(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドであり、前記ペプチドは、アミノ酸配列ＬＫＣＸ４ＱＨＧＫＶＶＴＣＨＲＤＭＫＦＣＹＨＮＴＧＭＰＦＲＮＬＫＬＩＬＱＧＣＳＳＳＣＳＥＴＥＮＮＫＣＣＳＴＤＲＣＮＫ  （配列番号１）を持ち、Ｘ４は、Ｙ又はＦを表す、アミノ酸配列を含む、ペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドは少なくとも１つのＡＳＩＣチャンネルのブロッカーである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記ペプチドが、ＡＳＩＣ１ａ及びＡＳＩＣ１ｂサブユニットからなる群から選択される少なくとも１つのサブユニットを含む少なくとも１つのＡＳＩＣチャンネルのブロッカーである、請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
前記ペプチドが、ホモメリックＡＳＩＣ１ａチャンネル、ホモメリックＡＳＩＣ１ｂチャンネル、ヘテロメリックＡＳＩＣ１ａ＋ＡＳＩＣ１ｂチャンネル及び／又はヘテロメリックＡＳＩＣ１ａ＋ＡＳＩＣ２ａチャンネルのブロッカーである、請求項３に記載のペプチド。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれか一項に記載のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項６】
ヌクレオチド配列：ａｔｇａａａａｃｔｃｔｇｃｔｇｃｔｇａｃｃｔｔｇｃｔｇｇｔｇｇｔｇａｃａａｔｃｇｔｇｔｇｃｃｔａｇａｃｔｔａｇｇａｔａｃｔｃｃｃｔｇａａａｔｇｔ７３ｔｘｘ７５ｃａａｃａｔｇｇｔａａａｇｔｔｇｔｇａｃｔｔｇｔｃａｔｃｇａｇａｔａｔｇａａｇｔｔｔｔｇｃｔａｔｃａｔａａｃａｃｔｇｇｃａｔｇｃｃｔｔｔｔｃｇａａａｔｃｔｃａａｇｃｔｃａｔｃｃｔａｃａｇｇｇａｔｇｔｔｃｔｔｃｔｔｃｇｔｇｃａｇｔｇａａａｃａｇａａａａｃａａｔａａｇｔｇｔｔｇｃｔｃａａｃａｇａｃａｇａｔｇｃａａｃａａａｔａｇ（配列番号４）；又は
ｃｔｇａａａｔｇｔ１０ｔｘｘ１２ｃａａｃａｔｇｇｔａａａｇｔｔｇｔｇａｃｔｔｇｔｃａｔｃｇａｇａｔａｔｇａａｇｔｔｔｔｇｃｔａｔｃａｔａａｃａｃｔｇｇｃａｔｇｃｃｔｔｔｔｃｇａａａｔｃｔｃａａｇｃｔｃａｔｃｃｔａｃａｇｇｇａｔｇｔｔｃｔｔｃｔｔｃｇｔｇｃａｇｔｇａａａｃａｇａａａａｃａａｔａａｇｔｇｔｔｇｃｔｃａａｃａｇａｃａｇａｔｇｃａａｃａａａｔａｇ（配列番号２２）；を含み、配列中７３ｔｘｘ７５及び１０ｔｘｘ１２が、ｔａｃ、ｔａｔ、ｔｔｔ又はｔｔｃを表す、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項５又は６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項８】
請求項７に記載のベクターであり、前記ベクターが発現ベクターである、ベクター。
【請求項９】
請求項７又は８のいずれか一項に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１０】
請求項１乃至４のいずれか一項に記載の１以上のペプチドを含む医薬組成物。
【請求項１１】
医薬として使用されるための、請求項１乃至４のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１２】
前記医薬が鎮痛剤である、請求項１１に記載の使用されるためのペプチド。
【請求項１３】
前記鎮痛剤が、ＡＳＩＣチャンネルの活性化を含む痛みのもしくは病態の予防もしくは治療のためである、請求項１２に記載の使用されるためのペプチド。
【請求項１４】
前記ＡＳＩＣチャンネル活性化を含む痛みもしくは病態が、炎症性、神経障害、癌関連、術後関連、筋骨格、及び内蔵痛み、炎症、癌、線維筋痛症及び過敏性腸症候群からなる群から選択される、請求項１３に記載の使用されるためのペプチド。
【請求項１５】
前記医薬が、うつ病、不安症、脳卒中、癲癇、中枢炎症及び神経変性疾患からなる群から選択される中枢神経疾患の予防及び治療のために使用される、請求項１１に記載の使用されるためのペプチド。
【請求項１６】
前記医薬が、中枢内に、皮下、経皮的に、全身、経口又は呼吸経路を介して、投与される、請求項１１乃至１５のいずれか一項に記載の使用されるためのペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規ペプチドに関連し、これは鎮痛を誘導し、かつＡＳＩＣ１ａチャンネル（酸感受性イオンチャンネル）を阻害するものであり、より具体的にはホモメリックＡＳＩＣ１ａ、ホモメリックＡＳＩＣ１ｂチャンネル及び／又はヘテロメリックチャンネルであって少なくとも１つのＡＳＩＣ１ａ及びＡＳＩＣ１ｂから選択されるサブユニットを持ち、前記ペプチドをコードするポリヌクレオチド、及びまた、医薬組成物、宿主細胞及びそれに含まれるベクター、に関する。特に、前記ペプチドは、配列表の配列番号１のアミノ酸配列と最低限５６％同一性を示す。これらは、特に２つの５７−アミノ酸ペプチドＡＳＩＣａｉｇｅｎ−１（π−Ｄｐ１）とＡＩＳＣａｌｇｉｎ−２（π−Ｄｐ２）であり、これは蛇ブラックマンバ（ブラックマンバ）から単離され、配列番号２と３にそれぞれ対応する。
【０００２】
本発明はまた、それらの診断用ツール又は医薬、特に鎮痛薬を得るための使用、及びＡＳＩＣチャンネルを阻害する鎮痛分子の同定のための使用に関する。
【０００３】
本発明は、特に次の痛み、即ち、ＡＳＩＣＳチャンネル（例えば、炎症、神経障害、癌関連、術後、筋骨格系、内蔵などの痛み）の活性化に伴う痛み、中枢神経疾患（例えば、心的外傷後ストレス、うつ病、不安、心臓発作、癲癇、多発性硬化症、脳炎症、神経変性疾患など）、及びＡＳＩＣチャンネルの関与が提案されている病的状態（例えば、炎症、癌、線維筋痛症、過敏性腸症候群など）の防止及び治療において応用される。
【０００４】
以下明細書で、カッコ内の参照番号は、最後にまとめた参考文献番号である。
【背景技術】
【０００５】
痛みの処置を考慮することは、患者の生活品質改善のために本質的な側面である。痛みは、欧州では毎年約６千万人の相当数の個人の影響を与えており、これ痛みを処置するための鎮痛薬での年間コストが１億ドルであることを表す。世界中で鎮痛薬に費やす年間費用は、約２５億ドルであり、２０１０年には４２億ドルに達するものとなる。痛みは２つのカテゴリーに分類される：急性と慢性の痛みである。急性の痛みは、時間的に制限された急激かつ短い痛みである。逆に、慢性の痛みは、持続性であり、例えば痛覚過敏にリンクしており、大きな疾患負担となり、大人の約２０％及び高齢者の約５０％に影響を与えている。
【０００６】
痛みの処置は本質的に抗炎症剤に基づくものであり、これは非ステロイド系（ＮＳＡＩＤ）又はステロイド系（コルチコイド）のいずれかであり、弱い又は強いアヘンに基づく。ＮＳＡＩＤは、世界中で最も広く処方される治療薬の部類であり、これは炎症及び痛み自体の両方に効果があるからである。これらは、急性であっても慢性であっても炎症性痛みの全てのタイプに使用される（Ｂｅｒｔｉｎ  ａｎｄ  Ｖｅｒｇｎｅ−Ｓａｌｌｅ、  ２００７］［１］）。ＮＳＡＩＤ及び／又はコルチコイドが炎症性痛みを十分緩和しない場合には、処方する医者は、非抗炎症鎮痛剤、例えばパラセタモル、弱いアヘン（コデイン、トラマドル）を組み合わせ、及び前記痛みがかかる処理でも続く場合には、強いアヘン（モルヒネ、オキシコデイン、フェンタニル）を組み合わせる（［Ｇｕｔｓｔｅｉｎ  ＆  Ａｋｉｌ、  ２００６］［２］）。
【０００７】
ＮＳＡＩＤが非常に効果的である一方で、それにもかかわらずこれらは大きな副作用をももたらす。最も普通の副作用には、消化不良がしばしば見られることから、ＮＳＡＩＤの使用が多くの臨床状態では制限されている。また、腎臓、皮膚、粘膜、アレルギー及び呼吸器、血液、肝臓などの起こり、最終的には感覚神経及び心理的に悪い副作用が存在する（［Ｂｅｒｔｉｎ  ａｎｄ  Ｖｅｒｇｎｅ−Ｓａｌｌｅ、  ２００７、  ｍｅｎｔｉｏｎｅｄ  ａｂｏｖｅ］［１］）。さらに、ＮＳＡＩＤは、全てのタイプの痛みに効果的ではない。アヘンはまた、痛みを抑える主な役割を果たすが、幻覚症状と心肺機能低下をもたらす。鎮痛薬はまた、依存性、例えばモルヒネ、メタドン依存症の原因となり得る。これらはまた鎮痛薬への慣れの原因となり、即ち、一定の効果を得るために投与量が増加する必要がある。この慣れは時間とともに強くなり、従って、投与量の増加をさらに必要とし、薬物がその効果を失うこととなる。実際、痛みを抑える必要のある投与量は、前記薬物の毒性量よりも大きくなり得る。最終的に、アヘンでの処置はまた、治療が停止される場合に重度の便秘又は痛覚過敏などの悪影響を与える（例えば術後痛み）（Ｇｕｔｓｔｅｉｎ  ＆  Ａｋｉｌ、  ２００６、  ｍｅｎｔｉｏｎｅｄ  ａｂｏｖｅ；  Ｂａｎｎｉｓｔｅｒ  ＆  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ、  ２０１０］［２、３］）。
【０００８】
既存の治療薬の多様性にもかかわらず、多くのタイプの痛みが知られている薬物には比較的効果的ではなく、例えば、神経系の障害に続く神経痛（５０％の患者が開放されていない）、過敏性腸症候群又は慢性炎症腸疾患、線維筋痛症などの慢性内蔵痛及び癌及び骨移植に伴う痛みなどである（  ［Ｙｅｎｎｕｒａｊａｌｉｎｇａｍ  ｅｔ  ａｌ．、  ２００４；  Ｍｉｚｏｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、  ２００９］  ［４、５］）。
【０００９】
この意味で、これらの欠点を解消する新規鎮痛薬の発見及び／又は新規鎮痛目標は、真実の発展を示すべきである。痛みついての医薬業界の研究は過去数年においていくつかの限定的進歩にとどまってきた。例えば、片頭痛に対してはトリプタンが注目され、なお限定的であるが新規薬物が、例えば癌関連及び神経因性痛みに対してテトラヒドロカンナビノール及びカンナビジオールの組合せなどである。事実、過去２０年間でなされた進歩は、本質的に前記利用可能な鎮痛薬のより好ましい使用及び投与量の調整からなされたものである。これらの鎮痛薬の主要なファミリーのどれもが、限定的効果及び／又は相当な副作用のために最適な効果／リスク比を持たない。
【００１０】
