(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
損傷した神経細胞を回復又は再生させることによって、患者におけるパーキンソン病の進行を改善するための医薬であって、
治療上有効な量の少なくともひとつのシスタミン類似体、又は薬剤的に許容されるその塩を含み、
患者がＨｏｅｈｎ及びＹａｈｒの評価に従ったステージＩＩ、ＩＩＩ又はＩＶのパーキンソン病患者であり、
少なくとも１つのシスタミン類似物がシステアミン、シスタミン又はその薬剤的に許容される塩である、
上記の医薬。
【請求項２】
患者がＨｏｅｈｎ及びＹａｈｒの評価に従ったステージＩＩ、ＩＩＩ又はＩＶのパーキンソン病患者である、請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
パーキンソン病患者がＨｏｅｈｎ及びＹａｈｒの評価に従ったステージＩＩの患者である、請求項１に記載の医薬。
【請求項４】
パーキンソン病患者がＨｏｅｈｎ及びＹａｈｒの評価に従ったステージＩＩＩの患者である、請求項１に記載の医薬。
【請求項５】
パーキンソン病患者がＨｏｅｈｎ及びＹａｈｒの評価に従ったステージＩＶの患者である、請求項１に記載の医薬。
【請求項６】
少なくともひとつのシスタミン類似体、又は薬剤的に許容されるその塩の治療上有効な量が体重あたり１日に約０．１ないし約７５０ｍｇ／ｋｇの範囲、約０．５ないし約６０ｍｇ／ｋｇの範囲又は約１ないし約２０ｍｇ／ｋｇの範囲である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項７】
少なくともひとつのシスタミン類似体、又は薬剤的に許容されるその塩の治療上有効な量が、一単位剤形あたり５ないし２０００ｍｇの有効成分を含む単位剤形、１０ないし１
５００ｍｇの有効成分を含む単位剤形、２０ないし１０００ｍｇの有効成分を含む単位剤形又は５０ないし７００ｍｇの有効成分を含む単位剤形によって投与されるように適合される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項８】
さらにシステインを含む請求項１〜７のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項９】
シスタミン類似体及びシステインそれぞれが１０：１ないし１：１０の比で存在する、請求項８に記載の医薬。
【請求項１０】
シスタミン類似体及びシステインが１：１の比で存在する、請求項９に記載の医薬。
【請求項１１】
シスタミン類似体及びシステインが連続的に使用されるように適合される、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項１２】
シスタミン類似体及びシステインが同時に使用されるように適合される、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項１３】
シスタミン類似体がシスタミン又は薬剤的に許容されるその塩である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項１４】
シスタミン類似体がシステアミン又は薬剤的に許容されるその塩である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
今日、パーキンソン病（ＰＤ）の治療の大半は対症療法的なものであり、疾病の進行の元となる神経細胞の変性を阻止するものではない。パーキンソン病及びハンチントン病におけるシスタミンの特性が、様々な動物モデルによって研究されてきた。ハンチントン病（ＨＤ）の動物モデルにおいて、シスタミンは、ハンチントン病遺伝子を保有するマウスの寿命の延長や運動系の症状の軽減といった神経保護効果を示している（Ｄｅｄｅｏｇｌｕ  ｅｔ  ａｌ．２００２；Ｋａｒｐｕｊ  ｅｔ  ａｌ．２００２）。ハンチントン病タンパク質の変異型のような、タンパク質の凝集に関与する酵素であるトランスグルタミナーゼに対するシスタミンの阻害能が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで証明されている（Ｇｒｅｅｎ  １９９３；Ｊｅｉｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００５；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００５）。脳内における脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の濃度の上昇もまた、このような神経細胞の保護効果の鍵となる要素の一つとして特定されてきた（Ｂｏｒｒｅｌｌ−Ｐａｇｅｓ  ｅｔ  ａｌ．２００６）。飲用水を通して投与された高用量のシスタミンは、ミトコンドリア機能に対する１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）の酸化ストレス及び有害効果を軽減する（Ｓｔａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．２００８）。シスタミン及び／又はシステアミンの効果は、パーキンソン病のＭＰＴＰマウスモデルにおいて報告されている（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１０，Ｔｒｅｍｂｌａｙ  ｅｔ  ａｌ．２００６；Ｓｔａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．２００８；Ｇｉｂｒａｔ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）。
【０００２】
シスタミンの代謝により、システアミンのみならず、ヒポタウリン及びタウリンも含む幾つかの中間体が産生される。シスタミン及びシステアミンはどちらも有機化合物であり、最初は放射線防護物質として記述された（Ｂａｃｑ  ａｎｄ  Ｂｅａｕｍａｒｉａｇｅ  １９６５）。システアミンはシステインの脱炭酸型であるが、代謝過程、特にクレブス回路でのＡＴＰの生成（Ｌｅｏｎａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．２００５）に関与するコエンザイムＡの分解を通した、全ての組織による恒常的な産生が主な供給源である（Ｐｉｔａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９２）。システインはほとんどのタンパク質の共通成分であるが（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．２００４）、そのチオールが酸化されやすく、ジスルフィド誘導体であるシスチンが誘導されるため、通常は血漿中のシステインの基礎濃度は低い。
【０００３】
シスタミンの還元型であるシステアミン（２−アミノエタンチオール）は、シスチンの細胞内への蓄積による腎不全を引き起こす幼児期の疾患である、シスチン蓄積症の治療用に承認された（Ｄｏｈｉｌ  ｅｔ  ａｌ．２００９）。システアミンはハンチントン病のマウスモデルにおいて著しい有効性を示し（Ｂｏｒｒｅｌｌ−Ｐａｇｅｓ  ｅｔ  ａｌ．２００６）、かつその安全性が実証されていることから、その分子はこの疾患を患う患者のために開発が進められている（Ｄｕｂｉｎｓｋｙ  ａｎｄ  Ｇｒａｙ  ２００６）。
【０００４】
最近、システアミン酒石酸水素塩（ＣＹＳＴＡＧＯＮ（登録商標））による予備試験が、安全な治療用の用量を確立するため、ハンチントン病患者に対して行われた（Ｄｕｂｉｎｓｋｙ  ａｎｄ  Ｇｒａｙ，２００６）。ハンチントン病患者９名が、単一施設における非盲検の第Ｉ相臨床試験に登録された。被験者は、１日あたり１０ｍｇ／ｋｇ、かつ１週間ごとにさらに１０ｍｇ／ｋｇずつ増加させたシステアミンによる治療を、最大用量７０ｍｇ／ｋｇまで、又は許容不可能な副作用（悪心及び運動障害）が出現するまで受けた。この臨床試験により、ハンチントン病患者には１日あたり２０ｍｇ／ｋｇ用量のシステアミンが許容されると結論付けられた（Ｄｕｂｉｎｓｋｙ  ａｎｄ  Ｇｒａｙ，２００６）。しかし、臨床的な有効性は示されなかった。このことが全てヒトに取り入れられるものではないとしても、ハンチントン病の動物モデルによって行われた研究により、有意な治療上の効果を達成するにはかなり高い用量のシスタミン又はシステアミンを要することが示された。さらに、システアミンは血液脳関門（ＢＢＢ）を通過できるが、脳におけるシステアミン又はその代謝産物の変動を検出するためにはより高用量のシスタミン又はシステアミン（ｉ．ｐ．又はｐ．ｏ．）が必要となる（Ｂｏｕｓｑｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。パーキンソン病の進行を改善するシスタミン及びシステアミンの有効性、及びそれらの脳への輸送特性については不明である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
現存するパーキンソン病の治療法は主に症状への対応のために意図されており、これまでに疾病の進行を軽減させるための治療は得られていない。従って、パーキンソン病の進行率を改善できる治療薬の開発が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、パーキンソン病の進行を改善するためにシスタミン類似体が使用できることを初めて示した。
【０００７】
本発明はパーキンソン病の進行を改善するための方法を提供するものであり、その方法は、治療上有効な量の少なくともひとつのシスタミン類似体、薬剤的に許容されるその塩、すなわち本発明の組成物又は配合物を、必要としている患者に対して投与することを含んでいる。
【０００８】
本発明は、治療上有効な量の少なくともひとつのシスタミン類似体、薬剤的に許容されるその塩、すなわち本発明の組成物又は配合物を、必要としている患者に対してパーキンソン病の進行を改善するために使用することを提供するものである。
【０００９】
本発明は、治療上有効な量の少なくともひとつのシスタミン類似体又は薬剤的に許容されるその塩を、神経救出剤及び／又は神経修復剤として、患者に対してパーキンソン病の進行を改善するために使用することを提供するものである。
【００１０】
本発明は、少なくともひとつのシスタミン類似体又は薬剤的に許容されるその塩を含み、かつシステイン又は薬剤的に許容されるその塩を含む、パーキンソン病の進行を改善するための配合物又は医薬組成物を提供するものである。
【００１１】
本発明は、神経救出剤及び／又は神経修復剤として少なくともひとつのシスタミン類似体又は薬剤的に許容されるその塩を含み、かつシステイン又は薬剤的に許容されるその塩を含む、パーキンソン病の進行を改善するための配合物又は医薬組成物を提供するものである。
【００１２】
さらに別の態様によれば、本明細書に記載する薬剤を製造するための、シスタミン類似体、又は薬剤的に許容されるその塩、すなわち本発明の組成物又は配合物の使用が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】黒質チロシン水酸化酵素陽性神経細胞におけるシスタミンの有益な効果を示した図である。ａ）黒質緻密部（ＳＮｐｃ）におけるチロシン水酸化酵素（ＴＨ）陽性神経細胞の立体的な細胞計数により、生理食塩水で処置したＭＰＴＰマウスにおけるＴＨ陽性神経細胞の総数が、生理食塩水＋生理食塩水で処置した動物に比較して有意に減少することが明らかとなった（ｐ＜０．００１）。ａ）ＭＰＴＰ及びシスタミンによる前及び後処置マウスでは、生理食塩水処置動物と同等な数のＴＨ陽性神経細胞が示された。ｂ）ＳＮｐｃの顕微鏡写真は、生理食塩水、ならびにＭＰＴＰ及びシスタミンによる後処置マウスにおけるクレシル染色されたＴＨ陽性神経細胞の数が、ＭＰＴＰ及び生理食塩水による処置マウスに比較して増加している（生理食塩水に対して同程度である）ことを示す。ｃ）の表に、クレシル及びＴＨ陽性神経細胞の立体的細胞計数を要約する。下部のパネルに、前及び後処置のスケジュールを時系列で示す。  値は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表す。統計解析は一元配置分散分析法を用いて行った。  生理食塩水＋生理食塩水群との有意差：＊＊＊＝ｐ＜０．００１。  ＭＰＴＰ＋生理食塩水群との有意差：＃＝ｐ＜０．０５；＃＃＝ｐ＜０．０１；＃＃＃＝ｐ＜０．００１。  ｂ）のスケールバー＝４００μｍ、挿入図＝２５μｍ。  略語：Ｐｒｅ−Ｔｘ（ＭＰＴＰ及びシスタミンによる前処置）；Ｐｏｓｔ−Ｔｘ（ＭＰＴＰ及びシスタミンによる後処置）。
【図２】黒質におけるＮｕｒｒ１  ｍＲＮＡの発現におけるシスタミンの有益な効果を示した図である。ａ）ＳＮｐｃにおけるＮｕｒｒ１  ｍＲＮＡレベル（ドーパミン（ＤＡ）表現型の発現及び維持に関与する遺伝子）のデンシトメトリーを用いた測定により、３つの対照群（生理食塩水＋生理食塩水；生理食塩水＋シスタミン  Ｐｒｅ−Ｔｘ、生理食塩水＋シスタミン  Ｐｏｓｔ−Ｔｘ）及びシスタミンにより処置したＭＰＴＰ動物は同様の結果を示したが、生理食塩水により処置したＭＰＴＰ動物のＮｕｒｒ１  ｍＲＮＡレベルは有意に減少することが明らかとなった（ｐ＜０．０１）。ｂ）ＳＮｐｃにおけるレベルを示す顕微鏡写真（矢印を参照）は、対照ならびにＭＰＴＰ及びシスタミンによる後処置マウスのＮｕｒｒ１  ｍＲＮＡレベルが、ＭＰＴＰ及び生理食塩水により処置されたマウスｂ）に比較して正常レベルにあることを示す。  値は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表す。統計解析は一元配置分散分析法を用いて行った。  生理食塩水＋生理食塩水群との有意差：＊＊＝ｐ＜０．０１。  ＭＰＴＰ＋生理食塩水群との有意差：＃＝ｐ＜０．０５；＃＃＝ｐ＜０．０１。  ｂ）のスケールバー＝１ｍｍ。
【図３】黒質ＤＡＴ陽性細胞におけるシスタミンの有益な効果を示した図である。  ＤＡトランスポーター（ＤＡＴ）ｍＲＮＡの発現を、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションにおいても明らかにした。ａ）ＳＮｐｃにおけるＤＡＴ発現細胞の立体的な細胞計数により、生理食塩水で処置したＭＰＴＰマウスにおける神経細胞の総数が、生理食塩水＋生理食塩水で処置した動物に比較して有意に減少することが示された（ｐ＜０．００１）。ａ）ＭＰＴＰ及びシスタミンによる前及び後処置マウスでは、生理食塩水処置動物と同等な数のＤＡＴ陽性細胞が示された。ｂ）ＳＮｐｃの顕微鏡写真はＤＡＴ  ｍＲＮＡ発現細胞を示す。挿入図は、感光乳剤前の、ＤＡＴ  ｍＲＮＡのオートラジオグラフィーを表す（デンシトメトリーにより測定）。ｃ）の表に、立体的細胞計数、及びＳＮｐｃにおけるＤＡＴ  ｍＲＮＡ発現のデンシトメトリーによる測定を要約する。  値は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表す。統計解析は一元配置分散分析法を用いて行った。  生理食塩水＋生理食塩水群との有意差：＊＝ｐ＜０．０５；＊＊＊＝ｐ＜０．００１。  ＭＰＴＰ＋生理食塩水群との有意差：＃＝ｐ＜０．０５；＃＃＝ｐ＜０．０１。  ｂ）のスケールバー＝４００μｍ、挿入図＝５００μｍ。
【図４】亜急性ＭＰＴＰモデルにおける、黒質ＴＨ陽性細胞の減少の時間経過を示した図である。ａ）ＳＮｐｃにおけるＴＨ陽性神経細胞の立体的な細胞計数により、最終のＭＰＴＰ注射後７及び１４日のＴＨ陽性神経細胞の総数が、生理食塩水（ｐ＜０．０１）及びＭＰＴＰ処置後１日の群に比較して有意に減少することが明らかとなったが（ｐ＜０．００１）、ＭＰＴＰ処置後１日の群に対しては神経細胞数の減少傾向のみが示された（ｐ＝０．０６３）。ｂ）ＳＮｐｃの顕微鏡写真は、ＭＰＴＰ処置後７及び１４日の群における、クレシル染色されたＴＨ陽性神経細胞数の減少を表す。ｃ）の表に、クレシル及びＴＨ陽性神経細胞の立体的細胞計数を要約する。  値は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表す。統計解析は一元配置分散分析法を用いて行った。  生理食塩水群との有意差：＊＊＝ｐ＜０．０１。  ｂ）のスケールバー＝４００μｍ。
【図５】亜急性ＭＰＴＰモデルにおける、Ｎｕｒｒ１及びＤＡＴ  ｍＲＮＡ発現の減少の時間経過を示した図である。  デンシトメトリーを用いたａ）Ｎｕｒｒ１及びｂ）ＤＡＴ  ｍＲＮＡ発現の測定により、両ＤＡマーカーのＳＮｐｃにおけるレベルが、ＭＰＴＰによる処置後２４時間から有意に減少を始めていることが示された（それぞれｐ＜０．０１及びｐ＜０．０５）。  値は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表す。統計解析は一元配置分散分析法を用いて行った。  対照群との有意差：＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＝ｐ＜０．０５。
【図６】亜急性ＭＰＴＰモデルにおける、黒質ＤＡのアポトーシス過程の時間経過を示した図である。  腹側中脳におけるａ）ＢＡＸ及びｂ）Ｂｃｌ−２タンパク質レベルのウェスタンブロット分析。ｃ）ＢＡＸ／Ｂｃｌ２の比は、最終のＭＰＴＰ注射後２４時間に有意に増大したことから（ｐ＜０．０５）、ＭＰＴＰ送達のためのこの特定の投与計画では、この時点でアポトーシス過程は既に開始されていたことが示唆される。値は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表す。統計解析は一元配置分散分析法を用いて行った。  対照群との有意差：＊＝ｐ＜０．０５。
【図７】脳のシステアミンのレベルの増大を示した図である。  大脳のシステアミンｂ）及びシステインｃ）のレベルを、蛍光検出を組み合わせたＨＰＬＣによって測定した。  システアミン（２）ならびにシステイン（１）の標準溶液の分子構造及びＨＰＬＣ溶出特性をＡに示す。  マウスに５０ｍｇ／ｋｇのシスタミンを単回でｉ．ｐ．注射して１時間後に屠殺すると、システアミンはこれに応答し、同時点で屠殺したビヒクルマウスに比較して有意に増大した（ｐ＜０．０５）Ｂ。  ２００ｍｇ／ｋｇの用量によってもまた、シスタミン注射後１時間及び３時間にシステアミンの有意な増大が引き起こされる（ｐ＜０．０１）Ｂ。  大脳におけるシステインのレベルは、用量及び灌流時間に関わらず安定であるＣ。  データは平均（ｎｍｏｌ／ｍｇ  タンパク質）±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表す。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。
