(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルをグラム染色する方法であって、
サンプルを自動染色装置にロードすること、
グラム陽性及びグラム陰性菌の細胞壁を染色するために十分な条件下で、サンプルを一次染色剤と接触させること、
一次染色剤−捕捉剤複合体を形成するために十分な条件下で、サンプルを捕捉剤と接触させること、
一次染色剤−捕捉剤複合体をグラム陽性菌からは除去しないがグラム陰性菌から除去するために十分な条件下で、サンプルを１，２−プロパンジオール、エチレングリコール又はその混合物を含む脱色製剤と接触させることを含み、
脱色されたグラム陰性菌を染色するために十分な条件下で、サンプルを対比染色剤と接触させることを含む、方法。
【請求項２】
サンプルと対比染色剤との接触が、サンプルと１，２−プロパンジオール、エチレングリコール又はその混合物を含む脱色製剤との接触の少なくとも３０秒経過後に続く、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
サンプルが脱色製剤と少なくとも３０秒間接触させられる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
サンプルが脱色製剤と少なくとも６０秒間接触させられる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
サンプルと脱色製剤との接触が、圧縮空気を使用して達成される、請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
脱色製剤が１，２−プロパンジオール、エチレングリコール又はその混合物を含む脱色剤とそれ以外の脱色剤とを含む、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
脱色製剤が、少なくとも８０％の１，２−プロパンジオール、エチレングリコール又はその混合物を含む脱色剤と２０％以下のそれ以外の脱色剤とを含む、請求項１から６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
脱色製剤が１，２−プロパンジオール又はエチレングリコールを含む、請求項１から７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
グラム陽性又はグラム陰性菌を検出することを更に含む、請求項１から８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
一次染色剤がクリスタルバイオレット試薬であり、捕捉剤がヨウ素試薬である、請求項１から９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
自動染色装置が、
各スライド上に染色されるサンプルを有する複数のスライドを保持するためのカルーセル手段と、
予め決められた速度でカルーセル手段を回転させるための手段と、
カルーセル手段の回転中にスライドとサンプル上に試薬を誘導し塗布を制御するための手段と
を備える、方法であって、
カルーセル中のスライド上にクリスタルバイオレット試薬を誘導して、スライド上の細菌をクリスタルバイオレット試薬と接触させることと、
カルーセル中のスライド上に水、水性緩衝剤又は水性洗剤を誘導して、スライドからクリスタルバイオレット試薬を洗浄することと、
カルーセル中のスライド上にヨウ素試薬を誘導して、スライド上の細菌をヨウ素試薬と接触させることと、
カルーセル中のスライド上に水、水性緩衝剤又は水性洗剤を誘導して、スライドからヨウ素試薬を洗浄することと、
カルーセル中のスライド上に、１，２−プロパンジオール、エチレングリコール又はその混合物を含む脱色製剤と対比染色剤を、同時に又は別々に誘導することと、
カルーセル中のスライド上に水、水性緩衝剤又は水性洗剤を誘導して、スライドから混合試薬を洗浄することと
を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
脱色製剤がグラム陰性菌からクリスタルバイオレット試薬及びヨウ素試薬を除去するために少なくとも６０秒を要する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
１，２−プロパンジオール、エチレングリコール又はその混合物を含む、自動化グラム染色において脱色をするための薬剤。
【請求項１４】
自動化グラム染色のためのキットであって、第１の容器に１，２−プロパンジオール、エチレングリコール又はその混合物を含む脱色製剤を含み、第２の容器に一次染色製剤を、第３の容器に捕捉製剤を、第４の容器に対比染色製剤を含む、キット。
【請求項１５】
容器が、自動化染色装置にロードされるように構成されている、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
一又は複数の顕微鏡スライドを更に含む、請求項１４又は１５に記載のキット。
【請求項１７】
一又は複数のコントロールスライドを更に含む、請求項１６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、微生物を検出し、ある例では同定する目的で、生物学的物質を染色する方法に関する。より特定的には、本開示は、顕微鏡スライド上で自動化グラム染色を実施するための方法、組成物及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
グラム染色は、微生物、特に細菌の検出、分類及び同定のための、周知で一般的に使用される微生物学的技術である。最も一般的なグラム染色の方法は、染色、捕捉、脱色及び対比染色の４つのステップを含む。組織学実験室において一般的に使用されるグラム染色は、特に脱色ステップにおけるばらつきを受けて、一貫性がないことが知られている。脱色ステップに影響を及ぼす可変要素は、溶媒強度、濃度、体積及び暴露時間を含む。手作業でのグラム染色手順では、脱色ステップは、常套的にアルコール又はアセトンを使用し、このステップには数秒しかかからない。しかしながら、自動化染色手順にとって、この脱色プロセスはあまりにも急速に生じる。本開示は、自動化染色プラットフォームおけるグラム染色の脱色の問題を扱う。
【発明の概要】
【０００３】
ここで提供されるものは、グラム染色の自動化を可能にする方法、組成物及びキットである。本発明者は、例えば、自動化及び／又はコンピュータ実装染色装置を使用して、グラム染色の自動化を可能にする、グラム染色の脱色ステップを延長する組成物を同定した。
【０００４】
顕微鏡スライド上のサンプル等のサンプルをグラム染色する方法が提供される。このような方法は、グラム陽性菌とグラム陰性菌を検出し区別するために使用することができる。幾つかの例では、開示されたグラム染色法は、酵母等（例えば、カンジダ及びクリプトコッカス）のような非細菌性微生物を検出するために使用される。
【０００５】
特定の例では、本方法は、一次染色剤−捕捉剤複合体をグラム陽性菌からは除去しないがグラム陰性菌からは有意に除去するのに十分な条件下で、サンプルを遅効性脱色製剤（１，２−プロパンジオール又はエチレングリコールを含むもの等）と接触させることを含む。このサンプルは、一次染色剤（クリスタルバイオレット等）と捕捉剤（ヨウ素等）とに予め接触させたものである。特定の例では、本方法は、グラム陽性菌及びグラム陰性菌の細胞壁及び細胞膜を染色するのに十分な条件下で、サンプルを一次染色剤と接触させること；一次染色剤−捕捉剤複合体を形成するのに十分な条件下で、サンプルを捕捉剤と接触させること；脱色されたグラム陰性菌を染色するのに十分な条件下で、サンプルを対比染色剤と接触させること；又はそれらの組み合わせ等の、グラム染色手順の一又は複数の追加のステップを含む。
【０００６】
遅効性脱色製剤として作用しうる組成物もまた提供される。一例では、組成物は、少なくとも８０％の遅効性脱色剤（１，２−プロパンジオール又はエチレングリコール等）と２０％以下の即効性脱色剤（例えば、０．１から２０％の即効性脱色剤、例えばエチルアルコール又はアセトン）を含む。このような組成物は、自動化グラム染色において遅効性脱色製剤として使用することができる。
【０００７】
自動化グラム染色のためのキットもまた提供される。一例では、キットは、少なくとも８０％又は少なくとも９０％の遅効性脱色剤（１，２−プロパンジオール又はエチレングリコール等）と２０％以下の即効性脱色剤（例えば、０．１から２０％又は１から１０％の即効性脱色製剤、例えばエチルアルコール又はアセトン）とを含む製剤等の、遅効性脱色製剤を容器内に含む。幾つかの例では、キットは、容器中の一又は複数の一次染色剤、容器中の捕捉剤、容器中の対比染色剤、顕微鏡スライド、カバースリップ、その他染色剤、及びコントロールスライド等の他の成分を追加として含むことができる。特定の例では、容器は、自動化グラム染色プラットフォームで使用されるように構成される。
【０００８】
本開示の前述並びにその他の目的及び特徴は、添付図面を参照して説明する以下の詳細な説明から更に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、自動化グラム染色の例示的な方法を示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下の用語及び方法の説明は、本開示のよりよい理解のため、また本開示の実施に際しての指針を当業者を与えるために提供される。文脈から他の意味が定まらない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、一又は複数を指す。例えば、「検体を含む」という用語は、単数又は複数の検体を含み、「少なくとも一つの検体を含む」という語句と同等であると考えられる。「又は」という用語は、文脈に特に明記されていない限り、記載された選択要素のうちの一つの要素又は二つ以上の要素の組み合わせを指す。本明細書で使用される場合、「含む（comprise）」は「含む（includes）」を意味する。従って、「Ａ又はＢを含む（comprising）」は、「Ａ、Ｂ、又はＡ及びＢを含む（including）」を意味し、追加の要素を排除しない。
【００１１】
