(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎｏｔｃｈ１特異的アンタゴニストに応答しないＧＳＩ応答性Ｔ細胞白血病を治療するための医薬であって、該医薬が抗Ｎｏｔｃｈ３アンタゴニスト抗体を含む医薬。
【請求項２】
Ｔ細胞白血病が、活性化Ｎｏｔｃｈ３のレベルの有意な増加を有する、請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
Ｔ細胞白血病が、リンパ芽球性白血病である、請求項１又は２に記載の医薬。
【請求項４】
Ｔ細胞白血病が、Ｔ−ＡＬＬである、請求項３に記載の医薬。
【請求項５】
抗Ｎｏｔｃｈ３アンタゴニスト抗体が、抗Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲ抗体である、請求項１〜４の何れか一項に記載の医薬。
【請求項６】
抗Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲ抗体が、Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲのＬＮＲ−Ａドメイン及びＨＤ−Ｃドメインに結合する、請求項５に記載の医薬。
【請求項７】
抗Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲ抗体が、抗体２５６Ａ−４又は２５６Ａ−８の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗体のヒト化形態である、請求項５に記載の医薬。
【請求項８】
抗Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲ抗体が、抗体２５６Ａ−４又は２５６Ａ−８の重鎖及び軽鎖可変領域を含む、請求項５に記載の医薬。
【請求項９】
抗Ｎｏｔｃｈ３アンタゴニスト抗体が、Ｎｏｔｃｈ３の一つ以上のＥＧＦ様リピートに結合する抗Ｎｏｔｃｈ３抗体である、請求項１〜４の何れか一項に記載の医薬。
【請求項１０】
Ｎｏｔｃｈ１特異的アンタゴニストの有効量を更に含む、請求項１〜９の何れか一項に記載の医薬であって、抗Ｎｏｔｃｈ３アンタゴニスト抗体及びＮｏｔｃｈ１特異的アンタゴニストが、別々に、連続して、又は同時に投与される、医薬。
【請求項１１】
Ｎｏｔｃｈ１特異的アンタゴニストが、抗Ｎｏｔｃｈ１アンタゴニスト抗体である、請求項１０に記載の医薬。
【請求項１２】
抗Ｎｏｔｃｈ１アンタゴニスト抗体が、抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体である、請求項１１に記載の医薬。
【請求項１３】
抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体が、Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲのＬＮＲ−Ａドメイン、ＬＮＲ−Ｂドメイン、及びＨＤ−Ｃドメインに結合する、請求項１２に記載の医薬。
【請求項１４】
抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体が、抗体Ａ、Ａ−１、Ａ−２、Ａ−３から選択される抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗体である、請求項１２に記載の医薬。
【請求項１５】
抗Ｎｏｔｃｈ１アンタゴニスト抗体が、Ｎｏｔｃｈ１の一つ以上のＥＧＦ様リピートに結合する抗Ｎｏｔｃｈ１抗体である、請求項１１に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００９年９月３０日に出願された米国特許仮出願番号６１／２４７２９８の米国特許法１１９(ｅ)に基づく優先権を主張し、この内容を出典明記により本明細書に援用する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、Ｎｏｔｃｈ１及びＮｏｔｃｈ３アンタゴニストを単独または組み合わせて使用して、一般的に癌を、特に白血病を治療する方法に関する。ノッチ関連癌の治療及び診断のための組成物及び方法もまた提供される。
【０００３】
配列リスト
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂ経由でＡＳＣＩＩ形式で送信され、その全体が出典明示により本明細書に援用される配列表を含む。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１０年９月３日に作成され、Ｐ４３７１．ｔｘｔと命名され、大きさは  ６５，６００バイトである。
【背景技術】
【０００４】
Ｎｏｔｃｈ受容体ファミリーは、ウニとヒトほどに異なる生命体において発達に影響を与えるシグナルを伝達する進化的に保存された膜貫通型レセプターの類である。Ｎｏｔｃｈ受容体及びそのリガンドのＤｅｌｔａ及びＳｅｒｒａｔｅは、（哺乳類のＪａｇｇｅｄとして知られる）上皮成長因子（ＥＧＦ）様反復を含む大きな細胞外ドメインを持つ膜貫通タンパク質である。Ｎｏｔｃｈパラログの数は、種間で異なる。例えば、哺乳類の４つのノッチ受容体（Ｎｏｔｃｈ１−Ｎｏｔｃｈ４）、線虫の２つ（ＬＩＮ−１２及びＧＬＰ−１）、及びキイロショウジョウバエ（Ｎｏｔｃｈ）の１つがある。Ｎｏｔｃｈ受容体は、細胞表面への輸送中に膜貫通ドメインに対するＮ末端であるＳ１部位で、フューリン様プロテアーゼによってタンパク分解性に処理され、細胞外ノッチ（ＥＣＮ）サブユニット及びノッチの膜貫通サブユニット（ＮＴＭ）を生成する。これらの二つのサブユニットは  非共有結合的に結合したままで、成熟したヘテロ二量体の細胞表面受容体を構成する。
【０００５】
Ｎｏｔｃｈ１ ＥＣＮサブユニットは３６のＮ末端ＥＧＦ様リピートを含み、その後にＳ１部位の前にある３つのタンデムに反復されたＬｉｎ１２／Ｎｏｔｃｈリピート（ＬＮＲ）モジュールが続く。Ｎｏｔｃｈ３ ＥＣＮは類似構造を有するが、３４のＥＧＦ様リピートを持つ。各ＬＮＲモジュールは３つのジスルフィド結合、及びカルシウムイオンの配位が予測される保存された酸性及び極性残基の一群を含む。ＥＧＦリピート領域内で活性化リガンドの結合部位が位置する。Ｎｏｔｃｈ１及びＮｏｔｃｈ３のＮＴＭは、細胞外領域（Ｓ２切断部位を内部に持つ）、膜貫通セグメント（Ｓ３切断部位を内部に持つ）、及び、ＲＡＭ領域、アンキリン反復、トランス活性化ドメイン及びカルボキシ末端ＰＥＳＴドメインを含む大きな細胞内領域（ＩＣＮ又はＩＣＤ）を含む。ＥＣＮ及びＮＴＭサブユニットの安定した会合は、ＥＣＮのカルボキシ末端（ＨＤ−Ｎと言う）、及びＮＴＭの細胞外アミノ末端（ＨＤ−Ｃと言う）を含むヘテロ２量体化ドメイン（ＨＤ）に依存する。リガンド誘導活性化の前に、Ｎｏｔｃｈは３つのＮＬＲ及びＨＤドメインを含む負の制御領域（ＮＲＲ）により、静止コンフォーメーションで維持される。
【０００６】
ＥＣＮサブユニットへのＮｏｔｃｈリガンドの結合は、制御された膜内タンパク質分解を介して生じる２つの連続したタンパク質分解切断を開始する。部位Ｓ２でのメタロプロテアーゼ（ＡＤＡＭ１７）による最初の開裂は、Ｎｏｔｃｈ膜貫通サブユニットを形質膜の内層に近い部位Ｓ３での第二の開裂の影響を受けやすい状態にする。部位S3開裂は、プレセニリン及びニカストリンを含み、かつγ-セクレターゼ活性を促進する多タンパク質複合体によって触媒され、Ｎｏｔｃｈの貫通サブユニットの細胞内部分を解放し、それを核に移行させて標的遺伝子の転写を活性化することができるようにする。（Ｎｏｔｃｈのタンパク質分解性開裂のレビューについて、例えばSisodia et al., Nat. Rev. Neurosci. 3:281-290, 2002を参照。)
【０００７】
Ｊａｇｇｅｄ及びＤｅｌｔａ様類の５つのＮｏｔｃｈリガンドがヒトにおいて同定されている（Ｊａｇｇｅｄ１（Ｓｅｒｒａｔｅ１とも言う）、Ｊａｇｇｅｄ２（Ｓｅｒｒａｔｅ２とも言う）、Ｄｅｌｔａ様１（ＤＬＬ１とも言う）、Ｄｅｌｔａ様３（ＤＬＬ３とも言う）、及びＤｅｌｔａ様４（ＤＬＬ４とも言う））。リガンドの各々は、Ｎｏｔｃｈ結合に必須の保存されたＮ末端Ｄｅｌｔａ、Ｓｅｒｒａｔｅ、ＬＡＧ２（ＤＳＬ）モチーフを持つ１回膜貫通型タンパク質である。ＤＳＬモチーフのＣ末端の一連のＥＧＦ様モジュールは膜貫通セグメントに先行する。Ｎｏｔｃｈ受容体と違い、リガンドはそのC末端に７０−２１５アミノ酸の短い細胞質側末端を有する。加えて、リガンドの別のタイプが報告されている（例えば、ＤＮＥＲ、ＮＢ３、及びＦ３／コンタクチン）。（Ｎｏｔｃｈリガンド及びリガンド媒介Ｎｏｔｃｈ活性化のレビューについて、例えば D’Souza et al., Oncogene 27:5148-5167, 2008を参照。）
【０００８】
Ｎｏｔｃｈ経路はハエ及び脊椎動物における神経新生に影響を与えるものも含め、多様な発生過程及び生理的過程において機能する。一般的に、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、側方抑制、系統の決定、細胞群間の境界の確立に関与している。（例えば、Bray, Mol. Cell Biol. 7:678-679, 2006を参照。）癌及び神経変性疾患を含むヒトの様々な疾患はNotch受容体又はそのリガンドをコードする遺伝子の変異に起因することが示されている。（例えば、Nam et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 6:501-509, 2002を参照。）
【０００９】
腫瘍性タンパク質としてのＮｏｔｃｈ１の役割は、Ｔ細胞の前駆細胞を含む白血病で実証された。この役割はヒト急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）に最初に認められた。（例えば、Aster et al., Annu. Rev. Pathol. Mech. Dis. 3:587-613, 2008を参照。）Ｔ−ＡＬＬは、優先的に子供や若者が罹患する高悪性度の白血病である。反復性の染色体転座ｔ（７；９）（ｑ３４；ｑ３４．３）は、切断されたヒトＮｏｔｃｈ１の構成的活性型変異体を生成し、Ｔ−ＡＬＬのサブセットにおいて同定された。（７；９）転座に加えて、ヒトＮｏｃｔｈ１における高頻度機能獲得型変異が全ヒトＴ−ＡＬＬの５０％以上において後に発見された。（Weng et al., Science, 306:269-271, 2004を参照。）これらの変異は、細胞外のＨＤドメイン及び細胞内のＰＥＳＴドメインで生じる。他の研究では、骨髄細胞におけるＮｏｔｃｈ１のＩＣＮのレトロウイルスベースの発現は移植された骨髄細胞を投与されたマウスモデルにおいてＴ−ＡＬＬを引き起こすことを示した。（Aster et al., Mol. Cell Biol. 20:7505-7515, 2000を参照。）
【００１０】
Ｔ細胞の前駆細胞の白血病におけるＮｏｔｃｈの役割に一致して、Ｎｏｔｃｈ１シグナル伝達は、マウスモデルにおいて、Ｔ細胞の分化に必須であり、Ｎｏｔｃｈ１媒介シグナルがＢ細胞の分化を犠牲にしてＴ細胞の分化を促進することが示されている。（例えば、Wilson et al., J. Exp. Med. 194:1003-1012, 2001を参照。）白血病におけるＮｏｔｃｈ１の更なる役割が記載されている。Ｎｏｔｃｈ１のＰＥＳＴドメインにおける活性化突然変異は、Ｎｏｔｃｈの変異を活性化すると、骨髄性及びＴ−分化系列決定に先行する白血病幹細胞で発生する可能性があることを示唆し、ヒト急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）及び系列スイッチ白血病において低頻度で報告されている。（Palomero et al., Leukemia 20:1963-1966, 2006を参照。）
【００１１】
Ｔ−ＡＬＬにおける高頻度のＮｏｔｃｈ１機能獲得型変異の発見に先立ち、胸腺におけるＮｏｔｃｈ３のＩＣＮの強制発現がトランスジェニックマウスにおいてＴ細胞白血病／リンパ腫を引き起こすことが観察された。（Bellavia et al., EMBO J. 19:3337-3348, 2000を参照。）Ｎｏｔｃｈ３のｍＲＮＡはまた、３０人のＴ−ＡＬＬ患者のサンプルのすべてにおいて発現されているものとして報告されているが、通常の末梢血Ｔリンパ球及び非Ｔ細胞白血病では検出されなかった。（例えば、Bellavia et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 99:3788-3793, 2002を参照。）
【００１２】
Ｎｏｔｃｈ１及びＮｏｔｃｈ３はまた、種々な他の癌と関連付けられている。例えば、固形腫瘍において、増加したＮｏｔｃｈ１の発現がヒトの子宮頸部、結腸、肺、膵臓、皮膚、脳の癌で観察されており（Leong et al., Blood 107:2223-2233, 2006を参照）、Ｎｏｔｃｈ１の発現上昇は乳癌の予後不良に相関している（Parr et al., Int. J. Mol. Med. 14:779-786, 2004; Reedijk et al., Cancer Res. 65:8530-8537, 2005を参照）。染色体転座（１５；１９）は非小細胞肺癌腫瘍のサブセットにおいて同定され、転座は、Ｎｏｔｃｈ３の転写を高めると考えられている。卵巣癌では、Ｎｏｔｃｈ３遺伝子増幅が〜１９％の腫瘍で発生することが判明し、かつＮｏｔｃｈ３の過剰発現は、卵巣漿液性癌の半数以上で発見された。トランスジェニックマウスにおける活性化Ｎｏｔｃｈ１及びＮｏｔｃｈ３の過剰発現はマウスの乳腺腫瘍を誘発し、Ｎｏｔｃｈ３の過剰発現は、マウスモデルにおける脈絡叢の腫瘍形成を誘導するのに十分であり、特定の脳腫瘍の発生におけるＮｏｔｃｈ３の役割を示唆している。（癌におけるＮｏｔｃｈ３に関するレビューについては、Shih et al. Cancer Res. 67:1879-1882, 2007を参照。）
【００１３】
治療効果を有する特定の抗Ｎｏｔｃｈ１アンタゴニスト抗体が記載されている。（米国特許出願公開第２００９／００８１２３８（Ａ１）号を参照いただき、その全体が出典明示により本明細書において明示的に援用される。）例えば、そうした抗体は、Ｎｏｔｃｈ１の負の調節領域領域（ＮＲＲ）に結合し、Ｎｏｔｃｈ１シグナル伝達をブロックし、血管形成及び血管新生を混乱させ、非小細胞肺癌及び結腸腺癌のマウス異種移植モデルにおける腫瘍増殖を阻害する。そこに記述された特定の抗体は、ＬＮＲ−Ａ及びＬＮＲ−Ｂ（３回のＬＩＮ１２／Ｎｏｔｃｈリピートの最初と二番目）及びＮｏｔｃｈ１のＮＲＲのＨＤ−Ｃに結合する。Ｎｏｔｃｈ１のＥＧＦリピートに結合し、Ｎｏｔｃｈ１活性を、恐らくはリガンド結合をブロックすることで、ブロックする別の抗Ｎｏｔｃｈ１抗体もまた記載されている。（国際公開第２００８／０９１６４１号を参照。）
【００１４】
特定の抗Ｎｏｔｃｈ３アンタゴニスト抗体もまた記載されている。（米国特許出願公開第２００８／０２２６６２１（Ａ１）号を参照いただき、その全体が本明細書において明示的に援用される。）そうした抗体はＮｏｔｃｈ３の負の制御領域（ＮＲＲ）に結合し、Ｎｏｔｃｈ３シグナル伝達をブロックする。そこに記載された特定の抗体は  ＬＮＲ−Ａ（３回のＬＩＮ１２／Ｎｏｔｃｈリピートの最初）及びＮｏｔｃｈ３のＮＲＲのＨＤ−Ｃ（あるいは米国特許出願公開第２００８／０２２６６２１（Ａ１）号に記載の２番目の２量体化ドメインとして言及される）に結合する。Ｎｏｔｃｈ３のＥＧＦ様リピート領域に結合し、恐らくはリガンド結合をブロックすることで、Ｎｏｔｃｈ３の活性を、ブロックする別の抗Ｎｏｔｃｈ３抗体もまた記載されている。（Li et al., J. Biol. Chem. 283:8046-8054, 2008を参照。）
【００１５】
