(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト肝細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を産生するための方法であって、前記方法は、
（ａ）培養容器中の細胞培養培地にヒト単球を播種するステップと；
（ｂ）０．６〜１．６ｎｇ／ｍｌのインターロイキン３（ＩＬ−３）、０．３〜２．５ｎｇ／ｍｌのマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）及び５０〜２００ｎＭのアデノシンを含む細胞培養培地中で前記単球を培養するステップと；
（ｃ）ステップ（ｂ）と同時に又はステップ（ｂ）の後で、１〜５ｎｇ／ｍｌの線維芽細胞増殖因子４（ＦＧＦ−４）を含む細胞培養培地中で前記細胞を培養するステップと、
を含む方法。
【請求項２】
ステップ（ｃ）の前記細胞培養培地が、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、グルカゴン、インスリン、及びヘパリンからなる群から選択される少なくとも１つの化合物を更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｃ）の前記細胞培養培地が、ＥＧＦ、グルカゴン、インスリン、及びヘパリンを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のうちの少なくとも一つの前記細胞培養培地が、無血清である、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のうちの少なくとも一つの前記細胞培養培地が、アルブミンを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ヒト単球を播種した後１時間未満の時点で、前記細胞培養培地を変更するステップを更に含む、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｂ）及び（ｃ）のうちの少なくとも一方において、前記細胞培養培地の容積が、前記培養容器の４０〜９０μｌ／ｃｍ２である、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｂ）において、前記細胞が、少なくとも４日間培養される、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｃ）において、前記細胞が、少なくとも７日間培養される、請求項１乃至８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ヒト単球に由来する細胞であって、請求項１乃至９のいずれか一項に記載の方法により取得可能なヒト肝細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞において、前記細胞は、その代謝特性及び生存能を失わずに少なくとも１５日間培養中で維持することができ、前記細胞は、ＣＤ９５結合抗体と共に２４時間インキュベートされるとアポトーシスを起こすことが可能であり、かつ前記細胞は、５００μＭのカフェインで細胞を処理することによって阻害することができないシトクローム活性を示す細胞。
【請求項１１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ毒性試験における、請求項１０に記載の細胞の使用。
【請求項１２】
細胞療法において使用するための請求項１０に記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト肝細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を産生する方法、並びにその方法により産生された細胞及びそれら細胞に使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝臓は、グリコーゲン貯蔵、血漿タンパク質合成、ホルモン産生、及び解毒作用等の様々な機能を持つ臓器であり、したがって生存に必要である。肝臓機能のほとんどに関与する肝臓の主要組織の細胞は、肝細胞と呼ばれる。
【０００３】
ヒト肝細胞は、例えば、急性及び慢性肝不全の細胞移植に使用することができる。更に、ヒト肝細胞は、ある薬物が人体に有害効果を及ぼすことになるか否かを決定するために、前臨床薬物試験及びハイスループットスクリーニングにおいて、医薬業界によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用される。しかしながら、初代肝細胞の使用は、肝臓組織の入手可能性、表現型の変化が初代肝細胞の培養初期に生じること、それら細胞の寿命が限られていることにより制約を受ける。更に、初代肝細胞は、典型的な誘導因子と共にインキュベーションした後のＣＹＰ活性及び誘導強度に大きなばらつきを示す。したがって、初代肝細胞で得られる結果は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ前臨床薬物試験に必要とされるほど再現性のあるものではない可能性がある。
【０００４】
したがって、初代肝細胞の使用に代わるものを開発する努力がなされている。１つの代替は、ＨｅｐＧ２及びＨｅｐａＲＧ細胞等の不死化細胞系の使用である（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。しかしながら、これら細胞系の多くは、由来が腫瘍形成性であり、正常な肝細胞の代謝能力を保持しておらず、そのため、薬理学及び毒物学におけるこれら細胞系の応用可能性は限定的であり、ｉｎ  ｖｉｖｏでの応用可能性は更により限定的である。
【０００５】
他の手法では、肝細胞に分化する骨髄由来成体幹細胞又は誘導多能性幹細胞が使用されている（非特許文献４；非特許文献５）。しかしながら、これら手法には、出発物質の複雑な単離及び複雑な分離プロトコール並びにこれら細胞のゲノム操作が必要である。
【０００６】
最後に、「ネオ肝細胞（ｎｅｏ−ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）」と呼ばれる、ヒト肝細胞の特徴を有する細胞が、まず５ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦ及び０．４ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３の混合物で単球を６日間処理し、その後３ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−４で細胞を少なくとも７日間処理することにより、末梢単球から得られている（非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８）。しかしながら、その後、これら細胞は、血清不活化マクロファージの集団と最もよく似ていることが示されており、これら細胞は肝細胞の幾つかの表現型特徴を示すものの、それら特徴は、マクロファージ分化の通常プログラムの一部として獲得されていると結論付けられた（非特許文献９）。更に、「ネオ肝細胞」をもたらす分化プロトコールは、非常に低い再現性を示した。
【０００７】
したがって、ヒト肝細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を高い再現性及び高い細胞収量で産生するための方法、及びそのような方法により得られる細胞が依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｊａｖｉｔｔ（１９９０年）Ｔｈｅ  ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ４巻：１６１〜１６８頁
【非特許文献２】Ａｎｉｎａｔら（２００６年）Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ２４巻：７５〜８３頁
【非特許文献３】Ｃｅｒｅｃら（２００７年）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ４５巻：９５７〜９６７頁
【非特許文献４】Ｆａｕｓｔｏ（２００４年）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３９巻（６号）：１４７７〜１４８７頁
【非特許文献５】Ｓｉ−Ｔａｙｅｂら（２０１０年）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ５１巻（１号）：２９７〜３０５頁
【非特許文献６】Ｒｕｈｎｋｅら（２００５年）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２８巻（７号）：１７７４〜１７８６頁
【非特許文献７】Ｒｕｈｎｋｅら（２００５年）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ７９巻（９号）：１０９７〜１１０３頁
【非特許文献８】Ｅｈｎｅｒｔら（２００８年）Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．３６巻（９号）：１９２２〜１９２９頁
【非特許文献９】Ｒｉｑｕｅｌｍｅら（２００９年）Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ７７巻（３号）：２６３〜２７６頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、本発明の目的は、非常に再現性が高く、高収量で細胞を産生する、ヒト肝細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を産生するための方法を提供することである。
本発明の更なる目的は、細胞移植及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ薬物試験に好適である、ヒト肝細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明のこれらの及び更なる目的は、本記載から明白になるように、独立クレームの主題により達成される。
本発明の好ましい実施形態の幾つかは、従属クレームの主題を形成する。
【００１１】
本発明の発明者らは、ヒト末梢単球をＩＬ−３及びアデノシンで処理し、その後ＦＧＦ−４で処理すると、ヒト肝細胞の特徴を有する細胞が高い細胞収量で再現性よく産生されることを見出した。これら細胞は、ＣＤ９５リガンド等のアポトーシス誘導物質で処理されると、アポトーシスを起こすことが可能である。更に、これら細胞は、シトクローム酵素の長期発現を示し、したがってｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験での物質の急性毒性の決定だけでなく長期毒性の決定を可能にする。更に、本発明者らは、本発明の方法により産生された細胞が、末梢単球のドナーの性別に応じてシトクローム発現の差異を示し、したがって薬物代謝の性依存的差異の研究も容易にすることを示すことができた。
【００１２】
したがって、１つの実施形態では、本発明は、ヒト肝細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を産生するための方法であって、以下のステップを含む方法を提供する：
（ａ）培養容器中の細胞培養培地にヒト単球を播種するステップ；
（ｂ）インターロイキン３（ＩＬ−３）及びアデノシンを含む細胞培養培地中でその単球を培養するステップ；及び
（ｃ）その細胞を、ステップ（ｂ）と同時に又はステップ（ｂ）の後で、線維芽細胞増殖因子４（ＦＧＦ−４）を含む細胞培養培地中で培養するステップ。
【００１３】
本発明の好ましい実施形態では、ステップ（ｂ）の細胞培養培地は、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）を更に含む。
本発明の更なる好ましい実施形態では、アデノシンは、１０〜３００ｎＭの濃度でステップ（ｂ）の細胞培養培地に存在する。
【００１４】
本発明の更に別の好ましい実施形態では、ステップ（ｃ）の細胞培養培地は、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、グルカゴン、インスリン、及びヘパリンからなる群から選択される少なくとも１つの化合物を更に含み、本発明の更により好ましい実施形態では、ステップ（ｃ）の細胞培養培地は、ＥＧＦ、グルカゴン、インスリン、及びヘパリンを含む。
【００１５】
本発明の更なる好ましい実施形態では、ステップ（ａ）、（ｂ）、及び／又は（ｃ）の細胞培養培地は無血清であり、更により好ましい実施形態では、細胞培養培地はアルブミンを含む。
【００１６】
本発明の更なる実施形態では、本方法は、ヒト単球の播種後１時間未満の時点で細胞培養培地を変更するステップを更に含む。
本発明の更に別の実施形態では、ステップ（ｂ）及び／又は（ｃ）の細胞培養培地容積は、培養容器の４０〜９０μｌ／ｃｍ２である。
【００１７】
本発明の１つの実施形態では、細胞は、本発明の方法のステップ（ｂ）において、少なくとも４日間培養される。
本発明の更に別の実施形態では、細胞は、本発明の方法のステップ（ｃ）において、少なくとも７日間培養される。
【００１８】
本発明は、本発明の方法により取得可能であり、少なくとも１５日間培養中で維持することができる、ヒト肝細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を更に提供する。
