(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナプシンＡ（ＮＰ−Ａ）を含むＲＡＧＥシグナル伝達調節剤。
【請求項２】
前記ＲＡＧＥシグナル伝達の調節はＮＦκＢ活性化を含む、請求項１に記載のＲＡＧＥシグナル伝達調節剤。
【請求項３】
前記ＲＡＧＥシグナル伝達調節剤は、遅延型である、請求項１または２に記載のＲＡＧＥシグナル伝達調節剤。
【請求項４】
糖尿病性腎症の予備的な検出方法であって、
（Ａ）糖尿病性腎症の検出の対象となる被験体からのサンプルを、固相に固定されたＲＡＧＥリガンド認識領域に接触させる工程、
（Ｂ）（Ａ）において接触した該サンプルに、ナプシンＡ（ＮＰ−Ａ）に特異的に結合する結合分子を接触させる工程、ならびに
（Ｃ）前記結合分子の該ＮＰ−Ａへの結合を検出する工程であって、該結合の存否またはレベルは、該被験体が将来糖尿病性腎症に罹患することまたはその可能性を示す、工程を包含する、方法。
【請求項５】
前記サンプルは尿である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＲＡＧＥリガンド認識領域は、ＲＡＧＥ細胞外領域（配列番号２７の２２−３３２位）、ＲＡＧＥ８、ｍＲＡＧＥ８、ＲＡＧＥ１、ｍＲＡＧＥ１、ＲＡＧＥ２、ｍＲＡＧＥ２、ＲＡＧＥ３、ｍＲＡＧＥ３、ＲＡＧＥ４、ｍＲＡＧＥ４、ＲＡＧＥ７、ｍＲＡＧＥ７、ＲＡＧＥ１４３、ｍＲＡＧＥ１４３、ＲＡＧＥ２２３、ｍＲＡＧＥ２２３、ＲＡＧＥ２２６およびｍＲＡＧＥ２２６、これらの少なくとも１つを含む分子、またはそれらの改変体あるいはそれらの複合体からなる群より選択される、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
糖尿病性腎症の予測、予備的な検出または診断のためのキットであって、該キットは
（Ａ）固定されたＲＡＧＥリガンド認識領域を有する固相、
（Ｂ）ナプシンＡ（ＮＰ−Ａ）に特異的に結合する結合分子、ならびに
（Ｃ）前記結合分子の該ＮＰ−Ａへの結合を検出する手段を備え、該結合の存在またはレベルは、該被験体が将来糖尿病性腎症に罹患することまたはその可能性を示す、キット。
【請求項８】
前記サンプルは尿である、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
前記ＲＡＧＥリガンド認識領域は、ＲＡＧＥ細胞外領域（配列番号２７の２２−３３２位）、ＲＡＧＥ８、ｍＲＡＧＥ８、ＲＡＧＥ１、ｍＲＡＧＥ１、ＲＡＧＥ２、ｍＲＡＧＥ２、ＲＡＧＥ３、ｍＲＡＧＥ３、ＲＡＧＥ４、ｍＲＡＧＥ４、ＲＡＧＥ７、ｍＲＡＧＥ７、ＲＡＧＥ１４３、ｍＲＡＧＥ１４３、ＲＡＧＥ２２３、ｍＲＡＧＥ２２３、ＲＡＧＥ２２６およびｍＲＡＧＥ２２６、これらの少なくとも１つを含む分子、またはそれらの改変体あるいはそれらの複合体からなる群より選択される、請求項７または８に記載のキット。
【請求項１０】
糖尿病または糖尿病性腎症の検出方法であって、
（Ａ）糖尿病または糖尿病性腎症の検出の対象となる被験体からのサンプルを、固相に固定されたＲＡＧＥリガンド認識領域に接触させる工程、
（Ｂ）（Ａ）において接触した該サンプルに、ナプシンＡ（ＮＰ−Ａ）に特異的に結合する結合分子を接触させる工程、および
（Ｃ）前記結合分子の該ＮＰ−Ａへの結合を検出する工程であって、該結合の存在またはレベルは、該被験体が糖尿病または糖尿病性腎症に罹患していることを示す、工程を包含する、方法。
【請求項１１】
前記サンプルは尿である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＲＡＧＥリガンド認識領域は、ＲＡＧＥ細胞外領域（配列番号２７の２２−３３２位）、ＲＡＧＥ８、ｍＲＡＧＥ８、ＲＡＧＥ１、ｍＲＡＧＥ１、ＲＡＧＥ２、ｍＲＡＧＥ２、ＲＡＧＥ３、ｍＲＡＧＥ３、ＲＡＧＥ４、ｍＲＡＧＥ４、ＲＡＧＥ７、ｍＲＡＧＥ７、ＲＡＧＥ１４３、ｍＲＡＧＥ１４３、ＲＡＧＥ２２３、ｍＲＡＧＥ２２３、ＲＡＧＥ２２６およびｍＲＡＧＥ２２６、これらの少なくとも１つを含む分子、またはそれらの改変体あるいはそれらの複合体からなる群より選択される、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
糖尿病または糖尿病性腎症の検出または診断のためのキットであって、該キットは、
（Ａ）固定されたＲＡＧＥリガンド認識領域を有する固相、
（Ｂ）ナプシンＡ（ＮＰ−Ａ）に特異的に結合する結合分子、および
（Ｃ）前記結合分子の該ＮＰ−Ａへの結合を検出する手段を備え、該結合の存在またはレベルは、該被験体が糖尿病または糖尿病性腎症に罹患していることを示す、キット。
【請求項１４】
前記サンプルは尿である、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
前記ＲＡＧＥリガンド認識領域は、ＲＡＧＥ細胞外領域（配列番号２７の２２−３３２位）、ＲＡＧＥ８、ｍＲＡＧＥ８、ＲＡＧＥ１、ｍＲＡＧＥ１、ＲＡＧＥ２、ｍＲＡＧＥ２、ＲＡＧＥ３、ｍＲＡＧＥ３、ＲＡＧＥ４、ｍＲＡＧＥ４、ＲＡＧＥ７、ｍＲＡＧＥ７、ＲＡＧＥ１４３、ｍＲＡＧＥ１４３、ＲＡＧＥ２２３、ｍＲＡＧＥ２２３、ＲＡＧＥ２２６およびｍＲＡＧＥ２２６、これらの少なくとも１つを含む分子、またはそれらの改変体あるいはそれらの複合体からなる群より選択される、請求項１３または１４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
糖尿病合併症である糖尿病血管障害（腎症、網膜症、神経症）、並びに、慢性腎症の早期診断、及び、発症予防効果の評価に活用なバイオマーカーに関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病合併症の代表である糖尿病性腎症と慢性腎症の患者数は、200万人以上、1,000万人を越える予備群がいると言われているが、如何に早期に発見するかが極めて重要である。発症後のマーカーとして、尿中アルブミンや血中クレアチンが用いられているが、それ以前の極初期のマーカーとなり得る分子が求められている。
【０００３】
これに関して特許文献１〜６では、それぞれ変形性関節症の進行のし易さの検出方法；慢性肝炎、肝硬変、肝がんの分別診断のための新規バイオマーカーおよび該バイオマーカーを用いた慢性肝炎、肝硬変、肝がんの分別診断方法；２型糖尿病診断剤；癌の組織型を判別するカクテル抗体、判別キット及び判別方法；アミロイドβとアミロイドβ結合蛋白質との相互作用を阻害する物質をスクリーニングする方法；５−ＨＴ２Ａインバースアゴニスト及びアンタゴニストの抗精神病薬との併用；ＱＴ間隔調整方法；疾患治療薬としての選択的セロトニン受容体逆作動薬；およびムスカリンアゴニストとしてのアミノ置換ジアリール［ａ，ｄ］シクロヘプテン類似体および精神神経疾患の治療方法を開示する。
【０００４】
非特許文献１は、ヘモペキシンを認識し、除去する新規受容体（ＲＡＧＥではない）を報告する。
【０００５】
非特許文献２は、全血のＤＮＡマイクロアレイ解析の結果を開示し、ＮＰ−Ａを記載する。
【０００６】
非特許文献３〜５は、ヘモペキシンに関する疾患との関係の情報を開示する。非特許文献３は、腎糸球体がＴＮＦα刺激に依りＨＰＸを生産することを記載する。非特許文献４および５には、微小変化型ネフローゼ症候群に関しＨＰＸに関する記載が存在する。
【０００７】
非特許文献６は、ラットに糖尿病を誘導した際にトランスサイレチン濃度が減少することを報告する。
【０００８】
非特許文献７は酸化ストレスによりラット血漿中でカルボニル化を受けるタンパク質を解析しＨＰＸもその一つとして記載する。
【０００９】
非特許文献８は、血糖降下作用があるキノコ多糖の糖尿病ラット血漿タンパク質変動の二次元解析を記載する。ＴＴＲ、トランスフェリンおよびＨＰＸの記載が存在する。
【００１０】
非特許文献９は、ネフローゼ症候群を生じさせる糸球体腎炎の尿中マーカー候補をプロテオームとインフォーマティックス解析し、ＨＰＸ、トランスフェリン、ＴＴＲに関する記載が存在する。
【００１１】
非特許文献１０は、ＩＩ型糖尿病の血中糖化タンパク質の同定とインシュリン刺激による変動を解析し、トランスフェリンとＨＰＸを記載する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特許公開2011-158261公報
【特許文献２】特許公開2009-114092公報
【特許文献３】特許公開2010-261920公報
【特許文献４】特許公開2010-249776公報
【特許文献５】特許公開2007-121309公報
【特許文献６】特許公表2010-522198公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Blood  106  (7)  2572-2579  (2005)
【非特許文献２】Biol.  Pharm.  Bull.,  33(6)  1033-1042  (2010)
【非特許文献３】Kidney  International  63,  1681-1686  (2003)
【非特許文献４】Pediatr.  Nephrol.,  20,  1410-1415  (2005)
【非特許文献５】Kidney  International  57,  1512-1520  (2000)
【非特許文献６】British  Journal  of  Nutrition  (1996),  76,  891-897
【非特許文献７】J  Proteome  Res  10,  3959-3972  (2011)
【非特許文献８】Proteomics    6,  5291-5302  (2006)
【非特許文献９】J.  Am.  Soc  Nephrol  18,  913-922  (2007)
【非特許文献１０】Diabetes  Care  28,  645-652  (2005)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
血中クレアチン濃度が上昇した時点では腎症はかなり進展しており、極初期のマーカーとなり得る分子が求められていたが、これを本願発明は解決し、糖尿病合併症の発症・進展要因である終末期糖化生成物（ＡＧＥｓ、後期糖化生成物ともいう）を認識する受容体であるＲＡＧＥの認識領域を結合したＲＡＧＥビーズを用いた糖尿病モデルマウスの尿、および、血清中のＲＡＧＥ結合分子のプロテオーム解析を行い、ＲＡＧＥビーズを用いることにより、従来の疾患プロテオームでは検出不可能な腎症等のマーカーを見出した。本発明は以下を提供する。
（１）ナプシンＡ（ＮＰ−Ａ）、ナプシンＡ前駆体、トランスフェリン、ヘモペキシン（ＨＰＸ）、ヘモペキシン関連物質、トランスサイレチン（ＴＴＲ）、およびキニノーゲン（ＫＮＮ）からなる群より選択される分子を含む、ＡＧＥ受容体（ＲＡＧＥ）のリガンド。
（２）項目１に記載のリガンドまたは該リガンドをコードする核酸分子を少なくとも１種含むＲＡＧＥシグナル伝達調節剤。
（３）前記リガンドは、ＮＰ−Ａ、ＨＰＸ、ＴＴＲまたはＫＮＮを少なくとも１種含む項目２に記載のＲＡＧＥシグナル伝達調節剤。
（４）前記ＲＡＧＥシグナル伝達の調節はＮＦκＢ活性化を含む、項目２または３に記載のＲＡＧＥシグナル伝達調節剤。
（５）前記ＲＡＧＥシグナル伝達調節剤は、遅延型である、項目２〜４のいずれか１項に記載のＲＡＧＥシグナル伝達調節剤。
（６）ナプシンＡ（ＮＰ−Ａ）、ナプシンＡ前駆体、ヘモペキシンおよびヘモペキシン関連物質からなる群より選択される少なくとも１つの分子または該分子をコードする核酸分子を含む糖尿病および／または糖尿病血管障害および／または糖尿病腎症のマーカー。
（７）前記マーカーはＮＰ−Ａおよび／またはナプシンＡ前駆体あるいはそれらをコードする核酸分子を含む尿中マーカーである、項目６に記載のマーカー。
（８）前記マーカーはヘモペキシンおよび／またはヘモペキシン関連物質あるいはそれらをコードする核酸分子を含む血中マーカーである、項目６または７に記載のマーカー。
（９）前記ヘモペキシンおよび／またはヘモペキシン関連物質あるいはそれらをコードする核酸分子は、トランスサイレチン（ＴＴＲ）および／またはキニノーゲン（ＫＫＮ）あるいはそれらをコードする核酸分子と組み合わせて使用される、項目８に記載のマーカー。
（１０）糖尿病性腎症の予備的な検出方法であって、
（Ａ）糖尿病性腎症の検出の対象となる被験体からのサンプルを、固相に固定されたＲＡＧＥリガンド認識領域に接触させる工程、
（Ｂ）ナプシンＡ、ナプシンＡ前駆体（ＮＰ−Ａ）、ヘモペキシンおよびヘモペキシン関連物質からなる群より選択される少なくとも１つの分子に特異的に結合する結合分子に接触させる工程、および
（Ｃ）前記結合分子の該ＲＡＧＥリガンド認識領域への結合を検出する工程であって、該結合の阻害の存否またはレベルは、該被験体が将来糖尿病性腎症に罹患することまたはその可能性を示す、工程を包含する、方法。
（１１）前記分子はナプシンＡ（ＮＰ−Ａ）および／またはナプシンＡ前駆体であり、前記サンプルは尿である、項目１０に記載の方法。
（１２）前記分子はヘモペキシンおよび／またはヘモペキシン関連物質であり、前記サンプルは血液、血清または血漿である、項目１０または１１に記載の方法。
（１３）前記ＲＡＧＥリガンド認識領域は、ＲＡＧＥ細胞外領域（配列番号２７の２２−３３２位）、ＲＡＧＥ８、ｍＲＡＧＥ８、ＲＡＧＥ１、ｍＲＡＧＥ１、ＲＡＧＥ２、ｍＲＡＧＥ２、ＲＡＧＥ３、ｍＲＡＧＥ３、ＲＡＧＥ４、ｍＲＡＧＥ４、ＲＡＧＥ７、ｍＲＡＧＥ７、ＲＡＧＥ１４３、ｍＲＡＧＥ１４３、ＲＡＧＥ２２３、ｍＲＡＧＥ２２３、ＲＡＧＥ２２６およびｍＲＡＧＥ２２６、これらの少なくとも１つを含む分子、またはそれらの改変体あるいはそれらの複合体からなる群より選択される、項目１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
（１４）糖尿病性腎症の予測、予備的な検出または診断のためのキットであって、該キットは
（Ａ）固定されたＲＡＧＥリガンド認識領域を有する固相、
（Ｂ）ナプシンＡ、ナプシンＡ前駆体（ＮＰ−Ａ）、ヘモペキシンおよびヘモペキシン関連物質からなる群より選択される少なくとも１つの分子に特異的に結合する結合分子、および
（Ｃ）前記結合分子の該ＲＡＧＥリガンド認識領域への結合を検出する手段を備え、該結合の阻害の存在またはレベルは、該被験体が将来糖尿病性腎症に罹患することまたはその可能性を示す、キット。
（１５）前記分子はナプシンＡ（ＮＰ−Ａ）および／またはナプシンＡ前駆体であり、前記サンプルは尿である、項目１４に記載のキット。
（１６）前記分子はヘモペキシンおよび／またはヘモペキシン関連物質であり、前記サンプルは血液、血清または血漿である、項目１４または１５に記載のキット。
（１７）前記ＲＡＧＥリガンド認識領域は、ＲＡＧＥ細胞外領域（配列番号２７の２２−３３２位）、ＲＡＧＥ８、ｍＲＡＧＥ８、ＲＡＧＥ１、ｍＲＡＧＥ１、ＲＡＧＥ２、ｍＲＡＧＥ２、ＲＡＧＥ３、ｍＲＡＧＥ３、ＲＡＧＥ４、ｍＲＡＧＥ４、ＲＡＧＥ７、ｍＲＡＧＥ７、ＲＡＧＥ１４３、ｍＲＡＧＥ１４３、ＲＡＧＥ２２３、ｍＲＡＧＥ２２３、ＲＡＧＥ２２６およびｍＲＡＧＥ２２６、これらの少なくとも１つを含む分子、またはそれらの改変体あるいはそれらの複合体からなる群より選択される、項目１４〜１６のいずれか１項に記載のキット。
（１８）糖尿病または糖尿病性腎症の検出方法であって、
（Ａ）糖尿病または糖尿病性腎症の検出の対象となる被験体からのサンプルを、固相に固定されたＲＡＧＥリガンド認識領域に接触させる工程、
（Ｂ）ナプシンＡ、ナプシンＡ前駆体（ＮＰ−Ａ）、ヘモペキシンおよびヘモペキシン関連物質からなる群より選択される少なくとも１つの分子に特異的に結合する結合分子に接触させる工程、および
（Ｃ）前記結合分子の該ＲＡＧＥリガンド認識領域への結合を検出する工程であって、該結合の阻害の存在またはレベルは、該被験体が糖尿病または糖尿病性腎症に罹患していることを示す、工程を包含する、方法。
（１９）前記分子はナプシンＡ（ＮＰ−Ａ）および／またはナプシンＡ前駆体であり、前記サンプルは尿である、項目１８に記載の方法。
（２０）前記分子はヘモペキシンおよび／またはヘモペキシン関連物質であり、前記サンプルは血液、血清または血漿である、項目１８または１９に記載の方法。
（２１）前記ＲＡＧＥリガンド認識領域は、ＲＡＧＥ細胞外領域（配列番号２７の２２−３３２位）、ＲＡＧＥ８、ｍＲＡＧＥ８、ＲＡＧＥ１、ｍＲＡＧＥ１、ＲＡＧＥ２、ｍＲＡＧＥ２、ＲＡＧＥ３、ｍＲＡＧＥ３、ＲＡＧＥ４、ｍＲＡＧＥ４、ＲＡＧＥ７、ｍＲＡＧＥ７、ＲＡＧＥ１４３、ｍＲＡＧＥ１４３、ＲＡＧＥ２２３、ｍＲＡＧＥ２２３、ＲＡＧＥ２２６およびｍＲＡＧＥ２２６、これらの少なくとも１つを含む分子、またはそれらの改変体あるいはそれらの複合体からなる群より選択される、項目１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
（２２）糖尿病または糖尿病性腎症の検出または診断のためのキットであって、該キットは、
（Ａ）固定されたＲＡＧＥリガンド認識領域を有する固相、
（Ｂ）ナプシンＡ、ナプシンＡ前駆体（ＮＰ−Ａ）、ヘモペキシンおよびヘモペキシン関連物質からなる群より選択される少なくとも１つの分子に特異的に結合する結合分子、および
（Ｃ）前記結合分子の該ＲＡＧＥリガンド認識領域への結合を検出する手段を備え、該結合の阻害の存在またはレベルは、該被験体が糖尿病または糖尿病性腎症に罹患していることを示す、キット。
（２３）前記分子はナプシンＡ（ＮＰ−Ａ）および／またはナプシンＡ前駆体であり、前記サンプルは尿である、項目２２に記載のキット。
（２４）前記分子はヘモペキシンおよび／またはヘモペキシン関連物質であり、前記サンプルは血液、血清または血漿である、項目２２または２３に記載のキット。
（２５）前記ＲＡＧＥリガンド認識領域は、ＲＡＧＥ細胞外領域（配列番号２７の２２−３３２位）、ＲＡＧＥ８、ｍＲＡＧＥ８、ＲＡＧＥ１、ｍＲＡＧＥ１、ＲＡＧＥ２、ｍＲＡＧＥ２、ＲＡＧＥ３、ｍＲＡＧＥ３、ＲＡＧＥ４、ｍＲＡＧＥ４、ＲＡＧＥ７、ｍＲＡＧＥ７、ＲＡＧＥ１４３、ｍＲＡＧＥ１４３、ＲＡＧＥ２２３、ｍＲＡＧＥ２２３、ＲＡＧＥ２２６およびｍＲＡＧＥ２２６、これらの少なくとも１つを含む分子、またはそれらの改変体あるいはそれらの複合体からなる群より選択される、項目２２〜２４のいずれか１項に記載のキット。
（２６）ナプシンＡ（ＮＰ−Ａ）、ナプシンＡ前駆体、ヘモペキシンおよびヘモペキシン関連物質からなる群より選択される少なくとも１つの分子あるいは該分子をコードする核酸分子に対して特異的に相互作用する因子を含む糖尿病および／または糖尿病血管障害および／または糖尿病腎症の予備検出剤、予測診断剤、検出剤または診断剤。
（２７）前記検出剤または診断剤は核酸または抗体である、項目２６に記載の予備検出剤、予測診断剤、検出剤または診断剤。
【００１５】
本願発明において見出された糖尿病、糖尿病合併症（特に糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症等）のマーカーを記載する。
発症群特有の分子：ヘモペキシン、ヘモペキシン前駆体（プロタンパク質）、Ｐｆａ１、Ｉｇ  κ鎖、ナプシンＡ（ＮＰ−Ａ）、ナプシンＡ前駆体（プロタンパク質）、トランスフェリン
健常群特有の分子：第ＸＩＩ因子、Ｆ１２タンパク質、キニノーゲン−１  アイソフォーム１、キニノーゲン−１アイソフォーム−２、キニノーゲン−１  アイソフォーム３、キニノーゲン、プロテインＳ１００−Ａ８、血漿カリクレイン前駆体、血漿カリクレイン、β−２−グロビン，ヘモグロビンサブユニットβ−２、β−グロビン，α−１−グロビン、トランスサイレチン、補体Ｃ３。
【００１６】
本発明において見出された発症群特異的な分子としてのナプシンＡ（ＮＰ−Ａ）、ヘモペキシン（ＨＰＸ）、健常群特異的な分子としてのトランスサイレチン（ＴＴＲ）、キニノーゲン（ＫＮＮ）等の分子は、通常の遺伝子マーカーの検出手法によって被験体由来のサンプルにおいて測定することができるが、好ましくは、糖尿病血管障害の発症・進展因子である終末期糖化産物（ＡＧＥｓ）の受容体であるＲＡＧＥの認識領域を結合させたビーズにより、尿、血清等のサンプル中から、ＲＡＧＥビーズに特異的に結合する分子を分離することによって、微量でも検出することができる。
【００１７】
本発明において見出されたナプシンＡ（ＮＰ−Ａ）、ヘモペキシン（ＨＰＸ）、健常群特異的な分子としてのトランスサイレチン（ＴＴＲ）、キニノーゲン（ＫＮＮ）等の分子は、ＲＡＧＥリガンドとして機能するものである。
【００１８】
本発明者らが開発したＲＡＧＥビーズを用いた手法により、ストレプトゾトシン投与により糖尿病を発症させた糖尿病モデルマウスの尿、並びに、血清から、発症群特異的な分子としてナプシンＡ（ＮＰ−Ａ）、ヘモペキシン（ＨＰＸ）、健常群特異的な分子としてトランスサイレチン（ＴＴＲ）、キニノーゲン（ＫＮＮ）などを同定し、さらに、ＲＡＧＥリガンドとして機能することを明らかにし、本発明を完成させた。糖尿病合併症は、ＲＡＧＥを介したリガンドの取り込みが初期刺激になると考えられていることから、ＲＡＧＥに特異的に結合する分子のプロテオーム解析により、糖尿病性腎症等の糖尿病合併症マーカーになり得る分子を見出せる可能性があるとの着眼点から本特許の実験は開始された。その結果、発症群特異的な分子が見出され、実際にＲＡＧＥリガンドであること、従来の手法で糖尿病性腎症を検出できる以前の段階で発症を検出可能なことが示された。したがって、本発明は、従来手法では確認できなかった糖尿病性腎症に関するマーカーを提供するとともに、早期マーカーまたは予測マーカーとしての利用可能なマーカーを提供する。
【００１９】
本発明のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。
【発明の効果】
【００２０】
糖尿病または腎症等糖尿病合併症の極初期のマーカーが提供され、従来の方法に関していうと、糖尿病または糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症等の糖尿病合併症の予測診断が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１−１】図１−１は、ストレプトゾトシン投与により糖尿病を誘導したマウス（発症群、図中Ｓｔｚ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ群）、並びに、コントロール（健常群、図中Ｃｏｎｔｒｏｌ群）の７１日目の血清中のグルコース濃度（糖尿病発症の指標）とクレアチニン濃度（腎症発症の指標）の測定結果である。上図はＳｔｚ群の血中グルコース濃度が有意に高く、糖尿病を発症していることを示し、下図はＳｔｚ群の血中クレアチニン濃度が有意に高く糖尿病性腎症を発症していることを示す。ストレプトゾトシン投与による糖尿病の発症と進展により、糖尿病合併症である腎症も発症していることが確認された。病態特異的にＲＡＧＥと相互作用する分子を同定した際に使用した検体が、健常群と糖尿病性腎症発症群を代表する検体であることを確認した参考データである。
【図１−２】図１−２は、Ａにおいて、糖尿病性腎症発症発症マーカーになり得る分子のＲＡＧＥビーズによるスクリーニングのために、Ｓｔｚ処理により糖尿病を誘導したマウス（Ｓｔｚ；各欄右に示す濃い棒）および健常群（ｃｏｎｔｌ；各欄左に示す薄い棒）の血糖値の経時変化を示す。Ｂにおいて、糖尿病性腎症発症発症マーカーになり得る分子のＲＡＧＥビーズによるスクリーニングのために、Ｓｔｚ処理により糖尿病を誘導したマウス（Ｓｔｚ）と健常群（ｃｏｎｔｌ）の血清クレアチニン濃度の変化。血糖値の上昇が確認できた数週間後ではクレアチニン濃度の上昇（糖尿病性腎症のマーカーの一つ）は検出されなかったが、全採血時（７１日目）には、クレアチニン濃度はＳｔｚ群で有意に上昇していた。＊は有意差がある（ｐ＜０．０５）ことを示す。
【図２】図２は、実施例１においてＲＡＧＥビーズを活用したＲＡＧＥと相互作用する分子の捕捉と同定した結果を示す。左は血清サンプルのもの右は尿サンプルのものを示す。血清については、タンパク質の種類が多いのでさらに２Ｄ  ＤＩＧＥによる解析を行った。糖尿病性腎症発症群は蛍光色素Ｃｙ３で、健常群を蛍光色素Ｃｙ５でラベルした後に、両者を混合し、２次元電気泳動で構成タンパク質を分離し、実施例６で用いた。尿については、ストレプトゾトシン投与により糖尿病を誘導したマウスの尿をＲＡＧＥ固定化ビーズに結合させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、高血糖値を示すマウス特有のタンパク質が検出された。全個体が糖尿病性腎症を発症していると思われる高血糖値群に特有のタンパク質バンドをゲルから切り出し、トリプシン分解を行ってＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦ  ＭＳによる解析をしたところ、ナプシンＡが同定され、糖尿病血管障害の尿中マーカーとして使用できる可能性がある。
【図３】図３は、実施例２の結果を示す。ＮＰ−ＡがＲＡＧＥに結合することの確認をおこなったものである。Ａ，Ｂ：  ＲＡＧＥのリガンドとしての機能が知られているリボース  ＡＧＥ（Ｒｉｂｏｓｅ−ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  ｅｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔ：Ｒ−ＡＧＥ）をＡｌｅｘａ  ５５５（蛍光物質）で標識して、ＣＦＰ融合ＲＡＧＥ発現細胞（ＣＦＰ＿ＲＡＧＥ）と反応させた。Ｃ，Ｄ：  ＮＰ−ＡをＣＦＰ＿ＲＡＧＥと反応させた後、抗ＮＰ−Ａ抗体による間接蛍光抗体法によりＮＰ−Ａの結合を解析した。Ａ，Ｃ：ＲＡＧＥ発現細胞をＮＰ−Ａと反応させた結果；Ｂ，Ｄ：ＲＡＧＥ発現細胞をＲＡＧＥ中和抗体（Ａｂ）で処理した後にＮＰ−Ａと反応させた結果である。左から位相差像、ＣＦＰ＿ＲＡＧＥ由来の蛍光像およびＮＰ−Ａ由来の蛍光像を示す。ＲＡＧＥの代表的なリガンドであるＲ−ＡＧＥ  同様に、ナプシンＡ（ＮＰ−Ａ）は、ＲＡＧＥ発現細胞に結合し、その結合はＲＡＧＥ機能を阻害する特異的な抗体（中和抗体）により阻害されることが観察された。このことから、発症群特有にＲＡＧＥビーズに結合したＮＰ−Ａが、細胞上でもＲＡＧＥに結合する分子であることが確認された。
【図４】図４は、実施例３のＲＡＧＥ発現細胞をＮＰ−Ａで刺激した場合のＥＲＫ１／２の活性化（リン酸化）の確認を示す。上からＥＲＫ１、ＥＲＫ２、Ｐ−ＥＲＫ１、Ｐ−ＥＲＫ２のバンドを示す。ＲＡＧＥの代表的リガンドであるＲ−ＡＧＥでＲＡＧＥ発現細胞を刺激すると、シグナル伝達系の一つであるＭＡＰＫカスケード上のＥＲＫのリン酸化が２分後には観察され、５分後にリン酸化の程度は最大となり、１０分後には速やかな脱リン酸化が観察された。ＮＰ−Ａの場合、１５分後にリン酸化が最大になり３０分後には脱リン酸化されていることが確認された。このことから、ＮＰ−ＡがＲＡＧＥを介したシグナル伝達系を活性化することが示された。一方、ＮＰ−Ａによる活性化の程度はＡＧＥに比べて弱く、リン酸化の経過も異なっていることも確認された。
【図５】図５は、実施例４のＲ−ＡＧＥ、ＮＰ−ＡによるＮＦκＢの活性化を示す。ルシフェラーゼをレポーター遺伝子としてＮＦκＢの活性を評価した。ＲＡＧＥ発現細胞をＲＡＧＥ中和抗体による前処理をした際の活性を１とした相対値で示した。左はＲ−ＡＧＥの活性、右はＮＰ−Ａの活性を示す。ＮＰ−Ａが、Ｒ−ＡＧＥ同様に、ＲＡＧＥを介してＮＦκＢの活性化することが確認された。
【図６】図６Ａは、実施例５のマウス尿中のＮＰ−Ａの検出を示す。ＲＡＧＥ１４３（ＲＡＧＥ認識領域の一部）を固定化したプレートと抗ＮＰ−Ａ抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより、健常群および糖尿病発症群（ストレプトゾトシン投与で糖尿病を誘導、糖尿病は発症しているが、糖尿病性腎症の発症は検出できない状態）各々の、尿中のＮＰ−Ａを検出した結果を示す図である。＊は有意差がある（ｐ＜０．０５）ことを示す。図６ＢはＪａｆｆｅ法による３８日目の尿中クレアチニン濃度を示す。図６ＣはＪａｆｆｅ法による３８日目の血中クレアチニン濃度を示す。図６Ａの発症群（Ｓｔｚ）は、糖尿病発症群であるが、糖尿性病腎症の発症が従来法では検出されていない段階の個体群である。実施例において使用した発症モデルマウスは、いずれも同様の処理を施した発症モデル（Ｓｔｚ群）であるが、糖尿病の進展状態により、Ｓｔｚ群、糖尿病発症群、糖尿病性腎症発症群と記載されるが同じ種類のモデルマウスを指すことが理解される。なお、図２（実施例１）において使用した発症群は、糖尿病が進展し従来法で糖尿病性腎症の発症が確認された発症群であり（図１−２の７１日目の個体群を参照）、図６で検出対象とされたＳｔｚ群とは同じ条件でＳｔｚ刺激を行ったものの独立して行った実験シリーズであるので留意が必要である。
【図７】図７は、実施例６の２Ｄ  ＤＩＧＥによる健常群、若しくは、糖尿病性腎症発症群特有のＲＡＧＥに結合する血清中の分子の検出を示す。左上のＣｙ３（糖尿病性腎症発症群）と左下のＣｙ５（健常群）の画像を重ね合わせた画像を右の拡大図に示す。実際の蛍光画像では、左上図のＣｙ３は緑色であり、左下図のＣｙ５は赤色の蛍光を発し、これらを重ね合わせると右図になり、重なった箇所（糖尿病性腎症発症群と健常群に共通なスポット）はカラー表示では黄色く見える。実際のゲルを銀染色後に、蛍光画像データと照らし合わせながら、糖尿病性腎症発症群特有のスポット、健常群に特有のスポット数十をくりぬき、ゲルをトリプシン消化後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦＭＳにて同定した（実施例７）。ＨＰＸ（ヘモペキシン）と記載したスポットはカラー表示では緑色であるため、糖尿病性腎症発症群特有であり、ＫＮＮ（キニノーゲン）およびＴＴＲ（トランスサイレチン）と記載したスポットはカラー表示では赤色であるため、健常群特有であるといえる。
【図８】図８は、実施例７のＨＰＸ（ヘモペキシン）がＲＡＧＥに認識され取り込まれることの確認を示す。上段：ＣＦＰ＿ＲＡＧＥ発現細胞をＨＰＸと反応させた後、抗ＨＰＸ抗体による間接蛍光抗体法によりＨＰＸの結合を解析した。下段：ＲＡＧＥ発現細胞をＲＡＧＥのリガンド認識を阻害するＲＡＧＥ中和抗体で処理した後にＨＰＸと反応させた結果。中和抗体処理によりＨＰＸの結合が観察されなくなり、ＨＰＸのＲＡＧＥに依存した認識と取り込みが確認できる。このことから、糖尿病性腎症発症群特有にＲＡＧＥビーズに結合したＨＰＸが実際にＲＡＧＥに結合し取り込まれることが確認された。左から順に位相差像、ＲＡＧＥ発現の蛍光像および取り込まれたＨＰＸの蛍光像を示す。
【図９】図９は、実施例８のＴＴＲ、ＫＮＮがＲＡＧＥに結合することの確認を示す。Ａ，Ｂ：ＴＴＲをＣＦＰ＿ＲＡＧＥ発現細胞と反応させた後、抗ＴＴＲ抗体による間接蛍光抗体法によりＴＲＲの結合を解析した。Ｃ，Ｄ：ＫＮＮをＣＦＰ＿ＲＡＧＥと反応させた後、抗ＫＮＮ抗体による間接蛍光抗体法によりＫＮＮの結合を解析した。Ａ，Ｃ：ＲＡＧＥ発現細胞をリガンドと反応させた結果；Ｂ，Ｄ：ＲＡＧＥ発現細胞をＲＡＧＥ中和抗体（Ａｂ）で処理した後にリガンドと反応させた結果である。ＴＴＲおよびＫＮＮ共に、ＲＡＧＥ発現細胞に結合し、その結合はＲＡＧＥ機能を阻害する特異的な抗体（中和抗体）により阻害されることが観察された。このことから、健常群特有にＲＡＧＥビーズに結合したＴＴＲとＫＮＮが、細胞上でもＲＡＧＥに結合する分子であることが確認された。
【図１０】図１０は、実施例９のＨＰＸ刺激によるＲＡＧＥ発現細胞のＥＲＫのリン酸化である。上からＥＲＫ１、ＥＲＫ２、Ｐ−ＥＲＫ１およびＰ−ＥＲＫ２のバンドを示す。左はＲ−ＡＧＥ、右はＨＰＸにより刺激した結果を示す。糖尿病性腎症発症群特有のリガンドであるＨＰＸによりＲＡＧＥ発現細胞を刺激すると、刺激直後からシグナル伝達系の一つであるＭＡＰＫカスケード上のＥＲＫのリン酸化が観察され始め、１５分後にリン酸化の程度は最大になった後、速やかな脱リン酸化が生じた。ＨＰＸがＲＡＧＥを介したシグナル伝達系を活性化させることが確認された。
【図１１】図１１は、実施例１０のＴＴＲおよびＫＮＮ刺激によるＲＡＧＥ発現細胞のＥＲＫのリン酸化を示す。上から、ＥＲＫ−１，ＥＲＫ−２、Ｐ−ＥＲＫ１およびＰ−ＥＲＫ２のバンドを示す。左はＴＴＲを示し、右はＫＮＮを示す。健常群特有のリガンドであるＴＴＲあるいはＫＮＮによりＲＡＧＥ発現細胞を刺激すると、刺激直後からシグナル伝達系の一つであるＭＡＰＫカスケード上のＥＲＫのリン酸化が観察され、３０分後に脱リン酸化が生じていた。ＴＴＲおよびＫＮＮがＲＡＧＥを介したシグナル伝達系を活性化させることが確認された。しかし、活性化の程度は弱かった。
【図１２】図１２は、実施例１１のＴＴＲ、ＨＰＸおよびＫＮＮによるＲＡＧＥを介したＮＦκＢの活性化を示す。ルシフェラーゼをレポーター遺伝子としてＮＦκＢの活性を評価した。ＲＡＧＥ発現細胞をＲＡＧＥ中和抗体による前処理を際の活性を１とした相対値で示した。ＴＴＲ、ＨＰＸおよびＫＮＮが、ＲＡＧＥを介してＮＦκＢの活性化することが確認された。