γ−セクレターゼ阻害剤（ＧＳＩＳ）は、複数のＮｏｔｃｈ受容体を阻害するｐａｎ−Ｎｏｔｃｈ阻害剤であり、Ｎｏｔｃｈ関連疾患の治療のために提案されており、実際にはＴ−ＡＬＬの治療のための臨床試験で使用されている。（ Roy et al., Curr. Opin. Genet. Dev. 17:52-59, 2007; Deangelo et al., J. Clin. Oncol. 2006 ASCO Annual Meeting Proceedings Part I 24:6586, 2006を参照。）しかしながら、GSISは体重減少及び腸杯細胞化生を引き起こし、腸陰窩の前駆細胞の増殖を維持し、分泌細胞運命への分化を禁止することにより  細胞運命の決定においてノッチが働く役割を反映している（van Es et al., Nature 435:959-963, 2005を参照）。ｐａｎ-Ｎｏｔｃｈ阻害のこれらの副作用は、臨床の場で管理しやすいであろうが、個々のＮｏｔｃｈ受容体を標的とし、したがって、これらの副作用を最小限にするか又は減少させる阻害剤は好都合であり得る。
【００１６】
Ｎｏｔｃｈ受容体を標的とすることにより癌を治療する更なる治療法のための必要性が当技術分野にてある。本明細書に記載の発明は、上記の必要性を満たし、かつ他の利点を提供する。
【発明の概要】
【００１７】
本発明は、Ｎｏｔｃｈアンタゴニストを単独で又は組み合わせで用いる癌の治療に関する。本発明は、特にＴ−ＡＬＬの異なるクラスの特性評価に一部が関連する。Ｔ−ＡＬＬの一つのクラスは、ＧＳＩによる治療に敏感であり、かつ、Ｎｏｔｃｈ１特異的アンタゴニストによる治療に感受性である。対照的に、Ｔ−ＡＬＬの別のクラスは、ＧＳＩによる治療に感受性であるが、Ｎｏｔｃｈ１特異的アンタゴニストによる治療に非感受性（すなわち、耐性）である。本明細書に示すように、Ｔ−ＡＬＬの後者のクラスは、Ｎｏｔｃｈ３特異的アンタゴニストによる治療に感受性であり、及びＮｏｔｃｈ１特異的アンタゴニスト及びＮｏｔｃｈ３特異的アンタゴニストの組み合わせによりいっそう感受性である。これらの結果は、白血病、特にＴ−ＡＬＬのようなＴ細胞の前駆細胞白血病におけるＮｏｔｃｈ１及びＮｏｔｃｈ３の両方の役割を示している。
【００１８】
一態様では、Ｎｏｔｃｈ特異的アンタゴニストに応答しないＧＳＩ−応答性癌の治療方法が与えられ、その方法はそうした癌患者にＮｏｔｃｈ３特異的アンタゴニストの有効量を投与することを含む。所定の実施態様において、癌はＴ細胞白血病である。所定の実施態様において、Ｔ細胞白血病はリンパ芽球性白血病である。所定の実施態様において、Ｎｏｔｃｈ３特異的アンタゴニストは、抗Ｎｏｔｃｈ３アンタゴニスト抗体である。所定の実施態様において、抗Ｎｏｔｃｈ３アンタゴニスト抗体は、抗Ｎｏｔｃｈ３  ＮＲＲ抗体である。所定の実施態様において、抗Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲ抗体はＮｏｔｃｈ３ ＮＲＲのＬＮＲ−Ａ及びＨＤ−Ｃドメインに結合する。所定の実施態様において、抗Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲ抗体は、抗体２５６Ａ-４又は２５６Ａ-８の重鎖および軽鎖可変領域のＣＤＲを有する。所定の実施態様において、抗Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲ抗体は、抗体２５６Ａ-４又は２５６Ａ-８のヒト化形態である。所定の実施態様において、抗Ｎｏｔｃｈ３アンタゴニスト抗体は、Ｎｏｔｃｈ３の一つ以上のＥＧＦ様リピートに結合する抗Ｎｏｔｃｈ３抗体である。
【００１９】
更なる実施態様にて、本方法は更にＮｏｔｃｈ１特異的アンタゴニストの有効量を投与することを含む。所定の実施態様において、投与されたＮｏｔｃｈ１特異的アンタゴニストは、抗Ｎｏｔｃｈ１アンタゴニスト抗体である。所定の実施態様において、抗Ｎｏｔｃｈアンタゴニスト抗体は、抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体である。所定の実施態様において、抗Ｎｏｔｃｈ ＮＲＲ抗体は、Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲのＬＮＲ−Ａ、ＬＮＲ−Ｂ及びＨＤ−Ｃドメインに結合する。所定の実施態様において、抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体は、抗体Ａ、Ａ-１、Ａ-２、Ａ-３から選択される。所定の実施態様において、抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体は、抗体Ａ、Ａ−１、Ａ−２、Ａ−３から選択される抗体の重鎖及び軽鎖可変領域ＣＤＲを含む。所定の実施態様において、抗Ｎｏｔｃｈ１アンタゴニスト抗体は、Ｎｏｔｃｈ１の一以上のＥＧＦ様リピートに結合する抗Ｎｏｔｃｈ１抗体である。
【００２０】
本発明の更なる態様にて、活性化Ｎｏｔｃｈ３ ＩＣＤに結合する抗体が与えられる。所定の実施態様において、抗体は配列番号４のペプチドに結合する。所定の実施態様において、抗体はポリクローナルである。所定の実施態様において、抗体はモノクローナルである。
【００２１】
本発明のさらなる態様では、Ｎｏｔｃｈ３のアンタゴニストによる治療に適した癌を同定す方法が与えられ、その方法は、請求項１５に記載の抗体と癌のサンプルを接触させること、及び、活性化Ｎｏｔｃｈ３のレベルの有意な増加がサンプル中に存在するかどうかを判定することを含み、そこで活性化Ｎｏｔｃｈ３のレベルの有意な増加が存在していることは、癌がＮｏｔｃｈ３のアンタゴニストによる治療に適していることを示している。所定の実施態様において、癌はＧＳＩ応答性である。
【００２２】
本発明による上記及び更なる態様及び実施態様が本発明に与えられる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ−１Ｄ】図１Ａ−１ＤはヒトＮｏｔｃｈ１（配列番号１）及びマウスＮｏｔｃｈ１（配列番号２）のモチーフ及び他の特徴を付記したアラインメントを示す。
【図２】図２はヒトＮｏｔｃｈ３（配列番号３）の配列を示す。ＥＧＦリピート領域はアミノ酸残基４３から１３８３に広がり、ＬＮＲモジュールは、アミノ酸残基１３８４から１４２２に及ぶＬＮＲ−Ａを有し、アミノ酸残基１３８４から１５０３に広がり、２量体化ドメインは、アミノ酸残基１５７２から１６４０に及ぶＨＤ−Ｃを有し、アミノ酸残基１５０４から１６４０に広がる。
【図３Ａ−３Ｄ】図３Ａ−３Ｄは、Ｔ−ＡＬＬ細胞株のＰ−１２ Ｉｃｈｉｋａｗａが、ＧＳＩ（ＤＡＰＴ）及び抗ＮＲＲ１（α-Ｎ１）の両方に耐性であることを示す。
【図４Ａ−４Ｄ】図４Ａ−４Ｄは、Ｔ−ＡＬＬ細胞株のＨＰＢ−ＡＬＬが、コントロール細胞に比べ、Ｇ０／Ｇ１における細胞の蓄積、及びＳ／Ｇ２／Ｍにおける細胞の減少によって証明されるように、ＧＳＩ（ＤＡＰＴ）及び抗ＮＲＲ１（α-Ｎ１）の両方に感受性であることを示す。
【図５Ａ−５Ｄ】図５Ａ−５Ｄは、Ｔ−ＡＬＬ細胞株のＴＡＬＬ−１が、ＧＳＩに感受性があるが、抗ＮＲＲ１（α−Ｎ１）に耐性があることを示す。
【図６】図６は、細胞の大きさの測定が、図３−５において同定されたＴ−ＡＬＬの３つのクラスを反映していることを示す。
【図７】図７は、アネキシンＶ（アポトーシスのマーカー）及び７−ＡＡＤ（細胞死のマーカー）による染色が、図３−５において同定されたＴ−ＡＬＬの３つのクラスを反映していることを示す。
【図８】図８の左のパネルは、Ｋｉ−６７染色（細胞増殖のマーカー）が、図３−５において同定されたＴ−ＡＬＬの３つのクラスを反映していることを示す。左にシフトしたピークは右にシフトしたピークに比べ、Ｋｉ−６７の低染色及び増殖の減少を示す。図８の右のパネルは、Ｋｉ−６７染色の減少（すなわち、増殖の減少）が、アネキシンＶ／７−ＡＡＤダブルネガティブ（すなわち、非アポトーシス性）細胞と逆の相関があることを示す。
【図９Ａ−９Ｆ】図９Ａ−９Ｆは、ＴＡＬＬ−１細胞株が、部分的に抗ＮＲＲ３（α−Ｎ３）に感受性があり、かつ抗ＮＲＲ１（α−Ｎ１）及び抗ＮＲＲ３による治療に感受性であることを示す。
【図１０Ａ−１０Ｆ】図１０Ａ−１０Ｆは、Ｔ−ＡＬＬ細胞株のＣＣＲＦ−ＣＥＭが、ＧＳＩ、抗ＮＲＲ１（α−Ｎ１）及び抗ＮＲＲ３（α−Ｎ３）の両方に耐性であることを示す。
【図１１Ａ−１１Ｆ】図１１Ａ−１１Ｆは、ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞株が、抗ＮＲＲ１（α−Ｎ１）に感受性があるが、抗ＮＲＲ３（α−Ｎ３）には感受性で無いことを示す。
【図１２】図１２は、活性化Ｎｏｔｃｈ３ ＩＣＤ（α−Ｎｏｔｃｈ３ ＩＣＤ）を認識する抗体を用いるイムノブロットを示し、Ｊａｇｇｅｄ１に刺激されたＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞の核画分において活性化Ｎｏｔｃｈ３ ＩＣＤを検出する。
【図１３】図１３は、ＴＡＬＬ−１細胞株が、開裂した活性化Ｎｏｔｃｈ３を高レベルで発現し（下のパネル）、ＤＡＰＴによりブロックできるが、抗ＮＲＲ１（α−Ｎ１）ではブロックできず、一方、ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞株は、開裂した活性化Ｎｏｔｃｈ１を高レベルで発現し、ＤＡＰＴ及び抗ＮＲＲ１（α−Ｎ１）でブロックできることを示す。
【図１４】図１４は、図９Ａ−９Ｆに示す実験結果のグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
実施態様の詳細な説明
定義
本明細書の解釈の目的のために、以下の定義が適用され、必要な場合には、単数形で使用される用語はまた複数を含み、かつその逆も含まれる。以下に記載される任意の定義が本明細書で出典明示により援用される文書と相反する場合には、以下に記載される定義が統制するものとする。  
【００２５】
本明細書で用いられる「Ｎｏｔｃｈ」なる用語は、具体的に又は文脈で特に明記しない限り、任意の天然型又は変異体（天然又は合成であろうと）Ｎｏｔｃｈポリペプチド(Ｎｏｔｃｈ１−４)を指す。「天然配列」なる用語は、天然に生じる切断型（例えば、細胞外ドメイン配列又は膜貫通サブユニット配列）、天然に生じる変異体（例えば、選択的スプライシング型）及び天然に生じる対立遺伝子変異体を特に網羅する。「野生型Ｎｏｔｃｈ」なる用語は、一般に、天然に生じる、非変異Ｎｏｔｃｈタンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドを言う。「野生型Ｎｏｔｃｈ配列」なる用語は、一般に、天然に生じる、非変異Ｎｏｔｃｈに見いだされるアミノ酸配列を言う。
【００２６】
本明細書で用いられる「Ｎｏｔｃｈ１」なる用語は、具体的に又は文脈で特に明記しない限り、任意の天然型又は変異体（天然又は合成であろうと）Ｎｏｔｃｈ１ポリペプチドを指す。「天然配列」なる用語は、天然に生じる切断型（例えば、細胞外ドメイン配列又は膜貫通サブユニット配列）、天然に生じる変異体（例えば、選択的スプライシング型）及び天然に生じる対立遺伝子変異体を特に網羅する。「野生型Ｎｏｔｃｈ１」なる用語は、一般に、天然に生じる、非変異Ｎｏｔｃｈ１タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドを言う。「野生型Ｎｏｔｃｈ１配列」なる用語は、一般に、天然に生じる、非変異Ｎｏｔｃｈ１に見いだされるアミノ酸配列を言う。
【００２７】
本明細書で用いられる「Ｎｏｔｃｈ１リガンド」なる用語は、具体的に又は文脈で特に明記しない限り、任意の天然型又は変異体（天然又は合成であろうと）Ｎｏｔｃｈ１リガンド（例えば、Ｊａｇｇｅｄ１、Ｊａｇｇｅｄ２、Ｄｅｌｔａ様１、Ｄｅｌｔａ様３、及び／又はＤｅｌｔａ様４）ポリペプチドを指す。「天然配列」なる用語は、天然に生じる切断型（例えば、細胞外ドメイン配列又は膜貫通サブユニット配列）、天然に生じる変異体（例えば、選択的スプライシング型）及び天然に生じる対立遺伝子変異体を特に網羅する。「野生型Ｎｏｔｃｈ１リガンド」なる用語は、一般に、天然に生じる、非変異Ｎｏｔｃｈ１リガンドのアミノ酸配列を含むポリペプチドを言う。「野生型Ｎｏｔｃｈ１リガンド配列」なる用語は、一般に、天然に生じる、非変異Ｎｏｔｃｈ１リガンドに見いだされるアミノ酸配列を言う。
【００２８】
本明細書で用いられる「Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ」なる用語は、具体的に又は文脈で特に明記しない限り、３つのＬＮＲモジュール及びＬＮＲモジュールのカルボキシル末端から膜貫通ドメインへ伸長するアミノ酸配列を含む、任意の天然型又は変異体（天然又は合成であろうと）ポリペプチド領域を指し、その配列はＨＤドメイン（ＨＤ−Ｎ及びＨＤ−Ｃ）を含む。典型的なＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲは、ヒトＮｏｔｃｈ１のアミノ酸配列のおよそアミノ酸１４４６からおよそアミノ酸１７３５の領域（配列番号１、図１）、及びマウスＮｏｔｃｈ１のアミノ酸配列のおよそアミノ酸１４４６からおよそアミノ酸１７２５の領域（配列番号２、図１）からなる。「天然配列Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ」なる用語は、Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲの天然に生じる切断型（例えば、細胞外ドメイン配列又は膜貫通サブユニット配列）、天然に生じる変異体（例えば、選択的スプライシング型）及び天然に生じる対立遺伝子変異体を特に網羅する。「野生型Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ」なる用語は、一般に、天然に生じる、非変異Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲを言う。幾つかの実施態様において、Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲはＮｏｔｃｈ１、例えば、Ｓ１、Ｓ２、及び／又はＳ３部位でプロセシングされたＮｏｔｃｈ１、又はプロセシングを受けていないＮｏｔｃｈ１などのＮｏｔｃｈ１に含まれる。幾つかの実施態様において、Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲは、例えば、配列番号１のアミノ酸１６６５から１７３５を含む断片に非共有結合した配列番号１のアミノ酸１４４６から１６６４を含む断片など、Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲのアミノ酸配列の２つ以上の非共有性結合断片を含む。その他の実施態様において、配列番号２のアミノ酸１４４６から１６５４を含む断片が配列番号２のアミノ酸１６５５から１７２５を含む断片に非共有結合している。
【００２９】
本明細書で用いられる「Ｎｏｔｃｈ１シグナル伝達の増加」なる用語は、実質的に同一の条件下にあるコントロールにおいて観察されたＮｏｔｃｈ１シグナル伝達のレベルを著しく上回るＮｏｔｃｈ１シグナル伝達の増加を意味する。所定の実施態様において、Ｎｏｔｃｈ１シグナル伝達の増加は少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、又は１０倍、コントロールにおいて観察されたレベルを上回っている。
【００３０】
本明細書で用いられる「Ｎｏｔｃｈ１シグナル伝達の減少」なる用語は、実質的に同一の条件下にあるコントロールにおいて観察されたＮｏｔｃｈ１シグナル伝達のレベルを著しく下回るＮｏｔｃｈ１シグナル伝達の減少を意味する。所定の実施態様において、Ｎｏｔｃｈ１シグナル伝達の減少は少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、又は１０倍、コントロールにおいて観察されたレベルを下回っている。
【００３１】
