(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３８の残基１〜２３３のアミノ酸配列または配列番号３３のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む単離ポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドが異種アミノ酸配列に融合する、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項３】
前記異種アミノ酸配列が、免疫グロブリン定常ドメイン若しくはその断片、リンカー、又はタグである、請求項２に記載の単離ポリペプチド。
【請求項４】
配列番号３８の残基１〜２３３のアミノ酸配列または配列番号３３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、前記ポリペプチドは、ジャガイモウイルスＡ（ＰＶＡ）核封入タンパク質（ＮＩａ）プロテアーゼ変異体をコードし、前記変異体が酸化に対して耐性を示し、且つ活性を保持する、単離ポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号４２に示す配列を有するポリヌクレオチドを含む、単離ポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項４に記載の単離ポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項７】
配列番号４２又は４７に示す配列を有する単離ポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項８】
請求項６又は７に記載のベクターを含む、単離宿主細胞。
【請求項９】
ポリペプチドを発現させる方法であって、
ａ．請求項８に記載の宿主細胞を提供する工程と；
ｂ．少なくとも１つのポリペプチドの発現に十分な条件下で前記宿主細胞を培養する工程であって、前記少なくとも１つのポリペプチドは、配列番号３８の残基１〜２３３のアミノ酸配列または配列番号３３のアミノ酸配列を含む、工程と、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジャガイモウイルスＮＩａプロテアーゼ変異体又はその断片、それをコードするポリヌクレオチド、並びにその製造及び使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
大きな努力を払って、より高度な選択性及び／又は特異的活性を得るために酵素及び他のタンパク質の改変がなされてきた（Ｍａｔｓｕｍｕｒａ  ａｎｄ  Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０５：３３１〜３３９，２００１；Ｒｏｔｈｍａｎ  ａｎｄ  Ｋｉｒｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２７：５９３〜６０８，２００３；Ａｈａｒｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３７：７３〜７６，２００５）。ヒトのトリプシン様セリンプロテアーゼは、通常は認識されない標的タンパク質内の特定の所定の一次配列を認識するプロテアーゼをつくる目的で改変するための魅力的な標的であり、特定の空間的かつ一時的な標的活性化の調整に起因する。また、トリプシン様セリンプロテアーゼは、分子生物学において価値のある研究手段である。
【０００３】
トリプシン様セリンプロテアーゼの製造には、必要とされる適切なジスルフィド結合の形成に関する構造的複雑性、及び活性のためのネイティブな球状ポリペプチド鎖の適切なプロセシングにより、難題が提起される。更に、トリプシン様セリンプロテアーゼは、収縮した認識配列を有することが多く、これが分子に改変され得る絶対的特異性を制限する。（Ｇｏｓａｌｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，４：６２６〜３６，２００５、米国特許出願公開第２００４００７２２７６Ａ１号）。ヒトのトリプシン様セリンプロテアーゼに代わり、より製造の容易な細胞内植物ウイルスプロテアーゼを出発点として用いて、治療法及び新規研究手段を開発することができる。
【０００４】
ポティウイルスは、主にアブラムシにより伝染し、毎年牧草、農作物、園芸作物、及び鑑賞植物に甚大な損失を与える植物ウイルスの種類である。ポティウイルスの典型的な例は、ジャガイモウイルスＡ（ＰＶＡ）、タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）、及びタバコ脈斑ウイルス（tobacco vein mottling virus）（ＴＶＭＶ）である。ポティウイルスのモノパータイトゲノムは、５’末端でウイルスのコードするタンパク質（ＶＰｇ）と共有結合し、３’末端でポリアデニル化されている（＋）鎖ＲＮＡを含む（Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊ．７：１２８１〜１２８７，１９８８）。ゲノムは、ｍＲＮＡとして、及びウイルスゲノムから翻訳されたポリメラーゼにより相補的な（−）鎖ＲＮＡを合成するためのテンプレートとして機能する。細胞に侵入する際、ウイルスのＲＮＡは、内因性のリボソームに結合し、ゲノムは、単一ポリペプチド鎖として翻訳される。次いで、大きな単一のポリタンパク質が、ウイルスのコードする３つのプロテアーゼ、第１のタンパク質（Ｐ１）、ヘルパー成分（ＨＣ）、及び核封入タンパク質（ＮＩａ）プロテアーゼにより成熟タンパク質にプロセシングされる（Ｖｅｒｃｈｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９０：２９８〜３０６，１９９２）。ＮＩａプロテアーゼは、成熟ＲＮＡ複製関連タンパク質及びキャプシドタンパク質の生成を含む、大部分のポリタンパク質のプロセシングに関与している（Ｖｅｒｃｈｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９０：２９８〜３０６，１９９２）。
【０００５】
