(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エアロゾル投与装置内の気体媒質に浮遊し接触する薬学的有効量のエアロゾル化したダプソン粒子を含有することを特徴とする、
気道炎症の予防又は治療を必要とする患者の気道炎症を予防又は治療するための吸入投与用医薬組成物。
【請求項２】
水溶液中に薬学的有効量のダプソンを含有することを特徴とする、
気道炎症の予防又は治療を必要とする患者の気道炎症を予防又は治療するための吸入投与用医薬組成物。
【請求項３】
前記患者は、嚢胞性線維症、気管支拡張症、閉塞性細気管支炎、肺気腫、慢性気管支炎、慢性鼻副鼻腔炎、吸引毒性傷害、慢性閉塞性肺疾患、特発性肺線維症、喘息及び慢性気道炎症からなる群から選ばれる疾病又は疾患を患っている請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記水溶液は、前記水溶液のエアロゾルの噴霧化により投与される請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記医薬組成物は、１日１回投与される請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記医薬組成物は、均等な時限的投薬量で１日に２〜１２回投与される請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記医薬組成物の投与量は、１回の投与につき体重１ｋｇあたり０．５ｍｇから体重１ｋｇあたり５．０ｍｇである請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記医薬組成物の投与量は、１回の投与につき体重１ｋｇあたり１．０ｍｇから体重１ｋｇあたり４．０ｍｇである請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記医薬組成物の投与量は、１回の投与につき体重１ｋｇあたり１．５ｍｇから体重１ｋｇあたり３．０ｍｇである請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記医薬組成物の投与量は、１回の投与につき体重１ｋｇあたり２．０ｍｇである請求項９に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、気道炎症の、及び、気道炎症の特徴がある疾患又は疾病の治療に関する。特に、本発明は、哺乳類の生体内に投与した場合に気道炎症を軽減するエアロゾル化したダプソン（又は、ダプソンの水性製剤）を提供する。
【背景技術】
【０００２】
気道の炎症、特に喘息、嚢胞性線維症、肺気腫及び慢性閉塞性肺疾患などの慢性炎症性疾患に関連する疾病は、往々にして衰弱性であり、複雑であり、治療に費用がかかる。一般的に好中球支配性炎症の特徴があるこれら疾病に対する現在の治療の選択肢は、免疫系の過剰活動を抑制するためのステロイドの使用及びマクロライド系抗生物質の投与を含む。しかし、これらの治療には、いずれも欠点がある。ステロイドは一般に免疫系を抑制するため、その使用により患者の感染症（例えば、日和見感染症）のリスクが高くなる。マクロライド系抗生物質の使用は、マクロライド耐性菌の進化を危険なほど高めることになる。明らかに、気道炎症治療のための改善された方策が必要である。
【０００３】
合成スルホンであるダプソン（ジアミノジフェニルスルホン）は、ハンセン病、ニューモシスチス・ジロヴェチ（旧:ニューモシスチス・カリニ）肺炎及びマラリアなど様々な疾病の治療に使用され、奏効している。ダプソンは抗炎症剤としても認められており、好中球支配性炎症、例えば、疱疹状皮膚炎の特徴がある皮膚疾患を治療するため、全身及び局所的のいずれにおいても使用されている（２００１年、Zhu et al）。
【０００４】
Berlow et al.（１９９０年）は、経口投与型ダプソンを用いたステロイド依存性喘息の治療を記載している。ステロイド依存性喘息が表れている患者は、病徴の再発を伴わずにステロイド投与を停止することは不可能であり、反面、特に長期間にわたるステロイド使用によって副作用を発症する危険性がある。研究の結果は、１０人中９人の患者が、ダプソンを服用しながら実質的にステロイド摂取を減量又は停止することができたことを示している。しかし、経口（従って、全身）投与では、１０人中９人の患者が著しい貧血を起こしている。
【０００５】
Chougule et al.（２００８年）は、ダプソンの噴霧乾燥リポソームドライパウダー吸入器用製剤の開発を研究しており、そのような製剤によるニューモシスチス・カリニ感染症治療の可能性について述べている。研究の目的は、体外における噴霧乾燥製剤の沈着を評価することにある。結果は、専用拡散セルを用いて評価した場合に、セロファン膜を介した持続放出（１６時間まで）を示すダプソンの噴霧乾燥製剤を研究者らが開発できたことを示している。市販のアンダーセンカスケードインパクタ装置を用いて、エアロゾル性能も評価している。研究者らによれば、「前途有望」と思われる結果であった。しかし、これらの結果は非常に予備的なものである。生体内試験を試みることなく、炎症に対する効果が実証も示唆もされていないからである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このように、先行技術では、エアロゾル化したダプソン製剤を用いた好中球支配性気道炎症の治療法を提供するには全く至っていない。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ダプソンのエアロゾル化した（又は、水性）製剤を用いた、気道炎症、特に、好中球支配性炎症の治療方法を提供する。本発明は、この方法のようにダプソンを哺乳類に投与した場合、患者の気道の好中球支配性炎症に伴う症状を解消（例えば、軽減、低下又は低減）することを実証する初めてのものである。また、本発明は、免疫抑制剤としてよりも免疫変調成分として機能するというダプソンの作用形態の初めての実証も含む。従って、炎症を治療するために、例えば、ステロイドの代わりにダプソンを投与することで、治療を受けている患者の感染症リスクが高まりにくくなる。更に、化合物が微生物に選択圧を加えることがないため、ダプソンの使用が抗生物質耐性菌株の増加に寄与することはない。特に重要なのは、本明細書で実証されるように、ダプソンは、経口及びエアロゾルのいずれにおいてもＬＰＳ誘導性上皮内好中球蓄積を減少させたが、エアロゾルのダプソンでの治療のみが（しかも、経口投与に求められる低濃度で）粘液線毛輸送機能を正常な状態に回復させたことである。更に、ダプソンの投与に的を絞ったこのやり方であれば、経口の全身ダプソン投与に起因する厄介な副作用（例えば、貧血）が発生しにくい。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ−１Ｃ】図１Ａ〜１Ｃは、ＮＨＢＥ培養細胞からのＩＬ-８分泌に対するダプソンの作用を示す。増殖因子をＬＰＳ又はダプソンの暴露の２４時間前に培地から引き上げ、上清をＬＰＳ刺激の２４時間後に採取した。図１Ａ：１０μｇ／ｍｌのＬＰＳでＩＬ-８が大幅に増加し、０．３、１又は１０μｇ／ｍｌのダプソンがこの効果を抑制した。図１Ｂ：１μｇ／ｍｌのダプソンでは、２４、４８及び７２時間の時点で基礎ＩＬ-８分泌に影響はなかった。図１Ｃ：１μｇ／ｍｌのダプソンが、２４及び７２時間の時点でＬＰＳ誘導性のＩＬ-８分泌を対照群レベルにまで抑制した。値は、平均値±標準誤差（ＳＥ）である。ｎ＝６である。対照群（Cont）との比較で、*P < 0.05、 ***P < 0.001である。ＬＰＳ単体との比較で、#P < 0.05、 ##P < 0.01である。
【図２Ａ−２Ｄ】図２Ａ〜２Ｄは、気液界面条件下で培養されたＮＨＢＥ培養細胞からのＬＰＳ誘導性の頂端側（図２Ａ及び２Ｃ）又は側底側（図２Ｂ及び２Ｄ）ＩＬ-８分泌に対するダプソン及びデキサメタゾン（ＤＥＸ）の作用を示す。ＮＨＢＥ細胞を、１μｇ／ｍｌのダプソン（図２Ａ及び２Ｂ）又は０．１μｇ／ｍｌのＤＥＸ（図２Ｃ及び２Ｄ）の存在及び非存在下において媒地中で培養し、２４時間にわたり頂端（ＡＰ）又は側底（ＢＬ）側から１０μｇ／ｍｌのＬＰＳで刺激した。図２Ａ：ＡＰ側ＬＰＳが、頂端側ＩＬ-８分泌を大幅に増加させ、ダプソンによりこの作用が抑制された。図２Ｂ：ＡＰ側及びＢＬ側ＬＰＳが、側底側ＩＬ-８分泌を大幅に増加させ、ダプソンによりこの作用が抑制された。値は、平均値±ＳＥであり、ダプソンにおいてｎ＝６である。対照群との比較で、***P < 0.001である。ＬＰＳ単体との比較で、#P < 0.05、 ###P < 0.001である。図２Ｃ：ＡＰ側ＬＰＳが、頂端側ＩＬ-８分泌を大幅に増加させた。ＤＥＸが、ＬＰＳ誘導性のＩＬ-８分泌と共に基礎ＩＬ-８レベルを抑制した。図２Ｄ：ＡＰ側及びＢＬ側ＬＰＳが、側底側ＩＬ-８分泌を大幅に増加させ、ＤＥＸによりこの作用が抑制された。値は、平均値±ＳＥであり、ＤＥＸにおいてｎ＝４である。対照群との比較で、*P < 0.05、 **P < 0.001である。ＬＰＳ単体との比較で、#P < 0.05である。
