(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト化Ｉｇ遺伝子座を含むトランスジェニックベクターであって、該ヒト化Ｉｇ遺伝子座が、ウサギのＩｇ遺伝子座またはＩｇ遺伝子座の一部に由来し、該ヒト化Ｉｇ遺伝子座は、複数のＩｇ遺伝子セグメントを含み、ここで：
（ａ）該遺伝子セグメントが、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１及び配列番号１９２のものであり；
（ｂ）該遺伝子セグメントが、再構成されていない配置、部分的に再構成された配置、または完全に再構成された配置において並列しており；そして
（ｃ）該ヒト化Ｉｇ遺伝子座が、遺伝子再構成を受けることができ、かつ遺伝子変換および／または超変異を受けることができ、そして前記ウサギにおいて、ヒト化免疫グロブリンのレパートリーを生じることができる、
トランスジェニックベクター。
【請求項２】
ウサギ中でヒト化抗体の機能的なレパートリーを生じることができるヒト化免疫グロブリン遺伝子座を含むトランスジェニックベクターを作製するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）少なくとも１つのＶ遺伝子セグメント、少なくとも１つのＪ遺伝子セグメント、および少なくとも１つの定常領域遺伝子セグメントを含む該動物に由来するＩｇ遺伝子座またはその一部を含むＤＮＡフラグメントを得る工程；ならびに
（ｂ）ヒト化Ｉｇ遺伝子座を生じるように、工程（ａ）のＤＮＡフラグメント中に配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１及び配列番号１９２の遺伝子セグメントを組み込む工程であって、ここで、（ｉ）該遺伝子セグメントが、再構成されていない配置、部分的に再構成された配置、または完全に再構成された配置において並列しており；そして（ｉｉ）ヒト化Ｉｇ遺伝子座が遺伝子再構成を受けることができ、遺伝子変換および／または超変異を受けることができ、そして該ウサギ中でヒト化免疫グロブリンのレパートリーを生じることができる、工程、
を包含する、方法。
【請求項３】
請求項１に記載のトランスジェニックベクター中に存在するヒト化免疫グロブリン遺伝子座を含む、トランスジェニックウサギであって、完全な内因性の調節機構および抗体産生機構を保存している、トランスジェニックウサギ。
【請求項４】
請求項３に記載のトランスジェニックウサギに由来するＢ細胞であって、請求項１に記載のトランスジェニックベクター中に存在するヒト化免疫グロブリン遺伝子座を含む、Ｂ細胞。
【請求項５】
請求項３に記載のトランスジェニックウサギを用いてヒト化免疫グロブリンを産生するための方法。
【請求項６】
前記ヒト化免疫グロブリンが抗体であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ヒト化免疫グロブリンがポリクローナル抗体であることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ヒト化免疫グロブリンがモノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
特許協力条約の実施細則の８０１（ａ）（ｉ）およびＰＣＴ規則５．２に従い、本出願は、２００４年７月１５日に１．４８９ＫＢのサイズで作成された、ファイル３９６９１−０００７ＰＣＴとして保存された配列表を含むコンパクトディスクと、配列表の紙コピーに代わる２部のコピーによって行われる。その内容全体が、引用により本明細書中に明確に組み込まれる。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、非ヒトトランスジェニック動物からヒト化抗体を生産させるための方法および手段に関する。本発明は、具体的には、新規の免疫グロブリン重鎖および軽鎖構築物、ヒト化抗体を発現する非ヒトトランスジェニック動物を作成することにおいて有用である組み換えのトランスジェニックベクター、トランスジェニック動物、ならびにヒト化免疫グロブリン調製物に関する。トランスジェニックベクターには、ヒト化された免疫グロブリン遺伝子座が含まれる。これには、非ヒト動物内因性の調節機構および抗体生産機構を本質的には完全なまま残し、多様化させられたヒト化抗体を生じるように、非ヒトトランスジェニック動物中で、遺伝子再構成、遺伝子変換、および超変異を受けさせることができる。得られるヒト化抗体は、ヒトに対する最少の免疫原性を有しており、ヒト患者の治療的処置における使用に適している。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
抗体は、薬学的産物の１つの重要なクラスである。これは、ガン、アレルギー性疾患のような種々のヒトの疾患および症状の処置、移植による拒絶反応、宿主対移植片反応の予防において良好に使用されている。
【０００４】
動物から得られる抗体調製物の重要な問題点は、ヒト患者において本来備わっている、非ヒト免疫グロブリンについての免疫原性である。非ヒト抗体の免疫原性を低下させるためには、動物の可変（Ｖ）領域のエキソンをヒト定常（Ｃ）領域のエキソンと融合させることにより、キメラ抗体遺伝子を得ることができることが示されている。
【０００５】
ヒト化モノクローナル抗体もまた開発されており、これは、臨床的に使用されている。ヒト化モノクローナル抗体は、通常は、ヒト抗体であり、その中のいくつかのＣＤＲ残基と、場合によってはいくつかのＦＲ残基が、非ヒト動物、例えば、齧歯類の抗体の中に類似している部位に由来する残基で置換されている。ヒト化は、本質的には、Ｗｉｎｔｅｒとその共同研究者らの方法に従って（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４（１９８８））、非ヒト動物、例えば、齧歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列を、ヒトのモノクローナル抗体の対応する配列で置換することによって、行うことができる。
【０００６】
キメラの生殖細胞系列変異体マウスにおける抗体重鎖−結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合体欠失により、内因性抗体の生産の完全な阻害が生じることが記載されている。ヒトの生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子配列を、そのような生殖細胞系列変異体マウスに導入することにより、抗原でのチャレンジの際にヒト抗体の生産が生じる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７：３３（１９９３）を参照のこと。この遺伝子操作によるアプローチによって、遺伝子操作されたマウス中でヒト免疫グロブリンポリペプチドの発現が生じるが、ヒト免疫グロブリンの発現レベルは低い。これは、免疫グロブリンの効率的な発現に不可欠である免疫グロブリン遺伝子座の中の種特異的調節エレメントが原因である。トランスフェクトされた細胞株において示されるように、ヒトの免疫グロブリン遺伝子中に存在する調節エレメントは、非ヒト動物においては適正には機能しない場合がある。
【０００７】
実際に、免疫グロブリン遺伝子中のいくつかの調節エレメントが記載されている。特に注目すべきは、重鎖定常領域の下流（３’）のエンハンサーと、軽鎖遺伝子中にあるイントロンのエンハンサーである。さらに、他の、すでに同定されている制御エレメントもまた、免疫グロブリン遺伝子中に存在し得る。マウスでの研究では、免疫グロブリン分子の膜と、膜形態の細胞質尾部が、ヒトＣγ１遺伝子についてホモ接合型であるマウスの血清中でのヒト−マウスキメラ抗体の発現レベルにおいて重要な役割を果たしていることが示されている。したがって、動物中でのヘテロ接合型免疫グロブリン遺伝子の発現については、エンハンサーエレメントと、膜貫通部分（Ｍ１エキソン）および細胞質尾部（Ｍ２エキソン）をコードするエキソンを含む配列を、動物において通常見ることができる配列と、同様の位置で、置き換えることが望まれる。
【０００８】
非ヒト抗体の潜在的な免疫原性によって生じる問題に加えて、モノクローナル抗体の使用は、通常は、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体を問わず、ガンのような破壊的な疾患、および伝染力の強い病原体での感染が、その複雑さ、様々な原因によるとされる病因論、および適応性にあることが原因で１つの標的を攻撃することによって処置することは困難であるという事実によって、さらに限定される。著しく定義された標的に対して指向させられたモノクローナル抗体は、その標的が変化する、進化する、および突然変異すると、うまくいかない。したがって、悪性腫瘍は、標準的なモノクローナル抗体での治療に対して耐性を獲得する場合がある。この問題の解決方法は、ポリクローナル抗体の使用である。ポリクローナル抗体は、複雑な疾患に関係している複数の進化しつつある標的を標的化して、攻撃する能力を有している。ポリクローナル抗体は、また、細菌やウイルスの毒素を中和する能力も有しており、病原体を死滅させ、排除するための免疫反応を指示する。
【０００９】
したがって、高力価の、親和性の高いヒト化ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の大量生産に適している新しいアプローチが、臨床的に非常に必要とされている。
【００１０】
マウスのゲノム中にヒト免疫グロブリン遺伝子を導入することにより、遺伝子操作されたマウスにおいて多様化させられたヒト抗体のレパートリーの発現が生じる。マウスとヒトのいずれにおいても、主な抗体の多様性は、遺伝子再構成によって作成される。このプロセスにより、種々の抗原結合部位を有している多数の抗体分子をコードする多数の異なる組み換えＶ（Ｄ）Ｊセグメントが作成される。しかし、ウサギ、ブタ、ウシ、および鳥類のような他の動物においては、主な抗体の多様性は、実質的に異なる機構、すなわち、鋳型を用いる突然変異、または遺伝子変換、および鋳型を用いない突然変異、または超変異によって生じる。例えば、ウサギとニワトリにおいては、ＶＤＪ再構成が極めて限られており（免疫グロブリンのおよそ９０％が３’近傍にＶＨ１エレメントを伴って生じる）、抗体の多様性は、遺伝子変換と超変異によって生じる。対照的に、マウスとヒトの遺伝子変換は、仮にあったとしても極めて稀に生じる。したがって、遺伝子変換および超変異によってそれらの主な抗体のレパートリーを多様化させる動物においては、遺伝子の再構成に基づく遺伝子操作アプローチにより、低い抗体力価と限られた抗体多様性を有している動物が得られる。したがって、ヒトの治療のための非免疫原性の抗体調製物を生産するための大動物の遺伝子操作には、別の遺伝子操作ストラテジーが必要である。
【００１１】
非ヒトトランスジェニック動物中でのヒト化抗体の生産は、２００２年２月１４日に公開されたＰＣＴ公開番号ＷＯ０２／１２４３７に記載されている。この開示は、その全体を参照することにより明確に本明細書中に組み入れられる。ＷＯ０２／１２４３７には、１つ以上のヒト化免疫グロブリン遺伝子座を含む、遺伝子操作された非ヒト動物が記載されている。ヒト化免疫グロブリン遺伝子座は、非ヒトトランスジェニック動物中で遺伝子再構成と遺伝子変換を受けることができる。非ヒトトランスジェニック動物には、その中での抗体多様性が主に遺伝子変換によって生じて、多様化されたヒト化抗体を生じる動物が含まれる。得られたヒト化抗体は、ヒトに対して最少の免疫原性を有しており、ヒト患者の治療的処置における使用に適している。これには、さらに、種々の非ヒト哺乳動物、例えば、ニワトリ、ウシ、ヒツジ、およびウサギの免疫グロブリン重鎖定常領域セグメントの５’および３’隣接領域に由来する新規のヌクレオチド配列が記載されている。ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントに、そのような５’および３’配列に相同な配列が隣接している組み換えベクターは、非ヒト動物の免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントを、対応するヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントで置き換えるために有用であることが示されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の要旨）
１つの局面においては、本発明は、複数のヌクレオチド配列が隣接するヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントを含む単離された核酸分子に関する。ここで、隣接配列は、同じである場合も、異なる場合もあり、これには、遺伝子変換および／または超変異によって主に抗体多様性を生じる動物の免疫グロブリン重鎖もしくは軽鎖遺伝子に由来するスペーサー配列の、あるいは、２つ以上のスペーサー配列のコンセンサス配列に由来する、少なくとも約２０個の連続しているヌクレオチドが含まれる。
【００１３】
別の局面においては、本発明は、複数のヌクレオチド配列が隣接している、ヒト免疫グロブリン重鎖または軽鎖定常領域（Ｃ）遺伝子セグメントを含む単離された核酸分子に関する。ここで、隣接配列は、同じである場合も、異なる場合もあり、これには、非霊長類動物の免疫グロブリン重鎖もしくは軽鎖遺伝子に由来するスペーサー配列の、あるいは、２つ以上のスペーサー配列のコンセンサス配列に由来する、少なくとも約２０個の連続しているヌクレオチドが含まれる。
【００１４】
さらなる局面においては、本発明は、複数のヌクレオチド配列が隣接するヒト免疫グロブリン重鎖または軽鎖遺伝子セグメントを含む単離された核酸分子に関する。ここで、隣接配列は、同じである場合も、異なる場合もあり、これには、配列番号１から１８５（表１）からなる群より選択されるスペーサー配列の、あるいは、２つ以上のスペーサー配列のコンセンサス配列に由来する、少なくとも約２０個の連続しているヌクレオチドが含まれる。
【００１５】
１つの実施形態においては、隣接配列には、スペーサー配列の少なくとも約５０個の連続しているヌクレオチドが含まれる。
【００１６】
別の実施形態においては、ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、重鎖のＶ、Ｄ、またはＪセグメントであり、Ｖセグメントは、例えば、ＶＨ３、ＶＨ１、ＶＨ５、またはＶＨ４ファミリーのメンバーであり得る。
【００１７】
さらなる実施形態においては、ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、軽鎖ＶまたはＪセグメントであり、Ｖセグメントは、例えば、κ軽鎖遺伝子セグメント、例えば、Ｖκ１、Ｖκ３、またはＶκ４である場合も、また、λ軽鎖セグメント、例えば、Ｖλ１、Ｖλ２、またはＶλ３である場合もある。
【００１８】
さらなる実施形態においては、主に遺伝子変換および／または体細胞超変異により抗体多様性を生じる非霊長類動物とは、例えば、ウサギ、ブタ、鳥類（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、あるいはガチョウ）、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、またはロバであるが、霊長類ではない他の動物、例えば、齧歯類もまた、本発明の範囲に具体的に含まれる。
【００１９】
別の局面においては、本発明は、上記の核酸分子のいずれかを含む組み換えベクターに関する。
【００２０】
さらに別の局面においては、本発明は、ヒト化免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座を含むトランスジェニックベクターに関する。ここで、ヒト化Ｉｇ遺伝子座は、非ヒト動物のＩｇ遺伝子座またはＩｇ遺伝子座の一部に由来するものであり、これには、複数のＩｇセグメントが含まれる。ここで、
（ａ）少なくとも１つの遺伝子セグメントが、スペーサー配列に由来するか、または２つ以上のそのようなスペーサー配列のコンセンサス配列に由来する少なくとも２０個の連続しているヌクレオチドを含むヌクレオチド配列が隣接しているヒトＩｇ遺伝子セグメントであり；
（ｂ）複数の遺伝子セグメントが、再構成されていない立体配置、部分的に再構成された立体配置、または完全に再構成された立体配置において並列しており；そして
（ｃ）非ヒト動物が遺伝子を変換する動物であり、非ヒト動物中でヒト化された免疫グロブリンのレパートリーを生産する場合には、ヒト化Ｉｇ遺伝子座が遺伝子再構成を受けることができ、必要に応じて、さらに遺伝子変換および／または超変異を受けることができる。
【００２１】
さらなる実施形態においては、トランスジェニックベクター中に存在するヒト化Ｉｇ重鎖遺伝子座は、約５から１００個のＶ遺伝子セグメントを含み、これには少なくとも１つのヒトＶ遺伝子セグメントが含まれる。特異的な実施形態においては、ヒト化Ｉｇ重鎖遺伝子座には、１つ以上のヒトＶ遺伝子セグメントが含まれる。
【００２２】
別の実施形態においては、トランスジェニックベクター中に存在するヒト化Ｉｇ重鎖遺伝子座には、約５から２５個のＤの遺伝子セグメントが含まれる。特異的な実施形態においては、ヒト化Ｉｇ重鎖遺伝子座には、１つまたはいくつかのヒトＤ遺伝子セグメントが含まれる。
【００２３】
さらに別の実施形態においては、トランスジェニックベクター中に存在するヒト化Ｉｇ重鎖遺伝子座には、約１から１０個のＪ遺伝子セグメントが含まれ、これには少なくとも１つのヒトＪ遺伝子セグメントが含まれる。特異的な実施形態においては、ヒト化Ｉｇ重鎖遺伝子座には、１つ以上のヒトＪ遺伝子セグメントが含まれる。
【００２４】
別の実施形態においては、トランスジェニックベクター中に存在するヒト化Ｉｇ重鎖遺伝子座には、約１から２５個のＣ領域セグメントが含まれ、これには少なくとも１つのヒトＣ領域セグメントが含まれる。特異的な実施形態においては、トランスジェニックベクター中に存在するヒト化Ｉｇ重鎖遺伝子座には、１つ以上のヒトＣ遺伝子セグメントが含まれる。
【００２５】
なおさらに別の実施形態においては、トランスジェニックベクター中に存在するヒト化Ｉｇ遺伝子座は、非ヒト動物の軽鎖遺伝子座であり、これには、少なくとも１つのＶ遺伝子セグメントと、少なくとも１つのＪ遺伝子セグメントと、少なくとも１つの定常（Ｃ）領域遺伝子セグメントが含まれる。ここで、少なくとも１つの遺伝子セグメントは、ヒト軽鎖ＶおよびＪセグメント、ならびにヒト軽鎖Ｃ領域セグメントの群より選択される。特異的な実施形態においては、定常領域遺伝子セグメントは、ヒト軽鎖定常領域遺伝子セグメントであり、これは、例えば、ＣλまたはＣκ遺伝子セグメントであり得る。別の実施形態においては、ヒト化Ｉｇ軽鎖遺伝子座には、ヒトＶおよびＪセグメント、ならびにヒトＣ領域セグメントより選択される２つ以上のセグメントが含まれる。さらなる実施形態においては、ヒト化Ｉｇ軽鎖遺伝子座には、少なくとも１つのヒトＶセグメントと、少なくとも１つのヒトＪセグメントと、少なくとも１つのヒトＣ領域セグメントが含まれる。
【００２６】
さらなる実施形態においては、トランスジェニックベクター中に存在するヒト化Ｉｇ軽鎖遺伝子座には、約５から１００個のＶ遺伝子セグメントが含まれ、これには少なくとも１つのヒトＶ遺伝子セグメントが含まれる。ここで、ヒトＶ遺伝子セグメントは、非ヒト動物の５から１００個のＶ遺伝子セグメントに対して下流に存在する。特異的な実施形態においては、ヒトＶ遺伝子セグメントは、再構成された立体配置においてＪ遺伝子セグメントのすぐ５’側に存在する。別の実施形態においては、トランスジェニックベクター中に存在するヒト化Ｉｇ軽鎖遺伝子座には、１つ以上のヒトＶ遺伝子セグメントが含まれる。
【００２７】
なお別の実施形態においては、トランスジェニックベクター中に存在するヒト化Ｉｇ軽鎖遺伝子座には、約１から１０個のＪ遺伝子セグメントが含まれ、これには少なくとも１つのヒトＪ遺伝子セグメントが含まれる。特異的な実施形態においては、トランスジェニックベクター中に存在するヒト化Ｉｇ軽鎖遺伝子座には、１つ以上のヒトＪ遺伝子セグメントが含まれる。
【００２８】
別の実施形態においては、トランスジェニックベクター中に存在するヒト化Ｉｇ軽鎖遺伝子座には、約１から２５個のＣ領域セグメントが含まれ、これには少なくとも１つのヒトＣ領域セグメントが含まれる。特異的な実施形態においては、トランスジェニックベクター中に存在するヒト化Ｉｇ軽鎖遺伝子座には、１つ以上のヒトＣ遺伝子セグメントが含まれる。
【００２９】
