(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分散培養培地及び培地補助剤を含んでなる、インビボ様巨大シナプスとその増強されたシナプス形成製造用培地であって、
前記培地補助剤がニューロトロフィン3、カリウム又はその塩、及び塩基性繊維芽細胞増殖因子のいずれか、又はいずれかの組合せを含む
前記製造用培地。
【請求項２】
前記培地補助剤がニューロトロフィン3、カリウム又はその塩、及び塩基性繊維芽細胞増殖因子を含む、請求項１に記載の製造用培地。
【請求項３】
増強されたシナプス形成がシナプス数の増大、及びシナプスの神経伝達物質放出量の増大を含む、請求項１又は２に記載の製造用培地。
【請求項４】
巨大シナプスがcalyx of Heldシナプスである、請求項３に記載の製造用培地。
【請求項５】
分散培養培地がイーグルMEM培地、DMEM培地、ハムF10培地、ハムF12培地、M199培地、高性能改良199培地、RPMI-1640培地、DMEM/F12又は神経基本培地である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造用培地。
【請求項６】
終濃度で、ニューロトロフィン3を1〜500ng/mL、カリウム又はその塩を1〜50mM、及び／又は塩基性繊維芽細胞増殖因子を1〜100ng/mLで含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の製造用培地。
【請求項７】
終濃度で、ニューロトロフィン3を50ng/mL、カリウム又はその塩を25mM、及び／又は塩基性繊維芽細胞増殖因子を5ng/mLで含む、請求項６に記載の製造用培地。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の製造用培地を用いてインビトロで細胞を培養する工程を含む、インビボ様巨大シナプスとその増強されたシナプス形成を製造する方法。
【請求項９】
前記細胞が神経細胞、神経前駆細胞、神経幹細胞、神経細胞株、又はエフェクター細胞との共培養下の神経細胞である、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インビトロで神経細胞（ニューロン）のインビボにおける形態学的性質、生理学的性質及び発生学的性質を再現し、かつ神経細胞のシナプス形成数及び神経伝達物質放出量を増強することのできる補助剤、当該補助剤を含む神経細胞培養用培地、及び当該培地を用いたインビボ様シナプス形成増強神経細胞モデルの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
シナプスは、神経系の基本単位である神経細胞（ニューロン）間の高度に特異的な連結であって、高い正確性と忠実性によって胎児期から生後初期の発生期間に形成される。機能的なシナプスの接触は、中枢神経系の2つの神経細胞間（すなわち、軸索細胞体間（axosomatic）、軸索樹状突起間（axodendritic）、軸索軸索間（axoaxonic）及び樹状突起間（dendrodendritic））、及び末梢の単一神経細胞とその周辺のエフェクター細胞（effector cell）間（例えば、運動ニューロンと筋細胞の間の神経筋接合シナプス）で生じる。
【０００３】
神経伝達物質を最終的に適切に放出するために、シナプス前細胞、シナプス後細胞、及びグリア細胞間で厳密に制御された分子コミュニケーションによって、シナプスの形成、成熟及び安定化が行われる。また、学習、記憶及び知覚過程のような脳の高度な機能は神経シナプスの発生及び可塑性に依存している。ニューロンは、多くのシナプスと連結して、神経回路網を構成する。このシナプスの数は、通常の老化過程で徐々に減少する他、神経変性疾患では急速に減少することが知られている（非特許文献１及び２）。
【０００４】
シナプスと神経回路網の形成において、発生の時期、誘導、及びシナプスの数の制御に重要な役割を果たすのは、環境決定分子である。分散初代神経細胞の培養技術は、40年以上にわたって一般的な手法であった。それ故、近年では、神経学研究室や製薬会社においては、インビトロの神経細胞培養培地の開発が進められており、皮質ニューロン用、海馬ニューロン用及び神経筋接合部用といった、いくつかの初代培養モデルが開発されている（非特許文献３〜５）。それらの開発により、個々の神経細胞で電気生理学、高解像度イメージング及び薬理学的実験を行うことが容易になった。実際、神経細胞や神経回路網形成のインビトロの研究では、脳の基本的な発生機序を解明するために、可能な限りインビボの性質に近い神経細胞を再現する技術に大きな関心が寄せられている。さらに、神経回路網の発生を調製する分子を見つけることが神経変性疾患や加齢における治療法を見つける上での重要なステップとなっている。シナプスの発生及び機能の研究用モデルとして、哺乳動物の聴覚脳幹における軸索細胞体間末端にあるcalyx of Heldと呼ばれる巨大中枢神経系シナプスが解剖学者や電気生理学者に広く利用されている（非特許文献６〜１０）。しかし、このシナプスをインビトロで形成させるのは非常に困難という問題があった。
【０００５】
従来の標準的なインビトロ神経細胞培養培地には、星状細胞によってプレコンディションされたハムF12及びMEM（登録商標）に基づく市販の混合物、又はN2培地（非特許文献１１）及びB-27（登録商標）補助剤（Life technologies)のような培地補助剤が含まれている。これらの補助剤は、インビトロで神経細胞の長期培養を補助することができる。また、B-27は、星状細胞のフィーダー層なしに神経細胞を培養することができる。しかし、これらの補助剤を含む培地の主な目的は、神経細胞の生存と寿命を増加させることであって、シナプスのインビボにおける形態学的性質、生理学的性質及び発生学的性質を再現したり、シナプス数や神経伝達物質放出を増加するものではない。現在までのところ、可溶性分子で、シナプス数の確実な誘導因子として同定されているのは、スロンボスポンジン、コレステロール及びhevin等の数因子に過ぎない(特許文献１、非特許文献１２〜１３)。
【０００６】
