(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
逆転写酵素を含む反応液と、前記反応液とは比重が異なり、前記反応液とは混和しない液体とが充填され、前記反応液が移動する流路を含む反応容器が挿入される挿入口を有する装着部と、
前記装着部に前記反応容器が装着された場合に、前記流路の第１領域を加熱する第１加熱部と、
前記装着部に前記反応容器が装着された場合に、前記第１領域よりも前記挿入口に近い前記流路の第２領域を加熱する第２加熱部と、
前記装着部、前記第１加熱部及び前記第２加熱部の配置を、第１の配置と、第２の配置との間で切換える駆動機構と、
前記第１加熱部、前記第２加熱部、及び前記駆動機構を制御する制御部と、
を含み、
前記第１の配置は、前記装着部に前記反応容器が装着された場合に、前記第１領域が重力の作用する方向における前記流路の最下部に位置する配置であり、
前記第２の配置は、前記装着部に前記反応容器が装着された場合に、前記第２領域が重力の作用する方向における前記流路の最下部に位置する配置であり、
前記制御部は、
前記装着部、前記第１加熱部及び前記第２加熱部の配置が前記第１の配置になるように前記駆動機構を制御し、前記第１加熱部の温度を、前記逆転写酵素が活性を有する温度に制御し、前記第２加熱部の温度を、前記逆転写酵素が失活しない温度に制御する第１処理と、
前記第１処理の後に、前記装着部、前記第１加熱部及び前記第２加熱部の配置が前記第２の配置になるように前記駆動機構を制御し、前記第２加熱部の温度を、前記逆転写酵素が失活する温度に制御する第２処理と、を行う、熱サイクル装置。
【請求項２】
請求項１に記載の熱サイクル装置において、
前記制御部は、
前記第１処理の後で前記第２処理の前に、前記装着部、前記第１加熱部及び前記第２加熱部の配置が前記第１の配置になるように前記駆動機構を制御し、前記第１加熱部の温度
を、前記逆転写酵素が活性を有する温度に制御し、前記第２加熱部の温度を、前記逆転写酵素が失活する温度に制御する第３処理を行う、熱サイクル装置。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の熱サイクル装置において、
前記制御部は、
前記第２処理において、前記第１加熱部の温度を、ポリメラーゼ連鎖反応におけるアニーリング及び伸長温度に制御する、熱サイクル装置。
【請求項４】
請求項３に記載の熱サイクル装置において、
前記制御部は、
前記第２処理の後に、前記装着部、前記第１加熱部及び前記第２加熱部の配置が前記第１の配置になるように前記駆動機構を制御する、熱サイクル装置。
【請求項５】
請求項３又は４に記載の熱サイクル装置において、
前記逆転写酵素が活性を有する温度は、ポリメラーゼ連鎖反応における熱変性温度である、熱サイクル装置。
【請求項６】
熱サイクル装置の制御方法であって、
前記熱サイクル装置は、
逆転写酵素を含む反応液と、前記反応液よりも比重が小さく、前記反応液とは混和しない液体とが充填され、対向する内壁に前記反応液が近接して移動する流路を含む反応容器が挿入される挿入口を有する装着部と、
前記装着部に前記反応容器が装着された場合に、前記流路の第１領域を加熱する第１加熱部と、
前記装着部に前記反応容器が装着された場合に、前記第１領域よりも前記挿入口に近い前記流路の第２領域を加熱する第２加熱部と、
前記装着部、前記第１加熱部及び前記第２加熱部の配置を、第１の配置と、第２の配置との間で切換える駆動機構と、
を含み、
前記第１の配置は、前記装着部に前記反応容器が装着された場合に、前記第１領域が重力の作用する方向における前記流路の最下部に位置する配置であり、
前記第２の配置は、前記装着部に前記反応容器が装着された場合に、前記第２領域が重力の作用する方向における前記流路の最下部に位置する配置であり、
前記制御方法は、
前記装着部、前記第１加熱部及び前記第２加熱部の配置が前記第１の配置になるように前記駆動機構を制御し、前記第１加熱部の温度を、前記逆転写酵素が活性を有する温度に制御し、前記第２加熱部の温度を、前記逆転写酵素が失活しない温度に制御する第１処理を行うことと、
前記第１処理の後に、前記装着部、前記第１加熱部及び前記第２加熱部の配置が前記第２の配置になるように前記駆動機構を制御し、前記第２加熱部の温度を、前記逆転写酵素が失活する温度に制御する第２処理を行うことと、
を含む、熱サイクル装置の制御方法。
【請求項７】
逆転写酵素を含む反応液と、前記反応液が移動する流路を含む反応容器が挿入可能な挿入口を有する装着部と、
前記装着部に前記反応容器が装着された場合に、前記流路の第１領域を加熱する第１加熱部と、
前記装着部に前記反応容器が装着された場合に、前記第１領域よりも前記挿入口に近い前記流路の第２領域を加熱する第２加熱部と、
前記装着部、前記第１加熱部及び前記第２加熱部の配置を、第１の配置と、第２の配置
との間で切換える駆動機構と、
前記第１加熱部、前記第２加熱部、及び前記駆動機構を制御する制御部と、
を含み、
前記第１の配置は、前記装着部に前記反応容器が装着された場合に、前記第１領域が重力の作用する方向における前記流路の最下部に位置する配置であり、
前記第２の配置は、前記装着部に前記反応容器が装着された場合に、前記第２領域が重力の作用する方向における前記流路の最下部に位置する配置であり、
前記制御部は、
前記装着部、前記第１加熱部及び前記第２加熱部の配置が前記第１の配置になるように前記駆動機構を制御し、前記第１加熱部の温度を、前記逆転写酵素が活性を有する温度に制御し、前記第２加熱部の温度を、前記逆転写酵素が失活しない温度に制御する第１処理と、
前記第１処理の後に、前記装着部、前記第１加熱部及び前記第２加熱部の配置が前記第２の配置になるように前記駆動機構を制御し、前記第２加熱部の温度を、前記逆転写酵素が失活する温度に制御する第２処理と、を行う、熱サイクル装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、熱サイクル装置及び熱サイクル装置の制御方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子の利用技術の発展によって、遺伝子診断や遺伝子治療など遺伝子を利用した医療が注目されている他、農畜産分野においても品種判別や品種改良に遺伝子を用いた手法が多く開発されている。遺伝子を利用するための技術として、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction；ポリメラーゼ連鎖反応）法などの技術が広く普及している。今日では、ＰＣＲ法は生体物質の情報解明において必要不可欠な技術となっている。
【０００３】
ＰＣＲ法は、増幅の対象とする核酸（標的核酸）及び試薬を含む溶液（反応液）に熱サイクルを施すことで、標的核酸を増幅させる手法である。熱サイクルは、２段階以上の温度を周期的に反応液に施す処理である。ＰＣＲ法においては、２段階又は３段階の熱サイクルを施す手法が一般的である。
【０００４】
ＰＣＲ法では一般に、チューブや生体試料反応用チップ（バイオチップ）と称する、生化学反応を行うための容器を使用する。しかしながら従来の手法においては、必要な試薬等の量が多く、また反応に必要な熱サイクルを実現するために装置が複雑化したり、反応に時間がかかったりするという問題があった。そのため微少量の試薬や検体を用いてＰＣＲを精度よく短時間で行うためのバイオチップや反応装置が必要とされていた。
【０００５】
このような問題を解決するために、特許文献１には、反応液と、反応液と混和せず反応液よりも比重の小さい液体とが充填された生体試料反応用チップを、水平方向の回転軸の周りに回転させることで、反応液を移動させて熱サイクルを施す生体試料反応装置が開示されている。
【０００６】
また、ＲＮＡ（ribonucleic acid）を鋳型に逆転写反応を行い、生成されたｃＤＮＡ（complementary deoxyribonucleic acid）に対してＰＣＲを行うＲＴ−ＰＣＲ（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction；逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）法が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００９−１３６２５０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＲＴ−ＰＣＲ法で用いられる逆転写酵素は、通常は耐熱性酵素ではないので、高温に曝されると失活する可能性がある。逆転写酵素が失活して十分な逆転写反応を行えなくなると、その後のＰＣＲも正しく行うことができなくなるので、ＲＴ−ＰＣＲの反応精度が低下する可能性がある。ここで、熱サイクルに要する時間を短縮するためには、熱サイクル装置を予熱しておくことが好ましい。特許文献１には、熱サイクル装置の収容部が、１つのヒーターの側から生体試料反応用チップを挿入するスリットである例が示されている。当該スリットに生体試料反応用チップを装着する際に、温度が高すぎるヒーターがあると、反応液が高温に曝されて逆転写酵素が失活する可能性があった。
