(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シルクフィブロインを含むマイクロニードルであって、該マイクロニードルがベース部および貫入先端を有し、該先端が50nmから50μmの範囲の寸法を有する、マイクロニードル。
【請求項２】
少なくとも1つの活性剤をさらに含む、請求項1記載のマイクロニードル。
【請求項３】
前記活性剤が、タンパク質、ペプチド、抗原、免疫原、ワクチン、抗体またはその一部分、抗体様分子、酵素、核酸、siRNA、shRNA、アプタマー、ウイルス、細菌、低分子、細胞、ホルモン、抗生物質、治療剤、診断剤およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項2記載のマイクロニードル。
【請求項４】
前記マイクロニードルが少なくとも24時間室温から37℃の温度で維持されるとき、前記活性剤がその本来の生物活性の少なくとも30%を保持する、請求項2記載のマイクロニードル。
【請求項５】
1つまたは複数の生体分解性ポリマーをさらに含む、請求項1記載のマイクロニードル。
【請求項６】
生物学的環境に接したときに、制御された速度で分解するように適合されている、請求項1記載のマイクロニードル。
【請求項７】
マイクロニードルの分解により、その内部に分配されている活性剤の放出が制御される、請求項2記載のマイクロニードル。
【請求項８】
基材、および基材と一体化されているかまたは基材に付着されかつ基材から延びている、1つまたは複数のシルクフィブロインマイクロニードル、
を含む、マイクロニードルデバイスであって、各マイクロニードルがベース部および貫入先端を含む、デバイス。
【請求項９】
前記マイクロニードルが少なくとも1つの活性剤をさらに含む、請求項8記載のデバイス。
【請求項１０】
前記シルクフィブロインマイクロニードルが、15μmから1500μmの範囲の長さである、請求項8記載のデバイス。
【請求項１１】
前記基材が1つまたは複数の生体適合性ポリマーを含む、請求項8記載のデバイス。
【請求項１２】
前記基材が、柔軟性であり、かつ表面と接触したときに、その表面に順応する、請求項8記載のデバイス。
【請求項１３】
前記基材が、シルクフィブロインを含み、かつシルクフィブロインマイクロニードルと一体化されている、請求項8記載のデバイス。
【請求項１４】
生物学的障壁を越えてまたは生物学的障壁に活性剤を送達するための医薬の製造におけるシルクフィブロインおよび活性剤を含むマイクロニードルの使用であって：
マイクロニードルが生物学的障壁に貫入し、かつ、活性剤がマイクロニードルから放出される、使用。
【請求項１５】
前記生物学的障壁が対象の組織である、請求項14記載の使用。
【請求項１６】
前記組織が皮膚である、請求項15記載の使用。
【請求項１７】
前記活性剤が、対象の組織内でのマイクロニードルの分解を通じて放出される、請求項14記載の使用。
【請求項１８】
マイクロニードルの貫入先端からベース部に延びる流体マイクロチャネルをさらに含む、請求項1記載のマイクロニードル。
【請求項１９】
多孔質である、請求項1記載のマイクロニードル。
【請求項２０】
接着剤をさらに含む、請求項8記載のデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、35 U.S.C.§119(e)の下で、2010年10月19日出願の米国仮出願第61/394,479号の恩典を主張し、その内容の全体を参照により本明細書に組み入れる。
【０００２】
政府による支援
本発明は、National Institutes of Healthから授受した助成金第EB002520号；Air Force Office of Scientific Researchから授受した助成金第FA9550-10-1-0172号；およびDefense Advanced Research Projects Agencyから授受した助成金第W911-NF-07-1-0618号の下で、連邦政府による支援を受けた為されたものである。米国政府は本発明において一定の権利を有している。
【０００３】
発明の分野
本発明は、概ね、マイクロニードルおよびマイクロニードルデバイス、ならびにその製造および使用方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
経皮投与は、アクセスが容易であり胃腸管内での高分子の分解を回避できることから、薬物およびワクチンの送達のための有用な経路と言うことができる［1］。マイクロニードルは、経皮的な薬物送達のための皮下ニードルの安全かつ比較的痛みの少ない代替品となっている。しかし、マイクロニードルの製造に使用される伝統的な材料である金属および合成ポリマーには、その生産および性能を損なわせる様々な制約が付随する。
【０００５】
1つの現在のマイクロニードル技術は、持続的な薬物放出を提供するために、関心対象の薬物を充填したマイクロ粒子（ポリ-ラクチド-コ-グリコリド（PLGA）またはカルボキシメチルセルロースのいずれか）を添加した溶解可能なポリ-ラクチド-コ-グリコリド（PLGA）ポリマー製のマイクロニードルボディ部を用いるものである［2］。しかし、ポリマー融点が135℃より高く、真空が処理に必要となり、これらの条件が様々な温度感受性の薬物、特にペプチドおよびタンパク質に有害となり得るため、このマイクロニードルシステムを製造する方法が、制約となる。
【０００６】
最近開発されたマイクロニードルシステムでは、インフルエンザワクチンを含有するポリマー（カルボキシメチルセルロース、Lutrol F-68NFおよびD-(+)-トレハロース無水物のブレンド）で硬質の金属製マイクロニードル構造物をコーティングすることによる室温処理が用いられている［3］。組み込まれたワクチンの活性は、処理の間、一部温存され得る［4,5］が、マイクロニードルへの薬物添加におけるコーティングのアプローチは、バルクに添加する構造と比べると、小さな治療物質捕捉容積しか提供しない。さらに、金属ベースのマイクロニードルシステムは、それらの機能を損なわせる制約、例えば、不適切に利用された場合の破損の危険［6］および小さな金属構造物が皮膚に残存した場合の炎症応答または感染の可能性、も有する。
【０００７】
バルク添加されるマイクロニードルは、生体適合性かつ溶解可能な材料、例えばポリビニルピロリドン（PVP）および炭水化物から製造される［3,7］。この溶解可能なシステムはバルク添加されるため、比較的大きな用量を投与することができる。このポリマーは、室温で硬化させることができる。しかし、処理中の高温に起因する薬物の分解は回避することができるものの、紫外光による硬化は、組み込まれた薬物の活性に影響を及ぼし得る。加えて、これらのポリマーマイクロニードルシステムを用いる薬物放出動態の制御は限定的である。今のところ、このポリマーマイクロニードルが急速に溶解されるため、比較的短期間のバースト送達になってしまう。したがって、生体適合性であり、頑丈でありかつ効率的な薬物送達マイクロニードルおよびそのようなマイクロニードルの製造に対する改善されたアプローチが依然として強く求められている。
【発明の概要】
【０００８】
マイクロニードルは、効果的であり、容易に適用でき、かつ比較的痛みが少ないが、現時点では、薬物の放出動態を正確に制御できない、薬物添加能力が限定的である、処理条件下で薬物の活性が低下または不活性化するおよびニードルと皮膚との接触面で局部感染が発生する等の様々な制約がある。これに対処するため、本発明者らは、機械的に頑丈であり、マイクロニードル内の活性剤の活性を安定化し、そしてマイクロニードルのプログラム可能な分解により制御された薬物放出挙動を実現する、生体適合性のシルクフィブロインベースのマイクロニードルを開発した。さらに、活性剤、例えば抗生物質をシルクフィブロインベースのマイクロニードル内で安定化させることができるため、注射部位における感染の制御も有益であり得る。
【０００９】
したがって、本発明の局面は、薬物および生物学的分子を含む活性剤を、生物学的障壁、例えば皮膚、組織または細胞膜を越えて輸送または送達するための、シルクフィブロインベースのマイクロニードルおよびマイクロニードルデバイス；ならびにその製造および使用方法を提供する。1つの局面においては、ベース部から貫入先端まで、例えば既定の距離だけ延びるマイクロニードルボディ部を含む、シルクフィブロインを含むマイクロニードルが、本明細書で提供される。貫入先端は、生物学的障壁のタイプおよび／または使用者の要望もしくは利用法に基づき、任意のサイズの直径を有し得る。いくつかの態様において、貫入先端は、例えば約200nmから約40μmまたは約300nmから約30μmを含む、約50nmから約50μmの範囲の寸法（例えば、直径）を有し得る。いくつかの態様において、貫入先端は、500nm未満から約2μmの範囲の寸法（例えば、直径）を有し得る。いくつかの態様において、貫入先端は、約300nmから約30μmの範囲の寸法（例えば、直径）を有し得る。いくつかの態様において、貫入先端は、50μmより大きいまたは50nmより小さい寸法（例えば、直径）を有し得る。マイクロニードルボディ部の長さは、貫入先端が、活性剤の送達のために既定の深さまでの組織貫入を提供するように、ベース部から既定の距離のところに位置するよう、選択することができる。いくつかの態様において、シルクフィブロインマイクロニードルは、約15μmから約1500μmまたは約200μmから約800μmのボディ長を有し得る。
【００１０】
様々な態様において、シルクフィブロインベースのマイクロニードルはさらに、少なくとも1つの追加材料を含み得、追加材料は、マイクロニードル全体に分散されるかまたはマイクロニードルの一部を形成することができる。追加材料は、任意で追加の賦形剤またはアジュバントを含む、細孔形成剤、構造成分、バイオセンサまたは放出させるための活性剤であり得る。
【００１１】
特定の態様において、シルクフィブロインベースのマイクロニードルはさらに、活性剤、例えばワクチン、抗生物質、ホルモン、ペプチド、抗体および抗体様フラグメントを含み得る。そのような態様において、活性剤は、マイクロニードルが貯蔵または輸送の際に少なくとも約24時間またはそれより長く、0℃より高い温度、例えばほぼ室温で維持されるとき、その本来の生物活性の少なくとも約30%を保持することができる。したがって、少なくとも1つの活性剤を貯蔵および送達するためのマイクロニードルも、本明細書で提供される。そのようなマイクロニードルは、少なくとも1つの活性剤およびシルクフィブロインを含み、マイクロニードルはベース部および約50nmから約40μmの範囲の先端直径を有する貫入先端を有し、かつ活性剤は、マイクロニードルが少なくとも約24時間0℃より高い温度で維持されるとき、その本来の生物活性の少なくとも約30%を保持する。いくつかの態様において、活性剤は、免疫原、例えばワクチンである。
【００１２】
特定の態様においては、少なくとも約24時間またはそれより長期間投与されたとき、マイクロニードル内に分散されている活性剤の少なくとも約10%またはそれ以上が生物学的障壁に放出され得る。
【００１３】
本明細書で提供される別の局面は、基材および1つまたは複数の本明細書に記載されるシルクフィブロインマイクロニードルを含むマイクロニードルデバイスであって、シルクフィブロインマイクロニードルが、基材と一体化されまたは基材に付着されかつ基材から延びており；そして各シルクフィブロインマイクロニードルがベース部および貫入先端を含む、デバイス、である。マイクロニードルのベース部は、剛性であるかまたは処置部位の表面に順応するよう柔軟性、例えばフィルム形態であり得る基材に取り付けるまたは基材の一部分として形成することができる。いくつかの態様において、本発明のマイクロニードルデバイスは、基材と基材から好ましくは既定の距離だけ突出している1つまたは複数のシルクフィブロインマイクロニードルとを含み得る。
【００１４】
いくつかの態様において、各マイクロニードルは、基材から同じ距離または異なる距離延びるものであり得、したがって、単一のデバイスに一定または多様なマイクロニードル貫入深度の既定のプロファイルを提供することができる。各マイクロニードルボディ部の長さは、貫入先端が、少なくとも1つの活性剤の送達のために既定の深さまでの組織貫入を提供するように、ベース部から規定の距離のところに位置するよう、選択することができる。
【００１５】
複数のマイクロニードルは、ランダムまたは既定のパターンに、例えばアレイとして、配置することができる。マイクロニードル間の距離および複数のマイクロニードルの配置は、所望の処置様式および処置部位の特徴にしたがって選択することができる。マイクロニードルは、生体分解性、生体侵食性（bioerodible）であるか、またはそれ以外の方法で、貫入した組織にマイクロニードルの少なくとも一部分を残せるよう設計され得る。典型的には、マイクロニードルのベース部およびボディ部は、同じ直径を有するかまたはその先端よりも大きい直径を有するであろう。マイクロニードルボディ部の形状および直径は、所望の処置様式および処置部位の特徴にしたがって選択することができる。
【００１６】
シルクフィブロインベースのマイクロニードルおよびシルクフィブロインベースのマイクロニードルデバイスを製造する方法も、本明細書で提供される。いくつかの態様において、そのような製造方法は、穏やかな処理条件を用いるため、本明細書に記載されるマイクロニードル内に分散されている活性剤の生物活性が維持される。
【００１７】
本発明のさらなる局面は、生物学的障壁を越えてまたは生物学的障壁に少なくとも1つの活性剤を送達する方法に関する。この方法は、シルクフィブロインおよび活性剤を含むマイクロニードルを提供する工程；マイクロニードルを生物学的障壁に貫入させる工程；ならびにマイクロニードルから活性剤を放出させる工程、を含む。
【００１８】
本明細書に記載される任意の局面のいくつかの態様において、マイクロニードルの製造に使用されるシルクフィブロインは、再生シルクフィブロインであり得る。いくつかの態様において、シルクフィブロインは、セリシン除去されたものであり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図1は、本発明の1つまたは複数の態様にしたがう、例示的なマイクロニードルの線図である。
【図２】図2は、本発明の1つまたは複数の態様にしたがう、複数のシルクフィブロインマイクロニードルが基材から突出しているマイクロニードルデバイスの線図である。
【図３】図3A〜3Kは、シルクフィブロインマイクロニードルを含む本発明の1つまたは複数の態様を製造するための概略的なプロセスの例示的な工程を示す。図3Aは、マイクロニードル用モールディング（molding）マスターの製造における基材としての、200nm厚の低応力窒化ケイ素（Si3N4）層を有するシリコーン（Si）ウエハーを示す。図3Bは、このウエハーを1μmのポジ型フォトレジスト（S1813、Rohm & Haas）でコーティングすることを示す。図3Cは、フォトリソグラフィを行い、その後のエッチング工程においてマスクとして機能する円形のフォトレジストパターンを残すことを示す。図3Dは、SF6ガスを用いて異方性の反応性イオンエッチング（RIE）を行ってパターン加工されたSi3N4フィルムをエッチングし、その下のSi材料を露出させることを示す。図3Eは、Si3N4マスクをアンダーカットするためにフッ化水素酸、硝酸および酢酸（HNA）の混合物を用いて行った時限的・等方性のウェットエッチングを示す。図3Fは、短時間の超音波浴により残存するSi3N4円形マスクを除去し、その下のSiマイクロニードル用モールドを露出させることを示す。図3Gは、ポリジメチルシロキサン（PDMS）ポリマーを雄型Siマイクロニードル用モールドに注ぎ、これを硬化させることを示す。図3Hは、Siマスターから取り除いた後の雌型PDMSモールドを示す。図3Iは、シルクフィブロイン水溶液と所望の薬物のブレンドを示す。図3Jは、薬物添加シルクフィブロインの溶液をPDMSモールドに注ぎ、この溶液を乾燥させて薬物添加シルクフィブロインフィルムを形成することを示す。図3Kは、PDMSモールドから取り除いた後の薬物添加シルクフィブロインベースのマイクロニードルデバイスの1つの態様を示す。
【図４】図4A〜4Cは、本発明の1つの態様にしたがう、例示的な雄型マイクロニードル用モールディングマスターおよび得られるマイクロニードルの写真を示す。図4Aは、底面の直径が150μm、高さが60μm、先端の半径が<500nmのSiマイクロニードル用モールディングマスターの1つの態様を示す。図4Bは、オリジナルのSiマスター、例えば図4Aに示されるもの、を高い精度で再現したシルクマイクロニードル構造物を示す。図4Cは、直径が<2μmと測定された、図4Bのシルクマイクロニードルの先端の拡大図を示す。
【図５】図5では、メタノール処理したシルクフィブロインフィルムからのインディゴ染料の放出と未処理フィルムからのそれを比較している。未処理フィルム（上）は、組織に接触したときに部分的に溶解してインディゴ染料を放出するのに対して；メタノール処理フィルム（下）は拡散を通じてインディゴ染料を放出している。
【図６】図6A〜6Cは、シルクフィブロインフィルムの膨潤および薬物放出挙動に対するメタノール処理の効果を示す。図6Aは、水和させた、反応性赤120号染料（モデル染料、MW=〜1500）添加シルクフィブロインフィルムの写真集を示す。図6Bは、様々なメタノール処理（異なる処理時間、いくつかの濃度で）を行った反応性赤120号染料添加シルクフィブロインフィルムの累積的放出挙動を示す。図6Cは、反応性赤120号染料添加シルクフィブロインフィルムのフィルム透過性に対する（2つの異なる処理時間、示された濃度の）メタノール処理の効果を示す。
【図７】図7A〜7Fは、シルクフィブロインマイクロニードルを含む本発明の1つまたは複数の態様を製造するための概略的なプロセスの例示的な工程を示す。図7Aは、高速ミリング（milling）および化学ウェットエッチングにより製造されたアルミニウム（Al）製のマスターを示す。図7Bは、PDMSをAlマスター上でキャスティングし、雌型PDMSモールドを作製することを示す。図7Cは、Alマスターから取り除いた雌型PDMSモールドを示す。図7Dは、薬物添加シルクフィブロイン溶液をPDMSモールド上でキャスティングすることを示す。図7Eは、薬物添加シルクフィブロイン溶液を乾燥させて、薬物添加シルクフィブロインマイクロニードルを形成することを示す。図7Fは、（PDMSモールドから取り除いた後の）本明細書に記載される薬物添加シルクマイクロニードルの1つまたは複数の態様を示す。
【図８】図8A〜8Fは、Alモールディングマスターおよび例示的なシルクフィブロインマイクロニードルの画像を示す。図8Aは、機械的ミリング後のAlニードルのテンプレートの例を示す。図8Bは、20分間の化学エッチング後のAlマイクロニードル用マスターの例を示す。図8Cは、例示的なAlマイクロニードル用マスターの巨視図を示す。図8Dは、2時間の化学エッチング後のAlマイクロニードル用マスターの例を示す。図8Eは、例示的なシルクマイクロニードルパッチの巨視図を示しており、1つの態様においては、例えば可視化の目的で、これに反応性赤120号染料が組み込まれる。図8Fは、シルクフィブロインマイクロニードルの1つまたは複数の態様を示す。可視化の目的で、シルクフィブロインマイクロニードルに反応性赤120号染料を添加した。
【図９】図9A〜9Cは、本発明の1つまたは複数の態様にしたがうシルクフィブロインマイクロニードルからの分子、例えば薬物の放出の例示的な研究モデルおよび結果を示す。図9Aは、インビトロヒドロゲル皮膚モデルにおいて薬物添加シルクフィブロインマイクロニードルを評価するための例示的な実験設定を示す概略図を示す。シルクフィブロインマイクロニードルは、ポリマー膜およびコラーゲンヒドロゲルに貫入し、その後にモデル薬物を制御された様式で放出する。図9Bは、マイクロニードルによりコラーゲンスラブ中に放出された西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素（HRP）の、5分間放出後および2時間放出後の生物活性を発色基質により検出したことを示す。図9Cは、コラゲナーゼ消化および吸光分光法により決定した、一定期間、例えば40時間の間の、コラーゲンヒドロゲルにおけるシルクフィブロインマイクロニードルの総モデル薬物放出を示す。図8Cの差し込み図は、シルクフィブロインマイクロニードルからコラーゲンヒドロゲルへのモデル薬物放出における初期の現象を示す（N=3、エラーバーは標準偏差を表す）。
【図１０】図10A〜10Bは、細菌成長の制御に使用するためにテトラサイクリン抗生物質を添加したまたは添加しなかった例示的なシルクフィブロインマイクロニードルの結果を示す。図10Aは、テトラサイクリン添加シルクフィブロインマイクロニードルおよび対照シルクフィブロインマイクロニードルに曝露された黄色ブドウ球菌（S.aureus）叢におけるクリアランスゾーンの代表的写真を示す。図10Bは、テトラサイクリン添加シルクフィブロインマイクロニードルおよび対照シルクマイクロニードルに曝露された黄色ブドウ球菌叢における平均コロニー形成単位（CFU）数を、106 CFU/10-mm径寒天生検サンプルで示す。N=3、エラーバーは標準偏差を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明は本明細書に記載される特定の方法論、プロトコルおよび試薬等に限定されず、それらは変更され得るものであることを理解されたい。本明細書で使用されている用語は、特定の態様を説明する目的しか有しておらず、本発明の範囲を限定することは意図されていない。本発明の範囲は、特許請求の範囲によってのみ定義される。
【００２１】
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、単数形は、文脈がそうでないことを明確に示していない限り、複数の参照を含み、その逆も同様である。実践されている実施例またはそうでないことが示されている場合以外では、本明細書で使用される成分の量または反応条件を表すすべての数値は、すべての例において、「約」という用語によって修飾されることを理解されたい。
【００２２】
特定されているすべての特許およびその他の刊行物は、明示的に、説明および開示の目的、例えば本発明に関連して使用され得るそのような刊行物に記載の方法論の説明および開示の目的で、参照により本明細書に組み入れられる。これらの刊行物は、本願の出願日より以前の開示物として提供されるにすぎない。これに関連するいかなる事情も、本発明者らがそれが先行発明であるためまたは他の何らかの理由でそのような開示物よりも先の日付を主張する資格を有さないことの承認として扱われるべきではない。日付に関するすべての言及またはこれらの文献の内容に関する表示は、出願人が入手し得た情報に基づいており、それらはそれらの日付またはこれらの文献の内容の正確性に関する何らかの承認となるものではない。