ＮＩａプロテアーゼは、ピコルナウイルスの３Ｃシステインプロテアーゼのファミリーに属し（Ｐａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２１０：１９４〜２０１，１９９５）、伸長Ｐ６−Ｐ１’認識配列ＥＸＸＹＸＱ*（Ｓ／Ｇ）（配列番号６９）を示す（Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１７１：３５６〜３６４，１９８９）。ポティウイルスのメンバー全体にわたってＮＩａプロテアーゼの認識配列は著しく類似しているが、各プロテアーゼは、その標的配列に対して高度に特異的である（Ｔｏｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ＦＥＢＳ  Ｊ．２７２：５１４〜５２３，２００４）。構造的に、ＮＩａプロテアーゼは、トリプシン様プロテアーゼにおいてセリンによりＮＩａ触媒システインが置換されたことを含む分岐進化を通してトリプシン様セリンプロテアーゼと関連していると考えられる（Ｂａｚａｎ  ａｎｄ  Ｆｌｅｔｔｅｒｉｃｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：７８７２〜７８７６，１９８８）。ＮＩａ及びトリプシン様セリンプロテアーゼは、類似する全体的な三次元のタンパク質折り畳み及びそれぞれの触媒残基の空間的近接性を共有している。システインプロテアーゼの３Ｃ様ファミリーは、より複雑な細胞外プロテアーゼよりも幾つかの利点をもたらす。これらは、細菌のサイトゾルで容易に産生させることができ、ジスルフィド結合を有しず、かつ伸長基質認識配列を有する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
３Ｃ様プロテアーゼの使用に関する問題点は、活性部位及び／又は表面に露出しているシステインの酸化により非還元条件下において活性が低下することであり、そのために用途が制限されることである（Ｈｉｇａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐｏｓｉａ  ｏｎ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，６１５〜６２１，１９８７）。したがって、プロテアーゼは、その機能活性を維持するために還元剤を必要とする（Ｎｕｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５０：１４５〜５５，２００５；Ｂｉｒｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ６：６０９〜１８，１９９５）。したがって、外因性の還元剤が存在しなくても活性を保持する改変された植物ウイルスプロテアーゼが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の１つの態様は、ＮＩａプロテアーゼ変異体をコードする単離ポリペプチドであって、前記変異体が酸化に対して耐性を示し、かつ活性を保持する、単離ポリペプチドである。
【０００８】
本発明の別の態様は、単離ポリペプチドであって、
ａ．位置１９のシステインがセリン又はバリンに置換されている、
ｂ．位置１１０のシステインがセリンに置換されている、
ｃ．位置１５１のシステインがセリン又はアラニンに置換されている、
ｄ．位置１８１のシステインがセリンに置換されている、及び
ｅ．位置２１１のシステインがセリンに置換されている、
からなる群より選択されるアミノ酸置換を有する配列番号１に示す配列を有するポリペプチドを含む、単離ポリペプチドである。
【０００９】
本発明の別の態様は、配列番号３８の残基１〜２３３に示される配列を有するポリペプチドを含む単離ポリペプチドである。
【００１０】
本発明の別の態様は、本発明のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドである。
【００１１】
本発明の別の態様は、本発明のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを含むベクターである。
【００１２】
本発明の別の態様は、本発明のベクターを含む単離宿主細胞である。
【００１３】
本発明の別の態様は、本発明のポリペプチドを発現させる方法である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
特許及び特許出願を含み、それらには限定されない全ての刊行文献は、本明細書への参照により、完全に説明されているごとくに、本願に包含される。
【００１５】
本明細書及び特許請求の範囲で使用されるとき、文脈で明確に指示されない限り、単数形「ａ」、「ａｎｄ」、及び「ｔｈｅ」は、複数形の言及を含む。したがって、例えば、「ポリペプチド」への言及は１つ以上のポリペプチドへの言及であり、当業者に対して公知であるそれらの等価物を包含する。
【００１６】
別段の規定がない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されている意味と同一の意味を有する。本明細書に記載されているのと類似の又は等価なあらゆる組成物及び方法を、本発明を実施又は試験するために使用することが可能であるが、代表的な組成物及び方法を本明細書に記載する。
【００１７】
用語「ＮＩａプロテアーゼ」は、本明細書で使用するとき、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＢ５８２３８に示されているウイルスプロタンパク質のアミノ酸２０３２〜２２６４によりコードされているジャガイモウイルスＡ（ＰＶＡ）ＮＩａプロテアーゼを指す。ＮＩａプロテアーゼのポリペプチド配列を配列番号１に示す。
【００１８】
本明細書で用いられる用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって連結されてポリペプチドを形成する少なくとも２つのアミノ酸残基を含む分子を指す。アミノ酸が５０個未満の低分子ポリペプチドは、「ペプチド」と呼ばれることもある。ポリペプチドは「タンパク質」と呼ばれることもある。
【００１９】
用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書で使用するとき、糖−リン酸骨格鎖又は他の等価な共有結合化学によって共有結合されたヌクレオチド鎖を含む分子を指す。二本鎖及び一本鎖のＤＮＡ及びＲＮＡが、ポリヌクレオチドの典型的な例である。
【００２０】
用語「相補配列」は、第１の単離ポリヌクレオチド配列と逆平行であり、第１のポリヌクレオチド配列におけるヌクレオチドに対して相補的なヌクレオチドを含む第２の単離ポリヌクレオチド配列を意味する。典型的には、このような「相補配列」は、適切な条件下で第１の単離ポリヌクレオチド配列と組み合わされたときに、二本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＲＮＡのような二本鎖のポリヌクレオチド分子を形成することができる。
【００２１】
用語「変異体」は、本明細書で使用するとき、レファレンス「野性型」ポリペプチド又はポリヌクレオチドとは異なり、本質的な特性を保持していても保持していなくてもよいポリペプチド又はポリヌクレオチドを指す。一般的に、野性型と変異体との配列の違いは、全体的には極めて類似しており、領域のほとんどは同一である。変異体は、例えば、ヌクレオチド又はアミノ酸の置換、挿入、又は欠失等の１以上の変更により、野性型配列と異なる場合がある。置換又は挿入により、保存的又は非保存的なアミノ酸置換、あるいは終止コドンの発生が生じる場合もある。ポリヌクレオチドの変異体は、天然に存在してもよく、野性型ポリヌクレオチドと７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有してもよい。
