(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物で発現可能なプロモーターに作動可能に連結されるコード配列を含むキメラ遺伝子であって、該植物で発現可能なプロモーターは該コード配列に対する異種調節エレメントであり、前記コード配列が、配列番号４のアミノ酸位置２〜アミノ酸位置３８２のアミノ酸配列を含むＨＰＰＤタンパク質、または配列番号４のアミノ酸位置２〜アミノ酸位置３８２のアミノ酸配列と少なくとも９０％配列同一性を有し、ＨＰＰＤタンパク質の酵素機能を保持するタンパク質をコードする核酸配列を含むことを特徴とするキメラ遺伝子。
【請求項２】
トランジットペプチド／ＨＰＰＤ融合タンパク質が該キメラ遺伝子によってコードされるように、ＨＰＰＤコード配列の上流に、植物において活性の該トランジットペプチドをコードする核酸配列を含むことを特徴とする、請求項１記載のキメラ遺伝子。
【請求項３】
請求項１または２記載の少なくとも１つのキメラ遺伝子を含む、ベクター。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項記載のキメラ遺伝子を含むことを特徴とする、植物細胞、植物の部分、植物、または種子。
【請求項５】
ＰＤＨ（プレフェナートデヒドロゲナーゼ）酵素をコードするキメラ遺伝子をさらに含む、請求項４記載の植物細胞、植物の部分、植物または種子。
【請求項６】
さらに、２，４−Ｄおよびジカンバのグループから選択される少なくとも１つの成長レギュレーター、ならびに／またはアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）、ＥＰＳＰシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）および／もしくはグルタミンシンターゼ（ＧＳ）を阻害する少なくとも１つの除草剤に対する耐性を付与する一つまたは複数のキメラ遺伝子を含む、請求項４または５記載の植物細胞、植物の部分、植物または種子。
【請求項７】
ＨＰＰＤ阻害剤型除草剤に対して耐性な植物を得るための方法であって、請求項１または２記載のキメラ遺伝子が、該植物に導入されることを特徴とする、方法。
【請求項８】
請求項４、５または６記載の植物または種子を含有する区域または圃場中の雑草を防除するための方法であって、請求項４、５または６記載の種子または植物に顕著に影響せずに、該雑草に有毒な供与量のＨＰＰＤ阻害剤型除草剤を該区域または圃場に施用することを含む、方法。
【請求項９】
ＨＰＰＤ阻害剤が、イソキサフルトール、テンボトリオン、メソトリオン、スルコトリオン、ピラスルホトール、トプラメゾン、２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−ＳＯ２ＣＨ３−４−ＣＦ３フェニル）プロパン−１，３−ジオンおよび２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−ＳＯ２ＣＨ３−４−２，３Ｃｌ２フェニル）プロパン−１，３−ジオン、ビシクロピロン、ベンゾビシクロン、テフリルトリオン、ジケトニトリル、およびピラゾキシフェンの群より選択されることを特徴とする、請求項８記載の、雑草を防除するための方法。
【請求項１０】
請求項４、５または６記載の植物を成長させることを含む、油または粗挽き粉を得るための方法。
【請求項１１】
ＨＰＰＤ阻害剤型除草剤で該植物を処理すること、穀粒を収穫すること、および該穀粒を粉砕して粗挽き粉を製造し、場合により油を抽出することをさらに含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
植物をＨＰＰＤ阻害剤型除草剤に耐性にするための、配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＰＰＤタンパク質またはＨＰＰＤタンパク質と少なくとも９０％の配列同一性を有し、ＨＰＰＤタンパク質の酵素機能を保持するＨＰＰＤタンパク質の使用。
【請求項１３】
ＨＰＰＤ阻害剤型除草剤が、イソキサフルトール、テンボトリオン、メソトリオン、スルコトリオン、ピラスルホトール、トプラメゾン、２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−ＳＯ２ＣＨ３−４−ＣＦ３フェニル）プロパン−１，３−ジオンおよび２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−ＳＯ２ＣＨ３−４−２，３Ｃｌ２フェニル）プロパン−１，３−ジオン、ビシクロピロン、ベンゾビシクロン、テフリルトリオン、ジケトニトリル、およびピラゾキシフェンからなる群より選択される、請求項１２記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
緒言
本発明は、Blepharismidae科に属する原生生物から得られるヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＥＣ１．１３．１１．２７、本明細書において「ＨＰＰＤ」と略記する）をコードする核酸配列およびそれによってコードされるタンパク質、ならびに当該核酸配列を含むキメラ遺伝子、ならびにＨＰＰＤ阻害剤型除草剤に耐性の植物を得るための当該核酸配列、タンパク質またはキメラ遺伝子の使用に関する。
【０００２】
背景
ＨＰＰＤは、チロシン分解産物であるｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸（本明細書においてＨＰＰと略記する）が、植物におけるトコフェロールおよびプラストキノンの前駆体であるホモゲンチジン酸（本明細書においてＨＧと略記する）に変換される反応を触媒する酵素である（Crouch N.P. et al. (1997) Tetrahedron, 53, 20, 6993-7010, Fritze et al., (2004), Plant Physiology 134:1388-1400）。トコフェロールは、膜結合抗酸化剤として作用する。プラストキノンは、最初にＰＳＩＩとチトクロムｂ６／ｆ複合体の間の電子伝達体として作用し、次にカロテノイドの生合成に関与するフィトエンデサチュラーゼについての酸化還元コファクターである。
【０００３】
これまでにＮＣＢＩデータベースに存在する、様々な生物由来の７００種を超える核酸配列が、ＨＰＰＤドメインを有する推定上のタンパク質をコードするとしてアノテーションされたが、その配列には、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／ＴｒＥＭＢＬデータベースに示されたアクセッションナンバーＡ８Ｒ３Ｈ６およびＮＣＢＩタンパク質データベースに示されたアクセッションナンバーＢＡＦ９１８８１で開示された配列が含まれる。しかし、アクセッションナンバーＡ８Ｒ３Ｈ６／ＢＡＦ９１８８１に対応する配列を含めた大部分の配列について、そのタンパク質が、in vitroアッセイまたは植物体への（in planta）アプローチのいずれかでＨＰＰＤの酵素活性を有することも、そのようなＨＰＰＤタンパク質が植物中で発現された場合にＨＰＰＤ阻害剤型除草剤に対する除草剤耐性を付与することができることも証明されていない。いくつかのＨＰＰＤタンパク質およびそれらの一次配列、特にPseudomonas（Rueetschi et al., Eur. J. Biochem., 205, 459-466, 1992、国際公開公報第９６／３８５６７号）などの細菌、Arabidopsis（国際公開公報第９６／３８５６７号、Genebank AF047834）、ニンジン（国際公開公報第９６／３８５６７号、Genebank 87257）、Avena sativa（国際公開公報第０２／０４６３８７号）、コムギ（国際公開公報第０２／０４６３８７号）、Brachiaria platyphylla（国際公開公報第０２／０４６３８７号）、Cenchrus echinatus（国際公開公報第０２／０４６３８７号）、Lolium rigidum（国際公開公報第０２／０４６３８７号）、Festuca arundinacea（国際公開公報第０２／０４６３８７号）、Setaria faberi（国際公開公報第０２／０４６３８７号）、Eleusine indica（国際公開公報第０２／０４６３８７号）、Sorghum（国際公開公報第０２／０４６３８７号）などの植物、Coccicoides（Genebank COITRP）、Coptis japonica（国際公開公報第０６／１３２２７０号）、Chlamydomonas reinhardtii（ES 2275365）、またはマウスもしくはブタのような哺乳動物のＨＰＰＤタンパク質が、技術の現状において記載されている。表示された参考文献中に開示された対応配列は、本明細書によって参照により組み入れられる。
【０００４】
大部分の植物は、アロゲン酸を経由してチロシンを合成する（Abou-Zeid et al. (1995), Applied Env Microb 41: 1298-1302; Bonner et al., (1995), Plant Cells Physiol. 36, 1013-1022; Byng et al., (1981), Phytochemistry 6: 1289-1292; Connely and Conn (1986), Z. Naturforsch 41c: 69-78; Gaines et al., (1982), Plants 156: 233-240）。これらの植物では、ＨＰＰは、チロシンの分解だけに由来する。他方で酵母Saccharomyces cerevisiaeまたは細菌Escherichia coliなどの生物では、ＨＰＰは、チロシン前駆体であり、プレフェナートをＨＰＰに変換する酵素プレフェナートデヒドロゲナーゼ（本明細書下記にＰＤＨと呼ぶ）の作用によって合成される（Lingens et al., (1967) European J. Biochem 1: 363-374; Sampathkumar and Morrisson (1982), Bioch Biophys Acta 701: 204-211）。したがってこれらの生物では、ＨＰＰの生成は、チロシン分解経路ではなく、芳香族アミノ酸の生合成経路（シキミ酸経路）に直接関係する。
【０００５】
ＨＰＰＤの阻害は、光合成のアンカップリング、補助集光性色素の欠乏、および最も重要には、普通はカロテノイドによって提供される光防護の欠如が原因の、ＵＶ線および活性酸素種によるクロロフィルの破壊（ブリーチング）につながる（Norris et al. (1995), Plant Cell 7: 2139-2149）。光合成活性組織のブリーチングは、成長阻害および植物の死滅につながる。
【０００６】
ＨＰＰからホモゲンチジン酸への変換を阻害するためにＨＰＰＤを阻害し、その酵素に特異的に結合する一部の分子は、非常に効果的な選択的除草剤であることが証明されている。
【０００７】
現在では、最も多く市販されているＨＰＰＤ阻害剤型除草剤は、以下のこれら四つの化学ファミリーの一つに属する：
１）トリケトン、例えばスルコトリオン［すなわち２−［２−クロロ−４−（メチルスルホニル）ベンゾイル］−１，３−シクロヘキサンジオン］、メソトリオン［すなわち２−［４−（メチルスルホニル）−２−ニトロベンゾイル］−１，３−シクロヘキサンジオン］；テンボトリオン［すなわち２−［２−クロロ−４−（メチルスルホニル）−３−［（２，２，２，−トリ−フルオロエトキシ）メチル］ベンゾイル］−１，３−シクロ−ヘキサンジオン］；テフリルトリオン［すなわち２−［２−クロロ−４−（メチルスルホニル）−３−［［（テトラヒドロ−２−フラニル）メトキシ］メチル］ベンゾイル］−１，３−シクロヘキサンジオン］］；ビシクロピロン［すなわち４−ヒドロキシ−３−［［２−［（２−メトキシエトキシ）メチル］−６−（トリフルオロメチル）−３−ピリジニル］カルボニル］ビシクロ［３．２．１］オクタ−３−エン−２−オン］；ベンゾビシクロン［すなわち３−（２−クロロ−４−メシルベンゾイル）−２−フェニルチオビシクロ［３．２．１］オクタ−２−エン−４−オン］；
２）ジケトニトリル、例えば２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−メチルスルホニル−４−トリフルオロメチルフェニル）−プロパン−１，３−ジオンおよび２−シアノ−１−［４−（メチルスルホニル）−２−トリフルオロメチルフェニル］−３−（１−メチルシクロプロピル）プロパン−１，３−ジオン；
３）イソキサゾール、例えばイソキサフルトール［すなわち（５−シクロプロピル−４−イソキサゾリル）［２−（メチルスルホニル）−４−（トリフルオロメチル）フェニル］メタノン］（植物ではイソキサフルトールは、ＨＰＰＤ阻害剤の性質を示すジケトニトリル化合物であるＤＫＮに迅速に代謝される）；ならびに
４）ピラゾリネート、例えばトプラメゾン［すなわち［３−（４，５−ジヒドロ−３−イソキサゾリル）−２−メチル−４−（メチルスルホニル）フェニル］（５−ヒドロキシ−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）メタノン］、およびピラスルホトール［（５−ヒドロキシ−１，３−ジメチルピラゾール−４−イル（２−メシル−４−トリフルアロ（trifluaro）メチルフェニル）メタノン］；ピラゾフェン（pyrazofen）［２−［４−（２，４−ジクロロベンゾイル）−１，３−ジメチルピラゾール−５−イルオキシ］アセトフェノン］。
【０００８】
これらのＨＰＰＤ阻害型除草剤は、それが迅速に分解されるトウモロコシ（Zea mays）などの代謝耐性を示す作物でのイネ科雑草および／または広葉雑草に対して使用することができる（Schulz et al., (1993). FEBS letters, 318, 162-166; Mitchell et al., (2001) Pest Management Science, Vol 57, 120-128; Garcia et al., (2000) Biochem., 39, 7501-7507; Pallett et al., (2001) Pest Management Science, Vol 57, 133-142）。これらのＨＰＰＤ阻害型除草剤の範囲を拡大するために、植物、特に性能の劣る代謝耐性を有さないまたは有する植物に、農地条件下で許容されうる耐性レベルを付与するために、いくつかの試みが開発されている。
【０００９】
ホモゲンチジン酸のＨＰＰＤ介在性生成をバイパスする試み（米国特許第６，８１２，０１０号）に加えて、除草剤に比べて十分な量のターゲット酵素を植物中に生成するように感受性酵素を過剰発現させることが行われている（国際公開公報第９６／３８５６７号）。ＨＰＰＤの過剰発現は、イソキサフルトール（ＩＦＴ）のジケトニトリル（ＤＫＮ）誘導体に対する、より優れた出芽前耐性を招いたが、耐性は、出芽後処理ｈｒの耐性としては不十分であった（Matringe et al., (2005), Pest Management Science 61: 269-276）。
【００１０】
第三の戦略は、ＨＰＰからホモゲンチジン酸への変換を触媒するＨＰＰＤの性質を保持する一方で、突然変異前のネイティブなＨＰＰＤよりもＨＰＰＤ阻害剤に対して感受性が低いターゲット酵素を得るために、ＨＰＰＤを突然変異させることであった。この戦略は、ジケトニトリルファミリーに属する２種のＨＰＰＤ阻害型除草剤である２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−メチルスルホニル−４−トリフルオロメチルフェニル）−プロパン−１，３−ジオンおよび２−シアノ−１−［４−（メチルスルホニル）−２−トリフルオロメチルフェニル］−３−（１−メチルシクロプロピル）プロパン−１，３−ジオン（EP496630）に耐性の植物を産出するためにうまく応用された（国際公開公報第９９／２４５８５号）。Ｐｒｏ２１５Ｌｅｕ、Ｇｌｙ３３６Ｇｌｕ、Ｇｌｙ３３６Ｉｌｅ、およびより顕著にはＧｌｙ３３６Ｔｒｐ（突然変異アミノ酸の位置をPseudomonas ＨＰＰＤに関して表示する）が、その酵素の活性に変化を起こさずにこれらのジケトニトリル除草剤を用いた出芽前処理に対する耐性増加を担う突然変異として同定された。
【００１１】
さらに最近には、タバコおよびダイズのプラスチドゲノムへのPseudomonas ＨＰＰＤ遺伝子の導入が核トランスフォーメーションよりも有効であって、イソキサフルトールの出芽後施用に対する耐性さえも付与することが示された（Dufourmantel et al., 2007, Plant Biotechnol J.5(1):118-33）。
【００１２】
国際公開公報第０４／０２４９２８号では、発明者らは、植物細胞へのＨＰＰ前駆体の流入を増加させることによって、これらの植物細胞中のプレニルキノン生合成（例えばプラストキノン、トコフェロールの合成）を増加させようと努めた。これは、該前駆体の合成を、ＰＤＨ酵素の過剰発現によって「シキミ酸」経路と連結させることによって行われた。発明者らは、また、ＰＤＨ酵素をコードする遺伝子を用いた植物のトランスフォーメーションが、ＨＰＰＤ阻害剤に対する該植物の耐性を増大できるようにすることに気付いた。
【００１３】
特許出願である国際公開公報第２００９／１４４０７９号では、Pseudomonas fluorescens ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）タンパク質の位置３３６で突然変異したＨＰＰＤをコードする核酸配列、およびＨＰＰＤ阻害剤型除草剤に耐性の植物を得るためのその使用が開示されている。
【００１４】
国際公開公報第２００２／０４６３８７号では、様々なＨＰＰＤ阻害剤型除草剤に対する耐性を付与するために関連することのある植物由来のＨＰＰＤタンパク質のいくつかのドメインが同定されたが、植物体データも生化学データも前記ドメイン機能の影響を確認することを示されなかった。
【００１５】
国際公開公報第２００８／１５０４７３号では、ＨＰＰＤ阻害剤型除草剤に対する、改善された耐性を得るために、二つの別個の耐性メカニズムの組み合わせ、すなわち突然変異型ＨＰＰＤ酵素をコードする改変Avena sativa遺伝子およびＣＹＰ４５０トウモロコシ−モノオキシゲナーゼ（ｎｓｆ１遺伝子）が例示されたが、両方のタンパク質の組み合わせに基づく相乗効果を実証しているデータは開示されていない。
【００１６】
上記のいくつかのＨＰＰＤ阻害剤型除草剤に対して耐性を示す植物を開発するために達成されたこれらの成功に関わらず、より新しいＨＰＰＤ阻害剤、またはいくつかの異なるＨＰＰＤ阻害剤、特にトリケトン（例えばスルコトリオン、メソトリオン、テンボトリオン、ベンゾビシクロンおよびビシクロピロン）およびピラゾリネート（例えば、トプラメゾンおよびピラスルホトール）のクラスに属するＨＰＰＤ阻害剤に対する植物の耐性を発生および／または改善することが依然として必要である。
【００１７】
説明
したがって本発明は、Blepharismidae科に属する生物から入手可能な、または入手されたＨＰＰＤタンパク質をコードする遺伝子、およびその変異体または突然変異体を含有するトランスジェニック植物であって、任意の当該ＨＰＰＤコード導入遺伝子を含有しない植物よりもＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性が低い植物の作製、さらに顕著にはｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸からホモゲンチジン酸への転換を触媒する性質を示すＨＰＰＤ酵素をコードする、Blepharisma属に属する生物由来の遺伝子、その変異体または突然変異体に関する。ＨＰＰＤタンパク質をコードするBlepharismidae由来遺伝子が優れたＨＰＰＤ阻害剤耐性候補として選択されたが、それは、ＨＰＰＤタンパク質から実験的および構造的に決定されたように、それらのタンパク質がＨＰＰＤ阻害剤型除草剤に感受性の参照分子として採用された感受性Arabidopsis ＨＰＰＤタンパク質に比べて、ＨＰＰＤ阻害剤耐性にとって関連する位置にアミノ酸組成の高い分岐を示すことによる。
【００１８】
したがってさらに顕著には、本発明は、ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸からホモゲンチジン酸への転換を触媒する性質を示すＨＰＰＤ酵素をコードする、Blepharismidae科に属する生物から、特にBlepharisma属から入手可能な、または入手された、より顕著には、Blepharisma japonicum種から入手された遺伝子、その変異体または突然変異体を含有するトランスジェニック植物の作製であって、該ＨＰＰＤ導入遺伝子を含有しない植物よりもＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性が低いトランスジェニック植物の作製に関する。
【００１９】
一態様では、本発明は、本明細書において「本発明のＨＰＰＤタンパク質」または「Blepharisma ＨＰＰＤタンパク質」と名付けられたＨＰＰＤタンパク質であって、配列番号４のアミノ酸位置２〜３８２のアミノ酸配列と、特に配列番号４、５、６または７のいずれか一つ、好ましくは配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％；少なくとも９７％；少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するＨＰＰＤタンパク質に関する。
【００２０】
さらなる一態様では、本発明は、本明細書において「本発明のＨＰＰＤタンパク質」または「Blepharisma ＨＰＰＤタンパク質」と名付けられたＨＰＰＤタンパク質であって、配列番号４のアミノ酸位置２〜３８２のアミノ酸配列と、特に配列番号４、５、６、７のいずれか一つ、好ましくは配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％；少なくとも９７％；少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するＨＰＰＤタンパク質に関し、ここで、配列番号４の位置１８５〜位置３８２の任意のアミノ酸が任意の天然アミノ酸によって修正されていることがあり、それは優先的には任意の保存的置換のことがある。
【００２１】
さらなる一態様では、本発明は、本明細書において「本発明のＨＰＰＤタンパク質」または「Blepharisma ＨＰＰＤタンパク質」と名付けられたＨＰＰＤタンパク質であって、配列番号４のアミノ酸位置２〜３８２のアミノ酸配列と、特に配列番号４、５、６、７のいずれか一つ、好ましくは配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％；少なくとも９７％；少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列配列同一性を有し、以下のアミノ酸、すなわちＨｉｓ（１８３）、Ｓｅｒ（２２６）、Ａｓｎ（２４１）、Ｇｌｎ（２６５）、Ｈｉｓ（２６６）、Ｔｙｒ（２９５）、Ｇｌｎ（３３４）、Ｐｈｅ（３４７）、Ｇｌｕ（３４９）、Ｇｌｙ（３６０）、およびＡｓｎ（３６３）の一つまたは複数をカッコ内の数字によって定義される位置に有するＨＰＰＤタンパク質に関する。
【００２２】
さらなる一態様では、本発明は、本明細書において「本発明のＨＰＰＤタンパク質」または「Kordia ＨＰＰＤタンパク質」と名付けられたＨＰＰＤタンパク質であって、配列番号４のアミノ酸位置２〜３８２のアミノ酸配列と、特に配列番号４、５、６、７のいずれか一つ、好ましくは配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％；少なくとも９７％；少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するＨＰＰＤタンパク質に関し、ここで、表（ｉ）の第２列に示されたそれぞれの位置で、天然アミノ酸が表（ｉ）の第３列に挙げられた任意のアミノ酸によって置換されていることがある。
【００２３】
【表１】
0005871813.tif 000002
【００２４】
【表２】
0005871813.tif 000003
【００２５】
さらなる一態様では、本発明は、本明細書において「本発明のＨＰＰＤタンパク質」または「Kordia ＨＰＰＤタンパク質」と名付けられたＨＰＰＤタンパク質であって、配列番号４のアミノ酸位置２〜３８２のアミノ酸配列と、特に配列番号４、５、６、７のいずれか一つ、好ましくは配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％；少なくとも９７％；少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するＨＰＰＤタンパク質に関し、ここで、表（ｉｉ）の第２列に示されたそれぞれの位置で、天然アミノ酸が表（ｉｉ）の第３列に挙げられた任意のアミノ酸によって置換されていることがある。
【００２６】
【表３】
0005871813.tif 000004
【００２７】
さらなる一態様では、本発明は、本明細書において「本発明のＨＰＰＤタンパク質」または「Kordia ＨＰＰＤタンパク質」と名付けられたＨＰＰＤタンパク質であって、配列番号４のアミノ酸位置２〜３８２のアミノ酸配列と、特に配列番号４、５、６、７のいずれか一つ、好ましくは配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％；少なくとも９７％；少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するＨＰＰＤタンパク質に関し、ここで、表（ｉｉｉ）の第２列に示されるそれぞれの位置で、天然アミノ酸が表（ｉｉｉ）の第３列に挙げられた任意のアミノ酸によって置換されていることがある。
【００２８】
本発明には、トランジットペプチド融合タンパク質のように配列番号４の配列のアミノ酸位置２〜アミノ酸位置３８２の配列に比べてアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたタンパク質、または配列番号４の配列にアミノ酸変化を有するタンパク質であって、ＨＰＰＤタンパク質の酵素機能を保持し、植物に発現された場合にＨＰＰＤ耐性を、好ましくは配列番号４のタンパク質によって付与された耐性に匹敵する範囲のＨＰＰＤ耐性を依然として付与するタンパク質が含まれる。これには、配列番号：５、６または７の任意のタンパク質などの、配列番号４のタンパク質由来の変異型または突然変異型タンパク質、特にイソキサゾール、ジケトニトリル、トリケトンまたはピラゾリネートのクラスのＨＰＰＤ阻害剤型除草剤に対してホスト植物の内因性ＨＰＰＤよりも感受性が低い突然変異体または変異体、好ましくは、イソキサゾール、ジケトニトリル、トリケトンおよび／またはピラゾリネートのクラスのＨＰＰＤ阻害剤型除草剤、特にメソトリオン、テンボトリオン、イソキサフルトールまたはビシクロピロンの任意の一つがそのような植物に施用される場合、より顕著には出芽後に施用される場合に、その突然変異体または変異体を発現しているホスト植物に農学的に関連する除草剤耐性を付与する突然変異体または変異体が含まれる。これには、また、植物中に発現された場合にＨＰＰＤ阻害剤耐性を付与する、配列番号：４の配列の活性部分を含むタンパク質が含まれる。これには、配列番号４〜７の任意の一つのアミノ酸配列を有するタンパク質などの、配列番号：４の配列と実質的に同じアミノ酸配列を有するタンパク質が含まれる。これには、下記に定義されるような単離されたタンパク質、およびまた、あるアミノ酸が下記に定義される類似のアミノ酸によって、好ましくは保存的アミノ酸置換によって置換されている、配列番号：４のタンパク質などのタンパク質が含まれる。同様に本発明のＨＰＰＤタンパク質として本明細書に含まれるのは、配列番号４のアミノ酸位置２〜３８２のアミノ酸配列を含むＨＰＰＤタンパク質であるが、１〜２０、１〜１５、１〜１０個、または１、２、３、４、５、６、７、８、もしくは９個のアミノ酸が欠失しているか、または他のアミノ酸によって置換されているＨＰＰＤタンパク質、特にＨＰＰＤ酵素活性を保持し、ホスト植物に発現された場合にＨＰＰＤ阻害剤型除草剤に対する耐性を付与するタンパク質である。本明細書に含まれるのは、下記の本発明のＤＮＡ配列に相同なＤＮＡ配列によってコードされるＨＰＰＤタンパク質、または配列番号：１のＤＮＡの少なくとも一部（少なくとも２０〜３０個のヌクレオチド）とハイブリダイゼーションするＤＮＡ配列もしくは配列番号：１に基づくプライマーを使用して入手可能なＤＮＡ配列によってコードされるＨＰＰＤタンパク質、または真核微生物、特にBlepharismidae科微生物などの原生生物などの微生物のゲノム配列から見出されるＤＮＡ配列によってコードされる、配列番号：４と少なくとも７５％の配列同一性を有するＨＰＰＤタンパク質である。本発明のＨＰＰＤタンパク質として本明細書に含まれるのは、植物に発現された場合に当該植物に除草剤耐性を付与するBlepharismidae ＨＰＰＤタンパク質で���って、ここで、当該耐性は、メソトリオン、テンボトリオン、イソキサフルトールまたはビシクロピロンなどのＨＰＰＤ阻害剤に対するものであり、特に当該ＨＰＰＤタンパク質は、配列番号：４のアミノ酸位置２〜３８２の配列を含むタンパク質などのBlepharisma japonicum ＨＰＰＤタンパク質である。これには、さらに下記に記載するような突然変異型または変異型ＨＰＰＤタンパク質が含まれる。
【００２９】
本発明は、配列番号：４、５、６、もしくは７から成る群より選択されるアミノ酸配列、または上記表（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）の一つもしくは複数に開示されたようなアミノ酸置換によるその派生配列を含む実質的に精製されたタンパク質と特異的に結合可能な抗体を包含し、それを提供する。
【００３０】
本発明のさらなる一局面は、本発明の一つまたは複数のタンパク質またはペプチド分子に特異的に結合する抗体、単鎖抗原結合分子、または他のタンパク質、およびそれらのホモログ、融合体またはフラグメントに関する。特に好ましい一態様では、その抗体は、配列番号：４〜７に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはそのフラグメント、または上記表（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）の一つもしくは複数に開示されたようなアミノ酸置換によるその派生配列に特異的に結合する。
【００３１】