特に説明がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を持つ。対立が生じた場合には、用語の説明を含む本明細書が支配する。微生物学の一般的な用語及び方法の説明は、Wistreich及びLechtman, Laboratory Exercises in Microbiology, 第６版, 1988並びにBoyd, General Microbiology, 第２版, 1988に見いだされうる。
【００１２】
全ての刊行物、特許出願、特許及び本明細書で言及されるその他の文献は、全ての目的のため、出典明示によりその全部が援用される。 
【００１３】
本明細書に記載されるものと類似又は同等の方法及び材料を、開示された技術を実施し又は試験するために使用できるが、適切な方法及び材料は以下に記載する。材料、方法及び実施例は、例証するために過ぎず、限定を意図するものではない。
【００１４】
本開示の様々な実施態様の総括を容易にするため、以下の特定用語の説明を提供する。
【００１５】
抗体（Ａｂ）：少なくとも軽鎖又は重鎖免疫グロブリン可変領域を含み、抗原（標的因子等）のエピトープに特異的に結合するポリペプチド。抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体又は抗体の断片並びに当該技術分野で知られている他の物を含む。幾つかの例では、抗体は、特定の細菌又は特定の種類の細菌等の標的に対して特異的であり、従って、本明細書で提供されるグラム染色法を用いて、コンパニオンアッセイにおいて使用することができる。
【００１６】
抗体は重鎖及び軽鎖から構成され、それらの各々は可変重鎖（VH）領域及び可変軽鎖（VL）領域と呼ばれる可変領域を有している。併せて、ＶＨ領域及びＶＬ領域が、抗体により認識される抗原に結合することに関与する。これは、インタクトな免疫グロブリンと、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２ 断片、単鎖ＦＶタンパク質（「ｓｃＦｖ」）、及びジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）等の当該技術分野で周知のそれらの変異体及びその一部を含む。ｓｃＦｖタンパク質は、免疫グロブリンの軽鎖可変領域と免疫グロブリンの重鎖可変領域がリンカーによって結合されている融合タンパク質である一方、ｄｓＦｖでは、鎖が変異させられて、鎖の結合を安定化するためにジスルフィド結合が導入されている。この用語は、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）及びヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二重特異性抗体）等の遺伝子組換え型もまた含む。Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL)；Kuby, Immunology, 第３版., W.H. Freeman & Co., New York, 1997も参照されたい。
【００１７】
「モノクローナル抗体」は、Ｂリンパ球の単一クローンにより、又は単一の抗体の軽鎖及び重鎖遺伝子がトランスフェクトされている細胞により産生される抗体である。モノクローナル抗体は、例えば、骨髄腫細胞と免疫脾臓細胞との融合産物からハイブリッド抗体産生細胞を作製することによる、当業者に知られた方法により作製される。これらの融合細胞及びそれらの子孫は「ハイブリドーマ」と呼ばれる。モノクローナル抗体は、ヒト化モノクローナル抗体を含む。
【００１８】
細菌：幾つかの例では、病気を引き起こす原核生物（病原性細菌）。細菌は、その細胞壁の構造特性に基づいて分類することができる。例えば、「グラム陽性」細胞壁中の厚いペプチドグリカン層は紫色に染色される一方、薄い「グラム陰性」細胞壁はピンク色に染色される。形態学とグラム染色を組み合わせることにより、大部分の細菌は、４つのグループ（グラム陽性球菌、グラム陽性桿菌、グラム陰性球菌、及びグラム陰性桿菌）のうちの一つに属するものとして分類することができる。
【００１９】
開示されたグラム染色法で検出することができる細菌の例は以下を含むが、これに限定されない。特に、アシネトバクター・バウマンニ（Acinetobacter baumanii）、アクチノバチルス属（Actinobacillus sp.）、放線菌（Actinomycetes）、放線菌属（Actinomyces sp.）（イスラエル放線菌（Actinomyces israelii）及びネスルンド放線菌（Actinomyces naeslundii）等）、エロモナス属（Aeromonas sp.）（エロモナス・ハイドロフィラ（Aeromonas hydrophila）、エロモナス・ベロニ次亜種ソブリア（Aeromonas veronii biovar sobria）（エロモナス・ソブリア(Aeromonas sobria)）及びエロモナス・カビエ(Aeromonas caviae)等）、アナプラズマ・ファゴサイトフィルム（Anaplasma phagocytophilum）、アルカリゲネス・キシロスオキシダンス（Alcaligenes xylosoxidans）、アシネトバクター・バウマンニ（Acinetobacter baumanii）、アクチノバチルス・アクチノミセタムコミタンス（Actinobacillus actinomycetemcomitans）、バチルス属（Bacillus sp.）（炭疽菌(Bacillus anthracis)、セレウス菌(Bacillus cereus)、枯草菌(Bacillus subtilis)、バチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)及びバチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus)等）、バクテロイデス属（Bacteroides sp.）（バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)等）、バルトネラ属（Bartonella sp.）（バルトネラ・バシリホルミス(Bartonella bacilliformis)及びヘンセラ菌(Bartonella henselae)等）、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium sp.）、ボルデテラ属（Bordetella sp.）（百日咳菌(Bordetella pertussis)、パラ百日咳菌(Bordetella parapertussis)及び気管支敗血症菌(Bordetella bronchiseptica)等）、ボレリア属（Borrelia sp.）（回帰熱ボレリア(Borrelia recurrentis)及びボレリア・ブルグドルフェリ(Borrelia burgdorferi)等）、ブルセラ属（Brucella sp.）（ウシ流産菌(Brucella abortus)、イヌ流産菌(Brucella canis)、ヤギ流産菌(Brucella melintensis)及びブタ流産菌(Brucella suis)等）、バークホルデリア属（Burkholderia sp.）（類鼻疽菌(Burkholderia pseudomallei)及びセパシア菌（Burkholderia cepacia）等）、カンピロバクター属（Campylobacter sp.）（カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)、カンピロバクター・ラリ(Campylobacter lari)及びカンピロバクター・フィタス(Campylobacter fetus)等）、キャプノサイトファーガ属（Capnocytophaga sp.）、カルジオバクテリウム・ホミニス（Cardiobacterium hominis）、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）、肺炎クラミジア（Chlamydophila pneumoniae）、オウム病クラミジア（Chlamydophila psittaci）、シトロバクター属（Citrobacter sp.）、Ｑ熱コクシエラ（Coxiella burnetii）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）（ジフテリア(Corynebacterium diphtheriae)、コリネバクテリウム・ジェイケウム(Corynebacterium jeikeum)及びコリネバクテリウム(Corynebacterium)等）、クロストリジウム属（Clostridium sp.）（ウェルシュ菌(Clostridium perfringens)、クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)、ボツリヌス菌(Clostridium botulinum)及び破傷風菌(Clostridium tetani)等）、エイケネラ・コローデンス（Eikenella corrodens）、エンテロバクター属（Enterobacter sp.）（エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンテロバクター・アグロメランス(Enterobacter agglomerans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)及び、毒素原性大腸菌(enterotoxigenic E. coli)、腸管侵入性大腸菌(enteroinvasive E. coli)、腸管病原性大腸菌(enteropathogenic E. coli)、腸管出血性大腸菌(enterohemorrhagic E. coli)、腸管凝集性大腸菌(enteroaggregative E. coli)及び尿路病原性大腸菌(uropathogenic E. coli)等の日和見性大腸菌(opportunistic Escherichia coli)を含む大腸菌(Escherichia coli）、腸球菌属（Enterococcus sp.）（フェカリス菌(Enterococcus faecalis)及びフェシウム菌(Enterococcus faecium)等）、エーリキア属（Ehrlichia sp.）（エーリキア・シャフェンシア(Ehrlichia chafeensia)及びエーリキア・カニス(Ehrlichia canis)等）、ブタ丹毒菌（Erysipelothrix rhusiopathiae）、ユーバクテリウム属（Eubacterium sp.）