過去数年の同定された分子目標の中で、イオンチャンネルは特に重要な位置を占めるが、それはそれらが感覚中枢神経による痛みシグなりの検出及び伝達に関与するからである。ＡＳＩＣチャンネル（酸感受性イオンチャンネル）は、細胞外媒体の酸性化により活性化されるカチオンチャンネル（細胞外アシドーシス）である（Ｗａｌｄｍａｎｎ  ＆  Ｌａｚｄｕｎｓｋｉ、  １９９８；  Ｗｅｍｍｉｅ  ｅｔ  ａｌ．、  ２００６；  Ｌｉｎｇｕｅｇｌｉａ  ｅｔ  ａｌ．、  ２００７］  ［６、７、８］）。これまで、少なくとも７つのサブユニット（ＡＳＩＣ１ａ、ＡＳＩＣ１ｂ、ＡＳＩＣ１ｂ２、ＡＳＩＣ２ａ、ＡＳＩＣ２ｂ、ＡＳＩＣ３及びＡＳＩＣ４）をコードする４つの遺伝子が哺乳類で同定されている。機能性ＡＳＩＣチャンネルは、トリマーとして種々のＡＳＩＣサブユニットの関与により生じており（［Ｊａｓｔｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２００７］［９］）、ホモメリック又はケテロメリックチャンネルとなる（［Ｌｉｎｇｕｅｇｌｉａ  ｅｔ  ａｌ．、  １９９７；  Ｂｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、  ２００２；  Ｈｅｓｓｅｌａｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、  ２００４］  ［１０、１１、１２］）。ＡＳＩＣチャンネルは、本質的に末梢神経系の侵害受容感覚神経で発現される（Ｗａｌｄｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．、  １９９７ａ；  Ｌｉｎｇｕｅｇｌｉａ  ｅｔ  ａｌ、  ２００７、  ｍｅｎｔｉｏｎｅｄ  ａｂｏｖｅ；  Ｎｏｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、  ２０１０］  ［１３、８、１４］）。ＡＳＩＣ１ａ及びＡＳＩＣ２イソフォームは、中枢神経系及び末梢神経系の両方に存在するが、ＡＳＩＣ１ｂ及びＡＳＩＣ３の発現は感覚ニューロンに限定されている（Ｗａｌｄｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．、  １９９７ｂ；  Ｂａｓｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、  ２００１；  Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、  １９９８］  ［１５、１６、１７］。
【００１１】
次の仮説がなされている、即ち、感覚ニューロンで発現されるＡＳＩＣチャンネル、特にＡＳＩＣ３チャンネルは、虚血、炎症、血腫、骨折、病変、外科手術（術後痛み）又はある種の腫瘍の進展の際に細胞外酸性化を検出することが可能であるということである（Ｒｅｅｈ  ａｎｄ  Ｓｔｅｅｎ、  １９９６］［１８］）。次のことが偶然に知られて数年になる、即ち、細胞外酸性化が痛みを起こすこと（Ｓｔｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、  １９９５ａ；  Ｉｓｓｂｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、  １９９６］  ［１９、２０］）、及び健康なヒトのボランティアで実施された実験で、酸性皮膚痛みにおけるＡＳＩＣチャンネルの関与が示されたことであり、これはアミロリド及びＡＳＩＣチャンネルの非特異的インヒビターであるＮＳＡＩＤの手段によりなされた（［Ｗａｌｄｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．、  １９９７ａ、  ｍｅｎｔｉｏｎｅｄ  ａｂｏｖｅ；  Ｖｏｉｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．、  ２００１］［１３、２３］）。神経活動（扁桃体の、海馬のシナプス可塑性）での中枢神経系ニューロンで発現されるある種のＡＳＩＣチャンネルの重要な役割、及び脊髄ニューロンによる痛み情報の伝達の神経変調（ＡＳＩＣ１ａチャンネル）がまた示された（［Ｎｏｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、  ２０１０］［１４］）。
【００１２】
最近まで、ＡＳＩＣチャンネルを阻害可能な活性リガンドの範囲は、アミロリド、ある種のＮＳＡＩＤ及び化合物Ａ−３１７５６７に限定されていた（［Ｄｕｂｅ  ｅｔ  ａｌ．、  ２００５］［２４］。しかし、これらのどの分子も、ＡＳＩＣチャンネル又は特定のＡＳＩＣサブユニットに完全には特異的ではなかった。ＡＳＩＣチャンネル特異的エフェクターの同定を目的として、多数のサソリ、蜂、蜘蛛、蛇又はイソギンチャクの毒が調べられてきた。最近、２つの動物性ペプチド毒、ＰｃＴｘ１及びＡＰＥＴｘ２が同定され、これらはホモメリックＡＳＣ１ａチャンネル及びＡＳＩＣ３サブユニットを含むチャンネルをそれぞれ阻害する（Ｅｓｃｏｕｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．、  ２０００；  Ｄｉｏｃｈｏｔ  ｅｔ  ａｌ．、  ２００４］  ［２５、２６］）。ＡＰＥＴｘ２の末梢（皮下）注射は、ラットで炎症性及び酸性痛みに対し（［Ｄｅｖａｌ  ｅｔ  ａｌ．、  ２００８］  ［２７］）及び
ＡＰＥＴｘ２の術中塗布のりの術後痛みに対し（  ［Ｄｅｖａｌ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、  ３１（１６）：  ６０５９−６０６６、  ２０１１］［３６］）鎮痛効果を誘導し、一方でＰｃＴｘ１の中央注射はマウスで強力な鎮痛作用を誘導した（［Ｍａｚｚｕｃａ  ｅｔ  ａｌ．、  ２００７］［２８］）。これらの２つの毒物の鎮痛作用は、痛み情報の受容及び伝達におけるＡＳＩＣチャンネルの関与を示すものである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｂｅｒｔｉｎ  ａｎｄ  Ｖｅｒｇｎｅ−Ｓａｌｌｅ、  “Ｔｒａｉｔｅｍｅｎｔｓ  ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔｅｕｘ  ｄｅ  ｌ’ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｅｔ  ｄｅｓ  ｄｏｕｌｅｕｒｓ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｉｒｅｓ”  ［“Ｄｒｕｇ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐａｉｎ”］  ＵＰＳＡ  Ｐａｉｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  -  Ａ  Ｅｄｉｔｏｒｉａｌ  Ｐａｒｉｓ、  ｐ．１１３−１３２、  ２００７
【非特許文献２】Ｇｕｔｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ａｋｉｌ、  “Ｏｐｉｏｉｄ  ａｎａｌｇｅｓｉｃｓ”、  ｉｎ  “Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”  Ｂｒｕｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｅｄｓ．  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、  ２００６．
【非特許文献３】Ｂａｎｎｉｓｔｅｒ  ＆  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ、  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｐａｌｌｉａｔ．  Ｃａｒｅ、  ４：  １−５、  ２０１０
【非特許文献４】Ｙｅｎｎｕｒａｊａｌｉｎｇａｍ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．、  １：  ９７−１１０、  ２００４
【非特許文献５】Ｍｉｚｏｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｉｎｔ．  Ｒｅｖ．  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．、  ８５：  ２４９−２６０、  ２００９
【非特許文献６】Ｗａｌｄｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｌａｚｄｕｎｓｋｉ、  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．、  ３：  ４１８−４２４、  １９９８
【非特許文献７】Ｗｅｍｍｉｅ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、  ２９：  ５７８−５８６、  ２００６
【非特許文献８】Ｌｉｎｇｕｅｇｌｉａ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、  ２８２：  １７３２５−１７３２９、  ２００７
【非特許文献９】Ｊａｓｔｉ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｎａｔｕｒｅ、  ４４９：  ３１６−３２３、  ２００７
【非特許文献１０】Ｌｉｎｇｕｅｇｌｉａ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、  ２７２：  ２９７７８−２９７８３、  １９９７
【非特許文献１１】Ｂｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．、  ９５：  １０２４０−１０２４５、  ２００２
【非特許文献１２】Ｈｅｓｓｅｌａｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、  ２７９：  １１００６−１１０１５、  ２００４
【非特許文献１３】Ｗａｌｄｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｎａｔｕｒｅ、  ３８６：  １７３−１７７、  １９９７ａ