以上のような背景から、calyx of Heldシナプス等のシナプスの機能を詳細に研究するためには、インビトロの系で発生学的に、生理学的に、形態学的にインビボの性質を再現することのできる補助因子を探索し、細胞培養用培地を初代神経細胞培養用に最適化する必要がある。しかしながら、インビトロの系でインビボ様の神経細胞シナプスの性質を再現した神経細胞モデルの作製方法は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】US05/024363
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Selkoe D.J., 2002, Science, 298(5594): 789-91
【非特許文献２】Lee S.H. and Sheng M., 2000, Curr Opinion in Neurobiol., 10 (1):125-31
【非特許文献３】Murray M.R., 1965, Methods, Biology and Physiology, 2: 373-55
【非特許文献４】Mains R.E. and Patterson P.H., 1973, J. Cell Biol., 59: 329-45
【非特許文献５】Dichter M.A., 1978, Brain Res, 149: 279-93
【非特許文献６】Forsythe I. J., 1994, Physiol, 479: 381-7;
【非特許文献７】Yamashita et al., 2010, Nat. Neurosci, 13(7):838-44
【非特許文献８】Micheva K. et al., 2003, Nat. Neurosci., 6(9):925-32
【非特許文献９】Takahashi T. et al., 1996, Science, 274(5287):594-7
【非特許文献１０】Borst J. and Van Hoeve J., 2011, Annu. Rev. Physiol., 17:56
【非特許文献１１】Bottenstein J.E. & Sato G.H., 1979, Proc Natl Acad Sci, 76 (1) 514-7
【非特許文献１２】Mauch D.H., et al., 2001, Science, 294 (5545): 1354-7
【非特許文献１３】Kucukdereli H., et al., 2011, PNAS, 108 (32): E440-9
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、細胞培養用培地組成を改良することによって神経細胞モデルを製造する方法、及びその製造に必要な細胞培養用培地組成を開発し、提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために研究開発を重ねた結果、従来の細胞培養用培地に所定の補助剤を添加した培地で初代神経細胞等を培養することによって、その補助剤未添加の細胞培養用培地で培養した神経細胞と比較して、シナプス形成数及び神経伝達物質の放出量を増加できるとともに、インビトロで神経細胞を形態学的に、生理学的に、そして発生学的にインビボ様の細胞を再現することに成功した。本願発明は、前記研究結果に基づいて完成されてものであり、以下を提供する。
【００１１】
（１）ニューロトロフィン3（NT-3)、カリウム又はその塩、塩基性繊維芽細胞増殖因子（FGF2)又はその組合せを含むインビボ様シナプス形成増強神経細胞モデル製造用培地補助剤。
（２）シナプス形成の増強がシナプス数の増大、及びシナプスの神経伝達物質放出量の増大を含む、（１）に記載の培地補助剤。
（３）シナプスがcalyx of Heldシナプス、神経細胞‐神経細胞間シナプス、及び神経細胞‐末梢エフェクター細胞間シナプスからなる群から選択される、（２）に記載の培地補助剤。
（４）細胞培養用培地に（１）〜（３）のいずれかに記載の培地補助剤を添加してなるインビボ様シナプス形成増強神経細胞モデル製造用培地。
（５）前記細胞培養用培地がイーグルMEM培地、DMEM培地、ハムF10培地、ハムF12培地、M199培地、高性能改良199培地、RPMI-1640培地、DMEM/F12又は神経基本培地である、（４）に記載の培地。
（６）終濃度で、ニューロトロフィン3を1〜500ng/mL、カリウム又はその塩を1〜50mM、及び／又は塩基性繊維芽細胞増殖因子を1〜100ng/mLで含む、（４）又は（５）に記載の培地。
（７）終濃度で、ニューロトロフィン3を50ng/mL、カリウム又はその塩を25mM、及び／又は塩基性繊維芽細胞増殖因子を5ng/mLで含む、（４）に記載の培地。
（８）（４）〜（７）のいずれかに記載の培地を用いて細胞をインビトロで培養する工程を含む、インビボ様シナプス形成増強神経細胞モデルを製造する方法。
（９）前記細胞が神経細胞、神経前駆細胞、神経幹細胞、神経細胞株、又はエフェクター細胞との共培養下の神経細胞である、（８）に記載の方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のインビボ様シナプス形成増強神経細胞モデル製造用培地補助剤によれば、既知の細胞培養用培地に添加するだけで、インビトロでインビボ様シナプス形成増強神経細胞モデルを容易に調製することができる。
【００１３】
本発明のインビボ様シナプス形成増強神経細胞モデル製造用培地及び当該培地を用いたインビボ様シナプス形成増強神経細胞モデルの製造方法によれば、インビボの性質を再現した神経細胞モデルを簡便に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１−１】左カラムのA1〜A3は、FM染色で視覚化した初代培養calyx of Heldにおけるシナプスを示す。図中、矢印は、単一のcalyx of Heldシナプス構造を示す。また、右カラムのB1〜B3は、それぞれA1〜A3の微分干渉顕微鏡像（DIC: Differential Interference Contrast microscope image）を示す。図中のスケールバーは、10μmである。
【図１−２】M培地及び本発明の調製培地で培養したcalyx of Heldにおけるシナプス数を図１−１の結果に基づいて定量化したグラフである。MはM培地を、またM+は、M培地に本発明の培地補助剤を添加した調製培地を示す。
