(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
αｖβ３インテグリンに結合し、αＩＩｂβ３及び／又はα５β１インテグリンに対する結合性が、配列番号１のアミノ酸配列からなる野生型ロドストミンよりも低いポリペプチドであって、前記ポリペプチドは配列番号５７のアミノ酸配列を含むことを特徴とするポリペプチド、或いは薬学的に許容されるその塩。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、配列番号４４のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドにコードされている、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列からなる野生型ロドストミンよりも低減した血液凝固時間の延長活性を示す、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチドをＰＥＧ化した、ＰＥＧ化ポリペプチド。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチドをアルブミン複合化した、アルブミン複合化ポリペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のポリペプチドまたは薬学的に許容されるその塩と、薬学的に許容される担体とを含む、αｖβ３インテグリン関連疾患を治療又は予防するための医薬組成物。
【請求項７】
αｖβ３インテグリン関連疾患を治療および／または防止するための医薬の製造における、αｖβ３インテグリンに結合し、αＩＩｂβ３及び／又はα５β１インテグリンに対する結合性が、配列番号１のアミノ酸配列からなる野生型ロドストミンよりも低いポリペプチドまたは薬学的に許容されるその塩の使用であって、前記ポリペプチドは配列番号５７のアミノ酸配列を含む、前記使用。
【請求項８】
前記ポリペプチドが配列番号４４のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドにコードされている、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
αｖβ３インテグリン関連疾患を治療および／または防止するための医薬の製造における使用であって、αｖβ３インテグリンに結合し、αＩＩｂβ３及び／又はα５β１インテグリンに対する結合性が、配列番号１のアミノ酸配列からなる野生型ロドストミンよりも低く、配列番号５７のアミノ酸配列を含むポリペプチドをアルブミン複合化又はＰＥＧ化されたポリペプチドの、前記使用。
【請求項１０】
請求項１に記載のポリペプチドを製造する方法であって、
（ａ）宿主細胞を、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによりトランスフェクトする段階；
（ｂ）前記宿主細胞を培地中で増殖させる段階；および
（ｃ）前記ポリペプチドを単離する段階、
を含む、前記方法。
【請求項１１】
段階（ｂ）が、メタノールを前記培地に添加する段階をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記宿主細胞を、アミノ酸を含まない培地で増殖させる工程をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
段階（ｃ）が、カラムクロマトグラフィーを実施して前記ポリペプチドを得る段階をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
αｖβ３インテグリンに結合し、αＩＩｂβ３及び／又はα５β１インテグリンに対する結合性が、配列番号１のアミノ酸配列からなる野生型ロドストミンよりも低いポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記ポリペプチドは配列番号５７のアミノ酸配列を含む、前記ポリヌクレオチド。
【請求項１５】
前記ポリヌクレオチドが配列番号４４のヌクレオチド配列を含む、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項４又は５に記載のポリペプチドをコードする、請求項１４又は１５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】
αｖβ３インテグリンに結合し、αＩＩｂβ３及び／又はα５β１インテグリンに対する結合性が、配列番号１のアミノ酸配列からなる野生型ロドストミンよりも低いポリペプチドであって、前記ポリペプチドは配列番号５７のアミノ酸配列を含み、前記ポリペプチドはアルブミン複合化されており、および前記ポリペプチドはリンカーアミノ酸配列を含むことを特徴とする前記ポリペプチド、或いは薬学的に許容されるその塩。
【請求項１８】
請求項１７に記載のポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体とを含む、αｖβ３インテグリン関連疾患を治療又は予防するための医薬組成物。
【請求項１９】
αｖβ３インテグリン関連疾患を治療および／または防止するための医薬の製造における、請求項１〜５のいずれかに記載のポリペプチド或いは薬学的に許容されるその塩の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許出願の相互参照
本願は、３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に準じて、２００６年１２月２６日に出願された米国仮特許出願第６０／８７１，８５４号の利益を主張するものであり、参照によりその全体を本明細書に組み入れる。
【０００２】
本発明は、全般にディスインテグリン変種に関し、より詳細にはαｖβ３インテグリン関連疾患の治療及び防止用の選択的αｖβ３インテグリン拮抗物質としてのディスインテグリン変種に関する。
【背景技術】
【０００３】
骨は、「骨リモデリング」と称する再生と修復の過程を連続的に受ける幾つかの細胞タイプで構成された複合組織である。骨リモデリングを担う２つの主要な細胞タイプは、骨を吸収する破骨細胞と、新しい骨を形成する骨芽細胞である。骨リモデリングは、幾つかの全身ホルモン（例えば、副甲状腺ホルモン、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、性ホルモン及びカルシトニン）及び局所因子（例えば、一酸化窒素、プロスタグランジン、成長因子及びサイトカイン）によって調節されていることが知られている［１］。
【０００４】
インテグリンは、細胞を基質に固定し、外部から誘導されるシグナルを原形質膜を横切って伝達する、ヘテロ２量体マトリックス受容体である［５］。インテグリンαｖβ３は、生体内［６］とインビトロ［７、８］の両方で、破骨細胞によって媒介される骨吸収に関与する。このヘテロ２量体分子は、オステオポンチン、骨シアロタンパク質などの骨基質タンパク質に含まれるアミノ酸モチーフＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ、配列番号２）を認識する［７、８］。インテグリンαｖβ３は、破骨細胞中で発現され［９］、その発現は吸収性ステロイド及びサイトカインによって調節される［１０］。ブロッキング実験に基づいて、αｖβ３インテグリンは、主要な機能的接着受容体として破骨細胞上で同定された。インテグリンαｖβ３阻害剤は、破骨細胞の骨結合能力及び骨吸収能力を低下させる［７、１１］。インテグリンαｖβ３は、破骨細胞の機能において主要な役割を果たし［７、１１、１２］、このインテグリンの阻害剤は、骨粗しょう症［１１］、溶骨性転移［１３］及び悪性腫よう誘発性高カルシウム血症を防止すると考えられている。
【０００５】
破骨細胞によって媒介される骨溶解に関連した多数の骨疾患が存在する。骨粗しょう症は、骨の吸収と形成が調和せず、骨の分解が骨の構築を上回るときに誘発される最も一般的な骨疾患である。骨粗しょう症は、ホルモンの不均衡、疾患、投薬（例えば、コルチコステロイド又は抗てんかん薬）などの別の条件によっても誘発される［２］。骨は、ヒト乳癌、前立腺癌、肺癌及び甲状腺癌並びに他の癌による最も一般的な転移部位の１つである［３、４］。骨粗しょう症は、閉経後のエストロゲン欠乏症からも生じ得る。続発性骨粗しょう症は、リウマチ様関節炎に付随し得る。骨転移は、他の器官の転移には見られない破骨細胞性骨吸収の極めて独特な段階を示す。癌に付随する骨溶解は破骨細胞によって本質的に媒介され、破骨細胞は、活性化されていると考えられ、また、骨芽細胞によって間接的に又は腫よう生成物によって直接的に、活性化され得ることが広く受け入れられている［４］。また、高カルシウム血症（高血中カルシウム濃度）は、溶骨性骨疾患の重大な合併症である。高カルシウム血症は、大規模な骨破壊を有する患者で比較的頻繁に起き、特に乳癌、肺癌、腎臓癌、卵巣癌及びすい癌並びに骨髄腫に一般的である［４］。
【０００６】
ディスインテグリンは、血小板上、並びに血管内皮細胞及び幾つかの腫よう細胞を含めた他の細胞上で発現されるインテグリンαＩＩｂβ３、α５β１及びαｖβ３に特異的に結合する低分子量ＲＧＤ含有ペプチドの１ファミリーである［１４、１５］。その強力な抗血小板活性に加えて、ディスインテグリンの研究によって、循環器疾患の診断における新しい用途、並びに動脈血栓症、骨粗しょう症及び血管新生に関連した腫ようの増殖と転移における治療薬の設計が明らかになった［１５］。マレーマムシ（Ｃａｌｌｏｓｅｌａｓｍａ  ｒｈｏｄｏｓｔｏｍａ）の毒液に由来するディスインテグリンであるロドストミン（Ｒｈｏｄｏｓｔｏｍｉｎ）（Ｒｈｏ）は、血小板糖タンパク質αＩＩｂβ３を遮断することによって、生体内及びインビトロでの血小板凝集を阻害することが見いだされた［１６、１７］。また、ロドストミンは、腫よう細胞の生存度に影響を及ぼさずに、非ミネラル化とミネラル化の両方の骨細胞外基質に対する乳癌細胞及び前立腺癌細胞の接着を用量依存的に阻害することが報告された。また、ロドストミンは、乳癌細胞及び前立腺癌細胞の遊走及び浸潤を阻害する［１８］。ロドストミンは、脂肪生成及び肥満を抑制することも判明した［１９］。しかし、ロドストミンは、インテグリンαＩＩｂβ３、α５β１及びαｖβ３に非特異的に結合するので、ロドストミンの薬学的使用は重大な副作用を引き起こす。例えば、ロドストミンを癌治療に適用するとき、血小板凝集阻害は、望ましくない副作用である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】ｖａｎ’ｔ  Ｈｏｆ  ＲＪ，  Ｒａｌｓｔｏｎ  ＳＨ．  （２００１  ）  Ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ａｎｄ  ｂｏｎｅ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０３：２５５−６１
【非特許文献２】Ｍｉｙａｕｃｈｉ  ＡＪ，  Ａｌｖａｒｅｚ  ＥＭ，  Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ  Ａ，  Ｔｅｔｉ  Ｍ１  Ｇｒａｎｏ  Ｓ，  Ｃｏｌｕｃｃｉ  Ａ，  Ｚａｍｂｏｎｉｎ−Ｚａｌｌｏｎｅ  ＦＰ，  Ｒｏｓｓ  ＳＬ，  Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍ，  Ｃｈｅｒｅｓｈ  Ｄ．  （１９９１  ）  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｂｙ  ａｎ  αｖβ３  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｉｎ  ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６６：２０３６９−２０３７４
【非特許文献３】Ｃｒｉｐｐｅｓ  ＢＡ，  Ｅｎｇｌｅｍａｎ  ＶＷ，  Ｓｅｔｔｌｅ  ＳＬ，  Ｄｅｌａｒｃｏ  Ｊ，  Ｏｒｎｂｅｒｇ  ＲＬ，  Ｈｅｌｆｒｉｃｈ  ＭＨ，  Ｈｏｒｔｏｎ  ＭＡ，  Ｎｉｃｋｏｌｓ  ＧＡ．  （１９９６）  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  β３  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ−  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｏｎｅ  ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｈｙｒｏｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄｅｃｔｏｍｉｚｅｄ  ｒａｔ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３７：９１８−９２４
【非特許文献４】Ｈｏｒｔｏｎ  ＭＡ，  Ｔａｙｌｏｒ  ＭＬ，  Ａｒｎｅｔｔ  ＴＲ，  Ｈｅｌｆｒｉｃｈ  ＭＨ．  （１９９１  ）  Ａｒｇ−ｇｌｙ−ａｓｐ  （ＲＧＤ）  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ａｎｔｉ−ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ２３Ｃ６  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｄｅｎｔｉｎｅ  ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｓｐｒｅａｄｉｎｇ  ｂｙ  ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｓ．  Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  １９５：３６８−３７５
【非特許文献５】Ｒｏｓｓ  ＦＰ，  Ａｌｖａｒｅｚ  Ｊｌ，  Ｃｈａｐｐｅｌ  Ｊ，  Ｓａｎｄｅｒ  Ｄ，  Ｂｕｔｌｅｒ  ＷＴ，  Ｆａｒａｃｈ−Ｃａｒｓｏｎ  ＭＣ，  Ｍｉｎｔｚ  ＫＡ，  Ｒｏｂｅｙ  ＰＧ，  Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍ  ＳＬ，  Ｃｈｅｒｅｓｈ  ＤＡ．  （１９９３）  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  ｂｏｎｅ  ｍａｔｒｉｘ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ  ａｎｄ  ｂｏｎｅ  ｓｉａｌｏｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  αｖβ３  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅ  ｂｏｎｅ  ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６８：９９０１−  ９９０７
【非特許文献６】ｌｎｏｕｅ  Ｍ，  Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍ  ＳＬ，  Ｈｕｒｌｅｒ  Ｌ，  Ｈｒｕｓｋａ  Ｋ，  Ｓｅｆｔｏｒ  Ｅ，  Ｈｅｎｄｒｉｘ  Ｍ，  Ｒｏｓｓ  ＦＰ．  （１９９５）  ＧＭ−ＣＳＦ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ  αｖβ３  ａｎｄ  αｖβ５  ｉｎ  ａ  ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ｍａｎｎｅｒ  ｄｕｒｉｎｇ  ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ．  Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ  １０：Ｓ１６３ａ．  （Ａｂｓｔｒ．）
【非特許文献７】Ｍｉｍｕｒａ  Ｈ，  Ｃａｏ  Ｘ，  Ｒｏｓｓ  ＦＰ，  Ｃｈｉｂａ  Ｍ１  Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍ  ＳＬ．  （１９９４）  １  ，２５（ＯＨ）２Ｄ３  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ３  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｔｈｅ  β３−ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ａｖｉａｎ  ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３４：１０６１−１０６６