【非特許文献１４】Ｎｏｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、  “Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｏｎ  ａｃｉｄ−ｓｅｎｓｉｎｇ  ｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌｓ：  ｎｅｗ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．  Ｃｌｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  “Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｉｏｎ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ”、  ３：  ３３１−３４６、  ２０１０
【非特許文献１５】Ｗａｌｄｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、  ２７２：  ２０９７５−２０９７８、  １９９７ｂ
【非特許文献１６】Ｂａｓｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、  ２７６：  ３３７８２−３３７８７、  ２００１
【非特許文献１７】Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．、  ９５：  １０２４０−１０２４５、  １９９８
【非特許文献１８】Ｒｅｅｈ  ａｎｄ  Ｓｔｅｅｎ、  Ｐｒｏｇ．  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．、  １１３：  １４３−１５１、  １９９６
【非特許文献１９】Ｓｔｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｌｅｔｔ．、  １９９：  ２９−３２、  １９９５ａ
【非特許文献２０】Ｉｓｓｂｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｌｅｔｔ．、  ２０８：  １９１−１９４、  １９９６
【非特許文献２１】Ｕｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．、  １０：  １１８５−１１９１、  ２００２
【非特許文献２２】Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、  ２４：  １０９７４−１０９７９、  ２００４
【非特許文献２３】Ｖｏｉｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、  ２１：  ８０２６−８０３３、  ２００１
【非特許文献２４】Ｄｕｂｅ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｐａｉｎ、  １１７：  ８８−９６、  ２００５
【非特許文献２５】Ｅｓｃｏｕｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、  ２７５：  ２５１１６−２５１２１、  ２０００
【非特許文献２６】Ｄｉｏｃｈｏｔ  ｅｔ  ａｌ．、  ＥＭＢＯ  Ｊ．、  ２３：  １５１６−１５２５、  ２００４
【非特許文献２７】Ｄｅｖａｌ  ｅｔ  ａｌ．、  ＥＭＢＯ  Ｊ．、  ２７：  ３０４７−３０５５、  ２００８
【非特許文献２８】Ｍａｚｚｕｃａ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、  １０：  ９４３−９４５、  ２００７
【非特許文献２９】Ｄｅｖａｌ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、  ３１（１６）：  ６０５９−６０６６、  ２０１１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
従って、ＡＳＩＣチャンネル又は特定のＡＳＩＣサブユニットに特異的であり、鎮痛効果を持ち、一方で同時に、従来の鎮痛薬の依存性、欠点及び障害を解消する、他のエフェクターを同定する真の必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者は、ブラックマンバ蛇の毒から、新規なペプチドであって、鎮痛効果を誘導し、ＡＳＩＣチャンネル（酸性感受性イオンチャンネル）、より具体的にはホモメリックＡＳＩＣ１ａチャンネル、ホモメリックＡＳＩＣ１ｂチャンネル、ヘテロメリックＡＳＩＣ１ａ＋２ａチャンネル及びヘテロメリックＡＳＩＣ１ａ＋１ｂチャンネルを阻害するペプチドを見出し、同定した。
【００１６】
これらは特にペプチドＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１（π−Ｄｐ１）及びＡＳＩＣａｌｇｉｎ−２（π−Ｄｐ２）であり、これらは、マウスにインビボで中央（髄腔内及び脳室内）注射後、異なる痛みモード（化学的、熱的、炎症性）で強い鎮痛効果を示し、これはモルヒネと同等であるが、アヘンレセプター活性とは独立している。さらに、これらのペプチドは、中央に注射した場合に神経毒性を示さない。皮下抹消注射による投与の場合、これらのペプチドはまた鎮痛効果を持ち、炎症性痛覚過敏を回復させた。これらの２つのペプチドは、鎮痛効果を持つ、ブラックマンバ蛇毒から抽出された最初のペプチドである。
【００１７】
この説明に限定されるものではないが、これらのペプチドの最も可能性のあるメカニズムは、ＡＳＩＣイオンチャンネルの阻害であり、ＡＳＩＣイオンチャンネルは痛み情報の受容、伝達及び変調において重要な役割を演じている。事実、これらのペプチドは効果的に、ラット及びヒトの、ＡＳＩＣ１ａチャンネル、ホモメリックＡＳＩＣ１ｂチャンネル及び／又はＡＳＣＩ１ａ及び／又はＡＳＩＣ１ｂサブユニットを含むのヘテロメリックチャンネルを阻害する。これらの２つのペプチドは、特に、ホモメリックＡＳＩＣ１ｂ及びＡＳＩＣ１ａチャンネル及びヘテロメリックＡＳＩＣ１ａ＋ＡＳＩＣ１ｂ及びＡＳＩＣ１ａ＋ＡＳＩＣ２ａチャンネルの最初に知られたインヒビター（阻害剤）である。
【００１８】
前記ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１（π−Ｄｐ１）及びＡＳＩＣａｌｇｉｎ−２（π−Ｄｐ２）ペプチドはまた、感覚ニューロン及び中枢神経ニューロンに存在するＡＳＩＣの伝達を阻害する。これらは、これ自体が痛み受容に関与する、カプサイシン及び熱により活性化されるＴＲＰＶ１伝達への効果を持たない。これらは、基底状態でのニューロンの電気的性質を変更せず、ＡＳＩＣチャンネル活性化可能な細胞外酸性化に応じるニューロン興奮可能性を低下させる。
【００１９】
ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１（π−ＤＰ１）及びＡＳＩＣａｌｇｉｎ−２（π−ＤＰ２）ペプチドは従って、げっ歯類では、モルヒネと匹敵する強力な鎮痛性を持ち、これはアヘンレセプターがブロックされている場合でも観察され、このことはある種類のげっ歯類及びヒトＡＳＩＣチャンネルを特異的に阻害することができるということで説明され得る。前記ペプチドの中央注射は、毒性を示さず（神経毒性、痙攣など）、運動活性（加速ローターロッド試験）にもなんら効果を持たない。
【００２０】
ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１（π−ＤＰ１）及びＡＳＩＣａｌｇｉｎ−２（π−ＤＰ２）ペプチドは、従って、人の痛みに対する治療可能性を持つ分子に含まれ得る（例えば、癌関連痛み、神経因性痛み、術後痛みなど）。
【００２１】
本発明の対象は従ってペプチドであって：
（ｉ）アミノ酸配列
ＬＫＣＸ４ＱＨＧＫＶＶＴＣＨＲＤＭＫＦＣＹＨＮＴＧＭＰＦＲＮＬＫＬＩＬＱＧＣＳＳＳＣＳＥＴＥＮＮＫＣＣＳＴＤＲＣＮＫ（配列番号１）
（配列中Ｘ４は、いずれかのアミノ酸を表す）；又は
（ｉｉ）配列番号１と少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、好適には少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９８％の同一性を示す天然又は合成配列であって、上記配列番号１のペプチドの生物的性質を保持するものであり、即ち、鎮痛効果を誘導し、前記ＡＳＩＣ１ａ及びＡＳＩＣ１ｂサブユニットとからなる群から選択される少なくとも１つのサブユニットを含む少なくとも１つのＡＳＩＣチャンネルを阻害する配列、
を有するペプチドである。
【００２２】
本発明による前記ペプチドは、より具体的には、ホモメリックＡＳＩＣ１ａチャンネル、ホモメリックＡＳＩＣ１ｂチャンネル及び／又は前記ＡＳＩＣ１ａ及びＡＳＩＣ１ｂサブユニットとからなる群から選択される少なくとも１つのサブユニットを含むヘテロメリックＡＳＩＣチャンネル、特にヘテロメリックＡＳＩＣ１ａ＋ＡＳＩＣ１ｂチャンネル及び／又はヘトロメリックＡＳＩＣ１ａ＋ＡＳＩＣ２ａチャンネルのブロッカーとして作用する。
【００２３】
本発明の目的で、用語「ブロッカー」とは、前記チャンネルによる生成される伝達を濃度依存的に阻害することができるペプチドを意味する。例えば、ＰｃＴｘ１（［Ｅｓｃｏｕｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．、  ２０００、  ｍｅｎｔｉｏｎｅｄ  ａｂｏｖｅ］［２５］）などのペプチドは、１ｎＭ濃度でホモメリックＡＳＩＣ１ａチャンネルにより生成される伝達の５０％を阻害することができ、又は
ＰｃＴｘ２（［Ｄｉｏｃｈｏｔ  ｅｔ  ａｌ．、  ２００４、  ｍｅｎｔｉｏｎｅｄ  ａｂｏｖｅ］  ［２６］）などのペプチドは、２μＭ濃度でラットで、ヘテロメリックＡＳＩＣ１ａ＋ＡＳＩＣ３チャンネルにより生成される伝達の５０％を阻害することができる。
【００２４】
好ましくは、本発明の前記ペプチドは、蛇マンバ属ブラックマンバから抽出される。
例えば、これらは、前記毒から、逆極性高性能液体クロマトグラフ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）手段により連続的に分離して得られる。前記ペプチドはまた、ＤＮＡ組み換え方法、又は化学的合成で製造され得る。
【００２５】
好ましくは、本発明の前記ペプチドは、ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１（π−Ｄｐ１）又はＡＳＩＣａｌｇｉｎ−２（π−Ｄｐ２）ペプチドを含み、これらは、配列番号１の配列を持ち、ここでＸ４はそれぞれＹ又はＦである（それぞれ配列番号２及び３）。
【００２６】
本発明の課題はまた、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである。