所定の実施態様において、Ｎｏｔｃｈ１シグナル伝達（すなわち、Ｎｏｔｃｈ１シグナル伝達の増加又は減少）は、例えば、米国特許出願公開第２００９／００８１２３８（Ａ１）号の実施例５に記載された、適切なレポーターアッセイを用いて評価される。所定の実施態様において、Ｎｏｔｃｈ１シグナル伝達は、米国特許出願公開第２００９／００８１２３８（Ａ１）号の、実施例５及び実施例７にそれぞれ記載された、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞の分化アッセイ又はＨＵＶＥＣ細胞の発芽アッセイなど、インビトロでの活性アッセイを用いて用いて評価される。所定の実施態様において、Ｎｏｔｃｈ１シグナル伝達は、米国特許出願公開第  ２００９／００８１２３８（Ａ１）号の実施例８に記載された、Ｃａｌｕ６及びＨＭ７モデルなど、インビボでの異種移植モデルを用いて評価される。
【００３２】
「Ｎｏｔｃｈ１活性化変異」及び「Ｎｏｔｃｈ１シグナル伝達を活性化する変異」なる用語は、Ｎｏｔｃｈ１野生型アミノ酸配列と比較して一又は複数のアミノ酸の挿入、一又は複数のアミノ酸の欠失、又は一又は複数のアミノ酸の置換であって、これによって対応するＮｏｔｃｈ１野生型アミノ酸配列からのＮｏｔｃｈ１シグナル伝達と比較してＮｏｔｃｈ１シグナル伝達の増加が引き起こされるものであるか、又は、Ｎｏｔｃｈ１野生型核酸配列と比較して一又は複数のヌクレオチドの挿入、一又は複数のヌクレオチドの欠失、一又は複数のヌクレオチドの転位、又は一又は複数のヌクレオチドの置換であって、これによって対応するＮｏｔｃｈ１野生型核酸配列を含む細胞におけるＮｏｔｃｈ１シグナル伝達と比較して変異核酸配列を含む細胞におけるＮｏｔｃｈ１シグナル伝達の増加が引き起こされるものを指す。活性化突然変異を含むＮｏｔｃｈ１受容体からのＮｏｔｃｈ１シグナル伝達はリガンド依存性でもリガンド非依存性でもよい。
【００３３】
「抗Ｎｏｔｃｈ１抗体」又は「Ｎｏｔｃｈ１に結合する抗体」なる用語は、十分な親和性を持ってＮｏｔｃｈ１に結合することができ、Ｎｏｔｃｈ１を標的にする診断薬及び／又は治療薬として有用である抗体を指す。好ましくは、抗Ｎｏｔｃｈ１抗体が、関係の無い非Ｎｏｔｃｈタンパク質に結合する程度は、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）により測定すると、抗体のＮｏｔｃｈ１に対する結合のおよそ１０％未満である。所定の実施態様において、Ｎｏｔｃｈ１に結合する抗体は解離定数（Ｋｄ）が、１μＭ以下、０．５μＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下，１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、又は０．１ｎＭ以下である。所定の実施態様において、抗Ｎｏｔｃｈ１抗体は異なる種、例えば、齧歯類（マウス、ラット）及び霊長類のＮｏｔｃｈ１の間で保存されるＮｏｔｃｈ１のエピトープに結合する。
【００３４】
「抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体」又は「Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲに結合する抗体」なる用語は、十分な親和性でＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲを結合することができ、Ｎｏｔｃｈ１を標的とする診断及び／又は治療上の薬剤として有用である抗体を指す。好ましくは、関係のないＮｏｔｃｈ以外のタンパク質に対する抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)によって測定するところの、Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲへの抗体の結合のおよそ１０％未満である。所定の実施態様において、Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲに結合する抗体は、１μＭ以下、０．５μＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、又は０．１ｎＭ以下の解離定数(Ｋｄ)を有する。所定の実施態様において、抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体は、異なる種、例えば齧歯類(マウス、ラット)及び霊長類のＮｏｔｃｈ間で保存されるＮｏｔｃｈのエピトープに結合する。
【００３５】
「Ｎｏｔｃｈ１特異的アンタゴニスト」なる用語は、上記で定義したようにＮｏｔｃｈ１シグナル伝達の減少に影響を与え、Ｎｏｔｃｈ受容体（哺乳類ではＮｏｔｃｈ２、３、又は４）によるシグナル伝達に有意には影響を与えない薬剤を指す。
【００３６】
「抗Ｎｏｔｃｈ１アンタゴニスト抗体」とは、効果は上記で定義したように、Ｎｏｔｃｈ１シグナル伝達の減少に影響を与える抗Ｎｏｔｃｈ１抗体（抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体を含む）である。
【００３７】
「抗体Ａ，Ａ−１，Ａ−２，及びＡ−３」に対する単独又は任意の組合わせにおける参照は、特に明記されない限り、米国特許出願公開第２００９／００８１２３８（Ａ１）号に記載のファージの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、及び再編成された抗体に指定された抗体Ａ，Ａ−１，Ａ−２，及びＡ−３を意味する。
【００３８】
本明細書で用いられる「Ｎｏｔｃｈ３」なる用語は、具体的に又は文脈で特に明記しない限り、任意の天然型又は変異体（天然又は合成であろうと）Ｎｏｔｃｈ３ポリペプチドを指す。「天然配列」なる用語は、天然に生じる切断型（例えば、細胞外ドメイン配列又は膜貫通サブユニット配列）、天然に生じる変異体（例えば、選択的スプライシング型）及び天然に生じる対立遺伝子変異体を特に網羅する。「野生型Ｎｏｔｃｈ３」なる用語は、一般に、天然に生じる、非変異Ｎｏｔｃｈ３タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドを言う。「野生型Ｎｏｔｃｈ３配列」なる用語は、一般に、天然に生じる、非変異Ｎｏｔｃｈ３に見いだされるアミノ酸配列を言う。
【００３９】
本明細書で用いられる「Ｎｏｔｃｈ３リガンド」なる用語は、具体的に又は文脈で特に明記しない限り、任意の天然型又は変異体（天然又は合成であろうと）Ｎｏｔｃｈ３リガンド（例えば、Ｊａｇｇｅｄ１、Ｊａｇｇｅｄ２、Ｄｅｌｔａ様１、Ｄｅｌｔａ様３、及び／又はＤｅｌｔａ様４）ポリペプチドを指す。「天然配列」なる用語は、天然に生じる切断型（例えば、細胞外ドメイン配列又は膜貫通サブユニット配列）、天然に生じる変異体（例えば、選択的スプライシング型）及び天然に生じる対立遺伝子変異体を特に網羅する。「野生型Ｎｏｔｃｈ３リガンド」なる用語は、一般に、天然に生じる、非変異Ｎｏｔｃｈ３リガンドのアミノ酸配列を含むポリペプチドを言う。「野生型Ｎｏｔｃｈ３リガンド配列」なる用語は、一般に、天然に生じる、非変異Ｎｏｔｃｈ３リガンドに見いだされるアミノ酸配列を言う。
【００４０】
「活性化Ｎｏｔｃｈ３ ＩＣＤ」は、Ｓ３部位での開裂により得られ、核への転位が可能なＮｏｔｃｈ３切断産物を指す。所定の実施態様において、活性化Ｎｏｔｃｈ３ ＩＣＤはヒトＮｏｔｃｈ３（配列番号３）のアミノ酸１６２２−２３２１から成る。
【００４１】
本明細書で用いられる「Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲ」なる用語は、具体的に又は文脈で特に明記しない限り、３つのＬＮＲモジュール及びＬＮＲモジュールのカルボキシル末端から膜貫通ドメインへ伸長するアミノ酸配列を含む、任意の天然型又は変異体（天然又は合成であろうと）ポリペプチド領域を指し、その配列はＨＤドメイン（ＨＤ−Ｎ及びＨＤ−Ｃ）を含む。典型的なＮｏｔｃｈ３ ＮＲＲは、ヒトＮｏｔｃｈ３のアミノ酸配列のおよそアミノ酸１３８４からおよそアミノ酸１６４０の領域（配列番号３、図２）からなる。「天然配列Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲ」なる用語は、Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲの天然に生じる切断型（例えば、細胞外ドメイン配列又は膜貫通サブユニット配列）、天然に生じる変異体（例えば、選択的スプライシング型）及び天然に生じる対立遺伝子変異体を特に網羅する。「野生型Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲ」なる用語は、一般に、天然に生じる、非変異Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲを言う。幾つかの実施態様において、Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲはＮｏｔｃｈ３、例えば、Ｓ１、Ｓ２、及び／又はＳ３部位でプロセシングされたＮｏｔｃｈ３、又はプロセシングを受けていないＮｏｔｃｈ３などのＮｏｔｃｈ３に含まれる。幾つかの実施態様において、Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲは、例えば、ヒトＮｏｔｃｈ３（配列番号３）のアミノ酸１５７２から１６４０を含む断片に非共有結合したヒトＮｏｔｃｈ３（配列番号３）のアミノ酸１３８４から１５７１を含む断片など、Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲのアミノ酸配列の２つ以上の非共有性結合断片を含む。
【００４２】
本明細書で用いられる「Ｎｏｔｃｈ３シグナル伝達の増加」なる用語は、実質的に同一の条件下にあるコントロールにおいて観察されたＮｏｔｃｈ３シグナル伝達のレベルを著しく上回るＮｏｔｃｈ１シグナル伝達の増加を意味する。所定の実施態様において、Ｎｏｔｃｈ３シグナル伝達の増加は少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、又は１０倍、コントロールにおいて観察されたレベルを上回っている。
【００４３】
本明細書で用いられる「Ｎｏｔｃｈ３シグナル伝達の減少」なる用語は、実質的に同一の条件下にあるコントロールにおいて観察されたＮｏｔｃｈ３シグナル伝達のレベルを著しく下回るＮｏｔｃｈ３シグナル伝達の減少を意味する。所定の実施態様において、Ｎｏｔｃｈ３シグナル伝達の減少は少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、又は１０倍、コントロールにおいて観察されたレベルを下回っている。
【００４４】
所定の実施態様において、Ｎｏｔｃｈ３シグナル伝達（すなわち、Ｎｏｔｃｈ３シグナル伝達の増加又は減少）は、例えば、米国特許出願公開第２００８／０２２６６２１（Ａ１）号の実施例５に記載された、適切なレポーターアッセイを用いて評価される。所定の実施態様において、Ｎｏｔｃｈ３シグナル伝達は、米国特許出願公開第２００８／０２２６６２１（Ａ１）号の、実施例７に記載された、アポトーシスアッセイ、細胞遊走アッセイ、浸潤アッセイ、及び形態アッセイなど、インビトロでの活性アッセイを用いて用いて評価される。所定の実施態様において、Ｎｏｔｃｈ３シグナル伝達は、インビボでの異種移植モデルを用いて評価され、例えば、米国特許出願公開第２００８／０２２６６２１（Ａ１）号の実施例１１に記載される。
【００４５】
「抗Ｎｏｔｃｈ３抗体」又は「Ｎｏｔｃｈ３に結合する抗体」なる用語は、十分な親和性でＮｏｔｃｈ３を結合することができ、Ｎｏｔｃｈ３を標的とする診断及び／又は治療上の薬剤として有用である抗体を指す。好ましくは、関係のない、非Ｎｏｔｃｈタンパク質に対する抗Ｎｏｔｃｈ３抗体の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)によって測定するところの、Ｎｏｔｃｈ３への抗体の結合のおよそ１０％未満である。所定の実施態様において、Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲに結合する抗体は、１μＭ以下、０．５μＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、又は０．１ｎＭ以下の解離定数(Ｋｄ)を有する。所定の実施態様において、抗Ｎｏｔｃｈ３抗体は、異なる種、例えば齧歯類(マウス、ラット)及び霊長類のＮｏｔｃｈ３の間で保存されるＮｏｔｃｈ３のエピトープに結合する。
【００４６】
「抗Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲ抗体」又は「Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲに結合する抗体」なる用語は、十分な親和性でＮｏｔｃｈ３ ＮＲＲを結合することができ、Ｎｏｔｃｈ３を標的とする診断及び／又は治療上の薬剤として有用である抗体を指す。好ましくは、関係のない非Ｎｏｔｃｈタンパク質に対する抗Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲ抗体の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)によって測定するところの、Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲへの抗体の結合のおよそ１０％未満である。所定の実施態様において、Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲに結合する抗体は、１μＭ以下、０．５μＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、又は０．１ｎＭ以下の解離定数(Ｋｄ)を有する。所定の実施態様において、抗Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲ抗体は、異なる種、例えば齧歯類(マウス、ラット)及び霊長類のＮｏｔｃｈ３の間で保存されるＮｏｔｃｈ３のエピトープに結合する。
【００４７】
「Ｎｏｔｃｈ３特異的アンタゴニスト」なる用語は、上記で定義したようにＮｏｔｃｈ３シグナル伝達の減少に影響を与え、別のＮｏｔｃｈ受容体（哺乳類ではＮｏｔｃｈ１、２、又は４）によるシグナル伝達に有意には影響を与えない薬剤を指す。
【００４８】
「抗Ｎｏｔｃｈ３アンタゴニスト抗体」とは、効果は上記で定義したように、Ｎｏｔｃｈ３シグナル伝達の減少に影響を与える抗Ｎｏｔｃｈ３抗体（抗Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲ抗体を含む）である。
【００４９】
「抗体２５６Ａ−４及び２５６Ａ−８」に対する単独又は組合わせによる参照は、マウスモノクローナル抗体を意味する。米国特許出願公開第２００８／０２２６６２１（Ａ１）号に記載のマウスモノクローナル抗体に指定される２５６Ａ−４及び２５６Ａ−８を意味する。
【００５０】
「アンタゴニスト」なる用語は標的分子の生物学的活性を（部分的又は完全に）有意に阻害する薬剤を指す。
【００５１】
「活性化Ｎｏｔｃｈ３ ＩＣＤに結合する抗体」とは、活性化Ｎｏｔｃｈ３ ＩＣＤに結合し、インタクトなＮＴＭを含むＮｏｔｃｈ３から活性化Ｎｏｔｃｈ３ ＩＣＤを識別するにの有用である抗体を指す。
【００５２】
本明細書において「抗体」なる用語は最も広い意味で用いられ、特に、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、及び望む生物学的活性を示す限りにおいて抗体断片を包含する。
【００５３】
