(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で示される環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩を含有することを特徴とする抗菌剤。
【化１】
0005863648.tif 000014
［式（１）中、Ｒ１は置換基を有していてもよい炭素数が７、８又は９のアシル基を示し、Ｒ２はメチル基又は水素原子を示し、Ｒ３はエチル基又はメチル基を示す。］
【請求項２】
請求項１に記載の環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩を含有することを特徴とする微生物防除剤。
【請求項３】
請求項１に記載の環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩を含有することを特徴とする抗グラム陽性菌剤。
【請求項４】
請求項１に記載の環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩を含有することを特徴とする抗メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）剤。
【請求項５】
請求項１に記載の環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩を含有することを特徴とする抗バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）剤。
【請求項６】
請求項１に記載の環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩を含有することを特徴とする感染症治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な化学構造を有する化合物とその製造方法、及びその化合物を含有する感染症治療薬とその化合物を産生する新規微生物に関する。【０００２】
また、本発明は、リソバクター属に属する新規な微生物の産生する培養物から分画された抗生物質を含有する画分、その抗生物質の製造方法及びそれから得られる抗生物質に関し、更に、上記画分から得られる、抗菌活性を示すが治療効果を示さない抗生物質と、抗菌活性を示し治療効果も示す抗生物質の使用方法とそれらの製造方法に関する。【０００３】
更に、本発明は抗生物質を産生する微生物、その微生物の培養による新規抗生物質の製造方法及びその新規抗生物質に関する。
【背景技術】
【０００４】
抗生物質は、微生物の防除や感染症の治療に必要不可欠なものとなっている。しかしながら、抗生物質の過度の使用はそれに対する耐性菌を生み、その結果多くの薬剤に耐性を有する多剤耐性菌が出現し臨床上大きな問題となっている。特にメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（以下、「ＭＲＳＡ」と略記する）は、臨床現場での出現頻度が高く、社会的な問題に発展している。更に、ＭＲＳＡに対する最終的な治療薬として用いられることの多いバンコマイシンに対して耐性を有する腸球菌（バンコマイシン耐性腸球菌、以下、「ＶＲＥ」と略記する）も、本邦の臨床現場から分離されるようになり、多剤耐性菌に対する新たな治療薬の提供が切望されている。【０００５】
特に、ＭＲＳＡに有効なバンコマイシンに対して耐性を示すＶＲＥの出現は、より深刻に受け止められている。なぜならば、腸球菌自体が腸管内に常在している菌であるため潜在的な保菌者を発生させ易く、長期間、患者の体内に存在することによって他の菌に耐性遺伝子が伝播して、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＶＲＳＡ）等を発生させる危険性が高まると予想されるからである。【０００６】
また、耐性菌出現の問題とは別に、バンコマイシン等に比べて安全性の点でも優れ、実質的に治療効果の高い抗生物質を求める声も大きく、そのため、ＭＲＳＡやＶＲＥに有効であると共に既存薬に比べて副作用等が少なく安全性も高い新規抗生物質を得るための検討が進められている。【０００７】
そのような新たな治療薬として完全化学合成による合成抗生物質であるリネゾリドが知られている。また、各種の微生物の産生する抗生物質の中から、上記の多剤耐性菌に有効性を示す抗生物質を見出すための検討も多数行われている（特許文献１〜３）。これらのうち、特許文献１と２には、上記の多剤耐性菌に有効性を示す抗生物質を産生するリソバクター属に属する微生物とその微生物を用いた抗生物質の製造方法が記載されている。【０００８】
先の目的の為に、新規な化学構造を有する抗生物質の創出や既存の抗生物質の改良等の合成による探索と共に、これまで報告されていない新規で有用な抗生物質を産生する能力を有する新規微生物の探索も幅広く行われている。微生物の産生する抗生物質は生体内で産生される天然物であるため、化学合成品に比べて生体に対する安全性の高いものが多いと考えられるからである。【０００９】
新たな抗生物質を産生する微生物として、既に多くの種類の微生物が報告されており、本発明で用いるキサントモナス科のリソバクター属に属する微生物もそのような微生物として特許文献１、２、５等に報告されている。これらの内、特許文献２と特許文献５には、上記多剤耐性菌に抗菌活性を示す抗生物質を産生する菌とその菌を用いた抗生物質の製造方法が記載されている。【００１０】
多剤耐性菌の中でも、臨床上特に問題となっているメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（以下、「ＭＲＳＡ」と略記する）、バンコマイシン耐性腸球菌（以下、「ＶＲＥ」と略記する）に対して抗菌活性を有し、かつ優れた治療効果を示す新たな抗生物質の提供が強く望まれている。しかしながら、これまで報告されている多剤耐性菌に有効な抗生物質はほとんどがＭＲＳＡのみに抗菌活性を示す抗生物質であり、同時にＶＲＥに対しても抗菌活性を示す抗生物質の報告例は少ない。ＭＲＳＡとＶＲＥの両者に有効な抗生物質の例としては、特許文献３に報告されている抗生物質の中に上記両多剤耐性菌にインビトロで抗菌活性を示す（以下、特に付記がない限り、抗菌活性は「インビトロで示される抗菌活性」の意味で記載する。）抗生物質が記載されている。【００１１】
また、特許文献１と特許文献２にはリソバクター（ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属、特許文献６にはフラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、特許文献７にはストレプトマイセス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する新規微生物とその微生物から産生され、製造される新規抗生物質が記載されている。【００１２】
一方、本発明者は、抗生物質の探索に有用に用いられる、カイコ（カイコガの幼虫）を実験動物とする「カイコ黄色ブドウ球菌感染モデル」（特許文献４）を構築し、その検討を進めていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特許第３３３９２３５号公報
【特許文献２】特許第４０５４５７６号公報
【特許文献３】特許第４０５７４２６号公報
【特許文献４】特開２００７−３２７９６４号公報
【特許文献５】特公平６−９９４４４号公報
【特許文献６】特開２００３−１１３１９２号公報
【特許文献７】特開２００７−１３１５５２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
上記特許文献２と３には、ＭＲＳＡだけでなくＶＲＥに対しても有効性を示す抗生物質が記載されている。しかしながら、従来の報告例の多くは、特許文献１のようにＭＲＳＡに対する有効性だけが記載されており、ＶＲＥに対する有効性を示す抗生物質はほとんど報告されていないのが現状である。そこで耐性菌の出現の可能性を考慮すると、ＭＲＳＡだけでなくＶＲＥにも有効性を示し、特許文献２、特許文献３等の既存の抗生物質とは異なる化学構造を有し、耐性菌に対する作用機序も既存の治療薬と異なることが期待できる抗生物質の選択肢を更に増やす必要がある。【００１５】
また、従来の報告例のほとんどは、最小発育阻止濃度（以下、「ＭＩＣ」と略記することがある）で評価したインビトロにおける抗菌活性を中心に抗生物質が選択されており、インビボにおける治療効果を含めた評価によって抗生物質が選択された例はほとんどなく、最後に治療効果の篩が残っているため、実用化へのハードルが高いという問題がある。【００１６】
以上より、本発明の最初の課題は、従来の薬剤とは異なる化学構造を有する新規な化合物を提供することにあり、更には、多剤耐性菌にも有効な新規な化合物を提供することにある。【００１７】
また、多くの候補化合物から目的の化合物を選別する際に、抗菌活性だけでなく、治療効果も含めて評価して選別することで、既に実用化へのハードルが低くなっている「治療効果の高い新規な化合物」を提供することにある。【００１８】
更に、上記したように、多剤耐性菌をターゲットとした抗生物質は多いが、ＶＲＥに対して明確に有効性を示す抗生物質は少なく、実用化されているＶＲＥ用抗生物質としてはオキサゾリジノン系抗生物質であるリネゾリド(ｌｉｎｅｚｏｌｉｄ)が知られている程度である。しかしながらリネゾリドは完全化学合成によって創出された合成抗生物質であり、生体に対する安全性の問題と既存薬剤に対する耐性菌の出現の可能性を考慮すると、ＶＲＥに有効な多剤耐性菌用の抗生物質の選択肢を更に増やす必要があった。【００１９】
一方、微生物の産生する物質からＶＲＥに対して有効性を示す抗生物質を得ることができれば、完全化学合成品に比べて医薬品の開発・製造に必要なハードルを低くできる可能性が高い。なぜならば、少なくとも、製造は培養法によって行うことができるため、特殊な触媒等の薬剤や高温高圧が必要な化学合成法による製造よりも低コストで安全な製造を行うことが可能と考えられるからである。【００２０】
そのような微生物の産生する物質でＶＲＥに有効な抗生物質として、上記特許文献２に記載の抗生物質の中に、ＭＲＳＡとＶＲＥの両者に抗菌活性を示す抗生物質が記載されている。しかし、それらは、インビボにおける感染症の治療効果（以下、特に付記しない限り、「治療効果」とは、インビボの評価系で確認された感染症の治療の効果の意味で記載する）を示すかどうかまでは記載されていない。これは、従来、抗生物質の治療における有効性は最小発育阻止濃度（以下、「ＭＩＣ」と略記する）で評価した抗菌活性の大きさがその抗生物質の治療効果の大きさに反映されるとして評価していたからである。従来は「治療効果」を簡便に評価する方法がなかったこともＭＩＣによる評価にたよらざるを得なかった理由と考えられる。しかしながら、後述する本発明者の検討結果からＭＩＣによって評価された「抗菌活性の大きさ」は、必ずしもそれらの抗生物質の「治療効果の大きさ」を反映していないことが確認されたのである。【００２１】
つまり、従来報告されている抗生物質については、そのほとんどがＭＩＣによる抗菌活性が評価されて選別され、「抗菌活性」の大きさのみが開示されているのであり、その「治療効果」の大きさについてまで開示されているとはいえないものであった。【００２２】
従って、微生物の産生する抗生物質を含有する画分（以下、「抗生物質含有画分」と記載する）や、その画分から得られる抗生物質を提供するにあたって、それらの示す抗菌活性だけでなく、その治療効果も評価した上で選別することが重要であり、従って、そのように選別された従来ない有用性の高い抗生物質含有画分や、その画分から得られる抗生物質を提供することが本発明の解決すべき課題となった。【００２３】
そして上記課題を解決することで、抗菌活性を示しかつ治療効果も示す抗生物質含有画分とそこから得られる抗生物質を選別できると共に、抗菌活性は示すが治療効果を示さない抗生物質含有画分や抗生物質を選別することも可能となることに思い当たった。更に、前者が感染症治療剤として有用性が高いことは当然であるが、従来注目されることがなかった後者の抗生物質含有画分等も、微生物防除剤として用いた場合、これらは治療剤として用いられることはないので多剤耐性菌の出現を実質的に考慮する必要がなく、従って微生物防除剤として好適に用いられる性質を有することに思い当たった。【００２４】
すなわち、本発明の２番目の課題は、従来ない有効性を有する微生物の産生する抗生物質含有画分、そこから得られる抗生物質とその製造方法を提供することであり、更に、上記抗生物質含有画分や抗生物質が、抗菌活性だけでなくその治療効果の有無も含めて評価されて選別された抗生物質含有画分と抗生物質を提供することである。更に、多剤耐性菌に治療効果を示す抗生物質含有画分と抗生物質を提供することである。また、上記抗生物質含有画分又は抗生物質を含有する微生物防除剤を提供することである。【００２５】
一方、微生物の産生する物質から得られる抗生物質は生体に対する安全性に関し合成品より優れている可能性が高いと予想され、そのような抗生物質は医薬品とするための開発ステップを軽減できると考えられる。例えば、製造方法においても化学合成の場合よりも生体に優しい原材料を用いることができ、工程や設備も、製造条件が常温常圧に近いので、より簡便で安全な工程・設備により行うことができるというメリットを有する。そのため、化学合成により創出された抗生物質より医薬品開発ステップを軽減できる可能性が高い。【００２６】
しかし、ＭＲＳＡに対して有効性を示すだけでなく、ＶＲＥに対しても抗菌性を示す抗生物質を産生する微生物については、特許文献２のような例はあるものの、実際の治療における治療効果や耐性菌の出現等を考慮すると、更に検討を進める必要があった。つまりＭＲＳＡだけでなくＶＲＥに対しても抗菌活性を有し、実際に治療効果を示す抗生物質を産生するという特徴を有する微生物を新たに見出すと共に、その微生物を用いたＭＲＳＡとＶＲＥの両者に有効性を示す新たな抗生物質とその製造方法の提供が望まれていた。【００２７】
また、ＭＲＳＡ、ＶＲＥ等に対する抗菌活性の有無にかかわらず、広く新規な抗生物質を得るためには、新規な微生物の提供が望まれていた。【００２８】
