(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴｄＩＣ２６−ｍｅｒ（配列番号１）、Ｉ−ＯＤＮ１（配列番号２）、Ｉ−ＯＤＮ２（配列番号３）、Ｉ−ＯＤＮ３（配列番号４）、Ｉ−ＯＤＮ９（配列番号５）およびＩ−ＯＤＮ１０（配列番号６）よりなる群から選ばれたオリゴデオキシ核酸分子（ＯＤＮ）を含む免疫促進用医薬組成物。
【請求項２】
さらにポリカチオン性ポリマーを含む、請求項１に記載の免疫促進用医薬組成物。
【請求項３】
該ポリカチオン性ポリマーが、ポリカチオン性ペプチド、抗菌性ペプチド、３〜７の疎水性アミノ酸のリンカーによって隔てられた少なくとも２つのＫＬＫモチーフを含む合成ペプチドまたは成長ホルモンである、請求項２に記載の免疫促進用医薬組成物。
【請求項４】
さらに活性成分を含む、請求項１ないし３のいずれかに記載の免疫促進用医薬組成物。
【請求項５】
さらに補助物質を含む、請求項１ないし４のいずれかに記載の免疫促進用医薬組成物。
【請求項６】
請求項１に記載の１またはそれ以上のＯＤＮを１ｎｇ〜１ｇ含む、請求項１ないし５のいずれかに記載の免疫促進用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫促進性のオリゴデオキシ核酸分子（ＯＤＮ）およびそのようなＯＤＮを含有する医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ワクチンは、他のいかなる医学的介入よりも多くの生命（および資源）を救うことができる（非特許文献１）。世界的なワクチン接種プログラムのおかげで多くの致死的疾患の発症率は急激に減少している。この見方は疾患の完成されたパネル（whole panel）、たとえば、結核、ジフテリア、百日咳、麻疹および破傷風にはあてはまるが、ＡＩＤＳなどの大抵のウイルス感染症を含む多数の感染疾患に対する有効なワクチンは存在しない。また、感染性であるか非感染性であるかを問わず、マラリアおよび癌を含めて毎年何百万もの患者の何百万もの人命を奪う他の疾患に対するワクチンも存在しない。さらに、抗生物質に耐性の細菌および微生物の急激な出現は他の治療を要求しており、ワクチンは必然の選択となってきている。最後に、ワクチンに対する大いなる必要性はまた、心血管性疾患または癌または創傷よりもむしろ感染疾患が世界的に死亡および不具の最大の原因であるという事実によっても説明される（非特許文献２）。
【０００３】
免疫学的な観点からの今日のワクチンの分野における１つの主要な問題は、伝統的なワクチン（および/またはこれら製剤に含まれる免疫変調化合物）が高レベルの抗体を誘発させるべくデザインされているということである（非特許文献３）。しかしながら、抗体自体は、ウイルス、細胞内細菌、ある種の寄生虫および癌によって引き起こされる大抵の病気を含む多数の疾患を防ぐうえでは有効ではない。そのような疾患の例は、これらに限られるわけではないが、上記ＨＩＶウイルスまたはマラリアの場合のPlasmodium種である。多くの実験系で、これら適応症には免疫系の体液性部門よりもむしろＴ細胞を含む細胞性部門が重要であることが示されている。それゆえ、従来のワクチンの限界を克服する新規で革新的な技術が必要とされている。焦点は、抗原特異的なＴ細胞（病原感染細胞上に発現された分子を認識する）を含む細胞性の免疫系を信頼性をもって誘発する技術に対するものでなければならない。理想的には、ワクチンは、正常な細胞から病気になった細胞および/または感染した細胞を識別できるＴ細胞と、それと同時に細胞外画分中の病原体を認識するＢ細胞によって分泌される抗体との両者を誘発させるべくデザインされる。
【０００４】
幾つかの確立されたワクチンは、生きた弱毒化した微生物からなるが、ビルレントな野生株に逆戻りする危険が存在する。この点は、とりわけ免疫無防備状態の宿主では生命を脅かす筋書きともなりうる。別法として、ワクチンは病原体由来の抗原をこれら抗原に対する免疫応答を誘発もしくは促進する化合物（これら化合物は一般にアジュバントと呼ばれる）と組み合わせて投与される。なぜなら、これらサブユニットワクチン自体は一般に有効でないからである。
【０００５】
上記ワクチンが価値ある医学的治療であることに疑問はないわけであるが、その複合性ゆえに、たとえばワクチン接種した個体の細胞によって発現される分子と交差反応性を示すワクチンに含まれる抗原に対して重篤な副作用が惹起されうるという不利がある。さらに、規制当局、たとえば世界保健機構（ＷＨＯ）、食品医薬品局（ＦＤＡ）、およびそれらの対応ヨーロッパ部門による、ワクチンの組成および免疫の誘発機構の正確な記述に対する現存する要求は、満たすのが難しい。
【０００６】
抗原提示細胞は先天免疫系に属しており、先天免疫系は微生物への暴露後の初期に感染を制限する第一線の宿主防御として発展してきたものである（非特許文献４）。先天免疫系の細胞は、獲得免疫系によって認識される一層複雑で特異的な構造ではなく、標的上に発現されたパターンないし比較的に非特異的な構造を認識する（非特許文献４）。先天免疫系の細胞の例はマクロファージおよび樹状細胞であるが、顆粒球（たとえば、好中球）、ナチュラルキラー細胞その他もそうである。対照的に、獲得免疫系の細胞は、Ｔ細胞の場合にはペプチドを含む特異的で抗原性の構造を認識し、Ｂ細胞の場合にはペプチド並びに三次元構造を認識する。獲得免疫系は先天免疫系に比べてはるかに特異的で複雑であり、所定の病原体／抗原への暴露を繰り返すことにより改善される。
【０００７】
系統発生的には先天免疫系は遥かに古く、非常に原始的な生物において既に認めることができる。それにもかかわらず、先天免疫系は抗原暴露の初期相において重要である。というのは、病原体を封じ込める（containing）ことに加えて、先天免疫系の細胞、すなわちＡＰＣは獲得免疫系の細胞の初回抗原刺激を受けさせ（prime）、かくして特異的な免疫応答を惹起して侵入者の排除に導くからである。要約すると、先天免疫系の細胞、とりわけＡＰＣは、（ａ）原始的なパターン認識系により感染を封じ込めること、および（ｂ）獲得免疫系の細胞に初回抗原刺激を受けさせて特異的な免疫応答および記憶に導き、侵入してきた病原体または他の標的の排除という結果となること、によって免疫応答の誘導相の際に重要な役割を果たしている（非特許文献５）。これらメカニズムはまた、腫瘍細胞を排除または封じ込めるのにも重要である。
【０００８】
上記のように、先天免疫系の細胞は、その各標的上に発現されたパターンを認識する。例を挙げると、グラム陰性細菌の場合のリポ多糖（ＬＰＳ）、ミコバクテリアの糖脂質、グラム陽性細菌のリポテイコ酸、酵母のマンナンおよびウイルスの二本鎖ＲＮＡである（非特許文献４）。さらに、先天免疫系の細胞は、腫瘍細胞上のタンパク質の変化したグリコシル化などのパターンを認識する。
【０００９】
最近の知見は、原生生物または下等真核生物のＤＮＡを哺乳動物（および、おそらく全てではないが大抵の脊椎動物）の先天免疫系（しかしながら、おそらく獲得免疫系も）によって認識されるさらなるパターンとして記載している（非特許文献６；非特許文献７）。
【００１０】
免疫系は、細菌を含む下等生物を、おそらく病原体と宿主とのＤＮＡの構造上および配列使用上の差異ゆえに認識する。とりわけ、非脊椎動物に由来するＤＮＡの短いストレッチ、あるいはある種の塩基の前後関係での非メチル化シトシン−グアニンジヌクレオチド（ＣｐＧ）を含む短い合成ＯＤＮの形態のものが標的にされる（非特許文献８）。ＣｐＧモチーフは細菌ＤＮＡでは予想された頻度で見出されるが、脊椎動物ＤＮＡでは遥かに低い頻度でしか見出されない（非特許文献７;非特許文献９）。さらに、非脊椎動物（すなわち、細菌）のＣｐＧモチーフはメチル化されていないのに対して脊椎動物のＣｐＧ配列はメチル化されている。これら細菌ＤＮＡと脊椎動物ＤＮＡとの差異は、脊椎動物が非脊椎動物のＤＮＡを危険なシグナルとして認識することを可能にする。
【００１１】
