(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイコプラズマ・ハイオニュ−モニエ感染により起こる障害から動物を能動的に保護するための、マイコプラズマ・ハイオニュ−モニエに対する母系由来の抗体を持つ動物への皮内投与用のマイコプラズマ・ハイオニュ−モニエ抗原を含むワクチン。
【請求項２】
単回ワクチン接種後に、能動的保護を誘発することを特徴とする請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
１０日齢と１８日齢との間の動物への投与用であることを特徴とする請求項１から２のいずれかに記載のワクチン。
【請求項４】
抗原が不活性化マイコプラズマ・ハイオニュ−モニエ抗原を含むことを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載のワクチン。
【請求項５】
ワクチンがアジュバントとして酢酸ビタミンＥを含むことを特徴とする請求項４に記載のワクチン。
【請求項６】
マイコプラズマ・ハイオニュ−モニエ感染により起こる障害から動物を保護するための、血清中にマイコプラズマ・ハイオニュ−モニエに対する母系由来の抗体を持つ動物への皮内投与用のワクチンの製造のための、マイコプラズマ・ハイオニュ−モニエ抗原の使用。
【請求項７】
マイコプラズマ・ハイオニュ−モニエ抗原を含むワクチンを皮内投与することにより、マイコプラズマ・ハイオニュ−モニエに対する母系由来の抗体を持つ非ヒト動物を、マイコプラズマ・ハイオニュ−モニエ感染により起こる障害から能動的に保護する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイコプラズマ・ハイオニュ−モニエに対する母系由来の抗体の存在下で投与しても、マイコプラズマ・ハイオニュ−モニエ感染により起こる障害から動物を能動的に保護する、マイコプラズマ・ハイオニュ−モニエ抗原を含むワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
病原性微生物マイコプラズマ・ハイオニュ−モニエ（Ｍｈｙｏとも略される）が原因のブタマイコプラズマ肺炎は、ブタの広汎性慢性呼吸器疾患である。とりわけ、若い子ブタはこの非致死性の疾患にかかりやすい。流行性肺炎は、飼料要求率が減り、発育不良となる慢性疾患である。該疾患は伝染性が高く、通常、感染した気道分泌物、たとえば、咳／くしゃみの後の感染した飛沫の形の分泌物と直接接触することで伝染する。この疾患は、呼吸器系のあらゆる種類の二次感染にかかりやすくなり、平均日成長の低下を起こし、死さえもたらしかねないという、重要な、問題のある結果をもたらす。たとえば、米国では、ブタ農場全体の９９％がマイコプラズマ・ハイオニュ−モニエに感染されていると推定される。年間の損害は、１億ドルから３億ドルの間と推定される。
【０００３】
マイコプラズマ・ハイオニュ−モニエによる感染に対して動物を保護する数多くのワクチンが、当該分野で知られている。全細胞または部分細胞不活性化製剤または修飾生体製剤を含む効果的なワクチン、サブユニットワクチン、または核酸もしくはＤＮＡワクチンが記載されている。ポルシリス（Ｐｏｒｃｉｌｉｓ）（登録商標）Ｍ  ＨＹＯ（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ  Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ社、ボクスメール、オランダから入手可能）のような市販のワクチンは、多くの場合、全細胞不活性化製剤（バクテリン）に基づく。
【０００４】
若い子ブタは、マイコプラズマ・ハイオニュ−モニエに対する母系由来の抗体（ＭＤＡ）が存在していても、筋肉内にＭｈｙｏワクチンを接種すると、（部分的に）保護され得ることが知られている（Ｄｒｅｘｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｒｅｃｏｒｄ，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｖｏｌ．１６６，Ｎｏ．３，１６  Ｊａｎｕａｒｙ  ２０１０，ｐｐ７０−７４）。しかしながら、特にＭＤＡ存在下での単回ワクチン接種後に、保護は改善され得る。
【０００５】