【００２２】
活性、特異性、安定性、可溶性等を高める目的のために変異体ポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドの構造又は機能を変化させることが可能である。ロイシンをコードするコドンをイソロイシン又はバリンをコードするコドンに、アスパラギン酸をコードするコドンをグルタミン酸をコードするコドンに、トレオニンをコードするコドンをセリンをコードするコドンに置換すること、又は構造的に関連するアミノ酸をコードするコドンの同様の置換（すなわち、保存的突然変異）は、全てではないが、場合によっては、得られる分子の生物活性に大きな影響を与えない。保存的置換とは、化学的に関連する側鎖を共有するアミノ酸ファミリー内で起こる置換である。天然のアミノ酸は、その側鎖に基づいて、（１）酸性（アスパラギン酸、グルタミン酸）、（２）塩基性（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、（３）非極性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、及び（４）無電荷で極性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン）の４つのファミリーに分けることができる。フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンは、芳香族アミノ酸として連帯的に分類される場合もある。あるいは、天然のアミノ酸は、（１）酸性（アスパラギン酸、グルタミン酸）、（２）塩基性（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、（３）脂肪族（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン）（セリン及びスレオニンは、所望により脂肪族ヒドロキシル基として別にグループ化される）、（４）芳香族（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン）、（５）アミド（アスパラギン、グルタミン）、並びに（６）硫黄含有（システイン及びメチオニン）にグループ化することができる（Ｓｔｒｙｅｒ（ｅｄ．），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ  ｅｄ，ＷＨ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，１９８１）。変異体ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド又はその断片のアミノ酸配列の変化により機能的ホモログを生じるかどうかは、本明細書に記載のアッセイを使用して、改変されたポリペプチド又は断片が非改変ポリペプチド又は断片と同様の反応を生じさせることができるかどうかを評価することにより容易に判定することができる。１つを超える置換が起こったペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を、同様のやり方で容易に試験することができる。
【００２３】
用語「野性型」又は「ＷＴ」は、天然源から単離されたとき、そのポリペプチド又はポリヌクレオチドの特徴を有するポリペプチド又はポリヌクレオチドを指す。代表的な野性型ポリヌクレオチドは、集団内で最も高頻度でみられる遺伝子をコードするポリヌクレオチドであり、したがって、適宜「正常」又は「レファレンス」又は「野性型」形態と呼ばれる。
【００２４】
用語「活性」又は「活性である」は、本明細書で使用するとき、活性ＮＩａプロテアーゼ、例えば、その基質を切断することができるＮＩａプロテアーゼを指す。代表的な基質は、例えば、表５及びＭｅｒｔｉｓら（Ｍｅｒｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８３：１２１１〜１２２１，２００２）に記載されているＳＥＶＶＬＦＱＡＳＳ（配列番号７０）、ＳＥＡＶＹＴＱＧＳＳ（配列番号７１）、又はＳＥＮＶＴＦＱＧＳＳ（配列番号７２）の同定されている認識配列に相当する合成ペプチドである。基質の部分的切断は、プロテアーゼの有効な生物活性にとって十分であり、例えば、基質の５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％である。したがって、生物活性は、基質の完全な切断を必要とするものではない。「部分的に活性」とは、その基質を部分的に切断するＮＩａプロテアーゼを指す。
【００２５】
用語「酸化に対して耐性」又は「酸化耐性」は、本明細書で使用するとき、ＮＩａプロテアーゼ変異体が活性であり、野性型ＮＩａプロテアーゼの機能的安定性に必要な還元剤の非存在下で機能的に安定であることを意味する。野性型ＮＩａプロテアーゼの活性に必要な還元剤は、典型的には０．１〜１０ｍＭの範囲のジチオトレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール、又はトリスカルボキシエチルホスフェート（ＴＣＥＰ）であり得る。
【００２６】
「異種アミノ酸配列」は、本明細書で使用するとき、自然界ではＮＩａプロテアーゼポリペプチドに融合しないアミノ酸配列を指す。異種アミノ酸配列は、標準的な方法を用いてＮＩａプロテアーゼポリペプチドのＮ末端又はＣ末端のいずれかに結合し得る。異種配列を用いて、ポリヒスチジン又はグルタミンＳ−トランスフェラーゼタグの結合等の融合タンパク質を精製するためのタグを提供することもでき、あるいは免疫グロブリン若しくはアルブミンの定常ドメイン又はこれらの断片の結合等のＮＩａプロテアーゼの半減期を延ばすこともできる。異種アミノ酸配列は、周知の方法を用いて、例えば、化学カップリング又はアミド結合を介してポリペプチドに融合させることができる。また、免疫グロブリンのヒンジ又はその断片、免疫グロブリンの可変領域の断片、あるいはリンカーをＮＩａプロテアーゼポリペプチドに融合させてもよい。
【００２７】
用語「ベクター」は、生体系内で複製され得る、又はこうした系の間で移動可能である、ポリヌクレオチドを意味する。ベクターポリヌクレオチドは、典型的に、生体系においてこれらのポリヌクレオチドの複製又は維持を促進する機能を有する、複製起点、ポリアデニル化シグナル又は選択マーカーのような因子を含有する。このような生体系の例としては、細胞、ウイルス、細菌、動物、植物、及びベクターを複製することのできる生物学的成分を利用して再構成された生体系を挙げることができる。ベクターを含むポリヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子であってもよく、これらのハイブリッドであってよい。
