(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
圧電片の固有振動数の変化に基づいて細胞を感知するための方法であって、
圧電材料からなる圧電片及びこの圧電片の内部領域を介して対向するように形成された一対の励振電極を含む第１の振動領域と、前記細胞を吸着するために前記励振電極の少なくとも一方の表面に形成され、正に帯電した吸着層と、前記第１の振動領域を発振させるための第１の発振回路と、を用い、
細胞の周期を揃える工程と、
前記工程で周期を揃えた細胞を前記吸着層に吸着させる工程と、
前記吸着層に吸着された細胞に対して、当該細胞を増加または減少させる薬液を供給する工程と、
少なくとも前記薬液を供給した後、第１の発振回路の発振周波数である周波数情報を取得する工程と、を備えたことを特徴とする感知方法。
【請求項２】
前記吸着層には、周期を揃えた所定の数の細胞を吸着させることを特徴とする請求項１記載の感知方法。
【請求項３】
取得された前記周波数情報及びこの周波数情報に基づいて取得された共振抵抗値の少なくとも一方を表示する工程を含むことを特徴とする請求項１または２に記載の感知方法。
【請求項４】
予め求めた細胞数と周波数情報である信号の変化量との対応関係に基づいて、細胞数を演算する工程を含むことを特徴とする請求項１ないし３のいずれか一つに記載の感知方法。
【請求項５】
前記吸着層は、正に帯電したアミノ基を含むことを特徴とする請求項１ないし４のいずれか一つに記載の感知方法。
【請求項６】
前記第１の振動領域に対して参照用として設けられ、圧電材料からなる圧電片及びこの圧電片の内部領域を介して対向するように形成された一対の励振電極を含む第２の振動領域と、前記第２の振動領域を発振させるための第２の発振回路と、を用い、
前記周波数情報は、第１の発振回路の発振周波数であることに代えて、前記第１の発振回路及び第２の発振回路の各々の発振周波数の差分であることを特徴とする請求項１ないし５のいずれか一つに記載の感知方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、圧電片に設けられた電極上の吸着層に細胞を吸着させ、圧電片の固有振動数の変化に基づいて細胞を感知する感知方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
動物に対して効果を持つ（何らかの作用を及ぼす）薬剤の選別（スクリーニング）や薬剤の性能評価、更には薬剤の作用メカニズムの解明など薬剤の開発を行うにあたり、動物を用いた動物試験に代えて、培養細胞を用いた試験が行われることがある。即ち、細胞を培養し、この細胞に対して薬剤を投与して当該薬剤の評価が行われる。そして、薬剤の効果の有無や程度を確かめるための指標の一つとして、例えば薬剤投与後における細胞数の増加や減少が評価（測定）される。具体的には、例えば有用な細胞を増殖させることのできる薬剤を選定（同定）する場合には、薬剤投与後に細胞数が増加したか否かを評価する。また、例えば抗癌剤として効果のある薬剤を選定する場合には、薬剤投与後に細胞数の減少や細胞の死滅が確認されたか否かを評価する。
【０００３】
しかし、現在のところ、細胞数を高い精度で速やかに測定できる手法は少ない。具体的には、細胞数の測定法としては、培養皿（ディッシュ）にて細胞を培養した後、この培養皿から細胞を剥がして（採取して）、血球計算盤や自動細胞計数機で測定する方法や、ラジオアイソトープ（ＲＩ）を用いて細胞を標識してＲＩ強度を測定する方法、あるいはＢｒｄＵ（５−ｂｒｏｍｏ−２’−ｄｅｏｘｙ−ｕｒｉｄｉｎｅ）と呼ばれる試薬を細胞に取り込ませて標識し、免疫染色によって定量する方法などが知られている。これらの測定方法は、いずれも手間がかかる（速やかに測定できない）上、薬剤を投与した後、ある時点で測定することになる（エンドポイントアッセイ）ため、経時的な細胞数の変化を評価することは困難である。また、細胞数を経時的に測定できる装置も知られているが、このような装置は極めて高価であり、また汎用性が低く、細胞数の測定に用途が限定されてしまう。そのため、速やかにかつ簡便に細胞数を経時的に測定できる手法が求められている。
【０００４】
一方、細胞が増殖するにあたって、細胞分裂やタンパク質の合成などを周期的に繰り返しており、この周期の長さや、ある一つの周期の中で細胞分裂やタンパク質の合成がどのタイミングで起こっているのかということについては、癌や再生医療と関連があるため、近年盛んに研究されている。この細胞周期を同定するにあたり、現在では主にフロートサイトメトリー（ＦＡＣＳ）と呼ばれる手法を用いているが、この手法は既述の測定方法と同様に、ある時点（エンドポイント）で採取した細胞がどのような活動（細胞分裂やタンパク質の合成など）を行っていたかを測定する方法であり、また細胞を固定化した上で蛍光色素を細胞に取り込むという煩雑な作業が必要になってしまう。そのため、このような細胞周期を研究する分野においても、細胞周期をリアルタイムで速やかにかつ簡便に測定できる手法が求められている。
【０００５】
