(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式（４−１）で表わされる化合物、その互変異性体もしくは立体異性体、又はそれらの塩を含むことを特徴とする抗アレルギー剤。
【化８】
0006004318.tif 000033
【請求項２】
前記化学式（４−１）で表わされる化合物、その互変異性体もしくは立体異性体、又はそれらの塩が、オリーブ由来である請求項１記載の抗アレルギー剤。
【請求項３】
オリーブ残渣由来である請求項２記載の抗アレルギー剤。
【請求項４】
前記オリーブが、ミッション種、マンザニロ種及びルッカ種からなる群から選択される少なくとも一種である請求項２又は３記載の抗アレルギー剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗アレルギー剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
アレルギーに苦しむ患者は、世界的に増加の傾向にある。その症状は、アレルギー性鼻炎、気管支喘息、食物アレルギー等、多岐にわたっている。アレルギー反応は、（１）感作、（２）脱顆粒、（３）免疫反応の３つの遷延化のステージからなる。感作状態とは、免疫系が、生体が将来同じアレルゲンに接触したときに即座に反応できるように準備している状態のことである。感作の過程は、マクロファージがアレルゲンを食して断片にまで裁断し、それらの断片をＴリンパ球に提示することから始まる。引き続いて起こる過程は、Ｔ細胞がインターロイキン４を分泌し、Ｂ細胞が形質細胞に成熟する過程である。形質細胞は、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）として知られるアレルゲン特異的な分子を作り出す。こうして作られたＩｇＥという抗体は、組織中の肥満（マスト）細胞又は血液中の好塩基球の表面にあるレセプターと結合する。感作後にアレルゲンが生体と接触すると、アレルゲンは肥満細胞の表面でＩｇＥと直ちに結合する。１個のアレルゲン分子が細胞表面上の２個のＩｇＥ分子と結合すると、ＩｇＥ分子と結合しているレセプター同士が会合し、その結果、細胞膜内の幾種類もの酵素が直接的、間接的に活性化する。活性化するのはチロシンキナーゼ、フォスフォリパーゼＣ、プロテインキナーゼＣ及びカルシウムイオンで、これらは情報の流れを作り、顆粒から化学伝達物質を放出させる（脱顆粒）。この情報の流れは、サイトカインとして知られる化学物質の生合成と分泌も促進させる。分子の相互作用に基づいた情報の流れは他にもあり、プロスタグランジン又はロイコトリエンといった脂質由来メディエーター（伝達物質）の分泌につながる。肥満細胞から放出される様々な化学物質は、多くのアレルギー症状の原因となる。炎症組織内の活性化肥満細胞又はその近くに位置する他の細胞から化学伝達物質が放出されると、好塩基球又は抗酸球等の細胞は血管を通り抜け、その炎症組織へと遊走する。これらの細胞の遊走が容易になるのは、放出された化学伝達物質が末梢血管中の細胞又は血管内皮の細胞にくっついている接着分子の発現又は結合活性を促進するからである。血液中の細胞は、血管内皮細胞に接着し、それらの細胞に沿って回転し、さらにそれらの細胞の間隙を通過して周りの細胞へと潜り込む。そして、自ら化学伝達物質を放出する。この化学伝達物質は、免疫活性を維持したり、組織を傷害したりする。
【０００３】
前述のアレルギー症状の治療薬として、植物抽出物、例えば、南天実又はオリーブ等の抽出物を含む抗アレルギー剤が提案されている（例えば、特許文献１及び２）。これらの抗アレルギー剤は、食用植物を原料としているため、安全性が高い。しかしながら、従来の抗アレルギー剤は、効果が不十分なことがあるため、さらに有効な抗アレルギー剤の研究が続けられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００７−２１０９０９号公報
【特許文献２】特開２００２−３１６９３７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明は、安全性が高く、従来のものよりさらにアレルギー症状の抑制効果に優れた抗アレルギー剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記目的を達成するために、本発明の抗アレルギー剤は、下記化学式（１）で表わされる化合物、下記化学式（２）で表わされる化合物、下記化学式（３）で表わされる化合物及び下記化学式（４）で表わされる化合物からなる群から選択される少なくとも一種の化合物、その互変異性体もしくは立体異性体、又はそれらの塩を含むことを特徴とする。
【化１】
0006004318.tif 000002
化学式（１）において、
Ｒ１１は、水素原子、アルキル基、アシル基、アリール基又はアラルキル基であり、２つのＲ１１は同一でも異なっていてもよく、
Ｒ１２は、水素原子又はアルキル基であり、
Ｒ１３は、ヒドロキシ基、アルコキシ基又はオキソ基であり、
Ｒ１５及びＲ１６は、それぞれ、水素原子、アルキル基、アリール基又はハロゲン基であり、３つのＲ１５、及びＲ１６は同一でも異なっていてもよく、
Ｌは、単結合であるか、又は存在せず、
Ｌが単結合の場合、Ｒ１４は、酸素原子、硫黄原子又はＮ−Ｒ１７（Ｒ１７は、水素原子、アルキル基、アリール基又はハロゲン基）であり、
Ｌが存在しない場合、Ｒ１４は、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アシルオキシ基、アリールオキシ基又はアリールアルキルオキシ基であり、
Ｚ１は、酸素原子、硫黄原子又はＮ−Ｒ１８（Ｒ１８は、水素原子、アルキル基、アリール基又はハロゲン基）であり、
ｍ及びｎは、それぞれ、正の整数である。
【化２】
0006004318.tif 000003
化学式（２）において、
Ｒ２１は、水素原子、アルキル基、アシル基、アリール基又はアラルキル基であり、２つのＲ２１は同一でも異なっていてもよく、
Ｒ２２は、水素原子、アルキル基、アリール基又はハロゲン基であり、３つのＲ２２は同一でも異なっていてもよく、
ｐは、正の整数である。
【化３】
0006004318.tif 000004
化学式（３）において、
Ｒ３１〜Ｒ３７は、それぞれ、水素原子、アルキル基、アシル基、アリール基又はアラルキル基であり、２つのＲ３１、２つのＲ３２、及びＲ３３〜Ｒ３７は同一でも異なっていてもよく、
Ｒ３８〜Ｒ４０は、それぞれ、水素原子、アルキル基、アリール基又はハロゲン基であり、３つのＲ３８、３つのＲ３９、及びＲ４０は同一でも異なっていてもよく、
Ｚ２〜Ｚ４は、それぞれ、酸素原子、硫黄原子又はＮ−Ｒ４１（Ｒ４１は、水素原子、アルキル基、アリール基又はハロゲン基）であり、同一でも異なっていてもよく、
ｓは、正の整数である。
【化４】
0006004318.tif 000005
化学式（４）において、
Ｒ４２は、水素原子、アルキル基、アシル基、アリール基又はアラルキル基であり、２つのＲ４２は同一でも異なっていてもよく、
Ｒ４３は、水素原子又はアルキル基であり、
Ｒ４４は、水素原子、アルキル基、アリール基又はハロゲン基であり、３つのＲ４４は同一でも異なっていてもよく、
Ｚ５は、酸素原子、硫黄原子又はＮ−Ｒ４５（Ｒ４５は、水素原子、アルキル基、アリール基又はハロゲン基）であり、
ｔ及びｕは、それぞれ、正の整数である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明者らは、アレルギー症状を抑えるためには、前述の脱顆粒を阻害することが必要であるとの考えのもと、研究を行った。脱顆粒反応を抑制することができれば、ヒスタミン等の化学伝達物質を肥満細胞中に封じ込めることができ、アレルギー症状を抑えることができる。研究の結果、前記化学式（１）で表わされる化合物、前記化学式（２）で表わされる化合物、前記化学式（３）で表わされる化合物及び前記化学式（４）で表わされる化合物が、脱顆粒反応を抑制することを見出し、本発明に想到した。これらの４つの化合物は、例えば、後述のように、食用オリーブから抽出されるものであり、安全性が高い。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、本発明の実施例における抗アレルギー活性評価方法のフローチャートである。
【図２】図２は、本発明の実施例の抗アレルギー活性評価における２４ウェルマイクロプレート上の配置図である。
【図３】図３は、本発明の実施例の抗アレルギー活性評価における９６ウェルマイクロプレート上の配置図である。
【図４】図４は、本発明の実施例における抗アレルギー活性評価結果を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明の実施例におけるポメス各フラクションの抗アレルギー活性評価結果を示すグラフである。
【図６】図６は、本発明の実施例におけるフラボノイド標品群のＨＰＬＣクロマトグラム（波長＝２９０ｎｍ）である。
【図７】図７は、本発明の実施例におけるポリフェノール標品群のＨＰＬＣクロマトグラム（波長＝２９０ｎｍ）である。
【図８】図８は、本発明の実施例におけるイリドイド標品群のＨＰＬＣクロマトグラム（波長＝２９０ｎｍ）である。
【図９】図９は、本発明の実施例におけるＦｒ．３及びＨｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌのＨＰＬＣクロマトグラム（波長＝２９０ｎｍ）である。
【図１０】図１０は、本発明の実施例におけるＦｒ．３の主成分及びＨｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌの吸収スペクトルである。
【図１１】図１１は、本発明の実施例におけるＦｒ．４、５及びＶｅｒｂａｓｃｏｓｉｄｅのＨＰＬＣクロマトグラム（波長＝２９０ｎｍ）である。
【図１２】図１２は、本発明の実施例におけるＦｒ．４、５の主成分及びＶｅｒｂａｓｃｏｓｉｄｅの吸収スペクトルである。
【図１３】図１３は、本発明の実施例におけるＦｒ．６、７のＨＰＬＣクロマトグラム（波長＝２９０ｎｍ）である。