【００２８】
用語「発現ベクター」は、生体系又は再構成された生体系において、発現ベクター中に存在するポリヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドの翻訳を導くために利用することができるベクターを意味する。
【００２９】
本発明は、酸化に対して耐性であるＮＩａプロテアーゼ変異体、該変異体をコードするポリヌクレオチド、これらポリヌクレオチドを含むベクター、単離宿主細胞、本発明のポリペプチドを発現させる方法、並びに本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドを用いる方法を提供する。本発明の変異体は、研究手段として有用であり、例えば、融合タンパク質を切断してタグを除去するために用いることができる。
【００３０】
本発明の１つの実施形態は、ＮＩａプロテアーゼ変異体をコードする単離ポリペプチドであって、該変異体が酸化に対して耐性を示し、その活性を保持する、単離ポリペプチドである。酸化条件では、すなわち、還元剤の非存在下では、野性型ＮＩａは凝集し、不活性になる（実施例１）。
【００３１】
別の実施形態では、酸化に対して耐性であり、その活性を保持しているＮＩａプロテアーゼ変異体は、少なくとも１つの置換されたシステイン残基を有する。他の変異体は、２、３、４、又は５つの置換されたシステイン残基を有し得る。配列番号１に示す野性型ＮＩａプロテアーゼは、合計５つのシステイン：１つの活性部位は位置１５１のシステインであり、４つのシステインは位置１９、１１０、１８１、及び２１１であり、これらは、結晶構造予測に基づいて、プロテアーゼの表面上に存在するので、酸化を受けやすい。代表的な置換は、セリン、バリン、又はアラニンへの置換である。代表的なＮＩａプロテアーゼの配列を表２に示す。
【００３２】
本発明の変異体は、周知の方法、例えば、部位特異的又はランダム突然変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：４８８〜４９２，１９８５；Ｗｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１５１：１１９〜１２３，１９９４；Ｉｓｈｉｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２９３：５３〜７１，１９８８）、又は化学合成（米国特許第６，６７０，１２７号、米国特許第６，５２１，４２７号）により作製することができる。合理的設計を使用して、野性型プロテアーゼの構造又は活性に対して特定の効果を有することが期待される変異体を設計することができる。ポリペプチド又はその断片のアミノ酸配列の変化により機能的ホモログが生じるかどうかは、本明細書に記載のアッセイを使用して、変異体ポリペプチド又は断片が野性型ポリペプチド又は断片と同様の反応を生じさせることができるかを評価することにより容易に判定することができる。１つを超える置換が起こったペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を、同様のやり方で容易に試験することができる。プロテアーゼ活性を評価する代表的なアッセイは、タンパク質分解の際の４−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）ベンゾイル（ＤＡＢＣＹＬ）−ＹＧＥＮＶＴＦＱＧＳＫ−５−［（２−アミノエチル）アミノ］ナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）（配列番号７３）等のフルオロフォア／クエンチャー基質ペプチドにより放出される蛍光を測定するか、又はプロテアーゼ切断後のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるペプチド基質の切断を評価する。
【００３３】
本発明のポリペプチドは、自動ペプチド合成機で固相ペプチド合成などの化学合成により生成してもよい。あるいは、本発明のポリペプチドは、網状赤血球溶解物に基づく発現系等の無細胞発現系の使用により、又は容易に単離される親和性標識ポリペプチドの組換え発現等の周知の技術による本発明の核酸配列を有する細胞からの発現及び単離により、これらポリペプチドをコードするポリヌクレオチドから得ることができる。
【００３４】
本発明の別の実施形態は、単離ポリペプチドであって、
ａ．位置１９のシステインがセリン又はバリンに置換されている、
ｂ．位置１１０のシステインがセリンに置換されている、
ｃ．位置１５１のシステインがセリン又はアラニンに置換されている、
ｄ．位置１８１のシステインがセリンに置換されている、及び
ｅ．位置２１１のシステインがセリンに置換されている、
からなる群から選択される置換を有する、配列番号１に示される配列を有する、ポリペプチドを含む、単離ポリペプチドである。
【００３５】
本発明のポリペプチドは、異種ポリペプチドと融合した本発明のポリペプチドを含む融合ポリペプチドを含むことができる。このような異種ポリペプチドは、リーダー又は分泌シグナル配列、プレ−又はプロ−又はプレプロ−タンパク質配列、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）（Ｇｅｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８６：８２１−２８４，１９８９）、ＨＡペプチドタグ（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ３７：７６７〜７７８，１９８４）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＲＦ）等の蛍光タグであってよい。代表的なＮＩａプロテアーゼ変異体−Ｈｉｓ−ｔａｇ融合タンパク質は、配列番号３７、３８、又は３９に示すアミノ酸配列を有する。１つの態様では、ＮＩａプロテアーゼ変異体ポリペプチドは、免疫グロブリンの定常ドメイン又はその断片に融合する。このようなコンストラクトは周知であり、例えば、米国特許第５１１６９６４号、同第５７０９８５９号、同第６０１８０２６号；国際公開第０４／００２４１７号；同第０４／００２４２４号；同第０５／０８１６８７号；及び同第０５／０３２４６０号に記載されている。免疫グロブリンの定常ドメインは、ＣＨ１、ＣＨ２、若しくはＣＨ３ドメイン、又はヒンジ領域であってよく、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、又はＩｇＡに由来してよい。ＮＩａプロテアーゼ変異体ポリペプチドは、リンカー、例えばグリシンリッチリンカーを介して、又は免疫グロブリン可変領域の断片を介して免疫グロブリンの定常ドメイン又はその断片に融合することができる。このようなリンカー及び可変領域の断片は、例えば、国際公開第０８／０１１４４６号及び米国特許第５９０８６２６号に記載されている。代表的な融合タンパク質は、配列番号３８の残基１〜２３３に示されるアミノ酸配列を有するＮＩａプロテアーゼ変異体と、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメイン等の免疫グロブリンドメインに由来するか又は類似する１以上のドメインとを共にコンジュゲートさせることにより形成することができる。
