(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）神経毒素（ＢｏＮＴ）を活性についてアッセイする方法であって、
ａ）ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳ）由来神経細胞を、ＢｏＮＴを含む組成物と接触させること；および
ｂ）生物学的活性について前記ＢｏＮＴをアッセイすること、
を含む方法。
【請求項２】
前記ＢｏＮＴが、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅおよび前記ＢｏＮＴの改変バリアントからなる群から選択される血清型を有する、請求項１の方法。
【請求項３】
前記生物学的活性が、ＳＮＡＰ−２５の切断、ＶＡＭＰ２の切断および神経伝達物質放出からなる群から選択される、請求項１の方法。
【請求項４】
前記アッセイが定性的である、請求項１の方法。
【請求項５】
前記アッセイが定量的である、請求項１の方法。
【請求項６】
前記ＢｏＮＴが精製されている、請求項１の方法。
【請求項７】
前記ＢｏＮＴが複合体中にない、請求項１の方法。
【請求項８】
前記ＢｏＮＴが複合体中にある、請求項１の方法。
【請求項９】
前記ｈｉＰＳ由来神経細胞と接触させる前に、前記ＢｏＮＴを試験化合物と接触させるステップをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項１０】
前記試験化合物が抗体である、請求項９の方法。
【請求項１１】
前記抗体が中和抗体である、請求項１０の方法。
【請求項１２】
前記中和抗体が、精製された抗体、血清および抗毒素からなる群から選択される試料中にある、請求項１１の方法。
【請求項１３】
ボツリヌス菌神経毒素（ＢｏＮＴ）を活性についてアッセイする方法であって
ａ）ヒト人工多能性幹（ｈｉＰＳ）細胞由来神経細胞を、ｉ）ＢｏＮＴ、およびｉｉ）中和抗体を含む組成物と接触させること；および
ｂ）生物学的活性について前記ＢｏＮＴをアッセイすること、
を含む方法。
【請求項１４】
前記ＢｏＮＴが、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅおよび前記ＢｏＮＴの改変バリアントからなる群から選択される血清型を有する、請求項１３の方法。
【請求項１５】
前記生物学的活性が、ＳＮＡＰ−２５の切断、ＶＡＭＰ２の切断および神経伝達物質放出からなる群から選択される、請求項１３の方法。
【請求項１６】
前記アッセイが定性的である、請求項１３の方法。
【請求項１７】
前記アッセイが定量的である、請求項１３の方法。
【請求項１８】
前記ＢｏＮＴが精製されている、請求項１３の方法。
【請求項１９】
前記ＢｏＮＴが複合体中にない、請求項１３の方法。
【請求項２０】
前記ＢｏＮＴが複合体中にある、請求項１の方法。
【請求項２１】
前記中和抗体が、精製された抗体、血清および抗毒素からなる群から選択される試料中にある、請求項１３の方法。
【請求項２２】
生物学的に活性なＢｏＮＴを含む調製物中の生物学的に活性なＢｏＮＴの量を測定する方法であって、以下のステップ：
（ａ）ｈｉＰＳ細胞由来神経細胞を、生物学的に活性なＢｏＮＴを含む調製物の試料と接触させること；および
（ｂ）ＢｏＮＴの生物学的活性について前記試料をアッセイすることにより、調製物中に存在する生物学的に活性なＢｏＮＴの量を測定すること、
を含む前記方法。
【請求項２３】
ＢｏＮＴを活性についてアッセイするための、ヒト人工多能性幹（ｈｉＰＳ）細胞由来神経細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、２０１１年９月２９日に出願した米国仮出願第６１／５４０，６９３号の優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、病原因子を試験するための（例えば、ボツリヌス菌神経毒素（ＢｏＮＴ，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ）検出および分析）組成物および方法に関する。特に、本発明は、病原因子を検出および分析するためのヒト人工多能性幹（ｈｉＰＳ，ｈｕｍａｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ）由来細胞の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
グラム陽性土壌生息細菌、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）により合成されるボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ，ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ）は、人類に知られている最も有毒な物質であり、神経麻痺疾患ボツリヌス中毒症の原因病原因子である（Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｅ（２００５）ｉｎ  Ｔｏｐｌｅｙ  ａｎｄ  Ｗｉｌｓｏｎ’ｓ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ、Ｓ．Ｐ．Ｂｏｒｒｉｅｌｌｏ、Ｐ．Ｒ．Ｍｕｒｒａｙ、Ｇ．Ｆｕｎｋｅ編（Ｈｏｄｄｅｒ  Ａｒｎｏｌｄ、Ｌｏｎｄｏｎ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）、１０３５〜１０８８頁（非特許文献１））。ＡからＧと名付けられた７つの免疫学的に別個の血清型のＢｏＮＴが記載されている（Ｇｉｍｅｎｅｚ  ＤＦ  ＆  Ｇｉｍｅｎｅｚ  ＪＡ（１９９５）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２７：  １〜９頁（非特許文献２））。ＢｏＮＴは、最初は約１５０ｋＤａの一本鎖ポリペプチドとして合成されるが、翻訳後タンパク質分解切断が、ジスルフィド結合により連結された約１００ｋＤａおよび約５０ｋＤａの別個の重鎖および軽鎖（ＨＣおよびＬＣ）をもたらす。ＨＣはさらに、ＨＣＣおよびＨＣＮサブドメインに機能的に分けられる。ＨＣＣドメインは、エンドサイトーシスをもたらす特定の神経細胞表面受容体の認識および結合に関与し、一方ＨＣＮドメインは、エンドサイトーシスの小胞膜におけるチャネル形成、ならびにエンドソーム膜を越えたＬＣの移行および内在化に関与する（Ｍｏｎｔｅｃｕｃｃｏら、（２００４）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １２：  ４４２〜４４６頁（非特許文献３）；Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ａ  ＆  Ｍｏｎｔａｌ  Ｍ（２００７）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８２：  ２９６０４〜２９６１１頁（非特許文献４）；Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ａら（２００９）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０６：  １３３０〜１３３５頁（非特許文献５））。移行中、ジスルフィド結合が切断され、およびＬＣが細胞サイトゾルへ放出され、亜鉛依存性エンドペプチダーゼとしての活性酵素成分に再折り畳みされる（Ｆｉｓｃｈｅｒら、上記参照；Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ａ  ＆  Ｍｏｎｔａｌ  Ｍ（２００７）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０４：  １０４４７〜１０４５２頁（非特許文献６））。ＬＣは次いで、前シナプス小胞の細胞内ＳＮＡＲＥタンパク質を特異的に標的にし、切断し、神経伝達物質放出の阻害をもたらす。各ＢｏＮＴ血清型は別個の切断標的を有し、ＢｏＮＴ／ＡおよびＥは別個の部位でＳＮＡＰ−２５を切断し、ＢｏＮＴ／Ｂ、Ｄ、ＦおよびＧは異なる部位でＶＡＭＰ／シナプトブレビンを切断し、ＢｏＮＴ／ＣはＳＮＡＰ−２５およびシンタキシンの両方を切断する（Ｍｏｎｔｅｃｕｃｃｏ  Ｃ  ＆  Ｓｃｈｉａｖｏ  Ｇ（１９９４）Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １３：  １〜８頁（非特許文献７）に概説されている）。
【０００４】
自然発生のボツリヌス中毒症は稀であるが重篤な疾患であり、米国では１年に約１１０例が発生し、致死率は約５〜１０％である（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＥＡ  ＆  Ｍｏｎｔｅｃｕｃｃｏ  Ｃ（２００８）ｉｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、Ａｎｄｒｅｗ  Ｇ．Ｅｎｇｅｌ編（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、３３３〜３６８頁）（非特許文献８）。この極めて強い効力（ＢｏＮＴ／Ａに関する推定ヒト致死量１ｎｇ／体重ｋｇ（Ｂｏｓｓｉ  Ｐら（２００６）Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ６３：  ２１９６〜２２１２頁（非特許文献９））、疾患ボツリヌス中毒症の重症度、および症例の、特に大規模での治療に関わる高いコストのため、ＢｏＮＴはカテゴリーＡ選択病原因子（Ｓｅｌｅｃｔ  Ａｇｅｎｔ）に分類されており、生物テロ兵器として深刻な脅威となっている（Ａｒｎｏｎ  ＳＳら（２００１）ＪＡＭＡ  ２８５：  １０５９〜１０７０頁（非特許文献１０））。
【０００５】
ＢｏＮＴ／Ａおよび程度ははるかに少ないがＢｏＮＴ／Ｂはまた、さまざまな神経筋障害を治療する独特の重要な医薬として、および化粧品においても使用されている。食品医薬品局がＢｏＮＴの使用を承認した条件には、美容的治療ならびにさまざまな筋痙縮障害、多汗症および片頭痛を一時的に軽減するための治療が含まれる（Ｃｈａｄｄｏｃｋ  ＪＡ  ＆  Ａｃｈａｒｙａ  ＫＲ（２０１１）ＦＥＢＳ  Ｊ  ２７８：  ８９９〜９０４頁（非特許文献１１））。ＢｏＮＴの美容的および臨床的適用は増加しており、臨床試験、正確な効力判定、および中和抗体スクリーニングを必要とする医薬用のＢｏＮＴの新たな製剤が開発中である。例えば、ＢｏＮＴは、疼痛性障害、随意筋力、頸部、頭蓋ジストニアを含む限局性ジストニア、ならびに良性特発性眼瞼痙攣、片側顔面痙攣、および限局性痙縮、胃腸障害、多汗症、および美容シワ矯正、眼瞼痙攣、顎口腔ジストニア、顎開口型（ｊａｗ  ｏｐｅｎｉｎｇ  ｔｙｐｅ）、顎閉口型（ｊａｗ  ｃｌｏｓｉｎｇ  ｔｙｐｅ）、歯ぎしり、メージュ症候群、舌ジストニア、眼瞼の失行（ａｐｒａｘｉａ  ｏｆ  ｅｙｅｌｉｄ）、オープニング頸部ジストニア（ｏｐｅｎｉｎｇ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｄｙｓｔｏｎｉａ）、頸部前屈、頸部後屈、頸部側屈、斜頸、咽頭ジストニア、喉頭ジストニア、痙攣性発声障害／内転型、痙攣性発声障害／外転型、痙攣性呼吸困難、四肢ジストニア、上肢ジストニア、動作特異性ジストニア、書痙、音楽家痙攣、ゴルファー痙攣、下肢ジストニア、大腿内転、大腿外転、膝屈曲、膝伸展、足首屈曲、足首伸展、内反尖足、変形足ジストニア、足指の過伸展（ｓｔｒｉａｔａｌ  ｔｏｅ）、足指の屈曲、足指の伸展、軸性ジストニア、ピサ症候群、ベリーダンサージストニア、分節性ジストニア、片側性ジストニア、全身性ジストニア、ｌｕｂａｇ病におけるジストニア、皮質基底核変性症におけるジストニア、ｌｕｂａｇ病におけるジストニア、遅発性ジストニア、脊髄小脳失調症におけるジストニア、パーキンソン病におけるジストニア、ハンチントン病におけるジストニア、ハレルフォルデン−スパッツ病におけるジストニア、ドーパ誘発性ジスキネジア／ドーパ誘発性ジストニア、遅発性ジスキネジア／遅発性ジストニア、発作性ジスキネジア／ジストニア、運動誘発性非運動誘発性動作誘発性口蓋ミオクローヌス（ｋｉｎｅｓｉｏｇｅｎｉｃ  ｎｏｎ−ｋｉｎｅｓｉｏｇｅｎｉｃ  ａｃｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐａｌａｔａｌ  ｍｙｏｃｌｏｎｕｓ）、ミオクローヌス  ミオキミア、硬直、良性筋痙攣、遺伝性顎振戦、奇異性顎筋活動、片側咀嚼筋痙、肥大性鰓弓筋ミオパシー、咬筋肥大、前脛骨筋肥大、眼振、動揺視、核上性注視麻痺、持続性部分てんかん、痙性斜頸手術計画、声帯外転筋麻痺、難治性変異性発声障害（ｒｅｃａｌｃｉｔａｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｄｙｓｐｈｏｎｉａ）、上部食道括約筋機能不全、声帯肉芽腫、吃音  ジル・ド・ラ・トゥレット症候群、中耳ミオクローヌス、防御性喉頭閉鎖（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｌａｒｙｎｘ  ｃｌｏｓｕｒｅ）、咽頭切除後発語不全（ｐｏｓｔｌａｒｙｎｇｅｃｔｏｍｙ  ｓｐｅｅｃｈ  ｆａｉｌｕｒｅ）、防御性眼瞼下垂、眼瞼内反  オッジ括約筋機能不全、偽アカラシア、非アカラ��ア食道運動障害、膣痙、術後固定  振戦、膀胱機能障害、排尿筋括約筋筋失調、膀胱括約筋痙攣、片側顔面痙攣、神経再支配ジスキネジア（ｒｅｉｎｎｅｒｖａｔｉｏｎ  ｄｙｓｋｉｎｅｓｉａｓ）、美容的使用  目尻のシワ、渋面  顔面非対称、オトガイ筋の凹み、全身硬直症候群、強縮  前立腺肥大、過脂肪、治療小児脳性麻痺（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｉｎｆａｎｔｉｌｅ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｐａｌｓｙ）  斜視（混合麻痺併発、網膜剥離手術後、白内障手術後、無水晶体眼における）、筋炎性斜視、ミオパチー斜視、解離性上斜位、斜視手術に伴う、内斜視、外斜視、アカラシア、裂肛、外分泌腺活動亢進、フレイ症候群、ワニの涙症候群、多汗症（脇、掌、足裏）、鼻漏、相対的な唾液分泌過多（脳卒中、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症における）、痙攣状態（脳炎および脊髄炎における）、自己免疫過程、多発性硬化症、横断性脊髄炎、デビック症候群、ウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染、真菌感染、遺伝性痙性対不全麻痺における（ｉｎ  ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  ｓｐａｓｔｉｃ  ｐａｒａｐａｒｅｓｉｓ）、脳卒中後症候群  大脳半球梗塞、脳幹梗塞、脊髄梗塞、中枢神経系外傷における、大脳半球病変、脳幹病変、脊髄病変、中枢神経系出血、脳内出血、くも膜下出血、硬膜下出血、髄腔内出血における、新生物、半球腫瘍、脳幹腫瘍、および脊髄腫瘍における治療のために薬学的に投与される。