【０００９】
本発明は、以上のような問題点に鑑みてなされたものであり、本発明のいくつかの態様によれば、逆転写酵素の失活によってＲＴ−ＰＣＲの反応精度が低下することを抑制でき、かつ、反応に要する時間（反応時間）を短縮できる熱サイクル装置及び熱サイクル装置の制御方法を提供することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（１）本形態に係る熱サイクル装置は、逆転写酵素を含む反応液と、前記反応液よりも比重が小さく、かつ、前記反応液とは混和しない液体とが充填され、対向する内壁に前記反応液が近接して移動する流路を含む反応容器が挿入される挿入口を有する装着部と、前記装着部に前記反応容器が装着された場合に、前記流路の第１領域を加熱する第１加熱部と、前記装着部に前記反応容器が装着された場合に、前記第１領域よりも前記挿入口に近い前記流路の第２領域を加熱する第２加熱部と、前記装着部、前記第１加熱部及び前記第２加熱部の配置を、第１の配置と、第２の配置との間で切換える駆動機構と、前記第１加熱部、前記第２加熱部を制御する制御部と、を含み、前記第１の配置は、前記装着部に前記反応容器が装着された場合に、前記第１領域が重力の作用する方向における前記流路の最下部に位置する配置であり、前記第２の配置は、前記装着部に前記反応容器が装着された場合に、前記第２領域が重力の作用する方向における前記流路の最下部に位置する配置であり、前記制御部は、前記第１加熱部の温度を、前記逆転写酵素が活性を有する温度に制御し、かつ、前記第２加熱部の温度を、前記逆転写酵素が失活しない温度に制御する第１処理を行う。
【００１１】
本形態によれば、装着部、第１加熱部及び第２加熱部の配置を切り換えることで、反応容器が第１の配置に保持された状態と、反応容器が第２の配置に保持された状態とを切り換えることができる。第１の配置は、反応容器を構成する流路の第１領域が、重力の作用する方向における流路の最下部に位置する配置である。第２の配置は、反応容器を構成する流路の第２領域が、重力の作用する方向における流路の最下部に位置する配置である。すなわち、重力の作用によって第１の配置においては反応液を第１領域に、第２の配置においては反応液を第２領域に保持できる。第１領域は第１加熱部によって加熱され、第２領域は第２加熱部によって加熱されるので、第１領域と第２領域とは異なる温度とすることができる。したがって、第１の配置又は第２の配置に反応容器を保持する間、反応液を所定の温度に保持できるので、加熱時間を容易に制御可能な熱サイクル装置を提供できる。また、第１処理では、挿入口から遠い第１領域を加熱する第１加熱部の温度は、逆転写酵素が活性を有する温度である第１温度であり、挿入口に近い第２領域を加熱する第２加熱部の温度は、逆転写酵素が失活しない温度である第２温度であるので、第１処理を行なっている間に反応容器を装着部に装着しても、逆転写酵素が失活するような高温に反応液が曝されることがない。したがって、逆転写酵素の失活を抑制できるので、反応精度を高めた熱サイクル装置を実現できる。また、第１温度が逆転写酵素によって逆転写反応が進行する温度であるので、反応容器を装着した後に加熱を開始する場合と比較して、速やかに逆転写反応を開始できる。したがって、反応容器を装着した後に加熱を開始する場合よりも反応時間を短縮できる。
【００１２】
（２）上述の熱サイクル装置において、前記制御部は、さらに、前記駆動機構を制御し、
前記第１処理の後に、前記装着部、前記第１加熱部及び前記第２加熱部の配置が前記第２の配置になるように前記駆動機構を制御し、かつ、前記第２加熱部の温度を、前記逆転写酵素が失活する温度に制御する第２処理を行なってもよい。
【００１３】
第２処理においては、装着部、第１加熱部及び第２加熱部の配置が第２の配置に制御されるので、反応液が第２領域に保持される。すなわち、反応液は逆転写酵素が失活する温度である第３温度になる。したがって、本形態によれば、反応液を反応容器の第２領域へ移動させることによって逆転写酵素を失活させることができる。したがって、第１加熱部の温度を逆転写酵素が失活する温度に変更する場合と比較して、逆転写反応からポリメラーゼ連鎖反応の熱サイクルに移行する場合に要する時間を短縮することができる。
【００１４】
（３）上述の熱サイクル装置において、前記制御部は、前記第１処理の後で前記第２処理の前に、前記装着部、前記第１加熱部及び前記第２加熱部の配置が前記第１の配置になるように前記駆動機構を制御し、かつ、前記第１加熱部の温度を、前記逆転写酵素が活性を有する温度に制御し、前記第２加熱部の温度を、前記逆転写酵素が失活する温度に制御する第３処理を行なってもよい。
【００１５】
第３処理においては、装着部、第１加熱部及び第２加熱部の配置が第１の配置に制御されるので、反応液が第１領域に保持される。第３処理における第１加熱部の温度は逆転写酵素が活性を有する温度であるので、逆転写反応が進行する。よって、本形態によれば、反応液が第１領域に保持されている時間を使って、第２領域を加熱する第２加熱部の温度を第２温度から第３温度に変更できる。したがって、第２処理において装着部、第１加熱部及び第２加熱部の配置が第２の配置に制御された場合に、速やかに逆転写酵素を失活させることができる。
【００１６】
（４）上述の熱サイクル装置において、前記制御部は、前記第２処理において、前記第１加熱部の温度を、ポリメラーゼ連鎖反応におけるアニーリング及び伸長温度に制御してもよい。
【００１７】
第２処理においては、装着部、第１加熱部及び第２加熱部の配置が第２の配置に制御されるので、反応液が第２領域に保持される。よって、本形態によれば、反応液が第２領域に保持されている時間を使って、第１領域を加熱する第１加熱部の温度を第１温度から第４温度に変更できる。したがって、第２処理の後に第１加熱部の温度をアニーリング及び伸長温度に制御する場合と比較して、逆転写反応からポリメラーゼ連鎖反応の熱サイクルに移行する場合に要する時間を短縮できる。
【００１８】
（５）上述の熱サイクル装置において、前記制御部は、前記第２処理の後に、前記装着部、前記第１加熱部及び前記第２加熱部の配置が前記第１の配置になるように前記駆動機構を制御してもよい。
【００１９】
本形態によれば、第２処理の後に、装着部、第１加熱部及び第２加熱部の配置を第１の配置に制御するので、第１の配置に切換えてから第１加熱部の温度をアニーリング及び伸長温度に制御する場合と比較して、反応液がアニーリング及び伸長温度に保持される時間を精度よく制御できる。
【００２０】
（６）上述の熱サイクル装置において、前記逆転写酵素が活性を有する温度は、ポリメラーゼ連鎖反応における熱変性温度であってもよい。
【００２１】
本形態によれば、装着部、第１加熱部及び第２加熱部の配置を第２の配置に制御した場合に、逆転写酵素が失活する温度でありかつポリメラーゼ連鎖反応におけるＤＮＡの熱変性温度に制御された第２領域に反応液が保持される。これによって、逆転写酵素の失活と、ポリメラーゼ連鎖反応における熱変性とを同一の工程で行うことができる。したがって、逆転写酵素の失活と熱変性の温度とが異なる場合と比較して、逆転写反応からポリメラーゼ連鎖反応の熱サイクルに移行する場合に要する時間を短縮できる。
【００２２】
（７）本形態に係る熱サイクル装置の制御方法は、熱サイクル装置の制御方法であって、前記熱サイクル装置は、逆転写酵素を含む反応液と、前記反応液よりも比重が小さく、かつ、前記反応液とは混和しない液体とが充填され、対向する内壁に前記反応液が近接して移動する流路を含む反応容器が挿入される挿入口を有する装着部と、前記装着部に前記反応容器が装着された場合に、前記流路の第１領域を加熱する第１加熱部と、前記装着部に前記反応容器が装着された場合に、前記第１領域よりも前記挿入口に近い前記流路の第２領域を加熱する第２加熱部と、前記装着部、前記第１加熱部及び前記第２加熱部の配置を、第１の配置と、第２の配置との間で切換える駆動機構と、を含み、前記第１の配置は、前記装着部に前記反応容器が装着された場合に、前記第１領域が重力の作用する方向における前記流路の最下部に位置する配置であり、前記第２の配置は、前記装着部に前記反応容器が装着された場合に、前記第２領域が重力の作用する方向における前記流路の最下部に位置する配置であり、前記制御方法は、前記第１加熱部の温度を、前記逆転写酵素が活性を有する温度に制御することと、前記第２加熱部の温度を、前記逆転写酵素が失活しない温度に制御することと、を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】実施形態に係る熱サイクル装置１の斜視図。
