(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＸＣケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４）に結合し、ＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない分離抗体であって、
前記抗体が、３つのＣＤＲｓを含む少なくとも１つの重鎖可変領域と、３つのＣＤＲｓを含む少なくとも１つの軽鎖可変領域とを含み、
前記抗体が、
配列番号：１のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号：２のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、配列番号：３のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、配列番号：８８のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号：８９のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号：９０のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体である；又は、
配列番号：１のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号：２のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、配列番号：３のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、配列番号：４のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号：５のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号：６のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体である；又は、
配列番号：７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号：８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号：９のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、配列番号：１０のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号：１１のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号：１２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体である；又は、
配列番号：１３のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号：１４のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、配列番号：１５のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、配列番号：１６のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号：１７のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号：１８のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体である；又は、
配列番号：１９のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号：２０のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、配列番号：２１のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、配列番号：２２のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号：２３のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号：２４のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体である
、抗体。
【請求項２】
０．４μｇ／ｍＬ以上の濃度で用いた場合に、前記抗体がＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない、請求項１記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体が、ＣＸＣＲ４に対するリガンドの結合を阻害することができ、又はＣＸＣＲ４発現細胞のリガンドが誘発する遊走を阻害することができ、又はＣＸＣＲ４発現細胞内におけるリガンドが誘発するカルシウム流を阻害することができる、請求項１又は２記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体が、配列番号：６９又はそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列の重鎖可変領域（ＶＨ）ドメイン、及び／又は配列番号：１０３又はそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列の軽鎖可変領域（ＶＬ）ドメインを有する、請求項１記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体が、配列番号：６９又はそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列のＶＨドメイン、及び／又は配列番号：７０又はそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列のＶＬドメインを有する、請求項１記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体が、配列番号：７１又はそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列のＶＨドメイン、及び／又は配列番号：７２又はそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列のＶＬドメインを有する、請求項１記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体が、配列番号：７３又はそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列のＶＨドメイン、及び／又は配列番号：７４又はそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列のＶＬドメインを有する、請求項１記載の抗体。
【請求項８】
前記抗体が、配列番号：７５又はそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列のＶＨドメイン、及び／又は配列番号：７６又はそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列のＶＬドメインを有する、請求項１記載の抗体。
【請求項９】
前記抗体が、
配列番号：６９のアミノ酸配列からなるＶＨドメイン及び配列番号：１０３のアミノ酸配列からなるＶＬドメインを含む抗体である；又は、
配列番号：６９のアミノ酸配列からなるＶＨドメイン及び配列番号：７０のアミノ酸配列からなるＶＬドメインを含む抗体である；又は、
配列番号：７１のアミノ酸配列からなるＶＨドメイン及び配列番号：７２のアミノ酸配列からなるＶＬドメインを含む抗体である；又は、
配列番号：７３のアミノ酸配列からなるＶＨドメイン及び配列番号：７４のアミノ酸配列からなるＶＬドメインを含む抗体である；又は、
配列番号：７５のアミノ酸配列からなるＶＨドメイン及び配列番号：７６のアミノ酸配列からなるＶＬドメインを含む抗体である、
請求項１〜３のいずれか１項記載の抗体。
【請求項１０】
前記抗体がヒト抗体である、請求項１〜９のいずれか１項記載の抗体。
【請求項１１】
前記抗体が完全なヒト抗体である、請求項１０記載の抗体。
【請求項１２】
前記抗体が、抗体の重鎖定常領域及び／又は抗体の軽鎖定常領域の全て又は一部を含む、請求項１〜１１のいずれか１項記載の抗体。
【請求項１３】
前記抗体がＩｇＧ抗体である、請求項１２記載の抗体。
【請求項１４】
前記抗体がＩｇＧ１抗体である、請求項１３記載の抗体。
【請求項１５】
前記抗体が、配列番号：１２４のアミノ酸配列又はそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む重鎖、及び／又は配列番号：１２５のアミノ酸配列又はそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む軽鎖を含む、請求項１２〜１４のいずれか１項記載の抗体。
【請求項１６】
前記抗体が、配列番号：１０８のアミノ酸配列又はそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む重鎖、及び／又は配列番号：１０９のアミノ酸配列又はそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む軽鎖を含む、請求項１２〜１４のいずれか１項記載の抗体。
【請求項１７】
前記抗体が、配列番号：１１２のアミノ酸配列又はそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む重鎖、及び／又は配列番号：１１３のアミノ酸配列又はそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む軽鎖を含む、請求項１２〜１４のいずれか１項記載の抗体。
【請求項１８】
前記抗体が、配列番号：１１６のアミノ酸配列又はそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む重鎖、及び／又は配列番号：１１７のアミノ酸配列又はそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む軽鎖を含む、請求項１２〜１４のいずれか１項記載の抗体。
【請求項１９】
前記抗体が、配列番号：１２０のアミノ酸配列又はそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む重鎖、及び／又は配列番号：１２１のアミノ酸配列又はそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む軽鎖を含む、請求項１２〜１４のいずれか１項記載の抗体。
【請求項２０】
前記抗体が、
配列番号：１２４のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号：１２５のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗体である；又は、
配列番号：１０８のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号：１０９のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗体である；又は、
配列番号：１１２のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号：１１３のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗体である；又は、
配列番号：１１６のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号：１１７のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗体である；又は
配列番号：１２０のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号：１２１のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗体である、
請求項１２〜１４のいずれか１項記載の抗体。
【請求項２１】
前記抗体が、抗体の抗原結合断片である、請求項１〜２０のいずれか１項記載の抗体。
【請求項２２】
前記抗体の前記抗原結合断片が、Ｆａｂ'、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）2、ＴａｎｄＡｂｓ二量体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、直鎖状抗体、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体断片、バイボディ、トリボディ、ｓｃ−ダイアボディ、カッパ（ラムダ）ボディ、ＢｉＴＥ、ＤＶＤ−Ｉｇ、ＳＩＰ、ＳＭＩＰ、またはＤＡＲＴである、請求項２１記載の抗体。
【請求項２３】
前記抗体が、少なくとも第２の診断薬又は治療薬と結合している、請求項１〜２２のいずれか１項記載の抗体。
【請求項２４】
前記抗体が、少なくとも放射線治療薬、化学療法薬、抗血管新生薬、アポトーシス誘導薬、抗チューブリン薬、抗細胞又は細胞毒性薬、ステロイド、サイトカインアンタゴニスト、サイトカイン発現阻害剤、ケモカインアンタゴニスト、ケモカイン発現阻害剤、ＡＴＰアーゼ阻害剤、抗炎症薬、信号伝達経路阻害剤、抗癌剤、他の抗体、凝固剤又は抗ウィルス剤と結合している、請求項２３記載の抗体。
【請求項２５】
前記抗ウィルス剤が、ヌクレオシド、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤及びプロテアーゼ阻害剤からなる群から選択される、請求項２４記載の抗体。
【請求項２６】
少なくとも第２の治療薬又は診断薬と結合した、請求項１〜２５のいずれか１項記載の抗体を含む免疫複合体。
【請求項２７】
請求項１〜２５のいずれか１項記載の少なくとも第１の抗体又は請求項２６記載の免疫複合体を含む組成物。
【請求項２８】
前記組成物が、薬学的に許容される組成物である、請求項２７記載の組成物。
【請求項２９】
前記組成物が、少なくとも第２の治療薬を更に含む、請求項２７または２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記第２の治療薬が、放射線治療薬、化学療法薬、抗血管新生薬、アポトーシス誘導薬、抗チューブリン薬、抗細胞又は細胞毒性薬、ステロイド、サイトカインアンタゴニスト、サイトカイン発現阻害剤、ケモカインアンタゴニスト、ケモカイン発現阻害剤、ＡＴＰアーゼ阻害剤、抗炎症薬、信号伝達経路阻害剤、抗癌剤、他の抗体、凝固剤又は抗ウィルス剤である、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
前記第２の治療薬が、ヌクレオシド、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤及びプロテアーゼ阻害剤からなる群から選択される、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
請求項１〜２５のいずれか１項記載の抗体をコードするヌクレオチド配列領域を含む核酸分子。
【請求項３３】
前記ヌクレオチド配列領域が、配列番号：３４、配列番号：４５、配列番号：５６、配列番号：６７、若しくは配列番号：１００のヌクレオチド配列、又はそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列からなる、請求項３２記載の核酸分子。
【請求項３４】
請求項３２又は３３記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項３５】
請求項３２若しくは３３記載の核酸分子、又は請求項３４記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項３６】
請求項３２若しくは３３記載の核酸分子、又は請求項３４記載の発現ベクターを含むウィルス。
【請求項３７】
少なくとも第１の容器内に、
（ａ）請求項１〜２５のいずれか１項記載の抗体；
（ｂ）請求項２６記載の免疫複合体；
（ｃ）請求項２７〜３１のいずれか１項記載の組成物；
（ｄ）請求項３２又は３３記載の核酸分子；
（ｅ）請求項３４記載の発現ベクター；
（ｆ）請求項３５記載の宿主細胞；又は
（ｇ）請求項３６記載のウィルス
を含むキット。
【請求項３８】
（ａ）コードされた抗体を発現するのに効果的な条件下に、請求項３４記載の発現ベクターを含む宿主細胞を培養すること；及び
（ｂ）前記宿主細胞から、発現した抗体を得ること
を含む、抗体の製造方法。
【請求項３９】
ＣＸＣＲ４を含む組成物を、請求項１〜２５のいずれか１項記載の抗体又は請求項２６記載の免疫複合体と接触させることを含む、ＣＸＣＲ４の結合方法。
【請求項４０】
ＣＸＣＲ４を含むと思われる組成物を請求項１〜２５のいずれか１項記載の抗体又は請求項２６記載の免疫複合体と、前記ＣＸＣＲ４と前記抗体との複合体の形成を可能にするのに効果的な条件下で接触させ、そのようにして形成された前記複合体を検出することを含む、ＣＸＣＲ４の検出方法。
【請求項４１】
動物において、ＣＸＣＲ４の発現と関連する疾患の診断方法であって、
（ａ）前記動物から得られた試験試料を、請求項１〜２５のいずれか１項記載の抗体又は請求項２６記載の免疫複合体と接触させる工程；
（ｂ）前記試験試料中の抗体−抗原複合体の存在及び／又は量及び／又は位置を測定又は検出する工程；及び
（ｃ）前記試験試料中の抗体−抗原複合体の存在及び／又は量を、対照と比較する工程を含む、前記方法、
に使用するための請求項１〜２５のいずれか１項記載の抗体又は請求項２６記載の免疫複合体を含む診断用組成物。
【請求項４２】
前記試験試料を前記動物から分離し、インビトロで前記抗体又は免疫複合体と接触させる、請求項４１記載の方法、
に使用するための請求項４１記載の診断用組成物。
【請求項４３】
前記抗体又は免疫複合体を前記動物に投与し、それによって、インビボで前記試料と接触させる、請求項４１記載の方法、
に使用するための請求項４１記載の診断用組成物。
【請求項４４】
ＣＸＣＲ４の発現と関連する前記疾患が、ＣＸＣＲ４により介在される疾患、ＣＸＣＲ４＋細胞の異常な増殖により特徴づけられる疾患、又はＣＸＣＲ４の過剰発現により特徴づけられる疾患である、請求項４１〜４３のいずれか１項記載の方法、
に使用するための請求項４１〜４３のいずれか１項記載の診断用組成物。
【請求項４５】
前記疾患が、癌、転移性癌、癌細胞による器官の浸潤、血管形成に関連する疾患、炎症若しくは免疫疾患、リウマチ様関節炎のような自己免疫疾患、ＨＩＶ感染のようなウィルス感染、又は免疫系を復元するために骨髄から幹細胞を移動させるのが望ましい病状である、請求項４１〜４３のいずれか１項記載の方法、
に使用するための請求項４１〜４３のいずれか１項記載の診断用組成物。
【請求項４６】
前記試料中のＣＸＣＲ４の量の増加が、前記疾患の特徴である、請求項４１〜４５のいずれか１項記載の方法、
に使用するための請求項４１〜４５のいずれか１項記載の診断用組成物。
【請求項４７】
動物における、ＣＸＣＲ４の発現又は活性と関連する疾患の治療方法であって、前記疾患を患っている動物に、請求項１〜２５のいずれか１項記載の抗体又は請求項２６記載の免疫複合体の治療的有効量を投与することを含む方法、
に使用するための請求項１〜２５のいずれか１項記載の抗体又は請求項２６記載の免疫複合体を含む治療用組成物。
【請求項４８】
ＣＸＣＲ４の発現又は活性と関連する前記疾患が、ＣＸＣＲ４により介在される疾患、ＣＸＣＲ４＋細胞の異常な増殖により特徴づけられる疾患、又はＣＸＣＲ４の過剰発現により特徴づけられる疾患である、請求項４７記載の方法、
に使用するための請求項４７記載の治療用組成物。
【請求項４９】
前記疾患が、癌、転移性癌、癌細胞による器官の浸潤、血管形成に関連する疾患、炎症若しくは免疫疾患、リウマチ様関節炎のような自己免疫疾患、ＨＩＶ感染のようなウィルス感染、又は免疫系を復元するために骨髄から幹細胞を移動させるのが望ましい病状である、請求項４７又は４８記載の方法、
に使用するための請求項４７又は４８記載の治療用組成物。
【請求項５０】
前記抗体又はその免疫複合体が、以下の１又はそれ以上を引き起こす、請求項４７〜４９のいずれか１項記載の方法、
（ａ）ＣＸＣＲ４の、少なくともＳＤＦ−１への結合の阻害；
（ｂ）ＣＸＣＲ４リガンドに対するＣＸＣＲ４介在性細胞応答の阻害、又はＣＸＣＲ４発現細胞のリガンドが誘発する遊走の阻害；
（ｃ）ＣＸＣＲ４＋細胞のＡＤＣＣの誘導；
（ｄ）インビボにおける抗腫瘍効果の誘導；
（ｅ）ＣＸＣＲ４＋細胞のＣＤＣの誘導；
（ｆ）既存の癌により引き起こされる転移形成の阻害；
（ｇ）癌細胞の新しい器官への浸潤の阻害；
（ｈ）腫瘍間質へのＣＸＣＲ４＋細胞の誘引の阻害、及び／又は腫瘍に有利な微小環境を引き起こすための前記細胞の活性化の阻害；
（ｉ）他の治療に有効な化合物を用いた治療のための腫瘍細胞の感作、
に使用するための請求項４７〜４９のいずれか１項記載の治療用組成物。
【請求項５１】
ＣＸＣＲ４リガンドに対する前記ＣＸＣＲ４介在性細胞応答の前記阻害が、ＣＸＣＲ４リガンドに対するカルシウムイオンの流出の阻害である、請求項５０記載の方法
に使用するための請求項５０記載の治療用組成物。
【請求項５２】
第２の治療薬を前記動物に投与することを更に含む、請求項４７〜５１のいずれか１項記載の方法、
に使用するための請求項４７〜５１のいずれか１項記載の治療用組成物。
【請求項５３】
前記第２の治療薬が、放射線治療薬、化学療法薬、抗血管新生薬、アポトーシス誘導薬、抗チューブリン薬、抗細胞又は細胞毒性薬、ステロイド、サイトカインアンタゴニスト、サイトカイン発現阻害剤、ケモカインアンタゴニスト、ケモカイン発現阻害剤、ＡＴＰアーゼ阻害剤、抗炎症薬、信号伝達経路阻害剤、抗癌剤、他の抗体、凝固剤又は抗ウィルス剤である、請求項５２記載の方法、
に使用するための請求項５２記載の治療用組成物。
【請求項５４】
前記第２の治療薬が、ヌクレオシド、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤及びプロテアーゼ阻害剤からなる群から選択される、請求項５３記載の方法、
に使用するための請求項５３記載の治療用組成物。
【請求項５５】
前記抗体が、前記抗体の少なくとも２つの抗原結合断片を含む、二価又は多価抗体である請求項４１〜４６のいずれか１項記載の方法に使用するための、請求項４１〜４６のいずれか１項記載の診断用組成物、又は
前記抗体が、前記抗体の少なくとも２つの抗原結合断片を含む、二価又は多価抗体である請求項４７〜５４のいずれか１項記載の方法に使用するための、請求項４７〜５４のいずれか１項記載の治療用組成物。
【請求項５６】
前記動物がヒトを対象としている請求項４１〜４６及び５５のいずれか１項記載の方法に使用するための、請求項４１〜４６及び５５のいずれか１項記載の診断用組成物、又は
前記動物がヒトを対象としている請求項４７〜５５のいずれか１項記載の方法に使用するための、請求項４７〜５５のいずれか１項記載の治療用組成物。
【請求項５７】
治療、画像処理又は診断に用いるための、請求項１〜２５のいずれか１項記載の抗体、又は請求項２６記載の免疫複合体。
【請求項５８】
ＣＸＣＲ４の発現又は活性と関連する疾患の治療、画像処理又は診断に用いるための、請求項５７記載の抗体又は免疫複合体。
【請求項５９】
ＣＸＣＲ４の発現又は活性と関連する前記疾患が、ＣＸＣＲ４により介在される疾患、ＣＸＣＲ４＋細胞の異常な増殖により特徴づけられる疾患、又はＣＸＣＲ４の過剰発現により特徴づけられる疾患である、請求項５８記載の抗体又は免疫複合体。
【請求項６０】
前記疾患が、癌、転移性癌、癌細胞による器官の浸潤、血管形成に関連する疾患、炎症若しくは免疫疾患、リウマチ様関節炎のような自己免疫疾患、ＨＩＶ感染のようなウィルス感染、又は免疫系を復元するために骨髄から幹細胞を移動させるのが望ましい病状である、請求項５８または５９記載の抗体又は免疫複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して抗体の分野、ＣＸＣＲ４生物学、及び関連する治療に関する。特に、本発明は、ＣＸＣＲ４と結合する抗体を提供する。このような抗ＣＸＣＲ４抗体は、腫瘍血管の画像処理、転移形成の阻害若しくは減少、及び血管新生の阻害若しくは減少により、例えば、癌及びウィルス感染、特にＨＩＶ感染の治療、炎症及び免疫疾患の治療、腫瘍増殖及び進行の監視又は予測のような、ＣＸＣＲ４と関連する疾患及び病状における診断及び治療的用途を有している。本発明の抗体をベースとする組成物及び方法は、免疫複合体及び他の治療の組み合わせの使用、キット及び方法にまでも広がる。
【背景技術】
【０００２】
８００以上のメンバーにより、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲｓ）は、ヒトゲノムによりコードされる全遺伝子の＞２％の割合を占める、信号伝達に関与する細胞表面分子の最も大きなファミリーを意味する。ＧＰＣＲスーパーファミリーのメンバーは、共通の膜トポロジー：３つの細胞内ループ及び３つの細胞外ループによって結合する、細胞外Ｎ−末端、細胞内Ｃ−末端及び７つの膜貫通（ＴＭ）ヘリックスを共有する。それらの共通の位相構造に基づいて、ＧＰＣＲｓは７回膜貫通（７ＴＭ）受容体とも呼ばれる。これらの受容体は、神経伝達、内分泌腺及び外分泌腺から遊離されるホルモン及び酵素、免疫応答、心筋及び平滑筋の収縮、及び血圧調整を含む、重要な生理的機能を制御する。それらの機能障害は、最も流行しているヒトの疾患のいくつかの原因である。新たな実験及び臨床データは、ＧＰＣＲｓが癌の進行及び転移において極めて重要な役割を有することを示す。したがって、ある種のＧＰＣＲｓが抗癌剤の適切な標的になり得る可能性がある。
【０００３】
ケモカインは、特に、癌、ウィルス感染、喘息及びアレルギー性疾患、並びにリウマチ様関節炎及びアテローム性動脈硬化症のような自己免疫疾患を含む、種々の疾患及び障害における免疫及び炎症応答において役割を果たしている。それらの構造に依存し、ケモカインは、Ｃ−Ｃケモカイン（システイン−システインモチーフを含む）又はＣ−Ｘ−Ｃケモカイン（システイン−Ｘ−システインモチーフを含む）として分類される。したがって、このようなケモカインと結合する受容体は、それぞれＣＣＲ又はＣＸＣＲファミリーのメンバーとして分類される。
【０００４】
ＣＸＣＲ４（フュージン、ＨＭ８９、ＬＥＳＴＲ、ＨＵＭＳＴＲとも呼ばれる）は、ストローマ細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１、また、ＣＸＣＬ１２及びＰＢＳＦと呼ばれる）に特異的なアルファ−ケモカイン受容体、リンパ球に対して強力な走化能を与える分子である。この受容体は、ＣＤ４+Ｔ細胞を感染させるためにＨＩＶ分離物が用いることができる、いくつかのケモカイン受容体のうちの１つである。いくつかの正常組織はＣＸＣＲ４を発現する。ｍＲＮＡ及び機能タンパク質の両者に関して、発現が証明されている、注目に値する細胞の例には：造血細胞／骨髄前駆細胞；免疫系細胞、例えば、Ｔ細胞、プレＢ細胞及びプラズマ細胞、樹枝状細胞、ＮＫ細胞；血液細胞、例えば、単球、肥満細胞、血小板；神経系細胞、例えば、ニューロン、星状膠細胞、小膠細胞；他の細胞、例えば、内皮細胞、血管平滑筋、胃腸上皮、及び他の特定の上皮細胞が含まれる。
【０００５】
ＣＸＣＲ４は、種々の腫瘍内で発現し、癌の病態生理学、特に癌転移において決定的な役割を演じている（Ｄｏｒｓａｍ及びＧｕｔｋｉｎｄ，２００７，Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ７：７９−９４）。ＣＸＣＲ４の発現は、試験を行ったほとんど全ての腫瘍において見られた。ＳＤＦ−１が、肝臓、肺、骨髄、リンパ節において特に高いレベルで、脳（いくらか低いレベルで）、すなわち、通常、癌が転移する部位において発現することも興味のあることである。ＣＸＣＲ４を標的とする抗体のような薬剤に対する潜在的な適応症には、癌（例えば、転移性の癌）、例えば、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、食道癌、結腸直腸癌、肝臓癌及び肺癌（ＳＣＬＳ及びＮＳＣＬＣの両者）、並びに悪性及び転移性メラノーマ、脳腫瘍（神経膠腫）、頭頚部癌、特定の白血病、非ホジキンリンパ腫のようなリンパ腫、小児腫瘍（例えば、神経芽細胞腫）、腎臓癌、血管芽細胞腫が含まれる。肺腫瘍、非小細胞肺癌、卵巣癌、子宮頸癌、甲状腺乳頭癌、骨肉腫、及び他の悪性腫瘍を含む、他のいくつかの癌、において、ＣＸＣＲ４の過剰発現が見られた。抗ＣＸＣＲ４抗体は、ＨＩＶ又は他のレトロウィルス感染のようなウィルス感染の治療、自己免疫疾患、炎症性疾患のような免疫疾患の治療、並びに血管形成及び血管新生の阻害のためにも用いることができる。
【０００６】
それらの複合体構造のために、ＧＰＣＲｓは、特異抗体を増加させるには「困難な標的」であると考えられる。ＧＰＣＲｓは、溶解した細胞の膜画分から容易に精製することも、正確に折りたたまれた可溶性タンパク質として、種々の発現系で組換え技術によって生産することもできない。
【０００７】
ＧＰＣＲｓに対する抗体の生成に関する問題は、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２６０，７７４−７８４（１９９９）に記載されている。更に、Ｓｕｉら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２７０，４４９７−４５０６（２００３）は、ＧＰＣＲケモカイン受容体ＣＸＣＲ４に対するヒト抗体を得る試みに関する問題を説明し、ステップバック選択を組み合わせたパスファインダー法を用いても、特異的抗体を確認することができなかったことを報告している。したがって、ＧＰＣＲｓの分野において、特異的抗体の生成には大きな課題が残っている。
【０００８】
Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．は、ＣＸＣＲ４に対するモノクローナル抗体を開発し、そのうちのいくつかは前臨床開発の最終段階にある。ＣＸＣＲ４抗体の潜在的有効性を示すデータは、ＮＷＢ及び他社によって動物モデルに集められた。次の開発は、選択された抗体のヒト化、第Ｉ相臨床試験のための調製における毒性試験を含む。
【０００９】
ＭＤＸ−１３３８は、Ｍｅｄａｒｅｘ社由来の、完全なヒトモノクローナル抗体である、抗ヒトＣＸＣＲ４−特異的抗体である。インビトロにおける試験は、ＭＤＸ−１３３８が、ＣＸＣＲ−４を発現する細胞と、低いナノモル親和性で結合することを示した。ＭＤＸ−１３３８は、ＣＸＣＲ４発現細胞へのＣＸＣＬ１２リガンド結合を阻害し、ＣＸＣＬ１２が誘発する遊走及びカルシウム流を、低いナノモルＥＣ50値で阻害する。ＭＤＸ−１３３８はＩｇＧ４であり、それ故、ＡＤＣＣ及びＣＤＣ活性を欠いている。ＭＤＸ−１３３８は、ＣＸＣＲ４発現細胞系の範囲でアポトーシスを誘発し、多発性ＡＭＬ及びリンパ腫異種移植片モデルにおいて抗腫瘍活性をも有する。
【００１０】
更に、ＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１を標的とする、種々の開発段階の、多くの小分子化合物及びペプチドがある。
【００１１】
発明者らは、ＣＸＣＲ４を認識する追加の抗体の同定が、多くの治療法の選択肢を展開することに有効であると認識していた。しかし、上記で議論したように、ＣＸＣＲ４のようなＧＰＣＲｓの性質は、このような抗体の開発が真の難題を引き起こすことを意味する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
特に、その自然の膜結合形式においてＣＸＣＲ４を認識するＣＸＣＲ４に対するヒト抗体に対する要求がある。ヒト抗体は、一般に、利点を示すと認識されるが、それらを、成功したヒトの治療のための候補とするために十分に高い親和性及び適切な機能特性を有するヒト抗体の開発が決して容易でないことが知られている。これは、その複雑さ及び膜貫通特性のために、ＧＰＣＲｓの場合と同様である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、腫瘍、ウィルス感染、及びＣＸＣＲ４＋細胞が関与する、炎症又は免疫疾患のような他の疾患及び病状の安全かつ効果的な治療において用いるための新規な治療用組成物及び方法を提供することにより、先行技術における、特定の限定を克服する。本発明は、ＣＸＣＲ４、好ましくはＣＸＣＲ４の１つ又はそれ以上の細胞外ドメイン内のエピトープと結合する抗体、特にヒト抗体を提供する。このような抗体は、腫瘍及びウィルス感染、並びに炎症又は免疫疾患のような、ＣＸＣＲ４＋細胞が関与する他の疾患及び病状の治療に有効である。本発明の組成物及び方法は、この特定のカテゴリーの抗体を用いる免疫複合体及び組み合わせの使用にも拡張される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、Ｃ−９Ｐ２１クローンの、特に、重鎖及び軽鎖のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。ｓｃＦｖをＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ部位を介してｐＨＯＧ２１内にクローニングした。初期クローニングに使用した制限部位（ＮｃｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＭｌｕＩ及びＮｏｔＩ）をイタリック体で下線を付して示す。ＶＨとＶＬとの間のリンカー配列をイタリック体で示す。ｃ−ｍｙｃエピトープ及び６Ｈｉｓをそれぞれ下線及び２重下線で示す。
【図２】図２は、Ｂ−１Ｍ２２クローンの、特に、重鎖及び軽鎖のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。ｓｃＦｖをＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ部位を介してｐＨＯＧ２１内にクローニングした。初期クローニングに使用した制限部位（ＮｃｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＭｌｕＩ及びＮｏｔＩ）をイタリック体で下線を付して示す。ＶＨとＶＬとの間のリンカー配列をイタリック体で示す。ｃ−ｍｙｃエピトープ及び６Ｈｉｓをそれぞれ下線及び２重下線で示す。
【図３】図３は、Ｃ−１Ｉ２４クローンの、特に、重鎖及び軽鎖のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。ｓｃＦｖをＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ部位を介してｐＨＯＧ２１内にクローニングした。初期クローニングに使用した制限部位（ＮｃｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＭｌｕＩ及びＮｏｔＩ）をイタリック体で下線を付して示す。ＶＨとＶＬとの間のリンカー配列をイタリック体で示す。ｃ−ｍｙｃエピトープ及び６Ｈｉｓをそれぞれ下線及び２重下線で示す。
【図４】図４は、Ｄ−１Ｋ２１クローンの、特に、重鎖及び軽鎖のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。ｓｃＦｖをＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ部位を介してｐＨＯＧ２１内にクローニングした。初期クローニングに使用した制限部位（ＮｃｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＭｌｕＩ及びＮｏｔＩ）をイタリック体で下線を付して示す。ＶＨとＶＬとの間のリンカー配列をイタリック体で示す。ｃ−ｍｙｃエピトープ及び６Ｈｉｓをそれぞれ下線及び２重下線で示す。
【図５】図５は、９Ｎ１０クローンの、特に、重鎖及び軽鎖のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。ｓｃＦｖをＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ部位を介してｐＨＯＧ２１内にクローニングした。初期クローニングに使用した制限部位（ＮｃｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＭｌｕＩ及びＮｏｔＩ）をイタリック体で下線を付して示す。ＶＨとＶＬとの間のリンカー配列をイタリック体で示す。ｃ−ｍｙｃエピトープ及び６Ｈｉｓをそれぞれ下線及び２重下線で示す。
【図６】図６Ａは、Ｂ−１Ｍ２２、Ｃ−９Ｐ２１、Ｃ−１Ｉ２４及びＤ−１Ｋ２１ｓｃＦｖクローンの、ＣＸＣＲ４トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞株への結合を、非トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞株を対照に示しているＥａｓｙＣｙｔｅ染色である。図６Ｂは、Ｂ−１Ｍ２２、Ｃ−９Ｐ２１、Ｃ−１Ｉ２４及びＤ−１Ｋ２１ｓｃＦｖクローンの、トランスフェクトＤＴ４０細胞株への結合を、非トランスフェクトＤＴ４０細胞株を対照に示しているＥａｓｙＣｙｔｅ染色である。図６Ｃは、Ｃ−９Ｐ２１、９Ｎ１０及びＦ７ＩｇＧクローンの、Ｒａｍｏｓ及びＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞株への結合を示すＥａｓｙＣｙｔｅ染色である。
【図７】図７Ａは、１０5個のＪｕｒｋａｔ細胞の、０．５μｇのＢ−１Ｍ２２、Ｃ−９Ｐ２１、Ｃ−１Ｉ２４又はＤ−１Ｋ２１ｓｃＦｖクローンでの、リガンド及びＡＭＤ−３１００との非競合下及び競合下のＥａｓｙＣｙｔｅ染色を示す。図７Ｂは、１０5個のＲａｍｏｓ細胞の、０．５μｇのＢ−１Ｍ２２、Ｃ−９Ｐ２１、Ｃ−１Ｉ２４又はＤ−１Ｋ２１ｓｃＦｖクローンでの、リガンド及びＡＭＤ−３１００との非競合下及び競合下のＥａｓｙＣｙｔｅ染色を示す。図７Ｃは、１０5個のＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞の、０．１μｇのＣ−９Ｐ２１、９Ｎ１０又はＦ７ＩｇＧクローンでの、４μｇ、１μｇ及び０．５μｇのリガンドとの非競合下及び競合下のＥａｓｙＣｙｔｅ染色を示す。
【図８】図８Ａは、１０5個のＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞の、０．５μｇのＣ−１Ｉ２４（点線）、Ｂ−１Ｍ２２（濃い実線）又はＦ７（薄い実線）でのＥａｓｙＣｙｔｅ染色を、ＰＢＳ（黒い陰影）と比較して示す。図８Ｂは、１０5個のＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞の、０．５μｇのＤ−１Ｋ２１（点線）、Ｃ−９Ｐ２１（濃い実線）又はＦ７（薄い実線）でのＥａｓｙＣｙｔｅ染色を、ＰＢＳ（黒い陰影）と比較して示す。全ての抗体がＩｇＧ１型であり、結合はヤギ抗ヒトＩｇＧｒＰＥ２次抗体で検出した。
【図９】図９は、Ｂ−１Ｍ２２、Ｃ−９Ｐ２１、Ｃ−１Ｉ２４又はＤ−１Ｋ２１の、マウス又はサルＣＸＣＲ４を一過性に発現するＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞への結合を示す。「Ｆｕｇｅｎｅ」と表記されたカラムは、ＤＮＡ不存在下にトランスフェクション剤で処理した細胞を示し、陰性対照とする。
【図１０】図１０は、Ｂ−１Ｍ２２、Ｃ−９Ｐ２１、Ｃ−１Ｉ２４及びＤ−１Ｋ２１ｓｃＦｖクローンをＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞上で滴定し、Ｃａ++流アッセイに使用する最適濃度を決定する、ＥａｓｙＣｙｔｅ実験を示す。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｅは、（Ｆｌｕｏ−４で標識した）ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞上でのＣａ++流アッセイの結果を示す。Ｂ−１Ｍ２２、Ｃ−９Ｐ２１、Ｃ−１Ｉ２４及びＤ−１Ｋ２１抗体は、ｓｃＦｖレベル（図１１Ａ）及びＩｇＧレベル（図１１Ｂ、１１Ｃ及び１１Ｄ）の両者で試験し、９Ｎ１０クローンはＩｇＧレベル（図１１Ｅ）で試験した。ＣＸＣＲ４特異的リガンドであるＳＤＦ−１αの添加前に、細胞を４μｇ／ｍＬのｓｃＦｖ（図１１Ａ）、１０及び１００μｇ／ｍＬのＩｇＧ（図１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ）、又は１及び１０μｇ／ｍＬのＩｇＧ（図１１Ｅ）と共に１５分間、プレインキュベートした。リガンド添加の約１０秒後にシグナルの記録を開始した。曲線下の面積（ＡＵＣ）を積分して求め、ＳＤＦ−１αのみによる最大刺激でのＡＵＣに対する百分率としてプロットした。
【図１２】図１２Ａ及び図１２Ｂは、（Ｆｌｕｏ−４で標識した）ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞上でのＣａ++流アッセイの結果を示す。Ｃ−９Ｐ２１及び９Ｎ１０抗体は、ＩｇＧレベルで試験した。ＣＸＣＲ４特異的リガンドであるＳＤＦ−１αの添加前に、抗体の濃度を変えながら細胞とともに１５分間、プレインキュベートした。リガンド添加の約１０秒後にシグナルの記録を開始した。図１２Ａは、一連の濃度でのシグナル低下を示し、図１２Ｂは、最初のデータを示す。
【図１３】図１３は、抗ＣＸＣＲ４ｓｃＦｖＣ−９Ｐ２１による、リガンド（ＳＤＦ−１α）誘導細胞移動の抑制を示す。ＢＡＴＤＡ標識ヒトＴ細胞白血病ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞は、ボイデンチャンバー内へ移動するように誘導された。ボイデンチャンバーでは、ＳＤＦ−１リガンドはチャンバー下部に置かれ、細胞はチャンバー上部において抗体又は対照としての培地のみと共培養された。チャンバーの下部に移動した細胞は、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００により誘導された細胞溶解後の蛍光強度により検出した。３重試験での平均及び標準偏差をプロットする。
【図１４】図１４Ａ、図１４Ｂ、図１４Ｃは、抗ＣＸＣＲ４抗体であるＢ−１Ｍ２２、Ｃ−９Ｐ２１、Ｃ−１Ｉ２４及びＤ−１Ｋ２１による、ＡＤＣＣの誘導を示す。Ｃ−９ｐ２１及びＤ−１Ｋ２１ｓｃＦｖ（ａ）、Ｃ−９Ｐ２１及びＤ−１Ｋ２１ＩｇＧ（ｂ）、Ｂ−１Ｍ２２及びＣ−１Ｉ２４ＩｇＧ（ｃ）について、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞の用量応答致死を示す。
【図１５】図１５Ａ及び図１５Ｂは、Ｂ−１Ｍ２２、Ｃ−９Ｐ２１、Ｃ−１Ｉ２４及びＤ−１Ｋ２１抗体のＣＤＣ誘導能試験の結果を示す。Ｂ１−Ｍ２２及びＣ−１Ｉ２４ＩｇＧはヒト血清存在下においてＲａｍｏｓ細胞の用量応答致死を示すが（図１５Ａ）、Ｃ−９Ｐ２１及びＤ−１Ｋ２１はＣＤＣを誘導しない（図１５Ｂ）。対照として、ＩｇＧ１型Ｆ７抗体を使用した。
【図１６】図１６Ａは、抗ＣＸＣＲ４抗体であるＢ−１Ｍ２２、Ｃ−９Ｐ２１、Ｃ−１Ｉ２４及びＤ−１Ｋ２１のアポトーシス活性のアネキシンＶによる分析を示す。対照として、Ｆ７抗体及びスタウロスポリン（Ｓ：２５ｎＭ）を使用した。抗体及びスタウロスポリンを添加しない陰性対照（バックグラウンドレベル）を、０カラムに示す。薄灰色陰影は、アネキシンＶ及びＰＩの両者に対して陽性である死細胞全量を示し、濃灰色陰影は、アネキシンＶに対しては陽性であるが、ＰＩに対しては陰性であることによって定義されるアポトーシス細胞を示す。図１６Ｂは、抗ＣＸＣＲ４抗体であるＣ−９Ｐ２１及び９Ｎ１０のアポトーシス活性のアネキシンＶによる分析を示す。対照として、Ｆ７抗体を使用した。薄灰色陰影は、アネキシンＶ及びＰＩの両者に対して陽性である死細胞全量を示し、濃灰色陰影は、アネキシンＶに対しては陽性であるが、ＰＩに対しては陰性であることによって定義されるアポトーシス細胞を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の抗体の特定の利点は、抗体がＣＸＣＲ４発現細胞において重大なアポトーシスを誘発しないことである。臨床分野における主要な抗体とは対照的であり（例えば、ＷＯ  ２００８／０６０３６７に記載されたＭｅｄａｒｅｘ抗体）、これはアポトーシスを誘発する。ＣＸＣＲ４は、多くの正常細胞で発現するので、アポトーシスを誘発しないことは、あまりにも多くの不要な細胞死滅とそのような抗体がこのように良好な安全プロフィールを有するために、実際の治療上の利点がある。
【００１６】
本明細書に開示された本発明の抗体の追加又は他の好ましい特性は、抗体が拮抗的抗体であることである。したがって、重大なアポトーシスを誘発しない特性は、抗体が拮抗的抗体であるという特性をも兼ね備えている。すなわち、それらは例えば、受容体−リガンド相互作用を遮断又は阻害することにより、及び／又はＣＸＣＲ４受容体からの下流シグナル伝達事象を遮断又は阻害することにより、例えば、リガンドが誘発又は介在するＣＸＣＲ４によるシグナル伝達を遮断又は阻害することにより、ＣＸＣＲ４の機能を遮断又は阻害する。この特性は、例えば、診断のために、単にＣＸＣＲ４発現細胞を標識するための使用に対するものとしての治療における抗体の使用にとって重要である。
【００１７】
この点について、広範囲の健康／正常細胞でＣＸＣＲ４が発現することが知られており、ＣＸＣＲ４及びそのリガンドＳＤＦ−１は、いずれも開発において重要である。しかし、前記で議論したように、ＣＸＣＲ４がほとんど全ての悪性腫瘍で過剰発現し、それらの増殖に寄与していることもわかっている。おそらく更に重要なことには、ＳＤＦ−１は、通常、リンパ節、骨髄、肺、肝臓等の、最も転移しやすい組織中で強く発現しており、腫瘍細胞がＳＤＦ−１の勾配に沿って移動することが概して受け入れられている。したがって、本発明の抗体の主要な目的は、腫瘍の増殖を制限し、ＣＸＣＲ４の機能を阻害することにより、例えば、受容体−リガンド相互作用を遮断又は阻害することにより、転移の形成を防止することである。ＣＸＣＲ４は血管形成に関与していると考えられ、したがって、ＣＸＣＲ４の機能の遮断又は阻害は、血管新生及び腫瘍の血管新生に影響を及ぼすためにも用いることができる。
【００１８】
機能の遮断又は阻害、特に受容体−リガンド相互作用の遮断又は阻害は、炎症性疾患及び自己免疫疾患を治療するための、本発明の抗体の使用においても重要である。また、主要な目的は、ＣＸＣＲ４＋細胞を死滅させることでなく、その活性を下方制御し（自己免疫疾患において）、ＣＸＣＲ４＋細胞の炎症部位への移動を防止又は減少することである（炎症性疾患及び自己免疫疾患の両方で有用）。
【００１９】
拮抗作用（ＣＸＣＲ４の機能の遮断又は阻害）も、感染症、例えば、ＣＸＣＲ４が機能的役割を果たすウィルス、細菌、真菌又は寄生虫感染を治療するための本発明の抗体の使用において重要である。このようなウィルス感染症の例は、いくつかの株（ＣＸＣＲ４指向性株）が、宿主細胞に感染するためにＣＸＣＲ４受容体を使用することがわかっているレトロウィルス感染、特にＨＩＶである。したがって、ＣＸＣＲ４受容体の遮断又は阻害は、例えば、ＨＩＶによるＣＸＣＲ４＋細胞の感染を遮断又は阻害することにより、ＨＩＶの拡張を制限し得る。