故に、抗体を検出するための、環境、食品、医薬製剤中のＢｏＮＴ活性、および研究適用でのＢｏＮＴ活性の定量的で信頼のおける検出は、テロ対策としてのボツリヌス中毒症の予防、ならびに新薬開発、患者の安全性試験、製品の品質管理試験および品質保証試験の両方において極めて重要である。
【０００６】
多くのＢｏＮＴ検出方法が発表されており、これらは４つの一般的なカテゴリーに分類することができる（Ｃａｉら、（２００７）Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３３：  １０９〜１２５頁（非特許文献１２）に概説されている）：１．ホロトキシンの存在を免疫学的に検出するが、活性状態か不活性状態かを区別することができないインビトロアッセイ（ＥＬＩＳＡ）；２．毒素ＬＣの酵素活性を検出するが、生物学的に活性なホロトキシンとＬＣのみとを区別しないエンドペプチダーゼアッセイ；３．インビボアッセイ（マウスバイオアッセイ）；および最後に４．片側横隔膜アッセイ、局所注入アッセイ、初代細胞または不死化細胞を用いた細胞ベースのアッセイなどのインビボシミュレーションアッセイ。十分に活性なＢｏＮＴを検出するには、検出アッセイは、中毒プロセスの全ての段階（例えば、細胞表面受容体へのＨＣ結合、エンドサイトーシス、小胞チャネル形成、ジスルフィド結合の切断、細胞サイトゾルへのＬＣの導入、および最後にＳＮＡＲＥタンパク質のタンパク質分解切断）を測定するべきである。マウスバイオアッセイおよびインビボシミュレーションアッセイのみが、これらの段階の全てを測定する。マウスバイオアッセイは、マウスにＢｏＮＴの種々の希釈物を静脈内または腹腔内注入すること、次いでボツリヌス中毒の症状（四肢麻痺、努力呼吸、毛並みの乱れ等）についてマウスを観察すること（Ｈａｔｈｅｗａｙ  ＣＬ（１９８８）ｉｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ：  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ．Ｂａｌｏｗｓ  Ａ、Ｈａｕｓｌｅｒ  ＷＨ、Ｏｈａｓｈｉ  Ｍ  ＆  Ｔｕｒａｎｏ  ＭＡ編（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１１１〜１３３頁（非特許文献１３）；Ｓｃｈａｎｔｚ  ＥＪａＫ、Ｄ．Ａ．（１９７８）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ  ６１：  ９６〜９９頁（非特許文献１４））、および最終的に死を伴う。ＭＢＡは定量的であり、中毒の全段階をモニターすることができるが、エラー率が大きく、検査室間または検査室内で標準化されておらず、多数の動物ならびに対応する施設および訓練されたスタッフを必要とする。片側横隔膜および局所注入アッセイは動物の苦痛を低減し、なかには十分に感受性であるものもあるが、依然として多数の動物および熟練スタッフを必要とする。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｅ（２００５）ｉｎ  Ｔｏｐｌｅｙ  ａｎｄ  Ｗｉｌｓｏｎ’ｓ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ、Ｓ．Ｐ．Ｂｏｒｒｉｅｌｌｏ、Ｐ．Ｒ．Ｍｕｒｒａｙ、Ｇ．Ｆｕｎｋｅ編（Ｈｏｄｄｅｒ  Ａｒｎｏｌｄ、Ｌｏｎｄｏｎ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）、１０３５〜１０８８頁
【非特許文献２】Ｇｉｍｅｎｅｚ  ＤＦ  ＆  Ｇｉｍｅｎｅｚ  ＪＡ（１９９５）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２７：  １〜９頁
【非特許文献３】Ｍｏｎｔｅｃｕｃｃｏら、（２００４）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １２：  ４４２〜４４６頁
【非特許文献４】Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ａ  ＆  Ｍｏｎｔａｌ  Ｍ（２００７）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８２：  ２９６０４〜２９６１１頁
【非特許文献５】Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ａら（２００９）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０６：  １３３０〜１３３５頁
【非特許文献６】Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ａ  ＆  Ｍｏｎｔａｌ  Ｍ（２００７）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０４：  １０４４７〜１０４５２頁
【非特許文献７】Ｍｏｎｔｅｃｕｃｃｏ  Ｃ  ＆  Ｓｃｈｉａｖｏ  Ｇ（１９９４）Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １３：  １〜８頁
【非特許文献８】Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＥＡ  ＆  Ｍｏｎｔｅｃｕｃｃｏ  Ｃ（２００８）ｉｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、Ａｎｄｒｅｗ  Ｇ．Ｅｎｇｅｌ編（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、３３３〜３６８頁
【非特許文献９】Ｂｏｓｓｉ  Ｐら（２００６）Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ６３：  ２１９６〜２２１２頁
【非特許文献１０】Ａｒｎｏｎ  ＳＳら（２００１）ＪＡＭＡ  ２８５：  １０５９〜１０７０頁
【非特許文献１１】Ｃｈａｄｄｏｃｋ  ＪＡ  ＆  Ａｃｈａｒｙａ  ＫＲ（２０１１）ＦＥＢＳ  Ｊ  ２７８：  ８９９〜９０４頁
【非特許文献１２】Ｃａｉら、（２００７）Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３３：  １０９〜１２５頁
【非特許文献１３】Ｈａｔｈｅｗａｙ  ＣＬ（１９８８）ｉｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ：  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ．Ｂａｌｏｗｓ  Ａ、Ｈａｕｓｌｅｒ  ＷＨ、Ｏｈａｓｈｉ  Ｍ  ＆  Ｔｕｒａｎｏ  ＭＡ編（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１１１〜１３３頁
【非特許文献１４】Ｓｃｈａｎｔｚ  ＥＪａＫ、Ｄ．Ａ．（１９７８）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ  ６１：  ９６〜９９頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
これらのアッセイのこれらの明白に特定された欠点は、ＭＢＡの特異的な、感受性の定量的代替物を提供する細胞ベースのモデルを開発するよう、ＦＤＡおよびＵＳＤＡを含む規制当局からの勧告を促してきた（国立環境衛生学研究所、２００８）。ニューロ−２ａおよびＰＣ−１２を含むさまざまな連続細胞系が毒性試験に使用されてきたが、ＭＢＡに匹敵するほど十分に感受性ではない。ラット、マウス、またはニワトリに由来する一次神経細胞、およびマウス胚性幹細胞に由来する神経細胞は、著しくより感受性である（Ｈａｌｌ  ＹＨら（２００４）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８８：  ５５〜６０頁；Ｋｅｌｌｅｒ  ＪＥ、Ｃａｉ  Ｆ  ＆  Ｎｅａｌｅ  ＥＡ（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３：  ５２６〜５３２頁；Ｌａｌｌｉ  Ｇら（１９９９）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１２（Ｐｔ  １６）：  ２７１５〜２７２４頁；Ｎｅａｌｅら、（１９９９）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４７：  １２４９〜１２６０頁；Ｓｔａｈｌ  ＡＭら（２００７）Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  １２：  ３７０〜３７７頁）。記載された毒性試験および抗体検出に最も感受性の細胞タイプは、初代ラット脊髄細胞（ＲＳＣ）アッセイであり（Ｐｅｌｌｅｔｔら、（２００７）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５８１：  ４８０３〜４８０８頁）、ＭＢＡより感受性で再現性があり、マウスバイオアッセイ（Ｐｅｌｌｅｔｔら、（２０１０）Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）とよく相関する。さらに、胚性幹細胞に由来する神経細胞も、高感受性であることが示されている（ＭｃＮｕｔｔら、（２０１１）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ４０５：  ８５〜９０頁；Ｐｅｌｌｅｔｔ  Ｓら（２０１１）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ４０４：  ３８８〜３９２頁；Ｋｉｒｉｓ  Ｅら（２０１１）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ。しかし、ＲＳＣアッセイは、依然として細胞の調製に幾らかの動物および熟練スタッフの利用を必要とし、細胞の新たなバッチを連続的に調製する必要があるため試験標準化に容易に適合できない。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、病原因子を試験するための組成物および方法（例えば、ボツリヌス菌神経毒素（ＢｏＮＴ）検出および分析）に関する。特に、本発明は、病原因子を検出および分析するためのヒト人工多能性幹（ｈｉＰＳ）由来細胞の使用に関する。
【００１０】
本発明の実施形態は、研究、スクリーニング、臨床および治療適用において使用するための神経細胞（例えば、ヒト（例えば、ｉＰＳ由来））を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、ＢｏＮＴおよびＢｏＮＴに対する中和抗体の検出および分析において使用される。例示的な実施形態が、本明細書および以下に記載される。追加の実施形態が本明細書に記載され、当業者の知識の範囲内である。
【００１１】
