(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
0005863651.tif 000015
〔式中、ｎは１を示す。なお、式中、ＣｙｓとＣｙｓとの結合は、ペプチド結合またはジスルフィド結合を意味し、それ以外の結合はペプチド結合を意味する。〕
で表される環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩。
【請求項２】
式（Ｉ）において、ＣｙｓとＣｙｓとがジスルフィド結合によって結合していることを特徴とする、請求項１に記載の環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩。
【請求項３】
式（Ｉ）：
【化２】
0005863651.tif 000016
〔式中、ｎは１を示す。なお、式中、ＣｙｓとＣｙｓとの結合は、ペプチド結合またはジスルフィド結合を意味し、それ以外の結合はペプチド結合を意味する。〕で表される環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩の製造方法であって、
式（ＩＶ）：
【化３】
0005863651.tif 000017
〔式中、ｎは式（Ｉ）におけるｎと同じである〕
で表される化合物を環化させることを特徴とする環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩の製造方法。
【請求項４】
環状ペプチド化合物が、式（Ｉ）において、ＣｙｓとＣｙｓとがジスルフィド結合によって結合している化合物であって、式（ＩＶ）で表される化合物の両末端のシステインのチオール基を酸化架橋することで環化させることを特徴とする請求項３に記載する製造方法。
【請求項５】
請求項１または２に記載する環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩を有効成分とする経口投与形態を有する医薬組成物。
【請求項６】
不全角化に起因する皮膚状態異常の改善、エピモルフィンの過剰発現に起因する疾患の予防または治療、慢性閉塞性動脈硬化症状の予防または治療、バージャー病の予防または治療、及び損傷臓器の治療からなる群から選択される少なくとも１つの用途に使用される請求項５に記載する医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩およびその製造方法に関する。さらに詳しくは、不全角化を起因とする皮膚の状態異常の予防、治療または改善に有用な環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの表皮は、下層から順に、基底層と有棘層と顆粒層と角質層とからなる。ヒトの正常な皮膚では、前記角質層は、バリア機能を発現し、物理的刺激や化学的刺激から皮膚を保護している。【０００３】
正常な皮膚は、通常、２８日間の周期でターンオーバーする。正常な皮膚のターンオーバーでは、ケラチノサイトが顆粒層から角質層へと押し上げられる。このとき、ケラチノサイトの分化により脱核が生じて有核細胞が消失し、成熟した角質層が形成される。しかしながら、ターンオーバーが早すぎる場合などには、最終分化段階のケラチノサイトにおいて、脱核が起こらず、角質層が不全角化の状態となり、皮膚のバリア機能が著しく低下する。このような不全角化と同様の状態は、オレイン酸を皮膚に塗布することによっても引き起こされる（非特許文献１）。【０００４】
一方、エピモルフィンは、上皮組織の形態形成の制御に関与している因子の１つであると考えられている（非特許文献２〜５）。また、前記エピモルフィンのノックアウトにより、マウスにおける癌化誘導が減少することが報告されている（例えば、非特許文献６を参照）。【０００５】
前記上皮組織の形態形成を制御するために、エピモルフィンにより奏される上皮組織の形態形成促進作用を阻害するオリゴペプチドが提案されている（例えば、特許文献１および２を参照）。【０００６】
しかしながら、上皮組織の形態形成促進作用に対する前記オリゴペプチドの阻害作用は、上皮組織の形態形成を制御するには不十分であるため、エピモルフィンによって引き起こされる皮膚などの上皮細胞の形態・分化異常の発生などを高効率で抑制することができるさらに有用な化合物が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平１０−７６９８号公報
【特許文献２】特許第３９２２３４５号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】エクスペリメンタル・デルマトロジー（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ）、１９９７年、第６巻、ｐ．２９−３５
【非特許文献２】ザ・ジャーナル・オブ・デルマトロジー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ）、１９９１年、第１８巻、ｐ．３９７−４０１
【非特許文献３】セル（Ｃｅｌｌ）、１９９２年、第６９巻、ｐ．４７１−４８１
【非特許文献４】ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、１９９８年、第１４０巻、ｐ．１５９−１６９
【非特許文献５】ネイチャー・レビュー・モレキュラー・セル・バイオロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、２００９年、第１０巻、ｐ．２２８−２３４
【非特許文献６】アニサ・シェーカー（Ａｎｉｓａ  Ｓｈａｋｅｒ）ら、「エピモルフィン欠損は、炎症誘導性結腸癌発生からマウスを守るとともに、幹細胞ニッチ筋線維芽細胞分泌を変える（Ｅｐｉｍｏｒｐｈｉｎ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｍｉｃｅ  ｆｒｏｍ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ａｌｔｅｒｓ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｎｉｃｈｅ  ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ）」、ザ・ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）、２０１０年５月１０日、第１２０巻、ｐ．２０８１−２０９３
【非特許文献７】ラボラトリー・インベスティゲーション（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）、２０１０年、第９０巻、ｐ．８６７−８８０
【非特許文献８】キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２００５年、第６５巻、ｐ．８６１７−８６２１
【非特許文献９】ディベロプメンタル・バイオロジー（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、２００６年、第２９１巻、ｐ．２５−３７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、エピモルフィンまたはオレイン酸によってヒトの皮膚に引き起こされる皮膚の状態の異常の発生を抑制することができる環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩を提供することを目的とする。また、本発明は、前記環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩を簡便に製造することができる環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
すなわち、本発明の要旨は、
（１）  式（Ｉ）：【００１１】
【化１】
0005863651.tif 000002
【００１２】
〔式中、Ｘａａ1およびＸａａ5はそれぞれ独立して、置換基を有してもよいセリル基、置換基を有してもよいスレオニル基または置換基を有してもよいチロシニル基、Ｘａａ2は置換基を有してもよいイソロイシル基、置換基を有してもよいバリル基または置換基を有してもよいロイシル基、Ｘａａ3およびＸａａ4はそれぞれ独立して、置換基を有してもよいアスパラギニル基、置換基を有してもよいグルタミニル基、置換基を有してもよいアスパラチル基または置換基を有してもよいグルタミル基、Ｃｙｓはシステイニル基、Ｒ1は式（ＩＩ）：【００１３】
【化２】
0005863651.tif 000003
【００１４】
（式中、ｎは１〜１０の整数を示す）
で表される基または式（ＩＩＩ）：【００１５】
【化３】
0005863651.tif 000004
【００１６】
（式中、ｎは１〜１０の整数を示す）
で表される基を示す。なお、式中、ＣｙｓとＣｙｓとの結合は、ペプチド結合またはジスルフィド結合を意味し、それ以外の結合はペプチド結合を意味する。〕
で表される環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩、
（２）  式（Ｉ）において、Ｘａａ1がセリル基、Ｘａａ2がイソロイシル基、Ｘａａ3がグルタミル基、Ｘａａ4がグルタミニル基、Ｘａａ5がセリル基であり、Ｒ1が式（ＩＩＩ）で表される基であり、ｎが１である前記（１）に記載の環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩、ならびに
（３）  式（Ｉ）：【００１７】
【化４】
0005863651.tif 000005
【００１８】
〔式中、Ｘａａ1およびＸａａ5はそれぞれ独立して、置換基を有してもよいセリル基、置換基を有してもよいスレオニル基または置換基を有してもよいチロシニル基、Ｘａａ2は置換基を有してもよいイソロイシル基、置換基を有してもよいバリル基または置換基を有してもよいロイシル基、Ｘａａ3およびＸａａ4はそれぞれ独立して、置換基を有してもよいアスパラギニル基、置換基を有してもよいグルタミニル基、置換基を有してもよいアスパラチル基または置換基を有してもよいグルタミル基、Ｃｙｓはシステイニル基、Ｒ1は式（ＩＩ）：【００１９】
【化５】
0005863651.tif 000006
【００２０】
（式中、ｎは１〜１０の整数を示す）
で表される基または式（ＩＩＩ）：【００２１】
【化６】
0005863651.tif 000007
【００２２】
（式中、ｎは１〜１０の整数を示す）
で表される基を示す。なお、式中、ＣｙｓとＣｙｓとの結合は、ペプチド結合またはジスルフィド結合を意味し、それ以外の結合はペプチド結合を意味する。〕
で表される環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩の製造方法であって、式（ＩＶ）：【００２３】
【化７】
0005863651.tif 000008
【００２４】
〔式中、Ｘａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、ＣｙｓおよびＲ1は式（Ｉ）におけるＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、ＣｙｓおよびＲ1と同じである〕
で表される化合物を環化させることを特徴とする環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩の製造方法
に関する。
【発明の効果】
【００２５】
