らはＡＰＩＭと呼んでいる）のその後の同定に基づいている。したがって、本発明はより具体的には、このようなモチーフを含み、且つＰＣＮＡと相互作用可能なペプチド又はその模倣薬、このような薬剤を含む医薬組成物、及び上記のような治療、特に細胞増殖の低減又は防止を伴う治療におけるこのような薬剤の使用に関する。好ましくは細胞増殖抑制剤と併せてＰＣＮＡ相互作用モチーフを含む薬剤を使用することを含む治療法も提供される。
【背景技術】
【０００２】
ヒト及び動物の細胞は、活性酸素種、ＵＶ光、ｘ線及び内因性又は外因性の細胞増殖抑制剤のような種々のＤＮＡ損傷の原因に曝されている。
【０００３】
細胞増殖抑制剤は、例えばＤＮＡを損傷させることにより、又は細胞複製機構に干渉することにより、細胞の成長及び／又は増大（増殖／複製）を阻害又は抑制する薬剤である。アルキル化剤は細胞増殖抑制剤の一種であり、その幾つかが臨床的に又は研究目的で使用されている。
【０００４】
アルキル化剤はＮ原子又はＯ原子で塩基を修飾することによりＤＮＡ損傷を引き起こす。損傷の種類は薬剤の種類によって変わり、ほとんどの薬剤が特異的なＤＮＡ修飾を引き起こす。ＤＮＡ損傷にはアルキル化付加（adducts）と鎖間架橋とが含まれ、これが複製中のミスコード及び／又は複製の阻止につながり、その後二本鎖切断又は損傷乗り越え合成が起こり得る。
【０００５】
ヒト及び動物の細胞は、塩基除去修復、ヌクレオチド除去修復及びミスマッチ修復を含む様々なＤＮＡ修復システムを保有している。例としては、酸化的脱メチル化により、３−メチルシトシン（３ｍｅＣ）をシトシンに、及び１−メチルアデニン（１ｍｅＡ）をアデニンに再変換するヒトＤＮＡ酸化デメチラーゼ、ｈＡＢＨ２である。
【０００６】
ＤＮＡ修復と細胞周期によって調節されるＤＮＡ複製との間の緊密な連携がゲノム完全性には必須である。損傷の存在下では、損傷が修復されるまでＤＮＡ複製を停止することが重要であり、そうでなければ突然変異が起こり伝播する。ＤＮＡ複製とＤＮＡ修復との両方にかかわることが知られているタンパク質の１つは増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）である。
【０００７】
ＰＣＮＡは、細菌からより高等な真核生物まで機能的に保存されているタンパク質のスライディングクランプファミリーのメンバーであり、その主な機能はゲノムの重複に必要とされる高い処理能力を有する複製ポリメラーゼを提供することである。生きているＳ期細胞では、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）でタグ付けされたＰＣＮＡが複製の異なる中心（foci）提示部位を形成する。そのため、ＰＣＮＡをＳ期マーカーとして使用することができる。
【０００８】
ＤＮＡ修復、クロマチン集合化、エピジェネティックなクロマチン再構築（remodelling）、姉妹染色分体凝集、細胞周期制御及び生存等の細胞過程にかかわる多くのタンパク質は、１２個を超える複製フォークを含有する、いわゆる複製工場に局在化している。これらのタンパク質の多くは、ＰＩＰ−ボックス（ＱｘｘＬ／Ｉ／ＭｘｘＦ／ＤＦ／Ｙ）（ここではｘは任意のアミノ酸であり得る）と呼ばれる、保存されたＰＣＮＡ相互作用ペプチド配列を介してＰＣＮＡと相互作用する。ＫＡｘボックスと呼ばれる代替的なＰＣＮＡ結合モチーフが、ペプチドディスプレイライブラリを使用して同定されたが、このモチーフはｉｎ  ｖｉｖｏでのＰＣＮＡ相互作用にとって重要であることは実証されていない。
【０００９】
様々なタンパク質がＰＣＮＡと相互作用し、ｈＡＢＨ２を含むこれらのタンパク質の幾つかが複製中心においてＰＣＮＡと共局在化することが分かっている。しかしながら、共局在化自体は共局在化するタンパク質間に何らかの直接的又は間接的な相互作用があることを示唆してはいない。実際、ｈＡＢＨ２にはＰＩＰ−ボックス又はＫＡｘボックス等のＰＣＮＡ結合モチーフが存在していないことにより、ｈＡＢＨ２がＰＣＮＡと相互作用しないことが示唆されるであろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明につながる研究において、本発明者らは驚くべきことに、様々なタンパク質が新規のＰＣＮＡ相互作用モチーフを介してＰＣＮＡと相互作用することを見出した。これらのタンパク質の１つであるｈＡＢＨ２では、このモチーフはＮ末端に位置している。本発明者らは、このモチーフがＰＣＮＡとの相互作用に必須であり、且つ十分でもあることを確認した（実施例１を参照されたい）。
【００１１】
以下の実施例でより詳細に説明されるように、アルキル化による損傷のＤＮＡ修復におけるこのＰＣＮＡ相互作用モチーフの機能を研究するために、このモチーフを含む組換えペプチドを発現する細胞株を様々な用量のメチルメタンスルホネート（ＭＭＳ）（これは３−メチルシトシン及び１−メチルアデニンの形成を引き起こすＳＮ２アルキル化剤である）に曝した。このモチーフを含む組換えペプチドの発現が、細胞をＭＭＳにより引き起こされるＤＮＡ損傷に対して増感させることが見出され、これによりこのモチーフを含む組換えペプチドがＰＣＮＡとｈＡＢＨ２との間の相互作用を競合阻害することが示された。
【００１２】
他の種類のＤＮＡ損傷を引き起こす、ＢＣＮＵ、テモゾロマイド（ＴＺＭ）及びマイトマイシンｃ（ＭＭＣ）を含む他の薬剤も試験したが、大変驚くべきことに、本発明者らは、このモチーフを含む組換えペプチドは、細胞をこれらの薬剤により引き起こされる損傷に対しても増感させることを見出した。これは全く予想できないことであったが、それはＢＣＮＵが主として鎖間架橋と幾つかの一塩基環状付加体（１，Ｎ（６）エテノアデニン（ethanoadenine））とをもたらすＯ６−クロロエチル化剤であり、ＴＺＭが０６Ｇメチル化剤であることが報告され、ＭＭＣがＣｐＧにおけるグアニンのＮアルキル化を介して鎖間架橋を引き起こし、ｈＡＢＨ２がこれらの種類のＤＮＡ損傷を修復しないためである。その代わりとして、この種の損傷を修復する他の酵素が存在し、例えばＴＺＭによる損傷は、Ｏ６−メチルグアニン−ＤＮＡトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）により直接的に修復される。これらの研究結果により、このモチーフを含む組換えペプチドがｈＡＢＨ２とＰＣＮＡとの間の相互作用を阻害するだけではないこと、及び他のタンパク質を伴ってもよい、すなわち他のタンパク質を、新規のモチーフを介してＰＣＮＡと相互作用させてもよいことが示される。
【００１３】
本発明者らは、このモチーフを含む組換えペプチドの発現が、ＡＢＨ２ノックアウトマウス、すなわちＡＢＨ２を保有していないマウス由来の細胞株で観察されたものを超えて、細胞増殖抑制剤（具体的にＭＭＳ）の細胞傷害効果を増大させることも見出し、これによりさらに、このモチーフを含む組換えペプチドが広範な効果を有し、ｈＡＢＨ２だけではなく他のタンパク質も阻害し得ることが示された。
【００１４】
これらの驚くべき研究結果により、本発明者らはＰＣＮＡ結合モチーフを含むペプチドに関する治療的使用を提案している。
【００１５】
ＡＰＩＭと呼ばれる、新規の本発明のＰＣＮＡ結合モチーフは特徴付けられており、以下のように規定され得る：
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ３’Ｘ１’（配列番号１）
（式中、Ｘ１及びＸ１’は独立して、塩基性アミノ酸の群から選択され、Ｘ２は脂溶性アミノ酸であり、Ｘ３及びＸ３’は独立して、非荷電の、好ましくは非極性アミノ酸の群から選択される）。
【００１６】
ＰＣＮＡと相互作用可能なペプチド（又はオリゴペプチド化合物）は、このようなペプチド（又は配列）モチーフを含有し得る、又はこれを含み得る。このため、ＰＣＮＡと相互作用可能であり、且つこのようなモチーフを含むオリゴペプチド化合物が本明細書中に開示され、本発明の或る特定の態様を表し得る。
【００１７】
例えば一実施の形態において、本発明は、ＰＣＮＡと相互作用可能であり、且つモチーフＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ３’Ｘ１’（配列番号１）（式中、Ｘ１及びＸ１’は独立して、塩基性アミノ酸の群から選択され、Ｘ２は脂溶性アミノ酸であり、Ｘ３及びＸ３’は独立して、非荷電の、好ましくは非極性アミノ酸の群から選択される）を含む、オリゴペプチド化合物であって、
（ｉ）オリゴペプチド化合物が少なくとも１１個のアミノ酸又は同等のサブユニットを含むこと、
（ｉｉ）Ｘ２がフェニルアラニンではないこと、
（ｉｉｉ）オリゴペプチド化合物が少なくとも１つのＤ−アミノ酸を含むこと、
（ｉｖ）オリゴペプチド化合物が、少なくとも１つのシグナル配列、すなわちオリゴペプチド化合物を特定の位置に方向付ける配列、例えば細胞に方向付ける配列（例えばオリゴペプチド化合物を細胞に方向付ける細胞透過配列）及び／又は特定の細胞コンパートメントに方向付ける配列（例えばオリゴペプチド化合物を核に方向付ける核局在化シグナル配列）を含むこと、並びに
（ｉｖ）オリゴペプチド化合物がモチーフ［Ｋ／Ｒ］−Ｆ−［Ｌ／Ｉ／Ｖ］−［Ｌ／Ｉ／Ｖ］−［Ｋ／Ｒ］（配列番号２７）を含むこと、
の少なくとも１つをさらに特徴とするオリゴペプチド化合物を提供し得る。
【００１８】
特にこのような実施の形態において、オリゴペプチド化合物は核局在化シグナル配列を含む。別の実施の形態では、オリゴペプチド化合物は細胞透過配列（細胞透過ペプチド）を含む。またさらなる実施の形態では、オリゴペプチド化合物は細胞透過配列と核局在化配列とを含む。
【００１９】
したがって、このような実施の形態において、本発明の化合物は、少なくとも１つのシグナル配列と共に、上記で規定のように、ＰＣＮＡ相互作用モチーフを含むオリゴペプチド化合物を含有する（すなわち含む）構築物の形態を取り得ることが分かる。したがってこの態様では、本発明は、少なくとも１つのシグナル配列と共に、ＰＣＮＡと相互作用可能であり、且つモチーフＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ３’Ｘ１’（配列番号１）（式中、Ｘ１及びＸ１’は独立して、塩基性アミノ酸の群から選択され、Ｘ２は脂溶性アミノ酸であり、Ｘ３及びＸ３’は独立して、非荷電の、好ましくは非極性アミノ酸の群から選択される）を含むオリゴペプチド化合物を含む構築物を提供することが分かり得る。
【００２０】
上述のように、新規の本発明のモチーフは、このようなモチーフを含有するオリゴペプチド化合物（例えばペプチド）又はタンパク質とＰＣＮＡとの相互作用を媒介することが確定している。
【００２１】
相互作用は直接的でも若しくは間接的でもよく、モチーフとＰＣＮＡとの直接的な結合を伴ってもよく、又はモチーフが間接的に結合してもよく、例えば結合が別の分子によって媒介されてもよい。このため「ＰＣＮＡ相互作用」又は「ＰＣＮＡ結合」に対するこの言及は、任意の形態の相互作用、又は直接的結合及び間接的結合の両方を含み得る。
【００２２】
本明細書での「モチーフ」に対する任意の言及は、本明細書で規定のようなＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ３’Ｘ１’を意味すると理解されるものとする。
【００２３】
好ましくは、Ｘ１及びＸ１’は独立して、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、メチルリシン（ＭｅＫ）及びアセチルリシン（ＡｃＫ）、並びにより好ましくはＫ、Ｒ及びＨ、又はＫ及びＲから選択される。
【００２４】
Ｘ２は好ましくは芳香族アミノ酸であり、より好ましくはフェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、ｔｅｒｔ−ブチルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ｔｅｒｔ−ブチルフェニルアラニン、ビフェニルアラニン及びトリｔｅｒｔ−ブチルトリプトファン（特定の実施の形態ではこのリストからＦが除外される場合がある）、特にＦ、Ｗ及びＹ、若しくはＷ及びＹ、Ｆ及びＹ若しくはＦ及びＷから選択され、又は特定の実施の形態ではＸ２はＦ若しくはＷ若しくはＹであり得る。
【００２５】
Ｘ３及びＸ３’は好ましくは脂肪族アミノ酸であり、例えば独立してロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、メチオニン（Ｍ）及びノルロイシン（Ｎｏｒ）から選択され得る。
【００２６】
好ましくはＸ３及びＸ３’は両方ともＡではなく、より好ましくはＸ３及びＸ３’はＬ、Ｉ、Ｖ及びＭから、さらにより好ましくはＬ、Ｉ及びＶから選択される。
【００２７】
或る特定の実施の形態において、モチーフとＰＣＮＡとの結合は、Ｘ２がＷ又はＹである場合に改善され得る。このため一実施の形態では、Ｘ２はＦではない。しかしながら上記のように、他の実施の形態ではＸ２はＦであってもよい。
【００２８】
このようにして本発明は、モチーフ［Ｋ／Ｒ］−［Ｆ／Ｙ／Ｗ］−［Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ａ／Ｍ］−［Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ａ／Ｍ］−［Ｋ／Ｒ］（配列番号２８）を含むオリゴペプチド化合物（該オリゴペプチド化合物はＰＣＮＡと相互作用可能である）を提供し得る。
【００２９】
別の実施の形態において、モチーフは［Ｋ／Ｒ］−［Ｙ／Ｗ］−［Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ａ／Ｍ］−［Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ａ／Ｍ］−［Ｋ／Ｒ］（配列番号２９）と規定され得る。
【００３０】
別の実施の形態において、モチーフは［Ｋ／Ｒ］−［Ｆ／Ｙ／Ｗ］−［Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ａ］−［Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ａ］−［Ｋ／Ｒ］（配列番号３０）と規定され得る。
【００３１】
別の実施の形態において、モチーフは［Ｋ／Ｒ］−［Ｙ／Ｗ］−［Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ａ］−［Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ａ］−［Ｋ／Ｒ］（配列番号３１）と規定され得る。
【００３２】
別の実施の形態において、モチーフは［Ｋ／Ｒ］−[Ｆ／Ｗ］−［Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ａ／Ｍ］−［Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ａ／Ｍ］−［Ｋ／Ｒ］（配列番号３２）と規定され得る。
【００３３】
別の実施の形態において、モチーフは［Ｋ／Ｒ］−[Ｆ／Ｗ］−［Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ａ］−［Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ａ］−［Ｋ／Ｒ］（配列番号３３）と規定され得る。
【００３４】
別の実施の形態において、モチーフは［Ｋ／Ｒ］−［Ｆ／Ｗ］−［Ｌ／Ｉ／Ｖ］−［Ｌ／Ｉ／Ｖ］−［Ｋ／Ｒ］（配列番号３４）と規定され得る。
【００３５】
別の実施の形態において、モチーフは［Ｋ／Ｒ］−［Ｆ／Ｙ／Ｗ］−［Ｌ／Ｉ／Ｖ］−［Ｌ／Ｉ／Ｖ］−［Ｋ／Ｒ］（配列番号３５）と規定され得る。
【００３６】
さらに別の実施の形態において、モチーフは［Ｋ／Ｒ］−［Ｙ／Ｗ］−［Ｌ／Ｉ／Ｖ］−［Ｌ／Ｉ／Ｖ］−［Ｋ／Ｒ］（配列番号３６）と規定され得る。
【００３７】
さらに別の実施の形態において、モチーフは［Ｋ／Ｒ］−Ｆ−［Ｌ／Ｉ／Ｖ］−［Ｌ／Ｉ／Ｖ］−［Ｋ／Ｒ］（配列番号３７）と規定され得る。
【００３８】
オリゴペプチド化合物は単離化合物であるのが好ましい。
【００３９】
好ましい実施の形態では、オリゴペプチド化合物は配列ＲＦＬＶＫ（配列番号２）を有する又はこれを含む。他の好ましい実施の形態では、オリゴペプチド化合物は、ＫＦＬＬＲ（配列番号３）、ＫＹＬＬＲ（配列番号４）、ＫＷＬＬＲ（配列番号５）、ＫＹＩＬＲ（配列番号６）、ＫＹＶＬＲ（配列番号７）、ＲＦＬＬＲ（配列番号８）、ＲＹＬＬＲ（配列番号９）、ＲＷＬＬＲ（配列番号１０）、ＲＹＩＬＲ（配列番号１１）、ＲＹＶＬＲ（配列番号１２）、ＲＦＬＩＲ（配列番号１３）、ＲＹＬＶＲ（配列番号１４）、ＲＷＬＭＲ（配列番号１５）、ＲＹＶＬＲ（配列番号１６）、ＲＹＶＩＲ（配列番号１７）、ＲＷＬＶＫ（配列番号１８）、ＲＹＬＶＫ（配列番号１９）、ＲＷＬＩＫ（配列番号２０）、ＲＷＩＶＫ（配列番号２１）、ＲＷＶＶＫ（配列番号２２）、ＲＷＡＶＫ（配列番号２３）、ＲＹＶＶＫ（配列番号２４）、ＲＹＬＩＫ（配列番号２５）又はＲＹＬＭＫ（配列番号２６）から選択される配列を有する又はこれを含む。これらの特定の配列は例示として挙げられているが、これらは本発明の範囲を限定するものと意図されない。
【００４０】
好ましい一実施の形態において、本発明のオリゴペプチド化合物は、特定の細胞型に対してモチーフを標的化し、細胞への化合物の侵入を容易にし、及び／又は化合物を特定の細胞内コンパートメント、好ましくは核に局在化させる、シグナル配列も含む。このためシグナル配列は、オリゴペプチド化合物を任意の所望の位置に、例えば任意の所望の細胞位置又は細胞内位置に局在化する又は代替的に置くのに、方向付け、転位又は輸送するように作用する任意の配列と見なされ得る。好ましい実施の形態では、所望の位置は細胞（すなわち細胞の内側）及び／又は細胞の核である。
【００４１】
このため、シグナル配列は、オリゴペプチド化合物を細胞に、又は細胞膜を通って（すなわち細胞の内部に）輸送するように作用する配列であり得る。したがってシグナル配列は、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）又はタンパク質形質導入配列としても当該技術分野で知られる、いわゆる「細胞透過」配列（又はより具体的には「細胞透過ペプチド」）であり得る。
【００４２】
したがって上述のように、本発明の好ましい実施の形態は、（ｉ）本明細書で規定のようなＡＰＩＭモチーフ（すなわちＰＣＮＡ相互作用モチーフ）を含むオリゴペプチド化合物と、（ｉｉ）細胞透過配列（より具体的には細胞透過ペプチド）とを含む構築物である。
【００４３】
