(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
レグマイン結合部分に共有結合された脂質成分を含むレグマイン標的指向性脂質であって、レグマイン結合部分が、式（Ｉ）
【化１】
0005871930.tif 000006
により表される反応部を有するアザ−Ａｓｎマイケルアクセプター型のレグマイン阻害剤を含む、レグマイン標的指向性脂質。
【請求項２】
脂質成分が１，２−ジアシルグリセロ−ホスホアルカノールアミンを含み、レグマイン結合部分が１，２−ジアシルグリセロ−ホスホアルカノールアミンのアミン基に結合している、請求項１に記載のレグマイン標的指向性脂質。
【請求項３】
１，２−ジアシルグリセロ−ホスホアルカノールアミンが１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む、請求項２に記載のレグマイン標的指向性脂質。
【請求項４】
レグマイン標的指向性脂質成分が、式（ＩＩ）：
【化２】
0005871930.tif 000007
の化合物を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のレグマイン標的指向性脂質。
【請求項５】
脂質ナノ粒子を含むレグマイン標的指向性ナノ粒子組成物であって、ナノ粒子が請求項１から３のいずれか一項に記載のレグマイン標的指向性脂質をナノ粒子の成分として包含する、レグマイン標的指向性ナノ粒子組成物。
【請求項６】
レグマイン標的指向性脂質が、ナノ粒子中で１つ以上の他のミセルまたは小胞形成脂質材料と混合されている、請求項５に記載のレグマイン標的指向性ナノ粒子組成物。
【請求項７】
ナノ粒子が、（ａ）レグマイン標的指向性脂質、（ｂ）双性イオン性脂質成分、（ｃ）アミノ置換脂質成分、（ｄ）中性脂質成分、および（ｅ）ポリエチレングリコールにコンジュゲートされた脂質成分を含み、ならびに場合により成分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）が、約１．１：６．７：６．７：２．２：１の（ａ）：（ｂ）：（ｃ）：（ｄ）：（ｅ）のモル比でナノ粒子中に存在する、請求項５または６に記載のレグマイン標的指向性ナノ粒子組成物。
【請求項８】
双性イオン性脂質成分（ｂ）が、１，２−ジアシルグリセロ−ホスホコリン化合物を含み、および／またはアミノ置換脂質成分（ｃ）が、１，２−ジアシルグリセロ−ホスホアルカノールアミン化合物を含み、および／または中性脂質成分（ｄ）が、コレステロールを含み、および／またはポリエチレングリコールにコンジュゲートされた脂質成分（ｅ）が、ポリエチレングリコールにコンジュゲートされた１，２−ジアシルグリセロ−ホスホアルカノールアミン化合物を含む、請求項７に記載のレグマイン標的指向性ナノ粒子組成物。
【請求項９】
１，２−ジアシルグリセロ−ホスホコリン化合物が、１，２−ジ−（９Ｚ−オクタデセノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンを含み、１，２−ジアシルグリセロ−ホスホアルカノールアミン化合物が、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンを含み、およびポリエチレングリコールにコンジュゲートされた１，２−ジアシルグリセロ−ホスホアルカノールアミン化合物が、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール］を含み、化合物のポリエチレングリコール部の平均分子量が、約２０００原子質量単位（ａｍｕ）である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
がん治療薬がナノ粒子内に封入されている、請求項５から９のいずれか一項に記載のレグマイン標的指向性ナノ粒子組成物。
【請求項１１】
がん治療薬が、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、イホスファミド、５−フルオロウリシル、フロクスウリジン、シトシンアラビノシド、メルカプトプリン、チオグアニン、アザチオプリン、フルダラビン、ペントスタチン、クラドリビン、エトポシド、エトポシドホスファート、テニポシド、アムサクリン、パクリタキセル、メトトレキサート、トリメトプリム、ピリメタミン、ペメトレキセド、ビタキシン、アネコルバート、アンジオスタチン、エンドスタチン、スクワラミン、血管新生抑制トリプトファニル−ｔ−ＲＮＡシンテターゼペプチド断片、ベバシズマブ、チボザニブ、バンデタニブ、バタラニブ、アレムツズマブ、セツキシマブ、ゲムツズマブ、イブリツモマブ、パンチツムマブ、リツキシマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、アクチノマイシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、バルルビシン、イダルビシン）、ウルソール酸、２−シアノ−３，１２−ジオキソオレアナ−１，９−ジエン−２８−酸エステル、２−シアノ−３，１２−ジオキソオレアナ−１，９−ジエン−２８−酸アミド、１−［２−シアノ−３−，１２−ジオキソオレアナ−１，９（１１）−ジエン−２８−オイル］イミダゾール（ＣＤＤＯ−Ｉｍとしても公知である。）、ならびに生理的に許容されるこれらの塩およびプロドラッグからなる群から選択される少なくとも１つの化合物を含む、請求項１０に記載のレグマイン標的指向性ナノ粒子組成物。
【請求項１２】
がん治療薬が、Ｓｔａｔ３阻害剤、抗腫瘍剤、または腫瘍増殖に関与する受容体もしくは受容体リガンドのアゴニストもしくはアンタゴニストである化合物を含む、請求項１０または１１に記載のレグマイン標的指向性ナノ粒子組成物。
【請求項１３】
がん治療薬を封入するための、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１４】
レグマインを発現する腫瘍またはがん疾患を治療するための、請求項５から１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
がん治療薬を封入するための、請求項５から１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
レグマインを発現する腫瘍またはがん疾患を治療するための薬剤の調製のための、請求項５から１２のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１７】
レグマインを発現するがん疾患の標的指向および治療のための医薬組成物であって、有効量の請求項１０から１２のいずれか一項に記載のレグマイン標的指向性ナノ粒子組成物を含む、医薬組成物。
【請求項１８】
レグマインを発現する腫瘍の標的指向および治療のための医薬組成物であって、有効量の請求項１０から１２のいずれか一項に記載のレグマイン標的指向性ナノ粒子組成物を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
リガンド標的指向はナノ粒子（ＮＰ）を介した薬剤送達における主要な前進であり、高い局所濃度および低い全身曝露を達成し、薬物毒性を低減させる一方、標的細胞への最適用量の送達を維持する。このストラテジーについてのプルーフオブコンセプト（Ｐｒｏｏｆ  ｏｆ  ｃｏｎｃｅｐｔ）は抗体およびホーミングペプチドを使用して確立されたが、この抗体およびホーミングペプチドは腫瘍の脈管構造により過剰発現される接着受容体に結合するものであり、この接着受容体としては腫瘍細胞上のインテグリン、ＨＥＲ−２および葉酸細胞表面受容体が挙げられる。リガンド標的指向に関連した懸念としては、受容体の飽和、低い受容体−リガンド親和性、限定的な組織浸透および固形腫瘍の遺伝的不均質性が挙げられる。レグマインは種々の腫瘍細胞により過剰発現されるアスパラギニルエンドペプチダーゼである。この結果として、レグマインは治療剤を腫瘍細胞に向かわせるための好都合な標的を提供する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００２】
本発明の組成物および方法はリガンド標的指向に関連した懸念に取り組む一方で、腫瘍特異的な薬剤送達のための有効な手段を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本発明は、場合により抗がん化学療法剤を封入するリポソームナノ粒子の水分散液を含む、水溶性腫瘍標的指向性リポソームナノ粒子組成物を提供する。本発明の水溶性腫瘍標的指向性リポソームナノ粒子組成物は、１つ以上の他のミセルまたは小胞形成脂質材料と混合されたナノ粒子性リポソーム分散液形態においてレグマイン標的指向性脂質を含み、場合により抗がん化学療法剤をリポソームナノ粒子内に封入する。レグマイン標的指向性脂質成分はレグマイン結合部分に共有結合された疎水性の脂質部を含む。抗がん化学療法剤はリポソームナノ粒子内にナノ粒子を調製する間に封入されることが可能であり、またはナノ粒子を予め形成し、続いて化学療法剤を充填することも可能である。好ましい水溶性腫瘍標的指向性リポソームナノ粒子組成物は、（ａ）レグマイン標的指向性脂質成分、（ｂ）双性イオン性脂質成分、（ｃ）アミノ置換脂質成分、（ｄ）中性脂質成分および（ｅ）ナノ粒子性リポソームとして水溶性担体（例えば生理的に耐容できるバッファーであり、薬剤処方において一般に用いられる様々な生理的に許容される賦形剤および補助剤を包含することが可能である。）中に分散されたポリエチレングリコールにコンジュゲートされた脂質成分を含む。レグマイン標的指向性脂質成分はレグマイン結合部分に共有結合された疎水性の脂質部を含む。レグマイン結合部分は、レグマインと安定な複合体または共有結合を選択的に形成する任意の材料であることが可能である。
【０００４】
好ましいレグマイン標的指向性部分はアザ−Ａｓｎマイケルアクセプター型のレグマイン阻害剤である。好ましいレグマイン標的指向性脂質成分はリン脂質に結合するアザ−Ａｓｎマイケルアクセプターのレグマイン阻害剤を含む。例えば、ＲＲ−１１ａとして公知の阻害剤は図１、パネル（ａ）中に示されるように適切な脂質に結合することが可能である。
【０００５】
幾つかの好ましい実施形態において、レグマイン標的指向性脂質成分は１，２−ジアシルグリセロ−ホスホアルカノールアミン基、例えば１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）などに共有結合されたレグマイン結合部分を含む。
【０００６】
好ましい双性イオン性脂質成分（ｂ）は１，２−ジアシルグリセロ−ホスホコリン化合物、例えば１，２−ジ−（９Ｚ−オクタデセノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）などを含む。
【０００７】
好ましいアミノ置換脂質成分（ｃ）は１，２−ジアシルグリセロ−ホスホアルカノールアミン化合物、例えばＤＯＰＥなどを含む。
【０００８】
好ましい中性脂質成分（ｄ）はコレステロールを含む。
【０００９】
好ましいポリエチレングリコールにコンジュゲートされた脂質成分（ｅ）は、ポリエチレングリコールにコンジュゲートされた１，２−ジアシルグリセロ−ホスホアルカノールアミン化合物、例えば１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）］などを含み、この化合物のポリエチレングリコール部の平均分子量が約２０００原子質量単位（ａｍｕ）である。
【００１０】
１つの好ましい実施形態において、成分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）はリポソームナノ粒子中にモル比（ａ）：（ｂ）：（ｃ）：（ｄ）：（ｅ）が約１．１：６．７：６．７：２．２：１で存在する。
【００１１】
好ましくは、リポソームナノ粒子組成物は抗がん化学療法剤、例えばドキソルビシン、１−［２−シアノ−３−，１２−ジオキソオレアナ−１，９（１１）−ジエン−２８−オイル］イミダゾール（ＣＤＤＯ−Ｉｍとしても公知である。）または任意の他の公知の抗がん化学療法剤を封入する。
【００１２】