【００２３】
それ以外の定義がなされていない限り、本明細書で使用されるすべての技術・科学用語は、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者に広く理解されているのと同じ意味を有する。本発明の実施または試験には任意の公知の方法、デバイスおよび材料が使用され得るが、本明細書では、その前提で、方法、デバイスおよび材料が記載されている。
【００２４】
マイクロニードルの製造に使用される伝統的な材料である金属および合成ポリマーは、様々な制約を伴い、それによってそれらの性能が損なわれている。理想的には、マイクロニードルシステムは、機械的に頑丈な、生体適合性の材料および／または移植後に患者の体内で溶解する生体分解性の材料から製造されることが求められる。Davis et al., 37 J. Biomech. 1155 (2004); Sullivan et al., 20 Adv. Mats. 933 (2008)。シルクフィブロインは、優れた機械的特性、生体適合性および生体分解性を含む様々な物性ゆえに、生物医学用途における優れたバイオポリマー材料であることが証明されている。Altman et al., 24 Biomats. 401 (2003); Jiang et al., 17 Adv. Functional Mats. 2229 (2007)。
【００２５】
タンパク質、抗生物質、酵素、薬物、核酸（例えば、DNA、RNA）、ワクチン、抗体および抗体様フラグメントを含むがこれらに限定されない活性剤は、完全水溶液処理（all-aqueous processing）によってシルクフィブロインマトリックス中に組み込むことができる。シルクフィブロインは、様々な生物学的および／または化学的ドーパント（dopant）の封入を実現しそれらの機能性を維持する生物学的に好ましい微小環境を提供する。タンパク質（Bini et al., 335 J. Mol. Bio. 27 (2004)）、酵素（Lu et al., Stabilization of Enzymes in Silk Films, 10 Macromol. Biosci. 359 (2009)）および小有機体（Lawrence et al., 9 Biomacromol. 1214 (2008)）が、様々な生化学的機能化のために、シルクマトリックスに組み込まれている。加えて、これらの薬剤は、制御された様式でこれらのシルク材料から放出させることができる。さらに、生物活性種は、コールドチェーンを意識せずに、長期間の間、乾燥形態で保存され得る。Lu et al., Biomacromol. 217 (2009)。これらの潜在的特性のため、薬物送達用の経皮マイクロニードルおよびマイクロニードルデバイスの製造のための有用な材料としてシルクが調査された。この点、様々な重要な薬剤、例えばワクチン、インスリンおよび応急薬物の安定的な貯蔵および効率的な送達の両方をマイクロニードルデバイスそれ自体において提供するために、シルクフィブロインが生物活性剤に与える安定性を利用することができる。
【００２６】
経皮的な薬物送達を成功させるために、マイクロニードルは、痛みを最小限に抑えまたは回避しつつ、皮膚の外層（角質層）を越えて活性剤を移動させなければならない。15μmから500μmの間の長さのガラス、金属およびPLGAコポリマー製マイクロニードルは、薬物送達に効果的であり、痛みをほとんどまたは全く引き起こさない。Henry et al., 87 J. Pharm. Sci. 922 (1998); Arora et al., 364 Intl. J. Pharm. 227 (2008)。様々なマイクロニードルのデザインが記載されている。Reed & Lye, 92 IEEE 56 (2005)。典型的には、これらのマイクロニードルは、中空であるか、または投与する薬剤で表面コーティングされるかのいずれかである。McAllister et al., 100 PNAS 13755 (2003)。より最近になって、カルボキシメチルセルロース（高さ600μm、ベース部300μmおよび中心間隔600μm）またはアミロペクチンから製造された溶解性マイクロニードルが、タンパク質をカプセル化し、ブタの死体皮膚を越えてそれを送達するために使用された。しかし、これらのマイクロニードルにおける致命的な座屈荷重問題を克服するためには、ニードル用モールドを遠心分離することが必要であった。Lee et al., Dissolving Microneedles of Transdermal Drug Delivery, 29 Biomats. 2113 (2008)。本発明の態様は、薬剤をマイクロニードルマトリックス内またはマトリックス上に添加することができ、異なる用途に合わせてマイクロニードルのサイズ、添加される活性剤および放出プロファイルを容易に調整することができるシルクフィブロインに基づくシンプルであるが優れたデザインアプローチを提供する。いくつかの態様において、本発明のシルクフィブロインマイクロニードルは、他のポリマーのそれらよりも鋭く堅い。いくつかの態様において、本明細書に記載されるマイクロニードル内に分配される活性剤は、長期間にわたり安定化され得る。いくつかの態様において、本明細書に記載されるマイクロニードルおよび／またはマイクロニードルデバイスからの活性剤の放出は、制御することができる、例えばシルクフィブロインマトリックス内のベータシート構造の量を調節することによって制御することができる。
【００２７】
マイクロニードル
本明細書で提供される1つの局面は、シルクフィブロインを含むマイクロニードルに関する。そのようなマイクロニードルは各々ベース部および貫入先端を有し、貫入先端は約50nmから約50μmの範囲の寸法を有する。一例にすぎないが、本発明にしたがうマイクロニードルの例示的な態様110、120、130、140、150、160が図1に示されており、各マイクロニードルは、ベース部114、124、134、144、154、164から貫入先端112、122、132、142、152、162まで延びるシルクフィブロインマイクロニードルボディ部110、120、130、140、150、160を含む。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「貫入先端」という用語は、表面、例えば生物学的障壁の表面に最初に接触しこれに貫入するよう適合された、マイクロニードルの一端を表す。貫入先端は、任意の形状および／または寸法のものであり得る。貫入先端は、例えば円形、長方形、正方形、三角形、多角形および不規則形状であるがこれらに限定されない様々な幾何学形状を有し得る。いくつかの態様において、貫入先端は、例えば、光学機器、例えば顕微鏡、および／または人間の眼の解像度の限界により点に見えることがあり得る。いくつかの態様において、貫入先端の形状は、マイクロニードルボディ部の断面のそれと同じまたは異なり得る。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「寸法」という用語は、概ね、物体の面のサイズの測定値を表す。本明細書に記載されるマイクロニードルの貫入先端に関して、いくつかの態様において、貫入先端の寸法は、貫入先端の最も幅広の形状の測定値により示され得る。例えば、円形の先端の寸法は、円形の先端の直径により示され得る。本発明にしたがい、貫入先端は、約50nmから約50μmの範囲の寸法（例えば、直径）を有し得、これには約100nmから約40μm、約200nmから約40μm、約300nmから約30μm、約500nmから約10μmまたは約1μmから約10μmが含まれる。いくつかの態様において、貫入先端は、約50nmから約10μm、例えば、約50nmから約8μm、約100nmから約5μmまたは約100nmから約2μm、の範囲の寸法（例えば、直径）を有し得る。他の態様において、貫入先端は、50nm未満または50μm超の寸法（例えば、直径）を有し得る。（一般に、10μmを超える寸法を有する貫入先端を有する［9］）従来のポリマーベースの溶解可能マイクロニードルのデザインと比較して、本明細書に記載されるマイクロニードルのいくつかの態様は、より鋭い先端（例えば、10μm、5μmまたは2μm未満）を有し得、それによって各マイクロニードルが組織（例えば、皮膚）に貫入する可能性を高め、かつこれは組織に投与される活性剤の総量を増大させる。
【００３０】
本明細書に記載されるマイクロニードルのベース部は、概ね、貫入先端の反対側の端部である。マイクロニードルのベース部は、マイクロニードルの生物学的障壁への貫入を容易にするため、硬質の基材またはデバイスに付着または固定され得る。マイクロニードルのベース部は、任意のサイズおよび／または形状のものであり得る。ベース部は、例えば円形、長方形、正方形、三角形、多角形および不規則形状であるがこれらに限定されない様々な幾何学形状を有し得る。様々な態様において、ベース部の形状は、マイクロニードルボディ部の断面のそれに追随するものであり得る。
【００３１】
概ね、本明細書に記載されるマイクロニードルのベース部は、マイクロニードルの最も幅広の部分である、例えば、ベース部114および124は、マイクロニードル110および120の最も幅広の部分である。しかし、いくつかの態様において、マイクロニードルのベース部およびボディ部は、実質的に同じ幅を有し得る、例えば、マイクロニードル130、140のベース部134、144とボディ部130、140は実質的に同じ幅を有する。いくつかの態様において、マイクロニードルのベース部、ボディ部および貫入先端は、ベース部144から貫入先端142までマイクロニードルボディ部全体を通じて均一な幅を有するマイクロニードル140に示されるように、実質的に同じ幅を有し得る。当業者は、マイクロニードルボディ部の長さおよびアスペクト比、貫入される表面のタイプならびにシルクフィブロインの機械的特性を含むがこれらに限定されない多くの要因に基づき、適当なベース部の寸法を決定することができる。いくつかの態様において、マイクロニードルのベース部の寸法（例えば、直径）は、50nmから約1500μm、約50nmから約1000μm、約100nmから約750μm、約250nmから約500μmまたは約500nmから約500μmの範囲であり得る。
【００３２】
本明細書に記載されるマイクロニードルは、対象への痛みを最小限に抑えつつ組織を穿孔するのに使用するために適した任意の細長形状であり得る。例えば、これに限定されないが、マイクロニードルは、実質的に円筒形、くさび形、円錐形、ピラミッド形、不規則形状またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
【００３３】
本明細書に記載されるマイクロニードルの断面の形状および／または面積は、マイクロニードルボディ部の長さ方向に沿って均一であるおよび／または変化するものであり得る。マイクロニードルの断面形状は、長方形、正方形、卵形、円形、ダイヤモンド形、三角形、楕円形、多角形、U字形または星形を含むがこれらに限定されない様々な形状をとり得る。いくつかの態様において、マイクロニードルの断面は、例えば、そのボディ部の長さ方向に沿って（均一な形状および面積を有する）均一な断面の直線的なボディ部を有するマイクロニードル140により図示されているように、マイクロニードルボディ部の長さ方向に沿って均一な形状および面積を有し得る。いくつかの態様において、マイクロニードルの断面は、マイクロニードルボディ部の長さ方向に沿って面積が変化する同一形状を有し得る。例えば、図1に示されるように、マイクロニードル110、120または150は、貫入先端112、122または152に向かって断面積が減少する同一形状を有するテーパー状のボディ部を含み得；またはマイクロニードル160は、マイクロニードルボディ部の長さ方向に沿って断面積が変化する同一形状を有し得る。マイクロニードルが不規則形状であるいくつかの態様において、それらの断面は、マイクロニードルボディ部の長さ方向に沿って形状および面積の両方が変化し得るか、または、それらの断面は、マイクロニードルボディ部の長さ方向に沿って形状が変化する（一定の面積である）ものであり得る。1つの態様において、本明細書に記載されるマイクロニードルは、マイクロニードルボディ部の長さ方向に沿って実質的に円形の断面を有するテーパー状のボディ部を含む。マイクロニードルボディ部の断面の寸法は、50nmから約1500μm、約50nmから約1000μm、約100nmから約750μm、約250nmから約500μmまたは約500nmから約500μmの範囲であり得る。
【００３４】
マイクロニードルボディ部の長さは、例えば投与の標的となる組織のタイプ、必要とされる貫入深度、マイクロニードルの非挿入部分の長さおよび生物学的障壁を越えてまたは生物学的障壁にマイクロニードルを適用する方法であるがこれらに限定されない多くの要因に依存して、マイクロメートルからセンチメートルまで様々であり得る。一例にすぎないが、手術中にマイクロニードルを臓器組織（例えば、心臓組織）の数センチメートル（a few centimeters）のところまで到達させる必要がある場合、マイクロニードルは、数十センチメートル（several centimeters）の長さのものであり得る。そのような態様において、マイクロニードルはさらに、臓器組織（例えば、心臓組織）へのマイクロニードルの貫入を容易にするために、アプリケーターまたはデバイスに固定され得る。したがって、本明細書に記載されるマイクロニードルのいくつかの態様は、約0.5cmから約10cm、約1cmから約8cmまたは約2cmから約6cmの長さを有し得る。
【００３５】
いくつかの態様において、マイクロニードルボディ部の長さは、約10μmから約5000μm、約50μmから約2500μm、約100μmから約1500μm、約150μmから約1000μmまたは約200μmから約800μmまで様々であり得る。いくつかの態様において、マイクロニードルボディ部の長さは、約200μmから約800μmまで様々であり得る。例として、本明細書に記載されるマイクロニードルのいくつかの態様は、皮膚への貫入のために使用され得る。皮膚の最外障壁である角質層は、一般に、約10μmから20μm厚であり、これが約50μmから100μm厚の生きた上皮を覆っている。この上皮は無血管であるが、ランゲルハンス細胞（未成熟の骨髄樹状細胞）を有しており、これは例えば、免疫応答、例えば免疫付与の誘導に関与し得る。これらの皮膚層の下にある真皮は約1mmから2mm厚であり、豊富な毛細血管床を保有しており、これが活性剤の全身送達の有用な標的となり得る。シルクフィブロインの頑丈な機械的特性は、任意の適当な深度まで皮膚に貫入するマイクロニードルの構築を可能にする。例えば、マイクロニードルの長さは、例えば免疫応答を誘導するため、活性剤を生きた上皮に送達するのに十分な長さ（皮膚表面下約10μmから120μm）となるよう構築され得る。いくつかの態様において、マイクロニードルの長さは、活性剤を真皮に送達するのに十分な長さ（皮膚表面下約60μmから2.1mm）となるよう構築され得る。当業者は、組織の厚み、例えば皮膚の厚み（例えば、年齢、性別、身体における位置、種（動物）の関数として）、薬物送達プロファイル（例えば、高速 - 長いニードル 対 低速 - 短いニードル；高速 - 最小のβシート構造 対 低速 - 最大のβシート構造）、活性剤の拡散特性（例えば、イオン電荷、分子量、形状）またはそれらの任意の組み合わせ、を含むがこれらに限定されない多くの要因に応じてマイクロニードルの長さを調整することができる。マイクロニードルの長さは、投与の標的となる組織に依存して、約50μmから約700μmの間の範囲であり得る。いくつかの態様において、個々のマイクロニードルが15μmから300μmのサイズ範囲であるデバイスを、シルクフィブロインから製造することができる。
【００３６】
したがって、マイクロニードルボディ部の長さは、各々の個別の用途に応じて選択および構築され得る。いくつかの態様において、マイクロニードルボディ部の長さはさらに、非挿入部分、すなわち、組織への貫入には通常関与しないマイクロニードルの部分、を含み得る。それらの態様において、マイクロニードルボディ部の長さは、挿入部の長さ（生物学的障壁にまたは生物学的障壁を越えて貫入できるマイクロニードルの部分）および非挿入部の長さを含み得る。非挿入部の長さは、用途ならびに／または個々のデバイスのデザインおよび構成（例えば、マイクロニードルを把持するマイクロニードルアダプタまたはシリンジ）に依存し得る。
【００３７】
有利な点として、シルクベースのマイクロニードルまたはマイクロニードルデバイスは、全体が生体適合性であり、かつ完全にまたは部分的に生体分解性および／または生体侵食性であり得る。「生体適合性」という用語は、一般に、環境または対象に対して有害ではない材料を表し；環境は、インビボ環境または体外の環境、例えば作物畑の環境であり得、かつ環境化学は天然に存在する環境の間で様々であり得る。「生体分解性」という用語は、一般に、共通の環境化学（例えば酵素、pHおよび天然に存在する化合物）により、対象（例えば、ヒト）内部の環境を含むその環境に害を及ぼすことなく再吸収され得る元素または単純な化学構造物を生じるよう改変され得る化学構造を有する材料を表す。生体分解性材料はまた、物理的消失および化学的変化を起こすという点で、生体侵食性でもあり得る。例えば、生体分解性材料は、元素または化学構造物まで解体され得るのに対して、生体侵食性材料は、化学構造の大部分をインタクトな状態で残したまま巨視的レベルで解体（例えば、分子鎖切断）され得る。したがって、本発明のシルクベースのマイクロニードルは、生体適合性であり、対象に対して有害ではない材料または成分に分解または侵食され得るため、対象から除去することを要しない。加えて、シルクフィブロインは、完全水溶液処理によって調製することができ、これが生物および環境に対するその適合性をさらに向上させている。
【００３８】
活性剤およびその安定化
いくつかの態様において、本発明のシルクフィブロインマイクロニードルは、少なくとも1つの活性剤を含み得る。本明細書に記載されるマイクロニードル内に分配される活性剤の量は、マイクロニードルのサイズおよび／またはカプセル化効率に依存してピコグラムレベルからミリグラムレベルまで様々であり得る。活性剤の非限定的な例には、有機物質、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、フェノールスルホンフタレイン、ヌクレオチド、核酸（例えば、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、siRNA、shRNA）、アプタマー、抗体またはその一部分（例えば、抗体様分子）、ホルモン（例えば、インスリン、テストステロン）、成長因子、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、有機リン酸デヒドロゲナーゼ、リガーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ、RNAまたはDNAポリメラーゼ、グルコースオキシダーゼ、ラクターゼ）、細胞（例えば、赤血球、幹細胞）、細菌もしくはウイルス、その他のタンパク質もしくはペプチド、低分子（例えば、薬物、染料、アミノ酸、ビタミン、抗酸化物質）、脂質、炭水化物、発色団、発光性有機化合物（例えば、ルシフェリン、カロテン）および発光性無機化合物（例えば、化学染料および／もしくはコントラスト増強剤、例えばインドシアニングリーン）、免疫原性物質、例えばワクチン、抗生物質、抗真菌剤、抗ウイルス剤、治療剤、診断剤またはそれらのいずれかのプロドラッグ、アナログもしくは組み合わせが含まれる。例えば、その内容の全体が参照により本明細書に組み入れられるWO 2011/006133, Bioengineered Silk Protein-Based Nucleic Acid Delivery Systems; WO 2010/141133, Silk Fibroin Systems for Antibiotic Delivery; WO 2009/140588, Silk Polymer-Based Adenosine Release: Therapeutic Potential for Epilepsy; WO 2008/118133, Silk Microspheres for Encapsulation & Controlled Release; WO 2005/123114, Silk-Based Drug Delivery System; US 61/477,737, Compositions and Methods for Stabilization of Active Agentsを参照のこと。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「タンパク質」および「ペプチド」という用語は、本明細書において置き換え可能に使用され、隣接する残基のアルファアミノ基とカルボキシ基の間のペプチド結合によって別の残基に接続されたひとつながりのアミノ酸残基を表す。「タンパク質」および「ペプチド」という用語は、本明細書において置き換え可能に使用され、そのサイズまたは機能によらず、修飾アミノ酸（例えば、リン酸化、糖化等）およびアミノ酸アナログを含むタンパク質アミノ酸のポリマーを表す。「タンパク質」は多くの場合、比較的大きなポリペプチドを参照するのに使用され、「ペプチド」は多くの場合、小さなポリペプチドを参照するのに使用されるが、当技術分野におけるこれらの用語の用法は重複しかつばらつきのあるものである。本明細書で使用される場合、「ペプチド」という用語は、そうでないことが示されていない限り、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質およびタンパク質のフラグメントを表す。「タンパク質」および「ペプチド」という用語は、本明細書において、遺伝子産物およびそのフラグメントを参照する場合、置き換え可能に使用される。したがって、例示的なペプチドまたはタンパク質には、遺伝子産物、天然に存在するタンパク質、ホモログ、オルソログ、パラログ、フラグメントならびに上記物質のその他の等価物、バリアント、フラグメントおよびアナログが含まれる。
【００４０】