天然のＣｐＧ含有ＤＮＡ（ＯＤＮ）並びにＣｐＧモチーフを含有しチオホスフェート置換（ホスフェートをチオホスフェート残基と交換）されたＯＤＮ（ＣｐＧ−ＯＤＮ）は、免疫細胞増殖および体液性免疫応答の強力なアクチベーターであるのみならず（非特許文献８）、強い細胞性免疫応答をも刺激する（非特許文献７に概説）。非メチル化ＣｐＧモチーフを含むＤＮＡ／ＯＤＮは、単球（樹状細胞、マクロファージ）およびＢ細胞を直接活性化することができる。同様に、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は直接には活性化されないが、単球由来のＩＬ−１２（インターロイキン１２）に応答し、そのＩＦＮ−γ産生は顕著に増大している（非特許文献１０）。その結果、ＣｐＧ ＤＮＡによる単球およびＮＫ細胞の誘発は、Ｔｈ１型応答の誘導および細胞障害性Ｔ細胞の発生を促進する。
【００１２】
ポリイノシン−ポリシチジン酸（ポリＩ：Ｃ）などのようなイノシンおよびシトシンに基づくリボ核酸は、Ｔｈ１特異的な免疫応答を促進することが知られている。イノシンおよびシトシンに基づくリボ核酸はＩＬ−１αおよびＩＬ−１２などのサイトカインを産生するようにマクロファージを刺激することが知られており（非特許文献１１）、強力な１型インターフェロンのインデューサー（非特許文献１１）および強力なＮＫ細胞スティミュレーター（非特許文献１２）としても知られている。
【００１３】
しかしながら、この作用はイノシンおよびシトシン残基を含むリボ核酸に厳格に限られている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】ノッサル（Nossal）、１９９８、Nat Med 4,475-476
【非特許文献２】ブルーム（Bloom）およびウィダス（Widdus）、１９９８、Nat Med 4, 480-484
【非特許文献３】ハロウ（Harrow）およびレーン（Lane）、１９８８、Antibodies: a laboratory manual (Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory)
【非特許文献４】ホフマン（Hoffmann）ら、１９９９、Science 284, 1313-1318
【非特許文献５】ロイット（Roitt）ら、１９９８、Immunology (London:Mosby International Ltd)
【非特許文献６】クリーグ（Krieg）、１９９６、J Lab Clin Med 128, 128-133
【非特許文献７】リップフォード（Lipford）ら、１９９８、Trends Microbiol 6, 496-500
【非特許文献８】クリーグ（Krieg）ら、１９９５、Nature 374, 546-549
【非特許文献９】ピゼツキー（Pisetsky）、１９９９、Immunol Res 19, 35-46
【非特許文献１０】チェイス（Chace）ら、１９９７、Clin Immunol Immunopathol 84, 185-193
【非特許文献１１】マネッティ（Manetti）ら、１９９５、Eur. J. Immunol. 25, 2656-2660
【非特許文献１２】カバノー（Cavanaugh）ら、１９９６、Res. Comm. Mol. Pathol. Pharmacol. 91, 131-147
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】ＷＯ９８／１６２４７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の発明者らによる研究は、非メチル化ＣｐＧモチーフを含むＯＤＮは免疫系を刺激するうえで有効であるが、本質的な欠点、とりわけ特異性（高いバックグラウンド）および高い全身的なＴＮＦ−α産生などの副作用に関する欠点を有することを示している。高い全身的なＴＮＦ−α放出はトキシックショック症候群を引き起こすことが知られており、これは患者の死を引き起こしうるものである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
それゆえ、本発明の目的は、そのようなＣｐＧ配列に基づくＯＤＮのような激しい副作用を有することのない適当な新規なＯＤＮを提供することである。さらに、本発明の目的は、知られたＯＤＮを含有する医薬組成物の副作用を低減すること、および動物、とりわけヒトを含む哺乳動物のワクチン接種に適した有効な免疫促進特性を備えた、安全かつ有効な充分に許容できる（well-tolerable）医薬組成物を提供することである。
【００１８】
この目的は、式（Ｉ）：
【化１】
0005908851.tif 000002
（式中、ＸはいずれもＯまたはＳ、
ＮＭＰはいずれも、デオキシアデノシン−、デオキシグアノシン−、デオキシイノシン−、デオキシシトシン−、デオキシウリジン−、デオキシチミジン−、２−メチル−デオキシイノシン−、５−メチル−デオキシシトシン−、デオキシプソイドウリジン−、デオキシリボースプリン−、２−アミノ−デオキシリボースプリン−、６−Ｓ−デオキシグアニン−、２−ジメチル−デオキシグアノシン−またはＮ−イソペンテニル−デオキシアデノシン−モノホスフェートまたは−モノチオホスフェートよりなる群から選ばれた２'デオキシヌクレオシドモノホスフェートまたはモノチオホスフェート、
ＮＵＣは、デオキシアデノシン−、デオキシグアノシン−、デオキシイノシン−、デオキシシトシン−、デオキシウリジン−、デオキシチミジン−、２−メチル−デオキシイノシン−、５−メチル−デオキシシトシン−、デオキシプソイドウリジン−、デオキシリボースプリン−、２−アミノ−デオキシリボースプリン−、６−Ｓ−デオキシグアニン−、２−ジメチル−デオキシグアノシン−またはＮ−イソペンテニル−デオキシアデノシンよりなる群から選ばれた２'デオキシヌクレオシド、
ａおよびｂは０〜１００の整数であり、ただしａ＋ｂは４〜１５０である、
ＢおよびＥは核酸分子の５'末端または３'末端の一般的な基）
の構造を有する免疫促進性のオリゴデオキシ核酸分子（ＯＤＮ）によって解決される。
【００１９】
驚くべきことに、デオキシイノシン残基を含むＯＤＮ（Ｉ−ＯＤＮ）がＣｐＧモチーフを含むＯＤＮに匹敵する、または多くの場合ＣｐＧモチーフを含むＯＤＮよりも良好な免疫促進作用を示すことがわかった。さらに、本発明によるＯＤＮは、ＣｐＧ ＯＤＮに比べて一層特異的な免疫応答を所定の抗原または抗原フラグメントに対して産生する。加えて、本発明によるＯＤＮは、有害な副作用の誘発、とりわけ全身的なＴＮＦ−αまたはＩＬ−６の誘発が低減している。
【００２０】
ポリ−ＩＣすなわちＷＯ９８／１６２４７において言及された分子などのようなイノシン含有ＲＮＡ分子についてある種の免疫促進作用が記載されてはいるが、驚くべきことにデオキシイノシン残基を含むデオキシ核酸分子が良好な免疫促進性のＯＤＮであることがわかった。
【００２１】
さらに、本発明によるＩ−ＯＤＮは、特定のＣｐＧモチーフに基づくＯＤＮとは対照的に、ＣｐＧオリゴヌクレオチドについて記載されているような（たとえば、ＥＰ０４６８５２０Ａ２、ＷＯ９６／０２５５５、ＷＯ９８／１８８１０、ＷＯ９８／３７９１９、ＷＯ９８／４０１００、ＷＯ９８／５２５８１、ＷＯ９９／５１２５９およびＷＯ９９／５６７５５（すべて参照のため本明細書中に引用する）を参照）特定のモチーフまたはパリンドローム配列には依存しない。それゆえ、本発明によるＩ−ＯＤＮの一つの群はＣＩモチーフを含んでいるのが好ましい（それゆえ、これら引用した文献に記載されたＯＤＮのうちでも１またはそれ以上のグアノシン残基がデオキシイノシン残基で置換されているものは本発明のＯＤＮの好ましい態様である）。ＣＩモチーフはその主たる免疫促進特性には必要ではない、というのはＣＩまたはＩＣの文脈中にイノシンが位置していないＩ−ＯＤＮもまた免疫促進特性を示すからである。
【００２２】
それゆえ、本発明によるＩ−ＯＤＮはデオキシイノシン残基を含むＤＮＡ分子であり、一本鎖の形態で提供されるのが好ましい。
【００２３】