本発明の組成物はレグマインを発現する腫瘍の治療における使用にとりわけ適している。本発明の方法の態様は、がん治療の必要がある患者に、本発明の組成物のリポソームナノ粒子内に封入された有効量の抗がん化学療法剤を投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】レグマイン標的化ナノ粒子（ＮＰ）の調製および性質決定を説明する図である。パネル（ａ）は１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）へのＲＲ−１１ａのコンジュゲーションを説明する。パネル（ｂ）は腫瘍の低酸素を実証する蛍光顕微鏡検査イメージを提供する（スケールバー、１００μｍ）。パネル（ｃ）は、細胞膜に発現したレグマインへの抗マウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の親和性を実証する抗体濃度に対する特異的結合のグラフであって、スキャチャード解析により決定されたものを提供する。パネル（ｄ）はマウス４Ｔ１および４ＴＯ７乳癌細胞ならびにＣＴ２６結腸癌細胞についての、時間に対するローダミン陽性細胞のグラフを提供するが、これらの細胞はＣｏＣｌ２と共に約２４時間培養した後、非標的化ナノ粒子（非標的化）またはＲＲ−１１ａ標的化ナノ粒子（標的化）ＮＰを添加したものである（ｎ＝３ウェル／群、データは平均値±標準誤差を表す。）。パネル（ｅ）は、本発明の標的化ＮＰ（上列）および非標的化ＮＰ（下列）で処置されたマウスからの腫瘍、肝臓、脾臓および腎臓細胞についての、ＮＰの分布を可視化する蛍光顕微鏡検査イメージを提供するが、これらのＮＰの分布はローダミンＢの蛍光により指し示される（ｎ＝２マウス／群、スケールバー、１００μｍ）。
【図２】レグマイン標的指向はＰＥＧ−リポソームに封入されたドキソルビシンの取り込みを亢進し、ＮＰを介した原発性乳腺腫瘍への薬剤送達を改善することを実証する図である。パネル（ａ）は４Ｔ１および４ＴＯ７細胞についての、時間に対する平均蛍光強度（ＭＦＩ）のグラフを提供するが、これらの細胞はＣｏＣｌ２と共に約２４時間培養し、次いでドキソルビシンを充填された標的化ナノ粒子組成物（本明細書においてＲＤＺ−２１８と呼ぶ）、ドキソルビシンを充填された非標的化ＮＰ（ＮＰ−Ｄｏｘ）または遊離のドキソルビシン（遊離Ｄｏｘ）と共に指示された時間インキュベートし、続いてフローサイトメトリー分析を行ってドキソルビシンの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を決定したものである（各時点についてｎ＝３ウェル／群、データは平均値±標準誤差を表す。）。パネル（ｂ）は薬剤取り込み濃度のパーセンテージを示す棒グラフであって、ＲＤＺ−２１８、ＮＰ−Ｄｏｘおよび遊離Ｄｏｘで処理された細胞のＭＦＩを段階希釈されたドキソルビシンのＭＦＩと比較することにより決定したものを提供する。パネル（ｃ）は対照（無処理）、遊離Ｄｏｘ、ＮＰ−Ｄｏｘ、遊離ＲＲ−１１ａ、ＮＰ−ＲＲ１１ａ（ドキソルビシン無し）およびＲＤＺ−２１８で処理された死滅４Ｔ１および４ＴＯ７細胞の相対的パーセンテージを比較する棒グラフを提供するが、このパーセンテージは処理後約２４時間でフローサイトメトリーの前方および側方散乱プロットを分析することにより決定したものである（データは無処理細胞（対照）に対して相対的に示される。ｎ＝３ウェル／群、データは平均値±標準誤差を表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５）。パネル（ｄ）は、４ＴＯ７細胞を鼠径部乳房脂肪体内に注射された雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスからの腫瘍（上列）、肝臓（中列）および心臓（下列）の細胞の蛍光顕微鏡検査イメージを提供する。腫瘍を約５日間、約５００ｍｍ３のサイズになるまで樹立し、その後にＲＤＺ−２１８、ＮＰ−Ｄｏｘまたは遊離Ｄｏｘを使用した２回の静脈内注射をマウスに与えた。マウスを最後の注射から約２４時間後に屠殺して組織を分離し、蛍光顕微鏡検査により直ちに分析してドキソルビシンの分布を検出した。ＤＡＰＩを使用して組織切片を染色し、細胞核を可視化した（ｎ＝２マウス／群、スケールバー、１００μｍ）。
【図３】ＲＤＺ−２１８を使用した４ＴＯ７腫瘍を持つマウスの治療的処置は毒性を伴わずに原発性乳腺腫瘍増殖の完全な抑制をもたらすことを実証する図であり、このマウスはＲＤＺ−２１８、ＮＰ−Ｄｏｘ、遊離のドキソルビシン（遊離Ｄｏｘ）、空のＲＲ−１１ａにコンジュゲートされたＮＰ（ＮＰ−ＲＲ−１１ａ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）のいずれかの静脈内注射を３日間隔で５回処置されたものである。データの点は処置日数を表す。ｎ＝５マウス／群。パネル（ａ）は時間に対する腫瘍サイズのグラフを提供する（データは平均値±標準誤差を表す。）。パネル（ｂ）は解剖前に撮影された原発腫瘍のイメージを提供する。イメージは各群からの代表である。パネル（ｃ）は各処置群のマウスからの原発腫瘍の腫瘍湿重量を比較する棒グラフを提供する（データは平均値±標準誤差を表す。＊ｐ＜０．０５）。パネル（ｄ）は各処置群のマウスからのＴＵＮＥＬ陽性の（アポトーシス性の）腫瘍細胞を比較する棒グラフを提供する（ｎ＝５視野／切片。データは平均値±標準誤差を表す。＊＊＊ｐ＜０．０００５）。パネル（ｅ）は各処置群からのマウスについて体重変化を比較する棒グラフを提供する（屠殺時の全体重から原発腫瘍重量を減算し、腫瘍細胞チャレンジ前の体重と比較して体重変化を決定した。データは平均値±標準誤差を表す。対照群をＲＤＺ−２１８処置群と比較した。＊＊ｐ＝０．００２９、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図４】レグマインのシステイン残基とアザ−Ａｓｎマイケルアクセプターとのマイケル付加をパネル（ａ）中で、レグマインのＣｙｓ残基とアザ−Ａｓｎ−エポキシドとの反応をパネル（ｂ）中で、およびレグマインのＣｙｓ残基とアザ−Ａｓｎ−ハロメチルケトンとの反応をパネル（ｃ）中で、模式的に説明する図である。
【図５】ＡはＲＲ−１１ａを連結されたＮＰの物理化学的性質決定の図である。ＣＤＤＯ−Ｉｍを充填されたレグマイン標的化ＮＰを動的光散乱およびＴＥＭ（挿入図）により分析し、粒子サイズ分布（直径、ｎｍ）およびゼータ電位（ｍＶ）を決定した。スケールバー＝１００ｎｍ。ＢはＲＲ−１１ａを連結されたＮＰの物理化学的性質決定の図である。ＣＤＤＯ−Ｉｍを含まないレグマイン標的化ＮＰを動的光散乱およびＴＥＭ（挿入図）により分析し、粒子サイズ分布（直径、ｎｍ）およびゼータ電位（ｍＶ）を決定した。スケールバー＝１００ｎｍ。ＣはＲＲ−１１ａを連結されたＮＰの物理化学的性質決定の図である。ＣＤＤＯ−Ｉｍを充填された非標的化ＮＰを動的光散乱およびＴＥＭ（挿入図）により分析し、粒子サイズ分布（直径、ｎｍ）およびゼータ電位（ｍＶ）を決定した。スケールバー＝１００ｎｍ。ＤはＲＲ−１１ａを連結されたＮＰの物理化学的性質決定の図である。ＣＤＤＯ−Ｉｍを含まない非標的化ＮＰを動的光散乱およびＴＥＭ（挿入図）により分析し、粒子サイズ分布（直径、ｎｍ）およびゼータ電位（ｍＶ）を決定した。スケールバー＝１００ｎｍ。
【図６】Ａは封入されたＣＤＤＯ−Ｉｍはマウス乳癌細胞および原発腫瘍におけるＳＴＡＴ−３リン酸化を阻害することをウエスタンブロット分析により示す図である。４Ｔ１マウス乳癌細胞をＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍＬ）および様々な濃度のＣＤＤＯ−Ｉｍで処理した。Ｂは封入されたＣＤＤＯ−Ｉｍはマウス乳癌細胞および原発腫瘍におけるＳＴＡＴ−３リン酸化を阻害することをウエスタンブロット分析により示す図である。４ＴＯ７マウス乳癌細胞を、ＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍＬ）と遊離のＣＤＤＯ−Ｉｍ（遊離ＣＤＤＯ）、空の標的化ＮＰ（Ｌｅｇ−ＮＰ）、非標的化ＮＰに封入されたＣＤＤＯ−Ｉｍ（ＮＰ−ＣＤＤＯ）または標的化ＮＰに封入されたＣＤＤＯ−Ｉｍ（Ｌｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯ）とを組み合わせて処理した。Ｃは封入されたＣＤＤＯ−Ｉｍはマウス乳癌細胞および原発腫瘍におけるＳＴＡＴ−３リン酸化を阻害することをウエスタンブロット分析により示す図である。ＭＭＴＶ−Ｎｅｕ原発腫瘍抽出物を、ＰＢＳ（レーン１）、Ｌｅｇ−ＮＰ（レーン２）またはＬｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯ（レーン３）の８回の静脈内注射で処置されたマウスから調製した。
【図７】ＡはＬｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯでの治療的処置は４ＴＯ７腫瘍の増殖を阻害することを示す図である。５×１０３個の４ＴＯ７腫瘍細胞を使用してチャレンジされ、Ｌｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯまたは対照（ＰＢＳ、遊離のＣＤＤＯ、ＮＰ−ＣＤＤＯまたはＬｅｇ−ＮＰ）で処置されたマウスの処置概略図である（ｎ＝８マウス／群）。ＢはＬｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯでの治療的処置は４ＴＯ７腫瘍の増殖を阻害することを示す図である。２日ごとに腫瘍を触診し、腫瘍サイズを算出した。データは平均値±標準誤差を表す。ＣはＬｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯでの治療的処置は４ＴＯ７腫瘍の増殖を阻害することを示す図である。腫瘍重量を１９日目に測定し、体重と比較してパーセント腫瘍量を決定した。データは平均値±標準誤差を表す。＊ｐ＜０．０５。
【図８】ＡはＭＭＴＶ−Ｎｅｕ原発腫瘍のＬｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯでの治療的処置は腫瘍増殖を遅延させることを示す図である。１×１０４個のＭＭＴＶ−Ｎｅｕ原発腫瘍細胞を使用してチャレンジされ、Ｌｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯまたは対照（ＰＢＳまたはＬｅｇ−ＮＰ）で処置されたマウスの処置概略図である（ｎ＝８マウス／群）。ＢはＭＭＴＶ−Ｎｅｕ原発腫瘍のＬｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯでの治療的処置は腫瘍増殖を遅延させることを示す図である。３日ごとに腫瘍を触診し、腫瘍サイズを算出した。データは平均値±標準誤差を表す。ＣはＭＭＴＶ−Ｎｅｕ原発腫瘍のＬｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯでの治療的処置は腫瘍増殖を遅延させることを示す図である。腫瘍重量を４６日目に測定し、パーセント腫瘍量を算出するのに用いた。データは平均値±標準誤差を表す。＊ｐ＜０．０５。
【図９】ＡはＬｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯは腫瘍のサイトカインおよび増殖因子発現プロファイルをインビボで調節することを示す図である。全組織抽出物を図８Ａ中に記載されるように処置されたマウスから分離したＭＭＴＶ−Ｎｅｕ原発腫瘍から調製した。ウエスタンブロット分析（左のパネル）を実施し、アクチン（右のグラフ）に対して定量化して、Ｔｈ１関連の増殖因子およびサイトカインのタンパク質発現を決定した。データは３つの独立した実験からの平均値±標準誤差を表す。＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．００５。ＢはＬｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯは腫瘍のサイトカインおよび増殖因子発現プロファイルをインビボで調節することを示す図である。全組織抽出物を図８Ａ中に記載されるように処置されたマウスから分離したＭＭＴＶ−Ｎｅｕ原発腫瘍から調製した。ウエスタンブロット分析（左のパネル）を実施し、アクチン（右のグラフ）に対して定量化して、Ｔｈ２関連の増殖因子およびサイトカインのタンパク質発現を決定した。データは３つの独立した実験からの平均値±標準誤差を表す。＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．００５。ＣはＬｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯは腫瘍のサイトカインおよび増殖因子発現プロファイルをインビボで調節することを示す図である。全組織抽出物を図８Ａ中に記載されるように処置されたマウスから分離したＭＭＴＶ−Ｎｅｕ原発腫瘍から調製した。ウエスタンブロット分析（左のパネル）を実施し、アクチン（右のグラフ）に対して定量化して、抗アポトーシス性タンパク質の発現を決定した。データは３つの独立した実験からの平均値±標準誤差を表す。＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．００５。