本明細書で使用される「核酸」という用語は、ポリヌクレオチド、例えばデオキシリボ核酸（DNA）および、適当な場合は、リボ核酸（RNA）、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のそれらのポリマーを表す。個別に限定されていない限り、この用語は、参照核酸と類似の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと類似の様式で代謝される、天然ヌクレオチドの既知のアナログを含む核酸を含む。それ以外のことが示されていない限り、個々の核酸配列は、明示的に示されている配列と共に、暗示的に、保存的に修飾されたそのバリアント（例えば、縮重コドン置換）および相補的配列も含む。具体的に、縮重コドン置換は、1つまたは複数の選択された（またはすべての）コドンの3番目の位置が塩基混合物および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することによって達成され得る（Batzer, et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka, et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985), およびRossolini, et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)）。「核酸」という用語はまた、等価物として、ヌクレオチドアナログから生成されるRNAまたはDNAのいずれかの誘導体、バリアントおよびアナログ、ならびに一本鎖（センスまたはアンチセンス）および二本鎖ポリヌクレオチドを含むと理解されたい。
【００４１】
「短鎖干渉RNA（siRNA）」という用語は、本明細書で「低分子干渉RNA」とも称され、標的遺伝子の発現を、例えばRNAiによって阻害するよう機能する作用物質と定義される。siRNAは、化学的に合成することができ、インビトロ転写により生産することができ、または宿主細胞中で生産することができる。siRNA分子はまた、一方の鎖が不活性化させたいメッセージと同一である二本鎖RNAの切断によっても生成することができる。「siRNA」という用語は、RNA干渉（RNAi）経路を誘導する低分子阻害性RNA二重鎖を表す。これらの分子は、様々な長さ（一般には18〜30塩基対）であり得、そのアンチセンス鎖の中にそれらの標的mRNAに対する様々な程度の相補性を含み得る。すべてではないが一部のsiRNAは、センス60鎖および／またはアンチセンス鎖の5'または3'末端に、対を形成しないオーバーハング塩基を有する。「siRNA」という用語には、2つの個別の鎖の二重鎖および二重鎖領域を含むヘアピン構造を形成することができる一本鎖が含まれる。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「shRNA」という用語は、短ヘアピンRNAを表し、これはRNAiおよび／またはsiRNA種として機能するが、shRNA種が安定性が高められた二本鎖ヘアピン様構造物である点で相違する。本明細書で使用される場合、「RNAi」という用語は、干渉性RNAを表すか、またはRNA干渉分子は核酸分子またはそのアナログ、例えば、遺伝子発現を阻害するRNAベースの分子である。RNAiは、選択的な転写後遺伝子サイレンシングの手段を表す。RNAiは、特定のmRNAを破壊するかまたはRNA、例えばmRNAのプロセシングもしくは翻訳を抑制することができる。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「酵素」という用語は、他の物質の化学反応を触媒するタンパク質分子であって、その反応の完了時に破壊されたり実質的に改変されたりしないものを表す。この用語には、天然に存在する酵素および生物工学的な酵素またはそれらの混合物が含まれ得る。酵素ファミリーの例には、キナーゼ、デヒドロゲナーゼ、オキシドレダクターゼ、GTPase、カルボキシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、デカルボキシラーゼ、トランスアミナーゼ、ラセマーゼ、メチルトランスフェラーゼ、ホルミルトランスフェラーゼおよびα-ケトデカルボキシラーゼが含まれる。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「ワクチン」という用語は、対象の体内に導入されたときに免疫システムを活性化し、抗体を形成しならびに／またはT細胞および／もしくはB細胞応答を生じることによって特定の疾患に対する免疫を生成する、死滅した微生物、生きている弱毒化された生物、サブユニット抗原、トキソイド抗原、接合抗原または他のタイプの抗原性分子の任意の調製物を表す。一般に、微生物に対するワクチンは、ウイルス、細菌、寄生生物、マイコプラズマまたはその他の感染性作用物質の少なくとも一部分に対するものである。
【００４５】
本明細書に記載されるマイクロニードルに含めることができるワクチン製品の例には、BIOTHRAX（登録商標）（炭疽菌ワクチン・沈降精製、Emergent Biosolutions, Rockville, MD）；TICE（登録商標）BCG Live（カルメットゲラン菌・膀胱内用、Organon Tekina Corp. LLC, Durham, NC）；MYCOBAX（登録商標）BCG Live（Sanofi Pasteur Inc）；DAPTACEL（登録商標）（ジフテリアおよび破傷風トキソイドおよび無細胞百日咳［DTaP］ワクチン・沈降精製、Sanofi Pasteur Inc.）；INFANRIX（登録商標）（DTaPワクチン・沈降精製、GlaxoSmithKline）；TRIPEDIA（登録商標）（DTaPワクチン、Sanofi Pasteur）；TRIHIBIT（登録商標）（DTaP/Hib#、sanofi pasteur）；KINRIX（登録商標）（ジフテリアおよび破傷風トキソイド、無細胞百日咳・沈降精製ならびに不活性化ポリオウイルスワクチン、GlaxoSmithKline）；PEDIARIX（登録商標）（DTaP-HepB-IPV、GlaxoSmithKline）；PENTACEL（登録商標）（ジフテリアおよび破傷風トキソイドおよび無細胞百日咳・沈降精製、不活性化ポリオウイルスならびにヘモフィルスb型混合［破傷風トキソイド混合］ワクチン、sanofi pasteur）；ジフテリアおよび破傷風トキソイド・沈降精製（小児用、Sanofi Pasteur）；DECAVAC（登録商標）（ジフテリアおよび破傷風トキソイド・沈降精製、成人用、Sanofi Pasteur）；ACTHIB（登録商標）（ヘモフィルスb型・破傷風トキソイド混合ワクチン、Sanofi Pasteur）；PEDVAXHIB（登録商標）（Hibワクチン、Merck）；Hiberix（ヘモフィルスb型・破傷風トキソイド混合ワクチン、ブースター用量、GlaxoSmithKline）；COMVAX（登録商標）（B型肝炎-Hibワクチン、Merck）；HAVRIX（登録商標）（A型肝炎ワクチン、小児、GlaxoSmithKline）；VAQTA（登録商標）（A型肝炎ワクチン、小児、Merck）；ENGERIX-B（登録商標）（Hep B、小児、未成年、GlaxoSmithKline）；RECOMBIVAX HB（登録商標）（B型肝炎ワクチン、Merck）；TWINRIX（登録商標）（HepA/HepBワクチン、18歳以上、GlaxoSmithKline）；CERVARIX（登録商標）（ヒトパピローマウイルス・二価［16および18型］ワクチン、組換え、GlaxoSmithKline）；GARDASIL（登録商標）（ヒトパピローマウイルス・二価［6、11、16および18型］ワクチン、組換え、Merck）；AFLURIA（登録商標）（インフルエンザワクチン、18歳以上、CSL）；AGRIFLU（商標）（インフルエンザウイルスワクチン・筋内注射用、Novartis Vaccines）；FLUARIX（登録商標）（インフルエンザワクチン、18歳以上、GaxoSmithKline）；FLULAVAL（登録商標）（インフルエンザワクチン、18歳以上、GaxoSmithKline）；FLUVIRIN（登録商標）（インフルエンザワクチン、4歳以上、Novartis Vaccine）；FLUZONE（登録商標）（インフルエンザワクチン、6ヶ月以上、Sanofi Pasteur）；FLUMIST（登録商標）（インフルエンザワクチン、2歳以上、MedImmune）；IPOL（登録商標）（e-IPVポリオワクチン、sanofi Pasteur）；JE VAX（登録商標）（日本脳炎ウイルスワクチン・不活性化、BIKEN, Japan）；IXIARO（登録商標）（日本脳炎ウイルスワクチン・不活性化、Novartis）；MENACTRA（登録商標）（髄膜炎菌［A、C、YおよびW-135群］およびジフテリアワクチン、Sanofi Pasteur）；MENOMUNE（登録商標）-A/C/Y/W-135（髄膜炎菌多糖体ワクチン、sanofi pasteur）；MMRII（登録商標）（MMRワクチン、Merck）；MENVEO（登録商標）（髄膜炎菌［A、C、YおよびW-135群］オリゴ糖体・ジフテリアCRM197混合ワクチン、Novartis Vaccines）；PROQUAD（登録商標）（MMRおよび水痘ワクチン、Merck）；PNEUMOVAX 23（登録商標）（肺炎球菌多糖体ワクチン、Merck）；PREVNAR（登録商標）（肺炎球菌ワクチン、7価、Wyeth/Lederle）；PREVNAR-13（登録商標）（肺炎球菌ワクチン、13価、Wyeth/Lederle）；POLIOVAX（商標）（ポリオウイルス・不活性化、sanofi pasteur）；IMOVAX（登録商標）（狂犬病ワクチン、Sanofi Pasteur）；RABAVERT（商標）（狂犬病ワクチン、Chiron）；ROTATEQ（登録商標）（ロタウイルスワクチン、生、経口・5価、Merck）；ROTARIX（登録商標）（ロタウイルス、生、経口ワクチン、GlaxoSmithKline）；DECAVAC（商標）（破傷風およびジフテリアトキソイドワクチン、sanofi pasteur）；Td（ジェネリック）（破傷風およびジフテリアトキソイド、沈降精製、Massachusetts Biol. Labs）；TYPHIMVI（登録商標）（腸チフスVi多糖体ワクチン、Sanofi Pasteur）；ADACEL（登録商標）（破傷風トキソイド、弱毒性ジフテリアトキソイドおよび無細胞百日咳、sanofi pasteur）；BOOSTRIX（登録商標）（破傷風トキソイド、弱毒性ジフテリアトキソイドおよび無細胞百日咳、GlaxoSmithKline）；VIVOTIF（登録商標）（腸チフスワクチン・生・経口Ty21a、Berna Biotech）；ACAM2000（商標）（天然痘（ワクシニア）ワクチン、生、Acambis, Inc.）；DRYVAX（登録商標）（天然痘（ワクシニア）ワクチン）；VARIVAX（登録商標）（水痘［生］ワクチン、Merck）；YF-VAX（登録商標）（黄熱病ワクチン、Sanofi Pasteur）；ZOSTAVAX（登録商標）（水痘帯状疱疹、Merck）；またはそれらの組み合わせが含まれるがこれらに限定されない。Center for Disease Control and Prevention（CDC）のデータベースに列挙されている任意のワクチン製品も、本明細書に記載される組成物に含めることができる。
【００４６】
いくつかの態様において、動物用ワクチン、例えばイヌ用およびネコ用ワクチンを、本明細書に記載されるマイクロニードルに含めることもできる。動物用ワクチンの例には、DURAMUNE（登録商標）MAX 5（5種対応ワクチン:イヌジステンパー、イヌ伝染性肝炎、アデノウイルス2型、パラインフルエンザおよびパルボウイルス、Fort Dodge）；NEOPAR（登録商標）（パルボウイルス、Neo Tech）；VANGUARD（登録商標）PLUS 5（イヌジステンパー、アデノウイルス1型および2型、パラインフルエンザおよびパルボウイルス；Pfizer）；BRONCHI-SHIELD（登録商標）III（イヌパラインフルエンザ；Fort Dodge）；ならびにECLIPSE（登録商標）4（ネコ鼻気管炎、カリシおよび汎白血球減少症ウイルスならびにオウム病クラミジア、Schering-Plough/Intervet）が含まれるがこれらに限定されない。任意の市販の動物用ワクチンを本明細書に記載されるマイクロニードルに含めることができる。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「アプタマー」という用語は、選択された非オリゴヌクレオチド分子または分子群を特異的に認識することができる一本鎖、部分的に一本鎖、部分的に二本鎖または二本鎖のヌクレオチド配列を意味する。いくつかの態様において、アプタマーは、ワトソン・クリック塩基対または三重鎖形成以外のメカニズムによって非オリゴヌクレオチド分子または分子群を認識する。アプタマーは、これに限定されないが、ヌクレオチド、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、修飾ヌクレオチドおよび骨格修飾、分枝点および非ヌクレオチド残基、基または架橋を含むヌクレオチドを含む、確定された配列セグメントおよび配列を含み得る。分子に結合するアプタマーを選択する方法は、当技術分野で広く知られており、当業者はそれを容易に知ることができる。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「抗体（"antibody"）」または「抗体（"antibodies"）」という用語は、インタクトな免疫グロブリンまたはFc（結晶化フラグメント）領域もしくはFc領域のFcRn結合フラグメントを有するモノクローナルもしくはポリクローナル抗原結合フラグメントを表す。「抗体」という用語には、「抗体様分子」、例えば抗体のフラグメント、例えば抗原結合フラグメントも含まれる。抗原結合フラグメントは、組換えDNA技術によってまたはインタクトな抗体の酵素的もしくは化学的切断によって生成することができる。「抗原結合フラグメント」には、とりわけ、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、dAbおよび相補性決定領域（CDR）フラグメント、単鎖抗体（scFv）、単一ドメイン抗体、キメラ抗体、ダイアボディならびに特異的抗原結合性をそのポリペプチドに付与するのに十分な免疫グロブリンの少なくとも一部分を含むポリペプチドが含まれる。本明細書に記載される目的上、リニア抗体も含まれる。Fab、Fc、pFc'、F(ab')2およびFvという用語は、標準的な免疫学的意味で用いられる（Klein, Immunology (John Wiley, New York, N.Y., 1982); Clark, W.R. (1986) The Experimental Foundations of Modern Immunology (Wiley & Sons, Inc., New York); およびRoitt, I. (1991) Essential Immunology, 7th Ed., (Blackwell Scientific Publications, Oxford)）。様々な抗原に対する特異的な抗体または抗原結合フラグメントは、R&D Systems、BD Biosciences、e-BiosciencesおよびMiltenyi等の販売元から市販されているか、または当業者に公知の方法によってこれらの細胞表面マーカーに対して惹起することができる。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「相補性決定領域」（CDR；すなわち、CDR1、CDR2およびCDR3）という用語は、抗原への結合のために存在する必要のある抗体可変ドメインのアミノ酸残基を表す。各可変ドメインは、典型的には、CDR1、CDR2およびCDR3として特定される3つのCDR領域を有する。各相補性決定領域は、Kabatにより定義される「相補性決定領域」（すなわち、軽鎖可変ドメインのおよそ24〜34（L1）、50〜56（L2）および89〜97（L3）の残基ならびに重鎖可変ドメインのおよそ31〜35（H1）、50〜65（H2）および95〜102（H3）の残基；Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)）のアミノ酸残基ならびに／または「超可変ループ」（すなわち、軽鎖可変ドメインのおよそ26〜32（L1）、50〜52（L2）および91〜96（L3）の残基ならびに重鎖可変ドメインのおよそ26〜32（H1）、53〜55（H2）および96〜101（H3）の残基；Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）の残基を含み得る。いくつかの例において、相補性決定領域は、Kabatにしたがい定義されるCDR領域および超可変ループの両方のアミノ酸を含み得る。
【００５０】
「リニア抗体」という表現は、Zapata et al., Protein Eng., 8(10):1057-1062 (1995)に記載される抗体を表す。簡単に説明すると、これらの抗体は、一対の直列Fdセグメント（VH-CH1-VH-CH1）を含み、これが相補的な軽鎖ポリペプチドと一対の抗原結合領域を形成しているものである。リニア抗体は、二特異性または一特異性であり得る。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「単鎖Fv」または「scFv」抗体フラグメントという表現は、抗体のVHおよびVLドメインを含み、これらのドメインが単一のポリペプチド鎖に存在する抗体フラグメントを意味することが意図される。好ましくは、Fvポリペプチドはさらに、そのscFvが抗原結合に望ましい構造を形成できるようにするポリペプチドリンカーをVHとVLドメインの間に含む（Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer- Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)）。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「ダイアボディ（diabody）」という用語は、2つの抗原結合部位を有し、同一のポリペプチド鎖（VH-VL）中に軽鎖可変ドメイン（VL）に連結された重鎖可変ドメイン（VH）を含む、小さな抗体フラグメントを表す。同一鎖中の2つのドメイン間での対形成には短すぎるリンカーを使用することによって、これらのドメインは別の鎖の相補的ドメインと対を形成し、2つの抗原結合部位を生成することを強いられる（EP 404,097; WO 93/11161; Hollinger et ah, Proc. Natl. Acad. Sd. USA, P0:6444-6448 (1993)）。
【００５３】
本明細書で使用される場合、「低分子」という用語は、ペプチド、ペプチド模倣体、アミノ酸、アミノ酸アナログ、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドアナログ、アプタマー、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、約10,000グラム／モル未満の分子量を有する有機または無機化合物（すなわち、ヘテロ有機化合物および有機金属化合物を含む）、約5,000グラム／モル未満の分子量を有する有機または無機化合物、約1,000グラム／モル未満の分子量を有する有機または無機化合物、約500グラム／モル未満の分子量を有する有機または無機化合物、ならびにそのような化合物の塩、エステルおよびその他の薬学的に許容できる形態を含むがこれらに限定されない天然または合成分子を表す。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「細菌」という用語は、細菌のすべてのバリアント、例えば原核生物およびシアノバクテリアを含むことが意図される。細菌は、小さく（典型的な線寸法はおよそ1m）、区分化されておらず、環状DNAおよび70Sのリボソームを有する。
【００５５】
「抗生物質」という用語は、本明細書において、微生物の生存率を低下させるまたは微生物の成長もしくは複製を阻害する化合物または組成物を表すのに使用される。本開示において使用される場合、抗生物質は、さらに、抗菌剤、静菌剤または殺菌剤を含むことが意図される。例示的な抗生物質には、ペニシリン、セファロスポリン、ペネム、カルバペネム、モノバクタム、アミノグリコシド、スルホンアミド、マクロライド、テトラサイクリン、リンコシド（lincoside）、キノロン、クロラムフェニコール、バンコマイシン、メトロニダゾール、リファンピン、イソニアジド、スペクチノマイシン、トリメトプリムおよびスルファメトキサゾールが含まれるがこれらに限定されない。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「細胞」という用語は、植物、酵母、蠕虫、昆虫および哺乳動物を含む原核生物または真核生物の任意の細胞を表す。哺乳動物細胞には、霊長類、ヒト、および、マウス（mouse）、ハムスター、ウサギ、犬（dog）、猫（cat）、家畜動物、例えばウマ、ウシ、ネズミ（murine）、ヒツジ、イヌ（canine）、ネコ（feline）等を含むがこれらに限定されない関心対象の任意の動物由来の細胞が含まれるがこれらに限定されない。これらの細胞は、造血細胞、神経細胞、間葉細胞、皮膚細胞、粘膜細胞、間質細胞、筋細胞、脾細胞、細網内皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、腎細胞、胃腸細胞、肺細胞、T細胞等であるがこれらに限定されない幅広い組織タイプのものであり得る。造血幹細胞、神経幹細胞、間質幹細胞、筋幹細胞、心血管幹細胞、肝幹細胞、肺幹細胞、胃腸幹細胞等を含むがこれらに限定されない幹細胞、胚性幹（ES）細胞、ES由来細胞および幹細胞前駆体も含まれる。酵母細胞もまた、本発明において細胞として使用され得る。いくつかの態様において、細胞は、エクスビボまたは培養細胞、例えば、インビトロであり得る。例えば、エクスビボ細胞については、細胞は、健常および／または疾患を患っている対象から得ることができる。細胞は、非限定的な例として、生検または当業者に公知のその他の外科的手段によって得ることができる。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「ウイルス」という用語は、タンパク質のカプシドに包まれた核酸から構成される感染性作用物質を表す。そのような感染性作用物質は、自立複製することができない（すなわち、複製に宿主細胞の機構の使用が必要となる）。ウイルスゲノムは、一本鎖（ss）または二本鎖（ds）のRNAまたはDNAであり得、逆転写酵素（RT）を使用することができるまたは使用できないものである。加えて、ssRNAウイルスは、センス（+）またはアンチセンス（-）のいずれかであり得る。例示的なウイルスには、dsDNAウイルス（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス）、ssDNAウイルス（例えば、パルボウイルス）、dsRNAウイルス（例えば、レオウイルス）、（+）ssRNAウイルス（例えば、ピコルナウイルス、トガウイルス）、（-）ssRNAウイルス（例えば、オルソミクソウイルス、ラブドウイルス）、ssRNA-RTウイルス、すなわちライフサイクルの中でDNAが介在する（+）センスRNA（例えば、レトロウイルス）およびdsDNA-RTウイルス（例えば、肝炎ウイルス）が含まれるがこれらに限定されない。いくつかの態様において、ウイルスには、野生型（天然）ウイルス、死滅したウイルス、生きている弱毒化されたウイルス、修飾されたウイルス、組換えウイルスまたはそれらの任意の組み合わせも含まれ得る。ウイルスの他の例には、エンベロープウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、非エンベロープウイルス、バクテリオファージ、組換えウイルスおよびウイルスベクターが含まれるがこれらに限定されない。本明細書で使用される場合、「バクテリオファージ」という用語は、細菌に感染するウイルスを表す。
