(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロトイルデンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードし、かつ下記（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される配列を含む、単離されたポリヌクレオチド：
ａ）添付の配列表の配列番号１又は１４；
ｂ）配列番号１又は１４に相補的な核酸配列；
ｃ）ａ）及びｂ）に定義した核酸配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列又はそれらの相補鎖。
【請求項２】
プロトイルデンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする、配列番号１又は１４からなる請求項１に記載される単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
プロトイルデンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする請求項１又は２に記載される核酸配列を含むベクターであって、前記核酸配列が、前記ベクターで形質転換された宿主細胞によって認識される配列を制御するように機能的に連結されている、ベクター。
【請求項４】
発現ベクターであることを特徴とする、請求項３に記載されるベクター。
【請求項５】
前記ベクターが、プラスミド、コスミド、ファージ、リポソーム、又はウイルスの形態で存在することを特徴とする、請求項３又は４に記載されるベクター。
【請求項６】
下記（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、プロトイルデンシンターゼ活性を有する、単離されたペプチド：
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の対立遺伝子変異体のアミノ酸配列であって、前記対立遺伝子変異体が、配列番号１又は１４に示される核酸分子の逆鎖と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされている、アミノ酸配列；及び
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列のオーソログのアミノ酸配列であって、前記オーソログが、配列番号１又は１４に示される核酸分子の逆鎖と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされている、アミノ酸配列。
【請求項７】
請求項３〜５のいずれか一項に記載されるベクターを含有する宿主細胞。
【請求項８】
前記宿主細胞が、真菌、細菌、昆虫、動物及び植物細胞からなる群より選択されることを特徴とする、請求項７に記載される宿主細胞。
【請求項９】
前記宿主細胞が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞であることを特徴とする、請求項７又は８に記載される宿主細胞。
【請求項１０】
前記プロトイルデンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸が、それぞれの細胞のコドン使用頻度に合わせて改変されていることを特徴とする、請求項７〜９のいずれか一項に記載される宿主細胞。
【請求項１１】
前記宿主細胞が、同担子菌類（ｈｏｍｏｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｓｔｅ）であることを特徴とする、請求項７又は８に記載される宿主細胞。
【請求項１２】
前記宿主細胞が、ナラタケ（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ）属の同担子菌類であることを特徴とする、請求項１１に記載される宿主細胞。
【請求項１３】
下記工程ａ及びｂを含む、メレオリドを生産する方法：
ａ．前記メレオリドの生産を可能にする好適な栄養条件下で、請求項７〜１２のいずれか一項に記載される宿主細胞を増殖させる工程；及び
ｂ．前記宿主細胞又はその増殖培地から前記メレオリドを単離する工程。
【請求項１４】
前記メレオリドが、メレオリドＩ、アルミラリジン、メレオリドＡ、メレオリドＦ、メレオリドＢ、メレオリドＫ、アルミリル・エベルニテート、アルミラリン、アルナミオール、メレオリドＪ、アルミラリビン、１０−α−ヒドロキシ−メレオリド、アルミリル・オルセリネート、メレオリドＥ、１−Ｏ−トリフルオロアセチル−メレオリドＥ、メレオリドＨ、５'−Ｏ−メチル−メレドナール、メレドナール、アルナミアール、メレオリドＣ、メレオリドＤ、メレドナールＡ、メレドナールＣ、メレドノールから選択されることを特徴とする、請求項１３に記載される方法。
【請求項１５】
前記工程ａ）及びｂ）が、下記工程ｉ〜ｉｖからなることを特徴とする、請求項１３又は１４に記載される方法：
ｉ．ａ）添付の配列プロトコルからの配列番号１又は１４、ｂ）配列番号１又は１４に相補的な核酸配列、並びにｃ）ａ）及びｂ）に定義した核酸配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列又はそれらの相補鎖から選択される核酸配列を含むように形質転換又は形質導入された宿主細胞を好適な栄養条件下で増殖させる工程；
ｉｉ．前記核酸配列を過剰発現させる工程；
ｉｉｉ．このようにして、前記宿主細胞でのメレオリド生産を増大させる工程；並びに
ｉｖ．前記宿主細胞又はその増殖培地からメレオリドを単離する工程。
【請求項１６】
メレオリドの生産を目的とする、請求項１又は２のいずれか一項に記載されるポリヌクレオチド、又は請求項３〜５のいずれか一項に記載されるベクター、又は請求項６に記載されるポリペプチドの使用。
【請求項１７】
前記メレオリドの生産が、プロトイルデンシンターゼをコードするポリヌクレオチドの異種過剰発現又は相同過剰発現を用いて実施されることを特徴とする、請求項１６に記載される使用。
【請求項１８】
前記宿主細胞が、酵母であることを特徴とする、請求項７又は８に記載される宿主細胞。
【請求項１９】
前記ナラタケ（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ）属の同担子菌類が、ワタゲナラタケ（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｇａｌｌｉｃａ）又はナラタケ（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｍｅｌｌｅａ）であることを特徴とする、請求項１２に記載される宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド及び当該ポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチド、並びにそれらの生産及び用途、さらにはそれらの変異体及びその用途に関する。さらに、本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド／ポリペプチドを用いることによってメレオリド及び関連する真菌性セスキテルペノイドアリールエステルを生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