本発明は、上記に鑑みてなされたものであり、本発明の３番目の課題は、抗生物質を産生することができる新規な微生物を提供することにあり、また、抗生物質の製造方法に用いられる新規な微生物を提供することにある。特に、少なくともＭＲＳＡとＶＲＥの両者に有効性を示す多剤耐性菌に有効な新規な抗生物質を産生することができる新規な微生物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
本発明者は、上記の事情に鑑み、抗生物質を産生する新規微生物と、その微生物から得られる抗生物質含有画分、そこから得られる抗生物質を得るために、上記微生物の培養上清から得られる抗生物質含有画分や、その画分に分離・精製処理を加えて得られた抗生物質を評価する方法の検討を行った。その結果、微生物や培養上清中の抗生物質を分離・精製する方法の取捨選択に当たり、各試料の抗菌活性については黄色ブドウ球菌に対するＭＩＣで評価し、それと共にそれらの治療効果についても併せて評価するという方法に思い当たった。そして、各試料の治療効果の大きさの評価方法として、上記した特許文献４の、カイコを実験動物として用いたカイコ黄色ブドウ球菌感染モデルを適用し、目的とする微生物株や上記有用性の高い抗生物質含有画分を取得するための検討を行った。【００３０】
その結果、国内各地で採取した土壌中から分離した土壌細菌１４３４６株の内その培養上清に黄色ブドウ球菌に対する抗菌活性を認めた菌株が３４８７株あり、それらの菌の培養上清の示す上記カイコ黄色ブドウ球菌感染モデルにおける治療効果を検討したところ、治療効果を示した微生物は４５株に減少した。このことから、ＭＩＣで評価した抗菌活性は、評価された抗生物質の、ＭＩＣ対象菌の惹起した感染症に対する「治療効果」を保証するものではないことが確認された。【００３１】
そして、上記４５株の培養上清から得られた抗生物質含有画分の抗菌スペクトルを検討したところ、４５株の中にＭＲＳＡとＶＲＥの両多剤耐性菌に抗菌活性を示す微生物が含まれており、更に、その微生物の培養物から分画された抗生物質含有画分中には、マウス黄色ブドウ球菌感染モデルにおいて、バンコマイシンと比較して同等又はそれより高い治療効果を示す抗生物質が含まれていることを見出した。そして、上記高い治療効果を示した抗生物質について、その化学構造を含めて詳細に検討したところ、その抗生物質は、新規抗生物質であることを確認した。【００３２】
また、他の抗生物質含有画分の抗菌スペクトルの検討や、その画分中の抗生物質の検討も行ったところ、他の抗生物質含有画分の抗菌スペクトルも上記新規抗生物質と同様であり、その化学構造も上記新規抗生物質の関連化合物であることが明らかとなり、最終分画段階の上記新規抗生物質以外の他の抗生物質含有画分も有用性の高い画分であることを確認した。【００３３】
また、上記新規抗生物質を含む画分の示す治療効果（ＥＤ５０：５０％効果用量）は、精製初期画分の３００倍に濃縮されているのに対し、抗菌活性（ＭＩＣ）は５倍に濃縮されているに過ぎないことが確認された。【００３４】
この事実は、後述する分画操作法によって得られた精製初期の抗生物質含有画分中には抗菌活性は比較的高いが治療効果をほとんど示さない抗生物質が高い割合で含まれていることを示している。従って、精製初期の抗生物質含有画分に含まれるこれらの抗生物質は感染症治療剤としては用い難いものと考えられた。【００３５】
しかしながら、見方を変えると、抗菌活性は高いが治療効果を示さないということは、そのような抗生物質は感染症の治療剤として用いることは実質的にないので、逆に微生物防除剤等の抗菌剤に適していると評価することができる。なぜならば、治療剤には用いられないので、抗菌剤として用いた場合に懸念される多剤耐性菌の出現を考慮する必要がないからである。また、精製後半の分画からは除かれているので、上記新規抗生物質との化学構造上の類似性もないことが確認されており、感染症治療剤として選別された抗生物質との交差反応による多剤耐性菌の出現も考慮する必要はない。【００３６】
つまり、精製初期の分画から得られる、抗菌活性は高いが治療効果が弱い抗生物質含有画分や、そこから得られる抗生物質も、微生物防除を用途とする場合は非常に有用性の高い画分である。【００３７】
更に、以上のＭＲＳＡとＶＲＥに抗菌活性を示す抗生物質含有画分や、抗生物質を産生する微生物は、性状分析や１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列等の解析結果、その産生物の新規性等からリソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する新規微生物（以下、「ＲＨ２１８０−５」と表記する）であることも判明し、本発明の抗生物質含有画分やそこから得られる抗生物質は新規微生物から得られるものであることが明らかとなり本発明を完成するに至った。【００３８】
また、上記「マウス黄色ブドウ球菌感染モデル」において高い治療効果を示した抗生物質についてその化学構造を含めて詳細に検討したところ、その抗生物質は新規な化学構造を有する環状ペプチド化合物であることを確認した。また、培養上清中には、かかる物質以外にも同様の化学構造を有する関連の環状ペプチド化合物が含まれていること、それらも、かかる物質同様の抗菌スペクトルを示すことを確認した。【００３９】
すなわち、本発明は、以下を提供するものである。
＜１＞
下記式（１）で示される環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩。
【化１】
0005863648.tif 000002
［式（１）中、Ｒ１は置換基を有していてもよい炭素数が７、８又は９のアシル基を示し、Ｒ２はメチル基又は水素原子を示し、Ｒ３はエチル基又はメチル基を示す。
＜２＞
上記式（１）中のＲ１の置換基が水酸基である＜１＞に記載の環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩。
＜３＞
上記式（１）中のＲ１が、３−ヒドロキシ−５−メチル−ヘキサノイル基、３−ヒドロキシ−６−メチル−ヘプタノイル基又は３−ヒドロキシ−７−メチル−オクタノイル基である＜１＞に記載の環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩。
＜４＞
上記式（１）中のＲ１が３−ヒドロキシ−５−メチル−ヘキサノイル基であり、Ｒ２がメチル基であり、Ｒ３がエチル基である＜１＞に記載の環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩。
＜５＞
上記式（１）中のＲ１が３−ヒドロキシ−７−メチル−オクタノイル基であり、Ｒ２がメチル基であり、Ｒ３がエチル基である＜１＞に記載の環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩。
＜６＞
独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）における受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−８７０のリソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属するＲＨ２１８０−５株、又はその株と同様の化合物を産生する能力を有する変異株を培養し、その培養物から得られる＜１＞ないし＜５＞の何れかに記載の環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩。【００４０】
＜７＞
＜１＞ないし＜６＞の何れかに記載の環状ペプチド化合物を産生する能力を有する、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）における受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−８７０のリソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属するＲＨ２１８０−５株、又はその株と同様の化合物を産生する能力を有する変異株を培養し、その培養物から製造することを特徴とする＜１＞ないし＜６＞の何れかに記載の環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩の製造方法。【００４１】
＜８＞
＜１＞ないし＜６＞の何れかに記載の環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩を、製薬学的に許容し得る担体と共に含んでなる感染症治療薬。【００４２】
＜９＞
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−８７０のリソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物を培養し、その培養物には＜１＞ないし＜６＞の何れかに記載の環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩が含有され、該培養物を分画することによって得られることを特徴とする抗生物質含有画分。
＜１０＞
上記抗生物質含有画分が、抗菌活性を示す抗生物質を含む画分である＜９＞に記載の抗生物質含有画分。
＜１１＞
上記抗生物質含有画分が、少なくとも、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）とバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）の両者に抗菌活性を示すものである＜９＞又は＜１０＞に記載の抗生物質含有画分。
＜１２＞
上記抗生物質含有画分が、少なくとも、黄色ブドウ球菌による感染症に治療効果を示す抗生物質を含む画分である＜９＞ないし＜１１＞の何れかに記載の抗生物質含有画分。
＜１３＞
上記抗生物質含有画分が、少なくとも、黄色ブドウ球菌による感染症にバンコマイシンに比較して同等又はそれより高い治療効果を示す抗生物質を含む画分である＜１２＞に記載の抗生物質含有画分。
＜１４＞
上記抗生物質含有画分が、抗菌活性を示すが実質的に治療効果を示さない抗生物質を含有する画分である＜９＞又は＜１０＞に記載の抗生物質含有画分。
＜１５＞
上記抗菌活性を示すが実質的に治療効果を示さない抗生物質が、微生物防除剤として用いられるものである＜１４＞に記載の抗生物質含有画分。【００４３】
＜１６＞
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−８７０のリソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物を培養し、その培養物には＜１＞ないし＜６＞の何れかに記載の環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩が含有され、該培養物から、抗菌活性を示す抗生物質及び／又は感染症に治療効果を示す抗生物質を、分離・精製することを特徴とする抗生物質の製造方法。
＜１７＞
上記抗生物質が、少なくとも、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）とバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）の両者に抗菌活性を示すものである＜１６＞に記載の抗生物質の製造方法。
＜１８＞
上記抗生物質が、少なくとも、黄色ブドウ球菌による感染症に治療効果を示すものである＜１６＞又は＜１７＞に記載の抗生物質の製造方法。
＜１９＞
上記抗生物質が、抗菌活性を示すが実質的に治療効果を示さない抗生物質である＜１６＞に記載の抗生物質の製造方法。【００４４】
＜２０＞
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−８７０のリソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物を培養し、その培養物には＜１＞ないし＜６＞の何れかに記載の環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩が含有され、該培養物から得られることを特徴とする抗生物質。
＜２１＞
上記抗生物質が、少なくとも、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）とバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）の両者に抗菌活性を示すものである＜２０＞に記載の抗生物質。
＜２２＞
上記抗生物質が、少なくとも、黄色ブドウ球菌による感染症に治療効果を示すものである＜２０＞又は＜２１＞に記載の抗生物質。
＜２３＞
上記抗生物質が、少なくとも、黄色ブドウ球菌による感染症にバンコマイシンに比較して同等又はそれより高い治療効果を示すものである＜２２＞に記載の抗生物質。
＜２４＞
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−８７０のリソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物を培養し、その培養物には＜１＞ないし＜６＞の何れかに記載の環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩が含有され、該培養物から得られ、少なくとも、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）とバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）の両者に抗菌活性を示し、かつ、少なくとも、黄色ブドウ球菌による感染症に治療効果を示すことを特徴とする抗生物質。
＜２５＞
下記式（１）で示される＜２０＞ないし＜２４＞の何れかに記載の抗生物質。
【化２】
0005863648.tif 000003
［式（１）中、Ｒ１は水酸基を１つ有する炭素数が７、８又は９のアシル基を示し、Ｒ２はメチル基又は水素原子を示し、Ｒ３はエチル基又はメチル基を示す。］【００４５】
＜２６＞
＜９＞又は＜１０＞に記載の抗生物質含有画分を含有することを特徴とする微生物防除剤。