本発明によるＩ−ＯＤＮは、組換え法により単離するかまたは化学的に合成することができる。後者の場合、本発明によるＩ−ＯＤＮはまた修飾したオリゴヌクレオチドを含んでいてよく、そのような修飾したオリゴヌクレオチドは、メチルホスホネートや他のリンベースの修飾オリゴヌクレオチド、たとえば、ホスホトリエステル、ホスホアミデートおよびホスホロジチオレートなどの標準的な化学変換を用いて合成することができる。しかしながら、他の非リンベースの修飾オリゴヌクレオチドを用いることができ（スターチャック（Stirchak）ら、３月１７日（１９８９）、６１２９−６１４１）、モノホスフェートまたはモノチオホスフェートが本発明に使用するのに好ましい２'デオキシヌクレオシドモノホスフェートである。
【００２４】
本発明によるＩ−ＯＤＮのＮＭＰは、デオキシアデノシン−、デオキシグアノシン−、デオキシイノシン−、デオキシシトシン−、デオキシウリジン−、デオキシチミジン−、２−メチル−デオキシイノシン−、５−メチル−デオキシシトシン−モノホスフェートまたは−モノチオホスフェート（通常通り、ホスフェート基またはチオホスフェート基はデオキシリボースの５'である）よりなる群から選ばれるのが好ましい。ＣｐＧモチーフに基づくＯＤＮでは該モチーフがメチル化されていないことが必須であるが、驚くべきことに、このことは本発明によるＯＤＮの場合には当てはまらない。というのも、たとえば２−メチル−デオキシイノシンや５−メチル−デオキシシトシン残基は本発明によるＯＤＮの免疫促進特性に対していかなる一般的な悪影響をも及ぼさないからである。代わりに、ＮＭＰの２−デオキシ形に代えて、他のとりわけ不活性な基、たとえば、−Ｆ、−ＮＨ２、−ＣＨ３など、特に−ＣＨ３がリボース基の２位に位置していてよい。もちろん、−ＯＨおよびＳＨ基は、リボース、とりわけイノシンＮＭＰについてのリボース残基の２'位に存在することは本発明によるＩ−ＯＤＮでは排除される。
【００２５】
本発明によるＯＤＮの長さは、従来技術に従って使用される標準ＯＤＮの範囲内である。それゆえ、４未満および１５０を超える全長の分子は徐々に低下した免疫促進能を示す。好ましいＯＤＮは１０〜６０、とりわけ１５〜４０の塩基（ヌクレオシド）を含み、これはこれら好ましい態様において式Ｉ中のａ＋ｂが１０〜６０、好ましくは１５〜４０であることを意味する。
【００２６】
これに対して、従来技術で免疫促進性であるとして記載されているイノシンおよびシチジン含有リボ核酸分子は、分子量が２００,０００を遥かに超える大きくて比較的定められていないポリ核酸であった（Sigma Chemicalsより市販されているポリイノシン−ポリシチジン酸の分子量は２２０,０００〜４６０,０００（少なくとも５００〜１０００のＣ＋Ｉ残基）の範囲である）。本発明による分子は遥かに長さが短く、長さおよび組成がよく定められたＤＮＡ分子であり、製品における再現性の高いものである。
【００２７】
さらに、式Ｉで示されるＩ−ＯＤＮのデオキシイノシン含有ＮＭＰが１〜４の硫黄原子を有するモノチオホスフェートであり、他のＮＭＰ、とりわけ他の全てのＮＭＰがヌクレオシドモノチオホスフェートとして存在するのが好ましい。なぜなら、そのようなＯＤＮは一層高いヌクレアーゼ耐性を示すからである（本発明において「モノチオホスフェート」中の「モノ」はホスフェートに関するものであること、すなわち各ＮＭＰ中に１つのホスフェート基（１つのリン原子）が存在することは明らかである）。好ましくは、本発明によるＮＭＰにおいて、Ｘ１およびＸ２の少なくとも一方はＳであり、Ｘ３およびＸ４の少なくとも一方はＯである。好ましくは、Ｘ３およびＸ４はＯである（Ｘ３は、（ＮＭＰの合成のために）、たとえばホスフェート基からまたはＮＭＰ−リボースの３'基から由来するものであってよい）。
【００２８】
好ましくは、本発明によるＯＤＮは下記配列を含む：
ｈｈｈ ｗｄｉ ｄｈｈ ｈ、
ｎｈｈ ｈｈｈ ｗｄｉ ｎｈｈ ｈｈｈ ｈｈｈ ｗｎ、
ｎｈｈ ｗｄｉ ｄｉｎ ｈｈｈ ｈｄｉ ｎｄｉ ｎｈ、
ｎｈｈ ｈｈｈ ｗｄｉ ｄｈｈ ｈｈｈ ｈｈｈ ｗｎまたは
ｎｈｈ ｗｄｉ ｄｉｄ ｈｈｈ ｈｄｉ ｄｄｉ ｄｈ
（式中、ｎはいずれも、デオキシアデノシン−、デオキシグアノシン−、デオキシシトシン−またはデオキシチミジン−モノホスフェートまたは−モノチオホスフェートよりなる群から選ばれた２'−デオキシヌクレオシドモノホスフェートまたはモノチオホスフェート、
ｈはいずれも、デオキシアデノシン−、デオキシシトシン−またはデオキシチミジン−モノホスフェートまたは−モノチオホスフェートよりなる群から選ばれた２'−デオキシヌクレオシドモノホスフェートまたはモノチオホスフェート、
ｉは、デオキシイノシン−モノホスフェートまたは−モノチオホスフェート、
ｗはいずれも、デオキシアデノシン−またはデオキシチミジン−モノホスフェートまたは−モノチオホスフェートよりなる群から選ばれた２'−デオキシヌクレオシドモノホスフェートまたはモノチオホスフェート、
ｄはいずれも、デオキシアデノシン−、デオキシグアノシン−またはデオキシチミジン−モノホスフェートまたは−モノチオホスフェートよりなる群から選ばれた２'−デオキシヌクレオシドモノホスフェートまたはモノチオホスフェート）。
【００２９】
上記に記載したように、本発明によるＩ−ＯＤＮには特別のモチーフ（ＣｐＧやパリンドロームなどの）は必要ない。しかしながら、好ましい態様において式ＩによるＯＤＮが２'−デオキシイノシン−モノホスフェートまたは−モノチオホスフェートに３'側にて隣接した２'−デオキシシトシン−モノホスフェートまたは−モノチオホスフェートを少なくとも１つ含んでそのような５'−ＣＩ３'−モチーフを形成するように、ＣＩモチーフを含むＯＤＮが好ましい。
【００３０】
本発明による好ましいＯＤＮは、下記配列の１またはそれ以上を含む：
ｇａｃｉｔｔ、
ｉａｃｉｔｔ、
ｇａｉｃｔｔ、
ｉａｉｃｔｔ
（式中、ａはデオキシアデノシン−モノホスフェートまたは−モノチオホスフェート、
ｇはデオキシグアノシン−モノホスフェートまたは−モノチオホスフェート、
ｉはデオキシイノシン−モノホスフェートまたは−モノチオホスフェート、
ｃはデオキシシトシン−モノホスフェートまたは−モノチオホスフェート、
ｔはデオキシチミジン−モノホスフェートまたは−モノチオホスフェート）。
【００３１】
本発明によるＩ−ＯＤＮは、医薬の分野への応用、たとえば動物またはヒトに医薬として投与するのに特に適している。本発明によるＩ−ＯＤＮは、とりわけワクチン組成物中またはワクチン組成物とともに免疫促進剤として機能するのに特に適している。
それゆえ、本発明はまた本発明によるＯＤＮを含む医薬組成物にも関する。
【００３２】
本発明による好ましい医薬組成物はワクチンであるので、該組成物は本発明によるＯＤＮの他に抗原を含んでいなければならない。この抗原がワクチン接種した個体の防御／免疫応答を引き起こす能力は、該抗原を本発明によるＯＤＮと組み合わせることにより、とりわけ該ＯＤＮの免疫促進作用によって著しく増大する。
【００３３】
ワクチンは、全く様々な異なる抗原を含んでいてよい。抗原の例は、不活化したウイルスまたは細菌、真菌、原生生物あるいは癌細胞などの完全に殺した生物である。抗原はまた、これら生物／組織の下部画分（subfractions）、タンパク質、または最も単純な形態でペプチドからなっていてもよい。抗原はまた、グリコシル化タンパク質またはペプチドの形態で免疫系によって認識されてよく、多糖または脂質であるかまたは含んでいてよい。短いペプチドを用いることができる。なぜなら、たとえば細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は主要組織適合複合体（ＭＨＣ）と結合した通常８〜１１アミノ酸長の短い形態の抗原を認識するからである（ラメンシー（Rammensee）ら、Immunogenetics 41, (1995), 178-228）。Ｂ細胞は約１５アミノ酸から開始して一層長いペプチドを認識する（ハロウ（Harrow）ら、Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)）。
【００３４】