、野兎病菌（Francisella tularensis）、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Fusobacterium nucleatum）、ガードネレラ菌（Gardnerella vaginalis）、ゲメラ・モルビロルム（Gemella morbillorum）、ヘモフィルス属（Haemophilus sp.）（インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)、軟性下疳菌(Haemophilus ducreyi)、ヘモフィルス・エジプチウス(Haemophilus aegyptius)、パラインフルエンザ菌(Haemophilus parainfluenzae)、ヘモフィルス・ヘモリチカス(Haemophilus haemolyticus)及びヘモフィルス・パラヘモリチカス(Haemophilus parahaemolyticus)等）、ヘリコバクター属（Helicobacter sp.）（ピロリ菌(Helicobacter pylori)、ヘリコバクター・シネディ(Helicobacter cinaedi)及びヘリコバクター・フェネリアエ(Helicobacter fennelliae)等）、キンゲラ・キンギイ（Kingella kingii）、クレブシエラ属（Klebsiella sp.）（肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)、クレブシエラ・グラヌロマティス(Klebsiella granulomatis)及びクレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)等）、ラクトバチルス属（Lactobacillus sp.）、リステリア菌（Listeria monocytogenes）、レプトスピラ・インテロガンス（Leptospira interrogans）、在郷軍人病菌（Legionella pneumophila）、レプトスピラ・インテロガンス（Leptospira interrogans）、ペプトストレプトコッカス属（Peptostreptococcus sp.）、カタル球菌（Moraxella catarrhalis）、モルガネラ属（Morganella sp.）、モビルンカス属（Mobiluncus sp.）、ミクロコッカス属（Micrococcus sp.）、マイコバクテリウム属（Mycobacterium sp.）（らい菌(Mycobacterium leprae)、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ(Mycobacterium intracellulare)、マイコバクテリウム・アビウム(Mycobacterium avium)、マイコバクテリウム・ボビス(Mycobacterium bovis)及びマイコバクテリウム・マリヌム(Mycobacterium marinum)等）、マイコプラズマ属（Mycoplasm sp.）（肺炎マイコプラズマ(Mycoplasma pneumoniae)、マイコプラズマ・ホミニス(Mycoplasma hominis)及びマイコプラズマ・ゲニタリウム(Mycoplasma genitalium)等）、ノカルジア属（Nocardia sp.）（ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、ノカルジア・シリアシゲオルジカ(Nocardia cyriacigeorgica)、ノカルジア・ブラジリエンシス(Nocardia brasiliensis)等）、ナイセリア属（Neisseria sp.）（淋菌(Neisseria gonorrhoeae)及び髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)）、パスツレラ・マルトシダ（Pasteurella multocida）、プレジオモナス・シゲロイデス（Plesiomonas shigelloides）、プレボテラ属（Prevotella sp.）、ポルフィロモナス属（Porphyromonas sp.）、プレボテラ・メラニノゲニカ（Prevotella melaninogenica）、プロテウス属（Proteus sp.）（プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)及びプロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)等）、プロビデンシア属（Providencia sp.）（プロビデンシア・アルカリファシエンス(Providencia alcalifaciens)、プロビデンシア・レットゲリ(Providencia rettgeri)、プロビデンシア・スチュアルティイ(Providencia stuartii)等）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、アクネ菌（Propionibacterium acnes）、ロドコッカス・エクイ（Rhodococcus equi）、リケッチア属（Rickettsia sp.）（リケッチア・リケッチイ(Rickettsia rickettsii)、痘瘡リケッチア(Rickettsia akari)及び発疹チフスリケッチア(Rickettsia prowazekii)、ツツガムシ病リケッチア(Orientia tsutsugamushi)（旧リケッチア・ツツガムシ(Rickettsia tsutsugamushi)）及び発疹熱リケッチア(Rickettsia typhi)等）、ロドコッカス属（Rhodococcus sp.）、霊菌（Serratia marcescens）、ステノトロフォモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）、サルモネラ属（Salmonella sp.）（サルモネラ菌(Salmonella enterica)、チフス菌(Salmonella typhi)、パラチフス菌(Salmonella paratyphi)、腸炎菌(Salmonella enteritidis)、サルモネラ・コレレスイス(Salmonella cholerasuis)及びネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)等）、セラチア属（Serratia sp.）（霊菌(Serratia marcesans)及びセラチア・リクファシエンス(Serratia liquifaciens)等）、シゲラ属（Shigella sp.）（志賀赤痢菌(Shigella dysenteriae)、シゲラ・フレックスネリ(Shigella flexneri)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)及びソンネ菌(Shigella sonnei)等）、スタフィロコッカス属（Staphylococcus sp.）（黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ヘモリチカス(Staphylococcus hemolyticus)、スタフィロコッカス・サプロフィチカス(Staphylococcus saprophyticus)等）、連鎖球菌属（Streptococcus sp.）（肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)（例えば、クロラムフェニコール耐性セロタイプ４肺炎球菌(chloramphenicol-resistant serotype 4 Streptococcus pneumoniae)、スペクチノマイシン耐性セロタイプ６Ｂ肺炎球菌(spectinomycin-resistant serotype 6B Streptococcus pneumoniae)、ストレプトマイシン耐性セロタイプ９Ｖ肺炎球菌(streptomycin-resistant serotype 9V Streptococcus pneumoniae)、エリスロマイシン耐性セロタイプ１４肺炎球菌(erythromycin-resistant serotype 14 Streptococcus pneumoniae)、オプトヒン耐性セロタイプ１４肺炎球菌(optochin-resistant serotype 14 Streptococcus pneumoniae)、リファンピシン耐性セロタイプ１８Ｃ肺炎球菌(rifampicin-resistant serotype 18C Streptococcus pneumoniae)、テトラサイクリン耐性セロタイプ１９Ｆ肺炎球菌(tetracycline-resistant serotype 19F Streptococcus pneumoniae)、ペニシリン耐性セロタイプ１９Ｆ肺炎球菌(penicillin-resistant serotype 19F Streptococcus pneumoniae)及びトリメトプリム耐性セロタイプ２３Ｆ肺炎球菌(trimethoprim-resistant serotype 23F Streptococcus pneumoniae)、クロラムフェニコール耐性セロタイプ４肺炎球菌(chloramphenicol-resistant serotype 4 Streptococcus pneumoniae)、スペクチノマイシン耐性セロタイプ６Ｂ肺炎球菌(spectinomycin-resistant serotype 6B Streptococcus pneumoniae)、ストレプトマイシン耐性セロタイプ９Ｖ肺炎球菌(streptomycin-resistant serotype 9V Streptococcus pneumoniae)、オプトヒン耐性セロタイプ１４肺炎球菌(optochin-resistant serotype 14 Streptococcus pneumoniae)、リファンピシン耐性セロタイプ１８Ｃ肺炎球菌(rifampicin-resistant serotype 18C Streptococcus pneumoniae)、ペニシリン耐性セロタイプ１９Ｆ肺炎球菌(penicillin-resistant serotype 19F Streptococcus pneumoniae)又はトリメトプリム耐性セロタイプ２３Ｆ肺炎球菌(trimethoprim-resistant serotype 23F Streptococcus pneumoniae)）、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ミュータンス菌(Streptococcus mutans)、Ａ群溶血性連鎖球菌(Streptococcus pyogenes, Group A streptococci)、Ｂ群溶血性連鎖球菌(Streptococcus pyogenes, Group B streptococci)、Ｃ群溶血性連鎖球菌(Streptococcus agalactiae, Group C streptococci)、ストレプトコッカス・アンギノサス(Streptococcus anginosus)、Ｄ群溶血性連鎖球菌(Streptococcus equismilis, Group D streptococci)、ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、Ｆ群溶血性連鎖球菌(Group F streptococci)及びＧ群溶血性連鎖球菌(Streptococcus anginosus Group G streptococci)等）、スピリルム・ミヌス（Spirillum minus）、ストレプトバチルス・モニリフォ