別の態様では、抗体は、配列番号：４〜７に示されるアミノ酸配列より選択されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む融合タンパク質に特異的に結合する。別の態様では、抗体は、配列番号：４〜７に示されるアミノ酸配列もしくはそのフラグメント、または上記表（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）の一つもしくは複数に開示されたようなアミノ酸置換によるその派生配列より選択されるアミノ酸配列を含む融合タンパク質に特異的に結合する。
【００３２】
本発明の抗体は、本発明のタンパク質もしくはペプチド分子を定量的もしくは定性的に検出するために、またはタンパク質の翻訳後改変を検出するために使用されることがある。本明細書に使用されるように、結合が無関係な分子の存在によって競合的に阻害されない場合、抗体またはペプチドは、本発明のタンパク質またはペプチド分子に「特異的に結合する」と言われる。
【００３３】
別の態様では、本発明は、本明細書において「本発明のＨＰＰＤ核酸／ＤＮＡ」と名付けられた、上記と同義の本発明のＨＰＰＤをコードする核酸またはＤＮＡであるＨＰＰＤ核酸またはＤＮＡに関する。これには、配列番号１のヌクレオチド位置４〜ヌクレオチド位置１１４７の配列、配列番号２のヌクレオチド位置２５〜ヌクレオチド位置１１６７の配列、もしくは配列番号３のヌクレオチド位置４〜ヌクレオチド位置１５４２の配列から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡか、またはＨＰＰＤをコードするＤＮＡ領域を含むＤＮＡ、または０．１％ ＳＤＳを含有する５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ（１倍濃度のクエン酸ナトリウム）＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸三ナトリウム、５０mMリン酸ナトリウム、ｐＨ７．６を意味する）中で６０から６５℃の間の温度でインキュベーションし、続いて同じ温度で０．１％ ＳＤＳを含有する５×ＳＳＣを用いて洗浄したときに、配列番号１、２、および３から成る群より選択される配列とまだハイブリダイゼーションするように別のＤＮＡと十分に相補的なＤＮＡが含まれる。試験配列および本発明の配列が二本鎖の場合、試験配列を構成している核酸は、好ましくは、配列番号１、２、および３から成る群より選択される配列のＴＭから１０℃以内のＴＭを有する。試験配列および配列番号１、２、および３から成る群より選択される配列が一緒に混合され、同時に変性される場合、それらの配列のＴＭ値は、好ましくは相互のＴＭから５℃以内である。より好ましくはハイブリダイゼーションは、下記と同義の相対的にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で行われる。
【００３４】
一態様では、変性された試験配列または本発明の配列は、好ましくは最初に支持体に結合され、ハイブリダイゼーションが、６０から６５℃の間の温度で０．１％ ＳＤＳを含有する５×ＳＳＣ中で特定時間行われ、続いて同じ温度であるが０．１×ＳＳＣで支持体がすすがれる。ハイブリダイゼーションが、配列番号１、２、および３から成る群より選択される配列のフラグメントを必要とする場合、技術者に明らかなように、ハイブリダイゼーション条件はあまりストリンジェントではないことがある。
【００３５】
同様に本発明のＨＰＰＤ  ＤＮＡとして本明細書に含まれるのは、本発明のＨＰＰＤタンパク質をコードするＤＮＡ配列であって、ネイティブなコドンをホスト細胞においてより好まれるコドンに置換することなどによって、微生物もしくは植物での発現のために適合されたＤＮＡ配列、またはクローニングの容易さのために一定の制限部位が付加もしくは除去されたＤＮＡ配列、または付加、置換もしくは欠失されたヌクレオチドを一定数有するＤＮＡ配列である。これには、また、さらに下に記載するような単離されたＤＮＡ配列、および変異型、突然変異型または合成のＤＮＡまたは核酸が含まれる。
【００３６】
特定の一態様では、本発明のBlepharisma ＨＰＰＤ ＤＮＡは、植物に外因性遺伝子を発現させるプロモーターのコントロール下で、植物中に発現される。さらなる特定の一態様では、そのように発現されたＨＰＰＤ酵素のＮ末端に、トランジットペプチドなどのシグナルトランジットペプチド、好ましくはアミノ酸約１２０個（アミノ酸約３０〜約１２０個）のクロロプラストトランジットペプチドなどのプラスチドトランジットペプチド、最も好ましくは第１部分がヒマワリ（Helianthus annuus）由来で、第２部分がZea mays由来の最適化トランジットペプチド（米国特許第５，１８８，６４２号に記載）などの二重トランジットペプチド、または植物リブロースビスカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ小サブユニット（ＲｕＢｉｓＣＯ ｓｓｕ）の、適切な場合は成熟ＲｕＢｉｓＣＯ ｓｓｕのＮ末端部分の少数のアミノ酸を含む、プラスチドトランジットペプチド（EP 189 707）が位置する。
【００３７】
さらなる特定の一態様では、本発明には、配列番号１に由来するか、またはそれから入手可能な本発明のＨＰＰＤタンパク質をコードするＤＮＡであって、コドン最適化されたＤＮＡ、例えば配列番号２のヌクレオチド位置２５〜ヌクレオチド位置１１６７（明示された位置を含む）の配列を含むＤＮＡなどの、E. coliでの発現のために最適化されたＤＮＡが含まれる。
【００３８】
さらなる特定の一態様では、本発明には、配列番号１に由来し、植物での発現のために最適化されたコドン最適化ＤＮＡ、例えば配列番号３のヌクレオチド位置４００〜ヌクレオチド位置１５４２（明示された位置を含む）の配列を含むＤＮＡなどの、本発明のＨＰＰＤタンパク質をコードするＤＮＡが含まれる。
【００３９】
さらなる特定の一態様では、配列番号４のアミノ酸位置２〜アミノ酸位置３８２のアミノ酸配列を含むＨＰＰＤ、または配列番号４〜７の任意の一つのアミノ酸配列を含むＨＰＰＤなどの本発明のＨＰＰＤは、イソキサゾール、ジケトニトリル、トリケトンもしくはピラゾリネートのクラスのＨＰＰＤ阻害剤型除草剤、またはイソキサフルトール、テンボトリオン、メソトリオン、スルコトリオン、ピラスルホトール、トプラメゾン、２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−ＳＯ２ＣＨ３−４−ＣＦ３フェニル）プロパン−１，３−ジオンおよび２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−ＳＯ２ＣＨ３−４−２，３Ｃｌ２フェニル）プロパン−１，３−ジオン、ビシクロピロン、ベンゾビシクロン、テフリルトリオン、およびピラゾキシフェンより選択されるＨＰＰＤ阻害剤型除草剤に対してホスト植物内因性ＨＰＰＤよりも感受性が低い。
【００４０】
さらなる特定の一態様では、本発明には、コドン最適化されたＤＮＡなどの、E. coliでの発現のために最適化された、本発明のＨＰＰＤタンパク質をコードするＤＮＡ、例えばイソキサゾール、ジケトニトリル、トリケトンまたはピラゾリネートのクラスの少なくとも１種のＨＰＰＤ阻害剤型除草剤、好ましくはテンボトリオン、メソトリオン、ビシクロピロン、テフリルトリオン、イソキサフルトール、ジケトニトリル、ピラスルホトール、トプラメゾン、スルコトリオン、ピラゾレートおよびベンゾフェナップに対してホスト植物の内因性ＨＰＰＤよりも感受性が低いＨＰＰＤをコードする、配列番号２のヌクレオチド位置２５〜ヌクレオチド位置１１６７（定義された位置を含む）の配列を含むＤＮＡが含まれる。
【００４１】
さらなる特定の一態様では、本発明には、コドン最適化ＤＮＡなどの、植物での発現のために最適化された本発明のＨＰＰＤタンパク質をコードするＤＮＡ、例えばイソキサゾール、ジケトニトリル、トリケトンまたはピラゾリネートのクラスの少なくとも１種のＨＰＰＤ阻害剤型除草剤、好ましくはテンボトリオン、メソトリオン、ビシクロピロン、テフリルトリオン、イソキサフルトール、ジケトニトリル、ピラスルホトール、トプラメゾン、スルコトリオン、ピラゾレートおよびベンゾフェナップに対してホスト植物の内因性ＨＰＰＤよりも感受性が低いＨＰＰＤをコードする、配列番号３のヌクレオチド位置４００〜ヌクレオチド位置１５４２（定義された位置を含む）の配列を含むＤＮＡが含まれる。
【００４２】
さらなる特定の一態様では、本発明は、コドン最適化ＤＮＡなどの、E. coliでの発現のために最適化された、または植物での発現のために最適化された本発明のＨＰＰＤタンパク質をコードするＤＮＡ、例えばホスト植物に内因性のＨＰＰＤよりも感受性が低いＨＰＰＤをコードする、配列番号２のヌクレオチド位置２５〜ヌクレオチド位置１１６７（明示された位置を含む）または配列番号３のヌクレオチド位置４００〜ヌクレオチド位置１５４２（明示された位置を含む）の配列を含むＤＮＡを含む植物、植物の部分、植物細胞、およびこれらの植物の後代に関する。そのような植物には、非限定的に、セイヨウアブラナ、ヒマワリ、タバコ、テンサイ、ワタ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、イネ、モロコシ、トマト、マンゴー、モモ、リンゴ、ナシ、イチゴ、バナナ、メロン、ジャガイモ、ニンジン、レタス、キャベツ、タマネギ、ダイズ（soya spp）、サトウキビ、エンドウ、ソラマメ、ポプラ、ブドウ、柑橘類、アルファルファ、ライムギ、エンバク、芝草および飼料用イネ科草本、アマおよびアブラナ、ならびに堅果の生る植物などの、作物、果物および野菜が含まれる。
【００４３】
より特定の一態様では、本発明は、コドン最適化ＤＮＡなどの、E. coliでの発現のために最適化された、または植物での発現のために最適化された、本発明のＨＰＰＤタンパク質をコードするＤＮＡ、例えばホスト植物に内因性のＨＰＰＤよりも感受性が低いＨＰＰＤをコードする配列番号２のヌクレオチド位置２５〜ヌクレオチド位置１１６７（明示された位置を含む）または配列番号３のヌクレオチド位置４００〜ヌクレオチド位置１５４２（明示された位置を含む）の配列を含むＤＮＡを含む植物、植物の部分、植物細胞、およびこれらの植物の後代に関し、ここでそれらの植物は、セイヨウアブラナ、ヒマワリ、タバコ、テンサイ、ワタ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、イネ、ジャガイモ、ダイズ、サトウキビ、エンドウ、ソラマメ、ポプラ、ブドウ、アルファルファ、ライムギ、エンバク、芝草および飼料用イネ科草本、アマおよびアブラナ、ならびに堅果の生る植物から成る群より選択され、なおより好ましくは、そのような植物は、ダイズ、イネ、テンサイ、コムギ、ワタ、セイヨウアブラナ、アブラナまたはトウモロコシからなる群より選択される。
【００４４】
別の特定の態様では、本発明のＨＰＰＤタンパク質は、配列番号７の配列を含み、植物、特にホスト植物の内因性非突然変異型ＨＰＰＤに比べて、テンボトリオン、スルコトリオン、メソトリオン、ビシクロピロン、テフリルトリオンなどのトリケトンのクラス（リケトンＨＰＰＤ阻害剤と名付ける）、特にテンボトリオン、またはジケトニトリル（イソキサフルトール）のクラス、またはピラスルホトール、ピラゾレート、トプラメゾン、ベンゾフェナップなどのピラゾリネートのクラス（ピラゾリネートＨＰＰＤ阻害剤と名付ける）のＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性が低く、ここで、本発明のそのようなＨＰＰＤは、発現されているか、または発現される。
【００４５】
ＨＰＰＤタンパク質の酵素活性は、ＨＰＰまたはＯ２基質の量の減少を測定すること、または酵素反応由来の任意の生成物、すなわちホモゲンチジン酸またはＣＯ２の蓄積を測定することのいずれかを可能にする任意の方法によって測定することができる。特に、ＨＰＰＤ活性は、参照により本明細書に組み入れられるGarcia et al. (1997), Biochem. J. 325, 761-769またはGarcia et al. (1999), Plant Physiol. 119, 1507-1516に記載された方法によって測定することができる。
【００４６】
本発明によると、トリケトンのクラスのＨＰＰＤ阻害剤（またはトリケトンＨＰＰＤ阻害剤）は、トリケトン骨格を有するＨＰＰＤ阻害剤を意味する。そのようなトリケトンＨＰＰＤ阻害剤の一例として、分子スルコトリオン［すなわち２−［２−クロロ−４−（メチルスルホニル）ベンゾイル］−１，３−シクロヘキサンジオン］、メソトリオン［すなわち２−［４−（メチルスルホニル）−２−ニトロベンゾイル］−１，３−シクロヘキサンジオン］、およびテンボトリオン［すなわち２−［２−クロロ−４−（メチルスルホニル）−３−［（２，２，２，−トリ−フルオロエトキシ）メチル］ベンゾイル］−１，３−シクロ−ヘキサンジオン］、テフリルトリオン［すなわち２−｛２−クロロ−４−メシル−３−［（ＲＳ）−テトラヒドロ−２−フリルメトキシメチル］ベンゾイル｝シクロヘキサン−１，３−ジオン］、ビシクロピロン［すなわち４−ヒドロキシ−３−｛２−［（２−メトキシエトキシ）メチル］−６−（トリフルオロメチル）−３−ピリジルカルボニル｝ビシクロ［３．２．１］オクタ−３−エン−２−オン］、ベンゾビシクロン［すなわち３−（２−クロロ−４−メシルベンゾイル）−２−フェニルチオビシクロ［３．２．１］オクタ−２−エン−４−オン］を引用することができる。本発明によると、ピラゾリネートのクラスのＨＰＰＤ（またはピラゾリネートＨＰＰＤ阻害剤）は、ピラゾール基を有するＨＰＰＤ阻害剤を意味する。そのようなピラゾリネートＨＰＰＤ阻害剤の一例として、分子トプラメゾン［すなわち［３−（４，５−ジヒドロ−３−イソキサゾリル）−２−メチル−４−（メチルスルホニル）フェニル］（５−ヒドロキシ−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）メタノン］およびピラスルホトール［（５−ヒドロキシ−１，３−ジメチルピラゾール−４−イル（２−メシル−４−トリフルアロメチルフェニル）メタノン］を引用することができる。
【００４７】
本発明は、また、本発明のBlepharisma ＨＰＰＤをコードする核酸配列、特に単離されたＤＮＡ、好ましくは植物で発現可能なキメラ遺伝子、およびその適応配列に関する。
【００４８】
本発明は、また、ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸からホモゲンチジン酸への転換を触媒する性質を保持する本発明のＨＰＰＤ酵素であって、テンボトリオン、スルコトリオンおよびメソトリオンなどのトリケトンのクラス、またはピラスルホトールおよびトプラメゾンなどのピラゾリネートのクラス、テフリルトリオン、ビシクロピロン、ベンゾビシクロンのＨＰＰＤ阻害剤に対して、内因性の非突然変異型植物ＨＰＰＤよりも感受性が低いＨＰＰＤ酵素をコードする核酸配列に関し、そのうち、コードされるアミノ酸配列は、配列番号４と少なくとも７５％、８０％、特に少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、なおより好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を示す。
【００４９】
より特定の一態様では、本発明の核酸配列は、ホスト植物の内因性ＨＰＰＤよりも、テンボトリオン、スルコトリオン、メソトリオン、ビシクロピロン、およびテフリルトリオンなどのトリケトンのクラス、イソキサフルトールなどのイソキサゾールのクラス、またはピラスルホトール、ピラゾレート、トプラメゾン、ベンゾフェナップなどのピラゾリネートのクラス（ピラゾリネートＨＰＰＤ阻害剤と名付ける）、またはジケトニトリルなどのジケトンのクラスのＨＰＰＤ阻害剤に対して感受性が低いＨＰＰＤ酵素をコードする。
【００５０】
本発明によると、「核酸配列」は、天然起源または合成起源であろうと、ＤＮＡまたはＲＮＡ型、好ましくはＤＮＡ型、特に二本鎖でありうるヌクレオチド配列、特に本発明によるＨＰＰＤをコードするコドンが、それが発現される予定のホスト生物に応じて（例えば、本来の生物または起源生物に比べて、そのようなホスト生物またはそのようなホスト生物が属する群のコドン使用頻度表からの、より好ましいまたは最も好ましいコドンによってコドンを置換することによって）最適化されたＤＮＡ配列であると理解される。「単離された核酸／ＤＮＡ／タンパク質」は、本明細書に使用されるように、自然に存在しない核酸／ＤＮＡ／タンパク質（天然ＤＮＡとは異なるヌクレオチド配列を有する人工もしくは合成ＤＮＡ、または改変タンパク質など）、またはそれが本来存在した自然環境にもはやない核酸／ＤＮＡ／タンパク質、例えば、キメラ遺伝子中の異種調節エレメント（植物で発現可能なプロモーターに作動可能に連結される細菌コード配列など）に関連する配列をコードするＤＮＡ、トランスジェニック植物細胞などの別のホスト細胞に導入されたＤＮＡを表す。
【００５１】
本発明の特定の一態様および求められている解決、すなわちトリケトン、イソキサゾール、またはピラゾリネートＨＰＰＤ阻害剤に対して感受性が低いＨＰＰＤを考慮して、下記のように国際公開公報第２００９／１４４０７号に広く記載された方法を用いて、トリケトン、イソキサゾール、またはピラゾリネートＨＰＰＤ阻害剤、特にテンボトリオン、メソトリオン、ピラスルホトール、トプラメゾンスルコトリオン、ビシクロピロン、ジケトニトリル、ベンゾフェナップ、ピラゾレート、テフリルトリオンより選択されるＨＰＰＤ阻害剤を使用して耐性レベルの測定が分析される。
【００５２】
ある配列「Ｘ」を「含む」ＤＮＡまたはタンパク質という用語は、本明細書全体に使用されるように、他のヌクレオチドまたはアミノ酸配列が５’末端（またはＮ末端）および／または３’末端（またはＣ末端）に包含されうるように少なくとも配列「Ｘ」、例えば選択マーカータンパク質（のヌクレオチド配列）、トランジットペプチド（のヌクレオチド配列）、および／または５’リーダー配列もしくは３’トレーラー配列を包含または含有するＤＮＡまたはタンパク質を表す。同様に、本出願の明細書および特許請求の範囲にわたる「含む（comprise）」、「含んでいる」または「含む（comprises）」という用語の使用は、述べられた整数もしくは工程または整数もしくは工程の群の包含を意味するのであって、他の任意の整数もしくは工程または整数もしくは工程の群の除外を意味しないことを了解されたい。
【００５３】
本発明の一態様では、ＨＰＰＤをコードするコード領域は、配列番号１、２、および３のヌクレオチド配列などの、配列番号４、５、６、および７に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００５４】
しかしながら、その挿入、欠失および置換を含めたこれらのヌクレオチド配列の変異体もまた、同じ効果に対して使用されうることが明らかであろう。同時に、Blepharismaと異なる種由来の、言及されたヌクレオチド配列のホモログを使用することができる。
【００５５】
記載されたヌクレオチド配列の変異体は、配列リスト中の確認されたヌクレオチド配列などの、ＨＰＰＤ酵素をコードする確認されたヌクレオチド配列と好ましくは少なくとも約７０％、８０％、または８５もしくは９０％または少なくとも９５％の配列同一性を有する。
【００５６】
本発明に記載されたようなタンパク質と「実質的に同じアミノ酸配列」を有するタンパク質は、本明細書に使用されるように、本発明によるタンパク質と少なくとも９０％、特に少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％の配列同一性を有するタンパク質を表し、ここで、配列同一率は、Wisconsin package of GCGのＧＡＰプログラム（Madison, Wisconsin, USA）バージョン１０．０（GCGデフォルト使用）においてblosum62スコアリングマトリックスを使用することによって決定される。本出願にわたり使用されるように「配列同一性」は、タンパク質に関する場合、この特定の分析を使用したアミノ酸の同一率を表す。本明細書に使用されるように「配列同一性」は、ＤＮＡ配列に関する場合、Wisconsin package of GCGのＧＡＰプログラム（Madison, Wisconsin, USA）バージョン１０．０（GCGデフォルト使用）においてnwsgapdnaスコアリングマトリックスを使用することによって決定される。
【００５７】
本発明のために、二つの関連するヌクレオチド配列またはアミノ酸配列のパーセント表示された「配列同一性」は、二つの最適にアライメントされた配列中で同一の残基を有する位置の数を、比較された位置数で割ったもの（×１００）を表す。ギャップ、すなわち一方の配列中に存在するが他方には存在しないアライメント中の位置は、同一でない残基を有する位置として見なされる。二つの配列のアライメントは、NeedlemanおよびWunschのアルゴリズム（Needleman and Wunsch 1970）によって行われる。上記コンピューター援用配列アライメントは、好都合には、ギャップ生成ペナルティー５０およびギャップ伸長ペナルティー３を有するデフォルトのスコアリングマトリックスを使用してWisconsin Packageバージョン１０．１（Genetics Computer Group, Madision, Wisconsin, USA）の一部であるＧＡＰなどの標準的なソフトウェアプログラムを使用して行うことができる。
【００５８】
本発明によるＨＰＰＤ酵素をコードするヌクレオチド配列に相同なヌクレオチド配列は、ゲノム配列データのin silico解析によって同定されることができる。
【００５９】
相同ヌクレオチド配列は、また、本発明によるＨＰＰＤ酵素をコードする確認されたヌクレオチド配列またはその部分をプローブとして使用してストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションすることによって確認および単離されることがある。そのような部分は、好ましくは、本発明によるＨＰＰＤコード遺伝子配列のコード領域由来の、好ましくは配列番号１、配列番号２または配列番号３のコード領域由来の、少なくとも４０個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有するはずである。しかしながら、プローブは、言及された任意のＨＰＰＤ遺伝子由来の約５０、６０、７５、１００、２００または５００個の連続するヌクレオチドなどの、ＨＰＰＤをコードする核酸から得られたより長い領域のヌクレオチド配列を含むことがある。好ましくはプローブは、異なるＨＰＰＤタンパク質をアライメントすることによって確認されることがある、高度に保存された領域をコードするヌクレオチド配列を含むべきである。
【００６０】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、本明細書に使用されるように、プローブとターゲット配列の間に少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％の配列同一性がある場合に、一般にハイブリダイゼーションが起こることを意味する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、５×ＳＳＣ（１５０mM ＮａＣｌ、１５mMクエン酸三ナトリウム）、５０mMリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×Denhardt溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０μg/mlのサケ精子ＤＮＡなどの変性およびシェアリングされた担体ＤＮＡを含む溶液中で一晩インキュベーションし、続いて０．１×ＳＳＣ中で約６５℃でハイブリダイゼーション支持体を好ましくは約１０分間２回洗浄することである。他のハイブリダイゼーション条件および洗浄条件は周知であり、Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY (1989)の特に第１１章に例示されている。
【００６１】
そのような変異体配列は、また、非限定的に配列番号１、２、３のヌクレオチド配列またはそれらの相補体より選択される約２０〜約５０個の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドなどの、酵素をコードするＨＰＰＤ遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用したＤＮＡ増幅によって得ることができる。
【００６２】
本発明は、また、配列番号４のＨＰＰＤアミノ酸配列に類似のアミノ酸配列である、一つまたは複数のアミノ酸が挿入、欠失または置換された変異型ＨＰＰＤ酵素を包含する。この状況でアミノ酸配列の変異体は、それへの任意のアミノ酸置換、付加または欠失に関わらず、本明細書記載のアミノ酸配列に類似の触媒活性を有するポリペプチド、酵素またはタンパク質を表す。好ましくは、変異型アミノ酸配列は、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、または８５または９０％または９５％の配列同一性を有する。同様に好ましくは、変異型アミノ酸配列を含むポリペプチドは、ＨＰＰＤ酵素活性を有する。ＨＰＰＤ酵素活性を決定する方法は、当技術分野において周知であり、その方法には、国際公開公報第２００９／１４４０７９号または国際公開公報第２００２／０４６３８７号に広く記載されたアッセイが含まれる。
【００６３】
置換は、アミノ酸が異なる天然または非慣例的アミノ酸残基によって置換されたアミノ酸変化を包含する。本発明のＨＰＰＤタンパク質に含有されるアミノ酸残基が類似の性質の別の天然アミノ酸によって置換される、例えばＧｌｙ⇔Ａｌａ、Ｖａｌ⇔Ｉｌｅ⇔Ｌｅｕ、Ａｓｐ⇔Ｇｌｕ、Ｌｙｓ⇔Ａｒｇ、Ａｓｎ⇔ＧｌｎまたはＰｈｅ⇔Ｔｒｐ⇔Ｔｙｒのような置換は、「保存的」と分類されることがある。また、本発明のＨＰＰＤタンパク質中に存在するアミノ酸残基が、異なる群由来の天然アミノ酸などの異なる性質を有するアミノ酸によって置換されている（例えば荷電または疎水性アミノ酸をアラニンによって置換）、本発明によって包含される置換は、「非保存的」のことがある。アミノ酸置換は、典型的には単一残基であるが、クラスター化または分散した複数の残基のときがある。アミノ酸欠失は、通常は約１〜１０個のアミノ酸残基の水準であり、一方で挿入は任意の長さであってよい。欠失および挿入は、Ｎ末、Ｃ末に加えられることがあるか、または内部欠失もしくは挿入のことがある。一般に、アミノ酸配列内の挿入は、アミノ末端またはカルボキシ末端融合物よりも短く、１〜４個のアミノ酸残基の水準である。「類似のアミノ酸」は、本明細書に使用されるように、類似のアミノ酸側鎖を有するアミノ酸、すなわち極性、非極性または実際的に中性の側鎖を有するアミノ酸を表す。「非類似アミノ酸」は、本明細書に使用されるように、異なるアミノ酸側鎖を有するアミノ酸を表し、例えば極性側鎖を有するアミノ酸は、非極性側鎖を有するアミノ酸に非類似である。極性側鎖は、通常はタンパク質表面に存在する傾向があり、そこでそれらの側鎖は、細胞中に見出される水性環境と相互作用することができる（「親水性」アミノ酸）。他方で、「非極性」アミノ酸は、タンパク質の中心に存在する傾向にあり、そこでそれらのアミノ酸は、類似の非極性隣接物と相互作用することができる（「疎水性」アミノ酸」）。極性側鎖を有するアミノ酸の例はアルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、リシン、セリン、およびトレオニンである（疎水性であるシステインを除き全て親水性）。非極性側鎖を有するアミノ酸の例は、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、およびトリプトファン（中性のグリシン以外は全て疎水性）である。
【００６４】
同様に本発明によって包含されるのは、本発明によるＨＰＰＤ酵素を特異的に認識する抗体である。
【００６５】
本発明は、また、植物をトランスフォーメーションするための方法におけるマーカー遺伝子としての、またはＨＰＰＤ阻害剤である除草剤に対する耐性を植物に付与することを可能にするコード配列としての、本発明によるＨＰＰＤをコードする核酸の使用、および本発明によるＨＰＰＤをコードする核酸配列を含む植物へのＨＰＰＤ阻害剤の使用に関する。本発明の一態様では、そのような使用においてＨＰＰＤ阻害剤は、トリケトンまたはピラゾリネート、好ましくはテンボトリオン、メソトリオンまたはスルコトリオン、ビシクロピロン、およびテフリルトリオンである。もちろんこの配列は、また、他の遺伝子マーカーおよび／または有用な農業的性質を有する一つもしくは複数のタンパク質をコードする配列と組み合わせて使用することができる。
【００６６】
作物の商業生産では、信頼できる農薬の管理下で作物の圃場から望まれない植物（すなわち「雑草」）を除去することが望ましい。理想的な処理は、圃場全体に施用することができるが、作物を無影響のまま残す一方で、望まれない植物だけを除去する処理である。そのような一処理系は、除草剤に耐性の作物を使用することを必要とすることによって、除草剤が除草剤耐性作物の圃場にスプレー散布された場合に、その作物がよく生育し続ける一方で、除草剤に耐性でない雑草が死滅するか、または激しく被害を受けるようにする。理想的には、そのような処理系は、除草剤の性質を変えることを利用して、雑草防除が柔軟性および経済性の最良の可能な組み合わせを提供できるようにする。例えば、個々のの除草剤は、圃場において異なる寿命を有し、圃場に施用された後に残留し、比較的長期間有効な除草剤もあれば、一方で、他の化合物または非活性な化合物に急速に分解される除草剤もある。理想的な処理系は、異なる除草剤を使用可能であることにより、栽培者が特定の状況に応じて除草剤を選択できる。
【００６７】
いくつかの除草剤耐性作物が現在市販されているが、多数の市販の除草剤および除草剤／作物の組み合わせについて生じた一問題は、個別の除草剤が典型的には通常の雑草種に対して不完全な範囲の活性を有することである。ある期間使用された個別の除草剤の大部分について、除草剤耐性の雑草種および生物型の個体群の方が優勢になった（例えばTranel and Wright (2002) Weed Science 50: 700-712; Owen and Zelaya (2005) Pest Manag. Sci. 61: 301-311を参照されたい）。一つよりも多い除草剤に耐性のトランスジェニック植物が記載されている（例えば国際公開公報第２００５／０１２５１５号を参照されたい）。しかし、作物生産、雑草防除の選択肢、残留雑草の防除の拡張、および作物収量の改善の各局面における改善が、引き続き求められている。
