(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号７〜配列番号１１のいずれか一つで示されるアミノ酸配列からなる融合タンパク質を含む、転写因子機能に対する阻害剤。
【請求項２】
配列番号７〜配列番号１１のいずれか一つで示されるアミノ酸配列からなる融合タンパク質。
【請求項３】
請求項２に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項４】
請求項３に記載の核酸を含むベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項６】
前記宿主細胞が、ＢＬ２１  ｓｔａｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓ  Ｓである、請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項７】
請求項４に記載のベクターを発現させる工程を含む、融合タンパク質を作製するための方法。
【請求項８】
配列番号７で示されるアミノ酸配列からなる融合タンパク質および薬剤的に許容できる賦形剤を含む、多発性硬化症を治療するための医薬組成物。
【請求項９】
配列番号８で示されるアミノ酸配列からなる融合タンパク質および薬剤的に許容できる賦形剤を含む、アレルギー性喘息を治療するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質転写因子トランス活性化制御ドメインとタンパク質形質導入ドメインとを有する融合タンパク質、および、それを含む転写因子機能に対する阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
転写因子は、ＤＮＡ中の特異的な配列への結合または他の因子への結合により転写活性を調節することのできる、遺伝子の転写を制御するための要素である。この結合または相互作用が正しく機能しない場合には、当該転写因子の機能不全または欠損に関係する種々の疾患が誘導され得る。
【０００３】
タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）のアイデンティティは、もともと、１９９８年に、ＢＲＭ（生物学的応答修飾物質）の細胞内への送達をＨＩＶ‐ＴＡＴタンパク質の一部分によって促進することができるということで報告された。約５０種類の異なるＰＴＤがこれまでに発見されており、Ｔａｔ、ＶＰ２２、Ａｎｔｐ  ＨＰ４およびＨｐｈ‐１は基礎および治療研究に頻繁に用いられている。これらＰＴＤが、１２０ｋＤａよりも大きなタンパク質を短期間のうちに効果的に細胞中へと送達するとのこと、および、ＰＴＤによってＤＮＡ／ＲＮＡまたは送達不能な化学的化合物を細胞中へと形質導入できるとのことが示されている。ＰＴＤは、例えば皮膚経路、鼻腔内経路または眼経路などの局所投与経路を介した体内へのまたはＢＢＢ（血液脳関門）を越える脳内へのＢＲＭの細胞内送達を促進するための新規の薬物送達システムである。
【０００４】
それ故に、本発明者は、転写因子はＤＮＡまたは他のタンパク質との相互作用を通して機能を発揮するという事実に基づき、転写因子の当該部分とＰＴＤとを含む融合タンパク質の生成を完成させる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、転写因子のＴＭＤとＰＴＤとを含む転写因子機能に対する阻害剤を提供すること、ならびに、前記融合タンパク質および薬剤的に許容できる賦形剤を含む、転写因子の機能不全または欠損に関係する疾患を治療するための医薬組成物を提供すること、を目的とする。
【０００６】
さらに、本発明は、ヒトにおける転写因子の機能不全または欠損に関係する疾患を治療するための方法であって、前記ヒトに、転写因子のＴＭＤとＰＴＤとを含む有効量の融合タンパク質を投与することを含む方法を提供することを目的とする。
【０００７】
さらに、本発明は、転写因子のＴＭＤとＰＴＤとを含む融合タンパク質、前記融合タンパク質をコードする核酸、前記核酸を含むベクター、および、前記ベクターを含む宿主細胞を提供することを目的とする。
【０００８】
さらに、本発明は、宿主細胞中で転写因子のＴＭＤをコードする遺伝子とＰＴＤをコードする遺伝子とを含むベクターを発現させる工程を含む、融合タンパク質を作製するための方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一実施形態において、ＴＭＤ（転写調節ドメイン）は、これに限定されるものではないが例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、転写コアクチベーター、転写リプレッサー、エンハンサー結合因子もしくはリガンドなどの転写の際に重要な分子もしくは因子との機能的相互作用に関与するか、または、二量体化／多量体化もしくは核局在化に関与する転写因子の一部分を指す。
【００１０】
一実施形態において、本発明は、転写因子のＴＭＤとＰＴＤとを含む融合タンパク質を含む転写因子機能に対する阻害剤を提供する。加えて、当該実施形態における前記転写因子は、ＲＯＲγｔ（レチノイン酸関連オーファン受容体ガンマｔ）、Ｔｂｅｔ（Ｔ‐ｂｏｘ２１）、ＧＡＴＡ‐３（ＧＡＴＡ結合タンパク質３）、ＦＯＸＰ３（フォークヘッドボックスＰ３）、ＲＯＲα４（レチノイン酸関連オーファン受容体アルファ４）、ＨＩＦ‐１／２α（低酸素誘導性因子１／２α）、ＳＴＡＴ（シグナル伝達性転写活性化因子）、ＰＰＡＲγ（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ）、ｐ５３、ＡＰ‐１、ＮＦκＢ（核因子カッパＢ）、ＮＫｘ２．５（ＮＫ２転写因子関連、遺伝子座５）、ＦＯＸＯ（フォークヘッドボックスＯ）、ＲＥＬＡ（ｖ‐ｒｅｌ細網内皮症ウィルス癌遺伝子ホモログＡ）またはＲｕｎｘ（ｒｕｎｔ関連転写因子）からなる群より選択される。加えて、当該実施形態における前記転写因子は、ＲＯＲγｔ（レチノイン酸関連オーファン受容体ガンマｔ）、Ｔｂｅｔ（Ｔ‐ｂｏｘ２１）、ＧＡＴＡ‐３（ＧＡＴＡ結合タンパク質３）およびＦＯＸＰ３（フォークヘッドボックスＰ３）からなる群より選択される。加えて、当該実施形態におけるＰＴＤは、ＨＰ４、Ｈｐｈ‐１、Ｍｐｈ‐１、Ｓｉｍ‐２、Ｔａｔ、ＶＰ２２、Ａｎｔｐ（アンテナペディア）、Ｐｅｐ‐１（ペプチド）、ＰＴＤ‐５、Ｒ９（アルギニン）、７ＲおよびＣＴＰ（細胞質内形質導入ペプチド）からなる群より選択される。当該実施形態におけるＰＴＤは、配列番号１のアミノ酸配列を有していてもよい。当該実施形態における転写因子のＴＭＤは、ＤＮＡ結合ドメインまたはタンパク質相互作用ドメインであってもよい。前記転写因子のＴＭＤは、ヘリックス・ターン・ヘリックスドメイン、ジンクフィンガードメイン、ロイシンジッパードメイン、ウィングドヘリックスドメイン、ウィングドヘリックスターンヘリックスドメイン、ヘリックス・ループ・ヘリックスドメイン、ＨＭＧボックスドメインおよびフォークヘッドドメインからなる群より選択される１つ以上を含む。前記転写因子のＴＭＤは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、転写コアクチベーター、転写リプレッサー、エンハンサー結合因子またはリガンドと相互作用するドメイン、二量体化／多量体化に関与するドメイン、ならびに、核局在化に関与するドメインからなる群より選択される１つ以上を含む。前記転写因子のＴＭＤは、配列番号２〜６の配列を有していてもよい。前記転写因子のＴＭＤは、配列番号７〜１１の配列を有していてもよい。
【００１１】