【図３】図３は、ＬＰＳ誘導性ＩＬ-８ｍＲＮＡ発現に対するダプソンの作用を示す。増殖因子は、ＬＰＳ、ダプソン又はデキサメタゾン（ＤＥＸ）の暴露の２４時間前に培地から引き上げた。ＮＨＢＥ細胞を、１０μｇ／ｍｌのＬＰＳ、０．３〜１０μｇ／ｍｌのダプソン、０．１μｇ／ｍｌのＤＥＸ又はその組み合わせで４時間にわたって刺激し、リアルタイム定量ＰＣＲを用いてＩＬ-８ｍＲＮＡ発現を評価した。１μｇ／ｍｌのダプソンでは、基礎ＩＬ-８ｍＲＮＡレベルに影響はなかったが、ＤＥＸはこれを減少させている。１０μｇ／ｍｌのＬＰＳがＩＬ-８ｍＲＮＡ発現を５倍を上回って増加させ、１及び１０μｇ／ｍｌのダプソンと０．１μｇ／ｍｌのＤＥＸによりこの作用が抑制された。データは、対照群と比較した倍率変化として表わされている。値は、平均値±ＳＥである。ｎ＝４である。対照群との比較で、*P < 0.05、 ***P < 0.001である。ＬＰＳ単体との比較で、#P < 0.05、 ##P < 0.01である。
【図４】図４は、２４時間にわたるＬＰＳ誘導性のＭＡＰＫ活性化に対するダプソンの一時的作用を示す。増殖因子は、ＬＰＳ又はダプソンの暴露の２４時間前に培地から引き上げた。ウェスタンブロット法により、ＥＲＫ１／２、ｐ３８及びＪＮＫのトレオニンリン酸化及びチロシンリン酸化を計測した。ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ Ｊというソフトウェアで、バンド強度を計算した。１０μｇ／ｍｌのＬＰＳでは[リン酸化（ｐ）ＥＲＫ１／２]／[ＥＲＫ１／２]の比率が大幅に増加したが、[ｐ−ｐ３８]／[ｐ３８]は増加しなかった。ｐ−ＪＮＫは検出されなかった。１μｇ／ｍｌのダプソンは、１時間の時点ではＬＰＳ誘導性のＥＲＫ１／２リン酸化反応を抑制したが、４及び２４時間の時点では抑制しなかった。値は、４回以上の個別の実験の平均値±ＳＥである。対照群（ＬＰＳ−、ダプソン−、各回）との比較で、*P < 0.05である。ＬＰＳ単体との比較で、#P < 0.05である。
【図５Ａ−５Ｂ】図５Ａ及び５Ｂは、ＬＰＳ誘導性のＥＲＫ１／２リン酸化反応（図５Ａ）及びＩＬ-８分泌（図５Ｂ）に対するＰＤ９８０５９（ＭＥＫ阻害剤）の作用を示す。増殖因子は、ＬＰＳの暴露の２４時間前に培地から引き上げた。２０μＭのＰＤ９８０５９を、ＬＰＳ刺激の１時間前に添加した。図５Ａ：ＬＰＳは、４時間の時点でＥＲＫ１／２リン酸化反応を用量依存的に高め、ＰＤ９８０５９によりこの作用が消滅した。値は、４回の個別の実験の平均値±ＳＥである。対照群（Cont）との比較で、*P < 0.05、 **P < 0.01である。ＬＰＳ単体との比較で、#P < 0.05である。図５Ｂ：ＰＤ９８０５９はＬＰＳ誘導性のＩＬ-８分泌を抑制しなかった。値は、平均値±ＳＥであり、ｎ＝６である。対照群との比較で、***P < 0.01である。
【図６Ａ−６Ｂ】図６Ａ及び６Ｂは、フェレットの気道におけるＬＰＳ誘導性好中球蓄積に対するダプソン治療の効果を示す。５日間毎日１日１回３０分間、フェレットにＬＰＳ（１０μｇ）被覆気管内チューブを挿管し、４日目〜８日目には、経口又は噴霧形態でダプソンを投与した。９日目に気管を取り出し、組織学的分析を行った。４つの異なる部位からの試料ごとに８つのランダムな位置で１５０μｍ中の上皮内好中球の総数を数え、平均化した。図６Ａ：経口のダプソンは、上皮内好中球数を減少させはしたが、大幅なものではなかった。数は、平均値±ＳＤである。ｎ＝４である。図６Ｂ：噴霧化したダプソンは、好中球蓄積を大幅に抑制した。値は、平均値±ＳＤである。賦形薬（vehicle）においてはｎ＝４であり、ダプソンにおいてはｎ＝５である。賦形薬（ＬＰＳ＋、ダプソン−）との比較で、*P < 0.05である。
【図７Ａ−７Ｂ】図７Ａ及び７Ｂは、３ｍｍ断片上で測った、粘液線毛輸送機能（ＭＣＴ）のＬＰＳ誘導性阻害に対するダプソン治療の効果を示す。図７Ａ：経口のダプソンは、ＭＣＴを増進させはしたが、大幅なものではなかった（Ｐ＝０．０９）。値は、平均値±ＳＤである。ｎ＝４である。図７Ｂ：噴霧化したダプソンは、正常レベルまでＭＣＴを大幅に増進させた。値は、平均値±ＳＤである。ｎ＝５である。賦形薬（ＬＰＳ＋、ダプソン−）との比較で、**P < 0.01である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、ダプソンのエアロゾル製剤投与による気道炎症の治療方法を提供する。理論により拘束されないが、ダプソンは、ＩＬ−８及びＩＬ−１３を抑制することにより、（免疫抑制に対立するものとしての）免疫調節効果を発揮すると思われる。システインＸシステイン（ＣＸＣ）ケモカインファミリーであるＩＬ−８は、最も強力な好中球化学誘引物質の１つとして作用する。従って、ＩＬ−８活性の減衰は、炎症部位への好中球の動員を低下又は減少させ、これにより、その部位での好中球支配性炎症が減少又は低下する。ＩＬ−１３は、喘息患者の杯細胞過形成を誘導することで知られており、この過程の抑制は、気道炎症の症状を制御するためにも役立つ。
【００１０】
ステロイドが免疫抑制剤であり、その使用で炎症を抑えることができる一方で、その使用により免疫が抑制されてしまい、感染症（例えば、日和見感染症）のリスクが高くなることから、本発明の方法は、炎症に対するステロイドの使用と比べ、有利である。同様に、ダプソンの使用がマクロライド耐性菌の進化に寄与しないことから、ダプソンの使用は、マクロライド系抗生物質の使用と比べ、有利である。また、本明細書で実証されるように、ダプソンは、経口及びエアロゾルのいずれにおいてもＬＰＳ誘導性上皮内好中球蓄積を減少させたが、エアロゾルのダプソンでの治療のみが粘液線毛輸送機能を正常な状態に回復させている。（気道上皮に存在する繊毛によって行われる気管支の自浄機構である粘膜毛様体クリアランスは、気道表面の健康の目安である。）このように、この重要な機能の回復において、エアロゾル化したダプソンが経口投与されたダプソンよりも優れているという発見は、非常に重要である。
【００１１】
別の実施の形態において、ダプソンは、以下に示すように、例えば、ダプソンからなる水性の生理学的に受容可能なキャリアを導入することで気道に投与される。
【００１２】
本発明の方法を実施することで、エアロゾル化したダプソン調合剤を使った治療対象の気道炎症の症状が抑えられる。投与により、ＩＬ−８が抑制され、粘液線毛輸送機能及び粘膜毛様体クリアランスが回復する。完全に軽減（低減、改善、解消など）する（症状が完全になくなる）場合もあるが、常にそうであるとは限らない。例えば、患者が通常若しくはほぼ通常レベルで活動ができる水準まで症状が単に和らいだ又は部分的に改善した患者にとっては大いに有益であることを当業者は認識するであろう。当業者は、例えば、肺活量、気道閉塞の程度、血中酸素濃度の測定や、症状（例えば、喘鳴、咳など）の有無及び／又は頻度の観察、様々な撮像技術などによるこのような治療の効果についての評価と測定を熟知している。一般に、本発明の方法を実施することで、炎症の症状が、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０又は９０％、更には１００％低減する。
【００１３】
本発明の方法は、患者又は対象の呼吸器系への、生理学的に適合するダプソンのエアロゾル組成物（又は、別の実施の形態では、水溶性キャリア中のダプソン）の投与を伴う。「呼吸器系」という表現は、空気（通常、酸素を豊富に含む空気）の肺への又は肺からの搬送及びＣＯ２を多く含む空気の肺からの排出に関わる全ての開口部及び経路と、肺自体を含むよう意図される。例えば、鼻及び鼻腔、口、喉頭、気管、気管支及び細気管支とその枝管、及び肺胞末梢気道（例えば、線維筋性壁を有する非軟骨性誘導気道である膜性細気管支、及び、線維筋性壁が部分的に胞状となった気道である呼吸細気管支）が含まれる。エアロゾル化したダプソンの投与ができる通常の２つの開口部とは鼻と口であり、これらのうちの一方又は双方を介した投与が、本発明に包含される。ただし、エアロゾルは、外科的に導入された開口（例えば、気管切開）を介して、また更には、例えば、挿管法により、例えば、肺へ直接投与してもよい。
【００１４】
このように、経口吸入器（ドライパウダー吸入器、定量吸入器など）、フェイスマスク、経鼻又は気管内チューブ、ネブライザなどを含むが、これに限定されない多種多様な既知のエアロゾル投与装置のいずれかを用いて投与を行うことができる。選択される装置の種類は、例えば、エアロゾルが患者により自己投与されるのかどうか、又は、例えば、急性発作又は発症の状況で、医療関係者により投与されるのかどうかなど、状況によって異なる。一般に、慢性疾患の治療に使用される装置は、患者の自己投与に適したものである。このような投与は、当分野で知られる幾つかの種類又は様式のエアロゾル投与装置のいずれかを用いて行うことができる。典型的な装置は、噴射剤（例えば、１３４ａ又は２２７などのフッ化炭素、圧搾空気、アルカンなど）が入った加圧キャニスタ内の溶液（懸濁液もよい）中に最も一般的に薬剤が保存されている定量吸入器（metered-dose inhaler：ＭＤＩ、例えば、「パッファー」）、１回分の薬を粉末エアロゾルとして放出するドライパウダー吸入器（dry powder inhaler：ＤＰＩ）、及び、水性製剤から作られたエアロゾルとして薬剤を供給するネブライザを含むが、これに限定しない。装置は、例えば、単回投与又は反復投与、使い捨て又は再利用可能／詰め替え可能などでもよく、また、様々な材料から様々な形状で作られたものでもよく、また、様々な機構（例えば、息止め、呼吸駆動型など）により操作するものでもよい。
