(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列からなる、
突然変異熱ショックタンパク質１１０（ＨＳＰ１１０）。
【請求項２】
請求項１に記載の突然変異ＨＳＰ１１０をコードする配列を含む、単離された核酸。
【請求項３】
ガンを患っている患者の生存及び／又は前記患者の処置に対する反応を予測するためのバイオマーカーとしての、請求項１に記載の突然変異ＨＳＰ１１０の使用、及び／又は、該ＨＳＰ１１０をコードする遺伝子のイントロン８のスプライス受容部位に局在する１７個のチミジンヌクレオチドのマイクロサテライトリピートの使用。
【請求項４】
ガンを患っている患者の生存及び／又は前記患者の処置に対する反応を予測するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、
ａ）前記患者の生体サンプルにおける請求項１に記載の突然変異ＨＳＰ１１０の発現を測定する工程；及び／又は
ｂ）ＨＳＰ１１０をコードする遺伝子のイントロン８のスプライス受容部位に局在する１７個のチミジンヌクレオチドのマイクロサテライトリピートのチミジン反復の長さを決定する工程；及び、
ｃ）工程ａ）で測定した発現レベル及び／又は工程ｂ）で同定したチミジン欠失の長さを前記患者の予後に関連付け、それにより前記患者の予後を推定する工程
を含む、方法。
【請求項５】
ａ）ＨＳＰ１１０をコードする遺伝子のイントロン８のスプライス受容部位に局在する１７個のチミジンヌクレオチドのマイクロサテライトリピートのチミジン欠失の長さを決定する工程；及び、
ｂ）工程ａ）で同定したチミジン反復の長さを前記患者の予後に関連付け、それにより前記患者の予後を推定する工程
を含む、請求項４に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項６】
ａ）前記患者の生体サンプルにおける請求項１に記載の突然変異ＨＳＰ１１０の発現を測定する工程；及び、
ｂ）ネガティブコントロールサンプルにおける請求項１に記載の突然変異ＨＳＰ１１０の発現を測定する工程；
を含み、
工程ｂ）で測定した発現と比較して有意に高い工程ａ）で測定した突然変異ＨＳＰの発現が、生存予後が良好であること、及び／又は患者が処置に対して反応する可能性があることを示す、請求項４に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項７】
ａ）前記患者の生体サンプルにおける請求項１に記載の突然変異ＨＳＰ１１０の発現を測定する工程；
ｂ）前記生体サンプルにおける野生型ＨＳＰ１１０の発現を測定する工程；及び、
ｃ）工程ａ）及びｂ）で測定した発現を比較し、それにより前記患者の予後を推定する工程
を含む、請求項４に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項８】
腫瘍のＭＳＩ表現型を検査するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、
ａ）ＭＳＩ表現型を有するガンに罹患している可能性がある患者の生体サンプルにおけるＨＳＰ１１０をコードする遺伝子のイントロン８のスプライス受容部位に局在する１７個のチミジンヌクレオチドのマイクロサテライトリピートを遺伝子型決定する工程；及び、
ｂ）前記マイクロサテライトリピート上の不安定性の有無を検出する工程
を含み、
患者の生体サンプルにおける前記マイクロサテライトリピート上の不安定性の検出が、患者がＭＳＩ表現型を有するガンを患っていることを示す、方法。
【請求項９】
ＭＳＩ表現型を有する傾向があるガンを患っている被験体を処置するのに適切な治療計画を決定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、
前記患者の生体サンプルにおける熱ショックタンパク質１１０（ＨＳＰ１１０）をコードする遺伝子のイントロン８のスプライス受容部位に局在する１７個のチミジンヌクレオチドのマイクロサテライトリピートのチミジン反復の長さを決定する工程を含み、
前記チミジン反復の長さに基づいて、被験体に適切な治療計画が推定される、方法。
【請求項１０】
前記ガンが、結腸直腸ガン、胃ガン、子宮内膜ガン、膀胱ガン、尿路ガン、卵巣ガン、前立腺ガン、リンパ腫、白血病、膠芽細胞腫、星状細胞腫及び神経芽細胞腫からなる群より選択される、請求項４〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記ガンが、結腸直腸ガンである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
−  請求項１に記載の突然変異ＨＳＰ１１０の存在を検出するための手段、及び／又は、
−  ＨＳＰ１１０をコードする遺伝子のイントロン８のスプライス受容部位に局在する１７個のチミジンヌクレオチドのマイクロサテライトリピートの長さを検出するための手段
からなる、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、その基質結合ドメインを持たない突然変異熱ショックタンパク質１１０（ＨＳＰ１１０）であって、そのシャペロン活性を示さず、並びに／又は熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）及び／若しくは熱ショックタンパク質２７（ＨＳＰ２７）に結合できないが、野生型ＨＳＰ１１０に結合できる突然変異熱ショックタンパク質１１０（ＨＳＰ１１０）に関する。このような突然変異熱ショックタンパク質１１０は、（ｉ）ガン、より具体的にはマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）表現型を有する傾向があるガン、例えば結腸直腸ガン（ＣＲＣ）を患っている患者の生存及び／又は前記患者の処置に対する反応を予測するための方法において、並びに（ｉｉ）ガンを処置するのに使用できる。
【０００２】
ＨＳＰタンパク質及びＨＳＰ１１０
熱ショックタンパク（ＨＳＰ）はシャペロンタンパク質と称される機能的に関連したタンパク質のクラスであり、細胞が高温又はその他のストレス、例えば感染症、炎症、運動、毒素（多くのものの中でもエタノール、ヒ素、微量金属及び紫外線）への細胞曝露、飢餓、低酸素状態（酸素欠乏）、窒素欠乏（植物の場合）又は水欠乏に曝露された場合にその発現が増加する。その結果として、熱ショックタンパク質はストレスタンパク質とも称され、それらのアップレギュレーションがストレス反応の一部としてより一般的に説明されることもある。ＨＳＰタンパク質のシャペロン活性はそれらのＡＴＰ結合ドメインによって媒介されており、タンパク質の折り畳みに、タンパク質複合体の形成に、タンパク質の膜透過輸送に、及びそれらの一部をリソソーム分解にターゲティングするのに不可欠である。ヒトでは、ＨＳＰ７０及びＨＳＰ１１０を含む少なくとも８個のＨＳＰタンパク質がある。１９９０年代の中頃から、ＨＳＰ７０は、ガン細胞（細胞株及び腫瘍の両方）において、低分化度、転移傾向の高増殖能及び様々な細胞毒性剤への耐性と相関するパターンで多量に発現していることが公知である。
【０００３】
その他のストレス誘導性ＨＳＰと同様に、ＨＳＰ１０５とも称されるＨＳＰ１１０は、悪条件から細胞を保護する。しかしながら、酵母及びDrosophilaの両方においてｈｓｐ１１０遺伝子ノックアウトは致死的であるので、ＨＳＰ１１０は特定の重要な機能も提供する（Trott et al., Genetics 170 (3), 1009 (2005)）。ＨＳＰ１１０は、ＨＳＰ７０ヌクレオチド交換因子として作用するだけではなく（Andreasson et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105 (43), 16519 (2008)）、シャペロン抗凝集活性も有する。それは、変性タンパク質基質の結合及び安定化について、ＨＳＣ７０及びＨＳＰ７０と比較して約４倍超効率的である（Wang et al., Cancer research 63 (10), 2553 (2003)）。また、ＨＳＰ１１０はＨＳＰ７０誘導因子として作用し、それにより、有害なストレス因子からの細胞保護においてＨＳＰ７０と一緒に重要な役割を果たすことができることも公知である。最近、ＨＳＰ１１０はガン細胞で異常に蓄積することが実証されたが、これがそれらの生存を高めると考えられている（Yamagishi et al., The FEBS journal 275 (18), 4558 (2008); Hosaka et al., Cancer science 97 (7), 623 (2006); Yamagishi et al., Experimental cell research 312 (17), 3215 (2006); Siatskas et al., Faseb J 19 (12), 1752 (2005)）。ＨＳＰ１１０は結腸ガン細胞で特に強く発現しており（Kai et al., Oncology reports 10 (6), 1777 (2003)）、マイクロサテライト安定性（ＭＳＳ）原発性結腸直腸ガン（ＣＲＣ）の遺伝子発現プロファイル分析により、ＨＳＰ１１０の発現が転移及び予後不良に関連付けられている（Slaby et al., Oncology reports 21 (5), 1235 (2009)）。
【０００４】
マイクロサテライト不安定性表現型及びマイクロサテライト安定性表現型
一部のガンは、特に、ＭＭＲ遺伝子ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６及びＰＭＳ２の変化を不活性化するので、ミスマッチ修復（ＭＭＲ）欠損を特徴とする。その結果として、これらの腫瘍は、マイクロサテライト反復配列に影響を与える全体的な不安定現象を特徴とする「マイクロサテライト不安定性」又は「ＭＳＩ」と称される特定の表現型を示す。ＭＳＩ表現型を有する腫瘍は、リンチ症候群又は体質性ミスマッチ修復欠損（ＣＭＭＲ−Ｄ）などの珍しい遺伝性症候群と関連して発生し得るか、又は結腸直腸ガン、胃ガン及び子宮内膜ガンの１０〜１５％で、及び多くのその他の腫瘍ではそれよりも少ない程度で散発的に発生し得る（Duval and Hamelin, Annales de genetique 45: 71-75 (2002)）。
【０００５】
リンチ症候群は、ＤＮＡ複製時のミスマッチ修復に関与する「ＭＭＲ遺伝子」と称される４個の遺伝子ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＰＭＳ２のうちの１個の常染色体突然変異が原因である。リンチ症候群を患っている患者は、結腸ガン、並びに子宮内膜、卵巣、胃、小腸、肝臓、上部泌尿器系、脳及び皮膚を侵す様々なガンを成人期に発症する７０％のリスクを有する。
【０００６】
その上、ＣＭＭＲ−Ｄ／リンチ３症候群は、ＭＭＲ遺伝子の有害な生殖細胞両アレル突然変異が原因であり（Ricciardone et al., Cancer Res. 59: 290-3 (1999); Wang et al., Cancer Res. 59: 294-7 (1999)）、小児腫瘍、及び患者ごとに非常に異なる幅広い臨床症状の発生を特徴とする。腫瘍は、主に、リンパ腫、白血病、星状膠細胞に由来する脳腫瘍及び／又は非常に早期に発症する結腸直腸腫瘍である。コールサインと称されるその他の兆候、例えば非定型「カフェ・オ・レ」スポットはＣＭＭＲ−Ｄ患者で高頻度に観察されるが、一般集団の健常者にも存在する。たとえ特異的ではなくても、それらにより、一般集団におけるＣＭＭＲ−Ｄ症候群のリスクがある個体をガンの発生前に認識できる。
【０００７】
結腸直腸ガン、胃ガン又は子宮内膜ガンなどの散発性ＭＳＩガンでは、ＭＭＲ欠損は、腫瘍の原発部位にかかわらず、症例の９０％超において、ＭＬＨ１の両アレルがそのプロモーター部位のｄｅ  ｎｏｖｏメチル化によってエピジェネティックにサイレンシングされることが原因である（Kane et al., Cancer Research 57: 808-811 (1997)）。散発性ＭＳＩガンは、結腸直腸ガン、胃ガン又は子宮内膜ガンに限定されず、膀胱ガン、尿路ガン、卵巣ガン、前立腺ガン、リンパ腫、白血病、膠芽細胞腫、星状細胞腫及び神経芽細胞腫を含み得る。
【０００８】
ＭＭＲ系の正常機能は、ＤＮＡの複製及び組換え時に生じる塩基の誤った挿入、欠失及び誤取り込みを認識及び修復すること、並びにある種のＤＮＡ損傷を修復することである。ＭＭＲ欠損はそれ自体が直接のトランスフォーメーション事象ではないこと、及びＭＳＩ腫瘍は、ゲノム全体にわたる多数のマイクロサテライトリピート配列の遺伝的不安定性を特徴とする特徴的な分子経路を介して発症することが現在では十分に確立されている（Duval and Hamelin, Cancer research 62 (9), 2447 (2002)）。ＭＳＩ発ガン現象の根底にある機序について発表された論文の大多数は、結腸直腸ガン（ＣＲＣ）の研究に関するものである。これらにより、ＭＳＩ  ＣＲＣには、ＣＩＮ（「染色体不安定性」（「マイクロサテライト安定性」）の場合にＭＳＳとも称される）と称される主な腫瘍型に代わる特徴的な一群が含まれていたことが明らかになった（Walther et al., Gut 57 (7), 941 (2008)）。コーディングリピートにおける遺伝的不安定性に加えて、ＭＳＩ腫瘍細胞は、ゲノム全体にわたって何百もの非コーディングマイクロサテライトリピートの変異を蓄積する（Giannini et al., Oncogene 23 (15), 2640 (2004)）が、発ガン現象におけるこれらの突然変異の機能的結果は、いまだに十分に調査されていない。
【０００９】
既知の腫瘍のＭＳＩの状態は、５個の遺伝子マイクロサテライトマーカー：ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、ＮＲ２１、ＮＲ２４及びＮＲ２７のパネルにおいてマイクロサテライト不安定性を見ることによって決定され得る。これらのマーカーの２個以上に不安定性を有する腫瘍は、ＭＳＩ−Ｈｉｇｈ（ＭＳＩ−Ｈ）であると定義したのに対して、１個のマーカーに不安定性を有するか、又は不安定性を示さない腫瘍は、ＭＳＩ−Ｌｏｗ（ＭＳＩ−Ｌ）及びマイクロサテライト安定性（ＭＳＳ）腫瘍とそれぞれ定義した。ＭＳＩ−Ｈガンは、ＭＳＩ−Ｌ及びＭＳＳ腫瘍と区別可能な臨床病理学的特徴を有し（ＭＳＩ−Ｌ及びＭＳＳ腫瘍は、同じ臨床的及び分子的な特徴を有するとみなされる）、ＭＳＩ−Ｈ及びＭＳＩ−Ｌ／ＭＳＳ腫瘍の間の区別は、それらの予後及び処置に重要である（Duval and Hamelin, Annales de genetique 45: 71-75 (2002)）。例えば、結腸直腸ガンのＭＳＩの状態（すなわち、腫瘍をＭＳＩ−Ｈ又はＭＳＩ−Ｌ／ＭＳＳとして分類すること）は、第ＩＩ病期及び第ＩＩＩ病期結腸ガンにおいてフルオロウラシルによる補助化学療法に恩恵があることの予測因子であることが公知である（Ribic et al., N Engl J Med 349:247 (2003)）。従って、結腸直腸腫瘍を同定し、ＭＳＩの状態に分類することは、患者の診断、予後及び最適な処置計画についての重要情報を医師に提供する。
【００１０】
現在、ＭＳＩガンは識別可能な腫瘍実体を表すと考えられているが、これらの腫瘍内で見られる独特な様式の細胞トランスフォーメーションを考慮した特異的な治療アプローチは依然としてない。また、ＭＳＩ  ＣＲＣは、異なる予後及び化学療法剤に対する反応を示すことが一貫して報告されており（Sargent et al., J Clin Oncol 28 (20), 3219 (2010); Zaanan et al., Ann Oncol 21 (4), 772 (2010)）、依然としてこれらを評価することができない。
【００１１】
従って、ガン、より具体的にはＭＳＩ表現型を有する傾向があるガンに罹患した患者の生存を予測するための、及び治療に対する前記患者の反応を評価するためのマーカーを同定することの必要性がある。ＭＳＩ及びＭＳＳガンの臨床的及び分子的な特異性を考慮して、ＭＳＩ及びＭＳＳガンに特に適した処置を開発することの必要性もある。
【００１２】
発明の説明
驚くべきことに、本発明者らは、ＭＳＩ  ＣＲＣ細胞株及び原発性腫瘍又は腺腫において、エクソン９を持たず、従って野生型ＨＳＰ１１０の３８１位〜８５８位のアミノ酸を持たない異常スプライシングされたｍＲＮＡから作成された突然変異型のＨＳＰ１１０タンパク質を同定した。本発明者らはまた、ＨＳＰＨ１遺伝子（すなわち、ＨＳＰ１１０タンパク質をコードする遺伝子）のイントロン８のスプライス受容部位に局在する１７個のチミジンヌクレオチドのマイクロサテライトリピートに影響を与える欠失を同定した。前記マイクロサテライトリピートに影響を与える欠失の長さは、突然変異ＨＳＰ１１０のｍＲＮＡ又はタンパク質の発現レベルと相関することが見出されたことにより、マイクロサテライトリピートの欠失は、突然変異ＨＳＰ１１０の異常発現につながる原因事象であることが示唆されている。また、突然変異ＨＳＰ１１０の発現は、ＨＳＰ１１０の正常な細胞局在及びその他のＨＳＰとのその相互作用の両方を妨げるので、そのシャペロン活性及びその抗アポトーシス機能をドミナントネガティブに抑制することが見出された。
【００１３】
驚くべきことに、突然変異ＨＳＰ１１０は、その抗アポトーシス特性だけではなく野生型ＨＳＰ１１０との結合性も喪失しなかったので、野生型ＨＳＰ１１０の抗アポトーシス機能を用量依存的に遮断することが見出された。すなわち、突然変異ＨＳＰ１１０タンパク質は、ドミナントネガティブ突然変異体である。
【００１４】
いかなる理論にも束縛されないが、本発明者らは、突然変異ＨＳＰ１１０の発現レベルが野生型ＨＳＰ１１０の発現レベルと同程度か又はそれよりも高い場合に特に観察される突然変異ＨＳＰ１１０のプロアポトーシス効果が、各突然変異ＨＳＰ１１０分子が１個の野生型ＨＳＰ１１０分子と複合体を形成し、それにより野生型ＨＳＰ１１０の活性をドミナントネガティブに中和するという事実によるものであると考える。その結果として、突然変異ＨＳＰ１１０を発現する細胞は、アポトーシス、特に化学療法薬物によって誘導されるアポトーシスに対してより感受性である。
【００１５】
その結果として、アポトーシス及び／又は化学療法薬物に対する感受性を高めるために、ガン、特にＭＳＩ又はＭＳＳ表現型を有するガン、より具体的には結腸直腸ガンを患っている患者に突然変異ＨＳＰ１１０を投与できる。
【００１６】
加えて、突然変異ＨＳＰ１１０の発現プロファイルは、生存及び処置に対する反応を予測するための信頼できる初期マーカーとして使用できることが見出された。実際、突然変異ＨＳＰ１１０の高い発現レベルは、良好な予後及び処置に対する肯定的な反応と相関する。
【００１７】
定義
「野生型ＨＳＰ１１０」という用語は、熱ショック１１０kDaタンパク質を指す。野生型ＨＳＰ１１０のアミノ酸配列は、配列番号２（Swiss-ProtアクセッションナンバーＱ９２５９８、２０１１年３月８日アップデート、バージョン１１９）として示される。「野生型ＨＳＰ１１０」という用語は、配列番号２のタンパク質（完全長及び成熟アイソフォーム）、並びにその他の種におけるホモログ、タンパク質分解プロセシングによって得られた変異体、そのスプライス変異体及びアレル変異体を包含する。
【００１８】
「ガン」という用語は、制御されていない細胞成長を典型的な特徴とする哺乳動物の生理的状態を指すか、又は前記状態を説明するものである。前記ガンは散発性ガンでもよいし、遺伝性ガンでもよい。前記ガンは腺腫（すなわち、悪性に発展し得るか又は悪性になり得る良性腫瘍）でもよいし、悪性腫瘍（すなわち、原発性腫瘍又は転移性腫瘍）でもよい。ガンの例としては、限定されないが、肉腫、ガン腫、白血病、リンパ腫、生殖細胞腫瘍及び芽細胞腫が挙げられる。
【００１９】
好ましい実施態様では、前記ガンは、ＭＳＩ表現型を有する傾向があるガンである。「ＭＳＩ表現型を有する傾向があるガン」は、散発性ガン又は遺伝性ガンを指し、マイクロサテライト不安定性は有ってもよいし（ＭＳＩ）、無くてもよい（ＭＳＳ）。例えば、マイクロサテライト不安定性が有るか否かの検出は、例えばBuhard et al., J Clin Oncol 24 (2), 241 (2006)及び欧州特許出願第ＥＰ１１３０５１６０．１号に記載されているように、ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、ＮＲ２１、ＮＲ２４及びＮＲ２７などのマイクロサテライトマーカーを遺伝子型決定することによって実施され得る。不安定性が少なくとも２個のマイクロサテライトマーカーで検出される場合、ガンはＭＳＩ表現型を有すると定義される。反対に、不安定性が１個のマイクロサテライトマーカーで検出されるか、又はいかなるマイクロサテライトマーカーでも検出されない場合、前記ガンはＭＳＳ表現型を有する。
【００２０】
ＭＳＩ表現型を有する傾向があるガンの例としては、結腸直腸ガン（結腸ガン又は大腸ガンとも称される）、胃ガン、子宮内膜ガン、膀胱ガン、尿路ガン、卵巣ガン、前立腺ガン、リンパ腫、白血病、膠芽細胞腫、星状細胞腫及び神経芽細胞腫などの腺腫又は原発性腫瘍が挙げられる。好ましくは、ガンは、結腸直腸ガンである。さらに好ましくは、ガンは、第ＩＩ病期又は第ＩＩＩ病期結腸直腸ガンである。
【００２１】
ＭＳＩ表現型を有する傾向がある散発性ガンは、ミスマッチ修復（ＭＭＲ）遺伝子ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６及びＰＭＳ２のうちの１個の体細胞遺伝子変異が原因のガンを指し得る。例えば、ＭＳＩ表現型を有する傾向がある散発性ガンは、ＭＬＨ１遺伝子プロモーターの両アレルのｄｅ  ｎｏｖｏメチル化が原因のガンであり得る。
【００２２】
ＭＳＩ表現型を有する傾向がある遺伝性ガンは、リンチ症候群又は体質性ミスマッチ修復欠損（ＣＭＭＲ−Ｄ）と関連して発生するガンを指し得る。
【００２３】
リンチ症候群を患っている患者は、４個の遺伝子ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＰＭＳ２のうちの１個に常染色体突然変異を有する患者と定義される。
【００２４】
ＣＭＭＲ−Ｄを患っている患者は、４個の遺伝子ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＰＭＳ２のうちの１個に生殖細胞両アレル突然変異を有する患者と定義される。
【００２５】
「第ＩＩ病期結腸直腸ガン」は、リンパ節に広がっておらず、遠隔浸潤していない腫瘍を意味する（American Joint Comittee on Cancer" 2010, Chap. 14. p. 173-201）。
【００２６】
「第ＩＩＩ病期結腸直腸ガン」は、リンパ節に広がっている腫瘍を意味する（American Joint Comittee on Cancer" 2010, Chap. 14. p. 173-201）。
【００２７】
本明細書において使用される場合、患者は、ヒト又は非ヒト哺乳動物、特に齧歯類、ネコ科、イヌ科、ウシ又はヒツジの哺乳動物である。好ましい実施態様では、患者は、ヒト患者である。より具体的には、患者は、子供、成人、男性又は女性である。
【００２８】
「処置」は、限定されないが、化学療法処置及び／又は放射線療法処置及び／又は外科的処置を意味する。本明細書において使用される場合、「処置」という用語は、例えば、患者の状態を治癒、改善すること、及び／又はガンを患っている患者の寿命を延ばすことを目的とする治療方法を包含する。それはまた、転移の発生又は拡散を予防することを目的とする方法、及び再燃を予防することを目的とする方法などの予防方法を包含する。例えば、化学療法処置は、例えばオキサリプラチンなどのアルキル化剤を用いて実施され得る。化学療法処置はまた、補助化学療法処置、例えば５−フルオロウラシル剤を使用する化学療法処置でもよい。いくつかの実施態様では、前記化学療法処置は、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又は多くとも１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個の薬剤を組み合わせ得る（例えば、オキサリプラチン、５−フルオロウラシル及びホリニン酸の組み合わせ（すなわち、ＦＯＬＦＯＸ処置）又は５−フルオロウラシル及びホリニン酸の組み合わせ（すなわち、ＦＵＦＯＬ又はＬＶ５ＦＵ２処置）など）。