なおさらなる実施形態においては、トランスジェニックベクター中に存在するヒト化Ｉｇ遺伝子座は、非ヒト動物の軽鎖遺伝子座であり、これには、少なくとも１つのＶ遺伝子セグメントと、少なくとも１つのＪ遺伝子セグメントと、少なくとも１つの定常（Ｃ）領域遺伝子セグメントが含まれる。ここで、少なくとも１つの遺伝子セグメントは、ヒト軽鎖ＶおよびＪセグメント、ならびにヒト軽鎖Ｃ領域セグメントの群より選択される。特異的な実施形態においては、定常領域遺伝子セグメントは、ヒト軽鎖定常領域遺伝子セグメントであり、これは、例えば、ＣλまたはＣκ遺伝子セグメントであり得る。別の実施形態においては、ヒト化Ｉｇ軽鎖遺伝子座には、ヒトＶおよびＪセグメント、ならびにヒトＣ領域セグメントより選択される２つ以上のセグメントが含まれる。さらなる実施形態においては、ヒト化Ｉｇ軽鎖遺伝子座には、少なくとも１つのヒトＶセグメントと、少なくとも１つのヒトＪセグメントと、少なくとも１つのヒトＣ領域セグメントが含まれる。
【００３０】
異なる局面においては、本発明は、５’から３’の方向で、５’ヌクレオチド配列、ヒト免疫グロブリン配列、そして３’ヌクレオチド配列からなる２つ以上のユニットを含む核酸分子に関する。ここで、５’ヌクレオチド配列と３’ヌクレオチド配列は同じである場合も、異なる場合もあり、これには、非霊長類動物の免疫グロブリン重鎖もしくは軽鎖遺伝子中のコード領域の間隔を隔てるスペーサー配列に由来するか、あるいは、２つ以上のスペーサー配列のコンセンサス配列に由来する、少なくとも約２０個の連続しているヌクレオチドが含まれる。特異的な実施形態においては、スペーサー配列は、配列番号１から１８５（表１）の中から選択される。別の特定の実施形態においては、核酸分子の全ての反復ユニット中の５’ヌクレオチド配列および／または３’ヌクレオチド配列は同じである。別の特定の実施形態においては、核酸分子の反復ユニットには、少なくとも２つの異なる５’配列および／または３’配列が含まれる。さらなる実施形態においては、５’ヌクレオチド配列と３’ヌクレオチド配列は互いに異なるが、全ての５’ヌクレオチド配列は同一であり、全ての３’配列も同一である。
【００３１】
さらなる局面においては、本発明は、非ヒト動物中でヒト化抗体の機能的なレパートリーを生産することができるヒト化免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座を含むトランスジェニックベクターを作成するための方法に関する。この方法には：
（ａ）少なくとも１つのＶ遺伝子セグメントと、少なくとも１つのＪ遺伝子セグメントと、少なくとも１つの定常領域遺伝子セグメントを含む、非ヒト動物に由来するＩｇ遺伝子座またはその一部を含むＤＮＡフラグメントを得る工程；ならびに、
（ｂ）ヒト化Ｉｇ遺伝子座を生産するように、工程（ａ）のＤＮＡフラグメント中に少なくとも１つのヒトＩｇ遺伝子セグメントを組み込む工程であって；ここで、ヒトＩｇ遺伝子セグメントには、非霊長類動物の免疫グロブリン重鎖もしくは軽鎖遺伝子中のコード領域の間隔を隔てるスペーサー配列に由来するスペーサー配列か、あるいは、２つ以上のそのようなスペーサー配列のコンセンサス配列に由来する、少なくとも約２０個の連続しているヌクレオチドを含むヌクレオチド配列が隣接しており；ここで、（ｉ）複数の遺伝子セグメントが、再構成されていない立体配置、部分的に再構成された立体配置、または完全に再構成された立体配置において並列しており；そして（ｉｉ）ヒト化Ｉｇ遺伝子座が遺伝子再構成を受けることができ、そして、必要に応じて、非ヒト動物中でヒト化免疫グロブリンのレパートリーを生産することができる、工程
が含まれる。
【００３２】
ヒト化Ｉｇ遺伝子座は、ヒト化Ｉｇ重鎖または軽鎖遺伝子座であり得る。ヒト化Ｉｇ重鎖遺伝子座の場合には、工程（ａ）で得られたＤＮＡフラグメントには、さらに、少なくとも１つのＤ遺伝子セグメントが含まれる。
【００３３】
別の局面においては、本発明は、上記のヒト化免疫グロブリン遺伝子座を含むトランスジェニック動物と、そのようなトランスジェニック動物を作成するための方法に関する。１つの実施形態においては、トランスジェニック動物には、ヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座と、ヒト化免疫グロブリン軽鎖遺伝子座の両方が含まれる。別の実施形態においては、トランスジェニック動物中に存在する重鎖遺伝子座と軽鎖遺伝子座のうち１つだけが、ヒト化されている。別の実施局面においては、動物の免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも１つのＶ、Ｄ、Ｊ、およびＣ領域の全てがヒト化されている。さらに別の実施形態においては、トランスジェニック動物の内因性免疫グロブリン遺伝子座のＶ、Ｄ、Ｊ、およびＣ領域の全てがヒト化されている。
【００３４】
さらなる局面においては、本発明は、本発明にしたがって生産されたトランスジェニック動物に由来するＢ細胞に関する。
【００３５】
なおさらなる局面においては、本発明は、本発明のトランスジェニック動物を使用して生産されるヒト化免疫グロブリンと、ヒト化免疫グロブリンを含む抗体調製物または薬学的組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１は、ウサギ免疫グロブリン遺伝子の重鎖遺伝子座の模式図である。
【図２】図２は、ウサギ重鎖スペーサー配列の比較を示す。
【図３】図３は、ウサギ重鎖スペーサー配列の比較を示す。
【図４】図４は、ウサギ重鎖スペーサー配列の比較を示す。
【図５】図５は、ウサギ免疫グロブリン軽鎖遺伝子座の模式図である。
【図６】図６は、ヒトＶＨエレメントとウサギのスペーサーエレメントを用いた免疫グロブリン遺伝子Ｖ遺伝子座の組み立てを説明する。
【図７】図７は、ｒｅｄεβγ−システムを用いた相同組み換えによる２つのカセットの挿入である。上のカセットには、ゲンタマイシンカセットに隣接している２つの制限部位（ＦｓｅＩとＡｓｃＩ）が含まれている。下のカセットには、反転させられ（ｉ）変異させられた（７１）ｌｏｘＰ部位と、ＦＲＴ部位と、ＭｌｕＩ制限部位が含まれている。修飾後、ＢＡＣはＦｓｅＩとＡｓｃＩで消化される。
【図８】図８は、ウサギＫ１軽鎖遺伝子座をベースとするヒト化ウサギ軽鎖遺伝子座（ｒＬＣ３−Ｂ）を示す。ウサギＣκ１をヒトＣκで置き換えた。ヒトの再構成ヒトＶκＪκが挿入されている。合成のヒトＶκＪκは、ウサギのＶκエレメントと８０％を超える配列相同性を共有する。
【図９ａ】図９ａは、ニワトリの軽鎖ゲノム遺伝子座を含むＢＡＣクローンの配列を示す。ニワトリの軽鎖ゲノム遺伝子座のヌクレオチド配列を図９ｂに示す（配列番号１８６）。
【図９ｂ−１】図９ａは、ニワトリの軽鎖ゲノム遺伝子座を含むＢＡＣクローンの配列を示す。ニワトリの軽鎖ゲノム遺伝子座のヌクレオチド配列を図９ｂに示す（配列番号１８６）。
【図９ｂ−２】図９ａは、ニワトリの軽鎖ゲノム遺伝子座を含むＢＡＣクローンの配列を示す。ニワトリの軽鎖ゲノム遺伝子座のヌクレオチド配列を図９ｂに示す（配列番号１８６）。
【図９ｂ−３】図９ａは、ニワトリの軽鎖ゲノム遺伝子座を含むＢＡＣクローンの配列を示す。ニワトリの軽鎖ゲノム遺伝子座のヌクレオチド配列を図９ｂに示す（配列番号１８６）。
【図９ｂ−４】図９ａは、ニワトリの軽鎖ゲノム遺伝子座を含むＢＡＣクローンの配列を示す。ニワトリの軽鎖ゲノム遺伝子座のヌクレオチド配列を図９ｂに示す（配列番号１８６）。
【図９ｂ−５】図９ａは、ニワトリの軽鎖ゲノム遺伝子座を含むＢＡＣクローンの配列を示す。ニワトリの軽鎖ゲノム遺伝子座のヌクレオチド配列を図９ｂに示す（配列番号１８６）。
【図９ｂ−６】図９ａは、ニワトリの軽鎖ゲノム遺伝子座を含むＢＡＣクローンの配列を示す。ニワトリの軽鎖ゲノム遺伝子座のヌクレオチド配列を図９ｂに示す（配列番号１８６）。
【図９ｂ−７】図９ａは、ニワトリの軽鎖ゲノム遺伝子座を含むＢＡＣクローンの配列を示す。ニワトリの軽鎖ゲノム遺伝子座のヌクレオチド配列を図９ｂに示す（配列番号１８６）。
【図９ｂ−８】図９ａは、ニワトリの軽鎖ゲノム遺伝子座を含むＢＡＣクローンの配列を示す。ニワトリの軽鎖ゲノム遺伝子座のヌクレオチド配列を図９ｂに示す（配列番号１８６）。
【図９ｂ−９】図９ａは、ニワトリの軽鎖ゲノム遺伝子座を含むＢＡＣクローンの配列を示す。ニワトリの軽鎖ゲノム遺伝子座のヌクレオチド配列を図９ｂに示す（配列番号１８６）。
【図９ｂ−１０】図９ａは、ニワトリの軽鎖ゲノム遺伝子座を含むＢＡＣクローンの配列を示す。ニワトリの軽鎖ゲノム遺伝子座のヌクレオチド配列を図９ｂに示す（配列番号１８６）。
【図１０】図１０は、ニワトリの免疫グロブリンスペーサー配列とヒトＶエレメントを用いた、ヒト化免疫グロブリン遺伝子座の構築を示す概要である。
【図１１】図１１は、マウスの免疫グロブリンスペーサー配列またはウサギの免疫グロブリンスペーサー配列と、ヒトＶエレメントを用いた、ヒト化免疫グロブリン遺伝子座の構築を示す概要である。
【図１２ａ−１】図１２ａから１２ｃは、ヒト化軽鎖遺伝子座を示す。１７個のヒトのＶ偽遺伝子と１８個のニワトリのスペーサー配列を含む合成の配列（図１２ａ、ユニット１、１２，２３５ｂｐ、配列番号１８７）を（ａ）に示す。機能的な再構成されたヒトＶκＪκ遺伝子フラグメントと、１１個のヒトＶ偽遺伝子と、１２個のニワトリのスペーサー配列と、２つのイントロンを含む、第２の合成の配列（図１２ｂ、ユニット２、１３，２８３ｂｐ、配列番号１８８）を（ｂ）に示す。ユニット１とユニット２を、ヒトＣκと、ウサギのイントロンと、スペーサー配列（図１２ｃ）を含むＢＡＣ１７９Ｌ１に由来するフラグメントを用いて結合させた。
【図１２ａ−２】図１２ａから１２ｃは、ヒト化軽鎖遺伝子座を示す。１７個のヒトのＶ偽遺伝子と１８個のニワトリのスペーサー配列を含む合成の配列（図１２ａ、ユニット１、１２，２３５ｂｐ、配列番号１８７）を（ａ）に示す。機能的な再構成されたヒトＶκＪκ遺伝子フラグメントと、１１個のヒトＶ偽遺伝子と、１２個のニワトリのスペーサー配列と、２つのイントロンを含む、第２の合成の配列（図１２ｂ、ユニット２、１３，２８３ｂｐ、配列番号１８８）を（ｂ）に示す。ユニット１とユニット２を、ヒトＣκと、ウサギのイントロンと、スペーサー配列（図１２ｃ）を含むＢＡＣ１７９Ｌ１に由来するフラグメントを用いて結合させた。
【図１２ａ−３】図１２ａから１２ｃは、ヒト化軽鎖遺伝子座を示す。１７個のヒトのＶ偽遺伝子と１８個のニワトリのスペーサー配列を含む合成の配列（図１２ａ、ユニット１、１２，２３５ｂｐ、配列番号１８７）を（ａ）に示す。機能的な再構成されたヒトＶκＪκ遺伝子フラグメントと、１１個のヒトＶ偽遺伝子と、１２個のニワトリのスペーサー配列と、２つのイントロンを含む、第２の合成の配列（図１２ｂ、ユニット２、１３，２８３ｂｐ、配列番号１８８）を（ｂ）に示す。ユニット１とユニット２を、ヒトＣκと、ウサギのイントロンと、スペーサー配列（図１２ｃ）を含むＢＡＣ１７９Ｌ１に由来するフラグメントを用いて結合させた。
【図１２ａ−４】図１２ａから１２ｃは、ヒト化軽鎖遺伝子座を示す。１７個のヒトのＶ偽遺伝子と１８個のニワトリのスペーサー配列を含む合成の配列（図１２ａ、ユニット１、１２，２３５ｂｐ、配列番号１８７）を（ａ）に示す。機能的な再構成されたヒトＶκＪκ遺伝子フラグメントと、１１個のヒトＶ偽遺伝子と、１２個のニワトリのスペーサー配列と、２つのイントロンを含む、第２の合成の配列（図１２ｂ、ユニット２、１３，２８３ｂｐ、配列番号１８８）を（ｂ）に示す。ユニット１とユニット２を、ヒトＣκと、ウサギのイントロンと、スペーサー配列（図１２ｃ）を含むＢＡＣ１７９Ｌ１に由来するフラグメントを用いて結合させた。
【図１２ｂ−１】図１２ａから１２ｃは、ヒト化軽鎖遺伝子座を示す。１７個のヒトのＶ偽遺伝子と１８個のニワトリのスペーサー配列を含む合成の配列（図１２ａ、ユニット１、１２，２３５ｂｐ、配列番号１８７）を（ａ）に示す。機能的な再構成されたヒトＶκＪκ遺伝子フラグメントと、１１個のヒトＶ偽遺伝子と、１２個のニワトリのスペーサー配列と、２つのイントロンを含む、第２の合成の配列（図１２ｂ、ユニット２、１３，２８３ｂｐ、配列番号１８８）を（ｂ）に示す。ユニット１とユニット２を、ヒトＣκと、ウサギのイントロンと、スペーサー配列（図１２ｃ）を含むＢＡＣ１７９Ｌ１に由来するフラグメントを用いて結合させた。
【図１２ｂ−２】図１２ａから１２ｃは、ヒト化軽鎖遺伝子座を示す。１７個のヒトのＶ偽遺伝子と１８個のニワトリのスペーサー配列を含む合成の配列（図１２ａ、ユニット１、１２，２３５ｂｐ、配列番号１８７）を（ａ）に示す。機能的な再構成されたヒトＶκＪκ遺伝子フラグメントと、１１個のヒトＶ偽遺伝子と、１２個のニワトリのスペーサー配列と、２つのイントロンを含む、第２の合成の配列（図１２ｂ、ユニット２、１３，２８３ｂｐ、配列番号１８８）を（ｂ）に示す。ユニット１とユニット２を、ヒトＣκと、ウサギのイントロンと、スペーサー配列（図１２ｃ）を含むＢＡＣ１７９Ｌ１に由来するフラグメントを用いて結合させた。
【図１２ｂ−３】図１２ａから１２ｃは、ヒト化軽鎖遺伝子座を示す。１７個のヒトのＶ偽遺伝子と１８個のニワトリのスペーサー配列を含む合成の配列（図１２ａ、ユニット１、１２，２３５ｂｐ、配列番号１８７）を（ａ）に示す。機能的な再構成されたヒトＶκＪκ遺伝子フラグメントと、１１個のヒトＶ偽遺伝子と、１２個のニワトリのスペーサー配列と、２つのイントロンを含む、第２の合成の配列（図１２ｂ、ユニット２、１３，２８３ｂｐ、配列番号１８８）を（ｂ）に示す。ユニット１とユニット２を、ヒトＣκと、ウサギのイントロンと、スペーサー配列（図１２ｃ）を含むＢＡＣ１７９Ｌ１に由来するフラグメントを用いて結合させた。
【図１２ｂ−４】図１２ａから１２ｃは、ヒト化軽鎖遺伝子座を示す。１７個のヒトのＶ偽遺伝子と１８個のニワトリのスペーサー配列を含む合成の配列（図１２ａ、ユニット１、１２，２３５ｂｐ、配列番号１８７）を（ａ）に示す。機能的な再構成されたヒトＶκＪκ遺伝子フラグメントと、１１個のヒトＶ偽遺伝子と、１２個のニワトリのスペーサー配列と、２つのイントロンを含む、第２の合成の配列（図１２ｂ、ユニット２、１３，２８３ｂｐ、配列番号１８８）を（ｂ）に示す。ユニット１とユニット２を、ヒトＣκと、ウサギのイントロンと、スペーサー配列（図１２ｃ）を含むＢＡＣ１７９Ｌ１に由来するフラグメントを用いて結合させた。
【図１２ｃ】図１２ａから１２ｃは、ヒト化軽鎖遺伝子座を示す。１７個のヒトのＶ偽遺伝子と１８個のニワトリのスペーサー配列を含む合成の配列（図１２ａ、ユニット１、１２，２３５ｂｐ、配列番号１８７）を（ａ）に示す。機能的な再構成されたヒトＶκＪκ遺伝子フラグメントと、１１個のヒトＶ偽遺伝子と、１２個のニワトリのスペーサー配列と、２つのイントロンを含む、第２の合成の配列（図１２ｂ、ユニット２、１３，２８３ｂｐ、配列番号１８８）を（ｂ）に示す。ユニット１とユニット２を、ヒトＣκと、ウサギのイントロンと、スペーサー配列（図１２ｃ）を含むＢＡＣ１７９Ｌ１に由来するフラグメントを用いて結合させた。
【図１３ａ−１】図１３ａ〜ｅは、ヒト化重鎖遺伝子座を示す。ヒトＶＨ３遺伝子フラグメントと、ウサギのスペーサーと、イントロン配列からなる４個の合成のＤＮＡフラグメント（ユニット１〜４、図１３ａ〜ｄ、配列番号１８９、１９０、１９１、１９２）を、（図１３ｅ）に示すように、ＢＡＣ  ２１９Ｄ２３、２７Ｎ５、およびＦｏｓ１５Ｂの一部と結合させた。
【図１３ａ−２】図１３ａ〜ｅは、ヒト化重鎖遺伝子座を示す。ヒトＶＨ３遺伝子フラグメントと、ウサギのスペーサーと、イントロン配列からなる４個の合成のＤＮＡフラグメント（ユニット１〜４、図１３ａ〜ｄ、配列番号１８９、１９０、１９１、１９２）を、（図１３ｅ）に示すように、ＢＡＣ  ２１９Ｄ２３、２７Ｎ５、およびＦｏｓ１５Ｂの一部と結合させた。
【図１３ｂ−１】図１３ａ〜ｅは、ヒト化重鎖遺伝子座を示す。ヒトＶＨ３遺伝子フラグメントと、ウサギのスペーサーと、イントロン配列からなる４個の合成のＤＮＡフラグメント（ユニット１〜４、図１３ａ〜ｄ、配列番号１８９、１９０、１９１、１９２）を、（図１３ｅ）に示すように、ＢＡＣ  ２１９Ｄ２３、２７Ｎ５、およびＦｏｓ１５Ｂの一部と結合させた。
【図１３ｂ−２】図１３ａ〜ｅは、ヒト化重鎖遺伝子座を示す。ヒトＶＨ３遺伝子フラグメントと、ウサギのスペーサーと、イントロン配列からなる４個の合成のＤＮＡフラグメント（ユニット１〜４、図１３ａ〜ｄ、配列番号１８９、１９０、１９１、１９２）を、（図１３ｅ）に示すように、ＢＡＣ  ２１９Ｄ２３、２７Ｎ５、およびＦｏｓ１５Ｂの一部と結合させた。
【図１３ｂ−３】図１３ａ〜ｅは、ヒト化重鎖遺伝子座を示す。ヒトＶＨ３遺伝子フラグメントと、ウサギのスペーサーと、イントロン配列からなる４個の合成のＤＮＡフラグメント（ユニット１〜４、図１３ａ〜ｄ、配列番号１８９、１９０、１９１、１９２）を、（図１３ｅ）に示すように、ＢＡＣ  ２１９Ｄ２３、２７Ｎ５、およびＦｏｓ１５Ｂの一部と結合させた。
【図１３ｂ−４】図１３ａ〜ｅは、ヒト化重鎖遺伝子座を示す。ヒトＶＨ３遺伝子フラグメントと、ウサギのスペーサーと、イントロン配列からなる４個の合成のＤＮＡフラグメント（ユニット１〜４、図１３ａ〜ｄ、配列番号１８９、１９０、１９１、１９２）を、（図１３ｅ）に示すように、ＢＡＣ  ２１９Ｄ２３、２７Ｎ５、およびＦｏｓ１５Ｂの一部と結合させた。
【図１３ｂ−５】図１３ａ〜ｅは、ヒト化重鎖遺伝子座を示す。ヒトＶＨ３遺伝子フラグメントと、ウサギのスペーサーと、イントロン配列からなる４個の合成のＤＮＡフラグメント（ユニット１〜４、図１３ａ〜ｄ、配列番号１８９、１９０、１９１、１９２）を、（図１３ｅ）に示すように、ＢＡＣ  ２１９Ｄ２３、２７Ｎ５、およびＦｏｓ１５Ｂの一部と結合させた。
【図１３ｃ−１】図１３ａ〜ｅは、ヒト化重鎖遺伝子座を示す。ヒトＶＨ３遺伝子フラグメントと、ウサギのスペーサーと、イントロン配列からなる４個の合成のＤＮＡフラグメント（ユニット１〜４、図１３ａ〜ｄ、配列番号１８９、１９０、１９１、１９２）を、（図１３ｅ）に示すように、ＢＡＣ  ２１９Ｄ２３、２７Ｎ５、およびＦｏｓ１５Ｂの一部と結合させた。
【図１３ｃ−２】図１３ａ〜ｅは、ヒト化重鎖遺伝子座を示す。ヒトＶＨ３遺伝子フラグメントと、ウサギのスペーサーと、イントロン配列からなる４個の合成のＤＮＡフラグメント（ユニット１〜４、図１３ａ〜ｄ、配列番号１８９、１９０、１９１、１９２）を、（図１３ｅ）に示すように、ＢＡＣ  ２１９Ｄ２３、２７Ｎ５、およびＦｏｓ１５Ｂの一部と結合させた。
【図１３ｃ−３】図１３ａ〜ｅは、ヒト化重鎖遺伝子座を示す。ヒトＶＨ３遺伝子フラグメントと、ウサギのスペーサーと、イントロン配列からなる４個の合成のＤＮＡフラグメント（ユニット１〜４、図１３ａ〜ｄ、配列番号１８９、１９０、１９１、１９２）を、（図１３ｅ）に示すように、ＢＡＣ  ２１９Ｄ２３、２７Ｎ５、およびＦｏｓ１５Ｂの一部と結合させた。
【図１３ｃ−４】図１３ａ〜ｅは、ヒト化重鎖遺伝子座を示す。ヒトＶＨ３遺伝子フラグメントと、ウサギのスペーサーと、イントロン配列からなる４個の合成のＤＮＡフラグメント（ユニット１〜４、図１３ａ〜ｄ、配列番号１８９、１９０、１９１、１９２）を、（図１３ｅ）に示すように、ＢＡＣ  ２１９Ｄ２３、２７Ｎ５、およびＦｏｓ１５Ｂの一部と結合させた。
【図１３ｄ−１】図１３ａ〜ｅは、ヒト化重鎖遺伝子座を示す。ヒトＶＨ３遺伝子フラグメントと、ウサギのスペーサーと、イントロン配列からなる４個の合成のＤＮＡフラグメント（ユニット１〜４、図１３ａ〜ｄ、配列番号１８９、１９０、１９１、１９２）を、（図１３ｅ）に示すように、ＢＡＣ  ２１９Ｄ２３、２７Ｎ５、およびＦｏｓ１５Ｂの一部と結合させた。
【図１３ｄ−２】図１３ａ〜ｅは、ヒト化重鎖遺伝子座を示す。ヒトＶＨ３遺伝子フラグメントと、ウサギのスペーサーと、イントロン配列からなる４個の合成のＤＮＡフラグメント（ユニット１〜４、図１３ａ〜ｄ、配列番号１８９、１９０、１９１、１９２）を、（図１３ｅ）に示すように、ＢＡＣ  ２１９Ｄ２３、２７Ｎ５、およびＦｏｓ１５Ｂの一部と結合させた。
【図１３ｄ−３】図１３ａ〜ｅは、ヒト化重鎖遺伝子座を示す。ヒトＶＨ３遺伝子フラグメントと、ウサギのスペーサーと、イントロン配列からなる４個の合成のＤＮＡフラグメント（ユニット１〜４、図１３ａ〜ｄ、配列番号１８９、１９０、１９１、１９２）を、（図１３ｅ）に示すように、ＢＡＣ  ２１９Ｄ２３、２７Ｎ５、およびＦｏｓ１５Ｂの一部と結合させた。
【図１３ｄ−４】図１３ａ〜ｅは、ヒト化重鎖遺伝子座を示す。ヒトＶＨ３遺伝子フラグメントと、ウサギのスペーサーと、イントロン配列からなる４個の合成のＤＮＡフラグメント（ユニット１〜４、図１３ａ〜ｄ、配列番号１８９、１９０、１９１、１９２）を、（図１３ｅ）に示すように、ＢＡＣ  ２１９Ｄ２３、２７Ｎ５、およびＦｏｓ１５Ｂの一部と結合させた。
【図１３ｄ−５】図１３ａ〜ｅは、ヒト化重鎖遺伝子座を示す。ヒトＶＨ３遺伝子フラグメントと、ウサギのスペーサーと、イントロン配列からなる４個の合成のＤＮＡフラグメント（ユニット１〜４、図１３ａ〜ｄ、配列番号１８９、１９０、１９１、１９２）を、（図１３ｅ）に示すように、ＢＡＣ  ２１９Ｄ２３、２７Ｎ５、およびＦｏｓ１５Ｂの一部と結合させた。
【図１３ｅ】図１３ａ〜ｅは、ヒト化重鎖遺伝子座を示す。ヒトＶＨ３遺伝子フラグメントと、ウサギのスペーサーと、イントロン配列からなる４個の合成のＤＮＡフラグメント（ユニット１〜４、図１３ａ〜ｄ、配列番号１８９、１９０、１９１、１９２）を、（図１３ｅ）に示すように、ＢＡＣ  ２１９Ｄ２３、２７Ｎ５、およびＦｏｓ１５Ｂの一部と結合させた。