細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）技術は近年になって大きく進展しており、様々な細胞透過ペプチドが当該技術分野で既知であり、また説明されている。実に広範なこのようなペプチドが市販されている。細胞透過ペプチドは大きさ、配列及び電荷、実際にはそれらの機能機構（現段階で一部のペプチドでは知られておらず、他のペプチドでは完全に解明されていない）が大きく異なり得るが、原形質膜を通って転位し、付着又は連結部分（いわゆる「カーゴ（cargo）」）を細胞の細胞膜、又はさらに場合によっては核に送達するという共通の能力を共有している。このためＣＰＰはペプチド系の送達ベクターである。
【００４４】
ＣＰＰは、ショウジョウバエ（Drosophila）のホメオボックスタンパク質アンテナペディア（転写因子）等の細胞膜を通って転位することができる天然に存在するタンパク質、ＨＩＶ−１転写因子ＴＡＴ等のウイルスタンパク質、及びＨＳＶ−１由来のカプシドタンパク質ＶＰ２２から誘導され得るか、又はＣＰＰは例えば、キメラタンパク質又はポリアルギニン等の合成ポリペプチドから合成的に誘導され得る。上述のように、形質導入効果に関与する単一の機構は存在せず、そのためＣＰＰの設計は異なる構造及び配列に基づき得る。細胞透過ペプチドは、Jarver et al. 2006 Biochimica et Biophysica Acta 1758, pages 260-263にレビューされており、以下の第２表では様々な代表的なペプチドが挙げられている。さらに米国特許第６，６４５，５０１号明細書は使用され得る様々な細胞透過ペプチドを記載している。
【００４５】
【表１−１】
0005863240.tif 000002
【表１−２】
0005863240.tif 000003
【００４６】
アンテナペディア由来のＣＰＰ（Ａｎｔｐ群）は、アンテナペディアタンパク質の３番目のループに対応し、タンパク質の転位に関与することが分かっている、第２表に示される１６−アミノ酸Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの配列に基づき特定の対象となる群を表す。Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎは特に薬学的使用を含む送達ビヒクルとして広く開発されており、広範のＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ誘導体及び修飾配列が提案及び記載されている。特に、国際公開第９１／１８９１号パンフレット、国際公開第００／１４１７号パンフレット、国際公開第００／２９４２７号パンフレット、国際公開第２００４／０６９２７９号パンフレット及び米国特許第６，０８０，７２４号明細書が参照され得る。したがって、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの１６−アミノ酸配列は修飾及び／又は切断されていてもよく、又はペプチドが化学的に修飾されていてもよく、又は細胞透過活性を保持しながらレトロ類似体、インベルソ（inverso）類似体若しくはレトロインベルソ類似体を作製してもよい。
【００４７】
有利に使用され得る別の群の細胞透過ペプチドはＨＩＶ−ＴＡＴ配列に基づき、ＨＩＶ−ＴＡＴ及びその断片は本発明に従って使用するのに好ましい群のＣＰＰを表す。様々なＴＡＴ系ＣＰＰは米国特許第５，６５６，１２２号明細書に記載されている。以下の実施例で使用される例示的なＨＩＶ−ＴＡＴペプチドはＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号７１）であるが、より長い又は短いＴＡＴ断片を使用してもよいことが容易に認識される。
【００４８】
上述のように、特定の構造的特徴又は配列モチーフが全てのＣＰＰに共通するというわけではない。しかしながら、様々な群のＣＰＰが例えば両親媒性であり且つ正味正に荷電したペプチドのような特定の特徴により同定され得る。他の群のＣＰＰは高いα−へリックス含量を示す構造を有し得る。別の群は高い塩基性アミノ酸含量を特徴とするペプチドであり得る。このためＣＰＰは、アルギニン、例えば５個〜２０個、６個〜１５個又は６個〜１２個のＲ残基、例えばＲ７（配列番号７０）、Ｒ８（配列番号７２）又はＲ１１（配列番号７３）等の塩基性アミノ酸のオリゴマー、あるいはＱＳＲ８（配列番号７４）であり得るか、又はこれを含み得る。
【００４９】
高プロリンの両親媒性ペプチドは別の群のＣＰＰであり、プロリン由来のピロリジン環の存在を特徴とするこのようなペプチドは、Pujals et al. 2008 Advanced Drug Delivery Reviews 60, pages 473-484に記載されている。
【００５０】
他の開発に成功したＣＰＰとしては、ｐＶＥＣ（Elmquist et al. 2003 Biol. Chem 384, pages 387-393、Holm et al. 2005 Febs Lett. 579, pages 5217-5222）及びカルシトニン由来ペプチド（Krauss et al. 2004 Bioorg. Med. Chem. Lett., 14, pages 51-54）が挙げられる。
【００５１】
市販のＣＰＰとしては、Ｐｅｐ−１ペプチド系のＣｈａｒｉｏｔ（Active Motif, France）、プロテグリンペプチドＰＧ−１系のＳｙｎ−Ｂベクター（Syntem, France）、及びＭＰＧペプチド系のＥｘｐｒｅｓｓ−ｓｉ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（Genospectra, USA）が挙げられる。
【００５２】
公的に利用可能であり且つ報告されているＣＰＰの他に、新規の又は派生したＣＰＰペプチドを既知の又は報告されている基準（例えば上述のような既知のＣＰＰ配列又は塩基性アミノ酸含量、α−へリックス含量等の特徴）に基づき設計及び合成してもよい。さらに、無作為に設計した又は他のペプチドを、例えばレポーター分子、例えば検出ラベル又は蛍光タグ等のタグを含有するこのようなペプチドと所望のカーゴ（本発明によるオリゴペプチド化合物）とをカップリング又は付着させること、及び例えばこれらのペプチドを生細胞に添加し、その後例えば共焦点顕微鏡検査を用いて細胞の取り込みを調べることにより構築物が細胞膜を通って転位するかどうかを確かめるために試験することによって、ＣＰＰ活性に関してスクリーニングすることができる。
【００５３】
実際ＣＰＰは、実質的にいかなる細胞型も浸透又は侵入する場合が一般的であるが、場合によっては、上首尾の又は効率的な送達は、カーゴの正確な性質（例えばカーゴペプチド配列）及び／又は使用されるＣＰＰに依存的であり得るか、又はこれに応じて変わり得ることが観察される場合がある。最適なペプチド配列及び組合せ等を決定すること、並びにカーゴ及び／又はＣＰＰの配列若しくは構造等を試験及び／又は修飾することは十分当業者の通常の技術内であろう。
【００５４】
上述のように、本発明のオリゴペプチド化合物（又は構築物）内に含まれ得るシグナル配列は化合物（又は構築物）を特定の細胞内コンパートメント、特に核に方向付けるシグナルペプチドであり得る。核局在化シグナル（ＮＬＳ）も同様に当該技術分野で既知であり、また文献で広く説明されており、任意の既知の又は機能的なＮＬＳを使用してもよい。
【００５５】
したがって、本発明のさらに好ましい実施の形態は、（ｉ）本明細書で規定のようなＡＰＩＭモチーフ（すなわちＰＣＮＡ相互作用モチーフ）を含むオリゴペプチド化合物と、（ｉｉ）核局在化シグナルとを含む構築物である。
【００５６】
ＮＬＳは長さ及び／又は配列が異なっていてもよく、広範な特異的なＮＬＳ配列が説明されている。しかしながら一般には、正に荷電したアミノ酸（とりわけリシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）及び／又はヒスチジン（Ｈ））を含むペプチドがＮＬＳとして機能し得ることが見出されている。このため例示的なＮＬＳは、例えば４個〜２０個、より具体的には４個〜１５個、４個〜１２個、４個〜１０個又は４個〜８個のアミノ酸を有するペプチドであり得る。ここで、少なくとも４つのアミノ酸（より具体的にはＮＬＳペプチドにおけるアミノ酸残基の少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％又は９０％）が好ましくはＫ、Ｒ又はＨから選択される正に荷電したアミノ酸である。このような例示的なＮＬＳは例えば、配列ＲＫＲＨ（配列番号７５）を有し得るか、又はこれを含み得る。
【００５７】
核局在化シグナル（実際に実験的に決定したＮＬＳ配列と予測又は提案されるＮＬＳ配列との両方が含まれる）及びＮＬＳを同定する戦略は、Lange et al., J. Biol. Chem. 2007, 282（8）, 5101-5105、Makkerh et al., Current Biology 1996, 6（8）, 1025-1027、Leslie et al., Methods 2006, 39, 291-308、並びにLusk et al. Nature Reviews MCB 2007, 8, 414-420で説明されている。
【００５８】
従来のＮＬＳは、１つのストレッチ（一分節（monopartite））又は２つのストレッチ（二分節（bipartite））の塩基性アミノ酸のいずれかから成る。一分節ＮＬＳはＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳ（１２６ＰＫＫＫＲＫＶ１３２［配列番号７６］）で例示され、二分節ＮＬＳは核質ＮＬＳ（１５５ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ１７０［配列番号７７］）で例示され得る。一分節ＮＬＳコンセンサス配列Ｋ−［Ｋ／Ｒ］−Ｘ−［Ｋ／Ｒ］（配列番号７８）が提案されており、したがって一実施の形態では本発明によるＮＬＳは、このようなコンセンサス配列（ここでＸは任意のアミノ酸である）を含み得るか、又はこれから成り得る。
【００５９】
本発明による代表的な二分節ＮＬＳは、配列ＫＲ−［Ｘ］５〜２０−ＫＫＫＫ（配列番号７９）、例えばＫＲ−Ｘ１０−ＫＫＫＫ（配列番号８０）（ここでＸは任意のアミノ酸である）を有し得る。
【００６０】
代替的な例示的な二分節ＮＬＳは、ＲＫＲＨ−［Ｘ］２〜１０−ＫＫ（配列番号８１）、例えばＲＫＲＨ−Ｘ２−ＫＫ（配列番号８２）、例えばＲＫＲＨ−ＩＩ−ＫＫ（配列番号８３）の形態を取り得る。
【００６１】
癌タンパク質ｃ−ｍｙｃ  ＮＬＳは、９個のアミノ酸残基の内の３つだけが塩基性であるという点で従来のＮＬＳとは異なり（ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ［配列番号８４］）、このことはＮＬＳを必ずしも上記で与えられるコンセンサス配列又は従来の配列に適合させる必要はないことを示している。Makkerh et al（同上）は塩基性アミノ酸の集団（例えばＫＫＫＫ［配列番号８５］）が中性及び酸性の残基に隣接しているＮＬＳ配列、例えばＰＡＡＫＫＫＫＬＤ（配列番号８６）を説明している。
【００６２】
例示として与えられ得る他の可能性のあるＮＬＳ配列としては、ＰＫＫＫＲＫＶＬ（配列番号８７）、ＫＫＫＲＫ（配列番号８８）、ＫＫＫＲＶＫ（配列番号８９）、ＫＫＫＲＫＶＬ（配列番号９０）及びＲＫＫＲＫＶＬ（配列番号９１）が挙げられる。既知のＮＬＳの誘導体である任意のＮＬＳ、例えばＳＶ４０、核質、ＵＮＧ２又はｃ−ｍｙｃ  ＮＬＳを使用してもよい。
【００６３】
推測の、提案された又は予測されたＮＬＳ配列を、当該技術分野で既知であり、且つ説明されている原理及びアッセイを使用してＮＬＳ活性に関して試験することができる。例えば、候補ＮＬＳ配列を所望のカーゴに付着させ（この場合、本明細書で規定のような本発明によるオリゴペプチド）、構築物に検出可能なレポーター分子（例えば可視化し得るタグ又はラベル、例えば蛍光ラベル）を与え、構築物を試験細胞に接触させることができる。それから細胞における構築物の分布を決定することができる。
【００６４】
したがって概要としては、当業者は好適なシグナル配列を知っているが、例示として本明細書中の以下で言及される。細胞透過ペプチド配列の例としては、アンテナペディアタンパク質のホメオドメインの３番目のへリックスに対応する１６−アミノ酸ペプチドであるＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ（商標）、Ｒ６−Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ（アルギニン残基をＰｅｎｅｔｒａｔｉｎのＮ末端に加えた）等の高Ｒタグ、及びＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＱ（配列番号９２）等のＨＩＶ  Ｔａｔタンパク質の誘導体が挙げられる。核局在化配列の例としてはＳＶ４０タンパク質誘導体ＫＫＫＲＫ（配列番号９３）が挙げられる。
【００６５】
好ましい本発明による構築物は、（ｉ）本明細書で規定のようなＡＰＩＭモチーフを含むオリゴペプチド化合物と、（ｉｉ）核局在化シグナルと、（ｉｉｉ）細胞透過シグナル配列とを含む。
【００６６】
本発明による構築物の分離した要素又は構成要素を任意の順番で含有しても又は提示してもよいが、上記の順番（例えばＡＰＩＭオリゴペプチド化合物−ＣＰＰ、ＡＰＩＭオリゴペプチド化合物−ＮＬＳ、ＡＰＩＭオリゴペプチド化合物−ＮＬＳ−ＣＰＰ）が好ましい。
【００６７】
さらに、本発明のオリゴペプチド化合物又は構築物は２つ以上のＰＣＮＡ相互作用モチーフを含有し得る。このため代替的に、本発明による構築物はＰＣＮＡ相互作用モチーフを含むオリゴペプチド化合物を２つ以上含有し得る。構築物又はオリゴペプチド化合物は例えば、１個〜１０個、例えば１個〜６個、又は１個〜４個又は１個〜３個、又は１つ若しくは２つのモチーフを含有し得る。シグナル配列も含有する構築物内に、このようなモチーフは、離間していても、又は選択に従い位置していてもよい、例えばこのようなモチーフは共に集団化してもよく、又はこのようなモチーフはシグナル配列要素で分離されていてもよい：例えばモチーフ−ＮＬＳ−モチーフ−ＣＰＰ；又はモチーフ−ＮＬＳ−モチーフ−モチーフ−ＣＰＰ；又はモチーフ−モチーフ−ＮＬＳ−ＣＰＰ等。
【００６８】
本発明による構築物の構成要素又は要素を、当該技術分野で既知の技法に従って任意の所望の又は従来のやり方で互いに付着又は連結させてもよい。このため、構成要素又は別々の部分は、例えば既知の化学的なカップリング技術を使用して化学的に連結若しくは共役してもよく、又は構築物を、遺伝子工学技法、例えば融合タンパク質を形成する技法を使用してまとめて単一的に形成してもよく、又は構築物を、例えばペプチド合成技法を使用して、まとめて単純に合成してもよい。
【００６９】
別々の部分又は構成要素は、互いに直接的に連結していてもよく、又はこれらは１つ若しくは複数のリンカー（又はスペーサ）配列によって間接的に連結していてもよい。このため、リンカー配列は、構築物の２つ以上の個々の部の間に入っても、若しくはこれを分離してもよく、又はオリゴペプチド構築物においてモチーフ要素を分離してもよい。リンカー配列の正確な性質は重要ではなく、リンカー配列は可変長及び／又は配列であり得る、例えばリンカー配列は、０個〜４０個、より具体的には０個〜２０個、０個〜１５個、０個〜１２個、０個〜１０個、０個〜８個又は０個〜６個、０個〜４個又は０個〜３個の残基、例えば１個、２個若しくは３個、又はそれ以上の残基を有し得る。代表的な例として、存在する場合、リンカー配列は１個〜１５個、１個〜１２個、１個〜１０個、１個〜８個、１個〜６個又は１個〜４個の残基等を有し得る。残基の性質は重要ではないが、残基は例えば、任意のアミノ酸、例えば中性アミノ酸若しくは脂肪族アミノ酸であり得るか、又は代替的に残基は疎水性又は極性又は荷電又は構造形成、例えばプロリンであり得る。中性及び／又は脂肪族のアミノ酸の短い（例えば１個〜６個の）配列を含む、広範の異なるリンカー配列が有用であることが分かっている。
【００７０】
したがって例示的なリンカー配列としては、任意の単一のアミノ酸残基、例えばＡ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｇ、Ｒ、Ｑ、Ｔ若しくはＷ、又はこのような残基から成るジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド若しくはヘキサペプチドが挙げられる。
【００７１】
代表的なリンカーとして、Ｉ、ＩＩ、ＩＬ、Ｒ、Ｗ、ＷＷ、ＷＷＷ、ＲＩＬ、ＲＩＷ、ＧＡＱ、ＧＡＷ、ＶＡＴ、ＩＩＬＶＩ（配列番号９４）、ＩＩＬＶＩＩＩ（配列番号９５）等が言及され得る。
【００７２】
異なる要素間のリンカーは同じであっても又は異なっていてもよい。
【００７３】
一実施の形態において、配列ＭＤＲＷＬＶＫＲＩＬＶＡＴＫ（配列番号９６）又はＭＤＲＷＬＶＫＲＩＬＫＫＫＲＫＶＡＴＫＧ（配列番号９７）を有する又はこれを含むオリゴペプチド化合物が提供される。
【００７４】
他の代表的な本発明の化合物（又はより具体的には構築物）としては、
ＭＤＲＷＬＶＫＧＡＱＰＫＫＫＲＫＶＬＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号９８）、
ＭＤＲＷＬＶＫＧＡＷＫＫＫＲＶＫＩＩＲＫＫＲＲＱＲＲＲＫ（配列番号９９）、
ＭＤＲＷＬＶＫＧＡＷＫＫＫＲＫＩＩＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号１００）、
ＭＤＲＷＬＶＫＧＡＷＫＫＫＲＫＩＩＲＫＫＲＲＱＲＲＲＫ（配列番号１０１）、
ＭＤＲＷＬＶＫＲＩＷＫＫＫＲＫＩＩＲＫＫＲＲＱＲＲＲＫ（配列番号１０２）、
ＭＤＲＷＬＶＫＷＷＷＫＫＫＲＫＩＩＲＫＫＲＲＱＲＲＲＫ（配列番号１０３）、
ＭＤＲＷＬＶＫＷＷＲＫＲＨＩＩＫＫＲＫＫＲＲＱＲＲＲＫ（配列番号１０４）、
ＭＤＲＷＬＶＫＲＩＷＫＫＫＲＫＩＩＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＫ（配列番号１０５）、
ＭＤＲＷＬＶＫＲＩＷＫＫＫＲＫＩＩＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号１０６）、
ＭＤＲＦＬＶＫＧＡＷＲＫＲＨＩＩＫＫＲＫＫＲＲＱＲＲＲＫ（配列番号１０７）、
ＭＤＲＷＬＶＫＷＫＫＫＲＫＩＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＫ（配列番号１０８）、
ＭＤＲＷＬＶＫＷＫＫＫＲＫＩＲＫＫＲＲＱＲＲＲＫ（配列番号１０９）、
