(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪アルコールの生産に使用するためのアシル-CoA レダクターゼ、アシル-CoA シンターゼ、チオエステラーゼおよびアセチル-CoA カルボキシラーゼをコードする遺伝子を含む組換え微生物細胞であって、該遺伝子が外来性である、組換え微生物細胞。
【請求項２】
外来性の遺伝子が、組換え細胞における発現のために最適化されるよう改変されている請求項 1の組換え微生物細胞。
【請求項３】
細胞が、アシル-CoA デヒドロゲナーゼの発現を欠失している請求項 1の組換え微生物細胞。
【請求項４】
細胞が、サッカロマイセス・セレビシエ、カンジダ・リポリティカ、大腸菌、アルスロバクター、ロドトルラ・グルチニンス、アシネトバクター、ボツリオコッカス・ブラウニ、ビブリオ・ファーニッシ、ミクロコッカス・ルテウス、ステノトロホモナス・マルトフィリアまたはバチルス・スブチリス細胞である請求項 1の組換え微生物細胞。
【請求項５】
細胞が、アルスロバクター AK 19、アシネトバクター・エスピー・株 M-1、大腸菌 B、大腸菌 C、大腸菌 K または大腸菌 W 細胞である請求項 ４の組換え微生物細胞。
【請求項６】
細胞がラン藻細胞である請求項 1の組換え微生物細胞。
【請求項７】
ラン藻細胞が、シネコシスティス・エスピーPCC6803またはシネココッカス・エロンガツス PCC7942 細胞である請求項 ６の組換え微生物細胞。
【請求項８】
細胞が、細菌、酵母、または糸状菌からの微生物細胞である請求項 1の組換え微生物細胞。
【請求項９】
アシル-CoA シンターゼがfadDである請求項 2の組換え微生物細胞。
【請求項１０】
遺伝子が、組換え細胞における発現のために最適化されるよう改変されている請求項 1の組換え微生物細胞。
【請求項１１】
アシル-CoA シンターゼ遺伝子が、fadD、fadK、BH3103、yhfL、Pfl-4354、EAV15023、fadD1、fadD2、RPC_4074、fadDD35、fadDD22、faa3p、または ZP_01644857をコードする遺伝子である請求項 2の組換え微生物細胞。
【請求項１２】
アシル-CoA シンターゼ遺伝子が、結核菌 HR7Rv由来fadDD35 [NP_217021]、枯草菌由来yhfL [NP_388908]、緑膿菌 PAO1由来fadD1 [NP_251989]、ステノトロホモナス・マルトフィリア R551-3由来のZP_01644857をコードする遺伝子、またはサッカロマイセス・セレビシエ由来faa3p [NP_012257]である請求項 １１の組換え微生物細胞。
【請求項１３】
チオエステラーゼ 遺伝子が、tesA、‘tesA、tesB、fatB、fatB2、fatB3、fatB [M141T]、fatA またはfatA1である請求項 1の組換え微生物細胞。
【請求項１４】
発現または過剰発現されるよう改変されているpdh、panK、aceEF、fabH、fabD、fabG、acpP、および fabF 遺伝子の少なくとも１つをさらに含む請求項 1の組換え微生物細胞。
【請求項１５】
遺伝子発現が減弱されるよう改変されているfadE、gpsA、ldhA、pflB、adhE、pta、poxB、ackA、および ackB 遺伝子の少なくとも１つをさらに含む請求項 1の組換え微生物細胞。
【請求項１６】
plsBおよびsfaの少なくとも１つの改変された遺伝子をさらに含む請求項 1の組換え微生物細胞。
【請求項１７】
脂肪アルコールが、飽和C10、C12、C14、C16 またはC18 脂肪アルコールまたはその組み合わせを含む請求項 1の組換え微生物細胞。
【請求項１８】
以下の工程を含む組換え細胞において脂肪アルコールを生産する方法：
a)請求項 1の組換え微生物細胞を得る工程; 
b)組換え微生物細胞を発現に好適な条件下で培養する工程、および、
c)脂肪アルコールを生産させる工程。
【請求項１９】
以下の工程を含む脂肪アルコールを生産する方法:
(a)請求項 1の組換え微生物細胞を提供する工程、
(b)組換え微生物細胞を発現に適した条件下で培養する工程、および
(c)脂肪アルコールを分離する工程。
【請求項２０】
以下の工程を含む脂肪アルコールを生産する方法:
(a)請求項 1の組換え微生物細胞を脂肪アルコールを生産するに十分な条件下で培養する工程、
(b)脂肪アルコールを有機相中に分離する工程、および
(c)有機相から脂肪アルコールを精製する工程。
【請求項２１】
脂肪アルコールが8-30の炭素鎖長を含む請求項 １８の方法。
【請求項２２】
脂肪アルコールが1-5の分枝点を含む請求項 １８の方法。
【請求項２３】
細胞が、fabA (EC 4.2.1.60), fabB (EC 2.3.1.41), fabD (EC 2.3.1.39), fabG (EC 1.1.1.100), fabH (EC 2.3.1.180), fabI (EC 1.3.1.9) および fabZ (EC 4.2.1.-)をコードする１またはそれ以上の外来性の遺伝子をさらに発現する請求項 1の組換え微生物細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
脂肪酸 生合成経路からの生成物(即ち、脂肪酸誘導体)を生産する遺伝子操作された 細胞および微生物、ならびにその使用方法が提供される。生成物は特にバイオ燃料として有用である。
【背景技術】
【０００２】
関連出願とのクロスリフェレンス
本出願は、2007年3月28日出願の米国仮出願第60/908,547号; 2007年11月21日出願の米国仮出願第60/989,798号;および2007年5月18日出願のPCT出願PCT/US2007/011923からの優先権を主張し、それらはその全体を引用により本明細書に含める。
【０００３】
背景
技術開発に伴って、燃料源への依存が高まっている。かかる燃料源はますます制限され取得が困難となってきている。今までにない速度で起こっている化石燃料の燃焼により、世界の燃料需要はすぐに現在の燃料の供給を上回ってしまうであろう。
【０００４】
そのため、太陽光、水力、風力、およびバイオマスなどの再生可能エネルギー源を利用する努力がなされてきている。石油源に由来しない燃料の新しい源を作るためのバイオマスの利用(即ち、バイオ燃料)が１つの選択肢として現れている。バイオ燃料は、アルカンおよびエステルででき得る生分解性、クリーンな燃焼の可燃燃料である。例示的なバイオ燃料はバイオディーゼルである。バイオディーゼルは、「真の」バイオディーゼルと称される純粋な形態、または、通常の石油ディーゼルといくらかの濃度にて混合物として、ほとんどの内燃ディーゼルエンジンにおいて利用可能である。
【０００５】
バイオディーゼルは、石油に基づくディーゼルと比較して多数の興味深く、魅力的な有利な特性を提供し、例えば、燃焼の際の排出の削減が挙げられる(例えば、一酸化炭素、硫黄、芳香族炭化水素、すす粒子等)。バイオディーゼルはまた、 バランスのとれた二酸化炭素循環を維持する。というのはそれは、再生可能な生物学的物質に基づくからである。バイオディーゼルは毒性ではなく、完全に生分解性であり、その高い引火点および低い可燃性のために非常に安全である。さらに、バイオディーゼルは良好な潤滑特性を提供するため、エンジンに対する損傷を低減する。
【０００６】
バイオディーゼルを作る現在の方法は、植物油原料、例えば、欧州におけるナタネ、北米におけるダイズ、および東南アジアにおけるヤシ油からのトリアシルグリセリドのエステル交換を含む。工業規模のバイオディーゼル生産はしたがって地理的および季節的に植物油原料が生産される地域に制限される。エステル交換プロセスはバイオディーゼルとして利用可能な脂肪エステル(fatty ester)の混合物をもたらす。エステル交換プロセスの望ましくない副生物はグリセリンである。バイオディーゼルとして有用であるためには、脂肪エステルはさらに異質の生成物から精製されなければならない。これは脂肪エステル生産に要求されるコストおよびエネルギー量を増加させ、最終的にはバイオディーゼル生産も同様である。さらに、植物油原料は効率的でないエネルギー源である。というのはそれらは栽培のための広範な土地を必要とするからである。例えば、ナタネからのバイオディーゼルの収率は1300 L/ヘクタールのみである。というのは種油のみがバイオディーゼル生産に用いられ、ナタネのバイオマスの残りは用いられないからである。さらに、いくらかの植物油原料、例えば、ナタネおよびダイズの栽培には、土地の栄養素の枯渇を防ぐために頻繁な輪作が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
それゆえ、経済的かつエネルギー的に効率のよいバイオ燃料および再生可能な エネルギー源、例えば、バイオマスからバイオ燃料を作る方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
概要
本発明は、組換え細胞からの脂肪酸誘導体の生産に関する。一般に、脂肪酸誘導体は、脂肪酸誘導体酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子を発現または過剰発現させることによって生産される。さらに、アシル-CoA デヒドロゲナーゼ酵素をコードする遺伝子を、遺伝子の発現が減弱するよう組換え細胞において改変してもよい。
【０００９】
１つの側面において、本発明は、以下の少なくとも１つを含む組換え細胞を提供する：(a) 脂肪酸誘導体酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子、その遺伝子は、遺伝子が過剰発現するように改変されている、および(b)アシル-CoA デヒドロゲナーゼ酵素をコードする遺伝子、その遺伝子は、遺伝子の発現が減弱するように改変されている。脂肪酸誘導体酵素遺伝子をコードする改変された遺伝子は、アシル-CoA シンターゼ、チオエステラーゼ、エステルシンターゼ、アルコール アシルトランスフェラーゼ、アルコール デヒドロゲナーゼ、アシル-CoA レダクターゼ、または脂肪アルコール形成 アシル-CoA レダクターゼをコードする遺伝子でありうる。１つの態様において、改変された遺伝子は、アシル-CoA シンターゼ、チオエステラーゼまたはエステルシンターゼをコードする。いくつかの態様において、アシル-CoA シンターゼおよびチオエステラーゼ および/またはエステルシンターゼが 改変されている。いくつかの態様において、細胞はまた、輸送タンパク質をコードする遺伝子を含む。
【００１０】
本発明の組換えまたは宿主細胞は、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、カンジダ・リポリティカ（Candida lipolytica）、大腸菌、アルスロバクター（Arthrobacter）、ロドトルラ・グルチニンス（Rhodotorula glutinins）、アシネトバクター（Acinetobacter）、カンジダ・リポリティカ、ボツリオコッカス・ブラウニ（Botryococcus braunii）、ビブリオ・ファーニッシ（Vibrio furnissii）、ミクロコッカス・ルテウス（Micrococcus leuteus）、ステノトロホモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）またはバチルス・スブチリス（Bacillus subtilis） 細胞、例えば、アルスロバクター AK 19、アシネトバクター・エスピー・株 M-1、大腸菌 B、大腸菌 C、大腸菌 Kまたは大腸菌 W 細胞であり得る。別の態様において、組換え細胞はラン藻細胞、例えば、シネコシスティス・エスピー（Synechocystis sp.）PCC6803またはシネココッカス・エロンガツス（Synechococcus elongatus） PCC7942 細胞である。さらに別の態様において、組換え細胞は、植物、動物またはヒト細胞である。あるいは、組換え細胞は、細菌、酵母、または糸状菌からの微生物細胞である。
【００１１】
第二の側面において、本発明は、脂肪酸誘導体を生産することが出来る組換え細胞を提供し、ここで、該細胞は脂肪酸誘導体酵素をコードする少なくとも１つの外来性核酸配列を含むように改変されている。外来性核酸配列は、アシル-CoA シンターゼ、チオエステラーゼ、エステルシンターゼ、アルコール アシルトランスフェラーゼ、アルコール デヒドロゲナーゼ、アシル-CoA レダクターゼ、または脂肪アルコール形成 アシル-CoA レダクターゼをコードするものでありうる。いくつかの態様において、細胞は、脂肪酸誘導体酵素をコードする少なくとも２つの外来性核酸配列、例えば、アシル-CoA シンターゼをコードする第一の外来性核酸配列およびチオエステラーゼまたはエステルシンターゼをコードする第二の外来性核酸配列を含むように改変されている。別の態様において、脂肪酸誘導体酵素をコードする遺伝子は、組換え細胞における発現のためにコドンを至適化するように改変されている。
【００１２】
１つの態様において、組換え細胞は、アシル-CoA シンターゼをコードする改変された遺伝子、例えば、 fadD、fadK、BH3103、yhfL、Pfl-4354、EAV15023、fadD1、fadD2、RPC_4074、fadDD35、fadDD22、faa3p またはタンパク質 ZP_01644857をコードする遺伝子を含む。アシル-CoA シンターゼ遺伝子の例は、結核菌（M. tuberculosis） HR7Rv由来のfadDD35 [NP_217021]、枯草菌（B. subtilis）由来のyhfL [NP_388908]、緑膿菌（P. aeruginosa） PAO1由来のfadD1[NP_251989]、ステノトロホモナス・マルトフィリア R551-3由来のタンパク質 ZP_01644857をコードする遺伝子、またはサッカロマイセス・セレビシエ由来のfaa3p [NP_012257]である。
【００１３】
第二の態様において、組換え細胞は、チオエステラーゼをコードする改変された遺伝子、例えば tesA、tesA、tesB、fatB、fatB2、fatB3、fatB [M141T]、fatA またはfatA1を含む。
【００１４】
第三の態様において、組換え細胞は、エステルシンターゼ、例えば、アシネトバクター・エスピーピー、アルカニボラックス・ボルクメンシス（Alcanivorax borkumensis）、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、サッカロマイセス・セレビシエ、ヒト、シモンジア・チネンシス（Simmondsia chinensis）、モルチエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）、クリプトコッカス・クルヴァツス（Cryptococcus curvatus）、アルカニボラックス・ ジャデンシス（Alcanivorax jadensis）、アルカニボラックス・ボルクメンシス、アシネトバクター・エスピー・HO1-N またはロドコッカス・オパクス（Rhodococcus opacus）から得られたエステルシンターゼ遺伝子をコードする改変された遺伝子を含む。エステルシンターゼ遺伝子の例としては、シモンジア・チネンシス、アシネトバクター・エスピー・株 ADP1、アルカニボラックス・ボルクメンシス、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、ファンディバクター・ジャデンシス（Fundibacter jadensis）、シロイヌナズナ、またはアルカリゲネス・エウトロファス（Alkaligenes eutrophus）からの二機能性 エステルシンターゼ/アシル-CoA:ジアシルグリセロール アシルトランスフェラーゼであるwax/dgatが挙げられる。
【００１５】
１つの態様において、本発明の組換え細胞はさらに、発現または過剰発現されるように改変されているpdh、panK、aceEF、fabH、fabD、fabG、acpP、およびfabF遺伝子の少なくとも１つを含む。第二の態様において、組換え細胞はさらに、遺伝子の発現が減弱されるように改変されているfadE、gpsA、ldhA、pflB、adhE、pta、poxB、ackA、およびackB遺伝子の少なくとも１つを含む。第三の態様において、組換え細胞はさらに、plsB およびsfaの少なくとも１つの改変された遺伝子を含む。
【００１６】
別の態様において、アシル-CoA デヒドロゲナーゼ酵素をコードする遺伝子が欠失されている。
【００１７】
本発明による組換え細胞は、非組換え細胞、例えば、それ以外は同一である非組換え細胞または類似の系譜および表現型の細胞と比較してより多くのアシル-CoAを生産する。
【００１８】
本発明はさらに、本明細書に開示する組換え細胞によって生産される組成物を提供する。組換え細胞から生産される脂肪酸誘導体を含む組成物は以下を含みうる：約 50 ppm以下の(less than or equal to)ヒ素、約 30 ppm、約 25 ppm、または約 10-50 ppmの間のヒ素;約 200 ppm以下のカルシウム、約 150 ppmのカルシウム、約 119 ppmのカルシウムまたは約 50-200 ppm の間のカルシウム;約 200 ppm以下の塩素、約 150 ppmの塩素、約 119 ppmの塩素または約 50-200 ppm の間の塩素;約 50 ppm以下の銅、約 30 ppm の銅、約 23 ppmの銅、または約 10-50 ppmの間の銅;約 300 ppm以下の鉄、約 200 ppm の鉄、約 136 ppm の鉄、または約 50-250 ppm の間の鉄;約 50 ppm以下の鉛、約 30 ppmの鉛、約 25 ppm の鉛、または約 10-50 ppmの間の鉛;約 50 ppm以下のマンガン、約 30 ppm のマンガン、約 23 ppm のマンガン、または約 10-50 ppmの間のマンガン;約 50 ppm以下のマグネシウム、約 30 ppmのマグネシウム、約 23 ppm のマグネシウム、または約 10-50 ppm の間のマグネシウム;約 0.5 ppm以下の水銀、約 0.1 ppm の水銀、約 0.06 ppm の水銀または約 0.01-0.2 ppm の間の水銀;約 50 ppm以下のモリブデン、約 30 ppm のモリブデン、約 23 ppm のモリブデンまたは約 10-50 ppmの間のモリブデン;約 2%以下の窒素; 約 1% の窒素、約 0.5% の窒素、または約 0.1-1% の間の窒素; 約 200 ppm以下のカリウム、約 150 ppm のカリウム、約 103 ppm のカリウム、または約 50-200 ppmの間のカリウム;約 300 ppm以下のナトリウム、200 ppm のナトリウム、約 140 ppm のナトリウム、または約 50-300 ppm の間のナトリウム;約 1 ppm以下の硫黄、約 1%以下の硫黄、約 0.14% の硫黄、または約 0.05-0.3% の間の硫黄; 約 50 ppm以下の亜鉛、約 30 ppm の亜鉛、約 23 ppmの亜鉛、または約 10-50 ppm の間の亜鉛; または約 700 ppm以下のリン、約 500 ppm のリン、約 350 ppm のリン、または約 100-700 ppm の間のリン。
【００１９】
１つの側面において、本発明の組換え細胞によって生産される組成物は、脂肪酸誘導体の還元末端から炭素鎖の7位に二重結合(C7 とC8の間)を有する脂肪酸を含む。いくつかの態様において、組成物は、C5-C25 脂肪エステルまたはC10-C20 脂肪エステルまたはC12-C18 脂肪エステルを含む。別の態様において、脂肪酸誘導体は、直鎖脂肪酸誘導体、分枝鎖脂肪酸誘導体、環状部分を含む。さらに別の態様において、脂肪酸誘導体は不飽和であるか (例えば、モノ不飽和)または飽和である。 
【００２０】
別の側面において、組成物は、アルコールおよびアシル-CoAから生産される脂肪エステルを含み、ここでアルコールは少なくとも 約 1、約 2、約 3、約 4、約 5、約 6、約 7、約 8、約 10、約 12、約 14、約 16、または約 18 炭素長であり、アシル-CoAは少なくとも 約 2、約 4、約 6、約 8、約 10、約 12、約 14、約 16、約 18、約 20、約 22、約 24、または約 26 炭素長である。いくつかの態様において、脂肪エステルが生産されるアルコールおよびアシル-CoAは、約 2、約 4、約 6、約 8、約 10、約 12または約 14 炭素原子異なる。
【００２１】
１つの態様において、本発明の組換え細胞によって生産される組成物の現代炭素比(fraction of modern carbon)は約 1.003から約 1.5である。
【００２２】
別の側面において、本発明は、以下の工程を含む組換え細胞における脂肪酸誘導体の生産方法を提供する： a)組換え細胞を得る工程; b)組換え細胞を培養する工程、およびc) 脂肪酸誘導体を生産する工程。
【００２３】
さらなる側面において、本発明は、以下の工程を含む組換え細胞における脂肪酸誘導体の生産を上昇させる方法を提供する：脂肪酸誘導体酵素をコードする外来性核酸を組換え細胞に導入する工程、および外来性核酸を発現させる工程、ここで、組換え細胞における核酸の発現の結果、非組換え細胞、例えば、それ以外は同一の非組換え細胞または類似の系譜 および表現型の細胞と比較しての脂肪酸誘導体の生産が上昇する。いくつかの態様において、外来性核酸は、アシル-CoA シンターゼ、チオエステラーゼまたはエステルシンターゼをコードする。別の態様において、アシル-CoA シンターゼ、チオエステラーゼおよびエステルシンターゼをコードする外来性核酸が組換え細胞に導入される。別の態様において、組換え細胞における脂肪酸誘導体の生産レベルを上昇させる方法が提供され、かかる方法は以下の工程を含む:核酸コンストラクトを宿主細胞に導入する工程、該核酸コンストラクトは、以下の(a) および(b) を含む：(a)配列番号2、配列番号3、配列番号6、配列番号9 または配列番号13の脂肪酸誘導体酵素をコードする核酸配列、および(b)核酸配列の発現のための制御配列; 核酸配列を発現させる工程;および脂肪酸誘導体を得る工程。
【００２４】
さらに別の側面において、本発明は、脂肪酸誘導体酵素をコードする核酸配列を含む組換えコンストラクトを提供し、ここで、核酸配列は、脂肪酸誘導体酵素をコードする遺伝子を過剰発現するように改変されている。１つの態様において、核酸配列は、アシル-CoA シンターゼ、チオエステラーゼまたはエステルシンターゼをコードする遺伝子を過剰発現するように改変されている。第二の態様において、核酸配列は、 (1)アシル-CoA シンターゼをコードする遺伝子、および(2)チオエステラーゼまたはエステルシンターゼをコードする遺伝子を過剰発現するように改変されている。第三の態様において、核酸配列は、 (1)アシル-CoA シンターゼ、(2)チオエステラーゼ、および(3) エステルシンターゼをコードする遺伝子を過剰発現するように改変されている。第四の態様において、コンストラクトはさらに、アシル-CoA デヒドロゲナーゼの発現が減弱するように改変されているアシル-CoA デヒドロゲナーゼをコードする核酸配列を含む。かかる組換えコンストラクトを含むベクターも本発明によって提供される。いくつかの態様において、ベクターはさらに、形質転換細胞の選択を提供する構造遺伝子を含む。
【００２５】
別の側面において、本発明は、以下の工程を含む宿主細胞における脂肪酸誘導体の生産を上昇させる方法を提供する:宿主細胞をヌクレオチド配列で形質転換して、宿主細胞に脂肪酸誘導体酵素遺伝子を発現または過剰発現させる工程、ここで、宿主細胞における脂肪酸誘導体の生産は、形質転換されていない細胞と比較して上昇している。かかる方法において、宿主細胞は、生産された脂肪酸誘導体を得るために収集および溶解されうる。あるいは、宿主細胞は輸送タンパク質をコードするヌクレオチド配列によって形質転換され、宿主細胞は脂肪酸誘導体を細胞外に放出する。
【００２６】
さらに別の側面において、本発明は、宿主細胞において機能的なプロモーターに作動可能に連結した脂肪酸誘導体酵素をコードする核酸配列を含むベクターを提供し、ここで、核酸配列は、アシル-CoA シンターゼをコードする第一の核酸配列およびチオエステラーゼまたはエステルシンターゼをコードする第二の核酸配列を含む。ベクターはさらに輸送タンパク質をコードする核酸配列を含んでいてもよい。１つの態様において、第二の核酸配列はチオエステラーゼをコードし、ベクターはさらにエステルシンターゼをコードする第三の核酸配列を含む。第二の態様において、ベクターはさらに輸送タンパク質をコードする核酸配列を含む。
【００２７】
さらなる側面において、本発明は、以下の工程を含む脂肪酸誘導体の生産方法を提供する: (a)本発明のベクターを含む宿主細胞を提供する工程、および(b)宿主細胞を培養して脂肪酸誘導体を生産させる工程。いくつかの態様において、生産された脂肪酸誘導体を得るために宿主細胞の培養物からの上清が収集される。かかる方法により生産された脂肪酸誘導体も本発明によって提供される。
【００２８】
１つの側面において、本発明によって生産される脂肪酸誘導体はバイオ燃料組成物として使用することができる。脂肪酸誘導体は、バイオディーゼル、脂肪アルコール、脂肪エステル、トリアシルグリセリド、ガソリンまたはジェット燃料として使用することができる。
【００２９】
別の側面において、本発明の組換え細胞によって生産される組成物は、脂肪エステルおよび遊離脂肪酸を含む。例えば、１つの態様において、遊離脂肪酸の重量パーセンテージは少なくとも 約 1%、約 2%、約 3%、約 4%、約 5%、約 6%、約 7%、約 8%、約 9%、約 10%、約 15%、約 20%、または約 25%である。別の態様において、生産される脂肪エステルの重量パーセンテージは少なくとも 約 50%、約 55%、約 60%、約 65%、約 70%、約 75%、約 80%、約 85%、または約 90%である。さらなる態様において、脂肪エステルの遊離脂肪酸に対する比は、約 10:1、約 9:1、約 8:1、約 7:1、約 5:1、約 2:1または約 1:1である。
【００３０】
１つの態様において、本発明によって生産される組成物は脂肪エステル（fatty ester)を含み、ここで脂肪エステルは以下の少なくとも１つである: エチルドデカノエート、エチルトリデカノエート、エチルテトラデカノエート、エチルペンタデカノエート、エチルシス-9-ヘキサデセノエート、エチルヘキサデカノエート、エチルヘプタデカノエート、エチルシス-11-オクタデセノエート、エチルオクタデカノエート、またはそれらの組合せ。
【００３１】
第二の態様において、本発明によって生産される組成物は遊離脂肪酸を含み、ここで遊離脂肪酸は以下の少なくとも１つである: ドデカン酸、テトラデカン酸、ペンタデカン酸、シス-9-ヘキサデセン酸、ヘキサデカン酸、シス-11-オクタデセン酸、またはそれらの組合せ。 
【００３２】
これらの態様の組成物も、バイオ燃料、例えば、バイオディーゼル、脂肪アルコール、脂肪エステル、トリアシルグリセリド、ガソリンまたはジェット燃料として使用することができる。
【００３３】
いくつかの態様において、本明細書に開示する組成物は、総遊離脂肪酸に対するC12 遊離脂肪酸の重量パーセンテージが少なくとも 約 5%、10%、または15%である。別の態様において、本明細書に開示する組成物は、総遊離脂肪酸に対するC14 遊離脂肪酸の重量パーセンテージが少なくとも 約 20%、30%、または40%である。別の態様において、本明細書に開示する組成物は、総遊離脂肪酸に対する C15 遊離脂肪酸の重量パーセンテージが少なくとも 約 1% または2%である。別の態様において、本明細書に開示する組成物は、総遊離脂肪酸に対するC16 遊離脂肪酸の重量パーセンテージが少なくとも 約 20%、30%、または40%である。別の態様において、本明細書に開示する組成物は、総遊離脂肪酸に対するC18 遊離脂肪酸の重量パーセンテージが少なくとも 約 15%、20%、または25%である。
【００３４】
いくつかの態様において、本明細書に開示する組成物は、総脂肪エステルに対するC12 脂肪エステルの重量パーセンテージが少なくとも 約 1%、2%、または3%である。別の態様において、本明細書に開示する組成物は、総脂肪エステルに対する C14 脂肪エステルの重量パーセンテージが少なくとも 約 10%、15%、または20%である。別の態様において、本明細書に開示する組成物は、総脂肪エステルに対する C16 脂肪エステルの重量パーセンテージが少なくとも 約 30%、40%、または50%である。別の態様において、本明細書に開示する組成物は、総脂肪エステルに対するC18 脂肪エステルの重量パーセンテージが少なくとも 約 20%、30%、または40%である。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図 1は、脂肪酸誘導体生産を上昇させるために過剰発現または減弱されうる様々な遺伝子を同定する表である。この表はまた、脂肪酸誘導体生成物の構造を変化させるために調節されうる様々な遺伝子も同定する。脂肪酸誘導体の構造を変化させるために用いられる遺伝子のいくつかは、脂肪酸誘導体の生産も上昇させる。
【図２】図 2は、FAS 生合成経路を示す図である。
【図３】図 3は、以下の酵素によって触媒される工程を含むベータ酸化経路を示す図である： (1) アシル-CoA シンターゼ (EC 6.2.1.-)、(2) アシル-CoA デヒドロゲナーゼ (EC 1.3.99.3)、(3) エノイル-CoA ヒドラターゼ (EC 4.2.1.17); (4) 3-ヒドロキシブチリル-CoA エピメラーゼ (EC 5.1.2.3)、および (5) 3-ケトアシル-CoA チオラーゼ (EC 2.3.1.16)。このβ-酸化サイクルの最終反応は、アセチル-CoA および２炭素短いアシル- CoA 脂肪酸を放出し、これはβ-酸化反応に再び入る。
【図４】図 4は、提供された基質に応じた脂肪エステルを生産する生合成経路を示す図である。
【図５】図 5は、脂肪アルコールを生産する 生合成経路を示す図である。
【図６】図 6は、脂肪エステルを生産する 生合成経路を示す図である。
【図７】図 7は、pCDFDuet-1-fadD-acr1および様々な チオエステラーゼ遺伝子を含むプラスミドによって共形質転換された実施例5に記載の株による脂肪アルコール 生産を示すグラフである。飽和C10、C12、C14、C16 およびC18 脂肪アルコールが同定された。
【図８】図 8は、生産株からの脂肪アルコールの放出を示すグラフである。37℃で培養した場合、生産された脂肪アルコールのおよそ 50%が細胞から放出された。
【図９】図 9A-Dは、アルコール アセチル トランスフェラーゼ (AAT、EC 2.3.1.84)を発現する生産宿主およびエステルシンターゼ (EC 2.3.1.20、2.3.1.75)を発現する生産宿主によって生産されたオクチルオクタノエート (C8C8)のGS-MS スペクトルを示すプロットである。図 9Aは、株 C41(DE3、ΔfadE/pHZ1.43)/pRSET B+pAS004.114B)の酢酸エチル 抽出物を示すGC-MS スペクトルであり、ここで、 pHZ1.43 プラスミドはADP1 エステルシンターゼ (EC 2.3.1.20、2.3.1.75)を発現した。図 9Bは、株 C41(DE3、ΔfadE/pHZ1.43)/pRSET B+pAS004.114B)の酢酸エチル 抽出物を示すGC-MS スペクトル であり、ここで、pHZ1.43 プラスミドはSAATを発現した。図 9Cは、株 C41(DE3、ΔfadE/pHZ1.43)/pRSET B+pAS004.114B) の酢酸アセチル 抽出物を示すGC-MS スペクトルであり、ここで、pHZ1.43 プラスミドはADP1 (エステルシンターゼ) または SAATを含まなかった。図 9Dは、C41(DE3、ΔfadE/pHZ1.43)/pRSET B+pAS004.114Bによって生産されたC8C8のマススペクトルおよびフラグメンテーションパターンを示すGC-MS スペクトルであり、ここで pHZ1.43 プラスミドは SAATを発現した。
【図１０】図 10は、生産宿主においてA. baylyi ADP1からのエステルシンターゼ (WSadp1)をCuphea hookerianaからのチオエステラーゼ遺伝子と共発現させた場合に作られたエチルエステルの分布を示すグラフである。