【００２９】
本明細書において使用される場合、「熱ショックタンパク質１１０（ＨＳＰ１１０）をコードする遺伝子のイントロン８のスプライス受容部位に局在する１７個のチミジンヌクレオチドのマイクロサテライトリピート」という用語は、配列番号９：
【化１】
0006045563.tif 000002
の配列の位置７３〜位置８９の間に含まれるチミジン反復を指す。
【００３０】
突然変異熱ショックタンパク質１１０
本発明の第１の態様は、突然変異熱ショックタンパク質１１０（ＨＳＰ１１０）であって、
ａ）シャペロン活性を示さず、及び／又は熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）及び／若しくは熱ショックタンパク質２７（ＨＳＰ２７）に結合できず；並びに
ｂ）配列番号２の野生型ＨＳＰ１１０タンパク質に結合できる、
突然変異熱ショックタンパク質１１０（ＨＳＰ１１０）である。
【００３１】
好ましい実施態様では、突然変異ＨＳＰ１１０タンパク質は、配列番号２の３８１位〜８５８位のアミノ酸からなるドメインを持たない。別の好ましい実施態様では、突然変異ＨＳＰ１１０タンパク質は、エクソン９を持たないｍＲＮＡによってコードされる。ＨＳＰ１１０をコードする遺伝子のエクソン９は、例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００６６４４．２（２０１０年１２月２７日に公開されたバージョン）の位置１５３６〜１６４２に記載されている。
【００３２】
別の好ましい実施態様では、突然変異ＨＳＰ１１０タンパク質は、配列番号１と少なくとも８０％、好ましくは配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなる。最も好ましくは、突然変異ＨＳＰ１１０タンパク質は、配列番号１を含むか、又は配列番号１からなる。
【００３３】
例えば、本発明のクエリアミノ酸配列と少なくとも９５％「同一」のアミノ酸配列を有するタンパク質は、サブジェクトタンパク質配列がクエリアミノ酸配列の各１００アミノ酸あたり最大５個のアミノ酸変異を含み得ることを除いて、サブジェクトタンパク質のアミノ酸配列がクエリ配列と同一であることを意図する。換言すれば、クエリアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質を得るために、サブジェクト配列における最大５％（１００個のうちの５個）のアミノ酸残基が挿入されてもよいし、欠失されてもよいし、又は別のアミノ酸で置換されてもよい。
【００３４】
本出願の枠組みにおいて、同一性のパーセンテージは、グローバルアライメントを使用して計算される（すなわち、２個の配列は、それらの全長にわたって比較される）。２個以上の配列の同一性及び相同性を比較するための方法は、当技術分野において周知である。例えば、＜＜ニードル＞＞プログラムが使用され得るが、これは、Needleman-Wunschのグローバルアライメントアルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970 J. Mol. Biol. 48:443-453）を使用して、２個の配列の全長を考慮した場合のそれらの最適なアライメント（ギャップを含む）を見出すものである。ニードルプログラムは、例えば、ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋワールドワイドウェブサイトで利用可能である。本発明による同一性のパーセンテージは、好ましくは、EMBOSS：：ニードル（グローバル）プログラムを使用して、「ギャップオープン」パラメータ＝１０．０、「ギャップエクステンド」パラメータ＝０．５、及びBlosum62マトリックスで計算される。
【００３５】
参照配列と「少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一」のアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなるタンパク質は、参照配列と比較して、欠失、挿入及び／又は置換などの突然変異を含み得る。置換の場合、置換は、好ましくは、以下の表に示される保存的置換に対応する。好ましい実施態様では、参照配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなるタンパク質は、保存的置換によって参照配列と異なるのみである。別の好ましい実施態様では、参照配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなるタンパク質は、参照配列の天然に存在するアレル変異体に対応する。さらに別の好ましい実施態様では、参照配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなるタンパク質は、参照配列とは別の非ヒト哺乳動物種に由来する相同配列に対応する。
【００３６】
【表１】
0006045563.tif 000003
【００３７】
本発明の突然変異ＨＳＰ１１０タンパク質は、シャペロン活性を示さず、及び／又は熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）及び／若しくは熱ショックタンパク質２７（ＨＳＰ２７）に結合できないが、それらは配列番号２の野生型ＨＳＰ１１０タンパク質に結合できる。
【００３８】
「シャペロン活性」は、限定されないが、タンパク質の折り畳み、タンパク質複合体の形成、タンパク質の膜貫通輸送、及びそれらの一部のリソソーム分解へのターゲティングを可能にする能力を意味する。当業者であれば、突然変異ＨＳＰ１１０がシャペロン活性を有するか否かを容易に決定できる。例えば、シャペロン活性は、実施例１の「ＨＳＰ１１０のシャペロン活性」という表題の段落に記載されているように、タンパク質熱不安定性アッセイを使用して決定され得る。
【００３９】
本明細書全体を通して、「結合」という用語は、当技術分野におけるその通常の意味を有する。特に、「結合」という用語は、非特異的な結合とは反対に、特異的な結合を指す。当業者であれば、突然変異ＨＳＰ１１０がＨＳＰ７０、ＨＳＰ２７及び／又は野生型ＨＳＰ１１０に結合できるか否かを容易に決定できる。例えば、突然変異ＨＳＰ１１０がＨＳＰ７０、ＨＳＰ２７及び／又は野生型ＨＳＰ１１０に結合する能力は、実施例１の「免疫沈降及びウエスタンブロッティング」という表題の段落に記載されているように、免疫沈降アッセイによって決定され得る。
【００４０】
本発明はさらに、配列番号１と少なくとも８０％同一、好ましくは配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなる突然変異ＨＳＰ１１０タンパク質のフラグメントに関するが、ただし前記フラグメントは、突然変異ＨＳＰ１１０タンパク質と同じ生物学的活性を保持する（すなわち、それらはシャペロン活性を示さず、及び／又はＨＳＰ７０及び／若しくはＨＳＰ２７に結合できないが、それらは配列番号２の野生型ＨＳＰ１１０タンパク質に結合できる）。これらのフラグメントは、好ましくは、上記突然変異ＨＳＰ１１０タンパク質の少なくとも５個の隣接する（連続する）アミノ酸を含むか、又は前記アミノ酸からなる。好ましくは、フラグメントは、突然変異ＨＳＰ１１０の少なくとも６個、８個、１０個、１２個、１５個、１８個、２０個、２５個、３０個、５０個、７５個、１００個、１２５個、１５０個、２００個、２５０個、２７５個、３００個、３２５個、３５０個、３７５個の連続するアミノ酸を含むか、又は前記アミノ酸からなる。また好ましくは、フラグメントは、ペプチドである（すなわち、それは、多くとも５０個のアミノ酸からなる）。
【００４１】
本発明はまた、本発明の突然変異ＨＳＰ１１０タンパク質又はフラグメントのペプチド模倣体に関する。本明細書において使用される場合、＜＜ペプチド模倣体＞＞という用語は、本発明の突然変異ＨＳＰ１１０タンパク質の生物学的作用を模倣する非ペプチド構造要素を含有する化合物を指す。既知タンパク質のペプチド模倣体を設計及び合成するための方法は当技術分野において周知であり、例えば、Ripka and Rich, Curr Opin Chem Biol 2(4):441-52 (1998)及びPatch and Barron, Curr Opin Chem Biol 6(6):872-7 (2002)に記載されている方法が挙げられる。
【００４２】
本発明はさらに、上記突然変異ＨＳＰ１１０をコードする配列を含むか、又は前記配列からなる単離された核酸を対象とする。
【００４３】
好ましい実施態様では、単離された核酸は、配列番号３と少なくとも８０％同一、好ましくは配列番号３と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のヌクレオチド配列を含むか、又は前記ヌクレオチド配列からなり、より好ましくは、単離された核酸は、配列番号３を含むか、又は配列番号３からなる。
【００４４】
「核酸分子」は、リン酸エステルポリマー型のリボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジン又はシチジン；「ＲＮＡ分子」）若しくはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン又はデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）、又はそれらのあらゆるリン酸エステル類似体、例えばホスホロチオエート及びチオエステルの一本鎖型又は二本鎖へリックスのいずれかを指す。ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ及びＲＮＡ−ＲＮＡの二本鎖へリックスが可能である。核酸分子、特にＤＮＡ又はＲＮＡ分子という用語は、分子の１次構造及び２次構造のみを指し、それをあらゆる特定の３次形態に限定するものではない。従って、この用語は、二本鎖ＤＮＡラウンド、とりわけ、直鎖状（例えば、制限フラグメント）又は環状のＤＮＡ分子、プラスミド及び染色体を含む。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造について議論する場合、配列は、ＤＮＡの非転写鎖（すなわち、ｍＲＮＡと相同の配列を有する鎖）に沿って５’から３’の方向にある配列のみを示す通常の慣習に従って記載され得る。「リコンビナントＤＮＡ分子」は、分子生物学的操作を受けたＤＮＡ分子である。
【００４５】
本発明の別の態様は、本発明の核酸分子を含むベクター、例えば発現ベクターを提供する。別の実施態様では、本発明は、このようなベクターを含有及び／又は発現するホスト細胞（例えば、細菌、酵母、真菌又は哺乳動物のホスト細胞）を提供する。本発明はまた、適切な培地中でこのような本発明のホスト細胞を培養することによって、本発明のリコンビナント突然変異ＨＳＰ１１０タンパク質を製造するための方法を提供する。前記方法は、本発明のリコンビナント突然変異ＨＳＰ１１０を精製する工程、及び場合によりそれを医薬組成物に製剤化する工程をさらに含み得る。
【００４６】
このような核酸は、アデノウイルスベクターを使用して、及び／又は遺伝子治療の枠組みで患者に投与されるためのものである。
【００４７】
本発明はまた、本発明の突然変異ＨＳＰ１１０タンパク質を特異的に認識する抗体に関する。
【００４８】
いくつかの実施態様では、前記抗体は、本発明の突然変異ＨＳＰ１１０タンパク質を認識できるが、野生型ＨＳＰ１１０タンパク質、例えば配列番号２の配列の野生型ＨＳＰ１１０タンパク質を認識できない。
【００４９】
好ましくは、前記抗体は、配列番号１の配列の突然変異ＨＳＰ１１０タンパク質を認識できる。
【００５０】
ターゲットタンパク質に「特異的に結合」する抗体は、その他のタンパク質又はエピトープ、さらに密接に関連するタンパク質又はエピトープに対するよりも高いアフィニティ及び／又はアビディティで、前記ターゲットタンパク質に結合する。好ましくは、本発明の抗体は、それが配列番号２の配列の野生型ＨＳＰ１１０タンパク質に結合するよりも高いアフィニティ及び／又はアビディティで、本明細書において記載される突然変異ＨＳＰ１１０タンパク質、例えば配列番号１の配列を含むか、又は配列番号１の配列からなるタンパク質に結合する。典型的には、抗体は、突然変異ＨＳＰ１１０をリガンドとして及び抗体を分析物として使用してBIAcore 3000機器で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって測定した場合に、約１０−７Ｍ以下、例えば約１０−８Ｍ以下、例えば約１０−９Ｍ以下、約１０−１０Ｍ以下若しくは約１０−１１Ｍ又はさらにそれ未満のＫＤに相当するアフィニティで結合する。抗体は、非特異的な抗原（例えば、野生型ＨＳＰ１１０、ＢＳＡ、カゼイン）に結合するアフィニティよりも少なくとも１０倍低い、例えば少なくとも１００倍低い、例えば少なくとも１０００倍低い、例えば少なくとも１０，０００倍低い、例えば少なくとも１００，０００倍低いＫＤに相当するアフィニティで、ターゲットに結合し得る。アフィニティが低くなる量は抗体のＫＤに依存し、その結果、抗体のＫＤが非常に低い（すなわち、抗体が高特異的である）場合、抗原に対するアフィニティが非特異的な抗原に対するアフィニティよりも低い量は、少なくとも１０，０００倍であり得る。
【００５１】
「抗原を認識する抗体」及び「抗原に特異的な抗体」という語句は、本明細書において、「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と互換的に使用される。
【００５２】
本明細書において使用される場合、「ｋｄ」（ｓｅｃ−１）という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の解離平衡速度定数を指すことを意図する。前記値は、ｋｏｆｆ値とも称される。
【００５３】
本明細書において使用される場合、「ｋａ」（Ｍ−１×ｓｅｃ−１）という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の結合平衡速度定数を指すことを意図する。
【００５４】
本明細書において使用される場合、「ＫＤ」（Ｍ）という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の解離平衡定数を指すことを意図する。
【００５５】
本明細書において使用される場合、「ＫＡ」（Ｍ−１）という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の結合平衡定数を指すことを意図し、ｋａをｋｄで割ることによって得られる。
【００５６】
本明細書において使用される場合、「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体のクラス（例えば、ＩｇＧ１、ｌｇＧ２、ｌｇＧ３、ｌｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ又はＩｇＭ）を指す。
【００５７】
「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子を指す。このようなものとして、抗体という用語は、全抗体分子だけではなく、抗体フラグメント及び抗体の変異体（ヒト化抗体などの誘導体を含む）を包含する。天然の抗体では、２つの重鎖はジスルフィド結合によって互いに連結されており、各重鎖はジスルフィド結合によって軽鎖に連結されている。２種類の軽鎖、すなわちラムダ（λ）及びカッパ（κ）がある。抗体分子の機能的活性を決定する５つの主な重鎖クラス（又はアイソタイプ）がある：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥ。各鎖は、異なる配列ドメインを含有する。軽鎖は、２つのドメイン、すなわち可変ドメイン（ＶＬ）及び定常ドメイン（ＣＬ）を含む。重鎖は、４つのドメイン、すなわち１つの可変ドメイン（ＶＨ）及び３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３（まとめてＣＨと称される）を含む。軽鎖（ＶＬ）及び重鎖（ＶＨ）の両方の可変領域は、抗原への結合認識及び特異性を決定する。軽鎖（ＣＬ）及び重鎖（ＣＨ）の定常領域ドメインは、重要な生物学的特性、例えば抗体鎖会合、分泌、経胎盤移動、補体結合、及びＦｃ受容体（ＦｃＲ）への結合を付与する。Ｆｖフラグメントは、免疫グロブリンのＦａｂフラグメントのＮ末端部分であり、１つの軽鎖及び１つの重鎖の可変部分からなる。抗体の特異性は、抗体結合部位と抗原決定基との間の構造的相補性にある。抗体結合部位は、主に超可変領域又は相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基で構成される。時折、非超可変領域又はフレームワーク領域（ＦＲ）からの残基は、ドメイン構造全体に影響を与えるので、結合部位に影響を与える。相補性決定領域（ＣＤＲ）は、ネイティブな免疫グロブリン結合部位の天然のＦｖ領域の結合アフィニティ及び特異性を一緒に規定するアミノ酸配列を指す。免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖はそれぞれ、３つのＣＤＲを有する（それぞれＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、Ｌ−ＣＤＲ３及びＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３と命名される）。従って、抗原結合部位は、重鎖及び軽鎖の各Ｖ領域からのＣＤＲセットを含む６つのＣＤＲを含む。
【００５８】
フレームワーク領域（ＦＲ）は、ＣＤＲの間に介在するアミノ酸配列、すなわち、Kabatら（Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991）によって定義されているように、単一種における異なる免疫グロブリンの間で比較的保存されている免疫グロブリン軽鎖及び重鎖の可変領域の一部分を指す。本明細書において使用される場合、「ヒトフレームワーク領域」は、天然に存在するヒト抗体のフレームワーク領域と実質的に同一（約８５％以上、特に９０％、９５％又は１００％）のフレームワーク領域である。
【００５９】
本明細書において使用される場合、「モノクローナル抗体」又は「ｍＡｂ」という用語は、特異的な抗原に対する単一アミノ酸組成の抗体分子であって、Ｂ細胞の単一クローン又はハイブリドーマによって産生され得る抗体分子を指す。モノクローナル抗体はまた、リコンビナント、すなわち、タンパク質工学によって製造され得る。
【００６０】
「キメラ抗体」という用語は、非ヒト動物に由来する抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインが、別の抗体、特にヒト抗体のＣＨドメイン及びＣＬドメインに結合したものを含む人工的な抗体を指す。非ヒト動物として、マウス、ラット、ハムスター、ウサギなどの任意の動物が使用され得る。キメラ抗体はまた、少なくとも２つの異なる抗原に対する特異性を有する多重特異性抗体を意味する。
【００６１】
「ヒト化抗体」という用語は、フレームワーク又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）が、親免疫グロブリンの特異性と比較して異なる特異性のドナー免疫グロブリンからのＣＤＲを含むように改変された抗体を指す。好ましい実施態様では、マウスのＣＤＲをヒト抗体のフレームワーク領域に移植して、「ヒト化抗体」を調製する。
【００６２】
「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体の一部分、好ましくはインタクトな抗体の抗原結合領域又は可変領域を含む。抗体フラグメントの例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、ダイアボディ、及び抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が挙げられる。
【００６３】
「Ｆａｂ」という用語は、約５０，０００の分子量及び抗原結合活性を有する抗体フラグメントであって、ＩｇＧをプロテアーゼ（パパイン）で処理することによって得られるフラグメントのうち、Ｈ鎖のＮ末端側の約半分及びＬ鎖全体がジスルフィド結合により一緒に結合されている抗体フラグメントを意味する。
【００６４】
「Ｆ（ａｂ’）２」という用語は、約１００，０００の分子量及び抗原結合活性を有する抗体フラグメントであって、ＩｇＧをプロテアーゼ（ペプシン）で処理することによって得られるフラグメントのうち、ヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されるＦａｂよりもわずかに大きい抗体フラグメントを指す。
【００６５】
「Ｆａｂ’」という用語は、約５０，０００の分子量及び抗原結合活性を有する抗体フラグメントであって、Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することによって得られる抗体フラグメントを指す。
【００６６】
一本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）ポリペプチドは、共有結合されたＶＨ：：ＶＬヘテロダイマーであって、通常は、ペプチドをコードするリンカーによって連結されたＶＨ及びＶＬをコードする遺伝子を含む遺伝子融合体から発現されるものである。本発明のヒトｓｃＦｖフラグメントは、好ましくは、遺伝子組換え技術を使用することによって適切なコンフォメーションで保持されているＣＤＲを含む。「ｄｓＦｖ」は、ジスルフィド結合によって安定化されたＶＨ：：ＶＬヘテロダイマーである。二価及び多価抗体フラグメントは、一価ｓｃＦｖの会合によって自然に形成し得るか、又はペプチドリンカーによって一価ｓｃＦｖをカップリングすることによって作成され得る（例えば、二価ｓｃ（Ｆｖ）２）。
【００６７】
「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメントであって、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が同じポリペプチド鎖中で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結されたもの（ＶＨ−ＶＬ）を含む抗体フラグメントを指す。同じ鎖上で２つのドメイン間をペアリングさせるには短いリンカーを使用することによって、ドメインを別の鎖の相補ドメインとペアリングさせ、２つの抗原結合部位を作らせる。
【００６８】
本発明の予測方法及び予測用途
ＭＳＩ  ＣＲＣにＨＳＰ１１０をコードする遺伝子のイントロン８のスプライス受容部位に局在する１７個のチミジンのマイクロサテライトリピートにヌクレオチドの欠失があること、及び突然変異ＨＳＰ１１０が存在すること、及び欠失の長さが突然変異ＨＳＰ１１０の発現に影響を与えることが見出された。より正確には、３個のチミジンの欠失が突然変異ＨＳＰ１１０のｍＲＮＡ及びタンパク質の低発現と相関したこと、及び８個のチミジンの欠失が突然変異ＨＳＰ１１０のｍＲＮＡ及びタンパク質の高発現と相関することが見出された。突然変異ＨＳＰ１１０の発現レベルが、生存予後及び／又は処置に対する反応の予測と相関することも見出された。また、突然変異ＨＳＰ１１０は、野生型ＨＳＰ１１０と複合体をドミナントネガティブに形成するので、その抗アポトーシス効果を遮断できることが見出された。より具体的には、突然変異ＨＳＰ１１０タンパク質は、野生型ＨＳＰ１１０タンパク質と複合体をドミナントネガティブに形成するので、その抗アポトーシス効果を遮断できることが見出された。その結果として、高レベルの突然変異ＨＳＰ１１０を発現する腫瘍細胞（これは、通常、ＭＳＩ表現型を有する腫瘍である）は、アポトーシス、特に化学療法処置によって誘導されるアポトーシスに対してより感受性である。
