(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号６、８、１０、１６および１８から選択されるアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項２】
配列番号２０のアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項３】
配列番号６、８、１０、１６、１８および２０から選択されるアミノ酸配列において、１個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含み、二酸化チタンおよび／または二酸化珪素に結合可能なペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチドと、該ペプチドに連結されたタンパク質またはその一部を含む融合タンパク質。
【請求項５】
前記タンパク質は細胞増殖因子である、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記細胞増殖因子は上皮細胞増殖因子である、請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチドまたは請求項４〜６のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項７に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項９】
請求項４〜６のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞またはインビトロ翻訳系に導入して該融合タンパク質を発現させ、該融合タンパク質を回収することを特徴とする、タンパク質の製造方法。
【請求項１０】
二酸化チタンおよび／または二酸化珪素を用いて融合タンパク質を回収する請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項４〜６のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む試料に二酸化チタンおよび／または二酸化珪素を接触させて、該試料中の融合タンパク質を二酸化チタンおよび／または二酸化珪素に結合させ、二酸化チタンおよび／または二酸化珪素に結合した融合タン
パク質を回収する工程を含む、タンパク質の精製方法。
【請求項１２】
二酸化チタンおよび／または二酸化珪素の微粒子と、請求項８に記載のベクターを含む、タンパク質を発現させて精製するためのキット。
【請求項１３】
少なくとも表面が二酸化チタンおよび／または二酸化珪素からなる基材上に、該二酸化チタンおよび／または二酸化珪素を介して請求項４〜６のいずれか一項に記載の融合タンパク質を固定化することを特徴とする、タンパク質の固定化方法。
【請求項１４】
少なくとも表面が二酸化チタンおよび／または二酸化珪素からなる基材上に、請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチドに結合した生理活性物質を接触させることにより、該二酸化チタンおよび／または二酸化珪素を介して生理活性物質を固定化することを特徴とする、生理活性物質の固定化方法。
【請求項１５】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチドに対する抗体。
【請求項１６】
請求項４〜６のいずれか一項に記載の融合タンパク質または請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチドに結合した生理活性物質を含む、二酸化チタンおよび／または二酸化珪素を含む生体材料用表面処理剤。
【請求項１７】
少なくとも表面が二酸化チタンおよび／または二酸化珪素からなる基材上に、請求項４〜６のいずれか一項に記載の融合タンパク質または請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチドに結合した生理活性物質が固定化された生体材料。
【請求項１８】
少なくとも表面が二酸化チタンおよび／または二酸化珪素からなる基材上に、請求項５もしくは６に記載の融合タンパク質または請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチドに結合した生理活性物質が固定化された生体材料を含み、該生体材料上に細胞を誘導することにより再生医療用に使用される医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目的タンパク質に標的物質結合性を付与するポリペプチド配列を選択する方法およびそれに用いる核酸構築物に関する。本発明はまた、金属酸化物または含珪素化合物に特異的に結合するペプチドおよびそれを用いた融合タンパク質の製造方法、融合タンパク質の精製方法、タンパク質の固定化方法、および生体材料用表面処理剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
「ペプチドアプタマー」とは、ある標的分子に対して特異的に結合する人工ペプチドの総称である。現在、「抗体」と類似の結合機能を発現するペプチドアプタマーは、化学・生物学・医科学分野の分子検出用プローブなどとして注目されているだけでなく、医療分野においては、抗体医薬に替わる次世代の分子標的薬として期待されている。【０００３】
標的分子に対して特異的に結合するペプチドアプタマーを得るために、ランダムポリペプチドをコードするDNAからランダムポリペプチドを発現させ、それを標的分子と接触させ、標的分子と特異的に結合するものを選択し、それをコードするDNAを増幅するというサイクルを繰り返してペプチドアプタマーをスクリーニングすることが行われている。【０００４】
このようなスクリーニングには、ファージディスプレイ（非特許文献１）、リボソームディスプレイ（特許文献１−４、非特許文献２）、mRNAディスプレイ（非特許文献３−５）などの手法が採用されている。このようなディスプレイ技術を利用したスクリーニング法によって選択されたポリペプチドはそのアミノ酸配列をコードする遺伝情報を伴っているので、選択されたポリペプチドはそれをコードする遺伝情報に基づいて、直ちに遺伝子工学的に大量に複製することができる。またアミノ酸配列についても、遺伝情報を解析することによって、容易に明らかにすることができる。【０００５】
上記のようなディスプレイ技術の発展により標的物質結合性ペプチドを効率よくスクリーニングできるようになったが、得られた標的物質結合性ペプチドを目的のタンパク質に融合させて目的のタンパク質に標的物質結合性を付与しようとすると、タンパク質の種類によっては、立体構造の問題等により、融合タンパク質が標的物質結合性を示さないということがしばしば起こっていた。【０００６】
一方、金属酸化物や含珪素化合物は医療材料として近年注目を集めている。そこで、金属酸化物や含珪素化合物に特異的に結合するペプチドを得ることができれば、金属酸化物や含珪素化合物を含む医療材料に対して種々の表面修飾が可能となり、医療材料の多機能化に有用と考えられる。
本発明者らは、金属酸化物や含珪素化合物に特異的に結合するペプチドとして、ヒスチジンに富んだアミノ酸配列を有するペプチドを報告している（特許文献５）。また、非特許文献６、７には、二酸化チタン結合ペプチドTBP-1が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第3127158号公報
【特許文献２】特表2001-521395号公報
【特許文献３】特表2002-500514号公報
【特許文献４】国際公開第01/75097号パンフレット
【特許文献５】特開2009-136280号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】G. P. Smith et al. (1985) Science, vol.228, p.1315-1317
【非特許文献２】J Hanes and A Pluckthun (1997) Proc Natl Acad Sci U S A, vol.94, p.4937-4942
【非特許文献３】L.C. Mattheakis et al. (1994) Proc Natl Acad Sci U S A, vol.91, p.9022-9026
【非特許文献４】R. W. Roberts et al. (1997) Proc Natl Acad Sci U S A, vol.94, p.12297-12302