本発明の環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩は、エピモルフィンに対し拮抗的に作用し、その生理活性を制御する。したがって、本発明の環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩によれば、エピモルフィンまたはオレイン酸によってヒトの皮膚に引き起こされる皮膚の状態の異常の発生を抑制することができるという優れた効果が奏される。本発明の環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩は、前記効果に基づき、医薬品の有効成分として有用である。また、本発明の環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩は、エピモルフィンの機能もしくは特性を解明または検証する実験系において、エピモルフィンの活性を制御、特に抑制するための試薬として用いることができる。さらに、エピモルフィンの拮抗剤として、エピモルフィンまたはエピモルフィン作用剤の活性や作用を評価するための試薬や対照薬として用いることができる。また、本発明の環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩の製造方法によれば、前記環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩を簡便に製造することができるという優れた効果が奏される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】参考例１において、ＨａＣａＴ細胞における内因性エピモルフィンの発現量とオレイン酸との関係を調べた結果を示す図面代用写真である。
【図２】参考例２において、ＨａＣａＴ−ＴＥ細胞の培養上清およびＰＴ６７−ＴＥ細胞の培養上清それぞれにおける分泌エピモルフィンの量とオレイン酸との関係を調べた結果を示す図面代用写真である。
【図３】実施例１において、ペプチドのマススペクトルを示すチャートである。
【図４】実施例１において、酸化後のペプチドのマススペクトルを示すチャートである。
【図５】（Ａ）は、試験例２において、実験番号：１１の培地を用いたときの細胞クラスターの形態を観察した結果を示す図面代用写真、（Ｂ）は実験番号：１０の培地を用いたときの細胞クラスターの形態を観察した結果を示す図面代用写真である。
【図６】試験例２において、培地の種類と内腔形成率との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図７】（Ａ）は、試験例３において、実験番号：１５の培地を用いたときの細胞クラスターの形態を観察した結果を示す図面代用写真、（Ｂ）は、実験番号：１４の培地を用いたときの細胞クラスターの形態を観察した結果を示す図面代用写真である。
【図８】試験例３において、培地の種類と内腔形成率との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図９】試験例４において、培地の種類とコーニファイドエンベロープ形成率との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図１０】試験例５において、培地の種類または細胞の種類とコーニファイドエンベロープ形成率との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図１１】試験例６において、試料の種類と表皮の厚さとの関係を調べた結果を示すグラフである。
【図１２】試験例６において、試料の種類と全細胞中の染色細胞の割合との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図１３】（Ａ）は、試験例７において、０．５体積％オレイン酸含有エタノール溶液を塗布せずに実験番号：３６の試料を塗布したときの細胞構造体の組織形態を観察した結果を示す図面代用写真、（Ｂ）は、試験例７において、０．５体積％オレイン酸含有エタノール溶液および実験番号：３７の試料を塗布したときの細胞構造体の組織形態を観察した結果を示す図面代用写真、（Ｃ）は、試験例７において、０．５体積％オレイン酸含有エタノール溶液および実験番号：３８の試料を塗布したときの細胞構造体の組織形態を観察した結果を示す図面代用写真、（Ｄ）は、試験例７において、０．５体積％オレイン酸含有エタノール溶液および実験番号：３９の試料を塗布したときの細胞構造体の組織形態を観察した結果を示す図面代用写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
１．環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩
本発明の環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩は、式（Ｉ）：
【００２８】
【化８】
0005863651.tif 000009
【００２９】
〔式中、Ｘａａ1およびＸａａ5はそれぞれ独立して、置換基を有してもよいセリル基、置換基を有してもよいスレオニル基または置換基を有してもよいチロシニル基、Ｘａａ2は置換基を有してもよいイソロイシル基、置換基を有してもよいバリル基または置換基を有してもよいロイシル基、Ｘａａ3およびＸａａ4はそれぞれ独立して、置換基を有してもよいアスパラギニル基、置換基を有してもよいグルタミニル基、置換基を有してもよいアスパラチル基または置換基を有してもよいグルタミル基、Ｃｙｓはシステイニル基、Ｒ1は式（ＩＩ）：
【００３０】
【化９】
0005863651.tif 000010
【００３１】
（式中、ｎは１〜１０の整数を示す）
で表される基または式（ＩＩＩ）：
【００３２】
【化１０】
0005863651.tif 000011
【００３３】
（式中、ｎは１〜１０の整数を示す）
で表される基を示す。なお、式中、ＣｙｓとＣｙｓとの結合は、ペプチド結合またはジスルフィド結合を意味し、それ以外の結合はペプチド結合を意味する。〕
で表される構造（配列番号：１）を有する。
【００３４】
本発明者らは、
（Ａ）  ヒトの皮膚モデルとオレイン酸との接触および前記皮膚モデル中における外因性エピモルフィンの発現それぞれにより、皮膚モデルにおいて、同様の組織形態の異常が生じること、および
（Ｂ）  Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys（配列番号：２）で示されるアミノ酸配列を含む直鎖状のペプチド（Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp、配列番号：３）は、エピモルフィンまたはオレイン酸によって引き起こされる皮膚モデルの組織形態の異常を抑制しないが、上記配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有するとともに、かかるアミノ酸配列からなるペプチドが当該ペプチド鎖中のシステイニル基とこのペプチド鎖に、ジスルフィド結合またはペプチド結合によって付加したシステイニル基と式（ＩＩ）で表される基とで環化させた環状ペプチド化合物やその薬理的に許容される塩は、前記組織形態の異常を抑制することを見出した。本発明は、これらの知見に基づくものである。
【００３５】
本発明の環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩は、式（Ｉ）で表される構造を有する点に１つの大きな特徴がある。このように、本発明の環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩は、分子内に上記配列番号：２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド鎖を当該ペプチド鎖中のシステイニル基とこのペプチド鎖に、ジスルフィド結合またはペプチド結合によって付加したシステイニル基と式（ＩＩ）または式（ＩＩＩ）で表される基とによって環化された構造を有しているので、エピモルフィンまたはオレイン酸によって引き起こされるヒトの組織などの状態の異常を抑制することができる。以下、エピモルフィンまたはオレイン酸によって引き起こされるヒトの組織などの状態の異常を抑制する作用を、単に「抑制作用」ともいう。
【００３６】
Ｘａａ1は、置換基を有してもよいセリル基、置換基を有してもよいスレオニル基または置換基を有してもよいチロシニル基である。前記置換基は、本発明の効果を阻害しない官能基であればよい。前記置換基としては、例えば、単糖または多糖から誘導されたチオグリコシル基、単糖または多糖から誘導されたＯ-グリコシル基、単糖または多糖から誘導されたＮ-グリコシル基、リン酸基などが挙げられる。前記Ｘａａ1のなかでは、前記抑制作用を十分に発現させる観点から、好ましくはセリル基である。
【００３７】
Ｘａａ2は、置換基を有してもよいイソロイシル基、置換基を有してもよいバリル基または置換基を有してもよいロイシル基である。前記置換基は、本発明の効果を阻害しない官能基であればよい。前記置換基としては、例えば、炭素数１〜３のアルキル基など、具体的にはメチル基、エチル基またはプロピル基が挙げられる。前記Ｘａａ2のなかでは、前記抑制作用を十分に発現させる観点から、好ましくはイソロイシル基である。
【００３８】
Ｘａａ3は、置換基を有してもよいアスパラギニル基、置換基を有してもよいグルタミニル基、置換基を有してもよいアスパラチル基または置換基を有してもよいグルタミル基である。前記置換基は、本発明の目的を阻害しない官能基であればよい。Ｘａａ3が置換基を有してもよいアスパラギニル基である場合、前記置換基としては、単糖または多糖から誘導されたチオグリコシル基、単糖または多糖から誘導されたＯ-グリコシル基、単糖または多糖から誘導されたＮ-グリコシル基などが挙げられる。Ｘａａ3が置換基を有してもよいグルタミニル基である場合、前記置換基としては、アミノ基などが挙げられる。Ｘａａ3が置換基を有してもよいアスパラチル基である場合、前記置換基としては、スクシンイミド基、リン酸基などが挙げられる。Ｘａａ3が置換基を有してもよいグルタミル基である場合、前記置換基としては、カルボキシル基などが挙げられる。前記Ｘａａ3のなかでは、前記抑制作用を十分に発現させる観点から、好ましくはグルタミル基である。
【００３９】
Ｘａａ4は、置換基を有してもよいアスパラギニル基、置換基を有してもよいグルタミニル基、置換基を有してもよいアスパラチル基または置換基を有してもよいグルタミル基である。前記置換基は、本発明の効果を阻害しない官能基であればよい。前記置換基としては、前記Ｘａａ3における置換基と同様のものが挙げられる。前記Ｘａａ4のなかでは、前記抑制作用を十分に発現させる観点から、好ましくはグルタミニル基である。
【００４０】
Ｘａａ5は、置換基を有してもよいセリル基、置換基を有してもよいスレオニル基または置換基を有してもよいチロシニル基である。前記置換基は、本発明の効果を阻害しない官能基であればよい。前記置換基としては、前記Ｘａａ1における置換基と同様のものが挙げられる。前記Ｘａａ5のなかでは、前記抑制作用を十分に発現させる観点から、好ましくはセリル基である。
【００４１】
式（Ｉ）において、ｎは、１〜１０の整数である。前記ｎは、前記抑制作用を十分に発現させる観点から、１０以下、好ましくは８以下であり、より好ましくは５以下、さらに好ましくは３以下、特に好ましくは１である。
【００４２】
なお、Ｘａａ1〜Ｘａａ5、Ｒ1およびＣｙｓは、それぞれ、Ｌ−体の官能基であってもよく、Ｄ−体の官能基であってもよい。ヒトの皮膚への適応性の観点から、Ｘａａ1〜Ｘａａ5、Ｒ1およびＣｙｓは、好ましくはＬ−体の官能基である。
【００４３】
