(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物（Ｒ）−Ｎ−(３−（７−メチル−１Ｈ−インダゾール−５−イル）−１−（４−（１−メチルピペリジン−４−イル）ピペラジン−１−イル）−１−オキソプロパン−２−イル）−４−（２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−イル）ピペリジン−１−カルボキシアミド、またはその医薬的に許容される塩。
【化１】
0005908455.tif 000038
【請求項２】
治療上の有効量の（Ｒ）−Ｎ−（３−（７−メチル−１Ｈ−インダゾール−５−イル）−１−（４−（１−メチルピペリジン−４−イル）ピペラジン−１−イル）−１−オキソプロパン−２−イル）−４−（２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−イル）ピペリジン−１−カルボキシアミドを医薬的に許容される佐剤、担体、または希釈剤と共に含む医薬組成物。
【請求項３】
有効成分として請求項１の化合物またはその医薬的に許容される塩を含む、片頭痛または神経障害性疼痛から選択される病態を治療するための医薬組成物。
【請求項４】
該病態が片頭痛である、請求項３の医薬組成物。
【請求項５】
該病態が神経障害性疼痛である、請求項３の医薬組成物。
【請求項６】
有効成分として請求項１の化合物またはその医薬的に許容される塩を含む、増殖性疾患を治療するための医薬組成物。
【請求項７】
該増殖性疾患が乳癌または神経膠腫である、請求項６の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は米国仮出願番号第６１／３１９，０１５号（２０１０年３月３０日出願）の利益を主張する。
【０００２】
本開示は、概して、ＣＧＲＰ受容体アンタゴニストである化合物（Ｒ）−Ｎ−(３−（７−メチル−１Ｈ−インダゾール−５−イル）−１−（４−（１−メチルピペリジン−４−イル）ピペラジン−１−イル）−１−オキソプロパン−２−イル）−４−（２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−イル）ピペリジン−１−カルボキシアミド（化合物Ｉまたは式（Ｉ）の化合物）（その医薬的に許容される塩を含む）に関連する。本開示はまた、ＣＧＲＰが関連する障害、例えば、片頭痛、神経原性血管拡張、神経原性炎症、熱傷、循環性ショック、閉経に伴う紅潮、喘息のような炎症性呼吸器疾患症候群、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、および癌に該化合物を用いるための医薬組成物および方法に関連する。
【背景技術】
【０００３】
カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）は自然に分泌される３７アミノ酸のペプチドであり、１９８２年に初めて同定された（Amara, S. G. et al, Science 1982, 298, 240−244）。アミノ酸がそれぞれ１個（ラット）および３個（ヒト）異なる２つの形態のペプチド（αＣＧＲＰおよびβＣＧＲＰ）が発現されている。このペプチドは末梢神経系（ＰＮＳ）および中枢神経系（ＣＮＳ）に広く分布しており、主に知覚求心系および中枢神経細胞に局在し、血管拡張を含むさまざまな生物学的効果を示す。
【０００４】
細胞から放出されると、ＣＧＲＰは特異的な細胞表面のＧタンパク質共役受容体に結合し、主に細胞内アデニル酸シクラーゼの活性化によりその生物学的作用を発揮する（Poyner, D. R. et al, Br J Pharmacol 1992, 105, 441−7；Van Valen, F. et al, Neurosci Lett 1990, 119, 195−8.）。ペプチドフラグメントＣＧＲＰ（８−３７）のアンタゴニスト作用およびＣＧＲＰの直鎖状アナログのＣＧＲＰ２活性化能に基づき、２つのクラスのＣＧＲＰ受容体、ＣＧＲＰ１およびＣＧＲＰ２が存在すると考えられている（Juaneda, C. et al. TiPS 2000, 21, 432−438）。しかしながら、ＣＧＲＰ２受容体には分子学的根拠が欠落している（Brain, S. D. et al, TiPS 2002, 23, 51−53）。ＣＧＲＰ１受容体は３個の構成要素：（ｉ）７回膜貫通型カルシトニン受容体様受容体（ＣＲＬＲ）；（ｉｉ）１回膜貫通型受容体活性調節タンパク質１（ＲＡＭＰ１）；および（ｉｉｉ）細胞内受容体コンポーネントタンパク質（intracellular receptor component protein：ＲＣＰ）を有する（Evans B. N. et al., J Biol Chem. 2000, 275, 31438−43）。ＲＡＭＰ１は、ＣＲＬＲの細胞膜への輸送およびＣＧＲＰ受容体へのリガンドの結合に必要とされる（McLatchie, L. M. et al, Nature 1998, 393, 333−339）。ＲＣＰは、シグナル伝達（Evans B. N. et al., J Biol Chem. 2000, 275, 31438−43）に必要である。ＣＧＲＰ受容体への小分子アンタゴニストの結合には種特異的な違いがあることが知られており、典型的には、ヒトの受容体のアンタゴニズムでは他の種のものに比べて高い親和性が見られる（Brain, S. D. et al, TiPS 2002, 23, 51−53）。ＲＡＭＰ１のアミノ酸配列により種の選択性が決定され、特に、アミノ酸残基Ｔｒｐ７４はヒトの受容体のフェノタイプに重要である（Mallee et al. J Biol Chem 2002, 277, 14294−8）。
【０００５】
受容体レベルのＣＧＲＰの阻害剤は、ＣＧＲＰ受容体の過剰な活性化が起こっている病態生理学的状態に有用であるとされる。これらのいくつかは、例えば、神経原性血管拡張、神経原性炎症、片頭痛、群発性頭痛および他の頭痛、熱傷、循環性ショック、閉経期紅潮、ならびに喘息である。ＣＧＲＰ受容体の活性化は片頭痛の発症に関与する（Edvinsson L. CNS Drugs 2001;15(10):745−53；Williamson, D. J. Microsc. Res. Tech. 2001, 53, 167−178.；Grant, A. D. Brit. J. Pharmacol. 2002, 135, 356−362.）。ＣＧＲＰの血清濃度は片頭痛の期間中上昇し（Goadsby PJ, et al. Ann Neurol 1990;28:183−7）、抗片頭痛薬の治療により頭痛が改善するにつれＣＧＲＰ濃度は通常に回復する（Gallai V. et al. Cephalalgia 1995;15: 384−90）。片頭痛患者はコントロールに比べて高いＣＧＲＰの基底濃度を呈する（Ashina M, et al., Pain 2000, 86(1-2):133−8.2000）。ＣＧＲＰの静脈内注入により、片頭痛患者における頭痛が持続される（Lassen LH, et al. Cephalalgia 2002 Feb;22(1):54−61）。イヌおよびラットにおける前臨床的研究により、ペプチドアンタゴニストＣＧＲＰ（８−３７）で全身のＣＧＲＰをブロックしても安静時の全身血行動態および局所血流は変化しないことが報告された（Shen, Y−T. et al, J Pharmacol Exp Ther 2001, 298, 551−8）。従って、ＣＧＲＰ受容体アンタゴニストは非選択的５−ＨＴ１Ｂ／１Ｄアゴニスト「トリプタン類」（例えば、スマトリプタン）に関連する能動的血管収縮の心血管系における易罹病性を回避する、片頭痛の新たな治療を提供し得る。
【０００６】
ヒト治験において、ＣＧＲＰアンタゴニストの有効性が示されている。Davis CD, Xu C. Curr Top Med Chem. 2008 8(16):1468−79；Benemei S, Nicoletti P, Capone JG, Geppetti P. Curr Opin Pharmacol. 2009 9(1):9−14. Epub 2009 Jan 20；Ho TW, Ferrari MD, Dodick DW, Galet V, Kost J, Fan X, Leibensperger H, Froman S, Assaid C, Lines C, Koppen H, Winner PK. Lancet. 2008 372:2115. Epub 2008 Nov 25；Ho TW, Mannix LK, Fan X, Assaid C, Furtek C, Jones CJ, Lines CR, Rapoport AM；Neurology 2008 70:1304. Epub 2007 Oct 3 を参照されたい。
【０００７】
本発明は技術的なアドバンテージを提供する。例えば、本発明の化合物は新規のものであり、ＣＧＲＰを阻害する。さらに、本発明の化合物は、医薬的使用におけるアドバンテージ、例えば、それらの作用メカニズム、結合、阻害効率、標的の選択性、溶解性、安全性プロフィール、または生物学的利用能の１つまたはそれ以上の観点におけるアドバンテージを提供する。
【０００８】
ＣＧＲＰ受容体アンタゴニストは、ＷＯ２００３／１０４２３６を含むＰＣＴ公開公報で開示される。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、（Ｒ）−Ｎ−（３−（７−メチル−１Ｈ−インダゾール−５−イル）−１−（４−（１−メチルピペリジン−４−イル）ピペラジン−１−イル）−１−オキソプロパン−２−イル）−４−（２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−イル）ピペリジン−１−カルボキシアミド（化合物Ｉまたは式（Ｉ）の化合物）、ならびにＣＧＲＰを調節する、および患者におけるＣＧＲＰまたはＣＧＲＰ受容体シグナリングレベルの異常が関連する病態を治療するための医薬組成物および方法を包含する。
【化１】
0005908455.tif 000002
【００１０】
（発明の詳細な説明）
本発明は、本発明の化合物の全ての医薬的に許容される塩の形態を包含する。医薬的に許容される塩とは、その対イオンが該化合物の生理活性または毒性に著しく寄与することがなく、故に薬理学的同等物として機能するものである。これらの塩は、市販の試薬を用い、一般的な有機化学的技法により製造することができる。陰イオン塩の形態は、例えば、酢酸塩、アシストレート（acistrate）、ベシレート（besylate）、臭化物、塩化物、クエン酸塩、フマル酸塩、グルクロン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、ヨウ化物、乳酸塩、マレイン酸塩、メシル酸塩、硝酸塩、パモ酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、トシル化物およびキシナホ酸塩である。陽イオン塩の形態は、例えば、アンモニウム塩、アルミニウム塩、ベンザチン塩、ビスマス塩、カルシウム塩、コリン塩、ジエチルアミン塩、ジエタノールアミン塩、リチウム塩、マグネシウム塩、メグルミン塩、４−フェニルシクロヘキシルアミン塩、ピペラジン塩、カリウム塩、ナトリウム塩、トロメタミン塩、および亜鉛塩である。
【００１１】