【非特許文献５】N. Nemoto et al. (1997) FEBS Lett., vol.414, p.405-408
【非特許文献６】K Shiba et al., Langmuir (2005), vol.21, p3090
【非特許文献７】K Shiba et al., Nano Lett. (2006), vol.6, p515
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、目的タンパク質に標的物質結合性を付与するポリペプチド配列を効率よく選択する方法を提供すること、ならびに金属酸化物および／または含珪素化合物に特異的に結合するペプチドを提供することを課題とする。
【００１０】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、ランダムポリペプチドをコードする第１の核酸配列とそれに読み枠を合わせて連結された目的タンパク質またはその一部をコードする第２の核酸配列とを含む核酸構築物をライブラリーとして用いてスクリーニングを行うことにより、目的タンパク質に標的物質結合性を付与するポリペプチド配列を効率よく選択できることを見出した。さらに、上記方法を用いて、金属酸化物および／または含珪素化合物に特異的に結合するペプチド配列を見出し、これを用いることにより、金属酸化物や含珪素化合物を含む生体材料の表面を高機能化できることを見出して本発明を完成させるに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は以下を提供する。
[１]目的タンパク質に標的物質結合性を付与するポリペプチド配列を選択する方法であって、次の工程（１）〜（３）を繰り返すことを特徴とする方法。
(1) ランダムポリペプチドをコードする第１の核酸配列とそれに読み枠を合わせて連結された目的タンパク質またはその一部をコードする第２の核酸配列とを含む核酸構築物からランダムポリペプチドと目的タンパク質またはその一部の融合タンパク質ライブラリーを発現させる工程；
(2) 標的物質に前記ライブラリーを接触させる工程；および
(3) 標的物質に結合するポリペプチド配列を含む融合タンパク質を選択し、選択された融合タンパク質をコードする核酸構築物を増幅する工程。
[２]前記目的タンパク質が細胞増殖因子である、[１]に記載の方法。
[３]前記細胞増殖因子が上皮細胞増殖因子である、[２]に記載の方法。
[４]前記核酸構築物が、第１の核酸配列の５’側に、プロモーター配列、Shine-Dalgarno配列、および開始コドンを含む、[１]〜[３]のいずれかに記載の方法。
[５]前記核酸構築物が、第２の核酸配列の３’側に、スペーサー配列および／またはSecM配列をコードする核酸配列を含む、[１]〜[４]のいずれかに記載の方法。
[６]スペーサー配列が配列番号２のアミノ酸番号８５−１７３のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列である、[５]に記載の方法。
[７]リボソームディスプレイ法により前記融合タンパク質ライブラリーを発現させる、[１]〜[６]のいずれかに記載の方法。
[８]前記標的物質が金属酸化物または含珪素化合物である、[１]〜[７]のいずれかに記載の方法。
[９] プロモーター配列、Shine-Dalgarno配列、開始コドン、およびランダムポリペプチドをコードする第１の核酸配列とそれに読み枠を合わせて連結された目的タンパク質またはその一部をコードする第２の核酸配列を、５’側からこの順序で含む核酸構築物。
[１０]さらに、第２の核酸配列の３’側に、スペーサー配列および／またはSecM配列をコードする核酸配列を含む、[９]に記載の核酸構築物。
[１１]スペーサー配列が配列番号２のアミノ酸番号８５−１７３のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列である、[１０]に記載の核酸構築物。
[１２]下記アミノ酸配列を含むペプチド。
Tyr-Xaa0-Xaa1-Tyr-Tyr-Xaa2-Xaa3-Tyr-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11（配列番号４：ここで、Xaa0、Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6、Xaa7、Xaa8、Xaa9、Xaa10およびXaa11は任意のアミノ酸を示す）。
[１３] Xaa0がTyrまたはAsnであり、Xaa1がAsn、Asp、GlyまたはArgであり、Xaa2がSer、TyrまたはGlyであり、Xaa3がAsn、Ser、Gly、ArgまたはAspであり、Xaa4がTyr、AsnまたはArgであり、Xaa5がGly, Asp、TyrまたはArgであり、Xaa6がArg、Gly、AspまたはAsnであり、Xaa7がSer、Asp、GlyまたはHisであり、Xaa8がTyrまたはGlyであり、Xaa9がSer、ArgまたはGlyであり、Xaa10がSer、Gly、ArgまたはAsnであり、Xaa11がAsp、Cys、ArgまたはTyrである、請求項１２に記載のペプチド。
[１４] 配列番号６、８、１０、１６および１８から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のペプチド。
[１５] 配列番号２０のアミノ酸配列を含むペプチド。
[１６] [１２]〜[１５]のいずれかに記載のペプチドと、該ペプチドに連結されたタンパク質またはその一部を含む融合タンパク質。
[１７]前記タンパク質は細胞増殖因子である、[１６]に記載の融合タンパク質。
[１８]前記細胞増殖因子は上皮細胞増殖因子である、[１７]に記載の融合タンパク質。
[１９] [１２]〜[１５]のいずれかに記載のペプチドまたは[１６]〜[１８]のいずれかに記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
[２０] [１９]に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
[２１] [１６]〜[１８]のいずれかに記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞またはインビトロ翻訳系に導入して該融合タンパク質を発現させ、該融合タンパク質を回収することを特徴とする、タンパク質の製造方法。
[２２]金属酸化物または含珪素化合物を用いて融合タンパク質を回収する[２１]に記載の方法。
[２３] [１６]〜[１８]のいずれかに記載の融合タンパク質を含む試料に金属酸化物または含珪素化合物を接触させて、該試料中の融合タンパク質を金属酸化物または含珪素化合物に結合させ、金属酸化物または含珪素化合物に結合した融合タンパク質を回収する工程を含む、タンパク質の精製方法。
[２４]金属酸化物または含珪素化合物の微粒子と、[２０]に記載のベクターを含む、タンパク質を発現させて精製するためのキット。
[２５]少なくとも表面が金属酸化物または含珪素化合物からなる基材上に、該金属酸化物または含珪素化合物を介して[１６]〜[１８]のいずれかに記載の融合タンパク質を固定化することを特徴とする、タンパク質の固定化方法。
[２６] 少なくとも表面が金属酸化物または含珪素化合物からなる基材上に、[１２]〜[１５]のいずれかに記載のペプチドに結合した生理活性物質を接触させることにより、該金属酸化物または含珪素化合物を介して生理活性物質を固定化することを特徴とする、生理活性物質の固定化方法。
[２７] [１２]〜[１５]のいずれかに記載のペプチドに対する抗体。
[２８] [１６]〜[１８]のいずれかに記載の融合タンパク質または[１２]〜[１５]のいずれかに記載のペプチドに結合した生理活性物質を含む、金属酸化物または含珪素化合物を含む生体材料用表面処理剤。
[２９]少なくとも表面が金属酸化物又は含珪素化合物からなる基材上に、[１６]〜[１８]のいずれかに記載の融合タンパク質または[１２]〜[１５]のいずれかに記載のペプチドに結合した生理活性物質が固定化された生体材料。
[３０]少なくとも表面が金属酸化物又は含珪素化合物からなる基材上に、[１７]もしくは[１８]に記載の融合タンパク質または[１２]〜[１５]のいずれかに記載のペプチドに結合した生理活性物質が固定化された生体材料を含み、該生体材料上に細胞を誘導することにより再生医療用に使用される医薬。
【００１２】
本発明の方法によれば、目的タンパク質に標的物質結合性を付与するポリペプチド配列を効率よく選択することができる。