例えば、いくつかの実施形態において、本発明は、ａ）ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳ）由来神経細胞を、ＮＴを含む組成物と接触させるステップと、ｂ）生物学的活性についてＮＴをアッセイするステップとを含む、クロストリジウム種（ｃｌｏｓｔｒｉａｌ  ｓｐｅｃｉｅｓ）（例えば、ボツリヌス菌神経毒素（ＢｏＮＴ））を活性についてアッセイする方法を提供する。いくつかの実施形態において、クロストリジウム種は、ボツリヌス菌、酪酸菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、クロストリジウム・バラティ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂａｒａｔｉｉ）である。いくつかの実施形態において、ＢｏＮＴは、血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧを含む全７つの既知の血清型、ならびに各血清型内の既知の亜型を包含する。いくつかの実施形態において、ＮＴは、組換えＮＴ、変異体ＮＴまたはキメラＮＴである。いくつかの実施形態において、生物学的活性は、ＳＮＡＰ−２５、ＶＡＭＰまたはシンタキシンの切断である。いくつかの実施形態において、アッセイは定性的であるが、他においては定量的である。いくつかの実施形態において、ＮＴは精製されるが、他においてはそれは複合体、溶液またはマトリックス中にある。いくつかの実施形態において、ＮＴは組換えである。いくつかの実施形態において、ＮＴは、治療モダリティー、マーカー、イメージング剤、酵素、受容体、抗体または生物活性化合物から選択される別の分子とコンジュゲートされる。いくつかの実施形態において、方法は、ｈＰＳ由来神経細胞を接触させる前に、ＮＴを試験化合物と接触させるステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、試験化合物は、ＮＴの抗体（例えば、中和抗体）または低分子阻害剤である。いくつかの実施形態において、中和抗体は精製されているか、または血清もしくは抗毒素試料中にある。
【００１２】
本発明はさらに、ａ）ヒト人工多能性幹（ｈｉＰＳ）由来神経細胞を、ａ）ＮＴ、およびｂ）中和抗体を含む組成物と接触させるステップと、ｂ）生物学的活性についてＮＴをアッセイするステップとを含む、クロストリジウム種（ｃｌｏｓｄｒｉａｌ  ｓｐｅｃｉｅｓ）神経毒素（例えば、ＢｏＮＴ）を活性についてアッセイする方法を提供する。
【００１３】
本発明はまた、生物学的に活性なＢｏＮＴを含む調製物、好ましくは、生物学的に活性なＢｏＮＴを含む医薬調製物中の生物学的に活性なＢｏＮＴの量を測定する方法にも関する。いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）ｈｉＰＳ細胞由来神経細胞を、生物学的に活性なＢｏＮＴを含む調製物試料と接触させるステップと、（ｂ）ＢｏＮＴの生物学的活性について試料をアッセイすることにより、調製物中に存在する生物学的に活性なＢｏＮＴの量を測定するステップとを含む。
【００１４】
さらなる実施形態において、本発明は、活性についてＢｏＮＴをアッセイするためのヒト人工多能性幹（ｈｉＰＳ）細胞由来神経細胞の使用を提供する。
【００１５】
追加の実施形態を本明細書に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ｉＰＳニューロンにおけるＢｏＮＴ受容体発現を示す。Ａ．ｉＰＳ細胞を４、７、１０、１４および２１日間成熟させ、ＢｏＮＴ受容体の発現レベルについてウエスタンブロットによりアッセイした。Ｂ．ｉＰＳ細胞を５、１０、１５および２０日間成熟させ、成人ヒト脳細胞を使用して定量的ＰＣＲアッセイを行った。
【図２】７つの異なる基質（右に示された）に播種したｉＰＳ神経細胞のＢｏＮＴ／Ａ１感受性の比較を示す。
【図３】ｉＰＳ神経細胞およびＲＳＣ細胞のＢｏＮＴ／Ａ１感受性を示す。
【図４】ｉＰＳ神経細胞におけるＢｏＮＴ／Ａ１活性の検出の時間依存性を示す。
【図５】ＲＳＣ細胞と比較したｉＰＳ神経細胞のＢｏＮＴ／Ａ１取り込み速度を示す。
【図６】神経細胞による活性依存性ＢｏＮＴ／Ａ１取り込みを示す。Ａ．ｉＰＳ神経細胞およびＲＳＣ細胞を、５５Ｕまたは２７５ＵのＢｏＮＴ／Ａ１に細胞刺激培地で１、５、１０および１５分間曝露させ、次いで毒素を除去し、２４時間インキュベーションした。Ｂ．ｉＰＳ神経細胞を、５５ＵのＢｏＮＴ／Ａ１に神経培地および細胞刺激培地の両方で１、５および１０分間曝露させた。Ｃ．神経細胞を、１．７〜５５ＵのＢｏＮＴ／Ａ１に細胞刺激培地で５分間曝露させ、神経培地を用いて２回洗浄し、２４時間インキュベートした。
【図７】ｉＰＳ神経細胞における抗体プロテクションアッセイのウエスタンブロットおよびデンシトメトリーデータを示す。Ａ．ｉＰＳ神経細胞を１．５Ｕの毒素および抗体に２４時間曝露させた。Ｂ．ｉＰＳ神経細胞を５５Ｕの毒素−抗体混合物に細胞刺激培地で５分間曝露させ、混合物を除去し、細胞を２回洗浄し、２４時間インキュベートした。
【図８】ＢｏＮＴ／Ａ複合体および精製ＢｏＮＴ／Ａに対するｉＰＳ神経細胞の感受性を示す。Ａ．精製ＢｏＮＴ／Ａ１およびＢｏＮＴ／Ａ１複合体を含むＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ラダーＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製：ＳｅｅＢｌｕｅ（登録商標）Ｐｌｕｓ２  Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄ）。Ｂ．毒素曝露４８時間後のＢｏＮＴ／Ａ１精製毒素およびＢｏＮＴ／Ａ１複合体に対するｉＰＳ神経細胞の感受性。
【図９】ｉＰＳ神経細胞におけるＢｏＮＴ／Ｂ、Ｃ、およびＥ活性の検出を示す。ｉＰＳ神経細胞は７日間成熟させ、ＲＳＣ細胞をＢｏＮＴ／Ｂ（Ａ）、／Ｃ（Ｂ）、および／Ｅ（Ｃ）の連続希釈物に４８時間並行して曝露させた。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
定義
本発明の理解を促すため、いくつかの用語および語句を以下に定義する。
【００１８】
本明細書で使用するとき、用語「宿主細胞」は、インビトロにあろうとインビボにあろうと、任意の真核または原核細胞（例えば、哺乳動物細胞、鳥類細胞、両生類細胞、植物細胞、魚類細胞、および昆虫細胞）を指す。
【００１９】
本明細書で使用するとき、用語「細胞培養」は、細胞の任意のインビトロ培養を指す。この用語の中に含まれるのは、連続細胞系（例えば、不死化表現型を有する）、初代細胞培養物、有限細胞系（例えば、非形質転換細胞）、および卵母細胞および胚を含む、インビトロで維持された任意の他の細胞集団である。
【００２０】
本明細書で使用するとき、用語「有毒な」は、毒性物質を投与する前の同じ細胞または組織と比較した、細胞または組織に対する任意の不利益なまたは有害な影響を指す。
【００２１】
本明細書で使用するとき、用語「医薬組成物」は、組成物をインビトロ、インビボまたはエクスビボでの診断的または治療的使用に特に適するようにする、活性剤と担体（不活性または活性）との組み合わせを指す。
【００２２】
本明細書で使用するとき、用語「薬学的に許容可能な担体」は、リン酸緩衝生理食塩水、水、乳剤（例えば、油／水または水／油乳剤など）、およびさまざまなタイプの湿潤剤などの標準的な薬学的担体のいずれかを指す。組成物は、安定剤および保存料を含むこともできる。担体の例として、安定剤および佐剤。（例えば、Ｍａｒｔｉｎ、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１５版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌ．  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ［１９７５］参照）。
【００２３】
本明細書で使用するとき、用語「検出する」、「検出すること」または「検出」は、検出可能に標識された組成物を発見もしくは識別する一般的行為、または検出可能に標識された組成物の特定の観察のどちらかを述べ得る。
【００２４】
本明細書で使用するとき、用語「精製された」または「精製すること」は、試料からの成分（例えば、汚染物質）の除去を指す。例えば、抗体は、汚染非免疫グロブリンタンパク質の除去により精製される。抗体はまた、標的分子に結合しない免疫グロブリンの除去によっても精製される。非免疫グロブリンタンパク質の除去および／または標的分子に結合しない免疫グロブリンの除去は、試料中の標的反応性免疫グロブリンの割合の増加をもたらす。別の例において、組換えポリペプチドは細菌宿主細胞において発現され、該ポリペプチドは、宿主細胞タンパク質の除去により精製される。組換えポリペプチドの割合は、これにより試料中で増加する。
【００２５】
本明細書で使用するとき、用語「試料」は広義で使用する。ある意味において、任意の供給源から得られた標本または培養物の他、生物試料および環境試料を含むことが意図される。生物試料は、動物（ヒトを含む）から得ることができ、流体、固体、組織、および気体を包含することができる。生物試料には、細胞、組織、血液製剤（血漿、血清等など）が含まれる。しかし、このような例は、本発明に適用可能な試料のタイプを限定すると解釈するべきでない。いくつかの実施形態において、試料はまた、医薬または美容目的に適用されるＢｏＮＴ調製物などの生物学的に活性なＢｏＮＴを含む調製物の試料であってもよい。さらに、本開示の一態様において、試料はまた、ＢｏＮＴを含むことが疑われる環境試料または食品試料であってもよい。
【００２６】
本発明は、病原因子を試験するための組成物および方法（例えば、ボツリヌス菌神経毒素（ＢｏＮＴ）検出および分析）に関する。特に、本発明は、病原因子を検出および分析するためのヒト人工多能性幹（ｈｉＰＳ）由来細胞の使用に関する。
【００２７】
本発明の実施形態は、ＢｏＮＴを検出および分析するための系および方法を提供する。いくつかの実施形態において、系およびアッセイは、ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）検出のための感受性および再現性が高いプラットフォームとして、ヒトｉＰＳ由来神経細胞を利用する。いくつかの実施形態において、神経細胞は、ＧＡＢＡ作動性、ドーパミン作動性、およびグルタミン作動性神経細胞の９８％純粋な汎神経細胞集団（ｐａｎ−ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）であり、分化細胞として作製され低温保存される。別の態様において、神経細胞は、ＧＡＢＡ作動性、ドーパミン作動性、およびグルタミン作動性神経細胞の本質的に純粋な汎神経細胞集団であり、分化細胞として作製され低温保存され、分化細胞は、神経細胞という点で少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９６％純粋である。本発明の実施形態の進展の過程で実施された実験は、該細胞が、全てのＢｏＮＴ血清型によるＢｏＮＴ中毒に必要な受容体および基質の全てを発現することを示した。ＢｏＮＴ検出アッセイは、ｉＰＳ由来神経細胞が、ＢｏＮＴ／Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＥならびに中和抗体の定量的検出に対し高感受性であることを示している。
【００２８】
２００７年の１１月、２つの独立したグループが、サイレンス化遺伝子（ｓｉｌｅｎｃｅｄ  ｇｅｎｅ）の小さなセットを単純に活性化することにより、ヒト線維芽細胞が多能性幹細胞に再プログラム化され得ることを初めて示した（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋら（２００７）Ｃｅｌｌ  １３１：  ８６１〜８７２頁；Ｙｕ  Ｊら（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８：  １９１７〜１９２０頁）。これらの細胞は人工多能性幹細胞と命名され、細胞系と同様に維持および低温保存することができる。この発見は、十分に機能する分化したヒト体細胞と類似した、および動物利用を必要としない、膨大な数のヒトｉＰＳ由来細胞モデルを開発する機会を開くものである。
【００２９】
本明細書に記載された系および方法において使用するｉＰＳ細胞の選択において、細胞は、確実におよび再現可能に作製でき、このような研究に十分な量で分化細胞の純粋集団を生成できることが好ましい。いくつかの実施形態において、このような細胞は、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｉｎｃ．（マジソン、ＷＩ）から入手可能である。
【００３０】
本発明の実施形態の進展の過程で実施された実験は、ヒトｉＰＳ由来神経細胞が、ボツリヌス神経毒素、中和抗体および阻害剤の検出ならびにＢｏＮＴ細胞侵入および輸送研究に対する、感受性、選択性が高い、種特異的細胞モデルであることを示した。これらの神経細胞は、ＢｏＮＴ効力測定、ならびに抗体検出、阻害剤のスクリーニング、および研究適用に対するＭＢＡの代わりとなるのに適している。
【００３１】
Ｉ．細胞