【図１０】ＡはＬｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯでの治療的処置は原発腫瘍内への免疫細胞の浸潤を調節することを示す図である。マウスを図８Ａ中に表されるように処置した。腫瘍細胞チャレンジ後４６日目に、生きた原発腫瘍の単一細胞懸濁液をフローサイトメトリーにより分析して、活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞を検出した。データは平均値±標準誤差を表す。ＢはＬｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯでの治療的処置は原発腫瘍内への免疫細胞の浸潤を調節することを示す図である。マウスを図８Ａ中に表されるように処置した。腫瘍細胞チャレンジ後４６日目に、生きた原発腫瘍の単一細胞懸濁液をフローサイトメトリーにより分析して、活性化されたマクロファージを検出した。データは平均値±標準誤差を表す。ＣはＬｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯでの治療的処置は原発腫瘍内への免疫細胞の浸潤を調節することを示す図である。マウスを図８Ａ中に表されるように処置した。腫瘍細胞チャレンジ後４６日目に、生きた原発腫瘍の単一細胞懸濁液をフローサイトメトリーにより分析して、活性化された樹状細胞を検出した。データは平均値±標準誤差を表す。ＤはＬｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯでの治療的処置は原発腫瘍内への免疫細胞の浸潤を調節することを示す図である。マウスを図８Ａ中に表されるように処置した。Ｍ１マクロファージを凍結腫瘍切片中でＦ４／８０（赤の染色）およびＮＯＳ２（明るい染色）に対する抗体を用いた免疫組織化学により同定した。細胞核をＤＡＰＩ（暗い染色）を使用して染色した。スケールバー＝１００μｍ。
【図１１】ＡはＬｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯおよびｐＮｅｕＴｍの併用療法は抗腫瘍免疫サーベイランスを亢進して乳癌再発を予防することを示す図である。腫瘍再発試験の処置スケジュールの概略図である。マウスにＭＭＴＶ−Ｎｅｕ原発腫瘍細胞（０日目、黒の破線矢印）を同所性にチャレンジし、Ｌｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯまたは対照ＮＰ（灰色の実線矢印）で処置し、ｐＮｅｕＴｍまたはｐＶｅｃｔｏｒ（灰色の破線矢印）を接種した。原発腫瘍をサイズが約５００ｍｍ３に達した後に外科的に除去した（黒の実線矢印）。４週間後、マウスの対側乳房脂肪体中にＭＭＴＶ−Ｎｅｕ原発腫瘍細胞を再チャレンジした（５３日目、黒の破線矢印）。腫瘍寸法を測定し、腫瘍サイズを算出するのに用いた（ｎ＝５マウス／群）。データは平均値±標準誤差を表す。ＢはＬｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯおよびｐＮｅｕＴｍの併用療法は抗腫瘍免疫サーベイランスを亢進して乳癌再発を予防することを示す図である。二次腫瘍の体積が５００ｍｍ３に達した時にマウスを屠殺した。腫瘍を持たないマウスを最初の腫瘍細胞チャレンジ後１２８日で屠殺した。ＰＢＳ、Ｌｅｇ−ＮＰまたはＬｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯのいずれかで処置されたｐＮｅｕＴｍ接種マウスからの脾臓細胞を放射線照射されたＭＭＴＶ−Ｎｅｕ原発腫瘍細胞と共に培養し、フローサイトメトリーにより分析した。データは平均値±標準誤差を表す。＊ｐ＜０．０５。ＣはＬｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯおよびｐＮｅｕＴｍの併用療法は抗腫瘍免疫サーベイランスを亢進して乳癌再発を予防することを示す図である。Ｌｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯ／ｐＮｅｕＴＭで処置されたマウスからの脾臓細胞を放射線照射されたＨＥＶｃまたはＭＭＴＶ−Ｎｅｕ原発腫瘍細胞と共に培養し、フローサイトメトリーにより分析した。ＨＥＲ−２のタンパク質発現をウエスタンブロッティングにより確認した。データは平均値±標準誤差を表す。＊＊＊ｐ＜０．０００５。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は新規のＮＰ標的指向ストラテジーに関し、このストラテジーはアスパラギニルエンドペプチダーゼであるレグマインに結合する標的指向性部分を利用するものである。本発明はリポソームナノ粒子の水分散液を含む水溶性腫瘍標的指向性リポソームナノ粒子組成物を提供する。ナノ粒子は好ましくは抗がん化学療法剤を封入し、この抗がん化学療法剤は予め形成されたリポソーム組成物に添加されることが可能であり、またはリポソームを形成する間にリポソーム中に組み込まれることも可能である。リポソームナノ粒子は１つ以上の他のミセルまたは小胞形成脂質材料と混合されたナノ粒子性リポソーム分散液形態においてレグマイン標的指向性脂質を含み、好ましくはポリエチレングリコールにコンジュゲートされた脂質を組み込む。好ましいリポソームナノ粒子組成物は、（ａ）レグマイン標的指向性脂質成分、（ｂ）双性イオン性脂質成分、（ｃ）アミノ置換脂質成分、（ｄ）中性脂質成分および（ｅ）ポリエチレングリコールにコンジュゲートされた脂質成分、例えばＰＥＧ−リポソーム組成物を含む。レグマイン標的指向性脂質成分はレグマイン結合部分に共有結合された疎水性の脂質部を含む。
【００１５】
レグマイン結合部分は、レグマインと安定な複合体または共有結合を選択的に形成する任意の材料、例えば不可逆なレグマイン阻害剤であることが可能であり、レグマインへの親和性を有するペプチドスキャフォールド、例えば反応性官能基に付着されたＡｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ（またはＡｌａ−Ａｌａ−Ｘ、式中、Ｘは修飾されたＡｓｎ、例えばアザ−Ａｓｎ残基など）など、例えばアザ−Ａｓｎ−ハロメチルケトン、アザ−Ａｓｎエポキシドおよびマイケルアクセプターとしてα，β−不飽和カルボニル部分を含むアザ−Ａｓｎマイケルアクセプターを典型的に含む。かかるアザ−Ａｓｎ部分は、阻害剤とレグマインとの間に共有結合性のスルフィド結合を形成するように、例えば図４中に示されるように、レグマインの活性部位でシステイン残基と反応する。
【００１６】
好ましい標的指向性部分は式（Ｉ）により表される。
【００１７】
【化１】
0005871930.tif 000002
この標的指向性部分は合成アザ−ペプチドマイケルアクセプター型のレグマイン阻害剤であり、レグマインの活性部位のシステイン残基に対するマイケルアクセプターとして働く電子不足の二重結合を包含する修飾アザ−Ａｓｎ部分に付着された２つのアラニン残基を含む。式（Ｉ）はＲＲ−１１ａとして公知であるアザ−Ａｓｎマイケルアクセプターレグマイン阻害剤の反応部を表す。
【００１８】
【化２】
0005871930.tif 000003
式中、ＲＲ−１１ａのスクシンイミジルオキシ基はリン脂質により置き換えられている。便宜上、式（Ｉ）の構造は本明細書においてレグマイン標的指向性脂質材料を参照してＲＲ−１１ａという。
【００１９】
好ましいレグマイン標的指向性脂質は式（ＩＩ）の化合物を含む。
【００２０】
【化３】
0005871930.tif 000004
【００２１】
細胞表面のレグマイン発現は固形腫瘍の顕著な特徴である低酸素ストレスにより駆動され、レグマイン標的指向性部分、例えばＲＲ−１１ａなどに連結されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）被覆リポソームは高いリガンド−受容体親和性、取り込みおよび優れた腫瘍浸透を示す。本発明のＲＲ−１１ａにコンジュゲートされたＰＥＧ−リポソーム組成物により送達される抗がん化学療法剤、例えばドキソルビシンなどは、腫瘍選択性の亢進、薬剤感度の低減および全身的な薬物毒性の除去を劇的にもたらした。
【００２２】
本発明の標的化リポソーム組成物のナノ粒子（ＮＰ）担体部は、抗がん化学療法剤、例えばドキソルビシンなどを封入する能力を持つ、例えば小胞または他の膜構造などの膜脂質、例えばリポソームまたはミセルを好ましくは含む。好ましいＮＰは疎水性脂質部および親水性部を持つ材料を含むが、この材料は水系中に分散された場合にリポソームまたはミセルを形成するようにアレンジされたものである。図１、パネル（ａ）は１つの好ましい膜脂質材料（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、ＤＯＰＥ）を説明する。用語「脂質」は、脂質材料の疎水性部が二重層の方向を向き、親水性部が水相の方向を向くような、二重層またはミセルを形成する能力を持つ任意の脂肪酸誘導体をいう。親水性特性は、リン酸基、ホスホン酸基、カルボキシラート基、硫酸基、スルホン酸基、スルフヒドリル基、アミノ基、ニトロ基、水酸基または当該技術分野で周知の他の同様の基の存在に由来する。疎水性は、炭素原子が２０個までの長鎖飽和および不飽和脂肪族炭化水素基ならびに１つ以上のアリール、ヘテロアリール、シクロアルキルおよび／または複素環基により置換されたかかる基を包含するが、これらの基に限定されるものではない基を含ませることにより、与えることが可能である。好ましい脂質はホスホグリセリドおよびスフィンゴ脂質である。ホスホグリセリドの代表例としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリンおよびジリノレオイルホスファチジルコリンが挙げられる。リンを含有する基を欠く化合物、例えばスフィンゴ脂質およびスフィンゴ糖脂質ファミリーなどもまた、脂質と呼ばれる基の範囲内である。加えて、上記の両親媒性脂質はトリグリセリドおよびステロールを包含する他の脂質と混合することができる。
【００２３】
レグマイン阻害剤／腫瘍標的指向剤は、付着が腫瘍に発現したレグマインに腫瘍標的指向剤が結合するのを妨げない限り、任意の適切な位置、例えば直鎖の末端または中間位置でリポソームナノ粒子に付着することが可能である。腫瘍標的指向剤はまた、所望の場合、ナノ粒子への付着を促進する二価の架橋基を場合により包含または備えることも可能である。
【００２４】
本発明の組成物は、レグマインを発現する腫瘍への標的化送達のための任意の抗がん化学療法剤（例えば抗腫瘍剤）を有益に封入することが可能である。かかる化学療法剤は例えばＩｍａｉ  ａｎｄ  Ｔａｋａｏｋａ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ６，７１４−７２６（２００６）中に記載され、この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。かかる化学療法剤の限定されない例としては、アルキル化剤（例えばシスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、イホスファミド）、プリンおよびピリミジンのアナログおよび誘導体（例えば５−フルオロウリシル、フロクスウリジン、シトシンアラビノシド、メルカプトプリン、チオグアニン、アザチオプリン、フルダラビン、ペントスタチン、クラドリビン）、トポイソメラーゼ阻害剤（例えばエトポシド、エトポシドホスファート、テニポシド、アムサクリン）、タキサン（例えばパクリタキセル）、葉酸代謝拮抗剤（例えばメトトレキサート、トリメトプリム、ピリメタミン、ペメトレキセド）、血管新生阻害剤（例えばビタキシン、アネコルバート（ａｎｅｃｏｒｖａｔｅ）、アンジオスタチン、エンドスタチン、スクワラミン、血管新生抑制トリプトファニル−ｔ−ＲＮＡシンテターゼ断片、例えばＴ２−ＴｒｐＲＳなど）、抗腫瘍モノクローナル抗体（例えばベバシズマブ、チボザニブ、バンデタニブ、バタラニブ、アレムツズマブ、セツキシマブ、ゲムツズマブ、イブリツモマブ、パンチツムマブ、リツキシマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ）ならびに他の抗悪性腫瘍剤または化学療法剤、例えば細胞毒性のある抗生物質（例えばアクチノマイシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン）、アントラサイクリン抗生物質（例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、バルルビシン、イダルビシン）、トリテルペノイドＳｔａｔ３阻害剤（例えばウルソール酸、２−シアノ−３，１２−ジオキソオレアナ−１，９−ジエン−２８−酸エステル、例えば１−［２−シアノ−３，１２−ジオキソオレアナ−１，９（１１）−ジエン−２８−オイル］イミダゾール（ＣＤＤＯ−Ｉｍとしても公知である。）などの２−シアノ−３，１２−ジオキソオレアナ−１，９−ジエン−２８−酸アミド）など、ならびに生理的に許容されるこれらの塩およびプロドラッグが挙げられる。