一実施形態において、本発明は、転写因子のＴＭＤとＰＴＤとを含む融合タンパク質を提供する。加えて、当該実施形態における前記転写因子は、ＲＯＲγｔ（レチノイン酸関連オーファン受容体ガンマｔ）、Ｔｂｅｔ（Ｔ‐ｂｏｘ２１）、ＧＡＴＡ‐３（ＧＡＴＡ結合タンパク質３）、ＦＯＸＰ３（フォークヘッドボックスＰ３）、ＲＯＲα４（レチノイン酸関連オーファン受容体アルファ４）、ＨＩＦ‐１／２α（低酸素誘導性因子１／２α）、ＳＴＡＴ（シグナル伝達性転写活性化因子）、ＰＰＡＲγ（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ）、ｐ５３、ＡＰ‐１、ＮＦκＢ（核因子カッパＢ）、ＮＫｘ２．５（ＮＫ２転写因子関連、遺伝子座５）、ＦＯＸＯ（フォークヘッドボックスＯ）、ＲＥＬＡ（ｖ‐ｒｅｌ細網内皮症ウィルス癌遺伝子ホモログＡ）およびＲｕｎｘ（ｒｕｎｔ関連転写因子）からなる群より選択される。加えて、当該実施形態における前記転写因子は、ＲＯＲγｔ（レチノイン酸関連オーファン受容体ガンマｔ）、Ｔｂｅｔ（Ｔ‐ｂｏｘ２１）、ＧＡＴＡ‐３（ＧＡＴＡ結合タンパク質３）およびＦＯＸＰ３（フォークヘッドボックスＰ３）からなる群より選択される。加えて、当該実施形態におけるＰＴＤは、ＨＰ４、Ｈｐｈ‐１、Ｍｐｈ‐１、Ｓｉｍ‐２、Ｔａｔ、ＶＰ２２、Ａｎｔｐ（アンテナペディア）、Ｐｅｐ‐１（ペプチド）、ＰＴＤ‐５、Ｒ９（アルギニン）、７ＲおよびＣＴＰ（細胞質内形質導入ペプチド）からなる群より選択される。当該実施形態におけるＰＴＤは、配列番号１のアミノ酸配列を有していてもよい。当該実施形態における転写因子のＴＭＤは、ＤＮＡ結合ドメインまたはタンパク質相互作用ドメインであってもよい。前記転写因子のＴＭＤは、ヘリックス・ターン・ヘリックスドメイン、ジンクフィンガードメイン、ロイシンジッパードメイン、ウィングドヘリックスドメイン、ウィングドヘリックスターンヘリックスドメイン、ヘリックス・ループ・ヘリックスドメイン、ＨＭＧボックスドメインおよびフォークヘッドドメインからなる群より選択される１つ以上を含む。前記転写因子のＴＭＤは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、転写コアクチベーター、転写リプレッサー、エンハンサー結合因子またはリガンドと相互作用するドメイン、二量体化／多量体化に関与するドメイン、ならびに、核局在化に関与するドメインからなる群より選択される１つ以上を含む。前記転写因子のＴＭＤは、配列番号２〜６の配列を有していてもよい。前記転写因子のＴＭＤは、配列番号７〜１１の配列を有していてもよい。さらに、本発明は、前記融合タンパク質をコードする核酸、前記核酸を含むベクター、および、前記ベクターを含む宿主細胞を提供する。当該実施形態におけるＰＴＤは、配列番号１の配列を有していてもよい。前記転写因子のＴＭＤは、配列番号２〜６の配列を有していてもよい。前記宿主細胞における前記融合タンパク質は、配列番号７〜１１の配列を有していてもよい。前記宿主細胞は、ＢＬ２１  ｓｔａｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓ  Ｓであってもよい。
【００１２】
一実施形態において、本発明は、宿主細胞中で転写因子のＴＭＤをコードする遺伝子とＰＴＤをコードする遺伝子とを併せ持つベクターを発現させることにより融合タンパク質を作製するための方法を提供する。
【００１３】
一実施形態において、本発明は、転写因子のＴＭＤとＰＴＤとを含む融合タンパク質および薬剤的許容可能賦形剤を含む、転写因子の機能不全または欠損に関係する疾患を治療するための医薬組成物を提供する。当該実施形態における前記転写因子がＮＫｘ２．５（ＮＫ２転写因子関連、遺伝子座５）またはＨＩＦ‐１α（低酸素誘導性因子１α）である場合には、前記転写因子の機能不全または欠損に関係する疾患は、神経系疾患であってもよい。当該実施形態における前記転写因子がＨＩＦ‐１α（低酸素誘導性因子１α）である場合には、前記転写因子の機能不全または欠損に関係する疾患は、神経系疾患であってもよい。当該実施形態における前記転写因子がＰＰＡＲγ（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ）である場合には、前記転写因子の機能不全または欠損に関係する疾患は、糖尿病であってもよい。当該実施形態における前記転写因子がＲＯＲγｔ（レチノイン酸関連オーファン受容体ガンマｔ）、ＲＯＲα４（レチノイン酸関連オーファン受容体アルファ４）またはＦＯＸＯ（フォークヘッドボックスＯ）である場合には、前記転写因子の機能不全または欠損に関係する疾患は、自己免疫疾患または炎症性疾患であってもよい。当該実施形態における前記転写因子がＨＩＦ‐２α（低酸素誘導性因子２α）またはＳＴＡＴ（シグナル伝達性転写活性化因子）である場合には、前記転写因子の機能不全または欠損に関係する疾患は、自己免疫疾患または炎症性疾患であってもよい。当該実施形態における前記転写因子がＡＰ‐１またはＮＦκＢ（核因子カッパＢ）である場合には、前記転写因子の機能不全または欠損に関係する疾患は、血管疾患または炎症性疾患であってもよい。前記転写因子がｐ５３、ＳＰ１またはＲＥＬＡ（ｖ‐ｒｅｌ細網内皮症ウィルス癌遺伝子ホモログＡ）である場合には、前記転写因子の機能不全または欠損に関係する疾患は、癌であってもよい。当該実施形態における前記転写因子がＧＡＴＡ‐３（ＧＡＴＡ結合タンパク質３）である場合には、前記転写因子の機能不全または欠損に関係する疾患は、喘息またはアトピーであってもよい。当該実施形態における前記転写因子がＲＯＲγｔである場合には、前記転写因子の機能不全または欠損に関係する疾患は、ＥＡＥ（ＭＳ）、ＲＡまたはＩＢＤ（クローン病）であってもよい。当該実施形態における前記転写因子がＦｏｘｐ３である場合には、前記転写因子の機能不全または欠損に関係する疾患は、癌であってもよい。当該実施形態における前記転写因子がＴｂｅｔである場合には、前記転写因子の機能不全または欠損に関係する疾患は、ＲＡ、ＩＢＤ（クローン病）またはＥＡＥ（ＭＳ）であってもよい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明にかかる融合タンパク質を用いて、転写因子の機能不全または欠損に関係する種々の疾患を治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明にかかる一実施形態として用いられたタンパク質である、ＲＯＲγｔ‐ＴＭＤとＨｐｈ‐１‐ＰＴＤとの間の融合タンパク質（以下、ｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤと称されることとなる）、Ｈｐｈ‐１‐ＰＴＤが存在しないために細胞中へと形質導入され得ないＨｐｈ‐１‐ＰＴＤを有しないＲＯＲγｔ‐ＴＭＤ自体、ＲＯＲγｔ‐ＴＭＤの代わりにＬＢＤ（リガンド結合ドメイン）を有する融合タンパク質ｔＲＯＲγｔ‐ＬＢＤ、の構造を示す。
【図２】本発明にかかる一実施形態として用いられたｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤ、ＲＯＲγｔ‐ＴＭＤおよびｔＲＯＲγｔ‐ＬＢＤについてのクマシーブルー染色の描写を示す。
【図３】本発明にかかる一実施形態として用いられたｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤは用量および時間依存的にジャーカットＴ細胞中へと形質導入することができる、ということを確認するウエスタンブロット分析の描写を示す。
【図４】本発明にかかる一実施形態として用いられたｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤ融合タンパク質は蛍光顕微鏡法により分析されるＨｅＬａ細胞の核中へと送達され得る、ということを示す。
【図５】ｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤは濃度依存的にＩＬ‐１７プロモーターへの内在性ＲＯＲγｔのＤＮＡ結合活性を阻害するが、一方、ｔＲＯＲγｔ‐ＬＢＤ、Ｈｐｈ‐１‐ＰＴＤを有しないＲＯＲγｔ‐ＴＭＤ、または、ＤＮＡ結合に重要なアミノ酸の変異に起因してＩＬ‐１７プロモーターに結合することができない、変異型のｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤ（ＲＲ‐ＡＧ）は、内在性ＲＯＲγｔのＤＮＡ結合活性を阻害することができない、という結果を示す。