【図２】M培地及び本発明の様々な培地補助剤を添加した調製培地で培養し、それぞれを視覚的に確認したcalyx of Heldにおけるシナプス形成数を定量化したグラフである。
【図３】本発明のインビボ様シナプス形成増強神経細胞モデル製造方法によるインビトロで培養されたcalyx of Held様シナプスの形態を示す図である。A:本発明の前記製造方法で培養した、FM染色されたcalyx of Held様シナプスの共焦点画像である。図中の矢印は、個々のシナプスを示している。図中のスケールバーは、20μmである。B: 免疫染色後固定した培養15日目（DIV15）のcalyx of Held様シナプスを3次元再構築した画像である。（ａ）はVGLUT1を、（ｂ）はシナプトフィジン（Synaptophysin:Syp）を、（ｃ）はDAPIを示す。図中のスケールバーは、10μmである。C：GFPを発現している培養16日目（DIV16）の生細胞におけるcalyx of Held様シナプスの3次元再構築画像を示す。
【図４−１】本発明のインビボ様シナプス形成増強神経細胞モデル製造方法によるインビトロで培養されたcalyx of Held様シナプスのFM dye放出能を示す。上図はFM dye蛍光図、下図はその微分干渉顕微鏡像（DIC）を示す。左カラムは刺激前、及び右カラムは刺激後である。
【図４−２】A: 本発明のインビボ様シナプス形成増強神経細胞モデル製造方法によってインビトロで培養されたcalyx of Held様シナプスにおけるFM dye放出動力学を示す。B: Aの結果に基づいたFM dyeによる蛍光測定開始時に対する蛍光減少率（％）を示している。
【図５】チューブリンを染色した培養16日目（DIV16）の海馬ニューロン（Hippocampal neuron）における軸索（axon）及び樹状突起（dendritic process）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
１．インビボ様シナプス形成増強神経細胞モデル製造用培地補助剤
１−１．概要と定義
本発明の第１の態様は、インビボ様シナプス形成増強神経細胞モデル製造用培地補助剤（以下、本明細書ではしばしば「培地補助剤」と略記する）である。本発明の培地補助剤は、細胞培養用培地に添加することでその細胞培養用培地をインビボ様シナプス形成増強神経細胞モデル製造用培地（以下、本明細書ではしばしば「調製培地」と略記する）にすることができる。
【００１６】
本明細書における「インビボ様シナプス形成増強神経細胞モデル」に関して、「インビボ様神経細胞モデル」とは、インビトロで培養され、発生学的に、生理学的に、及び形態学的に、インビボの細胞の性質を再現した神経細胞をいう。それ故、インビボ様神経細胞モデルは、神経発生学、神経生理学及び神経形態学の研究においてインビボの神経細胞のモデル細胞となり得る。さらに、「形成増強インビボ神経細胞モデル」は、本明細書における神経細胞を言うが、本培地補助剤未添加の細胞培養用培地で培養した神経細胞と比較して、単位神経細胞あたりのシナプス数及びシナプスあたりの神経伝達物質の放出量が増大する性質を有する。
【００１７】
本明細書において「シナプス」とは、calyx of Heldシナプス、神経細胞‐神経細胞間シナプス、及び神経細胞‐末梢エフェクター細胞間シナプスを含む。本明細書において単に「補助剤」と表記した場合、本発明の培地補助剤を含む上位の概念であることを意味する。「補助剤」とは、それのみでは培養細胞を培養できないが、細胞培養用培地に添加することによって、その補助剤に含まれる有効成分の作用により、培地に新たな効果を付与することのできる薬剤をいう。補助剤は、核酸分子（遺伝子若しくはその断片を発現可能な状態で含むプラスミド、siRNA等を含む）、ペプチド（オリゴペプチド及びポリペプチドを含む）、低分子化合物（神経伝達物質を含む）又はその組合せを有効成分として含む。したがって、本発明の培地補助剤は、細胞培養用培地に添加することによって、その培地にインビボ様シナプス形成増強神経細胞モデル調製能を付与することのできる補助剤である。ここでいう「インビボ様シナプス形成増強神経細胞モデル調製能」とは、細胞をインビボ様シナプス形成増強神経細胞モデルに調製することのできる能力をいう。なお、インビボ神経細胞モデル調製能には、前述の単位神経細胞あたりの、シナプス形成数を増強するシナプス形成増強能及び神経伝達物質放出量を増強する神経伝達物質増強能を含めるものとする。それ故、本発明の培地補助剤は、シナプス形成増強剤又は神経伝達物質放出増強剤としても作用し得る。
なお、「細胞培養用培地」については、第２態様の章で詳述する。
【００１８】
１−２．構成
本発明の培地補助剤は、細胞培養用培地にインビボ様シナプス形成増強神経細胞モデル調製能を付与する有効成分としてニューロトロフィン3、カリウム若しくはその塩、又は塩基性繊維芽細胞増殖因子を含む。
【００１９】
「ニューロトロフィン3」（neurotrophin−3:NT-3；以下「NT-3」と表記する）は、神経栄養成長因子の1つであり、NGF、NT-4、NT-5及びBDNFと共にニューロトロフィンファミリーを構成している。NT-3は、主として中枢神経系及び骨格筋で発現して、チロシン高親和性受容体であるTrkCチロシンキナーゼ型受容体に結合し、その下流のシグナル伝達経路を活性化することによって、既存のニューロンの生存及び分化等に寄与している（Maisonpierre P.C., et al., 1990, Science, 247(4949Pt1): 1446-51; McAllister A.K., et al., 1999, Annu. Rev. Neurosci. 22: 295-318）。本発明のNT-3の由来は、特に限定はしない。好ましくは脊椎動物由来、より好ましくは哺乳動物由来である。例えば、本発明の培地補助剤を用いた調製培地で培養する細胞がマウス由来の場合、当該NT-3は、ラット、ウサギ、又はヒトのような同じ哺乳動物の異なる生物種由来のNT-3オルソログを用いても構わない。
【００２０】