Ｔ細胞エピトープとは対照的に、Ｂ細胞抗原の三次元構造もまた抗体による認識には重要である。持続した抗原特異的な免疫応答を得るため、必要な免疫系の全ての細胞が関与する免疫カスケードを誘起するのにアジュバントが役に立つ。主としてアジュバントは、その作用の仕方に制限はないが、いわゆる抗原提示細胞（ＡＰＣ）に作用する。これら細胞は通常、まず抗原と出会い、ついでプロセシングした抗原または非修飾抗原を免疫エフェクター細胞に提示する。媒介する細胞型もまた関与していてよい。適当な特異性を有するエフェクター細胞だけが増殖性の（productive）免疫系において活性化される。アジュバントはまた、抗原および同時に注射した他の因子を局所的に保持する。さらに、アジュバントは他の免疫細胞に対する化学誘引物質として作用し、あるいは免疫系に対する刺激剤として局所的および/または全身的に作用する。
【００３５】
本発明の好ましい態様によれば、Ｔ細胞エピトープを抗原として用いる。あるいは、Ｔ細胞エピトープとＢ細胞エピトープとの組み合わせも好ましい。
本発明の組成物に使用する抗原は重要ではない。もちろん、異なる抗原の混合物を本発明に従って用いることも可能である。好ましくは、ウイルスまたは細菌病原体に由来する、または真菌または寄生虫に由来するタンパク質またはペプチドをそのような抗原（誘導体化した抗原またはグリコシル化したまたは脂質化した（lipidated）抗原または多糖または脂質を含む）として用いる。他の好ましい抗原の採取源は腫瘍抗原である。好ましい病原体は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ａ型およびＢ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、インフルエンザウイルス、ロタウイルス、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、クラミジア・ニューモニア（Chlamydia pneumonias）、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）、ミコバクテリウム・チューバーキュローシス（Mycobacterium tuberculosis）、ストレプトコッカス・ニューモニア（Streptococcus pneumonias）、バシラス・アントラシス（Bacillus anthracis）、ビブリオ・コレラ（Vibrio cholerae）、プラスモジウム（Plasmodium）種（Pl. falciparum, Pl. vivaxなど）、アスペルギルス（Aspergillus）種またはカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）から選択される。
【００３６】
抗原はまた癌細胞によって発現される分子であってもよい（腫瘍抗原）。入手（derivation）プロセスは、病原体／癌細胞からの特定のタンパク質の精製、該病原体の不活化並びにそのようなタンパク質のタンパク質分解によるまたは化学的な誘導体化または安定化を含む。同様にして、腫瘍抗原（癌ワクチン）または自己免疫抗原もまた本発明による医薬組成物に用いることができる。そのような組成物を用いて腫瘍ワクチン接種または自己免疫疾患の治療を行ってよい。
【００３７】
ペプチド抗原の場合、ペプチドのミミトープ（mimitopes）／アゴニスト／スーパーアゴニスト（superagonists）／アンタゴニストまたは免疫学的特性に影響を及ぼすことなくある位置で変化させたペプチドまたは非ペプチドのミミトープ／アゴニスト／スーパーアゴニスト／アンタゴニスト（スパービエ（Sparbier）およびウォルデン（Walden）、１９９９に概説）が本発明に含まれる。ペプチド抗原はまた、ポリカチオン性化合物または免疫促進性化合物との相互作用を容易にするためにペプチド抗原のカルボキシ末端側かまたはアミノ末端側のいずれかに伸長を含んでいてよい。自己免疫疾患の治療のためにはペプチドアンタゴニストを適用することができる。
【００３８】
抗原はまた、抗原提示および抗原提示細胞への抗原のターゲティングを促進する分子を含むように誘導体化してもよい。
本発明の一つの態様において、本発明の医薬組成物は自己免疫疾患に関与するタンパク質またはタンパク質断片およびペプチドに対する耐性を付与するように働く。この態様に用いる抗原は、免疫系に対して寛容にするかまたは自己免疫プロセスに関与するエピトープに対する免疫応答をダウンレギュレーションするように働く。
【００３９】
好ましくは本発明による医薬組成物、とりわけワクチンの形態の医薬組成物は、ポリカチオン性ポリマー、好ましくはポリカチオン性ペプチド、とりわけポリアルギニン、ポリリシンまたは抗菌性ペプチドをさらに含む。
【００４０】
本発明に従って用いるポリカチオン性化合物は、ＷＯ９７／３０７２１による特徴的な作用を示すあらゆるポリカチオン性化合物であってよい。好ましいポリカチオン性化合物は、塩基性ポリペプチド、有機ポリカチオン、塩基性ポリアミノ酸またはその混合物から選ばれる。これらポリアミノ酸は、少なくとも４アミノ酸残基の鎖長を有していなければならない（ゴールドマン（Goldman）ら（１９８３）に記載のTuftsinを参照）。特に好ましいのは、ポリリシン、ポリアルギニン、および８を超える、とりわけ２０を超えるアミノ酸残基の範囲に２０％を超える、とりわけ５０％を超える塩基性アミノ酸を含むポリペプチドまたはその混合物のようなペプチド結合を含む物質である。他の好ましいポリカチオンおよびその医薬組成物は、ＷＯ９７／３０７２１（たとえば、ポリエチレンイミン）およびＷＯ９９／３８５２８に記載されている。好ましくは、これらポリペプチドは２０〜５００アミノ酸残基、とりわけ３０〜２００残基を含む。
【００４１】
これらポリカチオン性化合物は化学的にまたは組換えにより製造してよく、あるいは天然の採取源に由来してもよい。
【００４２】
カチオン性（ポリ）ペプチドはまた、ガンツ（Ganz）およびレーラー（Lehrer）、１９９９;ハンコック（Hancock）、１９９９に概説されている特性を有するポリカチオン性で抗菌性の微生物ペプチドであってもよい。これら（ポリ）ペプチドは、原核生物または動物または植物起源のものであってよく、化学的にまたは組換えにより製造されてよい（アンドロー（Andreu）およびリバ（Rivas）、１９９８；ガンツ（Ganz）およびレーラー（Lehrer）、１９９９；シマコ（Simmaco）ら、１９９８）。そのようなペプチドの配列は、たとえば以下のインターネットアドレスの下に抗菌配列データベース（Antimicrobial Sequences Database）中に見出すことができる：
http://www.bbcm.univ.trieste. it/~tossi/pagl.html。
【００４３】
そのような宿主防御ペプチドまたは防御剤（defensives）もまた、本発明によるポリカチオン性ポリマーの好ましい形態である。一般に、好ましくはＡＰＣ（樹状細胞を含む）によって媒介される獲得免疫系を最終生成物として活性化（またはダウンレギュレーション）することを可能にする化合物はポリカチオン性ポリマーとして用いる。
【００４４】
本発明においてポリカチオン性物質として使用するのに特に好ましいのは、カテリシジン（cathelicidin）由来の抗菌ペプチドまたはその誘導体（Ａ１４１６／２０００、参照のため本明細書中に引用する）、とりわけ哺乳動物、好ましくはヒト、ウシまたはマウスのカテリシジンに由来する抗菌ペプチド、または（ヒト）成長ホルモンなどの神経刺激性の化合物である。
【００４５】