【００６９】
ＨＳＰ１１０をコードする遺伝子のイントロン８のスプライス受容部位に局在する１７個のチミジンのマイクロサテライトリピートの長さが、生存予後及び／又は処置に対する反応の予測と相関することも見出された。ＭＳＩ表現型を有する第ＩＩＩ病期結腸直腸ガンを患っている患者であって、大きな欠失を有する患者は、良好な生存予後を有することが見出された。また、ＭＳＩ表現型を有する第ＩＩ病期又は第ＩＩＩ病期結腸直腸ガンを患っている患者であって、化学療法で処置され、前記マイクロサテライトリピートにおける大きな欠失（すなわち、少なくとも５個のチミジンの欠失）を有する患者もまた、良好な生存予後及び／又は化学療法に対する反応の良好な予測を有することが見出された。
【００７０】
当然のことながら、欠失のサイズは、１７個のチミジンのマイクロサテライトリピートのチミジン反復の長さ（すなわち、反復におけるチミジンの数）を決定することによって決定され得る。
【００７１】
本明細書において使用される場合、１７個のチミジンヌクレオチドの前記マイクロサテライトリピートのチミジン反復の長さを決定することは、１７個のチミジンヌクレオチドの前記マイクロサテライトリピート内におけるチミジン欠失の長さを決定することと同等である。
【００７２】
従って、本発明の一態様は、ガン、特にＭＳＩ表現型を有する傾向があるガンを患っている患者の生存及び／又は前記患者の処置に対する反応を予測するためのバイオマーカーとしての、ＨＳＰ１１０をコードする遺伝子のイントロン８のスプライス受容部位に局在する１７個のチミジンのマイクロサテライトリピートの、並びに／又は上記突然変異ＨＳＰ１１０（すなわち、ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質）及び／若しくはフラグメントの使用を対象とする。突然変異ＨＳＰ１１０（すなわち、ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質）の量の増加は、生存予後が良好であること及び／又は処置に対する反応の予測が良好であることを示す。小さなチミジン欠失（すなわち、３個又は４個のチミジン）は、生存予後が不良であること及び／又は処置に対する反応の予測が不良であることを示し、大きなチミジン欠失（すなわち、５個〜８個のチミジン）は、生存予後が良好であること及び／又は処置に対する反応の予測が良好であることを示す。
【００７３】
いくつかの実施態様では、本発明はまた、ガン、特にＭＳＩ表現型を有する傾向があるガンを患っている患者の生存及び／又は前記患者の処置に対する反応を予測するためのバイオマーカーとしての、ＨＳＰ１１０をコードする遺伝子のイントロン８のスプライス受容部位に局在する１７個のチミジンのマイクロサテライトリピートの、並びに／又は上記突然変異ＨＳＰ１１０核酸の、並びに／又は上記ＨＳＰ１１０タンパク質及び／若しくはそのフラグメントの使用を対象とする。
【００７４】
いくつかの実施態様では、４欠失以下の小さなチミジン欠失は、生存予後が不良であること及び／又は処置に対する反応の予測が不良であることを示し、大きなチミジン欠失（すなわち、５個以上のチミジン）は、生存予後が良好であること及び／又は処置に対する反応の予測が良好であることを示す。
【００７５】
「バイオマーカーとしての使用」は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける使用を意味し、突然変異ＨＳＰ１１０は、例えば、リガンド、抗体、プローブ及び／又はプライマーを使用して検出され得、チミジン欠失の長さは、遺伝子型決定又は配列決定することによって検出され得る。従って、本発明はまた、ガンを患っている患者の生体サンプルにおけるマイクロサテライトリピートのチミジン欠失の長さ及び／又は突然変異ＨＳＰ１１０を検出するための手段の使用を対象とする。
【００７６】
本発明はさらに、ガンを患っている患者の生存及び／又は前記患者の処置に対する反応を予測するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、
ａ）前記患者の生体サンプルにおける上記突然変異熱ショックタンパク質１１０（ＨＳＰ１１０）の発現レベルを測定する工程；及び／又は
ｂ）前記患者の生体サンプルにおける熱ショックタンパク質１１０（ＨＳＰ１１０）をコードする遺伝子のイントロン８のスプライス受容部位に局在する１７個のチミジンヌクレオチドのマイクロサテライトリピートのチミジン反復の長さを決定する工程；
ｃ）及び、工程ａ）で測定した発現レベル及び／又は工程ｂ）で同定したチミジン反復の長さを前記患者の予後に関連付け、それにより前記患者の予後を推定する工程
を含む方法を対象とする。
【００７７】
いくつかの実施態様では、ガンを患っている患者の生存及び／又は前記患者の処置に対する反応を予測するための方法は、
ａ）前記患者の生体サンプルにおける本発明の突然変異ＨＳＰ１１０タンパク質の発現を測定する工程；及び／又は
ｂ）前記患者の生体サンプルにおける本発明の突然変異ＨＳＰ１１０  ｍＲＮＡの発現を測定する工程；及び／又は
ｃ）前記患者の生体サンプルにおける熱ショックタンパク質１１０（ＨＳＰ１１０）をコードする遺伝子のイントロン８のスプライス受容部位に局在する１７個のチミジンヌクレオチドのマイクロサテライトリピートのチミジン反復の長さを決定する工程；
ｄ）及び、工程ａ）及び／若しくはｂ）で測定した発現レベル並びに／又は工程ｃ）で同定したチミジン反復の長さを前記患者の予後に関連付け、それにより前記患者の予後を推定する工程
を含む。
【００７８】
実際、実施例において実証するように、突然変異ＨＳＰ１１０の高い発現レベルは、生存予後が良好であること及び／又は処置に対する反応の予測が良好であることと相関する。
【００７９】
加えて、実施例において実証するように、反復内における小さなチミジン欠失（すなわち、３個若しくは４個のチミジン、又はそれ未満）は、生存予後が不良であること及び／又は処置に対する反応の予測が不良であることを示し、反復内における大きなチミジン欠失（すなわち、５個〜８個のチミジン、又はそれ以上）は、生存予後が良好であること及び／又は処置に対する反応の予測が良好であることを示す。すなわち、反復内における少なくとも５個のチミジンの欠失は、生存予後が良好であること及び／又は処置に対する反応の予測が良好であることを示す。いくつかの実施態様では、反復内における少なくとも５個のチミジンの欠失は、患者が、反復内に小さなチミジン欠失を有する患者と比較して低い処置後再燃リスクを有すること、又は患者が処置後に再燃しないであろうことを示す。いくつかの実施態様では、反復内における５個のチミジン又はそれ以上の欠失は、患者が、反復内に小さなチミジン欠失を有する患者と比較して処置に対して反応する可能性が高いことを示す。
【００８０】
具体的な実施態様では、本発明の方法は、
ａ）前記患者の生体サンプルにおける上記突然変異ＨＳＰ１１０の発現を測定する工程；
ｂ）ネガティブコントロールサンプルにおける上記突然変異ＨＳＰ１１０の発現を測定する工程；
を含み、
工程ｂ）で測定した発現と比較して有意に高い工程ａ）で測定した突然変異ＨＳＰ１１０の発現が、生存予後が良好であること及び／又は処置に対する反応の予測が良好であることを示す。
【００８１】
患者の生体サンプルにおける突然変異ＨＳＰ１１０の発現レベルが、ネガティブコントロールサンプルにおける突然変異ＨＳＰ１１０のレベルと比較して２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍若しくは１０倍又は少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％若しくは７５％増加している場合、より高い発現は、統計的に有意であるとみなされる。好ましい実施態様では、患者の生体サンプルにおける突然変異ＨＳＰ１１０の発現レベルが少なくとも７５％増加している場合、より高い発現は、統計的に有意であるとみなされる。
【００８２】
別の具体的な実施態様では、本発明の方法は、
ａ）前記患者の生体サンプルにおける上記突然変異ＨＳＰ１１０の発現を測定する工程；
ｂ）前記生体サンプルにおける野生型ＨＳＰ１１０の発現を測定する工程；
ｃ）工程ａ）及びｂ）で測定した発現を比較し、それにより前記患者の予後を推定する工程
を含む。
【００８３】
実際、突然変異ＨＳＰ１１０が野生型ＨＳＰ１１０と同程度のレベル又は野生型ＨＳＰ１１０よりも高いレベルで発現している場合、予後は良好であろう。特に、本実施態様の枠組みでは、突然変異ＨＳＰ１１０の発現レベルが、野生型ＨＳＰ１１０の発現レベルの５０％以上、６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、９０％以上又は１００％以上であることは、例えば、予後が良好であること、及び／又は患者が処置に対して反応する可能性があることを示し得る。
【００８４】
工程ａ）及びｂ）で測定した発現の比較は、例えば、式：比＝突然変異ＨＳＰ１１０の発現レベル／野生型ＨＳＰ１１０の発現レベルを用いて、発現比を計算することによって実施され得る。０，７５以上の発現比は、例えば、予後が良好であること、及び／又は患者が処置に対して反応する可能性があることを示し得る。
【００８５】
さらに別の具体的な実施態様では、本発明の方法は、
ａ）前記患者の生体サンプルにおける上記突然変異ＨＳＰ１１０及び野生型ＨＳＰ１１０の発現を測定する工程；
ｂ）工程ａ）で得られた発現を分析して、発現比を作成する工程；
ｃ）ネガティブコントロールサンプルにおける上記突然変異ＨＳＰ１１０及び野生型ＨＳＰ１１０の発現を測定する工程；
ｄ）工程ｃ）で得られた発現を分析して、発現比を作成する工程；
を含み、
工程ｄ）で作成した発現比と比較して有意に高い工程ｂ）で作成した発現比が、患者が良好な生存予後を有すること、及び／又は患者が処置に対して反応する可能性があることを示す。
【００８６】
工程ｂ）で作成した比が、工程ｄ）で作成した比と比較して少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍又は１０倍増加している場合、より高い発現比は、統計的に有意であるとみなされる。好ましい実施態様では、患者の生体サンプルにおける発現比が少なくとも７，５倍増加している場合、比は、統計的に有意であるとみなされる。
【００８７】
突然変異ＨＳＰ１１０及び野生型ＨＳＰ１１０の発現レベルを測定するための方法は、当技術分野において周知である。発現レベルは、ｍＲＮＡを定量化することによって、又はタンパク質を定量化することによって測定され得る。適切な方法としては、例えば、免疫化学、Ｅｌｉｓａ、ウエスタンブロッティング、フローサイトメトリー、ノーザンブロッティング、ＰＣＲ（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ及びＱＲＴ−ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写増幅法（transcription-mediated amplification）（ＴＭＡ）、鎖置換増幅法（strand displacement amplification）（ＳＤＡ）、核酸配列ベース増幅法（nucleic acid sequence based amplification）（ＮＡＳＢＡ）、増幅不応性突然変異システム（Amplification Refractory Mutation System）（ＡＲＭＳ）及び高分解能融解曲線分析（High Resolution Melting analysis）（ＨＲＭ  ＰＣＲ）が挙げられる。
【００８８】
増幅不応性突然変異システム（ＡＲＭＳ）は、ヌクレオチド残基が１個異なる鋳型をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーが識別できるように、前記プライマーを設計する増幅戦略である。ＡＲＭＳは、アレル特異的ＰＣＲ又は特異的アレルのＰＣＲ増幅（ＰＡＳＡ）とも称されている。従って、ＡＲＭＳプライマーを設計して、複アレル系の特定メンバーを増幅すると同時に塩基がわずか１個だけ前者と異なり得る別のアレルの増幅に対する不応性を保持できる。ＡＲＭＳの主な利点は、増幅工程及び診断工程を合わせることであり、増幅産物の存在は特定のアレルの存在を示し、その逆もまた同様である。通常の診断の場合、ＡＲＭＳのこの特徴は、それが非常に時間効率の良い方法であることを意味する。
【００８９】
高分解能融解曲線（ＨＲＭ）分析は、二本鎖ＤＮＡサンプルにおける突然変異、多型及びエピジェネティックな差異を検出するための有力な分子生物学技術である。ＨＲＭ分析は、二本鎖ＤＮＡサンプル上で実施する。典型的には、ＨＲＭ分析前にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、目的の突然変異があるＤＮＡ領域を増幅する。基本的には、ＰＣＲプロセスにより、微量の目的のＤＮＡ領域が大量になるので、その量はより良い分析をするのに十分である。チューブの中には今や、目的のＤＮＡ領域の多くのコピーがある。増幅されるこの領域は、アンプリコンとして公知である。ＰＣＲプロセスの後、ＨＲＭ分析を開始する。簡潔に言えば、このプロセスは、アンプリコンＤＮＡを約５０℃から約９５℃まで正確に加温することである。このプロセスにおけるいくつかの時点で、アンプリコンの融解温度に達し、２本のＤＮＡ鎖が分離するか、又は「融解」して離れる。ＨＲＭの秘訣は、リアルタイムで起こっているこのプロセスをモニタリングすることである。これは、蛍光色素を使用することによって達成される。ＨＲＭに使用される色素はインターカレーター色素として公知であり、固有の特性を有する。それらは二本鎖ＤＮＡに特異的に結合し、それらは結合すると明るく蛍光を発する。二本鎖ＤＮＡが無い場合、それらが結合するものはなく、それらは低レベルで蛍光を発するにすぎない。ＨＲＭ分析の開始時には、数十億コピーのアンプリコンにより、高レベルの蛍光がサンプル中にある。しかし、サンプルが昇温し、２本のＤＮＡ鎖が融解して離れるにつれて、二本鎖ＤＮＡの存在は減少するので、蛍光は減少する。ＨＲＭ装置は、蛍光を測定することによってこのプロセスを観察するカメラを有する。次いで、この装置は、蛍光レベル対温度を示す融解曲線として公知のグラフとして、このデータを単純にプロットする。２本のＤＮＡ鎖が解離するアンプリコンの融解温度は、完全に予測できる。それは、ＤＮＡの塩基配列に依存する。２人の異なるヒトからの２つのサンプルを比較する場合、全く同じ形状の融解曲線が得られるはずである。しかしながら、これらのヒトのうちの１人が増幅されたＤＮＡ領域に突然変異を有する場合、これは、ＤＮＡ鎖が融解して離れる温度が変化させるであろう。従って、今度は、２つの融解曲線は異なって見える。差異はほんの少しかもしれないが（おそらくは、わずかな程度）、ＨＲＭ装置はこのプロセスを「高分解能」でモニタリングする能力を有するので、これらの変化を正確に記録し、従って、突然変異が存在するか否かを同定することが可能である。
【００９０】
上記方法により、あらゆる処置に対する反応を予測することが可能になる。具体的な実施態様では、前記処置は、例えば、オキサリプラチンなどのアルキル化剤による処置、又は５−フルオロウラシルによる処置、又はＦＯＬＦＯＸ処置、又はＦＵＦＯＬ処置である。
【００９１】
好ましい実施態様では、突然変異ＨＳＰ１１０の発現レベルの測定は、突然変異ＨＳＰ１１０の存在を検出するのに使用され得るフォワードプライマー、リバースプライマー及びプローブを使用して、ＱＲＴ−ＰＣＲによって実施される。特に、フォワードプライマーは、
【化２】
0006045563.tif 000004
の配列を有し得、リバースプライマーは、
【化３】
0006045563.tif 000005
の配列を有し得、突然変異ＨＳＰ１１０に特異的にハイブリダイゼーションする蛍光プローブは、
【化４】
0006045563.tif 000006
の配列のＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９プローブであり得る。
【００９２】
別の好ましい実施態様では、野生型ＨＳＰ１１０の発現レベルの測定は、野生型ＨＳＰ１１０の存在を検出するのに使用され得るフォワードプライマー、リバースプライマー及びプローブを使用して、ＱＲＴ−ＰＣＲによって実施される。特に、フォワードプライマーは配列番号４の配列を有し得、リバースプライマーは配列番号５の配列を有し得、突然変異ＨＳＰ１１０に特異的にハイブリダイゼーションする蛍光プローブは、
【化５】
0006045563.tif 000007
の配列のＨＳＰ１１０ｗｔプローブであり得る。
【００９３】
好ましくは、プローブは、少なくとも１つの蛍光ラベル又は色素でラベリングされる。蛍光色素は当技術分野において公知の多種多様の色素であり得、６−ＦＡＭ（商標）、ＶＩＣ（登録商標）、ＴＥＴ（商標）、ＮＥＤ（商標）、Ｃｙ３（登録商標）、Ｃｙ５（登録商標）、ＨＥＸ、ＴＡＭＲＡ、ＤＡＢＣＹＬ、ＢＨＱ（商標）、ＤＤＱなどが挙げられる。
【００９４】
より好ましくは、プローブは、レポーター色素及びクエンチャー色素でラベリングされる。さらにより好ましくは、プローブは、それらの５’末端がレポーター色素でラベリングされ、それらの３’末端がクエンチャー色素でラベリングされる。レポーター色素は蛍光色素でもよく、例えば、６−ＦＡＭ（商標）、ＶＩＣ（登録商標）、ＴＥＴ（商標）、ＮＥＤ（商標）、Ｃｙ３（登録商標）、Ｃｙ５（登録商標）、ＨＥＸなどであり得る。クエンチャー色素は非蛍光色素（例えば、ＭＧＢ（商標））でもよいし、蛍光色素でもよく、例えば、ＴＡＭＲＡ、ＤＡＢＣＹＬ、ＢＨＱ（商標）、ＤＤＱなどであり得る。
【００９５】
より好ましい実施態様では、ＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９プローブは、その５’末端がレポーター色素ＶＩＣ（商標）でラベリングされ、その３’末端がクエンチャー色素ＴＡＭＲＡでラベリングされ、ＨＳＰ１１０ｗｔプローブは、その５’末端がレポーター色素６−ＦＡＭ（商標）でラベリングされ、その３’末端がクエンチャー色素ＴＡＭＲＡでラベリングされる。
【００９６】
好ましい実施態様では、ＱＲＴ−ＰＣＲは、最初の変性工程、続いて変性−アニーリング−伸長工程のサイクルを含む。
【００９７】
最初の変性工程は、９０℃〜１０５℃の範囲の加熱条件下で１５秒間〜１５分間実施され得る。好ましくは、加熱条件は、９２℃〜１０２℃、より好ましくは９５℃〜１００℃の範囲であり、さらにより好ましくは、加熱条件は、９５℃である。好ましくは、最初の変性工程は、１分間〜１５分間、より好ましくは８分間〜１２分間、さらにより好ましくは５分間〜１０分間実施され、さらにより好ましくは、最初の変性工程は、１０分間実施される。
好ましい実施態様では、最初の変性工程は、９５℃で１０分間実施される。
【００９８】
変性−アニーリング−伸長工程の各サイクルは、加熱条件下の変性段階、続いて、増幅されるべき配列にプライマー及びプローブがハイブリダイゼーションするのを可能にする条件下で実施されるアニーリング段階、そして、増幅されるべき配列にアニーリングしている各プライマーからポリメラーゼが伸長産物を合成するのを可能にする条件下で実施される伸長段階を含む。
【００９９】
変性段階は、９０℃〜１０５℃、好ましくは９２℃〜１００℃、より好ましくは９４℃〜９８℃で、１０秒間〜４分間、好ましくは１０秒間〜２分間、より好ましくは１５秒間〜１分間実施され得る。
【０１００】
アニーリング段階は、３５℃〜７０℃、好ましくは４０℃〜６５℃、より好ましくは４５℃〜６０℃、さらにより好ましくは５０℃〜６０℃で、１０秒間〜２分間、好ましくは２０秒間〜１，５分間、より好ましくは３０秒間〜１分間実施され得る。
【０１０１】
伸長段階は、４０℃〜８０℃、好ましくは５０℃〜７５℃、より好ましくは５５℃〜６５℃、さらにより好ましくは５８℃〜６２℃で、１０秒間〜５分間、好ましくは２０秒間〜３分間、より好ましくは３０秒間〜１分間、さらにより好ましくは３０秒間〜４５秒間実施され得る。
【０１０２】
好ましい実施態様では、変性段階は９５℃で１５秒間実施され、アニーリング段階及び伸長段階は合わせて、６０℃で１分間実施される。変性−アニーリング−伸長工程は、３０〜６０サイクル、好ましくは３５〜５０サイクル、より好ましくは４０〜４５サイクル反復され得る。さらにより好ましくは、変性−アニーリング−伸長工程は、４０サイクル反復される。
【０１０３】
あるいは、突然変異ＨＳＰ１１０の発現の測定は、ウエスタンブロット又は免疫組織化学によって実施され得る。
【０１０４】
本明細書において使用される場合、ウエスタンブロットは、ニトロセルロース又は膜などの支持体上に固定化されたタンパク質（又はポリペプチド）の分析を指す。最初に、少なくとも１つのタンパク質を含む混合物をアクリルアミドゲル上で分離し、次いで、分離したタンパク質をゲルから固体支持体（例えば、ニトロセルロース又はナイロン膜）に転写する。固定化したタンパク質を、少なくとも１つの目的の抗原に対する反応性を有する少なくとも１つの抗体に曝露する。結合した抗体は、放射性標識抗体の使用を含む様々な方法によって検出され得る。好ましくは、突然変異ＨＳＰ１１０及び野生型ＨＳＰ１１０のいずれかを検出するのに使用される抗体は、タンパク質のＮ末端部分を認識し得る。例えば、このような抗体は、Abcam（登録商標）のウサギポリクローナル抗体ab24503であり得る。野生型ＨＳＰ１１０もまた、Stressgen（登録商標）のウサギポリクローナル抗体SPA-11101を使用して認識され得る。
【０１０５】
好ましくは、本発明の方法において、突然変異ＨＳＰ１１０及び野生型ＨＳＰ１１０の発現レベルの測定は、同じ技術を使用して実施される。例えば、突然変異ＨＳＰ１１０の発現レベルの測定がＱＲＴ−ＰＣＲによって実施される場合、野生型ＨＳＰ１１０の発現レベルの測定は、ＱＲＴ−ＰＣＲによって実施される。
【０１０６】
より好ましくは、突然変異ＨＳＰ１１０及び野生型ＨＳＰ１１０の発現レベルの測定は、競合的に実施される。すなわち、突然変異ＨＳＰ１１０及び野生型ＨＳＰ１１０の発現レベルの測定は、同じ生体サンプルで同時に実施される。特に、突然変異ＨＳＰ１１０及び野生型ＨＳＰ１１０の発現レベルの測定は、突然変異ＨＳＰ１１０及び野生型ＨＳＰ１１０にハイブリダイゼーションできる上記フォワードプライマー及びリバースプライマー、並びにそれぞれが上記突然変異ＨＳＰ１１０又は野生型ＨＳＰ１１０に特異的にハイブリダイゼーションできる２つのプローブを使用して、ＱＲＴ−ＰＣＲによって競合的に実施される。好ましい実施態様では、ＱＲＴ−ＰＣＲは、最初の変性工程、続いて上記変性−アニーリング−伸長工程を含む。
【０１０７】
別の好ましい実施態様では、突然変異ＨＳＰ１１０及び野生型ＨＳＰ１１０の発現の測定は、タンパク質レベルで実施され得る。
【０１０８】
発現比は、当技術分野において周知の任意の方法を使用して計算され得る。好ましくは、発現比は、以下のように得られる：
−  Ｃｔ値を得るために、前記患者の生体サンプルにおいて、ＱＲＴ−ＰＣＲによって上記突然変異ＨＳＰ１１０の発現を測定すること；
−  Ｃｔ値を得るために、前記患者の生体サンプルにおいて、ＱＲＴ−ＰＣＲによって上記野生型ＨＳＰ１１０の発現を測定すること；
−  式Ｅ＝２−（野生型ＨＳＰ１１０Ｃｔ−突然変異ＨＳＰ１１０Ｃｔ）を使用して、発現比（Ｅ）を計算すること。
【０１０９】
本明細書において使用される場合、生体サンプルは、血液サンプル、血清サンプル、血漿サンプル、排泄物サンプル又はガンの生検からなり得る。好ましくは、生体サンプルは、腺腫又は原発性ガンの生検からなり得る。さらにより好ましくは、生体サンプルは、結腸直腸ガン、胃ガン、子宮内膜ガン、膀胱ガン、尿路ガン、卵巣ガン、前立腺ガン、リンパ腫、白血病、膠芽細胞腫、星状細胞腫及び神経芽細胞腫からなる群より選択される腺腫又は原発性ガンの生検からなり得る。好ましくは、生体サンプルは、結腸直腸ガンの生検である。
【０１１０】