【００５８】
「治療剤」という用語は、当技術分野で知られており、対象において局所的にまたは全身的に作用する生物学的、生理学的または薬理学的に活性な物質である任意の化学部分を表す。「薬物」とも呼ばれる治療剤の例は、周知の参考文献、例えば、Merck Index、the Physicians Desk ReferenceおよびThe Pharmacological Basis of Therapeuticsに記載されており、それらには医療薬；ビタミン；ミネラルサプリメント；疾患もしくは疾病の処置、予防、診断、治癒もしくは緩和に使用される物質；身体の構造もしくは機能に作用する物質；または生理学的環境に置かれた後に生物学的に活性となるもしくはより活性が高くなるプロドラッグが含まれるがこれらに限定されない。対象に投与されたときに本発明の組成物から隣接する組織または体液中に放出され得る様々な形態の治療剤が使用され得る。その例には、ステロイドおよびステロイドのエステル（例えば、エストロゲン、プロゲステロン、テストステロン、アンドロステロン、コレステロール、ノルエチンドロン、ジゴキシゲニン、コール酸、デオキシコール酸およびケノデオキシコール酸）、含ホウ素化合物（例えば、カルボラン）、化学療法用ヌクレオチド、薬物（例えば、抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌剤）、エンジイン（例えば、カリケアマイシン、エスペラマイシン、ジネマイシン、ネオカルチノスタチンクロモフォアおよびケダルシジンクロモフォア）、重金属錯体（例えば、シスプラチン）、ホルモンアンタゴニスト（例えば、タモキシフェン）、非特異的（非抗体）タンパク質（例えば、糖オリゴマー）、オリゴヌクレオチド（例えば、標的核酸配列（例えば、mRNA配列）に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド）、ペプチド、タンパク質、抗体、光動力剤（例えば、ローダミン123）、放射性核種（例えば、I-131、Re-186、Re-188、Y-90、Bi-212、At-211、Sr-89、Ho-166、Sm-153、Cu-67およびCu-64）、毒素（例えば、リシン）ならびに転写ベースの医薬が含まれる。
【００５９】
いくつかの態様において、治療剤には、鎮痛薬が含まれ得る。鎮痛薬の例には、アセトアミノフェン、非ステロイド性抗炎症薬（NSAID）、コルチコステロイド（例えば、MEDROL（登録商標）、PREDNISONE（登録商標）またはコルチゾンであるがこれらに限定されない）；催眠薬；抗けいれん薬（例えば、NEURONTIN（登録商標）（ガバペンチン）、LYRICA（登録商標）（プレガバリン）であるがこれらに限定されない）；局所麻酔薬（例えば、LIDODERM（登録商標））およびそれらの任意の組み合わせが含まれるがこれらに限定されない。
【００６０】
本明細書で提供されるマイクロニードルのいくつかの態様に含めることができる例示的なNSAIDには、イブプロフェン、ナプロキセン（naproxin）、アスピリン、フェノプロフェン（NALFON）、フルルビプロフェン（ANSAID（登録商標））、ケトプロフェン（ORUVAIL（登録商標））、オキサプロジン（DAYPRO（登録商標））、ジクロフェナクナトリウム（VOLTAREN（登録商標）、VOLTAREN-XR（登録商標）、CATAFLAM（登録商標））、エトドラク（LODINE（登録商標））、インドメタシン（INDOCIN（登録商標）、INDOCIN-SR（登録商標））、ケトロラク（TORADOL（登録商標））、スリンダク（CLINORIL（登録商標））、トルメチン（TOLECTIN（登録商標））、メクロフェナメート（MECLOMEN（登録商標））、メフェナム酸（PONSTEL（登録商標））、ナブメトン（RELAFEN（登録商標））、ピロキシカム（FELDENE（登録商標））およびCOX-2阻害剤、例えばCELEBREX（登録商標）が含まれるがこれらに限定されない。
【００６１】
いくつかの態様において、鎮痛薬には、アセトアミノフェン混合薬（例えば、アセトアミノフェンと催眠薬）、例えばアセトアミノフェンとコデイン（例えば、TYLENOL（登録商標）とコデイン、CAPITAL（登録商標）とコデイン、フェナフェンとコデインであるがこれらに限定されない）；アセトアミノフェンとハイドロコドン（例えば、ANEXSIA（登録商標）；ANODYNOS-DHC（登録商標）；BANCAP HC（登録商標）；CO-GESIC（登録商標）；DOLACET（登録商標）；DUOCET（商標）；HYDROCET（登録商標）；HYDROGESIC（登録商標）；HY-PHEN（登録商標）；LORCET（登録商標）；LORCET（登録商標）-HD；LORCET（登録商標）PLUS；LORTAB（登録商標）；MARGESIC（登録商標）H；MEDIPAIN 5（登録商標）；NORCO（登録商標）；STAGESIC（登録商標）；T-GESIC（登録商標）；VICODIN（登録商標）；VICODIN（登録商標） ES；VICODIN（登録商標）HP；ZYDONE（登録商標）であるがこれらに限定されない）；およびアセトアミノフェンとオキシコドン（PERCOCET（登録商標）、ROXICET（登録商標）、ENDOCET（登録商標）、ROXILOX（登録商標）、TYLOX（登録商標））が含まれ得る。
【００６２】
「診断剤」は、診断に使用することができる任意の化学部分である。例えば、診断剤には、放射性同位体、例えばインジウムまたはテクネチウムを含有するイメージング剤；ヨウ素、ガドリニウムまたはシアニンを含有するコントラスト剤または染料；酵素、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、GFP、アルカリホスファターゼまたはβ-ガラクトシダーゼ；蛍光物質、例えばユーロピウム誘導体；発光物質、例えばN-メチルアクリジウム誘導体等が含まれる。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「抗真菌剤」という用語は、真菌細胞の成長、生存および／または複製を阻害または防止することができる物質を表す。いくつかの態様において、抗真菌剤には、動物または植物における真菌感染を予防または処置することができるものが含まれる。抗真菌剤は、広域抗真菌剤または1つもしくは複数の特定の真菌種に特異的な抗真菌剤であり得る。抗真菌剤の非限定的な例には、エルゴステロール合成阻害剤、例えばアゾール（例えば、イミダゾールおよびトリアゾール）ならびにフェンプロピモルフ、テルビナフィン、ケトコナゾール、イトラコナゾール（itroconazole）、フルコナゾール、ボリコナゾール、ポサコナゾール、ラブコナゾールおよびミコナゾールが含まれる。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「抗ウイルス剤」という用語には、例えば宿主細胞に侵入し宿主細胞のDNAを利用して自らを複製するウイルスの能力を妨げることによって；ウイルスの細胞付着または侵入を減らすことによって；複製を遅らせることによって；および／またはウイルスがウイルスDNAを取り囲むタンパク質コートを脱ぎ捨てるのを妨げることによって、ウイルス感染を処置する、ウイルスの成長および複製を破壊するもしくは遅らせる、ならびに／またはウイルス感染を遅らせるのに使用される任意の薬剤が含まれる。これらに限定されないが、例示的な抗ウイルス剤には、リバビリン、アシクロビル、オセルタミビルおよびザナミビル、アマンタジンならびにリマンタジンが含まれる。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「ホルモン」という用語は、概ね、天然に存在するまたは天然に存在しないホルモン、そのアナログおよび模倣体を表す。特定の態様において、「ホルモン」という用語は、治療的処置、例えば成長ホルモン処置、に使用される任意のホルモンを表す。本明細書で使用される場合、「成長ホルモン」または「GH」は、ネイティブ配列またはバリアント形態の、任意の供給源由来の、天然、合成または組換えの、成長ホルモンを表す。その例には、ヒトネイティブ配列を有する天然または組換えGHであるヒト成長ホルモン（hGH）（ソマトトロピンまたはソマトロピン）、ならびにソマトレム、ソマトトロピンおよびソマトロピンを含む、組換えDNA技術によって生成される任意のGHまたはバリアントを表す、組換え成長ホルモン（rGH）、が含まれる。1つの態様において、ホルモンにはインスリンが含まれる。
【００６６】
特定の態様において、「活性剤」という用語は、その活性剤の生物活性を阻害または低下させる特定条件に一定期間供されるときにその生物活性を安定化させることが望まれる、任意の分子、化合物または組成物を参照して使用される。そのような条件には、状態変化サイクル、温度、気圧、湿度および露光が含まれ得るがこれらに限定されない。1つの態様において、状態変化サイクルは、凍結乾燥サイクルである。本発明にしたがい、少なくとも1つの活性剤の生物活性が、その活性剤を含むシルクフィブロインベースのマイクロニードル内で維持され得る。
【００６７】
少なくとも1つの活性剤が添加されたシルクフィブロインベースのマイクロニードル（「活性剤添加マイクロニードル」と称される）が状態変化サイクルに供されるおよび／または一定期間特定条件下で維持されるとき、活性剤は、その本来の生物活性の少なくとも約30%、例えばその本来の生物活性の少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%またはそれ以上を保持し得る。言い換えれば、シルクフィブロインベースのマイクロニードル内での活性剤の安定性（すなわち、活性剤がシルクフィブロインベースのマイクロニードル内でその生物活性（例えば、その本来の生物活性の少なくとも約30%）を保持する能力）は、非シルクフィブロインベースのマイクロニードル内での活性剤の安定性と比較して、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%増大し得る。
【００６８】
本明細書に記載される活性剤添加マイクロニードルは、任意の温度でまたは製造元の推奨する活性剤指定の温度で維持することができる。いくつかの態様において、活性剤添加マイクロニードルは、液体窒素中またはドライアイス中で維持することができる。いくつかの態様において、活性剤添加マイクロニードルは、例えば、上下限値を含む約-80℃から約-20℃の間、または上下限値を含む約-20℃から約0℃の間で維持することができる。いくつかの態様において、活性剤添加マイクロニードルは、0℃より高い温度で維持することができる。それらの態様において、活性剤添加マイクロニードルは、約0℃からほぼ周囲温度の温度で維持することができる。本明細書で使用される場合、「周囲温度」という用語は、本明細書に記載される活性剤添加マイクロニードルが維持される際にそれを取り囲んでいる温度を表すのに使用され、0℃から60℃の間、0℃から50℃の間または0℃から40℃の間の温度が含まれる。いくつかの態様において、周囲温度は、冷蔵庫の温度（例えば、上下限値を含む0℃から15℃の間）である。いくつかの態様において、周囲温度は、ほぼ対象の体温（例えば、ヒト対象については、上下限値を含む36℃から38℃の間、またはその他の動物についてはそれよりも高いもしくは低い体温範囲）である。いくつかの態様において、周囲温度は、室温、例えば20℃から35℃の間であり、それは地理的条件により様々であり得る。例えば、温帯地域、例えばアフリカにおける室温は、一般に、寒帯地域、例えば米国または英国におけるそれよりも温暖であり得る。
【００６９】
本明細書に記載される活性剤添加マイクロニードルは、任意の期間、例えば時間、日、週、月または年、維持することができる。いくつかの態様において、本明細書に記載される活性剤添加マイクロニードルは、少なくとも約3時間、少なくとも約6時間、少なくとも約9時間、少なくとも約12時間、少なくとも約24時間またはそれより長い間、維持することができる。いくつかの態様において、本明細書に記載される活性剤添加マイクロニードルは、少なくとも約1日、少なくとも約2日、少なくとも約3日、少なくとも約4日、少なくとも約5日、少なくとも約6日、少なくとも約7日またはそれより長い間、維持することができる。いくつかの態様において、本明細書に記載される活性剤添加マイクロニードルは、少なくとも約1週、少なくとも約2週、少なくとも約3週、少なくとも約4週またはそれより長い間、維持することができる。いくつかの態様において、本明細書に記載される活性剤添加マイクロニードルは、少なくとも約1ヶ月、少なくとも約2ヶ月、少なくとも約3ヶ月、少なくとも約4ヶ月、少なくとも約5ヶ月、少なくとも約6ヶ月、少なくとも約7ヶ月、少なくとも約8ヶ月、少なくとも約9ヶ月、少なくとも約10ヶ月、少なくとも約11ヶ月、少なくとも約12ヶ月またはそれより長い間、維持することができる。
【００７０】
マイクロニードルデバイス
本明細書で提供される別の局面は、基材、および基材と一体化されまたは基材に付着されかつ基材から延びる本明細書に記載される1つまたは複数のシルクフィブロインマイクロニードルを含み、各シルクフィブロインマイクロニードルがベース部および貫入先端を含む、マイクロニードルデバイスである。いくつかの態様において、マイクロニードルデバイスは、基材およびシルクフィブロインマイクロニードルを含み得る。いくつかの態様において、マイクロニードルデバイスは、基材および少なくとも2本、少なくとも3本、少なくとも4本、少なくとも5本、少なくとも6本、少なくとも7本、少なくとも8本、少なくとも9本、少なくとも10本、少なくとも15本、少なくとも20本、少なくとも25本、少なくとも30本、少なくとも40本、少なくとも50本、少なくとも60本、少なくとも70本、少なくとも80本、少なくとも90本、少なくとも100本またはそれ以上のマイクロニードルを含み得る。
【００７１】
図2は、本発明の1つまたは複数の態様にしたがうマイクロニードルデバイス200の少なくとも一部分の図を示している。本発明のマイクロニードルデバイス200は、生体適合性が高く製造が容易なシルクフィブロイン材料から形成することができる。マイクロニードルデバイス200は、基材204および基材204から突き出た複数のシルクフィブロインマイクロニードル210を含む。マイクロニードルの基本的な幾何学要件（アスペクト比、ベース部の直径およびテーパーのプロファイルを含む）は、マイクロニードルの機能、すなわち、生物学的障壁の貫入、貫入時の幾何学形状の維持および必要な貫入深度への到達によって決定され得る。いくつかの態様において、シルクフィブロインマイクロニードル210は、一体的に形成され、基材204から延びるものであり得る。いくつかの態様において、シルクフィブロインマイクロニードル210は、予め形成され、その後に別個の基材204に付着することができる。シルクフィブロインマイクロニードルは、処置部位の生物学的障壁にまたは生物学的障壁を越えて適用したい1つまたは複数の活性剤を含み得る。本明細書に記載されるように、各マイクロニードルは、ベース部214から貫入先端212まで、例えば（マイクロニードルボディ部の長さによって示される）既定の距離だけ延びるマイクロニードルボディ部210を含む。本明細書に記載されるように、貫入先端212は、様々な要因、例えば、貫入される生物学的障壁のタイプ、マイクロニードルのデザイン上の要件（例えば、アスペクト比）、製造プロセスの条件および／または使用者の好みもしくは利用法、に基づき任意のサイズの寸法（例えば、直径）を有することができる。様々な態様において、貫入先端212は、例えばナノメートルまたはマイクロメートル範囲で、任意のサイズの寸法（例えば、直径）を有することができる。いくつかの態様において、貫入先端212は、約50nmから約50μmの範囲の寸法（例えば、直径）を有することができる。他の態様において、貫入先端212は、50μmを超える寸法（例えば、直径）を有することができる。マイクロニードルボディ部210の長さは、既定の深度まで組織に貫入して薬剤を適用するよう、貫入先端212がベース部214から既定の距離のところに位置するように選択することができる。ベース部214は、基材204に取り付けるまたは、例えばフィルムの形態で、基材204の一部分として形成することができる。マイクロニードルボディ部の形状および直径は、所望の処置様式および処置部位の特徴にしたがい選択することができる。
【００７２】
マイクロニードルデバイス上に存在する各マイクロニードルは、同じマイクロニードル長を有する必要はない。いくつかの態様において、マイクロニードルデバイス上の各マイクロニードルは、同じマイクロニードルボディ長を有し得る。代替の態様において、マイクロニードルデバイス上のマイクロニードルは、異なるマイクロニードルボディ長を有し得る。したがって、単一のマイクロニードルデバイスに、マイクロニードル貫入深度が一定または多様となる既定のプロファイルを提供することができる。いくつかの態様において、各マイクロニードルのボディ長は、表面の湾曲を調整するように同調させることができる。
【００７３】
複数のマイクロニードルは、ランダム、擬似ランダムまたは既定のパターン、例えば図8Eに示されるようなアレイとして、配置することができる。マイクロニードル間の距離および複数のマイクロニードルの配置は、所望の処置様式および処置部位の特徴にしたがい選択することができる。例えば、いくつかの態様において、マイクロニードルの部分集団を、例えば標的スポットに送達する活性剤の量を増大させるために、一グループとして密集させて配置することができる。
【００７４】
マイクロニードルは、基材に対して垂直にまたは斜めに向けることができる。いくつかの態様において、マイクロニードルは、基材に対して垂直に向けることができる。そのような態様においては、単位基材面積あたり高いマイクロニードル密度を提供することができる。
【００７５】
基材：マイクロニードルデバイスの基材は、金属、セラミック、半導体、有機体、ポリマーおよびそれらの任意の複合材を含む様々な材料から構築することができる。基材には、マイクロニードルを付着するまたはマイクロメートルと一体的に形成されるベース基材が含まれる。その後に基材を、ルアーロックシリンジまたは障壁貫入方法として現在皮下ニードルを使用しているその他の従来から使用されている薬物送達デバイスに調和するよう適合させることができる。
【００７６】
このデバイスのいくつかの態様において、基材は、1つまたは複数の生体適合性ポリマーを含み得る。「生体適合性ポリマー」という用語は、ヒトの身体と接触したときにその対象において有害な応答を誘発しないポリマー材料を意味する。生体適合性ポリマーの例には、シリコーンおよびシリコーンベースのポリマー；ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）；天然または合成ヒドロゲル；ポリウレタン；ポリスルホン；セルロース；ポリエチレン；ポリプロピレン；ポリアミド；ポリエステル；ポリメチルメタクリレート、ポリ乳酸（PLA）、ポリグリコール酸（PGA）、ポリ（乳酸-co-グリコール酸）（PLGA）、当技術分野で知られている任意の生体適合性ポリマーおよびそれらの任意の組み合わせが含まれるがこれらに限定されない。
【００７７】
このデバイスのいくつかの態様において、基材は、例えば、ポリ（ラクチド）、ポリ（グリコリド）、ポリ（ラクチド-co-グリコリド）、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリエーテルエステル、ポリカプロラクトン（polycarpolactone）、ポリエステルアミド、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリヒドロキシアルカノエート、分解性ポリウレタン、それらの任意のコポリマーおよびそれらの任意のブレンドであるがこれらに限定されない1つまたは複数の生体分解性ポリマーを含み得る。
【００７８】
このデバイスのいくつかの態様において、基材は、任意の柔軟性の材料から形成することができる。そのような態様において、基材は、マイクロニードルが所望の深度まで組織に貫入できるようにしつつ、表面、例えば組織または臓器の表面と接触したときにその表面に順応するのに十分柔軟性であり得る。1つの態様において、柔軟性の基材は、シルクフィブロインマイクロニードルと一体化したシルクフィブロインフィルムを含む。代替の態様において、基材は、任意の剛性の材料であり得る。
【００７９】
マイクロニードルが突出している基材の表面は、実質的に平坦な表面、湾曲した表面、波状の表面またはそれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの態様において、マイクロニードルが突出している基材の表面は、貫入される標的表面のそれと類似の湾曲プロファイルを有するよう構成され得る。
【００８０】