ＭＤＲＷＬＶＫＷＲＫＲＨＩＲＫＫＲＲＱＲＲＲＫ（配列番号１１０）、
Ａｃ−ＭＤＲＷＬＶＫＧＡＷＲＫＲＨＩＲＫＫＲＲＱＲＲＲＫ（配列番号１１１）、
Ａｃ−ＭＤＲＷＬＶＫＷＫＫＫＲＫＩＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号１１２）、
Ａｃ−ＭＤＲＡＬＶＫＷＫＫＫＲＫＩＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号１１３）、
Ａｃ−ＭＤＲＷＬＶＫＫＫＫＲＫＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＫ（配列番号１１４）、
Ａｃ−ＭＤＲＷＬＶＫＫＫＫＲＫＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号１１５）、
ＭＤＲＷＬＶＫＲＩＷＫＫＫＲＫＩＩＲＷＬＶＫＷＷＷＲＫＫＲＲＱＲＲＲＫ（配列番号１１６）、
ＫＲＲＲＱＲＲＫＫＲＩＩＫＲＫＫＫＷＷＷＫＶＬＷＲＤＭ（配列番号１１７）が挙げられる。
【００７５】
配列番号９８〜配列番号１１７に記載のような配列を有するオリゴペプチド化合物を以下の実施例６の第３表に示し、この表は構築物を構成する別々の構成要素（すなわちモチーフ含有配列、リンカー、ＮＬＳ、ＣＰＰ等）を示す。したがって、特定されるように配列番号９８〜配列番号１１７は、配列が異なり得るリンカー配列で連結する場合もある、モチーフ含有配列、ＮＬＳ及びＣＰＰを少なくとも１つ含む構築物を表すことが分かる。配列番号１１７（ＲＩ−ＭＤＲ２６−３）はＤ−アミノ酸から構成されるレトロインバース（retro-inverse）ペプチドである。ＳＶ４０又はＵＮＧ２  ＮＬＳ配列に基づきＮＬＳ配列を、またＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ、ＨＩＶ−ＴＡＴ又は高Ｒペプチドに基づきＣＰＰ配列を使用する。
【００７６】
さらなる態様において、本発明は、上記で規定のように配列番号１を有する又はこれを含む（例えば配列番号１の）ペプチドをコードする核酸分子を提供する。このような核酸分子の相補体も提供される。好ましくは、核酸分子は、配列番号１を有する又はこれを含む（例えば配列番号１の）ペプチドをコードする配列と操作可能に連結したプロモータ配列を含む。好ましい実施の形態では、核酸分子は上記で規定のようにシグナル配列もコードする。
【００７７】
本発明の核酸分子は、少なくとも１５個のヌクレオチドを含み、好ましくは８００個以下のヌクレオチド、より好ましくは７００個、６５０個、６００個、５５０個、５００個、４５０個、４００個、３５０個、３００個、２５０個、２００個、１５０個、１００個又は５０個以下のヌクレオチドを含む。核酸分子は単離分子であるのが好ましい。
【００７８】
さらなる態様は、本明細書で規定のような核酸分子を含むベクターに関する。ベクターは、複製起点、抗生物質耐性等の選択可能なマーカー、及び／又は多重クローニング部位のような通常ベクターで見出されるさらなる要素も含有し得る。ベクターはさらに発現ベクターであってもよく、核酸分子の発現のためにさらなる要素、例えば転写及び／又は翻訳の制御又は調節要素を含んでいてもよい。このような制御要素、例えばプロモータ、リボソーム結合部位、エンハンサ、ターミネータ等は当該技術分野で既知であり、広く説明されている。
【００７９】
ベクターは例えばプラスミド又はウイルスであってもよく、好ましくはベクターはレトロウイルス、アデノウイルス及びアデノウイルス随伴ウイルスから選択される。
【００８０】
別の態様において、上記のような核酸分子及び／又はベクターを含有する組換え宿主細胞が提供される。宿主細胞は動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞、最も好ましくはラット、ネズミ又はヒトの細胞である。
【００８１】
「組換え」とは、核酸分子及び／又はベクターが宿主細胞に導入されていることを意味する。宿主細胞は自然状態で核酸分子の内因性コピーを含有しても又は含有していなくてもよいが、核酸分子及び／又はベクターの外因性又はさらなる内因性のコピーが導入されているという点で組換えである。
【００８２】
さらなる態様において、薬理学的に（又は薬学的に）許容される賦形剤と共に、本明細書で規定のようなオリゴペプチド化合物、本明細書で規定のような核酸分子、及び／又は本明細書で規定のようなベクターを含む、医薬組成物が提供される。
【００８３】
賦形剤としては、当該技術分野で既知の任意の賦形剤、例えば任意の担体若しくは希釈剤、又は緩衝剤、抗酸化剤、キレート剤、結合剤、コーティング、崩壊剤、充填剤、香味剤、着色剤、流動促進剤、滑沢剤、保存剤、吸着剤及び／又は甘味剤等の任意の成分又は薬剤が挙げられ得る。
【００８４】
賦形剤は例えば、乳酸、デキストロース、メタ重亜硫酸ナトリウム、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、微結晶セルロース、ラクトース、デンプン、キトサン、α化デンプン、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、デキストレート（dextrates）、デキストリン、デキストロース、リン酸二カルシウム二水和物（dibasic calcium phosphate dihydrate）、リン酸三カルシウム、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、マルトデキストリン、マンニトール、粉末セルロース、塩化ナトリウム、ソルビトール及び／又はタルクから選択され得る。
【００８５】
医薬組成物は、当該技術分野で既知の任意の形態で、例えば錠剤、カプセル、コート錠、液体、懸濁剤、タブ、サシェ剤、インプラント、吸入剤、粉末、ペレット、エマルション、凍結乾燥剤（lyophilisate）、発泡剤、スプレー、軟膏、エマルション、香油、硬膏又はそれらの任意の混合物として提供され得る。医薬組成物は、例えば胃液耐性調製物として、及び／又は持続作用形態で提供され得る。医薬組成物は、経口、非経口、局所、直腸、生殖器、皮下、経尿道、経皮、鼻腔内、腹腔内、筋肉内及び／又は静脈内投与、及び／又は吸入による投与に適した形態であり得る。
【００８６】
代表的な実施の形態において、医薬組成物はリポソーム投与に適した形態であり、このため好ましくは医薬組成物を含有するリポソームが提供される。リポソームが使用される場合、医薬組成物がさらなる賦形剤を含む必要はなく、このため本明細書で規定のようなオリゴペプチド化合物、本明細書で規定のような核酸分子、及び／又は本明細書で規定のようなベクターを含むリポソームも提供される。
【００８７】
データベース検索を利用して、本発明者らは、２００個を超える他のタンパク質（その多くがＤＮＡ修復、維持及び細胞周期調節、例えば転写、複製、リン酸化、ユビキチン化、損傷乗り越え合成、姉妹染色分体凝集及び細胞周期調節にかかわる）において新規のＰＣＮＡ結合モチーフの存在を発見した（第１表及び実施例４を参照されたい）。これらのタンパク質には以下のものが含まれる：
停滞した転写の進行に重要なタンパク質である、ＴＦＩＩＳ伸長因子で見出される保存されたＮ末端ドメインＩを含有するため、本発明者らがＴＦＩＩＳ様タンパク質と名付けた機能未知のタンパク質。このタンパク質はその７個のＮ末端アミノ酸内にモチーフを含有する。
【００８８】
細胞周期制御及び増殖に重要な多機能な転写因子ＴＦＩＩ−Ｉ。ＴＦＩＩ−Ｉを過剰発現する細胞は、γ−Ｈ２ＡＸ中心（ＤＮＡ二本鎖切断に対するマーカー）の持続を増大させ、このことはＤＮＡ修復におけるＴＦＩＩ−Ｉの役割を示唆している。このタンパク質は４つのモチーフを含有する。
【００８９】
複製後のＤＮＡ脱連環及びＤＮＡ分離において機能するＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ  α（Ｔｏｐｏ  ＩＩ  α）。このタンパク質は１つのモチーフを含有する。
【００９０】
へリックスのねじれを認識する鍵となるヌクレオチド除去修復タンパク質ＸＰＡ。このタンパク質は１つのモチーフを含有する。
【００９１】
適切な中心体機能及び染色体分離に重要であることが分かっている相同組換えタンパク質であるＲＡＤ５１Ｂ。このタンパク質は１つのモチーフを含有する。
【００９２】
ファンコーニ貧血コア複合体タンパク質（ＦＡＮＣＣ）。ＦＡコア複合体は、架橋剤のＤＮＡ修復を調節する、ＤＮＡ損傷によって活性化されるシグナル伝達経路にかかわることが分かっている。このタンパク質は１つのモチーフを含有する。
【００９３】
少なくとも１つのモチーフを含有することが見出されているさらなるタンパク質が第１表に挙げられる。
【００９４】
理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者らの研究結果は、ＰＣＮＡがその通常のパートナーの少なくとも１つと相互作用するのを妨げることにより、細胞を細胞増殖抑制剤の効果に対して増感させることができることを示している。このようにして、細胞増殖抑制剤の効果は調整することができる。例えば、修復タンパク質（例えばｈＡＢＨ２）とＰＣＮＡとの相互作用を阻害し、これによりＤＮＡ修復を阻害して、結果としてＤＮＡ損傷における細胞増殖抑制剤の効果を増大させることができる。
【００９５】
このためさらなる態様において、障害若しくは病態、特に細胞の成長を阻害することが望まれる障害若しくは病態、例えば過剰増殖性障害、又は細胞増殖抑制療法を必要とする、若しくは細胞増殖抑制療法に対して反応性がある任意の病態の治療方法であって、本明細書で規定のようなオリゴペプチド化合物、本明細書で規定のような核酸分子、及び／又は本明細書で規定のようなベクターを、それを必要とする被験体に投与すること（特に有効量投与すること）を含む、治療方法が提供される。
【００９６】
別の態様において、治療法に使用される、特に細胞の成長を阻害することが望まれる障害若しくは病態、例えば過剰増殖性障害の治療に、又は細胞増殖抑制療法（すなわち細胞増殖抑制剤の使用）を伴う任意の治療に使用される、本明細書で規定のようなオリゴペプチド化合物、本明細書で規定のような核酸分子、及び／又は本明細書で規定のようなベクターが提供される。したがってこの化合物等は、細胞増殖抑制療法を必要とする、又は細胞増殖抑制療法に対して反応性がある任意の病態の治療に使用することができる。
【００９７】
別の態様において、細胞の成長を阻害することが望まれる障害若しくは病態、例えば過剰増殖性障害の治療に、又は細胞増殖抑制療法を伴う治療に使用される薬物の製造における、本明細書で規定のようなオリゴペプチド化合物、本明細書で規定のような核酸分子、及び／又は本明細書で規定のようなベクターの使用が提供される。
【００９８】
上述のように、本発明につながる驚くべき研究結果の１つは、広範の様々な細胞増殖抑制薬の効果を、ＰＣＮＡ相互作用モチーフを有するペプチドの使用によって増強又は促進し、それによりＰＣＮＡと、広範であると推測されるタンパク質、例えばＤＮＡの修復及び複製、並びに細胞周期の進行等にかかわるタンパク質との相互作用を阻害することができることである。このことにより、この細胞増殖抑制剤の効果を増強させるため、又は細胞をその効果に対して増感させるため、任意のＰＣＮＡ相互作用分子を細胞増殖抑制剤と併用してもよいという一般的提案が導かれる。
【００９９】
したがってさらに別の態様において、細胞の成長を阻害することが望まれる障害若しくは病態、例えば過剰増殖性障害の治療方法、又は細胞増殖抑制療法を伴う治療方法であって、ＰＣＮＡと相互作用可能なオリゴペプチド化合物、又はＰＣＮＡと相互作用可能なオリゴペプチド化合物をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を、それを必要とする被験体に投与すること、及び別々に、同時に又は連続して細胞増殖抑制剤を、それを必要とする被験体に投与することを含む、治療方法が提供される。
【０１００】
代替的に考えると、細胞の成長を阻害することが望まれる障害若しくは病態、例えば過剰増殖性障害の治療において、又は細胞増殖抑制療法を伴う治療において細胞増殖抑制剤と併用される、ＰＣＮＡと相互作用可能なオリゴペプチド化合物、又は該オリゴペプチド化合物をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子が提供される。
【０１０１】
このため、細胞の成長を阻害することが望まれる障害若しくは病態、例えば過剰増殖性障害の治療において、又は細胞増殖抑制療法を伴う治療において細胞増殖抑制剤と併用される薬物の製造における、ＰＣＮＡと相互作用可能なオリゴペプチド化合物、又は該オリゴペプチド化合物をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子の使用が提供される。
【０１０２】
このため一実施の形態において、薬物はさらに細胞増殖抑制剤を含み得る。
【０１０３】
薬物はオリゴペプチド化合物又は核酸分子と細胞増殖抑制剤との両方を含む単一組成物の形態であり得る、又は薬物は別々の（例えば同時又は連続）投与のためにこれらを含有するキット又は製品の形態であり得る。
【０１０４】
このため、細胞の障害、例えば過剰増殖性障害の治療のための薬物の製造における、又は細胞増殖抑制療法を伴う治療における、ＰＣＮＡと相互作用可能なオリゴペプチド化合物、又は該オリゴペプチド化合物をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子の使用であって、薬物が細胞増殖抑制剤と別々に、同時に又は連続して投与される、ＰＣＮＡと相互作用可能なオリゴペプチド化合物、又は該オリゴペプチド化合物をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子の使用も提供される。
【０１０５】
別の態様において本発明は、細胞の成長を阻害することが望まれる障害若しくは病態、例えば過剰増殖性障害の治療において又は細胞増殖抑制療法を伴う治療において、別々に、同時に又は連続して使用される複合調製物としての、細胞増殖抑制剤と共にＰＣＮＡと相互作用可能なオリゴペプチド化合物、又は該オリゴペプチド化合物をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含有する製品を提供する。
【０１０６】
ＰＣＮＡと相互作用可能なオリゴペプチド化合物、好ましくは配列番号１を含む又は有するオリゴペプチド化合物は、細胞増殖抑制剤の効果を調整させる又は促進するのに使用することができる。
【０１０７】
したがって本発明によるオリゴペプチド化合物（構築物を含む）は、細胞の成長を阻害することが望まれる（又は有益であり得る）任意の病態又は臨床状況において、治療上の有用性を有する。
【０１０８】
「阻害する」という用語は、細胞成長の任意の低減又は減少、及び細胞成長の防止又は廃止を含むように広範に使用される。したがって「阻害」は、細胞成長の低減又は防止を含む。これは、当業者に既知の技法により確定することができるように、細胞数、サイズ（例えば、細胞を含有する組織のサイズ）、細胞生存度及び／又は細胞死等を確定又は評価することのような任意の適切な又は都合の良い手段により確定することができる。
【０１０９】
本明細書で言及する場合、細胞の「成長」はまた、特に細胞の増殖を含む細胞成長の任意の態様を含むように、広範に使用される。
【０１１０】
したがってオリゴペプチド化合物は、細胞成長（特に細胞増殖）の低減に反応性がある任意の病態（本明細書では任意の障害又は任意の臨床状況を含むように広範に使用される）の治療において使用することができる。したがってオリゴペプチド化合物は、細胞成長（又は増殖）を標的とする任意の治療法（又は治療）において有用性が見出される。換言すれば、化合物は、細胞増殖を阻害することが望まれる又は好都合である任意の治療上の用途において使用することができる。
【０１１１】
本明細書で使用する場合、「治療」という用語は、臨床的病態の管理において有益な任意の効果又は工程（又は処置）を広範に表し、したがって治療法としての治療と予防法としての治療との両方を含む。治療は、治療前の病態若しくは症状との関係で、治療されている病態若しくはその１つ又は複数の症状を低減すること、軽減すること、改善すること、その発症を遅らせること、若しくは排除すること、又はいずれにせよ被験体の臨床状態を向上させることを含み得る。治療は、治療プログラム又は計画に寄与する、又はその一部分である任意の臨床的な工程又は処置を含み得る。予防法的治療は、例えば予防法的治療前の病態又は症状との関係で、病態又は病態の開始、又はその１つ又は複数の症状を遅延化させること、制限すること、低減すること、又は予防することを含み得る。したがって予防法は、病態又はその症状の発生又は発症の絶対的な予防と、病態若しくは症状の開始若しくは発症の任意の遅延化、又は病態若しくは症状の発症若しくは進行に対する低減若しくは制限との両方を明確に含む。したがって本発明による治療は、細胞の成長、又は身体若しくは細胞集団のサイズの増大（例えば組織、腫瘍又は成長における）を止める（killing）こと、阻害すること、又は遅らせること、細胞数を低減すること又は細胞の拡散（例えば別の解剖学的部位への）を防止すること、細胞成長のサイズを低減すること等を含む。「治療」という用語は、治癒、又は細胞成長若しくは細胞の成長（cell growth, or a growth of cells）の完全な廃止若しくは排除を示唆しない。
【０１１２】
本発明の治療上の用途及び有用性は概して細胞増殖を阻害することを伴い得るので、任意の増殖性細胞が、本明細書で開示及び包含される治療法及び有用性において標的となり得る。かかる増殖性細胞は、健常細胞又は疾患細胞、及び増殖が起こる任意の組織の細胞を含み得る。例えば、かかる細胞は、特に、悪性及び非悪性の新生物細胞の両方を含む新生物細胞、並びに免疫系の細胞（免疫細胞）、概して造血系の細胞、又は皮膚細胞を含み得る。
【０１１３】
異常な又は不要な細胞成長を伴う障害又は病態を細胞増殖抑制剤で治療することができ、細胞増殖抑制剤は細胞成長及び増殖を低減又は防止することが望まれる任意の状況（細胞を死滅させる又は切除することが望まれる状況を含む）において使用することができる。したがって、代替的に上で述べたように、本発明のオリゴペプチド化合物（構築物を含む）は、細胞増殖抑制剤の使用を伴う（又はこれを含む）任意の治療方法において使用することができる。これは、細胞増殖抑制剤に反応性がある任意の病態、又は細胞増殖抑制剤で治療することができる、若しくは細胞増殖抑制剤の使用を必要とする任意の病態の治療を含み得る。
【０１１４】