前記薬理的に許容される塩としては、酸付加塩および塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩としては、例えば、無機酸塩、有機酸塩などが挙げられる。前記無機酸塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、リン酸塩などが挙げられる。また、有機酸塩としては、クエン酸塩、シュウ酸塩、酢酸塩、ギ酸塩、プロピオン酸塩、安息香酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩などが挙げられる。塩基付加塩としては、無機塩基塩、有機塩基塩などが挙げられる。無機塩基塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩などが挙げられる。有機塩基塩としては、例えば、トリエチルアンモニウム塩、トリエタノールアンモニウム塩、ピリジニウム塩、ジイソプロピルアンモニウム塩などの有機塩基塩などが挙げられる。
【００４４】
式（Ｉ）で表される環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩のなかでは、前記抑制作用を十分に発現させる観点から、式（Ｉ）において、Ｘａａ1がセリル基、Ｘａａ2がイソロイシル基、Ｘａａ3がグルタミル基、Ｘａａ4がグルタミニル基、Ｘａａ5がセリル基であり、Ｒ1が式（ＩＩＩ）で表される基であり、ｎが１である化合物が好ましい。
【００４５】
本発明の環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩による前記抑制作用は、例えば、
（ａ）エピモルフィンを発現するケラチノサイトを支持体上で三次元に培養して得られる分化細胞構築物の表面に本発明の環状ペプチド化合物を塗布すること、
（ｂ）ケラチノサイトを支持体上で三次元に培養して得られる分化細胞構築物の表面にオレイン酸を塗布した後、さらに本発明の環状ペプチド化合物を塗布すること、
（ｃ）エピモルフィンを発現するケラチノサイトの細胞凝集物をコラーゲンゲル中に包埋させ、当該細胞凝集物を、本発明の環状ペプチド化合物を含む培地中で培養すること、
（ｄ）ケラチノサイトの細胞凝集物をコラーゲンゲル中に包埋し、当該細胞凝集物を、オレイン酸と本発明の環状ペプチド化合物とを含む培地中で培養すること、
（ｅ）本発明の環状ペプチド化合物を含む培地中でエピモルフィンを発現するケラチノサイトを培養した後、得られたケラチノサイトを、カルシウムイオン導入剤を含む培地中で培養すること、または
（ｆ）本発明の環状ペプチド化合物とオレイン酸とを含む培地中でケラチノサイトを培養した後、得られたケラチノサイトを、カルシウムイオン導入剤を含む培地中で培養すること
により、ケラチノサイトの形態の異常などが改善されることに基づいて評価することができる。
【００４６】
本発明の環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩は、エピモルフィンに対し拮抗的に働き、エピモルフィンの生理活性を抑制し、当該エピモルフィンまたはオレイン酸によって引き起こされるヒトの組織の状態の異常を抑制することができるので、例えば、ヒトの皮膚の不全角化などの抑制、毛成長促進または毛成長抑制、血管などの再生に有用であり、医薬、医薬部外品、または化粧品の有効成分として、また、上記作用を評価する試薬などとして有用である。そのため、本発明の環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩によれば、ヒトの皮膚の不全角化を抑制することにより、前記不全角化に起因するヒトの状態の異常を改善することができる。したがって、本発明の環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩は、不全角化に起因するヒトの皮膚の状態の異常を改善する用途などに有用である。かかるヒトの皮膚の状態の異常としては、例えば、肌荒れ、ニキビ、タコ、イボ、乾癬などが挙げられる。
【００４７】
また、エピモフィンは、内胚葉細胞に存在するレセプター型チロシンキナーゼを介して臓器の形成などに関与していることが知られている。また、エピモルフィンが過剰に発現した場合、例えば、慢性関節リウマチ、癌（例えば、腎細胞癌、皮膚癌など）、動脈硬化症、膠原病、造血器疾患、腎疾患、筋ジストロフィー、骨粗鬆症、神経線維腫症、Ｓｔｕｒｇｅ−Ｗｅｂｅｒ症候群、結節性硬化症、神経管閉塞障害、分節異常、脳孔症、水頭症などの疾患が引き起こされる可能性がある〔ラボラトリー・インベスティゲーション（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）、２０１０年、第９０巻、ｐ．８６７−８８０（非特許文献７）；キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２００５年、第６５巻、ｐ．８６１７−８６２１（非特許文献８）；ディベロプメンタル・バイオロジー（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、２００６年、第２９１巻、ｐ．２５−３７（非特許文献９）〕。本発明の環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩によれば、エピモルフィンの生理活性を抑制することができることから、肺、肝臓、腎臓、胃、腸などの臓器の損傷の治療、血管再生、慢性閉塞性動脈硬化症状、バージャー病などの予防・治療、さらにはエピモルフィンの過剰発現に起因する疾患の予防または治療などの用途に有用である。したがって、本発明の環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩は、エピモルフィンの過剰発現に起因する疾患の予防または治療剤、慢性閉塞性動脈硬化症状、バージャー病などの予防または治療剤、損傷臓器の治療剤などの製剤として有用である。
【００４８】
前記製剤においては、本発明の環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩は、器官、局所部位、組織などに導入するに適した薬理的に許容される担体に保持させてもよい。
【００４９】
前記製剤中における本発明の環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩の含有量は、治療上有効量であり、前記製剤の用途、投与経路、適用対象となる疾患または損傷臓器の種類、剤形などによって異なることから一概には決定することができないが、前記製剤の用途、投与経路、適用対象となる疾患または損傷臓器の種類、剤形などに応じて適宜設定することができる。通常、前記製剤中における本発明の環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩の含有量は、０．０００１〜１００質量％である。
【００５０】
また、前記製剤は、前記製剤の用途、投与経路、適用対象となる疾患または損傷臓器の種類、剤形などに応じて、他の助剤をさらに含有していてもよい。前記助剤としては、例えば、本発明の環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩の効果を発現させる対象となる部位に到達するまでの間に、本発明の環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩の分解を抑制する性質を呈する薬理的に許容される助剤、賦形剤、結合剤、安定剤、緩衝剤、溶解補助剤、等張剤などが挙げられる。
【００５１】
製剤の剤形は、適用対象となる疾患または損傷臓器の種類などによって適切な剤形が異なることから一概には決定することができないが、適用対象となる疾患または損傷臓器の種類などに応じて適宜決定することが好ましい。前記製剤の剤形としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、シロップ剤、注射剤などが挙げられる。
【００５２】
前記製剤の投与経路は、前記製剤の用途、適用対象となる疾患または損傷臓器の種類、投与対象となるヒトの年齢または体重などによって異なることから一概には決定することができないが、前記製剤の用途、適用対象となる疾患または損傷臓器の種類、投与対象となるヒトの年齢または体重などに応じて適宜決定することが好ましい。前記製剤の投与経路としては、例えば、局所投与、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、経口投与などが挙げられる。
【００５３】
前記製剤の投与量は、前記製剤の用途、適用対象となる疾患または損傷臓器の種類、投与対象となるヒトの年齢または体重などによって異なることから一概には決定することができないが、前記製剤の用途、適用対象となる疾患または損傷臓器の種類、投与対象となるヒトの年齢または体重などに応じて適宜決定することが好ましい。前記製剤の投与量は、例えば、投与対象となるヒトが成人である場合、１日あたり成人の体重１ｋｇに対して、本発明の環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩の量が、エピモルフィンの生理活性を十分に抑制する観点から、好ましくは１μｇ以上、より好ましくは１０μｇ以上となり、投与対象のヒトへの負荷を抑制する観点から、好ましくは１０ｍｇ以下、より好ましくは１ｍｇ以下となるように調整されることが望ましい。
【００５４】
２．環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩の製造方法
本発明の環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩の製造方法は、式（Ｉ）で表される環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩の製造方法であって、式（ＩＶ）：
【００５５】
【化１１】
0005863651.tif 000012
【００５６】
〔式中、Ｘａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、ＣｙｓおよびＲ1は式（Ｉ）におけるＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、ＣｙｓおよびＲ1と同じである〕
で表される化合物（配列番号：４）を環化させることを特徴とする。本発明の製造方法では、式（ＩＶ）で表される化合物を環化させるので、前記環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩を簡便に、かつ効率よく製造することができる。
【００５７】
式（ＩＶ）で表される化合物は、例えば、式（ＩＶ）におけるＣｙｓ、Ｘａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5およびＣｙｓそれぞれに対応するアミノ酸と、式（Ｖ）：
【００５８】
【化１２】
0005863651.tif 000013
【００５９】
〔式中、ｎは式（Ｉ）におけるｎと同じである〕
で表される化合物とを用い、ペプチドの化学合成法などを行なうことにより製造することができる。前記化学合成法としては、例えば、固相合成法、段階的伸長法、液相合成法などが挙げられる。前記化学合成法のなかでは、目的とする環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩の製造が容易であり、しかも、その収率および純度が高いことから、固相合成法が好ましい。前記固相合成法としては、例えば、Ｆｍｏｃ合成法、Ｂｏｃ合成法などが挙げられる。かかる固相合成法は、市販のペプチド合成機を用いて行なうことができる。
【００６０】