【図１１】図 11は、25℃での様々な エステルシンターゼによるエチルエステルの生産を示すグラフである。エチルエステルは、様々な エステルシンターゼ遺伝子を担持する組換え 大腸菌 株によって生産された。組換え株は、1 pHZ1.43; 2.  pHZ1.97_377; 3. pHZ1.97_atfA2; 4. pHZ1.97_376; 5. pHZ1.97_atfA1;を有する、6. プラスミドを有さない(対照) 1. C41 (DE3、ΔfadEΔfabR)/pETDuet-1-tesA + pCDFDuet-1-fadDであった。
【図１２】図 12は、様々な 大腸菌 株から生産された脂肪酸 エチルエステル (FAEE)のアシル 組成を示すグラフである。組換え 株は、1 pHZ1.43; 2.  pHZ1.97_377; 3. pHZ1.97_atfA2; 4. pHZ1.97_376; 5. pHZ1.97_atfA1を有する; 6.プラスミドを有さない(対照)1. C41 (DE3、ΔfadEΔfabR)/ pETDuet-1-tesA + pCDFDuet-1-fadDである。
【図１３】図 13は、 37℃での様々な エステルシンターゼによるエチルエステルの生産を示すグラフである。エチルエステルは様々な エステルシンターゼ遺伝子を担持する組換え 大腸菌 株によって生産された。組換え 株は、 1 pHZ1.43; 2.  pHZ1.97_377; 3. pHZ1.97_atfA2; 4. pHZ1.97_376;  5. pHZ1.97_atfA1を有する、; 6. プラスミドを有さない(対照)、1. C41 (DE3、ΔfadEΔfabR)/ pETDuet-1-tesA + pCDFDuet-1-fadDであった。
【図１４】図 14は、形質転換体、C41 (DE3、ΔfadEΔfabR)/ pETDuet-1-tesA + pCDFDuet-1-fadD +pHZ1.97_atfA2 tからの３つの個々のコロニーから生産された遊離脂肪酸(FFA)および脂肪酸 エチルエステル(FAEE)の濃度を示すグラフである。FFAは脂肪酸 エチルエステル (FAEE)に変換され、GC/MSにより定量された。
【図１５】図 15は、FabAおよびFabBについての制御領域を示す図である。FadRおよびFabR コンセンサス結合部位を太字で示す。垂直の矢印は、fabA 発現を変化させるために突然変異が行われうる位置を示す。各位置について提案される塩基も括弧により示す。典型的な 大腸菌 プロモーターの-35および-10 領域を構成する２つの領域を括弧によって示す。プロモーターをコンセンサス プロモーター 配列の近くに位置させる提案される突然変異も示される。
【図１６】図 16Aおよび図 16Bは、GC/MS 分析を示すクロマトグラムである。図 16Aは、プラスミドpCDFDuet-1-fadD-WSadp1、pETDuet-1-’tesAにより形質転換された大腸菌 LS9001 株の培養物のエチル 抽出物を示すクロマトグラムである。図 16Bは、参照として用いたエチルヘキサデカノエートおよびエチルオレエートを示すクロマトグラムである。
【図１７】図 17は、pOP-80 プラスミドの地図である。
【図１８】図 18は、配列番号1、pOP-80 プラスミドの全長 DNA 配列である。
【図１９】図 19は、配列番号2、大腸菌のコドン最適化した fadD35 遺伝子のDNA 配列(受入番号(accession code) NP_217021)である。
【図２０】図 20は、配列番号3、大腸菌のコドン最適化した fadD1 遺伝子のDNA 配列(受入番号 NP_251989) である。
【図２１】図 21は、配列番号4、NCBIに受入番号 NC_000964にて寄託されたDNA 配列に基づくBsyhfLBspHIF プライマーである。
【図２２】図 22は、配列番号5、NCBIに受入番号 NC_000964にて寄託されたDNA 配列に基づくBsyhfLEcoR プライマーである。
【図２３】図 23は、配列番号6、バチルス・スブチリスからのyhfL 遺伝子のDNA 配列である。
【図２４】図 24は、配列番号7、NCBIに受入番号 NC_001141にて寄託されたDNA 配列に基づくScfaa3pPciF プライマーである。
【図２５】図 25は、配列番号8、NCBIに受入番号 NC_0011411にて寄託されたDNA 配列に基づく Scfaa3pPciI プライマーである。
【図２６】図 26は、配列番号9、サッカロマイセス・セレビシエ からのFAA3 遺伝子のDNA 配列(NP_012257)である。
【図２７】図 27は、配列番号10、NCBIに受入番号 NZ_AAVZ01000044にて寄託されたDNA 配列に基づくSmprk59BspF プライマーである。
【図２８】図 28は、配列番号11、NCBIに受入番号 NZ_AAVZ01000044にて寄託されたDNA 配列に基づくSmprk59HindR プライマーである。
【図２９】図 29は、配列番号12、PrkBsp プライマーである。
【図３０】図 30は、配列番号13、ステノトロホモナス・マルトフィリア R551-3からのタンパク質 ZP_01644857をコードするDNA 配列である。
【図３１】図 31は、配列番号14、ステノトロホモナス・マルトフィリア ATCC 17679からのZP_01644857のタンパク質 配列である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
略語および用語
以下の用語および方法の説明は、本開示を詳細に説明するため、および本開示を実施する当業者へのガイドのために提供する。本明細書において用いる場合、単数形「ある」または「１つの」または「その」は、特に断りのない限り複数形を包含する。例えば、「ある細胞」または「その細胞」という言及は、１または複数のかかる細胞を含む。用語「または」とは、特に断りのない限り、記載された選択肢である複数の要素の１つの要素または２以上の要素の組合せを意味する。例えば、「チオエステラーゼ活性または脂肪アルコール-形成アシル-CoAレダクターゼ活性」という表現は、チオエステラーゼ 活性、脂肪アルコール 形成アシル-CoAレダクターゼ 活性、またはチオエステラーゼ活性と脂肪アルコール形成 アシル-CoA レダクターゼ活性との両方の組合せを指す。さらに、明細書全体にわたって、省略された 遺伝子名または酵素名を用いて言及がなされることがあるが、かかる省略された 遺伝子または酵素名は遺伝子または酵素の属を表すことが理解される。例えば、「fadD」は、酵素「FadD」をコードする遺伝子、ならびにアシル-CoA シンターゼ (EC 6.2.1.-)をコードする遺伝子をいう。かかる遺伝子名は、同じ生理学的機能を有する同じペプチドおよび相同の酵素をコードするすべての遺伝子を含み、酵素名は、同じ基本的な化学反応を触媒するかまたは同じ活性を有するすべてのペプチドを含む。図 1は、様々な 省略された 遺伝子およびペプチド名、それらの活性の説明、およびそれらの酵素 分類番号を提供する。これらは、脂肪酸誘導体を生産するのに用いることが出来る、関連する活性を有する酵素およびそれらの関連する遺伝子のクラスのその他のメンバーを同定するのに用いることが出来る。
【００３７】
特に断りのない限り、本明細書において用いるすべての技術および科学用語は本開示が属する分野の当業者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載するものと類似または同等の方法および材料が本開示の実施または試験において使用できるが、好適な方法および材料を以下に記載する。材料、方法および実施例は単に例示のためのものであり、限定の意図はない。本開示のその他の特徴は以下の詳細な説明および請求の範囲から明らかである。
【００３８】
受入番号: 本明細書にわたり、受入番号は、米国の国立衛生研究所により維持されるNCBI データベース (National Center for Biotechnology Information)に由来する。受入番号は、2007年3月27日にデータベースにおいて提供されているものである。
【００３９】
酵素分類番号 (EC): EC番号は、Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB)によって確立されている (http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/にて入手可能)。本明細書において提供されているEC 番号は東京大学に部分的に支援されているKyoto Encyclopedia of Genes and Genomicsに維持されているKEGG Ligand データベースに由来する。EC番号は、2007年3月27日にデータベースにおいて提供されているものである。
【００４０】
減弱する: 弱める、低減させるまたは減少させること。一例において、フィードバック阻害あるいは生成物または反応物ではない組成物によってもたらされる阻害(非経路特異的フィードバック) に対する特定の酵素の感受性は酵素 活性が化合物の存在によって影響されないように低減される。別の例において、fabH 遺伝子の発現は温度感受性であり、その配列は、温度の変動に対する感受性を低下させるように変化されうる。fabH 遺伝子の発現は、分枝アミノ酸が望ましい場合減弱されうる。別の例において、活性が低くなるように改変された酵素は、減弱されたと称されうる。
【００４１】
酵素をコードする配列の機能的改変は、酵素の発現の減弱のために利用することが出来る。配列の改変は、例えば、遺伝子配列または遺伝子配列の転写または翻訳を制御する配列における１以上のヌクレオチドの突然変異、欠失または挿入を含み得、かかる改変により、遺伝子産物の生産の低減または阻害が導かれるか、あるいは遺伝子産物が非機能的とされる。例えば、大腸菌におけるfabRの機能的欠失は、脂肪酸 生合成経路の抑制を低下させ、それにより大腸菌がより多くの不飽和脂肪酸(UFA)を生産することが可能となる。いくつかの場合において、機能的欠失はノックアウト 突然変異として記載される。
【００４２】
酵素の発現を減弱するためにその他の方法を利用することもできる。例えば、減弱は、遺伝子をコードする配列を上記のように改変することによって; 遺伝子をより活性の低いプロモーターの制御下に置くことによって、目的の遺伝子を標的とする干渉RNA、リボザイムまたはアンチセンス 配列を発現させることによって;物理的または化学的環境、例えば、温度、pH、または溶質 濃度を、遺伝子または遺伝子産物の最適活性が実現しないように変化させることによって;あるいは当該技術分野において知られているいずれかのその他の技術によって、達成することが出来る。
【００４３】
バイオ燃料:「バイオ燃料」という用語は、バイオマスに由来するあらゆる燃料をいう。
【００４４】
バイオマスは、バイオ燃料に変換することができる生物学的物質である。１つの例示的なバイオマスの源は植物材料である。例えば、トウモロコシ、サトウキビ、およびスイッチグラスをバイオマスとして利用することができる。バイオマスの別の非限定的な例は動物材料、例えば、牛糞肥料である。バイオマスは、工業、農業、林業、および家庭からの廃棄物も含む。バイオマスとして利用することが出来るかかる廃棄物の例としては、発酵廃液、わら、材木、汚泥、廃物および食品廃棄物が挙げられる。バイオマスはまた、炭素源、例えば、炭水化物(例えば、糖)も含む。 
【００４５】
バイオ燃料は石油に基づく燃料の代替となりうる。例えば、バイオ燃料は、輸送燃料 (例えば、ガソリン、ディーゼル、ジェット燃料等)、暖房用燃料および発電燃料を含む。バイオ燃料は再生可能な エネルギー源である。バイオ燃料の非限定的な例は、バイオディーゼル、炭化水素 (例えば、アルカン、アルケン、アルキン、または芳香族 炭化水素)、およびバイオマス由来のアルコールである。
【００４６】
バイオディーゼル:バイオディーゼルはバイオ燃料である。バイオディーゼルは石油由来であるディーゼルの代替物となりうる。バイオディーゼルは、「純」 バイオディーゼルと称される純粋な形態、またはいずれかの濃度にて石油に基づくディーゼルとの混合物として内燃 ディーゼル エンジンにおいて利用することが出来る。
【００４７】
バイオディーゼルは炭化水素またはエステルから構成されうる。１つの態様において、バイオディーゼルは、脂肪エステル、例えば、脂肪酸 メチルエステル(FAME)または脂肪酸 エチルエステル(FAEE)から構成される。好ましい態様において、これらの FAMEおよびFAEEは、炭素鎖長が約 8-20、10-18、または12-16 炭素長である脂肪アシル 部分から構成される。バイオディーゼルとして使用される脂肪エステルは、飽和または不飽和の炭素鎖を含みうる。
【００４８】
バイオクルード(Biocrude):バイオクルードはバイオ燃料である。バイオクルードは、石油に基づく燃料の代替物として利用することが出来る。さらに、バイオクルードは原油のように、その他の燃料、例えば、ガソリン、ディーゼル、ジェット燃料、または暖房用の油へと変換することができる。さらに、バイオクルードは原油のように、例えば、医薬品、化粧品、消費財、工業的 プロセス等における使用のためにその他の工業的に有用な 化学物質へと変換することができる。
【００４９】
バイオクルードは、例えば、炭化水素、炭化水素 生成物、脂肪酸 エステル、および/または脂肪族ケトンを含みうる。好ましい態様において、バイオクルードは炭化水素、例えば、脂肪族 (例えば、アルカン、アルケン、アルキン)または芳香族炭化水素から構成される。 
【００５０】
炭素源:一般に、原核または単純な真核細胞の生育のための炭素の源として使用されるのに好適な基質または化合物をいう。炭素源は様々な形態であり得、例えば、これらに限定されないが、ポリマー、炭水化物、酸、アルコール、アルデヒド、ケトン、アミノ 酸、ペプチド、ガス(例えば、COおよびCO2)等が挙げられる。これらには、例えば、様々な 単糖類、例えば、グルコース、フルクトース、マンノースおよびガラクトース; オリゴ糖類、例えば、フルクト-オリゴ糖 およびガラクト-オリゴ糖; 多糖類、例えば、キシロース、およびアラビノース; 二糖類、例えば、スクロース、マルトースおよびツラノース; セルロース性物質、例えば、メチル セルロースおよびナトリウム カルボキシメチル セルロース; 飽和または不飽和脂肪酸 エステル、例えば、コハク酸エステル、乳酸エステルおよび酢酸エステル; アルコール、例えば、エタノール等、またはそれらの混合物が含まれる。 
【００５１】
炭素源はさらに光合成産物であってもよく、これに限定されないが、グルコースが含まれる。
【００５２】
流体の曇り点:溶解した固体がもはや完全に可溶性でなくなり、第二相として沈殿して流体が曇った外観となる温度。この用語は様々な意義を有するいくつかの用途に関連する。
【００５３】
石油工業において、曇り点とは、その温度より低い温度では、ろう(wax)またはその他の重炭化水素が原油、精製油または燃料中にて結晶化し、曇った外観を形成する温度をいう。固化したろうの存在は、流体の流れる挙動、燃料 フィルター/インジェクター等を詰まらせる傾向、冷たい表面(例えば、パイプラインまたは熱交換器ファウリング(fouling))上のろうの蓄積、さらに水との乳化特性に影響を及ぼす。 曇り点は、冷たい作動温度にてフィルターまたは小さい開口部を塞ぐ油の傾向の指標である。
【００５４】
非イオン性界面活性剤またはグリコール溶液の曇り点は、混合物が相分離しはじめて二相が現れ、その結果曇りはじめる温度である。この挙動は、ポリオキシエチレン鎖を含む非イオン性界面活性剤に特徴的であり、水中での温度 挙動に対して逆の溶解性を示し、それゆえ温度が上がるとある点で「曇り始める(cloud out)」。この挙動を示すグリコールは、「曇り点 グリコール」として知られ、シェール阻害剤として用いられる。曇り点は塩分により影響され、より塩分の多い流体において一般により低い。
【００５５】
曇り点 低下添加剤:上記のような溶液の曇り点を低下または下降させるために組成物に添加されうる添加剤。
【００５６】
検出可能:存在またはあることが確認できること。例えば、反応物からの生成物の生成 (例えば、C18 脂肪酸の生成)は以下に提供する方法を用いて検出可能である。
【００５７】
内因性:核酸分子および特定の細胞または微生物に言及する際に本明細書において用いる場合、「内因性」とは、細胞中にあり、組換え操作技術を用いて細胞に導入されたものではない核酸配列またはペプチドをいう。例えば、細胞が最初から自然から単離されていた場合、細胞に存在していた遺伝子である。組換え技術によって転写または翻訳を活性化する制御配列、例えば、プロモーターまたはエンハンサー 配列が変化されていたとしても遺伝子は依然として内因性であるとみなされる。
【００５８】
エステルシンターゼ:エステルシンターゼは、脂肪エステルを生成することができるペプチドである。より具体的には、エステルシンターゼは、チオエステルを脂肪エステルに変換するペプチドである。好ましい態様において、エステルシンターゼは、チオエステル、アシル-CoAを脂肪エステルに変換する。 
【００５９】
別の態様において、エステルシンターゼは、チオエステルおよびアルコールを基質として用いて脂肪エステルを生成する。エステルシンターゼは、短鎖および長鎖 アシル-CoAを基質として用いることが出来る。さらに、エステルシンターゼは、短鎖および長鎖 アルコールを基質として用いることが出来る。
【００６０】
エステルシンターゼの非限定的な例は、ろう シンターゼ、ろう-エステルシンターゼ、アシル CoA:アルコール トランスアシラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、および脂肪アシル補酵素 A:脂肪アルコール アシルトランスフェラーゼである。例示的な エステルシンターゼは、酵素分類番号 EC 2.3.1.75に分類される。例示的な GenBank 受入番号は図 1に提供される。
【００６１】
外来性:核酸分子および特定の細胞に言及する際に本明細書において用いる場合、「外来性」とは、天然にみられる特定の細胞に由来しない核酸 分子をいう。例えば、「外来性 DNA」は、微生物のゲノム DNA 配列内に挿入されたDNA 配列、または微生物に導入された染色体外の 核酸配列をいうことがある。したがって、非天然 核酸分子はいったん細胞に導入されると細胞にとって外来性であるとみなされる。天然である核酸 分子は特定の細胞にとって外来性であることもあり得る。例えば、大腸菌 DH5α細胞から単離された全コード配列は、いったんコード配列が第２の大腸菌 DH5α 細胞に導入されると、両方の細胞が DH5α 細胞であるにもかかわらず、第２の大腸菌 DH5α 細胞にとって外来性核酸である。
【００６２】
発現:遺伝子における遺伝性の情報、例えば、DNA 配列が、機能的遺伝子産物、例えば、タンパク質またはRNAとなるプロセスである。
【００６３】
遺伝子 発現 プロセスにおけるいくつかの工程を調節することができ、例えば、転写 工程、翻訳工程、および結果として得られる タンパク質の翻訳後 改変が挙げられる。遺伝子 制御はその構造および機能についての細胞の制御を与え、それは細胞の 分化、形態形成およびあらゆる生物の万能性および適応性の基礎である。遺伝子制御は進化的変化のための基質として働くことも可能である。というのは、遺伝子 発現の時期、位置、および量の制御は、生物における遺伝子の機能(作用)に対して顕著な 効果を有しうるからである。
【００６４】
発現される遺伝子には、メッセンジャー RNA (mRNA) へと転写されてタンパク質へと翻訳される遺伝子、ならびにタンパク質へと翻訳されない種々のRNA、例えば トランスファー RNA (tRNA)、リボソーム RNA (rRNA)、および調節性RNAへと 転写される遺伝子が含まれる。
【００６５】
脂肪エステル:脂肪エステルはエステルである。好ましい態様において、脂肪エステルは、脂肪酸から作られたあらゆるエステル、例えば、脂肪酸 エステルである。
【００６６】
１つの態様において、脂肪エステルは、 A側 (即ち、カルボン酸酸素に結合した炭素鎖) およびB側 (即ち、親カルボン酸を構成する炭素鎖)を含む。好ましい態様において、脂肪エステルが脂肪酸 生合成経路に由来する場合、A側に寄与するのはアルコールであり、B側に寄与するのは脂肪酸である。 
【００６７】
あらゆるアルコールが脂肪エステルのA側 の形成に用いることが出来る。例えば、アルコールは脂肪酸 生合成経路由来のものであり得る。あるいは、アルコールは非脂肪酸 生合成経路を介して生成されたものでありうる。さらに、アルコールは外来性に提供されることもあり得る。例えば、アルコールは脂肪エステルが生物によって生成する場合においては発酵ブロスにおいて供給されうる。あるいは、カルボン酸、例えば、脂肪酸または酢酸は、アルコールも生成することができる生物によって脂肪エステルが生成される場合に外来性に供給されうる。
【００６８】
A側またはB側を構成する炭素鎖はあらゆる長さであり得る。１つの態様において、エステルのA側は、少なくとも 約 1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、14、16、または18 炭素長である。エステルのB側は少なくとも 約 4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、または 26 炭素長である。A側 および/またはB側は直鎖または分枝鎖であり得る。分枝鎖は１以上の 分枝点を有しうる。さらに、分枝鎖は環状分枝を含みうる。さらに、A側 および/またはB側は飽和または不飽和でありうる。不飽和である場合、A側 および/または B側は１以上の 不飽和点を有しうる。 
【００６９】
１つの態様において、脂肪エステルは生合成により生成される。この態様において、まず、脂肪酸が「活性化」される。「活性化」脂肪酸の非限定的な例は、アシル-CoA、アシル ACP、およびアシルリン酸である。アシル-CoAは脂肪酸 生合成または分解の直接生成物でありうる。さらに、アシル-CoAは、遊離脂肪酸、CoA、およびアデノシン ヌクレオチド 三リン酸 (ATP)から合成されうる。アシル-CoAを生成する酵素の一例はアシル-CoA シンターゼである。
【００７０】
脂肪酸が活性化された後、それは容易に受け取る側の求核剤へと移されうる。例示的な 求核剤は、アルコール、チオール、またはリン酸である。
【００７１】
別の態様において、脂肪エステルは、脂肪アシルチオエステルおよびアルコールに由来するものであり得る。 
【００７２】
１つの態様において、脂肪エステルはろうである。ろうは長鎖 アルコールおよび長鎖 脂肪酸に由来するものであり得る。別の態様において、脂肪エステルは、脂肪酸 チオエステル、例えば、脂肪アシル 補酵素 A (CoA)である。別の態様において、脂肪エステル は 脂肪アシルパントテン酸（panthothenate)、アシル アシル キャリアタンパク質 (ACP)、または脂肪 リン酸 エステルである。
【００７３】
脂肪エステルは多くの用途を有する。例えば、脂肪エステルは、バイオ燃料または界面活性剤として利用することが出来る。
【００７４】
脂肪酸誘導体:「脂肪酸誘導体」という用語は、部分的には生産宿主 生物の脂肪酸 生合成経路から作られた生成物を含む。「脂肪酸誘導体」はまた、部分的にアシル-ACPまたはアシル-ACP 誘導体から作られた生成物も含む。脂肪酸 生合成経路は脂肪酸 シンターゼ 酵素を含み、それは本明細書に記載のように脂肪酸誘導体を生成するように操作され得、いくつかの例において、所望の 炭素鎖 特徴を有する脂肪酸誘導体を生成するさらなる酵素とともに発現されうる。例示的な 脂肪酸誘導体としては、例えば、短鎖および長鎖 アルコール、炭化水素、および脂肪アルコールおよびエステル、例えば、ろう、脂肪酸 エステル、または脂肪エステルが挙げられる。
【００７５】
脂肪酸誘導体酵素:脂肪酸誘導体の生産において発現または過剰発現されうるすべての酵素は本明細書において脂肪酸誘導体酵素と総称される。これらの酵素は、脂肪酸 生合成経路の一部であり得る。脂肪酸誘導体 シンターゼの非限定的な例としては、脂肪酸 シンターゼ、チオエステラーゼ、アシル-CoA シンターゼ、アシル-CoA レダクターゼ、アルコール デヒドロゲナーゼ、アルコール アシルトランスフェラーゼ、脂肪アルコール形成 アシル-CoA レダクターゼ、およびエステルシンターゼが挙げられる。脂肪酸誘導体酵素は基質を脂肪酸誘導体へと変換する。いくつかの例において、基質は脂肪酸誘導体であり得、それを脂肪酸誘導体酵素が別の脂肪酸誘導体へと変換する。
【００７６】
脂肪アルコール形成 ペプチド:アシル CoAから脂肪アルコールへの変換を触媒することが出来るペプチドであり、脂肪アルコール形成 アシル-CoA レダクターゼ (FAR、EC 1.1.1.*)、アシル-CoA レダクターゼ (EC 1.2.1.50)またはアルコール デヒドロゲナーゼ (EC 1.1.1.1)が含まれる。さらに、当業者であればいくつかの脂肪アルコール形成 ペプチドはその他の反応も同様に触媒することを認識している。例えば、いくつかのアシル-CoA レダクターゼ ペプチドは脂肪酸に加えてその他の基質も受け入れる。かかる非特異的ペプチドも、それゆえ含まれる。脂肪アルコール形成 ペプチドをコードする核酸配列は当該技術分野において知られており、かかるペプチドは公共源から入手できる。例示的な GenBank 受入番号を図 1に提供する。
【００７７】
現代炭素比(fraction of modern carbon):  現代炭素比 (fM) は、National Institute of Standards and Technology (NIST) Standard Reference Materials (SRMs) 4990Bおよび 4990Cにより規定され、これらはそれぞれシュウ酸標準 HOxIおよびHOxIIとして知られている。基本的な定義は14C /12C 同位体比 HOxIの0.95倍に関連する (AD 1950を参照)。これは崩壊を修正した産業革命前の木におよそ匹敵する。現在生きているバイオスフェア(植物材料)については、fM はおよそ1.1である。
【００７８】
炭化水素: 元素、炭素 (C) および水素 (H)を含む化学物質を包含する。すべての炭化水素は、炭素バックボーンおよびそのバックボーンに結合した水素原子からなる。この用語は、用語「脂肪族炭化水素」の短縮形として用いられることがある。基本的に３つのタイプの炭化水素が存在する: (1)少なくとも 約１つの芳香族環を有する芳香族 炭化水素; (2)アルカンとも称され、二重、三重または芳香族結合を有さない、飽和炭化水素; および(3) 炭素原子間に１以上の二重 または三重結合を有し、アルケン (例えば、ジエン)およびアルキンを含む不飽和炭化水素。
【００７９】
単離: 「単離された」生物学的成分(例えば、核酸 分子、タンパク質、または細胞) は実質的に生物学的成分が天然に存在するその他の生物学的成分、例えば、その他の染色体および 染色体外DNA 配列; 染色体および染色体外RNA;およびタンパク質から分離または精製されている生物学的成分である。「単離された」核酸 分子およびタンパク質は、標準的精製方法によって精製された核酸分子およびタンパク質を含む。この用語はまた、生産宿主細胞において組換え発現により調製された核酸 分子およびタンパク質ならびに化学合成された核酸分子およびタンパク質も包含する。
【００８０】
一例において、単離されているとは、それが由来する生物の天然ゲノムにおいて それが直近に隣接している配列の両方(即ち、5’末端の配列および3’末端の配列)に直近していない天然核酸分子をいう。
【００８１】
微生物: 古細菌ドメイン、真正細菌ドメインおよび真核生物ドメインに由来する原核および真核微生物種を含み、後者には酵母および糸状菌、原生動物、藻類、またはより高等の原生生物が含まれる。用語「微生物細胞」および「微生物(microbe)」は微生物という用語と互換的に用いられる。
【００８２】
核酸分子:  RNA 配列とDNA 配列との両方を包含し、限定されないが、、cDNA、ゲノム DNA 配列、およびmRNAが含まれる。この用語には、合成核酸分子、例えば化学合成されたものまたは組換え生産されたものが含まれる。核酸分子は二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖である場合、核酸分子はセンス鎖またはアンチセンス鎖であり得る。さらに、核酸分子は環状または直鎖状であり得る。
【００８３】
作動可能に連結: 第一の核酸配列が第二の核酸配列と機能的関係に位置している場合、第一の核酸配列は第二の核酸配列に作動可能に連結している。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響する位置にある場合、プロモーターはコード配列に作動可能に連結している。一般に、作動可能に連結した DNA 配列は近接しており、同じリーディングフレーム内で２つのタンパク質のコード領域を連結している可能性がある。単一のメッセンジャー RNAとしてタンデムに転写される作動可能に連結した別々の遺伝子の立体配置はオペロンと称される。例えばプラスミド ベクター中で単一のプロモーターの転写調節下に、遺伝子を近接させることは、合成オペロンを構成する。
【００８４】
ORF (オープンリーディングフレーム): 一連の、終止コドンなしにアミノ酸をコードするヌクレオチドトリプレット(即ち、コドン)。これら配列は通常ペプチドへと翻訳されうる。
【００８５】
過剰発現:ペプチドが同じ種の非組換え宿主細胞におけるその濃度と比較して組換え 宿主細胞においてより高濃度にて存在する場合。過剰発現は、当該技術分野において知られているいずれの方法を用いて達成してもよい。例えば、過剰発現は、宿主細胞のゲノム DNA 配列における制御配列を変化させること、１以上の コード配列をゲノム DNA 配列に導入すること、遺伝子 発現制御に関与する１以上の 遺伝子を変化させること(例えば、リプレッサー遺伝子を欠失させることまたは活性のアクティベターを生成すること)、染色体位置における遺伝子を増幅させること(タンデムリピート)、染色体外の核酸配列を導入すること、安定化配列の導入によって転写されるRNAの安定性を上昇させること、およびそれらの組合せによって引き起こすことが出来る。
【００８６】
ペプチドを過剰生産する組換え微生物の例としては、アシル-CoA シンターゼ(EC 6.2.1.-)をコードする核酸配列を発現する微生物が挙げられる。その他の例としては、チオエステラーゼ ペプチド (EC 3.1.2.-)の内因性 コード配列の上流に外来性 プロモーター 配列が導入された微生物が挙げられる。過剰発現はまた、ある遺伝子の内因性翻訳速度と比較してのその遺伝子の上昇した翻訳速度も含む。過剰発現について試験する方法は当該技術分野において周知である。例えば、転写された RNA レベルはrtPCRを用いて評価することができ、タンパク質 レベルはSDS page ゲル分析を用いて評価することができる。
【００８７】
分配係数:分配係数、Pは、有機相にある化合物の平衡濃度を 水相 (例えば発酵ブロス)において平衡にある濃度によって割ったものであると規定される。本明細書において記載する二相系の１つの態様において、有機相は生産 プロセスの際に脂肪酸誘導体によって形成される。しかし、いくつかの例において、有機相は、例えば、生成物分離を促進するためにオクタン層を提供することによって提供されうる。二相系について記載する場合、分配係数、Pは通常logPとして議論される。logPが1の化合物は有機相に10:1に分配される。logPが-1の化合物は、有機相に1:10に分配される。適当な発酵ブロス および有機相を選択することにより、高い logP値を有する 脂肪酸誘導体は、発酵槽において非常に低濃度であっても有機相に分離される。 
【００８８】
生産宿主:生産宿主は、本明細書に開示する生成物を生産するために用いられる細胞である。本明細書に開示する場合、生産宿主は選択された遺伝子を発現または過剰発現するよう改変されているか、または選択された遺伝子の発現が減弱されるよう改変されている。生産宿主の非限定的な例としては、植物、動物、ヒト、細菌、酵母、または糸状菌細胞が挙げられる。
【００８９】