本明細書に記載されている通り、本発明の実施形態は、ＢｏＮＴなどの病原因子の検出および分析において使用するための多能性由来幹細胞を提供する。いくつかの実施形態において、細胞はヒト（例えば、ヒト人工多能性幹由来細胞（ｈｉＰＳ，ｈｕｍａｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｅｌｌｓ）由来神経細胞またはヒト胚性幹細胞）である。ｉＰＳ細胞を生成する方法は、例えば、Ｙｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００９年５月８日；３２４（５９２８）：７９７〜８０１頁．Ｅｐｕｂ  ２００９、ＷＯ２０１１０５６９７１およびＷＯ２０１１０２５８５２に記載され、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。いくつかの実施形態において、ｉＰＳ細胞は、適切な方法（例えば、米国特許出願ＵＳ２０１０／０２７９４０３および米国特許出願ＵＳ２０１０／０２１６１８１に記載されているもの（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている））を用いて神経細胞に分化させる。
【００３２】
いくつかの実施形態において、神経細胞は、ＧＡＢＡ作動性、ドーパミン作動性、およびグルタミン作動性神経細胞の９８％純粋な汎神経細胞集団であり、分化細胞として作製され低温保存される。いくつかの実施形態において、市販の神経細胞由来ｉＰＳ細胞（例えば、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｉｎｃ．（マジソン、ＷＩ）またはＧｌｏｂａｌＳｔｅｍ（ロックビル、ＭＤ）から入手可能なもの）が利用されるが、他の供給源が利用されてもよい。いくつかの実施形態において、細胞は神経細胞ｈｉＰＳ細胞である。
【００３３】
別の態様において、細胞は、ＧＡＢＡ作動性、ドーパミン作動性、およびグルタミン作動性神経細胞の本質的に純粋な汎神経細胞集団である、ならびに分化細胞として作製され低温保存される神経細胞であり、分化細胞は、神経細胞という点で少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９６％純粋である。
【００３４】
本発明は、本明細書に記載された細胞に限定されない。追加の細胞系および初代細胞培養物が利用されてもよい。例えば、いくつかの実施形態において、コリン作動性神経細胞が利用される。
【００３５】
いくつかの実施形態において、適切な細胞系は、ＢｏＮＴ中毒に必要なまたは十分な受容体および基質を発現する。
【００３６】
いくつかの実施形態において、本発明は、ＢｏＮＴの検出および分析を行うのに必要な、十分なまたは有用な成分と共に本明細書に記載された細胞系を含む、系およびキットを提供する。例えば、いくつかの実施形態において、キットは、細胞および細胞培養試薬（例えば、プレート、緩衝液等）、アッセイ試薬、対照（陽性および陰性ＢｏＮＴならびに／または阻害剤対照）およびアッセイを行い分析するための指示書を含む。
【００３７】
本発明の一態様において、ｈｉＰＳ細胞由来神経細胞は、上述したプロセスにより生成したｈｉＰＳ細胞が神経細胞へ分化および／または成熟することにより得ることができ、または得られている。このような神経細胞分化は、一態様において、約３７℃、約５％ＣＯ２下でｈｉＰＳ細胞を培養して達成することができる。一態様において、培養のための培地は、Ｂ２７およびグルタマックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）を補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地であってもよい。さらに別の態様において、細胞は、ポリリジンコートプレートで培養され、さらなる態様において、プレートはさらにマトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡ）でコートされる。一態様において、９６ウェルプレートが、細胞が１ウェル当たり約４０，０００細胞密度で増殖する培養に対し使用される。一態様において、細胞は約２４時間にわたって播種することができる。その後細胞は、一態様において約２〜約２８日間、一態様において約４〜約１４日間、または一態様において約４〜約７日間にわたって成熟させてもよい。
【００３８】
一態様において、前記ｈｉＰＳ細胞由来神経細胞は、基本的に以下の添付例に記載された分化および成熟プロセスにより得られる。
【００３９】
本発明の実施形態はまた、前述の分化および成熟プロセスにより得られるｈｉＰＳ細胞由来神経細胞にも関する。
【００４０】
一態様において、このようなｈｉＰＳ細胞由来神経細胞は、以下のマーカー、すなわちβ３チューブリン、ＮｅｕＮ、ｖＧＡＴ、ｖＧＬＵＴ２、ＮＳＥ（ｎｅｕｒｏｎｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｎｏｌａｓｅ（神経細胞特異的エノラーゼ））またはＴｂｒ１（Ｔ−ｄｏｍａｉｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  １（Ｔドメイン転写因子１））の１つまたは複数の存在、および一態様においては全ての存在を特徴とする。β３チューブリンまたはＮｅｕＮに関して、本発明のｈｉＰＳ細胞由来神経細胞の培養物における陽性細胞数は、約９９％であることが想定される。ｖＧＡＴまたはｖＧＬＵＴ２に関して、培養物の細胞の少なくとも一部が、前記マーカーに対して陽性であることが一態様において想定される。
【００４１】
一態様において、このようなｈｉＰＳ細胞由来神経細胞は、以下のマーカー、すなわちＧＦＡＰ、ＴＨ、ＮＮＥ（ｎｏｎ−ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｅｎｏｌａｓｅ（非神経細胞性エノラーゼ））、Ｔｂｒ２（Ｔ−ｄｏｍａｉｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ２（Ｔドメイン転写因子２））、またはＮｏＧｏ  ａ，Ｃの１つまたは複数の非存在、および一態様においては全ての非存在を特徴とする。ＧＦＡＰに関して、ｈｉＰＳ細胞由来神経細胞の培養物における陽性細胞数は著しく少なく、一態様において約５％より下または約１％よりも下であることが想定され、残りのマーカーに関して、これらは仮にあったとしても検出可能な量より下で存在することが一態様において想定される。
【００４２】
前述のマーカーの存在もしくは非存在または量は、一態様において、従来の免疫学的技法により判定することができる。例えば、マーカーは、β３チューブリンまたはＮｅｕＮがＦＡＣＳ分析により関係する限り、細胞溶解物の免疫組織学的染色法、ウエスタンブロット分析により判定することができる。さらなる検出技法が記載されている（例えば、ＵＳ２０１２／０１７８０８３、ＵＳ２００８／０２８０３０１、Ｅｎｇｌｕｎｄ  ２００５、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２５：  ２４７〜２５１頁；Ｄｕｐｕｉｓ  ２００２、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  １０：  ３５８〜３６５頁参照（これらの各々は参照により本明細書に組み込まれている））。
【００４３】
さらなる態様において、ｈｉＰＳ細胞由来神経細胞は、以下の電気生理学的特性、すなわちテトロドトキシン（ｔｅｒｔｒｏｄｏｔｏｘｉｎ）（ＴＴＸ）によるＮａ２＋チャネルの阻害、テトラエチルアンモニウムによるＫ＋チャネルの阻害、ニフェジピンによるＬ型Ｃａ２＋チャネルの阻害、ｗ−アガトキシンＩＶＡによるＰ／Ｑ型Ｃａ２＋チャネルの阻害、またはｗ−コノトキシンＧＶＩＡによるＮ型Ｃａ２＋チャネルの阻害の少なくとも１つ、および一態様においては全てを特徴とする。このような電気生理学的特性は、例えば、それぞれの阻害剤で細胞を処理する前後のパッチクランプ測定を含む標準的電気生理学的測定により試験することができる。
【００４４】
別の態様において、ｈｉＰＳ細胞由来神経細胞は、ＢｏＮＴに対する感受性、および一態様においてはＢｏＮＴ／Ａに対する感受性を特徴とする。さらに、細胞は、一態様において、用量依存的に他の神経毒性化合物、および特に以下の化合物、すなわちスタウロスポリン、ＡＴＰ競合キナーゼ阻害剤、クロロプロマゾイン（ｃｈｌｏｒｏｐｒｏｍａｚｏｉｎｅ）またはフェノチアジンの少なくとも１つまたは全てに対しても感受性である。前述の化合物に対する感受性は、例えば細胞生存アッセイにおいて判定することができる。
【００４５】
一態様においてｈｉＰＳ細胞由来神経細胞は、以下の化合物、すなわちアンチマイシンＡ、マイトマイシンＣ、ＭＫ５７１、ＰＤ９８０９２またはスタウロスポリンの少なくとも１つ、および一態様においては全てに対しても、神経突起伸長に関して感受性である。
【００４６】
さらに、一態様においてｈｉＰＳ細胞由来神経細胞は、以下の化合物、すなわちアンチマイシンＡ（ａｎｔｉｍｙｃｉｎｅ  Ａ）またはバリノマイシン（ｖａｌｉｎｏｍｙｃｉｎｅ）の少なくとも１つ、または一態様においては全てに対しミトコンドリア膜電位消失に関して感受性である。
【００４７】
ＩＩ．アッセイおよび使用
本発明の実施形態は、ＢｏＮＴをアッセイするための組成物および方法を提供する。アッセイの、研究適用、臨床適用、診断適用および治療適用における使用が見出される。
【００４８】
いくつかの実施形態において、アッセイは、多能性細胞（例えば、ｈｉＰＳ由来神経細胞）を利用する。ヒト細胞の使用は、種特異的モデルの利点を提供する。さらに、多能性細胞に由来する神経細胞は、体性神経細胞（ｓｏｍａｔｉｃ  ｎｅｕｒｏｎ）を反映していない可能性がある、癌細胞系または改変細胞系に由来する神経細胞とは対照的に、正常な健康な神経細胞の代表である。
【００４９】
いくつかの実施形態において、アッセイは、ＢｏＮＴの効力をスクリーニングするために、神経細胞、例えば、ｈｉＰＳ由来神経細胞を利用する。他の実施形態において、アッセイは、ＢｏＮＴの毒性をスクリーニングする。さらなる実施形態において、アッセイは、活性についてＢｏＮＴに対する中和抗体または他の生物医薬の存在または特性をスクリーニングする。いくつかの実施形態において、アッセイは定量的であるが、他においてアッセイは定性的である。
【００５０】
いくつかの実施形態において、細胞は、最初に適切なマトリックスで培養される。いくつかの実施形態において、細胞は、神経細胞の成熟を得るために培養される。本発明の実施形態において使用される多能性細胞は、既存のアッセイで使用される細胞より急速に成熟するという利点を提供する。いくつかの実施形態において、細胞は次に、適切な期間、毒素（例えば、ＢｏＮＴ）に曝露される。毒素曝露後、所望のパラメータ（例えば、ＥＣ５０）が適切な方法を用いて計算される。本明細書に記載されたアッセイは、精製ＢｏＮＴおよび複合体での（例えば、天然の状況およびいくつかの医薬調製物において見出される他のタンパク質と複合体化した）ＢｏＮＴの両方の検出に適している。本明細書に記載されたアッセイは、ＢｏＮＴ血清型（例えば、ＢｏＮＴ／Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧ）またはそれらのバリアントもしくはキメラをいくつでも検出するのに適している。いくつかの実施形態において、ＢｏＮＴは組換え発現される。他の実施形態において、ＢｏＮＴは細菌細胞から精製される。
【００５１】
いくつかの実施形態において、抗体プロテクションアッセイは中和抗体を試験するために行われる。ＢｏＮＴは、さまざまな状態に対する多数の患者の治療に効果的に使用されるが（Ｄｈａｋｅｄら、Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｒｅｓ  １３２：  ４８９〜５０３頁に概説されている）、中和抗体を発生するものがあり、さらなる治療の成功を妨げることになる。例えば、治療された患者の約５％が中和ＢｏＮＴ抗体を発生し、さらなる治療を妨げることになると頸部ジストニアの治療では推定されている（Ｋｅｓｓｌｅｒら、（１９９９）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  ２４６：  ２６５〜２７４頁）。高感受性の定量的アッセイは市販されていないため、現在、患者は、中和抗体の発生について治療経過にわたりモニターされていない（Ｓｅｓａｒｄｉｃら、（２００４）Ｍｏｖ  Ｄｉｓｏｒｄ  １９  Ｓｕｐｐｌ  ８：  Ｓ８５〜９１頁）。ｉＰＳ神経細胞を用いる本明細書に示された試験プラットフォームは、ＢｏＮＴの治療的または美容的反復注入を受けた患者の血清におけるＢｏＮＴ中和抗体の感受性検出および定量的検出を提供する。中和抗体は、試料タイプ（例えば、精製抗体、血清、抗毒素等）をいくつでも検出することができる。
【００５２】
いくつかの実施形態において、ＢｏＮＴの低分子阻害剤が試験される（例えば、研究または薬物スクリーニングのために）。例えば、いくつかの実施形態において、細胞は、最初にＢｏＮＴ、次いで阻害剤に曝露され、両方に共曝露され、または細胞は最初に阻害剤、次いでＢｏＮＴに曝露される。
【００５３】
適切なエンドポイント測定はいくつでも、ＢｏＮＴ活性をアッセイするのに利用することができる。例には、ウエスタンブロット、神経伝達物質放出、ＥＬＩＳＡ（Ｎｕｓｓ  ＪＥら（２０１０）Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  １５：  ４２〜５１頁）、または例えばＦＲＥＴセンサー（Ｄｏｎｇら、（２００４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：  １４７０１〜１４７０６頁）などの細胞内発現レポーターが含まれるが、これらに限定されない。