「単離された」抗体とは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、抗体の研究、診断又は治療的な使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。幾つかの実施態様において、抗体は、(１)例えばローリー法で測定した場合、抗体の９５重量％以上に、及び幾つかの実施態様では９９重量％以上に、(２)例えばスピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分なほどに、又は(３)例えばクーマシーブルーあるいは銀染色を用いた非還元下あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥにより均一になるまで精製される。抗体の自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないため、単離された抗体には、組換え細胞内のインサイツでの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも一つの精製工程により調製される。
【００５４】
「天然抗体」は、通常、２つの同一の軽(Ｌ)鎖及び２つの同一の重(Ｈ)鎖からなる、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一本の共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の中で変化する。また重鎖及び軽鎖のそれぞれは、規則的に離間した鎖間ジスルフィド結合を有する。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン（ＶＨ）を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン(ＶＬ)を、他端に定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間のインターフェイスを形成すると考えられている。
【００５５】
抗体の「可変領域」又は「可変ドメイン」とは、抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ末端ドメインを意味する。重鎖の可変ドメインは「ＶＨ」と称されうる。軽鎖の可変ドメインは「ＶＬ」と称されうる。これらのドメインは一般に抗体の最も可変の部分であり、抗原結合部位を含む。  
【００５６】
「可変」という用語は、可変ドメインのある部分が抗体間の配列において広範囲に異なることを意味し、特定の各抗体の特定の抗原に対する結合及び特異性に用いられる。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって均等には分布していない。それは軽鎖及び重鎖の可変ドメイン両方の超可変領域（ＨＶＲ）と称される３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分はフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる。天然重鎖及び軽鎖の可変ドメイン各々は、大きなβ-シート構造をとり、３つの高頻度可変領域により接続された４つのＦＲ領域を含み、それはβシート構造を連結するループを形成し、かつ場合によっては、βシート構造の一部を形成する。各鎖の高頻度可変領域はＦＲ領域により一緒に近傍に保持され、別の鎖の由来する高頻度可変領域とともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ED. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)）。定常ドメインは抗体の抗原への結合に直接は関係ないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞障害における抗体の寄与を示す。
【００５７】
任意の脊椎動物種に由来する抗体(イムノグロブリン)の「軽鎖」には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と称される２つの明確に区別される型の一つが割り当てられる。
【００５８】
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、抗体（イムノグロブリン）は異なるクラスへ割り当てられる。イムノグロブリンの５つの主要なクラスがある：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、かつそれらの幾つかは更にサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２に分類される。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配位はよく知られており、例えば、Abbas等．Cellular and Mol. Immunology, 第４版(2000)(W.B. Saunders, Co., 2000)に概説されている。抗体は、抗体と１以上の他のタンパク質又はペプチドとの共有結合性又は非共有結合性の会合により形成された大きな融合分子の一部であり得る。
【００５９】
「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、ほぼインタクトな形態の抗体を指し、以下に定義するような抗体断片は意味しない。この用語は、特にＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
【００６０】
本明細書中の目的における「ネイキッド抗体」は、細胞障害性部分又は放射性標識にコンジュゲートしていない抗体である。
【００６１】
「抗体断片」は、好ましくはその抗原結合領域を含む、インタクトな抗体の一部を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２及びＦｖ断片；ダイアボディ；線形抗体；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成される多特異性抗体が含まれる。
【００６２】
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Ｆｃ」断片と命名される。ペプシン処理はＦ(ａｂ')２断片を生じ、それは２つの抗原結合部位を持ち、なお抗原を交差結合することができる。
【００６３】
「Ｆｖ」は、完全な抗原結合部位を含む最小抗体断片である。一実施態様では、二本鎖Ｆｖ種は、堅固な非共有結合をなした一つの重鎖及び一つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)種では、柔軟なペプチドリンカーによって１の重鎖及び１の軽鎖可変ドメインは共有結合性に連鎖することができ、よって軽鎖及び重鎖は、二本鎖Ｆｖ種におけるものと類似の「二量体」構造に連結することができる。この配置において、各可変ドメインの３つのＨＶＲは相互に作用してＶＨ-ＶＬ二量体表面に抗原結合部位を形成する。集合的に、６つのＨＶＲが抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン(又は抗原に対して特異的な３つのＨＶＲのみを含むＦｖの半分)でさえ、全結合部位よりも親和性が低くなるが、抗原を認識して結合する能力を有している。
【００６４】
Ｆａｂ断片は、重鎖及び軽鎖の可変ドメインを含み、かつ軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第一定常領域(ＣＨ１)をも有する。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１領域のカルボキシ末端に数個の残基が付加している点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ'-ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が一つの遊離チオール基を担持しているＦａｂ'に対するここでの命名である。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は、その間にヒンジのシステインを有するＦａｂ'断片の対としてもともと産生された。また、抗体断片の他の化学結合も知られている。
【００６５】
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。通常、ｓｃＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはｓｃＦｖが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓｃＦｖの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)のPluckthunを参照のこと。
【００６６】
「ダイアボディ」なる用語は、２つの抗原結合部位を持つ抗体断片を指し、その断片は同一のポリペプチド鎖(ＶＨ−ＶＬ)内で軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)が結合してなる。非常に短いために同一鎖上で２つのドメインの対形成ができないリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させ、２つの抗原結合部位を創製する。ダイアボディは二価でも二特異性であってもよい。ダイアボディは、例えば、欧州特許第４０４０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；Hudson等 (2003) Nat. Med. 9:129-134；及びHollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90:6444-6448 (1993)に更に詳細に記載されている。トリアボディ及びテトラボディもまたHudson等 (2003) Nat. Med. 9:129-134に記載されている。
【００６７】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」なる用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団に含まれる個々の抗体は、少量で存在しうる可能性がある突然変異、例えば自然に生じる突然変異を除いて同一である。従って、「モノクローナル」との形容は、異なる抗体の混合物ではないという抗体の性質を示す。所定の実施態様において、このようなモノクローナル抗体は、通常、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を含み、この場合、標的に結合するポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列から単一の標的結合ポリペプチド配列を選択することを含むプロセスにより得られる。例えば、この選択プロセスは、雑種細胞クローン、ファージクローン又は組換えＤＮＡクローンのプールのような複数のクローンからの、唯一のクローンの選択とすることができる。重要なのは、選択された標的結合配列を更に変化させることにより、例えば標的への親和性の向上、標的結合配列のヒト化、細胞培養液中におけるその産生の向上、インビボでの免疫原性の低減、多選択性抗体の生成等が可能になること、並びに、変化させた標的結合配列を含む抗体も、本発明のモノクローナル抗体であることである。異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体の調製物とは異なり、モノクローナル抗体の調製物の各モノクローナル抗体は、抗原の単一の決定基に対するものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体の調製物は、それらが他の免疫グロブリンで通常汚染されていないという点で有利である。
【００６８】
「モノクローナル」との形容は、抗体の、実質的に均一な抗体の集団から得られたものであるという特性を示し、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は様々な技術によって作製することができ、それらの技術には、例えば、ハイブリドーマ法(例えば、Kohler and Milstein, Nature, 256:495-97 (1975)；Hongo等, Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995)；Harlow等, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)；Hammerling等: Monoclonal Antibodies and T-Cell hybridomas 563-681 (Elsevier, N. Y., 1981))、組換えＤＮＡ法(例えば、米国特許第４８１６５６７号参照)、ファージディスプレイ技術(例えば、Clackson等, Nature, 352:624-628 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol. 222:581-597 (1992)；Sidhu等, J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)；Lee等, J. Mol. Biol. 340(5);1073-1093 (2004)；Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004)；及びLee等, J. Immounol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004))、並びに、ヒト免疫グロブリン座位の一部又は全部、或るいはヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子を有する動物にヒト又はヒト様抗体を生成する技術(例えば、国際公開第９８／２４８９３号；国際公開第９６／３４０９６号；国際公開第９６／３３７３５号；国際公開第９１／１０７４１号；Jakobovits等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993)；Jakobovits等, Nature 362: 255-258 (1993)；Bruggemann等, Year in Immunol. 7:33 (1993)；米国特許第５５４５８０７号；同第５５４５８０６号；同第５５６９８２５号；同第５６２５１２６号；同第５６３３４２５号；同第５６６１０１６号; Marks等, Bio.Technology 10: 779-783 (1992)；Lonberg等, Nature 368: 856-859 (1994)；Morrison, Nature 368: 812-813 (1994)；Fishwild等, Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996)及びLonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)参照)が含まれる。
【００６９】
本明細書においてモノクローナル抗体は、特に「キメラ」抗体を含み、それは特定の種由来又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体において、対応する配列に一致する又は類似する重鎖及び／又は軽鎖の一部であり、残りの鎖は、所望の生物学的活性を表す限り、抗体断片のように他の種由来又は他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体において、対応する配列に一致するか又は類似するものである(米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855(1984))。キメラ抗体には、抗体の抗原結合領域が例えば対象の抗原をマカクザルに免疫投与することによって作製される抗体に由来している、ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ(登録商標)抗体が含まれる。