メレオリドは、ナラタケ（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ）属の同担子菌類（ｈｏｍｏｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｓｔｅ）によって生産される特有の二次代謝物であり、その種は、食用キノコとしてみなされているだけではなく、多くの種が周知の森林寄生体であるが、このことは、栄養が不十分な地域全体にそれらが増殖するのを可能にする根状菌糸束を形成するその能力を表している。
【０００３】
メレオリドは、プロトイルデンタイプのセスキテルペノイドであり、強力な抗菌及び細胞傷害活性を有する。これまでのところ、約５０種のメレオリドが知られているが、これらは上記真菌属によってほぼ排他的に生産されている。各分子は、エステル結合を介して、オルセリン酸様ポリケチド側鎖に結合された三環式セスキテルペノイド骨格を含む。プロトイルデンの生合成は、普遍的セスキテルペノイド前駆体であるファルネシル二リン酸のプロトイルデンへの環化、次いでシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼによる更なる修飾、並びにこれに続くポリケチド側鎖の結合を含むと考えられている。
【０００４】
いくつかのテルペン、特に植物由来のテルペン（例えば、メントール、アルテミシニン又はタキソール）の生合成は、過去に詳しく研究されているが、大部分のテルペン、特に真菌により生産されるテルペンの合成についてはほとんど知られていない。
【０００５】
すべてのテルペンの生合成は、三つの普遍的前駆体、すなわちゲラニル二リン酸、ファルネシル二リン酸、若しくはゲラニルゲラニル二リン酸のうちの１つの環化及び転位で開始して、それぞれモノテルペノイド、セスキテルペノイド若しくはジテルペノイドを生産する。これらの環化反応は、テルペンシンターゼによって触媒されるが、これは天然で知られる最も複雑な化学反応の１つである。
【０００６】
一般に、植物テルペンシンターゼと真菌テルペンシンターゼは、低いレベルの配列同一性しか示さず、植物からは数種のテルペンシンターゼが単離されているが、微生物からは２、３種類しか報告されていない。また、非常に限られた数の真菌性セスキテルペノイドシンターゼしかクローニング、並びに機能的に特性決定されておらず、そのようなものとして例えば、トリコジエンシンターゼ、アリストロケンシンターゼ、及びプレシルフィペルフォラン−８ｂ−オールシンターゼがある。さらに、近年、主要産物としてゲルマクレンＡ、α−ムウロレン、δ−カジネン及びα−クプレネンを産生するウシグソヒトヨタケ（Ｃｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｃｉｎｅｒｅｕｓ）由来の６つのセスキテルペンシンターゼが特性決定されている。
【０００７】
プロトイルデンタイプのセスキテルペノイド（メレオリドとしても知られる；前記参照）の生合成は、普遍的セスキテルペノイド前駆体であるファルネシル二リン酸のプロトイルデンへの環化、次いでシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼによる更なる修飾、並びにこれに続くポリケチド鎖の結合を含むと考えられている。
【０００８】
医療において、特にメレオリドは、その抗菌及び細胞傷害活性によって非常に興味深いことから、これらを特異的に生産させるか、又は制御された方法で濃縮させることが望ましい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、本発明の目的は、相同的又は異種のいずれにかかわらず標的生産を達成するのに用いることができる新規の手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明によれば、上記及びその他の目的は、プロトイルデンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードし、且つ下記ａ）〜ｃ）からなる群より選択される配列を含む単離されたポリヌクレオチド、又は合成若しくは組換えポリヌクレオチドを提供することによって達成される：
ａ）添付の配列表の配列番号１又は１４；
ｂ）配列番号１又は１４に相補的な核酸配列；
ｃ）ａ）及びｂ）に定義した核酸配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列又はそれらの相補鎖。
【００１１】
上記目的は、さらに、メレオリドの生産を目的とする、前記ポリヌクレオチド又は前記ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの使用、及びメレオリドを生産するための各方法によって達成される。
【００１２】
上記目的はこのようにして完全に達成される。
【００１３】
前述したポリヌクレオチドは、プロトイルデンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするが、ポリヌクレオチドは、本発明者らの知る限りでは、初めて同定、精製され、酵素により特性決定された。この新規に同定されたポリヌクレオチドは、プロトイルデンへのファルネシル二リン酸の環化を触媒するが、その段階は、メレオリド生産の合成において極めて重要な段階を表している。従って、プロトイルデンシンターゼをコードする遺伝子を同定したことによって、例えば、新規に同定された遺伝子を過剰発現させて、プロトイルデンシンターゼの複数のコピーを生成することにより、メレオリドの生産に影響を与える貴重かつ有効な手段がみいだされ、生み出された。これを用いて、メレオリド合成の環化速度が高められ、これにより、メレオリドの生産が増大する。このようして、高度に濃縮されたメレオリドを得ることができ、こうしたメレオリドは、強力な抗菌性かつ細胞傷害性物質であり、治療及び医療のあらゆる分野において治療手段として用いることができる。
【００１４】