基材は、例えば、マイクロニードルデバイスのデザイン、処置したい標的部位の面積／形状および／またはマイクロニードルアプリケーターのサイズから決定される任意の形状および／または任意の寸法のものであり得る。いくつかの態様において、基材の形状および寸法は、障壁貫入方法として現在皮下ニードルを使用している任意のアプリケーター（例えば、シリンジ）、任意のマイクロインジェクション機器、任意のマイクロニードルホルダー、任意のマイクロニードル投与またはアプリケーターデバイス、任意のマイクロニードルアレイアプリケーターデバイスおよび／またはマイクロニードルアレイカートリッジシステムに調和するよう構成され得る。マイクロニードルまたはマイクロニードルアレイインジェクターまたはアプリケーターの非限定的な例には、米国特許出願第US 2008/0183144号；同第US 2003/0208167号；同第US 2010/0256597号；ならびに米国特許第US 6743211号；および同第US 7842008号に記載されるものが含まれる。
【００８１】
いくつかの態様において、基材は、その内部に分配された少なくとも1つの活性剤を含み得る。いくつかの態様において、基材は、本明細書に記載される活性剤を含まないものであり得る。
【００８２】
本明細書に記載されるマイクロニードルおよびマイクロニードルデバイスの製造方法
本明細書に記載されるマイクロニードルおよび／またはマイクロニードルデバイスの任意の態様の製造に使用する方法は、使用される材料によって様々であり得、それにはソフトリソグラフィ法、マイクロ組立、マイクロ成形、バルクマイクロマシニング（machining）法、表面マイクロマシニング法、標準的なリソグラフィ法、ウェットエッチング、反応性イオンエッチング、プラズマエッチング、ステレオリソグラフィおよびレーザー化学三次元ライティング法、固体プリンティング、マシニング、モジュラー組立法、マイクロモールディング、レプリカモールディング法、インジェクションモールディング法、ホットモールディング法、レーザーアブレーション法、任意のマイクロファブリケーション法、方法の組み合わせ、ならびに米国特許第US 6503231号；米国特許出願第US 2003/0208167号および同第US 2009/0182306号；およびHenry et al., "Micromachined Needled for the Transdermal Delivery of Drugs", Micro Electro Mechanical Systems, Heidelberg, Germany, p.494-498 (Jan. 26-29, 1998)に記載される方法を含むがこれらに限定されないマイクロニードルの製造に関して当技術分野で公知となっている他の方法が含まれる。
【００８３】
図3A〜3Kおよび7A〜7Fは、本明細書に記載されるマイクロニードルの1つまたは複数の態様の、モールディングによる製造の例を示している。1つの態様において、この方法は、各々がマイクロニードルの表面を画定する1つまたは複数のマイクロ凹部（例えば、PDMSモールド300、700のマイクロ凹部302、702）を有するモールドを提供する工程、少なくとも1つのマイクロ凹部にシルクフィブロイン溶液を充填する工程；およびシルクフィブロインをモールディングし、それによってマイクロニードルを形成する工程、を含む。シルクフィブロインの性質により、他のポリマーと比較して非常に細かな、しかし容易に再現可能な、成型されたマイクロニードルを得ることができる。
【００８４】
シルクフィブロイン：シルクフィブロインは、例えばその完全水溶液処理（Sofia et al., 54 J. Biomed. Mater. Res. 139 (2001); Perry et al., 20 Adv. Mater. 3070-72 (2008)）、比較的容易な官能基化（Murphy et al., 29 Biomat. 2829-38 (2008)）および生体適合性（Santin et al., 46 J. Biomed. Mater. Res. 382-9 (1999)）ゆえに、本発明の態様において使用する上で特に魅力的なバイオポリマー候補である。例えば、シルクは、ヒトインプラントにおける組織工学スキャホールドとしてU.S. Food and Drug Administrationに承認されている。Altman et al., 24 Biomaterials: 401 (2003)を参照のこと。
【００８５】
本明細書で使用される場合、「シルクフィブロイン」という用語には、カイコフィブロインおよび昆虫またはクモシルクタンパク質が含まれる。例えば、Lucas et al., 13 Adv. Protein Chem. 107 (1958)を参照のこと。本発明の局面にしたがい、任意のタイプのシルクフィブロインが使用され得る。カイコ、例えばボンビックス・モリ（Bombyx mori）によって産生されるシルクフィブロインが最も一般的であり、地球に優しい、再生産可能な供給源と言える。例えば、シルクフィルムに使用されるシルクフィブロインは、B.モリの繭からセリシンを抽出することによって取得され得る。有機栽培したカイコ繭も市販されている。しかし、クモシルク（例えば、ネフィラ・クラビペス（Nephila clavipes）から得られるもの）、トランスジェニックシルク、遺伝子工学シルク、例えば細菌、酵母、哺乳動物細胞、トランスジェニック動物またはトランスジェニック植物由来のシルク（例えば、WO 97/08315；米国特許第5,245,012号）およびそれらのバリアントを含む多くの異なるシルクを使用することができる。本明細書に記載される任意の局面のいくつかの態様において、マイクロニードルの製造に使用されるシルクフィブロインは、再生シルクフィブロインであり得る。いくつかの態様において、シルクフィブロインは、例えば実施例に記載される方法を用いて、セリシン除去され得る。
【００８６】
本明細書に記載されるマイクロニードルおよび／またはマイクロニードルデバイスを製造するのに使用されるシルクフィブロイン水溶液は、当技術分野で公知の任意の技術を用いて調製することができる。活性剤を埋め込むまたは運搬するために使用される溶液中のシルクフィブロインの濃度は、個々の活性剤および／または既定の放出プロファイルに適したものにされ得る。いくつかの態様において、本明細書に記載されるマイクロニードルおよび／またはマイクロニードルデバイスを製造するためのシルクフィブロイン溶液は、上下限値を含めて、約4%（w/v）から約20%（w/v）まで様々であり得る。いくつかの態様において、シルクフィブロイン溶液は、約6%（w/v）から約8%（w/v）まで様々であり得る。シルクフィブロイン溶液を調製する適当なプロセスは、例えば、米国特許出願第11/247,358号；WO/2005/012606；およびWO/2008/127401に開示されている。その中で精密ろ過工程を使用することができる。例えば、調製されたシルクフィブロイン溶液を、さらに処理して本明細書に記載されるシルクマトリックスベースのマイクロニードルおよび／またはマイクロニードルデバイスにする前に、例えば、遠心分離および／またはシリンジベースの精密ろ過によってさらに処理することができる。
【００８７】
様々な態様において、シルクフィブロインは、異なる用途および所望の特性（例えば、分子放出プロファイルの調節、マイクロニードルの機械的特性および活性剤の安定性）に応じて修飾することができる。当業者は、例えばシルクフィブロインの側鎖基、シルクフィブロインの所望の反応性および／またはシルクフィブロインの所望の電荷密度に依存して、シルクフィブロインを修飾するための適当な方法を選択することができる。1つの態様において、シルクフィブロインの修飾は、アミノ酸側鎖化学、例えば共有結合を通じた化学修飾または電荷・電荷相互作用を通じた修飾、を使用するものであり得る。例示的な化学修飾法には、カルボジイミドカップリング反応（例えば、米国特許出願第US 2007/0212730号を参照のこと）、ジアゾニウムカップリング反応（例えば、米国特許出願第US 2009/0232963号を参照のこと）、アビジン・ビオチン相互作用（例えば、国際出願第WO 2011/011347号を参照のこと）およびPEGポリマーの化学的に活性なまたは活性化された誘導体によるペグ化（例えば、国際公開第WO 2010/057142号を参照のこと）が含まれるがこれらに限定されない。シルクフィブロインはまた、シルクタンパク質の機能性を改変する遺伝子修飾を通じて修飾することもできる（例えば、国際出願第WO 2011/006133号を参照のこと）。例えば、シルクフィブロインは、シルクのさらなる修飾、例えば有機・無機複合体を形成するのに使用することができる繊維性タンパク質ドメインおよび鉱化ドメインを含む融合ポリペプチドの含有、を提供できるよう遺伝子修飾することができる。WO 2006/076711を参照のこと。加えて、シルクフィブロインマトリックスは、例えばマトリックスの柔軟性に影響する化合物、例えばグリセロールと組み合わせることができる。例えば、WO 2010/042798, Modified Silk films Containing Glycerolを参照のこと。
【００８８】
いくつかの態様において、シルクフィブロインはまた、シルクフィブロインを含む混合ポリマーのマイクロニードルを形成するよう、他の生体適合性および／または生体分解性ポリマーと混合することもできる。1つまたは複数の生体適合性および／または生体分解性ポリマー（例えば、2つまたはそれ以上の生体適合性ポリマー）を、シルクフィブロインと共に水溶液に加えることができる。その中で使用することができる生体適合性ポリマーには、ポリエチレンオキシド（PEO）、ポリエチレングリコール（PEG）、コラーゲン、フィブロネクチン、ケラチン、ポリアスパラギン酸、ポリリジン、アルギネート、キトサン、キチン、ヒアルロン酸、ペクチン、ポリカプロラクトン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリヒドロキシアルカノエート、デキストラン、ポリ無水物、ポリマー、PLA-PGA、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリカプロラクトン、ポリフマレート、コラーゲン、キトサン、アルギネート、ヒアルロン酸ならびにその他の生体適合性および／または生体分解性ポリマーが含まれるがこれらに限定されない。例えば、国際出願第WO 04/062697号；同第WO 05/012606号を参照のこと。マイクロニードルは、生体分解性、生体侵食性であるか、またはそれ以外の方法で、貫入した組織にマイクロニードルの少なくとも一部分を残せるよう設計され得る。
【００８９】
いくつかの態様において、本明細書に記載される少なくとも1つの活性剤は、本明細書に記載されるシルクフィブロインマイクロニードルまたはマイクロニードルデバイスを形成する前に、シルクフィブロイン溶液に加えることができる。そのような態様において、活性剤は、活性剤がマイクロニードル内に分散されるよう、モールドを充填する前、その間または後にシルクフィブロイン溶液に加えることができる。
【００９０】
バルク添加シルクフィブロインを、そのような活性剤を添加したシルクフィブロインマイクロニードルを調製する直接的な方法において使用することができる。シルク溶液を関心対象の活性剤と混合することができ；所望の厚みおよび表面積のマイクロニードルをキャスティングし、乾燥させ、そしてその後に所望の物性を生じるよう処理することができる。活性剤添加マイクロニードルまたはマイクロニードルデバイスは、モノリシックな活性剤送達インプラントまたは診断デバイスとして使用することができる。例えば、シルクフィブロインベースのマイクロニードルおよび／またはマイクロニードルデバイスに添加したコントラスト剤、例えばGFP分子は、それらの非線形的な光学特性を維持することができる。Putthanarat et al., 45 Polymer 8451 (2004)。加えて、シルクフィブロインを通じた低分子医薬（5-フルオロウラシル、ビタミンC、レゾルシノール、フェノールスルホン酸ナトリウムおよび塩化ベンジルトリメチルアンモニウム）の拡散が研究され、透過性がpHおよび薬物の特性に依存することが見出された。Chen et al., 35 Polymer 2853 (1994)。さらに、異なる分子量（4kDa、10kDa、20kDaおよび40kDa）のデキストランおよび西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）ならびにモデルタンパク質としてのリゾチーム（Lys）を含有するシルク水溶液からモノリシックなバルク添加フィルムが調製された。このフィルムからの放出は、およそ4週間持続し、その放出挙動は、フィルムの結晶性および薬物の特性（分子量およびシルクへの吸着を含む）に関連するものであった。Hofmann et al., 111 J. Contr. Release 219 (2006)。ヘパリンを添加したポリウレタン・シルクブレンドフィルムは、24時間持続するヘパリン放出を示し、かつ高い制御性を示し：放出されるヘパリンの放出速度およびその累積量の比率は、（a）フィルムに添加されるヘパリンの量；（b）シルクフィブロイン対ポリウレタンの組成比；および（c）フィルムの厚み、を調整することによって制御可能であった。Liu et al., 63 Mats. Lett. 263 (2009)。したがって、活性剤は、シルクフィブロイン中に均一にまたは不均一に分散させることができ、例えば、米国特許出願第US 2007/0212730号に記載されるカルボジイミド媒介修飾法を用いることで、勾配をかけて分散させることができる。
【００９１】
代替の態様において、マイクロニードルを形成し、その後にこれを少なくとも1つの活性剤と接触させ（例えば、少なくとも1つの活性剤中に浸漬し）、マイクロニードルの外表面を少なくとも1つの活性剤でコーティングすることができる。
【００９２】
シルクタンパク質から製造されるマイクロニードルのアレイは、以前に開示されているが、それらは急速かつ制御されないバースト放出を示すものであった［8］。本発明の態様にしたがい、β-シート含有量、溶解度、活性剤添加能、分解時間および薬物透過性を含むシルクフィブロインの特性に影響するシルク処理が使用され得る。シルク処理の選択肢には、制御遅乾（Lu et al., 10 Biomacromolecules 1032 (2009)）、水中アニーリング（Jin et al., Water-Stable Silk Films with Reduced β-Sheet Content, 15 Adv. Fnct. Mats. 1241 (2005)）、ストレッチング（Demura & Asakura, Immobilization of glucose oxidase with Bombyx mori silk fibroin by only stretching treatment and its application to glucose sensor, 33 Biotech & Bioengin. 598 (1989)）、圧縮およびメタノール（Hofmann et al., 2006）、エタノール（Miyairi et al., 1978）、グルタルアルデヒド（Acharya et al., 2008）および1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（EDC）（Bayraktar et al., 2005）を含む溶媒浸漬が含まれる。本発明の1つの態様にしたがい、シルクフィブロインマイクロニードル構造物およびデバイスからの活性剤の放出を制御するシルク処理が使用され得る。本発明の他の態様にしたがい、その他の特徴が、1つまたは複数の処理の選択肢にしたがう処理により付与される。
【００９３】
したがって、シルクフィブロインの構造変化をもたらす能力は、本明細書に記載されるマイクロニードルの機械的特徴を制御するためだけでなく、ニードルの溶解速度および／またはマイクロニードルを介して送達される活性剤の持続放出プロファイルを制御するために利用することができる。例えば、本明細書に記載されるシルクフィブロインマイクロニードルおよび／またはマイクロニードルデバイスのいくつかの態様は、シルクフィブロインマイクロニードルおよび／またはマイクロニードルデバイスの溶解度を調節するためにさらに処理することができる。いくつかの態様において、本明細書に記載されるシルクフィブロインマイクロニードルおよび／またはマイクロニードルデバイスの溶解度は、三次構造、例えばβ-シート構造を所望のレベルにすることによって調節することができる。例えば、シルクフィブロインマイクロニードルを本明細書に記載されるようにして調製し、その後にフィブロイン中のランダムコイル、β-ターンおよびβ-シート構造を調整するよう処理することができる。そのような態様において、シルクフィブロインの水溶液中での不溶性および／またはそのβ-シート構造は、当技術分野で公知の多くの方法、例えば、熱処理（例えば、水中アニーリング）、ストレッチング、メタノールまたはエタノール浸漬およびそれらの任意の組み合わせ、によって誘導することができる。例えば、いくつかの態様において、風乾したフィブロインマイクロニードルは、約10%のβ-シート構造を含有し得る。メタノール処理は、β-シート含有量を50%超またはそれ以上に増加させることができる。フィブロインフィルムの構造は、処理に関係なく、周囲温度で数ヶ月間安定であり得る。いくつかの態様において、シルクフィブロインの構造に影響を与えずに、様々な酵素を様々な濃度でシルクフィブロインに添加することができる。加えて、高いβ-シート構造含有量の提供は、シルクフィブロインに水不溶性を付与するために使用することができる。
【００９４】
いくつかの態様において、本明細書に記載されるシルクフィブロインマイクロニードルおよび／またはマイクロニードルデバイスは、例えば活性剤の生物学的障壁への放出プロファイルを調節するために、多孔質構造を含み得る。シルクフィブロインマトリックス内に多孔質構造を生成する方法、例えば凍結乾燥、塩浸出および気泡法は、当技術分野で周知であり、例えば米国特許第US 7842780号；ならびに米国出願第US 2010/0279112号；および同第US 2010/0279112号に記載されており、これらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れる。
【００９５】
したがって、いくつかの態様において、多孔質のシルクフィブロインマイクロニードルは、塩浸出法によって製造することができる。例えば、US 7842780およびUS 2010/0279112を参照のこと。シルクフィブロイン溶液を、有機溶媒には不溶の水溶性粒子または細孔形成物質（porogen）を含むマイクロニードル用モールドに投入することができる。あるいは、細孔形成物質を、モールドへの投入前に、シルクポリマー溶液と混合することができる。粒子（細孔形成物質）の直径は、既定の孔サイズにしたがい様々であり得る。その中で使用することができる水溶性の細孔形成物質の例には、NaCl、アルカリ金属、アルカリ土類金属ハロゲン化物、ホスフェートおよびスルフェート、糖の結晶、水溶性のマイクロスフィア、多糖ならびにタンパク質マイクロスフィアが含まれる。その後、乾燥させたシルクフィブロインマイクロニードルまたはマイクロニードルデバイスを、粒子または細孔形成物質は溶解するがシルクフィブロインは溶解しない水またはその他の溶媒に浸漬し、粒子（細孔形成物質）を除去し、本明細書に記載される多孔質のシルクフィブロインマイクロニードルまたはマイクロニードルデバイスを得ることができる。
【００９６】
代替の態様において、多孔質のシルクフィブロインマイクロニードルは、凍結乾燥法によって製造することができる。例えば、US 7842780およびUS 2010/0279112を参照のこと。そのような態様において、マイクロニードルモールドに投入されたシルクフィブロイン溶液を、零度以下の温度、例えば約-80℃から約-20℃で、少なくとも約12時間、少なくとも約24時間またはそれより長い間凍結させ、その後に凍結乾燥することができる。1つの態様において、シルクフィブロイン溶液を、一方向から凍結させることができる。いくつかの態様において、シルクフィブロイン溶液は、塩を含まないものであり得る。いくつかの態様において、アルコール、例えば15%〜25%のメタノールまたはプロパノールを、シルクフィブロイン溶液に加えることができる。
【００９７】
いくつかの態様において、マイクロニードルは、内部に流体マイクロチャネルを含み得る。流体マイクロチャネルは、マイクロニードルの貫入先端からベース部まで延びるものであり得る。マイクロニードルが本明細書に記載されるマイクロニードルデバイスの基材に付着されるいくつかの態様において、流体マイクロチャネルは、マイクロニードルの貫入先端から基材の反対表面まで延びるものであり得る。流体マイクロチャネルは、例えば標的部位に投与する活性剤の急速な放出および／またはボーラス投与のために、活性剤を送達または輸送することができる。いくつかの態様において、流体マイクロチャネルは、例えば投与される活性剤を含有する別個のリザーバに連結することができる。本明細書に記載されるマイクロニードルのあらゆる製造法を、本明細書に記載されるマイクロニードル内に流体マイクロチャネルを形成するのに適合させることができる。例えば、既に形成されたマイクロニードルに流体マイクロチャネルをエッチングすることができ、また、流体チャネルを含むように雄型モールドを適合させることができる。流体チャネルを有するマイクロニードルを作製する追加の方法には、米国特許第6,503,231号に記載される方法が含まれるがこれらに限定されない。
【００９８】
いくつかの態様において、本明細書に記載されるマイクロニードルは、例えば、マイクロニードルから活性剤が放出される速度を調節するために、少なくとも1つの本明細書に記載される生体適合性および／または生体分解性ポリマーの層でコーティングすることができる。そのような態様において、生体適合性および／または生体分解性ポリマーは、少なくとも1つの活性剤を含み得る。
【００９９】
本明細書に記載されるマイクロニードルおよび／またはマイクロニードルデバイスをモールディングによって製造するいくつかの態様において、マイクロニードル用モールドのマイクロ凹部を、シルクフィブロイン溶液で充填することができる。いくつかの態様において、マイクロ凹部を、シルクフィブロイン溶液で部分的に充填することができる。いくつかの態様において、マイクロ凹部を、シルクフィブロイン溶液で完全に充填することができる。いくつかの態様において、マイクロ凹部を、層ごとに異なるシルクフィブロイン溶液（例えば、異なるシルクフィブロイン濃度および／または組成）で充填することができる。いくつかの態様において、マイクロ凹部を、層ごとに、シルクフィブロイン溶液ならびに異なる生体適合性および／または生体分解性ポリマー、ならびにその任意のブレンドで充填することができる。
【０１００】