ルミ（Streptobacillus moniliformi）、トレポネーマ属（Treponema sp.）（トレポネーマ・カラテウム(Treponema carateum)、トレポネーマ・ペテヌエ(Treponema petenue)、梅毒トレポネーマ(Treponema pallidum)及びトレポネーマ・エンデミカム(Treponema endemicum)）、トロフェリマ・ウィッペリ（Tropheryma whippelii）、ウレアプラズマ・ウレアリチカム（Ureaplasma urealyticum）、ベイロネラ属（Veillonella sp.）、ビブリオ属（Vibrio sp.）（コレラ菌(Vibrio cholerae)、腸炎ビブリオ菌(Vibrio parahemolyticus)、ビブリオ・バルニフィカス(Vibrio vulnificus)、腸炎ビブリオ菌(Vibrio parahaemolyticus)、ビブリオ・バルニフィカス(Vibrio vulnificus)、ビブリオ・アルギノリチカス(Vibrio alginolyticus)、ビブリオ・ミミカス(Vibrio mimicus)、ビブリオ・ホリセ(Vibrio hollisae)、ビブリオ・フルビアリス(Vibrio fluvialis)、ビブリオ・メチニコフィイ(Vibrio metchnikovii)、ビブリオ・ダムセラ(Vibrio damsela)及びビブリオ・ファーニシイ(Vibrio furnisii)等）、エルシニア属（Yersinia sp.）（エルシニア菌(Yersinia enterocolitica)、ペスト菌(Yersinia pestis)及び仮性結核菌(Yersinia pseudotuberculosis)）及びザントモナス・マルトフィリア（Xanthomonas maltophilia）。
【００２０】
接触：直接的な物理的関係に置くこと。固体及び液体の両方の形態を含む。例えば、接触は、試薬（グラム染色の成分等）と溶液中若しくは表面上（例えば顕微鏡スライド上）のサンプルとの間でインビトロで生じうる。
【００２１】
脱色剤：複合体をグラム陽性菌の細胞壁からは除去しないが、グラム陰性菌の細胞壁からは実質的に除去する等の、一次染色剤（例えば、クリスタルバイオレット）及び捕捉剤（例えば、ヨウ素）複合体をサンプル（例えば、一次染色剤及び捕捉剤で染色されたサンプル）から実質的に除去することができる薬剤。一例では、このような複合体は、クリスタルバイオレット−ヨウ素（ＣＶ−Ｉ）複合体という。特定の例では、脱色剤は、グラム陽性の細胞からは実質的に除去しないが、グラム陰性の細胞から複合体（従って、一次染色剤）を実質的に除去（少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％の複合体の除去等）するのに十分な時間の間、一次染色剤−捕捉剤複合体（例えば、ＣＶ−Ｉ複合体）を含むサンプルと共にインキュベートされる。
【００２２】
脱色製剤：一又は複数の脱色剤を含む組成物。遅効性脱色製剤又は脱色剤は、グラム陰性細胞から一次染色剤−捕捉剤（例えば、ＣＶ−Ｉ）複合体（と従って一次染色剤、例えばクリスタルバイオレット）を除去するために長時間、例えば、自動化装置が脱色ステップを完了できる時間を要し、従って、所望より多くの脱色が生じる（グラム陽性菌の脱色等）前に脱色ステップの完了を制御する自動化装置の能力を維持する。幾つかの例では、遅効性脱色製剤は、グラム陰性菌から一次染色剤−捕捉剤（例えば、ＣＶ−Ｉ）複合体を除去するのに、少なくとも３０秒、少なくとも６０秒、少なくとも１２０秒又は少なくとも２２０秒、例えば１から４分かかる。例としては、１，２−プロパンジオール及びエチレングリコールを含む。即効性脱色剤は、グラム陰性細胞から一次染色剤−捕捉剤（例えば、ＣＶ−Ｉ）複合体（と従って一次染色剤、例えばクリスタルバイオレット）を除去するのに、例えば２０秒未満、１５秒未満、１０秒未満、又は５秒未満、例えば１から２秒、１から５秒、１から１０秒又は１から２０秒、短時間しか要しないものである。例としては、エチルアルコール、アセトン、ジエチルエーテル、メチルエーテル、エチルアルコールとアセトンの混合物、及びエチルアルコールとメタノール若しくは２−プロパノール等の他のアルコールとの混合物を含む。
【００２３】
検出する：例えば、特定の細菌である病原体（例えばシグナル又は特定の微生物、例えばグラム陽性又はグラム陰性菌）が存在するか又は不存在であるかを決定すること。幾つかの例では、これは更に定量を含む。例えば、特定の例では開示される本方法及び試薬の使用がシグナルの強弱の報告を可能にする。
【００２４】
グラム陽性菌：グラム染色中に、紺青色又は紫色に染まる細菌であり、厚いペプチドグリカン層を有する。典型的なグラム陽性菌は以下を含む。
0006017666.tif 000002
0006017666.tif 000003
【００２５】
グラム陰性菌：グラム染色中に、紺青色又は紫色の染色を失うか、又は保持しないが、サフラニン等の対比染色剤により染色され、ピンク色又は赤色に見える細菌。グラム陰性菌は、薄いペプチドグリカン層を有する。例示的なグラム陰性菌は以下を含む。
0006017666.tif 000004
【００２６】
一次染色剤（Primary stain）：グラム染色において、サンプルに塗布される最初の染料である。一次染色剤の例は、クリスタルバイオレット染料である。
【００２７】
定量：サンプル中に存在する標的となる細菌の量等の、標的の量（相対量等）を決定し又は測定すること。
【００２８】
基準値：特定の状況を表す数又は数の範囲。実験値を、例えば、診断又は予測を行うために、基準値と比較することができる。例えば、基準値は、グラム陽性又はグラム陰性等の陽性又は陰性の結果を定めることが期待される色の、相対的又は絶対的な、最大又は最少量（又は範囲）でありうる。
【００２９】
スライド：伝統的に、顕微鏡検査のためにサンプルを載せるか又は取り付けるために使用される基板であり、典型的には光に対して透過的であるが必ずしもそうではない。サンプルは、スライドに取り付けられる前及び／又は後に処理され得る。幾つかの例では、スライドは、程度の差はあるが、透明又は不透明であり、ガラス、シリカ、石英又はその他グラム染色に適している材料で作製され得る。スライドは、一又は複数の対象からの一又は複数の検体を受け入れるように構成され得る。本明細書で使用されるスライドは、グラム染色のためのサンプルを提示するのに適している、テープ、ディスク、プレート若しくは任意の他の平坦な、湾曲した、矩形、若しくは円形の表面又は形状の、従来とは異なる基板も含む。
【００３０】
対象：生存しているか又は死亡している多細胞生物であり、そのカテゴリーには植物並びにヒト及び非ヒト動物、例えば獣医対象（例えば、トリ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ウマ及び齧歯動物）が含まれる。一例では、対象は、細菌感染していることが分かっているか又は疑われている。
【００３１】
捕捉剤（Trapping agent）：染料と複合体を形成し、その後、サンプル又は基板から染料が洗浄され得る程度を減少させ又は遅らせる薬剤。グラム染色プロトコルにおいて、ヨウ素は捕捉剤の一例である。捕捉剤は、媒染剤と呼ばれることもあるが、より正確には捕捉剤である。媒染剤は、基板とより強く結合し、容易に洗浄されず、グラム染色においては、偽陽性を避けるために、洗浄を通じて除去されるある程度の能力が要求される。媒染剤は、染料と複合体を形成し、その後、布等の基板に付加的に結合し、次いで洗浄による染料除去を強く妨げる。捕捉剤もまた染料と複合体を形成するが、その複合体は、洗浄中の染料の除去を妨げるのみである。捕捉動作のメカニズムは、しばしば解明されていないが、拡散の有益な遅延又は立体障害によるものであり得る。捕捉剤は、基板との強固な接合を通しては作用しないと思われ、典型的には、捕捉剤と複合体をなした染料が、グラム染色におけるように、十分に強力な脱色剤を十分長く塗布することによる等、正しい条件下でなおも除去され得る。
【００３２】
十分な条件下：所望の活性を可能にする任意の環境を説明するために使用される語句。これは、試薬が物理的又は化学的にサンプルと相互作用し若しくは反応し、それらを通して拡散し、又はその成分を置換することを可能にする条件下で、試薬をサンプルと接触させることを含む。特定の例では、これは、サンプル中のグラム陰性又はグラム陽性菌の正確な検出を可能にするために、サンプル（細菌を含むことが分かっているか又はそのような疑いがあるもの等）をグラム染色剤の一又は複数の試薬又は成分と接触させることを含む。
【００３３】
概略