【図２】実施形態に係る熱サイクル装置１の本体１０の分解斜視図。
【図３】図１のＡ−Ａ線における垂直断面図。
【図４】実施形態に係る熱サイクル装置１に装着される反応容器１００の構成を表す断面図。
【図５】実施形態に係る熱サイクル装置１の機能ブロック図。
【図６】図６（Ａ）は、第１の配置における、図１（Ａ）のＡ−Ａ線を通り回転軸Ｒに垂直な面における断面を模式的に示す断面図、図６（Ｂ）は、第２の配置における図１（Ａ）のＡ−Ａ線を通り回転軸Ｒに垂直な面における断面を模式的に示す断面図。
【図７】実施形態に係る熱サイクル装置１の制御方法の一例を説明するためのフローチャート。
【図８】図７に示される制御方法における第１加熱部２１の温度Ｔ１及び第２加熱部２２の温度Ｔ２の時間変化を示すグラフ。
【図９】熱サイクル処理の一例を説明するためのフローチャート。
【図１０】実施例における反応液１４０の組成を示す表。
【図１１】図１０におけるフォワードプライマー（F primer）、リバースプライマー（R primer）、プローブ（Probe）の塩基配列を示す表。
【図１２】熱サイクル処理のサイクル数と測定される輝度との関係を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明の好適な実施形態について図面を用いて詳細に説明する。なお、以下に説明する実施形態は、特許請求の範囲に記載された本発明の内容を不当に限定するものではない。また以下で説明される構成の全てが本発明の必須構成要件であるとは限らない。
【００２５】
１．本実施形態に係る熱サイクル装置の全体構成
図１は、本実施形態に係る熱サイクル装置１の斜視図である。図２は、本実施形態に係る熱サイクル装置１の本体１０の分解斜視図である。図３は、図１のＡ−Ａ線における垂直断面図である。図３において、矢印ｇは重力の作用する方向を表す。
【００２６】
本実施形態に係る熱サイクル装置１は、逆転写酵素を含む反応液１４０と、反応液１４０よりも比重が小さく、かつ、反応液１４０とは混和しない液体１３０とが充填され、対向する内壁に前記反応液が近接して移動する流路１１０を含む反応容器１００（詳細は「２．本実施形態に係る熱サイクル装置に装着される反応容器の構成」の項で後述される）が挿入される挿入口１５１を有する装着部１５と、装着部１５に反応容器１００が装着された場合に、流路１１０の第１領域１１１を加熱する第１加熱部２１と、装着部１５に反応容器１００が装着された場合に、第１領域１１１よりも挿入口１５１に近い流路１１０の第２領域１１２を加熱する第２加熱部２２と、装着部１５、第１加熱部２１及び第２加熱部２２の配置を、第１の配置と、第２の配置との間で切換える駆動機構３０と、第１加熱部２１及び第２加熱部２２を制御する制御部４０と、を含む。第１の配置は、装着部１５に反応容器１００が装着された場合に、第１領域１１１が重力の作用する方向における流路１１０の最下部に位置する配置であり、第２の配置は、装着部１５に反応容器１００が装着された場合に、第２領域１１２が重力の作用する方向における流路１１０の最下部に位置する配置である。
【００２７】
図１に示される例では、熱サイクル装置１は、本体１０と駆動機構３０とを含んで構成されている。図２に示されるように、本体１０は、装着部１５、第１加熱部２１及び第２加熱部２２を含んで構成されている。
【００２８】
装着部１５は、反応容器１００を装着する構造である。図１及び図２に示される例では、熱サイクル装置１の装着部１５は、挿入口１５１を有し、挿入口１５１から反応容器１００を差し込んで装着するスロット構造である。図２に示される例では、装着部１５は、第１加熱部２１の第１ヒートブロック２１ｂ及び第２加熱部２２の第２ヒートブロック２２ｂを貫通する穴に反応容器１００を差し込む構造となっている。第１ヒートブロック２１ｂ及び第２ヒートブロック２２ｂについては後述する。本体１０に設けられる装着部１５の数は複数であってもよく、図１及び図２に示される例では、１０個の装着部１５が本体１０に設けられている。また、図２及び図３に示される例では、装着部１５が第１加熱部２１及び第２加熱部２２の一部として構成されているが、駆動機構３０を動作させた場合に両者の位置関係が変化しない限り、装着部１５と第１加熱部２１及び第２加熱部２２とは別の部材として構成されていてもよい。
【００２９】
第１加熱部２１は、装着部１５に反応容器１００を装着した場合に、反応容器１００の流路１１０の第１領域１１１を加熱する。図３に示される例では、第１加熱部２１は、本体１０において、反応容器１００の第１領域１１１を加熱する位置に配置されている。
【００３０】
第１加熱部２１は、熱を発生させる機構と、発生した熱を反応容器１００に伝える部材とを含んでもよい。図２に示される例では、第１加熱部２１は、熱を発生させる機構としての第１ヒーター２１ａと、発生した熱を反応容器１００に伝える部材としての第１ヒートブロック２１ｂを含んで構成されている。
【００３１】
熱サイクル装置１においては、第１ヒーター２１ａはカートリッジヒーターであり、導線１９によって図示しない外部電源に接続される。第１ヒーター２１ａとしてはこれに限らず、カーボンヒーター、シートヒーター、ＩＨヒーター（電磁誘導加熱器）、ペルチェ素子、加熱液体、加熱気体などを使用できる。第１ヒーター２１ａは第１ヒートブロック２１ｂに挿入されており、第１ヒーター２１ａが発熱することで第１ヒートブロック２１ｂが加熱される。第１ヒートブロック２１ｂは、第１ヒーター２１ａから発生した熱を反応容器１００に伝える部材である。熱サイクル装置１においては、第１ヒートブロック２１ｂは、アルミニウム製のブロックである。カートリッジヒーターは温度制御が容易であるので、第１ヒーター２１ａをカートリッジヒーターとすることで、第１加熱部２１の温度を容易に安定させることができる。したがって、より正確な熱サイクルを実現できる。
【００３２】
ヒートブロックの材質は熱伝導率、保温性、加工しやすさ等の条件を考慮して適宜選択できる。例えば、アルミニウムは熱伝導率が高いので、第１ヒートブロック２１ｂをアルミニウム製とすることで、反応容器１００を効率よく加熱できる。また、ヒートブロックに加熱ムラが生じにくいので、精度の高い熱サイクルを実現できる。また、加工が容易なので第１ヒートブロック２１ｂを精度よく成型でき、加熱の精度を高めることができる。したがって、より正確な熱サイクルを実現できる。なお、ヒートブロックの材質は、例えば銅合金を使用してもよく、複数の材質を組み合わせてもよい。
【００３３】
第１加熱部２１は、装着部１５に反応容器１００を装着した場合に、反応容器１００に接触していることが好ましい。これによって、第１加熱部２１によって反応容器１００を加熱した場合に、第１加熱部２１と反応容器１００とが接触しない構成よりも第１加熱部２１の熱を反応容器１００に安定して伝えることができるので、反応容器１００の温度を安定させることができる。本実施形態のように、装着部１５が第１加熱部２１の一部として形成されている場合には、装着部１５が反応容器１００と接触することが好ましい。これによって、第１加熱部２１の熱を反応容器１００に安定して伝えることができるので反応容器１００を効率よく加熱できる。
【００３４】
第２加熱部２２は、装着部１５に反応容器１００を装着した場合に、第１領域１１１よりも挿入口１５１に近い反応容器１００の流路１１０の第２領域１１２を、第１の温度とは異なる第２の温度に加熱する。図３に示される例では、第２加熱部２２は、本体１０において、反応容器１００の第２領域１１２を加熱する位置に配置されている。第２加熱部２２は、第２ヒーター２２ａ及び第２ヒートブロック２２ｂを含む。本実施形態における第２加熱部２２の構成は、加熱される反応容器１００の領域及び加熱する温度が第１加熱部２１と異なる以外は、第１加熱部２１と同様である。なお、第１加熱部２１と第２加熱部２２とで異なる加熱機構を採用してもよい。また、第１ヒートブロック２１ｂと第２ヒートブロック２２ｂとが異なる材質であってもよい。