また、本発明のペプチド配列を用いることにより、タンパク質に金属酸化物や含珪素化合物への結合性を付与することができる。これにより、金属酸化物や含珪素化合物を用いてタンパク質を精製したり、タンパク質を固定化したりすることが可能になる。また、本発明のペプチド配列を含む融合タンパク質を用いて金属酸化物や含珪素化合物を含む生体材料の表面を修飾することにより、生体材料の表面にタンパク質や生理活性物質等を誘導することができ、生体材料の高機能化が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の一態様であるリボソームディスプレイを用いた上皮細胞増殖因子（EGF）に二酸化チタン結合性を付与するペプチドのスクリーニング方法の模式図。
【図２】スクリーニングに使用したDNA構築物の模式図（１）および塩基配列（２）。（２）において、四角で囲んだ部分はランダムペプチドをコードする配列、二重下線部はEGFをコードする配列、斜体部はスペーサーをコードする配列、破線はSecMをコードする配列を示す。EGFは配列番号２のアミノ酸番号３０−８２に該当する。
【図３】各種ペプチド融合EGF（P-EGF）の構造と無細胞タンパク質翻訳系における発現（模式図と電気泳動写真）。
【図４】各種P-EGFの二酸化チタンへの結合性評価（模式図と結合解析写真）。１は二酸化チタン粒子への結合を、２は二酸化チタンプレート表面への結合を評価した。
【図５】各種P-EGFの二酸化珪素プレートへの結合性評価（模式図と結合解析写真）。
【図６】TOP1-EGF表面修飾の有無による二酸化チタンプレート上での細胞増殖評価（模式図と写真）。１は表皮角化細胞、２はNIH-3T3細胞。
【図７】化学合成TOP1-EGF（sTOP1-EGF）の二酸化チタンプレートへの結合性評価とsTOP1-EGF表面修飾の有無による二酸化チタンプレート上でのNRK-49F細胞増殖評価（模式図と写真）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
＜目的タンパク質に標的物質結合性を付与するポリペプチド配列を選択する方法＞
本発明の目的タンパク質に標的物質結合性を付与するポリペプチド配列を選択する方法は、次の工程（１）〜（３）を繰り返すことを特徴とする。
(1) ランダムポリペプチドをコードする第１の核酸配列とそれに読み枠を合わせて連結された目的タンパク質またはその一部をコードする第２の核酸配列とを含む核酸構築物からランダムポリペプチドと目的タンパク質またはその一部の融合タンパク質ライブラリーを発現させる工程；
(2) 標的物質に前記ライブラリーを接触させる工程；および
(3) 標的物質に結合するポリペプチド配列を含む融合タンパク質を選択し、選択された融合タンパク質をコードする核酸構築物を増幅する工程。
【００１５】
ここで、目的タンパク質は全長でもよいし、DNA結合領域、リガンド結合領域、活性領域等、一部分であってもよい。
目的タンパク質の種類は特に制限されないが、酵素、抗体、シグナル伝達因子、チャネル、細胞増殖因子、転写因子、接着因子、受容体などが例示される。なお、機能未知のタンパク質でもよい。
目的タンパク質は、例えば、ヒトを含む哺乳動物、植物、ウイルス、酵母、あるいは細菌など、あらゆる生物に由来する天然の配列を持つポリペプチドを用いることができる。
あるいは、前記天然ポリペプチドの一部や、アミノ酸配列を改変した変異ポリペプチドを目的タンパク質として利用することもできる。更に、人工的に設計されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを目的タンパク質とすることもできる。
【００１６】
標的物質としては、タンパク質又はペプチドが結合しうるものであれば何でもよいが、低分子化合物、ペプチド、金属（塩や酸化物を含む）、含珪素化合物などが例示される。
【００１７】
以下、ランダムポリペプチドをコードする第１の核酸配列とそれに読み枠を合わせて連結された目的タンパク質またはその一部をコードする第２の核酸配列とを含む核酸構築物について説明する。
ランダムポリペプチドは任意のアミノ酸がランダムに配列したものを意味する。ランダムポリペプチドは、たとえば３残基以上、通常５〜１００残基、好ましくは５〜５０残基、あるいは５〜２０残基程度の長さからなるランダムなアミノ酸配列を有する。アミノ酸は天然のものでも非天然のものでもよく、これらが混合されたものでもよい。より簡便にはランダムポリペプチドは天然の20アミノ酸から選ばれるアミノ酸の一種類以上から構成される。
【００１８】
ポリペプチドを全くランダムな配列（アミノ酸残基数ｎ個）にする場合は、A,T,G,Cを３ｎ個ランダムに配列させればよい。ただし、効率よくクローンを翻訳させるためには、終止コドンが出現しないよう、３ｍ番目（ｍ＝１，２，３・・・，ｎ）の塩基がTまたはCになるようにしてもよい。あるいは、特定の複数種類のアミノ酸のみからなるランダム配列になるようコドンを調整してもよい。
例えば、後述の実施例のように、NRYコドンの繰り返しを利用することで、８種類のアミノ酸（Ser, Asn, Gly, Asp, Arg, His, CysまたはTyr）がランダムに出現するペプチド配列を発現させることができる。
N = A, G, C, T
R = A, G
Y = C, T
なお、ランダムポリペプチドが非天然のアミノ酸を含む場合は、コドンを公知の手段にしたがって改変すればよい。
【００１９】
目的タンパク質またはその一部をコードする第２の核酸配列は、上記ランダムポリペプチドをコードする第１の核酸配列に読み枠を合わせて連結される。
ここで、「読み枠を合わせて連結される」とは、ランダムポリペプチドと目的タンパク質またはその一部が融合タンパク質として翻訳されるように連結されることを意味する。なお、ランダムポリペプチドと目的タンパク質またはその一部は直接連結されてもよいし、１〜数アミノ酸（例えば、1〜10アミノ酸）のアミノ酸配列を介して連結されてもよい。
ランダムポリペプチドをコードする第１の核酸配列は、人工的に合成し、制限酵素認識配列を利用したり、ＰＣＲを利用したりして目的タンパク質またはその一部をコードする核酸配列に遺伝子工学的に連結することができる。ただし、ランダムポリペプチドをコードする第１の核酸配列と目的タンパク質またはその一部をコードする第２の核酸配列を全て人工的に合成してもよい。
【００２０】
上記核酸構築物は、好ましくは、第１の核酸配列の５’側に、プロモーター配列、Shine-Dalgarno（ＳＤ）配列、および開始コドンを５’側からこの順で含む。
プロモーターは、使用する発現系に応じて適宜、選択することができる。例えば、大腸菌細胞や大腸菌由来の無細胞翻訳系を用いる場合、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター等の大腸菌で機能するプロモーターが例示される。
【００２１】
上記核酸構築物は、好ましくは、第２の核酸配列の３’側に、スペーサー配列とSecM配列の少なくとも一方をコードする核酸配列を含む。
スペーサー配列はランダムペプチドと目的タンパク質またはその一部との融合タンパク質の自由度を高めるため、１０〜２００アミノ酸の配列とすることが好ましい。スペーサー配列のアミノ酸配列は、融合タンパク質と標的物質との結合反応に悪影響を与えない配列であれば特に制限されないが、配列番号２のアミノ酸番号８５−１７３のアミノ酸配列が特に好ましい（図２）。
この配列は、Bcl-xLのX線結晶構造解析で決定できないほど「自由度が高い」と考えられる配列を独自に抽出し、より柔軟性を高めるためにGlyを適宜導入した新規配列である。この配列を融合したEGFの発現量は、他のProtein spacerと融合したEGFに比べて飛躍的に高くなっており、効率的なスクリーニングを可能とする。
ただし、この配列は、融合タンパク質と標的物質との結合反応を低下させない限り、一部改変されてもよい。すなわち、スペーサー配列は、配列番号２のアミノ酸番号８５−１７３において、１または数個（好ましくは２〜１０個、より好ましくは２〜５個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、または付加された配列であってもよい。
上記のスペーサー配列を用いて融合タンパク質を作製すれば、無細胞翻訳系で発現しにくいタンパク質の翻訳効率の改善が期待できる。また、機能性タンパク質とタンパク質をつなぐリンカー等として応用すれば、細胞内外＆生体内イメージングに利用するプロテインプローブ・プロテインセンサーの開発等に役立てることができる可能性を秘めている。
【００２２】
