(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カチオン性脂質成分の免疫活性化鏡像異性体を含む医薬組成物であって、前記鏡像異性体がＲ−ＤＯＴＡＰであり、該Ｒ−ＤＯＴＡＰがリポソームを構成しているものである、
患者における免疫系の活性化に有効である、医薬組成物。
【請求項２】
１以上の抗原をさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
カチオン性脂質の鏡像異性体を有効成分として含み、前記鏡像異性体がＲ−ＤＯＴＡＰであり、該Ｒ−ＤＯＴＡＰがリポソームを構成しているものである、免疫刺激性アジュバント効果を誘発するための薬剤。
【請求項４】
１以上の抗原をさらに含む、請求項３に記載の薬剤。
【請求項５】
患者における免疫応答を誘導するための薬剤であって、
カチオン性脂質の免疫活性化鏡像異性体を有効成分として有し、前記鏡像異性体がＲ−ＤＯＴＡＰであり、該Ｒ−ＤＯＴＡＰがリポソームを構成しているものである、薬剤。
【請求項６】
１以上の抗原をさらに含む、請求項５に記載の薬剤。
【請求項７】
免疫系の活性化を必要とする患者における疾患を治療又は予防するための医薬であって、
カチオン性脂質の免疫活性化鏡像異性体を有効成分として含み、前記鏡像異性体がＲ−ＤＯＴＡＰであり、該Ｒ−ＤＯＴＡＰがリポソームを構成しているものである、医薬。
【請求項８】
前記鏡像異性体は免疫刺激性アジュバント効果を誘発する、請求項７に記載の医薬。
【請求項９】
少なくとも１つの抗原を含む、請求項７又は８に記載の医薬。
【請求項１０】
少なくとも１つの抗原が修飾されて疎水性が増強している、請求項９に記載の医薬。
【請求項１１】
少なくとも１つの抗原が、脂質の付加された抗原である、請求項９又は１０に記載の医薬。
【請求項１２】
少なくとも１つの抗原が、パルミチン酸の付加された抗原である、請求項１１記載の医薬。
【請求項１３】
前記疾患が癌である、請求項７〜１２のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項１４】
前記疾患が感染症である、請求項７〜１２のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項１５】
前記感染症の感染病原体がヒトパピローマウイルスである、請求項１４に記載の医薬。
【請求項１６】
３ｎｍｏｌ〜６００ｎｍｏｌの量にてＲ−ＤＯＴＡＰが投与される、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
少なくとも１つのサイトカイン又はケモカインの産生を刺激する、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記少なくとも１つのサイトカイン又はケモカインは、ＣＣＬ−３、ＣＣＬ−４、ＣＣＬ−５、ＣＣＬ−１９、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、又はこれらの組み合わせである、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
３ｎｍｏｌ〜６００ｎｍｏｌの量にてＲ−ＤＯＴＡＰが投与される、請求項３又は４に記載の薬剤。
【請求項２０】
少なくとも１つのサイトカイン又はケモカインの産生を刺激する、請求項３又は４に記載の薬剤。
【請求項２１】
前記少なくとも１つのサイトカイン又はケモカインは、ＣＣＬ−３、ＣＣＬ−４、ＣＣＬ−５、ＣＣＬ−１９、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、又はこれらの組み合わせである、請求項２０に記載の薬剤。
【請求項２２】
３ｎｍｏｌ〜６００ｎｍｏｌの量にてＲ−ＤＯＴＡＰが投与される、請求項５又は６に記載の薬剤。
【請求項２３】
前記少なくとも１つのサイトカイン又はケモカインの産生を刺激する、請求項５又は６に記載の薬剤。
【請求項２４】
前記少なくとも１つのサイトカイン又はケモカインは、ＣＣＬ−３、ＣＣＬ−４、ＣＣＬ−５、ＣＣＬ−１９、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、又はこれらの組み合わせである、請求項２３に記載の薬剤。
【請求項２５】
３ｎｍｏｌ〜６００ｎｍｏｌの量にてＲ−ＤＯＴＡＰが投与される、請求項７〜１５のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項２６】
少なくとも１つのサイトカイン又はケモカインの産生を刺激する、請求項７〜１５のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項２７】
前記少なくとも１つのサイトカイン又はケモカインは、ＣＣＬ−３、ＣＣＬ−４、ＣＣＬ−５、ＣＣＬ−１９、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、又はこれらの組み合わせである、請求項２６に記載の医薬。
【請求項２８】
前記患者において、細胞毒性Ｔ細胞による免疫応答を生じさせる、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に免疫応答の刺激、より詳細には免疫応答の刺激における脂質のＲ及びＳ鏡像異性体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
このセクションでは、下記に記載及び／又は特許請求されている本発明の多様な態様に関連しうる当該技術の多様な態様を読み手に紹介することが意図される。この考察は、本発明の多様な態様のより良好な理解を促進する背景情報を読み手に提供するのを助けると考えられる。したがって、これらの記述は、この観点から読まれるべきであり、従来技術の自認として読まれるべきではないことが理解されるべきである。
【０００３】
ヒトに使用する安全で効果的な免疫療法の開発は、世界中の患者にとって依然として緊急な医療上の必要性がある。適切な免疫応答を誘発するために、免疫応答を増強、指示、又は促進する免疫修飾因子（「イムノモディファイヤー(immunomodifier)」）をワクチン設計又は免疫療法に使用することができる〔Gregoriadis, G., Immunological adjuvants: a role for liposomes. Immunol Today 11:89 (1990)〕。例えば、ワクチンは、免疫応答を刺激する抗原を含むことができる。しかし、抗原を含有する幾つかのワクチンの候補は、ワクチンが免疫系の抗原提示細胞（「ＡＰＣ」）に抗原を効率的に送達しない及び／又は抗原が弱免疫原性なので、免疫応答の弱い刺激物質である。したがって、抗原をＡＰＣに効果的に送達し、また抗原に応答して免疫系を刺激する免疫療法が必要である。イムノモディファイヤーは、そのような免疫療法において機能する潜在性を有する。そのような免疫療法はこれらの及び他の利益を有することができる。例えば、治療ワクチンの一部として含まれるとき、イムノモディファイヤーは、少なくとも以下を満たすべきである：（１）ＡＰＣにおいて抗体送達及び／又はプロセッシングを改善する〔Wang, R, F., and Wang, H. Y. Enhancement of antitumor immunity by prolonging antigen presentation on dendritic cells. Nat Biotechnol 20:149 (2002)〕、（２）ワクチン抗原に対する免疫応答の発生を奨励する免疫調節サイトカインの産生を誘導し、したがって細胞毒性Ｔリンパ球（「ＣＴＬ」）を含む細胞性免疫を促進する、（３）効果的なワクチンに必要な免疫化の数又は抗原の量を低減する〔Vogel, F. R. Improving vaccine performance with adjuvants. Clin Infect Dis 30 Suppl 3:S266 (2000)〕、（４）ワクチン抗原の生物学的又は免疫学的半減期を増加する、並びに（５）免疫抑制因子を阻害することにより抗原に対する免疫耐性を克服する〔Baecher-All
an, C, and Anderson, D. E. Immune regulation in tumor-bearing hosts. Curr Opin Immunol 18:214 (2006)〕。
【０００４】
現在、免疫応答を誘発する、ペプチド又はタンパク質抗原のような抗原の効力を増強するのに使用される第一次分類の作用物質は、油中水エマルジョン、アラム、及び抗原応答を増強する他の化学薬品のようなアジュバントであるが、これらのアジュバントは上記に記載されたイムノモディファイヤーではなく、それはこれら自体が直接的な免疫調節効果を有していないからである〔Vogel, F. R., and Powell, M. F. A compendium of vaccine adjuvants and excipients, Pharm Biotechnol 6: 141 (1995)〕。幾つかのそのようなアジュバントが動物における用途に利用可能であり、それらのうちの幾つかは、臨床試験において試験されている。アルミニウム塩のような伝統的なアジュバントに加えて、固有の免疫効果を有する、インフルエンザビロソーム〔Gluck, R., and Walti, E. 2000. Biophysical validation of Epaxal Berna, a hepatitis A vaccine adjuvanted with immunopotentiating reconstituted influenza virosomes (IRIV). Dev Biol (Basel) 103:189 (2000)〕及びChironのMF59〔Kahn, J. O., et al. Clinical and immunologic responses to human immunodeficiency virus (HIV) type 1SF2 gp120 subunit vaccine combined with MF59 adjuvant with or without muramyl tripeptide dipalmitoyl phosphatidylethanolamine in non-HIV-infected human volunteers. J Infect Dis 170:1288 (1994)〕のような製品が市販されている。例えば、アジュバントに基づいたサブミクロンエマルジョンであるMF59は、樹状細胞により内部移行される〔Dupuis, M., et al., Dendritic cells internalize vaccine adjuvant after intramuscular injection. Cell Immunol 186:18 (1998)〕。しかし、ＨＳＶ及びインフルエンザワクチンについての臨床報告によると〔Jones, C. A., and Cunningham, A. L. Vaccination strategies to prevent genital herpes and neonatal herpes simplex virus (HSV) disease. Herpes 11:12 (2004); Minutello, M. et al., Safety and immunogenicity of an inactivated subunit influenza virus vaccine combined with MF59 adjuvant emulsion in elderly subjects, immunized for three consecutive influenza seasons. Vaccine 17:99 (1999)〕、動物モデルからの証拠は、MF59アジュバントがＴ細胞応答を増強するのではなくむしろ中和抗体の産生を増強することを示唆している。したがって、細胞性免疫応答を刺激する新たな方法が必要である。