【００１５】
いくつかの実施の形態において、本発明で使用する吸入装置は、呼吸駆動型、即ち、エアロゾル化した製剤の投与が、患者の実際に吸入する時間に制限されるものである。本発明を実施するにあたり使用に適した呼吸駆動型の代表的な吸入装置の１つに、Aerogen社（カリフォルニア州サニーベール）製のAerodose（商標）吸入器がある。この吸入器は、圧電発振器により作用する多孔質膜を用いてエアロゾルを発生させる。使用してもよい別の吸入器又はネブライザは、例えば、PARI LC PLUS（商標）ジェット式ネブライザ（PARI社、ドイツStamberg）などの従来のエアジェット式ネブライザ、及び、当分野で周知のその他のものを含む。エアロゾル投与用の様々なシステム、装置及び組成物が、例えば、内容全体が引用されることによりそれぞれ本明細書に取り込まれる以下の交付済み米国特許に記載されている。米国特許第7,740,463号、米国特許第7,683,029号、米国特許第7,497,214号、米国特許第7,223,381号、米国特許第7,163,014号、米国特許7,040,314号、米国特許第6,932,962号、米国特許第6,743,413号及び米国特許第6,575,162号。
【００１６】
本明細書で使用される「エアロゾル」という用語は、気体媒質中の固体又は液体粒子の懸濁液を言う。本明細書において、この用語は、例えば、「ミスト」、「噴霧製剤」なども含む。本発明により投与される製剤は、治療を必要とする患者へのエアロゾル化投与に適している。従って、製剤は生理学的に適合するものである。少なくとも、製剤は、ダプソンに加え、生理学的／生物学的に適合した又は適切なキャリアを含む。製剤中のダプソンの量は変えてもよいが、一般に、約１〜９９％（重量／体積）の範囲である。
【００１７】
患者の肺への投与に適した製剤は、一般に、投与の際に気体媒質中に浮遊されたダプソンからなる固体粒子、又は、投与の際に気体媒質中に浮遊されたダプソンからなる液滴のいずれかからなる。ダプソンの商業的供給源は、当業者によく知られている。また、当業者は、活性薬剤のダプソンに加え、１つ以上の追加成分を含んでもよいこのような製剤の生産及び製造にも精通している。液体キャリアを使用する場合は、無菌食塩水又は生理学的に適合するｐＨ（例えば、約６．５〜８、通常約７．３〜７．４）で緩衝した食塩水であってもよい。典型的な追加成分は、安定剤、保存剤、様々な有機物及び無機物の医薬品賦形剤（様々なポリマ、低分子量オリゴマー、自然産物など）、湿潤剤、及び界面活性剤、特に、非イオン性及びイオン性界面活性剤を含むが、これに限定されない。追加成分（表面改質剤でもよい）の代表的な例は、セチルピリジニウム塩化物、ゼラチン、カゼイン、レシチン（リン脂質）、デキストラン、グリセロール、アカシア・ゴム、コレステロール、トラガカント、ステアリン酸、塩化ベンザルコニウム、ステアリン酸カルシウム、グリセロールモノステアレート、セトステアリルアルコール、セトマクロゴール乳化ワックス、ソルビタンエステル類、ポリオキシエチレンアルキルエーテル類（例えば、セトマクロゴール１０００などのマクロゴールエーテル類）、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体類、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類（例えば、ポリソルベート２０である商品名Ｔｗｅｅｎ２０（米国登録商標）及びＴｗｅｅｎ８０（米国登録商標）（ICI Specialty Chemicals社）などの市販のTween類）、ポリエチレン・グリコール（例えば、Ｃａｒｂｏｗａｘｓ３３５０（米国登録商標）、１４５０（米国登録商標）及び Ｃａｒｂｏｐｏｌ９３４（米国登録商標）（Union Carbide社））、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ステアリン酸ポリオキシエチレン類、コロイド状二酸化ケイ素、リン酸塩類、ドデシル硫酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ、ＨＰＣ‐ＳＬ及びＨＰＣ‐Ｌ）、ヒドロキシプロピル・メチルセルロース（ＨＰＭＣ）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、非結晶セルロース、ケイ酸アルミニウム・マグネシウム、トリエタノールアミン、ポリビニル・アルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、酸化エチレン及びホルムアルデヒド含有４‐（１,１,３,３‐テトラメチルブチル）フェノールポリマ（チロキサポール、スペリオン（superione）及びトリトンとしても知られる）、ポロキサマー類（例えば、酸化エチレン及び酸化プロピレンのブロックコポリマー類であるＰｌｕｒｏｎｉｃｓＦ６８（米国登録商標）及びＦ１０８（米国登録商標））、ポロキサミン類（例えば、酸化プロピレン及び酸化エチレンのエチレンジアミンへの逐次付加に由来する四官能性ブロックコポリマーである、Ｐｏｌｏｘａｍｉｎｅ９０８（米国登録商標）としても知られるＴｅｔｒｏｎｉｃ９０８（米国登録商標）（BASF Wyandotte Corporation社、ニュージャージー州パー���ッパニー））、ジミリストイルホスファチジルグリセロールなどの荷電リン脂質、スルホコハク酸ジオクチル（ＤＯＳＳ）、Ｔｅｔｒｏｎｉｃ１５０８（米国登録商標）（Ｔ−１５０８）（BASF Wyandotte Corporation社）、スルホコハク酸ナトリウムのジアルキルエステル類（例えば、スルホコハク酸ナトリウムのジオクチルエステルであるＡｅｒｏｓｏｌ ＯＴ（米国登録商標）（American Cyanamid社））、ラウリル硫酸ナトリウムであるＤｕｐｏｎｏｌ Ｐ（米国登録商標）、スルホン酸アルキルアリールポリエーテルであるＴｒｉｔｏｎｓ Ｘ−２００（米国登録商標）（Rohmand and Haas社）、ステアリン酸スクロースとジステアリン酸スクロースの混合物であるＣｒｏｄｅｓｔａｓ Ｆ−１１０（米国登録商標）（Croda社）、Ｏｌｉｎ‐１０Ｇ（米国登録商標）又はＳｕｒｆａｃｔａｎｔ １０−Ｇ（米国登録商標）としても知られるｐ−イソノニルフェノキシポリ−（グリシドール）（Olin Chemicals社、コネチカット州スタンフォード市）、Ｃｒｏｄｅｓｔａｓ ＳＬ−４０（米国登録商標）（Croda社）、及びC18H37CH2(CON(CH3)-CH2(CHOH)4(CH2OH)2であるＳＡ９ＯＨＣＯ（Eastman Kodak社)、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ｎ−デシル β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−デシル β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−ドデシル β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ドデシル β−Ｄ−マルトシド、ヘプタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ヘプチル β−Ｄ−チオグルコシド、ｎ−ヘキシル β−Ｄ−グルコピラノシド、ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ｎ−ノイル β−Ｄ−グルコピラノシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、オクチル β−Ｄ−チオグルコピラノシドなどを含む。チロキサポールは、肺送達又は鼻腔内投与にとって、更には噴霧療法にとって特に好ましい表面改質剤である。これら化合物の多くは、医薬品賦形剤として知られており、特に本明細書に参考として組み込まれるアメリカ薬学会（American Pharmaceutical Association）及び英国薬学会（The Pharmaceutical Society of Great Britain）の共同出版による「医薬品賦形剤ハンドブック（Handbook of Pharmaceutical Excipients）」（１９８６年Pharmaceutical Press出版）に詳しく記載されている。これらは市販されており、及び／又は、当分野で既知の技術によって生成される。
【００１８】
また、ダプソンのエアロゾルは、例えば、ステロイド、抗生物質（例えば、マクロライド）、充血除去剤、抗がん剤などの抗炎症性（又はその他の性質）を有するその他の化合物など、その他の生物学的活性成分を含んで処方されてもよい。あるいは、エアロゾルのダプソン製剤は、それらが同じ製剤に含まれなければ、そのような生物学的活性成分と併せて用いてもよい。
【００１９】