【００２０】
しかし、前記で議論したように、本発明の抗体の作用の主な形態は、その拮抗特性により（有利には、ＣＸＣＲ４＋細胞の重大なアポトーシスを誘導しない能力と組み合わせて）、ある実施形態においては、本発明の抗体は、ＣＸＣＲ４＋細胞の選択的排除（殺傷）を誘発し得る。このような選択的排除は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、有糸分裂の異常のようなメカニズムによる場合があり、重大なアポトーシスの誘発を引き起さないと思われる。
【００２１】
本発明者らは、ＣＸＣＲ４と結合するＣＸＣＲ４特異的抗体を調製した。
【００２２】
例えば、前記抗体は、ＣＸＣＲ４でトランスフェクションした細胞及びＣＸＣＲ４を自然に発現する細胞のような、ＣＸＣＲ４＋細胞と結合する。特に、前記抗体は、ＣＸＣＲ４でトランスフェクションしたＨＥＫ２９３Ｔ−細胞、ＣＸＣＲ４でトランスフェクションしたＤＴ４０−細胞、並びに自然にＣＸＣＲ４を発現するＲａｍｏｓ（Ｂ−細胞）、Ｊｕｒｋａｔ（Ｔ−細胞白血病）及びＣＣＲＦ−ＣＥＭ（ヒトＴ−細胞白血病）と結合する（実施例２、３及び４を参照されたい）。
【００２３】
重要なことに、前記抗体は、ＣＸＣＲ４−細胞、すなわち、ＣＸＣＲ４を発現しない細胞とは有意に結合しない。特に、前記抗体は、ＣＸＣＲ４をトランスフェクションしていない細胞、又は自然にＣＸＣＲ４を発現しない細胞とは有意に結合しない。
【００２４】
前記抗体は、ＣＸＣＲ４と結合することが知られているリガンド、例えば、天然のリガンドＳＤＦ−１ａ（ＳＤＦ−１とも呼ばれる）及び／又はＣＸＣＲ４と結合する他のリガンド（例えば、非天然のリガンド）、例えば、ＡＭＤ−３１００（ＣＸＣＲ４と非常に高い特異性を有し、ＣＸＣＲ４を阻害する）の結合をも阻害する（実施例３を参照されたい）。
【００２５】
したがって、本明細書に開示される抗体は、ＣＸＣＲ４と特異的に結合し、本明細書で議論する病状の診断及び治療のために適切な候補物質となる。
【００２６】
相補性決定領域（ＣＤＲｓ）を含む、ＣＸＣＲ４、そのＶH及びＶLドメインと結合する、本発明の好ましい抗体分子のアミノ酸及び／又はＤＮＡ配列を、本明細書に記載の種々の配列番号に示す。
【００２７】
したがって、本発明は、ＣＸＣＲ４と結合し、ＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない性質を有する抗体を提供する。好ましくは、前記抗体は、ＣＸＣＲ４の機能の１つ又はそれ以上を遮断又は阻害し、例えば、ＳＤＦ−１（又はＡＭＤ−３１００のような他のＣＸＣＲ４リガンド）のＣＸＣＲ４への結合を遮断又は阻害し、ＳＤＦ−１（又は他のＣＸＣＲ４リガンド）に対する応答におけるＣＸＣＲ４＋細胞の移動を遮断又は阻害し、ＳＤＦ−１（又は他のＣＸＣＲ４リガンド）をＣＸＣＲ４＋細胞に加えることにより誘発されるＣａ2+流を遮断又は阻害し、又はＣＸＣＲ４受容体からの他の下流シグナル伝達事象を遮断又は阻害する拮抗的抗体である。
【００２８】
好ましくは、前記抗体は分離される。また、好ましくは、前記抗体はヒト型であり、及び／又はＣＸＣＲ４は好ましくはヒト型である。好ましくは、前記抗体は、ＣＸＣＲ４の細胞外ドメイン内のエピトープと結合する。したがって、「ＣＸＣＲ４との結合」に対するあらゆる言及には、「ＣＸＣＲ４の細胞外ドメイン内のエピトープとの結合」の好ましい実施形態が含まれる。本発明の抗体の他の好ましい特性は、ＣＸＣＲ４発現細胞（ＣＸＣＲ４＋細胞）のＡＤＣＣを誘発する能力、ＣＸＣＲ４発現細胞のＣＤＣを誘発する能力及び少なくともヒトＣＸＣＲ４、更に好ましくはヒト及びサルのＣＸＣＲ４、又はヒト及びマウスのＣＸＣＲ４、最も好ましくはヒト、マウス及びサルのＣＸＣＲ４と結合する能力の１又はそれ以上である。異種間の反応性が観察される場合、更に好ましくは、抗体は、ヒト及びサル、又はヒト及びマウスのＣＸＣＲ４と同様の親和性で結合する。好ましくは、本発明の抗体は、抗腫瘍活性、例えば、インビボにおける腫瘍細胞の増殖阻害を示す。
【００２９】
したがって、本発明は、好ましくは、ヒトＣＸＣＲ４の細胞外ドメイン中のエピトープと結合し、好ましくはＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない特性を有する分離ヒト抗体を提供する。したがって、本明細書に開示される全ての実施形態において、ＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない特性は好ましい特徴である。
【００３０】
一実施形態においては、本発明は、ＣＸＣＲ４と結合し、ＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない特性を有し、配列番号：１、７、１３若しくは１９のアミノ酸配列、又はこれらの配列の任意の１つと実質的に相同的な配列を含む、重鎖ＣＤＲ１ドメインを含む抗体を提供する。
【００３１】
それに代え、又はそれに加え、本発明の一実施形態においては、ＣＸＣＲ４と結合し、ＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない特性を有する抗体は、配列番号：２、８、１４若しくは２０のアミノ酸配列、又はこれらの配列の任意の１つと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ２ドメインを含む。
【００３２】
それに代え、又はそれに加え、本発明の一実施形態においては、ＣＸＣＲ４と結合し、ＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない特性を有する抗体は、配列番号：３、９、１５若しくは２１のアミノ酸配列、又はこれらの配列の任意の１つと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ３ドメインを含む。
【００３３】
それに代え、又はそれに加え、本発明の一実施形態においては、ＣＸＣＲ４と結合し、ＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない特性を有する抗体は、配列番号：４、１０、１６、２２若しくは８８のアミノ酸配列、又はこれらの配列の任意の１つと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ１ドメインを含む。
【００３４】
それに代え、又はそれに加え、本発明の一実施形態においては、ＣＸＣＲ４と結合し、ＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない特性を有する抗体は、配列番号：５、１１、１７、２３若しくは８９のアミノ酸配列、又はこれらの配列の任意の１つと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ２ドメインを含む。
【００３５】
それに代え、又はそれに加え、本発明の一実施形態においては、ＣＸＣＲ４と結合し、ＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない特性を有する抗体は、配列番号：６、１２、１８、２４若しくは９０のアミノ酸配列、又はこれらの配列の任意の１つと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含む。
【００３６】
したがって、特定の実施形態においては、本発明は、ＣＸＣＲ４と結合し、ＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない特性を有し、１つ又はそれ以上の重鎖ＣＤＲドメインを含む抗体であって、重鎖ＣＤＲドメインが、
（ａ）配列番号：１、７、１３若しくは１９のアミノ酸配列、又はこれらと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ１ドメイン；
（ｂ）配列番号：２、８、１４若しくは２０のアミノ酸配列、又はこれらと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ２ドメイン；及び
（ｃ）配列番号：３、９、１５若しくは２１のアミノ酸配列、又はこれらと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ３ドメインからなる群から選択される抗体を提供する。
【００３７】
特定の実施形態においては、本発明は、ＣＸＣＲ４と結合し、ＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない特性を有し、１つ又はそれ以上の軽鎖ＣＤＲドメインを含む抗体であって、軽鎖ＣＤＲドメインが、
（ａ）配列番号：４、１０、１６、２２若しくは８８のアミノ酸配列、又はこれらと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ１ドメイン；
（ｂ）配列番号：５、１１、１７、２３若しくは８９のアミノ酸配列、又はこれらと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ２ドメイン；及び
（ｃ）配列番号：６、１２、１８、２４若しくは９０のアミノ酸配列、又はこれらと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメインからなる群から選択される抗体をも提供する。
【００３８】
特定の好ましい実施形態においては、抗体は、ＣＸＣＲ４と結合し、ＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない特性を有し、
（ａ）配列番号：３のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ３、及び
（ｂ）配列番号：６のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ３の両方を含む。
【００３９】
更に好ましくは、配列番号：１のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ１ドメイン、及び／又は配列番号：４のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ１ドメイン、及び／又は配列番号：２のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ２ドメイン、及び／又は配列番号：５のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ２ドメインも存在する。
【００４０】
特定の好ましい実施形態においては、抗体は、ＣＸＣＲ４と結合し、ＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない特性を有し、
（ａ）配列番号：９のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ３、及び
（ｂ）配列番号：１２のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ３の両方を含む。
【００４１】
更に好ましくは、配列番号：７のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ１ドメイン、及び／又は配列番号：１０のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ１ドメイン、及び／又は配列番号：８のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ２ドメイン、及び／又は配列番号：１１のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ２ドメインも存在する。
【００４２】
特定の好ましい実施形態においては、抗体は、ＣＸＣＲ４と結合し、ＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない特性を有し、
（ａ）配列番号：１５のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ３、及び
（ｂ）配列番号：１８のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ３の両方を含む。
【００４３】
更に好ましくは、配列番号：１３のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ１ドメイン、及び／又は配列番号：１６のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ１ドメイン、及び／又は配列番号：１４のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ２ドメイン、及び／又は配列番号：１７のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ２ドメインも存在する。
【００４４】
特定の好ましい実施形態においては、抗体は、ＣＸＣＲ４と結合し、ＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない特性を有し、
（ａ）配列番号：２１のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ３、及び
（ｂ）配列番号：２４のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ３の両方を含む。
【００４５】
更に好ましくは、配列番号：１９のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ１ドメイン、及び／又は配列番号：２２のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ１ドメイン、及び／又は配列番号：２０のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ２ドメイン、及び／又は配列番号：２３のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ２ドメインも存在する。
【００４６】
特定の好ましい実施形態においては、抗体は、ＣＸＣＲ４と結合し、ＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない特性を有し、
（ａ）配列番号：３のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ３、及び
（ｂ）配列番号：９０のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ３の両方を含む。
【００４７】
更に好ましくは、配列番号：１のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ１ドメイン、及び／又は配列番号：８８のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ１ドメイン、及び／又は配列番号：２のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ２ドメイン、及び／又は配列番号：８９のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ２ドメインも存在する。
【００４８】
好ましい一実施形態においては、配列番号：１のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号：２のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号：３のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含むＣＤＲ３が、個々に、又は組み合わせて存在する。
【００４９】
更に他の好ましい実施形態においては、配列番号：４のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号：５のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号：６のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ３が、個々に、又は組み合わせて存在する。
【００５０】
好ましい一実施形態においては、配列番号：７のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号：８のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号：９のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含むＣＤＲ３が、個々に、又は組み合わせて存在する。
【００５１】
更に他の好ましい実施形態においては、配列番号：１０のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号：１１のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号：１２のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ３が、個々に、又は組み合わせて存在する。
【００５２】
好ましい一実施形態においては、配列番号：１３のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号：１４のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号：１５のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含むＣＤＲ３が、個々に、又は組み合わせて存在する。
【００５３】
更に他の好ましい実施形態においては、配列番号：１６のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号：１７のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号：１８のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含むＣＤＲ３が、個々に、又は組み合わせて存在する。
【００５４】
好ましい一実施形態においては、配列番号：１９のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号：２０のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号：２１のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含むＣＤＲ３が、個々に、又は組み合わせて存在する。
【００５５】
更に他の好ましい実施形態においては、配列番号：２２のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号：２３のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号：２４のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含むＣＤＲ３が、個々に、又は組み合わせて存在する。
【００５６】
更に他の好ましい実施形態においては、配列番号：８８のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号：８９のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号：９０のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含むＣＤＲ３が、個々に、又は組み合わせて存在する。
【００５７】
また、特定の実施形態においては、本発明は、ＣＸＣＲ４と結合し、ＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない特性を有し、配列番号：３のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ３ドメイン、及び／又は配列番号：６のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含む抗体を提供する。
【００５８】
前記抗体は、配列番号：２のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ２ドメイン、及び／又は配列番号：５のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ２ドメインを更に含んでいてもよく、及び／又は配列番号：１のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ１ドメイン、及び／又は配列番号：４のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ１ドメインを更に含んでいてもよい。
【００５９】
特定の実施形態においては、本発明は、ＣＸＣＲ４と結合し、ＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない特性を有し、配列番号：９のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ３ドメイン、及び／又は配列番号：１２のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含む抗体を提供する。
【００６０】
前記抗体は、配列番号：８のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ２ドメイン、及び／又は配列番号：１１のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ２ドメインを更に含んでいてもよく、及び／又は配列番号：７のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ１ドメイン、及び／又は配列番号：１０のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ１ドメインを更に含んでいてもよい。
【００６１】
特定の実施形態においては、本発明は、ＣＸＣＲ４と結合し、ＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない特性を有し、配列番号：１５のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ３ドメイン、及び／又は配列番号：１８のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含む抗体を提供する。
【００６２】
前記抗体は、配列番号：１４のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ２ドメイン、及び／又は配列番号：１７のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ２ドメインを更に含んでいてもよく、及び／又は配列番号：１３のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ１ドメイン、及び／又は配列番号：１６のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ１ドメインを更に含んでいてもよい。
【００６３】
特定の実施形態においては、本発明は、ＣＸＣＲ４と結合し、ＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない特性を有し、配列番号：２１のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ３ドメイン、及び／又は配列番号：２４のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含む抗体を提供する。
【００６４】
前記抗体は、配列番号：２０のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ２ドメイン、及び／又は配列番号：２３のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ２ドメインを更に含んでいてもよく、及び／又は配列番号：１９のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ１ドメイン、及び／又は配列番号：２２のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ１ドメインを更に含んでいてもよい。
【００６５】
特定の実施形態においては、本発明は、ＣＸＣＲ４と結合し、ＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない特性を有し、配列番号：３のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ３ドメイン、及び／又は配列番号：９０のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含む抗体を提供する。
【００６６】
前記抗体は、配列番号：２のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ２ドメイン、及び／又は配列番号：８９のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ２ドメインを更に含んでいてもよく、及び／又は配列番号：１のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ１ドメイン、及び／又は配列番号：８８のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ１ドメインを更に含んでいてもよい。
【００６７】
また、特定の実施形態においては、本発明は、ＣＸＣＲ４と結合し、ＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない特性を有し、配列番号：２のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ２ドメイン、及び／又は配列番号：５のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ２ドメインを含む抗体を提供する。
【００６８】
前記抗体は、配列番号：３のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ３ドメイン、及び／又は配列番号：６のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメインを更に含んでいてもよく、及び／又は配列番号：１のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ１ドメイン、及び／又は配列番号：４のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ１ドメインを更に含んでいてもよい。
【００６９】
特定の実施形態においては、本発明は、ＣＸＣＲ４と結合し、ＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない特性を有し、配列番号：８のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ２ドメイン、及び／又は配列番号：１１のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ２ドメインを含む抗体を提供する。
【００７０】
前記抗体は、配列番号：９のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ３ドメイン、及び／又は配列番号：１２のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメインを更に含んでいてもよく、及び／又は配列番号：７のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ１ドメイン、及び／又は配列番号：１０のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ１ドメインを更に含んでいてもよい。
【００７１】
特定の実施形態においては、本発明は、ＣＸＣＲ４と結合し、ＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない特性を有し、配列番号：１４のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ２ドメイン、及び／又は配列番号：１７のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ２ドメインを含む抗体を提供する。
【００７２】
前記抗体は、配列番号：１５のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ３ドメイン、及び／又は配列番号：１８のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメインを更に含んでいてもよく、及び／又は配列番号：１３のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ１ドメイン、及び／又は配列番号：１６のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ１ドメインを更に含んでいてもよい。
【００７３】
また、特定の実施形態においては、本発明は、ＣＸＣＲ４と結合し、ＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない特性を有し、配列番号：２０のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ２ドメイン、及び／又は配列番号：２３のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ２ドメインを含む抗体を提供する。
【００７４】
前記抗体は、配列番号：２１のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ３ドメイン、及び／又は配列番号：２４のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメインを更に含んでいてもよく、及び／又は配列番号：１９のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ１ドメイン、及び／又は配列番号：２２のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ１ドメインを更に含んでいてもよい。
【００７５】
また、特定の実施形態においては、本発明は、ＣＸＣＲ４と結合し、ＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない特性を有し、配列番号：２のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ２ドメイン、及び／又は配列番号：８９のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ２ドメインを含む抗体を提供する。
【００７６】
前記抗体は、配列番号：３のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ３ドメイン、及び／又は配列番号：９０のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメインを更に含んでいてもよく、及び／又は配列番号：１のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ１ドメイン、及び／又は配列番号：８８のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ１ドメインを更に含んでいてもよい。
【００７７】
また、特定の実施形態においては、本発明は、ＣＸＣＲ４と結合し、ＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない特性を有し、配列番号：１のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ１ドメイン、及び／又は配列番号：４のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ１ドメインを含む抗体を提供する。
【００７８】
前記抗体は、配列番号：３のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ３ドメイン、及び／又は配列番号：６のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメインを更に含んでいてもよく、及び／又は配列番号：２のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ２ドメイン、及び／又は配列番号：５のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ２ドメインを更に含んでいてもよい。
【００７９】
特定の実施形態においては、本発明は、ＣＸＣＲ４と結合し、ＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない特性を有し、配列番号：７のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ１ドメイン、及び／又は配列番号：１０のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ１ドメインを含む抗体を提供する。
【００８０】
前記抗体は、配列番号：９のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ３ドメイン、及び／又は配列番号：１２のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメインを更に含んでいてもよく、及び／又は配列番号：８のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ２ドメイン、及び／又は配列番号：１１のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ２ドメインを更に含んでいてもよい。
【００８１】
特定の実施形態においては、本発明は、ＣＸＣＲ４と結合し、ＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない特性を有し、配列番号：１３のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ１ドメイン、及び／又は配列番号：１６のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ１ドメインを含む抗体を提供する。
【００８２】
前記抗体は、配列番号：１５のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ３ドメイン、及び／又は配列番号：１８のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメインを更に含んでいてもよく、及び／又は配列番号：１４のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ２ドメイン、及び／又は配列番号：１７のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ２ドメインを更に含んでいてもよい。
【００８３】
特定の実施形態においては、本発明は、ＣＸＣＲ４と結合し、ＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない特性を有し、配列番号：１９のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ１ドメイン、及び／又は配列番号：２２のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ１ドメインを含む抗体を提供する。
【００８４】
前記抗体は、配列番号：２１のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ３ドメイン、及び／又は配列番号：２４のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメインを更に含んでいてもよく、及び／又は配列番号：２０のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ２ドメイン、及び／又は配列番号：２３のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ２ドメインを更に含んでいてもよい。
【００８５】
特定の実施形態においては、本発明は、ＣＸＣＲ４と結合し、ＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない特性を有し、配列番号：１のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ１ドメイン、及び／又は配列番号：８８のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ１ドメインを含む抗体を提供する。
【００８６】
前記抗体は、配列番号：３のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ３ドメイン、及び／又は配列番号：９０のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメインを更に含んでいてもよく、及び／又は配列番号：２のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む重鎖ＣＤＲ２ドメイン、及び／又は配列番号：８９のアミノ酸配列、又はこれと実質的に相同的な配列を含む軽鎖ＣＤＲ２ドメインを更に含んでいてもよい。
【００８７】
本発明の特定の好ましい抗体は、配列番号：１、２、３、４、５及び６、又は前記配列番号の任意の１つと実質的に相同的な配列からなる群から選択される１又はそれ以上のＣＤＲｓを含む。
【００８８】
本発明の特定の好ましい抗体は、配列番号：７、８、９、１０、１１及び１２、又は前記配列番号の任意の１つと実質的に相同的な配列からなる群から選択される１又はそれ以上のＣＤＲｓを含む。
【００８９】
本発明の特定の好ましい抗体は、配列番号：１３、１４、１５、１６、１７及び１８、又は前記配列番号の任意の１つと実質的に相同的な配列からなる群から選択される１又はそれ以上のＣＤＲｓを含む。
【００９０】
本発明の特定の好ましい抗体は、配列番号：１９、２０、２１、２２、２３及び２４、又は前記配列番号の任意の１つと実質的に相同的な配列からなる群から選択される１又はそれ以上のＣＤＲｓを含む。
【００９１】
本発明の特定の好ましい抗体は、配列番号：１、２、３、８８、８９及び９０、又は前記配列番号の任意の１つと実質的に相同的な配列からなる群から選択される１又はそれ以上のＣＤＲｓを含む。
【００９２】
本発明の特定の好ましい抗体は、配列番号４、５及び６；又は１０、１１及び１２；又は１６、１７及び１８；又は２２、２３及び２４；又は８８、８９及び９０、又は前記配列番号の任意の１つと実質的に相同的な配列の、２又はそれ以上の軽鎖ＣＤＲｓを含む。
【００９３】
特に好ましい結合分子は、配列番号４、５及び６；又は１０、１１及び１２；又は１６、１７及び１８；又は２２、２３及び２４；又は８８、８９及び９０、又は前記配列番号の任意の１つと実質的に相同的な配列のうちの３つを含む（すなわち、前記軽鎖ＣＤＲ１及びＣＤＲ２及びＣＤＲ３のそれぞれ、又はそれらの実質的に相同的な配列の１つ）。
【００９４】
他の特定の好ましい抗体は、配列番号：１、２及び３；又は７、８及び９；又は１３、１４及び１５；又は１９、２０及び２１、又は前記配列番号のいずれか１と実質的に相同的な配列の重鎖ＣＤＲｓの２つ又はそれ以上を含む。
【００９５】
特に好ましい抗体は、配列番号：１、２及び３；又は７、８及び９；又は１３、１４及び１５；又は１９、２０及び２１、又は前記配列番号のいずれか１つと実質的に相同的な配列の重鎖ＣＤＲｓの３つ（すなわち、前記重鎖ＣＤＲ１及びＣＤＲ２及びＣＤＲ３又はそれらと実質的に相同的な配列のそれぞれの１つ）を含む。
【００９６】
更に特に好ましい特定の抗体は、配列番号：４、５及び６、又はこれらの配列の任意の１つと実質的に相同的な配列の軽鎖ＣＤＲｓの３つ（すなわち、前記軽鎖ＣＤＲ１及びＣＤＲ２及びＣＤＲ３、又はこれらと実質的に相同的な配列のそれぞれの１つ）、並びに配列番号：１、２及び３、又はこれらの配列の任意の１つと実質的に相同的な配列の重鎖ＣＤＲｓの３つ（すなわち、前記重鎖ＣＤＲ１及びＣＤＲ２及びＣＤＲ３、又はこれらと実質的に相同的な配列のそれぞれの１つ）を含む。
【００９７】
更に特に好ましい特定の抗体は、配列番号：１０、１１及び１２、又はこれらの配列の任意の１つと実質的に相同的な配列の軽鎖ＣＤＲｓの３つ（すなわち、前記軽鎖ＣＤＲ１及びＣＤＲ２及びＣＤＲ３、又はこれらと実質的に相同的な配列のそれぞれの１つ）、並びに配列番号：７、８及び９、又はこれらの配列の任意の１つと実質的に相同的な配列の重鎖ＣＤＲｓの３つ（すなわち、前記重鎖ＣＤＲ１及びＣＤＲ２及びＣＤＲ３、又はこれらと実質的に相同的な配列のそれぞれの１つ）を含む。
【００９８】
更に特に好ましい特定の抗体は、配列番号：１６、１７及び１８、又はこれらの配列の任意の１つと実質的に相同的な配列の軽鎖ＣＤＲｓの３つ（すなわち、前記軽鎖ＣＤＲ１及びＣＤＲ２及びＣＤＲ３、又はこれらと実質的に相同的な配列のそれぞれの１つ）、並びに配列番号：１３、１４及び１５、又はこれらの配列の任意の１つと実質的に相同的な配列の重鎖ＣＤＲｓの３つ（すなわち、前記重鎖ＣＤＲ１及びＣＤＲ２及びＣＤＲ３、又はこれらと実質的に相同的な配列のそれぞれの１つ）を含む。
【００９９】
更に特に好ましい特定の抗体は、配列番号：２２、２３及び２４、又はこれらの配列の任意の１つと実質的に相同的な配列の軽鎖ＣＤＲｓの３つ（すなわち、前記軽鎖ＣＤＲ１及びＣＤＲ２及びＣＤＲ３、又はこれらと実質的に相同的な配列のそれぞれの１つ）、並びに配列番号：１９、２０及び２１、又はこれらの配列の任意の１つと実質的に相同的な配列の重鎖ＣＤＲｓの３つ（すなわち、前記重鎖ＣＤＲ１及びＣＤＲ２及びＣＤＲ３、又はこれらと実質的に相同的な配列のそれぞれの１つ）を含む。
【０１００】
更に特に好ましい特定の抗体は、配列番号：８８、８９及び９０、又はこれらの配列の任意の１つと実質的に相同的な配列の軽鎖ＣＤＲｓの３つ（すなわち、前記軽鎖ＣＤＲ１及びＣＤＲ２及びＣＤＲ３、又はこれらと実質的に相同的な配列のそれぞれの１つ）、並びに配列番号：１、２及び３、又はこれらの配列の任意の１つと実質的に相同的な配列の重鎖ＣＤＲｓの３つ（すなわち、前記重鎖ＣＤＲ１及びＣＤＲ２及びＣＤＲ３、又はこれらと実質的に相同的な配列のそれぞれの１つ）を含む。
【０１０１】
特に好ましい特定の抗体は、配列番号：１の重鎖ＣＤＲ１ドメイン、配列番号：２の重鎖ＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号：３の重鎖ＣＤＲ３ドメイン、又は前記配列の任意の１つと実質的に相同的な配列を含み；及び／又は配列番号：４の軽鎖ＣＤＲ１ドメイン、配列番号：５の軽鎖ＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号：６の軽鎖ＣＤＲ３ドメイン、又は前記配列の任意の１つと実質的に相同的な配列を含む。
【０１０２】
特に好ましい特定の抗体は、配列番号：７の重鎖ＣＤＲ１ドメイン、配列番号：８の重鎖ＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号：９の重鎖ＣＤＲ３ドメイン、又は前記配列の任意の１つと実質的に相同的な配列を含み；及び／又は配列番号：１０の軽鎖ＣＤＲ１ドメイン、配列番号：１１の軽鎖ＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号：１２の軽鎖ＣＤＲ３ドメイン、又は前記配列の任意の１つと実質的に相同的な配列を含む。
【０１０３】
特に好ましい特定の抗体は、配列番号：１３の重鎖ＣＤＲ１ドメイン、配列番号：１４の重鎖ＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号：１５の重鎖ＣＤＲ３ドメイン、又は前記配列の任意の１つと実質的に相同的な配列を含み；及び／又は配列番号：１６の軽鎖ＣＤＲ１ドメイン、配列番号：１７の軽鎖ＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号：１８の軽鎖ＣＤＲ３ドメイン、又は前記配列の任意の１つと実質的に相同的な配列を含む。
【０１０４】
特に好ましい特定の抗体は、配列番号：１９の重鎖ＣＤＲ１ドメイン、配列番号：２０の重鎖ＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号：２１の重鎖ＣＤＲ３ドメイン、又は前記配列の任意の１つと実質的に相同的な配列を含み；及び／又は配列番号：２２の軽鎖ＣＤＲ１ドメイン、配列番号：２３の軽鎖ＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号：２４の軽鎖ＣＤＲ３ドメイン、又は前記配列の任意の１つと実質的に相同的な配列を含む。
【０１０５】
特に好ましい特定の抗体は、配列番号：１の重鎖ＣＤＲ１ドメイン、配列番号：２の重鎖ＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号：３の重鎖ＣＤＲ３ドメイン、又は前記配列の任意の１つと実質的に相同的な配列を含み；及び／又は配列番号：８８の軽鎖ＣＤＲ１ドメイン、配列番号：８９の軽鎖ＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号：９０の軽鎖ＣＤＲ３ドメイン、又は前記配列の任意の１つと実質的に相同的な配列を含む。
【０１０６】
更なる実施形態においては、本発明は、ＣＸＣＲ４と結合し、ＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない特性を有し、３つのＣＤＲｓを含む少なくとも１つの重鎖可変領域と、３つのＣＤＲｓを含む少なくとも１つの軽鎖可変領域とを含み、前記重鎖可変領域が：
（ｉ）配列番号：１のアミノ酸配列を有する可変重（ＶＨ）ＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号：２のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号：３のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３を含む抗体を提供する。