【非特許文献８】Ｅｎｇｌｅｍａｎ  ＶＷ，  Ｎｉｃｋｏｌｓ  ＧＡ，  Ｒｏｓｓ  ＦＰ，  Ｈｏｒｔｏｎ  ＭＡ，  Ｇｒｉｇｇｓ  ＤＷ，  Ｓｅｔｔｌｅ  ＳＬ，  Ｒｕｍｉｎｓｋｉ  ＰＧ，  Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍ  ＳＬ．  （１９９７）  Ａ  ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｌｐｈａ（ｖ）ｂｅｔａ３  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｂｏｎｅ  ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９９：２２８４−２２９２
【非特許文献９】Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｉ１  Ｔａｎａｋａ  Ｈ，  Ｒｏｄａｎ  ＧＡ，  Ｄｕｏｎｇ  ＬＴ．  （１９９８）  Ｅｃｈｉｓｔａｔｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｔｈｅ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｐｒｅｆｕｓｉｏｎ  ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｎｕｃｌｅａｔｅｄ  ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ−ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌｓ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３９：５１８２−５１９３．
【非特許文献１０】Ｍｕｎｄｙ  Ｇ．  Ｒ．  （１９９１  ）  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｂｏｎｅ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ．  ＢｏｎｅＳｕｐｐｌ：Ｓ１−６
【非特許文献１１】Ｇｏｌｔｚｍａｎ  Ｄ．  （２００２）  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｉｅｓ，  ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  １  ：７８４−９６
【非特許文献１２】Ｙｏｎｅｄａ  Ｔ１  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＰＪ，  Ｈｉｒａｇａ  Ｔ，  Ｎｉｅｗｏｌｎａ  Ｍ，  Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ＲＡ．  （２００１  ）  Ｂｏｎｅ−  ｓｅｅｋｉｎｇ  ｃｌｏｎｅ  ｅｘｈｉｂｉｔｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ｐａｒｅｎｔａｌ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ａ  ｂｒａｉｎ−ｓｅｅｋｉｎｇ  ｃｌｏｎｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．  Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ  １６：１４８６−９５
【非特許文献１３】Ｍｕｎｄｙ  Ｇ．  Ｒ．  （２００２）  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｔｏ  ｂｏｎｅ：  ｃａｕｓｅｓ，  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ２：５８４−９３
【非特許文献１４】Ｇｏｕｌｄ  ＲＪ，  Ｐｏｌｏｋｏｆｆ  ＭＡ，  Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ＰＡ，  Ｈｕａｎｇ  ＴＦ，  Ｈｏｌｔ  ＪＣ，  Ｃｏｏｋ  ＪＪ，  Ｎｉｅｗｉａｒｏｗｓｋｉ  Ｓ．  （１９９０）  Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎｓ：  ａ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｖｉｐｅｒ  ｖｅｎｏｍｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｓｏｃ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ  １９５：１６８−１７１
【非特許文献１５】Ｈｕａｎｇ  ＴＦ．  （１９９８）  Ｗｈａｔ  ｈａｖｅ  ｓｎａｋｅｓ  ｔａｕｇｈｔ  ｕｓ  ａｂｏｕｔ  ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ  ？  Ｃｅｌｌ  ＭｏＩ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ５４：  ５２７−５４０
【非特許文献１６】Ｈｕａｎｇ  ＴＦ，  Ｏｕｙａｎｇ  Ｃ，  Ｔｅｎｇ  ＣＭ．  （１９９０）  Ｒｈｏｄｏｓｔｏｍｉｎ，  ａ  ｓｎａｋｅ  ｖｅｎｏｍ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｃｔｉｎｇ  ａｓ  ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ．  １１ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｎ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ；  Ｌｊｕｂｌｊａｎａ，  Ｙｕｇｏｓｌａｖｉａ，  Ａｂｓｔｒａｃｔ  １４１
【非特許文献１７】Ｙｅｈ  ＣＨ，  Ｐｅｎｇ  ＨＣ，  Ｙａｎｇ  ＲＳ，  Ｈｕａｎｇ  ＴＦ．  （２００１  ）  Ｒｈｏｄｏｓｔｏｍｉｎ，  ａ  ｓｎａｋｅ  ｖｅｎｏｍ  ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ，  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｅｌｉｃｉｔｅｄ  ｂｙ  ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｂｙ  ａ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  αｖβ３  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｏｆ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．  ＭｏＩ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ５９：１３３３−１３４２
【非特許文献１８】Ｙａｎｇ，  Ｒ．Ｓ．，  Ｔａｎｇ，  ＣＨ．  ，  Ｃｈｕａｎｇ，  ＷＪ．  ，  Ｈｕａｎｇ，  Ｔ．Ｈ．，  Ｐｅｎｇ，  Ｈ．Ｃ．，  Ｈｕａｎｇ，  Ｔ．Ｆ．  ａｎｄ  Ｆｕ，  Ｗ．  Ｍ．  （２００５）  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｓｎａｋｅ  ｖｅｎｏｍ  ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ．  Ｔｏｘｉｃｏｎ  ４５：６６１−６６９
【非特許文献１９】Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５，  Ｂｉｏｃｅｈｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ７０：１４６９−１４７８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、特にインテグリンαｖβ３に対して特異的選択性を有するディスインテグリン変種の製造に関連して、当分野ではこれらの欠陥及び不適切な点に対処する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の要旨
本発明によれば、本発明の一態様は、αｖβ３インテグリンに選択的なポリペプチドである。このポリペプチドは、αＩＩｂβ３及び／又はα５β１インテグリンに対する結合性が野生型ディスインテグリンよりも低い。このポリペプチドは、改変アミノ酸配列をコードする改変ディスインテグリンヌクレオチド配列によってコードされ、αＩＩｂβ３及び／又はα５β１インテグリン結合活性が低い。このポリペプチドは、ポリエチレングリコール化することができ又はアルブミンと複合化することができる。
【００１０】
このディスインテグリンヌクレオチド配列は、ヘビ毒に由来し得る。ディスインテグリンは、ロドストミン、アルボラブリン（ａｌｂｏｌａｂｒｉｎ）、アプラギン（ａｐｐｌａｇｉｎ）、バシリシン（ｂａｓｉｌｉｃｉｎ）、バトロキソスタチン（ｂａｔｒｏｘｏｓｔａｔｉｎ）、ビチスタチン（ｂｉｔｉｓｔａｔｉｎ）、セレベリン、セラスチン（ｃｅｒａｓｔｉｎ）、クロタトロキシン（ｃｒｏｔａｔｒｏｘｉｎ）、ズリシン（ｄｕｒｉｓｓｉｎ）、エレガンチン（ｅｌｅｇａｎｔｉｎ）、フラボリジン（ｆｌａｖｏｒｉｄｉｎ）、フラボスタチン（ｆｌａｖｏｓｔａｔｉｎ）、ハリシン（ｈａｌｙｓｉｎ）、ハリスタチン（ｈａｌｙｓｔａｔｉｎ）、ジャララシン（ｊａｒａｒａｃｉｎ）、ジャラスタチン（ｊａｒａｓｔａｔｉｎ）、キストリン（ｋｉｓｔｒｉｎ）、ラチェシン（ｌａｃｈｅｓｉｎ）、ルトシン（ｌｕｔｏｓｉｎ）、モロシン（ｍｏｌｏｓｓｉｎ）、サルモシン（ｓａｌｍｏｓｉｎ）、サキサチリン（ｓａｘａｔｉｌｉｎ）、テルゲミニン（ｔｅｒｇｅｍｉｎｉｎ）、トリメスタチン、トリムクリン（ｔｒｉｍｕｃｒｉｎ）、トリムターゼ（ｔｒｉｍｕｔａｓｅ）、ウスリスタチン（ｕｓｓｕｒｉｓｔａｔｉｎ）及びビリジン（ｖｉｒｉｇｉｎ）から選択することができる。
【００１１】
本発明の別の一態様は、ロドストミンの変種であるポリペプチドであり、該ロドストミンは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。
【００１２】
本発明の別の一態様は、ポリペプチドは、配列番号３０−４２から選択されるアミノ酸を含む。
【００１３】
本発明の別の一態様は、配列番号１のアミノ酸４８、５０、５２又は５３に対応する位置における４個のアミノ酸置換の１、２、３個を更に含む、配列番号２９のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００１４】
本発明の別の一態様は、配列番号１の位置４８のＡｌａ、位置５０のＬｅｕ、Ｉｌｅ及びＨｉｓ、位置５２のＡｓｐ、Ｍｅｔ及びＡｓｎ、並びに位置５３のＶａｌ、Ｌｅｕ及びＭｅｔから選択されるアミノ酸置換を含むポリペプチドである。
【００１５】
本発明の別の一態様は、配列番号４３−５６から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドである。
【００１６】
本発明の別の一態様は、αＩＩｂβ３及び／又はα５β１に対する親和性がロドストミンの約１／５、１／５０又は１／１００以下であるポリペプチドである。本発明の一実施形態において、ポリペプチドは、αＩＩｂβ３及び／又はα５β１インテグリンに対する親和性がロドストミンの約１／２００以下である。本発明の別の一実施形態において、ポリペプチドは、αＩＩｂβ３及び／又はα５β１インテグリンに対する親和性がロドストミンの約１／１０００又は１／２０００以下である。本発明の別の一実施形態において、ポリペプチドは、血小板に対する親和性がロドストミンの約１／５、１／５０、１／１００、１／１０００又は１／２０００以下である。本発明の更に別の一実施形態において、ポリペプチドは、血液凝固時間の延長活性がロドストミン及び又は野生型ディスインテグリンよりも実質的に低い。
【００１７】
本発明の更に別の一態様は、本発明のポリペプチドと薬学的に許容される担体とを含む、生理的に許容される組成物である。
【００１８】
本発明の別の一態様は、配列番号５７−６９から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００１９】
本発明の更に別の一態様は、ヒトを含めたほ乳動物におけるαｖβ３インテグリン関連疾患の治療及び／又は防止にディスインテグリン変種を使用する方法である。この方法は、治療を必要とするほ乳動物にディスインテグリン変種の治療有効量を投与する段階を含む。この方法に使用されるポリペプチドは、ポリエチレングリコール化することができ又はアルブミンと複合化することができる。
【００２０】
本発明の一態様においては、ディスインテグリンは、ヘビ毒に由来し得、ロドストミン、アルボラブリン、アプラギン、バシリシン、バトロキソスタチン、ビチスタチン、セレベリン、セラスチン、クロタトロキシン、ズリシン、エレガンチン、フラボリジン、フラボスタチン、ハリシン、ハリスタチン、ジャララシン、ジャラスタチン、キストリン、ラチェシン、ルトシン、モロシン、サルモシン、サキサチリン、テルゲミニン、トリメスタチン、トリムクリン、トリムターゼ、ウスリスタチン及びビリジンの１つから選択することができる。
【００２１】
本発明の一態様においては、ディスインテグリンはロドストミンである。
【００２２】
本発明の別の一態様においては、ロドストミンは、配列番号１のアミノ酸配列を含むロドストミンの変種を含む。
【００２３】
別の一態様においては、ロドストミンは、配列番号３０−４２から選択されるアミノ酸を含むＲＧＤモチーフ変種を含む。
【００２４】
別の一態様においては、ロドストミンは、配列番号５７−６９から選択されるアミノ酸を含む。
【００２５】
本発明の一態様において、αｖβ３インテグリン関連疾患としては、骨粗しょう症、骨腫よう又は癌増殖及びこれに関連した症候、血管新生に関連した腫よう増殖及び転移、骨中の腫よう転移、悪性腫よう誘発性高カルシウム血症、血管新生に関連した眼疾患、パジェット病、リウマチ性関節炎、並びに骨関節炎が挙げられるが、これらだけに限定されない。
【００２６】
本発明の別の一態様において、本発明のポリペプチドは、血管新生に関連した眼疾患の治療及び／又は防止に使用される。該眼疾患としては、加齢黄斑変性症、糖尿病性網膜症、角膜血管新生疾患、虚血誘発性血管新生網膜症、強度近視及び未熟児網膜症が挙げられるが、これらだけに限定されない。
【００２７】
本発明の更に別の一態様において、本発明のポリペプチドは、骨粗しょう症の治療及び／又は防止に使用される。骨粗しょう症は、閉経後エストロゲン欠乏症、続発性骨粗しょう症、リウマチ様関節炎、卵巣切除、パジェット病、骨癌、骨腫よう、骨関節炎、破骨細胞形成の増加、及び破骨細胞活性の増加から選択される病的症状に付随し得る。また、骨粗しょう症としては、卵巣切除誘発性又は閉経後の骨粗しょう症又は骨量減少が挙げられるが、これらだけに限定されない。
【００２８】
本発明の更に別の一態様は、ヒトを含めたほ乳動物における卵巣切除誘発性の生理学的変化の治療及び／又は防止に本発明のポリペプチドを使用する方法である。
【００２９】
本発明の更に別の一態様は、ヒトを含めたほ乳動物における骨中の腫よう細胞増殖及びそれに関連した症候の抑制及び／又は防止にディスインテグリン変種を使用する方法である。
【００３０】
本発明の更に別の一態様は、本発明のポリペプチドを製造する方法であり、該方法は、以下の段階、すなわち、（ａ）前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを宿主細胞にトランスフェクトする段階、（ｂ）前記宿主細胞を培地中で増殖させる段階、及び前記ポリペプチドを単離する段階を含む。本発明の方法は、アミノ酸を含まない培地中で宿主細胞を増殖させること、及び上清を収集して前記ポリペプチドを得ることを更に含み得る。本発明の方法は、メタノールを培地に添加して、宿主細胞中でポリペプチド発現を誘発することを更に含み得る。本発明の方法は、カラムクロマトグラフィーを実施して、前記ポリペプチドを得る段階を更に含み得る。一実施形態において、本発明の方法は、ＨＰＬＣを実施して、単離ポリペプチドを得る段階を更に含み得る。
【００３１】
本発明の別の一態様は、αｖβ３インテグリンに選択的なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり、このポリペプチドは、ヘビ毒から単離されるディスインテグリンの変種であり得る。
【００３２】