【図６】本発明にかかる一実施形態として用いられたｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤ融合タンパク質は、脾臓Ｔ細胞において、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ｍＡｂにより誘導されるＴｃＲ活性化時の、Ｔｈ１７細胞からのＩＬ‐１７Ａの分泌を選択的に阻害するが、Ｔｈ１細胞からのＩＦＮ‐γの分泌、Ｔｈ２細胞からのＩＬ‐４の分泌、または、活性化Ｔ細胞からのＩＬ‐２の分泌には影響を与えない、という結果を示す。
【図７】本発明にかかる一実施形態として用いられたｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤ融合タンパク質が、ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ６２Ｌ＋ナイーブＴ細胞のＴｈ１７細胞への分化、ならびに、Ｔｈ１７細胞からのＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆの発現および分泌を選択的に阻害する、ということを示す。しかしながら、ｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤは、ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ６２Ｌ＋ナイーブＴ細胞のＴｈ１細胞への分化、ならびに、Ｔｈ１細胞からのＩＦＮ‐ｇの発現および分泌、ならびに、ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ６２Ｌ＋ナイーブＴ細胞のＴｈ２細胞への分化、ならびに、Ｔｈ２細胞からのＩＬ‐１３の発現および分泌には影響を与えない。また、ｔＲＯＲγｔ‐ＬＢＤ、および、Ｈｐｈ‐１‐ＰＴＤを有しないＲＯＲγｔ‐ＴＭＤは、ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ６２Ｌ＋ナイーブＴ細胞のＴｈ１７細胞への分化を阻害しない。加えて、ＤＮＡ結合に関与するアミノ酸にｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤの変異を有するｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤ（ＲＲ‐ＡＧ）は、ＴＨ１７細胞からのＩＬ‐１７Ａの分泌を部分的に阻害することができる。
【図８】ｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤは細胞中に存在するＲＯＲγｔがＩＬ‐１７Ａプロモーターへ結合するのを濃度依存的に阻害し；その阻害効果は、ＬＢＤを有する融合タンパク質（ｔＲＯＲγｔ‐ＬＢＤ）、および、ＰＴＤを有しないＲＯＲγｔ‐ＴＭＤにおいては観察されないが、ＤＮＡとの結合に関与するアミノ酸の変異に起因してＤＮＡに結合することができない変異型のｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤ（ＲＲ‐ＡＧ）は、Ｔｈ１７細胞からのＩＬ‐１７Ａを部分的に阻害する、という結果を示す。
【図９】ｎＴｒｅｇ細胞中へのｔＦｏｘｐ３‐ＴＭＤの細胞内送達に際し、本発明における一実施形態として用いられるｔＦｏｘｐ３‐ＴＭＤ融合タンパク質は、内在性Ｆｏｘｐ３のインタラクトームの（ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｉｃ）競合により、エフェクターＴ細胞に対するｎＴｒｅｇ細胞の免疫学的抑制機能を効果的に低下させる、という結果を示す。
【図１０】図９の結果を示す棒グラフを示す。
【図１１】本発明における一実施形態として用いられたｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤ融合タンパク質は、ヒト多発性硬化症（ＭＳ）の動物モデルであるＥＡＥに対し、効果的な治療および予防可能性を有する、ということを示す。
【図１２】本発明における一実施形態として用いられたｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤ融合タンパク質は、ナイーブＴ細胞のＴｈ１７細胞への分化およびＴｈ１７細胞からのＩＬ‐１７Ａの分泌を阻害し、また、ｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤのこの阻害活性は、Ｔｈ１細胞からのＩＦＮ‐ｇの分泌も阻害することができ、これらはＥＬＩＳＡにより分析される、ということを示す。
【図１３】本発明における一実施形態として用いられたｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤ融合タンパク質は、ナイーブＴ細胞のＴｈ１７細胞への分化およびＴｈ１７細胞からのＩＬ‐１７Ａの分泌を阻害し、また、ｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤのこの阻害活性は、Ｔｈ１細胞からのＩＦＮ‐ｇの分泌も阻害することができ、これらは細胞内染色により分析される、ということを示す。
【図１４】有髄領域を染色することができるルクソール・ファスト・ブルー染色により、本発明における一実施形態として用いられたｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤ融合タンパク質はヒトＭＳの動物モデルであるＥＡＥにおけるＣＮＳ中のニューロン細胞の脱髄に対する阻害効果を発揮することができる、ということを示す。
【図１５】ヘマトキシリン＆エオシン免疫組織化学染色による、本発明における一実施形態として用いられたｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤ融合タンパク質はヒトＭＳの動物モデルであるＥＡＥにおけるＣＮＳへの炎症性細胞の浸潤を阻害するとの描写を示す。
【図１６】過ヨウ素酸シッフ免疫組織化学染色による、本発明における一実施形態として用いられたｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤ融合タンパク質はヒトＭＳの動物モデルであるＥＡＥにおけるＣＮＳへの炎症性細胞の浸潤を阻害するとの描写を示す。
【図１７】本発明における一実施形態として用いられたｔＧＴ３‐ＴＭＤ融合タンパク質は、ｔＧＴ３‐ＴＭＤをアレルギー性喘息の動物モデルの気道中へと鼻腔内噴霧した場合に、異なる数種類の炎症性細胞および免疫細胞の浸潤を効果的に減少させることができ、これは細胞分染法により分析される、とのグラフを示す。
【図１８】本発明における一実施形態として用いられたｔＧＴ３‐ＴＭＤ融合タンパク質は、ｔＧＴ３‐ＴＭＤを気道中へと鼻腔内噴霧した場合に、Ｔｈ２特異的サイトカインであるＩＬ‐４およびＩＬ‐５の分泌を阻害することにより、アレルギー性喘息の動物モデルにおいて、治療効果を有し、これはＥＬＩＳＡにより分析される、とのグラフを示す。
【図１９】本発明における具体的な一実施例として用いられたｔＧＴ３‐ＴＭＤ融合タンパク質は、異なる数種類の炎症性細胞および免疫細胞の浸潤の阻害により、効果的に、アレルギー性喘息の動物モデルにおいて、治療効果を有し、これはヘマトキシリン＆エオシン染色により分析される、との描写を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
【実施例】
【００１７】
実施例１：転写因子のＴＭＤとＰＴＤとを含む融合タンパク質の生成、分離および精製
【００１８】