【００３７】
（発明の詳細な説明）
（Ａ．定義）
「抗体」（Ａｂ）と「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、同じ構造特性を有している糖タンパク質である。抗体は特異的な抗原に対して結合特異性を示すが、免疫グロブリンには、抗体と、抗原特異性を有していない他の抗体様分子の両方が含まれる。後者のポリペプチドは、例えば、リンパ系によっては低レベルで、そして骨髄腫によっては高レベルで生産される。
【００３８】
「自然界に存在している抗体および免疫グロブリン」は、通常、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、これは、２つの同じ軽（Ｌ）鎖と２つの同じ重（Ｈ）鎖から構成されている。個々の軽鎖は、ジスルフィド共有結合（単数または複数）によって重鎖に連結されているが、ジスルフィド結合の数は、それぞれの免疫グロブリンイソ型の重鎖に応じて変化する。重鎖と軽鎖のそれぞれは、規則的な間隔の鎖内ジスルフィド結合もまた有する。個々の重鎖は、一方の末端に可変ドメイン（ＶＨ）を、その後に、多数の定常ドメインを有している。個々の軽鎖は、一方の末端に可変ドメイン（ＶＬ）を有しており、その他方の末端には定常ドメインを有している；軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインとアラインメントされ、軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインとアラインメントされる。特定のアミノ酸残基が、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間の界面を形成すると考えられている（Ｃｌｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８６：６５１（１９８５）；Ｎｏｖｏｔｎｙ  ａｎｄ  Ｈａｂｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：４５９２（１９８５））。
【００３９】
用語「可変」とは、可変ドメインの特定の部分が抗体の間で配列に関して幅広く異なり、これがその特定の抗原についてそれぞれの特定の抗体の結合と特異性において使用されるという事実を意味する。しかし、可変性は、抗体の可変ドメイン全体にわたって均一に分布しているわけではない。これは、軽鎖および重鎖のいずれの可変ドメインにおいても、相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存されている部分は、フレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。自然界に存在している重鎖と軽鎖の可変ドメインのそれぞれには、３個のＣＤＲによって繋がれている４個のＦＲ領域が含まれる。それぞれの鎖のＣＤＲはＦＲ領域によって互いに近い位置に保たれ、他の鎖のＣＤＲとともに、抗体の抗原結合部位の形成に関与している（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）を参照のこと）。定常ドメインは、抗原に対する抗原の結合に直接は関与していないが、抗体依存性細胞傷害性における抗体の関与のような、種々のエフェクター機能を示す。
【００４０】
用語「モノクローナル抗体」は、Ｂ細胞の単一のクローンによって合成される抗体分子を意味するように使用される。
【００４１】
用語「ポリクローナル抗体」は、多数のＢ細胞クローンによって合成される抗体分子の集団を意味するように使用される。特異的な実施形態においては、ポリクローナル抗体はいくつかのエピトープを認識する。
【００４２】
用語「ヒト化抗体」と「ヒト化免疫グロブリン」は、本明細書中で使用される場合は、ヒト免疫グロブリンポリペプチド配列（または、ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントによってコードされるポリペプチド配列）の少なくとも一部を含む免疫グロブリン分子を意味する。本発明のヒト化免疫グロブリン分子は、ヒト化免疫グロブリン分子を生じるように遺伝子操作された非ヒトトランスジェニック動物から単離することができる。このようなヒト化免疫グロブリン分子は、動物から調製されるか、または動物に由来する細胞から調製される非ヒト化免疫グロブリン分子と比較して、霊長類、特に、ヒトに対しては免疫原性が低い。
【００４３】
用語「非ヒト動物」には、本明細書中で使用される場合は、哺乳動物が含まれるがこれに限定されない。「非ヒト動物」としては、例えば、非ヒト霊長類、ウサギ、ブタ、鳥類（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウなど）、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、および齧歯類（例えば、マウスおよびラット）が挙げられる。好ましい非ヒト動物は、遺伝子変換および／または体細胞超変異によって実質的に抗体多様性を生じる動物、例えば、ウサギ、ブタ、鳥類（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウなど）、ヒツジ、ヤギ、およびウシが挙げられる。特に好ましい非ヒト動物は、ウサギとニワトリである。
【００４４】
用語「非霊長類動物」としては、本明細書中で使用される場合には、霊長類ではない哺乳動物が挙げられるがこれに限定されず、これには上記に列挙した動物が含まれる。
【００４５】
語句「遺伝子変換および／または超変異によって実質的に抗体多様性を生じる動物」は、抗体多様化の主な機構が、遺伝子再構成とは対照的な遺伝子変換および／または超変異である動物を意味するように使用される。
【００４６】
用語「Ｉｇ遺伝子セグメント」は、本明細書中で使用される場合は、動物およびヒトの生殖細胞系列に存在し、Ｂ細胞中で互いに集まって再構成されたＩｇ遺伝子を形成する、Ｉｇ分子の種々の部分をコードするＤＮＡのセグメントを意味する。したがって、本明細書中で使用される場合Ｉｇ遺伝子セグメントにはＶ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、Ｊ遺伝子セグメント、Ｃ領域遺伝子セグメントが含まれる。
【００４７】
用語「ヒトＩｇ遺伝子セグメント」には、本明細書中で使用される場合は、ヒトＩｇ遺伝子セグメントの自然界に存在している配列と、ヒトＩｇセグメントの自然界に存在している配列の縮重形態と、さらには、ヒトＩｇ遺伝子セグメントの自然界に存在している配列によってコードされるポリペプチドと実質的に同一であるポリペプチド配列をコードする合成の配列のいずれもが含まれる。「実質的に」によって、アミノ酸配列同一性の程度が少なくとも約８５％〜９５％であることが意味される。特定の実施形態においては、ヒトＩｇ遺伝子セグメントは、免疫グロブリン分子をヒトにおいて非免疫原性にする。
【００４８】
本発明の特異的なヒト化免疫グロブリン分子には、ヒト重鎖可変領域ポリペプチド配列または軽鎖可変領域ポリペプチド配列の少なくとも一部が含まれる。別の特異的な免疫グロブリン分子には、ヒト重鎖もしくは軽鎖可変領域ポリペプチド配列の少なくとも一部と、ヒト定常ドメインポリペプチド配列の少なくとも一部が含まれる。
【００４９】
「ヒト化抗体の調製物」または「ヒト化抗体調製物」により、非ヒトトランスジェニック動物から（例えば、動物の血清、乳汁、または卵黄から）、あるいは、非ヒトトランスジェニック動物に由来する細胞から（例えば、Ｂ細胞またはハイブリドーマ細胞から）調製された、単離された抗体産物または精製された抗体産物が意味される。
【００５０】
ヒト化抗体調製物は、ヒト化免疫グロブリン分子のレパートリーを含むポリクローナル抗体の調製物であり得る。ヒト化抗体調製物は、また、モノクローナル抗体の調製物でもあり得る。
【００５１】
用語「抗体多様性」および「抗体のレパートリー」は、ほぼ同じ意味で使用され、生物体が発現できる全抗体特異性の全てを意味する。
【００５２】
用語「スペーサー配列」は、免疫グロブリン重鎖または軽鎖遺伝子中に存在する任意の非コードヌクレオチド配列を意味するように、本明細書中で使用される。したがって、この用語には、具体的に、免疫グロブリン重鎖遺伝子中のイントロン配列と、Ｖ、Ｄ、Ｊセグメント、およびＣ領域セグメント中の複数のコード領域の間隔を隔てる任意の他の非コード配列、免疫グロブリン軽鎖遺伝子中のイントロン配列と、ＶおよびＪセグメント、ならびにＣ領域セグメント中の複数のコード領域の間隔を隔てる任意の他の非コード配列、さらには、免疫グロブリン重鎖もしくは軽鎖遺伝子中の非コード配列である隣接している調節エレメント（例えば、エンハンサー）が含まれる。さらに、膜貫通ヘリックス部分をコードするエキソンと、重鎖および軽鎖のエンハンサーとの間に、非コード配列が具体的に含まれる。
【００５３】
遺伝子再構成および遺伝子変換を受ける能力を有しているＩｇ遺伝子座は、また、本明細書中では「機能的な」Ｉｇ遺伝子座とも呼ばれ、機能的なＩｇ遺伝子座によって生じる多様性を有している抗体は、また、本明細書中では、「機能的」抗体または抗体の「機能的な」レパートリーとも呼ばれる。
【００５４】
（Ｂ．関連する文献）
免疫グロブリン遺伝子中の調節エレメントは、Ｂｒａｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９），Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｅｎｈａｎｃｅｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＩｇＨ  ｌｏｃｕｓ；Ｌａｕｓｔｅｒ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｍｂｏ  Ｊ  １２：４６１５−２３（１９９３）；Ｖｏｌｇｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６５：６４００（２０００）；Ｈｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４６：４３７７（１９９１）によって記載されている。
【００５５】
ニワトリおよびウサギの中での遺伝子変換による抗体多様化は、Ｂｕｃｃｈｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２６：４０９−１１（１９８７）；Ｋｎｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５６：１７９−２１８（１９９４）；Ｌａｎｇｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４４：４２２−４６（１９９３）によって記載されている。ヒト−マウスキメラ抗体を発現するマウスの作成は、Ｐｌｕｓｃｈｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２１５：２７−３７（１９９８）によって記載されている。マウスに由来する膜と細胞質テールを有しているヒト−マウスキメラ抗体を発現するマウスの作成は、Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１２７１−１２７４（１９９３）；Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  ４：１０９９−１１０３によって記載されている。ヒト免疫グロブリンポリペプチドを発現するマウスの作成は、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ８（４）：４５５−８（１９９７）；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３（１）：６５−９３（１９９５）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３８：３５０−２（１９８９）によって記載されている。ＢＡＣクローンを使用するトランスジェニックマウスの作成は、Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １５：８５９−６５（１９９７）によって記載されている。ヒト抗体を発現するウシの作成は、Ｋｕｒｏｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２０（９）：８８９−８９４（２００２）によって記載されている。
【００５６】
トランスジェニックウサギの作成は、Ｆａｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐａｔｈｏｌ  Ｉｎｔ  ４９：５８３−９４（１９９９）；Ｂｒｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ
Ｄｅｖ  ４４：５６−６２（１９９６）によって記載されている。免疫グロブリンの発現を欠損させたウサギは、ＭｃＣａｒｔｎｅｙ−Ｆｒａｎｃｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ
Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２４：３５７−６４（１９８７）；Ａｌｌｅｇｒｕｃｃｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２１：４１１−７（１９９１）によって記載されている。
【００５７】
トランスジェニックニワトリの作成は、Ｓｈｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １６：１０５０−１０５３（１９９８）；Ｅｔｃｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６２：４３３−４５０；Ｐａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌｓ  Ｔｉｓｓｕｅｓ  Ｏｒｇａｎｓ  １６５（３−４）：２１２−９（１９９９）；Ｓａｎｇ，Ｈ．，“Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｃｈｉｃｋｅｎｓ−−ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １２：４１５（１９９４）；および、ＷＯ２００４００３１５７，“Ｇｅｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ａｎｉｍａｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  ｂａｓｅｄ  ｖｅｃｔｏｒ”；ならびに、ＷＯ２０００７５３００，“Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ  ａ  ｎｕｃｌｅｉｃ
ａｃｉｄ  ｉｎｔｏ  ａｎ  ａｖｉａｎ  ｇｅｎｏｍｅ，ｕｓｅｆｕｌ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｎｇ  ａｖｉａｎ  ｂｌａｓｔｏｄｅｒｍａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ａｖｉａｎ  ａｎｉｍａｌｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｄｅｓｉｒｅｄ  ｇｅｎｅｓ，ｂｙ  ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｇｅｒｍｉｎａｌ  ｄｉｓｃ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｇｇ．”によって記載されている。
【００５８】
γグロブリン血症のニワトリは、Ｆｒｏｍｍｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ
１０５（１）：１−６（１９７０）；Ｂｅｎｅｄｉｃｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  １９７７；８８（２）：１９７−２０５によって記載されている。
【００５９】
細胞からの動物のクローニングは、Ｔ．Ｗａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９９８；３９４：３６９−３７４；Ｊ．Ｂ．Ｃｉｂｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０：１２５６−１２５８（１９９８）；Ｊ．Ｂ．Ｃｉｂｅｌｌｉ  ｅｔ
ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９８；１６：６４２−６４６；Ａ．Ｅ．Ｓｃｈｎｉｅｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８：２１３０−２１３３（１９９７）；Ｋ．Ｈ．Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：６４−６６（１９９６）；Ｋｕｒｏｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２００４年６月６日によって記載されている。ウサギの核導入クローニングは、Ｓｔｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ３９：６５７−６６４（１９８８）、およびＣｈａｌｌａｈ−Ｊａｃｑｕｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ８（４）：２９５−２９９（２００３）によって記載されている。
【００６０】
トランスジェニック動物からの抗体の産生は、米国特許第５，８１４，３１８号、同第５，５４５，８０７号、および同第５，５７０，４２９号に記載されている。キメラ哺乳動物宿主についての相同組み換えは、米国特許第５，４１６，２６０号に説明されている。胚にＤＮＡを導入するための方法は、米国特許第５，５６７，６０７号に記載されている。胚性幹細胞の維持および拡大は、米国特許第５，４５３，３５７号に記載されている。
【００６１】
ブタ、ヒツジ、およびウシにおける抗体のレパートリーの多様化に関係している機構は、Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｅ．（１９９８）“Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂ−ｃｅｌｌ  ａｎｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  ｌａｒｇｅ  ｆａｒｍ  ａｎｉｍａｌｓ．”，Ｒｅｖ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈ  １７：４３に概説されている。ヒツジでの抗体の多様化は、Ｒｅｙｎａｕｄ，Ｃ．Ａ．，Ｃ．Ｇａｒｃｉａ，Ｗ．Ｒ．Ｈｅｉｍ，ａｎｄ  Ｊ．Ｃ．Ｗｅｉｌｌ（１９９５），“Ｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ  ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｈｅｅｐ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｉｓ  ａｎ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｃｅｓｓ”，Ｃｅｌｌ  ８０：１１５；およびＤｕｆｏｕｒ，Ｖ．，Ｓ．Ｍａｌｉｎｇｅ，ａｎｄ  Ｆ．Ｎａｕ．（１９９６），“Ｔｈｅ  Ｓｈｅｅｐ  Ｉｇ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｃｏｎｓｉｓｔｓ
ｏｆ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ＶＨ  ｆａｍｉｌｙ，”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５６：２１６３に記載されている。
【００６２】
（Ｃ．詳細な説明）
免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子には、個々の遺伝子によってコードされ、イントロン配列によって間隔を隔てられているいくつかのセグメントが含まれる。したがって、ヒト免疫グロブリン重鎖についての複数の遺伝子が、１４番染色体上で見られる。重鎖（ＶＨ）の可変領域には３つの遺伝子セグメント：Ｖ、Ｄ、およびＪセグメントが含まれ、その後ろに、Ｃ領域をコードする複数の遺伝子が続く。Ｖ領域は、大きなスペーサーによってＣ領域から隔てられおり、Ｖ、Ｄ、およびＪセグメントをコードする個々の遺伝子もまた、スペーサーによって隔てられている。