【００６８】
本発明のＨＰＰＤタンパク質または遺伝子は、有利には、植物中でそのような植物に有用な農学的性質を付与するタンパク質またはＲＮＡをコードする他の遺伝子と組み合わされる。トランスフォーメーションされた植物に有用な農的性質を付与するタンパク質またはＲＮＡをコードする遺伝子の中で、化学構造がＨＰＰＤ阻害剤型除草剤と異なる一つまたは複数の除草剤に耐性を付与するタンパク質、およびある昆虫に耐性を付与する他のタンパク質をコードするＤＮＡ配列、ある疾患に対する耐性を付与するもの、線虫または昆虫の防除を提供するＲＮＡをコードするＤＮＡなどについて言及することができる。そのような遺伝子は、特に、公開されたＰＣＴ特許出願である国際公開公報第９１／０２０７１号および国際公開公報第ＷＯ９５／０６１２８号に記載されている。
【００６９】
トランスフォーメーションされた植物細胞および植物に、ある除草剤に対する耐性を付与するタンパク質をコードするＤＮＡ配列の中で、ｂａｒ遺伝子もしくはＰＡＴ遺伝子、またはグルホシネート除草剤に耐性を付与する国際公開公報第２００９／１５２３５９号に記載されたStreptomyces coelicolor遺伝子、ターゲットとしてＥＰＳＰＳを定めるグリフォセートおよびその塩などの除草剤に対する耐性を付与する適切なＥＰＳＰＳをコードする遺伝子（米国特許第４，５３５，０６０号、米国特許第４，７６９，０６１号、米国特許第５，０９４，９４５号、米国特許第４，９４０，８３５号、米国特許第５，１８８，６４２号、米国特許第４，９７１，９０８号、米国特許第５，１４５，７８３号、米国特許第５，３１０，６６７号、米国特許第５，３１２，９１０号、米国特許第５，６２７，０６１号、米国特許第５，６３３，４３５号）、またはグリフォセートオキシドレダクターゼをコードする遺伝子（米国特許第５，４６３，１７５号）について言及することができる。
【００７０】
ターゲットとしてＥＰＳＰＳを定める除草剤に対する耐性を付与する適切なＥＰＳＰＳをコードするＤＮＡ配列の中で、さらに詳細には本明細書下記に二重突然変異トウモロコシＥＰＳＰＳもしくは２ｍＥＰＳＰＳと名付けられた、植物ＥＰＳＰＳ、特にトウモロコシＥＰＳＰＳ、特に二つの突然変異、特にアミノ酸位置１０２に突然変異およびアミノ酸位置１０６に突然変異を含むウモロコシＥＰＳＰＳ（国際公開公報第２００４／０７４４４３号）をコードする遺伝子であって、特許出願である米国特許第６，５６６，５８７号に記載された遺伝子、または、米国特許第５，６３３，４３５号の配列番号２および配列番号３によって記載された、ＣＰ４とも名付けられた、Agrobacteriumから単離されたＥＰＳＰＳをコードする遺伝子について言及されよう。
【００７１】
ターゲットとしてＥＰＳＰＳを定める除草剤に対する耐性を付与する適切なＥＰＳＰＳをコードするＤＮＡ配列の中で、より顕著にはArthrobacter globiformis由来のＥＰＳＰＳ ＧＲＧ２３をコードする遺伝子だけでなく、突然変異体ＧＲＧ２３  ＡＣＥ１、ＧＲＧ２３  ＡＣＥ２、またはＧＲＧ２３  ＡＣＥ３、特に国際公開公報第２００８／１００３５３号の配列番号２９のＧＲＧ２３（ａｃｅ３）Ｒ１７３Ｋなどの、国際公開公報第２００８／１００３５３号に記載されたようなＧＲＧ２３の突然変異体または変異体について言及されよう。
【００７２】
ＥＰＳＰＳをコードする、より顕著には上記遺伝子をコードするＤＮＡ配列の場合、これらの酵素をコードする配列は、有利にはトランジットペプチド、特に米国特許第５，５１０，４７１号または第５，６３３，４４８号に記載された「最適化トランジットペプチド」をコードする配列に先行される。
【００７３】
国際公開公報第２００７／０２４７８２号に、グリフォセートおよび少なくとも一つのＡＬＳ（アセト乳酸シンターゼ）阻害剤に耐性の植物が開示されている。さらに具体的には、ＧＡＴ（グリフォセート−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ）ポリペプチドおよびＡＬＳ阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチドをコードする遺伝子を含有する植物が開示されている。米国特許第６８５５５３３号に、突然変異型Arabidopsis ＡＬＳ／ＡＨＡＳ遺伝子を含有するトランスジェニックタバコ植物が開示された。米国特許第６，１５３，４０１号に、代謝（metabolisation）によって２，４−Ｄ（２，４−ジクロロフェノキシ酢酸）に対する耐性を付与する２，４−Ｄ−モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子を含有する植物が開示されている。米国特許第２００８／０１１９３６１号および米国特許第２００８／０１２０７３９号に、代謝によってジカンバ（３，６−ジクロロ−２−メトキシ安息香酸）に対する耐性を付与するジカンバモノオキシゲナーゼをコードする遺伝子を含有する植物が開示されている。
【００７４】
全ての上記除草剤耐性形質は、本発明の主題であるＨＰＰＤ耐性を果たす形質と組み合わせることができる。
【００７５】
昆虫に対する耐性の性質に関係するタンパク質をコードするＤＮＡ配列の中で、より顕著には文献に広く記載され、当業者に周知のＢｔタンパク質について言及されよう。また、Photorhabdusなどの細菌から抽出されたタンパク質について言及されよう（国際公開公報第９７／１７４３２号および国際公開公報第９８／０８９３２号）。
【００７６】
昆虫に対する耐性の新規な性質を付与する、関心が持たれるタンパク質をコードするそのようなＤＮＡ配列の中で、より顕著には、文献に広く記載され、当業者に周知のＢｔ ＣｒｙまたはＶＩＰタンパク質について言及されよう。これらには、Ｃｒｙ１Ｆタンパク質またはＣｒｙ１Ｆタンパク質から得られたハイブリッド（例えば、米国特許第６，３２６，１６９号；米国特許第６，２８１，０１６号；米国特許第６，２１８，１８８号に記載されたハイブリッドＣｒｙ１Ａ−Ｃｒｙ１Ｆタンパク質、またはその毒性フラグメント）、Ｃｒｙ１Ａ型タンパク質またはその毒性フラグメント、好ましくはＣｒｙ１Ａｃタンパク質またはＣｒｙ１Ａｃタンパク質から得られたハイブリッド（例えば、米国特許第５，８８０，２７５号に記載されたハイブリッドＣｒｙ１Ａｂ−Ｃｒｙ１Ａｃタンパク質）あるいはEP 451878に記載されたようなＣｒｙ１ＡｂもしくはＢｔ２タンパク質またはその殺虫性フラグメント、国際公開公報第０２／０５７６６４号に記載されたようなＣｒｙ２Ａｅ、Ｃｒｙ２ＡｆもしくはＣｒｙ２Ａｇタンパク質またはその毒性フラグメント、国際公開公報第２００７／１４０２５６号に記載されたＣｒｙ１Ａ．１０５タンパク質（配列番号７）またはその毒性フラグメント、ＮＣＢＩアクセッションＡＢＧ２０４２８のＶＩＰ３Ａａ１９タンパク質、ＮＣＢＩアクセッションＡＢＧ２０４２９のＶＩＰ３Ａａ２０タンパク質（国際公開公報第２００７／１４２８４０号の配列番号２）、ＣＯＴ２０２またはＣＯＴ２０３ワタ−イベント（event）から産生されたＶＩＰ３Ａタンパク質（それぞれ国際公開公報第２００５／０５４４７９号および国際公開公報第２００５／０５４４８０号）、国際公開公報第０１／４７９５２号に記載されたようなＣｒｙタンパク質、Estruch et al. (1996), Proc Natl Acad Sci U S A. 28;93(11):5389-94および米国特許第６，２９１，１５６号に記載されたようなＶＩＰ３Ａａタンパク質またはその毒性フラグメント、Xenorhabdus（国際公開公報第９８／５０４２７号に記載）、Serratia（特にS. entomophila由来）またはPhotorhabdus種の株由来の殺虫タンパク質、国際公開公報第９８／０８９３２号に記載されたようなPhotorhabdus由来のＴｃ−タンパク質など（例えば, Waterfield et al., 2001, Appl Environ Microbiol. 67(11):5017-24; Ffrench-Constant and Bowen, 2000, Cell Mol Life Sci.; 57(5):828-33）が含まれる。また、任意の上記配列、特にそれらの毒性フラグメントの配列といくつかの（１〜１０個、好ましくは１〜５個）のアミノ酸が異なるこれらのタンパク質、またはプラスチドトランジットペプチドなどのトランジットペプチド、または別のタンパク質もしくはペプチドに融合されたこれらのタンパク質の任意の一つの任意の変異体もしくは突然変異体が、本明細書に含まれる。
【００７７】
本発明は、また、コード配列、ならびに５’および／または３’位に、少なくとも５’位に異種調節エレメントを含むキメラ遺伝子（または発現カセット）に関し、その調節エレメントは、上に定義されたようにＨＰＰＤをコードする少なくとも一つの核酸配列を含有するコード配列と共にホスト生物、特に植物細胞または植物において機能することができる。
【００７８】
特定の一態様では、本発明は、ホスト生物が細菌、酵母、ピキア、真菌、バキュロウイルス、in vitro細胞、プロトプラスト、植物細胞、植物、その植物の部分、および植物種子より選択される、前記キメラ遺伝子に関する。
【００７９】
別の特定の態様では、本発明は、本発明によるＨＰＰＤをコードする核酸配列の５’位に植物トランジットペプチドをコードする核酸配列を含有する前記キメラ遺伝子に関し、この配列は、トランジットペプチド／ＨＰＰＤ融合タンパク質の発現を可能にするようにプロモーター領域と本発明によるＨＰＰＤをコードする配列の間に配置される。
【００８０】
さらなる特定の一態様では、本発明は、単独で、またはＨＰＰＤ阻害剤とは異なる点で作用する一つもしくは複数の他の公知の除草剤と組み合わせて、本発明によるＨＰＰＤ耐性遺伝子を含む植物、植物の部分、もしくは植物種子にＨＰＰＤ阻害剤型除草剤を使用すること、またはそのような植物、植物の部分、もしくは植物種子が成長もしくは播種される土壌にＨＰＰＤ阻害剤型除草剤を使用することに関する。より特定の一態様では、採用されるＨＰＰＤ阻害剤型除草剤は、テンボトリオン、スルコトリオン、メソトリオン、ビシクロピロン、テフリルトリオン、特にテンボトリオンなどのトリケトン（トリケトンＨＰＰＤ阻害剤と名付けられる）、ジケトニトリルなどのジケトンのクラス、イソキサフルトールなどのイソキサゾールのクラス、またはピラスルホトール、ピラゾレート、トプラメゾン、ベンゾフェナップなどのピラゾリネートのクラス（ピラゾリネートＨＰＰＤ阻害剤と名付けられる）から成る群より選択され、なおより顕著には、本発明は、そのようなＨＰＰＤ阻害剤耐性植物、植物の部分または植物種子へのテンボトリオン、メソトリオン、ジケトニトリル、ビシクロピロン、テフリルトリオン、ベンゾフェナップ、ピラスルホトール、ピラゾレートおよびスルコトリオンの施用に関する。
【００８１】
植物細胞および植物においてプロモーターとして機能する調節配列として、植物に自然に発現される遺伝子の任意のプロモーター配列、特にとりわけ植物の葉に発現されるプロモーター、例えば細菌、ウイルスもしくは植物起源の「構成的」プロモーター、または植物リブロース−ビスカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（ＲｕＢｉｓＣＯ）小サブユニット遺伝子のプロモーターなどの「光依存性」プロモーター、または使用されることのある任意の適切な公知の発現可能プロモーターを使用することができる。植物起源のプロモーターの間で、EP 0 507 698 A1に記載されたようなヒストンプロモーター、イネ−アクチンプロモーター（米国特許第５，６４１，８７６号）、または植物ユビキチンプロモーター（米国特許第５，５１０，４７４号）について言及されよう。植物ウイルス遺伝子のプロモーターの中で、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ １９Ｓまたは３５Ｓ、Sanders et al. (1987)、Nucleic Acids Res. 15(4):1543-58.）、シルコウイルス（AU 689 311）またはカッサバ葉脈モザイクウイルス（ＣｓＶＭＶ、米国特許第７，０５３，２０５号）のプロモーターについて言及されよう。
【００８２】
本発明の一態様では、植物の特定の領域または組織に特異的なプロモーター配列は、種子に特異的なプロモーター（Datla, R. et al., 1997, Biotechnology Ann. Rev. 3, 269-296）、特にナピン（napin）プロモーター（EP 255 378 A1）、ファセオリンプロモーター、グルテニンプロモーター、ヘリアンチニン（helianthinin）プロモーター（国際公開公報第９２／１７５８０号）、アルブミンプロモーター（国際公開公報第９８／４５４６０号）、オレオシンプロモーター（国際公開公報第９８／４５４６１号）、ＳＡＴ１プロモーターまたはＳＡＴ３プロモーター（PCT/US98/06978）などの、本発明のＨＰＰＤタンパク質を発現させるために使用することができる。
【００８３】
また有利にはフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧ）、キチナーゼ、グルカナーゼ、プロテイナーゼ阻害剤（ＰＩ）、ＰＲ１ファミリー遺伝子、ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）およびｖｓｐＢプロモーター（米国特許第５６７０３４９号、表３）、ＨＭＧ２プロモーター（米国特許第５６７０３４９号）、リンゴβ−ガラクトシダーゼ（ＡＢＧ１）プロモーターおよびリンゴ−アミノシクロプロパンカルボン酸シンターゼ（ＡＣＣシンターゼ）プロモーター（国際公開公報第９８／４５４４５号）から選択される誘導性プロモーターが使用されることがある。
【００８４】
本発明によると、プロモーターと組み合わせて、転写活性化因子（「エンハンサー」）、例えば出願である国際公開公報第８７／０７６４４号に記載されたタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）または例えばCarrington & Freed 1990, J. Virol. 64: 1590-1597によって記載されたタバコエッチウイルス（ＴＥＶ）の翻訳活性化因子、またはトウモロコシのａｄｈ１イントロンもしくはイネアクチンのイントロン１などのイントロンなどの、そのプロモーターとコード配列の間に位置する他の調節配列も使用されることがある。
【００８５】
さらなる特定の一態様では、本発明の遺伝子は、植物中に複数の、好ましくは二つのコピーが存在し、これらのそれぞれは、植物に発現可能な異なるプロモーターによってコントロールされる。
【００８６】
さらなる特定の一態様では、本発明のキメラ遺伝子は、ＨＰＰＤタンパク質をコードする任意のさらなるキメラ遺伝子と組み合わせることができ、好ましくはこれらの異なる遺伝子は、植物において活性な異なる調節エレメントによってコントロールされる。
【００８７】
さらなる特定の一態様では、本発明のキメラ遺伝子は、同一または異なる植物に発現可能なプロモーターのコントロール下のＣＹＰ４５０トウモロコシモノオキシゲナーゼ遺伝子（ｎｓｆ１遺伝子）と組み合わせることができる。
【００８８】
調節性ターミネーターまたはポリアデニル化配列として、例えばAgrobacterium tumefaciensのｎｏｓターミネーターなどの細菌起原、例えばＣａＭＶ ３５Ｓターミネーターなどのウイルス起原、または例えば公開された特許出願EP 0 633 317 A1に記載されたようなヒストンターミネーターなどの植物起原の任意の対応する配列が使用されることがある。
【００８９】
「遺伝子」という用語は、本明細書に使用されるように、典型的には少なくとも一つのプロモーター領域を含む５’および／または３’調節配列に隣接するＤＮＡコード領域であって、ＲＮＡを転写させ、それをタンパク質に翻訳できるようにする領域を表す。本発明のＨＰＰＤをコードするＤＮＡを呼ぶ場合の「キメラ遺伝子」は、そのネイティブなホスト細胞でのＨＰＰＤタンパク質の発現を推進する、自然に存在する原生生物の５’および／または３’調節配列とは異なる５’および／または３’調節配列（「異種プロモーター」または「異種調節配列」とも呼ばれる）を有する、ＨＰＰＤをコードするＤＮＡ配列を表す。
【００９０】
「配列Ｘを含むＤＮＡ／タンパク質」および「配列Ｘを含む配列を有するＤＮＡ／タンパク質」という用語は、本明細書に使用されるように、それらのヌクレオチドまたはアミノ酸配列中に少なくとも配列Ｘを包含または含有することによって、他のヌクレオチドまたはアミノ酸配列、例えばＮ末トランジットペプチドもしくはシグナルペプチドが、５’（またはＮ末端）および／または３’末端（またはＣ末端）に包含されることがあるであるＤＮＡまたはタンパク質を表す。「含んでいる」という用語は、「包含する」の意味のオープンエンド型の用語であって、本明細書に使用されるように、具体的に引用された他の要素もまたそのときに存在しうることを意味する。「から成る」という用語は、本明細書に使用されるようにクローズドエンド型の用語であって、すなわち具体的に引用された要素だけが存在する。「配列Ｘを含むタンパク質をコードするＤＮＡ」という用語は、本明細書に使用されるように、転写および／または翻訳の後に少なくともアミノ酸配列Ｘを含有するタンパク質を生じるコード配列を含むＤＮＡを表す。タンパク質をコードするＤＮＡは、必ずしも天然ＤＮＡではなく、半合成、完全合成または人工ＤＮＡのことがあり、イントロンならびに５’および／または３’フランキング領域を包含することがある。「ヌクレオチド配列」という用語は、本明細書に使用されるように、１本鎖または２本鎖形態でありうるＤＮＡまたはＲＮＡ分子の配列を表す。
【００９１】
本発明によるＨＰＰＤタンパク質は、当技術分野で公知の手順（例えば公開されたＰＣＴ特許出願である国際公開公報第９６／１００８３号参照）によりシグナルペプチドを備えることがあるか、またはそれらは、クロロプラストへのタンパク質の輸送を引き起こすクロロプラストトランジットペプチド（例えばVan Den Broeck et al., 1985, Nature 313, 358または米国特許第５，５１０，４７１号の改変クロロプラストトランジットペプチド）などの別のペプチドによって、分泌シグナルペプチドもしくは他のプラスチド、ミトコンドリア、ＥＲ、もしくは別のオルガネラにタンパク質をターゲティングするペプチドによって置換されることがあるか、またはそれは、メチオニンアミノ酸もしくはメチオニン−アラニンジペプチドによって置換されることがある。細胞内オルガネラにターゲティングするための、または植物細胞外もしくは細胞壁に分泌するためのシグナル配列は、自然にターゲティングまたは分泌されたタンパク質から見出され、好ましくは、その全てが参照により本明細書に組み入れられるKloesgenら（1989, Mol. Gen. Genet. 217, 155-161）、KloesgenおよびWeil（1991, Mol. Gen. Genet. 225, 297-304）、NeuhausおよびRogers（1998, Plant Mol. Biol. 38, 127-144)、Bihら(1999, J. Biol. Chem. 274, 22884-22894）、Morrisら（1999, Biochem. Biophys. Res. Commun. 255, 328-333）、Hesseら（1989, EMBO J. 8 2453-2461）、Tavladorakiら（1998, FEBS Lett. 426, 62-66）、Terashimaら（1999, Appl. Microbiol. Biotechnol. 52, 516-523）、Parkら（1997, J. Biol. Chem. 272, 6876-6881）、Shcherbanら（1995, Proc. Natl. Acad. Sci USA 92, 9245-9249）によって記載されたシグナル配列、特にトウモロコシ、ワタ、ダイズ、またはイネのターゲティングまたは分泌されたタンパク質由来のシグナルペプチド配列である。そのような植物シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列は、植物における発現のためにＨＰＰＤタンパク質をコードするキメラ遺伝子に挿入することができる。
【００９２】
実施例に特に述べない限り、リコンビナントＤＮＡを製造および操作するための全ての手順は、Sambrook et al., Molecular Clonign - A Laboratory Manual, Second Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1989)、ならびにAusubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USAの第１巻および第２巻に記載されている標準的な手順によって実施される。植物の分子生物学の研究のための標準物質および標準法は、BIOS Scientific Publications Ltd（UK）およびBlackwell Scientific Publications（UK）によって共同出版された、R.R.D. CroyによるPlant Molecular Biology Labfax（1993）に記載されている。ＰＣＲ技法のための手順は、M.A. Innis, D.H. Gelfand, J.J. SninskyおよびT.J. Whiteによって編集された"PCR Protocols: a guide to methods and applications"（Academic Press, Inc., 1990）に見出すことができる。
【００９３】
「耐性」、「耐性の」または「感受性が低い」という用語は互換的に使用され、それぞれのＨＰＰＤタンパク質をコードする遺伝子を含む核酸を用いてトランスフォーメーションされた株または植物の可視指標の表現型に応じて、異なる濃度の各種ＨＰＰＤ阻害剤の存在下でスクリーニングされたＨＰＰＤの固有耐性の相対レベルを意味する。これらの可視指標の表現型に関連する用量反応および用量反応における相対変化（褐色の発生、成長阻害、ブリーチング、除草効果など）は、好都合には例えばＧＲ５０（成長の５０％減少濃度）またはＭＩＣ（最小阻害濃度）の値により表現され、その際、値の増加は、発現されたＨＰＰＤの固有耐性が一連の異なる濃度の除草剤で植物の被害、分裂組織のブリーチング病徴などに基づき通常の方法で増加したことに対応する。これらのデータは、例えば、ｘ軸にプロットされた「用量」およびｙ軸にプロットされた「死滅率」、「除草剤の効果」、「出芽中の緑色植物の数」などを有する用量／反応曲線から得られたＧＲ５０値により表現することができ、その際、ＧＲ５０値の増加は、発現されたＨＰＰＤの固有耐性のレベル増加に対応する。除草剤は、適切には出芽前および出芽後に施用することができる。同じく、本発明によるＨＰＰＤタンパク質をコードする核酸もしくは遺伝子、または本発明のＨＰＰＤタンパク質の耐性レベルは、タバコなどの被験植物、またはダイズもしくはワタなどの作物の遺伝子組換え、再生、育種およびスプレー散布試験によりスクリーニングされ、これらの結果にしたがって、そのような植物は、ＨＰＰＤタンパク質をコードする外因性遺伝子を含有しない植物、または本発明のＨＰＰＤ ＤＮＡと同じプロモーターのコントロール下のArabidopsis thaliana ＨＰＰＤコードＤＮＡを含む遺伝子を含有する植物よりも、テンボトリオン、メソトリオン、ジケトニトリルおよび／またはビシクロピロンのようなＨＰＰＤ阻害剤に対して少なくとも２〜４倍耐性が高い。
【００９４】
「ホスト生物」または「ホスト」は、本発明によるＨＰＰＤを生成させるために、本発明による核酸またはキメラ遺伝子を導入することができる、任意の単細胞または多細胞異種性物であると理解される。これらの生物は、特に細菌、例えばE. coli、酵母、特にSaccharomyces属またはKluyveromyces属、ピキア、真菌、特にAspergillus、バキュロウイルスまたは好ましくは植物細胞および植物である。
【００９５】
「植物細胞」は、本発明によると、植物由来の、または植物から見出される任意の細胞であって、カルスのような未分化組織、胚のような分化組織、植物の部分、植物または種子を形成することができるか、またはその一部である細胞と理解される。これには、プロトプラストおよび花粉、培養された植物細胞またはin vitroで成長されたプロトプラスト、および完全な植物に再生できる植物細胞が含まれる。
【００９６】
「植物」は、本発明によると、光合成できる任意の分化した多細胞生物、特に単子葉または双子葉生物、より顕著には動物またはヒトの栄養を目的とするかまたはしない栽培植物、トウモロコシまたはコーン、コムギ、Brassica napusまたはBrassica junceaなどのBrassica spp植物、ダイズ、イネ、サトウキビ、ビート、タバコ、ワタなど、キュウリ、リーキ、ニンジン、トマト、レタス、コショウ、メロン、スイカなどの野菜植物などであると理解される。トランスジェニック植物は、本明細書に使用されるように、それらのゲノムに安定的に挿入された外来または異種遺伝子を含む植物を表す。
【００９７】
一態様では、本発明は、植物のトランスフォーメーションに関する。植物に自然に発現される遺伝子の任意のプロモーター配列、またはAgrobacteriumもしくは植物ウイルスプロモーターを含めた、植物に自然に発現される遺伝子のプロモーターエレメントの任意のハイブリッドもしくは組み合わせ、または植物における除草剤耐性遺伝子の転写をコントロールするために適する任意のプロモーターを、本発明の植物におけるプロモーター配列として使用することができる（本明細書において「植物で発現可能なプロモーター」と名付けられる）。そのような適切な、植物で発現可能なプロモーターの例は、上に記載されている。本発明の一態様では、そのような植物で発現可能なプロモーターは、本発明のＨＰＰＤタンパク質をコードするコード配列に作動可能に連結され、本発明のキメラＨＰＰＤ遺伝子を形成する。
【００９８】
本発明によると、プロモーター調節配列と組み合わせて、プロモーターとコード配列の間に位置する、イントロン配列または転写活性化因子（エンハンサー）などの他の調節配列を使用することも可能である。そのような適切な調節配列の例は、上に記載されている。
【００９９】
Agrobacterium tumefaciens由来のｎｏｓターミネーターなどの、細菌またはウイルス起原の任意の対応する配列、または出願EP 0 633 317 A1に記載されたようなヒストンターミネーターなどの植物起源の配列は、転写終結（およびポリアデニル化）調節配列として使用されることがある。
【０１００】
本発明の特定の一態様では、トランジットペプチドをコードする核酸配列が、本発明による外因性ＨＰＰＤをコードする核酸配列の５’（上流）に採用され、このトランジットペプチド配列は、配列番号６または配列番号７のタンパク質などの、トランジットペプチド−ＨＰＰＤ融合タンパク質の発現を可能にするように、プロモーター領域と外因性ＨＰＰＤをコードする配列の間に配置される。トランジットペプチドは、ＨＰＰＤをプラスチド中に、より顕著にはクロロプラスト中に方向付けることを可能にし、本発明のＨＰＰＤタンパク質がプラスチドに進入すると、融合タンパク質は、トランジットペプチドとＨＰＰＤタンパク質の間で切断される。トランジットペプチドは、ＥＰＳＰＳトランジットペプチド（米国特許第５，１８８，６４２号に記載）または植物リブロースビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ小サブユニット（ＲｕＢｉｓＣＯ ｓｓｕ）のトランジットペプチド（適切であれば成熟ＲｕＢｉｓＣＯ ｓｓｕ（EP 189 707 A1）のＮ末端部分の少数のアミノ酸を含む）などの単一ペプチドのことがある。またはさもなければ、特許EP 508 909 A1に記載されたように、第一の植物トランジットペプチドがプラスチド局在化する成熟タンパク質のＮ末端配列の部分と融合し、今度はこの部分が第二の植物トランジットペプチドと融合したものを含むトランジットペプチドなどの、いくつかのトランジットペプチドの融合体のことがあり、より顕著にはそのコード配列と共に特許EP 508 909 A1に記載されたように、ヒマワリＲｕＢｉｓＣＯ ｓｓｕのトランジットペプチドがトウモロコシＲｕＢｉｓＣＯ ｓｓｕのＮ末端の２２個のアミノ酸と融合し、今度はそれにトウモロコシＲｕＢｉｓＣＯ ｓｓｕのトランジットペプチドが融合したものを含む最適化トランジットペプチドのことがある。本発明は、また、トランジットペプチド−ＨＰＰＤ融合タンパク質およびそのような融合タンパク質をコードする核酸または植物で発現可能なキメラ遺伝子に関し、その際、この融合タンパク質の二つのエレメントは、上記と同義である。
【０１０１】
本発明は、また、少なくとも一つの上記と同義のキメラ遺伝子を含有するクローニングベクター、トランスフォーメーションベクターおよび／または発現ベクターに関する。上記キメラ遺伝子に加えて、このベクターは、複製起点を含有することがある。このベクターは、プラスミドもしくはプラスミドの部分、コスミド、または本発明によるキメラ遺伝子を導入することによってトランスフォーメーションされたバクテリオファージもしくはウイルスのことがある。トランスフォーメーションベクターは、技術者に周知であり、文献に広く記載されている。特に植物細胞または植物をトランスフォーメーションするために使用することのできるトランスフォーメーションベクターは、植物細胞または植物をトランスフォーメーションするために採用することのでき、追加的にそれ自体の複製エレメントおよび発現エレメントを含有するウイルスのことがある。本発明によると、植物細胞または植物をトランスフォーメーションするためのベクターは、好ましくは武装解除されたAgrobacterium Ｔｉプラスミドなどのプラスミドである。
【０１０２】
本発明は、また、上記と同義の配列番号４、５、６、または７のアミノ酸配列を含むタンパク質などの本発明のＨＰＰＤタンパク質をコードする配列を含むキメラ遺伝子を含むホスト生物、特に植物細胞、種子または植物、および作物を成長させ、植物生成物、例えば、ダイズ、イネ、コムギ、オオムギまたはトウモロコシ穀物またはコットンボールを収穫するための圃場における本発明の植物または種子の使用に関し、一態様では、該使用は、雑草を防除するためにそのような植物にＨＰＰＤ阻害剤型除草剤を施用することを必要とする。本発明の一態様では、そのような使用におけるＨＰＰＤ阻害剤は、トリケトンまたはピラゾリネート、好ましくはテンボトリオン、メソトリオン、トプラメゾンまたはスルコトリオン、ビシクロピロン、ピラスルホトール、ピラゾレート、ベンゾフェナップおよびテフリルトリオン、特にテンボトリオンである。