本発明によれば、「ポリヌクレオチド」という用語は、一般に、任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを指し、非修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又は修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡのいずれであってもよい。「ポリヌクレオチド」としては、限定するものではないが、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖領域又は一本鎖、二本鎖及び三本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、並びに一本鎖及び二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖又は、より一般的には二本鎖、若しくは三本鎖領域、あるいは一本鎖及び二本鎖領域の混合物のいずれであってもよいＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子がある。さらに、本明細書で用いられる「ポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又はＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を指す。こうした領域における鎖は、同じ分子由来のものであっても、異なる分子由来のものであってもよい。上記領域は、１つ以上の上記分子の全部を含んでいてもよいが、より一般には、上記分子のいくつかの１領域のみを含む。三重らせん領域の分子の１つは、多くの場合オリゴヌクレオチドである。本明細書で用いる「ポリヌクレオチド」という用語は、１つ以上の修飾塩基を含む前述のＤＮＡ又はＲＮＡも含む。従って、安定性若しくは別の理由のために修飾された骨格を有するＤＮＡ又はＲＮＡは、その用語が本明細書で意図される「ポリヌクレオチド」である。さらには、２つだけ例を挙げれば、イノシンのような特殊塩基、又はトリチル化塩基のような修飾塩基を含むＤＮＡ又はＲＮＡは、その用語が本明細書で用いられるポリヌクレオチドである。当業者には公知の多くの有用な目的に役立つＤＮＡ及びＲＮＡに対して、非常に多様な修飾が実施されていることは理解されよう。本明細書で用いられる「ポリヌクレオチド」という用語は、ポリヌクレオチドの化学的に、酵素により若しくは代謝により修飾された形態、並びにウイルス及び細胞（例えば、単細胞及び複合細胞など）に特有のＤＮＡ及びＲＮＡの化学形態を包含する。また、「ポリヌクレオチド」は、一般にオリゴヌクレオチドと呼ばれる短いポリヌクレオチドも包含する。
【００１５】
「ポリペプチド」とは、ペプチド結合又は修飾ペプチド結合によって互いに結合された２つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチド又はタンパク質を指す。「ポリペプチド」とは、一般にペプチド、オリゴペプチド及びオリゴマーと呼ばれる短い鎖と、一般にタンパク質と呼ばれる、より長い鎖の両方を指す。ポリペプチドは、２０個の遺伝子コード化アミノ酸以外のアミノ酸を含んでいてもよい。「ポリペプチド」は、プロセシング及びその他の翻訳後修飾のような自然のプロセス、また化学的修飾技術のいずれによって修飾されたものも含む。こうした修飾については基礎的テキストに十分に説明されており、研究論文、並びに大部の研究文書にさらに詳しく記載されており、当業者には公知である。所与のポリペプチドにおいて複数の部位に同じタイプの修飾が同じ程度若しくは様々な程度で存在してもよいことは理解されよう。また、所与のポリペプチドが様々な種類の修飾を含んでいてもよい。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、並びにアミノ若しくはカルボキシル末端など、ポリペプチドのどこに存在してもよい。修飾は、例えば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）の共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸塩の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、グリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のγ−カルボキシル化、ヒドロキシル化及びＡＤＰ−リボシル化、セレノイル化、硫酸化、タンパク質に対するｔＲＮＡ媒介によるアミノ酸付加、例えば、アルギニル化及びユビキチン化などがある。ポリペプチドは、分枝していてもよいし、分枝を含む、若しくは含まない環状であってもよい。環状、分枝及び分枝環状ポリペプチドは、翻訳後の天然プロセスから得られたものでもよいし、完全に合成方法によって作製したものでもよい。
【００１６】
「単離された」とは、その天然の状態から「人の手によって」改変されている、すなわち、もしそれが天然に存在するものであれば、変化しているか、若しくはその本来の環境から取り出されている、又はその両方を意味する。例えば、生存する生物に天然に存在しているポリヌクレオチド又はポリペプチドは、「単離されて」いないが、その天然の状態の共存材料から分離された同じポリヌクレオチド又はポリペプチドは、その用語が本明細書で用いられている意味で、「単離されて」いる。同様に、本明細書で用いられている「合成」配列という用語は、合成によって生成され、天然の供給源から直接単離されたものではない任意の配列を意味する。「組換え」とは、ある種に由来する遺伝子を別の種の宿主生物の細胞に移植又はスプライシングすることによって調製される遺伝子改変ＤＮＡを意味する。こうしたＤＮＡは、宿主の遺伝子組成の一部となり、複製される。
【００１７】
本明細書で用いられる「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という用語は、本発明のポリペプチド、特に、配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するワタゲナラタケ（Ａｍｉｌｌａｒｉａ  ｇａｌｌｉｃａ）のプロトイルデンシンターゼをコードする配列を含むポリヌクレオチドを包含する。この用語はまた、コード及び／又は非コード配列も含みうる別の領域と一緒に、ポリペプチドをコードする単一の連続的領域又は不連続的領域（例えば、組込まれたファージ又は挿入配列若しくは修正によって分断されたもの）を含むポリヌクレオチドも包含する。
【００１８】
本明細書で用いる「変異体」という用語は、それぞれ基準ポリヌクレオチド又はポリペプチドとは異なるが、本質的な特性を保持しているポリヌクレオチド又はポリペプチドである。ポリヌクレオチドの典型的な変異体は、これとは別の基準ポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列が異なる。変異体のヌクレオチド配列の変化によって、基準ポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドのアミノ酸配列が改変することもあれば、しないこともある。後述するように、ヌクレオチドの変化によって、基準配列によりコードされたポリペプチドにアミノ酸置換、付加、欠失、融合及び切断が起こりうる。ポリペプチドの典型的な変異体は、これとは別の基準ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。一般的に、相違は限定的であるため、基準ポリペプチド及び変異体の配列は全体として非常に類似しており、多数の領域で同一である。変異体と基準ポリペプチドは、１つ以上の置換、付加、欠失のいずれかの組合せによりアミノ酸配列が異なっている可能性がある。置換又は挿入されたアミノ酸残基は、遺伝コードによりコードされたものであってもよいし、そうでなくてもよい。ポリヌクレオチド又はポリペプチドの変異体は、対立遺伝子変異体のような天然に存在するものであってもよいし、天然に存在することが知られていない変異体であってもよい。ポリヌクレオチド又はポリペプチドの天然に存在しない変異体は、突然変異誘発技術、直接合成、並びに当業者には公知のその他の組換え方法によって作製することができる。