転写活性を制御するＲＯＲγｔ‐ＴＭＤドメイン（配列番号２、転写因子ＲＯＲγｔ中の転写活性を制御するドメイン）をコードするＤＮＡ断片またはＲＯＲγｔ‐ＬＢＤをコードするＤＮＡ断片をＰＣＲにより作製した。また、例えば、Ｈｐｈ‐１‐ＰＴＤとＲＯＲγｔ‐ＴＭＤとを含むｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤ、Ｈｐｈ‐１‐ＰＴＤとＲＯＲγｔ‐ＬＢＤとを含むｔＲＯＲγｔ‐ＬＢＤ、および、Ｈｐｈ‐１‐ＰＴＤを有しないＲＯＲγｔ‐ＴＭＤなどの、３種類の組換えＤＮＡ構築物を、組換えＤＮＡ技術によって作製する（図１）。３種類の組換えＤＮＡをｐＲＳＥＴｂベクターにクローニングし、これを用いてＢＬ２１  ｓｔａｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳコンピテント細胞を形質転換した。我々は、その形質転換コンピテント細胞の培養後に１ｍＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピル‐β‐Ｄ‐チオガラクトピラノシド）を加えることによりｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤ、ｔＲＯＲγｔ‐ＬＢＤおよびＲＯＲγｔ‐ＴＭＤ融合タンパク質の発現を誘導した。次いで、それら培養細胞を回収し、溶解緩衝液（１０ｍＭ  イミダゾール、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ８．０）で溶解後に超音波処理器により超音波処理した。これら融合タンパク質を、ｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤ、ｔＲＯＲγｔ‐ＬＢＤまたはＲＯＲγｔ‐ＴＭＤ融合タンパク質の初めの部分にある６×ヒスチジンを介してＮｉ‐ＮＴＡビーズと結合させた。次いで、我々は、これら融合タンパク質を、Ｎｉ‐ＮＴＡビーズを有するカラム中に入れ、このカラムを洗浄緩衝液（３０ｍＭ  イミダゾール、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ８．０）で洗浄し、次いで、融合タンパク質を溶出緩衝液（３Ｍ  イミダゾール、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ８．０）で単離した。我々は、ＰＤ‐１０を用いることによって緩衝液を１０％グリセロールＰＢＳへと変えることにより、ＮａＣｌおよびイミダゾールを除去した。次いで、我々は、回収タンパク質中の例えばＬＰＳなどのエンドトキシンを除去するためにＳＰビーズに通して融合タンパク質を再精製した。それらタンパク質を、結合緩衝液（３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．２）中でビーズに結合させ、次いで、カラムに入れ、溶出緩衝液（２Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ８．０）により単離した。最後に、我々は、それら融合タンパク質を含有する分画中のＮａＣｌを除去し、緩衝液をＰＢＳへと変え、次いで、−８０℃にて急速冷凍した。我々は、これらの融合タンパク質のサイズと純度とを、精製したｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤ、ｔＲＯＲγｔ‐ＬＢＤまたはＲＯＲγｔ‐ＴＭＤ融合タンパク質をＳＤＳ‐ＰＡＧＥにて分析することにより分析した（図２）。
【００１９】
Ｈｐｈ‐１‐ＰＴＤとＧＡＴＡ‐３の転写調節ドメイン（配列番号３）とを含むｔＧＴ３‐ＴＭＤ、Ｈｐｈ‐１‐ＰＴＤとＴｂｅｔの転写調節ドメイン（配列番号４）とを含むｔＴｂｅｔ‐ＴＭＤ、および、Ｈｐｈ‐１‐ＰＴＤとＦｏｘｐ３の転写調節ドメイン（配列番号５および６）とを含むｔＦｏｘｐ３‐ＴＭＤ（図１ｂ、１ｃおよび１ｄ参照）を、上記方法に従って作製した。
【００２０】
実施例２：融合タンパク質の細胞内送達の確認
【００２１】
＜２‐１．ウエスタンブロット分析による融合タンパク質の細胞内送達の確認＞
【００２２】
我々は、１時間、種々の濃度（０、１００ｎＭ、２００ｎＭ、５００ｎＭ、１μＭ、２μＭ、５μＭ）の当該融合タンパク質を、ジャーカットＴ細胞またはＣ５７ＢＬ／６脾細胞用の培養培地に加えるか、または、これらの細胞を、５ｕＭの当該融合タンパク質と共に、種々の長さの時間（０、１、３、４、１２、２４又は４８時間）にわたってインキュベートした。我々は、次いで、ＰＢＳで洗浄して、細胞中へ形質導入されずに残った融合タンパク質を除去した。我々は、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥにて細胞溶解物中の当該タンパク質を分離した後に、ｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤを認識するｍＡｂを用いることにより、ｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤが細胞中へと形質導入されるかどうかを確認した（図３参照）。ｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤが濃度依存的にこれらの細胞中へと効果的に形質導入されたこと、当該融合タンパク質のうちのほとんどが１時間以内に細胞中へと形質導入されたこと、および、形質導入されたタンパク質が細胞への形質導入後４８時間で分解され始めたこと、を我々は確認した。そのため、我々は、細胞中に長時間にわたり高濃度の当該融合タンパク質が存在することに起因する細胞毒性効果はないであろうと予測する。
【００２３】
＜２‐２．ｍＡｂを用いて形質導入された融合タンパク質の核中への送達の確認＞
【００２４】
５００ｎＭのｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤをＨｅＬａ細胞中へと１時間形質導入し、次いで、それらの細胞をＰＢＳで洗浄し、当該融合タンパク質に特異的な、蛍光タグを付けたｍＡｂの存在下で、トリトンＸ１００を用いて細胞膜を透過処理した。次いで、我々は、当該形質導入された融合タンパク質に特異的なｍＡｂの蛍光が、ＤＡＰＩによって染色された核と重なることを確認したが、これは、当該形質導入された融合タンパク質が核内へと輸送されているということを示唆するものである（図４ａ参照）。
【００２５】
上記と同じ実験方法を用いて、図１中のＧＡＴＡ‐３の転写調節ドメイン（配列番号３）を含むｔＧＴ３‐ＴＭＤ、Ｔｂｅｔの転写調節ドメイン（配列番号４）を含むｔＴｂｅｔ‐ＴＭＤ、および、Ｆｏｘｐ３の転写調節ドメイン（配列番号５、６）を含むｔＦｏｘｐ３‐ＴＭＤを、細胞中へと、および、さらにはそれらの細胞の核中へと、効果的に形質導入した（図４ｂ、４ｃおよび４ｄ参照）。
【００２６】
実施例３：融合タンパク質によるＴＦの転写活性の特異的阻害
【００２７】
＜３‐１．ｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤによるサイトカインＩＬ‐１７Ａの分泌の阻害＞
【００２８】
ｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤが、ＩＬ‐１７のプロモーター領域への内在性ＲＯＲγｔの結合を競合的かつ特異的に阻害することができるかどうかを試験するために、Ｈｅｌａ細胞に、ＲＯＲγｔを発現するＤＮＡとＩＬ‐１７プロモーターにより発現が駆動されるルシフェラーゼレポーターＤＮＡとを共にトランスフェクションし、ｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤと共にインキュベートした。我々は、リポフェクタミンを用いてＤＮＡをＨｅｌａ細胞にトランスフェクションした。ｐｌｕｓ試薬（インビトロジェン社）、１μｇのルシフェラーゼレポーター構築物および１μｇのｐＲＯＲγｔ‐Ｎ１プラスミドの混合物を、血清非存在下でＯｐｔｉ‐ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社）により適当量（ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅｄ  ｖｏｌｕｍｅ）まで希釈した。複合体を作製するためにこのトランスフェクション（ｔｒａｓｆｅｃｔｉｏｎ）混合物を室温で１５分間放置した後、Ｈｅｌａ細胞（１ウェルあたり１×１０５個の細胞）を、ＤＮＡ‐Ｐｌｕｓ‐リポフェクタミン試薬複合体と３時間混合し、次いで、１００ｎＭ〜２μＭのｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤ、ｔＲＯＲγｔ‐ＬＢＤまたは形質導入できないＲＯＲγｔ‐ＴＭＤ融合タンパク質で一晩処理した。