【００５４】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたアッセイの、診断評価、臨床治療の最適化および投薬、ならびに治療モダリティーの選択における、医薬としてのまたは研究利用のためのＢｏＮＴまたは誘導体の製造中の品質管理試験における使用が見出される。
【００５５】
明細書に記載されたアッセイの追加の適用には、阻害剤の検出、ならびに診断利用、臨床利用、スクリーニング利用および研究利用が含まれるが、これらに限定されない。
【００５６】
いくつかの実施形態において、本発明は、ａ）ｈｉＰＳ由来神経細胞を、ＢｏＮＴを含む組成物と接触させるステップと、ｂ）生物学的活性についてＢｏＮＴをアッセイするステップとを含む、ボツリヌス菌神経毒素（ＢｏＮＴ）を活性についてアッセイする方法を提供する。
【００５７】
前記方法の一態様において、アッセイは、ＢｏＮＴの生物学的活性の存在または非存在を判定するステップを含む。このようなアッセイはまた、定性的アッセイとも本明細書では呼ばれることがある。ＢｏＮＴ生物学的活性の存在または非存在に基づき、前記生物学的に活性なＢｏＮＴを含む組成物、または前記生物学的に活性なＢｏＮＴを含むことが疑われる組成物中の生物学的に活性なＢｏＮＴの存在または非存在に関して結論を下すことができると理解されよう。その上、さらに別の態様において、アッセイは、生物学的に活性なＢｏＮＴを含む組成物中の生物学的に活性なＢｏＮＴの量を測定するステップを包含してもよい。生物学的に活性なＢｏＮＴの量は、組成物中の前記ＢｏＮＴについてアッセイされた生物学的活性の量から導くことができると理解されよう。このようなアッセイはまた、本明細書では定量的アッセイとも呼ばれることがある。
【００５８】
本発明の方法の一態様において、ＢｏＮＴは、クロストリジウム神経毒素の異なる血清型群から選択される神経毒素であり、例を挙げると、例えば、ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ１、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ、またはＢｏＮＴ／Ｇから選択される。さらに、一態様において、破傷風毒素（ＴｅＮＴ）が本発明による方法において神経毒素として使用されてもよい。
【００５９】
細菌ボツリヌス菌および破傷風菌は、これらの極めて強力な神経毒素、例えば、それぞれボツリヌス毒素（ＢｏＮＴ）および破傷風毒素（ＴｅＮＴ）を自然に産生する。これらの神経毒素は神経細胞に特異的に結合し、神経伝達物質放出を破壊する。各毒素は、約１５０ｋＤａの不活性な一本鎖タンパク質として合成される。翻訳後プロセシングは、ジスルフィド架橋の形成、および細菌プロテアーゼ（複数可）によるタンパク質限定分解（ニッキング）を伴う。活性な二本鎖（ｄｉｃｈａｉｎ）神経毒素は、二つの鎖、ジスルフィド結合により連結された約５０ｋＤａのＮ末端軽鎖および約１００ｋＤａの重鎖からなる。神経毒素は、構造的に３つのドメイン、例えば、触媒軽鎖、移行ドメイン（Ｎ末端の半分）および受容体結合ドメイン（Ｃ末端の半分）を包含する重鎖からなる（例えば、Ｋｒｉｅｇｌｓｔｅｉｎ  １９９０、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １８８、３９；Ｋｒｉｅｇｌｓｔｅｉｎ  １９９１、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２０２、４１；Ｋｒｉｅｇｌｓｔｅｉｎ  １９９４、Ｊ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ  １３、４９参照）。ＢｏＮＴポリペプチドおよびＴｅＮＴポリペプチドの構造は、前述の参考文献に記載されている。
【００６０】
ＢｏＮＴの７つの抗原的に異なる血清型およびＴｅＮＴは、ＳＮＡＲＥタンパク質を切断してシナプス開口放出をブロックするＺｎ２＋エンドプロテアーゼである。神経毒素は、ボツリヌス中毒症および破傷風障害において見られる弛緩性筋麻痺を引き起こす（Ｆｉｓｃｈｅｒ  ２００７、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０４、１０４４７頁参照）。
【００６１】
さらに別の態様において、改変ＢｏＮＴまたはＴｅＮＴの活性が、本発明の方法においてアッセイされてもよい。このような改変ＢｏＮＴは、少なくとも１つの置換、付加および／または欠失をＢｏＮＴまたはＴｅＮＴのアミノ酸配列に導入して、前述のＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ１、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ、もしくはＢｏＮＴ／ＧまたはＴｅＮＴから誘導ことができる。このような改変ＢｏＮＴまたはＴｅＮＴは、故に、上述したＢｏＮＴまたはＴｅＮＴのいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有し得る。用語「同一の（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）」は本明細書で使用するとき、最上位の一致が得られるように整列された２つのアミノ酸配列間で同一アミノ酸の数を決定することにより特徴付けられる配列同一性を指す。配列同一性は、例えばＢＬＡＳＴＰまたはＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  １９９０、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５、４０３頁）などのコンピュータプログラムに体系化された、公表された技法または方法を用いて計算することができる。パーセント同一性値は、１つの態様において、アミノ酸配列全体にわたって計算される。さまざまなアルゴリズムに基づく一連のプログラムは、異なる配列を比較するのに熟練技能者に利用可能である。この文脈において、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈまたはＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムは、特に信頼できる結果を示す。配列アラインメントを実施するには、ＧＣＧソフトウェアパケット（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  １９９１、５７５サイエンスドライブ、マジソン、ウィスコンシン、ＵＳＡ  ５３７１１）の一部であるプログラムＰｉｌｅＵｐ（Ｈｉｇｇｉｎｓ  １９８９、ＣＡＢＩＯＳ  ５、１５１頁）またはプログラムＧａｐおよびＢｅｓｔＦｉｔ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  １９７０、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４８；  ４４３頁；Ｓｍｉｔｈ  １９８１、Ａｄｖ  Ａｐｐｌ  Ｍａｔｈ  ２、４８２頁）が使用されてもよい。パーセント（％）で上に列挙された配列同一性値は、以下の設定、すなわち、ＧＡＰ重量（ＧＡＰ  Ｗｅｉｇｈｔ）：５０、長さ重量（Ｌｅｎｇｔｈ  Ｗｅｉｇｈｔ）：３、平均一致（Ａｖｅｒａｇｅ  Ｍａｔｃｈ）：１０．０００および平均不一致（Ａｖｅｒａｇｅ  Ｍｉｓｍａｔｃｈ）：０．０００（特に指定のない限り、配列アラインメントの標準設定として常に使用されるものとする）で配列領域全体にわたるプログラムＧＡＰを用いて、本発明の別の態様において決定される。
【００６２】
一態様において、前述の改変ＢｏＮＴまたはＴｅＮＴポリペプチドの各々は、それぞれの非改変ポリペプチド、すなわちＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ１、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ、ＢｏＮＴ／ＧまたはＴｅＮＴの生物学的特性の１つまたは複数、および別の態様においては全てを保持する。未処理の前駆体は若干の生物学的機能を発揮することができ、または部分的に活性であると考え得るとしても、当業者は、十分な生物学的活性がタンパク質分解活性化後に維持されることを理解するであろう。「生物学的特性」は本明細書で使用するとき、（ａ）受容体結合、（ｂ）内在化、（ｃ）サイトゾルへのエンドソーム膜を越えた移行、および／または（ｄ）シナプス小胞膜融合に関与するタンパク質の細胞内タンパク質分解切断を指す。生物学的活性を評価するためのインビボアッセイには、マウスＬＤ５０アッセイ、および例えばＤｒｅｓｓｌｅｒら（Ｄｒｅｓｓｌｅｒ  ２００５、Ｍｏｖ  Ｄｉｓｏｒｄ  ２０：１６１７〜１６１９頁、Ｋｅｌｌｅｒ  ２００６、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １３９：  ６２９〜６３７頁）により記載されているエクスビボマウス片側横隔膜アッセイが含まれる。生物学的活性は、一般にマウス単位（ＭＵ）で表される。本明細書で使用するとき、１ＭＵは、腹腔内注入後に特定のマウス集団の５０％を致死させる神経毒性成分量、すなわちマウス腹腔内ＬＤ５０である。さらなる態様において、改変ポリペプチドは、改善または改変された生物学的特性を有することができ、例えば、これらは、酵素認識が改善される切断部位、または受容体結合もしくは上に明示された任意の他の特性が改善され得る切断部位を含んでもよい。
【００６３】
一態様において、改変ＢｏＮＴまたはＴｅＮＴは、本明細書に記載された方法により、上述した生物学的活性の１つまたは複数、および一態様においては全てがアッセイされてもよい。
【００６４】
本発明の一態様において、改変ＢｏＮＴまたはＴｅＮＴは、例えば、ＢｏＮＴまたはＢｏＮｔ／ＴｅＮＴハイブリッド、再標的化ＢｏＮＴ、再標的化ＴｅＮＴ、およびキメラＢｏＮＴまたはＴｅＮＴから選択される。改変ＢｏＮＴおよびＴｅＮＴは記載されている。
【００６５】
本発明の方法の一態様において、接触は、少なくとも２つの異なる成分を、前記成分の物理的および／または化学的相互作用を可能にするように物理的に近接させることを含む。前述の方法において、ｈｉＰＳ由来神経細胞は、生物学的に活性なＢｏＮＴを含む組成物、または生物学的に活性なＢｏＮＴを含むことが疑われる組成物と接触させる。接触は、組成物中に含まれる生物学的に活性なＢｏＮＴが、この生物学的活性をｈｉＰＳ細胞由来神経細胞に発揮できるようにするのに十分な時間および条件下で実施される。故に、一態様において接触は、（ａ）受容体結合、（ｂ）内在化、（ｃ）サイトゾルへのエンドソーム膜を越えた移行、および／または（ｄ）シナプス小胞膜融合に関与するタンパク質もしくはｈｉＰＳ細胞由来神経細胞において前記プロセスを模倣する基質の細胞内タンパク質分解切断を可能にするものとする。当業者は、どの条件をｈｉＰＳ細胞由来神経細胞の特定の培養に適用する必要があるかを十分に承知している。接触は、一態様において、本明細書に記載された方法によりＢｏＮＴ活性がアッセイされる組成物の試料を培養培地に添加することにより、ｈｉＰＳ細胞由来神経細胞が適切な培養培地および適切な培養条件下、ウェルプレートで培養される細胞培養系において実施されてもよい。
【００６６】
一態様において、適切な培養条件は、約３７℃、約５％ＣＯ２下での培養を含む。一態様において、培養のための培地は、Ｂ２７およびグルタマックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）を補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地である。さらに別の態様において、ｈｉＰＳ細胞由来神経細胞はポリリジンコートプレートで培養され、さらなる態様において、マトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡ）でさらにコートしたプレートが利用される。一態様において、９６ウェルプレートが、細胞が１ウェル当たり約１０，０００〜約１００，０００細胞密度、さらなる態様において約２０，０００〜約６０，０００細胞密度、およびさらに一態様において約４０，０００細胞密度に増殖された培養に使用される。一態様において、細胞は約２４時間にわたって播種することができる。一態様において、その後細胞は、接触が実施される前に約２〜約２８日間、一態様において約４〜約１４日間、または一態様において約４〜約７日間にわたって成熟させてもよい。
【００６７】
さらに一態様において、前記接触は以下の添付例に記載されているように実施される。
【００６８】
本発明の方法の一態様において、生物学的に活性なＢｏＮＴを含む組成物は、生物学的に活性なＢｏＮＴを含むことが知られている組成物、または生物学的に活性なＢｏＮＴを含むことが疑われる組成物である。組成物は、前記生物学的に活性なＢｏＮＴに加えて、例えば、適切な溶媒および／または安定剤（タンパク質および一態様において、ＢｏＮＴの複合タンパク質（ＨＡ７０、ＨＡ１７、ＨＡ３３、またはＮＴＮＨ（ＮＢＰ））、または他のタンパク質安定剤など）などの他の成分を含むことができる。組成物は、例えば本明細書の他の部分に言及されているＢｏＮＴの生物学的活性のいずれかを増強することにより、ＢｏＮＴの生物学的活性を促進するタンパク質をさらに含むこともできる。さらに一態様において、組成物は、１つを超えるＢｏＮＴを含んでもよい。