【００１９】
さらに、「宿主細胞」とは、形質転換若しくは形質導入された細胞、又は外来ポリヌクレオチド配列による形質転換若しくは形質導入が可能な細胞として現在定義されている。
【００２０】
本発明の一実施形態によれば、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１又は１４からなり、プロトイルデンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする。配列番号１はゲノム配列を表すのに対し、配列番号１４はｃＤＮＡを表す。
【００２１】
添付の配列表に開示する配列番号１及び１４は、それぞれ、ワタゲナラタケ（Ａｍｉｌｌａｒｉａ  ｇａｌｌｉｃａ）から同定されて、特性決定されたプロトイルデンシンターゼのゲノム配列及びｃＤＮＡである。新規に同定されたプロトイルデンシンターゼによって、類似のプロトイルデンシンターゼ、すなわち配列番号１又は１４とは若干異なるプロトイルデンシンターゼを、配列比較及びこれに続く酵素試験によって同定するのに用いることができる貴重な手段が提供されることから、上記配列の変異体（少なくとも９０％の配列同一性を有し、別のナラタケ（Ａｍｉｌｌａｒｉａ）種でもみいだされうる）もまた好適であり、本発明に含まれることが理解されるべきである。
【００２２】
本発明はまた、本発明の１つのポリヌクレオチド又は複数のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターで遺伝子改変される宿主細胞、並びに組換え技術による本発明のポリペプチドの生産にも関する。また、本発明のＤＮＡ構築物から誘導したＲＮＡを用いてこうしたポリペプチドを生産するために、無細胞翻訳系を使用することもできる。
【００２３】
従って、上記に加え、本発明はまた、プロトイルデン活性を有するポリペプチドをコードする、上に定義した核酸配列を含むベクターにも関する。尚、この核酸配列は、上記ベクターで形質転換された宿主細胞によって認識される配列を制御するように機能的に連結されている。本発明の一形態によれば、上記ベクターは、発現ベクターであり、別の形態によれば、上記ベクターは、プラスミド、コスミド、ファージ、リポソーム、若しくはウイルスの形態で存在させることができる。
【００２４】
組換え生産のために、発現系若しくはその部分、又は本発明のポリヌクレオチドを組み込むように宿主細胞を遺伝子改変することができる。宿主細胞へのポリヌクレオチドの導入は、多数の標準的実験マニュアル、例えば、Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｔｙ，（１９８６），及びＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｏｂｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）に記載されている方法によって実施することができる。
【００２５】
従って、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、宿主細胞中に安定的に形質転換／形質導入しようとするベクターに含有させてもよい。ベクターにおいて、本発明のポリヌクレオチドは、遺伝子／ポリヌクレオチドの発現を特異的にターゲッティングすることができるように、誘導プロモーターの制御下にあり、所望であれば、このようにして遺伝子を過剰発現させることもできる。
【００２６】
本発明のポリペプチドを生産するのに、非常に多様な発現系を用いることができる。こうしたベクターとして、中でも、染色体、エピソーム及びウイルス由来のベクター、例えば、細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポソン由来、酵母エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、ウイルス由来のベクター、並びにこれらの組合せ由来のベクター、例えば、プラスミド及びバクテリオファージ遺伝子エレメント（例えば、コスミド及びファージミド）由来のものがある。発現系構築物は、発現を調節すると共に、発現を発生させる制御領域を含んでいてもよい。一般的に、これに関しては、宿主においてポリヌクレオチドを維持し、増殖させる、若しくは発現させるのに適している、且つ／又はポリペプチドを発現させるのに適している任意の系若しくはベクターを発現に用いてよい。公知及び常用の技術、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（前掲参照）に記載の技術のいずれかにより、適切なＤＮＡ配列を発現系に挿入することができる。
【００２７】
以上のことから、本発明は、下記（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、単離されたペプチドにも関する：
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；
ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の対立遺伝子変異体のアミノ酸配列であって、前記対立遺伝子変異体が、配列番号１又は１４に示される核酸分子の逆鎖と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされている、アミノ酸配列；
ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列のオーソログのアミノ酸配列であって、前記オーソログが、配列番号１又は１４に示される核酸分子の逆鎖と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされている、アミノ酸配列；
（ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の断片であって、少なくとも１０個の連続したアミノ酸を含む断片。
【００２８】
また、本発明は、上に定義したベクターを含む宿主細胞、特に、酵母などの真菌、細菌、昆虫、動物及び植物細胞からなる群より選択される宿主細胞に関する。
【００２９】
本発明の別の形態によれば、それぞれの宿主細胞のコドン使用頻度に合わせて改変されたプロトイルデンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞を用いる。
【００３０】