【０１０３】
したがって本発明は、少なくとも一つの上記ＨＰＰＤキメラ遺伝子、または少なくとも一つの前記ＨＰＰＤ核酸配列を含有することを特徴とする、ホスト生物、特に植物細胞、種子、または植物に関する。
【０１０４】
特定の一態様では、本発明は、ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸からホモゲンチジン酸への転換を触媒する性質を保持し、特にトリケトン、またはピラゾリネート、好ましくはテンボトリオン、メソトリオン、トプラメゾンもしくはスルコトリオン、ビシクロピロン、ピラスルホトール、ピラゾレート、ベンゾフェナップおよびテフリルトリオン、特にテンボトリオンに対して、植物を、本発明のそのようなＨＰＰＤタンパク質を含まない同じ種の植物よりも耐性にする、本発明のＨＰＰＤタンパク質をコードする少なくとも一つの核酸配列を含有することを特徴とする、この植物細胞または植物に関し、本発明のＨＰＰＤを含有するそのような植物は、ＨＰＰＤ阻害剤型除草剤、特にトリケトン、またはピラゾリネート、好ましくはテンボトリオン、メソトリオン、トプラメゾンもしくはスルコトリオン、ビシクロピロン、ピラスルホトール、ピラゾレート、ベンゾフェナップおよびテフリルトリオン、特にテンボトリオンに対して農学的に許容されうる耐性を有する。
【０１０５】
別の特定の態様では、本発明は、ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸からホモゲンチジン酸への転換を触媒する性質を保持し、Arabidopsis thaliana由来ＨＰＰＤ、特に配列番号１１の（アミノ酸位置１２６〜アミノ酸位置５６８の）アミノ酸配列を含む、または配列番号１１もしくは配列番号１２の（アミノ酸位置１３４〜アミノ酸位置５７５の）アミノ酸配列を含むＨＰＰＤなどのホスト植物に内因性のＨＰＰＤよりもＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性が低い、本発明のＨＰＰＤをコードする少なくとも一つの核酸配列を含有することを特徴とする、植物細胞または植物に関する。
【０１０６】
特定の一態様では、本発明は、本明細書において同義の本発明のＨＰＰＤをコードする少なくとも一つの核酸配列を含有することを特徴とするホスト植物細胞、種子またはホスト植物に関し、その際、本発明のＨＰＰＤは、イソキサゾール、ジケトニトリル、トリケトンまたはピラゾリネートのクラスのＨＰＰＤ阻害剤型除草剤、より顕著にはイソキサフルトール、テンボトリオン、メソトリオン、スルコトリオン、ピラスルホトール、ビシクロピロン、テフリルトリオン、トプラメゾン、２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−ＳＯ２ＣＨ３−４−ＣＦ３フェニル）プロパン−１，３−ジオンおよび２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−ＳＯ２ＣＨ３−４−２，３Ｃｌ２フェニル）プロパン−１，３−ジオン、より顕著にはテンボトリオン、メソトリオン、ジケトニトリル、ビシクロピロン、トプラメゾン、ピラゾレート、ベンゾフェナップ、スルコトリオン、テフリルトリオン、およびピラスルホトール、最も顕著にはテンボトリオン、メソトリオンおよびビシクロピロンに対してホスト植物の内因性ＨＰＰＤよりも感受性が低い。
【０１０７】
別の特定の態様では、本発明は、前記のように本発明のＨＰＰＤをコードする少なくとも一つの核酸配列に加えて、ＰＤＨ（プレフェナートデヒドロゲナーゼ）酵素をコードする核酸配列（US 2005/0257283）に作動可能に連結される、上記のような植物で発現可能なプロモーターを含むキメラ遺伝子を含有することを特徴とする植物細胞または植物に関する。
【０１０８】
本発明は、また、本発明のキメラＨＰＰＤ遺伝子を含む、トランスフォーメーションされた細胞を含有する植物、特にトランスフォーメーションされた細胞から再生された植物、およびその後代植物または種子に関する。再生は、任意の適切な方法によって得ることができ、その方法は、例えば上記参考文献に記載されているように種の性質に依存する。以下の特許および特許出願は、特に、植物細胞をトランスフォーメーションおよび植物を再生するための方法に関して引用することができる：米国特許第４，４５９，３５５号、米国特許第４，５３６，４７５号、米国特許第５，４６４，７６３号、米国特許第５，１７７，０１０号、米国特許第５，１８７，０７３号、EP 267,159 A1、EP 604 662 A1、EP 672 752 A1、米国特許第４，９４５，０５０号、米国特許第５，０３６，００６号、米国特許第５，１００，７９２号、米国特許第５，３７１，０１４号、米国特許第５，４７８，７４４号、米国特許第５，１７９，０２２号、米国特許第５，５６５，３４６号、米国特許第５，４８４，９５６号、米国特許第５，５０８，４６８号、米国特許第５，５３８，８７７号、米国特許第５，５５４，７９８号、米国特許第５，４８９，５２０号、米国特許第５，５１０，３１８号、米国特許第５，２０４，２５３号、米国特許第５，４０５，７６５号、EP 442 174 A1、EP 486 233 A1、EP 486 234 A1、EP 539 563 A1、EP 674 725 A1、国際公開公報第９１／０２０７１号および国際公開公報第９５／０６１２８号。
【０１０９】
本発明は、また、本発明のＨＰＰＤキメラ遺伝子を含むトランスジェニック植物を栽培および／または交雑することによって得られる上記トランスジェニック植物またはその部分、およびそのトランスジェニック植物の種子に関する。
【０１１０】
本発明は、また、本発明の植物、その部分、または種子から得られる粗挽き粉または油などの最終製品に関する。
【０１１１】
本発明にしたがって得ることができる、トランスフォーメーションされた植物は、コムギ、オオムギ、サトウキビ、イネ、タマネギ、およびコーンもしくはトウモロコシなどの単子葉植物型、またはタバコ、ダイズ、アルファルファ、Brassica sppなどの双子葉植物型、アブラナ、ワタ、テンサイ、クローバー、野菜などの植物のことがある。
【０１１２】
本発明は、ホスト生物、特に植物細胞または植物に前記と同義の少なくとも一つの核酸配列または一つのキメラ遺伝子を組み込むことによってそのような生物をトランスフォーメーションするための方法に関し、その際、専門家の文献、特に本出願に引用された参考文献に十分に記載されている任意の適切な既知の手段によって、例えば本発明によるベクターを使用することによって、トランスフォーメーションを得ることが可能である。
【０１１３】
本発明による一トランスフォーメーション法は、ＤＮＡが付着しているかまたはＤＮＡを含有する固体または液体粒子を細胞、プロトプラストまたは組織に衝突（bombard）させることを含む。別のトランスフォーメーション法は、植物中に導入するための手段として、Agrobacterium tumefaciens ＴｉプラスミドまたはAgrobacterium rhizogenes Ｒｉプラスミドに挿入されたキメラ遺伝子を使用することを含む。マイクロインジェクションもしくはエレクトロポレーション、またはさもなければＰＥＧを用いた直接遺伝子導入などの他の方法が使用されることがある。技術者は、えり抜きのホスト生物、特に植物細胞または植物をトランスフォーメーションするために適した任意の方法を選択することができる。例として、ダイズをトランスフォーメーションするための技法が、参照により本明細書に組み入れられるEP 1186666 A1に開示された実施例１〜３に広く記載されている。イネについて、Agrobacterium介在性トランスフォーメーション（Hiei et al., 1994 Plant J 6:271-282、およびHiei et al., 1997 Plant Mol Biol. 35:205-21、参照により本明細書に組み入れられる）、エレクトロポレーション（米国特許第５，６４１，６６４号および米国特許第５，６７９，５５８号、参照により本明細書に組み入れられる）、または衝突（Christou et al., 1991、Biotechnology 9:957、参照により本明細書に組み入れられる）を行うことができよう。単子葉植物植物、特にイネをトランスフォーメーションするために適した技法は、参照により本明細書に組み入れられる国際公開公報第９２／０９６９６号に記載されている。ワタについて、Agrobacterium介在性トランスフォーメーション（Gould J.H. and Magallanes-Cedeno M., 1998 Plant Molecular Biology reporter, 16:1-10およびZapata C., 1999, Theoretical Applied Genetics, 98(2):1432-2242、参照により本明細書に組み入れられる）、ポリブレンおよび／または処理介在性トランスフォーメーション（Sawahel W.A., 2001, - Plant Molecular Biology reporter, 19:377a-377f、参照により本明細書に組み入れられる）が記載されている。
【０１１４】
本発明の特定の一態様では、本発明のＨＰＰＤは、クロロプラストにターゲティングされる。これは、トランジットペプチドをコードする核酸配列を、本発明のＨＰＰＤタンパク質をコードする核酸配列と融合させて、上記融合タンパク質をコードする核酸を得ることによって行われることがある。または、本発明のＨＰＰＤは、クロロプラストゲノムなどのプラスチドのトランスフォーメーションを使用して、クロロプラストなどのプラスチド中に直接発現させることができる。適切な方法は、ＤＮＡをコーティングした固体粒子またはＤＮＡを含む液体粒子を植物細胞または組織に衝突させること、および本発明のタンパク質をコードする、導入された遺伝子を相同組換えによって組み込むことを含む。適切なベクターおよび選択系は、当業者に公知である。タバコ植物のクロロプラストゲノムへのかかる組み込みのために使用することのできる手段および方法の一例は、国際公開公報第０６／１０８８３０号に示され、その内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１１５】
本発明は、また、ＨＰＰＤ阻害剤に対する植物を得るための方法であって、その植物が前記のように本発明のキメラＨＰＰＤ遺伝子によってトランスフォーメーションされていることを特徴とする方法に関する。
【０１１６】
したがって本発明は、また、ＨＰＰＤ阻害剤に対して耐性の植物を得るための方法であって、その植物が、コード配列と、５’位および場合により３’位にホスト生物において機能可能な異種調節エレメントとを含む本発明のキメラＨＰＰＤ遺伝子を含有することを特徴とし、そのコード配列が、前記本発明のＨＰＰＤをコードする遺伝子を規定している少なくとも一つの核酸配列を含むことを特徴とする方法に関する。
【０１１７】
本発明の一態様では、上記方法におけるＨＰＰＤ阻害剤は、トリケトンまたはピラゾリネート除草剤、好ましくはテンボトリオン、メソトリオン、ビシクロピロン、テフリルトリオン、ピラスルホトール、ピラゾレート、ジケトニトリル、ベンゾフェナップ、またはスルコトリオン、特にテンボトリオンである。
【０１１８】
本発明によると、上記ＨＰＰＤ阻害剤に対して耐性の植物を得るための方法であって、本発明のキメラＨＰＰＤ遺伝子である第一の導入遺伝子と、ＰＤＨ（プレフェナートデヒドロゲナーゼ）酵素をコードする核酸に作動可能に連結される、植物で発現可能なプロモーターを含むキメラ遺伝子である第二の導入遺伝子とを含む植物が」得られることを特徴とする方法も提供される。そのような二つの導入遺伝子を含む植物は、一つの導入遺伝子によって植物をトランスフォーメーションすること、次に第二の導入遺伝子によってこのトランスジェニック植物を再トランスフォーメーションすることによって、または（同一または二つの異なるトランスフォーメーションＤＮＡまたはベクター中の）二つの導入遺伝子によって植物を同時にトランスフォーメーションすることによって、または当技術分野において周知のように第一の導入遺伝子を含む植物を第二の導入遺伝子を含む植物と交雑することによって得ることができる。
【０１１９】
本発明は、また、植物が植えられるもしくは種が蒔かれる圃場または植物性作物にＨＰＰＤ阻害剤、特に前記と同義のＨＰＰＤ阻害剤型除草剤を施用することによって、そのような圃場または植物性作物における雑草を選択的に除去するための、または雑草の発芽を予防するための方法であって、このＨＰＰＤ阻害剤型除草剤が、本発明によりトランスフォーメーションされた植物に、作物の播種前（以後、播種前施用と名付ける）、作物の出芽前（以後、出芽前施用と名付ける）、または作物の出芽後（以後、出芽後施用と名付ける）のいずれかで施用されることを特徴とする方法に関する。
【０１２０】
本発明は、また、本発明前記のトランスフォーメーションされた種子を含有する区域または圃場中で防除するための方法であって、圃場の前記区域に、本発明前記の本発明のＨＰＰＤ核酸またはキメラＨＰＰＤ遺伝子を含有する種子または植物に顕著に影響せずに、前記雑草に有毒なＨＰＰＤ阻害剤型除草剤の供与量を施用することを含む方法に関する。
【０１２１】
本発明は、また、本発明によるキメラ遺伝子を用いてトランスフォーメーションされた植物を栽培するための方法であって、前記植物を栽培するために適した圃場の区域中に本発明のキメラ遺伝子を含む種子を植えること、および雑草が存在する場合、前記圃場の前記区域に、ターゲットが上に定義されたＨＰＰＤである除草剤の、雑草に有毒な供与量を、前記トランスフォーメーションされた種子または前記トランスフォーメーションされた植物にあまり影響せずに施用すること、および次にそれらが所望の成熟工程に達した場合、栽培された植物または植物の部分を収穫すること、および適切な場合には収穫された植物から種子を分離することを含む方法に関する。
【０１２２】
上記方法において、ターゲットがＨＰＰＤ酵素である除草剤は、作物を播種する前、作物の出芽前、または作物の出芽後のいずれかに本発明により施用することができる。
【０１２３】
本発明は、また、油、特にダイズ、コーンもしくはワタの油、または粗挽き粉を得るための工程であって、本発明のＨＰＰＤタンパク質を発現している作物、特にダイズ作物を成長させること、場合によりそのような作物をＨＰＰＤ阻害剤型除草剤で処理すること、穀粒を収穫すること、および穀粒を粉砕して粗挽き粉を製造し、油を抽出することを含む工程に関する。また、本発明のキメラ遺伝子を含む、全粒、破砕物または粉砕物のいずれかの種子または穀粒は、本発明の一部である。
【０１２４】
したがって本発明は、油または粗挽き粉を得るための方法であって、上記のトランスフォーメーションされた植物を成長させること、場合によりそのような植物をＨＰＰＤ阻害剤型除草剤で処理すること、穀粒を収穫すること、および穀粒を粉砕して粗挽き粉を製造し油を抽出することを含む方法に関する。
【０１２５】
本発明にさらに提供されるのは、イソキサフルトール、テンボトリオン、メソトリオン、ピラスルホトール、スルコトリオン、ビシクロピロン、テフリルトリオン、トプラメゾン、２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−メチルスルホニル−４−トリフルオロメチルフェニル）−プロパン−１，３−ジオンおよび２−シアノ−１−［４−（メチルスルホニル）−２−トリフルオロメチルフェニル］−３−（１−メチルシクロプロピル）プロパン−１，３−ジオンより選択されるＨＰＰＤ阻害剤型除草剤を必要とする上記方法である。
【０１２６】
同様に本明細書に提供されるのは、テンボトリオン、スルコトリオンおよびメソトリオンなどのトリケトンのクラス、またはピラスルホトールおよびトプラメゾンなどのピラゾリネートのクラスのＨＰＰＤ阻害剤型除草剤、特にテンボトリオン、スルコトリオン、トプラメゾン、ビシクロピロン、テフリルトリオンおよびメソトリオンより選択されるＨＰＰＤ阻害剤型除草剤、より顕著にはテンボトリオンを必要とする、本発明の上記方法である。
【０１２７】
本発明の意味のうち、「除草剤」は、それ自体で除草活性な物質または例えば、その活性を増加させる薬剤（相乗的薬剤）またはその活性を限定する薬剤（薬害軽減剤）などの、その効力を変化させる添加剤と組み合わされる、そのような物質であると理解される。もちろん、それらを実際に施用するために、上記除草剤が農芸化学において慣例的に採用される処方佐剤と共に本質的に公知の方法で組み合わされることも了解されたい。
【０１２８】
テンボトリオン、スルコトリオンおよびメソトリオンなどのトリケトンのクラス、またはピラスルホトールおよびトプラメゾンなどのピラゾリネートのクラスのような、特にテンボトリオン、スルコトリオン、トプラメゾン、ビシクロピロン、テフリルトリオンおよびメソトリオンより選択されるＨＰＰＤ阻害剤型除草剤、より顕著にはテンボトリオンは、広範囲の経済的に重要な単子葉および双子葉一年生有害植物に対して顕著な除草活性を有する。根茎、台木または他の多年生器官から苗条を生成し、防除が困難な多年生有害植物に対しても、活性物質は効率的に作用する。
【０１２９】
したがって本発明は、また、望まれない植物を防除する方法、または本発明によるＨＰＰＤを含む植物作物における植物の成長を調節するための方法に関し、その際、テンボトリオン、スルコトリオンおよびメソトリオンなどのトリケトンのクラス、またはピラスルホトールおよびトプラメゾンなどのピラゾリネートのクラスの、特にテンボトリオン、スルコトリオン、トプラメゾン、ビシクロピロン、テフリルトリオンおよびメソトリオンより選択される一つまたは複数のＨＰＰＤ阻害剤型除草剤、より顕著にはテンボトリオンが、植物（例えば単子葉植物もしくは双子葉植物の雑草などの有害植物または望まれない作物）、種子（例えば穀粒、種子、または塊茎もしくは芽を有する苗条部分などの栄養繁殖体）または植物が成長する区域（例えば栽培区域）に施用される。この状況で、テンボトリオン、スルコトリオンおよびメソトリオンなどのトリケトンのクラス、またはピラスルホトールおよびトプラメゾンなどのピラゾリネートのクラスの、特にテンボトリオン、スルコトリオン、トプラメゾン、ビシクロピロン、テフリルトリオンおよびメソトリオンより選択されるＨＰＰＤ阻害剤型除草剤、より顕著にはテンボトリオンが、例えば播種前（適切な場合、土壌に組み入れることによっても）、出芽前または出芽後に施用することができる。テンボトリオン、スルコトリオンおよびメソトリオンなどのトリケトンのクラス、またはピラスルホトールおよびトプラメゾンなどのピラゾリネートのクラスの、特にテンボトリオン、スルコトリオン、トプラメゾン、ビシクロピロン、テフリルトリオンおよびメソトリオンより選択されるＨＰＰＤ阻害剤型除草剤、より顕著にはテンボトリオンを用いて防除できる単子葉植物および双子葉植物の雑草の個別の代表例について本明細書に言及するが、この言及を、一定の種だけへの限定として意図することはない：
属：Aegilops、Agropyron、Agrostis、Alopecurus、Apera、Avena、Brachiaria、Bromus、Cenchrus、Commelina、Cynodon、Cyperus、Dactyloctenium、Digitaria、Echinochloa、Eleocharis、Eleusine、Eragrostis、Eriochloa、Festuca、Fimbristylis、Heteranthera、Imperata、Ischaemum、Leptochloa、Lolium、Monochoria、Panicum、Paspalum、Phalaris、Phleum、Poa、Rottboellia、Sagittaria、Scirpus、Setaria、Sorghumの単子葉有害植物。
属：Abutilon、Amaranthus、Ambrosia、Anoda、Anthemis、Aphanes、Artemisia、Atriplex、Bellis、Bidens、Capsella、Carduus、Cassia、Centaurea、Chenopodium、Cirsium、Convolvulus、Datura、Desmodium、Emex、Erysimum、Euphorbia、Galeopsis、Galinsoga、Galium、Hibiscus、Ipomoea、Kochia、Lamium、Lepidium、Lindernia、Matricaria、Mentha、Mercurialis、Mullugo、Myosotis、Papaver、Pharbitis、Plantago、Polygonum、Portulaca、Ranunculus、Raphanus、Rorippa、Rotala、Rumex、Salsola、Senecio、Sesbania、Sida、Sinapis、Solanum、Sonchus、Sphenoclea、Stellaria、Taraxacum、Thlaspi、Trifolium、Urtica、Veronica、Viola、Xanthiumの双子葉雑草。
【０１３０】
本発明によるＨＰＰＤタンパク質、ＤＮＡまたはキメラ遺伝子を含み、ＨＰＰＤ阻害剤型除草剤と異なる除草剤に対してもう一つのさらなる除草剤耐性も示すことがある本発明によるトランスジェニック作物において、テンボトリオン、スルコトリオンおよびメソトリオンなどのトリケトンのクラス、またはピラスルホトールおよびトプラメゾンなどのピラゾリネートのクラスの、特にテンボトリオン、スルコトリオン、トプラメゾン、ビシクロピロン、テフリルトリオンおよびメソトリオンより選択されるＨＰＰＤ阻害剤型除草剤、より顕著にはテンボトリオンを、有用植物および観賞植物、例えばコムギ、オオムギ、ライムギ、エンバク、モロコシおよび雑穀、イネおよびトウモロコシなどの穀類、またはテンサイ、ワタ、ダイズ、アブラナ、ジャガイモ、トマト、エンドウおよび他の野菜である他の作物の経済的に重要なトランスジェニック作物に使用することが好ましい。
【０１３１】
本発明に記載されたようなＨＰＰＤ阻害剤型除草剤に対する耐性以外の植物の性質に関する限り、現存する植物に比べて改変された性質を有する新規な植物を作製する従来方法は、例えば、伝統的な育種方法および突然変異体の作製である。または、改変された性質を有する新規な植物は、リコンビナント方法（例えば、EP-A-0221044 A1、EP-A-0131624 A1参照）の助けを借りて作製することができる。例えば、以下がいくつかの場合で記載されている：
−  植物中で合成されたデンプンを改変するための作物のリコンビナント改変（例えば国際公開公報第９２／１１３７６号、国際公開公報第９２／１４８２７号、国際公開公報第９１／１９８０６号）、
−  グルホシネート型（例えば、EP-A-0242236、EP-A-242246参照）またはグリフォセート型（国際公開公報第９２／００３７７号）またはスルホニル尿素型（EP-A-0257993、US-A-5013659）の一定の除草剤に耐性のトランスジェニック作物、
−  植物をある病害虫に耐性にするBacillus thuringiensis毒素（Ｂｔ毒素）を生成可能なトランスジェニック作物、例えばコーン、ワタもしくはダイズ、またはその雑種もしくは突然変異体（EP-A-0193259）、
−  改変された脂肪酸組成を有するトランスジェニック作物（国際公開公報第９１／１３９７２号）、
−  耐病性増加を引き起こす新規な成分または二次代謝物、例えば新規なフィトアレキシンを有する遺伝的に改変された作物（EPA 309862、EPA0464461）、
−  より高い収量およびより高いストレス耐性を備える、減少した光呼吸を有する遺伝的に改変された植物（EPA 0305398）、
−  薬学的または診断的に重要なタンパク質を生成するトランスジェニック作物（「分子ファーミング（molecular pharming）」）、
−  より高い収量またはより良好な品質によって区別されるトランスジェニック作物、
−  上記の新規な性質の組み合わせなどの新規な性質の組み合わせによって区別されるトランスジェニック作物（「遺伝子スタッキング（gene stacking）」）。
【０１３２】
改変された性質を有する新規なトランスジェニック植物を作製できる多数の分子生物学的技法が、原則として公知である；例えば、I. Potrykus and G. Spangenberg (eds.) Gene Transfer to Plants, Springer Lab Manual (1995), Springer Verlag Berlin, Heidelberg、or Christou, "Trends in Plant Science" 1 (1996) 423-431）を参照されたい。
【０１３３】
そのようなリコンビナント操作を実施するために、プラスミドに核酸分子を導入することが可能であり、そのことがＤＮＡ配列の組換えによる突然変異誘発または配列改変を可能にする。例えば、標準法の助けを借りて塩基置換を実施することができるか、部分配列を除去することができるか、または天然もしくは合成配列が付加されることがある。ＤＮＡフラグメントを相互に連結するために、アダプターまたはリンカーをフラグメントに付加することが可能である；例えば、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold   Spring Harbor, NY;またはWinnacker "Gene und Klone", VCH Weinheim 2. ed., 1996を参照されたい。
【０１３４】
例えば少なくとも一つの対応するアンチセンスＲＮＡ、共抑制効果を達成するためのセンスＲＮＡ、もしくは二本鎖サイレンシングＲＮＡ分子（ＲＮＡｉ）を形成するアンチセンスＲＮＡとセンスＲＮＡの両方の組み合わせの発現によって、または上記遺伝子産物の転写物を特異的に切断する、対応して構築された少なくとも一つのリボザイムの発現によって、遺伝子産物に対して低下した活性を有する植物細胞の作製を果たすことができる。これを行うために、第一に、存在しうる任意のフランキング配列を含めて遺伝子産物の全てのコード配列を含むＤＮＡ分子、さもなければコード配列の部分だけを含むＤＮＡ分子（細胞内でアンチセンス効果を生じるためにこれらの部分が十分に長いことが必要である）を使用することが可能である。遺伝子産物のコード配列と高度の相同性を有するが、完全には同一でないＤＮＡ配列を使用することも可能である。
【０１３５】
植物中に核酸分子を発現させる場合、得られたタンパク質は、植物細胞の任意の区画に局在することがある。しかしながら、特定の区画への局在を達成するために、例えば、特定の区画における局在を確実にするＤＮＡ配列にコード領域を連結することが可能である。そのような配列は、技術者に公知である（例えば、Braun et al., EMBO J. 11 (1992), 3219-3227; Wolter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 846-850; Sonnewald et al., Plant J. 1 (1991), 95-106を参照されたい）。とはいえ、核酸分子は、また、植物細胞のオルガネラ中に発現されることがある。
【０１３６】
トランスジェニック植物細胞を公知の技法によって再生して、インタクトな植物を得ることができる。原則として、トランスジェニック植物は、単子葉植物または双子葉植物を含めた、任意の植物種の植物であってもよい。
【０１３７】
したがって、本発明のキメラＨＰＰＤ遺伝子に加えて、相同（＝天然）の遺伝子もしくは遺伝子配列の過剰発現、抑制もしくは阻害、または異種（＝外来）の遺伝子もしくは遺伝子配列の発現の結果として改変された性質を有するトランスジェニック植物を得ることができる。
【０１３８】
本発明の植物、植物細胞または種子に関して、例えば２，４−Ｄもしくはジカンバなどの成長レギュレーターに対して、または必須植物酵素、例えばアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）、ＥＰＳＰシンターゼ、もしくはグルタミンシンターゼ（ＧＳ）を阻害する除草剤に対して、またはスルホニル尿素、グリフォセート、もしくはグルホシネートおよび類似の活性物質の群からの除草剤に対しても耐性のトランスジェニック作物にテンボトリオン、スルコトリオンおよびメソトリオンなどのトリケトンのクラス、またはピラスルホトールおよびトプラメゾンなどのピラゾリネートのクラスの、特にテンボトリオン、スルコトリオン、トプラメゾン、ビシクロピロン、テフリルトリオンおよびメソトリオンより選択されるＨＰＰＤ阻害剤型除草剤、より顕著にはテンボトリオンを採用することが好ましい。
【０１３９】
したがって本発明は、また、テンボトリオン、スルコトリオンおよびメソトリオンなどのトリケトンのクラス、イソキサフルトールなどのイソキサゾールのクラス、またはピラスルホトールおよびトプラメゾンなどのピラゾリネートのクラスの、特にテンボトリオン、スルコトリオン、トプラメゾン、ビシクロピロン、テフリルトリオンおよびメソトリオンより選択されるＨＰＰＤ阻害剤型除草剤、より顕著にはテンボトリオンに対する耐性に加えて、第二以上の除草剤耐性を含むトランスジェニック作物にも及ぶ、有害植物（すなわち雑草）を防除するための本発明によるこのＨＰＰＤ耐性植物に施用される除草剤の使用に関する。
【０１４０】
テンボトリオン、スルコトリオンおよびメソトリオンなどのトリケトンのクラス、またはピラスルホトールおよびトプラメゾンなどのピラゾリネートのクラスの、特にテンボトリオン、スルコトリオン、トプラメゾン、ビシクロピロン、テフリルトリオンおよびメソトリオンより選択されるＨＰＰＤ阻害剤型除草剤、より顕著にはテンボトリオンは、水和剤、乳剤、散布液、粉剤または粒剤の形態で慣例的な調製物に採用することができる。
【０１４１】
テンボトリオン、スルコトリオンおよびメソトリオンなどのトリケトンのクラス、またはピラスルホトールおよびトプラメゾンなどのピラゾリネートのクラスの、特にテンボトリオン、スルコトリオン、トプラメゾン、ビシクロピロン、テフリルトリオンおよびメソトリオンより選択されるＨＰＰＤ阻害剤型除草剤、より顕著にはテンボトリオンは、一般的な生物学的および／または物理化学的パラメーターに応じて様々な方法で製剤化することができる。可能性のある製剤の例は：水和剤（ＷＰ）、水溶剤（ＳＰ）、液剤、乳剤（ＥＣ）、水中油型およびび油中水型エマルション製剤などのエマルション製剤（ＥＷ）、スプレー散布液、懸濁剤（ＳＣ）、油系または水系分散剤（dispersions）、油剤、カプセル懸濁剤（capsule suspensions）（ＣＳ）、粉剤（ＤＰ）、種子粉衣製品、散布施用および土壌施用用の粒剤、微粒剤、スプレー粒剤、コーティング粒剤および吸着粒剤、顆粒水和剤（ＷＧ）、水溶性粒剤（ＳＧ）の形態の粒剤（ＧＲ）、ＵＬＶ製剤、マイクロカプセルおよびワックスである。