好ましくは、ヒト肝臓から単離された肝細胞は、除外される。
【００１９】
より好ましくは、細胞は、ＣＤ９５結合抗体と共に２４時間インキュベートされると、アポトーシスを起こすことが可能である。
更に、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ毒性試験又は細胞療法のための、本発明の細胞の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】単球を１４日間培養した後、様々な培養条件が、タンパク質含有量（ａ）及びＤＰＰ−ＩＶ、γ−ＧＴ、ＡＬＴ、及びＬＤＨ酵素活性（ｂ）に及ぼす影響を示す図である。レーン１：Ｒｕｈｎｋｅら（２００５年）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２８巻（７号）：１７７４〜１７８６頁に記載のプロトコールにより樹立された、「ネオ肝細胞」と呼ばれる細胞。レーン２：Ｒｕｈｎｋｅらのプロトコールに従ったが、培地容積を低減し（約７０μｌ／ｃｍ２）、接着時間をより短くし（約２０分間）、β−メルカプトエタノールを含まない培地、１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３、及び０．５ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦを用いて樹立された細胞。レーン３：レーン２と同様の条件だが、第１の培養ステップにおいて、１００ｎＭのアデノシンを更に含むＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２を基本培地として用いた。レーン４：レーン３に記載の培養条件であり、第２の培養ステップの細胞培養培地が、１０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＥＧＦ、０．２８ＩＵの組換えヒトインスリン、５ｎＭの組換えヒトグルカゴン、及び５ＩＵ／ｍｌのヘパリンを更に含む。
【図２ａ】単球を１４日間培養した後、２％ヒトアルブミン中での無血清培養が、本発明の方法により得られた細胞の様々な肝細胞特徴に及ぼす影響を示す図である。（ａ）培養期間、つまり本発明の方法のステップｂ）及びｃ）の全体にわたって、標準的条件（ｓｔｄ；つまり、１０％ＦＣＳ）及び無血清条件下で培養された本発明の細胞におけるＤＰＰ−ＩＶ、γ−ＧＴ、ＡＬＴ、及びＬＤＨの特異的酵素活性（ｎ＝４ドナー）
【図２ｂ】単球を１４日間培養した後、２％ヒトアルブミン中での無血清培養が、本発明の方法により得られた細胞の様々な肝細胞特徴に及ぼす影響を示す図である。（ｂ）細胞障害のマーカーとしてのＬＤＨの放出により決定された、標準的条件（つまり、１０％ＦＣＳ）及び無血清条件下で培養され、様々な濃度のＡＰＡＰと共に２４時間インキュベートされた本発明の細胞のＡＰＡＰ毒性（ｎ＝４ドナー）
【図２ｃ】単球を１４日間培養した後、２％ヒトアルブミン中での無血清培養が、本発明の方法により得られた細胞の様々な肝細胞特徴に及ぼす影響を示す図である。（ｃ）標準的条件（ｓｔｄ；つまり、１０％ＦＣＳ）及び無血清（ＨＡ）条件下で培養された本発明の細胞における、１μＭの３ＭＣ（３−メチルコラントレン）で４８時間処理することによるシトクロームＣＹＰ１Ａ２活性の誘導（ｎ＝３ドナー）
【図２ｄ】単球を１４日間培養した後、２％ヒトアルブミン中での無血清培養が、本発明の方法により得られた細胞の様々な肝細胞特徴に及ぼす影響を示す図である。（ｄ）標準的条件（ｓｔｄ；つまり、１０％ＦＣＳ）及び無血清条件下で様々な期間培養された本発明の細胞における、様々な濃度のメナジオンによる４８時間の刺激に応答した第ＶＩＩ因子の分泌
【図２ｅ】単球を１４日間培養した後、２％ヒトアルブミン中での無血清培養が、本発明の方法により得られた細胞の様々な肝細胞特徴に及ぼす影響を示す図である。（ｅ）標準的条件（ｓｔｄ；つまり、１０％ＦＣＳ）及び無血清条件下で１４日間培養された本発明の細胞における、１００μＭのＮＨ４Ｃｌを用いない場合（対照）及びＮＨ４Ｃｌを用いた場合の２４時間の尿素合成
【図２ｆ】単球を１４日間培養した後、２％ヒトアルブミン中での無血清培養が、本発明の方法により得られた細胞の様々な肝細胞特徴に及ぼす影響を示す図である。（ｆ）標準的条件（つまり、１０％ＦＣＳ；上段図）及び無血清条件下（下段図）で培養された本発明の細胞の形態
【図３ａ】本発明の細胞におけるアポトーシスの誘導を示す図である。（ａ）様々な濃度のＣＤ９５結合抗体ＡＰＯと共に２４時間インキュベーションした後、アポトーシスのマーカーとしてのＨＯＥＣＨＳＴ  ３３３４２によって視覚化された核凝縮により測定した、２１日間培養された本発明の細胞におけるアポトーシスの誘導
【図３ｂ】本発明の細胞におけるアポトーシスの誘導を示す図である。（ｂ）様々な期間で培養され、様々な濃度のＣＤ９５結合抗体ＡＰＯで２４時間処理された本発明の細胞におけるカスパーゼ−３活性。
【図４ａ】本発明の細胞（Ｍｅｔａｈｅｐｓ）及び初代ヒト肝細胞（ｐＨＨ）間の肝細胞特異的特徴の比較を示す図である。（ａ）基本条件下及び１００μＭのＮＨ４Ｃｌで処理した後の、初代ヒト肝細胞（培養４日目）及び同じドナーに由来する本発明の細胞（１４日目）における、（ＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍｅ（商標）尿素アッセイキットを使用して光度測定法で決定された）細胞タンパク質で正規化された尿素合成
【図４ｂ】本発明の細胞（Ｍｅｔａｈｅｐｓ）及び初代ヒト肝細胞（ｐＨＨ）間の肝細胞特異的特徴の比較を示す図である。（ｂ）初代ヒト肝細胞（培養６日目）及び１４日間培養された本発明の細胞における、５０μＭのリファンピシンで２４時間処理することによるシトクロームＣＹＰ３Ａ活性の誘導。初代ヒト肝細胞及び本発明の細胞は、同じドナーに由来する。
【図４ｃ】本発明の細胞（Ｍｅｔａｈｅｐｓ）及び初代ヒト肝細胞（ｐＨＨ）間の肝細胞特異的特徴の比較を示す図である。（ｃ）初代ヒト肝細胞（培養４日目）及び１４日間培養された本発明の細胞における、ＤＰＰ−ＩＶ、γ−ＧＴ（ＧＧＴ）、及びＡＬＴの特異的酵素活性。初代ヒト肝細胞及び本発明の細胞は、同じドナーに由来する。
【図５ａ】本発明の細胞（Ｍｅｔａｈｅｐｓ、ＭＨ）及び初代ヒト肝細胞間の遺伝子発現パターンの比較を示す図である。ａ）培養３、７、及び１４日目のＭｅｔａｈｅｐｓ及び同じドナーの初代ヒト肝細胞（培養４日目）の遺伝子発現パターンの相関性。Ｘ軸及びＹ軸は、ベータ−アクチンで正規化されたｌｏｇ２遺伝子発現である。
【図５ｂ】本発明の細胞（Ｍｅｔａｈｅｐｓ、ＭＨ）及び初代ヒト肝細胞間の遺伝子発現パターンの比較を示す図である。ｂ）初代肝細胞遺伝子発現（培養４日目）に対する、培養３日目（上段パネル）、７日目（中央パネル）、及び１４日目（下段パネル）のＭｅｔａｈｅｐｓにおける遺伝子発現の適合性。最暗色の部分は、非常に良好な適合性を有する遺伝子の割合を示し、最明色の部分は、検出可能でなかった遺伝子の割合を示す。
【図５ｃ１】本発明の細胞（Ｍｅｔａｈｅｐｓ、ＭＨ）及び初代ヒト肝細胞間の遺伝子発現パターンの比較を示す図である。ｃ）Ｍｅｔａｈｅｐｓ（培養１４日目）及び初代ヒト肝細胞（培養４日目）における、特定の生理機能を有する遺伝子をコードする遺伝子群の比較。
【図５ｃ２】本発明の細胞（Ｍｅｔａｈｅｐｓ、ＭＨ）及び初代ヒト肝細胞間の遺伝子発現パターンの比較を示す図である。ｃ）Ｍｅｔａｈｅｐｓ（培養１４日目）及び初代ヒト肝細胞（培養４日目）における、特定の生理機能を有する遺伝子をコードする遺伝子群の比較。
【図５ｃ３】本発明の細胞（Ｍｅｔａｈｅｐｓ、ＭＨ）及び初代ヒト肝細胞間の遺伝子発現パターンの比較を示す図である。ｃ）Ｍｅｔａｈｅｐｓ（培養１４日目）及び初代ヒト肝細胞（培養４日目）における、特定の生理機能を有する遺伝子をコードする遺伝子群の比較。
【図６ａ】本発明の細胞（培養１４日目）と、初代ヒト肝細胞（培養４日目）及び／又はＲｕｈｎｋｅら（２００５年）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２８巻（７号）：１７７４〜１７８６頁に記載の方法により樹立されたネオ肝細胞（ｎｅｏｈｅｐｓ）（培養１４日目）との比較を示す図である。（ａ）本発明の細胞（Ｍｅｔａｈｅｐｓ）及び同じドナーに由来するＮｅｏＨｅｐｓにおける、ヨウ化プロピジウムで細胞を染色し、その後ＦＡＣＳ分析をすることにより測定された、５００ｎｇ／ｍｌのＡＰＯで２４時間のアポトーシスの誘導
【図６ｂ】本発明の細胞（培養１４日目）と、初代ヒト肝細胞（培養４日目）及び／又はＲｕｈｎｋｅら（２００５年）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２８巻（７号）：１７７４〜１７８６頁に記載の方法により樹立されたネオ肝細胞（ｎｅｏｈｅｐｓ）（培養１４日目）との比較を示す図である。（ｂ）本発明の細胞（Ｍｅｔａｈｅｐｓ）、初代肝細胞、及びＮｅｏＨｅｐｓにおける第ＶＩＩＩ因子合成（タンパク質に対して正規化し、初代肝細胞の％として示されている）
【図６ｃ】本発明の細胞（培養１４日目）と、初代ヒト肝細胞（培養４日目）及び／又はＲｕｈｎｋｅら（２００５年）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２８巻（７号）：１７７４〜１７８６頁に記載の方法により樹立されたネオ肝細胞（ｎｅｏｈｅｐｓ）（培養１４日目）との比較を示す図である。（ｃ）本発明の細胞（Ｍｅｔａｈｅｐｓ）、初代肝細胞、及びＮｅｏＨｅｐｓにおける第ＶＩＩ因子合成（タンパク質に対して正規化し、初代肝細胞の％として示されている）
【図６ｄ】本発明の細胞（培養１４日目）と、初代ヒト肝細胞（培養４日目）及び／又はＲｕｈｎｋｅら（２００５年）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２８巻（７号）：１７７４〜１７８６頁に記載の方法により樹立されたネオ肝細胞（ｎｅｏｈｅｐｓ）（培養１４日目）との比較を示す図である。（ｄ）標準的条件（つまり、１０％ＦＣＳ）及び無血清条件下で培養された本発明の細胞（ＭＨ）、及びＮｅｏＨｅｐｓ（ＮＨ）における、５００μＭのカフェインで細胞を処理することによるＣＹＰ１Ａ２活性の阻害。阻害は、蛍光基質３ＣＥＣにより決定された。
【図７】発光Ｐ４５０Ｇｌｏ（商標）アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用するにより決定された、培養１４〜３５日目の本発明の細胞における、１０μＭフェニトインで４８時間処理することにより誘導可能なＣＹＰ３Ａ活性の長期安定性を示す図である。
【図８ａ】ＬＤＨ活性により測定された、低濃度のジクロフェナク（５０μＭ）で１５日間培養された本発明の細胞の長期毒性を示す図である。
【図８ｂ】ＬＤＨ活性により測定された、低濃度のアセトアミノフェン（５００μＭ）で１５日間培養された本発明の細胞の長期毒性を示す図である。
【図９】発光法により決定された、男性又は女性ヒトのいずれかから単離された培養１４日目の本発明の細胞におけるＣＹＰ１Ａ２、２Ｃ９、及び３Ａ４活性の性差を示す図である；男性又は女性の後ろにある「＋」は、ＣＹＰ１Ａ２の場合は１μＭの３−メチル−コラントレンで、並びにＣＹＰ３Ａ４及びＣＹＰ２Ｃ９の場合は５０μＭリファンピシンで誘導した後の活性を意味する。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の例示的な実施形態を詳細に説明する前に、以下の一般的定義を提供する。
下記で例示的に説明されている本発明は、任意の要素（複数可）の非存在下で、本明細書で具体的に開示されていない制限（複数可）下で、好適に実施することができる。
【００２２】
本発明は、特定の実施形態に関して説明されることになるが、本発明はそれらに限定されず、請求項によってのみ限定される。
用語「含む」は、本明細書及び請求項で使用される場合、他の要素を除外しない。本発明の目的では、用語「からなる」は、用語「含む」の好ましい実施形態であるとみなされる。これ以降、ある群が、少なくともある数の実施形態を含むと定義される場合は、これも、好ましくはこれら実施形態のみからなる群を開示すると理解されるべきである。
【００２３】
本発明の目的では、用語「得られた」は、用語「取得可能な」の好ましい実施形態であるとみなされる。以降、例えば細胞が、特定の方法により取得可能であると定義される場合、これも、この方法により得られた細胞を開示すると理解されるべきである。
【００２４】
単数名詞を参照する際に、不定冠詞又は定冠詞、例えば「ａ」、「ａｎ」、又は「ｔｈｅ」が使用される場合、これは、特に別様の記載がない限り、その名詞の複数を含む。本発明の状況では、用語「約」又は「およそ」は、目的とする特徴の技術的効果が依然として保証されると当業者が理解するであろう正確性の間隔を示す。この用語は、典型的には、表示数値から±１０％、好ましくは±５％の偏差を指す。
【００２５】
用語「ヒト肝細胞」は、タンパク質合成及び貯蔵、糖質の変換、コレステロール、胆汁酸塩、及びリン脂質の合成、並びに外因性及び内因性物質の解毒作用に関与するヒト肝臓の主要組織の細胞を意味する。培養中の初代ヒト肝細胞は通常、六角形の形態を示し、ギャップ結合によりできる細胞間接触、並びにサイトケラチン１８及び汎アクチン（ｐａｎ−ａｃｔｉｎ）等の上皮マーカータンパク質の発現により決定される上皮表現型を含むコンフルエント細胞層を確立する。初代ヒト肝細胞、つまりいかなる形質転換ステップも行わずに肝臓組織から単離された細胞は、非常に限られた期間、つまり８〜１４日間しか、それらの特性及び生存能を失わずに培養中で維持することができない。