SecM配列は、SecM stall配列とも呼ばれ、リボソーム内部で翻訳アレストを起こすと報告されている配列である（FXXXXWIXXXXGIRAGP：配列番号３）。配列番号２においては、アミノ酸番号１７６−１９２の配列がSecM配列に該当する（図２）。SecMのアレスト配列を導入することで、mRNA、リボソーム、融合タンパク質の複合体を効率よく維持できるのでリボソームディスプレイに特に有効である。
【００２３】
配列番号１に、プロモーター配列、SD配列、開始コドン、ランダムポリペプチドをコードする核酸配列とそれに読み枠を合わせて連結された目的タンパク質（EGF）をコードする核酸配列、スペーサー配列およびSecM配列をコードする核酸配列を、５’側からこの順序で含む核酸構築物を示した（図２）。そして、配列番号２には配列番号１から翻訳される融合タンパク質のアミノ酸配列（スぺーサーとSecM配列を含む）を示した。ただし、本発明の核酸構築物とそれにコードされる融合タンパク質はこれらに限定されない。
【００２４】
上記核酸構築物は、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクターなどに組み込まれるてもよい。ベクターの種類は、用いる翻訳系やスクリーニング系にしたがって適宜選択することができる。
上記核酸構築物およびそれを含むベクターはMolecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001）などに記載されている公知の遺伝子学的手法によって作製することができる。
【００２５】
次に、各工程について説明する。
まず、上記核酸構築物から、ランダムポリペプチドと目的タンパク質またはその一部の融合タンパク質ライブラリーを発現させる。
発現には、大腸菌、酵母、哺乳動物細胞などの宿主細胞、ウイルス、ファージ、または無細胞翻訳系などを用いることができるが、効率よくスクリーニングするにはディスプレイシステムを用いることが好ましい。
【００２６】
ディスプレイシステムとは、ライブラリーから発現するポリペプチドが、そのアミノ酸配列をコードする核酸（遺伝情報）を伴っているシステムをいう。言い換えれば、遺伝情報が、それがコードしているポリペプチドとして提示（display）されているシステムをいう。ディスプレイの種類には、ファージディスプレイや、in vitroディスプレイなどが知られている。さらに、in vitroディスプレイには、リボソームディスプレイ、mRNAディスプレイなどが知られている。
【００２７】
ファージディスプレイでは、一般的に、繊維状ファージ（filamentous phage）の構成蛋白質をコードする遺伝子に、提示すべきポリペプチドをコードする遺伝子が連結される。その結果、ファージの構造蛋白質との融合蛋白質として、ポリペプチドがファージ表面に提示される（G. P. Smith et al. (1985) Science, vol.228, p.1315-1317）。
ファージディスプレイにおいては、標的ポリペプチド又はタンパク質と結合したポリペプチドの遺伝情報を得るために、標的ポリペプチド又はタンパク質と結合しなかったファージを洗浄により除去した後、標的ポリペプチド又はタンパク質に結合するポリペプチドを提示するファージを溶出して、大腸菌へ感染させ、ファージを増殖させる工程を行う。パニングを繰り返す場合であれば、大腸菌への感染およびファージの増殖の工程も繰り返し行う。
ファージディスプレイシステムとしては、たとえば、T7Select(R) Phage Display System（Novagen社製）のようなキットが市販されている。このようなキットを利用すれば、任意のcDNAライブラリーの遺伝情報をファージにポリペプチドとして提示させることができる。更に、スクリーニング用のライブラリーについても、Pre-made T7Select(R) cDNA Libraries（Novagen社製）などの市販のライブラリーを利用することができる。
【００２８】
リボソームディスプレイにおいては、大腸菌等の細胞から得られた無細胞翻訳系を使用し、与えられた遺伝情報に基づいてポリペプチドが合成される。生細胞中では、合成されたポリペプチドをリボソームから解離させるメカニズムが働くため、通常、両者のリンクは維持されない。しかし、リボソームディスプレイにおいては、両者の解離が抑制されているため、提示されたポリペプチドはそれをコードする遺伝情報（mRNA）を伴ったまま維持される。すなわち、mRNA−リボソーム−ポリペプチドの３つの要素の複合体が形成される。標的に結合したポリペプチドのｍRNAを回収することによって、その遺伝情報も回収される。
【００２９】
mRNAディスプレイでは、ポリペプチドとmRNAを化学的に結合することによって、両者のリンクが維持される。mRNAとポリペプチドの結合には、たとえば抗生物質の1種であるピューロマイシン（puromysin）の誘導体が利用される。ピューロマイシンは、リボソーム上で伸長中のポリペプチドのC末端に結合することにより伸長反応を阻害し、ポリペプチドをリボソームから解離させる。mRNAディスプレイでは、翻訳するmRNAの3’末端にピューロマイシン誘導体が結合しており、このピューロマイシンがポリペプチドのC末端に結合することで、mRNAとポリペプチドが共有結合でリンクされる。
【００３０】
リボソームディスプレイやmRNAディスプレイでは、標的ポリペプチド又はタンパク質と結合したポリペプチドと核酸を含む複合体中のmRNAからcDNAを合成し、PCRにより増幅させた後、再び転写・翻訳反応を行なえばよい。このような利点は、in vitroディスプレイライブラリーに共通する特徴である。したがって、本発明においては、in vitroディスプレイを使用することが好ましく、リボソームディスプレイを使用することがより好ましい。
【００３１】
ライブラリーの規模は、通常1×103以上、好ましくは1×104以上、より好ましくは1×105以上、さらに好ましくは1×106以上である。
【００３２】
次に、標的物質に前記融合タンパク質ライブラリーを接触させ、融合タンパク質ライブラリーから標的物質に結合するポリペプチド配列を含む融合タンパク質を選択し、それをコードする核酸構築物を増幅する。
【００３３】
標的物質に結合したポリペプチドを選択するには、標的と結合したポリペプチドを、標的と結合していない多数のポリペプチドの中からスクリーニングする必要がある。これはパニングとよばれる既知の方法に従って行う（Coomber (2002) Method Mol. Biol., vol.178, p.133-145）。パニングの基本的なプロトコルは以下のとおりである。
（１）標的物質にポリペプチドライブラリーを接触させる。
（２）標的物質に結合しなかった、ライブラリーに含まれていたその他のポリペプチドを除去する。例えば、洗浄により除去することができる。
（３）除去されなかったポリペプチド、すなわち標的物質に特異的に結合していたポリペプチドを回収する。
（４）必要に応じ（１）から（３）の操作を複数回繰り返す。
【００３４】
ディスプレイライブラリーなどから発現されたポリペプチドライブラリーと標的物質を接触させ、結合を可能にする条件は公知であり（WO95/11922、WO93/03172、WO91/05058）、当業者にとって過度の負担なしに確立することができる。
標的物質が金属（金属塩や金属酸化物を含む）や含珪素化合物等の場合、ポリペプチドとｍＲＮＡの複合体を含む試料にこれらの物質を添加することにより接触させることができる。あるいは、プレートやカラム等の担体に標的物質を結合させ、ここにポリペプチドとｍＲＮＡの複合体を含む試料を接触させてもよい。
【００３５】
リボソームディスプレイやmRNAディスプレイの場合、一連の工程を繰り返す場合には、（１）の工程の前に、回収されたポリペプチド-核酸を含む複合体中の核酸を増幅する。
例えば、mRNAはRT-PCRによって増幅することができる。RT-PCRによって、mRNAを鋳型としてDNAが合成される。DNAを再びmRNAに転写し、複合体の形成のために利用することができる。
一方、ファージディスプレイの場合、一連の工程を繰り返す場合には、（１）の工程の前に、目的のポリペプチド配列を含むファージを選択し、これを増殖させることにより、目的のポリペプチド配列を含む核酸構築物を増幅させる。
【００３６】
以上の操作により、目的タンパク質またはその一部に標的物質結合性を付与する特異的ペプチド配列が濃縮される。配列情報は、得られたｍＲＮＡの配列を解析することにより同定することができる。
【００３７】
＜金属酸化物および／または含珪素化合物に特異的に結合するペプチド＞
本発明のペプチドは下記アミノ酸配列を含む。