我々は、洗浄および抽出後に、ルシフェラーゼ検出システム（プロメガ社）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。各トランスフェクション実験は３回行ない、ルシフェラーゼの活性はルミネーター（プロメガ社）によって試験した。ｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤ融合タンパク質はルシフェラーゼ活性を６倍低下させたが、一方、ｔＲＯＲγｔ‐ＬＢＤまたは形質導入できないＲＯＲγｔ‐ＴＭＤはルシフェラーゼ活性に影響を与えなかった。加えて、ＤＮＡ結合に重要なアミノ酸の変異によりＤＮＡに結合することができない変異型のｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤ（ＲＲ‐ＡＧ）は、当該変異型がＩＬ‐１７プロモーターに結合することができなかったため、ルシフェラーゼ活性を妨げることはできなかった（図５）。したがって、ｔＲＯＲγｔ‐ｔ‐ＴＭＤ融合タンパク質は、内在性ＲＯＲγｔのＩＬ‐１７プロモーターへの結合を特異的に阻害するものであり、この阻害機能はＩＬ‐１７プロモーターに特異的であった。
【００２９】
上記と同じ実験方法を用いて、ＧＡＴＡ‐３の転写調節ドメインを含むｔＧＴ３‐ＴＭＤおよび転写調節ドメイン（配列番号４）を含むｔＴｂｅｔ‐ＴＭＤにより、ルシフェラーゼ活性の阻害を確認した（図４ｂおよび４ｃ参照）。
【００３０】
我々は、７週齢のメスのＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓から脾細胞を単離し、次いで、７２時間、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体および０．５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８抗体でコートされた１２個のウェル中でそれら脾細胞をインキュベートした後に、ＥＬＩＳＡにより、Ｔｈ１、Ｔｈ２またはＴｈ１７細胞から分泌されるサイトカインの量を測定した。我々は、Ｔ細胞の活性化を示すＩＬ‐２の分泌、Ｔｈ１特異的サイトカインであるＩＦＮ‐γの分泌、Ｔｈ２特異的サイトカインであるＩＬ‐４の分泌、および、Ｔｈ１７特異的サイトカインであるＩＬ‐１７Ａの分泌、の増加が、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８の両抗体によるＴＣＲ刺激によって誘導されたと判断した。
【００３１】
ｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤ融合タンパク質が、Ｔｈ１７細胞からのＩＬ‐１７Ａの発現および分泌を誘導する内在性ＲＯＲγｔの機能を抑制することができるかどうかを確認するために、我々は、脾細胞を、あらかじめ、２００ｎＭのｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤ融合タンパク質と共に１時間インキュベートし、次いで、それらの細胞を洗浄し、形質導入されなかったｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤを除去した。上記のように、それらの細胞を、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体によって刺激し、サイトカイン分泌のレベルを分析した。結果として、ＩＦＮ‐γ、ＩＬ‐４またはＩＬ‐２の分泌のレベルはｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤの細胞中への形質導入によって変化しなかったが、一方、ＩＬ‐１７Ａの分泌のレベルは用量依存的に減少した。これらの結果から、ｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤは、Ｔｈ１７細胞からのＩｌ‐１７Ａの分泌を特異的に阻害するが、Ｔｈ１細胞からのＩＦＮ‐γの分泌、Ｔｈ２細胞からのＩＬ‐４の分泌、および、活性化Ｔ細胞からのＩＬ‐２分泌には影響を与えない（図６参照）。
【００３２】
＜３‐２．ｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤによるナイーブＴ細胞のＴｈ１７細胞への分化の選択的阻害＞
【００３３】
実験３‐１にて言及されている同じプロトコルにより、ＭＡＣＳ（磁気細胞選別）を用いて７週齢のメスのＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓由来の未成熟のナイーブＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ６２Ｌ  Ｔ細胞を単離したが、これらの細胞はそれまでいかなる抗原にも一度も出会ったことはない。これらの未成熟のナイーブＣＤ４  Ｔ細胞を１００ｎＭまたは１００ｆＭのｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤで１時間処理した後に、我々は、７２時間、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体および０．５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８抗体によるＴｃＲ刺激と共に、それら細胞を、ナイーブＴ細胞のＴｈ１、Ｔｈ２またはＴｈ１７細胞への分化を誘導することができるサイトカインと共にインキュベートした。我々は、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ‐１２および抗ＩＬ‐４抗体を加えてＴ細胞をＴｈ１細胞へと分化させた。我々は、ＩＬ‐４、ＩＬ‐５  ｎｇ／ｍｌおよび抗ＩＦＮ‐γ抗体を加えてナイーブＴ細胞をＴｈ２細胞へと分化させ、また、３ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１、３０ｎｇ／ｍｌのＩＬ‐６、１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ‐２１、抗ＩＬ‐４抗体および抗ＩＦＮ‐γ抗体を加えてナイーブＴ細胞のＴｈ１７への分化を誘導した。細胞上清中へと分泌されたサイトカインのレベルを、７２時間のインキュベーションの後にＥＬＩＳＡにより分析した際、Ｔｈ１特異的サイトカインおよびＴｈ２特異的サイトカインは変化しなかったが、一方、ＲＯＲγｔにより誘導されることが知られている例えばＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７ＦなどのＴｈ１７細胞特異的サイトカインは有意に減少した。これらの結果から、ｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤは、ナイーブＴ細胞のＴｈ１７細胞への分化、ならびに、ＲＯＲγｔが重要な役割を果たしているＴｈ１７細胞特異的サイトカインの発現および分泌を選択的に阻害することができる（図７参照）。
【００３４】