【０１０７】
この実施形態の好ましい態様においては、前記軽鎖可変領域ＣＤＲｓの１つ又はそれ以上が、
（ｉ）配列番号：４のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号：５のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号：６のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３からなる群から選択される。好ましくは、前記軽鎖可変領域ＣＤＲｓの２つ又は３つが、前記群から選択される。前記配列の１又はそれ以上に実質的に相同的な配列を含む抗体も、本実施形態において提供される。
【０１０８】
更なる実施形態においては、本発明は、ＣＸＣＲ４と結合し、ＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない特性を有し、３つのＣＤＲｓを含む少なくとも１つの重鎖可変領域と、３つのＣＤＲｓを含む少なくとも１つの軽鎖可変領域とを含み、前記重鎖可変領域が：
（ｉ）配列番号：７のアミノ酸配列を有する可変重（ＶＨ）ＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号：８のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号：９のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３を含む抗体を提供する。
【０１０９】
この実施形態の好ましい態様においては、前記軽鎖可変領域ＣＤＲｓの１つ又はそれ以上が、
（ｉ）配列番号：１０のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号：１１のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号：１２のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３からなる群から選択される。好ましくは、前記軽鎖可変領域ＣＤＲｓの２つ又は３つが、前記群から選択される。前記配列の１又はそれ以上に実質的に相同的な配列を含む抗体も、本実施形態において提供される。
【０１１０】
更なる実施形態においては、本発明は、ＣＸＣＲ４と結合し、ＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない特性を有し、３つのＣＤＲｓを含む少なくとも１つの重鎖可変領域と、３つのＣＤＲｓを含む少なくとも１つの軽鎖可変領域とを含み、前記重鎖可変領域が：
（ｉ）配列番号：１３のアミノ酸配列を有する可変重（ＶＨ）ＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号：１４のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号：１５のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３を含む抗体を提供する。
【０１１１】
この実施形態の好ましい態様においては、前記軽鎖可変領域ＣＤＲｓの１つ又はそれ以上が、
（ｉ）配列番号：１６のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号：１７のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号：１８のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３からなる群から選択される。好ましくは、前記軽鎖可変領域ＣＤＲｓの２つ又は３つが、前記群から選択される。前記配列の１又はそれ以上に実質的に相同的な配列を含む抗体も、本実施形態において提供される。
【０１１２】
更なる実施形態においては、本発明は、ＣＸＣＲ４と結合し、ＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない特性を有し、３つのＣＤＲｓを含む少なくとも１つの重鎖可変領域と、３つのＣＤＲｓを含む少なくとも１つの軽鎖可変領域とを含み、前記重鎖可変領域が：
（ｉ）配列番号：１９のアミノ酸配列を有する可変重（ＶＨ）ＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号：２０のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号：２１のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３を含む抗体を提供する。
【０１１３】
この実施形態の好ましい態様においては、前記軽鎖可変領域ＣＤＲｓの１つ又はそれ以上が、
（ｉ）配列番号：２２のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号：２３のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号：２４のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３からなる群から選択される。好ましくは、前記軽鎖可変領域ＣＤＲｓの２つ又は３つが、前記群から選択される。前記配列の１又はそれ以上に実質的に相同的な配列を含む抗体も、本実施形態において提供される。
【０１１４】
更なる実施形態においては、本発明は、ＣＸＣＲ４と結合し、ＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない特性を有し、３つのＣＤＲｓを含む少なくとも１つの重鎖可変領域と、３つのＣＤＲｓを含む少なくとも１つの軽鎖可変領域とを含み、前記重鎖可変領域が：
（ｉ）配列番号：１のアミノ酸配列を有する可変重（ＶＨ）ＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号：２のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号：３のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３を含む抗体を提供する。
【０１１５】
この実施形態の好ましい態様においては、前記軽鎖可変領域ＣＤＲｓの１つ又はそれ以上が、
（ｉ）配列番号：８８のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号：８９のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号：９０のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３からなる群から選択される。好ましくは、前記軽鎖可変領域ＣＤＲｓの２つ又は３つが、前記群から選択される。前記配列の１又はそれ以上に実質的に相同的な配列を含む抗体も、本実施形態において提供される。
【０１１６】
本発明の更なる好ましい特定の実施形態は、ＣＸＣＲ４と結合し、ＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない特性を有し、配列番号：１、２若しくは３、又は配列番号：１、２若しくは３の１又はそれ以上と実質的に相同的な配列の重鎖ＣＤＲｓの１、２又は３つを含むＶＨドメイン、及び／又は配列番号：４、５若しくは６、又は配列番号：４、５若しくは６の１又はそれ以上と実質的に相同的な配列の軽鎖ＣＤＲｓの１、２又は３つを含むＶＬドメインを含む。
【０１１７】
本発明の更なる好ましい特定の実施形態は、ＣＸＣＲ４と結合し、ＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない特性を有し、配列番号：７、８若しくは９、又は配列番号：７、８若しくは９の１又はそれ以上と実質的に相同的な配列の重鎖ＣＤＲｓの１、２又は３つを含むＶＨドメイン、及び／又は配列番号：１０、１１若しくは１２、又は配列番号：１０、１１若しくは１２の１又はそれ以上と実質的に相同的な配列の軽鎖ＣＤＲｓの１、２又は３つを含むＶＬドメインを含む。
【０１１８】
本発明の更なる好ましい特定の実施形態は、ＣＸＣＲ４と結合し、ＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない特性を有し、配列番号：１３、１４若しくは１５、又は配列番号：１３、１４若しくは１５の１又はそれ以上と実質的に相同的な配列の重鎖ＣＤＲｓの１、２又は３つを含むＶＨドメイン、及び／又は配列番号：１６、１７若しくは１８、又は配列番号：１６、１７若しくは１８の１又はそれ以上と実質的に相同的な配列の軽鎖ＣＤＲｓの１、２又は３つを含むＶＬドメインを含む抗体を提供する。
【０１１９】
本発明の更なる好ましい特定の実施形態は、ＣＸＣＲ４と結合し、ＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない特性を有し、配列番号：１９、２０若しくは２１、又は配列番号：１９、２０若しくは２１の１又はそれ以上と実質的に相同的な配列の重鎖ＣＤＲｓの１、２又は３つを含むＶＨドメイン、及び／又は配列番号：２２、２３若しくは２４、又は配列番号：２２、２３若しくは２４の１又はそれ以上と実質的に相同的な配列の軽鎖ＣＤＲｓの１、２又は３つを含むＶＬドメインを含む抗体を提供する。
【０１２０】
本発明の更なる好ましい特定の実施形態は、ＣＸＣＲ４と結合し、ＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない特性を有し、配列番号：１、２若しくは３、又は配列番号：１、２若しくは３の１又はそれ以上と実質的に相同的な配列の重鎖ＣＤＲｓの１、２又は３つを含むＶＨドメイン、及び／又は配列番号：８８、８９若しくは９０、又は配列番号：８８、８９若しくは９０の１又はそれ以上と実質的に相同的な配列の軽鎖ＣＤＲｓの１、２又は３つを含むＶＬドメインを含む抗体を提供する。
【０１２１】
好ましい実施形態においては、軽鎖ＣＤＲｓの１、２又は３つは配列番号：４、５及び６；又は８８、８９及び９０において定義されており、及び／又は重鎖ＣＤＲｓの１、２又は３つは配列番号：１、２及び３において定義されている。
【０１２２】
本発明の好ましい特定の実施形態は、ＣＸＣＲ４と結合し、ＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない特性を有し、配列番号：６９、７１、７３若しくは７５のアミノ酸配列、又はこれらと実質的に相同的な配列を有するＶＨドメイン、及び／又は配列番号：７０、７２、７４、７６若しくは１０３のアミノ酸配列、又はこれらと実質的に相同的な配列を有するＶＬドメインを含む抗体を提供する。
【０１２３】
更なる好ましい実施形態は、ＣＸＣＲ４と結合し、ＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない特性を有し、配列番号：６９、７１、７３若しくは７５のアミノ酸配列を有するＶＨドメイン、及び３つの軽鎖ＣＤＲｓを含むＶＬドメインを含む抗体を提供する。好ましくは、前記軽鎖ＣＤＲｓは、配列番号４、５及び６；又は１０、１１及び１２；又は１６、１７及び１８、又は２２、２３及び２４、又は８８、８９及び９０を有する。
【０１２４】
更なる好ましい実施形態は、ＣＸＣＲ４と結合し、ＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない特性を有し、配列番号：６９のアミノ酸配列又はこれと実質的に相同的な配列を有するＶＨドメイン、及び／又は配列番号：７０のアミノ酸配列又はこれと実質的に相同的な配列を有するＶＬドメインを含む抗体を提供する。
【０１２５】
更なる好ましい実施形態は、ＣＸＣＲ４と結合し、ＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない特性を有し、配列番号：７１のアミノ酸配列又はこれと実質的に相同的な配列を有するＶＨドメイン、及び／又は配列番号：７２のアミノ酸配列又はこれと実質的に相同的な配列を有するＶＬドメインを含む抗体を提供する。
【０１２６】
更なる好ましい実施形態は、ＣＸＣＲ４と結合し、ＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない特性を有し、配列番号：７３のアミノ酸配列又はこれと実質的に相同的な配列を有するＶＨドメイン、及び／又は配列番号：７４のアミノ酸配列又はこれと実質的に相同的な配列を有するＶＬドメインを含む抗体を提供する。
【０１２７】
更なる好ましい実施形態は、ＣＸＣＲ４と結合し、ＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない特性を有し、配列番号：７５のアミノ酸配列又はこれと実質的に相同的な配列を有するＶＨドメイン、及び／又は配列番号：７６のアミノ酸配列又はこれと実質的に相同的な配列を有するＶＬドメインを含む抗体を提供する。
【０１２８】
更なる好ましい実施形態は、ＣＸＣＲ４と結合し、ＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない特性を有し、配列番号：６９のアミノ酸配列又はこれと実質的に相同的な配列を有するＶＨドメイン、及び／又は配列番号：１０３のアミノ酸配列又はこれと実質的に相同的な配列を有するＶＬドメインを含む抗体を提供する。
【０１２９】
配列番号：６９のアミノ酸配列又はこれと実質的に相同的な配列を有するＶＨドメイン、及び／又は配列番号：１０３若しくは７０のアミノ酸配列又はこれと実質的に相同的な配列を有するＶＬドメインを含む抗体が特に好ましい。
【０１３０】
更なる実施形態においては、本発明は、ＣＸＣＲ４と結合し、ＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない特性を有し、配列番号：３５（前記抗体はＣ−９Ｐ２１  ｓｃＦｖとも呼ばれる）、配列番号：４６（前記抗体はＢ−１Ｍ２２  ｓｃＦｖとも呼ばれる）、配列番号：５７（前記抗体はＣ−１Ｉ２４  ｓｃＦｖとも呼ばれる）、配列番号：６８（前記抗体はＤ−１Ｋ２１  ｓｃＦｖとも呼ばれる）、若しくは配列番号：１０１（前記抗体は９Ｎ１０  ｓｃＦｖとも呼ばれる）のアミノ酸配列を含み、又はＣＸＣＲ４と結合し、ＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない特性を有する前記配列のいずれかの断片、又は前記配列のいずれかに実質的に相同的な配列を含む抗体を提供する。
【０１３１】
Ｃ−９Ｐ２１又は９Ｎ１０配列をベースとする抗体が特に好ましい。
【０１３２】
本発明は、モノクローナル抗体Ｃ−９Ｐ２１、Ｂ−１Ｍ２２、Ｃ−１Ｉ２４、Ｄ−１Ｋ２１及び９Ｎ１０により例示され、その一本鎖形態を表１、２、３、４及び５に示す（それぞれ、配列番号：３５、４６、５７、６８及び１０１）。抗体Ｃ−９Ｐ２１、Ｂ−１Ｍ２２、Ｃ−１Ｉ２４、Ｄ−１Ｋ２１及び９Ｎ１０の完全長ＩｇＧ形態が製造され、それらの配列を、それぞれ表６、７、８、９及び１０に示す。Ｃ−９Ｐ２１、Ｂ−１Ｍ２２、Ｃ−１Ｉ２４、Ｄ−１Ｋ２１及び９Ｎ１０抗体のＣＤＲドメイン、ＶＨ及びＶＬドメインを表１〜５及び図１〜５に示す。これらのＣＤＲドメイン又はＶＨ及びＶＬドメイン（又はこれらと実質的に相同的な配列）を含む抗体は、本発明の好ましい態様である。Ｃ−９Ｐ２１又は９Ｎ１０をベースとする抗体が特に好ましい。
【０１３３】
本発明の好ましい実施形態は、好ましくは配列番号：３４によりコードされる、配列番号：３５を含むか、又はそれからなるＣ−９Ｐ２１抗体のｓｃＦｖ形態である。更に好ましくは、抗体は、図１に示すアミノ酸配列を含むか、又はそれからなり、好ましくは、この抗体は、図１に示す核酸配列によりコードされる。
【０１３４】
本発明の他の好ましい実施形態は、好ましくは配列番号：４５によりコードされる、配列番号：４６を含むか、又はそれからなるＢ−１Ｍ２２抗体のｓｃＦｖ形態である。更に好ましくは、この抗体は、図２に示すアミノ酸配列を含むか、それからなり、好ましくは、この抗体は図２に示す核酸配列によりコードされる。
【０１３５】
本発明の他の好ましい実施形態は、好ましくは配列番号：５６によりコードされる、配列番号：５７を含むか、又はそれからなるＣ−１Ｉ２４抗体のｓｃＦｖ形態である。更に好ましくは、この抗体は、図３に示すアミノ酸配列を含むか、それからなり、好ましくは、この抗体は図３に示す核酸配列によりコードされる。
【０１３６】
本発明の他の好ましい実施形態は、好ましくは配列番号：６７によりコードされる、配列番号：６８を含むか、又はそれからなるＤ−１Ｋ２１抗体のｓｃＦｖ形態である。更に好ましくは、この抗体は、図４に示すアミノ酸配列を含むか、それからなり、好ましくは、この抗体は図４に示す核酸配列によりコードされる。
【０１３７】
本発明の他の好ましい実施形態は、好ましくは配列番号：１００によりコードされる、配列番号：１０１を含むか、又はそれからなる９Ｎ１０抗体のｓｃＦｖ形態である。更に好ましくは、この抗体は、図５に示すアミノ酸配列を含むか、それからなり、好ましくは、この抗体は図５に示す核酸配列によりコードされる。
【０１３８】
他の好ましい実施形態は、Ｃ−９Ｐ２１、Ｂ−１Ｍ２２、Ｃ−１Ｉ２４、Ｄ−１Ｋ２１及び９Ｎ１０のＩｇＧ形態であり、好ましくは全長ＩｇＧ形態である。これらの任意の抗体のＩｇＧ１抗体が最も好ましい。
【０１３９】
したがって、本発明の他の好ましい実施形態は、配列番号：１０８（アミノ酸）の重鎖及び／又は配列番号：１０９（アミノ酸）の軽鎖を含む全長ＩｇＧ抗体である。また、好ましくは、配列番号：１０６によりコードされる重鎖及び／又は配列番号：１０７によりコードされる軽鎖を含むＩｇＧ抗体である。当然に、ＩｇＧ抗体が、実質的に同一の２本の重鎖及び実質的に同一の２本の軽鎖を含むであろうことが理解される。
【０１４０】
本発明の他の好ましい実施形態は、配列番号：１１２（アミノ酸）の重鎖及び／又は配列番号：１１３（アミノ酸）の軽鎖を含む全長ＩｇＧ抗体である。また、好ましくは、配列番号：１１０によりコードされる重鎖及び／又は配列番号：１１１によりコードされる軽鎖を含むＩｇＧ抗体である。
【０１４１】
本発明の他の好ましい実施形態は、配列番号：１１６（アミノ酸）の重鎖及び／又は配列番号：１１７（アミノ酸）の軽鎖を含む全長ＩｇＧ抗体である。また、好ましくは、配列番号：１１４によりコードされる重鎖及び／又は配列番号：１１５によりコードされる軽鎖を含むＩｇＧ抗体である。
【０１４２】
本発明の他の好ましい実施形態は、配列番号：１２０（アミノ酸）の重鎖及び／又は配列番号：１２１（アミノ酸）の軽鎖を含む全長ＩｇＧ抗体である。また、好ましくは、配列番号：１１８によりコードされる重鎖及び／又は配列番号：１１９によりコードされる軽鎖を含むＩｇＧ抗体である。
【０１４３】
本発明の他の好ましい実施形態は、配列番号：１０８（アミノ酸）の重鎖及び／又は配列番号：１２５（アミノ酸）の軽鎖を含む全長ＩｇＧ抗体である。また、好ましくは、配列番号：１０６によりコードされる重鎖及び／又は配列番号：１２３によりコードされる軽鎖を含むＩｇＧ抗体である。
Ｃ−９Ｐ２１又は９Ｎ１０配列をベースとする抗体が特に好ましい。
本発明の更なる実施形態においては、ＶＨ  ＣＤＲ１は、配列番号：１２６（Ｓ／Ｇ  Ｙ  Ｘ3  Ｍ／Ｉ  Ｈ／Ｓ）、又は配列番号：１２７（Ｘ1ＹＸ3ＭＨ）、又は配列番号：１２８（ＳＹＸ3ＭＨ）を有するか、含む。
【０１４４】
これらの実施形態においては、Ｘ1はＳ又はＧであってもよく、好ましくはＳである。Ｘ3は任意のアミノ酸であってもよく、好ましくは、Ｇ又はＷ又はＹ又はＡであり、最も好ましくはＷである。本実施形態の好ましいＶＨ  ＣＤＲ１配列は、配列番号：１、７、１３又は１９である。特に好ましいＶＨ  ＣＤＲ１は、配列番号：１のアミノ酸配列を有するか、又は含む。
【０１４５】
本発明の更なる実施形態においては、ＶＨ  ＣＤＲ２は、配列番号：１２９（Ｘ1ＩＸ3Ｘ4ＤＧＳＸ8Ｘ9Ｘ10ＹＡＤＳＶＫＧ）のアミノ酸配列を有するか、又は含む。これらの実施形態においては、Ｘ1、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ8、Ｘ9及びＸ10は任意のアミノ酸であってもよい。好ましくは、これらＸの１つ又それ以上、好ましくは全ては、以下の群から選択される：Ｘ1はＶ又はＲであり、（好ましくはＲ）、Ｘ3はＳ又はＮ（好ましくはＮ）、Ｘ4はＹ又はＳ（好ましくはＳ）、Ｘ8はＮ又はＳ（好ましくはＳ）、Ｘ9はＫ又はＴ（好ましくはＴ）、Ｘ10はＹ又はＳである（好ましくはＳ）。したがって、好ましいＶＨ  ＣＤＲ２は、配列番号：１３０（Ｖ／ＲＩＳ／ＮＹ／ＳＤＧＳＮ／ＳＫ／ＴＹ／ＳＹＡＤＳＶＫＧ）を有するか、又は含む。例えば、本実施態様の好ましいＶＨ  ＣＤＲ２配列は、配列番号：２又は１４を有するか、又は含む。配列番号：２が特に好ましい。
【０１４６】
本発明の更なる実施形態においては、ＶＨ  ＣＤＲ２は、配列番号：１３１（Ｘ1ＩＸ3ＰＸ5Ｘ6ＧＸ8Ｘ9ＮＹＡＱＫＦＱＧ）のアミノ酸を有するか、又は含む。これらの実施形態においては、Ｘ1、Ｘ3、Ｘ5、Ｘ6、Ｘ8及びＸ9は任意のアミノ酸であってもよい。好ましくは、これらＸの１つ又それ以上、好ましくは全ては、以下の群から選択される：Ｘ1はＲ又はＧであり（好ましくはＲ）、Ｘ3はＮ又はＩであり（好ましくはＮ）、Ｘ5はＮ又はＩであり（好ましくはＮ）、Ｘ6はＳ又はＦであり（好ましくはＳ）、Ｘ8はＧ又はＴであり（好ましくはＧ）、Ｘ9はＴ又はＡである（好ましくはＴ）。したがって、好ましいＶＨ  ＣＤＲ２は、配列番号：１３２（Ｒ／ＧＩＮ／ＩＰＮ／ＩＳ／ＦＧＧ／ＴＴ／ＡＮＹＡＱＫＦＱＧ）のアミノ酸配列を有するか、又は含む。例えば、本実施形態の好ましいＶＨ  ＣＤＲ２は、配列番号：８及び２０を有するか、又は含む。配列番号：２０が特に好ましい。
【０１４７】
ＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しないという本発明の抗体の能力（ＣＸＣＲ４抗体について以前には開示されていなかった能力）のため、本発明の抗体が公知の抗ＣＸＣＲ４抗体に対して異なるエピトープと結合すると考えられる（例えば、アポトーシスからＣＸＣＲ４＋細胞を保護するエピトープ、又はアポトーシスのメカニズムに関与しないか、又はアポトーシスを引き起こさないエピトープであるが、ＣＸＣＲ４に対するリガンドの結合には関与する）。
【０１４８】
したがって、ＣＸＣＲ４に対する結合について、本明細書で開示される抗体（Ｃ−９  Ｐ２１、Ｃ１Ｉ２４、Ｄ−１Ｋ２１、Ｂ−１Ｍ２２又は９Ｎ１０）のいずれかと競合し得る抗体が提供される。
【０１４９】
本明細書で用いられる場合、「競合抗体」という用語は、「関連抗体」と実質的又は基本的に同じ、又は一様に同一にエピトープについて結合する抗体を意味する。「競合抗体」には、エピトープ特異性が重複した抗体が含まれる。したがって、競合抗体は、ＣＸＣＲ４に対する結合について関連抗体と効果的に競合することができる。好ましくは、競合抗体は、関連抗体と同じエピトープと結合し得る。また、競合抗体は、好ましくは、関連抗体と同一のエピトープ特異性を有する。
【０１５０】
本明細書で用いられる場合、「関連抗体」は、ヒトＣＸＣＲ４の細胞外ドメイン内でエピトープと結合し、ＣＤＲ配列の１又はそれ以上を有するものが本明細書に定義されており、好ましくは、本明細書で定義される場合、ＶＨ及びＶＬドメインは、更に好ましくは配列番号：６９のＶＨ及び配列番号：７０のＶＬ、又は配列番号：７１のＶＨ及び配列番号：７２のＶＬ、又は配列番号：７３のＶＨ及び配列番号：７４のＶＬ、又は配列番号：７５のＶＨ及び配列番号：７６のＶＬ、又は配列番号：６９のＶＨ及び配列番号：１０３のＶＬである。最も好ましい関連抗体は、Ｃ−９Ｐ２１、Ｂ−１Ｍ２２、Ｃ−１Ｉ２４、Ｄ−１Ｋ２１及び９Ｎ１０から選択される。
【０１５１】
１種又はそれ以上の競合抗体の同定は、現在では容易な技術的事項であり、Ｃ−９Ｐ２１、Ｂ−１Ｍ２２、Ｃ−１Ｉ２４、Ｄ−１Ｋ２１及び９Ｎ１０のＩｇＧのような関連抗体が提供される。競合抗体の同定が、関連抗体との比較において特定されるように、それは、実際にはいずれか一方又は両方の抗体の結合が、競合抗体を同定するために必要な任意の方法でエピトープを実際に決定することが理解されるであろう。しかし、所望であれば、標準的方法を用いてエピトープマッピングを実施することができる。
【０１５２】
例として、エピトープの同定及び定義のための以下の方法が本明細書において言及される。ＣＸＣＲ４のアミノ酸配列は公知であり、したがって、例えば、Ｐｅｐｓｃａｎアッセイを用い、エピトープマッピングのために合成ペプチドを用いてもよい。部位特異的突然変異誘発も、エピトープマッピングにおける強力な手段であり、免疫複合体形成における、単一のアミノ酸の役割を評価するために用いることができる。タンパク質フットプリンティングは、エピトープが抗体−抗原複合体として結合する場合に切断から保護されているという事実に依存している。酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）及び血液凝集及びスロットブロッティングも、エピトープマッピングに用いることができる。抗体を用いた抗原の結晶化は、非線形エピトープをマッピングするために用いることができる。このような方法を実施するためのプロトコールは広く利用可能であり、当業者は、エピトープマッピングの適切な代わりの方法を知っているであろう。
【０１５３】
競合抗体の同定は、抗体の競合を評価し得る、種々の免疫学的スクリーニングアッセイの任意の１つを用いて容易に決定することができる。このような全てのアッセイは当該技術分野において通常であり、本明細書に更に詳細に記載される。米国特許第６，３４２，２１９号、第６，５２４，５８３号、第７，０５６，５０９号、第６，８８７，４６８号、第６，３４２，２２１号、第６，６７６，９４１号、第６，７０３，０２０号及び第６，４１６，７５８号のそれぞれは、特に、競合抗体をどのように特定するかに関する現在の教示を更にもっと補うために、参照として本明細書に組み入れられる。
【０１５４】
例えば、種々の起源動物から得られ、又は種々のアイソタイプであるとされている、試験すべき試験抗体の場合、基準及び試験抗体を混合し（又は予備吸着し）、ＣＸＣＲ４−含有組成物、好ましくはＣＸＣＲ４を発現する細胞、ＣＸＣＲ４を示すファージ、又は固定化ＣＸＣＲ４を含むバイオチップに適用する、簡易な競合アッセイを使用することができる。ＥＬＩＳＡをベースとするプロトコールは、このような簡易な競合試験において用いるのに特に適切である。
【０１５５】
特定の実施形態においては、基準抗体（例えば、Ｃ−９  Ｐ２１、Ｃ１Ｉ２４、Ｄ１Ｋ２１、Ｂ−１Ｍ２２又は９Ｎ１０）を、種々の量の試験抗体（例えば、１：１０、１：１００又は１：１０００）と、抗原組成物に適用する前に、一定期間予め混合する。他の実施形態においては、基準抗体及び種々の量の試験抗体を、抗原組成物にさらしている間に簡単に混合することができる。いずれの事象においても、種又はアイソタイプ二次抗体を用いることにより、基準抗体の結合のみを検出することができ、その結合は、結合のために「競合する」試験抗体の存在により減少するであろう。
【０１５６】
基準抗体と任意の試験抗体（種又はアイソタイプに関係なく）との間の抗体競合試験の実施において、最初に基準抗体（例えば、Ｃ−９  Ｐ２１、Ｃ１Ｉ２４、Ｄ１Ｋ２１、Ｂ−１Ｍ２２又は９Ｎ１０）を、例えば、次の同定に検出可能な、ビオチン、又は酵素若しくは放射性標識のような検出可能な標識で標識する。このケースにおいては、標識された基準抗体を、種々の比（例えば、１：１０、１：１００又は１：１０００）で試験抗体と予備混合又はインキュベートして試験を行い、次いで、標識された基準抗体の反応性をアッセイし、これを、潜在的に競合しない試験抗体をインキュベーション中でインキュベートする対照の値と比較する。
【０１５７】
アッセイは、抗体結合をベースとする、さまざまな範囲の免疫学的アッセイの任意の１つであってもよく、ビオチニル化抗体の場合にはストレプトアビジンを用い、又は酵素標識と関連する発色物質を用い（ペルオキシダーゼ酵素と共に３，３’、５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質等）、又は放射性標識を容易に検出することにより、基準抗体を、それらの標識を検出することにより検出する。ＣＸＣＲ４について基準抗体と競合する抗体は、結合標識において証明されるように、ＣＸＣＲ４との基準抗体の結合を効果的又は有意に減少することができるであろう。
【０１５８】
完全に不適切な抗体の存在下に、（標識された）基準抗体の反応性は高い値で制御されるだろう。制御された低い値は、競合が生じ、標識抗体の結合が減少する場合に、標識された基準抗体（例えば、Ｃ−９  Ｐ２１、Ｃ１Ｉ２４、Ｄ１Ｋ２１、Ｂ−１Ｍ２２又は９Ｎ１０）を、正確に同じタイプの未標識抗体とインキュベートすることにより得られる。  試験アッセイにおいて、試験抗体の存在下における、標識抗体の反応性における有意な減少は、ＣＸＣＲ４に対する結合についての標識抗体と「競合する」試験抗体を示す。
【０１５９】
有意な減少は、結合の減少において、「再現可能」、すなわち常に観察される。本発明に関し、「有意な減少」は、約１：１０〜約１：１００の任意の比において、少なくとも約２０％、更に好ましくは少なくとも約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０又は６５％、更に好ましくは約７０％、約７５％、又は約８０％の再現可能な減少（ＥＬＩＳＡ又は他の適切なアッセイにおいてＣＸＣＲ４に対する基準抗体の結合において）として定義される。更にストリンジェントな競合活性を有する抗体は、少なくとも約８２％、約８５％、約８８％、約９０％、約９２％又は約９５％ほどの再現可能な減少（ＥＬＩＳＡ又は他の適切なアッセイにおいてＣＸＣＲ４に対する基準抗体の結合において）を示すであろう。本発明を実施するために、必ずしも必要でないが、約９９％、約９８％、約９７％、又は約９６％ほどのＣＸＣＲ４に対する基準抗体の結合における再現可能な減少を示すような、完全又は完全に近い競合は、確実に除外するものではない。
【０１６０】
上記に記載した方法は、適切な競合アッセイの唯一の例である。当業者は、適切な方法及び変形を知っているであろう。他の競合アッセイを後述する。
【０１６１】
フローサイトメトリーを用いて、他の競合アッセイを実施する前に、ある量の試験抗体を、例えばビオチニル化により標識すべきである。ビオチニル化生成物の機能性（細胞結合特性の保持）、及びＣＸＣＲ４＋細胞の固定数に対する最大に近い結合を与える、本発明のビオチニル化抗体（Ａｂ１）の最小濃度を決定する。対数増殖培養物から集めた、１０6細胞の全てを、適切な温度で適切な時間、例えば、４℃で１時間、種々の濃度の抗体とインキュベートする。細胞を洗浄し、適切な温度で適切な時間、例えば、４℃で更に１時間、適切な検出抗体とインキュベートする。洗浄後、細胞をフローサイトメトリーにより分析する。各試験抗体について、抗体濃度に対する蛍光強度の平均値（ＭＦＩ）をプロットすることにより、データから飽和曲線を作成する。
【０１６２】
他の競合アッセイについては、ＣＸＣＲ４＋細胞を上述のようにして調製し、固定濃度の標識（ビオチニル化）抗体（ｂｉｏ−Ａｂ１）及び高濃度の非標識競合抗体の混合物を二連で処理し得る。固定濃度は、上記で決定した、固定数の腫瘍細胞に対する妥当な蛍光シグナルを生成する抗体の最小濃度である。理想的には、ｎＭで表わされる、この固定濃度は、平衡状態（ＫD）で試験抗体の親和性よりも低いべきである。このケースにおいては、記載した方法は、競合抗体の効果の評価に用いることができる（Ｓｃｈｏｄｉｎ及びＫｒａｎｚ，１９９３，Ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉ−Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６８：２５７２２−７）。抗体混合物を、適切な温度で適切な時間、例えば、４℃で１時間、標的細胞とインキュベートする。細胞を洗浄し、ビオチニル化抗体の細胞結合を、ＦＩＴＣ−標識ストレプトアビジンとのインキュベーションにより表す。各試験試料（ｂｉｏ−Ａｂ１＋Ａｂ２）についての平均の蛍光読み取りからバックグラウンドの蛍光（ＰＢＳ−５％  ＦＣＳ）を引いた後、阻害の割合を、以下の式に従い、各Ａｂ２濃度「ｃ」について計算する：
阻害％＝（１−ＭＦＩbio-Ab1+Ab2「c」／ＭＦＩbio-Ab1）×１００
が計算される。
【０１６３】
ＣＸＣＲ４と結合することができ、本明細書に開示される任意の抗体と競合し得る任意の抗体が予期されるが、好ましい抗体を以下に示す。したがって、好ましい一部の実施形態においては、以下のものが提供される。
【０１６４】
ヒトＣＸＣＲ４の細胞外ドメイン内のエピトープと結合し、好ましくはＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない特性を有し、前記抗体は
（ａ）３つのＣＤＲｓを含む少なくとも１つの重鎖可変領域と、３つのＣＤＲｓを含む少なくとも１つの軽鎖可変領域とを含み、
前記軽鎖可変領域が、
（ｉ）配列番号：４のアミノ酸配列を有する可変軽（ＶＬ）ＣＤＲ１；
（ｉｉ）配列番号：５のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２；及び／又は
（ｉｉｉ）配列番号：６のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３を含み：及び／又は
前記重鎖可変領域が、
（ｉｖ）配列番号：１のアミノ酸配列を有する可変重（ＶＨ）ＣＤＲ１；
（ｖ）配列番号：２のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２；及び／又は
（ｖｉ）配列番号：３のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３；を含み、
又は（ｂ）前記抗体はＣＸＣＲ４と結合する抗体（ａ）と競合し得る抗体である。
【０１６５】
ヒトＣＸＣＲ４の細胞外ドメイン内のエピトープと結合し、好ましくはＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない特性を有し、前記抗体は
（ａ）３つのＣＤＲｓを含む少なくとも１つの重鎖可変領域と、３つのＣＤＲｓを含む少なくとも１つの軽鎖可変領域とを含み、
前記軽鎖可変領域が、
（ｉ）配列番号：１０のアミノ酸配列を有する可変軽（ＶＬ）ＣＤＲ１；
（ｉｉ）配列番号：１１のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２；及び／又は
（ｉｉｉ）配列番号：１２のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３を含み：及び／又は
前記重鎖可変領域が、
（ｉｖ）配列番号：７のアミノ酸配列を有する可変重（ＶＨ）ＣＤＲ１；
（ｖ）配列番号：８のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２；及び／又は
（ｖｉ）配列番号：９のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３；を含み、
又は（ｂ）前記抗体はＣＸＣＲ４と結合する抗体（ａ）と競合し得る抗体である。
【０１６６】
ヒトＣＸＣＲ４の細胞外ドメイン内のエピトープと結合し、好ましくはＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない特性を有し、前記抗体は
（ａ）３つのＣＤＲｓを含む少なくとも１つの重鎖可変領域と、３つのＣＤＲｓを含む少なくとも１つの軽鎖可変領域とを含み、
前記軽鎖可変領域が、
（ｉ）配列番号：１６のアミノ酸配列を有する可変軽（ＶＬ）ＣＤＲ１；
（ｉｉ）配列番号：１７のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２；及び／又は
（ｉｉｉ）配列番号：１８のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３を含み：及び／又は  前記重鎖可変領域が、
（ｉｖ）配列番号：１３のアミノ酸配列を有する可変重（ＶＨ）ＣＤＲ１；
（ｖ）配列番号：１４のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２；及び／又は
（ｖｉ）配列番号：１５のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３；を含み、
又は（ｂ）前記抗体はＣＸＣＲ４と結合する抗体（ａ）と競合し得る抗体である。
【０１６７】
ヒトＣＸＣＲ４の細胞外ドメイン内のエピトープと結合し、好ましくはＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない特性を有し、前記抗体は
（ａ）３つのＣＤＲｓを含む少なくとも１つの重鎖可変領域と、３つのＣＤＲｓを含む少なくとも１つの軽鎖可変領域とを含み、
前記軽鎖可変領域が、
（ｉ）配列番号：２２のアミノ酸配列を有する可変軽（ＶＬ）ＣＤＲ１；
（ｉｉ）配列番号：２３のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２；及び／又は
（ｉｉｉ）配列番号：２４のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３を含み：及び／又は
前記重鎖可変領域が、
（ｉｖ）配列番号：１９のアミノ酸配列を有する可変重（ＶＨ）ＣＤＲ１；
（ｖ）配列番号：２０のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２；及び／又は
（ｖｉ）配列番号：２１のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３；を含み、
又は（ｂ）前記抗体はＣＸＣＲ４と結合する抗体（ａ）と競合し得る抗体である。
【０１６８】
ヒトＣＸＣＲ４の細胞外ドメイン内のエピトープと結合し、好ましくはＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない特性を有し、前記抗体は
（ａ）３つのＣＤＲｓを含む少なくとも１つの重鎖可変領域と、３つのＣＤＲｓを含む少なくとも１つの軽鎖可変領域とを含み、
前記軽鎖可変領域が、
（ｉ）配列番号：８８のアミノ酸配列を有する可変軽（ＶＬ）ＣＤＲ１；
（ｉｉ）配列番号：８９のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２；及び／又は
（ｉｉｉ）配列番号：９０のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３を含み：及び／又は
前記重鎖可変領域が、
（ｉｖ）配列番号：１のアミノ酸配列を有する可変重（ＶＨ）ＣＤＲ１；
（ｖ）配列番号：２のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２；及び／又は
（ｖｉ）配列番号：３のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３；を含み、
又は（ｂ）前記抗体はＣＸＣＲ４と結合する抗体（ａ）と競合し得る抗体である。
【０１６９】
一実施形態においては、前記抗体は、
（ａ）配列番号：６９のＶＨドメイン及び配列番号：７０のＶＬドメインを有するか；又は
（ｂ）ＣＸＣＲ４と結合する抗体（ａ）と競合し得る抗体である。
【０１７０】
一実施形態においては、前記抗体は、
（ａ）配列番号：７１のＶＨドメイン及び配列番号：７２のＶＬドメインを有するか；又は
（ｂ）ＣＸＣＲ４と結合する抗体（ａ）と競合し得る抗体である。
【０１７１】
一実施形態においては、前記抗体は、
（ａ）配列番号：７３のＶＨドメイン及び配列番号：７４のＶＬドメインを有するか；又は
（ｂ）ＣＸＣＲ４と結合する抗体（ａ）と競合し得る抗体である。
【０１７２】
一実施形態においては、前記抗体は、
（ａ）配列番号：７５のＶＨドメイン及び配列番号：７６のＶＬドメインを有するか；又は
（ｂ）ＣＸＣＲ４と結合する抗体（ａ）と競合し得る抗体である。
【０１７３】
一実施形態においては、前記抗体は、
（ａ）配列番号：６９のＶＨドメイン及び配列番号：１０３のＶＬドメインを有するか；又は
（ｂ）ＣＸＣＲ４と結合する抗体（ａ）と競合し得る抗体である。
【０１７４】
好ましくは、抗体（ｂ）は、本明細書で開示されたＣＤＲ配列の１又はそれ以上、ＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインを有する。
【０１７５】
好ましくは、抗体（ｂ）は抗体（ａ）と同じエピトープと結合し得る。
【０１７６】
実質的に相同的な配列の特定の例は、開示されたアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する配列である。特定の実施形態においては、ＣＸＣＲ４と結合し、ＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない特性を有する本発明の抗体は、配列番号：７０、７２、７４、７６又は１０３のアミノ酸配列に対し、少なくとも約７５％、更に好ましくは少なくとも約８０％、更に好ましくは少なくとも約８５％、更に好ましくは少なくとも約９０％又は９５％、最も好ましくは約９７％、９８％又は９９％のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列領域を含む少なくとも１つの軽鎖可変領域、及び／又は配列番号：６９、７１、７３、又は７５のアミノ酸配列に対し、少なくとも約７５％、更に好ましくは少なくとも約８０％、更に好ましくは少なくとも約８５％、更に好ましくは少なくとも約９０％又は９５％、最も好ましくは約９７％、又は９８％又は９９％のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列領域を含む少なくとも１つの重鎖可変領域を含む。
【０１７７】
実質的に相同的な配列の他の好ましい例は、開示されたアミノ酸の保存的アミノ酸置換を含む配列である。
【０１７８】
実質的に相同的な配列の他の好ましい例は、開示された１又はそれ以上のＣＤＲ領域において１、２、３又は４個、好ましくは１又は２個の変更したアミノ酸を含む配列である。このような変更は保存的又は非保存的アミノ酸置換であるか、又はそれらの混合である。
【０１７９】
このような全ての実施形態においては、好ましい変更は保存的アミノ酸置換である。
【０１８０】
全ての実施形態においては、実質的に相同的な配列を含む抗体は、ＣＸＣＲ４との結合能力を保持しており、好ましくは、本明細書に開示した他の特性の１又はそれ以上、例えば、ＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない特性、及び／又は拮抗的特性を保持している。
【０１８１】
本発明の他の実施形態は、ＣＸＣＲ４と結合し、好ましくは本明細書に開示された他の特性の１又はそれ以上、例えば、ＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない特性、及び／又は拮抗的特性を有し、本発明の抗体、本発明のＶＨ若しくはＶＬドメイン、又は本発明のＣＤＲｓの１又はそれ以上を含む結合タンパク質を提供する。好ましい実施形態においては、このような結合タンパク質は抗体である。
【０１８２】
本発明の好ましい抗体は、３つのＣＤＲｓを含む少なくとも１つの重鎖可変領域と、３つのＣＤＲｓを含む少なくとも１つの軽鎖可変領域とを含む。これらのＣＤＲｓの例及び好ましい配列を本明細書に開示する。
【０１８３】
本明細書で用いられる場合、「ＣＸＣＲ４」という簡易な用語は、特に示さないか、科学用語から明瞭でない場合、ＣＸＣケモカイン受容体４（フュージン、ＨＭ８９、ＬＥＳＴＲ、ＨＵＭＳＴＲとも呼ばれる）を意味する。
【０１８４】
ＣＸＣＲ４は遊離のＣＸＣＲ４、例えば組み換え型又は精製型ＣＸＣＲ４であってもよいが、好ましくは天然型、例えば細胞表面に存在する。
【０１８５】
本発明の抗体又は結合タンパク質はＣＸＣＲ４の断片、特にＣＸＣＲ４の細胞外ドメインの全て又は一部を含むか、それらからなる断片にも結合することができ、又はＣＸＣＲ４又はＣＸＣＲ４の断片を含む要素に結合することができる。実際、本発明の抗体のエピトープは、ＣＸＣＲ４の細胞外ドメインに位置する。
【０１８６】
「ＣＸＣＲ４」は、任意の形態のＣＸＣＲ４をも意味し、特にＣＸＣＲ４は哺乳動物種を超えて保存されている。したがって、本発明の抗体又は抗体断片は、例えばヒト、サル（例えば、カニクイザル又はアカゲザル／赤毛猿）、マウス（ネズミ科の動物）、乳牛（ウシ亜科の動物）、ラット、ハムスター、フェレット、モルモット及び／又はウサギのＣＸＣＲ４と結合し得る。好ましくは、本発明の抗体又は抗体断片は、少なくともヒトのＣＸＣＲ４と結合する。したがって、特に示さない限り、本明細書における「ＣＸＣＲ４」に対するあらゆる言及は、「ヒトＣＸＣＲ４」を意味するものと読むことができる。好ましい特定の実施形態においては、本発明の抗体又は抗体断片は、少なくともヒト及びサル（例えば、カニクイザル又はアカゲザル／赤毛猿）のＣＸＣＲ４と結合する。他の好ましい実施形態においては、本発明の抗体又は抗体断片は、少なくともヒト及びマウスのＣＸＣＲ４と結合する。他の好ましい実施形態においては、本発明の抗体又は抗体断片は、ヒト、サル及びマウスのＣＸＣＲ４と結合する。
【０１８７】
本明細書で用いられる場合、本明細書の抗体又は抗体断片との関連で、「ＣＸＣＲ４と結合する」又は「抗ＣＸＣＲ４」という用語は、以下の１又はそれ以上；好ましくは、以下の１以上；最も好ましくは以下の全てであり得る抗体又は抗体断片を意味する；
（ａ）例えば、フローサイトメトリー又は免疫組織科学により評価し、細胞、例えば、ＣＸＣＲ４又はＣＸＣＲ４を自然に発現する細胞でトランスフェクションした細胞の表面で発現するＣＸＣＲ４と結合し；
（ｂ）例えば、非還元条件下でウェスタンブロットにおいてＣＸＣＲ４との結合により評価し、構造的に依存して（例えば、非線形）ＣＸＣＲ４エピトープと結合し；
（ｃ）少なくともヒトのＣＸＣＲ４と、更に好ましくはヒト及びサルのＣＸＣＲ４、又はヒト及びマウスのＣＸＣＲ４と、最も好ましくはヒト、サル及びマウスのＣＸＣＲ４と結合し；
（ｄ）本明細書の他の箇所でも議論したように、ヒト及びサルのＣＸＣＲ４と、又はヒト及びマウスのＣＸＣＲ４と同様の親和性で、例えば１０ｎＭ以下、好ましくは５ｎＭ以下、更に好ましくは３ｎＭ以下又は２ｎＭ以下、例えば１ｎＭ以下のＫｄで結合する。
【０１８８】
本明細書で用いられる場合、本明細書の抗体又は抗体断片は、以下の１又はそれ以上；以下の１以上、最も好ましくは以下の機能的特性の全てであり得る。
（ｅ）ＣＸＣＲ４発現細胞の重大なアポトーシスを誘発しない；
（ｆ）ＣＸＣＲ４のその１又はそれ以上のリガンドへの結合を遮断又は阻害し、例えば、ＣＸＣＲ４の少なくともＳＤＦ−１又はＣＸＣＲ４についての他のリガンド、例えば、化合物ＡＭＤ−３１００への結合を遮断又は阻害し、好ましくはＣＸＣＲ４のＳＤＦ−１及びＡＭＤ−３１００の少なくとも両方への結合を阻害し；
（ｇ）ＣＸＣＲ４受容体からの下流シグナル事象を遮断又は阻害し、例えば、ＳＤＦ−１のようなＣＸＣＲ４リガンドへのＣＸＣＲ４が介在する細胞応答を阻害例えば、好ましくはＳＤＦ−１のようなＣＸＣＲ４−１に対する応答においてカルシウムイオンの放出を阻害し、又はＣＸＣＲ＋４細胞の移動を誘発するリガンド（例えば、ＳＤＦ−１）を遮断又は阻害する。
（ｈ）本明細書の他の箇所に開示されているように、ＣＸＣＲ４＋細胞のＡＤＣＣを誘発し；
（ｉ）インビボにおいて抗腫瘍効果を誘発し；
