(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
精製ビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）であって、配列番号２のバチルス・プミルスのＢＯＤと比較して少なくとも９５％の同一性（百分率）を有すること、ビリルビンをビリベルジンへと酸化する反応を触媒すること、及び４つの銅原子と結合することを特徴とする、精製ビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）。
【請求項２】
請求項１に記載のＢＯＤを調製する方法であって、
ａ）請求項１に記載のＢＯＤを発現する宿主細胞を調製する工程と、
ｂ）工程ａ）で調製される宿主細胞を培養する工程と、
ｃ）前記宿主細胞を溶解する工程と、
ｄ）工程ｃ）で得られる溶解物をアフィニティクロマトグラフィによって処理する工程と、
ｅ）前記精製ＢＯＤを回収する工程と
を含み、
工程ａ）で調製される前記宿主細胞が、ｐＦＤ１ベクターによって形質転換される大腸菌ＢＬ２１  Ｓｔａｒ株であること、及び工程ｂ）で実施される前記培養が、２０℃〜３０℃の温度で２０ｈ〜３０ｈの期間、嫌気条件下で振とうしながら行う液相培養であって、その間に前記ＢＯＤの発現がイソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することによって誘導されることを特徴とする、請求項１に記載のＢＯＤを調製する方法。
【請求項３】
液体試料中のビリルビン濃度を測定するための、請求項１に記載のＢＯＤの使用。
【請求項４】
請求項１に記載のＢＯＤを含むことを特徴とする、ビリルビンをアッセイするキット。
【請求項５】
液体試料中に溶解したビリルビンをアッセイする方法であって、
ａ）酵素反応前の前記液体試料のλｍａｘ＝４４０ｎｍでの吸光度を測定する工程と、  ｂ）前記液体試料中に請求項１に記載のＢＯＤを導入する工程と、
ｃ）酵素反応後の前記液体試料のλｍａｘ＝４４０ｎｍでの吸光度を測定する工程と、  ｄ）工程ａ）及び工程ｃ）で測定される吸光度の差異を算出するとともに、既知のビリルビン含有量を有する標準溶液に関して測定される吸光度の差異と比較する工程と、
ｅ）前記液体試料のビリルビン濃度を決定する工程と
を含むことを特徴とする、液体試料中に溶解したビリルビンをアッセイする方法。
【請求項６】
試料中に存在するビリルビンを分解するための、請求項１に記載のＢＯＤの使用。
【請求項７】
ケラチン繊維の酸化染色のための組成物における試薬としての、請求項１に記載のＢＯＤの使用。
【請求項８】
木材パルプを処理するための、請求項１に記載のＢＯＤの使用。
【請求項９】
工業用溶剤中で使用される染料を変色させるための、請求項１に記載のＢＯＤの使用。
【請求項１０】
少なくとも１つの請求項１に記載のＢＯＤを含む被覆材でコーティングされる導電性材料を含む、ＢＯＤ電極。
【請求項１１】
請求項１０に記載の電極から構成されることを特徴とする、ビリルビンバイオセンサー。
【請求項１２】
請求項１０に記載の電極から構成されることを特徴とする、酸素センサー。
【請求項１３】
上に酸化反応を触媒する酵素が固定化されるアノードと、カソードとしての請求項１０に記載の電極とを含む、酵素バイオ燃料電池。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なビリルビンオキシダーゼ、これを調製する方法、並びに、特にビリルビンをアッセイするための及び燃料として酸素を使用する酵素バイオ燃料電池を使用するための、その使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビリルビンオキシダーゼすなわちＢＯＤ（Ｅ．Ｃ．  １．３．３．５．）は、ビリルビンをビリベルジンへと酸化する反応：
ビリルビン＋１／２Ｏ２→ビリベルジン＋Ｈ２Ｏ
を触媒する酵素である。ＢＯＤは、銅原子と結合する部位を４つ有する。これらの４つの銅原子は、この酵素の適切な活性のために必要である。バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）のＣｏｔＡタンパク質（Genzyme Diagnostics社によってＢＯＤとして販売されているビリルビンオキシダーゼ活性を有するタンパク質）に銅が存在しないことがこの酵素の活性を低減させるのに十分であることが、実際に示されている（非特許文献１の論文の表３）。
【０００３】
ビリルビンは、ヘモグロビンの分解によって血液中に形成される黄色の物質である。ビリルビンは、肝臓で生成される主要な色素の１つである。
【０００４】
ＢＯＤは、様々な用途、例えばビリルビンのアッセイ（例えば、血液中の過剰のビリルビンを診断することを可能とする）のために、関心が持たれる。ＢＯＤは、ＢＯＤがカソードの電子を捕捉して酸素を水へと還元する酵素バイオ燃料電池（図１Ａの、ＢＯＤがレドックスポリマー中でカソードと結合している酵素バイオ燃料電池の概略図を参照されたい）を調製するために、又は酸素バイオセンサーとして、使用することもできる。
【０００５】
ＢＯＤの多くの供給源が存在する。この酵素は、微生物、例えばバチルス（Bacillus）属の微生物［バチルス・サブチリス（そのＣｏｔＡがビリルビンオキシダーゼ活性を有する。非特許文献２を参照されたい）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）（特許文献１）］によって、又は真菌（mycetes）、その中でもアオカビ属（Penicillium）［ペニシリウム・ヤンシネルム（Penicillium janthinellum）（特許文献２）］、エビタケ属（Trachyderma）（特許文献３）、ミロセシウム属（Myrothecium）（非特許文献３）、若しくは他にはスエヒロタケ属（Schizophyllum）、ヒトヨタケ属（Coprinus）、ホウロクタケ属（Trametes）、カワラタケ属（Coriolus）、スギタケ属（Pholiota）、ヒラタケ属（Pleurotus）、カイガラタケ属（Lenzites）若しくはツガサルノコシカケ属（Fomitopsis）（特許文献４）の真菌によって、産生され得る。
【０００６】
この酵素は、アルファルファの型（特許文献５）、ナス科（Solanaceae）、バショウ科（Musaceae）及びユリ科（Liliaceae）（特許文献６）、又は他にはキク科（Compositae）、例えばアーティチョーク（特許文献７）等の植物から抽出することもできる。
【０００７】
これらの酵素の中でも、最も有利な酵素特性、特に活性及び安定性を有するＢＯＤが選択されて、上市されている。これらは、ビリルビンオキシダーゼ活性を有するバチルス・サブチリスのＣｏｔＡ（Genzyme Diagnostics社によってＢＯＤとして販売されており、引き続きＢＯＤと示す）、及びミロセシウム・ベルカリア（Myrothecium verrucaria）のＢＯＤ（Sigma-Aldrich社及びAmano社によって販売されている）である。
【０００８】
本発明者らはここで、市販のＢＯＤより活性が高い及び／又は安定な、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）によって産生される新規なＢＯＤを特定した。本発明者らは、他の既知のＢＯＤのために現在使用されている方法より簡便かつ高速な、この新規なＢＯＤを調製する方法も開発した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第４，７７０，９９７号
【特許文献２】欧州特許出願公開第０２９５１０１号
【特許文献３】米国特許第４，６００，６８９号
【特許文献４】米国特許第４，６７７，０６２号
【特許文献５】米国特許第５，６２４，８１１号
【特許文献６】欧州特許第０１４０００４号
【特許文献７】欧州特許第０２４７８４６号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Durao et al., J Biol Inorg Chem. 2008 Feb; 13(2): 183-93
【非特許文献２】Sakasegawe et al. 2006 Applied and Environmental Microbiology 72, No. 1, 972-975
【非特許文献３】Tanaka et al. 1982 Agric. Biol. Chem. 46, 2499-2503