プロモーターおよびエンハンサー:真核生物における転写制御シグナルは、「プロモーター」および「エンハンサー」要素を含む。プロモーターおよびエンハンサーは、転写に関与する細胞タンパク質と特異的に相互作用する短い配列(array)の DNA 配列からなる (Maniatis et al.、Science 236:1237、1987)。プロモーターおよびエンハンサー 要素は、様々な 真核 源から単離されており、例えば、酵母、昆虫、哺乳類および植物細胞における遺伝子から単離されている。プロモーターおよびエンハンサー 要素はウイルスからも単離されている。類似の制御要素、例えば、プロモーターおよびエンハンサーは、原核生物においてもみられる。特定の プロモーターおよびエンハンサーの選択は、目的のタンパク質の発現に用いられる細胞タイプに依存する。いくつかの真核および原核プロモーターおよびエンハンサーは、広い生産宿主細胞 範囲を有するが、いくつかは限られたサブセットの生産宿主細胞において機能的である(例えば、Voss et al.、Trends Biochem. Sci.、11:287、1986; およびManiatis et al.、1987 前掲を参照されたい)。
【００９０】
「プロモーター 要素」、「プロモーター」、または「プロモーター 配列」という用語は、遺伝子発現を活性化するスイッチとして機能するDNA 配列をいう。遺伝子が活性化されると、それは転写されている、または転写に関与しているといわれる。転写には、遺伝子からのmRNAの合成が伴う。プロモーターは、それゆえ、転写調節要素として働き、また、遺伝子のmRNAへの転写の開始のための部位を提供する。
【００９１】
精製:「精製」という用語は、例えば、単離または分離によってその天然環境から取り出されている分子をいう。「実質的に精製された」分子は、それらが天然に関連しているその他の成分を少なくとも 約 60%、好ましくは 少なくとも 約 75%、より好ましくは 少なくとも 約 90%含まない。本明細書において用いる場合、「精製」または「精製する」という用語はまた、サンプルからの混入物の除去もいう。例えば、混入物の除去の結果、サンプルにおける目的の脂肪酸誘導体のパーセンテージが上昇しうる。例えば、脂肪酸誘導体が植物、細菌、酵母、または哺乳類生産宿主細胞において発現した後、脂肪酸誘導体は生産宿主細胞のタンパク質の除去によって精製される。精製の後、サンプルにおける脂肪酸誘導体のパーセンテージは上昇する。
【００９２】
精製という用語は完全に純粋であることを要求するわけではない; むしろ、それは相対的用語として意図される。したがって、例えば、精製脂肪酸誘導体調製物は、生成物が細胞内の環境にあるよりも生成物がより高濃度にあるものである。例えば、精製脂肪エステルは、 それに付随しうる細胞成分(例えば、核酸、脂質、炭水化物、およびその他のペプチド) から実質的に分離されたものである。別の例において、精製脂肪エステル調製物は、脂肪エステルが実質的に混入物、例えば、発酵の後に存在しうるもの、を含まないものである。
【００９３】
例えば、脂肪エステルは、サンプルの少なくとも 約 50重量%が脂肪エステルから構成されている場合、精製されている。別の例においてサンプルの少なくとも 約 60重量%、70重量%、80重量%、85重量%、90重量%、92重量%、95重量%、98重量%、または99重量%またはそれ以上が脂肪エステルから構成されている場合、精製されている。
【００９４】
組換え: 組換え核酸分子は、天然ではない配列を有するもの、配列の２つの別々のセグメントの人工的組合せにより作られた配列を有するもの、またはその両方である。この人工的組合せは、例えば、核酸分子の単離されたセグメントの化学合成または人工的操作によって、例えば、 遺伝子操作技術によって達成されうる。組換えはまた、人工的に操作されているが、核酸が単離された生物にみられるものと同じ制御配列およびコード領域を含む核酸分子を記載するのにも用いられる。組換えタンパク質は組換え 核酸 分子に由来するタンパク質である。
【００９５】
組換えまたは形質転換細胞は、例えば分子生物学技術によって、例えば、 アシル-CoA シンターゼをコードする核酸分子といった組換え核酸分子が導入された細胞である。形質転換は核酸分子が細胞に導入されうるあらゆる技術を含み、例えば、これらに限定されないが、ウイルスベクターによるトランスフェクション、コンジュゲーション、プラスミド ベクターによる形質転換、および裸のDNAの、エレクトロポレーション、リポフェクション、およびパーティクルガン加速による導入が挙げられる。
【００９６】
配列同一性:２つの核酸配列の間または２つのアミノ酸配列の間の類似性は、配列間で共有される配列同一性のレベルを単位として(in terms of)表される。配列同一性は典型的にはパーセンテージ 同一性を単位として(in terms of）表される。パーセンテージ同一性が高いほど、２つの配列はより類似している。本出願の目的のために、「同一性」および「類似性」という用語は互換的に用いられる。
【００９７】
比較のために配列をアラインする方法は当該技術分野において周知である。様々な プログラムおよびアラインメントアルゴリズムが以下に記載されている:  Smith & Waterman、Adv. Appl. Math. 2:482、1981; Needleman & Wunsch、J. Mol. Biol. 48:443、1970; Pearson & Lipman、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444、1988; Higgins & Sharp、Gene 73:237 244、1988; Higgins & Sharp、CABIOS 5:151-153、1989; Corpet et al.、Nucleic Acids Research 16:10881-10890、1988; Huang et al.、CABIOS 8:155-165、1992; およびPearson et al.、Methods in Molecular Biology 24:307-331、1994。Altschul et al.、J. Mol. Biol. 215:403-410、1990には、配列 アラインメント 方法および相同性 計算の詳細な考え方が提示されている。
【００９８】
NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST（商標）; Altschul et al.、J. Mol. Biol. 215:403-410、1990)はいくつかの源から入手可能であり、例えば、配列 分析 プログラムであるblastp、blastn、blastx、tblastnおよびtblastx と関連して使用するためには、National Center for Biotechnology Information (NBCI、Bethesda、MD)が挙げられる。 BLAST（商標） は、NBCI ウェブサイトにてインターネット上でアクセスできる。本明細書において用いる場合、配列同一性は 一般にデフォールトパラメーターに設定されたBLAST（商標） ソフトウェアによって決定される。例えば、blastn (version 2.0) ソフトウェアを用いて、デフォールトパラメーター (例えば、期待値(expect) = 10、行列(matrix) = BLOSUM62、フィルター = DUST (Tatusov and Lipmann、in preparation as of December 1、1999; およびHancock and Armstrong、Comput. Appl. Biosci. 10:67-70、1994)、ギャップ存在コスト = 11、残基あたりギャップコスト = 1、およびラムダ比 = 0.85)を用いて２つの核酸配列の間の配列同一性を決定することが出来る。２つのポリペプチドの比較のためには、blastp (version 2.0) ソフトウェアをデフォールトパラメーター (例えば、期待値10、フィルター = SEG (Wootton and Federhen、Computers in Chemistry 17:149-163、1993)、行列= BLOSUM62、ギャップ存在コスト = 11、残基あたりギャップコスト = 1、ラムダ = 0.85)とともに用いることが出来る。
【００９９】
核酸配列の比較のためには、BLAST（商標） (Blastn) プログラムの「Blast 2 sequences」機能を、デフォールトパラメーター(例えば、ギャップ開始コスト [デフォールト = 11]; ギャップ継続コスト [デフォールト = 1]; 期待値 (E) [デフォールト = 10.0]; ワードサイズ [デフォールト = 11];１行説明(one-line description)の数 (V) [デフォールト = 100]; 示すためのアラインメントの数 (B) [デフォールト = 100])に設定されたデフォールト BLOSUM62 行列を用いて使用する。参照配列に対してより大きな類似性を有する核酸配列はこの方法によって評価した場合、より大きいパーセンテージ 同一性、例えば 少なくとも 約 45%、少なくとも 約 60%、少なくとも 約 70%、少なくとも 約 75%、少なくとも 約 80%、少なくとも 約 85%、少なくとも 約 90%、少なくとも 約 95%、または少なくとも 約 98%、または少なくとも 約 99%の配列同一性を示す。
【０１００】
約 30 アミノ 酸より大きいアミノ酸配列の比較のためには、BLAST（商標） プログラム の「Blast 2 sequences」機能を、デフォールトパラメーター (例えば、ギャップ存在コスト 11、および残基あたりギャップコスト1)に設定されたデフォールト BLOSUM62 行列を用いて使用する。短いペプチド(例えば、およそ 30 アミノ 酸より短い)をアラインする場合、アラインメントは、デフォールトパラメーター(例えば、ギャップ開始 9、ギャップ伸長 1 ペナルティー)に設定されたPAM30 行列を用いるBlast 2 sequences 機能を用いて行うべきである。参照配列に対してより大きい類似性を有するタンパク質は、この方法によって評価した場合、より大きいパーセンテージ 同一性、例えば、その配列に対して少なくとも 約 35%、少なくとも 約 45%、少なくとも 約 50%、少なくとも 約 60%、少なくとも 約 80%、少なくとも 約 85%、少なくとも 約 90%、少なくとも 約 95%、少なくとも 約 98%、または少なくとも 約 99%の配列同一性を示す。
【０１０１】
界面活性剤:それが溶解されている液体の表面張力を低下させることが出来る物質である。それは典型的には水溶性頭部と炭化水素鎖または尾部から構成される。水溶性頭部は親水性であり、イオン性または非イオン性であり得る。炭化水素鎖は疎水性である。界面活性剤は様々な製品、例えば、洗浄剤および洗剤に用いられており、織物、革および紙の補助剤として、化学的プロセスにおいて、化粧品および医薬品において、食品産業および農業においても使用されている。さらに、それは環境にアクセスしにくいことが見いだされている粗製油の抽出および単離または水の乳濁を助けるためにも利用されうる。
【０１０２】
異なる用途を特徴とする４つのタイプの界面活性剤が存在する。アニオン性界面活性剤は洗浄剤様活性を有し、一般に洗浄用途に用いられる。カチオン性界面活性剤は長鎖炭化水素を含み、タンパク質および合成 ポリマーの処理にしばしば用いられ、あるいは織物柔軟剤およびヘアコンディショナーの成分である。両性界面活性剤も長鎖炭化水素を含み、典型的にはシャンプーに用いられる。非イオン性界面活性剤は 一般にクリーニング製品に用いられる。
【０１０３】
シンターゼ:シンターゼは、合成 プロセスを触媒する酵素である。本明細書において用いる場合、シンターゼという用語は、シンターゼおよびシンゼターゼを含む。
【０１０４】
輸送タンパク質:１以上の 化合物が生物またはオルガネラに入るおよび/またはそれらから出る動きを促進するタンパク質である。いくつかの態様において、ATP-結合カセット (ABC) 輸送タンパク質をコードする外来性 DNA 配列が、生産宿主が脂肪酸誘導体を培地に排出するように生産宿主によって機能的に発現される。ABC 輸送タンパク質は多くの生物においてみられており、例えば Caenorhabditis elegans、Arabidopsis thalania、Alcaligenes eutrophus (後にRalstonia eutrophaと名称変更)、またはRhodococcus erythropolisが挙げられる。ABC 輸送タンパク質の非限定的な例としては、 CER5、AtMRP5、AmiS2 およびAtPGP1が挙げられる。好ましい態様において、ABC 輸送タンパク質は CER5 (例えば、AY734542)である。
【０１０５】
別の態様において、輸送タンパク質は以下から選択される流出 タンパク質である: 大腸菌由来のAcrAB、TolC、またはAcrEFまたはThermosynechococcus elongatus BP-1由来のtll1618、tll1619、およびtll0139。
【０１０６】
さらなる態様において、輸送タンパク質 は、Drosophila melanogaster、Caenorhabditis elegans、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、またはサッカロマイセス・セレビシエまたは当該技術分野において周知である哺乳類 FATPのいずれかから選択される脂肪酸 輸送タンパク質 (FATP)である。
【０１０７】
生成物の生産を可能とする条件下:所望の生成物、例えば、アシル-CoAまたは脂肪酸誘導体、例えば、脂肪酸、炭化水素、脂肪アルコール、ろう、または脂肪エステルを生産宿主が生産するのを可能とするあらゆる発酵条件である。発酵条件には、通常、多くのパラメーターが含まれる。例示的な条件としては、これらに限定されないが、温度範囲、通気レベル、および培地組成が挙げられる。これらの条件のそれぞれは、個々におよび組み合わせて、生産宿主の生育を可能とする。
【０１０８】
例示的な培地としてはブロスまたはゲルが含まれる。一般に、培地は炭素源、例えば、 グルコース、フルクトース、セルロース等を含み、これは微生物によって直接代謝されうる。さらに、酵素が炭素源の動態化(例えば、デンプン またはセルロースの発酵性の糖への脱重合)、およびそれに続く代謝を促進するために培地中にて使用されうる。
【０１０９】
培養条件が生成物の生産を可能とするかを決定するために、生産宿主を約 4、8、12、24、36、または48 時間培養すればよい。培養中または培養後に、サンプルを得て、その培養条件が生成物の生産を可能とするかを決定するために分析するとよい。例えば、生産宿主が培養されるサンプルまたは培地における生産宿主を、所望の生成物の存在について試験するとよい。生成物の存在を試験する場合、アッセイ、例えば、これらに限定されないが、TLC、HPLC、GC/FID、GC/MS、LC/MS、MS、ならびに以下の実施例において提供されているアッセイを利用するとよい。 
【０１１０】
ベクター:細胞に導入されると、形質転換細胞を生じる核酸分子である。ベクターは、細胞中でそれを複製可能とする核酸配列、例えば、複製起点を含みうる。ベクターはまた、１以上の 選択可能マーカー遺伝子または当該技術分野において知られているその他の遺伝的要素を含みうる。
【０１１１】
ろう:ろうは脂肪エステルから構成される。好ましい態様において、脂肪エステルは、中鎖から長鎖の炭素鎖から構成されるA側およびB側を含む。
【０１１２】
脂肪エステルに加えて、ろうはその他の成分を含みうる。例えば、ろうはまた、炭化水素、ステロール エステル、脂肪族 アルデヒド、アルコール、ケトン、ベータ-ジケトン、トリアシルグリセロール等を含みうる。
【０１１３】
詳細な説明
多くの細胞の微生物は脂肪酸をエネルギー源として利用することができ、それゆえ、脂肪酸を代謝してエネルギーを作るβ 酸化 経路を含む。驚くべきことに、アシル-CoA シンターゼ 活性 (β 酸化 経路において見いだされた最初の酵素活性) を有するペプチドの過剰発現、および/またはベータ酸化経路におけるその他の遺伝子の減弱により、細胞 または微生物の生存能を維持しつつ、生産されるアシル-CoAの量を増やすことが出来ることが見いだされた。同様に、アシル-CoA シンターゼ 活性を有するペプチド の過剰発現と脂肪酸誘導体を形成するペプチドの過剰発現を組み合わせると、脂肪酸誘導体 生産を向上させることが出来る。
【０１１４】
脂肪酸誘導体はバイオ燃料および特殊化学製品として有用であり、これらはさらなる製品、例えば、栄養サプリメント、ポリマー、パラフィン代用品、およびパーソナルケア製品の製造に利用することが出来る。さらに、本明細書に開示する教示により、特定の分枝点、飽和レベルおよび炭素鎖長を有する脂肪酸誘導体の生産が可能となる。
【０１１５】
脂肪酸誘導体を生産するための生産宿主として利用できる微生物の非限定的な例としては、細菌、酵母、または糸状菌が挙げられる。好適な生産宿主のさらなる非限定的な例としては、植物、動物、またはヒト 細胞が挙げられる。
【０１１６】
アルコール (短鎖、長鎖、分枝または不飽和)は、本明細書に記載する生産宿主によって生産することができる。かかるアルコールは直接燃料として利用可能であるし、あるいはそれらは、脂肪エステルを作るために利用することが出来る。脂肪エステルは単独でまたはその他の本明細書に記載する脂肪酸誘導体と組合せて、燃料として有用である。
【０１１７】
同様に、本明細書に記載する生産宿主から生産される炭化水素はバイオ燃料として利用可能である。かかる炭化水素に基づく燃料は、分枝点、規定された飽和度、および特定の炭素長を含むよう設計することが出来る。バイオ燃料として単独でまたはその他の脂肪酸誘導体と組合せて使用する場合、 炭化水素は、添加剤またはその他の従来型の燃料 (例えば、アルコール、トリグリセリド由来のディーゼルおよび石油に基づく燃料)と組み合わされてもよい。
【０１１８】
様々な脂肪エステルについてのセタン価(centane number) (CN)、粘度、融点、および燃焼熱が、Knothe、Fuel Processing Technology 86:1059-1070、2005において特徴づけられており、これは引用によりその全体を本明細書に含める。本明細書に提供する教示を用いて、生産宿主をKnotheに記載の脂肪エステルのいずれかを生産するよう操作することができる。
【０１１９】
I. 脂肪酸誘導体の生産および生産を上昇させるための改変
アシル-CoA および/または  脂肪酸誘導体の生産に用いられる生産宿主はペプチドを過剰発現する核酸配列を含むように組換えにより改変することができる。例えば、生産宿主は、アシル-CoAの生産を上昇させ、脂肪酸生合成経路における脂肪酸誘導体および中間体、例えば アシル-CoAの異化を低下させるよう、または脂肪酸生合成経路の特定の点でのフィードバック阻害を低下させるよう改変されていてもよい。本明細書に記載する遺伝子を改変することに加えて、さらなる細胞資源を、脂肪酸、例えば、乳酸、コハク酸を過剰生産するよう転用してもよく、および/または、酢酸経路を減弱させてもよく、アセチル-CoA カルボキシラーゼ (acc)を過剰発現させてもよい。本明細書に記載する生産宿主に対する改変は、ゲノムの改変、組換え 発現系の追加、またはその組合せを介するものであってよい。
【０１２０】
関与する脂肪酸生合成経路を図 2から図 6に図示する。以下のサブセクションA-Gは これらの経路における工程を説明する。経路における異なる工程は異なる酵素によって触媒される。各工程は、より多くの酵素を生産し、それによってより多くの脂肪酸および脂肪酸誘導体の生産を導くための遺伝子の過剰発現の可能性のある場所である。経路に必要な酵素をコードする遺伝子は、かかる酵素を有さない生産宿主に組換えによって付加してもよい。最後に、脂肪酸および脂肪酸誘導体の生産を導く経路と競合しうる工程は、所望の 生成物の生産を上昇させるために減弱または阻止することができる。
【０１２１】
A.アセチル-CoA - マロニル-CoA からアシル-ACP
脂肪酸 シンターゼ (FAS)はアシル鎖の開始および伸長を触媒するペプチドの一群である(Marrakchi et al.、Biochemical Society、30:1050-1055、2002)。アシル キャリアタンパク質 (ACP)はFAS 経路における酵素とともに、生産される脂肪酸の長さ、飽和および分枝の程度を制御する。この経路における工程は、脂肪酸生合成 (fab)およびアセチル-CoA カルボキシラーゼ (acc) 遺伝子 ファミリーの酵素によって触媒される。所望の生成物に応じて、これら遺伝子の１以上が減弱または過剰発現されうる(各酵素の酵素活性およびその酵素分類番号の詳細な説明については図 1を参照)。
【０１２２】
1.脂肪酸生合成経路: アセチル-CoAまたはマロニル-CoAからアシル-ACP
生産宿主における脂肪酸生合成経路は前駆体であるアセチル CoA およびマロニル-CoAを用いる(図 1)。この経路における工程は、脂肪酸生合成 (fab)およびアセチル-CoA カルボキシラーゼ (acc) 遺伝子 ファミリーの酵素によって触媒される。この経路は、Heath et al.、Prog. Lipid Res. 40(6):467-97 (2001)に記載されており、これはその内容全体を引用により本明細書に含める。
【０１２３】
アセチル-CoAは、アセチル-CoA カルボキシラーゼ (Acc、４つの別々の遺伝子、accABCDによってコードされる多サブユニット 酵素)によってカルボキシル化されてマロニル-CoAを形成する。マロン酸基はマロニル-CoA:ACP トランスアシラーゼ (FabD)によってACPに移されてマロニル-ACPを形成する。次いで縮合反応が起こり、ここでマロニル-ACPがアセチル-CoAと結合(merge)する結果、β ケトアシル-ACPが生じる。β-ケトアシル-ACP シンターゼ III (FabH)はFAS サイクルを開始させ、β-ケトアシル-ACP シンターゼ I (FabB)およびβ-ケトアシル-ACP シンターゼ II (FabF)は後のサイクルに関与する。
【０１２４】
次いで、工程のサイクルが適切な 長さの飽和脂肪酸が作られるまで繰り返される。第一に、β-ケトアシル-ACPは NADPHによって還元されてβ-ヒドロキシアシル-ACPを形成する。この工程はβ ケトアシル-ACP レダクターゼ (FabG)によって触媒される。β-ヒドロキシアシル-ACPは次いで脱水されてトランス-2-エノイル-ACPを形成する。β-ヒドロキシアシル-ACP デヒドラターゼ/イソメラーゼ (FabA)またはβ-ヒドロキシアシル-ACP デヒドラターゼ (FabZ)がこの工程を触媒する。NADPH-依存性 トランス-2-エノイル-ACP レダクターゼ I、II、またはIII (それぞれFabI、FabK、およびFabL)がトランス-2-エノイル-ACPを還元してアシル-ACPを形成する。次のサイクルは、β-ケトアシル-ACP シンターゼ Iまたは β-ケトアシル-ACP シンターゼ II (それぞれFabBおよび FabF)によるマロニル-ACP とアシル-ACPとの縮合によって開始する。
【０１２５】
2.アシル ACP 生産を上昇させるための脂肪酸生合成経路に対する改変
生産宿主生物はアセチル-CoAおよびマロニル-CoAを過剰生産するように操作されうる。かかる生産宿主生物としては、植物、動物、またはヒト細胞が挙げられる。微生物、例えば、細菌、酵母、または糸状菌も生産宿主として利用できる。生産宿主として使用されうる微生物の非限定的な例としては、大腸菌、サッカロマイセス・セレビシエ、カンジダ・リポリティカ、大腸菌、アルスロバクター AK 19、ロドトルラ・グルチニンス、アシネトバクター・エスピー・株 M-1、カンジダ・リポリティカ、およびその他の油性微生物が挙げられる。上昇したアセチル-CoA/マロニル-CoA/脂肪酸および脂肪酸誘導体 生産を得るために生産宿主に対していくつかの異なる改変を、組み合わせてまたは個々に行うことが出来る。
【０１２６】
例えば、アセチル-CoA 生産を上昇させるために、以下の１以上の遺伝子を生産宿主において発現させるとよい:  pdh、panK、aceEF (ピルビン酸および2-オキソグルタル酸 デヒドロゲナーゼ複合体のE1p デヒドロゲナーゼ 成分およびE2p ジヒドロリポアミド アシルトランスフェラーゼ 成分をコードする)、fabH、fabD、fabG、acpP、fabF。別の例において、脂肪アシルCoA レダクターゼおよびアルデヒド デカルボニラーゼをコードするさらなるDNA 配列を生産宿主において発現させるとよい。すべて構成的、あるいは制御可能な プロモーターの制御下にある１以上の上記 遺伝子を含むプラスミドが構築できることは当該技術分野において周知である。これら遺伝子についての例示的な GenBank 受入番号は以下の通りである:  pdh (BAB34380、AAC73227、AAC73226)、panK (coaAとしても知られる、AAC76952)、aceEF (AAC73227、AAC73226)、fabH (AAC74175)、fabD (AAC74176)、fabG (AAC74177)、acpP (AAC74178)、fabF (AAC74179)。
【０１２７】
さらに、fadE、gpsA、ldhA、pflb、adhE、pta、poxB、ackA、および/または ackBの発現 レベルは、対応する遺伝子のヌルまたは欠失 突然変異を含む条件的に複製可能なまたは複製不可能なプラスミドによる形質転換により、またはプロモーターまたはエンハンサー 配列を置換することにより操作された微生物において低下またはノックアウトさせることができる。これら遺伝子についての例示的な GenBank 受入番号は以下の通りである: fadE (AAC73325)、gspA (AAC76632)、ldhA (AAC74462)、pflb (AAC73989)、adhE (AAC74323)、pta (AAC75357)、poxB (AAC73958)、ackA (AAC75356)、およびackB (BAB81430)。結果として得られる操作された生産宿主は適切な 環境にて生育させた場合に アセチル-CoA 生産レベルが上昇する。
【０１２８】
さらに、マロニル-CoA 過剰生産は、 デノボに合成されたプラスミドに含まれるaccABCD (例えば、受入番号 AAC73296、EC 6.4.1.2)によって上記のように生産宿主を操作することによって影響されうる。脂肪酸 過剰生産はデノボに合成されたプラスミドにリパーゼをコードするDNA 配列 (例えば、受入番号CAA89087、CAA98876) をさらに含めることによって達成できる。
【０１２９】
その結果、いくつかの例において、アセチル-CoA カルボキシラーゼは、その細胞内濃度をネイティブな 発現 レベルと比較して少なくとも 約 2-倍、好ましくは 少なくとも 約 5-倍、またはより好ましくは 少なくとも 約 10 倍、上昇させるように過剰発現される。
【０１３０】
さらに、利用可能なアシル-CoAの量を上昇させるためにplsB (例えば、受入番号 AAC77011) D311E 突然変異を利用できる。
【０１３１】
さらに、sfa 遺伝子 (FabAのサプレッサー、例えば、受入番号 AAN79592) の過剰発現 を生産宿主に含めて、モノ不飽和脂肪酸の生産を上昇させることが出来る(Rock et al.、J. Bacteriology 178:5382-5387、1996)。
【０１３２】
B.アシル-ACPから脂肪酸
1.脂肪酸生合成経路: アシル-ACPから脂肪酸
上記のように、アセチル-CoAおよびマロニル-CoAはいくつかの 工程にてプロセシングされてアシル-ACP 鎖を形成する。酵素 sn-グリセロール-3-リン酸 アシルトランスフェラーゼ (PlsB)は、アシル-ACPまたはアシル-CoAからグリセロール-3-リン酸のsn-1 位へのアシル基の転移を触媒する。したがって、PlsBは脂肪酸経路の一部であるリン脂質合成における鍵となる調節酵素である。PlsBの阻害は長鎖 アシル-ACPのレベルの上昇を導き、そのフィードバックは経路における初期の工程(例えば、accABCD、fabH、および fabI)を阻害する。例えばチオエステラーゼ過剰発現によるこの制御の脱共役は、脂肪酸 生産の上昇を導く。tesおよびfat 遺伝子 ファミリーはチオエステラーゼを発現する。FabI はインビトロで長鎖 アシル-CoAによっても阻害される。
【０１３３】
2.所望の脂肪酸を生産するための脂肪酸生合成経路に対する改変
脂肪酸誘導体の均質な集団の生産のために生産宿主を操作するために、１以上の 内因性遺伝子を減弱または機能的に欠失させることができ、その結果、１以上の チオエステラーゼを発現させることが出来る。例えば、C10 脂肪酸誘導体は、C18:1-ACPを使用するチオエステラーゼ C18 (例えば 受入番号AAC73596およびP0ADA1)の減弱、およびC10-ACPを使用するチオエステラーゼ C10 (例えば 受入番号Q39513)の発現により生産できる。この結果、炭素鎖長10を有する脂肪酸誘導体の比較的均質な 集団が得られる。別の例において、C14脂肪酸誘導体は非- C14脂肪酸を生産する内因性 チオエステラーゼを減弱させ、 チオエステラーゼ 受入番号 Q39473 (C14-ACPを使用する)を発現させることにより生産することができる。さらに別の例において、C12脂肪酸誘導体は C12-ACPを使用するチオエステラーゼ (例えば 受入番号 Q41635)を発現させ、非-C12 脂肪酸を生産するチオエステラーゼを減弱することによって生産することができる。アセチル CoA、マロニル CoA、および脂肪酸過剰生産は当該技術分野において知られている方法、例えば細胞溶解の後に放射性前駆体、HPLC、およびGC-MSを用いることによって確認することが出来る。請求項に記載の方法に有用なチオエステラーゼおよび生産宿主の非限定的な例を表1に列挙する。  
【０１３４】
表 1: チオエステラーゼ
【表１】
0005863088.tif 000002
* Mayer et al.、BMC Plant Biology 7:1-11、2007
【０１３５】
C.脂肪酸からアシル-CoA
1.脂肪酸からアシル-CoAへの変換
アシル-CoA シンターゼ (ACS)は、２工程機構によって遊離脂肪酸をアシル-CoAへとエステル化する。遊離脂肪酸はまずアシル-AMP 中間体 (アデニレート)へとATPの加ピロリン酸分解を介して変換される。アデニレートの活性化されたカルボニル 炭素は次いでCoAのチオール基とカップリングして、AMPとアシル-CoA 最終生成物を放出する。Shockey et al.、Plant. Physiol. 129:1710-1722、2002を参照。
【０１３６】
大腸菌 ACS 酵素 FadD および脂肪酸 輸送タンパク質 FadLは脂肪酸 取り込み系の必須成分である。FadLは脂肪酸の細菌細胞への輸送を媒介し、FadDはアシル-CoA エステルの形成を媒介する。他の炭素源が利用できない場合、外来性 脂肪酸は細菌によって取り込まれてアシル-CoA エステルへと変換され、これが転写因子 FadR に結合し、脂肪酸の輸送 (FadL)、活性化 (FadD)、およびβ 酸化 (FadA、FadB、FadE、およびFadH)に必要なタンパク質をコードするfad 遺伝子の発現を抑制解除する。代替の炭素源が利用可能な場合は、細菌は脂肪酸をアシル ACPとして合成し、これがリン脂質 合成に用いられるが、β-酸化の基質とはならない。したがって、アシル-CoAおよび アシル-ACPはともに、異なる最終生成物をもたらす脂肪酸の独立した源である。Caviglia et al.、J. Biol. Chem. 279(12):1163-1169、2004参照。
【０１３７】
2.脂肪酸からアシル-CoAへの変換を上昇させるための改変
生産宿主は、アシル-CoAへと変換されうる様々な 長さの脂肪酸を生産するよう既知のペプチドを用いて操作することができる。脂肪酸誘導体を作る１つの方法は、１以上の アシル-CoA シンターゼ ペプチド(EC 6.2.1.-)の発現を上昇させること、またはより活性な形態の１以上の アシル-CoA シンターゼ ペプチド(EC 6.2.1.-)を発現させることを含む。
【０１３８】
アシル-CoAおよび脂肪酸誘導体を生産するために発現されうるアシル-CoA シンターゼのリストを表 2に示す。これらアシル-CoA シンターゼは脂肪アシルCoAを基質として用いるいずれかの経路を最適化するように調べられた。バイオインフォマティクスおよび合成遺伝子を用いることにより、異種 fadD 遺伝子が生産株において発現され、バイオディーゼルおよび潜在的にバイオクルードを生産するそれらの能力が評価された。
【０１３９】
