(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）又は（２）に示されるいずれかのアミノ酸配列を含む、GalNAc末端糖鎖と特異的に結合するポリペプチド；
（１）配列番号２に示されたアミノ酸配列、又はそのアミノ酸配列において272位以外の位置で1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列(ただし、273位又は274位以降のアミノ酸配列がすべて欠失している場合を除く)、
（２）(１)に示されるアミノ酸配列のN末端側から30番目までのいずれかのアミノ酸配列が欠失しているアミノ酸配列。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドと共に当該ポリペプチドが二量体化したポリペプチドを含む組成物であって、GalNAc末端糖鎖と共にGal末端糖鎖結合活性を有するポリペプチド組成物。
【請求項３】
請求項１に記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項４】
下記（１）又は（２）に示されるいずれかの塩基配列を含み、GalNAc末端糖鎖と特異的に結合するポリペプチドをコードする核酸；
（１）配列番号１に記載の塩基配列、又はその相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつアミノ酸配列上の272位の位置がCysをコードするコドンである塩基配列（ただし、273位又は274位以降のアミノ酸配列に対応する塩基配列がすべて欠失している場合を除く）、
（２）（１）に示される塩基配列において、N末端側アミノ酸から30番目アミノ酸までのいずれかのアミノ酸配列をコードする塩基配列が欠失している塩基配列。
【請求項５】
請求項３又は４に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項６】
請求項３又は４に記載の核酸を用いて形質転換された、形質転換細胞。
【請求項７】
請求項６に記載の形質転換細胞を培養して得られる培養物から発現産物を採取し、GalNAc末端糖鎖と特異的に結合する単量体ポリペプチドと、Gal/GalNAc末端糖鎖と結合するその二量体ポリペプチドを、両者の混合物として取得する工程を含む、組換えポリペプチドの製造方法。
【請求項８】
さらに単量体と二量体とを分離する工程を含み、GalNAc末端糖鎖と特異的に結合する単量体ポリペプチドと、Gal/GalNAc末端糖鎖と結合するその二量体ポリペプチドとをそれぞれ取得する工程を含む、請求項７に記載の組換えポリペプチドの製造方法。
【請求項９】
下記（１）又は（２）に示されるいずれかのアミノ酸配列を含み、かつ配列番号２の272位に対応するCysがアルキル化されているポリペプチドであって、GalNAc末端糖鎖と特異的に結合するポリペプチド；
（１）配列番号２に示されたアミノ酸配列、又はそのアミノ酸配列において、272位以外の位置で1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列、
（２）（１）に示されたいずれかのアミノ酸配列において、N末端側から30番目までのいずれかのアミノ酸配列が欠失したアミノ酸配列。
【請求項１０】
下記（１）〜（５）に示されるいずれかのアミノ酸配列を含み、LDN糖鎖特異的結合活性を有するポリペプチド；
（１）配列番号２に示されたアミノ酸配列において、272位のアミノ酸がCys以外のアミノ酸であるアミノ酸配列、
（２）（１）に示されたアミノ酸配列において、272位以外の位置で1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列、
（３）配列番号２に示されたアミノ酸配列において、そのC末端側から13〜15番目のいずれかのアミノ酸までが欠失しているアミノ酸配列、
（４）（３）に示されたアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列、
（５）（１）〜（４）に示されたいずれかのアミノ酸配列において、そのN末端側から30番目までのいずれかのアミノ酸配列が欠失しているアミノ酸配列。
【請求項１１】
請求項１０に記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項１２】
下記（１）〜（４）に示されるいずれかの塩基配列を含み、LDN糖鎖特異的結合活性を有するポリペプチドをコードする核酸；
（１）配列番号１に記載の塩基配列において、272位アミノ酸に対応するコドンがCys以外のアミノ酸である塩基配列、
（２）（１）に示された塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつ272位アミノ酸に対応するコドンがCys以外のアミノ酸である塩基配列、
（３）配列番号１に記載の塩基配列において、C末端アミノ酸から13〜15番目のいずれかのアミノ酸に対応するアミノ酸配列をコードする塩基配列が欠失している塩基配列、
（４）（１）〜（３）に示されたいずれかの塩基配列において、N末端アミノ酸から30番目アミノ酸までのいずれかのアミノ酸配列をコードする塩基配列が欠失している塩基配列。
【請求項１３】
請求項１１又は１２に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１４】
請求項１１又は１２に記載の核酸を用いて形質転換された、形質転換細胞。
【請求項１５】
請求項１４に記載の形質転換細胞を培養して得られる培養物から発現産物を採取する工程を含む、LDN糖鎖特異的結合活性を有する組換えポリペプチドの製造方法。
【請求項１６】
請求項２に記載のポリペプチド組成物を含むことを特徴とするGal/GalNAc末端糖鎖を検出するための試薬。
【請求項１７】
請求項１に記載のポリペプチドを単量体の状態で含むか、又は請求項９に記載のポリペプチドを含むことを特徴とする、GalNAc末端糖鎖を特異的に検出するための試薬。
【請求項１８】
請求項１０に記載のポリペプチドを含むことを特徴とする、LDN糖鎖を特異的に検出するための試薬。
【請求項１９】
請求項１８に記載のLDN糖鎖を特異的に検出するための試薬を含む診断用キットであって、LDN糖鎖を高発現することで特徴付けられる疾患への罹患の有無を判定するための診断用キット。
【請求項２０】
LDN糖鎖を高発現する疾患が、内分泌腫瘍又は肺小細胞癌である、請求項１９に記載の診断用キット。
【請求項２１】
請求項２に記載のポリペプチド組成物に対して還元処理を施すことを特徴とする、GalNAc末端糖鎖結合活性の特異性を増大させる方法。
【請求項２２】
下記（１）又は（２）に示されるいずれかのアミノ酸配列のC末端側から13番目のアミノ酸までが欠失しているアミノ酸配列からなる二量体ポリペプチドであって、Gal/GalNAc末端糖鎖結合活性を有するポリペプチドに対し、還元処理を施すことを特徴とする、前記糖鎖結合活性をGalNAc末端糖鎖特異的な結合活性に変更する方法；
（１）配列番号２に示されたアミノ酸配列、又はそのアミノ酸配列において、272位以外の位置で1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列、
（２）（１）に示されたアミノ酸配列において、N末端側から30番目までのいずれかのアミノ酸配列が欠失したアミノ酸配列。
【請求項２３】
下記（１）又は（２）に示されるいずれかのアミノ酸配列をコードする核酸において、272位の位置のCysを他のアミノ酸に置換する変異を導入した核酸、又は前記アミノ酸配列のC末端側から13〜15番目のいずれかのアミノ酸に対応するコドンまでを欠失させた核酸、を用いて形質転換することで、得られる組換えポリペプチドの二量体化を防ぐことを特徴とする、LDN糖鎖特異的な結合活性を有する組換えポリペプチドの製造方法；
（１）配列番号２に示されたアミノ酸配列、又はそのアミノ酸配列において、272位以外の位置で1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列、
（２）（１）に示されたアミノ酸配列において、N末端側から30番目までのいずれかのアミノ酸配列が欠失したアミノ酸配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ノダフジレクチン(Wisteria floribunda aggulutinin，WFA)を、遺伝子工学的に生産する手法を開発した。また、一部のアミノ酸を改変することで、糖鎖認識活性の異なる新規な改変レクチンの作製法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発生や分化の過程において、糖鎖構造は細胞の状態を反映して変化することが知られており、現在広く使われている分化マーカーやがんマーカーの多くは糖鎖を認識しているものが多い。たとえば、発生期の分化マーカーであるStage Specific Embryonic Antigen 1(SSEA1)はルイスX：Galβ1,4GlcNAc(Fucα1,3)-という糖鎖構造に対する抗体であるし、大腸がんマーカーとして臨床医療で用いられているCA19-9のエピトープはシアリルルイスA：SAα2,3Galβ1,3GlcNAc(Fucα1,4)-という糖鎖抗原である。このように細胞表面の糖鎖は、細胞の種類、分化段階を鋭敏に反映しており、バイオマーカーの非常に有効な候補となりやすい。