本発明の別の一態様においては、ディスインテグリンは、ロドストミン、アルボラブリン、アプラギン、バシリシン、バトロキソスタチン、ビチスタチン、セレベリン、セラスチン、クロタトロキシン、ズリシン、エレガンチン、フラボリジン、フラボスタチン、ハリシン、ハリスタチン、ジャララシン、ジャラスタチン、キストリン、ラチェシン、ルトシン、モロシン、サルモシン、サキサチリン、テルゲミニン、トリメスタチン、トリムクリン、トリムターゼ、ウスリスタチン及びビリジンから選択される。
【００３３】
本発明の別の一態様においては、ディスインテグリンは、ロドストミンを含む。
【００３４】
本発明の別の一態様においては、ディスインテグリンは、配列番号１のアミノ酸配列を含むロドストミンの変種を含む。
【００３５】
本発明の別の一態様においては、ポリペプチドは、配列番号３０−４２から選択されるアミノ酸配列を有するＲＧＤモチーフ変種を含む。
【００３６】
本発明の別の一態様においては、ポリヌクレオチドは、配列番号４３−５６及び７８−１３５から選択される配列を含む。
【００３７】
本発明の別の一態様においては、ポリヌクレオチドは、配列番号１のアミノ酸４８、５０、５２又は５３に対応する位置における４個のアミノ酸置換の１、２、３個を有するポリペプチドをコードし得る。
【００３８】
本発明の別の一態様は、本発明のポリヌクレオチドと厳密な条件下でハイブリッド形成するポリヌクレオチドである。
【００３９】
本発明の別の一態様は、本発明のポリヌクレオチド配列とハイブリッド形成するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドである。
【００４０】
これら及び他の態様は、以下の図面と併せて、以下の種々の実施形態の記述から明らかであるが、その変更及び改変は、開示の新規の概念の精神及び範囲から逸脱することなく作用し得る。
【００４１】
添付図面は、本発明の１つ以上の実施形態を示し、本明細書と一緒に、本発明の原理を説明するのに役立つ。
【００４２】
本発明の追加の目的及び効果は、以下の記述である程度説明され、以下の記述からある程度明らかであり、又は本発明の実施によって習得することができる。本発明の目的及び効果は、添付の特許請求の範囲に特に示された要素及び組合せによって、理解し、達成されるはずである。
【００４３】
上記一般的記述と以下の詳細な説明の両方は、単なる例示及び説明に過ぎず、特許請求の範囲に記載の本発明を限定するものではないことを理解されたい。
【００４４】
本明細書の一部に組み入れられ、本明細書の一部を構成する添付図面は、本発明の実施形態を示し、記述と一緒に、本発明の原理を説明するのに役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、マウスにおける出血時間に対してＲＤ、ＨＳＡ−ＲＤ及びＡＲＬＤＤＬがロドストミンタンパク質よりも影響の小さいことを示すグラフである。
【図２】図２Ａは、ＰＧＰタンパク質で処置したラットにおける卵巣切除誘発性海綿骨量減少の抑制を示す海綿骨の写真である。横棒＝１ｍｍ。図２Ｂは、ＰＧＰタンパク質で処置したラットにおける破骨細胞数の卵巣切除誘発性増加の抑制を示す、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）で染色された海綿骨の写真である。横棒＝１００ｍｍ。
【図３】図３は、ＲＤタンパク質又はアレンドロナート（薬物処置）で処置したラットにおける卵巣切除誘発性破骨細胞活性化の阻害、薬物離脱期間中の破骨細胞マーカー濃度の反跳、及びＲＤ又はアレンドロナートの再投与中の、卵巣切除誘発性破骨細胞活性の増加の逆転を示すグラフである。
【図４】図４Ａ〜Ｄは、ＲＤタンパク質で処置した関節炎ラットにおける軟骨細胞層破壊の阻害を示す、サフラニンＯ及びヘマトキシリン染色膝関節の写真である。矢印は軟骨細胞層を示す。
【図５】図５Ａ〜Ｃは、ＲＤタンパク質で処置した骨関節炎ラットにおける血液サイトカイン上昇の抑制を示すグラフである。
【図６】図６Ａ〜Ｃは、ＲＤタンパク質で処置した骨関節炎マウスにおける血液サイトカイン上昇の抑制を示すグラフである。
【図７】図７は、ＲＤタンパク質で処置し、アレンドロナートでは処置していないＳＣＩＤマウスにおけるＰＣ−３骨腫よう増殖の阻害を示すグラフである。
【図８】図８は、ＲＤタンパク質で処置したＳＣＩＤマウスにおける腫よう誘発性体重減少の抑制を示すグラフである。
【図９】図９Ａは、ＲＤタンパク質で処置したＳＣＩＤマウスにおける、（中間のパネルにおいて矢印で示した）ＰＣ−３細胞のけい骨内（ｉｎｔｒａｔｉｂｉａｌ）注射、及び骨腫よう増殖の阻害の後に、各肢の近位けい骨における目に見える球状の腫よう増殖を示す写真である。図９Ｂは、ＲＤタンパク質で処置したＳＣＩＤマウスにおけるＰＣ−３腫よう細胞誘発性溶骨性骨病変の阻害を示す、けい骨のＸ線像である。図９Ｃは、ＲＤタンパク質で処置したＳＣＩＤマウスにおけるＰＣ−３腫よう誘発性骨溶解の阻害を示す、図９Ｂのデータを定量化したグラフである。図９Ｄは、ＲＤタンパク質で処置したＳＣＩＤマウス中のＩ型コラーゲンのＣ末端テロペプチドにおけるＰＣ−３腫よう誘発性増加の抑制を示すグラフである。図９Ｅは、ＲＤタンパク質又はアレンドロナートで処置したＳＣＩＤマウスの血清カルシウム濃度におけるＰＣ−３腫よう誘発性増加の抑制を示すグラフである。
【図１０】図１０Ａは、ＲＤタンパク質で処置したヌードマウスにおけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１骨腫よう増殖の阻害を示すグラフである。図１０Ｂは、ＲＤタンパク質で処置したヌードマウス中のＩ型コラーゲンのＣ末端テロペプチドにおけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１骨腫よう誘発性増加の抑制を示すグラフである。図１０Ｃは、ＲＤタンパク質で処置したヌードマウスにおけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１骨腫よう誘発性高カルシウム血症の阻害を示すグラフである。図１０Ｄは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を注射し、ＲＤタンパク質で処置したヌードマウスにおいて白血球数の変化がないことを示すグラフである。図１０Ｅは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を注射し、ＲＤタンパク質で処置したヌードマウスにおいて赤血球数の変化がないことを示すグラフである。図１０Ｆは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を注射し、ＲＤタンパク質で処置したヌードマウスにおいて血小板数の変化がないことを示すグラフである。
【図１１】図１１Ａは、未処置対照マウスと比較した、ＲＤ又はＲＤ−アルブミン（ＨＳＡ−ＲＤ）タンパク質で処置したＣ５７ＢＬ／６マウスから得られたＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）栓中の血管密度の低下を示す写真である。図１１Ｂは、未処置対照マウスと比較した、ＲＤ（毎日−ＲＤ／１日又は隔日−ＲＤ／２日）又はＲＤ−アルブミン（ＨＳＡ−ＲＤ−隔日）タンパク質で処置したＣ５７ＢＬ／６マウスから得られたＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）栓中のヘモグロビン含有量の低下を示すグラフである。
【図１２】図１２Ａは、未熟児網膜症（ＲＯＰ）マウスモデルにおける血管新生、及びＲＤタンパク質で処置したＲＯＰマウス（ＲＯＰ＋ＲＤ）における血管新生の減少を示す写真である。矢印は、血管プロファイル（ＢＶＰ）を示す。図１２Ｂは、ＲＤタンパク質で処置した未熟児網膜症（ＲＯＰ）マウスモデルにおけるＢＶＰの減少を示すグラフである。
【図１３】図１３Ａは、ＲＤ又はＲＤ−アルブミンタンパク質で処置したマウスにおける卵巣切除誘発性破骨細胞活性化の阻害を示すグラフである。図１３Ｂは、ＲＤ又はＲＤ−アルブミンタンパク質で処置したマウスにおける卵巣切除誘発性アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）不活性化の阻害を示すグラフである。図１３Ｃは、ＢＭＤの卵巣切除誘発性減少の抑制を示すグラフである。図１３Ｄは、ＢＭＣの卵巣切除誘発性減少の抑制を示すグラフである。
【図１４Ａ】図１４Ａは、ロドストミン変種のアミノ酸配列配列番号１及び５７−５９を示す図である。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、ロドストミン変種のアミノ酸配列配列番号６０−６３を示す図である。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、ロドストミン変種のアミノ酸配列配列番号６４−６７を示す図である。
【図１４Ｄ】図１４Ｄは、ロドストミン変種のアミノ酸配列配列番号６８−６９を示す図である。
【図１５Ａ】図１５Ａは、ロドストミン変種のヌクレオチド配列配列番号４３−４８を示す図である。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、ロドストミン変種のヌクレオチド配列配列番号４９−５４を示す図である。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、ロドストミン変種のヌクレオチド配列配列番号５５−５６を示す図である。
【図１６Ａ】図１６Ａは、ディスインテグリン変種のアミノ酸及びヌクレオチド配列配列番号７８−８５を示す図である。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、ディスインテグリン変種のアミノ酸及びヌクレオチド配列配列番号８６−９２を示す図である。
【図１６Ｃ】図１６Ｃは、ディスインテグリン変種のアミノ酸及びヌクレオチド配列配列番号９３−１００を示す図である。
【図１６Ｄ】図１６Ｄは、ディスインテグリン変種のアミノ酸及びヌクレオチド配列配列番号１０１−１０８を示す図である。
【図１６Ｅ】図１６Ｅは、ディスインテグリン変種のアミノ酸及びヌクレオチド配列配列番号１０９−１１６を示す図である。
【図１６Ｆ】図１６Ｆは、ディスインテグリン変種のアミノ酸及びヌクレオチド配列配列番号１１７−１２４を示す図である。
【図１６Ｇ】図１６Ｇは、ディスインテグリン変種のアミノ酸及びヌクレオチド配列配列番号１２５−１３２を示す図である。
【図１６Ｈ】図１６Ｈは、ディスインテグリン変種のアミノ酸及びヌクレオチド配列配列番号１３３−１３５を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
発明の詳細な説明
本発明を以下の実施例でより具体的に記述する。実施例は、その多数の改変及び変更が当業者には明らかなはずであり、単なる説明のためのものにすぎない。本発明の種々の実施形態を以下に詳述する。以下の記述において、また、特許請求の範囲を通して、特に示さない限り、単数形は複数形を含む。また、以下の記述において、また、特許請求の範囲を通して、「ｉｎ」の意味は、特に示さない限り、「ｉｎ」及び「ｏｎ」を含む。さらに、本明細書で用いる幾つかの用語をより具体的に以下に定義する。本明細書で引用し、考察するすべての参考文献を、各参考文献を参照により個々に組み入れたのと同じ程度に、参照によりその全体を本明細書に組み入れる。
【００４７】
本発明に含まれる本実施形態（例示的実施形態）を以下に詳細に記述する。本発明の実施例を添付図面に示す。
【００４８】
定義
本明細書で使用する用語は、本発明の状況において、また、各用語を使用する具体的状況において、一般に、当分野におけるその通常の意味を有する。本発明の記述に関して追加の手引を実務家に提供するために、本発明の記述に使用する特定の用語を、以下又は本明細書の中で考察する。特定の用語の同義語を記述する。１個以上の同義語の列挙は、別の同義語の使用を排除しない。本明細書で考察する任意の用語の例を含めて、本明細書の例の使用は、単なる説明に過ぎず、本発明又は任意の例示用語の範囲及び意味を決して限定しない。本発明は、本明細書に記載の種々の実施形態に限定されない。
【００４９】
特に断らない限り、本明細書で使用するすべての技術用語及び科学用語は、本発明が関係する分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。矛盾が生じた場合には、定義を含めて本文書を基準とする。
【００５０】
「ほぼ」、「約」又は「およそ」は、一般に、所与の値又は範囲の２０パーセント以内、１０パーセント以内、５、４、３、２又は１パーセント以内を意味するものとする。記述する数量は近似であり、「ほぼ」、「約」又は「およそ」という用語を明示しない場合でも、それらを暗示し得ることを意味する。
【００５１】
「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「核酸」、「核酸分子」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド配列」及び「ヌクレオチド配列」という用語は、区別なく使用され、任意の長さのヌクレオチドの重合体を指す。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド及び／又はその類似体若しくは誘導体を含み得る。この用語は変種を含む。変種としては、挿入体、付加体、欠失体、置換体などが挙げられる。ヌクレオチド配列は、５’から３’方向に記述する。
【００５２】
「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、区別なく使用され、任意の長さのアミノ酸の重合体を指し、天然アミノ酸、コードアミノ酸、非コードアミノ酸、化学若しくは生化学修飾アミノ酸、誘導体化アミノ酸、デザイナーアミノ酸、アミノ酸類似体、ペプチド模倣物及びデプシペプチド、並びに修飾、環式、二環式、デプシ環式（ｄｅｐｓｉｃｙｃｌｉｃ）又はデプシ二環式（ｄｅｐｓｉｂｉｃｙｃｌｉｃ）ペプチド骨格を有するポリペプチドを含み得る。この用語は、単鎖タンパク質及び多量体を含む。この用語は、ＦＩＴＣ、ビオチン、並びに６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１３７Ｃｓ、１８６Ｒｅ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２２３Ｒａ、２４１Ａｍ及び２４４Ｃｍを含めて、ただしこれらだけに限定されない放射性同位体などの標識；検出可能な生成物（例えば、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼなど）を有する酵素；蛍光剤及び蛍光標識、蛍光放射金属、例えば１５２Ｅｕ又はランタン系列の別の元素、電気化学発光化合物、化学発光化合物、例えば、ルミノール、イソルミノール又はアクリジニウム塩；特異的結合分子、例えば、磁性粒子、ミクロスフェア、ナノスフェアなどと複合化されたタンパク質も含む。この用語は、治療薬と複合化されたペプチドも含む。
【００５３】
これらの用語は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質、生物発光タンパク質（例えば、ルシフェリン又はエクオリン（緑色蛍光タンパク質））などの異種アミノ酸配列との融合タンパク質、異種及び相同リーダー配列との融合タンパク質、Ｎ末端メチオニン残基を含む又は含まない融合タンパク質、ポリエチレングリコール化タンパク質、並びに免疫学的タグ付き又はｈｉｓタグ付きタンパク質を含めて、ただしこれらだけに限定されない融合タンパク質も含む。かかる融合タンパク質は、エピトープとの融合体も含む。かかる融合タンパク質は、本発明のペプチドの多量体、例えば、ホモ２量体又はホモ多量体並びにヘテロ２量体及びヘテロ多量体を含み得る。この用語はペプチドアプタマーも含む。
【００５４】
ポリヌクレオチドに関連した「特異的にハイブリッド形成する」という用語は、厳密な条件下でのハイブリド形成を指す。ＤＮＡ／ＤＮＡとＤＮＡ／ＲＮＡの両方のハイブリド形成反応の厳密性を高める条件は周知であり、当分野で公表されている。厳密なハイブリド形成条件の例としては、４×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中で約６５−７０℃のハイブリド形成、又は４×ＳＳＣ＋５０％ホルムアミド中で約４２−５０℃のハイブリド形成、続いて１×ＳＳＣ中で約６５−７０℃での１回以上の洗浄が挙げられる。
【００５５】
「リガンド」という用語は、受容体を含めて、別の分子に結合する分子を指す。
【００５６】
「宿主細胞」は、任意の組換えベクター又はポリヌクレオチドのレシピエントであり得る、又はレシピエントであった、各細胞又は細胞培養物である。宿主細胞は、単一の宿主細胞の子孫を含み、子孫は、自然、偶発的又は計画的な変異及び／又は変化のために、最初の親細胞と（形態又は全ＤＮＡ補体が）必ずしも完全に同一ではない場合もある。宿主細胞としては、本発明の組換えベクター又はポリヌクレオチドを生体内又はインビトロでトランスフェクト又は感染させた細胞などが挙げられる。本発明の組換えベクターを含む宿主細胞は「組換え宿主細胞」とも称する。
【００５７】