【図１３】図１３は、実施例１２のマウス血清中のＨＰＸの検出を示す。図１３は、ＲＡＧＥ１４３（ＲＡＧＥ認識領域の一部）を固定化したプレートと抗ＨＰＸ抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより、健常群と糖尿病発症群（ストレプトゾトシン投与で糖尿病を誘導、糖尿病は発症しているが、糖尿病性腎症の発症は検出できない状態）各々の、血清中のＨＰＸを検出した結果を示す。＊は有意差がある（ｐ＜０．０５）ことを示す。本図の発症群（（Ｓｔｚ）は、糖尿病発症群であるが、糖尿性病腎症の発症が従来法では検出されない段階の個体群である。実施例において使用した発症モデルマウスは、いずれも同様の処理を施したモデル（Ｓｔｚ群）であるが、糖尿病の進展状態により、Ｓｔｚ群、糖尿病発症群、糖尿病性腎症発症群と記載されるが同じ種類のモデルマウスを指すことが理解される。なお、図７（実施例６）において使用した発症群は、糖尿病が進展し従来法で糖尿病性腎症の発症が確認された発症群であり（図１−２の７１日目の個体群参照）、図１３で検出対象とされたＳｔｚ群とは同じ条件でＳｔｚ刺激を行ったものの独立して行った実験シリーズであるので留意が必要である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞または形容詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００２３】
（用語の定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
【００２４】
本明細書において「ナプシンＡ（ＮＰ−Ａ）」とは、肺腺がんに罹患した患者に見出されることから、同がんのマーカーとして使用されているアスパラギン酸ペプチダーゼタンパク質であり、ＡＳＰ４；ＴＡ０１／ＴＡ０２；ａｓｐ  ４；ａｓｐａｒｔｙｌ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ４；ｋｉｄｎｅｙ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ａｓｐａｒｔｉｃ  ｐｒｏｔｅａｓｅ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ｎａｐｓｉｎ−１；ｎａｐｓｉｎ−Ａ；ｐｒｏｎａｐｓｉｎ  Ａ等の表記がなされ、略称としてはＮＡＰＳＡのほかＫＡＰ；Ｋｄａｐ；ＮＡＰ１；ＮＡＰＡ；ＳＮＡＰＡ等の表記がなされる。その前駆体であるナプシンＡプレプロタンパク質、ナプシンＡプロタンパク質等は、総称して「ナプシンＡ前駆体」という。対応するＧｅｎＢａｎｋ番号等としては、ＡＦ０９８４８４．１（前駆体）、ＮＭ＿００４８５１．１、ＮＰ＿００４８４２．１（プレプロタンパク質）を挙げることができる。この他のあくセッション番号としては、ＢＣ０１４８１３．１、ＧＩ：１５９２８６９３、ＣＡＢ８２９０７．１、ＧＩ：７３４０３５２、ＢＣ０１７８４２．１、ＧＩ：１７３８９６３２、ＧＩ：４７５８７５４を挙げることができる。本発明との関係では、ＮＰ−Ａは、ＮＰ−Ａ（ａｓｐａｒｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅ）  ｐｒｅｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎとして発現  ４２０  ａａ  （アミノ酸１−４２０）（配列番号４）し、シグナルペプチド（アミノ酸番号１−２５：シグナルペプチド）が切断されプロタンパク質（前駆体：配列番号４のアミノ酸番号２６−４２０）となり、さらに、切断されてｍａｔｕｒｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ（成熟体：配列番号４のアミノ酸番号６４−４２０）になる。２６−４２０の前駆体と６４−４２０の成熟体はマーカーとなり得、プレプロタンパク質もまたマーカーとなり得る可能性はある。
【００２５】
ナプシンＡの代表的なヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
であり得る。
【００２６】
ナプシンＡのアミノ酸配列としては、
（ａ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（ｄ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
であり得る。
【００２７】
本明細書において「トランスフェリン」とは、血漿に含まれるタンパク質の一種で、鉄イオンを結合しその輸送を担うものである。糖タンパク質で、分子量は約８０ｋＤａ。分子は２つの互いに似たドメインからなり、それぞれに３価鉄イオン（Ｆｅ（ＩＩＩ））結合部位が１個ずつある。いずれも鉄イオンには１個の窒素原子（ヒスチジン残基）と５個の酸素原子（２個のチロシン残基、１個のアスパラギン酸残基、１個の炭酸分子）が配位する。ＴＦ；  ＤＫＦＺｐ７８１Ｄ０１５６；ＰＲＯ１５５７；  ＰＲＯ２０８６などと称される。ＧｅｎＢａｎｋ登録番号としては、ＮＭ＿００１０６３  を挙げることができる。この他のアクセッション番号としては、ＮＭ＿１３３９７７．２、ＧＩ：１１８１２９９４２、ＢＣ０５９３６７．１、ＧＩ：３７７４７８５４、ＡＡＢ２２０４９．１、ＧＩ：２４８６４８を挙げることができる。
【００２８】
トランスフェリンの代表的なヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号５または配列番号７に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号６または配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号６または配列番号８に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号５または配列番号７に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号６または配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
であり得る。
【００２９】
トランスフェリンのアミノ酸配列としては、
（ａ）配列番号６または配列番号８に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号６または配列番号８に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号５または配列番号７に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（ｄ）配列番号６または配列番号８に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
であり得る。
【００３０】
本明細書において「ヘモペキシン（ＨＰＸ）」とは、急性期応答タンパク質の一つであり凝血酵素ともいい、血中の遊離のヘムを結合する糖タンパク質であって、このタンパク質に結合して肝臓に運ばれたヘムはビリルビンへと分解される。ＨＰＸ；ＦＬＪ５６６５２；ＨＸなどを表記される。ＧｅｎＢａｎｋ登録番号としては、ＮＭ＿０００６１３．２、ＮＰ＿０００６０４．１を挙げることができる。このほかのアクセッション番号としては、ＮＭ＿０１７３７１．２、ＧＩ：１６０３５８８２８、ＡＡＨ１１２４６．１、ＧＩ：１５０３００１２、ＢＣ００５３９５．１、ＧＩ：１３５２９２８０、ＡＡＡ５８６７８を挙げることができる。ヘモペキシンは糖鎖パターンが種々存在するといわれており、これらはいずれも本発明の目的においてヘモペキシンに入る。ヘモペキシン前駆体（プロタンパク質）およびヘモペキシンの分解物等代謝産物もまた、本発明の目的において有用であり、本明細書において「ヘモペキシン関連物質」と呼ぶ。「ヘモペキシン関連物質」としては、例えば、分解物等代謝産物を挙げることができるがそれらに限定されない。このように、ＨＰＸは、ＮＰ−Ａのようなプレプロタンパク質としては存在せず、４６２アミノ酸からなるタンパク質（配列番号１２）として発現して、アミノ酸番号１−２３がシグナルペプチドで、成熟体（ＨＰＸ本体）は、配列番号１２のアミノ酸番号２４−４６２である。ヘモペキシンは、糖鎖が付加された糖タンパク質であり、糖鎖の付加の違いにより複数種のＨＰＸがあるが、これらはいずれも本発明の目的において使用することができる。実施例で、複数のスポットがＨＰＸとして同定されたのは、糖鎖の違いによる。糖鎖なしの場合と糖鎖が付加された場合の両者がマーカーとなりうる（実施例の異なるスポットは、分子量から判断して、いずれも糖鎖付加を受けていると考えられる）。
【００３１】
ヘモペキシンの代表的なヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号９または配列番号１１に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１０または配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１０または配列番号１２に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号９または配列番号１１に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１０または配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
であり得る。
【００３２】
ヘモペキシンのアミノ酸配列としては、
（ａ）配列番号１０または配列番号１２に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号１０または配列番号１２に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号９または配列番号１１に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（ｄ）配列番号１０または配列番号１２に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
であり得る。
【００３３】
本明細書において「キニノーゲン（ＫＮＮ）」とは、血液中に存在するタンパク質で、タンパク分解酵素で分解されると生理活性物質、キニンを生じるものである。キニノーゲンは非アルコール性脂肪肝疾患の診断マーカーである。ウイリアムフィッツジェラルドフロージャック因子とも呼ばれあるいはフィッツジェラルド因子またはＨＭＷＫカリクレイン因子とも呼ばれる。ＫＮＧ１、ＫＮＧ，ＢＤＫなどと表記されうる。ＧｅｎＢａｎｋ登録番号としては、ＮＭ＿００１１０２４１６を挙げることができる。このほかのアクセッション番号としては、たとえば、ＡＹ４６２０５６．１、ＧＩ：４０７１５８９５、ＡＡＲ８８６３０．１、Ｍ１１４３７．１、ＧＩ：１８６７５１、ＡＡＢ５９５５１．１、ＧＩ：３８６８５３、ＡＡＢ５９５５０．１、ＧＩ：３８６８５２を挙げることができる。
【００３４】
本発明では少なくとも、ＨＭＷ（高分子量型）ＫＮＮ、ＫＩＮＩＮＯＧＥＮ，ＫＮＮアイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）２，３、重鎖（ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ）など複数の断片が同定されているため、いずれもマーカーとして利用することができる。また、ＫＮＮは、血液凝固が起こり発痛物質の生産、炎症反応が生じるという流れの中での役割を果たす。理論に束縛されることを望まないが、ＫＮＮには２つの代表的なアイソフォーム（ＨＭＷ（高分子量型）およびＬＭＷ（低分子量型））がある。ＨＭＷは、６４４アミノ酸からなる前駆体として合成され１−１８がシグナルペプチドである。成熟体（アミノ酸番号１９−６４４）はさらに、プロセッシングにより重鎖（ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ：アミノ酸番号１９−３６０）と軽鎖（ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ：アミノ酸番号３９０−６４４）になると同時に、血管透過性亢進作用、発痛作用などを有するブラジキニン（アミノ酸番号３８１−３８９）を放出する。ＬＭＷは重鎖とブラジキニン部分の配列は、ＨＭＷと同一であるが、軽鎖の配列が異なっており、血液凝固系には関係していないことが知られている。本発明において複数の断片が同定されたが、ほとんどは、血液凝固に関係するカニクレイン・キニン系（ＫＫ系）に関するＨＭＷ  ＫＮＮに由来していた。したがって、好ましくは、ＨＭＷ  ＫＮＮを好ましい実施形態として用いることができる。
【００３５】
キニノーゲンの代表的なヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号１３または配列番号１５に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１４、配列番号１６または配列番号１７に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１４、配列番号１６または配列番号１７に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１３または配列番号１５に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１４、配列番号１６または配列番号１７に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
であり得る。
【００３６】
キニノーゲンのアミノ酸配列としては、
（ａ）配列番号１４、配列番号１６または配列番号１７に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号１４、配列番号１６または配列番号１７に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号１３または配列番号１５に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（ｄ）配列番号１４、配列番号１６または配列番号１７に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
であり得る。
【００３７】
本明細書において「トランスサイレチン（ＴＴＲ）」とは、別名プレアルブミンともいい、同質のサブユニットからなる四量体を形成するタンパク質として知られており、血中ビタミンＡ輸送タンパク質であるレチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）とタンパク質複合体を形成し、チロキシン（Ｔ４）と結合することが知られている。ラットでは、主なＴ４輸送タンパク質として知られている。ＡＴＴＲ；ｃａｒｐａｌ  ｔｕｎｎｅｌ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  １；  ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ  ｔｙｐｅ  Ｉ；ｔｈｙｒｏｘｉｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｅａｌｂｕｍｉｎ、ＣＴＳ；ＣＴＳ１；ＰＡＬＢ；ＴＢＰＡ；ＨｓＴ２６５１とも称される。ＧｅｎＢａｎｋ登録番号としては、ＡＢＩ６３３４５を挙げることができる。この他のアクセッション番号としては、たとえば、ＮＰ＿０３８７２５．１、ＧＩ：７３０５５９９、ＢＣ０２０７９１．１、ＧＩ：１８０８９１４４、ＡＡＨ２０７９１．１、ＢＣ００５３１０．１、ＧＩ：１３５２９０４９、ＡＡＨ０５３１０．１を挙げることができる。トランスサイレチンは、Ｒａｚ，Ａ．らにより単離精製され、神田らにより一次構造が同定された（Ｒａｚ，Ａ．＆  Ｇｏｏｄｍａｎ  Ｄ．Ｓ．，（１９６９），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２２４，３２３０−３２３７；Ｋａｎｄａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，（１９７４），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４７，６７９６−６８０５）。これまで、その異常がアルツハイマー性痴呆および家族性アミロイドーシスポリニューロパチーと関連していることが知られている。
【００３８】
トランスサイレチンの代表的なヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号１８、配列番号２０または配列番号２２に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１９、配列番号２１または配列番号２３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１９、配列番号２１または配列番号２３に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１８、配列番号２０または配列番号２２に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１９、配列番号２１または配列番号２３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
であり得る。
【００３９】
トランスサイレチンのアミノ酸配列としては、
（ａ）配列番号１９、配列番号２１または配列番号２３に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号１９、配列番号２１または配列番号２３に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号１８、配列番号２０または配列番号２２に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（ｄ）配列番号１９、配列番号２１または配列番号２３に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
であり得る。
【００４０】
トランスサイレチンの代表的な配列は、配列番号１８、配列番号２０または配列番号２０（核酸配列）および配列番号１９、配列番号２１または配列番号２３（アミノ酸配列）において示される。
【００４１】
ここで、トランスサイレチンの生物学的活性としては、例えば、四量体を形成するタンパク質として知られており、血中ビタミンＡ輸送タンパク質であるレチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）とタンパク質複合体を形成し、チロキシン（Ｔ４）と結合する能力を挙げることができる。
【００４２】
トランスサイレチンは分子量約１４０００のサブユニット４個からなる複合タンパク質であり、肝臓で合成される。血液中のトランスサイレチンの臨床的意義としては、栄養状態および肝臓のタンパク質合成能を反映しているとされ、ネフローゼ症候群や急性肝炎の回復期等で高値を示すことが知られている。なお、本明細書では、トランスサイレチンというときは、４量体の複合タンパク質とサブユニット単体とを特に区別せず、両方を指すものとする。また、トランスサイレチンには誘導体があり、システイン化（システイニル）、グルタチオン化、Ｓ−Ｓ結合形成、酸化（例えば、メチオニン側鎖の酸化）、ホルミル化、アセチル化、リン酸化、糖鎖付加、ミリスチル化などを挙げることができるがそれらに限定されない。
【００４３】
本発明のナプシン−Ａ、ヘモペキシン、トランスフェリン、キニノーゲン、トランスサイレチン等、それらの前駆体、関連物質、誘導体は、ヒト、マウス、ラットのほか、他の動物（例えば、哺乳動物）でもそのホモログ（本明細書において、「対応する」遺伝子またはタンパク質などという）が知られている。従って、本明細書においてナプシン−Ａ、ヘモペキシン、トランスフェリン、キニノーゲン、トランスサイレチン等、それらの前駆体、関連物質、誘導体は、通常、特に言及しない場合は、ヒト、マウス、ラットのほか、生物一般において存在するナプシン−Ａ、ヘモペキシン、トランスフェリン、キニノーゲン、トランスサイレチン等、それらの前駆体、関連物質、誘導体を指す。
【００４４】
本明細書では、
このほか、本発明において見出された糖尿病合併症（糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症等）に関連する遺伝子としては、以下が挙げられる。
発症群特有の分子：ヘモペキシン、ヘモペキシン前駆体（プロタンパク質）、Ｐｆａ１、Ｉｇ  κ鎖、ナプシンＡ（ＮＰ−Ａ）、ナプシンＡ前駆体（プロタンパク質）、トランスフェリン
健常群特有の分子：第ＸＩＩ因子、Ｆ１２タンパク質、キニノーゲン−１  アイソフォーム１、キニノーゲン−１アイソフォーム−２、キニノーゲン−１  アイソフォーム３、キニノーゲン、プロテインＳ１００−Ａ８、血漿カリクレイン前駆体、血漿カリクレイン、β−２−グロビン，ヘモグロビンサブユニットβ−２、β−グロビン，α−１−グロビン、トランスサイレチン、補体Ｃ３。
【００４５】
本明細書において使用される場合、用語「後期糖化反応生成物（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  Ｅｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）」とは、ＡＧＥともいわれ、糖尿病患者の生活の質を損ねる元凶である血管合併症として知られる糖尿病性血管障害の発症・進展に関与している。血管合併症による眼、神経、腎臓の障害は、それぞれ糖尿病網膜症、神経症、腎症（あわせて三大合併症）とよばれており、糖尿病患者に特徴的な病態である。グルコースに代表される還元糖は、タンパク質、アミノ酸のアミノ基と非酵素的に反応して、シッフ塩基またはアマドリ転位化合物などの糖化生成物を形成する。ここまでの反応は可逆的であり、前期反応とよばれている。その後、さらに縮合、開裂、架橋形成などの複雑かつ不可逆的な反応を経て、後期糖化反応生成物を形成する。このような一連の反応は、グリケーションと称される。ＡＧＥはまた、このような過程を経て生成された構造物の総称である。生体中に存在するＡＧＥ構造としては、カルボキシメチルリジン(ＣＭＬ)、カルボキエチルリジン(ＣＥＬ)、ペントシジン、ピラリン、イミダゾリン、メチルグリオキサール、クロスリンなどが挙げられるが、これに限定されない。血漿中に存在するアルブミン、イムノグロブリン、オボアルブミンなどが上記の糖化を受けた産物もＡＧＥであり、ＡＧＥとして実験系に汎用されている。さらに、インビトロ実験系では、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）に糖化処理を施したもの、例えば、Ｒ−ＡＧＥ（リボースにより糖化処理をしたＢＳＡ）、Ｆ−ＡＧＥ（フルクトースにより処理をしたＢＳＡ）；Ｇ−ＡＧＥ（グルコースにより糖化処理をしたＢＳＡ）なども汎用されている。血糖コントロールの指標として用いられているヘモグロビンＡ１ｃはアマドリ転移化合物であるが、ＡＧＥに包含される。また、任意のタンパク質も、ＡＧＥに変換可能である。例えば、ＡＧＥに包含されるＣＭＬアルブミンおよびＣＥＬアルブミンは、いずれもアルブミンが糖化を受けたＡＧＥである。このようなＡＧＥ生成反応は、生体内において循環血液中、細胞外マトリクス、細胞内のいずれでも起こり得る。例えば、糖尿病患者の血管に存在するＡＧＥとしては、：蛍光性で架橋構造を有するもの（ペントシジン、クロスリンなど）および蛍光も架橋もないもの（カルボキシメチルリジン、ピラリン、メチルグリオキサール（ＭＧ）−イミダゾロンなど）の２つに大別できる。ＡＧＥが異常値を示す場合、細小血管症（腎症、網膜症、神経症など）、大血管障害（虚血性心疾患、脳血管疾患、閉塞性動脈硬化症のような疾患が予想される。一般に使用される検査方法では、基準物質としては、ピラリン（正常範囲：血漿中２３ｐｍｏｌ／ｍＬ未満）、ペントシジン（正常範囲：血漿中０．００９１５〜０．０４３１μｇ／ｍＬ（ＥＬＩＳＡで測定した場合））などが使用される（「今日の臨床検査  ２００７−２００８」発行所  株式会社  南江堂、参照）。
【００４６】
本明細書において使用される場合、「複合体」とは、２以上の部分を含む任意の構成体を意味する。例えば、一方の部分がポリペプチドである場合は、他方の部分は、ポリペプチドであってもよく、それ以外の物質（例えば、糖、脂質、核酸、他の炭化水素等）であってもよい。本明細書において複合体を構成する２以上の部分は、共有結合で結合されていてもよくそれ以外の結合（例えば、水素結合、イオン結合、疎水性相互作用、ファンデルワールス力等）で結合されていてもよい。２以上の部分がポリペプチドの場合は、キメラポリペプチドとも称しうる。したがって、本明細書において「複合体」は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、糖、低分子などの分子が複数種連結してできた分子を含む。
【００４７】
本明細書において使用される場合、用語「リガンド」とは、特異的な受容体または受容体のファミリーに対する結合パートナーである。リガンドは、受容体に対する内因性のリガンドであるか、またはその代わりに、薬剤、薬剤候補、もしくは薬理学的手段のような受容体に対する合成リガンドであり得る。
【００４８】
本明細書において「ＡＧＥ分子」とは、上記ＡＧＥに含まれる任意の分子をいう。例えば、ＡＧＥとしては、Ｌｙｓ−ＡＧＥ（グルタルアルデヒド修飾リジン修飾ＡＧＥ）、グルコース修飾ＡＧＥ（Ｇ−ＡＧＥ）、リボース修飾ＡＧＥ（Ｒ−ＡＧＥ）、フルクトース修飾ＡＧＥ（Ｆ−ＡＧＥ）またはそれらの改変体あるいはそれらの複合体を挙げることができるがそれらに限定されない。
【００４９】
本明細書において「ＡＧＥｓ様活性を示す分子」とは、少なくとも上述のＡＧＥの活性（本明細書において「ＡＧＥｓ様活性」という。）の一つを有する分子をいう。そのようなＡＧＥｓ様活性としては、ＲＡＧＥに対する結合活性（リガンド活性）を挙げることができるが、それに限定されない。
【００５０】
本明細書において使用される場合、用語「ＡＧＥ受容体（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ＡＧＥ）」とは、ＲＡＧＥともいわれ、（１）配列番号２７に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）上記配列番号２７に示されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（３）上記配列番号２７に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（４）上記配列番号２７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（５）配列番号２６に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（６）上記配列番号２６に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（７）上記配列番号２６に示される核酸配列において１または数個のヌクレオチドの置換、付加および／または欠失を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（８）上記配列番号２６に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；および（９）上記配列番号２６に示される核酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド、のうちの１つである。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．９（２００４．５．１２  発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。ＲＡＧＥはまた、１９９２年に、ウシ肺から同定され、ＡＧＥと結合するイムノグロブリンスーパーファミリーに属する、分子量約３５ｋＤａのＩ型膜タンパク質（糖鎖修飾を受けた完全なＲＡＧＥは、分子量５５ｋＤａ）である。ＲＡＧＥの細胞外ドメインは、１つのＶ型イムノグロブリンドメイン、続いて、２つのＣ型イムノグロブリンドメイン（Ｃ１領域およびＣ２領域）の、３つのイムノグロブリンフォールド構造を取るドメインが結合した構造を取っている。ＲＡＧＥはまた、細胞膜１回貫通型のドメインおよび４３アミノ酸の細胞質ドメインを含む。ＲＡＧＥは、多様なクラスのリガンド（ＡＧＥ、Ｓ１００／カルグラニュリン、アンフォテリンおよびアミロイド−βペプチド）と相互作用する。Ｖドメインは、リガンド結合に必須の部位であり、細胞質ドメインは、ＲＡＧＥ媒介性細胞内シグナル伝達に必須である。ＲＡＧＥはまた、各ドメイン内でジスルフィド結合を有するので、本発明の変異ＲＡＧＥ−界面活性剤複合体は、配列番号２７のアミノ酸配列における３８位、９９位、１４４位、２０８位、２５９位および３０１位に対応するシステイン��基を保持していることが好ましい。ＲＡＧＥは、正常組織および血管系においては低レベルでしか発現されない。しかし、この受容体は、そのリガンドが蓄積した場所においてアップレギュレートされる。ＲＡＧＥの発現は、糖尿病血管系において内皮細胞、平滑筋細胞、周皮細胞、腎メサンギウム細胞および浸潤性単核食細胞で増加している。また、ＡＧＥが蓄積している動脈硬化巣のような病的部位においても、ＲＡＧＥの発現が増加している。ＡＧＥ−ＲＡＧＥ相互作用は、血管系ホメオスタシスにおいて重要な細胞の特性を変化させる。例えば、ＲＡＧＥがＡＧＥと結合した後、血管内皮細胞は、ＶＣＡＭ−１、組織因子、およびＩＬ−６の発現、ならびに高分子へのそれらの透過性を増加させる。単核食細胞において、ＲＡＧＥは、サイトカインおよび増殖因子の発現を活性化し、可溶性ＡＧＥに応じて細胞移動を誘導するのに対して、走触性は、固定リガンドで起こる。
【００５１】
本明細書では、「ＲＡＧＥリガンド認識領域」とは、ＲＡＧＥリガンドが認識する領域をいう。詳細には、ＲＡＧＥリガンド認識領域は、ＲＡＧＥの細胞外領域の全部または一部をいう。
【００５２】
本明細書において使用される場合、用語「ＲＡＧＥ様ポリペプチド」とは、「ＲＡＧＥ８」、「ｍＲＡＧＥ８」、「ＲＡＧＥ１」、「ｍＲＡＧＥ１」、「ＲＡＧＥ２」、「ｍＲＡＧＥ２」、「ＲＡＧＥ３」、「ｍＲＡＧＥ３」、「ＲＡＧＥ４」、「ｍＲＡＧＥ４」、「ＲＡＧＥ７」、「ｍＲＡＧＥ７」、「ＲＡＧＥ１４３」、「ｍＲＡＧＥ１４３」、「ＲＡＧＥ２２３」、「ｍＲＡＧＥ２２３」、「ＲＡＧＥ２２６」および「ｍＲＡＧＥ２２６」と称されるポリペプチドまたはこれらの変異体を包含する。
【００５３】
本明細書において使用される場合、用語「ＲＡＧＥ分子」とは、ＲＡＧＥ様ポリペプチドの他、それらの任意の複合体を含むことが理解される。したがって、ＲＡＧＥ分子には、ＲＡＧＥ様ポリペプチド等、例えば、ＲＡＧＥ（全長）、ＲＡＧＥ細胞外領域（配列番号２７の２２−３３２位）、ＲＡＧＥ１４３、ＲＡＧＥ２２３、ＲＡＧＥ２２６等が包含されることが理解される。
【００５４】
本明細書では、「ＲＡＧＥリガンド認識領域」を含む分子は、「ＲＡＧＥ分子」のうち全長ＲＡＧＥ以外のもの（「ＲＡＧＥ様ポリペプチド」を含む）、例えば、「ＲＡＧＥ８」、「ｍＲＡＧＥ８」、「ＲＡＧＥ１」、「ｍＲＡＧＥ１」、「ＲＡＧＥ２」、「ｍＲＡＧＥ２」、「ＲＡＧＥ３」、「ｍＲＡＧＥ３」、「ＲＡＧＥ４」、「ｍＲＡＧＥ４」、「ＲＡＧＥ７」、「ｍＲＡＧＥ７」、「ＲＡＧＥ１４３」、「ｍＲＡＧＥ１４３」、「ＲＡＧＥ２２３」、「ｍＲＡＧＥ２２３」、「ＲＡＧＥ２２６」および「ｍＲＡＧＥ２２６」、ＲＡＧＥ細胞外領域（配列番号２７の２２−３３２位）、などを挙げることができる。
【００５５】