【００２７】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、配列：
ａｔｇａａａａｃｔｃｔｇｃｔｇｃｔｇａｃｃｔｔｇｃｔｇｇｔｇｇｔｇａｃａａｔｃｇｔｇｔｇｃｃｔａｇａｃｔｔａｇｇａｔａｃｔｃｃｃｔｇａａａｔｇｔ７３ｔｘｘ７５ｃａａｃａｔｇｇｔａａａｇｔｔｇｔｇａｃｔｔｇｔｃａｔｃｇａｇａｔａｔｇａａｇｔｔｔｔｇｃｔａｔｃａｔａａｃａｃｔｇｇｃａｔｇｃｃｔｔｔｔｃｇａａａｔｃｔｃａａｇｃｔｃａｔｃｃｔａｃａｇｇｇａｔｇｔｔｃｔｔｃｔｔｃｇｔｇｃａｇｔｇａａａｃａｇａａａａｃａａｔａａｇｔｇｔｔｇｃｔｃａａｃａｇａｃａｇａｔｇｃａａｃａａａｔａｇ  （配列番号４）；
又は
ｃｔｇａａａｔｇｔ１０ｔｘｘ１２ｃａａｃａｔｇｇｔａａａｇｔｔｇｔｇａｃｔｔｇｔｃａｔｃｇａｇａｔａｔｇａａｇｔｔｔｔｇｃｔａｔｃａｔａａｃａｃｔｇｇｃａｔｇｃｃｔｔｔｔｃｇａａａｔｃｔｃａａｇｃｔｃａｔｃｃｔａｃａｇｇｇａｔｇｔｔｃｔｔｃｔｔｃｇｔｇｃａｇｔｇａａａｃａｇａａａａｃａａｔａａｇｔｇｔｔｇｃｔｃａａｃａｇａｃａｇａｔｇｃａａｃａａａｔａｇ  （配列番号２２）；であり、
ここで７３ｔｘｘ７５及び１０ｔｘｘ１２はｔａｃ、ｔａｔ、ｔｔｔ又はｔｔｃを表す。
【００２８】
好ましくは、本発明の前記ポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件で、配列番号４又は配列番号２２の核酸配列とハイブリダイズできる核酸配列又はその相補的配列を含む。例えば、配列番号４又は配列番号２２の配列と少なくとも７６％、好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは９８％の同一性を示す天然又は合成配列を含むポリヌクレオチドである。
【００２９】
本発明の課題はまた、本発明のポルヌクレオチドを含むベクターである。
【００３０】
好ましくは前記ベクターは発現ベクターである。
【００３１】
本発明の課題はまた、本発明の１以上を含む、本発明のポリヌクレオチド又は本発明のベクターを含む宿主細胞である。
【００３２】
本発明の課題はまた、本発明の１以上のペプチド、本発明のポルヌクレオチド、本発明のベクター又は本発明の宿主細胞を含む医薬組成物である。本発明の医薬組成物はまた、１以上の薬学的に許容される担体（炭酸カルシウム、澱粉、タルク、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、アカシアゴムなど）を含んでよく、かつ溶液、懸濁、ペースト、ゲルカプル、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、凍結乾燥物、制御徐放性剤、ミクロ粒子、ミクロ又はナノスフェア、リポソームなどの剤形であり得る。本発明による医薬組成物は、経口、筋肉内、静脈内、皮下、局所的、肺経由、鼻腔内、直腸、舌下、皮内、腹腔内、くも膜下などに投与可能である。活性成分（本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター又は宿主細胞）の、本発明の医薬組成物中での有効量は、有効投与量が得られるように及び鎮痛量が哺乳類に投与されるように変更し得るものである。特定の哺乳類へ投与される量は、いくつかの因子で決定され、例えば：投与経路、処置期間、哺乳類の大きさと生理的状態、活性成分の力価及び前記活性成分への哺乳類の応答性などである。例えば、くも膜下投与される活性成分の鎮痛有効量は、一般に、約５ｎｇ／ｋｇから５００μｇ／ｋｇ（哺乳類の体重）の範囲、好ましくは約５０ｎｇ／ｋｇから５０μｇ／ｋｇ（哺乳類の体重）、最も好ましくは約５００ｎｇ／ｋｇから５μｇ／ｋｇ（哺乳類の体重）の範囲である。活性成分の有効量は、他の投与経路を使用する場合には変更され得る。有効鎮痛量は、哺乳類に投与されるべき活性成分の量を決定するために、活性成分を以下説明する１以上の痛み試験を行い、その投与量を前記の判断基準により変更することで推定され得る。
【００３３】
本発明の課題はまた、本発明のペプチド、本発明のヌクレオチド、本発明のベクター、本発明の宿主細胞又は本発明の医薬組成物から選択される物質を医薬として応用することである。
【００３４】
好ましくは、前記医薬は、鎮痛剤であり、例えば、ＡＳＩＣチャンネル特に、前記ＡＳＩＣ１ａ及びＡＳＩＣ１ｂサブユニットからなる群から選択される少なくとも１つのサブユニット、最も好ましくはホモメリックＡＳＩＣ１ａチャンネル、ホモメリックＡＳＩＣ１ｂチャンネル、ヘテロメリックＡＳＩＣ１ａ＋ＡＳＩＣ１ｂチャンネル及び／又はヘテロメリクＡＳＩＣ１ａ＋ＡＳＩＣ２ａチャンネルを含むＡＳＩＣチャンネルの活性化に伴う痛みの防止及び治療のための使用である。例えば、前記痛みは（ｉ）中枢又は末梢ＡＳＩＣをチャンネルの活性化から生じるか又は（ｉｉ）その活性化を誘導する。例えば、前記痛みは、ＡＳＩＣチャンネル活性化を伴う痛みであり、炎症性、神経性、癌関連性、術後関連、筋骨格系、内臓系などの痛みからなる群から選択される。
【００３５】
好ましくは、前記医薬は、例えば、ＡＳＩＣチャンネル特に、前記ＡＳＩＣ１ａ及びＡＳＩＣ１ｂサブユニットからなる群から選択される少なくとも１つのサブユニット、最も好ましくはホモメリックＡＳＩＣ１ａチャンネル、ホモメリックＡＳＩＣ１ｂチャンネル、ヘテロメリックＡＳＩＣ１ａ＋ＡＳＩＣ１ｂチャンネル及び／又はヘテロメリクＡＳＩＣ１ａ＋ＡＳＩＣ２ａチャンネルを含むＡＳＩＣチャンネルの活性化に伴う病的症状防止及び治療のための使用である。例えば、前記症状は、炎症、癌、線維筋痛症、過敏性腸症候群などの症状である。
【００３６】
好ましくは、前記医薬は、例え心的外傷後ストレス、うつ病、不安、発作、癲癇、中央炎症、多発性硬化症、神経変性疾患などからなる群から選択される中枢神経系疾患の予防及び治療のためである。
【００３７】
好ましくは、前記医薬は、非経口で、即ち局所的又は中央（腹腔内、硬膜外腔内、髄腔内、脳室内、皮内など）及び全身（筋肉内、静脈内、皮下など）、経口、曲種的（経皮など）又は呼吸系（呼吸など）を介して投与される。最も好ましくは、前記医薬は、髄腔外腔内、硬膜内、脳室内、又は腹腔内投与である。
【００３８】
本発明の課題はまた、本発明のペプチド、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、本発明の宿主細胞又は本発明の医薬組成物から選択される物質の診断用ツールとしての使用である。
【００３９】
本発明の課題はまた、本発明のペプチドの鎮痛活性を模倣する化合物の同定の方法であり、前記方法は次のステップ：
（ａ）本発明によるペプチドの鎮痛活性を決定し；
（ｂ）候補化合物の鎮痛活性を決定し；
（ｃ）ステップ（ａ）及び（ｂ）で得られた鎮痛活性とを比較し；及び
（ｄ）本発明のペプチドと同等又はそれを超える活性を持つ候補化合物を選択するステップ、とを含む。
【００４０】
本発明の課題はまた、本発明のペプチドの鎮痛活性を模倣する化合物を同定するための方法であり、前記方法は次にステップ：
（ａ）本発明のペプチドをサンプルと接触させ、前記サンプルとの前記ペプチドの結合を測定し；
（ｂ）候補化合物を添加し、及び前記サンプルと前記ペプチドとの結合への前記化合物の効果を評価し；
（ｃ）前記サンプルと前記ペプチドとの結合を変動させることができる候補化合物を選択する、ステップを含む。
【００４１】
本発明の目的で、表現「本発明のペプチドの鎮痛活性を模倣する化合物」とは、次のような候補化合物を意味することを意図しており、鎮痛を誘導することができ、及び本発明のペプチドが結合するＡＳＣＩチャンネルに結合し、又は本発明のペプチドと同一又は類似の生理的方法で作用することができ、即ち、前記ＡＳＩＣ１ａ及びＡＳＩＣ１ｂサブユニットからなる群から選択される少なくとも１つのサブユニット、特にホモメリックＡＳＩＣ１ａチャンネル、ホモメリックＡＳＩＣ１ｂチャンネル、ヘテロメリックＡＳＩＣ１ａ＋ＡＳＩＣ１ｂチャンネル及び／又はヘテロメリクＡＳＩＣ１ａ＋ＡＳＩＣ２ａチャンネルを含む少なくとも１つのチャンネルで生成される伝達を、可逆的にかつ用量依存的に変調（阻害又は刺激）することができる、候補化合物である。例えば、それはＰｃＴｘ１（［Ｅｓｃｏｕｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．、  ２０００、  ｍｅｎｔｉｏｎｅｄ  ａｂｏｖｅ］  ［２５］）などのペプチドを含み、これは１ｎＭ濃度で、５０％のホモメリックＡＳＩＣ１ａチャンネルにより生成される伝達を阻害することができ、又はＡＰＥＴｘ２（［Ｄｉｏｃｈｏｔ  ｅｔ  ａｌ．、  ２００４、  ｍｅｎｔｉｏｎｅｄ  ａｂｏｖｅ］  ［２６］）などのペプチドは、２μＭの濃度で、５０％のラットヘｔロメリックＡＳＩＣ１ａ＋ＡＳＩＣ３チャンネルを阻害する。
【００４２】
本発明の目的で、用語「サンプル」とは、昆虫又は哺乳類の全有機体又は不死化細胞から前もって分離された細胞又は組織を意味する。
【００４３】
用語「鎮痛活性」とは、以下で説明される痛みの試験又は鎮痛評価のための従来の実験室モデルにより示されるような、本発明のペプチドの哺乳類の痛みを処置又は軽減するための容量を意味する。従って、本発明のペプチドの鎮痛活性は例えば次の方法で決定され得る、
（ｉ）尾／足引っ込め時間（熱侵害測定）（［Ａｂｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．、  １９８２；  Ｃｒｉｄｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｈｅｎｒｙ、  １９９２］  ［２９、  ３０］）、
（ｉｉ）熱／冷プレート閾値（熱侵害測定）（［Ｗｏｏｌｆｅ  ａｎｄ  Ｍａｃｄｏｎａｌｄ、  １９４４、  Ａｎｋｉｅｒ、  １９７４］  ［３１、  ３２］）、
（ｉｉｉ）フォンフレイフィラメント閾値又はランドール−セリット又は装置ピンチ試験（機械的侵害活性測定）（［Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．、  １９９３］  ［３３］）。
（ｉｖ）動的重量分布試験（姿勢リンク侵害活性測定）、