【００７０】
非ヒト(例えばマウス)の抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。一実施態様では、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は所望の特異性、親和性及び／又は能力を有する非ヒト霊長類のような非ヒト種(ドナー抗体)からの高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。幾つかの場合において、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、もしくはドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性をさらに洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいは実質的に全てのＦＲが、ヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも一又は典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むであろう。また、ヒト化抗体は、場合によっては免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含む。さらなる詳細については、例えばJones等, Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等, Nature 332:323-329(1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596(1992)を参照のこと。また例としてVaswani及びHamilton, Ann. Allergy, Asthma &amp; Immunol. 1:105-115 (1998)；Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)；Hurle及びGross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)；米国特許第６９８２３２１号及び同第７０８７４０９号も参照のこと。
【００７１】
「ヒト抗体」は、ヒトによって生産される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するもの、及び／又はここで開示されたヒト抗体を製造するための何れかの技術を使用して製造されたものである。ヒト抗体のこの定義は、特に非ヒト抗原結合残基を含んでなるヒト化抗体を除く。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリを含む、当該分野で知られている様々な技術を使用して生産することが可能である。Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)；Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)。また、Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)；Boerner et al., J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991)において記述される方法は、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用できる。van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001)も参照のこと。抗原刺激に応答して抗体を産生するように修飾されているが、その内在性遺伝子座が無効になっているトランスジェニック動物、例えば免疫化ゼノマウスに抗原を投与することによってヒト抗体を調製することができる(例として、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ技術に関する米国特許第６０７５１８１号及び同第６１５０５８４号を参照)。また、例えば、ヒトのＢ細胞ハイブリドーマ技術によって生成されるヒト抗体に関するLi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)も参照のこと。
【００７２】
本明細書で使用される「高頻度可変領域」、「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」なる用語は、配列において高頻度可変であり、及び／又は構造的に定まったループを形成する抗体可変ドメインの領域を指す。一般に、抗体は６つのＨＶＲを含み；ＶＨに３つ(Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３)、ＶＬに３つ(Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３)である。天然の抗体では、Ｈ３及びＬ３は６つのＨＶＲのうちで最も高い多様性を示す、特にＨ３は抗体に良好な特異性を与える際に特有の役割を果たすように思われる。例として、Xu等 (2000) Immunity 13:37-45；Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ)のJohnson and Wu (2003)を参照。実際、重鎖のみからなる天然に生じるラクダ科の抗体は機能的であり、軽鎖が無い状態で安定である。Hamers-Casterman等 (1993) Nature 363:446-448；Sheriff等 (1996) Nature Struct. Biol. 3:733-736。
【００７３】
多数のＨＶＲの描写が使用され、ここに含まれる。カバット相補性決定領域(ＣＤＲ)は配列変化に基づいており、最も一般的に使用されている(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。Chothiaは、代わりに構造的ループの位置に言及している(Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。ＡｂＭ ＨＶＲは、カバットＨＶＲとChothia構造的ループの間の妥協を表し、Oxford MolecularのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアにより使用される。「接触」ＨＶＲは、利用できる複合体結晶構造の分析に基づく。これらＨＶＲのそれぞれからの残基を以下に示す。
【００７４】
0006025563.tif 000002
【００７５】
ＨＶＲは、次のような「拡大ＨＶＲ」を含むことができる、即ち、ＶＬの２４−３６又は２４−３４(Ｌ１)、４６−５６又は５０−５６(Ｌ２)及び８９−９７又は８９−９６(Ｌ３)と、ＶＨの２６−３５(Ｈ１)、５０−６５又は４９−６５(Ｈ２)及び９３−１０２、９４−１０２、又は９５−１０２(Ｈ３)である。可変ドメイン残基には、これら各々を規定するために、上掲のKabat等に従って番号を付した。
【００７６】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、ここで定義する高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００７７】
「カバット（Ｋａｂａｔ）による可変ドメイン残基番号付け」又は「カバットに記載のアミノ酸位番号付け」なる用語及びその異なる言い回しは、上掲のKabat 等の抗体の編集の軽鎖可変ドメイン又は重鎖可変ドメインに用いられる番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを用いると、実際の線形アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＨＶＲ内の短縮又は挿入に相当する２、３のアミノ酸又は付加的なアミノ酸を含みうる。例えば、重鎖可変ドメインには、重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基(例えばカバットによる残基８２ａ、８２ｂ及び８２ｃなど)と、Ｈ２の残基５２の後に単一アミノ酸の挿入(カバットによる残基５２ａ)を含んでもよい。残基のカバット番号は、「標準の」カバット番号付け配列によって抗体の配列の相同領域でアライメントすることによって与えられる抗体について決定してもよい。
【００７８】
カバット番号付けシステムは一般に、可変ドメイン内の残基を指す場合に用いられる(軽鎖のおよそ残基１−１０７及び重鎖の残基１−１１３)(例えば上掲のKabat et al.)。「ＥＵ番号付けシステム」又は「ＥＵインデックス」は一般に、イムノグロブリン重鎖定常領域を指す場合に用いられる(例えば上掲のKabat et al.において報告されたＥＵインデックス)。「カバットにおけるＥＵインデックス」はヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基番号付けを指す。本明細書中で特に明記しない限り、抗体の可変ドメイン内の残基番号の参照は、カバット番号付けシステムによって番号付けする残基を意味する。本明細書中で特に明記しない限り、抗体の定常ドメイン内の残基番号の参照は、ＥＵ番号付けシステムによる残基番号付けを意味する(例えば、米国特許出願２００８／０１８１８８８Ａ１のＥＵ番号付けに関する図を参照のこと)。
【００７９】
「親和性成熟」抗体とは、その改変を有していない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性に改良を生じせしめる、その一又は複数のＨＶＲにおいて一又は複数の改変を持つものである。一実施態様では、親和成熟抗体は、標的抗原に対してナノモル又はピコモルの親和性を有する。親和成熟抗体は、当該分野において知られているある手順を用いて生産されてよい。例えば、Marks等, Bio/Technology, 10：779-783(1992)は、ＶＨ及びＶＬドメインシャッフリングによる親和成熟について記載している。ＨＶＲ及び／又はフレームワーク残基のランダム突然変異誘導は、例としてBarbas等, Proc Nat Acad. Sci, USA 91：3809-3813(1994)；Schier等, Gene, 169：147-155(1995)；Yelton等, J. Immunol.155：1994-2004(1995)；Jackson等, J. Immunol.154(7)：3310-9(1995)；及びHawkins等, J. Mol. Biol.226：889-896(1992)に記載されている。
【００８０】
抗体の「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域(天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域)に帰する生物学的活性を意味し、抗体のアイソタイプにより変わる。抗体のエフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）；Ｆｃレセプター結合性；抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ＡＤＣＣ)；貪食作用；細胞表面レセプター(例えば、Ｂ細胞レセプター)のダウンレギュレーション；及びＢ細胞活性化が含まれる。
【００８１】
一般的に「結合親和性」は、分子(例えば抗体)の単一結合部位とその結合パートナー(例えば抗原)との間の非共有結合的な相互作用の総合的な強度を意味する。特に明記しない限り、「結合親和性」は、結合対のメンバー(例えば抗体と抗原)間の１：１相互作用を反映する内因性結合親和性を意味する。一般的に、分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、解離定数(Ｋｄ)として表される。親和性は、本明細書中に記載のものを含む当業者に公知の共通した方法によって測定することができる。低親和性抗体は抗原にゆっくり結合して素早く解離する傾向があるのに対し、高親和性抗体は抗原により密接により長く結合したままとなる。結合親和性の様々な測定方法が当分野で公知であり、それらの何れかを本発明のために用いることができる。以下に結合親和性を測定するための具体的な例示的実施態様を記載する。
【００８２】
一実施態様では、本発明の「Ｋｄ」又は「Ｋｄ値」は、以下のアッセイで示されるような、所望の抗体のＦａｂ型(バージョン)とその抗原を用いて実行される放射性標識した抗原結合アッセイ(ＲＩＡ)で測定される。段階的な力価の非標識抗原の存在下で、最小濃度の(１２５Ｉ)-標識抗原にてＦａｂを均衡化して、抗Ｆａｂ抗体コートプレートと結合した抗原を捕獲することによって抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性を測定する(例としてChen, et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)を参照)。アッセイの条件を決めるために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ(登録商標)マルチウェルプレート(Thermo Scientific)を５μｇ／ｍｌの捕獲抗Ｆａｂ抗体(Cappel Labs)を含む５０ｍＭ炭酸ナトリウム(ｐＨ９．６)にて一晩コートして、その後２％(w/v)のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳにて室温(およそ２３℃)で２〜５時間、ブロックする。非吸着プレート(Nunc #269620)に、１００ｐＭ又は２６ｐＭの［１２５Ｉ］抗原を段階希釈した所望のＦａｂと混合する(例えば、Presta等, (1997) Cancer Res. 57: 4593-4599の抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ-１２の評価と一致する)。ついで所望のＦａｂを一晩インキュベートする；しかし、インキュベーションは平衡状態に達したことを確認するまでに長時間(例えばおよそ６５時間)かかるかもしれない。その後、混合物を捕獲プレートに移し、室温で(例えば１時間)インキュベートする。そして、溶液を取り除き、プレートを０．１％のＴｗｅｅｎ２０ＴＭを含むＰＢＳにて８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μｌ／ウェルの閃光物質(MicroScint-20ＴＭ；Packard)を加え、プレートをTopcountＴＭγ計測器(Packard)にて１０分間計測する。最大結合の２０％か又はそれ以下濃度のＦａｂを選択してそれぞれ競合結合測定に用いる。
【００８３】