「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、ヒトを含めたほ乳動物における疾患の治療薬の任意の投与又は適用を包含し、例えば、退行又は失われた、欠損した若しくは不完全な機能の復元若しくは修復又は非効率的なプロセスの刺激による、疾患の抑制、その進行の抑止又は疾患の軽減を含む。この用語は、所望の薬理的及び／又は生理的効果を得ることを含み、ヒトを含めたほ乳動物における病的症状又は障害のあらゆる処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）を包含する。その効果は、障害若しくは症候を完全若しくは部分的に防止する点で予防的であり得、及び／又は障害及び／又は障害に起因し得る有害感情（ａｄｖｅｒｓｅ  ａｆｆｅｃｔ）の部分的若しくは完全治癒の点で治療的であり得る。したがって、本発明は、治療と予防の両方を提供する。本発明は、（１）障害を起こしやすいが、まだ徴候のない対象における障害の発生又は再発の防止、（２）障害の進行の抑止などの障害の抑制、（３）例えば、失われた、欠損した若しくは不完全な機能の復元若しくは修復によって又は非効率的なプロセスの刺激によって、障害又はその症候の退行など、宿主が障害又はその症候にもはや罹患しないような、障害又は少なくともその関連症候の停止又は終結、又は（４）障害又はそれに付随する症候の軽減、緩和又は改善（改善は、炎症、とう痛及び／又は腫ようサイズなどのパラメータの大きさの少なくとも減少を指すのに広い意味で使用される。）を含む。
【００５８】
「薬学的に許容される担体」とは、任意の従来のタイプの無毒の固体、半固体又は液体の充填剤、希釈剤、封入材料、処方助剤又は賦形剤を指す。薬学的に許容される担体は、使用投与量及び濃度でレシピエントに無毒であり、製剤の別の成分に適合する。
【００５９】
「組成物」とは、薬学的に許容される担体などの担体又は賦形剤を通常含む混合物を指し、該担体又は賦形剤は、当分野で従来のものであり、治療、診断又は予防目的で対象に投与するのに適切である。「組成物」は、ポリペプチド又はポリヌクレオチドが細胞又は培地中に存在する、細胞培養物を含み得る。例えば、経口投与用組成物は、溶液剤、懸濁液剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性製剤、洗口剤又は散剤を形成し得る。
【００６０】
「疾患」とは、医療行為を必要とする、又は医療行為が望まれる、任意の症状、感染症、障害又は症候群を指す。かかる医療行為としては、治療、診断及び／又は防止が挙げられる。
【００６１】
ペプチド
本発明のペプチドは、当分野で公知の方法によって発現され得る。細胞を用いた方法及び無細胞方法は、本発明のペプチドの生成に適切である。細胞を用いた方法は、一般に、核酸構築物を宿主細胞にインビトロで導入すること及び発現に適切な条件下で宿主細胞を培養すること、次いでペプチドを培地から若しくは（例えば、宿主細胞を破壊することによって）宿主細胞から又は両方から収穫することを含む。本発明は、当分野で周知である無細胞インビトロ転写／翻訳方法によってペプチドを生成する方法も提供する。
【００６２】
適切な宿主細胞としては、例えば、細菌、酵母、真菌、植物、昆虫及びほ乳動物細胞を含めて、原核細胞、真核細胞などが挙げられる。
【００６３】
通常、異種ペプチドは、修飾であろうと無修飾であろうと、上述したように、それ自体で発現されることができ、又は融合タンパク質として発現されることができ、分泌シグナルだけでなく、分泌リーダー配列も含み得る。本発明の分泌リーダー配列は、ある種のタンパク質を小胞体（ＥＲ）に誘導することができる。ＥＲは、膜結合タンパク質を別のタンパク質から分離する。タンパク質は、ＥＲに置かれると、分泌小胞を含めた小胞、原形質膜、リソソーム及び別の細胞小器官への分布のために更にゴルジ装置に誘導されることができる。
【００６４】
さらに、ペプチド部分及び／又は精製タグをペプチドに付加することができる。かかる領域は、ポリペプチドの最終調製前に除去することができる。とりわけ、分泌又は排出、安定性改善、及び精製の容易化のために、ペプチド部分をポリペプチドに付加することは、当分野ではよく知られた定常的技術である。適切な精製タグとしては、例えば、Ｖ５、ポリヒスチジン、アビジン及びビオチンが挙げられる。ビオチンなどの化合物とペプチドの複合化は、当分野で周知の技術によって実施することができる。（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ  ｅｄ．  （１９９６）  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ；  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）。ペプチドは、当分野で公知の技術によって、放射性同位体、毒素、酵素、蛍光標識、コロイド状金、核酸、ビノレルビン及びドキソルビシンと複合化することもできる。（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ  ｅｄ．  （１９９６）  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ；  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；  Ｓｔｅｆａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）。
【００６５】
本発明での使用に適切な融合パートナーとしては、例えば、フェチュイン、ヒト血清アルブミン、Ｆｃ及び／又はその断片の１個以上が挙げられる。ポリエチレングリコール複合体などの複合タンパク質も挙げられる。
【００６６】
本発明のペプチドは、当分野で公知の技術によって化学合成することもできる（例えば、Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３１０：  １０５  １１１（１９８４）、Ｇｒａｎｔ  ｅｄ．  （１９９２）  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，  Ａ  Ｕｓｅｒｓ  Ｇｕｉｄｅ，  Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、米国特許第６，９７４，８８４号））。例えば、ポリペプチドの断片に対応するポリペプチドは、ペプチド合成装置を用いて、又は当分野で公知の固相方法を使用して、合成することができる。
【００６７】
また、必要に応じて、非古典的アミノ酸又は化学アミノ酸類似体を置換体又は付加体としてポリペプチド配列に導入することができる。非古典的アミノ酸としては、一般的アミノ酸のＤ異性体、２，４−ジアミノ酪酸、ａ−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、ｇ−Ａｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ｂ−アラニン、フルオロ−アミノ酸、デザイナーアミノ酸（ｂ−メチルアミノ酸、Ｃａ−メチルアミノ酸、Ｎａ−メチルアミノ酸など）、及びアミノ酸類似体全般が挙げられるが、これらだけに限定されない。また、アミノ酸は、Ｄ（右旋性）の場合もＬ（左旋性）の場合もある。
【００６８】
本発明のポリペプチドは、化学合成及び組換え細胞培養物から標準方法によって回収及び精製することができる。標準方法としては、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーが挙げられるが、これらだけに限定されない。一実施形態において、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）を精製に使用する。ポリペプチドが単離及び／又は精製中に変性するときには、周知のタンパク質再折りたたみ技術によって、活性な高次構造を再生することができる。
【００６９】
本発明のペプチド又はペプチド模倣物は、種々の親水性ポリマーの１種類以上を用いて改変して、又は種々の親水性ポリマーの１種類以上と共有結合させて、ペプチドの溶解性及び循環半減期を増加させることができる。ペプチドとのカップリングに適切な非タンパク質親水性ポリマーとしては、ポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールによって例示されるポリアルキルエーテル、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリオキシアルケン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、セルロース及びセルロース誘導体、デキストラン並びにデキストラン誘導体が挙げられるが、これらだけに限定されない。一般に、かかる親水性ポリマーは、約５００から約１００，０００ダルトン、約２，０００から約４０，０００ダルトン又は約５，０００から約２０，０００ダルトンの平均分子量を有する。ペプチドは、Ｚａｌｌｉｐｓｋｙ，  Ｓ．（１９９５）  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，  ６：  １５０−１６５、Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉ，  Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  ６：  ６２−６９、米国特許第４，６４０，８３５号、同４，４９６，６８９号、同４，３０１，１４４号、同４，６７０，４１７号、同４，７９１，１９２号、同４，１７９，３３７号、又は国際公開第９５／３４３２６号に記載の方法のいずれかによって、かかるポリマーを用いて誘導体化することができる又はかかるポリマーに結合させることができる。
【００７０】
ある実施形態において、本発明のペプチドは、薬学的に許容される担体、賦形剤及び希釈剤と一緒の処方で提供される。多種多様な担体、賦形剤及び希釈剤が当分野で公知である。これらの薬剤担体、賦形剤及び希釈剤としては、ＵＳＰ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｌｉｓｔｉｎｇ．  ＵＳＰ  ａｎｄ  ＮＦ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，  Ｌｉｓｔｅｄ  ｂｙ  Ｃａｔｅｇｏｒｉｅｓ，  ｐ．２４０４−２４０６，  ＵＳＰ  ２４  ＮＦ  １９，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ  Ｉｎｃ．，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  Ｍｄ．（ＩＳＢＮ  １−８８９７８８−０３−１）に記載のものが挙げられる。薬学的に許容されるビヒクルなどの賦形剤、アジュバント、担体又は希釈剤は、公的に容易に利用可能である。さらに、ｐＨ調節・緩衝剤、浸透圧調節剤、安定剤、湿潤剤などの薬学的に許容される補助物質も、公衆に容易に利用可能である。
【００７１】
適切な担体としては、水、デキストロース、グリセリン、食塩水、エタノール、及びこれらの組合せが挙げられるが、これらだけに限定されない。担体は、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤、アジュバントなど、製剤の有効性を高める追加の薬剤を含むことができる。局所用担体としては、液体石油、パルミチン酸イソプロピル、ポリエチレングリコール、エタノール（９５％）、モノラウリン酸ポリオキシエチレン（５％）水溶液、ラウリル硫酸ナトリウム（５％）水溶液などが挙げられる。抗酸化剤、湿潤剤、粘度安定剤、類似薬剤などの他の材料も必要に応じて添加することができる。Ａｚｏｎｅなどの経皮浸透賦活薬も含めることができる。
【００７２】
医薬剤形においては、本発明の組成物は、薬学的に許容される塩の形で投与することができ又は単独で若しくは他の薬学的活性化合物との適切な会合及び組合せで使用することもできる。本発明の組成物は、可能な投与方法に従って処方される。
【００７３】
治療方法
αｖβ３インテグリン関連疾患としては、骨粗しょう症、骨腫よう又は癌増殖及びこれらに関連した症候、血管新生に関連した腫よう増殖及び転移、骨中の腫よう転移、悪性腫よう誘発性高カルシウム血症、血管新生に関連した眼疾患、パジェット病、リウマチ性関節炎、並びに骨関節炎が挙げられるが、これらだけに限定されない。
【００７４】
本発明のペプチドは、治療を必要とする対象に、静脈内注射などの全身的注射によって投与することができ又は（部位が手術中に露出するときには部位に直接注射若しくは直接適用することによってなど）関連部位に注射若しくは適用することによって投与することができ又は例えば障害が皮膚の場合など局所適用によって投与することができる。
【００７５】
本発明のペプチドは、単剤療法として使用することができる。或いは、本発明のペプチドは、標準投薬計画と併用して、αｖβ３インテグリン関連疾患を治療することができる。
【００７６】
薬剤は、経口、頬、経鼻、直腸、非経口、腹腔内、皮内、経皮、皮下、静脈内、動脈内、心臓内、脳室内、頭蓋内、気管内、鞘内投与など、又は移植若しくは吸入を含めて、種々の方法で投与することができる。したがって、本発明の組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏剤、溶液剤、坐剤、注射剤、吸入剤、エアロゾル剤などの固体、半固体、液体又はガス状の製剤中に処方することができる。以下の方法及び賦形剤は、単なる例示に過ぎず、決して限定的なものではない。
【００７７】
適切な賦形剤ビヒクルは、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセリン、エタノールなど及びこれらの組合せである。また、必要に応じて、ビヒクルは、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤などのわずかな量の補助的物質を含むことができる。かかる剤形を調製する実際の方法は、当業者に公知であり又は明らかである。投与する組成物又は製剤は、いずれにしても、治療対象において所望の状態を得るのに十分な量の薬剤を含む。
【００７８】
本発明のペプチドは、植物油又は他の類似の油、合成脂肪族酸グリセリド、高級脂肪族酸のエステル、プロピレングリコールなどの水系溶媒又は非水溶媒にペプチドを溶解、懸濁又は乳化することによって、必要に応じて、可溶化剤、等張化剤、懸濁剤、乳化剤、安定剤、防腐剤などの従来添加剤と一緒に、注射剤中に処方することができる。当分野では慣例のように、別の経口又は非経口送達処方を使用することもできる。
【００７９】
「ディスインテグリン」とは、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）配列を含む、ヘビ毒から精製することができるポリペプチドファミリーを指す。いかなる理論又は機序にも拘泥するものではないが、ＲＧＤトリペプチドは、インテグリンに高親和性で結合して、インテグリンとＲＧＤ含有タンパク質の相互作用を遮断すると考えられる。したがって、ディスインテグリンは、接着機能を遮断し、血小板凝集阻害剤として作用する。
【００８０】
略語「Ｒｈｏ」は、マレーマムシの毒液に由来するディスインテグリンである「ロドストミン」を意味する。ロドストミンは、インテグリンαＩＩｂβ３、α５β１及びαｖβ３に非特異的に結合し、血小板糖タンパク質αＩＩｂβ３を遮断して血小板凝集を阻害することによって血液凝固時間を延長する。
【００８１】
「ディスインテグリン変種」又は「ロドストミン変種」とは、ロドストミンなどの野生型ディスインテグリンから誘導された、改変された、又は変異したアミノ酸配列を含む機能的に活性なタンパク質、すなわちポリペプチド又はその任意の誘導体を指す。機能的に活性なディスインテグリン／ロドストミン変種は、インテグリンαｖβ３活性に特異的に結合し、それを阻害することができる。本発明のディスインテグリン又はロドストミン変種は、本発明の目的に適切な任意の方法によって、一実施形態において部位特異的変異誘発法によって、別の一実施形態においてポリメラーゼ連鎖反応法によって、構築することができる。変種としては、対象ペプチドと比較して、挿入体、付加体、欠失体、置換体などが挙げられる。ポリペプチド配列の変種としては、生物学的に活性な多形変種が挙げられる。
【００８２】
本発明のペプチドは、天然及び非天然アミノ酸を含み得る。ペプチドは、Ｄアミノ酸、Ｄアミノ酸とＬアミノ酸の組合せ、及び種々の「デザイナー」又は「合成」アミノ酸（例えば、β−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、Ｎα−メチルアミノ酸など）を含み、特別な性質を有することができる。さらに、ペプチドは環式であり得る。ペプチドは、特別な高次構造モチーフを導入するために、非古典的アミノ酸を含むことができる。任意の公知非古典的アミノ酸を使用することができる。アミノ酸類似体及びペプチド模倣物をペプチドに組み入れて、ＬＬ−Ａｃｐ（ＬＬ−３−アミノ−２−プロペニドン（ｐｒｏｐｅｎｉｄｏｎｅ）−６−カルボン酸）、βターン誘発性ジペプチド類似体、βシート誘発性類似体、βターン誘発性類似体、αヘリックス誘発性類似体、γターン誘発性類似体、Ｇｌｙ−Ａｌａターン類似体、アミド結合等電子体、トレトラゾル（ｔｒｅｔｒａｚｏｌ）などを含めて、ただしこれらだけに限定されない特定の二次構造を誘導又は優先することができる。