【００６３】
免疫グロブリンの軽鎖には２つのタイプ：κおよびλが存在する。ヒトκ軽鎖の遺伝子は２番染色体上に見られ、ヒトλ軽鎖の遺伝子は２２番染色体上に見られる。抗体軽鎖の可変領域には、ＶセグメントとＪセグメントが含まれ、これらは別々の遺伝子セグメントによってコードされている。κ軽鎖遺伝子の生殖細胞系列での立体配置においては、直線的な配置でおよそ１００〜２００個のＶ領域遺伝子が存在しており、それぞれの遺伝子がそれぞれのリーダー配列を有しており、その後ろにおよそ５個のＪ遺伝子セグメントと、ｃ領域遺伝子セグメントが続く。全てのＶ領域は、イントロンによって隔てられており、さらに、Ｖ、Ｊ、およびＣ領域遺伝子セグメントを隔てるイントロンが存在する。
【００６４】
感染から防御する免疫系の能力は、抗体の多様なレパートリーを作成するように特殊化された遺伝的機構に原因がある。Ｂ細胞中では、抗体をコードする遺伝子は、可変（Ｖ）領域中に無数の結合部位の組み合わせを生じるような様式で組み立てられる。１０１２種類を超える可能な結合構造が、そのような機構によって生じると推定される。ヒトを含む全ての動物において、抗体を作成するプロセスは、免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座の可変（Ｖ）セグメント、多様化（Ｄ）セグメント、結合（Ｊ）セグメントを組換えることによって開始される。この工程の後、動物の種に応じて、２つの一般的な機構が、抗体の多様な結合構造を生じさせるために使用される。
【００６５】
ヒトやマウスのようないくつかの動物においては、免疫グロブリン重鎖遺伝子座上に、Ｖ、Ｄ、およびＪ遺伝子セグメントの複数のコピーが、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座上にＶおよびＪ遺伝子セグメントの複数のコピーが存在する。これらの動物における抗体の多様性は、遺伝子再構成、すなわち、再構成された重鎖可変領域と軽鎖可変領域を形成するような遺伝子セグメントの異なる組み合わせによって、主に生じる。しかし、他の動物（例えば、ウサギ、鳥類（例えば、ニワトリ、ガチョウ、およびアヒル）、ヒツジ、ヤギ、およびウシ）においては、遺伝子再構成は、抗体の多様性を生じることにおいてはより小さい役割しか果たしていない。例えば、ウサギにおいては、ごく限られた数のＶ遺伝子セグメント、最も多くの場合には、Ｖ領域の３’末端のＶ遺伝子セグメントだけが、連続するＶＤＪセグメントを形成するように遺伝子再構成において使用される。ニワトリにおいては、１つのＶ遺伝子セグメント（Ｄ領域に隣接しているもの、すなわち、「３’近接Ｖ遺伝子セグメント」）と、１つのＤセグメントと、１つのＪセグメントだけが、重鎖の再構成に使用される：また、１つのＶ遺伝子セグメント（３’近接Ｖセグメント）と、１つのＪセグメントだけが、軽鎖の再構成に使用される。したがって、これらの動物においては、接合部の多様化によって生じる最初に再構成された可変領域配列の中には少ししか多様性は存在しない。再構成されたＩｇ遺伝子のさらなる多様化は、遺伝子変換によって行われる。遺伝子変換は、上流のＶ遺伝子セグメントに由来する短い配列が再構成されたＩｇ遺伝子中のＶ遺伝子セグメント内の短い配列を置き換えるプロセスである。抗体配列のさらなる多様化は、超変異によって生じる場合もある。
【００６６】
免疫グロブリン（抗体）は、５つのクラス（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、およびＩｇＤ）に属し、これらのそれぞれは、免疫防御において異なる生物学的役割を有している。血液中で最も豊富に存在し、感染に応答する能力を有しているものは、ＩｇＧクラスである。ヒトＩｇＧクラスの中には、Ｆｃドメインを含む重鎖定常領域の構造によって決定される４つのサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４イソ型）が存在している。抗体のＦ（ａｂ）ドメインは、抗原上の特異的な配列（エピトープ）に結合するが、抗体のＦｃドメインは、抗原を排除するための免疫系の他の成分を動員し、活性化する。
【００６７】
抗体は、動物から得られたポリクローナル抗血清によってヒトの生命にかかわる感染症を処置することができることが見出された１８９０年代から、治療薬としてうまく使用されている。抗体の研究における目覚しい進歩は、抗体の組み換え生産のための方法の開発、それに続く、抗体ヒト化技術の開発と、非ヒト動物において完全なヒトモノクローナル抗体を作成するための方法の開発にともなって生じた。
【００６８】
結果として、キメラモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、およびヒトモノクローナル抗体は、薬学的産物の重要なクラスとして、最近、浮上してきた。モノクローナル抗体をベースとする薬剤は、疾患を処置することにおいて、特定の標的（例えば、受容体またはリガンド）をブロックする場合に極めて有効であるが、ガンおよび感染性病原体への感染のような特定の破壊的疾患は、それらの複雑さ、様々な原因によるとされる病因論、および適応性が原因で、処置することが難しい場合がある。モノクローナル抗体は、集団の全体へ、または個体の中へと疾患が広がる間に、変化し、進化し、そして成熟する、明確に定義された標的に対して向けられたものである。このような適応性の進化は、単特異的薬剤（例えば、モノクローナル抗体）にとっては致命的であり、単特異的薬剤は、耐性株によって迅速に回避される。高力価の抗生物質に耐性である細菌およびウイルスの多く、ならびに、悪性であるガンは、モノクローナル抗体治療のような標準的な抗ガン剤に対する耐性を生じる。
【００６９】
対照的に、ポリクローナル抗体は、複雑な疾患に関係している複数の進化しつつある標的に結合し、それらを排除する能力を有している。複数の抗原に結合することにより、ポリクローナル抗体は、抗原の成熟の事象においてもなお、標的を飽和させて活性を保つ。この後、情報伝達のカスケードの間に、ポリクローナル抗体は、強い免疫反応を誘導して、標的抗原、病原体、または細胞を排除する。これらの特性により、ポリクローナル抗体は感染性疾患やガンを処置するために理想的な抗体である。
【００７０】
これまでのところ、ポリクローナル抗体の使用は、供給の問題、または非ヒトタンパク質に対する望ましくない反応によって、厳しく制限されてきた。
【００７１】
本発明により、免疫グロブリン（Ｉｇ）トランス遺伝子座の免疫グロブリンをコードするエレメントの選択的なヒト化に基づく、新しいヒト化アプローチが提供される。このようなヒト−動物トランス遺伝子座の作成により、多様化された親和性の高いヒト化（ポリクローナル）抗体を高い収量で発現するトランスジェニック動物を作成することができる。
【００７２】
第１段階として、ヒト以外（霊長類以外を含む）の免疫グロブリン重鎖および軽鎖のゲノム遺伝子座が同定され、配列決定される。例えば、本発明の一部として、ウサギおよびニワトリの免疫グロブリン重鎖および軽鎖のゲノム配列が決定された。これらは、図１、５、および９に示される。
【００７３】
ウサギのＩｇ重鎖ゲノム遺伝子座の分析により、免疫グロブリン重鎖可変領域（Ｖｈ）には、多数の遺伝子が含まれており、これには、機能的な遺伝子と機能的ではない偽遺伝子が含まれていることが明らかにされた。１８個のＶｈ遺伝子のアラインメントにより、ウサギの重鎖可変領域の遺伝子配列（Ｖｈ１〜Ｖｈ１８）の間に高度（８０〜９０％）な配列同一性があることが明らかになった。ウサギの重鎖可変領域の遺伝子は、ヒトの重鎖可変領域の遺伝子のＶｈ３グループと最も高い相同性を共有している。具体的には、ウサギのＶｈ１−ａ２遺伝子のヒトＶｈ３−２３配列との配列比較により、７２．８％の配列同一性が明らかになった。
【００７４】
さらに、複数のウサギの重鎖可変領域の遺伝子配列を隔てる非コード（例えば、イントロン）配列を分析した。図２〜４は、ウサギの重鎖イントロン配列の比較を示す。このようなイントロン配列は２つのグループに別れ、これらが高度に保存されていることが見出された。グループ１のイントロンの特別なメンバーは、驚くほど高い（８０〜９０％）の配列同一性を示す。
【００７５】
同様の観察を、ウサギの免疫グロブリン軽鎖可変領域のゲノム配列に分析によって行った。具体的には、ウサギの免疫グロブリン軽鎖遺伝子座の分析により、軽鎖可変領域（Ｖ１）領域に多数の遺伝子セグメントが含まれており、これらが高度な（８０〜９０％）配列同一性を示すことが明らかにされた。さらに、ウサギの軽鎖可変領域（Ｖκ）は、ヒトの軽鎖可変領域の遺伝子配列のＶκ１グループと高い相同性を示すことが明らかにされた。ほとんどのＶκ配列は、機能的であり、高度に保存されていることが見出された。ウサギの重鎖可変領域の遺伝子とは異なり、ウサギの軽鎖可変領域の遺伝子中では、イントロン配列は異なることが見出されている。
【００７６】
ニワトリの免疫グロブリン重鎖および軽鎖のゲノム配列を用いた同様の研究によっても、同様の結果が得られた。
【００７７】
１つの局面においては、本発明により、スペーサー配列が提供される。スペーサー配列は、非霊長類動物の重鎖または軽鎖の遺伝子中のコード領域の間隔を隔てる。１つの実施形態においては、本発明により、遺伝子変換によって実質的に抗体多様性を生じる動物（例えば、ウサギおよびニワトリを含む）の重鎖および軽鎖の遺伝子に由来するスペーサー配列が提供される。このようなスペーサー配列は、その後、ヒト化免疫グロブリン遺伝子座を作成するプロセスにおいて使用されるヒト免疫グロブリン重鎖または軽鎖遺伝子セグメントに隣接させるように使用される。
【００７８】
スペーサー配列には、通常は、少なくとも２０個のヌクレオチド、または少なくとも約３０個のヌクレオチド、または少なくとも約４０個のヌクレオチド、または少なくとも約５０個のヌクレオチドが含まれ、そして通常は、約２０個から約１００００個のヌクレオチドの長さである。スペーサー配列には、非ヒト動物（例えば、霊長類以外）中の自然界に存在しているイントロン配列に由来する適切な長さのヌクレオチドの連続するストレッチが含まれる場合があり、また、人工的な配列が含まれる場合もある。人工的な配列は、例えば、２つ以上の自然界に存在しているイントロン配列のコンセンサス配列であり得る。
【００７９】
スペーサー配列には、配列番号１から１８５（表１）からなる群より選択される配列に由来するか、あるいは、２つ以上のそのような配列のコンセンサス配列に由来する、少なくとも約２０（３０、４０、５０などであって、１０ヌクレオチドずつ増大して１０００まで）個の連続しているヌクレオチドが含まれる場合がある。必ずしもそうである必要はないが、その免疫グロブリンがヒト化させられるヒト以外（霊長類以外）の動物のゲノム配列中の対応する領域の間隔を隔てるスペーサー配列により、ヒト化に使用されるヒト重鎖または軽鎖の配列（例えば、Ｖ、Ｄ、Ｊ、Ｃ領域の配列）の間隔を隔てることもできる。
【００８０】
一般的には、非ヒト動物の免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座のヒト化には、ヒト化免疫グロブリン遺伝子座を作成するために動物のゲノム中に１つ以上のヒトＩｇ遺伝子セグメントを組み込むことが含まれる。したがって、ヒト化Ｉｇ重鎖遺伝子座の作成には、１つ以上のＶおよび／またはＤおよび／またはＪセグメント、ならびに／あるいはＣ領域セグメントの動物のゲノムへの組み込みが含まれる。同様に、ヒト化Ｉｇ軽鎖遺伝子座の作成には、１つ以上のＶおよび／またはＪセグメント、ならびに／あるいはＣ領域セグメントの動物のゲノムへの組み込みが含まれる。
【００８１】
使用されるアプローチに応じて、ヒトＩｇ遺伝子セグメント（単数または複数）を、動物の内因性のＩｇ遺伝子座が通常存在する染色体位置に、あるいは、動物の異なる遺伝子座に組み込むことができる。染色体の位置にはかかわらず、本発明のヒト化Ｉｇ遺伝子座は、非ヒト動物中で、遺伝子再構成、および遺伝子変換、および超変異を受ける能力を有しており、それによってヒト化Ｉｇ分子の多様化されたレパートリーを生じる。遺伝子再構成および遺伝子変換を受ける能力を有しているＩｇ遺伝子座はまた、「機能的な」Ｉｇ遺伝子座とも呼ばれ、機能的なＩｇ遺伝子座によって作成される多様性を有している抗体はまた、「機能的な」抗体または抗体分子の「機能的な」レパートリーとも呼ばれる。
【００８２】
さらなる局面においては、本発明により、非霊長類動物のＩｇ重鎖または軽鎖遺伝子中の複数のコード領域の間隔を隔てるスペーサー配列に由来するか、あるいは、２つ以上のそのようなスペーサー配列のコンセンサス配列に由来する、少なくとも約２０個の連続しているヌクレオチドを含むヌクレオチド配列が隣接している、ヒトＩｇ遺伝子セグメントを含む核酸分子が提供される。隣接配列中のスペーサー配列に由来するセクションとしての隣接配列は、同一であっても、異なっていてもよい。スペーサー配列に由来するか、あるいは２つ以上のスペーサー配列のコンセンサス配列に由来する、連続しているヌクレオチドは、ヒトＩｇ遺伝子セグメントに対して直接融合させることができる。あるいは、ヒトＩｇ遺伝子セグメントと、少なくとも１つのスペーサーを起源とするヌクレオチド配列との間の介在配列である場合もある。したがって、例えば、ヒトＶ遺伝子セグメントの５’末端の隣接配列にはプロモーター領域が含まれ、これは、ヒトＶ遺伝子セグメントに対して直接連結させられ、少なくとも２０ヌクレオチドのスペーサー配列に由来するヌクレオチドのストレッチからのその間隔が隔てられる。
【００８３】
さらに別の局面においては、本発明は、ヒト重鎖Ｖ、Ｄ、および／またはＪ遺伝子セグメント、ならびに／あるいはＣ領域セグメントが、もとの非ヒト動物の免疫グロブリン遺伝子中と同じ立体配置で存在し、非霊長類動物のＩｇ重鎖または軽鎖遺伝子中のコード領域の間隔を隔てるイントロン配列に由来する少なくとも約２０個の連続しているヌクレオチドを含む配列によって間隔を隔てられている、ヒト化Ｉｇ重鎖遺伝子座に関する。別の実施形態においては、本発明により、ヒト軽鎖Ｃ領域セグメント、および／またはＪ遺伝子セグメント、および／またはＶ領域セグメントが、もとの非ヒト動物の免疫グロブリン遺伝子と同じ立体配置で非ヒト動物（例えば、霊長類以外）のイントロン配列によって間隔を隔てられている、ヒト化軽鎖遺伝子座が提供される。特定の実施形態においては、スペーサー配列は、ヒト以外（霊長類以外）の動物の非コード配列（例えば、イントロン配列）に基づいて設計される。１つの実施形態においては、スペーサーは、ヒト以外（霊長類以外）の動物に由来する適切な非コード配列を保持し得る。あるいは、構築を簡単にするために、高度に相同である非コード（イントロン）配列に基づいて設計されるコンセンサス配列が設計され、複数のヒト重鎖または軽鎖の遺伝子セグメントの調製のための同じ型のスペーサー配列として使用される。
【００８４】
本発明により、具体的には、ヒト化免疫グロブリン遺伝子座の構築に有用な、単離された核酸配列およびベクターが提供される。
【００８５】
１つの実施形態においては、ヒト化されるＩｇ遺伝子座を含むＤＮＡフラグメントは、遺伝子変換により抗体多様性を生じる動物（例えば、ウサギおよびニワトリ）から単離される。このような大きなＤＮＡフラグメントは、ヒト以外、例えば、非霊長類動物のゲノムＤＮＡから調製することができる、プラスミド、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、または細菌の人工染色体（ＢＡＣ）などのライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。動物のＣ領域の全体を、１つのプラスミドまたはコスミドクローンに含めることができ、これは続いて、ヒト化される。ＹＡＣクローンには、２メガ塩基までのＤＮＡフラグメントを持たせることができ、したがって、動物の重鎖遺伝子座全体、またはその大きな部分を１つのＹＡＣクローン中に単離することができ、また、１つのＹＡＣクローン中に含ませるように再構築することもできる。ＢＡＣクローンは、より小さい大きさ（約１５０〜４５０ｋｂ）のＤＮＡフラグメントを持つことができる。しかし、Ｉｇ遺伝子座の重複するフラグメントを含む複数のＢＡＣクローンを別々にヒト化して、その後、動物のレシピエント細胞に一緒に注入することができる。ここで、重複しているフラグメントは、レシピエント動物の細胞中で組み換わって連続しているＩｇ遺伝子座を生じる。
【００８６】
ヒトＩｇ遺伝子セグメントは、ＤＮＡフラグメントの連結、または相同組み換えによるＤＮＡフラグメントの挿入を含む種々の方法によって、ベクター（例えば、ＢＡＣクローン）上のＩｇ遺伝子座に組み込むことができる。ヒトＩｇ遺伝子セグメントの組み込みは、ヒトＩｇ遺伝子セグメントがトランス遺伝子中で宿主動物配列に動作可能であるように連結されて、機能的なヒト化Ｉｇ遺伝子座、すなわち、遺伝子再構成、および遺伝子変換、および超変異が可能であるＩｇ遺伝子座を生じ、これによってヒト化抗体の多様化されたレパートリーの生産を導くように、行われる。
【００８７】
１つの実施形態においては、ヒトＩｇ遺伝子セグメントは、相同組み換えによってＩｇ遺伝子座に組み込むことができる。相同組み換えは、細菌、酵母、および他の細胞中で、高頻度の相同組み換え事象で行うことができる。例えば、酵母細胞は、動物のＩｇ遺伝子座またはその大きな部分を含むＹＡＣで形質転換される。続いて、そのような酵母細胞は、さらに、本明細書中で上記に記載されるような組み換えベクターで形質転換される。組み換えベクターは、５’隣接配列と３’隣接配列に連結されたヒトＩｇ遺伝子セグメントを有している。組み換えベクター中の５’隣接配列と３’隣接配列は、ＹＡＣ上の動物のＩｇ遺伝子セグメントの隣接配列と相同である。相同組み換えの結果、ＹＡＣ上の動物のＩｇ遺伝子セグメントは、ヒトＩｇ遺伝子セグメントで置き換えられる。あるいは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌細胞は、動物のＩｇ遺伝子座またはその大きな部分を含むＢＡＣで形質転換される。そのような細菌細胞は、さらに、５’隣接配列と３’隣接配列に連結されているヒトＩｇ遺伝子セグメントを有している組み換えベクターで形質転換される。組み換えベクター中の５’隣接配列と３’隣接配列は、相同組み換えを媒介し、組み換えベクター上のヒトＩｇ遺伝子セグメントと、ＢＡＣ上の動物のＩｇ遺伝子セグメントとを交換する。ヒト化ＹＡＣとＢＡＣは、細胞から容易に単離することができ、トランスジェニック動物の作成に使用することができる。
【００８８】
本発明のさらなる局面においては、ヒト化免疫グロブリンを生産することができるトランスジェニック動物を作成する方法が提供される。
【００８９】
本発明にしたがって、ヒト化免疫グロブリンを作成することができるトランスジェニック動物が、レシピエント細胞または動物の細胞中に、ヒト化Ｉｇ遺伝子座を有している本明細書中の上記に記載されている１つ以上のトランスジェニックベクターを導入し、遺伝子修飾されたレシピエント細胞（単数または複数）から動物へと導くことによって、作成することができる。
【００９０】
レシピエント細胞は、例えば、非ヒト動物に由来するものであり得る。非ヒト動物は、遺伝子変換、および／または超変異によって抗体多様性を生じる動物、例えば、鳥類（例えば、ニワトリ）、ウサギ、ウシなどである。このような動物においては、３’近接Ｖ遺伝子セグメントは、免疫グロブリンの生産のために優先的に使用される。動物の３’近接Ｖ遺伝子セグメントの置き換えによるか、または３’近接Ｖ遺伝子セグメントの極近くに置くことによるかのいずれかによる、トランスジェニックベクター上のＩｇ遺伝子座へのヒトＶ遺伝子セグメントの組み込みにより、免疫グロブリンの大部分において、ヒトＶ領域ポリペプチド配列の発現が生じる。あるいは、再構成されたヒトＶ（Ｄ）Ｊセグメントを、トランスジェニックベクター上の免疫グロブリン遺伝子座のＪ遺伝子座中に挿入することもできる。
【００９１】
ヒト化Ｉｇ遺伝子座を含むトランスジェニックベクターは、レシピエント細胞（単数または複数）に導入され、その後、ランダムな組み込みによって、または標的化された組み込みによって、レシピエント細胞（単数または複数）のゲノム中に組み込まれる。
【００９２】
ランダムな組み込みのために、ヒト化Ｉｇ遺伝子座を含むトランスジェニックベクターを、標準的なトランスジェニック技術によって動物のレシピエント細胞中に導入することができる。例えば、トランスジェニックベクターを、受精卵の前核に直接注入することができる。トランスジェニックベクターは、また、卵母細胞の受精の前に、精子をトランスジェニックベクターとともにインキュベーションすることによって導入することもできる。トランスジェニック動物は、受精卵から発生させることができる。トランスジェニックベクターを導入することに代わる別の方法は、胚性幹細胞をトランスフェクトし、その後、遺伝子修飾された胚性幹細胞を胚発生させることによる。あるいは、トランスジェニックベクター（裸のもの、または促進試薬と組み合わせたもの）を、発生しつつある胚に直接注入することができる。最終的には、キメラであるトランスジェニック動物が、トランスジェニック動物の少なくともいくつかの体細胞のゲノム中に組み込まれたヒト化Ｉｇトランス遺伝子を含む胚から作成される。