【０１４２】
これら個別の種類の製剤は、原則として公知であり、例えば、Winnacker-Kuechler, "Chemische Technologie" [Chemical technology], volume 7, C. Hanser Verlag Munich, 4th Ed. 1986; Wade van Valkenburg, "Pesticide Formulations", Marcel Dekker, N.Y., 1973; K. Martens, "Spray Drying" Handbook, 3rd Ed. 1979, G. Goodwin Ltd. Londonに記載されている。
【０１４３】
不活性物質、界面活性剤、溶媒およびさらなる添加剤などの必要とされる製剤佐剤も公知であり、例えば、Watkins, "Handbook of Insecticide Dust Diluents and Carriers", 2nd Ed., Darland Books, Caldwell N.J., H.v. Olphen, "Introduction to Clay Colloid Chemistry"; 2nd Ed., J. Wiley & Sons, N.Y.; C. Marsden, "Solvents Guide"; 2nd Ed., Interscience, N.Y. 1963; McCutcheon's "Detergents and Emulsifiers Annual", MC Publ. Corp., Ridgewood N.J.; Sisley and Wood, "Encyclopedia of Surface Active Agents", Chem. Publ. Co. Inc., N.Y. 1964; Schoenfeldt, "Grenzflaechenaktive Aethylenoxidaddukte" [Interface-active ethylene oxide adducts], Wiss. Verlagsgesell., Stuttgart1976; Winnacker-Kuechler, "Chemische Technologie" [Chemical technology], volume 7, C. Hanser Verlag Munich, 4th Ed. 1986に記載されている。
【０１４４】
これらの製剤に基づき、例えば殺虫剤、殺ダニ剤、除草剤、殺真菌剤などの、他の農薬的に活性な物質との組み合わせ、および薬害軽減剤、肥料および／または成長レギュレーターとの組み合わせを、例えばレディーミックスまたはタンクミックスの形態で調製することも可能である。
【０１４５】
水和剤は、水中で均一に分散させることができ、活性物質に加えて、希釈剤または不活性化物質の他にイオン性および／または非イオン性界面活性剤（湿潤剤、分散剤）、例えばポリオキシエチル化アルキルフェノール、ポリオキシエチル化脂肪族アルコール、ポリオキシエチル化脂肪族アミン、脂肪族アルコールポリグリコールエーテルスルフェート、アルカンスルホン酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、リグノスルホン酸ナトリウム、２，２’−ジナフチルメタン−６，６’−ジスルホン酸ナトリウム、ジブチルナフタレンスルホン酸ナトリウム、またはさもなければオレオイルメチルタウリン酸ナトリウム（sodium oleoylmethyltaurinate）も含む調製物である。水和剤を調製するために、除草活性物質は、ハンマーミル、ブロワーミルおよびエアジェットミルなどの慣用の装置で細かく粉砕され、同時にまたは続いてのいずれかで製剤用佐剤と混合される。
【０１４６】
乳剤は、有機溶媒、例えばブタノール、シクロヘキサノン、ジメチルホルムアミド、キシレンまたはさもなければより高い沸点の芳香族化合物または炭化水素または有機溶媒混合物中に１種または複数主jのイオン性および／または非イオン性界面活性剤（乳化剤）を添加して活性物質を溶解することによって調製される。使用されることのある乳化剤の例は：ドデシルベンゼンスルホン酸カルシウムなどのアルキルアリールスルホン酸カルシウム、または脂肪酸ポリグリコールエステル、アルキルアリールポリグリコールエーテル、脂肪族アルコールポリグリコールエーテル、プロピレンオキシド／エチレンオキシド縮合物、アルキルポリエーテル、ソルビタンエステル、例えば、ソルビタン脂肪酸エステルまたはポリオキシエチレンソルビタンエステル、例えば、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルなどの非イオン性乳化剤である。
【０１４７】
粉剤は、活性物質を、例えばタルク、カオリン、ベントナイトおよびパイロフィライトなどの天然粘土、または珪藻土などの微粉化された固体物質と一緒に活性物質を粉砕することによって得られる。
【０１４８】
懸濁剤は、水性または油性のことがある。それらは、適切であれば例えば他の剤形の場合に上に既に挙げた界面活性剤を添加して、例えば市販のビーズミルにより湿式粉砕することによって調製することができる。
【０１４９】
エマルション製剤、例えば水中油型エマルション製剤（ＥＷ）は、水性有機溶媒と、適切であれば例えば他の剤形について上に既に指摘されたような界面活性剤とを使用して、例えば撹拌機、コロイドミルおよび／またはスタティックミキサーによって調製することができる。
【０１５０】
粒剤は、吸着性の粒状不活性物質に活性物質をスプレー散布することによって、または展着剤、例えばポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウムもしくはさもなければ鉱物油の助けを借りて砂、カオリナイトなどの担体もしくは粒状不活性物質の表面に活性物質濃縮物を塗布することのいずれかによって調製することができる。また、適切な活性物質を、粒状肥料の製造について慣例的な方法で、所望であれば肥料との混合物として、造粒することができる。
【０１５１】
顆粒水和剤は、一般に固体不活性物質なしにスプレードライ、流動床造粒、ディスク造粒、高速撹拌機を用いた混合、および押し出しなどの慣例的な方法によって調製される。
【０１５２】
ディスク粒剤、流動床粒剤、押出機粒剤およびスプレー粒剤を調製するには、例えば、"Spray-Drying Handbook" 3rd ed. 1979, G. Goodwin Ltd., London; J.E. Browning, "Agglomeration", Chemical and Engineering 1967, pages 147 et seq.; "Perry's Chemical Engineer's Handbook", 5th Ed., McGraw-Hill, New York 1973, p. 8-57の方法を参照されたい。
【０１５３】
作物保護薬品の製剤化に関するさらなる詳細については、例えばG.C. Klingman, "Weed Control as a Science", John Wiley and Sons, Inc., New York, 1961, pages 81-96およびJ.D. Freyer, S.A. Evans, "Weed Control Handbook", 5th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1968, pages 101-103を参照されたい。
【０１５４】
一般に、農薬製剤は、本発明の化合物を０．１〜９９重量％、特に０．１〜９５重量％含む。水和剤では、活性物質濃度は、例えば約１０〜９０重量％であって、１００重量％までの残りは慣例の製剤成分から構成される。乳剤の場合、活性物質濃度は、約１〜９０、好ましくは５〜８０重量％のことがある。粉剤の形態の製剤は、１〜３０重量％の活性物質、好ましくはほとんどの場合５〜２０重量％の活性物質を含み、散布液は、約０．０５〜８０、好ましくは２〜５０重量％の活性物質を含む。顆粒水和剤の場合、活性物質含量は、活性化合物が液体または固体形態であるかどうか、そして使用される造粒佐剤、賦形剤などに部分的に依存する。顆粒水和剤の場合、例えば、活性物質含量は、１から９５重量％の間、好ましくは１０から８０重量％の間である。
【０１５５】
加えて、言及された活性物質製剤は、適切であれば、それぞれの場合に展着剤、湿潤剤、分散剤、乳化剤、浸透剤（penetration）、保存料、凍結防止剤、溶媒、増量剤、担体、着色料、消泡剤、蒸発抑制剤、ならびにｐＨおよび粘度調節剤などの慣用の佐剤を含む。
【０１５６】
これらの製剤に基づき、テンボトリオン、スルコトリオンおよびメソトリオンなどのトリケトンのクラス、またはピラスルホトールおよびトプラメゾンなどのピラゾリネートのクラスの、特に、テンボトリオン、スルコトリオン、トプラメゾン、ビシクロピロン、テフリルトリオンおよびメソトリオンより選択されるＨＰＰＤ阻害剤型除草剤、より顕著にはテンボトリオンと、例えば、殺虫剤、殺ダニ剤、除草剤、殺真菌剤などの他の農薬活性物質ならびに薬害軽減剤、肥料および／または成長レギュレーターとの組み合わせを、例えば本発明によるＨＰＰＤ耐性植物に施用されるべきレディーミックスまたはタンクミックスの形態で調製することも可能である。
【０１５７】
混合製剤またはタンク混合物中にテンボトリオン、スルコトリオンおよびメソトリオンなどのトリケトンのクラス、またはピラスルホトールおよびトプラメゾンなどのピラゾリネートのクラスの、特にテンボトリオン、スルコトリオン、トプラメゾン、ビシクロピロン、テフリルトリオンおよびメソトリオンより選択されるＨＰＰＤ阻害剤型除草剤、より顕著にはテンボトリオンと組み合わせて、本発明によるＨＰＰＤ耐性植物に施用することのできる活性物質は、例えば、Weed Research 26 (1986) 441-445または"The Pesticide Manual", 14th edition, The British Crop Protection Council and the Royal Soc. of Chemistry, 2003およびその中で引用された文献に記載されているように、例えば、アセト乳酸シンターゼ、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、セルロースシンターゼ、エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ、グルタミンシンセターゼ、ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ、フィトエンデサチュラーゼ、光化学系Ｉ、光化学系ＩＩ、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの阻害に基づく公知の活性物質である。本発明による化合物と組み合せることができる公知の除草剤または植物成長レギュレーターは、例えば以下の活性物質（それらの化合物は、国際標準化機構（ＩＳＯ）による一般名により、または化学名により、適切であればコード番号と共に示される）であり、それらは常に、酸、塩、エステルならびに立体異性体および光学異性体などの異性体などの全ての使用形態を含む。これに関連して、一つの使用形態および場合によってはいくつかの使用形態も例として挙げられる：
アセトクロール、アシベンゾラル、アシベンゾラル−Ｓ−メチル、アシフルオルフェン、アシフルオルフェン−ナトリウム、アクロニフェン、アラクロール、アリドクロル、アロキシジム、アロキシジム−ナトリウム、アメトリン、アミカルバゾン、アミドクロル、アミドスルフロン、アミノシクロピラクロル、アミノピラリド、アミトロール、スルファミン酸アンモニウム、アンシミドール、アニロホス、アシュラム、アトラジン、アザフェニジン、アジムスルフロン、アジプロトリン、ＢＡＨ−０４３、ＢＡＳ−１４０Ｈ、ＢＡＳ−６９３Ｈ、ＢＡＳ−７１４Ｈ、ＢＡＳ−７６２Ｈ、ＢＡＳ−７７６Ｈ、ＢＡＳ−８００Ｈ、ベフルブタミド、ベナゾリン、ベナゾリン−エチル、ベンカルバゾン、ベンフルラリン、ベンフレセート、ベンスリド、ベンスルフロン−メチル、ベンタゾン（bentazone）、ベンズフェンジゾン、ベンゾビシクロン、ベンゾフェナップ、ベンゾフルオル、ベンゾイルプロップ、ビフェノックス、ビラナホス、ビラナホス−ナトリウム、ビスピリバック、ビスピリバック−ナトリウム、ブロマシル、ブロモブチド、ブロモフェノキシム、ブロモキシニル、ブロムロン（bromuron）、ブミナホス、ブソキシノン（busoxinone）、ブタクロール、ブタフェナシル、ブタミホス、ブテナクロール、ブトルアリン、ブトロキシジム、ブチレート、カフェンストロール、カルベタミド、カルフェントラゾン、カルフェントラゾン−エチル、クロメトキシフェン、クロランベン、クロラジホップ、クロラジホップ−ブチル、クロルブロムロン、クロルブファム、クロルフェナック、クロルフェナック−ナトリウム、クロルフェンプロップ、クロルフルレノール、クロルフルレノール−メチル、クロリダゾン、クロリムロン、クロリムロン−エチル、クロルメコート−クロリド、クロルニトロフェン、クロロフタリム、クロルタール−ジメチル、クロロトルロン、クロルスルフロン、シニドン、シニドン−エチル、シンメチリン、シノスルフロン、クレトジム、クロジナホップ、クロジナホップ−プロパルギル、クロフェンセット、クロマゾン、クロメプロップ、クロプロップ、クロピラリド、クロランスラム、クロランスラム−メチル、クミルロン、シアナミド、シアナジン、シクラニリド、シクロエート、シクロスルファムロン、シクロキシジム、シクルロン、シハロホップ、シハロホップ−ブチル、シペルコート、シプラジン、シプラゾール、２，４−Ｄ、２，４−ＤＢ、ダイムロン（daimuron/dymron）、ダラポン、ダミノジッド、ダゾメット、ｎ−デカノール、デスメディファム、デスメトリン、デトシル−ピラゾレート（ＤＴＰ）、ジアレート、ジカンバ、ジクロベニル、ジクロルプロップ、ジクロルプロップ−Ｐ、ジクロホップ、ジクロホップ−メチル、ジクロホップ−Ｐ−メチル、ジクロスラム、ジエタチル、ジエタチル−エチル、ジフェノキスロン、ジフェンゾコート、ジフルフェニカン、ジフルフェンゾピル、ジフルフェンゾピル−ナトリウム、ジメフロン、ジケグラック−ナトリウム、ジメフロン、ジメピペレート、ジメタクロル、ジメタメトリン、ジメテナミド、ジメテナミド−Ｐ、ジメチピン、ジメトラスルフロン、ジニトラミン、ジノセブ、ジノテルブ、ジフェナミド、ジプロペトリン、ジクワット、ジクワット−ジブロミド、ジチオピル、ジウロン、ＤＮＯＣ、エグリナジン−エチル、エンドタール、ＥＰＴＣ、エスロプロカルブ、エタルフルラリン、エタメトスルフルロン−メチル、エテホン、エチジムロン、エチオジン、エトフメセート、エトキシフェン、エトキシフェン−エチル、エトキシスルフロン、エトベンザニド、Ｆ−５３３１、すなわちＮ−［２−クロロ−４−フルオロ−５−［４−（３−フルオロ−プロピル）−４，５−ジヒドロ−５−オキソ−１Ｈ−テトラゾール−１−イル］−フェニル］エタンスルホンアミド、フェノプロップ、フェノキサプロップ、フェノキサプロップ−Ｐ、フェノキサプロップ−エチル、フェノキサプロップ−Ｐ−エチル、フェントラザミド、フェニュロン、フランプロップ、フランプロップ−Ｍ−イソプロピル、フランプロップ−Ｍ−メチル、フラザスルフロン、フロラスラム、フルアジホップ、フルアジホップ−Ｐ、フルアジホップ−ブチル、フルアジホップ−Ｐ−ブチル、フルアゾレート、フルカルバゾン、フルカルバゾン−ナトリウム、フルセトスルフロン、フルクロラリン、フルフェナセット（チアフルアミド）、フルフェンピル、フルフェンピル−エチル、フルメトラリン、フルメツラム、フルミクロラック、フルミクロラック−ペンチル、フルミオキサジン、フルミプロピン、フルオメツロン、フロロジフェン、フルオログリコフェン、フルオログリコフェン−エチル、フルポキサム、フルプロパシル、フルプロパネート、フルピルスルフロン、フルピルスルフロン−メチル−ナトリウム、フルレノール、フルレノール−ブチル、フルリドン、フルロクロリドン、フルロキシピル、フルロキシピル−メプチル、フルルプリミドール、フルルタモン、フルチアセット、フルチアセット−メチル、フルチアミド、ホメサフェン、フォラムスルフロン、ホルクロルフェニュロン、ホサミン、フリロキシフェン、ジベレリン酸、グルホシネート、Ｌ−グルホシネート、Ｌ−グルホシネート−アンモニウム、グルホシネート−アンモニウム、グリフォセート、グリフォセート−イソプロピルアンモニウム、Ｈ−９２０１、ハロサフェン、ハロスルフロン、ハロスルフロン−メチル、ハロキシホップ、ハロキシホップ−Ｐ、ハロキシホップ−エトキシエチル、ハロキシホップ−Ｐ−エトキシエチル、ハロキシホップ−メチル、ハロキシホップ−Ｐ−メチル、ヘキサジノン、ＨＮＰＣ−９９０８、ＨＯＫ−２０１、ＨＷ−０２、イマザメタベンズ、イマザメタベンズ−メチル、イマザモックス、イマザピック、イマザピル、イマザキン、イマゼタピル、イマゾスルフロン、イナベンフィド、インダノファン、インドール酢酸（ＩＡＡ）、４−インドール−３−イル酪酸（ＩＢＡ）、ヨードスルフロン、ヨードスルフロン−メチル−ナトリウム、アイオキシニル、イソカルバミド、イソプロパリン、イソプロツロン、イソウロン、イソキサベン、イソキサクロルトール、イソキサフルトール、イソキサピリホップ、ＫＵＨ−０４３、ＫＵＨ−０７１、カルブチレート、ケトスプラドックス（ketospiradox）、ラクトフェン、レナシル、リニュロン、マレイン酸ヒドラジド、ＭＣＰＡ、ＭＣＰＢ、ＭＣＰＢ−メチル、−エチルおよび−ナトリウム、メコプロップ、メコプロップ−ナトリウム、メコプロップ−ブトチル（butotyl）、メコプロップ−Ｐ−ブトチル、メコプロップ−Ｐ−ジメチルアンモニウム、メコプロップ−Ｐ−２−エチルヘキシル、メコプロップ−Ｐ−カリウム、メフェナセット、メフルイジド、メピコート−クロリド、メソスルフロン、メソスルフロン−メチル、メタベンズチアズロン、メタム、メタミホップ、メタミトロン、メタザクロール、メタゾール、メトキシフェノン、メチルダイムロン、１−メチルシクロプロペン、メチルイソチオシアネート、メトベンズロン、メトベンズロン、メトブロムロン、メトラクロール、Ｓ−メトラクロール、メトスラム、メトキスロン、メトリブジン、メトスルフロン、メトスルフロン−メチル、モリネート、モナリッド、モノカルバミド、モノカルバミド二水素硫酸塩、モノリニュロン、モノスルフロン、モニュロン、ＭＴ１２８、ＭＴ−５９５０、すなわちＮ−［３−クロロ−４−（１−メチルエチル）−フェニル］−２−メチルペンタンアミド、ＮＧＧＣ−０１１、ナプロアニリド、ナプロパミド、ナプタラム、ＮＣ−３１０、すなわち４−（２，４−ジクロロベンゾイル）−１−メチル−５−ベンジルオキシピラゾール、ネブロン、ニコスルフロン、ニピラクロフェン、ニトラリン、ニトロフェン、ナトリウム−ニトロフェノレート（異性体混合物）、ニトロフルオルフェン、ノナン酸、ノルフルラゾン、オルベンカルブ、オルトスルファムロン、オリザリン、オキサジアルギル、オキサジアゾン、オキサスルフロン、オキサジクロメホン、オキシフローフェン、パクロブトラゾール、パラコート、パラコートジクロリド、ペラルゴン酸（ノナン酸）、ペンディメタリン、ペンドラリン（pendralin）、ペノキススラム、ペンタノクロール、ペントキサゾン、ペルフルイドン、ペトキサミド、フェニソファム、フェンメディファム、フェンメディファム−エチル、ピクロラム、ピコリナフェン、ピノキサデン、ピペロホス、ピリフェノップ（pirifenop）、ピリフェノップ−ブチル、プレチラクロール、プリミスルフロン、プリミスルフロン−メチル、プロベナゾール、プロフルアゾール、プロシアジン、プロジアミン、プリフルラリン（prifluraline）、プロホキシジム、プロヘキサジオン、プロヘキサジオン−カルシウム、プロヒドロジャスモン（prohydrojasmone）、プロメトン、プロメトリン、プロパクロール、プロパニル、プロパキザホップ、プロパジン、プロファム、プロピソクロール、プロポキシカルバゾン、プロポキシカルバゾン−ナトリウム、プロピザミド、プロスルファリン、プロスルホカルブ、プロスルフロン、プリナクロール、ピラクロニル、ピラフルフェン、ピラフルフェン−エチル、ピラゾリネートピラゾレート（ピラゾレート）、ピラゾスルフロン−エチル、ピラゾキシフェン、ピリバムベンズ（pyribambenz）、ピリバムベンズ−イソプロピル、ピリベンゾキシム、ピリブチカルブ、ピリダフォル、ピリデート、ピリフタリド、ピリミノバック、ピリミノバック−メチル、ピリミスルファン、ピリチオバック、ピリチオバック−ナトリウム、ピロキサスルホン、ピロキススラム、キンクロラック、キンメラック、キノクラミン、キザロホップ、キザロホップ−エチル、キザロホップ−Ｐ、キザロホップ−Ｐ−エチル、キザロホップ−Ｐ−テフリル、リムスルフロン、サフルフェナシル、セクブメトン、セトキシジム、シデュロン、シマジン、シメトリン、ＳＮ−１０６２７９、スルファレート（ＣＤＥＣ）、スルフェントラゾン、スルホメツロン、スルホメツロン−メチル、スルホセート（グリフォセート−トリメシウム）、スルホスルフロン、ＳＹＮ−５２３、ＳＹＰ−２４９、ＳＹＰ−２９８、ＳＹＰ−３００、テブタム、テブチウロン、テクナゼン、テプラロキシジム、ターバシル、テルブカルブ、テルブクロル、テルブメトン、テルブチラジン、テルブトリン、ＴＨ−５４７、テニルクロール、チアフルアミド（thiafluamide）、チアザフルロン、チアゾピル、チジアジミン、チジアズロン、チエンカルバゾン、チエンカルバゾン−メチル、チフェンスルフロン、チフェンスルフロン−メチル、チオベンカルブ、チオカルバジル、トラルコキシジム、トリアレート、トリアスルフロン、トリアジフラム、トリアゾフェナミド、トリベニュロン、トリベニュロン−メチル、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）、トリクロピル、トリジファン、トリエタジン、トリフロキシスルフロン、トリフロキシスルフロン−ナトリウム、トリフルラリン、トリフルスルフロン、トリフルスルフロン−メチル、トリメツロン、トリネキサパック、トリネキサパック−エチル、トリトスルフロン、チトデフ（tsitodef）、ウニコナゾール、ウニコナゾール−Ｐ、バーナレート、ＺＪ−０１６６、ＺＪ−０２７０、ＺＪ−０５４３、ＺＪ−０８６２および以下の化合物。
【０１５８】
【化１】
0005871813.tif 000005
【０１５９】
本発明によるＨＰＰＤ耐性植物が成長している区域に施用される、テンボトリオン、スルコトリオンおよびメソトリオンなどのトリケトンのクラス、またはピラスルホトールおよびトプラメゾンなどのピラゾリネートのクラス、特にテンボトリオン、スルコトリオン、トプラメゾン、ビシクロピロン、テフリルトリオンおよびメソトリオンより選択されるＨＰＰＤ阻害剤型除草剤、より顕著にはテンボトリオンの必要な施用量は、温度、湿度、使用される除草剤の特性などの外部条件の関数として変化する。それは、広い範囲内、例えば０．００１から１．０kg/ha以上の活性物質の間で変化することがあるが、好ましくは０．００５から７５０g/haの間である。
【０１６０】
本発明によるＨＰＰＤ耐性植物に、ＨＰＰＤ阻害剤型除草剤をＨＰＰＤ阻害剤型除草剤と異なる除草剤と組み合わせて施用する場合、これらの混合物は、非ＨＰＰＤ阻害剤型除草剤の存在に基づき作物被害を引き起こすおそれがある。そのような作物被害を軽減／排除するために、適切な薬害軽減剤を添加することができる。解毒活性量で採用されるこれらの薬害軽減剤は、例えば穀物（コムギ、オオムギ、ライムギ、コーン、イネ、雑穀）、アルファルファ、テンサイ、サトウキビ、アブラナ、ワタおよびダイズ、好ましくはコーン、ワタ、テンサイ、またはダイズなどの商業的に重要な作物に使用される除草剤／農薬の植物毒性副作用を軽減する。
【０１６１】
薬害軽減剤は、好ましくは以下から成る群（立体異性体および農業において慣用の塩を含む）より選択される：
Ａ）式（Ｓ−Ｉ）
【０１６２】
【化２】
0005871813.tif 000006
［式中、記号および指数は以下の意味を有する：
ｎＡは、０〜５、好ましくは０〜３の自然数であり；
ＲＡ１は、ハロゲン、（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）−アルコキシ、ニトロまたは（Ｃ１−Ｃ４）−ハロアルキルであり；
ＷＡは、ＮまたはＯ型のヘテロ環原子１〜３個を有する、部分不飽和または芳香族五員複素環から成る群より選択される、少なくとも１個の窒素原子および最大で１個の酸素原子が環に存在する不飽和または飽和の二価複素環式基、好ましくは（ＷＡ１）〜（ＷＡ４）、
【０１６３】
【化３】
0005871813.tif 000007
から成る群からの基であり、
ｍＡは、０または１であり；
ＲＡ２は、ＯＲＡ３、ＳＲＡ３もしくはＮＲＡ３ＲＡ４であるか、あるいは少なくとも１個の窒素原子および好ましくはＯおよびＳから成る群からの最大３個のヘテロ原子を有し、（Ｓ−Ｉ）中のカルボニル基に窒素原子を介して結合している、置換されていないか、または（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）−アルコキシおよび場合により置換されたフェニルから成る群からの基によって、好ましくは式ＯＲＡ３、ＮＨＲＡ４もしくはＮ（ＣＨ３）２、特に式ＯＲＡ３の基によって置換されている、飽和または不飽和三〜七員複素環であり；
ＲＡ３は、水素、または好ましくは合計１〜１８個の炭素原子を有する非置換もしくは置換脂肪族炭化水素基であり；
ＲＡ４は、水素、（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）−アルコキシまたは置換もしくは非置換フェニルであり；
ＲＡ５は、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ８）−アルキル、（Ｃ１−Ｃ８）−ハロアルキル）、（Ｃ１−Ｃ４）−アルコキシ−（Ｃ１−Ｃ８）−アルキル、シアノまたはＣＯＯＲＡ９であり、ここで、ＲＡ９は、水素、（Ｃ１−Ｃ８）−アルキル、（Ｃ１−Ｃ８）−ハロアルキル、（Ｃ１−Ｃ４）−アルコキシ−（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）−ヒドロキシアルキル、（Ｃ３−Ｃ１２）−シクロアルキルまたはトリ−（Ｃ１−Ｃ４）−アルキルシリルであり；
ＲＡ６、ＲＡ７、ＲＡ８は、同一であるかまたは異なり、水素、（Ｃ１−Ｃ８）−アルキル、（Ｃ１−Ｃ８）−ハロアルキル、（Ｃ３−Ｃ１２）−シクロアルキルまたは置換もしくは非置換フェニルである］で示される化合物；
好ましくは：
ａ）ジクロロフェニルピラゾリン−３−カルボン酸型の化合物、好ましくはエチル１−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（エトキシカルボニル）−５−メチル−２−ピラゾリン−３−カルボキシレート（Ｓ１−１）などの化合物（「メフェンピル−ジエチル」、Pestic. Man.参照）、および国際公開公報第９１／０７８７４号に記載されているような関連化合物；
ｂ）ジクロロフェニルピラゾールカルボン酸の誘導体、好ましくはエチル１−（２，４−ジクロロフェニル）−５−メチルピラゾール−３−カルボキシレート（Ｓ１−２）、エチル１−（２，４−ジクロロフェニル）−５−イソプロピルピラゾール−３−カルボキシレート（Ｓ１−３）、エチル１−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（１，１−ジメチルエチル）ピラゾール−３−カルボキシレート（Ｓ１−４）、エチル１−（２，４−ジクロロフェニル）−５−フェニルピラゾール−３−カルボキシレート（Ｓ１−５）ならびにEP-A-333 131およびEP-A-269 806に記載されているような関連化合物などの化合物；
ｃ）トリアゾールカルボン酸型の化合物、好ましくはフェンクロラゾール（−エチルエステル）、すなわちエチル１−（２，４−ジクロロフェニル）−５−トリクロロ−メチル−（１Ｈ）−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキシレート（Ｓ１−６）などの化合物、ならびにEP-A-174 562およびEP-A-346 620に記載されているような関連化合物；
ｄ）５−ベンジル−２−イソキサゾリン−３−カルボン酸または５−フェニル−２−イソキサゾリン−３−カルボン酸または５，５−ジフェニル−２−イソキサゾリン−３−カルボン酸型の化合物、好ましくはエチル５−（２，４−ジクロロベンジル）−２−イソキサゾリン−３−カルボキシレート（Ｓ１−７）もしくはエチル５−フェニル−２−イソキサゾリン−３−カルボキシレート（Ｓ１−８）などの化合物および国際公開公報第９１／０８２０２号に記載されているような関連化合物、または特許出願である国際公開公報第−Ａ−９５／０７８９７号に記載されているようなエチル５，５−ジフェニル−２−イソキサゾリンカルボキシレート（Ｓ１−９）（「イソキサジフェン−エチル」）もしくはｎ−プロピル５，５−ジフェニル−２−イソキサゾリンカルボキシレート（Ｓ１−１０）もしくはエチル５−（４−フルオロフェニル）−５−フェニル−２−イソキサゾリン−３−カルボキシレート（Ｓ１−１１）、
【０１６４】
Ｂ）式（Ｓ−ＩＩ）
【０１６５】
【化４】
0005871813.tif 000008
［式中、記号および指数は以下の意味を有する：
ＲＢ１は、ハロゲン、（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）−アルコキシ、ニトロまたは（Ｃ１−Ｃ４）−ハロアルキルであり；
ｎＢは、０〜５、好ましくは０〜３の自然数であり；
ＲＢ２は、ＯＲＢ３、ＳＲＢ３もしくはＮＲＢ３ＲＢ４であるか、あるいは少なくとも１個の窒素原子および好ましくはＯおよびＳから成る群からの最大３個のヘテロ原子を有し、（Ｓ−ＩＩ）中のカルボニル基に窒素原子を介して結合している、置換されていないか、または（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）−アルコキシもしくは場合により置換されたフェニルからの基によって、好ましくは式ＯＲＢ３、ＮＨＲＢ４もしくはＮ（ＣＨ３）２、特に式ＯＲＢ３の基によって置換されている、飽和または不飽和三〜七員複素環であり；
ＲＢ３は、水素、または好ましくは合計１〜１８個の炭素原子を有する非置換もしくは置換脂肪族炭化水素基であり；
ＲＢ４は、は、水素、（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）−アルコキシまたは置換もしくは非置換フェニルであり；