本明細書においてカリウムは、カリウムイオンを包含する。また、「その塩」とは、カリウム塩であって、例えば、塩化カリウム、炭酸カリウム、酢酸カリウム、硝酸カリウム等が挙げられる。本発明の培地補助剤におけるカリウム塩は、二種以上のカリウム塩の混合物であってもよい。なお本明細書では、「カリウム又はその塩」を以下しばしば「カリウム等」と略記する。
【００２１】
「塩基性繊維芽細胞増殖因子」（basic fibroblast growth factor：bFGF/FGF2；以下「FGF2」と表記する）は、細胞増殖因子、血管新生因子、神経栄養因子として間葉系細胞、神経外胚葉細胞、内皮細胞、上皮細胞を含む様々な種類の細胞増殖を刺激し、神経の分化、生存、再生を誘導すると共に、四肢の発生、血管新生、組織修復等に関与するタンパク質因子である（Reuss B. et al., 2003, Cell Tissue Res., 313: 139-157; Ribatti D. et al., 2007, Cytokine Growth Factor Rev., 18(3-4): 327-34）。本発明のFGF2の由来は、特に限定はしない。好ましくは脊椎動物由来、より好ましくは哺乳動物由来である。前述のNT-3と同様に、例えば、本発明の培地補助剤を用いた調製培地で培養する細胞とは異なる生物種由来であるが、同じ哺乳動物のFGF2オルソログを用いることができる。
【００２２】
本発明の培地補助剤は、NT-3、カリウム等及びFGF2を二以上の組合せで包含することができる。具体的には、NT-3とカリウム等の組合せ、NT-3とFGF2の組合せ、カリウム等とFGF2の組合せ、並びにNT-3、カリウム等及びFGF2の組合せが挙げられる。
【００２３】
前記有効成分を二以上の組合せで包含する場合、各有効成分の含有比率は、本発明の培地補助剤を後述するインビボ様シナプス形成増強神経細胞モデル調製培地に添加したときに、それぞれの有効成分が有効量となる含有比率であれば、特に限定はしない。本明細書において「有効量」とは、NT-3、カリウム等及びFGF2が有効成分としての機能を発揮する上で必要な量であって、かつ培養細胞に対する細胞毒性がほとんど又は全くない量をいう。例えば、後述するように、本発明の培地補助剤を細胞培養用培地に添加したときに、終濃度で、NT-3、カリウム等、及びFGFがそれぞれ1〜500ng/mL、1〜50mM、及び1〜100ng/mLの範囲となる比率で含有することが好ましい。
【００２４】
本発明の培地補助剤は、前記有効成分を抑制又は失活させない範囲において他の成分を含むことができる。ここでいう他の成分は、他の有効成分を含む。本明細書において「他の有効成分」とは、前記有効成分とは異なる効果を付与する成分をいう。具体的には、例えばBDNFやNGFを含む。
【００２５】
本発明の培地補助剤の剤形は、前記有効成分を抑制又は失活せず又はしにくく、かつ保存や細胞培養用培地への添加が容易な形態であれば特に限定しない。一般的な剤形としては、液体又は固体（粉末、顆粒を含む）が挙げられる。前記有効成分のうちNT-3及びFGF2は、タンパク質であることから、熱やプロテアーゼ等の分解酵素による影響を受け難い剤形であることが好ましい。例えば、液体であれば、プロテアーゼインヒビター等を含んでいてもよい。
【００２６】
１−３．効果
本発明の培地補助剤によれば、細胞培養用培地に添加することで、その細胞培養用培地にインビボ様シナプス形成増強神経細胞モデル製造能を付与することができる。
【００２７】
２．インビボ様シナプス形成増強神経細胞モデル製造培地
２−１．概要
本発明の第２の態様は、インビボ様シナプス形成増強神経細胞モデル製造培地である。本発明の調製培地は、前記第１態様の培地補助剤を添加した細胞培養用培地であって、培養した細胞をインビボ様シナプス形成増強神経細胞モデルにすることができる。
【００２８】
２−２．構成
本発明の調製培地は、細胞培養用培地に前記第１態様に記載の培地補助剤を添加したものである。
【００２９】
本明細書において「細胞培養用培地」とは、細胞培養において一般的に用いられる当該分野で公知の培地をいう。標準細胞培養用培地又は特殊細胞培養用培地のいずれを用いてもよい。ここでいう「標準細胞培養用培地」とは、主として哺乳動物由来の様々な種類の細胞の培養に用いられる汎用性の高い基本培地をいう。具体的には、例えば、イーグルMEM（Eagle Minimum Essential Medium）、DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）、ハムF10（Ham's Nutrient Mixture F10）培地、ハムF12（Ham's Nutrient Mixture F12）培地、M199培地、高性能改良199培地（Hight Performance Medium 199）、RPMI-1640（Roswell Park Memorial Institute-1640）培地、DMEM/F12（Dulbecco's Modified Eagle Medium/ Ham's Nutrient Mixture F12）培地及び神経基本培地が挙げられる。DMEM/F12培地の場合、その混合比率は、特に制限しない。好ましくは、構成成分の重量濃度比でDMEMとF12を6：4〜4：6の範囲で混合すればよい。前記標準細胞培養用培地の具体的な組成については、当該分野で公知であり、適当な文献（例えば、Kaech S. and Banker G., 2006, Nat. Protoc., 1(5): 2406-15）に記載の組成に基づいて調製するか、又は各メーカー（Life technologies, Thermo scientific, Wako Pure Chemical Industries等）の市販品を用いればよい。また、ここでいう「特殊細胞培養用培地」とは、標準細胞培養用培地に各種補助剤を添加することによって、神経細胞の培養に最適となるように調製された培地、又は神経細胞に分化誘導できるように調製された培地をいう。例えば、各メーカーで市販されている神経細胞培養用培地が挙げられる。具体的には、例えば、DMEM/F12（5：5）に、インシュリンとトランスフェリンを添加した培地を基本培地として、栄養培地で培養した初代アストログリア細胞の培養上清と血清アルブミンを加えて調製された住友ベークライト（Sumitomo bakelite）の神経細胞培養用培地にさらにNGF2.5S及びBDNFを補助剤として加えた「M培地」が挙げられる。