【発明の概要】
【００１１】
第１の主題によれば、本発明は、バチルス・プミルスの野生型ＢＯＤに関し、特に、本発明によるビリルビンオキシダーゼ、特に精製ビリルビンオキシダーゼ（純度＞９５％）は、配列番号２のバチルス・プミルスの野生型ＢＯＤと比較して、少なくとも８０％の同一性（百分率）、及び少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％及び９９％（数値が大きいほど好ましい）の同一性を有する。これは、ビリルビンをビリベルジンへと酸化する反応を触媒し、４つの銅原子と結合する。
【００１２】
配列番号２は、バチルス・プミルスＳＡＦＲ０３２株の野生型ＢＯＤに対応する。例えば、本発明は、配列番号２のＢＯＤと９８％の同一性（百分率）を有する、他のバチルス・プミルス株の野生型ＢＯＤ、例えば配列番号６のＡＴＣＣ７０６１株のＢＯＤにも関する。本発明による好ましいＢＯＤは、配列番号２のバチルス・プミルスＳＡＦＲ０３２株の野生型ＢＯＤである。
【００１３】
基準配列としてのバチルス・プミルスの野生型ＢＯＤの配列（配列番号２）と比較される配列の同一性は、２つの配列の間で最大の一致が得られるように２つの配列を整列させた場合に、同一であるアミノ酸残基の百分率によって評価される。
【００１４】
バチルス・プミルスゲノムの体系的シーケンシングから予測されるタンパク質配列は、ＵｎｉＰｒｏｔデータベースに記載されている（２００７年１１月１３日のアクセッション番号Ａ８ＦＡＧ９「外側スポアコートタンパク質Ａ（Outer Spore Coat Protein A）」、及び２００８年９月２３日のアクセッション番号Ｂ４ＡＩＢ１「スポアコートタンパク質Ａ（Spore Coat Protein A）」）。ＵｎｉＰｒｏｔデータベースにおいて提供される情報は予測及び推定のものであり、バチルス・プミルスのタンパク質の実験的単離及び特徴付けから得られたものではないことに留意すべきである。加えて、このデータベースに記載されている表示は、これらのタンパク質に関するいずれかのＢＯＤ活性を予測することを可能とするものではない。これは、バチルス・プミルス（B. pumilus）のＢＯＤの前には、生物バチルス・サブチリス（B. subtilis）、バチルス・リケニフォルミス（B. licheniformis）（Koschorreck, K., et al., Cloning and characterization of a new laccase from Bacillus licheniformis catalysing dimerization of phenolic acids. Appl Microbiol Biotechnol, 2008. 79(2): p. 217-24、Koschorreck, K., R.D. Schmid, and V.B. Urlacher, Improving the functional expression of a Bacillus licheniformis laccase by random and site-directed mutagenesis. BMC Biotechnol, 2009. 9: p. 12）、バチルス・ハロデュランス（B. halodurans）及びバチルスＨＲ０３（B. HR03）から現在特徴付けられている様々なＣｏｔＡの中で、ＢＯＤとして特徴付けられていたのはバチルス・サブチリスのＣｏｔＡのみであり、他のＣｏｔＡはラッカーゼ（ＢＯＤとは異なり、弱いテトラピロール酸化活性を有する酵素）であったためである。
【００１５】
当業者は、同一性（百分率）を、例えば、ＢＬＡＳＴシリーズのプログラム（Altschul et al., NAR, 25, 3389-3402）等の配列比較コンピュータプログラムを使用して算出することができる。ＢＬＡＳＴプログラムは、基準配列として示される配列番号２の全体からなる比較ウインドウに対して実行される。
【００１６】
基準配列と少なくともＸ％の同一性を有するアミノ酸配列を有するペプチドは、本発明においては、配列が、上記基準ペプチドの機能特性（本件ではそのビリルビン酸化酵素活性）を保持しながら、基準配列のアミノ酸１００個当たり最大１００−Ｘ個の修飾を含み得るペプチドと定義される。本発明との関係では、「修飾」という用語は、基準配列におけるアミノ酸の連続又は分散した欠失、置換又は挿入を含む。
【００１７】
本発明による新規なＢＯＤは、ミロセシウム・ベルカリア又はバチルス・サブチリス由来の市販のＢＯＤと比較して、改善した特性を有する。
【００１８】
特に、バチルス・プミルスのＢＯＤは、２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）の酸化の触媒に関して、ミロセシウム・ベルカリア又はバチルス・サブチリスのＢＯＤより良好な酵素特性（活性、触媒効率ｋｃａｔ、及び酵素に対する基質の親和性ＫＭ）を有する。
【００１９】
酵素特性は、以下の実施例の第４部に記載のように決定することができる。
【００２０】
以下の表Ｉは、バチルス・サブチリス及びバチルス・プミルスのＢＯＤに関する、触媒効率ｋｃａｔ、すなわち酵素１分子当たり及び単位時間当たりの生成物へと変換される基質の分子の数、並びに基質（ＡＢＴＳ）の親和性を表すミカエリス定数ＫＭを示している。
【００２１】
バチルス・プミルス及びバチルス・サブチリスのＢＯＤの酵素特性は、これらの２つの酵素が非常に類似した使用の最適条件（ｐＨ３〜４及び温度７５℃〜８０℃）を有するため、容易に比較することができる。
【００２２】
【表１】
0005865342.tif 000002
【００２３】
Kataoka et al. (2005, Protein Expression and Purification, 41, 77-83)によってミロセシウム・ベルカリア（M. verrucaria）のＢＯＤについて記載されたｐＨ６．５での酵素特性は、ｋｃａｔが１１５ｓ−１及びＫＭが２５０μＭである。さらに、Sakurai et al. (2008, Biochemical and Biophysical Research communication, 371, 416-419)は、ＡＢＴＳに対するミロセシウム・ベルカリアのＢＯＤの比活性（１０６Ｕ／ｍｇである）を決定した。本発明によるＢＯＤそれ自体の比活性は３７５Ｕ／ｍｇである。
【００２４】
加えて、バチルス・プミルスのＢＯＤは、非常に良好な熱安定性及び良好なビリルビン酸化酵素特性を有する。
【００２５】
本発明は、本発明によるＢＯＤをコードする核酸分子にも関する。この核酸分子は好ましくは、バチルス・プミルスＳＡＲＦ−０３２の野生型ＢＯＤをコードする配列番号１、バチルス・プミルスＡＴＣＣ７０６１の野生型ＢＯＤをコードする配列番号５、又は他には酵母ピキア・パストリス（Pichia pastoris）によるその発現を改善させるために修飾されたバチルス・プミルスＳＡＲＦ−０３２の野生型ＢＯＤの配列に対応する配列番号７から選ばれる配列を有する核酸分子である。
【００２６】
本発明によるＢＯＤをコードする核酸分子は、発現ベクター、例えばプラスミドへとクローニングすることができ、引き続き、好適な宿主、例えば細菌、酵母、又は他には細胞培養物を形質転換するために使用することができる。
【００２７】
「発現ベクター」という用語は、その発現に必要不可欠なシグナル、特にプロモーター（構成的又は誘導的）、リボソーム結合部位、転写停止シグナルの間にコードヌクレオチド配列を挿入することが可能な領域、及び任意に選択性マーカー、例えば抗生物質への耐性のための遺伝子を有するベクターを意味することを意図する。
【００２８】
本発明は、上記核酸分子を含む発現ベクター、及び上記発現ベクターによって形質転換され、本発明によるＢＯＤを発現する宿主細胞にも関する。
【００２９】
宿主細胞への発現ベクターの導入は、当業者に既知の任意の方法によって、特に、例えばカルシウムイオンの存在下における、宿主細胞の膜の透過性の変更によって、又はエレクトロポレーションによって、実施することができる。
【００３０】
本発明によるＢＯＤを発現するように形質転換した宿主細胞の培養後、上記細胞を、遠心分離によって回収することができ、本発明による上記ＢＯＤを含む酵素を放出させるために溶解することができる。
【００３１】
大腸菌が宿主微生物である場合、使用することができるプラスミドは、特にプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＵＣ１８、ｐＥＴ、ｐＧＥＸ、ｐＧＳ、ｐＭＡＬ−ｃ２等である。