表2: アシル-CoA シンターゼ
【表２】
0005863088.tif 000003
【０１４０】
大腸菌 FadDに対するそれらの類似性の程度に基づいて、以下の相同の遺伝子を選択して、合成および評価した: 
M. tuberculosis HR7Rv 由来のfadDD35 [NP_217021]
枯草菌由来のyhfL [NP_388908]
緑膿菌 PAO1由来のfadD1 [NP_251989]
fadD ホモログである、サッカロマイセス・セレビシエ由来のFaa3p [NP_012257]。
【０１４１】
アシル-CoA、ならびに脂肪酸誘導体を生産するために利用できる真核 生物由来のさらなる脂肪酸 アシル-CoA シンターゼには、Shockey et al.、Plant. Physiol. 129: 1710-1722、2002 (シロイヌナズナ)、Caviglia et al.、J. Biol. Chem. 279: 1163-1169、2004 (ラット)、および Knoll et al.、J. Biol. Chem. 269(23):16348-56、1994 (酵母)に記載のものが挙げられる。これらシンゼターゼをコードする遺伝子配列は当該技術分野において知られている。例えば、Johnson et al.、J. Biol. Chem. 269: 18037-18046、1994; Shockey et al.、Plant. Physiol. 129: 1710-1722、2002; Black et al.、J. Biol Chem. 267: 25513-25520、1992を参照。これらの真核 アシル-CoA シンターゼは、大腸菌 fadD 配列と高い相同性を有さないにもかかわらず、大腸菌 fadD ノックアウトにおけるFadD 活性を補完することが出来る。
【０１４２】
D.アシル-CoAから脂肪アルコール
1.アシル-CoAから脂肪アルコールへの変換
アシル-CoAは NADH-依存性 アシル-CoA レダクターゼ (例えば、Acr1)によって脂肪 アルデヒドへと還元される。脂肪 アルデヒドは次いで NADPH-依存性 アルコール デヒドロゲナーゼ (例えば、YqhD)によって脂肪アルコールへと還元される。あるいは、脂肪アルコール形成 アシル-CoA レダクターゼ (FAR)がアシル-CoAの 脂肪アルコールおよびCoASHへの還元を触媒する。 FARはNADHまたはNADPH をこの４電子還元における補因子として使用する。アルコールを生成する FAR 反応はアルデヒド 中間体を介して進行するが、遊離のアルデヒドは放出されない。したがって、アルコール-形成性FARは、アシル-CoAの２電子還元を行い、遊離の脂肪 アルデヒドを 生成物として生じる酵素とは異なっている (Cheng and Russell、J. Biol. Chem.、279(36):37789-37797、2004; Metz et al.、Plant Physiol.、122:635-644、2000参照)。
【０１４３】
2.アシル-CoA から脂肪アルコールへの変換を上昇させるための改変
生産宿主はアシル-CoAから脂肪アルコールを生産することが知られているポリペプチドを用いて操作することができる。脂肪アルコールを作る１つの方法は、脂肪アルコール 形成アシル-CoAレダクターゼ (FARからの遺伝子、例えば acr1によってコードされる、EC 1.2.1.50/1.1.1)、またはアシル-CoAレダクターゼ (EC 1.2.1.50) およびアルコール デヒドロゲナーゼ (EC 1.1.1.1)の発現を上昇させることまたはそれらのより活性な形態を発現させることを含む。例示的な GenBank 受入番号を図 1に提供する。
【０１４４】
脂肪アルコールは炭化水素に基づく界面活性剤とも記載されうる。界面活性剤生産のために、生産宿主は再生可能な炭素源から界面活性剤を生産するよう改変される。かかる生産宿主は、脂肪酸を 脂肪アルデヒドに変換することができるタンパク質をコードする第一の外来性 DNA 配列と脂肪アルデヒドをアルコールに変換することができるタンパク質をコードする第二の外来性 DNA 配列とを含む。いくつかの例において、第一の外来性 DNA 配列は脂肪酸 レダクターゼをコードする。一つの態様において、第二の外来性 DNA 配列は哺乳類ミクロソーム アルデヒド レダクターゼまたは長鎖 アルデヒド デヒドロゲナーゼをコードする。さらなる例において、第一および第二の外来性 DNA 配列は、アルスロバクター AK 19、ロドトルラ・グルチニンス、アシネトバクター・エスピー・株 M-1、またはカンジダ・リポリティカに由来する。一つの態様において、第一および第二の 異種 DNA 配列はアシネトバクター・エスピー・株 M-1 またはカンジダ・リポリティカからの複数酵素複合体に由来する。
【０１４５】
脂肪酸を界面活性剤 生産に利用できる長鎖 アルコールに変換するタンパク質をコードする異種 DNA 配列のさらなる源としては、これらに限定されないが、モルチエレラ・アルピナ (ATCC 32222)、クリプトコッカス・クルヴァツス、(Apiotricum curvatumとも称される)、アルカニボラックス・ ジャデンシス (T9T =DSM 12718 =ATCC 700854)、アシネトバクター・エスピー・HO1-N (ATCC 14987)およびロドコッカス・オパクス (PD630 DSMZ 44193)が挙げられる。
【０１４６】
一例において、脂肪酸誘導体は約 6 〜約 36 炭素原子、約 8 〜約 30 炭素原子、約 10 〜約 26 炭素原子、約 12 〜約 20 炭素原子、または約 12 〜約 16 炭素原子の炭素鎖長を有する飽和または不飽和 界面活性剤生成物である。別の例において、界面活性剤生成物は約 10 〜約 18 炭素原子、または 約 12 〜約 14 炭素原子の炭素鎖長を有する。
【０１４７】
界面活性剤を生産するために適当な生産宿主は 真核または原核微生物のいずれでもよい。例示的な生産宿主としては、アルスロバクター AK 19、ロドトルラ・グルチニンス、アシネトバクター・エスピー・株 M-1、シロイヌナズナ(Arabidopsis thalania)、カンジダ・リポリティカ、サッカロマイセス・セレビシエ、およびアセチル CoA カルボキシラーゼを発現するよう操作された大腸菌が挙げられる。脂質および油の形態で高レベルの界面活性剤 前駆体を合成する生得的な能力を示す生産宿主、例えば、 ロドコッカス・オパクス、アルスロバクター AK 19、およびロドトルラ・グルチニンス、アセチル CoA カルボキシラーゼを発現するよう操作された大腸菌、及びその他の油性細菌、酵母、および真菌も利用可能である。
【０１４８】
E. 脂肪アルコールから脂肪エステル
生産宿主は様々な 長さの脂肪エステルを生産することが知られているポリペプチドを用いて操作することができる。脂肪エステルを作る１つの方法は、１以上の アルコール O-アセチルトランスフェラーゼ ペプチド (EC 2.3.1.84)の発現を上昇させることまたはそのより活性な形態を発現させることを含む。これらのペプチドはアセチル-CoA とアルコールとを、CoAおよびエステルに変換することにより、アルコールのアセチル化を触媒する。いくつかの例において 、アルコール O-アセチルトランスフェラーゼ ペプチドは、選択されたチオエステラーゼ ペプチド、FAS ペプチドおよび脂肪アルコール形成ペプチドとともに発現させることが出来、それによって炭素鎖長、飽和および分枝の程度が制御できる。場合によっては、bkd オペロンを、分枝脂肪酸 前駆体の生産を可能にするために共発現させることができる。 
【０１４９】
本明細書において用いる場合、アルコール O-アセチルトランスフェラーゼ ペプチドは、酵素 分類番号EC 2.3.1.84におけるペプチド、ならびにアセチル-CoAとアルコールとからCoAおよびエステルを形成させる変換を触媒することが出来るあらゆるその他のペプチドを含む。さらに、当業者であれば、アルコール O-アセチルトランスフェラーゼ ペプチドはその他の反応も触媒することを認識しているであろう。
【０１５０】
例えばいくつかのアルコール O-アセチルトランスフェラーゼ ペプチドは脂肪アルコールまたはアセチル-CoA チオエステルに加えてその他の基質、例えば、その他のアルコールおよびその他のアシル-CoA チオエステルを受け入れる。かかる非特異的または多様な特異性のアルコール O-アセチルトランスフェラーゼ ペプチドも、それゆえ含まれる。アルコール O-アセチルトランスフェラーゼ ペプチド 配列は公共源から入手可能である。例示的な GenBank 受入番号を図 1に提供する。特定の アルコール O-アセチルトランスフェラーゼ ペプチドの活性を特徴づけるアッセイは当該技術分野で周知である。O-アシルトランスフェラーゼは、ドナーアシル基 またはアクセプター アルコール 部分に対する新規な活性および特異性を有するように操作されうる。操作された酵素は、よく記載されている合理的および進化的 アプローチを介して作成することが出来る。
【０１５１】
F.アシル-CoAから脂肪エステル 
1.脂肪エステルの生産
脂肪エステルは、長鎖 脂肪アルコールを脂肪アシルCoAにエステル結合を介して結合させるアシル-CoA:脂肪アルコール アシルトランスフェラーゼ (例えば、エステルシンターゼ)によって合成される。エステルシンターゼおよびコードする遺伝子はホホバ植物および細菌、アシネトバクター・エスピー・株 ADP1 (以前は、Acintetobacter calcoaceticus ADP1)から知られている。細菌のエステルシンターゼは二機能性酵素であり、エステルシンターゼ 活性およびジアシルグリセロール 基質および脂肪アシルCoAからトリアシルグリセロールを形成する能力 (アシル-CoA:ジグリセロール アシルトランスフェラーゼ (DGAT) 活性)を示す。遺伝子 wax/dgatは、エステルシンターゼとDGATとの両方をコードする。Cheng et al.、J. Biol. Chem. 279(36):37798-37807、2004; Kalscheuer and Steinbuchel、J. Biol. Chem. 278:8075-8082、2003を参照。エステルシンターゼは本明細書に記載のように、燃料、例えば、バイオディーゼルとして利用できる特定の脂肪エステルを生産するために用いることもできる。
【０１５２】
2. 脂肪エステルを生産するための改変
アシル-CoAおよびアルコールからの脂肪エステル、例えば、ろうの生産は、既知のポリペプチドを用いて操作することができる。脂肪エステルを作る１つの方法としては、１以上の エステルシンターゼ (EC 2.3.1.20、2.3.1.75)の発現を上昇させること、またはそれらのより活性の形態を発現させることが挙げられる。エステルシンターゼ ペプチド 配列は公共源から入手可能である。例示的な GenBank 受入番号を図 1に提供する。エステルシンターゼ 活性を同定する方法は米国特許第7,118,896号に提供されており、これはその内容全体を引用により本明細書に含める。 
【０１５３】
特定の例において、所望の 生成物がエステルに基づく バイオ燃料である場合、生産宿主は、再生可能な エネルギー源から生成されるエステルを生産するように改変される。かかる生産宿主は、飽和、不飽和または分枝脂肪エステルを再生可能な エネルギー源から合成する能力を生産宿主に付与するために発現されるエステルシンターゼをコードする外来性 (exongenous)DNA 配列を含む。いくつかの態様において、生物は以下の例示的な タンパク質をコードするDNA 配列も発現することが出来る: 脂肪酸 エロンガーゼ、アシル-CoA レダクターゼ、アシルトランスフェラーゼ、エステルシンターゼ、脂肪アシル トランスフェラーゼ、ジアシルグリセロール アシルトランスフェラーゼ、アシル-coA ろう アルコール アシルトランスフェラーゼ。別の態様において、生物は、二機能性 エステルシンターゼ/アシル-CoA:ジアシルグリセロール アシルトランスフェラーゼをコードするDNA 配列を発現する。例えば、二機能性 エステルシンターゼ/アシル-CoA:ジアシルグリセロール アシルトランスフェラーゼは、シモンジア・チネンシス、アシネトバクター・エスピー・株 ADP1 (以前はAcinetobacter calcoaceticus ADP1)、アルカニボラックス・ボルクメンシス、緑膿菌、ファンディバクター・ジャデンシス、シロイヌナズナ、または Alcaligenes eutrophus (後に Ralstonia eutrophaと再び名付けられた)からの複数酵素複合体から選択されうる。１つの態様において、脂肪酸 エロンガーゼ、アシル-CoA レダクターゼまたはろう シンターゼは、Alcaligenes eutrophus (Ralstonia eutrophaと後に再び名付けられた)またはエステル、例えば、ろうまたは脂肪エステルを生産する文献公知のその他の生物からの複数酵素複合体からのものである。
【０１５４】
脂肪エステル 生産に有用なエステル 合成 タンパク質をコードする異種 DNA 配列のさらなる源としては、これらに限定されないが、モルチエレラ・アルピナ (例えば、ATCC 32222)、クリプトコッカス・クルヴァツス (Apiotricum curvatumとも称される)、アルカニボラックス・ ジャデンシス (例えば T9T =DSM 12718 =ATCC 700854)、アシネトバクター・エスピー・HO1-N (例えば、ATCC 14987)およびロドコッカス・オパクス (例えば、PD630、DSMZ 44193)が挙げられる。
【０１５５】
脂肪エステルの生産に有用な生産宿主は真核または原核微生物であり得る。脂肪エステルを生産する生産宿主の非限定的な例としては、サッカロマイセス・セレビシエ、カンジダ・リポリティカ、大腸菌、アルスロバクター AK 19、ロドトルラ・グルチニンス、アシネトバクター・エスピー・株 M-1、カンジダ・リポリティカ、およびその他の油性微生物が挙げられる。 
【０１５６】
一例においてアシネトバクター・エスピー・ADP1(Acinetobacter sp. ADP1)由来の座位AAO17391におけるエステルシンターゼ(Kalscheuer and Steinbuchel、J. Biol. Chem. 278:8075-8082、2003に記載、引用により本明細書に含める)が用いられる。別の例において、シモンジア・チネンシス（Simmondsia chinensis)由来の座位AAD38041におけるエステルシンターゼが用いられる。
【０１５７】
所望により、エステル 排出輸送体、例えば、 FATP ファミリーのメンバーを、エステルの細胞外環境への放出の促進のために利用できる。利用できるエステル 排出輸送体の非限定的な例はDrosophila melanogaster由来の 座位NP_524723における脂肪酸 (長鎖) 輸送タンパク質 CG7400-PA、アイソフォーム Aである。
【０１５８】
G.アシル-ACP、アシル-CoAから炭化水素
1.特定の微生物からの炭化水素
多様な微生物が、炭化水素、例えば、 アルカン、オレフィンおよび イソプレノイドを生産することが知られている。これらの炭化水素の多くは脂肪酸生合成に由来する。これらの炭化水素の生産は、ネイティブな生産宿主における脂肪酸生合成に関与する遺伝子を制御することによって制御することが出来る。
【０１５９】
例えば、藻類 ボツリオコッカス・ブラウニにおける炭化水素 生合成は、脂肪アルデヒドの脱カルボニルを介して起こる。脂肪アルデヒドは脂肪アシル - チオエステルの脂肪-アシルCoAレダクターゼによる還元によって生産される。したがって、最終的なアルカンの構造は、アルカン 生合成に導かれる脂肪酸鎖 長を制御する特定の遺伝子、例えば、 チオエステラーゼを発現するようボツリオコッカス・ブラウニ(B. braunii)を操作することによって制御することが出来る。ボツリオコッカス・ブラウニにおける分枝鎖 脂肪酸生合成をもたらす酵素の発現は、分枝鎖 アルカンの生産をもたらす。脂肪酸の不飽和化を生じさせる遺伝子の導入はオレフィンの生産をもたらす。これら遺伝子のさらなる組合せは、生産される炭化水素の最終的構造に対するさらなる制御を提供しうる。
【０１６０】
より高いレベルのネイティブなまたは操作された炭化水素を生産するために、脂肪酸およびその前駆体の生合成 またはその他の生成物への分解に関与する遺伝子を発現、過剰発現、または減弱させることができる。これらアプローチのそれぞれは脂肪アルコールの還元を介してアルカンを生産するビブリオ・ファーニッシ M1およびその他のビブリオ・ファーニッシ 株におけるアルカンの生産に適用できる。ビブリオ・ファーニッシに加えて、脂肪酸経路を利用するその他のアルカン生産性生物も利用できる。
【０１６１】
これらアプローチのそれぞれは、ミクロコッカス・ルテウス、ステノトロホモナス・マルトフィリア、および関連微生物の多くの株により生産されるオレフィンの生産にも適用できる。これら微生物は脂肪酸 前駆体のヘッドトゥーヘッドの 縮合に由来する長鎖オレフィンを生産する。本明細書に記載する方法を用いて脂肪酸 前駆体の構造およびレベルを制御することにより、様々な鎖長、分枝、および飽和レベルのオレフィンの形成が導かれる。
【０１６２】
ラン藻も脂肪酸誘導体、例えば、脂肪アルコール、脂肪エステル、および炭化水素の生産のための生産宿主として利用することが出来る。例えば、シネコシスティス・エスピーPCC6803およびシネココッカス・エロンガツス PCC7942は生産宿主として働くことが出来、標準的分子生物学 技術を用いて操作することが出来る (Thiel、Genetic analysis of cyanobacteria、in 1 THE MOLECULAR BIOLOGY OF CYANOBACTERIA、ADVANCES IN PHOTOSYNTHESIS AND RESPIRATION 581-611 (Kluwer Academic Publishers 1994); Koksharova & Wolk、Appl. Microbiol. Biotechnol.、58: 123-137、2002)。脂肪酸生合成 遺伝子はこれらの生物において容易に同定および単離することが出来る (表18参照)。
【０１６３】
さらに、多くのラン藻は炭化水素、例えば、ヘプタデカンの天然の生産生物であり、それゆえ、炭化水素 生産を上昇させるためにその脂肪酸生合成 遺伝子を操作することと共に調節解除および過剰発現されうる炭化水素 生合成 遺伝子を含む。
【０１６４】
その他の細菌と異なり、いくつかのラン藻 (例えば、シネコシスティス・エスピー・PCC6803)はその脂質のなかにポリ不飽和脂肪酸を含み(Murata、Plant Cell Physiol.、33: 933-941、1992)、それゆえポリ不飽和脂肪酸誘導体を生産する固有の能力を有する。もっとも重要なことに、ラン藻は太陽光を集めて二酸化炭素を固定することにより、その細胞の炭素のすべてを合成 する光合成 生物である。それゆえ、ラン藻において生産された脂肪酸誘導体は CO2に直接に由来する。
【０１６５】
2.一級アルコールの還元からの炭化水素
炭化水素は、一級アルコールの還元のための進化したオキシドレダクターゼを用いて生産することもできる。一級脂肪アルコールは微生物、例えば、ビブリオ・ファーニッシ M1においてアルカンを生産するのに用いられることが知られている(Park、J. Bacteriol.、187:1426-1429、2005)。脂肪アルコールから炭化水素を生産するために用いられ得るオキシドレダクターゼの一例はNAD(P)H-依存性 オキシドレダクターゼである。合成 NAD(P)H依存性オキシドレダクターゼは進化的操作の使用を介して生産することができ、生産宿主において発現させて脂肪酸誘導体を生産することができる。 
【０１６６】
所望の 活性を有するための脂肪アルコール レダクターゼの「進化」のプロセスは周知である(Kolkman and Stemmer、Nat. Biotechnol. 19:423-8、2001; Ness et al.、Adv Protein Chem. 55:261-92、2000; Minshull and Stemmer、Curr. Opin. Chem. Biol. 3:284-90、1999; Huisman and Gray、Curr. Opin. Biotechnol. 13:352-8、2002; 米国特許出願公開2006/0195947号）。
【０１６７】
NAD(P)H 依存性 オキシドレダクターゼのライブラリーは標準的方法、例えば、 変異性 PCR、部位特異的ランダム突然変異誘発、部位特異的 飽和 突然変異誘発、または部位指向特異的 突然変異誘発によって作成される。さらに、ライブラリーは天然 NAD(P)H 依存性 オキシドレダクターゼコード配列の「シャッフリング」を介して作成されうる。ライブラリーは好適な生産宿主、例えば、 大腸菌にて発現される。オキシドレダクターゼライブラリーの異なるメンバーを発現する個々のコロニーは次いで脂肪アルコールの還元を触媒しうるオキシドレダクターゼの発現について分析される。
【０１６８】
例えば、各細胞は、全細胞生体変換、細胞抽出物、または透過性細胞としてアッセイされうる。細胞から精製された酵素も同様に分析されうる。脂肪アルコール レダクターゼは、分光光度法または蛍光定量法でNAD(P)Hの脂肪アルコール-依存性酸化をモニターすることによって同定される。アルカンの生産は GC/MS、TLC、またはその他の 方法によってモニターされる。
【０１６９】
このようにして同定されたオキシドレダクターゼは、アルカン、アルケン、および関連分枝炭化水素の生産に用いられる。これはインビトロまたはインビボで達成される。後者は、 進化した脂肪アルコール レダクターゼ遺伝子を脂肪アルコールを生産する生物、例えば、本明細書に記載するものにおいて発現させることによって達成される。脂肪アルコールはアルカンを生産するアルコール レダクターゼのための基質として作用する。その他のオキシドレダクターゼもこの反応を触媒するように操作され得、例えば、分子状水素、グルタチオン、FADH、またはその他の 還元補酵素を使用するものである。
【０１７０】
H.脂肪酸誘導体の放出- 輸送タンパク質 
輸送タンパク質は、脂肪酸誘導体を生産宿主の外に排出する。多くの輸送 および流出 タンパク質が、非常に多様な化合物を排出するために働いており、特定のタイプの脂肪酸誘導体に選択的となるように天然に改変されている可能性がある。好適な 輸送タンパク質の非限定的な例は、ATP-結合カセット (ABC) 輸送タンパク質、流出 タンパク質、および脂肪酸 トランスポーター タンパク質 (FATP)である。好適な 輸送タンパク質のさらなる非限定的な例としては、生物、例えば、Caenorhabditis elegans、シロイヌナズナ、アルカリゲネス・エウトロファス、Rhodococcus erythropolisからのABC 輸送タンパク質が挙げられる。利用可能な例示的な ABC 輸送タンパク質は、CER5、AtMRP5、AmiS2、またはAtPGP1である。好ましい態様において、ABC 輸送タンパク質はCER5 (例えば、 AY734542)である。図 1に同定される輸送タンパク質も参照。好適な 輸送タンパク質を発現する遺伝子を含むベクターをタンパク質 生産宿主に挿入して、脂肪酸誘導体の放出を上昇させることができる。
【０１７１】
生産宿主はまた脂肪酸誘導体を放出する内因性の能力について選択されうる。生成物の生産および発酵ブロスへの放出の効率は細胞内生成物の細胞外生成物に対する比として表現されうる。いくつかの例において比は、約 5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、または1:5でありうる。
【０１７２】
II.脂肪酸誘導体の炭素鎖 特徴の選択
特定の分枝点、飽和レベル、炭素鎖長、およびエステル 特徴を有する脂肪酸誘導体を所望のように生産することが出来る。特定の 誘導体を天然に生産する微生物を選択するとよい。あるいは、特定の 脂肪酸誘導体を生産する酵素を発現する遺伝子を生産宿主微生物に挿入してもよい。図 1は、所望の 特徴を有する脂肪酸誘導体を作るために単独でまたは組み合わせて利用されうる酵素の非限定的な例を提供する。
【０１７３】
いくつかの例において、異なる種または操作された変異体を起源とする外来性 FAS 遺伝子の発現を生産宿主に導入することにより、ネイティブな 生産宿主のものとは構造的に(長さ、分枝、不飽和度等において)異なる脂肪酸の生合成をもたらすことが出来る。これらの異種遺伝子産物はまた、生産宿主細胞における天然の調節機構によって影響されないように選択または操作することができ、それゆえ所望の商業的生成物の生産の制御が可能となる。例えば、バチルス・スブチリス、サッカロマイセス・セレビシエ、Streptomyces spp.、Ralstonia、Rhodococcus、Corynebacteria、Brevibacteria、Mycobacteria、油性酵母等 からのFAS 酵素を生産宿主において発現させることが出来る。かかる外来性 酵素の発現は、生産される脂肪酸の構造を変化させる。
【０１７４】
生産宿主が操作されて特定のレベルの不飽和、分枝、または炭素鎖長を有する脂肪酸を生産する場合、その結果得られる操作された脂肪酸は、脂肪酸誘導体の生産に利用できる。かかる生産宿主から作られた脂肪酸誘導体は、 操作された脂肪酸の特徴を示しうる。
【０１７５】
例えば、生産宿主は操作されて分枝、短鎖 脂肪酸をつくり得、それは次いで生産宿主に分枝、短鎖脂肪アルコールの生産のために利用されうる。。同様に、炭化水素は規定されたレベルの分枝、不飽和、および/または 炭素鎖長を有する脂肪酸を生産するよう生産宿主を操作することにより生産され得、したがって、均一な炭化水素集団が作られる。さらなる工程を用いることにより結果として得られる 生成物の均一性を改善することができる。例えば、不飽和アルコール、脂肪エステル、または炭化水素が望ましい場合、生産宿主生物を操作して、低レベルの飽和脂肪酸を生産させることができ、 さらにさらなるデサチュラーゼを発現するように改変され得、それにより飽和生成物の生産が低められる。
【０１７６】
A.分枝および環状部分
1.分枝および環状脂肪酸誘導体の操作
脂肪酸は脂肪酸誘導体の生産において鍵となる中間体である。脂肪酸誘導体を作るために分枝または環状脂肪酸を用いることにより、分枝点、環状部分、およびその組合せを含む脂肪酸誘導体を生産することが出来る。 
【０１７７】
例えば、大腸菌は天然に直鎖脂肪酸(sFA)を生産する。分枝鎖脂肪酸(brFA)を生産するように大腸菌を操作するために、分枝前駆体を提供するいくつかの 遺伝子(例えば、bkd オペロン)を生産宿主に導入して発現させることにより、分枝 前駆体からの脂肪酸生合成を開始させることが出来る (例えば、fabH) 。bkd、ilv、icm、およびfab 遺伝子 ファミリーを分枝鎖脂肪酸誘導体を生産するために発現または過剰発現させるとよい。同様に、環状脂肪酸を生産するために、環状前駆体を提供する遺伝子を生産宿主に導入して発現させることにより、環状 前駆体からの脂肪酸生合成を開始させることが出来る。 ans、chc、およびplm 遺伝子 ファミリーを環状脂肪酸を生産するために発現または過剰発現させるとよい。図 1に本発明の方法および生産宿主に用いることが出来るこれら遺伝子 ファミリーにおける遺伝子の非限定的な例を記載する。
【０１７８】
さらに、生産宿主を、brFAの伸長のためのタンパク質(例えば、ACP、FabF等)をコードする遺伝子の発現 および/または通常sFAを導く対応する大腸菌 遺伝子の欠失または減弱のために操作することが出来る。この点に関して、導入された遺伝子 (例えば、fabH、fabF)と競合するであろう内因性 遺伝子は欠失または減弱される。 
【０１７９】
分枝 アシル-CoA (例えば、2-メチル-ブチリル-CoA、イソバレリル-CoA、イソブチリル-CoA等)はbrFAの前駆体である。brFAを含むほとんどの微生物において、brFAは分枝アミノ酸(例えば、イソロイシン、ロイシン、およびバリン)から２工程にて合成される (Kadena、Microbiol. Rev. 55:288、1991)。生産宿主を、brFAを生産するために、またはbrFAを過剰生産するために、これら２工程に関与する１以上の酵素を発現または過剰発現するように操作することが出来る。例えば、生産宿主はbrFAを導く１工程を達成しうる内因性 酵素を有し得、それゆえ第２工程に関与する酵素をコードする遺伝子のみが組換えにより導入される必要がある。
【０１８０】
2.分枝脂肪酸および分枝脂肪酸誘導体の形成
brFAの形成における第一工程は、対応するαケト 酸の 分枝鎖 アミノ酸 アミノトランスフェラーゼによる生産である。生産宿主は内因性にかかる酵素をコードする遺伝子を含みうるか、またはかかる遺伝子は組換えにより導入されうる。大腸菌は、例えば、かかる酵素である、IlvE (EC 2.6.1.42; GenBank受入番号YP_026247)を内因性に発現する。いくつかの生産宿主において、異種 分枝鎖 アミノ酸 アミノトランスフェラーゼを発現させてはならない。しかし、内因性でなければ、大腸菌 IlvE またはその他のいずれかの分枝鎖 アミノ 酸 アミノトランスフェラーゼ (例えば、Lactococcus lactis からのIlvE (GenBank 受入番号 AAF34406)、Pseudomonas putidaからのIlvE (GenBank受入番号NP_745648)、またはStreptomyces coelicolorからのIlvE (GenBank受入番号NP_629657))を導入することができる。アミノトランスフェラーゼ 反応 が選択された生産宿主生物におけるbrFA 生合成において律速であれば、アミノトランスフェラーゼを過剰発現させることができる。
【０１８１】
第二工程は、α-ケト酸の対応する 分枝鎖 アシル-CoAへの酸化的脱炭酸である。この反応は、E1α/β (デカルボキシラーゼ)、E2 (ジヒドロリポイルトランスアシラーゼ)およびE3 (ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ) サブユニットからなる分枝鎖α-ケト 酸デヒドロゲナーゼ複合体(bkd; EC 1.2.4.4.) (Denoya et al.、J. Bacteriol. 177:3504、1995)によって触媒することができる。これら分枝鎖α-ケト 酸デヒドロゲナーゼ複合体は、ピルビン酸およびα-ケトグルタル酸 デヒドロゲナーゼ 複合体に類似している。brFAを有する および/または分枝鎖 アミノ 酸上で生育するすべての微生物は生産宿主、例えば、大腸菌における発現のためのbkd 遺伝子の単離のための源として利用できる。さらに、大腸菌はそのピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の一部としてE3 成分を有し(lpd、EC 1.8.1.4、GenBank 受入番号  NP_414658)、それはそれゆえ、E1α/βおよび E2 bkd 遺伝子のみを発現するのに十分であり得る。表3は、分枝鎖 アシル-CoA 前駆体の提供のために生産宿主において組換えにより導入され、発現されうるいくつかの 微生物からのbkd 遺伝子の非限定的な例を記載する。かかる bkd 遺伝子を有する微生物は、生産宿主としても利用できる。
【０１８２】
表3:選択された微生物からのBkd 遺伝子
【表３】
0005863088.tif 000004
【０１８３】
別の例において、イソブチリル-CoAは生産宿主、例えば大腸菌においてクロトニル-CoA レダクターゼ (Ccr、EC 1.6.5.5、1.1.1.1)およびイソブチリル-CoA ムターゼ (ラージサブユニット IcmA、EC 5.4.99.2; スモールサブユニット IcmB、EC 5.4.99.2) (Han and Reynolds、J. Bacteriol. 179:5157、1997)の共発現を介して作ることが出来る。クロトニル-CoAは大腸菌およびその他の微生物における脂肪酸生合成の中間体である。選択された微生物からのccrおよびicm 遺伝子の非限定的な例を表4に示す。
【０１８４】
表4: 選択された微生物からの Ccrおよびicm 遺伝子
【表４】
0005863088.tif 000005
【０１８５】