次に、我々は、ＲＯＲγｔにより発現が誘導される遺伝子の制御領域へのｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤの結合が、ｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤによるナイーブＴ細胞のＴｈ１７細胞への分化の阻害に重要かどうかを調べた。上記で記載されているのと同じ実験条件下で、我々は、ｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤの代わりに、ｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤのＤＮＡ結合に重要なアミノ酸が変異しているｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤ（ＲＲ‐ＡＧ）で、ナイーブＴ細胞を処理した。ｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤ（ＲＲ‐ＡＧ）は、ＲＯＲγｔにより誘導を受けるＩＬ‐１７遺伝子プロモーターに結合することはできなかったが、一方、ナイーブＴ細胞のＴｈ１７細胞への分化は部分的に阻害された。この結果から、ｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤは、ＲＯＲγｔにより誘導を受ける遺伝子のプロモーターへ内在性ＲＯＲγｔが結合するのを妨げることができただけでなく、ＲＯＲγｔにより誘導を受ける遺伝子のプロモーターにおいてＲＯＲγｔにより動員されるインタラクトームの機能の阻害もし、それによりナイーブＴ細胞のＴｈ１７細胞への分化を阻害していた（図８参照）。
【００３５】
ナイーブＴ細胞のＴｈ１７細胞への分化におけるＲＯＲγｔカルボキシル末端のリガンド結合ドメインの調節機能を確認するために、我々は、ｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤの代わりに１００ｎＭのｔＲＯＲγｔ‐ＬＢＤでナイーブＴ細胞を処理すること以外は上記＜３‐２＞で記載されているのと同じプロトコルを用いて実験を行なった。結果として、ｔＲＯＲγｔ‐ＬＢＤは、ナイーブＴ細胞のＴｈ１、Ｔｈ２またはＴｈ１７細胞への分化に影響を与えない。この結果から、我々は、ＰＴＤを有しないＲＯＲγｔ‐ＴＭＤは細胞中へ送達されないため、ｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤだけが、ナイーブＴ細胞のＴｈ１７細胞への分化を特異的に阻害することができる、ということを確認した。
【００３６】
＜ナイーブＴ細胞のＴｈ１細胞への分化の阻害＞
【００３７】
ｔＴｂｅｔ‐ＴＭＤがナイーブＴ細胞のＴｈ１細胞への分化を阻害することができるかどうかを調べるために、我々は、脾臓を準備し、ＭＡＣＳ（磁気細胞選別）を用いて７週齢のメスのＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓からナイーブＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ  Ｔ細胞を単離し、これらの細胞を４ｕＭのｔＴｂｅｔ‐ＴＭＤで２時間処理した。これらの細胞を洗浄し、形質導入されなかったｔＴｂｅｔ‐ＴＭＤタンパク質を排除した後に、それら細胞を、７２時間、抗ＣＤ３ｍＡｂ（１ｕｇ）および抗ＣＤ２８ｍＡｂ（１ｕｇ）でのＴｃＲ刺激後に、ＩＬ‐１２（１０ｎｇ／ｍｌ）および抗ＩＬ‐４（５ｕｇ／ｍｌ）の存在下で培養し、その細胞を、採取し、ＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびイオノマイシン（１ｕｇ／ｍｌ）で４時間、再刺激した。それら細胞を、透過処理し、ＦＩＴＣで標識された抗ＩＦＮ‐ｇ  ｍＡｂと共にインキュベートし、次いで、細胞内ＩＦＮ‐ｇのレベルをＦＡＣＳにより分析した。この結果からは、ｔＴｂｅｔ‐ＴＭＤで処理したナイーブＴ細胞はＴｈ１細胞へと分化することができなかったが、これは、ｔＴｂｅｔ‐ＴＭＤが内在性Ｔｂｅｔの機能を抑制する、とのことを示唆しており、これは、ナイーブＴ細胞のＴｈ１細胞への分化およびＴｈ１細胞の機能の阻害に繋がる。したがって、ｔＴｂｅｔ‐ＴＭＤは、Ｔｈ１細胞が主要な役割を果たす慢性的な炎症反応および自己免疫疾患を軽減するための新規治療薬となり得る。
【００３８】
＜天然の制御性Ｔ細胞の機能阻害＞
【００３９】
我々は、次に、ｔＦｏｘｐ３‐ＴＭＤが、ｎＴｒｅｇ細胞において、内在性Ｆｏｘｐ３の競合的阻害を介してｎＴｒｅｇ細胞の免疫学的機能を抑制することができるかどうかを調べた。我々は、脾臓を準備し、ＭＡＣＳ（磁気細胞選別）を用いて７週齢のメスのＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓からｎＴｒｅｇ細胞を単離し、同種ＭＨＣを発現するＢＭＤＣ（骨髄樹状細胞）を用いてｎＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激し、次いで、これらの細胞をｔＦｏｘｐ３‐ＴＭＤで処理した。ｔＦｏｘｐ３‐ＴＭＤで処理したｎＴｒｅｇ細胞を、エフェクターＴ細胞として調製されたＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞と共に７２時間共培養し、エフェクターＴ細胞に対するｎＴｒｅｇ細胞の免疫抑制能を、エフェクターＴ細胞中へのチミジン取り込み法によって分析した。これらの結果が示したのは、ｔＦｏｘｐ３‐Ｆ‐ＴＭＤ以外のすべてのｔＦｏｘｐ３‐ＴＭＤで処理したｎＴｒｅｇ細胞は、エフェクターＴ細胞の増殖に対し、同様のレベルの免疫抑制活性を示したということ、および、特に、ｎＴｒｅｇ細胞対エフェクターＴ細胞が１：４の比の、ｔＦｏｘｐ３‐Ｆ‐ＴＭＤで処理したｎＴｒｅｇ細胞は、エフェクターＴ細胞の増殖に対し、最も顕著な免疫抑制を示したということであった。これらの結果は、ＤＮＡ配列の認識に関与するｔＦｏｘｐ３‐Ｆ‐ＴＭＤ中のアミノ酸残基は内在性Ｆｏｘｐ３の機能を阻害すること、及び／又は、ｔＦｏｘｐ３‐Ｆ‐ＴＭＤは、内在性Ｆｏｘｐ３により誘導を受ける遺伝子のプロモーター領域にアクセスする転写コアクチベーターの機能を阻害し得、それにより、ｎＴｒｅｇ細胞の機能を抑制すること、を示唆する（図９）。
【００４０】
＜誘導性の制御性Ｔ細胞（ｉＴｒｅｇ）の機能阻害＞
【００４１】
我々は、次に、異なる機能的ＴＭＤを含むｔＦｏｘｐ３‐ＴＭＤが、ｉＴｒｅｇ細胞において、内在性Ｆｏｘｐ３の競合的阻害を介してｉＴｒｅｇ細胞の免疫学的機能を抑制することができるかどうかを調べた。我々は、ＭＡＣＳを用いてＦｏｘＰ３‐ＧＲＰ‐ノックイン（ＫＩ）マウスの脾細胞からＣＤ４＋Ｔ細胞を調製し、ＦＡＣＳを用いてＣＤ４＋ＧＦＰ‐ＣＤ６２Ｌ２＋細胞をさらに精製した。これらの細胞を、ｔＦｏｘｐ３‐ＴＭＤで処理し、７２時間、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ｍＡｂによるＴｃＲ刺激後にそれらをＴＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ‐２（１００Ｕ／ｍｌ）の存在下で培養することによりｉＴｒｅｇ細胞へと分化するよう誘導した。次いで、ｔＦｏｘｐ３‐ＴＭＤで処理したｉＴｒｅｇ細胞の、エフェクターＴ細胞の増殖および機能に対する免疫抑制活性を、エフェクターＴ細胞中へのチミジン取り込み法によって分析した。Ｆｏｘｐ３発現のレベルは、ｔＦｏｘｐ３‐Ｆ‐ＴＭＤで処理したナイーブＴ細胞から分化したｉＴｒｅｇ細胞と、ｔＦｏｘｐ３‐Ｆ‐ＴＭＤ処理なしでナイーブＴ細胞から分化したものとの間で同等であった。これらの結果が示したのは、ｔＦｏｘｐ３‐Ｆ‐ＴＭＤおよびｔＦｏｘｐ３‐Ｒ‐ＴＭＤ以外のすべてのｔＦｏｘｐ３‐ＴＭＤで処理したｉＴｒｅｇ細胞は、エフェクターＴ細胞の増殖に対し、同等のレベルの免疫抑制活性を示したが、ｎＴｒｅｇ細胞対エフェクターＴ細胞が１：４の比の、ｔＦｏｘｐ３‐Ｆ‐ＴＭＤまたはｔＦｏｘｐ３‐Ｒ‐ＴＭＤで処理したｉＴｒｅｇ細胞は、エフェクターＴ細胞の増殖に対し、最も顕著な免疫抑制を示した、ということであった。これらの結果は、ＤＮＡ配列の認識に関与するｔＦｏｘｐ３‐Ｆ‐ＴＭＤ中のアミノ酸残基が内在性Ｆｏｘｐ３の機能を阻害すること、および／または、ｔＦｏｘｐ３‐Ｆ‐ＴＭＤは、内在性Ｆｏｘｐ３により誘導を受ける遺伝子のプロモーター領域にアクセスする転写コアクチベーターの機能を阻害し得、それにより、ｉＴｒｅｇ細胞の機能を抑制していること、を示唆する。また、Ｆ（フォークヘッド結合）ドメインの代わりにＲ（リプレッサー）ドメインを含むｔＦｏｘｐ３‐Ｒ‐ＴＭＤを用いたｉＴｒｅｇ細胞の処理により、エフェクターＴ細胞に対するｉＴｒｅｇ細胞の免疫抑制能を阻害することができる、という結果は、ｉＴｒｅｇ細胞において、ｔＦｏｘｐ３‐Ｒ‐ＴＭＤは、ＤＮＡ結合とは無関係に、内在性Ｆｏｘｐ３の転写活性および機能を効果的に阻害している、ということを示している。