【図１４】図１４は、本発明の実施例におけるＦｒ．６、７の主成分の吸収スペクトルである。
【図１５】図１５は、本発明の実施例におけるＦｒ．８、９及びフラボノイド標品群のＨＰＬＣクロマトグラム（波長＝２９０ｎｍ）である。
【図１６】図１６は、本発明の実施例におけるＦｒ．８、９の主成分及びＬｕｔｅｏｌｉｎの吸収スペクトルである。
【図１７】図１７は、本発明の実施例におけるカラム分離前のポメスメタノール抽出液乾固物のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１８】図１８は、本発明の実施例におけるＨＰＬＣ条件の変更によるＦｒ．７の未知成分のリテンションタイムの変化を示すグラフである。
【図１９】図１９は、本発明の実施例におけるＨＰＬＣによるＦｒ．７のフラクション分離を示すグラフである。
【図２０】図２０は、本発明の実施例におけるＦｒ．７及びＦｒ．７−１〜７−３のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２１】図２１は、本発明の実施例におけるＦｒ．７及びＦｒ．７−１〜７−３の抗アレルギー活性評価の結果を示すグラフである。
【図２２】図２２は、本発明の実施例におけるＦｒ．７乾固物、５０％ＴＦＡ水溶液に２４時間浸漬した後のＦｒ．７乾固物及びＨｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌのＨＰＬＣクロマトグラム（波長＝２９０ｎｍ）である。
【図２３】図２３は、本発明の実施例における５０％ＴＦＡ水溶液に２４時間浸漬した後のＦｒ．７乾固物のリテンションタイム８．９３分のピーク及びＨｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌの吸収スペクトルである。
【図２４】図２４は、本発明の実施例におけるＦｒ．７乾固物及び５０％ＴＦＡ水溶液に２４時間浸漬した後のＦｒ．７乾固物のＨＰＬＣクロマトグラム（波長＝２５０ｎｍ）である。
【図２５】図２５は、本発明の実施例におけるＦｒ．７の未知成分の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（溶媒：ＣＤＣｌ３）である。
【図２６】図２６は、本発明の実施例におけるＦｒ．７の未知成分のＤＥＰＴスペクトル（溶媒：ＣＤＣｌ３）である。
【図２７】図２７は、本発明の実施例におけるＦｒ．７の未知成分の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（溶媒：ＣＤＣｌ３）である。
【図２８】図２８は、本発明の実施例におけるＦｒ．７の未知成分の１Ｈ−ＮＭＲ拡大スペクトル（溶媒：ＣＤＣｌ３）である。
【図２９】図２９は、本発明の実施例におけるＦｒ．７の未知成分のＣ−Ｈ  ＣＯＳＹスペクトル（溶媒：ＣＤＣｌ３）である。
【図３０】図３０は、本発明の実施例におけるＦｒ．７の未知成分のＨ−Ｈ  ＣＯＳＹスペクトル（溶媒：ＣＤＣｌ３）である。
【図３１】図３１は、本発明の実施例におけるＦｒ．７の未知成分のＨ−Ｈ  ＣＯＳＹ拡大スペクトル（溶媒：ＣＤＣｌ３）である。
【図３２】図３２は、本発明の実施例におけるＦｒ．７の未知成分のＨＭＢＣスペクトル（溶媒：ＣＤＣｌ３）である。
【図３３】図３３は、本発明の実施例におけるＦｒ．７の未知成分のＨＭＢＣ結果からの相関性を示す図である。
【図３４】図３４は、本発明の実施例におけるＦｒ．７の未知成分のＨＭＢＣ拡大スペクトル（溶媒：ＣＤＣｌ３）である。
【図３５】図３５は、本発明の実施例におけるＦｒ．７の未知成分のＨＭＢＣ拡大スペクトル（溶媒：ＣＤＣｌ３）である。
【図３６】図３６は、本発明の実施例における１１位照射デカップリングの結果を示すグラフである。
【図３７】図３７は、本発明の実施例における１１位照射デカップリング時の６位の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図３８】図３８は、本発明の実施例における２’位照射デカップリングの結果を示すグラフである。
【図３９】図３９は、本発明の実施例における２’位照射デカップリング時の１’位の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図４０】図４０は、本発明の実施例における４位照射デカップリングの結果を示すグラフである。
【図４１】図４１は、本発明の実施例における４位照射デカップリング時の５、８位の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図４２】図４２は、本発明の実施例における１’位照射デカップリングの結果を示すグラフである。
【図４３】図４３は、本発明の実施例における１’位照射デカップリング時の２’位の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図４４】図４４は、本発明の実施例における６位照射デカップリングの結果を示すグラフである。
【図４５】図４５は、本発明の実施例における６位照射デカップリング時の１１位の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図４６】図４６は、本発明の実施例における６位照射デカップリング時の５位の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図４７】図４７は、本発明の実施例における１０位照射デカップリングの結果を示すグラフである。
【図４８】図４８は、本発明の実施例における１０位照射デカップリング時の５位の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図４９】図４９は、本発明の実施例におけるＦｒ．７の未知成分のＭＳスペクトルである。
【図５０】図５０は、本発明の実施例における抗アレルギー活性比較に用いたフラボノイドを示す図である。
【図５１】図５１は、本発明の実施例における抗アレルギー活性比較に用いたその他のフラボノイドを示す図である。
【図５２】図５２は、本発明の実施例における抗アレルギー活性比較に用いたフェノール及びイリドイドを示す図である。
【図５３】図５３は、本発明の実施例におけるポリフェノール標品の抗アレルギー活性評価の結果を示すグラフである。
【図５４】図５４は、本発明の実施例におけるヒドロキシ基の有無と抗アレルギー活性の関係を示すグラフである。
【図５５】図５５は、本発明の実施例における２−３位間の結合様式の違いと抗アレルギー活性の関係を示すグラフである。
【図５６】図５６は、本発明の実施例における糖の有無と抗アレルギー活性の関係を示すグラフである。
【図５７】図５７は、本発明の実施例における糖の結合場所の違いと抗アレルギー活性の関係を示すグラフである。
【図５８】図５８は、本発明の実施例における３、３’、４’、５’位の違いと抗アレルギー活性の関係を示すグラフである。
【図５９】図５９は、本発明の実施例における３、３’、４’、５’位の違いと抗アレルギー活性の関係を示す別のグラフである。
【図６０】図６０は、本発明の実施例におけるＨｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌ誘導体の抗アレルギー活性比較結果を示すグラフである。
【図６１】図６１は、本発明の実施例におけるＣａｆｆｅｉｃ  ａｃｉｄ及びＲｏｓｍａｒｉｎｉｃ  ａｃｉｄの抗アレルギー活性比較結果を示すグラフである。
【図６２】図６２は、本発明の実施例におけるＣｕｒｃｕｍｉｎ及びＦｅｒｕｌｉｃ  ａｃｉｄの抗アレルギー活性比較結果を示すグラフである。
【図６３】図６３は、本発明の実施例におけるＣａｔｅｃｈｏｌを基本骨格として持つポリフェノール標品の抗アレルギー活性評価の結果を示すグラフである。
【図６４】図６４は、本発明の実施例における活性の高いポリフェノール標品の抗アレルギー活性評価の結果を示すグラフである。
【図６５】図６５は、本発明の実施例におけるポメス含有成分の抗アレルギー活性評価の結果を示すグラフである。
【図６６】図６６は、本発明の実施例のβ―ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ阻害活性試験における９６ウェルマイクロプレート上の配置図である。
【図６７】図６７は、本発明の実施例におけるＨｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌ標品を用いて作成したＨＰＬＣ検量線（波長＝２９０ｎｍ）である。
【図６８】図６８は、本発明の実施例におけるＶｅｒｂａｓｃｏｓｉｄｅ標品を用いて作成したＨＰＬＣ検量線（波長＝２９０ｎｍ）である。
【図６９】図６９は、本発明の実施例におけるＬｕｔｅｏｌｉｎ標品を用いて作成したＨＰＬＣ検量線（波長＝２９０ｎｍ）である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の抗アレルギー剤において、前記化学式（１）で表わされる化合物が、下記化学式（１−１）で表わされる化合物（Ｏｌｅｕｒｏｐｅｉｎ  ａｇｌｙｃｏｎｅ）であることが好ましい。
【化５】
0006004318.tif 000006
【００１０】
本発明の抗アレルギー剤において、前記化学式（２）で表わされる化合物が、下記化学式（２−１）で表わされる化合物（Ｈｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌ）であることが好ましい。
【化６】
0006004318.tif 000007
【００１１】
本発明の抗アレルギー剤において、前記化学式（３）で表わされる化合物が、下記化学式（３−１）で表わされる化合物（Ｖｅｒｂａｓｃｏｓｉｄｅ）であることが好ましい。
【化７】
0006004318.tif 000008
【００１２】
本発明の抗アレルギー剤において、前記化学式（４）で表わされる化合物が、下記化学式（４−１）で表わされる化合物（３，４−ＤＨＰＥＡ−ＥＤＡ）であることが好ましい。
【化８】
0006004318.tif 000009
【００１３】