【図８】脳のヒポタウリン及びタウリンのレベルが一定であることを示した図である。  大脳のヒポタウリン（２）及びタウリン（１）の濃度を、ＵＶ検出を組み合わせたＨＰＬＣによって測定した。  １ｎｇ／ｍＬのタウリン（１）又はヒポタウリン（２）を含む標準溶液の分子構造及びＨＰＬＣ溶出特性をＡに示す。脳において、ヒポタウリン（２）及びタウリン（１）は安定した量で観察された。  データは平均（ｎｍｏｌ／ｍｇ  タンパク質）±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表す。
【図９】システイン存在下での、システアミンの脳への取り込みの増大を示した図である。  ｉｎ  ｓｉｔｕでの大脳灌流技術を用いたシステアミン及びシステインの脳への取り込み、及びＨＰＬＣ法による定量化を示す。  Ａは、ｉｎ  ｓｉｔｕ大脳灌流法の模式図である。適切な連結（青色の導管）後に１００％の灌流液が右半球に到達するように、カテーテルは直接右内頚動脈に挿入するＡ。各分子のクリアランス係数（μＬ／ｇ／ｓ）が示すように、システイン（１）及びシステアミン（２）の両方はＢＢＢを通過できる。共灌流の際、システイン及びシステアミンクリアランス係数は有意に増大する。  データは平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表す（μＬ／ｇ／ｓ）。  ＊ｐ＜０．０５。
【図１０】シスタミンが、パーキンソン病の一側性線条体６−ＯＨＤＡマウスモデルにおいてドーパミン作動性神経細胞を救出することを示した図である。  パネル（Ｅ）に実験の時間経過を示す。全てのマウスに対し、一側性線条体内への６−ＯＨＤＡ（４μｇ）又は同量のビヒクル（偽物質）の注射を行った。３日後、ＤＡ作動性の変性過程の進行中に、マウスを毎日１０ｍｇ／ｋｇのシスタミン（又は生理食塩水）によって１４日間処置した。最終のシスタミン注射後に、マウスに経心腔的灌流を２４時間行い、死後の分析のために脳を処理した。  （Ａ）ＳＮｐｃにおけるＴＨ陽性神経細胞の立体的な細胞計数により、生理食塩水で処置した６−ＯＨＤＡマウスのＴＨ陽性神経細胞の総数が、偽物質＋生理食塩水で処置した動物に比較して有意に７２％減少することが明らかとなった（ｐ＜０．００１）。シスタミンで処置した６−ＯＨＤＡマウスのＴＨ陽性神経細胞の総数は、偽物質＋シスタミンで処置した動物に比較して２７％のみ減少することが示される（ｐ＜０．０５）。６−ＯＨＤＡ＋生理食塩水群は、６−ＯＨＤＡ＋シスタミン群とは有意に異なっていた（ｐ＜０．００１）。  （Ｂ）及び（Ｃ）それぞれ、デンシトメトリーを用いたＳＮｐｃにおけるＮｕｒｒ１及びＤＡＴ  ｍＲＮＡレベルの測定。完全なＤＡ作動性を示すこれら２つのさらなるマーカーでは、（Ａ）におけるＴＨの染色で見られたものと同様のパターンが明らかとなり、シスタミンの神経救出特性が確認された。  （Ｄ）ＨＰＬＣによって行った線条体ＤＡの含有量の測定は、対照マウスに比較して、生理食塩水で処置した６−ＯＨＤＡマウスにおいてのみＤＡのレベルが有意に減少していることを示した（ｐ＜０．０１）。  値は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表す。統計解析は一元配置分散分析法を用いて行った。  ＊＝ｐ＜０．０５；＊＊＝ｐ＜０．０１；＊＊＊＝ｐ＜０．００１。
【図１１】マウスにおける６−ＯＨＤＡを用いた線条体の損傷による行動障害を、シスタミンが逆転させることを示した図である。  パネル（Ｄ）に実験の時間経過を示す。全てのマウスに対し、一側性線条体内への６−ＯＨＤＡ（４μｇ）又は同量のビヒクル（偽物質）の注射を行った。３週間後、損傷が安定して変性が最大に達した際に、マウスを毎日１０ｍｇ／ｋｇのシスタミン（又は生理食塩水）によって６週間処置した。実験の間を通し、３つの異なる時点、すなわちシスタミン処置開始前（手術後３週）、損傷発生後６週及び９週に、３つの異なる行動試験によってマウスを評価した。行動試験は、一側性のＤＡ作動性の損傷範囲を示す、感覚運動の非対称性を評価するために選択した。  （Ａ）蓄積したアポモルヒネにより誘導される対側性回転を、ロータメーター装置によって測定した。６−ＯＨＤＡによる一側性の損傷によって誘導された損傷後３、６及び９週の対側性回転の増加は、手術後６及び９週間のシスタミン処置によって有意に減少した（ｐ＜０．０５）。  （Ｂ）ステップ試験により、歩みを調節するパーセンテージが、対側の前足において減少（同側に比較して）することが明らかとなった。  （Ｃ）円筒試験では肢の非対称的な使用もまた示され、ここでは６−ＯＨＤＡ損傷マウスが、偽物質により処置したマウスに比較して、手術後３週、６週及び９週に対側性接触の有意な減少を示した。この非対称性は、６−ＯＨＤＡ損傷マウスを、損傷後６及び９週にシスタミンで処置した場合には観察されなかった。  値は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表す。統計解析は一元配置分散分析法を用いて行った。  ＊＝ｐ＜０．０５；＊＊＝ｐ＜０．０１；＊＊＊＝ｐ＜０．００１。
【図１２】シスタミンが、パーキンソン病の一側性線条体６−ＯＨＤＡマウスモデルにおいて、ドーパミン作動性の黒質系の幾つかの状況を回復させ、かつ線条体のカテコールアミン作動性の量及び動態を変化させることを示した図である。  パネル（Ｄ）に実験の時間経過を示す。図１１に示すように、全てのマウスに対して一側性線条体内への６−ＯＨＤＡ（４μｇ）又は同量のビヒクル（偽物質）の注射を行い、かつ３週間後に開始したシスタミン（又は生理食塩水）による処置を６週間行った。最終のシスタミン注射後に、マウスに経心腔的灌流を２４時間行い、死後の分析のために脳を処理した。  （Ａ）ＳＮｐｃにおけるＴＨ陽性神経細胞の立体的な細胞計数により、生理食塩水で処置した６−ＯＨＤＡマウスのＴＨ陽性神経細胞の総数が、偽物質＋生理食塩水で処置した動物に比較して有意に９３％減少することが明らかとなった（ｐ＜０．００１）。シスタミンで処置した６−ＯＨＤＡマウスのＴＨ陽性神経細胞の総数は、偽物質＋シスタミンで処置した動物に比較して６５％のみ減少することが示される（ｐ＜０．００１）。６−ＯＨＤＡ＋生理食塩水群は、６−ＯＨＤＡ＋シスタミン群とは有意に異なる（ｐ＜０．０１）。  （Ｂ）ＨＰＬＣによって測定した、６−ＯＨＤＡ損傷マウスにおけるＤＡレベルは、生理食塩水及びシスタミンで処理した動物について、それぞれ８８％及び８４％減少した（ｐ＜０．００１）。シスタミンは、破壊された線条体のＤＡ量を有意に回復させなかった。  （Ｃ）しかしながらシスタミンは、行動による損傷評価試験と有意に関連する（データ未提示）生理食塩水によって処置した６−ＯＨＤＡマウスと比較して、ＤＡの代謝回転を正常化する強い傾向を発揮した。  値は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表す。統計解析は一元配置分散分析法を用いて行った。  ＊＝ｐ＜０．０５；＊＊＝ｐ＜０．０１；＊＊＊＝ｐ＜０．００１。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
使用及び方法
一実施形態によれば、シスタミン類似体及び薬剤的に許容されるその塩は神経救出及び／又は神経回復剤として使用できる。この神経救出／神経回復活性は、神経保護剤の活性とは区別できる。
【００１５】
本明細書で用いられる「神経保護剤」により、変性過程で残された「健常」神経細胞を保護できる。従って、神経保護剤は診断時に投与され得ることが理解される。
【００１６】
本明細書で用いられる「神経救出剤」により、損傷したが死んではいない神経細胞の神経変性過程を、機能的回復を有するか又は有さない状態で停止できる。従って、神経救出剤は可能な限り早期に投与する必要があるが、ＰＤの診断後であっても投与できることが理解される。
【００１７】
本明細書で用いられる「神経回復剤」により、損傷した神経細胞の機能的及び／又は構造的回復ならびに再生によって機能を再確立できる。従って、神経回復剤は診断後に最大の有効性を示し得ることから、ＰＤに対する臨床での使用に大きく関連することが理解される。
【００１８】
さらなる実施形態によれば、シスタミン類似体及び薬剤的に許容されるその塩は、パーキンソン病の進行を改善するために使用できる。
【００１９】
一実施形態によれば、「パーキンソン病の進行を改善する」ことはａ）損傷したが死んではいない神経細胞における抗アポトーシス作用による、機能的回復を有するか又は有さない状態での神経変性過程の減少；及び／又はｂ）機能的及び／又は構造的回復ならびに再生により特徴付けられる。
【００２０】
さらなる実施形態によれば、「パーキンソン病の進行を改善する」ことは以下の機構の一つによって特徴付けられる：
ａ）損傷したが死んではいない神経細胞における抗アポトーシス作用による、機能的回復を有するか又は有さない状態での神経変性過程の減少；及び／又は
ｂ）損傷した神経細胞の機能的及び／又は構造的回復ならびに再生、及び／又は
ｃ）神経発生の促進。
【００２１】
さらに別の実施形態によれば、パーキンソン病の進行は総パーキンソン病統一スケール（総ＵＰＤＲＳ）スコアによって定量化され、総ＵＰＤＲＳスコアの増加はパーキンソン病の症状の進行を表し、かつ期間を通しての総ＵＰＤＲＳスコアの増加はパーキンソン病の進行率を表す。例えば、Ｇｏｅｔｚ  ＣＧ，Ｔｉｌｌｅｙ  ＢＣ，Ｓｈａｆｔｍａｎ  ＳＲ，Ｓｔｅｂｂｉｎｓ  ＧＴ，Ｆａｈｎ  Ｓ，Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｍａｒｔｉｎ  Ｐ，Ｐｏｅｗｅ  Ｗ，Ｓａｍｐａｉｏ  Ｃ，Ｓｔｅｒｎ  ＭＢ，Ｄｏｄｅｌ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｍｏｖｅｍｅｎｔ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ−ｓｐｏｎｓｏｒｅｄ  ｒｅｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｆｉｅｄ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒａｔｉｎｇ  Ｓｃａｌｅ（ＭＤＳ−ＵＰＤＲＳ）：ｓｃａｌｅ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｍｅｔｒｉｃ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｒｅｓｕｌｔｓ．Ｍｏｖ  Ｄｉｓｏｒｄ  ２３：２１２９−２１７０を参照されたい。
この方法のさらに別の実施形態によれば、該期間はシスタミン類似体又は薬剤的に許容されるその塩の投与開始後１２、２４、又は３６週である。
【００２２】
本明細書で用いられるパーキンソン病患者のステージは、Ｈｏｅｈｎ及びＹａｈｒによって記載された、症状に従った以下の５段階の異なるステージである（Ｈｏｅｈｎ  Ｍ  Ｍ，Ｙａｈｒ  Ｍ  Ｄ，Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ：ｏｎｓｅｔ，ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  １９６７，１７：４２７−４２）。
ステージＩ：（軽度又は早期の疾病）：症状は身体の片側のみに影響する。
ステージＩＩ：身体の両側が影響されるが、姿勢は正常を保つ。
ステージＩＩＩ：（中程度の疾病）：身体の両側が影響され、かつ起立及び歩行の間に軽度の不均衡がみられるが、患者はなお自立している。
ステージＩＶ：（進行した疾病）：身体の両側が影響され、かつ起立及び歩行の間に無力な不安定性が見られる。このステージの患者は相当な援助を必要とする。
ステージＶ：重篤かつ完全に進行した疾病。患者はベッド又は椅子で過ごすように制限される。
【００２３】
本明細書で用いられる、「早期ステージのパーキンソン病患者」は、Ｈｏｅｈｎ及びＹａｈｒによって定義されたパーキンソン病のステージＩ又はＩＩにあり、かつ対症的な抗パーキンソン病療法を必要としないパーキンソン病患者である。一実施形態によれば、このようなパーキンソン病患者は対症的な治療を少なくとも次の９か月間必要としない。早期ステージのパーキンソン病患者は、関連する試験の実施などにより同定され得る。
【００２４】
一実施形態によれば、患者は早期ステージのパーキンソン病患者である。
【００２５】
さらに別の実施形態によれば、早期ステージのパーキンソン病患者は、Ｈｏｅｈｎ及びＹａｈｒの評価に従ったステージＩの患者である。
【００２６】
さらに別の実施形態によれば、早期ステージのパーキンソン病患者は、３０未満、２５未満、２３未満、２１未満、又は２０未満のＵＰＤＲＳ総スコアを有する患者である。
【００２７】
さらに別の実施形態によれば、パーキンソン病患者は、Ｈｏｅｈｎ及びＹａｈｒの評価に従ったステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ又はＶの患者である。
【００２８】
さらに別の実施形態によれば、パーキンソン病患者は、Ｈｏｅｈｎ及びＹａｈｒの評価に従ったステージＩＩＩ、ＩＶ又はＶの患者である。
【００２９】
さらに別の実施形態によれば、パーキンソン病患者は、Ｈｏｅｈｎ及びＹａｈｒの評価に従ったステージＩＩＩ又はＩＶの患者である。
【００３０】
さらに別の実施形態によれば、パーキンソン病患者は、Ｈｏｅｈｎ及びＹａｈｒの評価に従ったステージＩＩＩの患者である。
【００３１】
本発明は、
パーキンソン病患者の疲労を減少させるための；
パーキンソン病患者の非運動系症状の重症度を低下させるための；
パーキンソン病患者の機能低下を減少させるための；
疾病の臨床的進行を低減させるための；もしくは
疾病の臨床的進行を遅延させるための使用又は方法に関する。
【００３２】
対象の発明はさらにパーキンソン病を呈する患者を治療するための方法を提供し、該方法は、パーキンソン病を呈する患者の同定、及びそのように同定された患者に、患者を治療するために有効な量のシスタミン類似体若しくは薬剤的に許容されるその塩、又は本発明の組成物若しくは配合物を定期的に投与することを含む。
【００３３】
本発明は、患者におけるパーキンソン病の進行を遅延させるか又は低減するための方法に関し、該方法は、患者に治療上有効な量の少なくともひとつのシスタミン類似体又は薬剤的に許容されるその塩、本発明の組成物又は配合物を投与することを含む。
【００３４】
本発明は、患者におけるパーキンソン病の進行を遅延させるか又は低減するための、治療上有効な量の少なくともひとつのシスタミン類似体又は薬剤的に許容されるその塩、本発明の組成物又は配合物の使用に関する。
【００３５】
対象の発明はさらに、パーキンソン病患者におけるパーキンソン病の臨床的進行を遅延させるための、治療上有効な量のシスタミン類似体若しくは薬剤的に許容されるその塩、又は本発明の組成物若しくは配合物の使用を提供する。
【００３６】
対象の発明はさらに、パーキンソン病患者におけるパーキンソン病の臨床的進行を遅延させるための方法を提供し、該方法は、治療上有効な量のシスタミン類似体若しくは薬剤的に許容されるその塩、又は本発明の組成物若しくは配合物を患者に投与することを含む。
【００３７】
対象の発明はさらに、パーキンソン病患者における非運動系症状の重症度を低下させるための、治療上有効な量のシスタミン類似体若しくは薬剤的に許容されるその塩、又は本発明の組成物若しくは配合物の使用を提供する。
【００３８】
対象の発明はさらに、パーキンソン病患者における非運動系症状の重症度を低下させるための方法を提供し、該方法は、治療上有効な量のシスタミン類似体若しくは薬剤的に許容されるその塩、又は本発明の組成物若しくは配合物を患者に投与することを含む。
【００３９】
対象の発明はさらに、ステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ又はＶ（Ｈｏｅｈｎ及びＹａｈｒの評価に従う）のパーキンソン病患者を治療するための方法を提供し、該方法は、パーキンソン病を呈する患者の同定、及びそのように同定された患者に、患者を治療するために有効な量のシスタミン類似体若しくは薬剤的に許容されるその塩、又は本発明の組成物もしくは配合物を定期的に投与することを含む。
【００４０】
対象の発明はさらに、パーキンソン病の初期兆候を呈する患者の治療のために使用する、シスタミン類似体若しくは薬剤的に許容されるその塩、又は本発明の組成物若しくは配合物を提供する。
【００４１】
対象の発明はさらに、初期ステージのパーキンソン病患者におけるパーキンソン病の進行率低下のために使用する、薬剤的に有効な量のシスタミン類似体若しくは薬剤的に許容されるその塩、又は本発明の組成物もしくは配合物を含む医薬組成物を提供する。
【００４２】
対象の発明はさらに、パーキンソン病の初期兆候を呈する患者を治療するための、治療上有効な量のシスタミン類似体若しくはの薬剤的に許容されるその塩、又は本発明の組成物若しくは配合物の使用を提供する。
【００４３】
対象の発明はさらにパーキンソン病の初期兆候を呈する患者を治療するための方法を提供し、該方法は、パーキンソン病の初期兆候を呈する患者の同定、及びそのように同定された患者に、患者を治療するために有効な量のシスタミン類似体若しくは薬剤的に許容されるその塩、又は本発明の組成物もしくは配合物を定期的に投与することを含む。
【００４４】
対象の発明はさらに、初期ステージのパーキンソン病患者の疲労を減少させるために使用する、シスタミン類似体若しくは薬剤的に許容されるその塩、又は本発明の組成物もしくは配合物を提供する。
【００４５】
対象の発明はさらに、初期ステージのパーキンソン病患者の疲労を減少させるための、治療上有効な量のシスタミン類似体若しくは薬剤的に許容されるその塩、又は本発明の組成物若しくは配合物の使用を提供する。
【００４６】
対象の発明はさらに初期ステージのパーキンソン病患者の疲労を減少させるための方法を提供し、該方法は、患者を初期ステージのパーキンソン病患者であると同定すること、及びそのように同定された患者に、疲労を減少させるために有効な量のシスタミン類似体又は薬剤的に許容されるその塩を定期的に投与することを含む。