＜２７＞
＜２０＞に記載の抗生物質を含有することを特徴とする微生物防除剤。【００４６】
＜２８＞
リソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−８７０の微生物又はその自然的若しくは人工的に変異した微生物であって、下記式（１）で示される化合物又はその塩を産生する能力を有する微生物。
【化３】
0005863648.tif 000004
［式（１）中、Ｒ１は水酸基を１つ有する炭素数が７、８又は９のアシル基を示し、Ｒ２はメチル基又は水素原子を示し、Ｒ３はエチル基又はメチル基を示す。］
＜２９＞
上記抗生物質が、少なくともメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）及びバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）に対して抗菌活性を有するものである＜２８＞に記載の微生物。
＜３０＞
配列表の配列番号１で示される１６Ｓ  ｒＲＮＡ領域の塩基配列を有する＜２８＞又は＜２９＞に記載の微生物。
【発明の効果】
【００４７】
本発明によれば、感染症等に有効な新規な化学構造を有する化合物を提供することができる。更には、ＭＲＳＡ、ＶＲＥ等の多くの多剤耐性菌に有効性を示す新規な化学構造を有する化合物又はその塩、及びそれらの製造方法、並びにそれらの化合物を産生する新規な微生物を提供することができる。【００４８】
更に、本発明によれば、新たな微生物により産生される有用な抗生物質を含有する画分と、その抗生物質を提供することができる。更に、該抗生物質の中には、ＭＲＳＡだけでなくＶＲＥにも抗菌活性を示すものがあり、また、黄色ブドウ球菌に高い治療効果を示すものがある。従って、極めて有用な新規抗生物質を含有する画分や、その新規抗生物質を提供することができるという効果を有している。【００４９】
更に、本発明によれば、抗菌活性を有する上記抗生物質を産生することのできる新規な微生物を提供することができる。特に、本発明の微生物が産生した抗生物質には、ＭＲＳＡやＶＲＥに抗菌活性を有し、治療効果も高いことが確認されているものが存在するので、多剤耐性菌に対して有効性の高い新規な抗生物質を産生することができる新規な微生物を提供することができるという効果を有している。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】ＲＨ２１８０−５の培養物から得られた治療効果を示す物質を含有する画分のＯＤＳカラムによる分画結果を示す図である。縦軸は吸収強度、横軸は溶出時間（分）を示す。また別枠で表示した各ピークの欄上の数字は各ピーク物質の分子量を示す。
【図２】ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質のアミノ酸組成分析の解析結果を示す図である。
【図３】ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ分析の解析結果を示す図である。縦軸はシグナル強度、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。
【図４】ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質のＴＯＦ（Ｔｉｍｅ  ｏｆ  Ｆｌｉｇｈｔ：飛行時間型）ＭＳのＭＳ−ＭＳ分析の解析結果を示す図である。
【図５】ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ１物質とＰｅａｋ２物質のＴＯＦ（Ｔｉｍｅ  ｏｆ  Ｆｌｉｇｈｔ：飛行時間型）ＭＳのＭＳ−ＭＳ分析の解析結果を示す図である。
【図６】ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ３物質とＰｅａｋ４物質のＴＯＦ（Ｔｉｍｅ  ｏｆ  Ｆｌｉｇｈｔ：飛行時間型）ＭＳのＭＳ−ＭＳ分析の解析結果を示す図である。
【図７】ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ６物質とＰｅａｋ７物質のＴＯＦ（Ｔｉｍｅ  ｏｆ  Ｆｌｉｇｈｔ：飛行時間型）ＭＳのＭＳ−ＭＳ分析の解析結果を示す図である。
【図８】ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ８物質とＰｅａｋ９物質のＴＯＦ（Ｔｉｍｅ  ｏｆ  Ｆｌｉｇｈｔ：飛行時間型）ＭＳのＭＳ−ＭＳ分析の解析結果を示す図である。
【図９】各解析結果から導き出されたＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の化学構造を示す図である。
【図１０】各解析結果から導き出されたＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質のアミノ酸の立体構造も明らかにした化学構造を示す図である。
【図１１】ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の溶菌活性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
以下、本発明について説明するが、本発明は、以下の具体的態様に限定されるものではなく、技術的思想の範囲内で任意に変形することができる。
【００５２】
＜本発明の環状ペプチド化合物＞
本発明は、下記式（１）で表されることを特徴とする新規な化合物に係るものであり、３７員環の環状ペプチド構造を基本骨格とし、Ｒ１からＲ３の基の違いにより、複数の化合物が確認されている。これらは、本発明者が見出した、後述する新規微生物株であるイソバクター  エスピーＲＨ２１８０−５の培養物から、後述する最終精製段階であるＲＰ−ＨＰＬＣで分取されたピーク画分中から単離されたが、本発明の「下記式（１）で示される環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩」を得る方法は、上記方法には限定されず、如何なる方法で得られたものでもよく、微生物が産生したものには限定されない。
【００５３】
なお、それぞれの単離・精製された化合物は、以下、便宜上、上記微生物株の株名にピーク名をつけ、例えば、ピーク１から得られた化合物であれば、「ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ１物質」、又は単に「Ｐ１」と表記することとする。
【００５４】
【化４】
0005863648.tif 000005
［式（１）中、Ｒ１は置換基を有していてもよい炭素数が７、８又は９のアシル基を示し、Ｒ２はメチル基又は水素原子を示し、Ｒ３はエチル基又はメチル基を示す。
【００５５】
上記式（１）中のＲ１は、置換基を有していてもよい炭素数が７、８又は９のアシル基を示す。上記アシル基の炭素数には「Ｃ＝Ｏ」の炭素数（１個）も含まれる。置換基を除いた「炭素数が７、８又は９のアシル基」は、「Ｒ’−Ｃ（＝Ｏ）−」で表わされ、ここで、Ｒ’は、炭素数が６、７又は８のアルキル基を示す。また、Ｒ’は直鎖であっても分岐を有していてもよいが、分岐を有していることが好ましい。また、分岐された部分はメチル基であることが好ましく、特に限定はないが、Ｒ’の「Ｃ＝Ｏ」とは反対側の末端は、「ＣＨ３（ＣＨ３）ＣＨ−」となっていることが特に好ましい。また、Ｒ’すなわちＲ１が分岐を有する場合には、上記Ｒ１の炭素数（７、８又は９）には、分岐された部分の炭素数も含まれる。また、下記表１に示すＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ１物質〜ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ９物質における上記式（１）中のＲ１の置換基は、水酸基である。
【００５６】
具体的には、上記式（１）中のＲ１は、３−ヒドロキシ−５−メチル−ヘキサノイル基、３−ヒドロキシ−６−メチル−ヘプタノイル基又は３−ヒドロキシ−７−メチル−オクタノイル基であることが好ましい。
【００５７】
また、上記式（１）で示される「環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩」は、Ｒ１が３−ヒドロキシ−５−メチル−ヘキサノイル基であり、Ｒ２がメチル基であり、Ｒ３がエチル基であるものが好ましく、Ｒ１が３−ヒドロキシ−７−メチル−オクタノイル基であり、Ｒ２がメチル基であり、Ｒ３がエチル基であるものが好ましい。
【００５８】
式（１）中に示されるＲ１、Ｒ２、Ｒ３と各ピークから得られた物質との関係を、表１に示す。この内、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質とＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ９物質についてはＲ１、Ｒ２、Ｒ３の構造が確定しているが、他のピークから得られた物質についてはＲ１の構造が完全には確定していないので、表１中のＲ１の構造式は主に精密質量分析の結果の解析と生合成経路からによるものである。後述する各ピーク物質の抗菌スペクトルの検討結果から、Ｒ１の違いは抗菌スペクトルに特に影響を与えていないという傾向が明確に認められている。従って、少なくともこれらの側鎖は、置換基を有していてもよいアシル基であればよく、好ましくは置換基を有していてもよい炭素数が７ないし９のアシル基であればよい。
【００５９】
【表１】
0005863648.tif 000006
表１中、「高分解能質量分析」は、ＨＲ  ＴＯＦ  ＭＳ  ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋
【００６０】
＜本発明の環状ペプチド化合物の調製方法＞
本発明の環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩の調製方法は特に限定されず、微生物が産生したものであってもよいし、合成したものであってもよいし、それらを組み合わせたものでもよい。
【００６１】
＜本発明の環状ペプチド化合物の単離精製方法＞
本発明の新規な環状ペプチド化合物の単離精製方法は、カイコ黄色ブドウ球菌感染モデルにおける治療効果を指標として選択されたものであるが、その方法に特に限定されるものではなく、一般的に微生物の培養物から目的の化合物を精製する方法として用いられている方法を適宜組み合わせて実施すればよい。
【００６２】
具体的には、溶媒抽出、転溶、水沈殿、ＯＤＳカラム等によるクロマトグラフィー、ＯＤＳカラム等を用いたＲＰ−ＨＰＬＣによる分取等が挙げられる。上記溶媒抽出の溶媒や転溶の溶媒としては特に限定はないが、アセトン等の水溶性溶媒；ブタノール等の親水性溶媒；それらの混合溶媒；水と親水性溶媒との混合溶媒；水と水溶性溶媒との混合溶媒；等が好ましい。また、ＯＤＳカラムの代わりに、オクチル基やブチル基で修飾した担体、ポリスチレン系のポリマー担体等を充填したカラムを用いてもよい。
【００６３】
なお、上記した単離精製方法は一例に過ぎず、最終的に目的とする本発明の新規な環状ペプチド化合物が得られる方法であれば、如何なる単離精製方法であってもよい。
【００６４】
＜単離精製された本発明の環状ペプチド化合物の構造解析＞
以上の精製方法を実施した場合、最終的にＲＰ−ＨＰＬＣによって、ＲＨ２１８０−５の培養物から少なくとも９つのピークに分けられる９つの化合物を分取することができる（図１）。これらは、ＲＰ−ＨＰＬＣより前段階の単離精製方法によっては単一の画分中に存在する化合物群であって、また、ＵＶ吸収パターンが類似していることから、互いに類似する化合物群である。
【００６５】
これらの９つのピークのうちの主要なピークであるピーク５からのＲＰ−ＨＰＬＣ精製標品を構造解析の例として挙げる。その構造解析方法は既存の構造解析手段を適宜組み合わせて行えばよいが、次の解析手段により効率よく実施することができる。すなわち、精密質量分析による分子量測定、酸加水分解処理後のアミノ酸分析（図２）、１Ｈ−ＮＭＲと１３Ｃ−ＮＭＲによる解析（図３）、ＴＯＦ（Ｔｉｍｅ  ｏｆ  Ｆｌｉｇｈｔ：飛行時間型）ＭＳ解析（図４はピーク５、図５はピーク１と２、図６はピーク３と４、図７はピーク６と７、図８はピーク８と９の、ＴＯＦ−ＭＳ解析結果。）、その他、ＵＶスペクトル（図１）や、赤外線吸収スペクトル（ＩＲ）で解析することができる。
【００６６】
以上の構造解析手段を実施した結果、ピーク５から得られた物質は、精密質量分析により、分子量が１６１６．９［ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳで、（Ｍ＋Ｈ）＋が、ｍ／ｚ＝１６１７．８７５５］；アミノ酸分析により、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｕ、Ａｒｇがそれぞれ２分子、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅがそれぞれ１分子検出された（図２）。そして、最終的にピーク５から得られた物質は、式（１）のＲ１が３−ヒドロキシ−５−メチル−ヘキサノイル、Ｒ２がメチル、Ｒ３がエチルである新規な環状ペプチド骨格を有する新規な化合物であることが判明した。そしてこの新規な化合物を、「ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質」（以下、単に「Ｐ５」と記載することもある。）と命名した。
【００６７】
また、同様に、ピーク９から得られた物質は、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質のＲ１の炭素数が２つ延長した形の化合物であることが確定し、「ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ９物質」（以下、単に「Ｐ９」と記載することもある。）と命名した。また、他のピークから得られた物質も、同じ環状ペプチド構造を基本骨格として有する化合物であることが判明し、同様に「ＲＨ２１８０−５」にＰｅａｋ番号ｎを付する形で命名した（以下、単に「Ｐｎ」と記載することもある。）。
【００６８】