（ｖ）自発的侵害挙動の測定、及び／又は１以上のインビトロ試験：例えば、候補化合物の選別を次のように行う、ラベル化（例えば、Ｃ１４、Ｈ３又はＩ１２５などの放射性元素ラベル、パーオキシダーゼ又はアルカリ又は酸ホスファターゼの酵素ラべル、ＦＩＴＣ又はローダミンなどの蛍光ラベル、抗体、抗原、ビオチン、常磁性イオン、ラテックス粒子などで）した本発明のペプチドを前記サンプルと結合することができる条件下でサンプルと接触させ、前記サンプルに結合した前記ラベル化ペプチドの結合を測定し、および、前記ラベル化ペプチドの活性を模倣する前記化合物が前記レセプター（ＡＳＩＣ１ａ及びＡＳＩＣ１ｂサブユニットからなる群から選択される少なくとも１つを含むＡＳＩＣチャンネル）のサイトへの結合を前記ペプチドと競争させる。従って、より少ない量の検出可能なラベル剤が、前記試験化合物が前記ペプチドの活性を模倣せず前記レセプターと結合しないか、より小さい親和性で結合する場合よりも、より強く前記試験化合物が前記ペプチドの活性を、前記レセプターに結合することで模倣する場合に、測定される。又は、競争選別方法は、本発明のペプチドをラベル化する代わりに候補化合物をラベル化することで実施され得る。従って、より高い量の検出可能なラベル剤が、前記試験化合物が前記ペプチドの活性を模倣せず前記レセプターと結合しないか、より小さい親和性で結合する場合よりも、より強く前記試験化合物が前記ペプチドの活性を、前記レセプターに結合することで模倣する場合に、測定される。
【００４４】
ペプチドの鎮痛活性を模倣する化合物を同定する方法の例は、例えば（これには限定されるものではないが）米国特許第５  ８７７  ０２６  ［３４］に記載されている。
【００４５】
他の利点は、添付図面により示される以下の実施例に基づき、当業者にはより明らかなものとなる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１の（Ａ）は、蛇ブラックマンバの毒から分離されたＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１（π−ＤＰ１）及びＡＳＩＣａｌｇｉｎ−２（π−Ｄｐ２）のアミノ酸配列（それぞれ配列番号２、及び３）を表し、（Ｂ）は、ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１をコードする相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）のヌクレオチド配列（配列番号５）を示す。シグナル配列（イタリック）及び最終ペプチド（太字）（配列番号６参照）及び停止コドン（＊）が示される。５’非コード末端の配列は表されていない（対応する配列番号９）。
【図２】図２は、ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１（π−Ｄｐ１）及びＡＳＩＣａｌｇｉｎ−２（π−Ｄｐ２）ペプチドのマウスへのインビボ鞘内注射後の鎮痛効果を示す。化学的痛み（ホルマリン）：（Ａ）５分間隔で測定された自発的痛み挙動の動力学、（Ｂ）急性痛みの相Ｉ（０から１０分）及び炎症性痛みの相ＩＩ（１０から４５分）の合計経過時間。急性熱痛み：（Ｃ）尾引っ込め時間の速度論、（Ｄ）それぞれの動物で測定された曲線下面積（ＡＵＣ）の平均、炎症性痛覚過敏：（Ｅ）足引っ込め時間の速度論。コントロール値に対して痛覚過敏の有意性：＃、ｐ＜０．０５；＃＃、Ｐ＜０．０１；＃＃＃、ｐ＜０．００１；Ｎｅｗｍａｎ  Ｋｅｕｌｓ  多重比較によるＡＮＯＶＡ試験による。（Ｆ）痛覚過敏レベル（Ｔ−７分）から、それぞれの動物について測定された曲線下面積（ＡＵＣ）の平均。平均値±ｓｅｍ（平均値の標準偏差）が表され、試験された動物数（ｎ）が脚注で示される。ベヒクル±ナキソロン（ＮＡＬ）の注射又はラインで図に示されるそれぞれに対する有意性：有意性なしｎｓ、ｐ＞０．０５；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；Ｎｅｗｍａｎ  Ｋｅｕｌｓ  多重比較によるＡＮＯＶＡ試験による。
【図３】図３は、ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１（π−Ｄｐ１）ペプチドのマウスへのインビボ脳室内注射後の急性熱痛み試験での、鎮痛効果：（Ａ）尾引き込み時間の速度、（Ｂ）それぞれの動物で測定した曲線下面積（ＡＵＣ）の平均を示す。平均値±ｓｅｍ（平均値の標準偏差）が表される。試験された動物数（ｎ）が脚注で示される。ベヒクルの注射又はラインで図に示されるそれぞれに対する有意性：有意性なしｎｓ、ｐ＞０．０５；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；Ｎｅｗｍａｎ  Ｋｅｕｌｓ  多重比較によるＡＮＯＶＡ試験による。
【図４】図４は、ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１（π−Ｄｐ１）ペプチドの皮下インビボ注射後の炎症性痛覚過敏試験での鎮痛効果：（Ａ）後ろ足引き込み時間の試験の鎮痛効果を示す。ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１（π−Ｄｐ１）ペプチドは、左後足の皮下に注射され、同時にカラギーナン（□）が再度２時間後に注射された（時間、０又はＴ０、□）。同様の手順を実施した、ただし、ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１ペプチドの注射はＴ０でのみであり、即ち炎症性痛覚過敏の現れた後である（■）。（Ｂ）時間Ｔ−７分から、それぞれの動物で推定された曲線下面積（ＡＵＣ）の平均。平均±ｓｅｍ（平均値の標準偏差）が表される。試験された動物数（ｎ）が脚注で示される。ベヒクルの注射に対する有意性：＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；Ｎｅｗｍａｎ  Ｋｅｕｌｓ  多重比較によるＡＮＯＶＡ試験による。カラギーナンの注射の前のコントロール値に対しての有意性：＃、ｐ＜０．０５；＃＃、Ｐ＜０．０１；＃＃＃、ｐ＜０．００１；ペアＴ−試験による。
【図５】図５は、ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１（π−Ｄｐ１）及びＳＩＣａｌｇｉｎ−２（π−Ｄｐ２）ペプチドによる、ＣＯＳ細胞中で異種的に発現されるＡＳＩＣチャンネルによる生成される伝達の阻害を示す。それぞれ、ラットホモメリックＡＳＩＣ１ａ伝達のＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１（π−Ｄｐ１）による阻害の用量応答曲線、ＩＣ５０＝４９ｎＭ（Ａ）、ヒトホモメリックＡＳＩＣ１ａ伝達のＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１（π−Ｄｐ１）による阻害の用量応答曲線、ＩＣ５０＝１２７ｎＭ（Ｂ）、ラットホモメリックＡＳＩＣ１ｂ伝達のＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１（π−Ｄｐ１）による阻害の用量応答曲線、ＩＣ５０＝６５０ｎＭ（Ｃ）、ラットヘテロメリックＡＳＩＣ１ａ＋ＡＳＩＣ１ｂ（比率１：１）伝達のＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１（π−Ｄｐ１）による阻害の用量応答曲線、ＩＣ５０＝２２３ｎＭ（Ｃ）、及びラットヘテロメリックＡＳＩＣ１ａ＋ＡＳＩＣ１ｂ（比率２：１）伝達のＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１（π−Ｄｐ１）による阻害の用量応答曲線、ＩＣ５０＝３０８ｎＭ（Ｃ）である。４から１５実験例に基づき、平均値±ｓｅｍ（平均値の標準偏差）が表される。ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１（π−Ｄｐ１、６７４ｎＭ）及びＡＳＣＩＣａｌｇｉｎ−２（π−Ｄｐ２、８５２ｎＭ）による伝達阻害のオリジナルプロットが示される。（Ｆ）オリジナルプロット伝達は、ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−２（π−Ｄｐ２、６７４ｎＭ）によるヒトヘテロメリックＡＳＩＣ１ａ＋ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−２（比率２：１）の阻害を示す。休止電位：−６０ｍＶ、白棒：ｐＨ７．４から５．５へ低下、黒棒：ペプチドの適用。
【図６】図６は、ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１（π−Ｄｐ１）及びＡＳＩＣａｌｇｉｎ−２（π−Ｄｐ２）ペプチドによる、培地内のネズミの感覚ニューロン及び中枢ニューロンの天然ＡＳＩＣを伝達の阻害を示す。（Ａ）ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−２（π−Ｄｐ２、８５２ｎＭ、□）及びＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１（π−Ｄｐ１、６７４ｎＭ、■）によるラット（ｎ＝３４）の感覚ニューロンのＡＳＩＣを伝達の平均阻害。右側には、休止電位−５０ｍＶでの最初の伝達、及びｐＨを７．４から６へ低下させた場合（白棒）の記録された伝達の例を示す。前記感覚ニューロンでは、合計ＡＳＩＣ伝達は、ホモメリックＡＳＩＣ１ａ伝達、ＡＳＩＣ１ｂ伝達及びＡＳＩＣ３タイプの伝達の混合からの結果である。（Ｂ）ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−２（π−Ｄｐ２、８５２ｎＭ、□）及びＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１（π−Ｄｐ１、６７４ｎＭ、■）によるマウス（ｎ＝１８）の背側脊髄ニューロンのＡＳＩＣを伝達の平均阻害。右側には、休止電位−５０ｍＶでの最初の伝達、及びｐＨを７．４から６へ低下させた場合（白棒）の記録された伝達の例を示す。（Ｃ）（Ｂ）ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−２（π−Ｄｐ２、２９３ｎＭ、８５２ｎＭ及び２．９μＭ、□）及びＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１（π−Ｄｐ１、２２４ｎＭ及び２．２μＭ、■）によるマウス（ｎ＝２６）の海馬ニューロンのＡＳＩＣを伝達の平均阻害。右側には、休止電位−５０ｍＶでの最初の伝達、及びｐＨを７．４から５．５へ低下させた場合（白棒）の記録された伝達の例を示す。前記中枢ニューロン（ナウス脊髄及び海馬）では、合成ＡＳＩＣ伝達は、ホモメリックＡＳＩＣ１ａ伝達及びヘテロメリックＡＳＩＣを１ａ＋ＡＳＩＣ２ａ伝達の混合の結果となる。平均値±ｓｅｍ（平均値の標準偏差）が表される。