【００３６】
本発明の別の実施形態は、配列番号３８の残基１〜２３３に示す配列を有するポリペプチドを含む単離ポリペプチドである。
【００３７】
別の実施形態では、本発明は、配列番号３８の残基１〜２３３に示す配列を有するポリペプチドを含む単離ポリペプチドを提供する。
【００３８】
本発明のポリペプチドは、保存のために凍結乾燥することができ、使用前に好適なキャリアで再構成できる。代表的なキャリアは、リン酸緩衝生理食塩水である。この技術は、従来のタンパク質調製で有効であることが示されている。凍結乾燥及び再構成技術は、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｒｅｙ  ａｎｄ  Ｍａｙ，Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｖｏｌ．１３７，１９９９；Ｗａｎｇ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２０３：１〜６０，２０００を参照されたい。これら技術は、室温保存を含む長期間安定性の高いタンパク質製剤の開発、並びにより容易な地理的分布を可能にする。また、このプロセスは、再構成手順を調整することにより、タンパク質をより高濃度で用いることを可能にする。
【００３９】
本発明の別の態様は、本発明のポリペプチド又はその相補体のいずれかをコードする単離ポリヌクレオチドである。特定の代表的なポリヌクレオチドを本明細書に開示するが、遺伝暗号の縮重及び所与の発現系におけるコドンの選択性を考慮して、本発明のＮＩａプロテアーゼ変異体をコードする他のポリヌクレオチドも本発明の範囲内に含まれる。代表的なポリヌクレオチドは、配列番号４１〜４３及び４６〜４８に示す核酸配列を含むポリヌクレオチドである。
【００４０】
本発明のポリヌクレオチドは、自動ポリヌクレオチド合成機での固相ポリヌクレオチド合成のような化学合成により生成することができる。あるいは、本発明のポリヌクレオチドは、ＰＣＲに基づく複製、ベクターに基づく複製、又は制限酵素に基づくＤＮＡ操作技術などの他の技術によって生成することもできる。所与の公知の配列のポリヌクレオチドを生成する又は得るための技術は、当該技術分野において周知である。
【００４１】
本発明のポリヌクレオチドはまた、転写されているが翻訳されていない配列、終結シグナル、リボソーム結合部位、ｍＲＮＡ安定化配列、イントロン、及びポリアデニル化シグナルなどの、少なくとも１つの非コード配列を含んでもよい。
【００４２】
本発明の別の実施形態は、本発明のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを含むベクターである。
【００４３】
本発明の別の実施形態は、配列番号４２又は４７に示す配列を有する単離ポリヌクレオチドを含むベクターである。本発明のベクターは、ポリヌクレオチドを維持し、ポリヌクレオチドを複製し、又は再構成された生体系を包含する生体系において本発明のベクターによりコードされたポリペプチドの発現を促進するために有用である。ベクターは、細菌プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入エレメント、酵母染色体エレメント、バキュロウイルス、ＳＶ４０などのパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、家禽ジフテリアウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ピコロナウイルス及びレトロウイルスに由来するベクター、並びにコスミド及びファージミドなどのこれらの組み合わせに由来するベクターのような、染色体由来、エピソーム由来及びウイルス由来のものであってよい。
【００４４】
本発明のベクターは、アジュバント、脂質、緩衝液又は特定用途に適当なその他の賦形剤とともに、微小粒子中に配合されることができる。
【００４５】
本発明の１つの実施形態では、ベクターは発現ベクターである。発現ベクターは典型的に、このようなベクターによってコードされたポリペプチドの発現を制御、調節、惹起又は許容することができる核酸配列エレメントを含む。このようなエレメントは、転写エンハンサー結合部位、ＲＮＡポリメラーゼ開始部位、リボソーム結合部位、及び所与の発現系におけるコードされたポリペプチドの発現を促進する他の部位を含んでよい。このような発現系は、当該技術分野において周知の、細胞に基づく系、又は無細胞系であってよい。コードされたポリペプチドの発現に使用するのに好適な核酸配列エレメント及び親ベクター配列もまた、当該技術分野において周知である。
【００４６】
本発明の他の実施形態は、本発明のベクターを含む単離宿主細胞である。代表的な宿主細胞の例としては、古細菌細胞；細菌細胞、例えば連鎖球菌、ブドウ球菌、腸球菌、大腸菌、ストレプトミセス、シアノバクテリア、枯草菌、及び黄色ブドウ球菌；真菌細胞、例えばクリベロマイセス（Kluveromyces）、サッカロミセス、担子菌（Basidomycete）、カンジダアルビカンス、又はアスペルギルス；昆虫細胞、例えばドロソフィラＳ２及びスポドプテラＳｆ９；動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ，ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、２９３、ＣＶ−１、ボーズメラノーマ（Bowes melanoma）、及び骨髄腫；並びに植物細胞、例えば裸子植物又は被子植物細胞が挙げられる。本発明の方法における宿主細胞は、個々の細胞として提供されても細胞群として提供されてもよい。
【００４７】
ベクターなどのポリヌクレオチドの宿主細胞への導入は、当業者には周知の方法によって行うことができる（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２nd  ｅｄ．，Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ，１９９４；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３rd  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００１）。これらの方法としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング（scrape loading）、弾丸導入（ballistic introduction）、及び感染が挙げられる。