bkd 遺伝子の発現に加えて、brFA 生合成の開始は、分枝鎖 アシル-CoAに対する特異性を有するβ-ケトアシル-アシル-キャリアタンパク質 シンターゼ III (FabH、EC 2.3.1.41) を利用する (Li et al.、J. Bacteriol. 187:3795-3799、2005)。かかるFabH 酵素の非限定的な例を表5に列挙する。あらゆるbrFA-含有微生物の脂肪酸生合成に関与するfabH 遺伝子を生産宿主において発現させることが出来る。天然には brFAを作らない生産宿主からのBkd およびFabH 酵素は brFA 生産を支持しないことがあり得、それゆえ、BkdおよびFabHは組換えにより発現されうる。bkdおよびfabH 遺伝子を含むベクターをかかる生産宿主に挿入することが出来る。同様に、Bkd およびFabH 生産の内因性 レベルはbrFAの生産に十分でないことがあり得、それゆえ、それらは過剰発現されうる。さらに、脂肪酸生合成経路のその他の成分を発現または過剰発現させることが出来、例えば、 アシル キャリアタンパク質 (ACP) およびβ-ケトアシル-アシル-キャリアタンパク質 シンターゼ II(fabF、EC 2.3.1.41)である (候補の非限定的な例は表 5に挙げる)。これらの遺伝子の発現に加えて、内因性脂肪酸生合成 経路におけるいくつかの遺伝子は生産宿主において減弱されうる。brFA 生産を導く経路の酵素と基質について競合しうる酵素をコードする遺伝子はbrFA 生産を上昇させるために減弱されうる。例えば、大腸菌においてbrFA 生合成を干渉する可能性の最も高い候補はfabH (Genbank 受入番号# NP_415609) および/または fabF 遺伝子(Genbank 受入番号 # NP_415613)である。
【０１８６】
表5: brFAを有する選択された微生物からのFabH、ACPおよびfabF遺伝子
【表５】
0005863088.tif 000006
【０１８７】
上記のように、brFA 合成 およびアルコール 合成を支持する遺伝子を発現させることの組合せを介して分枝鎖 アルコールが生産されうる。例えば、アルコール レダクターゼ、例えば、Acinetobacter baylyi ADP1からのAcr1がbkd オペロンと共発現される場合、大腸菌はイソペンタノール、イソブタノールまたは 2-メチル ブタノールを合成することができる。 同様に、Acr1が ccr/icm 遺伝子と共発現される場合、大腸菌はイソブタノールを合成することができる。
【０１８８】
3.環状脂肪酸および環状脂肪酸誘導体の形成
生産宿主、例えば、大腸菌をω-環状脂肪酸(cyFA)を合成することが出来る生物へと変換するために、環状 前駆体 シクロヘキシルカルボニル-CoA (CHC-CoA) を提供する遺伝子(Cropp et al.、Nature Biotech. 18:980-983、2000)を生産宿主に導入して発現させる。同様の変換がその他の生産宿主、例えば、細菌、酵母および糸状菌についても可能である。
【０１８９】
大腸菌においてCHC-CoAを提供する遺伝子の非限定的な例は以下を含む: ストレプトマイセス・コリヌスのアンサトリエニン 遺伝子 クラスターからの ansJ、ansK、ansL、chcA およびansM (Chen et al.、Eur. J. Biochem. 261: 98-107、1999)またはストレプトマイセス(Streptomyces) sp. HK803 のホスラクトマイシン B 遺伝子 クラスターからの plmJ、plmK、plmL、chcAおよびplmM (Palaniappan et al.、J. Biol. Chem. 278:35552-35557、2003) とともに、S. collinus、S. avermitilisまたは S. coelicolorからの chcB 遺伝子 (Patton et al.、Biochem. 39:7595-7604、2000) (GenBank 受入番号については表6参照)。上記表5に列挙する遺伝子を次いでω-環状脂肪酸の開始および伸長を可能とするために発現させることができる。あるいは、相同の遺伝子をcyFAを作る微生物から単離して大腸菌において発現させることができる。
【０１９０】
表6: CHC-CoAの合成のための遺伝子
【表６】
0005863088.tif 000007
* chcAのみがGenBank エントリーU72144においてアノテーションされており、ansJKLMはChen et al.による(Eur. J. Biochem. 261:98-107、1999)。
【０１９１】
表5に挙げる遺伝子 (fabH、ACP およびfabF)はω-環状脂肪酸の開始および伸長を起こらせるのに十分である。というのはそれらは広い基質特異性を有しうるからである。これらのいずれかの遺伝子と表5からのansJKLM/chcAB または pmlJKLM/chcAB 遺伝子の共発現がcyFAを生じない場合は、cyFAを作る微生物からのfabH、ACP および/または fabF ホモログを単離し(例えば縮重 PCR プライマーまたは異種 DNA配列プローブの使用により)、共発現させればよい。表7はω-環状脂肪酸を含む微生物の非限定的な例を列挙する。
【０１９２】
表7:ω-環状脂肪酸を含む微生物の非限定的な例
【表７】
0005863088.tif 000008
* cyFA 生合成の前駆体としてシクロヘキシルカルボニル-CoAではなくシクロヘプチルカルボニル-CoAを使用。
【０１９３】
B.飽和
脂肪酸は、脂肪酸誘導体の生産において鍵となる中間体である。脂肪酸誘導体における飽和度は、脂肪酸 中間体の飽和度を調節することによって制御することができる。sfa、gns、およびfab ファミリーの遺伝子を脂肪酸の飽和を制御するために発現または過剰発現させることが出来る。図 1に本発明の方法および生産宿主において利用できるこれら遺伝子 ファミリーにおける遺伝子の非限定的な例を記載する。
【０１９４】
生産宿主は、生産宿主をfabBを過剰発現するよう操作することにより、または低温で生産宿主を培養することにより(例えば、37℃未満)、不飽和脂肪酸を生産するよう操作されうる。FabBはシス-δ3デセノイル-ACPを優先し、大腸菌における不飽和脂肪酸生産がもたらされる。fabBの過剰発現により、かなりのパーセンテージの不飽和脂肪酸の生産が導かれる(de Mendoza et al.、J. Biol. Chem.、258:2098-101、1983)。fabBを遺伝子を天然には有さない生産宿主に挿入して発現させることが出来る。これら不飽和脂肪酸は、脂肪酸誘導体、例えば、 脂肪アルコール、脂肪エステル、ろう、オレフィン、アルカン等を生産するよう操作された生産宿主において中間体として利用することが出来る。
【０１９５】
あるいは、脂肪酸生合成のリプレッサー、例えば、fabR (Genbank 受入番号 NP_418398)を欠失させてもよく、それによっても大腸菌における不飽和脂肪酸 生産が上昇する (Zhang et al.、J. Biol. Chem. 277:15558、2002)。類似の欠失をその他の生産宿主において行うことも出来る。不飽和脂肪酸のさらなる上昇は例えば、fabM (トランス-2,シス-3-デセノイル-ACP イソメラーゼ、Genbank 受入番号DAA05501) の過剰発現およびStreptococcus pneumoniae からのfabK (トランス-2-エノイル-ACP レダクターゼ II、Genbank 受入番号 NP_357969)の発現制御 (Marrakchi et al.、J. Biol. Chem. 277: 44809、2002)、および大腸菌 fabI ((トランス-2-エノイル-ACP レダクターゼ、Genbank 受入番号NP_415804)の欠失により達成できる。さらに、不飽和脂肪エステルのパーセンテージを高めるためには、生産宿主は、fabB (β-ケトアシル-ACP シンターゼ I、受入番号: BAA16180、EC:2.3.1.41をコードする)、sfa (fabAのサプレッサー、受入番号: AAC44390をコードする)および gnsA およびgnsB (ともに secG ヌル突然変異体 サプレッサー(即ち、冷ショックタンパク質)、受入番号 :ABD18647.1、AAC74076.1をコードする)を過剰発現するとよい。いくつかの例において、内因性 fabF 遺伝子を減弱することができ、それにより生産されるパルミトレイン酸 (C16:1)のパーセンテージが上昇する。
【０１９６】
C.鎖長およびエステル 特徴
1.鎖長および奇数鎖の生産
本明細書において記載する方法は、様々な長さの脂肪エステルおよび脂肪酸誘導体の生産を可能とする。鎖長はチオエステラーゼにより制御され、チオエステラーゼはtesおよびfat 遺伝子 ファミリーの発現により生産される。特定のチオエステラーゼを発現させることにより、所望の 炭素鎖長を有する脂肪酸および脂肪酸誘導体を生産することが出来る。好適な チオエステラーゼの非限定的な例を図 1に列挙する。特定の チオエステラーゼをコードする遺伝子を生産宿主に導入することにより、特定の 炭素鎖長の脂肪酸または脂肪酸誘導体を生産することが出来る。内因性 チオエステラーゼの発現はしたがって抑制しなければならない。
【０１９７】
１つの態様において、脂肪酸誘導体は、約 4〜36 炭素原子、約 6 〜32 炭素原子、約 10 〜30 炭素原子、約 10〜18 炭素原子、約 24〜32 炭素原子、約 26〜30 炭素原子、約 26 〜32 炭素原子、約 5〜10 炭素原子、約 10〜16 炭素原子、または約 12〜18 炭素原子の炭素鎖を含む。別の態様において、脂肪酸誘導体は、約 20 炭素原子未満、約 18 炭素原子未満、または約 16 炭素原子未満の炭素鎖を含む。別の態様において、脂肪エステル 生成物は、24〜46 炭素原子の炭素原子含量を有する飽和または不飽和脂肪エステル 生成物である。１つの態様において、脂肪エステル 生成物は24〜32 炭素原子の炭素原子含量を有する。別の態様において、脂肪エステル 生成物は14および 20 炭素の炭素含量を有する。別の態様において、脂肪エステルは、C18:1のメチルエステルである。別の態様において、脂肪エステルは、C16:1のエチルエステルである。別の態様において、脂肪エステルは、C16:1のメチルエステルである。さらに別の態様において、脂肪エステルは、オクタノールのオクタデシル エステルである。
【０１９８】
いくつかの微生物は 優先的に偶数または奇数 炭素鎖の脂肪酸および脂肪酸誘導体を生産する。例えば、大腸菌は通常、偶数 炭素鎖 脂肪酸および脂肪酸 エチルエステル(FAEE)を生産する。驚くべきことに、本明細書に開示する方法を用いるとその生産を変えることが出来る。例えば、大腸菌を奇数 炭素鎖の脂肪酸およびFAEEを生産するようにすることが出来る。
【０１９９】
2.エステル特徴
エステルは「A」側および「B」側と称されうる部分を含む。B側には生産宿主生物におけるデノボ合成から生産される脂肪酸が寄与しうる。生産宿主がさらに操作されてアルコール、例えば脂肪アルコールを作るいくつかの態様において、A側もまた生産宿主生物により生産される。さらに別の態様において、A側は培地において提供されうる。所望のチオエステラーゼ 遺伝子を選択することにより、B側、(および脂肪アルコールが作られる場合はA側)は、特定の炭素鎖特徴を有するよう設計されうる。これらの特徴には、分枝点、不飽和、および所望の炭素鎖長が含まれる。
【０２００】
特定の チオエステラーゼ遺伝子が選択された場合に、 AおよびB側の両方が生産宿主によって寄与される場合、それらは脂肪酸生合成経路中間体を用いて類似の炭素鎖特徴を有することになる。例えば、生産される脂肪エステルの少なくとも約 50%、60%、70%、または 80%は、約 2、4、6、8、10、12、または 14 炭素長にて異なるA側および B側を有することになる。A側およびB側はまた、類似の分枝および飽和レベルを示しうる。
【０２０１】
A側に寄与するための脂肪アルコールの生産に加えて、生産宿主はその他の短鎖アルコール、例えば、 エタノール、プロパノール、イソプロパノール、イソブタノール、およびブタノールを当該技術分野で周知の技術を用いてA側上に取り込むために生産しうる。例えば、ブタノールは生産宿主生物によって作られうる。ブタノール生産細胞を作るために、例えば、LS9001 株をさらに操作して大腸菌(Escherichia coli) K12からのatoB (アセチル-CoA アセチルトランスフェラーゼ) 、Butyrivibrio fibrisolvensからのβ -ヒドロキシブチリル-CoA デヒドロゲナーゼ、Clostridium beijerinckii からのクロトナーゼ、Clostridium beijerinckiiからのブチリル CoA デヒドロゲナーゼ、Cladosporium fulvumからのCoA-アシル化 アルデヒド デヒドロゲナーゼ (ALDH) およびClostridium acetobutylicumのアルデヒド-アルコール デヒドロゲナーゼをコードするadhE をpBAD24 発現 ベクターにおいてprpBCDE プロモーター系の下で発現させることが出来る。その他の生産宿主生物もブタノールまたはその他の短鎖 アルコールを生産するように同様に 改変することができる。例えば、エタノールはKalscheuer et al.、Microbiology 152:2529-2536、2006に教示される方法を用いて生産宿主において生産され得、これは引用により本明細書に含める。
【０２０２】
III.脂肪酸誘導体 生産を上昇させるための生産株の遺伝子操作
脂肪酸誘導体の生産のための生合成経路に関与する異種 DNA 配列は、当該技術分野で周知の技術 (非限定的な例として、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈降法、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム-媒介トランスフェクション、コンジュゲーション、形質導入、およびゲノム組込みが挙げられる)を用いて生産宿主細胞に安定にまたは一過性に導入されうる。安定な形質転換のために、DNA 配列はさらに、選択可能マーカーを含み得、非限定的な例としては、 例えば、抗生物質耐性および栄養要求欠損を補完する遺伝子が挙げられる。
【０２０３】
本開示の様々な態様は、代謝または生合成経路に関与するタンパク質をコードする異種 DNA 配列を含む発現 ベクターを利用する。好適な 発現 ベクターとしては、これらに限定されないが、ウイルスベクター(例えば、 バキュロウイルス ベクター)、ファージ ベクター(例えば、 バクテリオファージ ベクター)、プラスミド、ファージミド、コスミド、フォスミド、細菌人工染色体、ウイルスベクター (例えば、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス、アデノ-随伴ウイルス、SV40、単純ヘルペス ウイルス等に基づくウイルスベクター)、P1-に基づく人工染色体、酵母 プラスミド、酵母 人工染色体、および特定の目的の生産宿主(例えば、 大腸菌、シュードモナス・ピスム（Pseudomonas pisum）およびサッカロマイセス・セレビシエ)のためのその他のベクターが挙げられる。
【０２０４】
有用な 発現 ベクターは形質転換生産宿主細胞の選択のための表現形質を提供する１以上の 選択可能マーカー遺伝子を含みうる。選択可能マーカー遺伝子は選択培地において培養された形質転換生産宿主細胞の生存または生育に必要なタンパク質をコードする。選択可能マーカー遺伝子を含むベクターで形質転換されていない生産宿主細胞は培地で生育できない。典型的な選択遺伝子は (a) 抗生物質 またはその他の 毒素(例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、またはテトラサイクリン)に耐性を付与するタンパク質、(b)栄養要求欠損を補完するタンパク質、または(c)複合培地から入手できない必須栄養素を供給するタンパク質をコードする(例えば、バシラスについてはD-アラニンラセマーゼ(racemate)をコードする遺伝子)。別の態様において、選択可能マーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸 レダクターゼをコードするもの、またはネオマイシン 耐性を付与するもの (真核細胞培養における使用のため)、またはテトラサイクリンまたはアンピシリン 耐性を付与するもの (原核生産宿主細胞、例えば、 大腸菌における使用のため)である。
【０２０５】
発現 ベクターにおいて生合成経路における遺伝子をコードするDNA 配列は適当な発現制御配列(プロモーター、エンハンサー等)に作動可能に連結して、コードされた遺伝子産物の合成を導く。かかるプロモーターは微生物またはウイルス起源であってよく、CMVおよびSV40が挙げられる。使用する生産宿主/ベクター系に応じて、多数の好適な転写および翻訳 制御要素、例えば構成的および誘導可能 プロモーター、転写 エンハンサー 要素、転写 ターミネーター等のいずれもが発現 ベクターにおいて利用できる (例えば、Bitter et al.、 Methods in Enzymology、153:516 544、1987参照)。  
【０２０６】
原核生産宿主細胞における使用に好適な プロモーターとしては、これらに限定されないが、T4、T3、Sp6およびT7 ポリメラーゼを認識できるプロモーター、バクテリオファージ ラムダのPR および PL プロモーター、大腸菌のtrp、recA、熱ショック、および lacZ プロモーター、枯草菌のα-アミラーゼおよびシグマ-特異的プロモーター、バチルスのバクテリオファージのプロモーター、ストレプトマイセス プロモーター、バクテリオファージ ラムダの int プロモーター、pBR322のベータ・ラクタマーゼ遺伝子のbla プロモーター、およびクロラムフェニコール アセチルトランスフェラーゼ 遺伝子のCAT プロモーターが挙げられる。原核 プロモーターは Glick、J. Ind. Microbiol. 1:277、1987; Watson et al.、MOLECULAR BIOLOGY OF GENE、4th Ed. (1987)、Benjamin Cummins (1987); およびSambrook et al.、MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL、2nd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989)により概説されている。真核生産宿主における使用に好適な 真核 プロモーターの非限定的な例はウイルス起源のものであり、マウス メタロチオネイン I 遺伝子のプロモーター(Hamer et al.、J. Mol. Appl. Gen. 1:273、1982);ヘルペス ウイルスのTK プロモーター (McKnight、Cell 31:355、1982); SV40 初期プロモーター (Benoist et al.、Nature (London) 290:304、1981);サイトメガロウイルス プロモーター (Foecking et al.、Gene 45:101、1980);酵母 gal4 遺伝子 プロモーター (Johnston et al.、PNAS (USA) 79:6971、1982; Silver et al.、PNAS (USA) 81:5951、1984); および IgG プロモーター (Orlandi et al.、PNAS (USA) 86:3833、1989)が挙げられる。
【０２０７】
生産宿主は、誘導可能 プロモーターに作動可能に連結した生合成経路 遺伝子産物をコードする異種 DNA 配列により遺伝子的に改変されうる。誘導可能 プロモーターは当該技術分野で周知である。好適な 誘導可能 プロモーターの非限定的な例としては、タンパク質、代謝産物または化学物質によって影響を受けるプロモーターが挙げられる。これらとしてはこれらに限定されないが以下が挙げられる:ウシ 白血病 ウイルス プロモーター、メタロチオネイン プロモーター、デキサメタゾン-誘導可能 MMTV プロモーター、SV40 プロモーター、MRP polIII プロモーター、テトラサイクリン-誘導可能 CMV プロモーター (例えば、ヒト 最初期 CMV プロモーター)ならびにtrpおよびlac オペロン由来のもの。
【０２０８】
いくつかの例において、生産宿主は構成的 プロモーターに作動可能に連結された生合成経路 遺伝子産物をコードする異種 DNA 配列により遺伝子的に改変される。好適な 構成的 プロモーターは当該技術分野において知られており、例えば、構成的 アデノウイルス 主要後期 プロモーター、構成的 MPSV プロモーター、または構成的 CMV プロモーターが挙げられる。
【０２０９】
いくつかの例において、改変された生産宿主は、生合成経路に関与する単一のタンパク質をコードする外来性 DNA 配列により遺伝子的に改変されたものである。  別の態様において、改変された生産宿主は生合成経路に関与する２以上のタンパク質をコードする外来性 DNA 配列、例えば、生合成経路における第一および第二の酵素をコードする外来性 DNA 配列により遺伝子的に改変されたものである。
【０２１０】
生産宿主が遺伝子的に改変されて生合成経路に関与する２以上のタンパク質を発現する場合、かかるDNA 配列はそれぞれ単一または別々の発現 ベクターに含まれうる。かかるDNA 配列が単一の発現 ベクターに含まれる場合、いくつかの態様において、ヌクレオチド 配列は共通の制御要素に作動可能に連結しており、ここで、共通の制御要素は、単一の発現 ベクターにおけるすべての生合成経路 タンパク質をコードするDNA 配列の発現を制御する(例えば、 プロモーター)。 
【０２１１】
改変された生産宿主が生合成経路に関与する２以上のタンパク質をコードする異種 DNA 配列により遺伝子的に改変されている場合、DNA 配列の１つは誘導可能 プロモーターに作動可能に連結し、１以上のDNA 配列は構成的 プロモーターに作動可能に連結していてもよい。
【０２１２】
いくつかの態様において、生合成経路 中間体の細胞内 濃度 (例えば遺伝子的に改変された生産宿主における中間体濃度)は最終生成物の収量をさらに追加するよう高められ得る。中間体の細胞内 濃度は多数の方法で高められ得、例えば、これらに限定されないが、生合成経路のための基質の培地中の濃度の上昇;生合成経路において活性な酵素の触媒活性の上昇;生合成経路において活性な酵素のための基質 (例えば一次基質)の細胞内量の上昇; 等が挙げられる。
【０２１３】
いくつかの例において、脂肪酸誘導体または中間体は生産宿主の細胞質中に生産される。細胞質濃度は多数の方法で高められ得、例えば、これらに限定されないが、脂肪酸の補酵素 Aへの結合によるアシル-CoA チオエステルの形成が挙げられる。さらに、アシル-CoAの濃度は細胞におけるCoAの生合成の上昇によっても高められ得、例えば、パントテン酸 生合成 に関与する遺伝子(例えば、panD)の過剰発現またはグルタチオン 生合成に関与する 遺伝子(例えば、グルタチオンシンターゼ)のノックアウトによってなされる。
【０２１４】
制御配列、コード配列、およびその組合せを、生産宿主の染色体において導入または変化させることが出来る。いくつかの例において、所望の 組換え 配列の生産宿主 ゲノム 配列への組込みは、選択可能マーカー、例えば、抗生物質の使用を必要としない。いくつかの例において、ゲノム 変化には制御に非感受性のプロモーター によるネイティブな プロモーターの置換による標的 遺伝子の制御配列の変化が含まれる。これを行うための多くのアプローチが存在する。例えば、Valle and Flores、Methods Mol. Biol. 267:113-122、2006は、大腸菌において染色体 遺伝子を過剰発現させるPCRに基づく方法を記載している。別のアプローチ は、Court et al.、Proc. Nat. Acad. Sci. 100:15748-15753、2003により開発された技術を用いる、染色体において直接に特異的突然変異を作るための一本鎖オリゴヌクレオチドの使用に基づく。この技術は、遺伝的組換えを促進するためのバクテリオファージラムダからのBeta タンパク質の過剰発現の使用に基づく。このアプローチの利点は70 (またはそれ以上の)塩基長の合成オリゴヌクレオチドを点突然変異、挿入、および欠失を作るために用いることが出来ることであり、それによってクローニング 工程がすべて排除される。さらに、系 は所望の 突然変異を単離するためにマーカーが必要でないために十分に効率的である。
【０２１５】
このアプローチにより、遺伝子の調節領域を、より強いプロモーターの作成のためおよび/またはリプレッサーの結合部位を排除するために変化させることが出来る。そのようにして、所望の 遺伝子を生産宿主生物において過剰発現させることが出来る。
【０２１６】
IV.発酵 
A.生産効率の最大化
脂肪酸誘導体の生産および単離は特定の発酵技術の使用によって促進されうる。生産を最大化させ、コストを削減する１つの方法は、炭化水素生成物に変換される炭素源のパーセンテージを上昇させることである。
【０２１７】
通常の細胞の生活環において、炭素は、細胞機能、例えば、 脂質、糖類、タンパク質、有機酸および核酸の生産に用いられる。生育に関連する活性に必要な炭素の量を減らすと、炭素源の出力への変換効率を高めることが出来る。これは、所望の密度、例えば、対数増殖期のピークに達する密度までまず微生物を培養することにより達成できる。かかる点において、複製チェックポイント遺伝子が細胞の増殖の停止に利用されうる。具体的には、クオラムセンシングメカニズム(Camilli and Bassler Science 311:1113、2006; Venturi FEMS Microbio. Rev. 30:274-291、2006;およびReading and Sperandio FEMS Microbiol. Lett. 254:1-11、2006に概説、これら参考文献は引用により本明細書に含まれる)を利用して、遺伝子、例えば、 p53、p21、またはその他の チェックポイント 遺伝子を活性化することが出来る。
【０２１８】
細胞複製を停止するよう活性化され得、大腸菌において生育できる遺伝子としては umuDC 遺伝子が挙げられ、その過剰発現は静止期から対数増殖期への進行を停止する (Murli et al.、J. of Bact. 182:1127、2000)。 UmuCは非コード損傷に対する損傷乗り越え合成を行うことが出来るDNA ポリメラーゼであり、これは多くのUVおよび化学物質 突然変異誘発の機構の基礎である。umuDC 遺伝子産物は損傷乗り越え合成のプロセスに用いられ、DNA配列損傷チェックポイントとしても働く。umuDC遺伝子産物には UmuC、UmuD、umuD’、UmuD’2C、UmuD’2 およびUmuD2が含まれる。同時に、生成物生産遺伝子は活性化され得、したがって複製および維持経路が用いられる必要性が最小となり、一方脂肪酸誘導体が作られる。生産宿主微生物はまた、適切な 最終生成物 生産 遺伝子とともにこの遺伝子のデノボ 合成を介してprpBCDE プロモーター 系の下でpBAD24において大腸菌からumuCおよび umuDを発現するように操作されうる。
【０２１９】
脂肪エステルまたは炭化水素生成物に変換される入力 炭素のパーセンテージはコスト推進要因である。プロセスが効率的であるほど(即ち、脂肪エステルまたは炭化水素生成物に変換される入力 炭素のパーセンテージが高いほど)、プロセスは安価となる。酸素-含有炭素源 (例えば、グルコースおよびその他の炭水化物に基づく源)について、酸素は二酸化炭素の形態で放出されなければならない。2 酸素原子が放出される度に、１炭素原子が放出され、最大理論的代謝効率は ~34% (w/w) となる(脂肪酸由来生成物について)。この値はしかし、その他の 炭化水素 生成物および炭素源については変化する。文献における典型的な効率はおよそ <5%である。炭化水素 生成物を生産するよう操作された生産宿主は 1、3、5、10、15、20、25、および30%を超える効率を有しうる。一例において、生産宿主は約 10% 〜約 25%の効率を示す。別の例において、かかる生産宿主は約 25%から約 30%の効率を示す。別の例において、かかる生産宿主は >30%の効率を示す。
【０２２０】
生産宿主はさらに組換えセルロソーム、例えば、その内容全体を引用により本明細書に含めるPCT出願番号 PCT/US2007/003736に記載のものを発現するよう操作され得、これは生産宿主がセルロース性材料を炭素源として利用することを可能にしうる。例えば、生産宿主はさらにインベルターゼ (EC 3.2.1.26)を発現するよう操作され得、それによってスクロースが炭素源として利用可能となる。
【０２２１】
同様に、生産宿主はそれらすべての内容全体を引用により本明細書に含めるIngram et al.の米国特許第5,000,000; 5,028,539; 5,424,202; 5,482,846、および5,602,030号に記載の教示を用いて操作され得、それによって生産宿主は炭素を効率的に同化し得、セルロース性物質が炭素源として利用可能になる。 
【０２２２】
一例において、発酵チャンバは連続的還元が行われている発酵物を封入する。この例において、安定な還元環境が作られるであろう。電子のバランスは二酸化炭素の放出(気体形態における)により維持されるであろう。NAD/H および NADP/H バランスを増強する努力は電子のバランスの安定化において役立ちうる。
【０２２３】
細胞内 NADPHの利用能はまたNADH:NADPH トランスヒドロゲナーゼを発現するよう生産宿主を操作することによっても増強されうる。１以上の NADH:NADPH トランスヒドロゲナーゼの発現は解糖において生産されたNADH をNADPHに変換し、それは脂肪酸誘導体の生産を促進する。
【０２２４】
B.小規模 炭化水素 生産 
小規模の炭化水素生成物の生産のためには、pBAD24 (アンピシリン 耐性および最終生成物合成 経路を有する)およびpUMVC1 (カナマイシン 耐性およびアセチル CoA/マロニル CoA 過剰発現系を有する)を担持する大腸菌 BL21(DE3) 細胞を、培養が OD600 が>0.8に達成するまで、75μg/mL アンピシリンおよび50 μg/ml カナマイシンを追加した500 mL LB 培地中で>200 rpmにて振盪しながら一晩2 L フラスコで37℃でインキュベートする。OD600が>0.8に達すると、細胞に25 mM ナトリウム プロプリオネート(proprionate)(pH 8.0) を追加して生産のために操作された遺伝子 系を活性化し、UmuC およびUmuD タンパク質を活性化することにより細胞増殖を停止させる。誘導は6 時間30℃で行う。インキュベーションの後、培地をGC-MSを用いて炭化水素 生成物について調べる。
【０２２５】
C.大規模 炭化水素 生産
大規模の生成物の生産のためには、操作された生産宿主を10 L、100 Lまたはそれ以上のバッチで培養し、発酵させ、適当なプラスミドにコードされる特定の遺伝子に基づいた所望の生成物の発現を誘導する。
【０２２６】
例えば、pBAD24 (アンピシリン 耐性および最終生成物合成 経路を有する)ならびに pUMVC1 (カナマイシン 耐性およびアセチル-CoA/マロニル-CoA 過剰発現系を有する)を担持する大腸菌 BL21(DE3) 細胞を 500 mL の種培養物からインキュベートし、LB 培地 (グリセロール 非含有) 中での10 L 発酵 (100 L 発酵のために5 L)にて 37℃で >200 rpm で振盪しながら培養物の OD600 が> 0.8に達するまで (典型的には 16 時間) 50 μg/mL カナマイシンおよび75 μg/mL アンピシリンとともにインキュベートする。培地を 25 mM ナトリウム プロプリオネート (pH 8.0)を維持するよう連続的に補給し、umuCおよびumuD タンパク質の活性化によって、操作された遺伝子系を生産 ならびに細胞増殖の停止のために活性化する。 培地に連続的にグルコースを補給し濃度 25 g/100 mLを維持する。
【０２２７】
１時間の誘導の後、全細胞体積の10%を超えないアリコートを１時間毎に取り出し、撹拌せずに放置し、炭化水素 生成物が表面に上昇し、 自発的な相分離が起こるようにする。炭化水素成分を次いで収集し、水相を反応 チャンバに戻す。反応 チャンバは連続的に作動させる。OD600が 0.6を下回ると、細胞を種培養物から培養した新しいバッチと交換する。
【０２２８】