【００３５】
第１加熱部２１及び第２加熱部２２は、装着部１５に反応容器１００を装着した場合に、流路１１０に対して、反応液１４０が移動する方向に温度勾配を形成する温度勾配形成部として機能する。ここで、「温度勾配を形成する」とは、所定の方向に沿って温度が変化する状態を形成することを意味する。したがって、「反応液１４０が移動する方向に温度勾配を形成する」とは、反応液１４０が移動する方向に沿って温度が変化する状態を形成することを意味する。「所定の方向に沿って温度が変化する状態」は、例えば、所定の方向に沿って温度が単調に高く又は低くなっていてもよいし、所定の方向に沿って、温度が高くなる変化から低くなる変化へ、又は、低くなる変化から高くなる変化へ、途中で変化していてもよい。熱サイクル装置１の本体１０においては、第１加熱部２１が装着部１５の挿入口１５１から相対的に遠い側、第２加熱部２２が装着部１５の挿入口１５１から相対的に近い側に配置されている。
【００３６】
また、第１加熱部２１と第２加熱部２２とは、互いに離間して本体１０に設けられている。これによって、互いに異なる温度に制御された第１加熱部２１と第２加熱部２２とが互いに影響を及ぼしにくくなるので、第１加熱部２１及び第２加熱部２２の温度が安定しやすくなる。第１加熱部２１と第２加熱部２２との間にスペーサーを設けてもよい。熱サイクル装置１の本体１０においては、第１加熱部２１及び第２加熱部２２は、その周囲を固定部材１６、フランジ１７及びフランジ１８で固定されている。フランジ１８は軸受３１で支持されている。なお、所望の反応精度が確保できる程度に温度勾配が形成される限り、加熱部の数は２以上の任意の数であってもよい。
【００３７】
第１加熱部２１及び第２加熱部２２の温度は、図示しない温度センサー及び後述される制御部４０によって制御されてもよい。第１加熱部２１及び第２加熱部２２の温度は、反応容器１００が所望の温度に加熱されるように設定されることが好ましい。第１加熱部２１及び第２加熱部２２の温度の制御の詳細については、「３．熱サイクル装置の制御例」の項で詳述される。なお、第１加熱部２１及び第２加熱部２２の温度は、反応容器１００の第１領域１１１及び第２領域１１２が所望の温度に加熱されるように制御されていればよい。例えば、反応容器１００の材質や大きさを考慮することで、第１領域１１１及び第２領域１１２の温度をより正確に所望の温度に加熱できる。本実施形態においては、温度センサーによって第１加熱部２１及び第２加熱部２２の温度を測定する。本実施形態の温度センサーは熱電対である。なお、温度センサーとしてはこれに限らず、例えば測温抵抗体やサーミスタを使用してもよい。
【００３８】
駆動機構３０は、装着部１５、第１加熱部２１及び第２加熱部２２の配置を、第１の配置と、第１の配置とは異なる第２の配置との間で切換える。本実施形態においては、駆動機構３０は、装着部１５、第１加熱部２１及び第２加熱部２２を、重力の作用する方向に対して垂直な成分を有し、かつ、装着部１５に反応容器１００を装着した場合に流路１１０を反応液１４０が移動する方向に対して垂直な成分を有する回転軸Ｒの周りに回転させる機構である。
【００３９】
「重力の作用する方向に対して垂直な成分を有する」方向は、「重力の作用する方向に対して平行な成分」と「重力の作用する方向に対して垂直な成分」とのベクトル和で表した場合における、重力の作用する方向に対して垂直な成分を有する方向である。
【００４０】
「流路１１０を反応液１４０が移動する方向に対して垂直な成分を有する」方向は、「流路１１０を反応液１４０が移動する方向に対して平行な成分」と「流路１１０を反応液１４０が移動する方向に対して垂直な成分」とのベクトル和で表した場合における、流路１１０を反応液１４０が移動する方向に対して垂直な成分を有する方向である。
【００４１】
本実施形態に係る熱サイクル装置１においては、駆動機構３０は、装着部１５、第１加熱部２１及び第２加熱部２２を、同一の回転軸Ｒの周りに回転させている。また、本実施形態においては、駆動機構３０は図示しないモーター及び駆動軸を含み、駆動軸と本体１０のフランジ１７とが接続されて構成されている。駆動機構３０のモーターを動作させると、駆動軸を回転軸Ｒとして本体１０が回転される。本実施形態においては、回転軸Ｒの方向に沿って１０個の装着部１５が設けられている。なお、駆動機構３０としては、モーターに限らず、例えばハンドル、ぜんまい等を採用できる。
【００４２】
熱サイクル装置１は、制御部４０を含む。制御部４０は、第１加熱部２１及び第２加熱部２２を制御する。制御部４０は、さらに駆動機構３０を制御してもよい。制御部４０による制御例については、「３．熱サイクル装置の制御例」の項で詳述される。制御部４０は、専用回路によって実現して後述される制御を行うように構成されていてもよい。また、制御部４０は、例えばＣＰＵ（Central Processing Unit）がＲＯＭ（Read Only Memory）やＲＡＭ（R andom Access Memory）等の記憶装置に記憶された制御プログラムを実行することによってコンピューターとして機能し、後述される制御を行うように構成されていてもよい。この場合、記憶装置は、制御に伴う中間データや制御結果などを一時的に記憶するワークエリアを有していてもよい。また、制御部４０は、時間を計測するためのタイマーを有していてもよい。また、制御部４０は、上述した図示しない温度センサーの出力に基づいて第１加熱部２１及び第２加熱部２２を所望の温度に制御してもよい。
【００４３】
熱サイクル装置１は、反応容器１００を第１加熱部２１及び第２加熱部２２に対して所定の位置に保持する構造を含むことが好ましい。これによって、第１加熱部２１及び第２加熱部２２によって反応容器１００の所定の領域を加熱できる。より具体的には、反応容器１００を構成する流路１１０の、第１領域１１１を第１加熱部２１によって、第２領域１１２を第２加熱部２２によって、加熱できる。本実施形態においては、第１ヒートブロック２１ｂ及び第２ヒートブロック２２ｂに設けられた貫通孔（装着部１５の直径）の大きさを適切に設定することによって、第１加熱部２１及び第２加熱部２２に対して反応容器１００を所定の位置に保持している。
【００４４】
第１ヒートブロック２１ｂは、フィン２１０を有する構造であってもよい。これによって、第１加熱部２１の表面積が大きくなるので、第１加熱部２１の温度を高い温度から低い温度に変更する場合に要する時間が短くなる。
【００４５】
熱サイクル装置１は、第１加熱部２１及び第２加熱部２２に対して送風するファン５００を含んでいてもよい。送風することによって、第１加熱部２１と第２加熱部２２との間での熱の移動を抑制できる。したがって、互いに異なる温度に制御された第１加熱部２１と第２加熱部２２とが互いに影響を及ぼしにくくなるので、第１加熱部２１及び第２加熱部２２の温度が安定しやすくなる。
【００４６】
図１に示されるように、熱サイクル装置１は測定部５０を含んでもよい。本実施形態においては、測定部５０は蛍光検出器を含んで構成されている。これによって、例えばリアルタイムＰＣＲのような蛍光測定を伴う用途に熱サイクル装置１を使用できる。測定部５０の数は測定が問題なく行える限り任意である。図１に示される例では、１個の測定部５０をスライド５２に沿って移動させて蛍光測定を行う。
【００４７】
測定部５０の位置は、第２加熱部２２に近い側よりも第１加熱部２１に近い側が好ましい。これによって、反応容器１００を装着部１５に装着する際に作業の障害となりにくくなる。また、測定部５０は、反応容器１００の第１領域１１１からの光を測定するように設けられていてもよい。第１加熱部２１の温度をＰＣＲのアニーリング及び伸長温度（アニーリング及び伸長反応が進行する温度）にした場合に、リアルタイムＰＣＲにおいて適切な蛍光測定ができる。また、後述される蓋（封止部１２０）付きの反応容器１００を用いる場合には、蓋に近い側となる第２領域１１２よりも、蓋から遠い側となる第１領域１１１の方が、測定部５０と反応液１４０との間に存在する部材が少ないので、より適切な蛍光測定ができる。
【００４８】
上述のように、熱サイクル装置１をリアルタイムＰＣＲに用いる場合には、ＰＣＲに必要な熱サイクルを反応液１４０に施す期間中においては、測定部５０を第１加熱部２１に近い側に設け、第１加熱部２１をＰＣＲのアニーリング及び伸長温度（５０℃〜７５℃程度）にすることが好ましい。この場合、挿入口１５１に近い第２加熱部２２をＰＣＲのアニーリング及び伸長温度よりも高い熱変性温度（９０℃〜１００℃程度）にする。
【００４９】
２．本実施形態に係る熱サイクル装置に装着される反応容器の構成