【００３０】
前記細胞培養用培地に添加される前記第１態様に記載の培地補助剤の含有量は、特に限定はしないが、好ましくは培地補助剤に含まれるNT-3、カリウム等及びFGF2が終濃度で、それぞれ1〜500ng/mL、1〜50mM、及び1〜100ng/mLとなる範囲である。より好ましくはNT-3が10〜200ng/mL、カリウム等が10〜30mM、及びFGF2が3〜8ng/mLとなる範囲である。さらに好ましくは、NT-3が50ng/mL、カリウム等が25mM、及びFGF2が5ng/mLである。
【００３１】
本発明の調製培地は、必要に応じて血清を含んでいてもよい。血清は、いずれの生物種由来であってもよいが、好ましくは鳥類又は哺乳類由来である。例えば、ウシ胎児血清（FBS: Fetal Bovine Serum）が好適である。血清の好ましい濃度は、終濃度で1〜20％、好ましくは5〜15％、より好ましくは8〜12％、一層好ましくは10％である。また、本発明の調製培地は、必要に応じてグリア細胞（アストログリア細胞を含む）の培養上清や血清アルブミンを含んでいてもよい。
【００３２】
２−３．効果
本発明の調製培地を用いることで、培養した細胞に以下の性質を付与することができる。
（１）インビボと同様の構造的形態
インビボ条件で通常観察される形態と同様の形態を再現できる。
（２）シナプス形成数の増加
細胞培養用培地で培養した神経細胞よりも10倍以上のシナプスを形成させることができる。
（３）神経伝達物質放出量の増加及びインビボと同様のシナプス前細胞の機能性
細胞培養用培地で培養した神経細胞よりもシナプスからの神経伝達物質の放出量を増強できる。また、シナプスからの放出強度及び動力学は、インビボで観察されるそれに、より近い状態で再現することができる。
【００３３】
したがって、本発明の調製培地によれば、細胞培養系で、従来の細胞培養用培地では困難であった発生学的、生理学的、及び形態学的にインビボの性質に、より近い状態が再現された神経細胞を培養することができる。
【００３４】
３．インビボ様シナプス形成増強神経細胞モデル製造方法
３−１．概要
本発明の第３の態様は、インビボ様シナプス形成増強神経細胞モデルの製造方法である。本発明のインビボ様シナプス形成増強神経細胞モデル製造方法によれば、前記第２態様の調製培地を用いて細胞培養を行うことにより、従来の細胞培養培地を用いた方法では困難であった、インビボで観察される神経細胞の発生学的、生理学的、及び形態学的な性質が再現されたインビボ様シナプス形成増強神経細胞モデルを容易に製造することができる。
【００３５】
３−２．構成
本発明のインビボ様シナプス形成増強神経細胞モデル製造方法は、培養工程を必須工程として含む。以下、培養工程について具体的に説明をする。
【００３６】
＜培養工程＞
「培養工程」とは、前記第２態様に記載のインビボ様シナプス形成増強神経細胞モデル調製培地を用いて、細胞をインビトロで培養する工程である。
【００３７】
本工程で使用する細胞の種類は、神経細胞への分化能を有するあらゆる細胞が含まれる。例えば、ラット副腎髄質由来のPC-12細胞のように、神経細胞由来ではない細胞も包含される。好ましくは神経細胞（脳神経細胞、末梢神経細胞を含む）、神経前駆細胞及び神経幹細胞である。複数種の細胞の混合物であってもよい。また、シナプス形成や細胞形態の研究を行う上では、大型のシナプスを形成する細胞が好ましい。例えば、腹側蝸牛神経核（VCN: Ventral Cochlear Nucleus）細胞と内側台形体核（MNTB：Medial Nucleus of the Trapezoid Body）細胞は、それらの細胞間でcalyx of Heldと呼ばれる巨大シナプスを形成することから好適である。
【００３８】
また、本発明の製造方法で使用する細胞は、正常細胞由来又は変異細胞由来のいずれであってもよい。例えば、癌細胞における挙動を研究するために、中枢神経癌由来の細胞を用いてもよい。インビボ様シナプス形成増強神経細胞モデルにしたい変異細胞を目的に応じて適宜選択すればよい。
【００３９】
さらに、本工程で使用する細胞は、いずれの培養細胞も含まれる。例えば、初代培養細胞及び株化細胞が挙げられる。初代培養細胞の例としては、大脳半球、大脳皮質、海馬又は線条体のような脳神経組織から分離した細胞が挙げられる。株化細胞の例として、具体的には、中枢神経系腫瘍や神経芽種から確立した細胞が挙げられる。
【００４０】
本工程で使用する培地は、前記第２態様に記載のいずれかの調製培地である。調製培地は、培養期間中、同一組成のものを用いてもよいし、培地交換ごとに異なる組成のものを用いてもよい。例えば、最初の培養では、培地補助剤の有効成分としてFGF2とカリウム等を含む調製培地を使用し、次の培地交換では同じ細胞培養用培地に有効成分としてFGF2、カリウム等及びNT-3を含む培地補助剤を添加してなる調製培地を使用することができる。
【００４１】
本工程で細胞をインビトロで培養する方法は、基本的には、培養する細胞の種類及び由来に応じて当該分野で公知の神経細胞培養方法と同じ方法で行えばよい。通常は、細胞を細胞培養用培地に播種した後、5％CO2下、37℃で培養する。より具体的には、例えば、海馬神経細胞についてはKaech S. and Banker G., 2006, Nat. Protoc. 1(5): 2406-15に、また皮質神経細胞についてはHilgenberg L.G. and Smith M.A., 2007, J. Vis. Exp., 10: 562に記載の培養方法を参照すればよい。なお、調製培地が血清を含まない場合には、必要に応じて終濃度で1〜20％、好ましくは5〜15％、より好ましくは8〜12％、一層好ましくは10％で添加すればよい。また、本発明の調製培地には、必要に応じてグリア細胞培養上清を添加することもできる。
【００４２】
培養期間は、培養する細胞の種類及び由来、及び目的に応じて適宜定めればよい。例えば、初代培養細胞を用いて発生学的に再現されたインビボ様シナプス形成増強神経細胞モデルを製造する場合には、5日〜35日程度培養すればよい。生理学的に再現されたインビボ様シナプス形成増強神経細胞モデルを製造する場合には、5日〜35日程度培養すればよい。また、形態学的に再現されたインビボ様シナプス形成増強神経細胞モデルを製造する場合には、5日〜35日程度培養すればよい。