本明細書において使用される場合、用語「ＲＡＧＥ８」および「ｍＲＡＧＥ８」とは、（１）配列番号２９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）上記配列番号２９に示されるアミノ酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；（３）上記配列番号２９に示されるアミノ酸配列において、９２位および９５位以外のアミノ酸位置で１または数個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（４）上記配列番号２９に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体を含むポリペプチド；（５）上記配列番号２９に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する変異体を含むポリペプチド；（６）配列番号２８に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（７）上記配列番号２８に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（８）上記配列番号２８に示される核酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（９）上記配列番号２８に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドであって、該コードされるアミノ酸配列において９２位および９５位のアミノ酸配列は、配列番号２９における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示す、ポリペプチド；（１０）上記配列番号２８に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；および（１１）上記配列番号２８に示される核酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドのうちの１つによって示される。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．９（２００４．５．１２  発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。
【００５６】
本明細書において使用される場合、用語「ＲＡＧＥ１」および「ｍＲＡＧＥ１」とは、（１）配列番号３１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）上記配列番号３１に示されるアミノ酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；（３）上記配列番号３１に示されるアミノ酸配列において、９２位、９５位、２０６位および２５０位以外のアミノ酸位置で１または数個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（４）上記配列番号３１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体を含むポリペプチド；（５）上記配列番号３１に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する変異体を含むポリペプチド；（６）配列番号３０に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（７）上記配列番号３０に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（８）上記配列番号３０に示される核酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（９）上記配列番号３０に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９２位、９５位、２０６位および２５０位のアミノ酸配列は、配列番号３１における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示す、ポリペプチド；（１０）上記配列番号３０に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；および（１１）上記配列番号３０に示される核酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、のうちの１つによって示される。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．９（２００４．５．１２  発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。
【００５７】
本明細書において使用される場合、用語「ＲＡＧＥ２」および「ｍＲＡＧＥ２」とは、（１）配列番号３３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）上記配列番号３３に示されるアミノ酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；（３）上記配列番号３３に示されるアミノ酸配列において、９２位、９５位および２０６位以外のアミノ酸位置で１または数個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（４）上記配列番号３３に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体を含むポリペプチド；（５）上記配列番号３３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する変異体を含むポリペプチド；（６）配列番号３２に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（７）上記配列番号３２に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（８）上記配列番号３２に示される核酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（９）上記配列番号３２に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドであって、該コードされるアミノ酸配列において９２位、９５位および２０６位のアミノ酸配列は、配列番号３３における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示す、ポリペプチド；（１０）上記配列番号３２に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；および（１１）上記配列番号３２に示される核酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、のうちの１つによって示される。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．９（２００４．５．１２  発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。
【００５８】
本明細書において使用される場合、用語「ＲＡＧＥ３」および「ｍＲＡＧＥ３」とは、（１）配列番号３５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）上記配列番号３５に示されるアミノ酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；（３）上記配列番号３５に示されるアミノ酸配列において、９２位、９５位および２０６位以外のアミノ酸位置で１または数個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（３７４）上記配列番号３５に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体を含むポリペプチド；（５）上記配列番号３５に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する変異体を含むポリペプチド；（６）配列番号３４に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（７）上記配列番号３４に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（８）上記配列番号３４に示される核酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（９）上記配列番号３４に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドであって、該コードされるアミノ酸配列において９２位、９５位および２０６位のアミノ酸配列は、配列番号３５における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示す、ポリペプチド；（１０）上記配列番号３４に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；および（１１）上記配列番号３４に示される核酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、のうちの１つによって示される。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．９（２００４．５．１２  発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。
【００５９】
本明細書において使用される場合、用語「ＲＡＧＥ４」および「ｍＲＡＧＥ４」とは、（１）配列番号３７に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）上記配列番号３７に示されるアミノ酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；（３）上記配列番号３７に示されるアミノ酸配列において、１４位、１７位、１２８位および１７２位以外のアミノ酸位置で１または数個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（４）上記配列番号３７に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体を含むポリペプチド；（５）上記配列番号３７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する変異体を含むポリペプチド；（６）配列番号３６に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（７）上記配列番号３６に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（８）上記配列番号３６に示される核酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（９）上記配列番号３６に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドであって、該コードされるアミノ酸配列において１４位、１７位、１２８位および１７２位のアミノ酸配列は、配列番号３７における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示す、ポリペプチド；（１０）上記配列番号３６に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；および（１１）上記配列番号３６に示される核酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、のうちの１つによって示される。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．９（２００４．５．１２  発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。
【００６０】
本明細書において使用される場合、用語「ＲＡＧＥ７」および「ｍＲＡＧＥ７」とは、（１）配列番号３９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）上記配列番号３９に示されるアミノ酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；（３）上記配列番号３９に示されるアミノ酸配列において、９２位および９５位以外のアミノ酸位置で１または数個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（４）上記配列番号３９に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体を含むポリペプチド；（５）上記配列番号３９に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する変異体を含むポリペプチド；（６）配列番号３８に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（７）上記配列番号３８に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（８）上記配列番号３８に示される核酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（９）上記配列番号３８に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドであって、該コードされるアミノ酸配列において９２位および９５位のアミノ酸配列は、配列番号３９における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示す、ポリペプチド；（１０）上記配列番号３８に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；および（１１）上記配列番号３８に示される核酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、のうちの１つによって示される。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．９（２００４．５．１２  発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。
【００６１】
本明細書において使用される場合、用語「ＲＡＧＥ１４３」および「ｍＲＡＧＥ１４３」とは、（１）配列番号４１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）上記配列番号４１に示されるアミノ酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；（３）上記配列番号４１に示されるアミノ酸配列において、９２位および９５位以外のアミノ酸位置で１または数個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（４）上記配列番号４１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体を含むポリペプチド；（５）上記配列番号４１に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する変異体を含むポリペプチド；（６）配列番号４０に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（７）上記配列番号４０に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（８）上記配列番号４０に示される核酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（９）上記配列番号４０に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドであって、該コードされるアミノ酸配列において９２位および９５位のアミノ酸配列は、配列番号４１における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示す、ポリペプチド；（１０）上記配列番号４０に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；および（１１）上記配列番号４０に示される核酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、のうちの１つによって示される。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．９（２００４．５．１２  発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。
【００６２】
本発明において、ＲＡＧＥ１４３を使用することが好ましくありうる。理論に束縛されることは望まないが、ＲＡＧＥ１４３は、ＲＡＧＥ１同様の認識活性を有し、かつ、分子としての安定性が優れているからである。ＲＡＧＥ１、ＲＡＧＥ２２３，ＲＡＧＥ２２６なども使用することができるが、保存中に分解が生じやすく、実験期間中に反応性が変化する可能性があることから、分解を進行させない任意の方法を用いて使用することが好ましく、あるいは長時間のアッセイにおいてはＲＡＧＥ１４３が好ましくありうる。ＲＡＧＥ１４３に限らず、ＲＡＧＥ１、ＲＡＧＥ２２３，ＲＡＧＥ２２６などでも同様の結果は得られることが理解される。
【００６３】
本明細書において使用される場合、用語「ＲＡＧＥ２２３」および「ｍＲＡＧＥ２２３」とは、（１）配列番号４３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）上記配列番号４３に示されるアミノ酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；（３）上記配列番号４３に示されるアミノ酸配列において、９２位および９５位以外のアミノ酸位置で１または数個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（４）上記配列番号４３に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体を含むポリペプチド；（５）上記配列番号４３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する変異体を含むポリペプチド；（６）配列番号４２に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（７）上記配列番号４２に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（８）上記配列番号４２に示される核酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（９）上記配列番号４２に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドであって、該コードされるアミノ酸配列において９２位および９５位のアミノ酸配列は、配列番号４３における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示す、ポリペプチド；（１０）上記配列番号４２に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；および（１１）上記配列番号４２に示される核酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、のうちの１つによって示される。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．９（２００４．５．１２  発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。
【００６４】
本明細書において使用される場合、用語「ＲＡＧＥ２２６」および「ｍＲＡＧＥ２２６」とは、（１）配列番号４５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）上記配列番号４５に示されるアミノ酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；（３）上記配列番号４５に示されるアミノ酸配列において、９２位および９５位以外のアミノ酸位置で１または数個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（４）上記配列番号４５に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体を含むポリペプチド；（５）上記配列番号４５に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する変異体を含むポリペプチド；（６）配列番号４４に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（７）上記配列番号４４に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（８）上記配列番号４４に示される核酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（９）上記配列番号４４に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドであって、該コードされるアミノ酸配列において９２位および９５位のアミノ酸配列は、配列番号４５における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示す、ポリペプチド；（１０）上記配列番号４４に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；および（１１）上記配列番号４４に示される核酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、のうちの１つによって示される。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．９（２００４．５．１２  発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。
【００６５】
なお、上記ＲＡＧＥ様ポリペプチドは、天然型ＲＡＧＥの活性が保持されている限り、非天然アミノ酸を含んでいてもよいし、アミノ酸アナログ、アミノ酸誘導体などを含んでいてもよい。
【００６６】
上記のＲＡＧＥ様ポリペプチドにおいても、分子内ジスルフィド結合を形成することは重要であるので、配列番号２７のアミノ酸配列の３８位、９９位、１４４位、２０８位、２５９位および３０１位に対応するシステインは保持されていることが好ましい。
【００６７】
本明細書において「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然アミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。
【００６８】
本明細書において、「アミノ酸」は、本発明の目的を満たす限り、天然のものでも非天然のものでもよい。
【００６９】
本明細書において「アミノ酸誘導体」または「アミノ酸アナログ」とは、天然に存在するアミノ酸とは異なるがもとのアミノ酸と同様の機能を有するものをいう。そのようなアミノ酸誘導体およびアミノ酸アナログは、当該分野において周知である。本明細書では、アミノ酸誘導体およびアミノ酸アナログは、アミノ酸と同じ生物学的機能を提供し得る限り代替として使用され得ることが理解される。
【００７０】
本明細書において「天然のアミノ酸」とは、天然のアミノ酸のＬ−異性体を意味する。天然のアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチオニン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、γ−カルボキシグルタミン酸、アルギニン、オルニチン、およびリジンである。特に示されない限り、本明細書でいう全てのアミノ酸はＬ体であるが、Ｄ体のアミノ酸を用いた形態もまた本発明の範囲内にある。
【００７１】
本明細書において「非天然アミノ酸」とは、タンパク質中で通常は天然に見出されないアミノ酸を意味する。非天然アミノ酸の例として、ノルロイシン、パラ−ニトロフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、パラ−フルオロフェニルアラニン、３−アミノ−２−ベンジルプロピオン酸、ホモアルギニンのＤ体またはＬ体およびＤ−フェニルアラニンが挙げられる。
【００７２】
本明細書において「アミノ酸アナログ」とは、アミノ酸ではないが、アミノ酸の物性および／または機能に類似する分子をいう。アミノ酸アナログとしては、例えば、エチオニン、カナバニン、２−メチルグルタミンなどが挙げられる。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様な様式で機能する化合物をいう。
【００７３】
本明細書において「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」を含む。「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体およびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体などが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。
【００７４】
本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「ヌクレオチド誘導体」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのようなヌクレオチド誘導体およびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのようなヌクレオチド誘導体およびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド型核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００７５】
本明細書において「複合分子」とは、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、糖、低分子などの分子が複数種連結してできた分子をいう。そのような複合分子としては、例えば、糖脂質、糖ペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書では、配列番号２等で例示されるアミノ酸を有するポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントであって、診断に関与する生物学的な活性性を有する限り、それぞれの改変体もしくはフラグメントなどをコードする核酸分子も使用することができる。また、そのような核酸分子を含む複合分子も使用することができる。
【００７６】
本明細書において「核酸」はまた、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換可能に使用される。特定の核酸配列はまた、「スプライス改変体」を包含する。同様に、核酸によりコードされた特定のタンパク質は、その核酸のスプライス改変体によりコードされる任意のタンパク質を暗黙に包含する。その名が示唆するように「スプライス改変体」は、遺伝子のオルタナティブスプライシングの産物である。転写後、最初の核酸転写物は、異なる（別の）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプライスされ得る。スプライス改変体の産生機構は変化するが、エキソンのオルタナティブスプライシングを含む。読み過し転写により同じ核酸に由来する別のポリペプチドもまた、この定義に包含される。スプライシング反応の任意の産物（組換え形態のスプライス産物を含む）がこの定義に含まれる。
【００７７】
本明細書において「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常染色体上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定する遺伝子を構造遺伝子といい、その発現を左右する遺伝子を調節遺伝子という。本明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」ならびに／あるいは「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」をさすことがある。
【００７８】
本明細書において遺伝子の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。
【００７９】
アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された１文字コードにより言及され得る。
【００８０】
本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。同一性の検索は例えば、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．９（２００４．５．１２  発行）を用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記ＢＬＡＳＴを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメーターの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。
【００８１】
本明細書において「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  ＰＲａｃ１ｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）などの実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。従って、本発明において使用されるポリペプチド（例えば、トランスサイレチンなど）には、本発明で特に記載されたポリペプチドをコードする核酸分子に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドも包含される。
【００８２】
本明細書において「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、配列番号２、４、６などで表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００８３】
ＤＮＡ二重鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基の組成、長さおよび塩基対不一致の程度が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、当業者によって調整され得、これらの変数を適用させ、そして異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成するのを可能にする。完全に一致したＤＮＡ二重鎖の融解温度は、以下の式によって概算され得る。
Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−６００／Ｎ−０．７２（％ホルムアミド）
ここで、Ｎは、形成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃは、ハイブリッド中の（グアニン＋シトシン）塩基のパーセンテージである。不完全に一致したハイブリッドに関して、融解温度は、各１％不一致（ミスマッチ）に対して約１℃ずつ減少する。
【００８４】
本明細書において「精製された」生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたものをいう。したがって、通常、精製された生物学的因子におけるその生物学的因子の純度は、その生物学的因子が通常存在する状態よりも高い（すなわち濃縮されている）。