【００４７】
対象の発明はさらに、初期ステージのパーキンソン病患者における非運動系症状の重症度を低下させるための方法を提供し、該方法は、患者を初期ステージのパーキンソン病患者であると同定すること、及びそのように同定された患者に、非運動系症状の重症度を低下させるために有効な量のシスタミン類似体若しくは薬剤的に許容されるその塩、又は本発明の組成物若しくは配合物を定期的に投与することを含む。
【００４８】
対象の発明はさらに、初期ステージのパーキンソン病患者の疲労を減少させるための方法を提供し、該方法は、初期ステージのパーキンソン病患者に、疲労を減少させるために有効な量のシスタミン類似体若しくは薬剤的に許容されるその塩、又は本発明の組成物若しくは配合物を定期的に投与することを含む。
【００４９】
対象の発明はさらに、初期ステージのパーキンソン病患者における非運動系症状の重症度を低下させるための方法を提供し、該方法は、初期ステージのパーキンソン病患者に、非運動系症状の重症度を低下させるために有効な量のシスタミン類似体若しくは薬剤的に許容されるその塩、又は本発明の組成物若しくは配合物を定期的に投与することを含む。
【００５０】
対象の発明はさらに、パーキンソン病患者におけるパーキンソン病の臨床的進行を遅延させるための方法を提供し、該方法は、パーキンソン病患者に、該患者におけるパーキンソン病の臨床的進行を遅延させるために有効な量のシスタミン類似体若しくは薬剤的に許容されるその塩、又は本発明の組成物若しくは配合物を定期的に投与することを含む。
【００５１】
対象の発明はさらに、初期ステージのパーキンソン病患者におけるパーキンソン病の進行率低下のために使用する、シスタミン類似体若しくは薬剤的に許容されるその塩、又は本発明の組成物若しくは配合物を提供する。
【００５２】
対象の発明はさらに、初期ステージのパーキンソン病患者における機能低下を減少させるために使用する、シスタミン類似体若しくは薬剤的に許容されるその塩、又は本発明の組成物若しくは配合物を提供する。
【００５３】
医薬組成物及びシスタミン類似体
一態様によれば、シスタミン類似体はシステアミン、シスタミン、タウリン若しくはヒポタウリン、又は薬剤的に許容されるそれらの塩である。
【００５４】
さらなる態様によれば、シスタミン類似体はシスタミン若しくはシステアミン、又は薬剤的に許容されるそれらの塩である。
【００５５】
さらなる態様によれば、シスタミン類似体はシステアミン酒石酸水素塩である。
【００５６】
さらなる態様によれば、シスタミン類似体はシステアミン塩酸塩である。
【００５７】
さらなる態様によれば、シスタミン類似体はシスタミン二塩酸塩である。
【００５８】
別の態様によれば、少なくともひとつのシスタミン類似体又は薬剤的に許容されるその塩、及び少なくともひとつの薬剤的に許容される担体又は賦形剤を含む医薬組成物が提供される。
【００５９】
別の態様によれば、シスタミン類似体又は薬剤的に許容されるその塩及び１以上の追加の薬剤、例えばブロモクリプチン、ベンゾトロピン、レボドパ、ロピニロール、プラミペキソール、ロチゴチン、カベルゴリン、エンタカポン、トルカポン、アマンタジン、セレギリン及びラサギリンを含む配合物が提供される。
【００６０】
さらに別の態様によれば、患者におけるパーキンソン病の進行を改善する薬剤を製造するための、シスタミン類似体又は薬剤的に許容されるその塩、本発明の組成物又は配合物の使用が提供される。
【００６１】
さらなる実施形態によれば、本発明の化合物は以下の式：
ＮＨ２−（ＣＨ２）２−ＳＨ
システアミン
ＮＨ２−（ＣＨ２）２−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２）２−ＮＨ２
シスタミン
ＮＨ２−（ＣＨ２）２−Ｓ（Ｏ２）−ＯＨ
タウリン
ＮＨ２−（ＣＨ２）２−Ｓ（Ｏ）−ＯＨ
ヒポタウリン
【化１】
0006000985.tif 000002
により表されるか、又は薬剤的に許容されるそれらの塩である。
【００６２】
シスタミン類似体又は薬剤的に許容されるその塩は、当該技術分野において公知の方法によって得ることができる。化合物は様々な供給源、例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州セントルイスから市販されている。
【００６３】
一実施形態によれば本発明は、本明細書に記載する少なくともひとつのシスタミン類似体又は薬剤的に許容されるその塩を含み、かつ少なくともひとつの追加の薬剤をさらに含む医薬組成物を提供し、ここで該追加の薬剤とはシステインである。
【００６４】
一実施形態によれば本発明は、本明細書に記載する少なくともシスタミン類似体又は薬剤的に許容されるその塩を含み、かつ少なくともひとつの追加の薬剤をさらに含む医薬組成物を提供し、ここで該追加の薬剤とはＬ−システインである。
【００６５】
別の実施形態によれば、本明細書に記載する少なくともひとつのシスタミン類似体、及び１以上の追加の薬剤を含む配合物が提供される。
【００６６】
一実施形態によれば、該追加の薬剤とはシステインである。
【００６７】
一実施形態によれば、該追加の薬剤とはＬ−システインである。
【００６８】
一実施形態によれば、シスタミン類似体及びシステインは、シスタミン類似体及びシステインそれぞれが１０：１ないし１：１０の比で存在する。さらなる実施形態によれば、シスタミン類似体及びシステインが１：１の比で存在する。
【００６９】
配合物の一実施形態によれば、シスタミン類似体及び追加の薬剤は、連続的に使用されるように適合される。
【００７０】
配合物の別の実施形態によれば、シスタミン類似体及び追加の薬剤は、同時に使用されるように適合される。
【００７１】
上記の配合物は、医薬製剤の形態で使用するために都合のよいものであってよく、従って上記の配合物を薬剤的に許容される担体と共に含む医薬製剤が、本発明のさらなる態様を構成する。
【００７２】
本発明の方法又は本発明の配合物において使用する個々の成分は、別々又は組み合わせた医薬製剤によって、連続的又は同時に投与されてよい。
【００７３】
一実施形態によれば本発明は、薬剤を製造するための、本明細書に記載した化合物、組成物又は配合物の使用を提供する。
【００７４】
他に記載のない限り、本明細書に示される構造は、該構造の全ての異性体（例えば鏡像異性体、ジアステレオマー、及び幾何異性体（又は配座異性体））；例えば各不斉中心のＲ及びＳ立体配置、（Ｚ）及び（Ｅ）二重結合異性体、ならびに（Ｚ）及び（Ｅ）配座異性体を含むことも意図される。従って、本化合物の単一の立体化学異性体、ならびに鏡像異性体、ジアステレオマー、及び幾何異性体（又は配座異性体）の混合物も本発明の範囲内である。単一の光学異性体又は鏡像異性体は、キラルＨＰＬＣ、酵素による変換、及びキラル補助剤のような当該技術分野において公知の方法によって得ることができる。
【００７５】
一実施形態によれば、適用可能な場合に、シスタミン類似体又はシステインは、対応する立体異性体を少なくとも７５％、８５％、９０％、９５％、９７％及び９９％含まない、単一の立体異性体の形態で提供される。
【００７６】
薬剤的に許容されるシスタミン類似体又はシステインの塩もまた提供される。薬剤的に許容される化合物の塩とは、薬剤的に許容される無機及び有機の酸ならびに塩基に由来するものを意味する。適切な酸として、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酒石酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、２−ナフタレンスルホン酸及びベンゼンスルホン酸が挙げられる。その他の酸、例えばシュウ酸はそれ自体が薬剤的に許容されるものではないが、シスタミン類似体及び薬剤的に許容されるそれらの酸付加塩を得るための中間体として有用であり得る。
【００７７】
アミノ酸に由来する塩もまた含まれる（例えばＬ−アルギニン、Ｌ−リジン）。
【００７８】
塩基に由来する塩には、アルカリ金属類（例えばナトリウム、リチウム、カリウム）及びアルカリ土類金属類（例えばカルシウム、マグネシウム）が挙げられる。
【００７９】
以下、シスタミン類似体又はシステインに言及する際には、化合物及び薬剤的に許容されるその塩も含む。
【００８０】
一実施形態によれば、塩は酒石酸水素塩である。
【００８１】
一実施形態によれば、塩は塩酸塩である。
【００８２】
薬剤的に許容される塩に関しては、その開示が参照により本明細書に取り込まれる、Ｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ，Ｊ．ｏｆ  Ｐｈａｒ．Ｓｃｉ．，ｖｏｌ．６６，ｎｏ．１，Ｊａｎｕａｒｙ  １９７７，ｐｐ．１−１９、の表１に示される、ＦＤＡに承認された市販の塩のリストも参照されたい。
【００８３】
当業者は、化合物は異なった多形として存在し得ることを理解するであろう。当該技術分野において公知であるように、多形性は、１を超えて異なる結晶へと結晶化する化合物の能力、又は「多形性の」種である。多形は少なくとも２の異なる配置による化合物の固体の結晶相、又はその化合物分子の固体の状態での多形である。いずれかの所定の化合物の多形は同一の化学式又は組成物によって定義されるが、２つの異なる化学化合物の結晶構造としての化学構造において異なる。
【００８４】
当業者はさらに、本発明に従った化合物が、異なる溶媒和物の形態、例えば水和物として存在し得ることを理解するであろう。シスタミン類似体又はシステインの溶媒和物は、結晶化過程の間に、溶媒分子が化合物分子の結晶性の格子構造内に取り込まれる際にも形成され得る。
【００８５】
他に定義されない限り、本明細書で用いられる全ての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。加えて、材料、方法、及び実施例は単なる例示であり、限定を意図するものではない。
【００８６】
本発明の目的のために、化学元素は、元素周期表、ＣＡＳ版、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，７５ｔｈ  Ｅｄに従って同定した。さらに、有機化学の一般的原理は”Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，Ｔｈｏｍａｓ  Ｓｏｒｒｅｌｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｏｏｋｓ，Ｓａｕｓａｌｉｔｏ：１９９９，及び”Ｍａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｅｄ．：Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｂ．ａｎｄ  Ｍａｒｃｈ，Ｊ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：２００１に記載される。
【００８７】
加えて、他に記載のない限り、本明細書に示されるシスタミン類似体又はシステインは、同位体が濃縮された１以上の原子の存在下においてのみ異なる化合物を含むことも意図される。例えば、１以上の水素原子が重水素もしくはトリチウムによって置換されているか、又は１以上の炭素原子が、１３Ｃもしくは１４Ｃが濃縮された炭素によって置換されているシスタミン類似体又はシステインは、本発明の範囲内である。このような化合物は、例えば分析用ツール、生物学的アッセイのプローブ、又は改良された治療用の特性を有する化合物として有用である。
【００８８】
治療に用いるために必要とされるシスタミン類似体の量は、選択される特定の化合物によってのみではなく、投与経路、治療が必要とされる状態の性質、ならびに患者の年齢及び状態によっても異なる可能性があり、最終的には担当医師の決定によるであろうことが理解され得る。しかしながら一般的に適切な用量は、体重あたり１日に約０．１ないし約７５０ｍｇ／ｋｇの範囲、例えば０．５ないし６０ｍｇ／ｋｇの範囲、又は例えば１ないし２０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。
【００８９】
所望の用量は、単一用量、又は適切な間隔で投与される分割用量、例えば１日あたり２，３，４、又はそれ以上の用量によって好都合に提供されてよい。
【００９０】
シスタミン類似体は単位剤形によって好都合に投与され、例えば一単位剤形あたり５ないし２０００ｍｇ、１０ないし１５００ｍｇ、好都合には２０ないし１０００ｍｇ、最も好都合には５０ないし７００ｍｇの有効成分が含まれる。一実施形態によればシスタミン類似体は、６００ｍｇの単位剤形によって１日あたり２回、好都合に投与される。
【００９１】
シスタミン類似体又は薬剤的に許容されるその塩を、パーキンソン病に対して有効な第２の治療薬と併用する場合、各化合物の用量は、該化合物を単独で用いる際と同じか、又は異なってよい。当業者は適切な用量を容易に理解するであろう。
【００９２】
治療法において使用する際、シスタミン類似体は未精製の化学物質として投与されてもよいが、有効成分は医薬組成物として提供されることが好ましい。従って本発明はさらに、シスタミン類似体又は薬剤的に許容される本発明の塩を含む医薬組成物を、１以上の薬剤的に許容される担体と共に、かつ任意にその他の治療用及び／又は予防用成分と共に提供する。単数又は複数の担体は、製剤のその他の成分と適合し、かつそのレシピエントに対して有害ではないという意味で「許容可能」でなければならない。
【００９３】
医薬組成物として、経口、経直腸、経鼻、局所（経頬及び舌下を含む）、経皮、経膣、又は非経口（筋肉内、皮下、及び静脈内を含む）投与に適したもの、又は吸入もしくは吹送による投与に適した形態が挙げられる。適切な場合には、組成物は別々の用量単位で好都合に投与されてよく、かつ薬学の技術分野において公知であるいずれかの方法によって調製されてよい。全ての方法は、有効成分を液体担体もしくは微粉化した固体担体又は両方と合わせる工程、及び次に必要に応じて産物を所望の組成物に成形する工程を含む。
【００９４】
経口投与に適した医薬組成物は、それぞれが所定量の有効成分を粉末又は顆粒として、溶液として、懸濁液又はエマルションとして含む、カプセル、カシェ剤又は錠剤のような別々の単位として好都合に提供されてよい。有効成分はまた、ボーラス、舐剤又はペーストとして提供されてもよい。経口投与のための錠剤及びカプセルは、結合剤、注入剤、潤滑剤、崩壊剤、又は湿潤剤のような従来の賦形剤を含んでよい。錠剤は、当該技術分野において公知の方法によってコートされてもよい。経口用液剤は、例えば水性又は油性の懸濁液、溶液、エマルション、シロップもしくはエリキシル剤の形態であってよいか、又は使用前に水もしくはその他の適したビヒクルによって構成するための乾燥製品として提供されてもよい。このような液剤は、懸濁剤、乳化剤、非水性ビヒクル（食用油を含み得る）、又は保存料のような従来の添加物を含んでもよい。
【００９５】
シスタミン類似体は非経口投与（例えば注射、例えばボーラス投与又は持続点滴による）のために処方されてよく、かつ保存料を添加したアンプル、プレフィルドシリンジ、少量点滴、又は複数回用量用容器内での単位用量の形態として提供されてよい。組成物は油性もしくは水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、又はエマルションのような形態であってよく、かつ懸濁剤、安定剤及び／又は分散剤のような処方用薬剤を含んでよい。あるいは有効成分は、無菌固体の無菌的な分離によって、又は使用前に適切なビヒクル、例えば発熱物質を含まない無菌水によって構成するための、溶液からの凍結乾燥によって得た粉末の形態であってよい。
【００９６】
表皮への局所投与のために、シスタミン類似体は軟膏、クリームもしくはローション、又は経皮パッチとして処方されてよい。このような経皮パッチは、リナロール、カルバクロール、チモール、シトラール、メントール及びｔ−アネトールのような浸透促進剤を含んでよい。軟膏及びクリームは、例えば適切な増粘剤及び／又はゲル化剤を添加した水性又は油性の基剤と共に処方されてよい。ローションは水性又は油性の基剤と共に処方されてよく、かつ一般的には１以上の乳化剤、安定剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤、又は着色料も含み得る。
【００９７】
口中への局所投与に適した組成物として、通常はスクロース及びアカシア又はトラガカントである、香味の付いた基剤中の有効成分を含む舐剤；ゼラチン及びグリセリン、又はスクロース及びアカシアのような不活性基剤中の有効成分を含むトローチ；及び適切な液体担体中の有効成分を含む口腔洗浄薬が挙げられる。
【００９８】
直腸内投与に適した、担体が固体である医薬組成物は、例えば単位用量坐薬として提供される。適切な担体として、ココアバター及び当該技術分野で通常用いられるその他の材料が挙げられ、坐薬は、有効化合物を軟化もしくは融解した単数又は複数の担体と混合し、続いて冷却後に鋳型で成形することによって、好都合に形成されてよい。
【００９９】
膣内投与に適した組成物は、有効成分に加えて、その適切性が当該技術分野において公知であるような担体を含むペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム又はスプレーとして提供されてよい。
【０１００】
経鼻投与のために、化合物又は配合物は液体スプレーもしくは分散性の粉末として、又は液滴の形態で使用してよい。液滴は、１以上の分散剤、可溶化剤又は懸濁剤を含む、水性又は非水性の基剤と共に処方されてよい。液体スプレーは、加圧パックから好都合に送達される。
【０１０１】
吸入による投与のために、化合物又は配合物は、吹送器（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｏｒ）、噴霧器もしくは加圧パック、又はエアロゾルスプレー送達用のその他の好都合な手段から好都合に送達される。加圧パックは、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又はその他の適切なガスのような、適切な噴霧剤を含んでよい。加圧エアロゾルの場合に、投与量単位は、定量を送達するためのバルブを用いた調節によって決定されてよい。
【０１０２】