疾患特異的な糖鎖変化を検出する方法として、抗糖鎖抗体とともに古くから使われてきたのが植物や真菌由来の糖鎖結合タンパク質であるレクチンである。レクチンを用いて、組織切片を染色すると、性格の異なった細胞あるいは分化の異なった細胞などを染め分けることが可能であるが、レクチンの糖鎖認識特異性は厳密ではないため、どんな糖鎖構造が変化しているかを特定することはできない。植物レクチンの１つであるノダフジレクチン(Wisteria floribunda agglutinin，WFA)はマメ科レクチンに属するレクチンで、N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)残基を含む糖鎖を認識することが知られているが、詳細な特異性は明らかになっていない。それにも関わらず、WFAのユニークな糖鎖認識特異性は様々な生物学的分野でマーカーとして用いられている。例えば、脳神経分野においては、WFAはペリニューロナルネットワーク(PNN)を染色する古典的なマーカーとして知られているし(非特許文献１)、胃においては正常な腺窩上皮細胞を染色する(非特許文献２)。前立腺癌と前立腺肥大症とを鑑別するための鑑別法にも用いられている(特許文献１)。また、最近は診断に用いるバイオマーカーとしての有効性がクローズアップされており、WFA陽性のMUC1は肝内胆管がんの胆汁診断マーカーとなることが報告されている(特許文献２，非特許文献３)。
ノダフジ種子からのレクチンの単離は1970年代に複数のグループから報告されている(表１)。【０００３】
【表１】
0006011985.tif 000002
【０００４】
Toyoshimaらは分子量の異なる２種類の糖タンパク質レクチン(WFMとWFH)の単離と生化学的な解析を報告している。単量体の分子量がおよそ32KDaで、67KDaの2量体を形成するWisteria floribunda Mitogen(WFM)は赤血球凝集活性とphytogen活性を有する(非特許文献４)が、35KDa単量体の4量体である136KDaのWisteria floribunda hemaggulutinin(WFH)は、Mitogen活性は有さないが、WFMより強い赤血球凝集活性と白血球凝集活性を持っている(非特許文献５)。一方、Kurokawaが精製したレクチンは、２つの32KDaサブユニットがS-S結合した68KDaの糖タンパク質であり、GalNAcによって阻害される赤血球凝集活性を有する(非特許文献６)。これらの２つのグループはそれぞれタンパク質の古典的な生化学的分離手法によりレクチン精製したが、Poretzらのグループはpolyleucyl hog gastric mucinへのアフィニティにより、赤血球凝集活性を持つ28KDa単量体どうしのS-S結合によるホモ2量体レクチン(非特許文献７)とMitogen活性を持つレクチン(32KDaの単量体による66KDaの2量体)を単離している(非特許文献８)。これらのこれまでに報告されたノダフジ種子由来レクチンは、GalNAc認識などの性質は似ている部分があるが、アミノ酸組成、糖組成や分子量等に微妙な違いがあり、同一の分子か異なる分子かは判断が難しいのが現状である。
WFAの生物学的重要性は近年増してきているが、WFAの糖鎖認識の詳細は未だ未解明なままであり、上記のニューロンと胃におけるWFAが認識する糖鎖構造が同じかどうかさえわかっていない。また、その生産についても、Vector Laboratory社やEY Laboratory社より試薬として販売されているWFAは天然のノダフジ種子から精製しており、安定的な供給や精製ロット間の均一性を管理するためには遺伝子工学的手法によるリコンビナントレクチン生産へのシフトが求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２０１０／０９０２６４
【特許文献２】国際公開ＷＯ２０１０／１００８６２
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Hartig，W.，Brauer，K.，and Bruckner，G. (1992) Neuroreport 3(10)，869-872
【非特許文献２】Ikehara，Y.，Sato，T.，Niwa，T.，Nakamura，S.，Gotoh，M.，Ikehara，S. K.，Kiyohara，K.，Aoki，C.，Iwai，T.，Nakanishi，H.，Hirabayashi，J.，Tatematsu，M.，and Narimatsu，H. (2006) Glycobiology 16(9)，777-785
【非特許文献３】Matsuda，A.，Kuno，A.，Kawamoto，T.，Matsuzaki，H.，Irimura，T.，Ikehara，Y.，Zen，Y.，Nakanuma，Y.，Yamamoto，M.，Ohkohchi，N.，Shoda，J.，Hirabayashi，J.，and Narimatsu，H. (2010) Hepatology 52(1)，174-182
【非特許文献４】Toyoshima，S.，Akiyama，Y.，Nakano，K.，Tonomura，A.，and Osawa，T. (1971) Biochemistry 10(24)，4457-4463
【非特許文献５】Toyoshima，S.，and Osawa，T. (1975) J Biol Chem 250(5)，1655-1660
【非特許文献６】Kurokawa，T.，Tsuda，M.，and Sugino，Y. (1976) J Biol Chem 251(18)，5686-5693
【非特許文献７】Cheung，G.，Haratz，A.，Katar，M.，Skrokov，R.，and Poretz，R. D. (1979) Biochemistry 18(9)，1646-1650
【非特許文献８】Kaladas，P. M.，and Poretz，R. D. (1979) Biochemistry 18(22)，4806-4812
【非特許文献９】Naito，S.，Hirai，M. Y.，Chino，M.，and Komeda，Y. (1994) Plant Physiol 104(2)，497-503
【非特許文献１０】Tateno，H.，Mori，A.，Uchiyama，N.，Yabe，R.，Iwaki，J.，Shikanai，T.，Angata，T.，Narimatsu，H.，and Hirabayashi，J. (2008) Glycobiology 18(10)，789-798
【非特許文献１１】Emanuelsson，O.，Brunak，S.，von Heijne，G.，and Nielsen，H. (2007) Nat Protoc 2(4)，953-971
【非特許文献１２】Young，N. M.，Johnston，R. A.，and Watson，D. C. (1991) Eur J Biochem 196(3)，631-637
【非特許文献１３】Adar，R.，Streicher，H.，Rozenblatt，S.，and Sharon，N. (1997) Eur J Biochem 249(3)，684-689
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、生物学的重要性が高いノダフジ種子由来レクチンWFAの糖鎖認識の詳細の解明と共に、その安定的な供給、精製ロット間の均一性を達成することを目的とする。そのために、遺伝子工学的手法によるリコンビナントレクチンを提供するものであり、さらに、当該リコンビナントレクチンを改変することにより、認識対象の糖鎖が変更されたＷＦＡ改変体を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ノダフジレクチンをコードする遺伝子をノダフジ種子由来のcDNAよりクローニングし、大腸菌にてリコンビナントレクチンを発現させることに成功した。リコンビナントWFA(rWFA)の糖鎖結合活性を解析した結果、市販のものと同様のレクチン活性を有することが確認できた。また、2量体である天然型WFA(nWFA)を還元剤処理により単量体にすると、糖鎖認識特異性が変化し、GalNAc末端糖鎖を認識するレクチンになることを見出した。さらには、2量体形成に寄与するシステイン残基に変異を導入したrWFAはLDN(GalNAcβ1,4GlcNAc)糖鎖を特異的に認識することを見出した。
以上の知見を得たことで、本発明を完成した。【０００９】
すなわち、本発明は以下の発明を含むものである。
〔１〕  下記(１)又は(２)に示されるいずれかのアミノ酸配列を含み、かつGal/GalNAc末端糖鎖結合活性又はGalNAc末端糖鎖結合活性を有するポリペプチド；
（１）配列番号２に示されたアミノ酸配列、又はそのアミノ酸配列において272位以外の位置で１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列(ただし、273位又は274位以降のアミノ酸配列がすべて欠失している場合を除く)、
（２）(１)に示されるアミノ酸配列のN末端側から30番目までのいずれかのアミノ酸配列が欠失しているアミノ酸配列。
〔２〕  前記〔１〕に記載の(１)又は(２)に示されたいずれかのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、Gal/GalNAc末端糖鎖結合活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
〔３〕  下記(１)又は(２)に示されるいずれかの塩基配列を含み、Gal/GalNAc末端糖鎖結合活性を有するポリペプチドをコードする核酸；
（１）配列番号１に記載の塩基配列、又はその相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつアミノ酸配列上の272位の位置がCysをコードするコドンである塩基配列(ただし、273位又は274位以降のアミノ酸配列に対応する塩基配列がすべて欠失している場合を除く)
（２）(１)に示される塩基配列において、アミノ酸配列のN末端側から30番目までのいずれかのアミノ酸配列に対応する塩基配列が欠失している塩基配列。