患者（又は、患者の世話をする健康管理士）が守る投与スケジュールは、幾つかの要因、例えば、治療する疾病又は疾患、疾患の重症度、患者の年齢、性別及び体重、服薬遵守を達成又は最大化するためのスケジューリング利便性に応じて変更してもよい。一般に、投与は、毎日２〜４回（例えば、約１２時間毎、又は８時間毎、又は４時間毎）行われるが、場合によっては、頻度を減らしても（例えば、１日に１回のみ）又は増やしても（例えば、２時間毎）よい。各投与の継続期間は、投与される量、使用される装置の種類などに応じて異ならせてもよい。一般に、投与に要する時間は、約５〜３０分、例えば、約５、１０、１５、２０、２５又は３０分である。しかし、一部の短時間の投与装置では、たった数分（例えば、１〜４分）で投与を完了できる。更に、一部の患者（例えば、急性喘息発作を起こしている患者）への投与は、例えば、患者が病院に搬送されるまで、又は、患者が医療機関において安定するまでなど、更に長期間にわたって連続的且つ継続的に行ってもよい。熟練した医療関係者（例えば、医者、呼吸療法士など）は、これらの要素をよく心得ており、それに応じて治療プロトコールを計画及び調整することができる。
【００２０】
一服につき投与されるダプソンの量は、例えば、治療する疾病又は疾患、疾患の重症度、患者の年齢、性別及び体重、治療に対する患者の耐性などの様々な要因によっても変わる。一般に、吸入で投与される量は、体重１ｋｇあたり約０．５〜約５ｍｇの範囲であり、例えば、体重１ｋｇあたり約０．５〜約１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５又は５．０ｍｇであり、１回の服用で体重１ｋｇあたり約２ｍｇであることが多い。
【００２１】
本発明の方法で治療できる疾病は、様々な気道炎症、特に、中球支配性炎症を含み、これには、気管支が狭くなり、空気が肺へ、特に肺から移動し難くなる、例えば、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）や喘息（進行中の慢性喘息、重症喘息及び喘息の「発作」又は急性発作、特に好中球性の重症喘息）、嚢胞性線維症、気管支拡張症、閉塞性細気管支炎、肺線維症（例えば、特発性肺線維症）、肺気腫、急性呼吸促迫症候群、気管支炎、慢性気管支炎、慢性副鼻腔炎、鼻副鼻腔炎及び慢性鼻副鼻腔炎、慢性気道感染症、毒性の吸入傷害などの様々な閉塞性肺疾患が含まれるが、これに限定されない。炎症を起こしうる多種多様な要因は、喫煙又は受動喫煙への曝露、炭坑、金鉱及び木綿工業で見られる労働現場の粉塵、カドミウムやイソシアネートなどの化学薬品及び溶接時の煙への職業的暴露、大気汚染（例えば、二酸化硫黄、一酸化炭素、煤などの微粒子、粉塵など）への暴露、例えば、調理時の煙や暖炉の煙に起因する屋内空気汚染、遺伝的感受性（例えば、アルファ‐１‐抗トリプシン欠乏症、及び自己免疫反応（例えば、自己抗体及び自己反応性Ｔ細胞を介した持続性炎症）、例えば、イエダニ、ペットのふけ、花粉、食品、虫刺されなどによって引き起こされるアレルギー性免疫反応及び／又はアナフィラキシーなどを含むが、これに限定されない。
【００２２】
本発明の方法は、気道炎症に苦しむ患者への、ダプソンのエアロゾル化した製薬の投与を伴う。このような患者は、一般に、哺乳類、通常人間であるが、常にそうであるとは限らない。この技術の獣医学的用途も考えられる。
【００２３】
本発明の方法は、一般に、気道炎症又は粘液線毛輸送機能（ＭＣＴ）障害（例えば、通常又は基礎レベルのＭＣＴより遅い）、特に、好中球が関与する炎症の特徴がある又はそれにより引き起こされる疾病又は疾患を患う患者の特定を含む。典型的な疾病としては、嚢胞性線維症、気管支拡張症、閉塞性細気管支炎、肺気腫、慢性気管支炎、慢性鼻副鼻腔炎、吸引毒性傷害、慢性閉塞性肺疾患、特発性肺線維症、喘息及び慢性気道炎症を含むが、これに限定されない。この方法は、罹患患者の気道に、例えば、気道上皮細胞、特に、上皮繊毛に接触するようにダプソンを投与することにより行われる。本発明の方法は、一般に、ＩＬ−８の過剰発現を低減又は軽減する（例えば、方法は、正常レベル、規制レベル又は基礎レベルを超えるレベルのＩＬ-８ｍＲＮＡ発現を防止する）。これにより、ＩＬ−８の過剰発現に伴う疾病を患う患者の、そのような過剰発現で起こる病徴が和らげられる。例えば、粘液線毛輸送機能が、正常又はほぼ正常レベルに回復する。当業者は、例えば、呼吸特性、肺及び気道の画像解析、酸素やＣＯ２などの血中濃度、患者の自己報告、生体組織検査、痰分析などの特定のパラメータを観察及び／又は測定することにより、そのような患者を判断、特定及び／又は診断する方法及び試験に精通している。一旦エアロゾルのダプソン治療の対象となりそうな患者が特定されると、医療専門家は、通常、患者への服用量及び／又は投与計画を処方するとともに、吸入器の使用の指示を与え、おそらくはそれに関する指導又はその実演を行う。その後、医療専門家は、エアロゾル投与の成果を監視する。服用量及び／又は服用回数は、治療に対する患者の反作用又は反応と、疾病の臨床症状の調整又は解消に向かった進展に応じて調節してもよい。治療期間は、患者ごとに、又は、一人の患者でもその時々により異なってもよく、短期でも長期でもよい。治療する疾患の慢性的性質により、エアロゾルのダプソン治療はしばしば長期間となり、例えば、数週間、又は数ヶ月、又は数年、更には患者の残りの人生にわたって継続される。
【００２４】
当業者は、患者の気道への活性薬剤の投与が、常にエアロゾル化した製薬を用いて行われる必要はないことを認識するであろう。例えば、薬の導入（例えば、気管切開チューブ、鼻腔チューブなどの既存の導管を介した）には、例えば、生理学的に受容可能な液体キャリア中のダプソンといった、水性製剤の使用が必要となる場合がある。当業者は、エアロゾルに関して上述したようなエアロゾル調剤薬と多くの性質を共有するそのような製剤の調合に通じている（例えば、調剤薬中に存在する活性薬剤や賦形剤の量、ｐＨ、治療する疾病、患者の特定、診断及びモニタリング、投与スケジュール、別の薬剤と併せた投与など）。しかし、そのような調剤薬は「ドライパウダー」ではなく、液体である。そのような製剤の投与経路と方法は、例えば、手動で投与された鼻用ミスト又はスプレー（例えば、容器又は装置を手で圧迫又はポンプを押すことによる投与）を介した、又は、点鼻薬若しくは鼻洗浄を介するなどした導入を含むが、これに限定されない。
【実施例】
【００２５】
実施例１：ダプソンは、ＬＰＳで刺激されたヒト気管支上皮細胞からのＩＬ-８分泌を抑制し、フェレットの気道炎症を解消する。
【００２６】
序説
気道を、患者の体内環境を外部から隔てる上皮細胞で覆う。気道上皮は、外的刺激及び細菌に対する機械的バリアであるだけでなく、先天性且つ後天性免疫応答、及び、気道炎症に積極的に関与している。細菌が侵入すると、粘膜毛様体クリアランスが活性化され、炎症性メディエータ及びサイトカインが防衛として分泌されるが、これらもまた気道を損傷しうる。上皮由来の多面的サイトカインの中で、ステインＸシステイン（ＣＸＣ）ケモカインファミリーの１つであるＩＬ−８は、最も強力な好中球走化性因子の１つとして作用する。好中球支配性炎症は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、びまん性汎細気管支炎（diffuse panbronchiolitis：ＤＰＢ）及び嚢胞性線維症（cystic fibrosis：ＣＦ）の特性を示す。ＩＬ−８は、気道上皮細胞により作られる。痰及び気管支肺胞洗浄（bronchoalveolar lavage：ＢＡＬ）液中の増量したＩＬ−８は、ＤＰＢ及びＣＦの重症度に関連するものであり、重症喘息及びＣＯＰＤを患う対象の気管支上皮内のＩＬ−８遺伝子発現が増加する。
【００２７】
炎症誘発性サイトカイン、細菌性フラジェリン及びリポ多糖体（lipopolysaccharide：ＬＰＳ）は、正常ヒト気管支上皮（normal human bronchial epithelial：ＮＨＢＥ）細胞によるＩＬ−８生成を増加させ得る。有機塵中に存在する様々な物質の中で、ＬＰＳは、炎症反応の主な誘導因子である。ＬＰＳは、核因子κＢ（nuclear factor-κΒ：ΝΚ-κΒ）経路、ホスファチジルイノシトール‐３‐キナーゼ（phosphatidylinositol 3 -kinase：ＰＩ３Ｋ）及びマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（mitogen-activated protein kinase：ＭＡＰＫ）経路を含む細胞内シグナル伝達経路を活性化させるＴｏｌｌ様受容体４（toll-like receptor 4：ＴＬＲ４）と結合する。ＩＬ−８遺伝子発現に寄与する３つのＭＡＰＫ経路は、細胞外シグナル制御プロテインキナーゼ（extracellular-regulated protein kinase：ＥＲＫ）、ｃ−Ｊｕｎ ＮＨ２末端タンパク質キナーゼ（c-Jun NH2-terminal protein kinase：ＪＮＫ）及びｐ３８ＭＡＰＫカスケードである。これら経路のそれぞれの活性化の相対的度合いと機能的結果は、細胞の種類と実験システムにより異なる。
【００２８】
マクロライド系抗生物質は、ＤＰＢを患う対象のＢＡＬ中の好中球及びＩＬ−８濃度、及び、ＣＦ患者における痰ＩＬ−８濃度を減少させる。マクロライドは、ＥＲＫ又はΝΚ-κΒの不活性により、培養液中の気道上皮細胞からのＩＬ−８放出を抑制することができる。
【００２９】