【０００５】
更に、上記に記述したように、幾つかの抗原は免疫応答の弱い刺激物質である。したがって、抗原を上記に記載された免疫応答を刺激する物質と同時投与することに加えて、弱免疫原性抗原を修飾して、その免疫原性を増加することができる。例えば、弱免疫原性抗原を免疫原性ペプチド、多糖又は脂質と結合して、その免疫原性を増加することができる。しかし、弱免疫性抗原をこれらの種類の化合物に単に結合するだけでは、免疫応答を誘発するのに十分ではない場合がある。例えば、得られた免疫応答を結合化合物の免疫原性エピトープに向かわせることができるが、弱抗原に向かわせることはできない場合があるか又は結合抗原を免疫系のＡＰＣに効率的に送達できない場合がある。したがって、追加的な方法が、免疫応答を弱免疫原性の抗原において刺激するために必要である。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の特定の例示的な態様を下記に記載する。これらの態様は、本発明がとりうる特定の形態の簡潔な概要を読み手に提供するためだけに提示されること、及びこれらの様態は、本発明の範囲を限定することが意図されないことが理解されるべきである。事実、本発明は下記に明示的に記載されない場合がある多様な態様を包含することができる。
【０００７】
本発明は、カチオン性脂質のキラリティー、並びに、特定の用量及び組成条件下で（１）抗原を免疫系に効果的に提示する又は送達するため、及び（２）抗原に応答して免疫系を刺激するために、新規部類の免疫刺激物質として作用する、カチオン性脂質のＲ及びＳ鏡像異性体を使用すること、に関する。
【０００８】
リポソームは、小さい分子量の、薬剤、プラスミドＤＭＡ、オリゴヌクレオチド、タンパク質、及びペプチドを送達するために広く使用されてきた。非ウイルス抗原担体としてリポソームビヒクルを使用するワクチンは、弱毒生ワクチン又はワクシニア若しくはインフルエンザウイルスのようなウイルスベクターを使用するような伝統的な免疫化と比較してより好ましい。本発明の譲受人に譲渡された米国特許出願第１２／０４９，９５７号は、カチオン性脂質と抗原という２つの分子を含有するカチオン性脂質／抗原複合体を含む、簡素であるが効果的な脂質に基づいた免疫療法、及び得られた免疫応答に対する脂質用量の効果を開示する。報告された結果は、抗原と複合体を形成したカチオン性リポソームが、免疫応答を刺激し、樹状細胞（ＡＰＣ）のＴ細胞との相互作用を開始するように機能することを示している。
【０００９】
本発明において、選択されたカチオン性脂質の２つの鏡像異性体により実施した追加の試験は、カチオン性脂質のＲ及びＳ鏡像異性体が、多様な条件下で強力な免疫活性化因子として作用する能力には、両者の間で差があるという発見をもたらした。抗原と組み合わせると、Ｒ鏡像体を含有するカチオン性脂質／抗原複合体は、多様な用量条件下で（低用量条件を含む）、複合体に配合された抗原に特異的な強い免疫応答を誘導し、腫瘍退縮をもたらす。しかし、Ｓ−ＤＯＴＡＰと抗原から構成される複合体は、限定された腫瘍退縮しか誘導することができず、Ｒ−ＲＯＴＡＰが有効であった全ての用量において誘導することができなかった。しかし、ＤＯＴＡＰの両方の鏡像異性体は共に、細胞性免疫応答を誘導する第１段階である、樹状細胞の成熟及び活性化の誘導においては、同等に有効である。
【００１０】
したがって、本発明の１つの態様は、被験者における免疫応答を誘導するのに十分な用量の、カチオン性脂質の少なくとも１つの鏡像異性体の組成物を提供する。
【００１１】
本発明の別の態様は、被験者にカチオン性脂質の特定の鏡像異性体又は鏡像異性体の混合物を投与することによる、被験者における免疫応答を誘導する方法を提供する。
【００１２】
本発明の別の態様は、被験者における免疫応答を誘導するのに十分な用量の、カチオン性脂質のＲ又はＳ鏡像異性体の組成物を提供する。
【００１３】
本発明の別の態様は、免疫応答が抗体特異的である場合、少なくとも１つの抗原をＲ又はＳ鏡像異性体に加えて、カチオン性脂質／抗原複合体を形成させることを含む。
【００１４】
（関連出願の相互参照）
本出願は、Elizabeth Vasievich、Weihsu Chen、Kenya Toney、Gregory Conn、Frank Bedu-Addo及びLeaf Huangにより２００８年４月１７日に出願され、表題が“Stimulation of an Immune Response by Enantiomers of Cationic Lipids”の米国仮出願第６１／０４５，８３７号の利益を請求し、この開示はその全体が参照として本明細書に組み込まれる。
【００１５】
本発明の多様な特徴、態様、及び利点は、添付の図面を参照しながら以下の詳細な記載を読むと、より良好に理解される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】１，２−ジオレイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（「ＤＯＴＡＰ」）のキラリティーを表す。
【図１Ｂ】１，２−ジオレイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（「ＤＯＴＡＰ」）のキラリティーを表す。
【図２】Ｒ−ＤＯＴＡＰ、Ｓ−ＤＯＴＡＰ、及びラセミ混合物ＲＳ−ＤＯＴＡＰによる、同時刺激分子ＣＤ８０の発現をもたらすヒト樹状細胞の活性化を表すグラフである。
【図３】Ｒ−ＤＯＴＡＰ、Ｓ−ＤＯＴＡＰ、及びラセミ混合物ＲＳ−ＤＯＴＡＰによる、同時刺激分子ＤＣ８３の発現をもたらすヒト樹状細胞の活性化を表すグラフである。
【図４】Ｒ−ＤＯＴＡＰ、Ｓ−ＤＯＴＡＰ、及びラセミ混合物ＲＳ−ＤＯＴＡＰによる、同時刺激分子ＤＣ８６の発現をもたらすヒト樹状細胞の活性化を表すグラフである。
【図５】Ｒ−ＤＯＴＡＰ、Ｓ−ＤＯＴＡＰ、及びラセミ混合物ＲＳ−ＤＯＴＡＰによる、ケモカインＣＣＬ−３の産生をもたらすヒト樹状細胞の刺激を表すグラフである。
【図６】Ｒ−ＤＯＴＡＰ、Ｓ−ＤＯＴＡＰ、及びラセミ混合物ＲＳ−ＤＯＴＡＰによる、ケモカインＣＣＬ−４の産生をもたらすヒト樹状細胞の刺激を表すグラフである。
【図７】Ｒ−ＤＯＴＡＰ、Ｓ−ＤＯＴＡＰ、及びラセミ混合物ＲＳ−ＤＯＴＡＰによる、ケモカインＣＣＬ−５の産生をもたらすヒト樹状細胞の刺激を表すグラフである。
【図８】Ｒ−ＤＯＴＡＰ、Ｓ−ＤＯＴＡＰ、及びラセミ混合物ＲＳ−ＤＯＴＡＰによる、ケモカインＣＣＬ−１９の産生をもたらすヒト樹状細胞の刺激を表すグラフである。
【図９】Ｒ−ＤＯＴＡＰ、Ｓ−ＤＯＴＡＰ、及びラセミ混合物ＲＳ−ＤＯＴＡＰによる、サイトカインＩＬ−２の産生をもたらすヒト樹状細胞の刺激を表すグラフである。
【図１０】Ｒ−ＤＯＴＡＰ、Ｓ−ＤＯＴＡＰ、及びラセミ混合物ＲＳ−ＤＯＴＡＰによる、サイトカインＩＬ−８の産生をもたらすヒト樹状細胞の刺激を表すグラフである。
【図１１】Ｒ−ＤＯＴＡＰ、Ｓ−ＤＯＴＡＰ、及びラセミ混合物ＲＳ−ＤＯＴＡＰによる、サイトカインＩＬ−１２の産生をもたらすヒト樹状細胞の刺激を表すグラフである。
【図１２】腫瘍サイズ、及び注射後の時間に基づいたカチオン性脂質／抗原複合体の多様な用量のインビボ抗腫瘍効果を示すグラフである。
【図１３】カチオン性脂質／抗原複合体のインビボ抗腫瘍効能に対するＳ−ＤＯＴＡＰ用量の効果を示すグラフである。
【図１４】カチオン性脂質／抗原複合体のインビボ抗腫瘍効能に対するＲ−ＤＯＴＡＰ用量の効果を示すグラフである。
【図１５】抗原の用量が２０μgのカチオン性脂質／抗原複合体のインビボ抗腫瘍免疫応答に対する、ＤＯＴＡＰ、Ｒ−ＤＯＴＡＰ、及びＳ−ＤＯＴＡＰのラセミ混合物の脂質用量応答効果を表すグラフである。抗原用量の効果は、ＤＯＴＡＰのラセミ混合物によっても示されている。Ｓ−ＤＯＴＡＰと比較したＲ−ＤＯＴＡＰ：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、ｎ＝５〜６。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の１つ以上の特定の実施態様を下記に記載する。これらの実施態様の簡潔な記載を提供するための努力として、実際の実施における全ての特徴を必ずしもこの明細書に記載しない場合がある。任意のそのような実施の発生において、多数の実施特異的決定が開発者の特定の目標を達成するために行われなければならず、それらは実施毎に変わりうることが理解されるべきである。更に、そのような開発の努力は、複雑であり、時間がかかるが、いずれにしてもこの開示の利益を有する当業者にとって日常的な仕事であることが理解されるべきである。
【００１８】
本発明の要素（例えば、例示的な実施態様）を紹介する場合、冠詞の「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」及び「ｓａｉｄ」は、１つ以上の要素があることを意味することが意図される。用語「含む」、「含まれる」及び「有する」は、包含的であって、提示された要素以外に追加の要素があってもよいことを意味することが意図される。
【００１９】
本発明の一つの態様は、哺乳動物において免疫応答を刺激して疾患を予防又は治療するための、カチオン性脂質の鏡像異性体を提供する。個別のキラル脂質は、例えばケモカイン及び／又はサイトカインの産生のために、ＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路の多様な構成要素を活性化することにより、免疫調節物質として独立して用量依存的に機能することができる。免疫応答を効果的に誘導する用量範囲は、ＲとＳの鏡像異性体の間で、また哺乳類の多様な種内においても異なることが観察される。例えば、齧歯類の種において、ＤＯＴＡＰのＲ鏡像異性体は、約３０nmol〜約４００nmolの範囲にわたって腫瘍増殖を効果的に減弱する。対照的に、ＤＯＴＡＰのＳ鏡像異性体は、同じ齧歯類種において同じ用量範囲にわたって、効果的ではあるが、Ｒ鏡像異性体よりも効果は少ない。別の態様において、キラルカチオン性脂質は、免疫系の細胞に提示して、同時に、強力な抗原特異的免疫応答を刺激するために、抗原又は薬剤と結合させてもよい。本発明の幾つかの態様において、抗原はリポペプチドである。
【００２０】
