(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号 NITE P-1185のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体D3707-13。
【請求項２】
受託番号 NITE P-1186のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体D3708-36。
【請求項３】
受託番号 NITE P-1187のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体D3710-62。
【請求項４】
受託番号 NITE P-1188のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体D3805-2G1-110。
【請求項５】
受託番号が、NITE P-1185、NITE P-1186、NITE P-1187又はNITE P-1188の何れかであるハイブリドーマ。
【請求項６】
請求項１〜４の何れかに記載の抗体を含むキット。
【請求項７】
請求項１〜４の何れかに記載の抗体を使用して、生体試料中の酸化型DJ-1蛋白質量の変化を測定する方法。
【請求項８】
疾病の治療に有効な薬物候補化合物のスクリーニング方法であって、
（１）モデル動物に薬物候補化合物を投与する工程と、
（２）請求項１〜４の何れかに記載の抗体を使用して、モデル動物から採取した生体試料中の酸化型DJ-1蛋白質量の変化を測定する工程と、
を含む薬物候補化合物のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、含硫アミノ酸残基を含むポリペプチドに対する抗体、この抗体を産出するハイブリドーマ、抗体を含むキット、抗体を使用する方法及び薬物候補化合物のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
パーキンソン病は、脳内のドーパミン不足とアセチルコリンの相対的増加が原因で手足の震え等の運動症状が生じる神経変性疾病であり、手足の震え等の運動症状によって一般的に診断される。ただ、運動症状によってパーキンソン病と診断されたときには、既に症状が進んでおり、治療が困難であることが多い。そのため、従来から運動症状が生じる前に、パーキンソン病を診断する診断方法が求められている。
【０００３】
さて、DJ-1は、NIH3T3細胞を形質転換させる癌遺伝子として発見された（非特許文献１を参照）のち、その点突然変異（166位のロイシンがプロリンに変異）産物が、パーキンソン病の原因遺伝子PARK7と同一であることが判明している（非特許文献２を参照）。
【０００４】
また、DJ-1蛋白質の二次元電気泳動のスポットの位置が、過酸化水素、パラコートによる酸化ストレスの前後で移動していること、その位置の変化から、移動の原因がシステイン残基の酸化であることが分かっている（非特許文献３を参照）。
【０００５】
さらに、DJ-1蛋白質のX-線結晶構造解析から、パーキンソン病に関わる点変異の導入によって、二量体構造に変化が起こること、X線照射により106位のシステイン残基が酸化されてスルフィン酸（SO2H）残基に変化していることが分かっている（非特許文献４を参照）。なお、参考のため、ヒトDJ-1蛋白質のDNA配列を配列番号１に、そのアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【０００６】
このようにパーキンソン病と酸化型DJ-1蛋白質の含有量との間には因果関係があり、DJ-1蛋白質の酸化には106位のシステイン残基が関与している、と考えられている。また、酸化型DJ-1蛋白質はパーキンソン病に加え、アルツハイマー病や動脈硬化とも関係していると考えられている。そこで、従来から、パーキンソン病などの診断に利用するため、酸化型DJ-1蛋白質と特異的に結合する抗体等について研究されている。
【０００７】
例えば、発明者らは、抗原として利用するために、システイン残基がシステインスルホン酸等に酸化された酸化型ヒトDJ-1蛋白質やそれに対する抗体を開発している（特許文献１、２を参照。）。また、還元型ヒトDJ-1蛋白質の一部とバキュロウィルスの表面蛋白質(gp64)との融合蛋白質を抗原に使用して酸化型DJ-1蛋白質に対する抗体を開発している（特許文献３を参照）。
【０００８】
しかし、現在までに得られている酸化型DJ-1蛋白質に対する抗体は、酸化型DJ-1蛋白質に加えて、還元型DJ-1蛋白質とも反応してしまうとの問題点があった。そのため、生体試料中の酸化型DJ-1蛋白質含有量を測定するには、より特異性の高い抗体が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開２００５−７５５１３号公報
【特許文献２】特開２００７−３１９０８４号公報
【特許文献３】特開２０１０−１８３８４３号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Nagakubo D,Taira T,Kitaura H,Ikeda M,Tamai K,Iguchi-Ariga M,Ariga H.J-1,a novel oncogene which transforms mouse NIH3T3 cells in cooperaion with ras.Biochem Biophys Res Commun.(1997)231,509-13
【非特許文献２】Bonifati V,Rizzu P,van Baren MJ,Schaap O,Breedveld GJ,Krieer E,Dekker MC,Squitieri F,Ibanez P,Joosse M,van Dongen JW,Vanacore N,va Swieten JC,Brice A,Meco G,van Duijn CM,Oostra BA,Heutink P.Mutations in the DJ-1 gene associated with autosomal recessive early-onset parkinsonism.Science.(2003)299,256-9.