【００２５】
幾つかの好ましい実施形態において、化学療法剤は腫瘍増殖に関与する受容体または受容体リガンドのアゴニストまたはアンタゴニストである抗腫瘍剤である。
【００２６】
標的化リポソーム／化学療法剤複合体またはこの複合体を含有する組成物の薬剤投与計画は、幾つかの因子、例えば年齢、体重、性別および患者の医学的状態のタイプ、状態の重篤度、投与経路、使用される特定の標的指向性分子の結合活性などに基づく。薬剤投与計画は前述の因子に大いに依存的であり得る。約０．０１ミリグラムから約１０００ミリグラム／キログラム体重のオーダーの用量レベルは前述の医学的状態を治療するのに有用である。好ましい用量レベルは約０．０１ミリグラムから約１００ミリグラム／キログラム体重の範囲にある。
【００２７】
注射による投与の場合、本発明を具体化する標的化リポソーム／化学療法剤複合体またはこの複合体を含有する組成物は、例えば水、生理食塩水またはブドウ糖水溶液などの医薬的に許容される担体と共に処方される。注射の場合、典型的な１日の用量は約０．０１ミリグラムから約１００ミリグラム／キログラム体重であり、前述の因子に依存して、単回投与または複数回投与として毎日注射される。
【００２８】
以下の限定されない例は本発明のある特定の態様をさらに説明する。
【実施例】
【００２９】
［実施例１］
レグマイン標的化ナノ粒子の処方および性質決定
ナノ粒子組成物  ＲＲ−１１ａの合成は文献中に記載されている。例えば、Ｅｋｉｃｉ，Ｏ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．Ａｚａ−ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｍｉｃｈａｅｌ  ａｃｃｅｐｔｏｒｓ：ａ  ｎｅｗ  ｃｌａｓｓ  ｏｆ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  ｃａｓｐａｓｅｓ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｃｌａｎ  ＣＤ  ｃｙｓｔｅｉｎ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４７，１８８９−１８９２（２００４）またはＯｖａｔ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ａｚａ−ｐｅｐｔｉｄｙｌ  Ｍｉｃｈａｅｌ  ａｃｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  ｅｐｏｘｉｄｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ−−ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ  ａｎｄ  Ｉｘｏｄｅｓ  ｒｉｃｉｎｕｓ  ｌｅｇｕｍａｉｎｓ（ａｓｐａｒａｇｉｎｙｌ  ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ）．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ５２，７１９２−７２１０（２００９）を参照のこと。全てのリン脂質（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）をクロロホルム中に溶解した。標的指向を達成するため、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）を使用してアザ−ペプチドのカルボン酸末端を活性化することにより修飾し、続いてＮ−ヒドロキシスクシンアミドと反応させてＮＨＳ−エステルを生産した。ＲＲ−１１ａはＷｕＸｉ  ＡｐｐＴｅｃ  Ｃｏ．Ｌｔｄが合成した。ＲＲ−１１ａにコンジュゲートされたＮＰは、最初に、ＲＲ−１１ａと１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）との約１：１のモル比でトリエチルアミン（ＴＥＡ）の存在下での、約２４時間、室温での反応により生成した。二番目に、結果として得られた化合物を１，２−ジ−（９Ｚ−オクタデセノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、ＤＯＰＥ、コレステロールおよび１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＤＯＰＥ−ＰＥＧ）と約１．１：６．７：６．７：２．２：１のモル比で、別のリポソーム系について以前に記載されたように組み合わせた。Ｈｏｏｄ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．Ｔｕｍｏｒ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６，２４０４−２４０７（２００２）を参照のこと。サイズ分布をＺＥＴＡＳＩＺＥＲ  ＮＡＮＯ（登録商標）光散乱アナライザー（Ｍａｌｖｅｒｎ）上の動的光散乱により決定した。
【００３０】
ナノ粒子内へのドキソルビシン充填  ドキソルビシンを次のようにＮＰ内に充填した。簡潔に言うと、脂質フィルムを約１ｍｌの滅菌リン酸アンモニウムバッファー（３００ｍＭ、ｐＨ７．４）中で再水和し、最短で約１時間撹拌し、続いて超音波処理でＳＵＶを生産した。外側のリン酸アンモニウムバッファーをＮＡＰ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でのゲルろ過クロマトグラフィーによりＰＢＳ（ｐＨ７．４）と交換した。水中のドキソルビシンを次いで１０ｍＭ溶液として添加し、混合物を一晩室温でインキュベートした。最後に、ドキソルビシンを組み込んだリポソームを、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）バッファーを溶出液として用いたＮＡＰ−１０カラムを使用したゲルろ過クロマトグラフィーにより精製した。ドキソルビシンを充填されたＲＲ−１１ａコンジュゲートのリポソームＮＰ組成物をＲＤＺ−２１８と命名した。
【００３１】
ＤＯＰＥへのＲＲ−１１ａのコンジュゲーションは、最初に１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）を使用してアザ−ペプチドのカルボン酸末端を活性化することにより修飾し、続いてＮ−ヒドロキシスクシンアミドと反応させてＮＨＳ−エステルを生産し、トリエチルアミンを触媒として用いてクロロホルム中でＤＯＰＥのアミノ基にカップリングさせることにより達成した。図１、パネル（ａ）を参照のこと。腫瘍の低酸素をＧｌｕｔ−１抗体を使用した染色により検出し、フルオレセインにコンジュゲートされた二次抗体を用いて可視化した。細胞核をＤＡＰＩ染色により可視化した。スケールバー、１００μｍ。図１、パネル（ｂ）を参照のこと。細胞膜に発現したレグマインへの抗マウスレグマインｍＡｂの親和性をスキャチャード解析により決定した。図１、パネル（ｃ）を参照のこと。対照およびＣｏＣｌ２で処理された細胞の平均Ｋｄをそれぞれ約１．１０７±０．２３２ｎＭおよび約１．２０８±０．１０７ｎＭと算出した。対照およびＣｏＣｌ２で処理された細胞の結合部位の数をそれぞれ約４６，７６０および約１１７，８００部位／細胞と算出した。ＮＰを赤い蛍光を持つＤＯＰＥ−ローダミンＢ脂質の存在下で処方した。マウス４Ｔ１および４ＴＯ７乳癌細胞ならびにＣＴ２６結腸癌細胞を約２４時間、約１００μＭのＣｏＣｌ２と共に培養し、その後にＲＲ−１１ａ−（非標的化）またはＲＲ−１１ａ＋（標的化）ＮＰを細胞に加えた。図１、パネル（ｄ）を参照のこと。指示された時間の後にＮＰを除去し、蛍光顕微鏡検査を用いて直ちに細胞を撮像して、ローダミンＢ陽性細胞のパーセンテージを定量した。ｎ＝３ウェル／群。データは平均値±標準誤差を表す。樹立された同所性の４Ｔ１乳腺腫瘍を有する雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスに非標的化または標的化ＮＰを単回注射した。マウスを約２４時間後に屠殺し、器官を蛍光顕微鏡検査により直ちに分析して、ローダミンＢの蛍光により指し示されるＮＰの分布を可視化した。ｎ＝２マウス／群。スケールバー、１００μｍ。図１、パネル（ｅ）を参照のこと。
【００３２】
［実施例２］
レグマイン標的指向はＰＥＧ−リポソームに封入されたドキソルビシンの取り込みを亢進し、ＮＰを介した原発性乳腺腫瘍への薬剤送達を改善する
動物および細胞株  雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスはＴｈｅ  Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｒｏｄｅｎｔ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｙから購入した。全ての動物実験はＮＩＨ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓに従って実施し、Ｔｈｅ  Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの許可を受けた。４Ｔ１および４ＴＯ７マウス乳癌細胞株はＳｕｚａｎｎｅ  Ｏｓｔｒａｎｄ−Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｒｙｌａｎｄ、カレッジパーク、メリーランド州、アメリカ）より提供された。ＣＴ２６マウス結腸癌細胞はＡＴＣＣから購入した。
【００３３】
結合試験およびスキャチャード解析  抗マウスレグマイン抗体（約４０μｇ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、氷上で約３０分間、約０．５ｍＣｉの１２５Ｉ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）と共に、約１００μｇのＩＯＤＯ−ＧＥＮ（登録商標）試薬（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）を使用してコーティングされたポリスチレンチューブ中でインキュベートした。組み込まれなかった１２５ＩをＰＤ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でのゲルろ過により除去した。４Ｔ１細胞（５×１０５個）を１００μＭのＣｏＣｌ２存在下または非存在下で約２４時間培養し、続いて約１４ｎＭの段階希釈された１２５Ｉ標識抗体と共に約２時間、約４μＣでインキュベーションを行った。細胞を、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳを使用して３回洗浄し、結合した放射性標識の量をシンチレーションカウンターで決定した。対応する一分間あたりのカウント数（ＣＰＭ）をＰＲＩＳＭ（登録商標）ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用したスキャチャードプロット解析に用い、レグマイン結合部位の数を算出するのに用いた。
【００３４】