本発明の別の実施形態によれば、宿主細胞は、同担子菌類、特にナラタケ（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ）属の同担子菌類（ｈｏｍｏｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｓｔｅ）、特にワタゲナラタケ（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｇａｌｌｉｃａ）、ナラタケ（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｍｅｌｌｅａ）、オニナラタケ（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｏｓｔｏｙａｅ）、並びにナラタケ（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ）属のその他のメンバーである。
【００３１】
本発明のさらに別の形態は、下記工程ａ及びｂを含む、メレオリドを生産する方法に関する：
ａ．メレオリドの生産を可能にする好適な栄養条件下で、上に定義した宿主細胞を増殖させる工程；及び
ｂ．上記宿主細胞又はその増殖培地から前記メレオリドを単離する工程。
【００３２】
本発明の一形態によれば、メレオリドは、メレオリドＩ、アルミラリジン、メレオリドＡ、メレオリドＦ、メレオリドＢ、メレオリドＫ、アルミリル・エベルニテート（ａｒｍｉｌｌｙｌ  ｅｖｅｒｎｉｔａｔｅ）、アルミラリン、アルナミオール、メレオリドＪ、アルミラリビン、１０−α−ヒドロキシ−メレオリド、アルミリル・オルセリネート（ａｒｍｉｌｌｙｌ  ｏｒｓｅｌｌｉｎａｔｅ）、メレオリドＥ、１−Ｏ−トリフルオロアセチル−メレオリドＥ、メレオリドＨ、５’−Ｏ−メチル−メレドナール、メレドナール、アルナミアール、メレオリドＣ、メレオリドＤ、メレドナールＡ、メレドナールＣ、メレドノールから選択される。
【００３３】
さらに別の形態によれば、前記工程を含む方法は、下記工程ｉ〜ｉｖからなる：
ｉ．ａ）添付の配列プロトコルからの配列番号１又は１４、ｂ）配列番号１又は１４に相補的な核酸配列、並びにｃ）ａ）及びｂ）に定義した核酸配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列又はそれらの相補鎖から選択される核酸配列を含むように形質転換若しくは形質導入された宿主細胞を好適な栄養条件下で増殖させる工程；
ｉｉ．上記核酸配列を過剰発現させる工程；
ｉｉｉ．このようにして、上記宿主細胞でのメレオリド生産を増大させる工程；並びに
ｉｖ．上記宿主細胞又はその増殖培地から前記メレオリドを単離する工程。
【００３４】
開示された方法とプロトイルデンシンターゼの標的過剰発現を用いれば、宿主細胞又は宿主細胞が含まれている培地にメレオリドを蓄積させることが可能である。宿主細胞又は宿主細胞培養物に、メレオリド生産の増大を達成又は補助するのに必要となりうる追加的及び／若しくは必須の前駆体又はその他の物質、栄養素若しくは代謝物を添加することは、当業者の技術及び知識の範囲内にあることが理解されるべきである。
【００３５】
従って、本発明はまた、上に定義した方法によって得られるメレオリドにも関する。こうして得られたメレオリドは、例えば、あらゆる細菌を原因とする感染又は疾患を治療するための薬剤として効果的に用いることができる。
【００３６】
以上のことから、本発明はまた、メレオリドの生産を目的とする、それぞれ上に定義したポリヌクレオチド、ベクター、又はポリペプチドの使用にも関連する。
【００３７】
本発明のメレオリドの生産は、プロトイルデンシンターゼをコードするポリヌクレオチドの異種過剰発現又は相同過剰発現によって実施され得ることが理解されるべきである。系及び方法、並びにそれぞれの好適な宿主細胞については、当業者が本発明の教示を読めば明瞭に理解されよう。
【００３８】
さらに別の利点が以下の実施形態及び添付の図面の説明から明らかになるであろう。
【００３９】
以上述べてきた特徴、並びにこれから説明しようとする特徴が、それぞれ明示した組合せだけではなく、別の組合せでも、あるいは単独でも、本発明の範囲を逸脱することなく用いられうることは言うまでもない。
【００４０】
本発明の複数の実施形態を図面に示し、以下の説明でさらに詳しく説明することにする。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】６−プロトイルデンへのファルネシル二リン酸の環化、酸化反応及び側鎖結合を含む、メレオリドＩ生合成のスキームを示す。
【図２】ワタゲナラタケ（Ａ．ｇａｌｌｉｃａ）株ＦＵ０２４７２液内培養有機抽出物のＨＰＬＣ分析を示す。利用可能な標準を用いて、観察した化合物ピークのうち２つをメレオリドＩ及びアルミラリジンとして同定した。
【図３】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に発現させたＰｒｏ１クローンがプロトイルデンシンターゼ活性を有することを確認するための非放射性及び放射性試験アッセイを示す。Ａ／Ｂ）特徴的な質量スペクトルを有する保持時間８．７７分でピークを示すガスクロマトグラム。Ａ）Ｐｒｏ１を発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）クローンからの抽出物。Ｂ）ワタゲナラタケ（Ａ．ｇａｌｌｉｃａ）菌糸体からの抽出物。Ｃ〜Ｆ）ラジオＴＬＣアッセイ：一点鎖線は開始であり、破線は溶媒前端である。Ｃ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐＵＣ１９ネガティブコントロール。Ｄ）ジテルペンシンターゼの基質である［１−3Ｈ］−ＧＧＰＰと一緒にインキュベートした大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｐｒｏ１クローン。Ｅ）［１−3Ｈ］−ＦＰＰと一緒にインキュベートした大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｐｒｏ１クローン。Ｆ）ワタゲナラタケ（Ａ．ｇａｌｌｉｃａ）ポジティブコントロール。
【図４】真菌性セスキテルペンシンターゼの推定アミノ酸配列アラインメントを示す。ワタゲナラタケ（Ａ．ｇａｌｌｉｃａ）プロトイルデンシンターゼ（クローンＰｒｏ１；配列番号２）、ウシグソヒヒトヨタケ（Ｃｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）−ムウロレンシンターゼ（Ｃｏｐ３；配列番号１２「Ｃｏｐ３」）及びＣｏｐ５（いまだ未知の産物を含むセスキテルペンシンターゼ；配列番号１３「Ｃｏｐ５」）を比較する。黒いボックスは３つの配列について同一である残基を示し、グレーのボックスは、３つの配列のうち２つについて同一である残基を示す。Ｂ）黒いボックスとして示すエキソンと保存されているＤＥＸＸＤ及びＮＤｘｘＳｘｘｘＥモチーフを有するワタゲナラタケ（Ａ．ｇａｌｌｉｃａ）プロトイルデンシンターゼゲノム配列を概略的に表す図。