【非特許文献３】Mitsumoto A,Nakagawa Y,Takeuchi A,Okawa K,Iwamatsu A,Takanzawa Y.Oxidized forms of peroxiredoxins and DJ-1 on two-dimensional gels increaed in response to sublethal levels of paraquat. Free Radic Res.(2001)35,301-10.
【非特許文献４】Wilson MA,Collins JL, Hod Y,Ringe D,Petsko GA.The 1.1-A resolution crystal structure of DJ-1,the protein mutated in autosomal recessive early onset Parkinson's disease.Proc Natl Acad Sci USA.(2003)100,9256-61.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
この発明は、含有する含硫アミノ酸残基の酸化が疾病と関連するポリペプチドに対する抗体であって、従来よりも酸化型ポリペプチドへの特異性が高い抗体を提供することを課題とする。また、この発明は、パーキンソン病などの疾病をより効率よく診断等できるキット、方法、スクリーニング方法等を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明者らは、鋭意検討の結果、酸化型ポリペプチド（例えば、酸化型DJ-1蛋白質）との反応性が、還元型ポリペプチド（例えば、還元型DJ-1蛋白質）に対する反応性と比較して高い抗体を得えた。すなわち、この発明の抗体は酸化型ポリペプチドに対してより特異性の高い抗体である。また、この発明のハイブリドーマは、この発明の抗体を産出するハイブリドーマである。さらに、この発明のキット、方法、スクリーニング方法は、この発明の抗体を使用することを主な特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
この発明の抗体、これを使用するキット、これを使用する方法及びスクリーニング方法により、従来よりも、パーキンソン病などの患者をより早期かつ精度よく発見して、治療できるようになった。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、各抗体の特異性をELISA法により比較した図である。なお、図１（ａ）は実験方法の概要を模式的に示す図であり、図１（ｂ）は実験結果を示す表である。
【図２】図２は、各抗体の特異性をWestern Blot法により比較した図である。
【図３】図３は、各抗体の特異性を二次元電気泳動法により比較した図である。
【図４】図４は、抗体のスクリーニング結果を要約した図である。
【図５】図５は、試料中の酸化型DJ-1蛋白質の含有量を、種類の異なる検出抗体を使用してサンドイッチ法により測定した結果を示す図である。
【図６】図６は、試料中の酸化型DJ-1蛋白質の含有量を、捕獲抗体及び検出抗体の両方にD3805-2G1-110抗体を使用してサンドイッチ法により測定した結果を示す図である。なお、図６（ａ）は実験方法の概要を模式的に示す図であり、図６（ｂ）は実験結果を示すグラフである。
【図７】図７は、抗体の認識部分を分子間相互作用解析（Biacore法）により確認した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
この発明は、含硫アミノ酸残基を含むポリペプチドに対する抗体、この抗体を含むキット、この抗体を使用する方法及び薬物候補化合物のスクリーニング方法である。そこで、これらについて以下に詳説する。
【００１６】
１．抗体
この発明の抗体は、含有する含硫アミノ酸残基の酸化が疾病と関連するポリペプチドに対する抗体であって、含硫アミノ酸残基が酸化された酸化型ポリペプチドとの反応性が、含硫アミノ酸残基が酸化されていない還元型ポリペプチドと比較して高い特定の抗体である。
【００１７】