本発明は、本発明の化合物に存在する原子の全ての同位体を含むと意図される。同位体は、同じ原子番号を有するが異なる質量数を有する原子を包含する。一般的な例として、限定されないが、水素の同位体は重水素およびトリチウムを含む。炭素の同位体は１３Ｃおよび１４Ｃを含む。本発明の同位体標識化合物は、通常用いられる非標識試薬の代わりに適当な同位体標識試薬を用い、当業者に周知の一般的方法または本明細書中に記載されるものと類似の方法により製造することができる。かかる化合物は、例えば、生物学的活性の測定におけるスタンダードおよび試薬としての使用といった様々な使用の可能性を有する。安定な同位体の場合、かかる化合物は、生物学的、薬理学的、または薬物動態学的性質を好ましいものに改変する可能性を有する。
【００１２】
合成方法
略語は、通常、当該分野の慣例に従うものとする。本明細書および実施例で用いられる化学略語は以下のように定義される：「ＮａＨＭＤＳ」：ナトリウムビス（トリメチルシリル）アミド；「ＤＭＦ」：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド；「ＭｅＯＨ」：メタノール；「ＮＢＳ」：Ｎ−ブロモスクシンイミド；「Ａｒ」：アリール；「ＴＦＡ」：トリフルオロ酢酸；「ＬＡＨ」：水素化アルミニウムリチウム；「ＢＯＣ」、「ＤＭＳＯ」：ジメチルスルホキシド；「ｈ」：時間；「ｒｔ」：室温または保持時間（文脈による）；「ｍｉｎ」：分；「ＥｔＯＡｃ」：酢酸エチル；「ＴＨＦ」：テトラヒドロフラン；「ＥＤＴＡ」：エチレンジアミンテトラ酢酸；「Ｅｔ２Ｏ」：ジエチルエーテル；「ＤＭＡＰ」：４−ジメチルアミノピリジン；「ＤＣＥ」：１，２−ジクロロエタン；「ＡＣＮ」：アセトニトリル；「ＤＭＥ」：１，２−ジメトキシエタン；「ＨＯＢｔ」：１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物；「ＤＩＥＡ」：ジイソプロピルエチルアミン；「Ｎｆ」：ＣＦ３（ＣＦ２）３ＳＯ２−；および「ＴＭＯＦ」：オルトギ酸トリメチル。
【００１３】
本明細書中で用いられる略語は以下のように定義される:「１ｘ」：１回；「２ｘ」：２回；「３ｘ」：３回；「℃」：摂氏；「ｅｑ」：当量；「ｇ」：グラム；「ｍｇ」：ミリグラム；「Ｌ」：リットル；「ｍＬ」または「ｍｌ」：ミリリットル；「μＬ」：マイクロリットル；「Ｎ」：規定度；「Ｍ」：モル濃度；「ｍｍｏｌ」：ミリモル；「ｍｉｎ」：分；「ｈ」：時間；「ｒｔ」：室温；「ＲＴ」：保持時間；「ａｔｍ」：気圧；「ｐｓｉ」：ポンド毎平方インチ；「ｃｏｎｃ．」：濃；「ｓａｔ」または「ｓａｔ’ｄ」：飽和；「ＭＷ」：分子量；「ｍｐ」：融点；「ｅｅ」：鏡像体過剰率；「ＭＳ」または「Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ」：質量分析；「ＥＳＩ」：エレクトロスプレーイオン化質量分析；「ＨＲ」：高解像度；「ＨＲＭＳ」：高解像度質量分析；「ＬＣＭＳ」：液体クロマトグラフィー連結質量分析；「ＨＰＬＣ」：高圧液体クロマトグラフィー；「ＲＰ ＨＰＬＣ」：逆相ＨＰＬＣ；「ＴＬＣ」または「ｔｌｃ」：薄層クロマトグラフィー；「ＮＭＲ」：核磁気共鳴分光法；「１Ｈ」：プロトン；「δ」：デルタ；「ｓ」：一重線；「ｄ」：二重線；「ｔ」：三重線；「ｑ」：四重線；「ｍ」：多重線；「ｂｒ」：ブロードな；「Ｈｚ」：ヘルツ；「α」；「β」；「Ｒ」；「Ｓ」；「Ｅ」；および「Ｚ」：当業者に周知の立体化学記号。
【００１４】
化合物Ｉはスキーム１に従って製造することができる。この合成は１４個の化学工程であり、高い収束性を有し、最後の３工程で３つのメジャーなフラグメントを組み合わせるものである。従って、この合成はメジャーなフラグメントＡ（スキーム２）およびＢ（スキーム３）の合成で開始される。
【化２】
0005908455.tif 000003
【００１５】
フラグメントＡの合成は、Ｎ−Ｂｏｃ−４−ピペリドン、およびホスホノ酢酸トリメチルから製造されたイリドのホーナー−エモンズ反応で開始され、ｔｅｒｔ−ブチル ４−（２−メトキシ−２−オキソエチルリデン）ピペリジン−１−カルボキシレートが高い収率で得られる（スキーム２）。パラジウム炭素による触媒的水素付加反応により、不飽和二重結合が還元される。ｔｅｒｔ−ブチル ４−（２−メトキシ−２−オキソエチル）ピペリジン−１−カルボキシレートをＬＤＡで処理することによりエノレートが得られ、それを２−ニトロベンズアルデヒドで捕捉することによりニトロアルコールが得られる。酢酸中における鉄によるニトロ基の還元、次いで、ジオキサン中の塩化水素による処理により、フラグメントＡの合成が完了する。
【化３】
0005908455.tif 000004
【００１６】
インダゾールアミノ酸Ｂの合成は、一塩化ヨウ素の作用による２，６−ジメチルアニリンのヨウ素化により開始される（スキーム３）。この中間体を一旦取り除けておく。Ｎ−ＣＢＺ−Ｌ−セリンメチルエステルにワンポットメタンスルホニル化／脱離反応を行い、Ｎ−ＣＢＺ−デヒドロアラニンメチルエステルを得る。酢酸パラジウム（ＩＩ）を用いて得られたヨージドとデヒドロアニリンをヘックカップリングにより効果的にカップリングし、生成物を６５％の収率で得る。この時点で、（−）−１，２−ビス（（２Ｒ，５Ｒ）−２，５−ジエチルホスホラノ）ベンゼン（シクロオクタジエン）ロジウム（Ｉ）テトラフルオロボレートおよび水素（６０ｐｓｉ）を用いる触媒的不斉水素化により不斉中心を導入すると、不斉アミノ酸が〜９６％ ｅｅで得られる。次いで、亜硝酸イソアミルの作用によりインダゾール環を形成する。得られたインダゾールは高い結晶性を有する。アセトン／ヘキサンからの１回の結晶化により、インダゾールアミノ酸が高い純度および高いｅｅ（９９．８％ ｅｅ）において得られる。水素化条件下におけるＣＢＺ保護基の除去により、フラグメントＢの製造が完了する。インダゾールアミノ酸Ｂはまた、ラセミのアミノ酸またはケト酸の酵素的分割により製造することもできる（Hanson, Ronald L.；Davis, Brian L.；Goldberg, Steven L.；Johnston, Robert M.；Parker, William L.；Tully, Thomas P.；Montana, Michael A.；Patel, Ramesh N.  Process Research and Development, Bristol−Myers Squibb,  New Brunswick,  NJ,  USA.  Organic Process Research & Development  (2008),  12(6),  1119−1129.）。
【化４】
0005908455.tif 000005
【００１７】
フラグメントＡおよびＢを炭酸Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルを用いてカップリングして尿素部分を導入する（収率７８％、スキーム４）。水酸化リチウムによるメチルエステルのけん化によりカルボン酸がほぼ定量的収率で得られる。酸と１−（１−メチルピペリジン−４−イル）ピペラジンのＴＢＴＵ（登録商標）触媒カップリングにより化合物Ｉの合成が完了する。フラッシュクロマトグラフィーにより、生成物がアモルファスな粉末として得られ、それをアセトンから結晶化すると化合物Ｉが白色の結晶性微粉末として得られる。
【化５】
0005908455.tif 000006
【００１８】
【化６】
0005908455.tif 000007
ｔｅｒｔ−ブチル ４−（２−メトキシ−２−オキソエチルリデン）ピペリジン−１−カルボキシレート．水素化ナトリウム／ミネラル油（６０％、７．９２ｇ、１９８．０２ｍｍｏｌｅｓ）をヘキサンで洗浄し、ジメチルホルムアミド（２２０ｍＬ）で懸濁した。該混合物を０℃に冷却した。ホスホノ酢酸トリメチル（２９．０ｍＬ、１８９．８２ｍｍｏｌｅｓ）を撹拌した反応混合物に滴下して加えた。０℃で２０分後、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−４−ピペリドン（３０．４１ｇ、１５２．６２ｍｍｏｌｅｓ）のジメチルホルムアミド（８０ｍＬ）溶液を該混合物に滴下して加えた。該反応物を室温で３時間撹拌し、次いで、ジエチルエーテル（６５０ｍＬ）で希釈した。該混合物を水で１回洗浄し、水層をジエチルエーテルで１回抽出した。合わせた有機層を水で４回洗浄し、水相を廃棄した。有機相をブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、濃縮乾燥した。表題化合物は白色の固形物として９２％の収率で得られた。  1H−NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 5.68 (s, 1 H), 3.66 (s, 3 H), 3.40−3.51 (m, 4 H), 2.90 (t, J = 5.49, 2 H), 2.25 (t, J = 5.49, 2 H), 1.44 (s, 9 H).
【００１９】
【化７】
0005908455.tif 000008
ｔｅｒｔ−ブチル ４−（２−メトキシ−２−オキソエチル）ピペリジン−１−カルボキシレート．１：１ 酢酸エチル／メタノール混合物（２２０ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル ４−（２−メトキシ−２−オキソエチルリデン）ピペリジン−１−カルボキシレート（３５．７１ｇ、１４０ｍｍｏｌｅｓ）を５０％湿潤１０％パラジウム炭素（３．３ｇ）で注意深く処理した。反応容器に５５ｐｓｉの水素ガスをチャージし、該混合物をＰａｒｒ装置により室温で１６時間振盪した。次いで、該反応混合物を濾過して触媒を除去し、濾液を減圧濃縮した。表題化合物は無色透明な油状物として９７％の収率で得られた。  1H−NMR (300 MHz, CDCl3): δ =  4.04 (d, J = 10.25, 2 H), 3.64 (s, 3 H), 2.68 (t, J = 12.44, 2 H), 2.21 (d, J = 6.95, 2 H), 1.98−1.77 (m, 1 H), 1.64 (d, J = 13.54, 2 H), 1.41 (s, 9 H), 1.25−0.99 (m, 2 H).
【００２０】
【化８】
0005908455.tif 000009
４−［２−ヒドロキシ−１−メトキシカルボニル−２−（２−ニトロ−フェニル）−エチル］−ピペリジン−１−カルボン酸 ｔｅｒｔ−ブチルエステル．Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミン（４．４０ｍＬ、３１．３ｍｍｏｌｅｓ）をテトラヒドロフラン（５０ｍＬ）に溶解した。該混合物を−７８℃に冷却した。ブチルリチウム（２．５Ｍ／ヘキサン、１２．４ｍＬ、３１ｍｍｏｌｅｓ）を撹拌した該溶液に滴下して加えた。−７８℃で３０分間撹拌後、ｔｅｒｔ−ブチル ４−（２−メトキシ−２−オキソエチル）ピペリジン−１−カルボキシレート（６．６５ｇ、２５．８ｍｍｏｌｅｓ）のテトラヒドロフラン（１５ｍＬ）溶液を該混合物に滴下して加えた。撹拌を−７８℃で１時間続けた。２−ニトロベンズアルデヒド（３．９０ｇ、２５．８ｍｍｏｌｅｓ）のテトラヒドロフラン（２０ｍＬ）溶液を該混合物に滴下して加え、次いで、撹拌を−７８℃でさらに２．５時間続けた。該反応物を塩化アンモニウム冷水溶液でクエンチし、水で希釈した。該混合物を酢酸エチルで２回抽出し、水相を廃棄した。該物質を乾燥し（硫酸マグネシウム）、濾過し、濃縮乾燥した。シリカゲルクロマトグラフィーにより目的生成物を９４％の収率において薄黄色の泡状物質として得た。  MS m/e (M−C4H8+H)+ = 353.1.