本発明の抗アレルギー剤において、前記化学式（１）で表わされる化合物、前記化学式（２）で表わされる化合物、前記化学式（３）で表わされる化合物及び前記化学式（４）で表わされる化合物からなる群から選択される少なくとも一種の化合物、その互変異性体もしくは立体異性体、又はそれらの塩が、オリーブ（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐｅａ）由来であることが好ましい。食用に適するオリーブ由来であれば、より安全性が高い。
【００１４】
本発明の抗アレルギー剤は、オリーブ残渣（以下、「ポメス」と言う。）由来であることがより好ましい。ポメスとは、オリーブ果実からオリーブ果汁液及びオリーブオイルを圧搾したのちの搾りかすを意味する。これまで産業廃棄物として処理されてきたポメスを用いることで、未利用資源の有効活用につながる。
【００１５】
本発明の抗アレルギー剤において、前記オリーブは、ミッション種、マンザニロ種及びルッカ種からなる群から選択される少なくとも一種であることがさらに好ましい。
【００１６】
本発明において、アレルギー（アレルギー性疾患）としては、特に制限されないが、例えば、Ｉ型アレルギー性疾患、ＩＩ型アレルギー性疾患、ＩＩＩ型アレルギー性疾患、ＩＶ型アレルギー性疾患、Ｖ型アレルギー性疾患等があげられ、好ましくは、Ｉ型アレルギー性疾患である。前記Ｉ型アレルギー性疾患としては、特に制限されないが、具体的には、例えば、蕁麻疹、花粉症、喘息、ＰＩＥ症候群、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、食物アレルギー、薬物アレルギー、アナフィラキシー等があげられる。
【００１７】
本発明において、アルキル基としては、特に限定されないが、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基等があげられ、アルコキシ基、アリールアルキルオキシ基等のアルキル基を構造中に含む基においても同様である。本発明において、前記アルキル基は、例えば、その一つ以上の水素原子が任意の置換基に置換されていてもよい。前記アルキル基における置換基としては、特に制限されないが、例えば、ヒドロキシ基、ハロゲン基、アシル基、アシルオキシ基、アルコキシ基、カルバモイル基等があげられる。
【００１８】
本発明において、アシル基としては、特に限定されないが、例えば、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、イソブチリル基、バレリル基、イソバレリル基、ピバロイル基、ヘキサノイル基、シクロヘキサノイル基、ベンゾイル基、エトキシカルボニル基等があげられ、アシル基を構造中に含む基（アシルオキシ基等）においても同様である。
【００１９】
本発明において、アリール基としては、特に限定されないが、例えば、ベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環、フェナントレン環、ピリジン環、チオフェン環、ピレン環等の任意の芳香環又は複素芳香環から誘導される基等があげられる。
【００２０】
本発明において、アラルキル基としては、特に限定されないが、例えば、ベンジル基、フェネチル基、ジフェニルメチル基、トリチル基等があげられる。
【００２１】
本発明において、アルコキシ基としては、特に限定されないが、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基等があげられる。本発明において、前記アルコキシ基は、例えば、その一つ以上の水素原子が任意の置換基に置換されていてもよい。前記アルコキシ基における置換基としては、特に限定されないが、例えば、ヒドロキシ基、ハロゲン基、アシル基、アシルオキシ基、アルコキシ基、カルバモイル基等があげられる。
【００２２】
本発明において、ハロゲン基としては、特に限定されないが、例えば、フルオロ基（フッ素原子）、クロロ基（塩素原子）、ブロモ基（臭素原子）及びヨード基（ヨウ素原子）等があげられる。なお、前記ハロゲン基とは、置換基としてのハロゲン原子の名称である。
【００２３】
本発明において、アシルオキシ基としては、特に限定されないが、例えば、アセトキシ基、プロピオニルオキシ基、ブタノイルオキシ基、３−クロロブチリルオキシ基等があげられる。本発明において、前記アシルオキシ基は、例えば、一つ以上の水素原子が任意の置換基に置換されていてもよい。前記アシルオキシ基における置換基としては、特に限定されないが、例えば、ヒドロキシ基、ハロゲン基、アシル基、アシルオキシ基、アルコキシ基、カルバモイル基等があげられる。
【００２４】
本発明において、アリールオキシ基としては、特に限定されないが、例えば、フェノキシ基等があげられる。前記アリールオキシ基は、例えば、一つ以上の水素原子が任意の置換基に置換されていてもよい。前記アリールオキシ基における置換基としては、特に限定されないが、例えば、ヒドロキシ基、ハロゲン基、アシル基、アシルオキシ基、アルコキシ基、カルバモイル基等があげられる。
【００２５】
本発明において、アリールアルキルオキシ基としては、特に限定されないが、例えば、ベンジルオキシ基等があげられる。前記アリールアルキルオキシ基は、例えば、一つ以上の水素原子が任意の置換基に置換されていてもよい。前記アリールアルキルオキシ基における置換基としては、特に限定されないが、例えば、ヒドロキシ基、ハロゲン基、アシル基、アシルオキシ基、アルコキシ基、カルバモイル基等があげられる。
【００２６】
前記化学式（１）において、ｍは、１から５までの整数であることが好ましく、特に好ましくは、２であり、ｎは、１から５までの整数であることが好ましく、特に好ましくは、１である。前記化学式（２）において、ｐは、１から５までの整数であることが好ましく、特に好ましくは、２である。前記化学式（３）において、ｓは、１から５までの整数であることが好ましく、特に好ましくは、２である。前記化学式（４）において、ｔは、１から５までの整数であることが好ましく、特に好ましくは、２であり、ｕは、１から５までの整数であることが好ましく、特に好ましくは、１である。
【００２７】
本発明の抗アレルギー剤は、前述のとおり、前記化学式（１）で表わされる化合物、前記化学式（２）で表わされる化合物、前記化学式（３）で表わされる化合物及び前記化学式（４）で表わされる化合物からなる群から選択される少なくとも一種の化合物、その互変異性体もしくは立体異性体、又はそれらの塩を含むことを特徴とする。本発明の抗アレルギー剤は、その機能を損なわない範囲で、これらの成分以外のその他の成分を含んでもよい。前記その他の成分としては、例えば、ビタミン、ミネラル、着色料、保存料等があげられる。
【００２８】
本発明の抗アレルギー剤の製造方法は、特に限定されず、例えば、後述の実施例に記載の方法により、オリーブ果実からポメスメタノール抽出液乾固物を分離することで製造できる。ただし、実施例に記載の方法は例示に過ぎず、本発明の抗アレルギー剤の製造方法は、これに限定されない。
【００２９】
本発明の抗アレルギー剤の投与対象は、特に限定されず、ヒト；サル、ウシ、ブタ、イヌ等の非ヒト哺乳類；ニワトリ等の鳥類；魚介類等があげられる。投与方法は、特に限定されず、例えば、経口投与でもよいし、非経口投与でもよい。前記非経口投与は、例えば、静脈注射、筋肉注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与、腹腔内投与、局所投与等があげられる。本発明の抗アレルギー剤の投与量は、特に限定されず、例えば、動物種、年齢等に応じて適宜設定できる。本発明の抗アレルギー剤をヒト成人に投与する場合、１日あたりの投与量は、本発明の抗アレルギー剤に含まれる抗アレルギー活性成分量として、例えば、０．１ｍｇ／５０ｋｇ〜１００ｍｇ／５０ｋｇであり、好ましくは、１ｍｇ／５０ｋｇ〜５０ｍｇ／５０ｋｇであり、より好ましくは、１０ｍｇ／５０ｋｇ〜２０ｍｇ／５０ｋｇである。
【００３０】
本発明の抗アレルギー剤の剤型は、特に限定されず、用途に応じて適宜決定できる。本発明の抗アレルギー剤を経口投与する場合、その剤型は、例えば、固体状又は液体状の経口製剤があげられ、具体的には、錠剤、被覆錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、トローチ剤、液剤等があげられる。本発明の抗アレルギー剤を非経口投与する場合、その剤型は、例えば、注射用製剤、点滴製剤等の非経口製剤があげられる。本発明の抗アレルギー剤は、例えば、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、吸収促進剤、乳化剤、安定化剤、防腐剤等の各種添加剤を含んでもよく、従来公知の製剤化技術等により製剤化可能である。
【００３１】
本発明の抗アレルギー剤は、飲食品に添加してもよい。本発明において、飲食品とは、一般食品、保健機能食品を含む。前記一般食品としては、特に限定されないが、例えば、穀物加工食品、野菜加工食品、果物加工食品、食肉加工食品、水産物加工食品、乳製品、飲料、健康食品等があげられる。前記穀物加工食品としては、特に限定されないが、例えば、小麦粉、米粉、シリアルバー、せんべい、あられ、クッキー等があげられる。前記野菜加工食品としては、特に限定されないが、例えば、野菜ペースト、乾燥野菜、野菜スープ等があげられる。前記果物加工食品としては、特に限定されないが、例えば、果物ピューレ、乾燥果物等があげられる。前記食肉加工食品としては、特に限定されないが、例えば、ハム、ベーコン、ソーセージ等があげられる。前記水産物加工食品としては、特に限定されないが、例えば、佃煮、塩干物、魚肉ソーセージ、はんぺん、かまぼこ、ちくわ等があげられる。前記乳製品としては、特に限定されないが、例えば、乳飲料、ヨーグルト、アイスクリーム、チーズ等があげられる。前記飲料としては、特に限定されないが、例えば、清涼飲料、緑茶、紅茶、コーヒー等があげられる。また、前記保健機能食品は、一般に、機能性食品とも称される。前記保健機能食品としては、例えば、特定保健用食品、栄養機能食品等があげられる。
【実施例】
【００３２】