グラム染色は、細菌をその細胞膜構造に基づき、グラム陽性及びグラム陰性という二つの一般的な分類に区別する等、微生物、特に細菌の検出、分類及び同定のための、周知で一般的に使用される微生物学的技術である。グラム陽性とグラム陰性菌との主な違いは、グラム陽性菌では、一次染色試薬が細胞構造全体に吸収される一方、グラム陰性菌では、染色は表面的にしか生じないことである。そのため、後にサンプルが脱色剤を用いて処理されるとき、グラム陰性菌はその色を失う傾向があるが、グラム陽性菌は通常、青色又は紫色に染まったままである。
【００３４】
グラム染色は、一貫性がなく、結果が変動しがちである。特に、脱色ステップは、細菌の適度の脱色を実現することに関し、問題がある場合がある。脱色が十分でない場合、グラム陰性菌は、一次染色剤（例えば、クリスタルバイオレット）を保持する一方、脱色が過度である場合、グラム陽性菌とグラム陰性菌の両方が脱色される。脱色における非一貫性は、脱色溶媒に対する一次染色剤−捕捉剤複合体の親和性、塗布された脱色溶媒の量、脱色溶媒の相対的な溶解強度、並びに脱色溶媒がサンプルと接触する時間に起因しうる。
【００３５】
従来の手作業のグラム染色法において、脱色ステップは、グラム陰性菌を脱色するのに少量（２から３滴等）のみを要し、数秒しかかからない。グラム染色剤は、通常、手作業で調製され、分析される。しかしながら、これは、自動化手順にとっては素早すぎ、計装の限界のため、このステップで数分を要する可能性がある。結果として、伝統的な脱色剤が自動化システムにおいて使用される場合、容認できない量の脱色が行われる。従って、本明細書において、脱色ステップを延長し、グラム染色の自動化を可能にする、新規の遅効性脱色剤及び製剤が提供される。
【００３６】
グラム染色の方法
グラム染色は、伝統的には、４つのステップを含んでおり、それぞれのステップでは、サンプルに以下の試薬のうちの一つを塗布する。それらの試薬は、一般にはクリスタルバイオレット液である一次染色剤；一般にはヨウ素である捕捉剤（媒染剤とも呼ばれる）；一般にはエタノール又はエタノール／アセトンである脱色剤；及び、通常はサフラニンＯ、フクシン若しくはその他赤色染料を含む対比染色剤である。本開示は、非常に急速な脱色ステップ（例えば、１−５秒）を含んでいたグラム染色の従前の手作業の方法を改良する方法を提供する。開示されたグラム染色の方法は、脱色ステップを延長する（例えば、脱色に少なくとも３０秒又は少なくとも６０秒かかる）遅効性脱色剤が同定されているため、自動化プロセスにおいて使用することができる。
【００３７】
本開示は、サンプルをグラム染色する方法を提供する。このような方法は、サンプル中に存在するグラム陽性菌及びグラム陰性菌を検出し、区別するために使用することができる。特定の例では、本方法は、一次染色剤−捕捉剤複合体（例えば、ＣＶ−Ｉ複合体）を、グラム陽性菌からは除去しないが、グラム陰性菌から除去するのに十分な条件下で、一つのサンプル（又は複数のサンプル）を遅効性脱色製剤と接触させることを含み、ここで、サンプルは一次染色剤と捕捉剤に前もって接触させられている。
【００３８】
幾つかの例では、本方法は、グラム染色の一又は複数の他のステップを更に含むことが理解される。例えば、本方法は、以下の一又は複数を更に含む場合がある。それらは、グラム陽性菌及びグラム陰性菌の細胞壁（ペプチドグリカンを含み）（またいくつかの例では細胞膜を含む）を染色するのに十分な条件下で、サンプルを一次染色剤と接触させること、グラム陽性菌から一次染色剤を除去することを防ぐが、グラム陰性菌からは防がないことが可能な、一次染色剤−捕捉剤複合体を形成するのに十分な条件下で、サンプルを捕捉剤と接触させること、及び、脱色されたグラム陰性菌の細胞壁（ペプチドグリカンを含み）（またいくつかの例では細胞膜）を染色するのに十分な条件下で、サンプルを対比染色剤と接触させることである。
【００３９】
サンプルを一次染色剤と接触させることは、サンプルを、クリスタルバイオレット（ＣＶ）又はゲンチアナバイオレットを含む製剤と接触させるか又はインキュベートすることを含む。一例では、一次染色製剤は、少なくとも０．５ｇ／Ｌ、少なくとも０．７５ｇ／Ｌ、少なくとも１ｇ／Ｌ、少なくとも２ｇ／Ｌ、少なくとも３ｇ／Ｌ、少なくとも４ｇ／Ｌ、又は少なくとも５ｇ／Ｌ、例えば１から４ｇ／Ｌ、例えば３ｇ／Ｌの濃度で、ＣＶ又はゲンチアナバイオレットを含む。幾つかの例では、ＣＶ又はゲンチアナバイオレットは、例えば５０ｍｌのイソプロパノール、５０ｍｌのエタノール／メタノール、及び９００ｍｌの水等、イソプロパノール、エタノール／メタノール及び水を含む溶液中に存在する。幾つかの例では、ＣＶ又はゲンチアナバイオレット溶液は、安定性を高めるために、シュウ酸アンモニウムを含む。
【００４０】
サンプルを捕捉剤と接触させることは、サンプルを、グラムヨウ素又はポリビニルピロリドン−ヨウ素（ＰＶＰ−ヨウ素）溶液等の、ヨウ素を含む製剤と接触させるか又はインキュベートすることを含む。グラムヨウ素は、例えば、水やアルコール混合物中に、少なくとも０．１％のヨウ素（例えば、少なくとも０．２％、少なくとも０．５％、又は少なくとも１％、例えば約０．１％から１％のヨウ素）と少なくとも０．１％のヨウ素カリウム（例えば、少なくとも０．２％、少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも１．５％、又は少なくとも２％、例えば約０．１％から２％のヨウ素カリウム）を含みうる混合物である。ＰＶＰ−ヨウ素は、少なくとも１％のポリビニルピロリドン（例えば、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、又は少なくとも３５％、例えば約１から３５％のポリビニルピロリドン）と少なくとも１％のヨウ素（例えば、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、又は少なくとも３５％、例えば約１％から３５％のヨウ素）を水中に含む（例えば米国特許第２７３９９２２号及び第３８９８３２６号を参照のこと）。
【００４１】
サンプルを対比染色剤と接触させることは、サンプルを、フクシン（塩基性フクシン又は石炭酸フクシン等）、ニュートラルレッド及び／又はサフラニンＯを含む製剤と接触させるか又はインキュベートすることを含みうる。一例では、対比染色製剤は、少なくとも０．０１％、少なくとも０．０２％、少なくとも０．０３％、少なくとも０．０５％、少なくとも０．１％、少なくとも０．２％、少なくとも０．３％、少なくとも０．４％、又は少なくとも０．５％、例えば０．０２％から０．５％の濃度でフクシンを含む。一例では、対比染色製剤は、少なくとも０．０１％、少なくとも０．０２％、少なくとも０．０３％、少なくとも０．０５％、少なくとも０．１％、少なくとも０．２％、少なくとも０．３％、少なくとも０．４％、又は少なくとも０．５％、例えば０．０２％から１％の濃度でニュートラルレッドを含む。一例では、対比染色製剤は、少なくとも０．１％、例えば少なくとも０．２％、少なくとも０．３％、少なくとも０．４％、少なくとも０．５％、少なくとも０．６％、少なくとも０．７％、又は少なくとも０．８％、例えば０．１％から１％又は０．１％から０．８％のサフラニンＯの濃度でサフラニンＯを含む。対比染色剤は水で調剤することができるが、幾つかの例では、１％から２０％のエタノール又はメタノールを含むことがある。
【００４２】
幾つかの例では、サンプルは、遅効性脱色製剤及び対比染色剤と同時にインキュベートされる。幾つかの例では、遅効性脱色製剤／対比染色製剤の組み合わせにおける遅効性脱色製剤の濃度は、約７５％から９９％の範囲、例えば少なくとも７５％の遅効性脱色製剤、少なくとも８０％の遅効性脱色製剤、少なくとも９０％の遅効性脱色製剤、又は少なくとも９５％の遅効性脱色製剤でありうる。他の例では、サンプルは、初めに遅効性脱色製剤と共に、後に対比染色剤と共にインキュベートされる。
【００４３】
当業者は、グラム染色法の各接触ステップが、次の接触ステップの前に、洗浄ステップを含むか、又は、後に洗浄ステップが続く場合があることを認識する。前の製剤を望ましくない反応を起こさずに洗い流すことが可能な任意の後続の製剤を使用して、洗浄を行うことができる。例えば、後続の製剤は、過剰量でサンプルと接触させられ、流出が許される、次のグラム染色製剤のうちの一つであり得、その場合、洗浄は、サンプルと次のグラム染色製剤を接触させることと効果的に組み合わされる（例えば、図１で示される順番）。別の例では、別個の洗浄ステップが、接触ステップの後に追加されるか又はその一部である（例えば、図１に示されるもの）。この例では、洗浄は、サンプルが不活性製剤（例えば、水又は緩衝剤）と接触させられるときに生じ、その後、流出が許される。
【００４４】
幾つかの例では、サンプルが遅効性脱色製剤と接触させられるか又はインキュベートされる時間は、伝統的な手作業のグラム染色よりも長い。例えば、遅効性脱色製剤の使用は、グラム陰性細胞から一次染色剤−捕捉剤（例えばＣＶ−Ｉ）複合体（と従って一次染色剤、例えばクリスタルバイオレット）を除去するのに、より長い時間を要する。幾つかの例では、サンプルは、少なくとも３０秒、少なくとも４５秒、少なくとも６０秒、少なくとも１２０秒、又は少なくとも２２０秒、例えば３０秒から４分、１から５分、又は２から４分、遅効性脱色製剤と接触させられるか又はインキュベートされる。幾つかの例では、より長い時間の脱色により、自動化装置が脱色ステップを完了することが可能になり、従って、所望より多くの脱色が生じる（グラム陽性菌の脱色等）前に、脱色ステップが完了することを制御する自動化装置の能力を維持する。従って、幾つかの例では、一又は複数のステップ間の時間又はそのステップの時間は、装置の特定の一部によるグラム染色の自動化等の、自動化に適合するように設計される。
【００４５】
一例では、サンプルは、少なくとも３０秒、少なくとも４０秒、少なくとも５０秒、少なくとも６０秒、少なくとも７０秒、少なくとも８０秒、少なくとも９０秒、少なくとも１００秒、少なくとも１２０秒、少なくとも１５０秒、少なくとも１８０秒、少なくとも２１０秒、少なくとも２２０秒、少なくとも２４０秒、少なくとも２７０秒又は少なくとも３００秒、一次染色剤、捕捉剤又は対比染色剤とインキュベートされるか又は接触する。加えて、サンプルを任意の又はそれぞれのグラム染色製剤（一次染色剤、捕捉剤、遅効性脱色製剤及び対比染色剤）と接触させた後、幾つかの例では、少なくともおよそ１０秒、２０秒、３０秒、４０秒、５０秒、６０秒、７０秒、８０秒、９０秒、１００秒、１２０秒、１５０秒、１８０秒、２１０秒、２４０秒、２７０秒又は３００秒が経過した後、サンプルと洗浄製剤又は任意の後続のグラム染色製剤との後続の接触が生じる場合がある。従って、例えば、サンプルを一次染色剤と接触させた後、少なくとも１０秒後、例えば少なくとも３０秒、又は少なくとも１分後に、捕捉剤との接触が生じる場合がある。不活性製剤を使用する別個の洗浄ステップが含まれる例では、その洗浄ステップの後に、少なくともおよそ０．５秒、１秒、２秒、４秒、６秒、８秒、１０秒、２０秒、３０秒、４０秒、５０秒、６０秒、７０秒、８０秒、９０秒、１００秒、１２０秒、１５０秒、１８０秒、２１０秒、２４０秒、２７０秒又は３００秒が経過した後、次のグラム染色製剤との接触が生じうる。