（ｊ）腫瘍を有する動物に投与することにより腫瘍を局部にとどめ；
（ｋ）ＣＸＣＲ４＋細胞のＣＤＣを誘発し；
（ｌ）インビトロ又はインビボにおいて、抗ウィルス効果、特に抗ＨＩＶ効果を誘発し；
（ｍ）ＣＸＣＲ4受容体についてアゴニスト活性を阻害しない。
【０１８９】
ＣＸＣＲ４＋細胞の結合に関し、本発明の抗体はＣＸＣＲ４＋細胞と結合し、ＣＸＣＲ４-細胞と有意に結合しないことを理解すべきである（実施例２において示すように）。
【０１９０】
「ＣＸＣＲ４-細胞と有意に結合しない」という用語は、ＣＸＣＲ４-細胞との抗体のあらゆる結合が治療又は診断目的のために前記抗体の使用を妨げないことであると理解すべきである。したがって、ＣＸＣＲ４-との「有意でない」結合は、抗体のＣＸＣＲ４-細胞との結合が、１種又はそれ以上のＣＸＣＲ４+細胞との結合よりも有意に弱いことを含むか、バックグラウンドレベルである、例えば、陰性対照実験において観察されるレベルに匹敵するかそれから有意に異なると考えることができる。
【０１９１】
治療又は診断目的のために、主な検討事項は、抗体が、治療又は診断適用の際に接触し得る抗体と任意のＣＸＣＲ４-細胞よりも、１種又はそれ以上のタイプのＣＸＣＲ４+細胞と強く結合しなければならないことである。
【０１９２】
本発明の抗体は、「ＣＸＣＲ４−特異的」として言及される場合がある。「ＣＸＣＲ４−特異的」という用語は、抗体のＣＸＣＲ４発現細胞との結合が、治療又は診断目的のために前記抗体の使用を可能にするのに十分に特異的であると解釈すべきである。本明細書に開示されるＣＸＣＲ４−特異的抗体は、ＣＸＣＲ４（例えば、細胞表面上の）と結合する能力を有するが、非−ＣＸＣＲ４タンパク質とは有意に結合しない（例えば、ＣＸＣＲ４−細胞とは有意に結合しない）。当業者は、標的ＣＸＣＲ４+細胞（例えば、トランスフェクトされ、ＣＸＣＲ４を発現する細胞、又は自然にＣＸＣＲ４を発現する細胞、例えば、Ｒａｍｏｓ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞、Ｒａｊｉ細胞）との結合強度を、１種又はそれ以上のＣＸＣＲ４-細胞、例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞又はＤＴ４０細胞のようなＣＸＣＲ４で形質転換していない野生型細胞との結合強度と比較することにより、任意の所定の抗体がＣＸＣＲ４−特異的であることを容易に決定することができる。
【０１９３】
ＣＸＣＲ４が、それを発現する細胞タイプに依存し、いくらか異なる構造を生じる傾向にあることが先行技術に開示されている。したがって、本発明の抗体は、それらが、ＣＸＣＲ４でトランスフェクションされるか、自然にＣＸＣＲ４を発現する１種又はそれ以上の細胞型と結合し得る場合、細胞表面上のＣＸＣＲ４と結合する能力を有すると考えられる。好ましい抗体は複数の細胞型上のＣＸＣＲ４と結合する能力を有し、それ故、ＣＸＣＲ４の複数の構造と結合する能力を有する、例えば、本明細書に開示されるＣ−９Ｐ２１、９Ｎ１０及びＣ−１Ｉ２４抗体はこのような能力を示す。
【０１９４】
当業者は、例えば、フローサイトメトリー及び適切なアッセイを用いてＣＸＣＲ４-細胞と比較したＣＸＣＲ４+細胞との結合が、実施例２及び３に開示されていることに気付くであろう。
【０１９５】
当該技術分野において周知の免疫組織化学的方法は、抗体の細胞又は試料との結合を採点することを用い得る。このようなアッセイは、特定の抗体の特異性を試験するため、又は組織試料中のＣＸＣＲ４発現を検出するに用いることができ、手短に言えば、抗体は、例えば、陽性対照（ＣＸＣＲ４−陽性として知られる細胞）及び陰性対照（ＣＸＣＲ４−陰性として知られる細胞）を含むヒト組織の高密度アレイ上で試験することができる。膜形成性染色の強度は、４段階スケール（０、１、２、３）における目視検査によって評価し得る。好ましい抗体は、ＣＸＣＲ４＋組織について、弱いか又は強い（すなわち、０を超えるスコア）、好ましくは強い免疫組織学的スコアを示す。
【０１９６】
前記で議論したように、本発明の抗体は、ＣＸＣＲ４＋細胞（ＣＸＣＲ４発現細胞）の重大なアポトーシスを誘発しない特性を有する。「ＣＸＣＲ４＋細胞の重大なアポトーシスを誘発しない」という用語は、抗体の存在下に誘発されるアポトーシスのレベルが、抗体の非存在下、例えば、陰性対照条件又はバックグラウンドレベル、例えば、培地のみの存在下に誘発されるアポトーシスのレベルに匹敵するか、又は有意に異ならないことを意味する。したがって、好ましくは、本発明の抗体は、天然、バックグラウンド、又はアポトーシスの対照レベルを超えて、アポトーシスの測定可能又は有意な増加を誘発しない。これは、抗体の非存在下に観察されるアポトーシスと比較し、重大な測定可能かつ重大なアポトーシスを誘発する、ＷＯ２００８／０６０３６７（例えば図７）に開示されたＭｅｄａｒｅｘ抗体のような先行技術の抗体とは異なっている（本明細書の実施例１０も参照されたい）。好ましくは、本発明の抗体は、≧０．４μｇ／ｍＬの濃度、例えば、以下に示す濃度、又は少なくとも０．４μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、３μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、６μｇ／ｍＬ、７μｇ／ｍＬ、８μｇ／ｍＬ、９μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、１１μｇ／ｍＬ、１２μｇ／ｍＬ、１５μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、３０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、７５μｇ／ｍＬ及び１００μｇ／ｍＬで、重大なアポトーシスを誘発しない（好ましくはＩｇＧ、例えばＩｇＧ１形態）。更に好ましくは、本発明の抗体は、インビトロにおいてＣＸＣＲ４＋Ｒａｍｏｓ細胞において評価した場合に、重大なアポトーシスを誘発しない（例えば、実施例１０に開示するようなアッセイを用いて評価した場合）。好ましくは、本発明の抗体は、≧０．１４μｇ／１×１０5細胞の濃度、例えば、以下に示す濃度、又は少なくとも０．１４μｇ／１×１０5細胞、０．２５μｇ／１×１０5細胞、０．５μｇ／１×１０5細胞、１μｇ／１×１０5細胞、２μｇ／１×１０5細胞、３μｇ／１×１０5細胞、３．５μｇ／１×１０5細胞、４μｇ／１×１０5細胞、５μｇ／１×１０5細胞、１０μｇ／１×１０5細胞、１５μｇ／１×１０5細胞、２０μｇ／１×１０5細胞、２５μｇ／１×１０5細胞、３０μｇ／１×１０5細胞及び３５μｇ／１×１０5細胞を用いた場合に、重大なアポトーシスを誘発しない。更に好ましい細胞はＲＡＭＯＳ細胞である。好ましくは、本発明の抗体は、治療に有用な濃度（例えば、≧０．４μｇ／ｍＬの濃度、例えば、以下に示す濃度、又は少なくとも０．４μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、３μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、６μｇ／ｍＬ、７μｇ／ｍＬ、８μｇ／ｍＬ、９μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、１１μｇ／ｍＬ、１２μｇ／ｍＬ、１５μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、３０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、７５μｇ／ｍＬ及び１００μｇ／ｍＬ）で用いた場合に重大なアポトーシスを誘発しない（好ましくはＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１形態、好ましくは抗体濃度は血清中の抗体濃度である）。例として、ＣＸＣＲ４＋細胞の重大なアポトーシスを誘発しない抗体は、アネキシンＶ結合に対して陽性であるとしてアポトーシス細胞を定義するアッセイにおいて抗体とインキュベーションすることにより、１０％以上の細胞がアポトーシスを引き起こさない抗体である。好ましいアッセイは実施例１０に記載され、Ｒａｍｏｓ細胞と、１０μｇ／ｍＬ以下の濃度のＩｇＧ１抗体を必要とする。また、ＣＸＣＲ４＋細胞の重大なアポトーシスを誘発しない抗体は、バックグラウンド又は対照レベル以上のアポトーシスにおける増加が、アネキシンＶ結合に対して陽性であるとしてアポトーシス細胞を定義するアッセイにおいて、前記バックグラウンド及び対照レベルにわたり最大の５０％の増加である抗体である。好ましいアッセイを実施例１０に開示し、Ｒａｍｏｓ細胞及び１０μｇ／ｍＬ以下の濃度のＩｇＧ１抗体の使用を必要とする。
【０１９７】
アポトーシスの誘発は、周知の標準法、例えば、アネキシンＶ染色を分析する方法を用いてアッセイすることができる（アネキシン染色を必要とする例示的方法について、実施例１０を参照されたい）。簡単に言えば、細胞（例えば、Ｒａｍｏｓ細胞）を抗体（例えば、ＩｇＧ１形式の抗体）と、適切な時間、例えば２４又は４８時間インキュベートし、細胞収集及びアネキシンＶ染色後に、効果をＦＡＣＳ分析（例えば、ＥａｓｙＣｙｔｅを用いて）により測定することができる。アネキシンＶ染色は、アポトーシス細胞を示すが、死細胞は、例えばＰＩ染色により同定される（また、アポトーシス細胞から区別される）。
【０１９８】
抗体Ｃ−９Ｐ２１、Ｂ−１Ｍ２２、Ｃ−１Ｉ２４、Ｄ−１Ｋ２１及び９Ｎ１０は、特に、ＳＤＦ−１のようなＣＸＣＲ４リガンドに対する応答におけるカルシウムイオンの放出を阻害することにより、ＣＸＣＲ４によるリガンド誘発シグナル伝達を阻害し、例えば、ＳＤＦ−１のようなＣＸＣＲ４リガンドに対するＣＸＣＲ４介在性細胞応答を阻害し得ることがわかった（実施例６を参照されたい）。したがって、本発明の抗体は、好ましくは、特に、ＳＤＦ−１のようなＣＸＣＲ４リガンドに対する応答におけるカルシウムイオンの放出を阻害することにより、ＳＤＦ−１のようなＣＸＣＲ４リガンドに対するＣＸＣＲ４介在性細胞応答を阻害し得る。特に、前記抗体は、好ましくは、ＳＤＦ−１が誘発するカルシウム流を阻害し得る。適切なアッセイ法は公知であり、１つのアッセイを実施例６に開示する。
【０１９９】
ＣＸＣＲ４からの下流シグナル伝達事象は、ＣＸＣＲ４によるリガンド誘発シグナル伝達、ＣＸＣＲ４リガンドに対するＣＸＣＲ４介在性細胞応答、カルシウムイオンの放出、リガンド誘発性遊走等のような、本明細書に開示された、種々のＣＸＣＲ４介在事象の「遮断」又は「阻害」は、問題となっている性質が抗体の非存在下に比べ、本発明の抗体の存在下に、測定可能又は有意に減少することを意味する。例えば、前記性質は、抗体の非存在下における結合に比べ、抗体の存在下に、少なくとも１０、２０、３０又は４０％、更に好ましくは、少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０又は７５％、より好ましくは少なくとも８０％減少し得る。少なくとも８５、９０又は９５％の減少は、特定の性質については期待される。
【０２００】
少なくとも２０％又は３０％阻害におけるカルシウムイオンの放出（カルシウム流）の遮断又は阻害のケースにおいては、本発明の抗体について、少なくとも７０％、７５％、８０％、又は９５％以下の阻害まで上昇するのがしばしば示される（実施例６を参照されたい）。このような阻害を達成するために用いられる抗体の典型的な濃度は４μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ又は１００μｇ／ｍＬである。本発明の特定の実施形態においては、インビトロにおいて、ＣＸＣＲ４＋細胞、例えばＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞からのカルシウムイオンの放出を５０％阻害まで上昇させることのできる抗体濃度（ＩＣ50）は、好ましくは５０ｎＭ未満、４０ｎＭ、３５ｎＭ又は３０ｎＭ（又は３０〜５０の任意の整数）、２５ｎＭ、２０ｎＭ、１５ｎＭ、１０ｎＭ、７ｎＭ又は５ｎＭ（又は５〜３０の任意の整数）である。例えば、本発明のＣ−９Ｐ２１抗体は、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞について２９ｎＭのＩＣ50を有することがわかっている。９Ｎ１０抗体は、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞について３．８５ｎＭのＩＣ50を有することがわかっている。
【０２０１】
ある実施態様においては、抗体は、ＳＤＦ−１のようなＣＸＣＲ４のリガンドに対して、ＣＸＣＲ４＋細胞の遊走又は走化性を遮断又は阻害し得る（実施例７を参照されたい）。遊走又は走化性の阻害は、標準法を用い、例えばトランスウェルアッセイを用いてアッセイすることができる。すなわち、走化性を可能にし、ＣＸＣＲ４を発現する細胞を、１つのチャンバー内で抗体と接触させ、適切なポアサイズを有するフィルターの膜により、ＳＤＦ−１のようなＣＸＣＲ４のリガンドを第一のチャンバーから分離して他のチャンバー内に置く。リガンドに向かう細胞の移動（走化性）における抗体の効果は、抗体の非存在下における走化性に対する、抗体の存在における走化性を比較することにより測定される。適切なアッセイを実施例７に開示する。少なくとも５０％、また１００％以下の遊走の阻害が、抗体の濃度に依存して示される。
【０２０２】
本発明の特定の実施形態においては、インビトロにおいて、ＣＸＣＲ４＋細胞、例えば、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞の細胞遊走の阻害を５０％まで上昇させ得る抗体濃度（ＩＣ50）は、好ましくは２０μｇ／ｍＬ未満、１５μｇ／ｍＬ（又は１５〜２０の任意の整数）、１０μｇ／ｍＬ（又は１０〜１５の任意の整数）、５μｇ／ｍＬ（又は５〜１０の任意の整数）、４μｇ／ｍＬ、３μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ又は１μｇ／ｍＬである。例えば、本発明のＣ−９Ｐ２１抗体は、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞について、２．９μｇ／ｍＬのＩＣ50を有することがわかった。本発明の特定の実施形態においては、インビトロにおいて、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、１５μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ又は３０μｇ／ｍＬ（又は６〜３０μｇ／ｍＬの間の任意の整数）で１００％阻害し得る。
【０２０３】
好ましくは、本発明の抗体（例えば、Ｃ−９Ｐ２１、Ｃ−１Ｉ２４、Ｄ−１Ｋ２１、Ｂ−１Ｍ２２、及び９Ｎ１０）は、ＣＸＣＲ４の１又はそれ以上のリガンドへの結合を阻害し得る。好ましくは少なくともＳＤＦ−１の結合が阻害される。更に好ましくは、ＳＤＦ−１及びＡＭＤ−３１００への結合が阻害される。例えば、抗体Ｃ−９Ｐ２１、Ｃ−１Ｉ２４、９Ｎ１０及びＤ−１Ｋ２１は、そのリガンドＳＤＦ−１へのＣＸＣＲ４の結合を阻害し得ることがわかった（実施例３）。抗体Ｃ−９Ｐ２１、Ｃ−１Ｉ２４及びＤ−１Ｋ２１は、ＣＸＣＲ４の、ＣＸＣＲ４のＡＭＤ−３１００への結合を阻害し得ることがわかった（実施例３）。カルシウム流における、それらの効果を考えると、Ｂ−１Ｍ２２がＣＸＣＲ４への結合についてリガンドとも競合することが予想される。
【０２０４】
リガンドのＣＸＣＲ４との「結合の遮断」又は「結合の阻害」は抗体の非存在下に対し、抗体の存在下に、リガンドのＣＸＣＲ４との結合が、測定可能に、又は有意に減少すること、例えば、少なくとも１０、２０、３０又は４０％、更に好ましくは少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０又は７５％、より好ましくは少なくとも８０％減少することを意味する。リガンドのＣＸＣＲ４との結合が少なくとも８５、９０又は９５％減少する実施態様も検討される。また、リガンドが最初にＣＸＣＲ４と接触し、次いで抗体を加える場合、リガンドは、ＣＸＣＲ４に対する抗体の結合を阻害し得る。
【０２０５】
抗体が、リガンドのＣＸＣＲ４との結合を阻害し得るかどうかを測定するためのアッセイは周知であり、当業者には直ちに明らかである。適切なアッセイを実施例３に開示する。手短に言えば、ＣＸＣＲ４＋細胞をＳＤＦ−１（又は必要に応じてＡＭＤ−３１００）と、又はＳＤＦ−１（又は必要に応じてＡＭＤ−３１００）なしでインキュベートし、抗体を加え、次いで、標識抗ヒト抗体で抗体を検出した。リガンドのＣＸＣＲ４との結合を阻害する能力を有する抗体について、ＳＤＦ−１（又は必要に応じてＡＭＤ−３１００）の存在下におけるプレインキュベーションは、ＣＸＣＲ４との抗体の結合の減少をもたらす。特に、自然にＣＸＣＲ４を発現するＲａｍｏｓ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞又はＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞との抗体の結合、及びＳＤＦ−１又はＡＭＤ−３１００を用いたプレインキュベーションが阻害される。また、試験される抗体を、リガンドとして、同時に細胞に加えることができ又は抗体を最初に加えることができる。
【０２０６】
抗体が、リガンドのＣＸＣＲ４との結合を遮断し得るかどうかを測定するための他のアッセイには、標識リガンド、例えば、放射性標識リガンドの使用が含まれる。
【０２０７】
本発明の抗体の主なメカニズムではないが、本発明の抗体は、好ましくは、ＣＸＣＲ４＋細胞の抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を誘発する能力を有している。ＡＤＣＣは、当該技術分野において周知の方法を用いてインビトロでアッセイすることができる。ＰＢＭＣｓの存在下にＡＤＣＣ溶解を評価するためにＣＸＣＲ４＋細胞、例えば、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞が蛍光標識で標識される、適切な方法を実施例８に開示する。また、例えば、Ｃｒ５１放出アッセイを用いてもよい。したがって本発明の抗体は、例えば、例えば、ヒトＰＢＭＣｓの存在下に、インビトロにおいて、ＣＸＣＲ４＋細胞の少なくとも１０％、１５％、２０％、２２％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９８％の死滅を引き起こし得る。１００％又はほとんど１００％の死滅を引き起こし得る抗体も含まれる。例えば、Ｂ−１Ｍ２２抗体は、ある実験（基本的に、ヒトＰＢＭＣ及びＢ−１Ｍ２２抗体の存在下にＣＸＣＲ４＋細胞系ＣＣＲＦ−ＣＥＭの１００％の死滅が誘発される実施例８を参照されたい）において１００％（又は実験誤差の結合を考えるとほとんど１００％）の死滅を誘発することがわかっている。更に、ＩｇＧレベルにおいて、抗体Ｃ−９Ｐ２１及びＣ−１Ｉ２４は、ヒトＰＢＭＣｓの存在下にＣＸＣＲ４＋細胞系ＣＣＲＦ−ＣＥＭの少なくとも５０％、５５％又は６０％の死滅を引き起こすことがわかり、抗体Ｄ−１Ｋ２１は、ヒトＰＢＭＣｓの存在下にＣＸＣＲ４＋細胞系ＣＣＲＦ−ＣＥＭの少なくとも１５％、２０％又は２５％の死滅を引き起こすことがわかった（実施例８を参照されたい）。
【０２０８】
本発明の抗体の主なメカニズムではないが、ＡＤＣＣは、ある用途、特にある治療用途に有利である。したがって、好ましい実施形態においては、抗体は、ＰＢＭＣｓの存在下に、ＣＸＣＲ４＋細胞、好ましくはＣＸＣＲ４＋腫瘍細胞のＡＤＣＣを誘発し得る。他の実施形態においては、抗体は、ＡＤＣＣを誘発しないか、又はわずかに誘発する。
【０２０９】
本発明の抗体は、好ましくは、このようなＡＤＣＣレベルを達成するのに必要な抗体濃度に関して適切な効果を有する。また、適切なインビトロ試験を実施例８に開示する。
【０２１０】
したがって、インビトロにおける、ＣＸＣＲ４＋細胞、例えばＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞の最大の半分の細胞溶解に必要な抗体濃度（ＥＣ50）は、好ましくは、２０００ｎｇ／ｍＬ未満、１５００ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬ、７００ｎｇ／ｍＬ、６５０ｎｇ／ｍＬ、６２０ｎｇ／ｍＬ、６００ｎｇ／ｍＬ、５５０ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、４５０ｎｇ／ｍＬ、４００ｎｇ／ｍＬ、３５０ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬ、２５０ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬ、１２５ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、９０ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、７０ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、４５ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、３５ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、９ｎｇ／ｍＬ、７ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ又は０．２５ｎｇ／ｍＬである。例えば、ＩｇＧレベルで、本発明のＣ−９Ｐ２１抗体は、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞について１８５２ｍｇ／ｍＬのＥＣ50を有し、本発明の抗体Ｃ１Ｉ２４は、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞について４９．２ｍｇ／ｍＬのＥＣ50を有することがわかった。本発明の抗体Ｄ−１Ｋ２１は７９．９ｎｇ／ｍＬのＥＣ50を有することがわかり、本発明の抗体Ｂ−１Ｍ２２は１１５．７ｎｇ／ｍＬのＥＣ50を有することがわかった。
【０２１１】
ある実施形態においては、抗体は、ＣＸＣＲ４＋細胞の補体依存細胞毒性（ＣＤＣ）を誘発し得るが、他の実施形態においては、抗体はＣＤＣを誘発することができない。例えば、抗体Ｂ−１Ｍ２２及びＣ１Ｉ２４、特にＣ１Ｉ２４は、ＣＸＣＲ４＋細胞、例えばＲａｍｏｓ細胞のＣＤＣを誘発する良好な能力を示した（実施例９参照）。
【０２１２】
ＣＤＣの誘発は、周知の標準法を用い、例えば、ヒト血清の存在下にＣＤＣ溶解を評価するための、Ｒａｍｏｓ細胞のようなＣＸＣＲ４＋細胞を、蛍光標識で標識することによりアッセイすることができる。適切なアッセイを実施例９で議論する。
【０２１３】
他の好ましい特性には、本発明の抗体が投与された場合に、インビボにおける重大な毒性のないこと、及びインビボにおける他の重大な副作用のないことである。
【０２１４】
好ましくは、本明細書に開示された能力は、適切な対象レベルと比較した場合に、測定可能又は有意なレベルで、更に好ましくは統計的に有意なレベルで観察される。
【０２１５】
一部の抗体は、それが結合するようになる細胞内に内在化し得る。したがって、本発明のある実施形態においては、抗体は内在化し得る。抗体分子と付着する他の任意の薬剤が抗体分子内に内在化するので、この特性は、免疫複合体における使用にとって特に有利である。他の実施形態においては、有意な内在化は示されない。
【０２１６】
当業者は、例えば、フローサイトメーター又は共焦点顕微鏡による温度差動蛍光標識を用いた、内在化をアッセイする適切な方法を知っているであろう。適切なアッセイの例には、塩基性ｐＨ（細胞外で見られるように）で蛍光が最小であり、酸性ｐＨ（細胞内部で見られるように）で蛍光が最大である、ｐＨ感受性色素（例えば、ＣｙｐＨｅｒ５Ｅ）により標識した二次抗体を含む。
【０２１７】
ＣＸＣＲ４の「リガンド」という用語には、自然に生産され、組換え的に発現し、又は研究室で合成される、ＳＤＦ−１のような天然のＣＸＣＲ４のリガンドが含まれる。この用語には、ＣＸＣＲ４と結合し得るＡＭＤ−３１００のような、ＣＸＣＲ４の非天然又は改変リガンドも含まれる。
【０２１８】
「ＣＸＣＲ４＋細胞」又は「ＣＸＣＲ４発現細胞」は、その表面で、好ましくは少なくとも実質的に野生型の構造でＣＸＣＲ４を発現する細胞を意味する。ＣＸＣＲ４細胞は、ＣＸＣＲ４について自然に陽性であるか、又はそれらは組換え型ＣＸＣＲ４を発現する形質転換体である。
【０２１９】
したがって、本発明を考慮すると、抗ＣＸＣＲ４抗体の範囲を製造することができ、本明細書の他の箇所で議論される任意の疾患、特に、癌（転移性癌を含む）、自己免疫疾患、炎症性疾患及び感染症、特にＨＩＶのようなウィルス感染の治療を含む、種々の実施形態において用いることができる。
【０２２０】
明細書全体を通して用いられる場合、上限が後で特に示されない限り、「ａ」及び「ａｎ」は、基準の化合物又は工程の「少なくとも１」「少なくとも最初」、「１又はそれ以上」又は「複数」を意味する感覚で用いられる。したがって、本明細書で用いられる場合、「抗体」は「少なくとも最初の抗体」を意味する。任意の単一の薬剤の量と同様に、組み合わせの動作可能な限界及びパラメータは、本明細書の開示を考慮して当業者が知っているであろう。
【０２２１】
本発明の好ましい実施形態は、少なくとも１種の本発明の抗ＣＸＣＲ４抗体、又はその抗原結合断片を含む組成物である。
【０２２２】
本明細書に定義される本発明の抗体、又はその一部若しくは断片をコードするヌクレオチド配列、又はそれと実質的に相同的な核酸配列を含む核酸分子は、本発明の更なる態様を形成する。好ましい核酸分子は、配列番号：３５（好ましくは配列番号：３４によりコードされる）、配列番号：４６（好ましくは配列番号：４５によりコードされる）、配列番号：５７（好ましくは配列番号：５６によりコードされる）、配列番号：６８（好ましくは配列番号：６７によりコードされる）又は配列番号：１０１（好ましくは配列番号：１００によりコードされる）で示されるアミノ酸配列をコードする配列を含む。他の好ましい核酸分子は、配列番号：６９、７１、７３又は７５（好ましくは、配列番号：７７、７９、８１又は８３によりコードされる）のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする配列を含み、及び／又は配列番号：７０、７２、７４、７６又は１０３（好ましくは、配列番号：７８、８０、８２、８４又は１０５によりコードされる）のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする配列を含む。更に好ましくは以下の組み合わせ：配列番号６９及び７０；又は配列番号：７１及び７２；又は配列番号：７３及び７４；又は配列番号：７５及び７６；又は配列番号：６９及び１０３をコードする核酸である。また、好ましいものは、配列番号７７及び７８；又は配列番号：７９及び８０；又は配列番号：８１及び８２；又は配列番号８３及び８４；又は配列番号：７７及び１０５を含む核酸配列である。
【０２２３】
他の好ましい核酸分子は、本発明の抗体のＩｇＧ形態をコードする配列、例えば、実施例４に開示する配列、又はマウスキメラ形態を含む。
【０２２４】
上記に示したように、本発明に包含される他の核酸分子は、本発明のヒト抗体の一部又は断片をコードするもの、例えば、抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするもの（例えば、それぞれ配列番号：７７、７９、８１又は８３のような、配列番号：６９、７１、７３、７５をコードするもの）、又は抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするもの（例えば、それぞれ配列番号：７８、８０、８２、８４又は１０５のような、配列番号：７０、７２、７４、７６又は１０３をコードするもの）である。他の好ましい核酸分子は、本発明の抗体の重鎖をコードするもの（例えば、それぞれ配列番号：１０６、１１０、１１４又は１１８のような、配列番号：１０８、１１２、１１６又は１２０をコードするもの）、又は抗体の軽鎖をコードするもの（例えば、それぞれ、配列番号：１０７、１１１、１１５、１１９又は１２３のような、配列番号：１０９、１１３、１１７、１２１又は１２５をコードするもの）である。
【０２２５】
したがって、本明細書で定義されるように、本発明の抗体の断片、又はそれに実質的な配列、又はこのような断片をコードする配列を含む核酸分子は、本発明の更なる態様を形成する。
【０２２６】
有利には、ＩｇＧ形式である場合、本発明の抗体は、ＣＸＣＲ４について高い結合親和性を有し、すなわち、１×１０-8Ｍ又は１×１０-9Ｍ、又はそれ未満の範囲にＫｄを有する。重要なことに、このような親和性を有する抗体は、治療に有用である確立した範囲内である。
【０２２７】
ある実施形態においては、本発明の抗体は、ヒトのＣＸＣＲ４及びサルのＣＸＣＲ４の両方に結合し得る。例えば、抗体Ｃ−９Ｐ２１、Ｃ１Ｉ２４、Ｄ１Ｋ２１、９Ｎ１０及びＢ−１Ｍ２２は、この能力を有している。このような、種間、特にヒトと、前臨床動物モデルとして一般に用いられる種間の交差反応性は、前臨床試験から臨床用途への、より効果的な移行を可能にするので、有利である。例えば、用いられる特定の動物モデル内に存在する天然のＣＸＣＲ４と交差反応する抗体を有することは、このモデルにおける結果が、どちらかといえばヒト患者における事態を反映させることを意味し、それにより、例えば、なされる投与、及び潜在的に関連があり、問題のある副作用を特定する可能性の、より正確な評価を可能にする。抗体がサル及びヒトの両方のＣＸＣＲ４と同様の親和性を有する場合に、特にそうである。
【０２２８】
ヒトのＣＸＣＲ４及びサルのＣＸＣＲ４の両方と結合する、本発明の抗体の能力は、このような抗体が、治療の有害な副作用、及び適切な耐性用量を評価するための前臨床試験において試験を行い得ることを意味する。
【０２２９】
更に、ヒトのＣＸＣＲ４及びマウスのＣＸＣＲ４の両方と結合する能力は、マウスモデル、例えば、免疫正常マウスを用いたマウス同系モデルにおける本発明のこのような抗体により示される結果が、ヒトを対象とした場合の抗体の活性の代表である可能性が高いことを意味する。この理由は、ヒトのＣＸＣＲ４と結合し得るが、マウスのＣＸＣＲ４と結合し得ない抗体が、マウスモデル内のヒト腫瘍細胞により発現するＣＸＣＲ４と結合するが、内在性マウスＣＸＣＲ４とは結合し得ないことである。これは、腫瘍により発現するＣＸＣＲ４及び内在性ＣＸＣＲ４が存在するヒト患者における状況とは当然に異なる。
【０２３０】
このような状況の潜在的な欠点は、ヒトのＣＸＣＲ４と結合するが、マウスのＣＸＣＲとは結合しないか、有意に低い親和性を有する抗体が免疫不全のマウス（例えば、ヌードマウス又はＳＣＩＤマウス）におけるヒト腫瘍異種移植片モデルにおいて良好に機能するが、これは、より多くのＣＸＣＲ４が存在するヒトの系において同様の性能により反映されないことである。言い換えると、ヒトのＣＸＣＲ４とは結合し得るが、マウスのＣＸＣＲ４とは結合し得ない抗体を用いた、マウス異種移植片系において見られる抗腫瘍効果は、現実の臨床よりも優れていると思われる場合がある。一方、ヒト及びマウスのいずれのＣＸＣＲ４とも結合し得る抗体を用いた作業の場合、これは、マウスモデル系に存在する全ての形態のＣＸＣＲ４と結合し、抗体をヒトに入れた状況の代表である場合がある。抗体が、マウス及びヒトのいずれのＣＸＣＲ４とも同様の親和性を有する場合に、特にそうである。
【０２３１】
好ましい実施形態においては、本発明の抗体は、ヒト及びサルのＣＸＣＲ４と、又はヒト及びマウスのＣＸＣＲ４と、又はヒト及びサル及びマウスのＣＸＣＲ４と、同様の親和性で結合する。
【０２３２】
「同様の親和性」は、ヒト、及び１種又はそれ以上の興味のある他の種（例えば、サル又はマウス）のＣＸＣＲ４に対する抗体の結合親和性が同程度であり、例えば、２０倍以上異ならないことを意味する。更に好ましくは、結合親和性の相違は、１５倍未満であり更に好ましくは１０倍未満、最も好ましくは、５、４、３又は２倍未満である。結合親和性の比較は、任意の適切な方法で実施することができる。ＣＸＣＲ４のような細胞表面リガンドについて、ＦＡＣＳのようなフローサイトメトリー法は、結合曲線における比較の便利な方法を提供し、例えば同じ実験における中間値を比較することができる。適切な方法を実施例５に記載する。
【０２３３】
しかし、他の実施形態においては、本発明の抗体は、サルのＣＸＣＲ４とは結合しない場合があり、及び／又はそれらはマウスのＣＸＣＲ４とは結合しない場合がある。
【０２３４】
組成物、免疫複合体、薬剤、組み合わせ、カクテル、キット、第一及び第二の医療用途、並びに本発明の全ての方法の以下の記載において、「抗体」及び「免疫複合体」という用語、又は抗原結合領域又はその断片は、特に示さず、科学用語から明瞭にならない限り、抗ＣＸＣＲ４抗体の範囲、並びに特異的Ｃ−９Ｐ２１、Ｂ−１Ｍ２２、Ｃ−１Ｉ２４、Ｄ−１Ｋ２１及び９Ｎ１０抗体を意味する。
【０２３５】
本明細書で用いられる場合、「抗体」及び「免疫グロブリン」という用語は、広く、ヒト抗原結合ドメインを含む、あらゆる免疫学的結合剤又は分子を意味し、ポリクローナル及びモノクローナル抗体を含む。重鎖中の定常領域のタイプに依存し、全抗体は、５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭの１つに割り当てられ、本発明の抗体はこれらのクラスのいずれか１つであり得る。これらのいくつかは、更に、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４等のサブクラス又はイソタイプに分けられる。種々のクラスの免疫グロブリンに相当する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ及びμと命名される。種々のクラスの免疫グロブリンのサブユニットの構造及び三次元構造は周知である。
【０２３６】
一般に、本発明においては、抗原結合領域よりもむしろ、全抗体が用いられ、生理学的状況において最も一般的な抗体であり、研究室の環境において、最も容易に製造されるので、ＩｇＧ及び／又はＩｇＭが好ましい。ＩｇＧ１抗体が特に好ましい。
【０２３７】
哺乳動物抗体の「軽鎖」は、その定常ドメインのアミノ酸配列、その可変ドメインのフレームワーク領域のアミノ酸配列をベースとし、明らかに異なる２つのタイプの１つ：カッパ（κ）及びラムダ（λ）に割り当てられる。基本的に本発明の抗体のκ又はλ軽鎖定常領域の使用には選択の優先傾向はない。
当業者により理解されるように、「抗体」という用語に包含される免疫学的結合剤は、抗体及びその抗原結合断片にまで拡大され、全抗体、二量体、三量体及び多量体抗体；二種特異性抗体；キメラ抗体、組換え型及び改変抗体、及びそれらの断片が含まれる。
【０２３８】
したがって、「抗体」という用語は、任意の抗原結合領域を有する抗体様分子にも言及して用いられ、この用語には、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2などの抗原結合ドメイン、単一ドメイン抗体（ＤＡＢｓ）、ＴａｎｄＡｂｓ二量体、Ｆｖ，ｓｄＦｖ（単一鎖Ｆｖ）、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、Ｆｄ、直鎖抗体、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体断片、バイボディ、トリボディ（それぞれ、ｓｃＦｖ−Ｆａｂ融合体、二種特異性又は三種特異性）；ｓｃ−ダイアボディ；カッパ（ラムダ）ボディ（ｓｃＦｖ−ＣＬ融合体）を含む抗体断片；二種特異性Ｔ−細胞Ｅｎｇａｇｅｒ（ＢｉＴＥ）（Ｔ細胞を引きつけるためのｓｃＦｖ−ｓｃＦｖタンデム）；二重可変ドメイン（ＤＶＤ）−Ｉｇ（二種特異性形態）；小さい免疫タンパク質（ＳＩＰ）（ミニボディの一種）；ＳＭＰＩ（「小さいモジュールの免疫薬理学的」）ｓｃＦＶ−Ｆｃ二量体；ＤＡＲＴ（ｄｓ安定化ダイアボディ「Ｄｕａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＲｅＴａｒｇｅｔｔｉｎｇ」）：１種又はそれ以上のＣＤＲｓを含む、小さい抗体模倣体などが含まれる。
【０２３９】
種々の抗体をベースとする構築物及び断片を製造し、使用する方法は、当該技術分野において周知である（特に、本明細書に参照として組み入れられるＫａｂａｔら、１９９１を参照されたい）。特に、ダイアボディはＥＰ４０４，０９７及びＷＯ９３／１１１６１に更に開示されているが、直鎖抗体は、Ｚａｐａｔａら（１９９５）に開示されている。
【０２４０】
抗体は、従来の方法を用いて断片化することができる。例えば、Ｆ（ａｂ’）2断片は、抗体をペプシンで処理することにより生成し得る。得られたＦ（ａｂ’）2断片を処理してジスルフィド架橋を還元し、Ｆａｂ’断片を生成することができる。パパイン消化は、Ｆａｂ断片の形成をもたらし得る。Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）2、ｓｃＦＶ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂｓ、ＴａｎｄＡｂｓ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、二量体、ミニボディ、ダイアボディ、二種特異性抗体断片及び他の断片は、組換え技術を用いて合成することもでき、又は化学的に合成することができる。抗体断片を生成する技術は周知であり、当該技術分野において開示されている。例えば、Ｂｅｃｋｍａｎら、２００６；Ｈｏｌｌｉｇｅｒ及びＨｕｄｓｏｎ，２００５；Ｌｅ  Ｇａｌｌら、２００４；Ｒｅｆｆ及びＨｅａｒｄ，２００１；Ｒｅｉｔｅｒら、１９９６；及びＹｏｕｎｇら、１９９５のそれぞれは、効果的な抗体断片の生産を開示し、可能にする。
【０２４１】
抗体又は抗体断片は、天然に産生され、又は全部又は一部について合成的に生成される。したがって、抗体は任意の適切な原料から製造することができ、例えば、組換え起源からであってもよく、及び／又はトランスジェニック動物又はトランスジェニック植物、又はＩｇＹ方法を用いて卵中で製造することができる。したがって、抗体分子はインビトロ又はインビボで生成することができる。
【０２４２】
好ましくは、抗体又は抗体断片は、３つのＣＤＲドメインを含む抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び３つのＣＤＲドメインを含む抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。前記ＶＬ及びＶＨは、一般に抗原結合部位を形成する。
【０２４３】
「Ｆｖ」断片は、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は、硬く、非共有結合で連結した、１本の重鎖と一本の軽鎖可変ドメインを有する。この構造においては、各可変ドメインの３つの超可変領域（ＣＤＲs）ＶH−ＶL二量体の表面の抗原結合部位を定義するために相互作用する。集合的に、６つの超可変領域（ＣＤＲｓ）が、抗体に対して抗原結合特異性を与える。
【０２４４】
しかし、抗体の軽鎖可変領域からの３つのＣＤＲｓ及び重鎖可変領域からの３つのＣＤＲｓの存在は抗原結合に必要でないことが、当該技術分野において十分に立証されている。したがって、上記古典的な抗体断片が効果的であることは公知である。
【０２４５】
例えば、ラクダ科の動物の抗体（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、１９９３；Ａｒｂａｂｉ  Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら、１９９７））は、広範囲の抗原結合レパートリーを有しているが、軽鎖を欠いている。また、ＶＨドメインのみを含む単一ドメイン抗体（Ｗａｒｄら、１９８９；Ｄａｖｉｅｓ及びＲｉｅｃｈｍａｎｎ，１９９５）、又はＶＬドメインのみを含む単一ドメイン抗体（（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｕｃｋｅｎら、２００１）を用いた結果は、これらのドメインが、容認できる高い親和性で抗原と結合し得ることを示す。したがって、３つのＣＤＲｓは抗原と効果的に結合し得る。
【０２４６】
１個のＣＤＲ、又は２個のＣＤＲｓが抗原と効果的に結合し得ることも公知である。第一の例として、ＧＦＰのような異種タンパク質に挿入されたＶＨ  ＣＤＲ３が、この異種タンパク質に抗原結合能力を与えることが示されているように（Ｋｉｓｓら、２００６；  Ｎｉｃａｉｓｅら、２００４）、１個のＣＤＲは異種タンパク質に挿入され、この異種タンパク質に抗原結合能力を与える
【０２４７】
更に、２個のＣＤＲｓが抗原と効果的に結合し、親抗体により所有するものよりも優れた特性を与えさえすることが知られている。例えば、親抗体からの２個のＣＤＲｓ（ＶＨ  ＣＤＲ１及びＶＬ  ＣＤＲ３領域）が、親分子の抗原認識特性を維持しているが、腫瘍に浸透させる優れた能力を有していることが示された（Ｑｉｕら、２００７）。これらのＣＤＲドメインを適切なリンカー配列（例えば、ＶＨ  ＦＲ２由来）と接続すると、天然の親抗体に類似する様式でＣＤＲｓを配向し、等しく良好な抗原認識をもたらす。したがって、親抗体において見られる構造を維持するような適切なフレームワーク領域を用いて、２つのＣＤＲドメイン（好ましくはＶＨドメインからの１つ及びＶＬドメインからの１つ、更に好ましくは、２つのＣＤＲドメイン１つがＣＤＲ３ドメインである）を含む抗原結合抗体模倣体を構築することが可能であることは当該技術分野において公知である。
【０２４８】
したがって、本発明の好ましい抗体は６つのＣＤＲ領域（軽鎖からの３つ、及び重鎖からの３つ）を含むが、６つより少ないＣＤＲ領域を含む抗体、及び１又は２つのＣＤＲ領域を含む抗体は本発明に包含される。更に、重鎖又は軽鎖のみからのＣＤＲｓを有する抗体も意図される。
【０２４９】
ＣＸＣＲ４と結合する本発明の好ましい抗体は、３つのＣＤＲｓを含む少なくとも１つの重鎖可変領域と、３つのＣＤＲｓを含む少なくとも１つの軽鎖可変領域とを含み、前記重鎖可変領域は：
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列又はそれと実質的に相同的な配列を有する可変重（ＶＨ）ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号：２のアミノ酸配列又はそれと実質的に相同的な配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２、及び
（ｃ）配列番号：３のアミノ酸配列又はそれと実質的に相同的な配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３、又は
（ｄ）配列番号：７のアミノ酸配列又はそれと実質的に相同的な配列を有する可変重（ＶＨ）ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号：８のアミノ酸配列又はそれと実質的に相同的な配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２、及び
（ｆ）配列番号：９のアミノ酸配列又はそれと実質的に相同的な配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３、又は
（ｇ）配列番号：１３のアミノ酸配列又はそれと実質的に相同的な配列を有する可変重（ＶＨ）ＣＤＲ１、
（ｈ）配列番号：１４のアミノ酸配列又はそれと実質的に相同的な配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２、及び
（ｉ）配列番号：１５のアミノ酸配列又はそれと実質的に相同的な配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３、又は
（ｊ）配列番号：１９のアミノ酸配列又はそれと実質的に相同的な配列を有する可変重（ＶＨ）ＣＤＲ１、
（ｋ）配列番号：２０のアミノ酸配列又はそれと実質的に相同的な配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２、及び
（ｌ）配列番号：２１のアミノ酸配列又はそれと実質的に相同的な配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３を含む。
【０２５０】
特定の重鎖ＣＤＲ領域と併せて用いるための、好ましい軽鎖ＣＤＲ領域は、本明細書の他の箇所に開示されている。しかし、本発明の重鎖可変領域と併せて用いるための３つのＣＤＲｓを含む、他の軽鎖可変領域も意図される。本発明の重鎖可変領域と併せて用いることができ、ＣＸＣＲ４と結合する抗体を産生する適切な軽鎖可変領域は、当業者によって容易に特定することができる。
【０２５１】
例えば、本発明の重鎖可変領域は、１本の軽鎖可変領域又は軽鎖可変領域のレパートリーと組み合わせることができ、得られた抗体を、ＣＸＣＲ４との結合について試験を行った。種々の軽鎖可変領域を有する、本発明の重鎖可変領域のこのような組み合わせの妥当な数が、ＣＸＣＲ４との結合能力を維持していることが期待される。実際、９Ｎ１０抗体は、Ｃ−９Ｐ２１と同じ重鎖可変領域を有しているが、異なる軽鎖可変領域を有している。
【０２５２】
本発明の好ましい軽鎖可変領域と併せて用いるための他の重鎖可変領域を特定するための類似の方法を用いることができた。
【０２５３】
特定の実施形態においては、抗体又は抗体断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤの定常領域のような、重鎖定常領域の全て又は一部を含む。好ましくは、重鎖定常領域は、ＩｇＧ１重鎖定常領域又はその一部である。更に、抗体又は抗体断片は、カッパ軽鎖定常領域又はラムダ軽鎖定常領域、又はそれらの一部を含む。このような定常領域の全て又は一部は、天然に製造することができ、又は全体的に若しくは部分的に合成によってもよい。このような定常領域の適切な配列は周知であり、当該技術分野において立証されている。重及び軽鎖からの定常領域の完全な補体が本発明の抗体に含まれる場合、このような抗体は、本明細書において通常、「完全長」抗体又は「全」抗体と呼ばれる。
【０２５４】
Ｆｃ領域を含む抗体は、特定の用途、特にインビボにおける治療用途に好ましい。ここで、Ｆｃ領域はＡＤＣＣのようなエフェクター機能を媒介する。適切なＦｃ領域は当業者に周知であり、したがって、選択することができる。
【０２５５】
本明細書で用いられる場合、アミノ酸又は核酸配列に関して「実質的に相同的」という用語は、開示されたアミノ酸又は核酸配列に対し、少なくとも７０％又は７５％、好ましくは少なくとも８０％、更に好ましくは、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列を含む。したがって、本発明の実質的に相同的な配列には、本発明の配列に対し、１個又は複数の塩基又はアミノ酸の変更（付加、置換、挿入又は欠失）が含まれる。アミノ酸レベルにおいては、好ましい実質的に相同的な配列は、本発明の配列を作成する、１若しくはそれ以上のフレームワーク領域及び／又は１若しくはそれ以上のＣＤＲｓにおいて、１、２、３、４又は５個以下、好ましくは１、２又は３個、更に好ましくは１又は２個のみの変更されたアミノ酸を含む。前記変更は、保存的又は非保存的アミノ酸であってもよい。好ましくは、前記変更は保存的アミノ酸置換である。
【０２５６】