＜本発明の環状ペプチド化合物ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の物理化学的性状＞
以上の本発明の新規な環状ペプチド構造を有する新規な化合物のうち、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の物理化学的性状は次の通りである。
【００６９】
（１）高分解能質量分析値  ＨＲ  ＴＯＦ  ＭＳ  ｍ／ｚ  （Ｍ＋Ｈ）＋：
１６１７．８７５５
ＴＯＦ（Ｔｉｍｅ  ｏｆ  Ｆｌｉｇｈｔ：飛行時間型）ＭＳ解析：図４
（２）１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ：図３
【００７０】
（３）溶媒への溶解性：
水、エタノール、メタノール、アセトニトリルに溶解
クロロホルムに不溶
（４）外観：白色粉末
【００７１】
＜本発明の環状ペプチド化合物の微生物を用いた製造方法＞
本発明の新規な環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩は、化学合成によっても、それを産生する微生物の培養によって得られるものであってもよく、製造方法は特に限定されないが、上記の環状ペプチド化合物を産生する能力を有する、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）における受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−８７０のリソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属するＲＨ２１８０−５株、又はその株と同様の化合物を産生する能力を有する変異株を培養し、その培養物から製造することが好ましい。
【００７２】
すなわち、本発明は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）における受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−８７０のリソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属するＲＨ２１８０−５株、又はその株と同様の化合物を産生する能力を有する変異株を培養し、その培養物から得られる前記式（１）で表わされる環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩でもある。
【００７３】
＜本発明の抗生物質含有画分＞
更に、本発明は、配列表の配列番号１で示される１６Ｓ  ｒＲＮＡ領域の塩基配列を有する受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−８７０のリソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物を培養し、その培養物には上記の環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩が含有され、該培養物を分画することによって得られることを特徴とする抗生物質含有画分である。
【００７４】
なお、バクテリアの一般的な性状として、その菌株としての性質は変異し易いため、ＲＨ２１８０−５が、上記した性状の範囲内に留まらない可能性も有している。しかしながら、ＲＨ２１８０−５（受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−８７０）から変異した微生物であってもリソバクター属に属する微生物であり、抗生物質含有画分を産生する能力を有している限り、ＲＨ２１８０−５（受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−８７０）に含まれるものである。
【００７５】
また、上記変異には自然的な変異と人工的な変異の両方を含むことは言うまでもないことである。
【００７６】
本発明の抗生物質含有画分は、上記ＲＨ２１８０−５を培養し、その培養物に対して何らかの分画処理を施したものを言う。ここで「培養物」とは、培養上清、培養した菌体、培養した菌体の破砕物等の何れをも意味するものである。また、「分画処理」とは、通常、培養物に対して行われる抽出、沈殿、膜分離、転溶、クロマトグラム等の、目的物質の分離・精製を目的として行われる処理を全て含むものである。
【００７７】
本発明の抗生物質含有画分の使用については、そこに含まれる抗生物質が、抗菌活性を示し、更に治療効果も示すものは、感染症治療剤の製造に用いることができ、抗菌活性を示すが、治療効果を示さないものは、微生物防除剤の製造に用いることができる。抗菌活性を示すが実質的に治療効果を示さない抗生物質を含有する抗生物質含有画分は、本発明の１つの態様である。
【００７８】
微生物防除剤としての使用方法は、特に制限はないが、例えば、抗菌性が求められる資材、用具等の表面に塗布、浸漬、湿潤させて用いる方法を挙げることができる。より具体的には、例えば、医療用のガーゼや包帯等に付着させたり浸潤させて用いたり、絆創膏等の各種の皮膚用粘着シートに用いる粘着剤の抗菌成分や塗り薬中の抗菌成分として好適に用いることができる。本発明の抗生物質含有画分は、抗菌活性を示すが実質的に治療効果を示さない抗生物質が微生物防除剤として用いられる（微生物防除剤としての用途に用いられる、及び／又は、微生物防除剤として用いられる性能を有している）ものであることが好ましい。
【００７９】
通常、抗生物質は、多剤耐性菌の出現に留意する必要から微生物防除剤として用いることは難しいが、本発明における治療効果を示さない抗生物質含有画分とそこから得られる抗生物質は、そのような心配なしに微生物防除剤として用いることができる。微生物防除剤として用いる場合、抗生物質含有画分は、画分のまま用いたり、画分を濃縮するだけでも用いたりすることができ、また、その画分から抗生物質を分離・精製して、その抗生物質を用いることもできる。それらの処理はそれぞれの用途に応じて選択すればよい。
【００８０】
以上、治療効果の有無を問わず、本発明の抗生物質含有画分は、ＲＨ２１８０−５を培養し、培養物を分画処理することによって得ることができる。
【００８１】
本発明の抗生物質含有画分と各画分から得られる抗生物質を産生する微生物は、沖縄の土壌中から分離した多くの微生物の中から、ＭＩＣによる抗菌活性と、特許文献４に記載されたカイコ黄色ブドウ球菌感染モデルを用いた方法で治療効果を評価されて選別された微生物である。
【００８２】
＜本発明の微生物であるＲＨ２１８０−５について＞
以下、本発明の微生物であるＲＨ２１８０−５について詳述する。リソバクター属に属する「ＲＨ２１８０−５株」と命名した微生物（以下、「ＲＨ２１８０−５」と表記する）を新規に発見した。このＲＨ２１８０−５は、千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８、独立行政法人製品評価技術基盤機構（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ、以下、「ＮＩＴＥ」と略記する）、特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に、２０１０年１月２５日に国内寄託され、受託番号「ＮＩＴＥ  Ｐ−８７０」として受託された微生物である。
「ＲＨ２１８０−５」は、その後、千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に、原寄託申請書を提出して、国内寄託（原寄託日：２０１０年１月２５日）から、ブダペスト条約に基づく寄託への移管申請を行ない（移管日（国際寄託日）：２０１１年５月２０日）、生存が証明され、ブダペスト条約に基づく寄託（国際寄託）への移管申請が受領された結果、受託番号「ＮＩＴＥ  ＢＰ−８７０」を受けているものである。
【００８３】
本発明の微生物は、リソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−８７０の微生物又はその自然的若しくは人工的に変異した微生物であって、抗菌活性を有する抗生物質を産生する能力を有する微生物である。リソバクター属に属する新規な微生物であることは、後述する本菌株の性質と１６Ｓ  ｒＲＮＡ領域の配列から同定された。
【００８４】
形態：本ＲＨ２１８０−５は、グラム陰性の桿菌であり、鞭毛は認められないが滑走性が認められる。子実体の形成は認められない。また抗酸性を示さない。
【００８５】
培地における生育状況：
（１）肉汁寒天平板上では薄黄色のコロニーを形成する。拡散性の色素は認められない。
（２）肉汁ゼラチン穿刺培養では内部に渡ってゼラチンを液化しながら生育する。
【００８６】
生理学的性質：本ＲＨ２１８０−５の生理学的、化学分類学的性質は以下の通りである
（１）生育ｐＨ（最適生育ｐＨ）：５〜９（６〜８）
（２）生育温度（至適生育温度）：１０〜４０℃（２５〜３０℃）
（３）酸素に対する態度：好気的
（４）ＭＲテスト（Ｍｅｔｈｙｌ  ｒｅｄ  ｔｅｓｔ）：−
（５）ＶＰテスト（Ｖｏｇｅｓ−Ｐｒｏｓｃａｕｅｒ  ｔｅｓｔ）：＋
（６）色素の生成（Ｐｉｇｍｅｎｔ）：＋
（７）オキシダーゼ（Ｏｘｉｄａｓｅ  ｔｅｓｔ）：＋
（８）カタラーゼ（Ｃａｔａｌａｓｅ  ｔｅｓｔ）：＋
（９）ウレアーゼ（Ｕｒｅａｓｅ  ｔｅｓｔ）：−
（１０）フォスファターゼ（Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｔｅｓｔ）：＋
（１１）カゼイン加水分解（Ｃａｓｅｉｎ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ）：＋
（１２）セルロース加水分解（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ）：−
（１３）ゼラチン加水分解（Ｇｅｌａｔｉｎ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ）：＋
（１４）でんぷん加水分解（Ｓｔａｒｃｈ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ）：−
（１５）デオキシリボヌクレアーゼ（Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｔｅｓｔ）：＋
（１６）硝酸塩還元（Ｎｉｔｒａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）：−
（１７）脱窒（Ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）：−
（１８）硫化水素生成（Ｈ２Ｓ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）：−
（１９）インドール生成（Ｉｎｄｏｌｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）：−
（２０）クエン酸塩の利用（Ｃｉｔｒａｔｅ  ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ）：＋
（２１）ＯＦ−ｔｅｓｔ：ｏｘｉｄａｔｉｏｎ
（２２）下記の糖類等からの酸及びガスの生成能
Ｌ−アラビノース（Ｌ−ａｒａｂｉｎｏｓｅ）：−
Ｄ−キシロース（Ｄ−ｘｙｌｏｓｅ）：−
Ｄ−グルコース（Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ）：＋
Ｄ−マンノース（Ｄ−ｍａｎｎｏｓｅ）：＋
Ｄ−フラクトース（Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｓｅ）：＋
Ｄ−ガラクトース（Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｅ）：−
Ｄ−マルトース（Ｄ−ｍａｌｔｏｓｅ）：＋
Ｄ−スクロース（Ｄ−ｓｕｃｒｏｓｅ）：＋
Ｄ−ラクトース（Ｄ−ｌａｃｔｏｓｅ）：＋
Ｄ−トレハロース（Ｄ−ｔｒｅｈａｌｏｓｅ）：＋
Ｄ−ソルビトール（Ｄ−ｓｏｒｂｉｔｏｌ）：−
グリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）：−
スターチ（ｓｔａｒｃｈ）：−
【００８７】
分子生物学的解析結果：分子生物学的な系統分類の指標として用いられている１６Ｓ  ｒＲＮＡに関するＲＨ２１８０−５の解析結果は以下の通りである。
＜＜１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列＞＞
（１２）１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列の解析結果
ＲＨ２１８０−５のコロニーから、コロニーＰＣＲにより、１６Ｓ  ｒＲＮＡ領域の塩基配列を増幅し、シーケンサーによる解析を行った結果、５’末端側、３’末端側のいくつかの塩基を除く１６Ｓ  ｒＲＮＡのほぼ全長に当たる塩基配列が見出された。この塩基配列を配列表の配列番号１に示す。配列表の配列番号１の塩基配列は、１６Ｓ  ｒＲＮＡの全長ではないため、１６Ｓ  ｒＲＮＡ「領域」とした。この塩基配列をＮＣＢＩのＢＬＡＳＴで相同性検索を行ったところ、ＲＨ２１８０−５の１６Ｓ  ｒＲＮＡ領域の塩基配列は、リソバクター属であるＬｙｓｏｂａｃｔｅｒ  ｅｎｚｙｍｏｇｅｎｅｓ  ＤＳＮ２０４３Ｔ株の塩基配列と相同率９９％を示した。なお、上記Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ  ｅｎｚｙｍｏｇｅｎｅｓには、抗生物質産生の報告はないので、ＲＨ２１８０−５とは異なるものである。
【００８８】
以上のＲＨ２１８０−５の性質をバージース・マニュアル・オブ・システマティックバクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３  １９８９）による分類及びその他の文献の記載内容に照らし合わせ、更に、１６Ｓ  ｒＲＮＡ解析の結果を考慮して総合的に判断した結果、ＲＨ２１８０−５は、リソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物であると判断した。