あるいは、吸入又は吹送による投与のために、化合物又は配合物は、乾燥粉末組成物、例えば化合物とラクトース又はデンプンのような適切な粉末基剤との粉末混合物の形態であってよい。粉末組成物は、例えば、吸入器又は吹送器（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｏｒ）を用いてそこから粉末が投与され得る、カプセルもしくはカートリッジ、又は例えばゼラチンもしくはブリスターパックによる単位剤形として提供されてよい。
【０１０３】
所望により、有効成分の持続性又は改変された放出が為されるように適合させた上記組成物を用いてよい。システアミン製剤の例は、例えば米国特許出願公開第２００９００７６１６６号に記載されている。
【０１０４】
驚くべきことに本発明者らは、病変を引き起こす毒素であるＭＰＴＰよりも前及び後にシスタミンを投与した際、パーキンソン病の動物において有益な効果をもたらすことを見出した。本発明者らは、開始された神経変性過程がシスタミンによって覆されることを見出した。
実施例に記載するように、ＭＰＴＰ  ２０ｍｇ／ｋｇの７回ｉ．ｐ．注射による５日投与計画に従ってマウスに亜急性中毒を起こし、シスタミン  １０ｍｇ／ｋｇを、１）ＭＰＴＰ注射開始の２日前、又は２）最終のＭＰＴＰ投与の２４時間後のいずれかから、毎日ｉ．ｐ．投与して、傷害後１４日間これを続けた。
試験終了時に死後の分析を行って、ドーパミン作動性（ＤＡ作動性）の系の状態、さらに詳細にはパーキンソン病を標的とし系の状態について評価した。驚くべきことに本発明者らは、黒質線条体系の障害後に開始した（ＭＰＴＰ処置後２４時間）ＭＰＴＰ処置マウスへのシスタミンのｉ．ｐ．投与（１０ｍｇ／ｋｇ／日）が、ＴＨ免疫反応性細胞（ｐ＜０．０５）、ＤＡＴ  ｍＲＮＡ発現細胞（ｐ＜０．０５）の数の立体的計数、及び黒質Ｎｕｒｒ１  ｍＲＮＡレベル（ｐ＜０．０５）によって評価したように、黒質のＤＡ作動性神経細胞数を有意に回復させたことを見出した。
【０１０５】
本発明者らはまた、シスタミンが、パーキンソン病の一側性線条体６−ＯＨＤＡマウスモデルにおいてドーパミン作動性神経細胞を救出することも見出した。
本明細書の実施例にさらに示すように、シスタミンは、マウスにおける６−ＯＨＤＡを用いた線条体の損傷による行動障害を逆転させ、パーキンソン病の一側性線条体６−ＯＨＤＡマウスモデルにおいて、ドーパミン作動性の黒質系の幾つかの状況を回復させ、かつ線条体のカテコールアミン作動性の量及び動態を変化させる。本発明者らは、シスタミン化合物の役割が、現存の神経細胞を保存することのみに限定されるものではないことを見出した。化合物はまた、促進されたアポトーシス過程を逆転させることで、損傷した神経細胞を、起こりつつある変性から救出することもできる。
【０１０６】
いずれの特定の理論にも制約されるものではないが、本発明者らはシステアミンが、シスタミンの全身投与後の鍵となる向神経活性化合物であると考える。システアミン、システイン、ヒポタウリン及びタウリンを含む、ＨＰＬＣ測定を通して検討した分子の中で、システアミンは、未処置マウスへの５０ｍｇ／ｋｇ及び２００ｍｇ／ｋｇの単回ｉ．ｐ．注射後に唯一、脳において有意に増加したことが見出された。対照的に、システイン、ヒポタウリン及びタウリンのレベルは未変化のままであるか、又は検出閾値未満であった。加えて本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｖｏにて著しい量のシステアミンがＢＢＢを横断することを示した。これらの知見は、システアミンの神経薬理学及びその臨床的関連性へのさらなる支持に関する重要な情報を提供する。
【０１０７】
ＢＢＢは大多数の潜在的向神経活性化合物の臨床応用に対する主要な障壁であり、シスタミンのどの代謝産物が治療上の効果を発揮するかを決定する際に考慮されなければならない。アミノ酸輸送体は十分に研究されたＢＢＢの構成要素であり、ロイシン、アラニン、セリン又はシステイン選択性の系を含む（Ｗａｄｅ  ａｎｄ  Ｋａｔｚｍａｎ  １９７５；Ｓｅｒｓｈｅｎ  ａｎｄ  Ｌａｊｔｈａ  １９７９）。
システインは、ＢＢＢを横断するためにロイシン選択性の系を使用することが認識されている（Ｗａｄｅ  ａｎｄ  Ｂｒａｄｙ  １９８１）。タウリンがＢＢＢを横断する能力もまた、ラットにおいてＩＳＣＰを用いることにより記載されているが、これには内皮細胞のナトリウム及び塩素依存性の流入系が関与することが示唆される（Ｂｅｎｒａｂｈ  ｅｔ  ａｌ．１９９５）。一方、システアミンがＢＢＢを横断できる機構についてはさらなる研究が必要である。
ここでは、システアミン及びシステインのＢＢＢ輸送について研究するため、定量的かつ高度に鋭敏な技術を用いた。これは、ＢＢＢの物理的又は機能的な完全性を損なうことなく、全身投与に関与する末梢代謝過程をバイパスすることによって行われた。本発明者らは、有意な量のシステアミン及びシステインが脳に到達する能力を示した。システアミンの脳への取り込みは、灌流液へのシステインの添加によってさらに促進された。
【０１０８】
前述の、及び以下の実施例において、全ての温度は摂氏度により未修正で示され、かつ、他に記載のない限り、全ての部及びパーセンテージは重量による。
【０１０９】
以下の実施例では、先行する実施例において使用した本発明の反応物及び／又は操作条件の代わりに、一般的又は特異的に記載した本発明の反応物及び／又は操作条件を用いて反復することで、同様の成功を得ることができる。
【実施例１】
【０１１０】
げっ歯類におけるＭＰＴＰを用いたパーキンソニズム誘導後のシスタミンの
効果
【０１１１】
・動物
若齢成体（９週齢、２５グラム）雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（モントリオール、ケベック州、カナダ）から購入した。動物は１ケージあたり４匹収容し、標準的な条件下で食餌及び水を自由に摂取させ、１名の研究者によって同一の条件下で無作為に選択して使用した。全ての実験はカナダ動物管理協会（Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ）に従い、かつラバル大学中央病院（Ｃｅｎｔｒｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌｉｅｒ  ｄｅ  ｌ’Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ  Ｌａｖａｌ：ＣＨＵＬ、ケベック州、カナダ）の施設委員会により承認されて行った。実験の間を通して、研究に用いた全てのマウスの健康状態を、体重減少又はその他の健康に関わる問題の徴候について綿密にモニターした。動物の疼痛及び不快感を最少にするための全ての努力を行った。
【０１１２】
・ＭＰＴＰの投与
マウスは、０．９％生理食塩水又は０．９％生理食塩水に溶解して都度調製したＭＰＴＰ−ＨＣｌ（２０ｍｇ／ｋｇ  遊離塩基；Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）のいずれかによる７回のｉ．ｐ．注射を、実験プロトコルの最初の２日間に１２時間おきに受け、３日目以降には１日に１回受けた（Ｔｒｅｍｂｌａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｇｉｂｒａｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｇｉｂｒａｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【０１１３】
・シスタミンによる処置
パーキンソン病マウスにおけるシスタミン（シスタミン二塩酸塩、Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）の有益な効果を、０．９％無菌生理食塩水に都度溶解して調製したシスタミンを、１０ｍｇ／ｋｇの用量で、毎日ＭＰＴＰ投与前１時間にｉ．ｐ．注射することによって評価した。用量及び投与計画の選択は、本発明者らの以前の知見（Ｔｒｅｍｂｌａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｇｉｂｒａｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）に基づく。シスタミンの初回の注射は、１）ＭＰＴＰ注射開始の２日前（前処置）、又は２）最終のＭＰＴＰ投与後２４時間（後処置）に行い、該処置は傷害後１４日間毎日続けた。
本研究は別々の２回の実験に分けて行った。
【０１１４】
・実験番号１．ＭＰＴＰ損傷マウスにおけるシスタミンの神経救出特性
ＭＰＴＰの毒性に対するシスタミンの効果を次の実験群によって試験した：グループＩ、生理食塩水＋生理食塩水；グループＩＩ、生理食塩水＋シスタミン後処置；グループＩＩＩ、生理食塩水＋シスタミン前処置；グループＩＶ、ＭＰＴＰ＋生理食塩水；グループＶ、ＭＰＴＰ＋シスタミン後処置、グループＶＩ、ＭＰＴＰ＋シスタミン前処置。総計９６マウスを用いて（１群あたり、ｎ＝１６）体重の変動を毎日モニターし、最終のシスタミン（又はビヒクル）注射後２４時間に、灌流によって最終的に屠殺した。
【０１１５】
・実験番号２．亜急性のＭＰＴＰ処置によって誘導される黒質のＤＡ作動性神経細胞死の時間経過
この実験のために総計７２マウスを用い、６群に分けた（１群あたり、ｎ＝１２）。グループＩ、ＩＩ及びＩＩＩにはＭＰＴＰによる亜急性処置を施したが、グループＩＶ、Ｖ及びＶＩには０．９％生理食塩水を投与した。最終のＭＰＴＰ（又は生理食塩水）注射後、グループＩ及びＩＶは２４時間、グループＩＩ及びＶは７日、ならびにグループＩＩＩ及びＶＩは１４日に屠殺した。
【０１１６】
・灌流及び組織処理
動物をケタミン／キシラジン（Ｖｅｔａｌａｒ、Ｂｉｏｎｉｃｈｅ、ベルビル、オンタリオ州／Ｒｏｍｐｕｎ、Ｂａｙｅｒ、トロント、オンタリオ州）による深い麻酔下で屠殺し、ＲＮＡ分解酵素を含まない状態で２つの方法に従って灌流した。
【０１１７】
・実験１．全てのマウスを、ＲＮＡ分解酵素を含まない０．１Ｍ  リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）による心臓灌流に供した。心臓灌流後、脳を回収して２つの半球を分離した。左半球の後固定を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で４８時間行い、凍結保護のため、０．１Ｍ  ＰＢＳ中の２０％スクロースへ移した。凍結ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、モントリオール、ケベック州）にて冠状の脳切片を２５μｍの厚さに切り出し、不凍液（０．２Ｍ  第一リン酸ナトリウム、０．２Ｍ  第二リン酸ナトリウム、３０％エチレングリコ―ル、２０％グリセロール）中に連続的に回収し、使用時まで−２０℃にて保存した。左半球の切片はさらなる免疫組織化学、及びｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションプロトコルに使用した。右半球は２−メチルブタン中で急速凍結し、ＨＰＬＣ及びウェスタンブロット（ＷＢ）分析のためにクリオスタットで切り出しを行うまで−８０℃に保管した。
【０１１８】
・実験２．この実験では、各動物の２つの半球をそれぞれ急速凍結してＨＰＬＣ及びＷＢ分析に使用した。各群の残りの５匹のマウスは、ＲＮＡ分解酵素を含まない生理食塩水（０．９％）及びそれに続く４％ＰＦＡ、ｐＨ７．４によって心臓灌流を行った。心臓灌流後に脳を回収して４％ＰＦＡ中で後固定を２４時間行い、凍結保護のため、０．１Ｍ  ＰＢＳ中の２０％スクロースへ移した。脳を２５μｍの厚さの冠状切片に切り出した。実験２を完了するため、これらの切片を免疫組織化学及びｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに使用した。
【０１１９】
・ＨＰＬＣによるカテコールアミンの定量化
線条体ＤＡ、３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸（ＤＯＰＡＣ）及びホモバニリン酸（ＨＶＡ）の濃度を、電気化学的検出を組み合わせたＨＰＬＣによって測定した（Ｃａｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｃａｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。
各線条体サンプルは、レベルが＋１．１４５ないし＋１．３４５の範囲の構造の、２０μｍの厚さのクリオスタット切片を構成した（Ａｌｌｅｎ，２００８；Ｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。各サンプルに２００μｌの過塩素酸（０．１Ｎ；Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）を加え、ホモジナイズ後に遠心分離して（１３０００×ｇ）上清を得た。線条体組織由来の上清５０μｌを、Ｗａｔｅｒｓ  ７１７  ｐｌｕｓ  オートサンプラー自動インジェクター、Ａｔｌａｎｔｉｓ  ｄＣ１８（３μｌ）カラムを備えたＷａｔｅｒｓ  １５２５バイナリポンプ、Ｗａｔｅｒｓ  ２４６５電気化学検出器、及びガラス状炭素電極（Ｗａｔｅｒｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、ラシーヌ、ケベック州、カナダ）からなるクロマトグラフ系に直接注入した。電気化学ポテンシャルは１０ｎＡに設定した。４７．８ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．９ｍＭ  オクチル硫酸ナトリウム（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）、０．４ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ＮａＣｌ、及び８％メタノール（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）からなるｐＨ２．９の移動相を１．０ｍｌ／分にて送達した。ピークはＢｒｅｅｚｅソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ）を用いて同定した。ＨＰＬＣの定量化は、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）プロテインアッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ、ロックフォード、イリノイ州、米国）を用いて決定したタンパク質濃度に対して標準化した。
【０１２０】
・ＴＨ免疫組織化学
ＤＡ作動性神経細胞の減少を評価するため、酵素ＴＨに対する免疫組織化学を以前に記載されたように行った（Ｔｒｅｍｂｌａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｇｉｂｒａｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。簡単に述べると、数回の洗浄及びブロッキングプレインキュベーションを行った後の浮遊切片を、ウサギ抗ＴＨ抗体（Ｐｅｌ−Ｆｒｅｅｚ、ロジャーズ、アーカンソー州；１：５０００）と共に４℃にて一晩インキュベートした。次に切片を、ビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、バーリントン、オンタリオ州；１：１５００）を含む溶液中で、室温（ＲＴ）にて１時間インキュベートした後、続いてアビジン−ビオチンペルオキシダーゼ複合体（ＡＢＣ  Ｅｌｉｔｅ  ｋｉｔ；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、バーリントン、オンタリオ州）を含む溶液中に配置し、室温にて１時間インキュベートした。最終的に、反応を３，３’ジアミノベンジジン四塩酸塩（ＤＡＢ）溶液（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）及び０．１％の３０％過酸化水素（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）中で室温にて現像した。その他の切片は、インキュベーション溶液から一次抗体を省略した他は、上記のように処理した。これらの切片に対して実質的に免疫染色は行われていないため、陰性コントロールとして使用した。ＤＡＢ反応に続いて、切片をゼラチンコートされたスライドに乗せ、クレシルバイオレット（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）によって対比染色した。最終的に全ての切片を風乾させ、上昇するエタノールの勾配中で脱水させ、キシレン中で透徹させ、ＤＰＸ封入剤（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、ハットフィールド、ペンシルベニア州）を用いてカバースリップによる封入を行った。
【０１２１】
・Ｎｕｒｒ１及びＤＡＴに対するｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
特定の［３５Ｓ］ＵＴＰ標識された相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）プローブを用いて、ＤＡ作動性の系（Ｚｅｔｔｅｒｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）に関連する核内受容体であるＮｕｒｒ１の組織ｍＲＮＡレベルを評価した。Ｎｕｒｒ１に対するｃＲＮＡプローブは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋内にサブクローン化し、ＸｂａＩによって直線化した完全長のマウスＮｕｒｒ１  ｃＤＮＡの、４０３ｂｐ（ｇｅｎｅ  ｂａｎｋ受入番号：１５０４−１９０７  ＮＭ＿０１３６１３）のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片に由来する。
【０１２２】
長さ２２３８ｂｐの断片であるＤＡＴプローブは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋プラスミド内にクローン化した。ＮｏｔＩ酵素を用いて直線化を行った。［３５Ｓ］ＵＴＰ及びＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いてアンチセンスプローブを合成した。
. 