この目的のために、Ｍｈｙｏワクチンは、皮内投与が、筋肉内ワクチン接種と比べた場合、改善された能動的保護を誘発し得ることが発見された。これは、動物がＭｈｙｏに対してほとんど保護されない期間がなく、およびワクチンの服用がないという実質的なリスクを起こすことなく、非常に若い動物で誘発可能な、少なくともＭｈｙｏに対して改善された能動的保護を可能にする。また、本発明は、血清中にマイコプラズマ・ハイオニュ−モニエに対する母系由来の抗体を持つ動物への皮内投与用ワクチンの製造のための、マイコプラズマ・ハイオニュ−モニエ抗原の使用、およびマイコプラズマ・ハイオニュ−モニエに対する母系由来の抗体を持つ動物を、マイコプラズマ・ハイオニュ−モニエによる感染を原因とする障害から能動的に保護する方法に関する。
【０００６】
Ｊｏｎｅｓは、１３週齢のブタにおいて、Ｍｈｙｏワクチンの皮内投与により、同じワクチンの筋肉内投与より高い抗体価が得られると記載している（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｗｉｎｅ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．１３，Ｎｏ．１，ｐｐ１９〜２７）ことが知られている。しかしながら、Ｊｏｎｅｓは、抗体価は実際の保護と相関しないことも認識していた。皮内投与後と筋肉内投与後との間で、実際に得られる保護の比較はなされていない。実際、Ｊｏｎｅｓは、Ｍｈｙｏワクチンの皮内投与は、「実行可能であり、保護可能である」とだけしか結論を下していない。
【０００７】
また、国際公開第２００７／１０３０４２号にＭｈｙｏワクチンの皮内投与が記載されていることも知られている。しかしながら、該ワクチンの有効性を試験するために、低マイコプラズマ・ハイオニューモニエ発生率群が使用された（第２４頁、第１９〜２０行参照）。筋肉内投与後および皮内投与後に得られた保護の比較は言うまでもなく、ＭＤＡ陽性動物における結果の記載さえない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００７／１０３０４２号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｄｒｅｘｌｅｒｅｔ  ａｌ．，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｒｅｃｏｒｄ，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｖｏｌ．１６６，Ｎｏ．３，１６  Ｊａｎｕａｒｙ  ２０１０，ｐｐ７０−７４
【非特許文献２】Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｗｉｎｅ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．１３，Ｎｏ．１，ｐｐ１９〜２７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明で言うワクチンは、動物への投与に適した構成であり、１種以上の、弱毒化されたまたは死滅させられた微生物および／またはそのサブユニットのような抗原、または微生物の代謝産物のような任意の他の物質を、免疫学的に有効な量（すなわち、標的動物の免疫系を、少なくとも野生型微生物の攻撃の弊害を充分に減らすように刺激することができる量）含み、通常、水を始めとする液体のような医薬的に許容し得る担体と組合せられ、これを動物に投与すると、疾患や障害を治療する免疫応答を誘発し、言い換えると、感染が原因の疾患や障害（たとえば、咳、呼吸困難および下痢）の予防、寛解または治癒を助ける。一般的に、ワクチンは、抗原（または抗原を含む組成物）を医薬的に許容し得る担体と混合することを基本的に含む、当該分野で公知の方法を使用して製造することができる。抗原は、少なくとも、野生型微生物によるワクチン接種後の攻撃（たとえば、自然感染による）の弊害を充分減らすように、標的動物の免疫系を刺激する。ワクチンの用途または求められる特性に応じて、アジュバント、安定剤、粘度調整剤または他の成分のような、他の物質を加えてもよい。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