ＴＢは、非置換の、あるいは１個もしくは２個の（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル基によって、または［（Ｃ１−Ｃ３）−アルコキシ］カルボニルによって置換されている（Ｃ１−またはＣ２）−アルカンジイル鎖である］で示されるキノリン誘導体；
好ましくは：
ａ）８−キノリンオキシ酢酸型の化合物（Ｓ２）、好ましくは
１−メチルヘキシル（５−クロロ−８−キノリンオキシ）アセテート（慣用名「クロキントセット−メキシル」（Ｓ２−１）（Pestic. Man.参照）、
１，３−ジメチルブタ−１−イル（５−クロロ−８−キノリンオキシ）アセテート（Ｓ２−２）、
４−アリルオキシブチル（５−クロロ−８−キノリンオキシ）アセテート（Ｓ２−３）、
１−アリルオキシプロパ−２−イル（５−クロロ−８−キノリンオキシ）アセテート−（Ｓ２−４）、
エチル（５−クロロ−８−キノリンオキシ）アセテート（Ｓ２−５）、
メチル（５−クロロ−８−キノリンオキシ）アセテート（Ｓ２−６）、
アリル（５−クロロ−８−キノリンオキシ）アセテート（Ｓ２−７）、
２−（２−プロピリデンイミノキシ）−１−エチル（５−クロロ−８−キノリンオキシ）アセテート（Ｓ２−８）、２−オキソプロパ−１−イル（５−クロロ−８−キノリンオキシ）アセテート（Ｓ２−９）およびEP-A-86 750、EP-A-94 349およびEP-A-191 736またはEP-A-0 492 366に記載されているような関連化合物、ならびにまた国際公開公報第−Ａ−２００２／０３４０４８号に記載されているようなそれらの水和物および塩。
ｂ）（５−クロロ−８−キノリンオキシ）マロン酸型の化合物、好ましくはジエチル（５−クロロ−８−キノリンオキシ）マロネート、ジアリル（５−クロロ−８キノリンオキシ）マロネート、メチルエチル（５−クロロ−８−キノリンオキシ）マロネートなどの化合物およびEP-A-0 582 198に記載されているような関連化合物、
【０１６６】
Ｃ）式（Ｓ−ＩＩＩ）
【０１６７】
【化５】
0005871813.tif 000009
［式中、記号および指数は以下の意味を有する：
ＲＣ１は、（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）−ハロアルキル、（Ｃ２−Ｃ４）−アルケニル、（Ｃ２−Ｃ４）−ハロアルケニル、（Ｃ３−Ｃ７）−シクロアルキル、好ましくはジクロロメチルであり；
ＲＣ２、ＲＣ３は、同一であるか、または異なり、水素、（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル、（Ｃ２−Ｃ４）−アルケニル、（Ｃ２−Ｃ４）−アルキニル、（Ｃ１−Ｃ４）−ハロアルキル、（Ｃ２−Ｃ４）−ハロアルケニル、（Ｃ１−Ｃ４）−アルキルカルバモイル−（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル、（Ｃ２−Ｃ４）−アルケニルカルバモイル−（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）−アルコキシ−（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル、ジオキソラニル−（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル、チアゾリル、フリル、フリルアルキル、チエニル、ピペリジル、置換もしくは非置換フェニルであるか、またはＲＣ２およびＲＣ３は、一緒になって置換もしくは非置換複素環、好ましくはオキサゾリジン、チアゾリジン、ピペリジン、モルホリン、ヘキサヒドロピリミジンもしくはベンゾキサジン環を形成する］で示される化合物；
好ましくは：
出芽前薬害軽減剤（土壌作用性薬害軽減剤）として多くの場合に使用されるジクロロアセトアミド型の活性化合物、例えば、
「ジクロルミド」（Pestic.Man.参照）（＝Ｎ，Ｎ−ジアリル−２，２−ジクロロアセトアミド）、
「Ｒ−２９１４８」（＝３−ジクロロアセチル−２，２，５−トリメチル−１，３−オキサゾリジン、Stauffer製）、
「Ｒ−２８７２５」（＝３−ジクロロアセチル−２，２，−ジメチル−１，３−オキサゾリジン、Stauffer製）、
「ベノキサコル」（Pestic. Man.参照）（＝４−ジクロロアセチル−３，４−ジヒドロ−３−メチル−２Ｈ−１，４−ベンゾキサジン）、
「ＰＰＧ−１２９２」（＝Ｎ−アリル−Ｎ−［（１，３−ジオキソラン−２−イル）メチル］ジクロロアセトアミド、PPG Industries製）、
「ＤＫＡ−２４」（＝Ｎ−アリル−Ｎ−［（アリルアミノカルボニル）メチル］ジクロロアセトアミド、Sagro-Chem製）、
「ＡＤ−６７」または「ＭＯＮ４６６０」（＝３−ジクロロアセチル−１−オキサ−３−アザ−スピロ［４，５］デカン、NitrokemiaまたはMonsanto製）、
「ＴＩ−３５」（＝１−ジクロロアセチルアゼパン、TRI-Chemical RT製）
「ジクロノン（diclonon）」（ジシクロノン）または「ＢＡＳ１４５１３８」または「ＬＡＢ１４５１３８」（＝３−ジクロロアセチル−２，５，５−トリメチル−１，３−ジアザビシクロ［４．３．０］ノナン、BASF製）および
「フリラゾール」または「ＭＯＮ１３９００」（Pestic. Man.参照）（＝（ＲＳ）−３−ジクロロアセチル−５−（２−フリル）−２，２−ジメチルオキサゾリジン）など、
【０１６８】
Ｄ）式（Ｓ−ＩＶ）
【０１６９】
【化６】
0005871813.tif 000010
［式中、
ＸＤは、ＣＨまたはＮであり；
ＲＤ１は、ＣＯ−ＮＲＤ５ＲＤ６またはＮＨＣＯ−ＲＤ７であり；
ＲＤ２は、ハロゲン、（Ｃ１−Ｃ４）−ハロアルキル、（Ｃ１−Ｃ４）−ハロアルコキシ、ニトロ、（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）−アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ４）−アルキルスルホニル、（Ｃ１−Ｃ４）−アルコキシカルボニルまたは（Ｃ１−Ｃ４）−アルキルカルボニルであり；
ＲＤ３は、水素、（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル、（Ｃ２−Ｃ４）−アルケニルまたは（Ｃ２−Ｃ４）−アルキニルであり；
ＲＤ４は、ハロゲン、ニトロ、（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）−ハロアルキル、（Ｃ１−Ｃ４）−ハロアルコキシ、（Ｃ３−Ｃ６）−シクロアルキル、フェニル、（Ｃ１−Ｃ４)-アルコキシ、シアノ、(Ｃ１−Ｃ４)-アルキルチオ、（Ｃ１−Ｃ４）−アルキルスルフィニル、（Ｃ１−Ｃ４）−アルキルスルホニル、（Ｃ１−Ｃ４）−アルコキシカルボニルまたは（Ｃ１−Ｃ４）−アルキルカルボニルであり；
ＲＤ５は、水素、（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、（Ｃ３−Ｃ６）−シクロアルキル、（Ｃ２−Ｃ６）−アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）−アルキニル、（Ｃ５−Ｃ６）−シクロアルケニル、フェニル、または窒素、酸素および硫黄から成る群からのｖＤヘテロ原子を含有する三〜六員ヘテロシクリルであり、ここで、最後に記載したものから７個までの基は、ハロゲン、（Ｃ１−Ｃ６）−アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ６）−ハロアルコキシ、（Ｃ１−Ｃ２）−アルキルスルフィニル、（Ｃ１−Ｃ２）−アルキルスルホニル、（Ｃ３−Ｃ６）−シクロアルキル、（Ｃ１−Ｃ４）−アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ４）−アルキルカルボニルおよびフェニル、ならびに環式基の場合、さらに（Ｃ１−Ｃ４）−アルキルおよび（Ｃ１−Ｃ４）−ハロアルキルから成る群からのｖＤ置換基によって置換されており；
ＲＤ６は、水素、（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）−アルケニルまたは（Ｃ２−Ｃ６）−アルキニルであり、ここで、最後に記載したものから３個までの基は、ハロゲン、ヒドロキシ、（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）−アルコキシおよび（Ｃ１−Ｃ４）−アルキルチオから成る群からのｖＤ基によって置換されているか、または
ＲＤ５およびＲＤ６は、それらを担持している窒素原子と一緒になってピロリジニルまたはピペリジニル基を形成し；
ＲＤ７は、水素、（Ｃ１−Ｃ４）−アルキルアミノ、ジ−（Ｃ１−Ｃ４）−アルキルアミノ、（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、（Ｃ３−Ｃ６）−シクロアルキルであり、ここで、最後に記載したものから２個までの基は、ハロゲン、（Ｃ１−Ｃ４）−アルコキシ、ハロゲン−（Ｃ１−Ｃ６）−アルコキシおよび（Ｃ１−Ｃ４）−アルキルチオ、ならびに環式基の場合、さらに（Ｃ１−Ｃ４）−アルキルおよび（Ｃ１−Ｃ４）−ハロアルキルから成る群からのｖＤ置換基によって置換されており；
ｎＤは、０、１または２であり；
ｍＤは、１または２であり；
ｖＤは、０、１、２または３である］で示されるＮ−アシルスルホンアミドおよびそれらの塩；
これらの中で、Ｎ−アシルスルホンアミド型の、例えば国際公開公報第９７／４５０１６号から公知の、例えば下記式（Ｓ−Ｖ）
【０１７０】
【化７】
0005871813.tif 000011
［式中、
ＲＤ７は、（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、（Ｃ３−Ｃ６）−シクロアルキルであり、ここで、最後に記載したものから２個までの基は、ハロゲン、（Ｃ１−Ｃ４）−アルコキシ、ハロゲン−（Ｃ１−Ｃ６）−アルコキシおよび（Ｃ１−Ｃ４）−アルキルチオ、ならびに環式基の場合、さらに（Ｃ１−Ｃ４）−アルキルおよび（Ｃ１−Ｃ４）−ハロアルキルから成る群からのｖＤ置換基によって置換されており；
ＲＤ４は、ハロゲン、（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）−アルコキシ、ＣＦ３であり；
ｍＤは、１または２であり；
ｖＤは、０、１、２または３である］で示される化合物；
およびまた、
例えば国際公開公報第９９／１６７４４号から公知の、例えば下記式（Ｓ−ＶＩ）
【０１７１】
【化８】
0005871813.tif 000012
で示されるアシルスルファモイルベンズアミド、
例えば
ＲＤ５＝シクロプロピルおよび（ＲＤ４）＝２−ＯＭｅ（「シプロスルファミド」、Ｓ３−１）であり
ＲＤ５＝シクロプロピルおよび（ＲＤ４）＝５−Ｃｌ−２−ＯＭｅ（Ｓ３−２）であり、
ＲＤ５＝エチルおよび（ＲＤ４）＝２−ＯＭｅ（Ｓ３−３）であり、
ＲＤ５＝イソプロピルおよび（ＲＤ４）＝５−Ｃｌ−２−ＯＭｅ（Ｓ３−４）であり、かつ
ＲＤ５＝イソプロピルおよび（ＲＤ４）＝２−ＯＭｅ（Ｓ３−５）である化合物；
さらびにまた
例えばEP-A-365484から公知の、式（Ｓ−ＶＩＩ）
【０１７２】
【化９】
0005871813.tif 000013
［式中、
ＲＤ８およびＲＤ９は、相互に独立して、水素、（Ｃ１−Ｃ８）−アルキル、（Ｃ３−Ｃ８）−シクロアルキル、（Ｃ３−Ｃ６）−アルケニル、（Ｃ３−Ｃ６）−アルキニルであり、
ＲＤ４は、ハロゲン、（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）−アルコキシ、ＣＦ３であり、
ｍＤは、１または２である］で示されるＮ−アシルスルファモイルフェニル尿素型の化合物；
これらの中で特に
１−［４−（Ｎ−２−メトキシベンゾイルスルファモイル）フェニル］−３−メチル尿素、
１−［４−（Ｎ−２−メトキシベンゾイルスルファモイル）フェニル］−３，３−ジメチル尿素、
１−［４−（Ｎ−４，５−ジメチルベンゾイルスルファモイル）フェニル］−３−メチル尿素、
１−［４−（Ｎ−ナフトイルスルファモイル）フェニル］−３，３−ジメチル尿素が好まれる、
【０１７３】
Ｇ）ヒドロキシ芳香族化合物および芳香脂肪族カルボン酸誘導体のクラスからの活性化合物、例えば
国際公開公報第２００４０８４６３１号、国際公開公報第２００５０１５９９４号、国際公開公報第２００６００７９８１号、国際公開公報第２００５０１６００１号に記載されているようなエチル３，４，５−トリアセトキシベンゾエート、３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシ安息香酸、３，５−ジヒドロキシ安息香酸、４−ヒドロキシサリチル酸、４−フルオロサリチル酸（salicyclic acid）、１，２−ジヒドロ−２−オキソ−６−トリフルオロメチルピリジン−３−カルボキサミド、２−ヒドロキシ桂皮酸、２，４−ジクロロ桂皮酸；
【０１７４】
Ｈ）１，２−ジヒドロキノキサリン−２−オンのクラスからの活性化合物、例えば
国際公開公報第２００５１１２６３０号に記載されているような１−メチル−３−（２−チエニル）−１，２−ジヒドロキノキサリン−２−オン、１−メチル−３−（２−チエニル）−１，２−ジヒドロキノキサリン−２−チオン、１−（２−アミノエチル）−３−（２−チエニル）−１，２−ジヒドロキノキサリン−２−オンヒドロクロリド、１−（２−メチルスルホニルアミノエチル）−３−（２−チエニル）−１，２−ジヒドロ−キノキサリン−２−オンからの活性化合物、
【０１７５】
Ｉ）有害植物に対する除草作用に加えて、イネなどの作物に薬害軽減作用も有する活性化合物、例えば、
「ジメピペレート」または「ＭＹ−９３」（Pestic. Man.参照）（＝Ｓ−１−メチル−１−フェニルエチルピペリジン−１−チオカルボキシレート）（除草剤モリネートによる被害に対するイネ用薬害軽減剤として公知である）、
「ダイムロン」または「ＳＫ２３」（Pestic. Man.参照）（＝１−（１−メチル−１−フェニルエチル）−３−ｐ−トリル−尿素）（除草剤イマゾスルフロンによる被害に対するイネ用薬害軽減剤として公知である）
「クミルロン」＝「ＪＣ−９４０」（＝３−（２−クロロフェニルメチル）−１−（１−メチル−１−フェニル−エチル）尿素、特開昭６０−０８７２５４参照）（いくつかの除草剤による被害に対するイネ用薬害軽減剤として公知である）、
「メトキシフェノン」または「ＮＫ０４９」（＝３，３’−ジメチル−４−メトキシベンゾフェノン）（いくつかの除草剤による被害に対するイネ用薬害軽減剤として公知である）、
「ＣＳＢ」（＝１−ブロモ−４−（クロロメチルスルホニル）ベンゼン）（ＣＡＳ登録番号５４０９１−０６−４、Kumiai製）（イネにおけるいくつかの除草剤による障害に対する薬害軽減剤として公知である）、
【０１７６】
Ｋ）国際公開公報第−Ａ−１９９８／３８８５６号に記載されているような、式（Ｓ−ＩＸ）
【０１７７】
【化１０】
0005871813.tif 000014
［式中、記号および指数は以下の意味を有する：
ＲＫ１、ＲＫ２は、相互に独立してハロゲン、（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）−アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ４）−ハロアルキル、（Ｃ１−Ｃ４）−アルキルアミノ、ジ−（Ｃ１−Ｃ４）−アルキルアミノ、ニトロであり；
ＡＫは、ＣＯＯＲＫ３またはＣＯＯＲＫ４であり、
ＲＫ３、ＲＫ４は、相互に独立して水素、（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）−アルケニル、（Ｃ２−Ｃ４）−アルキニル、シアノアルキル、（Ｃ１−Ｃ４）−ハロアルキル、フェニル、ニトロフェニル、ベンジル、ハロベンジル、ピリジニルアルキルまたはアルキルアンモニウムであり、
ｎＫ１は、０または１であり、
ｎＫ２、ｎＫ３は、相互に独立して０、１または２である］で示される化合物、
好ましくは：メチル（ジフェニルメトキシ）アセテート（ＣＡＳ登録番号：４１８５８−１９−９）、
【０１７８】
Ｌ）国際公開公報第Ａ−９８／２７０４９号に記載されているような、式（Ｓ−Ｘ）
【０１７９】
【化１１】
0005871813.tif 000015
［式中、記号および指数は以下の意味を有する：
ＸＬは、ＣＨまたはＮであり、
ｎＬは、Ｘ＝Ｎの場合０〜４の整数であり、Ｘ＝ＣＨの場合０〜５の整数であり、
ＲＬ１は、ハロゲン、（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）−ハロアルキル、（Ｃ１−Ｃ４）−アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ４）−ハロアルコキシ、ニトロ、（Ｃ１−Ｃ４）−アルキルチオ、（Ｃ１−Ｃ４）−アルキルスルホニル、（Ｃ１−Ｃ４）−アルコキシカルボニル、場合により置換されたフェニル、場合により置換されたフェノキシであり、
ＲＬ２は、水素または（Ｃ１−Ｃ４）−アルキルであり、
ＲＬ３は、水素、（Ｃ１−Ｃ８）−アルキル、（Ｃ２−Ｃ４）−アルケニル、（Ｃ２−Ｃ４）−アルキニルまたはアリールであり、ここで、上記炭素含有基のそれぞれは、置換されていないか、またはハロゲンおよびアルコキシから成る群からの、１個もしくは複数、好ましくは最大３個の同一のもしくは異なる基によって置換されている］で示される化合物またはその塩、
【０１８０】
Ｍ）国際公開公報第−Ａ−１９９９００００２０号に記載されたような３−（５−テトラゾリルカルボニル）−２−キノロンのクラスの活性化合物、例えば１，２−ジヒドロ−４−ヒドロキシ−１−エチル−３−（５−テトラゾリルカルボニル）−２−キノロン（ＣＡＳ登録番号：２１９４７９−１８−２）、１，２−ジヒドロ−４−ヒドロキシ−１−メチル−３−（５−テトラゾリルカルボニル）−２−キノロン（ＣＡＳ登録番号：９５８５５−００−８）、
【０１８１】
Ｎ）国際公開公報第−Ａ−２００７０２３７１９号および国際公開公報第−Ａ−２００７０２３７６４号に記載されたような、式（Ｓ−ＸＩ）または（Ｓ−ＸＩＩ）
【０１８２】
【化１２】
0005871813.tif 000016
［式中、
ＲＮ１は、ハロゲン、（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル、メトキシ、ニトロ、シアノ、ＣＦ３、ＯＣＦ３であり、
Ｙ、Ｚは、相互に独立してＯまたはＳであり、
ｎＮは、０〜４の整数であり、
ＲＮ２は、（Ｃ１−Ｃ１６）−アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）−アルケニル、（Ｃ３−Ｃ６）−シクロアルキル、アリール、ベンジル、ハロベンジルであり、
ＲＮ３は、水素、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルである］で示される化合物、
【０１８３】
Ｏ）：以下から成る群からの一つまたは複数の化合物：
１，８−ナフタル酸無水物、
Ｏ，Ｏ−ジエチルＳ−２−エチルチオエチルホスホロジチオエート（ジスルホトン）、
４−クロロフェニルメチルカルバメート（メフェネート（mephenate））、
Ｏ，Ｏ−ジエチルＯ−フェニルホスホロチオエート（ジエトレート（dietholate））、
４−カルボキシ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−４−酢酸（ＣＬ−３０４４１５、ＣＡＳ登録番号：３１５４１−５７−８）、
２−プロペニル１−オキサ−４−アザスピロ［４．５］デカン−４−カルボジチオエート（ＭＧ−８３８、ＣＡＳ登録番号：１３３９９３−７４−５）、
メチル［（３−オキソ−１Ｈ−２−ベンゾチオピラン−４（３Ｈ）−イリデン）メトキシ］アセテート（国際公開公報第−Ａ−９８／１３３６１号から；ＣＡＳ登録番号：２０５１２１−０４−６）、
シアノメトキシイミノ（フェニル）アセトニトリル（シオメトリニル）、
１，３−ジオキソラン−２−イルメトキシイミノ（フェニル）アセトニトリル（オキサベトリニル）、
４’−クロロ−２，２，２−トリフルオロアセトフェノンＯ−１，３−ジオキソラン−２−イルメチルオキシム（フルキソフェニム）、
４，６−ジクロロ−２−フェニルピリミジン（フェンクロリム）、
ベンジル２−クロロ−４−トリフルオロメチル−１，３−チアゾール−５−カルボキシレート（フルラゾール）、
２−ジクロロメチル−２−メチル−１，３−ジオキソラン（ＭＧ−１９１）。
【０１８４】
殺真菌剤、殺虫剤、殺ダニ剤、殺線虫剤、トリ忌避剤、植物栄養素および土壌構造改良材などの他の公知の活性化合物との混合物も同様に可能である。
【０１８５】
いくつかの薬害軽減剤が除草剤として既に公知であり、しかるべく、有害植物に対する除草作用に加えて、作物を保護することによっても作用する。除草剤（混合物）対薬害軽減剤の重量比は、一般に除草剤施用量および問題となる薬害軽減剤の有効性に依存し、広い範囲内、例えば２００：１〜１：２００、好ましくは１００：１〜１：１００、特に２０：１〜１：２０の範囲で変動することがある。薬害軽減剤は、式（Ｉ）で示される化合物またはそれらと他の除草剤／農薬との混合物に類似して製剤化されることがあり、完成した製剤として、または除草剤とのタンクミックスとして提供および使用されることがある。
【０１８６】
式（Ｉ）で示される化合物の必要な施用量は、とりわけ温度、湿度および使用される除草剤の種類などの外部条件に応じて変動する。それは、広い範囲内で、例えば０．００１〜１００００g/ha以上の活性物質の間で変動することがあるが；しかしながら、それは、好ましくは０．５から５０００g/haの間、特に好ましくは０．５から１０００g/haの間であり、とりわけ好ましくは０．５から５００g/haの間である。
【０１８７】
本発明のトランスジェニック植物が、他の除草剤に対する耐性に関する一つまたは複数の他の遺伝子（例えば、グリフォセート除草剤に対する耐性を植物に付与する突然変異型もしくは非突然変異型ＥＰＳＰＳをコードする遺伝子またはグルホシネート除草剤に対する耐性を付与するｐａｔもしくはｂａｒ遺伝子など）を含有する場合、あるいはトランスジェニック植物が別の除草剤に自然耐性（スルホニル尿素耐性など）である場合、本発明による方法は、ＨＰＰＤ阻害剤を該除草剤または除草剤の組み合わせ、例えばグリフォセートおよび／またはグルホシネートおよび／またはスルホニル尿素除草剤と組み合わせて同時施用または時差施用することを含むことができる。
【０１８８】
本発明は、また、上記ＨＰＰＤ阻害剤型除草剤に関する選択に基づき、植物種のトランスフォーメーションの際にマーカー遺伝子として本発明のＨＰＰＤをコードするキメラ遺伝子を使用することに関する。
【０１８９】
本発明は、また、トリケトンまたはピラゾリネートＨＰＰＤ阻害剤に対して耐性の植物を得るための該方法であって、植物が、本明細書において定義された本発明のＨＰＰＤをその植物中で発現しているキメラ遺伝子を用いてトランスフォーメーションされていることを特徴とする方法に関する。
【０１９０】
特定の一態様では、本発明は、トリケトンまたはピラゾリネートＨＰＰＤ阻害剤に耐性の植物を得るための該方法であって、本発明のＨＰＰＤが、配列番号４（アミノ酸位置２〜アミノ酸位置３８２）、またはコーン、イネ、コムギ、ダイズ、サトウキビ、タマネギ、Brassica種植物、またはワタのコドン使用頻度に適応した本発明のＨＰＰＤをコードする合成ＤＮＡを含むことを特徴とする方法に関する。
【０１９１】
別の特定の態様では、本発明は、テンボトリオン、メソトリオン、ジケトニトリル、イソキサフルトール、スルコトリオン、テフリルトリオン、およびビシクロピロンより選択されるトリケトンＨＰＰＤ阻害剤に対して耐性の植物を得るための該方法に関する。
【０１９２】
別の特定の態様では、本発明は、トリケトンまたはピラゾリネートＨＰＰＤ阻害剤に対して耐性の植物を得るための該方法であって、その植物が、また、ＰＤＨ（プレフェナートデヒドロゲナーゼ）酵素、または少なくともＰＤＨを有する酵素をコードする、植物で発現可能なキメラ遺伝子を含むことを特徴とする方法に関する。
【０１９３】
本発明は、また、区域または圃場における雑草を防除するための方法であって、上記方法にしたがって得られた、トリケトンもしくはピラゾリネートＨＰＰＤ阻害剤に対して耐性のトランスフォーメーションされた植物またはそれに由来するトランスフォーメーションされた種子をこの区域または圃場中で栽培すること、および該トランスフォーメーションされた種子または該トランスフォーメーションされた植物に顕著に影響せずに、雑草に有毒な供与量の該トリケトンまたはピラゾリネートＨＰＰＤ阻害剤を施用することを含む方法に関する。
【０１９４】
本発明は、また、上記方法にしたがって得られたトリケトンまたはピラゾリネートＨＰＰＤ阻害剤に耐性の、トランスフォーメーションされた植物またはそのような植物に由来するトランスフォーメーションされた種子を成長させること、場合によりそのような植物または種子をトリケトンまたはピラゾリネートＨＰＰＤ阻害剤で処理すること、穀粒を収穫することおよびその穀粒を粉砕して粗挽き粉を製造し油を抽出することを含む、油または粗挽き粉を得るための方法に関する。
【０１９５】
本発明は、また、ＨＰＰＤ阻害剤がテンボトリオン、メソトリオン、トプラメゾン、ビシクロピロン、テフリルトリオンおよびスルコトリオンより選択されるトリケトンＨＰＰＤ阻害剤であることを特徴とする、上記のような本発明のＨＰＰＤの使用に関する。
【０１９６】
本発明は、また、本発明によるＨＰＰＤをコードする配列を含むキメラ遺伝子を含有し、また、プレフェナートデヒドロゲナーゼ（本明細書においてＰＤＨと略記する）酵素を過剰発現させる、ホスト生物において機能的な遺伝子を含有するこのホスト生物、特に植物細胞または植物に関する。
【０１９７】
「ＰＤＨ酵素」という用語は、本明細書に使用するように、プレフェナートをＨＰＰに転換するＰＤＨ活性を示している任意の天然または突然変異型ＰＤＨ酵素を表す。特に、該ＰＤＨ酵素は、任意の種類の生物由来のことがある。ＰＤＨ活性を有する酵素は、プレフェナート基質量の減少を測定すること、あるいは酵素反応から得られた生成物、すなわちＨＰＰまたはコファクターＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨの一方の蓄積を測定することのいずれかを可能にする任意の方法によって確認することができる。
【０１９８】
ＰＤＨ酵素をコードしている多数の遺伝子は、文献に記載されており、それらの配列は、ウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/から確認することができる。特に知られているのは、Mannhaupt et al. (1989) Gene 85、303-311に記載されているような酵母Saccharomyces cerevisiae（アクセッション番号Ｓ４６０３７）、特にHenner et al. (1986) Gene 49 (1) 147-152に記載されているような種B. subtilis（アクセッション番号Ｐ２０６９２）のBacillus属細菌、特にHudson et al. (1984) J. Mol. Biol. 180(4), 1023-1051に記載されたような種E. coli（アクセッション番号ＫＭＥＣＴＤ）のEscherichia属細菌、または特にXia et al. (1992) J. Gen. Microbiol. 138(7), 1309-1316に記載されているような種Erwinia herbicola（アクセッション番号Ｓ２９９３４）のErwinia属細菌のＰＤＨ酵素をコードする遺伝子である。
【０１９９】
本発明は、さらに、ＨＰＰＤ阻害剤に対して耐性のホスト生物、特に植物細胞または植物を得るための方法であって、そのような生物に少なくとも一つの核酸配列または上記と同義の一つのキメラ遺伝子を組み込むこと、およびこのホスト生物において機能的な遺伝子を用いてそれをさらに同時または連続的にトランスフォーメーションしてＰＤＨ（プレフェナートデヒドロゲナーゼ）酵素の発現を可能にすることによる方法に関する。特定の一態様では、本発明は、トリケトンまたはピラゾリネートＨＰＰＤ阻害剤、特にテンボトリオン、メソトリオン、トプラメゾン、ビシクロピロン、イソキサフルトール、ピラスルホトール、テフリルトリオン、またはスルコトリオンに耐性のホスト生物、特に植物細胞または植物を得るための方法に関する。
【０２００】
ＨＰＰＤ酵素の過剰発現を可能にする遺伝子およびＰＤＨ酵素の過剰発現を可能にする遺伝子の両方を用いてトランスフォーメーションされたホスト生物、特に植物細胞または植物を得るために使用されうる手段および方法は、国際公開公報第０４／０２４９２８号に広く記載されており、その内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０２０１】
任意の先行刊行物（またはそれから得られる情報）または公知の任意の事柄への本明細書における参照は、そのような先行刊行物（または情報）または公知の事柄が本発明の分野における共通の一般知識の部分を形成するという承認または容認または任意の形態の示唆として受け取られることはなく、受け取ってはならない。
【図面の簡単な説明】
【０２０２】
【図１】プラスミドｐＳＥ４２０：：ＦＭＰ３７ｅのマップを示す図である。
【図２】タバコ植物に挿入されたＴ−ＤＮＡのマップを示す図である。
【図３】実施例５〜１３による種々の植物に挿入されたＴ−ＤＮＡのマップを示す図である；略語は以下の意味を有する。Ａ、Ｂ、ＣおよびＧ：タバコ植物、Ｄ、ＥおよびＦ：Zea mays植物、Ｈ：ダイズ植物、Ｉ：イネ植物、ならびにＪ：ワタ植物。３５Ｓ：ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＫａｎＲ：抗生物質カナマイシンに対する耐性を付与する遺伝子、ｎｏｓ：ノパリンシンターゼプロモーター、Ｔｅｒ：ターミネーター、Ｈ６：Ｈｉｓ タグをコードする配列、ＯＴＰ：最適化トランジットペプチド、ＢＡＲ（ビアラホス耐性、国際公開公報第８７０５６２９号）およびＰＡＴ（ホスフィノトリシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ、EP 257542）：ビアラホス、ホスフィノトリシンまたはグルホシネートに対する耐性を付与する遺伝子、２ｍＥＰＳＰＳ：Zea mays由来の二重突然変異型（Ｔｈｒ１０２ＩｌｅおよびＰｒｏ１０６Ｓｅｒ）ＥＰＳＰＳ（５−エノールピルビルシキミ酸シンターゼ）をコードする遺伝子（米国特許出願公開第２００３００２７３１２号）、２ｍＡＨＡＳ：Arabidopsis由来の二重突然変異型ＡＬＳ（アセト乳酸シンターゼ）（Ｐｒｏ１９７ＡｌａおよびＴｒｐ５７４Ｌｅｕ；米国特許第５３７８８２４号）をコードする遺伝子、ＨＡ：Arabidopsis遺伝子由来のヒストンプロモーター、ＴＥＶ：タバコエッチウイルス、ＦＭＰ３７ｅ：その５’末端にＨｉｓタグをコードする配列を有する、E coliでの発現のために最適化された、ＦＭＰ３７をコードする遺伝子、ＦＭＰ３７ｔ：その５’末端にＨｉｓタグをコードする配列を有する、双子葉植物での発現のために最適化された、ＦＭＰ３７をコードする遺伝子、ＦＭＰ３７ｔ−ｈ：双子葉植物での発現のために最適化された、ＦＭＰ３７をコードする遺伝子、ＦＭＰ３７ｍ：Zea mays植物での発現のために最適化された、ＦＭＰ３７をコードする遺伝子、ＬＢ：左側境界配列、ＲＢ：右側境界配列。