固相合成法を行なう場合、固相として、例えば、ペプチド合成用樹脂などが用いられる。前記ペプチド合成用樹脂としては、例えば、ＰＡＭ樹脂、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂などが挙げられる。
【００６１】
固相合成法において、前記アミノ酸は、前記保護基によって分子内のアミノ基を予め保護して用いられる。前記保護基としては、例えば、９−フルオレニル−メトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。なお、前記アミノ酸は、必要に応じて、側鎖の官能基を当該官能基に応じた保護基により保護して用いることができる。なお、本明細書において、アミノ基や側鎖の官能基が保護されているアミノ酸を「保護アミノ酸」という。
【００６２】
式（Ｖ）において、ｎが１である場合、式（Ｖ）で表される化合物として、グリシンを用いることができる。式（Ｖ）において、ｎが２である場合、式（Ｖ）で表される化合物として、β−アラニンを用いることができる。また、式（Ｖ）において、ｎが３である場合、式（Ｖ）で表される化合物として、４−アミノ酪酸を用いることができる。式（Ｖ）において、ｎが４〜１０の整数である場合、式（Ｖ）で表される化合物は、ストレッカー反応を利用した化学合成によって得ることができる。固相合成法において、かかる式（Ｖ）で表される化合物は、前記アミノ酸の場合と同様に、アミノ基および必要に応じて側鎖の官能基を当該官能基に応じた保護基により保護して用いる。なお、本明細書において、アミノ基や側鎖の官能基が保護されている式（Ｖ）で表される化合物を「保護化合物」という。
【００６３】
固相合成法を行なう場合、式（ＩＶ）におけるＣｙｓ、Ｘａａ5、Ｘａａ4、Ｘａａ3、Ｘａａ2、Ｘａａ1、Ｒ1およびＣｙｓに対応する保護アミノ酸または保護化合物を、この順で、ペプチド合成用樹脂上で逐次的に縮合させ、つぎに、前記ペプチド合成用樹脂から式（ＩＶ）で表される化合物に対応する産物を切り出すと同時に保護基を除去する。
【００６４】
前記縮合には、一般的なペプチド合成に用いられる活性化試薬などが用いられる。前記縮合の際の反応温度は、ペプチドの合成において一般的な温度であればよい。通常、前記反応温度は、約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。
【００６５】
保護基の除去は、例えば、触媒の存在下での水素気流中での接触還元、酸処理、アルカリ処理などにより行なうことができる。
【００６６】
式（ＩＶ）で表される化合物の製造後、必要に応じて、得られた生成物の精製を行なってもよい。前記精製は、例えば、逆相高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーによって行なうことができる。
【００６７】
式（ＩＶ）で表される化合物の環化は、かかる化合物の両末端のシステインのチオール基同士を酸化架橋させることにより行なうことができる。前記システイニル基同士のジスルフィド化は、例えば、式（ＩＶ）で表される化合物を、酢酸水溶液などの酸性水溶液中でヨウ素によって酸化させることによって形成させることができる。また、式（ＩＶ）で表される化合物の環化は、かかる化合物の両末端のシステイニル基同士をペプチド結合させることによっても行なうことができる。かかるペプチド結合は、式（ＩＶ）で表される化合物に通常のペプチド合成に用いられる縮合試薬を作用させることによって行うことができる。斯くして、式（Ｉ）で表される本発明の環状構造を有するペプチド化合物を調製することができる。
【００６８】
得られた生成物が式（Ｉ）で表される化合物であることは、例えば、プロテインシークエンサーや質量分析装置などによって確認することができる。
【００６９】
なお、式（Ｉ）で表される化合物が遊離体として得られた場合、式（Ｉ）で表される化合物の薬理的に許容できる塩は、得られた生成物を、必要に応じて、常法にしたがって薬理的に許容できる塩に変換することにより得ることができる。
【００７０】
また、得られた生成物がその分子内に前記保護基を有する場合、常法に従って前記保護基を脱離させることができる。なお、保護基の導入と脱保護に関して、例えば、グリーンズ・プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス第４版〔ペーター・Ｇ．Ｍ．ワッツ（Ｐｅｔｅｒ  Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ）およびテオドラ．Ｗ．グリーン（Ｔｈｅｏｄｏｒａ  Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ）著、Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、２００６年発行〕に記載の方法に従うこともできる。また、必要に応じて、得られた生成物の単離や精製を行なってもよい。前記生成物の単離や精製は、例えば、逆相高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーなどによって行なうことができる。
【実施例】
【００７１】
つぎに、本発明を実施例に基づいてさらに詳しく説明するが、本発明は、かかる実施例のみに限定されるものではない。なお、以下において、Ｃｙｓはシステイニル基、Ｓｅｒはセリル基、Ｇｌｎはグルタミニル基、Ｇｌｕはグルタミル基、Ｉｌｅはイソロイシル基、Ｇｌｙはグリシル基を示す。【００７２】
（製造例１）
ＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２（シグマ−アルドリッチ社製）に、熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を濃度が１０質量％となるように添加し、熱不活性化ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２培地（以下、「ＤＨ１０培地」という）を得た。【００７３】
正常ヒト表皮ケラチノサイト細胞株であるＨａＣａＴ細胞を、前記ＤＨ１０培地中、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で培養した。【００７４】
マウスエピモルフィンをコードするｃＤＮＡ（ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号：Ｅ０６６２９、配列番号：５）におけるエピモルフィンのＮ末端側に対応する部位に、Ｔ７−タグをコードするＤＮＡ（配列番号：６）を付加し、Ｔ７−タグエピモルフィンをコードするｃＤＮＡを調製した。つぎに、前記Ｔ７−タグエピモルフィンをコードするｃＤＮＡを、レトロウイルス発現ベクターｐＱＣＸＩＮ（クローンテック社製）のＥｃｏＲＩ認識部位に挿入し、Ｔ７−タグエピモルフィン用発現プラスミドを調製した。【００７５】
得られたＴ７−タグエピモルフィン用発現プラスミドを、遺伝子導入用試薬（インビトロジェン社製、商品名：リポフェクタミンおよびインビトロジェン社製、商品名：プラス試薬）を用いてパッケージング細胞（クローンテック社製：ＰＴ６７細胞）に導入した。つぎに、得られた細胞のうち、５００μｇ／ｍＬのジェネティシン（ギブコ・ラボラトリー社製、商品名：Ｇ４１８）に対して耐性能を示す細胞から培養上清を回収した。【００７６】
回収された培養上清中から、レトロウイルスを得た。得られたレトロウイルスを前記ＨａＣａＴ細胞に感染させ、５００μｇ／ｍＬジェネティシン（ギブコ・ラボラトリー社製、商品名：Ｇ４１８）の存在下に、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で８日間培養した。その後、培養後の細胞におけるエピモルフィン発現を調べることにより、Ｔ７−タグエピモルフィンを産生するケラチノサイト（ＨａＣａＴ−ＴＥ細胞）を単離した。【００７７】
（製造例２）
線維芽細胞であるＰＴ６７細胞を、ＤＨ１０培地中、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で培養した。【００７８】
前記製造例１のＴ７−タグエピモルフィン用発現プラスミドを、遺伝子導入用試薬（インビトロジェン社製、商品名：リポフェクタミンおよびインビトロジェン社製、商品名：プラス試薬）を用いて、ＰＴ６７細胞に導入した。つぎに、得られた細胞を、５００μｇ／ｍＬジェネティシン（ギブコ・ラボラトリー社製）の存在下に、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で８日間培養した。その後、培養後の細胞におけるエピモルフィン発現を調べることにより、Ｔ７−タグエピモルフィンを産生する線維芽細胞（ＰＴ６７−ＴＥ細胞）を単離した。【００７９】
（製造例３）
ＩＬ−２シグナルペプチドをコードする核酸（配列番号：７）を、エピモルフィンをコードするｃＤＮＡ（配列番号：５）におけるエピモルフィンのＮ末端に対応する部位に付加し、ＩＬ−２シグナルペプチド結合エピモルフィンをコードする核酸を得た。得られた核酸をレトロウイルス発現ベクター（クローンテック社製、商品名：ｐＱＣＸＩＮ）のＥｃｏＲＩ認識部位に挿入して、細胞表面エピモルフィン用発現プラスミドを調製した。【００８０】
得られた細胞表面エピモルフィン用発現プラスミドを、商品名：リポフェクタミン（インビトロジェン社製）およびプラス試薬（インビトロジェン社製）を用いてパッケージング細胞ＰＴ６７に導入した。前記製造例１と同様にして得られたレトロウイルスをＨａＣａＴ細胞に感染させた。つぎに、得られた細胞を、５００μｇ／ｍＬジェネティシン（ギブコ・ラボラトリー社製、商品名：Ｇ４１８）の存在下に、５体積％二酸化炭素下、３７℃で８日間培養した。その後、培養後の細胞におけるエピモルフィン発現を調べることにより、細胞外エピモルフィンを産生する細胞（ＨａＣａＴ−ＥＰＭ細胞）を単離した。【００８１】
（参考例１）
ＨａＣａＴ細胞をＤＨ１０培地（実験番号：１）、０．０１体積％オレイン酸含有ＤＨ１０培地（実験番号：２）または０．０２５体積％オレイン酸含有ＤＨ１０培地（実験番号：３）中において、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で３日間培養した。【００８２】
培養後の細胞を単離し、得られた細胞を可溶化試薬〔組成：２体積％ＳＤＳ、１０体積％グリセロール、５体積％２−メルカプトエタノール、０．００８体積％ブロモフェノールブルー、０．６５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ約６．８）〕に溶解させることによって細胞抽出液を得た。【００８３】
得られた細胞抽出液と抗エピモルフィン抗体〔Ｒ＆Ｄシステムズ社製〕とを用いてウエスタンブロッティングを行ない、ＨａＣａＴ細胞における内因性エピモルフィンの発現量とオレイン酸との関係を調べた。なお、抗エピモルフィン抗体の代わりに抗β−アクチン抗体を用いたことを除き、前記と同様にして、ＨａＣａＴ細胞におけるβ―アクチンの発現量とオレイン酸との関係を調べた。【００８４】
参考例１において、ＨａＣａＴ細胞における内因性エピモルフィンの発現量とオレイン酸との関係を調べた結果を図１に示す。図１中、レーン１は実験番号：１の培地を用いたときの内因性エピモルフィンに対応するバンド、レーン２は実験番号：２の培地を用いたときの内因性エピモルフィンに対応するバンド、レーン３は、実験番号：３の培地を用いたときの内因性エピモルフィンに対応するバンドを示す。【００８５】
図１に示された結果から、ＨａＣａＴ細胞における内因性エピモルフィンの発現量は、実験番号：１〜３のいずれの培地を用いた場合であっても同程度であることがわかる。なお、ＨａＣａＴ細胞におけるβ―アクチンの発現量も、実験番号：１〜３のいずれの培地を用いた場合であっても同程度であることがわかる。したがって、これらの結果から、オレイン酸は、ＨａＣａＴ細胞における内因性エピモルフィンの発現量には、ほとんど影響を与えないことがわかる。【００８６】