特許文献１には、水晶振動子の電極表面に微生物を吸着させて、水晶振動子の発振周波数の変化に基づいて微生物を検知するセンサが記載されているが、既述の課題については検討されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−２７５７９８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明はこのような事情に基づいてなされたものであり、その目的は、細胞を簡便に速やかに感知できる感知方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記吸着層としては、正に帯電したアミノ基を含むものを用いることができる。また、前記第１の振動領域に対して参照用として設けられ、圧電材料からなる圧電片及びこの圧電片の内部領域を介して対向するように形成された一対の励振電極を含む第２の振動領域を備えていても良く、この場合には前記第１の振動領域及び前記第２の振動領域は、共通の圧電片に設けられていることが好ましい。
【００１２】
さらに、本発明の感知方法は、
圧電片の固有振動数の変化に基づいて細胞を感知するための方法であって、
圧電材料からなる圧電片及びこの圧電片の内部領域を介して対向するように形成された一対の励振電極を含む第１の振動領域と、前記細胞を吸着するために前記励振電極の少なくとも一方の表面に形成され、正に帯電した吸着層と、前記第１の振動領域を発振させるための第１の発振回路と、を用い、
細胞の周期を揃える工程と、
前記工程で周期を揃えた細胞を前記吸着層に吸着させる工程と、
前記吸着層に吸着された細胞に対して、当該細胞を増加または減少させる薬液を供給する工程と、
少なくとも前記薬液を供給した後、第１の発振回路の発振周波数である周波数情報を取得する工程と、を備えたことを特徴とする。
また前記第１の振動領域に対して参照用として設けられ、圧電材料からなる圧電片及びこの圧電片の内部領域を介して対向するように形成された一対の励振電極を含む第２の振動領域と、前記第２の振動領域を発振させるための第２の発振回路と、を用い、
前記周波数情報は、第１の発振回路の発振周波数であることに代えて、前記第１の発振回路及び第２の発振回路の各々の発振周波数の差分であってもよい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、圧電片の内部領域を介して対向するように一対の励振電極を形成すると共に、この励振電極の一方の表面に、正に帯電した吸着層を形成している。そのため、吸着層に細胞を容易に吸着させることができるので、圧電片の発振周波数の変化に基づいて、細胞を簡便に速やかに感知できる。また、この吸着層の形成された第１の振動領域と共に、吸着層の設けられていない参照用の第２の振動領域を設けて、これら第１の振動領域及び第２の振動領域における周波数の差分を算出することにより、感知センサの周囲の温度などの影響を抑えて細胞を高い精度で感知できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の感知装置の全体構成を示す概略図である。
【図２】前記感知装置のセンサユニットの一例を示す斜視図である。
【図３】前記センサユニットを示す分解斜視図である。
【図４】前記センサユニットを示す縦断面図である。
【図５】前記のセンサユニットに用いられる水晶振動子の一例を示す縦断面図である。
【図６】前記水晶振動子を示す平面図である。
【図７】前記水晶振動子に形成される吸着層を模式的に示す斜視図である。
【図８】感知装置における回路構成を示す概略図である。
【図９】前記水晶振動子における細胞の吸着及び分裂を示す模式図である。
【図１０】前記細胞を撮影した結果を示す撮像図である。
【図１１】前記感知装置にて得られる特性を示す特性図である。
【図１２】前記感知装置にて得られる特性を示す特性図である。
【図１３】前記感知装置にて得られる特性を示す特性図である。
【図１４】前記感知装置にて得られる特性を示す特性図である。
【図１５】前記感知装置にて得られる特性を示す特性図である。
【図１６】前記感知装置にて得られる特性を示す特性図である。
【図１７】前記感知装置に用いられる薬液の構造式の一例を示す模式図である。
【図１８】前記感知装置に用いられるπ回路を示す構成図である。
【図１９】水晶振動子の共振特性を示す特性図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
［第１の実施の形態：細胞の増加］
本発明の感知センサを備えた感知装置の第１の実施の形態の一例について、図１〜図８を参照して説明する。この感知装置は、図１に示すように、センサユニット２と、このセンサユニット２に薬液などの水溶液を供給する液供給系１と、センサユニット２に取り付けられた感知センサである水晶センサ７を駆動し、また得られた発振出力を処理する周波数測定部１０を含むネットワークアナライザ（制御部）１５と、を備えている。センサユニット２及び液供給系１は、例えば培地のｐＨ及び湿度の維持のために、二酸化炭素（ＣＯ2）雰囲気に保たれた恒温槽（インキュベーター）７０内に設置されている。図１中７１は液供給系１からセンサユニット２に向かって伸びる供給路７２に介設された例えば三方弁などにより構成されたバルブであり、７３は排液部である。また、図１において７４は、π回路が内部に設けられた冶具であり、水晶センサ７の発振周波数は、この冶具７４内のπ回路を介して周波数測定部１０にて測定される。尚、図１では感知装置を簡略化して示している。
【００１６】