ここで、含硫アミノ酸残基とは、具体的にはシステイン残基、メチオニン残基のことである。また、含硫アミノ酸残基の酸化とは、特許文献３に記載されているように、システイン残基が酸化してシステインスルホン酸残基となること、メチオニン残基が酸化してメチオニンスルフォキサイド残基となることである。また、ポリペプチドとは、生体試料中に含まれる蛋白質の全アミノ酸配列を含むものだけではなく、酸化される含硫アミノ酸残基近傍の部分アミノ酸配列を含むポリペプチド、これを含む融合蛋白質等も含む。さらに、含硫アミノ酸残基の酸化と関連する疾病としては、パーキンソン病、アルツハイマー病、動脈硬化等が例示できるが、これに限定するものではない。
【００１８】
なお、この発明において、「ある特定の抗原との反応性が他の抗原との反応性と比較して高い抗体」とは、免疫学でいう抗原抗体反応（抗体と抗原が結合すること）の測定値の違いが抗原によって大きく異なることである。すなわち、「ある特定の抗原に対する抗原抗体反応の測定値」／「他の抗原に対する抗原抗体反応の測定値」が大きい抗体のことである。
【００１９】
例えば、「酸化型DJ-1蛋白質との反応性（oxDJ-1）が、還元型DJ-1蛋白質との反応性（DJ-1）と比較して高い。」とは、酵素結合免疫吸着法（ELISA法）、ウェスタンブロット法(Western blot法)、二次元電気泳動法により測定した値から求めたoxDJ-1/DJ-1 の値が、ある一定の値よりも大きいことである。
【００２０】
具体的には、DJ-1蛋白質に対する抗体のうち、ELISA法から求めたoxDJ-1/DJ-1の値が5.6以上である抗体、ウェスタンブロット法から求めたoxDJ-1/DJ-1の値が8.0以上である抗体、二次元電気泳動から求めたoxDJ-1/DJ-1の値が100以上である抗体が例示できる。
【００２１】
より具体的には、受託番号 NITE P-1185のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体D3707-13、受託番号 NITE P-1186のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体D3708-36、受託番号 NITE P-1187のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体D3710-62、又は受託番号 NITE P-1188のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体D3805-2G1-110が例示できる。
【００２２】
なお、これらのモノクローナル抗体は、後述するように、特許文献３に記載のB7411C抗体、酸化型DJ-1蛋白質及び還元型DJ-1蛋白質の何れとも反応するD3843-1C10-208抗体と比較して、酸化型DJ-1蛋白質に対する特異性が高いことが確認できている。
【００２３】
抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体はもちろん、一本鎖抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体等であってもよく、これらの抗体を標識付けした標識抗体でもよい。また、前記抗体とグリーン蛍光蛋白質（GFP）等の蛍光発光蛋白質などと融合させた抗体であってもよい。
【００２４】
抗体の標識付けは、抗体に直接標識を結合させてもよいし（直接的）、この発明の抗体を一次抗体とし標識二次抗体と結合させて間接的に標識してもよい（間接法）。また、二次抗体の代わりにビオチンと特異的に結合する性質をもつ蛍光標識アビジンを使用するABC法を使用してもよい。
【００２５】
標識としては、標識に使用されている公知のものであれば使用できる。具体的には、FITC（フルオレセインイソシアネート）又はテトラメチルローダミンイソシアネート等蛍光色素、125I、32P、14C、35S又は3H等の放射性物質、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ又はフィコエリトリン等の酵素、金コロイドなどが挙げられる。
【００２６】
２．抗体の調製方法
この発明の抗体は、特に制限することなく公知の方法によって、調製することができる。例えば、抗原となる蛋白質を使用して免疫感作したのち、細胞融合、スクリーニングなどにより、調製することができる。以下により具体的に説明する。
【００２７】
（１）抗原