【００８９】
＜ＲＨ２１８０−５の新規性等＞
また、ＲＨ２１８０−５の１６Ｓ  ｒＲＮＡ領域の塩基配列に一致する１６Ｓ  ｒＲＮＡ領域の塩基配列を有する微生物が存在しないこと、ＲＨ２１８０−５の産生する化合物が、上記したように、新規な環状ペプチド構造を基本骨格とする新規な化合物であること、また、その化合物がＭＲＳＡだけでなくＶＲＥにも抗菌活性を示し、ＭＲＳＡによる感染症に対しマウスにおいて治療効果が確認されたこと、後述するＲＨ２１８０−５の産生する抗生物質のいくつかが、ＭＲＳＡだけでなくＶＲＥにも抗菌活性を示すという先行例の少ない抗菌スペクトルを有すること、黄色ブドウ球菌による感染症に、バンコマイシンに比較してより高い治療効果を示すこと、これまでに報告されていない有用性の高い新規な抗生物質を産生する等を含め総合的に判断した結果、ＲＨ２１８０−５は、新規な微生物株であると判断した。
【００９０】
ＲＨ２１８０−５は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）、特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に、国際寄託され、受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−８７０（原寄託日：２０１０年１月２５日、国際寄託日（移管日）：２０１１年５月２０日）を受けており、入手可能である。なお、バクテリアの一般的な性状として、その菌株としての性質は変異し易いため、ＲＨ２１８０−５は、先に示した生理学的性状の範囲内に留まらない可能性も有している。また、かかる「変異」には、自然的な変異と人工的な変異の両方を含むことは言うまでもない。ＲＨ２１８０−５（受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−８７０）から変異した微生物であっても、抗生物質を産生する能力を有している限り、本発明の微生物に含まれるものである。本発明の前記式（１）で示される環状ペプチド化合物は、ＲＨ２１８０−５（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−８７０）から変異した微生物が産生したものも含まれる。また、本発明の抗生物質含有画分とそこから得られる抗生物質は、このＲＨ２１８０−５の培養物から得ることができる。
【００９１】
すなわち、本発明の微生物は、リソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−８７０の微生物又はその自然的若しくは人工的に変異した微生物であって、抗菌活性を有する抗生物質を産生する能力を有する微生物である。また、配列表の配列番号１で示される１６Ｓ  ｒＲＮＡ領域の塩基配列を有する上記の微生物である。好ましくは、本発明の微生物は、上記式（１）で示される化合物又はその塩を産生する能力を有する微生物である。
【００９２】
更に好ましくは、本発明の微生物は、産生される抗生物質が、少なくともメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）及びバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）に対して抗菌活性を有するものである上記の微生物である。すなわち、少なくともＭＲＳＡ及びＶＲＥに抗菌活性を有する抗生物質を産生する能力を有しているＮＩＴＥ  ＢＰ−８７０の微生物や、ＮＩＴＥ  ＢＰ−８７０から変異した微生物は、更に好ましい本発明の微生物に含まれるものである。また言うまでもなく、その変異には自然的な変異と人工的な変異を含むものである。
【００９３】
＜ＲＨ２１８０−５の培養方法＞
以下に、ＲＨ２１８０−５の培養方法について記載する。本発明の新規な環状ペプチド構造を有する新規な化合物、抗生物質含有画分等を産生するＲＨ２１８０−５の培養方法は、リソバクター属の微生物に対して行われる一般的な培養方法に準じて行えばよい。具体的には、ＲＨ２１８０−５を、ＹＭＥ培地、ＳＧＭ培地、ＣＤＹ培地、ＹＰＧＭ培地等の栄養源含有培地に接種し、好気的条件下で培養を行う。培地中の炭素源としては、例えば、Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、シュクロース、デンプン、デキストリン、グリセリン、糖蜜、水飴、油脂類等の有機炭素化合物が用いられ、窒素源としては、肉エキス、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、胚芽、大豆粉、尿素、アミノ酸、アンモニウム塩等の有機・無機窒素化合物を用いることができる。また、塩類は、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩、鉄塩、銅塩、亜鉛塩、コバルト塩等の無機塩類を必要に応じて適宜添加する。更に、ビオチン、ビタミンＢ１、シスチン、オレイン酸メチル、ラード油等の生育促進物質を添加することが、目的物の産生量を増加させる点で好ましい。また、シリコン油、界面活性剤等の消泡剤を添加してもよい。
【００９４】
培養条件は、先に記したように好気的条件下で培養することが好ましく、液体培養法であれば通気攪拌培養が望ましい。小規模であればフラスコによる振とう培養法を用いてもよい。培養温度は２０℃〜４０℃で可能であるが、２５℃〜３５℃間に保つことが好ましく、３０℃近辺で行うことがより好ましい。培養ｐＨは、６〜８が好ましく、７付近で行うことが特に好ましい。培養期間は、用いた培地組成、培養温度等により変動するファクターであるが、ＲＨ２１８０−５の場合、通常は１〜２０日間程度、好ましくは３〜７日間程度の短期間に充分な量の目的物を確保することができる。
【００９５】
＜抗菌活性成分の精製方法＞
ＲＨ２１８０−５の培養物からの抗菌活性成分の回収は、通常の微生物培養物から生理活性物質を回収し精製する方法で行えばよい。ここで培養物とは、培養上清、培養菌体、培養菌体破砕物を含むものである。例えば、培養物に抽出処理としてアセトン等の適当な有機溶媒を加えて懸濁した後に、遠心分離やろ過膜分離等を行って菌体と分離した抽出上清に対して、通常用いられる単離精製処理を加えればよい。また必要に応じて残った菌体残渣を摩砕処理等してから再度抽出処理を行ってもよい。
【００９６】
通常、目的物質の分離・精製時に用いられる抽出溶媒や分離・精製手法は、ＭＩＣで判定された抗菌活性の濃縮度を指標として、その取捨選択が行われる。単なる抗菌活性成分の分離、濃縮であれば基本的にそのような手法でも問題はない。しかしながら、本発明のＲＨ２１８０−５の産生する抗生物質含有画分や抗生物質の分離・精製に当たっては、ＭＩＣの結果だけでなく、特許文献４で示したカイコ黄色ブドウ球菌感染モデルに対する治療効果を指標とした選択を行っている。その結果、ＭＩＣの結果を見ただけでは濃縮・精製することが困難であったと考えられる「ＲＨ２１８０−５の産生する新規な抗生物質」の濃縮・精製が成し遂げられたのである。そこで、その点に関し次に記載する。
【００９７】
＜カイコ黄色ブドウ球菌感染モデルにおける治療効果を指標とした抗生物質の分離・精製＞
（ＭＩＣによる有用菌株の絞込み）
本発明においても、数万株の非常に多くの菌株から有用菌株の絞込みを行う一次スクリーニングは、抗菌活性を評価する方法であれば何れの方法でも行うことができるが、例えば、ＭＩＣを指標として各種菌株の培養上清中に黄色ブドウ球菌に対して抗菌活性の認められた検体をピックアップすることができる。まったく抗菌活性を認めない菌株は検討対象とならないからである。抗菌活性を評価する方法であれば何れの方法であってもよいが、ＭＩＣを指標として各種供試菌株の培養上清中に黄色ブドウ球菌に対して抗菌活性の認められた菌株をピックアップする方法が好ましい。その後、菌株数が数千から数百程度に絞り込まれたら、それらから得られる抗生物質含有画分や抗生物質の治療効果の評価はカイコ黄色ブドウ球菌感染モデルを用いてそのＥＤ５０を測定することで検討することができる。
【００９８】
カイコ黄色ブドウ球菌感染モデルに対して治療効果の認められた菌株については、更に各種の分離・精製操作を行い、操作ごとにカイコ黄色ブドウ球菌感染モデルで治療効果を評価する。また各精製段階の抗生物質含有画分を投与して行った分離・精製操作の種類や手法による治療効果の濃縮度についてもカイコ黄色ブドウ球菌感染モデルで確認する。そうして「治療効果」を効果的に濃縮できる分離・精製操作の種類や手法を選別していく。
【００９９】
このような「治療効果を指標にした菌株や分離・精製操作方法の取捨選択」をマウス等の実験動物を用いて行うことは、手法上・コスト上・倫理上の問題から事実上不可能であり、カイコ黄色ブドウ球菌感染モデルを利用することによって始めて成し遂げられたものである（実施例１参照）。
【０１００】
表２の結果は、ＲＨ２１８０−５の培養液から精製される各精製段階の検体の抗菌活性ＭＩＣと、カイコ感染モデルの治療効果ＥＤ５０をまとめたものである。表２中、全活性「ｕｎｉｔ」とは、体重１ｇの黄色ブドウ球菌に感染したカイコの、５０％の確率で生存に必要な活性量と定義される。
【０１０１】
表２に示すように、極めて興味深いことに、行った単離精製操作によって、抗菌活性の濃縮度と、治療効果の濃縮度は、必ずしも一致しないことが明らかとなった。表２の結果は、ＥＤ５０が３００倍に濃縮されているのに対し、ＭＩＣは、この場合に行った単離精製方法では、５倍に濃縮されているに過ぎないことを示している。
【０１０２】
【表２】
0005863648.tif 000007
【０１０３】
表２の結果は、ＥＤ５０がアセトン抽出段階の９０から最終精製段階のＲＰ−ＨＰＬＣの分画ピーク０．３と、３００倍に濃縮されているのに対し、ＭＩＣは、この分離・精製方法では、２５から５と、５倍に濃縮されているに過ぎないことを示している。また、治療活性の回収率は、アセトン抽出物を１００％としたとき、質量％の回収率では僅かに０．１％に過ぎない２つのピークだけで３０％近くに達していることを示している。
【０１０４】
また、アセトン抽出以降の残渣部分は、抗菌活性は示すが治療効果を示さない抗生物質を比較的多く含むと考えられるので、それらを回収し濃縮することで抗菌活性を示すが実質的に治療効果を示さない抗生物質含有画分として用いることができる。
【０１０５】
ＲＨ２１８０−５は、カイコ黄色ブドウ球菌感染モデルを用いた治療効果を指標とした分離・精製方法を用いることによって効果的に見出された。なぜならば、従来から行われている抗菌活性のみを指標として目的物の分離・精製方法を行った場合には、治療効果の点では有効でない抗菌活性成分が濃縮されてしまい、生体内で治療効果の高い抗生物質を見逃してしまう可能性が高いことが表２の結果から推察されるからである。そして、その場合には、ＲＨ２１８０−５の有用性を確認することはできずに、ＲＨ２１８０−５自体を見逃してしまった可能性が高いのである。従って、新規微生物（ＲＨ２１８０−５）を提供するにあたり、カイコ黄色ブドウ球菌感染モデルを用いる治療効果を指標として取捨選択が行われたことが、本発明における非常に重要なポイントである。
【０１０６】
（最小発育阻止濃度ＭＩＣによる抗菌活性の評価）
ＲＨ２１８０−５の産生した培養物からの各分画段階の抗生物質含有画分や、そこから分離・精製した抗生物質の抗菌活性は、ＭＩＣによって評価することができる。ＭＩＣは一般的に認められている標準法に従って実施する。例えば、ＣＬＳＩ（旧ＮＣＣＬＳ米国臨床検査標準委員会）に基づく微量液体希釈法によって実施する。
【０１０７】
また、感受性の判定基準は、菌株毎に異なるので、上記ＣＬＳＩの定める判定基準に基づき、Ｓ：感受性、Ｉ：中間、Ｒ：耐性、の各カテゴリー分けを行う。
【０１０８】
（抗生物質含有画分について）
ここで、ＲＨ２１８０−５（受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−８７０）を培養し、その培養物を分画することによって得られる本発明の「抗生物質含有画分」とは、ＲＨ２１８０−５の培養物から、抗菌活性及び／又は治療効果を示す抗生物質を含む画分を分画したもの、その分画から一部の物質を分離・抽出した画分、分離・抽出した画分中の抗生物質を部分的に精製した画分、更に、純物質までに精製した抗生物質を含む画分の何れの画分をも意味するものである。
【０１０９】
また、表２のアセトン抽出物やブタノール抽出物、特にブタノール抽出物は、その後の精製工程の抗菌活性の濃縮度の低さと、逆に治療効果の濃縮度の高さから、後記する表４の９つのピーク（抗生物質含有画分）に含まれる抗生物質に比して、抗菌活性は示すが治療効果を示さないか、非常に弱い抗生物質を多く含む抗生物質含有画分であると考えることができる。このような抗生物質含有画分は、通常は有用性が低いと判断されるが、以下の理由により有用性が高く、本発明に含まれる抗生物質含有画分と判断することができる。
【０１１０】
つまり、抗菌活性が高い抗生物質は感染症の治療剤として用いられる場合には、多剤耐性菌の出現を考慮して使用に際してはその必要性を充分に吟味して使用されるべきものである。一方、抗生物質を微生物防除剤等の抗菌剤として用いた場合には、その使用態様からどうしても乱用されることとなり、その使用に制限をつけることは難しいので、抗菌活性が高くても、治療に用いる抗生物質を微生物防除用に用いることはない。
【０１１１】
しかしながら、本発明の抗菌活性は示すがカイコ黄色ブドウ球菌感染モデルやその他の微生物感染モデルで治療効果を示さないか弱いと評価された抗生物質を多く含む抗生物質含有画分や、そこから抗菌活性は示すが治療効果を示さないか弱い抗生物質として得られた抗生物質は、微生物防除剤等のインビトロの用途に用いることが可能である。なぜならば、それらの抗生物質含有画分は、感染症治療剤として用いられることはないので、多剤耐性菌の出現を考慮する必要がないからである。本発明において、抗菌活性は示すが「実質的に治療効果を示さない」とは、治療剤として用いることのできる程度の治療効果を示さないという意味である。
【０１１２】