〔４〕  下記(１)〜(６)のいずれかのアミノ酸配列を含み、かつGalNAc末端糖鎖を特異的に認識するポリペプチド；
（１）配列番号２に示されたアミノ酸配列において、272位のアミノ酸がCys以外のアミノ酸であるアミノ酸配列、
（２）(１)に示されたアミノ酸配列において、272位以外の位置で１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列、
（３）配列番号２に示されたアミノ酸配列において、そのC末端側から13〜15番目のいずれかのアミノ酸までが欠失しているアミノ酸配列、
（４）(３)に示されたアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列、
（５）配列番号２に示されたアミノ酸配列の272位がアルキル化されたCysであるアミノ酸配列、又はそのアミノ酸配列において、272位以外の位置で１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列、
（６）(１)〜(５)に示されたいずれかのアミノ酸配列において、N末端側から30番目までのいずれかのアミノ酸配列が欠失したアミノ酸配列。
〔５〕  下記(１)〜(５)に示されるいずれかのアミノ酸配列を含み、かつGalNAc末端糖鎖のうちでも特にLDN特異的糖鎖認識能を有するポリペプチド；
（１）配列番号２に示されたアミノ酸配列において、272位のアミノ酸がCys以外のアミノ酸であるアミノ酸配列、
（２）(１)に示されたアミノ酸配列において、272位以外の位置で１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列、
（３）配列番号２に示されたアミノ酸配列において、そのC末端側から13〜15番目のいずれかのアミノ酸までが欠失しているアミノ酸配列、
（４）(３)に示されたアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列、
（５）(１)〜(４)に示されたいずれかのアミノ酸配列において、そのN末端側から30番目までのいずれかのアミノ酸配列が欠失しているアミノ酸配列。
〔６〕  前記〔５〕に記載の(１)〜(５)のいずれかのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、LDN糖鎖を特異的に認識するポリペプチドをコードする核酸。
〔７〕  下記(１)〜(４)に示されるいずれかの塩基配列を含み、LDN糖鎖を特異的に認識するポリペプチドをコードする核酸；
（１）配列番号１に記載の塩基配列において、272位アミノ酸に対応するコドンがCys以外のアミノ酸である塩基配列、
（２）(１)に示された塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつ272位アミノ酸に対応するコドンがCys以外のアミノ酸である塩基配列、
（３）配列番号１に記載の塩基配列において、3’末端側からC末端側13〜15番目までのいずれかのアミノ酸に対応する塩基配列が欠失している塩基配列、
（４）(１)〜(３)に示されたいずれかの塩基配列において、5’側からN末端アミノ酸〜30番目アミノ酸までのいずれかのアミノ酸配列に対応する塩基配列が欠失している塩基配列。
〔８〕  前記〔２〕,〔３〕,〔６〕又は〔７〕に記載の核酸を含む発現ベクター。
〔９〕  前記〔２〕,〔３〕,〔６〕又は〔７〕に記載の核酸を用いて形質転換された、形質転換細胞。
〔１０〕  前記〔９〕に記載の形質転換細胞を培養して得られる培養物から採取することを特徴とする、Gal/GalNAc末端糖鎖結合活性、GalNAc末端糖鎖結合活性又はLDN糖鎖特異的結合活性を有するポリペプチドの製造方法。
〔１１〕  前記〔１〕又は〔４〕に記載のポリペプチドを含むことを特徴とするGal/GalNAc末端糖鎖，又はGalNAc末端糖鎖を特異的に検出するための試薬。
〔１２〕  前記〔５〕に記載のポリペプチドを含むことを特徴とする、LDN糖鎖を特異的に検出するための試薬。
〔１３〕  2量体を形成し、かつGal/GalNAc末端糖鎖結合活性を有する下記(１)又は(２)に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを還元処理し、次いで前記アミノ酸配列中のCysをアルキル化することを特徴とする、前記糖鎖結合活性をGalNAc末端糖鎖特異的な結合活性に変更する方法；
（１）配列番号２に示されたアミノ酸配列、又はそのアミノ酸配列において、272位以外の位置で１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列、
（２）(１)に示されたアミノ酸配列において、N末端側から30番目までのいずれかのアミノ酸配列が欠失したアミノ酸配列。
〔１４〕  2量体を形成し、かつGal/GalNAc末端糖鎖結合活性を有する下記(１)又は(２)に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの272位の位置のCysを他のアミノ酸に置換するか、又は前記アミノ酸配列のC末端側から13〜15番目までのいずれかのアミノ酸を欠失させることを特徴とする、前記糖鎖結合活性をLDN糖鎖特異的な結合活性に変更する方法；
（１）配列番号２に示されたアミノ酸配列、又はそのアミノ酸配列において、272位以外の位置で１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列、
（２）(１)に示されたアミノ酸配列において、N末端側から30番目までのいずれかのアミノ酸配列が欠失したアミノ酸配列。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、リコンビナントWFA(rWFA)が提供できたことで、天然WFAと同様の、末端GalNAc残基及びGal残基に対する糖鎖結合活性を有する、品質の安定したWFAレクチンを、形質転換細胞により大量生産可能になった。
また、本発明により提供された天然WFAの還元によるWFA単量体は、Gal残基を認識せず、GalNAc残基のみを特異的に認識するWFAレクチンであり、同リコンビナントWFA(rWFA)のシステイン改変によるWFA単量体は、末端GalNAc残基を有する糖鎖のうちでも、LDN(GalNAcβ1,4GlcNAc)糖鎖のみを特異的に認識するWFAレクチンである。このように、本発明においては、極めて有用性の高い糖鎖認識性を改変したWFAレクチンを提供することができた。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ノダフジレクチン(WFA)遺伝子の塩基配列及び推定アミノ酸配列N末端30アミノ酸はシグナル配列であることが予想される。146番目のアスパラギン(N)にはN-結合型糖鎖が付加することが予想される。C末端13アミノ酸は切断される可能性が考えられる。
【図２】マメ科植物レクチンのアミノ酸配列アラインメント
【図３】大腸菌でのリコンビナントWFA(rWFA)の発現（Ａ）rWFA及びC272A改変体の大腸菌発現用プラスミドの構築   N-末端のシグナル配列をHisx6 + FLAG配列に置き換え、pelB leader(ペリプラズムへの分泌シグナル)の下流に遺伝子を挿入した。大腸菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIPLに導入し、形質転換体を得た。（Ｂ）抗FLAG抗体によるリコンビナントタンパク質の発現の確認  その結果、リコンビナントタンパク質はペリプラズム画分以外に、培地にもリークして存在することがわかった。（Ｃ）抗FLAG抗体カラムを用いたリコンビナントタンパク質の培養上清からの精製  還元条件のSDS-PAGEでは、rWFAは31KDaに単一バンド(lane2)。市販のWFA(nWFA)は28KDaの単一バンドが観察された(lane1)。  非還元条件ではnWFAは約60KDaの単一のバンド(lane4)が、rWFAは2量体と単量体がおよそ半分ずつ存在することが確認された(lane5)。  一方、変異体(C272A)は還元、非還元条件ともに単量体の大きさに単一バンドが確認され、2量体を形成しないことが確認された。このことから、272位のCysが2量体の形成に必須であることが明らかとなった。
【図４】糖タンパク質アレイを用いた天然型WFAとリコンビナントWFAの糖鎖結合活性の比較（Ａ）糖タンパク質アレイ上のCy3ラベルnWFA及びrWFA（Ｂ）nWFA及びrWFAの糖鎖認識特異性の検証  その結果、nWFAとrWFAは非常に類似の糖鎖認識特異性を示した。両方ともに最も強いシグナルを示したのはAsialo-BSM(bovine submaxillary mucin)であり、GalNAc末端(A-di，βGalNAc，di-GalNAcβ，LDN，GA2，Tn，Forssman)の糖鎖と共に、Gal末端(asialo-AGPやasialo-TF)などにも結合性を示した。
【図５】C末端13アミノ酸を削除したリコンビナントWFAの発現（Ａ）C末端13アミノ酸を削除したリコンビナントWFA発現用プラスミドの構築  C末端13アミノ酸を削除したものと共に、N末端あるいはC末端にFLAG tagを付加したrWFA発現用プラスミドを構築した。（Ｂ）クマシーブリリアントブルー(CBB)染色によるタンパク質の検出結果  13アミノ酸を除いたものは2量体をほとんど形成できなかった。2量体はCBB染色では検出できなかった。
【図６】GPアレイによる糖鎖結合特異性解析GPアレイの結果、新たに大腸菌で作製した単量体rWFAはどれもLDN糖鎖を特異的に認識するレクチンであった。