抗原となるポリペプチドは、含有する含硫アミノ酸残基の酸化が疾病と関連するポリペプチドである。なお、ポリペプチドは、生体試料中に含まれる蛋白質の全アミノ酸配列を含むものだけではなく、酸化する含硫アミノ酸残基近傍の部分アミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。抗原の具体例としては、特許文献２に記載されている方法で得られるヒト酸化型DJ-1蛋白質が挙げられる。なお、含硫アミノ酸残基などの定義は前記と同じである。
【００２８】
（２）免疫感作
免疫感作は、例えば、マウスを免疫する場合、免疫原を、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮膚内等へ免疫原を注射することにより行う。接種間隔、接種量などは、接種方法により異なるが、例えば、マウスの皮下に接種する場合、抗原を3〜4日おきに、2週間程度接種する。このようにして、免疫感作された哺乳動物から、リンパ球等の抗体産生細胞を取り出し、細胞融合操作に使用する。なお、免疫感作に際しては、免疫原をアジュバントなどと混合した懸濁液の使用が好ましい。また、免疫原を、バキュロウィルスと混合して免疫すれば、より特異性の高い抗体を得ることができる。
【００２９】
なお、免疫感作方法に使用する哺乳動物としては、マウス、ラット、ハムスターなどが例示できる。ヒト抗原に対する抗体作製には、中でも、マウス、特に６〜8週齢のBalb/Cマウスの使用が好ましい。なお、免疫感作方法に使用する哺乳動物として、バキュロウィルスのgp64蛋白質を発現するトランスジェニックマウスを使用すれば、より特異性の高い抗体を得ることができる。
【００３０】
（３）細胞融合
細胞融合は、公知の方法に沿って、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを1:5〜1:20の割合で混合することにより行う。なお、細胞融合に際しては、ポリエチレングリコール（PEG）、センダイウィルスなどの融合剤を使用し、細胞融合後はHAT選択培地で培養する。これにより、抗体産生細胞と融合したハイブリドーマだけを効率よく増殖させることができる。
【００３１】
（４）スクリーニング方法
増殖したハイブリドーマを、スクリーニングして目的の抗体を産生するハイブリドーマを選別したのち、限界希釈等でクローニングして、液体培地中又は哺乳動物細胞の腹腔内で増殖させることにより、目的の抗体を取得することができる。ここで、目的の抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングする方法としては、エンザイムイムノアッセイ(EIA)、ラジオイムノアッセイ（RIA）、フローサイトメトリ等の公知の方法を使用できる。中でも、安全性や設備の簡便さから、EIAが好ましく、ELISA法がより好ましい。
【００３２】
なお、これらの方法は単独でもよいが、より特異性の高い抗体を選別するため、複数の方法を組合わせることが好ましい。また、電気泳動とWestern Blot法とを組合わせて、スクリーニングの結果得られたハイブリドーマが産生する抗体の特異性を確認してもよい。
【００３３】
３．キット
この発明の抗体を使用して、酸化型蛋白質を検出・測定する際には、二次抗体、発色剤、緩衝液等が必要であり、これらは市販のものを別々に購入して使用してもよい。しかし、これらを組合わせて予めキットとしておけば、各構成要素を別々に購入する手間を省き、検出・測定を容易に行うことができる。なお、蛋白質の抽出に必要な緩衝液なども併せてキット化しておけば検出・測定をより容易に行える。
【００３４】
４．診断に利用可能な方法
この発明の方法は、含硫アミノ酸残基を有するポリペプチドの含硫アミノ残基の生体内での酸化と病状の変化とが関係する疾病の診断に利用可能な方法であって、この発明の抗体を使用して、生体試料中の酸化型DJ-1蛋白質量の変化を測定する方法である。
【００３５】
なお、含硫アミノ酸残基を有する蛋白質の含硫アミノ残基の生体内での酸化と病状の変化とが関係する疾病としては、前記のパーキンソン病、アルツハイマー病、動脈硬化などが挙げられる。中でも、前記のように酸化型DJ-1蛋白質との関連性が高いことから、パーキンソン病の診断への使用が好ましい。
【００３６】
また、生体試料としては、蛋白質を含有している体液・体組織であればよく、具体的には、血液、尿、唾液、脳脊髄液、脳組織、筋肉組織、脂肪組織、皮膚組織、内臓組織などが挙げられる。中でも、採材時に検体への侵襲が少なく採取が容易な血液が好ましい。