一実施形態では、ワクチンは、単回ワクチン接種後に、能動的保護を誘発する。驚くべきことに、Ｍｈｙｏに対する母系由来の抗体の存在下でさえ、ワクチンを皮内投与すると、Ｍｈｙｏによる感染に対する能動的保護を誘発できることが発見された。これは、長期の保護でさえ、たとえば、肥育期全体を通して、ブースターワクチン接種を省くことができることを意味する。
【００１２】
一実施形態では、ワクチンは１０日齢と１８日齢との間の動物へ投与される。高力価の母系由来の抗体を持つ、１０日齢の若いＭＤＡ陽性動物においてさえ、Ｍｈｙｏ感染に対して、適切な能動的保護を誘発できることが発見された。１８日齢後に実質的に投与しない場合、これは、母系由来の抗体（最初の略３〜４週齢の間の受動的保護）と、能動的に誘発された免疫応答（１〜６ヶ月齢の間の能動的保護）との併合保護は、Ｍｈｙｏ感染に対し、事実上完全な保護を提供することを意味する。
【００１３】
好ましい実施形態では、ワクチン中の抗原は、不活性化されたマイコプラズマ・ハイオニュ−モニエ抗原を含む。不活性化抗原、すなわち、生きたマイコプラズマ・ハイオニュ−モニエ菌以外の抗原（たとえば、バクテリン、サブユニットなど）は、安全であり、ブタで適切な免疫応答を与えることが証明されている。特に、酢酸ビタミンＥ（酢酸α−トコフェロールとしても知られている）を含むアジュバントを使用する場合、単回皮内ワクチン接種の後でさえ、ＭＤＡを持つ若い動物で非常に良好な保護を得ることができる。
【００１４】
本発明を、以下の例を使用して、さらに説明する。
【００１５】
一般試験設定
試験は、以下の無作為化され部分的に盲検化された設計で行った。Ｍｈｙｏに対するワクチン接種を行ったことがなく、常にＭｈｙｏ感染が存在する一貫経営農場で、１０２６匹の子ブタ（約１００同腹子、疾患の徴候のある子ブタは除いた）を無作為に３つの群に分けた。１つの群（「ＩＭ」と呼ぶ）は、市販のワクチン、ポルシリスＭ  Ｈｙｏと同じＭｈｙｏ抗原を含むワクチンを筋肉内に接種した。抗原は、「Ｘ」と呼ばれるツインエマルジョンアジュバント中で処方した。このアジュバントは、５容量部のアジュバント「Ａ」と１容量部のアジュバント「Ｂ」の混合物である。アジュバント「Ａ」は、Ｔｗｅｅｎ８０水溶液で安定化された、おおよその平均粒径（容積荷重）が約１μｍの鉱物油滴（マルコール５２）で構成される。アジュバント「Ａ」は、２５重量％の鉱物油と、１重量％のＴｗｅｅｎを含む。残りは水である。アジュバント「Ｂ」は、これもＴｗｅｅｎ８０で安定化された、おおよその平均粒径（容積荷重）が４００ｎｍの生分解性酢酸ビタミンＥの小滴で構成される。アジュバント「Ｂ」は、１５重量％の酢酸ビタミンＥと６重量％のＴｗｅｅｎ８０を含み、残りは水である。第二群（「ＩＤ」と呼ぶ）は、同じ（ただし、より濃縮された）ワクチンを内皮的にワクチン接種し、第三群（「コントロール」と呼ぶ）は、筋肉内注射によって、アジュバントのみを接種した。単回ワクチン接種は、１０〜１８日齢で行った。
【００１６】
試験ではまず、子ブタのＭｈｙｏに対する母系由来の抗体の存在を試験した。試験の最初および屠殺の少し前に（約１５０日齢で）、子ブタの体重を個々に計った。屠殺場で、肺のＭｈｙｏ感染および胸膜炎で典型的な肺病巣を計測した。試験中、罹患状態（個々の治療が必要であると認知された疾患）および死亡率を記録した。ワクチンの有効性の一次パラメータは、平均肺病巣スコア、および一日平均体重増加（ＡＤＧ）であった。罹患状態、死亡率および胸膜炎病巣は、有効性の二次パラメータと考えた。
【００１７】
具体的方法
ワクチン接種および攻撃
対照ワクチンは、不活性化マイコプラズマ・ハイオニュ−モニエ菌を含む、一般的なタイプのＭｈｙｏワクチンであるポルシリス（登録商標）Ｍ  ＨＹＯであった。この市販のワクチンはツー・ショット・ワクチンであり、本設定は、シングル・ショット・ワクチン接種であるので、該ワクチンを、ポルシリス（登録商標）Ｍ  ＨＹＯに関して濃縮し、１ミリのワクチン当たりの抗原濃度をより高くした。ＩＭ群には、左耳の後ろに、濃縮ワクチン２ｍｌを５回投与した。ＩＤ群には、欧州特許第１５１５７６３号に記載されている注射針のない皮内用注射器を使用して、体の上部、主に首の、耳の後ろに、濃縮ワクチン０．２ｍｌを３０回投与した。実際は、ＩＤ群の動物は、ＩＭ群の動物と比較して、抗原集団の約６０％を受けた。さらに、欧州特許第１５１５７６３号等で知られている器具のようないわゆる皮内投与デバイスに関して、この抗原集団の一部だけが、実際に真皮内に沈着し、主な部分は下にある筋肉組織内に沈着することを理解すべきである。コントロール群には、左耳の後ろに、筋肉内注射で、アジュバントだけを２ｍｌ投与した。