実質的に相同的な核酸配列は、中程度のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件で、開示された核酸配列（又はその相補的配列）とハイブリダイズするヌクレオチド配列をも含み、例えば、本発明の１又はそれ以上の軽鎖又は重鎖ＣＤＲｓ、本発明の軽又は重鎖可変領域、又は本発明の抗体をコードする核酸配列とハイブリダイズする（又はそれらの相補配列とハイブリダイズする）。
【０２５７】
「実質的に相同的」という用語は、実質的に同じ方法で、本発明のタンパク質又は核酸分子のように、実質的に同じ機能を果たす本発明のアミノ酸及びヌクレオチド配列の修飾又は化学的同等物をも含む。例えば、任意の実質的に相同的な抗体（又はそれをコードする実質的に相同的な核酸）は、前述したように、ＣＸＣＲ４と結合する能力を維持すべきである。好ましくは、任意の実質的に相同的な抗体は、本明細書の他の箇所で定義したように、１種又はそれ以上の抗体の機能的能力を維持すべきである。好ましくは、任意の実質的に相同的な抗体は、問題となる抗体により認識されるＣＸＣＲ４の同じエピトープ、例えば、本明細書に開示されたように、本発明のＣＤＲドメイン又は本発明のＶＨ及びＶＬドメインにより認識されるのと同じエピトープと特異的に結合する能力を維持すべきである。同じエピトープ／抗原との結合は周知の方法により、例えば、結合アッセイを用い、例えば、競合アッセイを用い、容易に試験を行うことができ、当該技術分野において開示されている。他の機能的特性の維持も、周知の方法により容易に試験を行うことができ、当該技術分野において開示されている。本発明の抗体については、拮抗特性及び／又はアポトーシス特性の非誘発性が維持されていることが特に好ましい。
【０２５８】
したがって、当業者は、結合アッセイを「実質的に相同的な」抗体が、本発明の抗体及び抗体断片と同じ結合特異性を有するかどうかを試験するために用いることができることを認め、例えば、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡアッセイ又はＢＩＡコアアッセイのような結合アッセイは、このような「実質的に相同的な」抗体がＣＸＣＲ４と結合し得るかどうかを確立するために容易に用いることができるであろう。細胞におけるフローサイトメトリーは、ＣＸＣＲ４のような細胞表面受容体との結合を分析するための最も好都合なアッセイである。上記に概要を述べたように、競合結合アッセイは、「実質的に相同的な」抗体が、本発明の抗体により認識されるＣＸＣＲ４の同じエピトープと実質的に特異的に結合する能力を維持しているかどうかを試験するために用いることができる。前述の方法は、適切な競合アッセイの唯一の例である。当業者は他の適切な方法及び変更を知っているであろう。
【０２５９】
本発明のタンパク質の実質的に相同的な配列には、限定されないが、保存的アミノ酸置換が含まれ、例えば、抗体のＶＨ、ＶＬ又はＣＤＲドメインに影響を及ぼさない変更が含まれ、例えば、異なるリンカー配列が用いられるｓｃＦＶ抗体、ｔａｇ配列又は他の成分が加えられ、抗原の結合に寄与しない抗体、抗体分子又は断片の１つのタイプ又は形式の、抗体分子又は断片の他のタイプ又は形式への交換又は変換（例えば、ＦａｂからｓｃＦＶへの変換又はその逆）、又は抗体の、抗体分子の特定のクラス又はサブクラスへの変換（例えば、抗体分子の、ＩｇＧ又はそのサブクラス、例えば、ＩｇＧ１又はＩｇＧ３への変換）が含まれる。
【０２６０】
本明細書で用いられる場合、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸が、類似の側鎖を有する他のアミノ酸残基と置換されることである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該技術分野において定義されており、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、グリシン、システイン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ−分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。
【０２６１】
相同性は、従来の任意の方法により評価することができる。しかし、配列間の相同性の程度の決定については、配列の多重アライメントを作成するコンピュータプログラム、例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９４）が有用である。配列の１つの全長の少なくとも５０％がアライメント中に含まれる場合に、最も高いオーダーの適合が、２つの配列間で得られるように、所望であれば、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアルゴリズムは、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ、１９９２）、並びに１０のギャップ開始ペナルティ及び０．１のギャップ伸長ペナルティを一緒に用いることができる。配列を整列させるために用いることができる他の方法は、最も高いオーダーの適合が、２つの配列間で得られ、同一のアミノ酸の数が、２つの配列間で決定されるような、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）により改訂されたＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｈ（１９７０）である。２つのアミノ酸配列間の同一性を計算するための他の方法は、一般に当該技術分野において認識されており、例えば、Ｃａｒｉｌｌｏ及びＬｉｐｔｏｎ（１９８８）、並びにＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８，Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓに開示されたものが含まれる。
【０２６２】
一般に、このような計算のためにはコンピュータプログラムが使用されるであろう。この目的のためには、ＡＬＩＧＮ（Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ、１９８８）、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ、１９８８；Ｐｅａｒｓｏｎ、１９９０）及びｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、又はＧＣＧ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４）のような配列対を比較し、整列させるプログラムも有用である。更に、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにおけるＤａｌｉサーバーは、タンパク質配列の構造を基準とする配列を提供する（Ｈｏｌｍ，１９９３；１９９５；１９９８）。
【０２６３】
基準ポイントの提供の例としては、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の相同性を有するか、配列同一性を有する本発明の配列は、初期パラメータ（例えば、ＧＥＮＥＳＴＲＥＡＭネットワークサービス、ＩＧＨ、Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ，Ｆｒａｎｃｅにおいてインターネットにより得られる）を有するＡＬＩＧＮプログラムを用いて決定することができる。
【０２６４】
「少なくとも中程度のストリンジェントのハイブリダイゼーション条件」については、条件は、溶液中の２つの相補的核酸分子間の選択的ハイブリダイゼーションを促進するものを選択することを意味する。ハイブリダイゼーションは、核酸配列分子の全て又は一部に対して起こり得る。ハイブリダイゼーション部分は、通常、少なくとも１５（例えば、２０、２５、３０、４０又は５０）ヌクレオチド長である。当業者は、核酸二重鎖又はハイブリッドの安定性は、Ｔｍにより測定され、ナトリウム含有バッファーはナトリウムイオン濃度及び温度の関数である（Ｔｍ＝８１．５℃−１６．６（Ｌｏｇ１０［Ｎａ+］）＋０．４１（％（Ｇ＋Ｃ）−６００／ｌ）、又は類似の式）。したがって、ハイブリッド安定性を決定する洗浄条件におけるパラメータは、ナトリウムイオン濃度及び温度である。公知の核酸分子と類似するが同一でない分子を特定するため、１％のミスマッチを、Ｔｍにおける約１℃の減少をもたらすと推測することができる。例えば、＞９５％の同一性を有する核酸分子は、最終的な洗浄温度が約５℃下がることが求められる。これらの条件に基づき、当業者は、適切なハイブリダイゼーション条件を容易に選択することができるであろう。好ましい実施形態においては、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が選択される。例として、ストリンジェントなハイブリダイゼーションを達成するために、次の条件を使用することができる：上記式に基づき、Ｔｍ−５℃において、５×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）／５倍デンハート溶液／１．０％ＳＤＳでハイブリダイゼーションし、次いで６０℃で、０．２×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳで洗浄する。中程度のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、４２℃における３倍ＳＳＣにおける洗浄工程を含む。更なる例について、「ハイブリダイズする」配列を、非ストリンジェントな条件下（例えば、室温において、６×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド）、結合させ（ハイブリダイズさせ）、低ストリンジェント条件下（例えば、２×ＳＳＣ、室温、更に好ましくは２×ＳＳＣ、４２℃）又は高ストリンジェントな条件下（例えば、２×ＳＳＣ、６５℃）に洗浄する（ここで、ＳＳＣ＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）。
しかし、同等のストリンジェンシーは、他のバッファー、塩及び温度を用いて達成することもできることが理解される。ハイブリダイゼーション条件に関する他のガイダンスは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ及びＳｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．，１９８９，６．３．１−６．３．６：及びＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９，Ｖｏｌ．３に見出される。
【０２６５】
一般的に言えば、コード縮重のために、高ストリンジェンシーな条件下でハイブリダイズするであろう配列があるので、高ストリンジェンシーな条件下にハイブリダイズする配列が好ましい。
【０２６６】
他の好ましい実施形態においては、Ｃ−９Ｐ２１、Ｂ−１Ｍ２２、Ｃ−１Ｉ２４、Ｄ−１Ｋ２１又は９Ｎ１０のような、元の抗ＣＸＣＲ４抗体と比べ、向上した、又は優れた特性を有する第二世代の抗体が提供される。例えば、第二世代の抗体は、ＣＸＣＲ４について強力な結合親和性、優れた交差反応プロフィールを有し、よりいっそう低いレベルのＣＸＣＲ４＋細胞のアポトーシスの誘発、ＣＸＣＲ４＋細胞、特に腫瘍細胞を標的とする優れた能力、例えば、腫瘍細胞を阻害する改善された能力、改善された拮抗能力、例えばＳＤＦ−１のＣＸＣＲ４への結合により誘発されるカルシウム流入を阻害する能力の改善、リガンドが誘発する遊走の阻害の改善、出願に依存したＡＤＣＣ又はＣＤＣを誘発する能力の改善、又は本明細書の他の箇所で議論した疾患の治療の改善を有する。
【０２６７】
効果的な第二世代の抗体を特定するための比較は、例えば、本明細書に詳細に、又は当該技術分野において詳細に開示された種々のアッセイの１種又はそれ以上を用いて、容易に実施及び定量される。Ｃ−９Ｐ２１、Ｂ−１Ｍ２２、Ｃ−１Ｉ２４、Ｄ−１Ｋ２１又は９Ｎ１０抗体により例示されるような、本発明の抗ＣＸＣＲ４抗体と比較し、少なくとも約２倍、５倍、１０倍、２０倍、及び好ましくは少なくとも約５０倍の向上した生物学的特性又は活性を有する、抗体の抗体は本発明に包含される。特に好ましい第二世代の抗体には、本発明の抗体のＶＨ鎖、又はそのＶＨ  ＣＤＲｓを、他のＶＬ鎖（又は他のＶＬ  ＣＤＲｓ）と組み合わせて含む。
【０２６８】
ヒト又は動物の身体に由来する、ヒト又は動物の身体又は組織試料内にインサイチューで存在し得る、任意のこのような成分から識別される限りにおいて、本発明の抗体、結合タンパク質及び核酸分子は、一般に、「分離された」又は「精製された」分子である。しかし、配列は、ヒト又は動物の身体内に見られるような配列と一致するか、又は実質的に相同的である。したがって、核酸分子又は配列及びタンパク質又はポリペプチド、例えば抗体に関し、本明細書で用いられる場合、「分離された」又は「精製された」という用語は、分離され、精製され、又はその自然環境では実質的に存在しない場合に、例えば、ヒト又は動物の身体（必要であれば、それらは天然に存在する）から分離又は精製された、そのような分子を意味し、又は技術的過程により製造された場合に、そのような分子、すなわち、組換え及び合成的に製造された分子を意味する
【０２６９】
したがって、核酸分子に関して用いられる場合、このような用語は、他の核酸分子／遺伝子又はポリペプチドのような天然に関連する物質を実質的に含まない核酸を意味し得る。この用語は、組換えＤＮＡ技術により製造した場合に細胞物質若しくは培地を実質的に含まない、又は化学的に合成した場合に、化学的前駆体若しくは他の化学物質を実質的に含まない核酸分子をも意味する。分離又は精製された核酸は、更に核酸が由来する核酸（すなわち、核酸の５’及び３’末端に位置する配列）が自然にフランキングする配列、又は例えば遺伝子工学によって核酸（例えば、治療的価値のないタグ配列又は他の配列）がフランキングするように製造した配列を実質的に含まない。
【０２７０】
したがって、軽鎖ＣＤＲｓ１、２及び３、重鎖ＣＤＲｓ１、２及び３、軽鎖可変領域、重鎖可変領域のようなタンパク質又はポリペプチド分子、並びに全長抗体を含む、本発明の結合タンパク質又は抗体に関して用いる場合、「分離された」又は「精製された」という用語は、通常、それが由来する原料からの細胞物質又は他のタンパク質を実質的に含まないタンパク質を意味する。ある実施形態においては、特に、タンパク質をヒト又は動物に投与する場合、このような分離又は精製されたタンパク質は、組換え技術により製造された場合に培地を実質的に含まず、化学的に合成された場合、化学的前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない。このような分離又は精製されたタンパク質は、分離された核酸分子について前述したような、フランキング配列をも含まない
【０２７１】
本明細書で用いられる場合、「核酸配列」又は「核酸分子」という用語は、天然の塩基、糖類及び内部の糖（骨格）結合からなるヌクレオシド又はヌクレオチドモノマーの配列を意味する。この用語は、非天然のモノマー又はその一部を含む、修飾又は置換配列をも含む。本発明の核酸配列は、デオキシリボ核酸配列（ＤＮＡ）又はリボ核酸配列（ＲＮＡ）であってもよく、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン及びウラシルを含む天然の塩基を含んでいてもよい。配列は、修飾塩基を含んでいてもよい。このような修飾塩基の例には、アザ及びデアザアデニン、グアニン、シトシン、チミジン及びウラシル：並びにキサンチン及びヒポキサンチンが含まれる。核酸分子は、二重鎖又は一本鎖であってもよい。核酸分子は、全部又は一部が合成又は組換え型であってもよい。
【０２７２】
好ましい実施形態においては、本発明の抗体は、ヒト抗体、更に好ましくは完全なヒト抗体である。これに関し、ヒト抗体は、一般に、ヒトの治療において用いるための少なくとも３つの潜在的な利点を有している。第一に、ヒト免疫系は、抗体を異物として認識すべきでない。第二に、ヒトの血液循環における半減期は、天然のヒト抗体と同様であり、それによって、より少量で頻繁でない用量が与えられることを可能にする。第三に、エフェクター部分がヒトであるので、作用モードが標的細胞の死滅を必要とする実施形態においては、例えば、補体依存細胞毒性（ＣＤＣ）又は抗体依存細胞毒性（ＡＤＣＣ）により、更に効果的に標的細胞を破壊するために、ヒト免疫系の他の部分とよりいっそう相互作用するであろう。
【０２７３】
しかし、一般に、ヒト抗体はこれらの利点を示すことは認識されているが、それらを成功したヒトの治療のための候補とするために十分に高い親和性及び適切な機能特性を有するヒト抗体の開発は、決して簡単でないことが知られている。したがって、当該技術分野は、安全かつ効果的なヒトの治療のための抗ＣＸＣＲ４を欠いており、このような薬剤の開発のための課題を有している。
【０２７４】
本明細書で用いられる場合、抗体分子及び結合タンパク質に関し、「ヒト」という用語は、可変領域（例えば、ＶH、ＶL、ＣＤＲ又はＦＲ領域）、場合により、ヒトのレパートリーから分離され、又は由来し、又はヒト又はヒトのレパートリー、例えば、ヒトの生殖細胞又は体細胞内に見られる配列に由来するか関連する定常抗体領域を有する抗体及び結合タンパク質を意味する。本発明のＣ−９Ｐ２１、Ｂ−１Ｍ２２、Ｃ−１Ｉ２４、Ｄ−１Ｋ２１及び９Ｎ１０抗体は、可変領域が、ヒトレパートリーから分離されている、このようなヒト抗体分子の例である。
【０２７５】
本発明の「ヒト」抗体及び結合タンパク質は、ヒト配列によってコードされないアミノ酸残基、例えば、ランダムに導入された突然変異、又はインビトロにおける部位特異的突然変異、例えばインビトロクローニング又はＰＣＲにより導入される突然変異を更に含む。このような突然変異の特定の例は、抗体又は結合タンパク質の残基の少ない数、例えば、抗体又は結合タンパク質の５、４、３、２又は１個以下、好ましくは、抗体又は結合タンパク質のＣＤＲの１以上を作成する残基の５、４、３、２又は１個で保存的置換又は他の突然変異を含む突然変異である。このような「ヒト」抗体の特定の例には、潜在的な免疫原性部位の量を減少するために標準的修飾法に供される抗体及び可変領域が含まれる。
【０２７６】
したがって、本発明の「ヒト」抗体には、ヒト内に見られる配列に由来するか、又は関連する配列が含まれるが、これらはインビボにおいてヒト抗体生殖レパートリー内に自然には存在しない場合がある。更に、本発明のヒト抗体及び結合タンパク質には、ヒト配列から特定されるヒトコンセンサス配列、又はヒト配列と実質的に相同的な配列を含むタンパク質が含まれる。
【０２７７】
更に、本発明のヒト抗体及び結合タンパク質は、それ自体、ヒト抗体分子内に組み合わせて見られるＶH、ＶL、ＣＤＲ又はＦＲ領域の組み合わせであるが、これらに限定されない。したがって、本発明のヒト抗体及び結合タンパク質は、ヒト内において自然には存在する必要のない、このような領域の組み合わせを含むか、又は対応し得る。
【０２７８】
好ましい実施形態においては、ヒト抗体は完全なヒト抗体である。本明細書で用いられる場合、「完全なヒト」抗体は、実質的に非ヒト抗体配列を含まないか、任意の非ヒト抗体配列を含まない、前記で定義した、「ヒト」可変領域ドメイン及び／又はＣＤＲｓを含む抗体である。例えば、「実質的に非ヒト抗体配列を含まない」ヒト可変領域ドメイン及び／又はＣＤＲｓを含む抗体は、ドメイン及び／又はＣＤＲｓの５、４、３、２又は１個のみのアミノ酸がヒト抗体配列によりコードされないアミノ酸である、抗体である。したがって、「完全なヒト」抗体は、実質的に非ヒト可変領域ドメイン、例えば、特定のアミノ酸が、ヒト抗体において通常に存在するアミノ酸によく一致するように変更されているマウスの可変領域ドメインをベースとする「ヒト化」抗体からは区別される。
【０２７９】
本発明の「完全なヒト」抗体は、一本鎖抗体であるとして、任意の他の実質的な抗体配列を含まない、可変領域ドメイン及び／又はＣＤＲｓであってもよい。また、本発明の「完全ヒト」抗体は、１以上のヒト抗体定常領域と統合又は動作可能に結合した、ヒト可変領域ドメイン及び／又はＣＤＲｓであってもよい。特定の好ましい完全ヒト抗体は、ＩｇＧの定常領域の全補体を含むＩｇＧ抗体である。
【０２８０】
他の実施形態においては、本発明の「ヒト」抗体は、一部ヒトキメラ抗体である。本明細書で用いられる場合、「一部ヒトキメラ」抗体は、ラット又はマウスのような、非ヒト種の定常領域に動作可能に結合し、又はグラフトした、「ヒト」可変領域ドメイン及び／又はＣＤＲｓを含む抗体である。このような一部ヒトキメラ抗体は、例えば、定常領域が、好ましくは前臨床試験において用いられる動物種と同じである、前臨床試験において用いることができる。これらの一部ヒトキメラ抗体は、例えば、非ヒト種の定常領域が、抗体検出について追加のオプションを提供し得る、生体外診断において用いることができる。
【０２８１】
本明細書で用いられる場合、「断片」という用語は、生物学的に関連のある断片、例えば、抗原結合に寄与する断片、例えば、抗原結合部位の一部を形成し、及び／又はＣＸＣＲ４抗原の機能を阻害又は減少するのに寄与する断片を意味する。特定の好ましい断片は、本発明の抗体の重鎖可変領域（ＶHドメイン）及び／又は軽鎖可変領域（ＶLドメイン）を含む。他の好ましい断片は、本発明の抗体の１又はそれ以上の重鎖ＣＤＲｓ（又は本発明のＶHドメイン）、又は本発明の抗体の１又はそれ以上の軽鎖ＣＤＲｓ（又は本発明のＶLドメイン）を含む。特定の好ましい断片は、少なくとも５つのアミノ酸長であり、少なくとも１つのＣＤＲ領域、好ましくはＣＤＲ３領域、更に好ましくは重鎖ＣＤＲ３領域を含む。
【０２８２】
本発明の抗体が、定義された配列のいずれかの断片を含む（例えば、配列番号：３５、４６、５７、６８又は１０１の断片を含む）実施形態においては、例えば、本発明のＶH及び／又はＶLドメインを含む抗体、本発明の１又はそれ以上のＣＤＲｓを含む抗体又は結合タンパク質であり、これらの領域／ドメインは、各領域／ドメインがその生物学的機能を果たし、抗原結合に対する寄与を維持し得るように、通常、抗体又は結合タンパク質内で分離されている。したがって、天然の抗体及び／又は効果的な設計された抗体において見られるもののように、ＶH及びＶLドメインは、好ましくは適切な骨格配列／リンカー配列により分離されており、ＣＤＲｓは、好ましくは適切なフレームワーク領域により分離されている。したがって、本発明のＶH、ＶL及び個々のＣＤＲ配列は、好ましくは、抗原結合が可能なように、適切なフレームワーク又は骨格内に組み込まれて提供される。このようなフレームワーク配列又は領域は、適切な骨格を形成するのに適しているように、天然のフレームワーク領域、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／又はＦＲ４と一致し、又は例えば、種々の天然のフレームワーク領域と比較することにより特定されるコンセンサスフレームワーク領域と一致していてもよい。また、非抗体骨格又はフレームワーク、例えば、Ｔ細胞受容体フレームワークを用いることができる。
【０２８３】
フレームワーク領域のために用いることのできる適切な配列は周知であり、当該技術分野において文書にて立証されており、これらのいずれかを用いることができる。フレームワーク領域のための好ましい配列は、本発明のＶH及び／又はＶLドメインを生成する、１又はそれ以上（すなわち、１、２、３又は４）のフレームワーク領域であり、すなわち、表１、２、３、４又は５に開示されたフレームワーク領域の１若しくはそれ以上、又はそれに実質的に相同的なフレームワーク領域、特に、抗原特異性を維持することを可能にする特定のフレームワーク領域、例えば、抗体と実質的に同じ又は同じ３次元構造をもたらすフレームワーク領域である。
【０２８４】
特定の好ましい実施形態においては、必要に応じて、４種全ての可変軽鎖（配列番号：３０、３１、３２及び３３）及び／又は可変重鎖（配列番号：２５、２６、２７及び２８）、配列番号：３５（表１にも示す）のＦＲ領域、又はそれと実質的に相同的なＦＲ領域が、本発明の抗体において見い出される。
【０２８５】
特定の好ましい実施形態においては、必要に応じて、４種全ての可変軽鎖（配列番号：４１、４２、４３及び４４）及び／又は可変重鎖（配列番号：３６、３７、３８及び３９）、配列番号：４６（表２にも示す）のＦＲ領域、又はそれと実質的に相同的なＦＲ領域が、本発明の抗体において見い出される。
特定の好ましい実施形態においては、必要に応じて、４種全ての可変軽鎖（配列番号：５２、５３、５４及び５５）及び／又は可変重鎖（配列番号：４７、４８、４９及び５０）、配列番号：５７（表３にも示す）のＦＲ領域、又はそれと実質的に相同的なＦＲ領域が、本発明の抗体において見い出される。
【０２８６】
特定の好ましい実施形態においては、必要に応じて、４種全ての可変軽鎖（配列番号：６３、６４、６５及び６６）及び／又は可変重鎖（配列番号：５８、５９、６０及び６１）、配列番号：６８（表４にも示す）のＦＲ領域、又はそれと実質的に相同的なＦＲ領域が、本発明の抗体において見い出される。
【０２８７】
特定の好ましい実施形態においては、必要に応じて、４種全ての可変軽鎖（配列番号：９６、９７、９８及び３３）及び／又は可変重鎖（配列番号：２５、２６、２７及び２８）、配列番号：１０１（表５にも示す）のＦＲ領域、又はそれと実質的に相同的なＦＲ領域が、本発明の抗体において見い出される。
【０２８８】
更に、本発明の好ましい抗体は、本発明のＶH、ＶL又はＣＤＲｓからなるが、本発明の抗体が、本発明の１又はそれ以上のＶH、ＶL又はＣＤＲｓを、本発明以外の他のＶH、ＶL又はＣＤＲｓと組み合わせて含むことにも留意すべきである（本明細書で概要を述べた、本発明の抗体のＣＸＣＲ４結合特性又は抗ＣＸＣＲ４特性がまだ存在しているという条件で）。
【０２８９】
本明細書で用いられる場合、「重鎖相補性決定領域」（「重鎖ＣＤＲ」）という用語は、抗体分子の重鎖可変領域（ＶHドメイン）内の超可変領域を意味する。重鎖可変領域は、アミノ末端からカルボキシ末端に、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２及び重鎖ＣＤＲ３と命名された３つのＣＤＲｓを有する。重鎖可変領域は、４つのフレームワーク領域（アミノ末端からカルボキシ末端にＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）をも有している。これらのフレームワーク領域はＣＤＲを分離している。
【０２９０】
本明細書で用いられる場合、「重鎖可変領域」（ＶHドメイン）は、抗体分子の重鎖の可変領域を意味する。
【０２９１】
本明細書で用いられる場合、「軽鎖相補性決定領域」（「軽鎖ＣＤＲ」）という用語は、抗体分子の軽鎖可変領域（ＶLドメイン）内の超可変領域を意味する。軽鎖可変領域は、アミノ末端からカルボキシ末端に、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２及び軽鎖ＣＤＲ３と命名された３つのＣＤＲｓを有する。軽鎖可変領域は、４つのフレームワーク領域（アミノ末端からカルボキシ末端にＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）をも有している。これらのフレームワーク領域はＣＤＲｓを分離している。
【０２９２】
本明細書で用いられる場合、「軽鎖可変領域」（ＶLドメイン）は、抗体分子の軽鎖の可変領域を意味する。
【０２９３】
ＣＤＲｓの位置を定義するために、必要に応じて、Ｋａｂａｔ（参照により本明細書に特に組み入れられる、Ｋａｂａｔら、１９９１）の命名が本明細書に付随することに留意すべきである。
【０２９４】
当業者は、軽及び重鎖ＣＤＲｓ、軽及び重鎖可変領域、抗体、抗体断片、及び免疫複合体のような、本発明のタンパク質及びポリペプチドは、種々の周知の方法及び当該技術分野で開示されている方法のいずれかにより調製することができるが、最も好ましくは組換え法を用いて調製されることを理解するであろう。
【０２９５】
本発明の抗体の軽及び重鎖可変領域をコードする核酸断片は、任意の適切な方法により、例えばクローニング又は合成により、誘導又は製造することができる。例えば、このような配列は、例えば、ヒト生殖系遺伝子から適切な配列をクローニングし、生殖系配列に必要な修飾を行い、周知かつ当該技術分野で開示された方法を用いることにより、本発明の配列を得ることができる。かつより効率的なその他の方法は、プライマーを重複させて適切な軽鎖又は重鎖可変領域配列を合成し、完全な配列を得るためにプライマー伸長を用いる。次いで、この完全配列は、例えば、適切な発現ベクターにクローニングするために、更なるクローニング及び取扱のための適切な制限部位を含むプライマーを用いたＰＣＲにより増幅することができる。可変領域あたり５〜７つの重複プライマーは、通常は十分であり、それによって、この技術を非常に効率的かつ正確にすることができる。
【０２９６】
本発明の抗体の軽及び重鎖可変領域をコードする核酸断片がいったん得られると、これらの断片は、更に標準的組換えＤＮＡ技術により操作され、例えば、可変領域断片を、適切な定常領域ドメインを有する全長抗体分子に変換し、又は本明細書の他の箇所で議論した抗体断片の特定の形式、例えば、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ断片等に変換される。典型的には、又はこの更なる操作手順の一部として、本発明の抗体の生産を促進するために、本発明の抗体分子をコードする核酸断片を、一般的に適切な発現ベクターに導入する。
【０２９７】
ベクターが、用いられる宿主細胞と適合する限りは、可能な発現ベクターには、限定はされないが、コスミド、プラスミド又は修飾ウィルス（例えば、複製欠損レトロウィルス、アデノウィルス及びアデノ随伴ウィルス）が含まれる。発現ベクターは「宿主細胞の形質転換にとって適切であり」、これは、核酸分子と動作可能なように連結している、発現のために用いるための宿主細胞に基づいて選択される、本発明の核酸分子及び調節配列を含むことを意味する。動作可能なように連結は、核酸が核酸の発現を可能にする様式で調節配列と連結していることを意味すると意図される。
【０２９８】
したがって、本発明は、本発明の核酸分子又はその断片、本発明の核酸分子によりコードされるタンパク質配列の転写及び翻訳のために必要な調節配列を含む組換え発現ベクターを意図する。
【０２９９】
適切な調節配列は、細菌、真菌、ウィルス、哺乳動物又は昆虫の遺伝子を含む種々の起源に由来し得る（例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，１９９０に開示された調節配列を参照されたい）。適切な調節配列の選択は、以下に議論するように、選択された宿主細胞に依存し、当業者によって容易に達成することができる。このような調節配列の例には：転写プロモーター及びエンハンサー又はＲＮＡポリメラーゼ結合配列、翻訳開始シグナルを含むリボソーム結合配列が含まれる。更に、選択した宿主細胞及び使用するベクターに依存し、複製起点、追加のＤＮＡ制限部位、エンハンサー及び転写誘導能を与える配列のような他の配列が発現ベクターに組み込まれる。
【０３００】
本発明の組換え発現ベクターは、本発明の組換え分子で形質転換又はトランスフェクションされた宿主細胞の選択を容易にする選択可能なマーカー遺伝子を含んでもよい。選択可能なマーカー遺伝子の例は、特定の薬剤、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコール、アセチルトランスフェラーゼ、蛍ルシフェラーゼ、又は免疫グロブリン若しくは免疫グロブリン、好ましくはＩｇＧのＦｃ部分のような免疫グロブリンの一部に対して耐性を与える、ネオマイシン及びハイグロマイシンのようなタンパク質をコードする遺伝子である。選択可能なマーカー遺伝子の転写は、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、又は蛍ルシフェラーゼのような選択可能なマーカータンパク質の濃度の変化により測定される。選択可能なマーカー遺伝子が、ネオマイシン耐性形質転換細胞のような、抗生物質に対する耐性を与えるタンパク質をコードする場合、細胞はＧ４１８を用いて選択することができる。選択可能なマーカー遺伝子を組み込んだ細胞は生き残るが、他の細胞は死滅する。これは、本発明の組換え発現ベクターの発現について可視化及びアッセイを可能にし、特に、発現及び表現型における突然変異の効果を判定することを可能にする。選択可能なマーカーは、興味のある核酸から別個のベクターに導入することができることが認識されるであろう。
【０３０１】
組換え発現ベクターは、組換えタンパク質の発現の増大；組換えタンパク質の溶解度の増大をもたらし；親和性精製におけるリガンドとして作用することにより、標的組換えタンパク質の精製に役立つ融合部分をコードする遺伝子を含んでいてもよい（例えば、精製及び／又は同定を可能にする適切な「タグ」、例えば、Ｈｉｓタグ又はｍｙｃタグが存在していてもよい）。例えば、タンパク質分解による切断部位が標的組換えタンパク質に加えられ、融合部分から組換えタンパク質の分離を可能にし、次いで融合タンパク質の精製を可能にする。典型的な融合発現ベクターには、それぞれ、組換えタンパク質にグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、又はプロテインＡを融合する、ｐＧＥＸ（Ａｍｒａｄ  Ｃｏｒｐ，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）、ｐＭａｌ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が含まれる。
【０３０２】
組換え発現ベクターは、宿主細胞内に導入され、形質転換宿主細胞を生成し得る。「〜で形質転換される」、「〜でトランスフェクションされる」、「形質転換」及び「トランスフェクション」という用語は、当該技術分野において公知の多くの可能な方法の１つにより細胞に核酸（例えば、ベクター）を導入することを包含することを意図する。本明細書で用いられる場合、「形質転換宿主細胞」という用語は、本発明の組換え発現ベクターで形質転換されたグリコシル化が可能な細胞をも含むことを意図する。原核細胞は、例えば、エレクトロポレーション又は塩化カルシウムが介在する形質転換により、核酸で形質転換することができる。例えば、核酸は、従来の技術、例えば、リン酸カルシウム又は塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション又はマイクロインジェクションにより、哺乳動物細胞に導入することができる。宿主に形質転換及びトランスフェクションするための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、及び他の研究用教科書に見出すことができる。
【０３０３】
適切な宿主細胞には、多種多様の真核宿主細胞及び原核細胞が含まれる。例えば、本発明のタンパク質は、酵母細胞又は哺乳動物細胞内で発現させることができる。他の適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ、１９９０に見出すことができる。更に、本発明のタンパク質は、大腸菌のような原核細胞内で発現させることができる（Ｚｈａｎｇら、２００４）。
【０３０４】
本発明を実施するのに適切な酵母及び真菌宿主細胞には、サッカロミセス・セレビシエ、ピチア属又はクルイベロミセス属、及びアスペルギルス属の様々な種が含まれるが、これらに限定されない。サッカロミセス・セレビシエにおける発現ベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら、１９８７）、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ及びＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、１９８２）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら、１９８７）、及びｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）が含まれる。
酵母及び真菌のトランスフェクションのためのプロトコールは当業者に周知である（Ｈｉｎｎｅｎら、１９７８；Ｉｔｏら、１９８３、及びＣｕｌｌｅｎら、１９８７参照）。
【０３０５】
本発明を実施するのに適した哺乳動物細胞には、中でも、ＣＯＳ（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５０又は１６５１）、ＢＨＫ（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ６２８１）、ＣＨＯ（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ  ６１）、ＨｅＬａ（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ２）、２９３（ＡＴＣＣ番号１５７３）、ＮＳ−１細胞、ＮＳ０（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１１１７７）、及びＰｅｒ．Ｃ６（登録商標）（Ｃｒｕｃｅｌｌ、Ｌｅｉｄｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）が含まれる。哺乳動物細胞中における発現に向けられた適切な発現ベクターには、一般的に、プロモーター（例えば、ポリオーマ、アデノウィルス２、サイトメガロウィルス及びシミアンウィルス４０）、並びに他の転写及び翻訳制御配列が含まれる。哺乳動物発現ベクターの例には、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．，１９８７）及びｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら、１９８７）が含まれる。
【０３０６】
本明細書において提供される教示を考慮すると、植物、鳥類及び昆虫細胞に適切なタイプの発現ベクターを導入するためのプロモーター、ターミネーター、及び方法も容易に達成され得る。例えば、一実施形態においては、本発明のタンパク質は植物細胞から発現させることができる（アグロバクテリウム・リゾゲネスベクターの使用を概説するＳｉｎｋａｒら、１９８７を参照されたい；中でも、ＰＡＰＳ２０２２、ＰＡＰＳ２０２３、及びＰＡＰＳ２０３４を含む植物細胞のための発現ベクターの使用を開示するＺａｍｂｒｙｓｋｉら、１９８４も参照されたい）。
【０３０７】
本発明を実施するのに適した昆虫細胞には、カイコガ属（Ｂｏｍｂｙｘ）、ヤガ科（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ）又はスポドテラ（Ｓｐｏｄｏｔｅｒａ）種由来の細胞及び細胞系が含まれる。培養昆虫細胞（ＳＦ９細胞）中でタンパク質の発現に利用可能なバキュロウィルスベクターには、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈら、１９８３）及びｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｏｗ及びＳｕｍｍｅｒｓ１９８９）が含まれる。本発明の組換えタンパク質の発現のために適した、いくつかのバキュロウィルス−昆虫細胞発現系は、ＰＣＴ／ＵＳ／０２４４２に開示されている。
【０３０８】
また、本発明のタンパク質は、ラット、ウサギ、ヒツジ、及びブタのような、非ヒトトランスジェニック動物内でも発現させることができる（Ｈａｍｍｅｒら、１９８５；Ｐａｌｍｉｔｅｒら、１９８３；Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１９８５；Ｐａｌｍｉｔｅｒ及びＢｒｉｎｓｔｅｒ  １９８５、及び米国特許第４，７３６，８６６号）。
【０３０９】
本発明のタンパク質は、固相合成（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６４）；Ｆｒｉｓｃｈｅら、１９９６）、又は均質溶液中での合成（Ｈｏｕｂｅｎｗｅｙｌ，１９８７）のような、タンパク質の化学において周知の方法を用いて化学合成により調製することもできる。
【０３１０】
他の分子、例えばタンパク質と結合した、本発明の抗体及びタンパク質を含む、Ｎ−末端又はＣ−末端融合タンパク質は、組換え技術による融合により調製することができる。得られた融合タンパク質は、本明細書に開示される、選択されたタンパク質若しくはマーカータンパク質、又はタグタンパク質と融合した、本発明の抗体又はタンパク質を含む。本発明の抗体及びタンパク質は、公知の方法により、他のタンパク質と結合させることもできる。例えば、タンパク質は、ＷＯ９０／１０４５７に開示された、ヘテロ二官能性チオール含有リンカー、Ｎ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ−プロピオネート）又はＮ−スクシニミジル−５チオアセテートを用いて連結させることができる。融合タンパク質又は複合体を調製するために用いることのできるタンパク質の例には、免疫グロブリン、ホルモン、成長因子、レクチン、インスリン、低密度リポタンパク質、グルカゴン、エンドルフィン、トランスフェリン、ボンベシン、アシアログリコプロテイン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヘムアグルチニン（ＨＡ）及び末端が切断されたｍｙｃのような細胞結合タンパク質が含まれる。
【０３１１】
第一の抗ＣＸＣＲ４抗体核酸断片の調製方法に関係なく、更なる適切な抗体核酸断片は、標準的な分子生物学の方法により容易に調製することができる。あらゆる変異、突然変異又は第二世代の抗ＣＸＣＲ４抗体核酸断片が、本発明における使用に適していることを確認するため、核酸断片について、本発明の抗ＣＸＣＲ４抗体の発現を確認するために試験を行うであろう。好ましくは、変異、突然変異又は第二世代の核酸断片について、標準条件下、更に好ましくは標準的ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下におけるハイブリダイゼーションを確認するためにも試験を行うであろう。典型的な適切なハイブリダイゼーション条件は、約５０℃における、約７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、約０．５ＭのＮａＰＯ4、約１ｍＭのＥＤＴＡ内でのハイブリダイゼーション；及び約４２℃における約１％のＳＤＳによる洗浄を含む。
【０３１２】
種々の抗体を容易に調製することができるので、本発明の治療法は、患者内で少なくとも本発明の第一の抗ＣＸＣＲ４抗体の生物学的有効量を発現する少なくとも第一の核酸断片又は分子を、動物又は患者に提供することにより達成することができる。「抗ＣＸＣＲ４抗体を発現する核酸断片又は分子」は、一般に、少なくとも発現構築物又はベクターの形状であり、ウィルス内、又は組換え宿主細胞内に含まれる発現構築物又はベクターの形状であってもよい。本発明の好ましい遺伝子治療ベクターは、一般に、組換えレトロウィルス、単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）等の内部に含まれるようなウィルスベクターである。
【０３１３】
更なる態様は、本発明の１又はそれ以上の核酸断片又は分子を含む発現構築物又は発現ベクターを提供する。好ましくは、発現構築物又はベクターは組換え型である。好ましくは、前記構築物又はベクターは、本発明の核酸分子によってコードされるタンパク質配列の転写及び翻訳のために必要な調節配列を更に含む。
【０３１４】
更なる態様は、本発明の１又はそれ以上の発現構築物又は発現ベクターを含む宿主細胞又はウィルスを提供する。また、本発明の１又はそれ以上の核酸分子を含む宿主細胞又はウィルスも提供される。本発明の抗体を発現する細胞又はウィルスは更なる態様を形成する。
【０３１５】
本発明の更なる態様は、本発明の宿主細胞を培養する工程を含む、本発明の抗体の製造方法を提供する。好ましい方法は、（ｉ）コードされた抗体又はタンパク質の発現に適した条件下に、本発明の１若しくはそれ以上の組換え発現ベクター、又は１若しくはそれ以上の核酸配列を含む宿主細胞を培養し、場合により、（ｉｉ）宿主細胞から、又は培地／上清から、抗体又はタンパク質を分離し、又は得る工程を含む。このような製造方法は、抗体又はタンパク質生成物を精製し、及び／又は前記抗体又は生成物を、少なくとも１種の追加成分、例えば、薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む組成物に製剤化する工程を含んでもよい。
【０３１６】
本発明の抗体又はタンパク質を１種以上のポリペプチド鎖（例えば、Ｆａｂ断片のような特定の断片）により精製する実施形態においては、全てのポリペプチドは、好ましくは、同一又は異なる発現ベクターのいずれかから、宿主細胞内において発現され、例えば、本発明の結合タンパク質は、宿主細胞内で会合し、そこから分離又は精製することができる。
【０３１７】
本発明の抗体は、ＣＸＣＲ４と結合する、更なる抗体を生成するためにも用いることができる。このような使用は、例えば、新しい抗体を生成するために、親抗体のアミノ酸配列において１個又はそれ以上のアミノ酸の付加、欠失、置換又は挿入を含み、ここで、前記親抗体は、本明細書の他の箇所で定義されており、本発明の抗体の１つであり、得られた新しい抗体について、ＣＸＣＲ４と結合する抗体を特定し、本明細書に開示された他の好ましい機能特性の１以上を有する新しい抗体を得られたかについて試験を行なう。このような方法は、ＣＸＣＲ４と結合する能力、及び他の機能特性について全て試験を行うことのできる、複数の新規抗体を生成するために用いることができる。好ましくは、１個又はそれ以上のアミノ酸の前記付加、欠失、置換又は挿入は、１又はそれ以上のＣＤＲドメインにおいて起こる。
【０３１８】
親抗体に対する、このような修飾又は突然変異は、例えば、ランダム又は定方向突然変異誘発を実施することにより、周知の方法及び当該技術分野における文献を用いて、任意の適切な方法により実施することができる。定方向突然変異誘発を用いる場合、抗原結合に関与する主要な残基を特定するために、突然変異誘発のための適切な残基を同定するための１つの戦略は、結合タンパク質−抗原複合体、例えば、Ａｂ−Ａｇ複合体の結晶構造の分解を利用する（Ｄａｖｉｅｓ及びＣｏｈｅｎ，１９９６）。次いで、相互作用を増強させるために、それらの残基を変異させる。また。１個又はそれ以上のアミノ酸残基は、単に定方向突然変異について標的となり得、評価されるＣＸＣＲ４への結合において影響する。
ランダム突然変異誘発は、任意の適切な方法、例えば、エラープローンＰＣＲ、チェインシャッフリング又は大腸菌株の変異誘発により実施することができる。
したがって、本発明の１つ又はそれ以上のＶHドメインを、任意の適切な起源由来の１個のＶLドメイン又はＶLドメインのレパートリーと組み合わせることができ、得られた新しい抗体について、ＣＸＣＲ４に対して特異的な抗体を特定するために試験を行う。これは好ましい。逆に言えば、本発明の１つ又はそれ以上のＶLドメインを、任意の適切な起源由来の１個のＶHドメイン又はＶHドメインのレパートリーと組み合わせることができ、得られた新しい抗体について、ＣＸＣＲ４に対して特異的な抗体を特定するために試験を行う。
【０３１９】
同様に、本発明の、ＶH及び／又はＶLドメインの１つ又はそれ以上、好ましくは全ての３つのＣＤＲｓを、必要に応じて、１つのＶH及び／又はＶLドメイン、又はＶH及び／又はＶLドメインのレパートリーにグラフトし、得られた新しい抗体について、ＣＸＣＲ４に対して特異的な抗体を特定するために試験を行う。
【０３２０】