【００４３】
３−３．効果
本発明のインビボ様シナプス形成増強神経細胞モデル製造方法によれば、インビボでの神経細胞の発生学的、生理学的、及び形態学的な性質が再現された神経細胞をインビトロの細胞培養系で製造することができる。それ故、本製造方法で作製された神経細胞を神経発生学、神経生理学、神経構造学の研究に用いることで、インビボを反映した、より信憑性の高い実験結果を得ることができる他、インビボでは検証し得なかった神経細胞における新たな発見も可能となる。
【実施例】
【００４４】
以下に実施例を挙げて本発明の具体的な態様について説明する。ただし、以下の実施例は、本発明の一具体例に過ぎず、本発明の範囲を何ら制限するものではない。
【００４５】
＜実施例１：インビボ様シナプス形成増強神経細胞モデルにおけるシナプス形成増強能の確認（１）＞
（目的）
本発明の調製培地を用いたインビボ様シナプス形成増強神経細胞モデルの製造方法によりシナプス形成数の増加したインビボ様シナプス形成増強神経細胞モデルを製造できることを確認する。
【００４６】
（方法）
（１）神経細胞の調製と培養
解剖前に35mm培養ディッシュ（μdish35mm low；Ibidi)表面を100μg/mL ポリDリジン(Millipore)で1時間コートした後、超純水(Millipore)で3回洗浄した。洗浄後、前記ディッシュを解剖期間中（約2〜3時間）蓋を開けた状態でクリーンベンチ内に放置し、乾燥させた。
【００４７】
本明細書における実験は、全て日本生理学会（Physiological Society of Japan）及び沖縄科学技術大学院大学（Okinawa Institute of Science and Technology Graduate University）のガイドラインに従って行った。動物実験管理規定（animal experiment regulations）は、沖縄科学技術大学院大学の規定に基づく。
【００４８】
胎生18日目（E18）〜生後1日目（P1）のマウス（B6系又はICR系）の頭部を切除し、脳を摘出した。脳をひっくり返して、解剖顕微鏡下で硬膜層をはぎ取った後、まず、腹側蝸牛神経核（VCN）細胞を摘出するため、蝸牛神経核領域を、顕微解剖具(Feather, Japan)を用いて解剖した。蝸牛神経核領域は、顕微鏡下で脳幹から突き出るような状態で、はっきりと確認できる。摘出したVCN領域は、3mLのハンクス平衡塩（HBSS：Hank’s Balanced Salt Solution）(Life technologies)を含む第１の15ｍLチューブに入れた。続いて、内側台形体核（MNTB：Medial Nucleus of the Trapezoid Body）の主ニューロン（principal neuron）を摘出するため、MNTB領域を両側の中心線から約1mmの外側上オリーブ核（LSO:Lateral Superior Olive）の位置で2か所側方切開をして解剖した。その後、前記2箇所の側方切開に接続するために橋核（Pontine nuclei）から約2mmの横切開を行った。得られた組織片を、顕微解剖具(Feather, Japan)を用いて約2mmの深さで掬い取り、3mLのHBSSを含む第２の15ｍLチューブに入れた。
【００４９】
摘出された前記VCN領域及びMNTB領域をそれぞれ含む組織を神経細胞分散液（Nerve Cell Dissociation Medium ）(Sumitomo Bakelite)を用いて添付の説明書に従って分散させた。続いて、前記VCN細胞及びMNTB細胞をカウントし、それぞれを等細胞数で混合した細胞混合物を総数120,000細胞／ディッシュとなるように前記ポリDリジンでコートしたディッシュに播種し、アストログリア細胞の培養上清等を含む前記神経細胞培養用培地（Sumitomo Bakelite）に100ng/mLのNGF2.5S (Life technologies)及び25ng/mLのヒトBDNF (R&D Systems)を添加したM培地と、当該M培地に終濃度5ng/mLのヒトFGF2 (Peprotech)及び終濃度20mMのKCl(Nacalai Tesque)からなる本発明の培地補助剤をさらに添加した本発明の調製培地のそれぞれを用いて、5％CO2下37℃にて最大35日間培養した。培養4日目（DIV4）に、培養液の半分を、終濃度5ng/mLのヒトFGF2 (Peprotech)、終濃度20mMのKCl(Nacalai Tesque)及び終濃度50ng/mLのヒトNT-3(Peprotech)からなる本発明の培地補助剤をM培地に添加した本発明の調製培地で交換した。培養8日目（DIV8）には、培養液の半分を、DIV４で用いた交換培地にさらにアラビノースオペロンの調節タンパク質であるAraCを終濃度20μMで含む本発明の調製培地で交換した。培養12日目（DIV12）には、培養液の半分をDIV4で用いた交換培地と同じ組成の本発明の調製培地で交換した。
【００５０】
（２）神経細胞の観察
細胞を2μMのFM 染料(dye)で1分間染色した後、90mMのKClで2分間刺激し、2μMのFM 染料を含む低KCl（6mM）中で5分間回復させた。観察10分前に細胞を生理食塩水で洗浄した。全溶液中に10μMのCNQX及び50μMのAPVが含まれている。細胞は、共焦点顕微鏡（LSM710, Zeiss）を用いて観察し、シナプス形成数をカウントした。
【００５１】
（結果）
結果を図１−１〜図１−２に示す。図１−１より、calyx（萼）形状を有し、巨大シナプス構造（およそ20μm）を形成するcalyx of Heldを視覚的に同定し、また顕微鏡で直接観察することでカウントできることがわかった。図１−２より、M培地で培養したときのcalyx of Heldにおけるシナプス形成数（平均2.4）と比較して本発明の調製培地（ここではM+培地）で培養したときのcalyx of Heldにおけるシナプス形成数は、平均30.3で10倍以上増加した。したがって、本発明のNT-3、カリウム等及びFGF2を含む培地補助剤を添加した調製培地は、神経細胞のシナプス形成増強能を有することが立証された。
【００５２】
＜実施例２：インビボ様シナプス形成増強神経細胞モデルにおけるシナプス形成増強能の確認（２）＞