ネガティブコントロールサンプルが使用される場合、ネガティブコントロールサンプルは、例えば、健常個体又はＭＳＳ個体からの（好ましくは、ガン細胞と同じ組織からの）組織サンプル、患者からの健常組織（例えば、ガン組織の周囲の健常組織）のサンプル、又は一定量の突然変異ＨＳＰ１１０及び／又は野生型ＨＳＰ１１０を含むサンプルであって、健常個体又はＭＳＳ個体における突然変異ＨＳＰ１１０及び／又は野生型ＨＳＰ１１０の発現レベルを示すサンプルに対応し得る。具体的な実施態様では、ネガティブコントロールサンプルは、患者の生体サンプルと同じ種類のサンプルである。例えば、患者の生体サンプルが血液である場合、ネガティブコントロールサンプルは、血液である。別の例では、患者の生体サンプルが結腸直腸ガンの生検である場合、ネガティブコントロールサンプルは、マイクロサテライト安定性（ＭＳＳ）表現型を有する結腸直腸ガンの生検である。
【０１１１】
いくつかの実施態様では、本発明の方法は、前記患者の生体サンプルにおける熱ショックタンパク質１１０（ＨＳＰ１１０）をコードする遺伝子のイントロン８のスプライス受容部位に局在する１７個のチミジンヌクレオチドのマイクロサテライトリピートのチミジン反復の長さを決定する工程を含み、反復内における５個のチミジン又はそれ以上の欠失の同定が、生存予後が良好であること及び／又は処置に対する反応の予測が良好であることを示す。
【０１１２】
前記チミジン反復の長さの決定は、当業者に公知の方法によって実施され得る。例えば、それは、遺伝子型決定によって実施され得る。１７個のチミジンヌクレオチドのマイクロサテライトリピートの遺伝子型決定は、当業者に公知の方法によって実施され得る。例えば、実施例１の「突然変異の分析」という段落に記載されているように、又は本説明の「本発明の診断方法」という段落に記載されているように、遺伝子型決定する。１７個のチミジンヌクレオチドのマイクロサテライトリピートの遺伝子型決定は、当業者に公知の方法によって実施され得る。例えば、１７個のチミジンヌクレオチドのマイクロサテライトリピートの遺伝子型決定は、前記マイクロサテライトリピートを増幅し、キャピラリー電気泳動により増幅産物を単離することによって実施され得る。前記マイクロサテライトリピートの増幅は、実施例１の「突然変異の分析」という段落に記載されているように、通常のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を使用して実施され得る。適切な方法としては、増幅不応性突然変異システム（ＡＲＭＳ）及び高分解能融解曲線分析（ＨＲＭ  ＰＣＲ）も挙げられ得る。
【０１１３】
いくつかの実施態様では、前記患者は、ＭＳＩ表現型を有する第ＩＩ病期又は第ＩＩＩ病期結腸直腸ガンを患っている患者、好ましくはＭＳＩ表現型を有する第ＩＩＩ病期結腸直腸ガンを患っている患者である。いくつかの実施態様では、前記患者は、補助化学療法処置などの化学療法処置を受けた患者である。好ましい実施態様では、前記患者は、ＭＳＩ表現型を有する第ＩＩ病期又は第ＩＩＩ病期結腸直腸ガンを患っている患者であって、補助化学療法処置を受けた患者である。
【０１１４】
本発明の診断方法
驚くべきことに、本発明者らは、ＨＳＰ１１０タンパク質をコードするＨＳＰＨ１遺伝子（NCBI遺伝子ＩＤ：１０８０８）のイントロン８のスプライス受容部位に位置する１７個のチミジンヌクレオチドのマイクロサテライトリピートが、ＭＳＩ  ＣＲＣ細胞株及び原発性腫瘍においてほとんどの場合に突然変異していたことを見出した。また、前記マイクロサテライトリピートはまた、ＭＳＩ腺腫において高頻度に突然変異している。従って、診断方法が非効率的である場合、非常に早期の腺腫及び原発性腫瘍においてＭＳＩ表現型を診断するために、前記マイクロサテライトリピートの分析を使用し得る。
【０１１５】
従って、本発明はまた、腫瘍のマイクロサテライト不安定性表現型（ＭＳＩ）を診断するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、
ａ）ＭＳＩ表現型を有するガンに罹患している可能性がある患者の生体サンプルにおける熱ショックタンパク質１１０（ＨＳＰ１１０）をコードする遺伝子のイントロン８のスプライス受容部位に局在する１７個のチミジンヌクレオチドのマイクロサテライトリピートを遺伝子型決定する工程；
ｂ）前記マイクロサテライトリピート上の不安定性の有無を検出する工程
を含み、
患者の生体サンプルにおける前記マイクロサテライトリピート上の不安定性の検出が、患者がＭＳＩ表現型を有するガンを患っていることを示す方法を提供する。
【０１１６】
本明細書において使用される場合、生体サンプルは、培養細胞若しくは培養不死化細胞、並びに／又は結腸直腸ガン、胃ガン、子宮内膜ガン、膀胱ガン、尿路ガン、卵巣ガン、前立腺ガン、リンパ腫、白血病、膠芽細胞腫、星状細胞腫及び神経芽細胞腫からなる群で選択される腺腫又は原発性腫瘍の生検であり得る。好ましくは、生体サンプルは、結腸直腸ガンの生検である。
【０１１７】
１７個のチミジンヌクレオチドのマイクロサテライトリピートの遺伝子型決定は、当業者に公知の方法によって実施され得る。例えば、１７個のチミジンヌクレオチドのマイクロサテライトリピートの遺伝子型決定は、前記マイクロサテライトリピートを増幅し、キャピラリー電気泳動により増幅産物を単離することによって実施され得る。前記マイクロサテライトリピートの増幅は、実施例１の「突然変異の分析」という段落に記載されているように、通常のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を使用して実施され得る。適切な方法としては、増幅不応性突然変異システム（ＡＲＭＳ）及び高分解能融解曲線分析（ＨＲＭ  ＰＣＲ）も挙げられ得る。
【０１１８】
好ましい実施態様では、マイクロサテライトリピートの遺伝子型決定用のフォワードプライマー及びリバースプライマーはそれぞれ、
【化６】
0006045563.tif 000008
の配列を有する。
【０１１９】
好ましい実施態様では、マイクロサテライトマーカーの増幅は、最初の変性工程、続いて変性−アニーリング−伸長工程のサイクル、そして最後の伸長工程を含む。
【０１２０】
最初の変性工程は、９０℃〜１０５℃の範囲の加熱条件下で１５秒間〜５分間実施され得る。好ましくは、加熱条件は、９２℃〜１０２℃の範囲であり、より好ましくは、加熱条件は、９４℃である。好ましくは、最初の変性工程は、２０秒間〜２分間、より好ましくは２５秒間〜１分間実施され、さらにより好ましくは、最初の変性工程は、３０秒間実施される。
【０１２１】
好ましい実施態様では、最初の変性工程は、９４℃で３０秒間実施される。
【０１２２】
変性−アニーリング−伸長工程の各サイクルは、加熱条件下の変性段階、続いて、増幅されるべき配列にプライマーがハイブリダイゼーションするのを可能にする条件下で実施されるアニーリング段階、そして、増幅されるべき配列にアニーリングしている各プライマーからポリメラーゼが伸長産物を合成するのを可能にする条件下で実施される伸長段階を含む。
【０１２３】
変性段階は、９０℃〜１０５℃、好ましくは９２℃〜１００℃、より好ましくは９４℃〜９８℃で、１０秒間〜４分間、好ましくは１０秒間〜２分間、より好ましくは１５秒間〜１分間実施され得る。
【０１２４】
アニーリング段階は、３５℃〜７０℃、好ましくは４０℃〜６５℃、より好ましくは４５℃〜６０℃、さらにより好ましくは５０℃〜６０℃で、１０秒間〜２分間、好ましくは２０秒間〜１，５分間、より好ましくは２５秒間〜４５秒間実施され得る。
【０１２５】
伸長段階は、４０℃〜８０℃、好ましくは５０℃〜７５℃、より好ましくは６０℃〜７２℃で、１０秒間〜５分間、好ましくは２０秒間〜３分間、より好ましくは４０秒間〜２分間、さらにより好ましくは３０秒間〜１分間実施され得る。
【０１２６】
好ましい実施態様では、変性段階は９４℃で３０秒間実施され、アニーリング段階は５７℃で３０秒間実施され、伸長段階は７２℃で１分間実施される。変性−アニーリング−伸長工程は、３０〜６０サイクル、好ましくは３２〜４５サイクル、より好ましくは３５〜４２サイクル反復され得る。さらにより好ましくは、変性−アニーリング−伸長工程は、４０サイクル反復される。
【０１２７】
最後の伸長工程は、４０℃〜８０℃、好ましくは５０℃〜７５℃、より好ましくは６０℃〜７２℃で、１分間〜１０分間、好ましくは３分間〜８分間、より好ましくは５分間〜７分間実施され得る。
【０１２８】
好ましい実施態様では、最後の伸長工程は、７２℃で７分間実施される。
【０１２９】
「不安定性」は、チミジンヌクレオチドの反復パターンの欠失又は付加を意味する。
【０１３０】
特定の実施態様では、不安定性は、少なくとも１個のヌクレオチドの欠失又は付加が前記生体サンプルで検出される場合に存在する。好ましくは、不安定性は、少なくとも３個のチミジンヌクレオチドの欠失が前記生体サンプルで検出される場合に存在する。より好ましくは、不安定性は、３個〜８個のチミジンヌクレオチドの欠失が前記生体サンプルで検出される場合に存在する。
【０１３１】
本発明はまた、腫瘍のマイクロサテライト不安定性表現型（ＭＳＩ）を診断するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、
ａ）ＭＳＩ表現型を有するガンに罹患している可能性がある患者の生体サンプルにおける熱ショックタンパク質１１０（ＨＳＰ１１０）をコードする遺伝子のイントロン８のスプライス受容部位に局在する１７個のチミジンヌクレオチドのマイクロサテライトリピート上の不安定性の有無を検出する工程；
ｂ）ＭＳＩ表現型を有するガンに罹患している可能性がある患者の生体サンプルにおけるマイクロサテライトＢＡＴ２６、ＮＲ２１、ＮＲ２７、ＮＲ２４及びＢＡＴ２５からなる群で選択される少なくとも１個のマイクロサテライト上の不安定性の有無を検出する工程
を含み、
患者の生体サンプルにおける工程ａ）の前記マイクロサテライトリピート上の不安定性の検出及び工程ｂ）の少なくとも１個のマイクロサテライトリピート上の不安定性の検出が、患者がＭＳＩ表現型を有するガンを患っていることを示す方法を提供する。
【０１３２】
生体サンプルは、培養細胞若しくは培養不死化細胞、並びに／又は結腸直腸ガン、胃ガン、子宮内膜ガン、膀胱ガン、尿路ガン、卵巣ガン、前立腺ガン、リンパ腫、白血病、膠芽細胞腫、星状細胞腫及び神経芽細胞腫からなる群で選択される腺腫又は原発性腫瘍の生検であり得る。好ましくは、生体サンプルは、結腸直腸ガンの生検である。
【０１３３】
いくつかの実施態様では、ＨＳＰ１１０をコードする遺伝子のイントロン８のスプライス受容部位に局在する１７個のチミジンヌクレオチドのマイクロサテライトリピート上の、並びにマイクロサテライトリピートＢＡＴ２６、ＮＲ２１、ＮＲ２７、ＮＲ２４及びＢＡＴ２５からなる群で選択される少なくとも２個、３個、４個又は５個のマイクロサテライトリピート上の不安定性の検出は、患者がＭＳＩ表現型を有するガンを患っていることを示す。
【０１３４】
好ましくは、ＨＳＰ１１０をコードする遺伝子のイントロン８のスプライス受容部位に局在する１７個のチミジンヌクレオチドのマイクロサテライトリピート上の、並びに５個のマイクロサテライトリピートＢＡＴ２６、ＮＲ２１、ＮＲ２７、ＮＲ２４及びＢＡＴ２５上の不安定性の検出は、患者がＭＳＩ表現型を有するガンを患っていることを示す。
【０１３５】
ＢＡＴ２６マイクロサテライトマーカーは、ｈＭＳＨ２遺伝子のイントロン５に局在する２６Ａリピートであり、例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＧ＿０００７１１０．１の位置１６２９８〜１６３２３に見られる。より好ましくは、ＢＡＴ２６マイクロサテライトマーカーは、２０Ａ〜２６Ａの間に含まれる反復パターンを有する。
【０１３６】
ＮＲ２１マイクロサテライトマーカーは、ＳＬＣ７Ａ８遺伝子の５’非翻訳領域に局在する２１Ｔリピートであり、例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０１２２４４．２の位置４８３〜５０３に見られる。より好ましくは、ＮＲ２１マイクロサテライトマーカーは、１６Ｔ〜２１Ｔの間に含まれる反復パターンからなる。
【０１３７】
ＮＲ２７マイクロサテライトマーカーは、ＢＩＲＣ３遺伝子の５’非翻訳領域に局在する２６Ａリピートであり、例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１１６５．３の位置１０３１〜１０５６に見られる。より好ましくは、ＮＲ２７マイクロサテライトマーカーは、２３Ａ〜２６Ａの間に含まれる反復パターンからなる。
【０１３８】
ＮＲ２４マイクロサテライトマーカーは、ＺＮＦ２遺伝子の３’非翻訳領域に局在する２３Ｔリピートであり、例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０２１０８８．２の位置３２４８〜３２７０に見られる。より好ましくは、ＮＲ２４マイクロサテライトマーカーは、１８Ｔ〜２３Ｔの間に含まれる反復パターンからなる。
【０１３９】
ＢＡＴ２５マイクロサテライトマーカーは、ｃ−ＫＩＴ遺伝子のイントロン１６に局在する２５Ｔリピートであり、例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＧ＿００７４５６．１の位置７４１１８〜７４１４２に見られる。より好ましくは、ＢＡＴ２５マイクロサテライトマーカーは、１９Ｔ〜２５Ｔの間に含まれる反復パターンからなる。
【０１４０】
本発明によれば、工程ａ）及びｂ）において、不安定性の有無の検出は、当技術分野において周知の任意の方法によって実施され得る。例えば、不安定性の有無の検出は、配列決定又は遺伝子型決定によって実施される。適切な方法としては、増幅不応性突然変異システム（ＡＲＭＳ）及び高分解能融解曲線分析（ＨＲＭ  ＰＣＲ）も挙げられ得る。
【０１４１】
遺伝子型決定は、マイクロサテライトを増幅し、キャピラリー電気泳動により増幅産物を単離することによって実施され得る。マイクロサテライトの増幅は、通常のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を使用して実施され得、より好ましくは、マイクロサテライトの増幅は、マルチプレックスＰＣＲによって実施される。適切な方法としては、増幅不応性突然変異システム（ＡＲＭＳ）及び高分解能融解曲線分析（ＨＲＭ  ＰＣＲ）も挙げられ得る。
【０１４２】
好ましい実施態様では、ＨＳＰ１１０をコードする遺伝子のイントロン８のスプライス受容部位に局在する１７個のチミジンヌクレオチドの前記マイクロサテライトリピートの増幅は、上記のように実施され得る。
【０１４３】
好ましい実施態様では、マイクロサテライトリピートＢＡＴ２６、ＮＲ２１、ＮＲ２７、ＮＲ２４及びＢＡＴ２５からなる群で選択される前記少なくとも１個のマイクロサテライトの増幅は、最初の変性工程、続いて変性−アニーリング−伸長工程のサイクル、そして最後の伸長工程を含む。
【０１４４】
最初の変性工程は、９０℃〜１０５℃の範囲の加熱条件下で１５秒間〜１５分間実施され得る。好ましくは、加熱条件は、９２℃〜１０２℃、より好ましくは９５℃〜１００℃の範囲であり、さらにより好ましくは、加熱条件は、９５℃である。好ましくは、最初の変性工程は、１分間〜１５分間、より好ましくは２分間〜１２分間、さらにより好ましくは５分間〜１０分間実施され、さらにより好ましくは、最初の変性工程は、５分間実施される。
【０１４５】
好ましい実施態様では、最初の変性工程は、９５℃で５分間実施される。
【０１４６】
変性−アニーリング−伸長工程の各サイクルは、加熱条件下の変性段階、続いて、増幅されるべき配列にプライマーがハイブリダイゼーションするのを可能にする条件下で実施されるアニーリング段階、そして、増幅されるべき配列にアニーリングしている各プライマーからポリメラーゼが伸長産物を合成するのを可能にする条件下で実施される伸長段階を含む。
【０１４７】
変性段階は、９０℃〜１０５℃、好ましくは９２℃〜１００℃、より好ましくは９４℃〜９８℃で、１０秒間〜４分間、好ましくは１０秒間〜２分間、より好ましくは１５秒間〜１分間実施され得る。
【０１４８】
アニーリング段階は、３５℃〜７０℃、好ましくは４０℃〜６５℃、より好ましくは４５℃〜６０℃、さらにより好ましくは５０℃〜６０℃で、１０秒間〜２分間、好ましくは２０秒間〜１，５分間、より好ましくは２５秒間〜４５秒間実施され得る。
【０１４９】
伸長段階は、４０℃〜８０℃、好ましくは５０℃〜７５℃、より好ましくは６０℃〜７２℃で、１０秒間〜５分間、好ましくは２０秒間〜３分間、より好ましくは２５秒間〜１分間、さらにより好ましくは３０秒間〜４５秒間実施され得る。
【０１５０】
好ましい実施態様では、変性段階は９５℃で３０秒間実施され、アニーリング段階は５５℃で３０秒間実施され、伸長段階は７２℃で３０秒間実施される。変性−アニーリング−伸長工程は、３０〜６０サイクル、好ましくは３２〜４０サイクル、より好ましくは３５〜４０サイクル反復され得る。さらにより好ましくは、変性−アニーリング−伸長工程は、３５サイクル反復される。
【０１５１】
最後の伸長工程は、４０℃〜８０℃、好ましくは５０℃〜７５℃、より好ましくは６０℃〜７２℃で、１分間〜１０分間、好ましくは３分間〜８分間、より好ましくは４分間〜６分間実施され得る。
【０１５２】
好ましい実施態様では、最後の伸長工程は、７２℃で５分間実施される。
【０１５３】
マイクロサテライトマーカーＢＡＴ２６の増幅は、
【化７】
0006045563.tif 000009
の配列を有するフォワードプライマー、及び
【化８】
0006045563.tif 000010
の配列を有するリバースプライマーを使用して実施され得る。
【０１５４】
マイクロサテライトマーカーＮＲ２１の増幅は、
【化９】
0006045563.tif 000011
の配列を有するフォワードプライマー、及び
【化１０】
0006045563.tif 000012
の配列を有するリバースプライマーを使用して実施され得る。
【０１５５】
マイクロサテライトマーカーＮＲ２７の増幅は、
【化１１】
0006045563.tif 000013
の配列を有するフォワードプライマー、及び
【化１２】
0006045563.tif 000014
の配列を有するリバースプライマーを使用して実施され得る。
【０１５６】
マイクロサテライトマーカーＮＲ２４の増幅は、
【化１３】
0006045563.tif 000015
の配列を有するフォワードプライマー、及び
【化１４】
0006045563.tif 000016
の配列を有するリバースプライマーを使用して実施され得る。
【０１５７】
マイクロサテライトマーカーＢＡＴ２５の増幅は、
【化１５】
0006045563.tif 000017
の配列を有するフォワードプライマー、及び
【化１６】
0006045563.tif 000018
の配列を有するリバースプライマーを使用して実施され得る。
【０１５８】
「ＨＳＰ１１０をコードする遺伝子のイントロン８のスプライス受容部位に局在する１７個のチミジンヌクレオチドのマイクロサテライトリピート上の不安定性」は、チミジンヌクレオチドの反復パターンの欠失又は付加を意味する。本明細書において記載されるように、不安定性は、少なくとも３個のチミジンヌクレオチドの欠失が前記生体サンプルで検出される場合に存在するとみなされ得る。本明細書において記載されるように、不安定性は、３個〜８個のチミジンヌクレオチド又はそれ以上の欠失が前記生体サンプルで検出される場合に存在するとみなされ得る。
【０１５９】
「マイクロサテライトリピートＢＡＴ２６、ＮＲ２１、ＮＲ２７、ＮＲ２４及びＢＡＴ２５からなる群より選択される少なくとも１個のマイクロサテライトマーカー上の不安定性」は、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド又はトリヌクレオチドの反復パターンの欠失又は付加を意味する。
【０１６０】
例示的な実施態様では、ＢＡＴ２６マイクロサテライト上の不安定性は、ＢＡＴ２６マイクロサテライトが２６Ａ超又は２０Ａ未満の反復パターンからなる場合に存在するとみなされる。
【０１６１】
例示的な実施態様では、ＮＲ２１マイクロサテライト上の不安定性は、ＮＲ２１マイクロサテライトが２１Ｔ超又は１６Ｔ未満の反復パターンからなる場合に存在するとみなされる。
【０１６２】
例示的な実施態様では、ＮＲ２７マイクロサテライト上の不安定性は、ＮＲ２７マイクロサテライトが２６Ａ超又は２３Ａ未満の反復パターンからなる場合に存在するとみなされる。
【０１６３】
例示的な実施態様では、ＮＲ２４マイクロサテライトマーカー上の不安定性は、ＮＲ２４マイクロサテライトが２３Ｔ超又は１８Ｔ未満の反復パターンからなる場合に存在するとみなされる。
【０１６４】
例示的な実施態様では、ＢＡＴ２５マイクロサテライトマーカー上の不安定性は、ＢＡＴ２５マイクロサテライトが２５Ｔ超又は１９Ｔ未満の反復パターンからなる場合に存在するとみなされる。
【０１６５】
好ましくは、不安定性は、欠失又は付加が１個のアレル上で、より好ましくは２個のアレル上で検出される場合に存在するとみなされる。
【０１６６】
特定の実施態様では、この方法は、工程ａ）及びｂ）において、コントロールサンプルと比較することをさらに含む。ネガティブコントロールサンプルが使用される場合、ネガティブコントロールサンプルは、例えば、健常個体又はＭＳＳ個体からの（好ましくは、ガン細胞と同じ組織からの）組織サンプル、患者からの健常組織（例えば、ガン組織の周囲の健常組織）のサンプルに対応し得る。具体的な実施態様では、ネガティブコントロールサンプルは、患者の生体サンプルと同じ種類のサンプルである。例えば、患者の生体サンプルが血液である場合、ネガティブコントロールサンプルは、血液である。別の例では、患者の生体サンプルが結腸直腸ガンの生検である場合、ネガティブコントロールサンプルは、マイクロサテライト安定性（ＭＳＳ）表現型を有する結腸直腸ガンの生検である。
【０１６７】
本発明はまた、腫瘍のマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）表現型を診断するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、前記患者の生体サンプルにおける上記突然変異熱ショックタンパク質１１０（ＨＳＰ１１０）の有無を検出する工程を含み、患者の生体サンプルにおける前記突然変異ＨＳＰ１１０の存在の検出が、患者がＭＳＩ表現型を有するガンを患っていることを示す方法を対象とする。
【０１６８】
いくつかの実施態様では、前記方法は、
ａ）前記患者の生体サンプルにおける本発明の突然変異ＨＳＰ１１０タンパク質の発現を測定する工程；及び／又は
ｂ）前記患者の生体サンプルにおける本発明の突然変異ＨＳＰ１１０  ｍＲＮＡの発現を測定する工程
を含み、
患者の生体サンプルにおける前記突然変異ＨＳＰ１１０タンパク質及び／又はｍＲＮＡの存在の検出が、患者がＭＳＩ表現型を有するガンを患っていることを示す。
【０１６９】
具体的な実施態様では、本発明の方法は、
ａ）前記患者の生体サンプルにおける上記突然変異ＨＳＰ１１０の発現を測定する工程；
ｂ）ネガティブコントロールサンプルにおける上記突然変異ＨＳＰ１１０の発現を測定する工程；
を含み、
工程ｂ）で測定した発現と比較して有意に高い工程ａ）で測定した突然変異ＨＳＰ１１０の発現が、生存予後が良好であること及び／又は処置に対する反応の予測が良好であることを示す。
【０１７０】
工程ａ）及びｂ）において、突然変異ＨＳＰ１１０の発現の測定は、上記突然変異ＨＳＰ１１０タンパク質及び／又は突然変異ＨＳＰ１１０  ｍＲＮＡを測定することによって実施され得る。
【０１７１】
患者の生体サンプルにおける突然変異ＨＳＰ１１０の発現レベルが、ネガティブコントロールサンプルにおける突然変異ＨＳＰ１１０のレベルと比較して２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍若しくは１０倍又は少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％若しくは７５％増加している場合、より高い発現は、統計的に有意であるとみなされる。好ましい実施態様では、患者の生体サンプルにおける突然変異ＨＳＰ１１０の発現レベルが少なくとも７５％増加している場合、より高い発現は、統計的に有意であるとみなされる。
【０１７２】
別の具体的な実施態様では、本発明の方法は、
ａ）前記患者の生体サンプルにおける上記突然変異ＨＳＰ１１０の発現を測定する工程；