センサユニット２は、図２〜図４に示すように、支持体２１、封止部材３０、配線基板３、圧電振動子である水晶振動子４、流路形成部材５及び上部カバー２４が下側からこの順番で積層されて構成されている。既述の水晶センサ７は、配線基板３上に水晶振動子４を設けて構成されている。この水晶振動子４は、図３、図５及び図６に示すように、例えばＡＴカットの圧電片である円板状の水晶片４１の表面側及び裏面側に、夫々例えば金（Ａｕ）などからなる励振電極４２、４３を設けて構成されている。この例では、水晶片４１の裏面（下面）側に第１の励振電極４３Ａ及び第２の励振電極４３Ｂが互いに離間して配置されると共に、表面（上面）側に前記２つの励振電極４３Ａ、４３Ｂに対する共通の励振電極（共通電極）４２を配置している。従って、図５に示すように、第１の励振電極４３Ａ及び共通電極４２により第１の振動領域４Ａが形成され、第２の励振電極４３Ｂ及び共通電極４２により第２の振動領域４Ｂが形成されている。
【００１７】
共通電極４２における第１の励振電極４３Ａに対応する上方側の領域には、図５に示すように、感知対象物である細胞を吸着するための吸着層４６が形成されている。この吸着層４６は、図７に模式的に示すように、共通電極４２（金電極）の表面に結合したイオウ（Ｓ）を含む結合手４６ａと、この結合手４６ａに結合したアミノ基（−ＮＨ２）４６ｂとにより構成されている。このアミノ基４６ｂは、細胞の感知を行う時には、後述するように細胞や薬液などを含む水溶液中に曝されるので、当該水溶液に含まれる水素（Ｈ）と配位結合を起こして（−ＮＨ３）となり、正（プラス）に帯電することとなる。そして、細胞は、表面が負（マイナス）に帯電しているため、水溶液（試料液）中では、吸着層４６に静電的に引き寄せられるので、当該吸着層４６に極めて吸着しやすくなっている。
【００１８】
従って、吸着層４６に試料液中の細胞が吸着すると、第１の振動領域４Ａにおける発振周波数が質量負荷効果により低下し、一方第２の振動領域４Ｂでは共通電極４２に細胞が吸着しない。そのため、吸着層４６に細胞を吸着させた後、各領域４Ａ、４Ｂの発振周波数を比べる（差分を取る）ことにより、センサユニット２の周囲の温度、試料液そのものの粘度、試料液中に含まれる細胞以外の物質の付着などの外乱の影響を抑えて、吸着層４６に吸着した細胞の量に対応する発振周波数の変化（低下分）を感知できることになる。この吸着層４６を共通電極４２上へ付着させる方法や、吸着層４６に細胞を吸着させる方法については、後で詳述する。尚、既述の結合手４６ａとアミノ基４６ｂとの間には、実際には複数のメチル基（−ＣＨ２）などが介在している場合もあるが、ここでは説明を省略している。
【００１９】
既述の第１の励振電極４３Ａ及び第２の励振電極４３Ｂは、夫々引出電極４３１，４３２を介して、図３及び図６に示すように、水晶センサ７をセンサユニット２に装着した時に、配線基板３上に引き回された導電路３２、３４に夫々電気的に接続されるように構成されている。また、共通電極４２は、同様に裏面側へ回り込むように形成された引出電極４２１を介して、水晶センサ７をセンサユニット２に装着した時に、配線基板３上に形成された導電路３３に電気的に接続されるように構成されている。配線基板３の端部領域には、各導電路３２〜３４と夫々接続される接続端子３５〜３７が形成されている。そして、これら導電路３２、３４は、図８に示すように、周波数測定部１０に設けられた後述の発振回路６Ａ、６Ｂに夫々接続され、共通電極４２は、発振回路６Ａ、６Ｂのアース側に接続される。尚、図６（ａ）は水晶振動子４の表面側を示しており、同図（ｂ）は裏面側を示している。
【００２０】
水晶振動子４は、図３及び図４に示すように、配線基板３に形成された貫通孔３１を塞ぐように装着されており、水晶センサ７は、この図４に示すように、弾性体からなる流路形成部材５と、リング状の弾性体からなる封止部材３０と、により夫々表面側及び裏面側が押しつけられた状態でセンサユニット２に取り付けられる。
【００２１】
図１〜図４中２６は液体供給管、２７は液体排出管であり、液体供給管２６を介して液供給系１から供給される水溶液が流路形成部材５と水晶振動子４との間の流路である液体供給領域５３を通って液体排出管２７から排出されるように構成されている。また、図１に示すように、液供給系１は、薬液などの水溶液の貯留されたシリンジ状のポンプ２８を備えている。この例では、細胞数を減少あるいは細胞を死滅させるために、抗癌剤（薬液）であるアドリアマイシン及び細胞の栄養源である培地（ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）が１０％含まれたＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ）培地）を含む第１の水溶液の貯留されたポンプ２８ａと、細胞数を増加させるために、培地を含む第２の水溶液の貯留されたポンプ２８ｂと、が設けられている。
【００２２】
次に、周波数測定部１０について図８を参照して説明する。図８中６Ａは水晶振動子４の第１の振動領域４Ａを発振させるための第１の発振回路、６Ｂは水晶振動子４の第２の振動領域４Ｂを発振させるための第２の発振回路であり、これらの発振出力（周波数信号）は、スイッチ部８０により交互に周波数測定部１０に取り込まれるように構成されている。この周波数測定部１０は、周波数カウンターや、例えば特開２００６−２５８７８７号などの手法で回転ベクトルの速度を求める手法などによって周波数を検出するように構成されており、既述のように制御部であるネットワークアナライザ１５内に設けられている。尚、図８では既述の治具７４については省略している。
【００２３】