【００４８】
本発明の別の実施形態は、本発明の宿主細胞を提供する工程と、本発明の少なくとも１つのポリペプチドの発現に十分な条件下でこの宿主細胞を培養する工程とを含むポリペプチドの発現方法である。本発明のポリペプチドは、配列番号２〜３４及び３７〜３９に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【００４９】
宿主細胞は、所与の種類の宿主細胞を維持し又は増殖させるのに好適であり、ポリペプチドを発現させるために十分な、あらゆる条件下で培養され得る。ポリペプチドの発現に十分な培養条件、培地、及び関連する方法は、当該技術分野において周知である。例えば、多くの哺乳動物細胞種は、適切に緩衝されたＤＭＥＭ培地を用いて３７℃において好気的に培養することができ、一方、細菌、酵母及び他の細胞種は、ＬＢ培地中適切な雰囲気条件下で３７℃にて培養することができる。
【００５０】
本発明の方法では、ポリペプチドの発現は、当該技術分野において周知の種々の異なる技術を用いて確認することができる。例えば、ポリペプチドの発現は、ＳＤＳ−ｐａｇｅ、発現しているポリペプチドに特異的な抗体又は受容体リガンド等の検出試薬、あるいは例えばＦＡＣＳ又は免疫蛍光技術を用いて確認することができる。
【００５１】
本発明の他の特徴は、本発明を説明するために与えられ、本発明を限定することを意図するものではない例示的実施形態に関する以下の記載において明らかになるであろう。
【実施例】
【００５２】
（実施例１）
ＮＩａ変異体の作製及び特性評価
クローニング及び突然変異誘発
親和性精製のためのＮ−末端ポリヒスチジンタグを含む、配列番号１に示されるジャガイモウイルスＡ  ＮＩａプロテアーゼのアミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＢ５８２３８、アミノ酸残基２０３２〜２２６３）を、コドン使用頻度を最適化したｃＤＮＡ配列に逆翻訳した。配列をより小さな断片にし（parsing）、ＧＥＮＥＷＲＩＴＥＲ（商標）技術を用いてオリゴヌクレオチドとしてこれらを合成し、ＲＰ  ＨＰＬＣ（Ｄｉｏｎｅｘ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により精製することにより完全長ｃＤＮＡを作製した。次いで、米国特許第６，６７０，１２７号及び同第６，５２１，４２７号に記載の通り、精製オリゴヌクレオチドを完全長の二本鎖ｃＤＮＡ断片に組み立てた。
【００５３】
遺伝子組立プロセスにより得られたｃＤＮＡを、標準的なプロトコールを用いてｐＥＴ９ｄベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＮｃｏＩ／ＸｈｏＩ部位にクローニングした。活性部位のシステイン及び表面のスルフィドリル変化を標的とする突然変異誘発を、表１に示すオリゴヌクレオチドを用いるＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて行った。ＴＥＶ  ＮＩａプロテアーゼのタンパク質配列のアラインメント及び解かれた結晶構造（（Ａｌｌｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １５４：９〜２０，１９８６；Ｐｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：５０５６４〜７２，２００２）を用いて、ＮＩａプロテアーゼにおける不対システイン残基が表面に露出しているかどうかを推定した。これらは全て表面に露出していると考えられたので、全てを点突然変異の標的とした。第１段階として、活性部位のシステインを除く全てをセリン残基に変化させた。
【００５４】
位置１９のシステイン残基は、タンパク質発現の欠損により示される通り、セリン置換を許容しなかった（以下を参照されたい）。結果として、位置１９は、標準的なプロトコールを用いるＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発反応におけるＮＮＫオリゴを用いてランダム化された。残基１９の許容された置換を有する変異体を、タンパク質発現により同定した（以下を参照されたい）。Ｃ１５１Ｓ活性部位置換を上記の通りこれら変異体に導入して、触媒活性の差を評価した。作製された変異体及びそのアミノ酸配列を表２に示す。野性型ＮＩａ（配列番号４０）及び以下のＮＩａ変異体：Ｃ１５１Ｓ（配列番号４１）、Ｃ１９Ｖ／Ｃ１１０Ｓ／Ｃ１８１Ｓ／Ｃ２１１Ｓ（配列番号４２）、Ｃ１９Ｖ／Ｃ１１０Ｓ／Ｃ１５１Ｓ／Ｃ１８１Ｓ／Ｃ２１１Ｓ（配列番号４３）、Ｈｉｓ６−ＷＴ（配列番号４４）、ＷＴ−Ｈｉｓ６（配列番号４５）、Ｃ１５１Ｓ−Ｈｉｓ６（配列番号４６）、Ｃ１９Ｖ／Ｃ１１０Ｓ／Ｃ１８１Ｓ／Ｃ２１１Ｓ−Ｈｉｓ６（配列番号４７）、及びＣ１９Ｖ／Ｃ１１０Ｓ／Ｃ１５１Ｓ／Ｃ１８１Ｓ／Ｃ２１１Ｓ−Ｈｉｓ６（配列番号４８）について代表的なｃＤＮＡ配列を示す。
【００５５】
【表１】
0005908888.tif 000002
【００５６】
【表２】
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【００５７】
タンパク質発現
表１のＮＩａプロテアーゼ変異体のｃＤＮＡをコードするプラスミドをＢＬ２１細胞に形質転換し、形質転換体からの単一コロニーを、３７℃で一晩１００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地中で培養した。培養物のＯＤ６００が０．６〜０．８に達したとき、１ｍＭのＩＰＴＧを用いて、又はＴＢ自動誘導培地（Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａ，ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）中で細胞を培養することにより誘導を行った。２５℃又は１８℃で細胞を更に培養し、遠心分離し、−８０℃で保存した。野性型Ｃ１９残基を有する全てのＮＩａプロテアーゼ変異体が、調べた全ての表面スルフヒドリル変化の組み合わせにおいて非常に良好に発現した（表３）。
【００５８】
ＮＮＫライブラリについて、コンストラクトを上記の通りＴＢ自動誘導培地中で可溶性タンパク質発現についてスクリーニングした。ウエスタンブロットを行って、ＮＮＫ変異体の発現を分析した。
【００５９】
【表３】
0005908888.tif 000004
【００６０】
位置１９のＮＮＫ変異体のうちの幾つかは低レベルで検出可能であったが（変異体Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｆ、Ｇ及びＨ置換）（野性型ＮＩａのうちの１〜２％）、変異体Ｃ１９Ｖは、任意の他の変異体よりも著しく高いレベル、及び野性型ＮＩａと同等のレベルで発現した。この情報に基づいて、以下の変異体を更なる研究のために選択した：ＷＴ、Ｃ１５１Ｓ、Ｃ１１０Ｓ／Ｃ１８１Ｓ／Ｃ２１１Ｓ、Ｃ１１０Ｓ／Ｃ１５１Ｓ／Ｃ１８１Ｓ／Ｃ２１１Ｓ、Ｃ１９Ｖ／Ｃ１１０Ｓ／Ｃ１８１Ｓ／Ｃ２１１Ｓ、及びＣ１９Ｖ／Ｃ１１０Ｓ／Ｃ１５１Ｓ／Ｃ１８１Ｓ／Ｃ２１１Ｓ。