【００４２】
しかしながら、他のｔＦｏｘｐ３‐ＴＭＤで処理したｉＴｒｅｇ細胞は、エフェクターＴ細胞に対するｉＴｒｅｇ細胞の免疫抑制機能を低下させることはできなかった。したがって、ＤＮＡ配列の認識に関与するｔＦｏｘｐ３‐Ｆ‐ＴＭＤ中のアミノ酸残基は内在性Ｆｏｘｐ３の機能を阻害しており、ならびに／または、ｔＦｏｘｐ３‐Ｆ‐ＴＭＤは、内在性Ｆｏｘｐ３により誘導を受ける遺伝子のプロモーター領域にアクセスする転写コアクチベーターの機能を阻害し得、それにより、ｎＴｒｅｇ細胞およびｉＴｒｅｇ細胞の機能を抑制している（図１０）。
【００４３】
実施例４：ＥＡＥ動物モデルにおけるｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤ融合タンパク質の治療上の効力
【００４４】
＜４‐１．ＥＡＥ動物モデルにおけるｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤの治療上の効力の分析＞
【００４５】
Ｔｈ１７細胞が重要な役割を果たすＥＡＥ（ヒトＭＳの動物モデル）におけるｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤの治療上の効力を分析するために、６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを用いてＥＡＥ動物モデルを作製した。マウスには、２週間の安定化期間を与え、５００ｎｇの百日咳毒素をマウスの腹腔中へ注射し、その後、１５０ｎｇのＭＯＧペプチドおよび２００μｇのＣＦＡを皮下脂肪中へ注射した。行動反応は概して注射後９日目から始まった。最初は尾の麻痺であり、その後、後肢の麻痺、重症病期には前肢麻痺が現れた。疾患の進行の評価のために各症状をスコア化した（１ポイント：尾の軽微な麻痺、２ポイント：尾の完全な麻痺および後肢の軽微な麻痺、３ポイント：一方の後肢の完全な麻痺、４ポイント：両方の後肢の完全な麻痺、５ポイント：両方の後肢の完全な麻痺および前肢の軽微な麻痺、６ポイント：死亡）。５０μｇのｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤを、疾患誘導の２日目から一週間に３回腹膜腔中へ注射した。その結果が示すのは、ｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤで処理したマウスでは疾患発症頻度は５０％低下し、疾患重症度は改善して最小となった、ということである。未処理マウスの疾患発症頻度は１００％であり、疾患重症度は３．０５±０．２３であったが、ｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤで処理したマウスの疾患重症度は０．５５±０．２７であった。これらの結果が示しているのは、ｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤは、Ｔｈ１７細胞が重要な役割を果たすＥＡＥ（ＭＳの動物モデル）に対し、顕著な疾患予防効果を有している、ということである。
【００４６】
ＥＡＥのＴｈ１７細胞媒介性誘導および維持に対するｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤの治療上の効力を調べるために、５０μｇのｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤを、臨床スコア３である一方の後肢の完全な麻痺へと病徴が進行したＥＡＥを患うマウスの腹膜腔中へ一週間に３回注射し始めた。ｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤ注射後すぐにＥＡＥ臨床スコアが有意に低下し、ＥＡＥ症状は２２日目にはほぼ完全に消失した。したがって、ｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤは、主にＴｈ１７細胞によって誘導されるＥＡＥ自己免疫に対し、予防および治療効果を有している（図１１）。
【００４７】
＜４‐２．治療上の有効性に関する、ＥＡＥに対するｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤの作用の細胞機構＞
【００４８】
ｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤによって治療上の効力を示すＥＡＥを患うマウスの脾臓から単離したＣＤ４＋Ｔ細胞を調製し、ＥＡＥを誘導するのに用いた抗原性ペプチドＭＯＧで再刺激した。マウス中のＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＭＯＧペプチドの認識時に特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットへと分化していたため、分化ＣＤ４＋Ｔ細胞は、同抗原性ペプチドで再刺激されたときにはＴ細胞サブセットに特異的なサイトカインを分泌することができる。ＥＡＥ誘導後１０日目に、脾細胞を、ＥＡＥ誘導後２日目からｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤで処理したマウスから調製し、４０μｇ／ｍｌのＭＯＧペプチドで４８時間再刺激した。脾細胞の培養上清中のサイトカインのレベルをＥＬＩＳＡによって分析した際、Ｔｈ１７細胞からのＩＬ‐１７Ａサイトカイン分泌もＴｈ１細胞からのＩＦＮ‐ｇも有意に低下した（図１２）。脾細胞をＧｏｌｇｉ  ＰＬＵＧで処理してサイトカイン分泌を妨げ、かつ、細胞内サイトカインのレベルを細胞内染色および各サイトカインに特異的な蛍光標識ｍＡｂを用いるＦＡＣＳによって分析する実験からも同様の結果が得られた（図１３）。したがって、ＥＡＥに対するｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤの予防および治療効果は、内在性ＲＯＲγｔの特異的機能阻害ならびにＴｈ１７細胞の分化および機能の抑制に起因するものであり、これによりＴｈ１７細胞からの例えばＩＬ‐１７などのサイトカイン分泌の阻害がもたらされる。Ｔｈ１７細胞分化およびＲＯＲγｔを介する機能の阻害によって例えばＩＦＮ‐ｇなどのＴｈ１サイトカイン分泌の阻害がもたらされ得る、という事実は、Ｔｈ１７細胞はＥＡＥの初期の間に活性化されて主要な機能を果たし、その後に、より後になってＴｈ１細胞の活性化および機能が続いている可能性がある、ということを示唆するものである。
【００４９】
＜４‐３．ｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤによるＥＡＥに対する治療上の有効性の組織学的分析＞
【００５０】
ＥＡＥに対するｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤの治療上の有効性の組織学的分析を行なうために、未処理マウスにおいてＥＡＥ臨床スコアが最も高かった２１日目にマウスの脊髄を採取し、脱髄のレベルを調査した。ルクソール・ファスト・ブルーを用いて有髄組織領域を染色したため、ＥＡＥの後期における重篤な脱髄のある組織は染色され得ない。ｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤで処理したＥＡＥ誘導マウスの脊髄の髄鞘形成状態は、正常マウスのものに類似していた。炎症性細胞浸潤の程度をＨ＆ＥおよびＰＡＳ染色によって調査した際、ＥＡＥ誘導マウスにおいては炎症性細胞の脊髄への深刻な浸潤が観察されたが、ＥＡＥ誘導マウスへのｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤ処理は脊髄への目立ったレベルの炎症性細胞浸潤はなんら示さなかった。これらすべての結果をまとめると、ｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤは、ナイーブＴ細胞のＴｈ１７細胞への分化ならびに例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでのＩＬ‐１７の分泌などのＴｈ１７細胞の機能の抑制に繋がる、内在性ＲＯＲγｔの機能の阻害によって、ＥＡＥに対し、治療上の効力を発揮する（図１４、１５および１６）。