ダプソンは、刺激された気道細胞によるＩＬ-８分泌を抑制するという仮説を我々は立てた。従って、我々は、ＬＰＳにより刺激されたＮＨＢＥ細胞からのＩＬ-８分泌に対するダプソンの作用を研究し、更に、関連するシグナル伝達経路を調査した。そして、我々は、気道がＬＰＳに暴露された（ＬＰＳにより炎症を起こした）フェレットに経口で又はエアロゾルとして投与した場合の、気道への好中球動員を抑えるとともに粘膜毛様体クリアランスを持続させるダプソンの有効性の評価を行った。
【００３０】
材料及び方法
試薬
ダプソン（４，４’−ジアミノジフェニルスルホン）、ＬＰＳ（大腸菌血清型０１１１：Ｂ４）及びその他の全ての試薬は、特に記載しない限り、Sigma - Aldrich社（ミズーリ州セントルイス）から購入した。ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ（ＭＥＫ、ＥＲＫ１／２の上流のキナーゼ）阻害剤であるＰＤ９８０５９は、Calbiochem社（カリフォルニア州ラ・ホーラ）から入手した。リン酸化及び非リン酸化特異的ＥＲＫ１／２、抗ｐ３８ ＭＡＰＫ、抗ＳＡＰＫ／ＪＮＫ、リン酸化特異的ＮＦ-κＢ ｐ６５（Ｓｅｒ５３６）及び抗ウサギＩｇＧ-ＨＲＰ抗体は、Cell Signaling Technology社（マサチューセッツ州ベバリー）から購入した。ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）をダプソンの溶媒として用い、最終的濃度が０．０１％（ｖ／ｖ）を超えないようにした。体外での予備実験は、０．０１％のＤＭＳＯ媒体では、７２時間までの細胞の生存率及びＩＬ-８分泌に対し著しい作用がなかったことを示した（データ不掲載）。
【００３１】
ＮＨＢＥ細胞培養
ＮＨＢＥ細胞（Lonza Walkersville社、メリーランド州ウォーカービル）を、抗生物質を含まずＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔ（米国登録商標）キット（Lonza社）が補充された気管支上皮細胞増殖培地（bronchial epithelial cell growth medium：ＢＥＧＭ）で、１ｃｍ２あたり３５００個の細胞を培養皿に播種し、３７℃の５％ＣＯ２培養器内で培養した。全ての実験で、無エンドトキシン培地（０．００５単位／ｍｌ未満のエンドトキシン）と第２継代細胞を使った。細胞を、密集するまで６日間増殖させた。その後、抗生物質を含まない培養液を、１型ラット尾コラーゲンでコーティングした６ウェルプレート又は３５ｍｍ培養皿に移し、１ｃｍ２あたり３５００個の細胞を播種した。２４時間おきに培地を交換した。細胞シグナリングとＩＬ-８分泌に対する増殖因子の影響を避けるため、刺激する前の２４時間の間、補充物無しの気管支上皮細胞用基礎培地（bronchial epithelial cell basal medium：ＢＥＢＭ）内で細胞を培養した。細胞成熟が細胞シグナリングとサイトカイン分泌に影響を及ぼす可能性があり、密集の際に全ての細胞が同様の成長段階にあることから、細胞の相対数に標準化するのではなく、細胞密集時の細胞応答を評価した。
【００３２】
ＮＨＢＥ細胞分化のため、１型ラット尾コラーゲンでコーティングした直径６．５ｍｍ、細孔径０．４μｍ及び厚さ１０μｍのポリカーボネートインサート（Costar Transwell Clear、アメリカ・マサチューセッツ州ケンブリッジ）上に１ｃｍ２あたり２．０×１０５個の細胞を播種し、ＩＴＳ−Ａを含む無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（１．０％、Invitrogen社、カリフォルニア州カールスバッド）、上皮細胞増殖因子（epidermal growth factor：ＥＧＦ）（０．５ｎｇ／ｍｌの遺伝子組換えヒトＥＧＦ、Invitrogen社）、トリヨードチロニン（１０ｎｇ／ｍｌ、MP Biomedicals社、オハイオ州ソロン）、ヒドロコルチゾン（０．５μｇ／ｍｌ、MP Biomedicals社）、オールトランス型レチノイン酸（１．０×１０−７Ｍ、Sigma-Aldrich社）、ウシ血清アルブミン（２．０μｇ／ｍｌ、Sigma-Aldrich社）及びウシ下垂体抽出物（３０μｇ／ｍｌ、Invitrogen社）で培養した。密集がなされた後、頂端側培地を除去し、気液界面（air-liquid-interface：ＡＬＩ）法で細胞を培養した。４８時間おきに培地を交換し、１０〜１４日間３７℃の５％ＣＯ２下で細胞を維持した。
【００３３】
細胞毒性アッセイ
生存細胞数を判別するため、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（ＣＣＫ−８、株式会社同仁堂、日本熊本）を用いて、ホルマザン色素の生成を測定した。ＣＣＫ−８アッセイ溶液で処理した細胞を２時間培養し、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定した。データは、ダプソンに暴露されなかった対照細胞に対する％として表わした。
【００３４】
ＩＬ-８分泌の測定
培養上清を採取し、２００×ｇで５分間遠心分離機にかけ、分析がされるまで−２０℃で保管した。ＥＬＩＳＡ（Beckman Coulter社、カリフォルニア州ブレア）を用い、製造元の使用説明書に従ってＩＬ−８を測定した。各サンプルの濃度を、標準曲線から補間して得た後、サンプル希釈の結果の平均として計算した。
【００３５】
免疫ブロット法
刺激を行った後、播種した細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、その後、改良放射線免疫沈降緩衝液（１％のノニデットＰ−４０、１％のデオキシコール酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのピロリン酸ナトリウム、１ｍＭのＮａＶＯ４、５ｍＭのＮａＦ、１μｇ／ｍｌのアプロチニン、１μｇ／ｍｌのロイペプチン及び０．１ｍＭのＰＭＳＦ）中で１５分間氷上で溶解させ、そして、培養皿からこすり取った。２７ゲージ注射針に溶解物を通してＤＮＡを剪断し、２０，０００ｇを４℃で１５分間遠心分離することで不溶性物質を除去した。得られた上清のタンパク質濃度を、ＤＣプロテインアッセイ（Bio-Rad社、カリフォルニア州ハーキュリーズ）により測量した。同量のタンパク質抽出物を、それぞれ１２％のＳＤＳ‐ＰＡＧＥ用ミニゲルに載せ、ニトロセルロース膜（Bio-Rad社）に移した。膜は、５％の脱脂粉乳を含むブロッキング緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ及び０．１％のＴｗｅｅｎ２０（ｐＨ７．６））を用い、４℃で一晩ブロッキングした。その後、膜をすすぎ、以下の一次抗体で、室温で２時間培養した。リン酸化された（ｐ）‐ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）（希釈１：２０００）、ｐ−ｐ３８ ＭＡＰＫ（Ｔｈｒｌ８０／Ｔｙｒｌ８２）（希釈１：１０００）、ｐ−ＳＡＰＫ／ＪＮＫ（Ｔｈｒ１８３／Ｔｙｒ１８５）（希釈１：１０００）又はリン酸化したＮＦ‐κＢ ｐ６５ウサギポリクローナル免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）（希釈１：１０００）（Cell Signaling Technology社）。そして、膜を室温で１時間、抗ウサギＩｇＧ-ＨＲＰ二次抗体（希釈１：２０００）で培養した。その後、ブロット膜を、化学発光基質過酸化物ＬｕｍｉＧＬＯ（Cell Signaling Technology社）で成長させた。
【００３６】
３０℃で３０分間かけて、ストリッピング緩衝液（１００ｍＭの２−メルカプトエタノール、２％のＳＤＳ及び６２．５ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ６．７））で膜を剥離した。ブロットは、抗ｐ４４／４２ＭＡＰＫ、抗ｐ３８ＭＡＰＫ又は抗ＳＡＰＫ／ＪＮＫ抗体（それぞれ希釈１：１０００）、それに続き抗ウサギＩｇＧ-ＨＲＰ二次抗体（希釈１：２０００）で再プローブした。ＮＦ‐κＢ ｐ６５を載せる際のわずかな違いを補正するため、ブロットを剥離し、抗ヒトβアクチン抗体（希釈１：５０００）と引き続き抗マウスＩｇＧ-ＨＲＰ二次抗体（希釈１：５０００）で再プローブした。ウェスタンブロット画像をスキャンし、画像解析ソフトＮＩＨ image J（１８）で解析した。
【００３７】
リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応
ＩＬ-８ｍＲＮＡ発現の相対的定量化において、グリセルアルデヒド‐３‐リン酸デヒト゛ロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の発現が、内在性コントロールの役割を果たした。ＤＮＡインターカレーター色素としてＥｖａＧｒｅｅｎ を用い、増幅したＤＮＡの定量化を監視し、各サンプルの閾値サイクル（Ｃｔ）値を得るため、ＣＦＸ Ｍａｎａｇｅｒ（商標）ソフトウェア（Bio-Rad社）によりリアルタイム定量的ＰＣＲ曲線を分析した。定量化は、標準曲線に基づいて行った。適切なＩＬ−８及びＧＡＰＤＨのフォワード及びリバースプライマーを用いた。
【００３８】
動物実験