【００２６】
ヒト肝細胞の典型的な特徴には、これらに限定されないが、以下が含まれる：
−  以下のもの等の酵素活性：
・例えば、発色基質Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐ−ニトロアニリドで測定される、ジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）（Ｂａｕｖｏｉｓ（１９９０年）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０巻（３号）：４５９〜６８頁）；
・例えば、Ｒａｎｄｏｘ−Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社から購入されたＡＬＴキットを用いて製造業者の説明書に従って測定される、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）；
・例えば、Ｌ−ガンマ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリドとグリシルグリシンが反応してガンマ−グルタミル−グリシルグリシド及びｐ−ニトロアニリンが生じるγ−ＧＴ触媒反応に起因するｐ−ニトロアニリンの量を決定することによるガンマグルタミルトランスペプチダーゼ（γ−ＧＴ）を決定してもよい（Ｓｚａｓｚ  Ｇ：Ｇａｍｍａ−ｇｌｕｔａｍｙｌ−ｔｒａｎｓｐｅｐｔｉｄａｓｅ、ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｅｎ  ｄｅｒ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｓｃｈｅｎ  Ａｎａｌｙｓｅ、第３版（１巻）、Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ  ＨＵ編、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ／Ｂｅｒｇｓｔｒ．，Ｖｅｒｌａｇ  Ｃｈｅｍｉｅ、１９７４年、７５７〜７６２頁）；
・例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ社から得られる細胞毒性キットを製造業者の説明書に従って使用して測定される乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）；
−  ヘキソキナーゼ／グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ法（Ｂｏｎｄａｒら（１９７４年）Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２０巻／５号：５８６〜５９０頁）を使用してＮＡＤＰＨの光度測定法により測定される、グルカゴン刺激後のグルコース分泌
−  例えば、選択された薬理学的物質での処理時に細胞質酵素ＬＤＨが培地に放出されることにより測定される、アセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）及びジクロフェナク等の薬理学的物質を代謝する能力；
−  例えば、ウエスタンブロット又はＲＴ−ＰＣＲ分析により測定される、アルブミン、α−フェトプロテイン、アシアロ糖タンパク質受容体１及び２、カルバモイルリン酸シンテターゼ（１）、並びに凝固因子Ｉ及びＩＩの発現；
−  例えば、ウエスタンブロット又はＲＴ−ＰＣＲ分析により測定される、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｐ８〜９、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ３〜５、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ３Ａ４等のＣＹＰ４５０酵素の発現；
−  発光により（例えば、Ｐ４５０−Ｇｌｏ（商標）−アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を製造業者の説明書に従って使用して）又は蛍光（３−シアノ−クマリン；Ｄｏｎａｔｏら（２００４年）Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ３２巻（７号）：６９９〜７０６頁）により測定される、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、及びＣＹＰ３Ａ４等のＣＹＰ４５０酵素の活性；
−  例えば、酵素による尿素検査（例えば、製造業者の説明書に従って、Ｃｌｏｎａｇｅｎ社（ブリュッセル、ベルギー）のＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍｅ（商標）尿素アッセイキット）により測定される、アンモニウムイオンと共にインキュベーションした後の尿素合成能力；
−  例えば、細胞培養培地中の第ＶＩＩ因子が直接ＥＬＩＳＡで測定される、ビタミンＫと共にインキュベーションした後の第ＶＩＩ因子産生能力；
−  例えば、細胞培養培地中の第ＶＩＩＩ因子がサンドイッチＥＬＩＳＡで測定される（Ｅｓｐｏｓｉｔｏら（２０００年）Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．５８巻：１２３〜１３０頁；Ｚｉｙａｄｅｈら（１９９０年）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２５９巻：Ｆ７０４〜Ｆ７１４頁）、第ＶＩＩＩ因子産生能力；
−  例えば、細胞培養培地のＥＬＩＳＡにより測定される、アルブミンの分泌；
−  例えば、蛍光染料ローダミン１２３又はＨＯＥＣＨＳＴ３３３４２の輸出により測定される（Ｂｒｏｗｎ  ＣＤ（２００８年）、Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２３３巻（３号）：４２８〜３８頁）、ＡＢＣ輸送体ファミリーのタンパク質等の生体異物輸送体の発現；及び
−  例えば、様々なＣＹＰ  Ｐ４５０遺伝子及びＥ２Ｆ等の転写因子の遺伝子発現パターン、並びにＲＡＲ、ＲＸＲ及びＰＰＡＲファミリーの遺伝子発現パターン。
【００２７】
上記の特徴を決定するのに好適な試験方法の詳細は、下記の実施例部分に記載されている。
本発明の方法により産生される細胞は、上記に列挙した特徴の少なくとも１つ、好ましくは２つ又は３つ、より好ましくは４つ又は５つ、更により好ましくは６つ、７つ、又は８つ、最も好ましくは全てを示す。
【００２８】
本発明のプロセスでは、上記の特徴は、好ましくは、ＦＧＦ−４を含む細胞培養培地中で細胞を少なくとも４日間及び最長で４２日間培養した後で測定される。より好ましくは、特徴は、ＦＧＦ−４を含む細胞培養培地中で細胞を７〜１４日間培養した後で測定され、最も好ましくは、特徴は、ＦＧＦ−４を含む細胞培養培地中で細胞を１４日間培養した後で測定される。
【００２９】
用語「単球」は、細胞表面抗原ＣＤ１４の高レベル発現を特徴とする白血球タイプを指す。
これら単球は、通常、ヘパリン、ＥＤＴＡ、又はクエン酸塩等の抗血液凝固剤で処理された全血から得られる。全血は、単球を単離するまで、４℃で最長２４時間保管することができる。
【００３０】
全血は、好ましくは密度勾配遠心分離により血漿並びに白血球及び赤血球に分離することができ、血漿は、遠心分離後、「バフィーコート」とも呼ばれる、白血球全体を含有する層がその下に存在する上清に見出される。この「バフィーコート」の下に、赤血球を含有する相が存在する。その後、例えば、公知のプロセスを使用して遠心分離により、「バフィーコート」層を単離及び分離して、単球が得られる。例えば、「バフィーコート」層を、フィコールハイパック等のリンパ球分離媒体にコーティングし、遠心分離してもよい。「バフィーコート」が赤く染まることで明らかなように、「バフィーコート」が赤血球で汚染されている場合、細胞を、ＮＨ４Ｃｌ、ＫＨＣＯ３、及びＥＤＴＡを含有する赤血球溶解緩衝液と共にインキュベートする。
【００３１】
或いは、単球は、それらがＣＤ１４等の細胞表面マーカーを発現することに基づき、ＦＡＣＳ、免疫磁気ビーズ選別、及び磁気活性化細胞選別等の方法により、全血から得ることができる。
【００３２】
本発明の方法で使用される単球は、任意の単離されたヒト血液から得ることができ、また、血液は、由来が脾臓、リンパ節、又は骨髄等の器官であってもよい。本発明の別の実施形態では、単球は、腹水から単離される。
【００３３】
本発明の細胞、つまりヒト肝細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を細胞療法に使用することが目的である場合、本発明の方法の出発物質として使用される単球は、好ましくは自己由来の単球、つまりその後本発明の細胞で治療しようとする患者の血液に由来する単球である。
【００３４】
用語「細胞を播種する」は、本件のヒト肝細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞等の細胞混合物内の導入細胞又は少なくともある集団の生存及び／又は増殖を促進することが可能なｉｎ  ｖｉｔｒｏ環境に細胞混合物を導入することを指す。本発明の方法で接種される細胞は、末梢血又は腹水等の好適な供給源から得られる単球である。好ましい実施形態では、細胞は、それらの単離直後に播種される。しかしながら、単離と播種との間に、細胞の凍結又は遠心分離等の１つ又は複数の追加ステップを導入することも可能である。
【００３５】
細胞は、培養容器の１００，０００〜４００，０００細胞／ｃｍ２の密度で、好ましくは培養容器の１５０，０００〜３５０，０００細胞／ｃｍ２の密度で、より好ましくは培養容器の２００，０００〜３００，０００細胞／ｃｍ２の密度で、最も好ましくは培養容器の２５０，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種される。
【００３６】
細胞は、ＩＬ−３及びアデノシン及び随意にＭ−ＣＳＦを含む細胞培養培地に播種してもよい。しかしながら、細胞の播種後１時間以内、好ましくは２０分以内に培地が変更されることになっている場合、また、細胞が播種される細胞培養培地は、ＩＬ−３、アデノシン、及びＭ−ＣＳＦを欠如していてもよい。
【００３７】
「培養容器」は、液相中又は容器の内面に付着しているかのいずれかである培養培地又は寒天で細胞を増殖させるのに好適なあらゆる容器をいう。そのような専用容器のタイプには、ロールボトル、撹拌フラスコ、ペトリ皿、及び組織フラスコが含まれる。培養容器は、温度、湿度、及び気体が制御された環境中でインキュベートして、最大の細胞又は組織増殖を促進するように設計されている。一般的に、細胞培養培地又は寒天の層は、増殖表面を覆っている。増殖表面として使用されない容器の部分は、細胞培養を取り囲む内部気体環境を囲い込んでいる。細胞、組織、及び微生物等は、典型的には、容器の開口部から細胞培養容器の内部に導入される。細胞の導入後、開口部は、細胞の培養中に細胞が環境と接触しないように閉鎖される。
【００３８】
本発明の好ましい実施形態では、培養容器は、組織培養のために処理されており、それは、培養容器の表面が、ヒト肝細胞等の通常は接着状態で増殖する細胞は接着して増殖するが、懸濁中で増殖する細胞は、接着しないか又はわずかしか接着しないように処理されることを意味する。組織培養用のそのような処理には、容器の照射、或いは例えば特殊なプラスチック、ポリマー、若しくはナノ構造物による、又は細胞外マトリックスのタンパク質による容器のコーティングが含まれていてもよい。組織培養用に処理された培養容器は、組織培養皿及び組織培養フラスコを含んでいてもよく、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、Ｇｒｅｉｎｅｒ社、Ｓｉｇｍａ社、及びＴＰＰ社等の様々な供給業者から入手可能である。
【００３９】
用語「細胞培養」及び「細胞の培養」は、細胞、好ましくはヒト細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで維持及び増殖することを指す。理想的には、培養された細胞は、自発的には分化しないが、本発明の方法で使用されるＦＧＦ−４等の好適な刺激で処理される場合にのみ分化する。別様の指定がない限り、本開示が、本発明の細胞を培養するための期間を提供している場合、この期間は、本発明の方法のステップ（ａ）およびステップ（ｂ）の両方を含む。
【００４０】
「細胞培養培地」は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養で細胞を維持するために使用される。幾つかの細胞タイプの場合、培地は、培養中の細胞の増殖を支援するのに十分な場合もある。本発明による培地は、エネルギー源、アミノ酸、及び無機イオン等の栄養素を提供する。加えて、本発明による培地は、フェノールレッドのような色素、ピルビン酸ナトリウム、幾つかのビタミン、遊離脂肪酸、抗生物質、酸化防止剤、及び微量元素を含有していてもよい。
【００４１】