軽鎖及び／又は重鎖のＣＤＲｓ、特にＣＤＲ３の標的突然変異は、抗体親和性を増大させるのに効果的な方法であり、好ましいことがわかっている。好ましくは、ＣＤＲ３の３〜４個のアミノ酸のブロック又は「ホットスポット」と呼ばれる特定の領域が、突然変異誘発のための標的となる。
【０３２１】
「ホットスポット」は、体細胞過剰変異がインビボで起こる配列である（及び、下記のＮｅｕｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，  １９９５）。ホットスポット配列はあるコドンの形をとるコンセンサスヌクレオチド配列として定義され得る。そのコンセンサス配列はテトラヌクレオチド、ＲＧＹＷであり、ＲはＡかＧのどちらかであることができ、ＹはＣかＴであることができ、ＷはＡかＴのどちらかであることができる（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，  １９９５）。加えて、ヌクレオチドＡＧＹによりコードされるセリン残基は、潜在的なホットスポット配列に該当するＴＣＮによりコードされるセリンよりも可変ドメインのＣＤＲ領域に圧倒的に存在する（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５）。
【０３２２】
したがって、本発明の各抗体の重鎖、及び、軽鎖のＣＤＲのヌクレオチド配列はホットスポット配列とＡＧＹコドンの存在について精査され得る。軽鎖、及び、重鎖のＣＤＲ領域の同定されたホットスポットは、それから、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎ  Ｔｉｃｓデータベース（ＩＭＧＴ、HYPERLINK "http://imgt.cines.fr/textes/vquest/"ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／ｔｅｘｔｅｓ／ｖｑｕｅｓｔ／）（Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０）を用いて胚の重鎖の配列、及び、軽鎖の配列と任意選択的に比較されることができる。生殖系列と同一な配列により、体細胞突然変異は起こらなかったと示唆され、それ故、インビボで起きる体細胞事象を模倣して無作為に突然変異が導入され得る、又は、代わりに部位特異的突然変異誘発が、例えば、ホットスポット、及び／又は、ＡＧＹコドンに対して行われ得る。対照的に、異なる配列により、体細胞変異は既に起こったと示される。インビボでの体細胞変異が最適であったかどうかが決定されずにいるであろう。
【０３２３】
突然変異のために好ましいホットスポットは外側に露出されるアミノ酸をコードするホットスポットであり、好ましくは、抗原結合部位の部分を形成するアミノ酸をコードするホットスポットである。突然変異のために好ましいその他のホットスポットは非保存的アミノ酸をコードするホットスポットである。ＣＤＲの内側に埋め込まれる、又は、保存されるアミノ酸をコードするホットスポットは突然変異誘発されないのが好ましい。これらの残基は通常、全体の構造に重要であり、それらは内側に埋もれているので抗原と相互作用しそうにない。
【０３２４】
アミノ酸とタンパク質ドメインの上述した操作を行う方法は当業者に周知である。例えば、前記の操作であれば、適切な結合タンパク質及びそのドメインをコードする核酸分子が修飾され、その結果発現したタンパク質のアミノ酸配列が次に適切な方法で修飾されるその核酸のレベルで遺伝子工学により都合よく行われることができるであろう。
【０３２５】
１つ以上の抗体がＣＸＣＲ４に特異的に結合する能力をテストすることは、本分野において周知であり記述される適切な方法により行われ得る。ＣＸＣＲ４＋細胞株は培養物保存機関より入手可能であり、又は、それらはＣＸＣＲ４陰性細胞を組換えＣＸＣＲ４の発現を可能にするコンストラクトで形質転換することにより調製され得る。そのような細胞は、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＢＩＡＣｏｒｅ、ＦＡＣＳなどのような従来の方法により結合をアッセイするために容易に使用されることができる。
【０３２６】
これらの方法により作製された新しい抗体は改善された機能上の特質、例えば、もとの抗体よりＣＸＣＲ４について高い、又は、向上した親和性（又は、少なくとも同等の親和性）を好んで持つであろう。そして、それらは本明細書のどこかに記載される本発明の抗体と同じ方法で処理され、使用されることができる（例えば、治療、診断について、組成物などにおいて）。あるいは、又は、加えて、その新しい抗体は、本明細書のどこかに記載される１つ以上のその他の改善された機能上の特質を持つであろう。
【０３２７】
これらの方法により作製された、獲得された、又は、獲得可能な新しい抗体は本発明のそのうえにさらなる態様を形成する。
【０３２８】
本発明は、本発明の抗体、又は、抗体断片の少なくとも１つを、任意選択によるが希釈剤と共に含む組成物をさらに提供する。そのような組成物は医薬的に許容できる組成物、又は、基礎研究で使用される組成物であり得る。医薬的な組成物に関して、それらは非経口投与のため、静脈内投与のため、又は、皮下投与のためでも好んで製剤され得る。
【０３２９】
本発明は、本発明のヒト抗体、及び、抗体断片の多数の方法、及び、使用を提供する。全ての方法に関して、「ａ」及び「ａｎ」という用語は、特に言明された場合を除いて、列挙された方法の中の「少なくとも１つの」工程、「少なくとも第１の」工程、「１つ以上の」工程、又は、「複数の」工程を意味するために使用される。これは治療法の中の投与工程と特に関連がある。したがって、本発明について、様々な用量が用いられることができるだけではなく、様々な投与回数、例えば、多数回の注射までを含む注射が用いられ得る。抗ＣＸＣＲ４治療用抗体の投与前、投与後、又は、投与中に複合型治療法が用いられ得る。
【０３３０】
重要な生物学的意味を持つ、本発明の抗体、又は、免疫複合体の様々な有益なインビトロの方法と使用が提供される。ＣＸＣＲ４を含む組成物を少なくとも本発明の第１抗ＣＸＣＲ４抗体、又は、その抗原結合断片と効率的に接触させることを全般的に含むＣＸＣＲ４を結合する方法と使用がまず提供される。本発明の抗体、又は、その免疫複合体はしたがって結合アッセイにおいて使用され得る。適切に有益な結合アッセイには免疫ブロット、ウェスタンブロット、ドットブロット、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）、免疫沈降、アフィニティークロマトグラフィーなどのような本分野で一般に用いられるアッセイが含まれる。
【０３３１】
ＣＸＣＲ４／抗体複合体の形成とそのように形成された複合体を検出することを可能にするのに効率的な条件でＣＸＣＲ４を含むのではないかと考えられる組成物を少なくとも本発明の第１抗体、又は、その免疫複合体、又は、その抗原結合断片と接触させることを全般的に含むＣＸＣＲ４を検出する方法と検出における使用が提供される。その検出方法と使用は、生物学的サンプルとの関連で、例えば、腫瘍の診断において用いられることができる、そして、それに基づく診断キットもまた提供される。ＣＸＣＲ４の検出はある疾病の予後徴候となることができるということも信じられており、したがって、本明細書における診断の言及はまた、適切である場合、予後を含む。特に、ＣＸＣＲ４は転移性再発と生存、神経膠腫といくつかの小児癌について予後における有用性を持つことが示されてきた。
【０３３２】
本発明の抗体、又は、結合タンパク質はインビボ、又は、インビトロでＣＸＣＲ４を、特に、ＣＸＣＲ４＋細胞を検出するために使用されることができる。例えば、ＣＸＣＲ４がある腫瘍細胞で過剰発現されるとき、本発明の抗体、又は、結合タンパク質は腫瘍細胞をインビボ、又は、インビトロで検出するために使用されることができる。さらに、その抗体のＣＸＣＲ４＋細胞に局在化する能力は、本発明の抗体はＣＸＣＲ４＋細胞が存在する身体の部位を標的にすることができ、標的部位においてその抗体が作用できることを意味する。特に、その抗体のＣＸＣＲ４＋腫瘍細胞に局在化する能力は、本発明の抗体はＣＸＣＲ４＋腫瘍細胞が存在し、標的部位において抗体が作用できる身体の部位を標的にすることができることを意味する。
【０３３３】
本発明の方法、及び、本発明の使用は特に、任意の疾病、又は、ＣＸＣＲ４の発現、若しくは、ＣＸＣＲ４の活性に関連する健康状態、又は、ＣＸＣＲ４が生物学的役割を果たす健康状態を有する、又は、それらを発生させる危険のある動物、及び、患者において用いられることを意図されている。そのような疾病、及び、疾患には、ＣＸＣＲ４陽性細胞、典型的にはリガンドがＣＸＣＲ４に結合して疾患、若しくは、疾病の原因となる、又は、それに寄与するシグナル伝達系に関与する可能性がある免疫調節性ＣＸＣＲ４＋Ｔ細胞によって媒介される疾病が含まれる。それらはまた、ＣＸＣＲ４を発現する細胞の異常増殖によって引き起こされる疾病を含む。そのような異常に増殖する細胞はもともとＣＸＣＲ４＋である可能性があり、又は、それらは突然変異を誘発されて／癌化されてＣＸＣＲ４を発現することとなったのかもしれない。上述したように、ＣＸＣＲ４の発現が、癌細胞がＳＤＦ−１の勾配に沿って転移するのを助ける可能性がある。また、先天的にＣＸＣＲ４＋である細胞でのＣＸＣＲ４の過剰発現によって特徴づけられる疾病が含まれる。さらに、ＨＩＶのＣＸＣＲ４指向性株は宿主細胞に侵入するためにＣＸＣＲ４を使用し、それで、その受容体を妨害することでこの疾病の拡大を制限できる。
【０３３４】
したがって、ＣＸＣＲ４によって媒介される、及び／又は、ＣＸＣＲ４陽性細胞の異常増殖によって特徴づけられる、及び／又は、先天的にＣＸＣＲ４＋の細胞でのＣＸＣＲ４の過剰発現により特徴づけられる疾病、又は、疾患を治療する方法が提供される。
【０３３５】
別の観点で見ると、次の
（ｉ）ＣＸＣＲ４のそのリガンドへの結合の阻害、
（ｉｉ）ＣＸＣＲ４のリガンドに対するＣＸＣＲ４介在的細胞性反応の阻害、特に、例えば、癌転移／器官侵襲、若しくは、炎症反応に関連する走化性、若しくは、移動の阻害、又は、細胞内カルシウムイオン濃度（細胞活性化）の上昇の阻害、
（ｉｉｉ）ＣＸＣＲ４＋細胞の選択的除去、
（ｉｖ）骨髄間質において生産されるＳＤＦ−１とＣＸＣＲ４受容体の相互作用により骨髄において不活化されたままの細胞であるＣＸＣＲ４＋造血幹細胞の活性化と移動の誘導、
（ｖ）感染中にＣＸＣＲ４を共受容体として使用するＨＩＶのＸ４株によるＣＸＣＲ４＋細胞の感染の阻止のうちの１つ以上から利益を受けることができる健康状態の治療が提供される。
【０３３６】
ＣＸＣＲ４リガンドはＳＤＦ−１であることが好ましい。
【０３３７】
ＣＸＣＲ４が広範囲の疾病、及び、疾患に関係するので、任意の許容できるモデル系において効果的であると一旦示された既知の抗ＣＸＣＲ４治療法がＣＸＣＲ４発現と関連する全ての範囲の疾病、及び、疾患の治療に用いられることができるということが当業者に周知である。
【０３３８】
ある実施形態において、ＣＸＣＲ４に介在される健康状態は癌であり、特に、ＣＸＣＲ４、及び、そのリガンドとの相互作用により介在される、又は、助けられる拡大、転移形成、器官侵襲、及び／又は、腫瘍成長である。
【０３３９】
ＣＸＣＲ４は様々な腫瘍において発現し、この発現が癌の病態生理、特に、癌転移において決定的な役割を果たすことを示すかなりの考証が今や存在する。いくつかの証拠から、ＣＸＣＲ４の発現により悪性細胞がＳＤＦ−１ベースの勾配を転移性移動のために用いることが可能になるという現在広く受け入れられる考えに至ってきた。ＣＸＣＲ４はこれまでで癌細胞において最も一般的に発現されるケモカイン受容体である。研究されたほとんどすべての腫瘍において発現が見つけられてきた。ＳＤＦ−１（ＣＸＣＬ１２）は肝臓、肺、骨髄、リンパ節、及び、（比較的にやや低いレベルで）脳、すなわち、癌が典型的に転移する部位、又は、血液学的な腫瘍により侵襲される部位において特に高いレベルで発現することも興味深い。ＳＤＦ−１により引き起こされるＣＸＣＲ４シグナル伝達の妨害がマウスモデルにおいて転移の形成を低下させる、又は、防ぐことができるという多数の証拠が存在する。シグナル伝達のこの阻害は抗体（Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  ２００１及びその他多数）、ＣＸＣＲ４に対するｓｉＲＮＡ（Ｌｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，  ２００７）、及び、ペプチド（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ，  ２００８）により達成され得る。
【０３４０】
ＣＸＣＲ４を妨害することはまた、血管新生に影響、例えば、阻害的影響（抗血管新生作用）を有すると記述されている。したがって、さらなる実施形態において、本発明の抗体は、血管新生をもたらすために（例えば、抗血管新生作用を有するために）使用されることができる。さらに別の実施形態において、本発明の拮抗的な抗体は本分野において記述される抗血管新生剤と一緒に使用されることができる。特に、本発明の抗体は癌の治療のために、又は、腫瘍がアバスチンに対する耐性を獲得した患者の第２選択治療としてベバシズマブ（アバスチン）と組み合わせて使用されることができる。
【０３４１】
Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ，  ２００９による研究は、腫瘍細胞のＣＸＣＲ４はアバスチン処理により発現が上昇することを示す。このことは腫瘍細胞をＣＸＣＲ４を標的とする抗体での処置に対しより敏感にするであろう。これは、アバスチン処置に耐性になった患者にとって特別興味深い。あるいは、前記の２つの薬剤は一緒に投与され得る。
【０３４２】
さらに、抗転移作用を有すると記述されるＣＸＣＲ４シグナル伝達を妨害する化合物の多くが腫瘍成長を抑制すると知られてもいる。ＣＸＣＲ４受容体を妨害することにより腫瘍成長を制限することについての正確な作用はあまりよく理解されていないが、新生物細胞と周囲の間質との間の相互作用が最も重要であることを示す証拠が増えてきている。ある研究により、ＣＸＣＲ４に対するｓｉＲＮＡによる膵臓癌細胞、及び、大腸癌細胞の形質移入はインビトロでの細胞成長にほとんど影響をおよぼさないが、これらの細胞に由来する腫瘍のインビボでの成長はかなり抑制されることが示された（Ｇｕｌｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ，  ２００５）。さらに、筋繊維芽細胞の形質を有する癌腫関連繊維芽細胞が同じ患者に由来する正常な乳腺繊維芽細胞よりも混合された乳癌細胞の成長を顕著に刺激し、内皮性前駆細胞を呼び込むことにより血管新生を促進することが示された（Ｏｒｉｍｏ  ｅｔ  ａｌ，  ２００５）。これらの作用は腫瘍繊維芽細胞／筋繊維芽細胞により分泌されたＳＤＦ−１を通して媒介された。ＳＤＦ−１に対する抗体、又は、ＣＸＣＲ４に対するｓｉＲＮＡは腫瘍成長を阻害した。したがって、まとめると、これらの研究は、腫瘍の微小環境が癌の挙動にとり重要であり、インビボのＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４相互作用を標的とすることにより顕著な腫瘍成長の阻害が得られたことを示す。したがって、本発明の抗体はＣＸＣＲ４＋細胞の腫瘍間質への誘引を阻害するために、及び／又は、腫瘍に好都合な微小環境を作り出す前記細胞の活性化を阻害するために用いられることができる。
【０３４３】
別の実施形態において、治療されるＣＸＣＲ４介在性健康状態はＣＸＣＲ４を発現する癌化した細胞の存在である。
【０３４４】
すでに記述したように、ＣＸＣＲ４は多数の腫瘍において強く発現している。アポトーシスを誘導する方法であるＡＤＣＣ又はＣＤＣによりそれらの細胞を殺すためにこのことが用いられ得る。もちろん、ＣＸＣＲ４はまた広範囲の健康な細胞でも発現するので、安全面と副作用は不安の種である。ＣＸＣＲ４に対する小分子アンタゴニストについての限られた数の入手可能な第１相試験により、大部分は軽度の懸念ではあるが、いくつかの副作用が示された。しかしながら、ＣＸＣＲ４を標的とする薬剤の長期の使用について入手可能なデータはない。さらに、使用される薬剤に応じた変化が存在する可能性がある。アポトーシスを誘導するＭＤＸ−１３３８のような抗体は、そうではない抗体と非常に異なる安全性プロファイルを持つ可能性がある。さらに、ペプチド由来薬剤ＣＴＣＥ−９９０８は多核化、Ｇ2−Ｍ期停止、及び、異常体細胞分裂（分裂期細胞死）の誘導を介して卵巣癌細胞の死を引き起こすことが最近になり示された（Ｋｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ，  ２００９）。この作用機構、例えば、分裂期細胞死は、体細胞分裂を行うにしてもきわめてまれな十分に分化したＣＸＣＲ４＋神経細胞と比較して、細胞分裂しやすいＣＸＣＲ４＋腫瘍細胞においてずっと効率的であると推論され得る。したがって、ある実施形態において、ＣＸＣＲ４＋細胞の細胞殺滅は本発明の抗体についてのさらなる作用機構であるが、そのような殺滅はアポトーシス以外の機構により好んで誘導される。
【０３４５】
別の実施形態において、治療されるＣＸＣＲ４介在性健康状態は骨髄支持細胞の腫瘍部分への移動である。
【０３４６】
ＣＴＣＥ−９９０８（ＣＸＣＲ４シグナル伝達を妨害する二量体ペプチド）の経動脈的化学塞栓術との併用について調査する肝細胞性癌腫における第２相試験が開始されている。仮説は、転移過程を妨害することに加えて経動脈的化学塞栓法の後に腫瘍による骨髄由来支持細胞の補充をＣＴＣＥ−９９０８が妨げるであろうというものである。
【０３４７】
別の実施形態において、治療されるＣＸＣＲ４介在性健康状態はＣＸＣＲ４＋細胞の炎症部位への移動である。
【０３４８】
ＣＸＣＲ４は炎症における役割を果たすことが知られている。その他のサイトカインのように、ＳＤＦ−１は免疫システムのＣＸＣＲ４＋細胞を炎症部位に誘引することで炎症に寄与する。その相互作用の妨害は様々な炎症性疾患、及び、自己免疫疾患、例えば、リウマチ性関節炎によい可能性がある。ＣＸＣＲ４アンタゴニストである小分子薬剤候補ＡＭＤ３４６５は、肺肉芽腫形成の住血吸虫性抗原誘引モデルにおけるＴｈ２介在性炎症反応を抑止することが示されてきた（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ，  ２００６）。
【０３４９】
さらに別の実施形態において、治療されるＣＸＣＲ４介在性健康状態はウィルス感染、特に、ＨＩＶ感染のようなレトロウィルス感染、又は、ＣＸＣＲ４を受容体として用いる任意のその他のウィルスの感染である。
【０３５０】
かなりの部分のＨＩＶ株は感染の間にＣＸＣＲ４を共受容体として用いる（Ｘ４  ＨＩＶ株）。ＣＸＣＲ４受容体を妨害することは感染を阻止するのに非常に効果的であることが示されてきた。ＡＭＤ３１００はヒトにおけるインビトロとインビボの両方の治験において非常に高い効力でＸ４  ＨＩＶ株のＣＸＣＲ４株への侵入を抑制することが示されてきた。この化合物の増大した生物学的利用能を有する誘導体であるＡＭＤ０７０は現在、ＨＩＶの治療のための第２相試験の段階にある。その他のいくつかのＣＸＣＲ４に対するアンタゴニストがこの目的について様々な開発段階にある。
【０３５１】
さらに別の実施形態において、治療されるＣＸＣＲ４介在性健康状態は骨髄に保持される幹細胞を動員することが望ましい健康状態である。そのような幹細胞の動員はＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１相互作用を妨害することにより達成されることができ、これにより、例えば、免疫システムの回復、例えば、全身性放射線照射、骨髄移植、又は、非ホジキンリンパ腫、若しくは、多発性骨髄腫のような血液癌の後に必要とされる免疫システムの回復が可能になる。そのような方法はこれらの健康状態、及び、造血幹細胞の移植を必要とする、又は、それから利益を得ることができるであろうその他の任意の疾病を治療するのに有用である。
【０３５２】
２００９年１月にジェンザイム（Ｇｅｎｚｙｍｅ）社は、造血幹細胞の移植を必要とする非ホジキンリンパ腫、又は、多発性骨髄腫の患者に注射可能な薬剤として小分子ＣＸＣＲ４阻害剤プレリキサフォル（ｐｌｅｒｉｘａｆｏｒ）（以前のＡＭＤ３１００）をモゾビル（ＭｏｚｏｂｉｌTM）の商標で販売するＦＤＡの認可を得た。この製品はＧ−ＣＳＦと併用して自家幹細胞動員のために使用されることが意図される。骨髄間質より分泌されたＳＤＦ−１がこの場合幹細胞を活性型の状態で骨髄の中に留め置くことに寄与しているため、ＣＸＣＲ４とＳＤＦ−１の間の相互作用を妨害することにより末梢血中の白血球数とＣＤ３４＋細胞数の両方がかなり増加することが示されてきた。この適応のため開発中のその他のいくつかのＣＸＣＲ４アンタゴニストが存在する。
【０３５３】
さらに別の実施形態において、ＣＸＣＲ４に媒介されるシグナル伝達を妨害することにより腫瘍細胞がその他の治療化合物、例えば、化学療法薬剤での処理に敏感になる。したがって、化学療法薬剤との併用治療が特に好まれる。そのような実施形態は血液癌の治療に特に有用である。
【０３５４】
２００９年１２月に、ゲンザイム社は、化学療法との併用でモゾビル（登録商標）（プレリキサフォル注射液）が骨髄により保護される白血球細胞に治療上の効果を与えることができることを示唆する初期治験データ―が第１相／第２相試験によりもたらされたと発表した。その治験において、モゾビルは化学療法（ＭＥＣ投与計画：ミトキサントロン、エトポシド、及び、シタラビン）の前の事前調整ストラテジーとして再発性、若しくは、難治性急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の患者に与えられた。治験参加者の多くは、前処置に続いて、前処置に無応答性であるか短期の寛解を有するかのどちらかであった。引き続いての評価に利用可能な患者のうち、５０％の患者において完全な寛解（ＣＲ又はＣＲｉ）を研究者は観察した。同様の治験がその他の血液癌について開始された。
【０３５５】
上述される実施形態は様々な疾病の治療に使用され得る。
【０３５６】
ＣＸＣＲ４の発現上昇が示された腫瘍タイプの例は乳腺癌、前立腺癌、直腸結腸癌、膵臓癌、悪性、若しくは、転移性黒色腫、これらに限定されないが、口腔扁平上皮癌、及び、鼻咽頭癌を含む頭部頸部癌、食道癌、これらに限定されないが、神経膠腫、及び、髄膜腫を含む脳腫瘍、白血病、非ホジキンリンパ腫のようなリンパ腫、神経芽細胞腫、その他の小児癌、腎臓癌、血管芽腫、フォンヒッペル・リンドウ病、肺腫瘍（ＳＣＬＣとＮＳＣＬＣの両方）、肝臓癌、卵巣癌、子宮頸部癌、甲状腺乳頭癌、及び、骨肉腫である。転移性癌の治療、又は、癌細胞侵襲の抑制は特に好ましい。
【０３５７】
ＣＸＣＲ４介在性疾病、又は、疾患はまた、炎症、又は、自己免疫疾患に関連する疾病、又は、健康状態でもあり得る。好ましい疾病、又は健康状態には、（１）全身性アナフィラキシー、若しくは、過敏性応答、薬品アレルギー、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症（ＡＢＰＡ）、昆虫刺傷アレルギー、及び、食物アレルギーのようなアレルギー性疾病、（２）クローン病、潰瘍性大腸炎、回腸炎、及び、腸炎のような炎症性腸疾患、（３）膣炎、（４）乾癬、並びに、皮膚炎、湿疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、蕁麻疹、及び、掻痒のような炎症性皮膚炎、（５）血管炎、（６）脊椎関節症、（７）強皮症、（８）喘息、及び、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、慢性閉塞性肺疾患、過敏性肺疾患などのようなアレルギー性呼吸器疾患、（９）（リューマチ性、及び、乾癬性）関節炎、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、Ｉ型糖尿病、糸球体腎炎などのような自己免疫疾患、（１０）（同種移植片拒絶、移植片体宿主病を含む）移植片拒絶、並びに、（１１）アテローム硬化症、筋炎、Ｔ細胞介在性神経変性疾患、多発性硬化症、脳炎、髄膜炎、肝炎、腎炎、敗血症、サルコイドーシス、アレルギー性結膜炎、耳炎、キャッスルマン病、副鼻腔炎、ＬＰＳ−誘導エンドトキシンショック、ベーチェット症、及び、痛風のような望ましくない炎症性反応が抑制されなくてはならないその他の疾病が含まれる。リューマチ性関節炎、及び、Ｔｈ２介在性炎症は本発明の抗体で治療される特に好ましい疾病である。
【０３５８】
本明細書において使用されるように、「異常増殖」という用語は正常な、本来の、又は、予想される進行から逸脱する細胞増殖を意味する。例えば、異常な細胞増殖にはそのＤＮＡ、又は、その他の細胞性成分が損傷を受けた、又は、欠陥を持つようになった細胞の不適切な増殖が含まれることができる。
【０３５９】
異常な細胞増殖には、その特徴が不適切に高レベルの細胞分裂、不適切に低レベルのアポトーシス、又は、両方が原因となる、いずれかに媒介される、又は、いずれかが結果となる徴候に関連する細胞増殖が含まれ得る。そのような徴候は、例えば、癌性の、若しくは、非癌性の、良性の、若しくは、悪性の細胞、細胞集団、又は、組織の単発性局所増殖、若しくは、多発性局所増殖により特徴づけられ得る。
【０３６０】
本明細書における「腫瘍」へのどんな言及もまた「癌」、又は、「癌腫」を意味する。転移性癌はまた、原発腫瘍からの転移の低減が可能であるように、治療されることができる。外科手術後の患者に残るいわゆる微小残存病変（ＭＲＤ）は抗ＣＸＣＲ４抗体を用いる免疫治療について受けることができる可能性がある。
【０３６１】
したがって、本発明は、そのような疾病を有する動物、又は、患者に治療上有効量の本発明の抗ＣＸＣＲ４抗体、又は、そのような抗ＣＸＣＲ４抗体の抗原結合断片、又は、免疫複合体を投与することを含む、上述した疾病を治療する方法及び使用をさらに提供する。
【０３６２】
本発明のそのうえにさらなる態様は本発明の抗体、又は、そのような抗体の抗原結合断片、又は、免疫複合体を治療、画像化、又は、診断において用いられる組成物、又は、薬品の製造において使用することを提供する。
【０３６３】
そのうえにさらなる態様は、治療、診断、又は、画像化において使用される本発明の抗体、又は、そのような抗体の抗原結合断片、又は、免疫複合体を提供する。
【０３６４】
さらに、本発明は本発明の抗体、又は、そのような抗体の抗原結合断片、又は、免疫複合体を１つ以上の薬剤的に許容できる賦形剤、担体、希釈剤、緩衝液、又は、安定化剤と共に含む組成物を提供する。
【０３６５】
本明細書において記載されるインビボの方法は一般的に哺乳類動物において行われる。任意の哺乳類、例えば、ヒトや任意の家畜、家畜動物、又は、実験動物が処置され得る。具体的な例には、マウス、ラット、ブタ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ウサギ、ウシ、及び、サルが含まれる。しかしながら、好ましくは、その哺乳類動物はヒトである。
【０３６６】
したがって、本明細書で使用される「動物」又は「患者」という用語には任意の哺乳類、例えば、ヒトや任意の家畜、家畜動物、又は、実験動物が含まれる。具体的な例には、マウス、ラット、ブタ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ウサギ、ウシ、及び、サルが含まれる。しかしながら、好ましくは、その哺乳類動物はヒトを対象としている。
【０３６７】
本発明は、先に定義された疾患を未結合の、又は、裸の抗体、及び、その断片を用いて治療する方法、並びに、本発明の抗体、又は、その抗原結合断片が治療薬、又は、診断薬と機能するように結合する免疫複合体を使用するＣＸＣＲ４＋細胞（好ましくは、ＣＸＣＲ４＋腫瘍細胞、又は、ＣＸＣＲ４＋免疫系細胞、例えば、ＨＩＶのＣＸＣＲ４指向性株が感染することができる細胞）を標的とする方法の両方を関連付ける。特別に言及しない限り、又は、科学用語で明確にされない限り、本明細書において使用する「抗体、及び、その断片」という用語は、それ故、別の薬剤、特に、治療薬、又は、診断薬と結合していない「未結合の、又は、裸の」抗体、又は、断片を意味する。これらの定義は、例としてのみ挙げるが、抗体の生物学的半減期、親和性、結合活性、若しくは、その他の活性を改善するための修飾、又は、抗体のその他の作用因子との統合のような抗体の修飾を排除するものではない。
【０３６８】
本発明の治療法、及び、使用はまた、未結合の、又は、裸の抗体と免疫複合体の両方の使用を包含する。免疫複合体ベースの治療法において、本発明の抗体、又は、その抗原結合断片は、好ましくは、第２の治療薬（抗ＣＸＣＲ４抗体そのものは第１治療薬である）と機能するように結合する。
【０３６９】
適切な治療薬は、治療される疾患、若しくは、健康状態に応じて、及び／又は、望ましい治療作用機構に応じて選択されることができる。
【０３７０】
例えば、望ましい作用機構が拮抗的であり、例えば、標的ＣＸＣＲ４＋細胞の細胞性シグナル伝達を調節する、例えば、標的細胞内部のシグナル伝達を調節する、又は、標的細胞から別の細胞へのシグナル伝達を調節する、又は、ＣＸＣＲ４＋細胞、例えば、腫瘍細胞、若しくは、炎症性反応、若しくは、自己免疫性反応に関与する免疫系の細胞、若しくは、ＨＩＶのようなウイルスの感染に感受性の細胞の機能／シグナル伝達を下方制御する、若しくは、抑制するとき、適切な薬剤は、抗炎症薬剤、例えば、副腎皮質ステロイド類（好ましくはグルココルチコイド）、又は、ＣＯＸ−２阻害剤、スルホンアニリド類、リコフェロン及び、ω−３脂肪酸のような非ステロイド性抗炎症薬剤（ＮＳＡＩＤ）、ステロイドアンタゴニスト、サイトカイン、若しくは、ケモカインアンタゴニスト、又は、サイトカイン発現、若しくは、ケモカイン発現の阻害剤のような免疫調節性治療薬であり得る。別の薬剤は、アンジオスタチン、エンドスタチン、アンジオポイエチン類のいずれか一つ、バスキュロスタチン、カンスタチン及びマスピンなどの血管新生の阻害剤であり得る。別の薬剤は、成長因子受容体、例えば、ＩＧＦ−１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）、ＩＧＦ−２Ｒ、ＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ−３）、及び、ＦＧＦＲのようなＥＧＦＲ  ＩＧＦ受容体の阻害剤のような追加のシグナル伝達系の阻害剤であり得る。
【０３７１】
ＣＸＣＲ４＋細胞の成長の抑制が（例えば、癌の治療において）望ましい作用機構である場合、成長抑制作用を有する適切な薬剤、例えば、ステロイド受容体（例えば、エストロゲン受容体）の阻害剤のような細胞増殖抑制性治療薬が選択されることができる。
【０３７２】
細胞殺滅が望みの作用機構であるとき、放射線治療薬、又は、ＡＴＰ分解酵素阻害剤のような適切な細胞毒性薬剤が選択されることができる。
【０３７３】
癌の治療のために、適切な抗癌剤もまた使用されることができる。
【０３７４】
あるいは、抗ウィルス性適用、例えば、ＨＩＶの治療において、適切な抗ウィルス剤が追加の治療として使用されることができる。
【０３７５】
ある疾病、又は、疾病の段階について多数の作用機構が適切である可能性があり、そして、もしその通りならば、多数の追加の治療薬が用いられることができるということを特に言及することは重要である。多数の薬剤は多数の作用、又は、状況に応じて異なる作用を持つことを特に言及することもまた重要である。シグナル伝達系の妨害は腫瘍細胞の移動、並びに、腫瘍の成長の両方への作用を有することができる。多数の化学療法剤もまた１つより多い機能を有する。ケモカインとそのアンタゴニストは、抗炎症性適用と比較して癌との関係で様々な作用を持つことができる。しかしながら、疾病、疾病の段階、及び、望みの作用機構に応じて適切な追加の治療薬を選択することは十分に当業者の能力の範囲内であろう。
【０３７６】
追加の治療薬は免疫複合体の形態で提供されることができるが、もしこちらのほうがより適切であれば、例えば、様々な薬剤が一緒に（例えば、混合物として）、別々に、又は、順次投与される複合療法で代わりに提供されることができる。
【０３７７】
前述した治療法、及び、使用は、動物、又は、患者に経皮的注入、筋肉内注入、静脈内注入などによるように全身的に医薬的に効果がある組成物を投与することを一般的に含むであろう。しかしながら、治療薬が腫瘍部位、又は、炎症部位、又は、ウィルス感染部位のようなその他の適切な部位に局在することを可能にする任意の投与経路が許容できるであろう。それ故、その他の適切な送達経路には経口経路、経鼻経路、又は、経呼吸器経路、及び、経局所経路が含まれる。
【０３７８】
本明細書で使用される「投与」は、治療上の作用、例えば、抗腫瘍作用、抗炎症作用、又は、抗ウィルス作用を及ぼすのに効果的な量、及び、効果的な期間、抗ＣＸＣＲ４抗体治療薬を提供、又は、送達することを意味する。タンパク質性の治療薬の受動的投与は、部分的にはその単純さと再現性のため、一般に好まれる。
【０３７９】
しかしながら、「投与」という用語は本発明の抗ＣＸＣＲ４抗体が送達される、又は、そうでなければ標的部位に提供される一切の手段を意味するために本明細書において使用される。「投与」は、それ故、標的部位へ結果的に送達するのに効果的な方法で本発明の抗ＣＸＣＲ４抗体を生産する細胞を提供することを含む。そのような実施形態において、その細胞を選択的な透過性がある膜、構造、又は、移植可能な装置で、一般的に治療を止めるために取り外すことが可能であるものに製剤する、又は、詰めることが望ましい可能性がある。本発明の外来性抗ＣＸＣＲ４抗体は、用量がほぼモニターされ、制御されることを可能にする非侵襲性の方法を意味するので、なお全般的に好まれるであろう。
【０３８０】
本発明の治療法及び使用はまた、腫瘍の近辺でそれらが発現することとなる、又は、標的部位へ局在することとなるのに効果的な方法で本発明の抗ＣＸＣＲ４抗体をコードする核酸が提供されることにまで及ぶ。裸ＤＮＡ送達、組換え遺伝子とベクター、患者の細胞の生体外での操作を含む細胞ベースの送達などのような任意の遺伝子治療技術が用いられ得る。
【０３８１】
本発明の抗ＣＸＣＲ４抗体はまた、標的部位にその他の治療薬、又は、診断薬を送達するために使用されることができる。そのような実施形態において、その他の治療薬、又は、診断薬は一般に機能するように本発明の抗ＣＸＣＲ４抗体に結合される。
【０３８２】
本発明で使用される「治療上有効量」は、ＣＸＣＲ４リガンドのＣＸＣＲ４への結合を抑制するのに、ＣＸＣＲ４リガンドに対するＣＸＣＲ４介在的細胞性反応を抑制するのに、好ましくはＣＸＣＲ４リガンドに対する反応でカルシウムイオンを放出することを抑制するのに、若しくは、ＣＸＣＲ４＋細胞の移動を抑制するのに、炎症を低減するのに、転移の形成を抑制するのに、癌細胞侵襲を抑制するのに、腫瘍成長を抑制するのに、腫瘍血管新生を抑制するのに、ＣＸＣＲ４＋腫瘍を持つ動物、若しくは、患者への投与に基づく腫瘍退縮、若しくは、寛解を誘導するのに、ＣＸＣＲ４指向性ＨＩＶ株の拡散を制限するのに、及び／又は、作用機構が細胞殺滅を含むとき標的ＣＸＣＲ４＋細胞の少なくとも一部を特異的に殺滅するのに効果的な本発明の抗ＣＸＣＲ４抗体、若しくは、その免疫複合体の量である。そのような作用は、正常で健康な組織に含まれる細胞にほとんど、若しくは、全く結合せず、そのような細胞をほとんど、若しくは、全く殺さず、そして、動物、若しくは、患者の正常で健康な組織に無視できる、若しくは、制御できる有害な副作用をおよぼす間に達成されることが好ましい。
【０３８３】
「標的部位」は、疾患を媒介する、又は、異常に増殖して疾患の原因となる、若しくは、疾患を悪化させるＣＸＣＲ４＋細胞の位置を意味する。したがって、標的部位は、例えば、腫瘍、又は、ＣＸＣＲ４介在性炎症の部位であることができる。「標的細胞」は、疾患を媒介する、又は、異常に増殖して疾患の原因となる、若しくは、疾患を悪化させるＣＸＣＲ４＋細胞である。したがって、標的細胞は、例えば、ＣＸＣＲ４＋腫瘍細胞、免疫系の細胞、例えば、（抗炎症性適用／抗自己免疫疾患性適用に関して）ＣＸＣＲ４＋白血球、若しくは、ＣＸＣＲ４指向性ＨＩＶ株により標的とされるＣＸＣＲ４＋免疫細胞を含むことができる。
【０３８４】
ＣＸＣＲ４＋腫瘍細胞、（抗炎症性適用／抗自己免疫疾患性適用に関して）ＣＸＣＲ４＋白血球のようなＣＸＣＲ４＋細胞の殺滅、又は、炎症の低減、又は、腫瘍退縮、若しくは、寛解の誘導との関係で本明細書において使用される「優先的に」及び「特異的に」という用語は、標的部位に実質的に限定され、動物、又は、患者の正常で健康な組織における破壊を引き起こすことにまでは実質的に及ばないＣＸＣＲ４＋標的細胞の破壊、例えば、腫瘍細胞破壊を達成するために本発明の抗ＣＸＣＲ４抗体、又は、その免疫複合体が機能することをしたがって意味する。
【０３８５】
本発明の抗ＣＸＣＲ４抗体、又は、治療用複合体は１つ以上の放射線治療薬、化学療法薬剤、抗血管新生薬剤、アポトーシス誘導薬剤、抗チューブリン薬剤、抗細胞性、若しくは、細胞毒性薬剤、サイトカイン、若しくは、ケモカインアンタゴニスト、サイトカイン、若しくは、ケモカイン発現の阻害剤、ＡＴＰ分解酵素阻害剤、抗炎症薬剤、（例えば、二特異性抗体のような）その他の抗体、又は、血液凝固薬（血液凝固因子）、又は、副腎皮質ステロイド類、好ましくはグルココルチコイド、若しくは、非ステロイド性抗炎症薬剤（ＮＳＡＩＤ）のような抗炎症薬剤と結合することが好ましい。
【０３８６】
したがって、本発明は、抗ＣＸＣＲ４抗体が少なくとも１つのその他の治療薬、又は、診断薬と機能するように結合する、ある範囲の結合済みの抗体、及び、その断片を提供する。「免疫複合体」という用語は、抗体の別の有効な薬剤との機能可能な会合を定義するために広く使用され、任意の機能可能な会合を単に意味することを意図されるのではなく、化学的な「結合」に特に限定されるのではない。組換え融合タンパク質が特に考慮される。送達薬剤、又は、標的薬剤が標的に結合することができ、治療薬、又は、診断薬が送達されたうえで十分に機能的である限り、結合の方式は適切であろう。
【０３８７】
薬剤の炭水化物部分を介した抗体への結合もまた考慮される。Ｏ結合型とＮ結合型の両方のグリコシル化が抗体において自然に起こる。組換え体の抗体は、望ましい場合、（Ｘがプロリンを除く任意のアミノ酸であるアスパラギン−Ｘ−セリン、アスパラギン−Ｘ−トレオニン、セリン、又は、トレオニンのような）適切なアミノ酸配列を操作することで簡単に獲得される付加的なグリコシル化部位を抗体の１次配列に再形成する、又は、形成するために修飾されることができる。
【０３８８】
本発明の抗ＣＸＣＲ４抗体、又は、治療用結合体、及び、関連する方法と使用において現在使用するのに好ましい薬剤はその抗体の作用を補完し、又は、強化する薬剤、及び／又は、特定のタイプの疾患（例えば、腫瘍のタイプ）、若しくは、患者について選択される薬剤である。
【０３８９】
「抗体の作用を補完し、又は、強化する治療薬」は放射線治療薬、化学療法薬剤、抗血管新生薬剤、アポトーシス誘導薬剤、抗チューブリン薬剤、抗細胞性、若しくは、細胞毒性薬剤、血液凝固薬、サイトカイン、若しくは、ケモカインアンタゴニスト、サイトカイン、若しくは、ケモカイン発現の阻害剤、ＡＴＰ分解酵素阻害剤、副腎皮質ステロイド類、好ましくはグルココルチコイド、若しくは、非ステロイド性抗炎症薬剤（ＮＳＡＩＤ）のような抗炎症薬剤、その他の抗体（例えば、二特異性抗体）、抗体との使用が好ましいこれらのうちのいずれか１つ以上を含む。
【０３９０】
現在好まれる抗癌剤、特に抗白血病薬剤にはダウノルビシン、ドキソルビシン、シタラビン、６−チオグアニン、ミトキサントロン、ブスルファン（マイレラン（登録商標））、ダサチニブ（スプリセル（商標））、プレドニゾン、ビンクリスチン硫酸塩（オンコビン（登録商標））、クロラムブシル、フルダラビン、ペントスタチン、及び、クラドリビンのようなアントラサイクリン系薬剤が含まれる。
【０３９１】
現在好まれる抗血管新生薬剤にはアンジオスタチン、エンドスタチン、アンジオポイエチン類のいずれか１つ、バスキュロスタチン、カンスタチン、及び、マスピンが含まれる。
【０３９２】
本明細書において使用される「抗チューブリン薬剤」は、好ましくは細胞の有糸分裂に必要なチューブリンの活性を、好ましくはチューブリンの重合、又は、脱重合を直接的に、又は、間接的に阻害することによって細胞の有糸分裂を抑制する任意の薬剤、薬品、前駆薬、又は、それらの組合せを意味する。現在好まれる抗チューブリン薬剤には、コルヒチン、タキソール、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、及び、コンブレタスタチン類の１つ以上が含まれる。
【０３９３】
現在好まれるＮＳＡＩＤにはＣＯＸ−２阻害剤、スルホンアニリド類、リコフェロン、及び、ω−３脂肪酸が含まれる。
【０３９４】
前記の好ましい薬剤の本発明の抗ＣＸＣＲ４抗体との結合、又は、会合は、例えば、抗腫瘍特性、若しくは、抗炎症特性のような強化された治療上の特性、及び、相乗的な治療上の特性さえをしばしば持つ「免疫複合体」を生じる。
【０３９５】
抗細胞性、若しくは、細胞毒性薬剤の使用は（適切な場合、）本発明の抗ＣＸＣＲ４抗体「免疫毒」となり、一方、血液凝固因子の使用は本発明の抗ＣＸＣＲ４抗体「コアグリガンド」となる。
【０３９６】
上記の薬剤の１つ以上の組合せのような少なくとも２つの治療薬の使用もまた考慮される。
【０３９７】
ある適用において、本発明の抗ＣＸＣＲ４抗体治療薬は、細胞を殺す、又は、細胞の成長、若しくは、細胞分裂を抑制する能力を持つ細胞毒性薬剤、細胞増殖抑制薬剤、又は、そうでなければ抗細胞性薬剤に機能するように結合するであろう。適切な抗細胞性薬剤には化学療法薬剤、並びに、細胞毒物、及び、細胞増殖抑制薬剤が含まれる。細胞増殖抑制薬剤は一般的に標的細胞の自然な細胞周期を妨害し、その結果、好ましくは細胞を細胞周期から外す薬剤である。
【０３９８】
化学療法薬剤の例にはステロイド類のようなホルモン、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル、メトトレキサート、若しくは、アミノプテリンのような抗代謝物、アントラサイクリン類、マイトマイシンＣ、ビンカアルカロイド類、抗生物質、デメコルシン、エトポシド、ミトラマイシン、及び、クロラムブシル、若しくは、メルファランのような抗腫瘍アルキル化剤が含まれる。ある好ましい抗細胞性薬剤にはダウノルビシン、ドキソルビシン／アドリアマイシンなどのＤＮＡ合成阻害剤が含まれる。総合的に見て、タキソール／パクリタキセル、ドセタキセル、シスプラチン、ゲムシタビン、コンブレタスタチン、及び、ドキソルビシン／アドリアマイシンは現在好まれる抗癌剤である。
【０３９９】
プシンベリン、ペデリン、イルシニアスタチンＡのようなタンパク質合成阻害剤がそうであるようにサリシリハラミド、コンカナマイシン、又は、バフィロマイシンのようなＶ型ＡＴＰ分解酵素阻害剤もまた現在好まれる。
【０４００】
その他の潜在的な薬剤と比較して、ほとんどの毒素は細胞殺滅作用をもたらす能力がずっと大きいため、ある治療上の適用において毒素部分が好まれるであろう。それ故、本発明の抗ＣＸＣＲ４抗体コンストラクトについて好まれるある抗細胞性薬剤は植物由来の、真菌由来の、又は、細菌由来の毒素である。毒素の例にはエピポドフィロトキシン類、バクテリアエンドトキシン若しくはバクテリアエンドトキシンのリピッドＡ部分、サポリン若しくはゲロニンのようなリボソーム不活性化タンパク質、ａ−サルシン、アスペルギリン、レストリクトシン、胎盤性リボヌクレアーゼのようなリボヌクレアーゼ類、ジフテリア毒素、及び、シュードモナス外毒素が含まれる。現在好まれる例はリシン、ゲロニン、アブリン、ジフテリア毒素、シュードモナス毒素、及び、百日咳毒素である。
【０４０１】
ある好まれる毒素はリシンＡ鎖のようなＡ鎖毒素である。最も好まれる毒素部分はしばしば、炭水化物残基を修飾する、又は、除去するために処理されたリシンＡ鎖、いわゆる、脱グリコシル化Ａ鎖（ｄｇＡ）である。脱グリコシル化リシンＡ鎖は、その非常な効力、比較的長い半減期のため、そして、臨床グレードと臨床規模でそれを製造することが経済的に可能であるため好まれる。組換え体の、及び／又は、短縮型のリシンＡ鎖もまた使用されることができる。
【０４０２】
本発明の抗ＣＸＣＲ４抗体は血液凝固を促進することができる成分、すなわち、血液凝固薬を含むことができる。ここに、標的抗体は直接、又は、間接的に、例えば、別の抗体を介して、血液凝固を直接的に、又は、間接的に促進する因子に結合することができる。
【０４０３】
そのような使用に好まれる血液凝固因子は組織因子（ＴＦ）、並びに、短縮型ＴＦ（ｔＴＦ）、二量体の、三量体の、重合体の／多量体のＴＦ、及び、第ＶＩＩ因子を活性化する能力を欠く変異型ＴＦのようなＴＦ派生物である。その他の適切な血液凝固因子には第ＩＩ／ＩＩａ因子、第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子、第ＩＸ／ＩＸａ因子、及び、第Ｘ／Ｘａ因子のようなビタミンＫ依存的血液凝固因子、Ｇｌａ化修飾を欠くビタミンＫ依存的血液凝固因子、ラッセルクサリヘビ蛇毒第Ｘ因子活性化因子、トロンボキサンＡ2、及び、トロンボキサンＡ2合成酵素のような血小板活性化化合物、並びに、α２抗プラスミン因子のような繊維素溶解阻害剤が含まれる。総合的に見て、短縮型組織因子（ｔＴＦ）が現在好まれる。
【０４０４】
免疫複合体と免疫毒素の調製は一般的に本分野において周知である（米国特許第４，３４０，５３５号を参照のこと。）免疫毒素の生成、精製、及び、使用に関する本教示をさらに補足する目的で次の特許、米国特許第６，００４，５５４号、米国特許第５，８５５，８６６号、米国特許第５，９６５，１３２号、米国特許第５，７７６，４２７号、米国特許第５，８６３，５３８号、米国特許第５，６６０，８２７号、及び、米国特許第６，０５１，２３０号のそれぞれは参照により本明細書にさらに組み入れられる。
【０４０５】
様々な化学療法薬剤、及び、その他の医薬剤はまた、本発明の抗ＣＸＣＲ４抗体治療薬にうまく結合することができる。抗体に結合した抗新生物薬剤の例にはドキソルビシン、ダウノマイシン、メトトレキサート、及び、ビンブラスチンが含まれる。さらに、ネオカルジノスタチン、マクロマイシン、トレニモン、及び、α−アマニチンのようなその他の薬剤の結合が記載されてきた（米国特許第５，６６０，８２７号、米国特許第５，８５５，８６６号、及び、米国特許第５，９６５，１３２号を参照のこと。各々は本明細書に組み入れられる。）。
【０４０６】
コアグリガンドの調製もまた容易に実行される。１つ以上の血液凝固因子の本発明の抗ＣＸＣＲ４抗体との機能可能な会合は免疫毒素について上述された結合のような直接的な結合である可能性がある。あるいは、機能可能な会合は、その抗体が第２の結合領域、好ましくはその血液凝固因子に結合する抗体、又は、抗体の抗原結合領域に機能するように結合するような間接的な結合である可能性がある。血液凝固因子はその機能性血液凝固部位とは異なる部位、特に、共有結合がその分子を結合させるために使用される部位において本発明の抗ＣＸＣＲ４抗体と結合されなくてはならない。
【０４０７】
二特異的抗体、又は、三特異的抗体はまた、本発明の方法において使用され得る。そのような抗体において、１本の腕がＣＸＣＲ４に結合し、それは本発明の抗体である。二特異的抗体を調製する方法は周知であり、本分野において記述されている。
【０４０８】
免疫複合体、免疫毒素、及び、コアグリガンドの調製において、組換え体の発現が用いられ得る。本発明の選択された抗ＣＸＣＲ４抗体、及び、治療薬、毒素、又は、血液凝固薬をコードする核酸配列が発現ベクターにインフレームで結合される。組換え体の発現により核酸が翻訳され、望みの免疫複合体を生じる。化学架橋剤、及び、アビジン：ビオチン架橋もまた治療薬を本発明の抗ＣＸＣＲ４抗体に結合させることができる。
【０４０９】