成フェレットの雄（体重１．３〜２．０ｋｇ）２０匹を、Marshall Farms（ニューヨーク州ローズ）から入手した。フェレットに４０ｍｇ／ｋｇのケタミンと５ｍｇ／ｋｇのキシラジンで麻酔をかけ、３００μｌの水溶性Ｋ‐Ｙゼリー（Johnson & Johnson社、ニュージャージー州ニューブランズウィック）に混合された１０ｍｇのＬＰＳでコーティングした３．０カフなし気管内チューブ（ＥＴＴ）を挿管することにより、５日間毎日１日１回３０分間エンドトキシンに暴露した（２００９年Abanses et al.）。対照群として、２匹のフェレットには、ＬＰＳを含まないＫ‐Ｙゼリーを用いた。
【００３９】
経口投与用に、最終的濃度が３ｍｇ／ｍｌで、５％（ｖ／ｖ）のエタノール／５％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）／０．５％（ｗ／ｖ）のメチルセルロース溶液の賦形剤中にダプソンを調合した。噴霧形態で投与するため、０．６７％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯ／生理食塩水に、０．５ｍｇ／ｍｌの濃度でダプソンを溶解させた。ＬＰＳ処置されたフェレット１８匹を無作為に選び、４日目（ＬＰＳ処置の３日後）から５日間ダプソン治療を行い、５日間継続した。経口投与の際、経鼻胃チューブを通して、２ｍｇ／ｋｇのダプソン（ｎ＝４）又は賦形剤のみ（ｎ＝４）が毎日与えられた。これは、皮膚病患者の治療に用いる経口投与量に相当する。エアロゾル吸引の際、フェレットには、喉頭下１ｃｍまでＥＴＴを浅く挿管した。毎日１日１回１５分間、ジェット式ネブライザＰａｒｉ Ｍａｓｔｅｒ（PARI Respiratory Equipment社、バージニア州リッチモンド）を用い、霧状にした０．５ｍｇ／ｍｌのダプソン（ｎ＝５）又は０．６７％のＤＭＳＯ／生理食塩水（賦形剤）（ｎ＝５）でフェレットの治療を行った。フェレット（体重１．５ｋｇ）の肺胞被覆液の総体積は、０．３〜０．４ｍｌである。したがって、肺に送達される投与量は、報告されている噴霧効率を考えると、このシステムにおいては０．１〜１．０μｇと推定される。
【００４０】
９日目に、ダプソン治療したフェレットと賦形剤での対照分のフェレットとに犠牲になってもらい、気管を取り出した。各気管切片を１０％ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋し、光学顕微鏡（ＣＫＸ４１、オリンパス社、日本東京）を用いた組織学的分析用に処理され、及びデジタルカメラ装置（ＡｘｉｏＣａｍ ＩＣｃ １、Carl Zeiss社、ニューヨーク州ソーンウッド）を用いた写真撮影がなされた。組織を４μｍの厚さにカットし、スライドをヘマトキシリン及びエオシンで染色した。炎症細胞の蓄積と炎症の全体的重症度を測るため、上皮内好中球の総数を、４つの異なる部位からの試料ごとにランダムな８か所で１５０μｍにわたって数え、平均化した。
【００４１】
摘出した気管切片を、気管の粘液線毛輸送（ＭＣＴ）速度を測定するためにも用いた。繊毛によって口へと運ばれた、例えば、異物や微生物を含む粘液は、そこで咳を介して飲み込まれるか吐き出される。炎症状態においては、線毛細胞がその運輸機能を中断するため、細菌性の胚のコロニー形成、更なる刺激及び炎症が容易に引き起こされる。
【００４２】
相対湿度が９５〜１００％に保たれ、温度が２２℃〜２４℃に保たれたチャンバ内で、リンガー溶液を染み込ませたガーゼ片上に気管切片を置いた。ＭＣＴは、十字線（グリッド線）付き接眼レンズを有する顕微鏡下で気管切片に焦点を合わせ、気管上皮上に載せられた非常に細かいプラスチックの削りくずの先端の輸送時間を記録することによって測定した。３ｍｍの粒子を輸送する時間を、ＭＣＴ（ｍｍ/分）を計算するために用いた。各気管切片につき、５回繰り返し測定を行った。この研究は、バージニア コモンウェルス大学の動物実験委員会により認可されている。
【００４３】
統計
結果を、平均値±ＳＥ又は必要に応じて±ＳＤで表わしている。統計パッケージＳｔａｔｖｉｅｗ ５（SAS Institute社、ノースカロライナ州ケアリー）でデータの統計分析を行った。２つのグループの比較は、２標本t検定により行った。多重比較については、ＦｉｓｈｅｒのＰＬＳＤテストを用いた一元配置分散分析により行い、０．０５未満のＰ値を有意であるとした。
【００４４】
結果
ＮＨＢＥ細胞の生存率に対するダプソンの作用
培養したＮＨＢＥ細胞の総数がダプソン治療に影響されなかったことを確認するために、ＣＣＫ−８（株式会社同仁堂）を用いて細胞の生存率を評価した。９６ウェルプレート（１ウェルにつき３０００細胞）上に播種したＮＨＢＥ細胞を、３７℃で７２時間培養した（７０％までの密集）。濃度０．３、１又は１０μｇ／ｍｌのダプソンを、２４又は７２時間の間添加した。結果は、ダプソンで治療した細胞では、生存細胞の総数が、７２時間以上治療のなかった対照群と同様であったことを示した（図示せず）。
【００４５】
ＬＰＳ誘導性ＩＬ-８分泌に対するダプソンの作用
ＮＨＢＥ細胞からのＩＬ-８分泌に対するダプソンの作用を評価するため、ＬＰＳと同時に添加されたダプソンの存在下又は非存在下において、ＬＰＳでの刺激から２４時間後に細胞上清を採取した。細胞成熟が細胞シグナリングとサイトカイン分泌に影響を及ぼす可能性があり、密集の際に全ての細胞が同様の成長段階にあることから、細胞の相対数に標準化するのではなく、細胞密集時の細胞応答の評価を選んだ。ＬＰＳは、１０μｇ／ｍｌで、ＮＨＢＥ細胞からのＩＬ-８分泌を大幅に増加させたが（Ｐ＜０．００１）、ダプソンは、０．３、１又は１０μｇ／ｍｌで、これを抑えた（それぞれＰ＜０．０１）（図１Ａ）。１μｇ／ｍｌのダプソンでは、４８及び７２時間での基礎ＩＬ-８分泌に影響はなかった（図１Ｂ）。１μｇ／ｍｌのダプソンの存在下では、ＬＰＳ誘導性のＩＬ-８分泌が、最大７２時間まで大幅且つ持続的に減少した（図１Ｃ）。
【００４６】
ＡＬＩ調整したＮＨＢＥ細胞におけるダプソンの作用
ダプソンのＩＬ−８抑制効果が分化した細胞にも見られるかどうかを確認するため、１４日間ＡＬＩ調整下で培養したＮＨＢＥ細胞を用いた。ＡＬＩの細胞については、サンプルを、フィルタ上で成長した細胞の頂端側チャンバ及び側底側チャンバの双方から採取した。頂端側チャンバから細胞を採取するため、１５０μｌのハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ、Lonza Walkersville社）を頂端側に添加した。頂端側のＩＬ−８濃度は、側底側培地の体積６００μｌと等しくなるような４倍希釈値として表わした。
【００４７】
ＬＰＳで、頂端側から（ＡＰ‐ＬＰＳ）又は側底側から（ＢＬ−ＬＰＳ）、２４時間ＮＨＢＥ細胞を刺激し、両チャンバにおけるＩＬ-８分泌レベルを測定した。ダプソンは、側底側培地にのみ添加した。図２Ａに示すように、頂端側ＩＬ-８レベルは、ＡＰ‐ＬＰＳにより大幅に増加し（Ｐ＜０．００１）、ダプソンがこの反応を抑制した（Ｐ＜０．０５）。同様に、側底側ＩＬ-８レベルは、ＡＰ‐又はＢＬ−ＬＰＳにより大幅に増加し（それぞれＰ＜０．００１）（図２Ｂ）、ダプソンが頂端側及び側底側両方の反応を抑制した（ＡＰ‐ＬＰＳではＰ＜０．００１、ＢＬ−ＬＰＳではＰ＜０．０１）。
【００４８】
コルチコステロイドと比較するため、ＬＰＳ誘導性のＩＬ-８分泌に対する
デキサメタゾン（ＤＥＸ）の作用を調べた。ＤＥＸは、頂端側及び側底側の双方において、基礎ＩＬ-８レベルを抑止した（それぞれＰ＜０．０５）（図２Ｃ及び２Ｄ）。また、ＤＥＸは、ＡＰ‐ＬＰＳ又はＢＬ−ＬＰＳ誘導性のＩＬ-８の増加を大幅に抑制した（それぞれＰ＜０．０５）。
【００４９】
ＬＰＳ誘導性ＩＬ-８ｍＲＮＡ発現に対するダプソンの作用
ＩＬ-８ｍＲＮＡに対するダプソンの作用を調べるため、ＬＰＳ、ダプソン、ＤＥＸ又はその組み合わせでの刺激から４時間後に細胞からＲＮＡを抽出し、リアルタイム定量ＰＣＲ用に準備した。図３に示すように、１μｇ／ｍｌのダプソンでは、基礎ＩＬ-８ｍＲＮＡレベルに影響はなかったが、０．１μｇ／ｍｌのＤＥＸは、これを〜４０％まで減少させている（Ｐ＜０．０５）。１０μｇ／ｍｌのＬＰＳは、ＩＬ-８ｍＲＮＡレベルを対照群の５倍を超えて増加させた（Ｐ＜０．００１）。１及び１０μｇ／ｍｌのダプソンは、ＬＰＳ誘導性ＩＬ-８ｍＲＮＡの過剰発現を大幅に抑制した（それぞれＰ＜０．０５）。また、ＤＥＸも０．１μｇ／ｍｌでこれを抑制した（Ｐ＜０．０１）。
【００５０】
ＭＡＰＫのＬＰＳ誘導性リン酸化反応に対するダプソンの作用
ＭＡＰＫシグナリングは、ＩＬ-８合成において重要な経路である。ＮＨＢＥ細胞内におけるＥＲＫ１／２、ｐ３８及びＪＮＫのＬＰＳ誘導性リン酸化反応に対するダプソンの作用を評価した。１０μｇ／ｍｌのＬＰＳは、１、４及び２４時間の時点でＥＲＫ１／２を大幅にリン酸化したが（それぞれＰ＜０．０５）、ｐ３８及びＪＮＫはそうではなかった（図４）。１μｇ／ｍｌのダプソンは、１時間の時点ではＬＰＳ誘導性のＥＲＫ１／２リン酸化反応を抑制したが（Ｐ＜０．０５）、４時間後にはこの効果は消えた。そこで、選択的細胞透過性のＭＥＫ阻害剤であるＰＤ９８０５９（２'‐アミノ‐３'‐メトキシフラボン）の効果を評価した。図５Ａに示すように、ＬＰＳは、用量依存的にＥＲＫ１／２のリン酸化反応とＩＬ-８分泌を増加させ、ＰＤ９８０５９は２０μＭで１０μｇ／ｍｌのＬＰＳで誘導されたＥＲＫ１／２のリン酸化反応を消滅させた。しかし、この濃度のＰＤ９８０５９では、ＩＬ-８分泌は抑制されなかった（図５Ｂ）。