この周波数測定部１０にて得られた各振動領域４Ａ、４Ｂの各々の発振周波数は、演算部である差分取得プログラム１１ａによって比較され（差分を取られ）、表示部１７に表示される。また、このネットワークアナライザ１５に設けられた抵抗値測定プログラム１１ｂにより、前記各々の発振周波数に基づいて、水溶液中の粘弾性を示す共振抵抗値（クリスタルインピーダンス：ＣＩ）が求められると共に、各振動領域４Ａ、４Ｂの各々の粘弾性の差分が算出され、表示部１７に表示される。尚、図８中１４はＣＰＵ、１８はバスである。なお、共振抵抗値の測定方法については後述する。
【００２４】
次に、感知装置の作用について説明する。ここでは、細胞を培養する場合（細胞数の増加を確認する場合）について説明するが、先ず、吸着層４６の形成方法について述べる。センサユニット２を組み立てる前に、水晶振動子４において吸着層４６の形成される部分（共通電極４２の第１の励振電極４３Ａに対応する上方側の領域）以外の励振電極４２、４３を例えば樹脂などのマスク材で覆った後、水晶振動子４をシステアミン（ＨＳＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）溶液に浸漬する。前記部分がシステアミン溶液と接触すると、当該部分にシステアミン溶液中のイオウ（Ｓ）が多数箇所に自己吸着的に付着し、既述の吸着層４６が形成される。次いで、余分なシステアミン溶液を洗い流した後、既述のマスク材を除去する。この吸着層４６は、この例では互いに対向する一対の励振電極の一方に形成されているが、一対の励振電極の両方に薬液が供給される構成であれば、一対の励振電極の両面に吸着層４６を形成するようにしてもよい。
【００２５】
続いて、トリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）処理により別の培養皿からＨｅＬａ細胞（ヒト由来の細胞）を予め剥離しておき、例えば５０００個のＨｅＬａ細胞を含む水溶液を前記吸着層４６の表面に滴下（播種）する。ここで、吸着層４６に滴下するＨｅＬａ細胞の個数は、培養前のＨｅＬａ細胞の個数が分かるように、例えば予め実験を行うことによって、吸着層４６に吸着できるＨｅＬａ細胞の個数よりも少なく設定しておく。
【００２６】
既述のように、この水溶液中に含まれる水素が吸着層４６のアミノ基４６ｂに配位し、当該アミノ基４６ｂがプラスに帯電するので、表面がマイナスに帯電しているＨｅＬａ細胞は、図９（ａ）に示すように、この吸着層４６に吸着していく。そして、十分な吸着時間を取った後、滅菌したセンサユニット２内に水晶振動子４を収納し、このセンサユニット２を図２に示すように気密に一体化すると共に、配線基板３に形成された接続端子３５〜３７を介して振動領域４Ａ、４Ｂと発振回路６Ａ、６Ｂとを夫々電気的に接続する。そして、このセンサユニット２を恒温槽７０内に設置する。尚、図９では、ＨｅＬａ細胞及び吸着層４６を模式的に示しており、またこれらＨｅＬａ細胞及び吸着層４６の数量についても簡略化している。
【００２７】
次いで、各発振回路６Ａ、６Ｂにより例えば９ＭＨｚの周波数で水晶振動子４（振動領域４Ａ、４Ｂ）を発振させ、周波数測定部１０においてこれら振動領域４Ａ、４Ｂの各々の発振周波数の測定を開始する。ここで、第１の振動領域４Ａは、吸着層４６及びＨｅＬａ細胞の分だけ第２の振動領域４Ｂよりも発振周波数が低くなっている。そのため、培養開始前における各振動領域４Ａ、４Ｂの各々の発振周波数の差分は、吸着層４６及び培養開始前におけるＨｅＬａ細胞の個数に対応する。そして、液供給系１から培地（薬液である第２の水溶液）を液体供給領域５３に供給すると、各振動領域４Ａ、４Ｂでは、この水溶液によって振動（発振）が妨げられるので、発振周波数が低下してある値に各々落ち着く。
【００２８】
続いて、吸着層４６上のＨｅＬａ細胞に培地が例えば１μｌ／ｍｉｎの流速で供給されると、このＨｅＬａ細胞は、培地を栄養源として例えばタンパク質やＤＮＡを合成したり、あるいは分裂（増殖）したりする。この分裂によって生成した新たなＨｅＬａ細胞は、分裂前のＨｅＬａ細胞と同様に表面がマイナスに帯電しているので、図９（ｂ）に示すように、吸着層４６に速やかに吸着する。具体的には、ＨｅＬａ細胞が例えば２つに分裂すると、吸着力が一時的に弱くなり（吸着層４６から一時的に離れて）、その後吸着層４６に再吸着する。従って、ＨｅＬａ細胞が増殖した分、第１の振動領域４Ａにおける発振周波数は、質量負荷効果により低下していく。
【００２９】
そのため、各振動領域４Ａ、４Ｂの各々の発振周波数の差分を取ると共に、この差分から培養前の各振動領域４Ａ、４Ｂの差分を差し引くことにより、ＨｅＬａ細胞の個数に対応する周波数がリアルタイムに（経時的に）速やかに算出されることになる。即ち、第２の振動領域４Ｂの発振周波数は既述のように温度変化や水溶液そのものの粘度、あるいはＨｅＬａ細胞以外の物質の付着などの外乱によるものであることから、第１の振動領域４Ａの発振周波数から第２の振動領域４Ｂの発振周波数を差し引くと、外乱による周波数の変動分を補償した、ＨｅＬａ細胞の吸着に起因する周波数の差分が得られる。ここで、ＨｅＬａ細胞がタンパク質などを合成すると、ＨｅＬａ細胞の数量が増加しなくても、ＨｅＬａ細胞の重量が増加する。そのため、ＨｅＬａ細胞の数量が変化しなくても、領域４Ａにおける発振周波数が下降する。しかし、この細胞はその後タンパク質などによって増えた分に相当する重量の細胞を生成する（分裂する）ので、結果として見ると周波数の増減が細胞の数量に相当することになる。