天然の採取源に由来するポリカチオン性化合物としては、ＨＩＶ−ＲＥＶまたはＨＩＶ−ＴＡＴ（由来のカチオン性ペプチド、アンテナペディア（antennapedia）ペプチド、キトサンまたはキトサンの他の誘導体）または生化学的な製造または組換え製造によりこれらペプチドまたはタンパク質に由来する他のペプチドが挙げられる。他の好ましいポリカチオン性化合物は、カテリン（cathelin）またはカテリンの関連物質またはカテリンに由来する物質である。たとえば、マウスカテリンは、アミノ酸配列：ＮＨ２−ＲＬＡＧＬＬＲＫＧＧＥＫＩＧＥＫＬＫＫＩＧＯＫＩＫＮＦＦＱＫＬＶＰＱＰＥ−ＣＯＯＨを有するペプチドである。カテリンの関連物質またはカテリンに由来する物質はカテリン配列の全部または一部を含み、少なくとも１５〜２０アミノ酸残基を有する。誘導体化は、２０の標準アミノ酸以外のアミノ酸による天然アミノ酸の置換または修飾を含む。さらに、さらなるカチオン性残基がそのようなカテリン分子中に導入されてよい。これらカテリン分子は、抗原および本発明による免疫原性ＯＤＮと組み合わせるのが好ましい。しかしながら、これらカテリン分子は驚くべきことに、さらなるアジュバントを加えなくとも抗原に対するアジュバントとして有効なことがわかった。それゆえ、そのようなカテリン分子は、さらなる免疫刺激性物質を用いたまたは用いないワクチン製剤において有効なアジュバントとして用いることが可能である。
【００４６】
本発明に従って用いることのできる他の好ましいポリカチオン性物質は、３〜７の疎水性アミノ酸のリンカーによって隔てられた少なくとも２つのＫＬＫモチーフを含む合成ペプチドである（Ａ１７８９／２０００、参照のため本明細書中に引用する）。
【００４７】
本発明による医薬組成物の免疫促進作用が、各成分単独の作用の付加から予測されるものと比較して、あるいは抗原とともに用いたＯＤＮまたはポリカチオンの作用の付加から予測されるものと比較してさえも有意に高いことは非常に驚くべきことであった。
【００４８】
式Ｉ中のＢおよびＥは、核酸分子の５'末端および／または３'末端の一般的な基である。そのような基の例は、当業者であれば容易に利用できる（たとえば、“Oligonucleotides and Analogues - A Practical Approach”（１９９１）、エックスタイン（Eckstein）編、オックスフォードユニバーシティープレス）。本発明によるＩ−ＯＤＮについては、Ｂおよび／またはＥは、−Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＯＣＨ３、−ＯＨ、−ＣＨＯ、ホスフェート、チオホスフェート、サルフェートまたはチオサルフェート、またはホスホアルキル基、とりわけＣ１−Ｃ６のアルキル長および／または末端アミノ基を有するもの（アミノ基は本発明によるＩ−ＯＤＮのさらなる標識に用いることができる、たとえば−ＰＯ４−(ＣＨ２)ｎ−ＮＨ２または−ＰＯ４−(ＣＨ２)ｎ−ＮＨ−標識など）から独立に選ばれるのが好ましい。
【００４９】
Ｂとして特に好ましいのは、ヌクレオシド、とりわけ上記２'デオキシヌクレオチド（すなわち、ホスフェートまたはチオホスフェート基を含まない）である。あるいは、これら基はまた、他の分子、とりわけ担体分子または標識へのリンカー基を含んでいてよい。ＯＤＮが固相表面または粒子または標識に結合しているＯＤＮのそのような形態では、これら表面、粒子、標識などもＢおよび／またはＥ基の一部である。
【００５０】
もちろん、式Ｉによる分子のイオン化した（塩）形態や互変異性の形態は式Ｉに包含される。
【００５１】
本発明による医薬組成物は、さらなる活性成分（薬理学的に活性な物質）、とりわけワクチンに関連して用いることのできる物質をさらに含んでいてよい。そのようなさらなる活性成分の好ましい態様は、サイトカイン、抗炎症性物質、抗菌性物質またはそれらの組み合わせである。
【００５２】
もちろん、本発明による医薬組成物は、補助物質、とりわけ薬理学的に許容しうる担体、緩衝液物質、安定化剤またはそれらの組み合わせをさらに含んでいてよい。
【００５３】
本発明の医薬組成物中の成分の相対量は、個々の抗原の必要性および該医薬組成物を投与する動物および／またはヒトに大きく依存する。それゆえ、本発明による医薬組成物は、本発明の１またはそれ以上のＯＤＮを好ましくは１ｐｇ〜１０ｇ、好ましくは１ｎｇ〜１ｇ、さらに好ましくは１００ｎｇ〜１０ｍｇ、とりわけ１０ｍｇ〜１ｍｇ含むのが好ましい。抗原およびポリカチオン性ポリマーは同等の投与量で投与してよく、ワクチン当たり１〜１０,０００ｍｇの抗原および０.１〜１,０００ｍｇのポリカチオン性ポリマーが好ましい。
【００５４】
本発明の医薬組成物は、患者、たとえばワクチン接種候補者に有効量にて、たとえば１週間、２週間または１ヶ月の間隔で投与してよい。本発明の医薬組成物で処置する患者はまた、繰り返しワクチン接種してもよいし、または１回だけワクチン接種してもよい。本発明の好ましい使用は、とりわけヒトまたは動物を特定の抗原に対して防御することなく能動免疫することである。
【００５５】
本発明の医薬組成物の投与経路は重要ではなく、たとえば、皮下、筋肉内、皮内または経皮注射が経口摂取とともに適している。
【００５６】
たとえば抗原／ポリカチオン組成物と別に免疫促進性物質を注射することによって、本発明の医薬組成物を別々に投与することも可能である。それゆえ、本発明はまた、第一の成分として抗原およびポリカチオン性ポリマーを含む組成物、第二の成分として免疫促進性または走化性の物質を含む組成物、を含むキットにも関する。
【００５７】
上記成分は同じ部位に同時に投与することもできるが、異なる部位に異なる時間で、または異なる期間で投与することも可能である。また、組成物または成分の全身性または局所性の投与をそれぞれ変えることも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】卵アルブミン由来ペプチドＯＶＡ２５７−２６４、ポリＬ−アルギニン（ｐＲ６０）およびデオキシイノシンＩ含有オリゴデオキシヌクレオチド（Ｉ−ＯＤＮ）またはＣｐＧ１６６８を注射後のＯＶＡ２５７−２６４に対する免疫応答を示す。マウスの後ろ足に所定の混合物を注射した。４日後、水切りしたリンパ節細胞をイクスビボにてＯＶＡ２５７−２６４で刺激した。２４時間後にＩＦＮ−ｇ産生細胞の数をＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて決定した。結果をスポット数／１×１０６リンパ節細胞として表してある。
【００５９】
【図２】ＯＶＡ２５７−２６４、ポリＬ−アルギニン（ｐＲ６０）およびＩ含有オリゴデオキシヌクレオチド（Ｉ−ＯＤＮ）またはＣｐＧ１６６８を注射後の全身性のＴＮＦ−ａ産生の誘発を示す。マウスの後ろ足に所定の混合物を注射した。注射１時間後に尾静脈から採血し、血清を調製した。血清中のＴＮＦ−ａの濃度をＥＬＩＳＡを用いて決定した。
【００６０】
【図３】卵アルブミン由来ペプチドＯＶＡ２５７−２６４、ポリＬ−アルギニン（ｐＲ６０）およびデオキシイノシン含有オリゴデオキシヌクレオチド（Ｉ−ＯＤＮ）、ＣｐＧ１６６８またはＧｐＣを注射後のＯＶＡ２５７−２６４に対する免疫応答を示す。マウスの後ろ足に所定の混合物を注射した。４日後、水切りしたリンパ節細胞をイクスビボにてＯＶＡ２５７−２６４、無関係のペプチドｍＴＲＰ２１８１−１８８（マウスチロシナーゼ関連プロテイン２、ＶＹＤＦＦＶＷＬ）またはｐＲ６０で刺激した。２４時間後にＩＦＮ−ｇ産生細胞の数をＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて決定した。結果をスポット数／１×１０６リンパ節細胞として３回の試行の標準偏差とともに表してある。
【００６１】
【図４】ＯＶＡ２５７−２６４、ポリＬ−アルギニン（ｐＲ６０）およびＩ含有オリゴデオキシヌクレオチド（Ｉ−ＯＤＮ）、ＧｐＣまたはＣｐＧ１６６８を注射後の全身性のＴＮＦ−ａ産生の誘発を示す。マウスの後ろ足に所定の混合物を注射した。注射１時間後に尾静脈から採血し、血清を調製した。血清中のＴＮＦ−ａおよびＩＬ−６の濃度をサイトカイン特異的なＥＬＩＳＡを用いて決定した。
【００６２】
【図５】ＴＲＰ−２、ポリＬ−アルギニン、ＣｐＧ１６６８またはデオキシイノシンを含むランダムな２０−ｍｅｒ配列を注射後の卵アルブミン由来ペプチドＯＶＡ２５７−２６４に対する免疫応答を示す。マウスの後ろ足に所定の混合物を注射した。４日後、水切りしたリンパ節細胞をイクスビボにてＴＲＰ−２、無関係のペプチドＯＶＡ２５７−２６４またはｐＲ６０で刺激した。２４時間後にＩＦＮ−ｇ産生細胞の数をＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて決定した。結果をスポット数／１×１０６リンパ節細胞として３回の試行の標準偏差とともに表してある。