【００５１】
ＮＦ-κＢ ｐ６５のＬＰＳ誘導性リン酸化反応に対するダプソンの作用
ＬＰＳはＴＬＲ４を刺激し、ＮＦ-κＢ経路を介してＩＬ−８を誘導するので、ＮＨＢＥ細胞内におけるＮＦ-κＢ ｐ６５のリン酸化反応に対するダプソンの作用を調べた。増殖因子は、ＬＰＳ又はダプソンの暴露の２４時間前に培地から引き上げた。ＮＦ-κＢ ｐ６５のトレオニンリン酸化を、ウェスタンブロッティング法により測定した。バンド強度は、ＮＩＨ image Jソフトウェアで計算した。
【００５２】
結果は、ＬＰＳは１０μｇ／ｍｌで、ＮＦ-κＢ ｐ６５のリン酸化反応を１５分の時点で大幅に増加させ（Ｐ＜０．０１）、この効果は最大２時間まで持続した（Ｐ＜０．０５）ことを示した。ダプソンは１μｇ／ｍｌで、ＬＰＳ誘導性ＮＦ-κＢ ｐ６５リン酸化反応を対照レベルまで大幅に抑えた（１５及び３０分ではＰ＜０．０１、１及び２時間ではＰ＜０．０５）。更に、この抑制作用は、用量依存的である（０．３μｇ／ｍｌのダプソンでＰ＝０．１６、また、１及び１０μｇ／ｍｌのダプソンでＰ＜０．０１）。
【００５３】
フェレットの活動及び体重に対するダプソンの存在下又は非存在下における気管ＬＰＳの作用
フェレットをＬＰＳで５日間刺激し、５日間のダプソン治療又は賦形剤のみの投与を行った（検査した各時点で、賦形剤はｎ＝８、ダプソン群はｎ＝９）。フェレットの活動又は食欲に対してダプソンの存在下又は非存在下におけるＬＰＳの計測可能な作用はなく、これら２つのグループを比較した際、９日間にわたって体重の差もなかった（図示せず）。
【００５４】
ＬＰＳで炎症を起こしたフェレットの気管における上皮内好中球蓄積
ダプソンの生体内での効果を評価するにあたり、好中球を動員し、麻酔下にあり自発呼吸するフェレットの気管に炎症を起こさせるため、局所的にＬＰＳをコーティングした気管内チューブ（ＥＴＴ）を使用した（２００９年Abanses et al.）。水溶性ゼリー（他のグループではＬＰＳの賦形剤として使用）のみをコーティングしたＥＴＴを挿管した対照のフェレットは、３／１５０μｍ未満のわずかな上皮内好中球を示した。ＬＳＰで気管が炎症を起こし、噴霧化した賦形剤で治療された１匹のフェレットは、６日目に死亡したことから実験を終了できず、この動物については、更なる分析から除外した。ＬＰＳ暴露で、フェレットの気管上皮に著しい好中球蓄積を誘発し、ダプソン治療で上皮内好中球数を減少させた（図示せず）。経口投与したダプソンは、好中球動員を抑制する傾向があり（ｐ＝０．３）（図６Ａ）、噴霧化したダプソンは、好中球蓄積を大幅に抑制した（Ｐ＜０．０５）（図６Ｂ）。
【００５５】
摘出した気管切片の粘液線毛輸送機能（ＭＣＴ）
粘液線毛輸送機能（又は「粘膜毛様体クリアランス（mucociliary clearance：ＭＣＣ）」は、気道表面の健全性及び完全性の全般的尺度である。３ｍｍの切片におけるＭＣＴの時間を測った。ＬＰＳは、ＭＣＴを１〜３ｍｍ／分まで劇的に遅くした（通常、およそ７ｍｍ／分である）。経口のダプソンはＭＣＴを増進させたが、その伸び率は著しいものではなかった（Ｐ＝０．０９）。しかし、エアロゾルのダプソンは、図７Ａ及び７Ｂに示すように、ほぼ通常速度でＭＣＴを持続させた（６ｍｍ／分、ＬＰＳ対照との比較でＰ＝０．００７）。
【００５６】
考察
ダプソンがＬＰＳで刺激されたＮＨＢＥ細胞からのＩＬ-８分泌を抑制することを示してきた。ダプソンは、皮膚疾患、とりわけ好中球浸潤を伴ったものの治療に用いられる。ダプソンは、高い日和見感染リスクもなく炎症箇所の好中球走化性と機能を減じる、と仮定されてきた。これは、免疫調節とは一致するが、免疫抑制とは一致しない。
【００５７】
ダプソンは、有毒な活性酸素種、ミエロペルオキシダーゼ及びエラスターゼの局所産生を抑制するが、これは主な作用形態ではなさそうである。ダプソンに対する臨床反応が、好中球数が減少することにより特徴づけられるからである。別の研究者らは、ダプソンは、体外で接着分子ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８の活性化を妨げることで、好中球走化性を減じる可能性があることを示している。しかし、これには、生体内で用いられる治療レベルよりも高濃度のダプソンが必要であると思われる。本研究において用いたダプソンの濃度は、治療に必要とされる血清レベル０．５〜５μｇ／ｍｌの範囲内である（２００１年Zhu et al.）。０．３μｇ／ｍｌの低濃度のダプソンが、ＬＰＳ誘導性のＩＬ-８分泌を抑制したが、この効果が、生存細胞数を尺度とした細胞毒性によるものではなかったことを発見した。Schmidt et al.（２００１年）は、治療濃度のダプソンが、培養された正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）からの水疱性類天疱瘡ＩｇＧ媒介性のＩＬ−８放出を抑制し、ダプソンが基礎ＩＬ-８レベルを低下させることはなかった、と報告している。これらのデータは、ＮＨＢＥ細胞を使った本発明の結果と類似している。
【００５８】
気道上皮は機能的に二極化されており、上皮細胞が双方向にサイトカインを分泌できるとことが証明されている。分化し、二極化した気道上皮モデルにおけるダプソンの作用形態をより理解するため、ＮＨＢＥ細胞をＡＬＩで培養した（２００１年、Kanol et al.）。ダプソンの存在下においては、ＬＰＳ刺激によって誘導されたＩＬ-８分泌は大幅に減少する一方で、構成的ＩＬ−８放出はダプソンでは抑えられることはなかった。興味深いことに、頂端側から刺激した場合（気道感染時に起こるように）、ＮＨＢＥ細胞は、ＩＬ−８を頂端側及び側底側に向かって分泌したが、側底側から刺激した場合には、側底側に向かってのみ分泌している。フィルタ上で成長し、頂端側で黄色ブドウ球菌によって刺激された気道上皮細胞は、Ｔ細胞に頂端側への走化性を起こしたが、底側の上清には起こさなかった（２００６年、Escotte et al.）。頂端側に方向づけられた化学誘引物質勾配の存在は、上皮表面全域で好中球やリンパ球のような免疫細胞を働かせるために必要である可能性がある（２００７年、Chin et al.）。また、培養細胞系において、作用の強力な合成コルチコステロイドであるデキサメタゾン（ＤＥＸ）の作用をテストした。ＤＥＸは、ＮＨＢＥ細胞からのＩＬ−８放出を抑制すると報告されており、ＤＥＸがダプソンよりもＩＬ-８ｍＲＮＡ発現を抑制したことを確認した。しかし、ダプソンとは異なり、ＤＥＸが基礎ＩＬ-８レベル及びＬＰＳ誘導性の増加も抑制したことから、ＤＥＸが免疫抑制性であるのに対し、ダプソンは免疫調節性であることを意味している。
【００５９】
ダプソンがＩＬ−８を抑制する細胞内シグナル伝達経路については、あまり明らかにされていない。ＭＡＰＫが気道上皮細胞におけるＩＬ−８遺伝子発現を制御することから、これら経路に対するダプソンの作用を評価した。ＬＰＳは、ＮＨＢＥ細胞におけるリン酸化反応をＥＲＫ１／２では用量依存的に増進させるが、ＪＮＫ及びｐ３８では増進させず、少なくとも２４時間の間継続的にｐ−ＥＲＫ１／２レベルを上昇させたことがわかった。ＥＲＫ１／２の持続的活性化は、刺激されていないＮＨＢＥ細胞からの基礎ＩＬ-８分泌に必要であること、及び、ＩＬ−８は、特定のＭＥＫ阻害剤のＰＤ９８０５９では抑制されるが、ＪＮＫ又はｐ３８の薬理学的阻害剤では抑制されないことをこれまでに示してきた。ＰＤ９８０５９での前治療が、１及び２時間の時点でＥＲＫ１／２のＬＰＳ誘導性リン酸化反応を抑制することを示す者もいる。現在の研究においては、ＰＤ９８０５９の抑制効果が、４時間の時点でさえ確認されている。しかし、ＰＤ９８０５９は、ＬＰＳ誘導性のＩＬ-８分泌を減少させなかった。ダプソンが１μｇ／ｍｌでは、１時間の時点でのｐ−ＥＲＫ１／２は抑制されたが、４時間後は抑制されなかった。総合すれば、ＥＲＫ１／２の抑制だけでＬＰＳで刺激された細胞内のＩＬ−８を抑制するとは考えにくく、よって、ダプソンによる一時的なＥＲＫ１／２の抑制は、ＩＬ−８に対する効果のうちには入らない。
【００６０】
そこで、ＮＦ-κＢ活性化に対するダプソンの効果を調べた。ＮＦ-κＢは、気道上皮細胞内において炎症性メディエータ及びサイトカインの遺伝子発現を誘導することができ、ＬＰＳは、ＴＬＲ４を介してＮＦ-κＢを活性化させることができる。基礎ＮＦ-κＢ複合体は、Ｒｅｌファミリー・タンパク質のうちの２つであるｐ５０とｐ６５（ＲｅｌＡ）の二量体である。いずれのサブユニットもＤＮＡと接触するが、ｐ６５のみが、転写装置と直接接触するＣ末端領域内にトランス活性化ドメインを含んでいる。ＮＦ-κＢ ｐ６５は、その転写活性を促進し、核転座に関わるリン酸化反応により活性化される。１０μｇ／ｍｌのＬＰＳが、刺激のあと１５分〜２時間で、ＮＨＢＥ細胞内に著しいＮＦ-κＢ ｐ６５リン酸化反応を誘発したことを示した。ＬＰＳに応じた同様の反応が、ネズミ腸筋線維芽細胞に見られ、ＮＦ-κＢ ｐ６５のリン酸化反応がＬＰＳ処理の３０分以内に検知され、４時間かけてゆっくりと減少した。ダプソン１μｇ／ｍｌで、ＬＰＳ誘導性のＮＦ-κＢ ｐ６５リン酸化反応が２時間かけて基礎レベルまで抑制されることを発見した。これは、ダプソンが、ＮＦ-κＢ ｐ６５リン酸化反応をブロッキングすることによりＩＬ-８分泌の誘導を抑制する可能性があることを意味する。また、リン酸化ＮＦ-κＢ ｐ６５に対する用量依存的な抑制効果は、ＩＬ-８ｍＲＮＡ発現での実験結果と一致する。よって、ダプソンの作用は、少なくとも部分的に、遺伝子転写においてＩＬ−８を下方調整することによるものである。しかし、０．３μｇ／ｍｌのダプソンでは、ＮＦ-κＢ ｐ６５活性化を大幅に抑制することはない一方で、同じ濃度のダプソンがＩＬ−８放出を強く抑制している。ＬＰＳ誘導性のＩＬ-８ｍＲＮＡ発現を抑制するためには、１μｇ／ｍｌを超えるダプソンが必要であった。Schmidt et al.（２８）は、ダプソンは、ｍＲＮＡ濃度に影響を与えることなく、転写後レベルでＮＨＥＫからのＩＬ-８放出を抑制する、という仮説をたてた。