【００８５】
本明細書中で使用される用語「精製された」は、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、よりさらに好ましくは少なくとも９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも９８重量％の、同型の生物学的因子が存在することを意味する。
【００８６】
本明細書において「対応する」アミノ酸または核酸とは、あるポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子において、比較の基準となるポリペプチドまたはポリヌクレオチドにおける所定のアミノ酸またはヌクレオチドと同様の作用を有するか、または有することが予測されるアミノ酸またはヌクレオチドをいい、特に酵素分子にあっては、活性部位中の同様の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をするアミノ酸をいう。例えば、アンチセンス分子であれば、そのアンチセンス分子の特定の部分に対応するオルソログにおける同様の部分であり得る。対応するアミノ酸は、例えば、システイン化、グルタチオン化、Ｓ−Ｓ結合形成、酸化（例えば、メチオニン側鎖の酸化）、ホルミル化、アセチル化、リン酸化、糖鎖付加、ミリスチル化などがされる特定のアミノ酸であり得る。あるいは、対応するアミノ酸は、二量体化を担うアミノ酸であり得る。このような「対応する」アミノ酸または核酸は、一定範囲にわたる領域またはドメインであってもよい。従って、そのような場合、本明細書において「対応する」領域またはドメインと称される。
【００８７】
本明細書において「対応する」遺伝子（例えば、ポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子）とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子（例えば、ポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子）をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子に対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。従って、マウス、ラットのトランスサイレチンは、それぞれ、ヒトにおいて、対応するトランスサイレチンを見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。したがって、例えば、ある動物（例えば、マウス）における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子（例えば、アポリポタンパク質ＣＩＩ，アポリポタンパク質ＣＩＩＩ，トランスサイレチン、血清アルブミン）は、の配列をクエリ配列として用いてその動物（例えばヒト、ラット）の配列データベースを検索することによって見出すことができる。
【００８８】
本明細書において「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、このようなフラグメントは、例えば、全長のものがマーカーとして機能する場合、そのフラグメント自体もまたマーカーとしての機能を有する限り、本発明の範囲内に入ることが理解される。
【００８９】
本明細書中で使用される「異種」とは、異なる配列または対応しない配列、あるいは異なる種由来の配列である、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列をいう。例えば、ヒトのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列は、マウスのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に対して異種であり、そしてヒトＬＯＸ−１の核酸配列またはアミノ酸配列は、ヒトアルブミンのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に対して異種である。
【００９０】
本明細書において「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能を有する限り、上限または下限としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば上下１０％）のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。本明細書において有用なフラグメントの長さは、そのフラグメントの基準となる全長タンパク質の機能のうち少なくとも１つの機能が保持されているかどうかによって決定され得る。
【００９１】
本明細書において「生物学的機能」とは、ある遺伝子またはそれに関する核酸分子もしくはポリペプチドについて言及するとき、その遺伝子、核酸分子またはポリペプチドが生体内において有し得る特定の機能をいい、これには、例えば、特異的な抗体の生成、酵素活性、抵抗性の付与等を挙げることができるがそれらに限定されない。本発明においては、例えば、ヘモペキシン等のマーカーがＲＡＧＥを認識する機能などを挙げることができるがそれらに限定されない。本明細書において、生物学的機能は、「生物学的活性」によって発揮され得る。本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリヌクレオチド、タンパク質など）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能（例えば、転写促進活性）を発揮する活性が包含され、例えば、ある分子との相互作用によって別の分子が活性化または不活化される活性も包含される。２つの因子が相互作用する場合、その生物学的活性は、その二分子との間の結合およびそれによって生じる生物学的変化、例えば、一つの分子を抗体を用いて沈降させたときに他の分子も共沈するとき、２分子は結合していると考えられる。したがって、そのような共沈を見ることが一つの判断手法として挙げられる。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。そのような生物学的活性は、当該分野において周知の技術によって測定することができる。
【００９２】
したがって、「活性」は、結合（直接的または間接的のいずれか）を示すかまたは明らかにするか；応答に影響する（すなわち、いくらかの曝露または刺激に応答する測定可能な影響を有する）、種々の測定可能な指標をいい、例えば、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに直接結合する化合物の親和性、または例えば、いくつかの刺激後または事象後の上流または下流のタンパク質の量あるいは他の類似の機能の尺度が、挙げられる。
【００９３】
本明細書において「マーカー（物質）」とは、ある状態（例えば、糖尿病、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症等の糖尿病合併症などの疾患）に罹患しているかまたはその危険性があるかどうかを追跡する示標となる物質をいう。このようなマーカーとしては、遺伝子、遺伝子産物、代謝物質、酵素などを挙げることができる。本発明において、ある状態（例えば、糖尿病、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症等の糖尿病合併症などの疾患）についての診断、予備的検出、予測または事前診断は、その状態に関連するマーカーに特異的な薬剤、剤、因子または手段、あるいはそれらを含む組成物、キットまたはシステム等を用いて実現することができる。
【００９４】
本明細書において、「遺伝子産物」とは、遺伝子によってコードされるタンパク質またはｍＲＮＡをいう。本明細書では、糖代謝に直接関連しない遺伝子産物（すなわち、インスリンなどの糖代謝に関連しないタンパク質など）が糖尿病の指標として使用可能であることが見出された。
【００９５】
本明細書において「被験体」とは、本発明の診断または検出等の対象となる生物（例えば、ヒト）をいう。
【００９６】
本明細書において「サンプル」とは、被験体等から得られた任意の物質をいい、例えば、体液（血液、唾液、尿、涙液等）が含まれる。好ましくは血液、尿、涙液が使用され、マーカーによって、特異性に相違があるが、当業者は本明細書の記載をもとに適宜好ましいサンプルを選択することができる。
【００９７】
本明細書において「薬剤」、「剤」または「因子」（いずれも英語ではａｇｅｎｔに相当する）は、広義には、交換可能に使用され、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素（例えば、光、放射能、熱、電気などのエネルギー）でもあってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）など）、これらの複合分子が挙げられるがそれらに限定されない。ポリヌクレオチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリヌクレオチドの配列に対して一定の配列相同性を（例えば、７０％以上の配列同一性）もって相補性を有するポリヌクレオチド、プロモーター領域に結合する転写因子のようなポリペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。ポリペプチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリペプチドに対して特異的に指向された抗体またはその誘導体あるいはその類似物（例えば、単鎖抗体）、そのポリペプチドがレセプターまたはリガンドである場合の特異的なリガンドまたはレセプター、そのポリペプチドが酵素である場合、その基質などが挙げられるがそれらに限定されない。
【００９８】
本明細書において「相互作用」とは、２つの物質についていうとき、一方の物質と他方の物質との間で力（例えば、分子間力（ファンデルワールス力）、水素結合、疎水性相互作用など）を及ぼしあうこという。通常、相互作用をした２つの物質は、会合または結合している状態にある。
【００９９】
したがって、本明細書においてポリヌクレオチドまたはポリペプチドなどの生物学的因子に対して「特異的に相互作用する因子」とは、そのポリヌクレオチドまたはそのポリペプチドなどの生物学的因子に対する親和性が、他の無関連の（特に、同一性が３０％未満の）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対する親和性よりも、代表的には同等またはより高いか、好ましくは有意に（例えば、統計学的に有意に）高いものを包含する。そのような親和性は、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ、結合アッセイなどによって測定することができる。
【０１００】
本明細書において第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」とは、第一の物質または因子が、第二の物質または因子に対して、第二の物質または因子以外の物質または因子（特に、第二の物質または因子を含むサンプル中に存在する他の物質または因子）に対するよりも高い親和性で相互作用することをいう。物質または因子について特異的な相互作用としては、例えば、リガンド−レセプター反応、核酸におけるハイブリダイゼーション、タンパク質における抗原抗体反応、酵素−基質反応など、核酸およびタンパク質の両方が関係する場合、転写因子とその転写因子の結合部位との反応など、タンパク質−脂質相互作用、核酸−脂質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。従って、物質または因子がともに核酸である場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」ことには、第一の物質または因子が、第二の物質または因子に対して少なくとも一部に相補性を有することが包含される。また例えば、物質または因子がともにタンパク質である場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」こととしては、例えば、抗原抗体反応による相互作用、レセプター−リガンド反応による相互作用、酵素−基質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。２種類の物質または因子がタンパク質および核酸を含む場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」ことには、転写因子と、その転写因子が対象とする核酸分子の結合領域との間の相互作用が包含される。
【０１０１】
本明細書において「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、キメラ抗体、および抗イディオタイプ抗体、ならびにそれらの断片、例えばＦ（ａｂ’）２およびＦａｂ断片、ならびにその他の組換えにより生産された結合体を含む。さらにこのような抗体を、酵素、例えばアルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、αガラクトシダーゼなど、に共有結合させまたは組換えにより融合させてよい。
【０１０２】
本明細書において「手段」とは、ある目的を達成する任意の道具となり得るものをいい、特に、本明細書では、「選択的に認識する手段」とは、ある対象を他のものとは異なって認識することができる手段をいう。
【０１０３】
本明細書中で使用される用語「結合」は、２つのタンパク質もしくは化合物または関連するタンパク質もしくは化合物の間、あるいはそれらの組み合わせの間での、物理的相互作用または化学的相互作用を意味する。結合には、イオン結合、非イオン結合、水素結合、ファンデルワールス結合、疎水性相互作用などが含まれる。物理的相互作用（結合）は、直接的または間接的であり得、間接的なものは、別のタンパク質または化合物の効果を介するかまたは起因する。直接的な結合とは、別のタンパク質または化合物の効果を介してもまたはそれらに起因しても起こらず、他の実質的な化学中間体を伴わない、相互作用をいう。
【０１０４】
本明細書中で使用される「接触（させる）」とは、化合物を、直接的または間接的のいずれかで、本発明のマーカー、リガント等として機能しうるポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して物理的に近接させることを意味する。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、多くの緩衝液、塩、溶液などに存在させることができる。接触とは、核酸分子またはそのフラグメントをコードするポリペプチドを含む、例えば、ビーカー、マイクロタイタープレート、細胞培養フラスコまたはマイクロアレイ（例えば、遺伝子チップ）などに化合物を置くことが挙げられる。
【０１０５】
本明細書において「標識」とは、目的となる分子または物質を他から識別するための存在（たとえば、物質、エネルギー、電磁波など）をいう。そのような標識方法としては、ＲＩ（ラジオアイソトープ）法、蛍光法、ビオチン法、化学発光法等を挙げることができる。本発明のマーカーまたはそれを捕捉する因子または手段を複数、蛍光法によって標識する場合には、蛍光発光極大波長が互いに異なる蛍光物質によって標識を行う。蛍光発光極大波長の差は、１０ｎｍ以上であることが好ましい。リガンドを標識する場合、機能に影響を与えないものならば何れも用いることができるが、蛍光物質としては、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒが望ましい。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒは、クマリン、ローダミン、フルオレセイン、シアニンなどを修飾して得られた水溶性の蛍光色素であり、広範囲の蛍光波長に対応したシリーズであり、他の該当波長の蛍光色素に比べ、非常に安定で、明るく、またｐＨ感受性が低い。蛍光極大波長が１０ｎｍ以上ある蛍光色素の組み合わせとしては、Ａｌｅｘａ５５５とＡｌｅｘａ  ６３３の組み合わせ、Ａｌｅｘａ４８８とＡｌｅｘａ５５５の組み合わせ等を挙げることができる。核酸を標識する場合は、その塩基部分と結合できるものであれば何れも用いることができるが、シアニン色素（例えば、ＣｙＤｙｅＴＭシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試薬、Ｎ−アセトキシ−Ｎ2−アセチルアミノフルオレン（ＡＡＦ）、ＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨウ素誘導体）等を使用することが好ましい。蛍光発光極大波長の差が１０ｎｍ以上である蛍光物質としては、例えば、Ｃｙ５とローダミン６Ｇ試薬との組み合わせ、Ｃｙ３とフルオレセインとの組み合わせ、ローダミン６Ｇ試薬とフルオレセインとの組み合わせ等を挙げることができる。本発明では、このような標識を利用して、使用される検出手段に検出され得るように目的とする対象を改変することができる。そのような改変は、当該分野において公知であり、当業者は標識におよび目的とする対象に応じて適宜そのような方法を実施することができる。
【０１０６】
本明細書において使用される場合、用語「タグ」とは、受容体−リガンドのような特異的認識機構により分子を選別するための物質、より具体的には、特定の物質を結合するための結合パートナーの役割を果たす物質（例えば、ビオチン−アビジン、ビオチン−ストレプトアビジンのような関係を有する）をいい、「標識」の範疇に含まれうる。よって、例えば、タグが結合した特定の物質は、タグ配列の結合パートナーを結合させた基材を接触させることで、この特定の物質を選別することができる。このようなタグまたは標識は、当該分野で周知である。代表的なタグ配列としては、ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ、ＨＡ、Ａｖｉタグなどが挙げられるが、これらに限定されない。本発明のマーカーまたはマーカー捕捉分子にはこのようなタグを結合させてもよい。
【０１０７】
本明細書において「診断」とは、被験体における疾患、障害、状態などに関連する種々のパラメータを同定し、そのような疾患、障害、状態の現状または未来を判定することをいう。本発明の方法、装置、システムを用いることによって、体内の状態を調べることができ、そのような情報を用いて、被験体における疾患、障害、状態、投与すべき処置または予防のための処方物または方法などの種々のパラメータを選定することができる。本明細書において、狭義には、「診断」は、現状を診断することをいうが、広義には「予測診断」「事前診断」等を含む。早期の診断は「早期診断」ということもある。
【０１０８】
本明細書において特に、「予測診断」または「事前診断」とは、交換可能に使用され、糖尿病、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症等の糖尿病合併症等について言及する場合、糖尿病、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症等の糖尿病合併症等の発症前の段階を検出することをいい、将来の発症リスクを判定すること、糖尿病、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症等の糖尿病合併症等の予防を目的として糖尿病に罹患するおそれの有無を判定することを含む。本発明の方法、キット、組成物、検出剤、診断剤、システム等を用いることによって、体内の状態を事前に調べることができ、そのような情報を用いて、被験体における疾患、障害、状態、投与すべき処置または予防のための処方物または方法などの種々のパラメータを選定することができる。本明細書では、「予測診断」または「事前診断」は、他の従来の方法では診断できない段階での診断をも包含することから、「早期診断」の概念と一部重なって用いられる。
【０１０９】
本発明の診断方法は、原則として、身体から出たものを利用することができることから、医師などの医療従事者の手を離れて実施することができることから、産業上有用である。本明細書において、医師などの医療従事者の手を離れて実施することができることを明確にするために、特に「予測診断、事前診断もしくは診断」を「支援」すると称することがある。
【０１１０】
本明細書において使用される場合、用語「検出剤」とは、広義には、目的の物質（例えば、変性ＬＤＬ、ＡＧＥなど）を検出できるあらゆる因子をいう。
【０１１１】
本明細書において使用される場合、用語「診断剤」とは、広義には、目的の状態（例えば、疾患など）を診断できるあらゆる因子をいう。
【０１１２】
本明細書において「治療」とは、ある疾患または障害について、そのような状態になった場合に、そのような疾患または障害の悪化を防止、好ましくは、現状維持、より好ましくは、軽減、さらに好ましくは消退させることをいう。
【０１１３】
本明細書において「予防」とは、ある疾患または障害について、そのような状態になる前に、そのような状態にならないようにすることをいう。本発明の予測診断または事前診断を行うことによって、糖尿病、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症等の糖尿病合併症等の予防をするか、あるいは予防のための対策を講じることができる。
【０１１４】
本明細書において使用される場合、用語「固相」とは、本明細書中において「基板」および「基材」と互換的に使用され、本発明のデバイスが構築される材料をいう。抗体のような分子が固定され得る平面状の支持体をいう。本発明において表面プラズモン共鳴の原理を用いて検出する場合、固相は、金、銀またはアルミニウムを含む金属薄膜を片面に持つガラス基板の基材であることが好ましい。本発明において酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）のような機構を使用する場合、一般に、固相（基材）としては、マイクロタイタープレートが使用される。本発明において水晶発振子マイクロバランスの原理を用いて検出する場合は、周波数変換素子（例えば水晶発振子、表面弾性波素子）を固相として用い、直接受容体を結合させる。水晶板の片面はシリコーンで被覆し、もう一方の面は金電極を施したものを固相として用いる。基板の材料としては、共有結合かまたは非共有結合のいずれかで、本発明において使用される生体分子に結合する特性を有するかまたはそのような特性を有するように誘導体化され得る、任意の固体材料が挙げられる。適切な基材としては、ビーズ、金粒子、半導体ナノ粒子（例えば、ＣｄＴｅナノ粒子、ＣｄＳｅナノ粒子、ＧａＮナノ粒子、ＺｎＳナノ粒子、ＩｎＰナノ粒子など）、シリカナノ粒子、ポリスチレンナノ粒子、アクリル系ナノ粒子、ラテックスナノ粒子、カーボンナノ粒子、プレート（例えば、マイクロタイタープレート）、試験管、チップ、磁性粒子、膜、繊維、スライドガラス、金属薄膜、フィルター、チューブ、ボール、ダイアモンド様炭素被膜ステンレスなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１５】
固相および基板として使用するためのそのような材料としては、固体表面を形成し得る任意の材料が使用され得るが、例えば、ガラス、シリカ、シリコーン、セラミック、二酸化珪素、プラスチック、金属（合金も含まれる）、天然および合成のポリマー（例えば、ポリスチレン、セルロース、アミロース、キトサン、デキストラン、およびナイロン）以下が挙げられるがそれらに限定されない。基板は、複数の異なる材料の層から形成されていてもよい。例えば、ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化珪素、酸化珪素、窒化珪素などの無機絶縁材料を使用できる。また、ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイド、ポリスルホン等の有機材料を用いることができる。本発明においてはまた、ナイロン膜、ニトロセルロース膜、ＰＶＤＦ膜など、ブロッティングに使用される膜を用いることもできる。高密度のものを解析する場合は、ガラスなど硬度のあるものを材料として使用することが好ましい。基板として好ましい材質は、測定機器などの種々のパラメータによって変動し、当業者は、上述のような種々の材料から適切なものを適宜選択することができる。
【０１１６】
本明細書において「チップ」は、多様の機能をもち、システムの一部となる超小型集積回路をいう。本明細書において、受容体を固定化した固相を、受容体チップおよび／または受容体マイクロチップと呼ぶ。
【０１１７】
本明細書において使用される場合、用語「乾燥形態」とは、本発明で使用される成分を含む検出剤、デバイス、診断剤などにおいて、実質的に水分含量が低下している状態であることをいう。一般的には、「乾燥状態」は、風乾、減圧乾燥などの当該分野で周知の技術を用いて容易に達成することができる。
【０１１８】
本明細書において「抗原」（ａｎｔｉｇｅｎ）とは、抗体分子によって特異的に結合され得る任意の基質をいう。本明細書において「免疫原」（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ）とは、抗原特異的免疫応答を生じるリンパ球活性化を開始し得る抗原をいう。
【０１１９】
本明細書において「エピトープ」または「抗原決定基」とは、抗体またはリンパ球レセプターが結合する抗原分子中の部位をいう。エピトープを決定する方法は、当該分野において周知であり、そのようなエピトープは、核酸またはアミノ酸の一次配列が提供されると、当業者はそのような周知慣用技術を用いて決定することができる。
【０１２０】
本明細書において使用される抗体は、擬陽性が減じられるかぎり、どのような特異性の抗体を用いても良いことが理解される。従って、本発明において用いられる抗体は、ポリクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体であってもよい。
【０１２１】
本明細書中で使用される「化合物」は、任意の識別可能な化学物質または分子を意味し、これらには、低分子、ペプチド、タンパク質、糖、ヌクレオチド、または核酸が挙げられるが、これらに限定されず、そしてこのような化合物は、天然物または合成物であり得る。
【０１２２】
本明細書において「有機低分子」とは、有機分子であって、比較的分子量が小さなものをいう。通常有機低分子は、分子量が約１０００以下のものをいうが、それ以上のものであってもよい。有機低分子は、通常当該分野において公知の方法を用いるかそれらを組み合わせて合成することができる。そのような有機低分子は、生物に生産させてもよい。有機低分子としては、例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１２３】
本明細書において「リガンド」とは、あるタンパク質に特異的に結合する物質をいう。例えば，細胞膜上に存在する種々のレセプタータンパク質分子と特異的に結合するレクチン、抗原、抗体、ホルモン、神経伝達物質などがリガンドとして挙げられる。
【０１２４】
本明細書ではアミノ酸および塩基配列の類似性、相同性および同一性の比較は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。同一性の検索は例えば、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．９（２００４．５．１２  発行）を用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記ＢＬＡＳＴを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメータの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。
【０１２５】
本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」とは、その遺伝子などがインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されてｍＲＮＡが作製されることもまた発現の一態様であり得る。より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたもの（本明細書にいう誘導体）であり得る。
【０１２６】
本明細書においてポリヌクレオチドまたはポリペプチド発現の「検出」または「定量」は、例えば、ｍＲＮＡの測定および免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法またはＰＣＲ法などが例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法としては、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法などが例示される。アレイ（例えば、ＤＮＡアレイ、プロテインアレイ）を用いた遺伝子解析方法によっても行われ得る。ＤＮＡアレイについては、（秀潤社編、細胞工学別冊「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」）に広く概説されている。プロテインアレイについては、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．２００２ Ｄｅｃ；３２ Ｓｕｐｐｌ：５２６−３２に詳述されている。遺伝子発現の分析法としては、上述に加えて、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＡＣＥ法、ＳＳＣＰ法、免疫沈降法、ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステム、インビトロ翻訳などが挙げられるがそれらに限定されない。そのようなさらなる分析方法は、例えば、ゲノム解析実験法・中村祐輔ラボ・マニュアル、編集・中村祐輔 羊土社（２００２）などに記載されており、本明細書においてそれらの記載はすべて参考として援用される。
【０１２７】
本明細書において「発現量」とは、目的の細胞、組織などにおいて、ポリペプチドまたはｍＲＮＡ等が発現される量をいう。そのような発現量としては、本発明の抗体を用いてＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などの免疫学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明ポリペプチドのタンパク質レベルでの発現量、またはノーザンブロット法、ドットブロット法、ＰＣＲ法などの分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明において使用されるポリペプチドのｍＲＮＡレベルでの発現量が挙げられる。「発現量の変化」とは、上記免疫学的測定方法または分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明において使用されるポリペプチドのタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルでの発現量が増加あるいは減少することを意味する。あるマーカーの発現量を測定することによって、マーカーに基づく種々の検出または診断を行うことができる。
【０１２８】
本明細書中で使用される用語「結合」は、２つのタンパク質もしくは化合物または関連するタンパク質もしくは化合物の間、あるいはそれらの組み合わせの間での、物理的相互作用または化学的相互作用を意味する。結合には、イオン結合、非イオン結合、水素結合、ファンデルワールス結合、疎水性相互作用などが含まれる。物理的相互作用（結合）は、直接的または間接的であり得、間接的なものは、別のタンパク質または化合物の効果を介するかまたは起因する。直接的な結合とは、別のタンパク質または化合物の効果を介してもまたはそれらに起因しても起こらず、他の実質的な化学中間体を伴わない、相互作用をいう。
【０１２９】
本明細書中で使用される用語「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」または「改変する（ｍｏｄｉｆｙ）」は、特定の活性、転写物またはタンパク質の量、質または効果における増加または減少あるいは維持を意味する。
【０１３０】
本明細書において、活性、発現産物（例えば、タンパク質、転写物（ＲＮＡなど））の「減少」または「抑制」あるいはその類義語は、特定の活性、転写物またはタンパク質の量、質または効果における減少、または減少させる活性をいう。