【０１２３】
これらのマーカーに対するセンスプローブもまた作製したが、特異的なシグナルは得られなかった（データ未提示）。以下に記載する手順、及び以前に公表したプロトコルに従って脳の切片をハイブリダイズした（Ｂｅａｕｄｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｃｏｓｓｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｌａｐｏｉｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【０１２４】
このｉｎ  ｓｉｔｕプロトコルはＲＮＡ分解酵素を含まない状態で行った。薄片はＳｎｏｗｃｏａｔ  Ｘ−ｔｒａ（商標）スライド（Ｓｕｒｇｉｐａｔｈ、ウィニペグ、カナダ）に載せ、使用前に真空下で一晩保管した。脳切片を４％ＰＦＡ  ｐＨ７．４中で、室温にて２０分固定した。様々な連続浴（０．１Ｍ  ＰＢＳ  ５分を２回、０．１  μｇ／ｍｌ  プロテイナーゼＫ  ３７℃にて１０分、アセチル化浴（０．２５％無水酢酸、０．１Ｍ  トリエタノールアミン）１０分、標準的なクエン酸生理食塩水（ＳＳＣ）（０．３Ｍ  ＮａＣｌ、３０ｍＭ  クエン酸ナトリウム）５分を２回）によって前処理を行った。脱水のために、エタノール溶液の連続浴（３０％、６０％、１００％、１００％；各３分）を行った。組織切片におけるリボプローブのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを、５８℃にて一晩、標準的なハイブリダイゼーション緩衝液（５０％脱イオン化ホルムアミド、５Ｍ  塩化ナトリウム、１Ｍ  Ｔｒｉｓ、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ、５０×デンハルト液、５０％デキストラン硫酸、１０ｍｇ／ｍＬ  ｔＲＮＡ、１Ｍ  ＤＴＴ、２×１０６  ｃｐｍ／μｌ  ３５Ｓ結合プローブ）中で行った。異なる連続浴（４×ＳＳＣ（３０分）、カバースリップの除去、２×ＳＳＣ  ２回（５分）、２０  μｇ／ｍＬ  ＲＮａｓｅ  Ａ（１時間）３７℃にて、ミリＱ水  ２回（１５秒）、２×ＳＳＣ（１５分）、０．５×ＳＳＣ（３０分）６０℃にて、０．１×ＳＳＣ（３０分）６０℃にて、０．１×ＳＳＣ（５分）室温にて）を用いて後処理を行った。さらなる脱水のために、エタノール溶液の反復浴（３０％、６０％、１００％、１００％；各３分）を用いた。次に組織切片を、放射性物質感受性フィルムであるＢｉｏｍａｘＭＲ（Ｋｏｄａｋ、ニューヘブン、コネチカット州）に対して配置した。Ｎｕｒｒ１に対しては７２時間、及びＤＡＴに対しては５時間の曝露後、オートラジオグラムを現像した。
【０１２５】
脱脂はエタノールの４浴、キシレンの２浴、及びエタノールの３浴によって行った。これらの工程に続き、スライドを４２℃にて溶解したＮＴＢ乳剤（Ｋｏｄａｋ、ニューヘブン、コネチカット州）に浸し、４時間風乾した後、暗所にて４℃で５日間保管した。次にこの乳剤をＤ−１９現像液（Ｋｏｄａｋ、ニューヘブン、コネチカット州）中で現像し（３．５分）、脱イオン水ですすいだ後、Ｋｏｄａｋから入手したＲａｐｉｄ  Ｆｉｘｅｒ溶液中で固定した（５分）。スライドを脱イオン水で１時間すすいだ後発色させた。発色は、チオニン（１分）、続いて水及びエタノールに浸し、次に３エタノール（１分）及び３キシレン浴（３分）を用いて行った。スライドは、ＤＰＸ封入剤を用いてカバースリップにより封入した。
【０１２６】
ウェスタンブロット分析
プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ、ミシサーガ、オンタリオ州、カナダ）及びホスファターゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州、米国）の混合物を含む、８容積の溶解緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．５％ＳＤＳ、及び０．５％デオキシコール酸ナトリウム）中でサンプルをホモジナイズした。サンプルを超音波処理し（３×１０秒）、１００，０００ｇにて４℃で２０分遠心分離した。上清を回収し、−８０℃で保管した。各分画のタンパク質濃度を、ビシンコニン酸タンパク質アッセイキットによって決定した。一サンプルあたり２０μｇの総タンパク質をＬａｅｍｍｌｉローディング緩衝液に加え、９５℃で５分加熱した。次にサンプルを負荷し、ＳＤＳポリアクリルアミド（１２％）ゲル電気泳動に供した。タンパク質を０．４５μｍ  Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  ＰＶＤＦメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ビルリカ、マサチューセッツ州、米国）上に電気的にブロットし、１×ＰＢＳ中の５％無脂肪ドライミルク及び１％ＢＳＡ中で１時間ブロックした。メンブレンは、一時抗体としてウサギ抗ＴＨ（Ｐｅｌ−Ｆｒｅｅｚ；１：５，０００）、ウサギ抗ＢＡＸ（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；ダンバーズ、マサチューセッツ州；１：１，０００）、ウサギ抗Ｂｃｌ２（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；１：１，０００）、マウス抗アクチン（ＡＢＭ  Ｉｎｃ、リッチモンド、ブリティッシュ・コロンビア州、カナダ；１：１０，０００）、及び適切な二次抗体としてヤギ抗ウサギ又は抗マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、ウェスト・グローブ、ペンシルベニア州；１：１００，０００）によって免疫ブロットを行い、続いて化学発光試薬（ＫＰＬ、Ｍａｎｄｅｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ゲルフ、オンタリオ州、カナダ）を添加した。バンドの強度を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  Ｌａｓ  ４０００  デジタルイメージングシステム（Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌａｂ  ２００３  Ｉｍａｇｅ  Ｇａｕｇｅ  ソフトウェア  バージョン４．２、富士フィルム、ニューヘブン、コネチカット州）を用いて定量化した。
【０１２７】
・デンシトメトリーを用いたＮｕｒｒ１及びＤＡＴ  ｍＲＮＡレベルの測定
オートラジオグラフィーの標識のレベルをコンピュータ化されたデンシトメトリーによって定量化した。デジタル化した脳画像及びそれらの分析は上述の同じ機器を用いて行った。オートラジオグラムの光学密度を、１４Ｃ放射活性標準物質（ＡＲＣ１４６−１４Ｃ標準物質、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．，セントルイス、ミズーリ州）を用いて組織のμＣｉ／ｇに変換した。黒質緻密部（ＳＮｃ）におけるＮｕｒｒ１及びＤＡＴ  ｍＲＮＡレベルを、全ての切片に対して同様な前後方向面を用いて測定した。各ＳＮｃ面の平均標識値を、同じマウスの隣り合う３枚の切片から算出した。バックグラウンド強度は、Ｎｕｒｒ１又はＤＡＴ  ｍＲＮＡレベルを欠く黒質網様部（ＳＮｒ）の白い領域から取得し、これを全ての測定から差し引いた。
【０１２８】
・ＴＨ免疫反応性神経細胞の立体的定量化
ＤＡ作動性神経細胞の減少を、明視野の照明下でのＴＨ免疫反応性細胞（同定可能な体細胞）の立体的計数によって決定した。ＳＮｃを通して、Ｅ８００  Ｎｉｋｏｎ顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｃａｎａｄａ  Ｉｎｃ．，ミシサーガ、オンタリオ州、カナダ）に取り付けたＳｔｅｒｅｏ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒソフトウェア（ＭｉｃｒｏＢｒｉｇｈｔｆｉｅｌｄ、コルチェスター、バーモント州、米国）を用いて、切片を１０枚おきに分析した。低倍率での（４×対物レンズ）ＳＮｃの描写後、各切片上にポイントグリッドを置いた。分析するＳＮｃの最も頭側の面（ブレグマ−３．０８ｍｍ）のために、内側終止核による目に見える境界によってＳＮｃを描写した。分析するＳＮｃの中間部（ブレグマ−３．２８ｍｍ）及び最も尾側の面（ブレグマ−３．５８ｍｍ）のために、第３脳神経の出口によって構造の境界を決定した。免疫染色された細胞は、より高倍率（２０×対物レンズ）で、光学フラクショネーター法によって計数した。計数の変数は以下の通りである：計数枠間の距離（１５０μｍ×１５０μｍ）、計数枠の大きさ（７５μｍ）及び保護領域の厚さ（１μｍ）。禁止線と交差していない細胞のみを計数した。光学フラクショネーター（Ｇｌａｓｅｒ  ａｎｄ  Ｇｌａｓｅｒ，２０００）法を用いて、ＴＨ陽性（ＴＨ及びクレシルバイオレット陽性）及びＴＨ陰性（クレシルバイオレットのみ陽性）細胞を計数した。立体的細胞計数は、別々の研究者２名によって盲検的に行った。なお、ＴＨ免疫反応特性の分析はＳＮｃに限定したことから、腹側被蓋野（ＶＴＡ）は除外されることに留意されたい。
【０１２９】
・統計解析及び画像の準備
全ての解析は群平均±Ｓ．Ｅ．Ｍとして表す。実験番号１及び２に関連するデータは二元配置分散分析法によって評価した。二元配置分散分析法によって有意ではない交互作用項がもたらされた場合、チューキーポストホック多重比較検定を用い、データの有意性についてさらに解析した。全ての事例で、Ｐ値が０．０５未満のときに有意であるとみなした。顕微鏡写真は、Ｅ８００  Ｎｉｋｏｎ顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、トロント、オンタリオ州）に取り付けたＰｉｃｔｕｒｅ  Ｆｒａｍｅソフトウェア（Ｍｉｃｒｏｂｒｉｇｈｔｆｉｅｌｄ）によって撮影した。画像は、図解のためにＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ３を用いて整えた。
【０１３０】
結果
・ＤＡ作動系におけるシスタミンの効果
・亜急性ＭＰＴＰマウスモデルにおけるシスタミンの神経保護効果
【０１３１】
シスタミンの有益な効果を調査するために、ＤＡ系に関連する幾つかの特異的なマーカーを用いて、本研究で使用した全てのマウスにおいてエンドポイントでの組織学的評価を行った。ＴＨはＤＡの生合成における律速酵素で、かつＤＡ神経細胞のマーカーである。Ｎｕｒｒ１はＤＡ作動性表現型及びドーパミン輸送体の維持に関与する転写因子であり、ＤＡＴはプロＤＡ作動性黒質線条体神経細胞の高度に特異的なマーカーであることから、これらの発現はＤＡ作動性神経細胞の健常な状態を反映する。
【０１３２】
ＭＰＴＰ処理により、ＳＮｐｃにおけるニッスル染色神経細胞の減少を伴うＴＨ免疫反応性神経細胞の有意な減少がみられたが、これはＴＨ発現の低下によるＤＡ神経細胞の変性と一致した（ｐ＜０．００１、図１）。これにはＳＮｐｃにおける黒質Ｎｕｒｒ１及びＤＡＴ  ｍＲＮＡレベルの有意な減少が伴った（ｐ＜０．０１、図２；ｐ＜０．００１、図３）。ＭＰＴＰによる中毒の２日前に開始した、１０ｍｇ／ｋｇシスタミンの毎日の薬物投与によってシスタミンの神経保護作用が確認されたが、これはＳＮｐｃにおけるＴＨ免疫反応性細胞密度が、ＭＰＴＰによって処置されていない動物に比較して増加したことによって明らかにされた（ｐ＜０．００１、図１）。シスタミン前処置マウスにおける死後のＤＡ系の分析により、Ｎｕｒｒ１  ｍＲＮＡレベル（ｐ＜０．０１、図２）及びＤＡＴを発現するＳＮｐｃ神経細胞の密度の正常化（ｐ＜０．０１、図３）がさらに示された。
【０１３３】
・亜急性ＭＰＴＰマウスモデルにおけるシスタミンによる神経救出の可能性
シスタミン処置の神経救出特性の評価を、最終のＭＰＴＰ注射後２４時間に開始した。１０ｍｇ／ｋｇシスタミンによる後処置を行ったマウスでは、ＭＰＴＰにより誘導されたＤＡ作動性神経細胞の神経毒性もまた有意に低下した。ＭＰＴＰによる傷害後にシスタミンで処置したマウスは、ＭＰＴＰによって処置されていないマウスに匹敵する、著しく多数のＴＨ陽性及びニッスル陽性神経細胞（ｐ＜０．０１、図１）、ならびに高レベルのＮｕｒｒ１（ｐ＜０．５、図２）及びＤＡＴ（ｐ＜０．５、図３）ｍＲＮＡを示した。
【０１３４】
概して、ＤＡ系に関連するこれら３つの特異的マーカーの評価は同様なパターンを示し、かつ、シスタミンによる神経保護を裏付けるものではなく、シスタミンの神経救出特性に及ぶ、シスタミンによるＭＰＴＰ後処置の有益な効果が示された。
【０１３５】
神経変性過程を阻止する（神経保護）のみではなく、これを停止する（神経救出）シスタミンの能力を結論付けるため、本発明者らは、これらの実験で用いたＭＰＴＰモデルにおけるＤＡ関連変性の時間経過を定義するための試験を行った。
【０１３６】
・亜急性のＭＰＴＰ投与によって誘導された、黒質ＤＡ作動性細胞の変性の時間経過
ＴＨ陽性及びニッスル陽性神経細胞の減少は、最終のＭＰＴＰ注射後１日から１４日に屠殺したＭＰＴＰ群で２０％ないし２７％変動したが、７日及び１４日においてのみ、対応する生理食塩水群に比較して統計学的に有意であった（ｐ＜０．０１、図４）。１日目には有意なＴＨ陽性細胞の減少は見られなかったにもかかわらず、ＳＮｐｃにおけるＮｕｒｒ１及びＤＡＴ  ｍＲＮＡレベルの有意な低下が観察されたことから（ｐ＜０．０５、図５）、ＤＡ神経細胞の幾らかの脆弱性が示唆される。さらに、ウェスタンブロット分析により、プロ及び抗アポトーシス性タンパク質であるＢＡＸ及びＢｃ１２は、最終のＭＰＴＰ注射後２４時間にそれぞれ増加及び減少したことが示された（ｐ＜０．０５、図６）。まとめると、これらの知見は、最終のＭＰＴＰ注射後２４時間にＤＡ作動性神経細胞はまだ変性を始めていないが、これらはアポトーシス経路に導かれていることを示唆する。重要なことに、これはシスタミンの有益な効果が神経救出特性であることを裏付けている。
【０１３７】
結果
・ＤＡ作動系におけるシスタミンの効果
【実施例２】
【０１３８】
シスタミンの代謝及び脳への輸送特性
【０１３９】
・動物及びシスタミン投与
若齢成体（９週齢、２５ｇ）雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（モントリオール、ケベック州、カナダ）から購入した。動物は１ケージあたり４匹収容し、標準的な条件下で食餌及び水を自由に摂取させ、１名の研究者によって同一の条件下で無作為に選択して使用した。全ての実験はカナダ動物管理協会（Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ）に従い、かつラバル大学中央病院（Ｃｅｎｔｒｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌｉｅｒ  ｄｅ  ｌ’Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ  Ｌａｖａｌ：ＣＨＵＬ、ケベック州、カナダ）の施設委員会により承認されて行った。実験の間を通して、研究に用いた全てのマウスの健康状態を綿密にモニターした。シスタミン注射後に明らかに活性のある中間体を同定し、かつ全身及び大脳でのその代謝を理解するため、正常成体Ｃ５７ＢＬ／６雄マウスに単回のシスタミンの腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を行った。以前の文献で決定したように、３つの異なる用量：１０、５０、及び２００ｍｇ／ｋｇを用いた（Ｔｒｅｍｂｌａｙ  ｅｔ  ａｌ．２００６；Ｇｉｂｒａｔ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）。最終的にこれらの用量を生理食塩水の注射と比較した。シスタミンを無菌生理食塩水（０．９％）に溶解し、屠殺の１、３、１２、２４及び４８時間前に注射した。動物をケタミン／キシラジンによる深い麻酔下で屠殺し、０．１Ｍ  リン酸緩衝食塩水の心臓内注入によって灌流した。心臓灌流後に脳を回収し、２−メチルブタン中で急速凍結し、ＨＰＬＣ分析のためにクリオスタットで切り出しを行うまで−８０℃に保管した。この試験には総計２００マウスを用いた（１群あたりｎ＝１０）。