つぎに、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。ただし、本発明は、下記の実施例に限定されない。
【００３３】
（実施例１）
［オリーブ果実からの分離］
下記工程により、オリーブ果実から、ポメスメタノール抽出液乾固液及び果汁液乾固物を分離した。
（１）まず、オリーブ果実１．１５ｋｇの圧搾及びメタノール抽出により、オイルを含むポメスメタノール抽出液と、オイルを含む果汁液とに分離した。
（２）つぎに、前記オイルを含むポメスメタノール抽出液及び前記オイルを含む果汁液を、それぞれ、ヘキサンにより分液することで、ポメスメタノール抽出液及び果汁液と、オイルとに分離した。
（３）つぎに、前記ポメスメタノール抽出液及び前記果汁液を、それぞれ、減圧乾固させることで、ポメスメタノール抽出液乾固物３４．５ｇ及び果汁液乾固物（以下、被験物質と言うことがある。）を得た。
【００３４】
［抗アレルギー活性評価］
ラット好塩基球由来肥満細胞ＲＢＬ−２Ｈ３を用い、好塩基球の顆粒中に豊富に存在するβ−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅの放出率を脱顆粒の指標として測定することにより、被験物質の脱顆粒抑制作用の有無を評価した。β−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ放出率は、β−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅが糖分解酵素であることから、基質ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−２−ａｃｅｔａｍｉｄｅ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅに作用して遊離したｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌによる黄色発色の吸光度（波長＝４０５ｎｍ）測定の結果から算出した。
【００３５】
つぎに、図１を参照して、抗アレルギー活性評価方法の詳細について説明する。抗アレルギー活性評価は、つぎの材料を用いて行った。
培地：Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ（Ｂｉｏｗｅｓｔ社製）を１０％、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ  １００Ｘ（ＧＩＢＣＯ社製）を１％含んだＤＥＭＥ（和光純薬工業（株）製）
ＰＢＳ（−）：和光純薬工業（株）製
０．２５％トリプシンＥＤＴＡ溶液：和光純薬工業（株）製
抗体溶液：ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ（Ｓｉｇｍａ社製）を培地に溶かして、５０ｎｇ／ｍＬに調製したＡｎｔｉ  ＤＮＰ−ＩｇＥ溶液
抗原溶液：Ａｌｂｕｍｉｎ，ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ（Ｓｉｇｍａ社製）をＭＴ  Ｂｕｆｆｅｒに溶かして、２．５μｇ／ｍＬに調製したＤＮＰ−ＨＳＡ（ＤＮＰ−ｌａｂｅｌｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）溶液
ＭＴ  Ｂｕｆｆｅｒ：Ｔｙｒｏｄｅ’ｓ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ社製）にＨＥＰＥＳ（（株）同仁化学研究所製）を４．７６ｇ／Ｌ、Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を１ｇ／Ｌとなるように加えたもの
０．１Ｍ  Ｃｉｔｒａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  クエン酸水溶液と０．１Ｍ  クエン酸ナトリウム水溶液を５１：４９の割合で混合したもの（ｐＨ  ４．５）
基質溶液：ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−２−ａｃｅｔａｍｉｄｅ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ社製）を０．１Ｍ  Ｃｉｔｒａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒに溶かして、３．３ｍＭになるように調製したもの
酵素反応停止液：４Ｍ  グリシン水溶液と４Ｍ  ＮａＯＨ水溶液とイオン交換水を５０：３２：１８の割合で混合した２Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ  １０．０）
０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶液：Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（和光純薬工業（株）製）をＭＴ  Ｂｕｆｆｅｒで０．１％に希釈したもの
被験物質溶液：被験物質を１００％ＤＭＳＯに溶かし、ＭＴ  Ｂｕｆｆｅｒで適当な濃度に希釈したもの（このとき、ＤＭＳＯの最終濃度を０．１％以下となるようにした）
【００３６】
（ＲＢＬ−２Ｈ３細胞の継代培養）
まず、５０ｍＬ容培養フラスコで、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞の培養を行った。コンフルエントになったところで継代を行った。培養フラスコから古くなった培地を取り除き、ＰＢＳ（−）を３ｍＬ入れ、フラスコ内全面を洗浄し、すぐに取り除いた。再度ＰＢＳ（−）を３ｍＬ入れ、今度は１分間細胞表面のみを洗浄し、すぐに取り除いた。ついで、培養フラスコに０．２５％トリプシンＥＤＴＡ溶液を３ｍＬ入れ、フラスコの壁に付着している細胞を浮遊させた。この操作は、１０分以内に行った。つぎに、フラスコに新しい培地を１２ｍＬ入れ、トリプシンＥＤＴＡの働きを停止させ、５０ｍＬ容遠沈管にフラスコ内の溶液をすべて移し、２０００ｒｐｍ、８分間の条件で遠心分離を行った後、上清を除去した。つぎに、遠沈管に新しい培地を６ｍＬ入れ、ピペッティングし、１ｍＬを元のフラスコに戻し、そのフラスコに５ｍＬの新しい培地を加えてインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で培養した。
【００３７】
（ステップ１（Ｓ１）：２４ウェルマイクロプレートへの播種）
５０ｍＬ容培養フラスコで培養したＲＢＬ−２Ｈ３細胞を２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように５０ｍＬ容遠沈管に培地で希釈した。希釈後の細胞液を２４ウェルマイクロプレート上のＣＬ（Ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅ）  ｗｅｌｌ（図２参照）に１ｍＬ／ｗｅｌｌとなるように分注し、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で１晩培養した。
【００３８】
（ステップ２（Ｓ２）：抗体添加）
培養後、培地を吸引除去し、１ｍＬ／ｗｅｌｌのＰＢＳ（−）で洗浄後、抗体溶液を５００μＬ／ｗｅｌｌとなるように加えた。このとき、Ｂｌａｎｋには、抗体溶液の代わりに培地を加えた。これを２時間培養することにより細胞を感作させた。
【００３９】
（ステップ３（Ｓ３）：被験物質溶液添加）
２時間後、抗体溶液を除去し、１ｍＬ／ｗｅｌｌのＭＴ  Ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄した後、被験物質溶液を４９０μＬ／ｗｅｌｌとなるように加えた。このとき、Ｂ（Ｂｌａｎｋ）  ｗｅｌｌ及びＮ（Ｎｅｇａｔｉｖｅ）  ｗｅｌｌ（図２参照）には、被検物質溶液の代わりにＭＴ  Ｂｕｆｆｅｒを加えた。これを１０分間培養した。
【００４０】
（ステップ４（Ｓ４）：抗原添加）
培養後、抗原溶液を１０μＬ／ｗｅｌｌ加えよく混合し、さらに３０分間培養した。これにより、細胞を刺激した（脱顆粒）。
【００４１】
（ステップ５（Ｓ５）：氷冷）
３０分後、インキュベーターから２４ウェルマイクロプレートを取り出し、１０分間氷冷して反応を止めた。
【００４２】
（ステップ６（Ｓ６）：上清分取・細胞溶解）
ＣＬ  ｗｅｌｌの上清全量（５００μＬ）を、それぞれ、その真下に位置するＳ（Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）  ｗｅｌｌに移し（図２参照）、ＣＬ  ｗｅｌｌに０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶液５００μＬを加え、底面に付着している細胞を溶解させた。
【００４３】
（ステップ７（Ｓ７）：９６ウェルマイクロプレートへの播種）
Ｓ  ｗｅｌｌから５０μＬを、及びＣＬ  ｗｅｌｌから５０μＬを、それぞれ、２連で９６ウェルマイクロプレートに移し（図３参照）、５分間プレインキュベーションした。図３に示す９６ウェルマイクロプレートの各ウェルの抗体と被験物質の違いを、表１に示す
【表１】
0006004318.tif 000010
【００４４】
（ステップ８（Ｓ８）：基質添加）
基質溶液をＸ  ｗｅｌｌ（図３参照）のみに１００μＬ／ｗｅｌｌとなるように加え、２５分間インキュベーションした。
【００４５】
（ステップ９（Ｓ９）：酵素反応停止液添加）
その後、酵素反応停止液を全ウェルに１００μＬ／ｗｅｌｌとなるように加えた。
【００４６】
（ステップ１０：マイクロプレートリーダーによる吸光度測定）
ついで、基質溶液をＹ  ｗｅｌｌ（図３参照）のみに１００μＬ／ｗｅｌｌとなるように加え、マイクロプレートリーダーで吸光度（波長＝４０５ｎｍ）を測定した。Ｘ  ｗｅｌｌとＹ  ｗｅｌｌの溶液の色の違いを、表２に示す。得られた吸光度より、β−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ放出率及びＮｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌの放出率を１００％としたときの相対放出率を下記式を用いて算出した。