【００１８】
感染源は、農場に存在する自然の攻撃であり、感染は自然曝露により行った。
【００１９】
効果の測定
流行性肺炎に伴う肺病巣の存在および重症度は、一般的に知られている、ＧｏｏｄｗｉｎおよびＷｈｉｔｔｌｅｓｔｏｎｅによる方法に従って評価した。７つの肺葉のそれぞれについて、炎症に伴うＭｈｙｏの徴候を持つ表面の比率を測定した。これらの比率を以下の表１に列挙した重み因子と掛け合わせ、合計し、病巣スコアを得た。
【表１】
0005865350.tif 000002
【００２０】
一日平均体重増加（ＡＤＧ）は、ワクチン接種から屠殺までの体重増加を、ワクチン接種から屠殺までの期間（平均約１３６日間）で割って計算した。
【００２１】
肺炎病巣の肺の計測者が、胸膜炎病巣も計測した。存在は以下のように、つまり、病巣が存在しない場合は１、局所的病巣（スポット）が存在する場合は２、および大きな接着が存在する場合は３とした。
【００２２】
血清学的データに関し、試験開始時および屠殺時に１実験群当たり３０匹のブタから血液サンプルを採取した。これらのサンプルの抗体を、ＥＬＩＳＡ（ＣＨＥＣＫＩＴ−Ｈｙｏｐｔｅｓｔ  ＩＩ、ＩＤＥＸＸ）により試験した。
【００２３】
結果
試験開始時、９２％の子ブタがＭｈｙｏ抗原に関し血清学的に陽性であり、これは、ほとんど全ての動物が母系由来の抗体を持っていたことを示す。平均齢は１３．４日であり、最も若い動物は１０日齢、最も年老いた動物は１８日齢であった。ＭＤＡ陰性動物（ＳＰＦブタ、野生型Ｍｈｙｏ菌による実験的攻撃）を使用した先行する試験において、約２週齢での皮内ワクチン接種は、筋肉内ワクチン接種（データは示さず）より良好な有効性のある結果を得られなかった。しかしながら、本試験のＭＤＡ陽性ブタにおいては、皮内ワクチンを受けた群で、有意な有効性の改善が見られた。屠殺時の平均肺病巣スコア（１群当たり約３１５個の肺）を表２に示す。ウィルコクソンの順位和検定による治療における病巣スコアの効果は、統計的に有意であった（Ｐ＜０．０００１）。
【表２】
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【００２４】
ワクチン接種時と約１５０日齢での屠殺時との間のＡＤＧ（単位：グラム）で示すブタの成長を、表３に示す。ＩＤ群およびＩＭ群の結果を、多重比較のためのＴｕｋｅｙ法を使用して比較した。ＩＤ群の体重増加は、有意に高いようである（Ｐ＜０．０５）。
【表３】
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【００２５】
胸膜炎病巣の結果を表４に示す。該表では、スコア別にブタの数を示す。
【表４】
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【００２６】
保育期間中の臨床疾患（罹患状態）の罹患率は、３群全てで約２８％であった。しかしながら、最終期間中では、罹患状態は、コントロール群で２１％、ＩＭ群で１７％、ＩＤ群でわずか８％であった（統計的に有意、Ｐ＝０．０００７、カイ２乗検定による２×２分割表に従う）。「咳」および／または「呼吸困難」の徴候は、感染動物の７６％で記録された。死亡率は、３つの群でわずかに異なり、コントロールで４．６％、ＩＭ群で２．２％、およびＩＤ群で１．２％であった。実際の保護を示す７つのパラメータ（「平均病巣スコア」、「ＡＤＧ」、「病巣」、「スポット」、「大きな接着」、「罹患状態」および「死亡率」）において、皮内ワクチン接種が筋肉内ワクチン接種方法より良好な結果を得るという事実は、確実に、９９％を超えて（Ｐ＝１−（１／２）７＝０．９９３）、皮内ワクチン接種で、ＭＤＡ陽性子ブタにより良好な保護が与えられることを意味する。
【００２７】
結論
Ｍｈｙｏに対する母系由来の抗体を持つ動物の皮内ワクチン接種、特に不活性化ワクチンの接種（たとえば、ポルシリスＭｈｙｏ（商標）等；しかし、たとえば、Ｍｈｙｏ菌から精製された、または組換え発現した死菌および／またはその一部を含む任意の他の不活性化ワクチンは、原則として、同じ種類の免疫応答を誘発するという事実を踏まえると、同様の結果を提供するであろう）は、筋肉内ワクチン接種より有意に良好な保護を提供する。特に、一日平均体重増加、したがって、最終期の最後の獲得可能な生体体重は、血清陽性の動物にとって、この新しい投与レジメンから利益を享受する。