【０１３１】
本明細書において、活性、発現産物（例えば、タンパク質、転写物（ＲＮＡなど））の「増加」または「活性化」あるいはその類義語は、特定の活性、転写物またはタンパク質の量、質または効果における増加または増加させる活性をいう。
【０１３２】
したがって、本発明のマーカーの減少、抑制、増加または活性化等の調節能力を指標に、糖尿病、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症等の糖尿病合併症等の調節を行う薬剤を検出、スクリーニングすることができることが理解される。
【０１３３】
本明細書において「プローブ」とは、インビトロおよび／またはインビボなどのスクリーニングなどの生物学的実験において用いられる、検索の手段となる物質をいい、例えば、特定の塩基配列を含む核酸分子または特定のアミノ酸配列を含むペプチド、特異的抗体またはその断片などが挙げられるがそれに限定されない。本明細書においてプローブは、マーカー検出手段としてもちいられる。
【０１３４】
通常プローブとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相同なまたは相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましくは少なくとも１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは少なくとも１１の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１２の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１３の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１４の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも３０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも４０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも５０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、少なくとも９０％相同な、少なくとも９５％相同な核酸配列が含まれる。
【０１３５】
本明細書において「検索」とは、電子的にまたは生物学的あるいは他の方法により、ある核酸塩基配列を利用して、特定の機能および／または性質を有する他の核酸塩基配列を見出すことをいう。電子的な検索としては、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８５：２４４４−２４４８（１９８８））、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ法（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７（１９８１））、およびＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ法（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０））などが挙げられるがそれらに限定されない。生物学的な検索としては、ストリンジェントハイブリダイゼーション、ゲノムＤＮＡをナイロンメンブレン等に貼り付けたマクロアレイまたはガラス板に貼り付けたマイクロアレイ（マイクロアレイアッセイ）、ＰＣＲおよびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において、本発明において使用される遺伝子には、このような電子的検索、生物学的検索によって同定された対応遺伝子も含まれるべきであることが意図される。
【０１３６】
本明細書における「プライマー」とは、高分子合成酵素反応において、合成される高分子化合物の反応の開始に必要な物質をいう。核酸分子の合成反応では、合成されるべき高分子化合物の一部の配列に相補的な核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなど）が用いられ得る。本明細書においてプライマーはマーカー検出手段として使用され得る。
【０１３７】
通常プライマーとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましくは少なくとも１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは少なくとも１１の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１２の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１３の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１４の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１６の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１７の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１８の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１９の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも３０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも４０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、少なくとも９０％相同な、少なくとも９５％相同な核酸配列が含まれる。プライマーとして適切な配列は、合成（増幅）が意図される配列の性質によって変動し得るが、当業者は、意図される配列に応じて適宜プライマーを設計することができる。そのようなプライマーの設計は当該分野において周知であり、手動でおこなってもよくコンピュータプログラム（例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ，ＰｒｉｍｅｒＳｅｌｅｃｔ，ＤＮＡＳｔａｒ）を用いて行ってもよい。
【０１３８】
本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリペプチドまたはタンパク質）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能を発揮する活性が包含される。例えば、ある因子がリガンドである場合、その生物学的活性は、そのリガンドが対応するレセプターに結合する活性を包含する。
【０１３９】
本明細書において「キット」とは、通常２つ以上の区画に分けて、提供されるべき部分（例えば、抗体、標識など）が提供されるユニットをいう。混合されて提供されるべきでなく、使用直前に混合して使用することが好ましいような組成物の提供を目的とするときに、このキットの形態は好ましい。そのようなキットは、好ましくは、提供される部分（例えば、試薬をどのように処理すべきかを記載する指示書または説明書を備えていることが有利である。本明細書においてキットが試薬キットとして使用される場合、キットには、通常、抗体の使い方などを記載した指示書などが含まれる。
【０１４０】
本明細書において「指示書」は、本発明を使用する方法を医師または他の使用者に対する説明を記載したものである。この指示書は、本発明の検出方法、診断薬の使い方、または医薬などを投与することを指示する文言が記載されている。また、指示書には、投与部位として、骨格筋に投与（例えば、注射などによる）することを指示する文言が記載されていてもよい。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（ＦＤＡ）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ  ｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ、電子メール）のような形態でも提供され得る。
【０１４１】
本明細書において「被験体」とは、本発明の検出、診断または処置の対象となる生物をいい、ヒトでは「患者」ともいわれる。被験体は好ましくは、ヒトであり得る。
【０１４２】
本明細書において「生体内」または「インビボ」（ｉｎ  ｖｉｖｏ）とは、生体の内部をいう。特定の文脈において、「生体内」は、目的とする物質が配置されるべき位置をいう。
【０１４３】
本明細書において「インビトロ」とは、種々の研究目的のために生体の一部分が「生体外に」（例えば、試験管内に）摘出または遊離されている状態をいう。インビボと対照をなす用語である。
【０１４４】
本明細書において「エキソビボ」とは、ある処置について、体外で行われるがその後体内に戻されることが意図される場合、一連の動作をエキソビボという。
【０１４５】
本発明の体外診断薬等の医薬等としての処方手順は、当該分野において公知であり、例えば、日本薬局方、米国薬局方、他の国の薬局方などに記載されている。従って、当業者は、本明細書の記載があれば、過度な実験を行うことなく、使用すべき量を決定することができる。
【０１４６】
（好ましい実施形態）
以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。
【０１４７】
（新規ＡＧＥ受容体（ＲＡＧＥ）のリガンド）
１つの局面において、本発明は、ナプシンＡ（ＮＰ−Ａ）、ナプシンＡ前駆体、トランスフェリン、ヘモペキシン（ＨＰＸ）、ヘモペキシン関連物質、トランスサイレチン（ＴＴＲ）、およびキニノーゲン（ＫＮＮ）からなる群より選択される分子を含む、ＡＧＥ受容体（ＲＡＧＥ）のリガンドを提供する。
【０１４８】
このほか、本発明では、以下のＡＧＥ受容体（ＲＡＧＥ）のリガンドを提供する。なお、以下の記載では、糖尿病性腎症における発症群特有または健常群特有の分子で分類する。
・糖尿病性腎症発症群特有の分子：ヘモペキシン、ヘモペキシン前駆体（プロタンパク質）、Ｐｆａ１、Ｉｇ  κ鎖、ナプシンＡ（ＮＰ−Ａ）、ナプシンＡ前駆体（プロタンパク質）、トランスフェリン（ナプシンＡ，ナプシンＡ前駆体、トランスフェリンは、特に尿において特有であることが見出された。他方、ヘモペキシン、ヘモペキシン前駆体（プロタンパク質）、Ｐｆａ１、Ｉｇ  κ鎖等は、血液（血清）に特有であることが見出された。）
・健常群特有の分子：第ＸＩＩ因子、Ｆ１２タンパク質、キニノーゲン−１  アイソフォーム１、キニノーゲン−１アイソフォーム−２、キニノーゲン−１  アイソフォーム３、キニノーゲン、プロテインＳ１００−Ａ８、血漿カリクレイン前駆体、血漿カリクレイン、β−２−グロビン，ヘモグロビンサブユニットβ−２、β−グロビン，α−１−グロビン、トランスサイレチン、補体Ｃ３。
【０１４９】
これらの分子は、本発明において詳細に言及したヘモペキシン、キニノーゲン等と同様の実施形態で用いることができることが理解され、これらの技術事項は他の分子においても応用しうることが理解される。
【０１５０】
（ＲＡＧＥシグナル伝達調節剤）
本発明は、本発明のＡＧＥ受容体（ＲＡＧＥ）のリガンドを少なくとも１種含むＲＡＧＥシグナル伝達調節剤を提供する。例えば、ナプシンＡ（ＮＰ−Ａ）、ナプシンＡ前駆体、トランスフェリン、ヘモペキシン（ＨＰＸ）、ヘモペキシン関連物質、トランスサイレチン（ＴＴＲ）、およびキニノーゲン（ＫＮＮ）からなる群より選択される分子を少なくとも１種含むＲＡＧＥシグナル伝達調節剤が本発明によって提供される。
【０１５１】
１つの実施形態では、前記リガンドは、ＮＰ−Ａ、ＨＰＸ、ＴＴＲまたはＫＮＮを少なくとも１種含む。
【０１５２】
１つの実施形態では、前記ＲＡＧＥシグナル伝達の調節はＮＦκＢ活性化を含む。
【０１５３】
１つの実施形態では、前記ＲＡＧＥシグナル伝達調節剤は、遅延型である。本発明のＲＡＧＥシグナル伝達調節剤は、従来５分後でのリン酸化極大が見られていたものが、15分後のリン酸化極大が見られたことにより、比較的遅延されたリン酸化が必要とされる実験系の薬剤または試薬として用いることができる。
【０１５４】
１つの実施形態では、本発明で同定されたＡＧＥ、今回糖尿病性腎症発症群に特有な分子として同定されたＨＰＸ、ＮＰ−Ａ等、健常群に特有な分子として同定されたＫＮＮ、ＴＴＲ等のＲＡＧＥへの親和性の違いを活用して、ＲＡＧＥへの結合の強さを基準にしたＲＡＧＥ阻害剤の評価系を設計することができる。
【０１５５】
（マーカー）
１つの局面において、本発明は、ナプシンＡ（ＮＰ−Ａ）、ナプシンＡ前駆体、ヘモペキシンおよびヘモペキシン関連物質からなる群より選択される少なくとも１つの分子を含む糖尿病および／または糖尿病血管障害および／または糖尿病腎症のマーカーを提供する。
【０１５６】
１つの実施形態では、前記マーカーはＮＰ−Ａおよび／またはナプシンＡ前駆体を含む尿中マーカーである。
【０１５７】
１つの実施形態では、前記マーカーはヘモペキシンおよび／またはヘモペキシン関連物質を含む血中マーカーである。
【０１５８】
１つの実施形態では、前記ヘモペキシンおよび／またはヘモペキシン関連物質は、トランスサイレチン（ＴＴＲ）および／またはキニノーゲン（ＫＫＮ）と組み合わせて使用される。
【０１５９】
このほか、本発明では、以下のマーカーを提供する。なお、以下の記載では、糖尿病性腎症における発症群特有または健常群特有の分子で分類する。
・糖尿病性腎症発症群特有の分子：ヘモペキシン、ヘモペキシン前駆体（プロタンパク質）、Ｐｆａ１、Ｉｇ  κ鎖、ナプシンＡ（ＮＰ−Ａ）、ナプシンＡ前駆体（プロタンパク質）、トランスフェリン
・健常群特有の分子：第ＸＩＩ因子、Ｆ１２タンパク質、キニノーゲン−１  アイソフォーム１、キニノーゲン−１アイソフォーム−２、キニノーゲン−１  アイソフォーム３、キニノーゲン、プロテインＳ１００−Ａ８、血漿カリクレイン前駆体、血漿カリクレイン、β−２−グロビン，ヘモグロビンサブユニットβ−２、β−グロビン，α−１−グロビン、トランスサイレチン、補体Ｃ３。
【０１６０】
これらの本発明のマーカーは、それら同士を組み合わせもよく、および／あるいは、従来から知られているＨｂＡ１ｃやＣＰＲ等の臨床マーカーを組み合わせてもよい。
【０１６１】
（ナプシンＡ（ＮＰ−Ａ）、ナプシンＡ前駆体、トランスフェリン、ヘモペキシン（ＨＰＸ）、ヘモペキシン関連物質、トランスサイレチン（ＴＴＲ）、およびキニノーゲン（ＫＮＮ）等の核酸ならびにこれらに対応するタンパク質の検出）
１つの局面において、ナプシンＡ（ＮＰ−Ａ）、ナプシンＡ前駆体、トランスフェリン、ヘモペキシン（ＨＰＸ）、ヘモペキシン関連物質、トランスサイレチン（ＴＴＲ）、およびキニノーゲン（ＫＮＮ）等の核酸ならびにこれらに対応するタンパク質の検出のために、本発明は、これらのマーカーに特異的な因子または手段を提供する。例示的な実施形態では、サンプル（例えば、血液、尿等の体液など）に含まれるナプシンＡ（ＮＰ−Ａ）、ナプシンＡ前駆体、トランスフェリン、ヘモペキシン（ＨＰＸ）、ヘモペキシン関連物質、トランスサイレチン（ＴＴＲ）、およびキニノーゲン（ＫＮＮ）等ならびにこれらに対応するタンパク質を検出する際には、これらナプシンＡ（ＮＰ−Ａ）、ナプシンＡ前駆体、トランスフェリン、ヘモペキシン（ＨＰＸ）、ヘモペキシン関連物質、トランスサイレチン（ＴＴＲ）、およびキニノーゲン（ＫＮＮ）等ならびにこれらに対応するタンパク質を特異的に認識する抗体（以下、（抗）ナプシンＡ（ＮＰ−Ａ）抗体、（抗）ナプシンＡ前駆体抗体、（抗）トランスフェリン抗体、（抗）ヘモペキシン（ＨＰＸ）抗体、（抗）ヘモペキシン関連物質抗体、（抗）トランスサイレチン（ＴＴＲ）抗体、および（抗）キニノーゲン（ＫＮＮ）抗体等ならびにこれらに対応するタンパク質の抗体などと呼ぶ）を作製する。このような抗体は、従来公知の手法を用いて作製することができる。なお、抗体は、モノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であっても良い。他のマーカー（例えば、ナプシンＡ（ＮＰ−Ａ）、ナプシンＡ前駆体、トランスフェリン、ヘモペキシン（ＨＰＸ）、ヘモペキシン関連物質、トランスサイレチン（ＴＴＲ）、およびキニノーゲン（ＫＮＮ）等ならびにこれらに対応するタンパク質など）についても、同様に抗体を作製することができる。
【０１６２】
一例として、モノクローナル抗体の調製方法を以下に記載する。モノクローナル抗体は、抗原で免疫した動物から得られる抗体産生細胞と、ミエローマ細胞との細胞融合によりハイブリドーマを調製し、得られるハイブリドーマからトランスサイレチンの活性を特異的に阻害する抗体を産生するクローンを選択することにより調製することができる。
【０１６３】
動物の免疫に抗原として用いるナプシンＡ（ＮＰ−Ａ）、ナプシンＡ前駆体、トランスフェリン、ヘモペキシン（ＨＰＸ）、ヘモペキシン関連物質、およびキニノーゲン（ＫＮＮ）、トランスサイレチンタンパク質としては、組換えＤＮＡ法または化学合成により調製したナプシンＡ（ＮＰ−Ａ）、ナプシンＡ前駆体、トランスフェリン、ヘモペキシン（ＨＰＸ）、ヘモペキシン関連物質、およびキニノーゲン（ＫＮＮ）、トランスサイレチンタンパク質のアミノ酸配列の全部若しくは一部のペプチドが挙げられる。例えば、ナプシンＡ（ＮＰ−Ａ）の成熟型、ヘモペキシン（ＨＰＸ）の成熟型等のタンパク質のアミノ酸配列の全体または免疫原性を有する断片を免疫原として使用することができる。また、細胞表面に存在するタンパク質を特異的に検出するためのモノクローナル抗体としては、本発明のマーカーのタンパク質のアミノ酸配列における任意の１０以上からなるペプチドを抗原として使用することが好ましい。他の本発明の任意の因子（例えば、Ig κ等ならびにこれらに対応するタンパク質など）についても同様に抗原を設計することができる。
【０１６４】
得られた抗原用のナプシンＡ（ＮＰ−Ａ）、ナプシンＡ前駆体、トランスフェリン、ヘモペキシン（ＨＰＸ）、ヘモペキシン関連物質、およびキニノーゲン（ＫＮＮ）、トランスサイレチンをキャリアータンパク質（例えばサイログロブリン）に結合させた後、アジュバントを添加する。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント等が挙げられ、これらの何れのものを混合してもよい。
【０１６５】
上記のようにして得られた抗原を哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウマ、サル、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどの哺乳動物に投与する。免疫は、既存の方法であれば何れの方法をも用いることができるが、主として静脈内注射、皮下注射、腹腔内注射などにより行う。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔で、好ましくは４〜２１日間隔で免疫する。
【０１６６】
最終の免疫日から２〜３日後に抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞が挙げられるが、一般に脾臓細胞が用いられる。抗原の免疫量は１回にマウス１匹当たり、例えば１００μｇ用いられる。
【０１６７】
免疫した動物の免疫応答レベルを確認し、また、細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選択するため、免疫した動物の血中抗体価、または抗体産生細胞の培養上清中の抗体価を測定する。抗体検出の方法としては、公知技術、例えばＥＩＡ（エンザイムイムノアッセイ）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、ＥＬＩＳＡ（酵素連結イムノソルベントアッセイ）等が挙げられる。
【０１６８】
イムノアッセイによれば、夾雑物質の多いサンプルのままでも正確にマーカーの濃度を測定することが出来る。イムノアッセイの例としては、抗原抗体結合物を直接的または間接的に測定する沈降反応、凝集反応、溶血反応などの古典的な方法や、標識法と組み合わせて検出感度を高めたエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）等の方法が挙げられる。なお、これらのイムノアッセイに用いるマーカーに特異的な抗体は、モノクローナルでもよいし、ポリクローナルでもよい。
【０１６９】
質量分析によってマーカーの濃度を測定する場合のイオン化の方法としては、マトリクス支援レーザーイオン化（ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ、ＭＡＬＤＩ）、エレクトロスプレーイオン化（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ、ＥＳＩ）のいずれも適用可能であるが、多価イオンの生成が少ないＭＡＬＤＩが好ましい。特に、飛行時間質量分析計（ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｒ、ＴＯＦ）と組み合わせたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによれば、より正確にマーカーの濃度を測定することができる。さらに、２台の質量分析計を用いたＭＳ／ＭＳによれば、より正確にマーカーの濃度を測定することができる。
【０１７０】
電気泳動によりマーカーの濃度を測定する場合は、例えば、検査材料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供して目的のマーカーを分離し、適宜の色素や蛍光物質でゲルを染色し、目的のマーカーに相当するバンドの濃さや蛍光強度を測定すればよい。ＳＤＳ−ＰＡＧＥだけではマーカーの分離が不十分な場合は、等電点電気泳動（ＩＥＦ）と組み合わせた２次元電気泳動を用いることもできる。さらに、ゲルから直接検出するのではなく、ウエスタンブロッティングを行って膜上のマーカーの量を測定することもできる。
【０１７１】
クロマトグラフィーによってマーカーの濃度を測定する場合は、例えば、液体高速クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による方法を用いることができる。すなわち、サンプルをＨＰＬＣに供して目的のマーカーを分離し、そのクロマトグラムのピーク面積を測定することによりサンプル中のマーカーの濃度を測定することができる。
【０１７２】
抗体産生細胞と融合させるミエローマ（骨髄腫）細胞として、マウス、ラット、ヒトなど種々の動物に由来し、当業者が一般に入手可能な株化細胞を使用する。使用する細胞株としては、薬剤抵抗性を有し、未融合の状態では選択培地（例えばＨＡＴ培地）で生存できず、融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが用いられる。一般的に８−アザグアニン耐性株が用いられ、この細胞株は、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼを欠損し、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）培地に生育できないものである。
【０１７３】
ミエローマ細胞は、既に公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３）（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７９）１２３：１５４８−１５５０）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （１９７８）８１：１−７）、ＮＳ−１（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７６）６：５１１−５１９）、ＭＰＣ−１１  （Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｄ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  （１９７６）８：４０５−４１５）、ＳＰ２／０  （Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  （１９７８）２７６：２６９−２７０）、ＦＯ（ｄｅ  Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８０）３５：１−２１）、Ｓ１９４  （Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，Ｉ．Ｓ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９７８）１４８：３１３−３２３）、Ｒ２１０（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  （１９７９）２７７：１３１−１３３）等が好適に使用される。
【０１７４】
抗体産生細胞は、脾臓細胞、リンパ節細胞などから得られる。すなわち、前記各種動物から脾臓、リンパ節等を摘出または採取し、これら組織を破砕する。得られる破砕物をＰＢＳ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０等の培地または緩衝液に懸濁し、ステンレスメッシュ等で濾過後、遠心分離を行うことにより目的とする抗体産生細胞を調製する。
【０１７５】
次に、上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＥ−１６４０培地などの動物細胞培養用培地中で、ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを、混合比１：１〜１：１０で融合促進剤の存在下、３０〜３７℃で１〜１５分間接触させることによって行われる。細胞融合を促進させるためには、平均分子量１，０００〜６，０００のポリエチレングリコール、ポリビニルアルコールまたはセンダイウイルスなどの融合促進剤や融合ウイルスを使用することができる。また、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
【０１７６】
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、選択培地における細胞の選択的増殖を利用する方法等が挙げられる。すなわち、細胞懸濁液を適切な培地で希釈後、マイクロタイタープレート上にまき、各ウェルに選択培地（ＨＡＴ培地など）を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
【０１７７】
ハイブリドーマのスクリーニングは、限界希釈法、蛍光励起セルソーター法等により行い、最終的にモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを取得する。取得したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法としては、通常の細胞培養法や腹水形成法等が挙げられる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを１０〜２０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培地、または無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件（例えば３７℃，５％ＣＯ２濃度）で２〜１４日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。腹水形成法においては、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種の動物の腹腔内にハイブリドーマを投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、１〜４週間後に腹水または血清を採取する。
【０１７８】
上記抗体の採取方法において、抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜に選択して、またはこれらを組み合わせることにより精製する。
【０１７９】
従って、抗体作成の際に抗原として含まれる物質は、その対象となるマーカーの全長が好ましいが、免疫を惹起し得るエピトープを少なくとも一つ含んでいれば、部分配列でもよい。エピトープは、必ずしもその正確な位置および構造が判明していないとしても使用することができるが、必要な場合は、所定のタンパク質におけるエピトープの同定は、当該分野で周知の技術を使用して容易に達成される。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３９９８；米国特許第４，７０８，８７１号；およびＧｅｙｓｅｎら（１９８６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２３：７０９を参照することができる。同じエピトープを認識する抗体は、単純な免疫アッセイにおいて同定され得る。このように、ペプチドを含むエピトープを決定する方法は、当該分野において周知であり、そのようなエピトープは、核酸またはアミノ酸の一次配列が提供されると、当業者はそのような周知慣用技術を用いて決定することができる。
【０１８０】
従って、ペプチドを含むエピトープとして使用するためには、少なくとも３アミノ酸の長さの配列が必要であり、好ましくは、この配列は、少なくとも４アミノ酸、より好ましくは少なくとも５アミノ酸、少なくとも６アミノ酸、少なくとも７アミノ酸、少なくとも８アミノ酸、少なくとも９アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも１５アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸、少なくとも２５アミノ酸の長さの配列が必要であり得る。エピトープは直鎖状であってもコンフォメーション形態であってもよい。
【０１８１】
あるアミノ酸は、相互作用結合能力の明らかな低下または消失なしに、例えば、糖鎖結合領域、システイニル化領域、カチオン性領域または基質分子の結合部位のようなタンパク質構造において他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物学的機能を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質である。従って、特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列において、またはそのＤＮＡコード配列のレベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る。従って、生物学的有用性の明らかな損失なしに、種々の改変が、本明細書において開示されたペプチドまたはこのペプチドをコードする対応するＤＮＡにおいて行われ得る。
【０１８２】
上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の親水性および疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている（Ｋｙｔｅ．ＪおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７（１）：１０５−１３２，１９８２）。
【０１８３】
本明細書中において、機能的に等価なポリペプチドを作製するために、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を欠失させることをいう。アミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、アルキル化、グリコシル化、リン酸化、水酸化、アシル化（例えば、アセチル化）などを含むが、これらに限定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。
【０１８４】
本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わることまたは取り除かれることをいう。このような置換、付加または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、マーカーなど）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１０％以内、または１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。