（目的）
NT-3、カリウム塩（KCL）及びFGF2の個々の有効成分を含む本発明の培地補助剤を添加してなる調製培地を用いた場合であってもインビボ様シナプス形成増強神経細胞モデルの製造方法により、シナプス形成数の増加したインビボ様シナプス形成増強神経細胞モデルを製造できることを確認する。
【００５３】
（方法）
（１）神経細胞の調製と培養
基本的方法は、前記実施例１に記載の方法に準じて行った。ただし、本実施例では、M培地、5ng/mLのヒトFGF2 (Peprotech)のみからなる本発明の培地補助剤を添加した本発明の調製培地（M+FGF2培地）、M培地に終濃度25mMのKCl(Nacalai Tesque)のみからなる本発明の培地補助剤を添加した本発明の調製培地（M+KCl培地）、M培地に終濃度50ng/mLのヒトNT-3(Peprotech)のみからなる本発明の培地補助剤を添加した本発明の調製培地（M+NT-3培地）、及び終濃度5ng/mLのヒトFGF2 (Peprotech)、終濃度20mMのKCl(Nacalai Tesque)及び終濃度50ng/mLのヒトNT-3(Peprotech)の全てを含む本発明の培地補助剤を添加した本発明の調製培地（M+培地）のそれぞれの培地を用いて、5％CO2下37℃にて最大35日間培養した。培養期間中、培地交換は、半分量を4日目、8日目、及び12日目に行い、交換培地にはその培養液に用いられた培地と同種の調製培地を用いた。
【００５４】
（２）神経細胞の観察と定量
前記実施例１と同様に、培養後の細胞を2μMのFM 染料(dye)で1分間染色した後、90mMのKClで2分間刺激し、2μMのFM 染料を含む低KCl（6mM）中で5分間回復させた。観察10分前に細胞を生理食塩水で洗浄した。全溶液中に10μＭのCNQX及び50μMのAPVが含まれている。細胞は、共焦点顕微鏡（LSM710, Zeiss）を用いて観察した。シナプス形成数をカウントし、その結果に基づいて各種培地補助剤を用いた時のインビボ様シナプス形成増強神経細胞モデル製造方法におけるシナプス形成数を定量化した。
【００５５】
（結果）
図２に結果を示す。この図で示すように、M+培地のみならず、M+FGF2培地、M+NT-3培地及びM+KCl培地のいずれを用いた場合にもM培地で培養したときと比較して、シナプス形成数は、有意に高いことが立証された。したがって、本発明の培地補助剤の有効成分であるNT-3、KCl及びFGF2は、それぞれ単独で神経細胞のシナプス形成増強能を本発明の調製培地に付与できることが立証された。
【００５６】
＜実施例３：インビボ様シナプス形成増強神経細胞モデルにおける神経細胞の発生学的及び形態学的再現性の確認＞
（目的）
本発明のインビボ様シナプス形成増強神経細胞モデル製造方法で調製されたインビボ様シナプス形成増強神経細胞モデルが、インビボにおけるその神経細胞本来の形態を再現していることを確認する。
【００５７】
（方法）
VCN及びMNTBの両領域に由来する解剖組織を、神経細胞分散液セット(Sumitomo Bakelite)を用いてプロトコルに従い、別々に分離した。続いて、分離した神経細胞をカウントし、VCN及びMNTB神経細胞の等混合液を1ディッシュあたり120000細胞の総密度でポリDリジンで被覆したプレートに播種した。M培地及びプレコンディション培地を用いて5% CO2下、37℃で最大35日間培養した。M培地は、星状細胞培養上清等を含む神経培養培地（Sumitomo Bakelite)に100 ng/mL NGF 2.5S (Life technologies)及び25 ng/mL human BDNF (R&D Systems)を加えることによって得た。また、本発明のプレコンディション培地は、human FGF2 (Peprotech)を最終濃度5 ng/mLで、及びKCl (Nacalai Tesque)を最終濃度20 mMで含む本発明の培地補助剤をM培地にさらに加えることによって得た。4日目に、培地の半分を、human FGF2 (Peprotech)を最終濃度5 ng/mLで、KCl (Nacalai Tesque)を最終濃度20 mMで、及びhuman NT-3 (Peprotech)を最終濃度50 ng/mLで含む本発明の培地補助剤をM培地に添加することによって調製した本発明のプレコンディション培地で置き換えた。8日目に培地の半分を、アラビノースオペロン調節タンパク質であるAraCを最終濃度20μMで、4日目の培地交換に用いた培地にさらに加えることによって調製した本発明のプレコンディション培地で置き換えた。12日目に、培地の半分を4日目の培地交換に用いた培地と同じ成分を持つ本発明のプレコンディション培地で置き換えた。その後、細胞を4％ PFAを含むPBSで室温にて10分間固定し、0.2％サポニンで室温にて30分間透過処理した。細胞を3% BSAを含むPBSで30分間ブロッキングして、その後一次抗体(抗VGLUT1抗体：Millipore、抗synaptophysin抗体：Zymed)と共にインキュベートした。さらに、二次抗体に相当するAlexa 488又はAlexa 568（Life technologies）と共にインキュベートした。細胞は、DAPIを含んだProlong Gold（Life technologies）でマウントした。画像は、Zen software (Zeiss)を用いて取得し、3D再構成にはEmaris（Bitplane）を用いた。
【００５８】
（結果）
結果を図３に示す。B及びCの結果より、本発明の製造方法で調製されたインビボ様シナプス形成増強神経細胞モデルとしてのcalyx of Held様シナプスの形態は、インビボで観察される本来のcalyx of Heldのそれと近似で再現されていた。したがって、本発明の調製培地を用いて調製されたインビボ様シナプス形成増強神経細胞モデルは、神経細胞のインビボにおける形態を再現できることが立証された。
【００５９】
＜実施例４：神経伝達物質の放出量増加とシナプス前細胞の機能性＞
（目的）
本発明のインビボ様シナプス形成増強神経細胞モデルが、神経伝達物質の放出量を増強する神経伝達物質増強能を有することFM dyeを用いて確認する。
【００６０】
（方法）