【０１４０】
・システイン及びシステアミンのＨＰＬＣによる測定
蛍光検出を組み合わせたＨＰＬＣを、用量応答試験及びｉｎ  ｓｉｔｕ大脳灌流（ＩＳＣＰ）の手順の両方の実験セットによるシステイン及びシステアミンの定量化において使用した。前頭皮質を２００μＬのＮａＨＣＯ３中でホモジナイズし、続いて１５７００ｇ（４℃）にて２０分遠心分離した。３０μＬの４−フルオロ−７−スルファモイルベンゾフラザン（ＡＢＤ−Ｆ）試薬を用いて、５０μｌの上清に直接誘導体化を行った。アルキル化反応は５５℃、１５分で完了し、４．９μＬの１２Ｎ  ＨＣｌを用いて停止させた。７５００ｇ（４℃）での１０分の遠心分離後、上清を、４℃に設定したＷａｔｅｒｓ  ７１７  ｐｌｕｓ  オートサンプラー自動インジェクター、Ａｔｌａｎｔｉｓ  ｄＣ１８（３μＬ；３．９×１５０ｍｍ）カラムを備えたＷａｔｅｒｓ１５２５バイナリポンプ、及びＷａｔｅｒｓ  ２４８７二波長吸光度検出器（Ｗａｔｅｒｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、ラシーヌ、ケベック州、カナダ）からなるクロマトグラフに直ちに注入した。励起波長を３８５ｎｍ、発光波長を５１５ｎｍに設定した。２．５％メタノール及びｐＨ４．０に調整した０．１Ｍ  酢酸アンモニウムからなる移動相を１ｍｌ／分にて送達した（Ｓａｎｔａ  ｅｔ  ａｌ．２００６）。ピークはＢｒｅｅｚｅソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ  ｌｉｍｉｔｅｄ）を用いて同定及び定量した。ＨＰＬＣの定量化は、タンパク質濃度に対して標準化した。タンパク質測定は、製造者によるプロトコルの記載に従い、ビシンコニン酸プロテインアッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ、ロックフォード、イリノイ州、米国）を用いて決定した。
【０１４１】
・タウリン及びヒポタウリンのＨＰＬＣによる測定
タウリン及びヒポタウリンを、ＵＶ検出を組み合わせたＨＰＬＣによって測定した。ＮａＨＣＯ３中の脳の上清（ブレグマ１．５４ないし−０．５８ｍｍ）の抽出物（詳細は上記の項を参照のこと）を、公表した方法を改変したものに基づき（Ｓａｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃｚｕｐｒｙｎａ  １９８９；Ｃａｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９９）、試薬である塩化ダンシル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州、米国）を用いて直接誘導体化した。簡単に述べると、５０μＬの塩化ダンシル（１．２ｍｇ／ｍＬ）及び５０μＬのサンプル又は標準溶液を混合し、次に３０分９０℃にてインキュベートした。７５００ｇ（４℃）での１０分の遠心分離後、上清を上記のクロマトグラフに直ちに注入した。吸光度を３３７ｎｍに設定し、かつ０．５吸光度単位の感度をフルスケールに設定した。移動相は、０．１５％（ｖ／ｖ）リン酸を含む水−アセトニトリルの混合物（８８．５〜１１．３５％ｖ／ｖ）からなり、０．８ｍＬ／分の速度で送達した。結果は上記と同じ方法を用いて得た。
【０１４２】
・Ｉｎ  ｓｉｔｕでの大脳灌流
Ｉｎ  ｓｉｔｕでの大脳灌流（ＩＳＣＰ）は、以前に記載されたように（Ｄａｇｅｎａｉｓ  ｅｔ  ａｌ．２０００；Ｏｕｅｌｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．２００９）、ケタミン／キシラジンの混合物（１４０／８ｍｇ／ｋｇ）のｉ．ｐ．注射によって促進される深い麻酔下で行った。１００％の灌流液がＢＢＢに確実に到達するように、外枝の結紮に続いて右総頚動脈にカテーテルを挿入した（模式図として、図３ａを参照）。次に胸部を開き、心臓を除去後、灌流を直ちに流速２．５ｍＬ／分で開始した。灌流液は、炭酸水素緩衝生理食塩水：１２８ｍＭ  ＮａＣｌ、２４ｍＭ  ＮａＨ−ＣＯ３、４．２ｍＭ  ＫＣｌ、２．４ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．９ｍＭ  ＭｇＣｌ２及び９ｍＭ  Ｄ−グルコースからなるものであった。溶液に９５％Ｏ２及び５％ＣＯ２のガスを吹き込んでｐＨ７．４とした後、３７℃で加温した。全ての実験において、ＢＢＢの完全性及び血管容積のマーカーとして放射性トレーサー（０．３μＣｉ／ｍＬ  １４Ｃ−スクロース）をシステアミン（２５９μＭ）及びシステイン（１６５μＭ）と共灌流した。この試験では、未処置マウスの４つの異なる群（ｎ＝３）を評価し、これらはシステイン、システアミンの両分子、又は対照として１４Ｃ−スクロースのみによって灌流した。
【０１４３】
６０秒の灌流後、マウスの断頭によってこの手順を終了した。右大脳半球を回収し、前頭皮質を切り出して、システイン及びシステアミンのＨＰＬＣによる測定のためにドライアイス上で急速に冷凍した。
【０１４４】
この半球の残りの脳組織を２ｍＬのＳｏｌｖａｂｌｅ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）により５０℃にて４８時間消化し、次に９ｍＬのＨｉｓａｆｅシンチレーションカクテル（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）と混合した。各実験終了時に、脳輸送係数（以下の方程式を参照）を算出するため、ＨＰＬＣ定量化のために放射性標識マーカーを添加する前、かつ、シンチレーション計数のためにシリンジ及びカテーテルを通過した後の灌流液を一定分量採取した。脳の消化物及び還流液中の１４Ｃ同位元素を、Ｗａｌｌａｃシンチレーションカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって計数した。１４Ｃ−スクロースを用いて決定した血管空間によって補正したシステイン又はシステアミンの分布の測定量から、システイン及びシステアミン取り込みのクリアランス係数（Ｃｌｕｐ；μＬ／ｇ／秒）を算出した。血管空間は一定であり、２０μＬ／ｇ未満であった。前記したように、以下の方程式を用いて最終的に算出した（Ｄａｇｅｎａｉｓ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。
【０１４５】
【数１】
0006000985.tif 000003
Ｖｄ（μＬ／ｇ）は試験化合物の分布量を表し、Ｔ（秒）は灌流時間であり、Ｘシステイン（ｎｇ／ｍｇ組織）又はＸスクロース（ｄｐｍ／ｇ）はそれぞれ、該半球の前頭皮質もしくは残りの組織中に見出されたシステイン又はスクロースの量である。Ｃは灌流液中の濃度（ｎｇ／μＬ；ｄｐｍ／ｍＬ）（上記方程式の例ではシステイン）である。
【０１４６】
・データ及び統計解析
全てのデータは群平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．によって表す。データは二元配置分散分析法によって評価し、スチューデントｔ検定を用いて有意性を解析した。各群は、対応する時点（１、３、１２、２４、又は４８時間）における０ｍｇ／ｋｇ群と比較した。ＩＳＣＰ実験のため、有意性の解析にはスチューデントｔ検定を用いた。全ての事例で、ｐ値が０．０５未満の際に有意であるとみなした。
【０１４７】
結果
・シスタミン投与の一般的効果
【０１４８】
用量応答試験を通して死亡はみられず、２００ｍｇ／ｋｇシスタミン群のマウスが以前に報告されたように（Ｇｉｂｒａｔ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）低体温（震え）及び傾眠（眼瞼を閉じる）の徴候をおおよそ２時間呈した以外は、全てのマウスは良好な健康状態を示した。
【０１４９】
・シスタミン投与後の、血漿及び脳のシステインならびにシステアミンのレベル
シスタミンの単回用量をｉ．ｐ．注射したマウスの血漿及び脳中に見出される代謝産物を調べるため、高感度のＨＰＬＣ法を用い、ＡＢＤ−Ｆ化合物を用いたチオール（−ＳＨ）誘導体化を通して、蛍光検出の前にシステアミン及びシステインを特異的に測定することが可能であった（図７ａ）。シスタミン処置マウスの血漿中にシステアミンは検出されなかった。全身の発現とは反対に、大脳のシステアミン及びシステイン濃度の分析によって脳システアミンの著しい増加が明らかになった（図７ｂ）。この増加は、本用量応答試験で用いた、シスタミンの３つの投与用量の全て及び各時点において観察された。二元配置分散分析法によって、用量及び時間の２つの因子についての有意差、及びこれら２つの因子の間の有意な相互作用（ｐ＜０．０００１）が明らかとなった。ポストホック解析によって、５０ｍｇ／ｋｇ（ｐ＜０．０５）及び２００ｍｇ／ｋｇ（ｐ＜０．０１）用量の注射の、特に１時間後に有意な増加が明らかになった。システアミンのレベルは、生理食塩水群に比較してシスタミン投与後３時間もなお有意に増大し（ｐ＜０．０１）、４８時間かけて次第に減少した。シスタミン投与は、最も高い２００ｍｇ／ｋｇの用量においてもシステインの血漿（データ未提示）又は脳のレベルには影響を与えなかった（図７ｃ）。試験したいずれの用量又は時点においても、システインの血漿及び／又は脳のレベルのどのような有意な変化の徴候もみられなかった。
【０１５０】
・シスタミン投与後の、血漿及び脳のヒポタウリンならびにタウリンのレベル
ヒポタウリンはシステアミンの主要な代謝産物であり、これは部分的にタウリンを産生し得る。これら２つの分子の濃度を決定するため、ＵＶ検出前の、一級アミノ基の塩化ダンシルによる誘導体化を利用した（図８ａ）。この反応は芳香族及び脂肪族アミンの両方に起こって安定なスルホンアミド付加体を産生し、同じ方法によるヒポタウリン（図８ａ；化合物２）及びタウリン（図８ａ；化合物１）両方の検出を可能にする。群の間で幾らかの変動はみられたが、３通りの用量（１０、５０又は２００ｍｇ／ｋｇ）のいずれも、対照群に比較して、脳のヒポタウリン及びタウリンに有意な変化は観察されなかった（図８ｂ及びｃ）。屠殺のいずれの時点（１、３、１２、２４及び４８時間）においても、ヒポタウリン及びタウリンが脳に蓄積する徴候はみられなかった。血漿濃度は検出閾値未満か又はそれに近いままであった。
【０１５１】
・システインはシステアミンの脳輸送を促進する
大多数の内在性及び外来性の化合物はＢＢＢを横断しないためにＣＮＳでは不活性であることから、本発明者らはシステアミン及びシステインの脳への取り込みについて調べた。本発明者らはＩＳＣＰを用い、頸動脈を通した脳への直接注入によって、システアミン及びシステインの血液−脳輸送パラメータを測定した（Ｄａｇｅｎａｉｓ  ｅｔ  ａｌ．２０００；Ｏｕｅｌｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．２００９）（図９ａ）。システイン及びシステアミンは、それぞれ４．３９±０．４７及び０．１５±０．０２μＬ／ｇ／ｓであるそれらの脳輸送係数（Ｃｌｕｐ）にみられるように、両方がＢＢＢを横断する（図９ｂ及びｃ）。比較として、モルヒネのような日常的に用いられるＣＮＳへの薬物は、０．３μＬ／ｇ／秒のＣｌｕｐを示すが、ジアゼパム又は脂肪酸のような高度に拡散性の薬物は、４０μＬ／ｇ／秒にまで達するＣｌｕｐを示す（Ｂｏｕｒａｓｓｅｔ  ｅｔ  ａｌ．２００３；Ｏｕｅｌｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．２００９）。興味深いことに、システイン及びシステアミンの共灌流はそれらの脳への取り込みを促進した。実際に両化合物を同時に注入した際には、システアミン（＋１３３％；ｐ＜０．０５）及びシステイン（＋５９％；ｐ＜０．０５）のＣｌｕｐの有意な増大が測定された。ＢＢＢを横断することが示されているヒポタウリン及びタウリンについては再評価しなかった（Ｂｅｎｒａｂｈ  ｅｔ  ａｌ．１９９５）。
【実施例３】
【０１５２】
６−ＯＨＤＡの線条体内投与に続くシスタミンの神経救出及び神経回復特性
【０１５３】
・材料及び方法
・動物
若齢成体（９週齢、２５グラム）雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（モントリオール、ケベック州、カナダ）から購入した。動物は１ケージあたり４匹収容し、標準的な条件下で食餌及び水を自由に摂取させ、１名の研究者によって同一の条件下で無作為に選択して使用した。全ての実験はカナダ動物管理協会（Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ）に従い、かつラバル大学中央病院（Ｃｅｎｔｒｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌｉｅｒ  ｄｅ  ｌ’Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ  Ｌａｖａｌ：ＣＨＵＬ）の施設委員会により承認されて行った。実験の間を通して、研究に用いた全てのマウスの健康状態を、体重減少又はその他の健康に関わる問題の徴候について綿密にモニターした。動物の疼痛及び不快感を最少にするための全ての努力を行った。
【０１５４】
・６−ＯＨＤＡ及びシスタミンによる処理
このプロトコルは、６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨＤＡ）の一側性定位固定線条体内注射に基づくものであった。６−ＯＨＤＡの線条体内投与は、黒質のＤＡ神経細胞に進行性及び逆行性の変性による変化を生じさせる（Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。マウスをイソフルランによって麻酔し、マウスに適合させた定位固定用の枠に配置した。６−ＯＨＤＡを２μｇ／μｌの濃度で０．９％生理食塩水及び０．０２％アスコルビン酸に溶解し、２μｌを右線条体に０．５μｌ／分の速度で注射した。注射後、針を後退させる前に、定位置に３分間置いた。注射はハミルトンシリンジを用いて、定位固定座標、すなわちＡＰ：＋０．０４ｃｍ、ＭＬ：−０．１８ｃｍ、ＤＶ：−０．３１ｃｍ（Ａｌｌａｎ  Ｐ．２００８のアトラスに対応する）に従って行った。
【０１５５】
対照としてその他のマウスを同一の外科的手順に供し、２μｌの溶媒のみ（０．９％生理食塩水及び０．０２％アスコルビン酸）を同一の座標に注射した。この試験はさらに２つの異なる実験に分けた。
１）６−ＯＨＤＡ損傷マウスにおけるシスタミン（シスタミン二塩酸塩、Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）の神経救出効果。この実験では、１０ｍｇ／ｋｇ  シスタミンの初回のｉ．ｐ．注射を手術後３日目に行い、該処置は１４日間毎日続けた。
２）６−ＯＨＤＡ損傷マウスにおけるシスタミン（シスタミン二塩酸塩、Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）の神経回復効果。シスタミンによる処置は、ドーパミン作動性（ＤＡ作動性）の損傷が安定し、ピークに達した手術後３週間目に開始した。該処置は６週間毎日続けた。