【００８３】
末端アミノ又はカルボキシル基が存在しないように、デスアミノ又はデスカルボキシ残基をペプチド末端に組み入れ、プロテアーゼに対する感受性を低下させ、又は高次構造を限定することができる。Ｃ末端官能基としては、アミド、アミド低級アルキル、アミドジ（低級アルキル）、低級アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシ、その低級エステル誘導体、薬学的に許容されるその塩などが挙げられる。
【００８４】
「ＩＣ５０」又は「半値抑制濃度」という用語は、Ｒｈｏ又はその変種の受容体の５０％阻害に必要なＲｈｏ又はその変種の濃度を指す。ＩＣ５０は、変種の受容体に対する変種の親和性など、生物学的過程を５０％阻害するのに必要なＲｈｏ又はその変種の量の尺度である。
【００８５】
使用する「治療有効量」という用語は、生きている対象に投与したときに、生きている対象に所望の効果をもたらす量を指す。例えば、生きている対象に投与する本発明のディスインテグリン又はＲｈｏ変種の有効量は、インテグリンαｖβ３媒介性疾患を防止及び／又は治療する量である。正確な量は、治療目的に応じて決まり、当業者が公知技術を用いて確認することができる。当分野で公知のように、全身送達と局所送達、年齢、体重、全般的健康状態、性別、食事、投与時間、薬物相互作用及び重症度に対する調節が必要な場合もあり、それは当業者が定常的な実験法によって確認することができる。
【００８６】
「受容体拮抗物質」という用語は、受容体への作動物質の結合を遮断することによって受容体の機能を阻害する受容体結合リガンド又は作動物質の結合を許容するが、受容体を活性化する作動物質の能力を阻害する受容体結合リガンドを指す。
【００８７】
「実質的に低いインテグリンαＩＩｂβ３及び／又はα５β１受容体遮断活性」という用語は、インテグリンαＩＩｂβ３及び／又はα５β１受容体の遮断において、野生型ロドストミン又は他のディスインテグリンと比較して１／５以下の低活性を指す。例えば、αＩＩｂβ３及び／又はα５β１受容体遮断活性の低下を計算するには、フィブリノーゲンなどのマトリックスタンパク質に対するインテグリンαＩＩｂβ３及び／又はα５β１結合の阻害に対するロドストミン変種のＩＣ５０をＲｈｏのＩＣ５０と比較する。
【００８８】
「ＲＧＤモチーフ変種」という用語は、ロドストミン中のＲＧＤを含む配列など、対応する野生型配列のＲＧＤ配列にまたがるアミノ酸配列中の改変を含むペプチドを指す。「ＲＧＤモチーフ変種」の例としては、４８ＡＲＧＤＤＰ５３、４８ＰＲＬＤＭＰ５３、４８ＰＲＩＤＭＰ５３及び４８ＡＲＬＤＤＬ５３が挙げられる。
【００８９】
「ＲＤ」という用語は、ＲＧＤモチーフ変種４８ＰＲＬＤＭＰ５３を有するロドストミン変種を指す。
【００９０】
「ＰＧＰ」という用語は、ＲＧＤモチーフ変種４８ＰＲＧＤＧＰ５３を有するロドストミン変種を指す。
【００９１】
ＡＲＬＤＤＬという用語は、ＲＧＤモチーフ変種４８ＡＲＬＤＤＬ５３を有するロドストミン変種を指す。
【００９２】
「αＩＩｂβ３及び／又はα５β１受容体と比較したインテグリンαｖβ３の抑制性選択性」という用語は、αＩＩｂβ３及び／又はα５β１受容体の阻害に対する変種のＩＣ５０とαｖβ３受容体の阻害に対する変種のＩＣ５０との比として表される、インテグリンαｖβ３とαＩＩｂβ３及び／又はα５β１受容体に対する変種の結合選択性を指す。
【００９３】
「出血時間の延長における実質的に低い活性」という用語は、本明細書に記載の出血時間実験によって測定して、血液凝固を統計的に有意に阻害する能力の低下を指す。
【００９４】
「ポリエチレングリコール化ＲＤ」という用語は、ＲＤタンパク質のポリエチレングリコール化生成物を指す。
【００９５】
「アルブミン−ＲＤ又はＨＳＡ−ＲＤ」という用語は、ＲＤタンパク質のヒトアルブミン複合生成物を指す。
【００９６】
本発明の概要
本発明は、選択的αｖβ３インテグリン拮抗物質であるディスインテグリン変種に関する。ＲＤ関連化合物などのディスインテグリン変種は、破骨細胞分化をインビトロで強力に阻害する。ディスインテグリン変種は、動物試験において、破骨細胞吸収活性も阻害し、破骨細胞形成の卵巣切除誘発性増加も抑制する。また、ＲＤは、骨中のヒト前立腺及び乳癌細胞の腫よう増殖を阻害する。悪性腫よう誘発性高カルシウム血症も、ＲＤ関連タンパク質によって効果的に遮断された。（変形性骨炎としても知られる）パジェット病は、典型的には、骨組織の不規則な分解と形成のために骨が増大及び変形する慢性骨障害である。ビスホスホナートは、パジェット病の治療に認可された。骨関節炎は、破骨細胞活性の増加にも関係する。類似の作用機序に基づくと、ＲＤ誘導体は、これらの骨障害の治療にも有効なはずである。３０ｍｇ／ｋｇの極めて多量のＲＤ又はＰＧＰの静脈内注射は、マウスの生存に影響しなかった（ｎ＝３）。また、ＰＧＰの６週間の長期投与（Ｉ．Ｖ．、０．５ｍｇ／ｋｇ／日）は、クレアチニン、ＧＯＴ及びＧＰＴの血清レベルに影響せず、腎臓及び肝臓に対する副作用がないことを示唆している。したがって、ＲＤ及びその誘導体は、骨粗しょう症、骨腫よう、悪性腫よう誘発性高カルシウム血症、パジェット病、リウマチ性関節炎、骨関節炎及び血管新生に関連した眼疾患の治療薬候補である。
【００９７】
ヘビ毒の多くの種類は、ＲＧＤドメインを含むタンパク質を含む。これらのＲＧＤドメイン含有タンパク質は、ディスインテグリンと呼ばれる。ＲＧＤドメインにまたがる配列の改変により、別の種類のインテグリンに対する結合親和性が低いが、αｖβ３インテグリンに対する選択性が高い、極めて独特のポリペプチド変種が生成した。ロドストミン変種を含めたディスインテグリン変種は、とりわけ、骨粗しょう症、骨中の腫よう増殖の抑制、及び血管新生に関連した眼疾患の治療薬候補であることが判明した。さらに、少なくとも１個のアミノ酸置換を含むＲＧＤモチーフ領域を有するロドストミン変種を含めたディスインテグリン変種は、αｖβ３インテグリンの選択的拮抗物質を開発するための貴重なツールであり得る。
【００９８】
本発明の一態様は、インテグリンαｖβ３受容体拮抗活性を有し、野生型ディスインテグリンよりも低いインテグリンαＩＩｂβ３及び／又はα５β１受容体遮断活性を有する、ポリペプチドである。このポリペプチドは、実質的に低いインテグリンαＩＩｂβ３及び／又はα５β１受容体遮断活性を有するポリペプチドをもたらす改変アミノ酸配列をコードする改変ディスインテグリンヌクレオチド配列によってコードされる。このポリペプチドは、ポリエチレングリコール化することができる又はアルブミンと複合化することができる。
【００９９】
ディスインテグリンヌクレオチド配列は、ヘビ毒に由来し得る。本発明によれば、ディスインテグリンとしては、アルボラブリン（Ｃｒｙｐｔｅｌｙｔｒｏｐｓ  ａｌｂｏｌａｂｒｉｓ）、アプラギン（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ）、バシリシン（Ｃｒｏｔａｌｕｓ  ｂａｓｉｌｉｓｃｕｓ）、バトロキソスタチン（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ  ａｔｒｏｘ）、ビチスタチン（Ｂｉｔｉｓ  ａｒｉｅｔａｎｓ）、セレベリン（Ｃｒｏｔａｌｕｓ  ｏｒｅｇａｎｕｓ  ｃｅｒｂｅｒｕｓ）、セラスチン（Ｃｒｏｔａｌｕｓ  ｃｅｒａｓｔｅｓ  ｃｅｒａｓｔｅｓ）、クロタトロキシン（Ｃｒｏｔａｌｕｓ  ａｔｒｏｘ）、ズリシン（Ｃｒｏｔａｌｕｓ  ｄｕｒｉｓｓｕｓ  ｄｕｒｉｓｓｕｓ）、エレガンチン（Ｐｒｏｔｏｂｏｔｈｒｏｐｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）、フラボリジン（Ｔｒｉｍｅｒｅｓｕｒｕｓ  ｆｌａｖｏｖｉｒｉｄｉｓ）、フラボスタチン（Ｔｒｉｍｅｒｅｓｕｒｕｓ  ｆｌａｖｏｖｉｒｉｄｉｓ）、ハリシン（Ｇｌｏｙｄｉｕｓ  ｂｌｏｍｈｏｆｆｉ）、ハリスタチン（Ｇｌｏｙｄｉｕｓ  ｈａｌｙｓ）、ジャララシン（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ  ｊａｒａｒａｃａ）、ジャラスタチン（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ  ｊａｒａｒａｃａ）、キストリン（Ｃａｌｌｏｓｅｌａｓｍａ  ｒｈｏｄｏｓｔｏｍａ）、ラチェシン（Ｌａｃｈｅｓｉｓ  ｍｕｔａ  ｍｕｔａ）、ルトシン（Ｃｒｏｔａｌｕｓ  ｏｒｅｇａｎｕｓ  ｌｕｔｏｓｕｓ）、モロシン（Ｃｒｏｔａｌｕｓ  ｍｏｌｏｓｓｕｓ  ｍｏｌｏｓｓｕｓ）、サルモシン（Ｇｌｏｙｄｉｕｓ  ｂｌｏｍｈｏｆｆｉ  ｂｒｅｖｉｃａｕｄｕｓ）、サキサチリン（Ｇｌｏｙｄｉｕｓ  ｈａｌｙｓ）、テルゲミニン（Ｓｉｓｔｒｕｒｕｓ  ｃａｔｅｎａｔｕｓ  ｔｅｒｇｅｍｉｎｕｓ）、トリメスタチン（Ｔｒｉｍｅｒｅｓｕｒｕｓ  ｆｌａｖｏｖｉｒｉｄｉｓ）、トリムクリン（Ｐｒｏｔｏｂｏｔｈｒｏｐｓ  ｍｕｃｒｏｓｑｕａｍａｔｕｓ）、トリムターゼ（Ｐｒｏｔｏｂｏｔｈｒｏｐｓ  ｍｕｃｒｏｓｑｕａｍａｔｕｓ）、ウスリスタチン（Ｇｌｏｙｄｉｕｓ  ｕｓｓｕｒｉｅｎｓｉｓ）、ビリジン（Ｃｒｏｔａｌｕｓ  ｖｉｒｉｄｉｓ）が挙げられるが、これらだけに限定されない。
【０１００】
本発明の別の一態様は、ロドストミンの変種である単離ポリペプチドであり、ロドストミンは、配列番号１によって定義されたアミノ酸配列を含み、変種はＲＧＤモチーフ変種を含む。
【０１０１】
本発明の一実施形態において、ＲＧＤモチーフ変種は、配列番号３０−４２から選択されるアミノ酸配列を含み得る。
【０１０２】
本発明の別の一態様は、配列番号１のアミノ酸４８、５０、５２又は５３に対応する位置における４個のアミノ酸置換の１、２、３個を更に含む、配列番号２９のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【０１０３】
本発明の別の一態様は、配列番号１の位置４８のＡｌａ、位置５０のＬｅｕ、Ｉｌｅ及びＨｉｓ、位置５２のＡｓｐ、Ｍｅｔ及びＡｓｎ、並びに位置５３のＶａｌ、Ｌｅｕ及びＭｅｔから選択されるアミノ酸置換を含むポリペプチドである。
【０１０４】
本発明の別の一態様は、配列番号４３−５６から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドである。
【０１０５】
例えば、具体的に、本発明の別の一実施形態において、ＲＧＤモチーフ変種は、配列番号２９で示される野生型ＲＧＤモチーフのＧｌｙ５０又はＭｅｔ５２に対応する残基における少なくとも１個のアミノ酸置換を含み得る。少なくとも１個のアミノ酸置換は、配列番号３６−３７のＬｅｕ５０、配列番号３９のＩｌｅ５０、配列番号４０のＨｉｓ５０、配列番号４１のＡｓｎ５２、又は配列番号４２のＧｌｙ５２に対応する残基において起こる。
【０１０６】
本発明の別の一実施形態において、ＲＧＤモチーフ変種は、配列番号２９で示される野生型ＲＧＤモチーフのＰｒｏ４８とＭｅｔ５２、又はＭｅｔ５２とＰｒｏ５３に対応する残基における少なくとも２個のアミノ酸置換を含み得る。少なくとも２個のアミノ酸置換は、配列番号３０のＡｌａ４８とＡｓｐ５２、又は配列番号３５のＡｓｐ５２とＭｅｔ５３に対応する残基であり得る。
【０１０７】
本発明の更に別の一実施形態において、ＲＧＤモチーフ変種は、配列番号２９で示される野生型ＲＧＤモチーフのＰｒｏ４８、Ｍｅｔ５２及びＰｒｏ５３、又はＧｌｙ５０、Ｍｅｔ５２及びＰｒｏ５３に対応する残基における少なくとも３個のアミノ酸置換を含み得る。少なくとも３個のアミノ酸置換は、配列番号３１のＡｌａ４８、Ａｓｐ５２及びＶａｌ５３、配列番号３２のＡｌａ４８、Ａｓｐ５２及びＬｅｕ５３、配列番号３４のＡｌａ４８、Ａｓｐ５２及びＭｅｔ５３、配列番号３７のＬｅｕ５０、Ａｓｐ５２及びＬｅｕ５３に対応する残基であり得る。
【０１０８】
本発明の更に別の一実施形態において、ＲＧＤモチーフ変種は、配列番号２９で示される野生型ＲＧＤモチーフのＰｒｏ４８、Ｇｌｙ５０、Ｍｅｔ５２及びＰｒｏ５３に対応する残基における少なくとも４個のアミノ酸置換を含み得る。少なくとも４個のアミノ酸置換は、配列番号３８のＡｌａ４８、Ｌｅｕ５０、Ａｓｐ５２及びＬｅｕ５３に対応する残基であり得る。
【０１０９】
本発明の別の一態様は、配列番号４４−５６から選択される改変ロドストミンヌクレオチド配列を有するＤＮＡによってコードされる単離ポリペプチドである。このポリペプチドは、αＩＩｂβ３及び／又はα５β１に対する親和性がロドストミンの約１／５、１／５０又は１／１００以下である。本発明の一実施形態において、ポリペプチドは、αＩＩｂβ３及び／又はα５β１インテグリンに対する親和性がロドストミンの約１／２００以下である。本発明の別の一実施形態において、ポリペプチドは、αＩＩｂβ３及び／又はα５β１インテグリンに対する親和性がロドストミンの約１／１０００又は１／２０００以下である。本発明の別の一実施形態において、ポリペプチドは、血小板に対する親和性がロドストミンの約１／５、１／５０、１／１００、１／１０００又は１／２０００以下である。本発明の更に別の一実施形態において、ポリペプチドは、血液凝固時間の延長活性がロドストミン又は野生型ディスインテグリンよりも実質的に低い。
【０１１０】
本発明の更に別の一態様は、本発明のポリペプチドと、薬学的に許容される担体とを含む、生理的に許容される組成物である。
【０１１１】
本発明の更に別の一態様は、ヒトを含めたほ乳動物におけるαｖβ３インテグリン関連疾患の治療及び／又は防止にディスインテグリン変種を使用する方法である。この方法は、治療を必要とするほ乳動物に単離ポリペプチド又は薬学的に許容されるその塩の治療有効量を投与する段階を含む。その中のポリペプチドは、インテグリンαｖβ３受容体拮抗活性を有し、野生型ディスインテグリンよりも実質的に低いインテグリンαＩＩｂβ３及び／又はインテグリンα５β１受容体遮断活性を有し、それによってほ乳動物におけるαｖβ３インテグリン関連疾患を治療及び／又は防止する。このポリペプチドは、実質的に低いインテグリンαＩＩｂβ３及び／又はインテグリンα５β１受容体遮断活性を有するポリペプチドをもたらす改変ディスインテグリンアミノ酸配列をコードする改変ディスインテグリンヌクレオチド配列によってコードされる。この方法に使用されるポリペプチドは、ポリエチレングリコール化することができる又はアルブミンと複合化することができる。
【０１１２】
上述したように、ディスインテグリンヌクレオチド配列は、ヘビ毒に由来し得、ロドストミン、アルボラブリン、アプラギン、バシリシン、バトロキソスタチン、ビチスタチン、セレベリン、セラスチン、クロタトロキシン、ズリシン、エレガンチン、フラボリジン、フラボスタチン、ハリシン、ハリスタチン、ジャララシン、ジャラスタチン、キストリン、ラチェシン、ルトシン、モロシン、サルモシン、サキサチリン、テルゲミニン、トリメスタチン、トリムクリン、トリムターゼ、ウスリスタチン及びビリジンから選択することができる。
【０１１３】
本発明の一実施形態において、この方法は、治療を必要とするほ乳動物に単離ポリペプチド又は薬学的に許容されるその塩の治療有効量を投与する段階を含み、ポリペプチドは配列番号１のアミノ酸配列を含み、変種は、ＲＧＤモチーフ変種を含む。
【０１１４】
本発明の別の一実施形態において、この方法は、治療を必要とするほ乳動物に単離ポリペプチド又は薬学的に許容されるその塩の治療有効量を投与する段階を含み、ポリペプチドは、配列番号１によって定義されたアミノ酸配列を含むロドストミンの変種であり、変種は、配列番号３０−４２から選択されるアミノ酸配列を有するＲＧＤモチーフ変種を含む。
【０１１５】
本発明の更に別の一実施形態において、この方法は、治療を必要とするほ乳動物に単離ポリペプチド又は薬学的に許容されるその塩の治療有効量を投与する段階を含み、ポリペプチドは、配列番号５７−６９から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１１６】
本発明の一実施形態において、本発明のポリペプチドは、αｖβ３インテグリン関連疾患の治療及び／又は防止に使用される。αｖβ３インテグリン関連疾患としては、骨粗しょう症、骨腫よう又は癌増殖及びそれに関連した症候、血管新生に関連した腫よう増殖及び転移、骨中の腫よう転移、悪性腫よう誘発性高カルシウム血症、血管新生に関連した眼疾患、パジェット病、リウマチ性関節炎、並びに骨関節炎が挙げられるが、これらだけに限定されない。
【０１１７】
本発明の別の一実施形態において、本発明のポリペプチドは、血管新生に関連した眼疾患の治療及び／又は防止に使用される。該眼疾患としては、加齢黄斑変性症、糖尿病性網膜症、角膜血管新生疾患、虚血誘発性血管新生網膜症、強度近視及び未熟児網膜症が挙げられるが、これらだけに限定されない。
【０１１８】