過剰増殖性障害の治療は、特に関心が持たれる一態様を表す。「過剰増殖性障害」という用語は、増大した、望ましくない、又は不要な細胞の増殖を伴う任意の障害又は病態を含むように、本明細書で広範に使用される。したがって、包括的に又は特定の文脈においてに関わらず、例えば正常細胞若しくは健常細胞、又は問題となっている病態の非存在下における細胞との関係で（例えば健常被験体若しくは対照被験体と比較して若しくはそれとの関係で、又は同じ被験体における健常組織若しくは非罹患組織から採取した細胞と比較して若しくはそれとの関係で）細胞の増殖が増大している病態だけでなく、正常状態に対して細胞増殖が増大しておらず（又は著しく若しくは有意に増大しておらず）、起こる増殖が不要な又は望ましくない病態も含まれる。これは、例えば「正常な」応答、例えば免疫応答又は炎症性応答等（換言すれば、特定の（例えば正常な）状況において起こり得るがそれにもかかわらず不要であり得る「正常な」応答）において起こり得る不要な又は望ましくない細胞の増殖を含み得る。かかる不要な増殖性応答は、例えば、不要な炎症性応答、又は不要な免疫応答、例えば自己免疫応答若しくはアレルギー反応等をもたらす細胞の増殖であり得る。
【０１１５】
したがって本発明により治療され得る過剰増殖性障害は、炎症（より具体的には炎症性障害若しくは病態、又は炎症を伴う、若しくは炎症と関連する、若しくは炎症を特徴とする病態）、及び自己免疫障害若しくは病態、又は自己免疫成分を有する障害若しくは病態を明確に含む。
【０１１６】
過剰増殖性障害は、自律的に成長する能力を有する細胞、すなわち正常な調節機構とは無関係に生存及び再生する細胞の増殖を伴い得る（がこれらに限定されない）。したがって過剰増殖性障害は新生物障害であってもよく、上で示したようにこれは悪性又は非悪性の障害であり得る。
【０１１７】
過剰増殖性細胞は、病理学的なもの（すなわち正常細胞でなく、且つ疾患状態と関連する）、又は非病理学的なもの（すなわち正常でないが疾患状態と関連する）に分類することができる。
【０１１８】
病理学的な過剰増殖性細胞は、以下の疾患状態又は障害と関連し得る、又はこれを特徴とし得る：再狭窄、糖尿病性腎症、甲状腺過形成、グレイヴズ病、乾癬、前立腺肥大症、Ｌｉ−Ｆｒａｕｍｅｎｔｉ症候群及び癌（任意の腫瘍又は悪性腫瘍を含む）。
【０１１９】
非病理学的な過剰増殖性細胞の例は、乳汁分泌の発達時の乳管上皮細胞、また創傷修復と関連する細胞を含む。
【０１２０】
本発明の化合物は、かかる障害、並びに糖尿病性網膜症及び末梢血管疾患を含む疾患等の治療に有用であり得る。
【０１２１】
上で示したように過剰増殖性障害は、悪性又は非悪性の新生物障害であり得る。前癌状態障害及び非新生物障害も含まれる。前癌状態障害又は非新生物障害又は非悪性過剰増殖性障害の例は、骨髄異形成障害、子宮頸部上皮内癌、家族性腸ポリープ症（例えばガードナー症候群）、口腔白板症（oral leukoplasias）、組織球増殖症、ケロイド、血管腫、過剰増殖性動脈狭窄、炎症性関節炎、過角化症、及び関節炎を含む丘疹鱗屑性発疹を含む。疣贅及びＥＢＶ誘導性疾患（例えば感染性単核球症）等のウイルス誘導性過剰増殖性疾患、瘢痕形成等も含まれる。
【０１２２】
したがって過剰増殖性障害は、例えば新生物障害、例えば癌、乾癬性関節炎、関節リウマチ、胃過剰増殖性障害、例えば炎症性腸疾患、乾癬を含む皮膚障害、ライター症候群、毛孔性紅色粃糠疹及び過剰増殖性変異型の角質化障害から選択される任意の過剰増殖性障害であり得る。
【０１２３】
癌は、特に関心が持たれる過剰増殖性障害を表し、例えば充実性腫瘍及び血液学的癌を含む全ての種類の癌が含まれる。代表的な種類の癌は、子宮頸部癌、子宮癌、卵巣癌、膵臓癌、腎臓癌、胆嚢癌、肝臓癌、頭頸部癌、扁平上皮細胞癌、胃腸癌、乳癌、前立腺癌、精巣癌、肺癌、非小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、白血病（例えば急性リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病及び慢性骨髄性白血病）、脳癌（例えば星状細胞腫、神経膠芽腫、髄芽細胞腫）、神経芽腫、肉腫、大腸癌、直腸癌、胃癌、肛門癌、膀胱癌、膵臓癌、子宮内膜癌、形質細胞腫、リンパ腫、網膜芽細胞腫、ウイルムス腫瘍、ユーイング肉腫、黒色腫、及び他の皮膚癌を含む。
【０１２４】
洞腫瘍、尿道癌及び尿生殖器癌、食道癌、骨髄腫、内分泌癌、骨肉腫、血管肉腫、及び線維肉腫、並びに悪性又は良性の末梢神経系又は中枢神経系の任意の腫瘍（神経膠腫及び神経芽腫を含む）にも言及することができる。
【０１２５】
自己免疫障害又は疾患は、特に関心が持たれるさらなる病態を表し、例えば関節リウマチ、多発性硬化症、免疫障害、例えば全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ；ループス）、又は重症筋無力症を含む。
【０１２６】
一般的に言って、血液学的障害、又は必ずしも悪性若しくは癌性ではない血液若しくは骨髄の疾患（例えば種々の悪液質、又は形成異常、非悪性過形成（hyperplasis）、肉芽腫（agranuloma）又は意義不明の単クローン性高ガンマグロブリン血症（ＭＧＵＳ））にも関心が持たれる。したがって血液若しくは骨髄細胞又はそれらの前駆体の不要な、又は望ましくない、又は異常な増殖を伴う任意の病態を、本発明により治療することができる。
【０１２７】
特に言及することができる他の病態は、新生物性髄膜炎、及び骨髄増殖性疾患、例えば真性赤血球増加症（過剰な赤血球が産生される場合に起こる）を含む。
【０１２８】
種々の病態は、炎症の結果として起こってもよく、又はそうでなくとも炎症若しくは自己免疫疾患と関連していてもよい。かかる病態も本発明により治療することができる。硬化性粘液水腫及び丘疹性ムチン沈着症、アミロイドーシス及びヴェグナー肉芽腫に特に言及することができる。
【０１２９】
上で示したように、本発明の化合物は、細胞増殖抑制剤の効果を増加させる、又は促進することができる。したがって、本発明の化合物は、細胞増殖抑制剤を使用することができる任意の治療上の用途において有用性が見出され得る。これは、疾患細胞以外のものを含み得る細胞を死滅させる又は切除することが望まれる任意の状況を含み得る。特に、かかる状況は、移植の前に骨髄を切除することが望まれる場合に生じる。したがって本発明の化合物は、骨髄除去、特に移植（例えば骨髄移植又はより包括的には造血性幹細胞移植（ＨＳＣＴ）であり得る）前の骨髄除去において使用することができる（造血性幹細胞は、骨髄からと同様に、血液、例えば末梢血液から得る又は導くこともできる）。
【０１３０】
幹細胞移植は、悪性又は非悪性であってもよく、或る特定の他の種類の癌、例えば充実性腫瘍癌、例えば神経芽腫、線維形成性（Demoplastic）小円形細胞癌、ユーイング肉腫及び絨毛癌であってもよい血液又は骨髄の疾患又は病態（すなわち血液学的病態又は障害）の治療に使用することができる。血液学的悪性腫瘍は、白血病、リンパ腫（ホジキン及び非ホジキン）、及び骨髄腫を含む。非悪性血液学的障害は、食細胞障害（例えば骨髄形成異常）、貧血（例えば重度の形成不全、若しくは再生不良性貧血）、及び骨髄増殖性障害（例えば真性赤血球増加症及び本態性血小板増加症）を含む。幹細胞移植により治療され得る他の後天性の病態は、代謝障害、例えばアミロイドーシス、及び環境誘導性疾患、例えば放射線中毒を含む。幹細胞移植は、先天性障害、例えば種々のリソソーム蓄積症、免疫不全症、及び非悪性血液学的障害、例えば貧血、血球減少症、血球貪食症候群、ヘモグロビン異常症、鎌状赤血球症、及びβ重症型サラセミアの治療に使用することもできる。
【０１３１】
放射線療法（radiotherapy）（放射線療法（radiation therapy）及び放射線腫瘍学としても既知である）は、上で説明した過剰増殖性障害を含む種々の病態の治療において使用することができる。「放射線療法」は、ＤＮＡ鎖を構成する原子を直接的に又は間接的に電離することにより、細胞のＤＮＡを損傷することができる電離放射線の使用を意味する。間接的な電離は、水の電離の結果として起こり、フリーラジカル、特にヒドロキシルラジカルを形成し、その後ＤＮＡを損傷する。放射線療法の最も一般的な形態では、放射線の効果のほとんどはフリーラジカルを介する。
【０１３２】
持続的な（persistent）ＤＮＡ二本鎖切断、又はプログラムされた細胞死の活性化によりもたらされる細胞傷害効果のために、放射線療法は、癌の治療において、及び病理学的組織の切除のために有用である。電離放射線は、腫瘍細胞及び癌細胞等の過剰増殖性細胞を、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏの両方で、アポトーシスによる細胞死に至らしめる。
【０１３３】
不運にも放射線療法は、周囲の正常組織を損傷する許容不可能な高いリスクを伴わずに腫瘍細胞を死滅させるのに十分に高線量の局所放射線を送達することができないことが多いので、患者由来の癌細胞を完全に根絶することはできないことが多い。細胞が放射線誘導性細胞死に対して広く変動する感受性を示すこと、また電離放射線がホスファチジルイノシトール３−キナーゼ／Ａｋｔ（ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ）及びマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）シグナル伝達経路を介して生存促進性（pro-survival）応答機構を活性化することができることも知られている。したがって、電離放射線の効力に対して細胞を増感することにより放射線療法の有効性を増強する必要性が存在する。
【０１３４】
したがって、本発明の化合物は、かかる増感効果をもたらすために、換言すれば放射線療法の効果を増強するために（若しくは代替的に言えば増大させる、増加させる、若しくは促進するために）、又は被験体（若しくはより具体的には被験体中に存在し得る細胞）を放射線療法の効果をより受けやすいものとするために、使用することができる。したがって、放射線療法が使用される任意の治療上の用途において有用性を見出すことができる。これは、疾患細胞以外のものを含み得る細胞を死滅させる又は切除することが望まれる任意の状況を含み得る。
【０１３５】
したがって本発明の化合物は、電離放射線のＤＮＡ損傷効果に対する細胞の増感剤として使用することができる。「増感剤」は、細胞に対する電離放射線のＤＮＡ損傷効果を増強するのに使用される本発明の化合物を意味する。これは、内在性の細胞のＤＮＡ修復機構の阻害により達成することができる。
【０１３６】
したがって、本発明は、放射線療法と併用される、ＰＣＮＡ相互作用モチーフを含むオリゴペプチド化合物（より具体的には、本明細書で規定のようなＰＣＮＡ相互作用モチーフを含むオリゴペプチド化合物）、又は上記ＰＣＮＡ相互作用モチーフをコードする配列を含む核酸分子を包含する（ここで化合物は放射線療法と別々に、同時に又は連続して投与される）。化合物と共に放射線療法が、放射線療法に反応性がある、又は放射線療法を必要とする任意の病態の治療において施行され得る。したがって本発明の化合物又は構築物は、細胞の成長を阻害することが望まれる障害若しくは病態、例えば過剰増殖性障害の治療において、又は放射線療法を伴う任意の治療において、使用することができる。
【０１３７】
代替的に規定すると、本発明は、放射線療法のための増感剤としての、ＰＣＮＡ相互作用モチーフを含むオリゴペプチド化合物（より具体的には、本明細書で規定のようなＰＣＮＡ相互作用モチーフを含むオリゴペプチド化合物）、又は上記ＰＣＮＡ相互作用モチーフをコードする配列を含む核酸分子を提供する（ここで化合物は、放射線療法と別々に、同時に又は連続して投与される）。
【０１３８】
本発明のこれらの態様は、放射線療法に対して被験体（又はより具体的には上記被験体中の細胞若しくは組織）を増感する方法であって、本明細書で規定のような本発明のオリゴペプチド化合物、特に放射線療法に対して上記被験体（又は上記細胞若しくは組織）を増感するのに有効な量の上記化合物を上記被験体に投与することを含む、方法も提供する。
【０１３９】
本発明のこの態様は、被験体を治療する方法であって、本明細書で規定のような本発明のオリゴペプチド化合物と共に放射線療法を上記被験体に施行することを含む、方法を提供すると見ることもできる。より具体的にはかかる方法は、放射線療法に反応性がある、若しくは放射線療法を必要とする障害若しくは病態、若しくは細胞の成長を阻害することが望まれる障害若しくは病態の治療方法、又は放射線療法を伴う治療方法であり得る。
【０１４０】
本発明は、従来の外部ビーム放射線療法、定位的放射線療法、仮想シミュレーション（Virtual simulation）、３次元コンフォーマル放射線療法、強度調整放射線療法及び放射性同位体療法（ＲＩＴ）を含むがこれらに限定されない全ての種類の放射線療法を意図する。
【０１４１】
したがって本明細書で列挙した態様のいずれかの好ましい一実施の形態では、本明細書で規定のようなオリゴペプチド化合物、核酸分子及び／又はベクターは、放射線療法と共に（同時に、別々に又は連続して）使用される。
【０１４２】
本明細書で列挙した態様のいずれかのさらに好ましい一実施の形態では、本明細書で規定のようなオリゴペプチド化合物、核酸分子及び／又はベクターは、細胞増殖抑制剤と共に（同時に、別々に又は連続して）使用される。
【０１４３】
「細胞増殖抑制剤」は、動物細胞の成長及び／又は増幅（複製／増殖）を阻害又は抑制することができる薬剤を意味する。
【０１４４】
細胞増殖抑制剤としては、細胞傷害剤、抗新生物剤、及び腫瘍学的用途又は血液学的用途に適応し得る任意の薬剤が含まれる。したがって、化学療法の治療プロトコルにおいて使用される薬剤（「化学療法剤」）が含まれる。
【０１４５】
細胞増殖抑制剤は、通常その作用機構に従い異なる分類に群分けされ、これらの分類の全てが、本明細書では意図される。したがって、細胞増殖抑制剤は、アルキル化剤、架橋剤、インターカレート剤、ヌクレオチド類似体、紡錘体形成の阻害剤、及び／又はトポイソメラーゼＩ及び／又はＩＩの阻害剤であり得る。他の種類又は分類の薬剤は、抗代謝剤、植物アルカロイド及びテルペノイド、又は抗腫瘍抗生物質を含む。好ましくは細胞増殖抑制剤はアルキル化剤である。
【０１４６】
アルキル化剤はヌクレオシドをアルキル化することによりＤＮＡを修飾し、正しいＤＮＡ複製の防止をもたらす。ヌクレオチド類似体は、複製時にＤＮＡ中に組み込まれ、ＤＮＡ合成を阻害する。紡錘体形成の阻害剤は紡錘体形成を妨害し、分裂中期に有糸分裂の停止を引き起こす。インターカレート剤はＤＮＡ塩基の間に挿入され、それによりＤＮＡ合成を阻害する。トポイソメラーゼＩ又はＩＩの阻害剤は、ＤＮＡのねじれに影響を及ぼし、それによりＤＮＡ複製を妨げる。
【０１４７】
好適な細胞増殖抑制剤は当該技術分野で既知であるが、例えば、アクチノマイシンＤ、ＢＣＮＵ（カルムスチン）、カルボプラチン、ＣＣＮＵ、カンプトテシン（Campothecin）（ＣＰＴ）、カンタリジン、シスプラチン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ＤＴＩＣ、エピルビシン、エトポシド、ゲフィニチブ、ゲムシタビン、イフォスファミド（ifosamide）、イリノテカン、イオノマイシン、メルファラン、メトトレキサート、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）、ミトキサントロン  メルカプトプリン（mitozantronemercaptopurine）、オキサリプラチン、パクリタキセル（タキソール）、ＰＡＲＰ−１阻害剤、タキソテール、テモゾロミド（ＴＺＭ）、テニポシド、トポテカン（topotecane）、トレオスルファン（treosulfane）  ビノレルビン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、５−アザシチジン、５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン及び５−フルオロウラシルが、本明細書で参照される。当業者は任意の所与の細胞増殖抑制剤に関する好適な投与範囲を認識しており、一実施の形態では細胞増殖抑制剤は、その通常の用量範囲で、医薬組成物中に存在しており、又は被験体に投与される。好都合な一実施の形態では、本発明のオリゴペプチド化合物、核酸分子又はベクターは細胞増殖抑制剤に対して細胞を増感するため、より低用量の細胞増殖抑制剤が存在し得る／使用され得るので、本発明のオリゴペプチド化合物、核酸分子又はベクターと併用される場合、より低用量の細胞増殖抑制剤がより高用量の細胞増殖抑制剤自体と同じ又は同程度の治療上の効果を有する。したがって本発明のオリゴペプチド化合物、核酸分子又はベクターは、細胞増殖抑制剤に関して低い又は平均より低い耐性を有する被験体、例えば老齢者、乳児若しくは幼児、又は衰弱した人々（例えば疾患、栄養不良等により）を治療することを可能にする。
【０１４８】
過剰増殖性障害を治療するために細胞増殖抑制剤を使用した場合に直面する１つの問題は、通常、罹患細胞の全てが死滅するわけではないことである。細胞増殖抑制剤と本発明のオリゴペプチド化合物、核酸分子又はベクターとを共に使用した場合、罹患細胞がより高い割合で死滅し、また一実施の形態では、通常の用量より高い用量の細胞増殖抑制剤が、非常に高い割合、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％又は８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％又は９５％の疾患細胞を死滅させるために、最も好ましくは実質的に全ての疾患細胞を死滅させるために、本発明のオリゴペプチド化合物、核酸分子又はベクターと共に使用されると考えられる。
【０１４９】
上で示したように、本明細書で規定のようなオリゴペプチド化合物、核酸分子及び／又はベクターを細胞増殖抑制剤と共に使用する場合、２つの異なる薬剤が同じ医薬組成物中に存在してもよく、又はそれらの薬剤を別々に投与してもよい。別々の投与は、実質的に同時に、しかし異なる投与経路を介する、又は異なる位置での投与による投与を含み得る。別々の投与は、異なる時間での、例えば最大１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間又は１２時間の間隔での投与も含み得る。
【０１５０】
被験体は、動物（すなわち任意のヒト又は非ヒト動物）、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトである。
【０１５１】