本発明の組成物及び方法はその他の治療法と診断法と併用されることができる。本発明に従って抗ＣＸＣＲ４抗体と「組み合わせて」用いられる生物学的薬剤、好ましくは診断薬、又は、治療薬について、「組み合わせて」という用語はある範囲の実施形態を包含するために簡潔に用いられる。「組み合わせて」という語法は、特別に言及されない限り、又は、科学用語で明確にされない限り、様々な形式の組み合わされた組成物、医薬品、混合物、キット、方法、並びに、第１医薬用途、及び、第２医薬用途に当てはまる。
【０４１０】
本発明の「組み合わされた」実施形態はしたがって、例えば、本発明の抗ＣＸＣＲ４抗体が裸の抗体であり、それに機能するように結合していない薬剤、又は、治療薬と併用される点を含む。そのような場合、その薬剤、又は、治療薬は非標的型形態、又は、標的型形態で使用されることができる。「非標的型形態」において、その薬剤、特に、治療薬は本分野におけるその標準的な使用にしたがって一般的に用いられるであろう。「標的型形態」において、その薬剤は、標的疾病部位にその薬剤、又は、治療薬を送達する別個の抗体、又は、標的領域に一般に機能するように結合されるであろう。そのような標的型形態の生物学的薬剤、診断薬と治療薬の両方の使用はまた本分野においてきわめて標準的である。
【０４１１】
本発明のその他の「組み合わされた」実施形態において、本発明の抗ＣＸＣＲ４抗体は、抗体がそれ自体機能するように薬剤、又は、治療薬と会合する、又は、結合する免疫複合体である。機能可能な結合には本明細書において記載され、そして、本分野において既知である直接的な結合、及び、間接的な結合のあらゆる形態が含まれる。
【０４１２】
「組合せ」利用、特に、前駆薬の形態である治療薬との組合せでの本発明の抗ＣＸＣＲ４抗体に関する「組合せ」利用にはまた、組み合わされた組成物、医薬品、混合物、キット、方法、並びに、第１医薬用途、及び、第２医薬用途が含まれる。そのような実施形態において、前駆薬をその薬品の機能形態に変換することができる活性化成分は本発明の抗ＣＸＣＲ４抗体と再度、機能するように会合することができる。
【０４１３】
ある好ましい実施形態において、治療用組成物、配合剤、医薬品、混合物、キット、方法、並びに、第１医薬用途、及び、第２医薬用途は「前駆薬の組合せ」であるであろう。当業者により理解されるように、「前駆薬の組合せ」という用語は、別段に言及されない限り、前駆薬を活性がある薬品に変換することができる成分に本発明の抗体が機能するように結合することを意味し、その抗体が前駆薬それ自体に結合することを意味しない。しかしながら、本発明の前駆薬の実施形態は前駆薬の組合せとして使用される必要があるという必要条件は無い。したがって、前駆薬は、本分野においてそれらが使用される、ＡＤＥＰＴとその他の形態を含む任意の方法で使用されることができる。
【０４１４】
したがって、組み合わされた組成物、医薬品、混合物、キット、方法、並びに、第１、及び、第２医薬用途が好ましくは診断薬の点で、より好ましくは、治療薬の点で記述される場合、その組合せには裸の抗体であり、免疫複合体である抗ＣＸＣＲ４抗体が含まれ、本発明のインビボの実施形態の実行には、ある複合体の、又は、非複合体の形状で、ある形態の抗体とある形態の生物学的、診断用、若しくは治療用薬剤の総合的な提供が達成される限り、裸の抗体、若しくは、免疫複合体と生物学的、診断用、若しくは、治療用の薬剤の前投与、同時投与、又は、後投与が含まれる。
【０４１５】
本発明の腫瘍への作用の前述の、及び、その他の説明は、組み合わされた操作法、結合した薬剤のタイプなどを単に説明するためになされる。この記述的アプローチは本発明の抗ＣＸＣＲ４抗体の有益な特質についての控えめな表現、又は、過度の単純化のどちらかであると解釈されてはならない。それ故、そのような抗体それ自体が抗ＣＸＣＲ４特性を持つこと、及び、そのような抗体の免疫複合体はこれらの特性を保持し、結合した薬剤の特性とそれらを統合するであろうこと、そしてさらに、その抗体と任意の結合した薬剤の統合された作用は典型的には増強される、及び／又は、拡大されるであろうことが理解されるであろう。
【０４１６】
それ故、本発明は組成物、医薬組成物、少なくとも本発明の第１抗ＣＸＣＲ４抗体、若しくは、そのような抗ＣＸＣＲ４抗体の抗原結合断片、若しくは、免疫複合体の生物学的有効量と少なくとも第２生物学的薬剤、成分、若しくは、系の生物学的有効量を、任意選択によるが、少なくとも第１組成物、若しくは、容器に含む治療キット、及び、医療用混合物を提供する。
【０４１７】
「少なくとも第２生物学的薬剤、成分、又は、系」は、多くの場合、治療薬又は診断薬、成分又は系であろうが、しかし、必ずしもそうではない。例えば、少なくとも第２生物学的薬剤、成分、又は、系は抗体の修飾のための成分、及び／又は、抗体にその他の薬剤を結合するための成分を含むことができる。ある好ましい第２生物学的薬剤、成分、又は、系は前駆薬、又は、前駆薬それ自体を作成するための成分、及び、本発明の抗体をそのような前駆薬、若しくは、ＡＤＥＰＴの実施形態において機能するように適合させるための成分を含む、前駆薬を作成し使用するための成分である。
【０４１８】
治療薬、又は、診断薬が少なくとも第２生物学的薬剤、成分、又は、系として含まれる場合、そのような治療薬、及び／又は、診断薬は典型的には先に定義された１つ以上の疾患の治療、又は、診断に関連して使用されるものであろう。
【０４１９】
したがって、ある実施形態において、「少なくとも第２治療薬」は治療キット、又は、治療用混合物に含まれるであろう。その用語は第１治療薬である本発明の抗ＣＸＣＲ４抗体と関連して選択される。本発明に従って「少なくとも第２治療薬」であることに適切である治療薬は免疫複合体との関連で先に議論されている。
【０４２０】
本発明の組成物、キット、及び／又は、医薬品に関して、組み合わされた有効量の治療薬は単一の容器、若しくは、入れ物に含まれることができ、又は、別個の容器、若しくは、入れ物に含まれることができる。混合物は一般に併用のため一緒に混合されるであろう。静脈内投与のために製剤された薬剤は、多くの場合、好まれるであろう。画像化成分もまた含まれることができる。キットはまた、含まれる少なくとも第１抗体、及び、１つ以上のその他の生物学的薬剤の使用説明書を含むことができる。
【０４２１】
一般的に言って、少なくとも第２治療薬は動物、又は、患者に本発明の抗ＣＸＣＲ４抗体と実質的に同時に、例えば、単一の医薬組成物から、又は、ほぼ一緒に投与される２つの医薬組成物から投与されることができる。
【０４２２】
あるいは、少なくとも第２治療薬は動物、又は、患者に本発明の抗ＣＸＣＲ４抗体の投与に引き続いて投与されることができる。本明細書において使用される「引き続いて」は、少なくとも第２抗癌剤が動物、又は、患者に本発明の抗ＣＸＣＲ４抗体の投与とは別の時に投与されるように「ずらされる」ということを意味する。一般に、２つの薬剤がそれらのそれぞれの治療作用を及ぼすのを可能にするように効果的に時間間隔をあけてその２つの薬剤が投与される、すなわち、２つの薬剤は「生物学的に有効な時間間隔」で投与される。少なくとも第２治療薬は動物、又は、患者に本発明の抗ＣＸＣＲ４抗体の投与の前の生物学的に有効な時間で、又は、その治療薬の後の生物学的に有効な時間で投与されることができる。
【０４２３】
したがって、本発明は、
（ａ）動物、又は、患者が腫瘍量を実質的に低減させる第１治療を受けるようにさせること、及び、
（ｂ）その後、任意選択的に第２治療薬と機能するように会合する、少なくとも本発明の第１抗ＣＸＣＲ４抗体、又は、その抗原結合断片を投与することを含む、腫瘍を有する動物、又は、患者を治療する方法を提供する。
【０４２４】
好ましい第１治療には外科的切除、及び、化学療法的介入が含まれる。
【０４２５】
別の実施形態において、本発明は、
（ａ）動物、又は、患者が炎症のようなＣＸＣＲ４が介在する負荷を実質的に低減させる第１治療を受けるようにさせること、及び、
（ｂ）その後、任意選択的に第２治療薬と機能するように会合する、少なくとも本発明の第１抗ＣＸＣＲ４抗体、又は、その抗原結合断片を投与することを含む、ＣＸＣＲ４介在性疾患を有する動物、又は、患者を治療する方法を提供する。
【０４２６】
ある別の実施形態において、本発明の抗体と免疫複合体は１つ以上の診断薬、典型的には、先に定義された疾患の診断に関して使用される診断薬と組み合わされることができる。ある範囲の診断用組成物、キット、及び、方法はしたがって本発明に含まれる。
【０４２７】
そのうえにさらなる態様は、適切な量の本明細書において定義される本発明の抗体、又は、タンパク質を患者に投与することを含み、そして、その患者における本発明の抗体、若しくは、その他のタンパク質の存在、及び／又は、量、及び／又は、位置を検出する患者の診断法、又は、画像化法である。
【０４２８】
ある実施形態において、本発明は、ある動物において本発明の抗体とＣＸＣＲ４の間に複合体を形成するのに有効な量のその抗体、又は、その免疫複合体をその動物に投与することを含み、それにより動物におけるＣＸＣＲ４発現に関連する免疫抑制を低下させる方法を提供する。
【０４２９】
上述された使用と方法に従う画像化される、又は、診断される適切な疾病には本明細書のどこかに記載されるＣＸＣＲ４関連疾病と好ましくは本明細書のどこかに記載される任意の癌が含まれる。
【０４３０】
ある実施形態において、本発明は、
（ａ）動物から採取された試験サンプルを本発明の抗体、又は、その免疫複合体と接触させる工程を含む動物において疾病を診断する方法を提供する。
【０４３１】
さらなる実施形態において、本発明は、
（ａ）動物から採取された試験サンプルを本発明の抗体、又は、その免疫複合体と接触させる工程、
（ｂ）その試験サンプルにおいて抗体抗原複合体の存在、及び／又は、量、及び／又は、位置を測定する、又は、検出する工程、並びに、任意選択によるが、
（ｃ）試験サンプルにおける抗体抗原複合体の存在、及び／又は、量を対照と比較する工程を含む動物において疾病を診断する方法を提供する。
【０４３２】
上述の方法において、前記の接触させる工程は抗体抗原複合体の形成を可能にする条件で行われる。適切な条件は当業者により容易に決定されることができる。
【０４３３】
上述の方法において、任意の適切な試験サンプル、例えば、疾病に冒されているのではないかと考えられる生検の細胞、組織、若しくは、器官、又は、組織学的切片が使用されることができる。
【０４３４】
上述の方法のいくつかにおいては、試験サンプルにおける任意の量の抗体抗原複合体の存在は疾病の存在を示すであろう。好ましくは、実行される陽性の診断について、試験サンプルにおける抗体抗原複合体の量は適切な対照サンプルにおいて見つかる量よりも多い、好ましくは有意に多い。より好ましくは、有意に多いレベルとは統計学的に有意であり、好ましくは０．０５より小さい確率値で統計学的に有意である。統計学的有意性を決定する適切な方法は周知であり、本分野において記述されており、これらのいずれかが用いられることができる。
【０４３５】
適切な対照サンプルは当業者によれば適切に選択されることができるであろう。例えば、ある特定の疾病の診断の場合なら、適切な対照はその疾病を持たない患者に由来するサンプルであろう。適切な対照「値」は、対照「サンプル」を試験ごとに処理することなく、例えば、本分野において既知の正常な対象についての範囲を参照することにより容易に決定されることができるであろう。
【０４３６】
診断への応用、又は、画像化への応用における使用のために、本発明の抗体は、放射線不透過物、若しくは、3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、35Ｓ、123Ｉ、125Ｉ、131Ｉのような放射性同位体、放射線放出体（例えば、α線放出体、β線放出体、又は、γ線放出体）、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、若しくは、ルシフェリンのような蛍光化合物（フルオロフォア）若しくは化学発光化合物（クロモフォア）、アルカリフォスファターゼ、βガラクトシダーゼ、若しくは、ホースラディッシュペルオキシダーゼのような酵素、画像化剤、又は、金属イオン、又は、特定の同族の検出可能な部分、例えば、標識されたアビジン／ストレプトアビジンへの結合で検出されることができるビオチンのような化学部分のような検出可能なマーカーで標識されることができる。結合タンパク質、例えば抗体又は抗体断片に標識を付ける方法も当該分野で公知である。そのような検出可能なマーカーは、試験サンプルにおける結合タンパク質−抗原複合体の存在、量又は位置を調べることを可能にする。
【０４３７】
インビボでの使用に好ましい検出可能なマーカーにはビスマス（ＩＩＩ）、金（ＩＩＩ）、ランタン（ＩＩＩ）、若しくは、鉛（ＩＩ）のようなＸ線で検出可能な化合物、銅67、ガリウム67、ガリウム68、インジウム111、インジウム113、ヨウ素123、ヨウ素125、ヨウ素131、水銀197、水銀203、レニウム186、レニウム188、ルビジウム97、ルビジウム103、テクニチウム99m、若しくは、イットリウム90のような放射性イオン、コバルト（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、クロム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、エルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、若しくは、イッテルビウム（ＩＩＩ）のような核磁気スピン共鳴同位体、又は、ローダミン、若しくは、フルオレセインが含まれる。
【０４３８】
本発明にはまた、検出可能なシグナルを作り出す標識に直接的に、又は、間接的に結合する本発明の抗体を含む診断薬、又は、画像化剤が含まれる。適切な標識は本明細書のどこかに記載される。
【０４３９】
本発明には、本発明の抗体、免疫複合体、若しくは、組成物のうちの１つ以上、又は、本発明の抗体をコードする核酸分子のうちの１つ以上、又は、本発明の核酸配列を含む組換え発現ベクターの１つ以上、又は、本発明の組換え発現ベクター、若しくは、核酸配列を含む宿主細胞、若しくは、ウィルスの１つ以上がさらに含まれる。好ましくは、前記キットは本明細書において記載される方法と使用、例えば、本明細書において記載される治療法、診断法、若しくは、画像化法において用いられるものであり、又は、本明細書において記載されるインビトロアッセイ、若しくは、インビトロ方法において用いられるものである。そのようなキットに含まれる抗体は好ましくは本明細書のどこかに記載される抗体結合物であることができ、例えば、検出可能な部分に結合されることができ、又は、免疫複合体であり得る。好ましくは、前記キットは、例えば、診断におけるキットの構成物の使用説明書を含む。好ましくは、前記キットは本明細書のどこかに記載される疾病の診断用、又は、治療用であり、任意選択によるが、そのような疾病を診断する、又は、治療するキットの構成物の使用説明書を含む。
【０４４０】
本明細書において定義される本発明の抗体はまた、インビトロの、又は、インビボの適用とアッセイのための分子ツールとして用いられることができる。その抗体は抗原結合部位を持っているので、これらは特定の結合対の要素として機能することができ、そして、特定の結合対の要素が必要とされる任意のアッセイにおいてこれらの分子が使用されることができる。
【０４４１】
したがって、本発明のそのうえにさらなる態様は本明細書において定義される本発明の抗体を含む試薬、及び、例えば、インビトロ、又は、インビボのアッセイにおけるそのような抗体の分子ツールとしての使用を提供する。
【０４４２】
癌の治療はまた、
（ａ）腫瘍を持つ動物、又は、患者に本発明の抗ＣＸＣＲ４抗体に機能するように結合する診断薬を含み、検出できるように標識された少なくとも本発明の第１抗ＣＸＣＲ４抗体の診断的な量を投与し、それによって腫瘍の検出可能な画像を形成すること、並びに、
（ｂ）その後、同じ動物、又は、患者に少なくとも本発明の第１の裸の抗ＣＸＣＲ４抗体、又は、そのような抗体を用いる治療薬−抗体構成物の治療上最適化された量を投与し、それにより抗腫瘍作用を引き起こすことにより実行されることができる。
【０４４３】
次に、本発明を表及び図を参照しながら、以下の非制限的な実施例により更に詳細に説明する。
表１は、Ｃ−９Ｐ２１抗体に関して本明細書に開示した配列のいくつかを示す。
表２は、Ｂ−１Ｍ２２抗体に関して本明細書に開示した配列のいくつかを示す。
表３は、Ｃ−１Ｉ２４抗体に関して本明細書に開示した配列のいくつかを示す。
表４は、Ｄ−１Ｋ２１抗体に関して本明細書に開示した配列のいくつかを示す。
表５は、９Ｎ１０抗体に関して本明細書に記載した配列のいくつかを示す。
表６は、ＩｇＧ型Ｃ−９Ｐ２１抗体に関して本明細書に開示した配列のいくつかを示す。下線は可変領域を示す。
表７は、ＩｇＧ型Ｂ−１Ｍ２２抗体に関して本明細書に開示した配列のいくつかを示す。下線は可変領域を示す。
表８は、ＩｇＧ型Ｃ−１Ｉ２４抗体に関して本明細書に開示した配列のいくつかを示す。下線は可変領域を示す。
表９は、ＩｇＧ型Ｄ−１Ｋ２１抗体に関して本明細書に開示した配列のいくつかを示す。下線は可変領域を示す。
表１０は、ＩｇＧ型９Ｎ１０抗体に関して本明細書に開示した配列のいくつかを示す。下線は可変領域を示す。
表１１は、本発明の抗体に関して本明細書に開示した他の配列を示す。
【実施例】
【０４４４】
実施例１：新規抗体
ＣＸＣＲ４に特異的に結合できる５種のヒト抗体を同定した。一本鎖抗体をｃ−ｍｙｃ及び６×Ｈｉｓエピトープタグを有するｐＨＯＧ２１プラスミド（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら、１９９７）内にクローニングした。ＴＧ１細菌を形質転換し、ｓｃＦｖをＩＰＴＧ誘導により発現させた。精製ｓｃＦｖの結合をＥａｓｙＣｙｔｅで確認した。
【０４４５】
抗体の重鎖及び軽鎖を産生するクローンのヌクレオチド配列を配列決定した。抗体はＣ−９Ｐ２１、Ｂ−１Ｍ２２、Ｃ−１Ｉ２４、Ｄ−１Ｋ２１及び９Ｎ１０と命名した。Ｃ−９Ｐ２１の軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を、図１に示す。Ｃ−９Ｐ２１の軽鎖及び重鎖のＣＤＲ領域を表１に示す。Ｂ−１Ｍ２２の軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を、図２に示す。Ｂ−１Ｍ２２の軽鎖及び重鎖のＣＤＲ領域を表２に示す。Ｃ−１Ｉ２４の軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を、図３に示す。Ｃ−１Ｉ２４の軽鎖及び重鎖のＣＤＲ領域を表３に示す。Ｄ−１Ｋ２１の軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を、図４に示す。Ｄ−１Ｋ２１の軽鎖及び重鎖のＣＤＲ領域を表４に示す。９Ｎ１０の軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を、図５に示す。９Ｎ１０の軽鎖及び重鎖のＣＤＲ領域を表５に示す。
【０４４６】
更に、Ｃ−９Ｐ２１、Ｂ−１Ｍ２２、Ｃ−１Ｉ２４、Ｄ−１Ｋ２１及び９Ｎ１０抗体のＩｇＧ型を作製した。ＩｇＧ型は、ＩｇＧ１アイソタイプであり、２つの重鎖と２つの軽鎖とを有する。各重鎖は、ＶHドメイン（配列番号６９：Ｃ−９Ｐ２１、配列番号７１：Ｂ−１Ｍ２２、配列番号７３：Ｃ−１Ｉ２４、配列番号７５：Ｄ−１Ｋ２１、配列番号６９：９Ｎ１０）とヒトＩｇＧ１定常領域とを有する。各軽鎖は、ＶLドメイン（配列番号７０：Ｃ−９Ｐ２１、配列番号７２：Ｂ−１Ｍ２２、配列番号７４：Ｃ−１Ｉ２４、配列番号７６：Ｄ−１Ｋ２１、配列番号１０３：９Ｎ１０）とヒトλ軽鎖定常領域（Ｂ−１Ｍ２２及びＣ−１Ｉ２４）又はヒトκ軽鎖定常領域（Ｃ−９Ｐ２１、Ｄ−１Ｋ２１及び９Ｎ１０）とを有する。Ｃ−９Ｐ２１、Ｂ−１Ｍ２２、Ｃ−１Ｉ２４、Ｄ−１Ｋ２１及び９Ｎ１０の全ＩｇＧ配列を、それぞれ表６、７、８、９及び１０に示す。
【０４４７】
細胞及び細胞培養
ＣＣＲＦ−ＣＥＭ（急性リンパ芽球性白血病、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１１９）、ＨＥＫ２９３Ｔ／１７（ヒト腎臓、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１１２６８）、Ｒａｍｏｓ（バーキットリンパ腫、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５９６）、Ｊｕｒｋａｔ６Ｅ−１（ヒトＴ細胞白血病、ＡＴＣＣ番号ＥＣＡＣＣ）及びＤＴ４０（ニワトリリンパ腫、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２１１１）細胞株は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、ロックビル、ＭＤ）から入手した。ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、Ｒａｍｏｓ、Ｊｕｒｋａｔ及びＤＴ４０細胞はＲＰＭＩ−１６４０培養培地中に維持し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞はダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）培養培地中に維持した。全ての細胞をウシ胎児血清とともに維持し、その濃度はＤＴ４０及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞では１０％、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞、Ｊｕｒｋａｔ及びＲａｍｏｓでは２０％とした。全ての培地にペニシリン及びストレプトマイシンを添加した。
【０４４８】
Ｒａｍｏｓ及びＪｕｒｋａｔ細胞は、週に３回分割し、３×１０5細胞／ｍＬとして４８時間、週末にかけては２×１０5細胞／ｍＬとして生育させる。
ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞は、週に３回分割し、３×１０5細胞／ｍＬとして４８時間、週末にかけては２×１０5細胞／ｍＬとして生育させる。
【０４４９】
ＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞は、週に２、３回分割し、３．２×１０5細胞／ｍＬとして４８時間、週末にかけては２．７×１０5細胞／ｍＬとして生育させる。
【０４５０】
一過性トランスフェクトとして、２×１０6個のＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞をＴ７５（Ｎｕｎｃ）フラスコに播種する。播種から４８時間後に、細胞をＦｕｇｅｎｅ（Ｒｏｃｈｅ）でトランスフェクトする。各Ｔ７５について４０μＬのＦｕｇｅｎｅと１６μｇのＤＮＡを使用する。細胞は、トランスフェクションの４８時間後にアッセイに用いる。
【０４５１】
実施例２：ＣＸＣＲ４発現細胞に対する抗体クローンの結合の特異性
４種の抗体、Ｂ−１Ｍ２２、Ｃ−９Ｐ２１、Ｃ−１Ｉ２４及びＤ−１Ｋ２１のｓｃＦｖレベルでのＣＸＣＲ４に対する特異性を、ＣＸＣＲ４トランスフェクト細胞への結合能により試験した。トランスフェクト細胞と対応する非トランスフェクト細胞との相違点は、ＣＸＣＲ４の発現のみである。
【０４５２】
材料及び方法
ＤＴ４０及びＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞は上述のように維持した。
【０４５３】
ＤＴ４０＋ＣＸＣＲ４、ＨＥＫ２９３＋ＣＸＣＲ４、ＤＴ４０、ＨＥＫ２９３細胞を培養フラスコから採取し、ＰＢＳ（４００×ｇ、５分、４℃）で２回洗浄し、０．２％ＢＳＡ及び０．０９％ＮａＮ3を含有するＰＢＳに再懸濁した。１ウェル当たり１×１０5個の細胞をＶ型９６−ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ，Ｆｒｉｋｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に分取した。細胞を遠心分離（４００×ｇ、５分、４℃）し、０．２％ＢＳＡ及び０．０９％ＮａＮ3を含有するＰＢＳ中、５０μＬのｓｃＦｖ（１０μｇ／ｍＬ）に再懸濁した。１時間インキュベーション（４℃）後、細胞を０．２％ＢＳＡ及び０．０９％ＮａＮ3含有ＰＢＳ１００μＬで３回洗浄し、自家製マウス抗ｃＭｙｃ抗体（２．５μｇ／ｍＬ）で染色した。１時間インキュベーション（４℃）した後、細胞を０．２％ＢＳＡ及び０．０９％ＮａＮ3含有ＰＢＳ１００μＬで３回洗浄し、０．２％ＢＳＡ及び０．０９％ＮａＮ3含有ＰＢＳで５μｇ／ｍＬに希釈したＲＰＥ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆ０４７９、Ｄａｋｏ、Ｄｅｎｍａｒｋ）とともに４℃で３０分間、インキュベートした。細胞を洗浄、０．２％ＢＳＡ及び０．０９％ＮａＮ3含有ＰＢＳ２００μＬに再懸濁し、Ｕ型９６ウェルコスター（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｓｃｈｉｐｈｏｌ−Ｒｉｊｉｋ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）プレートに移し、ＥａｓｙＣｙｔｅ装置（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）によるフローサイトメトリーに用いた。
【０４５４】
結果
形質転換したＨＥＫ細胞上のＢ−１Ｍ２２を除く、４つのクローン全てが、トランスフェクションされた細胞株に特異的な結合性を示す（図６Ａ及び６Ｂを参照されたい）（しかし、Ｂ−１Ｍ２２抗体はＤＴ４０トランスフェクト細胞に特異的な結合を示す）。ＣＸＣＲ４は、以前から知られているように（Ｂａｒｉｂａｕｄら、２００１）、それを発現する細胞株に依存して多少異なる構造を取る傾向があることに留意すべきである。この事実が、異なる細胞株に異なる結果をもたらす原因のようである。これらの実験では、Ｃ−９Ｐ２１クローンが概して最も優れた結合物であった。
【０４５５】
更に、以下に記載のように、９Ｎ１０、Ｃ−９Ｐ２１及びＦ７クローンのＩｇＧレベルでの、天然にＣＸＣＲ４（Ｒａｍｏｓ、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ）を発現する細胞に結合する能力を試験した。
【０４５６】
材料及び方法
Ｒａｍｏｓ及びＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞は上述のように維持した。
【０４５７】
細胞を培養フラスコから採取し、ＰＢＳ（３５０×ｇ、５分、４℃）で２回洗浄し、０．２％ＢＳＡ及び０．０９％ＮａＮ3を含有するＰＢＳに再懸濁した。１ウェル当たり１×１０5個の細胞をＶ型９６−ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ，Ｆｒｉｋｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に分取した。細胞を遠心分離（３５０×ｇ、５分、４℃）し、０．２％ＢＳＡ及び０．０９％ＮａＮ3を含有するＰＢＳ中、５０μＬのＩｇＧ（５０μｇ／ｍＬ）に再懸濁した。１２点滴定を行い、３倍希釈した。１時間インキュベーション（４℃）した後、細胞を０．２％ＢＳＡ及び０．０９％ＮａＮ3含有ＰＢＳ１５０μＬで３回洗浄し、０．２％ＢＳＡ及び０．０９％ＮａＮ3含有ＰＢＳで２．５μｇ／ｍＬに希釈したＲＰＥ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＡｂＤ  ｓｅｒｏＴｅｃ、＃２０４００９）とともに４℃で３０分間、インキュベートした。細胞を洗浄、０．２％ＢＳＡ及び０．０９％ＮａＮ3含有ＰＢＳ２００μＬに再懸濁し、Ｕ型９６ウェルコスター（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｓｃｈｉｐｈｏｌ−Ｒｉｊｉｋ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）プレートに移し、ＥａｓｙＣｙｔｅ装置（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）によるフローサイトメトリーに用いた。
【０４５８】
結果
この実験では、用量依存的に３つのクローン全てが、細胞株を認識する（図６Ｃを参照されたい）。Ｆ７の両細胞への結合は、９Ｎ１０及びＣ−９Ｐ２１に比べて、わずかに高いようである。
【０４５９】
実施例３：抗ＣＸＣＲ４抗体のリガンド結合干渉
４種の抗体、Ｂ−１Ｍ２２、Ｃ−９Ｐ２１、Ｃ−１Ｉ２４及びＤ−１Ｋ２１のｓｃＦｖレベルでのＣＸＣＲ４に対する特異性を、ＣＸＣＲ４に特異的に結合する２種の分子の存在下及び不存在下におけるＣＸＣＲ４トランスフェクト細胞及びＣＸＣＲ４を恒常的に発現するリンパ芽球様細胞への結合能により、試験した。２種の分子の１つはＣＸＣＲ４の天然のリガンドであるＳＤＦ−１であり、もう一方は、ＣＸＣＲ４へのＳＤＦ−１αの結合を高い特異性で競合的に阻害するペプチドであるＡＭＤ３１００である。
【０４６０】
材料及び方法
Ｊｕｒｋａｔ及びＲａｍｏｓ細胞は上述のように維持した。
【０４６１】
ｓｃＦｖクローンを大規模に発現させ、ＳＥＣ分画によるモノマー画分として精製した。天然のＣＸＣＲ４+発現細胞株であるＪｕｒｋａｔ及びＲａｍｏｓを培養フラスコから採取し、０．２％ＢＳＡ及び０．０９％ＮａＮ3を含有するＰＢＳで２回洗浄し、１ウェル当たり１×１０5個の細胞をＶ型９６−ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ，Ｆｒｉｋｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に分取した。細胞を遠心分離（４００×ｇ、５分）によりペレット化し、ＳＤＦ−１α（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  ＥＣ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）１μｇと０．２％ＢＳＡ及び０．０９％ＮａＮ3を含有するＰＢＳで１０μｇ／ｍＬに希釈したｓｃＦｖ５０μＬとを同時に細胞に添加し、４℃で６０分間インキュベートした。リガンド不含の試料又は１５７μｇのＡＭＤ３１００をｓｃＦｖと共に細胞に添加した。ＡＭＤ３１００は単にこのレセプターに結合するのみであるので、ＣＸＣＲ４の特異性の対照として使用した。４００×ｇで５分間遠心分離した後、上清を吸引し、細胞を０．２％ＢＳＡ及び０．０９％ＮａＮ3を含有するＰＢＳ１００μＬでさらに２回洗浄し、遠心分離（４００×ｇ、５分）後、０．２％ＢＳＡ及び０．０９％ＮａＮ3を含有するＰＢＳで２．５μｇ／ｍＬに希釈した自家製抗ｃＭｙｃ抗体５０μＬとともに４℃で１時間、インキュベートした。０．２％ＢＳＡ及び０．０９％ＮａＮ3を含有するＰＢＳで３回洗浄後、０．２％ＢＳＡ及び０．０９％ＮａＮ3を含有するＰＢＳで５μｇ／ｍＬに希釈したｒＰＥ−結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色し、４℃で３０分間インキュベートした。細胞を再度洗浄し、０．２％ＢＳＡ及び０．０９％ＮａＮ3含有ＰＢＳ２００μＬに再懸濁し、Ｕ型９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移し、ＥａｓｙＣｙｔｅ装置（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）によるフローサイトメトリーに用いた。
【０４６２】
結果
Ｂ−１Ｍ２２を除く、４種のクローンの３つは両細胞株に特異的結合性を示す。これら３種の結合クローンの全てが、その競合の程度は異なるが、ＳＤＦ−１及びＡＭＤ３１００の両者により阻害される（図７Ａ（Ｊｕｒｋａｔ細胞）及び図７Ｂ（Ｒａｍｏｓ細胞）を参照されたい）。これにより、これらのクローンは天然のリガンドが結合する部位とほぼ同じ部位に結合すること、及び生物学的効果を有する可能性が示唆される。Ｂ−１Ｍ２２は、その結合レベルが低く、結合又は競合の状態を維持できないが、以下の実施例に示されるように、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞上のＣＸＣＲ４との結合においては本明細書に記載の最も優れた結合物の１つである（実施例４及び図８Ａを参照されたい）。この場合も、ＣＸＣＲ４がそれを発現する細胞株に依存して多少異なる構造を取る傾向があると思われ、これにより、Ｂ−１Ｍ２２に関して得られたデータが説明される。Ｃ−９Ｐ２１及びＣ１Ｉ２４が試験に用いた細胞種の全てに優れた結合性を示すことは、これらが複数の形態でＣＸＣＲ４に結合できることを示唆していると認められ、これは非常に有利である。
【０４６３】
更に他の実験において、以下に記載のように、３種の９Ｎ１０、Ｃ−９Ｐ２１及びＦ７抗体のＩｇＧレベルでのＣＸＣＲ４に対する特異性を、ＣＸＣＲ４に特異的に結合する分子であるＳＤＦ−１の存在下及び不存在下に、ＣＸＣＲ４を天然に発現するＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞への結合能により、試験した。
【０４６４】
材料及び方法
ＣＣＲＦ−ＣＥＭは上述のように維持した。
【０４６５】
天然のＣＸＣＲ４+を発現する細胞株ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞を培養フラスコから採取し、０．２％ＢＳＡ及び０．０９％ＮａＮ3を含有するＰＢＳで２回洗浄し、１ウェル当たり１×１０5個の細胞をＶ型９６−ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ，Ｆｒｉｋｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に分取した。細胞を遠心分離（３５０×ｇ、５分）によりペレット化し、４、１又は０．５μｇのＳＤＦ−１α（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  ＥＣ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）と０．２％ＢＳＡ及び０．０９％ＮａＮ3を含有するＰＢＳで２μｇ／ｍＬに希釈したＩｇＧ５０μＬとを同時に細胞に添加し、４℃で６０分間インキュベートした。リガンド不含の試料を対照とした。３５０×ｇで５分間遠心分離した後、上清を吸引し、細胞を０．２％ＢＳＡ及び０．０９％ＮａＮ3を含有するＰＢＳ１５０μＬでさらに２回洗浄し、遠心分離（３５０×ｇ、５分）後、０．２％ＢＳＡ及び０．０９％ＮａＮ3を含有するＰＢＳで２．５μｇ／ｍＬに希釈したＲＰＥ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＡｂＤ  ｓｅｒｏＴｅｃ、＃２０４００９）で染色し、４℃で３０分間インキュベートした。細胞を再度洗浄し、０．２％ＢＳＡ及び０．０９％ＮａＮ3を含有するＰＢＳ２００μＬに再懸濁し、Ｕ型９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移し、ＥａｓｙＣｙｔｅ装置（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）によるフローサイトメトリーに使用した。
【０４６６】
結果
Ｃ−９Ｐ２１及び９Ｎ１０の両クローンがＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞株に特異的な結合性を示す。両クローンはまた、ＳＤＦ−１により阻害される（図７Ｃを参照されたい）。本実験において、Ｆ７は、最も強い絶対シグナルにより判断されるように、細胞への最大の結合を示すことに留意すべきである。
【０４６７】
実施例４：抗体候補のＩｇＧ型への変換
同定された抗ＣＸＣＲ４抗体の生物学的活性を比較するために、Ｂ−１Ｍ２２、Ｃ−１Ｉ２４、Ｃ−９Ｐ２１及びＤ−１Ｋ２１及び９Ｎ１０を全長ＩｇＧ１抗体型に変換した。対照として、Ｆ７抗体を生成した。Ｆ７抗体はＣＸＣＲ４への結合により特徴付けされる（ＭｅｄａｒｅｘによるＷＯ２００８／０６０３６７参照）。Ｆ７抗体ＶＨ及びＶＬ鎖の配列は、ＷＯ２００８／０６０３６７の配列番号２５及び配列番号２９に規定されている。この抗体のＩｇＧ１型を作製するために、特許ＷＯ２００８／０６０３６７（ＶＨ：配列番号２５、ＶＬ：配列番号２９）の記載に従って、最適のヌクレオチド配列をＦ７抗体のアミノ酸配列から演繹した。この配列を合成し、Ｎｏｒｄｅｒｈａｕｇら（ＪＩＭ、２０４：２７−８７、１９９７）に記載されているようにヒトＩｇＧ１／κにクローン化し、ＨＥＫ２９３細胞に発現させ、続いてタンパク質Ａにより精製した。これらＩｇＧがＣＸＣＲ４陽性細胞への結合能を保持していることを確認するために、全てのＩｇＧをＣＸＣＲ４を天然に発現するＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞上で評価した。
【０４６８】
材料及び方法
対応する可変ドメインをコードする遺伝子を、ヒト定常ドメインに対する遺伝子を有する哺乳類の発現ベクターｐＬＮＯ内にクローン化した（Ｎｏｒｄｅｒｈａｕｇら、前述）。
【０４６９】
抗体を細胞工場内に発現させ、最初の採取物をタンパク質Ａカラムで精製し、サイズ排除クロマトグラフィーによりモノマーに分画した。
【０４７０】
天然のＣＸＣＲ４+を発現する細胞株ＣＣＲＦ−ＣＥＭを培養フラスコから採取し、０．２％ＢＳＡ及び０．０９％ＮａＮ3を含有するＰＢＳで２回洗浄し、１ウェル当たり１×１０5個の細胞をＶ型９６−ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ，Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に分取した。細胞を遠心分離（４００×ｇ、５分）によりペレット化し、０．２％ＢＳＡ及び０．０９％ＮａＮ3を含有するＰＢＳで１０μｇ／ｍＬに希釈したＩｇＧ５０μＬと４℃で６０分間インキュベートした。４００×ｇで５分間遠心分離した後、上清を吸引し、細胞を０．２％ＢＳＡ及び０．０９％ＮａＮ3を含有するＰＢＳ１００μＬでさらに２回洗浄し、遠心分離（４００×ｇ、５分）した。その後、０．２％ＢＳＡ及び０．０９％ＮａＮ3を含有するＰＢＳで５μｇ／ｍＬに希釈したｒＰＥ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）５０μＬで４℃、３０分間染色し、４℃で３０分間インキュベートした。細胞を再度洗浄し、０．２％ＢＳＡ及び０．０９％ＮａＮ3含有ＰＢＳ２００μＬに再懸濁し、Ｕ型９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移し、ＥａｓｙＣｙｔｅ装置（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）によるフローサイトメトリーに用いた。
【０４７１】
結果
試験したクローンの全てが、ＣＸＣＲ４陽性細胞への結合能を保持した（図８Ａ：Ｃ−１Ｉ２４及びＢ−１Ｍ２２、図８Ｂ：Ｄ−１Ｋ２１及びＣ−９Ｐ２１、９Ｎ１０のデータは図示せず）。図８に示すＥａｓｙＣｙｔｅ曲線から、これらの実験では、本明細書に記載のクローンはＣＸＣＲ４発現ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞への結合が、Ｆ７抗体よりも有意に優れていることも認められる（中央値が、ＰＢＳ陰性対照の３．１１に対して、４８．１１（Ｆ７）、１７９．０３（Ｄ−１Ｋ２１）、６２６．４３（Ｃ−９Ｐ２１）、９１０．５８（Ｃ−１Ｉ２４）及び１０７７．３３（Ｂ−１Ｈ２２））。
【０４７２】
実施例５：種間交差反応
抗体候補のサル及びマウスのＣＸＣＲ４との交差反応性をｓｃＦｖレベルで試験した。
【０４７３】
材料及び方法
ＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞は上述のように維持した。
ＦＡＣＳ結合分析（ＥａｓｙＣｙｔｅ）は、マウス（遺伝子バンク受け入れ番号ＢＣ０３１６６５）又はサル（アカゲザル）のＣＸＣＲ４（ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００１０３６１１０）をコードするプラスミドで一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３細胞を用いて行った。２つの実験を行った。１つは、検出にα−ｃＭｙｃ及びＰＥ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を使用し、もう１つは、直接結合したＲＰＥ−ｃ−Ｍｙｃ抗体を使用する。さらに、ＩｇＧレベルでの交差反応を分析した。後者では、抗体の結合はＰＥ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体で検出した。
【０４７４】
結果
Ｄ−１Ｋ２１は、マウス及びサルＣＸＣＲ４の両者に対して良好な交差反応性を示した。Ｂ−１Ｍ２２、Ｃ−９Ｐ２１及びＣ−１Ｉ２４のｓｃＦｖ変異体もサル抗原に良好な交差反応性を示したが、マウスＣＸＣＲ４に対しては、低（Ｂ−１Ｍ２２）から中程度（Ｃ−１Ｉ２４及びＣ−９Ｐ２１）の反応性であった（図９参照）。９Ｎ１０も試験したところ、Ｃ−９Ｐ２１と同じ交差反応性パターンを示したが、結合の絶対値はわずかに高かった。
【０４７５】
実施例６：ＣＸＣＲ４を介するリガンド誘導シグナリングの阻害
抗ＣＸＣＲ４抗体である、Ｂ−１Ｍ２２、Ｃ−１Ｉ２４、Ｃ−９Ｐ２１及びＤ−１Ｋ２１のｓｃＦｖ及びＩｇＧレベルでのＳＤＦ−１αリガンド誘導Ｃａ++流への影響力を試験した。９Ｎ１０はＩｇＧレベルのみについて試験した。実験は、天然のＣＸＣＲ４+陽性細胞株ＣＣＲＦ−ＣＥＭを用いて行った。
【０４７６】
最初の段階で、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞上の抗体を滴定して最適の抗体濃度を決定した。
【０４７７】
材料及び方法
ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞は上述のように維持した。
【０４７８】
天然のＣＸＣＲ４+を発現する細胞株ＣＣＲＦ−ＣＥＭを培養フラスコから採取し、０．２％ＢＳＡ及び０．０９％ＮａＮ3を含有するＰＢＳで２回洗浄し、１ウェル当たり１×１０5個の細胞をＶ型９６−ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ，Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に分取した。細胞を遠心分離（４００×ｇ、５分）によりペレット化し、０．２％ＢＳＡ及び０．０９％ＮａＮ3を含有するＰＢＳでＩｇＧを１０μｇ／ｍＬに希釈し、これを開始濃度として２倍希釈を１１回繰り返しながら各５０μＬのＩｇＧ液と４℃で６０分間インキュベートした。４００×ｇで５分間遠心分離した後、上清を吸引し、細胞を０．２％ＢＳＡ及び０．０９％ＮａＮ3を含有するＰＢＳ１００μＬでさらに２回洗浄し、遠心分離（４００×ｇ、５分）した。その後、０．２％ＢＳＡ及び０．０９％ＮａＮ3を含有するＰＢＳで５μｇ／ｍＬに希釈したｒＰＥ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）５０μＬで４℃、３０分間染色し、４℃で３０分間インキュベートした。細胞を再度洗浄し、０．２％ＢＳＡ及び０．０９％ＮａＮ3含有ＰＢＳ２００μＬに再懸濁し、Ｕ型９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移し、ＥａｓｙＣｙｔｅ装置（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）によるフローサイトメトリーに使用した。
【０４７９】
結果
結果として、競合実験に使用する抗体の濃度を、ＩｇＧとして１０μｇ／ｍＬ又は１００μｇ／ｍＬとし（ただし、９Ｎ１０は１μｇ／ｍＬ又は１０μｇ／ｍＬとした）（データは表示せず）、ｓｃＦｖとして４μｇ／ｍＬとした（図１０参照）。
【０４８０】
正確な濃度を確認した後、実際の競合実験を行った。
【０４８１】
材料及び方法
ＣＣＲＦ−ＣＥＭ標的細胞を遠心分離で採取し、ＲＰＭＩ−１６４０培養培地で２回洗浄した。２．５×１０6個の細胞（ＩｇＧ用）１ｍＬ又は２．５×１０7個の細胞（ｓｃＦｖ用）１０ｍＬをＦｌｕｏ−４−ＡＭ（アセトキシメチルエステル：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、プルロニックＦ−１２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びプロベネシドと最終濃度がそれぞれ１μＭ、０．０２％、１ｍＭとなるように混合した。全ての細胞を垂直回転ホイール（７ｒｐｍ）上で３７℃６０分間インキュベートした。その後のステップは全て１ｍＭのプロベネシド存在下に行った。細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＲＰＭＩ−１１６４０で２回洗浄し、アッセイ緩衝液（１４５ｍＭＮａＣｌ、４ｍＭＫＣ１、１ｍＭＮａＨ2ＰＯ4、０．８ｍＭＭｇＣｌ2、２５ｍＭＨｅｐｅｓ、２２ｍＭグルコース）で１回洗浄後、最終濃度４×１０6細胞／ｍＬで再懸濁した。同量の細胞、抗体及びリガンド（ＳＤＦ−１α）含有又は不含アッセイ緩衝液を混合した。最初の２つの成分（細胞と抗体）をリガンドであるＳＤＦ−１α（最終濃度：５０ｎｇ／ｍＬ）の添加前に１５分間、プレインキュベートした。抗体の最終濃度は、ＩｇＧでは１０μｇ／ｍＬ又は１００μｇ／ｍＬ、ｓｃＦｖでは４μｇ／ｍＬとした。試料は直ちに５１５−５４５ｎｍバンド通過フィルターを使用してＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で分析した。曲線下の面積（ＡＵＣ）をプリズムソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して積分して求め、ＳＤＦ−１αのみによる最大刺激でのＡＵＣに対する百分率としてプロットした。
【０４８２】
結果
ｓｃＦｖレベルで、Ｃ−９Ｐ２１及びＤ−１Ｋ２１変異体により強い拮抗作用が見られた。Ｃ−１Ｉ２４もある程度の拮抗作用を示した。Ｂ−１Ｍ２２では活性は認められなかった（図１１Ａ）。
【０４８３】
ＩｇＧレベルでは、試験した５種の抗体のうち４種の抗体、Ｂ−１Ｍ２２、Ｃ−１Ｉ２４、Ｃ−９Ｐ２１及び９Ｎ１０により、ＳＤＦ−１α誘導シグナリングの抑制が見られた（図１１Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥ）。未知の理由により、Ｄ−１Ｋ２１変異体では、ＩｇＧ型の高濃度においてのみ、わずかに抑制的に働くようであった。
【０４８４】
また、いずれの抗体も単独ではシグナリングを誘導することはできなかった。すなわち、これらの抗体は作動的活性を示さなかった（データは表示せず）。
結論として、これらの抗体は全て、ＣＸＣＲ４に結合するＳＤＦ−１αにより誘導されたＣａ++シグナリングに対して拮抗作用を示した。Ｃ−９Ｐ２１及び９Ｎ１０は最も顕著な効果を有していた。
【０４８５】
さらなる実験において、９Ｎ１０をＩｇＧレベルでのリガンド誘導カルシウム流の低減能について、Ｃ−９Ｐ２１に比較して測定した。
【０４８６】
材料及び方法
１００、２０、４、０．８、０．１６、０．０３２、０．０６４及び０．００１２８μｇ／ｍＬ濃度の滴定系列で抗体を使用して、上述と同様に実験を行った。
【０４８７】
結果
結果は、９Ｎ１０によるカルシウム流の抑制は、ＩＣ50（ｎＭ）が３．８５であり、Ｃ−９Ｐ２１のＩＣ50（ｎＭ）２９に比較しておよそ８倍効果的であることを示す（図１２Ａ及び１２Ｂ参照）。
【０４８８】