【００３２】
本発明によるＢＯＤを調製する好ましい方法によれば、ＢＯＤは、Ｃ末端の位置において６ＨＩＳタグと連結された酵素をコードするｐＥＴ２１ａ発現ベクターによって形質転換した大腸菌によって発現される。
【００３３】
以下の実験の節（第３節）において例示されるこの方法は、その迅速性及びその簡便性のために有利である。これは、ミロセシウム・ベルカリア由来のＢＯＤの産生には５日間に達する場合もある誘導期間が必要となるのに対して、大腸菌におけるバチルス・プミルスのＢＯＤの発現の誘導が４時間〜２４時間で起こるためである（Kataoka et al. Biochemistry. 2005 May 10; 44(18):7004-12、Kataoka et al., Biochem Biophys Res Commun. 2008 Jul 4; 371(3):416-9、Kataoka et al. K. Protein Expr Purif. 2005 May; 41(1):77-83）。
【００３４】
加えて、６ＨＩＳタグによって、純粋な酵素を得るように単一工程においてニッケル樹脂によるアフィニティクロマトグラフィによってバチルス・プミルスのＢＯＤを精製することが可能となる。このタグのサイズが小さいこと（６個のアミノ酸）が、このタグによって酵素の活性が顕著に妨害されないことから、このタグを除去しないこととすることを可能にする。比較として、Kataoka et al.による論文（上記を参照されたい）及び非特許文献１にそれぞれ記載されるミロセシウム・ベルカリアのＢＯＤ及びバチルス・サブチリスのＢＯＤの精製は、複数のクロマトグラフィ工程を必要とする。
【００３５】
したがって、この方法の迅速性及び簡便性は、現在市販されている酵素を調製する方法と比較して、相当な利点を提示する。
【００３６】
当業者は、使用する発現ベクターに応じて宿主細胞を選択するであろう。
【００３７】
好ましくは、ｐＥＴ２１ａ発現ベクターを使用する場合、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現する宿主細胞、例えば大腸菌ＢＬ２１  ＤＥ３株、ＢＬ２１−ＳＩ株、ＢＬ２１  ｐＬｙｓ株、Ｎｏｖａｂｌｕｅ（ＤＥ３）株又はＢＬ２１  Ｓｔａｒ株が選択される。
【００３８】
好ましくは、本発明によるバチルス・プミルスのＢＯＤは、大腸菌ＢＬ２１  Ｓｔａｒ株において産生される。これをコードする核酸分子は、配列番号３及び配列番号４のプライマーを用いるＰＣＲによって得られ、形質転換されたベクターｐＦＤ１を得るようにｐＥＴ２１ａベクターへとクローニングされる。このように産生させたＢＯＤは引き続き、細菌の溶解後に、アフィニティクロマトグラフィによって精製される。
【００３９】
本発明の別の有利な変形形態によれば、本発明によるＢＯＤは、ピキア・パストリス酵母によって産生される。
【００４０】
ピキア・パストリス酵母によるＢＯＤの過剰産生及び培養培地への分泌を可能とするために、特に配列番号１、配列番号５又は配列番号７の配列から選ばれる（好ましくは配列番号７の）、ＢＯＤをコードする遺伝子を、ＡＯＸ１遺伝子のレベルで酵母ゲノム中に相同組換えによって導入する。このために、ｐＦＤ２プラスミドを、ｐｍｅＩ酵素による消化によって線状化した後、エレクトロポレーションによって酵母中に導入し、陽性クローンを１００μｇ／ｍｌでｚｅｏｃｉｎを含有するＹＰＤ＋寒天培地上で選択する。ｚｅｏｃｉｎ（１００μｇ／ｍｌ）を添加したＹＰＤ培地の前培養物２００ｍｌに、ペトリ皿上で単離したクローンを使用して接種する。３０℃、２２０ｒｐｍでの終夜の振とう後、この前培養物を引き続き、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、グルコースの存在を除去するためにペレットを２００ｍｌの滅菌水中に取る。２回目の遠心分離の後、５Ｌ容のエルレンマイヤーフラスコ中の１ｍＭのＣｕＳＯ４を含有するＭＭＨ培地中の２Ｌの培養物に引き続き、このペレットを接種する。酵母を、振とう（２２０ｒｐｍ）しながら２５℃で２時間インキュベートした後、誘導を開始するために０．５％のメタノールを添加する。この誘導工程を、最大量の酵素を得るために５日間繰り返す。
【００４１】
この方法を実行するために、限定的なものでは全くないが、以下の材料を使用することができる：
ピキア・パストリスにおける発現のためのベクター（ｐＦＤ２）：サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のα因子分泌因子とインフレームでバチルス・プミルスのＢＯＤをコードするＤＮＡ配列（好ましくは最適化されている（配列番号７））を含有し、メタノール誘導性ＡＯＸ１プロモーターを含有するｐＰＩＣＺαプラスミド、
ＡＯＸ１プロモーター、α因子シグナルペプチド及びバチルス・プミルスのＢＯＤをコードするＤＮＡ配列を含有するＰＦＤ２ベクター由来のカセットの組込み後にビリルビンオキシダーゼを産生するのに使用されるピキア・パストリス酵母ＧＳ１１５株、
培養培地：
ＹＰＤ強化培地（酵母用）：
１％  酵母エキス
２％  バクトペプトン
２％  グルコース
ｐＨは調整せず、１２０℃で２０分間オートクレーブ処理する
ＭＭＨ最小培地（酵母用）：
１．３４％  酵母窒素ベース
１％  カザミノ酸
０．４％  ヒスチジン
４×１０−５％  ビオチン
ｐＨは調整せず、１２０℃で２０分間オートクレーブ処理する
ＬＢ強化培地（細菌用）：
１０ｇ／ｌ  トリプトン
５ｇ／ｌ  酵母エキス
５ｇ／ｌ  ＮａＣｌ
蒸留Ｈ２Ｏ  qs  １ｌ
ｐＨは調整せず、１２０℃で２０分間オートクレーブ処理する。
【００４２】
本発明は、本発明によるＢＯＤを調製する方法であって、
ａ）本発明によるＢＯＤを発現する宿主細胞を調製する工程と、
ｂ）工程ａ）で調製される宿主細胞を培養する工程と、
ｃ）上記宿主細胞を溶解する工程と、
ｄ）工程ｃ）で得られる溶解物をアフィニティクロマトグラフィによって処理する工程と、
ｅ）上記精製ＢＯＤを回収する工程と
を含む、本発明によるＢＯＤを調製する方法にも関する。
【００４３】
１つの好ましい実施の形態によれば、本発明による方法は、以下のようなものである：
ｐＦＤ１ベクターによって形質転換される大腸菌ＢＬ２１  Ｓｔａｒ株が工程ａ）で調製され、
工程ｂ）で実施される培養が、１８℃〜３７℃、好ましくは２０℃の温度で４ｈ〜３０ｈ、好ましくは２４ｈの期間、嫌気条件下で振とうしながら行う液相培養であって、その間にＢＯＤの発現がイソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することによって誘導される、液相培養である。
【００４４】
本方法をこれらの好ましい条件に従って実行すると、約２４時間という短い誘導時間でのＢＯＤの産生が可能となる。ＢＯＤの精製は、単一のアフィニティクロマトグラフィ工程において実施し、このように産生させたＢＯＤは実際に、その活性に必要な４つの銅原子を含む（実施例の第５部を参照されたい）。
【００４５】
変性剤、例えば尿素、塩化グアニジニウム、ＳＤＳ、トリトン等の存在下においてＢＯＤを産生させることも可能であり、そうすると、このように産生させたＢＯＤは、銅を欠いており、銅イオンを添加することによって活性化することができる。
【００４６】
本発明は、溶解したビリルビンをアッセイするための、すなわち試料、特に生体試料中のビリルビン濃度を測定するための、本発明によるバチルス・プミルスのＢＯＤの使用にも関する。
【００４７】
「生体試料」という用語は、生体液、例えば血液、血清、リンパ液、胆汁、尿、脳脊髄液、汗等を意味することを意図する。
【００４８】
生物におけるビリルビンの存在は正常なことであり、ビリルビンはヘモグロビンの分解により生じ、健康な成人では１日当たりおよそ２００ｍｇ〜２３０ｍｇのビリルビンが形成される。良好な健康状態の個体においては、ビリルビンは肝臓によって取り込まれ、その後分解される。したがって、その濃度は或る特定の閾値を超えるべきではなく、ビリルビンのアッセイは、以下のような病的状態を検出するのに有用である：
実質的な溶血の症例：先天性又は後天性の溶血性貧血、薬剤関連の毒性又は感染性の溶血、輸血事故等、
不十分な肝臓取込み又は抱合（conjugations）：ジルベール病、クリグラー・ナジャー病、リファンピシン（抗結核性抗生物質）の服用、