【００６９】
一態様において、組成物は、ボツリヌス菌細胞または生物学的に活性なＢｏＮＴを含む他の細菌細胞もしくは非細菌細胞の細胞溶解物である。一態様において、このような組成物も、部分的精製（例えば粗抽出物）またはＢｏＮＴの精製（例えば、精製ＢｏＮＴ調製物）によるこのような細胞溶解物から得られるＢｏＮＴ調製物である。別の態様において、組成物は混合成分を含む人工組成物である。さらに一態様において、組成物は、本明細書の他の部分に記載されている医薬組成物として使用される調製物である。
【００７０】
本発明の方法の一態様において、生物学的活性についてＢｏＮＴをアッセイするステップは、ｈｉＰＳ細胞由来神経細胞における生物学的に活性なＢｏＮＴ（存在するならば）により切断される、シナプス小胞膜融合に関与するタンパク質または他の基質の細胞内タンパク質分解切断を判定することにより実施される。
【００７１】
いくつかの実施形態において、シナプス小胞膜融合に関与するタンパク質または他の基質は、アッセイされるＢｏＮＴまたはＴｅＮＴにより認識される神経毒素切断部位を有する。神経毒素切断部位は本明細書で使用するとき、神経毒素ポリペプチドの内因性プロテアーゼにより認識され切断される切断部位を指す。神経毒素プロテアーゼにより認識される切断部位は、記載されている（例えば、ＥＰ  １  ９２６  ７４４  Ｂ１；その全体が参照により本明細書に組み込まれている）。原則として、神経毒素切断部位は、基質において自然発生する切断部位、または神経毒素ポリペプチドプロテアーゼにより認識され切断される人工的に設計された切断部位であり得る。
【００７２】
ＢｏＮＴ／Ａプロテアーゼにより認識され切断される神経毒素切断部位は本発明の一態様において、ＢｏＮＴ／Ａによる切断に感受性であるタンパク質に由来する。一態様において、このようなタンパク質は、ヒトＳＮＡＰ２５ＡもしくはＢまたはこれらのホモログ、パラログもしくはオルソログ（ラット、マウス、ウシ、ダニオ、フナ、アフリカツメガエル、シビレエイ、キタムラサキウニ、ヤリイカ、モノアラガイもしくはアメフラシ由来の）である。前記タンパク質に由来する適切な切断部位は、ＥＰ  １  ９２６  ７４４  Ｂ１に開示されている。
【００７３】
ＢｏＮＴ／Ｂプロテアーゼにより認識され切断される神経毒素切断部位は本発明の一態様において、ＢｏＮＴ／Ｂによる切断に感受性であるタンパク質に由来する。一態様において、このようなタンパク質は、ヒトまたはマウスＶＡＭＰ−１、ＶＡＭＰ−２およびＶＡＭＰ−３／セルブレビン、ウシＶＡＭＰ−２、ラットＶＡＭＰ−２もしくはＶＡＭＰ−３、ニワトリＶＡＭＰ−１、ＶＡＭＰ−２もしくはＶＡＭＰ−３、シビレエイＶＡＭＰ−１、キタムラサキウニＶＡＭＰ、ショウジョウバエｓｙｂＡ、ｓｙｎＢ、ｓｙｎＣ、ｓｙｎＤもしくはｓｙｎ、水蛭ＶＡＭＰ、アフリカツメガエルＶＡＭＰ−２もしくはＶＡＭＰ−３、ダニオＶＡＭＰ−１もしくはＶＡＭＰ−２、ヤリイカＶＡＭＰ、モノアラガイＶＡＭＰ、アメフラシＶＡＭＰまたは線虫ＳＮＢ１様あるいはこれらの任意のオルソログ、パラログまたはホモログである。前記タンパク質に由来する適切な切断部位は、例えばＥＰ  １  ９２６  ７４４  Ｂ１に開示されている。
【００７４】
ＢｏＮＴ／Ｃ１プロテアーゼにより認識され切断される神経毒素切断部位は本発明の一態様において、ＢｏＮＴ／Ｃ１による切断に感受性であるタンパク質に由来する。一態様において、このようなタンパク質は、ヒトおよびマウスシンタキシン１Ａ、シンタキシン１Ｂ１、シンタキシン２−１、シンタキシン２−２、シンタキシン２−３、シンタキシン３Ａもしくはシンタキシン１Ｂ２、ウシまたはラットシンタキシン１Ａ、シンタキシン１Ｂ１もしくはシンタキシン１Ｂ２、ラットシンタキシン２もしくはラットシンタキシン３、マウスシンタキシン１Ａ、シンタキシン１Ｂ１、シンタキシン１Ｂ２、シンタキシン２、シンタキシン３Ａ、シンタキシン３Ｂもしくはシンタキシン３Ｃ、ニワトリシンタキシン１Ａもしくはシンタキシン２、アフリカツメガエルシンタキシン１Ａもしくはシンタキシン１Ｂ、ダニオシンタキシン１Ａ、シンタキシン１Ｂもしくはシンタキシン３、シビレエイシンタキシン１Ａもしくはシンタキシン１Ｂ、キタムラサキウニシンタキシン１Ａもしくはシンタキシン１Ｂ、ショウジョウバエシンタキシン１Ａもしくはシンタキシン１Ｂ、水蛭シンタキシン１Ａもしくシンタキシン１Ｂ、ヤリイカシンタキシン１Ａもしくはシンタキシン１Ｂ、モノアラガイシンタキシン１Ａもしくはシンタキシン１Ｂまたはこれらの任意のオルソログ、パラログまたはホモログである。該タンパク質に由来する適切な切断部位は、例えばＥＰ  １  ９２６  ７４４  Ｂ１に開示されている。
【００７５】
ＢｏＮＴ／Ｄプロテアーゼにより認識され切断される神経毒素切断部位は本発明の一態様において、ＢｏＮＴ／Ｄによる切断に感受性であるタンパク質に由来する。一態様において、このようなタンパク質は、ヒトまたはマウスＶＡＭＰ−１、ＶＡＭＰ−２およびＶＡＭＰ−３／セルブレビン、ウシＶＡＭＰ−２、ラットＶＡＭＰ−２もしくはＶＡＭＰ−３、ニワトリＶＡＭＰ−１、ＶＡＭＰ−２もしくはＶＡＭＰ−３、シビレエイＶＡＭＰ−１、キタムラサキウニＶＡＭＰ、ショウジョウバエｓｙｂＡ、ｓｙｎＢ、ｓｙｎＣ、ｓｙｎＤ、もしくはｓｙｎ、水蛭ＶＡＭＰ、アフリカツメガエルＶＡＭＰ−２もしくはＶＡＭＰ−３、ダニオＶＡＭＰ−１もしくはＶＡＭＰ−２、ヤリイカＶＡＭＰ、モノアラガイＶＡＭＰ、アメフラシＶＡＭＰまたは線虫ＳＮＢ１様またはこれらの任意のオルソログ、パラログまたはホモログである。該タンパク質に由来する適切な切断部位は、例えばＥＰ  １  ９２６  ７４４  Ｂ１に開示されている。
【００７６】
ＢｏＮＴ／Ｅプロテアーゼにより認識され切断される神経毒素切断部位は本発明の一態様において、ＢｏＮＴ／Ｅによる切断に感受性であるタンパク質に由来する。一態様において、このようなタンパク質は、このようなタンパク質は、ヒトＳＮＡＰ−２５ＡもしくはＢまたはこれらのホモログ、パラログまたはオルソログ（ラット、マウス、ウシ、ダニオ、フナ、アフリカツメガエル、シビレエイ、キタムラサキウニ、ヤリイカ、モノアラガイまたはアメフラシ由来の）である。該タンパク質に由来する適切な切断部位は、例えばＥＰ  １  ９２６  ７４４  Ｂ１に開示されている。
【００７７】
ＢｏＮＴ／Ｆプロテアーゼにより認識され切断される神経毒素切断部位は本発明の一態様において、ＢｏＮＴ／Ｆによる切断に感受性であるタンパク質に由来する。一態様において、このようなタンパク質は、このようなタンパク質は、ヒトまたはマウスＶＡＭＰ−１、ＶＡＭＰ−２およびＶＡＭＰ−３／セルブレビン、ウシＶＡＭＰ−２、ラットＶＡＭＰ−２もしくはＶＡＭＰ−３、ニワトリＶＡＭＰ−１、ＶＡＭＰ−２もしくはＶＡＭＰ−３、シビレエイＶＡＭＰ−１、キタムラサキウニＶＡＭＰ、ショウジョウバエｓｙｂＡ、ｓｙｎＢ、ｓｙｎＣ、ｓｙｎＤ、もしくはｓｙｎ、水蛭ＶＡＭＰ、アフリカツメガエルＶＡＭＰ−２もしくはＶＡＭＰ−３、ダニオＶＡＭＰ−１もしくはＶＡＭＰ−２、ヤリイカＶＡＭＰ、モノアラガイＶＡＭＰ、アメフラシＶＡＭＰまたは線虫ＳＮＢ１様あるいはこれらの任意のオルソログ、パラログまたはホモログである。該タンパク質に由来する適切な切断部位は、例えばＥＰ  １  ９２６  ７４４  Ｂ１に開示されている。
【００７８】
ＢｏＮＴ／Ｇプロテアーゼにより認識され切断される神経毒素切断部位は本発明の一態様において、ＢｏＮＴ／Ｇによる切断に感受性であるタンパク質に由来する。一態様において、このようなタンパク質は、このようなタンパク質は、ヒトまたはマウスＶＡＭＰ−１、ＶＡＭＰ−２およびＶＡＭＰ−３／セルブレビン、ウシＶＡＭＰ−２、ラットＶＡＭＰ−２もしくはＶＡＭＰ−３、ニワトリＶＡＭＰ−１、ＶＡＭＰ−２もしくはＶＡＭＰ−３、シビレエイＶＡＭＰ−１、キタムラサキウニＶＡＭＰ、ショウジョウバエｓｙｂＡ、ｓｙｎＢ、ｓｙｎＣ、ｓｙｎＤ、もしくはｓｙｎ、水蛭ＶＡＭＰ、アフリカツメガエルＶＡＭＰ−２もしくはＶＡＭＰ−３、ダニオＶＡＭＰ−１もしくはＶＡＭＰ−２、ヤリイカＶＡＭＰ、モノアラガイＶＡＭＰ、アメフラシＶＡＭＰまたは線虫ＳＮＢ１様あるいはこれらの任意のオルソログ、パラログまたはホモログである。該タンパク質に由来する適切な切断部位は、例えばＥＰ  １  ９２６  ７４４  Ｂ１に開示されている。
【００７９】
ＴｅＮＴプロテアーゼにより認識され切断される神経毒素切断部位は本発明の一態様において、ＴｅＮＴによる切断に感受性であるタンパク質に由来する。一態様において、このようなタンパク質は、ヒトまたはマウスＶＡＭＰ−１、ＶＡＭＰ−２およびＶＡＭＰ−３／セルブレビン、ウシＶＡＭＰ−２、ラットＶＡＭＰ−２もしくはＶＡＭＰ−３、ニワトリＶＡＭＰ−１、ＶＡＭＰ−２もしくはＶＡＭＰ−３、シビレエイＶＡＭＰ−１、キタムラサキウニＶＡＭＰ、ショウジョウバエｓｙｂＡ、ｓｙｎＢ、ｓｙｎＣ、ｓｙｎＤ、もしくはｓｙｎ、水蛭ＶＡＭＰ、アフリカツメガエルＶＡＭＰ−２もしくはＶＡＭＰ−３、ダニオＶＡＭＰ−１もしくはＶＡＭＰ−２、ヤリイカＶＡＭＰ、モノアラガイＶＡＭＰ、アメフラシＶＡＭＰまたは線虫ＳＮＢ１様またはこれらの任意のオルソログ、パラログまたはホモログである。該タンパク質に由来する適切な切断部位は、例えばＥＰ  １  ９２６  ７４４  Ｂ１に開示されている。
【００８０】
ＢｏＮＴプロテアーゼにより認識され切断される神経毒素切断部位は本発明の別の態様において、ＢｏＮＴタンパク質で見出される自己触媒的切断部位に由来する。態様において、本発明に従って使用され、特定のＢｏＮＴまたはＴｅＮＴの自己触媒的切断部位に由来する神経毒素切断部位は、ＢｏＮＴ／Ａ残基２５０Ｔｙｒ−２５１Ｔｙｒ、ＢｏＮＴ／Ｂ残基２５６Ｐｈｅ−２５７Ｐｈｅ、ＢｏＮＴ／Ｃ１残基２５７Ｐｈｅ−２５８Ｔｙｒ、ＢｏＮＴ／Ｄ残基２５７Ｐｈｅ−２５８Ｐｈｅ、ＢｏＮＴ／Ｅ残基２３９Ｐｒｏ−２４０Ｌｅｕ、ＢｏＮＴ／Ｆ残基２５４Ｐｒｏ−２５５Ｌｅｕ、ＢｏＮＴ／Ｇ残基２５６Ｐｈｅ−２５７Ｐｈｅ、ＴｅＮＴ残基２５９Ｉｌｅ−２６０Ｔｙｒ、ＢｏＮＴ／Ａ残基Ｐｈｅ２６６−Ｇｌｙ２６７、ＢｏＮＴ／Ｂ残基Ｐｈｅ２７２−Ｇｌｙ２７３、ＢｏＮＴ／Ｃ１残基Ｐｈｅ２７３−Ｇｌｙ２７４、ＢｏＮＴ／Ｄ残基Ｐｈｅ２７３−Ｇｌｙ２７４、ＢｏＮＴ／Ｅ残基Ｐｈｅ２５５−Ｇｌｙ２５６、ＢｏＮＴ／Ｆ残基Ｐｈｅ２７０−Ｇｌｙ２７１、ＢｏＮＴ／Ｇ残基Ｐｈｅ２７２−Ｇｌｙ２７３またはＴｅＮＴ残基Ｐｈｅ２７５−Ｇｌｙ２７６を含む、少なくとも６個、少なくとも８個、少なくとも１０個または少なくとも１５個の連続残基を含む。該タンパク質に由来する適切な切断部位は、例えばＥＰ  １  ９２６  ７４４  Ｂ１に開示されている。
【００８１】
本発明の一態様において、ＢｏＮＴおよびＴｅＮＴに対する前述の神経毒素切断部位の切断は、前述のタンパク質の切断により得られる１つまたは複数の切断生成物を判定してアッセイされてもよい。該タンパク質に由来する生成物は、前記切断生成物に特異的に結合するが非切断タンパク質には結合しない抗体により判定することができる。該生成物へのこのような特異的結合抗体の結合は、本明細書または他に記載されている技法により測定することができる。例えば、特異的結合抗体は、検出可能な標識に共有または非共有結合することができる。このような検出可能な標識は、特異的結合抗体に共有結合した検出可能な部分であってもよく、または検出抗体もしくは特異的結合抗体に特異的に結合し、例えばこれと共有結合した検出可能な部分を介して検出を可能にするアプタマーなどの検出剤であってもよい。このような免疫アッセイのさまざまなタイプが、切断生成物を判定し、故にＢｏＮＴまたはＴｅＮＴの生物学的活性をアッセイするのにこのように使用され得る。
【００８２】
１つの態様において、本明細書に定義された神経毒素切断部位を有するタンパク質の切断は、ウエスタンブロットにより測定することができる。別の態様において、前記切断は、本明細書の他の部分に述べられたものを含むＥＬＩＳＡ、ＲＩＡまたは他の免疫学的アッセイ形式により測定することができる。
【００８３】
別の態様において、上に明示された神経毒素切断部位を含み、前記部位で切断すると、少なくとも１つの物理的および／または化学的特性が改変する人工基質が使用されてもよい。例えば、このような態様において想定される基質は、互いに物理的および／または化学的に相互作用し神経毒素切断部位を有するリンカーにより分離することができる、第一および第二の部分を含んでもよい。切断部位の切断の結果、２つの部分間の前述の相互作用が改変される。適切な部分は、例えば、非切断状態で共鳴エネルギー移動を示し、切断後に前記共鳴エネルギー移動が妨げられる、ドナーおよびアクセプターフルオロフォアである。あるいは、フルオロフォアおよび消光剤が適用されてもよく、消光剤の消光効果は切断後に反転する。前記種類の基質は、例えば、ＥＰ  １  ４３８  ５８６  Ｂ１、ＥＰ  ２  ２０８  ０６７  Ａ１、ＥＰ  １  ５４３  ３２９  Ａ２、ＥＰ  １  ８６９  ４５９  Ｂ１、ＥＰ  ２  ２９３  ０６４  Ｂ１、ＥＰ  １  ９２０  ２４８  Ｂ１、ＥＰ  ２  ２６４  ４５８  Ａ１、ＥＰ  ２  ３３２  ９５９  Ａ２、ＷＯ  ２０１１／４７２４１、ＥＰ  １  ９０１  ０６９  Ｂ１、ＥＰ  ２  ２９３  ０６４  Ｂ１、ＥＰ  １  ８０７  ６９８  Ｂ１またはＥＰ  ２  １０７  １１２  Ｂ１のいずれかに記載されており、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【００８４】