（参考例２）
製造例１で得られたＨａＣａＴ−ＴＥ細胞または製造例２で得られたＰＴ６７−ＴＥ細胞をＤＨ１０培地（実験番号：４）、０．０１体積％オレイン酸含有ＤＨ１０培地（実験番号：５）または０．０２５体積％オレイン酸含有ＤＨ１０培地（実験番号：６）中において、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で３日間培養した。また、製造例１で得られたＨａＣａＴ−ＴＥ細胞または製造例２で得られたＰＴ６７−ＴＥ細胞に対して、照射量が１０ｍＪ／ｃｍ2となるように紫外線Ｂ（ＵＶＢ）を照射し、その後、ＤＨ１０培地中において、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で３日間培養した（実験番号７）。【００８７】
得られた培養物を遠心分離〔１０００×ｇで３０分間〕に供し、培養上清を得た。【００８８】
得られた培養上清から、抗Ｔ７タグ抗体〔ノバジェン社製〕と、プロテインＧセファロースビーズ〔ＧＥヘルスケア製〕とを用いて、分泌エピモルフィンを回収した。回収された分泌エピモルフィンのウエスタンブロッティングを行ない、ＨＲＰ標識抗Ｔ７タグ抗体〔ノバジェン社製〕を用いて、ＨａＣａＴ−ＴＥ細胞の培養上清およびＰＴ６７−ＴＥ細胞の培養上清それぞれにおける分泌エピモルフィンの量とオレイン酸との関係を調べた。【００８９】
参考例２において、ＨａＣａＴ−ＴＥ細胞の培養上清およびＰＴ６７−ＴＥ細胞の培養上清それぞれにおける分泌エピモルフィンの量とオレイン酸との関係を調べた結果を図２に示す。図２中、レーン１は実験番号：４の培地を用いたときの分泌エピモルフィンに対応するバンド、レーン２は実験番号：５の培地を用いたときの分泌エピモルフィンに対応するバンド、レーン３は、実験番号：６の培地を用いたときの分泌エピモルフィンに対応するバンド、レーン４は、実験番号：７の培地を用いたときの分泌エピモルフィンに対応するバンドを示す。【００９０】
図２に示された結果から、ケラチノサイトであるＨａＣａＴ−ＴＥ細胞の培養上清における分泌エピモルフィンの量は、オレイン酸の濃度が最も高い実験番号：６の培地を用いた場合、最も多く、ＵＶＢが照射されたＨａＣａＴ−ＴＥ細胞の培養上清における分泌エピモルフィンの量と同程度であることがわかる。一方、ＨａＣａＴ−ＴＥ細胞の培養上清における分泌エピモルフィンの量は、オレイン酸を含まない実験番号：４の培地を用いた場合、最も低くなることがわかる。これに対して、線維芽細胞であるＰＴ６７−ＴＥ細胞の培養上清においては、オレイン酸の濃度とは関係なく、分泌エピモルフィンが検出されないことがわかる。これらの結果から、オレイン酸は、ケラチノサイトからのエピモルフィンの分泌を引き起こすことがわかる。したがって、オレイン酸により引き起こされる皮膚の不全角化とエピモルフィンにより引き起こされる皮膚の状態の異常とが関連していることが示唆される。【００９１】
（実施例１）
式（Ｉ）において、Ｘａａ1がセリル基、Ｘａａ2がイソロイシル基を示し、Ｘａａ3がグルタミル基、Ｘａａ4がグルタミニル基、Ｘａａ5がセリル基であり、ｎ＝１である化合物を以下のようにして、合成した。【００９２】
（１）ペプチドの合成
出発原料として、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｔ（２−Ｃｌ）樹脂〔２-クロロトリチルクロライド樹脂１ｇあたりＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）の量が０．７０ｍｍｏｌ〕０．２５ｍｍｏｌ相当量を、自動ペプチド合成装置〔アプライド・バイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）社製、商品名：４３０Ａ〕に入れた。【００９３】
まず、自動ペプチド合成装置のプログラムの制御下に、Ｆｍｏｃ−アミノ酸誘導体であるＦｍｏｃ−Ｓｅｒ(ＯＢｕ)２ｍｍｏｌをカップリング剤〔０．４５Ｍ  Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（以下、「ＨＢＴｕ」という）と０．４５Ｍ１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（以下、「ＨＯＢｔ」という）とを含むジメチルホルムアミド〕で活性化させ、前記反応槽に入れた。これにより、前記反応槽内において、樹脂上のアミノ酸残基とＦｍｏｃ−アミノ酸誘導体とのカップリング反応を行ない、Ｆｍｏｃ基保護ペプチド鎖を生成した。【００９４】
つぎに、樹脂上のＦｍｏｃ基保護ペプチド鎖中におけるＦｍｏｃ基を２０体積％ピペリジン含有Ｎ−メチルピロリドン溶液で除去し（脱保護）、洗浄した。その後、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＯＢｕ）、Ｆｍｏｃ−ＧｌｙおよびＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）をこの順で用いて前記と同様の操作を行なうことにより、Cys-Gly-Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys（配列番号：８）に示されるアミノ酸配列にしたがって、対応するＦｍｏｃ−アミノ酸誘導体を樹脂上のＦｍｏｃ基保護ペプチド鎖に逐次導入し、上記で示されるアミノ酸配列（配列番号：８）を有するＦｍｏｃ基保護ペプチドを含む樹脂を得た。なお、カップリング反応の成否は、カイザーテストを行なうことにより適宜確認した。【００９５】
得られたＦｍｏｃ基保護ペプチドを含む樹脂を、トリフルオロ酢酸（以下、「ＴＦＡ」という）とトリイソプロピルシラン（以下、「ＴＩＳ」という）と水とエタンジチオール（以下、「ＤＴ」という）の混合液〔ＴＦＡ／ＴＩＳ／水／ＤＴ（体積比）が９２．５／２．５／２．５／２．５〕中、室温で２時間インキュベーションして脱保護および樹脂からのペプチド鎖の切り出しを行なった。インキュベーション後の混合液から２-クロロトリチルクロライド樹脂をろ別し、ろ液を得た。得られたろ液を減圧下に濃縮して当該ろ液からＴＦＡを留去した。得られた残渣に、冷却ジエチルエーテルを添加して、ペプチドの粗生成物の沈殿物約７００ｍｇを回収した。【００９６】
得られた粗生成物約７００ｍｇを、逆相カラム〔ゾルバックス（Ｚｏｒｂａｘ）社製、オクタデシルシリカカラム、カラムの内径：３０ｍｍ、カラムの長さ２５０ｍｍ〕を備えた高速液体クロマトグラフィー分取装置〔（株）島津製作所製、商品名：モデルＬＣ８Ａ〕に供した。そして、０．１体積％トリフルオロ酢酸水溶液と０．１体積％トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル溶液とを用い、溶離液中のアセトニトリルの濃度勾配が１〜６０体積％となるように溶離液中のアセトニトリルの濃度を調整しながら、流速：１．０ｍＬ／分で２５分間クロマトグラフィーを行なった。目的のペプチドを含む画分を回収し、前記画分からアセトニトリルを留去した。つぎに、残渣を凍結乾燥させ、目的のペプチドのトリフルオロ酢酸塩１１０ｍｇを得た。その後、目的のペプチドのトリフルオロ酢酸塩を脱塩し、目的のペプチド（直鎖状ペプチド）を得た。なお、カイザーテストの結果から、前記ペプチドは、Cys-Gly-Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys（配列番号：８）に示されるアミノ酸配列からなるペプチドであることが確認された。【００９７】
（２）ペプチドの環化
前記（１）で得られたペプチド１１０ｍｇ（０．１３５ｍｍｏｌ）を５０体積％酢酸水溶液１３０ｍＬに添加した。得られた混合物に、０．５Ｍヨウ素水溶液２１０μＬ（０．８当量）を添加し、撹拌しながら室温で３時間混合した。これにより、ペプチド中の２つのシステイニル基のチオール基を酸化して、ジスルフィド結合を形成させた。その後、得られた混合物にアスコルビン酸７０ｍｇを添加した。【００９８】
つぎに、得られた混合物を、逆相カラム〔ズルバックス（Ｚｏｒｂａｘ）社製、オクタデシルシリカカラム、カラムの内径：３０ｍｍ、カラムの長さ２５０ｍｍ〕を備えた逆相高速クロマトグラフィー分取装置〔（株）島津製作所製、商品名：モデルＬＣ８Ａ〕に供した。そして、０．１体積％トリフルオロ酢酸水溶液と０．１体積％トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル溶液とを用い、溶離液中のアセトニトリルの濃度勾配が１〜６０体積％となるように溶離液中のアセトニトリルの濃度を調整しながら、流速：１．０ｍＬ／分で２５分間クロマトグラフィーを行なった。これにより、生成物２０ｍｇを得た。【００９９】
（３）環状ペプチド化合物の確認
前記（１）で得られたペプチドおよび前記（２）で得られた生成物（酸化後のペプチド）それぞれを質量分析装置〔（株）島津製作所製、商品名：ＬＣ−ＭＳ−２０１０〕に供し、前記（１）で得られたペプチドおよび前記（２）で得られた酸化後のペプチドそれぞれのマススペクトルを調べた。実施例１において、ペプチドのマススペクトルを図３に、実施例１において、酸化後のペプチドのマススペクトルを図４に示す。【０１００】
図３に示された結果から、前記（１）で得られたペプチドのマススペクトルでは、Cys-Gly-Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys（配列番号：８）に示されるアミノ酸配列からなるペプチドの理論値付近の８２６．２ｍ／ｚにピークが見られることがわかる。この結果から、前記（１）で得られたペプチドが上記Cys-Gly-Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys（配列番号：８）に示されるアミノ酸配列からなるペプチドであることが裏付けられた。【０１０１】
また、図３および４に示された結果から、前記（１）で得られたペプチドのマススペクトルでは、８２６．２ｍ／ｚにピークが見られるのに対して（図３参照）、前記（２）で得られた酸化後のペプチドのマススペクトルでは、水素原子２個分少ない８２４．２ｍ／ｚにピークが見られることがわかる（図４）。これらの結果から、前記（２）で得られた酸化後のペプチドは、２つのシステイニル基間でジスルフィド結合が形成されることによって、前記（１）で得られたペプチドが環化されていることが裏付けられた。したがって、前記（２）で得られた酸化後のペプチドは、式（Ｉ）において、Ｘａａ1がセリル基、Ｘａａ2がイソロイシル基、Ｘａａ3がグルタミル基、Ｘａａ4がグルタミニル基、Ｘａａ5がセリル基であり、Ｒ1が式（ＩＩＩ）で表される基であり、ｎが１である環状ペプチド化合物であることがわかる。なお、前記環状ペプチド化合物の純度をＨＰＬＣで調べたところ、９８．２％であることが確認された。【０１０２】
（実施例２）
実施例１において、ｎ＝１である化合物の代わりにｎ＝５である化合物を用いたことを除き、実施例１と同様に操作を行ない、環状ペプチド化合物を得た。【０１０３】
（実施例３）
実施例１において、ｎ＝１である化合物の代わりにｎ＝８である化合物を用いたことを除き、実施例１と同様に操作を行ない、環状ペプチド化合物を得た。【０１０４】
（比較例１）