当業者は、オリゴペプチド化合物、核酸分子及び／又はベクターを細胞中に導入する好適な方法を十分に認識している。例えば、幾つかの好適な方法について以下に簡潔に論じる。上で詳細に論じたように、ペプチド媒介性の送達方法、特に細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）（上で論じたように、例えば哺乳動物細胞のエンドソームへの取り込みを増強することにより、ＣＰＰを含有する又はＣＰＰが連結されているペプチド、タンパク質又はヌクレオチド分子の細胞への取り込みを容易にすることができるポリカチオン性であることもある短い配列である）を使用することができる。マイクロカプセル化は、生物活性材料を保護し、封入した物質又はその生成物を制御して放出させるために半透性のポリマー膜内に生物活性材料を封入する単純且つ費用対効果の良い方法を提供する。光化学的細胞内移行（internalisation）（ＰＣＩ）では、対象の分子と光増感化合物との両方が、細胞によりリソソーム又はエンドソームへと取り込まれる。その後細胞を好適な波長の光に曝露して光増感化合物を活性化し、光増感化合物にリソソーム又はエンドソームの膜を破壊させ、それにより細胞の細胞質ゾルへと対象の分子を放出させる。
【０１５２】
他の方法は、微量注入、赤血球ゴースト媒介性融合、リポソーム融合、ピノソームの浸透圧溶解、スクレイプ・ローディング（scrape loading）、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム及びウイルス媒介性トランスフェクション、並びにコポリマー担体の使用を含む。
【０１５３】
キトサン及び水溶性キトサン誘導体、特にグリコールキトサンは、そのｉｎ  ｖｉｖｏでの生体適合性及び生体分解性のために、最適なドラッグ担体として持ち上がっている。好ましい例は、５β−コラン酸で疎水的に修飾したグリコールキトサンである。
【０１５４】
標準的なアミノ酸１文字コードが本明細書で使用され、それによると例えばＫはリシン（Ｌｙｓ）を表し、Ｉはイソロイシン（Ｉｌｅ）を表す。
【０１５５】
本発明のオリゴペプチド化合物は、１つ又は複数の、例えば少なくとも１個、２個、３個、４個又は５個の、標準的な遺伝子コードによってはコードされていない側鎖を有するアミノ酸（本明細書で「非コードアミノ酸」と称する）を組み込み得る。これらは、代謝プロセスを通じて形成されるアミノ酸、例えばオルニチン若しくはタウリン、及び／又は人工的に修飾したアミノ酸、例えば９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、（ｔｅｒｔ）−ブチルオキシカルボニル（（tert）-（B）utyl （o）xy （c）arbonyl）（Ｂｏｃ）、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（Ｐｍｃ）保護アミノ酸、又はベンジルオキシ−カルボニル（Ｚ）基を有するアミノ酸から選択することができる。好ましくは、かかる非コードアミノ酸が存在する場合、それらはモチーフ内に位置しないが、一実施の形態では１つ又は複数の非コードアミノ酸がモチーフ内に存在する。
【０１５６】
本発明のオリゴペプチド化合物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏでの安定性を、当該技術分野で既知の安定化手段又は保護手段、例えば保護基若しくは安定化基の付加、アミノ酸誘導体若しくは類似体の組み込み、又はアミノ酸の化学的修飾の使用により改善又は増強することができる。かかる保護基又は安定化基は、例えばＮ末端及び／又はＣ末端に付加することができる。かかる基の一例はアセチル基であり、他の保護基又はペプチドを安定化することができる基は当該技術分野で既知である。
【０１５７】
本発明のオリゴペプチド化合物は通常、Ｌ−配置を有するアミノ酸のみを含むが、Ｄ−配置を有する１つ又は複数のアミノ酸が存在し得る。好ましくは、オリゴペプチド化合物は、少なくとも１個、２個、３個、４個又は５個のＤ−アミノ酸を含有しており、Ｄ−アミノ酸は好ましくはモチーフ中に見出されるが、別の実施の形態では、モチーフの外側にのみ存在する。オリゴペプチド化合物は直鎖状又は環状であり得る。
【０１５８】
したがって本発明のオリゴペプチド化合物のインベルソオリゴペプチド化合物、又はインベルソ類似体（より具体的にはインベルソペプチド）が特に含まれる。
【０１５９】
残基（例えばアミノ酸残基）が親化合物又は基準化合物（例えばペプチド）と反対方向に集合化したレトロオリゴペプチド化合物（又はレトロペプチド）も含まれる。
【０１６０】
レトロインベルソオリゴペプチド化合物は、親化合物又は基準化合物の配列と逆（反対）の順序でＤ−アミノ酸を含む。したがってレトロインベルソ類似体は、親配列又は基準配列におけるものと同様の側鎖のトポロジーをおよそ維持しながら、例えばペプチド結合の逆の末端及び逆の順序を有する。
【０１６１】
本発明の化合物は、部分的なインベルソ、レトロ又はレトロインベルソ配列を含み得る。
【０１６２】
「オリゴペプチド化合物」は、ペプチド結合又は同等の結合により共に連結される、アミノ酸又は同等のサブユニットから構成される化合物を意味する。したがって、「オリゴペプチド化合物」という用語は、ペプチド及びペプチド模倣物を含む。
【０１６３】
「同等のサブユニット」は、或るアミノ酸と構造的に及び機能的に類似のサブユニットを意味する。サブユニットの骨格部分は標準的なアミノ酸と異なっていてもよく、例えば１つ又は複数の炭素原子の代わりに１つ又は複数の窒素原子を組み込み得る。
【０１６４】
「ペプチド模倣物」は、ペプチドと機能的に同等又は類似であり、対応するペプチドと類似の３次元構造を採ることができるが、ペプチド結合により連結されたアミノ酸のみから構成されるわけではない化合物を意味する。ペプチド模倣物の好ましい種類はペプトイド、すなわちＮ−置換グリシンである。ペプトイドはその対応する天然のペプチドと密接に関連するが、その側鎖が、α−炭素（アミノ酸でそうであるように）ではなく分子骨格に沿って窒素原子に付加されているという点で化学的に異なっている。
【０１６５】
好ましい一実施の形態では、少なくともオリゴペプチド化合物のモチーフ部分はペプチド結合のみを含み、好ましくはコードアミノ酸のみから構成される。最も好ましくは、オリゴペプチド化合物はペプチドである。
【０１６６】
オリゴペプチド化合物はジアミノ酸及び／又はβ−アミノ酸を組み込み得るが、少なくともモチーフ部分は好ましくはα−アミノ酸のみから構成される。最も好ましくは、オリゴペプチド化合物はα−アミノ酸から成る。
【０１６７】
接頭辞「オリゴ」は、比較的小数のサブユニット（例えばアミノ酸）、すなわち２００個未満、好ましくは１００個未満、９０個未満、８０個未満、７０個未満、６０個未満又は５０個未満のサブユニットを指定するために使用される。したがって本発明のオリゴペプチド化合物は、少なくとも５個で且つ２００個以下のサブユニットを含み得る。好ましくは、本発明のオリゴペプチド化合物は、少なくとも６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個又は２０個のサブユニットを含む。代替的に規定すると本発明のオリゴペプチド化合物は、４０個以下、３５個以下、３０個以下、２９個以下、２８個以下、２７個以下、２６個以下又は２５個以下のサブユニットを含む。したがって代表的なサブユニット範囲は、５個〜４０個、５個〜３５個、５個〜３０個、５個〜２５個、５個〜２０個、５個〜１５個、５個〜１２個、５個〜１０個等を含み、５個〜２０個及び５個〜３０個が好ましい。
【０１６８】
オリゴペプチド化合物が５個より多くのサブユニットを含む場合、モチーフの外側のサブユニットの性質は重要ではなく、そのためモチーフの外側のサブユニットは例えばｈＡＢＨ２等の天然タンパク質中に見出されるものであってもよく、又はアラニン残基若しくは任意の他の好適な残基であってもよい。
【０１６９】
ペプチド模倣物は通常、患者の身体内でより長い半減期を有するので、長く持続する効果が望まれる実施の形態において好ましい。これは、組成物を再投与すべき頻度を低減するのに役立ち得る。しかしバイオセーフティの理由から、他の実施の形態ではより短い半減期が好ましいことがあり、これらの実施の形態ではペプチドが好ましい。
【０１７０】
本発明のオリゴペプチド化合物はより大きな単位の部分を形成することができ、例えばポリペプチドと融合して組換え融合タンパク質を形成することができ、又は足場（scaffold）と結合してペプチドアプタマーを形成することができる。したがって、本発明のオリゴペプチド化合物を組み込んだ融合タンパク質又はアプタマーは、本発明のさらなる態様を形成する。またさらなる態様は、かかる融合タンパク質又はアプタマーを含む医薬組成物、及び治療法における、又は上で説明した治療方法におけるかかる融合タンパク質又はアプタマーの使用を含む。
【０１７１】
理論に拘束されることを望むものではないが、最適なＤＮＡ修復、維持及び／又は細胞周期調節のために幾つかのタンパク質がＰＣＮＡと相互作用することが必要であると考えられており、本発明のオリゴペプチド化合物はＰＣＮＡと相互作用するコンセンサスモチーフを有する（posses）タンパク質と競合し得ると考えられている。最適なＤＮＡ修復、維持及び／又は細胞周期調節のために新規モチーフを介してＰＣＮＡと相互作用する必要があり得るタンパク質の例を第１表に列挙し、タンパク質はＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、トポイソメラーゼ、ＤＮＡ修復タンパク質、ＤＮＡ修復関連／相互作用タンパク質、姉妹染色分体接着に関与するタンパク質、クロマチン再構築、ＤＮＡ結合、ユビキチンプロセシング又はＳＵＭＯプロセシング、Ｅ３ユビキチンリガーゼ、転写因子、細胞周期調節因子、タンパク質キナーゼ、メチルトランスフェラーゼ（Metyltransferase）、アセチルトランスフェラーゼ、癌関連抗原、構造タンパク質又は中心体キネシンであり得る。
【０１７２】
十分なレベルの本発明のオリゴペプチド化合物が細胞内に存在する場合、これらのタンパク質の内の１つ又は複数の活性は、この競合的阻害により低減し、又はさらには消失する。
【０１７３】
本明細書で規定のようなオリゴペプチド化合物、核酸分子又はベクター自体は、酵素活性を有さず、細胞に対する毒性がないと考えられている（実施例２を参照されたい）。したがって、本明細書で規定のようなＰＣＮＡ相互作用モチーフを含む本発明のペプチドの発現は、該ペプチドが発現する細胞の成長に対して効果を有しない、又は微小な効果しか有しないことが示されている。これは、発現レベルに依存し得る。しかし、幾つかの状況では、本発明のオリゴペプチド化合物は細胞傷害性であり得ると考えられており、したがって該化合物は独立して細胞傷害剤（又は細胞増殖抑制剤）として使用することができる。したがって、本発明の化合物は、本明細書で論じた病態の治療における細胞傷害剤として、また必ずしも別々の細胞増殖抑制剤と、又は放射線療法と併用でなくとも、使用することができる。
【０１７４】
実験により、細胞に投与されたオリゴペプチド化合物は細胞に対する細胞傷害効果を有し得ることが示されている。
【０１７５】
細胞傷害効果は化合物の正確な性質、例えばその配列又は組成に依存して変動し得る。特に、細胞傷害効果はＮＬＳ及び／又はＣＰＰを含む構築物により得ることができ、両方及びＮＬＳ及びＣＰＰを含有する構築物で観察されている。細胞傷害性の強力な証拠が核局在構築物で観察されている。
【０１７６】
細胞傷害効果を示すオリゴペプチド化合物は、インベルソ、レトロ又はレトロインベルソ等であり得る。
【０１７７】
より具体的には、本発明によるＰＣＮＡ結合モチーフを２つ以上含有する化合物又は構築物により細胞傷害効果の増大を得ることができることがさらに観察されている。
【０１７８】
さらなる一態様では、
（ｉ）本明細書で規定のようなオリゴペプチド化合物、本明細書で規定のような核酸分子、及び／又は本明細書で規定のようなベクター、並びに
（ｉｉ）細胞増殖抑制剤
を含むキット又は医薬製品が本明細書で提供される。
【０１７９】
別の態様では、細胞の成長を阻害することが望まれる障害若しくは病態、例えば過剰増殖性障害の治療において又は細胞増殖抑制療法を伴う治療において同時に、連続して又は別々に使用される複合調製物としての、（ｉ）本明細書で規定のようなオリゴペプチド化合物、本明細書で規定のような核酸分子、及び／又は本明細書で規定のようなベクター、並びに（ｉｉ）細胞増殖抑制剤を含有する製品が提供される。
【０１８０】
細胞又は細胞培養物への本明細書で規定のようなオリゴペプチド化合物、核酸分子及び／又はベクターのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの投与も意図される。かかるｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法は、ＤＮＡ修復、維持及び／又は細胞周期調節を研究するために使用することができる。好ましい一態様ではｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法は、新規な細胞増殖抑制剤を同定するために使用される。これは、細胞増殖抑制剤のより迅速な同定、又は単独で使用した場合には弱い細胞増殖抑制活性しか有しないが、本発明のオリゴペプチド化合物、核酸分子若しくはベクターと併用した場合には有用な細胞増殖抑制活性を有する薬剤の同定を可能にし得る。
【０１８１】
本明細書で規定のような新規なＰＣＮＡ相互作用モチーフは、細胞の成長を阻害することが望まれる障害若しくは病態、例えば過剰増殖性障害の診断若しくはモニタリング、又は細胞増殖抑制療法若しくは放射線療法を伴う治療において、使用することができる。
【０１８２】
本発明者らは、幾つかの癌関連抗原がＰＣＮＡ結合モチーフを有することを見出した（第１表を参照されたい）。したがって、モチーフを含有するタンパク質の発現レベル及び／又は位置を検出することにより（ここでタンパク質の異常なレベル及び／又は位置は、障害、例えば過剰増殖性障害の指標である）、上で論じた過剰増殖性障害又は他の障害を診断することができる、又はその進行をモニタリングすることができると考えられる。
【０１８３】
「異常なレベル」は、タンパク質のレベルの増大（例えば、該レベルは、同じ細胞型の健常細胞におけるレベルと比較して１０％、２０％、３０％若しくは４０％より大きい）、又はタンパク質のレベルの減少（例えば、該レベルは、同じ細胞型の健常細胞におけるレベルと比較して１０％、２０％、３０％若しくは４０％より小さい）を意味する。
【０１８４】
好ましい一実施の形態では、モチーフを含有するタンパク質のレベルの増大は、障害、例えば過剰増殖性障害の指標である。
【０１８５】
モチーフ含有タンパク質のレベルは、任意の既知のタンパク質検出方法を使用して分析することができる。好ましくは、モチーフに特異的な抗体が使用される。抗体は、診断方法において使用するために、モチーフに対して十分に特異的でなければならない（基準タンパク質、例えばウシ血清アルブミンと比較して）。
【０１８６】
抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であってもよく、全抗体、例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ若しくはＩｇＤ、又は抗体断片、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂｓであってもよい。
【０１８７】
検出アッセイを、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで、例えば組織若しくは細胞、又は体液試料、例えば細胞溶解物、血清若しくは血液において、実施することができる。
【０１８８】
検出を、抗体と検出可能な物質とを結合すること（すなわち、物理的に連結すること）（すなわち、抗体標識）により、容易にすることができる。検出可能な物質の例は、種々の酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、ＮＭＲ造影剤及び放射性材料を含む。好適な酵素の例は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコースオキシダーゼ、リゾチーム、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ等を含み；好適な補欠分子族複合体の例は、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンを含み；好適な蛍光材料の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル又はフィコエリトリンを含み；発光材料の例は、ルミノールを含み；生物発光材料の例は、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリンを含み、好適な放射性材料の例は、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ又は３Ｈを含む。直接の可視標識の場合には、コロイド性金属粒子又は非金属粒子を使用することができる。
【０１８９】
好ましくは、細胞の成長を阻害することが望まれる障害又は病態、例えば過剰増殖性障害の被験体における進行を診断又はモニタリングする方法であって、
（１）抗体−抗原複合体の形成を可能にする条件下で上記被験体（例えば哺乳動物）から採取した試験試料とモチーフに特異的な抗体とを接触させる工程；
（２）試験試料中の抗体−抗原複合体の量を測定する工程；及び
（３）試験試料中の抗体−抗原複合体の量と対照試料中の抗体−抗原複合体の量とを比較する工程
を含む、方法が提供される。対照は、同じ被験体から採取した健常細胞、例えば健常線維芽細胞であり得る。
【０１９０】
別の態様では、本発明は、モチーフに特異的な抗体に関する。
【０１９１】
本発明は、細胞の成長を阻害することが望まれる障害又は病態、例えば過剰増殖性障害を診断又はモニタリングするキットであって、モチーフに特異的な抗体、及び障害又は病態を診断するためのその使用に関する取扱説明書を備える、キットをさらに含む。好ましくは抗体は上で説明した検出可能な物質とカップリングし、又はキットはかかる検出可能な物質を含む。
【０１９２】