本発明の細胞を培養する場合、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、アルファ−ＭＥＭ、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ培地、及びマッコイ培地等の任意の標準的培地が好適である。これら培地は、当業者に周知であり、Ｃａｍｂｒｅｘ社（イーストラザフォード、ＵＳＡ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（サンディエゴ、ＵＳＡ）、及びＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（ダイセンホーヘン、ドイツ）等の企業から購入することができる。好ましくは、培地は、ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（１：１）である。
【００４２】
好ましくは、培地は、２−メルカプト−エタノール又はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の硫黄化合物を含有していない。
しかしながら、本発明のプロセスで使用される培地は、Ｌ−グルタミン、ペニシリン、及びストレプトマイシン等の他の従来の細胞培養培地補完物を含有していてもよい。
【００４３】
本発明の方法では、単球は、インターロイキン３（ＩＬ−３）及びアデノシンを含有する培地中でまず培養される（本発明の方法のステップ（ｂ）に対応する）。
ＩＬ−３は、多能性造血幹細胞の骨髄前駆細胞への分化を刺激し、単球を含む骨髄系統の全ての細胞の増殖を刺激するサイトカインである。好ましくは、ヒトＩＬ−３が使用され、最も好ましくは、組換えヒトＩＬ−３が使用される。野生型ヒトＩＬ−３は、例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社（ミネアポリス、ＵＳＡ）、ＧｅｎＷａｙ社（サンディエゴ、ＵＳＡ）、又はＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社（ベルギッシュ  グラートバッハ、ドイツ）から得ることができる。
【００４４】
用語「ＩＬ−３」は、ＩＬ−３類似体、つまり、野生型ＩＬ−３の受容体結合特性及び骨髄細胞の増殖を刺激する等の生物活性を実質的に維持し、ＩＬ−３ポリペプチドのアミノ酸配列内に１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は付加を有する変異体も含むことが意図されている。好適なＩＬ−３類似体は、例えば、Ｌｏｐｅｚら（１９９２年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９巻：１１８４２〜１１８４６頁に記載されており、ポリペプチドの１０１位にアラニンを有するＩＬ−３、１１６位にバリンを有するＩＬ−３、及び１０１位にアラニンを有するＩＬ−３、及び１１６位にバリンを有するＩＬ−３が含まれる。
【００４５】
ＩＬ−３は、本発明の方法のステップ（ｂ）及び随意にステップ（ｃ）の細胞培養培地中に、０．２ｎｇ／ｍｌ〜２．５ｎｇ／ｍｌ又は０．３ｎｇ／ｍｌ〜２ｎｇ／ｍｌ、好ましくは０．４ｎｇ／ｍｌ〜１．８ｎｇ／ｍｌ又は０．５ｎｇ／ｍｌ〜１．７ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは０．６ｎｇ／ｍｌ〜１．６ｎｇ／ｍｌ又は０．７ｎｇ／ｍｌ〜１．５ｎｇ／ｍｌ、更により好ましくは０．８ｎｇ／ｍｌ〜１．４ｎｇ／ｍｌ又は０．９ｎｇ／ｍｌ〜１．１ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは１ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する。
【００４６】
アデノシンは、リボース糖分子部分に結合したアデニンの分子で構成されるヌクレオシドである。アデノシンは、エネルギー移動及びシグナル伝達等の生化学的プロセスに重要な役割を果たす。用語「アデノシン」は、アデノシンＡ３受容体に結合し、ＩＬ−３の刺激効果を高める、Ｎ６−（３−ヨードベンジル）アデノシン−５’−Ｎ−メチルウロンアミド（ＩＢ−ＭＥＣＡ）（Ｈｏｆｅｒら（２００９年）Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｓ．５８巻：２４７〜２５２頁）等のアデノシンの類似体も含むことが意図されている。アデノシンは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ダイセンホーヘン、ドイツ等の好適な供給業者から得ることができる。
【００４７】
アデノシンは、本発明の方法のステップ（ｂ）及び随意にステップ（ｃ）の細胞培養培地中に、１０〜３００ｎＭ又は２０〜２８０ｎＭ、好ましくは３０〜２５０ｎＭ又は４０〜２２０ｎＭ、より好ましくは５０〜２００ｎＭ又は６０〜１８０ｎＭ、更により好ましくは８０〜１５０ｎＭ又は９０〜１２０ｎＭ、最も好ましくは１００ｎＭの濃度で存在する。
【００４８】
本発明の好ましい実施形態では、細胞培養培地は、０．２〜２．５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３及び１０〜３００ｎＭのアデノシン、より好ましくは０．６〜１．６ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３及び５０〜２００ｎＭのアデノシン、更により好ましくは０．８〜１．４ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３及び８０〜１５０ｎＭのアデノシン、最も好ましくは１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３及び１００ｎＭのアデノシンを含む。
【００４９】
好ましい実施形態では、本発明の方法のステップ（ｂ）及び随意にステップ（ｃ）で使用される培地は、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）を更に含む。
Ｍ−ＣＳＦ（ＣＳＦ−１とも呼ばれる）は、単球、繊維芽細胞、及び内皮細胞により産生される、その特異的ｃ−Ｆｍｓ受容体（ＣＳＦ−１Ｒとも呼ばれる）に結合すると単球の分裂を誘導するサイトカインである。好ましくは、ヒトＭ−ＣＳＦが使用され、最も好ましくは、組換えヒトＭ−ＣＳＦが使用される。細胞培養培地に使用されるＭ−ＣＳＦは、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社（ミネアポリス、ＵＳＡ）又はＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社（ダイセンホーヘン、ドイツ）等の好適な供給業者から得ることができる。
【００５０】
用語「Ｍ−ＣＳＦ」は、本発明の意味内では、野生型Ｍ−ＣＳＦアミノ酸配列に対して１つ又は複数のアミノ酸置換、欠失、及び／又は付加を含み、Ｍ−ＣＳＦの受容体結合及び生物活性を保持するＭ−ＣＳＦの類似体も含むことが意図されている。好適なＭ−ＣＳＦ類似体には、例えば、Ｔａｙｌｏｒら（１９９４年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９巻（４９号）：３１１７１〜３１１７７頁に記載の（Ｑ１７Ａ、Ｒ２１Ａ）Ｍ−ＣＳＦ及び（Ｅ１１５Ａ、Ｎ１１９Ａ）Ｍ−ＣＳＦが含まれる。
【００５１】
Ｍ−ＣＳＦは、本発明の方法のステップ（ｂ）及び随意にステップ（ｃ）の細胞培養培地中に、０．１ｎｇ／ｍｌ〜７ｎｇ／ｍｌ又は０．２ｎｇ／ｍｌ〜５ｎｇ／ｍｌ、好ましくは０．２５ｎｇ／ｍｌ〜３ｎｇ／ｍｌ又は０．３ｎｇ／ｍｌ〜２．５ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは０．３５ｎｇ／ｍｌ〜１．０ｎｇ／ｍｌ又は０．４ｎｇ／ｍｌ〜０．８ｎｇ／ｍｌ、及び最も好ましくは０．５ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する。
【００５２】
本発明の好ましい実施形態では、ステップ（ｂ）の細胞培養培地は、０．２〜２．５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３、１０〜３００ｎＭのアデノシン、及び０．１ｎｇ／ｍｌ〜７ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦ、より好ましくは０．６〜１．６ｎｇ／ｍｌのＩＬ３、５０〜２００ｎＭのアデノシン、及び０．３ｎｇ／ｍｌ〜２．５ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦ、更により好ましくは０．８〜１．４ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３、８０〜１５０ｎＭのアデノシン、及び０．４ｎｇ／ｍｌ〜０．８ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦ、最も好ましくは１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３、１００ｎＭのアデノシン、及び０．５ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦを含む。
【００５３】
細胞は、ＩＬ−３及びアデノシン及び随意にＭ−ＣＳＦを含むが、ＦＧＦ−４を含まない細胞培養培地で、少なくとも４日間、好ましくは少なくとも５日間、より好ましくは少なくとも６日間、最も好ましくは７日間培養される。細胞は、ＩＬ−３及びアデノシン及び随意にＭ−ＣＳＦを含むが、ＦＧＦ−４を含まない細胞培養培地で、最長で１０日間、好ましくは最長で９日間、より好ましくは最長で８日間、最も好ましくは７日間培養される。好ましくは、細胞は、ＩＬ−３及びアデノシン及び随意にＭ−ＣＳＦを含むが、ＦＧＦ−４を含まない細胞培養培地で、少なくとも４日間及び最長で１０日間培養される。
【００５４】
本発明の方法の第２の培養ステップでは（本発明の方法のステップ（ｃ）に対応する）、細胞は、線維芽細胞増殖因子４（ＦＧＦ−４）を含む細胞培養培地で培養される。好ましい実施形態では、第１の培養ステップで使用される細胞培養培地は、除去され、ＦＧＦ−４を含む細胞培養培地が添加される。つまり、細胞は、ＩＬ−３及びアデノシン及び（随意に）Ｍ−ＣＳＦを含む細胞培養培地で細胞を培養した後、ＦＧＦ−４を含む細胞培養培地で培養される。第２の培養ステップで使用される細胞培養培地は、第１の培養ステップで使用される細胞培養培地と同じであってもよく、又は異なっていてもよい。したがって、培地は、ＩＬ−３、アデノシン、（随意に）Ｍ−ＣＳＦ、及びＦＧＦ−４を一緒に含んでいてもよく、又は培地は、ＦＧＦ−４のみを含んでいてもよい。好ましくは、本発明の第２の培養ステップで使用される細胞培養培地は、ＩＬ−３、Ｍ−ＣＳＦ、及びアデノシンを含んでいない。しかしながら、微量の、つまり最大で５０％又は４０％、好ましくは最大で３０％又は２０％、より好ましくは最大で１５％又は１０％、最も好ましくは最大で５％又は２％の濃度の、第１の培養ステップのＩＬ−３、アデノシン、及び（随意に）Ｍ−ＣＳＦが、第２の培養ステップに存在していてもよい。更なる実施形態では、細胞は、細胞を播種した直後に、ＩＬ−３、アデノシン、（随意に）Ｍ−ＣＳＦ、及びＦＧＦ−４を含む培地でインキュベートしてもよい。
【００５５】
更に、第２の培養ステップで使用される基本培地は、第１のステップで使用される基本培地と同じあってもよく、又は異なっていてもよい。例えば、ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（ｌ：１）が第１のステップで使用される場合、第２のステップで使用される培地も、ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（１：１）であってもよく、又は第２のステップで使用される培地は、例えばＲＰＭＩであってもよい。好ましくは、第１及び第２の培養ステップで使用される培地は同じであり、最も好ましくは、第１及び第２の培養ステップで使用される培地は、ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（１：１）である。
【００５６】
繊維芽細胞増殖因子は、血管新生、創傷治癒、及び胚発生に関与する増殖因子のファミリーである。繊維芽細胞増殖因子は、ヘパリン結合タンパク質であり、細胞表面に結合しているヘパラン硫酸プロテオグリカンとの相互作用は、ＦＧＦシグナル伝達に不可欠であることが示されている。好ましくは、ヒトＦＧＦ−４が使用され、最も好ましくは、組換えヒトＦＧＦ−４が使用される。組換えヒトＦＧＦ−４は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社（ミネアポリス、ＵＳＡ）等の好適な供給業者から得ることができる。
【００５７】
本発明の方法のステップ（ｃ）の細胞培養培地中のＦＧＦ−４の濃度は、０．５〜７ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１〜５ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは２〜４ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは３ｎｇ／ｍｌである。
【００５８】
本発明の好ましい実施形態では、本発明の第２の培養ステップで使用される細胞培養培地は、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、グルカゴン、インスリン、及びヘパリンからなる群から選択される少なくとも１つの化合物を更に含み、より好ましくは、本発明の第２の培養ステップで使用される細胞培養培地は、ＥＧＦ、グルカゴン、及びインスリンを更に含み、最も好ましくは、本発明の第２の培養ステップで使用される細胞培養培地は、ＥＧＦ、グルカゴン、ヘパリン、及びインスリンを更に含む。