本発明の更に別の一実施形態において、本発明のポリペプチドは、骨粗しょう症の治療及び／又は防止に使用される。骨粗しょう症は、閉経後エストロゲン欠乏症、続発性骨粗しょう症、リウマチ様関節炎、卵巣切除、パジェット病、骨癌、骨腫よう、骨関節炎、破骨細胞形成の増加、及び破骨細胞活性の増加から選択される病的症状を伴う。また、骨粗しょう症としては、卵巣切除誘発性骨粗しょう症又は骨量減少、及び閉経後骨粗しょう症又は骨量減少が挙げられるが、これらだけに限定されない。
【０１１９】
本発明の更に別の一態様は、ヒトを含めたほ乳動物における、卵巣切除又は閉経後の骨粗しょう症により誘発された生理学的変化の治療及び／又は防止のためのディスインテグリン変種の使用方法である。この方法は、インテグリンαｖβ３受容体拮抗活性を有し、野生型ディスインテグリンよりも実質的に低いインテグリンαＩＩｂβ３及び／又はα５β１受容体遮断活性を有し、それによってほ乳動物における卵巣切除により誘発された生理学的変化を治療及び／又は防止する単離ポリペプチド又は薬学的に許容されるその塩の治療有効量をそれを必要とするほ乳動物に投与することを含む。ポリペプチドは、実質的に低いインテグリンαＩＩｂβ３及び／又はα５β１受容体遮断活性を有する前記ポリペプチドをもたらす改変アミノ酸配列をコードする改変ディスインテグリンヌクレオチド配列によってコードされる。ディスインテグリンヌクレオチド配列は、ヘビ毒に由来し得、ロドストミン、アルボラブリン、アプラギン、バシリシン、バトロキソスタチン、ビチスタチン、セレベリン、セラスチン、クロタトロキシン、ズリシン、エレガンチン、フラボリジン、フラボスタチン、ハリシン、ハリスタチン、ジャララシン、ジャラスタチン、キストリン、ラチェシン、ルトシン、モロシン、サルモシン、サキサチリン、テルゲミニン、トリメスタチン、トリムクリン、トリムターゼ、ウスリスタチン及びビリジンの１種類から選択することができる。
【０１２０】
ほ乳動物における卵巣切除誘発性又は閉経後の生理学的変化の治療及び／防止に使用されるポリペプチド変種は、配列番号３０−４２から選択されるアミノ酸配列を含むＲＧＤモチーフ変種を含み得る。
【０１２１】
本発明の一実施形態において、この方法は、治療を必要とするほ乳動物に単離ポリペプチド又は薬学的に許容されるその塩の治療有効量を投与することを含み、ポリペプチド変種は、配列番号５７−６９から選択されるアミノ酸配列を含む。別の一実施形態において、ポリペプチド変種は、ポリエチレングリコール化される又はアルブミンと複合化される。
【０１２２】
本発明の更に別の一態様は、ヒトを含めたほ乳動物における骨中の腫よう細胞増殖及びそれに関連した症候の抑制及び／又は防止にディスインテグリン変種を使用する方法である。この方法は、インテグリンαｖβ３受容体拮抗活性を有し、野生型ディスインテグリンよりも実質的に低いインテグリンαＩＩｂβ３及び／又はα５β１受容体遮断活性を有し、それによってほ乳動物における骨中の腫よう細胞増殖及びそれに関連した症候を抑制及び／又は防止する単離ポリペプチド又は薬学的に許容されるその塩の治療有効量を治療を必要とするほ乳動物に投与することを含む。ポリペプチドは、改変アミノ酸配列をコードし、それによって実質的に低いインテグリンαＩＩｂβ３及び／又はα５β１受容体遮断活性を有する前記ポリペプチドをもたらす改変ディスインテグリンヌクレオチド配列によってコードされる。
【０１２３】
ディスインテグリンヌクレオチド配列は、ヘビ毒に由来し得、ロドストミン、アルボラブリン、アプラギン、バシリシン、バトロキソスタチン、ビチスタチン、セレベリン、セラスチン、クロタトロキシン、ズリシン、エレガンチン、フラボリジン、フラボスタチン、ハリシン、ハリスタチン、ジャララシン、ジャラスタチン、キストリン、ラチェシン、ルトシン、モロシン、サルモシン、サキサチリン、テルゲミニン、トリメスタチン、トリムクリン、トリムターゼ、ウスリスタチン及びビリジンから選択することができる。
【０１２４】
骨中の腫よう細胞増殖に関連した病理学的症候としては、破骨細胞活性の増加、骨吸収の増加、骨病変、高カルシウム血症、体重減少、これらの任意の組合せなどが挙げられる。骨中の腫よう細胞増殖は、前立腺癌、乳癌、肺癌、腎臓癌、卵巣癌、すい癌又は骨髄腫から生ずる骨癌細胞及び転移癌細胞を含む。
【０１２５】
本発明の一実施形態において、この方法は、治療を必要とするほ乳動物に単離ポリペプチド又は薬学的に許容されるその塩の治療有効量を投与することを含み、ポリペプチドはロドストミンの変種であり、ロドストミンは、配列番号１によって定義されたアミノ酸配列を含み、変種はＲＧＤモチーフ変種を含む。ＲＧＤモチーフ変種は、配列番号３０−４２から選択されるアミノ酸配列を含み得る。
【０１２６】
本発明の別の一実施形態において、この方法は、治療を必要とするほ乳動物に単離ポリペプチド又は薬学的に許容されるその塩の治療有効量を投与する段階を含み、ポリペプチドは、配列番号５７−６９から選択されるアミノ酸配列を含む。ポリペプチド変種は、ポリエチレングリコール化することができる又はアルブミンと複合化することができる。
【０１２７】
本発明の更に別の一態様は、本発明のポリペプチドを製造する方法であり、この方法は、（ａ）前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで宿主細胞を形質転換して、１種類以上の形質転換体を得る段階、（ｂ）形質転換体に挿入された前記ＤＮＡ構築物の１個以上の複製物を有する形質転換体を選択する段階、（ｃ）形質転換体を培地中で増殖させて、その細胞集団を増幅する段階、（ｄ）形質転換細胞を収穫する段階、（ｅ）収集した形質転換細胞をアミノ酸を含まない培地中で増殖させる段階、及び（ｇ）上清を収集して前記ポリペプチドを得る段階を含む。
【０１２８】
上記段階（ｅ）は、メタノールを培地に添加して、形質転換細胞中でポリペプチド発現を誘発する段階を更に含み得る。一実施形態において、段階（ｇ）は、カラムクロマトグラフィーを実施して、前記ポリペプチドを得る段階を更に含み得る。更なる一実施形態において、上記方法は、ＨＰＬＣを実施して、精製された単離ポリペプチドを得る段階を更に含み得る。
【０１２９】
本発明のこれら及び他の態様をより具体的に以下に記述する。
【０１３０】
ヒト組換えＲＡＮＫＬ及びＭ−ＣＳＦをＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から購入した。Ｉ型コラーゲンのＣ末端テロペプチドＥＬＩＳＡキットをＣｒｏｓｓ  Ｌａｐｓ（Ｈｅｒｌｅｖ、Ｄｅｎｍａｒｋ）から入手した。別のすべての化学物質をＳｉｇｍａから入手した。
【実施例１】
【０１３１】
ロドストミン及び変種をコードするＤＮＡの構築
ロドストミンをクローン化し、ベクターｐＧＥＸ−２ＫＳ［２０］中でテンプレートとして発現させた。ＲｈｏをコードするＤＮＡは、ピキア  パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）において優先的に用いられるコドンで構成された。精製を容易にするためにＥｃｏ  Ｒ１認識及び６個のヒスチジン残基を有するセンスプライマー５’−ＧＡＡＴＴＣＧＡＡＴＴＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＧＧＴＡＡＧＧＡＡＴＧＴＧＡＣＴＧＴＴＣＴＴ−３’（Ｒｈｏ−Ｐｉｃ−１、配列番号３）を用いたポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）によってＲｈｏ  ＤＮＡを増幅した。アンチセンスプライマーは、Ｓａｃ  ＩＩ認識及びＴＣＡ（又はＴＴＡ）終止コドンを有する５’−ＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＴＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＴＴＧＧＡＣＡＧＴＣＡＧＣ−３’又は５’−ＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＴＴＡＧＴＧＧＴＡＴＣＴＴＧＧＡＣＡＧＴＣＡＧＣ−３’（Ｒｈｏ−Ｐｉｃ−２、配列番号４）である。ＰＣＲ産物を精製し、次いで酵母組換えベクターｐＰＩＣＺαＡのＥｃｏ  Ｒ１及びＳａｃ  ＩＩ部位に連結した。組換えプラスミドを用いてＤＨ５α系統を形質転換し、低塩ＬＢ（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、１．５％寒天、ｐＨ７．０）及び２５μｇ／ｍｌ抗生物質Ｚｅｏｃｉｎを用いてコロニーを寒天板上で選択した。
【０１３２】
ロドストミン変種を合成し、Ｅｃｏ  ＲＩ及びＳａｃ  ＩＩ制限酵素切断部位を含むプライマーを用いた重複オリゴヌクレオチド戦略を使用してポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）によって増幅させた。変種の合成又は確認に用いた種々のプライマーのヌクレオチド配列を表１に示す。ＲＤ−ＨＳＡ融合タンパク質を類似の手順によって構築した。ヒト血清アルブミンのｃＤＮＡをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入し、アルブミンの構造遺伝子をＲｈｏ遺伝子のＮ末端においてＧＳＧＳＧＳリンカーアミノ酸配列と融合させ、Ｎ末端において６個のヒスチジン残基と融合させた。
【０１３３】
【表１】
0005908666.tif 000002
【０１３４】
備考：プライマーα因子を配列決定プライマーとして用いた。５’−ＡＯＸ１＆３’−ＡＯＸ１プライマーを用いて、挿入ＤＮＡの有無について調べた。
【０１３５】
ポリメラーゼ連鎖反応法を９５℃１分間、５５℃１分間、次いで７２℃１分間の２５サイクル実施した。プライマー混合物を用いて、複数の変異部位も作製した。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル上で分離させ、臭化エチジウム染色によって可視化した。所望のＰＣＲ産物を精製し、次いで酵母導入ベクターｐＰＩＣＺαＡのＥｃｏ  ＲＩ及びＳａｃ  ＩＩ部位に連結した。組換えプラスミドを用いて、エシェリキア  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＸＬ１−ｂｌｕｅ系統を形質転換し、抗生物質Ｚｅｏｃｉｎを含む寒天板上でコロニーを選択した。Ｅ．コリＸＬ１−ｂｌｕｅコロニーを採取し、プラスミドＤＮＡを単離し、挿入断片の配列決定によって配列を確認した。表２に、ロドストミン及び種々の変種をコードするＤＮＡの合成に用いたプライマー配列番号を示す。
【０１３６】
【表２】
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【実施例２】
【０１３７】
ロドストミン及び変種のタンパク質発現及び精製
ピキアにおけるロドストミン及びその変種のタンパク質発現を、軽微な改変を加えたＰｉｃｈｉａ  ＥａｓｙＣｏｍｐ（商標）Ｋｉｔのプロトコルに従って実施した。手短に述べると、ロドストミン又はその変種をコードするＤＮＡを含むプラスミド合計１０μｇを精製し、Ｓａｃ  Ｉで消化して、プラスミドを線状にした。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）製Ｐｉｃｈｉａ  ＥａｓｙＣｏｍｐ（商標）キットを用いて、熱ショック法によって、ピキア系統Ｘ３３を線状構築物で形質転換した。形質転換体は、１回の組換え（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ）によって５’ＡＯＸ１座において統合された。ＰＣＲによってピキア組み込み体を分析して、Ｒｈｏ遺伝子がピキアゲノムに組み込まれたかどうか確認し、細胞をＬｙｔｉｃａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）によって溶解させた。ＹＰＤ（１％酵母エキス、２％ペプトン、２％グルコース及び２％寒天）及び１００μｇ／ｍｌ  Ｚｅｏｃｉｎを含む寒天板上でコロニーを選択した。Ｒｈｏ遺伝子挿入物の複数の複製物を含む幾つかのクローンを選択して、最高のＲｈｏタンパク質発現を示すクローンを採取した。
【０１３８】
組換えＲｈｏ及びその変種を以下のように生成させた。選択したコロニーを、１００μｇ／ｍｌ  Ｚｅｏｃｉｎを含むＹＰＤ培地（１％酵母エキス、２％ペプトン及び２％デキストロース）中で３０℃で増殖させた。４８時間後、細胞を遠心分離によって収集し、（硫酸アンモニウムを含み、アミノ酸を含まない１．３４％酵母窒素ベースと４×１０−５％ビオチンとを含む）最小メタノール培地１リットル中で増殖させた。メタノール合計１％を２４時間ごとに１回添加して、Ｒｈｏ又は変種発現を２日間誘導した。上清を遠心分離によって収集し、５リットル緩衝剤Ａ（５ｍＭ  ＥＤＴＡ、８Ｍ尿素及び１０ｍＭリン酸Ｎａ緩衝剤、ｐＨ７．７）で２回透析した。最終溶液をニッケル−キレートカラムに充填し、２００ｍＭイミダゾール勾配で溶出させた。組換えロドストミン及びその変種をＨＰＬＣ（逆相Ｃ１８  ＨＰＬＣ）によって更に精製した。精製組換えＲｈｏは、トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって判断して、９５％を超える純度であった。
【０１３９】
続いて、Ｒｈｏ及びその変種をエレクトロスプレー質量分析にかけて、分子量を調べた。Ｒｈｏ及び変種のＲＧＤモチーフのアミノ酸配列を表３に示す。
【０１４０】
【表３】
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【実施例３】
【０１４１】
出血時間に対するＲＤ及びその誘導体の効果
出血時間を以下のように測定した。マウスにトリクロロアセトアルデヒド（２００ｍｇ／ｋｇ）を用いて麻酔し、軽微な改変を加えた既報の方法によって出血時間を測定した［２１］。食塩水又はタンパク質をマウス（ＩＣＲ、雄性、平均体重２３．５±１．８ｇ）の尾静脈を介して静脈内注射した。注射５分後にマウスの尾先端から０．５ｍｍを鋭く切った。次いで、尾を食塩水充填ビーカーに即時に浸漬し、３７℃で維持し、出血時間を測定した。
【０１４２】
図１は、マウスにおける尾出血時間に対するＲＤ及びＡＲＬＤＤＬタンパク質の効果を示す。ＨＳＡ−ＲＤ（５ｍｇ／ｋｇ）の食塩水、ＲＤ、ＡＲＬＤＤＬ、ロドストミン（各０．６ｍｇ／ｋｇ）の静脈内投与５分後に尾出血時間を測定した。ロドストミン（０．５ｍｇ／ｋｇ）の静脈内注射は、マウスにおける凝固時間の延長に顕著な効果を発揮した。しかし、αｖβ３インテグリンに選択性を示すＲＤとＡＲＬＤＤＬの両方（０．５ｍｇ／ｋｇ）は、ロドストミンに比べて、マウスにおける凝固時間にわずかしか影響を及ぼさなかった。結果を平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ（ｎ＝６）で表す。
【実施例４】
【０１４３】
血小板凝集アッセイ
少なくとも２週間投薬を受けていない健康なドナーから得られた静脈血（９部）試料を３．８％クエン酸ナトリウム（１部）中に収集した。血液試料を１５０×ｇで１０分間遠心分離して、多血小板血しょう（ＰＲＰ）を得、５分間放置し、ＰＲＰを収集した。乏血小板血しょう（ＰＰＰ）を残りの血液から２０００×ｇで２５分間遠心分離して調製した。ＰＰＰ血小板数を血液分析計によって測定し、２５０，０００血小板／μｌに希釈した。ＰＲＰ  １９０μｌとＲｈｏ又はＰＢＳ緩衝剤１０μｌの溶液をＨｅｍａ  Ｔｒａｃｅｒ  ６０１血小板凝集計中で３７℃で５分間温置した。２００μＭアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）１０マイクロリットルを更に添加して、光透過によって血小板凝集の応答をモニターした。
【実施例５】
【０１４４】
細胞接着阻害アッセイ
細胞接着阻害アッセイを既報のように実施した［２７］。手短に述べると、９６ウェルのＩｍｍｕｌｏｎ−２マイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＵＳＡ）のウェルに、基質を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ：１０ｍＭリン酸緩衝剤、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）１００μｌを５０−５００ｎＭの濃度で塗布し、４℃で終夜温置した。基質及びその塗布濃度は、フィブリノーゲン（Ｆｇ）２００μｇ／ｍｌ、ビトロネクチン（Ｖｎ）５０μｇ／ｍｌ及びフィブロネクチン（Ｆｎ）２５μｇ／ｍｌであった。各ウェルを熱変性１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）２００μｌと一緒に室温（２５℃）で１．５時間温置することによって、非特異的タンパク質結合部位をブロックした。熱変性ＢＳＡを廃棄し、各ウェルをＰＢＳ  ２００μｌで２回洗浄した。
【０１４５】