Tyr-Xaao-Xaa1-Tyr-Tyr-Xaa2-Xaa3-Tyr-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11（配列番号４）
ここで、Xaao、Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6、Xaa7、Xaa8、Xaa9、Xaa10およびXaa11は任意のアミノ酸を示す。これらのアミノ酸は金属酸化物および／または含珪素化合物への結合能が維持される限り天然、非天然のいずれのアミノ酸でもよいが、天然のアミノ酸が好ましい。各アミノ酸について、より好ましい例を以下に示す。
XaaoはTyrまたはAsnであることが好ましい。
Xaa1はAsn、Asp、GlyまたはArgであることが好ましい。
Xaa2はSer、TyrまたはGlyであることが好ましい。
Xaa3はAsn、Ser、Gly、ArgまたはAspであることが好ましい。
Xaa4はTyr, AsnまたはArgであることが好ましい。
Xaa5はGly, Asp、TyrまたはArgであることが好ましい。
Xaa6はArg、Gly、AspまたはAsnであることが好ましい。
Xaa7はSer、Asp、GlyまたはHisであることが好ましい。
Xaa8はTyrまたはGlyであることが好ましい。
Xaa9はSer、ArgまたはGlyであることが好ましい。
Xaa10はSer、Gly、ArgまたはAsnであることが好ましい。
Xaa11はAsp、Cys、ArgまたはTyrであることが好ましい。
【００３８】
配列番号４のアミノ酸配列として具体的には、下記のアミノ酸配列が挙げられる。
TOP-1（配列番号６）Tyr-Tyr-Asn-Tyr-Tyr-Ser-Asn-Tyr-Tyr-Gly-Arg-Ser-Tyr-Ser-Ser-Asp
TOP-2（配列番号８）Tyr-Tyr-Asp-Tyr-Tyr-Tyr-Ser-Tyr-Asn-Asp-Gly-Asp-Tyr-Arg-Gly-Cys
TOP-3（配列番号１０）Tyr-Tyr-Asn-Tyr-Tyr-Tyr-Gly-Tyr-Arg-Tyr-Asp-Gly-Gly-Arg-Gly-Cys
TOP-4（配列番号１６）Tyr-Tyr-Gly-Arg-Tyr-Ser-Asp-Tyr-Tyr-Asp-Asn-Gly-Tyr-Gly-Arg-Arg
TOP-5（配列番号１８）Tyr-Asn-Arg-Tyr-Asp-Gly-Arg-Tyr-Tyr-Arg-Asp-His-Gly-Arg-Asn-Tyr
本発明のペプチドは下記アミノ酸配列を含むものでもよい。
TOP-6（配列番号２０）Tyr-Asn-Asp-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Cys-Tyr-Arg-Asp-Tyr-Asp
ただし、金属酸化物または含珪素化合物への結合能が保持される（例えば、改変前の８０％以上）限り、配列番号６，８，１０,１６，１８，２０において、１または２個のアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加を有するものであってもよい。
上記のペプチドは人工的に合成してもよいし、遺伝子工学的に調製してもよい。
【００３９】
本発明のペプチドが結合する金属酸化物としては、酸化亜鉛（ZnO）、酸化コバルト（Co3O4）、二酸化チタン（TiO2）、酸化鉄（Fe3O4）などが例示される。本発明のペプチドはこの中の一種類以上に結合すればよい。本発明のペプチドが結合する含珪素化合物としては、二酸化ケイ素（SiO2）などの珪素酸化物等の無機珪素化合物や、シリコーン等の有機珪素化合物が挙げられる。本発明のペプチドはこの中の一種類以上に結合すればよい。本発明のペプチドは金属酸化物と含珪素化合物の一方に結合するものであってもよいし、両方に結合するものであってもよい。
【００４０】
本発明のポリヌクレオチドは上記ペプチドをコードする。本発明のポリヌクレオチドは上記ペプチドのアミノ酸配列に対応する塩基配列を有するものであればよく、各アミノ酸
に対応する任意のコドンを連結させた配列とすることができる。例えば、配列番号６のペプチドをコードするポリヌクレオチドとして、配列番号５の塩基配列が挙げられ、配列番号８のペプチドをコードするポリヌクレオチドとして、配列番号７の塩基配列が挙げられ、配列番号１０のペプチドをコードするポリヌクレオチドとして、配列番号９の塩基配列が挙げられる。
また、配列番号１６のペプチドをコードするポリヌクレオチドとして配列番号１５の塩基配列が挙げられ、配列番号１８のペプチドをコードするポリヌクレオチドとして配列番号１７の塩基配列が挙げられ、配列番号２０のペプチドをコードするポリヌクレオチドとして、配列番号１９の塩基配列が挙げられる。
【００４１】
本発明のベクターは上記ポリヌクレオチドを含むベクターであり、好ましくは、プロモーター配列の下流に発現可能に上記ポリヌクレオチドが配置され、さらにその下流に目的タンパク質またはその一部をコードする遺伝子（目的遺伝子）を組み込むための制限酵素認識部位（好ましくはマルチクローニングサイト）が配置された構造を有するベクターである。制限酵素認識部位に目的遺伝子を本発明のペプチドをコードする塩基配列と翻訳の読み枠が合うように連結し、適当な宿主に導入することにより、本発明のペプチドと目的タンパク質またはその一部の融合タンパク質を発現させることができる。
本発明のベクターは、エシェリヒア・コリなどの原核細胞用、哺乳動物用、ウイルスベクター、酵母用、あるいは無細胞翻訳系用などとすることができ、上記プロモーター配列、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび制限酵素認識部位を含むユニットをそれぞれの宿主用のベクターに組み込むことによって宿主に応じたベクターとすることができる。
【００４２】
本発明のペプチドに連結されるタンパク質の種類は特に制限されず、任意のタンパク質を用いることができるが、例えば、酵素、受容体、細胞増殖因子、転写因子などが挙げられる。
公知の配列あるいは自ら同定した配列にもとづいてクローニングを行い、それを本発明のベクターの制限酵素認識部位に本発明のペプチドをコードする塩基配列と翻訳の読み枠が合うように連結して組み換えベクターを作製し、それを宿主に導入することにより、融合タンパク質が得られる。なお、読み枠が合うように連結されていれば、ペプチドと目的タンパク質またはその一部の間に１〜数アミノ酸（例えば１〜１０アミノ酸）からなる任意のアミノ酸配列が含まれてもよい。このアミノ酸配列は、ペプチドの金属酸化物および／または含珪素化合物結合性ならびにタンパク質の活性を阻害しない限り任意であるが、他のペプチドタグやプロテアーゼ認識配列などが例示される。
なお、融合タンパク質は化学的結合によって本発明のペプチドと目的タンパク質またはその一部を結合させたものでもよく、化学的結合の態様としては、タンパク質のアミノ末端アミノ基を介して本発明のペプチドを結合させる態様が例示される。
【００４３】
宿主細胞からの融合タンパク質の回収は本発明のペプチドと金属酸化物または含珪素化合物との親和性を利用して行うことができる。融合タンパク質が分泌生産される場合や無細胞翻訳系を使用してタンパク質を生産する場合は、培養上清や無細胞翻訳系の上清を金属酸化物または含珪素化合物と接触させることで融合タンパク質を特異的に吸着させて回収することができる。また、融合タンパク質が宿主細胞内で生成するときは、細胞を破砕し、細胞抽出液から回収することもできる。なお、融合タンパク質が分泌生産されるように分泌シグナルを融合タンパク質に付加してもよい。
【００４４】
本発明のタンパク質の精製方法は、前記融合タンパク質を含む試料に金属酸化物または含珪素化合物を接触させて該試料中の融合タンパク質を金属酸化物または含珪素化合物に結合させ、金属酸化物または含珪素化合物に結合した融合タンパク質を回収することを特徴とする。すなわち、金属酸化物または含珪素化合物をアフィニティ担体として使用し、精製を行うものである。
融合タンパク質を回収した後に、金属酸化物または含珪素化合物に結合した融合タンパク質を溶出させることで純粋な融合タンパク質が得られる。
融合タンパク質を含む試料としては、上述したような培養上清や細胞抽出液などが挙げられる。