【００５９】
ＥＧＦは、細胞成長、増殖、分化、及び生存の調節に重要な役割を果たす増殖因子である。存在する場合、第２の培養ステップの細胞培養培地中のＥＧＦの濃度は、５〜２０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは７〜１５ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは８〜１２ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは１０ｎｇ／ｍｌである。好ましくは、ヒトＥＧＦが使用され、最も好ましくは、組換えヒトＥＧＦが使用される。細胞培養培地に使用されるＥＧＦは、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ社、ベルリン、ドイツ等の好適な供給業者から得ることができる。
【００６０】
グルカゴンは、膵臓により分泌され、肝臓が貯蔵グリコーゲンを、その後血流に放出されるグルコースに変換することを促すホルモンである。存在する場合、本発明の方法の第２の培養ステップの細胞培養培地中のグルカゴンの濃度は、２〜１０ｎＭ、好ましくは３〜８ｎＭ、より好ましくは４〜７ｎＭ、最も好ましくは５ｎＭである。好ましくは、ヒトグルカゴンが使用され、最も好ましくは、組換えヒトグルカゴンが使用される。細胞培養培地に使用されるグルカゴンは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ダイセンホーヘン、ドイツ等の好適な供給業者から得ることができる。
【００６１】
インスリンは、膵臓のランゲルハンス島により産生され、体内のエネルギー及びグルコース代謝を調節するペプチドホルモンである。存在する場合、本発明の方法の第２の培養ステップの細胞培養培地中のインスリンの濃度は、０．１０〜０．５０ＩＵ、好ましくは０．１５〜０．４０ＩＵ、より好ましくは０．１７〜０．３５ＩＵ、更により好ましくは０．２０〜０．３０ＩＵ、最も好ましくは０．２８ＩＵである。好ましくは、ヒトインスリンが使用され、最も好ましくは、組換えヒトインスリンが使用される。細胞培養培地に使用されるインスリンは、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ社、ベルリン、ドイツ等の好適な供給業者から得ることができる。
【００６２】
ヘパリンは、注射可能な抗血液凝固剤として広く使用されている高度に硫酸化されたグリコサミノグリカンである。存在する場合、本発明の方法の第２の培養ステップの細胞培養培地中のヘパリンの濃度は、２〜１０ＩＵ／ｍｌ、好ましくは３〜８ＩＵ／ｍｌ、より好ましくは４〜７ＩＵ／ｍｌ、最も好ましくは５ＩＵ／ｍｌである。細胞培養培地に使用されるヘパリンは、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ社、ベルリン、ドイツ等の好適な供給業者から得ることができる。
【００６３】
好ましくは、第２の培養ステップの細胞培養培地は、５〜２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、２〜１０ｎＭのグルカゴン、０．１０〜０．５０ＩＵのインスリン、及び２〜１０ＩＵ／ｍｌのヘパリンを含む。より好ましくは、第２の培養ステップの細胞培養培地は、８〜１２ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、３〜８ｎＭのグルカゴン、０．１７〜０．３５ＩＵのインスリン、及び３〜８ＩＵ／ｍｌのヘパリンを含み、最も好ましくは、第２の培養ステップの細胞培養培地は、１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、５ｎＭのグルカゴン、０．２８ＩＵのインスリン、及び５ＩＵ／ｍｌのヘパリンを含む。
【００６４】
本発明の更により好ましい実施形態では、第２の培養ステップの細胞培養培地は、０．５〜７ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−４、５〜２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、２〜１０ｎＭのグルカゴン、０．１０〜０．５０ＩＵのインスリン、及び２〜１０ＩＵ／ｍｌのヘパリンを含み、更により好ましくは、１〜５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−４、８〜１２ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、３〜８ｎＭのグルカゴン、０．１７〜０．３５ＩＵのインスリン、及び３〜８ＩＵ／ｍｌのヘパリンを含む。本発明の最も好ましい実施形態では、第２の培養ステップの細胞培養培地は、３ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−４、１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、５ｎＭのグルカゴン、０．２８ＩＵのインスリン、及び５ＩＵ／ｍｌのヘパリンを含む。
【００６５】
好ましい実施形態では、本発明の方法の第２の培養ステップで使用される細胞培養培地は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を含有していない。
第１及び第２の培養ステップで使用される細胞培養培地は、胆汁酸又は胆汁酸塩、例えばタウロコール酸、グリココール酸、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコラート、及びリトコール酸；カフェイン；及び／又はヒドロコルチゾン及びデキサメタゾン等のグルココルチコイド等の更なる化合物を含んでいてもよい。デオキシコラートが培地中に存在する場合、デオキシコラートは、１〜３０μＭ、好ましくは２〜２５μＭ又は３〜２０μＭ、より好ましくは４〜１８μＭ又は５〜１５μＭ、最も好ましくは１０μＭの濃度で存在する。カフェインが培地中に存在する場合、カフェインは、５〜１００μＭ、好ましくは１０〜８０μＭ又は２０〜７０μＭ、より好ましくは３０〜６５μＭ又は４０〜６０μＭ、最も好ましくは５０μＭの濃度で存在する。
【００６６】
細胞は、ＦＧＦ−４、並びに随意にＥＧＦ、グルカゴン、インスリン、及びヘパリンの１つ若しくは複数又は全てを含む細胞培養培地で、少なくとも７日間、及び好ましくは最長で５０日間、より好ましくは最長で４０日間、更により好ましくは最長で３５日間培養され、最も好ましくは、細胞は、７〜３５日間培養される。少なくともＦＧＦ−４、並びに随意にＥＧＦ、インスリン、グルカゴン、及びヘパリンの１つ又は複数を含有する細胞培養培地で、少なくとも４日間、好ましくは少なくとも７日間、より好ましくは少なくとも１４日間培養した後、細胞は、上述のようなヒト肝細胞の少なくとも１つの特徴を獲得する。
【００６７】
用語「培地変更」は、細胞と接触している培地を、例え吸引により取り除き、新しい培地、つまりそれまで細胞と接触していない培地を添加するステップを意味することが意図されている。好ましくは、培地は、単球を播種した後の１時間未満の、より好ましくは４５分未満、更により好ましくは３０分未満、最も好ましくは２０分又は１０分の時点で変更される。
【００６８】
培地変更の更なるステップは、単球を播種した１８〜３０時間後、好ましくは２０〜２８時間後、より好ましくは２２〜２６時間後、最も好ましくは２４時間後に行ってもよい。
【００６９】
本発明の別の好ましい実施形態では、第１及び／又は第２の培養ステップで使用される細胞培養培地は、無血清であり、つまり培地は、ウマ血清、ヒト血清、又は子ウシ血清（ＦＣＳ）等の血清成分を含有していない。しかしながら、無血清培地は、個別のタンパク質又はバルクタンパク質画分を含有していてもよい。無血清培地を使用することにより、できるだけ少数の変数を有するように設計された一連の条件で細胞を培養することが可能になる。更に、本発明の方法により産生される細胞が、細胞療法に使用することを目的とする場合、培地に血清を使用することは、汚染リスクもあるため、不利である。
【００７０】
更により好ましい実施形態では、無血清培地は、ヒト血清アルブミン又はウシ血清アルブミン等のアルブミンを含む。好ましくは、ヒト血清アルブミンが、培地中に存在する。ヒト血清アルブミンは、Ｓｉｇｍａ社（ダイセンホーヘン、ドイツ）又はＢａｘｔｅｒ社（ウンターシュライス−ハイム、ドイツ）等の好適な供給業者から得ることができる。存在する場合、アルブミンは、０．５〜１０％、好ましくは１〜８％、より好ましくは１．５〜５％、最も好ましくは２％の濃度で細胞培養培地の中に存在する。好ましくは、アルブミンは、本発明の方法の第１及び第２の培養ステップの無血清培地中に存在する。
【００７１】
本発明の更なる好ましい実施形態では、第１及び／又は第２の培養ステップでの細胞培養培地の容積は、低いままに維持されており、好ましくは、培地容積は、培養期間全体、つまり第１及び第２の両培養ステップにおいて低いままに維持される。好ましくは、細胞培養培地の容積は、培養容器の４０〜９０μｌ／ｃｍ２又は５０〜８５μｌ／ｃｍ２であり、より好ましくは６０〜８０μｌ／ｃｍ２又は６５〜７５μｌ／ｃｍ２であり、最も好ましくは７０μｌ／ｃｍ２である。培地の容積、及びしたがって細胞の上にある培地カラムの高さは、細胞周囲の酸素分圧に影響を及ぼすことが既に示されている（Ｇｓｔｒａｕｎｔｈａｌｅｒら（１９９９年）Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９巻（３号）：１５０〜１７２頁；Ｗｏｌｆｆら（１９９３年）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６５巻（５号）：Ｃ１２６６〜１２７０頁）。したがって、培地容積がより低いと、細胞が低酸素になるのが防止されると考えられる。
【００７２】
第２の培養ステップの後、ヒト肝細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を、更なる使用、例えば細胞療法用に回収することができる。用語「細胞を回収する」は、細胞が細胞培養から取り出され、随意に更なる使用のために加工されることを意味することが意図されている。細胞は、例えば、接着細胞を培養容器から剥離するトリプシン処理により回収することができる。その後、細胞を遠心分離して、細胞培養培地を除去してもよい。更に、細胞を、例えばＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）又は他の緩衝生理食塩溶液で１回又は複数回洗浄してもよい。或いは、回収した後、同じ又は新しい培養容器中の好適な培地に、細胞を再び播種してもよい。更に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ毒性試験等の幾つかの応用の場合、細胞を回収する必要がないが、第２の培養ステップ中又は第２の培養ステップ後に直接使用することもできる。
【００７３】
回収された細胞は、細胞療法又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ毒性試験に直接使用してもよく、又は約−１９６℃〜約−２０℃、好ましくは約−１９６℃〜−８０℃の温度で細胞を凍結することにより凍結保存してもよい。本発明の細胞は、凍結保存後でもそれらの特徴を維持することが、実験により示されている。
【００７４】
本発明の方法により、少なくとも１５〜５０×１０６個、好ましくは少なくとも２０〜４５×１０６個、より好ましくは３０〜４０×１０６個の、ヒト肝細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を、細胞を播種した後１０〜１４日以内に１００ｍｌの末梢血から得ることができる。
【００７５】
本発明の方法により得られる細胞は、「本発明の細胞」又は「Ｍｅｔａｈｅｐｓ」とも呼ばれ、より長期間、つまり少なくとも１５日間、好ましくは少なくとも１７日間又は２０日間、より好ましくは少なくとも２３日間又は２５日間、更により好ましくは少なくとも２８日間又は３２日間、最も好ましくは少なくとも３５日間、それらの代謝特性及び生存能を失わずに培養される能力により、初代ヒト肝細胞（ｐｈＨ）と区別することができる。本発明の細胞は、最長で５６日間、好ましくは最長で５２日間又は４９日間、より好ましくは最長で４５日間又は４２日間、最も好ましくは最長で３８日間培養される。この場合、培養期間は、ＦＧＦ−４による処理が開始される時点から計算される。
【００７６】