【図７】図７は、ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１（π−Ｄｐ１）及びＡＳＩＣａｌｇｉｎ−２（π−Ｄｐ２）ペプチドによる、マウスの背側脊髄ニューロンの膜電位への効果を示す。（Ａ）自発作用電位はシナプス活性を反映するニューロンの膜電位（点線：０ｍＶ）。ｐＨ７．４から６への低下によるＡＳＩＣ伝達の活性化は、前記ピークが作用電位をトリガーする脱分極を誘導する（拡大図）。ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１ペプチド（π−Ｄｐ１、６７４ｎＭ）の適用は、前記ニューロンの休止電位を変更せず、自発作用も変更しない。一方で、前記酸ｐＨ低下による誘導された脱分極は、もはや作用電位を誘導しない。（Ｂ）電気刺激により誘発される作用電位（上に対応する方形型伝達）４つの応答が重ねられており（左側図面）：２つの閾下脱分極と作用電位をトリガーする２つの他の電位（点線：０ｍＶ）である。
【実施例】
【００４７】
実施例１：  ２つのペプチド、ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１（π−Ｄｐ１）及びＡＳＩＣａｌｇｉｎ−２（π−Ｄｐ２）を蛇ブラックマンバからの分離
毒物及びペプチド毒の生成
凍結乾燥毒は  Ｌａｔｏｘａｎ  （Ｖａｌｅｎｃｅ、  Ｆｒａｎｃｅ）．社から入手した。毒を酢酸（１％）で希釈し、それをＳｅｐｈａｄｅｘＧ５０樹脂を含むカラムに通して分画した。ペプチド画分を回収し、続いて高性能液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）システムで分画した：
（１）ペプチド画分を、カチオン交換樹脂に負荷し、溶媒ｐＨ３．０の１％酢酸及び１Ｍの酢酸アンモニウムでｐＨ勾配を付けた。ＡＳＩＣａｌｇｉｎを含む画分を、６０％酢酸アンモニウムから出発して流出させた。
（２）このペプチド画分を、Ｃ１８逆相カラムに負荷し、内容物を、溶媒水−０．１％ＴＦＡとアセトニトル−０．１％ＴＦＡの間で疎水性勾配で溶出させた。ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１及びＡＳＩＣａｌｇｉｎ−２ペプチドは、それぞれアセトニトリルの２６％及び２７％で純粋に溶出された。
【００４８】
ペプチド分析
アミノ酸分析
ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１及びＡＳＩＣａｌｇｉｎ−２は２つの塩基性イソペプチドであり、５７アミノ酸を持ち、８個のシステインを持っておち４個のジスルフィド架橋を形成しており（図１Ａ、それぞれ配列番号２及び３）、２１個のアミノ酸（図１Ｂ、配列番号６参照）のシグナル配列が先行している。これらはお互いに、配列番号１、２又は３の４番目のアミノ酸の点でのみ相違する（配列番号６の２５番目の位置）
クローン化によるアミノ酸配列決定
ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１の全アミノ酸配列（図１Ｂ）は、粗毒内に痕跡量存在するメッセージＲＮＡ（ｍＲＮＡ）から、ＰＣＲによりｃＤＮＡをクローニングすることで決定された。蛇ブラックマンバ毒（Ｓｉｇｍａ）の毒２５ｍｇを、溶解緩衝液（５００ｍＭのＬｉＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１％（重量／容積）のＬｉＤＳ及びｐＨ７．５の１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液中の５ｍＭのジチオスレイトール）に懸濁させた。メッセンジャーＲＮＡを、ｄＴ２５オリゴヌクレオチドでグラフト化磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ、  ＵＫ）の手段で補足した。このオリゴヌクレオチドを、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ  逆転写酵素（ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．、  Ｊａｐａｎ）を用いて、ｍＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写を実施するためのプライマーとして直接使用した。得られた固相ｃＤＮＡライブラリーを、直接Ｎ末端配列決定に寄る前記毒の部分タンパク質配列から定められた、センス（ＴＧＩＴＴＹＣＡＲＣＡＹＧＧＩＡＡＲＧＴ、配列番号７）及びアンチセンス（ＹＴＴＩＡＲＲＴＴＩＣＧＲＡＡＩＧＧＣＡＴ、配列番号８）オリゴヌクレオチドを用いて、縮重ＰＣＲの実施に使用された。前記ポリメラーゼによるエラーを除外するために、３つの独立したＰＣＲを実施し、望ましいサイズ（８９塩基対）を持つ断片を生成し、続いてこれらをｐＧＥＭＴｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローニングして配列決定された。これらの配列により、付加ＥｃｏＲＩ制限サイトを持たせた特定のセンスオリゴヌクレオチド（ＡＣＡＣ（ＧＡＡＴＴＣ）ＧＣＴＡＴＣＡＴＡＡＣＡＣＴＧＧＣＡＴＧ、配列番号９）を合成し、同様に付加ＥｃｏＲＩサイトを持たせた特定のポリ−ｄＴ３０アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＣＡＣ（ＧＡＡＴＴＣ）ｄＴ３０、配列番号１０）を合成した。これらの２つのオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲによって、同定目的で全３’コード及び３’非コード末端を増幅することができた。３つの独立した約４００塩基対のＰＣＲ生成バンドが生成され、これらをＥｃｏＲＩ制限サイトでｐＧＥＭＴｅａｓｙベクターにサブクローニングすることで、ポリメラーゼにより生成されるエラーを除外して配列を決定することができた。
【００４９】
３’末端及び５’非コード配列にもとづいて、前記コード配列を含むセンスオリゴヌクレオチド（ＡＣＡＣ（ＧＡＡＴＴＣ）ＴＣＣＡＧＡＧＡＡＧＡＴＣＧＣＡＡＧＡＴＧ、配列番号１１）及びアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＣＡＣ（ＧＡＡＴＴＣ）ＡＴＴＴＡＧＣＣＡＣＴＣＧＴＡＧＡＧＣＴＡ、配列番号１２）を合成した。４つの独立したＰＣＲを、固相ｃＤＮＡライブラリー上で実施し、得られたＰＣＲ産物を再び  ｐＧＥＭＴｅａｓｙベクターにサブクローニングして、ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１毒前駆体の完全ヌクレオチド配列を得た。
【００５０】
ペプチド配列
前記配列は、自動配列決定装置（ＬＣ４９１、  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、  ＵＳＡ）で、前記制限されアルキル化されたペプチドのアミノ酸Ａｓｐ４０までを直接Ｎ−末端配列方法で確認した。
【００５１】
酵素開裂
前記配列を確認するために、ペプチドを次の酵素処理に付した：
（ａ）Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラム上の消化ペプチドの分離と伴う、Ｖ８プロテアーゼ。Ｄ１５及びＥ４３での開裂及び２つのペプチドの分子量１７８６．９Ｄａ（ペプチド１から１５）（完全に再配列化）、及び３１９４．５Ｄａ（ペプチド１６から４３）（部分配列）のＨＰＬＣにおける分離は、Ｎ末端配列を確認することを可能にする。
（ｂ）質量スペクトル測定による直接分析を伴う、トリプシン消化。トリプシン消化は、Ｎ末端配列をも確認し、かつＡＳＩＣａｌｇｉｎのペプチド配列の他の部分をも確認する。ＭＳ／ＭＳ分析により検出及び配列化されたトリプシンペプチドは、以下表１に与えられている。
【００５２】
【表１】
0006000245.tif 000002
【００５３】
質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）
全ての場合に、質量スペクトル分析は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦスペクトル装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、  ＵＳＡ）で実施された。
【００５４】
シナピン酸マトリクス（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、  ＵＳＡ）を用いて、既知分子量のタンパク質の混合物の内部較正を用いて、検量天然タンパク質が陽イオンリニアモードで分析された。
【００５５】
測定された分子量は、ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１で６５５４．８Ｄａ、ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−２で６５３８．４Ｄａであった。これは、ＧＰＭＡＷタンパク質分析ソフトウェアで、配列から計算される分子量と完全に一致した。これらの結果は、遊離カルボン酸Ｃで末端を示唆する。２８０ｎｍで計算される分子吸収係数は、ε＝３０４０（ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１）及びε＝１７６０（ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−２）である。
【００５６】
ホモログのデータベース検索
ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１及びＡＳＩＣａｌｇｉｎ−２は、データベースにはなく、知られたペプチド又は毒との完全な配列一致はなかった。
【００５７】
ＢＬＡＳＴ配列整列プログラムは、ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１及びＡＳＣａｌｇｉｎ−２はそれにもかかわらず、種々のコブラ蛇(ナジャ属Naja及びリンガルスRinghals)からの毒から精製されたペプチドＣＭ−１ｂ、ＣＭ−３及びＣＭ−２ａ、また、キングコブラOphiophagus  hannahの毒中に存在するα−神経毒ＯＨ−２６と４７％から５５％の配列同一性（６３％から６６％配列ホモロジー）を示すことを表す。しかし、これらのＣＭ及びＯＨ−２６神経毒は、ＡＳＩＣをチャンネルへの作用を記載されておらず、インビボでの鎮痛活性についても示されておらず、むしろ細胞毒性効果が示されている。従って、ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１又はＡＳＩＣａｌｇｉｎ−２との５５％未満の配列同一性では、本発明のペプチドで示される生理学的性質は失われる、と考えられる。一方で、当該技術分野では、イソフォーム及び／又はオーソログ毒物は、約７０％の配列同一性の結果それらのタンパク質配列におけるいくらかの相違にもかかわらず保持された活性を示す、ということが知られている。従って、ＡＳＩＣａｉｌｇｉｎ−１又はＡＳＩＣａｌｇｉｎ−２と少なくとも５６％から７０％の配列同一性を示すイソフォーム及び／又はオーソログ毒物は、本発明のペプチドの性質を保持し得る。