他の実施態様によると、〜１０反応単位(ＲＵ)の固定した抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃のＢＩＡｃｏｒｅ(登録商標)-２０００又はＢＩＡｃｏｒｅ(登録商標)-３０００(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)にて表面プラズモン共鳴アッセイを行ってＫｄ又はＫｄ値を測定する。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5, BIAcore Inc.)を、提供者の指示書に従ってＮ-エチル-Ｎ'-(３-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(ＥＤＣ)及びＮ-ヒドロキシスクシニミド(ＮＨＳ)で活性化した。抗原を１０ｍＭ 酢酸ナトリウム(ｐＨ４．８)で５μｇ／ｍｌ(〜０．２μＭ)に希釈し、結合したタンパク質の反応単位(ＲＵ)がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入した。抗原の注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入した。動力学的な測定のために、２倍の段階希釈したＦａｂ(０．７８ｎＭから５００ｎＭ)を２５℃、およそ２５μｌ／分の流速で０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭ界面活性剤(ＰＢＳＴ)を含むＰＢＳに注入した。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル(simple one-to-one Langmuir binding model) (BIAcore Evaluationソフトウェアバージョン3.2)を用いて、会合速度(ｋｏｎ)と解離速度(ｋｏｆｆ)を算出した。平衡解離定数(Ｋｄ)をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出した。例として、Chen, Y.,等, (1999) J. Mol Biol 293:865-881を参照。上記の表面プラスモン共鳴アッセイによる結合速度が１０６Ｍ−１Ｓ−１を上回る場合、分光計、例えば、流動停止を備えた分光光度計(stop-flow equipped spectrophometer)(Aviv Instruments)又は撹拌キュベットを備えた8000シリーズSLM-Aminco分光光度計(ThermoSpectronic)で測定される、漸増濃度の抗原の存在下にて、ＰＢＳ(ｐＨ７．２)、２５℃の、２０ｎＭの抗抗原抗体(Ｆａｂ型)の蛍光放出強度(励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ)における増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて結合速度を測定することができる。
【００８４】
また、本発明の「結合速度」又は「会合の速度」又は「会合速度」又は「ｋｏｎ」は、〜１０反応単位(ＲＵ)の固定した抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃のＢＩＡｃｏｒｅ(登録商標)-２０００又はＢＩＡｃｏｒｅ(登録商標)-３０００(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)を用いた前述と同じ表面プラズモン共鳴アッセイにて測定される。
【００８５】
「疾患」は、本発明の組成物又は方法による治療により利益を得る任意の状態又は症状である。これには、哺乳動物の問題の疾患の素因になる病的状態を含み、慢性及び急性の疾患が含まれる。本明細書において治療される疾患の非限定的な例は、癌などの状態等である。
【００８６】
「細胞増殖性疾患」及び「増殖性疾患」という用語は、ある程度の異常な細胞増殖を伴う疾患を意味する。一実施態様では、細胞増殖性疾患は癌である。
【００８７】
本明細書中の「腫瘍」とは、悪性か良性かにかかわらず、すべての腫瘍性細胞成長及び増殖と、すべての前癌性及び癌性細胞及び組織を指す。「癌」、「癌性」「細胞増殖性疾患」、「増殖性疾患」及び「腫瘍」なる用語は、本明細書に参照されるように相互に排他的でない。
【００８８】
「癌」及び「癌性」なる用語は、一般的に調節不可能な細胞成長／増殖に特徴がある哺乳動物の生理学的状態を指すか又は表す。癌の例には、上皮癌、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫及び白血病が含まれるが、これに限定されるものではない。このような癌のより具体的な例には、扁平細胞癌、小細胞肺癌、下垂体癌、食道癌、星状細胞腫、軟組織肉腫、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞性癌、胃腸癌、膵癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝腫瘍、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮上皮癌、唾液腺上皮癌、腎臓癌、肝癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝臓癌、脳癌、子宮体癌、精巣癌、胆管癌、胆嚢カルチノーマ、胃癌、メラノーマ、及び様々なタイプの頭頸部癌が含まれる。血管新生の調節不全により、本発明の組成物及び方法により治療されうる多くの疾患が引き起こされうる。これらの疾患には、非腫瘍性及び腫瘍性の両方の状態が含まれる。腫瘍性状態には上記のものが含まれるが、これに限定されるものではない。非腫瘍性疾患には、限定するものではないが、例えば、望ましくない又は異常な肥大、関節炎、関節リウマチ(ＲＡ)、乾癬、乾癬のプラーク、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化、アテローム硬化性プラーク、未熟児の網膜症を含む糖尿病性及び他の増殖的な網膜症、水晶体後繊維増殖、血管新生緑内障、年齢関連性黄斑変性、糖尿病性黄斑浮腫、角膜血管新生、角膜移植片血管新生、角膜移植片拒絶、網膜／脈絡叢血管新生、角度(ルベオーシス)の血管新生、眼性新生血管疾患、血管再狭窄、動静脈奇形(ＡＶＭ)、髄膜腫、血管腫、血管線維腫、甲状腺の過形成(甲状腺機能亢進症を含む)、角膜及び他の組織移植、慢性の炎症、肺炎症、急性の肺損傷／ＡＲＤＳ、敗血症、原発性肺高血圧症、悪性の肺滲出、大脳浮腫(例えば、急性の脳卒中／非開放性頭部損傷／外傷と関係するもの)、滑液炎症、ＲＡのパンヌス形成、筋炎骨化(myositis)、肥大性骨形成、骨関節炎(ＯＡ)、抵抗性腹水、多嚢胞性卵巣疾患、子宮内膜症、体液疾患(膵炎、コンパートメント症候群、熱傷、腸疾患)の第３の間隔、子宮類線維腫、早産、ＩＢＤなどの慢性炎症(クローン病及び潰瘍性大腸炎)、腎臓同種異系移植片拒絶反応、炎症性腸疾患、ネフローゼ症候群、望ましくない又は異常な組織塊成長(非癌)、出血性関節、肥大性瘢痕、体毛成長の阻害、オスラー-ウェーバー症候群、化膿肉芽腫水晶体後繊維増殖、強皮症、トラコーマ、血管癒着、関節滑膜炎、皮膚炎、子癇前症、腹水、心嚢貯留液(心外膜炎と関係するものなど)及び胸水が含まれる。
【００８９】
「白血病」なる用語は、造血組織、他の臓器、しばしば血液中の白血球細胞（白血球）数の異常な増加を特徴とする急性又は慢性疾患を指す。白血病は、限定されないが、Ｔ−系統急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）並びに他のリンパ球性白血病；成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、慢性骨髄性（骨髄性）白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性（骨髄性）白血病（ＡＭＬ）、及び他の顆粒球性白血病及び系列スイッチ白血病を含む急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を含む。
【００９０】
「Ｔ細胞白血病」なる用語は、Ｔ−系列リンパ芽球又はＴリンパ球の数の異常な増加によって特徴づけられる白血病を指す。
【００９１】
「Ｔ細胞前駆細胞白血病」は、Ｔ−系列リンパ芽球の数の異常な増加によって特徴づけられる白血病を指す。
【００９２】
「ＧＳＩ応答性癌」はガンマセクレターゼ阻害剤に応答し、又はそれで治療された場合にガンマセクレターゼ阻害剤に応答するであろう癌（白血病など）である。
【００９３】
治療薬に 「応答する」癌は、癌又は腫瘍の進行において有意な減少を示すものであり、限定されないが、（１）減速、及び完全な成長停止を含む腫瘍増殖のある程度の阻害；（２）癌又は腫瘍細胞数の減少;（３）腫瘍の大きさの縮小；（４）隣接する末梢器官及び／又は組織へ癌細胞の浸潤の阻害（すなわち、減少、減速又は完全な停止）;（５）転移の阻害（すなわち、減速又は完全な停止）を含む。
【００９４】
「Ｎｏｔｃｈ１特異的アンタゴニストに応答しない」癌は、（他のノッチアンタゴニスト、すなわち、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３又はＮｏｔｃｈ４アンタゴニストの非存在下で）Ｎｏｔｃｈ１特異的アンタゴニストによる治療に応答しないか、又は与えられた場合にそうした治療に応答しないであろう癌である。
【００９５】
本明細書中で使用される、「治療」（「治療する（treat）」又は 「処理（treat）」などのバリエーション）とは、治療を受けている個体又は細胞の自然経過を変化させる試みにおける臨床的介入を意味し、予防のため又は臨床病理の経過の最中の何れかで実行することができる。治療の望ましい効果は、病気の発生や再発を防ぎ、症状の緩和、病気の直接的又は間接的な病理学的影響の縮小、転移の予防、疾患の進行速度を低下、疾患状態の改善又は緩和、寛解又は改善された予後を含む。
【００９６】
「個体」、「被検体」、又は「患者」は脊椎動物である。所定の実施態様において、脊椎動物は哺乳動物である。哺乳動物とは、限定されないが、農場の動物（例えば、牛など）、スポーツ動物、ペット（例えばネコ、イヌ、馬など）、霊長類、マウス、ラットを含む。所定の実施態様において、哺乳動物はヒトである。
【００９７】
「薬学的製剤」なる用語は、有効である活性成分の生物学的活性を許容するような形態で存在し、製剤を投与する被検体にとって許容できない毒性がある他の成分を含まない調製物を指す。このような製剤は無菌であってよい。
【００９８】
「有効量」とは所望の治療又は予防結果を達成するために必要な用量及び期間での効果的な量を意味する。
【００９９】
本発明の実施態様
本発明は、Ｔ−ＡＬＬの異なるクラスの特性評価に、部分的に関連する。Ｔ−ＡＬＬの一クラスは、ｐａｎ−Ｎｏｔｃｈ阻害剤であるＧＳＩによる治療に感受性であり、また、Ｎｏｔｃｈ１特異的アンタゴニストによる治療に感受性であり、Ｎｏｔｃｈ１はＴ−ＡＬＬのこのクラスを特異的に駆動することを示している。Ｔ−ＡＬＬの別のクラスは、ＧＳＩによる治療に感受性であるが、Ｎｏｔｃｈ１特異的アンタゴニストでの治療には反応がなく（すなわち、耐性）、代替又は追加のＮｏｔｃｈ受容体がＴ−ＡＬＬのこのクラスを駆動する可能性があることを示している。本明細書に示すように、本発明者らは、T-ALLのこの後者のクラスはＮｏｔｃｈ３特異的アンタゴニストによる治療に一部は感受性であり、かつＮｏｔｃｈ１特異的アンタゴニスト及びＮｏｔｃｈ３特異的アンタゴニストの組み合わせにより一層感受性があることを発見した。これらの結果は、白血病、特Ｔ−ＡＬＬなどのＴ細胞白血病及びＴ細胞前駆細胞白血病におけるＮｏｔｃｈ１及びＮｏｔｃｈ３の両方の役割を示唆している。
【０１００】
Ａ．治療の方法
１．単独又はＮｏｔｃｈ１特異的アンタゴニストと組み合わせたＮｏｔｃｈ３特異的アンタゴニストによる癌の治療
本発明の様々な態様では、ＧＳＩ応答性癌の治療方法は、そうした癌に罹患した患者に、Ｎｏｔｃｈ３特異的アンタゴニストの有効量を投与することを含む方法を提供する。所定の実施態様において、ＧＳＩ応答性癌は白血病である。所定の実施態様において、ＧＳＩ応答性癌はＮｏｔｃｈ１特異的アンタゴニストに応答せず、例えば、癌は活性化Ｎｏｔｃｈ３のレベルを著しく増加させるか、及び／又は癌は活性化Ｎｏｔｃｈ１のレベルが欠損しているか、又は低下させる。更なる実施態様において、本方法はさらに、Ｎｏｔｃｈ１特異的アンタゴニストの有効量を投与する工程を包含する。本発明のこれら及び更なる態様は、以下に記載される。
【０１０１】
本発明の特定の態様において、Ｎｏｔｃｈ１特異的アンタゴニストに応答しないＧＳＩ応答性白血病の治療方法が提供され、その方法は、そうした白血病に罹患した患者にＮｏｔｃｈ３特異的アンタゴニストの有効量を投与することを含む。
【０１０２】
ＧＳＩ応答性性白血病は、さまざまな方法によって特定され得る。例えば、白血病を有する患者は、白血病がＧＳＩ応答性であるかどうかを決定するためにＧＳＩで治療され得る。そのようなＧＳＩは有意にＮｏｔｃｈ受容体を阻害する任意のＧＳＩを含めることができる。そのようなＧＳＩは、限定されないが、Ｎ-［Ｎ-（３，５-ジフルオロフェンアセチル）-Ｌ-アラニル］-Ｓ-フェニルグリシンｔ-ブチルエステル（ＤＡＰＴ）；ジベンザゼピン；ＭＫ-０７５２（Ｍｅｒｃｋ）；トリペプチドｚ-Ｌｅｕ-Ｌｅｕ-Ｎｌｅ-ＣＨＯ  (Curry et al., Oncogene 24:6333-6344); and cbz-IL-CHO (Weijzen et al., Nat. Med. 8:979-986, 2002)を含む。しかしながら、白血病を有する患者は、白血病がＧＳＩ応答性であるかどうかを判断するために、ＧＳＩにより治療されている必要はないことが留意される。他の方法を用いることができる。例えば、患者から除去された白血病細胞は、ＧＳＩ、例えば上記にリストされたものの何れかの存在下で、細胞増殖又は生存について評価することができる。更なる例において、患者から除去された白血病細胞は、一又は複数のＮｏｔｃｈ受容体によるＮｏｔｃｈシグナル伝達の増加について検討され、その細胞がＧＳＩ応答性であることを予測することができる。例えば、細胞はＮｏｔｃｈ受容体の変異、過剰発現、又は活性化の存在について評価することができる。上記と同様の方法は、任意の癌がＧＳＩ応答性であるかどうかを判断するために使用され得る。
【０１０３】
白血病（例えば、ＧＳＩ応答性白血病）は、様々な方法により、Ｎｏｔｃｈ１特異的アンタゴニストに応答しないものとして同定することができる。例えば、白血病を有する患者は、白血病がＮｏｔｃｈ１特異的アンタゴニストに応答するかどうかを決定するために、Ｎｏｔｃｈ１特異的アンタゴニストで治療することができる。所定の実施態様において、白血病に対して応答しないＮｏｔｃｈ１特異的アンタゴニストは抗Ｎｏｔｃｈ１アンタゴニスト抗体である。そうした実施態様の一つにおいて、抗Ｎｏｔｃｈ１アンタゴニスト抗体は、Ｎｏｔｃｈ１の細胞外ドメインに結合し、Ｎｏｔｃｈ１シグナル伝達を減少させる効果のある抗体である。そうした実施態様の一つにおいて、抗Ｎｏｔｃｈ１アンタゴニスト抗体は抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体である。抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ交代は、限定されないが、米国特許出願公開第２００９／００８１２３８（Ａ１）号に開示された、抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体の何れかを含み、出典明示によりその全体が本明細書に明示的に援用される。そうした抗体は、限定されないが、Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲに０．１μＭ以下の親和性で結合する抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体；Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲのＬＮＲ−Ａ、ＬＮＲ−Ｂ及びＨＤ−Ｃに結合する抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体；または上記の組み合わせを含む。典型的な抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体としては、限定されないが、米国特許出願公開第２００９／００８１２３８（Ａ１）号に記載された抗体、Ａ、Ａ−１、Ａ−２、Ａ−３、又は抗体、Ａ、Ａ−１、Ａ−２、Ａ−３から選択される抗体の重鎖及び軽鎖可変領域のＣＤＲを含む抗体を含む。その他のそうした実施態様において、抗Ｎｏｔｃｈ１アンタゴニスト抗体は、Ｎｏｔｃｈ１の一つ以上のＥＧＦ様リピートに結合する抗Ｎｏｔｃｈ１抗体である。このような抗体の例は、国際公開第２００８／０９１６４１号に記載されている。所定の実施態様において、一つ以上のＥＧＦ様リピートに結合する抗Ｎｏｔｃｈ１抗体は、Ｎｏｔｃｈ１へのリガンドの結合を有意に遮断することによって、Ｎｏｔｃｈ１シグナル伝達の減少に影響する。