実施例１（１）において、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｔ（２−Ｃｌ）樹脂の代わりにＦｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯＢｕ）−Ａｌｋｏ−樹脂〔樹脂１ｇあたりＦｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯＢｕ）の量が０．７０ｍｍｏｌ〕０．２５ｍｍｏｌ相当量を用いたことと、Ｆｍｏｃ−アミノ酸誘導体として、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＯＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＯＢｕ）、Ｆｍｏｃ−ＧｌｙおよびＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）をこの順に用いる代わりに、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｕ）、Ｆｍｏｃ−ＩｌｅおよびＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＯＢｕ）をこの順に用いたことを除き、実施例１（１）と同様に操作を行ない、Ser- Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp（配列番号：３）で示されるアミノ酸配列からなる直鎖状ペプチドを得た。【０１０５】
（試験例１）
実施例１で得られた環状ペプチド化合物をその濃度が１０μｇ/ｍＬとなるように精製水に添加し、試料を得た。つぎに、得られた試料を実施例１で得られた環状ペプチド化合物の濃度が０．００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加した。得られた培地中において、製造例３で得られたＨａＣａＴ−ＥＰＭ細胞を５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で培養し、経時的に細胞を採取した。採取された細胞に、細胞計数用キット〔（株）同仁化学研究所製、商品名：Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ〕に添付の試薬Ａ〔（株）同仁化学研究所製、商品名：ＷＳＴ−１〕と溶液Ｂとの混合溶液〔試薬Ａと溶液Ｂとの体積比（試薬Ａ／溶液Ｂ）＝１０／１〕１１０μＬを添加し、３時間インキュベーションした。得られた混合物について、分光光度計(ワッラック（ＷＡＬＬＡＣ）社製、商品名：ＡＲＶＯｔｍＳＸ  １４２０  ＭＵＬＴＩＬＡＢＥＬ  ＣＯＵＮＴＥＲ)を用いて４５０ｎｍにおける吸光度を測定し、ＨａＣａＴ−ＥＰＭ細胞の生育への影響を調べた。また、対照として、実施例１で得られた環状ペプチド化合物を添加した試料の代わりに、精製水を用いたことを除き、前記と同様に操作を行ない、ＨａＣａＴ−ＥＰＭ細胞の生育への影響を調べた。【０１０６】
さらに、実施例１で得られた環状ペプチド化合物の代わりに実施例２で得られた環状ペプチド化合物、実施例３で得られた環状ペプチド化合物または比較例１で得られた直鎖状ペプチドを用いたことを除き、前記と同様に操作を行ない、ＨａＣａＴ−ＥＰＭ細胞の生育への影響を調べた。実施例１で得られた環状ペプチド化合物、実施例２で得られた環状ペプチド化合物、実施例３で得られた環状ペプチド化合物および比較例１で得られた直鎖状ペプチドそれぞれによるＨａＣａＴ−ＥＰＭ細胞の生育への影響を調べた結果を表１に示す。なお、表１における評価基準は以下のとおりである。【０１０７】
＋＋：対照を用いたときと比べ、有意にＨａＣａＴ−ＥＰＭ細胞の生育の回復が検出される（危険率０．０１以下）。【０１０８】
＋  ：対照を用いたときと比べ、有意にＨａＣａＴ−ＥＰＭ細胞の生育の回復が検出される（危険率０．０５以下）。【０１０９】
−  ：ＨａＣａＴ−ＥＰＭ細胞の生育の回復が検出されない。【０１１０】
【表１】
0005863651.tif 000014
【０１１１】
表１に示された結果から、実施例１〜３で得られた環状ペプチド化合物を含む培地で培養したＨａＣａＴ−ＥＰＭ細胞は、生育状態が良好であることがわかる。なかでも、実施例１で得られた環状ペプチド化合物を含む培地で培養したＨａＣａＴ−ＥＰＭ細胞は、生育状態が最も良好であることがわかる。これに対し、比較例１で得られた環状ペプチド化合物を含む培地で培養したＨａＣａＴ−ＥＰＭ細胞は、生育状態が不良であることがわかる。ＨａＣａＴ細胞において、エピモルフィンを発現させた場合、細胞の生育状態が不良になる。これらの結果から、実施例１〜３で得られた環状ペプチド化合物は、エピモルフィンの生理活性を抑制して細胞の生育状態を改善していることが示唆される。【０１１２】
（製造例４）
実施例１で得られた環状ペプチド化合物をその濃度が１０μｇ／ｍＬとなるように精製水に溶解させ、被験試料１を得た。また、比較例１で得られた直鎖状ペプチドをその濃度が１０μｇ／ｍＬとなるように精製水に溶解させ、被験試料２を得た。【０１１３】
（試験例２）
以下の実験において、ＤＨ１０を実験番号：８の培地として用いた。また、１体積％オレイン酸含有エタノール溶液を、オレイン酸の濃度が０．０５体積％となるようにＤＨ１０に添加し、培地を得た（実験番号：９）。さらに、１体積％オレイン酸含有エタノール溶液と製造例４で得られた被験試料２とを、オレイン酸の濃度が０．０５体積％となり、かつ直鎖状ペプチドの濃度が０．０００１質量％となるようにＤＨ１０に添加し、培地を得た（実験番号：１０）。また、１体積％オレイン酸含有エタノール溶液と製造例４で得られた被験試料１とを、オレイン酸の濃度が０．０５体積％となり、かつ環状ペプチド化合物の濃度が０．０００１質量％となるようにＤＨ１０に添加し、培地を得た（実験番号：１１）。【０１１４】
ＨａＣａＴ細胞を、ＤＨ１０培地中において、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で培養した。【０１１５】
つぎに、得られたＨａＣａＴ細胞を、１０００Ｕ／ｍＬ  ＤＮアーゼＩ（シグマ−アルドリッチ社製）含有ＤＨ１０培地３５０μＬに懸濁した。得られた懸濁物を、２４−ウェルディッシュ（コーニング社製、超低接着表面）中、１００ｍｉｎ-1で回転させながら、５体積％二酸化炭素雰囲気下、３７℃で２４時間旋回培養して、平滑で丸い細胞凝集物を形成させた。【０１１６】
形成された細胞凝集物を、０．５質量％タイプＩＡコラーゲン溶液〔（株）高研製〕で調製された高密度のコラーゲンゲル中に包埋した。【０１１７】
つぎに、包埋後の細胞凝集物を、実験番号８：の培地、実験番号：９の培地、実験番号：１０の培地または実験番号：１１の培地中において、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で４日間培養して、細胞クラスターを形成させた。得られた細胞クラスターの形態を位相差顕微鏡下で観察した。【０１１８】
細胞クラスター内において、最外層の細胞は、コラーゲンと接しているために未分化状態を保持している。しかしながら、前記最外層に存在する未分化状態の細胞の内側に位置する細胞は、通常、速やかに分化を開始し、アノイキスに至る。そのため、前記細胞クラスターでは、正常状態では培養開始から３〜４日間経過時において、容易に判別できる内腔が形成される。そこで、ランダムに選択された１００個の細胞クラスターを観察し、全１００個の細胞クラスターにおける明らかな内腔形成が見られた細胞クラスターの割合を調べることにより、内腔形成率を算出した。【０１１９】
試験例２において、実験番号：１１の培地を用いたときの細胞クラスターの形態を観察した結果を図５（Ａ）に、実験番号：１０の培地を用いたときの細胞クラスターの形態を観察した結果を図５（Ｂ）に示す。図中、スケールバーは１００μｍの長さを示す。【０１２０】
また、試験例２において、培地の種類と内腔形成率との関係を調べた結果を図６に示す。図中、レーン１は実験番号：８の培地を用いたときの細胞クラスターにおける内腔形成率、レーン２は実験番号：９の培地を用いたときの細胞クラスターにおける内腔形成率、レーン３は実験番号：１０の培地を用いたときの細胞クラスターにおける内腔形成率、レーン４は実験番号：１１の培地を用いたときの細胞クラスターにおける内腔形成率を示す。【０１２１】
図５（Ａ）、図５（Ｂ）および図６に示された結果から、実験番号：１１の培地を用いたときの細胞クラスターは、内腔形成率が高いのに対して、実験番号：１０の培地を用いたときの細胞クラスターは、内腔形成率が低いことがわかる。これらの結果から、実施例１で得られた環状ペプチド化合物は、オレイン酸により引き起こされる細胞クラスターにおける内腔形成の異常の発生を抑制しているが、比較例１で得られた直鎖状ペプチドは、オレイン酸により引き起こされる細胞クラスターにおける内腔形成の異常の発生を抑制していないことがわかる。かかる細胞クラスターにおける内腔形成は、皮膚における分化や状態を反映している。したがって、実施例１で得られた環状ペプチド化合物は、オレイン酸により引き起こされる皮膚の状態の異常の発生を抑制することができることが示唆される。【０１２２】
（試験例３）
（１）培地の調製
以下の実験において、ＤＨ１０培地を実験番号：１２の培地として用いた。精製水１μＬをＤＨ１０培地１ｍＬに添加し、培地を得た（実験番号：１３）。さらに、製造例４で得られた被験試料２を直鎖状ペプチドの濃度が０．０００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加し、培地を得た（実験番号：１４）。また、製造例４で得られた被験試料１を環状ペプチド化合物の濃度が０．０００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加し、培地を得た（実験番号：１５）。【０１２３】
（２）細胞クラスター（細胞構造体）の形成および内腔形成率の算出
試験例２において、ＨａＣａＴ細胞の代わりに製造例３で得られたＨａＣａＴ−ＥＰＭ細胞を用いたことと、試験例２において、実験番号８：の培地、実験番号：９の培地、実験番号：１０の培地または実験番号：１１の培地の代わりに実験番号１２：の培地、実験番号：１３の培地、実験番号：１４の培地または実験番号：１５の培地を用いたこととを除き、試験例２と同様に操作を行ない、内腔形成率を算出した。【０１２４】
試験例３において、実験番号：１５の培地を用いたときの細胞クラスターの形態を観察した結果を図７（Ａ）に、試験例３において、実験番号：１４の培地を用いたときの細胞クラスターの形態を観察した結果を図７（Ｂ）に示す。図中、スケールバーは１００μｍの長さを示す。【０１２５】
また、試験例３において、培地の種類と内腔形成率との関係を調べた結果を図８に示す。図中、レーン１は実験番号：１２の培地を用いたときの細胞クラスターにおける内腔形成率、レーン２は実験番号：１３の培地を用いたときの細胞クラスターにおける内腔形成率、レーン３は実験番号：１４の培地を用いたときの細胞クラスターにおける内腔形成率、レーン４は実験番号：１５の培地を用いたときの細胞クラスターにおける内腔形成率を示す。図中、データは、３回の計数に基づくものであり、平均±標準誤差で示す。また、図中、＊は、Ｐ＜０．０５である。【０１２６】
図７（Ａ）、図７（Ｂ）および図８に示された結果から、実験番号：１５の培地を用いたときの細胞クラスターは、内腔形成率が高いのに対して、実験番号：１４の培地を用いたときの細胞クラスターは、内腔形成率が低いことがわかる。これらの結果から、実施例１で得られた環状ペプチド化合物は、エピモルフィンにより引き起こされる細胞クラスターにおける内腔形成の異常の発生を抑制しているが、比較例１で得られた直鎖状ペプチドは、エピモルフィンにより引き起こされる細胞クラスターにおける内腔形成の異常の発生を抑制していないことがわかる。したがって、実施例１で得られた環状ペプチド化合物は、エピモルフィンにより引き起こされる皮膚の状態の異常の発生を抑制することができることが示唆される。【０１２７】