【図７】単量体nWFAの糖鎖結合活性解析（Ａ）還元によるnWFA単量体の作製  2量体形成に寄与するS-S結合を還元し、アルキル化することにより単量体nWFAを作成した。非還元条件でのSDS-PAGEにより単量体であることを確認した。（Ｂ）糖鎖結合活性解析単量体化したnWFAはGalに対する特異性が消失し、GalNAc末端糖鎖を特異的に認識することが確認された。
【図８】天然WFAのアミノ酸解析
【図９】天然WFAとrWFAに対する各種レクチンによる染色  フコースを認識するAleuria Aurantia Lectin(AAL)レクチンを用いたレクチンブロットの結果、nWFAはAALに反応する糖鎖を含む糖タンパク質であることが確認できた。
【図１０】Glycan arrayの例
【図１１】Glycan array上の糖鎖の種類例
【図１２】形質転換動物細胞により産生された精製C272A改変rWFA(含N-糖鎖)（Ａ）SDS-PAGEにより単量体発現の確認(糖鎖の影響により分子量の増加)（Ｂ）GPアレイによる糖鎖結合特異性解析
【図１３】形質転換動物細胞及び形質転換酵母により産生された精製C272A、N146Q改変rWFA(不含N-糖鎖)（Ａ）SDS-PAGEにより単量体発現の確認（Ｂ）GPアレイによる糖鎖結合特異性解析
【発明を実施するための形態】
【００１２】
１．本発明のノダフジレクチン(WFA)及びそのリコンビナント改変体
１−１．本発明においてクローニングしたノダフジ種子由来レクチン及びリコンビナントレクチン
本発明において、我々は古くから組織マーカーとして用いられてきたノダフジ種子由来レクチンの遺伝子クローニングとリコンビナントレクチンの作製に成功した。
クローニングした遺伝子は286アミノ酸からなる新規タンパク質をコードしていた(図１，配列番号１，２)が、N-末端のシグナル配列やC-末端のプロセシングされる可能性がある領域を除いた成熟型レクチン領域(aa31-273)の予想分子量は26.6KDaであった。種子中では１本のN-glycanが付加されている可能性が考えられるため、その予想分子量およそ1.3KDaを加えると、27.9KDaとなり、市販のWFAレクチンの分子量とよく一致する。また、市販のWFAのLC/MS法によるショットガン・ペプチド配列分析の結果からも、今回クローニングしたレクチンはほぼ市販のWFAと同一であったが、天然物から精製した市販のWFAと比較してみると、C末端に13アミノ酸が付加されたポリペプチドであった。ピーナッツレクチン(Peanut Agglutinin，PNA)などの他のマメ科レクチンでもC末端がプロセスされる例が報告されていること(非特許文献１２)からみて、天然WFAでは、C末端13アミノ酸がプロセッシングされていると考えられる。
すなわち、本発明においては、天然WFAにおけるC末端側アミノ酸のプロセッシング前の「前駆体WFA」ともいうべき新規なリコンビナントWFA(rWFA)を提供するものである。本発明において、「rWFA」というとき、天然WFAと比較して、C末端側に13アミノ酸が付加されており、さらにシグナル配列であるN末端20アミノ酸が付加された、もしくは付加されていない「リコンビナントWFA」を指す。
今回クローニングしたWFAレクチンは、これまでにKurokawa(非特許文献６)やCheung(非特許文献７)らが報告したレクチンと分子量、アミノ酸組成ともに似ているが、Toyoshimaらにより精製が報告されたノダフジレクチンWFH(非特許文献５)とは分子量とアミノ酸組成が完全には一致しない。これらの違いは、分析法の違いによるものかも知れないし、ノダフジ種子にはさらに多くのレクチンやmitogenが存在している可能性も考えられる。
【００１３】
１−２．リコンビナントレクチン及びその改変体の2量体能
今回、大腸菌で発現させたrWFAは天然型WFA(nWFA)とは、糖鎖を有さず、少なくともC末端側に13アミノ酸を有している前駆体であるが、天然WFAとは同じ糖鎖認識活性を持つことが明らかになった。天然型WFAは１本のN-glycanを持っていることが予想されており、アミノ酸配列からみて、唯一のN-glycan(N型糖鎖)結合位置は146位のアスパラギン(N)である。しかし、糖鎖を持たないrWFAが活性を有したことから、この糖鎖は活性には必要ないと考えられる。マメ科レクチンファミリーに属するSoybean agglutinin (SBA)において、N-glycanの付加が活性や多量体形成に寄与しないことが報告されており(非特許文献１３)、WFAにおいても同様の傾向が確認された。nWFAはジスルフィド結合で2量体を形成するが、今回アミノ酸配列を決定したことにより、272番目の唯一のシステインがジスルフィド結合の形成に寄与している可能性が強く考えられた。WFAを大腸菌のペリプラズムに発現させた場合、培地から精製したrWFAのおよそ半分は2量体を形成できたが、システインのアラニンへの改変体であるC272Aは2量体を形成できなかったことからこの可能性が正しいと思われる。タンパク質の成熟過程においてC末端の13アミノ酸がプロセシングされると仮定すると、成熟型nWFAタンパク質はほぼC末端で2量体を形成していることになる。我々はさらにC末端の13アミノ酸を予め除いたリコンビナントレクチンの発現も試みたが、それらの発現量は13アミノ酸を含むものと変わらなかったにも関わらず、ほとんど2量体を形成することはできなかった。これらのことから、WFAタンパク質の成熟過程においては2量体を形成した後にC末端のプロセシングが起こると考えられる。
また、SBAやPNAなど同様にマメ科に属するレクチン配列中にはシステインを含んでいないにも関わらず、大腸菌で発現した際に非共有結合により多量体を形成できるが、WFAの場合にはシステインを含んでおり、ジスルフィド結合を形成できる点が上記レクチンと異なっている。Sophora Japonica agglutinin(SJA)の配列中にもWFAと近い位置にシステインが存在しており(図２)、このシステインが同様に2量体形成に寄与する可能性が示唆される。
【００１４】
１−３．WFAの単量体化及びリコンビナントレクチン改変体における糖鎖結合特異性
今回、大腸菌でrWFAを発現・精製し、Glycan arrayを用いて糖鎖結合特異性を調べた結果、rWFAは天然のものと同様にGal/GalNAcに対する糖鎖結合特異性を示した。しかしながら、2量体の形成に寄与する272番目システイン残基の改変体であるC272Aや2量体であるnWFAを還元アルキル化して単量体にしたnWFA-RCAは、糖鎖結合特異性が変化したことから、天然由来WFAのGal/GalNAc認識にはシステインを介した2量体形成が重要であると思われる。一方、nWFAの単量体であるnWFA-RCAはGalNAc末端の糖鎖を特異的に認識し、それ以外のGal末端の糖鎖は認識しなかった。単量体と2量体ではGalNAcに対する結合活性が変わらないことはKurokawaらによって報告されていたが(非特許文献６)、今回の結果ではGalNAcのみならず、末端にGalNAcを含む糖鎖全般に対しても、認識活性が変わらないことが明らかとなった。システイン残基は成熟型WFAのほぼC末端に存在しているので、レクチンの糖鎖結合ポケットの形成に関係していないと予想されるが、2量体を形成することでGal末端糖鎖結合活性が生じたことになる。nWFAがGalNAcとGalを同じポケットで認識しているのか、2量体を形成することでGalを認識するため新たな糖鎖認識部位が生じているのかは解らないが、結晶化してＸ線構造解析により構造が解ければ、糖鎖結合の分子メカニズムが明らかになるかもしれない。
また、rWFA C272Aは驚くべきことに非常に限定した糖鎖結合活性、つまりLDN特異的認識能を有していた。(図３Ｃ)に示すように、rWFAは培地から精製した場合は、およそ半分はシステイン残基を介して2量体を形成し、nWFAと同様にGal/GalNAc結合活性を示した。rWFA C272Aのシステイン残基の改変は糖鎖結合ポケットに影響するのではなく、タンパク質の合成過程において、2量体を形成しないことにより、ポケット以外の構造や安定性に影響を与えている可能性もある。
【００１５】
今回、WFAレクチンをコードする遺伝子を単離し、アミノ酸配列を改変したリコンビナントWFAを遺伝子工学的に作製した結果、WFAの複数の糖鎖結合特異性がLDNに収束することを見出した。これはレクチンの欠点の１つである幅広い糖鎖認識特異性を遺伝子改変により解決できる可能性があることを示すものである。今後はこれらを鋳型に用いた進化工学的な手法を用いることで、認識特異性をも変えることができる可能性があり、今後、各種疾患の診断バイオマーカーや、組織、細胞のマーカーとして有用な改変レクチンの開発が期待できる。
【００１６】
２．本発明のWFA遺伝子及びその発現産物について
本発明において提供された新規リコンビナントWFA（rWFA）は、下記（１）又は（２）に示されるいずれかのアミノ酸配列を含み、かつGal末端糖鎖と共にGalNAc末端糖鎖に対する結合活性（以下、Gal/GalNAc末端糖鎖結合活性という。）を有するか、又はGalNAc末端糖鎖結合活性を有するポリペプチドとして表現できる。ここで、2量体を形成したrWFAは、Gal/GalNAc末端糖鎖結合活性を有し、単量体のrWFAはGalNAc末端糖鎖のうちでもLDN特異的な結合活性を有する。
（１）配列番号２に示されたアミノ酸配列、又はそのアミノ酸配列において272位以外の位置で１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列（ただし、273位又は274位以降のアミノ酸配列がすべて欠失している場合を除く）、
（２）（１）に示されるアミノ酸配列のN末端側から30番目までのいずれかのアミノ酸配列が欠失しているアミノ酸配列。
なお、数個とは、1〜20個を指し、好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜5個を意味する。