【００３７】
さらに、酸化型蛋白質量の測定法としては、生体試料中の蛋白質を検出・測定する公知の方法、例えばEIA、RIA等が挙げられる。中でも、安全性と効率のよさから、EIAが好ましく、ELISA法がより好ましい。
【００３８】
５．薬物候補化合物のスクリーニング方法
この発明の薬物候補化合物のスクリーニング方法は、（１）モデル動物に薬物候補化合物を投与する工程と、（２）この発明の抗体を使用して、モデル動物から採取した生体試料中の酸化型DJ-1蛋白質量の変化を測定する工程と、を含む方法である。
【００３９】
ここで、モデル動物としては、マウス、ラット、モルモット、イヌ、サルなど従来から薬物候補化合物のスクリーニングに使用されている動物であれば特に問題なく使用できる。なお、薬物候補化合物の治療対象となる疾病、採取する生体試料、酸化型DJ-1蛋白質の測定方法は診断に利用可能な方法と同じである。
【００４０】
以下、この発明について実施例に基づいてより詳細に説明するが、以下の実施例によって、この発明の特許請求の範囲は如何なる意味においても制限されるものではない。
【実施例１】
【００４１】
１．抗原の調製
抗原として使用するため、還元型DJ-1蛋白質、酸化型DJ-1蛋白質及び106位のシステイン残基をセリン残基に変えた変異体（以下、C106S変異体と略す。）蛋白質を、特許文献２に記載に従って、以下のように調製した。
【００４２】
まず、ヒスチジンタグを付加したヒトDJ-1遺伝子又はC106S変異体の遺伝子を含むプラスミドを構築して、これらのプラスミドにより大腸菌を形質転換し、この大腸菌をLB培地で培養した。なお、ヒトDJ-1遺伝子により形質転換した大腸菌は複数培養した。
【００４３】
つぎに、ヒトDJ-1遺伝子、C106S変異体の遺伝子を含むプラスミドにより形質転換した大腸菌をそれぞれ集菌して可溶化した。得られた可溶化分から、遠心分離により上清を得て、この上清をNi-NTAカラム（QIAGEN）にかけた。Ni-NTAカラムを洗浄したのち、イミダゾールで溶出して、還元型DJ-1蛋白質とC106S変異体蛋白質を得た。
【００４４】
また、ヒトDJ-1遺伝子により形質転換した別の大腸菌に、50mMの過酸化水素を加えて37℃、15分間酸化処理したのち、Ni-NTAカラムを使用して同様に精製し、酸化型DJ-1蛋白質を得た。
【実施例２】
【００４５】
２．抗体の調製
得られた酸化型DJ-1蛋白質をgp64-トランスジェニックBalb/cマウスに一匹当たり40μgの酸化DJ-1リコンビナント体及び40μg バキュロウィルスを、百日咳アジュバント（フナコシ）に懸濁して、腹腔内投与し、2週間隔で2〜4回免疫した。免疫終了後、脾臓細胞を取り出して、抗体産生細胞とミエローマ細胞NS-1とをPEG1500により細胞融合し、HAT培地を使用してハイブリドーマを選別した
【実施例３】
【００４６】
３．ELISA法による抗体の１次スクリーニング
ELISA法により、実施例２で調製した抗体を１次スクリーニングした。まず、酸化型DJ-1蛋白質を含む抗原液（2μg/ml 炭酸バッファー）を、100μl/wellとなるようにELISAプレート（96 Well plate）に添加して4℃で一晩反応させ、固相化反応させた。固相化反応終了後、ELISAプレートの抗原液を捨て、洗浄液（0.05% Tween 20 PBS）で4回洗浄したのち、ブロッキング液（0.1％ Bovine Serum Albumin（BSA）PBS）を150μl/wellで加え、37℃で1時間反応させた。ブロッキング反応終了後、プレートを洗浄液で1回洗浄した。
【００４７】
各抗体を含む一次抗体液（培養上清を0.05% Tween 20 PBSで希釈したもの）を50μl/wellずつ各wellに加え、37℃で60分間反応させた。一次抗体反応終了後、ELISAプレートを洗浄液で4回洗浄した。HRP標識抗マウスIgG抗体（ジャクソンズ）含む二次抗体液（10,000倍希釈、0.05% Tween 20 PBS）を100μl/wellずつ各wellに加え、37℃で60分間反応した。
【００４８】
二次抗体反応の終了後、ELISAプレートを洗浄液で3回洗浄し、基質液としてTMB+ Substrate-chromogen（Dako Cytomstion）を50μl/wellずつ各wellに加え、室温、遮光下で30分間反応させた。基質反応終了後、1M H2SO4を反応停止液として50μl/wellずつ各wellに加え、1分間振盪後、波長450nmにおける吸光度を測定した。