インビトロでのナノ粒子取り込み  腫瘍細胞を約０．３×１０６個の細胞／ウェルで６ウェルプレート中に播種した。ＮＰ添加の約２４時間前に細胞を１００μＭ塩化コバルトで処理し、低酸素を刺激した。ＲＲ−１１ａにコンジュゲートされた、またはＲＲ−１１ａを含まない遊離のＮＰであって、空であるか０．２ｎＭドキソルビシン（Ｓｉｇｍａ）を充填されたＮＰであるかのいずれかを細胞に添加し、約１５および３０分間または約１、２、３、４および６時間インキュベートし、その後にこれらの細胞を、ＰＢＳを使用して洗浄し、１０％亜鉛ホルマリン（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して固定し、蛍光顕微鏡検査により直ちに分析してドキソルビシンの取り込みを可視化した。フローサイトメトリーによる解析のため、細胞を、ＮＰを除去した後にトリプシン処理し、ＦＡＣＳバッファー中に再懸濁して、平均蛍光強度について直ちに分析した。
【００３５】
体内分布アッセイ  サイズが約５００ｍｍ３の４ＴＯ７同所性腫瘍を持つマウスに、ローダミンＢを使用して標識されたＲＲ−１１ａにコンジュゲートされたＮＰ（ＲＲ−１１ａ＋）またはＲＲ−１１ａを含まないＮＰ（ＲＲ−１１ａ−）の単回用量を注射した。またはマウスにＲＤＺ−２１８、ＮＰ−Ｄｏｘ、遊離ＤｏｘまたはＰＢＳのいずれかを約４８時間間隔で３回注射した。最後の処置から約２４時間後、動物を屠殺して脾臓、腎臓、肺、肝臓、心臓および腫瘍を採取し、ＯＣＴ化合物（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ）中で凍結させ、直ちに薄片を作って蛍光顕微鏡検査により撮像した。
【００３６】
統計解析  実験群と対照との間で差がある試験結果の統計的有意差をＰＲＩＳＭ（登録商標）ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いた両側スチューデントｔ検定により決定した。Ｐ＜０．０５の場合に試験結果を有意とみなした。
【００３７】
ドキソルビシンをリン酸勾配を用いてＲＲ−１１ａ＋ＮＰ内に充填し、ＲＤＺ−２１８を生成した。対照としてＲＲ−１１ａ−ＮＰ（ＮＰ−Ｄｏｘ）内にもドキソルビシンを充填した。図２、パネル（ａ）中で説明されるように、４Ｔ１および４ＴＯ７細胞をＣｏＣｌ２と共に約２４時間培養し、次いでＲＤＺ−２１８、ＮＰ−Ｄｏｘまたは遊離Ｄｏｘと共に指示された時間インキュベートし、続いてフローサイトメトリー分析を行ってドキソルビシンの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を決定した。各時点についてｎ＝３ウェル／群。データは平均値±標準誤差を表す。薬剤取り込み濃度のパーセンテージは、ＲＤＺ−２１８、ＮＰ−Ｄｏｘおよび遊離Ｄｏｘで処理された細胞のＭＦＩを段階希釈されたドキソルビシンのＭＦＩと比較することにより決定した。図２、パネル（ｂ）を参照のこと。ＲＤＺ−２１８、ＮＰ−Ｄｏｘ、遊離Ｄｏｘ、遊離のＲＲ−１１ａまたは空のＲＲ−１１ａ＋ＮＰ（ＮＰ−ＲＲ−１１ａ）のいずれかでの処理後約２４時間の死滅４Ｔ１および４ＴＯ７細胞の相対的パーセンテージは、フローサイトメトリーの前方および側方散乱プロットを分析することにより決定した。図２、パネル（ｃ）を参照のこと。データは無処理細胞（対照）に対して相対的に示される。ｎ＝３ウェル／群。データは平均値±標準誤差を表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５。４ＴＯ７細胞を雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスの鼠径部乳房脂肪体内に注射した。腫瘍を約５日間、約５００ｍｍ３のサイズになるまで樹立し、その後にマウスにＲＤＺ−２１８、ＮＰ−Ｄｏｘまたは遊離Ｄｏｘを使用した２回の静脈内注射を与えた。マウスを最後の注射から約２４時間後に屠殺して組織を分離し、蛍光顕微鏡検査により直ちに分析してドキソルビシンの分布を検出した。図２、パネル（ｄ）を参照のこと。また組織切片をＤＡＰＩを使用して染色し、細胞核を可視化した。ｎ＝２マウス／群。スケールバー、１００μｍ。
【００３８】
［実施例３］
ＲＤＺ−２１８でのマウスの治療的処置は毒性を伴わずに原発性乳腺腫瘍増殖の完全な抑制をもたらす
雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスの胸部乳房脂肪体に約１×１０５個の４ＴＯ７細胞を注射した。腫瘍細胞チャレンジから約７日後、マウスにＲＤＺ−２１８、ＮＰ−Ｄｏｘ、遊離Ｄｏｘ（全て約１ｍｇ／ｋｇ  Ｄｏｘ）または生理食塩水のいずれかを使用した静脈内注射を３日間隔で５回与えた。腫瘍寸法をマイクロキャリパーを使用して各処置日に測定し、腫瘍サイズを算出するのに用いた。マウスを最後の処置から約２４時間後に屠殺した。体重と腫瘍重量の両方を決定し、組織を組織分析に供した。ＴＵＮＥＬ（Ｐｒｏｍｅｇａ）染色を製造業者のプロとコールに従って実施した。
【００３９】
雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスに４ＴＯ７腫瘍細胞を同所性に注射し、腫瘍を処置の約７日前まで樹立させた。マウスにＲＤＺ−２１８、ＮＰ−Ｄｏｘ、遊離のドキソルビシン（遊離Ｄｏｘ）、空のＲＲ−１１ａ＋ＮＰ（ＮＰ−ＲＲ−１１ａ）または生理食塩水（ＰＢＳ）のいずれかを使用した静脈内注射を３日間隔で５回与えた。データの点は処置日数を表す。ｎ＝５マウス／群。各処置日において、腫瘍寸法をマイクロキャリパーを使用して測定し、腫瘍サイズを算出するのに用いた。図３、パネル（ａ）を参照のこと。データは平均値±標準誤差を表す。マウスを５回目の注射から約１日後に屠殺し、解剖前に原発腫瘍のイメージを撮影した。図３、パネル（ｂ）を参照のこと。イメージは各群からの代表である。原発腫瘍の湿重量も測定した。図３、パネル（ｃ）を参照のこと。データは平均値±標準誤差を表す。＊ｐ＜０．０５。腫瘍切片をＴＵＮＥＬを使用して染色して可視化し、アポトーシス性腫瘍細胞のパーセンテージを定量した。ｎ＝５視野／切片。図３、パネル（ｄ）を参照のこと。データは平均値±標準誤差を表す。＊＊＊ｐ＜０．０００５。屠殺時の全体重から原発腫瘍重量を減算し、腫瘍細胞チャレンジ前の体重と比較して体重変化を決定した。図３、パネル（ｅ）を参照のこと。データは平均値±標準誤差を表す。対照群をＲＤＺ−２１８処置群と比較した。＊＊ｐ＝０．００２９、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【００４０】
［実施例４］
毒性の評価
約５００ｍｍ３サイズの同所性４ＴＯ７腫瘍を持つ雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスに、遊離のドキソルビシン、ＮＰ−ＤｏｘまたはＲＤＺ−２１８の静脈内注射を約２４時間間隔で５回連続して与えた。全ての群のドキソルビシン用量は５ｍｇ／ｋｇであった。
【００４１】
ＲＤＺ−２１８はインビボで毒性を示さず、従来技術の遊離ドキソルビシンおよびＰＥＧ−リポソームに封入されたドキソルビシンと対照的であった。雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスに４ＴＯ７乳腺腫瘍細胞を同所性に注射した。腫瘍を樹立させ、処置前に約５００ｍｍ３のサイズに達した。マウスに遊離のドキソルビシン（遊離Ｄｏｘ）、生来の（ＮＰ−ｄｏｘ）またはＲＲ−１１ａ＋のＰＥＧ−リポソームに封入されたドキソルビシン（ＲＤＺ−２１８）のいずれかを使用した静脈内注射を５回与えた。全ての群についてドキソルビシンを約５ｍｇ／ｋｇで２００μｌのＰＢＳ中に溶解して投与した。ｎ＝５マウス／群。結果を表１中に示す。画分は各処置後の全５匹中の生存マウスの数を表す。
【００４２】
【表１】
0005871930.tif 000005
【００４３】
考察
本発明は、ＰＥＧ−リポソームＮＰをアザ−Ａｓｎマイケルアクセプター阻害剤類からの小分子（分子量４５１）のレグマイン阻害剤であるＲＲ−１１ａにコンジュゲートすることにより、リガンド標的指向を実証する。図１、パネル（ａ）を参照のこと。ＲＲ−１１ａはクラン（ｃｌａｎ）ＣＤに特異的な配列を使用して設計されたもので、従ってクランＣＤプロテアーゼ、例えばレグマインなどに高度に特異的であり、ナノモルの範囲のＩＣ５０値（ＩＣ５０＝３１−５５ｎＭ）で不可逆的に阻害する。重要なことに、ＲＲ−１１ａはカスパーゼ、クロストリパインまたはジンジパインＫを包含する他の関係するプロテアーゼと相互作用せず、プロテアーゼによる切断にインビボで抵抗性である。ＲＲ−１１ａによるレグマイン阻害のメカニズムは、マイケルアクセプターのＣ２の二重結合上での触媒システイン残基による求核攻撃に関わって、このアスパラギニルエンドペプチダーゼを不可逆的に阻害する共有結合を形成することである。図４、パネル（ａ）を参照のこと。使用において、本発明の組成物はＮＰに連結されたＲＲ−１１ａをレグマインと共有結合させ、全リポソーム複合物の受容体への付着および後に続く不可逆な内部移行をもたらす。この提案されるメカニズムはＮＭＲ試験により支持されていて、高い結合親和性はＮＰ標的指向性を改善するであろうことから妥当である。ＮＰの１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）成分へのＲＲ−１１ａのカップリングは、トリエチルアミン（ＴＥＡ）との反応により、材料および方法の中に詳細に記載されたように達成された。図１、パネル（ａ）を参照のこと。ＲＲ−１１ａに連結されたＰＥＧ−リポソーム（ＲＲ−１１ａ＋）または生来のＰＥＧ−リポソーム（ＲＲ−１１ａ−）ＮＰの動的光散乱による分析は、それぞれ約１５０および１１０ｎｍの均一なサイズ分布を明らかにした（データは図示せず）。
【００４４】
レグマインは腫瘍標的指向のための優秀な処理を提供するが、この理由は、レグマインが種間で高度に保存されていて、ヒトとマウスのレグマインタンパク質の間で約８３％の相同性を有しており、ヒト固形腫瘍の大部分において過剰発現しているからである。このことに応じて、ウエスタンブロット分析は複数のマウス癌細胞株およびマウス原発性乳腺腫瘍におけるレグマインタンパク質の発現を証明し、従って従前の報告を確認した。細胞内のレグマインは普遍的に発現しているにもかかわらず、レグマインの細胞表面上での発現は微小環境で誘導された細胞ストレス、例えば血清飢餓などに応答して起こる。重要なことに、レグマインの細胞表面発現は固形腫瘍の顕著な特徴である低酸素ストレスにより亢進され、この低酸素ストレスは、低酸素を誘導可能な確立されたタンパク質であるＧｌｕｔ−１の腫瘍での発現により決定されるように、本発明者らの同所性のマウス乳癌モデルにおいて存在する。図１、パネル（ｂ）を参照のこと。そのうえ、複数のマウス癌細胞株のインビトロ免疫組織化学的分析は、低酸素ストレスがレグマインの細胞表面発現を誘導したことを指し示した（データは図示せず）。
【００４５】
リガンド標的指向の効率は標的受容体の存在量に部分的に依存し、標的細胞上での正常細胞に対する過剰発現により最大化される。従って、リガンド標的指向を制限するのは標的の細胞表面受容体の数であり、この数は腫瘍部位に特異的に結合することが可能な標的指向性化合物の分子数を決定する。このため、本発明者らは１２５Ｉ標識抗レグマイン抗体を用いた結合試験およびスキャチャードプロット解析を通じて、腫瘍細胞あたりのレグマイン結合部位の数を定量化した。本発明者らは、正常な酸素圧力下ではレグマイン結合部位の数は約４６，７６０であり、低酸素条件下ではこの数が約１１７，８００部位／細胞に増加したことを算出した。図１、パネル（ｃ）を参照のこと。低酸素が腫瘍細胞表面のレグマイン結合部位数の約３倍の増加を誘導したという事実は生物学的に妥当であるが、この理由は、低酸素は固形腫瘍微小環境の顕著な特徴であり、従って腫瘍のあらゆる単一の遺伝的特性への依存から標的指向系を解放するからである。このため、本明細書において記載される標的指向ストラテジーは、固形腫瘍において一般に観察される遺伝的不均質性により限定されるべきではない。
【００４６】