【００５８】
実施例２：  ＡＳＩＣａｉｌｇｉｎ−１（π−Ｄｐ１）及びＡＳＩＣａｌｇｉｎ−２（π−Ｄｐ２）ペプチドの、髄膜注射後の鎮痛効果
マウス（Ｃ５７Ｂ１６Ｊ、７−から１１週齢オス）の痛み挙動が、Ｈｙｌｄｅｎ及びＷｉｌｃｏｘ  ［１９８０］［３５］の手順に従い、脊椎のＬ５とＬ６の間に、前記ペプチドを髄膜注射（ＩＴ）した後、評価された。３４μＭのＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１（０．３４ｎｍｏｌ）又は２μＭのＡＳＩＣａｌｇｉｎ−２（０．２ｎｍｏｌ）の効果を、３．１ｍＭのモルヒネ（３１ｎｍｏｌ）又は１０μｌの生理的食塩水（１４５ｍＭのＮａＣ、５ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．０５％ウシ血清アルブミン）のＩＴ注射の効果と比較した。実験のいくつかの系列で、ナキソロン、アヘンレセプター阻害剤（特にμタイプ）を、５０μｌの０．９％のＮａＣｌ中で２ｍｇ／ｋｇを、前記ＡＳＩＣａｌｇｉｎペプチドのＩＴ注射の１０分前に、皮下に注射した。
【００５９】
毒性
ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１及びＡＳＩＣａｌｇｉｎ−２ペプチドの髄膜注射は、マウスの、運動障害の挙動、平衡障害、無関心、麻痺又は痙攣タイプに何ら変化を誘導せず、いかなる死亡をも引き起こさない。
【００６０】
急性化学的及び炎症性痛み
ホルマリン（０．９％ＮａＣｌ溶液中、２％で１５μｌ）をマウスの後足のアーチ部分へ皮下注射して、２つの相の痛みを誘導した：相Ｉは化学的痛みが１０分間の急性痛み、相ＩＩは炎症性痛みで１５から４５分間（図２Ａ）である。
【００６１】
前記痛みは、棒物の自発的痛み挙動を観察することで測定され、即ち、マウスが注射された足を持ち上げる、そこをつつき、舌でなめ、足を振る間の時間を計測することで、測定される（統合自発挙動）。
【００６２】
ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１の前記ＩＴ注射は、相Ｉの痛みを４０％、相ＩＩの痛みを７０％まで大きく低減する。この鎮痛効果は、モルヒネと類似する（図２Ｂ）。
【００６３】
ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−２のＩＴ注射は、ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１と同一の効果である。
【００６４】
ナキソロン、アヘンレセプター阻害剤での前処置は、前記２つの相ＩＩ及び相ＩＩのいずれにおいてもＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１の鎮痛効果に影響はない。
【００６５】
ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１及びＡＳＩＣａｌｇｉｎ−２ペプチドは、蛇ブラックマンバの毒から抽出された最初の鎮痛性ペプチドである。
【００６６】
急性熱痛み
熱痛みが、マウスを用いて、４６℃（反射運動、動物はブレースされている）の水中に浸漬させた尾を引っ張る時間を、３０秒の時間に限定して、研究した。
【００６７】
ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１ペプチドは、モルヒネと同等の強さの鎮痛効果を誘導したが（ＩＴ注射後７分間）、より高濃度ではより長い時間である（図２Ｃ）。
【００６８】
ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１の鎮痛効果は、ナキソロンの前処置によって大きくは阻害されない（図２Ｄ）。
【００６９】
炎症性過敏痛感
マウスの後ろ脚のアーチ内に２％のカラギーナンを皮下注射は、炎症性及び過敏痛感を誘導し、これは、４６℃の水中に浸漬された後ろ脚を引き込む時間（統合自発運動、動物はブレースされている）が、３０秒限定で、カラギーナンの注射後２時間、測定される（図２Ｅ、＃）。
【００７０】
ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１のＩＴ注射は、急激に鎮痛効果を誘導し、これは、モルヒネと同程度であり、実験期間を通じて持続した（６７分間、図２Ｅ）。
【００７１】
ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１の鎮痛効果は、ナキソランの前処理により２０％程度の僅かな阻害を受けるのみである。
【００７２】
運動活性
ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１ぺの運動活動への効果は、ローターロッド試験の手段で評価された。マウスを１分間で４回転（ｒｐｍ）する軸回転体上に置き、５ｒｐｍから４０ｒｐｍまで一定に加速して実施する。落下するまでの時間を、最大３００秒限定で測定する。
【００７３】
ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１ペプチドのＩＴ注射は、ベヒクル溶液の注射と比較して運動活性に関してはマウスの性能レベルでなんら有意な効果（ＡＮＯＶＡ試験）も誘導しない。
【００７４】
実施例３：  ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１（π−Ｄｐ１）の、インビボ脳室内注射後の鎮痛効果
ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１の脳室内（ＩＣＶ）注射は、定位置座標（皮質表面下−２．４ｍｍ、前後軸で−０．５ｍｍ、前頂に対して中外軸で＋１．６ｍｍ）を用いて、前記第３脳室内にイソフラン（１．５％）で麻酔されたマウス（５７Ｂ１６Ｊ、７−から１１週齢オス）に実施された。３４μＭのＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１（０．３４ｎｍｏｌ）を含む溶液の５μｌのＩＣＶ注射の効果が、５μｌの生理的食塩水（１４５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．０５％ウシ血清アルブミン）の効果と比較された。アヘンレセプター（特にμタイプ）の阻害剤であるナキソロンが、ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１のＩＣＶ注射の１０分前に、０．９％のＮａＣｌの５０μｌ中の２ｍｇ／ｋｇで皮下注射された。
【００７５】
毒性
ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１のＩＣＶ注射は、マウスの、運動問題、平衡問題、無関心、麻痺又は痙攣タイプに変化を誘導せず、３日後でさえ死亡もない。
【００７６】
急性熱痛み
熱的痛みが、マウスを用いて、４６℃の水に浸漬された尾を引き上げる（反射運動、動物はブレースされている）時間を、限度を３０秒として測定することで研究された。
【００７７】
ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１のＩＣＶ注射は、強い鎮痛効果を示し、実験を通じて持続し（６７分、図３）、この効果は、ナキソロンの前処理で変化はなかった。鎮痛効果は、尾の引き込み時間値は、コントロール値まで戻るまで数時間持続する。
【００７８】
実施例４：  ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１ペプチド（π−Ｄｐ１）の皮下注射後の鎮痛効果
ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１ペプチドの皮下（ＳＣ）注射の効果が、カラギーナン誘導炎症性痛覚過敏について試験された。
【００７９】
マウス（Ｃ５７Ｂ１６Ｊ、７−から１１週齢のオス）の後ろ脚のアーチ内に２％のカラギーナンの皮下注射は、炎症性及び過敏痛感を誘導し、これは、４６℃の水中に浸漬された後ろ脚を引き込む時間（統合自発運動、動物はブレースされている）が、３０秒限定で、カラギーナンの注射後２時間、測定される。
【００８０】
ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１ペプチド（０．９％のＮａＣｌ、０．０５％のウシ血清アルブミン中の３４μＭのＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１（０．３４ｎｍｏｌ）を含む１０μｌ）をカラギーナンと共に注射した場合、熱的炎症過敏痛感は観察されない（図４、□）。この条件下で、２時間後のＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１の第２のＳＣ注射は、なんらさらなる有意な効果を生じない（図４、□）。ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１ペプチドをカラギーナンと共注射しなかった場合、前記炎症が既に生じている場合に、カラギーナンのみの注射の２時間後の前記ペプチドのＳＣ注射は、炎症性痛感過敏を逆転させ、さらに、カラギーナンの注射前のコントロールと比較して鎮痛効果を発揮した（図４、■及び＃）。
【００８１】
実施例５：  ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１（π−Ｄｐ１）及びＡＳＩＣａｌｇｉｎ−２（π−Ｄｐ２）ペプチドの前記ＡＳＩＣを伝達に対する活性
ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１（π−Ｄｐ１）及びＡＳＩＣａｌｇｉｎ−２（π−Ｄｐ２）ペプチドは、ＣＯＳ細胞で異種的に発現され「全細胞」構成でパッチクランプ技術を用いて記録されるＡＳＩＣチャンネルにより精製される伝達を阻害する（「適用電位」モード）。
【００８２】