【００２１】
【化９】
0005908455.tif 000010
４−（４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，３，４−テトラヒドロ−キノリン−３−イル）−ピペリジン−１−カルボン酸 ｔｅｒｔ−ブチルエステル．窒素インレット、温度計、およびメカニカルスターラーを装着した３つ口フラスコ内で、４−［２−ヒドロキシ−１−メトキシカルボニル−２−（２−ニトロ−フェニル）−エチル］−ピペリジン−１−カルボン酸 ｔｅｒｔ−ブチルエステル（９．９３ｇ、２４．３ｍｍｏｌｅｓ）を酢酸（１．７５ｍｏｌｅｓ、１００ｍＬ）に溶解した。撹拌しながら鉄粉（８．９０ｇ、１５９ｍｍｏｌｅｓ）を該容器に加えた。撹拌した混合物をゆっくりと８０℃に３０分間かけて加熱し、室温に冷却した。次いで、それを酢酸エチルで希釈し、Ｃｅｌｉｔｅのパッドに通して濾過した。固形物を２０％メタノール／酢酸エチル、次いでメタノールで洗浄した。濾液を濃縮し、残渣を酢酸エチルおよび炭酸水ナトリウム水溶液で分液処理した。層を分離した。得られた水層を酢酸エチルで２回抽出した。有機層を合わせた。該混合物を水で２回洗浄し、水相を廃棄した。該物質を乾燥し（硫酸マグネシウム）、濾過し、濃縮乾燥した。シリカゲルクロマトグラフィーにより、表題化合物を薄黄色の泡状物質として７７％の収率で得た。  MS m/e (M−H)− = 345.1.
【００２２】
【化１０】
0005908455.tif 000011
３−（ピペリジン−４−イル）キノリン−２（１Ｈ）塩酸塩．撹拌した４−（４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，３，４−テトラヒドロ−キノリン−３−イル）−ピペリジン−１−カルボン酸 ｔｅｒｔ−ブチルエステル（５．６０ｇ、１６．２ｍｍｏｌｅｓ）の酢酸エチル（７０ｍＬ）溶液をＨＣｌ／ジオキサン（４Ｎ、４０ｍｍｏｌｅｓ、１０ｍＬ）で処理した。該混合物を室温で４５分間撹拌した。次いで、さらなるＨＣｌ／ジオキサン（４Ｎ、１２０ｍｍｏｌｅｓ、３０ｍＬ）を加え、撹拌を室温で１６時間続けた。生じた固形物を濾取し、酢酸エチルで洗浄した。それを５％水−イソプロパノール（１００ｍＬ）に懸濁し、該混合物を還流状態に加熱し、２０分間撹拌した。該混合物を室温に冷却し、室温で１６時間撹拌した。固形物を濾取し、イソプロパノールで洗浄し、高真空下で乾燥した。表題化合物を白色の固形物として７５％の収率で得た。  1H−NMR (DMSO−d6) δ 11.85 (s, 1 H), 9.02 (bs, 1 H), 8.88 (bs, 1 H), 7.70 (t, J = 3.81 Hz, 2 H), 7.53 − 7.30 (d, J = 8.24 Hz, 1 H), 7.17 (t, J = 7.48 Hz, 2 H), 3.36 (d, J = 12.51 Hz, 2 H), 3.10 − 2.94 (m, 3 H), 2.01 (d, J = 13.43 Hz, 2 H), 1.87 − 1.73 (m, 2 H)； MS m/e (M+H)+ = 229.0.
【００２３】
【化１１】
0005908455.tif 000012
４−ヨード−２，６−ジメチルベンゼンアミン塩酸塩．炭酸水素ナトリウム（１２６ｇ、１．５ｍｏｌｅｓ）および２，６−ジメチルアニリン（６１．５ｍＬ、５００ｍｍｏｌｅｓ）のメタノール（７００ｍＬ）懸濁液に一塩化ヨウ素（１．０Ｍ／ジクロロメタン、５５０ｍＬ、５５０ｍｍｏｌｅｓ）を室温で１時間かけて加えた。添加完了後、撹拌を３時間続けた。該反応物を濾過して過剰な炭酸水素ナトリウムを除去し、溶媒を減圧除去した。残渣をジエチルエーテル（１．５Ｌ）に再溶解し、塩酸（２Ｍ／エーテル、３７５ｍＬ、７５０ｍｍｏｌｅｓ）で処理した。得られた懸濁液を冷凍庫（−１５℃）に終夜保管した。固形物を濾取し、無色になるまでジエチルエーテルで洗浄し、１２６．５ｇ（８９％）を灰−緑色の粉末として得た。  1H−NMR (DMSO−d6) δ 2.33 (s, 6 H), 7.48 (s, 2 H), 9.05 (bs, 3 H)； 13C−NMR (DMSO−d6) δ 17.4, 91.5, 133.1, 131.2, 136.9.
【００２４】
【化１２】
0005908455.tif 000013
メチル ２−（ベンジルオキシカルボニル）アクリレート．火炎乾燥し、メカニカルスターラーを装着した３つ口フラスコに（Ｓ）−メチル ２−（ベンジルオキシカルボニル）−３−ヒドロキシプロパノエート（１２９ｇ、５０９ｍｍｏｌｅｓ）、無水ジクロロメタン（２Ｌ）、およびメタンスルホニルクロリド（４９．３ｍＬ、６３６ｍｍｏｌｅｓ）を加えた。該混合物を−１５℃に冷却し、トリエチルアミン（２１３ｍＬ、１５２７ｍｍｏｌｅｓ）で反応混合物の温度が０℃を超えないよう滴加して処理した。最初の当量のトリエチルアミンの添加は発熱性であった。トリエチルアミンの添加後、該混合物を０℃で３０分間撹拌した。冷却槽を取り外し、該混合物を室温で１．５時間撹拌した。該反応物をメタノール（２１ｍＬ）の添加によりクエンチした。該混合物を０．５％硫酸水素カリウム水溶液でｐＨ５になるまで洗浄し、次いで、飽和炭酸水素ナトリウムおよびブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、１：９ 酢酸エチル／ヘキサン）により、１１１ｇ（９２％）を粘稠性の無色の油状物として得、静置して固化させた。  1H−NMR (DMSO−d6) δ 3.71 (s, 3 H), 5.10 (s, 2 H), 5.60 (s, 1 H), 5.76 (s, 1 H), 7.39−7.35 (m, 5 H), 8.96 (s, 1 H)；13C−NMR (DMSO−d6) δ 52.3, 65.9, 127.8, 128.1, 128.3, 128.8, 133.3, 136.3, 153.5, 163.7.
【００２５】
【化１３】
0005908455.tif 000014
（Ｚ）−メチル ３−（４−アミノ−３，５−ジメチルフェニル）−２−（ベンジルオキシカルボニル）アクリレート．２Ｌの丸底フラスコに４−ヨード−２，６−ジメチルベンゼンアミン塩酸塩（５５ｇ、１９４ｍｍｏｌｅｓ）、メチル ２−（ベンジルオキシカルボニル）アクリレート（５９．２ｇ、２５２ｍｍｏｌｅｓ）、テトラブチルアンモニウムクロリド（５９．２ｇ、２１３ｍｍｏｌｅｓ）、酢酸パラジウム（ＩＩ）（４．３４ｇ、１９．４ｍｍｏｌｅｓ）、およびテトラヒドロフラン（１．２Ｌ、窒素気流で３０分間脱気した）を加えた。懸濁液が形成されるまで該混合物を撹拌し、窒素気流で３０分間脱気した。トリエチルアミン（１１０ｍＬ、７８９ｍｍｏｌｅｓ）を加え、得られた混合物を３時間加熱還流した。室温に冷却後、該反応混合物をＣｅｌｉｔｅのパッドに通して濾過し、テトラヒドロフラン（２ｘ１００ｍＬ）で洗浄し、濃縮した。残渣をジクロロメタンに溶解し、水（３ｘ）およびブライン（２ｘ）で精製し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、１：９ 酢酸エチル／ジクロロメタンを用いた）により、黄褐色の固形物を得た。該固形物を温メタノール（２１０ｍＬ）および水（１００ｍＬ）から再結晶化した。混合物を終夜室温に維持し、次いで０℃で２時間、最後に−１５℃で２時間維持した。得られた固形物を濾過し、氷冷１：１メタノール／水で洗浄し、高真空下で終夜乾燥し、４４．７ｇ（６５％）を薄黄褐色の固形物として得たが、それはＺ／Ｅ異性体の混合物（７３：２７）であった。  1H−NMR (DMSO−d6) δ, 2.05 (s, 6 H), 3.61 (s, 0.8 H), 3.68 (s, 2.2 H), 5.00 (s, 0.54 H), 5.13 (s, 1.46 H), 5.24 (s, 2 H), 7.40−7.21 (m, 8 H), 8.51 (s, 0.27 H), 8.79 (s, 0.73 H)；13C−NMR (DMSO−d6) δ 17.8, 51.7, 65.3, 119.4, 120.0, 120.3, 127.3, 127.7, 128.3, 130.9, 135.8, 137.2, 146.9, 154.7, 166.0.
【００２６】
【化１４】
0005908455.tif 000015
（Ｒ）−メチル ３−（４−アミノ−３，５−ジメチルフェニル）−２−（ベンジルオキシカルボニル）プロパノエート．火炎乾燥した２ＬのＰａｒｒ水素化ボトルに（Ｚ）−メチル ３−（４−アミノ−３，５−ジメチルフェニル）−２−（ベンジルオキシカルボニル）アクリレート（８４．５ｇ、２３９ｍｍｏｌｅｓ）、ジクロロメタン（３００ｍＬ）、およびメタノール（３００ｍＬ）を加えた。薄茶色の懸濁液が形成されるまで該ボトルを回旋した。窒素気流を用いて該混合物を３０分間脱気した。これに（−）−１，２−ビス（（２Ｒ，５Ｒ）−２，５−ジエチルホスホラノ）−ベンゼン（シクロオクタジエン）ロジウム（Ｉ）テトラフルオロボレート（［（２Ｒ，５Ｒ）−Ｅｔ−ＤｕＰｈｏｓＲｈ］ＢＦ４）（２．１１ｇ、３．２０ｍｍｏｌｅｓ）を迅速に加えた。該ボトルを直ちにＰａｒｒ水素化反応容器に装着した。水素（６０ｐｓｉ）および吸引を５サイクル行った後、該ボトルを６５ｐｓｉに加圧し、懸濁液を室温で１６時間撹拌した。該反応物は均一なものとなった。該反応混合物を濃縮し、得られた残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、１：９ 酢酸エチル／ジクロロメタン）で精製し、８２．９ｇ（９８％）を得た。  1H−NMR (DMSO−d6)  δ 2.04 (s, 6 H), 2.65 (dd, J = 13.4, 9.8 Hz, 1H), 2.82 (dd, J = 13.7, 5.2 Hz, 1 H), 3.62 (s, 3 H), 4.15−4.10 (m, 1H), 4.41 (s, 2 H), 5.00 (s, 2 H), 6.68 (s, 2 H), 7.37−7.28 (m, 5 H), 7.70 (d, J = 7.9 Hz, 1 H)； 13C−NMR (DMSO−d6) δ 17.7, 35.9, 51.7, 56.1, 65.3, 120.4, 124.0, 127.5, 127.7, 128.2, 128.3, 136.9, 142.6, 155.9, 172.5.