ＲＲ−１１ａのカップリングが腫瘍細胞によるＰＥＧ−リポソームＮＰの取り込みをインビトロで亢進する程度を評価するため、マウス乳癌細胞（４Ｔ１および４ＴＯ７）ならびに結腸癌細胞（ＣＴ２６）を低酸素ストレスに供し、蛍光色素ローダミンＢを使用して標識されたＲＲ−１１ａ＋またはＲＲ−１１ａ−のＮＰと共に様々な時点でインキュベートした。蛍光顕微鏡検査による分析は、ＲＲ−１１ａ−ＮＰと比較してＲＲ−１１ａ＋ＮＰの顕著な取り込み亢進を、３つ全ての細胞株において試験された全ての時点で明らかにした。図１、パネル（ｄ）を参照のこと。インビボでの標的指向の有効性は、約５００ｍｍ３サイズの同所性４Ｔ１乳腺腫瘍を持つ雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスへのこれらの同一の粒子の静脈内注射により決定した。これらの動物からの腫瘍および組織の蛍光顕微鏡検査は、ＲＲ−１１ａ−ＮＰと比較した場合のＲＲ−１１ａ＋ＮＰの原発腫瘍へのホーミングの顕著な増加、ならびに肝臓、脾臓および腎臓を包含する細網内皮系（ＲＥＳ）の器官における非特異的な蓄積の低減を明らかにした。図１、パネル（ｅ）を参照のこと。意外なことに、肝臓において観察されたＲＲ−１１ａ＋ＮＰ蓄積の顕著な減少は有意であり、この理由は、このＲＥＳ器官が非標的化ＰＥＧ−リポソームＮＰの主要な溜まり場として同定されているからであるが、このことは肝臓毒性をもたらす可能性がある。合わせて、これらの驚くべきデータは、ＰＥＧ−リポソームＮＰへのＲＲ−１１ａのカップリングが腫瘍細胞によるこれらのＮＰの取り込みを低酸素ストレス下で亢進し、原発腫瘍へのＮＰのホーミングを効果的に増加させる一方、ＲＥＳ器官における蓄積を低減させることを指し示す。
【００４７】
リガンドを介した有効なＮＰ薬剤送達のための重要な因子としては、最適な積荷を所望の標的細胞に運搬するＮＰの能力だけでなく、送達の後にこの積荷を効果的に放出するＮＰの能力もある。これらのパラメーターを決定的に評価するため、乳癌を治療するのに一般に用いられる化学療法薬であるドキソルビシンを、従前に記載されたように、リン酸アンモニウム勾配を通じてＮＰ内に充填した。低酸素ストレス下のマウス乳腺腫瘍細胞（４Ｔ１および４ＴＯ７）を次いで遊離のドキソルビシン（遊離Ｄｏｘ）またはドキソルビシンを充填されたＲＲ−１１ａ−（ＮＰ−Ｄｏｘ）またはＲＲ−１１ａ＋（ＲＤＺ−２１８）ＮＰのいずれかと共に様々な時点でインキュベートし、フローサイトメトリーにより直ちに分析して、細胞により内部移行されたドキソルビシンの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を定量した。ＲＤＺ−２１８で処理された細胞はＮＰ−Ｄｏｘで処理された細胞と比較した場合にドキソルビシンの取り込み亢進を示した。図２、パネル（ａ）を参照のこと。驚くべきことに、ＲＤＺ−２１８での処理は、ＮＰ−Ｄｏｘと比較してより迅速な時間に伴う薬剤取り込みだけでなく、遊離Ｄｏｘと同様のＲＤＺ−２１８取り込み率での約１６倍もの取り込み度合いの増加をももたらした。図２、パネル（ａ）を参照のこと。段階希釈された遊離のドキソルビシンで処理された細胞が生成したＭＦＩを、ドキソルビシンを封入したＮＰで処理された細胞のＭＦＩと比較することにより、本発明者らは驚くべきことに１００％近いＲＤＺ−２１８ＮＰが約４時間の処理のうちに細胞により取り込まれることを観察した。図２、パネル（ｂ）を参照のこと。そのうえ、遊離Ｄｏｘと比較して即時の迅速なＲＤＺ−２１８の取り込みはリガンド−受容体を介した内部移行を指し示すものであって、非標的化ＮＰ−Ｄｏｘと比較した場合に優れていた。
【００４８】
次に、ＲＤＺ−２１８のドキソルビシン生理活性を、フローサイトメトリーを使用して処理後約２４時間の死滅腫瘍細胞のパーセンテージを比較することにより、インビトロで決定した。図２、パネル（ｃ）を参照のこと。ＲＤＺ−２１８で処理された細胞は対照またはＮＰ−Ｄｏｘで処理された細胞と比較して３から１５倍の死滅細胞パーセンテージの増加を示した。興味深いことに、このＲＤＺ−２１８の細胞毒性作用は遊離Ｄｏｘの細胞毒性作用よりも強かった。重要なことに、遊離のＲＲ−１１ａまたは空のＲＲ−１１ａ＋ＮＰで処理された細胞において細胞毒性作用は観察されなかったが、このことはＲＤＺ−２１８を使用して観察された細胞毒性亢進はＮＰを介したドキソルビシン取り込み増加に起因するもので、ＲＲ−１１ａによる腫瘍細胞に対する何らかのレグマイン阻害作用に起因するものではないことを指し示す。まとめると、これらの結果は、ＲＤＺ−２１８が生物学的に有効な薬剤積荷の腫瘍細胞への送達をインビトロで亢進することを実証する。
【００４９】
リガンド標的化ＮＰ送達の主要な治療目標は、生物学的に有効な用量の薬剤を標的細胞に送達することが可能なままに、ＲＥＳ器官におけるＮＰの非特異的蓄積から生じる望ましくない全身性薬物毒性を最小限にすることである。しかしながら、薬剤送達のためにＮＰを用いることに伴う１つの懸念は、ＮＰは薬剤分子よりも相対的に大きく、従って血管壁の透過および腫瘍細胞へのアクセスが低分子質量の薬剤または抗体と比較してより起こりにくいであろうことである。このため、治療の場面において薬剤積荷を標的組織に効果的に、また特異的に送達するＲＤＺ−２１８の能力を試験するため、サイズが約５００ｍｍ３の確立された乳腺腫瘍を有するマウスに、ＲＤＺ−２１８、ＮＰ−Ｄｏｘまたは遊離Ｄｏｘのいずれかの静脈内注射を約４８時間間隔で２回与えた。最後の注射から約２４時間後の腫瘍の顕微鏡分析は、ＲＤＺ−２１８で処置された動物からの腫瘍において、強く、また広範囲に広がったドキソルビシンの蛍光を明らかにした。図２、パネル（ｄ）を参照のこと。対照的に、ＮＰ−Ｄｏｘまたは遊離Ｄｏｘのいずれかで処置されたマウスからの腫瘍において、ドキソルビシンの蛍光は著しく低減されたか、または点状であった。図２、パネル（ｄ）を参照のこと。驚くべきことに、ＲＤＺ−２１８で処置されたマウスのみが、それぞれＮＰ−Ｄｏｘおよび遊離Ｄｏｘで処置されたマウスと比較した場合に肝臓および心臓におけるドキソルビシン蛍光の顕著な低減を示した。図２、パネル（ｄ）を参照のこと。心臓におけるドキソルビシン蓄積の低減は、心毒性がドキソルビシン療法の用量制限因子であることから、とりわけ重要である。これらの結果は、ＲＤＺ−２１８が腫瘍浸透能力を持ち、およびＲＲ−１１ａ＋ＮＰが薬剤積荷の固形腫瘍への特異的送達をインビボで達成可能である一方で、末梢器官、例えば肝臓および心臓などにおける薬剤の非特異的蓄積を低減させることを明確に指し示す。
【００５０】
定着乳腺腫瘍を有するマウスにＲＲ−１１ａ＋ＮＰにより送達されたドキソルビシン積荷の治療的有効性は、ＲＤＺ−２１８、ＮＰ−Ｄｏｘ、空のＲＲ−１１ａ＋ＮＰ（ＮＰ−ＲＲ−１１ａ）、遊離Ｄｏｘまたは生理食塩水のいずれかの静脈内注射を３日間隔で５回マウスに与えることにより評価した。マイクロキャリパーを使用した腫瘍サイズの決定は、ＲＤＺ−２１８処置のみが腫瘍増殖を本質的に根絶した一方、対照群は生理食塩水で処置された動物と比較して腫瘍増殖を遅らせるのみであったことを明らかにした。図３、パネル（ａ）を参照のこと。腫瘍細胞チャレンジ後３週間、ＲＤＺ−２１８で処置されたマウスからの原発腫瘍の肉眼的検査は痕跡的な腫瘍小結節のみを明らかにした一方、対照マウスにはサイズが約５００ｍｍ３以上の大きな腫瘍塊があった。図３、パネル（ｂ）を参照のこと。ＲＤＺ−２１８での処置は、対照と比較した場合に約８から１２倍の腫瘍重量減少をもたらした。図３、パネル（ｃ）を参照のこと。このことに一致して、ＲＤＺ−２１８で処置されたマウスからの腫瘍切片のＴＵＮＥＬ免疫組織化学的分析は、対照動物からの腫瘍と比較して９から３５倍の間のアポトーシス性細胞パーセンテージの増加を明らかにした。図３、パネル（ｄ）を参照のこと。驚くべきことに、ＲＤＺ−２１８で処置されたマウスは試験過程の全体にわたって体重減少を何ら示さなかったが、このことは毒性低減を指し示すものである。図３、パネル（３）を参照のこと。
【００５１】
このＲＤＺ−２１８の毒性低減を確認するため、腫瘍を持ったマウスにおける毒性試験を、遊離Ｄｏｘ、ＮＰ−ＤｏｘまたはＲＤＺ−２１８の単回用量を全ての群について約５ｍｇ／ｋｇドキソルビシンで約５日間の過程にわたって毎日投与することにより実施した（表１）。ＲＤＺ−２１８で処理された群のみ、５日目の最後の処置の後に全ての動物が生存した。対照的に、約５ｍｇ／ｋｇで投与された遊離Ｄｏｘは致死的で、この群の全ての試験動物は最初の処置の後、直ちに死亡した。このことに対し、非標的化ＮＰ−Ｄｏｘで処置された群では５回全ての処置が完了した後に動物は１個体しか生き残らず、致死的な毒性が２回目および３回目の処置の後、５個体の動物のうち４個体において観察された。これらの驚くべき結果は、ＲＲ−１１ａを介したＰＥＧ−リポソームのリガンド標的指向は非標的器官におけるドキソルビシンの非特異的蓄積を低減させ、従って致死的な全身毒性を除去することを確認するものである。
【００５２】
［実施例５］
ＣＤＤＯ−Ｉｍが封入されたレグマイン標的指向性ＮＰ
脂質フィルム再水和の際の脂質二重層内へのＣＤＤＯ−Ｉｍの自発性組み込みを確実にするため、ＣＤＤＯ−ＩｍをＮＰ内に、ＣＤＤＯ−Ｉｍの物理的特性、即ち疎水性およびコレステロールとの化学的類似性を利用して組み込んだ。０．６モル比のＣＤＤＯ−Ｉｍをモル比がそれぞれ６．７：６．７：２．２：１：１．１のＤＯＰＥ：ＤＯＰＣ：コレステロール：ＤＯＰＥ−ＰＥＧ：ＤＯＰＥ−ＲＲ１１ａに添加することは、ＣＤＤＯ−Ｉｍの有効な充填をもたらした。ＮＰ崩壊による放出後の遊離のＣＤＤＯ−Ｉｍおよび封入されたＣＤＤＯ−ＩｍのＵＶ分光測定による分析は充填濃度が約４５μｍｏｌ／Ｌ  ＣＤＤＯ−Ｉｍであることを指し示したが、この濃度は有効なＳｔａｔ３阻害に必要とされる用量１００ｎｍｏｌ／Ｌよりも約４５０倍高濃度である。動的光散乱およびＴＥＭによる分析は、最適な平均ＮＰ直径である約１００ｎｍおよび０に近いゼータ電位を示した（図５Ａ−Ｄを参照のこと）。
【００５３】
［実施例６］
封入されたＣＤＤＯ−Ｉｍのインビボでの評価
材料  認証された４ＴＯ７／４Ｔ１マウス乳癌細胞はＳｕｚａｎｎｅ  Ｏｓｔｒａｎｄ−Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｒｙｌａｎｄ、カレッジパーク、メリーランド州）より提供を受け、１０％  ＦＢＳ、１％  ＨＥＰＥＳ、１％炭酸水素ナトリウムおよび１％ピルビン酸ナトリウムが添加されたＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、カールスバッド、カルフォルニア州、アメリカ）中で維持した。細胞株を、Ｂａｌｂ／ｃマウス中でのインビボの増殖／転移、ＩＬ−６およびＳ１００Ａ８／Ａ９の発現ならびに６−チオグアニンへの抵抗性により認証した。細胞はＭｙｃｏＡＬＥＲＴ（２００８、Ｌｏｎｚａ、バーゼル、スイス）を用いたマイコプラズマについての試験で陰性であった。ＭＭＴＶ−Ｎｅｕ原発腫瘍はＭｉｃｈａｅｌ  Ｋａｒｉｎ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、サンディエゴ、カルフォルニア州、アメリカ）より提供を受け、同系のＦＶＢ／ＮＪマウス中での連続継代により維持した。簡潔に言うと、ＭＭＴＶ−Ｎｅｕ原発腫瘍を細かく刻んで、滅菌条件下、Ｔｙｐｅ  ３  Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ、レイクウッド、ニュージャージー州、アメリカ）を使用して、２．５％  ＦＢＳおよび１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓが添加されたＲＰＭＩ−１６４０培地中で消化した。１×１０６個の細胞をＰＢＳ中に再懸濁し、同系の雌性ＦＶＢ／ＮＪマウスの乳房脂肪体内に注射した。この手法を原発腫瘍が約５００ｍｍ３のサイズに達するまで繰り返した。
【００５４】
ウエスタンブロット  タンパク質抽出物を従前に記載されたように調製した。ウエスタンブロットは以下の抗体、ウサギ抗リン酸化ＳＴＡＴ−３抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、ダンバーズ、マサチューセッツ州アメリカ）、ヤギ抗β−アクチン、ＩＬ−６およびＩＬ−１０抗体、ウサギ抗リン酸化ＳＴＡＴ−１、ＳＴＡＴ−３、ＩＬ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−２およびＴＧＦ−β抗体、ラット抗ＩＬ−１２ｂ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−γ抗体ならびにマウス抗ＩＬ−１５抗体（全てＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、サンタクルーズ、カルフォルニア州、アメリカ）および抗ＥＲＢＢ２抗体（Ａｂｃａｍ、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、アメリカ）を使用して探索した。タンパク質のバンド強度を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて定量し、β−アクチンに対して正規化した。
【００５５】