αｖβ３（ＣＨＯ−αｖβ３）及びαＩＩｂβ３（ＣＨＯ−αＩＩｂβ３）インテグリンを発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞をダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）１００μｌ中で維持した。インテグリンαｖβ３（ＣＨＯ−αｖβ３）及びαＩＩｂβ３（ＣＨＯ−αＩＩｂβ３）を発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、Ｄｒ．  Ｙ．  Ｔａｋａｄａ（Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）の好意により提供された。ヒト赤白血病Ｋ５６２細胞をＡＴＣＣから購入し、５％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養した。対数期増殖したＣＨＯ及びＫ５６２細胞をトリプシン処理によって剥離し、それぞれ３×１０５及び２．５×１０５細胞／ｍｌでアッセイに使用した。Ｒｈｏ及びその変種を培養細胞に添加し、３７℃、５％ＣＯ２で１５分間温置した。Ｒｈｏ及びその変種を濃度０．００１−５００μＭで阻害剤として使用した。次いで、処置した細胞を被覆プレートに添加し、３７℃、５％ＣＯ２で１時間反応させた。次いで、温置溶液を廃棄し、ＰＢＳ  ２００μｌで２回洗浄して、非接着細胞を除去した。結合細胞をクリスタルバイオレット染色によって定量した。手短に述べると、ウェルを１０％ホルマリン１００μｌで１０分間固定し、乾燥させた。次いで、０．０５％クリスタルバイオレット５０マイクロリットルをウェルに室温で２０分間添加した。各ウェルを蒸留水２００μｌで４回洗浄し、乾燥させた。着色溶液（５０％アルコール及び０．１％酢酸）１５０μｌを添加して着色した。生じた吸光度を６００ｎｍで読んだ。読みは、接着細胞数と相関した。阻害を、阻害％＝１００−［ＯＤ６００（ロドストミン変種処置試料）／ＯＤ６００（未処置試料）］×１００として定義した。
【実施例６】
【０１４６】
インテグリンαｖβ３、αＩＩｂβ３及びα５β１に対するＲＤ及びその誘導体の阻害効果
インテグリン結合に対するＲＤ及びその誘導体のＩＣ５０を、上記実施例５に記載の細胞接着アッセイによって得た。手短に述べると、フィブロネクチン、ビトロネクチン、フィブリノーゲンなどのマトリックスタンパク質を、実施例５に記載のように、一定濃度でマイクロタイタープレートに塗布し、インテグリンを発現する細胞にＲｈｏ及びその変種を０．００１−５００μＭの異なる濃度で添加してＩＣ５０を得た。ＩＣ５０が低いほど、変種の特異性又は作用強度が高い。
【０１４７】
ＲｈｏのＲＧＤモチーフの改変は、Ｒｈｏの生物活性に独特の効果を示した。すなわち、配列改変の結果として、マトリックスタンパク質に対するインテグリンαＩＩｂβ３又はα５β１の結合を阻害する活性が低下し、インテグリンαｖβ３に対する選択性が増加した。表４は、Ｒｈｏ及びその誘導体による細胞接着阻害のＩＣ５０の結果である。
【０１４８】
【表４】
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【０１４９】
ロドストミン変種は、αＩＩｂβ３及び／又はα５β１に対する親和性がＲｈｏよりも極めて低い（表４）。表４に示すように、例えば、インテグリンαＩＩｂβ３及びα５β１の阻害におけるＲＤ（すなわち、ＰＲＬＤＭＰ）のＩＣ５０は、Ｒｈｏのそれぞれ１０４倍及び１０倍を超えて増加した。さらに、インテグリンαＩＩｂβ３及びα５β１の阻害におけるＡＲＬＤＤＬのＩＣ５０は、Ｒｈｏの２０００倍を超えて増加した。αＩＩｂβ３結合に対するポリエチレングリコール化ＲＤ及びヒトアルブミン複合化ＲＤのＩＣ５０は、Ｒｈｏのそれぞれ１１３．７及び１２９．９倍増加した（表５）。したがって、血小板に対する変種の親和性は、Ｒｈｏよりも顕著に低下した（表５）。
【実施例７】
【０１５０】
破骨細胞形成に対するＲＤ及びその誘導体の効果
破骨細胞は、骨髄造血前駆体から分化した特殊化した単球／マクロファージファミリーメンバーである。Ｍ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）及びｓＲＡＮＫＬ（５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で破骨細胞前駆体を８日間培養すると、ＴＲＡＰなどの成熟表現型マーカーの獲得を特徴とする、多核の大きい成熟破骨細胞が形成された。骨髄の培養造血細胞からの破骨細胞形成方法、並びに破骨細胞形成に対するＲＤ及びその誘導体の効果を以下のように検討した。
【０１５１】
６−８週齢ＳＤラットから大腿骨を取り出し、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ及び１０％熱失活ＦＣＳ、２ｍＭグルタミン、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を補充したａ−ＭＥＭを骨髄腔に流して、骨髄細胞を調製した。非接着細胞（造血細胞）を収集し、２４時間後に破骨細胞前駆体として使用した。ヒト組換え可溶性ＲＡＮＫＬ（５０ｎｇ／ｍｌ）及びネズミＭ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、２４ウェルプレート中に１×１０６細胞／ウェル（０．５ｍｌ）で細胞を蒔いた。培地を３日ごとに交換した。８日目に、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）のアッセイによって破骨細胞形成を確認した。手短に述べると、接着細胞をリン酸緩衝食塩水中の１０％ホルムアルデヒドで３分間固定した。エタノール／アセトン（５０：５０ｖ／ｖ）で１分間処理後、細胞表面を風乾し、０．０１％ナフトールＡＳ−ＭＸホスファート（Ｓｉｇｍａ）及び０．０３％ファーストレッドバイオレットＬＢ塩（Ｓｉｇｍａ）を含む酢酸緩衝剤（０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０）中で５０ｍＭ酒石酸ナトリウムの存在下で室温で１０分間温置した。３個を超える核を含むＴＲＡＰ陽性多核細胞を計数することによって、各ウェルの破骨細胞様ＴＲＡＰ陽性細胞を採点した。
【０１５２】
ＲＤ誘導体は、破骨細胞の分化を著しく阻害し、αｖβ３に対するその抑制活性と相関した（表５）。一方、ＡＫＧＤＷＮ及びＰＲＧＥＭＰは、インテグリンαｖβ３及び破骨細胞分化の阻害にそれほど有効ではなかった（表５）。
【０１５３】
【表５】
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【実施例８】
【０１５４】
卵巣切除誘発性骨粗しょう症
雌性スプレーグドーリーラット（３月齢、２７０−２９０ｇ）又はＩＣＲマウス（４週齢、２２−２８ｇ）をこの試験に用いた。トリクロロアセトアルデヒド麻酔下でラット又はマウスの両側の卵巣を切除し（ＯＶＸ）、対照ラットを比較のために偽手術した（Ｓｈａｍ）。動物をすべて室温（２２±１℃）及び１２時間明暗サイクルの制御条件下で維持した。動物にＰｕｒｉｎａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｒｏｄｅｎｔ  Ｄｉｅｔ（ＰＭＩ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）（０．９５％カルシウム）及び水を自由に摂らせた。ラットの体重を毎週記録した。
【実施例９】
【０１５５】
骨密度（ＢＭＰ）及び骨塩量（ＢＭＣ）の分析
実験の最後に、ラット又はマウスを断頭して屠殺した。けい骨及び大腿骨を取り出し、軟部組織を除去し、けい骨及び大腿骨の長さ及び重量をＷｅｉｎｒｅｂ等［２６］によって記述されたように精密ノギス（±０．０５ｍｍ）で測定した。けい骨のＢＭＤ及びＢＭＣを二重エネルギーＸ線吸収測定器（ＤＥＸ、ＸＲ−２６；  Ｎｏｒｌａｎｄ、Ｆｏｒｔ  Ａｔｋｉｎｓｏｎ、ＷＩ）によって測定した。小対象測定用モードを使用した。Ｃｈｉｈ−Ｈｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  Ｆｉｂｒｉｌｌｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｂｏｎｅ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｂａｓｉｃ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  ｖｉａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｃ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  Ｒａｔ  Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ，”  Ｍｏｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ：  ６６：  ４４０−４４９，  （２００４）を参照されたい。腰椎ファントムについてＢＭＤを１年以上毎日測定して０．７％の変動係数が計算された［２２、２３］。吸光光度計によってけい骨及び大腿骨全体を走査し、ＢＭＤ及びＢＭＣを測定した。
【実施例１０】
【０１５６】
骨の組織形態計測
けい骨を４％ホルムアルデヒドで固定し、次いで１２％ＥＤＴＡを用いて脱灰し、エタノール溶液、次いでアセトンで脱水し、パラフィンで包埋した。連続切片（５ｍｍ）を長軸方向に切断し、マイヤーのヘマトキシリン−エオシン溶液で染色した。成長板及び近位けい骨の像をオリンパス顕微鏡によって写真撮影した。骨体積を二次海綿骨において画像解析ソフトウェア（Ｉｍａｇｅ−ｐｒｏ  ｐｌｕｓ  ３．０）を用いて測定した。二次海綿骨は、一次海綿骨の下に位置し、より大きい骨梁のネットワークを特徴とする。破骨細胞数を測定するために、切片を酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）で染色した。
【実施例１１】
【０１５７】
生体力学的三点曲げ試験
材料試験システム（ＭＴＳ−８５８、ＭＴＳ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｃ．、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）において三点曲げ試験を実施して、骨組織の機械的性質を測定した。２個の支持点間の距離は２０ミリメートルであり、変形速度は１ｍｍ／ｍｉｎであった。荷重／変形曲線をコンピュータに入力し、Ｔｅａｍ  ４９０ソフトウェア（バージョン４．１０、Ｎｉｃｏｌｅｔ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）によって分析した。断面パラメータを写真から測定して、断面慣性モーメントの計算に用いた。断面が楕円形であると仮定して断面慣性モーメントを計算した［２４］。
【０１５８】
Ｉ＝π［（ａｂ３×（ａ×２ｔ）（ｂ×２ｔ）３）／６４
式中、ａは内外方向の断面幅であり、ｂは体軸方向の断面幅であり、ｔは皮質の厚さの平均である。これらのパラメータはすべてイメージソフトウェアＩｍａｇｅ  Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ  ３．０  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ、ＭＤ）を用いて得られた。最大応力、極限応力及び弾性率（ヤング率）を以下の式によって計算した［２５］。
σ＝ＦＬｃ／４ｌ
Ｅ＝Ｆ／ｄ  ∋  Ｌ３／４８ｌ
式中、σは極限応力であり、ｃは質量中心からの距離であり（上述したように１／２ｂに等しい。）、Ｆは負荷荷重（Ｎ）であり、ｄは変位（ｍｍ）であり、Ｌは、折り曲げ具の２個の支持点間の距離（ｍｍ）である。また、極限応力におけるエネルギーを、それぞれの応力ひずみ曲線下面積を計算することによって測定した。
【実施例１２】
【０１５９】
マウスにおけるＲＤ誘導体によるＯＶＸ誘発性骨量減少の抑制
骨量減少に対するＲＤ誘導体の効果を検討するために、実施例８に記載のように、雌性マウスにおいて卵巣切除（ＯＶＸ）によって骨粗しょう症を誘発させた。ＯＶＸマウスは、全身のＢＭＤ及びＢＭＣの減少を示した。ＲＤ誘導体（Ｉ．Ｍ．、１．５ｍｇ／ｋｇ／隔日）又はアレンドロナート（ｐ．ｏ．、１．５ｍｇ／ｋｇ／隔日）による２週間の処置は、ＢＭＤ及びＢＭＣの減少を抑制した（表６）。コラーゲンのＣ末端テロペプチドの血中濃度は、破骨細胞活性を反映し得る。表６に示すように、ＲＤ誘導体又はアレンドロナートは、破骨細胞活性の卵巣切除誘発性増加も抑制した（表６）。ＲＤ誘導体の一部は、アレンドロナートよりもはるかに有効であると考えられた。また、週１回２週間のＲＤ処置（Ｉ．Ｍ．、１．５ｍｇ／ｋｇ）も、ＢＭＤ及びＢＭＣの減少を抑制した（表６）。これらのデータによれば、ＲＤ及びその誘導体は、骨粗しょう症をより長い投薬間隔で抑制することができる。
【０１６０】
【表６】
0005908666.tif 000007
【実施例１３】
【０１６１】
ラットにおけるＰＧ０  Ｐ及びＲＤ誘導体による卵巣切除誘発性骨量減少の抑制
ＰＧＰ（ＲＤ誘導体）を選択して、ラットにおける卵巣切除（ＯＶＸ）誘発性骨量減少からの保護をより詳細に検討した。実施例８のように、成体雌性ラット（３月齢）の卵巣を切除し、実施例９−１１のように、骨体積を卵巣切除から６週間後に測定した。ＰＧＰタンパク質は、卵巣切除誘発性骨体積減少と破骨細胞数増加の両方を抑制することが判明した。
【０１６２】
図２Ａに示すように、偽手術ラット（Ｓｈａｍ）と比較して、卵巣切除（ＯＶＸ）は、海綿骨をかなり減少させた。しかし、ＰＧＰ処置（ＩＶ、０．３ｍｇ／ｋｇ／日又はＩＭ、１．５ｍｇ／ｋｇ／隔日）は、二次海綿骨における海綿骨の卵巣切除誘発性減少をかなり抑制した。
【０１６３】
図２Ｂにおいては、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）染色によって、破骨細胞が海綿骨周辺に主に局在し、ＰＧＰが破骨細胞形成におけるＯＶＸ誘発性増加を抑制することが判明した。
【０１６４】
ＯＶＸラットは、実験の最後に体重増加も示した。ＰＧＰ処置（Ｉ．Ｖ．、０．３ｍｇ／ｋｇ／日又はＩ．Ｍ．、１．５ｍｇ／ｋｇ／隔日）は、体重のＯＶＸ誘発性増加をかなり抑制した。
【０１６５】
ラットは、卵巣切除から６週間後に大腿骨とけい骨の両方の湿重量、ＢＭＤ及びＢＭＣも減少した（表７）。ＰＧＰ処置（Ｉ．Ｖ．又はＩ．Ｍ．）は、ＯＶＸラットにおいてけい骨と大腿骨の両方の湿重量、ＢＭＤ及びＢＭＣの減少を抑制した。組織形態計測によって、卵巣切除が二次海綿骨において海綿骨減少を起こすことが示された（図２）。ＰＧＰ処置は、骨体積減少を著しく逆転させた（図２及び表７）。また、ＴＲＡＰ染色によって、破骨細胞が海綿骨周辺に主に局在し、ＯＶＸが破骨細胞数を増加させることが示された。ＰＧＰの長期投与は、ＯＶＸ誘発性破骨細胞形成に拮抗した（図２及び表７）。コラーゲンのＣ末端テロペプチドの血清レベルは、破骨細胞活性を反映する。値は、Ｓｈａｍ群よりもＯＶＸ群で著しく増加したのに対して、ＰＧＰ処置は破骨細胞活性のＯＶＸ誘発性増加に効果的に拮抗することが判明した（表７）。
【０１６６】
【表７】
0005908666.tif 000008
0005908666.tif 000009
【０１６７】
大腿骨の三点曲げ試験を実施して、大腿骨の機械的活性を調べた。偽手術群と比較して、最大荷重、極限荷重、ヤング率及び極限応力はＯＶＸラットで減少した。ＰＧＰ処置は、骨強度のＯＶＸ誘発性減少に対して保護作用を示した（表８）。これらの結果は、ＰＧＰ様タンパク質薬物が、卵巣切除に起因する骨量減少を顕著に抑制し得ることを示唆している。
【０１６８】
【表８】
0005908666.tif 000010
【実施例１４】
【０１６９】
ＲＤタンパク質の後処置は、ＯＶＸ誘発性破骨細胞活性化を阻害した
破骨細胞活性に対するＲＤ誘導体の動的治療効果を生体内で検討するために、骨粗しょう症を雌性ラットにおいて卵巣切除によって誘発させ、Ｉ型コラーゲンのＣ末端テロペプチドを血液から異なる間隔で測定した。偽手術ラット（Ｓｈａｍ）に比較して、卵巣切除（ＯＶＸ）は、破骨細胞活性をかなり増大させた。ＣＯＬ（１）α１鎖のＣ末端テロペプチドの血清レベルの測定によれば、ＯＶＸラットにおける破骨細胞活性が増大した。Ｉ型コラーゲンのＣ末端テロペプチドは、卵巣切除から２８日後に、３６１±２５．６（ｎ＝１５）の基底レベルから７０８±５０．７ｎｇ／ｍｌ（ｎ＝１５）に増加した。
【０１７０】
次いで、ＲＤ又はアレンドロナートを卵巣切除から１か月後に後処置した。ＲＤ（Ｉ．Ｍ．、１．５ｍｇ／ｋｇ／隔日）又はアレンドロナート（ｐ．ｏ．、１．５ｍｇ／ｋｇ／隔日）による後処置は、破骨細胞活性の卵巣切除誘発性増加を逆転させ、ＲＤはアレンドロナートよりもはるかに有効であった（図３）。破骨細胞活性は、ＲＤ又はアレンドロナート処置を中止すると回復した。破骨細胞活性の回復は、ＲＤ処置群よりもアレンドロナート処置群がはるかに速かった。しかし、ＲＤを再適用すると、破骨細胞活性の卵巣切除誘発性増加を効果的に抑制した。ＲＤ処置に応答した破骨細胞の値は、アレンドロナート処置に応答した破骨細胞の値よりもはるかに低かった（図３）。これらの結果によれば、ＲＤ関連タンパク質は、卵巣切除誘発性破骨細胞活性化に起因する骨量減少に対して治療効果を有する。