【０１８５】
（糖尿病または糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症等の糖尿病合併症の検出、予測、予備的な検出または診断）
１つの局面において、本発明は、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症等の糖尿病合併症の検出、診断、予測、予備的な検出または診断の方法を提供する。この方法は、（Ａ）糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症等の糖尿病合併症の検出の対象となる被験体からのサンプルを、固相に固定されたＲＡＧＥリガンド認識領域に接触させる工程、（Ｂ）ナプシンＡ、ナプシンＡ前駆体（ＮＰ−Ａ）、ヘモペキシンおよびヘモペキシン関連物質等の本発明のマーカーからなる群より選択される少なくとも１つの分子に特異的に結合する結合分子に接触させる工程、および（Ｃ）前記結合分子の該ＲＡＧＥリガンド認識領域への結合を検出する工程であって、該結合の阻害の存否またはレベルは、該被験体が将糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症等の糖尿病合併症に罹患することまたはその可能性を示す、工程を包含する。本発明のマーカーについては本明細書上記（マーカー）の節を参酌することができ、この節に記載された任意の実施形態を採用することができることが理解される。なお、理論に束縛されないが、糖尿病性腎症は微小血管系の障害であるが、糖尿病は微小血管障害のみではなく、動脈硬化のような大血管障害の発症にもつながることが知られている。この原因の一つが大動脈血管内皮にも発現しているＲＡＧＥを介した血管内皮機能不全誘導にあると考えられる。よって、ＲＡＧＥの本来機能を抑制することによる血管内皮機能不全誘導（＝血管障害）の調整関連に結びつけることができる。ここで、サンプルの取得は、どのような手段で行っても良い。通常、医師以外の担当者が測定に従事する場合は、何らかの形で医師が取得したものであり得る。測定結果から、糖尿病またはその可能性があるかどうかを決定する工程は、正常値と比べて、各々のマーカーに比較して異常であるかどうかを判定することによって実施することができる。
【０１８６】
本明細書中の実施例でも説明されるように、理論に束縛されることを望まないが、１つの例示的な実施例に基づいて説明すると、糖尿病モデルとコントロールとの対比実験において、ゼロ日目の値を「１」とした場合の相対値に換算した値をみると、ＨＰＸの場合、コントロール群の平均値はほとんど変化が無いのに対し、Ｓｔｚ群では、１６日目にＨＰＸ量の増加が検出されていることが見出された。この例示的な実施例では、データの値としては、ＯＤ値で０．０５程度と０．１以下の増大ではあるが、有意差が認められたことから、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症等の糖尿病合併症の予測診断ないし早期診断マーカーとして使用することができることが実証されたといえる。同様に、この例示的な実施例において、ＮＰ−Ａに関しても、ゼロ日目の値を「１」とした相対値で示すと、採尿が可能であった２２日目には、Ｓｔｚ群のみで値が上昇していることが見出された。ただし、採尿量が確保できた個体数が極端に少なく、コントロール群に比べＳｔｚ群は数十倍の薄い尿を大量に排出するため尿が異常に薄いことから、厳密な意味での統計学的比較はできていない。しかしながらＮＰ−Ａについても、上昇傾向は明確に示されていることから、必要に応じて尿の量等の他のパラメータを考慮しつつ、ＮＰ−Ａを糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症等の糖尿病合併症の予測診断ないし早期診断マーカーとして使用することができるといえる。
【０１８７】
本明細書中の実施例でも説明されるように、理論に束縛されることを望まないが、１つの例示的な実施例に基づいて説明すると、糖尿病モデルであるＳｔｚ群において、糖尿病発症の指標となる血糖値は、８日目には１／３の個体で検出限界を超えた高い値を、他の個体でも４００ｍｇ／ｄｌ以上の値を示し、既に糖尿病を発症していると考えられる。１６日目以降もこの傾向は変わらなかった。一般的に、糖尿病の進展に伴い合併症である糖尿病性腎症リスクは増大するため、血糖値の管理は合併症の予防に重要であるが、血糖値自体は腎症発症のマーカーにはなり得ないため、腎症発症のマーカーに対する需要が高まっていた。本発明では、従来の腎症マーカー（クレアチニンなど）の増大に先立ち、ＨＰＸやＮＰ−Ａが検出され、その検出に伴い腎症発症に対処した場合、腎症発症が抑制可能となることを見出した。したがって、従来の腎症マーカーとの対比でいえば、「予測診断」ということができる。実施例５および１２中で糖尿病を発症しているＳｔｚ群における血清クレアチン濃度は最終日でも顕著に増大しておらず、従来法では腎症との診断は実質的につかない。しかし、血清中のＨＰＸ濃度はゼロ日目よりも上がっており、尿中ＮＰ−Ａではより顕著に上がっていたことから、腎症発症の「予測診断」「早期診断」が可能であることが実質的に示されたことになる。Ｓｔｚ刺激した本モデルでは、図1に示し、また、実施例でも確認されているように、Ｓｔｚの刺激後通常２〜３ヶ月（例えば、７１日目）に、クレアチニン濃度の上昇で認められるような糖尿病性腎症を発症する。たとえば、図1−２Ｂに示し、また実施例において確認したように、２１日目ではクレアチニン濃度の有意な上昇が認められなかったが７１日目にはクレアチニン濃度の有意な上昇が認められた。したがって、この点からも、本発明は、糖尿病性腎症発症の「予測診断」「早期診断」が可能であるといえる。
【０１８８】
１つの実施形態では、検出方法は、下記の手順で行うことができる。すなわち、固相に固定化されたＲＡＧＥ認識領域に被験体からのサンプルを接触させ、続いて一次抗体である抗ＮＰ−Ａ抗体と反応させ、次にＨＲＰ標識二次抗体と反応させ、最終的にＨＲＰのと基質を添加し、（基質に応じて）発色、蛍光、または、発光で検出することができる。
あるいは、固相に固定化された抗体に被験体からのサンプルを接触させ、競合ＥＬＩＳＡや二次抗体を使用して検出することも可能である。腫瘍マーカーとしての活用、が考えられた関係から、既にキットが、販売されており、これを本発明の目的に応用することもできる。ＮＰ−Ａに関しては、株式会社  免疫生物研究所のＨｕｍａｎ  Ｎａｐｓｉｎ  Ａ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ−ＩＢＬ、等を用いることができる。また、ＨＰＸに関しては、ＡｓｓａｙＰｒｏ  ＡｓｓａｙＭａｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｈｅｍｏｐｅｘｉｎ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｃａｔ  Ｎｏ．＃ＷＨ２００１−１）等を用いることができる。
【０１８９】
あるいは、別の実施形態では、ＲＡＧＥ固定化ビーズと検体を接触させ、次に検出したい分子に対応する蛍光標識した抗体と反応させ、蛍光強度を測定する手法も可能である。
【０１９０】
別の局面では、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症等の糖尿病合併症の検出、診断、予測、予備的な検出または診断のためのキットを提供する。このキットは（Ａ）固定されたＲＡＧＥリガンド認識領域を有する固相、（Ｂ）ナプシンＡ、ナプシンＡ前駆体（ＮＰ−Ａ）、ヘモペキシンおよびヘモペキシン関連物質等の本発明のマーカーからなる群より選択される少なくとも１つの分子に特異的に結合する結合分子、および（Ｃ）前記結合分子の該ＲＡＧＥリガンド認識領域への結合を検出する手段を備え、該結合の阻害の存在またはレベルは、該被験体が将来糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症等の糖尿病合併症に罹患することまたはその可能性を示す。キットにおいては、単独の試薬の場合は、固相の代わりに溶液でもよいし凍結乾燥物も用いることができる。また、複数のＲＡＧＥリガンド認識領域を含めてもよい。また、本発明の糖尿病診断用キットには他の試薬類を含めてもよく、例えばＥＩＡを行うためのキットであれば、ビーズ等の担体、ブロッキング液、ＰＢＳ等の緩衝液、発色基質等を含むものでもよい。この方法またはキットでは、従来のマーカーでは検出、診断等ができない早期の段階で糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症等の糖尿病合併症の検出、診断を行うことができる。したがって、その意味では、早期診断ということもできる。もちろんのこと、従来のマーカーで診断ができる時期においても同様に診断が可能であるから、従来のマーカーと同じ意味での検出および診断ができる。本発明のマーカーについては本明細書上記（マーカー）の節を参酌することができ、この節に記載された任意の実施形態を採用することができることが理解される。
【０１９１】
本発明の疾病の診断方法で使用する健常値は、例えば、糖尿病を発症していないと確定診断された健常人における本発明のマーカーの体液中の濃度データを収集し、その濃度値を元に設定することができる。糖尿病の将来の発症リスクを判定する場合も、当該健常人における濃度値を元に健常値を設定することができる。なお、健常値を段階的に複数設定し、糖尿病の有無または将来の発症リスクを定量的に判定することもできる。
【０１９２】
本発明の疾病の診断方法において使用するサンプルについて、体液としては、尿または血液が好ましく用いられる。特に、被検者から採取した尿、血液から調製した血清または血漿（体液成分）を測定サンプルとすることが好ましい。血清または血漿は遠心分離等の公知の方法で血液から調製することができる。
【０１９３】
したがって、別の局面では、本発明は、糖尿病または糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症等の糖尿病合併症の検出方法または診断方法を提供する。この方法は、（Ａ）糖尿病または糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症等の糖尿病合併症の検出の対象となる被験体からのサンプルを、固相に固定されたＲＡＧＥリガンド認識領域に接触させる工程、（Ｂ）ナプシンＡ、ナプシンＡ前駆体（ＮＰ−Ａ）、ヘモペキシンおよびヘモペキシン関連物質等の本発明のマーカーからなる群より選択される少なくとも１つの分子に特異的に結合する結合分子に接触させる工程、および（Ｃ）前記結合分子の該RAGEリガンド認識領域への結合を検出する工程であって、該結合の阻害の存在またはレベルは、該被験体が糖尿病または糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症等の糖尿病合併症に罹患していることを示す、工程を包含する。本発明のマーカーについては本明細書上記（マーカー）の節を参酌することができ、この節に記載された任意の実施形態を採用することができることが理解される。
【０１９４】
また、さらに別の局面では、本発明は、糖尿病または糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症等の糖尿病合併症の検出または診断のためのキットを提供する。このキットは、（Ａ）固定されたＲＡＧＥリガンド認識領域を有する固相、（Ｂ）ナプシンＡ、ナプシンＡ前駆体（ＮＰ−Ａ）、ヘモペキシンおよびヘモペキシン関連物質からなる群より選択される少なくとも１つの分子に特異的に結合する結合分子、および（Ｃ）前記結合分子の該ＲＡＧＥリガンド認識領域への結合を検出する手段を備え、該結合の阻害の存在またはレベルは、該被験体が糖尿病または糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症等の糖尿病合併症に罹患していることを示す。本発明のマーカーについては本明細書上記（マーカー）の節を参酌することができ、この節に記載された任意の実施形態を採用することができることが理解される。
【０１９５】
１つの実施形態では、前記分子はナプシンＡ（ＮＰ−Ａ）および／またはナプシンＡ前駆体であり、前記サンプルは尿である。
【０１９６】
別の実施形態では、前記分子はヘモペキシンおよび／またはヘモペキシン関連物質であり、前記サンプルは血液、血清または血漿である。
【０１９７】
特定の実施形態では、前記ＲＡＧＥリガンド認識領域は、ＲＡＧＥ細胞外領域（配列番号２７の２２−３３２位）、ＲＡＧＥ８、ｍＲＡＧＥ８、ＲＡＧＥ１、ｍＲＡＧＥ１、ＲＡＧＥ２、ｍＲＡＧＥ２、ＲＡＧＥ３、ｍＲＡＧＥ３、ＲＡＧＥ４、ｍＲＡＧＥ４、ＲＡＧＥ７、ｍＲＡＧＥ７、ＲＡＧＥ１４３、ｍＲＡＧＥ１４３、ＲＡＧＥ２２３、ｍＲＡＧＥ２２３、ＲＡＧＥ２２６およびｍＲＡＧＥ２２６、これらの少なくとも１つを含む分子、またはそれらの改変体あるいはそれらの複合体からなる群より選択される。
【０１９８】
さらに別の実施形態では、血清、血漿、尿等のサンプルとＲＡＧＥ固定化ビーズとを混和した後にビーズを回収し、蛍光標識した複数の抗体（抗体毎に蛍光標識の蛍光波長を変える）と反応後に蛍光測定し、複数のマーカーを同時に、迅速に検出することができる。より具体的なプロトコールは以下のとおりである。
【０１９９】
１．ＲＡＧＥビーズの作製：アガロース、シリカ、磁気性等のビーズ上にＲＡＧＥを固定化する。固定化はビーズ上のアビジンにＲＡＧＥのビオチンタグを介して固定化することにより簡便かつ強固な固定が可能である。
【０２００】
２．ＲＡＧＥビーズとの反応：サンプルにＲＡＧＥビーズを添加し、低温で30分間転倒混和することにより、サンプル中のＲＡＧＥリガンドを結合させる。遠心（磁気性ビーズの場合、磁石を使用）によりＲＡＧＥビーズを回収し、ＴＢＳで洗浄する。
【０２０１】
３．２での反応物に、蛍光色素で標識した検出対象分子に対する抗体を添加する。吸収波長の異なる蛍光色素の組み合わせにより2種類以上の分子の同時検出が可能である（例えば、Ａｌｅｘａ  ４８８、５５５，６３３のＡｌｅｘａ系の組み合わせ、あるいは、Ｃｙ３，Ｃｙ５の組み合わせ等）。1時間反応させた後、ビーズを回収し洗浄する。
【０２０２】
４．検出：回収したビーズの蛍光を蛍光検出器で測定する。励起波長と吸収は長の選択により複数の分子の同時検出が可能である。
【０２０３】
また、高感度イムノクロマト法により簡便かつ迅速な分析に発展させることができる。これらの技術については、例えば、古河電工時報１２１，１７−２２（２００８）を参照することができる。そして、より具体的なプロトコールは以下のとおりである。
【０２０４】
（１）ＲＡＧＥ蛍光ナノ粒子保持パット：蛍光ナノ粒子として、蛍光シリカ粒子や半導体ナノ粒子が使用可能である。蛍光ナノ粒子上にＲＡＧＥ認識領域を固定化する（蛍光ナノ粒子の代わりに金コロイド粒子や着色ラテックス粒子を使用した従来のイムノクロマトへの適応も勿論可能である）。以下に、蛍光ナノ粒子として蛍光シリカ粒子（古河電工ＱＵＡＲＴＺ  ＤＯＴなど）を用いた場合について記載する。蛍光シリカ粒子は、内部に様々な蛍光色素を封入して蛍光波長を選ぶことができる。蛍光を使用せずに目視も可能なように、ローダミンを封入したローダミンシリカ粒子を使用した。ＲＡＧＥ蛍光ナノ粒子をグラスファイバーパットに塗布し減圧乾燥することにより、ＲＡＧＥ蛍光ナノ粒子保持パットを作製する。
【０２０５】
（２）クロマトグラフ担体（抗体固定化メンブレン）：  例えば、２．５ｘ１５ｃｍ（サイズは適宜選択可能である。）のニトロセルロース膜の下から２ｃｍの位置に、幅1ｍｍで抗ＨＰＸ抗体（ＴＢＳ溶液）を塗布する（ＮＰ−Ａ検出用の場合は、抗ＮＰ−Ａ抗体を用いる）。このラインがテストラインとなる。さらに１ｃｍの位置に抗ＲＡＧＥ抗体を塗布する。このラインがコントロールラインとなる。塗布した抗体が乾燥した後に、ブロッキング緩衝液（０．５％カゼインなどのブロッキング剤を含むＴＢＳ）中で1時間ブロッキングした後、乾燥させクロマトグラフ担体を完成させる。
【０２０６】
（３）イムノクロマト用キット：  パック粘着シート（ニップンテクノクラスタ社などから入手可能である。）に２のクロマトグラフ担体、メンブラン上方下部に１で作製したＲＡＧＥ蛍光ナノ粒子保持パッド、さらに試料添加用のパッド、吸収パッドを貼り付けイムノクロマト用キットを完成させる。
【０２０７】
（４）試料の分析：試料（血清、血漿、尿、涙液など）を緩衝液で希釈後に試料添加パットに添加し、毛管現象により試料を展開する。ＨＰＸと結合したＲＡＧＥ蛍光ナノ粒子は、抗ＨＰＸ抗体が固定化されているテストラインで捕捉され、それ以外のＲＡＧＥ蛍光ナノ粒子は、抗ＲＡＧＥ抗体が固定化されているコントロールラインで捕捉される。コントロールラインを設けることで、試料の展開が順調であったことが確認され、さらに、コントロールラインとテストラインの蛍光強度に比較により、定量的な検出が可能になる。検出は、ローダミンの色を目視し、ＨＰＸの有無を特別な機器を使用せずに確認できる。しかし目視では感度が悪いため、蛍光検出が可能な装置を用いることにより、高感度検出が可能になる。
また、Ｌａｂ−ｏｎ−ａ  Ｃｈｉｐとマイクロチップ電気泳動法と組み合わせた極微量での迅速分析に発展させることができる。これらの技術については、例えば、日薬理誌１３１、２８−３１（２００８）ＰＲＯＣＥＥＤＩＮＧ  ＯＦ  ＩＥＥＥ  ９２，１５４−１７３（２００４）ＰＡＮＡＳＯＮＩＣ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ５７、２１−２６（２０１１）を参照することができる。そして、より具体的なプロトコールは以下のとおりである。
【０２０８】
例示的な実施形態では、イムノクロマトキットを超微量対応にし、抗原抗体反応を微小な場で迅速に行い、さらにチップ上に高分解能の電気泳動の場、高感度の検出が可能なフローセルをチップ上に保有した形態を採用することができる。フローセルの数に依るが、10サンプル以上を同時並行的に分析し、感度と定量性も格段に上昇させることができる。
【０２０９】
例えば、ガラスなどの基板に半導体微細加工技術により「試料添加孔→ＲＡＧＥ反応槽→抗体との反応槽→高性能分離ユニット（電気泳動、液邸クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動などによる分子量分画）→検出ユニット」をマイクロ流路で統合し一連の作業を自動移動化可能な設計とすることができる。
【０２１０】
１つの実施形態では、診断の基準として、上昇するマーカータンパク質と減少するマーカータンパク質の比率などが重要になると考えた場合、発症群の血中に特有に同定されたＨＰＸと健常群に特有のＴＴＲとＫＫＮとの間の比が意味を持つ可能性がある。このような比率については、本明細書の記載をもとに当業者が実施することができる。イムノクロマトグラフィーはインフルエンザの迅速検査などで知られている手法であるところ、これらの手法を応用して本発明の糖尿病性腎症の検出にも適用することができる。これは、蛍光ナノ粒子を利用した高感度イムノクロマトグラフィー法ということができる。
【０２１１】
また、Ｌａｂ−ｏｎ−ａ  Ｃｈｉｐを血球中のＮＰ−ＡやＨＰＸ遺伝子の発現を検出することによりタンパク質レベルで発現する前の段階での検出が可能になる。検出には、ＰＡＮＡＳＯＮＩＣのセンシングチップなどが活用可能である（例えば、参考文献としてＰＡＮＡＳＯＮＩＣ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ５７、２１−２６（２０１１）を挙げることができる）。
【０２１２】
血球中の遺伝子レベルでの発現に関しては、ＤＮＡマイクロアレイによる白血球における遺伝子発現レベルを指標に２型糖尿病の診断に関する文献（例えば、特許文献３）を参考に、実施することができる。また、ＰＡＮＡＳＯＮＩＣ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ５７、２１−２６（２０１１）に記載されるように、センシングチップの活用により、血液からワンステップで目的の遺伝子の検出が可能になることが期待されることから、ワンステップでの遺伝子検出も実施することができる。基本的には、ＰＡＮＡＳＯＮＩＣのセンサーチップの手順で、ＳＮＰセンサの部分が、該当遺伝子を検出するように特化された設計を行うことによって、実施することができる。
【０２１３】
特に好ましい実施形態では、本発明では、糖尿病合併症（特に糖尿病性腎症）の初期マーカー（すなわち、血糖値は上がっているが、クレアチニン濃度は勿論のこと、タンパク尿などの状態が出る、以前のマーカー）が提供される。例示的な実施形態において、臨床検体では、糖尿病の初期（タンパク尿やクレアチニンの上昇はなし）で、血中ＨＰＸ、尿中ＮＰ−Ａが健常人に比べて有意さがあるか測定することによって判断することができる。さらに、ＨｂＡ１ｃ（ヘモグロビンエーワンシー）の値で初期をさら複数群に分け、測定し、初期の中でもグループ分けが可能か等を検証することもできる。好ましい実施形態では、極初期の兆候を効率的に捕捉するための手法として、ＲＡＧＥ固定化ビーズなどにより血清、血漿や尿を処理し、蛍光標識したＮＰ−Ａ抗体やＨＰＸ抗体と反応させ検出することなどを想定することができる。したがって、このような実施形態の場合は、ＨＰＸやＮＰ−Ａの同定のための血清や尿の処理過程を、そのまま検出のための手法に適用することができる。
【０２１４】
１つの実施形態では、サンプルは涙液である。この実施形態では涙液のみで簡易測定可能であれば、たとえば、涙液を郵送してもらって簡易判定をし、その後眼底検査等をする、ということが本発明において想定されうる。この実施形態では、上述のイムノクロマトキットで目視可能なタイプを用いることにより自宅であるいはこれを郵送等を行って検査会社にて検査させることによって涙液中のＨＰＸの検出が可能になり糖尿病性網膜症の初期異常が簡便に検出できるため、自覚症状もないままに進行する前に診断を可能とすることができる。眼科医の元で、散瞳による定期診察を度々受けるのは、それなりに負担なので意義もある実施形態であるといえる。また、涙液中のＨＰＸに関しては、アレルギー性結膜炎の炎症反応に伴う発現が知られている（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４０４（２０１０）８２−８５）が、糖尿病性のものでは報告がない。したがって、涙液中の他のマーカーも必要に応じて参酌しつつ糖尿病性網膜症の初期異常を診断することができる。
【０２１５】
本発明の糖尿病または糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症等の糖尿病合併症の診断方法等においては、サンプル（血液、尿等）中のマーカーの存否または濃度を測定する。そして、その測定値を健常値と比較することにより、糖尿病または糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症等の糖尿病合併症の診断等を行う。ここで、「糖尿病または糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症等の糖尿病合併症の診断」とは、糖尿病または糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症等の糖尿病合併症に罹患しているか否かを判定することのみではなく、糖尿病または糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症等の糖尿病合併症の予防を目的として糖尿病に罹患するおそれの有無を判定することや、糖尿病または糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症等の糖尿病合併症の改善状態や再発のモニタリングを行うことも含む。本発明の糖尿病または糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症等の糖尿病合併症の診断方法等においては、複数のマーカーの１つまたは複数のものを測定してもよい。より多いマーカーを使えば、多方面から糖尿病または糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症等の糖尿病合併症の診断を行うことができ、診断の精度が高くなる。また、これらマーカーは、そのレベルまたは濃度の変動をモニタリングすることにより、一見健常者にみえる被験者が糖尿病または糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症等の糖尿病合併症を発病する兆候を検出することもできる。特に、本発明は、従来のマーカーでは判定できない程度に早期の段階で糖尿病が糖尿病性腎症に進展する兆候を検出することができることに注目すべきである。
【０２１６】
本発明の疾病の診断方法では、被検者のサンプル（例えば、血液、尿等の体液）中における上記マーカーの少なくとも１つの濃度を健常値と比較し、糖尿病または糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症等の糖尿病合併症の発症の有無または将来の発症リスクを判定することができる。本発明の糖尿病または糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症等の糖尿病合併症の診断等では、血糖値またはクレアチニン値等の既存の指標を直接指標とするのではなく、別のマーカーを指標とするので、それらの既存の指標が変化する前の状態をも捉えることができる。その結果、糖尿病または糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症等の糖尿病合併症の有無に加え、糖尿病または糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症等の糖尿病合併症の将来の発症リスクを判定することができる。なお、「糖尿病または糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症等の糖尿病合併症」の「予測診断」および「事前診断」ならびに「糖尿病または糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症等の糖尿病合併症の将来の発症リスクを判定する」とは、交換可能に使用され、糖尿病または糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症等の糖尿病合併症を発症していない時点において、将来、糖尿病または糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症等の糖尿病合併症に罹患する可能性（危険性）の有無またはその可能性（危険性）の程度を判定することをいう。
【０２１７】
本発明の疾病の診断方法の１つの実施形態においては、マーカーに対する親和性を有する物質を固定化した担体としてＲＡＧＥリガンド認識領域を有する固相等を使用することができる。そして、ＲＡＧＥリガンド認識領域を有する固相等の担体にサンプル（例えば、血液、尿等の体液）またはその成分を接触させて、体液または体液成分に含まれるマーカーを、マーカーに対する親和性を有する物質を介して担体上に捕捉し、捕捉されたマーカーの量に基づいて体液中のマーカーの濃度を算出する。本発明の方法によれば、ＲＡＧＥリガンド認識領域またはそれを含む物質を有する固相等担体上に捕捉されたマーカーを測定対象とするので、測定サンプル中に含まれる夾雑物質の影響を低減させることができ、より高感度かつ高精度でマーカーの濃度を測定することができる。なお、サンプルの例としては、血液、血清または血漿、尿等が挙げられる。
【０２１８】
本発明の糖尿病または糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症等の糖尿病合併症の診断方法等の１つの実施形態では、ＲＡＧＥリガンド認識領域またはそれを含む物質を有する固相等として平面部分を有する担体が用いられる。このような担体では、マーカーに対する親和性を有する物質であるＲＡＧＥリガンド認識領域またはそれを含む物質はその平面部分の一部に固定化されている。かかる構成により、マーカーに対する親和性を有する物質であるＲＡＧＥリガンド認識領域またはそれを含む物質を、担体上の複数箇所にスポット的に固定化することができる。その結果、１個の担体で複数の測定サンプルを同時処理することや、１個の担体で複数のマーカーの濃度を同時測定することが可能となり、作業効率がよい。さらに、各スポットの面積を小さくすることにより、微量の測定サンプルからでもマーカーの濃度を測定することができる。なお、平面部分を有する担体の例としては、チップ等の基板が挙げられる。捕捉されたマーカーの量の測定には、質量分析、イムノアッセイ（抗体の場合）等を使用することができる。
【０２１９】
１つの局面では、本発明は、本発明の方法を実現するために、システムを構築することができる。
【０２２０】
本明細書において、「システム」とは、検出、予測診断、事前診断、診断等を行うための任意の系をいい、一般に、１または複数の構成要素からなり、複数の構成要素がある場合それらの要素は互いに作用・関連し合っており、全体として調和のとれた挙動・機能を示すという３条件を満足する系をいう。システムは、装置、組成物、診断薬など任意の形態であり得る。従って、システムは、例えば、測定装置を備える大掛かりなシステムから、クロマトグラフィーを備えるシステム、免疫反応を利用したキット、抗体を含む組成物（すなわち、マーカーのモノクロナール抗体を含む、体外医薬品である診断薬）などを包含することが理解される。
【０２２１】
１つの実施形態では、本発明は、被験体由来のサンプル中のマーカー、該マーカーに特異的に相互作用する因子、または該マーカーを選択的に認識する手段を含む、被験体が糖尿病であるかどうか事前診断または診断するためのシステムを提供する。
【０２２２】
ある具体的な局面では、本発明は、被験体由来のサンプル中のマーカーを含む、被験体が糖尿病であるかどうか事前診断するためのシステムまたは組成物を提供する。
【０２２３】
ある具体的な局面では、本発明は、被験体由来のサンプル中のマーカーに特異的に相互作用する因子を含む、被験体が糖尿病であるかどうか事前診断するためのシステムまたは組成物を提供する。
【０２２４】
ある具体的な局面では、本発明は、被験体由来のサンプル中のマーカーを選択的に認識する手段を含む、被験体が糖尿病であるかどうか事前診断するためのシステムを提供する。
【０２２５】
ある具体的な局面では、本発明は、被験体由来のサンプル中のマーカーを含む、被験体が糖尿病であるかどうか診断するためのシステムまたは組成物を提供する。
【０２２６】
ある具体的な局面では、本発明は、被験体由来のサンプル中のマーカーに特異的に相互作用する因子を含む、被験体が糖尿病であるかどうか診断するためのシステムまたは組成物を提供する。
【０２２７】
ある具体的な局面では、本発明は、被験体由来のサンプル中のマーカーを選択的に認識する手段を含む、被験体が糖尿病であるかどうか診断するためのシステムを提供する。
【０２２８】
これらの組成物またはシステムは、上記マーカーを同定することができる限り、任意の被験体由来のサンプル中のマーカー、該マーカーに特異的に相互作用する因子、または該マーカーを選択的に認識する手段を用いることができることが理解され得る。従って、本明細書において具体的に記載された因子または手段のみならず、当該分野において公知の任意の等価の因子または手段を用いることができることが理解される。
【０２２９】
１つの実施形態において、使用されるマーカーは、前記被験体の体液、例えば血液または尿中に存在するものであることが特徴である。理論に束縛されることを望まないが、体液であれば、取り出した後処理が簡便であり、大量の診断または診断支援が可能であるからである。理論に束縛されることを望まないが、尿または血液が好ましいのは、特定のマーカーについては、各々尿または血液で特異的な挙動が示されているからである。
【０２３０】
具体的な実施形態では、本発明において用いられるマーカーは、本明細書において（マーカー）等に記載されたものでありうる、１またはそれより多い物質を含む。好ましくは、２以上、３以上、あるいはそれより多い数のマーカー（特に、各々、誘導体と対を成しているものを１群とみなしたとき、異なる群から選択される複数のマーカー）を含むことが有利である。複数のマーカーを用いるシステムとして、より精確な診断を行うことが可能であり、確定診断をも可能にするからである。
【０２３１】