ろうエステル 生産のために、ろう エステルを単離し、簡単に1 M HClで洗浄してエステル結合を開裂させ蒸留水で徹底的に洗浄してpH 7に戻す。
【０２２９】
V.生産後プロセシング
発酵において生産された脂肪酸誘導体は発酵培地から分離されうる。脂肪酸誘導体を水性培地から分離するために知られているあらゆる技術を利用できる。本明細書において提供する１つの例示的な分離プロセスは二相(二相性) 分離プロセスである。このプロセスは、遺伝子操作された生産宿主を脂肪酸誘導体を生産するのに十分な条件下で発酵させること、誘導体を有機相に回収することおよび有機相を水性発酵ブロスから分離することを含む。この方法はバッチおよび連続発酵設定の両方において実施できる。 
【０２３０】
二相性分離は脂肪酸誘導体が比較的混ざり合わないことを利用して分離を容易にする。混ざり合わないこととは、化合物が水に比較的溶解できないことをいい、化合物の分配係数によって規定される。当業者であれば、生産される脂肪酸誘導体が高い logP値を有するように発酵ブロスと有機相とを選択することにより、脂肪酸誘導体 は発酵槽において非常に低濃度であっても有機相に分離されることを理解している。
【０２３１】
本明細書に記載する方法により生産された脂肪酸誘導体は発酵ブロスならびに細胞質において比較的混ざり合わない。それゆえ、脂肪酸誘導体は細胞内または細胞外のいずれかで有機相に回収される。生成物の有機相における回収は、脂肪酸誘導体の細胞機能に対する影響を小さくし、生産宿主がより多くの生成物を生産することを可能とする。
【０２３２】
本明細書に記載のように生産される脂肪アルコール、脂肪エステル、ろう、および炭化水素は均質な 化合物の生産を可能とし、ここで少なくとも約 60%、70%、80%、90%、または 95%の生産された脂肪アルコール、脂肪エステルおよびろうは、約 6未満、約 4未満の炭素または約 2未満の炭素にて変動する炭素鎖長を有する。これらの化合物は比較的均一な程度の飽和を有するよう生産され得、例えば、少なくとも約 60%、70%、80%、90%、または95%の 脂肪アルコール、脂肪エステル、炭化水素およびろうはモノ不飽和、ジ不飽和、またはトリ不飽和である。かかる化合物は直接燃料、パーソナルケア添加剤、または栄養サプリメントとして利用できる。かかる化合物はまた、後の反応、例えば エステル交換、水素化、(水素化、熱分解のいずれかまたは両方を介した)触媒的クラッキングまたはエポキシド化反応によりその他の生成物を作るための原材料としても利用できる。
【０２３３】
本明細書に記載のように生産される脂肪アルコール、脂肪エステル、ろう、および炭化水素は、低レベルの望ましくないまたは所望ではない要素を含み、かかる要素としては、限定されないが、重金属が含まれる。いくつかの態様において、本明細書に記載のように生産される脂肪アルコール、脂肪エステル、ろう、および炭化水素は以下を含む：約 50 ppm未満のヒ素;約 300 ppm未満のカルシウム; 約 200 ppm未満の塩素; 約 50 ppm未満のコバルト; 約 50 ppm未満の銅; 約 300 ppm未満の鉄; 約 2重量％未満の水; 約 50 ppm未満の鉛;約 50 ppm未満のマンガン; 約 0.2 ppm未満の水銀;約 50 ppm未満のモリブデン; 約 1重量％未満の窒素;約 200 ppm未満のカリウム;約 300 ppm未満のナトリウム;約 3重量％未満の硫黄; 50 ppm未満の亜鉛;または700 ppm未満のリン。
【０２３４】
いくつかの態様において、本明細書に記載のように生産される脂肪アルコール、脂肪エステル、ろう、および炭化水素は以下を含む：約 50% から約 90%の炭素; 約 5%から約 25% の水素; または約 5% から約 25%の酸素。別の態様において、本明細書に記載のように生産される脂肪アルコール、脂肪エステル、ろう、および炭化水素は以下を含む：約 65%  から約 85%の 炭素; 約 10%  から約 15% の水素;または約 10% から約 20%の酸素。
【０２３５】
VI.燃料組成物
本明細書に記載する脂肪酸誘導体は燃料として利用できる。当業者であれば、燃料の意図される目的に応じて、異なる脂肪酸誘導体を生産および利用できることを理解している。例えば、寒冷気候において使用されることが意図される自動車 燃料のためには、分枝脂肪酸誘導体が望ましいであろう。
【０２３６】
本明細書に記載する方法を用いて、所望の燃料品質を有する比較的均質な 脂肪酸誘導体を含む燃料を生産することができる。かかる脂肪酸誘導体に基づく燃料は、炭素フィンガープリント法、および、石油由来燃料またはトリグリセリド由来バイオディーゼルと比較した場合に不純物が無いことにより特徴づけられ得る。脂肪酸誘導体に基づく燃料は、その他の燃料または燃料添加剤と組み合わせて所望の性質を有する燃料を生産することができる。
【０２３７】
本明細書に開示する生産宿主および方法は、遊離脂肪酸および脂肪エステルを生産するために利用することが出来る。いくつかの態様において、生産宿主によって生産される生成物における遊離脂肪酸のパーセンテージは、少なくとも 約 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、または25%である。いくつかの態様において、生産宿主によって生産される生成物における脂肪エステルのパーセンテージは、少なくとも 約 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、または90%である。いくつかの態様において、生産宿主によって生産される生成物における脂肪エステルの遊離脂肪酸に対する比は、約 10:1、9:1、8:1、7:1、5:1、2:1、または1:1である。別の態様において、生産宿主によって生産される脂肪エステルは、エチルドデカノエート、エチルトリデカノエート、エチルテトラデカノエート、エチルペンタデカノエート、エチルシス-9-ヘキサデセノエート、エチルヘキサデカノエート、エチルヘプタデカノエート、エチルシス-11-オクタデセノエート、エチルオクタデカノエート、またはそれらの組合せである。別の態様において、生産宿主によって生産される遊離脂肪酸は、ドデカン酸、テトラデカン酸、ペンタデカン酸、シス-9-ヘキサデセン酸、ヘキサデカン酸、シス-11-オクタデセン酸、またはそれらの組合せである。
【０２３８】
A.炭素 フィンガープリント法
生物学的に生産された脂肪酸誘導体は、燃料、例えば、 アルコール、ディーゼルおよびガソリンのための新しい源である。脂肪酸誘導体を用いて作られたいくつかのバイオ燃料は再生可能な源から生産されているわけではなく、したがって、新規な組成物である。かかる新規な燃料は二重炭素-同位体 フィンガープリント法に基づいて石油化学の炭素由来の燃料とは区別されうる。さらに、特定の生物由来の炭素源(例えば、グルコース 対 グリセロール) は二重炭素-同位体 フィンガープリント法により判定できる (その内容全体を引用により本明細書に含める米国特許第7,169,588号、特に、4欄31行から6欄8行参照) 。
【０２３９】
脂肪酸誘導体および関連するバイオ燃料、化学物質、および混合物は、石油化学物質由来の対応物と14C (fM)および二重炭素-同位体 フィンガープリント法に基づいて完全に識別することが出来る。 
【０２４０】
本明細書に記載する脂肪酸誘導体はバイオ燃料および化学物質の生産において有用性を有する。本発明により提供されるこの新規な脂肪酸誘導体に基づく生成物はさらに石油化学物質源のみに由来する物質から二重炭素-同位体 フィンガープリント法に基づいて区別することが出来る。これら生成物を識別する能力は商業目的でこれら材料を追跡することにおいて有益である。例えば、「新しい」および「古い」炭素 同位体 プロファイルの両方を含む燃料または化学物質は「古い」材料のみからできている燃料および化学物質から識別できる。したがって、本発明の材料はその特有のプロファイルに基づいて、商業目的のために追跡でき、またはバイオ燃料として商業目的のために同定することが出来る。さらに、その他の競合する材料を生物由来のものまたは石油化学源に由来するものとして同定することが出来る。
【０２４１】
いくつかの例において、δ13C が 約 -10.9から約 -15.4の脂肪酸誘導体を含むバイオ燃料組成物が作られ、ここで 脂肪酸誘導体は組成物における生物由来材料 (即ち、再生可能資源、例えば、セルロース性材料および糖に由来する)の少なくとも 約 85% を占める。別の例において、バイオ燃料組成物は下記式を有する脂肪酸誘導体を含む：
X−(CH(R))nCH3
［式中、
Xは、CH3、-CH2OR1; -C(O)OR2; または-C(O)NR3R4; 
Rは各 nについて独立に非存在、Hまたは低級脂肪族; 
nは約8〜約34の整数、好ましくは、約 10 〜約 24;および、
R1、R2、R3およびR4は独立にHまたは低級アルキルから選択される］。
【０２４２】
典型的には、Rが低級 脂肪族である場合、R は分枝、非分枝または環状 低級 アルキルまたは低級 アルケニル 部分である。例示的な R基としては、限定されないが、メチル、イソプロピル、イソブチル、sec-ブチル、シクロペンテニル 等が挙げられる。脂肪酸誘導体は さらにδ13Cが約 -10.9 から 約 -15.4であるとして特徴づけられ、脂肪酸誘導体が組成物における生物由来材料の少なくとも 約 85% を占める。 いくつかの例においてバイオ燃料組成物における脂肪酸誘導体は少なくとも 約 1.003、1.010、または 1.5の現代炭素比(fM 14C)を有することを特徴とする。
【０２４３】
B.不純物
本明細書に記載する脂肪酸誘導体はバイオ燃料の製造に有用である。かかる脂肪酸誘導体は脂肪酸から直接作られ、トリグリセリドの化学的加工から作られるものではない。したがって、開示された脂肪酸誘導体を含む燃料は、トリグリセリド由来のバイオ燃料、例えば、植物油および脂肪に由来する燃料に通常付随するものよりも少ない不純物を含有する。
【０２４４】
本明細書に記載する粗脂肪酸誘導体バイオ燃料 (脂肪酸誘導体をその他の燃料、例えば、石油に基づく燃料と混合する前のもの)は、石油化学的ディーゼルまたはバイオディーゼルよりも少ないエステル交換 触媒を含有する。例えば、脂肪酸誘導体は、約 2%未満、1.5%、1.0%、0.5%、0.3%、0.1%、0.05%、または0%のエステル交換触媒またはエステル交換 触媒に起因する不純物を含みうる。
【０２４５】
エステル交換 触媒の非限定的な例としては、水酸化物触媒、例えば、 NaOH、KOH、およびLiOH;および酸性触媒、例えば、鉱酸触媒およびルイス酸触媒が挙げられる。エステル交換触媒に起因する触媒および不純物の非限定的な例としては、スズ、鉛、水銀、カドミウム、亜鉛、チタン、ジルコニウム、ハフニウム、ホウ素、アルミニウム、リン、ヒ素、アンチモン、ビスマス、カルシウム、マグネシウム、ストロンチウム、ウラン、カリウム、ナトリウム、リチウム、およびそれらの組合せが挙げられる。
【０２４６】
同様に、本明細書に記載する粗脂肪酸誘導体バイオ燃料(脂肪酸誘導体をその他の燃料、例えば、 石油化学的ディーゼルまたはバイオディーゼルと混合する前のもの) は、トリグリセリドから作られたバイオ燃料よりも少ないグリセロール (または グリセリン)を含む。例えば、脂肪酸誘導体は、約 2%未満、1.5%、1.0%、0.5%、0.3%、0.1%、0.05%、または0重量％のグリセロールを含みうる。 
【０２４７】
脂肪酸誘導体に由来する粗バイオ燃料はまた、トリグリセリドからできたバイオディーゼルと比較して少ない遊離アルコール (即ち、エステルを作るために用いられるアルコール)を含む。 これは部分的には生産宿主によるアルコールの利用効率に起因する。例えば、脂肪酸誘導体は、約 2%未満、1.5%、1.0%、0.5%、0.3%、0.1%、0.05%、または 0重量％の遊離アルコールを含む。
【０２４８】
開示された脂肪酸誘導体に由来するバイオ燃料は、さらに石油由来ディーゼルと比較して硫黄濃度が低いことによっても特徴づけられ得る。 例えば、脂肪酸誘導体由来のバイオ燃料は約 2%未満、1.5%、1.0%、0.5%、0.3%、0.1%、0.05%、または0重量％の硫黄を有しうる。
【０２４９】
C.添加剤
燃料添加剤は燃料またはエンジンの性能を増強するために用いられる。例えば、燃料添加剤は、凍結/ゲル化点、曇り点、潤滑性、粘度、酸化安定性、発火性、オクタン レベルおよび引火点を変化させるために利用されうる。米国においては、すべての燃料添加剤は環境保護庁に登録しなければならない。燃料添加剤の名称および燃料添加剤を販売する会社は、EPAに接触することによって公共に入手でき、庁のウェブサイトをみることによっても入手できる。当業者であれば本明細書に記載する脂肪酸誘導体は所望の性質を付与するために１以上の燃料添加剤と混合されうることを理解している。
【０２５０】
本明細書に記載する脂肪酸誘導体は、その他の燃料、例えば、トリグリセリド由来のバイオディーゼル、様々なアルコール、例えば、エタノールおよびブタノール、および石油由来生成物、例えば、ガソリンまたはディーゼルと混合できる。 
【０２５１】
いくつかの例において、ゲル化点の低い脂肪酸誘導体、例えば、C16:1エチルエステルまたはC18:1エチルエステルが生産される。このゲル化点の低い脂肪酸誘導体をトリグリセリドからできたバイオディーゼルと混合すると結果として得られる 燃料のゲル化点が、トリグリセリドからできたバイオディーゼルと比較して低下する。同様に、脂肪酸誘導体、例えば、 C16:1 エチルエステルまたはC18:1エチルエステルは石油由来ディーゼルと混合されると少なくとも約5重量％そしてしばしば5重量％を超えるバイオディーゼルである混合物が提供されうる。いくつかの例において、混合物は少なくとも約 10%、15%、20%、30%、40%、50%、60重量％の脂肪酸誘導体を含む。
【０２５２】
例えば、少なくとも約 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90% または95%の、8:0、10:0、12:0、14:0、14:1、16:0、16:1、18:0、18:1、18:2、18:3、20:0、20:1、20:2、20:3、22:0、22:1または22:3の炭素鎖を含む脂肪酸誘導体を含むバイオ燃料組成物を作ることが出来る。かかるバイオ燃料組成物はさらに、曇り点を約 5℃未満、または0℃に低下させうる曇り点 低下添加剤;界面活性剤;マイクロエマルジョン;少なくとも 約 5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70% または80%、85%、90%、または95%のトリグリセリド由来のディーゼル 燃料;石油由来ガソリン;または石油由来ディーゼル燃料から選択される少なくとも１つの 添加剤を含みうる。
【実施例】
【０２５３】
以下の実施例は、特定の脂肪酸誘導体を生産させるための生産宿主の操作を説明する。脂肪酸誘導体の生産に関与する生合成経路は図面に示す。
【０２５４】
例えば、図 1は、アシル-ACPの合成に直接関与する酵素を示すFAS 経路の図である。脂肪酸誘導体、例えば、ろう、脂肪エステル、脂肪アルコール、および炭化水素の生産を上昇させるために、図 1における１以上の酵素を、生産されるアシル-ACPの量を上昇させるためにフィードバック阻害を低減させるために過剰発現または突然変異させることが出来る。さらに、脂肪酸に基づかない生成物を作る中間体を代謝する酵素(副反応)を、脂肪酸生合成経路に向かう炭素の流れを上昇させるために機能的に欠失または減弱させることが出来る。以下の実施例において、脂肪酸生産を上昇させるために改変された多くの生産宿主を記載する。
【０２５５】
図 4、図 5および図 6は、それぞれ脂肪アルコールおよび脂肪エステルを作るよう操作されうる生合成経路を示す。図 5に示すように、各基質 (例えば、アセチル-CoA、マロニル-CoA、アシル-ACP、脂肪酸、およびアシル-CoA)の各生成物 (例えば、アセチル-CoA、マロニル-CoA、アシル-ACP、脂肪酸、およびアシル-CoA) への変換は、示された酵素クラスのメンバーである数種類のポリペプチドを用いて達成することが出来る。 
【０２５６】
以下の実施例は、特定の脂肪アルコール、ろう、脂肪エステル、および炭化水素を生産するよう操作されたまたは操作されうる微生物を記載する。  
【０２５７】
実施例 1. 生産宿主構築
例示的な生産宿主はLS9001である。LS9001はfadE 遺伝子 (アシル-CoA デヒドロゲナーゼ)をノックアウトするようOver-express.com (Saint Beausine、France)からのC41(DE3)を改変することによって生産した。
【０２５８】
簡単に説明すると、大腸菌のfadE ノックアウト株をfadEの上流約 830 bpを増幅するプライマーYafV_NotI およびIvry_Olおよび、fadEの下流約 960 bpを増幅するプライマーLpcaf_olおよび LpcaR_Bamを用いて作製した。オーバーラップPCRを用いて完全な fadE 遺伝子のインフレームの欠失のためのコンストラクトを作成した。fadE 欠失 コンストラクトを対抗選択のためのsacB 遺伝子を含む温度感受性 プラスミド pKOV3にクローニングし、fadEの染色体欠失をLink et al.、J. Bact. 179:6228-6237、1997の方法にしたがって作成した。結果として得られた株は脂肪酸および脂肪アシルCoAを分解することが出来なかった。このノックアウト株をここでΔfadEと命名する。
【０２５９】
生産宿主に含めたさらなる改変は、大腸菌におけるアセチル-CoA カルボキシラーゼ 活性を担う４つの遺伝子(accA、accB、accC、およびaccD、受入番号:  NP_414727、NP_417721、NP_417722、NP_416819、EC 6.4.1.2)を担持するプラスミドを導入することを含む。 accABCD 遺伝子をpACYCDuet-1 (Novagen、Madison、WI)のNcoI/HindIIIおよびNdeI/AvrII 部位において2シストロン性 オペロンとして２工程にてクローニングし、結果として得られたプラスミド をpAS004.126と名付けた。 
【０２６０】
生産宿主に含めたさらなる改変は、以下を含む: aceEF (ピルビン酸および2-オキソグルタル酸 デヒドロゲナーゼ複合体のE1p デヒドロゲナーゼ成分およびE2p ジヒドロリポアミド アシルトランスフェラーゼ 成分をコードする);および大腸菌、Nitrosomonas europaea (ATCC 19718)、バチルス・スブチリス、サッカロマイセス・セレビシエ、Streptomyces spp、Ralstonia、Rhodococcus、Corynebacteria、Brevi bacteria、Mycobacteria、および油性酵母からのfabH/fabD/fabG/acpP/fabF (FASをコードする)の過剰発現。同様に、生産宿主をPisum savitumからのaccABCD (アセチル co-A カルボキシラーゼをコードする)を発現するように操作した。しかし、生産宿主がブタノールも生産する場合、 Pisum savitum ホモログを発現させることはより望ましくない。
【０２６１】
いくつかの生産宿主において、遺伝子を Link、et al.、J.  Bacteriol. 179:6228-6237、1997の方法を用いてノックアウトまたは減弱させた。ノックアウトまたは減弱させた遺伝子には以下が含まれる： gpsA (生合成 sn-グリセロール 3-リン酸 デヒドロゲナーゼ、受入番号NP_418065、EC:  1.1.1.94をコードする); ldhA (乳酸デヒドロゲナーゼ、受入番号  NP_415898、EC:  1.1.1.28をコードする); pflb (ギ酸 アセチルトランスフェラーゼ 1、受入番号:  P09373、EC:  2.3.1.54をコードする); adhE (アルコール デヒドロゲナーゼ、受入番号:  CAA47743、EC:  1.1.1.1、1.2.1.10をコードする); pta (ホスホトランスアセチラーゼ、受入番号:  NP_416800、EC: 2.3.1.8をコードする); poxB (ピルビン酸オキシダーゼ、受入番号:  NP_415392、EC:  1.2.2.2をコードする); ackA (酢酸キナーゼ、受入番号:  NP_416799、EC: 2.7.2.1をコードする)およびそれらの組合せ。
【０２６２】
同様に、PlsB[D311E] 突然変異をfadE 欠失について実施例 1に記載した方法を用いてplsBを減弱させるためにLS9001に導入した。この突然変異はリン脂質 生産に転用される炭素の量を低下させた(図 1参照)。PlsB[D311E]をコードする対立遺伝子を、アスパラギン酸 311についてのGAC コドンをグルタミン酸についてのGAA コドンにより置換することによって作成した。変化させた対立遺伝子を遺伝子合成により作成し、染色体 plsB 野生型 対立遺伝子をLink et al.の方法(上記参照)を用いて突然変異体 plsB[D311E] 対立遺伝子と交換した。
【０２６３】
発酵を介する脂肪酸誘導体の商業的生産のために、生産宿主の内部の 調節経路をより多くの所望の 生成物を生産するために最適化した。多くの例において、この制御は、特定の酵素を過剰発現させることによって減少した。 いくつかの例を表 8に示す。
【０２６４】
表 8:脂肪酸誘導体生産のために最適化されうるさらなる遺伝子
【表８】
0005863088.tif 000009
【０２６５】
実施例 2.生産宿主 改変
以下のプラスミドを脂肪酸誘導体の合成に用いられる様々な タンパク質の発現のために構築した。コンストラクトは標準的 分子生物学 方法を用いて作成した。すべてのクローニングされた遺伝子はIPTG-誘導可能 プロモーター(例えば、T7、tacまたは lac プロモーター)の制御下に置いた。
【０２６６】
大腸菌のtesA 遺伝子(リーダー 配列を有さないチオエステラーゼ A 遺伝子、受入番号NP_415027 (Cho and Cronan、J. Biol. Chem.、270:4216-9、1995、EC:  3.1.1.5、3.1.2.-))を NdeI/AvrII で消化した pETDuet-1 (本明細書に記載するpETDuet-1はNovagen、Madison、WIから入手可能である)にクローニングした。Umbellularia californica、Cuphea hookerianaおよびCinnamonum camphorum由来のFatB-型植物 チオエステラーゼ (TE) をコードする遺伝子(受入番号: UcFatB1=AAA34215、ChFatB2=AAC49269、ChFatB3=AAC72881、CcFatB=AAC49151）を個々に３種類のベクターにクローニングした: (i) NdeI/AvrIIで消化したpETDuet-1、(ii) XhoI/HindIIIで消化したpBluescript KS+ (Stratagene、La Jolla、CA)( N-末端 lacZ::TE 融合 タンパク質を作るためのもの)および(iii) XbaI/HindIIIで消化したpMAL-c2X (New England Lab、Ipswich、MA) (n-末端 malE::TE融合を作るためのもの)。大腸菌由来のfadD 遺伝子(アシル-CoA シンゼターゼをコードする)を、そのNdeI/AvrII部位内にAcinetobacter baylyi ADP1由来のacr1 遺伝子 (アシル-CoAレダクターゼ) を含むNcoI/HindIIIで消化したpCDFDuet-1誘導体にクローニングした。表9はいくつかの例示的な生産株を作るために作成されたプラスミドの概要を提供する。当業者であれば異なるプラスミドおよびゲノム 改変を同様の株の達成のために利用できることを認識するであろう。
【０２６７】
表 9:生産宿主において用いられたプラスミドの概要
【表９】
0005863088.tif 000010
【０２６８】
選択された発現 プラスミドは、４-プラスミド 発現系を生産するために適合性の レプリコンおよび抗生物質耐性 マーカーを含む。それゆえ、LS9001は、(i) TE-発現プラスミドのいずれか、(ii) Acr1も発現するFadD-発現プラスミド、および(iii) エステルシンターゼ 発現 プラスミドにより共形質転換されうる。IPTGにより誘導されると、その結果得られた 株は、炭素源、例えば、 グルコースから上昇した濃度の脂肪アルコールを生産する。  
【０２６９】
実施例 3.組換え 大腸菌 株における脂肪アルコールの生産
脂肪アルコールを生産宿主において外来性のチオエステラーゼ 遺伝子およびアシル-CoAレダクターゼ 遺伝子を発現させることにより生産した。より具体的には、プラスミドpCDFDuet-1-fadD-acr1 (アシル-CoAレダクターゼ) およびpETDuet-1-’tesA (チオエステラーゼ)を大腸菌 株 LS9001 (実施例 1に記載)に形質転換し、対応する形質転換体を100 mg/L のスペクチノマイシンおよび 50 mg/Lのカルベニシリンを追加したLBプレートにおいて選択した。LS9001/pCDFDuet-1-fadD-acr1の４つの形質転換体を独立に 50 mg/Lのカルベニシリンおよび100 mg/L のスペクチノマイシンを追加した3 mLの M9 培地に接種した。形質転換体を含むサンプルを25℃でシェーカー (250 rpm) でOD600が0.5となるまで培養した。次いで、1.5 mLの各サンプルを30 mLの上記のM9 培地を含む250 mL フラスコに移した。 その結果得られた培養物を25℃でシェーカーで培養物のOD600が0.5 -1.0となるまで培養した。 IPTGを次いで終濃度1 mMとなるように添加した。細胞培養を40 時間続けた。
【０２７０】
細胞を次いで4000 rpmで沈降させた。細胞ペレットを1.0 mL のメタノールに懸濁した。3 mLの酢酸エチルを次いで懸濁した細胞と混合した。3 mLのH2Oを次いで混合物に添加した。次いで、混合物を20 分間超音波処理した。その結果得られた サンプルを4000 rpmで5 分間遠心分離した。次いで、脂肪アルコールを含む有機相 (上相)を GC/MS 分析に供した。総アルコール (テトラデカノール、ヘキサデカノール、ヘキサデセノールおよびオクタデセノールを含む)収率は約 1-10 mg/Lであった。空のベクターのみを担持する大腸菌 株を同様に培養した場合、0.2-0.5 mg/Lのみの脂肪アルコールの収率が 酢酸エチル抽出物中に測定された。
【０２７１】
実施例 4.重金属を有さず、奇数 炭素鎖を含む脂肪酸(FA)および脂肪酸 エチルエステル(FAEE)の生産
1.バイオディーゼル サンプル #23-30の生産
バイオディーゼル サンプル #23-30 (「サンプル #23-30」)を脂肪エステルを生産するように操作された大腸菌 株 (C41 DE3 ΔfadE ΔfabR TesA fadD adp1ws)のバイオリアクター 培養によって生産した。２段階接種プロトコールを培養の拡張のために使用した。第１段階は、250 mL バッフル付き 振盪 フラスコ 中の50 mL LB 培地 (100 μg/L カルベニシリンおよび100 μg/L スペクチノマイシンを追加したもの)への大腸菌 エステル 生産 株の1 mL 凍結ストック バイアルによる接種 からなるものであった。 この種フラスコを37℃で７時間インキュベートし(最終OD600 = 4.5 AU、pH 6.7)、その後3 mL の一次培養物を、100 μg/L カルベニシリンおよび100 μg/L スペクチノマイシンを含む350 mL 緩衝 F1 最小培地を含む３つの2 L バッフル付き フラスコのそれぞれに移した。使用した振盪 フラスコ 緩衝液は終濃度200 mM (pH 7.2)のBis-Tris プロパンであった。これらの二次種フラスコを37℃で８時間インキュベートし (最終OD600 = 12 AU、pH 5.5)、内容物を３つの 14 L バイオリアクターへの接種に用い、接種の後の出発体積は6.5リットルの緩衝 F1 最小培地であった。これらのバイオリアクターも100 μg/L カルベニシリンおよび100 g/L スペクチノマイシンを含んでいた。
【０２７２】
これらの14 L バイオリアクターをまず37℃で培養し、溶解酸素 レベルを撹拌および酸素富化カスケードループを用いて30%の飽和に維持した。培養物のpHは、1 M H2SO4 および無水アンモニアガスを用いて7.2に維持した。主に43% (w/v) グルコースからなる栄養フィードを基本培地における最初の5 g/L チャージが消耗されたときに開始した。グルコース 溶液 フィード速度を作動の持続時間を発酵持続時間について残余のグルコースを低い(しかし０ではない) 値に維持するように手動で調整した。培養物の吸光度の値が30 AUに達すると、培養物に1 mM IPTG (終濃度)にて誘導をかけた。この誘導点において、バイオリアクター 培養 温度を30℃に下げ、およそ 15 mL/L (6.5 から7リットルの体積に基づいて)のエタノールを培養物に添加し、最初から最後までHPLCにてモニターした。さらなるエタノールを残余濃度をおよそ 20 mL/Lに維持するように定期的にバイオリアクターに添加した。バイオリアクターをおよそ 60 時間の培養の後に収集し、およそ 10 Lのブロスを３つのバイオリアクターのそれぞれから収集した。
【０２７３】
これらの収集ブロスを合わせて、室温で２時間撹拌しながら等体積の酢酸エチルで抽出した。ブロス 抽出物を次いで遠心分離して(3500 rpm、30 分間)液層を分離し、次いでさらなる加工のために有機層を取り出した。酢酸エチルをほぼ完全にこの有機層からロータリーエバポレーション (Buechi、R-200) によって除き(GC/FID によって<0.3% 残余)、およそ 90 mL の暗色の油状液体が得られた。この液体をサンプル #23-30と称することとした。
【０２７４】
2.サンプル #23-30におけるFAおよびFAEEの定量
30m×0.25mm (0.10μm フィルム) DB-5 カラムを備えたAgilent 5975B MSD 系を用いてGC-MSを行った。カラム 温度は3分間100℃で等温であった。カラムは100℃から320℃まで20℃/分の速度で昇温するようプログラムした。最終温度に到達したら、カラムを5 分間320℃の等温に維持した。注入量は1 μLであった。キャリアガスである、ヘリウムを1.3 mL/分にて放出した。質量分析計は電子衝撃イオン化ソースを備えたものであった。イオン化ソース 温度を300℃に設定した。FAEE 標準 (例えば、エチルドデカノエート、エチルテトラデカノエート、エチルシス-9-ヘキサデセノエート、エチルヘキサデカノエート、エチルオクタデカノエート、すべて >99%); 脂肪酸 メチルエステル (FAME) 標準(例えば、メチルドデカノエート、メチルテトラデカノエート、メチルペンタデカノエート、メチルシス-9-ヘキサデセノエート、メチルヘキサデカノエート、メチルシス-11-オクタデセノエート、すべて >99%); トリメチルシリル ジアゾメタン (TMSD、ヘキサン中2 M); 塩酸 (37%); メタノール (>99.9%); および酢酸エチル (>99.9%)はSigma-Aldrichから購入し、さらに精製せずに使用した。
【０２７５】
サンプル #23-30 を50 μL トリメチルシリルジアゾメタン (TMSD)、8 μL HCl、および36 μL メタノールを1 mLのサンプル (酢酸エチル中1 mg/mL)に添加することによって誘導体化した。混合物を室温で1 時間インキュベートした。
【０２７６】
定量の前に、サンプル #23-30におけるFAEEおよびFAMEを２つの方法を用いて同定した。第１に、各化合物のGC 保持時間を既知の標準の保持時間と比較した。第２に、各化合物の同定を、化合物のマススペクトル をマススペクトル ライブラリーにおける標準の マススペクトルと適合させることによって確認した。
【０２７７】
FAEE またはFAME についての標準が入手可能であった場合、FAEEまたはFAMEの定量は、検量線 (濃度 vs 機械応答)の作成によって判定した。機械応答と分析物濃度との間の直線関係が得られた。サンプルにおける化合物の濃度は、その機械応答を取得し、検量線を参照することによって判定した。
【０２７８】
FAEEの標準が入手可能でなかった場合、平均機械応答を用いて、化合物の濃度を判定した。すべての既存の検量線の勾配と切片とを平均した。かかる平均から、濃度と機械応答との間の直線関係を決定した。そして未知の化合物の濃度は、式 1を用いて機械応答と濃度との間の直線関係に対してその機械応答を参照することによって決定した。