【００３０】
また、ＨｅＬａ細胞が増殖した分、吸着層４６の近傍の領域の粘弾性が増加するので、共振抵抗値が増加する。従って、この共振抵抗値の差分からも、ＨｅＬａ細胞の吸着量に対応する値が分かる。これら発振周波数の差分及び共振抵抗値の差分は、既述のように表示部１７に表示される。この際、これら差分のデータは、所定時間毎にデータのみを表示するようにしてもよいし、例えば図１１に示すように、データを連続的に取得してグラフ化したものを表示するようにしてもよい。また、発振周波数のみを表示するようにしてもよいし、共振抵抗値のみを表示するようにしてもよい。図１０は、細胞播種直後（培養前）と、４８時間培養した後と、において細胞を撮影した顕微鏡写真を示している。この図１０からも、吸着層４６に細胞が吸着して、この吸着層４６において細胞が接着進展及び増殖していることが分かる。尚、図１０に示す顕微鏡写真は、０．１９６ｃｍ２の電極面積を撮像したものである。
【００３１】
ここで、培養後のＨｅＬａ細胞の数量については、ＨｅＬａ細胞の個数に対応する周波数の変化分を予め求めておくことにより算出される。具体的には、例えば既述のようにＨｅＬａ細胞を培養した後、培養液の供給（培養）を停止して、その時のＨｅＬａ細胞の個数を既述の血球計算盤、自動細胞計数機、ラジオアイソトープ（ＲＩ）あるいはＢｒｄＵを用いた手法により計数する。培養開始前におけるＨｅＬａ細胞の個数及び発振周波数と、培養後の発振周波数とが既知であることから、培養後におけるＨｅＬａ細胞の個数を計数することによって、発振周波数の変化分に対応するＨｅＬａ細胞の変化量（検量線）が分かることになる。このような検量線を具体的に求めた例については、後述の第２の実施の形態にて詳述し、細胞の個数を求める例については、後述の第４の実施の形態にて詳述する。以上の発振周波数の測定により、成分や効果が未知の薬液を含む水溶液を用いた場合であっても、ＨｅＬａ細胞に対して供給した水溶液の効果（ＨｅＬａ細胞が増加するか否か及びどの程度ＨｅＬａ細胞が増加するか）が分かる。
【００３２】
上述の実施の形態によれば、水晶振動子４の発振周波数の変化に基づいて細胞を感知するにあたり、吸着層４６としてプラスに帯電したアミノ基４６ｂを用いている。そして、このプラスに帯電したアミノ基４６ｂは、細胞の培養に用いていた従来の培養ディッシュ（皿）と同程度の細胞吸着能力を持っている。そのため、表面がマイナスに帯電した細胞が吸着層４６に静電的な引き合いにより速やかに吸着するので、細胞を容易に感知することができる。また、前記静電的な引き合いにより、電極表面への細胞の接着及び伸展が促進されるので、増殖に適している。さらに、細胞の標識が不要であることから、細胞を速やかに感知できる。更に、細胞を培養している間に亘って発振周波数を測定しているので、例えば細胞の増加を経時的に（リアルタイムに）感知できる。また、１つの水晶振動子４上に２つの振動領域４Ａ、４Ｂを設けておき、一方の振動領域４Ａを測定用、他方の振動領域４Ｂを参照用としていることから、センサユニット２の周囲の温度などの影響を抑えることができ、従って細胞を高い精度で感知できる。そのため、これまでの細胞の計数方法に比べて、薬剤の評価速度を速めることができ、新たな薬剤を速やかに開発できる。以上の第１の実施の形態では、発振周波数の測定に加えて、共振抵抗値についても算出するようにしたが、共振抵抗値を用いずに発振周波数によってＨｅＬａ細胞を感知しても良い。
【００３３】
［第２の実施の形態；細胞周期の同定］
続いて、本発明の第２の実施の形態について、本発明のセンサユニット２を用いてＨｅＬａ細胞の周期の同定を行った例を説明する。既述のように、細胞は分裂（Ｇ２／Ｍ期）、タンパク質の合成（Ｇ１期）及びＤＮＡの合成（Ｓ期）からなる細胞周期を繰り返している。そこで、センサユニット２を用いて、この細胞周期の同定を行った。先ず、吸着層４６に吸着させるＨｅＬａ細胞の細胞周期がまちまちだと、細胞周期を特定できない。そのため、既述の第１の実施の形態と同様に水晶振動子４に吸着層４６を付着させると共に、この吸着層４６に滴下するＨｅＬａ細胞について、以下の処理を行うことにより、予め細胞周期を同調させた。
【００３４】
（細胞周期の同調）
具体的には、ダブルチミジンブロック法により、Ｓ期の初期のＨｅＬａ細胞については細胞活動を休止させ、一方Ｓ期以外の周期の活動を行っているＨｅＬａ細胞については、そのまま細胞活動を続けさせると共に、Ｓ期の初期に到達すると活動が休止するように調整した。そして、別途実験を行うことにより、ＨｅＬａ細胞がＳ期に同調したことを確認した。即ち、このダブルチミジンブロック法を行った後、吸着層４６にこのＨｅＬａ細胞を滴下すると共に、ＢｒｄＵ（５−ｂｒｏｍｏ−２’−ｄｅｏｘｙ−ｕｒｉｄｉｎｅ）と呼ばれる試薬を培地に添加した。続いて、２時間後に洗浄及び細胞周期の固定を行った後、抗ＢｒｄＵ抗体を用いた免疫染色を行ったところ、約８０％のＨｅＬａ細胞にＢｒｄＵが取り込まれて（約８０％のＨｅＬａ細胞がＢｒｄＵを取り込む活動を行う周期に到達して）おり、従ってＨｅＬａ細胞の大部分がＳ期に同調していることが分かった。
【００３５】
（細胞周期の同定）