用語「代謝特性」は、上述のようなヒト肝細胞の少なくとも１つの特徴、つまりジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、ガンマグルタミルトランスペプチダーゼ（γ−ＧＴ）、及び乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）等の酵素活性；グルカゴン刺激後のグルコース分泌；アセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）及びジクロフェナク等の薬理学物質を代謝する能力；アルブミン、α−フェトプロテイン、アシアロ糖タンパク質受容体１及び２、カルバモイルリン酸シンテターゼ（１）、及び凝固因子Ｉ及びＩＩの発現；ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｐ８〜９、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ３〜５、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ３Ａ４等のＣＹＰ４５０酵素の発現；ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、及びＣＹＰ３Ａ４等のＣＹＰ４５０酵素の誘導可能な活性；アンモニウムイオンと共にインキュベーションした後で尿素を合成する能力；ビタミンＫと共にインキュベーションした後で第ＶＩＩ因子を産生する能力；第ＶＩＩＩ因子を産生する能力；アルブミンの分泌；及びＡＢＣ輸送体ファミリーに由来するタンパク質等の生体異物輸送体の発現を意味することが意図されている。本発明の意味内では、上記の特性のいずれかが、ＦＧＦ−４を含有する培地で７日間培養された本発明の細胞の特性の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８２％又は８５％、より好ましくは少なくとも８７又は９０％、最も好ましくは９２又は９５％である場合、代謝特性は失われていない。
【００７７】
本発明の細胞の生存能は、当技術分野で公知の方法により、例えば、死細胞は色素を取り込んで青色に染色され、生細胞は色素を取り込まないトリパンブルー染色により決定することができる。本発明の意味内では、特定の時点で、細胞の２０％未満、好ましくは１８又は１５％未満、より好ましくは１２％又は１０％未満、最も好ましくは８又は５％未満が死細胞である場合、細胞は、生存能を保持している。
【００７８】
対照的に、初代ヒト肝細胞は、最長で１４日間のみ、及び無血清コラーゲンサンドイッチ等の特殊条件下で培養された場合のみ、肝細胞特徴を維持する（Ｔｕｓｃｈｌら（２００９年）Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ．１８１巻（１号）：１２４〜３７頁；Ｇ．Ｅｌａｕｔら（２００６年）Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．７巻（６号）：６２９〜６６０頁）。
【００７９】
したがって、初代ヒト肝細胞とは対照的に、本発明の細胞は、物質の長期毒性に関する研究に好適である。用語「長期毒性」は、ラパマイシン又はＡＰＡＰ等の薬理学物質での処理に応答して、少なくとも７日後、好ましくは少なくとも１０又は１４日後、より好ましくは少なくとも２０又は２５日後、更により好ましくは少なくとも２８又は３０日後、最も好ましくは少なくとも３５日後に、培地中のシトクロームＰ４５０酵素発現若しくは活性を誘導するか又はＬＤＨを放出する本発明の細胞の能力を指す。
【００８０】
更に、本発明の細胞は、例えば、ＣＤ９５を活性化する抗体で２４時間処理した後でアポトーシスを起こす能力により、ＨｅｐＧ２等の不死化細胞系と区別することができる。したがって、本発明の細胞がヒトに移植された後で腫瘍に成長するというリスクは低い。アポトーシスを起こす能力は、下記の実施例に記載のように、処理細胞をＨＯＥＣＨＳＴ染色で染色することにより、又は処理細胞におけるカスパーゼ活性を測定することにより測定することができる。本発明の細胞とＨｅｐＧ２細胞との別の相違点は、本発明の細胞が、アンモニアによる処理後に尿素を合成することができること、及びシトクロームＰ４５０系の酵素を誘導することができること、である。
【００８１】
最後に、例えば、Ｒｕｈｎｋｅら（２００５年）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２８巻（７号）：１７７４〜１７８６頁、Ｒｕｈｎｋｅら（２００５年）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ７９巻（９号）：１０９７〜１１０３頁、及びＲｉｑｕｅｌｍｅら（２００９年）Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ７７巻（３号）：２６３〜２７６頁に記載の「ネオ肝細胞」と呼ばれる細胞とは対照的に、本発明の細胞は、５００ｎｇ／ｍｌのＣＤ９５活性化抗体ＡＰＯで２４時間処理すると、アポトーシスを起こすことが可能である。用語「アポトーシスを起こすことが可能である」は、本発明の細胞（培養１４日目）をＣＤ９５活性化抗体ＡＰＯで２４時間インキュベーションした後、死細胞の数（例えば、ヨウ化プロピジウムで細胞を染色し、その後ＦＡＣＳ分析をすることにより測定される）が、抗体と共にインキュベートされていない対照細胞と比較して、少なくとも１．５倍、より好ましくは少なくとも１．８倍、更により好ましくは少なくとも２倍、最も好ましくは少なくとも２．５倍増加することを意味する。
【００８２】
また、「ネオ肝細胞」は、対応する受容体を発現するが、細胞死誘導性サイトカインＴＮＦ−α及びＣＤ９５Ｌによる致死的刺激に反応しないことが他者により見出されている（Ｍｓ．Ｉｓａｂｅｌｌｅ  Ｐｏｃｈｉｃ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｋｏｎｓｔａｎｚの博士論文：「Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  ＮｅｏＨｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  ｆｏｒ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｈｕｍａｎ  Ａｃｕｔｅ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ」、ｈｔｔｐ：／／ｋｏｐｓ．ｕｂ．ｕｎｉ−ｋｏｎｓｔａｎｚ．ｄｅ／ｈａｎｄｌｅ／ｕｒｎ：ｎｂｎ：ｄｅ：ｂｓｚ：３５２−ｏｐｕｓ−５７７４５で入手可能）。したがって、「ネオ肝細胞」は、細胞療法に有用ではない可能性があると結論付けられた。
【００８３】
また、本発明の細胞は、「ネオ肝細胞」よりも高いレベルの第ＶＩＩ因子及び第ＶＩＩＩ因子合成を示す。本発明の細胞における第ＶＩＩ因子の合成は、「ネオ肝細胞」よりも、少なくとも５倍、好ましくは少なくとも１０倍、より好ましくは少なくとも１５倍、最も好ましくは少なくとも２０倍高い。本発明の細胞における第ＶＩＩＩ因子の合成は、「ネオ肝細胞」よりも、少なくとも３倍、好ましくは少なくとも５倍、より好ましくは少なくとも７倍、最も好ましくは少なくとも１０倍高い。本発明の細胞及び「ネオ肝細胞」が無血清培地で産生される場合、本発明の細胞における第ＶＩＩ因子の合成は、「ネオ肝細胞」よりも、少なくとも２０倍、好ましくは少なくとも３０倍、より好ましくは少なくとも４０倍、最も好ましくは少なくとも５０倍高い。本発明の細胞及び「ネオ肝細胞」が無血清培地で産生される場合、本発明の細胞における第ＶＩＩＩ因子の合成は、「ネオ肝細胞」よりも、少なくとも５倍、好ましくは少なくとも７倍、より好ましくは少なくとも１０倍、最も好ましくは少なくとも１２倍高い。
【００８４】
更に、「ネオ肝細胞」とは対照的に、本発明の細胞は、５００μＭのカフェインで細胞を処理することによって阻害することができないシトクローム活性を示す。
本発明の細胞は、例えば薬物スクリーニングで物質の毒性を研究するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用することができる。例えば、細胞は、基本培地中で８〜２４時間饑餓状態にし、その後様々な量の試験物質又は対照用の対応する媒体を含有する基本培地でインキュベートすることができる。最長７２時間のインキュベーションの場合、培地は変更されず、より長いインキュベーションの場合は、培地試料を取得し、培地を週３回変更する。インキュベーション期間の終わりに、培地試料を取り出し、対応する溶解緩衝液（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００／ＭＯＰＳ）で細胞を溶解する。溶解した後、溶解物中のタンパク質含有量及び酵素活性（ＤＰＰ−ＩＶ、ＧＧＴ、ＬＤＨ、ＡＬＴ）を決定することができる。
【００８５】
上記で既に概説されているように、本発明の細胞は、例えば、試験化合物と共に、少なくとも１４日間、より好ましくは少なくとも２１日間、更により好ましくは少なくとも２８日間インキュベートすると、試験化合物の急性毒性だけでなく、試験化合物の長期毒性を研究するために使用することができる。
【００８６】
また、本発明の細胞は、「標的メタボロミクス」と呼ばれる手法に使用して、特に新たに開発された物質の作用機構及び代謝を研究することができる。この方法では、代謝物質は、自動質量分析ハイスループット法により定性的及び定量的に検査され、機能的に注釈がつけられる。既存の代謝プロファイルに基づき、関与する代謝経路に関する結論を導き出すことができ、標的構造を同定することができる（例えば、Ｄｕｄｌｅｙら（２０１０年）Ａｄｖ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．８０巻：４５〜８３頁；Ｋｏａｌ及びＤｅｉｇｎｅｒ（２０１０年）Ｃｕｒｒ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１０巻（２号）：２１６〜２２６頁を参照）。
【００８７】
更に、本発明の細胞は、ＣＹＰ依存性代謝を個々に特徴づける代謝表現型決定に使用して、患者特異的な治療投薬計画を開発することができる（例えば、Ｋｌｅｉｎら（２０１０年）Ｆｒｏｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１巻：１〜２０頁を参照）。
【００８８】
更に、本発明の細胞は、急性又は慢性肝不全を罹患している、例えば、薬剤誘導性又は毒性肝不全等の疾病、アルコール乱用、ウイルス性肝炎、例えばＢ、Ｂ／Ｄ、又はＣ型、鉄又は銅過負荷又は非アルコール性脂肪肝疾病、胆汁うっ滞性又は自己免疫性肝臓病、遺伝学的に遺伝する肝臓病、及び小児の肝臓病の経過中のヒトに細胞を移植することによる細胞療法に使用することができる。また、細胞は、フェニルケトン尿症等の原因が１つである疾病の、例えばＲＮＡを移植することによる遺伝子治療用に自己由来ベクターとして使用することができる（例えば、Ｋｏｒｍａｎｎら（２０１１年）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２９巻：１５４〜１５７頁を参照）。
【００８９】
好ましくは、細胞療法では、自己由来細胞、つまり本発明の細胞を用いて治療しようとする患者から単離された単球から産生された細胞が使用される。
細胞療法の場合、細胞は、脾臓内、門脈内、肝臓内、又は末梢静脈内注射、又はそれらの組み合わせのいずれかにより、無菌ＰＢＳ、０．９％ＮａＣｌ、又はリンゲル液中の懸濁物として投与される。
【００９０】
本発明のより完全な理解は、以下の具体的な例を参照することにより得られるが、それらの例は、例示の目的で本明細書に提供されており、本発明の範囲を限定するためのものではない。
【実施例】
【００９１】
１．本発明の方法による、ヒト肝細胞の特徴を有する細胞の産生
健常ドナーに由来する全血をヘパリンで処理し、血液対フィコールの比率が２：１のフィコールを使用して勾配遠心分離（４００ｇ；室温；３０分間）で分離した。中間層を、１：３〜１：４の細胞懸濁物対ＰＢＳの比率で氷冷無菌ＰＢＳに再懸濁し、その後４００ｇで５分間４℃にて遠心分離した。最初の洗浄後、上清を廃棄し、細胞ペレットを、氷冷無菌ＰＢＳに再懸濁した（５０ｍｌ全血からのＰＢＭＣの場合、２０〜３０ｍｌの氷冷無菌ＰＢＳを使用する）。可視的な赤血球の混入が存在した場合、この洗浄ステップは、無菌溶血緩衝液（８．２９ｇ／ｌのＮＨ４Ｃｌ、１ｇ／ｌのＫＨＣＯ３、０．０３７ｇ／ｌのＥＤＴＡ）で１０分間、暗所で室温にてインキュベーションした後で行う。再びＰＢＳに再懸濁した後、細胞を３００ｇで５分間遠心分離した（４℃）。もう一度上清を廃棄し、細胞をＰＢＳに再懸濁し、その後２５０ｇで５分間４℃にて最後の遠心分離を行った。
【００９２】
この最終洗浄ステップの後、ＰＢＳを廃棄し、細胞を、以下の組成を有する培地に３７℃にて再懸濁した：
ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（１：１）
１０％ＦＣＳ（標準条件）又は２％ヒトアルブミン（無血清条件）
２ｍＭグルタミン
１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン
１０００ＩＥペニシリン
１ｎｇ／ｍｌ組換えヒトＩＬ−３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）
１００ｎＭアデノシン（Ｓｉｇｍａ社、ダイセンホーヘン、ドイツ）
０．５ｎｇ／ｍｌ組換えヒトＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）
細胞を、２５０，０００細胞／ｃｍ２の密度で、細胞播種の３０〜１２０分前に培地と共に予めインキュベートしたペトリ皿に播種した。細胞を９６ウエルプレートに播種した場合、外側ウエルは、空のままにしておき、細胞培養培地のみで満たし、温度並びにＯ２及びＣＯ２分圧の違いをなくした。
【００９３】
播種した後、細胞を１０〜３０分間付着させた。付着した後、培地を、培養容器の１ｃｍ２当たり７０μｌの新しい培地に取り替えた。細胞培養培地を、培養の最初の２４時間以内に再び交換した。培養の最初の２４時間後、豆状の核を有する小さな円形細胞であることを特徴とする単球の接着集団が存在した。この段階では、細胞は、ＤＰＰ−ＩＶ、ＧＧＴ、及びＡＬＴの特異的活性をほとんど示さなかったが、単球マーカーＣＤ１４及び汎白血球マーカー（ｐａｎ−ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ−ｍａｒｋｅｒ）ＣＤ４５が高度に発現された。