【００６３】
【図６】メラノーマ由来ペプチドとＩ−ＯＤＮおよびポリＬ−アルギニン（ｐＲ６０）とを組み合わせた注射を示す。
【００６４】
【図７】メラノーマ由来ペプチドとＩ−ＯＤＮおよびｐＲ６０とを組み合わせた注射が全身性のＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の誘発を低減させることを示す。
【００６５】
【図８】メラノーマ由来ペプチドとランダムな１０−ｍｅｒ Ｉ−ＯＤＮおよびｐＲ６０とを組み合わせた注射を示す。
【００６６】
【図９】オリゴｄＩＣ２６−ｍｅｒおよびｐＲと組み合わせた卵アルブミン（ＯＶＡ）の投与がＯＶＡ特異的なＩｇＧ抗体の産生を促進することを示す。マウスの後ろ足に所定の混合物を皮下注射した。注射２４日および１１５日後に血清を回収し、ＯＶＡ特異的なＩｇＧ２ａ抗体（Ａ）およびＩｇＧ１抗体（Ｂ）についてＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。結果を抗体力価として示す。
【発明を実施するための形態】
【００６７】
本発明の詳細を下記実施例および図面により記載するが、本発明はもちろんこれらに限られるわけではない。
実施例
すべての実験においてチオホスフェート置換ＯＤＮ（ホスフェートをチオホスフェート残基で置換、以下、「チオホスフェート置換オリゴデオキシヌクレオチド」という）を用いたが、これはそのようなＯＤＮがより高いヌクレアーゼ耐性を示すからである（バラス（Ballas）ら、１９９６；クリーグ（Krieg）ら、１９９５；パロンチ（Parronchi）ら、１９９９）。
【００６８】
実施例１：種々のＩ−ＯＤＮとポリＬ−アルギニン（ｐＲ６０）とを組み合わせた注射は卵アルブミン由来のペプチドに対する免疫応答を相乗的に促進する
マウス：
Ｃ５７ＢＩ／６（Harlan/Olac）
ペプチド：
ニワトリ卵アルブミンのＭＨＣクラスＩ（Ｈ−２Ｋｂ）拘束エピトープであるＯＶＡ２５７−２６４ペプチド（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）(ロッツシュク（Rotzschke）ら、１９９１）を標準固相Ｆ−ｍｏｃ化学合成法を用いて合成し、ＨＰＬＣ精製し、ついで純度をマススペクトロメトリーにより分析した。投与量：３００μｇ／マウス。
【００６９】
ポリＬ−アルギニン６０（ｐＲ６０）：
平均重合度が６０アルギニン残基のポリＬ−アルギニン；SIGMA chemicals。投与量：１００μｇ／マウス。
ＣｐＧ−ＯＤＮ１６６８：
ＣｐＧモチーフを含むチオホスフェート置換ＯＤＮ：ｔｃｃ ａｔｇ ａｃｇ ｔｔｃ ｃｔｇ ａｔｇ ｃｔをNAPS GmbH、ゲッチンゲンにより合成した。投与量：５ナノモル／マウス。
【００７０】
Ｉ−ＯＤＮ１：
デオキシイノシンを含有するチオホスフェート置換ＯＤＮ：ｔｃｃ ａｔｉ ａｃｉ ｔｔｃ ｃｔｇ ａｔｇ ｃｔをNAPS GmbH、ゲッチンゲンにより合成した。投与量：５ナノモル／マウス。
Ｉ−ＯＤＮ２：
デオキシイノシンを含有するチオホスフェート置換ＯＤＮ：ｔｃｃ ａｔｇ ａｃｉ ｔｔｃ ｃｔｇ ａｔｇ ｃｔをNAPS GmbH、ゲッチンゲンにより合成した。投与量：５ナノモル／マウス。
Ｉ−ＯＤＮ３：
デオキシイノシンを含有するチオホスフェート置換ＯＤＮ：ｔｃｃ ａｔｉ ａｃｉ ｔｔｃ ｃｔｉ ａｔｉ ｃｔをNAPS GmbH、ゲッチンゲンにより合成した。投与量：５ナノモル／マウス。
【００７１】
実験群（１群５匹のマウス）
１．ＯＶＡ２５７−２６４
２．ＯＶＡ２５７−２６４ ＋ ｐＲ６０
３．ＯＶＡ２５７−２６４ ＋ ＣｐＧ１６６８
４．ＯＶＡ２５７−２６４ ＋ Ｉ−ＯＤＮ１
５．ＯＶＡ２５７−２６４ ＋ Ｉ−ＯＤＮ２
６．ＯＶＡ２５７−２６４ ＋ Ｉ−ＯＤＮ３
７．ＯＶＡ２５７−２６４ ＋ ＣｐＧ１６６８ ＋ ｐＲ６０
８．ＯＶＡ２５７−２６４ ＋ Ｉ−ＯＤＮ１ ＋ ｐＲ６０
９．ＯＶＡ２５７−２６４ ＋ Ｉ−ＯＤＮ２ ＋ ｐＲ６０
１０．ＯＶＡ２５７−２６４ ＋ Ｉ−ＯＤＮ３ ＋ ｐＲ６０
【００７２】
第０日目にマウスの後ろ足に上記化合物を含む全量１００μｌ（各足当たり５０μｌ）を注射した。注射４日後に動物を屠殺し、膝窩リンパ節を回収した。リンパ節を７０μｍセルストレーナーに通し、５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、SIGMA chemicals）を含むＤＭＥＭ培地（GIBCO BRL）で２回洗浄した。細胞をＤＭＥＭ／５％／ＦＣＳ中に３×１０６細胞／ｍｌに調節した。ＩＦＮ−ｇ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを記載に従って（ミヤヒラ（Miyahira）ら、１９９５）３回ずつ行った。この方法は、抗原特異的なＴ細胞の定量をするために広く用いられている手順である。リンパ球をイクスビボにて培地バックグラウンド−コントロール、ＯＶＡ２５７−２６４ペプチドまたはコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）で刺激した。単一のＩＦＮ−ｇ産生Ｔ細胞を表すスポットをカウントし、バックグラウンドスポットの数を全試料から差し引いた。ＣｏｎＡで刺激した後に検出された多数のスポット（データは示していない）は、使用したリンパ球が良好な状態にあることを示している。マウスの各実験群について図１にスポット数／１×１０６細胞を示す。
注射１時間後に尾静脈より採血し、血清を調製して全身的なＴＮＦ−ａの誘発をＥＬＩＳＡを用いて決定した（図２）。
【００７３】
実施例２：グアノシンをデオキシ−イノシンで交換すると、とりわけポリＬ−アルギニン（ｐＲ６０）と組み合わせたときに非免疫原性のＧｐＣ配列が高度に免疫原性の配列に変換される
マウス：
Ｃ５７Ｂ１／６（Harlan/Olac）
ペプチド：
ニワトリ卵アルブミンのＭＨＣクラスＩ（Ｈ−２Ｋｂ）拘束エピトープであるＯＶＡ２５７−２６４ペプチド（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）(ロッツシュク（Rotzschke）ら、１９９１）を標準固相Ｆ−ｍｏｃ合成法を用いて合成し、ＨＰＬＣ精製し、ついで純度をマススペクトロメトリーにより分析した。投与量：３００μｇ／マウス。
【００７４】
ポリＬ−アルギニン６０（ｐＲ６０）：
平均重合度が６０アルギニン残基のポリＬ−アルギニン；SIGMA chemicals。投与量：１００μｇ／マウス。
ＣｐＧ−ＯＤＮ１６６８：
ＣｐＧモチーフを含むチオホスフェート置換ＯＤＮ：ｔｃｃ ａｔｇ ａｃｇ ｔｔｃ ｃｔｇ ａｔｇ ｃｔをNAPS GmbH、ゲッチンゲンにより合成した。投与量：５ナノモル／マウス。
ＧｐＣ−ＯＤＮ：
非免疫原性のＧｐＣモチーフを含むチオホスフェート置換ＯＤＮ：ｔｃｃ ａｔｇ ａｇｃ ｔｔｃ ｃｔｇ ａｔｇ ｃｔをNAPS GmbH、ゲッチンゲンにより合成した。投与量：５ナノモル／マウス。
【００７５】
Ｉ−ＯＤＮ９：
デオキシイノシンを含有するチオホスフェート置換ＯＤＮ：ｔｃｃ ａｔｇ ａｉｃ ｔｔｃ ｃｔｇ ａｔｇ ｃｔをNAPS GmbH、ゲッチンゲンにより合成した。投与量：５ナノモル／マウス。
Ｉ−ＯＤＮ１０：
デオキシイノシンを含有するチオホスフェート置換ＯＤＮ：ｔｃｃ ａｔｉ ａｉｃ ｔｔｃ ｃｔｉ ａｔｉ ｃｔをNAPS GmbH、ゲッチンゲンにより合成した。投与量：５ナノモル／マウス。
【００７６】
実験群（１群５匹のマウス）
ＯＶＡ２５７−２６４
ＯＶＡ２５７−２６４ ＋ ｐＲ６０
ＯＶＡ２５７−２６４ ＋ ＣｐＧ１６６８
ＯＶＡ２５７−２６４ ＋ ＧｐＣ
ＯＶＡ２５７−２６４ ＋ Ｉ−ＯＤＮ９
ＯＶＡ２５７−２６４ ＋ Ｉ−ＯＤＮ１０
ＯＶＡ２５７−２６４ ＋ ＣｐＧ１６６８ ＋ ｐＲ６０