米国特許第７，３０３，８８１号（その全体が参照として本明細書に組み込まれる）は、疾患関連抗原と複合体を形成する多数のカチオン性脂質が、特定の疾患（例えば、ＨＰＶ陽性癌）を防止する予防免疫応答、また、特定の抗原を発現する細胞を死滅させて、疾患の効果的な治療をもたらす治療免疫応答も刺激することを示したことを開示する。現在、ＤＯＴＡＰのＲ及びＳ鏡像異性体を使用して、カチオン性脂質の免疫刺激能力に対するキラリティーの効果を更に理解するために研究が実施された。（ＤＯＴＡＰのＲ及びＳ鏡像異性体は、図１Ａ及び１Ｂに示されている）。これらの研究は、カチオン性脂質の個別の鏡像異性体が、抗体あり（又はなし）で免疫応答を刺激する免疫調節物質として、独立して機能しうるという発見をもたらした。更に、カチオン性脂質の鏡像異性体が抗体と複合体を形成する場合、抗原特異的な免疫応答が生じる。疾患特異的免疫応答の程度は、カチオン性脂質のＲとＳの鏡像異性体の間で有意に異なる。
【００２１】
別の態様において、免疫応答を刺激するのに十分な用量のキラルカチオン性脂質が、１つの抗原又は複数の抗原と組み合わせて投与される。この場合、カチオン性脂質／抗原の組み合わせは、カチオン性脂質と組み合わせて送達された抗原に特異的な免疫応答を生じさせることができる。生じる応答には、特定の細胞毒性Ｔ細胞、記憶Ｔ細胞又は抗原に関連する特定の疾患の予防若しくは治療応答をもたらすＢ細胞を含めることができる。
【００２２】
本発明のキラルカチオン性脂質は、カチオン性脂質複合体の形態であることができる。カチオン性脂質複合体は、リポソーム、ミセル又はエマルジョンのような多様なビヒクルの形態をとることができる。カチオン性脂質複合体は、単層又は多層であることができる。抗原が含まれる場合、抗原は、カチオン性脂質複合体に封入されていても封入されていなくてもよい。封入とは、抗原が、複合体の内部空間内に含有されうる及び／又は複合体の脂質壁の中に組み込まれうることを意味することが理解される。
【００２３】
本発明の別の態様は、これらの複合体を生成する方法に関し、この方法は、場合により、過剰量の個別の構成要素からこれらの配合物を精製する工程を含むことができる。
【００２４】
特定の実施態様において、カチオン性脂質複合体は、ｐＨ６．０〜８．０において、正の実効電荷及び／又は及び正の帯電表面を有する。
【００２５】
本発明のカチオン性脂質複合体に含まれうる任意の「抗原」は、核酸、ペプチド、リポペプチド、タンパク質、リポタンパク質、多糖、及びカチオン性脂質と複合体を直接形成することができる他の高分子であることができる。しかし、カチオン性薬剤（例えば、大型カチオン性タンパク質）を、アニオン性脂質と直接複合体を形成させてもよいし、最初にアニオン性脂質又はポリマーと、続いてキラルカチオン性脂質との間で複合体を順次形成させてもよい。この方法の使用は、本発明の複合体により正又は中性荷電薬剤を細胞に送達することを可能にする。
【００２６】
本発明の一つの態様は、樹状細胞を活性化するため、またケモカイン及びサイトカインの産生を刺激するための、キラルカチオン性脂質複合体の使用を含む。ケモカイン及びサイトカインは免疫応答の重要な調節因子である。ケモカインは、初めは、好中球、好酸球及び単球／マクロファージを含む、炎症性細胞の強力な化学走性誘因物質として同定された。後の研究は、ケモカインが、リンパ器官への樹状細胞及び他のリンパ球の輸送を調節することによって免疫応答への顕著な効果を有することを明らかにした。樹状細胞は、組織において抗原を採取し、流入領域リンパ節に遊走し、成熟してＴ細胞応答を刺激する遊走細胞である。ＣＣケモカインの一員であるＣＣＬ２は、最初は、走化性の、そして単球／マクロファージを活性化する因子として同定された。後の研究は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、及び好中球の機能に影響を与えることもできることを示した。更なる探求は、ＣＣＬ２が、Ｔｈ１サイトカイン、インターロイキン−１２（「ＬＩ−１２］）及びインターフェロン−γ（「ＩＦＮ−γ」）が存在する場合、ＣＤ８＋細胞毒性Ｔリンパ球（「ＣＴＬ」）活性の最も強力な活性化因子であることを見出した。このことは、ＣＣＬ２系とＩＦＮ−γ系との正の双方向性相互作用により説明することができる。サイトカイン又はケモカインのいずれかの不在は、Ｔｈ１の分極、後の特定の腫瘍免疫性の発生を妨げる場合がある。別のＣＣケモカインであるＣＣＬ−４でも、インビボで樹状細胞を動員及び拡張し、プラスミドＤＮＡワクチンの免疫原性を強化することが示されている。最近、ケモカインが、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞をＣＤ４＋Ｔ細胞−樹状細胞相互作用の部位に導くことにより免疫性を増強し、記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞の発生を促進することが示されている。本発明のカチオン性脂質複合体により刺激することができるケモカインの幾つかの例は、ＣＣＬ−２、ＣＣＬ−３及びＣＣＬ−４である。本発明のカチオン性脂質複合体により刺激することができるサイトカインの幾つかの例は、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−１２及びＩＦＮ−γである。本発明者たちは、本発明のカチオン性脂質複合体が、本明細書に開示されたものに加えて、ケモカイン及びサイトカインを刺激できることを考慮する。
【００２７】
＜脂質＞
本発明のキラルカチオン性脂質複合体は、場合により抗原と混合されてもよいリポソームを形成することができ、キラルカチオン性脂質のみ、又は中性脂質と組み合わせたキラルカチオン性脂質を含有することができる。適切なキラルカチオン性脂質種としては、以下に挙げるもののＲ及びＳ鏡像異性体が含まれるが、但しこれらに限定されない：３−β〔４Ｎ−（１Ｎ，８−ジグアニジノスペルミジン）−カルバモイル〕コレステロール（ＢＧＳＣ）；３−β〔Ｎ，Ｎ−ジグアニジノエチル−アミノエタン）−カルバモイル〕コレステロール（ＢＧＴＣ）；Ｎ，Ｎ１Ｎ２Ｎ３テトラ−メチルテトラパルミチルスペルミン（セルフェクチン）；Ｎ−ｔ−ブチル−Ｎ′−テトラデシル−３−テトラデシル−アミノプロピオン−アミジン（ＣＬＯＮフェクチン）；ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）；１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）；２，３−ジオレオイルオキシ−Ｎ−〔２−（スペルミンカルボキシアミド）エチル〕−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート）（ＤＯＳＰＡ）；１，３−ジオレオイルオキシ−２−（６−カルボキシスペルミル）−プロピルアミド（ＤＯＳＰＥＲ）；４−（２，３−ビス−パルミトイルオキシ−プロピル）−１−メチル−１Ｈ−イミダゾール（ＤＰＩＭ）；Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチル−Ｎ，Ｎ′−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２，３−ジオレオイルオキシ−１，４−ブタンジアンモニウムヨージド）（Ｔｆｘ−５０）；Ｎ−１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）又は他のＮ−（Ｎ，Ｎ−１−ジアルコキシ）−アルキル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−三置換アンモニウム界面活性剤；１，２−ジオレオイル−３−（４′−トリメチルアンモニオ）ブタノール−ｓｎ−グリセロール（ＤＯＢＴ）又はトリメチルアンモニウム基がブタノールスペーサーアームを介して二重鎖（ＤＯＴＢ）若しくはコレステリル基（ＣｈＯＴＢ）に連結しているコレステリル（４′−トリメチルアンモニア）ブタノエート（ＣｈＯＴＢ）；ＤＯＲＩ（ＤＬ−１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアミノプロピル−β−ヒドロキシエチルアンモニウム）若しくはＤＯＲＩＥ（ＤＬ−１，２−Ｏ−ジオレオイル−３−ジメチルアミノプロピル−β−ヒドロキシエチルアンモニウム）（ＤＯＲＩＥ）又はＷＯ９３／０３７０９に開示されているこれらの類似体；１，２−ジオレオイル−３−スクシニル−ｓｎ−グリセロールコリンエステル（ＤＯＳＣ）；コレステリルヘミスクシネートエステル（ＣｈＯＳＣ）；ジオクタデシルアミドグルシルスペルミン（ＤＯＧＳ）及びジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンスペルミン（ＤＰＰＥＳ）又は米国特許第５，２８３，１８５号に開示されているカチオン性脂質、コレステリル−３β−カルボキシル−アミド−エチレントリメチルアンモニウムヨージド、１−ジメチルアミノ−３−トリメチルアンモニオ−ＤＬ−２−プロピル−コレステリルカルボキシレートヨージド、コレステリル−３−Ｏ−カルボキシアミドエチレンアミン、コレステリル−３−β−オキシスクシンアミド−エチレントリメチルアンモニウムヨージド、１−ジメチルアミノ−３−トリメチルアンモニオ−ＤＬ−２−プロピル−コレステリル−３−β−オキシスクシネートヨージド、２−（２−トリメチルアンモニオ）−エチルメチルアミノエチル−コレステリル−３−β−オキシスクシネートヨージド、３−β−Ｎ−（Ｎ′，Ｎ′−ジメチルアミノエタン）カルバモイルコレステロール（ＤＣ−ｃｈｏｌ）及び３−β−Ｎ−（ポリエチレンイミン）−カルバモイルコレステロールのようなリポポリアミン；Ｏ，Ｏ′−ジミリスチル−Ｎ−リシルアスパルテート（ＤＭＫＥ）；Ｏ，Ｏ′−ジミリスチル−Ｎ−リシル−グルタメート（ＤＭＫＤ）；１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）；１，２−ジラウロリル−ｓｎ−グレセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＬＥＰＣ）；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＭＥＰＣ）；１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＯＥＰＣ）；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＰＥＰＣ）；１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＳＥＰＣ）；１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）；ジオレオイルジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＡＰ）；１，２−パルミトイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＰＴＡＰ）；１，２−ジステアロイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）；１，２−ミリストイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）；並びにナトリウムドデシルスルフェート（ＳＤＳ）。本発明は、本明細書に開示されているカチオン性脂質の構造変異体及び誘導体の使用を考慮する。
【００２８】
本発明の特定の態様は、以下の式：
【化１】
0005971945.tif 000002