したがって、rWFA遺伝子の塩基配列は、上記（１）又は（２）に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列であるといえるが、その塩基配列は、下記の（３）又は（４）で表現することもできる。
（３）配列番号１に記載の塩基配列、又はその相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつアミノ酸配列上の272位の位置がCysをコードするコドンである塩基配列（ただし、273位又は274位以降のアミノ酸配列に対応する塩基配列がすべて欠失している場合を除く）、
（４）（３）に示される塩基配列において、アミノ酸配列のN末端側から30番目までのいずれかのアミノ酸配列に対応する塩基配列が欠失している塩基配列。
なお、ストリンジェントな条件というとき、一般的なハイブリダイズ法において、90％以上、好ましくは95％以上の同一性のある配列がハイブリダイズできる緊縮条件を意味する。
本発明のWFA遺伝子を発現するための発現ベクターの構築に際して、特に分泌シグナルは不要であるが、発現産物の精製のためには、培地中に分泌させて、培地を精製する方が簡便かつ効率的であるため、分泌シグナルを付加することが好ましい。
本発明のリコンビナントWFAを製造するための形質転換宿主としては、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞又は酵母など真核細胞を用いることもできるが、天然体が本来有しているフコース含有糖鎖は、WFAレクチンの糖鎖認識能には関与していないため、大腸菌などの原核細胞宿主が好ましい。
得られたリコンビナントWFAに対しては、通常の精製方法が適用でき、例えば、通常のタグを用いた精製、又は糖鎖リガンドに対するアフィニティーカラムなどを用いて精製することができる。
本発明で得られたリコンビナントWFA（rWFA）は、天然WFAと同様の2量体と共に単量体をほぼ同量形成する。2量体化したrWFAは、天然WFAとほぼ同等の広範な糖鎖認識能を示すが、単量体の状態のrWFAは、後述のリコンビナントWFA改変体と同様に、LDN特異的糖鎖認識能を有する。当該rWFA単量体は、ゲル濾過等の手法で2量体から分離することができる。
【００１７】
３．本発明におけるLDN特異的糖鎖認識能を有するリコンビナントWFA改変体
（３−１）rWFAの272位Cysへの変異導入によるリコンビナントWFA改変体（C272rWFA）
本発明において、「LDN特異的糖鎖認識能」というとき、Gal末端糖鎖は認識せず、さらにGalNAc末端糖鎖のうちでも、GalNAcβ1,4GlcNAc糖鎖を有する場合のみを認識する糖鎖認識能を意味する。具体的には、正常の胃上皮細胞などに発現することが知られるLDN糖鎖マーカーが検出できる。
本発明において、開発されたLDN特異性を有するリコンビナントWFA改変体のうち、272位Cysへの変異導入によるリコンビナントWFA改変体（C272改変ｒWFA）は、272位のCysが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有することで、2量体を形成できず、その結果がLDN特異的糖鎖認識能を獲得したWFAレクチンであり、以下のように表現できる。
下記（１）〜（３）に示されるいずれかのアミノ酸配列を含み、かつLDN特異的糖鎖認識能を有するポリペプチド；
（１）配列番号２に示されたアミノ酸配列において、272位のアミノ酸がCys以外のアミノ酸であるアミノ酸配列、
（２）（１）に示されたアミノ酸配列において、272位以外の位置で１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列、
（３）（１）又は（２）に示されたアミノ酸配列において、そのN末端側から30番目までのいずれかのアミノ酸配列が欠失しているアミノ酸配列。
なお、数個とは、1〜20個を指し、好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜5個を意味する。
また、（１）のアミノ酸配列において、272位のアミノ酸としては、Cys以外のアミノ酸であればいずれのアミノ酸であっても良いが、Ala又はGlyなどの反応基を持たないアミノ酸が好ましく、特にAlaが好ましい。
また、当該リコンビナントWFA改変体遺伝子（C272rWFA遺伝子）は、上記（１）〜（３）に示されたアミノ酸配列をコードする塩基配列であるといえるが、その塩基配列は、下記の（４）〜（６）のいずれかの塩基配列として表現することもできる。
（４）配列番号１に記載の塩基配列において、272位アミノ酸に対応するコドンがCys以外のアミノ酸である塩基配列、
（５）（４）に示された塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつ272位アミノ酸に対応するコドンがCys以外のアミノ酸である塩基配列、
（６）（４）又は（５）に示された塩基配列において、5’側からN末端アミノ酸〜30番目アミノ酸までのいずれかのアミノ酸に対応する塩基配列が欠失している塩基配列。
なお、ストリンジェントな条件というとき、一般的なハイブリダイズ法において、90％以上、好ましくは95％以上の同一性のある配列がハイブリダイズできる緊縮条件を意味する。
また、本発明では、リコンビナントWFA改変体（C272改変rWFA）において、さらにN型糖鎖結合位置の146位アスパラギンをグルタミンに変異（N146Q）させたC272，N146Q改変rWFAのリコンビナントWFA改変体も作製している。当該改変体は、宿主として大腸菌などの細菌以外の酵母、哺乳動物細胞を用いた場合でも糖鎖を持たないことと共に、大腸菌で発現されたリコンビナントWFA改変体（C272改変rWFA）の場合と同一の「LDN特異的糖鎖認識能」を有していることが確認された。
【００１８】
（３−２）C末端側欠失によるリコンビナントWFA改変体(rWFA delta)
2量体リコンビナントWFAのC末側の部分アミノ酸配列を欠失させることによっても、C272の位置での2量体形成ができなくなり、単量体化できる。その単量体の糖鎖認識能はC272 rWFAと同様であって、LDN糖鎖特異性を示す。天然WFAは、リコンビナントWFAのC末側の13番目以降のアミノ酸配列(275〜293位)を有していないにもかかわらず、272位のCysの位置でS-S結合による2量体を形成している。このことから、天然WFAではタンパク質が生合成され、2量体形成後に、275以下の13アミノ酸部分が切断されると推定できる。一方、予めC末端から13番目までのアミノ酸を欠失させたリコンビナントWFAの場合に、15番目の位置に相当する272 Cysでの2量体形成能を失って単量体化され、かつC272rWFAと同等のLDN糖鎖特異性を獲得することが確認されている(図３)。このことは、272位のCys及びその近傍のアミノ酸配列が除去されていれば、同様のLDN糖鎖特異性を有する単量体が形成できると考えられる。すなわち、C末端側から13〜15番目までのアミノ酸を欠失させたリコンビナントWFA改変体であれば、C272 rWFAと同様のLDN糖鎖特異性を示す単量体を形成するリコンビナントWFA改変体であるといえる。
本発明では、このようなC末側アミノ酸配列欠失リコンビナントWFAを、C末側欠失リコンビナントWFA改変体、又は「rWFA delta」と呼ぶこともある。
「rWFA delta」は、以下のように表現できる。
下記(１)又は(２)に示されるいずれかのアミノ酸配列を含み、かつLDN特異的糖鎖認識能を有するポリペプチド；
（１）配列番号２に示されたアミノ酸配列において、そのC末端側から13〜15番目のいずれかのアミノ酸までが欠失しているアミノ酸配列、
（２）(１)に示されたアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列。
「rWFA delta」遺伝子は、上記(１)又は(２)に示されたアミノ酸配列をコードする塩基配列であるといえるが、その塩基配列は、下記の(３)〜(６)のいずれかの塩基配列として表現することもできる。
（３）配列番号１に記載の塩基配列において3’末端側からC末端から13〜15番目のいずれかのアミノ酸までに対応する塩基配列が欠失している塩基配列、
（４）(３)に示された塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列。
【００１９】
（３−３）リコンビナントWFA改変体遺伝子の発現
本発明のリコンビナントWFA改変体遺伝子(C272rWFA遺伝子又はrWFA delta遺伝子)を含むベクターを構築する際に、C272rWFA又はrWFA deltaを検出しやすくするために、上流側又は下流側にFLAGtagなどの検出用タグを結合してもよい。これらタグの結合によっても、そのLDN特異的糖鎖認識能は変わらない。
本発明のリコンビナントWFA改変体(C272rWFA又はrWFA delta)発現のための、宿主及び発現ベクターはリコンビナントWFAと同様であり、その精製方法も同様である。
【００２０】
４．本発明における還元WFA単量体について
本発明において「還元WFA単量体」というとき、2量体のリコンビナントWFA、又は天然WFAに対して、還元後システイン残基をアルキル化処理することで、単量体化されたWFAを指す。
その際の還元方法、及びアルキル化方法は既知の手法を順次、もしくは同時に適用することが可能である。典型的には、ジチオスレイトール(DTT)を用いた還元処理後にヨードアセトアミドなどのアルキル化剤と反応させる手法が適用できる。
いずれの還元WFA単量体も、Gal末端糖鎖に対する糖鎖認識能が失われ、GalNAc末端糖鎖のみを特異的に認識するようになる。
すなわち、本発明のGalNAc末端糖鎖を特異的認識するWFA単量体レクチンの製造法は、以下のように表現できる。