【００６１】
タンパク質の精製
還元剤である２ｍＭのＴＣＥＰの存在下で、標準的な方法を用いてタンパク質の精製を行った。簡潔に述べると、０．１Ｕ／ｍＬのベンゾアーゼ及び０．３ｍｇ／ｍＬのリゾチームを添加したバッファＡ（２０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ  ７．５，５００ｍＭ  ＮａＣｌ，２ｍＭ  ＴＣＥＰ）に細胞ペレットを再懸濁させ、氷上で超音波処理し、濾過し、ＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ精製システム（ＧＥ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いてバッファＡで予め平衡化された５ｍＬのＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰ（ＧＥ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）カラムに清澄化された（cleared）溶解物をロードした。バッファＡ中５０〜５００ｍＭのイミダゾールのイミダゾール段階勾配を用いてタンパク質を溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより画分を分析し、対象タンパク質を含有する画分をプールし、濃縮し、濾過し、次いで、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により更に精製した。濃縮及び精製されたサンプルを、バッファＡで予め平衡化されたＳｕｐｅｒｄｅｘ７５  ＳＥＣマトリクス（ＧＥ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に直接ロードし、１ｍＬ／分の流速で均一濃度で分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより画分を分析し、タンパク質を含有する画分をプールし、酵素活性について試験した。精製された変異体は全て良好に発現し、９５％を超える純度まで精製されていた。
【００６２】
また、タンパク質の発現、安定性、及び活性に対する酸化環境の影響を評価するために、変異体の一部（Ｃ１５１Ａ、Ｃ１９Ｖ／Ｃ１１０Ｓ／Ｃ１８１Ｓ／Ｃ２１１Ｓ、及びＣ１９Ｖ／Ｃ１１０Ｓ／Ｃ１５１Ｓ／Ｃ１８１Ｓ／Ｃ２１１Ｓ）を還元剤である２ｍＭのＴＣＥＰの非存在下で精製した。還元条件下でのみ、４つの遊離表面スルフヒドリルを有するＣ１５１Ａ変異体は、主に単一の単量体種に崩壊する。しかし、全ての表面スルフヒドリルが変化したプロテアーゼは、還元剤の完全な非存在下で単量体タンパク質として挙動する。これは、これら変化が、触媒活性を保持しながら明らかな物理的効果を提供することを示唆する（以下を参照されたい）。
【００６３】
基質及び活性の決定
野性型認識配列ＥＸＶＸＸＱＸ（配列番号７４）を用いて、ＰＶＡのポリタンパク質配列を探して、ＮＩａプロテアーゼのコンセンサス認識配列を決定した。これは、ＰＶＡポリタンパク質内のプロセシング分岐点を同定する、公開されている研究（Ｍｅｒｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌ．，８３：１２１１〜１２２１，２００２）とは独立して行った。公開されている及び潜在的な認識配列、並びにこの研究で求められたコンセンサス配列を表４に列挙する。選択認識配列に相当する合成ペプチドを、固相ペプチド化学（Ａｎａｓｐｅｃ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて合成し、野性型ＮＩａプロテアーゼによる切断について試験した。５μＭ  ＰＶＡ  ＮＩａプロテアーゼ及び５００μＭペプチドを含有する２０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、及び１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）中で反応を実施し、逆相ＨＰＬＣ及びＬＣ−ＭＳにより分析した。
【００６４】
また、ＮＩａプロテアーゼのコンセンサス認識配列ＥＮＶＴＦＱＧ（配列番号６５）を含有する融合基質タンパク質を用いて、各変異体の酵素活性を求めた。コンセンサス配列を融合タンパク質に導入し、基質として用いて、全てのＰＶＡ  ＮＩａプロテアーゼ変異体全ての酵素活性を評価した。配列はＮ−結合グリコシル化（ＮＶＴ）のコンセンサス部位を含有していたので、同程度に成功する別の配列ＥＡＶＴＦＱＧ（配列番号６６）を探した。これら融合タンパク質は、精製を促進するためのＮ末端ポリヒスチジンタグ、ＰＮＩａプロテアーゼコンセンサス認識配列、タンパク質分解切断を高感度で検出するためのＳ−タグ、及び融合基質タンパク質の可溶性発現を促進するための可溶性の高い「フィラー」タンパク質を含有していた。ｐＥＴ４１（Ｎｏｖａｇｅｎ）のトロンビン切断部位の３’末端とＸｈｏＩ部位との間の領域を増幅させ、５’プライマーに認識配列及びＮｄｅＩクローニング部位を付加し、ｐＥＴ２８（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ制限部位に挿入することによりこのカセットを作製した。次いで、「フィラー」タンパク質を、ｐＥＴ４１から得られた複数のクローニング部位に挿入することができた。ＥＮＶＴＦＱＧ及びＥＡＶＴＦＱＧコンセンサス認識配列を含む融合タンパク質のポリペプチド配列を、それぞれ配列番号６７及び６８に示す。
【００６５】
融合基質の対照として、ＴＥＶ（Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１７１：３５６〜３６４，１９８９）及びＴＶＭＶ  ＮＩａプロテアーゼ認識配列（Ｎａｌｌａｍｓｅｔｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃ．３８：１０８〜１１５，２００４）（表４）の両方を含む類似のコンストラクトを作製した。ヒトライノウイルス３Ｃ（ＨＲＶ３Ｃ）認識配列と同様に、Ｐ２’プロリンを含む融合タンパク質もコンセンサス配列のために作製し、基質として試験した（表４）。上記、列挙されたＴＥＶ及びＴＶＭＶプロテアーゼについて公開されている認識配列を含む、全ての認識配列を融合基質タンパク質に挿入した。２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び１ｍＭ  ＤＴＴ中で反応を実施し、３７℃で一晩反応させた。
【００６６】