図４は、本実施形態に係る熱サイクル装置１に装着される反応容器１００の構成を表す断面図である。図４において、矢印ｇは重力の作用する方向を表す。
【００５０】
反応容器１００は、逆転写酵素を含む反応液１４０と、反応液１４０とは比重が異なり、かつ、反応液１４０とは混和しない液体１３０（以下、「液体１３０」という）とが充填され、反応液１４０が対向する内壁に沿って移動する流路１１０を含む。本実施形態においては、液体１３０は、反応液１４０よりも比重が小さく、かつ、反応液１４０とは混和しない液体である。なお、液体１３０として、例えば、反応液１４０とは混和せず、かつ、反応液１４０よりも比重が大きい液体を採用してもよい。図４に示される例では、反応容器１００は流路１１０及び封止部１２０を含む。流路１１０には、反応液１４０と、液体１３０とが充填され、封止部１２０によって封止されている。
【００５１】
流路１１０は、対向する内壁に沿って反応液１４０が移動するように形成されている。ここで、流路１１０の「対向する内壁」とは、流路１１０の壁面の、向かい合う位置関係にある２つの領域を意味する。「沿って」とは、反応液１４０と流路１１０の壁面との距離が近い状態を意味し、反応液１４０が流路１１０の壁面に接触する状態を含む。したがって、「対向する内壁に沿って反応液１４０が移動する」とは、「流路１１０の壁面の、向かい合う位置関係にある２つの領域の両方に対して距離が近い状態で、反応液１４０が移動する」ことを意味する。換言すれば、流路１１０の対向する２つ内壁間の距離は、反応液１４０が該内壁に沿って移動する程度の距離である。
【００５２】
反応容器１００の流路１１０がこのような形状であると、流路１１０内を反応液１４０が移動する方向を規制できるので、流路１１０内を反応液１４０が移動する経路をある程度規定できる。これによって、流路１１０内を反応液１４０が移動する所要時間を、ある程度の範囲に制限できる。したがって、流路１１０の対向する２つ内壁間の距離は、流路１１０内を反応液１４０が移動する時間のバラツキによって生じる、反応液１４０に対して施される熱サイクル条件のバラツキが、所望の精度を満たせる程度、すなわち、反応の結果が所望の精度を満たせる程度であることが好ましい。より具体的には、流路１１０の対向する２つの内壁間の反応液１４０が移動する方向に対して垂直な方向における距離が、反応液１４０の液滴が２つ以上入らない程度であることが望ましい。
【００５３】
図４に示される例では、反応容器１００の外形は円錐台状であり、中心軸に沿う方向（図４における上下方向）を長手方向とする流路１１０が形成されている。流路１１０の形状は、流路１１０の長手方向に対して垂直な方向の断面、すなわち流路１１０のある領域における反応液１４０が移動する方向に対して垂直な断面（これを流路１１０の「断面」とする）が円形となる円錐台状である。したがって、反応容器１００においては、流路１１０の対向する内壁は、流路１１０の断面の中心を挟んで対向する流路１１０の壁面上の２点を含む領域である。また、「反応液１４０が移動する方向」は、流路１１０の長手方向となる。
【００５４】
なお、流路１１０の形状は錐台状に限られず、例えば、柱状であってもよい。また、流路１１０の断面の形状は円形に限らず、多角形や楕円形など、対向する内壁に沿って反応液１４０が移動できる限り任意である。例えば、反応容器１００の流路１１０の断面が多角形の場合には、「対向する内壁」は、流路１１０に内接する断面が円形の流路を仮定した場合に、該流路の対向する内壁であるものとする。すなわち、流路１１０に内接する、断面が円形の仮想流路の対向する内壁に沿って反応液１４０が移動するように流路１１０が形成されていればよい。これによって、流路１１０の断面が多角形の場合にも、第１領域１１１と第２領域１１２との間を反応液１４０が移動する経路をある程度規定できる。したがって、反応液１４０が第１領域１１１と第２領域１１２との間を移動する所要時間を、ある程度の範囲に制限できる。
【００５５】
反応容器１００の第１領域１１１は、第１加熱部２１によって加熱される、流路１１０の一部の領域である。第２領域１１２は、第２加熱部２２によって加熱される、第１領域１１１とは異なる流路１１０の一部の領域である。図４に示される例では、第１領域１１１は、流路１１０の長手方向における一方の端部を含む領域であり、第２領域１１２は、流路１１０の長手方向における他方の端部を含む領域である。図４に示される例では、流路１１０のうち封止部１２０に相対的に遠い側の端部を含む点線で囲まれた領域が第１領域１１１であり、流路１１０のうち封止部１２０に相対的に近い側の端部を含む点線で囲まれた領域が第２領域１１２である。本実施形態に係る熱サイクル装置１は、第１加熱部２１が反応容器１００の第１領域１１１を加熱し、第２加熱部２２が反応容器１００の第２領域１１２を加熱することによって、反応容器１００の流路１１０に対して、反応液１４０が移動する方向に温度勾配を形成する。
【００５６】
流路１１０には、液体１３０と、反応液１４０とが充填されている。液体１３０は、反応液１４０とは混和しない、すなわち混ざり合わない性質であるため、図４に示されるように、反応液１４０は液体１３０の中に液滴の状態で保持されている。反応液１４０は、液体１３０よりも比重が大きいため、流路１１０の重力の作用する方向における最下部の領域に位置している。液体１３０としては、例えば、ジメチルシリコーンオイル又はパラフィンオイルを使用できる。反応液１４０は、反応に必要な成分を含む液体である。反応がＲＴ−ＰＣＲである場合には、反応液１４０には、逆転写酵素に加えて、逆転写の鋳型となるＲＮＡ、逆転写されたｃＤＮＡを増幅するために必要なＤＮＡポリメラーゼ、並びにプライマー等が含まれる。例えば、液体１３０としてオイルを用いてＰＣＲを行う場合には、反応液１４０は上述の成分を含む水溶液であることが好ましい。
【００５７】
３．熱サイクル装置の制御例
図５は、本実施形態に係る熱サイクル装置１の機能ブロック図である。制御部４０は、第１加熱部２１に対して制御信号Ｓ１を出力することによって第１加熱部２１の温度を制御する。制御部４０は、第２加熱部２２に対して制御信号Ｓ２を出力することによって第２加熱部２２の温度を制御する。制御部４０は、駆動機構３０に対して制御信号Ｓ３を出力することによって駆動機構３０を制御する。制御部４０は、測定部５０に対して制御信号Ｓ４を出力することによって測定部５０を制御する。
【００５８】
次に、本実施形態に係る熱サイクル装置１の制御例について説明する。以下では、装着部１５に反応容器１００を装着した場合に、駆動機構３０が、装着部１５、第１加熱部２１及び第２加熱部２２を、第１の配置と、流路１１０内において重力の作用する方向における最下点の位置が第１の配置とは異なる第２の配置との間で回転させる制御を例にとり説明する。
【００５９】
図６（Ａ）は、第１の配置における、図１（Ａ）のＡ−Ａ線を通り回転軸Ｒに垂直な面における断面を模式的に示す断面図、図６（Ｂ）は、第２の配置における図１（Ａ）のＡ−Ａ線を通り回転軸Ｒに垂直な面における断面を模式的に示す断面図である。図６（Ａ）及び図６（Ｂ）において、白抜き矢印は本体１０の回転方向、矢印ｇは重力の作用する方向を表す。
【００６０】
図６（Ａ）に示されるように、第１の配置は、装着部１５に反応容器１００が装着された場合に、第１領域１１１が重力の作用する方向における流路１１０の最下部に位置する配置である。図６（Ａ）に示される例では、第１の配置では、液体１３０よりも比重が大きい反応液１４０は第１領域１１１に存在する。また、図６（Ｂ）に示されるように、第２の配置は、装着部１５に反応容器１００が装着された場合に、第２領域１１２が重力の作用する方向における流路１１０の最下部に位置する配置である。図６（Ｂ）に示される例では、第２の配置では、液体１３０よりも比重が大きい反応液１４０は第２領域１１２に存在する。
【００６１】
このように、駆動機構３０が、装着部１５、第１加熱部２１及び第２加熱部２２を、第１の配置と、第１の配置とは異なる第２の配置との間で回転させることによって、反応液１４０に対して熱サイクルを施すことができる。
【００６２】