代替的な診断方法は、モチーフをコードする異常なレベルの核酸分子の検出を伴う。この方法では、核酸のレベルは、好適な検出方法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、又は好適に標識したプローブを使用するハイブリダイゼーション法を使用してモニタリングされる。これより本発明を、以下の非限定的な実施例及び図面を参照してさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１９３】
【図１】ｈＡＢＨ２及びＰＣＮＡが共局在化すること、並びにｈＡＢＨ２の１０個のＮ末端アミノ酸がこの共局在化に必要且つ十分なことを示す共焦点顕微鏡画像である。ＥＹＦＰで標識した種々のｈＡＢＨ２構築物（残基１〜２６１を有する全長ｈＡＨＢ２、残基１１〜２６１を有する切断ｈＡＢＨ２、及び残基１〜１０から成るＨＡＢＨ２のＮ末端断片）を、ＥＣＦＰ標識ＰＣＮＡを用いて共局在化に関して試験した（実施例１を参照されたい）。左のレーンは、ｈＡＢＨ２単独でトランスフェクトした細胞を示し、残りの３つのレーンはｈＡＢＨ２構築物及びＰＣＮＡで同時トランスフェクトした細胞を示す。
【図２】ＦＲＥＴ分析の結果を示すグラフである。正規化ＦＲＥＴ（ＮＦＲＥＴ）測定結果を、ＥＹＦＰ（黄色蛍光タンパク質）／ＥＣＦＰ（シアン蛍光タンパク質）（レーン１、タグの二量体形成によるバックグラウンド）、ＥＹＦＰ−ＰＣＮＡ／ＥＣＦＰ−ＰＣＮＡ（レーン２、ＰＣＮＡがＰＣＮＡと結合することによる陽性対照）、ｈＡＨＢ２−ＥＹＦＰ／ＥＣＦＰ−ＰＣＮＡ（レーン３）及び１−１０Ｎ  ｈＡＢＨ２−ＥＹＦＰ／ＥＣＦＰ−ＰＣＮＡ（レーン４）の間で示す。
【図３】ｈＡＢＨ２１−１０−ＥＹＦＰを発現する、又は対照としてＥＹＦＰを発現する細胞に対する種々の細胞増殖抑制剤の効果を示すグラフである。処理細胞は左に、未処理細胞は右に示した。処理を、１０μＭ  ＭＭＳ、４０μＭ  ＢＣＮＵ、１μＭ  ＭＭＣ又は６００μＭ  ＴＭＺを用いて４日間実施した（それぞれ図３ａ〜図３ｄ）。示したデータは、少なくとも３回の実験のうち代表的な１回から得られたものであり、異なる用量での細胞成長を、８個の並行ウェルにおいて試験した。
【図４】Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗを使用した、ホモ・サピエンス（Homo sapiens）（ＮＰ００１００１６５５．１）、ボス・タウルス（Bos Taurus）（ＮＰ００１０１９６８７．１）、ドブネズミ（Rattus norvegicus）（ＸＰ２２２２７３．３）、ハツカネズミ（Mus musculus）（ＮＰ７７８１８１．２）、セキショクヤケイ（Gallus gallus）（ＸＰ４１５１８８．２）及びムラサキウニ（Strongylocentrotus purpuratus）（ＸＰ７９７７０４．１）由来のＡＢＨ２ホモログの１０個のＮ末端アミノ酸の配列アライメントを示す図である。配列は公的データベースから入手した。
【図５】種々の異なる種から実施例４において同定したタンパク質の配列のアライメントを示す図である。
【図６−１】実施例７で説明した種々のペプチドを用いた細胞傷害アッセイの結果を示すグラフである（図６（ａ）〜図６（ｈ））。ＨｅＬａ細胞を９６ウェルプレート中に播種し（６０００細胞／ウェル）、３時間インキュベートした。種々の用量のペプチドを、培地中における血清の存在下（黒ひし形）又は非存在下（黒四角）でウェルに添加した。１時間後に１０％又は２０％の血清を有する等量の培地（血清無含有培地に対して）をウェルに添加した。ＭＴＴアッセイによる細胞生存性の測定前に細胞を４８時間インキュベートした。グラフは、ペプチドの濃度（μＭ）に対する細胞成長（ＯＤ７５０ｎｍ）を示す。
【図６−２】実施例７で説明した種々のペプチドを用いた細胞傷害アッセイの結果を示すグラフである（図６（ａ）〜図６（ｈ））。ＨｅＬａ細胞を９６ウェルプレート中に播種し（６０００細胞／ウェル）、３時間インキュベートした。種々の用量のペプチドを、培地中における血清の存在下（黒ひし形）又は非存在下（黒四角）でウェルに添加した。１時間後に１０％又は２０％の血清を有する等量の培地（血清無含有培地に対して）をウェルに添加した。ＭＴＴアッセイによる細胞生存性の測定前に細胞を４８時間インキュベートした。グラフは、ペプチドの濃度（μＭ）に対する細胞成長（ＯＤ７５０ｎｍ）を示す。
【図６−３】実施例７で説明した種々のペプチドを用いた細胞傷害アッセイの結果を示すグラフである（図６（ａ）〜図６（ｈ））。ＨｅＬａ細胞を９６ウェルプレート中に播種し（６０００細胞／ウェル）、３時間インキュベートした。種々の用量のペプチドを、培地中における血清の存在下（黒ひし形）又は非存在下（黒四角）でウェルに添加した。１時間後に１０％又は２０％の血清を有する等量の培地（血清無含有培地に対して）をウェルに添加した。ＭＴＴアッセイによる細胞生存性の測定前に細胞を４８時間インキュベートした。グラフは、ペプチドの濃度（μＭ）に対する細胞成長（ＯＤ７５０ｎｍ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１９４】
実施例で使用した実験手順
発現構築物
蛍光タグ付き発現構築物ＥＣＦＰ−ＰＣＮＡ及びｈＡＢＨ２１−２６１−ＥＹＦＰのクローニングは、以前に説明されている（Aas et al., 2003）。ｈＡＢＨ２１−２６１−ＥＹＦＰを鋳型として利用して、ｈＡＢＨ２１−１０−ＥＹＦＰ及びｈＡＢＨ２１１−２６１−ＥＹＦＰをＰＣＲにより生成した。増幅産物を、それぞれＮｄｅＩ／ＡｇｅＩ及びＡｇｅＩ／ＥｃｏＲＩを使用してｐＥＹＦＰ−Ｎ１（Clonetech）中にクローニングした。ＥＳＴからのＰＣＲ産物（イメージクローン５１７６９７９（ＢＣ０３５３７４）ＲＺＰＤ）を、ｐＥＹＦＰ−Ｃ１（ＨｉｎｄＩＩＩ／Ａｃｃ６５１）中にクローニングして、ＥＹＦＰ−ＴＦＩＩＳ−Ｌを得た。ＥＹＦＰ−ＸＰＡ構築物は、Wim Vermeulen博士（Department of Cell Biology and Genetics, Rotterdam）から寛大にも提供を受けたＨｉｓ９−ＨＡ−ＥＧＦＰ−ＸＰＡ（Rademakers et al., 2003）においてＥＹＦＰとＥＧＦＰ（ＮｈｅＩ／ＢｓｒＧＩ断片）とを入れ替えることにより作製した。ＴＦＩＩ−Ｉ−ＥＹＦＰは、Robert G. Roeder博士（Laboratory of Biochemistry and Molecular Biology, The Rockefeller University, New York）から寛大にも提供を受けたｐＩ３ＣＸ−ＴＦＩＩ−Ｉ（Roy et al., 1993）からのＴＦＩＩ−ＩのＰＣＲ増幅、及びＥＹＦＰ−Ｎ１（ＳａｃＩ／ＡｐａＩ）中へのクローニングにより生成した。ＥＹＦＰ−Ｔｏｐｏ−ＩＩαは、William T. Beck（Division of Molecular Pharmacology, Department of Molecular Genetics, University of Illinois, Chicago）から寛大にも提供を受けたＥＧＦＰ−Ｔｏｐｏ−ＩＩα （ｐＴ１０４−１）（Mo and Beck, 1999）からＥＧＦＰタグ（ＥｃｏＲＩブラント／ＮｈｅＩ）とＥＹＦＰタグ（ＸｈｏＩブラント／ＮｈｅＩ）とを入れ替えることにより作製した。Ｆ４突然変異体を含むｈＡＢＨ２１−７−ＥＹＦＰ構築物は、ＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩオーバーハングでオリゴヌクレオチドをアニーリングし、その後ＡＴＧコドンで突然変異したＥＹＦＰ−Ｎ１にクローニングすることにより、作製した。全ての点突然変異を、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）ＩＩ取扱説明書マニュアルに従い部位特異的突然変異誘発により作製した。制限酵素及び仔牛小腸由来アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）は、New England Biolabs（登録商標）Inc.から、オリゴヌクレオチドはMedProbe、Eurogentech（Oslo, Norway）から入手した。全ての構築物を、配列決定により確認した。
共焦点画像化及びＦＲＥＴ測定
生きたＨｅＬａ細胞を、ＥＣＦＰ及びＥＹＦＰ融合構築物の一過性のトランスフェクション（製造業者の推奨に従い、Ｆｕｇｅｎｅ６（Roche Inc．）による）の１６時間〜２４時間後に調べた。蛍光画像を、Ｐｌａｎ−Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔｅ  ６３×／１．４油浸対物レンズを備えたＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０  Ｍｅｔａレーザー走査顕微鏡を使用して取得した。連続式スキャンを使用して、増強型シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）はλ＝４５８ｎｍで励起してλ＝４７０ｎｍ〜５００ｎｍで検出し、増強型黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）はλ＝５１４ｎｍで励起してλ＝５３０ｎｍ〜６００ｎｍで検出した。切片の厚みは１μｍとした。
【０１９５】
タグ（ＥＹＦＰ及びＥＣＦＰ）間の距離が１００Å（１０ｎｍ）未満である場合、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）が起こる。本発明者らは、供与体（ＥＣＦＰ）の励起時の受容体（ＥＹＦＰ）の発光を測定する増感発光方法を使用して、ＦＲＥＴを検出した。本発明者らは、ＥＣＦＰ蛍光色素の励起後のＥＹＦＰからの放射光の強度が、それぞれＥＹＦＰ及びＥＣＦＰレーザーでの励起後にＥＣＦＰ又はＥＹＦＰタグ付きタンパク質単独により放射された光（ブリードスルー（bleed through））よりも強かった場合（式：ＦＲＥＴ＝Ｉ２−Ｉ１（ＩＤ２／ＩＤ１）−Ｉ３（ＩＡ２／ＩＡ３）が０より大きい場合）、ＦＲＥＴが起こったものとした。ＦＲＥＴを、式：ＮＦＲＥＴ＝ＦＲＥＴ／（Ｉ１×Ｉ３）１／２を使用して発現レベルに関して正規化した。ＮＦＲＥＴは、２５ピクセル超を含有する関心領域（ＲＯＩ）内の平均強度（Ｉ）から算出した（全てのピクセルの強度が２５０未満であり、供与体及び受容体構築物の両方に関する平均強度が１００〜２００であった）。チャネル１（ＥＣＦＰ）及び３（ＥＹＦＰ）を、上で説明したように画像化のために測定し、チャネル２（ＦＲＥＴ）はλ＝４５８ｎｍで励起しλ＝５３０ｎｍ〜６００ｎｍで検出した。ＩＤ１、Ｄ２、Ｄ３及びＩＡ１、Ａ２、Ａ３は、同時トランスフェクトした細胞（Ｉ１及びＩ３）と同じ設定及び同じ蛍光強度を用いて、ＥＣＦＰ及びＥＹＦＰ構築物のみでトランスフェクトした細胞に関して確定した。ＥＣＦＰ−ＰＣＮＡ及びＥＹＦＰ−ＰＣＮＡは陽性対照として含め、同時発現したタグの二量体形成のために、エンプティベクターから発現したＥＣＦＰ及びＥＹＦＰタンパク質を全ての実験において陰性対照として含めた。
細胞株の培養、及び細胞抽出物の調製
対象の構築物を安定して発現するＨｅＬａ（子宮頸部癌）及びＨａＣａＴ（自発的に形質転換したケラチノサイト）細胞を、トランスフェクション（Ｆｕｇｅｎｅ６による）、その後の細胞選別又は希釈クローニング、並びに１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、アンホテリシンＢ（２５０μｇ／ｍｌ、Sigma-Aldrich）、ゲンタマイシン（１００μｇ／ｍｌ、Gibco）及びグルタミン（１ｍＭ、BioWhittaker（登録商標））を添加した選択（ゲンチシン（genticine）、Ｇ４１８、４００μｇ／ｍｌ（Invitrogen）を使用する）ダルベッコ変法イーグル培地／高グルコース４．５ｇ／ｌ（ＤＭＥＭ）（BioWhittaker（登録商標））での長期培養により調製した。細胞を５％二酸化炭素、加湿雰囲気中において３７℃で培養した。ＨｅＬａ由来の分画した細胞抽出物を、緩衝液Ｉ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、及び５０ｍＭ  ＫＣｌ）において１×血中血球容積（ＰＣＶ）で、及び緩衝液ＩＩ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ  ＫＣｌ、２０％グリセロール、０．５％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、１０ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、１×Ｃｏｍｐｌｅｔｅプロテアーゼ阻害剤（Roche）、ホスフェート阻害剤カクテル（ＰＩＣ  Ｉ及びＰＩＣ  ＩＩ、Sigma））において１×ＰＣＶで細胞ペレットを再懸濁することにより調製した。細胞を、一定振とう下で４℃で３０分間、インキュベートした。上清（可溶性画分）を回収した。ペレット（核を含有する）を、緩衝液ＩＩＩ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、及び１００ｍＭ  ＫＣｌ）において１×ＰＣＶで、緩衝液ＩＩにおいて１×ＰＣＶで再懸濁し、全ての核が破壊されるまで軽く（briefly）超音波処理した。７５０μｇの核小体含有画分を遠心分離し、ペレット（クロマチン結合画分）を緩衝液ＩＩ及びＩＩＩ中で再懸濁した。クロマチン結合画分を、ＤＮＡｓｅ／ＲＮＡｓｅカクテル（２μｌ  Ｏｍｎｉｃｌｅａｖｅ（登録商標）エンドヌクレアーゼ（２００Ｕ／μｌ、Epicentre（登録商標）Biotecnologies、WI）、２μｌ  ＤＮＡｓｅ（１０Ｕ／μｌ、Roche Inc．）、２μｌ  Ｂｅｎｓｏｎａｓｅ（２５０Ｕ／μｌ、Novagene、Ge）、２μｌ  小球菌ヌクレアーゼ（１００Ｕ／μｌ〜３００Ｕ／μｌ、Sigma-Aldrich）、及び２μｌ  ＲＮＡｓｅ（１０ｍｇ／ｍｌ、Sigma-Aldrich））と共に室温で３０分間、及び３７℃で１時間インキュベートした。７５０μｇの可溶性画分を、さらなる２μｌ  Ｏｍｎｉｃｌｅａｖｅ（登録商標）と共に、ＩＰ時に４℃で終夜インキュベートした。
共免疫沈降（ｃｏ−ＩＰ）及びウェスタン分析（ＷＢ）
ＧＦＰタンパク質に対して産生したインハウスアフィニティ精製ウサギポリクローナル抗体（ＥＹＦＰ及びＥＣＦＰタンパク質も認識する）を、New England Biolabs（登録商標） Incから得た手順に従ってプロテインＡ常磁性ビーズ（Ｄｙｎａｌ（登録商標））と共有結合した（以下ではα−ＧＦＰビーズと称する）。各画分を、４℃で終夜定速回転時にα−ＧＦＰビーズ（１０μｌ）と共にインキュベートした（ＩＰ）。ＩＰ後、間に氷上でのインキュベーション（５分間）を行いながら、２００μｌ  １０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＫＣｌ（ｐＨ７．５）でビーズを４回洗浄した。ビーズをその後ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）（Invitrogen）ローディング緩衝液及び１ｍＭ  ＤＴＴ中で再懸濁し、加熱し、１０％又は４％〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ＮｕＰＡＧＥ（登録商標））ゲル上で分離し、ＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ（登録商標）、Millipore）に移した。膜を、５％低脂肪粉乳を含むＰＢＳＴ（０．１％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むＰＢＳ）中で１時間ブロッキングした。一次抗体であるα−ＰＣＮＡ（ＰＣ１０、Santa Cruz biotechnology Inc．）及びα−ＧＦＰを１％粉乳に含むＰＢＳＴ中で希釈し、１時間インキュベートし、その後それぞれ二次抗体であるポリクローナルウサギ抗マウスＩｇＧ／ＨＲＰ及びポリクローナルブタ抗ウサギＩｇＧ／ＨＲＰ（DakoCytomation, Denmark）と共に１時間インキュベーションした。膜を化学発光試薬（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｍ、PIERCE）で処理し、タンパク質をＫｏｄａｋ  Ｉｍａｇｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ２０００Ｒで可視化した。
配列解析
初期配列解析のために、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ及びＴｒＥＭＢＬデータベースを使用して対象の配列領域と類似の部分配列を有するタンパク質を見出した。ＰＲＯＳＩＴＥ形式のモチーフでデータベースへの問合せを行った。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗを使用して対象の配列をアラインメントさせた。補足ファイル１に列挙した保存モチーフを、遺伝子オルソログの比較により同定した。Ｉｎｐａｒａｎｏｉｄ５．１版用のデータファイルを、代表的な生物のサブセットに関してＩｎｐａｒａｎｏｉｄウェブサーバー＜http://inparanoid.sbc.su.se/＞からダウンロードした。ヒトの配列を基準として使用し、Ｉｎｐａｒａｎｏｉｄ処理したｆａｓｔａファイルを、ローカルツールを使用して、ＡＰＩＭモチーフに関する正規表現でサーチした。Ｉｌｅ、Ｖａｌ及びＬｅｕに加えてＡｌａがモチーフの３位又は４位のいずれかに存在してもよいが同時に両方の位置には存在しないとする、わずかに拡張したモチーフ定義を使用した。計２２２１８種類のタンパク質配列から、ＡＰＩＭモチーフに対して少なくとも１つのヒットを有する６３６種類の配列が存在した。これらのエントリーを、ウェブサーバー＜http://gpcr.biocomp.unibo.it/esldb/＞からダウンロードしたｅＳＬＤＢデータベースにおいて実験上の及び予測の細胞内局在化に対してマッチさせ、核に対する標的化の示徴（indication）を有しない３４９種類のエントリーは除いた。残りの２８７種類のエントリーに関して対応するＩｎｐａｒａｎｏｉｄオルソログを同定し、対応する配列をｆａｓｔａファイルから抽出し、得られた配列ライブラリをＣｌｕｓｔａｌ  Ｗを用いてアラインメントさせた。
【０１９６】