【００９４】
最初の２４時間後、培地を週３回変更した。培養の最初の４〜１０日間、細胞を上記の培地で培養した。
細胞を、ＩＬ−３、Ｍ−ＣＳＦ、及びアデノシンを含む培地でインキュベートした後、培地を、以下の組成を有する同じ容積の培地と取り換えた：
ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（１：１）
１０％ＦＣＳ（標準条件）又は２％ヒトアルブミン（無血清条件）
２ｍＭグルタミン
１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン
１０００ＩＥペニシリン
３ｎｇ／ｍｌ組換えヒトＦＧＦ−４
１０ｎｇ／ｍｌ組換えヒトＥＧＦ
５ｎＭ組換えヒトグルカゴン
０．２８ＩＥ組換えヒトインスリン
５ＩＥ／ｍｌヘパリン
細胞を、少なくとも７日間、又は図及び図の凡例に示されている期間、この培地でインキュベートした。第２の培養ステップ中に、形態が再び変化し、細胞器官が豊富な細胞質を有する、大型で単核又は多核の多角形細胞、ｍｅｔａｈｅｐｓのコンフルエント又はサブコンフルエント層がもたらされる。この形態は、培養培地中の血清の存在又は非存在とは無関係に観察される。
【００９５】
実験を実施する前に、Ｌ−グルタミン、ペニシリン、及びストレプトマイシンのみを含有するＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２  １：１（「基本培地」と呼ぶ）でインキュベーションすることにより、細胞を飢餓状態にした。基本培地をインキュベーションにも使用して、培地成分が、実施されるアッセイと干渉するのを回避した。溶解する前に、細胞を、氷冷ＰＢＳで３回洗浄した。
【００９６】
２．タンパク質含有量の決定
タンパク質含有量は、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイ（Ｓｉｇｍａ社、ダイセンホーヘン、ドイツ）で決定した。細胞を、培養容器で増殖させ、基本培地で２４時間饑餓状態にし、表示されている実験用化学薬品と共にインキュベートした。培養培地を除去した後、細胞を、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（登録商標）／ＭＯＰＳで溶解し、１０μｌ等量の溶解物を、２００μｌのＢＣＡ試薬と共に３７℃にて３０分間インキュベートした（５０部の試薬＋１部の４％ＣｕＳＯ４）。５６０ｎｍの吸光度をマルチラベルカウンター（Ｄｙｎａｔｅｃｈ社製ＭＲ７０００）で測定した。タンパク質含有量は、ウシ血清アルブミンを基準として使用して計算した。
【００９７】
３．酵素活性の決定
ａ）ＬＤＨ活性
ＬＤＨ活性は、ピルビン酸塩及びβ−ＮＡＤＨを乳酸塩及びβ−ＮＤＡ＋にするＬＤＨ触媒反応から生じるβ−ＮＡＤ＋を、標準的プロトコール（Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ  Ｈ．Ｕ．（Ｈｒｓｇ．）「Ｍｅｔｈｏｄｅｎ  ｄｅｒ  ｅｎｚｙｍａｔｉｓｃｈｅｎ  Ａｎａｌｙｓｅ」３．Ａｕｆｌ．１９７４、Ｂａｎｄ  １、Ｖｅｒｌａｇ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｗｅｉｎｈｅｉｍ／Ｂｅｒｇｓｔｒ）を使用して、又は製造業者の説明書に従いＣｙｔｏ  Ｔｏｘ９６（登録商標）キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用して測定することにより分光光度的に決定した。
【００９８】
ｂ）ＡＬＴ活性
ＡＬＴの活性は、ＡＬＴによるＬ−アラニン及びα−ケトグルタル酸塩からピルビン酸塩及びＬ−グルタミン酸塩の生成、及びＬＤＨ依存性のβ−ＮＡＤ＋形成によるピルビン酸塩生成のその後の定量化からなる２段階反応により測定した（Ｓｃｈｕｍａｎｎ  Ｇら（２００２年）Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ  ４０巻（７号）：７１８〜７２４頁）。試料（１３，０００Ｕ／分で４℃にて遠心分離した後の、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（登録商標）／ＭＯＰＳ中の細胞溶解物）を、α−ケトグルタル酸塩の非存在下で、反応混合物（１００ｍｍｏｌ  ＴＲＩＳ、５００ｍｍｏｌ  Ｌ−アラニン、０．１８ｍｍｏｌ  β−ＮＡＤＨ、０．１ｍｍｏｌピリトキサル−５’−ホスフェート、１７００Ｕ／ｌ  Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ、ｐＨ７．１５）と共に３７℃にて３００秒間インキュベートした。１５ｍｍｏｌ  α−ケトグルタル酸塩を添加することにより反応を開始し、９０秒間インキュベーションした後、β−ＮＡＤＨ吸光度の減少を１８０秒間モニターした。或いは、Ｒａｎｄｏｘ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製のＡＬＴキットを製造業者の説明書に従って使用した。
【００９９】
ｃ）ガンマ−グルタミル−トランスペプチターゼ活性
ガンマ−グルタミル−トランスペプチターゼ活性は、Ｌ−γ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリン及びグリシルグリシンからγ−グルタミル−グリシルグリシド及びｐ−ニトロアニリンへのγ−ＧＴ触媒反応から生じるｐ−ニトロアニリンの光度決定を使用して測定した（Ｓｚａｓｚ  Ｇ：Ｇａｍｍａ−ｇｌｕｔａｍｙｌ−ｔｒａｎｓｐｅｐｔｉｄａｓｅ、ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｅｎ  ｄｅｒ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｓｃｈｅｎ  Ａｎａｌｙｓｅ、第３版（１巻）Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ  ＨＵ編、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ／Ｂｅｒｇｓｔｒ．、Ｖｅｒｌａｇ  Ｃｈｅｍｉｅ、１９７４年、７５７〜７６２頁）。
【０１００】
細胞を、ＰＢＳで３回すすぎ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（登録商標）で溶解し、遠心分離し（１３，０００Ｕ／分、１０分間）、細胞溶解物を１００ｍＭ  ＴＲＩＳ、４ｍＭ  Ｌ−γ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリド、及び５０ｍＭグリシルグリシンと共にインキュベートすることにより、総γ−ＧＴ活性を測定した。ｐ−ニトロアニリンの吸光度を４０５ｎｍで測定した。ΔＥ／分を、５、１０、１５、３０、及び４５分時点の測定から計算した。
【０１０１】
ｄ）ＤＰＰ−ＩＶ活性
ＤＰＰ−ＩＶ活性は、発色基質Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｒｏ−ｐ−ニトロアニリドのＤＰＰ−ＩＶ触媒切断から生じるｐ−ニトロアニリンの光度決定を使用して測定した。
【０１０２】
細胞をＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（登録商標）／ＭＯＰＳで溶解した。溶解物を遠心分離（１３，０００Ｕ／分；４℃）した後、溶解物を、３７℃にて０．１Ｍ  ＴＲＩＳ（ｐＨ８．０）中の０．２ｍＭ  Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｒｏ−ｐＮＡでインキュベートし、４０５ｎｍの吸光度を、０、５、１０、１５、３０、及び４５分後に測定してΔＥ／分を決定した。ｐ−ニトロアニリンを用いた標準曲線からＤＰＰ−ＩＶ活性を決定し、ＢＣＡ法により測定されたタンパク質含有量に対して正規化した。
【０１０３】
４．Ｐ４５０シトクローム活性の決定
ＣＹＰ  Ｐ４５０活性を測定するために、Ｐ４５０Ｇｌｏ（商標）アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を製造業者の説明書に従って使用した。手短に言えば、細胞を基本培地中で饑餓状態にし、様々な誘導因子と共にインキュベートした（ＣＹＰ１Ａ２の場合は、０．１〜１０μＭ、典型的には１μＭの濃度の３−メチルコラントレン；１０μＭのデキサメタゾン；１０〜１００μＭ、典型的には５０μＭのリファンピシン；ＣＹＰ３Ａ４の場合は、５〜１０μＭ、典型的には１０μＭのフェニトイン；及び２Ｃ９の場合は、５０μＭリファンピシン及び１０μＭフェニトインで２４時間〜７２時間）。典型的には、誘導は、４８時間のインキュベーション時間を使用して実施した。誘導した後、細胞を氷冷ＰＢＳで３回すすぎ、製造業者の説明書に従って、対応するルシフェリン基質を含有する基本培地でインキュベートし、３０分間インキュベーションした後、製造業者の説明書に従いルシフェリン検出試薬を用いて上清の発光を測定した。発光測定値は、ＢＣＡ法により決定された細胞溶解物中のタンパク質含有量に正規化した。
【０１０４】
蛍光染料３−シアノ−７−エトキシクマリン（ｅｔｈｏｘｙｃｏｕｍａｒｉｎｅ）を使用してＣＹＰ１Ａ２活性を決定するために（Ｄｏｎａｔｏら（２００４年）Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ３２巻（７号）：６９９〜７０６頁）、細胞を、３−メチルコラントレンで４８時間処理し、その後、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水中の３−シアノ−７−エトキシクマリン（３０μＭ）で１２０分間３７℃にてインキュベーションした後、氷冷ＰＢＳで３回すすいだ。７５μｌの上清をピペットでアッセイプレートに移し、２５μｌのβ−グルクロニダーゼ／アリールスルファターゼ（酢酸ナトリウム（Ｎａｔｒｉｕｍａｃｅｔａｔ）中１．５μｌ／１ｍｌ）と共に３７℃にて２時間インキュベートした。０．１ｍＭリン酸カリウム緩衝液を反応停止溶液として添加した後、励起／発光４０８／４５５ｎｍの蛍光をプレート蛍光光度計で測定した。蛍光測定値は、ＢＣＡアッセイにより決定されたタンパク質含有量に対して正規化した。
【０１０５】
５．ＡＰＡＰ毒性の決定
毒性アッセイは、細胞を基本培地で２４時間飢餓状態にした後、様々な濃度のＡＰＡＰを基本培地に溶解させて２４時間インキュベーションすることにより実施した。培地及び溶解物中のＬＤＨ活性を、Ｐｒｏｍｅｇａ社製のＣｙｔｏ  Ｔｏｘ９６（登録商標）キットを使用して上述のように決定し、ＬＤＨ放出（％）を、１００×（培地中のＬＤＨ活性／（培地中のＬＤＨ活性＋溶解物中のＬＤＨ活性）で計算した。
【０１０６】
６．アポトーシスの決定
ａ）ＨＯＥＣＨＳＴ３３３４２染色によるアポトーシス
細胞を、様々な濃度の抗ＡＰＯ（Ａｌｅｘｉｓ  ＡＸＸＯＲＡ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、レラッハ、ドイツ）／プロテインＡ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社、マウンテンビュー、ＵＳＡ）と共に２４〜４８時間インキュベートした。インキュベーション期間後、細胞をＨＯＥＣＨＳＴ３３３４２（１０μＭ）で１５分間染色し、ＰＢＳで３回洗浄した後、蛍光顕微鏡を使用して分析した。
【０１０７】
ｂ）カスパーゼ−３測定によるアポトーシス
細胞溶解物中のカスパーゼ−３活性は、Ｂｅｎｅｓｉｃら（２００６年）Ｋｉｄｎｅｙ  Ｂｌｏｏｄ  Ｐｒｅｓｓ  Ｒｅｓ．２９巻（５号）：２８０〜２９３頁に記載のように発色カスパーゼ−３基質Ａｃ−ＤＥＶＤ−ｐＮＡ（終濃度４０μＭ）を使用して決定した。ｐ−ニトロアニリンを用いた標準曲線を使用して活性を評価し、ＢＣＡ法により測定されたタンパク質含有量に対して正規化した。
【０１０８】
ｃ）ＦＡＣＳ分析によるアポトーシス細胞の評価
ＤＮＡ断片化によりアポトーシスを評価するために、ヨウ化プロピジウムで染色した細胞のＦＡＣＳ分析を実施した。細胞を基本培地で２４時間饑餓状態にし、基本培地又は表示濃度の抗ＡＰＯ（Ａｌｅｘｉｓ  ＡＸＸＯＲＡ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、レラッハ、ドイツ）を含有する基本培地でインキュベートした。２４時間インキュベーションした後、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）を使用して細胞を剥離し、２５０ｇで５分間（４℃）遠心分離し、０．２％ウシ血清アルブミンを含有する氷冷ＰＢＳに再懸濁した。連続撹拌下で純粋エタノールをＰＢＳ／ＢＳＡにゆっくりと添加して、エタノールの終濃度を７５％にした。細胞を−２０℃で凍結して、一晩固定させた。その後、細胞を４００ｇで５分間（４℃）遠心分離した。上清を廃棄し、ＰＢＳ中の５０μｌヨウ化プロピジウムで少なくとも３０分間暗所にて細胞を染色し、その後ＦＡＣＳ分析した。アポトーシスは、サブＧ１事象を評価することにより評価した。
【０１０９】
７．尿素合成の決定