【図５】サザンブロットハイブリダイゼーションによるワタゲナラタケ（Ａ．ｇａｌｌｉｃａ）プロトイルデンシンターゼ遺伝子コピー数の決定を示す。ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩレーンには１つのはっきりしたバンドが見える（いずれの酵素もゲノムクローンに標的部位がある）のに対し、ＨｉｎｄＩＩＩレーンには２つのバンドが見える（このクローンには、８５ｂｐ離れた２つの標的部位がある）。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
図１に、メレオリドＩ生合成の推定スキームを示すが、これは、６−プロトイルデンへのファルネシル二リン酸の環化、酸化反応及び側鎖結合を含む。
【実施例】
【００４３】
実施例１：タンパク質抽出物の調製
Ｔｒａｕｎｓｅｅ（オーストリア）付近で採集した担子器果から、ワタゲナラタケ（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｇａｌｌｉｃａ）株ＦＵ０２４７２を樹立し、２００ｍＬのＹＭＧ培地を含む５００ｍＬ  Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ振盪フラスコのバッチ式液内培養において、２３℃にて１４０ｒｐｍで撹拌しながら増殖させた。菌糸体を培養ブロスからろ過によって回収し、液体窒素で衝撃凍結した後、−８０℃で貯蔵した。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）をクローニングに使用し、また異種タンパク質発現には、Ｇａｔｅｗａｙ（商標）適合ベクターｐＤＥＳＴ１４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と一緒に、株ＢＬ２１（ＤＥ３）ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた。
【００４４】
ナラタケ（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ）からタンパク質抽出物を調製するために、ワタゲナラタケ（Ａ．ｇａｌｌｉｃａ）細胞培養物を液体窒素で凍結させ、乳鉢で破砕した。５容量の抽出バッファー（５０ｍＭ  ＭＥＳ、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール及び０．１ｇ／ｇ菌糸体ＰＶＰＰ、ｐＨ６．５）を粉末に添加した。Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘを用いてさらに処理した（１２，０００ｒｐｍで１分）後、タンパク質抽出物を遠心分離（４℃にて５，０００ｒｐｍで１０分）により清澄にした。タンパク質濃度をＱｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ  Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏｒａｄ）によって決定した。すべてのタンパク質定量アッセイは３回反復して実施した。
【００４５】
前記抽出バッファー中の培養物から細胞ペレットを分離することにより、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）タンパク質抽出物を調製して、細胞を２ラウンドのＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ処理により、一定冷却下で溶解した。
【００４６】
アッセイバッファー（５０ｍＭ  ＭＯＰＳ、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、ｐＨ７．２）中の［１−3Ｈ］−ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）（２０Ｃｉ／ｍモル）（Ｂｉｏｔｅｎｄ）を用いて、プロトイルデンシンターゼ活性を決定した。５００ｎＭの［１−3Ｈ］−ＦＰＰを２分用いた後、酢酸エチルでクエンチングすることにより、標準的プロトイルデンシンターゼ活性測定を実施した。次に、有機抽出物の一部をシリカゲルＴＬＣプレート上にスポットしてから、溶媒として９：１シクロヘキサン：酢酸エチルを用いて分離した後、ラジオＴＬＣリーダー（Ｒａｙｔｅｓｔ，Ｓｔｒａｕｂｅｎｈａｒｄｔ）で分析した。ＫM値の決定のために、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ（最終濃度）でクエンチングすることにより反応を停止した後、ｎ−ペンタンで抽出し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーよる精製、次いで液体シンチレーション計数による定量を実施した。すべての動態活性アッセイは３回反復して実施した。溶媒抽出物の質量分析法による分析を、Ｒｘｉ（商標）−５ｍｓ（内径０．２５ｍｍ、長さ３０ｍ）カラム（Ｒｅｓｔｅｋ）を備えたＱＰ２０１０Ｓ四極質量分析計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）で、以下の温度プログラムを用いて実施した：８０℃で２０分の後、カラムを速度１５℃／分で３００℃まで加熱し、３００℃の最終一定温度を４分。１ｋｅＶでの電気イオン化によってフラグメント化を達成した。
【００４７】
実施例２：ｃＤＮＡライブラリー構築及び配列決定
塩化セシウム−密度勾配と、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ）によって精製したワタゲナラタケ（Ａ．ｇａｌｌｉｃａ）株ＦＵ０２４７２ｍＲＮＡとを用いて、製造者のプロトコルに従い、ワタゲナラタケ（Ａ．ｇａｌｌｉｃａ）ＣｌｏｎｅＭｉｎｅｒ（商標）ｃＤＮＡライブラリー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を構築した。組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を５０μｇ／ｍＬカナマイシン含有２ＹＴ−寒天プレート上で選択して、２８００個のランダムに採取したコロニーを、選択のための５０μｇ／ｍＬカナマイシンと一緒に、ウェル当たり２００μＬの２ＹＴ培地を含む９６−ウェルマイクロプレートに移した。プレートを１６０ｒｐｍで連続振盪しながら、３７℃で約１２時間インキュベートした。フォワードプライマー５’−ＣＴＣ  ＧＣＧ  ＴＴＡ  ＡＣＧ  ＣＴＡ  ＧＣＡ  ＴＧＧ  ＡＴＧ−３’（配列番号３）及びリバースプライマー５’−ＧＴＧ  ＡＧＴ  ＣＧＴ  ＡＴＴ  ＡＣＡ  ＴＧＧ  ＴＣＡ  ＴＡＧ  ＣＴＧ−３’（配列番号４）を用いて、ワタゲナラタケ（Ａ．ｇａｌｌｉｃａ）ｃＤＮＡを培養物から直接増幅させた。ＰＣＲ産物を清浄にしてから、プライマー５’−ＣＧＡ  ＣＧＧ  ＣＣＡ  ＧＴＣ  ＴＴＡ  ＡＧＣ  ＴＣＧ  ＧＧＣ−３’（配列番号５）を用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７３０  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒで配列決定した（Ｆｒａｕｎｈｏｆｅｒ  ＩＭＥ  Ａａｃｈｅｎ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｇｒｏｕｐ）。配列データを、ＣＬＣ  Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ  ３  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＣＬＣ  ｂｉｏ）、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ  Ｐａｃｋａｇｅ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴｘ及びＬｏｃａｌ  ＢＬＡＳＴを用いて分析した。