【００６１】
これらの免疫調節効果は、エリスロマイシン、クラリスロマイシン及びアジスロマイシンなどのマクロライドの免疫調節効果に似ていた。クラリスロマイシンは、ＮＨＢＥ細胞におけるＥＲＫ１／２リン酸化反応を調節し、アジスロマイシンは、ＣＦ細胞株内のＮＦ-κＢ活性化を抑制し、結果、ＩＬ−８を調整する。ダプソンは、ＩＬ−８の調節を介して気道炎症も調節すると思われる。
【００６２】
局所的に適用されたＬＰＳを用いてフェレットに気管炎症を誘導した後、上皮の完全性の総合的尺度である好中球炎症及びＭＣＴに対する５日間にわたる経口又はエアロゾルのダプソンの効果を評価した。経口のダプソンは、上皮内好中球蓄積を減少させたが、統計的に著しいものではなかった。ダプソンが、好中球性皮膚病の治療にクリームとして局所的に使用した場合に効果的であると認識したことから、エアロゾルのダプソンの投与量を更に下げてＬＰＳ誘導性の気管炎症を抑制する可能性を評価した。噴霧化したダプソンは、気道の好中球浸潤を大幅に抑制し、ＬＰＳ暴露にも関わらず、ＭＣＴを維持又は回復させた。気道への正確な投与量を計算することは難しいが、たとえ総投与量の１０％が気管（３８）に効率的に送達されたとしても、投与されるダプソンは、０．３ｍｇのみであった。この投与量は、１．５ｋｇのフェレットに経口による全身投与量のおよそ１０分の1である。
【００６３】
要するに、ダプソンは、刺激をしていない（基礎）ＩＬ-８分泌には影響を及ぼさなかった。頂端側のＬＰＳ刺激は、頂端側及び側底側の双方のＩＬ−８を誘導したが、側底側のＬＰＳは、側底側のＩＬ−８のみを増加させた。ダプソンは、ＡＬＩ調整した細胞からの二極化したＩＬ-８分泌を抑制した。また、ダプソンは、ＬＰＳ誘導性ＩＬ-８ｍＲＮＡレベルを減少させた。ＬＰＳによるリン酸化反応は、細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）１／２では起こったが、ｐ３８ ＭＡＰＫ又はｃ−Ｊｕｎ Ｎ端末キナーゼでは起こらなかった。ＬＰＳは、ＮＦ-κＢ ｐ６５リン酸化反応も誘導し、その作用はダプソンにより抑制された。ダプソンは、経口でもエアロゾルでもＬＰＳ誘導性の上皮内好中球蓄積を減少させたが、エアロゾルのダプソン治療でのみ粘液線毛輸送機能が正常に回復した。
【００６４】
総合すると、これらのデータは、ダプソンは、ＭＣＴを維持しながら、ヒト気道細胞におけるＩＬ−８及び生体内の炎症を起こした哺乳類の気管における好中球動員を抑制することを示している。エアロゾルのダプソンは、嚢胞性線維症、慢性気管支炎及び重症喘息などの慢性気道炎症性疾患治療のための有望な治療法である。よって、全身に、特にエアロゾルとして与えられるダプソンは、好中球性気道炎症の治療において有用となろう。
【００６５】
実施例２：ダプソンのＩＬ−１３抑制特性
杯細胞は円柱状の上皮細胞であり、その唯一の機能が、水に溶解して粘液を形成するムチンの分泌である。杯細胞過形成は、喘息患者の気管支上皮細胞によって生じる病理学的分泌過多に関与するものであり、ＩＬ−１３は、喘息の生体内及び生体外モデルのいずれにおいても、胚細胞過形成を調整する中心的役割を果たすことで知られる。杯細胞過形成を抑制するダプソンの能力は、生体外で実験した。杯細胞過形成の生体外モデルは、気液界面（ＡＬＩ）条件下で培養した正常ヒト気管支上皮（ＮＨＢＥ）細胞を用いて発達させた。細胞分染及び顕微鏡法を用いて分析した対照実験は、ダプソン（３μｇ／ｍｌ）では、ＡＬＩ調整したＮＨＢＥ細胞の成長に対する計測可能な作用はなかったことを示した（図示せず）。しかし、ＩＬ−１３を用いて杯細胞過形成を誘導した場合、ダプソン（１０μｇ／ｍｌ）は、対照細胞培養よりも、杯細胞過形成の量と範囲を軽減した（図示せず）。このように、ダプソンは、ＩＬ−１３で誘導された杯細胞過形成を抑制することによっても、炎症回復に有益な効果を発揮する可能性がある。
【００６６】
参考文献
Abanses JC, Arima S, Rubin BK. Vicks VapoRub induces mucin secretion, decreases ciliary beat frequency, and increases tracheal mucus transport in the ferret trachea. Chest 2009;135: 143-148
Berlow, BA, Liebhaber, MI, Zeb, D and Spiegel, TM. J Allergy Clin Immunol. 1991 Mar;87(3):710-715.
Chin AC, Parkos CA. Pathobiology of neutrophil transepithelial migration: implications in mediating epithelial injury. Annu Rev Pathol 2007 ;2: 111-143
Chougule, M, Padhi, B and Misra, A. AAPS PharmSciTech, 9(1): 47-53
Schmidt E, Reimer S, Kruse N, Brocker EB, Zillikens D. The IL-8 release from cultured human keratinocytes, mediated by antibodies to bullous pemphigoid autoantigen 180, is inhibited by dapsone. Clin Exp Immunol 2001 ; 124: 157-162
Escotte S, Al Alam D, Le Naour R, Puchelle E, Guenounou M, Gangloff SC. T cell chemotaxis and chemokine release after Staphylococcus aureus interaction with polarized airway epithelium. Am J Respir Cell Mol Biol 2006;34:348-354
Kanoh S, Kondo M, Tamaoki J, Kobayashi H, Motoyoshi K, Nagai A. Differential regulations between adenosine triphosphate (ATP)- and uridine triphosphate-induced Cl- secretion in bovine tracheal epithelium. Am J Respir Cell Mol Biol 2001 ;25:370-376
Zhu YI, Stiller MJ. Dapsone and sulfones in dermatology: overview and update. J Am Acad Dermatol 2001 ;45 :420-434
【００６７】
本発明を好適な実施の形態に関して説明してきたが、当業者であれば、添付の請求項の精神及び範囲を逸脱することなく、本発明を変形例とともに実施できることを認識するであろう。よって、本発明は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、本明細書に記載の精神と範囲を逸脱することなく、その全ての変形例及び均等物を更に含むものである。
【図１Ａ−１Ｃ】
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【図２Ａ−２Ｂ】
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【図２Ｃ−２Ｄ】
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【図３】
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【図５Ａ−５Ｂ】
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【図６Ａ−６Ｂ】
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【図７Ａ−７Ｂ】
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【図４】
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