インビボでの腫瘍試験  ４ＴＯ７細胞（５×１０３個）またはＭＭＴＶ−Ｎｅｕ原発腫瘍細胞（１×１０４個）をそれぞれ雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスまたはＦＶＢ／ＮＪマウス内に同所性に注射した。２００μｌのＰＢＳ中のＮＰ（約１．３６×１０１３個の粒子）を静脈内投与し、腫瘍寸法を、デジタルマイクロキャリパーを用いて測定した。腫瘍体積は式［（ａ２×ｂ）／２］
を用いて算出したが、式中「ａ」は２つの直角に交わる直径のうちより大きいほうである。再発試験のため、原発腫瘍を外科的に除去し、マウスを対側乳房脂肪体中に同所性に再チャレンジした。マウスに１週間隔で３回の強制経口接種を、ｐＮｅｕＴｍ（Ｗｅｉ−Ｚｅｎ  Ｗｅｉ、Ｋａｒｍａｎｏｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ、デトロイト、ミシガン州、アメリカより提供）または空のベクターのいずれかが形質導入された弱毒化サルモネラ・チフィムリウム（ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）（１×１０８ＣＦＵ／マウス）を使用して行った。
【００５６】
フローサイトメトリー  脾臓細胞および腫瘍浸潤リンパ球を単離し、フルオレセインにコンジュゲートされたマウスＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ４５、Ｆ４／８０に対する抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、サンディエゴ、カルフォルニア州、アメリカ）（容積１００μｌ中に０．２５μｇ抗体／１０６個の細胞）および／またはグランザイムＢに対する抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、サンディエゴ、カルフォルニア州、アメリカ）（容積１００μｌ中に０．１２５μｇ抗体／１０６個の細胞）と共にインキュベートした（１×１０６個の細胞／チューブ）。データをデジタルＬＳＲ−ＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、フランクリンレイクス、ニュージャージー州、アメリカ）上で収集し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．、アシュランド、オレゴン州、アメリカ）を使用して分析した。
【００５７】
免疫組織化学  アセトン中で固定された腫瘍切片を一次抗体のラット抗マウスＦ４／８０抗体（１：５０希釈、ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ、ローリー、ノースカロライナ州、アメリカ）およびウサギ抗マウスＮｏｓ２抗体（１：５０希釈、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、サンタクルーズ、カルフォルニア州、アメリカ）を使用して染色し、それぞれ二次抗体のヤギ抗ラットＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８抗体またはヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８抗体（いずれも１：２００希釈、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、カールスバッド、カルフォルニア州、アメリカ）を使用して検出した。対照の染色のため、二次抗体のみと共に組織切片をインキュベートした。細胞核をＤＡＰＩジラクタート（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州、アメリカ）を使用して染色した。
【００５８】
ＣＤＤＯ−Ｉｍはマウス乳癌細胞におけるＳＴＡＴ−３活性化を阻害する  マウス乳癌細胞におけるＩＬ−６誘導性ＳＴＡＴ−３活性化を阻害するＣＤＤＯ−Ｉｍの能力を、４Ｔ１腫瘍細胞をＩＬ−６と共におよび遊離のＣＤＤＯ−Ｉｍ濃度を増加させながらインキュベートすることにより評価した。ウエスタンブロット分析は、ＣＤＤＯ−Ｉｍは１００ｎＭから１μＭの濃度でＳＴＡＴ−３のリン酸化を遮断し、全ＳＴＡＴ−３タンパク質の発現を抑制したことを明らかにした（図６Ａ）。ＳＴＡＴ−３活性化を阻害する封入されたＣＤＤＯ−Ｉｍの能力を、ＩＬ−６刺激４ＴＯ７腫瘍細胞を空の標的化ＮＰ（Ｌｅｇ−ＮＰ）、ＣＤＤＯ−Ｉｍを充填された非標的化（ＮＰ−ＣＤＤＯ）もしくは標的化（Ｌｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯ）ＮＰ、または遊離のＣＤＤＯ−Ｉｍと共にインキュベートすることにより確認した。ウエスタンブロット分析は、封入されたＣＤＤＯ−Ｉｍは遊離のＣＤＤＯ−Ｉｍと同様にＳＴＡＴ−３のリン酸化を遮断したことを示した（図６Ｂ）。重要なことに、Ｌｅｇ−ＮＰで処理された細胞はＳＴＡＴ−３リン酸化の阻害を示さず、従って阻害はもっぱらＣＤＤＯ−Ｉｍに起因し、ＮＰの何らかの非特異的作用によるものではなかったことを実証した（図６Ｂ）。
【００５９】
最後に、治療の場面においてＣＤＤＯ−Ｉｍ積荷をＭＭＴＶ−Ｎｅｕ原発腫瘍に送達するＬｅｇ−ＮＰの能力を試験した。この目的のため、同所性の乳腺腫瘍を持つマウスに生理食塩水（ＰＢＳ）、Ｌｅｇ−ＮＰまたはＬｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯのいずれかを使用した静脈内注射を３日間隔で８回与えた。最後の注射から１日後に得られたＭＭＴＶ−Ｎｅｕ原発腫瘍タンパク質抽出物のウエスタンブロット分析は、Ｌｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯは原発腫瘍におけるＳＴＡＴ−３のリン酸化を効果的に阻害することを示した（図６Ｃ）。まとめると、これらのデータは、ＣＤＤＯ−Ｉｍはマウス乳癌細胞におけるＳＴＡＴ−３のリン酸化を阻害することを実証する。加えて、この業績は、ＴＭＥへの標的化送達のためのリポソームＮＰ内へのＣＤＤＯ−Ｉｍの成功裡の封入およびインビボでのＳＴＡＴ−３リン酸化の有効な治療的阻害を実証する。
【００６０】
Ｌｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯはマウス乳腺腫瘍の増殖を抑制する  Ｌｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯのインビボでの作用を評価するため、ＢＡＬＢ／ｃマウスに約５×１０３個の４ＴＯ７腫瘍細胞を同所性にチャレンジし、４日後、マウスをＬｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯまたは対照の８回の静脈内注射で処置した（図７Ａ）。原発腫瘍の増殖は対照と比較した場合、Ｌｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯにより有意に抑制された（図７Ｂ）。重要なことに、遊離のＣＤＤＯ−Ｉｍまたは非標的化粒子中に封入されたＣＤＤＯ−Ｉｍでの処置は、Ｌｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯと比較した場合、腫瘍増殖を抑制するのに著しく有効性が低かった。加えてＬｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯで処置されたマウスは、無処理の対照と比較して有意な腫瘍量の減少を示した（図７Ｃ）。
【００６１】
しかしながら、原発腫瘍細胞と比較してエクスビボで長期培養されている樹立された腫瘍細胞株、例えば４ＴＯ７などは、治療的応答に影響し得る遺伝的および表現型変化を獲得する可能性がある。このため、Ｌｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯの有効性を決定的に評価するため、ＭＭＴＶ−Ｎｅｕ原発性細胞由来の同所性腫瘍で処置されたマウスを、Ｌｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯ、Ｌｅｇ−ＮＰまたはＰＢＳの８回の静脈内注射で処置した（図８Ａ）。腫瘍体積の算出は、Ｌｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯで処置されたマウスは対象と比較して有意に腫瘍量が低減したにもかかわらず（図８Ｃ）、わずかな腫瘍サイズ低減を示すのみであった（図８Ｂ）ことを明らかにした。このため、Ｌｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯは、４ＴＯ７細胞株由来の腫瘍と比較して原発腫瘍細胞の増殖をインビボで抑制するのに著しく有効性が低かった。
【００６２】
Ｌｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯは原発腫瘍におけるサイトカインおよび増殖因子の発現を調節する  ＳＴＡＴ−３シグナル伝達は、腫瘍細胞およびマクロファージを包含するＴＭＥ中の他の細胞によるサイトカインおよび増殖因子の発現を調節することにより、インビボでの腫瘍に関連した免疫抑制を仲介する。このため、これらの因子の発現レベルに対するＬｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯの作用を評価するため、全細胞抽出物をＬｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯ、Ｌｅｇ−ＮＰまたはＰＢＳで処置したマウスの原発腫瘍から得た。ウエスタンブロット分析は、対照と比較して、Ｌｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯで処置されたマウスにおいてｐＳＴＡＴ−１（７１５倍）、ＩＬ−１５（３７倍）、ＩＬ−１２ｂ（９倍）、ＩＦＮ−γ（２４倍）およびＧＭ−ＣＳＦ（６倍）のタンパク質発現の顕著なアップレギュレートを示した（図９Ａ）。逆に、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βのタンパク質発現はＬｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯで処置されたマウスの原発腫瘍において２から５倍の減少を示した（図９Ｂ）。Ｌｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯ処置はまた抗アポトーシス性タンパク質のＢｃｌ−ＸＬ（８倍）およびＢｃｌ−２（１．４倍）の発現をダウンレギュレートした（図９Ｃ）。興味深いことに、これらの結果はＬｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯ療法の結果としてのＴＭＥのＴｈ１サイトカイン極性化を指し示す。
【００６３】
Ｌｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯで処置されたマウスの原発腫瘍における抗原提示細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増加  腫瘍により動員される免疫細胞は、ＴＭＥからのＴｈ１極性化シグナルを受けるかＴｈ２極性化シグナルを受けるかに依存して異なるサイトカインおよび増殖因子を分泌する。このため、サイトカイン発現において観察されたＴｈ１シフトは、腫瘍中の免疫細胞の環境変化もまた明白であろうことを示唆した。この仮説を評価するため、生きた原発腫瘍の単一細胞懸濁液をＬｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯ、Ｌｅｇ−ＮＰまたはＰＢＳのいずれかで処置したマウスから得て、フローサイトメトリーにより分析して、活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞、ＤＣおよびマクロファージを検出した（図１０Ａ−Ｃ）。ＮＰ−Ｌｅｇ−ＣＤＤＯで処置されたマウスは、ＰＢＳ対照と比較して４．６倍のＣＤ８＋／ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増加を示した（図１０Ａ）。加えて、Ｌｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯで処置されたマウスでは、マクロファージ（ＣＤ４５＋／Ｆ４／８０＋）（図１０Ｂ）およびＤＣ（ＣＤ１４＋／ＣＤ１１ｃ＋およびＣＤ８０＋／ＣＤ１１ｂ＋）（図１０Ｃ）がそれぞれ５．６倍および２倍に増加したことが明らかになった。