ＯＶＡ２５７−２６４ ＋ ＧｐＣ ＋ ｐＲ６０
ＯＶＡ２５７−２６４ ＋ Ｉ−ＯＤＮ９ ＋ ｐＲ６０
ＯＶＡ２５７−２６４ ＋ Ｉ−ＯＤＮ１０ ＋ ｐＲ６０
【００７７】
第０日目にマウスの各後ろ足に上記化合物を含む全量１００μｌ（各足当たり５０μｌ）を注射した。注射４日後に動物を屠殺し、膝窩リンパ節を回収した。リンパ節を７０μｍセルストレーナーに通し、５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、SIGMA chemicals）を含むＤＭＥＭ培地（GIBCO BRL）で２回洗浄した。細胞をＤＭＥＭ／５％ＦＣＳ中に３×１０６細胞／ｍｌに調節した。ＩＦＮ−ｇ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを記載に従って（ミヤヒラ（Miyahira）ら、１９９５）３回ずつ行った。この方法は、抗原特異的なＴ細胞の定量をするために広く用いられている手順である。リンパ球をイクスビボにて培地（バックグラウンド）、ＯＶＡ２５７−２６４ペプチド、無関係のペプチドｍＴＲＰ２１８１−１８８（マウスチロシナーゼ関連プロテイン２、ＶＹＤＦＦＶＷＬ）、ｐＲ６０およびコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）で刺激した。単一のＩＦＮ−ｇ産生Ｔ細胞を表すスポットをカウントし、バックグラウンドスポットの数を全試料から差し引いた。ＣｏｎＡで刺激した後に検出された多数のスポット（データは示していない）は、使用したリンパ球が良好な状態にあることを示している。マウスの各実験群について図３にスポット数／１×１０６細胞を示してあり、イクスビボで刺激した３回の試行の標準偏差を示してある。注射１時間後に尾静脈より採血し、血清を調製して全身的なＴＮＦ−ａおよびＩＬ−６の誘発をサイトカイン特異的ＥＬＩＳＡを用いて決定した（図４）。
【００７８】
実施例３：デオキシイノシンを含むランダムな２０−ｍｅｒ配列とメラノーマ由来のペプチドとを組み合わせた注射は該ペプチドに対する強い免疫応答を誘発し、該免疫応答はポリＬ−アルギニン（ｐＲ６０）を同時に投与することによってさらに促進することができる
マウス：
Ｃ５７Ｂ１／６（Harlan/Olac）
ペプチド：
マウスチロシナーゼ関連プロテイン２のＭＨＣクラスＩ（Ｈ−２Ｋｂ）拘束エピトープであるＴＲＰ−２ペプチド（ＶＹＤＦＦＶＷＬ）（ブロム（Bllom）ら、１９９７）を標準固相Ｆ−ｍｏｃ合成法により合成し、ＨＰＬＣ精製し、ついで純度をマススペクトロメトリーにより分析した。投与量：３００μｇ／マウス。
【００７９】
ポリＬ−アルギニン６０（ｐＲ６０）：
平均重合度が６０アルギニン残基のポリＬ−アルギニン；SIGMA chemicals。投与量：１００μｇ／マウス。
ＣｐＧ−ＯＤＮ１６６８：
ＣｐＧモチーフを含むチオホスフェート置換ＯＤＮ：ｔｃｃ ａｔｇ ａｃｇ ｔｔｃ ｃｔｇ ａｔｇ ｃｔをNAPS GmbH、ゲッチンゲンにより合成した。投与量：５ナノモル／マウス。
【００８０】
ｗｄｉ：
チオホスフェート置換ＯＤＮ：ｎｈｈ ｈｈｈ ｗｄｉ ｎｈｈ ｈｈｈ ｈｈｈ ｗｎをNAPS GmbH、ゲッチンゲンにより合成した。投与量：５ナノモル／マウス。
ｗｄｉｄｉｎ：
チオホスフェート置換ＯＤＮ：ｎｈｈ ｗｄｉ ｄｉｎ ｈｈｈ ｈｄｉ ｎｄｉ ｎｈをNAPS GmbH、ゲッチンゲンにより合成した。投与量：５ナノモル／マウス。
ｗｄｉｄ：
チオホスフェート置換ＯＤＮ：ｎｈｈ ｈｈｈ ｗｄｉ ｄｈｈ ｈｈｈ ｈｈｈ ｗｎをNAPS GmbH、ゲッチンゲンにより合成した。投与量：５ナノモル／マウス。
ｗｄｉｄｉｄ：
チオホスフェート置換ＯＤＮ：ｎｈｈ ｗｄｉ ｄｉｄ ｈｈｈ ｈｄｉ ｄｄｉ ｄｈをNAPS GmbH、ゲッチンゲンにより合成した。投与量：５ナノモル／マウス。
【００８１】
実験群（１群５匹のマウス）
１．ＴＲＰ−２
２．ＴＲＰ−２ ＋ ｐＲ６０
３．ＴＲＰ−２ ＋ ＣｐＧ１６６８
４．ＴＲＰ−２ ＋ ｗｄｉ
５．ＴＲＰ−２ ＋ ｗｄｉｄｉｎ
６．ＴＲＰ−２ ＋ ｗｄｉｄ
７．ＴＲＰ−２ ＋ ｗｄｉｄｉｄ
８．ＴＲＰ−２ ＋ ＣｐＧ１６６８ ＋ ｐＲ６０
９．ＴＲＰ−２ ＋ ｗｄｉ ＋ ｐＲ６０
１０．ＴＲＰ−２ ＋ ｗｄｉｄｉｎ ＋ ｐＲ６０
１１．ＴＲＰ−２ ＋ ｗｄｉｄ ＋ ｐＲ６０
１２．ＴＲＰ−２ ＋ ｗｄｉｄｉｄ ＋ ｐＲ６０
【００８２】
第０日目にマウスの各後ろ足に上記化合物を含む全量１００μｌ（各足当たり５０μｌ）を注射した。注射４日後に動物を屠殺し、膝窩リンパ節を回収した。リンパ節を７０μｍセルストレーナーに通し、５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、SIGMA chemicals）を含むＤＭＥＭ培地（GIBCO BRL）で２回洗浄した。細胞をＤＭＥＭ／５％ＦＣＳ中に３×１０６細胞／ｍｌに調節した。ＩＦＮ−ｇ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを記載に従って（ミヤヒラ（Miyahira）ら、１９９５）３回ずつ行った。この方法は、抗原特異的なＴ細胞の定量をするために広く用いられている手順である。リンパ球をイクスビボにて培地（バックグラウンド）、ＴＲＰ−２ペプチド、無関係のＯＶＡ２５７−２６４ペプチド、ｐＲ６０およびコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）で刺激した。単一のＩＦＮ−ｇ産生Ｔ細胞を表すスポットをカウントし、バックグラウンドスポットの数を全試料から差し引いた。ＣｏｎＡで刺激した後に検出された多数のスポット（データは示していない）は、使用したリンパ球が良好な状態にあることを示している。マウスの各実験群について図５にスポット数／１×１０６細胞を示してあり、イクスビボで刺激した３回の試行の標準偏差を示してある。
【００８３】
実施例４：Ｉ−ＯＤＮとポリＬ−アルギニン（ｐＲ６０）とを組み合わせた注射はメラノーマ由来のペプチドに対する免疫応答を相乗的に促進する
実験群（１群５匹のマウス）
１．ＴＲＰ−２１８１−１８８
２．ＴＲＰ−２１８１−１８８ ＋ ｐＲ６０
３．ＴＲＰ−２１８１−１８８ ＋ ＣｐＧ１６６８
４．ＴＲＰ−２１８１−１８８ ＋ Ｉ−ＯＤＮ２
５．ＴＲＰ−２１８１−１８８ ＋ ＣｐＧ１６６８ ＋ ｐＲ６０
６．ＴＲＰ−２１８１−１８８ ＋ Ｉ−ＯＤＮ２ ＋ ｐＲ６０
【００８４】
第０日目にマウスの各後ろ足に上記化合物を含む全量１００μｌ（各足当たり５０μｌ）を注射した。注射４日後に動物を屠殺し、膝窩リンパ節を回収した。リンパ節を７０μｍセルストレーナーに通し、５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、SIGMA chemicals）を含むＤＭＥＭ培地（GIBCO BRL）で２回洗浄した。細胞をＤＭＥＭ／５％／ＦＣＳ中に３×１０６細胞／ｍｌに調節した。ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを記載に従って（ミヤヒラ（Miyahira）ら、１９９５）３回ずつ行った。この方法は、抗原特異的なＴ細胞の定量をするために広く用いられている手順である。リンパ球をイクスビボにて培地バックグラウンド−コントロール、ＴＲＰ−２１８１−１８８ペプチド、無関係のＯＶＡ２５７−２６４ペプチドおよびコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）で刺激した。単一のＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞を表すスポットをカウントし、バックグラウンドスポットの数を全試料から差し引いた。ＣｏｎＡで刺激した後に検出された多数のスポット（データは示していない）は、使用したリンパ球が良好な状態にあることを示している。マウスの各実験群について図６にスポット数／１×１０６細胞を示してあり、イクスビボで刺激した３回の試行の標準偏差を示してある。