式 1:濃度 = (機械応答 - 平均切片) / 平均勾配 
【０２７９】
FAMEを同定および定量した後、関連する遊離脂肪酸の濃度を FAME の濃度およびFAMEに対するFAの分子量比に基づいて決定した。最後に、mg/L単位でのFAEEおよびFAの濃度をバイオディーゼル サンプルにおけるパーセンテージ(w/w %)に変換した。
【０２８０】
サンプル #23-30におけるFAEEおよびFAの濃度を表 10に列挙する。FAEEおよびFAの総濃度は80.7%であった。残りの未知の化合物はLC/MS/MS 法によって分析しうる。エチルペンタデカノエート、エチルシス-9-ヘキサデセノエート、エチルヘキサデカノエートおよびエチルシス-11-オクタデセノエートがサンプル #23-30の主成分であった。
【０２８１】
表 10:サンプル #23-30におけるFAEE およびFAのパーセンテージ
【表１０】
0005863088.tif 000011
*パーセンテージは、w/w %である。
【０２８２】
驚くべきことに、サンプル #23-30は、奇数 FAおよびFAEEを含んでいた。さらなる分析、例えば LC/MS/MSを行うことにより、これら奇数炭素鎖 脂肪酸が大腸菌によって生産されたが、大腸菌の独自の脂質に由来するものではないことを確認することが可能である
【０２８３】
3.サンプル #23-30の定量元素分析
重金属は接触分解において用いられる触媒を汚染することが知られている。サンプル #23-30における重金属のレベルを測定するために、サンプル #23-30を、ヒ素、カルシウム、炭素、塩素、コバルト、銅、水素、鉄、カールフィッシャー 水、鉛、マンガン、マグネシウム、水銀、モリブデン、窒素、カリウム、ナトリウム、硫黄、亜鉛、酸素、およびリンの定量元素分析のためにGalbraith Laboratories、Inc.に送った。準備および分析方法は以下に記載する。結果は表 11に示す。表 11におけるすべての量は以下を除いては、定量レベル (LOQ)を下回った：炭素 (73.38%)、塩素 (91 ppm)、水素 (12.1%)、カールフィッシャー 水 (0.998%)、水銀 (0.057 ppm)、酸素 (14.53%)、およびリン (343 ppm)。それゆえ、サンプル #23-30は高レベルの測定された重金属を含むものではなかった。
【０２８４】
方法 G-52、Rev 6:金属分析のためのサンプルのマイクロ波分解
適当な量のサンプルを0.001 g単位で計量してマイクロ波容器に入れた。適切な試薬を次いでマイクロ波容器に添加した。可視反応が観察された場合、反応を容器のキャップをする前に停止させた。容器を次いで密封し、製造業者の指示に従ってマイクロ波中に置いた。各容器の温度は5 分間で最低180 ± 10℃に達した。それは10 分間最低180 ± 10℃に維持された。マイクロ波 プログラムの最後に、容器を取り出す前に最低 5 分間冷却させた。次いで容器のキャップを外し、適切な技術による分析のために容量フラスコに移した。
【０２８５】
方法 G-55、Rev 3:ハロゲンの判定のためのParr 酸素ボンベ燃焼
サンプルを計量して燃焼カップに入れ、鉱油を燃焼の補助剤として添加した。塩素 (Cl)および臭素 (Br)の測定のために、1% 過酸化水素 溶液をボンベに添加した。硫黄 (S)の測定のために、0.01 N 水酸化ナトリウム 溶液を添加した。サンプルおよびカップを好適な 吸収溶液とともにParr 酸素 燃焼 ボンベに入れて密封した。ボンベを酸素でパージし、酸素圧力25-30 atmに加圧し、発火させた。その後、ボンベの内容物をよく混合し、次の分析のためにビーカーに移した。
【０２８６】
方法 G-30B、Rev 7:金属分析のための無機および有機化合物の湿った灰分の消化
サンプルを H2SO4を用いて黒こげにした。不溶性硫酸を形成する金属を分析する場合は、HClO4 および HNO3 を用いて有機物質を黒こげにした。サンプルを黒こげにした後、HNO3 を添加し、サンプルを還流させて存在する金属を可溶化した。溶液が曇り始めると、HCl を完全な 消化を助けるために添加した。サンプルにケイ素が存在する場合には、ケイ素が目的の分析物でない場合に限りHFを用いることが出来た。用いたすべてのHFはテフロン（登録商標）容器に制限された。清澄な消化液(digestate)を定量的にクラスA 容量フラスコに移し、最終容積とした。サンプルを次いで分析した。
【０２８７】
方法 ME-4A Rev 2:イオンクロマトグラフィーによって抑制される陰イオンの判定
【表１１】
0005863088.tif 000012
【０２８８】
方法 S-300 Rev 7:クーロン滴定法 (カールフィッシャー)による水の判定
この方法では、電量分析とカールフィッシャー滴定とを組み合わせた。サンプルを、主にヨウ化物イオン (I-) および二酸化硫黄を含むアミン-メタノール 混合物と混合した。電気分解によって陽極にて生産されたヨウ素を水と反応させた。かかる場合において、ヨウ素は、ファラデーの法則にしたがって電気量と正比例して生産された。また、1モルの水は 化学量論的に1モルのヨウ素と反応するので、1 mgの水は、10.71 クーロンの電気に匹敵した。この原理を用いて、水分計は、電気分解に必要なクーロン数から直接水の量を判定した。この手順には、直接導入と噴霧器前処理技術との両方が含まれていた。
【０２８９】
【表１２】
0005863088.tif 000013
【０２９０】
方法 E16-2、rev 9 (Trace E16-2A): LECO SC-432DRを用いる硫黄判定
SC-432DR 硫黄分析機は、様々な有機および無機物質における硫黄含量を測定するために設計された非分散の赤外線のデジタル処理で制御される装置である。サンプルを純粋な酸素雰囲気中で1350 + 50℃で燃焼させた。硫黄を二酸化硫黄に酸化させ、赤外線吸収によって定量した。SC-432DRは２つの検出器、高範囲および低範囲の赤外線セルを備えていた。
【０２９１】
【表１３】
0005863088.tif 000014
【０２９２】
方法 ME-2、Rev 14: 炭素、水素、および窒素の判定
この装置はサンプルを純粋な酸素中で950℃でCO2、H2O、およびN2の燃焼生成物を生産する静止条件下で燃焼させる。 PE-240は 自動的に自己積分(self-integrating)、定常状態 熱伝導率分析機においてこれら生成物を分析する。無水タングステンを燃焼を助けるために添加してもよい。延長した燃焼時間 (例えば、燃焼困難モード(burn hard mode))をサンプルの燃焼が難しい場合に用いてもよい。
【０２９３】
【表１４】
0005863088.tif 000015
【０２９４】
方法 ME-70、Rev 4: 誘導結合プラズマ原子発光分析
この方法は、同時光学系およびプラズマの軸方向または半径方向観察を用いるICP-AESによる多元素判定を記載する。装置は発光分析(optical spectrometry)によって特徴的な発光スペクトルを測定する。サンプルは噴霧され、結果として得られる エアロゾルがプラズマトーチに運ばれる。元素特異的発光 スペクトルが高周波 誘導結合 プラズマにより生じる。スペクトルは回折格子分光計によって分散され、輝線の強度が感光装置によってモニターされる。バックグラウンド補正が微量元素判定のために必要である。バックグラウンドは分析の際にサンプル上にて分析線(analyte line)に隣接して測定されなければならない。分析線の片側または両側でバックグラウンド-強度測定のために選択される位置は、分析線に隣接するスペクトルの複雑性によって判定される。分析の１つのモードにおいて、用いられる位置はスペクトル干渉を極力受けないものであるべきであり、測定した分析物波長において起こるものと同じバックグラウンド 強度の変化を反映するものでなければならない。バックグラウンド補正は、バックグラウンド補正の測定が分析結果を実際に悪化させるような線幅拡大の場合には必要ではない。
【０２９５】
【表１５】
0005863088.tif 000016
【０２９６】
方法 E80-2、Rev 4:水銀の判定(自動化冷蒸気技術)
この手順はEPA SW846 方法 7471Aに基づく。冷蒸気 原子吸光は原子吸光の一般理論に基づき、それは、分析物の遊離原子は分析物濃度に比例するランプ源からのエネルギーを吸収するということを支持する。測定すべき金属を含むランプを用いることにより、吸収に必要な実際の波長が生じ、干渉は大幅に低減される。冷蒸気 原子吸光はこの原理を利用し、水銀原子は水銀イオンを塩化スズ(II) (SnCl2)によって還元することにより遊離する。窒素ガスは原子を光学セルを通して運び、セルは一方の側でHg ランプを、他方の側で検出器を備える。冷蒸気 方法を用いるため、火炎(flame)方法とは異なり、未消化の有機化合物が吸収波長が広帯域であるために干渉に関係する。
【０２９７】
【表１６】
0005863088.tif 000017
【０２９８】
表 11:サンプル #23-30の定量元素分析
【表１７】
0005863088.tif 000018
「<」として表す結果はLOQ未満である。* 酸素含量は 、その他のすべての元素についての観察結果を100%から差し引くことによって判定した。
【０２９９】
実施例5、生産宿主からの脂肪アルコールの生産および放出
Acr1 (アシル-CoAレダクターゼ)を、唯一の炭素およびエネルギー 源としてグルコース上で培養した大腸菌で発現させた。大腸菌は少量の 脂肪アルコール、例えば、ドデカノール(C12:0-OH)、テトラデカノール(C14:0-OH)およびヘキサデカノール(C16:0-OH)を生産した。別のサンプルにおいて、大腸菌においてFadD (アシル-CoA シンゼターゼ) を acr1と共に発現させた。脂肪アルコール 生産の５倍の上昇が観察された。
【０３００】
別のサンプルにおいて、acr1、fadD、およびaccABCD (アセチル-CoA カルボキシラーゼ) (実施例 1に記載のように構築したaccABCDを担持するプラスミド)を野生型 大腸菌C41(DE3)および大腸菌 C41(DE3 ΔfadE、アシル-CoA デヒドロゲナーゼを欠く株）において様々な別個のチオエステラーゼ(TE)とともに発現させた。 この結果さらに脂肪アルコール 生産が上昇し、脂肪アルコールプロファイルが改変された (図7参照)。例えば、大腸菌 ‘tesA (pETDuet-1-’tesA) のこの系における過剰発現は、C12:0-OH、C14:0-OHおよびC16:0-OHのおよそ60-倍の上昇を達成し、C14:0-OHが主要な脂肪アルコールであった。非常に類似の結果がChFatB3 酵素 (pMAL-c2X-TEcuにおけるCuphea hookeriana由来FatB3)を発現させた場合に得られた。 UcFatB1 酵素 (pMAL-c2X-TEucにおけるUmbellularia californicain由来FatB1)を発現させた場合、脂肪アルコール 生産はおよそ 20-倍上昇し、C12:0-OHが主な脂肪アルコールであった。
【０３０１】
ChFatB3 およびUcFatB1の発現もそれぞれ顕著な量の不飽和脂肪アルコール C16:1-OHおよびC14:1-OHの生産を導いた。脂肪アルコールの存在は tesAの発現から作られたサンプルの上清においてもみられた(図8)。37℃において、およそ 等量の 脂肪アルコールが上清および細胞ペレットにみられた。一方、25℃では、およそ 25%の脂肪アルコールが上清にみられた。
【０３０２】
実施例 6.様々な アシル-CoA レダクターゼを用いる脂肪アルコールの生産
この実施例は、様々な アシル-CoA レダクターゼを用いる脂肪アルコール 生産を記載する。脂肪アルコールは最終生成物であり得る。あるいは、生産宿主細胞は、脂肪エステルを生産するためにエステルシンターゼをさらに発現/過剰発現することが出来る。
【０３０３】
様々な源からの脂肪アシルCoA レダクターゼをコードする４つの遺伝子のそれぞれ(表 12)を大腸菌 発現のためにコドン最適化し、Codon Devices、Inc. (Cambridge、MA)により合成した。合成した遺伝子のそれぞれをNdeI-AvrII 断片としてpCDFDuet-1-fadDにクローニングした(実施例 3に記載)。大腸菌 fadD 遺伝子とともにこれらアシル-CoA レダクターゼ遺伝子を担持するプラスミドのそれぞれをOver-expression.comから購入した大腸菌 株 C41 (DE) 株に形質転換した。 
【０３０４】
組換え株を3 mLのLB ブロス (100 mg/L のスペクチノマイシンを追加)で 37℃で一晩培養した。0.3 mL の一晩培養液を30 mL の新しいM9 培地 (100 mg/Lのスペクチノマイシン含有)に移し、25℃で培養した。培養物のOD600が0.5に達すると、IPTGを終濃度1 mMとなるように添加した。各培養液にpH 7.0にてH2Oに溶解した３つの脂肪酸の１つを0.1%加えた。加えた３つの脂肪酸は、ナトリウム ドデカノエート、ナトリウム ミリステート、またはナトリウム パルミテートであった。脂肪酸を添加しない培養物も対照として含めた。誘導の後、培養液を同温度でさらに40 時間 25℃で培養した。
【０３０５】
発酵の最後に得られた脂肪アルコールの定量を、実施例 3 および実施例 4に記載のようにGC-MSを用いて行った。対応する脂肪酸から生産された結果として得られた脂肪アルコールを表 13に示す。結果は３つのアシル-CoA レダクターゼ- Acr1、AcrM およびBmFAR -が３つのすべての脂肪酸を対応する脂肪アルコールに変換することができたことを示す。結果はまた、ミリステートおよびパルミテートが基質である場合にhFAR およびJjFARは活性を有していたことを示した。しかし、ドデカノエートが基質である場合、ほとんどまたは全く活性がなかった。mFAR1およびmFAR2はミリステートを用いると低い活性を示すのみであり、他の２つの脂肪酸では活性を示さなかった。
【０３０６】
表 12: アシル-CoA レダクターゼ
【表１８】
0005863088.tif 000019
【０３０７】
表 13: 脂肪アルコール生産
【表１９】
0005863088.tif 000020
注: aこの場合ヘキサデカノールのみを定量した。 b 追加した脂肪酸 /生産された脂肪アルコール。 c生産された脂肪アルコールのピーク面積。
【０３０８】
実施例 7、中鎖脂肪エステル
様々な植物における酢酸アシル生産を担うアルコール アセチルトランスフェラーゼ (AAT、EC 2.3.1.84)は、中鎖長脂肪エステル、例えば、 オクチルオクタノエート、デシル オクタノエート、デシル デカノエート等を生産するために利用できる。中鎖 アルコール (例えば、C6およびC8)および中鎖 アシル-CoA (または 脂肪酸、例えば、C6およびC8)から合成された脂肪エステルは比較的低い融点を有する。例えば、ヘキシル ヘキサノエートは融点が-55℃であり、オクチルオクタノエートは融点が -18℃から-17℃である。これら化合物の低い融点によりこれらはバイオ燃料として使用するための良好な候補となる。
【０３０９】
実施例 8. 中鎖 脂肪エステル
この実施例において、チオエステラーゼをコードするSAAT 遺伝子を 生産宿主大腸菌 C41(DE3、ΔfadE)において大腸菌由来fadDおよび acr1 (A. baylyi ADP1由来アルコール レダクターゼ) とともに共発現させた。オクタン酸が発酵ブロスに提供された。この結果、オクチルオクタノエートが生産された。同様に、A. baylyi ADP1由来のエステルシンターゼ遺伝子を生産宿主においてSAAT 遺伝子の代わりに発現させた場合、オクチルオクタノエートが 生産された。 
【０３１０】
組換え SAAT 遺伝子はDNA 2.0 (Menlo Park、CA 94025)を用いて合成した。合成された DNA配列は公表された遺伝子配列 (受入番号 AF193789)に基づくものであったが、NcoI部位を除くように改変した。合成された SAAT 遺伝子 (BamHI-HindIII 断片として)をBamHIと HindIIIとで直鎖化した pRSET B (Invitrogen、Calsbad、California)にクローニングした。その結果得られたプラスミド、pHZ1.63Aを、大腸菌由来fadD 遺伝子およびA. baylyi ADP1由来acr1 遺伝子を担持するpAS004.114Bとともに大腸菌 生産宿主に共形質転換した。形質転換体を2%グルコースを含む3 mLのM9 培地で培養した。IPTG 誘導 および0.02%の オクタン酸の添加の後、培養を25℃で 40 時間続けた。次いで、3 mLの酢酸アセチルを全培養物に添加し、ミキサーで数回混合した。酢酸アセチル 相を GC/MSで分析した。
【０３１１】
驚くべきことに、酢酸アセチル抽出物において、酢酸アシルは観察されなかった。しかし、オクチルオクタノエートが観察された。しかし、 SAAT 遺伝子を有さない対照 株(C41(DE3、ΔfadE)/pRSET B+pAS004.114B)はオクチルオクタノエートを生産しなかった。さらに、A. baylyi ADP1由来のエステルシンターゼ遺伝子がpHZ1.43によって担持される株 (C41(DE3、ΔfadE)/pHZ1.43 B+pAS004.114B)がオクチルオクタノエートを生産した(図9A-D参照)。 
【０３１２】
SAAT 活性がオクチルオクタノエートを生産するという知見は、中鎖脂肪エステル、例えば、 オクチルオクタノエート、およびオクチル デカノエートの生産を可能とし、これらは融点が低く、トリグリセリドに基づくバイオディーゼルにかわるバイオ燃料としての使用のための良好な候補である。
【０３１３】
実施例 9、大腸菌 株 LS9001 における脂肪エステルの生産
脂肪エステルを 脂肪アルコール 形成アシル-CoAレダクターゼ、チオエステラーゼ、およびエステルシンターゼを発現するよう大腸菌 生産宿主を操作することによって生産した。したがって、生産宿主はエステルのAおよびB側の両方を生産し、両方の側の構造はチオエステラーゼ 遺伝子発現により影響を受けた。
【０３１４】
A. baylyi ADP1由来エステルシンターゼ(WSadp1と称する、受入番号: AA017391、EC 2.3.175)を A. baylyi ADP1 由来のゲノム DNA配列を鋳型として用いて以下のプライマーにより増幅した。プライマーは、(1) WSadp1_NdeI、5’-TCATATGCGCCCATTACATCCG -3’および(2) WSadp1_Avr、5’- TCCTAGGAGGGCTAATTTAGCCCTTTAGTT-3’であった。
【０３１５】
PCR産物を NdeI およびAvrIIで消化し、pCOALDeut-1 にクローニングし、 pHZ 1.43を得た。WSadp1 を担持するプラスミドをpETDuet-1’tesAおよびpCDFDuet-1-fadD-acr1の両方と共に 大腸菌 株 LS9001に共形質転換し、形質転換体を50 mg/Lのカナマイシン、50 mg/L のカルベニシリン および100 mg/L のスペクチノマイシンを追加したLBプレートで選択した。
【０３１６】
３つの形質転換体を3 mLの LBKCS (50 mg/Lのカナマイシン、50 mg/Lのカルベニシリン、100 mg/L のスペクチノマイシンおよび10 g/Lのグルコースを追加したLBブロス) に接種し、37℃でシェーカー (250 rpm)中でインキュベートした。培養物のOD600が0.5 に達すると、1.5 mL の各培養物を50 mLの LBKCSを含む250 mL フラスコに移した。次いで、フラスコをシェーカー (250 rpm) 中で 37℃で培養物のOD600が0.5-1.0となるまでインキュベートした。IPTGを次いで終濃度1 mMにて添加した。誘導した培養物を37℃ でシェーカー(250 rpm)中でさらに40-48 時間インキュベートした。 
【０３１７】
培養物を次いで50 mL コニカルチューブに入れ、細胞を 3500 X gで10 分間遠沈した。細胞ペレットを次いで5 mLの 酢酸エチルと混合した。 酢酸エチル抽出物をGC/MSで分析した。脂肪エステル （C16C16、C14:1C16、C18:1C18:1、C2C14、C2C16、C2C16:1、C16C16:1およびC2C18:1を含む)の収率は約 10 mg/Lであった。空のベクターのみを担持する大腸菌 株を同様に培養した場合、0.2 mg/Lのみの脂肪エステルが酢酸エチル抽出物中にみられた。
【０３１８】
実施例 10、生産宿主からの脂肪-エチルエステルの生産および放出
LS9001 株を A. baylyi由来エステルシンターゼ遺伝子を担持するプラスミド(プラスミド pHZ1.43)、Cuphea hookeriana由来チオエステラーゼ 遺伝子を担持するプラスミド(プラスミド pMAL-c2X-TEcu)および大腸菌 由来fadD 遺伝子を担持するプラスミド (プラスミド pCDFDuet-1-fadD)で形質転換した。
【０３１９】
この組換え 株を25℃で50mg/Lの カナマイシン、100 mg/Lの カルベニシリンおよび 100 mg/Lの スペクチノマイシンを含む3 mLの M9 培地で培養した。IPTG 誘導の後、培地を終濃度 1% エタノールおよび2% グルコースとなるよう調整した。
【０３２０】
培養物を IPTG 誘導後40 時間培養した。細胞を 3500 X g で 10 分間の遠心分離により消費培地から分離した。細胞ペレットを3 mLの M9 培地に再懸濁した。細胞 懸濁液および消費培地を次いで1体積の酢酸エチルにより抽出した。その結果得られた細胞懸濁液からの酢酸エチル 相および上清を GC-MS 分析に供した。
【０３２１】
C16 エチルエステルがもっとも主要なエステル 種 (このチオエステラーゼについて予想されるとおり、表1参照)であり、生産された脂肪エステルの20%が細胞から放出された (図10参照)。pCOLADuet-1 (エステルシンターゼ遺伝子について空の ベクター)、pMAL-c2X-TEuc (U. california由来fatB含有)およびpCDFDuet-1-fadD (大腸菌由来fadD 遺伝子 )を含む対照 大腸菌 株 C41(DE3、ΔfadE) は検出可能な量の脂肪-エチルエステルを生産することができなかった。脂肪エステルを市販の パルミチン酸 エチルエステルを参照として用いて定量した。
【０３２２】
脂肪エステルは、メタノールまたは イソプロパノールを発酵ブロスに添加する以外は本明細書に記載する方法を用いても作られた。予測される脂肪エステルが生産された。
【０３２３】
実施例 11、組換え 大腸菌 株において生産される脂肪-エチルエステルの組成に対する様々な チオエステラーゼの影響
チオエステラーゼ、FatB3 (C. hookeriana)、TesA (大腸菌)、および FatB (U. california) をエステルシンターゼ (A. baylyi)と同時に発現させた。プラスミド、pHZ1.61を NotI-AvrII 断片 (acr1 遺伝子担持) を pHZ1.43由来のNotI-AvrII 断片により置換することにより構築し、fadDおよびADP1 エステルシンターゼが１つのプラスミドにあり、両方のコード配列が別々の T7 プロモーターの制御下にあるようにした。pHZ1.61の構築により実施例 8に記載の ３つのプラスミド システムではなく２つのプラスミド システムを使用することが可能となった。 pHZ1.61を様々な上記のチオエステラーゼ 遺伝子を担持する様々な プラスミドの何れかと共に大腸菌 C41(DE3、ΔfadE)に共形質転換した。
【０３２４】
これら形質転換体によって生産される総脂肪酸 エチルエステル(上清および細胞内 脂肪酸 エチル流体の両方における)を本明細書に記載する技術を用いて評価した。脂肪酸 エチルエステルの収率および 組成を表14に要約する。
【０３２５】
表 14:組換え 大腸菌 C41(DE3、ΔfadE)/pHZ1.61および 様々なチオエステラーゼ遺伝子を担持するプラスミドによる脂肪酸 エチルエステルの収率(mg/L)および組成
【表２０】
0005863088.tif 000021
注: TesA、pETDuet-1-’tesA; chFatB3、pMAL-c2X-TEcu; ucFatB、pMAL-c2X-TEuc; pMAL、pMAL-c2X、本研究に用いたチオエステラーゼ 遺伝子について空の ベクター 。
【０３２６】
実施例 12.バイオ燃料を生産するための様々な エステルシンターゼの使用
エステルシンターゼをコードする４つの遺伝子を、NCBI GenBankに報告されている対応するDNA 配列に基づいてわずかに改変を加えて合成した。これらの改変には、対応するアミノ酸配列に変化を導入せずに存在する内部 NcoI、NdeI、HindIII およびAvrII 部位を除去することが含まれる。目的の４つの遺伝子を5’末端にNdeI 部位を、3’末端にAvrIIを有するよう合成した。配列を次いでpCOLADuet-1 (Novagene)のNdeIおよびAvrII 部位にクローニングし、pHZ1.97-376、pHZ1.97-377、pHZ1.97-atfA1 および pHZ1.97-atfA2を生産した。目的の４つの遺伝子のそれぞれを担持するプラスミドをそれぞれGenBank 受入番号:およびGenPeptide受入番号とともに以下の表 15に列挙する。
【０３２７】
表 15: エステルシンターゼ
【表２１】
0005863088.tif 000022
【０３２８】
４つのプラスミドのそれぞれを大腸菌 C41 (DE3、ΔfadEΔfabR)/ pETDuet-1-tesA + pCDFDuet-1-fadDに形質転換した。各形質転換からの３つの形質転換体を発酵のためにピックアップし、脂肪酸 エチルエステルを合成するそれらの能力を試験した。発酵は、実施例 9に記載のようにして行ったが、ただし、２つの異なる温度、25℃または37℃で行った。株 C41 (DE3、ΔfadEΔfabR)/ pETDuet-1-tesA + pCDFDuet-1-fadD+pHZ1.43 (ADP1 エステルシンターゼを発現する)を陽性対照として用い、C41 (DE3、ΔfadEΔfabR)/ pETDuet-1-tesA + pCDFDuet-1-fadDを陰性対照として用いた。
【０３２９】
fadEおよびfabR 活性が減弱され、 tesA および fadDを過剰発現する大腸菌 株における４つのそれぞれのエステルシンターゼ遺伝子の発現は、それぞれの株が、およそ 250 mg/LのFAEEを25℃で生産することを可能とした。これは、ADP1を発現する陽性対照によって生産されるものと同じ量である。一方、陰性対照 株は、25℃で同じ条件下で(図 11) 50 mg/L未満のFAEEを生産した。これら４つのエステルシンターゼから生産されたFAEE の脂肪アシル 組成は、 ADP1 エステルシンターゼからのものと同様である(図 12)。
【０３３０】
37℃で行った発酵からの結果は、pHZ1.97_aftA2を担持する株およびpHZ1.97_376を担持する株がpHZ1.43を担持する陽性対照よりも多くのFAEE を生産したことを示した(図 13)。pHZ1.97_aftA2 を担持する株およびpHZ1.97_376を担持する株は多量の遊離脂肪酸も生産した。一方、pHZ.143 を担持する株は遊離脂肪酸を蓄積しなかった(図 14)。結果は、これら４つのエステルシンターゼがエタノールおよび広い範囲のアシル-CoA を基質として受容することが出来ることを示した。
【０３３１】
実施例 13.バイオ燃料を生産するための真核 エステルシンターゼの使用
この実施例は、サッカロマイセス・セレビシエからのエステルシンターゼのクローニングおよび発現を記載する。プラスミドは標準的分子生物学 技術を用いて作製した。
【０３３２】
表 16: eeb1を有するプラスミド
【表２２】
0005863088.tif 000023
*サッカロマイセス・セレビシエ 遺伝子 eeb1 (GenBank 受入番号 YPL095C) を5’ BamHI および3’ HindIII 部位を導入するプライマーを用いてサッカロマイセス・セレビシエ ゲノム DNA 配列からPCR増幅した。
【０３３３】
大腸菌 C41 (DE3 ΔfadE) 生産宿主を様々な プラスミドの発現に用いた。大腸菌 細胞をM9 最小培地 (6 g/L Na2HPO4、3 g/L KH2PO4 、0.5 g/L NaCl、1 g/L NH4Cl、1 mg/L チアミン (ビタミン B1)、1 mM MgSO4、0.1 mM CaCl2、示された通りに0.4% (w/v) または2% (w/v) グルコース)で培養した。 すべての脂肪酸 ストック溶液は、脂肪酸 ナトリウムまたはカリウム 塩をpH 7.0の蒸留脱イオン 水に溶解することによって調製した。オクタン酸 ストックは、Sigma、St. Louis、MOから購入した。
【０３３４】
発酵は、プラスミド、pCDFDuet-1-acr1、pMAL-c2X-TEuc (ucFatB)、および pGL10.59 (eeb1) を含有するC41 (DE3 ΔfadE) 株を用いて行った。対照 株は、pCDFDuet-1-acr1、pMAL-c2X-TEuc、および空の pCOLADuet-1 ベクターを担持するC41 (DE3 ΔfadE) 株であった。各形質転換からの３つのコロニーを用いて、カルベニシリン (100 μg/mL)、スペクチノマイシン (100 μg/mL)、およびカナマイシン (50 μg/mL) を追加したM9 + 0.4% グルコース スターター培養液に接種した。培養液を37℃で一晩培養した。生産培養液を、1:100 希釈のスターター培養液を3 mL M9 培地 + 0.4% グルコースに接種するために作ることによって確立した。生産培養液をOD600 = 0.6となるまで37℃で培養した後、 1 mM IPTGで誘導をかけ、1% エタノールを与え、さらに40 時間25℃で培養した。全細胞培養物を、30 秒間激しくボルテックスすることにより、等体積の酢酸エチルによって抽出した。有機相を採取し、FAEE 検出のための方法、alkane_1_splitless_ctc.mを用いてGC/MSにかけ、それは、実施例 4、パート2、「サンプル #23-30におけるFAおよびFAEEの定量」に記載されている。
【０３３５】
いずれのサンプルにおいてもFAEE ピークは検出できなかった。Eeb1 が適切に発現されているか否かを判定するために、IPTG-誘導、および非誘導の培養物をSDS-PAGEによって分析した。Eeb1のサイズ (~52 kDa) に対応するバンドは検出できなかった。これは、この特定の プラスミド 系については、Eeb1は良好に発現しないことを示唆する。
【０３３６】
さらなる発現 実験を異なる発現ベクターを用いて行った。遺伝子を標的 タンパク質をマルトース 結合 タンパク質 (MBP) 融合として発現するベクター pMALc2xにクローニングした。全細胞溶解液のSDS-PAGE 分析により、1 mM IPTGにより誘導された培養物は、Eeb1-MBP 融合に対応する適切なサイズ(~92 kDa)のバンドを生じることが明らかとなった。バンドは、非誘導細胞には存在しなかった。
【０３３７】
Eeb1 酵素活性をプラスミドpCDFDuet-1-acr1 およびpGL10.104 (eeb1)を担持するC41 (DE3 ΔfadE) 大腸菌 株を用いて評価した。pCDFDuet-1-acr1およびpMALc2xを有するA C41 (DE3 ΔfadE)は、対照株として作用した。３つのコロニーを各形質転換からピックアップし、カルベニシリン (100 μg/mL)およびスペクチノマイシン (100 μg/mL) を追加したM9 + 0.4% グルコース オーバーナイトスターター培養液に接種するのに用いた。1:100 希釈のスターター培養液を用いて、10 mL M9 + 0.4% グルコース 生産培養液に接種した。生産培養液を37℃で OD600 = 0.4 - 0.5となるまで培養した後、1mM IPTGで誘導をかけ、1% エタノールを与え、そしてオクタン酸 (0.01%または0.02% 最終体積)またはデカン酸 (0.02% 最終体積)を与えた。発酵を25℃で24 時間継続させた。抽出を、1/10 体積の12 M HClおよび等体積の酢酸エチルを培養物に添加し、30 秒間ボルテックスすることによって行った。サンプルを上記のようにGC/MSにより分析した。