【００４６】
グラム染色法で使用される試薬の温度は、周囲の温度であるか、又は、各製剤で同一であるか若しくは一又は複数の製剤で異なるようにするために、自動化装置及び地域施設により制御することができる。一例では、不活性洗浄製剤は、周囲の大気温度よりも比較的低温である。幾つかの例では、不活性洗浄製剤は、サンプルと接触する直前で、５℃から５０℃の範囲である。幾つかの例では、一又は複数のグラム染色製剤（一次染色剤、捕捉剤、遅効性脱色製剤及び対比染色剤）は、サンプルと接触する直前で、１０℃から６０℃である。
【００４７】
幾つかの例では、グラム染色製剤のｐＨは調節され、酸、塩基及び緩衝剤を含むことができる。幾つかの例では、一又は複数のグラム染色製剤（一次染色剤、捕捉剤、遅効性脱色製剤及び対比染色剤）は、例えば、よりよい染色を行うため及びグラム染色を受けて細菌性細胞を非細菌性細胞と区別するためには、ｐＨ＝３からｐＨ＝８である。
【００４８】
幾つかの例では、本方法は、例えば、顕微鏡又は他の同様の装置を用いて、サンプル中のグラム陽性又はグラム陰性菌を検出することを更に含む。例えば、本方法は、分析されたサンプルがグラム陽性及び／又はグラム陰性菌を含むかどうかを決定することを含みうる。
【００４９】
開示された本方法は、図１に示されており、図１は、グラム染色手順１０１を含む、例示的な自動化染色方法１００を示す。図１に示されるグラム染色手順１０１は、サンプルを一次染色製剤と接触させるステップ１０７と、サンプルを捕捉製剤と接触させるステップ１０８と、サンプルを遅効性脱色製剤と接触させるステップ１０９と、サンプルを対比染色製剤と接触させるステップ１１０と、サンプルをグラム陽性、グラム陰性又は不確定として分類するステップ１１１とを含むステップを有する。従って、本方法は、サンプルを遅効性脱色製剤と接触させるステップ１０９を含む。図１は、サンプルを遅効性脱色製剤と接触させるステップ１０９が、サンプルが一次染色製剤と接触（１０７）させられ、捕捉製剤が接触（１０８）した後であるが、対比染色製剤と接触（１１０）させる前に、生じることを示す。上で説明した通り、各接触ステップ１０７、１０８、１０９及び１１０は、次の接触ステップの前に、追加の洗浄ステップを含むか、又は、後に追加の洗浄ステップが続く場合がある。例えば、サンプルが一次染色製剤と接触（１０７）させられた後、サンプルを捕捉製剤と接触（１０８）させる前又はその間に、それは洗浄される場合がある。本方法は、サンプル中の細菌がグラム陰性若しくはグラム陽性であるか、又は、そのような決定を下すのが不可能であるかを分類又は決定するステップ１１１も含みうる。
【００５０】
従って、サンプルを図１の任意の又はそれぞれのグラム染色製剤と接触（１０７、１０８、１０９及び／又は１１０）させた後、少なくともおよそ１０秒、２０秒、３０秒、４０秒、５０秒、６０秒、７０秒、８０秒、９０秒、１００秒、１２０秒、１５０秒、１８０秒、２１０秒、２１５秒、２２０秒、２４０秒、２７０秒又は３００秒が経過した後、洗浄製剤又は後続のグラム染色製剤との後続の接触が生じうる。不活性製剤を使用する別個の洗浄ステップが含まれる例では、その洗浄ステップの後に、少なくともおよそ０．５秒、１秒、２秒、４秒、６秒、８秒、１０秒、２０秒、３０秒、４０秒、５０秒、６０秒、７０秒、８０秒、９０秒、１００秒、１２０秒、１５０秒、１８０秒、２１０秒、２４０秒、２７０秒又は３００秒が経過した後、図１（１０７、１０８、１０９及び／又は１１０）の次のグラム染色製剤との接触が生じうる。
【００５１】
図１に示される通り、自動化グラム染色（１００）のための方法において、本方法は、サンプルを獲得するステップ１０２と、サンプルを自動化装置へロードするステップ１０３とを含むことができる。自動化装置は、グラム染色ステップ１０１と並行して（１０５）、又は、連続する前（１０４）若しくは後（１０６）で、分析を実施し得る。先行する連続分析（１０４）及び後続する連続分析（１０６）は、同一サンプル上だが、例えば、異なるスライド上で実施することができる。先行する連続分析（１０４）及び後続する連続分析（１０６）は、免疫測定法及び追加の微生物学的測定法を含む。
【００５２】
自動化
幾つかの例では、一又は複数のグラム染色ステップ（例えば、サンプルを一次染色製剤、捕捉製剤、遅効性脱色製剤及び／又は対比染色製剤と接触させること）は、自動染色装置を使用して生じる。例えば、開示される本方法は、ヴェンタナＮｅｘＥＳスペシャル・ステイナー（Ventana NexES Special Stainer）、ヴェンタナ・ベンチマーク・スペシャル・ステイナー（Ventana BenchMark Special Stainer）、ベンチマークＸＴ（Benchmark XT）、ベンチマーク・ウルトラ（Benchmark Ultra）及びディスカバリー（Discovery）システム等のヴェンタナ・メディカル・システムズ，インク（Ventana Medical Systems, Inc.）の装置を用いて使用することができる。典型的なシステムは、米国特許第６３５２８６１号、米国特許第５６５４２００号、米国特許第６５８２９６２号、米国特許第６２９６８０９号及び米国特許第５５９５７０７号で開示されており、自動化システム及び方法に関する追加情報は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６７０４２号にまた見いだすことができる。
【００５３】
幾つかの例では、自動化グラム染色のための本方法は、アルゴリズム、自動化装置内のコンピュータ、別個のコンピュータ、及び／又は分散コンピュータシステム及び／又はネットワークが、一又は複数のコンピュータ可読媒体において、コンピュータ実行可能指示を介して、任意の又は全てのグラム染色ステップ（例えば、図１のステップ１０７、１０８、１０９、１１０及び１１１等の図１の一又は複数のステップ）の実行に寄与する、コンピュータ実装法である。例えば、開示されるグラム染色方法のコンピュータ実装（例えば、図１に示される）は、サンプルの追跡、分析及び／又は分析ステップの選択及び／又はタイミング、装置の制御、結果の取得及び／又は解析、データ保持、医学又はその他の情報システムに対する報告及びそれとの連動、意思決定、サンプルフローに対する変更、及び／又は、オペレータ及びその他の人材への通知に寄与し得る。
【００５４】
自動化グラム染色法において、自動化装置は、複数のサンプルを処理し手順を進めるために、従来の手動グラム染色法よりも、数秒ではなく数分等、多くの時間を要する。例えば、脱色ステップは、グラム陰性菌のみから一次染色剤−捕捉剤複合体（例えば、ＣＶ−Ｉ複合体）を適切に除去するために、時間並びに体積及び溶媒和強度に関して、調節されうる。しかしながら、ヴェンタナ・メディカル・システムズ・インクＮｅｘＥＳスペシャル・ステイナー（Ventana Medical Systems, Inc. NexES Special Stainer）、ベンチマーク・スペシャル・ステイナー（BenchMark Special Stainer）、ベンチマークＸＴ（Benchmark XT）、ベンチマーク・ウルトラ（Benchmark Ultra）及びディスカバリー（Discovery）システムのような、投薬／塗布と洗浄／除去との間の時間が明確な最小値に固定されている自動化システムにとっては、脱色ステップの制御は、脱色製剤の体積又は溶媒和強度の何れかを余儀なく変更する。体積が非常に小さい場合、一貫性のない脱色が生じる可能性があり、グラム陰性菌のみから一次染色剤−捕捉剤複合体（例えば、ＣＶ−Ｉ複合体）を選択的に脱色することを可能にするために、エタノールの溶媒和強度を変化させることができない場合がある。例えば、ヴェンタナ・ベンチマーク・スペシャル・ステイナー（Ventana BenchMark Special Stainer）は、分配と除去の二つのプロセス間の確定した不変のロックステップ内で動作し、１，２−プロパンジオールを含むもののような遅効性脱色製剤が、この時間枠内でグラム陰性菌を効果的かつ選択的に脱色することが本明細書で示される。
【００５５】
自動染色装置は、部分的には圧縮空気の使用によって動作し得る。従って、幾つかの例では、サンプルが一次染色製剤、捕捉製剤、遅効性脱色製剤及び／又は対比染色製剤と接触させられるとき、一次染色製剤、捕捉製剤、遅効性脱色製剤及び／又は対比染色製剤をサンプルへ送達するために、圧縮空気が使用される。
【００５６】
幾つかの例では、本方法は、細菌の存在が分析されるように、サンプルを自動染色装置へロードすることを含む。
【００５７】
特定の例では、自動染色装置を使用してスライド上の細菌をグラム染色する方法が提供される。自動染色装置は、複数のスライドを保持するためのカルーセル手段を含み得、ここで、各スライドはその上に、細菌を含むことが分かっているか又はそのように疑われているサンプル等の染色されるサンプルを有する。自動染色装置は、予め決められたスピードでカルーセル手段を回転させる手段とカルーセル手段の回転中に（グラム染色試薬又はその他の染色剤等の）試薬をスライド及びサンプル上に誘導しその塗布を制御する手段とを含みうる。このような方法は、一次染色試薬（クリスタルバイオレットを含むもの等）をカルーセル中のスライド上に誘導して、スライド上の細菌を一次染色試薬と接触させること；水、水−界面活性剤混合物、又は緩衝剤をカルーセル中のスライド上に誘導して、例えば、過剰の染色剤の除去を可能にする条件下で、スライドから一次染色試薬を洗浄すること；捕捉試薬（ヨウ素を含むもの等）をカルーセル中のスライド上に誘導して、スライド上の細菌を、例えば、サンプルのグラム陽性菌中における一次染色剤−捕捉剤複合体の形成を可能にする条件下で、捕捉試薬と接触させること；水又はその他の緩衝剤をカルーセル中のスライド上に誘導して、過剰の捕捉試薬をスライドから洗浄すること；例えばサンプルのグラム陰性菌中の一次染色剤の除去を可能にする条件下で、遅効性脱色製剤及び対比染色剤を、別々にあるいは一緒に、カルーセル中のスライド上に誘導すること；及び水又は緩衝剤をカルーセル中のスライド上に誘導して、過剰の脱色製剤及び／又は対比染色剤をスライドから洗浄することを含む（遅効性脱色製剤と対比染色剤が別々に加えられる場合、本方法は、それらの間に洗浄ステップを含みうる）。本方法は、スライド上のグラム陽性又はグラム陰性菌を検出することを更に含みうる。  