そして、既述のダブルチミジンブロック法を行ったＨｅＬａ細胞を吸着層４６に滴下して吸着させ、センサユニット２を組み立てて、各領域４Ａ、４Ｂの発振とこれら領域４Ａ、４Ｂの発振周波数の測定とを開始すると共に、液供給系１から第２の水溶液（培地）を液体供給領域５３に供給して、前記ＨｅＬａ細胞を培養し、取得された発振周波数を表示部１７に表示する。図１１は、この時得られた第１の振動領域４Ａにおける発振周波数（差分を取る前の発振周波数）を示しており、また図１２はこの発振周波数に基づいて算出された共振抵抗値を示している。このように、発振周波数の表示部１７には、例えば発振周波数のデータを連続して取得し、グラフ化したものが表示される。この際、第１の振動領域４Ａにおける発振周波数と第２の振動領域４Ｂにおける発振周波数とを別個に表示してもよいし、これら第１の振動領域４Ａ及び第２の振動領域４Ｂにおける発振周波数の差分を取得し、この差分の発振周波数を表示してもよい。また、発振周波数の代わりに共振抵抗値のデータを表示するようにしてもよいし、発振周波数と共振抵抗値との両方のデータを表示するようにしてもよい。
【００３６】
これらの図１１及び図１２から、細胞周期を同調させたＨｅＬａ細胞の培養を行うことにより、発振周波数の減少及び共振抵抗値の増加が確認された。尚、図１３及び図１４は、ＨｅＬａ細胞を吸着層４６に吸着させずに培地を供給した時に得られた発振周波数及び共振抵抗値を示している。以上の図１１〜図１４の結果から、発振周波数及び共振抵抗値の変化は、ＨｅＬａ細胞の細胞活動に起因していることが分かる。
【００３７】
この時、発振周波数や共振抵抗値は、ある周期で増減を繰り返している。そこで、共振抵抗値について着目して検討すると、Ｍ期（Ｇ２／Ｍ期）において細胞分裂が起こる時、元々吸着層４６に吸着していた細胞が例えば２つに分裂するので、一時的に吸着層４６から離れて、その後これら細胞が吸着層４６に再吸着していると考えられる。そのため、Ｍ期では、共振抵抗値が一時的に減少すると考えられる。また、Ｇ１期では、タンパク質の合成が活発になるので、細胞の体積及び重量が増加して、共振抵抗値が上昇すると考えられる。更に、Ｓ期ではＤＮＡの合成が行われるので、このＳ期でも細胞の体積や重量が増加すると考えられる。このような考察を元に、共振抵抗値の増減に各Ｍ期、Ｇ１期及びＳ期を割り振ると、ＨｅＬａ細胞は、図１５に示すように、３時間のＧ２／Ｍ期と、１２時間のＧ１期と、９時間のＳ期と、をこの順番で２４時間の周期で繰り返している
【００３８】
従って、本発明の水晶センサ７は、予め細胞周期を同調させることにより、細胞の体積の増減を介して当該細胞周期についても測定できると考えられる。つまり、細胞の重量に応じて発振周波数が変化すると共に、細胞分裂の際に吸着層から浮き上がるときに一次的に重量が減少するように変化するため、細胞の種類に対応した発振周波数（又は共振抵抗値）の波形を取得することができる。これにより、発振周波数又は共振抵抗値を継続して取得することにより、細胞が培養により増加するときには、発振周波数又は共振抵抗値が周期的に増減を繰り返しながら、発振周波数で言えば徐々に減少し、共振抵抗値で言えば徐々に増加していく。そして、共振抵抗値で言えば、既述のように、増加後一次的に減少するポイントをＧ２／Ｍ期と判断することができるので、細胞の種類に対応した細胞周期を前記発振周波数又は共振抵抗値の波形から判断することができる。
【００３９】
このため、細胞の培養時に発振周波数及び共振抵抗値の少なくとも一方のデータを取得して、その波形を表示部１７に表示するようにすれば、細胞周期をリアルタイムで計測することができる。これにより、作業者は、その波形を見れば、細胞が細胞周期のどの段階にあるかがリアルタイムで分かるため、周期特異的な薬剤を最適なタイミングで添加することができ、このような薬剤の解析が容易になる。
【００４０】
（検量線の作成と細胞数の算出）
続いて、既述の検量線を求めるために行った実験について説明する。吸着層４６に５０００個のＳ期に同調させたＨｅＬａ細胞を吸着させ、培地を水晶センサ７に供給して４８時間に亘ってＨｅＬａ細胞の培養を行った。そして、培養前後における共振抵抗値及び発振周波数の夫々の差を求めると共に、培養後のＨｅＬａ細胞の個数を顕微鏡写真から直接計数した。この結果を以下の表に示す。
【００４１】
（表）
0005911279.tif 000002
【００４２】
この表から、ＨｅＬａ細胞１個あたりの共振抵抗値及び発振周波数の夫々の変化量は、夫々０．０２２Ω及び−０．０５８Ｈｚとなっていた。従って、これらの値を用いることにより、測定する度に培養後のＨｅＬａ細胞の個数を数えなくても、培養前後の発振周波数や共振抵抗値から、ＨｅＬａ細胞の個数を算出できる。
【００４３】
つまり、発振周波数を用いて細胞の個数を算出するときには、培養後の発振周波数と、培養前の発振周波数との差を求めることにより、発振周波数の変化量を求める。そして、既述のように、細胞１個あたりの発振周波数の変化量は、−０．０５８Ｈｚであることから、発振周波数の変化量に応じた細胞数を算出する。また、共振抵抗値を用いて細胞の個数を算出するときには、培養後の共振抵抗値と、培養前の共振抵抗値との差を求めることにより、共振抵抗値の変化量を求める。そして、既述のように、細胞１個あたりの共振抵抗値の変化量は、０．０２２Ωであることから、共振抵抗値の変化量に応じた細胞数を算出する。ここで、発振周波数又は共振抵抗値の変化量は、第１の振動領域４Ａの発振周波数（共振抵抗値）と第２の振動領域の発振周波数（共振抵抗値）の差分の発振周波数の変化量であってもよいし、第１の振動領域４Ａのみの発振周波数（共振抵抗値）の変化量であってもよい。
【００４４】