肝臓及び胆管の病態：様々な種類の肝炎（ウイルス性、毒性、薬剤関連）、様々な種類の肝硬変、稀な代謝異常（ローター病（Rotor's disease）、デュービン・ジョンソン病）、
胆管の病態、
胆管の結石症、
膵臓炎、
膵臓がん又は胆管がん。
【００４９】
したがって本発明は、液体試料、特に生体試料中のビリルビン濃度を測定するための、本発明によるＢＯＤの使用に関する。
【００５０】
第１の変形形態によれば、ＢＯＤによるビリルビンのアッセイの原理は、ビリルビンの分解によってもたらされる試料の色の変化の測定に基づいている。
【００５１】
ビリルビンは４４０ｎｍに光の吸収のピーク（λｍａｘ）を示す。ビリルビンがＢＯＤによって酵素的に分解されると、ビリルビンが存在する試料のλｍａｘでの吸光度が減少する。この減少によって、同じ実験条件下で測定される既知のビリルビン含有量を含有する較正溶液の４４０ｎｍでの吸光度の減少との比較によって試料中に最初から存在するビリルビンを定量化することが可能となる。
【００５２】
本発明は、本発明によるＢＯＤを含むことを特徴とする、溶解したビリルビンをアッセイするキットにも関する。
【００５３】
典型的には、アッセイキットは、ビリルビンアッセイ試験を実施するのに必要な試薬、特に：
バッファー、
検量線を作製するためのビリルビンの標準溶液、及び
アッセイを実施するのに必要な取扱説明書のセット
も含有する。
【００５４】
本発明は、液体試料中に溶解したビリルビンをアッセイする方法であって、
ａ）酵素反応前の上記液体試料のλｍａｘ＝４４０ｎｍでの吸光度を測定する工程と、
ｂ）上記液体試料中に本発明によるＢＯＤを導入する工程と、
ｃ）酵素反応後の上記液体試料のλｍａｘ＝４４０ｎｍでの吸光度を測定する工程と、
ｄ）工程ａ）及び工程ｃ）で測定される吸光度の差異を算出するとともに、既知のビリルビン含有量を有する標準溶液に関して測定される吸光度の差異と比較する工程と、
ｅ）上記液体試料のビリルビンの初期濃度を決定する工程と
を含むことを特徴とする、液体試料中に溶解したビリルビンをアッセイする方法にも関する。
【００５５】
別の変形形態によれば、液体試料中のビリルビンのアッセイは、本発明によるＢＯＤを含む電極を使用する電気化学的方法を用いて実施される。
【００５６】
したがって、本発明は、導電性材料、例えば導電性金属、特に白金、銅、銀、アルミニウム、金若しくは鋼、又は炭素、例えばガラス状炭素、炭素繊維、カーボンナノチューブの繊維、若しくは代替的にダイアモンドから作製される繊維等を含むＢＯＤ電極であって、上記導電性材料が、少なくとも１つの本発明によるＢＯＤを含む被覆材でコーティングされ、上記被覆材が、酵素と電極との間の電気伝導及びまたシステムの安定性を改善させるためにレドックスポリマーを含んでいてもよい、ＢＯＤ電極にも関する。
【００５７】
レドックスポリマーは、例えば、フェロセンベースのポリマー、オスミウムベースのポリマー及びルテニウムベースのポリマー、並びに導電ポリマー、例えばポリピロール及びポリアニリン等から選ぶことができる。
【００５８】
上記導電性材料上にＢＯＤを固定化する方法は、特に、ポリマーマトリクス中へのＢＯＤの包埋、ポリマー膜の表面でのＢＯＤの吸着、共有結合による付着、電着（Gao et al., Chem. Int. ED. 2002, 41, No. 5, 810-813）、又は他には米国特許出願公開第２００９／００５３５８２号に記載の技法を含む、当業者が利用可能な従来の方法から選ぶことができる。
【００５９】
１つの実施の形態の変形形態によれば、ＢＯＤが固定化されるＢＯＤ電極は、また、電極からの上記酵素の脱離を防止する膜でコーティングされる。想定される用途によれば、上記膜は、ナフィオン、セルロース、又は任意の他の生体適合性材料、すなわち生理環境と適合性の材料から構成することができる。
【００６０】
したがって、本発明は、本発明によるＢＯＤ電極から構成されるビリルビンバイオセンサーにも関する。一般的に、バイオセンサーは、生物学的標的を認識することが可能なバイオレセプターが固定化される電極からなる。バイオレセプターとの生物学的標的の結合によって、膜の物理化学的変化、及び電極と連結される電気化学的（電流測定的、電位差測定的、電気伝導度測定的、等）変換器による電気的シグナルの生成がもたらされる。本発明の場合では、バイオセンサーは本発明によるＢＯＤであり、生物学的標的はビリルビンである。
【００６１】
本発明は、本発明によるビリルビンバイオセンサーによって液体試料中に溶解したビリルビンをアッセイする方法にも関する。
【００６２】
ビリルビンバイオセンサーの使用の１つの変形形態によれば、このバイオセンサーが、個体の皮膚の下に埋め込まれ、上記個体の血液中のビリルビン濃度を記録することを可能とする。
【００６３】
本発明は、本発明による電極から構成される酸素センサーにも関する。
【００６４】
本発明によるＢＯＤ電極は、酵素バイオ燃料電池におけるカソードとして有利に使用することもできる。図１Ａは、酵素バイオ燃料電池の作動原理を概略的に表す。本発明による酵素バイオ燃料電池は、カソードとしてのＢＯＤ電極と、基質の酸化反応（「酵素Ｘ」によって触媒される）が起こるアノードとを含む機器である。例示としては、基質はグルコースの場合があり、「酵素Ｘ」はグルコースオキシダーゼの場合がある。かかる細胞は、バイオ燃料電池を医療用途のために個体に埋め込む場合に、特に関心が持たれる。基質は、汚染除去における用途が想定される場合、例えばニトライト、ニトレート、スルフィド、ウレート（urates）、アスコルベート、グルタメート、ピルベート、ラクテート、セルロース等から選ぶこともできる。酵素の選択は、引き続き、分解対象の基質に応じて行う。例えば、以下の酵素を使用することができ、これらの酵素が分解することができる基質の種類は、丸括弧内に言及される：グルコースオキシダーゼ（グルコース、又はこの酵素によって酸化される任意の糖）、ラクテートオキシダーゼ（ラクテート）、ピルベートオキシダーゼ（ピルベート）、アルコールオキシダーゼ（アルコール）、コレステロールオキシダーゼ（コレステロール）、グルタメートオキシダーゼ（グルタメート）、ピラノースオキシダーゼ（ピラノース）、コリンオキシダーゼ（コリン）、セロビオースデヒドロゲナーゼ（セロビオース）、グルコースデヒドロゲナーゼ（グルコース、又はこの酵素によって酸化される任意の糖）、ピラノースデヒドロゲナーゼ（ピラノース）、フルクトースデヒドロゲナーゼ（フルクトース）、アルデヒドオキシダーゼ（アルデヒド）、グルコノラクトンオキシダーゼ（グルコノラクトン）、アルコールデヒドロゲナーゼ（アルコール）、アスコルベートオキシダーゼ（酸素又はアスコルベート）、又は他にはスルフィドジオキシゲナーゼ（スルフィド）。バイオ燃料電池の電極での同時的な酸化及び還元のプロセスによって、電流が生成される。
【００６５】
図１Ｂは、グルコースベースの酵素バイオ燃料電池をより具体的に例示する。かかる酵素バイオ燃料電池は、酵素の固定化によって修飾される２つの電極からなる。グルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）が導電ポリマー「Ｉ」によってアノード（１）に結合しており、ビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）が導電ポリマー「ＩＩ」によってカソード（２）に結合している。作動モードでは、アノードでは、電子が、生理液中に存在するグルコースからＧＯｘへと、引き続きＧＯｘから導電ポリマー「Ｉ」へと、及び導電ポリマー「Ｉ」からアノードへと移動する。カソードでは、電子は、カソードから導電ポリマー「ＩＩ」へと、引き続きＢＯＤへと、及び最終的にはＢＯＤから生理液中に存在する酸素へと移動する。
【００６６】
バイオ燃料電池は任意に、それぞれの酵素によって電極を修飾すること、及び可溶性の媒介因子、例えばアノードにフェロセンメタノール及びカソードにフェリシアン化カリウムを添加すること、並びに、必要に応じて、アノードとカソードとを分離する膜を付加することによって作動することもできることに留意すべきである。
【００６７】
別の態様によれば、本発明は、試料、特に生体試料中に存在するビリルビンを分解するための、本発明によるＢＯＤの使用に関する。これは、試料中におけるビリルビンの存在が、他の物質（例えば、血中グルコース又は血中コレステロール）の検出を、特にこれらの他の物質を比色法によって検出する場合に、歪める可能性があるためである。
【００６８】