実施例７：リガンド誘導細胞移動の抑制
ｓｃＦｖＣ−９Ｐ２１によるリガンド誘導細胞移動の低減能をＣＸＣＲ４+ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞株内で評価した。抗ＧＦＰｓｃＦｖフラグメントを陰性対照として使用し、抗ｃＭｙｃ抗体を両ｓｃＦｖの架橋結合に使用してＩｇＧ型抗体の効果を模倣した。
【０４８９】
材料及び方法
ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞は上述のように維持した。
【０４９０】
ＣＣＲＦ−ＣＥＭ標的細胞を遠心分離により沈殿させ、ＦＣＳ不含のＲＰＭＩ−１６４０培養培地で２回洗浄した。細胞濃度を１×１０6個／ｍＬに調整し、この懸濁液の６０ｍＬを３８μＬのＢＡＴＤＡ［ビス（アセトキシメチル）２，２’：６’，２’’−ターピリジン−６，６’’−ジカルボキシレート］（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）と混合した。細胞は、ＢＡＴＤＡと３７℃で２０分間、１０分毎に静かに容器を転倒させて混合しながらインキュベートした。細胞を２０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０で３回洗浄し、最終濃度が２×１０7個／ｍＬとなるようにＲＰＭＩ−１６４０／２０％ＦＣＳに再懸濁した。標識細胞を同体積の１０％ＦＣＳ、抗ｃ−Ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０クローン）及びｓｃＦｖＣ−９Ｐ２１の２倍希釈系列を含有する培地と混合し、最終抗体濃度を２０μｇ／ｍＬの抗ｃＭｙｃＩｇＧ及び３２μｇ／ｍＬ〜１６ｎｇ／ｍＬのｓｃＦｖＣ−９Ｐ２１とした。抗ＧＦＰｓｃＦｖを３２μｇ／ｍＬで、２０μｇ／ｍＬの抗ｃＭｙｃ抗体と組み合わせて、陰性対照として使用した。並行して、０．１５ｎＭのＳＤＦ−１αリガンドを含有する３０μＬのＲＰＭＩをケモタキシス９６ウェルボイデンチャンバープレート（Ｎｅｕｒｏ  Ｐｒｏｂｅ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）の下部区画に添加した。５０μＬの抗体被覆ＢＡＴＤＡ標識細胞をケモタキシス９６チャンバープレートの上部区画に添加し、３７℃で２．５時間インキュベートした。フィルター上部の細胞を除去し、フィルターをＰＢＳで洗浄後、プレートを遠心分離に掛けてフィルターを取り除く前に下部チャンバー内の全細胞を回収した。プレートをＶ型プレートの上端に裏返し、遠心分離した。Ｖ型プレート中の細胞を１００μＬのＰＢＳで洗浄し、遠心分離により沈殿させ、１．３％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有するＰＢＳ３５μＬに再懸濁した。試料を黒い９６ウェルマイクロタイタープレートに移し、２００μＬのユーロピウム液（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）と混合し、テカン社Ｍ２００プレートリーダーを使用して蛍光（励起：３４０ｎｍ、発光：６１３ｎｍ、遅滞時間：０．４ｍｓ、積分時間：０．４ｍｓ）を分析した。各抗体濃度について、ｓｃＦｖの存在／不存在におけるシグナルの比及び移動阻害の百分率を計算した。データをプロットし、プリズムソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）の「対数（阻害剤）対応答」モデルを使用して非線形回帰曲線適合により分析した。
【０４９１】
結果
データは、抗ＣＸＣＲ４ｓｃＦｖＣ−９Ｐ２１の存在下において、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞のＳＤＦ−１誘導走化性が阻害されることを示している（図１３参照）。これらの条件下、ＩＣ50値（細胞移動を５０％阻害する抗体濃度）は２．９μｇ／ｍＬと算出され、ｓｃＦｖ濃度２０μｇ／ｍＬで１００％阻害に達した。抗ＧＦＰｓｃＦｖフラグメント（陰性対照）は、細胞移動を阻害しなかった（データは表示せず）。
【０４９２】
したがって、ｓｃＦｖ型のＣ−９Ｐ２１抗体は、ＩＣ50値２．９μｇ／ｍＬ（約１００ｎＭ）でＣＸＣＲ４+ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞のリガンド誘導性移動を阻害し、２０μｇ／ｍＬ（０．７μＭ）で１００％阻害する。
【０４９３】
実施例８：抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）の誘導
標的細胞を死滅させることが好ましい作用様式である場合には、抗体が治療的に有用であるためのモデル機構の１つは、ＣＸＣＲ４発現標的細胞のＡＤＣＣを仲介する能力である。これについてはＴ細胞リンパ腫から誘導され、ＣＸＣＲ４を恒常的に発現するＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞を使用して試験した。選択された抗体は、抗ｃＭｙｃ抗体と交差結合したｓｃＦｖフラグメント及び全ヒトＩｇＧ１抗体として試験した。
【０４９４】
材料及び方法
ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞は上述のように維持した。
【０４９５】
ＣＣＲＦ−ＣＥＭ標的細胞を遠心分離で沈殿させ、ＲＰＭＩ−１６４０培地で２回洗浄した。１ｍＬ当たり２．５×１０6個の細胞をカルセイン−ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と最終濃度が１０μＭになるように混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。細胞を１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地で３回洗浄し、細胞濃度を３×１０5細胞／ｍＬに調整した。ヒトＰＢＭＣは、新鮮なドナー血液からリンホプレップ（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ，Ｌｉｖｅｒｐｏｏｌ，ＵＫ）密度勾配遠心法により調製し、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０で洗浄して、液体窒素中、３×１０7細胞／ｍＬの濃度で１０％ＦＣＳ及び１０％ＤＭＳＯ含有ＲＰＭＩ中に凍結保存した。エフェクター細胞は、実験の日に融解し、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩで洗浄、６×１０6細胞／ｍＬの濃度で再懸濁した。各標的及びエフェクター細胞の５０μＬを９６ウェルマイクロタイタープレートの同じウェル内で混合し、エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）細胞比を２０：１とした。ＩｇＧ１型の抗体を同じウェルに１００μＬ添加し、０．８〜１０００ｎｇ／ｍＬの濃度範囲に調整した。したがって、ｓｃＦｖフラグメントを２０μＬ添加し、最終濃度を２．５〜５×１０4ｎｇ／ｍＬとして、抗ｃＭｙｃキメラ（マウス可変／ヒト定常）ＩｇＧ１抗体（９Ｅ１０ハイブリドーマ由来）の過剰（２０μｇ／ｍＬ）と予備混合した。マイクロタイタープレートを３７℃で４時間インキュベートした。３時間４５分のインキュベート後に、２０μＬの０．９％ＴｒｉｔｏｎＸ１００を対照ウェルに添加し、標的細胞を完全に溶解した（最大溶解）。各試料の上清１００μＬを黒いマイクロタイタープレートに移し、テカン社Ｍ２００プレートリーダーを使用して蛍光（励起：４８８ｎｍ、発光：５１８ｎｍ）を記録した。各実験は４重で行った。抗体不含の試料の蛍光強度をバックグラウンドとして差し引き、抗体による試料の特異的溶解の百分率を算出した。用量−応答曲線は、非線形回帰分析及びプリズムソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用する３パラメータ適合モデルにより計算した。
【０４９６】
結果
図１４に示す結果は、試験した抗ＣＸＣＲ４抗体の全てが、ヒトＰＢＭＣの存在下、ｓｃＦｖ及び全長ＩｇＧとしてＡＤＣＣを誘導可能で、最大殺活性はほぼ１００％であったことを示している。試験したｓｃＦｖ及びＩｇＧは、その最大殺活性に従って次のように順位づけされる。すなわち、Ｃ−９Ｐ２１＞Ｄ−１Ｋ２１（ｓｃＦｖ）；及びＢ−１Ｍ２２＞Ｃ−１Ｉ２４〜Ｃ−９Ｐ２１＞Ｄ−１Ｋ２１（ＩｇＧ）（表Ａも参照）。
【表Ａ】
0006045914.tif 000002
【０４９７】
したがって、試験した抗ＣＸＣＲ４抗体全てがＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞に対してＡＤＣＣ活性を示し、Ｂ−１Ｍ２２及びＣ−９Ｐ２１は最大の細胞殺活性を示した。
【０４９８】
実施例９：補体依存性細胞障害活性（ＣＤＣ）の誘導
本明細書に記載の抗ＣＸＣＲ４ＩｇＧが補体依存性細胞障害を仲介できるかどうかを試験するために、ＣＤＣ試験を、バーキットＢ細胞リンパ腫に由来し、ＣＸＣＲ４を恒常的に発現するＲａｍｏｓ細胞を使用して行った。
【０４９９】
材料と方法
Ｒａｍｏｓ細胞は上述のように維持した。
【０５００】
Ｂ−１Ｍ２２、Ｃ−１Ｉ２４、Ｃ−９Ｐ２１及びＤ−１Ｋ２１のＩｇＧのＣＤＣ誘導活性は、天然ＣＸＣＲ４+Ｒａｍｏｓ細胞株上で評価した。Ｒａｍｏｓ細胞を遠心分離で沈殿させ、ＲＰＭＩ−１６４０培養培地で２回洗浄した。１ｍＬ当たり２．５×１０6個の細胞をカルセイン−ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と最終濃度が１０μＭになるように混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。細胞を１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０で３回洗浄し、細胞濃度を４×１０6細胞／ｍＬに調整した。標識標的細胞２５μＬとヒト血清２５μＬを９６ウェルマイクロタイタープレートのウェル内で混合した。抗体（全てＩｇＧ型）の希釈液５０μＬを同じウェルに添加し、最終抗体濃度を５×１０-5〜５×１０4ｎｇ／ｍＬとした。０．９％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００２０μＬを対照ウェルに添加し、標的細胞を完全に溶解した（１００％と定義する最大溶解）。マイクロタイターを３７℃で１時間インキュベートした。１００μＬの１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０を全てのウェルに添加し、遠心分離を行った。各試料の上清１００μＬを黒いマイクロタイタープレートに移し、テカン社Ｍ２００プレートリーダーを使用して蛍光（励起：４８８ｎｍ、発光：５１８ｎｍ）を記録した。各実験は４重で行った。抗体不含の試料の蛍光強度をバックグラウンドとして差し引き、抗体による試料の特異的溶解の百分率を算出した。用量−応答曲線は、非線形回帰分析及びプリズムソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用する３パラメータ適合モデルにより計算した。
【０５０１】
結果
図１５Ａ及び１５Ｂに示す結果は、ヒト血清の存在下、Ｃ−１Ｉ２４抗体はＣＤＣを誘導することができることを示している。Ｃ−１Ｉ２４のＥＣ50値は０．７μｇ／ｍＬであり、最大殺活性は１００％であった。Ｂ−１Ｍ２２変異体にもわずかにＣＤＣ活性が認められたが、非常に高濃度（１００μｇ／ｍＬ）においてのみであった。陽性対照抗体としてＦ７を使用した。
【０５０２】
したがって、本明細書に記載した抗体のうち、２つの抗体、Ｃ−１Ｉ２４及びＭ−１Ｍ２２がＲａｍｏｓ細胞に対するＣＤＣ活性を示した。Ｃ−１Ｉ２４は優れたＣＤＣ活性を示した。
【０５０３】
実施例１０：アポトーシス誘導
抗ＣＸＣＲ４抗体のアポトーシス誘導活性をＣＸＣＲ４+Ｒａｍｏｓ細胞株上で評価した。
【０５０４】
材料及び方法
Ｒａｍｏｓ細胞は上述のように培養した。
【０５０５】
Ｒａｍｏｓ細胞を遠心分離で採取し、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０培養培地で２回洗浄し、３×１０5細胞／ウェルの濃度で１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０培地に再懸濁した。細胞懸濁液（２５０μＬ）を同じ体積の希釈被試験抗体（最終濃度：０．０８〜１０μｇ／ｍＬ）又はスタウロスポリン（２５ｎＭ）と２４ウェルプレートのウェル内で混合し、３７℃で４８時間インキュベートした。細胞を遠心分離により回収し、アネキシンＶ結合緩衝液（１０ｍＭＨｅｐｅｓ、１４０ｍＭＮａＣｌ、２．５ｍＭＣａＣｌ2、０．２％ＢＳＡ、ｐＨ７．４）で洗浄した。細胞を再度回収し、３００μＬのアネキシンＶ結合緩衝液に再懸濁した。ＦＩＴＣ結合アネキシンＶとヨウ化プロピジウム（ＰＩ）とを２４０μＬの細胞懸濁液に混合し、ＰＩの最終濃度を０．２μｇ／ｍＬとした。試料は、リガンドの添加後直ちに５１５−５４５ｎｍ及び６１０／２０ｎｍバンド通過フィルターを使用してＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で分析した。アポトーシス性細胞は、アネキシンＶ陽性／ＰＩ陰性として定義され、死亡細胞はＰＩ陽性として定義された。
【０５０６】
結果
図１６Ａに示した結果（Ｂ−１Ｍ２２、Ｃ−１Ｉ２４、Ｃ−９Ｐ２１及びＤ−１Ｋ２１）は、Ｂ−１Ｍ２２、Ｃ−１Ｉ２４、Ｃ−９Ｐ２１及びＤ−１Ｋ２１抗体の存在下において、図１６Ａに０と記したバックグラウンドレベル（陰性対照レベル）以上にはアポトーシスを誘導しないことを示した。対照的に、Ｆ７ＩｇＧ対照は、アッセイに使用された濃度全てにおいてアポトーシスを誘導した。図１６Ｂに示した結果は、Ｃ−９Ｐ２１及び９Ｎ１０抗体は、有意なアポトーシスを誘導しないことを示している。
【０５０７】
したがって、これらの結果は、本明細書に記載の抗体が、ＣＸＣＲ４陽性細胞のアポトーシスを誘導しないことを示し、Ｆ７と比較して、優れた副作用プロフィールを示す可能性を提供する。
【表１−１】
0006045914.tif 000003
【表１−２】
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【表２−１】
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【表２−２】
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【表３−１】
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【表３−２】
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【表４−１】
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【表４−２】
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【表５−１】
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【表５−２】
0006045914.tif 000012
配列番号：９１は配列番号：２５と同一である。
配列番号：８５は配列番号：１と同一である。
配列番号：９２は配列番号：２６と同一である。
配列番号：８６は配列番号：２と同一である。
配列番号：９３は配列番号：２７と同一である。
配列番号：８７は配列番号：３と同一である。
配列番号：９４は配列番号：２８と同一である。
配列番号：９９は配列番号：３３と同一である。
配列番号：１０２は配列番号：６９と同一である。
配列番号：１０４は配列番号：７７と同一である。
【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【０５０８】
参考文献
以下の参考文献は、それらが、本明細書に記載された典型的な手順又は他の詳細な補足を提供する程度に、本明細書に参照により具体的に組み込まれる。
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Ｇｕｌｅｎｇ，Ｔａｔｅｉｓｈｉ，Ｏｈｔａ，Ｋａｎａｉ，Ｊａｚａｇ，Ｉｊｉｃｈｉ，Ｔａｎａｋａ，Ｗａｓｈｉｄａ，Ｍｏｒｉｋａｎｅ，Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ，Ｙａｍｏｒｉ，Ｔｓｕｒｕｏ，Ｋａｗａｂｅ，Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ，Ｔａｉｒａ，Ｓａｔａ，Ｏｍａｔａ．”Ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆａｃｔｏｒ−１／ＣＸＣＲ４  ａｘｉｓ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｂｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ａ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍａｎｎｅｒ”．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６５：５８６４−７１，２００５
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Ｈｉｎｎｅｎ，Ｈｉｃｋｓ，Ｆｉｎｋ，”Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｙｅａｓｔ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５：１９２９，１９７８．
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Ｈｏｌｍ，”Ｄａｌｉ：ａ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  Ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ”，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０：４７８−４８０，１９９５．
Ｈｏｌｍ，”Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｂｙ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｄｉｓｔａｎｃｅ  Ｍａｔｒｉｃｅｓ”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２３３：１２３−３８，１９９３
Ｈｏｌｍ，”Ｔｏｕｒｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｏｌｄ  Ｓｐａｃｅ  Ｗｉｔｈ  Ｄａｌｉ／ＦＳＳＰ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，  ２６：３１６−９，  １９９８．
Ｈｕ，  Ｄｅｎｇ，  Ｂｉａｎ，Ｌｉ，Ｔｏｎｇ，Ｌｉ，Ｗａｎｇ，Ｘｉｎ，Ｈｅ，Ｚｈｏｕ，Ｘｉｅ，Ｗａｎｇ，Ｃａｏ．”Ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＣＸＣＲ４  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．”Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１：４６５８−６５，２００５
Ｉｔｏ，Ｆｕｋｕｄａ，Ｍｕｒａｔａ，Ｋｉｍｕｒａ，”Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔａｃｔ  Ｙｅａｓｔ  Ｃｅｌｌｓ  Ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ａｌｋａｌｉ  Ｃａｔｉｏｎｓ”，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３：１６３−１６８，１９８３．
Ｋａｂａｔ，Ｗｕ，Ｐｅｒｒｙ，Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｆｏｅｌｌｅｒ，”Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，第５版Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，６４７−６６９，１９９１．
Ｋａｕｆｍａｎ，Ｍｕｒｔｈａ，Ｄａｖｉｅｓ，”Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｃｉｓｔｒｏｎｉｃ  Ｍｒｎａｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ”，ＥＭＢＯ  Ｊ．，６：１８７−１９５，１９８７．
Ｋｉｍ，Ｌｅｅ，Ｍｉｄｕｒａ，Ｙｅｕｎｇ，Ｍｅｎｄｏｚａ，Ｈｏｎｇ，Ｒｅｎ，Ｗｏｎｇ，Ｋｏｒｚ，Ｍｅｒｚｏｕｋ，Ｓａｌａｒｉ，Ｚｈａｎｇ，Ｈｗａｎｇ，Ｋｈａｎｎａ，Ｈｅｌｍａｎ．”Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＬ１２  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｐａｔｈｗａｙ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ．”Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ２５：２０１−１１，２００８
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Ｋｉｓｓ，Ｆｉｓｈｅｒ，Ｐｅｓａｖｅｎｔｏ，Ｄａｉ，Ｖａｌｅｒｏ，Ｏｖｅｃｋａ，Ｎｏｌａｎ，Ｐｈｉｐｐｓ，Ｖｅｌａｐｐａｎ，Ｃｈａｓｔｅｅｎ，Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｗａｌｄｏ，Ｐａｖｌｉｋ，Ｂｒａｄｂｕｒｙ，”Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｌｏｏｐ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ  ａｓ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３４（１９）：ｅ１３２，２００６．
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Ｌｅ  Ｇａｌｌ，  Ｒｅｕｓｃｈ，  Ｌｉｔｔｌｅ  ａｎｄ  Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，”Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｌｉｎｋｅｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  Ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａ  Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔａｎｄｅｍ  Ｄｉａｂｏｄｙ”，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ  ＆  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，１７（４）：３５７−３６６，２００４．
Ｌｉａｎｇ，Ｗｕ，Ｒｅｄｄｙ，Ｚｈｕ，Ｗａｎｇ，Ｂｌｅｖｉｎｓ，Ｙｏｏｎ，Ｚｈａｎｇ，Ｓｈｉｍ．”Ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｏｆ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＣＸＣＲ４  ｗｉｔｈ  ａｎ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ．”Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３６３：  ５４２−６，  ２００７
Ｌｕｃｋｏｗ及びＳｕｍｍｅｒｓ，”Ｈｉｇｈ  Ｌｅｖｅｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｎｆｕｓｅｄ  Ｆｏｒｅｉｇｎ  Ｇｅｎｅｓ  ｗｉｔｈ  Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ”，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１７０：３１−３９，１９８９．
Ｍａｒｈａｂａら．，”ＣＤ４４  ａｎｄ  ＥｐＣＡＭ：  ｃａｎｃｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｍａｒｋｅｒｓ”  Ｃｕｒｒ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ８：７８４−８０４，２００８．
Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，”Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  １．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ａ  Ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ”，  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ａｓｓｏｃ．，８５：２１４９−２１５４，１９６４．
Ｍｕｌｌｅｒ，Ｈｏｍｅｙ，Ｓｏｔｏ，Ｇｅ，Ｃａｔｒｏｎ，Ｂｕｃｈａｎａｎ，ＭｃＣｌａｎａｈａｎ，Ｍｕｒｐｈｙ，Ｙｕａｎ，Ｗａｇｎｅｒ，Ｂａｒｒｅｒａ，Ｍｏｈａｒ，  Ｖｅｒａｓｔｅｇｕｉ，Ｚｌｏｔｎｉｋ．”Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．”Ｎａｔｕｒｅ  ４１０：５０−６，２００１
Ｍｕｎｚら，”Ｔｈｅ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  ＥｐＣＡＭ  ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｃ−ｍｙｃ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ”，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２３：５７４８−５８，２００４．
Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，”Ｏｐｔｉｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｌｉｎｅａｒ  Ｓｐａｃｅ”，ＣＡＢＩＯＳ，４：１１−１７  １９８８．
Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ，”Ａ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｒ  Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｔｗｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３，１９７０．
Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，”Ｓｏｍａｔｉｃ  ｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ，”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７：２４８−２５４，１９９５．
Ｎｉｃａｉｓｅ，Ｖａｌｅｒｉｏ−Ｌｅｐｉｎｉｅｃ，Ｍｉｎａｒｄ，Ｄｅｓｍａｄｒｉｌ，”Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｂｙ  ＣＤＲ  ｇｒａｆｔｉｎｇ  ｏｎ  ａ  ｎｏｎｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｓｃａｆｆｏｌｄ”，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．，１３：１８８２−１８９１，２００４．
Ｏ'Ｂｒｉｅｎら，”Ａ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｃａｐ
ａｂｌｅ  ｏｆ  ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｕｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ”，Ｎａｔｕｒｅ  ４４５：１０６−１０，２００７．
Ｏｒｉｍｏ，Ｇｕｐｔａ，Ｓｇｒｏｉ，Ａｒｅｎｚａｎａ−Ｓｅｉｓｄｅｄｏｓ，Ｄｅｌａｕｎａｙ，Ｎａｅｅｍ，Ｃａｒｅｙ，Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｗｅｉｎｂｅｒｇ．”Ｓｔｒｏｍａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｐｒｅｓｅｎｔ  ｉｎ  ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｅｌｅｖａｔｅｄ  ＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．”Ｃｅｌｌ  １２１：３３５−４８，２００５
Ｐａｌｍｉｔｅｒ及びＢｒｉｎｓｔｅｒ，”Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｍｉｃｅ”，Ｃｅｌｌ，４１：３４３−３４５，１９８５．
Ｐａｌｍｉｔｅｒ，Ｎｏｒｓｔｅｄｔ，Ｇｅｌｉｎａｓ，Ｈａｍｍｅｒ，Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，”Ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ−Ｈｕｍａｎ  ＧＨ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｇｅｎｅｓ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  Ｍｉｃｅ”，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２：８０９−８１４，１９８３．
Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ，”Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２４４４−２４４８，１９８８．
Ｐｅａｒｓｏｎ，”Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ＦＡＳＴＰ  ａｎｄ  ＦＡＳＴＡ”，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８３：６３−９８，１９９０．
Ｐｒａｎｇ，Ｐｒｅｉｔｈｎｅｒ，Ｂｒｉｓｃｈｗｅｉｎ，Ｇoｓｔｅｒ，Ｗｏｐｐｅｌ，Ｍｕｌｌｅｒ，Ｓｔｅｉｇｅｒ，Ｐｅｔｅｒｓ，Ｂａｅｕｅｒｌｅ，ｄａ  Ｓｉｌｖａ，”Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｅｐ−ＣＡＭ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＭＴ２０１  ａｇａｉｎｓｔ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ”，Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，９２（２）：３４２−３４９，２００５．
Ｑｉｕ，Ｗａｎｇ，Ｃａｉ，Ｗａｎｇ，Ｙｕｅ，”Ｓｍａｌｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ  ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ｔｗｏ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ａｎｄ  ａ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｕｍｏｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ｜，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２５（８）：９２１−９２９，２００７．
Ｒｅｆｆ及びＨｅａｒｄ，”Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｔｏ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａｔｔｅｍｐｔ  ｔｏ  Ｉｎｃｒｅａｓｅ  Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，４０：２５−３５，２００１．
Ｒｅｉｔｅｒ，Ｕｌｒｉｃｈ  Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，Ｌｅｅ及びＰａｓｔａｎ，”Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｖ  Ｆｒａｇｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  Ｆｖ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ”，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：１２３９−１２４５，１９９６．
Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｔａｎｎｅｒ，Ｈｏｆｍａｎｎ，Ｅｍｉｎｉ，Ｃｏｎｄｒａ，Ｊｏｎｅｓ，Ｋｉｅｆｆ，Ｅｌｌｉｓ，”Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  ｏｆ  ａ  ４００−Ｋｄａ  Ｅｎｖｅｌｏｐｅ  Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  Ｖｉｒｕｓ”，Ｇｅｎｅ，５４：１１３−１２３，１９８７．
Ｓｅｅｄ，”ａｎ  ＬＦＡ−３  Ｃｄｎａ  Ｅｎｃｏｄｅｓ  ａ  Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｏ  ｉｔｓ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＣＤ２”，Ｎａｔｕｒｅ，３２９：８４０，１９８７．
Ｓｉｎｋａｒ，Ｗｈｉｔｅ，Ｇｏｒｄｏｎ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｒｉ−Ｐｌａｓｍｉｄ  ａ  Ｒｅｖｉｅｗ”，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ（Ｂａｎｇａｌｏｒｅ），１１：４７−５８，１９８７．
Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ，”Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｅｑｕｅｎｃｅｓ”，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２：４８２，１９８１．
Ｓｍｉｔｈ，Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｆｒａｓｅｒ，”Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｅｔａ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｉｎ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｅｌｌｓ  Ｉｎｆｅｃｔｅｄ  Ｗｉｔｈ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ”，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，３：２１５６−２１６５，１９８３．
Ｓｐｉｚｚｏら，”Ｈｉｇｈ  Ｅｐ−ＣＡＭ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｏｏｒ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ｉｎ  ｎｏｄｅ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ”，Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ  ８６：２０７−１３，２００４．
Ｓｐｉｚｚｏら，”Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ（Ｅｐ−ＣＡＭ）ｉｓ  ａｎ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ”，Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｏｎｃｏｌ  １０３：４８３−８，２００６．
Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｇｉｂｓｏｎ，”ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ：  Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ，ｐｏｓｉｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｗｅｉｇｈｔ  ｍａｔｒｉｘ  ｃｈｏｉｃｅ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２２：４６７３−４６８０，１９９４．
ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｕｃｋｅｎ，Ｎｅｅｒ，Ｓａｂｌｏｎ，Ｄｅｓｍｅｔ，Ｃｅｌｉｓ，Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈｕｆｔｏｎ，”Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｎｏｖｅｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  Ｂ７．１  ａｎｄ  Ｂ７．２  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｉｎｇｌｅ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｄｏｍａｉｎｓ”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３１０：５９１−６０１，２００１．
Ｖａｒｇａら，”Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎ  ｇａｌｌｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｓ  ａｎ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ｐｏｏｒ  ｓｕｒｖｉｖａｌ”，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １０：３１３１−６，２００４．
Ｗａｇｎｅｒ，Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，”Ｃｏｄｏｎ  ｂｉａｓ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｍｕｔａｔｉｏｎ，”Ｎａｔｕｒｅ，３７６：７３２，１９９５．
Ｗａｒｄ，Ｇuｓｓｏｗ，Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｊｏｎｅｓ，Ｗｉｎｔｅｒ，”Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎｓ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  Ｃｏｌｉ”，Ｎａｔｕｒｅ，３４１（６２４２）：５４４−５４６，１９８９．
Ｗｅｎｔら，”Ｆｒｅｑｕｅｎｔ  ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔ  Ｅｐ−ＣＡＭ  ｉｎ  ｃｏｌｏｎ，ｓｔｏｍａｃｈ，ｐｒｏｓｔａｔｅ  ａｎｄ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒｓ”，Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ９４：１２８−３５，２００６．
Ｘｕ，Ｄｕｄａ，Ｄｉ  Ｔｏｍａｓｏ，Ａｎｃｕｋｉｅｗｉｃｚ，Ｃｈｕｎｇ，Ｌａｕｗｅｒｓ，Ｓａｍｕｅｌ，Ｓｈｅｌｌｉｔｏ，Ｃｚｉｔｏ，Ｌｉｎ，Ｐｏｌｅｓｋｉ，Ｂｅｎｔｌｅｙ，Ｃｌａｒｋ，Ｗｉｌｌｅｔｔ，Ｊａｉｎ．”Ｄｉｒｅｃｔ  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｔｈａｔ  Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ，  ａｎ  Ａｎｔｉ−ＶＥＧＦ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｕｐ−ｒｅｇｉｌａｔｅｓ  ＳＤＦ１α，ＣＸＣＲ４，ＣＸＣＬ６  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ  １  ｉｎ  Ｔｕｍｏｒｓ  ｆｒｏｍ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ．”Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６９（２０）７９０５−７９１０，２００９
Ｙｏｕｎｇ，ＭａｃＫｅｎｚｉｅ，Ｎａｒａｎｇ，Ｏｏｍｅｎ及びＢａｅｎｚｉｇｅｒ，”Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｂｙ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅ  Ｂｏｎｄ”，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１６３９６（３７７）：１３５−１３９，１９９５．
Ｚａｍｂｒｙｓｋｉ，Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｉｌａ，ＤｅＢｌｏｃｋ，Ｖａｎ  Ｍｏｎｔａｇｕ，Ｓｃｈｅｌｌ”Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ”，Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒ  ａｎｄ  Ｓｅｔｌｏｗ（ｅｄｓ．），Ｖｏｌ．ＶＩ，ｐｐ．２５３−２７８，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８４．
Ｚａｐａｔａ，Ｒｉｄｇｗａｙ，Ｍｏｒｄｅｎｔｉ，Ｏｓａｋａ，Ｗｏｎｇ，Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｃａｒｔｅｒ，”Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｌｉｎｅａｒ  Ｆ（Ａｂ'）2  Ｆ
ｒａｇｍｅｎｔｓ  Ｆｏｒ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  Ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ”，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，８（１０）：１０５７−１０６２，１９９５．
Ｚｈａｎｇ，Ｇｉｌｄｅｒｓｌｅｅｖｅ，Ｙａｎｇ，Ｘｕ，Ｌｏｏ，Ｕｒｙｕ，Ｗｏｎｇ，Ｓｃｈｕｌｔｚ，”Ａ  Ｎｅｗ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ”，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０３（５６５６）：３７１−３７３，２００４．
【図１】
0006045914.tif 000019
【図２】
0006045914.tif 000020
【図３】
0006045914.tif 000021
【図４】
0006045914.tif 000022
【図５】
0006045914.tif 000023
【図６Ａ】
0006045914.tif 000024
【図６Ｂ】
0006045914.tif 000025
【図６Ｃ】
0006045914.tif 000026
【図７Ａ】
0006045914.tif 000027
【図７Ｂ】
0006045914.tif 000028
【図７Ｃ】
0006045914.tif 000029
【図８Ａ】
0006045914.tif 000030
【図８Ｂ】
0006045914.tif 000031
【図９】
0006045914.tif 000032
【図１０】
0006045914.tif 000033
【図１１Ａ】
0006045914.tif 000034
【図１１Ｂ】
0006045914.tif 000035
【図１１Ｃ】
0006045914.tif 000036
【図１１Ｄ】
0006045914.tif 000037
【図１１Ｅ】
0006045914.tif 000038
【図１２Ａ】
0006045914.tif 000039
【図１２Ｂ】
0006045914.tif 000040
【図１３】
0006045914.tif 000041
【図１４】
0006045914.tif 000042
【図１５Ａ】
0006045914.tif 000043
【図１５Ｂ】
0006045914.tif 000044
【図１６Ａ】
0006045914.tif 000045
【図１６Ｂ】
0006045914.tif 000046
【配列表】
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