【０１７１】
第２の薬物処置期間後、ラットを屠殺し、けい骨及び大腿骨のＢＭＤ及びＢＭＣを測定した。表９に示すように、ＲＤの後処置は、卵巣切除の骨量減少効果を有効に逆転させた。骨体積の維持に関しては、ＲＤはアレンドロナートよりも有効であった。
【０１７２】
【表９】
0005908666.tif 000011
【実施例１５】
【０１７３】
骨関節炎動物におけるＲＤによる軟骨細胞損傷の阻害
雄性スプレーグドーリーラットの右膝のみの手術によって、骨関節炎動物モデルを得た。手術は、前十字靭帯（ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｃｒｕｃｉａｔｅ  ｌｉｇａｔｉｏｎ）処置及び部分的内側半月板切除を含んだ。手術後、手術から６週間後にラットを屠殺した最終日まで、ＲＤタンパク質を筋肉内経路（１．５ｍｇ／ｋｇ／隔日）又は局所的関節内注射（１回／週）によって投与した。各関節をパラフィン蝋で包埋し、薄片を作製し、０．１％サフラニン−Ｏ及びヘマトキシリンで染色した。図４Ｂに示すように、右膝関節の軟骨細胞層は、関節炎による損傷を受け、筋肉内注射（図４Ｄ）又は局所投与（図４Ｃ）のＲＤは、軟骨細胞層破壊を抑制した。
【実施例１６】
【０１７４】
骨関節炎ラットにおけるＲＤによる血液サイトカイン上昇の抑制
上述したように、骨関節炎ラットを手術によって作製した。手術から６週間後、血清を得て、サイトカインの血中濃度を測定した。図５Ａ−５Ｃに示すように、Ｃ反応性タンパク質、ＩＬ−１β、ＩＬ−６などのサイトカインの血清レベルは、骨関節炎ラットにおいて増加し、ＲＤ投与は、サイトカインの骨関節炎誘発性上昇を著しく抑制した。
【実施例１７】
【０１７５】
骨関節炎マウスにおけるＲＤによる血液サイトカイン上昇の抑制
上述したように、骨関節炎マウスを手術によって作製した。手術から６週間後、血清を得て、サイトカインレベルを測定した。図６Ａ−６Ｃに示すように、Ｃ反応性タンパク質、ＩＬ−１  ？、ＩＬ−６などのサイトカインの血清レベルは、骨関節炎マウスにおいて増加し、ＲＤ投与は、サイトカインの骨関節炎誘発性上昇を著しく抑制した。
【実施例１８】
【０１７６】
マウスにおける前立腺又は乳癌細胞のけい骨内注射
動物隔離飼育器（ＩＶＣラック）中で特定病原体除去（ＳＰＦ）条件下で２２±２℃で飼育した体重２０−２２ｇ（６週齢）の重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）雄性マウス又はＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ／ｎｕ雄性マウスを用いた。ヒト前立腺腺癌ＰＣ−３細胞又はヒト乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（無菌ＰＢＳ  １５ｍｌ中１×１０６細胞）を１日目にそれぞれＳＣＩＤマウス又はヌードマウスの左右けい骨の骨髄に注射した。１１日目に、動物を３群に無作為に割り当て、試験物質投与を開始した。１日１回合計１５回（５日間投与、２日間休止で３週間）、ＲＤ（１．５ｍｇ／ｋｇ）を筋肉内（ＩＭ）注射によって投与し、アレンドロナート（１．５ｍｇ／ｋｇ）を皮下（ＳＣ）注射によって投与した。実験期間中、体重及び腫よう増殖状態を毎週観察し、記録した。１か月後、マウスを屠殺し、後肢の重量を測定した。対照肢の重量を減算して、相対腫よう重量とした。また、赤血球（ＲＢＣ）、白血球（ＷＢＣ）及び血小板の血球算定、並びにＩ型コラーゲンのＣ末端テロペプチド（ＣＴＸ）及び血清カルシウム濃度の測定のために、血液試料を実験の最後に収集した。
【０１７７】
骨溶解を確認するために、Ｘ線像を軟Ｘ線発生装置（Ｙｏｕｎｇ−ｋｉｄ  Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．、Ｔａｉｐｅｉ、Ｔａｉｗａｎ）によって撮影した。動物にトリクロロアセトアルデヒド一水和物によって深麻酔をかけ、Ｋｏｄａｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇフィルム（１３×１８ｃｍ）上に腹臥位で横たえ、４５ｋＶで５秒間Ｘ線露光を実施した。骨溶解度を画像解析ソフトウェア（Ｉｍａｇｅ−ｐｒｏ  ｐｌｕｓ  ３．０）を用いて測定した。
【実施例１９】
【０１７８】
骨及び高カルシウム血症における腫よう増殖の阻害
骨中の腫よう細胞増殖は、骨吸収活性と関係がある。したがって、骨中の前立腺癌細胞の腫よう増殖に対するＲＤタンパク質の効果を調べた。ＰＣ−３細胞（１×１０６）をＳＣＩＤマウスの両方のけい骨の骨髄腔に局所注射した。腫よう細胞移植から１０日後にＲＤ又はアレンドロナートを投与した。１日１回合計１５回（５日間投与、２日間休止で３週間）、ＲＤ  １．５ｍｇ／ｋｇを筋肉内（ＩＭ）経路によって投与し、アレンドロナートを１．５ｍｇ／ｋｇで皮下（ＳＣ）注射によって投与した。３３日目に、腫よう増殖を示す後肢の膨潤を計算した。実験期間を通して体重を測定した。その結果、ＲＤ  １．５ｍｇ／ｋｇは、３３日目に後肢の腫よう細胞誘発性膨潤をかなり抑制した（４３．８±４．１％、ｎ＝２１−２２）（図７）。しかし、アレンドロナート１．５ｍｇ／ｋｇの皮下投与は後肢の腫よう増殖を抑制しなかった（図７）。
【０１７９】
図８は、ＳＣＩＤマウスにおける腫よう増殖に応じた体重減少に対するＲＤの効果である。未処置対照マウスは、実験の最後に体重減少を示した。ＲＤ処置は、腫よう増殖に起因する体重減少を防止した。アレンドロナートを正の対照として使用した。
【０１８０】
図９は、ＳＣＩＤマウスにおけるＲＤによる腫よう増殖及び溶骨性骨病変の阻害を示す。骨溶解を確認するために、Ｘ線像を軟Ｘ線発生装置によって撮影した。図９Ａにおいて、写真は、ＰＣ−３細胞のけい骨内注射から３３日後に撮影された。可視球状腫ようは、近位けい骨から成長した。ＲＤ処置（Ｉ．Ｍ．、１．５ｍｇ／ｋｇ／隔日）は腫よう増殖を阻害した。図９Ｂにおいて、３３日目に撮影したＸ線像によれば、癌細胞を注射したけい骨に溶骨性病変部が出現し、ＲＤ処置は骨溶解を抑制した。図９Ｃは、データを定量化したものである。図９Ｄは、ＥＬＩＳＡ法によって、ＲＤがタイプ−コラーゲン（破骨細胞活性マーカー）のＣ末端テロペプチドにおける腫よう誘発性増加を抑制したことを示す。図９Ｅによれば、ＲＤ及びアレンドロナート（１．５ｍｇ／ｋｇ／隔日）は、血清カルシウム濃度の腫よう誘発性増加（すなわち、高カルシウム血症）も抑制した。＊：対照に比べてｐ＜０．０５。＃：ＰＣ−３注射群に比べてｐ＜０．０５。
【０１８１】
乳癌は、骨に転移する傾向が強い。図１０は、ヌードマウスにおけるＲＤによる腫よう増殖の阻害を示す。ヒト乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（１×１０６）をヌードマウスの両方のけい骨の骨髄腔に局所注射した。腫よう細胞移植から１０日後にＲＤ（Ｉ．Ｍ．、１ｍｇ／ｋｇ／日）を合計１４日間投与した。２週間のＲＤ処置（ＩＭ、１．５ｍｇ／ｋｇ／日）は、骨中の腫よう増殖のＭＤＡ−ＭＢ−２３１誘発性増加を抑制した（図１０Ａ）。また、ＲＤは、破骨細胞活性（図１０Ｂ）及び高カルシウム血症（図１０Ｃ）の腫よう誘発性増加も抑制したが、ＲＢＣ、ＷＢＣ及び血小板の血球算定には影響を及ぼさなかった（図１０Ｄ−１０Ｆ）。＊：対照に比べてｐ＜０．０５。＃：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１注射群に比べてｐ＜０．０５。
【実施例２０】
【０１８２】
ＲＤタンパク質のポリエチレングリコール化
ポリエチレングリコール化生成物、又はアルブミンとの複合化は、持続時間を延長し、タンパク質薬物の抗原性を減少させることができる。ＲＤタンパク質の抗原性を最小化し、持続時間を延長するために、ポリエチレングリコール化ＲＤタンパク質を以下のように調製した。ｐＨ５の２０ｍＭ  ＮａＣＮＢＨ３中のＲＤタンパク質（４ｍｇ）を５ｍＭ  ＰＥＧｋ５−プロピオンアルデヒド（Ｏ−メチル−Ｏ’−［２−（６−オキソカプロイルアミノ）エチル］ポリエチレングリコール５，０００）（Ｓｉｇｍａ）と４℃で１２時間反応させた。ポリエチレングリコール化ＲＤタンパク質を逆相Ｃ１８  ＨＰＬＣによって精製した。精製後のポリエチレングリコール化ＲＤタンパク質の最終収率は、６０％を超えた。
【０１８３】
表６に示すように、ポリエチレングリコール化ＲＤは、破骨細胞の分化を阻害した。また、２週間のポリエチレングリコール化ＲＤ処置（Ｉ．Ｍ．、１．５ｍｇ／ｋｇ、週１回）は、ＢＭＤ及びＢＭＣの減少を抑制した（表６）。これらのデータによれば、ポリエチレングリコール化ＲＤは、その活性を生体内で失わなかった。
【実施例２１】
【０１８４】
ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）栓血管新生抑制アッセイ
インテグリンαｖβ３は血管新生に関係することが報告された。したがって、ＲＤタンパク質が血管新生を阻害し得るかどうかを、既報のものに軽微な改変を加えてＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）栓血管新生アッセイによって検討した［３２］。手短に述べると、２００ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦを含むＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂ．）の一定分量（５００μｌ）を６−８週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスの背部に皮下注射した。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）は、急速に栓を形成した。ＲＤを毎日（ＲＤ／１日）又は先日（ＲＤ／２日又はＨＳＡ−ＲＤ）筋肉内投与し（３ｍｇ／ｋｇ）、その後屠殺した。８日後、栓を取り、写真撮影した（図１１Ａ）。ドラブキン法及びドラブキン試薬キット５２５（Ｓｉｇｍａ）を用いて、栓のヘモグロビンを血管形成の指標として測定することによって、新生血管を定量化した（図１１Ｂ）。図１１Ａ及び１１Ｂに示すように、ＲＤタンパク質は、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）栓アッセイによって血管新生を阻害するのに有効であった。＊：対照群に対してＰ＜０．０５。
【実施例２２】
【０１８５】
放射性リガンド結合アッセイ：ＲＤ関連タンパク質の特異性
ＲＤ及びその誘導体ＰＧＰがαｖβ３インテグリンに加えて別の受容体に結合するかどうかを確認するために、ＲＤ及びその誘導体ＰＧＰを使用して、そのリガンドがタンパク質である受容体に対する標的特異性を分析した（ＭＤＳ  Ｐｈａｒｍａ  ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｔａｉｐｅｉ、Ｔａｉｗａｎによって評価された。）。
【０１８６】
表１０に示すように、ＲＤ及びＰＧＰは、カルシトニン、エンドセリンＥＴＡ、エンドセリンＥＴＢ、インスリン、レプチン、ナトリウムチャネル、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）、腫よう壊死因子（ＴＮＦ）及び血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）とそのそれぞれの受容体との結合活性に影響を及ぼさなかった。これは、ＲＤ関連タンパク質が標的タンパク質αｖβ３に対して生体内で選択的結合活性を発揮することを示している。
【０１８７】
【表１０】
0005908666.tif 000012
【実施例２３】
【０１８８】
未熟児網膜症マウスモデルにおけるＲＤによる血管新生阻害
Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ−Ｂｅｒｋａ  ｅｔ  ａｌ．［２８］に記載のように低酸素誘発性血管新生によって、マウスにおける未熟児網膜症の動物モデルを作製した。手短に述べると、７日齢の子及びその母を、７５％Ｏ２及び空気を含む密閉チャンバーに収容した。マウスを密閉チャンバー内に５日間置き（過酸素期間、Ｐ７からＰ１２）、次いで室内気中に更に７日間収容した（低酸素誘発性血管形成期間、出生後１２日から出生後１９日、すなわちＰ１２からＰ１９）。１２日目にＲＤ（２μｇ）を硝子体内経路を介して投与し、１９日目にマウスを屠殺した。
【０１８９】
各動物の眼の一方から３切片を作製し、脱パラフィンし、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。網膜内層の血管プロファイル（ＢＶＰ）を数えた。血管プロファイル（ＢＶＰ）は、内境界膜に付着した血管を含んだ。計数を写真用顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）を用いて倍率１００×で実施した。
【０１９０】
図１２Ａに示すように、ＲＤタンパク質は、未熟児網膜症（ＲＯＰ）マウスモデルにおける血管新生を阻害した。図１２Ｂは、ＲＤタンパク質で処置した未熟児網膜症（ＲＯＰ）マウスモデルにおけるＢＶＰの減少を示す。３個のヘマトキシリン・エオシン染色切片から、網膜内層の硝子体腔に伸びる血管プロファイル（ＢＶＰ）を数えて、血管新生を定量した。ＲＤ（２μｇ）で処置したＲＯＰ群（すなわち、ＲＯＰ＋ＲＤ）は、ビヒクルで処置したＲＯＰ群（ＲＯＰ）に比較して、血管新生の約４６％を減少させた。（各ＲＯＰ群ｎ＝７、ｓｈａｍ群ｎ＝２）データを平均±ＳＥとして示す。＃：ｓｈａｍ群に比べてｐ＜０．０１。＊＊：ＲＯＰ群に比べてｐ＜０．００１。
【実施例２４】
【０１９１】
アルブミン複合化ＲＤによる卵巣切除誘発性骨粗しょう症の阻害
骨粗しょう症に対するアルブミン複合化ＲＤの効果を、卵巣切除した雌性マウスにおいて検討した。ヒト血清アルブミン複合化ＲＤ（すなわち、ＲＤ−アルブミン）を、図１３Ａ及び１３Ｂの矢印で示すように投与した。ＲＤのデータを図１３Ａ−１３Ｄに比較のために入れた。Ｉ型コラーゲンのＣ末端ペプチド及びアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の血清レベルを、それぞれ破骨細胞及び骨芽細胞活性の指標として測定した。図１３Ｃ及び１３Ｄに示すように、ＢＭＤ及びＢＭＣも２週間ごとに測定した。ＲＤ−アルブミン処置（１５ｍｇ／ｋｇ／週）は、破骨細胞を著しく減少させたが、ＡＬＰ、活性を可逆的に増加させた。
【実施例２５】
【０１９２】
ＲＤによるリウマチ様関節炎の阻害
リウマチ様関節炎は、進行性関節破壊をもたらす浸潤性滑膜過形成を特徴とする原因不明の慢性全身的炎症性障害である。単球／マクロファージ系列に由来する破骨細胞は、リウマチ様関節炎における軟骨下骨破壊において重大な役割を果たす。Ｘ線撮影による研究によれば、リウマチ様関節炎においては、軟骨下骨の骨減少及び骨びらんが疾患初期に始まり、徐々に悪化する［２９］。骨を吸収する破骨細胞は、びらん性の滑膜／骨界面に認められる［３０］。最近の総説は、リウマチ様関節炎における破骨細胞の役割を考察している［３１］。したがって、破骨細胞の機能を著しく阻害するＲＤ関連タンパク質は、リウマチ様関節炎の治療に有用であり得る。
【０１９３】
ＬｅｗｉｓラットにウシＩＩ型コラーゲン（フロイント不完全アジュバント中２ｍｇ／ｍｌ）を皮内／皮下（ＳＣ）注射する。ラットがリウマチ様疾患を発症したら、幾つかの試験群に無作為に分割する。例えば足関節の膨潤によって明らかである、関節炎の臨床徴候が明確に見えた初日に治療を開始する。足の体積を測定後、ラットを屠殺し、組織病理学的変化を検討するために足首及び膝関節を収集する。
【０１９４】
図１４Ａ−Ｄは、Ｒｈｏ及びその変種のアミノ酸配列、それぞれ配列番号１及び５７−６９を示す。図１５Ａ−Ｃは、ロドストミン変種のヌクレオチド配列、配列番号４３−５６を示す。図１６Ａ−Ｈは、ディスインテグリン変種のアミノ酸及びヌクレオチド配列、配列番号７８−１３５を示す。
【０１９５】
本発明の例示的実施形態の上記記述は、単なる説明及び記述のためのものに過ぎず、網羅的なものではなく、開示した正確な形式に本発明を限定するものでもない。上記教示に照らして、多数の改変及び変更が可能である。
【０１９６】
本明細書の考察、及び本明細書に開示する本発明の実施から、本発明の別の実施形態が当業者に明白となるはずである。本明細書及び実施例は、以下の特許請求の範囲に記載の本発明の正確な範囲及び精神をもって、単なる例示と考えられることが意図される。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１６Ｆ】
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【図１６Ｇ】
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【図１６Ｈ】
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【配列表】
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