【０１０４】
しかしながら、白血病を有する患者は、白血病がＮｏｔｃｈ１特異的アンタゴニストに応答しないものであるかどうかを判断するために、Ｎｏｔｃｈ１特異的アンタゴニストで治療されている必要はないことが留意される。他の方法を用いることができる。例えば、患者から除去された白血病細胞は、Ｎｏｔｃｈ１活性化の欠損又は減少、又は所定の実施態様において、野生型Ｎｏｔｃｈ１の存在について評価することができ、これは白血病がＮｏｔｃｈ１特異的アンタゴニストに応答しないものであることを予測するだろう。例えば、細胞は、Ｈｅｙ１及びＨｅｙ２などのＮｏｔｃｈ１標的遺伝子の欠損又は転写の減少を評価することによって、Ｎｏｔｃｈ１シグナル伝達の欠損又は減少について評価することができる。更なる例において、細胞はＮｏｔｃｈ１シグナル伝達の欠損又は減少について、Ｎｏｔｃｈ１の活性化型の欠損又は減少を検出することにより、例えば、抗活性化Ｎｏｔｃｈ１ Ｖａｌ１７４４などの活性化Ｎｏｔｃｈ１特異的な抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入できる）を用いて評価することができる。所定の実施態様において、適切なコンパレータ細胞（陽性コントロール）は、Ｎｏｔｃｈ１特異的アンタゴニストに応答する白血病細胞、例えば、Ｎｏｔｃｈ１経路が活性化されている白血病細胞であってもよい。そのようなコンパレータ細胞は、例えば、ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞のように、Ｎｏｔｃｈ１が過剰発現され、変異され（例えば、Ｎｏｔｃｈ１活性化変異を持ち）又は活性化（例えば、構成的活性化）されることが知られているＴ−ＡＬＬ細胞を含み得る。患者から除去された白血病細胞が、コンパレータ細胞に比べて、活性化Ｎｏｔｃｈ１を欠損しているか、又は有意にレベルを低下させている場合は、患者の白血病では、推定上Ｎｏｔｃｈ１特異的アンタゴニストに応答しないものである。
【０１０５】
白血病細胞はまた、Ｎｏｔｃｈ３経路が活性化されていること、従って白血病はＮｏｔｃｈ１特異的アンタゴニストに応答しないものになると予測されていることを示している、Ｎｏｔｃｈ３の活性化について評価することができる。一実施態様において、白血病細胞はＮｏｔｃｈ３の過剰発現、変異又は活性化の存在について検査され得る。所定の実施態様において、Ｎｏｔｃｈ３活性化状態を評価する目的に適したコンパレータ細胞（陰性コントロール）は、Ｎｏｔｃｈ１特異的アンタゴニストに応答する白血病細胞、例えば、Ｎｏｔｃｈ１経路が活性化されている白血病細胞であってもよい。そのようなコンパレータ細胞は、例えば、ｍＨＰＢ−ＡＬＬ細胞など、Ｎｏｔｃｈ１が過剰発現され、変異され、又は活性化されることが知られているＴ−ＡＬＬ細胞を含み得る。このような細胞においては、Ｎｏｔｃｈ３が有意に活性化されることは期待されていない。従って、患者から除去された白血病細胞が、コンパレータ細胞に比べて活性化Ｎｏｔｃｈ３のレベルが有意に増加させている場合は、患者の白血病は推定上Ｎｏｔｃｈ１特異的アンタゴニストに応答しないものである。所定の他の実施態様において、適切なコンパレータ細胞（陽性コントロール）は、ＴＡＬＬ−１細胞など、Ｎｏｔｃｈ３が、過剰発現され、変異され、又は活性化されることが知られている白血病細胞であってもよい。そのような細胞において、Ｎｏｔｃｈ３は活性化Ｎｏｔｃｈ３のレベルを有意に増加させていることが予想される。従って、患者から除去された白血病細胞がコンパレータ細胞に比べて活性化Ｎｏｔｃｈ３の同等レベルを有する場合には、患者の白血病は、推定上Ｎｏｔｃｈ１特異的アンタゴニストに応答しないものである。上記と同様の方法は、任意の癌が、Ｎｏｔｃｈ１特異的アンタゴニストに応答しないものかどうかを決定するために使用することができる。
【０１０６】
Ｎｏｔｃｈ３活性化状態を評価するための有用なツールは、例で説明した新規抗Ｎｏｔｃｈ３ ＩＣＤ抗体であり、活性化Ｎｏｔｃｈ３ ＩＣＤに結合する。
【０１０７】
所定の実施態様において、投与されるＮｏｔｃｈ３特異的アンタゴニストは、抗Ｎｏｔｃｈ３アンタゴニスト抗体である。そのような実施態様の一つにおいて、抗Ｎｏｔｃｈ３アンタゴニスト抗体は、Ｎｏｔｃｈの細胞外ドメインに結合する抗体であり、Ｎｏｔｃｈ３シグナル伝達の減少を生じさせる。そのような実施態様の一つにおいて、抗Ｎｏｔｃｈ３アンタゴニスト抗体は、抗Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲ抗体である。抗Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲ抗体は、限定されないが、米国特許出願公開第２００８／０２２６６２１（Ａ１）号に開示されている抗Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲ抗体の何れかを含み、本明細書にてその全体が出典明示により明示的に援用される。そのような抗体は、限定されないが、Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲのＬＮＲ−Ａドメイン及びＨＤ−Ｃドメインに結合する、抗Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲ抗体を含む。典型的な抗Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲ抗体は、米国特許出願公開第２００８／０２２６６２１（Ａ１）号に記載されたモノクローナル抗体２５６Ａ−４及び２５６Ａ−８、及びそのヒト化型、並びに抗体２５６Ａ−４又は２５６Ａ−８の重鎖及び軽鎖可変領域のＣＤＲを含む抗Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲ抗体である。その他のそうした実施態様において、抗Ｎｏｔｃｈ３アンタゴニスト抗体は、Ｎｏｔｃｈ３の一つ以上のＥＧＦ様リピートに結合する抗Ｎｏｔｃｈ３抗体である。そのような抗体の例はLi et al., J. Biol. Chem. 283:8046-8054, 2008に記載されている。所定の実施態様において、Ｎｏｔｃｈ３の一つまたは複数のＥＧＦ様リピートに結合する抗Ｎｏｔｃｈ３抗体は、Ｎｏｔｃｈ３に対するリガンドの結合を有意にブロックすることにより、Ｎｏｔｃｈ３シグナル伝達の減少を生じさせる。
【０１０８】
所定の実施態様において、白血病はＴ細胞白血病である。所定のそうした実施態様において、Ｔ細胞白血病はＴ細胞前駆細胞白血病である。所定のそうした実施態様において、Ｔ細胞前駆細胞白血病は、Ｔ−ＡＬＬである。
【０１０９】
更なる実施態様において、Ｎｏｔｃｈ１特異的アンタゴニストに応答しないＧＳＩ応答性癌を治療する方法が提供され、その方法は、そうした癌を有する患者にＮｏｔｃｈ３特異的アンタゴニストの有効量を投与することを含み、かつ更にそうした患者にＮｏｔｃｈ１特異的アンタゴニストの有効量を投与することを含む。所定の実施態様において、ＧＳＩ応答性癌は、ＧＳＩ応答性白血病である。所定の実施態様において、投与されるべきＮｏｔｃｈ１特異的アンタゴニストは、抗Ｎｏｔｃｈ１のアンタゴニスト抗体である。そうした実施態様の一つにおいて、抗Ｎｏｔｃｈ１アンタゴニスト抗体は、Ｎｏｔｃｈ１の細胞外ドメインに結合し、Ｎｏｔｃｈ１シグナル伝達を減少を生じさせる抗体である。そうした実施態様の一つにおいて、抗Ｎｏｔｃｈ１アンタゴニスト抗体は、抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体である。抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体としては、限定されないが、米国特許出願公開第２００９／００８１２３８（Ａ１）号に開示されている抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲの抗体の何れかを含み、出典明示により本明細書に明示的に援用される。そのような抗体は、限定されないが、０．１μＭ以下の親和性でＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲに結合する抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体；Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲのＬＮＲ−Ａ、ＬＮＲ−Ｂ及びＨＤ−Ｃに結合する抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体；又は上記の組合わせを含む。典型的な抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体は、限定されないが、米国特許出願公開第２００９／００８１２３８（Ａ１）号に記載された抗体、Ａ、Ａ−１、Ａ−２、Ａ−３、及び抗体、Ａ、Ａ−１、Ａ−２、Ａ−３から選択された抗体の重鎖及び軽鎖可変領域ＣＤＲを含む抗体を含む。別のそうした実施態様において、抗Ｎｏｔｃｈ１アンタゴニスト抗体は、Ｎｏｔｃｈ１の一つ以上のＥＧＦ様リピートに結合する抗Ｎｏｔｃｈ１抗体である。そのような抗体の例は、国際公開第２００８／０９１６４１号に記載されている。所定の実施態様において、Ｎｏｔｃｈ１の一つ以上のＥＧＦ様リピートに結合する抗Ｎｏｔｃｈ１抗体は、Ｎｏｔｃｈ１に対するリガンドの結合を有意にブロックすることにより、Ｎｏｔｃｈ１シグナル伝達の減少を生じさせる。
【０１１０】
２．Ｎｏｔｃｈ１特異的アンタゴニストによる白血病の治療
本発明の更なる態様は、ＧＳＩに応答性であり、またＮｏｔｃｈ１特異的アンタゴニストにも応答性であるが、Ｎｏｔｃｈ３特異的アンタゴニストに応答せず、Ｎｏｔｃｈ１がＴ−ＡＬＬを駆動することを示している、Ｔ−ＡＬＬの一クラスの同定に一部は基づく。本発明の様々な態様において、ＧＳＩ応答性癌の治療方法が提供され、その方法はそうした癌を持つ患者にＮｏｔｃｈ１特異的アンタゴニストの有効量を投与することを含む。所定の実施態様において、ＧＳＩ応答性癌は白血病である。所定の実施態様において、ＧＳＩ応答性癌はＮｏｔｃｈ３特異的アンタゴニストに応答せず、例えば、癌は（例えば、Ｎｏｔｃｈ３特異的アンタゴニストに応答するコンパレータ細胞に比べた場合）活性化Ｎｏｔｃｈ１のレベルが欠損しているか、又は低下させ、及び／又は（例えば、Ｎｏｔｃｈ１特異的アンタゴニストに応答しないコンパレータ細胞に比べた場合）活性化Ｎｏｔｃｈ１のレベルを有意に増加させる。
【０１１１】
所定の実施態様において、白血病はＧＳＩに対する感受性により、及びＮｏｔｃｈ１特異的アンタゴニストに対する感受性により特徴付けられる白血病のクラスに属す。一実施態様において、白血病はＴ細胞白血病である。そうした実施態様の一つにおいて、Ｔ細胞白血病はＴ細胞前駆細胞白血病である。そうした実施態様の一つにおいて、T細胞白血病は、Ｔ−ＡＬＬである。その他の実施態様において、白血病はＮｏｔｃｈ１の活性化突然変異によって特徴付けられる。所定の実施態様において、Ｎｏｔｃｈ１特異的アンタゴニストは、上記の提供されるものの何れかである。更なる実施態様において、Ｎｏｔｃｈ３特異的アンタゴニストは、上記に提供されるものの何れかである。
【０１１２】
Ｂ．組成物及び診断法
本発明は更に、活性化ヒトＮｏｔｃｈ３  ＩＣＤに結合する抗体を提供する。一実施態様において、抗体は配列ＶＭＶＡＲＲＫＲＥＨＳＴＬＷ（配列番号４）に結合する。一実施態様において、抗体はポリクローナルである。上記の実施態様は単独又は組み合わせて存在し得る。
【０１１３】
そのような抗体は例えば、上記のようにＮｏｔｃｈ３特異的アンタゴニストによる治療に適した患者集団を同定するなどの診断方法において有用である。従って、所定の実施態様において、Ｎｏｔｃｈ３のアンタゴニストによる治療に適した癌を同定する方法が提供され、その方法はＮｏｔｃｈ３が癌において活性化されるかどうかを決定することを含む。一実施態様において、癌はＧＳＩ応答性癌である。その他の実施態様において、癌は白血病である。その他の実施態様において、白血病はＴ細胞白血病である。そのような実施態様の一つにおいて、Ｔ細胞白血病はＴ細胞前駆細胞白血病である。のような実施態様の一つにおいて、Ｔ細胞白血病は、Ｔ−ＡＬＬである。
【０１１４】
更なる実施態様において、Ｎｏｔｃｈ３が癌において活性化されているかどうかを決定することは、活性化Ｎｏｔｃｈ３ ＩＣＤを結合する抗体と癌のサンプルを接触させること、及び活性化Ｎｏｔｃｈ３の有意な増加レベル（活性化Ｎｏｔｃｈ３ ＩＣＤのレベルによって反映される）が存在するかどうかを決定することを含み、そこで活性Ｎｏｔｃｈ３の有意な増加レベルが存在することは、癌がＮｏｔｃｈ３のアンタゴニストによる治療に適していることを示している。活性化Ｎｏｔｃｈ３の有意な増加レベルがサンプル中に存在するかどうか決定するために、適切なコンパレータ（陽性コントロール）は、例えばＮｏｔｃｈ３のアンタゴニストに応答することが知られている癌に由来するサンプルであり得る。もし、「テスト」サンプル及び「コントロール」サンプルが活性化Ｎｏｔｃｈ３の同等のレベルを含む場合には、「テスト」サンプルが取得された癌は、Ｎｏｔｃｈ３のアンタゴニストによる治療に適している。他の適切なコンパレータ（陰性コントロール）は、例えばＮｏｔｃｈ３のアンタゴニストに応答しない癌由来のサンプルであり得る。「テスト」サンプルが、コントロールサンプルと比較して活性化Ｎｏｔｃｈ３のレベルの有意な増加を含む場合には、「テスト」サンプルが取得された癌は、Ｎｏｔｃｈ３のアンタゴニストによる治療に適している。上記方法の所定の実施態様において、Ｎｏｔｃｈ３のアンタゴニストはＮｏｔｃｈ３特異的アンタゴニストである。所定の実施態様において、Ｎｏｔｃｈ３特異的アンタゴニストは、上述のものの何れかである。
【実施例】
【０１１５】
Ｔ−ＡＬＬは３つのクラスに分類される。
以前の研究ではＴ−ＡＬＬ細胞株はＧＳＩによる治療に対して感受性又は非感受性であることが示されている。例えば、所定のＴ−ＡＬＬ細胞株は、活性化Ｎｏｔｃｈ１変異の発現にも関わらず、恐らくは非Ｎｏｔｃｈ経路、例えばＮｏｔｃｈの必要性を回避する経路の活性化により、ＧＳＩに対して耐性である（例えば、Palomero et al., Nat. Med. 13:1203-1210, 2007を参照）。しかしながら、一つの研究では、３０のＴ−ＡＬＬ細胞株のうち５つがＧＳＩ感受性であり、ＧＳＩに応答して細胞周期の停止を示した（Weng et al., Science, 306:269-271, 2004を参照）。下記の研究では、ＧＳＩに対してのみならずＮｏｔｃｈ１及びＮｏｔｃｈ３特異的アンタゴニストに対するＴ−ＡＬＬ細胞株の応答を更に探索した。Ｔ−ＡＬＬの３つのクラスは、ＧＳＩ及びＮｏｔｃｈ１特異的アンタゴニストに対するそれらの感受性に基づいて特徴づけられた。以下の研究で使用されたＮｏｔｃｈ１特異的アンタゴニストは、抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲの「抗体Ａ−２」であり。その単離及び特性評価は米国特許出願公開第２００９／００８１２３８（Ａ１）号において議論されている。便宜上、本明細書において「抗体Ａ−２」は「抗ＮＲＲ１」と呼ばれ、また、図中では「α−Ｎｏｔｃｈ１」、「ａＮｏｔｃｈ１」、又は「α−Ｎ１」とも呼ばれる。
【０１１６】