本実施形態によれば、装着部１５、第１加熱部２１及び第２加熱部２２の配置を切り換えることで、反応容器１００が第１の配置に保持された状態と、反応容器１００が第２の配置に保持された状態とを切り換えることができる。第１の配置は、反応容器１００を構成する流路１１０の第１領域１１１が、重力の作用する方向における流路１１０の最下部に位置する配置である。第２の配置は、反応容器１００を構成する流路１１０の第２領域１１２が、重力の作用する方向における流路１１０の最下部に位置する配置である。すなわち、重力の作用によって第１の配置においては反応液１４０を第１領域１１１に、第２の配置においては反応液１４０を第２領域１１２に保持できる。第１領域１１１は第１加熱部２１によって加熱され、第２領域１１２は第２加熱部２２によって加熱されるので、第１領域１１１と第２領域１１２とは異なる温度とすることができる。したがって、第１の配置又は第２の配置に反応容器１００を保持する間、反応液１４０を所定の温度に保持できるので、加熱時間を容易に制御可能な熱サイクル装置１を提供できる。
【００６３】
駆動機構３０は、第１の配置から第２の配置へと回転させる場合と、第２の配置から第１の配置へと回転させる場合とで、反対方向に装着部１５、第１加熱部２１及び第２加熱部２２を回転させてもよい。これによって、回転によって生じる導線１９などの配線の捩れを低減するための特別な機構が不要となる。したがって、小型化に適した熱サイクル装置１を実現できる。また、第１の配置から第２の配置へと回転させる場合の回転数、及び、第２の配置から第１の配置へと回転させる場合の回転数は、１回転未満（回転角度が３６０°未満）であることが好ましい。これによって、配線が捩れる程度を軽減できる。また、図１及び図２に示されるように、フランジ１８が導線１９を巻き取れる構成にしてもよい。
【００６４】
次に、熱サイクル装置１の制御方法の一例について、１ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲを例にとり説明する。図７は、本実施形態に係る熱サイクル装置１の制御方法の一例を説明するためのフローチャートである。図８は、図７に示される制御方法における第１加熱部２１の温度Ｔ１及び第２加熱部２２の温度Ｔ２の時間変化を示すグラフである。図８の横軸は時間（分）、縦軸は温度（℃）を表す。
【００６５】
ＲＴ−ＰＣＲは、ＲＮＡの検出又は定量を行うための手法である。逆転写酵素を用いてＲＮＡを鋳型としてＤＮＡへの逆転写を行い、逆転写によって合成されたｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅する。一般的なＲＴ−ＰＣＲでは、逆転写反応の工程とＰＣＲの工程とは独立しており、逆転写の工程とＰＣＲの工程との間で、容器を交換したり、試薬を追加したりする。これに対し１ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲは、専用の試薬を用いることで逆転写及びＰＣＲの反応を連続して行う。１ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲの試薬は、公知のものを使用することができる。
【００６６】
図７において、まず、制御部４０は、第１加熱部２１の温度Ｔ１を、逆転写酵素が活性を有する温度（第１温度）に制御し、かつ、第２加熱部２２の温度Ｔ２を、逆転写酵素が失活しない温度（第２温度）に制御する第１処理を行う（ステップＳ１００）。また、図７に示される例では、ステップＳ１００において、制御部４０は、装着部１５、第１加熱部２１及び第２加熱部２２の配置が第１の配置になるように駆動機構３０を制御している。なお、各ステップにおいて「制御部が（制御対象を）制御する」とは、当該ステップにおいて、制御部が制御対象を前のステップとは異なる状態に制御する場合と、制御部が制御対象を前のステップと同様の状態に維持することのいずれをも意味する。
【００６７】
「逆転写酵素が活性を有する温度」とは、反応液に含まれる逆転写酵素の活性が０ユニットより大きい温度を意味する。逆転写酵素が活性を有する温度は、逆転写酵素が失活しない温度であることが好ましい。逆転写酵素が失活しない温度は、逆転写酵素の種類に依存する温度であるが、一般的には２０℃以上７０℃以下程度の範囲内である。第１加熱部２１の温度Ｔ１は、逆転写反応が進行する温度（逆転写反応に好適な温度）に制御することが好ましい。逆転写反応が進行する温度は、一般的には４０℃以上５０℃以下程度の範囲内である。第１加熱部２１の温度Ｔ１は、逆転写酵素の種類毎に規定される至適温度に制御することがより好ましい。図８に示される例では、第１温度として４２℃を採用している。
【００６８】
７０℃を超える温度では、逆転写酵素が失活したり劣化しやすくなったりする。図８に示される例では、第２温度として５０℃を採用している。なお、「酵素が失活する」とは、酵素活性が低下又は消失し、実験条件を調節しても本来の活性を示さなくなることを意味する。本明細書においては、逆転写酵素の至適温度において測定される、反応液１４０に含まれる逆転写酵素の活性が、当該逆転写酵素が当該反応液の環境（ｐＨ等の条件）において期待される活性よりも低下した状態を意味する。「逆転写酵素が失活しない温度」は、期待される酵素活性に対して１００％の活性を逆転写酵素が示す場合、及び、ＲＴ−ＲＣＲにおいて許容される程度に活性が低下する場合（含まれる逆転写酵素の一部が失活する場合）を含む。
【００６９】
ステップＳ１００の後に、装着部１５に反応容器１００を装着する（ステップＳ１０２）。装着部１５の挿入口１５１にから反応容器１００を使用者が挿入することによって装着部１５に反応容器１００を装着する。
【００７０】
第１処理では、挿入口１５１から遠い第１領域１１１を加熱する第１加熱部２１の温度Ｔ１は、逆転写酵素が活性を有する温度である第１温度であり、挿入口１５１に近い第２領域１１２を加熱する第２加熱部２２の温度Ｔ２は、逆転写酵素が失活しない温度である第２温度であるので、第１処理を行なっている間に反応容器１００を装着部に装着しても、逆転写酵素が失活するような高温に反応液１４０が曝されることがない。したがって、逆転写酵素の失活を抑制できるので、反応精度を高めた熱サイクル装置１を実現できる。また、第１温度が逆転写酵素によって逆転写反応が進行する温度であるので、反応容器１００を装着した後に加熱を開始する場合と比較して、速やかに逆転写反応を開始できる。したがって、反応容器１００を装着した後に加熱を開始する場合よりも反応時間を短縮できる。
【００７１】
図７において、ステップＳ１０２の後に、制御部４０は、装着部１５、第１加熱部２１及び第２加熱部２２の配置が第１の配置になるように駆動機構３０を制御し、かつ、第１加熱部２１の温度Ｔ１を、逆転写酵素が活性を有する温度（第１温度）に制御し、第２加熱部２２の温度Ｔ２を、逆転写酵素が失活する温度（第３温度）に制御する第３処理を行なってもよい（ステップＳ１０４）。
【００７２】
「逆転写酵素が失活する温度」は、逆転写酵素の種類に依存する温度であるが、一般的には７０℃を超える温度である。図８に示される例では、第３温度として９５℃を採用している。
【００７３】
第３処理においては、装着部１５、第１加熱部２１及び第２加熱部２２の配置が第１の配置に制御されるので、反応液１４０が第１領域１１１に保持される。第３処理における第１加熱部２１の温度Ｔ１は逆転写酵素が活性を有する温度であるので、逆転写反応が進行する。よって、本実施形態によれば、反応液１４０が第１領域１１１に保持されている時間を使って、第２領域１１２を加熱する第２加熱部２２の温度Ｔ２を第２温度から第３温度に変更できる。したがって、第２処理において装着部１５、第１加熱部２１及び第２加熱部２２の配置が第２の配置に制御された場合に、速やかに逆転写酵素を失活させることができる。
【００７４】
ステップＳ１０４の後に、制御部４０は、第１時間を経過したか否かを判定する（ステップＳ１０６）。第１時間は、反応容器１００が装着部１５に装着されてから、反応容器１００内で逆転写反応が十分に行われるまでに必要な時間である。図８に示される例では、第１時間として１５分を採用している。第１時間の計測開始時刻は、例えば、使用者が装着部１５に反応容器１００を装着し終えた後に、図示しない操作受付手段（例えば、ボタンやレバーや、コンピューターからの通信信号を受け付ける信号受付部など）を介して使用者の操作を受け付けたタイミングとしてもよい。また例えば、第１時間の計測開始時刻は、装着部１５に反応容器１００が装着されたか否かを検出する図示しない検出手段（例えば、光学式センサー、接触式センサー、スイッチなど）の検出結果に基づいて判定したタイミングとしてもよい。制御部４０が第１時間を経過していないと判定した場合（ステップＳ１０６でＮＯの場合）には、ステップＳ１０６を繰り返す。制御部４０が第１時間を経過したと判定した場合（ステップＳ１０６でＹＥＳの場合）には、後述されるステップＳ１０８を行う。
【００７５】