ｂ）前記生体サンプルにおける野生型ＨＳＰ１１０の発現を測定する工程；
ｃ）工程ａ）及びｂ）で測定した発現を比較し、それによりＭＳＩ表現型の診断を推定する工程
を含む。
【０１７３】
工程ａ）において、突然変異ＨＳＰ１１０の発現の測定は、上記突然変異ＨＳＰ１１０タンパク質及び／又は突然変異ＨＳＰ１１０  ｍＲＮＡを測定することによって実施され得る。
【０１７４】
工程ｂ）において、野生型ＨＳＰ１１０の発現の測定は、上記野生型ＨＳＰ１１０タンパク質及び／又は野生型ＨＳＰ１１０  ｍＲＮＡを測定することによって実施され得る。
【０１７５】
実際、突然変異ＨＳＰ１１０の発現レベルが、野生型ＨＳＰ１１０の発現レベルの５０％以上、６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、９０％以上又は１００％以上であることは、患者がＭＳＩ表現型を有するガンを患っていることを示す。
【０１７６】
工程ａ）及びｂ）で測定した発現の比較は、例えば、式：比＝突然変異ＨＳＰ１１０の発現レベル／野生型ＨＳＰ１１０の発現レベルを用いて、発現比を計算することによって実施され得る。０，７５以上の発現比は、例えば、患者がＭＳＩ表現型を有するガンを患っていることを示し得る。
【０１７７】
さらに別の具体的な実施態様では、本発明の方法は、
ａ）前記患者の生体サンプルにおける上記突然変異ＨＳＰ１１０及び野生型ＨＳＰ１１０の発現を測定する工程；
ｂ）工程ａ）で得られた発現を分析して、発現比を作成する工程；
ｃ）ネガティブコントロールサンプルにおける上記突然変異ＨＳＰ１１０及び野生型ＨＳＰ１１０の発現を測定する工程；
ｄ）工程ｃ）で得られた発現を分析して、発現比を作成する工程；
を含み、
工程ｄ）で作成した発現比と比較して有意に高い工程ｂ）で作成した発現比が、患者がＭＳＩ表現型を有するガンを患っていることを示す。
【０１７８】
工程ａ）及びｃ）において、突然変異ＨＳＰ１１０の発現の測定は、上記突然変異ＨＳＰ１１０タンパク質及び／又は突然変異ＨＳＰ１１０  ｍＲＮＡを測定することによって実施され得、野生型ＨＳＰ１１０の発現の測定は、上記野生型ＨＳＰ１１０タンパク質及び／又は野生型ＨＳＰ１１０  ｍＲＮＡを測定することによって実施され得る。
【０１７９】
工程ｂ）で作成した比が、工程ｄ）で作成した比と比較して少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍又は１０倍増加している場合、より高い発現比は、統計的に有意であるとみなされる。好ましい実施態様では、患者の生体サンプルにおける発現比が少なくとも７，５倍増加している場合、比は、統計的に有意であるとみなされる。
【０１８０】
突然変異ＨＳＰ１１０及び野生型ＨＳＰ１１０の発現レベルを測定するための方法は、当技術分野において周知である。発現レベルは、ｍＲＮＡを定量化することによって、又はタンパク質を定量化することによって測定され得る。適切な方法としては、例えば、免疫化学、Ｅｌｉｓａ、ウエスタンブロッティング、フローサイトメトリー、ノーザンブロッティング、ＰＣＲ（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ及びＱＲＴ−ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写増幅法（ＴＭＡ）、鎖置換増幅法（ＳＤＡ）及び核酸配列ベース増幅法（ＮＡＳＢＡ）が挙げられる。適切な方法としては、増幅不応性突然変異システム（ＡＲＭＳ）及び高分解能融解曲線分析（ＨＲＭ  ＰＣＲ）も挙げられ得る。
【０１８１】
いくつかの実施態様では、突然変異ＨＳＰ１１０及び野生型ＨＳＰ１１０の発現レベルの測定は、「本発明の予測方法及び予測用途」という章における上記方法を使用して実施される。
【０１８２】
本明細書において使用される場合、生体サンプルは、血液サンプル、血清サンプル、血漿サンプル、排泄物サンプル又はガンの生検からなり得る。好ましくは、生体サンプルは、腺腫又は原発性ガンの生検からなり得る。さらにより好ましくは、生体サンプルは、結腸直腸ガン、胃ガン、子宮内膜ガン、膀胱ガン、尿路ガン、卵巣ガン、前立腺ガン、リンパ腫、白血病、膠芽細胞腫、星状細胞腫及び神経芽細胞腫からなる群より選択される腺腫又は原発性ガンの生検からなり得る。好ましくは、生体サンプルは、結腸直腸ガンの生検である。
【０１８３】
ネガティブコントロールサンプルが使用される場合、ネガティブコントロールサンプルは、例えば、健常個体又はＭＳＳ個体からの（好ましくは、ガン細胞と同じ組織からの）組織サンプル、患者からの健常組織（例えば、ガン組織の周囲の健常組織）のサンプル、又は一定量の突然変異ＨＳＰ１１０及び／又は野生型ＨＳＰ１１０を含むサンプルであって、健常個体又はＭＳＳ個体における突然変異ＨＳＰ１１０及び／又は野生型ＨＳＰ１１０の発現レベルを示すサンプルに対応し得る。具体的な実施態様では、ネガティブコントロールサンプルは、患者の生体サンプルと同じ種類のサンプルである。例えば、患者の生体サンプルが血液である場合、ネガティブコントロールサンプルは、血液である。別の例では、患者の生体サンプルが結腸直腸ガンの生検である場合、ネガティブコントロールサンプルは、マイクロサテライト安定性（ＭＳＳ）表現型を有する結腸直腸ガンの生検である。
【０１８４】
適切な治療計画を決定するための方法
上記方法を使用して、ＭＳＩ表現型を有する傾向があるガンを患っている被験体を処置するのに適切な治療計画を決定及び／又は選択できる。
【０１８５】
従って、本発明はまた、ＭＳＩ表現型を有する傾向があるガンを患っている被験体を処置するのに適切な治療計画を決定するための方法であって、
ａ）前記患者の生体サンプルにおける熱ショックタンパク質１１０（ＨＳＰ１１０）をコードする遺伝子のイントロン８のスプライス受容部位に局在する１７個のチミジンヌクレオチドのマイクロサテライトリピートのチミジン反復の長さを決定する工程、及び
ｂ）前記チミジン反復の長さに基づいて、被験体に適切な治療計画を推定及び／又は選択する工程
を含む方法に関する。
【０１８６】
本発明はまた、適切な治療計画を決定するためのバイオマーカーとしての、ＨＳＰ１１０をコードする遺伝子のイントロン８のスプライス受容部位に局在する１７個のチミジンのマイクロサテライトリピートの使用に関する。
【０１８７】
いくつかの実施態様では、ＭＳＩ表現型を有する傾向がある前記ガンは、結腸直腸ガン、好ましくは第ＩＩ病期又は第ＩＩＩ病期結腸直腸ガンであり得る。
【０１８８】
「適切な治療計画」は、ＭＳＩ表現型を有する傾向があるガンを患っている被験体を処置するのに適切な外科手術、化学療法及び／又は放射線療法を指し得る。
【０１８９】
小さなチミジン欠失（すなわち、３個若しくは４個のチミジン、又はそれ未満）は、適切な治療計画が、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又は多くとも１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個の薬剤を組み合わせる化学療法処置（例えば、オキサリプラチン、５−フルオロウラシル及びホリニン酸の組み合わせ（すなわち、ＦＯＬＦＯＸ処置）又は５−フルオロウラシル及びホリニン酸の組み合わせ（すなわち、ＦＵＦＯＬ又はＬＶ５ＦＵ２処置）など）であり得ることを示す。
【０１９０】
大きなチミジン欠失（すなわち、５個〜８個のチミジン、又はそれ以上）は、適切な治療計画が、５−フルオロウラシルなどの単一薬剤（gingle agent）による化学療法処置であり得ることを示す。
【０１９１】
前記チミジン反復の長さの決定は、当業者に公知の方法によって実施され得る。例えば、それは、遺伝子型決定によって実施され得る。１７個のチミジンヌクレオチドのマイクロサテライトリピートの遺伝子型決定は、当業者に公知の方法によって実施され得る。例えば、実施例１の「突然変異の分析」という段落に記載されているように、又は本説明の「本発明の診断方法」という段落に記載されているように、遺伝子型決定する。１７個のチミジンヌクレオチドのマイクロサテライトリピートの遺伝子型決定は、当業者に公知の方法によって実施され得る。例えば、１７個のチミジンヌクレオチドのマイクロサテライトリピートの遺伝子型決定は、前記マイクロサテライトリピートを増幅し、キャピラリー電気泳動により増幅産物を単離することによって実施され得る。前記マイクロサテライトリピートの増幅は、実施例１の「突然変異の分析」という段落に記載されているように、通常のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を使用して実施され得る。適切な方法としては、増幅不応性突然変異システム（ＡＲＭＳ）及び高分解能融解曲線分析（ＨＲＭ  ＰＣＲ）も挙げられ得る。
【０１９２】
本発明のキット
本発明はまた、上に定義される突然変異ＨＳＰ１１０の存在を検出するのに使用され得るフォワードプライマー、リバースプライマー及びプローブを含むか、又はこれらのものからなるキットを提供する。このキットは、野生型ＨＳＰ１１０を検出するのに使用され得るフォワードプライマー、リバースプライマー及びプローブをさらに含み得る。
【０１９３】
特に、本発明は、突然変異ＨＳＰ１１０及び野生型ＨＳＰ１１０にハイブリダイゼーションできるフォワードプライマー及びリバースプライマー、並びに上記突然変異ＨＳＰ１１０又は野生型ＨＳＰ１１０のいずれかに特異的にハイブリダイゼーションできる２つのプローブを含むキットを提供する。
【０１９４】
本発明のフォワードプライマーは、配列番号４又は１個若しくは２個のヌクレオチド置換により配列番号４の配列と異なる配列を含むか、又は配列番号４又は前記配列からなるヌクレオチド配列を有し得る。
【０１９５】
本発明のリバースプライマーは、配列番号５又は１個若しくは２個のヌクレオチド置換により配列番号５と異なる配列を含むか、又は配列番号５又は前記配列からなるヌクレオチド配列を有し得る。
【０１９６】
突然変異ＨＳＰ１１０に特異的にハイブリダイゼーションするプローブは、配列番号６の配列又は１個若しくは２個のヌクレオチド置換により配列番号６の配列と異なる配列を含むか、又は配列番号６の配列又は前記配列からなるヌクレオチド配列を有し得る。
【０１９７】
野生型ＨＳＰ１１０に特異的にハイブリダイゼーションするプローブは、配列番号７の配列又は１個若しくは２個のヌクレオチド置換により配列番号７の配列と異なる配列を含むか、又は配列番号７の配列又は前記配列からなるヌクレオチド配列を有し得る。
【０１９８】
好ましくは、プローブはラベリングされる。例えば、プローブは、当技術分野において公知の多種多様なラベル、例えばハプテンラベル（例えば、ビオチン）、マスタグラベル（例えば、安定同位体ラベル）、放射性ラベル、金属キレートラベル、発光ラベル（例えば、蛍光ラベル、リン光ラベル及び化学発光ラベル）などで共有的又は非共有的にラベリングされ得る。
【０１９９】
好ましくは、プローブは、少なくとも１つの蛍光ラベル又は色素でラベリングされる。蛍光色素は当技術分野において公知の多種多様の色素であり得、６−ＦＡＭ（商標）、ＶＩＣ（登録商標）、ＴＥＴ（商標）、ＮＥＤ（商標）、Ｃｙ３（登録商標）、Ｃｙ５（登録商標）、ＨＥＸ、ＴＡＭＲＡ、ＤＡＢＣＹＬ、ＢＨＱ（商標）、ＤＤＱなどが挙げられる。
【０２００】
より好ましくは、プローブは、レポーター色素及びクエンチャー色素でラベリングされる。さらにより好ましくは、プローブは、その５’末端がレポーター色素でラベリングされ、その３’末端がクエンチャー色素でラベリングされる。レポーター色素は蛍光色素でもよく、例えば、６−ＦＡＭ（商標）、ＶＩＣ（登録商標）、ＴＥＴ（商標）、ＮＥＤ（商標）、Ｃｙ３（登録商標）、Ｃｙ５（登録商標）、ＨＥＸなどであり得る。クエンチャー色素は非蛍光色素（例えば、ＭＧＢ（商標））でもよいし、蛍光色素でもよく、例えば、ＴＡＭＲＡ、ＤＡＢＣＹＬ、ＢＨＱ（商標）、ＤＤＱなどであり得る。
【０２０１】
より好ましい実施態様では、突然変異ＨＳＰ１１０に特異的にハイブリダイゼーションするプローブは、その５’末端がレポーター色素ＶＩＣ（商標）でラベリングされ、その３’末端がクエンチャー色素ＴＡＭＲＡでラベリングされ、野生型ＨＳＰ１１０に特異的にハイブリダイゼーションするプローブは、その５’末端がレポーター色素６−ＦＡＭ（商標）でラベリングされ、その３’末端がクエンチャー色素ＴＡＭＲＡでラベリングされる。
【０２０２】
本発明のフォワードプライマー及びリバースプライマー及びプローブは、好ましくは、１７〜３０ヌクレオチド長、より好ましくは１７〜２５ヌクレオチド長である。特に、前記フォワードプライマー及びリバースプライマー及びプローブは、互いに独立して、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド長であり得る。
【０２０３】
前記フォワードプライマー及びリバースプライマーはそれぞれ、高ストリンジェンシー及び特異的ハイブリダイゼーションの条件下で、配列番号３及び配列番号８の配列、又は配列番号３及び配列番号８の配列の逆配列にハイブリダイゼーションする。さらに、本発明の突然変異ＨＳＰ１１０にハイブリダイゼーションする前記プローブは、配列番号３の配列にハイブリダイゼーションし、本発明の野生型ＨＳＰ１１０にハイブリダイゼーションする前記プローブは、配列番号８の配列にハイブリダイゼーションする。
【０２０４】
温度及びイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。
【０２０５】
本発明はさらに、上記マイクロサテライトリピートにおけるチミジン欠失の長さを検出するのに使用され得るフォワードプライマー及びリバースプライマーを含むか、又は前記フォワードプライマー及びリバースプライマーからなるキットを提供する。
【０２０６】
本発明のフォワードプライマーは、配列番号１０又は１個若しくは２個のヌクレオチド置換により配列番号１０の配列と異なる配列を含むか、又は配列番号１０又は前記配列からなるヌクレオチド配列を有し得る。
【０２０７】
本発明のリバースプライマーは、配列番号１１又は１個若しくは２個のヌクレオチド置換により配列番号１１と異なる配列を含むか、又は配列番号１１又は前記配列からなるヌクレオチド配列を有し得る。
【０２０８】
本発明のフォワードプライマー及びリバースプライマー及びプローブは、好ましくは、１７〜３０ヌクレオチド長、より好ましくは１７〜２５ヌクレオチド長である。特に、前記フォワードプライマー及びリバースプライマー及びプローブは、互いに独立して、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド長であり得る。
【０２０９】
前記フォワードプライマー及びリバースプライマーは、高ストリンジェンシー及び特異的ハイブリダイゼーションの条件下で、配列番号９の配列、又は配列番号９の配列の逆配列にハイブリダイゼーションする。
【０２１０】
温度及びイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、６０℃〜７５℃の高いＴｍに対応する。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて塩基間のミスマッチの可能性があるが、ハイブリダイゼーションには、２個の核酸が相補配列を含有することが必要である。
【０２１１】
本発明はまた、上に定義される突然変異ＨＳＰ１１０の存在を検出するのに使用され得る抗体（すなわち、本発明の突然変異ＨＳＰ１１０タンパク質を特異的に認識する抗体）を含むか、又は前記抗体からなるキットを提供する。このキットは、野生型ＨＳＰ１１０を検出するのに使用され得る抗体をさらに含み得る。
【０２１２】
いくつかの実施態様では、本発明は、突然変異ＨＳＰ１１０タンパク質を特異的に認識する抗体、及び上記野生型ＨＳＰ１１０を特異的に認識する抗体を含むキットを提供する。
【０２１３】
いくつかの実施態様では、突然変異ＨＳＰ１１０タンパク質を特異的に認識する前記抗体、及び野生型ＨＳＰ１１０を特異的に認識する前記抗体は、同じものである。例えば、前記抗体は、AbcamのAb24503抗体であり得る。
【０２１４】
いくつかの実施態様では、突然変異ＨＳＰ１１０タンパク質を特異的に認識する前記抗体、及び野生型ＨＳＰ１１０を特異的に認識する前記抗体は、異なるものである。例えば、突然変異ＨＳＰ１１０タンパク質を特異的に認識する前記抗体は、配列番号１の配列の突然変異ＨＳＰ１１０タンパク質を認識でき、野生型ＨＳＰ１１０を特異的に認識する前記抗体は、StressgenのSPA-1101抗体であり得る。
【０２１５】
本発明はまた、
ａ）上に定義される突然変異ＨＳＰ１１０の存在を検出するための手段、及び／又は
ｂ）野生型ＨＳＰ１１０を検出するための手段、及び／又は
ｃ）上記マイクロサテライトリピートにおけるチミジン欠失の長さを検出するための手段
を含むか、又は前記手段からなるキットを提供する。
【０２１６】
いくつかの実施態様では、突然変異ＨＳＰ１１０の存在を検出するための前記手段は、上記フォワードプライマー、リバースプライマー及びプローブ、並びに／又は上に定義される突然変異ＨＳＰ１１０タンパク質を特異的に認識する抗体であり得る。いくつかの実施態様では、野生型ＨＳＰ１１０の存在を検出するための前記手段は、上記フォワードプライマー、リバースプライマー及びプローブ、並びに／又は上に定義される野生型ＨＳＰ１１０タンパク質を特異的に認識する抗体であり得る。
【０２１７】
いくつかの実施態様では、マイクロサテライトリピートにおけるチミジン欠失の長さを検出するための前記手段は、上に定義されるフォワードプライマー及びリバースプライマーであり得る。
【０２１８】
「マイクロサテライトリピートにおけるチミジン欠失の長さの検出」はまた、「前記マイクロサテライトリピートの不安定性の検出」を意味し得る。
【０２１９】
化合物及び医薬組成物
ＨＳＰ１１０は、ガン細胞で異常に蓄積することによりそれらの生存を高めるタンパク質であることが公知である（Yamagishi et al., The FEBS journal 275 (18), 4558 (2008); Hosaka et al., Cancer science 97 (7), 623 (2006); Yamagishi et al., Experimental cell research 312 (17), 3215 (2006); Siatskas et al., Faseb J 19 (12), 1752 (2005)）。また、ＨＳＰ１１０は結腸ガン細胞で特に強く発現しており（Kai et al., Oncology reports 10 (6), 1777 (2003)）、ＭＳＳ原発性ＣＲＣの遺伝子発現プロファイル分析により、ＨＳＰ１１０の発現が転移及び予後不良に関連付けられている（Slaby et al., Oncology reports 21 (5), 1235 (2009)）。
【０２２０】
本明細書において、突然変異ＨＳＰ１１０は、腫瘍細胞における野生型ＨＳＰ１１０に対してドミナントネガティブ効果を有するので、その抗アポトーシス効果を遮断し、腫瘍細胞をアポトーシス感受性にできることが見出された。
【０２２１】
従って本発明はまた、
ａ）上記突然変異熱ショックタンパク質１１０（ＨＳＰ１１０）；及び／又は
ｂ）配列番号１と少なくとも８０％同一、好ましくは配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなる突然変異熱ショックタンパク質（ＨＳＰ１１０）の少なくとも６個の連続するアミノ酸のフラグメント；及び／又は
ｃ）ａ）の突然変異ＨＳＰ１１０若しくはｂ）のフラグメントのペプチド模倣体；及び／又は
ｄ）ａ）の突然変異ＨＳＰ１１０若しくはｂ）のフラグメントをコードする核酸；及び／又は
ｅ）ナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解（ＮＭＤ）阻害剤；
からなる群より選択される、ガンの処置に使用するための化合物を対象とする。
【０２２２】
好ましい実施態様では、本発明の化合物は、上記突然変異熱ショックタンパク質１１０（ＨＳＰ１１０）及びナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解（ＮＭＤ）阻害剤の組み合わせからなる。
【０２２３】
ナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解（ＮＭＤ）は、細胞に対して潜在的に有害な効果を有する短縮タンパク質の製造を防ぐために、未成熟終止コドン（ＰＴＣ）を含有するｍＲＮＡを分解するｍＲＮＡの品質コントロールプロセスである。
【０２２４】
同定された突然変異ＨＳＰ１１０は、エクソン９を持たないためにＰＴＣが存在するｍＲＮＡによって作成される。本発明者らは、突然変異ＨＳＰ１１０が、ＭＳＩ腫瘍細胞においてＮＭＤプロセスを介して部分的に分解されることを見出した。その結果として、このようなタンパク質を発現する腫瘍における内在性突然変異ＨＳＰ１１０の発現を回復させ、及び／又は患者に投与される突然変異ＨＳＰ１１０の分解を防ぐためには、ＮＭＤを阻害することが賢明である。
【０２２５】
本明細書において使用される場合、ＮＭＤ阻害剤は、インドール誘導体化合物、好ましくは国際公開第２００８／１０１９３５号に記載されているインドール誘導体化合物であり得る。特に、前記ＮＭＤ阻害剤は、国際公開第２００８／１０１９３５号の請求項１６の式ＩＩを有するインドール誘導体化合物であり得る。好ましくは、前記ＮＭＤ阻害剤は、国際公開第２００８／１０１９３５号の請求項２１に定義される６−クロロ−５，１０−ジメチル−１１Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［３，２−ｇ］イソキノリン、５，１０−ジメチル−１１Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［３，２−ｇ］イソキノリン、５，８−ジメチル−６−（ピリジン−２−イルアミノ）−２Ｈ−イソキノリン−１−オン、６−（３−メトキシ−ピリジン−２−イルアミノ）−イソキノリン−１−オン、５，８−ジメチル−６−（５−メチル−ピリジン−２−イルアミノ）−イソキノリンからなる群で選択されるインドール誘導体であり得る。より好ましくは、前記ＮＭＤ阻害剤は、６−クロロ−５，１０−ジメチル−１１Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［３，２−ｇ］イソキノリンであり得る。この化合物は、科学論文（Durant et al., The Journal of Cell Biology 178: 1145-1160 (2007)）でＮＭＤＩ１とも称されている。
【０２２６】
前記化合物を得るための方法は、当業者に公知である。例えば、前記化合物を得るための方法は、国際公開第２００８／１０１９３５号に記載されている。
【０２２７】
最も好ましくは、前記ガンは、ＭＳＩ表現型を有する傾向があるガンである。前記ガンは、限定されないが、結腸直腸ガン、胃ガン、子宮内膜ガン、膀胱ガン、尿路ガン、卵巣ガン、前立腺ガン、リンパ腫、白血病、膠芽細胞腫、星状細胞腫及び神経芽細胞腫からなる群で選択されるガンであり得る。好ましくは、前記ガンは、結腸直腸ガンである。好ましくは、前記ガンは、原発性腫瘍又は腺腫であり得る。
【０２２８】
さらに最も好ましくは、前記ガンは、ＭＳＳ表現型を有するガンである。実際、これらのガンは、低レベルの突然変異ＨＳＰ１１０を発現する。突然変異ＨＳＰ１１０及び／又は野生型ＨＳＰ１１０の別の阻害剤（すなわち、上記ペプチド模倣体又はフラグメント）の投与は、それらのアポトーシス感受性を回復させると考えられる。
【０２２９】
あるいは、ガンは、ＭＳＩ表現型を有し得る。
【０２３０】
本発明者らは、突然変異ＨＳＰ１１０を発現する細胞が、アポトーシス、特に化学療法薬物によって誘導されるアポトーシスに対してより感受性であることを見出した。従って、本発明はまた、ガンの処置に同時に又は連続して使用するための、上記化合物及び化学療法薬物の組み合わせに関する。「化学療法薬物」は、ガンの処置について販売承認されている薬物、又はガンの処置について臨床試験若しくは前臨床試験を受けている薬物を意味する。
【０２３１】