この場合、正確な細胞数を算出する場合には、既述の手法により細胞周期を同調させて、計数した細胞を吸着層に吸着させて培養を開始し、発振周波数又は共振抵抗値を取得するが、大凡の細胞数を算出する場合には、細胞周期の同調は必ずしも行う必要はない。
【００４５】
このような、細胞数の算出は、例えば既述のネットワークアナライザ１５に細胞の個数を算出する細胞数演算プログラムを設けて行うようにしてもよい。この場合には、予め細胞の種類毎に、細胞１個あたりの発振周波数の変化量や、共振抵抗値の変化量を取得しておき、ネットワークアナライザ１５のメモリに格納しておく。そして、細胞数演算プログラムでは、培養前後の発振周波数（又は共振抵抗値）の変化量を演算し、細胞の種類に対応した細胞１個あたりの発振周波数（又は共振抵抗値）の変化量を用いて、細胞数の演算を行い、演算結果である細胞数を表示部に表示する。
【００４６】
（細胞１個の質量の計算）
続いて、細胞１個の質量を計算により求める手法について説明する。以下の式（１）により、１Ｈｚの周波数の変化は、約１ｎｇの重量の変化分に相当することが知られている。
式（１）
0005911279.tif 000003
【００４７】
既述のように、ＨｅＬａ細胞１個あたりの発振周波数の変化量は−０．０５８Ｈｚであるので、１個のＨｅＬａ細胞は、約５８ｐｇであることが分かる。そのため、ＨｅＬａ細胞以外の細胞であっても、水晶センサ７を用いることによって１個あたりの重量を測定できると考えられる。尚、この実験については、センサユニット２を既述のように一定温度に保たれた恒温槽７０に収納して実験を行っており、また既述の図１１（図１２）と図１３（図１４）とを比較しても分かるように、外乱の影響はほとんど少ないため、各振動領域４Ａ、４Ｂの差分を取らずに前記表の値として振動領域４Ａの値を用いている。
【００４８】
［第３の実施の形態；細胞の減少（死滅）］
続いて、本発明の第３の実施の形態について、本発明のセンサユニット２を用いてＨｅＬａ細胞の減少を感知した例を説明する。第３の実施の形態における装置については、既述の第１、第２の実施の形態と同じ構成であるため説明を省略するが、薬液としては既述の第１の水溶液（アドリアマイシン、図１７参照）を用いる。
【００４９】
先ず、既述の第１の実施の形態と同様に、共通電極４２への吸着層４６の付着及びこの吸着層４６へのＨｅＬａ細胞の滴下を行った後、センサユニット２を組み立てる。次いで、各領域４Ａ、４Ｂの発振とこれら領域４Ａ、４Ｂの発振周波数の測定とを開始すると共に、液供給系１から第２の水溶液（培地）を液体供給領域５３に供給する。続いて、培養開始から例えば４８時間後に、水晶センサ７に供給する水溶液を第２の水溶液から第１の水溶液に切り替える。第１の水溶液に含まれるアドリアマイシンにＨｅＬａ細胞が触れると、当該ＨｅＬａ細胞が死滅し、例えば細胞接着性を失う。そのため、死滅したＨｅＬａ細胞は、吸着層４６から離脱していく。こうしてアドリアマイシンの供給を続けると、吸着層４６からのＨｅＬａ細胞の離脱（死滅）が継続的に起こり、例えば吸着層４６から全てのＨｅＬａ細胞が剥離する。
【００５０】
図１６は、以上の処理を行った時に得られた第１の振動領域４Ａにおける発振周波数及び共振抵抗値を示した結果である。水晶センサ７に供給する水溶液を培地からアドリアマイシンに切り替えると、発振周波数が減少から増加に転じると共に、共振抵抗値が増加から減少に発振周波数の変化と同じタイミングで転じていた。また、アドリアマイシンの供給を開始した時から２１時間後には、発振周波数及び共振抵抗値についてはＨｅＬａ細胞を吸着させる前の値に戻っており、顕微鏡にて確認したところ、全てのＨｅＬａ細胞が死滅していることが分かった。
【００５１】
従って、本発明の水晶センサ７を用いることにより、抗癌剤による細胞死をリアルタイムで計測できると考えられる。この第３の実施の形態では、ＨｅＬａ細胞が増加から減少に転ずる様子を確認するために、水晶センサ７に供給する水溶液を培地からアドリアマイシンに切り替えたが、測定当初からアドリアマイシンを供給しても良い。
【００５２】
このように、図１に示す構成の感知装置を用いることにより、吸着層に吸着された細胞を増殖させる薬液と細胞を死滅させる薬液の供給をバルブ７１の切替えにより行うことができる、このため、細胞の増殖から死滅まで、一連の様子を周波数変化又は共振抵抗値変化で計測することができ、細胞の増殖や死滅の状況をリアルタイムで取得することができる。
【００５３】
既述の各例では、センサユニット２を組み立てる前に、水晶振動子４の吸着層４６に細胞を吸着させたが、センサユニット２にて細胞を吸着させても良い。具体的には、細胞及び培地を含む水溶液の貯留されたポンプ（図示せず）を既述の各ポンプ２８ａ、２８ｂとは別に設けて、センサユニット２を組み立てた後、水晶センサ７に対して培地（第１の水溶液）を例えば５０μｌ／ｍｉｎで供給する。そして、水晶センサ７の発振周波数が安定した後、バルブ７１を切り替えて、１×１０４個／ｍｌの細胞を水晶センサ７側に例えば１００ｍｌ供給する。次いで、水晶センサ７への細胞の供給が完了した後、液の供給を停止し、例えば１５時間静置して細胞を吸着層４６に吸着させる。その後、既述の各例のように、水溶液を供給する。
【００５４】