ペプチドは、ｐＨ７．４から６又は５．５へ細胞外で低下させる前にｐＨ７．４で３０秒、適用される。
【００８３】
ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１及びＡＳＩＣａｌｇｉｎ−２ペプチドは同じ効果を持ち、ラットホモメリックＡＳＩＣ１ａチャンネルにより生成される伝達を４９ｎＭで５０％阻害（ＩＣ５０）を生成する濃度で（図５Ａ）、ヒトホモメリックＡＳＩＣチャンネルにより生成される伝達を１２７ｎＭでＩＣ５０で阻害する（図５Ｂ）。ラットホモメリックＡＳＩＣ１ｂチャンネルで生成される伝達は、６５０ｎＭのＩＣ５０で阻害され（図５Ｃ）、ラット及びヒトヘテロメリックＡＳＩＣ１ａ＋ＡＳＩＣ２ａチャンネルでは３０８ｎＭのＩＣ５０、及びラットヘテロメリクＡＳＩＣ１ａ＋ＡＳＩＣ１ｂチャンネルでは２２３ｎＭのＩＣ５０で阻害される「図５Ｄ）（ＡＳＩＣチャンネルはヒトでは記載されていない）。
【００８４】
ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１及びＡＳＩＣａｌｇｉｎ−２ペプチドは、ラット及びヒトホモメリックＡＳＩＣ２ａ及びＡＳＩＣ３チャンネルは阻害せず、またラットヘテロメリックＡＳＩＣ１ａ＋ＡＳＩＣ３及びＡＳＩＣ１ｂ＋ＡＳＩＣ３チャンネルも阻害しない。
【００８５】
前記ペプチドの適用が停止されると、ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１及びＡＳＩＣａｌｇｉｎ−２ペプチドの効果は可逆的である。
【００８６】
ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１及びＡＳＩＣａｌｇｉｎ−２ペプチドは、現在まで、ホモメリックＡＳＩＣ１ｂチャンネル及びヘテロメリックＡＳＩＣ１ａ＋ＡＳＩＣ１ｂ及びＡＳＩＣ１ａ＋ＡＳＩＣ２ａチャンネルの阻害可能として記載された最初の例である。
【００８７】
他方では、  ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１ペプチド（２μＭ）は、カプサイシン（１μＭ）で活性化させたラットＴＲＰＶ１チャンネル（これはまた感覚神経端部で痛み伝達の関与する）により生成される伝達を阻害しない。
【００８８】
この説明に限定されるものではないが、ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１及びＡＳＩＣａｌｇｉｎ−２ペプチドの鎮痛効果は、中枢神経系ニューロンでのホモメリックＡＳＩＣする１ａチャンネル及びヘテロメリックＡＳＩＣする１ａ＋ＡＳＩＣ２ａチャンネルの阻害を含み（ＩＴ及びＩＣＶ注射）、及び感覚ニューロンでのホモメリックＡＳＩＣ１ａ及びＡＳＩＣ１ｂチャンネル、及びヘテロメリックＡＳＩＣする１ａ＋ＡＳＩＣ１ｂチャンネルの阻害を含む（皮下注射、ＩＴ注射、ただしホモメリックＡＳＩＣ１ａ及びＡＳＩＣ１ｂ及びヘテロメリックＡＳＩＣ１ａ＋ＡＳＩＣ１ｂが、脊髄後角のレベルで感覚ニューロンの中枢端部に存在する場合）。
【００８９】
実施例６：  中枢神経系ニューロン及び感覚ニューロンの天然ＡＳＩＣ伝達におけるＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１（π−Ｄｐ１）及びＡＳＩＣａｌｇｉｎ−２（π−Ｄｐ２）の活性
ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１及びＡＳＩＣａｌｇｉｎ−２ペプチドは、大人ラット脊髄神経節から（図６Ａ）、マウス胚背側脊髄から（図６Ｂ）、及び新生マウス（２日）海馬から（図６Ｃ）から単離された主培地でのニューロンでの「全細胞」構成（「適用電位」モード）でのパッチクランプ技術を用いて記録されたＡＳＩＣ伝達を阻害する。
【００９０】
ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１及びＡＳＩＣａｌｇｉｎ−２ペプチドの、感覚ニューロンの全ＡＳＩＣ伝達の部分的阻害は、感覚ニューロンでのＡＳＩＣ３タイプ（これはＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１及びＡＳＩＣａｌｇｉｎ−２ペプチドでは阻害されない）の大部分からなる、一方で、中枢系（海馬及び脊髄）ＳＩＣ伝達は、ホモメリックＡＳＩＣ伝達及びヘテロメリックＡＳＩＣ１ａ＋ＡＳＩＣ２ａ伝達（共にＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１及びＡＳＩＣａｌｇｉｎ−２ペプチドで阻害される）の混合からなる、ことで説明される。
【００９１】
実施例７：  ニューロンへの、ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１（π−Ｄｐ１）及びＡＳＩＣａｌｇｉｎ−２（π−Ｄｐ２）ペプチドの活性
培地での脊髄ニューロンへのＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１及びＡＳＩＣａｌｇｉｎ−２ペプチドの適用は、基底伝達レベルになんの変更も誘導しないし、「全細胞」構成でのパッチクランプ技術を用いて記録される静止電位にも変化を誘導しない（図７Ａ）。
【００９２】
ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１及びＡＳＩＣａｌｇｉｎ−２ペプチドの適用は、培地中の脊髄ニューロンの自発的シナプス電気活性を変更せず、電気刺激（「パッチクランプの「適用」モード）により誘導される作用電位の形状及び閾値も変化させない（図７Ｂ）。
【００９３】
この結果は、ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１及びＡＳＩＣａｌｇｉｎ−２ペプチドは、ニューロンの本質的な興奮性、シナプス機能又は作用電位の生成（Ｎａ＋チャンネル）又は脱分極（Ｋ＋チャンネル）で関与する電位依存伝達にも、影響を与えないということを示す。
【００９４】
他方で、ＡＳＩＣａｌｇｉｎ−１及びＡＳＩＣａｌｇｉｎ−２ペプチドでのＡＳＩＣチャンネルの阻害は、酸性ｐＨ低下（７．４から６．０）に応答するニューロン興奮を低減させ、ＡＳＩＣ伝達により生成される脱分極が作用電位を生じさせるには十分ではない（図７Ａ）。
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１８．  Ｒｅｅｈ  ａｎｄ  Ｓｔｅｅｎ、  Ｐｒｏｇ．  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．、  １１３：  １４３−１５１、  １９９６
１９．  Ｓｔｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｌｅｔｔ．、  １９９：  ２９−３２、  １９９５ａ
２０．  Ｉｓｓｂｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｌｅｔｔ．、  ２０８：  １９１−１９４、  １９９６
２１．  Ｕｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．、  １０：  １１８５−１１９１、  ２００２
２２．  Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、  ２４：  １０９７４−１０９７９、  ２００４
２３．  Ｖｏｉｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、  ２１：  ８０２６−８０３３、  ２００１
２４．  Ｄｕｂｅ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｐａｉｎ、  １１７：  ８８−９６、  ２００５
２５．  Ｅｓｃｏｕｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、  ２７５：  ２５１１６−２５１２１、  ２０００
２６．  Ｄｉｏｃｈｏｔ  ｅｔ  ａｌ．、  ＥＭＢＯ  Ｊ．、  ２３：  １５１６−１５２５、  ２００４
２７．  Ｄｅｖａｌ  ｅｔ  ａｌ．、  ＥＭＢＯ  Ｊ．、  ２７：  ３０４７−３０５５、  ２００８
２８．  Ｍａｚｚｕｃａ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、  １０：  ９４３−９４５、  ２００７
２９．  Ａｂｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｅｈａｖ．、  １７（６）：  １２１３−１２１９、  １９８２
３０．  Ｃｒｉｄｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｈｅｎｒｙ、  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．、  ５８４（１−２）：  １６３−１６８、  １９９２
３１．  Ｗｏｏｌｆｅ  ａｎｄ  Ｍａｃｄｏｎａｌｄ、  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｅｘｐ．  Ｔｈｅｒ．、  ８０：  ３００−３０７、  １９４４
３２．  Ａｎｋｉｅｒ、  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、  ２７（１）：  １−４、  １９７４
３３．  Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｐａｉｎ、  ５５：  ８５−９２、  １９９３
３４．  米国特許第５、８７７、０２６号
３５．  Ｈｙｌｄｅｎ  ａｎｄ  Ｗｉｌｃｏｘ、  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、  ６７：  ３１３−３１６、  １９８０
３６．  Ｄｅｖａｌ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、  ３１（１６）：  ６０５９−６０６６、  ２０１１
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
0006000245.tif 000005
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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