【００６４】
マクロファージは、活性化および極性化の様式に依存して、免疫機能および腫瘍増殖に対して大いに異なる作用を持つ。「古典的活性化」Ｍ１マクロファージは抗腫瘍免疫応答に関連したＮＯＳ２の高発現を典型的に示す。対照的に、「代替的活性化」Ｍ２マクロファージはＮＯＳ２を発現せず、免疫抑制および腫瘍促進応答に典型的に関連する。このため、Ｌｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯで処置されたマウスの原発腫瘍中のマクロファージはＭ１またはＭ２のいずれに対応するのかということについて調査がなされた。この目的のため、腫瘍の免疫組織化学および蛍光顕微鏡検査分析は、Ｌｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯで処置されたマウス由来の腫瘍におけるＦ４／８０＋／Ｎｏｓ２＋陽性細胞の顕著な増加を明らかにしたが（図１０Ｄ）、対照腫瘍は主にＮＯＳ２−である強いＦ４／８０＋染色を示した（図１０Ｄ）。これらの試験結果は、腫瘍浸潤マクロファージのＭ１極性化がＬｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯ処置の結果であることを示唆する。
【００６５】
併用療法はＨｅｒ−２  ＤＮＡワクチンの抗腫瘍作用を改善する  本試験結果は、Ｌｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯでの処置がＴＭＥを介した免疫抑制を遮断することを示唆する。そのうえ、サイトカイン発現プロファイルおよび免疫エフェクター細胞の浸潤に基づくと、免疫ＴＭＥは抗腫瘍応答に対して十分にプライミングされたように見えた。ＦＶＢ／ＮＪマウスに約１×１０４個のＭＭＴＶ−Ｎｅｕ原発腫瘍細胞を同所性にチャレンジし、Ｌｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯとＨＥＲ−２の細胞外ドメインに対するＤＮＡワクチン（ｐＮｅｕＴＭ）との組み合わせで処置した（図１１Ａ）。または、マウスを空の標的化ＮＰ（Ｌｅｇ−ＮＰ）または対照ワクチン（ｐＶｅｃｔｏｒ）でも処置した。原発腫瘍を体積が５００ｍｍ３に達した後に外科的に除去し、４週間の回復の後、実験的再発のため、マウスの対側脂肪体中に約１×１０４個のＭＭＴＶ−Ｎｅｕ原発腫瘍細胞を再チャレンジした。腫瘍の再発はＬｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯ／ｐＮｅｕＴｍ併用療法で処置したマウスにおいて対照と比較して有意に抑制され、４０％（２／５）のマウスにおいて完全な腫瘍拒絶をもたらした（図１１Ａ）。対照的に、ｐＮｅｕＴｍを使用したワクチン接種またはＬｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯでの処置は単独では腫瘍再発を防がなかった。これらの結果は、併用療法を介した腫瘍再発予防はＬｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯによって生じ、このＬｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯは免疫ＴＭＥをＴｈ１刺激し、従ってｐＮｅｕＴｍワクチン接種の後の抗腫瘍免疫応答を改善することを示唆する。
【００６６】
Ｌｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯ、Ｌｅｇ−ＮＰまたはＰＢＳと組み合わせてｐＮｅｕＴｍを接種されたマウスからの脾臓細胞を、放射線照射されたＭＭＴＶ−Ｎｅｕ原発腫瘍細胞と共に培養し、これらの脾臓細胞のＣＴＬ応答をフローサイトメトリーにより測定した。結果は、Ｌｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯで処置されたｐＮｅｕＴＭ接種マウスでは対照と比較してＣＤ８＋／グランザイムＢ＋脾臓細胞のパーセンテージが２．３倍増加したことを示した（図１１Ｂ）。加えて、このＣＴＬ応答ブーストが腫瘍細胞特異的であるかを評価するため、Ｌｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯ／ｐＮｅｕＴｍで処置されたマウスからの脾臓細胞のＣＴＬ応答を、ＨＥＲ−２高のＭＭＴＶ−Ｎｅｕ腫瘍細胞、対してＨＥＲ−２低のＨＥＶｃマウス内皮細胞のいずれかと共に培養した場合で比較した（図１１Ｃ）。これらの脾臓細胞のフローサイトメトリー分析は、ＨＥＲ−２高細胞に応答したＣＤ８＋／グランザイムＢ＋細胞のパーセンテージがＨＥＲ−２低細胞に対して４倍増加したことを明らかにし（図１１Ｃ）、従って併用療法で処置されたマウスの免疫応答は実際に腫瘍抗原特異的であったことを実証した。
【００６７】
考察
Ｌｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯで処置されたマウスの腫瘍におけるＣＤ８＋Ｔ細胞増加は、Ｔ細胞に対する強力なケモアトラクタントであるＩＬ−１５発現の顕著な増加と相関した。重要なことに、ＩＬ−１５は繊細なヒトＴ細胞および記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞のＴｈ１  Ｔ細胞への分化および増殖をインビトロで刺激する。顕著なことに、これらの試験結果は、ＴＭＥにおけるＩＬ−１５の発現増加がＬｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯを使用したＳＴＡＴ−３阻害の結果としてのＣＤ８＋Ｔ細胞の機能改善と相関するという所見と一致する。
【００６８】
腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）は固形腫瘍において、中でも最も一般的な免疫細胞である。ＴＡＭは炎症性細胞のさらなる動員を引き起こすサイトカイン放出による腫瘍促進性炎症を仲介する（２４）。このことに一致して、本発明者らは本明細書において原発腫瘍におけるＩＬ−１０およびＴＧＦ−βのタンパク質発現の減少を見出したが、これらのタンパク質は両方ともＴＡＭのがん促進性のＭ２表現型を誘導することが報告されている。対照的に、ＩＦＮ−γにより活性化されるマクロファージは腫瘍破壊に関連した表現型を有する。これらのＭ１マクロファージはＮＯＳ−２発現により部分的に特徴付けられる。興味深いことに、Ｌｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯで処置されたマウスの原発腫瘍におけるＮＯＳ−２＋マクロファージの浸潤増加が、原発腫瘍におけるＧＭ−ＣＳＦの発現増加と対応して観察された。重要なことに、ＧＭ−ＣＳＦはＤＣおよびマクロファージを包含する亢進されたプロフェッショナル抗原提示細胞の動員を誘導することが示された。
【００６９】
本結果は、ＨＥＲ−２  ＤＮＡワクチン（ｐＮｅｕＴｍ）と組み合わせたＬｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯを使用した免疫ＴＭＥの標的化操作がマウス腫瘍モデルにおける乳癌の再発を本質的に予防したことを実証する。併用療法はまた、単一療法を単独で受けたマウスと比較した場合、ＣＤ８＋Ｔ細胞の抗腫瘍ＣＴＬ応答を有意に改善した。そのうえ、併用療法で処置されたマウスは原発腫瘍細胞に対する特異的なＣＴＬ応答の亢進を示したもののＨＥＲ−２−内皮細胞に対しては示さず、従って腫瘍抗原特異的な免疫応答を実証する。重要なことに、併用療法はＨＥＲ−２＋原発腫瘍細胞での再チャレンジ後の腫瘍増殖を遅延させ、４０％のマウスにおいて再発を予防した。これらの結果は、免疫ＴＭＥの治療的操作はがん免疫療法の有効性を改善することが可能であることを明確に実証する。
【００７０】
まとめると、本明細書において記載される結果は、単一のサイトカイン療法による限定的な作用を示す幾つかの第Ｉ／ＩＩ相臨床試験の試験結果と合うが、このことは併用療法および複数サイトカインの特異的標的指向への必要性を強く強調した。顕著なことに、本明細書における所見は、ＴＭＥにおいて免疫サイトカインおよび増殖因子の主要なレパートリーを操作する新規の標的化治療アプローチを表している。重要なことに、ＴＭＥにおけるＴｈ１／Ｔｈ２移行のための特異的な標的指向性免疫操作により、多くの免疫刺激サイトカインの重篤な全身毒性を回避しつつ、これらのサイトカインの免疫促進作用を利用することができる。がんワクチン療法の抗腫瘍作用を改善してがんの再発を予防することにより、Ｌｅｇ−ＮＰ−ＣＤＤＯはがん患者の寿命および健康を増進するがん免疫療法の有効性を究極的に改善することが可能な強力な有用治療化合物を表している。
【００７１】
要約すると、インビボで高度に効率的な固形腫瘍への薬剤積荷送達能力がある新規のレグマイン標的化ＰＥＧ−リポソームＮＰが開発された。ＲＲ−１１ａへのカップリングは、固形腫瘍の顕著な特徴である低酸素ストレス下、腫瘍細胞表面上のレグマイン結合部位数の顕著な増加に起因して、腫瘍細胞によるＮＰ取り込みを顕著に亢進した。この現象は、レグマインに対するＲＲ−１１ａの高い結合親和性と併せて、治療の場面において薬剤が充填されたＲＲ−１１ａ＋ＮＰの固形腫瘍への特異的ホーミングを促進し、肝臓および心臓における非特異的な蓄積を低減させ、従って望ましくない薬物毒性を除去する。重要なことに、ＲＲ−１１ａ＋ＮＰによる薬剤送達は致死的用量のドキソルビシンの毒性を除去しただけでなく、腫瘍の低用量ドキソルビシンへの感度をも増加させたことから、従って有効な抗腫瘍応答を達成するのに必要な薬剤の量を低減させる。
【００７２】
腫瘍微小環境（ＴＭＥ）は、免疫サーベイランスからの腫瘍細胞のエスケープおよびがんワクチンの失敗をもたらす免疫抑制を仲介する。免疫抑制はＳＴＡＴ−３転写因子により仲介されるが、この転写因子は腫瘍および免疫細胞におけるシグナル伝達を増強する。免疫抑制はがんワクチンの有効性の主要な阻害物であり続けることから、本発明者らは本研究において、ＴＭＥへの合成ＳＴＡＴ−３阻害剤の治療的標的化送達がＨＥＲ−２  ＤＮＡワクチンと組み合わされてＨＥＲ−２＋乳癌に対する免疫サーベイランスを改善して乳癌再発を予防することが可能であるかを試験した。本発明のＣＤＤＯ−Ｉｍ積荷を封入するリガンド標的化ナノ粒子（ＮＰ）はＴＭＥへの特異的送達能力があり、原発腫瘍におけるＳＴＡＴ−３活性化の有効な治療的阻害を実証した。そのうえ、これらのＮＰでの処置は、ＩＦＮ−γ、ｐＳＴＡＴ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−１２ｂのタンパク質発現増加ならびにＴＧＦ−β、ＩＬ−６およびＩＬ−１０のタンパク質発現低減を特徴とする免疫ＴＭＥのプライミングをもたらした。加えて、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｍ１マクロファージおよび樹状細胞による顕著な腫瘍浸潤の増加が観察された。これらの変化は同所性の４ＴＯ７乳腺腫瘍の増殖遅延と相関し、およびＨＥＲ−２  ＤＮＡワクチンと組み合わせた場合、免疫適格（ｉｍｍｕｎｅ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）マウスにおいてＨＥＲ−２＋原発腫瘍の再発を予防した。そのうえ、この併用療法で処置されたマウスから分離された脾臓細胞において、抗腫瘍Ｔ細胞応答が亢進された。合わせて、これらのデータは、腫瘍特異的抗原に対する免疫サーベイランスの改善を通じた有効ながん再発予防を実証する。
【００７３】
本発明の腫瘍標的指向性ＮＰには顕著な臨床適用があるが、この理由は、ドキソルビシンおよびＣＤＤＯ−Ｉｍを封入するのに用いられるＲＲ−１１ａ＋ＮＰは例えばドキソルビシンおよびタキサンなどの薬剤の組み合わせを包含する他の薬剤化合物を封入するのにも適用可能であり、これらの薬剤の薬物動態の差を実質的に除去し得るからである。本技術は薬剤送達および化学療法の現状を前進させ、抗腫瘍作用に必要とされる生物学的に最適な薬剤用量を低減させるための手段を提供すると同時に、望ましくない全身毒性を除去するものであり、がん患者の健康および生活の質を顕著に改善することが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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