【００９３】
特定の実施形態においては、ヒト化Ｉｇ遺伝子座を含むトランス遺伝子が、内因性の免疫グロブリン遺伝子の発現が欠損している動物株に由来するレシピエント細胞（例えば、受精卵、または発生しつつある胚）のゲノム中にランダムに組み込まれる。このような動物株の使用により、ヒト化トランスジェニックＩｇ遺伝子座からの免疫グロブリン分子の優先的な発現が可能になる。このような動物の例としては、ＡｌｉｃｉａおよびＢａｓｉｌｅａウサギ株、さらには、ガンマグロブリン血症（Ａｇａｍｍａｇｌｏｂｉｎｅｍｉｃ）ニワトリ株、さらには、免疫グロブリンノックアウトマウスが挙げられる。あるいは、ヒト化免疫グロブリントランス遺伝子または遺伝子座を有しているトランスジェニック動物を、内因性免疫グロブリンの発現が欠損している動物株と交配させることができる。内因性Ｉｇ遺伝子座の欠損と、ヒト化トランスジェニックＩｇ遺伝子座についてホモ接合型である子孫を得ることができる。
【００９４】
標的化された組み換えのためには、トランスジェニックベクターを、胚性幹細胞、またはすでに分化した体細胞のような、適切な動物のレシピエント細胞中に導入することができる。以後、トランス遺伝子が動物のゲノムに組み込まれており、相同組み換えによって対応する内因性のＩｇ遺伝子座が置き換えられている細胞を、標準的な方法によって選択することができる。例えば、Ｋｕｒｏｉｗａ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２００４年６月６日を参照のこと。選択された細胞は、その後、徐核された核導入ユニット細胞、例えば、卵母細胞または胚性幹細胞、全能性のきちんとした機能を有している新生児を形成することができる細胞と融合させられる。融合は、十分に確立されている従来技術にしたがって行われる。卵母細胞の徐核と、核の導入は、また、注入用ピペットを使用する顕微手術によって行うこともできる。（例えば、Ｗａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９８）３９４：３６９を参照のこと）。得られた卵細胞は、その後、適切な培地中で培養されて、トランスジェニック動物を作成するために同調させたレシピエントに導入される。あるいは、選択された遺伝子修飾された細胞を、発生しつつある胚に注入して、その後、キメラ動物中へと発生させることもできる。
【００９５】
さらに、本発明にしたがって、ヒト化免疫グロブリンを生産することができるトランスジェニック動物を、また、レシピエント細胞（単数または複数）中に、内因性のＩｇ遺伝子セグメントの隣接配列に相同である５’隣接配列と３’隣接配列に連結されたヒトＩｇ遺伝子セグメントを有している、本明細書中で上記に記載されている１つ以上の組み換えベクターを導入し、内因性のＩｇ遺伝子セグメントが相同組み換えによってヒトＩｇ遺伝子セグメントによって置き換えられている細胞を選択し、そして選択された遺伝子修飾されたレシピエント細胞（単数または複数）から動物へと誘導することによって、作成することもできる。
【００９６】
トランスジェニックベクターの標的挿入と同様に、このアプローチにおいてレシピエントとしての使用に適切な細胞としては、胚性幹細胞、またはすでに分化した体細胞が挙げられる。ヒトＩｇ遺伝子セグメントを有している組み換えベクターを、例えば、トランスフェクションのような、任意の適切な手段によってそのようなレシピエント細胞中に導入することができる。以後、ヒトＩｇ遺伝子セグメントが相同組み換えによって対応する内因性Ｉｇ遺伝子セグメントと置き換わっている細胞を、標準的な方法によって選択することができる。これらの遺伝子修飾された細胞を、トランスジェニック動物のクローニングのための核導入手順において、核ドナー細胞とすることができる。あるいは、選択された遺伝子修飾された胚性幹細胞を、発生しつつある胚に注入することができる。これは続いて、キメラ動物へと発達させることができる。
【００９７】
上記の方法のいずれかによって作成されたトランスジェニック動物は、本発明の別の実施形態を形成する。トランスジェニック動物は、少なくとも１つ、すなわち、１つ以上の、ヒト化Ｉｇ遺伝子座をゲノム中に有しており、この遺伝子座から、ヒト化抗体の機能的なレパートリーが生産される。
【００９８】
特異的な実施形態においては、本発明により、ゲノム中に１つ以上のヒト化Ｉｇ遺伝子座を有しているトランスジェニックウサギが提供される。本発明のトランスジェニックウサギは、ヒト化Ｉｇ遺伝子座を再構成および遺伝子変換することができ、ヒト化された交代の機能的なレパートリーを発現することができる。
【００９９】
別の特異的な実施形態においては、本発明により、１つ以上のヒト化Ｉｇ遺伝子座をゲノム中に有しているトランスジェニックニワトリが提供される。本発明のトランスジェニックニワトリは、ヒト化Ｉｇ遺伝子座を再構成および遺伝子変換することができ、ヒト化抗体の機能的なレパートリーを発現することができる。別の特異的な実施形態においては、本発明により、１つ以上のヒト化Ｖ領域をゲノム中に有しているトランスジェニックマウスが提供される。ヒト化Ｖ領域には、非ヒトスペーサー配列が隣接している少なくとも２つのヒトＶ遺伝子セグメントが含まれる。トランスジェニックマウスは、ヒトＶエレメントを再構成することができ、抗体の機能的なレパートリーを発現することができる。
【０１００】
一旦、多様化させられたヒト化免疫グロブリン分子を生産することができる非ヒトトランスジェニック動物が作成されると、抗原に対するヒト化免疫グロブリンおよびヒト化抗体調製物を、抗原で動物を免疫化することによって容易に得ることができる。種々の抗原を使用して、トランスジェニックである宿主動物を免疫化することができる。このような抗原としては、微生物、例えば、ウイルス、および単細胞微生物（例えば、細菌および真菌）、生存している微生物、弱毒化された微生物、または死滅させた微生物、微生物のフラグメント、あるいは、微生物から単離された抗原性分子が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０１】
動物の免疫化に使用される例示的な細菌抗原としては、莢膜多糖類であるタイプ５および８のような、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）から精製された抗原、α毒素、付着因子結合タンパク質、コラーゲン結合タンパク質、およびフィブロネクチン結合タンパク質のような感染性因子の組み換えバージョンが挙げられる。例示的な細菌抗原としては、また、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、腸球菌（ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、腸内細菌（ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、および肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の弱毒化されたバージョン、あるいは、これらの細菌細胞に由来する培養上清が挙げられる。免疫化に使用することができる他の細菌抗原としては、精製されたリポ多糖（ＬＰＳ）、莢膜抗原、莢膜多糖類、および／または外膜タンパク質の組み換えバージョン、フィブロネクチン結合タンパク質、ならびに、シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、超球菌（ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、腸内細菌（ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、および肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来の内毒素および外毒素が挙げられる。
【０１０２】
真菌に対する抗体の作成のための例示的な抗原としては、真菌の弱毒化されたバージョン、またはその外膜タンパク質が挙げられる。真菌としては、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・パラシロシ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、カンジタ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、およびクリプトコッカス・ネオホルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０３】
ウイルスに対する抗体を作成するための免疫化に使用される例示的な抗原としては、ウイルスの外膜タンパク質および弱毒化させられたバージョンが挙げられる。ウイルスとして、呼吸器合胞体ウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ）（ＲＳＶ）（特に、Ｆ−タンパク質）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＥＢＶ、およびＨＳＶが含まれるが、これらに限定されない。
【０１０４】
治療用抗体を、単離された腫瘍細胞または腫瘍細胞株；腫瘍関連抗原（これには、Ｈｅｒ−２−ｎｅｕ抗原（それに対する抗体が乳ガンの処置に有用である）；ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、およびＣＤ５３抗原（それに対する抗体がＢ細胞リンパ腫の処置に有用である）；（３）前立腺特異的膜抗原（ＰＭＳＡ）（それに対する抗体が前立腺ガンの処置に有用である）、および１７−１Ａ分子（それに対する抗体が結腸ガンの処置に有用である）が含まれるが、これらに限定されない）でトランスジェニック動物を免疫化することによって、ガンの処置のために作成することができる。
【０１０５】
抗原は、任意の従来の様式でトランスジェニック宿主動物に、アジュバントとともに、またはアジュバントなしで投与することができ、予め決定されたスケジュールに従って投与することができる。
【０１０６】
免疫化後、免疫化されたトランスジェニック動物に由来する血清または乳汁を、抗原に特異的な薬学的等級のポリクローナル抗体を精製するために分画することができる。トランスジェニックである鳥類の場合には、抗体は、また、卵黄を分画することによっても得ることができる。濃縮され、精製された免疫グロブリン画分は、クロマトグラフィー（アフィニティー、イオン交換、ゲル濾過など）、硫酸アンモニウムのような塩、エタノールのような有機溶媒、またはポリエチレングリコールのような高分子を用いる選択的な沈降によって、得ることができる。
【０１０７】
モノクローナル抗体を作成するために、脾細胞が、免疫化されたトランスジェニック動物から単離され、これは、ハイブリドーマの生産のための形質転換細胞株との細胞融合において使用されるか、または、抗体をコードするｃＤＮＡが、標準的な分子生物学的技術によってクローニングされ、トランスフェクトされた細胞中で発現させられるかのいずれかが行われる。モノクローナル抗体を作成するための手順は、当該分野で十分に確立されている。例えば、欧州特許第０  ５８３  ９８０  Ａ１号（“Ｍｅｔｈｏｄ  Ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｒｏｍ  Ｒａｂｂｉｔｓ”）、米国特許第４，９７７，０８１号（“Ｓｔａｂｌｅ  Ｒａｂｂｉｔ−Ｍｏｕｓｅ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  Ａｎｄ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ”）、ＷＯ９７／１６５３７（“Ｓｔａｂｌｅ  Ｃｈｉｃｋｅｎ  Ｂ−ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｕｓｅ  Ｔｈｅｒｅｏｆ”）、およびＥＰ
０  ４９１  ０５７  Ｂ１（“Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｗｈｉｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｅｓ  Ａｖｉａｎ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ”）を参照のこと。これらの開示は、引用により本明細書中に組み入れられる。クローニングされたｃＤＮＡ分子からのモノクローナル抗体の生体外での生産は、Ａｎｄｒｉｓ−Ｗｉｄｈｏｐｆ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｉｃｋｅｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｂｙ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ”、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４２：１５９（２０００）によって、そして、Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．，“Ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ”Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １：８７（１９９５）によって記載されている。それらの開示は、引用により本明細書中に組み入れられる。
【０１０８】
Ｂ細胞のような、本発明のトランスジェニック動物に由来する細胞、または抗原に対して免疫化されたトランスジェニック動物から確立された細胞株もまた、本発明の一部である。
【０１０９】
本発明のさらなる局面においては、疾患の処置に望ましい、精製されたヒト化抗体組成物、好ましくは、ヒト化ポリクローナル抗体組成物を投与することにより、霊長類、具体的には、ヒト患者の疾患を処置するための方法が提供される。
【０１１０】
本発明の別の局面においては、精製されたモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体が、霊長類、特に、ヒトへの投与に適している適切な薬学的担体と混合させられて、薬学的組成物が提供される。本発明の薬学的組成物において使用することができる薬学的に許容される担体は、任意の全ての溶媒、分散媒体、等張化剤などであり得る。任意の従来の媒体、試薬、希釈剤、または担体は、レシピエントに対して、またはその中に含まれる抗体の治療有効性に対して不利益をもたらさない限りは、本発明の薬学的組成物中でのその使用は適切である。担体は、液体、半固体（例えば、ペースト状）、または固体の担体であり得る。担体の例としては、油、水、生理食塩溶液、アルコール、糖、ゲル、脂質、リポソーム、樹脂、多孔性基質、結合剤、増量剤、コーティング剤、保存料など、あるいはそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１１１】
投与に使用されるヒト化ポリクローナル抗体組成物は、通常、０．１から１００ｍｇ／ｍｌまでの免疫グロブリン濃度、より一般的には、１から１０ｍｇ／ｍｌまでの濃度のポリクローナル抗体の集団を含むことを特徴とする。抗体組成物には、種々のイソ型の免疫グロブリンが含まれる場合がある。あるいは、抗体組成物には、１つにイソ型の抗体のみが含まれる場合も、また、複数の選択されたイソ型の抗体が含まれる場合もある。
【０１１２】
ほとんどの場合においては、抗体組成物は、修飾されていない免疫グロブリン、すなわち、さらに例えば、化学的もしくは酵素的に、修飾されることなく動物から、調製されたヒト化抗体から構成される。あるいは、免疫グロブリン画分に、酵素消化（例えば、ペプシン、パパイン、プラスミン、グリコシダーゼ、ヌクレアーゼなどで）、加熱などのような処理が行われる場合もあり、そして／また、さらに分画される場合もある。
【０１１３】
抗体組成物は、通常は、血管系に投与され、適切な静脈に入れられたカテーテルを通じて、注射または注入によって静脈内に投与することが好都合である。抗体組成物は、適切な速度で、通常は、約１０分から約２４時間の範囲で、さらに一般的には、約３０分から約６時間の範囲で、患者が順応できる液体の速度によって投与される。有効投与量の投与は、１回の注入の中に存在させることができ、また、一連の注入の中に存在させることもできる。反復注入は、抗体調製物の半減期および臨床的な適応症に応じて、１日に１回、１週間に１回、１ヶ月に１回、または３ヶ月ごとに１回投与することができる。上皮表面への塗布については、抗体組成物は、意図される最終的な結果をもたらすために十分な量で処置が必要な表面に塗布され、そして必要な場合には繰り返すことができる。さらに、抗体は、例えば、筋肉内のボーラス注射として投与することができ、これには、その後、例えば、注入による持続的な投与が続く場合があるが、これは必ずしも必要ではない。
【０１１４】
抗体組成物は、疾患の原因となるか、あるいは、望ましくないかまたは異常な免疫反応を誘発する、ヒトの体組織中の抗原性物質に結合し、それを中和するために使用することができる。「抗原性物質」は、本明細書中では、タンパク質を含む任意の可溶性または細胞表面結合分子、さらには、細胞、または、疾患を引き起こす微生物、あるいは、少なくとも抗体に結合することができ、好ましくは、免疫反応を刺激することもできる因子を含むように定義される。
【０１１５】
単剤療法として、または化学療法と組み合わせた、感染性因子に対する抗体組成物の投与により、感染性粒子の排除がもたらされる。抗体の単独での投与により、感染性粒子の数は、１０倍から１００倍、より一般的には、１０００倍以上減少する。同様に、単剤療法として、または化学療法との組み合わせにおいて使用された、悪性疾患を有している患者における抗体療法により、悪性細胞の数は、通常、１０倍から１００倍、あるいは、さらに１０００倍減少する。治療は、感染性粒子、悪性細胞などの完全な排除が確実となるまでの期間、繰り返すことができる。いくつかの症例においては、抗体調製物での治療が、検出できる量の感染性粒子または望ましくない細胞が存在しなくなるまでの期間、続けられる。同様に、免疫反応の調節のための抗体療法の使用は、１回の治療用抗体の投与から構成される場合も、また、複数回の投与から構成される場合もある。治療は、任意の疾患の兆候がなくなるまでの期間、続けられ得る。
【０１１６】
この処置は、感染性疾患または悪性腫瘍を阻害するために十分な投与量で、化学療法と組み合わせて使用することができる。自己免疫疾患の患者または移植のレシピエントにおいては、抗体療法を、免疫反応を阻害するために十分な投与量の免疫抑制療法と組み合わせて使用することもできる。本発明はさらに、以下の実施例によって説明されるが、実施例は決して限定ではない。
【実施例】
【０１１７】
（実施例１）
（ウサギ免疫グロブリン遺伝子座を含むＢＡＣクローンの単離および配列決定）
高分子量のＤＮＡをａ２ｂ５雄ウサギから単離した。ウサギを安楽死させ、脾臓と腎臓を取り出し、氷冷したＰＢＳ中でリンスした。脂肪と結合組織を除去し、別々に処理した。臓器をフラグメントになるように切り、予め冷却しておいたＤｏｕｎｃｅホモジナイザーにおいてホモジナイズした。上清を冷却した５０ｍｌのファルコンチューブに移し、冷却したＰＢＳと混合し、大きな組織の破片を２分間の間、底に沈ませた。上清中の細胞を、２００ｇで４℃で１０分間かけてペレット状にし、ＰＢＳで１回洗浄し、１ｍｌのＰＢＳ中に再度懸濁させ、数えた。５×１０６、５×１０７、および５×１０８個の細胞のセットを、ＣＨＥＦ哺乳動物ゲノムＤＮＡプラグキット（ＣＨＥＦ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｌｕｇ  Ｋｉｔ）（ＢＩＯＲＡＤ）を使用してアガロースプラグに包埋した。ＨｉｎｄＩＩＩでの部分的消化の条件を最適化するために、プラグを５個の同じフラグメントに切断し、１から１０単位のＨｉｎｄＩＩＩで種々の時間の間、種々の温度で消化した。最良の結果は、４℃で３時間、または３７℃で２５分間の、２単位のＨｉｎｄＩＩＩを用いた場合に得られた。消化したＤＮＡを、以下のパラメーターを使用してパルスフィールドゲル電気泳動（Ｐｕｌｓｅ  Ｆｉｅｌｄ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）（ＰＦＧＥ）装置上でダブルサイズ分画した：６時間の逆行、１５秒間のスイッチ時間；６時間前方へ進める、１５秒間のスイッチ時間；２０時間前方へ進める、９０秒間のスイッチ時間；２００Ｖ、１４℃。所望される大きさの部分的に消化されたＤＮＡを有しているゲルの領域を切り取り、ＤＮＡをゲレース（ｇｅｌａｓｅ）を使用して単離した。１１ｎｇの挿入フラグメントを、１ｎｇのＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＢＥＬＯＢＡＣ１１と連結し、ＤＨ１０Ｂ細胞中にエレクトロポレーションした。得られたコロニーの１％についてＮｏｔＩを使用して大きさを測定し、平均の挿入フラグメントの大きさが１２４ｋｂであることを明らかにした。１×１０５個のクローンをナイロンフィルター（Ｎｙｌｏｎ  ｆｉｌｔｅｒ）上にスポットし、特異的プローブとのハイブリダイゼーションによってスクリーニングした。