【表２】
0006004318.tif 000011
【数１】
0006004318.tif 000012
【００４７】
図４に、抗アレルギー活性評価の結果を示す。図示のとおり、被験物質としてポメスメタノール抽出液乾固物を用いたときのみ、その濃度が高くなるにつれてβ−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ放出率が低くなっており、ポメスメタノール抽出液乾固物に抗アレルギー活性があることがわかった。
【００４８】
［ポメス各フラクションの抗アレルギー活性評価］
抗アレルギー活性の認められたポメスについて、さらに活性成分を探索するために、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ−７カラムにより分画して活性フラクションを明らかにした。ポメスメタノール抽出液乾固物３４．５ｇをＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ−７カラムによって分離して得た各フラクション乾固物の重量を表３に、抗アレルギー活性評価結果を図５にそれぞれ示す。
【表３】
0006004318.tif 000013
【００４９】
図５に示すとおり、Ｆｒ．１、２に抗アレルギー活性は無かったが、Ｆｒ．３〜９には抗アレルギー活性があった。Ｆｒ．６、７では１００μｇ／ｍＬ、Ｆｒ．５、８、９では３００〜５００μｇ／ｍＬ、Ｆｒ．３、４では８００μｇ／ｍＬで放出率を５０％抑制したことから、その抗アレルギー活性の強さは、Ｆｒ．６、７＞５、８、９＞３、４であることがわかった。
【００５０】
前記抗アレルギー活性評価におけるのと同様の材料を用いて、下記方法により、Ｆｒ．３〜９の乾固物のβ−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ阻害活性試験を実施した。その結果を、表４に示す。表４に示すとおり、β−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ阻害率が最も大きいものでも１０％前後しかないことがわかった。このことから、抗アレルギー活性評価中のｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ遊離反応におけるβ−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ酵素活性をＦｒ．３〜９の乾固物が阻害しないことがわかった。したがって、Ｆｒ．３〜９の乾固物が肥満細胞からのβ−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅの放出そのものを抑制していると判断できる。
＜β−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ阻害活性試験方法＞
前記抗アレルギー活性評価におけるのと同様にして５０ｍＬ容培養フラスコに培養したＲＢＬ−２Ｈ３細胞を、５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶液に溶解した。それを遠心分離して上清をとり、β−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ粗酵素液とした。９６ウェルマイクロプレートの全てのウェルに粗酵素液を２５μＬずつ加え、Ｎ  ｗｅｌｌ（図６６参照）にはＭＴ  Ｂｕｆｆｅｒを、ｓａｍｐｌｅ  ｗｅｌｌ（図６６参照）には被験物質溶液を２５μＬ添加し、５分間プレインキュベーションした。５分後、基質溶液をＸ  ｗｅｌｌ（図６６参照）に１００μＬずつ加え、２５分間インキュベーションした。その後、酵素反応停止液を１００μＬずつ全ウェルに加え、Ｙ  ｗｅｌｌ（図６６参照）に基質溶液を１００μＬずつ加えた。つぎに、吸光度をマイクロプレートリーダーで測定し（波長＝４０５ｎｍ）、下記式により、β−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ阻害率を算出した。
【数２】
0006004318.tif 000014
【表４】
0006004318.tif 000015
【００５１】
（ＨＰＬＣによる各フラクションの成分分析・同定）
図６〜８に、成分同定のために用いた下記既知成分標品のＨＰＬＣクロマトグラム（波長＝２９０ｎｍ）を示す。また、それらより得た各標品のリテンションタイム（Ｒ．Ｔ．）を表６に示す。なお、図６は、フラボノイド標品群のＨＰＬＣクロマトグラム（波長＝２９０ｎｍ）であり、図７は、ポリフェノール標品群のＨＰＬＣクロマトグラム（波長＝２９０ｎｍ）であり、図８は、イリドイド標品群のＨＰＬＣクロマトグラム（波長＝２９０ｎｍ）である。ほとんどが１種類の標品に対して、１本の主要ピークが見られたが、Ｓｉｌｙｍａｒｉｎ及びＯｌｅｕｒｏｐｅｉｎでは多くのピークが見られた。ＨＰＬＣ分析条件は、下記のとおりである。
＜ＨＰＬＣ分析条件＞
送液ポンプ                  ：ＪＡＳＣＯ  ＰＵ−９８０×２
検出器                      ：ＪＡＳＣＯ  ＭＤ２０１０Ｐｌｕｓ
波長                        ：２９０ｎｍ
カラム                      ：ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ１８−ＡＲＩＩ  ４．６×２５０ｍｍ
流速                        ：１ｍＬ／分
移動相原液                  ：酢酸：アセトニトリル：超純水：リン酸＝４０：５０：８．５：1．５
移動相溶媒                  ：Ａ  移動相原液を１．５％リン酸水溶液で２０倍に希釈
Ｂ  移動相原液を１．５％リン酸水溶液で２倍に希釈
カラム温度                  ：４０℃
サンプル濃度                ：５ｍｇ／ｍＬ
インジェクト容量            ：２０μＬ
グラジエントタイムプログラム：表５
【表５】
0006004318.tif 000016
【００５２】
＜既知成分標品＞
Ａｐｉｇｅｎｉｎ−７−Ｏ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ社製）
Ｃａｔｅｃｈｉｎ（ナカライテスク（株）製）
Ｆｅｒｕｌｉｃ  ａｃｉｄ（東京化成工業（株）製）
Ｇａｌｌｉｃ  ａｃｉｄ、Ｓｙｒｉｎｇｉｃ  ａｃｉｄ、ｏ−ｃｏｕｍａｒｉｃ  ａｃｉｄ、Ｆｌａｖａｎｏｎｅ、Ｌｕｔｅｏｌｉｎ、Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ、Ｒｕｔｉｎ、Ｃａｆｆｅｉｃ  ａｃｉｄ、Ｃａｔｅｃｈｏｌ（和光純薬工業（株）製）
Ｒｏｓｍａｒｉｎｉｃ  ａｃｉｄ（Ｓｉｇｍａ社製）
Ｈｅｓｐｅｒｉｄｉｎ、Ｓｉｌｙｍａｒｉｎ（ＬＫＴ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）
Ｄｉｏｓｍｉｎ、Ａｐｉｇｅｎｉｎ、Ｅｒｉｏｄｉｃｔｙｏｌ、Ｈｅｓｐｅｒｅｔｉｎ、Ｈｏｍｏｅｒｉｏｄｉｃｔｙｏｌ、Ｉｓｏｒｈａｍｎｅｔｉｎ、Ｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ、Ｌｕｔｅｏｌｉｎ−７−Ｏ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ、Ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ、Ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ−７−Ｏ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ、Ｒｈｏｉｆｏｌｉｎ、（＋）−Ｔａｘｉｆｏｌｉｎ、Ｈｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌ、Ｃｕｒｃｕｍｉｎ、Ｖｅｒｂａｓｃｏｓｉｄｅ、Ｏｌｅｕｒｏｐｅｉｎ（Ｅｘｔｒａｔｈｅｓｅ社製）
【００５３】
【表６】
0006004318.tif 000017
【００５４】
図９に、Ｆｒ．３及びＨｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌのＨＰＬＣクロマトグラム（波長＝２９０ｎｍ）を示す。図示のとおり、ＡのピークがＦｒ．３の主成分であることがわかった。そして、Ａのピーク及びＨｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌのＲ．Ｔ．が一致した（９．０分）。図１０に、Ａのピーク及びＨｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌの吸収スペクトルを示す。図示のとおり、Ａのピーク及びＨｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌの吸収スペクトルの形、極大吸収波長（２３５、２７９ｎｍ）が一致した。これらの結果から、Ｆｒ．３の主成分は、Ｈｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌであると同定された。
【００５５】
図１１に、Ｆｒ．４、５及びＶｅｒｂａｓｃｏｓｉｄｅのＨＰＬＣクロマトグラム（波長＝２９０ｎｍ）を示す。図示のとおり、Ｆｒ．４、５にはＢに共通した大きなピークが見られた。そして、Ｆｒ．４、５のＢのピーク及びＶｅｒｂａｓｃｏｓｉｄｅのＲ．Ｔ．が一致した（２０．８分）。図１２に、Ｆｒ．４、５のＢのピーク及びＶｅｒｂａｓｃｏｓｉｄｅの吸収スペクトルを示す。図示のとおり、Ｆｒ．４、５のＢのピーク及びＶｅｒｂａｓｃｏｓｉｄｅの吸収スペクトルの形、極大吸収波長（２３５、３３１ｎｍ）が一致した。これらの結果から、Ｆｒ．４、５の主成分は、Ｖｅｒｂａｓｃｏｓｉｄｅであると同定された。
【００５６】