本明細書において記載される化合物は、医薬組成物中に製剤化され得る。従って、本発明は、上記化合物のいずれか一つ及び生理学的に許容しうる担体を含む医薬組成物を企図する。生理学的に許容しうる担体は、当業者に公知の任意の方法によって調製され得る。
【０２３２】
少なくとも１つの本発明の化合物を含む医薬組成物としては、意図する目的を達成するのに有効な量で化合物が含有されているすべての組成物が挙げられる。加えて、医薬組成物は、活性化合物の加工を容易にする賦形剤及び補助剤を含む薬学的に許容しうる適切な担体を、薬学的に使用され得る調製物中に含有し得る。薬学的に許容しうる適切なビヒクルは当技術分野において周知であり、例えば、本分野における標準の参考書であるRemington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, Easton, USA, 1985)に記載されている。薬学的に許容しうるビヒクルは、通常、ペプチドの投与方法、溶解性及び安定性に従って選択され得る。例えば、静脈内投与用の製剤としては滅菌水溶液が挙げられ得るが、緩衝剤、希釈剤及びその他の適切な添加剤を含有してもよい。薬物送達のための生体材料及びその他のポリマーの使用、並びに特定の投与方法を検証するための様々な技術及びモデルは、文献に開示されている。
【０２３３】
本発明の化合物は、意図する目的を達成する任意の手段によって投与され得る。例えば、投与は、多数の異なる経路、例えば限定されないが、皮下使用、静脈内使用、皮内使用、筋肉内使用、腹腔内使用、脳内使用、髄腔内使用、鼻腔内使用、経口使用、直腸使用、経皮使用、口腔内使用、外用使用、局所使用、吸入使用又は皮下使用によって達成され得る。
【０２３４】
投与されるべき投薬量は、個体のニーズ、所望の効果及び選択される投与経路に依存する。投与される投与量は、レシピエントの年齢、性別、健康及び体重、併用処置、もしあれば処置の頻度、並びに所望の効果の性質に依存すると理解される。各処置に必要な総用量は、複数用量投与によって、又は単用量投与で投与され得る。
【０２３５】
意図する送達経路に応じて、化合物は、液体（例えば、溶液、懸濁液）、固体（例えば、丸剤、錠剤、坐剤）又は半固体（例えば、クリーム、ゲル）の形態として製剤化され得る。
【０２３６】
好ましい実施態様では、組成物は、正確な投薬を容易にするための単位剤形で提示される。「単位剤形」という用語は、ヒト被験体及びその他の哺乳動物のための単一投与量として適切な物理的に分離した単位であって、各単位が適切な医薬賦形剤と共同で所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性材料を含有するものを指す。典型的な単位剤形としては、液体組成物の予め充填され、予め測定されたアンプル若しくはシリンジ、又は固体組成物の場合は丸剤、錠剤、カプセル剤などが挙げられる。このような組成物では、本発明の化合物は、通常、微量成分であり（約０．１〜約５０重量％、又は好ましくは約１〜約４０重量％）、残りは、所望の剤形を形成するのに役立つ様々なビヒクル又は担体及び加工助剤である。
【０２３７】
本発明の化合物はまた、持続放出製剤で、又は持続放出薬物送達系から投与され得る。
【０２３８】
本発明はまた、例えば、遺伝子治療による処置の枠組みにおいて、本発明の突然変異ＨＳＰ１１０をコードする核酸を含む医薬組成物を企図する。この場合、核酸は、好ましくは、ペプチドをコードする配列が、その発現を可能にする発現シグナル（例えば、プロモーター、ターミネーター及び／又はエンハンサー）のコントロール下にあるベクター上に提示される。ベクターは、例えば、アデノウイルスベクター又はレンチウイルスベクターなどのウイルスベクターに対応し得る。
【０２３９】
本発明はさらに、本発明の化合物を含む医薬組成物、及び投与方法に関する説明書を含むキットを提供する。これらの説明書は、例えば、医学的適応、及び／又は投与経路、及び／又は投与量、及び／又は処置されるべき患者群を示し得る。
【０２４０】
本発明はさらに、ガンを処置するための方法であって、
ａ）上記突然変異熱ショックタンパク質１１０（ＨＳＰ１１０）；及び／又は
ｂ）配列番号１と少なくとも８０％同一、好ましくは配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一の少なくとも６個の連続するアミノ酸を含むか、又は前記アミノ酸からなるフラグメント；及び／又は
ｃ）ａ）の突然変異ＨＳＰ１１０若しくはｂ）のフラグメントのペプチド模倣体；及び／又は
ｄ）ａ）の突然変異ＨＳＰ１１０若しくはｂ）のフラグメントをコードする核酸；及び／又は
ｅ）ナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解（ＮＭＤ）阻害剤
からなる群より選択される化合物の有効量をそれを必要とする個体に投与することを含む方法を提供する。
【０２４１】
好ましい実施態様では、前記方法は、上記突然変異熱ショックタンパク質１１０（ＨＳＰ１１０）及びナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解（ＮＭＤ）阻害剤を投与することを含む。
【０２４２】
化合物は、「有効量」、すなわち、ガンを処置するのに十分な量で投与される。この量は、用いられる治療剤の有効性、使用される任意の担体の性質、疾患の重症度及び患者の年齢により変化すると理解される。任意の所定の組成物についての適切な量の決定は、適切な治療レベルを評価するために設計された一連の標準試験を用いて、当業者の範囲内である。
【０２４３】
「それを必要とする個体」は、ガンを患っている個体、又はガンを患った後の寛解期の個体を意味する。
【０２４４】
本発明の枠組みにおいて、個体は、好ましくは、ヒト個体である。しかしながら、本発明のポリペプチド及び薬物の獣医用途もまた想定される。従って、個体はまた、非ヒト個体、好ましくは非ヒト哺乳動物に対応し得る。
【０２４５】
「処置」という用語は、治療方法及び予防方法の両方、すなわち、状態を治癒、改善すること、及び／又はガンを患っている個体の寿命を延ばすことを目的とする方法を包含する。それはまた、転移の発生又は拡散を予防することを目的とする方法、及び再燃を予防することを目的とする方法を指す。
【０２４６】
学術論文若しくは要約、公開された若しくは未公開の特許出願、発行された特許、又は任意のその他の参考文献を含む本明細書において引用されたすべての参考文献は、引用された参考文献中のすべてのデータ、表、図及び文章を含め、参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【０２４７】
「含む」、「有する」、「含有する」及び「からなる」という用語は、異なる意味を有するが、本明細書全体を通して互換的に使用しており、互いに置き換えてもよい。
【０２４８】
以下の実施例及び図面を考慮して、本発明をさらに評価する。
【図面の簡単な説明】
【０２４９】
【図１】図１は、ＭＳＩによる不安定性がエクソンスキッピング又はエクソン保持を生じさせ得るイントロンＤＮＡリピートを含有する多数の候補遺伝子のスクリーニングを示す。候補遺伝子を選択するのに使用した基準を示す（ＩＲ：イントロンリピート。ＩＥＪ：イントロン−エクソンジャンクション）。すべての選択遺伝子は、ＣＲＣで発現していた。４５個の候補遺伝子の中で、２個が、ＭＳＩを示すＣＲＣ細胞株におけるエクソンスキッピングを示唆する異常なＲＴ−ＰＣＲプロファイルを示した（すなわち、ＭＲＥ１１及びＨＳＰ１１０）。
【図２】図２は、特異的な追加のＨＳＰ１１０  ＲＴ−ＰＣＲ産物の存在が１４個のＣＲＣ細胞株のＭＳＩ腫瘍サンプルで検出された分析を示す。そのサイズは、ＨＳＰ１１０  ｍＲＮＡにおけるエクソン９スキッピングを示唆していた。本発明者らは、ＭＭＲ能力を有する細胞株、例えば７個のＭＳＳ  ＣＲＣ細胞株及び４個のＭＳＳ  ＬＢＬ細胞株でその発現を検出できなかった。この結果は、それぞれ一連の４個のＭＳＩ原発性ＣＲＣ又は７個のＭＳＳ原発性ＣＲＣ（Ｔ）、及びそれらのマッチング正常粘膜（Ｎ）で確認された。
【図３】図３は、野生型ＨＳＰ１１０及び突然変異ＨＳＰ１１０タンパク質の構造を示す。
【図４】図４は、数個のＭＳＩ  ＣＲＣ細胞株及び原発性腫瘍及びコントロール（ＭＳＳ  ＣＲＣ及びＬＢＬ細胞株）のイントロンＨＳＰ１１０  Ｔ１７におけるアレルプロファイルを示す。ＭＳＳサンプルはわずかに多型的であったのに対してＭＳＩ  ＣＲＣ細胞株及び原発性腫瘍は多型領域（斜線の領域）の外側にある異常なアレルを常に示した。サイズが３〜８塩基対の範囲である様々なアレル欠失が観察された。観察された欠失は、大部分が、ＭＳＩ  ＣＲＣ細胞株で両アレル性であった。示されるように、ＭＳＩ原発性腫瘍では、アレルプロファイルは、ほとんどの場合、両アレル突然変異を非常に示唆していた。数字は、ＭＳＩ腫瘍サンプルにおけるＨＳＰ１１０  Ｔ１７欠失のサイズを示す（単位は塩基対）。
【図５】図５は、イントロンＨＳＰ１１０  Ｔ１７の突然変異頻度分析を示す。このリピートの突然変異は、ＭＳＩ原発性ＣＲＣ（１００％）及び前悪性腺腫（５３％）で、いずれのマイクロサテライトコーディング変異よりも高頻度に検出された。数字は、ＭＳＩ腫瘍又は腺腫サンプルにおけるＨＳＰ１１０  Ｔ１７欠失のサイズを示す。
【図６】図６は、ＲＴ−ＰＣＲによるＨＳＰ１１０ｗｔ及びＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９発現の分析を示す線図を示す。ＨＳＰ１１０ｗｔ及びＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９のＱＲＴ−ＰＣＲ産物に対応する増幅プロットを示す。ＨＳＰ１１０ｗｔ又はＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９転写産物のいずれかに特異的な異なるインターナルプローブ以外は同じＰＣＲプライマーを使用して定量ＲＴ−ＰＣＲによって、それらを競合的に増幅した。結果は、ＨＳＰ１１０ｗｔ発現に対するＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９のＮ倍差（ΔＣｔ）として表し（Ｅ）、ΔＣｔは、各場合において、ＨＳＰ１１０ｗｔ  ｍＲＮＡの平均Ｃｔ値からＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９  ｍＲＮＡの平均Ｃｔ値を引くことによって決定した。
【図７】図７は、ＭＳＳ及びＭＳＩ細胞株並びに原発性ＣＲＣにおけるＨＳＰ１１０ｗｔ及びＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９発現の定量化を示す。Ｅの比（ＥＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９／ＥＨＳＰ１１０ｗｔ）の値は、１４個のＭＳＩ  ＣＲＣ細胞株及び４３個の原発性腫瘍サンプルについて計算した。コントロールとして、本発明者らは、ＭＳＳ  ＬＢＬ（Ｎ＝２０）、ＭＳＳ  ＣＲＣ細胞株（Ｎ＝７；ＡＬＡ、ＣＯＬＯ３２０、ＳＷ４８０、ＦＥＴ、ＧＬＹ、ＦＲＩ、ＥＢ）及びＭＳＳ原発性ＣＲＣ（Ｎ＝２０）も試験した。ＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９発現に関して、ＭＳＩ及びＭＳＳ原発性ＣＲＣの間で大きな有意差が観察された（Ｐ＝８，５×１０−５；Studentのｔ検定）。Ｅの中央値は、各場合において黒色のバーによって示す。
【図８】図８は、Ｔ１７リピートの長さ及びＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９  ｍＲＮＡ発現の相関を示す。斜線及び白色のバーは、ＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９  ｍＲＮＡ発現が低かったか又は高かった（すなわち、本発明者らの一連の腫瘍で計算した中央値よりも小さいか又は大きい）ＣＲＣにそれぞれ対応する。Ｔ１７欠失のサイズには、これらの２つの腫瘍群の間で有意差があった（Ｐ＝１．１×１０−１３；Studentのｔ検定）。ＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９  ｍＲＮＡは、一般に、小さなＴ１７欠失（すなわち、３又は４塩基対）を示すＭＳＩ腫瘍、又は突然変異していなかったＭＳＳ腫瘍において、低レベルで発現していた。対照的に、それは、より大きなＴ１７欠失（すなわち、５〜８塩基対）を示すＭＳＩ腫瘍において、高く発現していた。
【図９】図９は、タンパク質凝集に対するＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９発現の効果を示す。ＨＳＰ７０、ＨＳＰ１１０及び／又はＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９でトランスフェクションしたＭＥＦ  ＨＳＦ１−／−細胞からのタンパク質抽出物を５５℃で１時間加熱した。熱ショック前後の可溶性タンパク質の初期量の比により、タンパク質凝集を定量化できた。各バーは、４回の異なる実験の平均値である。＊Ｐ＜０．０５。
【図１０】図１０は、野生型ＨＳＰ１１０に対するＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９の分析を示す。ＧＦＰタグ化ＨＳＰ１１０及び／又はＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９でトランスフェクションしたＨＣＴ１１６からの細胞溶解物を、ＨＳＰ１１０のＣ末端を認識するＨＳＰ１１０を使用して免疫沈降に供した。泳動後、膜をＧＦＰ抗体で免疫ブロットした。インプット：全細胞溶解物のタンパク質レベル。
【図１１】図１１は、アポトーシスに対するＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９の効果を示す。ＧＦＰタグ化ＨＳＰ１１０、ＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９又は空ベクター（ＧＦＰ）でトランスフェクションしたＨＣＴ１１６細胞を、指定用量のリコンビナントＴＲＡＩＬリガンド（５時間）で処理した。アポトーシスは、カスパーゼ３活性のＦＡＣＳ分析によって測定した。
【図１２】図１２は、アポトーシスに対する漸増用量のＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９の効果を示す。ＧＦＰタグ化ＨＳＰ１１０及び漸増用量のＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９又は空ベクター（ＧＦＰ）でトランスフェクションしたＨＣＴ１１６細胞を、リコンビナントＴＲＡＩＬリガンド（６０ng/ml、５時間）で処理し、アポトーシスのパーセンテージをＤＡＰＩ染色（クロマチン凝縮）によって決定した。
【図１３】図１３は、化学療法剤で処理した腫瘍細胞に対するＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９のプロアポトーシス効果を示す。ＨＣＴ１１６（ＭＳＩ）又はＳＷ４８０（ＭＳＳ）細胞をＨＳＰ１１０ｗｔ（１．５μg）でトランスフェクションし、２つの異なる用量（０．５及び１μg）のＧＦＰ空ベクター又はＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９のいずれかでコトランスフェクションした。オキサリプラチン（Ｏｘａ、４０μM、４８時間）による処理後、アポトーシスをＦＡＣＳ分析によって評価した。＊Ｐ＜０．０５。
【図１４】図１４は、ＭＳＩ又はＭＳＳ  ＣＲＣを有する患者における無病生存率（ＤＦＳ）のKaplan-Meier単変量解析を示す。統計的分析については、最初の５年間のみを示す。予想通り、ＭＳＩ又はＭＳＳ  ＣＲＣを有する患者の以下の臨床病理学的特性は、異なっていた。すなわち、Dukesの病期（Ｐ＝２．６×１０−４；Fisherの直接確率検定）、診断時の年齢（Ｐ＝２．９×１０−５）及び腫瘍位置（Ｐ＝５×１０−４）。
【図１５】図１５は、ＨＳＰ１１０発現に応じた、異なるＣＲＣ患者群におけるＤＦＳのKaplan-Meier推定を示す。図１のように、単変量解析を実施した。ＭＳＩ−ＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９Ｈｉｇｈ（Ｎ＝９；２４％）又はＭＳＩ−ＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９Ｌｏｗ（Ｎ＝２９；７６％）腫瘍を有する患者の以下の臨床病理学的特性には、有意差がなかった。すなわち、Dukesの病期、腫瘍位置、性別、ＢＲＡＦ、ＫＲＡＳ及びＰＩＫ３ＣＡ遺伝子突然変異の状態、ＧＩＭＰ及びＧＩＮの状態、ＭＳＩについてのターゲット遺伝子のフレームシフト突然変異、ＭＬＨ１及びＭＧＭＴのメチル化状態。
【図１６】図１６は、４０５個のＭＳＳ  ＣＲＣにおけるＨＳＰ１１０  Ｔ１７遺伝子型の分布を示す。
【図１７】図１７は、ＭＳＩ  ＣＲＣにおける突然変異ＨＳＰ１１０  Ｔ１７アレルの分布を示す。
【図１８】図１８は、初期コホートからの第ＩＩ病期及び第ＩＩＩ病期ＭＳＩ  ＣＲＣ患者の生存分析を、ＨＳＰ１１０  Ｔ１７ＤＮＡリピートにおける欠失のサイズに従って示す。ＨＳＰ１１０のＴ１７イントロンリピートにおける欠失のサイズに従って、患者を２群に分類する（ＭＳＩ  ＨＳＰ１１０ＤｅｌＬ患者はΔＴ＞５bp、Ｔ１１、Ｔ１０、Ｔ９；ＭＳＩ  ＨＳＰ１１０ＤｅｌＳ患者は０＜ΔＴ＜５、Ｔ１７〜Ｔ１２）。
【図１９】図１９は、検証コホートからの第ＩＩ病期及び第ＩＩＩ病期ＭＳＩ  ＣＲＣ患者の生存分析を、ＨＳＰ１１０  Ｔ１７ＤＮＡリピートにおける欠失のサイズに従って示す。ＨＳＰ１１０のＴ１７イントロンリピートにおける欠失のサイズに従って、患者を２群に分類する（ＭＳＩ  ＨＳＰ１１０ＤｅｌＬ患者はΔＴ＞５bp、Ｔ１１、Ｔ１０、Ｔ９；ＭＳＩ  ＨＳＰ１１０ＤｅｌＳ患者は０＜ΔＴ＜５、Ｔ１７〜Ｔ１２）。
【図２０】図２０は、第ＩＩ病期及び第ＩＩＩ病期ＭＳＩ  ＣＲＣ患者の生存分析を、ＨＳＰ１１０  Ｔ１７ＤＮＡリピートにおける欠失のサイズに従って示す（患者の全コホート）。ＨＳＰ１１０のＴ１７イントロンリピートにおける欠失のサイズに従って、患者を２群に分類する（ＭＳＩ  ＨＳＰ１１０ＤｅｌＬ患者はΔＴ＞５bp、Ｔ１１、Ｔ１０、Ｔ９；ＭＳＩ  ＨＳＰ１１０ＤｅｌＳ患者は０＜ΔＴ＜５、Ｔ１７〜Ｔ１２）。
【図２１】図２１は、ＭＳＩ  ＣＲＣ患者の生存分析を、ＨＳＰ１１０  Ｔ１７ＤＮＡリピートにおける欠失のサイズに従って示す。各生存分析において、腫瘍ＤＮＡにおけるＴ１７欠失のサイズに従って、患者を２群にクラスター化する（左上のパネル：ΔＴ＞２bp、Ｔ１４〜Ｔ９、すなわちＭＳＩ  ＨＳＰ１１０ＤｅｌＬＣＲＣ患者、０＜ΔＴ＜２、Ｔ１７〜Ｔ１５、すなわちＭＳＩ  ＨＳＰ１１０ＤｅｌＳ。右上のパネル：ΔＴ＞３bp、Ｔ１３〜Ｔ９、すなわちＭＳＩ  ＨＳＰ１１０ＤｅｌＬＣＲＣ患者、０＜ΔＴ＜３、Ｔ１７〜Ｔ１４、すなわちＭＳＩ  ＨＳＰ１１０ＤｅｌＳ。左下のパネル：ΔＴ＞４bp、Ｔ１２〜Ｔ９、すなわちＭＳＩ  ＨＳＰ１１０ＤｅｌＬＣＲＣ患者、０＜ΔＴ＜３、Ｔ１７〜Ｔ１３、すなわちＭＳＩ  ＨＳＰ１１０ＤｅｌＳ。右下のパネル：ΔＴ＞５bp、Ｔ１１〜Ｔ９、すなわちＭＳＩ  ＨＳＰ１１０ＤｅｌＬＣＲＣ患者、０＜ΔＴ＜５、Ｔ１７〜Ｔ１２、すなわちＭＳＩ  ＨＳＰ１１０ＤｅｌＳ）。
【図２２】図２２は、化学療法で処置した第ＩＩ病期及び第ＩＩＩ病期ＭＳＩ  ＣＲＣ患者の生存分析を、ＨＳＰ１１０  Ｔ１７ＤＮＡリピートにおける欠失のサイズに従って示す。ＨＳＰ１１０のＴ１７イントロンリピートにおける欠失のサイズに従って、患者を２群に分類する（ＭＳＩ  ＨＳＰ１１０ＤｅｌＬ患者はΔＴ＞５bp、Ｔ１１、Ｔ１０、Ｔ９；ＭＳＩ  ＨＳＰ１１０ＤｅｌＳ患者は０＜ΔＴ＜５、Ｔ１７〜Ｔ１２）。
【図２３】図２３は、５−フルオロウラシルで処置した第ＩＩ病期及び第ＩＩＩ病期ＭＳＩ  ＣＲＣ患者の生存分析を、ＨＳＰ１１０  Ｔ１７ＤＮＡリピートにおける欠失のサイズに従って示す。ＨＳＰ１１０のＴ１７イントロンリピートにおける欠失のサイズに従って、患者を２群に分類する（ＭＳＩ  ＨＳＰ１１０ＤｅｌＬ患者はΔＴ＞５bp、Ｔ１１、Ｔ１０、Ｔ９；ＭＳＩ  ＨＳＰ１１０ＤｅｌＳ患者は０＜ΔＴ＜５、Ｔ１７〜Ｔ１２）。
【０２５０】
配列の説明
配列番号１は、突然変異ＨＳＰ１１０タンパク質のアミノ酸配列を指す。
配列番号２は、野生型ＨＳＰ１１０タンパク質のアミノ酸配列を指す。
配列番号３は、突然変異ＨＳＰ１１０のヌクレオチド配列を指す。
配列番号４、５、６、７、１０、１１、１２〜２３は、プライマー及びプローブの配列を指す。
配列番号８は、野生型ＨＳＰ１１０のヌクレオチド配列を指す。
配列番号９は、ＨＳＰ１１０をコードする遺伝子のイントロン８のスプライス受容部位に局在する１７個のチミジンヌクレオチドのマイクロサテライトリピートを指す。
【実施例】
【０２５１】
実施例１：材料及び方法
腫瘍サンプル及び細胞株
ＣＲＣ細胞株はAmerican Type Culture Collectionから購入し、１０％ウシ胎仔血清（Invitrogen）及びグルタミンを含有するＤＭＥＭ（LifeTechnologies）中で保存した。原発性腫瘍及び正常結腸組織は、ＣＲＣの外科手術を受けている患者から入手した。すべての症例が腺ガンであることを病理組織学的に確認した。ＭＳＩの状態は、Buhard et al., J Clin Oncol 24 (2), 241 (2006)に記載されているように、５個の準単形モノヌクレオチドリピート（ＢＡＴ−２５、ＢＡＴ−２６、ＮＲ−２１、ＮＲ−２４及びＮＲ−２７）を含む蛍光マルチプレックスＰＣＲによって決定した。
【０２５２】
突然変異の分析
凍結サンプルの腫瘍ＤＮＡは、QIAamp DNA Tissue Kit (Qiagen)を使用して、製造業者の説明書に従って抽出した。ＨＳＰ１１０のイントロン８に特異的なプライマーは、e-primer3（http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/eprimer3.html）を使用して設計した。突然変異分析用のフォワードプライマー及びリバースプライマーはそれぞれ、
【化１７】
0006045563.tif 000019
の配列を有する。ＰＣＲ反応は、１００ngのゲノムＤＮＡ、０．１５〜０．４０μMの各プライマー及び１ユニットのHotStarTaq DNA polymerase (Qiagen)を含有する最終容量２０μlで実施した。熱サイクル条件は、最初の変性工程を９４℃で１０分間、並びに９４℃で３０秒間及び５７℃で３０秒間を４０サイクル含んでいた。蛍光ＰＣＲ産物の適切な希釈物をホルムアミド及びGeneScan（商標）400HD ROX（商標）Size Standard (Applied Biosystems)と混合し、熱変性させ、GeneMapper 3.7 software (Applied Biosystems)を使用するABI 3130 Genetic Analyzerにおいて、GS Performance Optimized Polymer 4を含有するショートキャピラリー上でランした。
【０２５３】
リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ（ＱＲＴ−ＰＣＲ）分析
全ＲＮＡは、Trizol試薬を使用して、製造業者の説明書（Invitrogen）に従って単離した。ＲＮＡの完全性は、RNA 6000 Nano LabChip kit (Agilent)を使用して、2100 Bioanalyzerで評価した。インタクトなＲＮＡを有するサンプルのみを遺伝子発現分析に使用した（２８Ｓ／１８Ｓ  ＲＮＡ比＞１．６及びＲＮＡプロファイルに異常ピーク無し）。ｃＤＮＡは、High Capacity cDNA Archive Kitを使用して、製造業者の説明書（Applied Biosystems）に従って合成した。ＱＲＴ−ＰＣＲ実験のために、ＰＣＲ産物の指数関数的増幅に関連するシグナルの増加が検出され始める時点のＣｔ値から、Applied SDS Biosystems分析ソフトウェアを使用して、製造業者に従って発現値を得た。プライマー