【０１１８】
スクリーニングのためのプローブを、ウサギ由来のゲノムＤＮＡを使用してＰＣＲによって増幅し、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔにクローニング氏、配列決定によって確認した。プライマー対（配列番号１９３〜２０８、表２）を、公開されている配列にしたがって設計した。ウサギ重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子座を提示するいくつかのＢＡＣを単離し、マップした（図１および５）。ＢＡＣｓ  ２１９Ｄ２３  ２１９Ｄ２３（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＹ３８６６９５）、２２５Ｐ１８（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＹ３８６６９７）、２７Ｎ５（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＹ３８６６９６）、３８Ａ２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＹ３８６６９４）、１７９Ｌ１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＹ４９５８２７）、２１５Ｍ２２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＹ４９５８２６）、１９（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＹ４９５８２８）、およびフォスミドＦｏｓ１５Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＹ３８６６９６８）を配列決定した。配列決定のためのショットガンライブラリーを、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ中に、１．５〜２ｋｂの大きさの挿入フラグメントを含めて構築した。配列分析には、ＳＴＡＤＥＮパッケージ（Ｒｏｇｅｒ  Ｓｔａｄｅｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を使用した。ソフトウェアによってプレギャップを調節し、ｇａｐ４を組み立てとギャップを閉じるために使用した。配列の特質クリッピング（ｑｕａｌｉｔｙ  ｃｌｉｐｐｉｎｇ）のために、ＰＨＲＥＤ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）とＳＴＡＤＥＮパッケージを組み合わせた。
【０１１９】
（実施例２）
（ヒト化ウサギ免疫グロブリン重鎖遺伝子座の構築）
ウサギの免疫グロブリン重鎖遺伝子座の配列を含むＢＡＣおよびフォスミドクローンを、定常領域、可変領域、および結合遺伝子セグメント、あるいは、３’エンハンサー領域に特異的なプローブを使用してゲノムＤＮＡライブラリーから単離した。単離したＢＡＣ（図１）２７Ｎ５（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＹ３８６６９６）、２１９Ｄ２３（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＹ３８６６９５）、２２５Ｐ１８（ＧｅｎＢａｎｋ
Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＹ３８６６９７）、３８Ａ２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＹ３８６６９４）、フォスミドＦｏｓ１５Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＹ３８６６９６８）を配列決定した（Ｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ３３０，４９−５９）。
【０１２０】
選択した免疫グロブリンコード配列を、ＥＴクローニングによる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での相同組み換えにより、対応するヒトの部分と交換した（Ｅ−Ｃｈｉａｎｇ  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ７３，５６−６５（２００１）；Ｄａｉｇｕａｎ
Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９７，５９７８−５９８３（２０００）；Ｍｕｙｒｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２７，１５５５−１５５７（１９９９）；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８，１３１４−１３１７（２０００））。
【０１２１】
あるいは、ＤＮＡフラグメントを、生体外での連結によって組み換え、その後、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を形質転換した。ＢＡＣおよび／またはＦｏｓ１５Ｂ、あるいはその一部を、生体外での連結および形質転換、ＥＴクローニングによって、あるいはＣｒｅリコンビナーゼによって媒介される組み込みによって結合させた。
【０１２２】
ＥＴクローニングのために、標的配列を含むベクターを、誘導性のλファージ組み換え酵素Ｒｅｄα、Ｒｅｄβおよびγを含むストレプトマイシン耐性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株に形質転換した。これらの組み換えタンパク質を、同時トランスフェクトさせたプラスミドから（プラスミドｐＳＣ１０１を有しているＤＨ１０Ｂ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞）、またはゲノムに組み込まれたλプロファージから（ＤＹ３８０大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株）のいずれかから発現させた。ＥＴクローニング手順には、２回の相同組み換え工程を含めた。
【０１２３】
最初の工程では、標的遺伝子座が、選択−対抗選択（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ−ｃｏｕｎｔｅｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）カセット（例えば、ｎｅｏ−ｒｐｓＬ、これは、ネオマイシンに対する耐性（ｎｅｏ）と、ストレプトマイシンに対する感受性（ｒｐｓＬ）を与える）によって置き換えた。ｎｅｏ−耐性コロニーの単離後、相同組み換えによる選択カセットの挿入を、制限酵素分析と部分的な配列決定によって確認した。
【０１２４】
第２の工程では、ｒｐｓＬ−ｎｅｏ選択カセットを、新しい配列と交換した。ストレプトマイシン耐性クローンを制限分析と配列決定によって分析した。ＥＴクローニング手順に使用したフラグメントには、２０から５０ｂｐの長さの隣接配列が含まれており、これは、標的配列と同じであった。連結に使用した配列は、その３’末端と５’末端に適切な制限酵素部位を有していた。これらの部位は、もともと備わっている部位であるか、またはそれらは、適切な部位を含むプライマーを使用してＰＣＲによって導入されたものであるかのいずれかであった。
【０１２５】
あるいは、配列を合成によって作成した。
【０１２６】
ヒト化重鎖を、ＢＡＣ  ２１９Ｄ２３中のウサギＪＨ、Ｃμ、およびＢＡＣ  ２７Ｎ５中のＣγの、対応するヒト部分での、ＥＴクローニングにより置き換えによって構築した。ＥＴクローニング手順に使用したヒト配列は、ヒトゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。
【０１２７】
ヒトＣμ、Ｃγ、およびＪＨ遺伝子セグメントを、ウサギの標的配列に相同である５０ｂｐのプライマー（配列番号２０９〜２１４、表２）を使用して増幅した。
【０１２８】
ＢＡＣクローン２２５Ｐ１８のクローン２１９Ｄ２３との連結、およびＢＡＣ  ２７Ｎ５のフォスミド１５Ｂとの連結の後、連結させた構築物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換し、Ｃｒｅリコンビナーゼによって媒介される挿入によって繋いだ。これによって、１８個のウサギの可変遺伝子、ウサギＤ領域、ヒトＪ領域、ヒトＣμ、ヒトＣγ、ウサギＣε、ウサギＣα４、および３’エンハンサーエレメントから構成される機能的な遺伝子座が得られた。
【０１２９】
トランスジェニック動物の作成のために、ヒト化ＢＡＣクローンを、３個の重複しているＢＡＣ（２２５Ｐ１８と２１９Ｄ２３とＢＡＣ２７Ｎ５）、または２つの重複している結合させたＢＡＣ（２２５Ｐ１８−２２９Ｄ２３と、ＢＡＣ２７Ｎ５−フォスミド１５Ｂ）を同時にか、または別々のいずれかで、あるいは、１つのＢＡＣとして（２２５Ｐ１８−２１９Ｄ２３−２７Ｎ５−フォスミド１５Ｂ）注入した。トランス遺伝子を有している創始動物をＰＣＲによって同定した。
【０１３０】
（実施例３）
（合成のフラグメントを用いたヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座の構築）
ヒトＶ配列とウサギのスペーサーを有している、ユニット１、ユニット２、ユニット３、およびユニット４と示される４個のフラグメント（図１３、配列番号１８９〜１９２）を化学的に合成した。それぞれのフラグメントには、５’に、ＡｓｃＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位が、３’にはｌｏｘ７１  Ｃｒｅリコンビナーゼ認識配列と、その後ろにＦｓｅＩとＭｌｕＩ制限酵素認識配列が隣接している。ユニット１は、ウサギのスペーサーＩ２９−３０、Ｉ３−４、Ｉ２−３、およびＩｌ−２の３’側半分（Ｉ１−２Ｂ）によって間隔を隔てられているヒトＶＨ３−４９、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−７、およびＶＨ３−１５可変遺伝子から構成されている。ユニット２は、ウサギのスペーサーＩ１−２Ａ、（Ｉ１−２の５’側半分）、Ｉ７−８、Ｉ６−７、およびＩ４−５の３’側半分（Ｉ４−５Ｂ）によって間隔を隔てられているヒトＶＨ３−４８、ＶＨ３−４３、およびＶＨ３−６４から構成されている。ユニット３は、ウサギのスペーサー配列Ｉ４−５Ｂ、Ｉ２６−２７、Ｉ１１−１２、およびＩ１７−１８によって間隔を隔てられているヒトＶＨ３−７４、ＶＨ３−３０、およびＶＨ３−９から構成されている。
【０１３１】
ユニット３は、上記に加えて、上流のＦｌｐリコンビナーゼ認識標的（ＦＲＴ）配列の隣接と、その後ろに、上記のＡｓｃＩ部位の前にＳｇｌｆＩ制限エンドヌクレアーゼ認識配列を有している。
【０１３２】
ユニット４は、ウサギのスペーサーＩ１−２が５’側に隣接しているヒトＶＨ３−２３遺伝子、ｌｏｘ６６  Ｃｒｅリコンビナーゼ標的配列と、ＡｓｃＩエンドヌクレアーゼ認識配列を有しており、３’には、ＩＶ−Ｃ（５’側半分）ウサギスペーサー配列が隣接しており、その後ろにＭｌｕＩエンドヌクレアーゼ認識配列が続く。
【０１３３】
ゲンタマイシン選択カセットを、ＡｓｃＩとＦｓｅＩ部位を含むプライマー配列番号２１５および２１６（表２）を使用してＰＣＲ増幅し、ＡｓｃＩ、ＦｓｅＩ、およびＭｌｕＩエンドヌクレアーゼ認識部位を含む修飾されたクローニング部位を有しているｐＧＥＭベクター（配列番号２１７および２１８（表２）を使用してＰＣＲによって修飾したｐＧＥＭ．Ｇｅｎｔａ）に連結した。
【０１３４】
ユニット１、２、および３を、ｐＧＥＭ．Ｇｅｎｔａ（Ｐｒｏｍｅｇａ）ベクターにクローニングした。
【０１３５】
ユニット４を、ＨｉｎｄＩＩＩで直鎖状にしたカスタマイズしたｐＢＥＬＯＢＡＣ１１（ＮＥＢ）ベクターにサブクローニングし、ＰＣＲ増幅した。正方向プライマー（配列番号２１９、表２）は、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰａｃＩ、およびＡａｔＩＩについての制限部位を有しており、逆方向プライマー（配列番号２２０）は、ＢａｍＨＩ、ＭｌｕＩ、およびＡｓｃＩについての制限部位を有している。プライマーは、ｐＢＥＬＯＢＡＣ１１クロラムフェニコール選択カセットを欠失させるように設計した。さらに、ネオマイシン選択カセットを、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を有しているプライマー配列番号２２１および２２２（表２）を用いてＰＣＲ増幅し、修飾したｐＢＥＬＯＢＡＣ１１ベクター（ｐＢＢ１１．１）に連結した。
【０１３６】
ユニット１〜４を、記載されているようにｃｒｅによって媒介される組み換えによって組み立てた（Ｍｅｊｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ７０（２）１６５−７０（２０００））。最初に、ユニット１をカスタマイズしたｐＧＥＭ．Ｇｅｎｔａベクターにクローニングし、ＦｓｅＩで消化し、その後、連結によって再度環化させた。このベクターではない（ｖｅｃｔｏｒｌｅｓｓ）構築物で、ｐＢＢ１１．１．Ｕｎｉｔ４とｐ７０６−Ｃｒｅプラスミドを有している大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を形質転換した。ユニット１とＰＢＢ１１．１．ｕｎｉｔ４との組み換えの後、ポジティブクローン（ユニット４／１）を、カナマイシンとゲンタマイシンを含む培地上で選択した。クローンを、種々の酵素を用いる制限分析によって特徴付けた。
【０１３７】
ユニット２の組み換えのために、ユニット４／１挿入フラグメントを、ＡｓｃＩとＰａｃＩでの二重消化によって切り出し、ｐＢＥＬＯＢＡＣ１１中に修飾したリンカーとともにクローニングした（ｐＢＢ１１．２：プライマー配列番号２２３および２２４（表２）を使用してＰＣＲによって増幅した）。
【０１３８】
ｐＢＥＬＯＢＡＣ１１を、ＨｉｎｄＩＩＩで直鎖状にし、ＰａｃＩおよびＡａｔＩＩエンドヌクレアーゼ認識部位をコードする正方向プライマーと、ＭｌｕＩおよびＮｏｔＩエンドヌクレアーゼ認識部位、ならびに、ｌｏｘ６６  Ｃｒｅリコンビナーゼ標的部位をコードする逆方向プライマーを用いて、ＰＣＲ増幅した。ユニット１／４の連結のために、ｐＢＢ１１．２ベクターをＭｌｕＩとＰａｃＩで開環させた。
【０１３９】
ｐＧＥＭ．Ｇｅｎｔａ．Ｕｎｉｔ２を、ｐＧＥＭ．Ｇｅｎｔａ．Ｕｎｉｔ１について記載したように、環状のベクターではない構築物へと変換し、ｐＢＢ１１．２．Ｕｎｉｔ４／１と、生体内でのＣｒｅによって媒介される組み換えによって繋いだ。続いて、得られた構築物ｐＢＢ１１．２．Ｕｎｉｔ４／１／２を、ＥＴクローニングによって野生型のｌｏｘｐ部位をｌｏｘ６６標的部位で置き換えることによる、ユニット３とのＣｒｅによって媒介される組み換えのために調製した（Ｍｕｙｒｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２７，１５５５−１５５７（１９９９）；Ｍｕｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２６（５）：３２５−３１（２００１））。クロラムフェニコール選択カセットを、ＢＡＣ標的配列に相同である５０ｂｐの配列を含むプライマー（配列番号２２５および２２６、表２）を用いてＰＣＲによって増幅した。逆方向プライマーには、ｌｏｘ６６部位を含めた。ゲルから精製したＰＣＲ産物を、標的ＢＡＣと、さらに相同組み換えに必要なｐＳＣ１０１プラスミドを有している細胞に形質転換した。ポジティブクローンを、クロラムフェニコールで選択し、制限分析と配列決定によって確認した。ｐＧＥＭ．Ｇｅｎｔａ．Ｕｎｉｔ３を、ユニット１および２について上記に記載したように生体内での組み換えのために調製し、受容体ＢＡＣ、さらには、ｐ７０６−Ｃｒｅプラスミドを有している細胞に形質転換した。ポジティブクローンｐＢＢ１１．２．Ｕｎｉｔ４／１／２／３を、ゲンタマイシンを用いて選択し、制限分析によって確認した。ｐＢＢ１１．２．Ｕｎｉｔ４／１／２／３を、さらにＥＴクローニングによって、ｌｏｘ７１標的部位を生じるように修飾した。その後、ｐＢＢ１１．２．Ｕｎｉｔ４／１／２／３を、ＢＡＣ  ２１９Ｄ２３、２７Ｎ５、およびＦｏｓ１５Ｂに由来するフラグメントに繋いだ。
【０１４０】
（実施例４）
（ＰＣＲ増幅したフラグメントを用いるヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座の構築）
ヒトＶＨエレメントを、ゲノムＤＮＡ（ＣｌｏｎＴｅｃｈ）とプライマー配列番号２２７〜２４８（表２）を使用して増幅した。ＰＣＲ産物を、ゲル電気泳動によって分析し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮキット（Ｑ−Ｂｉｏｇｅｎ）を使用してゲル精製した。その後、増幅産物を、Ｚｅｒｏ−Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、製造業者の説明書にしたがってサブクローニングした。全ての増幅したＶエレメントの配列を確認した。ヒト化Ｖ領域の構築のために、Ｖエレメントを、鋳型としてのプラスミドＤＮＡと、プライマー配列番号２４９〜２７０（表２）を使用して増幅した。正方向プライマーには、ＡｓｃＩ部位、その後ろに、ウサギスプライシング部位を含めた。逆方向プライマーには、ウサギの組み換えシグナル配列（ＲＳＳ）と、ＭｌｕＩ制限部位を含めた。ＰＣＲ産物を、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮキットを使用してゲル精製した。
【０１４１】
ヒトＶＨｓ、Ｖ３−３３、Ｖ３−７４、Ｖ３−４９、Ｖ３−２１、Ｖ３−４８、Ｖ３−７３、Ｖ３−７、およびＶ３−Ｄは、ＰＣＲによっては単離できず、これらは、化学合成した（ＢｌｕｅＨｅｒｏｎ，Ｂｏｔｈｅｌ，ＷＡ）。制限部位とウサギの調節配列を、合成の間に付加した。
【０１４２】
ウサギのスペーサー配列を、鋳型としてのＢＡＣ  ３８Ａ２および２２５Ｐ１８と、プライマー配列番号２７１〜２８８（表２）を使用して増幅した。ＢＡＣ  ２２５Ｐ１８をＮｈｅＩで二重消化し、４１ｋｂのフラグメントをゲル精製した。このフラグメントを、スペーサーＶ１−２、Ｖ２−３、Ｖ３−４、Ｖ４−５、およびＶ５−６の増幅のための鋳型とした。
【０１４３】
ＢＡＣ  ２２５Ｐ１８を、ＢｓｔＢＩで消化し、スペーサーＶ６−７とＶ７−８の鋳型をゲル精製した。ＢＡＣ  ３８Ａ２のＰａｃＩとＲｓｒＩＩでの二重消化により、スペーサーＶ２１−２２とＶ２２−２３の鋳型のゲル精製ができた。
【０１４４】
増幅したスペーサー配列をゲル精製し、ＸＬ−ＰＣＲ−ＴＯＰＯ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、製造業者の説明書にしたがってサブクローニングした。
【０１４５】
ＶＨエレメントとウサギのスペーサー配列を、修飾したｐＧＥＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ）とｐＢＳ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）ベクターにサブクローニングした。ｐＧＥＭベクターをＮｏｔＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＦｓｅＩ、ＡｓｃＩ、およびＭｌｕＩ部位を含む化学合成したオリゴヌクレオチド配列（オリゴ１：配列番号２８９；オリゴ２：配列番号２９０；表２）に連結させた。ベクターｐＢＳをＳａｃＩとＫｐｎＩで切断し、制限部位ＦｓｅＩ、ＡｓｃＩ、およびＭｌｕＩを含む化学合成したオリゴヌクレオチド配列（オリゴ１：配列番号２９１；オリゴ２：配列番号２９２；表２）と連結させた。
【０１４６】
ゲンタマイシンとネオマイシン選択カセットを、ＦｓｅＩまたはＡｓｃＩ部位を有するプライマー（配列番号２９３〜２９６、表２）を使用して増幅し、修飾したｐＧＥＭとｐＢＳベクターに連結した。