基材を有するマイクロニードルデバイスを、例えばモールディングによって製造するために、基材は、マイクロニードルのモールディングと同時に形成することができる、例えば、マイクロニードル用モールドをシルクフィブロイン溶液で過充填し、マイクロニードル用モールドの上にシルクフィブロイン溶液の層を形成させ、その後にこれを乾燥させて、マイクロニードルに付着しマイクロニードルを支持する基材とすることができる。そのような態様において、基材およびマイクロニードルは、一体的に連結されている。代替の態様において、マイクロニードルのすべてまたは一部分を初めに形成し、その後に別個の基材に付着するまたはそれと一体化させることができる。例えば、いくつかの態様において、既に形成されたマイクロニードルを、例えば糊付けまたは溶接によって、別個の基材に付着させることができる。いくつかの態様において、マイクロニードルのすべてまたは一部分を初めにマイクロニードル用モールドで形成し、その後に第2の材料をマイクロニードル上で形成またはモールディングすることができる。いくつかの態様において、例えばマイクロニードル用モールド内に留めておいた乾燥させたシルクフィブロインベースのマイクロニードルデバイスをバイオポリマー溶液で被覆し、このバイオポリマー溶液を乾燥させて追加の基材を形成することによって、マイクロニードルが付着されていない基材の表面上に少なくとも1つの追加の基材（例えば、同じまたは異なる材料を含むもの）を形成することができる。
【０１０１】
いくつかの態様において、マイクロニードルを付着する基材の表面は、生体適合性および／または生体分解性のポリマーフィルムを含み得る。そのような態様において、マイクロニードルを付着する基材の表面を、例えば、基材の表面を生体適合性および／もしくは生体分解性のポリマーフィルムで被覆することによって、またはマイクロニードルデバイスのマイクロニードルを生体適合性および／もしくは生体分解性のポリマーフィルムに貫入させ、基材の表面にポリマーフィルムを付着させることによって、生体適合性および／または生体分解性のポリマーフィルムでコーティングすることができる。
【０１０２】
本明細書に記載されるマイクロニードルおよび／またはマイクロニードルデバイスを製造する1つのアプローチは、モールディングである。マイクロニードル用モールドまたはマイクロニードル用マイクロモールドは、当技術分野で公知の任意の方法によって製造することができる。図3A〜3Fに示される1つの態様において、マイクロニードル用マイクロモールドは、モールド基材を提供する工程、図3A；モールド基材を保護層でコーティングする工程、図3A；保護層をフォトレジスト層でコーティングする工程、図3B；フォトレジスト層をパターン加工し、第1のマイクロパターン加工マスクを形成する工程、図3C；第1のマイクロパターン加工マスクを用いて保護層をエッチングし、第2のマイクロパターン加工マスクを形成する工程、図3D；第2のマイクロパターン加工マスクを用いて基材をエッチングし、基材の一部を除去する工程であって、第2のマイクロパターン加工マスクが徐々にアンダーカットされ、基材から、第2のマイクロパターン加工マスクに接している貫入先端に向かってテーパー状になっているベース端を含む1つまたは複数のマイクロニードルを含む雄型マイクロニードル用マイクロモールドが形成される、工程、図3E；および第2のマイクロパターン加工マスクを除去し、雄型マイクロニードル用マイクロモールドを取り出す工程、図3F、を含む方法によって調製することができる。雄型モールドは、等方性エッチングを通じてSiから製造されたものであり得る。代替の態様において、雄型モールドは、例えば図7Aおよび図8A〜8Dに示されるように、高速ミリングおよび化学ウェットエッチングを通じてアルミニウムから製造されたものであり得る。
【０１０３】
他の態様において、マイクロニードル用モールドは、加算（additive）プロセスまたは減算（subtractive）プロセスを用いてマイクロニードルの形状を画定するマイクロ凹部を生成するマイクロマシニングによって形成することができる。1つの態様において、モールドは、（a）第1の材料のブロックをマイクロ成形し、複数のマイクロ凸部を有するモールドインサートを形成する工程；および（b）マイクロ凸部を第2の材料で被覆し、マイクロ凸部によって画定される複数のマイクロ凹部を有するマイクロモールドを形成する工程、を含むプロセスによって作製された雌型モールドであり得る。
【０１０４】
当技術分野で公知の様々な方法が、本発明のマイクロニードルおよび／またはマイクロニードルデバイスの様々な態様を製造するのに使用され得る。上記のモールディング以外では、等方性エッチングも、シルクフィブロインから本発明の1つまたは複数の態様にしたがうマイクロニードルおよび／またはマイクロニードルデバイスを形成するのに使用することができる。他の態様においては、反応性エッチングを、シルクフィブロインマイクロニードルおよび／またはマイクロニードルデバイスの製造に適用することができる。いくつかの態様において、ミリングおよびエッチング（例えば、化学ウェットエッチング）を、シルクフィブロインから本発明の1つまたは複数の態様にしたがうマイクロニードルおよび／またはマイクロニードルデバイスを形成するのに使用することができる。
【０１０５】
いくつかの態様において、本明細書に記載されるマイクロニードルまたはマイクロニードルデバイスは、滅菌することができる。生物医学デバイスの滅菌方法は、当技術分野で周知であり、ガンマ線または紫外線照射、オートクレーブ（例えば、熱／蒸気）；アルコール滅菌（例えば、エタノールおよびメタノール）；ならびにガス滅菌（例えば、エチレンオキシド滅菌）が含まれるがこれらに限定されない。
【０１０６】
本明細書で提供される方法は、約50nmから約50μmの範囲の任意の寸法のシルクフィブロインベースのマイクロニードルの先端を生成するのに使用することができる。いくつかの態様において、シルクフィブロインベースのマイクロニードルの先端は、例えば2μmまたはそれ未満、さらには100nmまたはそれ未満を含むがこれらに限定されない10μmまたはそれ未満の直径を有するよう構築することができる。この先端にさらに小さな直径を持たせるのを妨げる根本的な制約はない（シルクレプリカキャスティングの限界は数十nmの解像度で実証されている、Perry et al., 20 Adv. Mat. 3070 (2008)）。
【０１０７】
さらに、本発明のマイクロニードルは、シルクフィブロインを機能化するために開発された多くの技術（例えば、活性剤、例えば染料およびセンサ）を活用することができる。例えば、
0005937092.tif 000002
を参照のこと。
【０１０８】
シルクフィブロインベースのマイクロニードルはまた、モノリシック様式の場合でさえも、例えば活性剤の送達をモニターするセンサと組み合わせることができ；または、生物学的もしくはその他の環境において使用するためのセンサを含めることができる。例えば、WO 2010/126640, Nanoimprinting of Silk Fibroin Structures for Biomedical & Biophotonic Applications; WO 2008/127401; WO 2008/118211; WO 2008/127402; WO 2008/140562を参照のこと。本発明のシルクフィブロインベースのマイクロニードルまたはマイクロニードルデバイスはまた、ホログラムおよびシルク光ファイバーを含むシルクフォトニック構造と組み合わせることができる。例えば、WO 2009/061823; PCT/US10/50565, Drawn Silk E-Gel Fibers & Methods of Making Same; PCT/US2010/042585, All-Protein Implantable, Resorbable Reflectors; PCT/US10/47307, Silk Transistor Devices & Method of Making Transistor Devices from Silkを参照のこと。
【０１０９】
代替の態様において、シルクフィブロインマイクロニードルは、ニードルパッチのニードルまたはベース部内で光熱エレメントを形成するプラズモンナノ粒子を含むことができる。このアプローチは、シルクフィブロインの優れたドーピング特性を活用するものである。温熱療法は、様々な薬剤の経皮送達を補助することが示されている。Park et al., Effect of Heat on Skin Permeability, 359 Intl. J. Pharm. 94 (2008)を参照のこと。1つの態様において、非常に限られた領域での短時間の熱のバーストが、周辺の組織に対する有害な影響を最小化しつつ透過性を最大化するのに使用され得る。したがって、プラズモン粒子をドーピングしたマイクロニードルは、極小のニードルを使用することによってだけでなく、周辺組織の代わりにニードル自体のみを経由して光を集中させ熱を発生させることによって、温熱療法に特異性を与えることができる。
【０１１０】
本発明の1つの態様には、生物学的障壁を越えてまたは生物学的障壁に少なくとも1つの活性剤を輸送するためのマイクロニードルデバイスが含まれる。このマイクロニードルデバイスは、シルクフィブロイン基材、および基材に一体化されまたは基材に付着されかつ基材から延びる複数のシルクフィブロインマイクロニードルを含み得、シルクフィブロインマイクロニードルは、少なくとも1つの活性剤を含む。活性剤は、デバイスの基材中もしくは基材上および／またはマイクロニードル中もしくはマイクロニードル上に含有され得る。したがって、例えば、パッチ形態のマイクロニードルデバイスは、薬剤が基材を通じてマイクロニードルにそしてマイクロニードルからマイクロニードルと接触した組織に拡散するように、薬剤を持続放出様式で送達するのに使用することができる。
【０１１１】
本明細書に記載されるマイクロニードルまたはマイクロニードルデバイスの例示的な適用
本明細書で提供されるさらなる局面は、生物学的障壁を越えて活性剤を送達する方法に関する。そのような方法は、少なくとも1つの活性剤を含む、本明細書に記載される少なくとも1つのマイクロニードルまたは少なくとも1つのマイクロニードルデバイスを提供する工程；マイクロニードルまたはマイクロニードルデバイスを生物学的障壁に貫入させる工程；およびマイクロニードルから活性剤を放出させる工程、を含む。いくつかの態様において、活性剤は、マイクロニードルの分解または溶解を通じて生物学的障壁に放出される。
【０１１２】
いくつかの態様において、マイクロニードルまたはマイクロニードルデバイスは、生物学的障壁を超えるまたは生物学的障壁へのマイクロニードルの投与を容易にするために、アプリケーターに付着され得る。一例にすぎないが、マイクロニードルまたはマイクロニードルデバイスは、適用の際、例えば、シリンジまたは本明細書に記載される任意のインジェクターもしくはマイクロニードル投与デバイスに付着され得る。内部組織に対しては、マイクロニードルまたはマイクロニードルデバイスの適用は、例えば、カテーテルの補助によって達成され得る。いくつかの態様において、マイクロニードルまたはマイクロニードルデバイスは、外科移植され得る。
【０１１３】
生物学的障壁は、活性剤を必要とする対象の任意の生物学的組織であり得る。生物学的障壁の例には、皮膚またはその一部分（例えば、角質層、上皮および真皮組織）、粘膜組織、血管組織、リンパ管、眼組織（例えば、角膜、結膜、強膜）および細胞膜を含む任意の細胞、組織または臓器が含まれ得るがこれらに限定されない。いくつかの態様において、生物学的障壁は、皮膚である。
【０１１４】
「対象」という用語には、哺乳動物、ヒト、非ヒト霊長類、例えばチンパンジーおよびその他の類人猿ならびにサル種；畜産動物、例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマ；家畜動物、例えば犬および猫；げっ歯類、例えばマウス、ラットおよびモルモットを含む実験動物が含まれるがこれらに限定されない。この用語は、特定の年齢または性別を表すものではない。したがって、男性か女性かによらず、成人および新生児対象ならびに胎児が網羅されることが意図されている。1つの態様において、対象は、哺乳動物である。1つの態様において、対象は、ヒト対象である。
【０１１５】
いくつかの態様において、本明細書に記載されるマイクロニードルまたはマイクロニードルデバイスは、活性剤を含まず、生物学的障壁に微孔を形成するために（例えば皮膚の透過処理のために）使用されるものであり得る。そのような態様においては、マイクロニードルの挿入またはマイクロニードルデバイスの投与後にそのマイクロニードルまたはマイクロニードルデバイスを除去し、その後にその微孔を通じて活性剤を、例えば活性剤を含む経皮パッチを用いて、投与することができる。
【０１１６】
いくつかの態様において、マイクロニードルまたはマイクロニードルデバイスは、活性剤の経皮送達のための使用に適応させることができる。一例にすぎないが、本明細書に記載されるマイクロニードルまたはマイクロニードルデバイスは、経皮パッチの一部とすることができる。そのような態様において、接着剤および任意でリザーバ、例えばマイクロニードルと連絡しているリザーバがさらに含まれる。リザーバは、マイクロニードルを通じて送達するための活性剤を含み得る。現在、幅広い医薬が経皮パッチ形態で利用可能となっており、それには禁煙を支援するためのニコチンパッチ；痛みを緩和するためのオピオイド薬、例えばフェンタニル（Duragesicとして販売されている）およびブプレノルフィン（BuTransとして販売されている）；例えば更年期の症状および更年期後の骨粗しょう症の処置のための、エストロゲンパッチ；避妊パッチ（Ortho EvraまたはEvraとして販売されている）および例えばホルモンを送達するための、男性用（Androde）および女性用（Intrinsa）の両方のテストステロンパッチ；例えば狭心症処置用のニトログリセリンパッチ；乗り物酔い処置用のスコポラミンパッチ；抗高血圧薬クロニジン（Catapres-TTS）；抗うつパッチ、例えば経皮形態のMAOIセレギリンであるEmsam；注意欠陥多動性障害（ADHD）薬メチルフェニデートの経皮送達剤であるDaytrana（それ以外ではRitalinまたはConcertaとしても公知）；ビタミンB12（例えば、高安定形形態のビタミンB12であるシアノコバラミン）；Exelonという商品名のパッチ形態のアルツハイマー治療薬であるリバスチグミン；インスリンパッチ、ならびに抗生物質パッチが含まれるがこれらに限定されない。
【０１１７】
いくつかの態様において、マイクロニードルまたはマイクロニードルデバイスは、例えば本明細書に記載されるものであるがこれらに限定されない成長ホルモンの経皮送達のための使用に適応させることができる。
【０１１８】
いくつかの態様において、マイクロニードルまたはマイクロニードルデバイスは、例えば本明細書に記載されるものであるがこれらに限定されない鎮痛薬の経皮送達のための使用に適応させることができる。
【０１１９】
いくつかの態様において、マイクロニードルまたはマイクロニードルデバイスは、例えば本明細書に記載されるものであるがこれらに限定されないワクチンまたはワクチン製品の経皮送達のための使用に適応させることができる。
【０１２０】
マイクロニードルまたはマイクロニードルデバイスが少なくとも1つの活性剤を含むいくつかの態様において、活性剤がマイクロニードルから放出される速度は、例えば、マイクロニードルの特性および／もしくはデザイン、ならびに／または本明細書に記載されるマイクロニードル内での活性剤の配分に依存して様々であり得る。いくつかの態様において、マイクロニードルまたはマイクロニードルデバイスは、1つの、生物学的障壁への活性剤の放出プロファイルによって特徴付けることができる。いくつかの態様において、マイクロニードルまたはマイクロニードルデバイスは、2つまたはそれ以上の、生物学的障壁への活性剤の放出プロファイルによって特徴付けることができる。例えば、内部に流体チャネルを含むマイクロニードルは、活性剤が流体チャネルを通じて生物学的障壁に投与される場合、活性剤の急速な放出を提供することができる。同時に、活性剤はまた、マイクロニードルの分解または溶解を通じて、マイクロニードルのバルクから比較的遅い速度で生物学的障壁に放出させることができる。
【０１２１】
いくつかの態様において、少なくとも1つの活性剤の所望の量を、既定の期間かけて、本明細書に記載されるマイクロニードルから放出させることができる。いくつかの態様において、活性剤の少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、もしくは少なくとも約97%、約98%もしくは約99%、または活性剤の100%を含む、活性剤の少なくとも約5%を、既定の期間かけて、マイクロニードルから放出させることができる。そのような態様において、活性剤の所望の量を、数秒間、数分間、数時間、数カ月間または数年間かけて、マイクロニードルから放出させることができる。いくつかの態様において、活性剤の所望の量を、組織への挿入後即座に、例えば5秒以内、10秒以内、30秒以内、1分以内またはそれより長い時間以内に、マイクロニードルから放出させることができる。いくつかの態様において、活性剤の所望の量を、少なくとも約1時間、少なくとも約2時間、少なくとも約3時間、少なくとも約6時間、少なくとも約12時間、少なくとも約1日間、少なくとも約2日間、少なくとも約3日間、少なくとも約4日間、少なくとも約5日間、少なくとも約6日間、少なくとも約1週間、少なくとも約2週間、少なくとも約1ヶ月間、少なくとも約2ヶ月間、少なくとも約3ヶ月間、少なくとも約6ヶ月間またはそれより長い時間かけて、マイクロニードルから放出させることができる。いくつかの態様において、活性剤の所望の量を、約1年間、約2年間、約3年間、約4年間またはそれより長い間かけて、マイクロニードルから放出させることができる。
【０１２２】
いくつかの態様において、記載されるマイクロニードルおよび／またはマイクロニードルデバイスからの活性剤の放出は、シルクフィブロインベースのマイクロニードルの溶解速度および／または溶解度によって制御することができる。そのような態様において、活性剤の少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、もしくは少なくとも約97%、約98%もしくは約99%、またはシルクフィブロインベースのマイクロニードルの100%を含む、シルクフィブロインベースのマイクロニードルの少なくとも約5%を、既定の期間かけて溶解または分解させることができる。そのような態様において、分解または溶解は、数秒間、数分間、数時間、数カ月間または数年間かけて起こり得る。いくつかの態様において、マイクロニードルの分解または溶解は、組織への挿入後即座に、例えば5秒以内、10秒以内、30秒以内、1分以内またはそれより長い時間以内に、起こり得る。いくつかの態様において、溶解または分解は、少なくとも約1時間、少なくとも約2時間、少なくとも約3時間、少なくとも約6時間、少なくとも約12時間、少なくとも約1日間、少なくとも約2日間、少なくとも約3日間、少なくとも約4日間、少なくとも約5日間、少なくとも約6日間、少なくとも約1週間、少なくとも約2週間、少なくとも約1ヶ月間、少なくとも約2ヶ月間、少なくとも約3ヶ月間、少なくとも約6ヶ月間またはそれより長い時間かけて起こり得る。いくつかの態様において、溶解または分解は、約1年間、約2年間、約3年間、約4年間またはそれより長い時間かけて起こり得る。活性剤の生物学的障壁への適当な放出速度を決定する方法は、当技術分野で周知であり、例えば実施例に記載される方法を用いるものである。
【０１２３】
別の局面において、マイクロニードルまたはマイクロニードルデバイスは、生物学的障壁から生物学的分子（例えば、バイオマーカー分子）を抽出するために使用することができる。例えば、マイクロニードルを、例えばペプチド、タンパク質、抗体、バイオマーカー結合分子および／またはリガンド結合分子であるがこれらに限定されないものでコーティングし、その後にこれを対象の生物学的障壁に挿入することができる。マイクロニードル表面に結合した生物学的分子またはバイオマーカー分子は、その後、例えば診断目的で分析することができる。
【０１２４】
いくつかの選択された定義
それ以外の記述がない限りまたは文脈から暗示されていない限り、以下の用語およびフレーズは以下に提供される意味を含む。それ以外の明示の記述がない限りまたは文脈から明白でない限り、以下の用語およびフレーズは、その用語またはフレーズがその属する技術の分野において獲得している意味を排除しない。これらの定義は、本明細書に記載される局面の個々の態様の説明を補助するために提供されるものであり、特許請求の範囲に記載の発明を限定することは意図されておらず、本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ限定されるものである。さらに、文脈がそれ以外のことを要求しない限り、単数形の用語はその複数形を含み、かつ複数形の用語はその単数形を含む。
【０１２５】
本明細書で使用される場合、「含む（comprising）」または「含む（comprises）」という用語は、特定されていない要素を、それが必須であろうがなかろうが含むこと許容する、本発明に必須の組成物、方法およびその各構成成分を参照して使用される。加えて、「含む（comprising）」または「含む（comprises）」という用語は、「から本質的になる」および「からなる」を含む。
【０１２６】
本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という用語は、所定の態様に必要とされる要素を表す。この用語は、本発明の態様の基本的かつ新規のまたは機能的な特徴に実質的に影響しない追加の要素の存在を許容する。
【０１２７】
「からなる」という用語は、その態様の説明の中で言及されていないあらゆる要素に対して排他的である、本明細書に記載される組成物、方法およびその各構成成分を表す。
【０１２８】
実施した実施例以外では、またはそうでないことが示されている場合以外では、本明細書で使用される成分の量または反応条件を表すすべての数値は、すべての例において、「約」という用語により修飾されることが理解されるべきである。「約」という用語は、百分率に関連して使用される場合、±1%を意味し得る。
【０１２９】
単数形の用語（「a」、「an」および「the」）は、文脈がそうでないことを明確に示していない限り、複数の参照を含む。同様に、「または」という単語は、文脈がそうでないことを明確に示していない限り、「および」を含むことが意図されている。
【０１３０】