金属酸化物または含珪素化合物に接触させる方法としては、バッチ式に試料と金属酸化物または含珪素化合物の微粒子を混合する方法や、金属酸化物または含珪素化合物の微粒子を充填したカラムに試料を負荷する方法などが例示される。カラムは遠心分離ができるようなスピンカラムとすることもできるし、チップの先端に金属酸化物または含珪素化合物の微粒子を敷き詰め、融合タンパク質を含む試料を押出して金属酸化物または含珪素化合物の微粒子の層を通過させる態様とすることもできる。金属酸化物または含珪素化合物の微粒子を用いる場合、その粒径は精製スケールなどに応じて任意に選択されるが、数十ｎｍ〜１０μｍのものを用いることが好ましい。金属酸化物または含珪素化合物の微粒子としては、例えば、市販のものを使用することができる。
試料と金属酸化物または含珪素化合物を接触する前に金属酸化物または含珪素化合物の微粒子を生理的緩衝液で平衡化しておくことが好ましい。生理緩衝液はタンパク質の性質などによって任意に選択して使用することができるが、リン酸緩衝液やトリス緩衝液などが例示される。
また、非特異吸着を抑制するために、平衡化の後に、ブロッキングを行うことが好ましい。ブロッキング液はウシ血清アルブミンなど公知のものを使用することができる。
試料と金属酸化物または含珪素化合物を接触する際は室温でもよいが、タンパク質の活性を失わせないために低温で行うことが好ましい。
試料と金属酸化物または含珪素化合物を接触させた後、低濃度の界面活性剤を含む洗浄液などを用いて洗浄を行い、次いで、結合した融合タンパク質を溶出させる。
溶出液としては、例えば、高濃度の塩などの水溶液が使用できる。
【００４５】
本発明のキットは、金属酸化物または含珪素化合物の微粒子と、上述したような本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む、タンパク質を発現させて精製するためのキットである。金属酸化物または含珪素化合物の微粒子を充填したスピンカラムや精製用カラムを含むものであってもよい。本発明のキットはさらに、溶出液、洗浄液、平衡化液、ブロッキング液などを含むものであってもよい。
【００４６】
本発明のタンパク質の固定化方法は、少なくとも表面が金属酸化物または含珪素化合物からなる基材上に、該金属酸化物または含珪素化合物を介して上記融合タンパク質を固定化することを特徴とする。基材表面の金属酸化物または含珪素化合物と、融合タンパク質に含まれるペプチドの相互作用により、融合タンパク質を基材表面に固定化できる。基材としては表面に金属酸化物または含珪素化合物を付着させることができるものであれば特に制限されないが、ガラスプレート、プラスチックプレート、シリコーンプレート、ガラスビーズ、プラスチックビーズ、シリコーンビーズなどが挙げられる。プレートやビーズ表面への金属酸化物または含珪素化合物の付着は物理吸着によるものであることが好ましい。金属酸化物または含珪素化合物そのものが基材であってもよい。本発明のタンパク質の固定化方法によれば、複数のタンパク質が本発明のペプチド配列を介して固定化されたプロテインチップを得ることもでき、そのようなプロテインチップはタンパク質の相互作用などに好適に使用できる。
【００４７】
本発明の抗体は本発明のペプチドに対する抗体である。本発明のペプチドを特異的に認識するものである限り、ポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体でもよい。
ポリクローナル抗体は、例えば、本発明のペプチドを含む免疫原でマウスやウサギなどの非ヒト哺乳動物を免疫し、その抗血清から本発明のペプチドを特異的に認識する抗体を回収することによって得ることができる。BSAやKLHなどのキャリアタンパク質に結合させて免疫に使用してもよい。抗体はプロテインＡなどによって精製することができる。
モノクローナル抗体は、例えば、本発明のペプチドを含む免疫原でマウスなどの非ヒト哺乳動物を免疫し、該哺乳動物から単離したリンパ球をマウスミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを作製し、得られたハイブリドーマが産生する抗体の中から、本発明のペプチドを特異的に認識する抗体を選択することによって得ることができる。モノクローナル抗体には、Ｆ（ａｂ'）2化抗体、Ｆ（ａｂ'）化抗体、短鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ（Ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）およびミニボディ（Ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）などのモノクローナル抗体のフラグメントも含まれる。
本発明の抗体は本発明のペプチドを含む融合タンパク質の検出、免疫沈降、FACS、ELISAなどに使用できる。
【００４８】
本発明のペプチドを含む融合タンパク質は、金属酸化物または含珪素化合物を含む生体材料用の表面処理剤として使用することができる。生体材料の表面に融合タンパク質を添加することで、生体材料表面に融合タンパク質を結合させることができ、これにより、生体材料表面に該タンパク質の特性を付与することができる。生体材料としては、金属酸化物または含珪素化合物そのものを素材とする材料であってもよいし、金属酸化物または含珪素化合物が金属、プラスチック、シリコーン等の基材表面にコートされた材料であってもよい。生体材料としては、人工関節、人工骨頭、人工弁、埋め込み型心臓、心臓ペースメーカー部品、人工歯根、義歯床、矯正用ワイヤー、クラウン、骨折固定材、脊柱固定器具、脊椎スペーサー、ステント、メスなどの手術器具、カテーテル、コンタクトレンズなどが例示される。
生体材料は生体内に導入される前に、生体外で融合タンパク質で表面処理されてもよいし、既に生体内に導入されている生体材料に、生体外から融合タンパク質を送達して生体内で表面処理されてもよい。
【００４９】
融合タンパク質が、前記ペプチドと細胞増殖因子の融合タンパク質であると、これを用いて金属酸化物又は二酸化珪素を含む生体材料を表面修飾することにより、該生体材料上に細胞を誘導することができるので、再生医療用の医薬として有用である。また、幹細胞の分化誘導にも有用である。
例えば、細胞増殖因子がEGFや線維芽細胞増殖因子（FGF）であると、これによって修飾された生体材料上に角化細胞や線維芽細胞などを誘導することができるので、創傷治療、頭蓋骨欠損部や心臓冠動脈の血管新生などに有用である。
また、細胞増殖因子が骨形成因子（BMP）であると、これによって修飾された生体材料上に骨芽細胞を誘導することができるので、軟骨再生や骨折治療などに有用である。
また、細胞増殖因子が腫瘍壊死因子（TNFα）であると、これによって修飾された生体材料上に接着する細胞のアポトーシスを誘導することができるので、心筋梗塞などに代表される循環器・血管系の外科治療で導入した金属系材料(ステントなど)周辺における血管の再狭窄防止などに有用である。
また、細胞増殖因子が神経成長因子（NGF）であると、これによって修飾された生体材料上に神経細胞を誘導することができるので、神経の再生による脳損傷治療やアルツハイマー病などの脳神経疾患の治療、運動神経障害や末梢神経障害の改善、緑内障修復などに有用である。
【００５０】
なお、本発明のペプチドを利用すれば、生理活性ペプチド（環状ペプチドも含む）、核酸、生理活性化合物、糖鎖などの生理活性物質を基材上に固定化することもできる。すなわち、生理活性ペプチド、核酸、生理活性化合物、糖鎖などの生理活性物質に本発明のペプチドを化学的に結合させ、これを少なくとも表面が金属酸化物または含珪素化合物からなる基材上に接触させることで、本発明のペプチドを介してこれらの物質を基材に固定化することができる。
この場合、例えば、生理活性物質が環状ポリペプチドであるサイクロスポリンＡ（Cyclosporin Ａ）であると、これによって表面修飾された生体材料上からの徐放により、患部周辺・局所的な免疫抑制効果が期待でき、副作用の小さな免疫抑制療法において有効である。また、肝・腎・骨髄移植時の拒絶反応の抑制などにも有用である。
【実施例】
【００５１】
以下、実施例を参照して本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の態様に限定されない。【００５２】
実施例1：「金属結合性ペプチドアプタマー融合EGF」を創出する新規リボソームディスプレイ法の開発と「TiO2結合性ペプチドアプタマー」の新規選択
今回開発した新規リボソームディスプレイ法(図１)は、主に5つのステップにより構成されている。