【０３３８】
GC/MSデータにより、オクタン酸 エチルエステルに対応するピークが、Eeb1を発現し、オクタン酸およびエタノールを与えた細胞について検出可能なことが明らかとなった。ベクター 対照 株もC2C8 ピークを示したが、Eeb1 発現細胞よりは小さいピークであった。
【０３３９】
0.02% デカン酸を与えた細胞は良好に生育せず、それゆえ以下の研究は0.01% または0.005% デカン酸を用いて行った。Eeb1がエタノール以外のアルコールを脂肪酸 エステルの合成において利用する能力を試験するために、発酵を同じ株: pCDFDuet-1-acr1およびpGL10.104を有するC41 (DE3 ΔfadE)を用いて行った。細胞を以前に記載されているようにして培養した。誘導の際、細胞に0.02% オクタン酸と、1% メタノール、エタノール、プロパノール、またはイソプロパノールを与えた。細胞にはまた、0.01%または0.005% デカン酸および1% エタノールを与えた。発酵を誘導の後24 時間25℃で続けた。GC/MSのために、培養物を遠沈して、ペレットと上清とに分離した。ペレットを等体積の新しい M9 + 0.4% グルコース 培地に再懸濁した。再懸濁したペレットと上清 サンプルとの両方を上記のように抽出し、GC/MSにより分析した。
【０３４０】
すべての上清サンプルは多量の脂肪酸を含んでおり、脂肪酸 エステルは検出されなかった。同様に、ベクター 対照 ペレット サンプルはピークを含まなかった。しかし、C10 脂肪酸を与えた細胞はデカン酸であると同定されるピークを示した。
【０３４１】
Eeb1 を発現し、C8 脂肪酸およびプロパノールまたはエタノールを与えた細胞由来のペレット サンプルはプロピルまたはエチルエステルに対応する小さいピークを示した。メタノールまたはイソプロパノールを与えた細胞についてはピークは検出されなかった。0.01% または0.005% C10 脂肪酸およびエタノールを与えた培養物は C2C10 FAEEも生産し、それはペレット サンプル中に存在していた。
【０３４２】
結果は、Eeb1は、オクタン酸またはデカン酸を用いてFAEEを合成することができ、かつ、オクタン酸 メチルエステルの生成のためにメタノールを使用することができることを示した。しかし、これらの化合物は高度に揮発性であり、 GC/MSデータが真のタイター(titer）を正確に反映しない可能性がある。生成物 形成をより正確に測定するために、これらのより揮発性 のFAEEの捕捉を促進するためにヘキサデカン オーバーレイを用いた。
【０３４３】
様々な 脂肪酸 基質を用いたEeb1 活性を、pCDFDuet-1-acr1 およびpGL10.104を有する株 C41 (DE3 ΔfadE) を用い、様々な鎖長の脂肪酸を与えて評価した。細胞を上記のように、ただし、誘導後の細胞のより良好な生育を促進するためにOD600 = 0.8 - 0.9にて誘導をかけて培養した。この時点で、細胞に1% エタノールおよび0.02% C8 脂肪酸または0.01%の以下の 脂肪酸を与えた: C10、C12、C14、およびC16。C8またはC10 脂肪酸を与えた培養物を、20% 総体積のヘキサデカンでオーバーレイした。発酵をさらに24 時間25℃で行った。生成物 分析のために、全培養物を (上清をペレットから分離せずに)、1/10 体積 の HCl および培養物と等体積の酢酸エチルによって上記のように抽出した。実施例 4、パート2、「サンプル #23-30におけるFAおよびFAEEの定量」に記載されているようにプログラム hex_1_splitless_ctc.mを用いてヘキサデカン サンプルを直接にGC/MSに注入した。
【０３４４】
ベクター 対照はいずれもFAEE ピークを示さなかった。C8- およびC10-を与えた細胞については、大きなC2C8およびC2C10 ピークが ヘキサデカン サンプルにおいて検出可能であったが、酢酸エチル サンプルにおいては検出できなかった。これは、ヘキサデカンが揮発性 FAEEの捕捉に成功することが出来たことを示した。残りの酢酸エチルサンプルについては、C2C12 および C2C14 FAEEについては小さいピークが検出できたが、C2C16については検出できなかった。したがって、Eeb1はC8 からC14の鎖長の脂肪酸を用いてエチルエステルを生成した。Eeb1はより長鎖の脂肪酸よりもC8 および C10を好んだ。
【０３４５】
実施例 14.大腸菌 fabA および/またはfabB 遺伝子を過剰発現する宿主 株を作るための組換え 配列のゲノム 組込み
fabR 遺伝子の生成物は、fabAおよびfabB 遺伝子の発現のリプレッサーとして作用することが知られている。FadRは、同遺伝子の活性化因子として働くことも知られている。FabRおよび予測コンセンサス結合配列はZhang et al.、J. Biol. Chem. 277:  15558-15565、2002により以前に公表された。コンセンサス 結合 配列およびその位置は大腸菌からのfabAおよびfabB 遺伝子と関連しており、図 15に示す。
【０３４６】
大腸菌のfabR ノックアウト 株を作成した。プライマー TrmA_R_NotIおよびFabR_FOPを用いてfabRの上流およそ 1000 bpを増幅し、プライマーSthA_F_Bam およびFabR_ROP を用いてfabRの下流およそ 1000 bp を増幅した(表D参照)。オーバーラップPCRを、完全な fabR 遺伝子のインフレームな欠失のためのコンストラクトの作成に適用した。fabR 欠失 コンストラクトを 対抗選択のためにSacBを含む温度感受性 プラスミド pKOV3にクローニングし、fabRの染色体 欠失をChurch およびその同僚の方法(Link et al.、J. Bact. 179:6228-6237、1997)に従って作成した。
【０３４７】
表 17: fabR ノックアウト プライマー
【表２３】
0005863088.tif 000024
【０３４８】
実施例15、生産宿主構築 
表 18はバイオディーゼル、脂肪アルコール、および炭化水素を生産する微生物において発現することが知られている本明細書に記載する多くの遺伝子のホモログを同定する。脂肪酸 生産を上昇させ、それゆえ、生産宿主、例えば、表 18に同定するものにおける炭化水素 生産を上昇させるために、異種 遺伝子、例えば、大腸菌由来のものを発現させることができる。当業者であれば表 18に示す微生物に内因性の遺伝子を、本明細書に記載する方法を用いて発現、過剰発現、または減弱させることができることを理解している。さらに、表 18に記載する遺伝子を、内因的に炭化水素を生産する生産宿主において発現、過剰発現、または減弱させて、規定された炭素鎖長、飽和点および分枝点を有する特定の炭化水素 の生産を可能とすることが出来る。
【０３４９】
表 18: 炭化水素 生産宿主
【表２４−１】
0005863088.tif 000025
【０３５０】
【表２４−２】
0005863088.tif 000026
【０３５１】
【表２４−３】
0005863088.tif 000027
【０３５２】
【表２４−４】
0005863088.tif 000028
【０３５３】
【表２４−５】
0005863088.tif 000029
【０３５４】
【表２４−６】
0005863088.tif 000030
【０３５５】
【表２４−７】
0005863088.tif 000031
【０３５６】
【表２４−８】
0005863088.tif 000032
【０３５７】
表18について、受入番号は 2007年4月15日からのGenBank、Release 159.0 からのものであり、EC 番号は、2007年4月からのKEGG、Release 42.0 (＋05/09/07までの、およびその日を含む日々のアップデート) からのものであり、Erwinia amylovora株 Ea273 についての結果は、Sanger sequencing center、5/9/07からの完全ショットガン配列から得、Erwiniaについての位置はSanger 偽染色体上の位置を示し、Vibrio furnisii M1からの配列は9/28/06からのLS9 VFM1 偽染色体、v2 buildからのものであり、完全遺伝子を含み、フランキング配列も含みうる。
【０３５８】
実施例 16、さらなる例示的な生産株
表19は、さらなる 例示的な 生産株を提供する。２例の生合成経路が脂肪酸、脂肪アルコールおよびろうエステルの生産のために記載されている。例えば、表 19 は、脂肪酸を生産する例1および2を提供する。例 1において脂肪酸を生産するために用いられる生産宿主 株は、遺伝子を同定する列において「x」印によって示す合成酵素活性を有するよう操作されている生産宿主細胞である (アセチル-CoA カルボキシラーゼ、チオエステラーゼ、およびアシル-CoA シンターゼ 活性を同定する「x」参照) 。生産宿主細胞は細菌、酵母、および真菌から選択しうる。これらの遺伝子は、図１に記載の１以上の遺伝子操作を含むよう改変された生産宿主細胞へと形質転換されうる。表19に示すように、さらなる生産宿主を示した外来性 遺伝子を用いて作ることが出来る。
【０３５９】
表 19:遺伝子操作された生産株の作成に有用な遺伝子の組合せ
【表２５−１】
0005863088.tif 000033
【０３６０】
【表２５−２】
0005863088.tif 000034
【０３６１】
実施例 17.アシル-CoAを過剰生産するためのさらなる アシル-CoA シンターゼの使用
大腸菌 fadDに対するホモログを、M. tuberculosis HR7Rv (NP_217021、FadDD35)、枯草菌 (NP_388908、YhfL)、サッカロマイセス・セレビシエ (NP_012257、Faa3p) および緑膿菌 PAO1 (NP_251989)からの所望の配列のコドン最適化した 遺伝子を合成することによって大腸菌において発現させることが出来る。合成遺伝子は、NcoI およびHindII 適合性 オーバーハングを含むように設計されうる。アシル-CoA シンターゼを次いで、NcoI/HindIII 消化したpTrcHis2 ベクター (Invitrogen Corp.、Carlsbad、California)に上記のようにクローニングし、大腸菌 株 MG1655 ΔfadEにおいて発現させることが出来る。大腸菌における発現の後、アシル-CoA 生産が上昇する。
【０３６２】
脂肪酸誘導体、例えばFAEEも、大腸菌 株 MG1655 ΔfadEの、 pTrcHis2 ベクター中の様々な アシル-CoA シンターゼと、pCL1920由来のA. baylyiからのエステルシンターゼまたはCuphea hookerianaからのチオエステラーゼ遺伝子を含む適合性プラスミドとによる共形質転換により生産することが出来る。結果として得られる生産宿主は、上記のようにエタノールを含有する培地で培養するとFAEEを生産する。
【０３６３】
実施例 18.アシル-CoAを過剰生産するためのさらなる アシル-CoA シンターゼの使用
多数の大腸菌 FadD ホモログのDNA 配列またはタンパク質 配列が公知である。しかし、わずかについての生化学的性質しか記載されていない。例えば、Knoll et al.、J. Biol. Chem. 269(23):16348-56、1994; Shockey et al.、Plant Physiol. 132: 1065-1076、2003を参照。 さらに、商業目的のために有意な レベルで活性形態にて発現されるそれらの能力は未知である。エステル生産のための異種 アシル-CoA シンターゼの使用の可能性を調査するために、いくつかの アシル-CoA シンターゼ遺伝子を以下のようにクローニングし、発現させた。この実施例はチオエステラーゼ、エステルシンターゼ、およびアシル-CoA シンターゼ遺伝子について別々のプラスミドにより生産宿主を形質転換することについて記載しているが、これらの遺伝子はそうではなく、共に１つのプラスミドに組み込まれて生産宿主を形質転換してもよい。
【０３６４】
1) pOP-80 プラスミドの構築
遺伝子を過剰発現させるために、強力な転写 プロモーターを担持する市販の ベクター pCL1920 (Lerner & Inouye、(1990) NAR 18: 4631)に基づく低コピー プラスミドを、pCL1920 を制限酵素AflII および SfoI (New England BioLabs Inc. Ipswich、MA)で消化することによって構築した。３つのDNA 配列断片がこの消化によって生じた。3737 bpの断片をゲル-精製キット (Qiagen、Inc. Valencia、CA)を用いてゲルで精製した。並行して、trc-プロモーター および市販の プラスミド pTrcHis2 (Invitrogen 、Carlsbad、CA)からのlacI 領域を含有するDNA 配列 断片を、プライマーLF302 (5’-atatgacgtcGGCATCCGCTTACAGACA-3’)およびLF303 (5’-aattcttaagTCAGGAGAGCGTTCACCGACAA-3’)を用いてPCRによって増幅した。これら２つのプライマーはPCR 生成物の末端にそれぞれZraI(gacgtc)およびAflII(cttaag) 酵素の認識 部位も導入するものであった。増幅の後、PCR 生成物をPCR-精製キット (Qiagen、Inc. Valencia、CA)を用いて精製し、供給会社(New England BioLabs Inc.、Ipswich、MA) の推奨にしたがってZraIおよびAflIIで消化した。消化の後、PCR 生成物をゲルで精製し、pCL1920由来の3737 bp DNA 配列 断片とライゲーションした。TOP10 化学的コンピテント 細胞 (Invitrogen 、Carlsbad、CA)のライゲーション 混合物による形質転換の後、形質転換体を100 μg/mL スペクチノマイシンを含有するLuria 寒天プレート上で選択した。多くのコロニーが37℃で一晩のインキュベーションの後、可視できた。これらコロニー中に存在するプラスミドを精製し、制限酵素で分析し、次いで配列決定した。このようにして生産された１つのプラスミドを維持し、pOP-80と命名し、さらなる 発現 実験のために使用した。pOP-80の地図を図 17に示す。
【０３６５】
プラスミド pOP-80の関連領域のDNA 配列を確証した。2 断片がライゲーションした接合部において、各末端の3-4 塩基が欠損していることが判明し、これはおそらく制限酵素の１つに混入したエキソヌクレアーゼ 活性によってもたらされた。おそらくこれらの小さい欠失は関連するプラスミド 機能に影響を与えなかった。結果として得られたプラスミドをこの実施例に記載のすべての発現 実験のために用いた。プラスミドの全長 配列を配列番号1 (図 18)として開示する。
【０３６６】
2)結核菌 HR7RvからのfadD35のクローニング
大腸菌のコドン最適化した遺伝子を、NCBIに受入番号 NP_217021にて寄託されたfadD35 遺伝子のタンパク質 配列を用いてDNA 2.0 Inc. (Menlo Park、CA)によって合成した。合成遺伝子は5’末端に特有のNcoI 部位および3’末端に特有のEcoRI 部位を含んでいた。合成遺伝子はDNA 2.0 Inc. により提供され、プラスミド pJ201:16084にクローニングした。fad35 遺伝子を、NcoIおよび EcoRIでの消化によりこのプラスミドから放出した。この断片の配列を配列番号1に示す。結果として得られたDNA 配列 断片 (配列番号2、図 19)を NcoI およびEcoRIで前もって消化しておいたpOP-80とライゲーションした。ライゲーション 混合物をTOP10 化学的コンピテント 細胞(Invitrogen 、Carlsbad、CA)に形質転換し、次いで 100 μg/mL スペクチノマイシンを含有するLuria 寒天プレートに播き、37℃で一晩インキュベートした。翌日にあらわれたコロニーをスクリーニングし、正しいプラスミドを含有する株を同定した。プラスミドをpDS9と命名した。
【０３６７】
3)緑膿菌 PAO1からのfadD1のクローニング 
大腸菌のコドン最適化した 遺伝子を、NCBI に受入番号 NP_251989にて寄託されたfadD1 遺伝子のタンパク質 配列を用いてDNA 2.0 Inc. (Menlo Park、CA)により合成した。合成遺伝子は5’末端に特有のBspHI 部位および  3’末端に特有のEcoRI 部位を含んでいた。合成遺伝子はDNA 2.0、Inc.により提供され、プラスミド pJ201:16083にクローニングした。fadD1 遺伝子をBspHI および EcoRIで消化することによってこのプラスミドから放出した。この断片の配列を配列番号3 (図 20)に示す。結果として得られたDNA 配列 断片を、NcoI およびEcoRIで前もって消化しておいたpOP-80dとライゲーションした。ライゲーション 混合物でTOP10 化学的コンピテント 細胞 (Invitrogen 、Carlsbad、CA)を形質転換し、100 μg/mL スペクチノマイシンを含有するLuria 寒天プレートに播き、37℃で一晩インキュベートした。翌日あらわれたコロニーをスクリーニングした。正しいプラスミドを含有する株を同定した。プラスミドをpDS8と命名した。
【０３６８】
4)バチルス・スブチリスからのyhfLのクローニング
yhfL 遺伝子を、バチルス・スブチリス I168 染色体 DNA 配列 をテンプレートとして用い、NCBIに受入番号 NC_000964にて寄託されたDNA 配列に基づいて設計された２つのプライマーを用いてPCRにより増幅した。2つのプライマーの配列は以下の通りであった:
BsyhfLBspHIF: 5’-CATCATGAATCTTGTTTC-3’ (配列番号4、図 21)
BsyhfLEcoR: 5’- CGGAATTCTTATTGGGGCAAAATATC-3’ (配列番号5、図 22)。
【０３６９】
これら２つの プライマーはBspHI 認識 部位を5’末端に、EcoRI 認識 部位を3’末端に導入した。PCR 生成物をZero Blunt TOPO PCR クローニングキット (Invitrogen 、Carlsbad、CA)を用いてpCR-Blunt II-TOPO ベクターに直接にクローニングした。yhfL 遺伝子を担持するプラスミドをpDS1と命名した。 yhfLをサブクローニングするために、プラスミド pDS1をBspHIおよび EcoRIで消化した。結果として得られたDNA 配列 断片 (配列番号6、図 23)をゲルで精製し、NcoIおよびEcoRIで 前もって消化しておいたpOP-80にクローニングした。pOP-80にクローニングされた枯草菌 yhfL 遺伝子を担持するプラスミドをpDS4と命名した。 
【０３７０】
5)サッカロマイセス・セレビシエからのfaa3p(NP_012257)のクローニング
faa3p 遺伝子を市販の サッカロマイセス・セレビシエ 染色体 DNA 配列 ATCC 204508D (American Type Culture Collection、Manassas、VA) をテンプレートとして用い、NCBIに受入番号 NC_001141にて寄託されたDNA 配列に基づいて設計された２つのプライマーを用いてPCRにより増幅した。２つのプライマーの配列は以下の通りであった:
Scfaa3pPciF: 5’-CGACATGTCCGAACAACAC-3’ (配列番号7、図 24)
Scfaa3pPciI: 5’-GCAAGCTTCTAAGAATTTTCTTTG-3’ (配列番号8、図 25)。
【０３７１】
これら２つの プライマーは5’末端にPciI 認識 部位、3’末端にHindIII 認識 部位を導入した。
【０３７２】
PCR 生成物をZero Blunt TOPO PCR クローニングキット (Invitrogen 、Carlsbad、CA)を用いてpCR-Blunt II-TOPO ベクターに直接にクローニングした。faa3p 遺伝子を担持するプラスミドをpDS2と命名した。faa3pをサブクローニングするために、プラスミド pDS2を PciI およびHindIIIで消化した。DNA 配列 断片 (配列番号9、図 26)をゲルで精製し、NcoI およびHindIIIで前もって消化しておいたpOP-80にクローニングした。pOP-80にクローニングされたサッカロマイセス・セレビシエ faa3p 遺伝子を担持するプラスミド をpDS5と命名した。 
【０３７３】
6)ステノトロホモナス・マルトフィリア R551-3からのZP_01644857 のクローニング
タンパク質 ZP_01644857 についての構造遺伝子配列は、座位 NZ_AAVZ01000044の部分としてNCBIにて入手可能である。遺伝子を、ステノトロホモナス・マルトフィリア R551-3 染色体 DNA 配列をテンプレートとして用い、寄託されたDNA 配列に基づいて設計した２つのプライマーを用いてPCRにより増幅した。２つのプライマーの配列は以下の通りであった:
Smprk59BspF: 5’- AGTCATGAGTCTGGATCG-3’ (配列番号10、図 27)
Smprk59HindR: 5’- GGAAGCTTACGGGGCGGGCG-3’ (配列番号11、図 28)。
【０３７４】
これら２つの プライマーは5’末端にBspHI 認識 部位を、3’末端にHindIII 認識 部位を導入した。
【０３７５】
PCR 生成物をZero Blunt TOPO PCR クローニングキット (Invitrogen 、Carlsbad、CA)を用いてpCR-Blunt II-TOPO ベクターに直接にクローニングした。タンパク質 ZP_01644857 をコードする遺伝子を担持するプラスミドをpDS3と命名した。遺伝子のさらなるサブクローニングを促進するために、内部 BspHI 部位をプライマー PrkBsp- (5’ GCGAACGGCCTGGTCTTTATGAAGTTCGGTGG-3’) (配列番号12、図 29) および QuikChange Multi Site-Directed mutagenesisキット(Stratagene、La Jolla、CA)を用いて部位特異的変異誘発によって除去した。適切な 突然変異をDNA 配列決定によって確証した後、結果として得られたプラスミドをBspHIおよびHindIIIで消化し、pDS6と命名した。DNA 配列 断片 (配列番号13、図 30)をゲルで精製し、NcoIおよびHindIIIで前もって消化しておいたpOP-80にクローニングした。pOP-80にクローニングされたタンパク質 ZP_01644857をコードする遺伝子を担持するプラスミドをpDS7と命名した。ZP_01644857のタンパク質 配列を配列番号14 (図 31)に開示する。
【０３７６】
7)脂肪エステルを生産するための株の構築
大腸菌 BL21(DE3) 株をまず、大腸菌 tesA 遺伝子を担持するプラスミド pETDuet-1-tesA (実施例 2に記載)、およびatfA2 エステル シンゼターゼ 遺伝子を担持するプラスミド pHZ1.97 (実施例 12に記載)でそれぞれ形質転換した。両方の遺伝子はIPTGによって誘導可能なT7 プロモーターの下にあった。両方のプラスミドを担持する２つの独立の形質転換体を異種 fadD 遺伝子を担持する組換え プラスミドのそれぞれによって形質転換し、100 μg/mL カルベニシリン、50 μg/mL カナマイシン、および100 μg/mL スペクチノマイシンを含有するLuria 寒天プレート上で選択した。３つのプラスミドを担持する３つの独立のコロニーを脂肪エステル 生産について試験した。
【０３７７】
8)ステノトロホモナス・マルトフィリア R551-3からのZP_01644857を用いて生産された脂肪エステルの分析
脂肪エステルを生産するための、生産宿主におけるステノトロホモナス・マルトフィリア R551-3 からのタンパク質 ZP_01644857の使用を評価するために、大腸菌 BL21(DE3) 株を、大腸菌 tesA 遺伝子を担持するプラスミド pETDuet-1-tesA (実施例 2に記載)、atfA2 エステル シンゼターゼ 遺伝子を担持するプラスミド pHZ1.97 (実施例 12に記載)および、タンパク質 ZP_01644857をコードする遺伝子を担持するプラスミド pDS7 (この実施例に上記)で形質転換した。この 生産宿主を発酵させて実施例 13に記載のように脂肪エステルを生産させた。対照として、プラスミド pETDuet-1-tesA、pHZ1.97、およびpCL1920を含有する第２の大腸菌 株 BL21(DE3)ΔfadEを、脂肪エステルを生産するための生産宿主として使用した。
【０３７８】
以下の表 20はこれら生産宿主からの脂肪エステル収量を示す。
【０３７９】
表 20. ZP_01644857を生産した生産宿主からの脂肪エステル収量
【表２６】
0005863088.tif 000035
a 対照:プラスミドpETDuet-1-tesA、pHZ1.97およびpCL1920を含有する株 BL21(DE3) D fadE。
bプラスミドpETDuet-1-tesA、pHZ1.97およびpDS7を含有する株 BL21(DE3) D fadE。
cこれらの値は3つの培養の平均を表す。
【０３８０】
実施例 19.ベータ-酸化の下方制御
この実施例は、大腸菌 株 MG1655 ΔfadE ΔydiOの作成を記載する。
【０３８１】
脂肪酸分解は、上記のβ 酸化 酵素反応 (図 3参照)のいずれかを減弱することによって排除または減弱することが出来る。例えば、大腸菌 株 MG1655 ΔfadE は、ydiOの上流を増幅するプライマーおよびydiO の下流を増幅するさらなる プライマーの使用によってさらに操作することが出来る。オーバーラップPCRを完全な ydiO 遺伝子のインフレームな欠失のためのコンストラクトの作成のために使用することが出来る。ydiO 欠失 コンストラクトを次いで対抗選択のためにsacB 遺伝子を含む温度感受性 プラスミド pKOV3にクローニングし、ydiOの染色体 欠失をLink et al.、J. Bact. 179:6228-6237、1997の方法にしたがって行う。結果として得られる株は、脂肪酸および脂肪アシルCoAを分解することができないであろう。fadEおよびydiOの二重ノックアウトのさらなる作成方法はCampbell et al.、Mol. Microbiol. 47:793-805、2003に記載されている。
【０３８２】
ベータ酸化経路を含まない生産宿主を使用することによって脂肪酸 分解を避けることも可能である。例えば、いくつかのStreptococcusの種が配列決定されており、ベータ-酸化に関与する遺伝子は見つからなかった。
【０３８３】
実施例 20.さらなるエステルシンターゼの同定
この実施例は、さらなる エステルシンターゼ、および脂肪エステルの生産のためにかかるシンターゼを使用する方法を提供する。
【０３８４】
バイオインフォマティクスを用いることにより、さらなる エステルシンターゼが同定された。これらのエステルシンターゼは、その他の既知のモチーフ、例えばADP1にみられるモチーフとは異なるモチーフを含む。モチーフにおける相違を以下の表 21に示す。
【０３８５】
表 21:エステルシンターゼモチーフの比較
【表２７】
0005863088.tif 000036
【０３８６】
同定した配列は標準的分子生物学 技術を用いてクローニングすることが出来る。これらの配列は、本明細書において記載するベクターを用いて発現させることが出来、様々な 脂肪エステルを作るために使用することが出来る。モチーフはまた、その他のエステルシンターゼを同定するためにも使用することが出来る。
【０３８７】
実施例 21. 生成物特徴決定
脂肪アルコールおよび脂肪エステルを特徴づけ、定量するために、電子衝撃質量分析 (MS)検出に結合したガスクロマトグラフィー (GC)を用いた。脂肪アルコール サンプルをまず過剰の N-トリメチルシリル (TMS) イミダゾールで誘導体化して検出感受性を高めた。脂肪エステルは誘導体化は必要なかった。脂肪アルコール-TMS 誘導体と脂肪エステルとの両方を酢酸エチルなどの適当な 揮発性溶媒に溶解した。
【０３８８】
サンプルを30 m DP-5 キャピラリー カラムで以下の方法を用いて分析した。GC/MS カラムへの1 μL スプリットレス注入の後、オーブンを100℃に3 分間維持した。温度を20℃/分の速度で320℃に上げた。オーブンを320℃でさらに5 分間維持した。キャリアガスであるヘリウムの流速は1.3 mL/分であった。MS 四極子(quadrapole)は50から550 m/zを走査した。生成物ピークの保持時間およびフラグメンテーションパターンを確実な参照と比較してピークの実体を確認した。
【０３８９】
例えば、ヘキサデコン酸 エチルエステルは 10.18 分にて溶出した (図16Aおよび16B)。284 マスユニットの親イオンが容易に観察された。マス断片化の際に生じた娘イオンはより豊富であった。これは80 マスユニットのもっとも優勢な娘イオンを含んでいた。誘導体化脂肪アルコール ヘキサデカノール-TMSは10.29 分に溶出し、313の親イオンが観察できた。もっとも優勢なイオンは299マスユニットのM-14イオンであった。
【０３９０】
定量を様々な 濃度の 適当な確実な参照を注入することにより上記のGC/MS 方法によって行った。この情報を用いて応答 (全統合イオン計数)対 濃度により標準曲線を作成した。
【０３９１】
均等物
本発明の特定の実施例が明示的に本明細書に開示されるが、上記の明細書および実施例は例示的なものであり限定的なものではない。本発明の多くの改変が実施例を含む本明細書を読むと当業者に明らかであろう。本発明の完全な範囲は均等物の完全な範囲と共に実施例および明細書を参照してかかる改変と共に決定されるべきである。
【０３９２】
本出願に記載するすべての刊行物、特許、特許出願およびその他の参考文献は、あたかも各刊行物、特許、特許出願またはその他の参考文献が具体的かつ個別的に引用により組み込まれていることが示されるかのように、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【図１−１】
0005863088.tif 000037
【図１−２】
0005863088.tif 000038
【図１−３】
0005863088.tif 000039
【図１−４】
0005863088.tif 000040
【図１−５】
0005863088.tif 000041
【図１−６】
0005863088.tif 000042
【図１−７】
0005863088.tif 000043
【図１−８】
0005863088.tif 000044
【図１−９】
0005863088.tif 000045
【図１−１０】
0005863088.tif 000046
【図１−１１】
0005863088.tif 000047
【図１−１２】
0005863088.tif 000048
【図１−１３】
0005863088.tif 000049
【図１−１４】
0005863088.tif 000050
【図１−１５】
0005863088.tif 000051
【図１−１６】
0005863088.tif 000052
【図１−１７】
0005863088.tif 000053
【図２】
0005863088.tif 000054
【図３】
0005863088.tif 000055
【図４】
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【図５】
0005863088.tif 000057
【図６】
0005863088.tif 000058
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
0005863088.tif 000063
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
0005863088.tif 000068
【図１７】
0005863088.tif 000069
【図１８−１】
0005863088.tif 000070
【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【配列表】
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