この実質的に治療効果を示さない抗生物質の分離・精製に当たっては、上記治療効果を示す抗生物質と同じ評価方法を用いればよく、具体的には、ＭＩＣで抗菌活性を示し、感染症モデルで治療効果が弱いか、治療効果を示さない抗生物質が分離・精製される方法を選択して実施すればよい。この際の感染症モデルに特に制限はないが、治療効果を示す抗生物質と同様にカイコ黄色ブドウ球菌感染モデル等カイコを用いた感染症モデルを好適に用いることができる。
【０１１３】
また、治療効果を示さない抗生物質の分離・精製は、そのことのみを目的として行ってもよいが、治療効果を示す抗生物質の分離・精製方法の検討を行った結果を利用する方法がより好ましい。つまり、抗生物質含有画分に対して治療効果を示す抗生物質を回収する方法を施し、その残渣に対して治療効果を示さない抗生物質の濃縮・分離・精製操作を行う方法を施すことによって特段の検討なしに抗菌活性を示すが治療効果を示さない抗生物質の分離・精製を行うことができる。
【０１１４】
次いで、抗生物質含有画分からの抗生物質の分離・精製方法について、治療効果を示す抗生物質の分離・精製方法を例として記載する。
【０１１５】
（抗生物質の分離・精製方法）
カイコ黄色ブドウ球菌感染モデルにおける治療効果を指標として選択される分離・精製方法に特に限定はないが、培養物の溶媒抽出、転溶、水沈殿、ＯＤＳカラム等によるクロマトグラフィー、ＯＤＳカラム等を用いたＲＰ−ＨＰＬＣによる分取等を挙げることができる。上記溶媒抽出の溶媒や転溶の溶媒としては特に限定はないが、アセトン等の水溶性溶媒；ブタノール等の親水性溶媒；それらの混合溶媒；水と親水性溶媒との混合溶媒；水と水溶性溶媒との混合溶媒；等が好ましい。また、ＯＤＳカラムの代わりに、オクチル基やブチル基で修飾した担体、ポリスチレン系のポリマー担体等を充填したカラムを用いてもよい（表２参照）。
【０１１６】
なお、上記した分離・精製方法は一例に過ぎず、最終的に目的とする抗生物質含有画分や抗生物質が得られる方法であれば、如何なる分離・精製方法であってもよい。
【０１１７】
（分離精製された抗生物質の構造解析）
以上のＲＰ−ＨＰＬＣによって、ＲＨ２１８０−５の培養物から９つのピーク（抗生物質含有画分に相当）に分けられる化合物を分取することができた（図１）。これらはＵＶ吸収パターンが類似していることから互いに類似する化合物であり、ＲＰ−ＨＰＬＣより前段階の分離・精製方法によっては単一の成分となっている。
【０１１８】
これらのピーク中に含まれる抗生物質の化学構造の解析方法に特に限定はなく、任意の方法を用いればよいが、例えば、これらの９つのピークのうち主要なピークであるピーク５のＲＰ−ＨＰＬＣ精製標品の構造解析は次の解析手段により行われた。
【０１１９】
すなわち、精密質量分析による分子量測定、酸加水分解処理後のアミノ酸分析（図２）、１Ｈ−ＮＭＲ解析や１３Ｃ−ＮＭＲ解析（図３）、ＴＯＦ（Ｔｉｍｅ  ｏｆ  Ｆｌｉｇｈｔ：飛行時間型）ＭＳ解析（図４）等を実施した結果、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｕ、Ａｒｇがそれぞれ２分子、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅがそれぞれ１分子検出され（図４）、図９に示す新規骨格構造を有する新規抗生物質（以下、「ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質」と表記する）であることが判明した。
【０１２０】
（抗菌スペクトル）
上記各ピークに含まれる抗生物質の示す抗菌スペクトルは、上記したＭＩＣによって検討することができる。それによって、例えば、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質は、試験例１の表３に示すように、黄色ブドウ球菌、腸球菌等のグラム陽性細菌に対して抗菌活性を示した。更に、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）だけでなくバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）に対しても抗菌活性を有し、多剤耐性細菌にも有効であることを確認することができた（表３参照）。
【０１２１】
また、ピーク６とピーク９に含まれる抗生物質も、ＭＲＳＡとＶＲＥに対しＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質と同様の抗菌スペクトルを示した（表３参照）。
【０１２２】
更に、ピーク１を除く、ピーク２、ピーク３、ピーク４、ピーク７、ピーク８に含まれる抗生物質の、多剤耐性菌と薬剤耐性を示さない菌に対する抗菌活性について検討したところ、上記ピークに含まれる抗生物質も、ピーク５、ピーク６、ピーク９と同様に多剤耐性菌と薬剤耐性を示さない菌に対して同様の抗菌活性を示し、多剤耐性の影響を受けていないことが確認された（試験例２の表４参照）。
【０１２３】
以上から、本発明の抗生物質含有画分に含有される治療効果を有する抗生物質は、ＲＨ２１８０−５（受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−８７０）の培養液から得られる、該微生物の産生した抗生物質であって、ＭＲＳＡ及びＶＲＥに対して抗菌活性を有することを特徴とする抗生物質であることが確認できる。
【０１２４】
＜マウス黄色ブドウ球菌感染モデルにおける治療効果＞
ＲＨ２１８０−５の産生する抗生物質は、各精製工程においてカイコ黄色ブドウ球菌感染モデルにおいてその治療効果を有することが確認されている。前記特許文献４において、カイコ黄色ブドウ球菌感染モデルに治療効果を示す物質は、マウス感染モデルに対しても治療効果を示すことが確認されている。そこで、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質に対しても同様の確認を行ったところ、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質はマウス感染モデルにおいても治療効果を示し、そのＥＤ５０値は０．６ｍｇ／ｋｇとなりバンコマイシンの１．６ｍｇ／ｋｇよりも明確に低く治療効果の高いことが確認された。（試験例３の表５参照）
【０１２５】
また、マウスに対する急性毒性試験の結果は、５０ｍｇ／ｋｇの投与量ではマウスは殺傷されなかったことから、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質は低毒性である。
【０１２６】
以上の結果から、ＲＨ２１８０−５の産生する本発明における抗生物質ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質は、黄色ブドウ球菌に対してバンコマイシンに比べて優れたＥＤ５０値を示し、高い治療効果を示すと共に、臨床上非常に問題となっているＭＲＳＡだけでなくＶＲＥにも有効性を示すという優れた特徴を有していることが確認できた。
【０１２７】
すなわち、ＲＨ２１８０−５の産生する本発明の抗生物質含有画分は、少なくとも黄色ブドウ球菌による感染症に治療効果を示す抗生物質を含んでおり、また、その抗生物質は、上記感染症に対し、バンコマイシンに比較して同等又はそれより高い治療効果を示すものである。
【０１２８】
また、他のピーク中の物質（抗生物質含有画分中の抗生物質に相当）も、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質と同様の抗菌スペクトル（ピーク６とピーク９で確認）とＵＶスペクトルを示すことから、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質と類似する化合物と考えられる。また、そのため治療効果もＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質と同様の傾向を示すものと推察される。
【０１２９】
ピーク５からのＲＰ−ＨＰＬＣ精製標品と同様に、その他のピークも、精密質量分析による分子量測定、酸加水分解処理後のアミノ酸分析、１Ｈ−ＮＭＲと１３Ｃ−ＮＭＲによる解析、ＴＯＦ型ＭＳ解析、ＵＶスペクトル、赤外線吸収スペクトル（ＩＲ）で構造解析した結果、下記式（１）と表１で示される化合物であった。
【０１３０】
【化５】
0005863648.tif 000008
［式（１）中、Ｒ１は水酸基を１つ有する炭素数が７、８又は９のアシル基を示し、Ｒ２はメチル基又は水素原子を示し、Ｒ３はエチル基又はメチル基を示す。］
【０１３１】
本発明は、上記式（１）で示される前記の抗生物質であることが好ましく、上記式（１）で示される抗生物質としては、上記表１で示されるものが特に好ましい。
【０１３２】
上記ＲＨ２１８０−５（受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−８７０）を培養し、その培養物には上記の環状ペプチド化合物又はその塩が含有され、該培養物から抗菌活性を示す抗生物質、及び／又は、感染症に治療効果を示す抗生物質を分離・精製する方法は有用な抗生物質を製造する方法として用いることができる。該ＲＨ２１８０−５（受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−８７０）は、配列表の配列番号１で示される１６Ｓ  ｒＲＮＡ領域の塩基配列を有する。
【０１３３】
また、その方法は、抗生物質が、メチシレン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）とバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）の両者に抗菌活性を示す抗生物質の製造方法として用いることができる。
【０１３４】
更に、本発明は、抗生物質がＭＲＳＡとＶＲＥに抗菌活性を示し、更に、少なくとも黄色ブドウ球菌による感染症に治療効果を示す抗生物質の製造方法として用いることができる。
【０１３５】
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−８７０の微生物を培養し、その培養物を分画することによって得られた抗生物質含有画分は有用である。更には、その培養物から得られた抗生物質を含有する微生物防除剤は有用である。また、物質として単離する前の画分を含有する微生物防除剤も同様に有用である。
【０１３６】
＜ＲＨ２１８０−５の培養物からの本発明の環状ペプチド化合物の調製方法＞
ＲＨ２１８０−５の培養物から、本発明の「前記式（１）で示される環状ペプチド化合物」を得る方法としては、通常の微生物培養物から生理活性物質を得る方法が挙げられる。ここで培養物とは、上記した通りである。
【０１３７】
また、本発明の「前記式（１）で示される環状ペプチド化合物」の調製にあたり、通常実施されるＭＩＣによる抗菌活性の確認だけでなく、特許文献４に記載のカイコ黄色ブドウ球菌感染モデルを用いた治療効果（ＥＤ５０）を指標として単離精製方法の取捨選択を行っている（表２参照）。
【０１３８】
つまり、本発明の前記式（１）で示される環状ペプチド化合物は、ＭＩＣだけでなくカイコ黄色ブドウ球菌感染モデルを用いた治療効果を指標として選択された単離精製方法を用いることによって効果的に見出されたものと考えることができる。
【０１３９】
＜抗菌スペクトル＞
本発明の前記式（１）で示される環状ペプチド化合物の示す抗菌スペクトルは、先に記載したＭＩＣによって検討することができる。それによって、例えば、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５、Ｐｅａｋ６、Ｐｅａｋ９の各物質は、黄色ブドウ球菌、腸球菌等のグラム陽性細菌に対して抗菌活性を示し、更に、ＭＲＳＡだけでなくＶＲＥに対しても通常の細菌とまったく同じ抗菌活性を示し、多くの多剤耐性菌に有効な物質であることを確認することができた（試験例１の表３、試験例４の表６参照）。
【０１４０】
先の各ピーク物質、すなわち、前記式（１）で示される環状ペプチド化合物の、メチシレン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ３、ＭＲＳＡ４）、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）と同じ菌種の薬剤感受性菌である黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ１）と腸球菌（ＥＦ１）に対するＭＩＣによる抗菌スペクトルを検討した結果（ピーク１物質は未実施）、ＭＳＳＡ１とＭＲＳＡ３及びＭＲＳＡ４、ＥＦ１とＶＲＥ間で各ピーク物質はほぼ同様のＭＩＣ値を示し、本発明の一群の化合物が、バンコマイシン耐性を含む薬剤耐性の影響を受けていないことを確認することができた（試験例２の表４参照）。
【０１４１】
本発明の前記式（１）で示される新規な環状ペプチド構造を有する新規な化合物には、少なくとも、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）の両者に抗菌活性を示す化合物が含まれる。
【０１４２】
以上から、本発明の新規な環状ペプチド構造を有する新規な化合物は、例えば、本発明の新規な微生物ＲＨ２１８０−５（受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−８７０）の培養液から製造することができ、少なくとも多剤耐性菌のＭＲＳＡ及びＶＲＥに対して抗菌活性を有する新規な化合物を含んでいることが確認できる。なお、先に挙げた微生物の培養方法、精製方法等は、本発明の化合物を見出すために選択された一例であって、効率よく大量に製造する必要がある場合等、目的に応じて別種の製造方法を選択することは当然行われることである。
【０１４３】
＜感染症治療薬＞
前記式（１）で表わされる環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩を、製薬学的に許容し得る担体と共に含んでなる感染症治療薬は、感染症に対して優れた治療効果を奏する。特に、本発明の前記式（１）で表わされる、新規な環状ペプチド構造を有する化合物又はその製薬学的に許容される塩は、カイコ黄色ブドウ球菌感染モデルだけでなく、後述するようにマウス黄色ブドウ球菌感染モデルでも、バンコマイシンに比して高い治療効果が確認されたものがあり、感染症治療薬の有効成分として好適に用いることができる。