図１３に、Ｆｒ．６、７のＨＰＬＣクロマトグラム（波長＝２９０ｎｍ）を示す。図示のとおり、３４．４分に共通のピークが見られた。図１４に、Ｆｒ．６、７の３４．４分のピークの吸収スペクトルを示す。図示のとおり、極大吸収波長は、２４３、２７９ｎｍであった。今回用いた標品の中には、Ｆｒ．６、７の３４．４分のピークとＲ．Ｔ．及び吸収スペクトルが一致するものは無かった。
【００５７】
図１５に、Ｆｒ．８、９及びフラボノイド標品群のＨＰＬＣクロマトグラム（波長＝２９０ｎｍ）を示す。図示のとおり、Ｆｒ．８、９にはＣに共通した大きなピークが見られた。そして、Ｆｒ．８、９のＣのピーク及びＬｕｔｅｏｌｉｎのＲ．Ｔ．が一致した（３０．２分）。図１６に、Ｆｒ．８、９のＣのピーク及びＬｕｔｅｏｌｉｎの吸収スペクトルを示す。図示のとおり、Ｆｒ．８、９のＣのピーク及びＬｕｔｅｏｌｉｎの吸収スペクトルの形、極大吸収波長（２４３、２７９ｎｍ）が一致した。これらの結果から、Ｆｒ．８、９の主成分は、Ｌｕｔｅｏｌｉｎであると同定された。
【００５８】
図１７に、カラム分離する前のポメスメタノール抽出液乾固物のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図示のとおり、ポメス中には、Ｈｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌ、Ｖｅｒｂａｓｃｏｓｉｄｅ及びＬｕｔｅｏｌｉｎという３つの既知成分と、１つの未知成分（Ｒ．Ｔ．＝３４．４分）が含まれていることがわかった。表７に、ポメスメタノール抽出液乾固物のＨＰＬＣ分析による成分同定結果をまとめた。表７に示すとおり、ポメスメタノール抽出液乾固物には、既知成分としてＨｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌ（オリーブ果実１．１５ｋｇあたり３３４ｍｇ）及びＶｅｒｂａｓｃｏｓｉｄｅ（オリーブ果実１．１５ｋｇあたり１１７ｍｇ）が多く含まれていることがわかった。なお、ポメス含有既知成分の含有量の算出には、図６７〜６９に示すＨＰＬＣ検量線を用いた。図６７は、Ｈｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌ標品を用いて作成したＨＰＬＣ検量線（波長＝２９０ｎｍ）であり、図６８は、Ｖｅｒｂａｓｃｏｓｉｄｅ標品を用いて作成したＨＰＬＣ検量線（波長＝２９０ｎｍ）であり、図６９は、Ｌｕｔｅｏｌｉｎ標品を用いて作成したＨＰＬＣ検量線（波長＝２９０ｎｍ）である。
【表７】
0006004318.tif 000018
【００５９】
［Ｆｒ．７含有未知成分の構造解析］
Ｆｒ．７から未知成分を分取しやすいようにＨＰＬＣ分析条件を下記のように変更することで、図１８に示すように未知成分のＲ．Ｔ．が速くなるようにし、下記ＨＰＬＣ分取条件により、図１９に示すようにＦｒ．７−１〜７−３に分離した。なお、図１８において、上の図がＨＰＬＣ条件変更前の結果であり、下の図が、ＨＰＬＣ条件変更後の結果である。図２０に、Ｆｒ．７及びＦｒ．７−１〜７−３のＨＰＬＣ分析結果を示す。図示のとおり、Ｆｒ．７及びＦｒ．７−２が同じＲ．Ｔ．に大きなピークを示しており、Ｆｒ．７からＦｒ．７−２に未知成分を分取できたことが確認された。図２１に、Ｆｒ．７及びＦｒ．７−１〜７−３の抗アレルギー活性評価の結果を示す。図示のとおり、Ｆｒ．７−１、７−３には抗アレルギー活性は無かった。一方、Ｆｒ．７−２の濃度が７０μｇ／ｍＬのときに放出率が５０％以下に低下しており、Ｆｒ．７−２には抗アレルギー活性が認められた。これらの結果から、Ｆｒ．７−２に分取された未知成分が、Ｆｒ．７の抗アレルギー活性の中心成分であることが確認された。
＜ＨＰＬＣ分析条件＞
送液ポンプ                  ：ＪＡＳＣＯ  ＰＵ−９８０×２
検出器                      ：ＪＡＳＣＯ  ＭＤ２０１０Ｐｌｕｓ
波長                        ：２９０ｎｍ
カラム                      ：ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ１８−ＡＲＩＩ  ４．６×２５０ｍｍ
流速                        ：１ｍＬ／分
移動相原液                  ：酢酸：アセトニトリル：超純水：ＴＦＡ＝４０：５０：９．５：０．５
移動相溶媒                  ：Ａ  移動相原液を０．５％ＴＦＡ水溶液で２０倍に希釈
Ｂ  移動相原液を０．５％ＴＦＡ水溶液で２倍に希釈
カラム温度                  ：４０℃
サンプル濃度                ：１００ｍｇ／ｍＬ
インジェクト容量            ：５０μＬ
グラジエントタイムプログラム：表８
【表８】
0006004318.tif 000019
＜ＨＰＬＣ分取条件＞
送液ポンプ                  ：ＪＡＳＣＯ  ＰＵ−９８０
検出器                      ：ＪＡＳＣＯ  ８７５ＵＶ
波長                        ：２９０ｎｍ
カラム                      ：ＤＥＶＥＬＯＳＩＬ  ＯＤＳ−８  １０×２５０ｍｍ
流速                        ：１ｍＬ／分
移動相溶媒                  ：Ａ  ２０％アセトニトリル−１６％酢酸水溶液
Ｂ  ２５％アセトニトリル−２０％酢酸水溶液
カラム温度                  ：４０℃
インジェクト重量            ：５０ｍｇ
タイムプログラム            ：表９
【表９】
0006004318.tif 000020
【００６０】
（未知成分の５０％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）水溶液による分解）
図２２に、Ｆｒ．７乾固物、室温（１８℃）で５０％ＴＦＡ水溶液に２４時間浸漬した後のＦｒ．７乾固物及びＨｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌのＨＰＬＣクロマトグラム（波長＝２９０ｎｍ）を示す。図２２において、上の図が、Ｆｒ．７乾固物のＨＰＬＣクロマトグラムであり、真ん中の図が、５０％ＴＦＡ水溶液に２４時間浸漬した後のＦｒ．７乾固物のＨＰＬＣクロマトグラムであり、下の図が、ＨｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌのＨＰＬＣクロマトグラムである。図示のとおり、Ｆｒ．７乾固物を５０％ＴＦＡ水溶液に２４時間浸漬すると、Ｒ．Ｔ．８．９３分に新たなピークが検出されることがわかった。図２３に、Ｒ．Ｔ．８．９３分のピーク及びＨｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌの吸収スペクトルを示す。図２３において、上の図が、Ｒ．Ｔ．８．９３分のピークの吸収スペクトルであり、下の図が、Ｈｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌの吸収スペクトルである。これらの結果から、Ｒ．Ｔ．８．９３分のピークの成分は、Ｈｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌと同定された。図２４に、Ｆｒ．７乾固物及び５０％ＴＦＡ水溶液に２４時間浸漬した後のＦｒ．７乾固物のＨＰＬＣクロマトグラム（波長＝２５０ｎｍ）を示す。図２４において、上の図が、Ｆｒ．７乾固物のＨＰＬＣクロマトグラムであり、下の図が、５０％ＴＦＡ水溶液に２４時間浸漬した後のＦｒ．７乾固物のＨＰＬＣクロマトグラムである。図示のとおり、ＴＦＡ水溶液と反応させることにより、波長＝２５０ｎｍでＲ．Ｔ．２２．３７分に新たなピークが検出されることがわかった。Ｆｒ．７乾固物を５０％ＴＦＡ水溶液に浸漬させると、抗アレルギー活性に関与する未知成分の量が減り、Ｈｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌ及び波長＝２５０ｎｍでＲ．Ｔ．２２．３７分のピークの成分の量が増えることから、未知成分の構造にはＨｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌ骨格が含まれており、酸による加水分解反応により、Ｈｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌとそれ以外の部分に分解されたと考えられた。
【００６１】
（ＮＭＲ、ＭＳによる未知成分の構造解析）