下記(１)又は(２)に示されるアミノ酸配列をコードする、Gal/GalNAc末端糖鎖結合活性を有するポリペプチドの2量体を、還元条件下でインキュベートし、同時に硫黄含有官能基のアルキル化処理を施すことを特徴とする、GalNAc末端糖鎖を特異的認識するWFA単量体レクチンの製造方法;
（１）配列番号２に示されたアミノ酸配列、又はそのアミノ酸配列において、272位以外の位置で１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列、
（２）(１)に示されたアミノ酸配列において、N末端側から30番目までのいずれかのアミノ酸配列が欠失したアミノ酸配列。
このような、GalNAc末端糖鎖を特異的認識する「WFA単量体レクチン」も本発明ではじめて提供されたものである。
【００２１】
５．LDN糖鎖マーカーの検出法及びそのためのキット
本発明において提供された各種リコンビナントWFAは、いずれもGal/GalNAc又はGalNAc糖鎖マーカー検出用レクチンとして有用であり、従来の天然WFAを用いて行われていたLDN糖鎖マーカー検出法にも用いることができる。
天然WFAの前駆体WFAといえるrWFAは、天然WFAと同等の糖鎖認識能を保持しており、しかも形質転換大腸菌などからWFA遺伝子発現産物として大量生産できるため、従来のGal/GalNAc末端糖鎖検出のために、天然WFAの代替物として用いることができる。当該rWFAをゲル濾過などで分離して得られる単量体rWFAは、LDN糖鎖を特異的に認識する。
また、本発明のGalNAc末端糖鎖を特異的認識するWFA単量体レクチン及び、さらにGalNAc末端糖鎖のうちでも特にLDN糖鎖のみを特異的に認識することができるC272改変体WFAは、C末側の単量体rWFAと同様、従来の天然WFAを用いて行われていた正常胃粘膜部位の検出のためのLDN糖鎖マーカー検出法に用いる場合に、より高い特異性が発揮できる。
具体的には、LDN糖鎖の高発現が予想される、内分泌腫瘍や肺小細胞癌などを検出するためのプローブとして用いることが考えられる。
【実施例】
【００２２】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は特にこれら実施例に限定されるものではない。
なお、本発明で使用されている技術的用語は、別途定義されていない限り、当業者により普通に理解されている意味を持つ。また、本発明で引用した先行文献又は特許出願明細書の記載内容は、本明細書の記載として組み入れるものとする。【００２３】
（実施例で用いた試薬）
精製ノダフジレクチン(nWFA)は、Vector Lab Inc.(Burlingame,CA,USA)より購入した。抗FLAG-tag M2-HRP conjugateは、Sigma-Aldrich社(St.Louis,MO,USA)より購入した。【００２４】
（実施例１）ノダフジレクチン遺伝子のクローニング
（１−１）cDNAライブラリーの調製
ノダフジ種子のtotal RNAは内藤らの方法を用いて抽出した(非特許文献９)。およそ150mgの種子を液体窒素中で破砕し、種子破砕物は抽出バッファー(1M Tris-HCl pH9.0 / 1％ SDS)とPCI(フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール(25:24:1))に混合し、乳液状になるまで懸濁した。遠心分離後の上清にPCIを加えた後、激しく撹拌し、遠心分離後の上清を回収し、上清に1/10容の3M Na-Acetateと３倍容のethanolを加え、-80℃で冷却し、核酸を沈殿させた。風乾後、H2Oに溶解し、4M LiClを加え氷上に一晩静置後、遠心分離しtotal RNAを沈殿物として回収した。Poly(A)RNAはNucleoTrapR mRNA(MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG，Duren，Germany)を用いて調製し、cDNA合成に供した。遺伝子クローニングに用いたcDNAライブラリーは上記のように調製したノダフジ種子のmRNAからMarathonR cRNA Amplification Kit(Clontech社，Mountain View，CA，USA)を用いて作製した。【００２５】
（１−２）遺伝子クローニング
ノダフジレクチンをコードする遺伝子はノダフジ種子由来のcDNAからクローニングした。マメ科レクチンであるSoybean Agglutinin(SBA)のアミノ酸配列(Accession:P05046)をQueryとして用いてBlast検索を行い、Genbank DBより3種類のレクチン様タンパク質のアミノ酸配列を得た(Robinia pseudoacacia，Accession:BAA36414，Sophora japonica，Accession:AAB51441，Cladrastis kentukea，Accession:AAC49150)。それら3種類のレクチン様タンパク質の核酸配列(Robinia pseudoacacia，Accession:AB012633，Sophora japonica，Accession:U63011，Cladrastis kentukea，Accession:U21940)をアライメントし、最も保存されている領域に下記の２本のPCR用のプライマーを設計した。
Fwd-1：5’-CTCTTGCTACTCAACAAGGTGAA-3’(配列番号３)
Rev-1：5’-CAACTCTAACCCACTCCGGAAG-3’(配列番号４)
ノダフジ種子由来cDNAを鋳型にKOD-plus-(TOYOBO，Osaka，Japan)でPCR反応(94℃，1分，(94℃，1分-60℃，30秒-68℃，1分を30サイクル)，68℃，1分)を行った結果、およそ650bpのDNA断片が増幅された。この断片をpCR-Blunt II-TOPO(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)にサブクローニングし、3130xl Genetic Analyzer(Applied Biosystems，CA)で核酸配列を決定したところ、新規の核酸配列であった。
この配列は部分配列であり、オープンリーディングフレームのN-末端および,C-末端を欠いていたためRACE(Rapid Amplification of cDNA End)法で全長配列決定を行った。3’-RACE法では、上記Fwd-1と下記のAdapter Primer-1(Clontech) プライマーを用いてPCR反応を行った(94℃ 1min，60℃ 30sec，68℃ 1min，35cycles)。
Adapter Primer-1：5’-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3’(配列番号５)
次いで、増幅した核酸を鋳型に、上記Fwd-2と下記のAdapter Primer-2(Clontech)のプライマーでNested PCRを行った。
Adapter Primer-2：5’-ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC-3’(配列番号６)
その結果得たおよそ700bpのDNA断片の配列決定した結果、終止コドンを含む遺伝子配列が得られた。
さらに5’側の配列未知の部分に関しても、下記のRev-2及びRev-3を設計して、上記Adapter Primer-1及びAdapter Primer-2を用いた5’-Race法を行い、完全長配列を決定した。
Rev-2：5’-ACTATAGACTGGTTCGCCGTCC-3’(配列番号７)
Rev-3：5’-GGGTGAGTTGTAAATGCCCTGA-3’(配列番号８)【００２６】
（１−３）レクチン遺伝子の配列解析
ノダフジ種子よりクローニングした新規レクチン遺伝子は861bpのORFからなり、286アミノ酸からなるタンパク質をコードしていた(図１)。この新規アミノ酸配列は、マメ科レクチンに保存されたモチーフ配列を持ち、クエリーに用いたRobinia pseudoacaciaと62.8％、Cladrastis kentukeaと60.9％、Sophora japonicaと60.6％の相同性をそれぞれ有した。また、大豆レクチンSBA(Glycine max:P05046)と58.5％、ピーナッツ豆レクチンPNA(Arachis hypogaea:P02872)とも39.5％の相同性をそれぞれ有していた(図２)。配列中には１カ所のN-結合型糖鎖付加部位が存在し、C-末端近傍に１カ所のシステイン残基を認めた。決定した全長アミノ酸配列を用いて、シグナル配列予測プログラムSignalP4.0(デンマーク工科大学、http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/  非特許文献１１)を用いて解析したところ、N末端側の疎水性アミノ酸クラスターはシグナル配列であり、30番目のセリンと31番目のリジンの間で切断されることが予測された。【００２７】
（実施例２）リコンビナントレクチン(rWFA)の形質転換大腸菌での発現
（２−１）レクチン遺伝子による大腸菌の形質転換
実施例１でクローニングしたノダフジレクチンを大腸菌で発現させるために、レクチン活性領域であることが予想されるアミノ酸31-286残基を、ペリプラズム発現型のベクターであるpET20b(Merck4Biosciences，Darmstadt，Germany)のpelB leaderの下流にN末端にHis TagとFLAG Tagを付加して組み込んだ。
また、WFAをコードするDNA断片を、下記WFA-HisFL-Fwd及びWFA-Revを用いて増幅し、pET20bのNcoI-XhoI部位に挿入した。