【化１８】
0006045563.tif 000020
及びインターナルプローブはPrimer Expressを使用して設計し、Applied Biosystemsによって合成された。インターナルプローブは、野生型ＨＳＰ１１０（以下、ＨＳＰ１１０ｗｔと称する）
【化１９】
0006045563.tif 000021
又は突然変異ＨＳＰ１１０（以下、ＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９と称する）
【化２０】
0006045563.tif 000022
転写産物のいずれかを増幅するために特別に設計した。鋳型無しのコントロール及び逆転写酵素無しのコントロール（逆転写酵素ネガティブ）の分析では無視できるシグナル（通常はＣｔ＞３５）が生じるので、プライマーの二量体形成及びゲノムＤＮＡの混入が無いことを確認するのに使用した。ＰＣＲ反応は、ABI Prism 7900 Sequence Detection System及びTaqMan PCR master mix (Applied Biosystems)を使用して、トリプリケートで実施した。結果は、ＨＳＰ１１０ｗｔ発現に対するＨＳＰ１１０ΔＥ９のＮ倍差（ΔＣｔ）として表し、ΔＣｔは、各場合において、ＨＳＰ１１０ｗｔ  ｍＲＮＡの平均Ｃｔ値からＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９  ｍＲＮＡの平均Ｃｔ値を引くことによって決定した。熱サイクル条件は、最初の変性工程を９５℃で１０分間、並びに９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間を４０サイクル含んでいた。
【０２５４】
細胞、プラスミド、トランスフェクション及び材料
ＨＣＴ１１６細胞、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）（American Type Culture Collection, ATCC）及びＨＳＦ１−／−ＭＥＦをＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清、Lonza, Basel, Switzerland）中で培養した。ＨＳＰ７０及びＨＳＰ２７構築物は、先に記載されているものとした（Ribeil et al., Nature 445: 102-105 (2007); Brunet et al., BMC Med Gene 10: 144 (2009)）。ＧＦＰ−ＨＳＰ１１０構築物は、Addgene (Cambridge, England)から入手した。ＨＳＰ１１０突然変異体は、以下のプライマー：
【化２１】
0006045563.tif 000023
を使用して、ＧＦＰ−ＨＳＰ１１０ベクターからＰＣＲによって製造した。酵素Ｂｇｌ  ＩＩ及びＨｉｎｄ  ＩＩＩによって消化した後、突然変異体ＨＳＰ１１０  ｃＤＮＡをＥＧＦｐ  Ｃ２ベクターにクローニングした。トランスフェクションは、Jet PEI reagent (Ozyme, Saint-Quentin-en-Yvelines, France)を使用して実施した。オキサリプラチンは、Sigma-Aldrichから購入した（原液５mg/ml）。リコンビナントＨｉｓ−ＴＲＡＩＬは、Olivier Micheau (INSERM U866, France)からのギフトであった。
【０２５５】
免疫沈降及びウエスタンブロッティング
最初に、トランスフェクション細胞を溶解緩衝液（５０mM  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．６）、１５０mM  ＮａＣｌ、５mM  ＥＤＴＡ及び０．１％ＮＰ４０）中で溶解させ、続いてＧＦＰ−タグ抗体を使用して免疫沈降を行った。免疫沈降物を１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中で分離し、次いで、ｗｅｔ転写装置（BioRad, Hercules, California, USA）を使用してＰＶＤＦ膜に転写した。最初に、一次抗体：Covance (Eurogentec, Angers, France)のＨＡ−タグ抗体、Santa-Cruz (TebuBio, Le Perray en Yvelines, France)の１４−３−３及びMillipore (Molsheim, France)のＧＦＰ−タグ抗体を使用して、膜を一晩プローブ化した。次に、膜を、適切なセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PE）と一緒に１時間インキュベーションし、ＥＣＬ（Amersham, Les Ullis, France）で可視化した。
【０２５６】
細胞死の分析
完全培地を入れた１２ウェル培養プレート（細胞１．５×１０５個／ウェル）に接着細胞をプレーティングした。適応があれば、細胞をＴＲＡＩＬ（１５０ng/ml又は５００ng/ml）で４時間処理し、Hoechst 33342染色（Sigma-Aldrich）によって細胞死を測定した。オキサリプラチン（ＯｘａＰｔ、２０及び４０μM）で４８時間処理した後、アポトーシス細胞をＡｐｏ２．７染色によって検出した。簡潔に言えば、細胞を回収し、ＰＢＳ中で洗浄し、ジギトニン（１００mg/ml、４℃で１０分間）で透過処理した。細胞を抗Ａｐｏ２．７抗体と一緒にインキュベーションし、LSR2フローサイトメーター（Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ）を使用して、フローサイトメトリーによってアポトーシス細胞を分析した。
【０２５７】
ＨＳＰ１１０シャペロン活性
ＨＳＰ１１０シャペロン活性は、タンパク質熱不安定性アッセイを使用して評価した。ＨＳＰ７０（ポジティブコントロール）、ＨＳＰ２７（ネガティブコントロール）、ＨＳＰ１１０又は突然変異体ＨＳＰ１１０（Dc Assay Kits, Bio-Rad, France）でトランスフェクションしたＨＳＦ１−／−ＭＥＦからの全タンパク質（２mg/mL）を５５℃で１時間加熱した。遠心分離して凝集したタンパク質を除去した後、上清に残ったネイティブなタンパク質を定量化した。可溶性タンパクの初期量と加熱後に得られた量との比により、タンパク質凝集を定量化できた。
【０２５８】
核／細胞質の抽出
プロテアーゼ阻害剤の存在下、０．２％ＮＰ−４０を含む溶解緩衝液（２０mM  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．４、１０mM  ＫＣｌ、１mM  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール）中で、５〜１０×１０６個の細胞を氷上で１０分間溶解した後、細胞質及び核の抽出物を得た。細胞溶解物を１４，０００rpmで１０分間遠心分離し、上清を丁寧に回収した（細胞質画分）。ペレットを１回洗浄し、溶解緩衝液（２０mM  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．４、１０mM  ＫＣｌ、１mM  ＥＤＴＡ、２０％グリセロール、３５０mM  ＮａＣｌ、プロテアーゼ阻害剤）に再懸濁し、遠心分離（１４０００rpm、１０分間）後に核画分を得た。
【０２５９】
免疫蛍光染色
ＧＦＰトランスフェクション細胞をＰＢＳ−パラホルムアルデヒド（４％）中で１５分間固定し、次いで、ＰＢＳ（Cambrex, Emerain ville, France）で洗浄した。ＧＦＰ蛍光は、Cell Observer station (Zeiss, Germany)を使用して評価した。
【０２６０】
患者
後ろ向き研究からの患者は、組織学的に証明されたDukes第２病期又はDukes第３病期ＣＲＣの治癒的外科切除を受けた。この研究は、施設当局の推奨に従って行った。患者は、Saint-Antoine hospital又はCentre de Physiopathologie de Toulouse Purpanで手術した。Dukes第３病期ＣＲＣ患者は、ＦＬ（フルオロウラシル＋ロイコボリン）及びオキサリプラチン（ＦＯＬＦＯＸ４）を含む薬物による補助化学療法を受けた。
【０２６１】
統計的分析
変数間の差は、必要に応じて、カイ二乗（Ｃｈｉ−２）検定又はFisherの直接確率検定で評価した。変数間の平均の比較は、Studentのｔ検定を使用して評価した。主要転帰は、無病生存率とした。生存曲線は、Kaplan-Meier推定を使用して得た。生存曲線間の差は、５年時点で、ログランク検定を使用して評価項目により評価した。
【０２６２】
実施例２：結果
ＣＲＣ細胞株及び原発性腫瘍におけるＭＳＩによる異常スプライシング事象の調査
ＭＳＩ駆動性の発ガン現象において推定上の役割を有する新たな突然変異体を発見するために、本発明者らは、非定量ＲＴ−ＰＣＲによって、少なくとも８個のヌクレオチドのモノヌクレオチドリピート配列を含有するイントロンの下流及びスプライス受容部位の周辺に位置する候補エクソン４５個の発現パターンを分析した。これらの候補遺伝子を選択するのに使用した詳細な基準を図１に示す。ヒトＭＳＩ及びＭＳＳ  ＣＲＣ細胞株のセットを使用して、非定量ＲＴ−ＰＣＲによって探索を行った（Ｎ＝２１；１４個のＭＳＩ、７個のＭＳＳ）。各ターゲットエクソンの上流配列及び下流配列にマッチしたプライマーを使用したところ、４３個が、ＭＳＩ及びＭＳＳガン細胞株において同じ発現パターンを示した。これらは選択的にスプライシングされたか（Ｎ＝１０）、又は選択的にスプライシングされなかった（Ｎ＝３３）。残りの２事例（ＭＲＥ１１及びＨＳＰ１１０）では、発現パターンは、ＭＳＩ及びＭＳＳサンプル間で著しく異なっていた。この原因は、ＭＳＩ  ＣＲＣ細胞株でのみ検出可能な追加のＰＣＲ産物の存在、並びにGiannini et al., Oncogene 23 (15), 2640 (2004)によって既に報告されているＭＲＥ１１のエクソン５スキッピング（結果は示さない）、及びＨＳＰ１１０のエクソン９スキッピング（図２及び示さない）であった。この追加のＨＳＰ１１０  ＲＴ−ＰＣＲ産物の存在は、ＭＳＩ原発性腫瘍サンプルに特異的であることも見出された（図２）。それは、一連の非腫瘍ヒト細胞株（ＭＭＲ能力を有する追加のコントロール（リンパ芽球様細胞株［ＬＢＬ］、Ｎ＝２０））では検出されなかった（図２）。ＭＳＩ  ＣＲＣを有する患者において、本発明者らは、追加のＲＴ−ＰＣＲ産物の増幅がＭＳＩ腫瘍組織に限定されていたことを観察し、正常粘膜サンプルのマッチングは全く観察されなかった（図２）。
【０２６３】
ＨＳＰ１１０  Ｔ１７イントロンＤＮＡマイクロサテライトは、ＭＳＩ  ＣＲＣ細胞株及び原発性腫瘍で常に突然変異している
次に、本発明者らは、イントロン８のスプライス受容部位の上流及び付近に位置するＨＳＰ１１０  Ｔ１７ＤＮＡリピートの突然変異の状態を決定した。この非コーディングリピートのアレルプロファイルは、ＭＳＩ及びＭＳＳ  ＣＲＣ細胞株並びに原発性腫瘍の本発明者らのパネルにおいて、並びにこの配列の多型の状態を評価するためのコントロールＬＢＬにおいて、蛍光遺伝子型決定を使用して分析した（表２）。
【０２６４】
【表２】
0006045563.tif 000024
0006045563.tif 000025
0006045563.tif 000026
【０２６５】
全体的には、この配列は、ＭＭＲ能力を有するサンプルではわずかに多型的であったのに対して（図４）、ＭＳＩ  ＣＲＣ細胞株（１４／１４（１００％））及びＭＳＩ  ＣＲＣ原発性腫瘍（４３／４３（１００％））では系統的に突然変異していた。アレル欠失は、多型領域を越えて３〜８塩基対の範囲であった（図４及び表２）。ＨＳＰ１１０  Ｔ１７の突然変異は、ＭＳＩ原発性ＣＲＣで報告したすべてのコーディングマイクロサテライトよりも高頻度であった（図５）。この突然変異は、ＭＳＩを示す腺腫（９／１７（５３％））でも検出されたが、アレル欠失は、ＭＳＩ原発性ＣＲＣで観察されたのよりも小さかった。このような前悪性結腸病変では、ＨＳＰ１１０  Ｔ１７の突然変異は、ＴＧＦＢＲ２に影響を与えるものと同じくらい高頻度であった（図５）。
【０２６６】
ＭＳＩ  ＣＲＣ細胞株及び原発性腫瘍におけるエクソン９ネガティブＨＳＰ１１０  ｍＲＮＡ（ＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９）の過剰発現
本発明者らは、ＭＳＩガン細胞株で観察された２個のＨＳＰ１１０  ＰＣＲ産物が、エクソン９を含有するか又はエクソン９を持たないＨＳＰ１１０選択的ｍＲＮＡに対応することを定量ＲＴ−ＰＣＲによって初めて確認した（図６）。エクソン９を含有するＨＳＰ１１０  ｍＲＮＡ（ＨＳＰ１１０ｗｔ）及びエクソン９を持たないＨＳＰ１１０  ｍＲＮＡ（ＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９）の両方を、ＭＳＩ及びＭＳＳ  ＣＲＣ細胞株並びにＭＳＳ  ＬＢＬにおいて競合的に定量化した（表２）。本発明者らは、ＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９  ｍＲＮＡがＭＳＳ  ＣＲＣ細胞株で弱く発現している（すなわち、ＨＳＰ１１０ｗｔ  ｍＲＮＡよりも１０〜２０倍少ない）ことを観察した（図７）。対照的に、ＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９  ｍＲＮＡ発現はＭＳＩ  ＣＲＣ細胞株でより多く、ＭＳＩ（Ｎ＝４３）及びＭＳＳ（Ｎ＝２０）原発性ＣＲＣの間で有意差があった（Ｐ＝８．５×１０−５；図６及び表２）。
【０２６７】
ＣＲＣにおけるＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９発現は、ＨＳＰ１１０  Ｔ１７ＤＮＡリピートのアレルの状態と相関する
本発明者らは、ＨＳＰ１１０  Ｔ１７イントロンＤＮＡリピートの突然変異が本発明者らの一連の原発性ＣＲＣにおけるＨＳＰ１１０の発現に影響を与え得るか否かを調査した。Ｔ１７欠失の長さは、ＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９  ｍＲＮＡの発現の有意な増加に関連しており、ＨＳＰ１１０ｗｔ転写産物に損害を与えていた（図８；Ｐ＝１．１×１０−１３）。これらの結果は、Ｔ１７リピートでアレルの可変シフト（３〜８bp）を示した１０個のＭＳＩ原発性ＣＲＣにおけるＨＳＰ１１０ｗｔ及びＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９の量を定量化することによって、タンパク質レベルで確認した。ここで再度、ウエスタンブロットを使用して、ＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９発現レベルとマイクロサテライト欠失の長さとの間の密接な関係が観察された（図９）。本発明者らは、ＨＳＰ１１０イントロンＴ１７マイクロサテライトの突然変異が、おそらくは、結腸直腸腫瘍におけるこのシャペロンの異常発現につながる原因事象であると結論付けた。
【０２６８】
ＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９は、変化したシャペロン機能を示す
ＨＳＰ１１０エクソン９のスキッピングはフレームシフトであるので、ＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９  ｍＲＮＡのエクソン１０に未成熟終止コドンを発生させる。ＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９は、Ｎ末端ＡＴＰ結合ドメインを含有するが、基質結合ドメインが欠けている短縮タンパク質である（図３）。本発明者らは、ＭＳＩ  ＣＲＣ細胞株における増加したＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９発現の役割をより良く理解するために、いくつかの機能アッセイを実施した。最初に、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）を使用して、熱ショックによって誘導されるタンパク質凝集を遮断するＨＳＰ１１０のｉｎ  ｖｉｔｒｏ能力を測定するタンパク質熱不安定性アッセイを使用して、シャペロン活性を研究した。ＨＳＰ１１０ｗｔは、ＨＳＰ７０などのその他のＨＳＰと同程度の抗凝集活性を示したが、ＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９は、このシャペロン活性を喪失していた（図９）。興味深いことに、ＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９を同時に加えた場合、ＨＳＰ１１０ｗｔの抗凝集活性は無効化されたので、この効果はドミナントネガティブであった（図９）。ＨＳＰ１１０は、ＨＳＰ７０などのその他のシャペロンに結合することが示されており、これが、全体的な細胞シャペロンネットワークに寄与する。本発明者らは今回、ＨＣＴ１１６細胞において、ＨＳＰ１１０ｗｔが、ＨＳＰ９０ではなくＨＳＰ７０及びＨＳＰ２７と効率的に相互作用したことを確認した。対照的に、ＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９は、ＨＳＰ７０及びＨＳＰ２７に結合する能力を喪失していたが、そのドミナントネガティブ効果と一致して、ＨＳＰ１１０ｗｔに強く結合した（図１０）。最後に、ＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９は、ＨＳＰ１１０ｗｔと比較して変化した細胞局在を示した。後者は核及び細胞質の両方で見られたが、ＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９は細胞質に限定されていた。
【０２６９】
ＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９はＨＳＰ１１０ｗｔの抗アポトーシス機能を遮断し、ガン細胞をオキサリプラチン感受性にする
多数の研究が、ＨＳＰ１１０の抗アポトーシス的役割についてこれまでに記載している。従って、本発明者らは、エクソン９スキッピングによるＨＳＰ１１０のトランケーションがアポトーシスに及ぼす効果を調査した。ＨＣＴ１１６細胞をＨＳＰ１１０ｗｔ又はＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９でトランスフェクションし、細胞死因子ＴＲＡＩＬ（腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド）を使用してアポトーシスをトリガーした。予想通り、ＴＲＡＩＬは用量依存的アポトーシスを誘導し、カスパーゼ−８切断、カスパーゼ−３活性、カスパーゼ−３ターゲットＰＡＲＰの切断、ミトコンドリア膜透過及び核凝縮を含む公知のアポトーシスマーカーの出現によって実証されたように、ＨＳＰ１１０ｗｔは保護効果を発揮した（図１１）。対照的に、ＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９は、ＨＳＰ１１０ｗｔの保護特性が欠如していただけではなく、その抗アポトーシス機能を用量依存的に遮断することもできた（図１２）。おそらくは、その結果として、様々なＭＳＩ（ＨＣＴ１１６、ＬｏＶｏ）、さらにはＭＳＳ（ＳＷ４８０）ＣＲＣ細胞株におけるＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９の過剰発現が、オキサリプラチン（ＣＲＣ患者の補助処置に一般的に使用されている薬物）などの抗ガン剤に対するそれらの感受性を高めた（図１３）。
【０２７０】
ＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９は、患者の生存及び化学療法に対する反応に影響を与える
次に、本発明者らは、ＣＲＣにおいてＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９  ｍＲＮＡの発現をＨＳＰ１１０ｗｔ転写産物と比較して評価することによって、ＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９が臨床的に重要であるか否かを調査した。全部で、臨床データを有するＭＳＩ  ＣＲＣ患者３８人及びＭＳＳ  ＣＲＣ患者５８人が、この研究に含まれていた。本発明者らは、ＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９発現レベルに従って、ＭＳＩ腫瘍を２群（すなわち、ＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９／ＨＳＰ１１０ｗｔ  ｍＲＮＡの比がそれぞれ７５％超及び７５％未満であるＭＳＩ−ＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９Ｈｉｇｈ（Ｎ＝９；２４％）及びＭＳＩ−ＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９Ｌｏｗ（Ｎ＝２９；７６％）腫瘍）に分類した（図６）。予想通り、患者の無病生存率（ＤＦＳ）は、患者の腫瘍ＭＳＩの状態と正の関連を示した（図１４）。さらに、ＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９を発現していなかったＭＳＳ−ＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９Ｎｅｇ患者及びＭＳＩ−ＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９Ｌｏｗ患者とは対照的に、ＭＳＩ−ＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９Ｈｉｇｈ患者は、優れたＤＦＳ及び化学療法に対する反応を示した（図１５）。重要なことに、ＭＳＩ−ＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９Ｈｉｇｈ及びＭＳＩ−ＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９Ｌｏｗ腫瘍を有する患者の臨床病理学的特徴（Dukes病期、患者の年齢及び性別、原発性腫瘍位置並びにＫＲＡＳ及びＢＲＡＦ突然変異の状態を含む）について、有意差は観察されなかった（表３）。
【０２７１】
【表３】
0006045563.tif 000027
0006045563.tif 000028
【０２７２】
実施例３：考察
その他のストレス誘導性ＨＳＰと同様に、ＨＳＰ１１０は、悪条件から細胞を保護する。しかしながら、酵母及びDrosophilaの両方においてｈｓｐ１１０遺伝子ノックアウトは致死的であるので、ＨＳＰ１１０は特定の重要な機能も提供する（Trott et al., Genetics 170 (3), 1009 (2005)）。ＨＳＰ１１０は、ＨＳＰ７０に対するヌクレオチド交換因子として作用するだけではなく（Andreasson et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105 (43), 16519 (2008)）、シャペロン抗凝集活性も有する。それは、変性タンパク質基質の結合及び安定化について、ＨＳＣ７０及びＨＳＰ７０と比較して約４倍超効率的である（Wang et al., Cancer research 63 (10), 2553 (2003)）。その強力なシャペロン（又はホルダー）機能により、ＨＳＰ１１０は非常に良い抗原担体であるので、ワクチン製剤の細胞外タンパク質として使用されている（Manjili et al., Cancer research 62 (6), 1737 (2002); Manjili et al., J Immunol 171 (8), 4054 (2003)）。ＨＳＰ１１０のシャペロン活性はＡＴＰ非依存性であるが、タンパク質の基質結合ドメインを必要とする。ＭＳＩ  ＣＲＣにおいて今回同定されたエクソン９スキッピングによる短縮型ＨＳＰ１１０（ＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９）は、基質結合ドメインを持たない。その結果として、それは、そのＨＳＰ１１０抗凝集シャペロン機能を喪失しており、ＨＳＰ７０に結合できず、それにより、ＨＳＰ７０タンパク質に対するヌクレオチド交換因子としてのその機能も喪失している。