【００２７】
【化１５】
0005908455.tif 000016
（Ｒ）−メチル ２−（ベンジルオキシカルボニル）−３−（７−メチル−１Ｈ−インダゾール−５−イル）プロパノエート．（Ｒ）−メチル ３−（４−アミノ−３，５−ジメチルフェニル）−２−（ベンジルオキシカルボニル）プロパノエート（５０．０ｇ、１４０ｍｍｏｌｅｓ）を火炎乾燥した５Ｌの３つ口丸底フラスコに量り、次いで、トルエン（２．４Ｌ）および氷酢酸（１２０ｍＬ、２．１ｍｏｌｅｓ）を加えた。該混合物をメカニカルスターラーで撹拌して透明な溶液を調製し、酢酸カリウム（１０３ｇ、１．０５ｍｏｌｅｓ）を加えた。得られた白色の懸濁液に亜硝酸イソアミル（２０．７ｍＬ、１５４ｍｍｏｌｅｓ）を室温で滴下して加え、得られた混合物を室温で１６時間撹拌した。飽和炭酸水素ナトリウム（１Ｌ）を加え、次いで、固体の炭酸水素ナトリウムを注意深く加えて酢酸を中和した。該混合物をジクロロメタン（２Ｌ）およびブライン（１．５Ｌ）の混合物で抽出した。分離後、水層をジクロロメタン（５００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した。溶媒を除去した黄褐色の固形物を得、ヘキサン（２Ｌ）およびトルエン（１５０ｍＬ）で洗浄した。固形物を温アセトン（２６０ｍＬ）およびヘキサン（７００ｍＬ）から再結晶化した。かすかに濁った混合物をゆっくりと室温に冷却し、次いで、０℃で１．５時間、最後に−１５℃で１．５時間冷却した。生じた固形物を濾取し、氷冷アセトン/ヘキサン（１：１、２００ｍＬ）で洗浄し、３９．１ｇ（収率７６％）を得た。分析ＨＰＬＣにより、＞９８％ＵＶ純度であることが示された。鏡像体過剰率（ｅｅ）は９９．８％（条件：Ｃｈｉｒａｌｐａｋ ＡＤカラム、４．６ｘ２５０ｍｍ、１０μm；Ａ＝エタノール、Ｂ＝０．０５％ジエチルアミン/ヘプタン；８５％Ｂ、１．０ｍＬ／分、５５分間。Ｒの保持時間は４４．６分、Ｓは２８．８分であった）と決定された。  1H−NMR (DMSO−d6) δ 2.48 (s, 3 H), 2.93 (dd, J = 13.4, 10.7 Hz, 1H), 3.10 (dd, J = 13.7, 4.9 Hz, 1H), 3.63 (s, 3H), 4.32−4.27 (m, 1 H), 4.97 (s, 2 H), 7.03 (s, 1 H), 7.24−7.22 (m, 2 H), 7.29 −7.27 (m, 3 H), 7.41 (s, 1 H), 7.83 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.99 (s, 1H), 13.1 (s, 1 H)； 13C−NMR (DMSO−d6) δ 16.7, 36.5, 51.8, 56.0, 65.3, 117.6, 119.6, 122.7, 127.2, 127.4, 127.6, 128.2, 129.3, 133.4, 136.8, 139.2, 155.9, 172.4.   質量分析: 368.16 (MH)+.
【００２８】
【化１６】
0005908455.tif 000017
（Ｒ）−メチル ２−アミノ−３−（７−メチル−１Ｈ−インダゾール−５−イル）プロパノエート．Ｐａｒｒ水素化ボトルに（Ｒ）−メチル ２−（ベンジルオキシカルボニル）−３−（７−メチル−１Ｈ−インダゾール−５−イル）プロパノエート（１１．０ｇ、２９．９ｍｍｏｌｅｓ）およびメタノール（７５ｍＬ）を加えた。該懸濁液に窒素をパージし、パラジウム（１０％／活性炭、７００ｍｇ）で処理した。該ボトルを水素下（１５ｐｓｉ）で終夜振盪した。該混合物をＣｅｌｉｔｅのパッドに通して触媒を濾去した。溶出物を濃縮し、７．７ｇ（定量的収率）を油状物として得、さらに精製することなく用いた。  1H−NMR (CD3OD) δ 2.54 (s, 3 H), 2.98 (dd, J = 13.5, 7.0 Hz, 1 H), 3.09 (dd, J = 13.5, 5.9 Hz, 1 H), 3.68 (s, 3 H), 3.75 (dd, J = 7.0, 6.2 Hz, 1 H), 7.01 (s, 1 H), 7.39 (s, 1 H), 7.98 (s, 1 H). 質量分析： 232.34 (M−H)−.
【００２９】
【化１７】
0005908455.tif 000018
（Ｒ）−メチル ３−（７−メチル−１Ｈ−インダゾール−５−イル）−２−（４−（２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−イル）ピペリジン−１−カルボキシアミド）プロパノエート．（Ｒ）−メチル ２−アミノ−３−（７−メチル−１Ｈ−インダゾール−５−イル）プロパノエート塩酸塩（７．２６ｇ、２７．０ｍｍｏｌｅｓ）のジメチルホルムアミド（５０ｍＬ）溶液（室温）に炭酸Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジル（７．６０ｇ、２９．７ｍｍｏｌｅｓ）、次いでトリエチルアミン（１１．２９ｍＬ、８１ｍｍｏｌｅｓ）を加えた。得られた混合物を３０分間撹拌し、３−（ピペリジン−４−イル）キノリン−２（１Ｈ）−オン（６．７７ｇ、２９．９ｍｍｏｌｅｓ）で何回かに分けて処理した。該反応物を２４時間撹拌した。該混合物を濃縮し、酢酸エチルに溶出し、水、ブライン、および０．５Ｎ ＨＣｌ（２ｘ）で順に洗浄した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、濃縮した。得られた残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、２０：１ 酢酸エチル/メタノール）で精製し、１１．９ｇ（７８％）を得た。  1H−NMR (CD3OD) δ 13.0 (s, 1 H), 11.8 (s, 1 H), 7.98 (s, 1 H), 7.63 (d, J = 7.6 Hz, 1 H), 7.57 (s, 1 H), 7.45  − 7.41 (m, 2 H), 7.27 (d, J = 8.2Hz, 1 H), 7.16 (t, J = 7.9 Hz, 1 H), 7.03 (s, 1 H), 6.85 (d, J = 7.9 Hz, 1 H), 4.31 − 4.26 (m, 1 H), 4.10 − 4.08 (m, 2 H), 3.60 (s, 3 H), 3.07 − 3.01 (m, 2 H), 2.93 − 2.88 (m, 1 H), 2.77 − 2.67 (m, 2 H), 2.48 (s, 3 H), 1.78 − 1.72 (m, 2 H), 1.34 − 1.26 (m, 2 H).  質量分析： 488.52 (MH)+.
【００３０】
【化１８】
0005908455.tif 000019
（Ｒ）−３−（７−メチル−１Ｈ−インダゾール−５−イル）−２−（４−（２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−イル）ピペリジン−１−カルボキシアミド）プロパン酸．（Ｒ）−メチル ３−（７−メチル−１Ｈ−インダゾール−５−イル）−２−（４−（２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−イル）ピペリジン−１−カルボキシアミド）プロパノエート（５．５０ｇ、１１．３ｍｍｏｌｅｓ）のテトラヒドロフラン（５０ｍＬ）およびメタノール（１０ｍＬ）溶液を０℃に冷却した。これに冷却した（０℃）水酸化リチウム一水和物（０．９５ｇ、２２．６ｍｍｏｌｅｓ）の水（２０ｍＬ）溶液を１５分間かけて滴下して加えた。該反応物を室温でさらに３時間撹拌した。該混合物を濃縮して有機溶媒を除去した。得られた残渣を最少量の水に溶解し、０℃に冷却し、冷（０℃）１Ｎ  ＨＣｌでｐＨ２となるまで処理した。生じた固形物を濾取し、冷水およびエーテルで洗浄し、次いで、高真空下で終夜乾燥し、５．０ｇ（９４％）を白色の固形物として得た。  1H−NMR (DMSO−d6)  δ 13.05 (bs, 1 H), 11.77 (s, 1 H), 7.98 (s, 1 H), 7.62 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 7.55 (s, 1 H), 7.44 (d, J = 8.2Hz, 1 H), 7.42 (s, 1 H), 7.27 (d, J = 8.2 Hz, 1 H), 7.16 (t, J = 7.6 Hz, 1 H), 7.05 (s, 1 H), 6.65 (d, J = 7.9 Hz, 1 H), 4.27 − 4.22 (m, 1 H), 4.10 − 4.07 (m, 2 H), 3.12 − 3.07 (m, 1 H), 3.03 − 2.99 (m, 1 H), 2.93 − 2.88 (m, 1 H), 2.77 − 2.66 (m, 2 H), 2.47 (s, 3 H), 1.77 − 1.74 (m, 2 H), 1.34 − 1.27 (m, 2 H).  質量分析： 474.30 (MH)+.