【０１４４】
上記の感染症治療薬中の、本発明化合物の含有量には特に制限はなく、目的や投与方法に応じて含有量を適宜選択して用いればよい。また、通常の抗生物質を製剤化する際に用いられる担体や賦形剤、その他の添加剤を、適宜、剤形等の要求に応じて本発明の化合物の薬理効果を損なわない範囲内で選択して用いればよい。
【０１４５】
前記の感染症治療薬の剤形は、投与の目的や方法に応じて適宜選択すればよく、例えば、粉末、顆粒、カプセル、錠剤、液剤等の経口投与用；注射剤、経静脈剤、坐剤、経皮、経鼻、経腸、吸入剤等の非経口投与用の何れにも本発明の化合物は用いることができる。経口投与のための賦形剤としては、乳糖、ブドウ糖、デンプン、ポリビニルピロリドン等、公知の賦形剤を用いることができ、液剤とする場合は、本発明の化合物に、不活性な溶媒、例えば、精製水、エタノール等と共に、薬学的に許容される乳剤、懸濁剤、可溶化剤、甘味剤、ｐＨ調整剤、芳香剤、防腐剤等を含有させて用いることができる。
【０１４６】
注射剤として用いる場合は、注射用の蒸留水や生理食塩水のような無菌の水性液剤を用いることができ、非水性の液剤としては、オリーブ油等の植物油；エタノール、ポリエチレングリコール、ブチレングリコール等のアルコール類等を用いることができる。更に、等張化剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、シクロデキストリン等の溶解補助剤を含んでいてもよい。
【０１４７】
以上のように製剤化した本発明の化合物の投与量は、症状、年齢、性別、剤形、投与方法、１日の投与回数等を考慮して適宜決定すればよいが、一般的な投与量は、成人１日当たり１０ｍｇ〜１０００ｍｇである。しかしながら、多剤耐性菌に対する治療で多用される重症化患者に点滴によって経静脈剤として用いられる場合等には更に多い投与量を必要とする場合もあり得る。
【実施例】
【０１４８】
以下、実施例、試験例及び検討例に基づき本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例等の具体的範囲に限定されるものではない。【０１４９】
実施例１
＜ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の単離精製＞
（１）抗菌活性を有する微生物のＭＩＣによる探索
各地から採取した土壌を生理食塩水に懸濁し、その上清をＧＡ培地及びＨＶ培地に塗布し、３０℃でインキュベート後に生育した菌を分離し、ＹＭＥ培地又はＳＧＭ培地、ＣＤＹ培地にて３０℃で５日間培養した。アセトンを等量加え、懸濁後に遠心分離しその上清をエバポレーションした。得られた残存物を生理食塩水で希釈後に黄色ブドウ球菌に対する抗菌活性を微量液体希釈法によるＭＩＣにて評価した。その結果、１４３４６株中、３４８７株の培養上清に抗菌活性が認められた。【０１５０】
（２）カイコ黄色ブドウ球菌感染モデル（以下、「カイコモデル」と略記する。）を用いた治療活性物質を産生する微生物株の検討
先の抗菌活性が認められた３４８７株の検体を、特許文献４に記載のカイコモデルに供してその治療効果を検討したところ、４５株の培養上清に治療効果が認められた。【０１５１】
（３）カイコモデルを用いた治療効果を指標とした治療活性物質の精製
上記４５株中、沖縄で採取された土壌から分離されたＲＨ２１８０−５について、培養上清からの治療活性物質の精製を実施した。ＲＨ２１８０−５は、後述する１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列の解析、産生物質の傾向等から、新規リソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属の微生物と判定された。【０１５２】
ＲＨ２１８０−５を、ＹＭＥ培地１２００ｍＬに接種して培養し、培養物の５０質量％アセトン抽出物からカイコモデルにおける治療効果を指標に治療効果を示す抗生物質の精製方法を検討した。その結果、ブタノール転溶、水沈殿、ＯＤＳカラムによるクロマトグラフィー、更にＯＤＳカラムを用いたＲＰ−ＨＰＬＣ（逆相ＨＰＬＣ）により、治療効果を示す抗生物質が精製された。【０１５３】
表２に示したように、以上の精製工程により、治療効果（ＥＤ５０値）の比活性は、アセトン抽出物の３００倍に上昇した。一方、抗菌活性（ＭＩＣ）の上昇は５倍に留まった。これは、精製の出発材料であるアセトン抽出物の示す抗菌活性には最終精製物の治療効果を示す抗生物質以外の物質も関与し、今回選択された精製工程により、治療効果を示す抗生物質以外の抗菌活性物質を除去できているためと推定される。【０１５４】
また、上記ＲＰ−ＨＰＬＣにおいて、ＵＶ吸収パターンの類似した９つの化合物が検出されていることから、ＲＨ２１８０−５は少なくとも９つの関連化合物を産生していることが確認された（図１のＨＰＬＣのＵＶ吸収パターン参照）。【０１５５】
実施例２
＜ＲＨ２１８０−５の培養とＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の製造＞
ＲＨ２１８０−５の斜面培養から白金耳で菌を掻き取り、１００ｍＬのＹＭＥ培地を入れた５００ｍＬ容の三角フラスコに接種し、３０℃で３日間振とう培養を行い種培養液とした。次いで、この種培養液１．０ｍＬを、先の液体培地１００ｍＬを入れた５００ｍＬ容の三角フラスコ１２本に接種し、３０℃で５日間振とう培養を行った。【０１５６】
このようにして得た培養液にアセトンを等量混合し、この混合液を充分に攪拌した後に遠心分離を行い、遠心上清をエバポレーションしてアセトンを除去した。次いで、この試料をブタノール転溶に供した。ブタノール転溶はアセトン抽出物を８０ｍＬの水に懸濁し、等量のブタノールを添加して充分に振とうした後、静置、分液ロートにてブタノール層を分取し、減圧乾固後水沈殿に供した。水沈殿は先の試料を８０ｍＬの水に懸濁し、遠心後に水を取り除き、沈殿物を分取した。【０１５７】
ブタノール抽出物残渣７５ｍｇのサンプルを６０％メタノールに溶解し、Ｗａｔｅｒｓ、Ｓｅｐ−ｐａＫ（Ｗａｔｅｒｓ社：登録商標）Ｃ１８、２５ｍＬを用いて、０．１％ＴＦＡを含む６０％〜１００％メタノールで、１０％ごとに２０ｍＬの液で溶出させた。その結果、７０％〜８０％メタノール画分で治療効果を示す抗生物質含有画分が溶出された。【０１５８】
先の治療効果を示す抗生物質含有画分をプールして乾固させ、内２２ｍｇを５０％メタノールに溶解し、Ｓｅｎｓｈｕ  ＰａＫ  ＳＰ−１００  ＯＤＳカラム（センシュー科学：直径２０ｍｍＸ長さ２５０ｍｍ）を用いて、７５％〜９５％メタノール＋０．１％ＴＦＡにて溶出させた。この条件のＲＰ−ＨＰＬＣにより治療効果を示す抗生物質含有画分は、それぞれ単一物質からなる９つのピークを示す物質に分画された。【０１５９】
以上のＲＰ−ＨＰＬＣにおいて、治療効果を示す抗生物質含有画分は、ピーク５を主要成分とする９つの類似したＵＶ吸収パターン（ＵＶ装置Ｗａｔｅｒｓ２９９６  ｐｈｏｔｏ  ｄｉｏｄｅ  ａｒｒａｙ）を有する化合物群からなっていることが確認された（図１参照）。
以上の操作により、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質を５．３ｍｇ得た。また、同様の方法で、ピーク１、ピーク２、ピーク３、ピーク４、ピーク６、ピーク７、ピーク８、ピーク９の各ピークからそれぞれのピーク物質を得た。【０１６０】
検討例１
＜ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の構造解析＞
ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質を、ブルカー・ダルトニクス社（ＢｒｕｋｅｒＤａｌｔｏｎｉｃｓ）ＢｉｏＴＯＦ−Ｑ質量分析器による精密質量分析に供した結果、分子量は１６１６．９［ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳで、（Ｍ＋Ｈ）＋が、ｍ／ｚ＝１６１７．８７５５］であることが分かった。【０１６１】
また、６Ｎ塩酸下、１０５℃で一晩加水分解処理をした後に、日立アミノ酸分析機によりアミノ酸分析を行ったところ、各々２分子のＴｈｒ、Ｇｌｕ、Ａｒｇと、各々１分子のＳｅｒ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅが検出された（図２）。【０１６２】
更に、日本電子ＥＣＡ−５００ＮＭＲによる１Ｈ、１３Ｃ−ＮＭＲ解析（図３）、ＴＯＦ−ＭＳ解析（図４）の結果、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質は、式（１）のＲ１が３−ヒドロキシ−５−メチル−ヘキサノイル、Ｒ２がメチル、Ｒ３がエチルである環状ペプチド化合物であり、図９に示す新規骨格を有する化合物であることが明らかとなった。【０１６３】
更に、酸加水分解を行ったＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質について、キラルカラムによるＤ，Ｌ体の決定を行ったところ、Ｉｌｅ，Ｓｅｒ，Ｌｅｕ，２個のＴｈｒはＬ体で、Ｎ−ＭｅＰｈｅ，２個のＡｒｇ，ＴｒｐはＤ体であることが明らかになった。
ＧｌｎとＧｌｕについては、酸加水分解の結果では両方ともＧｌｕとなり、Ｄ，Ｌ体が１：１で検出されたため、グルタミンおよびグルタミン酸を含むペプチドに対して、ビス（１，１―トリフルオロアセトキシ）ヨードベンゼンを反応させることにより、グルタミンをジアミノ酪酸に変換し、加水分解後、反応しなかったグルタミン酸について、キラルカラムによる絶対配置の決定を行ったところ、ＧｌｎがＤ体、ＧｌｕがＬ体であることが明らかになった。（この分解法によるペプチドのＤ，Ｌ体の決定法は本願において初めて行われた新規の方法である。）【０１６４】
脂肪酸鎖の水酸基については、改良モッシャー法により絶対配置Ｒを決定した。
その結果、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質は、各アミノ酸が図１０に示す立体構造を有する新規な環状ペプチド化合物であることが分かった。【０１６５】
検討例２
＜ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ９物質の構造解析＞
構造解析に供する試料としてＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ９物質を用いる以外は検討例１と同様の構造解析手段により構造解析を行った（図８参照）。その結果、式（１）のＲ１が３−ヒドロキシ−７−メチル−オクタノイルである以外は、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質と同じ化学構造を有する環状ペプチド化合物であることが確認された。【０１６６】
また、他のピーク物質についても同様の解析を行い、表１に示すＲ１、Ｒ２、Ｒ３を有すること以外は全て、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ９物質と同じ環状ペプチド骨格を有する化合物であることが確認された（図５、６、７、８参照）。【０１６７】
試験例１
＜本発明の環状ペプチド化合物の抗菌スペクトル検討＞
先のＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の、ＭＲＳＡ、ＶＲＥを含む各種の微生物に対する抗菌スペクトルの検討を行った。また、薬剤耐性の影響についても検討した。後者の検討には黄色ブドウ球菌と腸球菌を選択し、黄色ブドウ球菌については、薬剤耐性を示さない黄色ブドウ球菌（以下、「ＭＳＳＡ１」と略記する。）と、メチシリンを含む多くの薬剤に耐性を示すＭＲＳＡ２種（ＭＲＳＡ３、ＭＲＳＡ４；耐性薬剤については表３を参照）について、また、腸球菌については、薬剤耐性を示さない腸球菌（以下、「ＥＦ１」と略記する。）と、バンコマイシンに耐性を示す腸球菌（以下、「ＶＲＥ」と略記する。）について、各ピーク物質の示すＭＩＣ値をＣＬＳＩ（旧ＮＣＣＬＳ米国臨床検査標準委員会）に基づく微量検体希釈法によって測定した。【０１６８】
また、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ６物質とＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ９物質についても、ＭＳＳＡ１とＥＦ１、及びその薬剤耐性菌（ＭＲＳＡ３、ＭＲＳＡ４とＶＲＥ）についてＭＩＣ値を測定した。試験に供した各種の微生物とＭＩＣの測定結果を表３に示す。【０１６９】
【表３】
0005863648.tif 000009
【０１７０】
表３の結果から、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質は、黄色ブドウ球菌、腸球菌に抗菌活性を示すことからグラム陽性の球菌に抗菌活性を示すことが確認された。また、多剤耐性菌のＭＲＳＡ２種とＶＲＥに対しても、通常の菌（ＭＳＳＡ１とＥＦ１）と同じＭＩＣ値を示し、バンコマイシン耐性を含む多剤耐性の影響を受けないことが確認された。このＭＩＣの値は、従来報告のある抗生物質と比べて低い値でもなく、また、特に高い抗菌活性を示したものではないが、治療効果については、後述する検討により、バンコマイシンと比べた場合、バンコマイシン以上の治療効果を有することが確認された。【０１７１】
また、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ６物質とＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ９物質も、多剤耐性菌と通常の菌に対してＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質と同じ抗菌活性を有することが確認された。【０１７２】
試験例２
＜各ピーク物質の多剤耐性菌と薬剤耐性を有さない菌に対する抗菌活性の比較検討＞
試料量の少ないピーク１物質を除くピーク２物質からピーク９物質の８つの本発明の新規な環状ペプチド化合物について、多剤耐性菌と薬剤耐性を有さない菌に対する抗菌活性の比較検討を行った。【０１７３】