〔式中、Ｒ１は第四級アンモニウム基であり、Ｙ１は、炭化水素鎖、エステル、ケトン、及びペプチドから選択され、Ｃ＊はキラル炭素であり、Ｒ２及びＲ３は、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、エステル結合炭化水素、リンジエステル、及びこれらの組み合わせから独立して選択される〕により表される構造を有する、非ステロイド性のキラルカチオン性脂質を含む。ＤＯＴＡＰ、ＤＭＴＡＰ、ＤＳＴＡＰ、ＤＰＴＡＰ、ＤＰＥＰＣ、ＤＳＥＰＣ、ＤＭＥＰＣ、ＤＬＥＰＣ、ＤＯＥＰＣ、ＤＭＫＥ、ＤＭＫＤ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＴＭＡが、この一般構造を有する脂質の例である。
【００２９】
一つの実施態様において、本発明のキラルカチオン性脂質は、親油性基とアミノ基の間の結合が水溶液において安定している脂質である。したがって、本発明の複合体の特質は、保存の際のこれらの安定性（すなわち、小さい直径を維持し、配合後に生物学的活性を経時的に保持するこれらの能力）である。カチオン性脂質に使用されるそのような結合には、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、及びカルボニル結合が含まれる。当業者は、２つ以上のカチオン性脂質種を含有するリポソームを使用して本発明の複合体を生成できることを、容易に理解する。例えば、リシル−ホスファチジルエタノールアミン及びβ−アラニルコレステロールエステルの２つのカチオン性脂質種を含むリポソームが、特定の薬剤送達用途のために開示されている〔Brunette, E. et al., Nucl. Acids Res., 20: 1151 (1992)〕。
【００３０】
本発明の使用に適したキラルカチオン性脂質リポソームを考慮し、場合により抗原と混合するときに、本発明の方法は、上記に引用されたカチオン性脂質の使用のみに限定されず、むしろ、カチオン性リポソームが生成され、得られたカチオン性電荷密度が免疫応答を活性化及び誘導するのに十分である限り、任意の脂質組成物が使用できることが、更に理解されるべきである。
【００３１】
したがって、本発明の複合体は、キラルカチオン性脂質に加えて、他の脂質を含有することができる。これらの脂質としては、リソホスファチジルコリン（１−オレオイルリソホスファチジルコリン）を一例とするリソ脂質、コレステロール又はジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）又はジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）を含む中性リン脂質、並びにTween-80及びPEG-PEを例とする、ポリエチレングリコール部分を含有する多様な親油性界面活性剤、が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
本発明のキラルカチオン性脂質複合体は、形成された複合体の実効電荷が正である及び／又は複合体の表面が正に帯電されている限り、カチオン性脂質のみならず負荷電脂質を含有することもできる。本発明の負荷電脂質は、生理学的ｐＨ若しくはほぼ生理学的ｐＨで負の実効電荷を有する脂質種の少なくとも１つを含むものである。適切な負荷電脂質種には、ＣＨＥＭＳ（コレステリルヘミスクシネート）、ＮＧＰＥ（Ｎ−グルタリルホスファチジルエタノールアミン）、ホスファチジルグリセロール及びホスファチジン酸、又は同様のリン脂質類似体、が含まれるが、これらに限定されない。
【００３３】
本発明の薬剤送達複合体を含む脂質の生成に使用されるリポソームを生成する方法は、当業者に知られている。リポソーム調製の方法論の総説は、Liposome Technology (CFC Press New York 1984); Liposomes by Ostro (Marcel Dekker, 1987); Methods Biochem Anal. 33:337-462 (1988)及び米国特許第５，２８３，１８５号において見出すことができる。そのような方法には、凍結融解抽出及び超音波処理が含まれる。単層リポソーム（平均直径が約２００nm未満）及び多層リポソーム（平均直径が約３００nm超）の両方を、本発明の複合体を生成する出発成分として使用することができる。
【００３４】
本発明のカチオン性脂質複合体の生成に利用されるカチオン性リポソームにおいて、キラルカチオン性脂質は、リポソーム中に、総リポソーム脂質のうちの約１０モル％〜約１００モル％、又は約２０モル％〜約８０モル％の割合で存在する。中性脂質は、リポソームに含まれる場合、総リポソーム脂質の約０モル％〜約９０モル％、又は２０モル％〜約８０モル％若しくは４０モル％〜８０モル％の濃度で存在することができる。負荷電脂質は、リポソームに含まれる場合、総リポソーム脂質の約０モル％〜約４９モル％、又は０モル％〜約４０モル％の濃度で存在することができる。一つの実施態様において、リポソームは、キラルカチオン性と中性の脂質を約２：８〜約６：４の比で含有する。
【００３５】
本発明の複合体は、複合体を特定の組織若しくは細胞型に向かわせる標的因子として機能する、修飾された脂質、タンパク質、ポリカチオン、又は受容体リガンドを含有してもよいことが、さらに理解される。標的因子の例には、アシアロ糖タンパク質、インスリン、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、葉酸塩、並びに、細胞表面分子に対するモノクローナル及びポリクローナル抗体、が含まれるが、これらに限定されない。更に、複合体の循環中での半減期を変更するため、ポリエチレングリコール部分を含有する親油性界面活性剤を組み込むことによって、正荷電表面を立体的に遮蔽することができる。
【００３６】
カチオン性脂質複合体を、スクロース勾配から収集してからすぐに、等張スクロース又はデキストロース溶液中に保存してもよいし、これらを凍結乾燥し、使用前に等張溶液で再構築してもよい。一つの実施態様において、カチオン性脂質複合体は溶液中に保存される。本発明のカチオン性脂質複合体の安定性は、保存中のカチオン性脂質複合体の経時的な物理的安定性及び生物学的活性を決定する特定のアッセイにより測定される。カチオン性脂質複合体の物理的安定性の測定は、例えば電子顕微鏡法、ゲル濾過クロマトグラフィーを含む、当業者に既知の方法により、又は例えば実施例に記載されているCoulter N4SD粒径分析器を使用する準弾性光散乱により、カチオン性脂質複合体の直径及び電荷を決定することによって行われる。カチオン性脂質複合体の物理的安定性は、保存カチオン性脂質複合体の直径が、カチオン性脂質複合体が精製された時点に決定されたカチオン性脂質複合体の直径よりも１００％超又は５０％以下又は３０％以下増加しない場合、保存において「実質的に不変」である。
【００３７】
キラルカチオン性脂質は、純粋な又は実質的に純粋な形態で投与されることも可能であるが、医薬組成物、製剤、又は調合剤として存在することが好ましい。本発明のキラルカチオン性脂質複合体を使用する医薬製剤は、例えばリン酸緩衝食塩水、等張食塩水、又は酢酸塩若しくはHepesといった低イオン強度緩衝液のような、生理学的に適合する滅菌緩衝液中のカチオン性脂質複合体を含むことができる（例示的なｐＨは約３．０〜約８．０の範囲である）。キラルカチオン性脂質複合体は、エアロゾル剤として、又は腫瘍内、動脈内、静脈内、気管内、腹腔内、皮下及び筋肉内投与用の液剤として、投与することができる。
【００３８】
本発明の製剤は、当該技術に既知の任意の安定剤を組み込むことができる。例示的な安定剤は、コレステロール、及び、リポソーム二重層を硬化するのを助けることができる及び二重層の分解又は不安定化を防止することができる他のステロールである。また、ポリエチレングリコール、多糖及び単糖のような作用物質をリポソームに組み込んで、リポソーム表面を改質し、血液成分との相互作用に起因する不安定化を防止することができる。他の例示的な安定剤は、タンパク質、多糖、無機酸又は有機酸であり、それ単独でも混合物としてでも使用することができる。
【００３９】
多数の製剤方法を用いて、免疫刺激の持続時間を制御、変更又は延長することができる。制御放出調合剤は、カチオン性脂質を封入又は閉じ込めて、ゆっくりと放出する、ポリエステル、ポリアミノ酸、メチルセルロース、ポリビニル、ポリ（乳酸）及びヒドロゲルのような、ポリマー複合体の使用によって達成することができる。同様のポリマーを使用して、リポソームを吸着することもできる。刺激剤の放出プロフィールを変えるために、リポソームをエマルジョン製剤の中に含有させることができる。あるいは、リポソームの表面を、リポソーム及びエマルジョンの循環時間又は半減期を増やすことができるような、ポリエチレングリコール又は他のポリマーのような化合物及び糖のような他の物質で被覆することにより、刺激剤が血液循環に存在する持続時間を増やすことができる。
【００４０】
経口調合剤が必要な場合、キラルカチオン性脂質を、医薬担体、例えば、とりわけスクロース、ラクトース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、又はアラビアゴムのような、当該技術において既知の典型的な医薬担体と組み合わせることができる。全身への送達のために、カチオン性脂質をカプセル剤又は錠剤に封入することもできる。
【００４１】
本発明のキラルカチオン性脂質の投与の目的は、予防のためであっても治療のためであってもよい。予防のために提供される場合、カチオン性脂質は、病気のあらゆる兆候又は症状の前に提供される。治療のために提供される場合、カチオン性脂質は、疾患の発症時又は発症後に提供される。免疫刺激剤の治療投与は、疾患を軽減する又は治癒するために役立つ。両方の目的において、カチオン性脂質を追加的な治療剤又は抗原と共に投与することができる。カチオン性脂質が追加的な治療剤又は抗原と共に投与される場合、予防又は治療効果を、特定の疾患に対して生じることができる。
【００４２】
本発明の製剤は、獣医用及びヒト用の両方とも、上記に記載されたように、キラルカチオン性脂質を、単独で含んでも、Ｒ及びＳ鏡像体の混合物として含んでも、または場合により抗原若しくは薬剤分子のような１つ以上の治療成分と共に含んでもよい。製剤は単位投与形態で都合よく存在することができ、製薬技術において既知のあらゆる方法により調製することができる。
【００４３】
＜抗原＞
一つの実施態様において、キラルカチオン性脂質は、他の免疫調節物質の産生を含む多様な免疫応答を上げる又は下げるため、及び疾患と闘う免疫応答を増進するため、任意の追加の作用物質を用いることなく投与される。別の実施態様において、キラルカチオン性脂質は、１つの抗原又は複数の抗原と組み合わせて投与される。この場合、目的は、カチオン性脂質と組み合わせて送達される抗原に特異的な免疫応答を生じさせることである。生じる応答には、特定の細胞毒性Ｔ細胞、記憶Ｔ細胞、又は抗原に関連する特定の疾患の予防若しくは治療応答をもたらすＢ細胞を含めることができる。抗原は、任意の腫瘍関連抗原若しくは微生物抗原又は当業者に既知の他の任意の抗原であることができる。
【００４４】