【００３１】
【化１９】
0005908455.tif 000020
（Ｒ）−Ｎ−（３−（７−メチル−１Ｈ−インダゾール−５−イル）−１−（４−（１−メチルピペリジン−４−イル）ピペラジン−１−イル）−１−オキソプロパン−２−イル）−４−（２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−イル）ピペリジン−１−カルボキシアミド（Ｉ）．フラスコに（Ｒ）−３−（７−メチル−１Ｈ−インダゾール−５−イル）−２−（４−（２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−イル）ピペリジン−１−カルボキシアミド）プロパン酸（２．９ｇ、６．１１ｍｍｏｌｅｓ）、トリエチルアミン（３．００ｍＬ、２１．５ｍｍｏｌｅｓ）、１−（１−メチルピペリジン−４−イル）ピペラジン（１．２３ｇ、６．７２ｍｍｏｌｅｓ）、およびジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）を加えた。得られた溶液を２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（２．２６ｇ、７．０３ｍｍｏｌｅｓ）で何回かに分けて処理した。該反応物を室温で終夜撹拌した。該混合物を減圧濃縮してジメチルホルムアミドを除去した。粗生成物を７％メタノール／ジクロロメタンに溶解し、２％の水酸化アンモニウムを含有する７％メタノール／ジクロロメタンを溶出液として用いたフラッシュクロマトグラフィーで精製した。ピュアなフラクションを回収し、溶媒を減圧除去した。目的生成物を温アセトンから結晶化し、化合物Ｉを７７％の収率で得た。分析ＨＰＬＣにより、９９．０％ＵＶ純度（２３０ｎｍ）であることが示された。鏡像体過剰率（ｅｅ）は＞９９．９％（条件：Ｃｈｉｒａｌｐａｋ ＡＤカラム、４．６ｘ２５０ｍｍ、１０μｍ；溶出液:７０％（０．０５％ジエチルアミン）／ヘプタン／３０％エタノール；１．０ｍＬ／分、４５分間。Ｒの保持時間は１８．７分、Ｓの保持時間は２８．１分であった）と決定された。  1H−NMR (500 MHz, DMSO−d6) δ ppm 13.01 (s, 1 H), 11.76 (s, 1 H), 7.96 (s, 1 H), 7.62 (d, J = 7.10 Hz, 1 H), 7.60 (s, 1 H), 7.42 (m, 1 H), 7.36 (s, 1 H), 7.26 (d, J = 8.25 Hz, 1 H), 7.14 (m, 1 H), 7.00 (s, 1 H), 6.69 (d, J = 8.25 Hz, 1 H), 4.78 (q, J = 7.79 Hz, 1 H), 4.14 (d, J = 12.37 Hz, 2 H), 3.54 (dd, J = 9.16, 4.58 Hz, 1 H), 3.24 (m, 1 H), 3.11 (m, 1 H), 2.97 (m, 1 H), 2.89 (m, 2 H), 2.69 (m, 4 H), 2.32 (m, 1 H), 2.21 (m, 1 H), 2.07 (m, 4 H), 1.95 (t, J = 8.25 Hz, 1 H), 1.87 (m, J = 11.28, 11.28, 3.55, 3.44 Hz, 1 H), 1.76 (t, J = 12.03 Hz, 2 H), 1.68 (t, J = 11.11 Hz, 2 H), 1.53 (t, J = 8.25 Hz, 1 H), 1.32 (m, 4 H), 1.16 (m, 2 H)； 13C−NMR (DMSO−d6) δ 16.80, 27.30, 30.51, 30.51, 30.67, 35.50, 38.04, 41.74, 44.00, 44.16, 45.35, 45.78, 48.14, 48.39, 51.45, 54.76, 54.76, 60.61, 114.53, 117.79, 119.29, 119.34, 121.57, 122.78, 127.46, 127.79, 129.29, 129.79, 133.31, 133.72, 136.98, 137.41, 139.12, 156.50, 161.50, 170.42.  正確な質量分析: m/z 639.3770, [MH]+, Δ = −0.2 ppm.  施光度: −27.36度（589 nm）；濃度 = 4.71 mg/mL ／メタノール．
【００３２】
生物学的方法および他の性質
【化２０】
0005908455.tif 000021
【００３３】
水溶性
遊離塩基固形物を炭酸バッファー、およびエタノールアミンバッファーと混合した。第３のサンプルのｐＨはＨＣｌで調整した。２５℃に設定したインキュベーター内に置いたミキサーで固形物を媒体と混合した。平衡化後、サンプルの上清を採取し、適当に希釈し、ＨＰＬＣで分析した。
【００３４】
水性の媒体への溶解性、ｐＨ依存性
ｐＨ溶解性プロフィールの測定中は、結晶の化合物Ｉをゲル相に変換した。水と平衡状態にある結晶相が存在しないと、熱力学的に安定な溶液として化合物Ｉを製剤化することが可能なｐＨ範囲の正確な評価が妨げられる。水と平衡化することが可能な化合物Ｉの結晶性遊離塩基の形態を製造する試みは継続中である。ゲル相で収集したデータを表１に列挙する。
【表１】
0005908455.tif 000022
【００３５】
溶液状態の安定性
化合物Ｉの溶液状態の安定性を温度、ｐＨ、高輝度照明（ＨＩＬ）、バッファー濃度、および薬剤濃度の関数として評価した。用いた実験的マトリックスを表２に示す。
【表２】
0005908455.tif 000023
【００３６】
コハク酸バッファーを全ての溶液に用いた。光に曝露したサンプルでは、光安定性チャンバーをＩＣＨガイドライン（可視光暴露：１２０００００ ｌｕｘ・時間、ＵＶ：２００ワット時／ｍ２）に沿って用いた。４、８および１２週目に分析を行った。
【００３７】
溶液安定性の研究中、１０個の分解産物が観察された。１２週間保存後のサンプルに見られる各分解産物のパーセンテージを表３に示す。注：開始時点では、分解産物ＢおよびＧのみが見られ、それぞれの最初の濃度は０．１７％および０．０６％であった。
【００３８】
質量分析が可能である十分な量において存在する分解産物について、質量分析による評価を行った。その結果を表４に示す。分解産物Ｂに挙げられる２つのピークは現在のＨＰＬＣ技法では十分に分離できなかったため、分解産物Ｂに示す。分解産物ＡおよびＣは加水分解産物に対応する（図２）。
【００３９】
試験された最も好ましい条件、即ち、表２の条件Ｉでは、化合物Ｉは４０℃で１２週間後においてわずか０．３％しか分解されなかった。これにより、少なくとも１年間の化学的安定性についてＩＣＨガイドラインを満たす水性の製剤が見出される可能性が示唆される。
【表３】
0005908455.tif 000024
【表４】
0005908455.tif 000025
【化２１】
0005908455.tif 000026
【００４０】
溶液安定性：温度の影響
温度の影響を表５に要約する。温度上昇に伴う分解速度の上昇は、ほぼ加水分解の亢進によるものである。最も高い温度において分解は最終的に分解産物Ｃに到達したが、最も低い温度では分解は分解産物Ａで停止した（図２）。
【表５】
0005908455.tif 000027
【００４１】
溶液安定性：光の影響
安定性に対する光の影響を表６に要約する。光曝露されたサンプルにおいて７個の分解産物が記録されたが、その内の３個は他のいずれの条件においても観察されなかった。加水分解（分解産物Ａ）は光曝露により促進された。
【表６】
0005908455.tif 000028
【００４２】
溶液安定性：ｐＨの影響
分解速度に対するｐＨの影響を表７に要約する。分解速度の加速はｐＨと逆相関し、主に加水分解の亢進によるものであった。ｐＨ４において分解は加水分解産物Ｃにまで進んだが、ｐＨ５および６では、加水分解産物Ａで停止した。
【表７】
0005908455.tif 000029
【００４３】
溶液安定性：バッファー濃度の影響
コハク酸バッファーの濃度が高いほど、分解産物Ａへの加水分解速度が加速する傾向が見られた（表８）。
【表８】
0005908455.tif 000030
【００４４】
溶液安定性：薬剤濃度の影響
薬物含有量を増大させることにより加水分解速度が減速し、加水分解が分解産物Ａの形成に制限された（表９）。分解産物Ｇは、高濃度のサンプルにおいてのみ検出されたものであるが、本研究中の濃度においては著しく増量することはなく、単なる不純物と考えられる。分解産物Ｊは、最後のタイムポイントにおいてのみ検出することができた。
【表９】
0005908455.tif 000031
【００４５】
［１２５Ｉ］ＣＧＲＰの結合との競合
結合アッセイ
ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞膜のホモジネートを受容体の供給源として用いた。クローニングされたヒトＣＧＲＰ受容体と同一の配列の内因性のＣＧＲＰ受容体を発現している（Aiyar et al., 2001）ため、ヒト神経芽腫ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞をインビトロアッセイに用いた。細胞を３７℃、５％ＣＯ２において、アール塩およびＬ−グルタミンを含有する１０％ウシ胎児血清添加ＭＥＭ中でコンフルーエンスに達するまで増殖させた。細胞をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄することにより回収し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）および５ｍＭ ＥＤＴＡからなる低浸透圧性溶解バッファー中、４℃において５−１０分間インキュベートした。細胞を回収し、ポリプロピレンチューブに移し、ポリトロン（登録商標）を用いてホモジナイズした。ホモジネートを３２，０００ｘｇで３０分間遠心した。０．１％哺乳類プロテアーゼ阻害剤カクテルを含有する冷却した低浸透圧性溶解バッファーでペレットを再懸濁し、タンパク濃度を定量した。次いで、膜ホモジネートを分注し、アッセイ当日まで−８０℃で保存した。
【００４６】
化合物Ｉの放射標識内因性ヒトαＣＧＲＰ（ｈαＣＧＲＰ）ペプチド（［１２５Ｉ］ＣＧＲＰ、Amersham Biosciences）との競合能を放射性リガンド競合アッセイで測定した。化合物Ｉをまず１００％ ＤＭＳＯに可溶化し、段階希釈を行った。化合物をさらにアッセイバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ７．５、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．００５％ Ｔｒｉｔｏｎ X−１００）で２５倍に希釈し、９６ウェルアッセイプレートに移した（５０μｌ）。［１２５Ｉ］−ＣＧＲＰをアッセイバッファーで６００ｐＭに希釈し、５０μｌを各ウェル（アッセイ最終濃度１５ｐＭ）に加えた。ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞ペレットを解凍し、新たに０．１％ 哺乳類プロテアーゼ阻害剤カクテルを含有するアッセイバッファーで希釈し、前記のようにホモジナイズした。ウェルあたり５から１０μｇ（タンパク質）を１００μｌに加えた。次いで、アッセイプレートを室温（２５℃）で２時間インキュベートした。過剰量の冷洗浄バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ７．５、０．１％ＢＳＡ）を加えてアッセイを終了し、前もって０．５％ＰＥＩに浸漬したガラス繊維濾紙で直ちに濾過した。非特異的結合は１μＭ β−ＣＧＲＰで決定した。結合したタンパク質の放射活性はシンチレーションカウンターを用いて測定した。ＩＣ５０は放射標識リガンドの結合を５０％阻害することに必要な化合物の濃度として定義される。