１つの実施形態では、本発明において使用される因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択され、好ましくは、因子は、タンパク質または複合分子（例えば、糖タンパク質、脂質タンパク質など）である。好ましくは、因子は、抗体（例えば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体）である。このような因子は、標識されるか、または標識可能であることが好ましい。なぜなら、診断することが容易となるからである。
【０２３２】
本発明の好ましい実施形態において、使用される手段は、質量分析装置、核磁気共鳴測定装置、Ｘ線解析装置、ＳＰＲ、クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ、薄層クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー）、免疫学的手段（例えば、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ）、生化学的手段（例えば、ｐＩ電気泳動、サザンブロッティング、二次元電気泳動）、電気泳動機器、化学的分析機器、蛍光二次元ディファレンシャル電気泳動法（２ＤＥ−ＤＩＧＥ）、同位体標識法（ＩＣＡＴ）、タンデムアフィニティ精製法（ＴＡＰ法）、物理学的手段、レーザーマイクロダイセクションおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される。
【０２３３】
本発明の好ましい実施形態では、本発明のシステムは、さらに、マーカーの標準を含む。このような標準は、マーカーの検出手段（該マーカーに特異的に相互作用する因子、または該マーカーを選択的に認識する手段など）が正常に機能しているかどうかを確認するために用いることが好ましい。
【０２３４】
好ましい実施形態では、本発明では、対象となるサンプルを精製する手段をさらに備え得る。このような精製手段としては、例えば、クロマトグラフィーなどを挙げることができる。精製することによって、診断の精度を上げることができることから、好ましい実施形態において使用され得るが、これは必須ではない。
【０２３５】
本発明において、被験体は、哺乳動物を含み、１つの実施形態では、被験体は、齧歯類を含む。このような齧歯類（例えば、ラット、マウスなど）は、モデル動物、特に、糖尿病または糖尿病性腎症のモデル動物（例えば、ストレプトゾシン（Ｓｔｚ）マウス等）が作製されていることから好ましい。別の好ましい実施形態では、被験体は、ヒトを含む。
【０２３６】
１つの実施形態では、本発明において使用される因子または手段は、本発明のマーカーの定量をする能力を有する。このような定量は、標準曲線を描いたときに、検量線がきちんと描ける手段または因子であるものがよい。好ましくは、例えば、抗体、質量分析、クロマトグラフィー分析などを挙げることができる。従って、ある実施形態では、本発明のシステムは、マーカーの定量を行うための定量手段をさらに備える。
【０２３７】
１つの実施形態では、定量手段は、標準曲線と測定結果とを比較して前記マーカーが正常値の範囲内かどうかを判定する判定手段を含む。このような判定手段は、コンピュータを用いて実現することができる。
【０２３８】
１つの実施形態では、本発明のシステムは、マーカーまたはマーカーに特異的に相互作用する前記因子を含む組成物である。
【０２３９】
１つの局面において、本発明は、被験体由来のサンプル中のマーカー、該マーカーに特異的に相互作用する因子、または該マーカーを選択的に認識する手段の、被験体が糖尿病であるかどうか予測診断、事前診断、予測、検出または診断するための医薬の製造における、使用を提供する。ここで、サンプルの取得は、どのような手段で行ってもよい。通常、医師以外の担当者が測定に従事する場合は、何らかの形で医師が取得したものであり得る。測定結果から、糖尿病またはその可能性があるかどうかの決定は、正常値と比べて、各々のマーカーに比較して異常であるかどうかを判定することによって実施することができる。本発明の方法において、使用されるマーカーなどは、上記（新規ＡＧＥ受容体（ＲＡＧＥ）のリガンド）、（ＲＡＧＥシグナル伝達調節剤）、（マーカー）の項において記載される任意の１または複数の特徴を矛盾することがない限り有していても良いことが理解される。本発明の検出または診断において、マーカーの濃度を測定する方法は、そのマーカーの濃度を特異的に測定できる方法であれば、タンパク質の定量に一般に用いられている方法をそのまま用いることができる。例えば、各種のイムノアッセイ、質量分析（ＭＳ）、クロマトグラフィー、電気泳動等を用いることができる。
【０２４０】
本発明の検出または診断における好ましい実施形態の一つは、マーカーを担体上に捕捉し、その捕捉されたマーカーの濃度を測定することである。すなわち、マーカーに対する親和性を有する物質を担体に固定化し、その親和性を有する物質を介してマーカーを担体上に捕捉する。本実施形態によれば、サンプル中に含まれる夾雑物質の影響を低減させることができ、より高感度かつ高精度でマーカーの濃度を測定することができる。
【０２４１】
抗体検出の方法としては、公知技術、例えばＥＩＡ（エンザイムイムノアッセイ）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、ＥＬＩＳＡ（酵素連結イムノソルベントアッセイ）等が挙げられる。
【０２４２】
本実施形態においてマーカーの測定方法にイムノアッセイを用いる場合は、抗体を固定化した担体を用いることが好ましい。このようにすれば、担体に固定化された抗体を１次抗体としたイムノアッセイの系を簡単に構築することができる。例えば、マーカーに特異的でエピトープの異なる２種類の抗体を用意し、一方を１次抗体として担体に固定化し、他方を２次抗体として酵素標識し、サンドイッチＥＩＡの系を構築することができる。その他、結合阻止法や競合法によるイムノアッセイの系も構築可能である。さらに、担体として基板を用いる場合は、抗体チップによるイムノアッセイが可能である。抗体チップによれば、複数のマーカーの濃度を同時に測定でき、迅速な測定が可能である。
【０２４３】
一方、本実施形態においてマーカーの測定方法に質量分析を用いる場合は、抗体の他、イオン結合や疎水性相互作用によってマーカーを担体に捕捉することもできる。イオン結合や疎水性相互作用は抗原と抗体等のバイオアフィニティほどの特異性がなく、マーカー以外の物質も捕捉されるが、質量分析によれば分子量を反映した質量分析計スペクトルによって定量するので、問題はない。特に、担体として基板を使用したプロテインチップを用い、表面エンハンス型レーザー脱離イオン化（ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）−飛行時間質量分析（ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）（以下、「ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ」と称する）を行えば、マーカーの濃度をより正確に測定することができる。使用できる基板の種類としては、陽イオン交換基板、陰イオン交換基板、順相基板、逆相基板、金属イオン基板、抗体基板等を用いることができるが、陽イオン交換基板、特に弱陽イオン交換基板と、金属イオン基板が好ましく用いられる。
【０２４４】
イオン結合によってマーカーを担体に捕捉する場合は、イオン交換体を担体に固定化する。この場合、イオン交換体には陰イオン交換体、陽イオン交換体のいずれも用いることができ、さらに、強陰イオン交換体、弱陰イオン交換体、強陽イオン交換体、弱陽イオン交換体のいずれも用いることができる。例えば、弱陰イオン交換体の例としては、ジメチルアミノエチル（ＤＥ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）等の弱陰イオン交換基を有するものが挙げられる。また、強陰イオン交換体の例としては、４級アンモニウム（トリメチルアミノメチル）（ＱＡ）、４級アミノエチル（ジエチル，モノ・２−ヒドロキシブチルアミノエチル）（ＱＡＥ）、４級アンモニウム（トリメチルアンモニウム）（ＱＭＡ）等の強陰イオン交換基を有するものが挙げられる。また、弱陽イオン交換体の例としては、カルボキシメチル（ＣＭ）等の弱陽イオン交換基を有するものが挙げられる。さらに、強陽イオン交換体の例としては、スルホプロピル（ＳＰ）等の強陽イオン交換基を有するものが挙げられる。一方、疎水性相互作用によってマーカーを担体に捕捉する場合は、担体に疎水基をもつ物質を固定化する。疎水基の例としては、Ｃ４〜Ｃ２０のアルキル基、フェニル基等が挙げられる。さらに、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋、Ｍｇ２＋等の金属イオンを固定化した担体にマーカーを捕捉することもできる。
【０２４５】
本実施形態において用いる担体の例としては、ビーズ、マイクロタイタープレート、樹脂等の公知のものを使用することができる。特に、ビーズとマイクロタイタープレートは、イムノアッセイにおいて従来から用いられており、測定系の構築が容易である。一方、
基板のような、平面部分を有する担体を用いることもできる。この場合は、平面部分の一部にマーカーに対する親和性を有する物質を固定化することが好ましい。例としては、基盤としてチップを用い、その表面の複数箇所にスポット的にマーカーに特異的な抗体を固定化した担体が挙げられる。
【０２４６】
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ｅｔ
ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃμｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ  Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃμｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃμｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃμｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ
Ｍｏｌｅｃμｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃμｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃμｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃμｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃμｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃμｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ  ａｎｎｕａｌ  ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【０２４７】
人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。ｓ
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【０２４８】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０２４９】
必要な場合、以下の実施例で用いる動物の取り扱いは、食品総合研究所において規定される基準を遵守した。また、試薬類は具体的には実施例中に記載した製品を使用したが、他メーカー（Ｓｉｇｍａ，和光純薬、ナカライ、ａｂｃａｍ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ａｂｎｏｖａ，  ＡｓｓａｙＰｒｏ，  Ｏｒｉｇｅｎｅ，Ｂｉｏｂｙｔ，  Ｂｉｏｒａｄ，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＩＢＬ等）の同等品でも代用可能である。
【０２５０】
（調製例：糖尿病モデル）
本例では、糖尿病モデルとして同症状を発症させたマウスが実際に糖尿病の症状を示すことを確認した。
【０２５１】
ストレプトゾトシン投与により糖尿病を発症させたマウスの血中クレアチニン濃度を測定し、糖尿病血管障害の代表である糖尿病腎症を発症していることを確認した（図１−１）。糖尿病性腎症発症群のマウスを血糖値の値により高血糖値群、低血糖値群とし、さらに、糖尿病を発症していないコントロール（健常群）の３群に、採取した血清、並びに、尿をグループ分けした。糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症等の糖尿病合併症の発症・進展に関わる後期糖化生成産物（ＡＧＥ）を認識する受容体であるＲＡＧＥの認識領域を固定化したビーズに、各群の血清、若しくは、尿を添加し、健常群や発症群に特有にＲＡＧＥに結合する分子を回収し、分離・同定を試みた。ＲＡＧＥに結合する発症群特有の分子を同定することにより、生体内に存在する新規リガンドの選抜、あるいは、新規なバイオマーカーの選抜のため実施例１でこれらを用いた。高血糖群は糖尿病性腎症発症群であるため、高血糖群由来のサンプルを対象にした。以下にその手順を示す。
【０２５２】
ＭＵＴＡＩＮ  ＭＡＴＲＩＸ（Ｒｏｃｈｅ社製）に精製したビオチン化ＲＡＧＥ認識領域（２００  μｇ／ｍｌ）を添加し、１時間低温下で反応させた後、ＴＢＳにて洗浄し、ＲＡＧＥ固定化ビーズを作製した。  ２５０μｌの各群の尿にＲＡＧＥを固定化していないビーズ２０μｌを添加し、非特異的にビーズに結合する分子を除去するｐｒｅ  ｃｌｅａｎ処理を行った。Ｐｒｅ  ｃｌｅａｎ  後の健常群、高血糖値群、および、低血糖値群の各群の尿に、ＲＡＧＥ固定化ビーズ固定化ビーズ２０μｌ（５０％  ｓｌｕｒｒｙ）を添加し、１時間低温下で反応させ、ＲＡＧＥに特異的に結合する分子を回収した。
【０２５３】
さらに、糖尿病性腎症発症発症マーカーになり得る分子のＲＡＧＥビーズによるスクリーニングのために、Ｓｔｚ処理により糖尿病を誘導したマウス（Ｓｔｚ）と健常群（ｃｏｎｔｌ）の血糖値の変化を示す（図１−２Ａ）。また、糖尿病性腎症発症発症マーカーになり得る分子のＲＡＧＥビーズによるスクリーニングのために、Ｓｔｚ処理により糖尿病を誘導したマウス（Ｓｔｚ）と健常群（ｃｏｎｔｌ）の血清クレアチニン濃度の変化を示す。血糖値の上昇が確認できた数週間後ではクレアチニン濃度の上昇（糖尿病性腎症のマーカーの一つ）は検出されなかったが、全採血時（７１日目）には、クレアチニン濃度はＳｔｚ群で有意に上昇していた（図１−２Ｂ）。
【０２５４】
（実施例１：特異的分子の同定）
（尿中の特異的分子）
本実施例では、まず、尿中における特異的分子を同定した。
【０２５５】
尿中から回収された分子の種類は多くなく、一次元のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、発症群に特異的な分子が検出された。糖尿病性腎症発症群である高血糖値群に特異的バンドのゲルを切り出し、トリプシン消化後、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＡＳにより解析したところ、トランスフェリン、ナプシンＡ前駆体などが同定された（図２右図）。
【０２５６】
尿由来の分子を結合しているＲＡＧＥ固定化ビーズ  ２μｌを１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより展開したところ、結合しているタンパク質の種類が少なく、一次元電気泳動により健常群もしくは糖尿病性腎症発症群に特異的な分子の同定が可能と予測されたため、続いて各群由来の１５μｌを１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより展開した。クマシー染色後、糖尿病性腎症発症群に特有に検出された７５ｋＤａと４５ｋＤａのタンパク質バンドをクリーンベンチ内で切り出した。切り出しだ各ゲル片を還元アルキル化処理後にトリプシンにより消化した。トリプシン処理により得られたペプチド断片をＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦ  ＭＳにより計測した。得られたスペクトルデータは、ＮＣＢＩｎｒ（ＮａｔｉｎａｌＣｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｎｏｎｒｅｄｕｎｄａｎｔ  ｖｅｒ．２０１１０３１２）のデータベースに基づき、Ｍａｓｃｏｔ  ＭＳ／ＭＳ  Ｉｏｎｓ  Ｓｅａｒｃｈ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  （Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｌｏｎｄｏｎ，  ＵＫ）により解析した。その結果、４５ｋＤａのバンドはＮａｐｓｉｎ  Ａであること、７５ｋＤａのバンドはトランスフェリンであることが明らかとなった。
【０２５７】
結果として、いずれもＲＡＧＥリガンドしての報告はない分子であった。ナプシンＡ（ＮＰ−Ａ）は、高分化型肺腺ガン組織から見出された分子で、肺腺ガンのマーカーとても知られているが、肺の他には腎臓における発現が報告されている。しかし、本発明者が知るところでは、糖尿病や糖尿病腎症との関連での報告はなされていない。
【０２５８】
（血清について）
本実施例では、次に、血清中における特異的分子を同定した。
【０２５９】
５００μｌの複数マウス由来の各群の血清をＲＡＧＥを固定化していないビーズでｐｒｅ  ｃｌｅａｎ処理後に、ＲＡＧＥ固定化ビーズ４０μｌ（５０％  ｓｌｕｒｒｙ）を添加した。ビーズを洗浄後に、各群由来のタンパク質を結合しているビーズ２μｌを１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより展開したところ、各群とも複数のバンドが検出され、糖尿病性腎症発症群に特有なＲＡＧＥと結合する分子を一次元電気泳動で分離し同定することは困難であることが判明した。結果を図２左（血清）に示す。そこで、２Ｄ−ＤＩＧＥによる分離と特有の分子の同定を行った（実施例６で後述）。
【０２６０】
（実施例２：ＮＰ−ＡのＲＡＧＥへの特異的結合）
発症群特有にＲＡＧＥに結合したＮＰ−Ａが、実際にＲＡＧＥリガンドとしての機能するか明確にするために、まず細胞上で、ＮＰ−ＡがＲＡＧＥに特異的に結合するか確認した。
【０２６１】
ＣＦＰとの融合タンパク質としてＲＡＧＥを安定発現しているＣＨＯ（ＣＦＰ＿ＲＡＧＥ）を実験の４８時間前に、カバーガラスを入れたシャーレに播き（１０％ＦＣＳ、４ｍｇ/ｍｌＧ４１８含むＦ１２）、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２，３７℃）内で培養した。実験当日の細胞密度は８０％コンフルエントになるようにした。ＦＣＳを含まないＦ１２で洗浄し、必要に応じて、ＲＡＧＥの認識能を阻害することが知られているＲＡＧＥ中和抗体（ａｂｃａｍ社製）で１０分間前処理をした。続いてＡｌｅｘａ５５５で蛍光標識したリボース  ＡＧＥ：Ｒ−ＡＧＥ（代表的なＡＧＥの一つ、ＢＳＡをリボースと反応させることにより作製）を添加し１５分間反応させた。反応後に２％ホルマリンで固定し、スライドガラスにマウントして蛍光顕微鏡による観察に供した。
【０２６２】
結果として、ＣＦＰ＿ＲＡＧＥ安定発現株に、代表的なリガンドであるＡｌｅｘａ５５５標識Ｒ−ＡＧＥを取り込ませた場合、顕著な結合と取り込みが観察された。さらに、ＲＧＡＥ中和抗体で先に細胞を処理した場合、結合が消失した（図３Ａ，Ｂ）。
【０２６３】
同様に、ＮＰ−Ａと細胞を反応させ、間接蛍光抗体法によりＮＰ−Ａの結合を観察した。
【０２６４】
ＣＦＰとの融合タンパク質としてＲＡＧＥを安定発現しているＣＨＯ（ＣＦＰ＿ＲＡＧＥ）を実験の４８時間前に、カバーガラスを入れたシャーレに播き（１０％ＦＣＳ、４ｍｇ/ｍｌＧ４１８含むＦ１２）、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２，３７℃）内で培養した。実験当日の細胞密度は８０％コンフルエントになるようにした。ＦＣＳを含まないＦ１２で洗浄し、必要に応じて、ＲＡＧＥの認識能を阻害することが知られているＲＡＧＥ中和抗体（ａｂｃａｍ社製）で１０分間前処理をした。続いてＮＰ−Ａ（Ａｂｎｏｂａ社製，Ｔａｉｗａｎ）を添加し１５分間反応させた。反応後に２％ホルマリンで固定し、一次抗体である抗ＮＰ−Ａ抗体（免疫生物研究所製、マウスモノクローナル抗体）と反応後に、二次抗体であるＡｌｅｘａ５５５標識抗マウスＩｇＧと反応させた後、スライドガラスにマウントし、蛍光顕微鏡観察に供した。
【０２６５】
その結果、図３ＣおよびＤに示すように、ＲＡＧＥ発現細胞で顕著に観察されたＮＰ−Ａの結合は、ＲＡＧＥ中和抗体により完全に阻害された。このことから、ＮＰ−Ａが細胞上でＲＡＧＥに特異的に結合することが確認された。
【０２６６】
（実施例３：ＲＡＧＥ発現細胞をＮＰ−Ａで刺激した場合のＥＲＫ１／２の活性化（リン酸化）の確認）
本実施例では、ＮＰ−ＡがＲＡＧＥを介してシグナル伝達を惹起するか確認した。
【０２６７】
ＣＦＰ＿ＲＡＧＥ安定発現株を１２枚の３５ｍｍシャーレに実験の４８時間前に播き、ＣＯ２インキュベーター内で培養した。実験当日の細胞密度は８０％コンフルエントになるようにした。Ｆ１２で洗浄後に、Ｒ−ＡＧＥ、または、ＮＰ−Ａを添加し、各々０，２，５，１０，１５，３０分間培養し、冷たいＴＢＳで洗浄後に氷上におきＬｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ  （１％Ｔｒｉｔｏｎ−１００，プロテアーゼ阻害剤カクテルを含むＴＢＳ）１００μｌを添加し、Ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅを調製した。各反応時間のＣｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅ  １０μｇを１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより展開後にＰＶＤＦ膜に転写し、スキムミルクでブロッキング後に、一次抗体である抗ＥＲＫ１／２抗体（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、抗ウサギモノクローナル抗体）、若しくは、抗リン酸化ＥＲＫ１／２抗体（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、抗ウサギモノクローナル抗体）と反応させた後、二次抗体であるＨＰＲ標識抗ウサギＩｇＧ抗体と反応させ、ＥＣＬ  ｐｒｉｍｅにより発光シグナルをＸ線フィルムにより検出し、ＥＲＫ１／２の活性化（リン酸化で評価可能）が生じているか確認した。 
【０２６８】
ＭＡＰＫカスケード上にあるＥＲＫ１／２に着目したところ、ＮＰ−Ａ添加により、ＥＲＫ１／２の活性化（リン酸化）が観察された（図４左）。リン酸化の程度は１５分で最大になり、その後速やかに脱リン酸化され、３０分後には不活化されることが観察された（図４右）。このことは、ＮＰ−ＡがＲＡＧＥリガンドとして細胞に機能していることを示す。代表的なリガンドであるｒｉｂｏｓｅ−ＡＧＥの場合、シグナル強度がＮＰ−Ａに比べて強い他、リン酸化は添加後２分後から観察され、５分で最大になり、１５分後には完全に脱リン酸化される等、ＮＰ−Ａによる活性化と時間的な推移が異なる。ＮＰ−ＡによるＲＡＧＥを介したシグナル伝達は、細胞へ生じる機能変化がＡＧＥと異なっている可能性もある。
【０２６９】
（実施例４：ｒｉｂｏｓｅ  ＡＧＥ、ＮＰ−ＡによるＮＦｋＢの活性化）
本実施例では、ＮＰ−ＡのＲＡＧＥリガンドしての機能をさらに検証するために、ＮＰ−Ａによる制御因子であるＮＦκＢの活性化を確認した。ＮＦκＢの活性は、レポータージーンとしてルシフェラーゼを用い。その活性で評価した。
【０２７０】
Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅをレポーター遺伝子としてＮＦκＢプロモーター領域の下流に挿入したプラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）をＣＦＰ＿ＲＡＧＥ安定発現株にＬｉｐｏｆｅｃｔｒａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によりトランスフェクションし、一過性発現させた。トランスフェクション後４８時間後に、必要に応じて、ＲＡＧＥの認識能を阻害することが知られているＲＡＧＥ中和抗体（ａｂｃａｍ社製）で１０分間前処理をした。続いてＲ−ＡＧＥ、または、ＮＰ−Ａと１５分間させた後、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ用ｃｅｌｌ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）によりｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅを調製し、各ｌｙｓａｔｅのＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性を化学発光基質（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用して９６穴の白色プレートを用い、化学発光プレートリーダーにより測定した。
【０２７１】
その結果、ＮＰ−Ａ添加によりＲ−ＡＧＥ同様にＮＦκＢの活性化がみられた（図５）。この活性は、ＲＡＧＥ中和抗体により抑制されることから、ＮＰ−ＡはＲＡＧＥを介してＮＦκＢを活性化することが確認された。
【０２７２】
以上から、ＮＰ−ＡはＲＡＧＥリガンドとして機能する分子であることが明らかとなった。さらに、ＮＰ−Ａは、糖尿病血管障害の尿中マーカーとして非侵襲の検査に活用される可能性がある。
【０２７３】
（実施例５：ＮＰ−Ａの糖尿病または糖尿病性腎症の尿中マーカーとしての機能）
本実施例では、ＮＰ−Ａ濃度の時間経過の推移を観察した。手順は以下のとおりである。
【０２７４】
ＮＰ−Ａの糖尿病性腎症の尿中マーカーとしての有効性を明らかにするために、調製例（図１ー１、図１−２）およびこれまでの実施例とは独立した実験を行い、新たにストレプトゾトシンにより糖尿病を誘導したマウスの実験を行った（ストレプトゾトシン投与マウス１３匹、コントロールの健常マウス６匹）。糖尿病発症の指標となる血糖値は、８日目にはＳｔｚ群の１／３の個体で検出限界を超えた高い値を、他の個体でも４００ｍｇ／ｄｌ以上の値を示し、既に糖尿病を発症していると考えられる(詳細については、下記に示す表を参照）。
【０２７５】
そこでストレプトゾトシン投与マウス１３匹、コントロールの健常マウス６匹の尿からのＮＰ−Ａの検出を試みた（図５、図６）。
【０２７６】
ＲＡＧＥ１４３（２０μｇ／ｍｌ）を固定化したプレートに検体を分注し４℃で一晩反応させた。Ｎｏｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  ブロッキング液（Ｐｉｅｒｃｅ社）により、２時間室温でブロッキングした。続いて、検体１００μｌを各ウェルに添加し、４℃で一晩、反応させた。ＴＢＳ―Ｔｗｅｅｎ（０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０含ＴＢＳ）で洗浄後、ＮＰ−Ａ抗体（ｂｉｏｂｙｔ社、ウサギ  ポリクローナル抗体）１００μｌを各ウェルに添加し、室温で２時間反応し、続いて、二次抗体（ＨＰＲ標識抗ウサギＩｇＧ、Ｂｉｏｒａｄ社）と室温で１時間反応させた。ＨＲＰの基質であるＴＭＢ（Ｓｉｇｍａ社）５０μｌを各ウェルに添加し発色させ、５０μｌの１Ｎ  ＨＣｌを添加して反応を停止し、Ａ４５０の吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。
【０２７７】
その結果を図６に示す。０日目に対してのＯＤ値を１とした場合の相対値（Ｓｔｚ群では２２日目で上昇が検出されたが、コントロール群ではほとんど変動が観察されなかった。
【０２７８】
なお使用したマウスは、ゼロ日目の１９匹は全て同じ条件のマウスである。以下に血糖値の変化の推移を示す。
（血中ＨＰＸ、尿中ＮＰ−Ａ測定のために新たに開始したシリーズ２の血糖値変化）
【０２７９】
【表１】
0006004369.tif 000002
【０２８０】
開始時はコントロール群とした６匹の血糖値の方が高かったが、その後の血糖値の推移をみれば、Ｓｔｚ群では、測定限界を超えて高い値を示すなど高血糖を示すのに対して、コントロール群では、その後の上昇は観察されず、糖尿病を発症していないことが分かる。Ｓｔｚ群は、ｓｔｚ３，６を除き、他は全て糖尿病を発症していると考えられる。なお、３８日目のデータは全採血後に血糖値を測定しているため、その他のデータとは条件が異なることに留意されたい。いずれの条件でも、有意差は観察されているため、上記表では並列してデータを示す。
【０２８１】
クレアチニンについては、測定は和光純薬のラボアッセイＴＭクレアチニン（Ｊａｆｆｅ法）を用いたマイクロプレート法で測定した。尿中クレアチニンに関しては、コントロール群の採尿量が１００μｌ程度、Ｓｔｚ群の採尿量が１ｍｌ以上だったため、コントロール群は１０希釈、Ｓｔｚ群は原液で測定した。内標準がないため正確な比較は不可能であるものの、コントロール群とＳｔｚ群で顕著な差は認められなかった。より正確な腎症発症の指標となり得る血清クレアチニン濃度に関しては、コントロール群、Ｓｔｚ群とも、測定値はブランク値との差が＜０．０１の個体が殆どであるため、マイクロプレートを用いたＪａｆｆｅ法では検出限界以下に近いと考えられる。したがって、最終日の３８日目でも従来法であるＪａｆｆｅ法では糖尿病性腎症は発症していないとの判断が下される（図６Ｂ（尿中）および図６Ｃ（血中）を参照）。
【０２８２】
Ｓｔｚ刺激した本モデルでは、Ｓｔｚの刺激後通常２〜３ヶ月に、クレアチニン濃度の上昇で認められるような糖尿病性腎症を発症する（Ａｔｕｌ  Ａｒｙａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ６６，５７−６６  （２０１１），Ｊ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  anｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １３，２３３０−２３４１（２００９）を参照のこと。）。図２に示したＮＰ−Ａ同定のために先行して並行して作製したＳｔｚモデルの推移は以下のとおりである。すなわち、２１日目ではクレアチニン濃度の有意な上昇が認められなかったが７１日目にはクレアチニン濃度の有意な上昇が認められた（図１−２Ｂを参照）。Ｓｔｚモデルで後日発症する糖尿病性腎症発症は、本発明のマーカーを用いればクレアチニン濃度の有意な上昇を観察するはるか前に検出することができることが理解される。したがって、この点からも、本発明は、糖尿病性腎症発症の「予測診断」「早期診断」が可能であるといえる。
【０２８３】
理論に束縛されることを望まないが、本実施例に基づいて説明すると、糖尿病モデルとコントロールとの対比実験において、内標準に当たる物質がないため、暫定的にゼロ日目の値を「１」とした場合の相対値に換算した値をみると、ＮＰ−Ａに関しても、ゼロ日目の値を「１」とした相対値で示すと、採尿が可能であった２２日目には、Ｓｔｚ群のみで値が上昇していることが見出された。ただし、採尿量が確保できた個体数が少なく、コントロール群に比べＳｔｚ群は数十倍の薄い尿を大量に排出するため尿が異常に薄いことから、厳密な意味での統計学的比較はできていない。しかしながらＮＰ−Ａについても、上昇傾向は明確に示されていることから、必要に応じて尿の量等の他のパラメータを考慮しつつ、ＮＰ−Ａを糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症等の糖尿病合併症の予測診断ないし早期診断マーカーとして使用することができるといえる。また、糖尿病モデルであるＳｔｚ群において、糖尿病発症の指標となる血糖値は、８日目には１／３の個体で検出限界を超えた高い値を、他の個体でも４００ｍｇ／ｄｌ以上の値を示し、既に糖尿病を発症していると考えられる。１６日目以降もこの傾向は変わらなかった。一般的に、糖尿病の進展に伴い合併症である糖尿病性腎症リスクは増大するため、血糖値の管理は合併症の予防に重要であるが、血糖値自体は腎症発症のマーカーにはなり得ないため、腎症発症のマーカーに対する需要が高まっていた。本発明では、従来の腎症マーカー（クレアチニンなど）の増大に先立ち、ＮＰ−Ａが検出され、その検出に伴い腎症発症に対処した場合、腎症発症が抑制可能となることを見出した。したがって、従来の腎症マーカーとの対比でいえば、「予測診断」ということができる。実施例中で糖尿病を発症しているＳｔｚ群における血清クレアチン濃度は最終日でも顕著に増大しておらず、従来法では腎症との診断は実質的につかない。しかし、尿中ＮＰ−Ａではより顕著に上がっていたことから、腎症発症の「予測診断」「早期診断」が可能であることが実質的に示されたことになる。