概して、本発明によるＢＯＤは、特に織物産業及び製紙産業において、並びに、例えば、脱酸素によって、食品、例えば飲料、又は他には植物油を含有する食品の安定性及び／又は質を改善させるために、食品分野において、多くの産業的用途を有する。
【００６９】
より具体的には、ＢＯＤは、汚染除去に関連する用途に（例えば廃水の変色又は解毒、及び生体異物の分解に言及することができる）、有機合成反応物として、抗菌組成物の調製のために、解毒された木材及びカートン製の物品の製造のために、又は他には洗浄剤の製造のために（Morozova et al. Biochemistry (Mosc.) 2007 Oct; 72(10):1136-50）、並びに工業用溶剤（industrial media）中で使用される染料を変色させるために、使用することができる。
【００７０】
本発明によるＢＯＤは、フェノール酸を二量体化するために使用することもでき（Koschorreck, K., et al. 2008. Appl Microbiol Biotechnol (2008) 79:217-224）、したがって、織物用途及び食品用途に使用される色素及び染料の合成において関心が持たれる（R. Mustafa et al. Food Research International. Volume 38, Issues 8-9, October-November 2005, pages 995-1000）。この二量体化反応は、抗酸化化合物、例えばフェルラ酸二量体の調製のために使用することもできる（Garcia-Conesa MT, et al. Redox Rep. 1997 Oct-Dec; 3(5-6):319-23）。
【００７１】
本発明によるＢＯＤは、染色に好適な媒体中に、少なくとも１つの酸化基剤（oxidation base）、本発明によるＢＯＤ、及び任意に上記ＢＯＤに対する供与体（例えば基質、例えばビリルビン）を含む、ケラチン繊維の酸化染色のための組成物、例えば毛髪染色用組成物における反応物として、使用することもできる。上記組成物中で使用することができるＢＯＤ以外の様々な成分は、国際出願に係る国際公開第９９／１５１３８号に記載されている。例えば、酸化基剤（複数も可）は、パラフェニレンジアミン、ダブルベース（double bases）、パラアミノフェノール、オルトアミノフェノール及び複素環式酸化基剤から選ぶことができる。
【００７２】
本発明によるＢＯＤは、リグニン分解に対する作用に関して木材パルプを処理するために、及び／又はより良好な湿潤強度を有する紙を製造するために、有利に使用することができる（国際出願に係る国際公開第００／６８５００号を参照されたい）。
【００７３】
上記の構成に加えて、本発明は、本発明の例示的な実施形態及びまた添付の図面を参照する以下の記載から明らかになる他の構成も含む。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１Ａ】酵素バイオ燃料電池の作動原理を概略的に表す図である。
【図１Ｂ】グルコースベースの酵素バイオ燃料電池を表す図である。
【図２】ｐＦＤ１ベクターのプラスミドマップを表す図である。
【図３】３７℃でのＡＢＴＳ濃度の関数としてのバチルス・プミルスのＢＯＤの比活性（単位：Ｕ／ｍｇ）を例示するグラフである。
【図４】３７℃でのバチルス・プミルスのＢＯＤに関するミカエリス・メンテン式（非抱合型ビリルビン濃度の関数としてのｋｓｓ（単位：ｓ−１））のグラフ表示である。
【図５】５０ｍＭ  シトレート／ホスフェートバッファー（ｐＨ４．８）における、３７℃でのバチルス・プミルスのＢＯＤによる抱合型ビリルビンの酸化に関する触媒活性を表す図である。
【図６】５０ｍＭ  シトレート／ホスフェートバッファー（ｐＨ６．２）における、３７℃でのバチルス・プミルスのＢＯＤによるシリンガルダジン（ＳＧＺ）の酸化に関する触媒活性を表す図である。
【図７】５０ｍＭ  シトレート／ホスフェートバッファー（ｐＨ６．８）における、３７℃でのバチルス・プミルスのＢＯＤによるＤＭＰの酸化に関する触媒活性を表す図である。
【図８】ｐＨの関数としての様々な基質に対するバチルス・プミルスのＢＯＤの相対活性を表す図である。
【図９Ａ】４℃でのＡＢＴＳ酸化に関するバチルス・プミルスのＢＯＤのｐＨの関数としての安定性を表すグラフである。
【図９Ｂ】４℃でのＡＢＴＳ酸化に関するバチルス・プミルスのＢＯＤのｐＨの関数としての安定性を表すグラフである。
【図１０】温度の関数としてのバチルス・プミルスのＢＯＤによる相対活性としてのＡＢＴＳ酸化を表すヒストグラムである。
【図１１Ａ】８０℃での酵素インキュベーション時間の関数としてのバチルス・プミルスのＢＯＤの安定性（ＡＢＴＳ酸化に関する比活性として表す）をグラフとして表す図である。
【図１１Ｂ】８０℃での酵素インキュベーション時間の関数としてのバチルス・プミルスのＢＯＤの安定性（ＡＢＴＳ酸化に関する相対活性として表す）をグラフとして表す図である。
【図１２Ａ】１００ｍＭ  シトレート／ホスフェートバッファー（ｐＨ３）における、２５℃又は３７℃での尿素濃度の関数としてのバチルス・プミルスのＢＯＤの活性（ＡＢＴＳ酸化に関する比活性として表す）をグラフとして表す図である。
【図１２Ｂ】１００ｍＭ  シトレート／ホスフェートバッファー（ｐＨ３）における、２５℃又は３７℃での尿素濃度の関数としてのバチルス・プミルスのＢＯＤの活性（ＡＢＴＳ酸化に関する相対活性として表す）をグラフとして表す図である。
【図１３】ＮａＣｌ濃度の関数としてのバチルス・プミルスのＢＯＤによるＳＧＺの酸化の相対活性を表す図である。
【図１４】１０μＭ  ＡＢＴＳの存在下又は非存在下における５０ｍＭ  リン酸カリウムバッファー（ｐＨ６）における、３７℃でのバチルス・プミルスのＢＯＤによる８０ｍｇ／ｌのＲＢＢＲの変色を表す図である。
【実施例】
【００７５】
１．  材料
１．１  大腸菌株
ＤＨ５α：ｓｕｐＥ４４、ΔｌａｃＵ１６９、（Φ８０  ｌａｃＺＤＭ１５）、ｈｓｄＲ１７、ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡ１、ｇｙｒＡ９６、ｔｈｉ−１、ｒｅｌＡ１（Hanahan, 1983）。
この菌株を使用して、タンパク質発現ベクターを構築する工程の間にプラスミドを増幅する。
【００７６】
ＢＬ２１  Ｓｔａｒ：Ｆ−ｏｍｐＴ  ｈｓｄＳＢ（ｒＢ−、ｍＢ−）ｇａｌ  ｄｃｍ  ｒｎｅ１３１（ＤＥ３）（Invitrogen）。
この菌株を使用して、エルレンマイヤーフラスコ内でバチルス・プミルスのＢＯＤを産生させる。
【００７７】
引き続き、この菌株を、ｐＥＴ２１ａベクター内のＴ７プロモーターの制御下でバチルス・プミルスのＢＯＤをコードするＤＮＡ配列を含有するｐＦＤ１プラスミドによって形質転換する。
【００７８】
１．２  ベクター
ｐＦＤ１：Ｃ末端の位置において６×Ｈｉｓタグとインフレームでクローニングされたバチルス・プミルスのＢＯＤをコードする核酸配列（配列番号１）を含有するｐＥＴ２１ａプラスミド。
ｐＦＤ１ベクターのプラスミドマップを図２に示す。
【００７９】
１．３  培養培地
ＬＢ強化培地：
１０ｇ／ｌ  トリプトン
５ｇ／ｌ  酵母エキス
５ｇ／ｌ  ＮａＣｌ
蒸留Ｈ２Ｏ  約１Ｌ
ｐＨは調整せず、１ｂａｒで５０分間オートクレーブ処理する。
【００８０】
２．  遺伝子操作技法
２．１  スーパーコンピテント細菌の形質転換
スーパーコンピテントＤＨ５α細菌を、Inoue et al.（Inoue et al. 1990, Gene 96:23-28）によって記載されるプロトコルに従ってＳＥＭ法（簡便かつ効率的な方法）を使用して調製する。
【００８１】
２．２  ＤＮＡ調製
プラスミドＤＮＡ精製キット（Quiagen）を、小量及び大量のＤＮＡ調製に使用する。
【００８２】
２．３  二本鎖ＤＮＡのシーケンシング
二本鎖ＤＮＡをシーケンシングする。シーケンシング反応は、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（ｖ１．１又はｖ３．１）シーケンシングキットを用いて実施する。試薬は、様々な蛍光標識を有する４つのｄｄＮＴＰ（ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、及び反応に必要な他の全ての構成要素を含有する。取り込まれていない標識、塩及び他の汚染物質を除去するために、ＡＢＩ  ３１３０ｘｌシーケンサーを通過させる前に、伸長生成物を精製するものとする。