なお、ステップＳ１０４及びステップＳ１０６においては、装着部１５、第１加熱部２１及び第２加熱部２２の配置が第１の配置であるので、反応液１４０は第１領域１１１に保持される。よって、第２加熱部２２の温度Ｔ２の影響は受けない。したがって、図７においては便宜上ステップＳ１０４の後にステップＳ１０６を行う例で説明したが、第１時間の計時開始時刻はステップＳ１０４行うよりも前でもよい。また、ステップＳ１０４とステップＳ１０６の順序が入れ替わってもよい。図８に示される例では、第１時間の計時開始時刻とステップＳ１０４の開始時刻とは、ともに時刻０であり同時刻である。なお、時刻０よりも前の期間（図８において時刻が負になる期間）は、装着部１５に反応容器１００を装着するための期間に対応する。
【００７６】
ステップＳ１０６の後に、制御部４０は、装着部１５、第１加熱部２１及び第２加熱部２２の配置が第２の配置になるように駆動機構３０を制御し、かつ、第２加熱部２２の温度を、逆転写酵素が失活する温度（第３温度）に制御する第２処理を行なってもよい。
【００７７】
第２処理においては、装着部１５、第１加熱部２１及び第２加熱部２２の配置が第２の配置に制御されるので、反応液１４０が第２領域に保持される。すなわち、反応液１４０は逆転写酵素が失活する温度である第３温度になる。したがって、本実施形態によれば、反応液１４０を反応容器１００の第２領域へ移動させることによって逆転写酵素を失活させることができる。したがって、第１加熱部２１の温度Ｔ１を逆転写酵素が失活する温度に変更する場合と比較して、逆転写反応からポリメラーゼ連鎖反応の熱サイクルに移行する場合に要する時間を短縮することができる。
【００７８】
逆転写反応の後にＰＣＲを行う場合（例えば、本項で説明している１ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲを行う場合）には、制御部４０は、第２処理（ステップＳ１０８）において、第１加熱部２１の温度Ｔ１を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）におけるアニーリング及び伸長温度（第４温度）に制御してもよい。
【００７９】
「ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）におけるアニーリング及び伸長温度」は、核酸を増幅するためのプライマーに依存する温度であるが、一般的には５０℃以上７０℃以下程度の範囲内である。図８に示される例では、第４温度として６０℃を採用している。
【００８０】
第２処理においては、装着部１５、第１加熱部２１及び第２加熱部２２の配置が第２の配置に制御されるので、反応液１４０が第２領域１１２に保持される。よって、本実施形態によれば、反応液１４０が第２領域１１２に保持されている時間を使って、第１領域１１１を加熱する第１加熱部２１の温度Ｔ１を第１温度から第４温度に変更できる。したがって、第２処理の後に第１加熱部２１の温度をアニーリング及び伸長温度に制御する場合と比較して、逆転写反応からポリメラーゼ連鎖反応の熱サイクルに移行する場合に要する時間を短縮できる。
【００８１】
図８に示される例では、第１加熱部２１の温度Ｔ１が第４温度に制御されたタイミング（時刻ｔ）で、装着部１５、第１加熱部２１及び第２加熱部２２の配置を第１の配置から第２の配置へと切り換えている。したがって、図８に示される例では、時刻０から時刻ｔまでは逆転写反応が行われる期間、時刻ｔ以降はＰＣＲが行われる期間に対応する。
【００８２】
制御部４０は、第２処理（ステップＳ１０８）の後に、装着部１５、第１加熱部２１及び第２加熱部２２の配置が第１の配置になるように駆動機構３０を制御してもよい。
【００８３】
本実施形態によれば、第２処理の後に、装着部１５、第１加熱部２１及び第２加熱部２２の配置を第１の配置に制御するので、第１の配置に切換えてから第１加熱部２１の温度Ｔ１をアニーリング及び伸長温度に制御する場合と比較して、反応液１４０がアニーリング及び伸長温度に保持される時間を精度よく制御できる。
【００８４】
逆転写酵素が失活する温度（第３温度）は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）における熱変性温度であってもよい。すなわち、第３温度は、逆転写酵素が失活する温度であり、かつ、ＰＣＲにおける熱変性温度となる温度であってもよい。
【００８５】
「ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）における熱変性温度」は、核酸を増幅するためのプライマーに依存する温度であるが、一般的には９０℃以上１００℃以下程度の範囲内である。図８に示される例では、第３温度として９５℃を採用しているので、逆転写酵素が失活する温度であり、かつ、ＰＣＲにおける熱変性温度となる温度である。
【００８６】
本実施形態によれば、装着部１５、第１加熱部２１及び第２加熱部２２の配置を第２の配置に制御した場合に、逆転写酵素が失活する温度でありかつポリメラーゼ連鎖反応におけるＤＮＡの熱変性温度に制御された第２領域１１２に反応液１４０が保持される。これによって、逆転写酵素の失活と、ポリメラーゼ連鎖反応における熱変性とを同一の工程で行うことができる。したがって、逆転写酵素の失活と熱変性の温度とが異なる場合と比較して、逆転写反応からポリメラーゼ連鎖反応の熱サイクルに移行する場合に要する時間を短縮できる。また、１ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲにおいては、ホットスタートＰＣＲ酵素（所定の温度に曝されることで活性化するＰＣＲ酵素）を使うことが一般的である。ホットスタートＰＣＲ酵素が活性化する温度は、通常、熱変性の温度と共通の温度範囲である。したがって、第３温度を、逆転写酵素が失活する温度であり、かつ、ＤＮＡの熱変性温度とすることで、ホットスタートの工程も兼ねることができる。
【００８７】
図７において、ステップＳ１０８の後に、制御部４０は、第２時間を経過したか否かを判定する（ステップＳ１１０）。第２時間は、逆転写酵素の失活とＰＣＲのホットスタートに必要な時間である。本実施形態においては、第２時間として１０秒を採用している。制御部４０が第２時間を経過していないと判定した場合（ステップＳ１１０でＮＯの場合）には、ステップＳ１１０を繰り返す。
【００８８】
制御部４０が第２時間を経過したと判定した場合（ステップＳ１１０でＹＥＳの場合）には、熱サイクル処理を行う（ステップＳ１１２）。本実施形態においては、制御部４０が、装着部１５、第１加熱部２１及び第２加熱部２２の配置を第１の配置と第２の配置との間で所望の時間で所望の回数まで切り換えることによって熱サイクル処理を行う。図７に示される例では、ステップＳ１０８において、第１加熱部２１の温度Ｔ１はＰＣＲにおけるアニーリング及び伸長温度である第４温度に制御され、第２加熱部２２の温度Ｔ２はＰＣＲにおける熱変性温度である第３温度に制御されている。したがって、装着部１５、第１加熱部２１及び第２加熱部２２の配置が第１の配置である場合には反応液１４０は第４温度の第１領域１１１に保持され、装着部１５、第１加熱部２１及び第２加熱部２２の配置が第２の配置である場合には反応液１４０は第３温度の第２領域１１２に保持される。これによって、反応液１４０に対してＰＣＲに必要な所望の熱サイクルを施すことができる。
【００８９】
図９は、熱サイクル処理の一例を説明するためのフローチャートである。なお、図７のステップＳ１０８において、第１加熱部２１の温度Ｔ１はＰＣＲにおけるアニーリング及び伸長温度である第４温度に制御され、第２加熱部２２の温度Ｔ２はＰＣＲにおける熱変性温度である第３温度に制御されているものとする。また、熱サイクル処理のスタート時には、装着部１５、第１加熱部２１及び第２加熱部２２の配置は第２の配置である。すなわち、第３温度の第２領域１１２に反応液１４０が保持されている。
【００９０】
図９において、まず、制御部４０は、第３時間を経過したか否かを判定する（ステップＳ２００）。第３時間は、ＰＣＲにおける熱変性に必要となる時間である。本実施形態においては、第３時間として５秒を採用している。制御部４０が第３時間を経過していないと判定した場合（ステップＳ２００でＮＯの場合）には、ステップＳ２００を繰り返す。
【００９１】
制御部４０が第３時間を経過したと判定した場合（ステップＳ２００でＹＥＳの場合）には、制御部４０は、装着部１５、第１加熱部２１及び第２加熱部２２の配置を第２の配置から第１の配置へと切換えるように駆動機構３０を制御する（ステップＳ２０２）。これによって、第４温度の第１領域１１１に反応液１４０が移動する。