【０１４７】
最終的な構築物を、修飾したｐＢｅｌｏＢＡＣＩＩベクター中で組み立てた。ｐＢｅｌｏＢＡＣＩＩベクターを、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで開環し、クローニング部位を、ＦｓｅＩ、ＡｓｃＩ、ＭｌｕＩ部位を含むように、化学合成したオリゴヌクレオチド配列（オリゴ１：配列番号２９７；オリゴ２：配列番号２９８；表２）を使用して修飾した。
【０１４８】
ＢＡＣ  ２１９Ｄ２３を、ＥＴクローニングを使用して制限部位を導入することによって修飾した（Ｍｕｙｒｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２７，１５５５−１５５７（１９９９）；Ｍｕｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２６（５）：３２５−３１（２００１））。ネオマイシン選択カセットを、プライマー配列番号２９９および配列番号３００（表２）を用いて増幅した。正方向プライマーにはＦｓｅＩ部位を含め、逆方向プライマーにはＡｓｃＩ部位を含めた。
【０１４９】
精製したＰＣＲ産物で、ＢＡＣ  ２１９Ｄ２３と、相同組み換えに必要なプラスミドｐＳＣ１０１を有している大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を形質転換した。カセットとＢＡＣ中の標的部位の相同組み換えの後、導入した制限部位を制限分析によって確認した。その後、修飾したＢＡＣ  ２１９Ｄ２３をＦｓｅＩとＭｌｕＩで消化し、得られた１７ｋｂのフラグメント（ＦｓｅＩ−Ｎｅｏ−ＡｓｃＩカセット）を、ＰＦＧＥによって分離し、電気的溶出によって精製した。この精製したフラグメントを、ＦｓｅＩとＭｌｕＩで開環させた修飾したｐＢｅｌｏＢＡＣ  ＩＩベクターと連結させた。
【０１５０】
ヒトＶＨエレメントをコードする精製したＤＮＡフラグメントを、ＡｓｃＩとＭｌｕＩで開環させた修飾したｐＧＥＭ．ｎｅｏベクターと連結させた。同様に、スペーサー配列を、修飾したｐＧＥＭ．ｇｅｎｔａベクターにサブクローニングした。その後、スペーサー配列を有しているｐＧＥＭ．ｇｅｎｔａベクターをＦｓｅＩとＭｌｕＩで切断し、挿入フラグメントを、ＦｓｅＩとＡｓｃＩで開環させたｐＧＥＭ．ｎｅｏ．ＶＨベクターと連結させた。この工程を数回繰り返して、いくつかのスペーサーとＶＨセグメントから構成されるフラグメントを組み立てた。このようなフラグメントをＦｓｅＩとＭｌｕＩで切り出し、ＦｓｅＩとＡｓｃＩで直鎖状にした修飾したｐＢｅｌｏＢＡＣＩＩベクターと連結させた。これらのプロセスを、大きな免疫グロブリンＶ領域を組み立てるために繰り返した（図６）。ヒト化重鎖遺伝子座を、トランスジェニック動物の作成に使用した。
【０１５１】
（実施例５）
（ヒト化Ｃκとヒト化再構成ＶＪを含む、ヒト化ウサギ軽鎖遺伝子座の構築）
ウサギのゲノムＢＡＣライブラリーのスクリーニングにより、ウサギの軽鎖κ１遺伝子セグメントを含む３個のＢＡＣ（２１５Ｍ２２、１７９Ｌ１、および１９６Ｏ２；それぞれ、Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＹ４９５８２６、ＡＹ４９５８２７、およびＡＹ４９５８２８）が得られた。ウサギのＣκ１を、記載されている（Ｅ−Ｃｈｉａｎｇ
Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ７３，５６−６５（２００１）；Ｄａｉｇｕａｎ  Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９７，５９７８−５９８３（２０００）；Ｍｕｙｒｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２７，１５５５−１５５７（１９９９）；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８，１３１４−１３１７（２０００））ようなＥＴクローニングによって、ヒトＣκアロタイプＫｍ３と交換した。ヒトＣκ（アロタイプＫｍ３）を、標的配列に相同である５０ｂｐの配列を含むプライマー（配列番号３０１および３０２、表２）を用いてＰＣＲによって増幅した。相同アームを、ウサギの生殖細胞系列κ（ｂ５；ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｋ０１３６３）の公開されている配列に基づいて設計し、Ｃκのイントロン−エキソン境界と適合させた。ＢＡＣ  １７９Ｌ１中でのウサギのＣκのヒトＣκへの交換を、配列決定によって確認した。
【０１５２】
ＢＡＣ  １７９Ｌ１−ｈｕＣκを２回のＥＴクローニングによって修飾した。ネオマイシン選択カセットを、ＢＡＣ  １７９Ｌ１に相同である５０ｂｐの配列を含むプライマー（配列番号３０３および３０４、表２）を用いて増幅した。正方向プライマーには、さらに、ｉ−ＣｅｕＩメガヌクレアーゼ部位を含めた。ＰＣＲ産物をＥＴクローニングに使用した。ポジティブクローンをネオマイシンで選択し、制限酵素消化と配列決定によって正確であることをチェックした。ゼオシン選択カセットを、ＢＡＣ  １７９Ｌ１に相同である５０ｂｐの配列を含むプライマー（配列番号３０５および３０６、表２）を用いて増幅した。正方向プライマーには、さらに、ｉ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼ部位を含めた。ＰＣＲ産物をＥＴクローニングに使用した。ポジティブクローンをゼオシンで選択し、制限酵素消化と配列決定によって正確であることをチェックした。
【０１５３】
ＢＡＣ  ２１５Ｍ２２を１回のＥＴクローニングによって修飾した。ゲンタマイシン耐性遺伝子を、ＢＡＣ  ２１５Ｍ２２に相同である５０ｂｐの配列を含むプライマー（配列番号３０７および３０８、表２）を用いて増幅した。正方向プライマーには、さらに、ｉ−ＣｅｕＩメガヌクレアーゼ部位を含め、逆方向プライマーには、ｉ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼ部位を含めた。ＰＣＲ産物をＥＴクローニングに使用した。得られたクローンをゲンタマイシンで選択し、制限酵素消化と配列決定によって分析した。
【０１５４】
修飾したＢＡＣ  １７９Ｌ１および２２５Ｍ２２を、ｉ−ＣｅｕＩとｉ−ＳｃｅＩで切断した。９８ｋｂのフラグメントと、１３２ｋｂのフラグメントを精製し、連結させた。得られたクローンを、カナマイシンとクロラムフェニコールで選択し、制限酵素消化、ｉ−ＳｃｅＩとｉ−ＣｅｕＩ制限部位を含む領域のＰＣＲ、および配列決定によって正確であることをチェックした。得られたＢＡＣを、１７９−２１５−ｈｕＣκと呼んだ。
【０１５５】
ＢＡＣ  １７９−２１５−ｈｕＣκのウサギのＪκ１とＪκ２を、ＥＴクローニングによって、合成のヒトの再構成したＶκＪκ遺伝子と置き換えた。ウサギのプロモーター、ウサギのリーダー、ウサギのイントロンと、ヒトＶκＪκ遺伝子を有しているＤＮＡフラグメントを化学合成した。合成のヒトＶＪのコドン使用は、ウサギのＶκ遺伝子に最も高く相同であるＤＮＡ配列となるように最適化した。
【０１５６】
合成のヒトＶＪを、ＢＡＣ  １７９Ｌ１に相同である５０ｂｐの配列を含む正方向プライマー（配列番号３０９、表２）と、ゲンタマイシン耐性遺伝子に相同である配列およびＦＲＴ部位を含む逆方向プライマー（配列番号３１０、表２）を用いてＰＣＲ増幅した。ゲンタマイシン耐性遺伝子を、ＦＲＴ部位を含む正方向プライマー（配列番号３１１、表２）と、ＢＡＣ  １７９Ｌ１に相同である５０ｂｐおよびＦＲＴ部位を有している逆方向プライマー（配列３１２、表２）を用いて増幅した。合成のヒトＶＪとゲンタマイシン耐性遺伝子とを、合成のヒトＶＪ遺伝子についての正方向プライマーと、ゲンタマイシン耐性遺伝子についての逆方向プライマーを使用する重複伸張（ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）ＰＣＲによって結合させた。得られたフラグメントをＥＴクローニングに使用した。ポジティブクローンをゲンタマイシンで選択し、制限酵素消化と配列決定によって正確であることを確認した。
【０１５７】
ゲンタマイシン耐性遺伝子を、Ｆｌｐリコンビナーゼの発現を通じて、部位特異的組み換えによって除去した。組み換え後、１つのＦＲＴが残った。このＦＲＴ部位をＥＴクローニングによって欠失させた。合成のヒトＶＪに由来する２３２ｂｐのフラグメントを、（プライマー配列番号３１３および３１４（表２）を使用して）ＰＣＲによって増幅し、ＥＴクローニングに使用した。得られたコロニーを、ＦＲＴ部位が存在しないことについて（プライマー配列番号３１５および３１６（表２）を使用して）ＰＣＲによってスクリーニングし、配列決定によって確認した。
【０１５８】
ＢＡＣ  １７９−２１５−ｈｕＣκのネオマイシン耐性遺伝子をＥＴクローニングによって置き換えた。ゲンタマイシン耐性（ｐＲｅｐ−Ｇｅｎｔａ；Ｇｅｎｅｂｒｉｄｇｅｓ）遺伝子を、ＢＡＣ  １７９−２１５−ｈｕＣκに相同である５０ｂｐの配列を含むプライマー（配列番号３１７および３１８、表２）を用いてＰＣＲによって増幅した。正方向プライマーには、さらに、ｌｏｘＰ部位、ａｔｔＢ部位、およびＰｖｕＩ制限部位を持たせておいた。得られたクローンをゲンタマイシンで選択し、制限酵素消化と配列決定によって正確であることをチェックした。
【０１５９】
得られたＢＡＣ（ｒＬＣ３−Ｂ、図８）を、トランスジェニック動物の作成に使用した。
【０１６０】
（実施例６）
（複数のヒトＶκエレメント、ニワトリのスペーサーエレメント、および再構成されたヒトＶＪを含む、ヒト化ウサギ軽鎖遺伝子座の構築）
ウサギのゲノムＢＡＣライブラリーのスクリーニングにより、ウサギの軽鎖κ１遺伝子セグメントを含む３個のＢＡＣ（２１５Ｍ２２、１７９Ｌ１、および１９６Ｏ２；それぞれ、Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＹ４９５８２６、ＡＹ４９５８２７、およびＡＹ４９５８２８）が得られた。ウサギのＣκ１を、記載されている（Ｅ−Ｃｈｉａｎｇ
Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ７３，５６−６５（２００１）；Ｄａｉｇｕａｎ  Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９７，５９７８−５９８３（２０００）；Ｍｕｙｒｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２７，１５５５−１５５７（１９９９）；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８，１３１４−１３１７（２０００））ようなＥＴクローニングによって、ヒトＣκアロタイプＫｍ３と交換した。ヒトＣκ（アロタイプＫｍ３）を、標的配列に相同である５０ｂｐの配列を含むプライマー（配列番号３０１および３０２、表２）を用いてＰＣＲによって増幅した。相同アームを、ウサギの生殖細胞系列κ（ｂ５；ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｋ０１３６３）の公開されている配列に基づいて設計し、Ｃκのイントロン−エキソン境界と適合させた。ＢＡＣ  １７９Ｌ１中でのウサギのＣκのヒトＣκへの交換を、配列決定によって確認した。
【０１６１】
２つのＤＮＡフラグメント、１７個のヒトのＶ偽遺伝子と１８個のニワトリのスペーサー配列を含むユニット１（１２，２３５ｂｐ、図１２ａ、配列番号１８７）と、リーダーを伴う機能的な再構成されたヒトκＶＪ遺伝子フラグメント、１１個のヒトＶ偽遺伝子、１２個のニワトリのスペーサー配列、イントロン１、およびイントロン２の一部を含むユニット２（１３，２８３ｂｐ、図１２ｂ、配列番号１８８）を化学合成し、ベクターｐＢＲ３２２にクローニングした。
【０１６２】
ユニット１およびユニット２を、制限酵素ＮｇｏＭＩＶとＡｓｉＳＩ、またはＮｇｏＭＩＶとＡｓｃＩでそれぞれ消化し、３個のフラグメントの連結により修飾されたリンカーを有しているｐＢＥＬＯＢＡＣ１１に連結させた。修飾されたリンカーには、ＢｓｉＷＩ制限部位、ＦＲＴ５部位、ｒｐｓＬ−Ｎｅｏカセット、ＡｓｃＩ部位、およびＡｓｉＳＩ部位が含まれている。リンカーフラグメントを、高品質のポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、プライマーＣＥ＿１＿００１＿０１２９０４（配列番号３１９、表２）、および鋳型としてのプラスミドｐＲｐｓＬ−Ｎｅｏ（Ｇｅｎｅｂｒｉｄｇｅｓ）を用いて増幅した。その後、増幅した産物を、ｐＢＥＬＯＢＡＣ１１のＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩ部位に連結した。ユニット１とユニット２の連結のために、修飾されたｐＢＥＬＯＢＡＣ１１をＡｓｉＳＩとＡｓｃＩを用いて開環させた。ポジティブクローン（ｐＢＥＬＯＢＡＣ１１  Ｕｎｉｔ１／２）を制限酵素消化によってチェックした。
【０１６３】
ＢＡＣ  １７９Ｌ１（ＧＥＮＢＡＮＫ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＹ４９５８２７）を、ＥＴクローニングによる２つの修飾された選択カセットの挿入によって修飾した。カセット１は、ＢＡＣ  １７９Ｌ１に相同である５０ｂｐの配列とＡｓｃＩ部位を逆方向プライマー中に含むプライマー（配列番号３２１および３２２、表２）を用いて増幅したゲンタマイシン耐性遺伝子である。カセット２は、ＢＡＣ  １７９Ｌ１に相同である５０ｂｐの配列、ａｔｔＢ部位、ＦＲＴ５部位、およびＢｓｉＷＩ部位を正方向プライマー中に含むプライマー（配列番号３２３および３２４、表２）を用いて増幅したｒｐｓ１−Ｎｅｏ選択カセットである。
【０１６４】
精製したＰＣＲ産物で、ＢＡＣと、相同組み換えに必要なプラスミドｐＳＣ１０１を有している大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を形質転換した。相同組み換えの後、ＢＡＣの修飾がうまくできたことを、制限消化分析、サザンブロット、および配列決定によって確認した。
【０１６５】
修飾したＢＡＣ  １７９Ｌ１を、制限酵素ＡｓｃＩとＢｓｉＷＩで切り出した。ヒトＣκを含むフラグメントを精製し、同じ制限酵素で開環させたｐＢＥＬＯＢＡＣ１１  Ｕｎｉｔ１／２と連結させた。ポジティブクローンを、制限酵素消化によってチェックした。最終的な構築物（図１２ｃ）を、トランスジェニック動物の作成のために使用した。
【０１６６】
（実施例７）
（複数のヒトＶκエレメント、ニワトリのスペーサー、および再構成されていないヒトＪκ遺伝子座を含む、ヒト化ウサギ軽鎖遺伝子座の構築）
実施例６に記載した構築物を、以下のようなＥＴクローニングによって修飾した。再構成された機能的なＶＪ配列を、機能的な組み換えシグナル配列（ＲＳＳ）が隣接している機能的なＶ１と交換した。ＲＳＳを、ｐＢＥＬＯＢＡＣ１１  Ｕｎｉｔ１／２のＶ１に相同である５０ｂｐの配列を含む正方向プライマー（配列番号３２５、表２）、および、ＡｓｃＩ制限酵素部位を含み、ゲンタマイシン耐性遺伝子に対する相同性を有している逆方向プライマー（配列番号３２６、表２）を用いて、ＢＡＣ  １７９Ｌ１からＰＣＲ増幅した。ゲンタマイシン耐性遺伝子を、ＲＳＳの増幅に使用した逆方向プライマーに相同である配列を含む正方向プライマー（配列番号３２７、表２）、およびｐＢＥＬＯＢＡＣ１１
Ｕｎｉｔ１／２に相同である５０ｂｐの配列と、ＢｓｉＷＩ制限酵素部位を含む逆方向プライマー（配列番号３２８、表２）を用いて増幅した。
【０１６７】
ＲＳＳとゲンタマイシン耐性遺伝子を、ＲＳＳの増幅のための正方向プライマーと、ゲンタマイシン耐性遺伝子の増幅のための逆方向プライマーを使用する、重複伸張ＰＣＲによって結合させた。得られたフラグメントを、ＥＴクローニングによりｐＢＥＬＯＢＡＣ１１  Ｕｎｉｔ１／２を修飾するために使用した。ポジティブクローンをゲンタマイシンで選択し、制限酵素消化と配列決定によって分析した。
【０１６８】
ヒトのＣκを有しているＢＡＣ  １７９Ｌ１を、ＥＴクローニングによってさらに修飾した。カナマイシン選択カセットを、ＢＡＣ  １７９Ｌ１に相同である５０ｂｐの配列を含むプライマー（配列番号３２９および３３０、表２）を用いて増幅した。逆方向プライマーにはまた、ＡｓｃＩ制限酵素部位とＦＲＴ部位を含めておいた。ＰＣＲ産物をＥＴクローニングに使用した。アンピシリン選択カセットを、ＢＡＣ  １７９Ｌ１に相同である５０ｂｐの配列を含むプライマー（配列番号３３１および３３２、表２）を用いて増幅した。正方向プライマーには、また、ａｔｔＢ部位、ＡｓｉＳＩ制限酵素部位、およびＦＲＴ５部位も含めておいた。逆方向プライマーには、ＢｓｉＷＩ制限酵素部位とＦＲＴ部位を含めておいた。ＰＣＲ産物をＥＴクローニングに使用した。ヒトＪ領域を、ＢＡＣ  １７９Ｌ１に相同である５０ｂｐの配列を含むプライマー（配列番号３３３および３３４、表２）を用いて、ヒトのゲノムＤＮＡから増幅した。ＰＣＲ産物をＥＴクローニングに使用した。得られたクローンを、制限酵素消化と配列決定によって分析した。
【０１６９】
ポジティブクローンをＡｓｃＩとＢｓｉＷＩで切断した。得られたフラグメントを精製し、同じ制限酵素で切断した修飾したｐＢＥＬＯＢＡＣ１１  Ｕｎｉｔ１／２に連結した。ポジティブクローンをアンピシリンで選択し、制限酵素消化と配列決定によって分析した。正しいクローンを、トランスジェニック動物を作成するために使用した。
【０１７０】
（実施例８）
（複数のヒトＶκエレメントを含むヒト化ウサギ軽鎖遺伝子座の構築）
ウサギのゲノムＢＡＣライブラリーのスクリーニングにより、ウサギの軽鎖κ１遺伝子セグメントを含む３個のＢＡＣ（２１５Ｍ２２、１７９Ｌ１、および１９６Ｏ２；それぞれ、Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＹ４９５８２６、ＡＹ４９５８２７、およびＡＹ４９５８２８）が得られた。ウサギのＣκ１を、記載されている（Ｅ−Ｃｈｉａｎｇ
Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ７３，５６−６５（２００１）；Ｄａｉｇｕａｎ  Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９７，５９７８−５９８３（２０００）；Ｍｕｙｒｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２７，１５５５−１５５７（１９９９）；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８，１３１４−１３１７（２０００））ようなＥＴクローニングによって、ヒトＣκアロタイプＫｍ３と交換した。ヒトＣκ（アロタイプＫｍ３）を、標的配列に相同である５０ｂｐの配列を含むプライマー（配列番号３０１および３０２、表２）を用いてＰＣＲによって増幅した。相同アームを、ウサギの生殖細胞系列κ（ｂ５；ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｋ０１３６３）の公開されている配列に基づいて設計し、Ｃκのイントロン−エキソン境界と適合させた。ＢＡＣ  １７９Ｌ１中でのウサギのＣκのヒトＣκへの交換を、配列決定によって確認した。
【０１７１】
Ｖκ１ファミリー（Ｏ２、Ｌ８、Ｌ４、Ａ３０、Ｌ１１、Ｌ１、Ｌ５、Ｌ１５、Ｏ８、Ｌ１９、Ｌ１２、Ａ２０、Ｏ４、Ｌ１４、Ｌ２３、Ｌ９、Ａ４、Ｌ２４、Ｏ６、Ｌ２２、Ａ９、Ａ２５、Ａ１５、Ｏ９）のヒトＶκエレメントを、プライマー（配列番号３３５〜３８２、表２）、および鋳型としてのヒトゲノムＤＮＡを使用してＰＣＲによって増幅した。
【０１７２】
増幅産物をゲル電気泳動によって分析し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ（Ｑ−Ｂｉｏｇｅｎ）を使用してゲル精製し、Ｚｅｒｏ−Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングし、配列決定した。再構成されたヒトＶκ（Ｏ２）Ｊκ（Ｊ４）エレメントが、ＰＣＲ増幅によって生じ、これをサブクローニングし、配列決定した。ヒトＶκエレメントをウサギのスペーサーと結合させるために、ヒトＶκエレメントを、プラスミドＤＮＡを鋳型として使用して、プライマー（配列番号３８３〜４３０、表２）を用いて、ＰＣＲによって増幅した。プライマーには、ＡｓｃＩ部位またはＭｌｕＩ部位を含めた。
【０１７３】
ウサギのスペーサー配列を、プライマー配列番号４３１〜４５０（表２）を使用してＰＣＲによって増幅した。ＢＡＣ  １７９Ｌ１および２１５Ｍ２２を、ＳｐｅＩ、ＮｈｅＩ、ＡｃｌＩ、ＳｆｏＩ、ＭｌｕＩ、およびＳａｌＩ／ＸｈｏＩで消化した。フラグメントをゲル精製し、増幅鋳型として使用した。
【０１７４】