このような手法であれば、バルブ７１を切り替えるだけで細胞の吸着から当該細胞に対する薬液の供給までを連続的に行うことができるので便利である。また、以上の各例では、２つの振動領域４Ａ、４Ｂを設けてセンサユニット２の周囲の温度などの影響を抑えるようにしたが、これら振動領域４Ａ、４Ｂを各々別の圧電片４１、４１に形成し、互いに隣接するように配置してもよい。更に、１つの振動領域４Ａだけを設けるようにしても良く、この場合には測定前後の発振周波数の差分を計算するようにしても良い。
【００５５】
既述の吸着層４６を構成する化合物として、プラスに帯電したアミノ基４６ｂを用いたが、プラスに帯電していれば細胞を吸着できるので、吸着層４６にはアミノ基４６ｂに代えて、プラスに帯電したポリスチレン膜やコラーゲン膜などを用いても良い。また、細胞に対して供給する薬液としては、既述の第１の水溶液としてアドリアマイシンを用いたが、例えばアドリアマイシン以外の抗癌剤や細胞増殖のための増殖因子や、分化促進のための分化誘導剤などを用いても良い。更に、培養する細胞としては、ＨｅＬａ細胞以外にも、ＮＩＨ−３Ｔ３などのマウス由来の株化細胞や、初代培養細胞など、あらゆる細胞を用いることができ、制限はない。
【００５６】
また、細胞に対して水溶液を供給している間に亘って発振周波数を測定し、細胞を経時的に感知したが、間隔を置いて測定しても良い。本発明のセンサユニット２は、水晶センサ７を取り替えるだけで別の測定も行うことができるので、汎用性が高い。即ち、吸着層４６として抗体を用いた場合には、感知対象物として抗原を感知できる。また、互いに異なる種類の細胞同士の間の相互作用や、細胞とウイルスとの間の相互作用を調べる場合にもセンサユニット２を用いることができると考えられる。具体的には、細胞を吸着層４６に吸着させておき、この吸着層４６に対して別の細胞やウイルスを供給し、発振周波数の変化を測定することにより、これら細胞間や細胞とウイルスとの間で起こる相互作用を検出できる可能性がある。
【００５７】
以上において、本発明では、細胞容積が増えると質量が増加するため、この質量増加により発振周波数又は共振抵抗値が変化することを利用して、細胞容積の増減を検出するようにしてもよい。例えば、細胞周期のＧ１期は、細胞数は増加せず、タンパク合成等により細胞容積が増大する。従って、既述の細胞周期の同定により、細胞周期がＧ１期であると認識しているときには、発振周波数又は共振抵抗値の変化は、細胞容積の変化に依存するものであるため、細胞容積の増減を検出することができる。
【００５８】
ここで、共振抵抗値の測定方法について説明する。前記水晶センサ７の発振周波数は、冶具７４内のπ回路を介して周波数測定部１０にて測定されるが、このπ回路の構成について図１８に示す。図中Ｚｘは水晶振動子の電気等価回路である。Ｚｏ、Ｚｌは測定系のインピーダンスであり、Ｖｉは電源部７５の印加電圧、Ｖｏは、Ｚｌにかかる電圧であって、これらは次式の関係にある。
Ｖｏ／Ｖｉ＝Ｚｌ／（Ｚｏ＋Ｚｘ＋Ｚ１）                              図１９に水晶振動子の共振特性を示す。ｆｓは共振周波数、Ｌ[ｄＢ]は伝送量（減衰量）である。周波数ｆ＝ｆｓの時には、Ｚｘ＝Ｒ1（共振抵抗値）であり、次式が成り立つ。
Ｌ[ｄＢ]＝２０Ｌｏｇ（Ｚｌ／（Ｚｏ＋Ｚｌ＋Ｒ１））＋Ｖｏ／Ｖｉ        これにより、                                                                Ｒ１＝Ｚｌ／{１０＾（Ｌ−Ｖｏ／Ｖｉ）／２０}−（Ｚｏ＋Ｚｌ）        こうして、共振抵抗値Ｒ１は発振周波数に基づいて取得される。例えば２０秒に一回周波数を掃引し、データ（発振周波数及び共振抵抗値（ＣＩ））を取得している。
【００５９】
以上において、本発明では、少なくとも吸着層に吸着された細胞に薬液を供給した後、第１の発振回路の発振周波数を取得するようにすればよく、必ずしも薬液を供給しながら、リアルタイムで発振周波数を取得する必要はない。例えば、細胞への薬液の供給を開始する前と、細胞への薬液の供給を停止した後に、夫々発振周波数を取得し、これら発振周波数を比較して、細胞数の増減を把握するようにしてもよい。
【符号の説明】
【００６０】
１  液供給系
２  センサユニット
４  水晶振動子
４Ａ  振動領域
４Ｂ  振動領域
６Ａ  発振回路
７  水晶センサ
１０  周波数測定部
４２  共通電極
４２  励振電極
４６  吸着層
４６ａ  結合手
４６ｂ  アミノ基
【図１】
0005911279.tif 000004
【図２】
0005911279.tif 000005
【図３】
0005911279.tif 000006
【図４】
0005911279.tif 000007
【図５】
0005911279.tif 000008
【図６】
0005911279.tif 000009
【図７】
0005911279.tif 000010
【図８】
0005911279.tif 000011
【図９】
0005911279.tif 000012
【図１０】
0005911279.tif 000013
【図１１】
0005911279.tif 000014
【図１２】
0005911279.tif 000015
【図１３】
0005911279.tif 000016
【図１４】
0005911279.tif 000017
【図１５】
0005911279.tif 000018
【図１６】
0005911279.tif 000019
【図１７】
0005911279.tif 000020
【図１８】
0005911279.tif 000021
【図１９】
0005911279.tif 000022