WFA-HisFL-Fwd：5’-ccatggGACATCATCATCATCATCACCTCGACTACAAGGACGACGATGACAAGGGCAAGCTTGCGGCCGCGAATTCAAAAGAAACAACTTCCTTTGTC-3’(配列番号９)
WFA-Rev-1：5’-ctcgagTTAGATGGAACCGCGCAGAA-3’(配列番号１０)
作製した発現用プラスミドは大腸菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL(Agilent
Technologies，CA)に形質転換され、形質転換体はマニュアルに従って最終濃度100mMのisopropyl β-D-thiogalactopyranoside(IPTG)の添加により発現誘導を行い、25℃で一晩震盪培養を行った。【００２８】
（２−２）大腸菌でのrWFAの発現と精製
ペリプラズム画分の抽出はpET System Manual 11thEdition(Merck4Biosciences)に従い行った。可溶性タンパク質の抽出はBugBuster(Merck4Biosciences)を用いて行った。発現誘導後、リコンビナントタンパク質は、ペリプラズム画分に発現が確認できた(図３Ａ，Ｂ)。さらに、可溶性画分にも存在し、培地中にも漏れ出してきていることが明らかとなった(図３Ｂ，lane 5，7)ので、取扱いが簡便な培地中よりFLAG Tagにてリコンビナントタンパク質を精製した。精製はDDDDK-tagged Protein PURIFICATION GEL(MBL，Nagoya，Japan)を用いて行い、リコンビナントタンパク質の溶出はDDDDK溶出ペプチドを用いた。最終的に、溶出タンパク質はAmicon Ultra 3K(Merck Millipore，MA)で濃縮した。【００２９】
FLAG tagに対するアフィニティによりリコンビナントレクチンの精製を行った結果、リコンビナントWFA(rWFA)は、還元条件のSDS-PAGEで展開後にCBB染色で１本に染色されるおよそ31KDaのタンパク質として精製できた(図３Ｃ，lane 2)。【００３０】
（実施例３）リコンビナントWFA(rWFA)と天然WFA(nWFA)との配列上の同一性の検証
（３−１）天然由来WFAレクチン(nWFA)のアミノ酸解析
天然由来ノダフジレクチン(Vector Labから購入)のアミノ酸解析をアミノ酸シークエンサーProcise492HT(Applied Biosystems，CA)及び質量分析装置LTQ Orbitrap Velos ETD(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)を用いて行った。およそ2μgのレクチンタンパク質を2-メルカプトエタノール入りのサンプルバッファー中で100℃、5分間処理し、SDS-PAGE展開した。およそ28KDaのバンドは回収され、還元アルキル化の後、Trypsin消化を行いpeptide断片に分解した。濃縮後LTQ Orbitrap Velos ETDを用いてLC/MS解析し、構成するペプチドのアミノ酸配列を同定した。【００３１】
（３−２）rWFAとnWFAの配列比較の結果
実施例１でのノダフジレクチン遺伝子のクローニングで決定されたORFの推定アミノ酸配列が、天然から精製された市販のWFAレクチンと同一かどうかを検証した。(３−１)においてアミノ酸シークエンサーにより、nWFA(Vector
Lab)のN-末端側の31番目のリジン以下の配列が同定された。また、このnWFAを(３−１)のように、トリプシンで消化し、LC/MS法により構成ペプチドのアミノ酸配列を決定した結果、市販レクチンから得られたトリプシン消化ペプチドの93％が新規に決定したレクチン配列(シグナル配列部分を除く)に合致した(図８)。
また、実施例１で決定されたWFA-ORFアミノ配列のC末端の13アミノ酸は、天然由来レクチンから得られたペプチドには含まれておらず、タンパク質の成熟過程においてプロセシングされる可能性が考えられた。【００３２】
（３−３）SDS-PAGEによる分子量及び2量体形成能の比較
実施例２(２−２)で精製されたリコンビナントWFA(rWFA)は、還元条件のSDS-PAGEで、31KDaの単一バンドとして観察された(図３Ｃ，lane2)
一方、市販の天然WFA(nWFA)はリコンビナントより小さいおよそ28KDaの単一バンドとして確認できた(図３Ｃ，lane1)。2-メルカプトエタノールを除いた非還元条件でSDS-PAGEした結果、nWFAはおよそ60KDaの単一のバンドとして検出され、S-S結合で2量体を形成していることが示唆された(図３Ｃ，lane4)。一方、rWFAは非還元条件では、2量体の分子量と単量体の分子量の両方にバンドが検出できた(図３Ｃ，lane5)。【００３３】
（実施例４）天然由来WFAの還元によるnWFA単量体の作製
（４−１）天然由来WFAがフコースを含む糖鎖を有していることの確認
天然型WFA(nWFA)はフコースを含む糖鎖を持つことが報告されていたので、フコースを認識するAleuria Aurantia Lectin(AAL)レクチンを用いてレクチンブロットを行った。その結果、nWFAはAALに反応する糖鎖を含む糖タンパク質であることが確認できた(図５)。【００３４】
（４−２）nWFAの還元によるnWFA単量体の作製
天然由来WFAの還元はジチオスレイトール(DTT)を用いて行った。1mg/mL(100mM Tris pH8.5)のnWFA 1mLに10μLの1M DTTを添加し、室温で4時間還元反応を行った。続いて、25μLの1Mヨードアセトアミドを加え、室温、暗所で30分間アルキル化反応を行った。これによりnWFAは還元され、2量体形成に寄与していたシステインはアルキル化され、S-カルボキシアミドメチルシステインとなり、nWFAは単量体となった。反応後の余分な試薬は限外ろ過(Amicon 3K，millipore)にて取り除いた。【００３５】
（実施例５）変異体レクチンC272Aの作製
（５−１）変異体レクチンC272Aの大腸菌による発現
実施例３(３−３)では、nWFAでは非還元状態では28KDaの、還元状態では60KDaの単一バンドであったことから、nWFAは2量体を形成していると考えられるが、rwFAでは、還元状態では31KDaの単一バンドであったが、非還元条件では、2量体の分子量と単量体の分子量の両方にバンドが検出された(図３Ｃ)。
そこで、この2量体形成にシステイン残基が関与しているかどうかを検証するために、rWFAアミノ酸配列中で唯一の272位のシステインをアラニンに置換した変異体(C272A)を作製して大腸菌で発現させた。
変異体レクチンC272Aは、下記C272A-Fwd及びC272A-Revのプライマーを用いてPCRで作製した。
C272A-Fwd：5’-AGCAGTGATGATGCCAACAACTTGCAT-3’(配列番号１１) 
C272A-Rev：5’-ATGCAAGTTGTTGGCATCATCACTGCT-3’(配列番号１２)
FLAG-Tag WFAはそれぞれ以下のN-FLAG及びC-FLAG PCRプライマーを用いて増幅した断片をpET20bのEcoRI-XhoI部位に挿入して作製した。
N-FLAG：
WFA-FLAG-Fwd：
5’-gaattcAGACTACAAGGACGACGATGACAAGAAAGAAACAACTTCCTTTGT-3’(配列番号１３)
WFA-Rev-2：5’-ggcctcgagTTAGTTGCAATCATCACTGCTAGGATCT-3’(配列番号１４)，
C-FLAG：
WFA-Fwd-1：5’-ggaattcaAAAGAAACAACTTCCTTTGT-3’(配列番号１５) 
WFA-FLAG-Rev：
5’-ctcgagTTACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCGTTGGCATCATCACTGCTAGGATCT-3’
(配列番号１６)【００３６】
（５−２）SDS-PAGEによる2量体形成能の検討
FLAG tagで精製したC272Aは還元条件、非還元条件ともにSDS-PAGEで単量体の大きさ28KDaにバンドが確認された(図３Ｃ，lane3 and 6)。システインの変異体が2量体を形成しなかったことから、システインを介したS-S結合が2量体の形成に必須であることが明らかとなった。【００３７】
（実施例６）リコンビナントレクチン(rWFA)の糖鎖結合活性の解析
（６−１）糖鎖結合活性の測定
リコンビナントレクチンの糖鎖結合活性は産総研が開発した複合糖質マイクロアレイを用いて解析した(非特許文献１０)。リコンビナントレクチンはリジン残基をCy3(GE Healthcare，Buckinghamshire，UK)でラベルし、マイクロアレイに供した。Cy3シグナルはGlycostation Reader 1200(GPバイオサイエンス、Yokohama，Japan)を用いて測定した。【００３８】
（６−２）rWFAの糖鎖認識活性
大腸菌で作製したrWFAが糖鎖認識活性を有するかどうかを、糖鎖・糖タンパク質アレイを用いて解析した。Cy3でラベルしたnWFAとrWFAは糖タンパク質アレイに供された。その結果、nWFAとrWFAは非常に類似した糖鎖認識特異性を示した(図４)。両方ともに最も強いシグナルを示したのはAsialo-BSM(bovine submaxillary mucin)であった。また、予想されていたようにGalNAc末端の糖鎖(A-di，βGalNAc，di-GalNAcβ，LDN，GA2，Tn，Forssman)にも結合性を示した。さらに、asialo-AGPやasialo-TF、asialo-TG，asialo-FETなどにも結合性を示した。これらの結果から、大腸菌で発現したrWFAは天然のものと同じ糖鎖認識活性を有することが明らかとなった。【００３９】