分取用ＨＰＬＣにより５０ｍｇのＦｒ．７から２０ｍｇの未知成分を単離した。図２５に、単離した未知成分の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（溶媒：ＣＤＣｌ３）を示す。図２６には、さらに、単離した未知成分のＤＥＰＴ（ＤＥＰＴ４５°、ＤＥＰＴ９０°、ＤＥＰＴ１３５°）スペクトル（溶媒：ＣＤＣｌ３）をあわせて示す。図示のとおり、１３Ｃ−ＮＭＲの結果から、未知成分の全炭素数は１９個であることがわかった。また、ＤＥＰＴの結果から、各炭素の級数がわかった。図２７に、単離した未知成分の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（溶媒：ＣＤＣｌ３）を、図２８に、単離した未知成分の１Ｈ−ＮＭＲ拡大スペクトル（溶媒：ＣＤＣｌ３）を示す。また、図２９に、単離した未知成分のＣ−Ｈ  ＣＯＳＹスペクトル（溶媒：ＣＤＣｌ３）を示し、炭素と水素の結合を表１０にまとめた。未知成分の全炭素に結合している全水素数は２０個であることがわかり、炭素の級数との関係も一致した。図３０に、単離した未知成分のＨ−Ｈ  ＣＯＳＹスペクトル（溶媒：ＣＤＣｌ３）を、図３１に、単離した未知成分のＨ−Ｈ  ＣＯＳＹ拡大スペクトル（溶媒：ＣＤＣｌ３）を示す。これらから、４−５位間、５−６位間、６−１１位間、４−８位間、８−８位間、１’−２’位間に相関性が見られ、これらはそれぞれ隣接していると考えられた。図３２に、単離した未知成分のＨＭＢＣスペクトル（溶媒：ＣＤＣｌ３）を、図３３に、ＨＭＢＣ結果からの相関性を、図３４及び３５に、単離した未知成分のＨＭＢＣ拡大スペクトル（溶媒：ＣＤＣｌ３）を示す。図示のとおり、２−６位間、５−８位間、５−６位間、５−１１位間、６−１１位間、１’−２’位間、２’−４’位間、２’−８’位間、４’−８’位間については両方向に相関性が見られ、これらはそれぞれ近接していると考えられた。２→３位間、２→４位間、２→７位間、５→３位間、５→４位間、６→４位間、６→１０位間、８→３位間、８→４位間、８→９位間、１２→７位間、１’→３’位間、２’→３’位間、４’→５’位間、４’→６’位間、７’→３’位間、７’→６’位間、７’→８’位間、８’→６’位間については一方向からではあるが相関性が見られ、これらもそれぞれ近接していると考えられた。ＴＦＡ水溶液により、未知成分が分解されＨｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌが出てきたことと、これまでのＮＭＲ測定結果を総合して、未知成分は、ＩＵＰＡＣ名：４−［２−（３，４−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−ｐｈｅｎｙｌ）−ｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌｍｅｔｈｙｌ］−５−ｆｏｒｍｙｌ−６−ｍｅｔｈｙｌ−５，６−ｄｉｈｙｄｒｏ−４Ｈ−ｐｙｒａｎ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒの化学式（３）で表わされる構造（Ｃ１９Ｈ２２Ｏ８、分子量３７８）であると考えられた。図３６〜４８に、デカップリングの結果を示す。図３６は、１１位照射デカップリングの結果であり、図３７は、１１位照射デカップリング時の６位の１Ｈ−ＮＭＲ拡大スペクトルである。図３８は、２’位照射デカップリングの結果であり、図３９は、２’位照射デカップリング時の１’位の１Ｈ−ＮＭＲ拡大スペクトルである。図４０は、４位照射デカップリングの結果であり、図４１は、４位照射デカップリング時の５、８位の１Ｈ−ＮＭＲ拡大スペクトルである。図４２は、１’位照射デカップリングの結果であり、図４３は、１’位照射デカップリング時の２’位の１Ｈ−ＮＭＲ拡大スペクトルである。図４４は、６位照射デカップリングの結果であり、図４５は、６位照射デカップリング時の１１位の１Ｈ−ＮＭＲ拡大スペクトルであり、図４６は、６位照射デカップリング時の５位の１Ｈ−ＮＭＲ拡大スペクトルである。図４７は、１０位照射デカップリングの結果であり、図４８は、１０位照射デカップリング時の５位の１Ｈ−ＮＭＲ拡大スペクトルである。図示のとおり、１１位を照射すると６位が、２’位を照射すると１’位が、４位を照射すると５位と８位が、１’位を照射すると２位が、６位を照射すると５位と１１位が、１０位を照射すると５位が、それぞれスペクトルが変化したので、４−５位間、６−１１間、４−８位間、１’−２’位間、６−５位間、５−１０位間の隣接が証明された。図４９に、単離した未知成分のＭＳスペクトルを示す。図示のとおり、未知成分の分子量は３７８であることがわかった。これとＮＭＲの結果とを総合して、未知成分は、４−［２−（３，４−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−ｐｈｅｎｙｌ）−ｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌｍｅｔｈｙｌ］−５−ｆｏｒｍｙｌ−６−ｍｅｔｈｙｌ−５，６−ｄｉｈｙｄｒｏ−４Ｈ−ｐｙｒａｎ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒと同定された。この物質は、Ｏｌｅｕｒｏｐｅｉｎから糖が外れた構成をしているので、Ｏｌｅｕｒｏｐｅｉｎ  ａｇｌｙｃｏｎｅと呼ぶことができる。なお、ＮＭＲ、ＭＳは、下記条件にて実施した。
＜ＮＭＲ＞
装置：日本電子（株）製「ＪＮＭ−ＥＣＡ型核磁気共鳴装置」
データ処理装置：日本電子（株）製「Ｗｉｎ  Ａｌｐｈａ  ＮＭＲオペレーション」
溶媒：Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ−ｄ（Ｉｓｏｔｅｃ社製）
標準物質：ＴＭＳ（ＴｅｔｒａＭｅｔｈｙｌＳｉｌａｎｅ）
周波数：６００ＭＨｚ
＜ＭＳ＞
装置：日本電子（株）製「ＪＭＳ−ＳＸ１０２ＡＱＱ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ」
データ処理装置：日本電子（株）製「ＪＭＳ−ＤＡ５０００」
イオン化法：ＥＩ
イオン化電圧：７０ｅＶ
分解能：１０００（低分解能）
標準物質：ＰＦＫ（Ｐｅｒｆｌｕｏｒｏｋｅｒｏｓｅｎｅ）
【表１０】
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【００６２】
［各成分とポリフェノール標品との抗アレルギー活性比較］
つぎに、Ｈｙｄｒｏｔｙｒｏｓｏｌ、Ｖｅｒｂａｃｓｃｏｓｉｄｅ、Ｌｕｔｅｏｌｉｎ、Ｏｌｅｕｒｏｐｅｉｎ  ａｇｌｙｃｏｎｅ及び他のポリフェノール標品につき、抗アレルギー活性の比較を行った。図５０〜５２に、比較に用いたポリフェノール標品を示す。図５０及び５１には、フラボノイドを示し、図５２には、フェノール及びイリドイドを示している。比較結果を、図５３〜６４に示す。図５３は、ポリフェノール標品の抗アレルギー活性評価結果を示すグラフであり、図５４は、ヒドロキシ基の有無と抗アレルギー活性の関係を示すグラフであり、図５５は、２−３位間の結合様式の違いと抗アレルギー活性の関係を示すグラフであり、図５６は、糖の有無と抗アレルギー活性の関係を示すグラフであり、図５７は、糖の結合場所の違いと抗アレルギー活性の関係を示すグラフであり、図５８及び５９は、３、３’、４’、５’位の違いと抗アレルギー活性の関係を示すグラフであり、図６０は、Ｈｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌ誘導体の抗アレルギー活性比較結果を示すグラフであり、図６１は、Ｃａｆｆｅｉｃ  ａｃｉｄ及びＲｏｓｍａｒｉｎｉｃ  ａｃｉｄの抗アレルギー活性比較結果を示すグラフであり、図６２は、Ｃｕｒｃｕｍｉｎ及びＦｅｒｕｌｉｃ  ａｃｉｄの抗アレルギー活性比較結果を示すグラフであり、図６３は、Ｃａｔｅｃｈｏｌを基本骨格として持つポリフェノール標品の抗アレルギー活性評価の結果を示すグラフであり、図６４は、活性の高いポリフェノール標品の抗アレルギー活性評価の結果を示すグラフである。図５４に示すとおり、Ｆｌａｖａｎｏｎｅには抗アレルギー活性が認められず、Ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ（ＩＣ５０＝０．３２１μｍｏｌ／ｍＬ）には抗アレルギー活性が認められたことから、ヒドロキシル基を有していなければ、抗アレルギー活性が無いことがわかった。図５５に示すとおり、Ａｐｉｇｅｎｉｎ（ＩＣ５０＝０．００３７１μｍｏｌ／ｍＬ）の抗アレルギー活性が、Ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ（ＩＣ５０＝０．３２１μｍｏｌ／ｍＬ）の抗アレルギー活性より約１００倍高いことから、フラボノイド骨格の２−３位間が二重結合になっていると抗アレルギー活性が約１００倍高くなることがわかった。図５６に示すとおり、Ａｐｉｇｅｎｉｎ（ＩＣ５０＝０．００３７１μｍｏｌ／ｍＬ）の抗アレルギー活性が、Ａｐｉｇｅｎｉｎ−７−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ（ＩＣ５０＝１．２６μｍｏｌ／ｍＬ）及びＲｈｏｉｆｏｌｉｎ（ＩＣ５０＝１．１３μｍｏｌ／ｍＬ）の抗アレルギー活性より約４００倍高いことから、糖が結合しているフラボノイドは抗アレルギー活性が弱く、糖の結合していないフラボノイドは抗アレルギー活性が強いことがわかった。図５７に示すとおり、フラボノイド骨格の３位に糖が結合しているＲｕｔｉｎ（ＩＣ５０＝０．２５０μｍｏｌ／ｍＬ）及び７位に糖が結合しているＲｈｏｉｆｏｌｉｎ（ＩＣ５０＝１．１３μｍｏｌ／ｍＬ）を比較すると、Ｒｕｔｉｎの抗アレルギー活性の方が約４倍高いことから、糖の結合場所によって抗アレルギー活性の高さが変わることがわかった。図５８に示すとおり、Ｈｏｍｏｅｒｉｏｄｉｃｔｙｏｌ（ＩＣ５０＝０．１５９μｍｏｌ／ｍＬ）、Ｈｅｓｐｅｒｅｔｉｎ（ＩＣ５０＝０．１８２μｍｏｌ／ｍＬ）��Ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ（ＩＣ５０＝０．３２１μｍｏｌ／ｍＬ）、Ｅｒｉｏｄｉｃｔｙｏｌ（ＩＣ５０＝０．０９４６μｍｏｌ／ｍＬ）、（＋）−Ｔａｘｉｆｏｌｉｎ（ＩＣ５０＝０．１６５μｍｏｌ／ｍＬ）の抗アレルギー活性の高さにはさほど差は無かった。図５９に示すとおり、Ａｐｉｇｅｎｉｎ（ＩＣ５０＝０．００３７１μｍｏｌ／ｍＬ）、Ｉｓｏｒｈａｍｎｅｔｉｎ（ＩＣ５０＝０．００３１１μｍｏｌ／ｍＬ）、Ｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ（ＩＣ５０＝０．０１０８μｍｏｌ／ｍＬ）、Ｌｕｔｅｏｌｉｎ（ＩＣ５０＝０．００３３９μｍｏｌ／ｍＬ）、Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ（ＩＣ５０＝０．００３６３μｍｏｌ／ｍＬ）の抗アレルギー活性の高さにもさほど差は無かった。図５８及び５９から、３、３’、４’、５’位に結合しているものの違いと抗アレルギー活性の高さには関係が無いことがわかった。図６０に示すとおり、Ｈｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌ（ＩＣ５０＝１．９１μｍｏｌ／ｍＬ）、Ｖａｂａｓｃｏｓｉｄｅ（ＩＣ５０＝１．１７μｍｏｌ／ｍＬ）、Ｏｌｅｕｒｏｐｅｉｎ  ａｇｌｙｃｏｎｅ（ＩＣ５０＝０．０７２５μｍｏｌ／ｍＬ）、Ｏｌｅｕｒｏｐｅｉｎ（ＩＣ５０＝１．