尿素合成は、細胞を基本培地で２４時間飢餓状態にし、その後、様々な濃度の塩化アンモニウム（０〜１００ｍＭ）で２４時間インキュベーションした後で測定した。上清を収集し、製造業者の説明書に従いＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍｅ（商標）尿素アッセイキット（Ｃｌｏｎａｇｅｎ社）を使用して尿素含有量を決定した。培地の尿素含有量は、ＢＣＡ法により測定された細胞溶解物中のタンパク質含有量に対して正規化した。
【０１１０】
８．第ＶＩＩ因子分泌の決定
第ＶＩＩ因子分泌は、Ｅｓｐｏｓｉｔｏら（２０００年）Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．５８巻：１２３〜１３０頁；Ｚｉｙａｄｅｈら（１９９０年）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２５９巻：Ｆ７０４〜Ｆ７１４頁）と同様に、直接ＥＬＩＳＡにより測定した。飢餓状態にした後に、細胞を、表示されている様々なメナジオン濃度で４８時間インキュベートした。培地を収集し、１００μ等量を、免疫吸着プレート（Ｎｕｎｃ社）にて２００μｌ  Ｖｏｌｌｅｒ緩衝液（１．５９ｇ  Ｎａ２ＣＯ３＋２．９３ｇ  ＮａＨＣＯ３を１００ｍｌの再蒸留水（ａｑｕａ  ｂｉｄｅｓｔ）に添加）で一晩４℃にてインキュベートした。プレートを、２００μｌのＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０で３回すすぎ、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０中２００μｌの２％ＢＳＡで２時間ブロッキングした。その後、プレートを空にし、２％−ＢＳＡ−ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０中で５０μｌのウサギ抗第ＶＩＩ因子抗体（Ａｂｅａｍ社、ケンブリッジ、英国）１：１０００と共に１〜２時間４℃にてインキュベートした。２００μｌのＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０で３回洗浄した後、プレートを、２％−ＢＳＡ−ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０中で５０μｌの抗ウサギペルオキシダーゼ−Ａｋ１：５０００（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ社、ハイデルベルグ、ドイツ）と共に暗所で室温にて１時間インキュベートした。２００μｌのＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０で３回すすいだ後、その後、１００μｌのＨＲＰ基質（再蒸留水中の０．５ｍｇ／ｍｌのｏ−フェニレンジアミン、１１．８ｍｇ／ｍｌのＮａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、７．３ｍｇ／ｍｌのクエン酸、０．０１５％のＨ２Ｏ２）と共に、暗所にて１５及び４５分間インキュベーションを行った。マルチウエルリーダで４９０ｎｍの吸光度を測定し、その後波長補正した（６３０ｎｍ）。吸光度を、ＢＣＡ法により決定された細胞溶解物タンパク質含有量で正規化した。
【０１１１】
９．第ＶＩＩＩ因子分泌の決定
第ＶＩＩＩ因子は、Ｅｓｐｏｓｉｔｏら（２０００年）Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．５８巻：１２３〜１３０頁；Ｚｉｙａｄｅｈら（１９９０年）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２５９巻：Ｆ７０４〜Ｆ７１４頁と同様に、サンドイッチＥＬＩＳＡで測定した。飢餓状態にした後、細胞を２４時間基本培地でインキュベートした。培地を収集し、１００μｌ等量を、１μｇ／ｍｌヤギ抗ヒト第ＶＩＩＩ因子（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ社、ハイデルベルグ、ドイツ）が事前にコーティンされている免疫吸着プレート（Ｎｕｎｃ社）中で２時間室温にてインキュベートした。プレートを、２００μｌのＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０で３回すすいだ。その後、プレートを空にして、１％−ＢＳＡ−ＰＢＳ／０．０５％中で５０μｌウサギ抗第ＶＩＩＩ因子（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ社、ハイデルベルグ、ドイツ）１：１０００と共に室温にて１時間インキュベートした。２００μｌのＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０で３回洗浄した後、プレートを、１％−ＢＳＡ−ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０中で５０μｌ抗ウサギペルオキシダーゼ−Ａｋ１：５０００（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ社）と共に暗所で室温にて１時間インキュベートした。２００μｌのＰＢＳ／０．０５％−Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０で３回すすいだ後、その後、１００μｌのＨＲＰ基質（再蒸留水中の０．５ｍｇ／ｍｌのｏ−フェニレンジアミン、１１．８ｍｇ／ｍｌのＮａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、７．３ｍｇ／ｍｌのクエン酸、０．０１５％のＨ２Ｏ２）で、暗所にて１５及び４５分間インキュベーションを行った。マルチウエルリーダで４９０ｎｍの吸光度を測定し、その後波長補正した（６３０ｎｍ）。吸光度を、ＢＣＡ法により決定された細胞溶解物タンパク質含有量で正規化した。
【０１１２】
１０）初代ヒト肝細胞と比較した遺伝子発現解析
同じドナーのＭｅｔａｈｅｐｓ及び初代ヒト肝細胞（ｐＨＨ）の遺伝子発現を、ｃＲＮＡ−マイクロアレイ（Ｋａｔ．Ｎｒ．ＯＨＳ  ４０１、Ｈｕｍａｎ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ＳＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で解析した。このアレイで解析される遺伝子は、下記の表１に示されている。
【０１１３】
単球及び肝細胞は、肝細胞供与及び採血のインフォームドコンセントに署名した、肝部分切除を受けた患者から獲得した。患者は、Ｈｕｍａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（ＨＴＣＲ、ｃ／ｏ  ＢｉｏＰａｒｋ、Ｊｏｓｅｆ−Ｅｎｇｅｒｔ−Ｓｔｒ．９，９３０５３  レーゲンスブルク）と協力して選択した。
【０１１４】
肝細胞は、Ｗｅｉｓｓら（２００３年）Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ．３８巻（４号）：４７６〜４８２頁）に記載のように単離及び培養した。培養の４日後、製造業者の説明書に従ってＳＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製のアレイ等級全ＲＮＡ単離キットを使用して、ｍＲＮＡをｐＨＨから単離した。
【０１１５】
ＦＧＦ−４中で培養した３、７、及び１４日目のＭｅｔａｈｅｐｓについても同じことを実施した。
製造業者の説明書に従って、ｍＲＮＡ試料を、ビオチン化ｃＲＮＡに転写し、アレイ膜上でハイブリダイズした。その後、ＳＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製の化学発光検出キットを使用して化学発光検出を実施した。
【０１１６】
ＴＩＧＲ  Ｓｐｏｔｆｉｎｄｅｒソフトウェアでアレイを解析し、ＳＰＳＳソフトウェアを使用してデータを分析した。更に、クラスター解析を実施した。
１１）本発明の細胞の長期毒性
本発明の細胞が長期毒性研究に適合することを示すために、細胞を上述のように産生し、低濃度のアセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）及びジクロフェナク（ｄｉｃｌｏ）と共に１５日間インキュベートした。インキュベーションの１、３、６、８、１０、１３、及び１５日目に、培地試料を取り出し、培地中のＬＤＨ活性を、Ｐｒｏｍｅｇａ社製の細胞毒性キットを使用して決定した。ＬＤＨ放出を、１００×（培地中のＬＤＨ／ＬＤＨ培地＋ＬＤＨ溶解物）として％で計算した。
【０１１７】
低濃度のジクロフェナクは、Ｍｅｔａｈｅｐｓにおいて長期毒性を示す一方で、アセトアミノフェンは、Ｍｅｔａｈｅｐｓにおいて急性毒性を起こした。
１２）結果の考察
提示されたデータは、本発明の細胞の肝細胞様特徴を示す。重要な知見は、１Ａ２、２Ｃ９、及び３Ａ４等のＣＹＰ  Ｐ４５０酵素の発現及び活性により要約され、また、これらは、典型的物質（例えば、アリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）、プレグナン−Ｘ−受容体（ＰＸＲ）、構成的アンドロスタン受容体（ＣＡＲ）、及びグルココルチコイド受容体（ＧＲ）のリガンド）を使用して誘導可能である。肝臓で最も豊富なＣＹＰ  Ｐ４５０酵素であるＣＹＰ  ２Ｅ１は、ＡＰＡＰ毒性により、及びタンパク質レベルで間接的に示すことができた。更に、アンモニア依存性尿素合成並びに凝固因子ＶＩＩ及びＶＩＩＩの合成は、ＥＬＩＳＡにより示すことができた。ＤＰＰ−ＩＶ、γ−ＧＴ、及びＬＤＨの特異的酵素活性が存在し、初代肝細胞又は肝細胞由来細胞（Ｈｕｈ−７又はＨｅｐＧ２等）と類似している。したがって、本発明の細胞は、肝細胞様の代謝、遺伝子発現、合成機能、同様に酵素活性を示す。更に、本発明の細胞は、カスパーゼ−３活性、ＨＯＥＣＨＳＴ染色、及びＦＡＣＳ分析により示されるように、ＣＤ９５結合により誘導されるアポトーシスを起こすことが可能である。これは、治療介入に潜在的に使用することができる細胞の重要な特徴である。
【０１１８】
観察された酵素活性、代謝、及び合成特性を、培養中の初代ヒト肝細胞と比較し、本発明の細胞は、少なくとも２０％の肝細胞第ＶＩＩＩ因子合成、３０％の肝細胞ＣＹＰ３Ａ活性、並びに７０％の肝細胞特異的酵素活性を示した。更に、本発明の細胞は、長期毒性試験に有用であることが示された。
【０１１９】
Ｒｕｈｎｋｅら（２００５年）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２８巻（７号）：１７７４〜１７８６頁の方法により培養された細胞（「ネオ肝細胞」）と比較すると、本発明の細胞は、１０〜２０倍より高い第ＶＩＩＩ因子放出、並びに３ＣＥＣ蛍光により測定された、より高いＣＹＰ１Ａ２活性を示した。更に、ほとんどＣＹＰ２Ｃ９により媒介される３−ＣＥＣのカフェイン非感受性代謝は、Ｒｕｈｎｋｅらの方法により培養された細胞にはほとんど存在しない。加えて、後者の細胞は、２４時間のＣＤ９５結合後に、測定可能なアポトーシスを一切示さなかった。これは、本発明の細胞との別の顕著な違いである。
【０１２０】
【表１】
0006000950.tif 000002
0006000950.tif 000003
0006000950.tif 000004
0006000950.tif 000005
0006000950.tif 000006
0006000950.tif 000007
0006000950.tif 000008
0006000950.tif 000009
0006000950.tif 000010
0006000950.tif 000011
0006000950.tif 000012
【図１ａ】
0006000950.tif 000013
【図１ｂ】
0006000950.tif 000014
【図２ｆ】
0006000950.tif 000015
【図４ｃ】
0006000950.tif 000016
【図５ａ１】
0006000950.tif 000017
【図５ａ２】
0006000950.tif 000018
【図５ａ３】
0006000950.tif 000019
【図５ｂ１】
0006000950.tif 000020
【図５ｂ２】
0006000950.tif 000021
【図５ｂ３】
0006000950.tif 000022
【図２ａ】
0006000950.tif 000023
【図２ｂ】
0006000950.tif 000024
【図２ｃ】
0006000950.tif 000025
【図２ｄ】
0006000950.tif 000026
【図２ｅ】
0006000950.tif 000027
【図３ａ】
0006000950.tif 000028
【図３ｂ】
0006000950.tif 000029
【図４ａ】
0006000950.tif 000030
【図４ｂ】
0006000950.tif 000031
【図５ｃ１】
0006000950.tif 000032
【図５ｃ２】
0006000950.tif 000033
【図５ｃ３】
0006000950.tif 000034
【図６ａ】
0006000950.tif 000035
【図６ｂ】
0006000950.tif 000036
【図６ｃ】
0006000950.tif 000037
【図６ｄ】
0006000950.tif 000038
【図７】
0006000950.tif 000039
【図８ａ】
0006000950.tif 000040
【図８ｂ】
0006000950.tif 000041
【図９】
0006000950.tif 000042