本発明の方法のさらに１つの特定の態様において、アッセイは、一次抗体および一態様においては前記切断ＳＮＡＰ−２５に特異的に結合するモノクローナル抗体を用いて切断ＳＮＡＰ−２５の量を測定することにより、ｈｉＰＳ細胞由来神経細胞中に存在する切断ＳＮＡＰ−２５の量を測定して実施される。さらに、細胞中に存在する全ＳＮＡＰ−２５、例えば切断および非切断ＳＮＡＰ−２５は、二次抗体および一態様においては前記全ＳＮＡＰ−２５に結合するポリクローナル抗体により測定される。一態様において、結合した一次抗体の量および結合した二次抗体の量は、検出剤により、一態様においては結合した一次抗体の量と結合した二次抗体の量の間で識別できるようにする１つまたは複数の検出抗体により、測定することができる。例えば、第１の標識に連結され、一次抗体に結合する一次検出抗体、および第２の標識に連結され、二次結合抗体に結合する二次検出抗体が使用されてもよい。結合した一次抗体および結合した二次抗体の量、ならびに故に切断ＳＮＡＰ−２５および全ＳＮＡＰ−２５の量は、この後、測定した第１および第２の標識の量から導くことができる。一態様において、本明細書で想定された第１の標識は、西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素であってもよい。別の態様において、本明細書で想定された第２の標識は、アルカリホスファターゼなどの酵素であってもよい。標識は、非蛍光基質から蛍光生成物への検出可能な変換を触媒するのに使用することができる。
【００８５】
本発明の方法のさらに別の態様において、アッセイは、神経伝達物質放出（例えば、培養培地への）を判定して実施される。放出または非放出神経伝達物質の量は、本明細書または他に記載されている技法により判定することができる。
【００８６】
有利には、本発明により企図される方法は、動物以外の供給源、例えばｈｉＰＳ細胞由来神経細胞に基づいており、したがって、動物試験を回避する。それでもなお、ｈｉＰＳ細胞由来神経細胞は、必要とされるＢｏＮＴの全ての生物学的活性、例えば、（ａ）受容体結合、（ｂ）内在化、（ｃ）サイトゾルへのエンドソーム膜を越えた移行、および／または（ｄ）シナプス小胞膜融合に関与するタンパク質の細胞内タンパク質分解切断の試験を可能にする。したがって、該方法は、安全性測定または品質管理測定、および例えば大規模スクリーニングアプローチを通常は必要とする、改変された生物学的特性を有するＢｏＮＴの開発に使用することができる。
【００８７】
本発明はまた、（ａ）ｈｉＰＳ細胞由来神経細胞を、前記調製物の試料と接触させるステップと、（ｂ）ＢｏＮＴの生物学的活性について試料をアッセイして、調製物中に存在する生物学的に活性なＢｏＮＴの量を測定するステップとを含む、生物学的に活性なＢｏＮＴを含む調製物中の生物学的に活性なＢｏＮＴの量を測定する方法にも関する。
【００８８】
本発明はまた、本明細書の他の部分に明示されている組成物中のＢｏＮＴ活性をアッセイするための、ｈｉＰＳ細胞由来神経細胞の使用にも関する。
【００８９】
一態様において、アッセイは、ＢｏＮＴ活性および／または生物学的に活性なＢｏＮＴの存在または非存在を測定するステップを包含する。生物学的に活性なＢｏＮＴに関する定性的アッセイは、例えば、ＢｏＮＴに起因するいずれかの危害を防ぐためのリスク評価を目的とする適用において、例えば、ＢｏＮＴの製造プロセス中または薬学的もしくは美容的適用中の安全性管理測定として、あるいはバイオテロリズムなどのＢｏＮＴに基づく犯罪行為を防ぐために使用することができる。
【００９０】
別の態様において、アッセイは、ＢｏＮＴ活性および／または生物学的に活性なＢｏＮＴの量を測定することを包含する。生物学的に活性なＢｏＮＴに関する定量的アッセイは、ＢｏＮＴ製造プロセス中に、または美容的もしくは薬学的適用のため生物学的に活性なＢｏＮＴの適正な投与量を調節するのに使用することができる。したがって、このようなアッセイは、適正な医薬または化粧品の品質管理または処方の手段としても有用であり得る。
【００９１】
本発明はまた、本明細書の他の部分に明示された前記生物学的に活性なＢｏＮＴを含む調製物中の生物学的に活性なＢｏＮＴの量を測定するための、ｈｉＰＳ細胞由来神経細胞の使用にも関する。
【００９２】
上記の本明細書に引用された参考文献は、その全体の開示内容および本明細書において詳細に言及された開示内容に関して、参照により本明細書に組み込まれている。
なお、本願は特許請求の範囲に記載された発明に関するものであるが、他の態様として以下も包含し得る：
１．ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）神経毒素（ＢｏＮＴ）を活性についてアッセイする方法であって、
ａ）ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳ）由来神経細胞を、ＢｏＮＴを含む組成物と接触させること；および
ｂ）生物学的活性について前記ＢｏＮＴをアッセイすること、
を含む方法。
２．前記ＢｏＮＴが、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅおよび前記ＢｏＮＴの改変バリアントからなる群から選択される血清型を有する、上記１の方法。
３．前記生物学的活性が、ＳＮＡＰ−２５の切断、ＶＡＭＰ２の切断および神経伝達物質放出からなる群から選択される、上記１の方法。
４．前記アッセイが定性的である、上記１の方法。
５．前記アッセイが定量的である、上記１の方法。
６．前記ＢｏＮＴが精製されている、上記１の方法。
７．前記ＢｏＮＴが複合体中にある、上記１の方法。
８．前記ｈＰＳ由来神経細胞と接触させる前に、前記ＢｏＮＴを試験化合物と接触させるステップをさらに含む、上記１の方法。
９．前記試験化合物が抗体である、上記８の方法。
１０．前記抗体が中和抗体である、上記９の方法。
１１．前記中和抗体が、精製された抗体、血清および抗毒素からなる群から選択される試料中にある、上記１０の方法。
１２．ボツリヌス菌神経毒素（ＢｏＮＴ）を活性についてアッセイする方法であって
ａ）ヒト人工多能性幹（ｈｉＰＳ）細胞由来神経細胞を、ｉ）ＢｏＮＴ、およびｉｉ）中和抗体を含む組成物と接触させること；および
ｂ）生物学的活性について前記ＢｏＮＴをアッセイすること、
を含む方法。
１３．前記ＢｏＮＴが、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅおよび前記ＢｏＮＴの改変バリアントからなる群から選択される血清型を有する、上記１２の方法。
１４．前記生物学的活性が、ＳＮＡＰ−２５の切断、ＶＡＭＰ２の切断および神経伝達物質放出からなる群から選択される、上記１２の方法。
１５．前記アッセイが定性的である、上記１２の方法。
１６．前記アッセイが定量的である、上記１２の方法。
１７．前記ＢｏＮＴが精製されている、上記１２の方法。
１８．前記ＢｏＮＴが複合体中にある、上記１の方法。
１９．前記中和抗体が、精製された抗体、血清および抗毒素からなる群から選択される試料中にある、上記１２の方法。
２０．生物学的に活性なＢｏＮＴを含む調製物中の生物学的に活性なＢｏＮＴの量を測定する方法であって、以下のステップ：
（ａ）ｈｉＰＳ細胞由来神経細胞を、生物学的に活性なＢｏＮＴを含む調製物の試料と接触させること；および
（ｂ）ＢｏＮＴの生物学的活性について前記試料をアッセイすることにより、調製物中に存在する生物学的に活性なＢｏＮＴの量を測定すること、
を含む前記方法。
２１．ＢｏＮＴを活性についてアッセイするための、ヒト人工多能性幹（ｈｉＰＳ）細胞由来神経細胞の使用。
【実施例】
【００９３】
実験
以下の例は、本発明の特定の好ましい実施形態および態様を実証し、さらに例示するために提供されるものであり、本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。
【００９４】
例１
Ａ．方法
神経細胞：ヒトｉＰＳ由来神経細胞は、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｉｎｃ．（マジソン、ＷＩ）により凍結して供給された。神経細胞をＣｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ指示書に従って解凍し、生細胞をトリパンブルー排除アッセイによりカウントした。細胞は、特に指示のない限り、０．０１％ポリ−Ｌ−オルニチン（ＳＩＧＭＡ）および８．３μｇ／ｃｍ２マトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でコートした９６ウェルディッシュ（ＴＰＰ、ＭｉｄＳｃｉ）に１ウェル当たり４０，０００細胞密度で播種し、３７℃、約５％ＣＯ２下で、指示された成熟時間、神経培地（Ｂ２７およびグルタマックスを補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ、全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製でＣＤＩにより供給された）でインキュベートした。播種２４時間後、培地を完全に交換し、その後は培地の半分を２〜３日ごとに交換した。
【００９５】
初代ラット脊髄（ＲＳＣ）細胞は、以前に記載されているように調製し（Ｐｅｌｌｅｔｔら、２００７および２０１０）、１ウェル当たり７５，０００細胞密度でマトリゲルコート９６ウェルプレートに播種した。
【００９６】
ボツリヌス神経毒素：純ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）Ａ、Ｂ、ＣおよびＥ（１５０ｋＤａ）ならびにＢｏＮＴ／Ａ複合体は、以前に記載されているようにボツリヌス菌株Ｈａｌｌ  Ａ  ｈｙｐｅｒ、Ｏｋｒａ  Ｂ、Ｂｒａｚｉｌ  Ｃ、およびＢｅｌｕｇａ  Ｅから調製し（Ｍａｌｉｚｉｏら、（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １４５：  ２７〜３９頁；Ｐｒａｂａｋａｒａｎら、（２００１）Ｔｏｘｉｃｏｎ  ３９：  １５１５〜１５３１頁）、これによりＢｏＮＴ／Ｃ精製を、硫酸アンモニウム沈殿の前に０．２ｍｇ／ｍｌの酵母ＲＮＡ（ＳＩＧＭＡ）を培養物に添加するステップを追加して、Ｍａｌｉｚｉｏら（２０００）の方法により行った。毒素をリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４および４０％グリセロールに溶解し、使用まで−２０℃で貯蔵した。ＢｏＮＴ／Ａ、／Ｂ、／Ｃ、／ＥおよびＢｏＮＴ／Ａ複合体製剤の活性は、マウスバイオアッセイ（Ｈａｔｈｅｗａｙ  ＣＬ（１９８８）、上記参照；Ｓｃｈａｎｔｚ  ＥＪ  ＆  Ｋａｕｔｔｅｒ  ＤＡ（１９７８）Ｊ  Ａｓｓｏｃ  Ｏｆｆ  Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ６１：  ９６〜９９頁）により測定し、特異的毒性は、７×１０７マウスＬＤ５０単位／ｍｇ（ＢｏＮＴ／Ａ１）、７．７×１０７  ＬＤ５０単位／ｍｇ（ＢｏＮＴ／Ａ１複合体）、１×１０８  ＬＤ５０単位／ｍｇ（ＢｏＮＴ／Ｂ）、１．１×１０７  ＬＤ５０単位／ｍｇ（ＢｏＮＴ／Ｃ）、および７．６×１０７  ＬＤ５０単位／ｍｇ（ＢｏＮＴ／Ｅ）であった。
【００９７】
神経毒性アッセイ：全ての神経毒性アッセイには、ｉＰＳ神経細胞を、特に指示のない限り、示されているように５０μｌの神経培地でＢｏＮＴの連続希釈物に曝露させた。初代ラット脊髄細胞を、結果に示されているようにいくつかのアッセイにおいて対照細胞として使用した。全ての試料は最低３通りで試験し、毒素なしの陰性対照を常に含めた。明示された曝露時間後、毒素溶液を除去し、細胞を５０μｌの１×ＬＤＳ試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に溶解した。細胞溶解物を、以前に記載されているように（Ｐｅｌｌｅｔｔら（２００７）、上記参照；  Ｐｅｌｌｅｔｔら、（２０１０）、上記参照）ＳＮＡＰ−２５またはＶＡＭＰ２切断についてウエスタンブロットにより分析した。切断および非切断バンドは、Ｆｏｔｏ／Ａｎａｌｙｓｔ  ＦＸ系およびＴｏｔａｌＬａｂ  Ｑｕａｎｔソフトウェア（Ｆｏｔｏｄｙｎｅ）を用いてデンシトメトリーにより定量化した。データプロットを調製し、ＰＲＩＳＭソフトウェアを用いてＥＣ５０を得た。
【００９８】