【００５１】
実施例５：アレルギー性喘息に対するｔＧＴ３‐ＴＭＤの治療効果
【００５２】
＜５‐１．アレルギー性喘息に対するｔＧＴ３‐ＴＭＤの治療上の効力の細胞分析＞
【００５３】
Ｔｈ２細胞により誘導されるアレルギー性喘息に対するｔＧＴ３‐ＴＭＤのｉｎ  ｖｉｖｏでの治療上の効力を調べるために、アレルギー性喘息の動物モデルを、６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの腹膜腔中への１日目および１４日目の１００μｇのＯＶＡおよび２０ｍｇの水酸化アルミニウムの注射によって作製した。そして、２１日目、２２日目および２３日目に７５μｇのｔＧＴ３‐ＴＭＤを鼻腔内経路中へと噴霧してｔＧＴ３‐ＴＭＤを肺および気管支空間中へと送達し、抗原投与のために１５０μｇのＯＶＡを用いた。注射後２５日目に、ＢＡＬ液から細胞を採取し、種々の炎症性細胞および免疫細胞の数をカウントした。ｔＧＴ３‐ＴＭＤ処理は、種々の炎症性細胞および免疫細胞の数を有意に低下させた（図１７）。また、ｔＧＴ３‐ＴＭＤ処理により治療効果を示したアレルギー性喘息の動物モデルから脾臓Ｔ細胞を調製し、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で再刺激した。これらの脾臓Ｔ細胞はｉｎ  ｖｉｖｏでＯＶＡ抗原にさらされたため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗原再投与時にＴｈ２細胞特異的サイトカインを分泌することができる。培養上清中のＴｈ２特異的サイトカインのレベルをＥＬＩＳＡによって調査した際、ｔＧＴ３‐ＴＭＤで処理したマウスでは、ＩＬ‐２、ＩＬ‐５およびＩＬ‐１３の分泌は有意に低下した（図１８）。
【００５４】
＜５‐２．アレルギー性喘息に対するｔＧＴ３‐ＴＭＤの治療上の有効性の組織学的分析＞
【００５５】
免疫組織化学的方法による肺および気管支の炎症の重症度に対するｔＧＴ３‐ＴＭＤの治療上の効力の組織学的分析を行なうために、ＯＶＡ誘導アレルギー性喘息の動物モデルをｔＧＴ３‐ＴＭＤで処理し、肺および気管支組織を、ＰＢＳでの洗浄およびＲＢＣの排除後に２４時間ホルムアルデヒド溶液中で保持し、パラフィン組織切片を調製した。これらのパラフィン組織切片をＨ＆ＥおよびＰＡＳで染色した際、ｔＧＴ３‐ＴＭＤで処理したマウスの肺および気管支組織の組織学的状態は、深刻な組織破壊が観察された未処理マウス由来のものと比較すると、正常に近かった。また、炎症性細胞浸潤の程度は、有意に低下した。これらの結果に基づいて示唆されるのは、ｔＧＴ３‐ＴＭＤは、内在性ＧＡＴＡ‐３の機能を阻害し、Ｔｈ２細胞の免疫学的機能を抑制しており、それにより、アレルギー性喘息に対する治療上の有効性がもたらされる、ということである（図１９）。
【００５６】
実施例６：ｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤまたはｔＧＴ３‐ＴＭＤの急性毒性の分析
【００５７】
韓国実験流通センターから供給された６週齢の特定病原体除去（ＳＰＦ）ＳＤラットを用いて急性毒性試験を行なった。
【００５８】
各実験群につき２匹のラットを１ｇ／ｋｇのｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤまたはｔＧＴ３‐ＴＭＤで一回処理した後に、死亡率、臨床症状および体重変化をモニタリングし、血液学的かつ血液生化学的な試験を行ない、各器官および肺の異常性に関する目視検査を剖検時に行なった。
【００５９】
ｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤまたはｔＧＴ３‐ＴＭＤで処理したラットでは臨床的異常性および死亡は観察されず、体重変化、血液および血液学的生化学試験における細胞毒性、ならびに、剖検による異常性は検出されなかった。したがって、ｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤ処理は、１ｇ／ｋｇの注射では、いかなる毒性ももたらさなかったため、ｔＲＯＲγｔ‐ＴＭＤは、ＬＤ５０が１ｇ／ｋｇより大きい、安全な試薬であるはずである。
【００６０】
本発明にかかる融合タンパク質を含む各組成物は、例えば粉剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁剤、シロップ剤、エアロゾル剤等の従来の経口製剤、外用剤、坐剤または滅菌注射剤と共に用いられてもよい。具体的には、例えば従来の充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤等の希釈剤または賦形剤が、これら製剤の調製において用いられてもよい。経口投与用の固体製剤としては、例えば、錠剤、ペレット剤、粉剤、顆粒剤、カプセル剤等が挙げられ、これらは、例えばデンプン、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトース、ゼラチン等の、少なくとも１種類以上の賦形剤の、前記タンパク質への添加を伴って調製されてもよい。加えて、従来の賦形剤以外に、例えばステアリン酸マグネシウムまたはタルクなどの滑沢剤が用いられてもよい。経口投与用の液体製剤としては、例えば、懸濁剤、経口液剤、乳剤、シロップ剤等が挙げられ、これらは、例えば水および流動パラフィンなどの従来の希釈剤以外の例えば湿潤剤、甘味剤、香味剤、防腐剤等などのいくつかの賦形剤の添加を伴って調製されてもよい。好例の非経口製剤としては、滅菌水溶液、非水溶媒、懸濁剤、エマルジョン乳剤、凍結乾燥製剤および坐剤が挙げられる。好例の非水溶媒および懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、例えばオリーブ油などの植物油、および、例えばオレイン酸エチルなどの注射可能なエステルが挙げられる。坐剤の基剤として、ウィテップゾール、マクロゴール、ツイーン６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチン等が用いられてもよい。
【００６１】
加えて、本発明のタンパク質の用量は、患者の年齢、性別および体重に応じて様々であってもよい。一般的には、０．００１〜５００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１〜１００ｍｇ／ｋｇの量を、一日に一回または数回投与してもよい。加えて、当該タンパク質の用量は、投与の経路、疾患の重症度、性別、体重、年齢等に応じて増加または減少させてもよい。したがって、当該用量は、いかなる態様においても、本発明の範囲を限定するよう意図されたものではない。
【００６２】
具体的な実施例を参照して本発明を説明してきた。当業者は、本発明を、本発明の本質的特性から逸脱しない範囲内の修正された形として実現することができる、とのことを理解するであろう。したがって、開示されている実施例は、それらの制限的態様ではなくそれらの説明的態様において考えられなければならない。本発明の範囲は、前述の説明においてではなく、添付の特許請求の範囲において示されており、それと同等の範囲内の違いは、すべて、本発明に含まれているものと解釈されるべきである。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明における融合タンパク質は、転写因子の機能不全または欠損に関係する種々の疾患を治療することができる。
［配列表の名目］
【００６４】
配列番号１はタンパク質形質導入ドメインを表すものであり、配列番号２〜６は、転写因子のＴＭＤを表すものであり、配列番号７〜１１は、融合タンパク質を表すものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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