本開示の実施または試験には本明細書に記載されているものと類似または等価な方法および材料を使用することができるが、以下では適当な方法および材料について説明されている。「含む（comprise）」という用語は、「含む（include）」を意味する。「例えば（e.g.）」という略語は、ラテン語のexempli gratiaを語源とするものであり、本明細書においては非限定的な例を示すのに使用される。したがって、「例えば（e.g.）」という略語は、「例えば（for example）」という用語と同義語である。
【０１３１】
本明細書で使用される場合、「シルクフィブロインベースのマイクロニードル」および「シルクフィブロインマイクロニードル」というフレーズは、概ね、シルクフィブロインを含むマイクロニードルを表す。いくつかの態様において、「シルクフィブロインベースのマイクロニードル」というフレーズは、シルクフィブロインが、組成全体の少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%またはそれ以上を含む、組成全体の少なくとも約30%を構成する各マイクロニードルを表す。特定の態様において、シルクフィブロインベースのマイクロニードルは、実質的にシルクフィブロインから形成され得る。様々な態様において、シルクフィブロインベースのマイクロニードルは、実質的に、少なくとも1つの活性剤を含むシルクフィブロインから形成され得る。
【０１３２】
本明細書で使用される場合、「実質的」という用語は、少なくとも約60%、もしくは好ましくは少なくとも約70%、もしくは少なくとも約80%、もしくは少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約97%もしくは少なくとも約99%もしくはそれ以上、または70%から100%の間の任意の整数、の比率を意味する。いくつかの態様において、「実質的」という用語は、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%もしくはそれ以上、または90%から100%の間の任意の整数、の比率を意味する。いくつかの態様において、「実質的」という用語は、100%を含み得る。
【０１３３】
「安定化する」および「安定化」という用語は、本明細書において、シルクフィブロインベースのマイクロニードル内での少なくとも1つの活性剤の生物活性の維持または保持を表すのに使用される。本明細書で使用される場合、「活性剤の安定化」というフレーズは、シルクフィブロインベースのマイクロニードル内に分配されている、分散されているまたは埋め込まれている1つまたは複数の活性剤が、その本来の生物活性の少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%またはそれ以上を含む、その本来の生物活性の少なくとも約30%を保持することを意味する。活性剤の生物活性に関する「安定化する」および「保持する」という用語は、本明細書において置き換え可能に使用される。
【０１３４】
本明細書で使用される場合、「維持する（maintaining）」および「維持する（maintain）」という用語は、活性剤を含むマイクロニードルを参照する場合、本明細書に記載されるシルクフィブロインベースのマイクロニードル内の少なくとも1つの活性剤の生物活性を、その活性剤が特定条件に供されたときに、存続、持続または保持することを意味する。いくつかの態様において、シルクフィブロインベースのマイクロニードル内に分配された1つまたは複数の活性剤は、その本来の生物活性の少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%またはそれ以上を含む、その本来の生物活性の少なくとも約30%を保持する。
【０１３５】
本明細書で活性剤を参照して使用される場合、「生物活性」という用語は、概ね、活性剤が生物学的標的と相互作用するおよび／または生物学的標的に対する効果を生じる能力を表す。例えば、生物活性には、生物学的標的における刺激性、阻害性、制御性、毒性または致死性の応答の誘起が含まれ得るがこれらに限定されない。生物学的標的は、分子または細胞であり得る。例えば、生物活性は、活性剤が酵素の効果／活性を調節する能力、受容体をブロックする能力、受容体を刺激する能力、1つまたは複数の遺伝子の発現レベルを調節する能力、細胞の増殖を調節する能力、細胞の分裂を調節する能力、細胞の形態を調節する能力またはそれらの任意の組み合わせを表し得る。いくつかの例において、生物活性は、化合物が細胞内で毒性効果を生じる能力を表し得る。
【０１３６】
生物活性は、細胞応答をアッセイすることによって決定することができる。例示的な細胞応答には、溶解、アポトーシス、成長阻害および成長促進；細胞による関心対象のタンパク質またはその他の分子の産生、分泌および表面露出；受容体の活性化を含む、膜表面分子の活性化；膜をまたぐイオンの輸送；転写制御；細胞の生存率の変化；細胞の形態の変化；細胞の内部成分の存在または発現の変化；細胞内で産生される核酸の存在または発現の変化；細胞内で産生される酵素の活性の変化；ならびに受容体の存在または発現の変化、が含まれるがこれらに限定されない。様々な細胞応答をアッセイする方法、例えば、細胞の内因性タンパク質の存在もしくは発現の変化を決定するウェスタンブロットまたは活性剤に応答した細胞の形態をモニターする顕微鏡検査、が当業者に周知である。
【０１３７】
抗体を参照して言う「生物活性」という用語には、エピトープまたは抗原への結合親和性、抗体のインビボおよび／もしくはインビトロ安定性、例えばヒト対象に投与されたときの抗体の免疫原性、ならびに／またはインビボもしくはインビトロで標的分子の生物活性を中和もしくはアンタゴナイズする能力、が含まれるがこれら限定されない。上記の特性または特徴は、シンチレーション近接アッセイ、ELISA、ORIGEN免疫アッセイ（IGEN）、蛍光消光、蛍光ELISA、競合ELISA、BIAcoreバイオセンサを用いるSPR分析を含むがこれに限定されないSPR分析、インビトロおよびインビボ中和アッセイ（例えば、国際公開第WO 2006/062685号を参照のこと）、受容体結合、ならびに必要に応じてヒト、霊長類またはその他の任意の供給源を含む異なる供給源由来の組織切片を用いる免疫組織化学、を含むがこれらに限定されない当技術分野で知られている技術を用いて観察または測定することができる。免疫原性物質を参照して言う「生物活性」には、免疫原性が含まれ、その定義は以下で詳細に議論されている。ウイルスを参照して言う「生物活性」には、感染性が含まれ、その定義は以下で詳細に議論されている。コントラスト剤、例えば染料を参照して言う「生物活性」は、コントラスト剤が対象に投与されたときに対象の体内の構造物または流体のコントラストを高める能力を表す。コントラスト剤の生物活性には、特定条件下で生物学的環境と相互作用するおよび／または別の分子の応答に影響するその能力も含まれるがこれらに限定されない。
【０１３８】
活性剤を参照して言う「本来の生物活性」は、概ね、活性剤をシルクフィブロインベースのマイクロニードルに導入する直前または直後に測定されるその活性剤の生物活性を意味する。すなわち、活性剤の本来の生物活性は、例えば、活性剤をシルクフィブロインベースのマイクロニードルに導入する前または後の約20分以内に測定することができる。いくつかの例において、活性剤の本来の生物活性は、例えば、活性剤をシルクフィブロインベースのマイクロニードルに導入する約10秒、約15秒、約20秒、約25秒、約30秒、約1分、約2分、約3分、約4分、約5分、約6分、約7分、約8分、約9分、約10分、約11分、約12分、約13分、約14分、約15分、約16分、約17分、約18分、約19分または約20分前または後に測定することができる。別の態様において、本明細書で使用される場合、「本来の生物活性」という用語は、活性剤をシルクフィブロインベースのマイクロニードルに導入する前のその活性剤の生物活性を表現するのに使用され得る。いくつかの態様において、「本来の生物活性」という用語は、活性剤の最大生物活性、例えば、例えば再構成によるまたは温度上昇による活性剤の活性化の直後に測定される生物活性を表す。例えば、活性剤が当初は粉末である場合、活性剤の本来の生物活性は、再構成の直後に測定することができる。いくつかの態様において、「本来の生物活性」という用語は、製造元により指定された条件下で貯蔵または輸送されたときの、非シルクフィブロインベースのマイクロニードル内に分散された活性剤の生物活性を表す。いくつかの態様において、「本来の生物活性」という用語は、製造元により指定された条件下で本明細書に記載のシルクフィブロインベースのマイクロニードル内で貯蔵または輸送されたときの活性剤の生物活性を表す。
【０１３９】
「免疫原性」という用語は、ある物質、例えば抗原またはエピトープが、対象において液性および／または細胞性の免疫学的応答を惹起する能力を表す。当業者は、物質の免疫原性を容易に測定することができる。細胞性の免疫学的応答の存在は、当技術分野で知られている任意の方法、例えば増殖アッセイ（CD4+ T細胞）、CTL（細胞傷害性Tリンパ球）アッセイ（Burke, 前出；Tigges, 前出を参照のこと）または免疫原の投与後に活性化された細胞、例えば単球およびマクロファージの存在を決定するための対象の組織切片を用いる免疫組織化学によって測定することができる。当業者は、対象における液性の免疫学的応答の存在を、十分に確立された任意の方法によって容易に決定することができる。例えば、生物学的サンプル、例えば血液中で産生される抗体のレベルは、ウェスタンブロット、ELISAまたは抗体検出に関して公知の他の方法によって測定することができる。
【０１４０】
本明細書で使用される場合、ウイルスを参照して言う「感染性」という用語は、感受性のある宿主に侵入し、生存し、そして倍加しまたは免疫学的応答を引き起こす能力を体現するウイルスの特徴を意味する。ウイルスの感染性の決定に関して当業者に公知の任意の方法を、本明細書に記載される目的で使用することができる。
【０１４１】
本発明は、以下の番号が付された項目のいずれかにおいて定義され得る：
1.  シルクフィブロインを含むマイクロニードルであって、該マイクロニードルがベース部および貫入先端を有し、該先端が約50nmから約50μmの範囲の寸法を有する、マイクロニードル。
2.  前記先端の寸法が、約200nmから約40μmの範囲である、項目1記載のマイクロニードル。
3.  少なくとも1つの活性剤をさらに含む、項目1または2記載のマイクロニードル。
4.  前記活性剤が、タンパク質、ペプチド、抗原、免疫原、ワクチン、抗体またはその一部分、抗体様分子、酵素、核酸、siRNA、shRNA、アプタマー、ウイルス、細菌、低分子、細胞、ホルモン、抗生物質、治療剤、診断剤およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、項目3記載のマイクロニードル。
5.  前記活性剤が抗生物質である、項目1〜4のいずれか一つ記載のマイクロニードル。
6.  前記マイクロニードルが少なくとも約24時間0℃より高い温度で維持されるとき、前記活性剤がその本来の生物活性の少なくとも約30%を保持する、項目1〜5のいずれか一つ記載のマイクロニードル。
7.  前記活性剤がその本来の生物活性の少なくとも約50%を保持する、項目1〜6のいずれか一つ記載のマイクロニードル。
8.  少なくとも約1ヶ月間維持される、項目6または7記載のマイクロニードル。
9.  約0℃から室温より高い温度で維持される、項目6〜8のいずれか一つ記載のマイクロニードル。
10.  ほぼ室温から約37℃の温度で維持される、項目6〜9のいずれか一つ記載のマイクロニードル。
11.  1つまたは複数の生体分解性ポリマーをさらに含む、項目1〜10のいずれか一つ記載のマイクロニードル。
12.  生物学的環境に接したときに、制御された速度で分解する、項目1〜11のいずれか一つ記載のマイクロニードル。
13.  マイクロニードルの分解により、その内部に分配されている活性剤の放出が制御される、項目12記載のマイクロニードル。
14.  基材、および基材と一体化されているかまたは基材に付着されかつ基材から延びている、1つまたは複数のシルクフィブロインマイクロニードル、
を含む、マイクロニードルデバイスであって、各マイクロニードルがベース部および貫入先端を含む、デバイス。
15.  前記マイクロニードルが少なくとも1つの活性剤をさらに含む、項目14記載のデバイス。
16.  前記活性剤が、タンパク質、ペプチド、抗原、免疫原、ワクチン、抗体またはその一部分、抗体様分子、酵素、核酸、siRNA、shRNA、アプタマー、ウイルス、細菌、低分子、細胞、ホルモン、抗生物質、治療剤、診断剤およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、項目14〜15のいずれか記載のデバイス。
17.  前記デバイスが少なくとも約24時間0℃より高い温度で維持されるとき、前記活性剤がその本来の生物活性の少なくとも約30%を保持する、項目14〜16のいずれか一つ記載のデバイス。
18.  前記活性剤がその本来の生物活性の少なくとも約50%を保持する、項目14〜17のいずれか一つ記載のデバイス。
19.  少なくとも約1ヶ月間維持される、項目14〜18のいずれか一つ記載のデバイス。
20.  約0℃から室温より高い温度で維持される、項目14〜19のいずれか一つ記載のデバイス。
21.  ほぼ室温から約37℃の温度で維持される、項目14〜20のいずれか一つ記載のデバイス。
22.  前記シルクフィブロインマイクロニードルが、約15μmから約1500μmの範囲の長さである、項目14〜21のいずれか一つ記載のデバイス。
23.  前記シルクフィブロインマイクロニードルが、約150μmから約1000μmの範囲の長さである、項目22記載のデバイス。
24.  少なくとも1つの前記シルクフィブロインマイクロニードルの長さが他と異なる、項目14〜23のいずれか一つ記載のデバイス。
25.  シルクフィブロインマイクロニードルが、1つまたは複数の生体分解性ポリマーをさらに含む、項目14〜24のいずれか一つ記載のデバイス。
26.  前記シルクフィブロインマイクロニードルが、生物学的環境に接したときに、制御された速度で分解する、項目14〜25のいずれか一つ記載のデバイス。
27.  前記基材が1つまたは複数の生体適合性ポリマーを含む、項目14〜26のいずれか一つ記載のデバイス。
28.  前記基材が、表面と接触したときに、その表面に順応する、項目14〜27のいずれか一つ記載のデバイス。
29.  前記基材が、シルクフィブロインを含み、かつシルクフィブロインマイクロニードルと一体化されている、項目14〜28のいずれか一つ記載のデバイス。
30.  少なくとも1つの活性剤およびシルクフィブロインを含む、活性剤を貯蔵および送達するためのマイクロニードルであって、該マイクロニードルがベース部および貫入先端を有し、該先端が約50nmから約50μmの範囲の寸法を有し、かつ該マイクロニードルが少なくとも約24時間0℃よりも高い温度で維持されるとき、該活性剤がその本来の生物活性の少なくとも約30%を保持する、マイクロニードル。
31.  前記先端の寸法が、約200nmから約40μmの範囲である、項目30記載のマイクロニードル。
32.  前記活性剤がその本来の生物活性の少なくとも約50%を保持する、項目30〜31のいずれか記載のマイクロニードル。
33.  少なくとも約1ヶ月間維持される、項目30〜32のいずれか一つ記載のマイクロニードル。
34.  約0℃から室温より高い温度で維持される、項目30〜33のいずれか一つ記載のマイクロニードル。
35.  ほぼ室温から約37℃の温度で維持される、項目30〜34のいずれか一つ記載のマイクロニードル。
36.  前記活性剤が、マイクロニードルの制御可能な分解を通じて生物学的障壁に放出される、項目30〜35のいずれか一つ記載のマイクロニードル。
37.  生物学的障壁を越えてまたは生物学的障壁に活性剤を送達する方法であって：
シルクフィブロインおよび活性剤を含むマイクロニードルを提供する工程；
マイクロニードルを生物学的障壁に貫入させる工程；ならびに
マイクロニードルから活性剤を放出させる工程
を含む、方法。
38.  前記生物学的障壁が対象の組織である、項目37記載の方法。
39.  前記組織が皮膚である、項目37または38記載の方法。
40.  前記活性剤が、対象の組織内でのマイクロニードルの分解を通じて放出される、項目37〜39のいずれか一つ記載の方法。
41.  1つまたは複数のシルクフィブロインマイクロニードルを含むシルクフィブロインベースのマイクロニードルデバイスを製造する方法であって：
マイクロモールド基材およびマイクロモールド基材内の1つまたは複数の穴を含む、マイクロニードル用マイクロモールドを提供する工程であって、マイクロモールド基材内の穴の内表面がマイクロニードルの外表面を画定する、工程；
マイクロニードル用マイクロモールドにシルクフィブロイン溶液を充填する工程；
シルクフィブロイン溶液を乾燥させて、マイクロニードル用マイクロモールドの穴の内表面により画定される外表面を有するシルクベースのマイクロニードルを形成する乾燥工程；ならびに
シルクベースのマイクロニードルデバイスをマイクロニードル用マイクロモールドから分離する工程
を含む、方法。
42.  乾燥工程の前に、シルクフィブロイン溶液を少なくとも1つの活性剤とブレンドする工程をさらに含む、項目41記載の方法。
43.  少なくとも1つの活性剤の層で少なくとも1つのシルクフィブロインマイクロニードルをコーティングする工程をさらに含む、項目41または42記載の方法。
44.  乾燥工程の前に、シルクフィブロイン溶液を少なくとも1つの生体分解性ポリマーとブレンドする工程をさらに含む、項目41〜43のいずれか一つ記載の方法。
45.  シルクフィブロイン溶液の層がマイクロニードル用マイクロモールド上に形成され、かつその後にこれが乾燥されて、マイクロニードルに付着しかつマイクロニードルを支持する基材となるように、シルクフィブロイン溶液をマイクロニードル用マイクロモールドに過充填する、項目41〜44のいずれか一つ記載の方法。
46.  シルクフィブロイン基材が、表面と接触したときに、表面に順応可能である、項目45記載の方法。
47.  分離する工程の前に：
乾燥させたシルクベースのマイクロニードルデバイス上をバイオポリマー溶液で被覆する工程；および
バイオポリマー溶液を乾燥させ、それによってマイクロニードルに付着しかつマイクロニードルを支持する基材を形成する工程、
をさらに含む、項目41〜46のいずれか一つ記載の方法。
48.  バイオポリマー基材が、表面と接触したときに、表面に順応可能である、項目47記載の方法。
49.  シルクフィブロインマイクロニードルの溶解度を調節する工程をさらに含む、項目41〜48のいずれか一つ記載の方法。
50.  調節する工程が、シルクフィブロインマイクロニードルの溶解時間を増加させる水中アニーリングまたはメタノール処理を含む、項目49記載の方法。
51.  シルクフィブロインマイクロニードルに多孔質構造を形成する工程をさらに含む、項目41〜50のいずれか一つ記載の方法。
52.  マイクロニードル用マイクロモールドが：
モールド基材を提供する工程；
モールド基材を保護層でコーティングする工程；
保護層をフォトレジスト層でコーティングする工程；
第1のマイクロパターン加工マスクを形成するために、フォトレジスト層をパターン加工する工程；
第1のマイクロパターン加工マスクを用いて保護層をエッチングして、第2のマイクロパターン加工マスクを形成する工程；
第2のマイクロパターン加工マスクが徐々にアンダーカットされ、モールド基材から、第2のマイクロパターン加工マスクに接している貫入先端に向かってテーパー状になっているベース端を含む1つまたは複数のマイクロニードルを含む雄型マイクロニードル用マイクロモールドが形成されるように、第2のマイクロパターン加工マスクを用いてモールド基材をエッチングして、モールド基材の一部を除去する工程；および
第2のマイクロパターン加工マスクを除去して、雄型マイクロニードル用マイクロモールドを取り出す工程
によって調製される、項目41〜51のいずれか一つ記載の方法。
53.  エッチングが、異方性エッチング、等方性ドライエッチング、または等方性ウェットエッチングの1つまたは複数を含む、項目52記載の方法。
54.  雄型マイクロニードル用モールドを形成するために等方性エッチングに供される材料が、ガラス、金属、半導体、ポリマー、セラミック、またはこれらのいずれかのハイブリッド材料である、項目52または53記載の方法。
55.  保護層の材料が、Si3N4、酸化物、窒化物、金属、ポリマー、半導体、またはその他の有機材料を含む、項目52〜54のいずれか一つ記載の方法。
56.  フォトレジスト層をパターン加工する工程がフォトリソグラフィを含む、項目52〜55のいずれか一つ記載の方法。
57.  エッチングがマイクロニードルの幾何学形状を制御する、項目52〜56のいずれか一つ記載の方法。
58.  エッチングが、1μm以下の直径を有する貫入先端を有する雄型マイクロニードル用マイクロモールドを生成する、項目52〜57のいずれか一つ記載の方法。
【０１４２】
以下の実施例では、本発明のいくつかの態様および局面を説明している。関連分野の当業者には、本発明の意図および範囲を変更することなく様々な改変、付加、置換等をなし得ることならびにそのような改変物および派生物も添付の特許請求の範囲で定義される本発明の範囲に含まれることが、明らかであろう。以下の実施例は、いかなるかたちであれ、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【０１４３】
実施例1. シリコーン製マイクロニードル用モールディングマスターを用いる例示的なマイクロニードル製造法
シルクフィブロインマイクロニードルを含む本発明の態様の製造の構想を図3A〜3Kに示す。（図3A）製造に使用する基材は、200nm厚の低応力窒化ケイ素（Si3N4）層を有するシリコーン（Si）ウエハーであり；（図3B）このウエハーを、1μmのポジ型フォトレジスト（S1813、Rohm & Haas）でコーティングし；（図3C）、フォトリソグラフィを行い、その後のエッチング工程においてマスクとして機能する円形のフォトレジストパターンを残し；（図3D）SF6ガスを用いて異方性の反応性イオンエッチング（RIE）を行い、パターン加工されたSi3N4フィルムをエッチングし、その下のSi材料を露出させ；（図3E）フッ化水素酸、硝酸および酢酸（HNA）の混合物を用いて時限的・等方性のウェットエッチングを行い、Si3N4マスクをアンダーカットし；（図3F）短時間の超音波浴により残存するSi3N4円形マスクを除去し、その下のSiマイクロニードル用モールドを露出させ；（図3G）ポリジメチルシロキサン（PDMS）ポリマーを雄型Siマイクロニードル用モールドに注ぎ、これを硬化させ；（図3H）雌型PDMSモールドをSiマスターから取り除き；（図3I）シルクフィブロイン水溶液を所望の薬物とブレンドし；（図3J）薬物添加シルク溶液をPDMSモールドに注ぎ、この溶液を乾燥させてフィルムを形成し；そして（図3K）マイクロニードルのパターン加工をされ薬物を添加されたシルクフィルムをPDMSモールドから取り除く。