【００４９】
なお、酸化型DJ-1蛋白質の代わりに、還元型DJ-1蛋白質及びC106S変異体蛋白質を使用して同様の方法により吸光度を測定した。また、比較のため特許文献３に記載のB7411C抗体についても同様の方法で吸光度を測定した。測定結果を図１に示す。なお、図１（ａ）は実験方法の概要を模式的に示す図であり、図１（ｂ）は実験結果を示す表である。
【００５０】
図１は、各クローンの還元型DJ-1蛋白質（Nm）に対する反応、酸化型DJ-1蛋白質（Ox）に対する反応、C106S変異体蛋白質に対する反応(C106s)の違いを示している。この表から、D3707-13抗体、D3708-36抗体及びD3805-2G1-110抗体は、Ox/Nmの値がB7411C抗体と比べて高いこと、すなわち、B7411C抗体と比べて、酸化型DJ-1蛋白質により特異的に結合することが分かった。
【実施例４】
【００５１】
４．Western Blot法による抗体の２次スクリーニング
実施例２で調製した抗体の酸化型DJ-1蛋白質への特異性と、特許文献３に記載のB7411C抗体や市販の抗DJ-1抗体3E8（医学生物学研究所）の酸化型DJ-1蛋白質への特異性とを、電気泳動とWestern Blot法により以下のようにして比較した。
【００５２】
還元型DJ-1蛋白質、酸化型DJ-1蛋白質、C106S変異体蛋白質をそれぞれ50ng/wellとなるように、12%のポリアクリルアミドグラジエントゲルにアプライし、室温で1.5時間電気泳動した。得られたゲルをメンブレン（PVDF膜、ミリポア）に対して、タンク式ブロッティング装置（バイオラッド）とトランスファーバッファー（25mM Tris-HCl、192mMグリシン、10%メタノール）を使用して、4℃、100Vで1.5時間ブロットした。
【００５３】
TBST緩衝液（Tris-HCl 10mM、NaCl 0.15M、Tween20 0.5%及び5%スキムミルク）でメンブレン上のブロットを2時間ブロッキングした。抗DJ-1抗体3E8、B7411C抗体、D3805-2G1-110抗体、D3707-13抗体などの各抗体とメンブレンとを一晩反応させた。引き続き、HRP標識抗マウスIgG抗体（サンタクルーズ）と反応させ、Western Blotting検出試薬（ミリポア）を使用して発色させた。その結果を図２に示す。なお、図２は、実験コントロールであるB7411C抗体及び3E8抗体、２次スクリーニングした抗体のうちのD3707-13抗体とD3805-2G1-110抗体の結果を示している。
【００５４】
図２から、D3707-13抗体、D3805-2G1-110抗体が、還元型DJ-1蛋白質及びC106S変異体蛋白質と痕跡程度しか反応しておらず、殆ど酸化型DJ-1蛋白質とのみ反応していることが確認できた。これに対して、B7411C抗体及び抗DJ-1抗体3E8は、その大部分は酸化型DJ-1蛋白質と反応しているものの、還元型DJ-1蛋白質やC106S変異体蛋白質とも反応していることが確認できた。このように、D3707-13抗体及びD3805-2G1-110抗体は、B7411C抗体及び抗DJ-1抗体3E8と比べて、酸化型DJ-1蛋白質により特異的に結合することが分かった。
【実施例５】
【００５５】
５．二次元電気泳動法による抗体の３次スクリーニング
実施例２で調製した抗体と、従来からあるB7411C抗体及び抗DJ-1抗体3E8の酸化型DJ-1と還元型DJ-1蛋白質に対する基質特異性を二次元電気泳動によって比較した。具体的には次のようにして比較した。
【００５６】
（１）試料の調製
神経芽腫瘍細胞SH-SY5Yを、DMEM/F12培地（インビトロジェン）を含む直径10cmのディッシュに播種して、37℃、5% CO2 のCO2インキュベータ中で培養した。培養した細胞を回収して、PBSで洗浄し、二次元電気泳動に供した。
【００５７】
（２）二次元電気泳動
洗浄した細胞を等電点電気泳動用溶液（9M尿素、2% CHAPS、65mM DTE、0.5% IPG Buffer(GEヘルスケア・ジャパン)） 280μlに溶解して、15,000rpm 20分間遠心して不溶成分を除いた。そのうち、250μl（蛋白質量75μg）をImmobiline Dry Strip (7〜13cm長、pIレンジ4-7、(GEヘルスケア・ジャパン))に添加して、12時間膨潤させた。膨潤させたのち、IPGPhor 電気泳動装置(GEヘルスケア・ジャパン)により、一次元目の等電点電気泳動をした。