【００４７】
結果
化合物Ｉは、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞膜に発現される内因性ＣＧＲＰ受容体への［１２５Ｉ］ＣＧＲＰの結合の濃度依存的な阻害を示した。平均Ｋｉは２２．７±１．６ｐＭであった。
【００４８】
ＣＧＲＰペプチドとの相互関係
方法
飽和結合実験を用い、内因性ＣＧＲＰペプチドと化合物Ｉとの相互関係の性質を詳細に解析した。簡単に述べると、２種類の濃度（３０ｐＭおよび１００ｐＭ）のいずれか一方の濃度の化合物Ｉの非存在下（コントロール条件）または存在下（試験条件）において、［１２５Ｉ］ＣＧＲＰ濃度を漸増しながら［１２５Ｉ］ＣＧＲＰのＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞膜調製物への結合を測定した。Ｋｅｌｌソフトウェア（Biosoft、ケンブリッジ、ＵＫ）を用いて飽和データを双曲線方程式で解析し、解離定数（Ｋｄ）および結合部位の最大数（Ｂｍａｘ）を推定した。［１２５Ｉ］ＣＧＲＰの結合パラメーター（Ｋｄ、Ｂｍａｘ）に対する化合物Ｉ添加の影響を測定し、比較した。
【００４９】
結果
化合物Ｉは濃度依存的に［１２５Ｉ］ＣＧＲＰの結合の解離定数Ｋｄを増大させた（親和性は低下）が、［１２５Ｉ］ＣＧＲＰの結合部位の最大数（Ｂｍａｘ）は有意に変化しなかった。これにより、［１２５Ｉ］ＣＧＲＰのヒト受容体への結合の化合物Ｉによる阻害が競合的なメカニズムであることが示唆された（表１０）。
【表１０】
0005908455.tif 000032
【００５０】
細胞機能アッセイ−サイクリックＡＭＰアッセイ
方法
ＣＧＲＰ受容体複合体はＧタンパク質のＧｓクラスと共役する。ＣＧＲＰのこの複合体への結合により、Ｇｓ依存的なアデニル酸シクラーゼの活性化を介したサイクリックＡＭＰ（アデノシン ３’５’−環状一リン酸）の産生が誘起される。
【００５１】
化合物Ｉによる機能的アンタゴニズムは、接着ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞全体におけるＣＧＲＰ刺激性サイクリックＡＭＰ産生の阻害能を測定することにより決定した。ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞を０．３ｎＭ ＣＧＲＰのみの存在下において室温で３０分間インキュベート、あるいは０．３ｎＭ ＣＧＲＰの添加前に異なる濃度の化合物Ｉと共に１５分間プレインキュベートし、さらに３０分間インキュベートした。産生されたサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）を「溶解試薬」を用いて抽出し、RPA559 cAMP SPA Direct Screening Assay Kit（Amersham Pharmacia Biotech）を用いたラジオイムノアッセイでその濃度を測定した。０．３ｎＭ ＣＧＲＰ刺激性ｃＡＭＰ産生の５０％阻害に必要な化合物濃度としてＩＣ５０値を決定した。Ｙｍａｘは０．３ｎＭ ＣＧＲＰ刺激性ｃＡＭＰ産生の最大阻害パーセントとして定義される。
【００５２】
結果
化合物Ｉは、接着ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞全体におけるＣＧＲＰ刺激性サイクリックＡＭＰ産生の濃度依存的な阻害を示し、ＩＣ５０は３８．６±４．２ｐＭ、Ｙｍａｘは９５．４（±１．３）％であった。観察された最大阻害は約１００％であり、ＣＧＲＰ受容体の完全なアンタゴニズムが示唆された。
【００５３】
シルド解析
方法
シルド解析を化合物Ｉのアンタゴニズムの性質の特徴付けに用いた。ＣＧＲＰ刺激性ｃＡＭＰ産生の用量応答をＣＧＲＰ単独、あるいは異なる濃度の化合物Ｉの存在下におけるＣＧＲＰについて得た。特に、ＣＧＲＰによる用量依存的ｃＡＭＰ産生を５種類の濃度の化合物Ｉの存在下または非存在下においてアッセイした。化合物Ｉの濃度をＹ軸上の「用量比−１」に対してＸ軸上にプロットした（用量比は化合物Ｉの存在下におけるＣＧＲＰのＥＣ５０をＣＧＲＰ単独のＥＣ５０で割ったものである）。次いで、対数変換したＸおよびＹ軸について線形回帰を行った。傾きは１から大きく外れなかったため、競合的アンタゴニズムであることが示唆される。Ｋｂはアンタゴニストの解離定数である。
【００５４】
結果
化合物Ｉのシルド解析により、傾きの平均が１．０２±０．０４であり、アンタゴニストの解離定数Ｋｂの平均が２１．５±９．４ｐＭであることが分かった。漸増濃度の化合物Ｉの存在下においてＣＧＲＰの濃度応答が右方向に平行シフトしたことにより、ＣＧＲＰ刺激性ｃＡＭＰ産生の化合物Ｉによる競合的アンタゴニズムが示唆される。シルドプロットの傾きが１．０２であることにより、化合物ＩとＣＧＲＰ機能の競合的な相互作用がさらにサポートされる。２１．５ｐＭのＫｂは結合のＫｉ（２２．７ｐＭ）と一致している。
【００５５】
エクスビボにおけるヒト頭蓋内動脈のＣＧＲＰ誘発性拡張の回復
臨床状態（片頭痛に関連するＣＧＲＰ放出が治療の開始に先行する状態）を模倣するエクスビボにおける手段を獲得するため、まず、血管をＣＧＲＰにより拡張し、次いで、化合物Ｉにより拡張を回復させた。この回復プロトコルでは、アンタゴニストの後処理によりＣＧＲＰ誘発性動脈拡張が回復される（アゴニストの単回投与およびアンタゴニストの複数回投与を用いる）。簡単に述べると、ワイヤーを取り付けた動脈輪をカリウムイオン（内因性の張力を模倣するため）で収縮させ、ＣＧＲＰで完全に拡張し、漸増濃度のＣＧＲＰアンタゴニスト化合物Ｉで拡張を回復させる。化合物Ｉによる後処理は、エクスビボにおけるヒト頭蓋内動脈の完全なＣＧＲＰ誘発性拡張の回復に有効であった。
【００５６】
組織サンプル
ヒト動脈の剖検サンプルは組織調達業者から得た。全ての血管は氷冷ＨＥＰＥＳバッファー（組成（ｍＭ）：ＮａＣｌ １３０、ＫＣｌ ４、ＫＨ２ＰＯ４ １．２、ＭｇＳＯ４ １．２、ＣａＣｌ２ １．８、グルコース ６、ＮａＨＣＯ３ ４、ＨＥＰＥＳ １０、ＥＤＴＡ ０．０２５）中で輸送された。受領時に、血管をカルボゲン（５％ ＣＯ２および９５％ 酸素）で飽和した冷クレブスバッファー（組成（ｍＭ）：ＮａＣｌ １１８．４、ＫＣｌ ４．７、ＫＨ２ＰＯ４ １．２、ＭｇＳＯ４ １．２、ＣａＣｌ２ １．８、グルコース １０．１、ＮａＨＣＯ３ ２５）中に置いた。
【００５７】
方法
血管から結合組織を洗浄し、４−５ｍｍの長さの円筒状のセグメントに切断する。次いで、該血管を２つのステンレス製のフック間の組織浴内に設置し；一方を固定し、他方をフォースディスプレイスメントトランデューサー（force displacement transducer）に連結する。血管の張力はデータ収集システム（Powerlab, AD Instruments, Mountain View, CA）を用いて連続的に記録される。クレブスバッファーおよび設置した血管を含む組織浴は温度３７℃、ｐＨ７．４にコントロールされ、カルボゲンが連続的にバブルされる。一定の安静時張力（０．２５から０．５ｇ）となるまで動脈のセグメントを約３０−４５分間平衡化する。アッセイ前に血管を１００ｍＭ ＫＣｌで予備刺激（条件付け）し、次いで洗浄した。
【００５８】
化合物Ｉの抗張効果を評価するため、血管をまず１０ｍＭ 塩化カリウム（ＫＣｌ）で収縮させて内因性の張力を模倣し、次いで、１ｎＭ ｈαＣＧＲＰで完全に拡張させ、最後に、half log単位（ＥＣ５０の算出を可能にするため）で漸増する濃度の化合物Ｉの累積添加により拡張を回復させた。各濃度において、薬剤の効果は各血管におけるＣＧＲＰ誘発性拡張の回復（％）で表される。ＥＣ５０値を推定するため、各血管のデータ解析は、濃度応答データを４つのパラメーターのロジスティック関数に非線形回帰分析により個別にフィッティングして行われた。
【００５９】
結果
化合物Ｉは、エクスビボにおけるヒト頭蓋内動脈のＣＧＲＰ誘発性拡張に対し強力かつ完全な回復（ＥＣ５０＝８８０±５０ｐＭ）を示した。
【００６０】
シルド解析：エクスビボにおけるヒト頭蓋内動脈のＣＧＲＰ濃度応答曲線の阻害
あるＣＧＲＰ濃度範囲に対する機能的アンタゴニズムを評価するため、組織浴内の個々の動脈輪を化合物Ｉでプレインキュベートし、次いで、血管の完全な拡張が達成できるＣＧＲＰの濃度応答曲線を作成した（アゴニストの複数回投与およびアンタゴニストの複数回投与を用いる）。アンタゴニストのより高い濃度においてＣＧＲＰ濃度応答曲線の「右側シフト」が見られ、アンタゴニストの存在を上回って血管の完全な拡張の達成により高濃度のアゴニストが必要となった。簡単に述べると、ワイヤーを取り付けた動脈輪をアンタゴニストでプレインキュベートし、次いで、ＫＣｌ（内因性の張力を模倣するため）で収縮させ、漸増濃度のＣＧＲＰを加えて完全に拡張させる。化合物Ｉによる前処理はエクスビボにおけるヒト頭蓋内動脈のＣＧＲＰ誘発性拡張の阻害に有効であり、ＣＧＲＰ濃度応答曲線に平行な右側シフトを示した。
【００６１】
方法
ワイヤーを取り付けた各動脈輪を単一濃度（０．１−３０ｎＭ）のアンタゴニスト化合物Ｉで３０分間プレインキュベートし、次いで、１０ｍＭ ＫＣｌ（内因性の張力を模倣するため）で収縮させ、漸増濃度のＣＧＲＰを加えて血管の完全な拡張を達成させる。ＫＣｌ収縮により、ＣＧＲＰ添加前のアンタゴニストのプレインキュベート時間が約４５分となるよう安定化することができる。
【００６２】
結果
化合物Ｉは、エクスビボにおけるヒト頭蓋内動脈のＣＧＲＰ濃度応答曲線の平行な右側シフトを引き起こした。シルド解析によると、Ｋｂは９１ｐＭであった。これらの結果はインビトロにおける結合（Ｋｉ＝２２．７ｐＭ）および機能（Ｋｂ＝２１．５ｐＭ）アッセイとよく一致する。
【００６３】
マーモセットの顔面血流に対する化合物Ｉのインビボでの効果
新規ＣＧＲＰ受容体アンタゴニストのインビボでの効果を評価するため、マーモセットにｈαＣＧＲＰを一連の４回の静脈内注射（４５分間隔）で投与した。１回目のものはベースラインコントロールとしてのものであり、続いて試験化合物の皮下送達を行った。次の３回のＣＧＲＰ投与により、インビボでのＣＧＲＰの機能的アンタゴニズムの評価が可能となる。本研究では、化合物Ｉの強力かつ持続性のＣＧＲＰアンタゴニズムが示された。
【００６４】
方法
マーモセットを麻酔し、４５分間隔（−３０、１５、６０および１０５分）のｈαＣＧＲＰの静脈内注射（ＩＶ）により顔面血流を増加させた。０分の時点において送達された試験化合物のｈαＣＧＲＰ誘発性顔面血流変化に対する効果は、レーザードップラー血流計で測定した。有効な化合物であれば、１５、６０および１０５分で見られるｈαＣＧＲＰ誘発性の顔面血流の上昇を抑制するであろう（−３０分で見られるｈαＣＧＲＰのベースラインに対する効果に比べて）。
【００６５】
対象
体重３５０−６５０ｇの成熟オスおよびメスのコモンマーモセット（Callithrix jacchus）を対象として用いた。
【００６６】
麻酔および準備