Ｉｎｐａｒａｎｏｉｄでオルソログを含まない２４種類の配列エントリーは分析から除いた。保存部位の同定のために２つの異なる手順を並行して使用した。第１の手順（コンセンサス）では、コンセンサス配列を、ヒト配列における各ヒット位置に関する多重アライメントから評価した。コンセンサスを評価する際には、例えばＩｌｅ、Ｖａｌ及びＬｅｕを単一の残基型として処理するように、保存的ＡＰＩＭモチーフにおける同等記号（Ａｌａを除く）をコンセンサスの評価に関して同等記号として処理した（where treated）。正規表現を、ヒット位置が確定する前にコンセンサスに対してさらに試験した。代替手順（個別）では、正規表現を、ヒト配列におけるヒット位置に対応する各オルソログ部分配列に対して試験し、少なくとも５０％のオルソログがこの表現とマッチする位置のみを確定した。この評価では、ギャップのみから成る部分配列は、例えば代替的なスプライシング変異体を表し得ると仮定して、除外した。これらの２つの手順はほとんど同一の結果をもたらし、組み合わせたアウトプットを補足ファイル１に示す。計３７種類のエントリーをこの手順により除き、残りの２２６種類のエントリーを列挙して解析した。アウトプットにおいて使用したタンパク質の説明は、Ｉｎｐａｒａｎｏｉｄ未処理ヒトｆａｓｔａファイル及びＥｎｓｅｍｂｌ  ｒｅｌｅａｓｅ  ４５から取得した。アウトプットファイルはｈｔｍｌ形式であり、標準的なウェブブラウザにより開くことができる。
予測ＰＣＮＡ結合ペプチドのドットブロット分析
２８ｎｍｏｌのペプチド（スポットを可視化するためにポンソーで染色した）のドットを含有するアミノ−ＰＥＧ５００−ＵＣ５４０シート（安定性が向上した酸硬化性）を、オスロ大学（Norway）のバイオテクノロジーセンターのペプチド合成実験室で調製した。膜を１μｇ／ｍｌ  ＰＣＮＡで２時間探索し、その後一次抗体（α−ＰＣＮＡ、ＰＣ１０）で探索し、上で説明したようにＷＢのために展開した。
細胞生存アッセイ
ＨｅＬａ及びＨａＣａＴ細胞を９６ウェルプレート中に播種し（４０００細胞／ウェル）、４時間インキュベートした。種々の用量のＭＭＳ（メチルメタンスルホネート、Acros）、ＢＣＮＵ（１，３−ビス（２−クロロエチル）−１−ニトロソウレア（nitrosuream）、Sigma）、テモゾロミド（４−メチル−５−オキソ−２，３，４，６，８−ペンタアザビシクロ［４．３．０］ノナ−２，７，９−トリエン−９−カルボキサミド、ＴＺＭ、Sigma）及びマイトマイシンＣ（６−アミノ−１，１ａ，２，８，８ａ，８ｂ−ヘキサヒドロ−８−（ヒドロキシメチル）−８ａ−メトキシ−５−メチル−アジリノ［２’，３’：３，４］ピロロ［１，２−ａ］インドール−４，７−ジオンカルバメート、ＭＭＣ、Sigma）を、ウェルに添加した。Ｕ２ＯＳ細胞は、ＭＭＳ及びＴＭＺのみに曝露した。細胞を回収まで連続して曝露した。ＭＴＴアッセイ（Mosmann, 1983）を使用して細胞を４日間毎日回収した。ＯＤを５７０ｎｍで測定し、少なくとも６ウェルの平均を使用して細胞生存性を算出した。示したデータは、１つの代表的な実験で得られた成長であり、少なくとも２回再現された。
実施例１
この実施例で説明する本研究は、複製中心（foci）におけるｈＡＢＨ２の局在化を調べており、ｈＡＢＨ２とＰＣＮＡとの間の直接の相互作用、及びかかる相互作用に関与するｈＡＢＨ２の領域を特定している。
【０１９７】
生きているＳ期の細胞では、緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）でタグ付けしたＰＣＮＡが複製部位を表す異なる中心を形成するので、Ｓ期のマーカーとして使用することができる。
【０１９８】
シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）でタグ付けしたＰＣＮＡを、黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）と融合した種々のｈＡＢＨ２欠失構築物と同時発現した。ｈＡＢＨ２における１０個のＮ末端アミノ酸の欠失（ｈＡＢＨ２１１−２６１−ＥＹＦＰ）により、複製中心におけるＰＣＮＡとの共局在化が全体的に消失することが見出された。注目すべきことに、（ｈＡＢＨ２１−１０−ＥＹＦＰと称する構築物を得るために）これらの１０個のアミノ酸をＥＹＦＰと融合した場合には、ＰＣＮＡとの共局在化に十分であった（図１）。特に、ＥＣＦＰ−ＰＣＮＡの同時発現により、ｈＡＢＨ２構築物を単独で発現する細胞と比較して、核中心における全長ｈＡＢＨ２（ｈＡＢＨ２１−２６１−ＥＹＦＰ）及びｈＡＢＨ２１−１０−ＥＹＦＰの局在化が増大した。このことは、ｈＡＢＨ２の１０個のＮ末端アミノ酸により媒介されるＰＣＮＡとｈＡＢＨ２との間の直接の相互作用を示唆している。
【０１９９】
ｈＡＢＨ２及びＰＣＮＡの近接度を検証するために、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を測定した。全長ｈＡＢＨ２−ＥＹＦＰ及びｈＡＢＨ２１−１０−ＥＹＦＰの両方が、ＥＣＦＰ−ＰＣＮＡと共に正のＦＲＥＴを生成し、蛍光タグの間の距離が１００Å未満であることが実証された。このことは、ｈＡＢＨ２変異体が、ＥＣＦＰ−ＰＣＮＡと直接相互作用する、又はＥＣＦＰ−ＰＣＮＡと同じ複合体中に存在していることを示唆している（図２）。
【０２００】
直接的な相互作用を確認するために、ｈＡＢＨ２−ＥＹＦＰ、ｈＡＢＨ２１１−２６１−ＥＹＦＰ、ｈＡＢＨ２１−１０−ＥＹＦＰ又はＥＹＦＰを安定して発現する細胞由来のタンパク質抽出物を使用して共免疫沈降研究を行った。抗ＧＦＰ抗体を使用してそれぞれの融合タンパク質を免疫沈降させた。その後のウェスタンブロット分析により、内在性のＰＣＮＡは、ｈＡＢＨ２１−２１６−ＥＹＦＰ及びｈＡＢＨ２１−１０−ＥＹＦＰによりプルダウンされるが、ｈＡＢＨ２１１−２６１−ＥＹＦＰ又はＥＹＦＰによってはプルダウンされないことが明らかとなった。まとめると、これらの結果は、ｈＡＢＨ２がＰＣＮＡと直接相互作用すること、及び結合配列はｈＡＢＨ２の１０個のＮ末端アミノ酸内に含有されていることを示唆している。
実施例２
ｈＡＢＨ２を阻害するｈＡＢＨ２１−１０の能力を試験した。
【０２０１】
ｈＡＢＨ２１−１０−ＥＹＦＰ又はＥＹＦＰを単独で発現する細胞株を、アルキル化剤ＭＭＳ（メチルメタンスルホネート）、ＢＣＮＵ（カルムスチン）、テモゾロミド（ＴＺＭ）又はマイトマイシンＣ（ＭＭＣ）に曝露した。ＭＭＳはｈＡＢＨ２により修復される３−メチルシトシン（３ｍｅＣ）及び１−メチルアデニン（１ｍｅＡ）をもたらすＳＮ２アルキル化剤であり、ＢＣＮＵは鎖間架橋及び幾つかの単塩基環状付加体（１，Ｎ（６）エタノアデニン）を主にもたらすＯ６−クロロエチル化剤である。ＴＺＭは０６Ｇメチル化剤であると報告されており、ＭＭＣはＣｐＧのグアニンのＮ−アルキル化を介して鎖間架橋を引き起こす。
【０２０２】
ｈＡＢＨ２１−１０−ＥＹＦＰ又はＥＹＦＰの過剰発現は、未処理細胞の成長速度を損なわないが、ｈＡＢＨ２１−１０−ＥＹＦＰの発現がＭＭＳでの処理に対してＨｅＬａ細胞を増感することが見出された。驚くべきことに、ｈＡＢＨ２１−１０−ＥＹＦＰの発現が試験した他の細胞増殖抑制剤の全てに対してＨｅＬａ細胞を増感することも見出された（図３）。このことは、感度の増大が、３ｍｅＣ及び１ｍｅＡを主に修復すると考えられているｈＡＢＨ２の阻害によってのみ引き起こされたわけではなかったことを示している。
【０２０３】
マウスＡｂｈ２−／−細胞、すなわちＡＢＨ２ノックアウト細胞がＭＭＳに対する感度の増大を示すがＢＣＮＵに対する感度の増大は示さないことは以前の研究から既知である。したがって、ｈＡＢＨ２１−１０−ＥＹＦＰを発現する細胞の細胞増殖抑制剤、例えばＢＣＮＵに対する感度の増大は、ｈＡＢＨ２の阻害のみによっては説明することはできない。
【０２０４】
ｈＡＢＨ２１−１０−ＥＹＦＰを安定して発現するＨａＣａＴ（自発的に形質転換したケラチノサイト）細胞も、ＭＭＳ及びＴＭＺに対して過剰に感度が高い。
【０２０５】
異なるアルキル化剤での処理後の細胞のフロー及びコメットアッセイ分析により、ドラッグがそれぞれ、細胞周期に異なる影響を及ぼし、異なるレベル及びパターンのＤＮＡ修復中間体（脱塩基部位、ＳＳＢ、ＤＳＢ）（コメットアッセイにより検出される）を誘発することが示された。ＭＭＳはＳ期停止（１日目）を引き起こし、４時間後に最高レベルのＤＮＡ修復中間体をもたらした。しかし、ＭＭＳ処理した細胞は、正常な細胞周期分布を示し、２日目にＤＮＡ修復中間体のレベルの増大を示さなかった。ＭＭＳと同様に、ＴＭＺも、４時間後に最高レベルの修復中間体をもたらしたが、細胞は３日目までＧ２／Ｍで停止し、異なる損傷及び修復パターンを示した。ＴＭＺも、試験した他の全ての３つの薬剤より多くの鎖切断を誘発した。これは驚くべきことであり、なぜならＴＭＺはＭＧＭＴによる直接の修復機構による修復である０６メチル−Ｇを主に誘発し、任意の塩基又は鎖切断の除去を伴わないと考えられているからである。ＢＣＮＵ処理は、１日目の一過性のＧ２／Ｍ停止、及び非常に低いレベルの修復中間体をもたらし、架橋を含有するほとんどの細胞が死滅したことを示している。他方、ＭＭＣ処理は１日目及び２日目のＳ期停止をもたらし、これは対照細胞よりもｈＡＢＨ２１−１０−ＥＹＦＰを発現する細胞でより顕著であった。細胞は３日目にも依然としてＧ２／Ｍで停止していた。ＭＭＣ処理後のコメットアッセイにおいて細胞株間の有意差は観察することができなかったが、修復中間体の数は２日目に最大となった。
【０２０６】
概して、コメットアッセイにより、ＥＹＦＰ及びｈＡＢＨ２１−１０−ＥＹＦＰを発現する細胞の間の修復中間体の量にいかなる有意差も検出することはできなかった。コメット及びフロー分析により、使用した異なる薬剤が異なる細胞周期応答と、異なる修復パターンとの両方を誘発することが示されている。さらに全ての薬剤がＥＹＦＰを発現する細胞と比較してＡＰＩＭを発現する細胞における細胞傷害性を増大し、それによりこのことが修復又は細胞死の間の調節における幾つかのＡＰＩＭ含有タンパク質に関する役割を支持している。
実施例３
複数の異なる種由来のデータベース配列ＡＢＨ２のアライメントにより、７個のＮ末端アミノ酸が高度に保存されていることが明らかにされた（図４）。結合配列を同定するために、これらのアミノ酸のペプチド−ＰＣＮＡ相互作用に関する重要性をドットブロットアッセイを使用して調べた。とりわけ、Ａｒｇ３及びＬｙｓ７が互いに置換し得ること、並びにＰＣＮＡに対する見かけの親和性に影響を及ぼすことなく、Ｌｅｕ５及びＶａｌ６が互いに、又は他の脂肪族アミノ酸、例えばＩｌｅ及びＡｌａにより置換され得ることが見出された。さらに、完全に保存されている芳香族アミノ酸Ｐｈｅ４を、Ｔｙｒにより置き換えることができたが、この位置のＡｌａはＰＣＮＡ結合を有意に低減した。
【０２０７】
１位〜２位及び８位〜１０位のアミノ酸のＡｌａでの置換はＰＣＮＡ結合に影響を及ぼさず、コア相互作用配列としてのペンタペプチドＲＦＬＶＫ（配列番号２）が示唆された。
【０２０８】
さらなるアッセイにより、このペンタペプチドはそれのみでＰＣＮＡ結合に十分であるが、さらなる隣接アミノ酸が相互作用を増大させることが明らかにされた。
【０２０９】
次にｈＡＢＨ２の１位〜７位のアミノ酸、及びこの配列の変異体（Ｐｈｅ４がＴｙｒ、Ｔｒｐ又はＡｌａにより置き換えられている）を、ＥＹＦＰとの融合タンパク質として発現し、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＰＣＮＡとの共局在化に関して試験した。ドットブロットアッセイにおいて見出された結果と同様に、４位に芳香族アミノ酸を含有する融合タンパク質はＥＣＦＰ−ＰＣＮＡと共局在化したが、この位置にＡｌａを有するタンパク質は共局在化しなかった。
実施例４
Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ及びＴｒＥＭＢＬデータベースを使用してｈＡＢＨ２とＰＣＮＡとの結合に関与するものとして同定されている配列と類似の部分配列を有するタンパク質を見出した。クエリーとしてコンセンサス［ＫＲ］−［ＦＹＷ］−［ＬＩＶＡ］−［ＬＩＶＡ］−［ＫＲ］（配列番号３０）を使用して、２２６個のヒットを得たが（概要としては第１表を参照されたい）、この内の幾つかのヒトタンパク質をさらなる解析のために選択した。
【０２１０】
ｈＡＢＨ２と同様にその７個のＮ末端アミノ酸内に上記のコンセンサス配列を含有するタンパク質が１つあった。停滞した転写の進行に重要なタンパク質であるこのタンパク質はＴＦＩＩＳ伸長因子で見出される保存されたＮ末端ドメインＩも含有する。本発明者らはこのタンパク質をＴＦＩＩＳ様タンパク質（ＴＦＩＩＳ−Ｌ）と名付けた。このタンパク質の機能は未知である。
【０２１１】
第２のタンパク質は４つのコンセンサス配列を含有する、多機能転写因子ＴＦＩＩ−Ｉであった。ＴＦＩＩ−Ｉは細胞周期の制御及び増殖に重要であり、ＴＦＩＩ−Ｉを過剰発現する細胞はγ−Ｈ２ＡＸ中心（ＤＮＡ二本鎖切断に対するマーカー）の持続を増大させ、このことはＤＮＡ修復におけるＴＦＩＩ−Ｉの役割を示唆している。
【０２１２】
１つのコンセンサス配列を含有するＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ  α（Ｔｏｐｏ  ＩＩ  α）も調べた。Ｔｏｐｏ  ＩＩαは複製後のＤＮＡ脱連環及びＤＮＡ分離において機能する。
【０２１３】
コンセンサス配列は、へリックスのねじれを認識する鍵となるヌクレオチド除去修復タンパク質（ＮＥＲ）ＸＰＡの内部でも見出された。
【０２１４】
コンセンサス配列は、適切な中心体機能及び染色体分離に重要であることが分かっている相同組換えタンパク質であるＲＡＤ５１Ｂで見出された。
【０２１５】
別のタンパク質は、１つのコンセンサス配列を含有することが見出されたファンコーニ貧血コア複合体タンパク質（ＦＡＮＣＣ）であった。ファンコーニ貧血（ＦＡ）は、再生不良性貧血、白血病感受性の増大及び架橋剤に対する過敏性を特徴とする珍しい遺伝障害である。ＦＡコア複合体は、架橋剤のＤＮＡ修復を調節する、ＤＮＡ損傷によって活性化されるシグナル伝達経路にかかわることが分かっている。
【０２１６】
これらのタンパク質全てで、推定ＰＣＮＡ結合モチーフが、異なる種にわたって保存されることが見出された（図５）。これら５つのタンパク質の間で、Ｔｏｐｏ  ＩＩα及びＦＡＮＣＣ（損傷後）だけが、核のＳ期中心においてＢＲＣＡ１と共局在化することが報告されており、Ｔｏｐｏ  ＩＩ  αは潜在的なＰＩＰボックス（ＱｔｔＬａＦｋｐ、アミノ酸１２７７〜８４）を含有する唯一のタンパク質である。ここで本発明者らは、ありとあらゆるこれらのタンパク質のＥＹＦＰ融合タンパク質がＳ期中心においてＥＣＦＰ−ＰＣＮＡと共局在化することを示した。
【０２１７】
見出された他の対象となるＡＰＩＭを含有するタンパク質は、ＤＮＡ修復を含む幾つかのＤＮＡ維持過程にかかわるポリ（ＡＤＰ−リボース）ファミリー（ＰＡＲＰ−１、２及び４）と、ＰＡＲＰ−１パートナーと、複製フォークにより引き起こされる位相的な問題の解決にかかわるＴｏｐｏ  ＩＩαアイソフォームＤＮＡであるトポイソメラーゼＩＩ  βとのメンバーである。さらに、ＡＰＩＭは、点突然変異誘発及び大規模ゲノムの安定性の両方にかかわる損傷乗り越えポリメラーゼζのＲＥＶ３Ｌサブユニットと、ＤＮＡの複製及び修復の両方にかかわるＤＮＡリガーゼＩ及びＩＶと、全てが細胞周期の調節、ゲノムの維持及び完全性にかかわる、４つのＥ３ユビキチン−タンパク質リガーゼ（ＵＨＲＦ１及びＵＨＲＦ２／ＮＩＲＦ、ＵＢＲ１及び２）と、幾つかの他のＥ３ユビキチンリガーゼとにおいて見出される（第１表）。興味深いことに、Ｅ３ユビキチンリガーゼは乳腫瘍形成において遺伝子的に且つ発現的に変異することが頻繁に示されている。酵母のオルソログがその切断ＰＩＰボックスを介してＰＣＮＡと結合し、適切な姉妹染色分体凝集にかかわるタンパク質であるＮ−アセチルトランスフェラーゼＥＳＣＯ１／ＥＦＯ１、並びにＨＲを介した二本鎖切断のＤＮＡ修復に、及びＡＬＴ細胞におけるテロメアの維持にかかわることが分かっているヒト構造維持の染色体タンパク質（human structural maintenance of chromosome protein）５（ｈＳＭＣ５）もＡＰＩＭを含有している。最終的に、一般的な転写因子ＩＩ及びＩＩＩの幾つかのサブユニット、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ及びセリン／スレオニンタンパク質キナーゼのサブユニットがＡＰＩＭモチーフを含有することが見出される（第１表）。
【０２１８】
【表２】
0005863240.tif 000004
【０２１９】
【表３】
0005863240.tif 000005
【０２２０】
実施例５
実施例４で研究したタンパク質におけるコンセンサス配列の機能を実験で調べた。コンセンサス配列における芳香族アミノ酸ＰｈｅのＡｌａへの置換がｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＰＣＮＡ相互作用及びｉｎ  ｖｉｖｏでのＰＣＮＡとの共局在化を消失したため、対応する突然変異が全長タンパク質に対して同様の効果を有したかどうかを調べた。全長ｈＡＢＨ２におけるＰｈｅ４のＡｌａへの突然変異がＰＣＮＡとの共局在化を消失した。４つのモチーフを含有するＴＦＩＩ−Ｉでは、Ｐｈｅ残基を個々に及び集合的にＡｌａに置換した（Ｆ４３１Ａ、Ｆ５３６Ａ、Ｆ６４１Ａ及びＦ８０３Ａ）。単一突然変異はＰＣＮＡとの共局在化を低減しなかったが、ＴＦＩＩ−Ｉにおける全てのコンセンサス配列での突然変異は複製中心におけるＰＣＮＡとの共局在化を強く低減し、これにより同じタンパク質に存在する幾つかのコンセンサス配列モチーフが最適なＰＣＮＡ相互作用に寄与し得ることが示された。
参考文献
Aas, P.A., Otterlei, M., Falnes, P.O., Vagbo, C.B., Skorpen, F., Akbari, M., Sundheim, O., Bjoras, M., Slupphaug, G., Seeberg, E., and Krokan, H.E. （2003）. Human and bacterial oxidative demethylases repair alkylation damage in both RNA and DNA. Nature 421, 859-863.
Mo, Y.Y., and Beck, W.T. （1999）. Association of human DNA topoisomerase IIalpha with mitotic chromosomes in mammalian cells is independent of its catalytic activity. Experimental cell research 252, 50-62.
Mosmann, T. （1983）. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of immunological methods 65, 55-63.