本明細書で使用されるとき、「腫瘍関連抗原」とは、腫瘍又は癌細胞に関連し、主要組織適合性複合体（「ＭＨＣ」）分子の構成中で抗原提示細胞の表面に発現した場合、免疫応答（体液性及び／又は細胞性）を誘発することができるような、分子又は化合物（例えば、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、リポタンパク質、リポペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、脂質、糖脂質、炭水化物、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ）である。腫瘍関連抗原には、自己抗原、並びに、癌と特異的に関連しない場合もあるが、いずれにしても動物に投与されたときに腫瘍又は癌細胞に対して免疫応答を増強する及び／又は腫瘍又は癌細胞の増殖を低減するような、他の抗原が含まれる。より具体的な実施態様が本明細書において提供される。
【００４５】
本明細書で使用されるとき、「微生物抗原」は、微生物の抗原であり、感染性ウイルス、感染性細菌、感染性寄生虫、及び感染性真菌が含まれるが、これらに限定されない。微生物抗原は、無処置のままの微生物、及びその天然分離物、フラグメント、又は誘導体であってもよいし、天然の微生物抗原と同一又は同様であって、好ましくは対応する微生物（天然の微生物抗原が由来する微生物）に特異的な免疫応答を誘発するような合成化合物であってもよい。好ましい実施態様において、ある化合物が天然の微生物抗原と同様の免疫応答（体液性及び／又は細胞性）を誘発する場合、その化合物は天然の微生物抗原と同様である。天然の微生物抗原と同様である化合物又は抗体は、例えば、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、リポタンパク質、リポペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、脂質、糖脂質、炭水化物、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡのように、当業者によく知られている。天然の微生物抗原と同様である化合物の別の非限定的な例は、多糖抗原のペプチド模倣体である。より具体的な実施態様が本明細書において提供される。
【００４６】
用語「抗原」は、更に、本明細書に記載されているような既知の抗原又は野生型抗原の、ペプチド又はタンパク質類似体を包含することが意図される。類似体は、野生型抗原よりも可溶性であってもよいし、より安定していてもよく、また、抗原をより免疫学的に活性にする変異又は修飾を含むことができる。抗原を任意の方法で修飾することができ、例えば、脂質又は糖部分を付加すること、ペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列を変異させること、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列を変異させること、又は当業者に既知の他の任意の修飾  によって修飾することができる。抗原は、当業者に既知の標準的方法を使用して修飾することができる。
【００４７】
また、本発明の組成物及び方法に有用である別のものとして、所望の抗原のアミノ酸配列に相同性のあるアミノ酸配列を有するペプチド又はタンパク質があり、この場合、相同抗原は、対応する腫瘍、微生物又は感染細胞に免疫応答を誘発する。
【００４８】
一つの実施態様において、カチオン性脂質複合体中の抗原は、腫瘍を予防又は治療するワクチンを形成するための、腫瘍又は癌に関連する抗原、すなわち腫瘍関連抗原を含む。このように、一つの実施態様において、本発明の腫瘍又は癌ワクチンは、更に、少なくとも１つの腫瘍関連抗原の少なくとも１つのエピトープを含む。別の好ましい実施態様において、本発明の腫瘍又は癌ワクチンは、更に、１つ以上の癌関連抗原からの複数のエピトープを含む。本発明のカチオン性脂質複合体及び方法に有用である腫瘍関連抗原は、本来的に免疫原性であってもよいし、非免疫原性又は僅かに免疫原性であってもよい。本明細書において示されているように、腫瘍関連自己抗原ですら、治療効果のための本願ワクチン中で有利に用いることができるが、これは、本願組成物がそのような抗原の免疫耐性を打破することができるからである。例示的な抗原には、合成、組み換え、外来、又は相同抗原が含まれるが、これらに限定されず、抗原材料には、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、リポタンパク質、リポペプチド、脂質、糖脂質、炭水化物、ＲＮＡ、及びＤＮＡが含まれうるが、これらに限定されない。そのようなワクチンの例には、腫瘍関連抗原との複合体におけるカチオン性脂質を使用して、乳癌、頭部及び頸部癌、黒色腫、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌、腸癌、又は当該技術において既知の他の任意の癌を治療又は予防するものが挙げられるが、これらに限定されない。抗原を、リポソーム中に封入することなく、カチオン性脂質と共に配合することも可能である。したがって本発明のカチオン性脂質複合体を、癌を治療又は予防する方法に使用してもよい。そのような場合、免疫化される哺乳動物には、封入された抗原を有するリポソームを含有する医薬製剤を注射することができる。
【００４９】
本明細書に使用するのに適している腫瘍関連抗原には、天然の分子及び修飾された分子の両方が含まれ、それらは、単一の腫瘍型を指示するものであっても、幾つかの腫瘍型で共有されるものであっても、及び／又は通常の細胞と比較して腫瘍細胞に独占的に発現若しくは過剰に発現されるものであってもよい。タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、ペプチド及びリポペプチドに加えて、炭水化物、ガングリオシド、糖脂質、及びムチンについても、それらの発現の腫瘍特異的パターンが確認されている。癌ワクチンに使用される例示的な腫瘍関連抗原には、腫瘍遺伝子のタンパク質産物、腫瘍抑制遺伝子、腫瘍細胞に特有の突然変異又は再配列を有する他の遺伝子、再活性化胎児遺伝子産物、腫瘍胎児性抗原、組織特異的（だが腫瘍特異的ではない）分化抗原、増殖因子受容体、細胞表面炭水化物残基、外来性ウイルスタンパク質、及び多数の他の自己タンパク質が含まれる。
【００５０】
腫瘍関連抗原の特定の実施態様としては、例えば、Ｒａｓ  ｐ２１癌原遺伝子、腫瘍抑制因子ｐ５３及びＨＥＲ−２／ｎｅｕ、並びにＢＣＲ−ａｂｌ腫瘍遺伝子、またＣＤＫ４、ＭＵＭ１、カスパーゼ８及びベータカテニンのタンパク質産物のような、変異した又は修飾された抗原；ガレクチン４、ガレクチン９、炭酸脱水酵素、アルドラーゼＡ、ＰＲＡＭＥ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥｒｂＢ−２及びＫＳＡのような、過剰発現する抗原；アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）のような腫瘍胎児性抗原；癌胎児性抗原（ＣＥＡ）のような自己抗原、並びに、Ｍａｒｔ  １／Ｍｅｌａｎ  Ａ、ｇｐ１００、ｇｐ７５、チロシナーゼ、ＴＲＰ１及びＴＲＰ２のようなメラノサイト分化抗原；ＰＳＡ、ＰＡＰ、ＰＳＭＡ、ＰＳＭ−Ｐ１及びＰＳＭ−Ｐ２のような前立腺関連抗原；ＭＡＧＥ  １、ＭＡＧＥ  ３、ＭＡＧＥ  ４、ＧＡＧＥ  １、ＧＡＧＥ  ２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥのような再活性化した胎児遺伝子産物、並びにＮＹ−ＥＳＯ１、ＳＳＸ２及びＳＣＰｌのような他の精巣癌抗原；Ｍｕｃ−１及びＭｕｃ−２のようなムチン；ＧＭ２、ＧＤ２及びＧＤ３のようなガングリオシド、ルイス（ｙ）及びグロボ−Ｈのような中性糖脂質及び糖タンパク質；並びに、Ｔｎ、Thompson-Friedenreich抗原（ＴＦ）及びｓＴｎのような糖タンパク質、が挙げられる。また、本明細書における腫瘍関連抗原として更に含まれるものとしては、腫瘍細胞の全細胞及び溶解産物、並びにそれらのうちの免疫原性部分や、Ｂ細胞リンパ腫に対して使用されるＢリンパ球のモノクローナル増殖に対して発現する免疫グロブリンイディオタイプがある。
【００５１】
腫瘍関連抗原及びそれらの対応する腫瘍細胞標的には、癌腫の抗原として、例えばサイトケラチン、特にサイトケラチン８、１８及び１９が含まれる。上皮膜抗原（ＥＭＡ）、ヒト胚抗原（ＨＥＡ−１２５）、ヒト乳脂肪球、ＭＢｒ１、ＭＢｒ８、Ｂｅｒ−ＥＰ４、１７−１Ａ、Ｃ２６及びＴ１６も、既知の癌腫抗原である。デスミン及び筋肉特異的アクチンは、筋原性腫瘍の抗原である。胎盤アルカリホスファターゼ、ベータ−ヒト絨毛性ゴナドトロピン及びアルファ−フェトプロテインは、絨毛性及び胚細胞性腫瘍の抗原である。前立腺特異的抗原は、前立腺癌の抗原、結腸腺癌の癌胎児性抗原である。ＨＭＢ−４５は、黒色腫の抗原である。子宮頸癌では、有用な抗原をヒトパピローマウイルスでコードすることができる。クロモグラニン−Ａ及びシナプトフィジンは、神経内分泌及び神経外胚葉性腫瘍の抗原である。特に興味深いものは、壊死領域を有する固形腫瘍塊を形成する侵襲性腫瘍である。そのような壊死細胞の溶解産物は、抗原提示細胞のための抗原の豊富な供給源であり、したがって、本願の治療には、従来の化学療法及び／又は放射線治療と一緒にした有利な使用を見出すことができる。
【００５２】
一つの実施態様において、ヒトパピローマウイルスＨＰＶ抗原が使用される。腫瘍関連抗原として使用される特定のＨＰＶ抗原の1つは、ＨＰＶサブタイプ１６Ｅ７である。ＨＰＶ  Ｅ抗原−カチオン性脂質複合体は、子宮頸癌の予防及び治療に有効である。加えて、抗原活性を有するが、腫瘍形成活性を有さない遺伝子操作Ｅ７タンパク質、すなわちＥ７ｍタンパク質は、有効な腫瘍関連抗原である。Ｅ７ｍ−カチオン性脂質複合体は、細胞免疫を誘発して、確立された腫瘍の完全な退縮を引き起こし、したがって、強力な抗子宮頸癌ワクチンとして有用である。
【００５３】
腫瘍関連抗原は、当該技術において周知の方法により調製することができる。例えば、これらの抗原は、癌細胞の粗抽出物を調製すること（例えば、 Cohen et al, Cancer Res., 54:1055 (1994)に記載されている）、抗原を部分的に精製すること、組み換え技術、又は既知の抗原のデノボ合成、により、癌細胞から調製することができる。抗原は、被験者における発現及び免疫化被験者の免疫系への提示に適した形態の抗原性ペプチドをコードする核酸の形態であってもよい。更に、抗原は、完全抗原であってもよいし、少なくとも１つのエピトープを含む、完全抗原のフラグメントであってもよい。
【００５４】
特定の癌の素因をつくることが知られている病原体から誘導された抗体も、本発明の癌ワクチンに有利に含めることができる。世界中の癌症例の１６％近くが感染性病原体によるものであると推定され、多数の一般的な悪性腫瘍は、特定のウイルス遺伝子産物の発現により特徴付けられる。したがって、癌を引き起こすことに関与する病原体からの１つ以上の抗原を含めることは、宿主免疫応答の拡大を助けることができ、癌ワクチンの予防及び治療効果を増強することができる。本明細書において提供される癌ワクチンに使用するのに特に興味深い病原体には、Ｂ型肝炎ウイルス（肝細胞癌）、Ｃ型肝炎ウイルス（肝癌）、Epstein Banウイルス（ＥＢＶ）（バーキットリンパ腫、鼻咽頭癌、免疫抑制された個人におけるＰＴＬＤ）、ＨＴＬＶＬ（成人Ｔ細胞白血病）、腫瘍形成性ヒトパピローマウイルス型１６、１８、３３、４５（成人子宮頸癌）、及びヘリコバクター・ピロリ菌（Ｂ細胞胃リンパ腫）が含まれる。哺乳動物、より詳細にはヒトにおいて抗原として機能する、他の医療的に関連する微生物は、文献、例えばC. G. A Thomas, Medical Microbiology, Bailliere Tindall, Great Britain 1983において広範囲にわたって記載されており、その内容は全て参照として本明細書に組み込まれる。