【００８３】
２．４  ＢＯＤ発現ベクターの構築
ＰＣＲを、バチルス・プミルス細菌ＳＡＦＲ−０３２株のゲノムＤＮＡに対してＰｈｕｓｉｏｎ  ＨＦ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて実施する。バチルス・プミルスのＢＯＤをコードする遺伝子のＤＮＡ配列の３’末端及び５’末端に相補的な２つのオリゴデオキシリボヌクレオチド（配列番号３及び配列番号４）を、ＤＮＡ合成のためのプライマーとして使用する。
【００８４】
引き続き、増幅生成物及びまたｐＥＴ２１ａプラスミドを、その認識配列がＢａｍＨ１についてセンスオリゴヌクレオチド及びＸｈｏ１についてアンチセンスオリゴヌクレオチド中に導入されている（それぞれ配列番号３及び配列番号４に示される）２つの制限酵素ＢａｍＨ１及びＸｈｏ１によって処理する。消化生成物を「Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ（登録商標）」キット（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｅｘｔｒａｃｔ  ＩＩ（Clontech Laboratories, Inc．））によってゲル精製し、引き続き、ＢＯＤ遺伝子を、３７℃で終夜のＴ４  ＤＮＡリガーゼとの同時インキュベーションによってプラスミド中にライゲーションする。引き続き、新たに形成されるプラスミドを、アンピシリンを含有するプレート上でのＤＨ５α細菌の形質転換によって、選択し、増殖させる。
【００８５】
【表２】
0005865342.tif 000003
【００８６】
３．  バチルス・プミルスのビリルビンオキシダーゼ酵素の産生、精製及び特徴付け
３．１  野生型ＢＯＤ酵素の産生
ＢＯＤ酵素を、野生型ＢＯＤをコードする配列を有するｐＥＴ２１ａ組換えプラスミドによる大腸菌ＢＬ２１  ｓｔａｒ株中で産生させる。アンピシリン（１５０ｍｇ／ｌ）（ＬＢＡ）及び０．２５ｍＭ  ＣｕＳＯ４を添加したＬＢ培地の前培養物５０ｍｌに、アンピシリン（１００ｍｇ／ｌ）を添加したＬＢ寒天プレート上で単離したクローンを接種し、３７℃で終夜、２２０ｒｐｍで振とうする。引き続き、５Ｌ容のエルレンマイヤーフラスコ中の０．２５ｍＭ  ＣｕＳＯ４を含有する２リットルのＬＢＡ培地に、１／１００量を接種する。これを、０．８〜１  ＯＤ６００ｎｍ／ｍｌのＯＤ６００ｎｍが得られるまで、振とうしながら（２２０ｒｐｍ）３７℃でインキュベートする。引き続き、培養を、２００μＭのＩＰＴＧによって誘導し、２５℃で４時間振とうする（１８０ｒｐｍ〜２２０ｒｐｍ）。引き続き、細胞を、細菌中への銅の取込みを増大させるために、嫌気条件下で振とうしながら培養及びタンパク質誘導を２０時間継続するように、マグネチックバーの入った無菌の２Ｌ容ショットボトル中に移す。遠心分離（４０００ｇ、４℃）によって回収した細胞を水で洗浄し、−２０℃で保存する。
【００８７】
大腸菌におけるこのＢＯＤの発現の誘導が僅か２４時間で行われることを強調することが重要である。これは、現在利用可能な市販の酵素の誘導のためのプロトコルと比較して、相当な利点を示す。これは、ミロセシウム・ベルカリア由来のＢＯＤの産生には最大５日間の誘導期間が必要となる場合があるためである。
【００８８】
３．２  野生型ＢＯＤ酵素の精製
３．２．１  細胞の破壊、及びＤＮａｓｅ  Ｉによる処理
２リットルの培養物由来の細胞ペレットを、５００ｍＭ  ＮａＣｌ及び２０ｍＭ  イミダゾールを含有する４０ｍｌの５０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．６）中に取り、超音波１秒及び中断１秒のサイクルによる４０Ｗ、３分間の超音波処理出力で１０回超音波処理する。得られた試料（粗抽出物と称する）に、ＭｇＣｌ２を添加して最終濃度を２ｍＭとし、ＤＮａｓｅ  Ｉ（粗抽出物１ｍｌ当たり１Ｕ）によって３０分間常温で処理する。引き続き、不溶性の細胞の残骸を、２００００ｇで６０分間の遠心分離によって粗抽出物から除去する。
【００８９】
３．２．２  ニッケルカラムによるアフィニティクロマトグラフィ
０．２２μｍフィルターを通してろ過し、ＯＤ２８０ｎｍが１０となるまで希釈した超音波処理上清を、ＡＫＴＡ  ｐｕｒｉｆｉｅｒシステム（GC Healthcare（登録商標））に連結し、５００ｍＭ  ＮａＣｌ及び２０ｍＭ  イミダゾールを含有する５０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．６）中で平衡化したＨｉｓＰｒｅｐ  ＦＦ  １６／１０アフィニティカラム（GC Healthcare（登録商標））上に注入する。溶出を、１ｍｌ／分の流速で、５００ｍＭ  ＮａＣｌ及び１Ｍ  イミダゾールを含有する５０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．６）を５％から３０％へと変化させるグラジエントを用いて実施する。ＢＯＤタンパク質を含有する画分を、ＡＢＴＳ活性試験によって特定し、結合し、濃縮し、Ａｍｉｃｏｎ  ＹＭ１０膜に対する遠心分離によって、５０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．６）を用いて脱塩する。この段階で、ＢＯＤタンパク質は純粋であり、可溶性形態で−２０℃で保存することができる。
【００９０】
ここで再度、市販のＢＯＤ精製法と比較することによって、このタンパク質の使用によってもたらされる明確な利点を強調することができる。これは、市販のＢＯＤに必要不可欠な連続型のクロマトグラフィ（サイズ排除、陰イオン交換又は陽イオン交換、疎水性等）とは対照的に、純粋な酵素を得るために単一の精製工程しか必要とされないためである。
【００９１】
３．２．３  野生型ＢＯＤ酵素の特徴付け
３．２．３．１  分子量決定
全タンパク質の重量の分析を、備え付けたナノ液体クロマトグラフィ装置の上流にＣ４脱塩・予備濃縮カラム（μ−Ｐｒｅｃｏｌｕｍｎ（登録商標）カートリッジ、Ａｃｃｌａｉｍ  ＰｅｐＭａｐ  ３００、内径３００μｍ×５ｍ、LC Packings Dionex）及びＣ４分析カラム（Ｃ４  ＰｅｐＭａｐ  ３００、内径７５μｍ×５ｃｍ、LC Packings Dionex）を連結したＬＣＱ  Ｄｅｃａ  ＸＰ質量分析器を用いて実施した。
【００９２】
ＢＯＤについて６１００５．９１Ｄａの重量が得られた（すなわち、タンパク質の理論重量と比較して１３０．４Ｄａの差異）。理論重量はＮ末端メチオニンで切断されたタンパク質について算出されたが、僅か０．８０Ｄａの差異が見出され、これによって、タンパク質成熟プロセス時の細菌におけるこのアミノ酸の切断が示される。
【００９３】
３．２．３．２  濃度測定
溶液の酵素濃度を、標準としてＢＳＡを使用するブラッドフォード法に従って算出する（Bradford, anal. Biochimie 72:248, 1976）。
【００９４】
３．２．３．３  酵素アッセイ
酵素アッセイを、３ｍｌの体積、３７℃、０．１Ｍ  シトレート／ホスフェートバッファーにおいて、Varianの分光光度計を使用して実施し、ＡＢＴＳの酸化を、時間の関数として４２０ｎｍで追跡する（ε４２０ｎｍ＝３６ｍＭ−１ｃｍ−１）。酵素の比活性は、１分当たり及びタンパク質１ｍｇ当たりに酸化されるＡＢＴＳのμｍｏｌ単位で表す。使用される標準ＡＢＴＳ濃度は１ｍＭである。酵素を、０．０５ＯＤ４２０ｎｍ／分〜０．３ＯＤ４２０ｎｍ／分の傾きを測定するように希釈する。
【００９５】
４．  野生型のバチルス・プミルスのＢＯＤ酵素の酵素特性を研究する技法
４．１  定常状態における速度定数（ｋｃａｔ）及びミカエリス定数（ＫＭ）の決定
４．１．１  基質は２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）である
実験を、０．１Ｍ  シトレート／ホスフェートバッファー（ｐＨ３）において、Varianの分光光度計によって３７℃で実施する。本試験において、ＡＢＴＳ濃度は、０ｍＭから５ｍＭまで変化させる。試験は、酵素を添加することによって開始する。実験点は、以下の式に従って、Ｓｉｇｍａ−ｐｌｏｔ６．０ソフトウェアを使用して、ミカエリス・メンテンモデルに従う非線形回帰によって解析する：
ミカエリス・メンテンモデル：ｋｓｓ＝ｋｃａｔ×［Ｓ］／（ＫＭ＋［Ｓ］）
【００９６】
結果：
ｋｃａｔ＝３９１．３ｓ−１、及びＫＭ＝３１．７μＭ。
【００９７】