【０２７３】
ＣＲＣ細胞におけるＨＳＰ１１０過剰発現についての考えられる説明（Kai et al., Oncology reports 10 (6), 1777 (2003)）は、それらがそれらの代謝及びシグナル伝達経路を大幅に作り替え、それにより正常細胞の生存に可欠可能なタンパク質に依存するようになっているはずであるというものである。ＨＳＰ１１０の腫瘍形成特性は、十分に理解されていないが、その抗アポトーシス特性によって部分的には説明され得る（Ceballos et al., Oncogene 24 (28), 4559 (2005); Gotoh et al., FEBS letters 560 (1-3), 19 (2004)）。ＨＳＰ１１０の過剰発現は、結腸ガンを含む異なる細胞モデルにおいてアポトーシス細胞死を防ぐことが示されている。逆に、低分子干渉ＲＮＡを介したＨＳＰ１１０の除去は、ＨＣＴ１１６細胞でアポトーシスを誘導する（Hosaka et al., Cancer science 97 (7), 623 (2006)）。興味深いことに、本発明者らは、ＨＣＴ１１６細胞における同様のアポトーシス誘導が突然変異体ＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９の過剰発現によって達成されたことを本研究で示した。有意なＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９発現レベルはＭＳＩを示す結腸ガン細胞に限定されていたので、それらの生存を不利にした。実際、ＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９は、正常なＨＳＰ１１０抗アポトーシス特性を喪失しただけではなく、ＨＳＰ１１０に結合してこれらの保護機能も用量依存的に遮断する。さらに、ＭＳＩ及びＭＳＳ  ＣＲＣ細胞の両方で過剰発現している場合、ＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９は、これらの細胞を、化学療法薬物によって誘導されるアポトーシスに対して感受性にする。本発明者らのトランスフェクション実験によって示されたように、ＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９の発現がＨＳＰ１１０ｗｔの発現と同程度か又はそれよりも高い場合に、これらのプロアポトーシス効果が特に観察されることは、注目に値する。これは、おそらくは、各ＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９分子が１個のＨＳＰ１１０ｗｔ分子と複合体を形成し、それによりその機能をドミナントに中和するという事実によるものである。
【０２７４】
ＭＳＩ  ＣＲＣにおける内在性ＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９ドミナントネガティブプロアポトーシス突然変異体の選択及び発現の理由は不明である。考えられる説明は、長い非コーディングモノヌクレオチドリピート、例えばＨＳＰ１１０のイントロン８に位置するＴ１７が、多くの場合、ＭＭＲ欠損によるＭＳＩ腫瘍における突然変異のホットスポットであるというものである（Suraweera et al., Gastroenterology 123 (6), 1804 (2002); Buhard et al., J Clin Oncol 24 (2), 241 (2006)）。これらのマイクロサテライトの大部分は機能的に不明であるのに対して、一部は生物学的活性に寄与している。たとえそれらが腫瘍抑制効果をもたらすとしても、本研究で示されたように、これらの配列の高頻度の突然変異が起こり得るので、ＭＳＩ駆動性の腫瘍形成プロセスのアキレス腱に相当する。今回試験したすべてのＭＳＩ腫瘍サンプルはＨＳＰ１１０のＴ１７リピートで突然変異しており、ＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９の蓄積を可変レベルで示した。ＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９  ｍＲＮＡの発現レベルが高い（すなわち、閾値（ＨＳＰ１１０ｗｔの７５％）を超える）ものは、ＭＳＩ結腸腫瘍の約２５％に相当する。本発明者らのｉｎ  ｖｉｔｒｏの結果と一致して、それらは、優れた生存及び化学療法に対する反応に関連していた。一方、ＭＳＩ−ＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９Ｌｏｗを有するＣＲＣ患者は、ＭＳＩ−ＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９Ｈｉｇｈ及びＭＳＳ  ＣＲＣ患者と比較して中間の生存を示した。
【０２７５】
全体的には、これらの結果は、ＣＲＣにおけるＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９発現の用量依存的な臨床効果を非常に示唆している。この突然変異体の内在性発現が、どのようにしてＣＲＣ患者の予後及び処置に対する反応に影響を与え得るのかを理解するためには、より多数のＣＲＣ患者を使用してさらに研究することが必要である。本発明者らは、その他の原発位置、例えば胃、子宮内膜及びその他のここ最近報告された部位（Duval et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101 (14), 5002 (2004)）のＭＳＩガンにおいても、ＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９が異常発現を示すはずであると理解している。その上、ＨＳＰのターゲティングが、ガン治療における興味深い増感戦略として登場した。これは、ＨＳＰがガン遺伝子様機能を有し、有害微小環境に適応しなければならないストレス腫瘍細胞の「非ガン遺伝子依存性」を媒介し得るという知識によって推進されている。様々なＨＳＰ９０阻害剤（例えば、１７−アリルアミノ、１７−デメトキシゲルダナマイシン、１７ＡＡＧ）、ＨＳＰ２７阻害剤（例えば、オリゴヌクレオチドＯＧＸ−４２７）及びＨＳＰ７０阻害剤（例えば、ＨＳＰ７０ペプチドアプタマー（Rerole et al., Cancer research 71 (2), 484 (2011)））がガン患者で現在評価されており、一部は既に第ＩＩ／ＩＩＩ相臨床試験にある（Jego et al., Cancer letters）。興味深いことに、本研究は、細胞によって内因的に産生されるＨＳＰ阻害剤の最初の報告である。本発明者らは、ＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９の増感機能を模倣し、従ってガン治療に容易に適合できる小ペプチドを現在設計している。
【０２７６】
実施例４
ＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９転写産物は、未成熟終止コドン（ＰＴＣ）を含有する。その結果として、それは、腫瘍細胞のＮＭＤ系によって部分的に分解される。実験を行って、ＭＳＩ結腸ガン細胞においてＭＳＩにより生じたその他のＰＴＣ＋ｍＲＮＡと同様に、ＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９転写産物がＮＭＤ系によって部分的に分解されたことを実証した。その結果として、ＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９の再発現は、ＭＳＩ結腸腫瘍細胞株のアポトーシスを引き起こす（データは示さない）。腫瘍細胞におけるＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９活性を模倣する（特に、その抗アポトーシス効果を模倣する）化学的又は生物学的な化合物の合成は、ＣＲＣ処置における大きな治療的関心になるかもしれない。同様に、腫瘍細胞におけるＨＳＰ１１０ｄｅｌＥ９発現を促進しやすい化合物を使用することは、非常に興味深い。それは、特に、ナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解（ＮＭＤ）系を阻害する化合物の場合である。様々な薬理学的ＮＭＤ阻害剤が現在利用可能である。それらを使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの異なる細胞モデル及び動物モデル（第一選択のＭＳＩ  ＣＲＣを異種移植したヌードマウス）の両方でこれらの実験を再現できる。
【０２７７】
実施例５
方法
患者及び標本
６つの臨床施設のうちの１つにおいて、明確なＭＳＩ表現型を示す組織学的に証明された結腸直腸腺ガンの外科切除を受けた患者３６５人を本研究で同定する（Hopital Saint-Antoine, Paris, France; CHU de Dijon, Dijon, France; CHU de Toulouse Purpan, Toulouse, France; Centre Antoine Lacassagne, Nice, France; St John of God Pathology, Subiaco, Australia; National University Hospital, Singapore）。これらの患者については、臨床データが利用可能であり、腫瘍コレクションから腫瘍組織を取り出すことができた。この研究は、施設当局の推奨に従って行った。５−フルオロウラシル＋ロイコボリンを単独で、又はオキサリプラチンなどのその他の薬物と組み合わせて、ＭＳＩ  ＣＲＣを有する患者に処置した。再発は、均一に評価した（すなわち、生物学的試験及びガン胎児性抗原レベルの測定、肺のＸ線及び腹部超音波検査又はコンピュータ断層撮影による身体検査を術後最初の３年間は３カ月ごとに、その後は６カ月ごとに２年間、その後は１年ごとに行った）。患者の追跡調査は、外科手術から最後の来院又は疾患再発までの期間と定義した。本研究では、無再発生存率は、年齢、性別、原発性腫瘍位置及び腫瘍の病期にマッチしたＭＳＳ  ＣＲＣ患者２８２人のコホートで調べた（表４〜表７）。
【０２７８】
【表４】
0006045563.tif 000029
【０２７９】
【表５】
0006045563.tif 000030
【０２８０】
【表６】
0006045563.tif 000031
【０２８１】
【表７】
0006045563.tif 000032
【０２８２】
ＨＳＰ１１０におけるＴ１７リピートのマイクロサテライト不安定性分析
QIAamp DNA Tissue Kit (Qiagen)を使用して、サンプルの腫瘍ＤＮＡを抽出した。ＭＳＩ又はＭＭＲ欠損の状態を評価するために、ペンタプレックスＰＣＲ、又はＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６若しくはＰＭＳ２一次抗体を使用してホルマリン固定腫瘍組織上で免疫ペルオキシダーゼ染色をそれぞれ実施した。ＨＳＰ１１０  Ｔ１７突然変異の状態は、Dorard and al., Nature Medicine 17:1283-1289 (2011)に記載されているように、一連のＭＳＩ  ＣＲＣサンプル３６５個及び一連のコントロールＭＳＳ結腸腫瘍サンプル４０５個（本発明者らがＭＳＳ  ＣＲＣ患者における無再発生存率を調べるのに使用したＣＲＣ２８２個を含む）において、ＰＣＲ及び蛍光遺伝子型決定によって評価した。
【０２８３】
統計的分析
患者の転帰との関連性の分析については、無再発生存期間を使用し、外科手術から最初の再発（再燃又は死亡）までの期間と定義した。Kaplan及びMeierの方法に従って生存曲線を得て、５年時点で、評価項目を使用してログランク検定によって生存分布間の差を評価した。Cox比例ハザード回帰を使用して、単変量モデル及び多変量モデルを計算した。多変量解析については、すべての変数を比較可能な同じサンプルで評価しなければならないので、一部のサンプルについてのみ利用可能な変数は、多変量モデルに含めなかった。
【０２８４】
臨床転帰に関連するＨＳＰ１１０における最小サイズのＴ１７欠失を見出すために、Dorard and al., Nature Medicine 17:1283-1289 (2011)に記載されている先の研究コホートからの第ＩＩＩ病期患者で、分析を実施した。２つのクラスの欠失サイズ（２〜５塩基対）を定義するすべての閾値を試験した。選択した閾値は、転帰と最も有意な関連性を示すものであった。このようにして、すべての腫瘍を、大きな（ＤｅｌＬ）及び小さな（ＤｅｌＳ）ＨＳＰ１１０欠失を表す２つのクラスに分類した。小さな欠失クラスの腫瘍の再分類は、十分なサンプルサイズを得るために、全データセットについて第ＩＩＩ病期患者を使用する以外は同じ方法で調査した。
【０２８５】
ＨＳＰ１１０欠失サイズ群とその他の臨床アノテーションとの間の差は、カテゴリー変数にはFisherの直接確率検定、又は連続型変数には対応のないStudentのｔ−検定を使用して、統計的有意性について試験した。
【０２８６】
第ＩＩ病期及び第ＩＩＩ病期ＭＳＩ  ＣＲＣに合わせたＭＳＳ  ＣＲＣ集団の調整は、２つのＨＳＰ１１０サイズ群について上に記載したように、ＭＳＩの状態とその他の臨床アノテーションとの間の差を評価することによって確認した。
【０２８７】
すべての分析について、０．０５未満のＰ値が統計的有意性を示すとみなした。
【０２８８】
結果
ＭＳＩ及びＭＳＳ  ＣＲＣのＨＳＰ１１０  Ｔ１７の状態
研究対象集団は、十分に確立された基準を使用してＭＳＩを明確に示した病理学的に確認された結腸直腸腺ガンを有する連続的な多施設後ろ向きの一連の患者３６５人から構成されていた。
【０２８９】
ＨＳＰ１１０  Ｔ１７の状態は、一連のコントロールＭＳＳ  ＣＲＣ４０５個（５．２％第０病期、１８．５％第Ｉ病期、２０．５％第ＩＩ病期、２１．７％第ＩＩＩ病期、１４．３％第ＩＶ病期、１９．８％不明）で評価した。図１６に示されるように、アレルの長さは、報告した多型領域６の内側において、すべての症例でＴ１６又はＴ１７のいずれかであった。３６５個のＭＳＩ腫瘍のうち、３５３個（９６．７％）が、多型領域の外側で最大７塩基対の欠失を示した。ＭＳＩ  ＣＲＣにおける異なるＨＳＰ１１０突然変異体Ｔ１７アレルの頻度及び分布を図１７に示す。
【０２９０】
ＨＳＰ１１０  Ｔ１７突然変異の状態及びＭＳＩ  ＣＲＣ患者の生存
第ＩＩ病期及び第ＩＩＩ病期ＭＳＩ  ＣＲＣにおけるＨＳＰ１１０  Ｔ１７突然変異の推定上の臨床的関連性を調査した。最初に、第ＩＩ病期又は第ＩＩＩ病期腫瘍９８個の初期コホートにおいて、これを調べた。患者を、大きな欠失（ΔＴ＞５bp、Ｔ１１、Ｔ１０及びＴ９を含む；ＨＳＰ１１０ＤｅｌＬ）又は小さな欠失（０＜ΔＴ＜５、Ｔ１７、Ｔ１６、Ｔ１５、Ｔ１４、Ｔ１３及びＴ１２を含む；ＭＳＩ  ＨＳＰ１１０ＤｅｌＳ）を示した２群にクラスター化した。第ＩＩＩ病期ＨＳＰ１１０ＤｅｌＬの症例数は少なかった（ｎ＝８）が、これらの患者は、ＨＳＰ１１０ＤｅｌＳの症例と比較して優れた生存を示した（Ｐ＝０．０６５；図１８）。第ＩＩ病期の症例については、このような生存率の差は明らかではなかった（図１８）。第ＩＩ病期又は第ＩＩＩ病期ＭＳＩ  ＣＲＣ患者２３１人の多施設検証コホートにおいて、類似の結果が得られた（図１９）。２つのコホートを合わせると、第ＩＩＩ病期ＭＳＩ  ＨＳＰ１１０ＤｅｌＬ及びＨＳＰ１１０ＤｅｌＳＣＲＣ患者間の生存率の差は、有意に達した（Ｐ＝０．０１３；図２０）。その他のカットオフポイント（ΔＴ＝２、３又は４bp）を使用して突然変異体を分類しても、生存群に有意差はなかった（図２１）。多変量解析では、ＨＳＰ１１０  Ｔ１７突然変異の状態は、第ＩＩ病期及び第ＩＩＩ病期ＭＳＩ  ＣＲＣにおける無再発生存率に有意に関連していた（表８〜表１３）。
【０２９１】
【表８】
0006045563.tif 000033
【０２９２】
【表９】
0006045563.tif 000034
【０２９３】
【表１０】
0006045563.tif 000035
【０２９４】
【表１１】
0006045563.tif 000036
【０２９５】
【表１２】
0006045563.tif 000037
【０２９６】
【表１３】
0006045563.tif 000038
【０２９７】
臨床パラメータのうち、ＨＳＰ１１０ＤｅｌＬ及び近位の腫瘍位置の間でのみ、正の関連性のみが観察された（Ｐ＝０．０２７；表１４及び表１５）。
【０２９８】
【表１４】
0006045563.tif 000039
【０２９９】
【表１５】
0006045563.tif 000040
【０３００】
５−フルオロウラシルで処置したＭＳＩ  ＣＲＣ患者のＨＳＰ１１０  Ｔ１７突然変異の状態及び生存
ＨＳＰ１１０ＤＥ９突然変異体シャペロンは、結腸ガン細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて５−フルオロウラシル及びオキサリプラチンを含む化学療法剤に対して感受性にすることが示された。本研究では、５−フルオロウラシルに基づく補助化学療法で処置したＣＲＣ患者の無再発生存率を前記患者のＨＳＰ１１０  Ｔ１７突然変異の状態と関連させて調べた。患者のコホート全体では、補助化学療法を受けたＭＳＩ  ＨＳＰ１１０ＤｅｌＬＣＲＣ被験者は、ＨＳＰ１１０ＤｅｌＳ患者と比較して有意に良好な無再発生存率を示した（Ｐ＝０．０２６；図２２）。ＭＳＩ  ＨＳＰ１１０ＤｅｌＬＣＲＣ被験者は、使用した補助化学療法計画にかかわらず、優れた生存を示した。ＭＳＩ  ＣＲＣ患者は、５−フルオロウラシル単独による補助化学療法から恩恵を受けないことが報告されているので、この特定群のＭＳＩ  ＣＲＣ患者におけるＨＳＰ１１０  Ｔ１７突然変異の状態を次に調査した。ＭＳＩ  ＨＳＰ１１０ＤｅｌＬＣＲＣを有する患者は、ＭＳＩ  ＨＳＰ１１０ＤｅｌＳ患者と比較して優れた生存を示した（図２３）。多変量モデルにより、化学療法で処置したＭＳＩ  ＣＲＣ患者の生存は、ＨＳＰ１１０  Ｔ１７突然変異の状態に依存することが確認された（表１０〜表１５）。
【０３０１】
考察
連続的な多施設後ろ向きの多数のＭＳＩ  ＣＲＣ患者３６５人の分析からの結果を本明細書において示す。ＨＳＰ１１０  Ｔ１７マイクロサテライト内における欠失は、確立された高度に再現性のある高感度のＰＣＲ蛍光遺伝子型決定法（Buhard et al., J Clin Oncol, 24:241-251, (2006)）を使用して決定した。このアプローチを使用して、及びＨＳＰ１１０  Ｔ１７欠失のサイズに従ってＭＳＩ  ＣＲＣをさらに分類して、非常に異なる無再発生存率を有する２つの第ＩＩＩ病期患者群を観察した。大きな欠失（ＨＳＰ１１０ＤｅｌＬ；ΔＴ＝５〜７bp）を有する患者（すべての第ＩＩＩ病期ＭＳＩ  ＣＲＣの約２０％を占める）は優れた予後を示し、ＨＳＰ１１０ＤｅｌＳ患者（ΔＴ＝０〜４bp）の４０％超と比較して、わずか２／２２（９％）が５年後に再燃した。従って、全体的には、これらのデータは、ＨＳＰ１１０のＴ１７リピートにおける大きな欠失が、第ＩＩＩ病期ＭＳＩ  ＣＲＣ患者の生存の改善の前兆であることを示している。その他のカットオフポイントを使用して突然変異体を分類しても、生存群に有意差はなかった。しかしながら、小さな欠失と大きな欠失との間のカットオフポイントを５に近づけるほど、第ＩＩＩ病期ＣＲＣにおける無再発生存率の点では、差がより有意である。いずれの場合でも、５は、無再発群の第ＩＩＩ病期ＭＳＩ  ＣＲＣ患者の同定を可能にする唯一のカットオフ値である。
【０３０２】
別の重要な問題は、ＨＳＰ１１０  Ｔ１７突然変異の状態が、第ＩＩＩ病期ＭＳＩ  ＨＳＰ１１０ＤｅｌＬ及びＨＳＰ１１０ＤｅｌＳ患者について観察された異なる生存に機序的な関連性を提供するか否かということである。第ＩＩ病期及び第ＩＩＩ病期ＭＳＩ  ＨＳＰ１１０ＤｅｌＬ腫瘍を有する患者は、前記患者が受けた補助化学療法が５−フルオロウラシル単独か、又は５−フルオロウラシルをその他の薬物と組み合わせたものであったかにかかわらず、優れた生存を示した。従って、ＨＳＰ１１０  Ｔ１７の状態の決定は、補助化学療法から恩恵を受けるであろうＭＳＩ  ＣＲＣ患者についての有益な予測マーカーであり得る。ＭＳＩ  ＨＳＰ１１０ＤｅｌＬＣＲＣ患者が、５−フルオロウラシル単独で処置した場合に優れた生存を示したこと、及び生存率の差が、ＭＳＩ  ＨＳＰ１１０ＤｅｌＳＣＲＣ被験者と比較した場合に依然として有意であったことは、注目に値する。重要なことに、ＨＳＰ１１０突然変異の状態と患者の年齢又はＨＮＰＣＣの状態（これは最近、ＭＳＩ  ＣＲＣにおけるこの抗ガン剤に対する反応に影響を与える基準として示唆された）との間には、関連性がなかった。これらの知見は、ＣＲＣ患者における補助療法の使用について、重要な臨床的意義を持つ可能性がある。よく特徴付けられた患者コホートをさらに分析することによって、又は前向き無作為化比較研究によって確認したならば、ＨＳＰ１１０  Ｔ１７突然変異の状態は、ＭＳＩ  ＣＲＣにおいて直接的かつ論理的な補助化学療法に使用できることが示されるであろう。本コホートでは、ＭＳＩ  ＨＳＰ１１０ＤｅｌＬＣＲＣ患者は、ＦＯＬＦＯＸで処置した場合に優れた生存を示したが、生存率の差は、ＭＳＩ  ＨＳＰ１１０ＤｅｌＳＣＲＣ被験者と比較した場合に有意に達しなかった。
【０３０３】
上記知見は、ＨＳＰ１１０突然変異の状態に関係するＭＳＩ結腸ガンの中に、臨床的多様性の階層がさらにあることの証拠を提供する。従って、ＭＳＩ  ＨＳＰ１１０ＤｅｌＳ及びＨＳＰ１１０ＤｅｌＬＣＲＣ患者の生存を、年齢、性別、腫瘍部位及び病期にマッチしたＭＳＳ患者２８２人のコホートの生存と比較した。ＭＳＩ  ＨＳＰ１１０ＤｅｌＬ患者の生存は、第ＩＩＩ病期の及び補助療法（adjuvant）で処置した患者群の両方におけるＭＳＳ  ＨＳＰ１１０ＷＴ患者の生存よりも有意に良好であった。ＭＳＳ  ＨＳＰ１１０ＷＴ及びＭＳＩ  ＨＳＰ１１０ＤｅｌＳ患者群の間で、生存率の差は観察されなかった。単一化学療法剤として５−フルオロウラシルで処置した患者については、ＭＳＩ及びＭＳＳ群の生存の間で、有意差は観察されなかった。しかしながら、ＭＳＩ  ＨＳＰ１１０ＤｅｌＳ患者は、５−フルオロウラシルで処置したＭＳＳ  ＨＳＰ１１０ＷＴ症例と類似の生存を示したのに対して、ＭＳＩ  ＨＳＰ１１０ＤｅｌＬ患者の生存は、有意により良好であった。ＭＳＩ及びＭＳＳ  ＣＲＣ患者を含む多変量モデルでは、ＨＳＰ１１０  Ｔ１７突然変異の状態は、ＣＲＣ患者における無再発生存率に有意に関連していた（表４）。これらの最新の結果は、ＨＳＰ１１０  Ｔ１７突然変異の状態が、予測バイオマーカーとしてＭＳＩよりも優れている可能性があることを示唆している。それらはＣＲＣにおける臨床的多様性の問題を強調しており、前向き研究によって確認したならば、より一般にＭＳＩ及びＭＳＳ結腸直腸腫瘍の臨床的挙動を再検討することにつながるはずである。
【０３０４】
本明細書において示したデータは、ＨＳＰ１１０のＴ１７リピートの遺伝子型分析が、新たな知見をＭＳＩ  ＣＲＣの臨床的特徴に提供することを示している。この簡便な方法を使用して、新鮮な又はパラフィン包埋された腫瘍ＤＮＡサンプルのＨＳＰ１１０突然変異の状態を決定できる。従って、前向き無作為化比較研究でマイクロサテライト不安定性表現型を調査するのと常に一緒に、結腸腫瘍におけるＨＳＰ１１０  Ｔ１７突然変異の状態は、細胞傷害性補助化学療法から恩恵を受ける可能性が最も高い患者のサブセットを臨床医が選択するのを支援するのに使用できることを確認することが推奨され得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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