【００４８】
実施例３：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるワタゲナラタケ（Ａ．ｇａｌｌｉｃａ）プロトイルデンシンターゼの異種発現
ｃＤＮＡ配列決定により、候補テルペンシンターゼクローンをみいだした場合には、対応するｐＥＮＴＲＹベクターを、ｐＤＥＳＴ１４  ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎベクターを用いるＬＲ組換え反応に使用した。得られた発現構築物を異種発現のために大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｃｏｄｏｎ  ｐｌｕｓ  ｃｅｌｌｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に導入した。組換え細菌をＦｅｒｅｎｂａｃｈ−ｂａｆｆｌｅｄフラスコ中で培養して、ＯＤ600が０．５に達したら１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導した。誘導した細菌を１６０ｒｐｍで一定に振盪しながら２８℃で８時間維持した。次に、遠心分離により細胞を回収し、プロトイルデンアッセイバッファー中に再懸濁させた後、マイクロフルイダイザーを用いて溶解させた。
【００４９】
実施例４：ゲノムＤＮＡ単離及びサザンブロットハイブリダイゼーション
ワタゲナラタケ（Ａ．ｇａｌｌｉｃａ）ゲノムＤＮＡをセチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）法を用いて単離した後、１２０μｇを、必要に応じて５０単位のＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ若しくはＨｉｎｄＩＩＩ（ＮＥＢ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で８時間消化した。消化したＤＮＡを一定５０Ｖでの０．７％アガロースゲル電気泳動に一晩かけて分画し、陽荷電ナイロン膜（Ｒｏｃｈｅ）に移した後、一本鎖サケ精子ＤＮＡを含有するＲｏｔｉ（登録商標）−Ｈｙｂｒｉ−Ｑｕｉｃｋ（Ｒｏｔｈ）とプレハイブリダイズさせた。２つの核酸プローブ（約４００ｂｐ）を、プローブ１については、フォワードプライマー５’−ＣＣＴ  ＴＣＣ  ＴＧＡ  ＴＡＣ  ＴＣＴ  ＴＧＣ  ＣＡＡ  ＣＴＧ−３’（配列番号６）及びリバースプライマー５’−ＣＣＴ  ＣＣＴ  ＣＣＧ  ＴＣＧ  ＡＧＡ  ＣＧＴ  ＣＣＧ  ＡＧＴ  ＡＣ−３’（配列番号７）を、またプローブ２については、フォワードプライマー５’−ＧＴＣ  ＡＴＣ  ＡＡＴ  ＣＡＴ  ＣＣＧ  ＧＴＴ  ＡＴＣ  ＡＡＡ  Ｇ−３’（配列番号８）及びリバースプライマー５’−ＣＴＴ  ＧＧＧ  ＣＡＴ  ＣＡＧ  ＣＧＴ  ＴＡＴ  ＣＣＡ  ＣＣＴ  Ｃ−３’（配列番号９）を用いて、ＰＣＲにより合成した。これらの産物は、製造者の推奨に従い、ＤｅｃａＬａｂｅｌ（商標）ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｆｅｒｍｅｔａｓ）を用いて、α−32Ｐ−ｄＡＴＰ（Ｈａｒｔｍａｎｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃ）で標識した。
【００５０】
実施例５：ワタゲナラタケ（Ａ．ｇａｌｌｉｃａ）プロトイルデンシンターゼゲノムクローンの単離
ワタゲナラタケ（Ａ．ｇａｌｌｉｃａ）プロトイルデンシンターゼ遺伝子を含むゲノムクローンを、フォワードプライマー５’−ＧＧＧ  ＧＡＣ  ＡＡＧ  ＴＴＴ  ＧＴＡ  ＣＡＡ  ＡＡＡ  ＡＧＣ  ＡＧＧ  ＣＴＴ  ＣＧＡ  ＡＧＧ  ＡＧＡ  ＴＡＧ  ＡＡＣ  ＣＡＴ  ＧＴＣ  ＴＣＡ  ＡＣＧ  ＣＡＴ  ＣＴＴ  ＣＣＴ  ＴＣＣ  ＴＧ−３’（配列番号１０）、リバースプライマー５’−ＧＧＧ  ＧＡＣ  ＣＡＣ  ＴＴＴ  ＧＴＡ  ＣＡＡ  ＧＡＡ  ＡＧＣ  ＴＧＧ  ＧＴＴ  ＴＡＧ  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＡＡＴ  ＣＣＧ  ＴＣＡ  ＡＣＡ  ＡＴＴ  ＴＧＡ  ＧＧ−３’（配列番号１１）及び５０−ｌ反応液中のＨｅｒｃｕｌａｓｅ（登録商標）ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、１００ｎｇのワタゲナラタケ（Ａ．ｇａｌｌｉｃａ）ゲノムＤＮＡを増幅することにより単離した。前述したように、ＰＣＲ産物を精製した後、配列決定した。
【００５１】
実施例６：結果及び論考
Ｔｒａｕｎｓｅｅ（オーストリア）付近で採集したキノコ標本から細胞培養物（ＦＵ０２４７２）を樹立することにより、推定ナラタケ（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｇａｌｌｉｃａ）プロトイルデンシンターゼを単離して、特性決定した。この培養物を、メレオリド生産を可能にする液体ＹＭ６．３培地中で培養した。約５００時間の発酵後、培養物を回収して、メレオリド産物プロフィールを、適切な対照物質を用いてＬＣ−ＵＶ−ＭＳにより決定した。ＦＵ０２４７２によって生産された主要メレオリドは、メレオリドＩ及びアルミラリジンとして同定された（図２を参照）。
【００５２】
様々な時点で培養物をサンプリングすることにより、メレオリド蓄積プロフィール及びプロトイルデンシンターゼ活性を長時間にわたって調査した。放射性標識ファルネシル二リン酸と一緒に、培養物からの可溶性酵素抽出物をインキュベートすることにより、酵素活性を試験した。次いで、これら反応物からの有機抽出物をラジオＴＬＣによって分析した（図３参照）。試験したすべての粗タンパク質抽出物において様々なレベルのプロトイルデンシンターゼ活性が観察され、Ｒｆ値０．７の強度の非極性産物（仮に６−プロトイルデンと同定する）と、Ｒｆ値０．１の産物（仮にファルネソールと同定する）が得られた。２つの産物のアイデンティティーは後にＧＣ−ＭＳによって確認した（以下参照）。熱不活性化した対照画分は、ファルネシル二リン酸を非極性産物に変換することができなかった。最も高いプロトイルデンシンターゼ活性が１８５時間後の培養物において観察されたため、この時点を酵素精製のために選択した。
【００５３】