【００５８】
遅効性脱色製剤
開示される本方法において使用される遅効性脱色製剤は、１，２−プロパンジオール及びエチレングリコール等の遅効性脱色剤の同定に依拠する。本明細書において、１，２−プロパンジオール又は通常プロピレングリコール（ＰＧ）と呼ばれる脱色製剤は、例えばベンチマーク・スペシャル・ステイナー（BenchMark Special Stainer）の自動化染色機の時間制限のあるロックステップ（４分間）内で、グラム陰性菌からＣＶ−Ｉ複合体を効果的に脱色できることが示される。ＰＧは、グラム陰性菌のリポポリサッカライド層を溶解させ、細菌細胞膜（ペプチドグリカン）からのＣＶ−Ｉ複合体の拡散を可能にするには、他の脱色製剤よりも時間がかかり、よって、グラム陰性細胞のみの選択的な脱色を遅い速度で生じさせることができる。従って、ＰＧは、グラム染色が、伝統的な脱色剤を使用した場合よりも実質的に長い、脱色剤の塗布と除去の間の設定時間を有する自動化染色システムにより実施されることを可能にする。
【００５９】
上記及び他の任意の遅効性脱色剤の一又は複数は、所望の脱色速度の脱色製剤を生成するために、純粋な形で使用されるか、水又は緩衝剤で希釈されるか、又は即効性剤と混合され得る。一例では、遅効性脱色製剤は、１，２−プロパンジオール、エチレングリコール又はそれらの組み合わせ等の遅効性脱色剤を含む。特定の例では、遅効性脱色製剤は、１，２−プロパンジオール又はエチレングリコールであるか、又は、それらからなる。幾つかの例では、水が、例えば、約０％から２５％、例えば約０．５％から２５％、１％から２０％、５％から１０％の範囲、例えば約１０％の濃度で、遅効性脱色製剤に含まれ得る。
【００６０】
幾つかの例では、遅効性脱色製剤は、例えば少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも９９．９％の遅効性脱色剤（例えば、１，２−プロパンジオール、エチレングリコール又はそれらの組み合わせ）、例えば８０％から９９．９９％、８０％から９５％、９０％から９９％、又は９０％から９５％等の遅効性脱色剤と、２０％以下、１９％以下、１８％以下、１７％以下、１６％以下、１５％以下、１４％以下、１３％以下、１２％以下、１１％以下、１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下、０．５％以下、又は０．０１％以下の即効性脱色剤、例えば０．０１％から２０％、１％から２０％、１％から１０％、又は１％から５％の即効性脱色剤のような、遅効性脱色剤と即効性脱色剤の混合物を含みうる。即効性脱色剤の例は、プロピレングリコールメチルエーテル、ジエチルエーテル、エタノール、アセトン、メタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、又はその組み合わせ、例えばエチルアルコールとアセトンの混合物及びエチルアルコールとメタノール若しくは２−プロパノール等の他のアルコールとの混合物を含む。
【００６１】
サンプル
サンプルは、細菌の存在が分析されるあらゆる物質でありうる。サンプルは、生物学的又は非生物学的であり得、対象、環境、システム、又はプロセスから取得することができる。従って、幾つかの例では、本方法は、サンプルの取得を含む。例えば、サンプルは、細菌感染していることが分かっているか又はそのように疑われている対象から、又は、細菌により汚染されていることが分かっているか又はそのように疑われている源から取得することができる。
【００６２】
一例では、サンプルはヒト被験者等の対象物から取得することができる。このようなサンプルは、対象から取得され、対象により排出され、又は対象により分泌された任意の固体又は液体サンプル、例えば、細胞、細胞溶解物、末梢血（又は血清若しくは血漿等のその一部）、尿、胆液、腹水、唾液、口腔粘膜、組織生検（腫瘍生検又はリンパ節生検等）、外科標本、骨髄、羊水サンプル、微細針吸引、子宮頸部検体（例えば、子宮頸部細胞診、子宮頚膣部又は子宮頚内膜からの細胞）、脳脊髄液、房水又は硝子体液、浸出液、滲出液（例えば、腫瘍又は感染若しくは炎症の任意の他の部位から取得される液体）、関節（例えば、正常関節又は関節リウマチ、骨関節炎、痛風若しくは敗血症性関節炎等の病気の影響を受けた関節）から取得した液体、及び剖検材料でありうる。
【００６３】
一例では、サンプルは、例えば水域、空気、堆積物、塵、土壌から等の環境から、又は、自然又は住居用、商業用、工業用、医学用、学問用、農業用若しくはその他の人工の環境（例えば、食品加工、食糧生産及び食糧消費施設並びに処分環境）における生物又は無生物の物体内部又は表面等から取得され、農場、廃水流又は水源等の工業原料から取得することができる。従って、サンプルは、細菌、微生物若しくは多細胞生物を寄生させると一般的に知られているか又はそのように疑われている環境から取得することができる。
【００６４】
一例では、サンプルは、食品サンプル（肉、果物、乳製品若しくは野菜サンプル等）であるか、又は、食品加工工場で取得されたサンプルである。
【００６５】
幾つかの例では、サンプルは、採取された液体、剥離物、残留物又は培養物である。一例では、サンプルは細胞学的サンプルである。特定の例では、サンプルは、直接（例えば、フレッシュ若しくは冷凍状態）使用されるか、又は、使用前に、例えば濃縮、希釈、固定（例えば、ホルマリン、若しくは熱を使用する）及び／又はワックス（ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)サンプル等）中への包埋によって操作されうる。一例では、サンプルは、顕微鏡スライドに熱固定される。
【００６６】
追加の分析
幾つかの例では、開示される本方法は、例えば、サンプル中の特定の細菌を決定し又は同定するために、サンプルに対する追加分析を実施することを含みうる。追加分析は、グラム染色の前若しくは後に、あるいは、グラム染色と同時に若しくは同時期に実施されうる。このような追加分析は、通常、別個のスライド上で実施される。例えば、サンプルは、複数のスライド（例えば、ＦＦＰＥサンプルの異なる薄片又は切片）に塗布され得、ここで、各スライドが特定の分析を受ける。従って、同一サンプルスライド、及び／又は、同一サンプルから採取され、別個のスライドに取り付けられた複数の切片、及び／又は、同一及び／又は別個のスライドに取り付けられた同一及び／又は異なる対象からの異なるサンプルに対して、複数の分析が、並行して、及び／又は、連続して実施されうる。
【００６７】
一例では、サンプルは、例えば、特定の標的細菌に特異的な一又は複数の抗体とのインキュベートによる免疫学的測定に供せられ、標識（抗体上の標識又は二次標識抗体の使用を通じた標識等）を使用して検出される。例示的な検出可能な標識は、フルオロフォア、ハプテン、エンザイム、放射性標識、量子ドット及び当技術分野で周知のその他を含む。
【００６８】
別の例では、サンプルは、追加の微生物学的分析を受ける。例えば、サンプルは、以下の染料の一又は複数等の、一又は複数の他の染料と接触させられる場合がある。それらの染料は、抗酸菌（ＡＦＢ）ＩＩＩ、アルシアンブルー、過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）用のアルシアンブルー、アルシアンイエロー、コンゴーレッド、ジアスターゼ、ゴム、ギムザ、グロコットのメセナミン銀染色剤（ＧＭＳ）ＩＩ、鉄、ジョーンズ・ライトグリーン、ＰＡＳ用のジョーンズ・ライトグリーン、ムチカルミンＰＡＳ、細網、ステイナーＩＩ、トリクロムブルー及びトリクロムグリーンである。一例では、サンプルは、例えば、抗酸性を示すが、グラム染色では識別が難しいことがある、マイコ細菌又はノカルジアを検出するために、チール‐ネールゼン又は同様の染色剤と接触させられる。
【００６９】
キット
開示される本方法を用いて使用することができるキットが、ここに提供される。幾つかの例では、このようなキットは、より長い脱色ステップ（少なくとも３０秒、少なくとも１分、少なくとも２分、少なくとも３分、少なくとも４分又は少なくとも５分かかる脱色ステップ等）を有する自動化グラム染色法を用いて使用されうる。
【００７０】
特定の例では、開示されるキットは、容器（例えば、バイアル又はベッセル）中に遅効性脱色製剤を含む。幾つかの例では、キットはまた、グラム染色法の一又は複数の他のステップを実施するための試薬を含む場合がある。例えば、キットは、一次染色製剤、捕捉製剤及び／又は対比染色製剤を更に含み得、ここで、例えば各製剤は別個の容器中にある。
【００７１】
一例では、遅効性脱色製剤の容器は、１，２−プロパンジオール、エチレングリコール又はそれらの組み合わせ等の一又は複数の遅効性脱色剤を含む。特定の例では、遅効性脱色製剤は、１，２−プロパンジオール又はエチレングリコールであるか、あるいは１，２−プロパンジオール又はエチレングリコールからなる。幾つかの例では、遅効性脱色製剤は、例えば少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも９９．９％の一又は複数の遅効性脱色剤（例えば、１，２−プロパンジオール、エチルグリコール又はそれらの組み合わせ）、例えば８０％から９９．９９％、８０％から９９％、８０％から９０％、９０％から９９．９％、又は９０％から９８％の遅効性脱色剤と、２０％以下、１９％以下、１８％以下、１７％以下、１６％以下、１５％以下、１４％以下、１３％以下、１２％以下、１１％以下、１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下、０．５％以下、又は０．０１％以下の一又は複数の即効性脱色剤（例えば、プロピレングリコールメチルエーテル、ジエチルエーテル、エタノール、アセトン、メタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、又はそれらの組み合わせ、例えばエチルアルコールとアセトンの混合物及びエチルアルコールとメタノール若しくは２−プロパノール等のその他のアルコールとの混合物）、例えば０．０１％から２０％、０．１％から２０％、０．１％から１０％、１％から２０％又は１％から１０％の即効性脱色剤のような、遅効性脱色剤と即効性脱色剤の混合物を含みうる。