【００５５】
別の実施態様において、カチオン性脂質複合体の抗原は、病原体に由来する又は関連する抗原、すなわち微生物抗原を含む。このように、一つの実施態様において、本発明の病原体ワクチンは、更に、少なくとも１つの微生物抗原の少なくとも１つのエピトープを含む。本願ワクチンにより標的にされうる病原体には、ウイルス、細菌、寄生虫、及び真菌が含まれるが、これらに限定されない。別の実施態様において、本発明の病原体ワクチンは、更に、１つ以上の微生物抗原からの複数のエピトープを含む。
【００５６】
カチオン性脂質複合体及び方法において有用である微生物抗原は、本来的に免疫原性であってもよいし、非免疫原性又は僅かに免疫原性であってもよい。例示的な抗原には、合成、組み換え、外来又は相同抗原が含まれるが、これらに限定されず、抗原材料には、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、リポタンパク質、リポペプチド、脂質、糖脂質、炭水化物、ＲＮＡ及びＤＮＡが含まれうるが、これらに限定されない。
【００５７】
例示的なウイルス病原体には、哺乳動物、より詳細にはヒトに感染するウイルスが含まれるが、これに限定されない。ウイルスの例には、以下のものが含まれるが、これらに限定されない：レトロウイルス科（例えば、ヒト免疫不全ウイルス）、例としてはＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶ若しくはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ又はＨＩＶ−ＩＩＩとも呼ばれる）及び他の分離物、例としてはＨＩＶ−ＬＰ；ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；カリシウイルス科（例えば、胃腸炎を引き起こす菌株）；トガウイルス科（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；フラビウイルス科（例えば、デングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；コロナウイルス科（例えば、コノナウイルス）；ラブドウイルス科（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；コロナウイルス科（例えば、コノナウイルス）；ラブドウイルス科（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（例えば、エボラウイルス）；パラミクソウイルス科（例えば、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、 呼吸器合胞体ウイルス）；オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルス）；ブニヤウイルス科（例えば、ハンタンウイルス、ブンガウイルス、フレボウイルス及びナイロウイルス）；アレナウイルス科（出血熱ウイルス）；レオウイルス科（例えば、レオウイルス、オリビウイルス及びロタウイルス）；ビルナウイルス科； ヘパドナウイルス科（Ｂ型肝炎ウイルス）；パルボウイルス科（パルボウイルス）；パポーバウイルス科（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；アデノウイルス科（大部分のアデノウイルス）；ヘルペスウイルス科（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１及び２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイスル（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス）； ポックスウイルス科（痘瘡ウイルス、ワクチニアウイルス、ポックスウイルス）：イリドウイルス科（例えば、アフリカブタ熱ウイルス）；並びに未分類ウイルス（例えば、海綿状脳症の病原菌、デルタ肝炎の病原体（Ｂ型肝炎の欠陥サテライトであると考えられている）、非Ａ、非Ｂ肝炎の病原体（クラス１＝内部伝染；クラス２＝非経口伝染（すなち、Ｃ型肝炎）；ノーウォーク及び関連するウイルス、並びにアストロウイルス）。
【００５８】
また、グラム陰性及びグラム陽性菌を、本願組成物及び方法により、脊椎動物において標的にすることができる。そのようなグラム陽性菌には、パスツレラ種、スタフィロコッカス種及びストレプトコッカス種が含まれるが、これらに限定されない。グラム陰性菌には、エシェリキア・コリ、 シュードモナス種及びサルモネラ種が含まれるが、これらに限定されない。感染性細菌の特定の例には、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：ヘリコバクター・ピロリ、ボレラ・ブルグドルフェリ、レジオネラ・ニューモフィラ、マイコバクテリア種（例えば、Ｍ．ツベルクローシス、Ｍ．アビウム、Ｍ．イントラセルラーレ、Ｍ．カンサイ、Ｍ．ゴルドナエ）、スタフィロコッカス・アウレウス、ナイセリア・ゴノレア、ナイセリア・メニンギティディス、リステリア・モノサイトゲネス、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ａ群ストレプトコッカス）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｂ群ストレプトコッカス）、ストレプトコッカス（ビリダンス群）、ストレプトコッカス・フェカリス、ストレプトコッカス・ボビス、ストレプトコッカス（嫌気性種）、ストレプトコッカス・ニューモニエ、病原性カンピロバクター種、エンテロコッカス種、 ヘモフィルス・インフルエンザエ、バチルス・アントラシス、コリネバクテリウム・ジフテリエ、コリネバクテリウム種、エリシペロトリクス・ルシオパシアエ、クロストリジウム・パーフリンジェンス、クロストリジウム・テタニ、エンテロバクター・アエロゲネス、クレブシエラ・ニューモニエ、パスツレラ・マルトシダ、バクテロイデス種、フソバクテリウム・ヌクレアタム、ストレプトバチルス・モニリフォルミス、トレポネーマ・パリジウム、トレポネーマ・ペルテニュー、レプトスピラ、リケッチア、及びアクチノミセス・イスラエリイ。
【００５９】
本願組成物の微生物抗原の供給源として有用な細菌病原体のポリペプチドとしては、例えば、鉄調節外膜タンパク質（「ＩＲＯＭＰ」）、外膜タンパク質（「ＯＭＰ」）、せつ腫症を引き起こすアエロモナス・サルモニシダのＡタンパク質、細菌性腎疾患（「ＢＫＤ」）を引き起こすレニバクテリウム・サルモニナルムのｐ５７タンパク質、主要表面関連抗原（「ｍｓａ」）、表面発現細胞毒素（「ｍｐｒ」）、表面発現溶血素（「ｉｓｈ」）及びエルシニア症の鞭毛抗原；細胞外タンパク質（「ＥＣＰ」）、鉄調節外膜タンパク質（「ＩＲＯＭＰ」）及びパスツレラ症の構造タンパク質；ビブロシス・アングイラルム及びＶ．オルダリのＯＭＰ及び鞭毛タンパク質；エドワルドシエロシス・イクタルリ及びＥ．タルダの鞭毛タンパク質、ＯＭＰタンパク質、ａｒｏＡ及びｐｕｒＡ；イクチオフチリウスの表面抗原；サイトファーガ・コルムナリの構造及び調節タンパク質；並びにリケッチアの構造及び調節タンパク質、が挙げられるが、これらに限定されない。そのような抗原を単離してもよいし、組み換え技術により若しくは当該技術で既知の他の任意の方法により調製してもよい。
【００６０】
病原体の例には、哺乳動物、より詳細にはヒトに感染する真菌が更に挙げられるが、これに限定されない。真菌の例には、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、ヒストプラズマ・カプスラーツム、コクシジオイデス・イミチス、ブラストミセス・デルマチチジス、クラミジア・トラコマティス及び カンジダ・アルビカンスが挙げられるが、これらに限定されない。感染性寄生虫の例には、熱帯熱マラリア原虫、 四日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫及び三日熱マラリア原虫のようなマラリア原虫が挙げられる。他の感染性生物（例えば、原生生物）には、トキソプラズマ原虫が含まれる。寄生虫病原体のポリペプチドには、イクチオフチリウスの表面抗原が含まれるが、これに限定されない。
【００６１】
哺乳動物、より詳細にはヒトにおいて抗原として機能する、他の医療的に関連する微生物は、文献（例えばC. G. A Thomas, Medical Microbiology, Bailliere Tindall, Great Britain 1983を参照すること）において広範囲にわたって記載されている。本発明の組成物及び方法は、ヒトの感染症及びヒトの病原体の治療に加えて、非ヒト哺乳動物の感染を治療するのにも有用である。非ヒト哺乳動物の治療用の多くのワクチンが、Bennett, K. Compendium of Veterinary Products, 3rd ed. North American Compendiums, Inc., 1995に開示されているおり、ＷＯ０２／０６９３６９（その開示は全体が参照として本明細書に明確に組み込まれる）も参照すること。
【００６２】
例示的な非ヒト病原体としては、マウス乳癌ウイルス（「ＭＭＴＶ」）、ラウス肉腫ウイルス（「ＲＳＶ」）、トリ白血病ウイルス（「ＡＬＶ」）、トリ骨髄芽球症ウイルス（「ＡＭＶ」）、ネズミ白血病ウイルス（「ＭＬＶ」）、ネコ白血病ウイルス（「ＦｅＬＶ」）、ネズミ肉腫ウイルス（「ＭＳＶ」）、テナガザル白血病ウイルス（「ＧＡＬＶ」）、脾臓壊死ウイルス（「ＳＮＶ」）、細網内皮症ウイルス（「ＲＶ」）、サル肉腫ウイルス（「ＳＳＶ」）、メーソンファイザーサルウィルス（「ＭＰＭＶ」）、１型サルレトロウイルス（「ＳＲＶ−１」）、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ビスナウイルス、ネコ免疫不全ウイルス（「ＦＩＶ」）及びウマ伝染性貧血ウイルス（「ＥＩＡＶ」）のようなレンチウイルス、ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、サルＴ細胞白血病ウイル（「ＳＴＬＶ」）及びウシ白血病ウイルス（「ＢＬＶ」）のようなＴ細胞白血病ウイルス、並びに、ヒト泡沫状ウイルス（「ＨＦＶ」）、サル泡沫状ウイルス（「ＳＦＶ」）及びウシ泡沫状ウイルス（「ＢＦＶ」）のような泡沫状ウイルス、が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６３】
幾つかの実施態様において、感染性病原体を参照して本明細書で使用されるとき、「治療」、「治療する」及び「治療している」とは、病原体の感染に対する被験者の耐性を増加する又は被験者が病原体に感染する可能性を減少するような、予防的な治療、並びに／或いは、感染と戦うため、例えば感染を低減する若しくは排除する又は感染が悪化するのを防止するための、患者が感染した後の治療、を意味する。