【００５８】
一次元目の電気泳動が終了したのち、ゲルを平衡化液（50mM Tris-HCl(pH6.8)、6M尿素、30% グリセロール、2% SDS、20mM DTE）に浸して平衡化し、平衡化したドライストリップをSDS-PAGEゲル（12.5%）の上部に置いた。スラブ電気泳動装置（バイオラッド）にゲルをセットして、泳動バッファー（25mM Tris-HCl、14.4mg/ml グリシン、1mg/ml SDS）を満たし、30mAでブロモフェノールブルーバンドがゲル下端に見えるまで泳動した。
【００５９】
（３）抗体による染色
二次元電気泳動によって分離した蛋白質を、タンク式ブロッティング装置（バイオラッド）及びブロッティングバッファー（25mM Tris-HCl、192mMグリシン、10%メタノール）を使用して、メンブレン（PVDF膜、ミリポア）に対して4℃、100Vで1.5時間ブロットした。
【００６０】
転写終了後のメンブレンをブロッキングバッファー（20mMTris-HCl、50mM NaCl、5%スキムミルク）に浸し、室温で2時間ブロッキングした。
【００６１】
ブロッキング終了後、２次スクリーニングした抗体、B7411C抗体、3E8抗体と反応させた。その後、HRP標識抗マウスIgG抗体（サンタクルズ）と反応させ、Western Blotting検出試薬（ミリポア）を使用して発色した。その結果について、DJ-1蛋白質近傍の拡大図を図３に示す。なお、図３は、実験コントロールであるB7411C抗体、3E8抗体、３次スクリーニングした抗体のうちのD3707-13抗体、D3805-2G1-110抗体の結果を示している。
【００６２】
図３から、3E8抗体は酸化型DJ-1蛋白質（ox）に加えて、還元型DJ-1蛋白質（native）とも充分反応していること、すなわち酸化型DJ-1蛋白質に対する特異的に反応していないことが確認できた。これに対して、D3707-13抗体、D3805-2G1-110抗体、B7411C抗体は、酸化型DJ-1蛋白質とのみ反応し、還元型DJ-1蛋白質とは全く反応していないこと、すなわち酸化型DJ-1蛋白質と特異的に反応することが確認できた。
【００６３】
以上の結果から、D3707-13抗体、D3805-2G1-110抗体が、変成した酸化型DJ-1蛋白質に対しても高い特異性を維持していることが分かった。また、抗体の結合強度を比較すると、この発明にかかる抗体、D3707-13抗体、D3805-2G1-110抗体のほうが、従来からあるB7411C抗体よりも結合強度が高いことが分かった。
【００６４】
なお、１次〜３次の抗体スクリーニングの結果を図４に要約する。ここで、図４中の1stスクリーニングは実施例３のELISA法による結果を要約であり、2ndスクリーニングは実施例４のWestern blot法による結果の要約であり、3rdスクリーニングは実施例５の二次元電気泳動法による結果の要約である。
【００６５】
図４に示すように、スクリーニングによって、特許文献３に記載のB7411C抗体よりも酸化型DJ-1蛋白質に対して特異性の高い抗体（oxDJ-1/DJ-1が高い抗体）が複数得られた。
【実施例６】
【００６６】
６．サンドイッチ法による酸化型DJ-1蛋白質の定量
この発明の抗体を、蛋白質の一般的な定量方法であるサンドイッチ法に使用して、その性能を従来からある抗体と比較した。
【００６７】
（１）試薬の調製
捕獲抗体としてD3805-2G1-110抗体を含む固相溶液（2μg/ml、0.1M炭酸緩衝液、pH9.6）を調製した。また、HRP標識抗体を含む検出抗体液（2μg/ml）を以下の手順で調製した。まず、D3805-2G1-110抗体、特許文献３に記載のB7305A抗体、又はB7411C抗体を、0.2M炭酸水素Na（pH9.5）で透析し、活性化HRP（HRPを、0.1Mメタ過ヨウ素酸Naで処理し、HRPの糖鎖を酸化してアルデヒドとした）と混合して、抗体をHRP標識した。つぎに、標識後、NaBH4を添加して、未反応のアルデヒド基を失活させた。さらに、実施例１で調製した酸化型DJ-1蛋白質の濃度が0〜500ng/mlの範囲となるように0.1％BSA-PBSを加えて、濃度の異なる抗原液を調製した。