図３は、ＡＢＴＳ濃度の関数としてのバチルス・プミルスのＢＯＤの比活性（単位：Ｕ／ｍｇ）をグラフとして例示する。
【００９８】
比較として、バチルス・サブチリスの相同ＣｏｔＡタンパク質は、同じ最適な活性条件下でＡＢＴＳに対して、３２２ｓ−１のｋｃａｔ、１２４μＭのＫＭを示す（Martins et al., 2008. J Biol Inorg Chem, 13:183-193）。
【００９９】
４．１．２  基質は非抱合型ビリルビンである
実験を、５０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７）において、Varianの分光光度計において３７℃で実施する。本試験において、ビリルビン濃度は、０μＭから６０μＭまで変化させる。酵素の添加によって開始する本試験は、比色変化によって４５０ｎｍでビリルビンの酸化を追跡するものである（ε４５０ｎｍ＝３２ｍＭ−１ｃｍ−１）。実験点は、以下の式に従って、Ｓｉｇｍａ−ｐｌｏｔ６．０ソフトウェアを使用して、ミカエリス・メンテンモデルに従う非線形回帰によって解析する：
ミカエリス・メンテンモデル：ｋｓｓ＝ｋｃａｔ×［Ｓ］／（ＫＭ＋［Ｓ］）
【０１００】
結果：
ｋｃａｔ＝７０ｓ−１、及びＫＭ＝２２μＭ。
【０１０１】
図４は、バチルス・プミルスのＢＯＤに関するミカエリス・メンテン式（非抱合型ビリルビン濃度の関数としてのｋｓｓ（単位：ｓ−１））のグラフ表示である。
【０１０２】
４．１．３  基質は抱合型ビリルビンである
実験を、５０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．８）において、Varianの分光光度計において３７℃で実施する。本試験において、ビリルビン濃度は、０μＭから１５０μＭまで変化させる。酵素の添加によって開始する本試験は、比色変化によって４４０ｎｍで抱合型ビリルビンの酸化を追跡するものである（ε４４０ｎｍ＝２５ｍＭ−１ｃｍ−１）。実験点は、以下の式に従って、Ｓｉｇｍａ−ｐｌｏｔ６．０ソフトウェアを使用して、ミカエリス・メンテンモデルに従う非線形回帰によって解析する：
ミカエリス・メンテンモデル：ｋｓｓ＝ｋｃａｔ×［Ｓ］／（ＫＭ＋［Ｓ］）
【０１０３】
結果：
ｋｃａｔ＝６６．８ｓ−１、及びＫＭ＝３５．１μＭ。
【０１０４】
図５は、５０ｍＭ  シトレート／ホスフェートバッファー（ｐＨ４．８）における、３７℃でのバチルス・プミルスのＢＯＤによる抱合型ビリルビンの酸化に関する触媒活性を表す。
【０１０５】
４．１．４  基質はシリンガルダジン（ＳＧＺ）である
実験を、５０ｍＭ  シトレート／ホスフェートバッファー（ｐＨ６．２）において、Varianの分光光度計において３７℃で実施する。本試験において、メタノールで希釈したＳＧＺ濃度は、０μＭから３００μＭまで変化させる。酵素の添加によって開始する本試験は、比色変化によって５３０ｎｍでＳＧＺの酸化を追跡するものである（ε５３０ｎｍ＝６４ｍＭ−１ｃｍ−１）。実験点は、以下の式に従って、Ｓｉｇｍａ−ｐｌｏｔ６．０ソフトウェアを使用して、競合阻害のあるミカエリス・メンテンモデルに従う非線形回帰によって解析する：
競合阻害のあるミカエリス・メンテンモデル：ｋｓｓ＝ｋｃａｔ×［Ｓ］／（ＫＭ＋［Ｓ］＋［Ｓ］２Ｋｉ）
【０１０６】
結果：
ｋｃａｔ＝１１６．１、ＫＭ＝４５．６μＭ、及びＫｉ＝８２．９μＭ。
【０１０７】
図６は、５０ｍＭ  シトレート／ホスフェートバッファー（ｐＨ６．２）における、３７℃でのバチルス・プミルスのＢＯＤによるシリンガルダジンの酸化に関する触媒活性を表す。
【０１０８】
４．１．５  基質は２，６−ジメトキシフェノール（ＤＭＰ）である
実験を、５０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．８）において、Varianの分光光度計において３７℃で実施する。本試験において、２，６−ジメトキシフェノール濃度は、０μＭから４０００μＭまで変化させる。酵素の添加によって開始する本試験は、比色変化によって４６８ｎｍでＤＭＰの酸化を追跡するものである（ε４６８ｎｍ＝１４．８ｍＭ−１ｃｍ−１）。実験点は、以下の式に従って、Ｓｉｇｍａ−ｐｌｏｔ６．０ソフトウェアを使用して、ミカエリス・メンテンモデルに従う非線形回帰によって解析する：
ミカエリス・メンテンモデル：ｋｓｓ＝ｋｃａｔ×［Ｓ］／（ＫＭ＋［Ｓ］）
【０１０９】
結果：
ｋＳＳ＝５７．３ｓ−１、及びＫＭ＝８２２μＭ。
【０１１０】
図７は、５０ｍＭ  シトレート／ホスフェートバッファー（ｐＨ６．８）における、３７℃でのバチルス・プミルスのＢＯＤによるＤＭＰの酸化に関する触媒活性を表す。
【０１１１】
４．２  ｐＨの関数としての研究
４．２．１  ｐＨの関数としての活性
４．２．１．１  ＡＢＴＳ
ｐＨの関数としての反応速度定数の変動の研究を、基質として１ｍＭ  ＡＢＴＳを使用して、０．１Ｍ  シトレート／ホスフェートバッファーにおいて、３〜７のｐＨ範囲に対して実施する。実験は、Varianの分光光度計を使用して３７℃で実施する。活性は、４２０ｎｍで測定される比色変化をもたらすＡＢＴＳの酸化によって追跡する。本試験は、酵素を添加することによって開始する。
【０１１２】
バチルス・プミルスのＢＯＤによるｐＨの関数としてのＡＢＴＳの酸化の結果を、図８のグラフに相対活性として示す。
【０１１３】
４．２．１．２  非抱合型ビリルビン
ｐＨの関数としての反応速度定数の変動の研究を、基質として３０μＭ  非抱合型ビリルビンを使用して、０．２Ｍ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファーにおいて、７〜８．５のｐＨ範囲に対して実施する。実験は、Varianの分光光度計を使用して３７℃で実施する。活性は、４５０ｎｍで測定される比色変化をもたらすビリルビンの酸化によって追跡する（ε４５０ｎｍ＝３２ｍＭ−１ｃｍ−１）。本試験は、酵素を添加することによって開始する。
【０１１４】
バチルス・プミルスのＢＯＤによるｐＨの関数としての非抱合型ビリルビンの酸化の結果を、図８のグラフに相対活性として示す。
【０１１５】
４．２．１．３  抱合型ビリルビン
ｐＨの関数としての反応速度定数の変動の研究を、基質として１００μＭ  抱合型ビリルビンを使用して、０．１Ｍ  シトレート／ホスフェートバッファーにおいて、３〜７のｐＨ範囲に対して実施する。実験は、Varianの分光光度計を使用して３７℃で実施する。活性は、４４０ｎｍで測定される比色変化をもたらす抱合型ビリルビンの酸化によって追跡する。本試験は、酵素を添加することによって開始する。
【０１１６】
バチルス・プミルスのＢＯＤによるｐＨの関数としての抱合型ビリルビンの酸化の結果を、図８のグラフに相対活性として示す。
【０１１７】
４．２．１．４  シリンガルダジン（ＳＧＺ）
ｐＨの関数としての反応速度定数の変動の研究を、基質として２２μＭ  シリンガルダジンを使用して、０．１Ｍ  シトレート／ホスフェートバッファーにおいて、３〜７．５のｐＨ範囲に対して実施する。実験は、Varianの分光光度計を使用して３７℃で実施する。活性は、５３０ｎｍで測定される比色変化をもたらすシリンガルダジンの酸化によって追跡する。本試験は、酵素を添加することによって開始する。
【０１１８】
バチルス・プミルスのＢＯＤによるｐＨの関数としてのシリンガルダジンの酸化の結果を、図８のグラフに相対活性として示す。
【０１１９】
４．２．１．５  ２，６−ジメトキシフェノール（ＤＭＰ）
ｐＨの関数としての反応速度定数の変動の研究を、基質として１ｍＭ  ＤＭＰを使用して、０．１Ｍ  シトレート／ホスフェートバッファーにおいて、３〜７．５のｐＨ範囲に対して実施する。実験は、Varianの分光光度計を使用して３７℃で実施する。活性は、４６８ｎｍで測定される比色変化をもたらすＤＭＰの酸化によって追跡する。本試験は、酵素を添加することによって開始する。
【０１２０】
バチルス・プミルスのＢＯＤによるｐＨの関数としてのＤＭＰの酸化の結果を、図８のグラフに相対活性として示す。
【０１２１】
４．２．２  ｐＨの関数としての安定性
野生型ＢＯＤのｐＨの関数としての安定性を、常温でのｐＨ３〜９の範囲の混合バッファーにおける均一となるまで精製した酵素の希釈によって決定する。この混合バッファーは１２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、３０ｍＭ  イミダゾール及び３０ｍＭ  酢酸によって構成され、そのイオン強度はＮａＣｌによって１９０ｍＭに調整される。様々な試料を、時間に応じて採取する。残存活性を、１ｍＭ  ＡＢＴＳを含有する０．１Ｍ  シトレート／ホスフェートバッファー（ｐＨ３）において、Varianの分光光度計を使用して、４℃で測定する。