試験対象菌には、試験例１と同じ黄色ブドウ球菌と腸球菌を選択し、微生物も同じＭＳＳＡ１とＥＦ１、ＭＲＳＡ３とＭＲＳＡ４及びＶＲＥについて各ピーク物質の示すＭＩＣ値をＣＬＳＩ（旧ＮＣＣＬＳ米国臨床検査標準委員会）に基づく微量検体希釈法によって測定した。その結果を表４に示す。【０１７４】
【表４】
0005863648.tif 000010
ＭＩＣ（μｇ／ｍＬ）【０１７５】
ＭＳＳＡ１：黄色ブドウ球菌
ＭＲＳＡ３：ＯＸ，ＦＬ，ＫＭ，ＴＣ，ＥＭ耐性黄色ブドウ球菌
ＭＲＳＡ４：ＯＸ，ＦＬ，ＫＭ，ＣＰ，ＣＰＬＸ耐性黄色ブドウ球菌
ＥＦ１    ：腸球菌
ＶＲＥ    ：バンコマイシン耐性腸球菌【０１７６】
ＯＸ：オキサシリン、ＦＬ：フロモキエフ、ＫＭ：カナマイシン、
ＴＣ：テトラサイクリン、ＣＰ：クロラムフェニコール、ＥＭ：エリスロマイシン
ＣＰＬＸ：シプロフロキサシン【０１７７】
その結果、各ピーク物質の示すＭＩＣ値自体は従来報告されている抗菌剤に比べると大きい値となっているものの、通常の菌とその多剤耐性菌（ＭＳＳＡ１とＭＲＳＡ３，ＭＲＳＡ４との間、ＥＦ１とＶＲＥ間）の比較においては、ＭＩＣ値はほとんど同等の値を示し、各ピーク物質の抗菌活性は多剤耐性の影響を受けていないことが確認された。【０１７８】
なお、本発明の環状ペプチド化合物の場合、抗菌活性と治療効果は必ずしも一致していないことが確認されている。例えば、ＭＳＳＡに対するＭＩＣ値が表４の場合で６．３μｇ／ｍＬ、表３の場合で５μｇ／ｍＬを示したＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質は、後述するマウス黄色ブドウ球菌感染モデルに対する治療効果（ＥＤ５０値）の検討結果ではバンコマイシンの１／３程度のＥＤ５０値を示しており、高い治療効果を示すことが確認されている。【０１７９】
ＭＩＣ値５μｇ／ｍＬや６μｇ／ｍＬは、バンコマイシンでは耐性菌の示すＭＩＣ値とされている水準であるにもかかわらず、本発明の環状ペプチド化合物が充分な治療効果を示す理由の一つとして、本発明化合物が既存薬とは異なった作用機序で抗菌活性を示し、それが治療効果に反映している可能性が考えられる。既存薬と異なった作用機序で抗菌活性を示している場合は、少なくとも現時点での耐性菌の分離頻度が低いことが予測され、本発明の環状ペプチド化合物の有利な点と考えられる。【０１８０】
試験例３
＜ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質のマウス黄色ブドウ球菌感染モデル（以下、「マウスモデル」と略記する。）における治療効果と毒性の検討＞
７％ムチン＋０．２ｍＭクエン酸鉄（III）アンモニウム（Ｆｅｒｒｉｃ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）に、黄色ブドウ球菌Ｓｍｉｔｈ株を懸濁し、６．２×１０６個（２０×ＬＤ５０）を一群５匹のマウス（ＩＣＲ雌４週齢）の腹腔に投与した。各薬剤は、以下に示す方法で先の菌株投与２時間後に皮下注射した。【０１８１】
上記マウスモデルに対して、ＰＢＳに溶解したＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質を２５ｍｇ／ｋｇ、１２．５ｍｇ／ｋｇ、６．３ｍｇ／ｋｇとなるよう皮下注射し、投与後翌日の生存数を測定することでその治療効果（ＥＤ５０値）を検討した（１群５匹）。同様にしてバンコマイシンについても、今回用いたマウスモデルに対するＥＤ５０値を検討した。ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の場合、ＰＢＳ投与で生存なしとなる条件で、２５ｍｇ／ｋｇの投与量でマウス全匹の生存が確認された。また、ＥＤ５０値はプロビット法により求めた。【０１８２】
得られた結果を表５に示す。ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質はマウスモデルに対して治療効果を示し、そのＥＤ５０値は０．６ｍｇ／ｋｇとなり、同時に検討したバンコマイシンのＥＤ５０値１．６ｍｇ／ｋｇより明確に低く、黄色ブドウ球菌に対して治療効果の高い抗生物質となっていることが確認された。【０１８３】
【表５】
0005863648.tif 000011
【０１８４】
また、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質をマウスに皮下投与し、投与後翌日の観察によりマウスに対するＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の急性毒性についても検討した。急性毒性は、検討した中で最も高い濃度であるＥＤ５０値の８０倍量に相当する５０ｍｇ／ｋｇまでの投与量ではマウスはまったく殺傷されず、毒性を認めなかったことから、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質は低毒性であることが示唆された【０１８５】
以上の結果から、ＲＨ２１８０−５の産生する本発明の抗生物質ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質（Ｐ５）は、黄色ブドウ球菌に対して、バンコマイシンに比べて優れたＥＤ５０値を示し、高い治療効果を示すと共に、ＭＩＣによる抗菌活性の検討結果から臨床上非常に問題となっているＭＲＳＡだけでなく、今後ＭＲＳＡと同様に問題化されることが予想されるＶＲＥに対しても有効性を示すという優れた特徴を有していることが確認できた。【０１８６】
また、ＲＨ２１８０−５の培養物から単離精製された本発明の新規な環状ペプチド構造を基本骨格として有する新規な化合物９種中８種（ピーク１物質は抗菌スペクトルの検討未実施）は、共に多剤耐性菌とその同種の多剤耐性の性質を獲得していない菌株に対してほぼ同じＭＩＣ値を示した（表４）ことから、本発明の新規な環状ペプチド構造を基本骨格として有する新規な化合物は、特に多剤耐性菌に対して有効な感染症治療薬として用いられ得ることが確認できた。【０１８７】
試験例４
＜ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の抗菌スペクトルの検討＞
先のＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の、ＭＲＳＡ、ＶＲＥを含む各種の微生物に対する抗菌スペクトルの検討を行った。１０％血清を添加した場合と血清を添加しなかった場合それぞれのＭＩＣ値をＣＬＳＩ（旧ＮＣＣＬＳ米国臨床検査標準委員会）に基づく微量検体希釈法によって測定した。測定結果を表６に示す。【０１８８】
【表６】
0005863648.tif 000012
【０１８９】
表６の結果より、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質は、グラム陽性菌に対し有効であり、血清の添加によって活性が上昇することが確認できた。【０１９０】
試験例５
＜ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の殺菌活性の検討＞
ＣＡ−Ｍｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎ  Ｂｒｏｔｈ培地に１．８ｘ１０８個の黄色ブドウ球菌を摂取し、先のＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質（２５μｇ／ｍＬ）、バンコマイシン（ＶＭ、５μｇ／ｍＬ）、ゲンタマイシン（ＧＭ、２．５μｇ／ｍＬ）を添加し、１５分後、３０分後、６０分後、１２０分後の生存細胞数をＣＦＵ（ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ／ｍＬ）として求めた。結果を表７に示す。【０１９１】
【表７】
0005863648.tif 000013
【０１９２】
表７の結果より、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質を添加すると、バンコマイシン、ゲンタマイシンを添加した場合と比較して直ちに黄色ブドウ球菌が減少することが確認できた。【０１９３】
また、この結果等より、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−８７０の微生物を培養し、その培養物を分画することによって得られた抗生物質含有画分、更には、その培養物から得られた抗生物質を含有する微生物防除剤は、有用であることが分かった。ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質を含有する微生物防除剤は有用であるが、それ以外のピークの物質を含有しても、また、物質として単離する前の画分を含有する微生物防除剤も同様に有用であることが分かった。【０１９４】
試験例６
＜ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の溶菌活性の検討＞
ＣＡ−Ｍｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎ  Ｂｒｏｔｈ培地に黄色ブドウ球菌液を希釈し、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質、バンコマイシン、ダプトマイシンを試験例１で用いたときの５倍の濃度で添加し、３７℃で培養した。吸光度計（島津製作所社製）を用いて、添加後の６００ｎｍにおける吸光度（ＯＤ６００）を経時的に測定した。結果を図１１に示す。【０１９５】
図１１の結果より、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質が、バンコマイシン、ダプトマイシンと比較して吸光度（ＯＤ６００）の減少が大きかったことから、溶菌活性を示すことが確認できた。【０１９６】
実施例３
＜ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の製剤化＞
＜＜錠剤＞＞
ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質２０．０ｍｇ、ラクトース４０ｍｇ、デンプン２０ｍｇ、及び、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース５ｍｇを均一に混合した後、ヒドロキシプロピルメチルセルロース８質量％水溶液を結合剤として湿式造粒法で打錠用顆粒を製造した、これに滑沢性を与えるのに必要なステアリン酸マグネシウムを０．５ｍｇから１ｍｇ加えてから打錠機を用いて打錠し、錠剤とした。【０１９７】
＜＜液剤＞＞
ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質１０．０ｍｇを、２質量％２−ヒドロキシプロピル−β−サイクロデキストリン水溶液１０ｍＬに溶解し、注射用液剤とした。【０１９８】
検討例３
＜１６Ｓ  ｒＲＮＡ解析＞
ＲＨ２１８０−５の１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基をコロニーＰＣＲ法によって増幅し、増幅できたＲＮＡ断片についてシーケンサーによって解析した。その結果、５’末端側、３’末端側のいくつかの塩基を除く配列番号１に示すほぼ１６Ｓ  ｒＲＮＡ領域全長に相当する塩基配列を決定した。この塩基配列を元に、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴを用いて既存のリソバクター属に属する菌株との相同性検索を行った。その結果ＲＨ２１８０−５は、既存のＬｙｓｏｂａｃｔｅｒ  ｅｎｚｙｍｏｇｅｎｅｓ  ＤＳＭ  ２０４３Ｔ株と９９％の相同性を示したことから、ＲＨ２１８０−５はリソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物であると考えられた。【０１９９】
＜ＲＨ２１８０−５の新規性について＞
ＲＨ２１８０−５は、Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ  ｅｎｚｙｍｏｇｅｎｅｓ  ＤＳＭ  ２０４３Ｔ株と化学的性質について相似する点が多いが、産生する生理活性物質の抗菌スペクトルが異なること、生理活性物質の本体である化合物がこれまで報告されていない新規な環状ペプチド構造を基本骨格とする「有用な薬理作用を有するＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質とその関連化合物」である点で全く異なっている。この点は、既存の菌株との大きな相違点である。よって、以上の結果から、ＲＨ２１８０−５は、リソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する新規な微生物であると判定した。
【産業上の利用可能性】
【０２００】
本発明の新規な環状ペプチド化合物は、臨床上大きな問題となっているＭＲＳＡやＶＲＥ等の多剤耐性菌に対して有効性を示すことから、新たな感染症治療薬として利用可能である。また、本発明の新規微生物株は、先の新規で有用な環状ペプチド化合物の製造に好適に利用することができる。【０２０１】
更に、本発明は、新規な抗生物質含有画分とそこに含有される抗生物質、その抗生物質含有画分とそこから得られる新規で有用な抗生物質の製造方法を提供することができるという産業上の利用可能性を有している。【０２０２】
本願は、２０１０年５月２５日に出願した日本の特許出願である特願２０１０−１１９１３８、特願２０１０−１１９１３９及び特願２０１０−１１９１４０に基づくものであり、それらの出願の全ての内容はここに引用し、本願発明の明細書の開示として取り込まれるものである。
【受託番号】
【０２０３】
ＮＩＴＥ  ＢＰ−８７０
【配列表フリーテキスト】
【０２０４】
配列番号１は、リソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する未知の菌株の、１６Ｓ  ｒＲＮＡのほぼ全長にあたる塩基配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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