Rademakers, S., Volker, M., Hoogstraten, D., Nigg, A.L., Mone, M. J., Van Zeeland, A.A., Hoeijmakers, J.H., Houtsmuller, A.B., and Vermeulen, W. （2003）. Xeroderma pigmentosum group A protein loads as a separate factor onto DNA lesions. Mol Cell Biol 23, 5755-5767.
Roy, A.L., Malik, S., Meisterernst, M., and Roeder, R.G. （1993）. An alternative pathway for transcription initiation involving TFII-I. Nature 365, 355-359.
実施例６
シグナル配列と共にモチーフ（「ＡＰＩＭ」）含有ペプチドを含有する構築物の調製及び試験
配列番号９８〜配列番号１１７のペプチドを、標準的な技法を使用して合成し、示される場合は、同様に標準的な技法を使用して蛍光タグを組み込んだ。ペプチドを第３表に示す。この表は各ペプチドに対するアミノ酸配列を示し、また各ペプチド（必要に応じてモチーフ（「ＡＰＩＭ」）含有ペプチド、ＮＬＳ、ＣＰＰ及びリンカー、並びに含有される場合、使用するタグ）を構成する個々の構成要素を別々に挙げる。配列番号９８〜配列番号１１６のペプチドはＬ−アミノ酸で構成される。配列番号１１７のペプチドＲＩ−ＭＤＲ２６−３はＤ−アミノ酸で構成されるレトロインベルソペプチドである。第３表に示される全てのペプチドは、ＡＰＩＭペプチド、ＮＬＳ及びＣＰＰを少なくとも１つ有する。
【０２２１】
細胞に対するペプチドの効果を示すために、様々な研究に取り組んだ。このため、上記の実施例に記載のものに基づく技法を使用して、細胞におけるペプチドの局在化を求めるために、細胞をペプチドとインキュベートした。要するに、蛍光タグによって標識されることが示されているペプチドを細胞（ＨｅＬａ細胞）とインキュベートし、共焦点顕微鏡検査を使用して細胞の取り込みを調べた。
【０２２２】
細胞を細胞増殖抑制薬の効果に対して増感させるペプチドの効果を、以下に記載のようにＭＴＴアッセイ及びコロニー形成アッセイ（ＣＦＵアッセイ）を使用して研究した。
【０２２３】
細胞増殖抑制薬の非存在下でペプチド単独を使用して以下に記載のように、ＭＴＴアッセイによってペプチドの細胞傷害性を研究した。細胞傷害性データを細胞増殖抑制薬ＭＴＴアッセイで使用される対照（ペプチドを有するが、細胞増殖抑制薬を有しない対照）からも得た。ここでは、対照ペプチドの研究はより長期間（４日間）続けた。
【０２２４】
同様に以下に記載のように、膜傷害性を研究した。
【０２２５】
血清含有培地におけるペプチドのインキュベート後のペプチドのＭＳ解析によって、ペプチドの安定性を研究した。
ＭＴＴアッセイ
ＨｅＬａ細胞を９６ウェルプレートに播種し（６０００細胞／ウェル）、３時間インキュベートした。種々の用量のＭＭＳ及びシスプラチンをウェルに加えた。２４時間後、ペプチドを血清無含有培地中の細胞に添加し、１時間インキュベートした。細胞増殖抑制薬を有する新たな培地を添加し、さらに２４時間、４８時間及び７２時間後に細胞を採取した。ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）を細胞に添加し、ＯＤを５７０ｎｍで測定し［５２］、少なくとも６個のウェルの平均を使用して、細胞の生存度を算出した。データは１つの代表的な実験で得られた成長であり、少なくとも２回再現された（reproduced）。
コロニー形成（ＣＦＵ）アッセイ
７５０個のＨｅＬａ細胞を、細胞増殖抑制薬（ＭＭＳ）を含有する成長培地１１ｍｌの入った１０ｃｍ径の細胞培養皿に播種した。２日目、細胞を血清無含有条件下で１時間ペプチドで処理した。新たな細胞増殖抑制薬を含有する新たな培地を１０日間のさらなるインキュベートのために細胞に添加した。それから細胞を室温で１５分間、６％グルタルアルデヒドのＰＢＳ溶液中で固定し、ＰＢＳで１回洗浄して、クリスタルバイオレットで染色し、コロニー形成単位を計測した。少なくとも５０個の細胞から成るコロニーだけが含まれていた。
細胞傷害性アッセイ
４８時間後のペプチドの細胞傷害性を、ＭＴＴアッセイを使用して測定した。ＨｅＬａ細胞を９６ウェルプレートに播種し（６０００細胞／ウェル）、３時間インキュベートした。種々の用量のペプチドを、血清の存在下又は非存在下でウェルの培地中に添加した。１時間後に１×又は２×の血清を有する等量の培地（血清無含有培地に対して）を添加し、ＭＴＴの添加前に細胞を４８時間インキュベートした（上記を参照されたい）。
フローサイトメトリによる膜傷害性
細胞を種々の濃度（２μＭ、４μＭ及び８μＭ）のペプチドで１時間処理した。次に、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（ＰＢＳ中、５０μｇ／ｍｌ）を添加し、これは細胞膜が透過性であればＤＮＡを染色する。次の１０分以内にＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏフローサイトメータ（BD-Life Science）で解析を行った。
【０２２６】
結果を第４表に示す。このことから、試験した全てのタグ標識化ペプチド（本質的にＡＰＩＭ含有ペプチドとＣＰＰ及びＮＬＳとの構築物である）が核に局在化していると見ることができる。この効果は、構築物の個々の構成要素と連結する種々のリンカー配列を有するペプチド、可変長のリンカー、及びリンカー配列を有しないペプチドで見られた。このことにより、リンカー配列の存在が必須というわけではなく、またリンカー配列が変わっていてもよいことが示される。
【０２２７】
細胞増殖抑制剤を用いたＭＴＴ及びＣＦＵ実験の結果により、細胞増殖抑制剤の成長阻害効果を増大させるペプチドの効果が示される。このようにして、ペプチドは細胞を細胞増殖抑制剤の効果に対して増感させることができる。この効果は、ＡＰＩＭ含有ペプチドを発現するトランスフェクトした細胞株に関して上記の実施例２で報告されたものと類似している。
【０２２８】
また第４表は多くのペプチドの細胞傷害効果を示す。さらなる実験研究（データ図示せず）は、核に局在化しないペプチドと比較して、核に局在化するペプチドでより高い細胞傷害効果が観察されることを示している。一ペプチド（ＭＤＲ２、配列番号９８）を用いて行った膜傷害性実験は、膜傷害性が低いことを示していると考えられ、これによりペプチドで観察された細胞傷害効果は膜効果によるものではないことが示唆され得る。場合によっては細胞傷害効果はペプチド濃度の増大を伴ってのみ見ることができることが観察されている（例えば、１μＭのペプチドでは細胞傷害性を見ることはできず（しかし細胞を細胞増殖抑制剤に対して増感させる効果は見られている）、一方２μＭのペプチドでは、ペプチド自体の細胞傷害効果と、増感効果とが見られている）。
【０２２９】
第４表での結果は、細胞への侵入、核への局在化、細胞の細胞増殖抑制剤に対する増感、及び細胞傷害性におけるペプチドの効果は、異なるＮＬＳ及び／又はＣＰＰ配列で得ることができるが、効果の大きさ又は程度は様々である可能性があり、その効果は特定のＮＬＳ及び／又はＣＰＰ配列には依存しないと考えられることも示す。
【０２３０】
第３表及び第４表で示されるような或る特定のペプチドはＮ末端にＡｃ基を組み込んでいた。Ａｃ基はペプチドを安定化させるために血清及び細胞質ゾルの両方に含まれていた。ペプチドＭＤＲ２６−７２−０（配列番号１１２）はＣＦＵ及びＭＴＴアッセイ、並びに細胞傷害試験において良好な安定性及び良好な活性を示した。ＭＤＲ２６−７２−０はＣＰＰとして高Ｒ配列を含有する。同様に良好な結果が、同等のペプチド（ここでＣＰＰはＣＰＰ由来のもので置き換えられるか、又はＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ若しくはＨＩＶ−ＴＡＴに基づき、ＮＬＳがＳＶ４０又はＵＮＧ２由来であり得る）で得られると考えられる。
【０２３１】
【表４】
0005863240.tif 000006
【０２３２】
【表５】
0005863240.tif 000007
【０２３３】
【表６】
0005863240.tif 000008
【０２３４】
実施例７
さらなる細胞傷害性のデータ
この実施例において、細胞傷害試験のより詳細なデータが与えられる。細胞傷害アッセイを上記の実施例６に記載のように行った。結果は図６で与えられ、この図はペプチドＭＤＲ２６−０（配列番号１００）、ＭＤＲ２６−３（配列番号１０３）、ＭＤＲ２６−４（配列番号１０４）、ＭＤＲ２６−８（配列番号１０６）、ＭＤＲ２６−７（配列番号１０５）、ＭＤＲ２６−７２−０（配列番号１１２）、ＭＤＲ２６−７２−０１（配列番号１１５）及びＭＤＲ３４（配列番号１１６）に関するＭＴＴ細胞傷害アッセイの結果を示す。
【０２３５】
ペプチドの細胞傷害性を観察することができ、血清非存在下ではより大きい効果であることが見られる。細胞傷害性は、１つのＡＰＩＭモチーフを有する全てのＭＤＲ２６変異型ペプチドで見られる。細胞傷害性の増大が２つのＡＰＩＭモチーフを有するＭＤＲ３４変異型で見られる。細胞傷害性を示す同様の結果が、タグを有しない（ＭＤＲ３４−０）、又はＭＤＲ３４のインベルソ同等物（Ｉ−ＭＤＲ−３４）若しくはレトロインベルソ同等物（ＲＩ−ＭＤＲ−３４）である、ＭＤＲ３４（配列番号１１６）に対応するペプチドで得られる。ＮＬＳ配列を有さず、その代わりにリンカー２として伸長リンカー配列ＩＩＬＶＩＩＩ（配列番号９５）を有していたＭＤＲ３４−２は細胞傷害性の低減を示す。
実施例８
ＰＣＮＡとＡＰＩＭ含有ペプチドとの間の相互作用を支持するさらなる実験、免疫共沈降（ｃｏ−ＩＰ）実験が、内因性ＰＣＮＡ及びＥＹＦＰ−ＰＣＮＡを安定して発現する細胞由来のＥＹＦＰ−ＰＣＮＡの両方がｈＡＢＨ２をプルダウンすることができたことを示している。クロマチン濃縮画分でｈＡＢＨ２とＰＣＮＡとの間で見られたより多くの相互作用は、ＰＣＮＡ又はｈＡＢＨ２での翻訳後修飾を示している。これらの実験では、ＥＹＦＰ−ＰＣＮＡを安定して発現する細胞由来のｈＡＢＨ２のｃｏ−ＩＰを、α−ＥＹＦＰに対する抗体とカップリングする磁気ビーズを使用して明らかにした。膜を、α-ｈＡＢＨ２を用いてプローブし、α-ＰＣＮＡ抗体を用いて再プローブした。内因性タンパク質を発現するだけの細胞由来のｈＡＢＨ２のｃｏ−ＩＰも、α−ＰＣＮＡに対する抗体とカップリングする磁気ビーズを使用して明らかにした。膜を、α-ｈＡＢＨ２を用いてプローブし、α-ＰＣＮＡ抗体を用いて再プローブした。
【０２３６】
ｉｎ  ｖｉｖｏ架橋を示すさらなる実験がＡＰＩＭとＰＣＮＡとの間の直接的な結合を支持している。ｈＡＢＨ２１−７−ＥＹＦＰ  ３×ＦＬＡＧ及びｈＡＢＨ２１−７−Ｆ４Ａ−ＥＹＦＰ  ３×ＦＬＡＧを安定して発現する細胞由来の架橋及び逆架橋ＦＬＡＧ融合タンパク質を、α−ＦＬＡＧ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｇｅｌを使用して免疫沈降させた。ＩＰ溶出分画を、α-ＰＣＮＡ又はα−ＦＬＡＧ抗体を使用するウェスタンブロット法によって解析した。
【配列表フリーテキスト】
【０２３７】
配列番号１：コンセンサスＡＰＩＭ
配列番号２：ＰＣＮＡ結合モチーフ（ＡＰＩＭ）
配列番号３：ＡＰＩＭ変異体
配列番号４：ＡＰＩＭ変異体
配列番号５：ＡＰＩＭ変異体
配列番号６：ＡＰＩＭ変異体
配列番号７：ＡＰＩＭ変異体
配列番号８：ＡＰＩＭ変異体
配列番号９：ＡＰＩＭ変異体
配列番号１０：ＡＰＩＭ変異体
配列番号１１：ＡＰＩＭ変異体
配列番号１２：ＡＰＩＭ変異体
配列番号１３：ＡＰＩＭ変異体
配列番号１４：ＡＰＩＭ変異体
配列番号１５：ＡＰＩＭ変異体
配列番号１６：ＡＰＩＭ変異体
配列番号１７：ＡＰＩＭ変異体
配列番号１８：ＡＰＩＭ変異体
配列番号１９：ＡＰＩＭ変異体
配列番号２０：ＡＰＩＭ変異体
配列番号２１：ＡＰＩＭ変異体
配列番号２２：ＡＰＩＭ変異体
配列番号２３：ＡＰＩＭ変異体
配列番号２４：ＡＰＩＭ変異体
配列番号２５：ＡＰＩＭ変異体
配列番号２６：ＡＰＩＭ変異体
配列番号２７：ＡＰＩＭ変異体
配列番号２８：ＡＰＩＭ変異体
配列番号２９：ＡＰＩＭ変異体
配列番号３０：ＡＰＩＭ変異体
配列番号３１：ＡＰＩＭ変異体
配列番号３２：ＡＰＩＭ変異体
配列番号３３：ＡＰＩＭ変異体
配列番号３４：ＡＰＩＭ変異体
配列番号３５：ＡＰＩＭ変異体
配列番号３６：ＡＰＩＭ変異体
配列番号３７：ＡＰＩＭ変異体
配列番号３８：Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ
配列番号３９：Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ誘導体
配列番号４０：Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ誘導体
配列番号４１：Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ誘導体
配列番号４２：Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ誘導体
配列番号４３：Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ誘導体
配列番号４４：Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ誘導体
配列番号４５：Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ誘導体
配列番号４６：Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ誘導体
配列番号４７：Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ誘導体
配列番号４８：Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ誘導体
配列番号４９：Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ誘導体
配列番号５０：Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ誘導体
配列番号５１：Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ誘導体
配列番号５２：Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ誘導体
配列番号５３：Ｄ−Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ
配列番号５４：Ｐｅｇｅｌｉｎ（ｓｙｎＢ）
配列番号５５：ＨＩＶ−ＴＡＴ
配列番号５６：ＨＩＶ−ＴＡＴの残基４７−５７
配列番号５７：ＶＰ２２
配列番号５８：ＭＡＰ
配列番号５９：Ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ
配列番号６０：Ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ−１０
配列番号６１：ＫＡＬＡ
配列番号６２：Ｐｅｐ−１
配列番号６３：Ｐｅｐ−２
配列番号６４：ＭＰＧ
配列番号６５：Ｖｅｃｔｏｃｅｌｌペプチド
配列番号６６：Ｖｅｃｔｏｃｅｌｌペプチド
配列番号６７：Ｖｅｃｔｏｃｅｌｌペプチド
配列番号６８：Ｖｅｃｔｏｃｅｌｌペプチド
配列番号６９：Ｗｒ−Ｔトランスポータ
配列番号７０：Ｒ７
配列番号７１：ＨＩＶ−ＴＡＴペプチド
配列番号７２：Ｒ８
配列番号７３：Ｒ１１
配列番号７４：ＱＳＲ８
配列番号７５：ＮＬＳ
配列番号７６：ＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳ
配列番号７７：核質ＮＬＳ
配列番号７８：ＮＬＳコンセンサス配列
配列番号７９：ＮＬＳ変異体
配列番号８０：ＮＬＳ変異体
配列番号８１：ＮＬＳ変異体
配列番号８２：ＮＬＳ変異体
配列番号８３：ＮＬＳ変異体
配列番号８４：癌タンパク質ｃ−ｍｙｃ  ＮＬＳ
配列番号８５：塩基性アミノ酸のＮＬＳ集団
配列番号８６：ＮＬＳ変異体
配列番号８７：ＮＬＳ変異体
配列番号８８：ＮＬＳ変異体
配列番号８９：ＮＬＳ変異体
配列番号９０：ＮＬＳ変異体
配列番号９１：ＮＬＳ変異体
配列番号９２：ＨＩＶ  ＴＡＴ誘導体ペプチド
配列番号９３：ＳＶ４０タンパク質誘導体
配列番号９４：リンカー
配列番号９５：リンカー
配列番号９６：ＡＰＩＭオリゴペプチド化合物
配列番号９７：ＡＰＩＭオリゴペプチド化合物
配列番号９８：ＭＤＲ２
配列番号９９：ＭＤＲ２７
配列番号１００：ＭＤＲ２６−０
配列番号１０１：ＭＤＲ２６−１
配列番号１０２：ＭＤＲ２６−２
配列番号１０３：ＭＤＲ２６−３
配列番号１０４：ＭＤＲ２６−４
配列番号１０５：ＭＤＲ２６−７
配列番号１０６：ＭＤＲ２６−８
配列番号１０７：ＭＤＲ２６−１０
配列番号１０８：ＭＤＲ２６−７２
配列番号１０９：ＭＤＲ２６−３２
配列番号１１０：ＭＤＲ２６−４２
配列番号１１１：ＭＤＲ２６−４３
配列番号１１２：ＭＤＲ２６−７２−０
配列番号１１３：ＭＤＲ２６−７２−Ａ
配列番号１１４：ＭＤＲ２６−７２−０１１
配列番号１１５：ＭＤＲ２６−０１
配列番号１１６：ＭＤＲ３４
配列番号１１７：ＲＩ−ＭＤＲ２６−３
配列番号１１８：ＡＰＩＭ配列
配列番号１１９：ＡＰＩＭ配列
配列番号１２０：ＡＰＩＭ配列
配列番号１２１：ＡＰＩＭ配列
配列番号１２２：ＡＰＩＭ配列
配列番号１２３：ＮＬＳ
配列番号１２４：ＮＬＳナンバー
配列番号１２５：ＮＬＳ
配列番号１２６：ＮＬＳ
配列番号１２７：ＮＬＳ
配列番号１２８：ＮＬＳ
配列番号１２９：ＣＰＰ
配列番号１３０：ＣＰＰ
配列番号１３１：ＣＰＰ
配列番号１３２：ＣＰＰ
配列番号１３３：ＣＰＰ
配列番号１３４：第２のＡＰＩＭ配列
【図１】
0005863240.tif 000009
【図２】
0005863240.tif 000010
【図３】
0005863240.tif 000011
【図４】
0005863240.tif 000012
【図５】
0005863240.tif 000013
【図６−１】
0005863240.tif 000014
【図６−２】
0005863240.tif 000015
【図６−３】
0005863240.tif 000016
【配列表】
0005863240000001.app