次に、可溶性タンパク質画分における推定プロトイルデンシンターゼ活性が、実際に、真菌抽出物中に存在するプロトイルデンシンターゼ酵素活性によるものであるか否かを決定した。そのため、非放射性ファルネシル二リン酸にトリチウム標識材料を加えてから、ＦＵ０２４７２由来の可溶性タンパク質抽出物と一緒に１２時間インキュベートした。次いで、放射性材料画分をラジオＴＬＣ及びＧＣ−ＭＳによって分析することにより、産物のＲｆ値及びアイデンティティーを確認した。抽出した産物の質量スペクトルによって、ｍ／ｚ２０４（２４％）の分子親イオンと共に、ｍ／ｚ１７５（１００％）、１１９（９１％）、１０５（５９％）、１３３（３５％）、９１（４０％）、１８９（１７％）、１６１（１５％）及び１４７（１４％）のイオンが得られた。観察されたフラグメント化パターンは、セスキテルペノイド６−プロトイルデンについて以前報告されたものと一致した（図２参照）。驚くことに、ＧＣ−Ｍｓ分析によって７−プロトイルデンの存在は明らかにされなかったが、これは、最終的なメレオリド最終産物に観察されるように、６（７）位から７（８）位へのアリル転位が起こったことを示している。類似のアリル転位が、パクリタキセルの合成において、シトクロムＰ４５０依存性モノオキシゲナーゼによって触媒されるタキサ−４（５），１１（１２）−ジエンのタキサ−４（２０），１１（１２）−ジエンへの、及びタキサ−４（５），１１（１２）−ジエン−５−オールへの転換について記載されている（Ｊｅｎｎｅｗｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。従って、出願人らは、メレオリド生合成中に、アリル転位とヒドロキシル化反応の両方を触媒する類似のシトクロムＰ４５０依存性モノオキシゲナーゼ段階が関与していると考える。
【００５４】
前記酵素の更なる特性決定を、部分的に精製したワタゲナラタケ（Ａ．ｇａｌｌｉｃａ）プロトイルデンシンターゼ、チチウム（ｔｉｔｉｕｍ）標識ファルネシル二リン酸及びラジオＴＬＣ分析を用いて実施した。これらの実験から、ファルネシル二リン酸のＫmが０．５３Ｍであることが明らかになった。予想通り、酵素活性は二価金属イオンに完全に依存していることがわかった。最も高いプロトイルデンシンターゼ活性は、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2の存在下で達成され、代わりにＭｎＣｌ2を用いると７５％低下した。最適温度は２２℃であり、＞３５℃では活性がほぼ完全に消失した。複数の緩衝系を５０ｍＭで試験したところ、ｐＨ７．２（ＭＯＰＳバッファー）で最適活性が得られた。活性はｐＨ５．８（ＭＥＳバッファー）及びｐＨ８．５（Ｔｒｉｓバッファー）で５０％低下した。酵素はまた、エタノールの存在に対して非常に感受性が高く、５％という低い濃度であっても活性の著しい低減を引き起こした。
【００５５】
真菌の菌糸体からワタゲナラタケ（Ａ．ｇａｌｌｉｃａ）のプロトイルデンシンターゼタンパク質を均一になる（ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ）まで精製して、Ｅｄｍａｎ配列決定によりＮ−末端アミノ酸配列を決定する試みはうまくいかなかったことが明らかになったが、この酵素は恐らく４５ｋＤａモノマーであることがわかった。ｃＤＮＡライブラリーをＦＵ０２４７２菌糸体培養物から構築した後、２５９２個のランダムに選んだクローンからの配列の分析によって、真菌性テルペンシンターゼ（例えば、ウシグソヒヒトヨタケ（Ｃｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｃｉｎｅｒｅｕｓ）由来のもの）との相同性を有する６つの部分配列が同定された。これら配列のうち５つ（２つの全長ｃＤＮＡ、１つの部分ｃＤＮＡ、並びにイントロンを含む２つのクローン）は、単一の推定プロトイルデンシンターゼ遺伝子（Ｐｒｏ１と称される）を呈示した。残る配列、すなわち長さが約６００ｂｐの部分ｃＤＮＡは、Ｐｒｏ２と称される異なる遺伝子を呈示した。２つの推定酵素は、比較に利用可能な約２００個の残基についてアミノ酸レベルで約５５％の同一性を示した。Ｐｒｏ１の更なる分析から、長さ１０４２ｂｐのオープンリーディングフレームが明らかになり、これは、３４７個のアミノ酸残基及び推定分子質量４０ｋＤａを有するタンパク質をコードする。Ｐｒｏ１ポリペプチドは、他のテルペンシンターゼに特徴的であるのと同様に、適切な配向でＤＥＸＸＤ及びＮＤｘｘＳｘｘｘＥモチーフを含有していた。Ｐｒｏ１アミノ酸配列を用いて、ＧｅｎＢａｎｋを検索したところ、担子菌類ウシグソヒヒトヨタケ（Ｃｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）由来のＣｏｐ３及びＣｏｐ５セスキテルペンシンターゼとの近縁関係（それぞれ３２．６％及び３３％の同一性）が明らかになった。Ｃｏｐ３は−ムウロレンシンターゼであるが、Ｃｏｐ５の正確な機能は未だ決定されていない。Ｐｒｏ１と、子嚢菌又は植物由来のテルペンシンターゼとの間に、有意な相同性はまったく観察されなかった。
【００５６】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）におけるＰｒｏ１の異種発現によって、０．５Ｍトリチウム標識ファルネシル二リン酸基質の８０％を５分以内に６−プロトイルデンの特性（Ｒｆ＝０．７）に適合する産物に変換するのに十分なセスキテルペンシンターゼ活性を有する粗可溶性タンパク質抽出物が得られた。同じ溶解物をゲルナイルゲラニル（ｇｅｒｎａｙｌｇｅｒａｎｙｌ）二リン酸と一緒にインキュベートしても、有意な量のより低極性の産物は生産されず（＜１％）、空ベクター対照由来の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）対照溶解物を用いた場合、ファルネシル二リン酸及びゲラルニルゲラニル二リン酸のいずれも、より低極性の産物に変換されなかった（図３参照）。ペンタンで抽出した非放射性ファルネシル二リン酸を用いた異種テルペンシンターゼの特性決定、並びにＧＣ−ＭＳによる有機抽出物の分析によって、天然のプロトイルデンシンターゼと同一の保持時間及び質量スペクトルを有する産物の形成が明らかにされた。
【００５７】
１２７０全長Ｐｒｏ１ｃＤＮＡクローンを用いて、対応するゲノムＤＮＡ配列の増幅を可能にするプライマーを設計した（図４）。１６４５ｂｐの産物の分析により、８つのイントロンと９つのエキソンの存在が明らかになり、中には５０ｂｐという短いものもあった。植物テルペンシンターゼ遺伝子の以前の分析からはイントロンはほとんどみいだされなかった。Ｐｒｏ１クローンの５’及び３’末端をそれぞれ呈示する２つのオリゴヌクレオチドプローブを用いたサザンブロットによって、ワタゲナラタケ（Ａ．ｇａｌｌｉｃａ）ゲノムにはＰｒｏ１遺伝子のたった１つのコピーしかないことがわかった（図５）。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【配列表】
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