（試験例４）
（１）培地の調製
以下の実験において、ＤＨ１０培地を実験番号：１６の培地として用いた。また、１体積％オレイン酸含有エタノール溶液をオレイン酸の濃度が０．０２体積％となるようにＤＨ１０培地に添加して、培地を得た（実験番号：１７）。さらに、１体積％オレイン酸含有エタノール溶液と製造例４で得られた被験試料２とを、オレイン酸の濃度が０．０２体積％となり、かつ直鎖状ペプチドの濃度が０．０００００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加して、培地を得た（実験番号：１８）。また、１体積％オレイン酸含有エタノール溶液と製造例４で得られた被験試料１とを、オレイン酸の濃度が０．０２体積％となり、かつ環状ペプチド化合物の濃度が０．０００００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加して、培地を得た（実験番号：１９）。１体積％オレイン酸含有エタノール溶液と製造例４で得られた被験試料２とを、オレイン酸の濃度が０．０２体積％となり、かつ直鎖状ペプチドの濃度が０．００００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加して、培地を得た（実験番号：２０）。１体積％オレイン酸含有エタノール溶液と製造例４で得られた被験試料１とを、オレイン酸の濃度が０．０２体積％となり、かつ環状ペプチド化合物の濃度が０．００００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加して、培地を得た（実験番号：２１）。また、１体積％オレイン酸含有エタノール溶液と製造例４で得られた被験試料２とを、オレイン酸の濃度が０．０２体積％となり、かつ直鎖状ペプチドの濃度が０．０００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加して、培地を得た（実験番号：２２）。１体積％オレイン酸含有エタノール溶液と製造例４で得られた被験試料１とを、オレイン酸の濃度が０．０２体積％となり、かつ環状ペプチド化合物の濃度が０．０００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加して、培地を得た（実験番号：２３）。【０１２８】
（２）コーニファイドエンベロープ形成率の算出
ＨａＣａＴ細胞を、実験番号：１６〜２３のいずれかの培地中において、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で３日間培養した。【０１２９】
つぎに、得られたＨａＣａＴ細胞を、リン酸緩衝生理的食塩水で洗浄し、ついで、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液〔シグマ（ＳＩＧＭＡ）社製〕５００μＬ中において、３７℃で３分間インキュベーションした。【０１３０】
その後、得られたＨａＣａＴ細胞を１．０×１０５細胞／ｍＬとなるように無血清ＤＨ培地（ＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２、シグマーアルドリッチ社製）に懸濁した。得られた懸濁液に、カルシウム流入を引き起こすカルシウムイオノフォアＡ２３１８７（シグマ−アルドリッチ社製）を濃度が２０ｎｇ／ｍＬとなるように添加し、得られた混合物中に含まれるＨａＣａＴ細胞を５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で５時間培養した。【０１３１】
得られた細胞をリン酸緩衝化生理的食塩水で洗浄した。洗浄後の細胞を可溶化液〔組成：２質量％ＳＤＳ、２０ｍＭジチオスレイトール、残部精製水〕中で１０分間インキュベーションした。その後、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７によるカルシウム流入後の不溶性コーニファイドエンベロープに起因する残存不溶化細胞の数を光学顕微鏡下で計数し、全細胞の数と残存不溶化細胞の数とを用い、コーニファイドエンベロープ形成率を算出した。【０１３２】
試験例４において、培地の種類とコーニファイドエンベロープ形成率との関係を調べた結果を図９に示す。図中、１は実験番号：１６におけるコーニファイドエンベロープ形成率、２は実験番号：１７におけるコーニファイドエンベロープ形成率、３は実験番号：１８におけるコーニファイドエンベロープ形成率、４は実験番号：１９におけるコーニファイドエンベロープ形成率、５は実験番号：２０におけるコーニファイドエンベロープ形成率、６は実験番号：２１におけるコーニファイドエンベロープ形成率、７は実験番号：２２におけるコーニファイドエンベロープ形成率、８は実験番号：２３におけるコーニファイドエンベロープ形成率を示す。図中、データは、３回の計数に基づくものであり、平均±標準誤差で示す。また、図中、＊＊はＰ＜０．０１、＊＊＊はＰ＜０．００１である。【０１３３】
図９に示された結果から、実施例１で得られた環状ペプチド化合物を含む培地を用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率〔実験番号：１９（図中、４）、２１（図中、６）および２３（図中、８）〕は、比較例１で得られた直鎖状ペプチドを含む培地を用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率〔実験番号：１８（図中、３）、２０（図中、５）および２２（図中、７）〕と比べて高くなっていることがわかる。コーニファイドエンベロープの形成は、皮膚における分化状態を反映している。したがって、これらの結果から、実施例１で得られた環状ペプチド化合物は、オレイン酸により引き起こされる皮膚の状態の異常の発生を抑制することができることが示唆される。【０１３４】
（試験例５）
（１）培地の調製
以下の実験において、ＤＨ１０培地を実験番号：２４または２５の培地として用いた。製造例４で得られた被験試料２を、直鎖状ペプチドの濃度が０．０００００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加して、培地を得た（実験番号：２６）。また、製造例４で得られた被験試料１を、環状ペプチド化合物の濃度が０．０００００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加して、培地を得た（実験番号：２７）。製造例４で得られた被験試料２を、直鎖状ペプチドの濃度が０．００００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加して、培地を得た（実験番号：２８）。製造例４で得られた被験試料１を、環状ペプチド化合物の濃度が０．００００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加して、培地を得た（実験番号：２９）。また、製造例４で得られた被験試料２を、直鎖状ペプチドの濃度が０．０００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加して、培地を得た（実験番号：３０）。製造例４で得られた被験試料１を、環状ペプチド化合物の濃度が０．０００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加して、培地を得た（実験番号：３１）。【０１３５】
（２）コーニファイドエンベロープ形成率の算出
ＨａＣａＴ細胞を、実験番号：２４の培地中において、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で３日間培養した。【０１３６】
また、ＨａＣａＴ-ＥＰＭ細胞を用いた場合、ＨａＣａＴ-ＥＰＭ細胞を、実験番号：２５〜３１のいずれかの培地中において、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で３日間培養した。【０１３７】
つぎに、得られたＨａＣａＴ細胞またはＨａＣａＴ−ＥＰＭ細胞を、リン酸緩衝生理的食塩水で洗浄し、ついで、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液５００μＬ中において、３７℃で３分間インキュベーションした。【０１３８】
その後、得られたＨａＣａＴ細胞またはＨａＣａＴ−ＥＰＭ細胞を１．０×１０５細胞／ｍＬとなるように無血清ＤＨ培地に懸濁した。得られた懸濁液に、カルシウム流入を引き起こすカルシウムイオノフォアＡ２３１８７を濃度が２０ｎｇ／ｍＬとなるように添加し、得られた混合物中に含まれるＨａＣａＴ細胞を５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で５時間培養した。【０１３９】
試験例４と同様の操作を行なって、コーニファイドエンベロープ形成率を算出した。【０１４０】
試験例５において、培地の種類または細胞の種類とコーニファイドエンベロープ形成率との関係を調べた結果を図１０に示す。図中、１は実験番号：２４におけるコーニファイドエンベロープ形成率、２は実験番号：２５におけるコーニファイドエンベロープ形成率、３は実験番号：２６におけるコーニファイドエンベロープ形成率、４は実験番号：２７におけるコーニファイドエンベロープ形成率、５は実験番号：２８におけるコーニファイドエンベロープ形成率、６は実験番号：２９におけるコーニファイドエンベロープ形成率、７は実験番号：３０におけるコーニファイドエンベロープ形成率、８は実験番号：３１におけるコーニファイドエンベロープ形成率を示す。図中、データは、３回の計数に基づくものであり、平均±標準誤差で示す。また、図中、＊はＰ＜０．０５、＊＊はＰ＜０．０１である。【０１４１】
図１０に示された結果から、実施例１で得られた環状ペプチド化合物を含む培地を用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率〔実験番号：２７（図中、４）、２９（図中、６）および３１（図中、８）〕は、比較例１で得られた直鎖状ペプチドを含む培地を用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率〔実験番号：２６（図中、３）、２８（図中、５）および３０（図中、７）〕と比べて高くなっていることがわかる。したがって、これらの結果から、実施例１で得られた環状ペプチド化合物は、エピモルフィンにより引き起こされる皮膚の状態の異常の発生を抑制することができることが示唆される。【０１４２】
（試験例６）
（１）試料の調製
以下の実験において、５０体積％エタノール水溶液を実験番号：３２または３３の試料として用いた。実施例１で得られた環状ペプチド化合物をその濃度が１０ｎｇ／ｍＬとなるように５０体積％エタノール水溶液に添加し、試料を得た（実験番号：３５）。【０１４３】
比較例１で得られた直鎖状ペプチドをその濃度が１０ｎｇ／ｍＬとなるように５０体積％エタノール水溶液に添加し、試料を得た（実験番号：３４）。【０１４４】
（２）試料の評価
メス７週齢ヘアレスマウスＨｏｓ／ｈｒ−１（以下、「Ｈｏｓ／ｈｒ−１マウス」ともいう〔エスエルシー（ＳＬＣ）社供給〕の背部の皮膚に実験番号：３２〜３５のいずれかの試料１００μＬを飼育開始後１日目と３日目に塗布し、２日間飼育した。【０１４５】
その後、実験番号：３２においては、１日あたり２回３日間にわたって、前記Ｈｏｓ／ｈｒ−１マウスにおける塗布部位に、試料１００μＬを塗布後、エタノール１００μＬを塗布し、再度、試料１００μＬを塗布した。【０１４６】
また、実験番号：３３〜３５においては、１日あたり２回３日間にわたって、前記Ｈｏｓ／ｈｒ−１マウスにおける塗布部位に、実験番号：３３〜３５のいずれかの試料１００μＬを塗布後、１０体積％オレイン酸含有エタノール溶液１００μＬを塗布し、再度、実験番号：３３〜３５のいずれかの試料１００μＬを塗布した。【０１４７】