【０２０３】
配列リスト
配列番号１：Blepharisma japonicum ＨＰＰＤをコードする核酸配列
配列番号２：１個のアラニンおよび６個のヒスチジンアミノ酸をコードする核酸を含有する、E. coliのために最適化された、Blepharisma japonicum ＨＰＰＤをコードする核酸配列
配列番号３：５’末端に最適化トランジットペプチドおよびＨＩＳタグをコードする核酸配列を含有する、Nicotiana tabaccumのために最適化されたBlepharisma japonicum ＨＰＰＤをコードする核酸配列
配列番号４：配列番号１から得られたBlepharisma japonicum ＨＰＰＤのアミノ酸配列
配列番号５：配列番号２によってコードされるタンパク質
配列番号６：ＯＴＰ（最適化トランジットペプチド（国際公開公報第２００９／１４４０７９号））と融合されたBlepharisma japonicum ＨＰＰＤのアミノ酸配列（配列番号４）
配列番号７：配列番号３によってコードされるタンパク質
配列番号８：Arabidopsis thaliana ＨＰＰＤをコードする核酸配列
配列番号９：Arabidopsis thaliana ＨＰＰＤのアミノ酸配列
配列番号１０：配列番号８によってコードされるタンパク質＋最初のアミノ酸メチオニンのすぐ下流の追加的なアラニンおよびそれに続く６個のヒスチジンアミノ酸
配列番号１１：配列番号９で示されるタンパク質＋そのタンパク質のＮ末端に位置するＯＴＰ配列
配列番号１２：配列番号１０で示されるタンパク質＋そのタンパク質のＮ末端に直接位置するＯＴＰ配列
配列番号１３：プライマー配列Ｘｈｏ−ＯＴＰ−ｆｏｒ
配列番号１４：プライマー配列ＮｃｏＩ−ＯＴＰ−ｒｅｖ
配列番号１５：双子葉植物のために最適化されたBlepharisma japonicum ＨＰＰＤをコードする核酸配列
配列番号１６：Zea mays植物のために最適化されたBlepharisma japonicum ＨＰＰＤをコードする核酸配列
配列番号１７：Brassica napus植物のために最適化されたBlepharisma japonicum ＨＰＰＤをコードする核酸配列
配列番号１８：Beta vulgaris植物のために最適化されたBlepharisma japonicum ＨＰＰＤをコードする核酸配列
配列番号１９：Gossypium hirsutum植物のために最適化されたBlepharisma japonicum ＨＰＰＤをコードする核酸配列
配列番号２０：Glycine max植物のために最適化されたBlepharisma japonicum ＨＰＰＤをコードする核酸配列
配列番号２１：Hordeum vulgare植物のために最適化されたBlepharisma japonicum ＨＰＰＤをコードする核酸配列
配列番号２２：Oryza sativa植物のために最適化されたBlepharisma japonicum ＨＰＰＤをコードする核酸配列
配列番号２３：Triticum aestivum植物のために最適化されたBlepharisma japonicum ＨＰＰＤをコードする核酸配列
【０２０４】
実施例
本発明の様々な局面は、以下の実験実施例の助けを借りると、よりよく理解される。下のこれらの実施例に記載される全ての方法または操作は、例として示され、同じまたは類似の結果を得るために利用可能な種々の方法から選ばれたものに対応する。この選ばれたものは、結果の質に影響を及ぼさず、その結果として、同一または類似の結果を得るために技術者は任意の適切な方法を使用することができる。ＤＮＡフラグメントを操作するための方法の大部分は、Greene Publishing Associates and Wiley Interscience (1989)出版の"Current Protocols in Molecular Biology" Volumes 1 and 2, Ausubel F.M. et al.またはMolecular Cloning, T. Maniatis, E.F. Fritsch, J. Sambrook, 1982、またはSambrook J. and Russell D., 2001, Molecular Cloning: a laboratory manual (Third edition)に記載されている。
【０２０５】
実施例１
配列番号５のBlepharisma japonicum ＨＰＰＤ（ＦＭＰ３７ｅと名付ける）および配列番号１０によって確認されるArabidopsis thaliana ＨＰＰＤの調製
最初にArabidopsis thaliana Ａｔ ＨＰＰＤコード配列（１３３５bp；Genebank ＡＦ０４７８３４；国際公開公報第９６／３８５６７号）を発現ベクターｐＱＥ−３０（QIAGEN, Hilden, Germany）の制限部位ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩの間にクローニングした。得られたベクターを「ｐＱＥ３０−ＡｔＨＰＰＤ」と呼んだ。
【０２０６】
ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／ＴｒＥＭＢＬにアクセッションナンバーＡ８Ｒ３Ｈ６でリストされているタンパク質をコードする本来のBlepharisma japonicum ＨＰＰＤ配列（１１４９bp）を、Escherichia coli K12最適化コドン使用頻度（Eurofins MWGオペロン（Ebersberg, Germany）、GENEiusソフトウェア）を使用して改変および合成し、改変ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Eurofins , Ebersberg, Germany）にクローニングした。このベクターでは、ＭＣＳ（マルチクローニング部位）に対応する配列が部分的に除去され、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの認識に対応する配列だけが挿入部の両端に残った。５’末端のＡＴＧの直接下流に、アラニンアミノ酸をコードする核酸配列およびＮ末端ＨＩＳ６−タグ（６×ＨＩＳ、ｃａｔ  ｃａｔ  ｃａｔ  ｃａｃ  ｃａｔ  ｃａｃによってコードされる）をコードする核酸配列を挿入した。ＡＴＧの上流に、制限酵素ＮｃｏＩの認識部位に対応する配列を得るために二つの追加的なシトシン塩基対を付加し、終止コドンの下流に制限酵素ＸｂａＩの認識部位に対応する配列を付加した。結果として生じたベクター「ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＦＭＰ３７ｅ」を制限酵素ＮｃｏＩおよびＸｂａＩで消化し、ＤＮＡに対応する約３０００bpのベクターサイズの長さにまで泳動しないバンドを、アガロースゲルで電気泳動により分離した。次に、ＨＰＰＤをコードするＤＮＡを、MinElute（商標）Gel Extraction Kit（Qiagen, Hilden, Germany）を使用して精製し、予め同じ制限酵素で切断しておいたｐＳＥ４２０（ＲＩ）ＮＸベクター（下記参照）にクローニングした。クローニングおよび発現ベクターｐＳＥ４２０（ＲＩ）ＮＸ（５２６１bp）は、Invitrogen（Karlsruhe, Germany）によるプラスミドｐＳＥ４２０に基づく。このベクターの改変は、抗生物質カナマイシンに対する耐性を付与するｎｐｔＩＩ遺伝子（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ；Sambrook and Russell, 2001, Molecular Cloning: a laboratory manual (Third edition)）の付加を含み、スーパーリンカー領域（マルチクローニング部位）の大部分を欠如している。そのプラスミドは、ｔｒｐ−ｌａｃ（ｔｒｃ）プロモーターおよび各E. coliホスト株にｌａｃリプレッサーを提供するｌａｃＩｑ遺伝子を有する。ｌａｃリプレッサーは、ｌａｃオペレーター（ｌａｃＯ）に結合し、ターゲット遺伝子の発現を制限する；この阻害は、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を用いた誘導によって軽減することができる。
【０２０７】
結果として生じたベクターを「ｐＳＥ４２０（ＲＩ）ＮＸ−ＦＭＰ３７ｅ」と呼び（図１参照）、それを、Escherichia coli ＢＬ２１細胞（Merck, Darmstadt, Germany）をトランスフォーメーションするために使用した。参照として使用したＡｔＨＰＰＤ（Arabidopsis thaliana ＨＰＰＤ）については、国際公開公報第２００９／１４４０７９号を参照されたい。
【０２０８】
ＨＰＰＤの発現は、ｐＱＥ３０−ＡｔＨＰＰＤまたはｐＳＥ４２０（ＲＩ）ＮＸ−ＦＭＰ３７ｅを含有するE. coli Ｋ−１２ ＢＬ２１で実施した。ＯＤが０．５に達するまで細胞を成長させ、次に、ｌａｃリプレッサーと結合しｌａｃオペロンからそれを解離させる１mM ＩＰＴＧを用いた誘導によってｔｒｐ−ｌａｃ（ｔｒｃ）プロモーターから発現を開始させた。発現を２８℃で１５時間実施した。前スターター培養液を調製するために、２mLのＴＢ培地（１００μg・mL-1カルベニシリン）に５０μLのE. coli Ｋ−１２ ＢＬ２１グリセロール保存培養液を接種した。前スターター培養液を１４０rpmで１５時間浸透しながら３７℃でインキュベーションした。前スターター培養液２００μlを使用して、スターター培養を開始し（１００μg・L-1のＴＢ補充液５mL）、それを３７℃で３時間インキュベーションした。主培養液を調製するために、４００mLのＴＢ培地（１００μg・mL-1カルベニシリン）にスターター培養液４mLを接種した。ＯＤ６００が０．５に達するまでこのスターター培養液を１４０rpmで振盪しながら３７℃でインキュベーションした。次に、４００μlの１Ｍ ＩＰＴＧ溶液でリコンビナントタンパク質の発現を誘導した。これらの条件下で細胞をもう１時間成長させ、次に温度を２８℃に下げ、培養液を１４０rpmで１５時間振盪した。６０００×ｇで４℃で１５分間遠心分離することによって細胞を採集した。次に、細胞ペレットを−８０℃で保存した。
【０２０９】
ネイティブな形態のＨｉｓ６−ＡｔＨＰＰＤおよびＨｉｓ６−ＦＭＰ３７ｅの単離および精製
細胞の溶解
細菌細胞壁を形成するペプチドグリカンにおけるＮ−アセチルムラミン酸とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基の間の１，４−β−結合を切断する酵素であるリゾチームを使用して細胞を溶解させた。次に、細菌細胞の内圧によって細胞膜は破壊された。加えて、溶解緩衝液は、タンパク質を損傷せずに全ての形態のＤＮＡおよびＲＮＡを加水分解することによって細胞溶解液の粘度を大きく減少させるエンドヌクレアーゼであるBenzonase（登録商標）ヌクレアーゼを含有した。ネイティブな条件下の溶解を氷上で実施した。Ｈｉｓ６タグ付きタンパク質を精製するために、QIAexpress（登録商標）Ni-NTA Fast Start Kitをユーザーマニュアルの説明にしたがって使用した。
【０２１０】
固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によるＨｉｓ６タグ付きタンパク質の精製
溶解反応物の遠心分離後に得られた透明細胞溶解液（１０mL）を、QIAexpress（登録商標）Ni-NTA Fast Startキット（Qiagen, Hilden, Germany）からのNi-NTA Fast Startカラムにロードし、説明マニュアルにしたがって精製を実施した。Ｈｉｓ６タグ付きタンパク質を溶離緩衝液２．５mLで溶離させた。
【０２１１】
ゲル濾過によるＨＰＰＤ溶液の脱塩
Ni-NTA Fast Startカラムから２．５mLの溶離緩衝液で溶離したＨＰＰＤ溶液を、ユーザーマニュアルの説明にしたがってSephadex G-25 PD-10カラム（GE Healthcare, Freiburg, Germany）に適用した。全試料がゲルベッドに入った後に、３．５mLの保存緩衝液で溶離を行った。脱塩カラムから溶離したＨＰＰＤ溶液を１mLの分割量で−８０℃で凍結させた。
【０２１２】
Bradfordタンパク質アッセイを使用したＨＰＰＤタンパク質濃度の決定
タンパク質濃度は、標準Bradfordアッセイを使用して決定した（Bradford, (1976), Anal Biochem 72: 248-254）。
【０２１３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用したＨＰＰＤ溶液の純度の決定
約１０μgのタンパク質がロードされたゲルNuPAGE（登録商標）Novex ４〜１２％ビス−トリスゲル（Invitrogen, Karlsruhe, Germany）を使用したＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質ゲル電気泳動によって、溶離したタンパク質の完全性をチェックした。１０μLのLaemmli試料緩衝液を１〜１０μLのタンパク質溶液に添加し、その混合物を９０℃で１０分間インキュベーションした。短い遠心ステップの後に、NuPAGE（登録商標）ＭＯＰＳ ＳＤＳ泳動用緩衝液（２０×溶液からｄｄＨ２Ｏで希釈）を満たしたXCell SureLock（商標）Novex Mini-Cellゲルチャンバー中で予め固定しておいたＳＤＳゲルのスロットに混合物全体をロードした。次に、ゲルチャンバーに１５０ボルトの電圧を１時間印加した。タンパク質のバンドを染色するために、ゲルをCoomassie Brilliant Blue R-250染色溶液中に浸した。ポリアクリルアミドゲルの脱染のために、タンパク質のバンドが白いゲル上に青く見えるまでそれをCoomassie Brilliant Blue R-250脱染溶液中に浸した。
【０２１４】
実施例２
ＨＰＰＤ阻害剤に対するＨＰＰＤ酵素「配列番号５」および「配列番号１０」の耐性の動態的特徴づけおよび評価
標準的な分光光度アッセイ（国際公開公報第２００９／１４４０７９号に広く記載されている方法）によってＨＰＰＤ活性をチェックした。
【０２１５】
ＨＰＰＤのin vitro動態的性質の決定
異なるＨＰＰＤ酵素調製物のＫｍ、Ｖｍａｘ、およびｋｃａｔ値ならびに異なるＨＰＰＤ阻害剤のＫｉ、Ｋ１＝Ｋｏｎ、およびＫ−１＝Ｋｏｆｆを、ＨＰＰＤ活性測定のためのＨＰＬＣアッセイを使用して決定した。アッセイ混合物は、体積１mlの１５０mMトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．８）中に１０mMアスコルビン酸ナトリウム、６５０ユニットのウシカタラーゼ（Sigma C30(Sigma-Aldrich, Munich,Germany）、３４mgタンパク質/ml、２３，０００ユニット/mg）、ならびに適量のＨＰＰ、精製ＨＰＰＤ酵素およびＨＰＰＤ阻害剤を含有した。Ｋｍ、Ｖｍａｘ、およびｋｃａｔ値の決定のために、アッセイ混合物中のＨＰＰ濃度は、１０から４００μMの間を変動した。Ｋｉ、Ｋ１＝Ｋｏｎ、およびＫ−１＝Ｋｏｆｆ値の決定のために、２mM ＨＰＰを使用した。アッセイ混合物にＨＰＰＤ酵素を添加することによって全てのアッセイを開始し、０から２４０秒の一連の時間でに、２０μlの１０％過塩素酸の入った反応アッセイチューブに２００μlの反応混合物を添加することによって停止した。沈殿したタンパク質を１０，０００ｇで５分間遠心分離することによってペレットにした。上清１００μlを、１０％メタノール、０．１％トリフルオロ酢酸（緩衝液Ａ）で平衡化した２５０×４mm Knauer（Berlin, Germany）Eurospher 100-5 C18-カラムにロードした。同じく１．５ml/minで緩衝液Ａを用いた４分間の洗浄に続く９５％メタノールを用いた３分間の洗浄および緩衝液Ａを用いたさらなる２分間の洗浄を用いて、カラムを溶離させた。ＨＧＡ（ホモゲンチジン酸）およびＨＰＰ（ヒドロキシフェニルピルビン酸）の溶離を２９２nmでモニターした。ＨＧＡは約５分で溶離し、ＨＰＰはその後溶離する。ＨＧＡ濃度に対するＨＧＡピークの２９２nmの吸光度を較正するために、標準セットの濃度のＨＧＡを使用して標準曲線を提供した。ＫｍおよびＶｍａｘ値の決定のために、形成したＨＧＡを時間に対してプロットしたものから、異なる基質濃度でのＨＰＰＤ反応の初速度を決定し、ID Business Solutions Ltd.（www.idbs.com）XLfitソフトウェアスイートを使用してそれを単一反応物酵素のためのMichaelis-Mentenの式にあてはめた。Ｋｉ、Ｋ１＝Ｋｏｎ、およびＫ−１＝Ｋｏｆｆ値の決定のために、異なる阻害剤濃度でのＨＰＰＤ反応の時間経過を、ID Business Solutions Ltd. XLfitソフトウェアスイートを使用して強結合阻害剤についてのメカニズムＡ競合阻害のための式にあてはめた（Cha, S. (1975) Tight-binding inhibitors - I. Kinetic behaviour. Biochemical Pharmacology 24, 2177-2185）。
【０２１６】
表１：ＨＰＰＤ酵素（Arabidopsis thaliana「配列番号１０」およびBlepharisma japonicum「配列番号５」）の動態的特徴づけおよびＨＰＰＤ阻害剤ジケトニトリルに対するそれらに該当する耐性
下記表１において、「Ｋｍ」（Michaelis-Menten定数）は、酵素を特徴づけるために使用される速度パラメーターを意味し、それは、最大反応速度の半値を可能にする基質濃度として定義される。Ｋｍは、さらに、反応速度がその最大値の半値（Ｖｍａｘ／２）に達する基質濃度として定義され、その際、Ｖｍａｘは、反応の最大速度の意味を有する。Ｋｏｎ＝Ｋ１は、酵素−基質結合の結合速度定数に等しく、Ｋｏｆｆ＝Ｋ−１は、酵素−阻害剤複合体の解離速度定数に等しい。Ｋｉは、阻害定数を定義する。
【０２１７】
【表４】
0005871813.tif 000017
【０２１８】
上記表１で、原生生物ＨＰＰＤ「配列番号５」および植物ＨＰＰＤ「配列番号１０」の速度パラメーターＫｍおよびＶｍａｘが、すでに有意差を示し（６．３μM対８３μM）、その有意差がジケトニトリルに対する耐性レベルに関してはなお大きい（０．０１８μM対６．６μM）ことがはっきりと分かる。原生生物ＨＰＰＤ「配列番号５」は、被験ＨＰＰＤ阻害剤に対して植物ＨＰＰＤ「配列番号１０」よりもはるかに耐性であった。
【０２１９】
表２：ＨＰＰＤ阻害剤型除草剤テンボトリオンに対するArabidopsis（配列番号１０）およびBlepharisma japonicum（配列番号５）由来の両ＨＰＰＤ酵素のin vitro耐性測定。示した数は、異なる濃度のＨＰＰＤ阻害剤型除草剤テンボトリオンでの酵素活性の阻害率をそのＨＰＰＤ阻害剤型除草剤の不在下での活性と比較して表す。これらの測定は、国際公開公報第２００９／１４４０７９号に広く記載された分光光度法を使用して行った。
【０２２０】
【表５】
0005871813.tif 000018
【０２２１】
表２から、Blepharisma japonicum由来ＨＰＰＤ（配列番号５）が、Arabidopsis thalianaから得られたＨＰＰＤ（配列番号１０）よりもＨＰＰＤ阻害剤型除草剤テンボトリオンに対してはるかに耐性が高いことがはっきりと分かる。
【０２２２】
いくつかのＨＰＰＤ阻害剤存在下のＨＰＰＤ活性の測定
これに関連して、ｐＩ５０値は、酵素活性を５０％阻害するために必要な阻害剤濃度（モル濃度）のｌｏｇ値を意味する。
【０２２３】
ＨＰＰＤ阻害剤についてのｐＩ５０値は、ID Business Solutions Ltd. XLfitソフトウェアスイートを使用して、２mMの一定のＨＰＰ濃度および３分の一定のインキュベーション時間で、国際公開公報第２００９／１４４０７９号に広く記載されたアッセイを使用して、阻害剤濃度に対するＨＰＰＤ活性の用量反応プロットから決定した。
【０２２４】
表３：ｐＩ５０ ＨＰＰＤ酵素（Arabidopsis thaliana「配列番号１０」およびBlepharisma japonicum「配列番号５」）および以下にリストしたいくつかのＨＰＰＤ阻害剤テンボトリオン、ジケトニトリル、メソトリオン、ビシクロピロン、ピラスルホトール、スルコトリオン、ピラゾレート、テフリルトリオン、およびベンゾフェナップに対するそれらに該当する耐性の決定。記号「＞＞」は、その値が表示された値よりもはるかに高いが、試験した阻害剤濃度範囲（２．５×１０−６、５．０×１０−６、１．０×１０−５、２．５×１０−５、６．３×１０−５、および２．５×１０−４Ｍ）内で正確には計算できなかったことを意味する。
【０２２５】
【表６】
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【０２２６】
表４：阻害剤の不在下でArabidopsis thaliana由来ＨＰＰＤ（配列番号１０）およびBlepharisma japonicum由来ＨＰＰＤ（配列番号５）について測定された活性に比べた、５．０×１０−６Ｍの阻害剤の存在下での阻害率の決定
【０２２７】
【表７】
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【０２２８】
上記表３および４から、原生生物ＨＰＰＤ「配列番号５」が同一の実験条件下で植物ＨＰＰＤ「配列番号１０」を採用することによって観察されたものよりも、全ての被験ＨＰＰＤ阻害剤濃度で全ての被験ＨＰＰＤ阻害剤に対して優れたレベルの耐性を示したことがはっきりと分かる。
【０２２９】
実施例３：タバコ植物におけるＨＰＰＤ阻害剤型除草剤耐性を評価するためのキメラ遺伝子の構築
Ａ）キメラ遺伝子の構築
ＯＴＰをコードする配列を含有するベクターｐＲＰ−ＲＤ２２４（国際公開公報第２００９／１４４０７９号に広く記載されている）を使用して、制限酵素ＸｈｏＩの認識部位に対応する核酸配列の上流および制限酵素ＮｃｏＩの認識部位に対応する核酸配列の下流にＰＣＲ介在性結合させた。得られたＰＣＲ産物を、ユーザーマニュアルの説明にしたがってベクターpCR（登録商標）-Blunt II-TOPO（登録商標）（Invitrogen, Karlsruhe, Germany）にクローニングした。結果として生じたベクターを「ｐＣＲ−ＴＯＰＯ−ＯＴＰ」と呼んだ。標準的なＤＮＡ配列決定により正しい配列が挿入したことを確認した。ＯＴＰに対応するＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで消化し、適切なゲル電気泳動によって分離し、ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ制限酵素で予めそれ相応に消化しておいたプラスミドｐＲＴ１００（Toepfer, (1987), Nucleic Acids Res 15:5890）にクローニングした。プラスミドｐＲＴ１００は、ＣａＭＶ３５ＳプロモーターおよびＣａＭＶ３５Ｓターミネーターを含有している。続いて、結果として生じたベクターを制限酵素ＮｃｏＩおよびＸｂａＩで消化した。配列番号２に対応するＤＮＡフラグメントを得るために、ベクターｐＳＥ４２０（ＲＩ）ＮＸ−ＦＭＰ３７ｅ（図１参照）を制限酵素ＮｃｏＩおよびＸｂａＩに供した。制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩを採用することによって、結果として生じたベクターを消化し、ＣａＭＶ３５Ｓ：：ＯＴＰ：：ＦＭＰ３７ｅ：：ＣａＭＶ３５−ｔｅｒｍカセット（図２参照）を、同じ酵素で予め消化して脱リン酸しておいたバイナリーベクターｐＢｉｎ１９（Bevan (1984), Nucleic Acids Res. 12:8711-8721.）にサブクローニングした。結果として生じたベクターを「ＦＭＰ３７ｅｂｖ」と呼んだ。
【０２３０】
ＡｔＨＰＰＤの５’末端にＮｃｏＩ制限部位およびＮ末端Ｈｉｓ６タグをコードする配列を、そして３’末端にＸｂａＩ制限部位をＰＣＲ介在性結合させるためにベクターｐＱＥ−３０−ＡｔＨＰＰＤを使用した。
【０２３１】
ＡｔＨＰＰＤ遺伝子のＰＣＲ産物をアガロースゲルから単離し、制限酵素ＮｃｏＩおよびＸｂａＩで切断し、MinElute（商標）ＰＣＲ精製キット（Qiagen, Hilden, Germany）で精製し、同制限酵素で切断されたｐＳＥ４２０（ＲＩ）ＮＸベクターにクローニングした。作製したベクターを「ｐＳＥ４２０（ＲＩ）ＮＸ−ＡｔＨＰＰＤ」と呼び、それを制限酵素ＮｃｏＩおよびＸｂａＩで消化し、ＣａＭＶ３５ＳプロモーターおよびＣａＭＶ３５Ｓターミネーターを含有する、予め開いておいたベクターｐＲＴ１００（Toepfer et al., (1987), Nucleic Acids Res 15:5890）にクローニングした。作製したベクターを「ｐＲＴ１００−ＡｔＨＰＰＤ」と呼んだ。ベクターｐＣＲ−ＴＯＰＯ−ＯＴＰを制限酵素ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで消化し、ＯＴＰに対応するＤＮＡバンドを、上記制限酵素で予め開いておいたベクターｐＲＴ１００−ＡｔＨＰＰＤにクローニングした。続いて、結果として生じたベクターを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、関心が持たれる発現カセットを、予め開き、脱リン酸しておいたバイナリーベクターｐＢｉｎ１９にクローニングした。結果として生じたベクターを「ＡｔＨＰＰＤｂｖ」と呼んだ。
【０２３２】
バイナリーベクターＦＭＰ３７ｅｂｖおよびＡｔＨＰＰＤｂｖを使用して、抗生物質カナマイシンおよびリファンピシンを補充されたＹＥＢ培地で選択したAgrobacterium tumefaciens（ＥＨＡ１０１から得られたＡＴＨＶ）コンピテント細胞をトランスフォーメーションした（特許出願US005925808Aに広く記載されている）。
【０２３３】
Horsch et al., (1985), Science 227 ; 1229-1231に広く記載されているように、関心が持たれるバイナリーベクター（ＦＭＰ３７ｅｂｖまたはＡｔＨＰＰＤｂｖ）を含有するこれらのAgrobacterium株を使用して、タバコNicotiana tabacum L. cv Samsun NN植物からの約５×５mm2サイズの葉ディスクをトランスフォーメーションした。葉ディスクを、バイナリーベクターＦＭＰ３７ｅｂｖまたはＡｔＨＰＰＤｂｖのいずれかを含有するAgrobacterium tumefaciens細胞と共に２日間共培養した。次に、葉ディスクを培地に移し、ＢＡＰ（１mg/mL；ベンジルアミノプリン）、カルベニシリン（２５０mg/mL）、セフォタキシン（cefotaxine）（２５０mg/mL）、カナマイシン（７５mg/mL）およびテンボトリオン（１０−６Ｍ）を補充されたＭＳ（Musharige and Skoog, (1962), Physiol Plant 15(3): 473-497）培地上で６週間、苗条を再生させた。
【０２３４】
再生したカルスを培地：カルベニシリン（２５０mg/mL）、セフォタキシン（２５０mg/mL）、カナマイシン（７５mg/mL）、およびテンボトリオン（１０−６Ｍ）を補充されたＭＳ（１／２）上に移し、６〜１２週間発根を誘導した。この培地上で６週間後に、バイナリーベクターＡｔＨＰＰＤｂｖを含有するAgrobacterium tumefaciens細胞を用いてトランスフォーメーションされた苗条を、ＨＰＰＤ阻害剤テンボトリオンを枯渇する同培地上に移植した。
【０２３５】
結果を下記表５に要約する。実験全体にわたり、葉ディスクの入ったプレートをコントロールされた条件下の成長チャンバー（明１６時間、暗８時間、２５℃）中に入れた。
【０２３６】
カルスの発根
ＨＰＰＤ阻害剤テンボトリオンをさらに補充された培地に、配列番号１１（Arabidopsis thaliana）または配列番号７（Blepharisma japonicum）を含むＨＰＰＤをコードする核酸配列を用いてトランスフォーメーションされた細胞から再生した苗条カルスを移植し、６〜１２週間根の成長を誘導した。配列番号１１によって定義されたＨＰＰＤ（Arabidopsis thaliana）を含有するイベントのどれも、またトランスフォーメーションされたカルスのどれも、上に示された条件下で根の成長が観察されなかった。これとは逆に同一条件下で、配列番号７によって定義されるＨＰＰＤを含有するカルスは、明らかに多数の健康な根を発生した（下記の表５参照）。
【０２３７】
【表８】
0005871813.tif 000021
【０２３８】
葉ディスクの再生
ＨＰＰＤ配列番号１１（Arabidopsis thaliana）または配列番号７（Blepharisma japonicum）を含有する植物から葉ディスクを切り取り、続いてＢＡＰ（1mg/mL；ベンジルアミノプリン）、カルベニシリン（２５０mg/mL）、セフォタキシン（２５０mg/mL）を補充され、さらに、以下にリストされたＨＰＰＤ阻害剤の一つを記載濃度（テンボトリオン（１０−６Ｍ）、ジケトニトリル（５．１０−６Ｍ）、メソトリオン（１０−６Ｍ）およびビシクロピロン（１０−６Ｍ））で含むＭＳ培地上で、陽性対照としての非ＨＰＰＤ阻害剤を含有する培地と共に標準的な培養条件下で６週間再生させた。実験の終わりに、再生レベルを以下のように評価した：
「−」は、上記阻害剤を補充された培地上で葉ディスクが野生型タバコ植物からの葉ディスクと同じに見えたことを意味する。
「＋＋＋＋」は、阻害剤を有さない培地上で葉ディスクが野生型タバコ植物からの葉ディスクのように見えたことを意味する。
「＋」、「＋＋」、および「＋＋＋」は、再生した葉ディスクが、阻害剤の存在によって大きく（＋）、中程度に（＋＋）および小さく（＋＋＋）影響されたことを示す。
実験結果を表６に要約する。
【０２３９】
表６：Arabidopsisから得られたＨＰＰＤ（配列番号１１）またはBlepharisma japonicumからのＨＰＰＤ（配列番号７）のいずれかをコードする遺伝子を含むトランスジェニック植物由来の葉ディスクの再生に及ぼす様々なＨＰＰＤ阻害剤の効果