３９μｍｏｌ／ｍＬ）の４つのＨｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌ誘導体のうち、最も抗アレルギー活性が高かったのは、Ｏｌｅｕｒｏｐｅｉｎ  ａｇｌｙｃｏｎｅであった。図６１に示すとおり、Ｒｏｓｍａｒｉｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＩＣ５０＝１．１４μｍｏｌ／ｍＬ）は、Ｃａｆｆｅｉｃ  ａｃｉｄ（ＩＣ５０＝１．５４μｍｏｌ／ｍＬ）に似た構造を２つ有しているが、両者の抗アレルギー活性の高さにさほど差は無かった。図６２に示すとおり、２つのＦｅｒｕｌｉｃ  ａｃｉｄ（ＩＣ５０＝１．７０μｍｏｌ／ｍＬ）を結合させた構造をしているＣｕｒｃｕｍｉｎ（ＩＣ５０＝０．０１４３μｍｏｌ／ｍＬ）の抗アレルギー活性は、Ｆｅｒｕｌｉｃ  ａｃｉｄよりも約１００倍高かった。図６１及び６２から、抗アレルギー活性を有する構造が２つ結合したとしても、その結合様式及び糖の有無によって、抗アレルギー活性が高くなることも変化しないこともあることがわかった。図６３に示すとおり、Ｃａｔｅｃｈｏｌ（ＩＣ５０＝１．１６μｍｏｌ／ｍＬ）、Ｈｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌ（ＩＣ５０＝１．９１μｍｏｌ／ｍＬ）、Ｃａｆｆｅｉｃ  ａｃｉｄ（ＩＣ５０＝１．５４μｍｏｌ／ｍＬ）、Ｆｅｒｕｌｉｃ  ａｃｉｄ（ＩＣ５０＝１．７０μｍｏｌ／ｍＬ）、Ｏｌｅｕｒｏｐｅｉｎ（ＩＣ５０＝１．３９μｍｏｌ／ｍＬ）、Ｖｅｒｂａｓｃｏｓｉｄｅ（ＩＣ５０＝１．１７μｍｏｌ／ｍＬ）、Ｒｏｓｍａｒｉｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＩＣ５０＝１．４４μｍｏｌ／ｍＬ）の抗アレルギー活性の高さにさほど差が無かったことから、Ｈｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌ、Ｆｅｒｕｌｉｃ  ａｃｉｄ、Ｏｌｅｕｒｏｐｅｉｎ、Ｖｅｒｂａｓｃｏｓｉｄｅ、Ｒｏｓｍａｒｉｎｉｃ  ａｃｉｄの抗アレルギー活性は、Ｃａｔｅｃｈｏｌ構造に由来すると考えられた。図６４に示すとおり、使用したポリフェノール標品のうち、抗アレルギー活性の高いのは、Ａｐｉｇｅｎｉｎ（ＩＣ５０＝０．００３７１μｍｏｌ／ｍＬ）、Ｉｓｏｒｈａｍｎｅｔｉｎ（ＩＣ５０＝０．００３１１μｍｏｌ／ｍＬ）、Ｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ（ＩＣ５０＝０．０１０８μｍｏｌ／ｍＬ）、Ｌｕｔｅｏｌｉｎ（ＩＣ５０＝０．００３３９μｍｏｌ／ｍＬ）、Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ（ＩＣ５０＝０．００３６３μｍｏｌ／ｍＬ）、Ｃｕｒｃｕｍｉｎ（ＩＣ５０＝０．０１４３μｍｏｌ／ｍＬ）であることがわかった。以上の結果から、抗アレルギー活性が高くなる条件は、（１）フラボノイド構造をしていること、（２）その構造の２−３位間が２重結合となっていること、（３）アグリコンであること、があげられる。使用したポリフェノール標品の抗アレルギー活性評価におけるＩＣ５０を、表１１にまとめた。表１１において、ポメス含有成分には下線を付している。表１１に示すとおり、ポメス含有成分のうち、Ｌｕｔｅｏｌｉｎ（ＩＣ５０＝０．００３３９μｍｏｌ／ｍＬ）及びＯｌｅｕｒｏｐｅｉｎ  ａｇｌｙｃｏｎｅ（ＩＣ５０＝０．０７２５μｍｏｌ／ｍＬ）の抗アレルギー活性が高いことがわかった。
【表１１】
0006004318.tif 000022
【００６３】
（ポメス含有成分の抗アレルギー活性評価）
図６５に、ポメス含有成分の抗アレルギー活性評価の結果を示す。また、表１２に、ポメス含有成分の濃度（μｇ／ｍＬ）とβ−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ活性阻害率（％）との関係を示す。表１２に示すとおり、Ｖｅｒｂａｓｃｏｓｉｄｅ濃度６００（μｇ／ｍＬ）のとき、β−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ活性阻害率が１７．４０％と最も高く、図６５より、同じ濃度のときの脱顆粒抑制率（１００（％）−β−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ放出率（％））は４０％であり、少なくとも２３％は放出自体を抑制していることとなる。以上から、抗アレルギー活性評価中のｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ遊離反応におけるβ−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ酵素活性をポメス含有成分が阻害しないことがわかった。したがって、ポメス含有成分が、肥満細胞からのβ−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅの放出そのものを抑制していると言える。
【表１２】
0006004318.tif 000023
【００６４】
表１３に、各Ｆｒにおける各成分の含有割合を示す。また、図６５及び表１３から得られるポメスフラクション乾固物及び各成分標品の抗アレルギー活性の比較結果を、表１４〜２０に示す。表１４は、Ｆｒ．３及びＨｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌ標品の抗アレルギー活性（脱顆粒抑制活性）結果の比較を示し、表１５は、Ｆｒ．４及びＶｅｒｂａｓｃｏｓｉｄｅ標品の抗アレルギー活性（脱顆粒抑制活性）結果の比較を示し、表１６は、Ｆｒ．５及びＶｅｒｂａｓｃｏｓｉｄｅ標品の抗アレルギー活性（脱顆粒抑制活性）結果の比較を示し、表１７は、Ｆｒ．６及びＯｌｅｕｒｏｐｅｉｎ  ａｇｌｙｃｏｎｅ標品の抗アレルギー活性（脱顆粒抑制活性）結果の比較を示し、表１８は、Ｆｒ．７及びＯｌｅｕｒｏｐｅｉｎ  ａｇｌｙｃｏｎｅ標品の抗アレルギー活性（脱顆粒抑制活性）結果の比較を示し、表１９は、Ｆｒ．８及びＬｕｔｅｏｌｉｎ標品の抗アレルギー活性（脱顆粒抑制活性）結果の比較を示し、表２０は、Ｆｒ．９及びＬｕｔｅｏｌｉｎ標品の抗アレルギー活性（脱顆粒抑制活性）結果の比較を示す。表１４の放出率６０％のときのＨｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌ濃度を見ると約３倍の違いがあるので、Ｆｒ．３の抗アレルギー活性が全てＨｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌによるものとは言えない。したがって、Ｆｒ．３にはＨｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌ以外の抗アレルギー活性成分が含まれていると考えられた。表１５及び１６から、Ｖｅｒｂａｓｃｏｓｉｄｅは低濃度（１０、２０μｇ／ｍＬで放出率９６％）で抗アレルギー活性を示さないはずであるのに、Ｆｒ．４、５（推定含有Ｖｅｒｂａｓｃｏｓｉｄｅ濃度１０、２０μｇ／ｍＬで放出率５５％、４４％）では抗アレルギー活性を示していることから、Ｆｒ．４、５の主要抗アレルギー活性成分はＶｅｒｂａｓｃｏｓｉｄｅ以外の成分であると考えられた。表１７及び１８から、Ｏｌｅｕｒｏｐｅｉｎ  ａｇｌｙｃｏｎｅ濃度と放出率との関係がフラクション状態とＯｌｅｕｒｏｐｅｉｎ  ａｇｌｙｃｏｎｅ単体の状態で一致していることから、Ｆｒ．６、７の抗アレルギー活性は、Ｏｌｅｕｒｏｐｅｉｎ  ａｇｌｙｃｏｎｅによるものと言える。したがって、Ｆｒ．６、７の主要抗アレルギー活性成分はＯｌｅｕｒｏｐｅｉｎ  ａｇｌｙｃｏｎｅであると同定された。表１９及び２０から、Ｌｕｔｅｏｌｉｎ濃度と放出率との関係がフラクション状態とＬｕｔｅｏｌｉｎ単体の状態で一致していることから、Ｆｒ．８、９の抗アレルギー活性は、Ｌｕｔｅｏｌｉｎによるものと言える。したがって、Ｆｒ．８、９の主要抗アレルギー活性成分はＬｕｔｅｏｌｉｎであると同定された。表２１に、ポメス含有成分のオリーブ果実中における含有量を示す。表２１に示すとおり、Ｖｅｒｂａｓｃｏｓｉｄｅ、Ｈｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌ及びＯｌｅｕｒｏｐｅｉｎ  ａｇｌｙｃｏｎｅの含有量は、Ｌｕｔｅｏｌｉｎと比べて極めて多かった。
【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【表２１】
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【００６５】
（実施例２）
実施例１と同様にしてオリーブ果実から分離した３，４−ＤＨＰＥＡ−ＥＤＡにつき、Ｏｌｅｕｒｏｐｅｉｎ  ａｇｌｙｃｏｎｅとの抗アレルギー活性の比較を行った。その結果、３，４−ＤＨＰＥＡ−ＥＤＡは、ＩＣ５０＝２８．３μｇ／ｍＬであり、Ｏｌｅｕｒｏｐｅｉｎ  ａｇｌｙｃｏｎｅ（ＩＣ５０＝２７．４μｇ／ｍＬ）と数字上はほぼ同程度であったが、比較試験を行うと、Ｏｌｅｕｒｏｐｅｉｎ  ａｇｌｙｃｏｎｅよりも抗アレルギー活性がやや強かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５０】
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【図５１】
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【図６６】
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【図６７】
0006004318.tif 000040
【図６８】
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【図６９】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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