【０１２２】
４℃でのｐＨの関数としてのＡＢＴＳの酸化の比活性及び相対活性の結果を、図９Ａ及び図９Ｂのグラフに示す。
【０１２３】
４．３  温度の関数としての研究
４．３．１  温度の関数としての活性
温度の関数としての反応速度定数の変動の研究を、１ｍＭのＡＢＴＳの存在下において、０．１Ｍ  シトレート／ホスフェートバッファー（ｐＨ３）において実施する。
【０１２４】
温度は１０℃〜８５℃の範囲とする。活性は、温度調整されたVarianのＣａｒｙ  ＵＶ  Ｂｉｏｍｅｌｔ分光光度計によって追跡する。本試験は、酵素を添加することによって開始する。
【０１２５】
図１０は、ＡＢＴＳ酸化に関する温度の関数としてのバチルス・プミルスのＢＯＤの相対活性を表すヒストグラムである。
【０１２６】
４．３．２  温度の関数としての酵素の安定性
酵素を、８０℃の乾燥浴（dry bath）において１０ｍｇ／ｍｌの濃度でプレインキュベートする。２μｌの試料を採取し、酵素を、活性試験のために酵素濃度を調整するように、５０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．６）中に希釈する。８０℃でインキュベートした酵素の残存活性を、１ｍＭのＡＢＴＳの存在下において、３７℃で０．１Ｍ  シトレート／ホスフェートバッファー（ｐＨ３）において、Varianの分光光度計を使用して、決定する。本試験は、酵素を添加することによって開始する。
【０１２７】
図１１Ａ及び図１１Ｂは、８０℃での酵素インキュベーション時間の関数としてのバチルス・プミルスのＢＯＤの安定性（ＡＢＴＳ酸化に関する比活性及び相対活性として表す）をグラフとして表す。
【０１２８】
４．４  尿素の存在の関数としての活性の研究
第４．１．１項において上で記載されるプロトコルを、０Ｍ〜６Ｍの範囲の尿素濃度の存在下において再現した。
【０１２９】
図１２Ａ及び図１２Ｂは、２５℃及び３７℃での尿素濃度の関数としてのバチルス・プミルスのＢＯＤの活性（ＡＢＴＳ酸化に関する比活性及び相対活性として表す）をグラフとして表す。
【０１３０】
２５℃では、ＢＯＤに対する尿素の活性化効果が明らかに観察される。この効果は、より良好な酵素効率に関与すると考えられる酵素の活性部位の僅かな立体配座変化によるものであると考えられる。既知のこの現象は、他のタンパク質については既に記載がある（Hong-Jie Zhang et al. Biochemical and Biophysical Research Communications 238, 382-386 (1997)及びFan et al. Biochem. J. (1996) 315, 97-102を参照されたい）。
【０１３１】
３７℃では、この効果は見出されない。温度及び尿素の効果の組合せが過度に大きな活性部位の変化を引き起こし、結果として酵素の性能レベルの減少をもたらすという仮説を提示することが可能である。
【０１３２】
４．５  ＮａＣｌの存在の関数としての活性の研究
実験を、漸増濃度のＮａＣｌ（０ｍＭから１０００ｍＭまで）を含む５０ｍＭ  シトレート／ホスフェートバッファー（ｐＨ６．２）において、Varianの分光光度計によって３７℃で実施する。メタノール中に希釈したＳＧＺの濃度は、本試験においては５０μＭに固定する。酵素を添加することによって開始する本試験は、比色変化によって５３０ｎｍでＳＧＺの酸化を追跡するものである（ε５３０ｎｍ＝６４ｍＭ−１ｃｍ−１）。
【０１３３】
図１３は、ＮａＣｌ濃度の関数としてのバチルス・プミルスのＢＯＤによるＳＧＺ酸化の相対活性を表す。
【０１３４】
４．６  ＤＴＴ又はＥＤＴＡの存在の関数としての活性の研究
実験を、漸増濃度のＤＴＴ（０ｍＭから５０μＭまで）又は他にはＥＤＴＡ（０ｍＭから１２５ｍＭまで）を含む５０ｍＭ  シトレート／ホスフェートバッファー（ｐＨ６．２）において、Varianの分光光度計によって３７℃で実施する。メタノール中に希釈したＳＧＺの濃度は、本試験においては５０μＭに固定する。酵素を添加することによって開始する本試験は、比色変化によって５３０ｎｍでＳＧＺの酸化を追跡するものである（ε５３０ｎｍ＝６４ｍＭ−１ｃｍ−１）。以下の表ＩＩＩは、相対活性の形式で示される得られた結果を並べるものである。
【０１３５】
【表３】
0005865342.tif 000004
【０１３６】
４．７  レマゾールブリリアントブルーＲ（ＲＢＢＲ）変色活性の研究
多くの他のラッカーゼ及びビリルビンオキシダーゼと同様に、バチルス・プミルスのＢＯＤは、織物産業に使用される染料に対する変色活性を有する。一例としてレマゾールブリリアントブルーＲ（ＲＢＢＲ）を選択し、その変色を、ＡＢＴＳ等の媒介因子の存在下又は非存在下において経時的に測定する。
【０１３７】
実験を、３ｍｌでＡＢＴＳの非存在下又は存在下において、５０ｍＭ  リン酸カリウムバッファー（ｐＨ６）において、Varianの分光光度計によって３７℃で実施する。ＲＢＢＲ濃度は、各タンクにおいて８０ｍｇ／ｌに固定する。１０μｇの酵素を添加することによって開始する本試験は、５９３ｎｍでＲＢＢＲ染料の変色を経時的に追跡するものである。
【０１３８】
図１３は、１０μＭのＡＢＴＳの非存在下又は存在下における５０ｍＭ  リン酸カリウムバッファー（ｐＨ６）における、３７℃での３．３３μｇ／ｍｌのバチルス・プミルスのＢＯＤによるＲＢＢＲの変色を表す。
【０１３９】
５．  バチルス・プミルスのビリルビンオキシダーゼの４つの銅イオンの存在の検証
４つの銅イオンの存在を、銅のモル濃度を測定するために銅濃度に関する較正範囲を使用するビキノリンアッセイによって決定する（Felsenfeld, G. 1960. Arch. Biochem. Biophys., 87, 247-251、Griffiths et al. 1961, J. Biol. Chem., 236, 1850-1856）。結果を表ＩＩＩに示す。
【０１４０】
５４６ｎｍでの比色アッセイに基づく各測定を二連で実施する。
【０１４１】
この技法によって、３．７５μＭのＢＯＤタンパク質試料に対する１５．３μＭ（すなわち４．０８の比率）の銅の存在を示すことが可能となり、酵素と結び付く４つの銅イオンの存在が明確に確認される。
【０１４２】
最後に、ＢＯＤタンパク質における４つの銅イオンの存在を確認するために、タンパク質の銅に関する元素分析を、原子吸光によって実施した。結果によって、タンパク質１つ当たり４つの銅イオンの存在が明確に確認された。
【０１４３】
【表４】
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【図１Ａ】
0005865342.tif 000006
【図１Ｂ】
0005865342.tif 000007
【図２】
0005865342.tif 000008
【図３】
0005865342.tif 000009
【図４】
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【図５】
0005865342.tif 000011
【図６】
0005865342.tif 000012
【図７】
0005865342.tif 000013
【図８】
0005865342.tif 000014
【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
0005865342.tif 000016
【図１０】
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【図１１Ａ】
0005865342.tif 000018
【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
0005865342.tif 000020
【図１２Ｂ】
0005865342.tif 000021
【図１３】
0005865342.tif 000022
【図１４】
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【配列表】
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