【０１４４】
得られたマイクロニードルの構造を、拡大して分析した。図4Aは、底部の直径が150μm、高さが60μmおよび先端の半径が<500nmのSiマイクロニードル用モールディングマスターを示している。図4Bは、オリジナルのSiマスターを高精度で再現した、本発明の1つの態様にしたがうシルクフィブロインマイクロニードル構造物を示している。図4Cは、直径が2μm未満と測定された、シルクマイクロニードルの先端の拡大図を示している。従来のポリマーベースの溶解可能マイクロニードルのデザイン（Sullivan et al., 16 Nature Med. 915 (2010)）とは対照的に、本発明の製造法は、先端を鋭利にし（< 2μm vs. >10μm）、したがって各ニードルが皮膚に貫入する可能性を高め、したがって対象に投与される薬剤の全体量を増大させる。
【０１４５】
実施例2. シルクフィルムの薬物添加、シルク処理および薬物放出動態
図5は、シルクフィブロインベースのフィルムからの薬剤の放出が、厚み、β-シート含有量および分子量を通じて制御され得ることを示している。1つの態様において、フィルム厚の増大、β-シート含有量の増大および脱ガム時間の延長（平均分子量の減少に対応）はすべて、放出期間を延ばし、平均放出速度を低下させる。フィルムあたり0.25mgのGFPを含有する薄い、メタノール架橋されたシルクフィルムは、24時間以内にそれらに添加された全薬物の92.8%±7%を放出したが、この放出速度は、標的への適用のための放出挙動を制御するために容易に変更することができた。図5は、インディゴ染料を添加したメタノール処理シルクフィルムが、未処理フィルムよりも緩慢な、ニワトリ胸組織への放出を示したことを示している。図5に示されるように、未処理フィルム（上）は、組織に接触した際に部分的に溶解し、一方メタノール処理フィルム（下）は、拡散のみによるものであった。
【０１４６】
メタノール処理は、濃度および処理時間の両方が、膨潤およびシルクフィブロイン材料からの薬剤の放出に影響する。図6Aは、反応性赤120号（モデル染料、MW = 〜1500；Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）を添加した、水和させたシルクフィブロインフィルムの写真を示しており、これらは様々なフィルムの累積的放出挙動およびD/L2（フィルム透過性の尺度）を反映するものであり、異なる濃度のメタノールを、30秒間のメタノール処理、5分間のメタノール処理で比較している。このデータはまた、図6Bおよび6Cにグラフにより示されており、これらは、所定の薬剤の放出速度を制御するためにシルクフィブロインの3次元構造を操作できることを示している。メタノールの代わりにエタノールをシルクフィブロインマイクロニードルに対して使用し、シルクフィブロインの構造および薬剤の放出プロファイルに影響を与えることができることにも注目されたい。
【０１４７】
実施例3. アルミニウム製マイクロニードル用モールディングマスターを用いる別の例示的なマイクロニードル製造法
図7A〜7Fは、本発明の1つまたは複数の態様にしたがうシルクマイクロニードルを製造する例示的なプロセスの概略図を示している。そのような技術の効果は、周囲圧力および温度下でのシルクフィブロインマイクロニードルのマイクロモールディングによって実証されている。水溶液で得られるシルクフィブロインマイクロニードルは、Alモールディングマスターを概ね再現することができる。いくつかの態様において、水溶液で得られるシルクフィブロインマイクロニードルは、高さがおよそ500マイクロメートル、先端の半径が<10マイクロメートルであり得る。いくつかの態様において、シルクフィブロインマイクロニードルは、少なくとも1つの活性剤をドーピングすることができる。以降の実施例で示されているように、シルクフィブロインマイクロニードルのいくつかの態様は、巨大分子のモデル薬物としての西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）酵素をドーピングすることができる。他の態様において、シルクフィブロインマイクロニードルは、抗生物質テトラサイクリンを添加することができる。図8E〜8Fに示されているように、可視化の目的で、いくつかの態様において、反応性赤120号染料をシルクフィブロインマイクロニードルに組み込んだ。
【０１４８】
アルミニウム（Al）製のマイクロニードル用モールディングマスターを、高速マイクロミリングアプローチおよびその後の等方性ウェットエッチングにより製造した（図7Aおよび図8A）。ミリング工程により所望のトポロジーに近い寸法のマイクロニードル用テンプレートを作製し（図8A）、このAlテンプレートの時限的化学エッチングにより構造を精緻化して（図8Bおよび8D）、ニードルの高さがおよそ500マイクロメートルおよび先端の半径が<10マイクロメートルのニードルアレイを製作する（図8C）。これらのAlマイクロニードル用マスターを使用して、十分に確立されているソフトリソグラフィ技術［25］を用いることによって軟質エラストマー材料、例えばポリジメチルシロキサン（PDMS）を用いてエラストマーベースのマイクロニードル用雌型モールドを製造した（図7B〜7C）。この軟質エラストマー材料を利用することで、再現性のあるミクロンスケールの特徴を提供することができ、かつこの軟質エラストマー材料からシルクフィブロイン構造物を容易に剥がすことができ、したがって得られるデバイスが損傷する可能性を最小限にすることができる［19］。さらに、PDMSの表面特性は、例えばエラストマー表面を酸素プラズマに短時間曝露することによって［26］または当技術分野で公知の任意のその他の方法によって、疎水性から部分親水性まで改質することができる。加えて、PDMSの多孔質な網目は、エラストマーを通じて水を除去できるようにする［27］。これらは、モールディングプロセスにおいて高アスペクト比のシルク構造を獲得するために必須の特徴のいくつかの例である。
【０１４９】
シルクフィブロイン水溶液（6%〜8% wt/vol）を、このPDMSテンプレート上でキャスティングした（図7D）。いくつかの態様において、シルクフィブロイン水溶液はさらに、少なくとも1つの薬物を含み得る。いくつかの態様において、PDMSテンプレートは、例えばPDMS表面を酸素プラズマに短時間曝露することによって、処理され得る。シルクフィブロイン溶液を、例えば一晩の乾燥［28］によって固体状態に移行させた後（図7E）に、シルクフィブロインマイクロニードルのアレイをPDMSモールドから剥がすことができる（図7F、8E〜8F）。得られるシルクフィブロインマイクロニードルをさらに、例えばシルクフィブロインマイクロニードルの分解速度および／またはその内部に埋め込まれた活性剤の拡散特性を調整するために、後処理によって改質することができる。制御の程度は、例えばタンパク質の2次構造を調整することによって達成することができる。学説に拘束されることを望まないが、高含有量のベータシート2次構造は、シルクフィブロインフィルムに水不溶性を付与し得る。ベータシート含有量は、その乾燥速度［29］を通じたシルク材料の水和状態の調整［28］、メタノールもしくは高湿度（例えば、水蒸気アニーリング）または様々な温度への曝露、機械的および電気的曝露を含むがこれらに限定されない様々な方法によって制御することができる［28〜31］。ベータシート含有量の調整により、制御された結晶性、溶解度および放出動態を有するシルクフィブロイン材料を生成することができる［30〜33］。いくつかの態様において、様々な水蒸気アニーリング時間を使用して、シルクフィブロインニードルの薬物放出特性を調整することができる。これらの後処理工程は、シルクマイクロニードルの拡散性の制御を可能にし、最終的には薬物放出動態に対する制御を提供する。
【０１５０】
実施例4. シルクフィブロインマイクロニードルの放出動態の決定
シルクフィブロインマイクロニードルの放出動態に対する制御を実証するため、ゼラチンまたはコラーゲンヒドロゲルおよびポリマーフィルム膜の構築物を使用した（図9A〜9C）。衝撃試験（ballistic testing）において組織アナログとして一般的に利用されていることから、10〜20%のゼラチンヒドロゲルまたはコラーゲンヒドロゲルを選択した［34］。加えて、コラーゲンヒドロゲルは光学的に透明であり、したがって放出動態の評価が可能である。さらに、コラーゲンヒドロゲルの含水、拡散および機械的特性を調整することもできる。ポリマー膜は、2つの目的：（1）ニードルに十分な機械的強靱性があり膜穿孔が成功することを実証するために、皮膚の外層をシミュレートすること；および（2）モデル薬物がシルクフィブロインマイクロニードルアレイのバルクシルクフィブロイン基材から下層のコラーゲンヒドロゲルに放出されるのを防止するための拡散障壁として機能すること（すなわち、モニターされた放出がニードルからのもののみであることを確実にすること）、を有する［35,36］。図9Aに示されているように、最初にポリマー膜をHRP添加マイクロニードルパッチの上に置き、その後にコラーゲンヒドロゲルスラブを適用した。いくつかの態様において、本明細書に記載されるマイクロニードルのシルクフィブロインマイクロニードルの放出動態および／または機械的特性（例えば、貫入能力）を評価するモデルとして、哺乳動物の皮膚、例えばブタの皮膚を使用することができる。
【０１５１】
図9Bは、HRPの酵素活性を示しており、これはシルク処理およびコラゲナーゼ消化の間活性を保持し、そしてこれを活性なHRPの存在下で青色になる発色基質を使用して検出した。シルクフィブロインマイクロニードルからコラーゲンヒドロゲル（N=3）へのHPRの放出動態は、分光学的に決定した。コラーゲンヒドロゲルを、コラゲナーゼで選択的に消化した。その後、後述の例示的な材料および方法に記載されるようにして比色HRP酵素活性アッセイを実施した（図9C）。図8Cの挿入図は、コラーゲンヒドロゲルにおける初期のHRP放出を示している。HRPの持続的な放出が、試験期間全体を通して観察された（図9C）。48時間後のニードルあたり54pgのHRPの最大放出が、未処理のマイクロニードルデバイスにおいて観察された。2時間および8時間水中アニーリング処理したデバイスと比較して、未処理のシルクマイクロニードルは、同じ期間内に、それぞれ、約2.7±0.18および約5.6±0.99倍多くのHRPを放出した。シルクフィブロインマイクロニードルサンプル中のベータシート含有量を、例えば赤外線分光分析［31］により決定し、未処理、2hr-アニーリング処理および8hr-アニーリング処理のそれぞれのシルクフィブロインマイクロニードルサンプルについて、〜14%、〜18%および〜21%の結果を得た。このような発見は、水蒸気アニーリング時間を長くすることでベータシート含有量が高くなり、HRP放出が減少することを示している。したがって、一例にすぎないが、水蒸気アニーリングは、シルクフィブロインマイクロニードル内に埋め込まれた活性剤の放出を制御するための例示的なシルクフィブロインマイクロニードル処理法であり得る。いくつかの態様において、その他の後処理法を使用してシルクフィブロイン内のベータシート量を調節し、薬物の放出速度を制御することができる。
【０１５２】
さらに、いくつかの状況においては、マイクロニードル貫入部位における感染を防止するために、抗生物質の投与が望ましいことがあり得る。例えば、Donnelly et al. (2009) Pharm Res. 26: 2513-2522を参照のこと。感染を減らす目的でシルクフィブロインマイクロニードルを用いる効果を評価するために、抗生物質添加シルクフィブロインマイクロニードルを調製し、これを評価した。テトラサイクリンを添加したプレーンなシルクフィブロインマイクロニードル（対照として使用）を、本明細書に記載されるようにして調製した。このシルクフィブロインマイクロニードルのアレイを、図9Aに記載されるようにして使用し（すなわち、マイクロニードルのみを露出させ）、PDMSを用いて細胞培養プレートの底に貼り付けた。添加および未添加マイクロニードルアレイのいずれかを含む各プレートにトリプシン消化ソイ寒天を加え、ゲル化させた。その後、細菌の黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus; S. aureus）を各プレートに適用し、37℃で一晩インキュベートして、細菌叢を形成させた。
【０１５３】
テトラサイクリンを放出するマイクロニードルは、薬物放出領域の細菌密度を目に見えて減少させた（図10A）。細菌密度を定量するため、マイクロニードルアレイの上にあたる直径10-mmの寒天領域を切り出し、培養ブロス中でホモジナイズし、三連でプレートした。プレートした液体培養物を37℃で一晩インキュベートしてコロニーを成長させた。薬物添加シルクフィブロインマイクロニードルに曝露された寒天サンプルにおけるコロニー形成単位（百万CFU/切り出し領域）の、対照に対する10倍減少を決定した（図10B）。抗生物質添加マイクロニードルは、細菌の成長を阻害した。
【０１５４】
本明細書には、高アスペクト比のシルクフィブロインマイクロニードルを製造する1つまたは複数の態様が示されている。シルクフィブロインマイクロニードル製造時の穏やかな処理条件およびシルクフィブロイン生体材料の特性は、敏感な活性剤（例えば、抗生物質等の薬物および不安定な酵素）をマイクロニードル中に組込み貯蔵することを可能にし得る。例えば、本明細書に示されている事項から、すべて穏やかな周囲条件下で行われるシルクフィブロインマイクロニードルの製造および後処理が、大きな分子の機能を保存し、マイクロニードルからのその放出を制御し得ることが示唆される。さらに、シルクフィブロインマイクロニードルは、病原体の成長を阻害する抗生物質を添加することができ、それによって局部感染を防ぐための魅力的なストラテジーを提供することができる。本明細書に示されるシルクフィブロインベースのマイクロニードルシステムは、形態と機能を反復し、他のポリマーまたは金属製のマイクロニードルシステムに付随する現在の制約に見事に対処し、そして薬物および治療剤の貯蔵および送達のための効果的な経路を提供する。
【０１５５】
本明細書に記載されるシルクフィブロインマイクロニードルまたはマイクロニードルデバイスを使用することで、半減期の短いペプチド治療剤およびワクチンの持続送達［22］を含む多くの臨床的要望を満たすことができる。いくつかの態様において、ヒト成長ホルモン療法［23,38］および長期間の曝露を必要とするワクチン［24］が、本明細書に記載されるマイクロニードルまたはマイクロニードルデバイスのいくつかの態様からの利益を享受することができる。組み込まれた活性剤、例えばタンパク質に対するシルクフィブロインの安定化効果がマイクロニードルの利便性および自己投与性と組み合わさることで、安全かつ自己投与が容易であり、高い温度で貯蔵することができる薬物送達プラットフォームを実現することができる。
【０１５６】
例示的な材料および方法
マスターモールドの製造：アルミニウム（Al）製マスターは、0.5mm、15度のエンドミルを特注の70K rpmツールで使用するコンピュータ数値制御CNCマシニングにより製造した。このAlテンプレートをさらに、50℃のAlエッチング液（Alエッチング液タイプA、80%リン酸、5%硝酸、5%酢酸および10%蒸留水）中での時限的（1.5時間）化学ウェットエッチングにより処理した。
【０１５７】
シルク抽出：ボンビックス・モリの繭からシルクフィブロイン水溶液を得るプロセスは、当技術分野で以前に、例えば［37］に記載されている。簡単に説明すると、繭を炭酸ナトリウム水溶液中で約40分間煮沸することによってセリシンを除去した。乾燥後、シルクフィブロイン繊維を臭化リチウム溶液に溶解し、その後に、溶液が約6〜8% wt/vの濃度に達するまで、脱イオン（DI）水に対する透析により塩を除去した。
【０１５８】
HRP放出モデル：シルクフィブロインマイクロニードルに、1mg/mlのHRP（Sigma Aldrich）を添加した。その放出特性を変化させるため、このシルクフィブロインマイクロニードルパッチを、約2時間および約8時間、水蒸気アニーリングにより処理した。ゼラチンまたはコラーゲンヒドロゲルは、40mlのDI水を沸騰させ、これと4.5gのKNOX（商標）オリジナル無味ゼラチンパウダーを混合して、約0.112 g/mlの濃度のヒドロゲルを得ることによって調製した。この溶液を100mm径のペトリ皿に注ぎ、冷ました。このコラーゲンまたはゼラチンスラブは、高さがおよそ2.5mmと測定された。このスラブを10mm x 5mm片に切断した。シルクマイクロニードルパッチを、2ニードルアレイになるよう、さいの目切りした。このニードルを、Parafilm（Parafilm M, Pechiney Plastic Packaging）膜（図8Aのポリマー膜）に突き刺し、その後にヒドロゲルスラブに適用し、HRP放出を定量した。ヒドロゲルの脱水を防ぐため、すべての構築物を、加湿環境下で維持した。シルクフィブロインマイクロニードルからの総HRP放出量を定量するため、各々がシルクフィブロインマイクロニードルのアレイ、ポリマー膜およびコラーゲンヒドロゲルを含む複数のスタックを準備し、複数の時点で評価した。各々の指定の時点で、マイクロニードルをヒドロゲルスラブから除去し、HRPのさらなる放出を停止させた。次いで、ヒドロゲルスラブを、36℃で約2時間、400μlの1 mg/mlコラゲナーゼ（Sigma Aldrich）中で消化した。その後に、HRP含有量を、当技術分野で知られているプロトコルにしたがい、TMBペルオキシダーゼ基質（Bethyl Laboratories Inc）を用いて定量した。簡単に説明すると、2つの基質成分（クエン酸中の3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン（TMB）の0.4g/L溶液およびH2O2の0.02%溶液）を室温にし、等量混合し、そしてHRPを含有するサンプル（標準および実験サンプルを含む）に加えた。サンプルは、十分な発色が観察されるまで、室温でおよそ5〜10分間インキュベートした。次いで、等量のH2SO4を加えて呈色を停止させた。吸光度は、マイクロプレートリーダーを用い、450nmの波長で読み取った。並行して、既知量のHRPを含む濃度標準を、同一条件下で調製した。
【０１５９】
フーリエ変換赤外分光法（FTIR）：FTIR測定（FT/IR-6200 Spectrometer, Jasco）および分析は、当技術分野で公知の任意の方法、例えば［31］に記載される方法、を用いて実施した。アミドI領域の赤外線スペクトルのフーリエセルフデコンボリューションは、OPUS 5.0ソフトウェア（Bruker Optics）によって実施した。デコンボリューションは、27cm-1の半値幅および0.3のノイズ除去係数を用いて実施した。
【０１６０】
抗生物質添加シルクフィブロインマイクロニードルおよび細菌の成長：2mg/mlのテトラサイクリンを添加したシルクフィブロインマイクロニードルパッチを、本明細書に記載されるようにして製造した。トリプシン消化ソイ寒天を製造元の説明にしたがい調製し、これを100mm径ペトリ皿に小分けした（プレートあたり15〜20mL）。凍結乾燥した黄色ブドウ球菌ATCC 25923（American Type Culture Collection）の細菌培養物を、製造元の説明にしたがい再構成し展開させた。抗生物質添加シルクフィブロインマイクロニードルに曝露された細菌の感受性を試験するため、液体培養物を、光学密度（OD600）が1から1.2の間（およそ106 CFU/mLの生存細胞数に相当）になるまで、18〜24時間成長させた。寒天の10-mm径の生検（総面積=およそ78.5mm2）をマイクロニードルアレイの上から切り出した。このアレイサンプルを10mLのトリプシン消化ソイブロスに浸漬し、5〜10秒間ホモジナイズした。このホモジネートを希釈し、トリプシン消化ソイ寒天プレート上にプレートした（プレートあたり0.5mLの液体培養物）。液体培養物をインキュベートした後、個々のコロニーを区別できる最小希釈物を選択し、コロニーを計数した（サンプルあたり3プレート、処理タイプあたり3サンプル）。
【０１６１】
他の態様も、本発明の範囲および意図に含まれる。さらに、上記の説明では特定の発明を参照しているが、同説明は2つ以上の発明を含み得るものである。
【０１６２】
参考文献
0005937092.tif 000003
0005937092.tif 000004
0005937092.tif 000005
【０１６３】
開示される態様に対する様々な変更および修正が、本発明の意図および範囲から逸脱することなくなされ得、これらは当業者に明らかであろう。さらに、特定されているすべての特許およびその他の刊行物は、説明および開示の目的で、例えば、そのような刊行物中で説明されている、本発明に関連して使用され得る方法論の説明および開示の目的で、明示的に、参照により本明細書に組み入れられる。これらの刊行物は、本願の出願日以前の開示物として提供されるにすぎない。これに関するいかなる事情も、本発明者らがそれが先行発明であるためにまたは他の何らかの理由でそのような開示物よりも先の日付を主張する資格を有さないことの承認として扱われるべきではない。日付に関するすべての言及またはこれらの文献の内容に関する表示は、出願人が入手し得た情報に基づいており、それはその日付またはこれらの文献の内容の正確性に関する承認とはならない。
【図１】
0005937092.tif 000006
【図２】
0005937092.tif 000007
【図３】
0005937092.tif 000008
【図４Ａ】
0005937092.tif 000009
【図４Ｂ】
0005937092.tif 000010
【図４Ｃ】
0005937092.tif 000011
【図５】
0005937092.tif 000012
【図６Ａ】
0005937092.tif 000013
【図６Ｂ】
0005937092.tif 000014
【図６Ｃ】
0005937092.tif 000015
【図７】
0005937092.tif 000016
【図８】
0005937092.tif 000017
【図９Ａ】
0005937092.tif 000018
【図９Ｂ】
0005937092.tif 000019
【図９Ｃ】
0005937092.tif 000020
【図１０】
0005937092.tif 000021