【０１５６】
６−ＯＨＤＡの毒性に対するシスタミンの効果を次の実験群によって試験した：グループＩ、偽物質＋生理食塩水；グループＩＩ、６−ＯＨＤＡ＋生理食塩水；グループＩＩＩ；偽物質＋シスタミン；グループＩＶ、６−ＯＨＤＡ＋シスタミン。各実験に総計４０マウスを用いて（１群あたり、ｎ＝１０）体重の変動を毎日モニターし、最終のシスタミン（又はビヒクル）注射後２４時間に、灌流によって最終的に屠殺した。結果を図１０、１１及び１２に示す。
【０１５７】
・灌流及び組織処理
動物をケタミン／キシラジン（Ｖｅｔａｌａｒ、Ｂｉｏｎｉｃｈｅ、ベルビル、オンタリオ州／Ｒｏｍｐｕｎ、Ｂａｙｅｒ、トロント、オンタリオ州）による深い麻酔下で屠殺した。全てのマウスを、ＲＮＡ分解酵素を含まない０．１Ｍ  リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）による心臓灌流に供した。心臓灌流後に脳を回収し、各マウスにおける中脳全体を含む後脳部を、さらなる免疫組織化学及びｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析のために４％ＰＦＡ中で後固定を行った。右及び左線条体を含む前脳部は急速凍結してＨＰＬＣ及びＷＢ分析に使用した。
【０１５８】
Ｎｕｒｒ１及びＤＡＴに対する、ＨＰＬＣによるカテコールアミンの定量化、ＴＨ免疫組織化学及びｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、実施例１の記載に従って行った。
【０１５９】
・デンシトメトリーを用いたＮｕｒｒ１及びＤＡＴ  ｍＲＮＡレベルの測定
オートラジオグラフィーの標識のレベルをコンピュータ化されたデンシトメトリーによって定量化した。デジタル化した脳画像及びそれらの分析は上述の同じ機器を用いて行った。オートラジオグラムの光学密度を、１４Ｃ放射活性標準物質（ＡＲＣ１４６−１４Ｃ標準物質、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．，セントルイス、ミズーリ州）を用いて組織のμＣｉ／ｇに変換した。黒質緻密部（ＳＮｃ）におけるＮｕｒｒ１及びＤＡＴ  ｍＲＮＡレベルを、全ての切片に対して同様な前後方向面を用いて測定した。各ＳＮｃ面の平均標識値を、同じマウスの隣り合う３枚の切片から算出した。バックグラウンド強度は、Ｎｕｒｒ１又はＤＡＴ  ｍＲＮＡレベルを欠く黒質網様部（ＳＮｒ）の白い領域から取得し、これを全ての測定から差し引いた。
【０１６０】
・ＴＨ免疫反応性神経細胞の立体的定量化
ＤＡ作動性神経細胞の減少を、明視野の照明下でのＴＨ免疫反応性細胞（同定可能な体細胞）の立体的計数によって決定した。ＳＮｃを通して、Ｅ８００  Ｎｉｋｏｎ顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｃａｎａｄａ  Ｉｎｃ．，ミシサーガ、オンタリオ州、カナダ）に取り付けたＳｔｅｒｅｏ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒソフトウェア（ＭｉｃｒｏＢｒｉｇｈｔｆｉｅｌｄ、コルチェスター、バーモント州、米国）を用いて、切片を１０枚おきに分析した。低倍率での（４×対物レンズ）ＳＮｃの描写後、各切片上にポイントグリッドを置いた。分析するＳＮｃの最も頭側の面（ブレグマ−３．０８ｍｍ）のために、内側終止核による目に見える境界によってＳＮｃを描写した。分析するＳＮｃの中間部（ブレグマ−３．２８ｍｍ）及び最も尾側の面（ブレグマ−３．５８ｍｍ）のために、第３脳神経の出口によって構造の境界を決定した。免疫染色された細胞は、より高倍率（２０×対物レンズ）で、光学フラクショネーター法によって計数した。
計数の変数は以下の通りである：計数枠間の距離（１５０μｍ×１５０μｍ）、計数枠の大きさ（７５μｍ）及び保護領域の厚さ（１μｍ）。禁止線と交差していない細胞のみを計数した。光学フラクショネーター（Ｇｌａｓｅｒ  ａｎｄ  Ｇｌａｓｅｒ，２０００）法を用いて、ＴＨ陽性（ＴＨ及びクレシルバイオレット陽性）及びＴＨ陰性（クレシルバイオレットのみ陽性）の発現細胞を計数した。立体的細胞計数は、別々の研究者２名によって盲検的に行った。なお、ＴＨ免疫反応特性の分析はＳＮｃに限定したことから、腹側被蓋野（ＶＴＡ）は除外されることに留意されたい。
【０１６１】
・アポモルヒネにより誘導される回転
回転行動は、ＤＡの欠乏及びＤＡ受容体に対する非対称性の刺激の、信頼できる生理的基準を表すと考えられている。アポモルヒネ（Ａｎｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９６６；Ｕｎｇｅｒｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９６８）のようなＤＡアゴニストの適用により、ＤＡ受容体は直接刺激されてＤＡの欠乏した半球に対する対側性の回転を導く。損傷後３、６、及び９週間にマウスにアポモルヒネ（０．５ｍｇ／ｋｇ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を投与し、自動ロータメーターシステムを用いて回転行動を４５分間評価した。以前に記載されたように（Ｍｅｔｚ  ２００２）、結果を平均して有効回転数（＝対側性の回転数−同側性の回転数）で表した。注射後、回転の記録を開始する前に、動物を５分間慣らすようにした。
【０１６２】
・ステップ試験
歩みの調節についての試験を、ラット（Ｌｉｎｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）及びＭＰＴＰ処置マウス（Ｂｌｕｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）における試験を改変して行った。マウスの後肢を台上に載せた状態で、その尾の基部を保持し、マウスが３〜４秒かけて１メートルの距離を横断するように一定の速度で後方へ移動した。デジタルビデオカメラ（Ｓｏｎｙ  Ｈａｎｄｃａｍ、ＤＣＲ−ＨＣ９０Ｅ  ＰＡＬ）を用いてマウスをビデオに記録し、ビデオをオフラインにして、全距離にわたり、損傷のある半球に対して対側又は同側の足によって為された歩みの調節回数を数えることによって解析した。マウスの手術後３週、６週、及び９週目に３回の試行を行い、これらの試行を通した中央値データを算出した。
【０１６３】
・円筒試験
後肢で立つ間に体重を支える前肢の運動を測定する、肢の非対称使用（円筒）試験は、一側性に６−ＯＨＤＡを注射したラット及びマウスにおける黒質線条体細胞減少の良好な指標であることが示されてきた（Ｓｃｈａｌｌｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｔｉｌｌｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｌｕｎｄｂｌａｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｌａｎｃｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。探索行動の間の、自発性の前肢の使用における側面への偏りを試験するために、全角度からマウスを観察できるように２つの垂直な鏡の前に配置したガラス円筒（直径１０ｃｍ、高さ１４ｃｍ）の中にマウスを個別に入れた。マウスを直ちに３分間ビデオ記録した。ビデオ記録の前に、試験に用いる円筒への動物の慣らしは行わなかった。損傷に対して同側又は対側の前肢により独立して行われた、支持のための壁へのタッチ（十分に伸ばした指による接触）の数を数えるために、ビデオ記録を行った。前肢の非対称使用の程度は、損傷に対する対側の足（右足）によって行われたタッチを、各セッションにおけるタッチの総数のパーセンテージとして表すことによって得た。
【０１６４】
・統計解析
全ての解析は群平均±Ｓ．Ｅ．Ｍとして表す。データは二元配置分散分析法によって評価した。二元配置分散分析法によって有意ではない交互作用項がもたらされた場合、チューキーポストホック多重比較検定を用い、データの有意性についてさらに解析した。全ての事例で、Ｐ値が０．０５未満のときに有意であるとみなした。
【０１６５】
参考文献：
・アレンＰ．アレンの脳地図。シアトル（ワシントン州）：アレン脳科学研究所；２００８．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｒａｉｎ−ｍａｐ．ｏｒｇから入手可能。
・アンデン，Ｎ．Ｅ．、ダールストローム，Ａ．、フクスィ，Ｋ．、ラルソン，Ｋ．，１９６６．黒質線条体ドーパミンニューロンの機能的役割。Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２４，２３６−２７４．
・バックＺ．Ｍ．及びボーマリアージュＭ．Ｌ．（１９６５）保護物質の注射からＸ線照射の開始までの時間に応じた、マウスにおけるシステアミン及びシスタミンの放射線防護作用。Ａｒｃｈ．Ｉｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎ．Ｔｈｅｒ  １５３，４５７−４５９．
・ボードリーＧ、ラングロアＭＣ、ウェッペＩ、ロィヤールＣ、レベスクＤ．（２０００）ラット前脳における、ハロペリドール及びクロザピンによる、核受容体神経成長因子誘導Ｂの転写調節のパターン及び細胞特異性の対比。Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  ２０００；７５：１６９４−７０２．
・ベンラＨ．、ブーレＪ．Ｍ．及びルフォコニエＪ．Ｍ．（１９９５）血液脳関門におけるタウリン輸送：インビボ脳潅流研究。Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．６９２，５７−６５．
・ビヨルクンド，Ａ．、ローゼンブラッド，Ｃ．、ウィンクラー，Ｃ．、キリク，Ｄ．，１９９７．パーキンソン病の部分的障害モデルにおけるＧＤＮＦの神経保護効果及び再生効果の研究。Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ｄｉｓ  ４，１８６−２００．
・ブルームＳＲ、カスＤＫ、ツェンＫＹ．マウスにおける足踏み検査：ＭＰＴＰ誘発性パーキンソン病における前肢無動症を判定する信頼性の高い方法。Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  ２００９；２１９：２０８−１１．
・ボレル−パジェスＭ．、カナルスＪ．Ｍ．、コルドリエレスＦ．Ｐ．ら（２００６）シスタミン及びシステアミンは、ハンチントン病においてＨＳＪ１ｂ及びトランスグルタミナーゼを介して脳のＢＤＮＦレベルを増加させる。Ｊ．  Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  １１６，１４１０−１４２４．
・ブーケノーゲＴ．、レマクルＣ．及びルーゼンスＢ．（２００６）タウリンは、機能的な栄養素であるか？Ｃｕｒｒ：Ｏｐｉｎ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．Ｍｅｔａｂ．Ｃａｒｅ  ９，７２８−７３３．
・ブーラセットＦ．、チステルニーノＳ．、テムサマニＪ．及びシェルマンＪ．Ｍ．（２００３）血液脳関門におけるＰ−糖タンパク質ではなくモルヒネ−６−β−ｄ−グルクロニドを介した能動輸送の証拠。Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．８６，１５６４−１５６７．
・ブスケＭ、ジブラットＣ、セイント−ピエールＭ、ジュリアンＣ、カロンＦ、チケッティＦ．パーキンソン病の動物モデルにおけるω−３脂肪酸の作用の潜在的な神経防護作用機序としての脳由来神経栄養因子の調節。Ｐｒｏｇ  Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ．２００９  Ｎｏｖ  １３；３３（８）：１４０１−８．Ｅｐｕｂ  ２００９  Ｊｕｌ  ２４．
・ブスケＭ．、ジブラットＣ．、ウレットＭ．、ロィヤールＣ．、カロンＦ．及びチケッティＦ．（２０１０）シスタミン代謝及び脳輸送特性：神経変性疾患の臨床的意義。Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．（２０１０）１１４，１６５１−１６５８．
・ブスケＭ、グーＫ、エモンドＶ、ジュリアンＰ、カンＪＸ、チケッティＦ、カロンＦ．パーキンソン病のマウスモデルにおけるω−６脂肪酸のω−３脂肪酸へのトランスジェニック変換。Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．（２０１１）Ｆｅｂ；５２（２）：２６３−７１．Ｅｐｕｂ  ２０１０  Ｎｏｖ  ２９．
・カロンＦ．、モリセッティＭ．、グーレＭ．、グロンディンＲ．、ブランシェットＰ．Ｊ．、ベダルトＰ．Ｊ．及びディ・パオロＴ．（１９９９）ＭＰＴＰ除神経サルの長期的なＤｌ及びＤ２ドーパミン模倣薬治療：大脳基底核ＧＡＢＡ（Ａ）／ベンゾジアゼピン受容体複合体及びＧＡＢＡ含有量に対する効果。Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ  ３５，８１−９１．
・カロンＦ．ら、大脳基底核ＧＡＢＡ（Ｂ）受容体に対するＭＰＴＰ誘発性除神経の効果：ドーパミン濃度及びドーパミン輸送体との相関。Ｓｙｎａｐｓｅ  ２００１，Ｊｕｎｅ  １；４０（３）：２２５−３４．
・カロンＦ．ら、レボドパ誘発性運動合併症を伴うパーキンソン病の死後脳におけるＧＡＢＡ受容体及びドーパミン代謝回転の変化。Ｍｏｖ  Ｄｉｓｏｒｄ．２００３  Ｍａｒ；１８（３）：２４１−５３．
・カバリーニＤ．、スキャンドラＲ．及びデマルコＣ．（１９６３）硫化物の存在下におけるシステアミンのヒポタウリンへの酵素的酸化。Ｊ．  Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２３８，２９９９−３００５．
・コロソＲ．Ｍ．、ヒルシュベルガーＬ．Ｌ．、ドミニーＪ．Ｅ．、リーＪ．Ｉ．及びスティパヌクＭ．Ｈ（２００６）システアミンジオキシゲナーゼ：ラット及びマウスの組織におけるシステアミンのヒポタウリンへの生理的変換の証拠。Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．５８３，２５−３６．
・コスタンティニＬＣ、コールＤ、シャツールベディＰ、イサクソンＯ．イムノフィリンリガンドは、パーキンソン病の動物モデルにおける進行性ドーパミン作動性変性を予防できる。Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍａｒ．
・コゼットＭ、パーレンＡ、レベスクＤ．ヒト線条体に内在するチロシン水酸化酵素−陽性ニューロンは、転写因子Ｎｕｒｒ１を発現する。Ｅｕｒ  Ｊ  ＮｅｕｒｏＳｃｉ．２００４；２０：２０８９−９５．
・ダゲネスＣ．、ルーゼルＣ．、ポラックＧ．Ｍ．及びシェルマンＪ．Ｍ．（２０００）インサイチューマウス脳潅流モデルの開発及びそのｍｄｒｌａ  Ｐ糖タンパク質欠損マウスへの応用。Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ．２０，３８１−３８６．
・デデオグルＡ．、クビルスＪ．Ｋ．、ヤイトナーＴ．Ｍ．ら（２００２）ハンチントン病のマウスモデルにおけるシスタミンの治療効果。Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２，８９４２−８９５０．