【００６４】
微生物抗原は、当該技術において周知の方法により調製することができる。例えば、これらの抗原は、粗抽出物を調製すること、又は抗原を部分的に精製することにより、ウイルス及び細菌細胞から直接調製することもできるし、あるいは、組み換え技術により又は既知の抗原のデノボ合成により調製することもできる。抗原は、被験者における発現及び免疫化被験者の免疫系への提示に適した形態の抗原性ペプチドをコードする核酸の形態であってもよい。更に、抗原は、完全抗原であってもよいし、少なくとも１つのエピトープを含む、完全抗原のフラグメントであってもよい。
【００６５】
キラルカチオン性脂質小胞への抗原の組み込みを向上させる目的、及び、免疫系への細胞の送達も向上させる目的のため、抗原分子の抗原性を維持しながらカチオン性脂質の疎水性アシル鎖中での抗原の可溶性を向上させるために、抗原を脂質鎖と結合させることができる。脂質付加抗原は、リポタンパク質、又はリポペプチド、及びこれらの組み合わせであることができる。脂質付加抗原は、脂質と抗原との間に結合したリンカーを有することができ、例えば、Ｎ末端α又はε−パルミトイルリシンは、ジペプチドＳｅｒ−Ｓｅｒリンカーを介して抗原に連結していることができる。米国特許出願第１２／０４９，９５７号は、ＤＯＴＡＰ／Ｅ７−リポペプチド複合体が、ＤＯＴＡＰ／Ｅ７製剤と比較して、インビボにおいて増強された機能的抗原特異的ＣＤ８＋Ｔリンパ球応答を示し、したがって、優れた抗腫瘍効力を提供したことを開示している。
【００６６】
本発明は以下の実施例を考慮すると更に理解される。
【００６７】
〔実施例〕
＜カチオン性脂質の鏡像異性体による免疫系の効果的な刺激＞
１．細胞株及びペプチド
ＴＣ−１細胞は、ＨＰＶ１６  Ｅ６及びＥ７腫瘍遺伝子と活性化Ｈ−ｒａｓでで形質転換された、Ｃ５７ＢＬ／６マウス肺内皮細胞である。細胞を、１０％ウシ胎児血清及び１００U/mlのペニシリン及び１００mg/mlのストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ培地（Carlsbad, CAのInvitrogenにより販売）において増殖させた。ＨＰＶ１６  Ｅ７タンパク質（アミノ酸１１〜２０、ＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴ〔配列番号１〕）のＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドを、Pittsburgh Peptide Synthesis Facilityにおいて、Advanced ChemTech２００型ペプチド合成機を使用した固相合成により合成し、ＨＰＬＣにより精製した。
【００６８】
２．脂質／抗原複合体の調製及び物理的特性の決定
ＤＯＴＡＰの鏡像異性体は、Merck AG（EPROVA）, Switzerlandから供給された。他の脂質は、全て、Avanti Polar Lipids（Alabaster, AL）から購入した。小型単層ＤＯＴＡＰリポソームは、薄膜水和、続く押出しにより調製した。クロロホルム中の脂質を、ガラス管の中で窒素流により薄層として乾燥した。薄膜を２〜３時間真空乾燥し、次に、細胞培養等級水（Walkersville, MDのCambrexにより販売）、又はＥ７ペプチドを含有する緩衝液（そのような緩衝液は当業者に周知である）によって、１mLあたり０．７mgの脂質及び０．１mgのＥ７（モル比＝１１：１）の最終濃度になるように再水和した。脂質分散体を、孔径０．４、０．２及び０．１μmのポリカーボネート膜を通して連続的に押し出した。閉じ込められていないペプチドは除去されなかった。リポソームを、使用するまで４℃で保存した。Ｅ７ペプチドのリポソームとの会合は、リポソームと結合したペプチドの率を測定することにより決定した。簡潔には、Ｒ−ＤＯＴＡＰ／Ｅ７、Ｓ−ＤＯＴＡＰ／Ｅ７又はＲＳ−ＤＯＴＡＰ／Ｅ７複合体の非結合Ｅ７ペプチドを、Microcon（登録商標）遠心分離濾過装置（Millipore, Bedford, MA）により分離し、非結合ペプチドの濃度を、Micro BCA（商標）Protein Assay Kit（Pierce, Rockford, IL）により測定した。ペプチド会合の効率を、非結合ペプチド百分率として決定した。当業者に周知の一般的なリポソーム調製に使用される他の方法を使用することもできる。
【００６９】
３．統計分析
データは、少なくとも３つの独立した実験の平均±ＳＤとして表される。両側スチューデントｔ検定を使用して、平均における統計的に有意な差を評価した。有意性は、ｐ＜０．０５に設定した。
【００７０】
４．カチオン性脂質／Ｅ７複合体の個別のＲ及びＳ鏡像異性体は、ＤＯＡＴＰラセミ混合物と同様に、ヒト樹状細胞を活性化する
カチオン性リポソームを上記に記載されたように調製した。製剤に使用されるＥ７抗原は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１で拘束された同定済みヒトＥ７ペプチドである〔ＨＰＶ−１６  Ｅ７、アミノ酸１１〜２０、ＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴ（配列番号１）〕。ペプチドは、University of Pittsburgh, Molecular Medicine Institute, Pittsburgh, PAにおいて合成された。ヒトＨＬＡ−Ａ２ヒト樹状細胞は、Lonza（Walkersville, MD）から得た。凍結クリオバイアルを融解し、樹状細胞を、１２ウエル組織培養皿において、５０マイクログラム／mlのＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦを補充したＬＧＭ−３培地（Walkersville, MDのLonzaにより市販されている）により、培地２mlに１２５，０００細胞／cm２の初期平板培養密度で、３７℃・５％ＣＯ２にて培養した。細胞を培養で３日間増殖させると、顕微鏡検査では、接着した細胞及び円形になった細胞の混合物が認められた。
【００７１】
細胞を新たな用量の５０マイクログラム／mlのＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦにより３日目に処理し（全てのウエル）、試験ウエルを、インターロイキン１−ベータ（「ＩＬ−β」）、インターロイキン６（「ＩＬ−６」）及びＴＮＦ−αの混合物により１０ng/ml、プロスタグランジンＥ２（「ＰＧＥ−２」）により１０μg/ml（活性化の陽性対照）、処理無し（陰性活性化対照）、Ｓ−ＤＯＴＡＰ／Ｅ７により２．５、１０及び４０マイクロモル最終濃度及びＲ−ＤＯＴＡＰ／Ｅ７により２．５、１０及び４０マイクロモル最終濃度で処理した。処理した樹状細胞を、培養液中に２４時間維持してから、細胞表面マーカーの染色とフローサイトメトリーでの分析のために採取した。採取した細胞を血球計でカウントし、表面マーカーの標識のため、以下の抗体結合体１０μlを、各試料に順に加えた：ＣＤ８０−ＦＩＴＣ、ＣＤ８３−ＡＰＣ及びＣＤ８６−ＰＥ（BD Biosciences）。続いて、表面標識細胞をBD FACxcaliberフローサイトメーターを使用したフローサイトメトリーによって分析し、活性化により産生された同時刺激樹状細胞マーカー分子ＣＤ８０、ＣＤ８３及びＣＤ８６をモニタリングした。図２、３及び４により分かるように、カチオン性脂質／Ｅ７複合体の両方の鏡像異性体により処理された初代ヒト樹状細胞は、カチオン性脂質のラセミ混合物（ＲＳ−ＤＯＴＡＰ）で観察されたもの及び米国特許出願第１２／０４９，９５７号（本出願の譲渡人に譲渡された）に報告されたものと同様に、Ｔ細胞への抗原提示の成功のために評価及び必要とされる樹状細胞活性化の３つの同時刺激マーカーの全ての発現を上方制御した。
【００７２】
５．個別のＲ及びＳ鏡像異性体を含有するカチオン性脂質／Ｅ７複合体は、ヒト樹状細胞を活性化してケモカイン及びサイトカイン産生を誘発する効力が異なる
ヒトＨＬＡ−Ａ２樹状細胞（Lonza, Walkersville, MD）を上記に記載したように試験し、培養で増殖させた。３日目に、４０マイクロモルのＤＯＴＡＰ／Ｅ７複合体により、又は強力な免疫刺激物質であるリポ多糖（ＬＰＳ）の５０マイクロモル濃度（陽性対照）により、細胞を処理した。アッセイウエルから培地を取り出し、微量遠心管により１３００rpmで５分間遠心分離して、非結合樹状細胞をペレット化した。上澄みを取り出し、１mlあたり１０マイクロリットルのCalbiochem（La Jolla, CA）のプロテアーゼインヒビターカクテルセットＩ（カタログ番号５３９１３１）で処理し、分析するまで凍結保存した。試料を、Searchlight Protein Array Multiplex ELISAアッセイ〔Pierce Biotechnology（Woburn, MA）〕によりケモカイン及びサイトカイン発現について分析した。
【００７３】
細胞性免疫応答に必須であることが知られている、選択されたケモカインのＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５及びＣＣＬ１９の産生を評価し、ＩＬ−２、ＩＬ−８及びＩＬ−１２の産生を評価した（図５〜１１、ここでは、Ｒ−ＤＯＴＡＰ／Ｅ７及びＳ−ＤＯＴＡＰ／Ｅ７の有する、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ１９、ＩＬ−２、ＩＬ−８及びＩＬ−１２の産生を誘発する能力を例示している）。同図は、ＤＯＴＡＰの個別の鏡像異性体を含有するＤＯＴＡＰ／Ｅ７複合体が、ヒト樹状細胞によるサイトカイン及びケモカイン産生を誘発することを例示する。しかし、両方の鏡像異性体は、免疫系を異なる程度で活性化し、Ｒ−鏡像異性体がより高い効力を示す。
【００７４】
６．ＤＯＴＡＰのラセミ混合物の異なる用量でＤＯＴＡＰ／Ｅ７組成物により処理されたマウスにおけるＴＣ−１  ＨＰＶ陽性腫瘍の増殖の動態
図１２では、０日目に、ＨＰ−Ｖ陽性腫瘍の増殖を誘発するために、マウスにＴＣ−１細胞を皮下注射した。ＤＯＴＡＰ／Ｅ７組成物は、ＤＯＴＡＰのラセミ混合物を含んでいた。６日目に、１０μgのＥ７ペプチドを含有するＤＯＴＡＰ／Ｅ７組成物をマウスの腹部の両側の皮下に与えた。複合体中のＤＯＴＡＰ脂質濃度は、３〜６００nmolの範囲で異なる値（３、１５、３０、７５、１５０、３００及び６００nmol）にした。２３日目において、低用量のＤＯＴＡＰ（１５nmol）は、未処理対照と比較して部分的な腫瘍阻害効果を示し（Ｐ＜０．０５）、一方、３０、１５０又は３００nmolのＤＯＴＡＰは、増強された効力を示した（Ｐ＜０．０１）。７５nmolのＤＯＴＡＰは、最も有意な腫瘍退縮効果を示した（Ｐ＜０．００１）。ここでも、高用量のＤＯＴＡＰ（６００nmol）を与えたマウスは抗腫瘍活性を示さず、高用量のＤＯＴＡＰリポソームが免疫応答に負の調節を誘導したかもしれないことが確認された。加えて、１００nmol用量のＤＯＴＡＰを有するがＥ７ペプチドを有さないリポソームは、腫瘍増殖の有意な阻害を示さず、抗腫瘍効果が抗原特異的であることを示した。更に、アニオン性脂質である１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ＤＯＰＧ）のリポソームは、抗原と共に１５０nmolで投与されるても腫瘍増殖を有意に阻害できなかった。