５’末端に存在するスペーサー配列を、ＦＲＴとａｔｔＢ部位を含む上流オリゴヌクレオチドによって増幅した。ＰＣＲ産物を、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮキットを使用してゲル精製し、ＸＬ−ＰＣＲ−ＴＯＰＯ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、製造業者の説明書にしたがってサブクローニングした。
【０１７５】
ヒトＶκエレメントとウサギのスペーサー配列を、実施例４に記載したように修飾したｐＧＥＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングした。
【０１７６】
ヒトＶκと修飾したｐＧＥＭ．ｇｅｎｔａベクターを、ＡｓｃＩとＭｌｕＩで消化し、これらを連結させた。同様に、ウサギのスペーサー配列をｐＧＥＭ．ｎｅｏにクローニングした。その後、ｐＧＥＭ．ｎｅｏＶκをＦｓｅＩとＡｓｃＩで切断し、ＦｓｅＩとＭｌｕＩで切り出したｐＧｅｍ．ｇｅｎｔａ．ｓｐａｃｅｒの精製した挿入フラグメントと連結させた。ＡｓｃＩとＭｌｕＩの相補末端の連結により、それらの制限酵素部位は破壊され、いくつかのＶκとスペーサーエレメントを含むＶκ遺伝子座の構築のために、ＡｓｃＩとＭｌｕＩを繰り返し使用することができるようになる。ヒト化ＢＡＣ  １７９Ｌ１および２１５Ｍ２２のフラグメントと、ヒト化Ｖκ領域から構成される最終的な構築物を、ｐＢｅｌｏＢＡＣの中で組み立てた。ＢＡＣ  １７９Ｌ１および２１５Ｍ２２を修飾し、結合させた。その後、ＢＡＣ  １７９Ｌ１−２１５Ｍ２２−ｈｕＣκを、ＥＴクローニングによってさらに修飾した。制限酵素部位、選択マーカー、およびさらなる機能的部位を含む２つのカセットを、図７に示すようにＥＴクローニングによってベクター中に挿入した。カセットの増幅のために使用したプライマー（配列番号４５１〜４５４）を、表２に列挙する。
【０１７７】
最終的な構築物を組み立てるために、ヒトＶエレメント、ウサギのスペーサーエレメント、および耐性マーカーから構成されるユニットを、ｐＧＥＭからＦｓｅＩとＭｌｕＩで切り出し、ＦｓｅＩとＡｓｃＩで消化したＢＡＣ  １７９Ｌ１−２１５Ｍ２２と連結させた。その後、耐性マーカーを、ヒトＶエレメント、ウサギのスペーサーエレメント、および別の耐性マーカーから構成される新しい挿入フラグメントと置き換えた。数回繰り返した後、最終的な構築物は、ウサギのスペーサー配列によって隔てられた多くのＶκセグメント（Ｌ８、Ｌ４、Ａ３０、Ｌ１１、Ｌ１、Ｌ５、Ｌ１５、Ｏ８、Ｌ１９、Ｌ１２、Ａ２０、Ｏ４、Ｌ１４、Ｌ２３、Ｌ９、Ａ４、Ｌ２４、Ｏ６、Ｌ２２、Ａ９、Ａ２５、Ａ１５、Ｏ９）から構成される。ヒト化軽鎖遺伝子座を、トランスジェニック動物の作成のために使用する。
【０１７８】
（実施例９）
（ニワトリ重鎖遺伝子座スペーサー配列を有するヒト化重鎖遺伝子座の構築）
ニワトリのスペーサー配列によって隔てられている、ウサギＤ領域、ヒトＪ領域、ヒトＣμ、ヒトＣγ、ウサギＣα４、ウサギ３’αエンハンサー、およびヒトＶＨエレメント（プロモーター、および７マー／９マーの配列を含む）を含む、合成のヒト化重鎖遺伝子座を構築する。
【０１７９】
修飾したウサギＢＡＣ  ２７Ｎ５（「実施例２」を参照のこと）を、ＥＴクローニングによってさらに修飾した。この構築物には、ヒト化ＣμおよびＣγと、２つの１つずつしか存在しないＢｓｉＷＩおよびＡｓｉＳＩ制限部位が、α−４膜エキソンの下流に含まれている。ＤＮＡを、オリゴヌクレオチド配列番号４５５および４５６（表２）を用いて増幅した。
【０１８０】
フォスミドＦｏｓ１５ＢをＮｈｅＩで消化し、３’αエンハンサーを含む得られた１３ｋｂのフラグメントを、挿入フラグメントがＢｓｉＷＩおよびＡｓｉＳＩ部位と隣接するように、クローニングベクター中にサブクローニングした。その後、挿入フラグメントを、ＢｓｉＷＩおよびＡｓｉＳＩで切断し、修飾したＢＡＣ  ２７Ｎ５と連結させてＢＡＣ
２７Ｎ５Ｆｏｓを形成させた。
【０１８１】
ＢＡＣ  ２１９Ｄ２３中のウサギＪ領域を、ＥＴクローニングによって対応するヒトＪ領域と交換した。ヒトＪ領域を、プライマー配列番号４５７および４５８（表２）を使用してＰＣＲによって増幅した。
【０１８２】
１つずつしか存在しない制限酵素部位を、ＢＡＣ  ２１９Ｄ２３のＤ領域の上流（Ａ）とＣμの上流（Ｂ）に挿入した。ＢＡＣ  ２７Ｎ５Ｆｏｓ中では、制限部位Ａを、リンカー領域の上流に挿入し、Ｂを、ＢＡＣ  ２１９Ｄ２３に相同である配列の中に挿入した。酵素ＡおよびＢでの消化後、ヒトＪ領域とウサギＤ領域を含むフラグメントを単離し、ＢＡＣ  ２７Ｎ５Ｆｏｓと連結させて、ＢＡＣ  ２１９Ｄ２３／２７Ｎ５Ｆｏｓを作成した。
【０１８３】
ニワトリの重鎖スペーサー配列を、ニワトリ重鎖Ｖ偽遺伝子（Ｍａｎｓｉｋｋａ  ｅｔ
ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４５（１１），３６０１−３６０９（１９９０）、Ｒｅｙｎａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ５９（１），１７１−１８３（１９８９））に特異的なプライマー（配列番号４５９および４６０、表２）を使用して、ＰＣＲによってニワトリのゲノムＤＮＡから増幅した。あるいは、スペーサー配列を化学合成した。
【０１８４】
ＰＣＲ産物をゲル精製し、ｐＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、配列決定した。
【０１８５】
ヒト重鎖可変エレメントを、ＧＥＮＢＡＮＫに公開されている配列（例えば、Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＧ＿００１０１９）にしたがって設計したプライマーを用いてＰＣＲによって増幅したか、あるいは化学合成した。ヒトＶエレメントには、ヒトプロモーター領域、ヒトリーダー配列、リーダーとＶをコードする領域との間のヒトのイントロン、ヒトＶをコードする領域、およびヒトの組み換えシグナル配列が含まれている。増幅したか、または合成したフラグメントには、特異的な制限エンドヌクレアーゼ認識部位が隣接している。ニワトリのスペーサー配列とヒトのＶエレメントを、ヒト化免疫グロブリン遺伝子座を含む１つまたはいくつかの大きなＤＮＡフラグメントとなるように結合させた。構築物を、トランスジェニック動物を作成するために使用した。
【０１８６】
（実施例１０）
（ヒトＶエレメントおよび非ヒトスペーサー配列を含む（プロモーター領域とＲＳＳは含まない）ヒト化免疫グロブリン遺伝子座の構築）
非ヒトゲノムＤＮＡを用いて作成したＢＡＣライブラリーを、免疫グロブリンに特異的なプローブを用いてスクリーニングし、重鎖および軽鎖免疫グロブリンＣ、Ｊ、およびＤ領域を含むＢＡＣクローンを同定した。ＢＡＣクローンを修飾して、制限酵素部位を含ませた。ヒト重鎖および軽鎖可変エレメントを、ＧｅｎＢａｎｋ（例えば、Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＧ＿００１０１９）に公開されている配列にしたがって設計したプライマーを使用してＰＣＲによって増幅した。配列は、ゲノムＤＮＡから増幅したか、または化学合成した。ヒトＶエレメントには、ヒトのプロモーター領域、ヒトのリーダー配列、リーダーとＶをコードする領域との間のヒトのイントロン、ヒトＶをコードする領域、およびヒトの組み換えシグナル配列（ＲＳＳ）が含まれている。増幅したか、または合成したフラグメントは、末端に特異的な制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有している。非ヒトスペーサー配列は、ＰＣＲ増幅したか、または化学合成した。非ヒトスペーサー配列とヒトのＶエレメントを、ヒト化免疫グロブリン遺伝子座を含む１つまたはいくつかの大きなＤＮＡフラグメントとなるように結合させた。構築物を、トランスジェニック動物を作成するために使用した。ニワトリのスペーサー配列を用いたヒト化Ｖ領域の構築の例を、図１０に示す。
【０１８７】
（実施例１１）
（ヒトＶエレメントおよび非ヒトスペーサー配列を含むヒト化免疫グロブリン遺伝子座の構築）
非ヒトゲノムＤＮＡを用いて作成したＢＡＣライブラリーを、免疫グロブリンに特異的なプローブを用いてスクリーニングし、重鎖および軽鎖免疫グロブリンＣ、Ｊ、およびＤ領域を含むＢＡＣクローンを同定した。ＢＡＣクローンを修飾して、制限酵素部位を含ませた。ヒト重鎖および軽鎖可変エレメントを、ＧｅｎＢａｎｋ（例えば、Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＧ＿００１０１９）に公開されている配列にしたがって設計したプライマーを使用してＰＣＲによって増幅した。配列は、ゲノムＤＮＡから増幅したか、または化学合成した。ヒトＶエレメントには、ヒトＶをコードする領域が含まれている。非ヒトスペーサー配列は、ＰＣＲによって増幅したか、または化学合成した。これには、組み換えシグナル配列、スペーサー配列、プロモーター領域、リーダー配列、およびリーダーとＶをコードする領域との間のイントロンが含まれている。このような非ヒトスペーサー配列を、ヒトのＶエレメントと、１つまたはいくつかの大きなＤＮＡフラグメントとなるように結合させ、トランスジェニック動物を作成するために使用した。マウスまたはウサギのスペーサー配列を用いたヒト化Ｖ領域の構築の例を、図１１に示す。
【０１８８】
（実施例１２）
（ヒト化免疫グロブリンを発現するトランスジェニックウサギ）
トランスジェニックウサギを、Ｆａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐａｔｈｏｌ．Ｉｎｔ．４９：５８３−５９４，１９９９）に記載されているように作成した。簡単に説明すると、雌のウサギを標準的な方法を使用して過剰排卵させ、雄のウサギと交配させた。前核段階の受精卵を卵管から回収し、２０％のウシ胎児血清を補充したダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水のような適切な培養液に入れた。ヒト化免疫グロブリン遺伝子座を含むＢＡＣを、１対のマニピュレーターの力を借りて雄の前核にマイクロインジェクションした。形態学的に生存している受精卵を、偽妊娠させたウサギの卵管に移した。偽妊娠は、ヒトの絨毛膜性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）の注射によって誘導した。ヒト化軽鎖構築物を受精卵の４６４５個の前核に注入した後、４０４３個の卵母細胞を１３２匹のレシピエントに移した。全部で２５３匹の生存性の子孫が産まれ、そのうちの１１匹がトランスジェニックであった。ヒトκ軽鎖の発現を、ヒトκ軽鎖特異的試薬（例えば、マウスの抗ヒトκ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，９２２０−０１；ヤギの抗ヒトκ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２０６３−０８）を使用してＥＬＩＳＡによって検出した。
【０１８９】
ヒト化重鎖構築物を、４０８３個の受精卵の前核に注入した。３４８５個の卵母細胞を１１９匹のレシピエントに移し、４３３匹の子孫が生まれた。ＰＣＲおよびＦＩＳＨによる分析により、これらの動物のうちの２０匹がトランスジェニックであることが明らかになった。創始動物の血液中のヒト化重鎖を、ヒトＩｇＭ／ＩｇＧに特異的な抗体（例えば、ウサギの抗ヒトＩｇＭ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ  ６０９−４１３１；ウサギの抗ヒトＩｇＭ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ  ６０９−４６３１；ウサギの抗ヒトＩｇＧ、Ｐｉｅｒｃｅ  ３１１４２、ウサギの抗ヒトＩｇＧ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ６１４５−０８；ウサギの抗ヒトＩｇＧ、Ｐｉｅｒｃｅ  ３１７８４）を使用してＥＬＩＳＡによって検出した。
【０１９０】
ヒト化κ、μ、およびγ鎖を検出するサンドイッチ型ＥＬＩＳＡを、標準的な手順を使用して行った。簡単に説明すると、マイクロタイタープレートを捕捉抗体でコーティングし、希釈した血清試料とともにインキュベートした。結合したヒト免疫グロブリンを、二次標識抗体と、ペルオキシダーゼ−ストレプトアビジン結合体（Ｓｉｇｍａ、Ｓ２４３８）を使用して検出した。
【０１９１】
ヒト化重鎖免疫グロブリン鎖とヒト化軽鎖免疫グロブリン鎖の両方を発現する二重トランスジェニックである動物を、創始動物を交配させることによって作成した。
【０１９２】
（実施例１３）
（ヒト化免疫グロブリンを発現するトランスジェニックマウス）
トランスジェニックマウスを、Ｎａｇｙ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ
ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００３）に記載されているように作成した。簡単に説明すると、雌のマウスを標準的な方法を使用して過剰排卵させ、雄のマウスと交配させた。前核段階の受精卵を卵管から回収し、Ｍ２培地のような適切な培養液に入れた。ヒト化免疫グロブリン遺伝子座を含むＢＡＣを、１対のマニピュレーターの力を借りて雄の前核にマイクロインジェクションした。形態学的に生存している受精卵を、偽妊娠させた雌のマウスの卵管に移した。偽妊娠は無精子症の雄との交配によって誘導した。ヒト化軽鎖構築物を受精卵の１３２５個の受精卵の前核への注入の後、７８７個の卵母細胞を２９匹のレシピエントに移した。全部で５５匹の生存性の子孫が産まれ、そのうちの１１匹がトランスジェニックであった。
【０１９３】
ヒト化重鎖構築物を、１０５０個の受精卵の前核に注入した。６５０個の卵母細胞を２５匹のレシピエントに移し、６４匹の生存している子孫が生まれた。ＰＣＲによる分析から、これらの動物のうちの１９匹がトランスジェニックであることが明らかになった。
【０１９４】
ヒト化重鎖免疫グロブリン鎖とヒト化軽鎖免疫グロブリン鎖の両方を発現する二重トランスジェニックである動物を、創始動物を交配させることによって作成した。ヒト化κ、μ、およびγ鎖の発現を、標準的な手順を使用してＥＬＩＳＡによって検出した。簡単に説明すると、マイクロタイタープレートを捕捉抗体でコーティングし、希釈した血清試料とともにインキュベートした。結合したヒト免疫グロブリンを、二次標識抗体と、ペルオキシダーゼ−ストレプトアビジン結合体（Ｓｉｇｍａ、Ｓ２４３８）を使用して検出した。
【０１９５】
明細書を通じて引用された全ての参考文献は、引用により本明細書中に明確に組み入れられる。本発明は、特定の実施例を参照することによって説明されるが、それらに限定されない。当業者であれば、種々の変更はバリエーションが、本発明の本質から逸脱することなく可能であることを認識するであろう。全てのこのような変更とバリエーションが、本明細書の範囲に具体的に含まれる。
【０１９６】
【表１−１】
0006017763.tif 000002
【０１９７】
【表１−２】
0006017763.tif 000003
【０１９８】
【表１−３】
0006017763.tif 000004
【０１９９】
【表１−４】
0006017763.tif 000005
【０２００】
【表１−５】
0006017763.tif 000006
【０２０１】
【表２−１】
0006017763.tif 000007
【０２０２】
【表２−２】
0006017763.tif 000008
【０２０３】
【表２−３】
0006017763.tif 000009
【０２０４】
【表２−４】
0006017763.tif 000010
【０２０５】
【表２−５】
0006017763.tif 000011
【０２０６】
【表２−６】
0006017763.tif 000012
【０２０７】
【表２−７】
0006017763.tif 000013
【０２０８】
【表２−８】
0006017763.tif 000014
【０２０９】
【表２−９】
0006017763.tif 000015
【図９ｂ−１】
0006017763.tif 000016
【図９ｂ−２】
0006017763.tif 000017
【図９ｂ−３】
0006017763.tif 000018
【図９ｂ−４】
0006017763.tif 000019
【図９ｂ−５】
0006017763.tif 000020
【図９ｂ−６】
0006017763.tif 000021
【図９ｂ−７】
0006017763.tif 000022
【図９ｂ−８】
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【図９ｂ−９】
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【図９ｂ−１０】
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【図１２ａ−１】
0006017763.tif 000026
【図１２ａ−２】
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【図１２ａ−３】
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【図１２ａ−４】
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【図１２ｂ−１】
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【図１２ｂ−２】
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【図１２ｂ−３】
0006017763.tif 000032
【図１２ｂ−４】
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【図１３ａ−１】
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【図１３ａ−２】
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【図１３ｂ−１】
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【図１３ｂ−２】
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【図１３ｂ−３】
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【図１３ｂ−４】
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【図１３ｂ−５】
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【図１３ｃ−１】
0006017763.tif 000041
【図１３ｃ−２】
0006017763.tif 000042
【図１３ｃ−３】
0006017763.tif 000043
【図１３ｃ−４】
0006017763.tif 000044
【図１３ｄ−１】
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【図１３ｄ−２】
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【図１３ｄ−３】
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【図１３ｄ−４】
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【図１３ｄ−５】
0006017763.tif 000049
【図１】
0006017763.tif 000050
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
0006017763.tif 000054
【図６】
0006017763.tif 000055
【図７】
0006017763.tif 000056
【図８】
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【図９ａ】
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【図１０】
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【図１１】
0006017763.tif 000060
【図１２ｃ】
0006017763.tif 000061
【図１３ｅ】
0006017763.tif 000062
【配列表】
0006017763000001.app