VCN及びMNTBの両領域に由来する解剖組織を、神経細胞分散液セット(Sumitomo Bakelite)を用いてプロトコルに従い、別々に分離した。続いて、分離した神経細胞をカウントし、VCN及びMNTB神経細胞の等混合液を1ディッシュあたり120000細胞の総密度でポリDリジンで被覆したプレートに播種した。M培地及びプレコンディション培地を用いて5% CO2下、37℃で培養した。M培地は、星状細胞培養上清等を含む神経培養培地（Sumitomo Bakelite)に100 ng/mL NGF 2.5S (Life technologies)及び25 ng/mL human BDNF (R&D Systems)を加えることによって得た。また、本発明のプレコンディション培地は、human FGF2 (Peprotech)を最終濃度5 ng/mLで、及びKCl (Nacalai Tesque)を最終濃度20 mMで含む本発明の培地補助剤をM培地にさらに加えることによって得た。4日目に、培地の半分を、human FGF2 (Peprotech)を最終濃度5 ng/mLで、KCl (Nacalai Tesque)を最終濃度20 mMで、及びhuman NT-3 (Peprotech)を最終濃度50 ng/mLで含む本発明の培地補助剤をM培地に添加することによって調製した本発明のプレコンディション培地で置き換えた。8日目に培地の半分を、アラビノースオペロン調節タンパク質であるAraCを最終濃度20μMで、4日目の培地交換に用いた培地にさらに加えることによって調製した本発明の前馴化培地で置き換えた。12日目に、培地の半分を4日目の培地交換に用いた培地と同じ成分を持つ本発明のプレコンディション培地で置き換えた。その後、細胞を4％ PFAを含むPBSで室温にて10分間固定し、0.2％サポニンで室温にて30分間透過処理した。細胞を3% BSAを含むPBSで30分間ブロッキングして、その後一次抗体(抗VGLUT1抗体：Millipore、抗synaptophysin抗体：Zymed)と共にインキュベートした。さらに、二次抗体に相当するAlexa 488又はAlexa 568（Life technologies）と共にインキュベートした。細胞は、DAPIを含んだProlong Gold（Life technologies）でマウントした。画像は、Zen software (Zeiss)を用いて取得し、3D再構成にはEmaris（Bitplane）を用いた。培養した細胞は、2μMのFM 染料(dye)で1分間染色した後、90mMのKClで2分間刺激し、2μMのFM 染料を含む低KCl（6mM）中で5分間回復させた。観察10分前に細胞を生理食塩水で洗浄した。全溶液中に10μＭのCNQX及び50μMのAPVが含まれている。細胞は、共焦点顕微鏡（LSM710, Zeiss）を用いて観察し、シナプス形成数をカウントした。経時観察は、共焦点顕微鏡（LSM710, Zeiss）で行い、シナプス小胞の放出は、90mMのKClを2分間さらに添加することによって誘導した。
【００６１】
（結果）
図４−１及び図４−２に結果を示す。これらの図で示すように、本発明のVCN細胞及びMNTB細胞由来のインビボ様シナプス形成増強神経細胞モデルは、細胞培養用培地を用いて同一条件で培養したときのVCN細胞及びMNTB細胞と比較して、刺激後にcalyx of Held様シナプスからFM dyeを約60％多く放出することが明らかとなった。これは、本発明のインビボ様シナプス形成増強神経細胞モデルがシナプスにおける神経伝達物質の放出強度及び動力学においてインビボで観察されるそれ(Figure 3 from Kay A.R. et al., 1999, Neuron, 24(4): 809-17)と近似で再現されていることを示している。したがって、本発明の調製培地を用いて調製されたインビボ様シナプス形成増強神経細胞モデルは、神経細胞のシナプスからの神経伝達物質増強能を有することが立証された。
【００６２】
＜実施例５：インビボ様シナプス形成増強神経細胞モデルにおける神経回路網の増強＞
（目的）
本発明のインビボ様シナプス形成増強神経細胞モデルでは神経回路網が増強されていることを確認する。
【００６３】
（方法）
初代海馬神経細胞は、他で（Kaech S and Banker G, 2006, Nat. Protoc., 1(5): 2406-15）記載されている方法で得た。海馬神経細胞の培養にはTubulin cell tracker（Life technologies）を添付のプロトコルに従って用いた。細胞は、共焦点顕微鏡（LSM710, Zeiss）を用いて観察し、画像を取得した。
【００６４】
（結果）
図５に結果を示す。この図で示すように本発明の調製培地を用いて本発明の製造方法で調製されたインビボ様シナプス形成増強神経細胞モデルは、標準細胞培養用培地で調製された神経細胞と比較して、神経回路網が増強されていることが立証された。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明の培地補助剤及び調製培地は、主として研究所、大学、病院、及び製薬会社等の民間企に所属する研究者を対象に、神経細胞の研究用として市販され得る。特に、製薬会社は、向精神薬の新薬の効果と安全性をテストするために、又は神経変性病のモデルを作るために日常的に神経細胞培養用培地を使用しているので、本発明の培地補助剤及び調製培地は、ハイスループットな薬剤スクリーニングテストを行う上で製薬会社において利用することができる。
【００６６】
また、本発明の培地補助剤及び調製培地は、生物医学工業産業において、異種移植、同種移植及び自家移植予定の生体外神経幹細胞培養物や神経細胞を含む組織、及び神経組織再構築法を改良する上で利用することができる。
【００６７】
さらに、本発明の培地補助剤及び調製培地は、生物学とマイクロエレクトロニクスが融合した生体工学産業やナノテクノロジー産業において、シリコンチップ及び脳コンピュータ・インターフェース装置における神経細胞及びシナプス・ネットワークを改善する上で利用することができる。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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