【００９２】
ステップＳ２０２の後に、蛍光測定を開始する（ステップＳ２０４）。測定部５０をスライド５２上で移動させて、複数の反応容器１００についての蛍光測定を行なってもよい。
【００９３】
ステップＳ２０４の後に、制御部４０は、第４時間を経過し、かつ、蛍光測定を完了したか否かを判定する（ステップＳ２０６）。第４時間は、ＰＣＲにおけるアニーリング及び伸長に必要となる時間である。本実施形態においては、第４時間として３０秒を採用している。制御部４０が第４時間を経過していない又は蛍光測定を完了していないと判定した場合（ステップＳ２０６でＮＯの場合）には、ステップＳ２０６を繰り返す。
【００９４】
制御部４０が第４時間を経過し、かつ、蛍光測定を完了したと判定した場合（ステップＳ２０６でＹＥＳの場合）には、制御部４０は、所定のサイクル数に達したか否かを判定する（ステップＳ２０８）。本実施形態においては、所定のサイクル数として５０回を採用している。
【００９５】
制御部４０が所定のサイクル数に達していないと判定した場合（ステップＳ２０８でＮＯの場合）には、制御部４０は、装着部１５、第１加熱部２１及び第２加熱部２２の配置を第１の配置から第２の配置へと切換えるように駆動機構３０を制御する（ステップＳ２１０）。ステップＳ２１０の後に、ステップＳ２００からステップＳ２０８までを繰り返す。制御部４０が所定のサイクル数に達したと判定した場合（ステップＳ２０８でＹＥＳの場合）には、熱サイクル処理を終了する。
【００９６】
４．実施例
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されない。
【００９７】
図１０は、本実施例における反応液１４０の組成を示す表である。図１０において、「SuperScript III Platinum」は「SuperScript III Platinum One-Step Quantitative RT-PCR System with ROX（「Platinum」は登録商標、ライフテクノロジーズ社製）」であり、ＰＣＲ酵素と逆転写酵素が含まれている。ＲＮＡとしては、ヒト鼻腔拭い液（ヒトサンプル）から抽出したＲＮＡを用いた。なお、当該ヒトサンプルについては、市販のキット（「エスプラインインフルエンザＡ＆Ｂ−Ｎ（「エスプライン」は登録商標）」、富士レビオ株式会社製）を用いてイムノクロマトグラフィーを行った結果、インフルエンザＡ型が陽性であった。なお、イムノクロマトグラフィーにおける「Ａ型陽性」は、下記インフルエンザＡ型（InfA）を特異的に判別するものではない。
【００９８】
図１１は、インフルエンザＡ型（InfA）、豚インフルエンザＡ型（SW InfA）、豚インフルエンザＨ１型（SW H1）及びリボヌクレアーゼＰ（RNase P）に対応するフォワードプライマー（F primer）、リバースプライマー（R primer）及びプローブ（Probe）の塩基配列を示す表である。いずれも、「CDC protocol of realtime RTPCR for swine influenza A(H1N1)」（World Health Organization、２００９年４月３０日改訂１版）に記載されている塩基配列と同一である。図１１に示される４種類のプローブ（Probe）は、いずれも核酸の増幅に伴い測定される蛍光輝度が増加する。
【００９９】
実験手順は、図７及び図９に示されるフローチャートの通りであり、第１温度は４５℃、第２温度は５８℃、第３温度は９８℃、第１時間は６０秒、第２時間は１０秒、第３時間は５秒、第４時間は３０秒、熱サイクル処理のサイクル数は５０回とした。また、装着部１５に装着される反応容器１００は４個（サンプルＡ〜サンプルＤ）とした。
【０１００】
サンプルＡは、インフルエンザＡ型（InfA）に対応するフォワードプライマー、リバースプライマー及び蛍光プローブを含む。サンプルＢは、豚インフルエンザＡ型（SW InfA）に対応するフォワードプライマー、リバースプライマー及び蛍光プローブを含む。サンプルＣは、豚インフルエンザＨ１型（SW H1）に対応するフォワードプライマー、リバースプライマー及び蛍光プローブを含む。サンプルＤは、リボヌクレアーゼＰ（RNase P）に対応するフォワードプライマー、リバースプライマー及び蛍光プローブを含む。
【０１０１】
図１２は、本実施例における、熱サイクル処理のサイクル数と測定された輝度との関係を示すグラフである。図１２の横軸は熱サイクル処理のサイクル数、縦軸は輝度の相対値を表す。
【０１０２】
図１２に示されるように、サンプルＡ〜サンプルＤのいずれも、熱サイクル処理のサイクル数が２０回〜３０回程度となる辺りから輝度が大きく上昇していることが分かる。これによって、ＲＮＡを鋳型として逆転写されたｃＤＮＡが増幅されていることが分かる。サンプルＤは内在性コントロールの実験であり、サンプルＤで輝度が上昇していることから、ヒトサンプル由来のＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が増幅されたことが確認できた。さらに、サンプルＡ〜サンプルＤでｃＤＮＡが増幅されたことから、ヒトサンプルにはＩｎｆＡ、ＳＷ  ＩｎｆＡ、ＳＷ  Ｈ１の全てのＲＮＡが含まれていたことがわかった。この結果は、イムノクロマトグラフィーの結果とも合致している。したがって、本実施形態に係る熱サイクル装置１を用いて、１ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲを行うことができることが確認された。すなわち、本実施形態の熱サイクル装置１及び熱サイクル装置１の制御方法によって、逆転写酵素の失活を抑制でき、反応精度が良好であることが確認された。
【０１０３】
なお、上述した実施形態及び変形例は一例であって、これらに限定されるわけではない。例えば各実施形態及び各変形例は、複数を適宜組み合わせることが可能である。
【０１０４】
本発明は、上述した実施形態及び実施例に限定されるものではなく、さらに種々の変形が可能である。例えば、本発明は、実施形態で説明した構成と実質的に同一の構成（例えば、機能、方法及び結果が同一の構成、あるいは目的及び効果が同一の構成）を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成又は同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。
【符号の説明】
【０１０５】
１…熱サイクル装置、１５…装着部、１６…固定部材、１７…フランジ、１８…フランジ、１９…導線、２１…第１加熱部、２１ａ…第１ヒーター、２１ｂ…第１ヒートブロック、２２…第２加熱部、２２ａ…第２ヒーター、２２ｂ…第２ヒートブロック、３０…駆動機構、３１…軸受、４０…制御部、５０…測定部、５２…スライド、１００…反応容器、１１０…流路、１１１…第１領域、１１２…第２領域、１３０…液体、１４０…反応液、１５１…挿入口、２１０…フィン
【配列表フリーテキスト】
【０１０６】
配列番号１は、ＩｎｆＡのフォワードプライマーの配列である。
配列番号２は、ＩｎｆＡのリバースプライマーの配列である。
配列番号３は、ＩｎｆＡの蛍光プローブの配列である。
配列番号４は、ＳＷ  ＩｎｆＡのフォワードプライマーの配列である。
配列番号５は、ＳＷ  ＩｎｆＡのリバースプライマーの配列である。
配列番号６は、ＳＷ  ＩｎｆＡの蛍光プローブの配列である。
配列番号７は、ＳＷ  Ｈ１のフォワードプライマーの配列である。
配列番号８は、ＳＷ  Ｈ１のリバースプライマーの配列である。
配列番号９は、ＳＷ  Ｈ１の蛍光プローブの配列である。
配列番号１０は、ＲＮａｓｅ  Ｐのフォワードプライマーの配列である。
配列番号１１は、ＲＮａｓｅ  Ｐのリバースプライマーの配列である。
配列番号１２は、ＲＮａｓｅ  Ｐの蛍光プローブの配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0005971463.tif 000008
【図８】
0005971463.tif 000009
【図９】
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【図１０】
0005971463.tif 000011
【図１１】
0005971463.tif 000012
【図１２】
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【配列表】
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