導入チャンバー（４−５％の急速導入、１−２．５％で維持；Solomon et al., 1999）内でイソフルラン吸入により動物を麻酔した。麻酔は挿管および換気（血中ガスモニタリングを行いながら）により空気：酸素（５０：５０）およびイソフルランを送達して維持した。体温は、直腸計を用い、自動温度制御板上に置くことにより３８±０．５℃に維持した。脱毛クリームまたは剃毛により、顔の片側または両側の毛皮の小さな領域（約１．５平方ｃｍ）を除去した。手術領域をクリップし、ベタジンで処理した。試験化合物およびＣＧＲＰ受容体アゴニストｈαＣＧＲＰを投与するため、ＩＶ管を伏在静脈に挿管した。さらに、このＩＶ管により、血中ガスモニタリングおよび化合物の血中濃度分析用の血液サンプル（最大２．５ｍＬ、１０％）を採取することができる。血糖値を維持するため、５％デキストロース溶液がＩＶ投与される。麻酔の深さは、非侵襲的アームカフ法およびパルスオキシメータでそれぞれ血圧および心拍数を測定することによりモニターした。顔面血流のピークフラックスを安定させるため、グアネチジン５−１０ｍｇ／ｋｇ ＩＶ（必要に応じて５ｍｇ／ｋｇ ＩＶを補充）を投与した（投与しない場合、繰り返し刺激することにより次第に減少する（Escott et al., 1995））。微小血管血流は、自己接着性レーザードップラー血流プローブを顔面の皮膚に接着させることによりモニターした。該プローブは、２つのレーザービーム間を横切った赤血球の数をそれらの速度とかけあわわせたものを記録する（フラックスの変化として報告される）。
【００６７】
薬剤の送達
試験化合物は頸筋のＳＣ（０．１−０．６ ｍｌ／ｋｇ）により投与された。ＣＧＲＰ受容体アゴニスト、ｈαＣＧＲＰは１０μｇ／ｋｇの投与量でＩＶ（１ｍｌ／ｋｇ）により投与された。
【００６８】
試験プロトコル
インビボでの有効性および作用時間を調べるため、薬剤送達の３０分前（−０．５時間）にｈαＣＧＲＰ（１０μｇ／ｋｇ ＩＶ）を投与することにより、顔面血流のコントロールとしての上昇を誘起した。次いで、化合物Ｉを０時間の時点（０分）で投与し、ｈαＣＧＲＰを４５分間隔で〜２時間繰り返した（データは投与後０．２５、１および１．７５時間で収集した）。化合物Ｉは０．００３、０．０１および０．０３ｍｇ／ｋｇの投与量においてＳＣで投与した。血漿サンプルは各ｈαＣＧＲＰ投与の直前に採取した。試験後、動物は、完全に覚醒し歩行可能な状態になるまで動物を保温し続ける温度制御板上に置かれた輸送ケージに戻した。１４−２１日間の休養およびウォッシュアウト期間後、動物を再度試験に用いることができる。
【００６９】
結果
化合物Ｉ（０．００３−０．０３ｍｇ／ｋｇ、ＳＣ）は、マーモセットの顔面血流のＣＧＲＰ誘発性増加に対し用量依存的な阻害を示した。強力な（５３−８０％）阻害は０．０３ｍｇ／ｋｇにおいて投与後０．２５、１および１．７５時間で見られた。著しい（３５−４０％）阻害は、０．０１ｍｇ／ｋｇにおいて投与後全ての時点で見られた。０．００３ｍｇ／ｋｇでは、穏やか（２０％）だが有意な阻害が０．２５時間で見られたが、それ以降の試験時間では見られなかった。
【００７０】
効果と曝露を比較した結果、≧８ｎＭの血漿濃度が有意なインビボでの化合物Ｉの効果と相関し、≧２５ｎＭの血漿濃度が最大効果と相関する。
【００７１】
ラットにおける鼻腔内刺激の研究
化合物Ｉおよび化合物ＩＩＩ：ラットにおける鼻腔内刺激の１週間比較実験
本研究は、オスのラットに１週間鼻腔内投与した場合の化合物Ｉと化合物ＩＩＩの鼻腔内刺激の可能性を比較するために行われた。オスのラット（１０／群）に、化合物Ｉまたは化合物ＩＩＩ溶液（２５、７５または１７５ｍｇ／Ｌ／２２５ｍＭコハク酸、０．０２％塩化ベンザルコニウム、１．２５％無水デキストロース、ｐＨ５．８−６．２）を１日１回、１００μＬ／鼻孔の投与量で鼻腔内注入した。この投与パラダイムを用い、５、１５または３５ｍｇの固定用量の試験化合物を毎日投与した。結果として、ラットが成長するにつれ、体重で補正した投与量は減少した。コントロール群の１群にはコハク酸ベヒクルを投与し、シャムコントロール群には生理食塩水を鼻腔内注入により投与した。評価されたパラメーターは、臨床観察、体重、摂餌量、毒物動態学、および鼻の組織の組織学的評価を含む。
【００７２】
毒物動態学的パラメーターの値を表１１に示す。
【表１１】
0005908455.tif 000033
【００７３】
化合物Ｉの鼻腔内投与によりラットにおいて２４時間で全身曝露が提供され、この１週間の研究において初日と最終日では僅かな違いしか観察されなかった。
【００７４】
化合物Ｉの鼻腔内投与は良好な耐容性を示した；全ての投与群およびベヒクルコントロール群における存命中の所見は唾液分泌の上昇に限られており、おそらくは、この研究で用いられた著しく大量の投与体積に関連したものである。唾液分泌は生理食塩水を投与したラットでは見られなかった。
【００７５】
鼻腔内刺激は両方の化合物で見られたが、投与範囲において、化合物Ｉにより引き起こされた嗅上皮萎縮は、化合物ＩＩＩに比べて明らかに軽度のものであった（表１２）。損傷のタイプは以前化合物ＩＩで観察されたものと一致していた。鼻腔における所見の重篤度および観察頻度から、化合物Ｉは化合物ＩＩＩに比べて優れた鼻腔毒性プロフィールを有していることが示された。
【表１２】
0005908455.tif 000034
【００７６】
化合物Ｉおよび化合物ＩＩ:ラットにおける鼻腔内刺激の１週間調査研究
化合物Ｉおよび化合物ＩＩについて、鼻腔内刺激を直接比較した。オスのラット（６／群）に化合物Ｉおよび化合物ＩＩの（２２５ｍＭ コハク酸、１．２５％ 無水デキストロース、ｐＨ ５．８−６．２）溶液（７５または１７５ｍｇ／Ｌ）を１日１回、１２．５、２５または１００ｍＬ／鼻孔の投与体積において鼻腔内投与した。この研究では、鼻甲介の組織学的評価が評価した唯一のエンドポイントであった。
【００７７】
評価された各投与量（投与体積ｘ濃度）において、化合物Ｉにより引き起こされた嗅上皮萎縮は化合物ＩＩによるものと比べ、明らかに低い重篤度のものであった（表１３）。
【表１３】
0005908455.tif 000035
【００７８】
化合物ＩＩの用量−応答の関係は他の研究で観察されたものと一致していた。投与体積および濃度が増加するとより重篤な鼻腔毒性に寄与するが、濃度がより重要な因子であると考えられる。
【００７９】
要約すると、鼻腔内刺激に関し、化合物Ｉは化合物ＩＩに比べ優れていることが示された。
【００８０】
鼻腔内送達の可能性
ＣＧＲＰアンタゴニストの鼻腔内（ＩＮ）投与経路は、迅速な作用発現の可能性を有する非侵襲性送達が可能となるため、魅力的である。透過性の高い鼻腔上皮バリアー、良好な灌流状態にある粘膜組織、および限定された代謝能／組織滞留時間は、経口投与による吸収が非常に低い化合物Ｉのような化合物の鼻腔内送達をサポートする非常に有用な特性である。
【００８１】
鼻腔内送達の可能性をウサギの鼻腔内投与モデルにおいて、鼻腔内送達した化合物Ｉの血漿濃度−時間プロフィールおよび薬物動態学的パラメーター（Ｃｍａｘ、Ｔｍａｘ、ＡＵＣおよび生物学的利用能）とＩＶ経路により送達したものとを比較することにより評価した。投与した溶液濃度および投与体積は各実験のデータテーブルに含まれる。ベヒクルの組成は下表の備考に記載される。
【００８２】
方法
３−３．５ｋｇの範囲のオス  ニュージーランドホワイト３羽の群に、薬剤を以下の処方の１つにおいて単回投与した：０．５ ｍｇ／ｋｇ、３０秒間のＩＶボーラス注入、または０．３−３ｍｇ／ｋｇ、シリンジマイクロスプレーによるＩＮ投与。ＩＮ投与する前に、セボフルランの吸入麻酔により軽く鎮静させた。ウサギは２−５分以内に意識を回復した。一連の血液サンプルをヘパリン含有バキュテナーに、投与前２、５、１０、１５、３０分および投与後１、２、４、６、および２４時間後に採取した。血液サンプルは直ちに４℃で遠心し、分離した血漿をさらなるＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析まで−８０℃で保存した。
【００８３】
結果
薬物動態学的プロフィールにより、溶液として噴霧されると化合物Ｉはウサギの鼻孔から迅速に吸収されることが示唆された。ピーク濃度に到達するまでの時間（Ｔｍａｘ）は、実験した全ての投与量において０．２−０．３時間（１５−２０分）であった。０．３、１、および３ｍｇ／ｋｇにおける絶対的生物学的利用能は１３から３０％の範囲にあり、Ｃｍａｘは０．１２から２．０μＭの範囲であった（表１４）。
【表１４】
0005908455.tif 000036
【００８４】
ウサギにおける化合物Ｉの鼻腔内吸収は非常に迅速であった。＞１０ｎＭの血漿中濃度が５分以内に観察された。薬剤は、血中において、低用量で投与後少なくとも６時間、高用量で最大２４時間検出された。
【００８５】
先の研究では、投与濃度ではなく鼻腔内投与体積を変化させた際に、化合物ＩＩについてより大きな線形性との偏差が存在した。化合物Ｉの投与体積を一定に保ち、投与溶液濃度を変化させることにより、ＩＮ  ＡＵＣおよびＣｍａｘは用量依存性の線形性を示した（表１５）。これらのパラメーターのばらつきはまた、用量とともに増加した。これと同様の評価では、試験した３種類の投与量においてＩＮ時の生物学的利用能は投与量（または投与濃度）と共に上昇した（表１５）。
【表１５】
0005908455.tif 000037
【００８６】
要約すると、化合物Ｉの鼻腔内経路を介した投与により、迅速な全身性の吸収および経口投与に比べて比較的長い時間の血漿濃度の維持が可能となる。高い水溶性および優れた溶液安定性により、適当な噴霧装置の形態の鼻腔スプレー製剤の利用がよく支持される。ヒトにおける鼻腔への薬剤溶液の送達およびその蓄積は、前臨床的なＩＮ動物モデルにおけるものよりもさらに強力で再現性の高いものであることが期待される。化合物Ｉの製剤は、再利用可能な複数投与単位または使い捨ての投与単位の鼻腔スプレー装置における送達が企図される。
【００８７】
医薬組成物および治療方法
本発明の別の一態様は、化合物Ｉを医薬的に許容される佐剤、担体、または希釈剤と共に含む医薬組成物である。
【００８８】
一般的に、化合物Ｉは、治療上の有効量の化合物Ｉまたはその医薬的に許容される塩、ならびに医薬的に許容される担体を含み、一般的な賦形剤を含んでいてもよい医薬組成物として提供されるであろう。治療上の有効量は、当該分野の医師により決定される有意義な患者利益の提供に必要な量である。医薬的に許容される担体は、許容可能な安全性プロフィールを有する一般的に知られている担体である。組成物は、全ての固形および液体の剤形、例えば、カプセル剤、錠剤、ロゼンジ剤、および散剤、ならびに液体懸濁物、シロップ剤、エリキシル剤、および溶液を包含する。固形組成物は、放出制御製剤または徐放性製剤に製剤化されてもよい。組成物は一般的な製剤技法ならびに一般的な賦形剤（結合剤および湿潤剤など）および媒体（水およびアルコールなど）を用いて製造される。
【００８９】
固形組成物は通常、１回の投与あたり約１から約１０００ｍｇの活性成分を提供する投与単位に製剤化される。固形用量単位のいくつかの例は、０．１ｍｇ、１ｍｇ、１０ｍｇ、１００ｍｇ、５００ｍｇ、および１０００ｍｇである。液体組成物は通常、１−１００ｍｇ／ｍＬの単位用量範囲にある。液体の用量単位のいくつかの例は、０．１ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、および１００ｍｇ／ｍＬである。
【００９０】