・ドヒルＲ．、フィドラーＭ．、ガンゴイチＪ．Ａ．、カスケルＦ．、シュナイダーＪ．Ａ．及びバーショップＢ．Ａ．（２００９）シスチン症の子供に対する１日２回の酒石酸水素システアミン治療。Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．１５６，７１−７５．
・ドミニーＪ．、エラーＳ．及びドーソンＲ．Ｊｒ（２００４）生合成スクールの構築：ＣＮＳタウリン合成の区画化の検討。Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２９，９７−１０３．
・ドミニーＪ．Ｅ．Ｊｒ、シモンズＣ．Ｒ．、ヒルシュベルガーＬ．Ｌ．、ウォンＪ．、コロソＲ．Ｍ．及びスティパヌクＭ．Ｈ．（２００７）第２の哺乳類チオールジオキシゲナーゼ、システアミンジオキシゲナーゼの発見及び特性決定。Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２，２５１８９−２５１９８．
・ドゥビンスキーＲ．及びグレイＣ．（２００６）ＣＹＴＥ−Ｉ−ＨＤ：ハンチントン病におけるシステアミン（シスタゴン）の第Ｉ相投与量決定及び忍容性試験。Ｍｏｖ．Ｄｉｓｏｒｄ．２１，５３０−５３３．
・エウェズＬ．及びソルボＢ．（１９６６）ラット肝臓におけるシステインスルフィン酸を形成する酵素系の特性。Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １２８，２９６−３０５．
・フォックスＪ．Ｈ．、バーバーＤ．Ｓ．、シングＢ．ら（２００４）シスタミンは、ハンチントン病トランスジェニックマウス脳及びポリグルタミン凝集のＰＣ１２モデルにおいてＬ‐システインレベルを上昇させる。Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．９１，４１３−４２２．
・フレンチＥ．Ｄ．、ヴェッツァーニＡ．、ウェットセルＷ．Ｏ．Ｊｒ．及びシュバルツＲ．（１９８６）インビボ及びインビトロで試験した、ラット海馬におけるタウリンの抗興奮毒性作用。Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２０３，３４９−３６２．
・ジブラットＣ．、ブスケＭ．、セイント−ピエールＭ．、レベスクＤ．、カロンＦ．、ロィヤールＣ．及びチケッティＦ．（２０１０）シスタミンは、脳由来神経栄養因子の上方制御を介して若年成体マウスのＭＰＴＰ誘発性毒性を予防する。Ｐｒｏｇ．Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ３４，１９３−２０３．
・ジブラットＣ、セイント−ピエールＭ、ロィヤールＣ、チケッティＦ．（２００７）．パーキンソン病の急性モデル対慢性モデルにおけるシスタミンの神経防護作用特性。Ｔｈｅ  Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｓｕｐｐｌ．３−Ｓ４２．
・ジブラットＣ、ブスケＭ、セイント−ピエールＭ、レベスクＤ、カロンＦ、ロィヤールＣ、チケッティＦ．２００９．パーキンソン病のマウスモデルにおけるシスタミンの神経防護作用機序。Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  １５Ｓ２，Ｓ２９−Ｓ１９９．
・ジブラットＣ、セイント−ピエールＭ、ブスケＭ、レベスクＤ、ロィヤールＣ、チケッティＦ．亜急性と慢性のＭＰＴＰマウスモデル間の差：ドーパミン作動性ニューロン変性及びαシヌクレイン封入体の研究。Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ（２００９Ｂ）；１０９：１４６９−８２．
・グリーンＨ．（１９９３）コドンの反復によるヒト遺伝子疾患：進化メカニズムとの関連。Ｃｅｌｌ  ７４，９５５−９５６．
・ハックスタブルＲ．Ｊ．（１９９２）タウリンの生理作用。Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．７２，１０１−１６３．
・イアンクＲ、モハペルＰ、ブルンディンＰ、ポールＧ．マウスにおけるパーキンソン病の一側性６−ＯＨＤＡ−病変モデルの行動特性決定。Ｂｅｈａｖ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  ２００５；１６２：１−１０．
・ヤイトナーＴ．Ｍ．、デリカトニーＥ．Ｊ．、アルクビストＪ．、キャパーＨ．及びクーパＡ．Ｊ．（２００５）シスタミンによるトランスグルタミナーゼ２の阻害機序。Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６９，９６１−９７０．
・カープＭ．Ｖ．、ベシュールＭ．Ｗ．、シュプリンガーＪ．Ｅ．、シャバＤ．、ユーゼフＳ．、ペドッティＲ．、ミッチェルＤ．及びスタインマンＬ．（２００２）トランスグルタミナーゼ阻害物質であるシスタミン投与による、ハンチントン病のトランスジェニックモデルでの生存期間の延長と異常運動の軽減。Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８，１４３−１４９．
・ラポワントＮ、Ｓｔ−ヒレアＭ、マルティノリＭＧ、ブランシェットＪ、グールドＰ、ロィヤールＣら（２００４）ロテノンは、非特異的な中枢神経系毒性及び全身毒性を誘導する。ＦＡＳＥＢ  Ｊ．２００４；１８：７１７−９．
・リーＪ．Ｉ．、ロンドーニョＭ．、ヒルシュベルガーＬ．Ｌ．及びスティパヌクＭ．Ｈ．（２００４）システインジオキシゲナーゼとγ‐グルタミルシステインシンセターゼの調節は肝臓システイン濃度と関係がある。Ｊ  Ｎｕｔｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５，１１２−１２２．
・レインＥＳ、ハブリリクスＭＪら、成体マウスの脳における遺伝子発現のゲノム全域アトラス。Ｎａｔｕｒｅ  ２００７；４４５：１６８−７６．
・レオナルディＲ．、チャンＹ．Ｍ．、ロックＣ．Ｏ．及びヤコブスキーＳ．（２００５）コエンザイムＡ：活動再開。Ｐｒｏｇ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．４４，１２５−１５３．
・リンドナーＭＤ、ウィンＳＲ、ベッジＥＥ、ハンマンＪＰ、ジェンティーレＦＴ、ドハーティＥら、一側性ドーパミン枯渇及びパーキンソン病様症状を有するラットにおける封入カテコールアミン及びＧＤＮＦ産生細胞の移植。Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  １９９５；１３２：６２−７６．６９０．
・ルンドブラッドＭ、ピッコニＢ、リンドグレーンＨ、チェンチＭＡ．６−ヒドロキシドーパミン障害マウスにおけるｌ−ＤＯＰＡ誘発性ジスキネジアのモデル：黒質線条体機能の運動及び細胞パラメータの関係。Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ｄｉｓ  ２００４；１６：１１０−２３．
・マルティグノリＭ．、グロータスＧ．Ｍ．及びデカンターＲ．（２００６）ＣＹＰを介した薬物の代謝、阻害及び誘導についてのマウス、ラット、イヌ、サルならびにヒトの間の種差。Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２，８７５−８９４．
・ムラマツＭ．、カキタＫ．、ナカガワＫ．及びキリヤマＫ．（１９７８）神経組織からのアセチルコリン及びノルエピネフリンの放出におけるタウリンの調節的役割。Ｊｐｎ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２８，２５９−２６８．
・オヤＳ．Ｓ．及びサランサーリＰ．（１９９６）脳における浸透圧調節物質及び神経修飾物質としてのタウリン。Ｍｅｔａｂ．Ｂｒａｉｎ  Ｄｉｓ．１１，１５３−１６４．
・オルデンドルフＷ．Ｈ．及びサボＪ．（１９７６）３つの血液脳関門アミノ酸担体のうちの１つへのアミノ酸の割り当て。Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２３０，９４−９８．
・ウェレットＭ．、エモンドＶ．、チェンＣ．Ｔ．、ジュリアンＣ．、ブーラセットＦ．、オッドＳ．、ラ・フェルラＥ、バジネットＲ．Ｐ．及びカロンＦ．（２００９）血液脳関門を通したドコサヘキサエン酸及びエイコサペンタエン酸の拡散：ならびにインサイチュー脳潅流研究。Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．５５，４７６−４８２．
・パサンテス−モラレスＨ．、アルザーテＮ．Ｅ．及びクルスＣ．（１９８１）神経組織におけるタウリンの役割：イオン流動に対するその効果。Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  １３９，２７３−２９２．
・ピントＪ．Ｔ．、ヴァン・ラームスドンクＪ．Ｍ．、リービットＢ．Ｒ．、ハイデンＭ．Ｒ．、ヤイトナーＴ．Ｍ．、セイラーＨ．Ｔ．、クラスニコフＢ．Ｆ．及びクーパＡ．Ｊ．（２００５）シスタミンによるＹＡＣ１２８マウスとその野生型同腹子の処置は血しょう又は脳内におけるシスタミン蓄積を誘導しない：ハンチントン病の治療への意味合い。Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  ９４，１０８７−１１０１．
・ピントＪ．Ｔ．、ホメンコＴ．、サボＳ．、マクラーレンＧ．Ｄ．、デントンＴ．Ｔ．、クラスニコフＢ．Ｆ．、ヤイトナーＴ．Ｍ．及びクーパＡ．Ｊ．（２００９）システアミン及びシスタミンの代謝ならびに輸送に関与する含硫黄化合物の測定。脳代謝の領域差。Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ  Ａｎａｌｙｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ８７７，３４３４−３４４１．
・ピタリＧ．、マウリツィＧ．、フラティＶ．、ウルシニＣ．Ｌ．、スペラＬ．、デュプレＳ．及びカバリーニＤ．（１９９２）パンテテインからのＳ‐アミノエチル‐Ｌ‐システインの酵素的合成。Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １１１６，２７−３３．
・セラーＣ．Ｆ．及びクズピリナＭ．Ｊ．（１９８９）ダンシルクロリド誘導体の逆相高速液体クロマトグラフィー及び紫外検出を用いた、γ‐アミノ酪酸、グルタミン酸、グリシン及びタウリンの分析。Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  ４８７，１６７−１７２．
・サンタＴ．、アオヤマＣ．、フクシマＴ．、イマイＫ．及びフナツＴ．（２００６）ベンゾフラザン蛍光試薬、７‐フルオロ‐２，１，３‐ベンゾオキサジアゾール‐４‐スルホネート及び４‐アミノスルホニル‐７‐フルオロ‐２，１，３‐ベンゾオキサジアゾールによる誘導体化後の蛍光検出を伴う高速液体クロマトグラフィーによる還元型チオールの測定におけるチオール交換反応の抑制。Ｂｉｏｍｅｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  ２０，６５６−６６１．
・シャラートＴ、フレミングＳＭ、リージョアＪＬ、ティラーソンＪＬ，Ｂｌ及びＳＴ．脳卒中、皮質切除、パーキンソン病及び脊髄損傷の一側性ラットモデルにおけるＣＮＳ可塑性及び前肢感覚運動結果の評価。Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２０００；３９：７７７−８７．
・サーシェンＨ．及びライタＡ．（１９７９）アナログによる阻害パターンは、１０個以上のアミノ酸輸送系が脳細胞に存在することを示す。Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  ３２，７１９−７２６．
・スタックＥ．Ｃ．、フェロＪ．Ｌ．、キムＪ．、デル・シニョーレＳ．Ｊ．、グッドリッチＳ．、マトソンＳ．、ハントＢ．Ｂ．、コーミアＫ．、スミスＫ．、マトソンＷ．Ｒ．、リュウＨ．及びフェランテＲ．Ｊ．（２００８）パーキンソン病の神経毒モデルにおけるミトコンドリア機能障害及び酸化ストレスの治療減弱化。Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １７８２，１５１−１６２．
・ザ・サンＬ．、スーＳ．、チョウＭ．、ワンＣ．、ウーＹ．及びチャンＰ．（２０１０）マウスにおけるＭＰＴＰ誘発性ドーパミン作動性神経変性に対するシステアミンの効果。Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１３３５，７４−８２．
・ティラーソンＪＬ、コーエンＡＤ、フィルハウワーＪ、ミラーＧＷ、ジグモンドＭＪ、シャラートＴ．６‐ヒドロキシドーパミンによる行動学的及び神経化学的影響に対して、肢の強制使用が与える効果。Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２００１；２１：４４２７−３５．
・トランブレーＭ．Ｅ．、セイント−ピエールＭ．、ボリースＥ．、レベスクＤ．、ロィヤールＣ．及びチケッティＦ．（２００６）加齢パーキンソン病マウスにおけるシスタミンの神経防護作用効果。Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ａｇｉｎｇ  ２７，８６２−８７０．
・ウンゲルステッド，Ｕ．，１９６８．中枢モノアミンニューロンの６−ヒドロキシドーパミン誘発性変性。Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５，５１０７−５１１０．
・ウェードＬ．Ａ．及びカッツマンＲ．（１９７５）合成アミノ酸及び血液脳関門におけるＬ−ＤＯＰＡ輸送の性質。Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  ２５，８３７−８４２．
・ウェードＬ．Ａ．及びブレーディーＨ．Ｍ．（１９８１）血液脳関門におけるシステイン及びシスチンの輸送。Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  ３７，７３０−７３４．
・ワンＸ．、サルカールＡ．、チケッティＦ．、ユーＭ．、チューＡ．、ヨーキバルシＫ．、セイント−ピエールＭ．及びブラウネルＡ．Ｌ．（２００５）ハンチントン病のトランスジェニックＲ６／２マウスモデルにおけるトランスグルタミナーゼ阻害剤シスタミン誘発性の神経防護作用の脳血管ＰＥＴイメージング及び組織学的証拠。Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｓｃｉ  ２３１，５７−６６．
・ゼッターストローム・ロルフＨ．、ルドミラ・ソローミン、ロッテ・ヤンソン、バリー・Ｊ．ホッファー、ラーズ・オルソン、トマス・パールマン．Ｎｕｒｒ１欠損マウスにおけるドーパミンニューロン無形成。Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９７  Ａｐｒ  １１；２７６（５３１０）：２４８−５０．
【図１】
0006000985.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0006000985.tif 000011
【図９】
0006000985.tif 000012
【図１０】
0006000985.tif 000013
【図１１】
0006000985.tif 000014
【図１２】
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