図３−５は３つの代表的なヒトＴ−ＡＬＬ細胞株の分類を示す。それらの細胞株は、Ｐ−１２ Ｉｃｈｉｋａｗａ細胞株、ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞株、及びＴＡＬＬ−１細胞株を含む。細胞は、コントロール条件下（ＤＭＳＯのみ（ＤＡＰＴのビークル）又は抗ｇＤ（アイソタイプコントロール抗体））；ガンマセクレターゼ阻害剤、ＤＡＰＴ（５μＭ）；又は抗ＮＲＲ１（５μｇ／ｍｌ）の存在下で８日間生育させた。細胞は、標準的な手順に従って、固定され、ヨウ化プロピジウムで染色され、細胞周期の状態を分析するためのＦＡＣＳ用に調製した。増殖感受性は、与えられた治療がＳ／Ｇ２／Ｍの細胞の割合の対応する減少を伴い、Ｇ０／Ｇ１の細胞の割合の増加を引き起すかどうかを検討することにより評価された。結果は、Ｐ−１２ Ｉｃｈｉｋａｗａ細胞は、ＤＡＰＴ処置細胞、抗ＮＲＲ１処置細胞、及びコントロール（ＤＭＳＯ及び抗−ｇＤ−処置）細胞間での細胞周期状態に有意な相違を伴わずに、ＤＡＰＴ及び抗ＮＲＲ１の両方に耐性であることを示している（図３Ａ−３Ｄ）。ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞は、コントロール細胞のＧ０／Ｇ１の細胞が約３３−３４％であることに比べ、ＤＡＰＴ処置及び抗ＮＲＲ１処置を受けた細胞のそれぞれ約７８％及び７６％がＧ０／Ｇ１の細胞であることを示しており、ＤＡＰＴ及び抗ＮＲＲ１の両方に感受性である。ＴＡＬＬ−１細胞は、抗ＮＲＲ１処置細胞の約５５％及びコントロール細胞の約５３−５４％に比べて、ＤＡＰＴ処置細胞の約８７％がＧ０／Ｇ１であり、ＤＡＰＴに感受性であるが抗ＮＲＲ１に対して耐性である（図５Ａ−５Ｄ）。Ｎｏｔｃｈ１はＴＡＬＬ−１細胞において変異してないことが留意される。更なる研究が、第四細胞株、ＣＣＲＦ−ＣＥＭは、Ｐ−１２ Ｉｃｈｉｋａｗａ細胞と同じクラス（つまり、ＧＳＩ及び抗ＮＲＲ１の両方に耐性）に分類されることを明らかにした（データは示さず、及び図１０）。
【０１１７】
図６に示すように、細胞の大きさの測定は、Ｔ−ＡＬＬのこれらの３つのクラスを反映している。Ｐ−１２ Ｉｃｈｉｋａｗａ細胞株、ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞株、及びＴＡＬＬ−１細胞株は、コントロール条件下（ＤＭＳＯのみ（ＤＡＰＴのビークル）又は抗ｇＤ（アイソタイプコントロール抗体））；ガンマセクレターゼ阻害剤、ＤＡＰＴ（５μＭ）；又は抗ＮＲＲ１（５μｇ／ｍｌ）の存在下で一週間生育させた。細胞の直径はセルカウンター（Ｖｉ−セル、ベックマン・コールター）を用いて測定した。増殖阻害試験と一致して、Ｐ−１２ Ｉｃｈｉｋａｗａ株は、処置細胞及びコントロール細胞の間で相対的に一致した細胞の直径により示されるように、ＤＡＰＴ及び抗ＮＲＲ１の両方に耐性がある。ＨＰＢ−ＡＬＬは、これらの薬剤それぞれで処置された細胞の有意に小さなサイズで示されるように、ＤＡＰＴ及び抗ＮＲＲ１の両方に感受性である。ＴＡＬＬ−１は、ＤＡＰＴ又はコントロール薬剤ではなく、ＤＡＰＴにより処置された細胞の有意に小さなサイズで示されるように、ＤＡＰＴに対して感受性があるが、抗ＮＲＲ１に対して耐性である。これらの結果は、上記の増殖の研究と一致している。
【０１１８】
図７に示すように、アポトーシスの測定はまた、Ｔ−ＡＬＬのこれらの３つのクラスを反映している。Ｐ−１２ Ｉｃｈｉｗａｋａ細胞株、ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞株、及びＴＡＬＬ−１細胞株は、図６に関して上述した通りに処置された。細胞は、図７のｘ軸上の７−ＡＡＤの染色（細胞死のマーカー）、及び図７のｙ軸上のアネキシンＶの染色（アポトーシスのマーカー）により、ＦＡＣＳにより分析した。二重陽性集団における細胞の割合に基づき、ＤＡＰＴ又は抗ＮＲＲ１の何れかによる処置はＨＰＢ−ＡＬＬ細胞におけるアポトーシス細胞死を増加させる。対照的に、Ｐ−１２ Ｉｃｈｉｋａｗａ細胞は、両方の治療に耐性があるが、ＴＡＬＬ−１細胞はＤＡＰＴに感受性であるが抗ＮＲＲ１に対しては無い。これらの結果は、上述した増殖の研究及び細胞の直径の測定と一致している。
【０１１９】
図８に示すように、細胞増殖アッセイの結果はまた、Ｔ−ＡＬＬのこれらの３つのクラスを反映している。Ｐ−１２ Ｉｃｈｉｋａｗａ細胞株、ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞株、及びＴＡＬＬ−１細胞株は、図６に関して上述した通りに処置された。細胞は、増殖をマークするＫｉ−６７の染色を用いてＦＡＣＳにより分析した（左パネル）。左へのＦＡＣＳピークのシフトは、Ｋｉ−６７に対するより弱い染色、及び増殖の減少を示し、逆に、右へのＦＡＣＳのピークのシフトは、Ｋｉ−６７に対する強い染色、及び増殖の増加を示している。この増殖アッセイに基づき、ＨＰＢ−ＡＬＬはＤＡＰＴ及び抗ＮＲＲ１の両方に対して感受性があり、ＴＡＬＬ−１は、ＤＡＰＴに対して感受性があるが、抗ＮＲＲ１に対しては無く、Ｐ−１２ Ｉｃｈｉｋａｗａ細胞は両方に耐性であった。再び、これらの結果は、上記の他のアッセイ、並びに図８の右側のパネルに示されているアポトーシス測定によるものと一致している。そのパネルには、アネキシンＶ／７−ＡＡＤの２重陰性（非アポトーシス）細胞の細胞数を示している。低細胞数（すなわち、アネキシンＶ／７−ＡＡＤ二重陰性（非アポトーシス）細胞の低い数字）はアポトーシスの増加を示し、左側のパネルにおける増殖の減少と順に相関している。
【０１２０】
Ｂ．ＧＳＩ応答性、抗ＮＲＲ１耐性ＴＡＬＬ−１細胞は、Ａｎｔｉ−ＮＲＲ３に部分的に感受性がある。
上述したように、Ｔ−ＡＬＬの３つのクラスの２つは、ＨＰＢ−ＡＬＬ及びＴＡＬＬ−１により表され、両方ともＧＳＩに感受性であるが、前者は、抗ＮＲＲ１に感受性であるが、後者ではないことが異なる。ＧＳＩに対する感受性は、１つまたは複数のＮｏｔｃｈ受容体の果たす役割を示唆しているため、我々は、Ｎｏｔｃｈ１に加えて又はその代替のＮｏｔｃｈ受容体が、Ｔ−ＡＬＬの後者のクラスの抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲに対する耐性に役割を果たしているかどうかを尋ねた。この問題に取り組むために、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞、ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞、及びＴＡＬＬ−１細胞は、増殖がＮｏｔｃｈ３シグナル伝達に依存するかどうかをテストするために、処置のサブセットにおいてＮｏｔｃｈ３特異的アンタゴニストも１０μｇ／ｍｌで含まれたことを除き、図３−５に記載されるように処置された。これらの研究で使用されているＮｏｔｃｈ３特異的アンタゴニストは、マウス抗ヒトＮｏｔｃｈ３モノクローナル抗体２５６Ａ−４であり、その単離及び特性評価は米国特許出願公開第２００８／０２２６６２１（Ａ１）号で議論されている。便宜上、本明細書において２５６Ａ−４は「抗ＮＲＲ３」として呼ばれ、図では「α−Ｎ３」とも呼ばれる。
【０１２１】
結果は、ＴＡＬＬ−１の増殖は、抗ＮＲＲ３に対して部分的に感受性であり、かつ、抗ＮＲＲ１＋抗ＮＲＲ３に対してよりいっそう感受性であることを示し（図９Ａ−９Ｆを参照）、Ｎｏｔｃｈ３並びにＮｏｔｃｈ１を介したシグナル伝達が、なぜ細胞株がＤＡＰＴに感受性であって抗ＮＲＲ１には無いのかを説明していることを示唆している。具体的には、ＴＡＬＬ−１細胞のほぼ８３％は、コントロール（ＤＭＳＯ処置又はα−ＧＤ処置）細胞における約５３−５４％に比べて、ＤＡＰＴ処理後にＧ０／Ｇ１であった。抗ＮＲＲ３による処置はＧ０／Ｇ１の細胞が約６１％という結果となり、抗ＮＲＲ１の添加はこの数値を約６８％に増加させた。対照的に、ＣＣＲＦ−ＣＥＭは、試験された処置の全てに耐性であるように見え（図１０Ａ−１０Ｆ）、各々はＧ０／Ｇ１の細胞の約５２−５７％から示している。ＨＢＰ−ＡＬＬはＤＡＰＴ及び抗ＮＲＲ１処置の両方に感受性であり（各々はＧ０／Ｇ１の細胞が約６７％であることを示す）、抗ＮＲＲ３処置に感受性でない（Ｇ０／Ｇ１の細胞が約３７％であることを示す）ように見える（図１１Ａ−１１Ｆ）。
【０１２２】
図９Ｂ−９Ｆに記載の上記の実験結果が図１４に再プロットされる。ＴＡＬＬ−１細胞培養は、約５ｘ１０５細胞／ｍｌで開始され、指定された条件下で処置した後、図９Ｂ−９Ｆについて記載されたように、ｙ軸は、数百万の細胞の、細胞数／ｍｌである。図１４は、抗ＮＲＲ１及び抗ＮＲＲ３は各々個別に低い細胞数になったことを示している。しかしながら、抗ＮＲＲ１及び抗ＮＲＲ３の組み合わせは、ＤＡＰＴで見られたレベルに近づいて、細胞数を下げることにおいてより顕著な効果を持っていた。
【０１２３】
Ｃ．Ｎｏｔｃｈ３は、抗ＮＲＲ３感受性細胞において活性化される
Ｔ−ＡＬＬの３つのクラスにおけるＮｏｔｃｈ３の活性化状態を調べるために、切断された（すなわち、活性化）Ｎｏｔｃｈ３ ＩＣＤを認識する新しい抗Ｎｏｔｃｈ３ ＩＣＤ抗体が開発された。標準的な手順を使用して、ウサギポリクローナル抗体が、Ｓ３部位でのγ−セクレターゼの切断に起因すると予想されるＮｏｔｃｈ３ ＩＣＤのＮ末端に相当するペプチドに対して産生された。使用されるペプチド配列はＶＭＶＡＲＲＫＲＥＨＳＴＬＷ（配列番号４）であった。ペプチドは、免疫化のためにＢＳＡに結合させた。ポリクローナル抗体は、図１２に示すように、プロテインＡカラムで精製され、次いでイムノブロット法に使用された。抗体が、細胞核の、切断されたＮｏｔｃｈ３ ＩＣＤを認識するかどうかをテストするために、基底乳癌細胞株のＭＤＡ−ＭＢ−４６８が使用された。この株はＮｏｔｃｈ３の高いレベルを発現する。細胞は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を誘導するために固定化したＪａｇ１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）（又はコントロールとしてＦｃ）で処置され、細胞質（Ｃ）及び核（Ｎ）の分画は誘導後に指定された時点で分離された。Ｊａｇ１誘導無しに存在するＮｏｔｃｈ３ ＩＣＤのレベルを調べるためのコントロールとして、誘導されなかった細胞は、Ｎｏｔｃｈ３ ＩＣＤを安定化するために、指示されたように、ＤＡＰＴ（５μＭ）、ＤＭＳＯ（ＤＡＰＴのビークル）、又はプロテアーゼ阻害剤ＭＧ１３２により処置された。ＣＲＥＢ及びチューブリンは、それぞれ核及び細胞質タンパク質のマーカーとしての役割を果たした。抗Ｎｏｔｃｈ３ ＩＣＤ抗体は、核に局在し、Ｊａｇ１によって誘導される、期待されたサイズのバンドを認識することを示している。
【０１２４】
この新しい抗Ｎｏｔｃｈ３ ＩＣＤ抗体は、次いでＴ−ＡＬＬの３つのクラスにおいてＮｏｔｃｈ３の活性化状態を調べるするために使用された。図１３に示されるように、Ｐ１２ Ｉｃｈｉｋａｗａ細胞、ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞、及びＴＡＬＬ−１細胞の核画分は、切断された、活性化Ｎｏｔｃｈ１ ＩＣＤを認識する市販のポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）である抗Ｎｏｔｃｈ１ Ｖａｌ１７４４（上段パネル）か、又は抗Ｎｏｔｃｈ３ ＩＣＤ抗体（α−Ｎ３ ＩＣＤ Ｙ９３５、下段パネル）でイムノブロットされた。Ｎｏｔｃｈ１を発現する３Ｔ３細胞（３Ｔ３−Ｎ１）、及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＭＢ４６８）細胞がコントロールとして用いられた。前の図で説明した増殖阻害試験と一致して、ＴＡＬＬ−１は活性化Ｎｏｔｃｈ３を高いレベルで発現するが、活性化Ｎｏｔｃｈ１は発現しない（上段と下段それぞれのＴＡＬＬ−１レーンを比較せよ）。更に、ＴＡＬＬ−１における活性化Ｎｏｔｃｈ３の生成は、ＤＡＰＴによりブロックされる可能性があるが、抗ＮＲＲ１ではブロックされない（下段パネル）。更に、予想されるように、ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞は活性化Ｎｏｔｃｈ１を高いレベルで発現し、それはＤＡＰＴ又は抗ＮＲＲ１抗体によってブロック可能である（上段のＨＰＢ−ＡＬＬレーンを参照）。コントロールに関しては、活性化Ｎｏｔｃｈ１は、Ｊａｇｇｅｄ（＋ｊａｇ）で処置された３Ｔ３−Ｎ１細胞内に、淡い、上にシフトしたバンドとして見られる（上段パネル）。更にに、活性化Ｎｏｔｃｈ３はＤＡＰＴの非存在下で抗Ｎｏｔｃｈ３アゴニスト抗体（米国特許出願公開第２００８／０１１８５２０（Ａ１）号に２５６Ａ−１３として記載された、Ａ１３）で処置されたＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞において、かすかではあるが検出可能なバンドとして見られる（下段パネル）。前述の発明は、理解の明確さの目的のために図解及び実施例により詳細に記載されたが、その説明や実施例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に引用される全ての特許文献及び科学文献の開示は出典明示によりその全体が明示的に援用される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３Ａ−Ｂ】
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【図３Ｃ−Ｄ】
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【図４Ａ−Ｂ】
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【図４Ｃ−Ｄ】
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【図５Ａ−Ｂ】
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【図５Ｃ−Ｄ】
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【図６】
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【図８】
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【図９Ａ−Ｂ】
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【図９Ｃ−Ｄ】
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【図９Ｅ−Ｆ】
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【図１０Ａ−Ｂ】
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【図１０Ｃ−Ｄ】
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【図１０Ｅ−Ｆ】
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【図１１Ａ−Ｂ】
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【図１１Ｃ−Ｄ】
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【図１１Ｅ−Ｆ】
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【図１４】
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【図７】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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