本発明は全ての一般的な投与方法、例えば、経口、非経口、鼻腔内、舌下、および経皮方法を包含する。典型的には、１日用量は０．０１−１００ｍｇ／ｋｇ体重である。一般的に、経口ではより多量の化合物が、非経口では少量の化合物が必要とされる。しかしながら、具体的な投与レジメンは、正常な医学的判断により医師が決定するべきである。
【００９１】
本発明の別の一態様は鼻腔内投与である。
【００９２】
受容体レベルのＣＧＲＰの阻害剤は、ＣＧＲＰ受容体の過剰な活性化が起こっている病態生理学的状態に有用であるとされる。これらのいくつかは、例えば、神経原性血管拡張、神経原性炎症、片頭痛、群発性頭痛および他の頭痛、熱傷、循環性ショック、閉経期紅潮、ならびに喘息である。ＣＧＲＰ受容体の活性化は片頭痛の病因と関連している（Edvinsson L. CNS  Drugs 2001, 15(10),745−53；Williamson, D. J. Microsc. Res. Tech. 2001, 53, 167−178.；Grant, A. D. Brit. J. Pharmacol. 2002, 135, 356−362.）。ＣＧＲＰの血清濃度は片頭痛の期間中上昇し（Goadsby P. J. et al. Ann. Neurol. 1990, 28, 183−7）、抗片頭痛薬の治療により頭痛が改善するにつれＣＧＲＰ濃度は通常に回復する（Gallai V. et al. Cephalalgia 1995;15: 384−90）。片頭痛患者はコントロールに比べて高いＣＧＲＰの基底濃度を呈する（Ashina M, et al., Pain 2000, 86(1-2):133−8.2000）。ＣＧＲＰの静脈内注入により、片頭痛患者における頭痛が持続される（Lassen LH, et al. Cephalalgia 2002 Feb;22(1):54−61）。イヌおよびラットにおける前臨床的研究により、ペプチドアンタゴニストＣＧＲＰ（８−３７）で全身のＣＧＲＰをブロックしても安静時の全身血行動態および局所血流は変化しないことが報告された（Shen, Y−T. et al, J Pharmacol Exp Ther 2001, 298, 551−8）。従って、ＣＧＲＰ受容体アンタゴニストは非選択的５−ＨＴ１Ｂ／１Ｄアゴニスト「トリプタン類」（例えば、スマトリプタン）に関連する能動的血管収縮の心血管系における易罹病性を回避する、片頭痛の新たな治療を提供し得る。
【００９３】
本発明の別の一態様は、式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容される塩でＣＧＲＰ受容体に接触することを特徴とするＣＧＲＰ受容体の阻害方法である。
【００９４】
本発明の別の一態様は、治療上の有効量の式（Ｉ）の化合物を患者に投与することを特徴とする、ＣＧＲＰまたはＣＧＲＰ受容体シグナリングレベルの異常が関連する病態の治療方法である。
【００９５】
本発明の別の一態様は、ＣＧＲＰまたはＣＧＲＰ受容体シグナリングレベルの異常が関連する病態の治療剤の製造における式（Ｉ）の化合物の使用である。
【００９６】
本発明の別の一態様は、片頭痛または頭痛の治療方法である。
【００９７】
本発明の別の一態様は、神経障害性疼痛の治療方法である。
【００９８】
本発明の別の一態様は、炎症（特に、神経原性炎症）、疼痛、熱傷、循環性ショック、糖尿病、レイノー症候群、末梢動脈不全、くも膜下／頭蓋出血、腫瘍増殖、閉経に伴う紅潮、ならびに本明細書中で定義される式（Ｉ）の化合物を含む医薬組成物の投与によるＣＧＲＰ受容体のアンタゴニズムが有効であり得る他の病態の治療方法に関連する。
【００９９】
本発明の別の一態様は、（ａ）腸管粘膜における免疫の制御；（ｂ）アナフィラキシー性心障害に対する保護効果；（ｃ）骨再吸収のインターロイキン−１ｂ（ＩＬ−１ｂ）による刺激の促進または阻害；（ｄ）脊髄神経細胞におけるＮＫ１受容体発現の調節；および（ｅ）炎症性呼吸器疾患症候群および慢性閉塞性肺疾患（喘息を含む）からなる群より選択される方法に関連する。 （a) Calcitonin Receptor−Like Receptor Is Expressed on Gastrointestinal Immune Cells.  Hagner, Stefanie；Knauer, Jens；Haberberger, Rainer；Goeke, Burkhard；Voigt, Karlheinz；McGregor, Gerard Patrick.  Institute of Physiology, Philipps University, Marburg, Germany.  Digestion (2002), 66(4), 197−203； (b) Protective effects of calcitonin gene−related peptide−mediated evodiamine on guinea−pig cardiac anaphylaxis.  Rang, Wei−Qing；Du, Yan−Hua；Hu, Chang−Ping；Ye, Feng；Tan, Gui−Shan；Deng,  Han−Wu；Li, Yuan−Jian.  School of Pharmaceutical Sciences, Department of Pharmacology, Central South University, Xiang−Ya Road 88, Changsha, Hunan, Naunyn−Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology (2003), 367(3), 306−311； (c)  The experimental study on the effect calcitonin gene−related peptide on bone resorption mediated by interleukin−1.  Lian, Kai；Du, Jingyuan；Rao, Zhenyu；Luo, Huaican.  Department of Orthopedics, Xiehe Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan, Peop. Rep. China.  Journal of Tongji Medical University (2001), 21(4), 304−307； (d) Calcitonin gene−related Peptide regulates expression of neurokinin1 receptors by rat spinal neurons. Seybold VS, McCarson KE, Mermelstein PG, Groth RD, Abrahams LG.  J. Neurosci.  2003 23 (5): 1816−1824.  epartment of Neuroscience, University of Minnesota, Minneapolis, Minnesota 55455, and Department of Pharmacology, Toxicology, and Therapeutics, University of Kansas Medical Center, Kansas City, Kansas 66160； (e) Attenuation of Antigen−induced airway hyperresponsiveness in CGRP−deficient mice.  Aoki−Nagase, Tomoko；Nagase, Takahide；Oh−Hashi, Yoshio；Shindo, Takayuki；Kurihara, Yukiko；Yamaguchi, Yasuhiro；Yamamoto, Hiroshi；Tomita, Tetsuji；Ohga, Eijiro；Nagai, Ryozo；Kurihara, Hiroki；Ouchi, Yasuyoshi.  Department of Geriatric Medicine, Graduate School of Medicine, University of Tokyo, Tokyo, Japan.  American Journal of Physiology (2002), 283(5,Pt. 1), L963−L970；(f) Calcitonin gene-related peptide as inflammatory mediator. Springer, Jochen；Geppetti, Pierangelo；Fischer, Axel；Groneberg, David A.  Charite Campus−Virchow, Department of Pediatric Pneumology and Immunology, Division of Allergy Research, Humboldt−University Berlin, Berlin, Germany.  Pulmonary Pharmacology & Therapeutics (2003), 16(3), 121−130；および (g) Pharmacological targets for the inhibition of neurogenic inflammation.  Helyes, Zsuzsanna；Pinter, Erika；Nemeth, Jozsef；Szolcsanyi, Janos.  Department of Pharmacology and Pharmacotherapy, Faculty of Medicine, University of Pecs, Pecs, Hung. Current Medicinal Chemistry: Anti−Inflammatory & Anti−Allergy Agents (2003), 2(2), 191−218を参照されたい。
【０１００】
本発明の別の一態様は、癌ならびに増殖性の疾患および病態の治療方法に関連する。ＣＧＲＰアンタゴニストはまた、悪性疾患、特に神経膠腫ならびに脳に転移する乳癌の治療に有用性を示すとされている。ＣＧＲＰアンタゴニストは、特に酸素欠乏腫瘍に対し有用であり、接種転移の予防に有用である可能性がある。ＰＣＴ国際出願番号第ＷＯ２０１０００６１６８を参照されたい。
【０１０１】
本発明の別の一態様は、ＣＯＸ−２阻害剤、ＮＳＡＩＤ、アスピリン、アセトアミノフェン、トリプタン、エルゴタミン、ならびに片頭痛治療用カフェインからなる群より選択される１つまたはそれ以上の薬剤と式（Ｉ）の化合物の組み合わせを用いる治療方法に関連する。
【０１０２】
「片頭痛」、「頭痛」および関連する用語は、医療従事者により理解される通りのものである。片頭痛は片頭痛の全ての分類、例えば、普通型片頭痛、典型的片頭痛、群発頭痛、電撃性片頭痛、片麻痺型片頭痛、眼筋麻痺型片頭痛、および眼性片頭痛を包含する。
【０１０３】
「治療上の有効」は、医療従事者に理解されるような有意義な患者利益が存在することを意味する。
【０１０４】
「患者」は、医療従事者に決定される治療が有効である人を意味する。
【０１０５】
本開示が前述の説明的な実施例に限定されず、その本質から逸脱することなく別の具体的な形態で具現化され得ることは当業者に明らかであろう。故に、実施例は全ての点において説明が目的であり限定するものではなく、前述の例ではなく付属の請求項が参照されるべきであり、それ故、請求項と同等の意義および範囲である全ての改変がそれに包含されると意図される。