その後、前記Ｈｏｓ／ｈｒ−１マウスをさらに１日間飼育した。【０１４８】
実験番号：３２〜３５の試料の最初の塗布開始から８日目に、前記塗布部位から皮膚組織を採取した。採取した皮膚組織から凍結切片を作製した。かかる凍結切片をヘマトキシリン−エオシン染色により、細胞核を青紫色に染色するとともに、細胞質細胞質物質の大部分を赤色に染色し、表皮の厚さを測定した。【０１４９】
試験例６において、試料の種類と表皮の厚さとの関係を調べた結果を図１１に示す。図中、１は実験番号：３２の試料を用いたときの表皮の厚さ、２は実験番号：３３の試料を用いたときの表皮の厚さ、３は実験番号：３４の試料を用いたときの表皮の厚さ、４は実験番号：３５の試料を用いたときの表皮の厚さを示す。図中、データは、１０回の計数に基づくものであり、平均±標準誤差で示す。図中、＊＊＊はＰ＜０．００１である。【０１５０】
また、前記塗布部位に対して、接着テープ〔住友スリーエム（株）社製〕を貼付することによって角質層を採取した。採取された角質層の核をヨウ化プロピジウム（シグマ−アルドリッチ社製）によって染色した。【０１５１】
試験例６において、試料の種類と全細胞中の染色細胞の割合との関係を調べた結果を図１２に示す。図中、１は実験番号：３２の試料を用いたときの全細胞中の染色細胞の割合、２は実験番号：３３の試料を用いたときの全細胞中の染色細胞の割合、３は実験番号：３４の試料を用いたときの全細胞中の染色細胞の割合、４は実験番号：３５の試料を用いたときの全細胞中の染色細胞の割合を示す。図中、データは、３回の計数に基づくものであり、平均±標準誤差で示す。図中、＊＊＊はＰ＜０．００１である。【０１５２】
図１１に示された結果から、実施例１で得られた環状ペプチド化合物を含む実験番号：３５の試料を用いたときの表皮の厚さは、比較例１で得られた直鎖状ペプチドを含む実験番号：３４の試料を用いたときの表皮の厚さと比べて薄いことがわかる。また、図１２に示された結果から、実施例１で得られた環状ペプチド化合物を含む実験番号：３５の試料を用いたときの全細胞中の染色細胞の割合は、比較例１で得られた直鎖状ペプチドを含む実験番号：３４の試料を用いたときの全細胞中の染色細胞の割合と比べて著しく小さいことがわかる。したがって、これらの結果から、実施例１で得られた環状ペプチド化合物は、オレイン酸により引き起こされる皮膚の状態の異常の発生を抑制することができることが示唆される。【０１５３】
（試験例７）
以下の実験において、ＤＨ１０培地を実験番号：３６の試料として用いた。精製水１μＬをＤＨ１０培地１ｍＬに添加し、試料を得た（実験番号：３７）。また、実施例１で得られた環状ペプチド化合物をその濃度が０．００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加し、試料を得た（実験番号：３８）。さらに、比較例１で得られた直鎖状ペプチドをその濃度が０．００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加し、試料を得た（実験番号：３９）。【０１５４】
ヒト胎児肺線維芽細胞のＭＲＣ−５細胞を、１０質量％熱不活性化ＦＣＳを含有するα−ＭＥＭ（ギブコ・ラボラトリー社製）１０ｍＬ中において、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で７２時間培養した。【０１５５】
２４ウェル培養プレートのウェル内に支持体〔ＢＤバイオサイエンス社製、商品名：セルカルチャーインサート〕を設置した。前記支持体中において、前記ＭＲＣ−５細胞とコラーゲンゲル混合溶液（コラーゲンＩ型、新田ゼラチン株式会社製）とを混合した。得られた混合物をゲル化させて、細胞包埋ゲル（１．７×１０5／ｍＬ）を得た。得られた細胞包埋ゲルの上表面に、１ｍｇ／ｍＬフィブロネクチン水溶液（ＢＤバイオサイエンス社製）０．０５ｍｌを添加し、前記細胞包埋ゲルを室温で１時間放置した。つぎに、前記細胞包埋ゲル中のＭＲＣ−５細胞を、ＤＨ１０培地中において、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で一晩インキュベーションした。【０１５６】
その後、０．４μｇ／ｍＬヒドロコルチゾン（シグマ−アルドリッチ社製）と１００μｇ／ｍＬゲンタマイシン（ギブコ・ラボラトリー社製）とインスリン（５μｇ／ｍｌ）と５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸（シグマ−アルドリッチ社製）とを含有するＤＨ１０培地０．２ｍＬに懸濁したＨａＣａＴ細胞（７．０×１０４細胞）を前記細胞包埋ゲル上に播種した。【０１５７】
つぎに、前記ＨａＣａＴ細胞が播種された細胞包埋ゲルを、２４ウェル培養プレートのウェル中のＤＨ１０に浸漬させた。その後、細胞包埋ゲル中に含まれる細胞を、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で５日間インキュベーションし、細胞構築物を得た。つぎに、得られた細胞構築物中のＨａＣａＴ細胞の表面を、空気とＤＨ１０との接触面まで持ち上げて配置し、前記細胞構築物を、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で１５日間培養し、ＨａＣａＴ細胞を含む分化細胞構築物を得た。【０１５８】
その後、実験番号：３６においては、分化細胞構築物の表面に、実験番号：３６の試料５μＬを塗布し、分化細胞構築物を５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃でさらに１日間培養した。一方、実験番号：３７〜３９においては、分化細胞構築物の表面に、０．５体積％オレイン酸含有エタノール溶液５μＬと、実験番号：３７〜３９のいずれかの試料５μＬとを塗布し、分化細胞構築物を５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃でさらに１日間培養した。【０１５９】
得られた細胞構造体から凍結切片を作製した。かかる凍結切片をヘマトキシリン−エオシン染色により、細胞核を青紫色に染色するとともに、細胞質細胞質物質の大部分を赤色に染色した。染色後の凍結切片を用い、細胞構造体の組織形態を位相差顕微鏡下で観察した。【０１６０】
試験例７において、０．５体積％オレイン酸含有エタノール溶液を塗布せずに実験番号：３６の試料を塗布したときの細胞構造体の組織形態を観察した結果を図１３（Ａ）に、試験例７において、０．５体積％オレイン酸含有エタノール溶液および実験番号：３７の試料を塗布したときの細胞構造体の組織形態を観察した結果を図１３（Ｂ）に、試験例７において、０．５体積％オレイン酸含有エタノール溶液および実験番号：３８の試料を塗布したときの細胞構造体の組織形態を観察した結果を図１３（Ｃ）に、試験例７において、０．５体積％オレイン酸含有エタノール溶液および実験番号：３９の試料を塗布したときの細胞構造体の組織形態を観察した結果を図１３（Ｄ）に示す。図中、スケールバーは、５０μｍの長さを示す。【０１６１】
図１３（Ａ）および（Ｃ）に示された結果から、０．５体積％オレイン酸含有エタノール溶液と環状ペプチド化合物を含む実験番号：３８の試料とを塗布したときの細胞構造体では、実験番号：３６の試料を用いたときの細胞構造体と同様に、細胞核が見られないことがわかる。したがって、環状ペプチド化合物は、オレイン酸によって引き起こされる不全角化の発生を抑制することができることがわかる。【０１６２】
一方、図１３（Ｄ）に示された結果から、０．５体積％オレイン酸含有エタノール溶液と直鎖状ペプチドを含む実験番号：３９の試料とを塗布したときの細胞構造体においては、細胞核が見られることがわかる。したがって、直鎖状ペプチドは、オレイン酸によって引き起こされる不全角化の発生を抑制することができないことがわかる。【０１６３】
（試験例８）
試験例７において、実施例１で得られた環状ペプチド化合物の代わりに、式（Ｉ）で表される環状ペプチド化合物のうち、実施例１で得られた環状ペプチド化合物以外の化合物を用いたことを除き、試験例７と同様の操作を行ない、細胞構造体の組織形態を位相差顕微鏡下で観察する。【０１６４】
その結果、実施例１で得られた環状ペプチド化合物を用いたときと同様の結果が得られる。【０１６５】
以上の結果から、本発明の環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩によれば、エピモルフィンまたはオレイン酸によってヒトの皮膚に引き起こされる皮膚の状態の異常、特に不全角化の発生を抑制することができることがわかる。したがって、本発明の環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩は、不全角化に起因するヒトの皮膚の状態の異常を改善する用途などに有用であることが示唆される。
【配列表フリーテキスト】
【０１６６】
配列番号：１は、環状ペプチド化合物の配列である。６番目のシステイニル基と７番目のシステイニル基とは、ジスルフィド結合又はペプチド結合によって結合されている。１番目のＸａａは、置換基を有してもよいＳｅｒ、置換基を有してもよいＴｈｒまたは置換基を有してもよいＴｙｒである。２番目のＸａａは、置換基を有してもよいＩｌｅ、置換基を有してもよいＶａｌまたは置換基を有してもよいＬｅｕである。３番目のＸａａは置換基を有してもよいＡｓｎ、置換基を有してもよいＧｌｎ、置換基を有してもよいＡｓｐまたは置換基を有してもよいＧｌｕである。４番目のＸａａは、置換基を有してもよいＡｓｎ、置換基を有してもよいＧｌｎ、置換基を有してもよいＡｓｐまたは置換基を有してもよいＧｌｕである。５番目のＸａａは、置換基を有してもよいＳｅｒ、置換基を有してもよいＴｈｒまたは置換基を有してもよいＴｙｒである。１番目のＸａａと７番目のＣｙｓはいずれも配列の末端残基ではなく、両者はＲ１〔Ｒ１は、−ＣＯ−（ＣＨ2）n−ＮＨ−、または−ＮＨ−（ＣＨ2）n−ＣＯ−（式中、ｎは１〜１０の整数である）を意味する〕を介して結合している。【０１６７】
配列番号：２は、直鎖状ペプチドまたは環状ペプチド化合物の部分配列である。【０１６８】
配列番号：３は、直鎖状ペプチドの配列である。【０１６９】
配列番号：４は、環状ペプチド化合物を製造するための環化前の鎖状アミノ酸配列である。１番目のＣｙｓと２番目のＸａａは、Ｒ１〔Ｒ１は、−ＣＯ−（ＣＨ2）n−ＮＨ−、または−ＮＨ−（ＣＨ2）n−ＣＯ−（式中、ｎは１〜１０の整数である）を意味する〕を介して結合している。２番目のＸａａは、置換基を有してもよいＳｅｒ、置換基を有してもよいＴｈｒまたは置換基を有してもよいＴｙｒである。３番目のＸａａは、置換基を有してもよいＩｌｅ、置換基を有してもよいＶａｌまたは置換基を有してもよいＬｅｕである。４番目のＸａａは置換基を有してもよいＡｓｎ、置換基を有してもよいＧｌｎ、置換基を有してもよいＡｓｐまたは置換基を有してもよいＧｌｕである。５番目のＸａａは、置換基を有してもよいＡｓｎ、置換基を有してもよいＧｌｎ、置換基を有してもよいＡｓｐまたは置換基を有してもよいＧｌｕである。６番目のＸａａは、置換基を有してもよいＳｅｒ、置換基を有してもよいＴｈｒまたは置換基を有してもよいＴｙｒである。【０１７０】
配列番号：６は、Ｔ７タグ配列である。【０１７１】
配列番号：７は、ＩＬ−２シグナルペプチドの配列である。【０１７２】
配列番号：８は、環状ペプチド化合物を製造するための環化前の鎖状アミノ酸配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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