３Ｃ様プロテアーゼの基質特異性は非常に高いことが示されているが（Ｔｏｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ＦＥＢＳ  Ｊ．２７２：５１４〜５２３，２００４）、ＮＩａ野性型プロテアーゼは、ＴＶＭＶ  ＮＩａプロテアーゼ認識配列を含む融合基質を切断することができたが、ＰＶＡ  ＮＩａプロテアーゼコンセンサス配列よりもはるかに低い割合であった。しかし、ＮＩａ野性型プロテアーゼは、このフォーマットでＰ２’プロリン残基を含むＴＥＶＮＩａプロテアーゼ認識配列、又はＰＶＡ  ＮＩａプロテアーゼコンセンサス配列を切断することはできず、後者は、ある程度のレベルのＰ２’特異性を示唆する（表４）。
【００６７】
【表４】
0005908888.tif 000005
【００６８】
野性型ＮＩａプロテアーゼ及び変異体Ｃ１５１Ｓ、Ｃ１１０Ｓ／Ｃ１８１Ｓ／Ｃ２１１Ｓ、Ｃ１１０Ｓ／Ｃ１５１Ｓ／Ｃ１８１Ｓ／Ｃ２１１Ｓ、Ｃ１９Ｖ／Ｃ１１０Ｓ／Ｃ１８１Ｓ／Ｃ２１１Ｓ及びＣ１９Ｖ／Ｃ１１０Ｓ／Ｃ１５１Ｓ／Ｃ１８１Ｓ／Ｃ２１１Ｓを、ＥＮＶＴＦＱＧ（配列番号６６）コンセンサス認識部位を含む融合基質タンパク質に対する活性についてスクリーニングした。反応条件は、上記と同一であった。基質のタンパク質分解切断をＳＤＳ−ＰＡＧＥによりモニタした。活性部位にシステイン残基を含む各ＮＩａプロテアーゼ（ＷＴ、Ｃ１１０Ｓ／Ｃ１８１Ｓ／Ｃ２１１Ｓ、Ｃ１９Ｖ／Ｃ１１０Ｓ／Ｃ１８１Ｓ／Ｃ２１１Ｓ）は、これら条件下で完全に基質を切断した。また、野性型ＮＩａと比較して（データは示されていない）低効率ではあるが（１〜５％の基質が切断された）、ＮＩａプロテアーゼ活性部位変異体（Ｃ１５１Ｓ、Ｃ１１０Ｓ／Ｃ１５１Ｓ／Ｃ１８１Ｓ／Ｃ２１１Ｓ、Ｃ１９Ｖ／Ｃ１１０Ｓ／Ｃ１５１Ｓ／Ｃ１８１Ｓ／Ｃ２１１Ｓ）も基質を切断した。
【００６９】
酵素の反応速度
野性型ＮＩａプロテアーゼ及び活性部位及び表面システイン変異体を、フルオロフォア／クエンチャー基質ペプチド４−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）ベンゾイル（ＤＡＢＣＹＬ）−ＹＧＥＮＶＴＦＱＧＳＫ−５−［（２−アミノエチル）アミノ］ナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）（Ａｎａｓｐｅｃ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）に対する活性について試験した。励起波長３４０ｎｍ及び発光波長４９０ｎｍを用いてＳｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｍ２マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）において反応速度測定を行った。２ｍＭの酵素及び０．１〜３００μＭの基質を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ中で反応を実施し、３７℃で３０分間反応させた。計算された理論的吸光係数から酵素濃度を求めた。それぞれについて初期速度を求め、表５に示す。
【００７０】
【表５】
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【００７１】
表面に露出しているシステイン残基の置換は、ＮＩａプロテアーゼの触媒活性に対して大きな影響を与えなかったが、活性部位のシステイン残基（Ｃ１５１）における置換は、活性を著しく低下させた。これは、置換されたセリンが、活性部位内の微小環境において触媒に必要なヒドロキシルプロトンを供与できないことにより説明することができるが、システインの脱プロトン化は生理学的ｐＨにおいて容易に生じる。
【００７２】
しかし、精製プロセス中及び活性測定中に還元剤が存在するかどうかが活性部位のシステインを有する分子にのみ影響を与えるかどうかを判定するために、２つのＰＶＡ  ＮＩａプロテアーゼ変異体（Ｃ１９Ｖ／Ｃ１１０Ｓ／Ｃ１８１Ｓ／Ｃ２１１Ｓ、及びＣ１９Ｖ／Ｃ１１０Ｓ／Ｃ１５１Ｓ／Ｃ１８１Ｓ／Ｃ２１１Ｓ）を精製し、還元剤の非存在下でアッセイした。還元剤が存在しないことは、いずれの変異体の活性に対してもわずかな影響しか与えなかった（表５）。これは、これらタンパク質における活性部位のシステインが、酸化環境に対して過度に感受性ではない場合もあり、傾向は、主に非活性部位のシステイ残基によるものであることを示唆する。
本発明は、以下の態様を包含する。
［１］
ＮＩａプロテアーゼ変異体をコードする単離ポリペプチドであって、前記変異体が酸化に対して耐性を示し、且つ活性を保持する、単離ポリペプチド。
［２］
前記ＮＩａプロテアーゼ変異体における少なくとも１つのシステイン残基が置換される、上記［１］に記載の単離ポリペプチド。
［３］
前記少なくとも１つのシステイン残基が、セリン、バリン、又はアラニンに置換される、上記［２］に記載の単離ポリペプチド。
［４］
単離ポリペプチドであって、
ａ．位置１９のシステインがセリン又はバリンに置換されている、
ｂ．位置１１０のシステインがセリンに置換されている、
ｃ．位置１５１のシステインがセリン又はアラニンに置換されている、
ｄ．位置１８１のシステインがセリンに置換されている、及び
ｅ．位置２１１のシステインがセリンに置換されている、
からなる群より選択される置換を有する配列番号１に示す配列を有するポリペプチドを
含む、単離ポリペプチド。
［５］
前記ポリペプチドが異種アミノ酸配列に融合する、上記［１］又は［４］に記載の単離ポリペプチド。
［６］
前記異種アミノ酸配列が、免疫グロブリン定常ドメイン若しくはその断片、リンカー、又はタグである、上記［５］に記載の単離ポリペプチド。
［７］
配列番号２８に示される配列を有するポリペプチドを含む単離ポリペプチド。
［８］
上記［４］に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、単離ポリヌクレオチド。
［９］
配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、単離ポリヌクレオチド。
［１０］
配列番号４２に示す配列を有するポリヌクレオチドを含む、単離ポリヌクレオチド。
［１１］
上記［４］に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを含む、ベクター。
［１２］
配列番号４２又は４７に示す配列を有する単離ポリヌクレオチドを含む、ベクター。
［１３］
上記［１１］又は［１２］に記載のベクターを含む、単離宿主細胞。
［１４］
ポリペプチドを発現させる方法であって、
ａ．上記［１１］に記載の宿主細胞を提供する工程と；
ｂ．上記［４］に記載の少なくとも１つのポリペプチドの発現に十分な条件下で前記宿主細胞を培養する工程と、
を含む、方法。
【配列表】
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