（６−３）C末端13アミノ酸の欠失、及び272位のCys残基による糖鎖認識活性への影響
続いて、C末端の13アミノ酸の影響を調べるため、13アミノ酸を除いたrWFAを作製し、糖鎖認識活性を調べた(図５)。13アミノ酸を除いてN末端にFLAG-tagを加えたもの(rWFA N-FLAG)、同じ設計でCys 272をAlaに改変したもの(C272A N-FLAG)、改変型でFLAG tagの位置をC末端に変更したもの(C272A C-FLAG)の3種類を大腸菌で発現させた(図５Ａ)。
精製したリコンビナントレクチンをSDS-PAGEで展開した結果、C末端の13アミノ酸を欠失したrWFA N-FLAGはそのほとんどが2量体を形成することができずに、2ME-の非還元条件でも単量体の分子量に泳動された(図５Ｂ，lane6)。
また、予想通り改変型のC272A N-FLAGは単量体であり、C末端にtagを移したC272A C-FLAGも単量体での発現が確認された(図５Ｂ，lane7 and 8)。
精製したこれら３種類の単量体リコンビナントレクチンをCy3でラベル化し、糖鎖結合活性を糖鎖タンパク質アレイで検証した。その結果、３種類ともにnWFAで見られた糖鎖認識活性の多くが消失し、LDN(GalNAcβ1,4GlcNAc)とasialo-BSMへの結合活性のみが残存した。ここで、LDNの結合活性に比較するとasialo-BSMへの結合活性は無視できる程度であるため、当該結合活性は、「LDN特異的結合活性」と表現できる。さらに、C末端の13アミノ酸が付帯した改変型C272A WFA(図３Ｃ，lane3 and 6)も、同様のLDNとAsialo-BSMへの結合活性、すなわち「LDN特異的結合活性」を持っていた(data is not shown)。【００４０】
（６−４）C末端13アミノ酸の存在による2量体形成能及び糖鎖結合特異性への影響
プロセッシングされることが予想されるC末端13アミノ酸を削除し、N末端あるいはC末端にFLAG tagを付加したrWFAの発現を行った結果、13アミノ酸を除いたものは2量体をほとんど形成できなかった。2量体はCBB染色では検出できず、抗FLAG抗体のウエスタンブロットでかろうじて検出できた。C272Aは実施例５(図３)で確認した際と同様に2量体は形成できなかった。これらの精製したrWFAを用いて、糖鎖結合特異性を検討した(図６)。【００４１】
（６−５）単量体リコンビナントがLDN及びasialo-BSMのみを認識する原因の解明
LDNとasialo-BSMのみを認識したrWFAは単量体のレクチンだったため、nWFAとrWFAの糖鎖結合活性の違いが、単量体化によるものなのか、リコンビナント化によるものなのかを検証するために、実施例４で作製された還元後システイン残基がアルキル化されたnWFA単量体について、糖鎖認識活性を検討した(図７Ａ)。
糖タンパク質アレイで解析した結果、還元したWFA(nWFA-RCA)はnWFAともrWFAとも異なる糖鎖認識を示した。nWFA-RCAはLac，Lec，LN，Asialo-FET，Asialo-AGP，Asialo-TF，Asialo-TG，Tn，Asialo-GP，BSM，αGalに対する結合は消失あるいは大きく減少したのに対し、A-di，bGalNAc，di-GalNAcβ，LDN，GA2，Forssman，Asialo-BSMなど非還元末端がGalNAcである糖鎖に対する結合はほとんど変化が見られなかった(図７Ｂ)。
これらの結果からnWFAは単量体ではGalNAc末端の糖鎖に、より特異的に結合できることが示された。すなわち、天然のWFAでは、2量体化されたことで、GalNAc末端の糖鎖に加えて、Gal末端の糖鎖にも結合できるようになることが示された。【００４２】
（実施例７）ヒト培養細胞でのC272A改変レクチンの作製
大腸菌以外のホストでの改変レクチンの作製を検討するため、ヒト培養細胞(HEK293T株)に、実施例(５−１)に記載されたC272A変異を有するWFAをコードする核酸を導入した。具体的には、C272A改変rWFAをコードする遺伝子をpFLAG-CMV3発現ベクター(Sigma社)に組込み、HEK293T細胞に遺伝子導入した。
遺伝子導入後、10%ウシ血清を含むDMEM培地で48時間培養した培養上清より、抗FLAG抗体カラム(Sigma社)を用いて精製した結果、改変レクチンは、およそ35KDa付近の単一バンドとして検出できたが、糖鎖による分子量の増加が観察された(図１２Ａ)。これをCy3で標識し、糖タンパク質アレイに供した結果、大腸菌で作製した改変レクチンと同様の結合特異性(LDNとasialo-BSM)が確認された(図１２Ｂ)。【００４３】
（実施例８）ヒト培養細胞でのC272A，N146Q改変レクチンの作製
この実施例では、C272A改変rWFAに対して、唯一の糖鎖結合部位である146番目のアスパラギンをグルタミンに置換し(N146Q)、真核細胞であっても糖鎖を付与できないC272A改変レクチンのC272A,N146Q改変rWFAをコードする遺伝子を作製した。
当該C272A,N146Q改変rWFAをコードする遺伝子を、実施例７で用いたpFLAG-CMV3発現ベクター(Sigma社)に組込み、ヒト培養細胞(HEK293T株)に遺伝子導入した。
上記形質転換細胞を実施例７と同様に培養し発現誘導を行い、培養上清を回収後、同様の精製方法を適用して、精製C272A,N146Q改変レクチンを得た。
培養上清より精製した改変レクチンは、およそ33KDaの単一バンドとして検出できた(図１３Ａ左)。これをCy3で標識し、糖タンパク質アレイに供した結果、大腸菌で作製した改変レクチンと同様の結合特異性(LDNとasialo-BSM)が確認された(図１３Ｂ上)。
糖鎖付加が起こらない大腸菌で発現させたC272A改変rWFAがLDN結合活性を有していたことから、糖鎖付加が糖鎖認識能には影響を与えないことは十分に予測されていたが、この結果によりその点が明確になった。【００４４】
（実施例９）酵母でのC272A，N146Q改変レクチンの作製
酵母(メタノール資化性酵母Ogataea minuta TK10-1-2株)に、実施例８に記載されたC272A，N146Q改変rWFAをコードする遺伝子をHisおよびFLAGタグを有するpOMEA1-10H3F発現ベクターに組込み、O.minutaTK10-1-2株を形質転換した。
上記形質転換酵母を200mlのYPD培地(2％Peptone、1％Yeast Extract、2％グルコース)にて、30℃で2日間培養を行った。遠心分離により培養上清を除いた後、菌体に200 mlのBMMY培地(2％Peptone、1％Yeast Extract、1.34％Yeast Nitrogen Base w/o amino acids、1％MeOH、100mMリン酸カリウムバッファー(pH6.0))を加えて再懸濁し、30℃でさらに2日間培養することでEndo-Omの発現誘導を行った。培養上清を回収後、TBSバッファー(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン1.24g、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸塩6.27g、塩化ナトリウム8.77g/L)にて透析を行なった。透析後の粗レクチン液をHisTrap HPカラム(GE Healthcare社)に供し、50mMのイミダゾールを含むTBSバッファーで洗浄した後、500mMイミダゾールを含むTBSバッファーでグラジエント溶出をすることによりタンパク質を溶出した。カラムから溶出されたEndo-Omを含む画分をAmicon Ultra(10,000 MWCO，Millipore社)で限外ろ過濃縮し、さらにTBSバッファーで置換し、精製C272A，N146Q改変レクチンとした。
酵母培養上清より精製した改変レクチンは、およそ34Kda付近の単一バンドとして検出できた(図１２Ａ右)。それをCy3で標識し、糖タンパク質アレイに供した結果、大腸菌および培養細胞で作製した改変レクチンと同様の結合特異性(LDNとasialo-BSM)が確認された(図１２Ｂ下)。【００４５】
［配列フリーテキスト］
配列番号１  ：wisteria floribunda lectin(g)
配列番号２  ：wisteria floribunda lectin(a)
配列番号３  ：Fwd-1
配列番号４  ：Rev-1
配列番号５  ：Adapter Primer-1
配列番号６  ：Adapter Primer-2
配列番号７  ：Rev-2
配列番号８  ：Rev-3
配列番号９  ：WFA-HisFL-Fwd
配列番号１０：WFA-Rev-1
配列番号１１：C272A-Fwd
配列番号１２：C272A-Rev
配列番号１３：WFA-FLAG-Fwd(N-FLAG)
配列番号１４：WFA-Rev-2(N-FLAG)
配列番号１５：WFA-Fwd-1(C-FLAG)
配列番号１６：WFA-FLAG-Rev(C-FLAG)
【図１】
0006011985.tif 000003
【図２】
0006011985.tif 000004
【図３】
0006011985.tif 000005
【図４】
0006011985.tif 000006
【図５】
0006011985.tif 000007
【図６】
0006011985.tif 000008
【図７】
0006011985.tif 000009
【図８】
0006011985.tif 000010
【図９】
0006011985.tif 000011
【図１０】
0006011985.tif 000012
【図１１】
0006011985.tif 000013
【図１２】
0006011985.tif 000014
【図１３】
0006011985.tif 000015
【配列表】
0006011985000001.app