注射１時間後に尾静脈より採血し、血清を調製して全身的なＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の誘発をサイトカイン特異的ＥＬＩＳＡを用いて決定した（図７）。
【００８５】
実施例５：ランダムな１０−ｍｅｒ Ｉ−ＯＤＮとポリＬ−アルギニン（ｐＲ６０）とを組み合わせた注射はメラノーマ由来のペプチドに対する免疫応答を相乗的に促進する
実験群（１群５匹のマウス）
１．ＴＲＰ−２１８１−１８８
２．ＴＲＰ−２１８１−１８８ ＋ ｐＲ６０
３．ＴＲＰ−２１８１−１８８ ＋ ＣｐＧ１６６８
４．ＴＲＰ−２１８１−１８８ ＋ ＯＤＮ１７
５．ＴＲＰ−２１８１−１８８ ＋ ＣｐＧ１６６８ ＋ ｐＲ６０
６．ＴＲＰ−２１８１−１８８ ＋ ＯＤＮ１７ ＋ ｐＲ６０
【００８６】
第０日目にマウスの各後ろ足に上記化合物を含む全量１００μｌ（各足当たり５０μｌ）を注射した。注射４日後に動物を屠殺し、膝窩リンパ節を回収した。リンパ節を７０μｍセルストレーナーに通し、５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、SIGMA chemicals）を含むＤＭＥＭ培地（GIBCO BRL）で２回洗浄した。細胞をＤＭＥＭ／５％／ＦＣＳ中に３×１０６細胞／ｍｌに調節した。ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを記載に従って（ミヤヒラ（Miyahira）ら、１９９５）３回ずつ行った。この方法は、抗原特異的なＴ細胞の定量をするために広く用いられている手順である。リンパ球をイクスビボにて培地バックグラウンド−コントロール、ＴＲＰ−２１８１−１８８ペプチド、無関係のＯＶＡ２５７−２６４ペプチドおよびコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）で刺激した。単一のＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞を表すスポットをカウントし、バックグラウンドスポットの数を全試料から差し引いた。ＣｏｎＡで刺激した後に検出された多数のスポット（データは示していない）は、使用したリンパ球が良好な状態にあることを示している。マウスの各実験群について図８にスポット数／１×１０６細胞を示してあり、イクスビボで刺激した３回の試行の標準偏差を示してある。
【００８７】
マウス：
Ｃ５７Ｂ１／６（Harlan/Olac）
ペプチド：
マウスチロシナーゼ関連プロテイン２のＭＨＣクラスＩ（Ｈ−２Ｋｂ）拘束エピトープであるＴＲＰ−２ペプチド（ＶＹＤＦＦＶＷＬ）（ブロム（Bllom）ら、１９９７）を標準固相Ｆ−ｍｏｃ合成法により合成し、ＨＰＬＣ精製し、ついで純度をマススペクトロメトリーにより分析した。投与量：１００μｇ／マウス。
【００８８】
ポリＬ−アルギニン６０（ｐＲ６０）：
平均重合度が６０アルギニン残基のポリＬ−アルギニン；SIGMA chemicals。投与量：１００μｇ／マウス。
ＣｐＧ−ＯＤＮ１６６８：
ＣｐＧモチーフを含むチオホスフェート置換ＯＤＮ：ｔｃｃ ａｔｇ ａｃｇ ｔｔｃ ｃｔｇ ａｔｇ ｃｔをNAPS GmbH、ゲッチンゲンにより合成した。投与量：５ナノモル／マウス。
ＯＤＮ１７：
デオキシイノシンを含むチオホスフェート置換ＯＤＮ：ｈｈｈ ｗｄｉ ｄｈｈ ｈをNAPS GmbH、ゲッチンゲンにより合成した（ｈ＝ＣＡＴ、ｗ＝ＡＴ、ｄ＝ＧＡＴ）。投与量：１０ナノモル／マウス。
【００８９】
マウス：
Ｃ５７Ｂ１／６（Harlan/Olac）
ペプチド：
マウスチロシナーゼ関連プロテイン２のＭＨＣクラスＩ（Ｈ−２Ｋｂ）拘束エピトープであるＴＲＰ−２ペプチド（ＶＹＤＦＦＶＷＬ）（ブロム（Bllom）ら、１９９７）を標準固相Ｆ−ｍｏｃ合成法により合成し、ＨＰＬＣ精製し、ついで純度をマススペクトロメトリーにより分析した。投与量：１００μｇ／マウス。
【００９０】
ポリＬ−アルギニン６０（ｐＲ６０）：
平均重合度が６０アルギニン残基のポリＬ−アルギニン；SIGMA chemicals。投与量：１００μｇ／マウス。
ＣｐＧ−ＯＤＮ１６６８：
ＣｐＧモチーフを含むチオホスフェート置換ＯＤＮ：ｔｃｃ ａｔｇ ａｃｇ ｔｔｃ ｃｔｇ ａｔｇ ｃｔをNAPS GmbH、ゲッチンゲンにより合成した。投与量：５ナノモル／マウス。
Ｉ−ＯＤＮ２：
デオキシイノシンを含むチオホスフェート置換ＯＤＮ：ｔｃｃ ａｔｇ ａｃｉ ｔｔｃ ｃｔｇ ａｔｇ ｃｔをNAPS GmbH、ゲッチンゲンにより合成した。投与量：５ナノモル／マウス。
【００９１】
実施例６：オリゴデオキシＩＣ２６−ｍｅｒとポリＬ−アルギニン（ｐＲ）とを組み合わせた投与は卵アルブミン（ＯＶＡ）特異的な体液性応答を促進する
マウス：
Ｃ５７Ｂ１／６（Harlan/Olac）
卵アルブミン（ＯＶＡ）：
ニワトリ卵からの卵アルブミン、グレードＶ、SIGMA chemicals、Ａ−５５０３、ロット５４Ｈ７０７０：投与量：５０μｇ／マウス。
【００９２】
ポリＬ−アルギニン（ｐＲ）：
平均重合度が６０アルギニン残基のポリＬ−アルギニン；SIGMA chemicals、Ｐ−４６６３、ロット６８Ｈ５９０３。投与量：１００μｇ／マウス。
オリゴデオキシＩＣ、２６−ｍｅｒ（オリゴｄＩＣ２６−ｍｅｒ）：
オリゴｄＩＣ２６−ｍｅｒを標準ホスホアミダイト化学により４μモルスケールで合成し、ＨＰＬＣ（NAPS GmbH、ゲッチンゲン、ドイツ）により精製した。投与量：５ナノモル／マウス。
【００９３】
実験群（１群４匹のマウス）
１．ＯＶＡ ＋ オリゴｄＩＣ２６−ｍｅｒ ＋ ｐＲ
２．ＯＶＡ ＋ オリゴｄＩＣ２６−ｍｅｒ
３．ＯＶＡ ＋ ｐＲ
４．ＯＶＡ
【００９４】
第０日目にマウスの各後ろ足に上記化合物を含む全量１００μｌ（各足当たり５０μｌ）を注射した。注射２４時間後に血清を回収し、ＯＶＡ特異的抗体の存在についてＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。これらの結果は、ＯＶＡとオリゴｄＩＣおよびｐＲとを組み合わせた注射がＯＶＡを各物質単独で注射したときに比べてＯＶＡ特異的なＩｇＧ抗体の産生を促進したことを示している（図１３Ａ、Ｂ）。興味深いことに、オリゴｄＩＣ／ｐＲと組み合わせたＯＶＡの単一の注射を行ったときにＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ１の両者の力価が増大し、Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞の両者が関与していることを意味していた。しかしながら、１１５日後にはＯＶＡとオリゴｄＩＣ／ｐＲとを注射したマウスの血清でＩｇＧ２ａの増大レベルのみが検出できた。
【００９５】
これらデータは、オリゴｄＩＣおよびｐＲと組み合わせたＯＶＡの注射がＯＶＡ特異的な体液性応答を促進することを示している。この応答は、初期の相ではＴｈ１およびＴｈ２の両者により誘発された抗体イソ型が産生されるが、その後、主としてＴｈ１によって誘発された抗体が産生されるという特徴を有する。
【００９６】
参照文献
0005908851.tif 000003
【００９７】
0005908851.tif 000004
【００９８】
0005908851.tif 000005
【００９９】
0005908851.tif 000006
【０１００】
0005908851.tif 000007
【図１】
0005908851.tif 000008
【図２】
0005908851.tif 000009
【図３】
0005908851.tif 000010
【図４】
0005908851.tif 000011
【図５】
0005908851.tif 000012
【図６】
0005908851.tif 000013
【図７】
0005908851.tif 000014
【図８】
0005908851.tif 000015
【図９】
0005908851.tif 000016
【配列表】
0005908851000001.app