(1)下記のプライマー2の配列の一部[配列番号１２の２４〜４７]・SD配列・開始コドン・SfiI制限酵素サイト(1)・SfiI制限酵素サイト(2)・EGF配列・Ps配列・SecM stall配列の順に並んだ人工配列を、市販プラスミドのクローニングサイト内に構築する(構築物の全配列は配列番号１３)。次に、人工ペプチドライブラリーの配列情報をコードしているDNAライブラリー(図１−１)を化学的に合成し、両末端をSfiIで消化した後、プラスミドのSfiI制限酵素サイト(1)と SfiI制限酵素サイト(2)の間に挿入する(図２−１：得られた構築物の配列を配列番号１に示す)。このDNAライブラリーの特徴は、16個のNRYコドン(N = A, G, C, T; R = A, G; Y = C, T)により構成している(図２−１)。それゆえ、翻訳過程において、8種類のアミノ酸(Tyr, Cys, His, Arg, Asn, Ser, Asp, Gly)がランダムに出現する16個のアミノ酸で構成された直鎖型ペプチドライブラリーが合成できる。次に、DNAライブラリーが導入されたプラスミドを鋳型として、プライマー1[5'-aaacagctatgaccatgatta-3'：配列番号１１]とプライマー2[5'-ttaatacgactcactatagaaaagtcgacaataattttgtttaactt-3'：配列番号１２](プライマー2の下線部分の配列＝T7プロモーター)およびEx-Taq (タカラ社製)を利用したPCRにより、直鎖型DNAテンプレートを調製する。
(2)そのDNAテンプレートのT7プロモーター(図２−１)を利用した試験管内転写により、mRNAライブラリーを調製する(図１−２)。
(3)無細胞タンパク質翻訳系(バイオコゥマー社製PURESYSTEM classic II)による試験管内翻訳により、「人工ペプチドライブラリー(APL)−上皮細胞成長因子(EGF)−mRNA−リボソーム複合体」を調製する(図１−３)。【００５３】
この複合体の調製と安定化を実現するための工夫としては、DNAテンプレートにおいて、APLの下流に、EGF及びSecM stall配列をC末端に有するプロテインスペーサー(Ps)を導入すると共に、ストップコドンを完全に除去したことである(図２−１)。
ここでは、TiO2に結合するペプチドアプタマーのC末端に融合させることで、「APL融合EGF」そのものをライブラリーとして利用し、TiO2への結合活性を指標にして選択操作を行う。これにより、選択されたペプチドアプタマーは、EGFとの融合状態においてもTiO2結合性を保持する確率が飛躍的に高くなる。つまり、ペプチドアプタマーを単独で選択した後にEGFと融合させる場合に起こる「ペプチドアプタマーの標的結合性の失活」を回避するための工夫である。Ps は、細胞内タンパク質Bcl-xLにおいて、Ｘ線結晶構造解析により同定できないほど自由度が高い領域から独自に抽出した配列であり、より柔軟性を高めるためにGlyを適宜導入した新規配列である(本手法の開発過程において、この配列を融合したEGFの発現効率が、他のプロテインスペーサーと融合したEGFに比べて高いことも明らかとなった。それゆえ、リボソーム複合体の調製をより効率的に実行するための重要な要素の１つとなっている)。SecM stall配列は、翻訳と同時にリボソームのトンネル内部に結合することで、APL−EGF−Ps部位をリボソーム上に安定的に固定化する役割を担っている。また、ストップコドンの除去は、解離因子によるmRNAの認識を抑制するため、APL−EGF−Psを提示したリボソームをmRNA上に長期的に停滞させることができ、より安定な複合体の調製が可能となる。
【００５４】
(4)「人工ペプチドライブラリー(APL)−上皮細胞成長因子(EGF)−mRNA−リボソーム複合体」（試験管内翻訳溶液をそのまま使用）と標的金属としてのTiO2粒子(関東化学社製)を（約0.2 mg）混合し、4℃で約1時間、攪拌する。そして、TBS-Tバッファー（pH 7.5)で洗浄した後、そのTiO2の表面構造に対して特異的に結合する特殊ペプチドを提示した複合体のみを選択する(図１−４)。【００５５】
(5)ここで選択した複合体をEDTA溶液と反応させることで分解し、mRNAをカラム（Qiagen社製）により回収する(図１−５)。そして、その回収したRNAを鋳型として逆転写(RT)反応(総量200 ml)を行った(RNA：100 ml、プライマー1[配列番号１１]：40 pmol、dNTPs：100 nmol、RNasin 2 ml (Promega社製)、PrimeScript Reverse Transcriptase：8 ml (TaKaRa社製))。次に、そのRT産物を元にして、PCR(RT産物：200 ml、プライマー1[配列番号１１]：200 pmol、プライマー2[配列番号１２]：200 pmol、dNTPs：200 nmol、PrimeSTAR GXL DNA polymerase：20 ml (TaKaRa社製))を行うことで(総量1000 ml)、次の選択実験に必要なDNAテンプレートを構築する。【００５６】
さらに、図１に示すサイクル操作を５回繰り返した後、そのmRNAに記録されているアミノ酸配列(25個)を解析した結果、重複した配列を有するペプチドの存在を3種類(TOP1, TOP2, TOP3)確認できた(表１)。いずれのペプチドにおいても、チロシンが多く含まれた特徴的な配列が観測されており、天然には存在しない新たなペプチドであった。さらに、以前、ファージディスプレイ法により選択されたTiO2結合性ペプチドTBP-1(表１)とも全く異なる配列を有することも分かった。【００５７】
【表１】
0005863045.tif 000002
Freq.は得られた25クローン中の出現頻度を示す。
TBP-1は非特許文献６，７で報告されたペプチドを示す。
【００５８】
また、同様の実験を行うことにより、さらに下記3種類のTiO2結合性ペプチドが得られた。
TOP4  Y Y G R Y S D Y Y D N G Y G R R  （配列番号１６）
TOP5  Y N R Y D G R Y Y R D H G R N Y  （配列番号１８）
TOP6  Y N D Y Y Y Y C Y R D Y D  （配列番号２０）【００５９】
実施例2：各種「ペプチド融合EGF」の創製とそれらのTiO2結合性評価およびSiO2結合性評価
ここでは、各種ペプチドを融合したEGFの新規タンパク質P-EGF(図３−１、TOP1-EGF [今回選択された新規ペプチドTOP1配列をN末端に有し、C末端には検出用のFLAGタグを付加したEGF]、H6-EGF [ Hisが6個直列に並んだ配列をN末端に有し、C末端には検出用のFLAGタグを付加したEGF]、TBP-EGF [ファージディスプレイ法により選択されたTiO2結合性ペプチドminTBP-1の配列(TBP-1のTiO2結合性の発現に必須の配列)をN末端に有し、C末端には検出用のFLAGタグを付加したEGF])を発現するDNAテンプレートを新たに構築し、それらを無細胞蛋白質翻訳系(バイオコゥマー社製PURESYSTEM classic II)により発現させた。【００６０】
そして、各種P-EGFの翻訳溶液(各7μl)の電気泳動後のウエスタンブロットにおいて、P-EGFが観測されるべき位置に各バンド(9.5〜10kDa)を確認した(図３−２)。さらに、それらの発光強度の比較から、同程度のP-EGFの量が発現していることも確認できた(ここでのP-EGFのバンド検出は、抗FLAG抗体HRP複合体による認識の後、化学発光試薬とHRPとの反応による発光現象により行った)。【００６１】
次に、図４−１左のスキームに従って、各種P-EGF溶液(バイオコゥマー社製PURESYSTEM classic IIを利用して翻訳したP-EGFの溶液10μl)とTiO2粒子(関東化学社製)を混合し、遠心沈降と洗浄操作(TBS-Tバッファー, pH 7.5)を4回繰り返した後、粒子の表面に結合しているタンパク質だけを電気泳動した。そして、そのウエスタンブロットにおいて、TOP1-EGFだけが観測されるべき位置に発光バンドを確認することができた(図４−１右、ここでのP-EGFのバンド検出は、抗FLAG抗体HRP複合体による認識の後、化学発光試薬とHRPとの反応による発光現象により行った)。これにより、TOP1がTiO2結合性を強力に発現していることが明らかとなった。また、ファージディスプレイ法により選択されたTBP-EGFのバンドは検出されなかったことから、今回の新手法により選択されたTOP1のTiO2結合性の高さと、ペプチドアプタマー選択法としての新規リボソームディスプレイ法の優位性を証明することができた。【００６２】