【００７２】
一例では、一次染色製剤の容器は、クリスタルバイトレット（ＣＶ）又はゲンチアナバイオレットを含む。一例では、一次染色製剤は、クリスタルバイオレットを、少なくとも０．５ｇ／Ｌ、少なくとも０．７５ｇ／Ｌ、少なくとも１ｇ／Ｌ、少なくとも２ｇ／Ｌ、少なくとも３ｇ／Ｌ、少なくとも４ｇ／Ｌ、又は少なくとも５ｇ／Ｌ、例えば１から４ｇ／Ｌ、例えば３ｇ／Ｌの濃度で含む。幾つかの例では、ＣＶは、５０ｍｌのイソプロパノール、５０ｍｌのエタノール／メタノール及び９００ｍｌの水等の、イソプロパノール、エタノール／メタノール及び水を含む溶液中に存在する。幾つかの例では、ＣＶ又はゲンチアナバイオレット溶液は、安定性を高めるために、シュウ酸アンモニウムを含む。
【００７３】
一例では、捕捉製剤の容器は、グラムヨウ素又はポリビニルピロリドン−ヨウ素（ＰＶＰ−ヨウ素）溶液等のヨウ素を含む。幾つかの例では、グラムヨウ素は、少なくとも０．１％のヨウ素（例えば、少なくとも０．２％、少なくとも０．５％、又は少なくとも１％、例えば約０．１％から１％のヨウ素）と、少なくとも０．１％のヨウ素カリウム（例えば、少なくとも０．２％、少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも１．５％又は少なくとも２％、例えば約０．１％から２％のヨウ素カリウム）を、例えば、水やアルコール混合物中に含みうる。幾つかの例では、ＰＶＰ−ヨウ素は、少なくとも１％のポリビニルピロリドン（例えば、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、又は少なくとも３５％、例えば約１から３５％のポリビニルピロリドン）と、少なくとも１％のヨウ素（例えば、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、又は少なくとも３５％、例えば約１％から３５％のヨウ素）を水中に含みうる（例えば米国特許第２７３９９２２号及び第３８９８３２６号を参照のこと）。
【００７４】
一例では、対比染色製剤の容器は、フクシン（石炭酸フクシン又は塩基性フクシン等）、ニュートラレルレッド及び／又はサフラニンＯを含む。一例では、水性対比染色製剤は、少なくとも０．０１％、少なくとも０．０２％、少なくとも０．０３％、少なくとも０．０５％、少なくとも０．１％、少なくとも０．２％少なくとも０．３％、少なくとも０．４％又は少なくとも０．５％、例えば０．０２％から０．５０％の濃度でフクシンを含む。一例では、対比染色製剤は、少なくとも０．０１％、少なくとも０．０２％、少なくとも０．０３％、少なくとも０．０５％、少なくとも０．１％、少なくとも０．２％、少なくとも０．３％、少なくとも０．４％又は少なくとも０．５％、例えば０．０２％から１％の濃度でニュートラルレッドを含む。一例では、対比染色製剤は、少なくとも０．１％、少なくとも０．２％、少なくとも０．３％、少なくとも０．４％、少なくとも０．５％、少なくとも０．６％、少なくとも０．７％、又は少なくとも０．８％、例えば０．１％から１％又は０．１％から０．８％のサフラニンＯの濃度でサフラニンＯを含む。対比染色剤は水中で調剤することができるが、幾つかの例では１％から２０％のエタノール又はメタノールを含んでもよい。
【００７５】
幾つかの例では、一次染色製剤、捕捉製剤、遅効性脱色製剤及び／又は対比染色剤を含む容器又はベッセルは、自動染色装置にロードされるように構成又は成形される。例えば、容器は、ＮｅｘＥＳスペシャル・ステイナー（NexES Special Stainer）又はヴェンタナ・ベンチマーク・スペシャル・ステイナー（Ventana BenchMark Special Stainer）等のヴェンタナ・メディカル・システムズ，インク（Ventana Medical Systems, Inc.）の装置を用いて使用されるように構成される。幾つかの例では、容器は、米国特許第６３５２８６１号、米国特許第５６５４２００号、米国特許第６５８２９６２号、米国特許第６２９６８０９号及び米国特許第５５９５７０７号に開示されているようなベンチマークＸＴ（Benchmark XT）、ベンチマーク・ウルトラ（Benchmark Ultra）又はディスカバリー（Discovery）システムを用いて使用されるように構成され、これらの特許文献は全て、出典明示により本明細書に援用される。自動化システム及び方法に関する追加情報は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６７０４２号においても記載されており、この文献は出典明示により本明細書に援用される。一例では、容器は、ヴェンタナ・ベンチマーク（Ventana Benchmark）ディスペンサー等の、化学的耐性のあるポリプロピレン／ポリエチレンバイアルである。
【００７６】
キットはまた、サンプルの取り付けと、幾つかの例ではサンプルの固定に適したスライド等の一又は複数の顕微鏡スライド、並びにカバースリップ、ピペット又はそれらの組み合わせを含み得る。
【００７７】
キットはまた、試薬及びグラム染色プロトコルの適切な履行を確認するためのコントロールスライドを任意選択的に含みうる。例えば、コントロールスライドの一組は、黄色ブドウ球菌（又は本明細書に記載する何れかのグラム陽性菌）等のグラム陽性菌を含み得、コントロールスライドの別の一組は、大腸菌(又は本明細書に記載する何れかのグラム陰性菌)等のグラム陰性菌を含み得る。幾つかの例では、キット中のコントロールスライドは、細菌を含まない。
【００７８】
キットは、追加分析の実施のための追加試薬を任意選択的に更に含みうる。例えば、キットは、以下の染色剤の一又は複数を含む容器等の、他の染料又は染色剤を含む一又は複数のベッセル又は容器を含みうる。それらの染色剤は、抗酸菌（ＡＦＢ）ＩＩＩ、アルシアンブルー、過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）用のアルシアンブルー、アルシアンイエロー、コンゴーレッド、ジアスターゼ、ゴム、ギムザ、グロコットのメセナミン銀染色剤（ＧＭＳ）ＩＩ、鉄、ジョーンズ・ライトグリーン、ＰＡＳ用のジョーンズ・ライトグリーン、ムチカルミンＰＡＳ、細網、ステイナーＩＩ、トリクロムブルー及びトリクロムグリーンである。一例では、キットは、細菌特異的抗体を含むベッセル又は容器を含みうる。幾つかの例では、キットは、二次標識抗体（例えば、フルオロフォア又は量子ドットを用いて標識化されたもの）を含むベッセル又は容器を含む。
【００７９】
遅効性脱色組成物
本開示はまた、本明細書で提供されるキット及び方法において使用することができる遅効性脱色製剤を提供する。一例では、遅効性脱色製剤は、一又は複数の遅効性脱色剤と一又は複数の即効性脱色剤等の、遅効性脱色剤と即効性脱色剤の両方の混合物を含む。
【００８０】
一例では、遅効性脱色製剤は、一又は複数の遅効性脱色剤、例えば少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも９９．９％の一又は複数の脱色剤（例えば、１，２−プロパンジオール、エチレングリコール、又はそれらの組み合わせ）、例えば８０％から９９．９９％の一又は複数の遅効性脱色剤を含む。一例では、遅効性脱色製剤は、一又は複数の即効性脱色剤、例えば、２０％以下、１９％以下、１８％以下、１７％以下、１６％以下、１５％以下、１４％以下、１３％以下、１２％以下、１１％以下、１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下、０．５％以下、又は０．０１％以下の即効性脱色剤（例えばプロピレングリコールメチルエーテル、ジエチルエーテル、エタノール、アセトン、メタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、又はそれらの組み合わせ、例えばエチルアルコールとアセトンとの混合物及びエチルアルコールとメタノール若しくは２−プロパノール等のその他のアルコールとの混合物）、例えば０．０１％から２０％、０．１％から２０％、０．１％から１０％、１％から２０％、又は１％から１０％の即効性脱色剤を含む。
【００８１】
実施例１
グラム染色脱色剤の比較 
この実施例は、脱色速度を最適化するために、グラム染色における脱色剤を比較するために使用した方法について記載する。クリスタルバイオレットとグラムヨウ素を、Carson F, Hladik C. Histotechnology: A Self Instructional Text, 第３版, p. 231-233. Hong Kong: American Society for Clinical Pathology Press; 2009（出典明示により本明細書に援用）の手順に従って調製した。
【００８２】
グラム陽性コントロールのパラフィン包埋組織切片を、標準的な組織学的方法を使用して、脱パラフィンした。次いで、これらを、水平に位置する組織片上にクリスタルバイオレットを滴下（１滴あたり〜９０μＬ）した自動化プロトタイプ染色機で染色し、およそ４分間インキュベートし、次いで、水性界面活性剤溶液を用いて洗浄した。次いで、グラムヨウ素を切片に滴下し、これを約４分間インキュベートして、その後洗浄した。この時点で、目盛付ピペットを使用して、脱色溶媒を手作業で組織切片に加え、その後、特定の時間で、水性界面活性剤溶液を用いて手作業で洗浄した。次いで、石灰酸フクシン及びタルトラジンの対比染色剤を手作業で塗布した（それぞれ９０秒及び１５秒のインキュベーション）。次いで、スライドを脱水させ、キシレンで透明にし、その後永久マウント培地を用いてカバースリップした。顕微鏡（２０−２００ｘ）での検査により、グラム（−）細菌の脱色用の溶媒の選択性についての評価が可能になった。この結果を下の表に示す。
【００８３】
0006017666.tif 000005
【００８４】
本開示の原理が応用されうる多くの可能な実施態様に鑑みると、例示された実施態様は本開示の一例に過ぎず、本発明の範囲を限定するものとみなされるべきではないことを認識されたい。むしろ、本開示の範囲は、次の特許請求の範囲により定まる。従って、我々は、これらの特許請求の範囲及び趣旨内に入る全てを我々の発明として請求する。
【図１】
0006017666.tif 000006