【００６８】
（２）プレートの調製
固相溶液を96wellマイクロプレートに100μｌずつ分注し、4℃で24時間放置した。wellの余剰の結合部位を、ブロッキング液（0.1％BSA-PBS）300μlを加えて不活化した
【００６９】
（３）酸化型DJ-1蛋白質の測定
ブロッキングしたプレートの各wellに濃度の異なる抗原液を100μlずつ加えて、37℃で1時間反応させた。プレートを0.05％ Tween-PBSで洗浄したのち、検出抗体液100μlを加え、37℃で1時間反応させた。プレートを0.05％ Tween-PBSで洗浄したのち、固相上の酵素活性を、実施例３と同様の方法で測定した。その結果を図５に示す。
【００７０】
図５から、検出抗体にB7305A抗体、又はB7411C抗体を使用した場合には、吸光度の上昇が認められないことが分かった。これは、B7305A抗体、又はB7411C抗体が標識により失活したことによると考えられる。これに対して、この発明のD3805-2G1-110抗体を使用した場合には、抗原濃度と吸光度との間に高い直線性が認められた。
【００７１】
そこで、同様の方法により、D3805-2G1-110抗体を捕獲抗体、検出抗体の両方に使用し、酸化型DJ-1蛋白質の濃度が0〜100ng/mlの範囲で、抗原濃度と吸光度との関係について調べた。その結果を図６に示す。なお、図６（ａ）は実験方法の概要を模式的に示す図であり、図６（ｂ）は実験結果を示すグラフである。
【００７２】
図６から、D3805-2G1-110抗体を捕獲抗体、検出抗体の両方に使用した場合には、酸化型DJ-1蛋白質の濃度と吸光度との間に高い相関性があることが確認できた。この結果から、D3805-2G1-110抗体は酸化型DJ-1蛋白質に対する高い特異性を備えていることが分かった。
【実施例７】
【００７３】
７．抗体とペプチドによる分子間相互作用解析による認識部位の確認
D3805-2G1-110抗体、D3843-1C10-208抗体、D3707-13抗体が、酸化型DJ-1蛋白質の酸化に最も関連する106位のシステイン近傍を認識しているかを調べた。具体的には、ヒトDJ-1蛋白質の103位〜109位のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有するペプチドpep7又はそのシステイン残基を酸化させた酸化型ペプチドpep7oxとD3805-2G1-110抗体等との結合能を、表面プラズモン共鳴現象を利用するBiacore（登録商標）によって解析した。なお、pep7はペプチド合成装置で合成したものを使用し、pep7oxはpep7に過ギ酸を加えて37℃、15分間酸化処理したものを使用した。
【００７４】
まず、D3805-2G1-110抗体、D3843-1C10-208抗体、D3707-13抗体を、センサーチップ（Series S Sensor Chip CM5、GEヘルスケア・ジャパン）に固定し、抗体を固定したセンサーチップをBiacore（登録商標）BIACORE  T-100（GEヘルスケア・ジャパン）に挿入した。つぎに、HHBS-EP（0.01M HEPES、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005% Surfactant P20、pH7.4）緩衝液にpep7又はpep7oxが30μmol/lとなるように調製し、調製したpep7又はpep7ox 溶液をセンサーチップに10μml/minで流して、結合解離曲線を測定した。その結果を図７に示す。
【００７５】
図７から、何れの抗体もpep7よりpep7oxと強く結合していることが分かった。この結果から、D3805-2G1-110抗体、D3707-13抗体が、酸化型DJ-1蛋白質の106位のシステイン近傍を認識していることが、確認できた。一方、実験コントロールとして使用した酸化型DJ-1及び還元型DJ-1と反応するD3843-1C10-208抗体では、pep7及びpep7oxとの間に顕著な結合強度の違いは観察されなかった。この結果からD3843-1C10-208抗体は、Cys106以外の部位にエピトープがあると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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