次に、図４−２左のスキームに従って、各種P-EGF溶液(約2.0ng, 10μl in TBS, pH 7.5)をTiO2プレート（直径15 mm / 厚さ0.6 mmのガラスプレート(松浪ガラス工業社製)の表面にチタンを蒸着させて作製したプレート(この蒸着工程は、大阪真空工業社に依頼)を使用）上に添加し、洗浄操作(TBS-Tバッファー, pH 7.5)を3回繰り返した。そして、0.1％BSA溶液でブロッキングをした後、一次抗体として抗ヒトEGF抗体を添加した。さらに、洗浄操作(TBS-Tバッファー, pH 7.5)を3回繰り返した後、二次抗体として抗マウスIgG抗体HRP複合体を添加した。最後に、化学発光試薬とHRPとの反応による発光現象を指標にして、TiO2プレート上に固定化したタンパク質の存在を検出した。その結果、TOP1-EGFを添加したTiO2プレートだけに発光現象を確認することが出来た(図４−２右)。これにより、TOP1-EGFは、TiO2プレート上においても自発的かつ強力に結合していることが明らかとなった。さらに、ペプチドを融合していないEGFのみでは、TiO2結合しないことから、TOP1-EGFは、非特異的な結合ではなく、TOP1の特異的結合性によりTiO2プレート上に固定化していることが明らかとなった。【００６３】
さらに、TOP1の金属結合性の更なる可能性を見出すため、ガラスの主成分でもあるSiO2に対する結合性を評価した。なぜなら、SiO2の表面構造は、TiO2と非常に類似していることが知られているため、TOP1-EGF が、SiO2結合性を有する可能性が高いと考えたからである。そこで、図５左のスキームに従って、各種P-EGF溶液(約2.0ng, 10μl in TBS, pH 7.5)をSiO2プレート（直径15 mm / 厚さ0.6 mmのガラスプレート(松浪ガラス工業社製)）上に添加し、洗浄操作(TBS-Tバッファー, pH 7.5)を3回繰り返した。そして、0.1％BSA溶液でブロッキングをした後、一次抗体として抗ヒトEGF抗体を添加した。さらに、洗浄操作(TBS-Tバッファー, pH 7.5)を3回繰り返した後、二次抗体として抗マウスIgG抗体HRP複合体を添加した。最後に、化学発光試薬とHRPとの反応による発光現象を指標にして、SiO2プレート上に固定化したタンパク質の存在を検出した。その結果、TOP1-EGFを添加したSiO2プレートだけに発光現象を確認することができた(図５右)。これにより、TOP1-EGFは、SiO2プレート上においても自発的かつ強力に結合していることが明らかとなった。つまり、TOP1は、TiO2結合性とSiO2結合性の両方の結合機能を有する新規ペプチドアプタマーであることが判明した。【００６４】
実施例3：「TiO2結合性ペプチドアプタマー融合EGF」のTiO2プレート上における細胞増殖活性評価
ここでは、TiO2プレート上において固定化された状態のTOP1-EGFが、各種細胞の増殖を誘導する機能を発現できることを証明するために実験を行った。
まず、図６−１左のスキームに従って、TOP1-EGF溶液(約5.0ng, 12μl in TBS, pH 7.5)をTiO2プレート上に添加した後、洗浄操作(TBS-Tバッファー, pH 7.5)を3回行ったのち、0.1％BSA溶液でブロッキングすることで、「TOP1-EGF固定化TiO2プレート」を作製した。そして、そのTOP1-EGF固定化TiO2プレート上に、約5000個の角化細胞(ケラチノサイト)を播種し、６日間の培養(1%FBS含有DMEM培地使用)と顕微鏡観察(細胞は紫色に染色してある)を行った。その結果、TOP1-EGFを固定化していないTiO2プレートに比べ、TOP1-EGF固定化TiO2プレート上のケラチノサイトは、顕著に増殖しており、それら細胞の周辺には、大量のケラチンが産生されている様子が観測された(図６−１右)。それゆえ、TOP1-EGFは、TiO2プレート上に自発的に結合するだけでなく、皮膚の形成に不可欠な角化細胞の増殖を誘導することが明らかとなった。【００６５】
さらに、図６−２左のスキームと上記と同様の操作で、「TOP1-EGF固定化TiO2プレート」を作製し、そのTOP1-EGF固定化TiO2プレート上に、約5000個のNIH3T3線維芽細胞を播種した後、６日間の培養(1%FBS含有DMEM培地使用)と顕微鏡観察(細胞は紫色に染色してある)を行った。その結果、TOP1-EGFを固定化していないTiO2プレートに比べ、TOP1-EGF固定化TiO2プレート上のNIH3T3細胞は、顕著に増殖しており、各細胞は成長すると共に大きく伸展している様子が観測された(図６−２右)。それゆえ、TOP1-EGFは、TiO2プレート上に自発的に結合するだけでなく、線維芽細胞の増殖を誘導することが明らかとなった。【００６６】
実施例4：化学合成した「TiO2結合性ペプチドアプタマー融合EGF」のTiO2結合性評価とTiO2プレート上における細胞増殖活性評価
従来、タンパク質の合成は、大腸菌発現系、無細胞蛋白質翻訳系が主に利用されている。前者の大腸菌発現系は、培養→破砕・抽出→精製処理の操作に時間がかかるものの、大量に合成できることから最も汎用的に利用されている。しかし、タンパク質の発現による大腸菌への負担や毒性が問題となり、目的のタンパク質を得ること出来ないことも多々起こる。一方、後者の無細胞蛋白質翻訳系は、タンパク質の発現と処理が短時間で行えるため便利ではあるものの、大量に合成することは難しいだけでなく、ハイコストが常に問題となる。それゆえ、タンパク質を化学的手法により合成することが出来れば、短時間かつ安価で大量に得ることが出来る。そこで今回、TOP1-EGFをペプチド固相法により化学的に合成することを試みた。従来、固相法は、40〜50個のアミノ酸を超える長さのペプチド合成が極めて困難とされてきた。しかし今回、80個のアミノ酸(MQAYYNYYSNYYGRSYSSDGQLGQFEGNSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELR：配列番号１４)で構成されたsTOP1-EGFの合成に成功した。そこで、このsTOP1-EGFのTiO2結合性とTiO2プレート上における細胞増殖活性を評価した。【００６７】
まず、図７−１左のスキームに従って、各種P-EGF溶液(約2.0ng, 10μl in TBS, pH 7.5)をTiO2プレート上に添加し、洗浄操作(TBS-Tバッファー, pH 7.5)を3回繰り返した。そして、0.1％BSA溶液でブロッキングをした後、一次抗体として抗ヒトEGF抗体を添加する。さらに、洗浄操作(TBS-Tバッファー, pH 7.5)を3回繰り返した後、二次抗体として抗マウスIgG抗体HRP複合体を添加した。最後に、化学発光試薬とHRPとの反応による発光現象を指標にして、TiO2プレート上に固定化したタンパク質の存在を検出した。その結果、sTOP1-EGFを添加した領域のTiO2プレートだけに発光現象を確認することができた(図７−１右)。これにより、化学的に合成したsTOP1-EGFにおいても、TiO2結合性が保持されていることが明らかとなった。【００６８】
さらに、TiO2プレート上において固定化された状態のsTOP1-EGFが、細胞増殖を誘導する機能を発現することを確認する実験を行った。まず、図７−２左のスキームに従って、sTOP1-EGF溶液(約5.0ng, 12μl in TBS, pH 7.5)をTiO2プレート上に添加した後、洗浄操作(TBS-Tバッファー, pH 7.5)を3回行った。そして、0.1％BSA溶液でブロッキングすることで、「sTOP1-EGF固定化TiO2プレート」を作製した。そして、そのsTOP1-EGF固定化TiO2プレート上に、約5000個のNRK-49F線維芽細胞を播種し、６日間の培養(1%FBS含有DMEM培
地使用)と顕微鏡観察(細胞は無染色)を行った。その結果、EGFだけを添加したTiO2プレートに比べ、sTOP1-EGF固定化TiO2プレート上のNRK-49F線維芽細胞は、顕著に増殖しており、活発な生命活動を維持している様子が観測された(図７−２右)。それゆえ、化学的に合成したsTOP1-EGFは、TiO2プレート上に自発的に結合するだけでなく、線維芽細胞の増殖を誘導する活性を有することが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明の目的タンパク質に標的物質結合性を付与するポリペプチド配列を選択する方法は遺伝子工学やペプチド工学等の分野で有用である。
また、本発明のペプチドは、研究目的のみならず、移植医療や再生医療等の医療分野で有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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