【０２８４】
（実施例６：２Ｄ  ＤＩＧＥによるに血清中の分子の検出）
本実施例では、２Ｄ  ＤＩＧＥによるに血清中の分子の検出を試みた。
【０２８５】
各群由来の分子が結合したＲＡＧＥビーズを１ＭＮａＣｌ中に懸濁し、結合している分子を溶出させた。タンパク質濃度は１μｇ/μｌに調製した。ＣｙＤｙｅ  ＤＩＧＥ  Ｆｌｕｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｅｔｔａｎ  ＤＩＧＥ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）により、糖尿病性腎症発症群由来の分子５０μｇをＣｙ５で、健常群由来の分子５０μｇをＣｙ３により標識した。  両者を混合しＥｔｔａｎ  ＩＰＧｐｈｏｒ３によりＩｍｍｏｂｉｌｉｎｅ  ＤｒｙＳｔｒｉｐ  （ｐＨ  ３−１０）を膨潤化させた後、一次元目の等電点電気泳動を行った。泳動後のＳｔｒｉｐをＤＴＴ溶液、続いてヨードアセトアミド溶液により平衡化した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの上端にのせ、二次元目の泳動を行った。泳動終了後の蛍光像をＴｙｐｈｏｏｎ９４００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）により取得した。Ｃｙ５とＣｙ３の画像を重ね合わせることにより、両者に共通のスポット、特有のスポットを区別することが可能になる。続いて、ゲルを銀染色し、各スポットが肉眼でも確認可能なようにした。重ね合わせた蛍光画像と照らし合わせながら、健常群に特有のスポット、並びに、糖尿病性腎症発症群特有のスポットをクリーンベンチ内でくり抜いた。くり抜いたスポットを還元アルキル化後、トリプシンにより消化した。トリプシン処理により得られたペプチド断片をＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦ  ＭＳにより計測した。得られたスペクトルデータは、ＮＣＢＩｎｒ（ＮａｔｉｎａｌＣｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｎｏｎｒｅｄｕｎｄａｎｔ  ｖｅｒ．２０１１０３１２）のデータベースに基づき、Ｍａｓｃｏｔ  ＭＳ／ＭＳ  Ｉｏｎｓ  Ｓｅａｒｃｈ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  （Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｌｏｎｄｏｎ，  ＵＫ）により解析した。その結果、発症群特有の分子の一つとしてヘモペキシン（ＨＰＸ）が同定された。ＨＰＸは、急性期応答タンパク質であり炎症などの反応の際に急激に発現レベルが上がることが知られているが、糖尿病血管障害のマーカーとしての報告はない。健常群特有にＲＡＧＥに結合した分子として、トランスサイレチン（ＴＴＲ），と  キニノーゲン（ＫＮＮ）などが同定された。結果を図７に示す。
【０２８６】
ＴＴＲもＫＮＮも炎症反応に関わるカスケード上に存在する分子である。さらに、ＴＴＲは、チロキシンやレチノール結合タンパク質の輸送に関わると共に、アミロイドーシスの原因物質としても知られている。ＲＡＧＥとの関連での報告は以前からあったが、ＲＡＧＥリガンドであることを明確に示した報告はない。ＫＮＮは、炎症以外に、血液凝固カスケードに位置し、血栓などにも関係していることが方向されているが、ＲＡＧＥのリガンドであることは報告されていない。
【０２８７】
また、２Ｄ  ＤＩＧＥで同定された分子は、ＨＰＸ、ＴＴＲ、ＫＮＮのみではなく、以下のものがあった。また、複数のスポットがＨＰＸであるのは、糖鎖修飾の違いによるものである。
発症群特有の分子：ヘモペキシン、ヘモペキシン前駆体（プロタンパク質）、Ｐｆａ１、Ｉｇ  κ鎖、ナプシンＡ（ＮＰ−Ａ）、ナプシンＡ前駆体（プロタンパク質）、トランスフェリン
健常群特有の分子：第ＸＩＩ因子、Ｆ１２タンパク質、キニノーゲン−１  アイソフォーム１、キニノーゲン−１アイソフォーム−２、キニノーゲン−１  アイソフォーム３、キニノーゲン、プロテインＳ１００−Ａ８、血漿カリクレイン前駆体、血漿カリクレイン、β−２−グロビン，ヘモグロビンサブユニットβ−２、β−グロビン，α−１−グロビン、トランスサイレチン、補体Ｃ３
続いて、実施例７〜１０として、ＨＰＸ、ＴＴＲ、およびＫＮＮが、ＲＡＧＥリガンドとして機能するかＮＰ−Ａ同様の手順で検討した。
【０２８８】
（実施例７：ＨＰＸ（ヘモペキシン）がＲＡＧＥに認識され取り込まれることの確認）
本実施例では、ＨＰＸがＲＡＧＥに認識され取り込まれることを確認した。
【０２８９】
ＣＦＰとの融合タンパク質としてＲＡＧＥを安定発現しているＣＨＯ（ＣＦＰ＿ＲＡＧＥ）を実験の４８時間前に、カバーガラスを入れたシャーレに播き（１０％ＦＣＳ、４ｍｇ/ｍｌＧ４１８含むＦ１２）、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２，３７℃）内で培養した。実験当日の細胞密度は８０％コンフルエントになるようにした。ＦＣＳを含まないＦ１２で洗浄し、必要に応じて、ＲＡＧＥの認識能を阻害することが知られているＲＡＧＥ中和抗体（ａｂｃａｍ社製）で１０分間前処理をした。続いてＨＰＸ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加し１５分間反応させた。反応後に２％ホルマリンで固定し、一次抗体である抗ＨＰＸ抗体（Ａｂｎｏｖａ社、マウスモノクローナル抗体）と反応後に、二次抗体であるＡｌｅｘａ５５５標識抗マウスＩｇＧと反応させた後、スライドガラスにマウントし、蛍光顕微鏡観察に供した。
【０２９０】
図８に結果を示す。図８では、ＨＰＸ（ヘモペキシン）がＲＡＧＥに認識され取り込まれることの確認が示される。上段：ＲＡＧＥ発現細胞をＨＰＸと反応させた結果；下段：ＲＡＧＥ発現細胞をＲＡＧＥのリガンド認識を阻害するＲＡＧＥ中和抗体で処理した後にＨＰＸと反応させた結果。ＲＡＧＥに依存した認識と取り込みが確認できる（発症群特有にＲＡＧＥビーズに結合したＨＰＸが実際にＲＡＧＥに結合し取り込まれることが確認された）。左から順に位相差像、ＲＡＧＥ発現の蛍光像および取り込まれたＨＰＸの蛍光像を示す。
【０２９１】
（実施例８：ＴＲＲおよびＫＮＮがＲＡＧＥに結合することの確認）
本実施例では、ＴＲＲおよびＫＮＮがＲＡＧＥに結合することを確認した。
【０２９２】
ＣＦＰとの融合タンパク質としてＲＡＧＥを安定発現しているＣＨＯ（ＣＦＰ＿ＲＡＧＥ）を実験の４８時間前に、カバーガラスを入れたシャーレに播き（１０％ＦＣＳ、４ｍｇ/ｍｌＧ４１８含むＦ１２）、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２，３７℃）内で培養した。実験当日の細胞密度は８０％コンフルエントになるようにした。ＦＣＳを含まないＦ１２で洗浄し、必要に応じて、ＲＡＧＥの認識能を阻害することが知られているＲＡＧＥ中和抗体（ａｂｃａｍ社製）で１０分間前処理をした。続いてＴＴＲ（ＷＡＫＯ）、または、ＫＮＮ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加し１５分間反応させた。反応後に２％ホルマリンで固定し、一次抗体である抗ＴＴＲ抗体（Ａｂｎｏｖａ、マウスモノクローナル抗体）あるいは抗ＫＮＮ抗体（Ａｂｃａｍ、マウスモノクローナル抗体）と反応後に、二次抗体であるＡｌｅｘａ５５５標識抗マウスＩｇＧと反応させた後、スライドガラスにマウントし、蛍光顕微鏡観察に供した。
【０２９３】
結果を図９に示す。図９は、ＴＴＲおよびＫＮＮがＲＡＧＥに結合することの確認を示す。Ａ，Ｂ：ＴＴＲをＣＦＰ＿ＲＡＧＥ発現細胞と反応させた後、抗ＴＴＲ抗体による間接蛍光抗体法によりＴＴＲの結合を解析した。Ｃ，Ｄ：ＫＮＮをＣＦＰ＿ＲＡＧＥと反応させた後、抗ＫＮＮ抗体による間接蛍光抗体法によりＮＰ−Ａの結合を解析した。Ａ，Ｃ：ＲＡＧＥ発現細胞をリガンドと反応させた結果；Ｂ，Ｄ：ＲＡＧＥ発現細胞をＲＡＧＥ中和抗体（Ａｂ）で処理した後にリガンドと反応させた結果である。ＴＴＲ，  ＫＮＮ共に、ＲＡＧＥ発現細胞に結合し、その結合はＲＡＧＥ機能を阻害する特異的な抗体（中和抗体）により阻害されることが観察された。このことから、健常群特有にＲＡＧＥビーズに結合したＴＴＲとＫＮＮが、細胞上でもＲＡＧＥに結合する分子であることが確認された。
【０２９４】
（実施例９：ＨＰＸ刺激によるＲＡＧＥ発現細胞のＥＲＫのリン酸化）
本実施例では、ＨＰＸ刺激によるＲＡＧＥ発現細胞のＥＲＫのリン酸化を試みた。
【０２９５】
ＣＦＰ＿ＲＡＧＥ安定発現株を１２枚の３５ｍｍシャーレに実験の４８時間前に播き、ＣＯ２インキュベーター内で培養した。実験当日の細胞密度は８０％コンフルエントになるようにした。Ｆ１２で洗浄後に、Ｒ−ＡＧＥ、または、ＨＰＸを添加し、各々０，２，５，１０，１５，３０分間培養し、冷たいＴＢＳで洗浄後に氷上におきＬｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ  （１％Ｔｒｉｔｏｎ−１００，プロテアーゼ阻害剤カクテルを含むＴＢＳ）１００μｌを添加し、Ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅを調製した。各反応時間のＣｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅ  １０μｇを１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより展開後にＰＶＤＦ膜に転写し、スキムミルクでブロッキング後に、一次抗体である抗ＥＲＫ１／２抗体（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、抗ウサギモノクローナル抗体）、若しくは、抗リン酸化ＥＲＫ１／２抗体（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、抗ウサギモノクローナル抗体）と反応させた後、二次抗体であるＨＰＲ標識抗ウサギＩｇＧ抗体と反応させ、ＥＣＬ  ｐｒｉｍｅにより発光シグナルをＸ線フィルムにより検出し、ＥＲＫ１／２の活性化（リン酸化で評価可能）が生じているか確認した。 
【０２９６】
結果を図１０に示す。図１０には、ＨＰＸ刺激によるＲＡＧＥ発現細胞のＥＲＫのリン酸化が示される。上からＥＲＫ１、ＥＲＫ２、Ｐ−ＥＲＫ１、Ｐ−ＥＲＫ２のバンドを示す。左はリボースＡＧＥを示し、右はＨＰＸの発現を示す。発症群特有のリガンドであるＨＰＸによりＲＡＧＥ発現細胞を刺激すると、刺激直後からシグナル伝達系の一つであるＭＡＰＫカスケード上のＥＲＫのリン酸化が観察され始め、１５分後にリン酸化の程度は最大になった後、速やかな脱リン酸化が生じた。ＨＰＸがＲＡＧＥを介したシグナル伝達系を活性化させることが確認された。
【０２９７】
（実施例１０：ＴＲＲ，  ＫＮＮ刺激によるＲＡＧＥ発現細胞のＥＲＫのリン酸化）
本実施例では、ＴＲＲ，  ＫＮＮ刺激によるＲＡＧＥ発現細胞のＥＲＫのリン酸化を試みた。
【０２９８】
ＣＦＰ＿ＲＡＧＥ安定発現株を１２枚の３５ｍｍシャーレに実験の４８時間前に播き、ＣＯ２インキュベーター内で培養した。実験当日の細胞密度は８０％コンフルエントになるようにした。Ｆ１２で洗浄後に、ＴＴＲ、または、ＫＮＮを添加し、各々０，２，５，１０，１５，３０分間培養し、冷たいＴＢＳで洗浄後に氷上におきＬｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ  （１％Ｔｒｉｔｏｎ−１００，プロテアーゼ阻害剤カクテルを含むＴＢＳ）１００μｌを添加し、Ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅを調製した。各反応時間のＣｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅ  １０μｇを１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより展開後にＰＶＤＦ膜に転写し、スキムミルクでブロッキング後に、一次抗体である抗ＥＲＫ１／２抗体（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、抗ウサギモノクローナル抗体）、若しくは、抗リン酸化ＥＲＫ１／２抗体（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、抗ウサギモノクローナル抗体）と反応させた後、二次抗体であるＨＰＲ標識抗ウサギＩｇＧ抗体と反応させ、ＥＣＬ  ｐｒｉｍｅにより発光シグナルをＸ線フィルムにより検出し、ＥＲＫ１／２の活性化（リン酸化で評価可能）が生じているか確認した。 
【０２９９】
結果を図１１に示す。図１１に、ＴＴＲおよびＫＮＮ刺激によるＲＡＧＥ発現細胞のＥＲＫのリン酸化が示される。上から、ＥＲＫ−１，ＥＲＫ−２、Ｐ−ＥＲＫ１およびＰ−ＥＲＫ２のバンドを示す。左はトランスサイレチンを示し、右はキニノーゲンを示す。健常群特有のリガンドであるＴＴＲ，  ＫＮＮによりＲＡＧＥ発現細胞を刺激すると、刺激直後からシグナル伝達系の一つであるＭＡＰＫカスケード上のＥＲＫのリン酸化が観察され、５分後に脱リン酸化が生じていた。  ＴＴＲ，  ＫＮＮがＲＡＧＥを介したシグナル伝達系を活性化させることが確認された。活性化の程度は弱かった。
【０３００】
以上から、ＨＰＸ、ＴＴＲ、ＫＮＮがＲＡＧＥリガンドとして機能する分子であることが明らかとなった。
【０３０１】
（実施例１１：ＴＴＲ、ＨＰＸ、ＫＮＮによるＲＡＧＥを介したＮＦｋＢの活性化）
本実施例では、ＴＴＲ、ＨＰＸ、ＫＮＮによるＲＡＧＥを介したＮＦｋＢの活性化を試みた。
【０３０２】
Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅをレポーター遺伝子としてＮＦκＢプロモーター領域の下流に挿入したプラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）をＣＦＰ＿ＲＡＧＥ安定発現株にＬｉｐｏｆｅｃｔｒａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によりトランスフェクションし、一過性発現させた。トランスフェクション後４８時間後に、必要に応じて、ＲＡＧＥの認識能を阻害することが知られているＲＡＧＥ中和抗体（ａｂｃａｍ社製）で１０分間前処理をした。続いてＨＰＸ，ＴＴＲ，ＫＮＮのいずれかと１５分間させた後、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ用ｃｅｌｌ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）によりｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅを調製し、各ｌｙｓａｔｅのＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性を化学発光基質（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用して９６穴の白色プレートを用い、化学発光プレートリーダーにより測定した。
【０３０３】
結果を図１２に示す。図１２には、ＴＴＲ、ＨＰＸ、ＫＮＮによるＲＡＧＥを介したＮＦκＢの活性化が示される。ルシフェラーゼをレポーター遺伝子としてＮＦκＢの活性を評価した。ＲＡＧＥ発現細胞をＲＡＧＥ中和抗体による前処理を際の活性を１とした相対値で示した。ＴＴＲ、ＨＰＸ、ＫＮＮが、ＲＡＧＥを介してＮＦκＢの活性化することが確認された。
【０３０４】
（実施例１２：ＨＰＸの糖尿病または糖尿病性腎症の血中マーカーとしての機能）
さらに、ＨＰＸの糖尿病腎症の血中マーカーとしての有効性を明らかにするために、新たにストレプトゾトシンにより糖尿病を誘導したマウスの実験を行った（ストレプトゾトシン投与マウス１３匹、コントロールの健常マウス６匹）。糖尿病発症の指標となる血糖値は、８日目にはＳｔｚ群の１／３の個体で検出限界を超えた高い値を、他の個体でも４００ｍｇ／ｄｌ以上の値を示し（表１を参照）、既に糖尿病を発症していると考えられる。そこでストレプトゾトシン投与マウス１３匹、コントロールの健常マウス６匹の血清からのＨＰＸの検出を試みた。
【０３０５】
ＲＡＧＥ１４３（２０μｇ／ｍｌ）を固定化したプレートに検体を分注し４℃で一晩反応させた。Ｎｏｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  ブロッキング溶液（Ｐｉｅｒｃｅ社）により、２時間室温でブロッキングした。続いて、検体１００μｌを各ウェルに添加し、４℃で一晩、反応させた。ＴＢＳ―Ｔｗｅｅｎ（０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０含ＴＢＳ）で洗浄後、抗ＨＰＸ抗体（Ａｂｃａｍ社、ウサギ  ポリクローナル抗体）１００μｌを各ウェルに添加し、室温で２時間反応し、続いて、二次抗体（ＨＰＲ標識抗ウサギＩｇＧ、Ｂｉｏｒａｄ社）と室温で１時間反応させた。ＨＲＰの基質であるＴＭＢ（Ｓｉｇｍａ社）５０μｌを各ウェルに添加し発色させ、５０μｌの１Ｎ  ＨＣＬを添加して反応を停止し、Ａ４５０の吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。
【０３０６】
その結果を図１３ＡおよびＢに示す。図１３Ａは吸光度自体、図１３Ｂは０日目の値で正規化したものを示す。０日目に対して、のＯＤ値を１とした場合の相対値（Ｓｔｚ群では１６日目で上昇が検出されたが、コントロール群ではほとんど変動が観察されなかった。
【０３０７】
クレアチニン量については、実施例５に記載した（図６Ｂおよび図６Ｃを参照）ように、測定は和光純薬のラボアッセイＴＭクレアチニン（Ｊａｆｆｅ法）を用いたマイクロプレート法で測定した。尿中クレアチニンに関しては、コントロール群の採尿量が１００μｌ程度、Ｓｔｚ群の採尿量が１ｍｌ以上だったため、コントロール群は１０希釈、Ｓｔｚ群は原液で測定した。内標準がないため正確な比較は不可能であるものの、コントロール群とＳｔｚ群で顕著な差は認められなかった。より正確な腎症発症の指標となり得る血清クレアチニン濃度に関しては、コントロール群、Ｓｔｚ群とも、測定値はブランク値との差が＜０．０１の個体が殆どであるため、マイクロプレートを用いたＪａｆｆｅ法では検出限界以下に近いと考えられる。したがって、最終日の38日目でも腎症は発症していないことがわかった。その後の検査で腎症については確認した。なお、実施例５において説明したように、Ｓｔｚ刺激した本モデルでは、Ｓｔｚの刺激後通常２〜３ヶ月に、クレアチニン濃度の上昇が認められるような糖尿病性腎症を発症する（Ａｔｕｌ  Ａｒｙａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ６６，５７−６６  （２０１１），Ｊ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  anｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １３，２３３０−２３４１（２００９）））。図７に示したＨＰＸなどの同定のために先行して独立して作製したＳｔｚモデルの推移は以下のとおりである。すなわち、２１日目ではクレアチニン濃度の有意な上昇が認められなかったが７１日目にはクレアチニン濃度の有意な上昇が認められた（図１−２Ｂを参照。）。Ｓｔｚモデルで後日発症する糖尿病性腎症発症は、本発明のマーカーを用いればクレアチニン濃度の有意な上昇を観察するはるか前に検出することができることが理解される。したがって、この点からも、本発明は、糖尿病性腎症発症の「予測診断」「早期診断」が可能であるといえる。
【０３０８】
理論に束縛されることを望まないが、本実施例に基づいて説明すると、糖尿病モデルとコントロールとの対比実験において、ゼロ日目の値を「１」とした場合の相対値に換算した値をみると、ＨＰＸの場合、コントロール群の平均値はほとんど変化が無いのに対し、Ｓｔｚ群では、１６日目にＨＰＸ量の増加が検出されていることが見出された。この例示的な実施例では、データの値としては、ＯＤ値で０．０５程度と０．１以下の増大ではあるが、有意差が認められたことから、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症等の糖尿病合併症の予測診断ないし早期診断マーカーとして使用することができることが実証されたといえる。また、理論に束縛されることを望まないが、本実施例に基づいて説明すると、糖尿病モデルであるＳｔｚ群において、糖尿病発症の指標となる血糖値は、８日目には１／３の個体で検出限界を超えた高い値を、他の個体でも４００ｍｇ／ｄｌ以上の値を示し、既に糖尿病を発症していると考えられる。１６日目以降もこの傾向は変わらなかった。一般的に、糖尿病の進展に伴い合併症である糖尿病性腎症リスクは増大するため、血糖値の管理は合併症の予防に重要であるが、血糖値自体は腎症発症のマーカーにはなり得ないため、腎症発症のマーカーに対する需要が高まっていた。本発明では、従来の腎症マーカー（クレアチニンなど）の増大に先立ち、ＨＰＸが検出され、その検出に伴い腎症発症に対処した場合、腎症発症が抑制可能となることを見出した。したがって、従来の腎症マーカーとの対比でいえば、「予測診断」ということができる。実施例中で糖尿病を発症しているＳｔｚ群における血清クレアチン濃度は最終日でも顕著に増大しておらず、従来法では腎症との診断は実質的につかない。しかし、血清中のＨＰＸ濃度はゼロ日目よりも上がっており、尿中ＮＰ−Ａではより顕著に上がっていたことから、腎症発症の「予測診断」「早期診断」が可能であることが実質的に示されたことになる。
【０３０９】
（参考例）
本比較例では、上記実施例と同レベルの量のマーカーを従来の検出系で確認できるかを調べた。
【０３１０】
本例では、先に報告がある、ウエスタン・ブロットなどでは、ＨＰＸ，  ＮＰ−Ａ共に検出できるかを予備的な実験系で確認した。以下のように、ウエスタン・ブロットなどでは、ＨＰＸ，  ＮＰ−Ａ共に検出できなかった。以下にプロトコールを示す。
【０３１１】
まず、１１／１４（０日目）〜１２／１３（２９日目）血清２μｌをニトロセルロース膜にブロットし、５％  スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔ（０．１％  ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＴＢＳ）で１時間ブロッキング後、一次抗体：抗ＨＰＸ抗体（ウサギポリクローナル）と２時間反応させ、続いて二次抗体：ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧと１時間反応させた後、ＥＣＬ−Ｐｒｉｍｅを用いて検出した結果のＸ線フィルム像（露光時間は同一）を観察した。コントロール群（Ｃ）に対してＳｔｚ群（Ｓ）に顕著なシグナルの強さ、経過日数によるシグナルの増大などの傾向は認められなかった。ドットブロットの場合、非特異的なシグナルを拾っている可能性が高いため、１２／２２（３８日目）のサンプルに関しては、ドットブロットと並行してウェスタンブロットによる検出を試みた。
【０３１２】
１２／２２（３８日目）の血清１０μｌを１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し（夾雑物の影響で泳動が乱れる傾向にある）、続いてＰＶＤＦ膜に転写後に、ドットブロットと同様の手順でブロッキング、一次抗体、二次抗体と反応させ、ＥＣＬ  ｐｒｉｍｅにて検出したＸ線フィルム画像を観察した。期待されるＨＰＸの位置にシグナルは観察されなかった。同じサンプルをドットブロットにて解析した結果（スライド１の最下段と同一のデータ）を観察した。その結果、ドットブロットでは非特異的なシグナルを拾っていることが確認された。既に発表されている文献（非特許文献４：Pediatr. Nephrol., 20, 1410-1415 (2005)）中に、ネフローゼ症候群のひとつである微小変化型疾患（ＭＣＤ）ではあるが、血清中のＨＰＸをウェスタンブロットで検出したとの報告があるが、感度が悪く、上記実施例でＲＡＧＥ認識領域を活用した検出系では検出可能なレベルで設定した本実験のような微量のＨＰＸの検出には適用が困難であり、また夾雑物の影響により泳動パターンが安定しないことが確認された。
【０３１３】
１２／２２（３８日目）の尿１０μｌを１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し（夾雑物の影響で泳動が乱れる傾向にある）、続いてＰＶＤＦ膜に転写後に、ドットブロットと同様の手順でブロッキング、一次抗体、二次抗体と反応させ、ＥＣＬ  ｐｒｉｍｅにて検出したＸ線フィルム画像を観察した。しかしながら、期待されるＮＰ−Ａの位置にシグナルは観察されなかった。同じサンプルをドットブロットにて解析した結果（スライド１の最下段と同一のデータ）を観察したところ、ドットブロットでは非特異的なシグナルを拾っていることが確認された。また、ウエスタンブロットでは夾雑物の影響により泳動パターンが安定しないことが確認された。さらに、ドットブロットやウェスタンブロットでは、定量性が極めて悪いことがわかった。なお、使用した抗体は、抗原のホモロジーの高さからマウスおよびヒトの両方を認識するものと期待されるため、上記結果は、定量性の参考として参照することができることが理解される。
【０３１４】
以上から、本比較例では、濃縮後のドットブロットでも非特異的なシグナルも含むため、健常群、発症群での差を検出することは困難であった。ＲＡＧＥ認識領域固定化プレートを用いた場合のみ（上記実施例参照）、血清中のＨＰＸ，尿中のＮＰ−Ａ量に、有意差があることが示された。すなわち、従来技術としてＨＰＸを先に報告のあるウエスタンブロットによる検出を試みたが全く検出できなかった。
【０３１５】
したがって、本発明の方法は、きわめて有効な方法であるといえる。
【０３１６】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０３１７】
利用分野として食品産業、農林水産業、医療などの生物・生命関連分野が想定される。産業上の利用可能性として糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症等の糖尿病合併症、慢性腎症などの早期診断、予防効果の評価が意図され、特にヒトでのマーカーとしての利用が興味深い。
【配列表フリーテキスト】
【０３１８】
配列番号１：マウスナプシンＡをコードする核酸配列（アクセッション番号：BC014813.1  GI:15928693）
配列番号２：マウスナプシンＡのアミノ酸配列（４１９アミノ酸、１−２０：シグナルペプチド）（アクセッション番号：CAB82907.1  GI:7340352）
配列番号３：ヒトナプシンＡをコードする核酸配列（アクセッション番号：BC017842.1  GI:17389632）
配列番号４：ヒトナプシンＡのアミノ酸配列（アクセッション番号：NP_004842.1  GI:4758754）
配列番号５：マウストランスフェリンをコードする核酸配列（アクセッション番号：NM_133977.2  GI:118129942）
配列番号６：マウストランスフェリンのアミノ酸配列
配列番号７：ヒトトランスフェリンをコードする核酸配列（アクセッション番号：BC059367.1  GI:37747854）
配列番号８：ヒトトランスフェリンのアミノ酸配列（６９８アミノ酸）（アクセッション番号：AAB22049.1  GI:248648）
配列番号９：マウスヘモペキシンをコードする核酸配列（アクセッション番号：NM_017371.2  GI:160358828）
配列番号１０：マウスヘモペキシンのアミノ酸配列（４６０アミノ酸）（アクセッション番号：AAH11246.1  GI:15030012）
配列番号１１：ヒトヘモペキシンをコードする核酸配列（アクセッション番号：BC005395.1  GI:13529280）
配列番号１２：ヒトヘモペキシンのアミノ酸配列（４６２アミノ酸、１−２３：シグナルペプチド）（アクセッション番号：NP_000604.1  AAA58678）
配列番号１３：マウスキニノーゲンをコードする核酸配列（アクセッション番号：AY462056.1  GI:40715895）
配列番号１４：マウスキニノーゲン（ＨＭＷ  Kininogen-II）のアミノ酸配列：
（アクセッション番号：AAR88630.1）
配列番号１５：ヒトキニノーゲンをコードする核酸配列（アクセッション番号：M11437.1  GI:186751）
配列番号１６：ヒトキニノーゲンのアミノ酸配列：（spricing form )（アクセッション番号：AAB59551.1  GI:386853）
配列番号１７：ヒトキニノーゲンのアミノ酸配列：（spricing form )（アクセッション番号：AAB59550.1  GI:386852）
配列番号１８：マウストランスサイレチンをコードする核酸配列（アクセッション番号：NM_013697.5  GI:291463252）
配列番号１９：マウストランスサイレチンのアミノ酸配列（アクセッション番号：NP_038725.1  GI:7305599）
配列番号２０：ヒトトランスサイレチンをコードする核酸配列（アクセッション番号：BC020791.1  GI:18089144）
配列番号２１：ヒトトランスサイレチンのアミノ酸配列（アクセッション番号：AAH20791.1）
配列番号２２：ヒトトランスサイレチンをコードする核酸配列（アクセッション番号：BC005310.1  GI:13529049）
配列番号２３：ヒトトランスサイレチンのアミノ酸配列（アクセッション番号：AAH05310.1）
配列番号２４：ＰＲ−Ｌｏｘ−１またはＬｏｘ−１をコードする核酸配列
配列番号２５：ＰＲ−Ｌｏｘ−１またはＬｏｘ−１のアミノ酸配列
配列番号２６：ＲＡＧＥまたはｍＲＡＧＥをコードする核酸配列
配列番号２７：ＲＡＧＥまたはｍＲＡＧＥのアミノ酸配列
配列番号２８：ＲＡＧＥ８またはｍＲＡＧＥ８をコードする核酸配列
配列番号２９：ＲＡＧＥ８またはｍＲＡＧＥ８のアミノ酸配列
配列番号３０：ＲＡＧＥ１またはｍＲＡＧＥ１をコードする核酸配列
配列番号３１：ＲＡＧＥ１またはｍＲＡＧＥ１のアミノ酸配列
配列番号３２：ＲＡＧＥ２またはｍＲＡＧＥ２をコードする核酸配列
配列番号３３：ＲＡＧＥ２またはｍＲＡＧＥ２のアミノ酸配列
配列番号３４：ＲＡＧＥ３またはｍＲＡＧＥ３をコードする核酸配列
配列番号３５：ＲＡＧＥ３またはｍＲＡＧＥ３のアミノ酸配列
配列番号３６：ＲＡＧＥ４またはｍＲＡＧＥ４をコードする核酸配列
配列番号３７：ＲＡＧＥ４またはｍＲＡＧＥ４のアミノ酸配列
配列番号３８：ＲＡＧＥ７またはｍＲＡＧＥ７をコードする核酸配列
配列番号３９：ＲＡＧＥ７またはｍＲＡＧＥ７のアミノ酸配列
配列番号４０：ＲＡＧＥ１４３またはｍＲＡＧＥ１４３をコードする核酸配列
配列番号４１：ＲＡＧＥ１４３またはｍＲＡＧＥ１４３のアミノ酸配列
配列番号４２：ＲＡＧＥ２２３またはｍＲＡＧＥ２２３をコードする核酸配列
配列番号４３：ＲＡＧＥ２２３またはｍＲＡＧＥ２２３のアミノ酸配列
配列番号４４：ＲＡＧＥ２２６またはｍＲＡＧＥ２２６をコードする核酸配列
配列番号４５：ＲＡＧＥ２２６またはｍＲＡＧＥ２２６のアミノ酸配列
【図１−１】
0006004369.tif 000003
【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
0006004369.tif 000009
【図７】
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【図８】
0006004369.tif 000011
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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