【００７５】
７．Ｒ及びＳ−ＤＯＴＡＰの異なる用量でＲ−ＤＯＴＡＰ／Ｅ７及びＳ−ＤＯＴＡＰ／Ｅ７組成物により処理されたマウスにおけるＴＣ−１  ＨＰＶ陽性腫瘍増殖の動態
図１３及び１４では、０日目に、ＨＰＶ陽性腫瘍の増殖を誘発するために、マウスにＴＣ−１細胞を皮下注射した。６日目に、２０μgのＥ７ペプチドを含有するＲ及びＳ−ＤＯＴＡＰ／Ｅ７組成物を、マウスの腹部の両側の皮下に与えた。複合体中のＲ又はＳ−ＤＯＴＡＰ脂質濃度は、３〜６００nmolの範囲で異なる値（３、１５、３０、７５、１００、１２５、１５０、３００及び６００nmol）にした。ＤＯＴＡＰのラセミ混合物（図１２）と異なり、Ｓ−ＤＯＴＡＰ複合体は、腫瘍増殖を阻害する能力を示さず、腫瘍退縮は観察されなかった（図１３）。しかし、用量応答効果は観察され、２３日目には、Ｓ−ＤＯＴＡＰ用量の６００nmolは、未処理対照と比較して最も遅い腫瘍増殖を誘導した（Ｐ＜０．０５）。図１４を参照すると、Ｒ−ＤＯＴＡＰ及び抗原を含有する複合体の抗腫瘍効果は、ラセミ混合物（図１２）において観察された効果と同様であった。２３日目には、７５〜１５０nmol用量のＲ−ＤＯＴＡＰは、未処理対照と比較して部分的な腫瘍阻害効果を示し（Ｐ＜０．００１）、一方、３００nmolのＲ−ＤＯＴＡＰは、最も有意な腫瘍退縮効力を示した（Ｐ＜０．０００１）。ここでも、高用量のＲ−ＤＯＴＡＰ（６００nmol）を与えたマウスは有意な抗腫瘍活性を示さず、高用量のＲ−ＤＯＴＡＰリポソームが免疫応答に負の調節を誘導したかもしれないことが確認された。Ｅ７ペプチドのみは、腫瘍増殖の阻害を何も示さなかった（図示されず）。図１５は、多様なカチオン性脂質／Ｅ７抗原複合体、ＤＯＴＡＰ、Ｓ−ＤＯＴＡＰ３、及びＲ−ＤＯＴＡＰと２０μgの抗原、並びにＤＯＴＡＰと１０μgの抗原、の腫瘍退縮効力の脂質用量応答曲線を示す。
【００７６】
８．Ｓ−ＤＯＴＡＰ及びＲ−ＤＯＴＡＰ組成物によるＴ細胞増殖の誘発
本出願者たちは以前に、米国仮出願第６０／９８３，７９９号（本出願の譲渡人に譲渡された）において、ＤＯＴＡＰ／Ｅ７がヒトＴリンパ球と直接相互作用して、クローン増殖及びＴ細胞活性化をもたらすことを示した。これらの研究は、ＤＯＴＡＰのラセミ混合物がＴ細胞のクローン増殖を刺激する能力を検査した。これらの研究において、ＨＬＡ−Ａ２＋の健康な提供者から得た濃縮ヒトリンパ球を、媒質、ＤＯＴＡＰのみ、ペプチドのみ、又はＤＯＴＡＰ／Ｅ７で、直接刺激した。刺激を７日の間隔を置いて３回繰り返した。第３刺激の３日後、ＤＯＴＡＰ又はＤＯＴＡＰ／Ｅ７で処理したリンパ球は、クローン増殖がなかった培地対照とは対照的に、培養液中においてＴ細胞コロニーの広範な増殖を示した。増殖したＴ細胞は、有意なＣＴＬ活性も示した。
【００７７】
これらの研究において、ＤＯＴＡＰにより仲介されるＴ細胞活性化は、Ｔ細胞におけるＥＲＫリン酸化によっても更に確認された。同時刺激分子ＣＤ８６のヒトＴリンパ球におけるＤＯＴＡＰ誘発発現も観察された。これらの結果は、ＤＯＴＡＰが、ＭＡＰキナーゼ仲介細胞増殖を介してＴ細胞活性化に直接影響を与えることを示唆した。
【００７８】
本研究において、ＤＯＴＡＰのＲ及びＳ鏡像体によるヒトＴ細胞増殖の誘発が、Lonza, MAから得た精製Ｔ細胞を使用して、調査され確認された。Ｒ−ＤＯＴＡＰはＳ−ＤＯＴＡＰより多くのＴ細胞増殖を誘発し、ＤＯＴＡＰラセミ混合物の活性と同様であった。
【００７９】
＜考察＞
米国特許第７，３０３，８８１号に記載されているように、広範な部類のカチオン性脂質は、抗原と共に強力な免疫刺激物質として作用して、疾患の治療において抗原特異的免疫応答を生じることができる。例えば、米国特許第７，３０３，８８１号は、ＤＣ２．４樹状細胞上での同時刺激分子ＣＤ８０／ＣＤ８６の発現がカチオン性脂質によって刺激されることによって示されているように、カチオン性脂質から構成されるリポソームが樹状細胞を活性化することを開示する（図１４Ａ及びＡ４Ｂ）。米国特許第７，３０３，８８１号の図１４Ａに示されているように、異なるカチオン性リポソームによる、ＤＣ２．４細胞のＣＤ８０／ＣＤ８６の発現を刺激する能力は、大きく異なる。ポリカチオン性脂質である２，３−ジオレオイルオキシ−Ｎ−〔２−（スペルミンカルボキシアミド）エチル〕−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）と中性脂質であるジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）との３：１(w/w）リポソーム製剤であるリポフェクタミン（登録商標）、並びに、Ｏ，Ｏ′−ジミリスチル−Ｎ−リシルアスパラテート（ＤＭＫＥ）及びＯ，Ｏ′−ジミリスチル−Ｎ−リシルグルタメート（ＤＭＫＤ）から調製されるリポソームは、ＤＣ２．４細胞によるＣＤ８０／ＣＤ８６の発現を強く刺激する。
【００８０】
米国特許第７，３０３，８８１号において更に開示されているように、ＤＣ２．４細胞上でのＣＤ８０の発現を刺激する能力は、異なるカチオン性脂質ごとに異なっている。脂質の親水性頭部及び親油性尾部は、両方ともこの能力に対して有意な効果を有する。例えば、エチルホスホコリン（ＥＰＣ）頭部基を有するＤＸＥＰＣ脂質は、一般に、トリメチルアンモニウムプロパン（ＴＡＰ）頭部基を有するＤＸＴＡＰ脂質よりも強力であると思われる。１つの特定の頭部基構造を有する脂質のうち、より短いアシル鎖（１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＬＥＰＣ−１２：０）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＭＥＰＣ−１４：０））、又は不飽和アシル鎖（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＯＥＰＣ−１８：１））を有する脂質は、より長いアシル鎖（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＰＥＰＣ−１６：０））又は飽和アシル鎖（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＳＥＰＣ−１６：０））を有するものよりも強力であると思われる。しかし、これらのデータは、複数のカチオン性脂質が樹状細胞の活性化を刺激できることを示した。米国特許出願第１２／０４９，９５７号に報告されている研究は、カチオン性脂質が免疫刺激物質として作用する機構を強調している。
【００８１】
上記の研究のデータは、カチオン性脂質は、免疫系のＡＰＳへの抗原の効率的な標的及び送達ビヒクルであるばかりでなく、低用量組成物範囲で強力なアジュバントとしても機能し、ＭＡＰキナーゼ依存性シグナル伝達経路の活性化を介して免疫系機能に直接影響を与え、その結果として、サイトカイン及びケモカインを含む免疫系調節分子を産生する、という観察をもたらした。製剤の免疫刺激能力に対するカチオン性脂質の明白な用量応答効果が示されている。脂質／抗原複合体を摂取すると、粒子は、主に、主要な抗原提示専門細胞である樹状細胞に取り込まれることが示された。樹状細胞活性化の開始及び流入領域リンパ節への遊走は、示されているように、抗原特異的ＴＣ−１腫瘍に対する免疫応答を促進する。機能性ＣＤ８＋Ｔリンパ球は、ＤＯＴＡＰ／Ｅ７注射の摂取時にマウスにおいて生じ、腫瘍微環境における浸潤性Ｔ細胞数の増加によって、腫瘍サイズは減少し、増強されたアポトーシスを示した。得られたベル型（最適用量を上回る及び下回ると活性が減少する）のカチオン性脂質用量応答曲線は、非常に低い用量で活性を示し、カチオン性脂質のアジュバント又は免疫刺激物質としての活性は、ＥＣ５０が注射１回あたり約１５nmolの低さでも非常に強力であることを示した。高用量のカチオン性脂質は、免疫刺激活性を排除した。本出願者たちは、例えばオボアルブミンのような抗原がカチオン性リポソームに組み込まれ、単回皮下注射により投与される場合、抗原に対する効果的な抗体が産生されることも示した。カチオン性リポソームは、また、同時刺激分子ＣＤ８０及びＣＤ８３の発現を誘発し、ヒト樹状細胞を活性化することができる。カチオン性脂質及びカチオン性脂質／抗原複合体は、最適用量組成において、免疫系の強力な活性化因子であり、樹状細胞への効果的な送達に加えて、疾患の予防及び治療に有用な、簡単で安全で非常に効率的な免疫治療を提供することが明らかである。
【００８２】
免疫刺激の構造の理解に基づいて、更なる試験を実施して、カチオン性脂質のキラリティーの効果及びカチオン性脂質の免疫刺激能力を評価した。これに関して、ＤＯＴＡＰの純粋な合成Ｒ及びＳ鏡像異性体を利用し、慣用的に利用されているラセミ混合物と比較した。ＤＯＴＡＰのＲ及びＳ鏡像異性体は、両方とも、樹状細胞の活性化及び成熟に関してラセミＤＯＴＡＰと同様の能力を有することを示した。これらの３つの脂質は全て樹状細胞を誘発して、同時刺激分子ＣＤ８０、ＣＤ８３及びＣＤ８６を発現させた。
【００８３】
疾患に対して細胞性免疫応答を誘発することができる免疫刺激物質の重要な特徴は、重要なケモカイン及びサイトカインの産生を誘発する能力である。実施例に報告されているように、ケモカイン及びサイトカインの産生を誘発する能力において有意な差がＤＯＴＡＰのＲ及びＳ異性体の間に観察された。Ｒ−ＤＯＴＡＰは、Ｓ−ＤＯＴＡＰよりも強力な免疫活性化因子であることが観察された。全ての場合において、Ｒ−ＤＯＴＡＰの効力は、ＤＯＴＰＡラセミ混合物と同等又はそれを超えていた。
【００８４】
サイトカイン誘発のインビトロ効力がインビボ治療効能に転換できるかを決定するために、３つの製剤、Ｒ−ＤＯＴＡＰ／Ｅ７、Ｓ−ＤＯＴＡＰ／Ｅ７、及びＤＯＴＡＰ／Ｅ７（ラセミ混合物）を、腫瘍担持マウスにおいてＨＰＶ−Ｅ７陽性腫瘍を消滅させる能力について評価した。各製剤を複数の脂質用量で評価した。図１２〜１５に示されているように、Ｒ−ＤＯＴＡＰ及びＤＯＴＡＰ含有製剤は、両方ともベル型脂質用量応答を示し、強力なＥ７特異的活性は、特定の最適用量範囲内で腫瘍退縮をもたらした。Ｓ−ＤＯＴＡＰ含有製剤は、観察されたいずれの条件下でも腫瘍退縮を誘発しなかったが、高脂質製剤は、腫瘍増殖を遅らせた。
【００８５】
したがって、ＤＯＴＡＰのＲ鏡像異性体が、ＤＯＴＡＰの観察されたアジュバント効果の大部分を担っていることが明白である。しかし、両方の鏡像異性体ともに、成熟をもたらす樹状細胞の強力な活性化因子である。
【００８６】
上記に報告された研究は、キラル脂質又はキラル脂質の混合物から構成されるカチオン性脂質の特定の特有の組成物及び用途を同定し、これらを利用して、幾つかの衰弱性疾患のための簡単で費用効果の高い、切望されている免疫療法を開発することができる。
【００８７】
本発明の範囲を逸脱することなく上記記述の態様及び例示的実施態様に多様な変化を加えることができるので、上記に記載に含有されている全ての事項が例示的であり、限定的な意味で解釈されるべきでないことが意図される。このため、実施例は主にカチオン性脂質であるＤＯＴＡＰの鏡像異性体について考察したが、当業者は、このカチオン性脂質は単に例示されたものであり、本方法及び機構が他のカチオン性脂質にも適用可能であることを認識する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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