【０２４０】
【表９】
0005871813.tif 000022
【０２４１】
配列番号７（Blepharisma japonicum）によって定義されるＨＰＰＤを含有する植物は、この未処理対照に比べて同じまたはわずかだけ低下した再生を示したが、配列番号１１によって定義されるＨＰＰＤ（Arabidopsis thaliana）を含有する対応する植物は、全ての被験ＨＰＰＤ阻害剤の存在下で未処理対照に比べて再生を示さないが明らかに目に見えるブリーチング表現型を発生した。
【０２４２】
実施例４：耐性ＨＰＰＤタンパク質をコードする遺伝子を発現しているトランスジェニックタバコ植物のＨＰＰＤ阻害剤型除草剤に対する耐性を評価するための温室試験
Arabidopsis ＨＰＰＤ酵素またはＦＭＰ３７ ＨＰＰＤ酵素のいずれかを発現しているトランスジェニック植物系統の調製。除草剤耐性についての温室試験
テンボトリオン、イソキサフルトールおよびビシクロピロンの応答
上記のＨＰＰＤをコードするArabidopsis由来遺伝子またはＦＭＰ３７ ＨＰＰＤをコードするBlepharisma japonicum由来遺伝子ＦＭＰ３７ｅのいずれかを含有するＴ０タバコ植物（実施例３）を温室（２８／２０℃）に移し、さらに生育させ、種子を産生させた。それらの種子を収穫し、土壌に蒔き（砂およびオスモコートＰｒｏと混合したＥＤ７３）、温室中で発芽させた（２８／２０℃）。３〜４週間後に、上記土壌が入った単一の鉢に小植物を移植した。２週間後に、直径４〜６cmのサイズの植物に
−  硫酸アンモニウムおよび菜種油（raps oil）メチルエステルを補充されたＷＰ２０（水和剤２０％）製剤から調製したテンボトリオンを１００ｇ AI/haで、または
−  硫酸アンモニウムおよび菜種油メチルエステルを補充されたＷＰ２０製剤から調製したイソキサフルトールを１００ｇ AI/haで、または
−  硫酸アンモニウムおよび菜種油メチルエステルを補充されたＷＰ２０製剤から調製したビシクロピロンを１００ｇ AI/haで、または
−  硫酸アンモニウムおよび菜種油メチルエステルを補充された、活性成分（ＡＩ）を有さないＷＰ２０製剤から製造した「ブラインド製剤」
のいずれかをスプレー散布し、次に十分な光条件（２００００Lux）の成長チャンバーに移した。
【０２４３】
異なる除草剤の７施用後日（ＤＡＴ）に、トランスフォーメーションされた植物における病徴を、導入遺伝子を含有するタバコ植物と同時に同じ条件下でスプレー散布された野生型タバコ植物で観察された応答と比較して評価した（１００％は、その植物が野生型植物と同じブリーチング表現型を示したことを意味し、０％は、その植物が「ブラインド製剤」で処理された野生型植物のように見えたことを意味し、中間のパーセンテージは、観察された病徴の程度を表すことを意味する）。
【０２４４】
表７：野生型タバコ植物（Ａ）およびその代わりにプロモーターＣａＭＶ ３５Ｓ、ＯＴＰをコードする配列およびArabidopsis ＨＰＰＤをコードする配列を有する上記発現カセットを含有するタバコ−イベント（Ｂ）またはプロモーターＣａＭＶ  ３５Ｓ、ＯＴＰをコードする配列、およびＨＰＰＤ  ＦＭＰ３７をコードする配列ＦＭＰ３７ｅを有する上記発現カセットを含有するタバコ−イベント（Ｃ）のＴ１個体群。硫酸アンモニウムおよび菜種油メチルエステルを補充された１００ｇ AI/haのテンボトリオンまたはイソキサフルトールをスプレー散布してから７施用後日（ＤＡＴ）の除草被害の評価。ＦＭＰ３７ｅ遺伝子を含有する植物が、テンボトリオンおよびイソキサフルトールに対してはるかに耐性であったことが明らかである。分類（Ｂ）および（Ｃ）に属する植物は、除草剤施用前に該当する導入遺伝子の存在について選択されていない。
【０２４５】
【表１０】
0005871813.tif 000023
【０２４６】
【表１１】
0005871813.tif 000024
0005871813.tif 000025
【０２４７】
【表１２】
0005871813.tif 000026
0005871813.tif 000027
【０２４８】
ビシクロピロンに対する応答
野生型タバコ植物およびＨＰＰＤをコードするBlepharisma japonicum ＦＭＰ３７ｅ由来の遺伝子を有するＴ１タバコ植物の種子を、５０g/Lカナマイシンを補充されたＭＳ培地（Murashige and Skoog 1964）上に播種した。４週間後に、発根した緑色小植物を土壌に移植し、上記温室中で３週間成長させ、次に、ビシクロピロン（１００ｇ AI/ha）、硫酸アンモニウムおよび菜種油メチルエステルを含有する混合物をスプレー散布した。処理の７日後に除草剤に応答して発生した表現型に基づき、植物を２種類に分類した。クラスＩを、除草剤処理に応答して全く被害を示さなかったか、または軽度の被害を示した植物（被害：０〜３０％）と定義し、クラスＩＩを、強い被害から、同じ処理を受けた野生型植物で見られたものと類似の被害を示す植物（被害：３１〜１００％）と定義した。この場合、少なくとも一つのＴ−ＤＮＡを含有する植物だけを除草処理に供した。一般に、一つだけのＴ−ＤＮＡ挿入物を含有する植物であっても、すでに露地供与量のＨＰＰＤ阻害剤型除草剤ビシクロピロンに対して有意で十分なレベルの耐性を示したことが分かる。
【０２４９】
【表１３】
0005871813.tif 000028
【０２５０】
ＨＰＰＤ ＦＭＰ３７を含有する植物は、ＨＰＰＤ阻害剤型除草剤ビシクロピロンに対して耐性を示した。
【０２５１】
上記データから、いくつかの独立したトランスジェニックイベントから得られた、ＦＭＰ３７ ＨＰＰＤをコードするBlepharisma japonicum由来の遺伝子ＦＭＰ３７ｅを発現している植物が、標準的な農学的条件下で施用された供与量でいくつかのＨＰＰＤ阻害剤型除草剤に対して高度に耐性であると要約することができる。
【０２５２】
実施例５：いくつかの双子葉植物最適化変異体を植物に発現させるためのバイナリーベクターの構築およびそのような変異体を含有するタバコ植物の耐性を評価するための温室試験
ＦＭＰ３７ｔ（配列番号３）、ＦＭＰ３７ｔ−ｈ（配列番号１５）のｐＢｉｎ１９へのクローニング
ＨＰＰＤタンパク質ＦＭＰ３７をコードする、双子葉植物での発現のために最適化されたコドン使用頻度を有する遺伝子を設計し、ＦＭＰ３７ｔ−ｈ（配列番号１５）と名付け、ＯＴＰをコードする追加的な配列およびその５’末端にＨＩＳタグをコードする追加的な配列を有する同遺伝子をＦＭＰ３７ｔ（配列番号３）と呼んだ。ＦＭＰ３７ｔ−ｈ遺伝子に対応する配列を、制限酵素ＮｃｏＩおよびＸｂａＩを使用して、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターおよびターミネーターを含有する前記ベクターｐＲＴ１００−ＯＴＰにクローニングした。結果として生じたベクターをｐＲＴ１００−ＯＴＰ−ＦＭＰ３７ｔ−ｈと呼んだ。制限酵素ＸｈｏＩおよびＸｂａＩを使用して、ＦＭＰ３７ｔに対応する配列を前記ベクターｐＲＴ１００にクローニングし、結果として生じたベクターをｐＲＴ１００−ＯＴＰ−ＦＭＰ３７ｔと呼んだ。ＰｒｏｍＣａＭＶ３５Ｓ−ＯＴＰ−ＦＭＰ３７ｔ−ｈ−ＴｅｒＣａＭＶ３５ＳおよびＰｒｏｍＣａＭＶ３５Ｓ−ＯＴＰ−ＨＩＳ６−ＦＭＰ３７ｔ−ＴｅｒＣａＭＶ３５Ｓに対応するフラグメントを、制限酵素ＳｂｆＩを使用してｐＢＩＮ１９ベクター（上記）にサブクローニングした。バイナリーベクターをそれぞれｐＢｉｎ１９−ＦＭＰ３７ｔ−ｈ（図３Ｃ）およびｐＢｉｎ１９−ＦＭＰ３７ｔ（図３Ｂ）と呼んだが、これは、例えば上記タバコ植物などの双子葉植物をトランスフォーメーションするために使用することができる。次に、十分に成長したトランスフォーマント植物を、テンボトリオンなどのＨＰＰＤ阻害剤型除草剤に対するそれらの耐性について試験する。除草処理に対して観察された病徴の発生を評価し、同条件下での野生型植物の応答と比較する。
【０２５３】
植物のトランスフォーメーション、および１００ｇ ＡＩ／ＴＢＴを用いたＴ０の選択
一例として、Ｔ−ＤＮＡ  ＰｒｏｍＣａＭＶ３５Ｓ−ＯＴＰ−ＨＩＳ６−ＦＭＰ３７ｔ−ＴｅｒＣａＭＶ３５Ｓを含有する発根植物を標準的な成長条件下の温室に移す。２週間の順化期間の後に、Ｔ０植物を、硫酸アンモニウムおよび菜種油メチルエステルを補充されたＷＰ２０（水和剤２０％）製剤から調製された、１００ｇテンボトリオン/haを含有する混合物で処理する。処理の２週間後に、除草剤の施用による病徴を評価する。植物を４種類に分類する。「０」と評価された、処理された植物は、未処理タバコ植物のように見える。「１」と評価された植物は、除草剤の施用が原因で一過性の軽度ブリーチング表現型を示す。「２」と評価された植物は、永続的な軽度〜重度ブリーチング病徴を示す。最後に、「３」と評価された植物は、同じ処理を受けた野生型タバコ植物のように見える。以下の表９に結果を要約する。
【０２５４】
【表１４】
0005871813.tif 000029
【０２５５】
結論として、ＦＭＰ３７ ＨＰＰＤを発現しているいくつかのタバコ植物は、テンボトリオンに対して耐性である。
【０２５６】
実施例６：Zea mays植物をトランスフォーメーションするためのベクターへのＦＭＰ３７ ＨＰＰＤをコードする遺伝子ＦＭＰ３７ｅ、ＦＭＰ３７ｔおよびＦＭＰ３７ｍのクローニング
ＦＭＰ３７ｅ（配列番号２）、ＦＭＰ３７ｔ（配列番号３）、ＦＭＰ３７ｍ−ｈ（配列番号１６）
ａ  −  ｐＨｏｅ６／Ａｃ中のＦＭＰ３７ｅ：E. coliのために最適化されたコドン使用頻度を有し、その５’末端にＯＴＰをコードする配列およびＨｉｓタグをコードする配列を有する遺伝子
ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターのコントロール下でE. coliに発現するために最適化された、ＨＰＰＤ ＦＭＰ３７をコードする遺伝子を含有するベクターｐＲＴ１００−ＦＭＰ３７ｅを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化した。ＣａＭＶ３５Ｓ：：ＯＴＰ：：ＦＭＰ３７ｅ：：ＣａＭＶ３５Ｓ−ｔｅｒｍカセットを、さらに、予め同制限酵素で消化し、脱リン酸しておいたバイナリーベクターｐＨｏｅ６／Ａｃ（米国特許第６，３１６，６９４号）にクローニングした。結果として生じたベクターをｐＨｏｅ６／Ａｃ／ＦＭＰ３７ｅと呼んだ。
【０２５７】
ｂ  −  ｐＨｏｅ６／Ａｃ中のＦＭＰ３７ｔ（配列番号３）：双子葉植物のために最適化されたコドン使用頻度を有し、かつその５’末端にＯＴＰをコードする配列およびＨｉｓタグをコードする配列を有する遺伝子
ｐＲＴ１００中のＦＭＰ３７ｔ。Nicotiana tobaccumでの発現のために最適化され、かつ５’末端に最適化トランジットペプチドおよびＨＩＳタグをコードする核酸配列を含有する、タンパク質ＦＭＰ３７をコードする遺伝子の一種を取り寄せ、ＦＭＰ３７ｔと呼んだ。この配列の上流に制限酵素ＸｈｏＩのための認識配列および下流に制限酵素ＸｂａＩのための認識配列を付加した。ＯＴＰおよびＦＭＰ３７ｔに対応するＤＮＡを制限酵素ＸｈｏＩおよびＸｂａＩで消化し、適切なゲル電気泳動により分離し、予めＸｈｏＩおよびＮｃｏＩ制限酵素で消化しておいたベクターｐＲＴ１００（Toepfer,（1987), Nucleic Acid Res 15:5890）にクローニングした。プラスミドｐＲＴ１００は、ＣａＭＶ３５ＳプロモーターおよびＣａＭＶ３５Ｓターミネーターを含有する。結果として生じたベクターをｐＲＴ１００−ＦＭＰ３７ｔと呼び、それを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＣＡＭＶ３５Ｓ：：ＯＴＰ：：ＦＭＰ３７ｔ：：ＣａＭＶ３５Ｓ−ｔｅｒｍカセットに対応するＤＮＡを予め制限酵素処理しておいたベクターｐＨｏｅ６／Ａｃ（米国特許第６．３１６．６９４号）にクローニングするためにベクターの残りからそれを分離した。結果として生じたベクターをｐＨｏｅ６／Ａｃ／ＦＭＰ３７ｔと呼んだ（図３）。
【０２５８】
ｃ  −  ｐＨｏｅ６／Ａｃ中のＦＭＰ３７ｍ（配列番号１６）：単子葉植物のために最適化されたコドン使用頻度およびその５’末端にＯＴＰをコードする配列を有する遺伝子。
ｐＲＴ１００−ＯＴＰ（ＮｃｏＩ−ＸｂａＩ）中のＦＭＰ３７ｍの次にＨｉｎｄＩＩＩ
ＦＭＰ３７をコードする、単子葉植物での発現のために最適化された遺伝子のＦＭＰ３７ｍと呼ばれる変異体を取り寄せ、開始コドンの上流にＮｃｏＩ制限部位を付加し、一方で停止コドンの下流に制限酵素ＸｂａＩのための認識配列を付加した。ＦＭＰ３７ｍに対応するＤＮＡ配列を制限酵素ＮｃｏＩおよびＸｂａＩで消化し、次にゲル電気泳動によって分離させ、最終的にゲルから単離した。単離されたＤＮＡフラグメントを、同様に予め同じ制限酵素で消化しておいたベクターｐＲＴ１００−ＯＴＰ（上述）と混合した。結果として生じた、発現カセットＣａＭＶ３５Ｓ：：ＯＴＰ：：ＦＭＰ３７ｍ：：ＣａＭＶ３５Ｓｔｅｒｍを含有するベクターをｐＲＴ１００−ＯＴＰ−ＦＭＰ３７ｍと呼び、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩを使用してそれを単離し、次にさらに、予め開いて脱リン酸しておいたベクターｐＨＯＥ６／Ａｃにクローニングした。ベクターｐＨＯＥ６／Ａｃは、ＰＡＴ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）酵素をコードする遺伝子を含有し、除草剤グルホシネートに対する耐性を付与する（米国特許第６，３１６，６９４号）。結果として生じたプラスミドをｐＨｏｅ／Ａｃ／ＦＭＰ３７ｍと呼んだ（図３Ｆ）。
【０２５９】
トウモロコシのトランスフォーメーション：
プラスミドｐＨｏｅ６／Ａｃ（米国特許第６，３１６，６９４号）、ｐＨｏｅ６／Ａｃ／ＦＭＰ３７ｅ、ｐＨｏｅ６／Ａｃ／ＦＭＰ３７ｔおよびｐＨｏｅ６／Ａｃ／ＦＭＰ３７ｍを使用してトウモロコシ培養物をトランスフォーメーションした。トウモロコシの培養、プロトプラストの単離、トランスフォーメーションおよび稔性トランスジェニックトウモロコシ植物の再生は、米国特許第６２８４９４５号、"Zea mays（L.) with capability of long term、highly efficient plant regeneration including fertile transgenic maize having a heterologous gene、and their preparation"にしたがって行った。トランスフォーメーションされたカルスは、ホスフィノトリシンを含有する培地で選択した。次に、再生した発根植物を土壌に移植し、温室中で標準条件下（２８／２０℃）で成長および種子を産生させた。種子産生まで成植物を成長させ、さらなる播種のために種子を収集し、十分に発達した植物をそれぞれのＨＰＰＤ阻害剤型除草剤で処理する。
【０２６０】
実施例７：イネ植物に発現されるＦＭＰ３７ｅ遺伝子を含有するベクターの構築
イネ植物のトランスフォーメーション用のバイナリーベクターは、例えば、ＦＭＰ３７ｅの発現を推進するＣａＭＶ３５プロモーターを有し、E coli細菌での発現のために最適化されたコドン使用頻度を有するように構築し、その５’末端にＨｉｓタグをコードする配列およびさらに上流にＯＴＰをコードする配列、およびそれに続いてＣａＭＶ３５Ｓターミネーターを付加した。追加的に、トランスフォーメーションベクターは、また、トランスフォーメーション工程の間にグルホシネートに基づく選択を行うために、遺伝子がＣａＶＭ３５Ｓプロモーターに続いてＣａＭＶ３５Ｓターミネーターによって推進されるＰＡＴ遺伝子カセットを含有する（図３Ｉ参照）。そのバイナリーベクターをｐＴＭＶ３７０と呼んだ。類似であるが、ＨＰＰＤ酵素をコードするArabidopsis遺伝子を発現している発現カセットを含むバイナリーベクターを同様に構築した。
【０２６１】
実施例８：イネ植物のトランスフォーメーション
イネのトランスフォーメーションは、当技術分野で周知の方法を使用して達成する。簡潔には、未熟胚を使用して復旧系統６Ｇ４３１７からイネのAgrobacterium tumefaciens介在性トランスフォーメーションを行った。簡潔には、ドナー植物からの円錐花序を受粉の８〜１２日後に採集した。未熟種子の外花穎を除去した。その後、ＮａＯＣｌベースの溶液およびツイーンを使用して種子を滅菌した。種子をアセチルサリチル酸で予備誘導した。次に、Agrobacterium tumefaciens細胞を、暗条件でアセトシリンゴンの存在下で予備誘導した種子と共に２４℃で４日間共培養した。その後、胚からの子葉鞘を除去および洗浄し、次にホスフィノトリシンを補充した培地上に１６時間の光周期リズムで２８℃下で３週間置いた。次に、成長中のカルスを胚から切り取り、トリアシリン（triacillin）、ホスフィノトリシン、Ｌ−プロリンおよび硫酸銅（ＩＩ）を含有する新鮮培地に移植した。各カルス系統について、そしてテンボトリオン濃度によって異なるカルス片からランダムに単離した３個の苗条を、テンボトリオンを有するＭＳ／２に移植した。一般則として、再生培地からＭＳ／２への苗条の移植は、カルスが再生培地上に置かれてから９週間後に行った。培養物を２６．５℃でインキュベーションし（１６時間の光周期）、病徴の評価を２週間後に行った。
【０２６２】
移植された苗条から新しく発生している葉をブリーチングに基づいて評点付け、３群に分類した：
ａ）ブリーチングなし
ｂ）中程度のブリーチング
ｃ）完全なブリーチング
【０２６３】
分類「中程度のブリーチング」の中で、非常にわずかなブリーチング病徴を示している新しい葉を有することから緑の葉になる傾向にある苗条と、新しい葉がほとんど完全にブリーチングされた苗条の間で区別を行った。
【０２６４】
【表１５】
0005871813.tif 000030
【０２６５】
Ｔ０発根小植物を温室中の土壌に移植した。順化期間の後に、十分に成長した植物を異なるＨＰＰＤ阻害剤型除草剤で処理した。一例として、硫酸アンモニウムおよび菜種油メチルエステルを補充したテンボトリオンＷＰ２０をＴ０植物に１００ｇ AI/haスプレー散布した。スプレー施用の７日後に除草剤の施用が原因の病徴を評価し、同じ処理を受けた野生型植物で観察された病徴と比較した。
【０２６６】
温室試験でのテンボトリオンに対する応答
Ｔ０発根小植物（ホスフィノトリシン単独またはテンボトリオンを補充されたホスフィノトリシンのいずれかで選択）を温室中の土壌に移植した。順化期間の後に、十分に成長した植物を異なるＨＰＰＤ阻害剤型除草剤で処理した。一例として、硫酸アンモニウムおよび菜種油メチルエステルを補充されたＷＰ２０型製剤のテンボトリオンをＴ０植物に１００ｇ AI/haスプレー散布した。スプレー施用の７日後に、除草剤の施用が原因の病徴を評価し、同じ処理を受けた野生型植物で観察された病徴と比較した。処理の７日後に除草剤に応答して発生した表現型に基づき植物を３種類に分類した。クラスＩは、被害を示さなかった植物として定義し、クラスＩＩは、除草剤処理に応答して一時的な軽い被害を示した植物として定義し（被害：１０〜４０％）、クラスＩＩＩは、強い被害〜同じ処理を受けた野生型植物で見られたものと類似の被害を示している植物として定義した（被害：４１〜１００％）。一般に、一つだけのＴ−ＤＮＡ挿入物を含有する植物であっても、すでに、ＨＰＰＤ阻害剤型除草剤テンボトリオンの露地供与量に対して顕著で十分なレベルの耐性を示したことが分かることができる。
【０２６７】
【表１６】
0005871813.tif 000031
【０２６８】
結論として、タンパク質ＦＭＰ３７を発現しているイネ植物が、野生型イネ植物よりもＨＰＰＤ阻害剤型除草剤テンボトリオンの施用に対して高い耐性であることが分かる。
【０２６９】
実施例９：ダイズ−バイナリートランスフォーメーションベクターの構築
ダイズのトランスフォーメーション用のバイナリーベクターを、例えば、双子葉植物に発現させるためにコドン使用頻度が最適化された遺伝子ＦＭＰ３７ｔ−ｈ（配列番号１５）の発現を推進するＣａＭＶ３５プロモーターを有するように構築し、その５’末端にＯＴＰをコードする配列、およびさらに上流に植物でのｍＲＮＡの安定性を改善するための配列ＴＥＶ（タバコエッチウイルス）に続いてＣａＭＶ３５Ｓターミネーターを付加した。遺伝子ＦＭＰ３７ｔ−ｈのヌクレオチド配列を配列番号１５に示す。追加的に、トランスフォーメーションベクターは、また、トランスフォーメーション工程の間にグルホシネートに基づく選択のために遺伝子がＣａＶＭ３５Ｓプロモーターに続いてＣａＭＶ３５Ｓターミネーターによって推進されるＰＡＴ遺伝子カセット、およびトランスフォーメーションされた植物に除草剤グリフォセートに対する耐性を付与するために遺伝子がArabidopsis由来ヒストンプロモーターによって推進される２ｍＥＰＳＰＳ遺伝子カセットを含有する（図３Ｈ）参照。そのバイナリーベクターをｐＦＣＯ１１２と呼んだ。
【０２７０】
実施例１０：ダイズＴ０植物の樹立および選択
ダイズのトランスフォーメーションは、Pazら（2006, Plant cell Rep. 25:206)によって記載されたAgrobacterium tumefaciens介在性トランスフォーメーション由来ダイズ半切種子外植体を使用して説明された方法などの、当技術分野で周知の方法を使用して達成される。トランスフォーマントは、選択マーカーとしてイソキサフルトールを使用して確認した。緑色苗条の出現を観察し、除草剤イソキサフルトール耐性の指標として記述した。全体で、被験トランスジェニック苗条の１．５％は、イソキサフルトールで処理されていない野生型ダイズ苗条に匹敵する正常な緑化を示したが、一方で同量のイソキサフルトールで処理された野生型ダイズ苗条は完全にブリーチングした。これは、ＦＭＰ３７タンパク質の存在がイソキサフルトールにようにＨＰＰＤ阻害剤型除草剤に対する耐性を可能にすることを示している。
【０２７１】
耐性緑色苗条を発根培地に移植するかまたは接木した。発根した小植物を順化期間の後に温室に移した。次に、導入遺伝子を含有する植物に例えばテンボトリオンのようなＨＰＰＤ阻害剤型除草剤を１００ｇ AI/haの量でスプレー散布した。施用の１０日後に除草剤の施用が原因の病徴を評価し、同条件下の野生型植物で観察された病徴と比較した。ＦＭＰ３７  ＨＰＰＤタンパク質を発現している８イベントを上記緑色苗条から作製し、温室に移した。４週間順化させた後に、すなわち、３〜４節間に成長した工程の植物を、硫酸アンモニウムおよび菜種油メチルエステルを補充されたＷＰ２０製剤から調製した１００ｇ AI/haのテンボトリオンで処理した。施用の１０日後に、ＨＰＰＤ阻害剤型除草剤の施用によって起こった病徴を評価し、処理された非トランスジェニック野生型ダイズ植物で観察された病徴と比較した。８イベントのうち４イベントはブリーチング表現型を示さず、非処理野生型ダイズ植物のように見えた。１イベントは、一過性の軽度ブリーチング病徴を示したが、テンボトリオン施用の１４日後に回復した。もう一つのイベントは、局所一過性ブリーチング病徴を示したが、テンボトリオン施用の７日後に完全に回復した。残り二つのイベントは、テンボトリオンの処理後に非トランスジェニック野生型ダイズ植物のようなブリーチングを示した。これら全てのデータは、ＦＭＰ３７がダイズ植物にテンボトリオンのようなＨＰＰＤ阻害剤型除草剤に対する耐性を付与することを確認するものである。
【０２７２】
実施例１１：ワタ−バイナリートランスフォーメーションベクターの構築
ワタのトランスフォーメーション用のバイナリーベクターは、例えば、双子葉植物での発現用に最適化されたコドン使用頻度を有する遺伝子ＦＭＰ３７ｔ−ｈ（配列番号１５）の発現を推進するＣａＭＶ３５プロモーターを用いて構築し、その５’末端にＯＴＰをコードする配列およびさらに上流に植物でのｍＲＮＡの安定性を改善するための配列ＴＥＶ（タバコエッチウイルス）、それに続いてＣａＭＶ３５Ｓターミネーターを付加した。遺伝子ＦＭＰ３７ｔ−ｈのヌクレオチド配列を配列番号１５に示す。追加的に、トランスフォーメーションベクターは、また、トランスフォーメーション工程の間にグルホシネートに基づく選択を行うために、その遺伝子がＣａＶＭ３５Ｓプロモーターに続いてＣａＭＶ３５Ｓターミネーターによって推進されるＰＡＴ遺伝子カセットおよびトランスフォーメーションされた植物に除草剤グリフォセートに対する耐性を付与するためのArabidopsis由来ヒストンプロモーターによってその遺伝子が推進される２ｍＥＰＳＰＳ遺伝子カセットを含有する（図３Ｊ参照）。そのバイナリーベクターをｐＴＳＩＨ２１と呼んだ。
【０２７３】
実施例１２：ワタＴ０植物の樹立および選択
ワタのトランスフォーメーションを、当技術分野において周知の方法、特に好ましくはＰＣＴ特許公報である国際公開公報第００／７１７３３号に記載された方法を使用して達成する。
【０２７４】
再生した植物を温室に移す。順化期間の後に、十分に成長した植物に例えば硫酸アンモニウムおよび菜種油メチルエステルを補充されたテンボトリオンのようなＨＰＰＤ阻害剤型除草剤を１００ｇ AI/haスプレー散布する。スプレー施用の７日後に除草剤処理による病徴を評価し、同条件下で同じ処理に供された野生型ワタ植物で観察された病徴と比較する。
【０２７５】
実施例１３：別個の作用機序を有する４種の除草剤に対して耐性の植物を作製するためのバイナリートランスフォーメーションベクターの構築
双子葉植物のトランスフォーメーション用のバイナリーベクターを、例えば、双子葉植物での発現のために最適化されたコドン使用頻度を有する遺伝子ＦＭＰ３７ｔ−ｈ（配列番号１５）の発現を推進するＣａＭＶ３５プロモーターを用いて構築し、その５’末端にＯＴＰをコードする配列に続いてＣａＭＶ３５Ｓターミネーターを付加し」た。遺伝子ＦＭＰ３７ｔ−ｈのヌクレオチド配列を配列番号１５に示す。追加的に、トランスフォーメーションベクターは、また、その遺伝子を発現している植物にグルホシネート耐性を付与するために、ＣａＶＭ３５Ｓプロモーターに続いてＣａＭＶ３５Ｓターミネーターによってその遺伝子が推進されるＰＡＴ遺伝子カセット、トランスフォーメーションされた植物に除草剤グリフォセートに対する耐性を付与するためにArabidopsis由来ヒストンプロモーターによってその遺伝子が推進される二重突然変異体（Ｔｈｒ１０２ＩｌｅおよびＰｒｏ１０６Ｓｅｒ）ＥＰＳＰＳをコードする２ｍＥＰＳＰＳ遺伝子カセット、およびこの遺伝子を発現している植物にスルホニル尿素またはイミダゾリノンのクラスの除草剤に対する耐性を付与するＣａＭＶ３５Ｓプロモーターによって推進される耐性ＡＬＳ酵素（アセト乳酸シンターゼ、Ｐｒｏ１９７Ａｌａ、Ｔｒｐ５７４Ｌｅｕ）をコードするArabidopsis thaliana ２ｍＡＨＡＳ遺伝子カセットを含有する（図３Ｇ参照）。遺伝子カセットを、最終的にベクターｐＨｏｅ６／Ａｃ（米国特許第６，３１６，６９４号）にクローニングし、最終ベクターをｐＨｏｅ６／ＦＭＰ３７ｔ−ｈ／ＰＡＴ／ＥＰＳＰＳ／ＡＨＡＳと呼び、Agrobacterium tumefaciens介在性の現況技術の方法により双子葉植物をトランスフォーメーションするために使用する。Ｔ０植物を土壌に移植し、順化期間の後に、十分に成長した植物にＨＰＰＤ阻害剤クラスの除草剤、次にグリフォセート、次にグルホシネート、最終的に例えばスルホニル尿素のクラスの除草剤を連続的にスプレー散布する。
【０２７６】
実施例１４：三つの異なる作用機序の除草剤に対して耐性を示すトランスジェニック植物の作製
タバコのトランスフォーメーション用のバイナリーベクターを、例えば、双子葉植物での発現用に最適化されたコドン使用頻度を有する遺伝子ＦＭＰ３７ｔ−ｈ（配列番号１５）の発現を推進するＣａＭＶ３５プロモーターを用いた構築し、その５’末端にＯＴＰをコードする配列、およびさらに上流に植物中のｍＲＮＡの安定性を改善するための配列ＴＥＶ（タバコエッチウイルス）、続いてＣａＭＶ３５Ｓターミネーターを付加した。遺伝子ＦＭＰ３７ｔ−ｈのヌクレオチド配列を配列番号１５に示す。追加的に、トランスフォーメーションベクターは、また、トランスフォーメーション工程の間のグルホシネートに基づく選択のためにその遺伝子がＣａＶＭ３５Ｓプロモーターに続くＣａＭＶ３５Ｓターミネーターによって推進されるＰＡＴ遺伝子カセットおよびトランスフォーメーションされた植物に除草剤グリフォセートに対する耐性を付与するためにその遺伝子がArabidopsis由来ヒストンプロモーターによって推進される２ｍＥＰＳＰＳ遺伝子カセットを含有する（図３Ｈ参照）。バイナリーベクターをｐＦＣＯ１１２と呼んだ。上記ベクターを使用して、実施例３にしたがってNicotiana tobacum植物から得られた葉ディスクをトランスフォーメーションした。トランスジェニックタバコ植物を温室に移し、１１２１ｇ AI/haの量のグリフォセートで処理した。そのような耐性タバコ植物から種子を産生させ収穫した。これらの種子を土壌に蒔き、温室内で発芽させた。３〜４週間後に、１イベントあたり５０個の小植物を個別の鉢に移植した。２週間後に大きさ４〜６cmの植物に：
−  グルホシネート−アンモニウム  １０００ｇ AI/ha、
−  グリフォセート  １１２１ｇ AI/ha
−  テンボトリオン  １００ｇ AI/ha、または
−  テンボトリオン＋グリフォセート  １００ｇ AI/ha＋１１２１ｇ AI/ha
のいずれかをスプレー散布した。
【０２７７】
９日後に、それぞれの除草剤の施用によって起こった病徴を、下記表１２に概要するように評価した。処理の７日後にそれぞれの除草剤に応答して発生した表現型に基づき、植物を３種類に分類した。クラスＩを、被害を示さなかった植物と定義し、クラスＩＩを、除草剤処理に応答して一過性の軽度の被害を示した植物として定義し（被害：１０〜４０％）、クラスＩＩＩを、強い被害〜同じ処理を受けた野生型植物で見られたものと類似の被害を示している植物と定義した（被害：４１〜１００％）。一つまたは複数の上記除草剤を使用した処理によって、非トランスジェニックタバコ植物は、完全に死滅した。
【０２７８】
【表１７】
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【０２７９】
これらのデータは全て、ＨＰＰＤ阻害剤型除草剤、グリフォセートおよびグルホシネート−アンモニウムに関するいくつかの耐性遺伝子をコードするこれらの植物が、単独でまたは相互に組み合わせて施用されたこれらの除草剤のいずれかに対する耐性を付与することを確認するものである。
【０２８０】
これは、単一のローカスにこれらの三つの耐性遺伝子を含有するトランスジェニック植物が、農学的に関連する施用量でそのような除草剤に対して除草剤耐性を示した最初である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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