マトリックス選択：最適表面マトリックスを選択するために、神経細胞を７つの異なるマトリックスに播種した。マトリックスは、１．０μｇ／ｃｍ２ラミニン（ＰＤＬラミニン）または８．３μｇ／ｃｍ２マトリゲル（ＰＤＬマトリゲル）のどちらかでコートしたポリ−Ｄ−リジンコートプレート（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、０．０１％ポリ−Ｌ−オルニチンでコートし、この後１．０μｇ／ｃｍ２ラミニン（ＰＬＯラミニン）または８．３μｇ／ｃｍ２マトリゲル（ＰＬＯマトリゲル）のどちらかでコートしたプレート、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入したＰＬＯ−ラミニンコートプレート（ＰＬＯ−ラミニン（ＢＤ））、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＰＤＬコートプレート（ＰＤＬ（ＢＤ））、または０．０１％ＰＬＯコートプレート（ＰＬＯ（ＣＤＩ））からなった。神経細胞は１４日間成熟させ、ＢｏＮＴ／Ａに対する感受性を該毒素の連続希釈物に神経細胞を４８時間曝露させて測定した。神経細胞のいくつかを６週間維持し、上記のように再び試験した。
【００９９】
受容体発現分析：受容体発現分析には、ｉＰＳ神経細胞を、０．７５ｍｌの容量で２１０，０００細胞／ウェル密度で２４ウェルプレートに播種した。３ウェルからの細胞を、７５μｌ  １×ＬＤＳ試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に播種後、それぞれ４、７、１０、１４、および２１日目で回収した。細胞溶解物を、ＶＡＭＰ２を認識する抗体、またはＶＡＭＰ１、２、および３アイソフォーム、ならびにシンタキシンを認識する抗体を用いて、ＳＶ２Ａ、Ｂ、およびＣアイソフォーム、シナプトタグミンＩおよびＩＩ、ＳＮＡＰ−２５、ＶＡＭＰの発現についてウエスタンブロットにより分析した。ベータアクチンをローディングコントロールとして使用し、初代ラット脊髄細胞を陽性対照として使用した。ＳＶ２Ｃ抗体（Ｊａｎｚ  Ｒ  ＆  Ｓｕｄｈｏｆ  ＴＣ（１９９９）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ９４：  １２７９〜１２９０頁）は、Ｒｏｇｅｒ  Ｊａｎｚにより惜しみなく提供された。全ての他の抗体は、Ｓｙｎａｐｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ゲッティンゲン、ドイツ）製であった。全ての抗体はヒトタンパク質を認識する。
【０１００】
リアルタイムｑＰＣＲによるｍＲＮＡ分析には、ｉＰＳ神経細胞の３つの独立した培養物をそれぞれ示された時間維持した。細胞をプレート上で直接溶解し、ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ＫｉｔおよびＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ  Ｓｅｔ（Ｑｉａｇｅｎ、バレンシア、ＣＡ）を用いて精製した。陽性対照には、ヒト成人全脳ＲＮＡを購入した（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、サンタクララ、ＣＡ）。全ての試料について、ｃＤＮＡをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＶＩＬＯ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カールスバッド、ＣＡ）を用いて生成した。リアルタイムｑＰＣＲ増幅は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘならびに以下のＴａｑＭａｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ：ＳＮＡＰ２５（Ｈｓ００９３８９６２＿ｍ１）；ＳＴＸ１Ａ（Ｈｓ００２７０２８２＿ｍ１）；ＳＴＸ１Ｂ（Ｈｓ０１０４１３１５＿ｍ１）；ＶＡＭＰ１（Ｈｓ００２４９９１１＿ｍ１）；ＶＡＭＰ２（Ｈｓ００３６０２６９＿ｍ１）；ＶＡＭＰ３（Ｈｓ００９２２１６６＿ｍ１）；ＳＶ２Ａ（Ｈｓ００３７２０６９＿ｍ１）；ＳＶ２Ｂ（Ｈｓ００２０８１７８＿ｍ１）；ＳＶ２Ｃ（Ｈｓ００３９２６７６＿ｍ１）；ＳＹＴ１（Ｈｓ００１９４５７２＿ｍ１）；ＳＹＴ２（Ｈｓ００９８０６０４＿ｍ１）およびヒトＧＡＰＤＨ  Ｅｎｄｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｅｔ（全てＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を用いて、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ、バーゼル、スイス）で行った。Ａｂｓ  Ｑｕａｎｔ／２ｎｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ分析を全ての試料で行い、Ｃｐ値は、内因性ＧＡＰＤＨ発現のＣｐに対する標準化により相対的倍率変化に変換した。平均および標準偏差を、３つの生物学的複製物内の各遺伝子について計算した。技術的な４重のＰＣＲ反応（ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｑｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｅ  ＰＣＲ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ）を各遺伝子に対して行った。
【０１０１】
活性依存性ＢｏＮＴ／Ａ１取り込みアッセイ：ＢｏＮＴ／Ａ１は、５０μｌの細胞刺激培地（Ｂ２７およびグルタマックスを補充した２．２ｍＭ  ＣａＣｌおよび５６ｍＭ  ＫＣｌを含有するＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎカスタムＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地）または神経培地当たり、５５または２７５Ｕの濃度に希釈し、４日間成熟させたＣＤＩ  ｉＰＳ神経細胞およびＲＳＣ細胞に添加した。細胞をそれぞれ１、５、１０および１５分間、毒素とインキュベートした。陰性対照には、毒素なしのそれぞれの培地を細胞に添加した。毒素を除去し、細胞を２００μｌの神経培地で直ちに２回洗浄し、この後２００μｌの新鮮神経培地中で２４時間インキュベートした。試料を４つの複製物において回収した。
【０１０２】
５分以内のＢｏＮＴ／Ａ１の活性依存性取り込みに対する必要最低毒素濃度を測定するために、５０μｌの細胞刺激培地当たり、１．７２から５５Ｕの間の濃度に毒素を希釈した。４日間成熟させたｉＰＳ神経細胞を、毒素希釈物に５分間曝露させ、この後毒素を除去し、神経培地で２回洗浄し、神経培地で２４時間インキュベートした。全ての希釈物を４つの複製物において試験した。
【０１０３】
抗体プロテクション分析：ＢｏＮＴ／Ａ１特異的抗体を、Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９３に従って調製した。中和抗体によるｉＰＳ神経細胞におけるＢｏＮＴ／Ａ１活性の阻害を、２つの異なる方法を用いて分析した。第１のアッセイには、５５ＵのＢｏＮＴ／Ａ１を細胞刺激培地で連続希釈抗体と結合させ、３７℃で１時間インキュベートして抗体−毒素相互作用を可能にした。４日間成熟させたｉＰＳ神経細胞を毒素−抗体混合物に５分間曝露させ、この後毒素−抗体混合物を除去し、神経培地で２回の洗浄ステップを行い、神経培地で２４時間インキュベートした。第２のアッセイには、１．５ＵのＢｏＮＴ／Ａを神経培地で抗体の連続希釈物と結合させ、３７℃で１時間インキュベートした。ｉＰＳ神経細胞を毒素−抗体混合物に２４時間曝露させた。マウスバイオアッセイとの比較は、容量１６７μＬ、周囲温度で１．５時間、５〜１０ＵのＢｏＮＴ／Ａ１とプレインキュベートした抗体の連続希釈物を使用した。容量を５００マイクロリットルに調整し、１希釈物当たり４匹のマウスに注射した。
【０１０４】
Ｂ．結果
ｉＰＳ神経細胞はＢｏＮＴ中毒に重要な受容体を発現する：ヒトｉＰＳ由来神経細胞がＢｏＮＴ活性を検出するのに使用できるかどうかを判定するため、ＢｏＮＴ細胞侵入および触媒活性に必要な受容体および酵素標的の発現を、それぞれウエスタンブロットおよび定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により分析した（図１）。ウエスタンブロットは、ＳＶ２Ａに対するシグナル、ＳＶ２Ｂ、シナプトタグミン１、シンタキシン、ＳＮＡＰ−２５、ＶＡＭＰ２、およびベータアクチンに対するかすかなバンドを生じ、これらは細胞播種後２１日間にわたり変化しなかった（図１Ａ）。ＶＡＭＰ２はＶＡＭＰ２特異的抗体により検出されたが、３つのＶＡＭＰアイソフォーム全てを認識する抗体はシグナルが得られず、ＶＡＭＰ２がｉＰＳ神経細胞における優勢なＶＡＭＰアイソフォームであることを示している。初代ラット脊髄細胞溶解物を抗体検出の陽性対照として使用し、ｉＰＳ神経細胞対ＲＳＣ細胞のバンドにおける強度の違いは、抗体による特異的認識または異なる発現レベルに起因している可能性がある。ｑＰＣＲによる同じタンパク質のｍＲＮＡレベルの分析は、ウエスタンブロットにより検出されなかったＳＶ２ＢおよびＣアイソフォーム、シナプトタグミン２、ならびにＶＡＭＰ１および３を含む、分析した全てのタンパク質の発現を示した（図２Ｂ）。しかし、これらのアイソフォームのｍＲＮＡレベルは、ウエスタンブロットにより検出されたアイソフォーム（ＳＶ２Ａ、シナプトタグミン１、およびＶＡＭＰ２）のｍＲＮＡレベルより少なくとも２００倍低かった。故に、ｑＰＣＲデータはウエスタンブロットデータを裏付けるものであり、ｉＰＳ神経細胞がこれらのタンパク質のＳＶ２Ａ、シナプトタグミン１、およびＶＡＭＰ２アイソフォーム（前脳神経細胞を代表する神経細胞（Ｊａｎｚ  Ｒ  ＆  Ｓｕｄｈｏｆ  ＴＣ（１９９９）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ９４：  １２７９〜１２９０頁）と一致する）を主に発現することを示している。全てのタンパク質の発現レベルは試験期間を通じて変化せず、細胞が播種後４日目で十分に成熟し、少なくとも２１日間安定したままであることを示している。
【０１０５】
表面マトリックスは、ＢｏＮＴ／Ａ１アッセイに関して細胞の質に影響しない：播種マトリックス（ｐｌａｔｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ）がＢｏＮＴに対する感受性に影響するかどうかを判定するために、７つの異なるマトリックスに播種した神経細胞をＢｏＮＴ／Ａ１感受性について試験した。神経細胞は全てのマトリックスに付着し、成熟し、軸索および樹状突起の増加するネットワークを形成した。顕著な形態的違いが、ラミニンまたはマトリゲル有りまたは無しのプレートで増殖させた細胞間で観察された。ＰＤＬ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）ラミニンもしくはマトリゲルプレートまたはＰＬＯ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）ラミニンもしくはマトリゲルプレートで増殖させた細胞は、ほとんどが単層で増殖したが、主にプレートの周辺近くで長い軸索を伸ばしているいくつかの凝集物を形成した。対照的に、ＰＬＯまたはＰＤＬプレートで増殖させた細胞は、細胞のネットワーク間で伸びる軸索および樹状突起を有する細胞の単一の単層にとどまった。ＰＬＯラミニン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で増殖させた細胞は、ＰＬＯまたはＰＤＬプレートで増殖させた細胞に類似していた。
【０１０６】
神経細胞を１４日間の成熟後、ＢｏＮＴ／Ａの連続希釈物に曝露させ、細胞溶解物のウエスタンブロット分析は、ＳＮＡＰ−２５切断が試験した全ての基質についてほぼ同一であることを示した（図２）。検出限界は０．０５マウスＬＤ５０単位であり、切断は１．７５から３．５Ｕの間で完全であった。ＥＣ５０は０．２１から０．３１の範囲であった。
【０１０７】
これらのデータは、このアッセイのために試験した表面マトリックスのいずれにも細胞を播種できることを示している。全ての以下の実験は、ＰＬＯ−マトリゲルコートプレートで行った。細胞凝集を減らすために、より平らな表面積を有するＴＰＰプレート（ＭｉｄＳｃｉ）を使用した。これはウェル周辺近くでの凝集を完全に取り除いた。
【０１０８】
４〜１４日の細胞成熟時間は優れた感受性のＢｏＮＴ／Ａ１試験プラットフォームを提供する：細胞成熟時間がｉＰＳ神経細胞のＢｏＮＴ感受性に影響を与えるかどうかを判定するため、並行して播種した４および７日後に、同じ毒素希釈物を用いて細胞をＢｏＮＴ／Ａ１感受性について分析した。ＢｏＮＴ検出について記載された現在最も高感受性の細胞（Ｐｅｌｌｅｔら、２００７、上記参照；Ｐｅｌｌｅｔｔら、（２０１０）Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）であるＲＳＣ細胞とｉＰＳ神経細胞の感受性を比較するため、初代ラット脊髄細胞（ＲＳＣ細胞）も並行して試験した。得られたデータは、ＥＣ５０約０．３Ｕであり、４または７日間成熟させた細胞の感受性の統計的有意差を一貫して示さなかった（図３）。これは、１４日目の細胞（図２）およびＲＳＣ細胞について上記に観察されたＥＣ５０と類似している。ｉＰＳ神経細胞の用量応答曲線はＲＳＣ細胞より著しく急であり、１００％切断に１．７５Ｕで達したが、ＲＳＣ細胞では使用した毒素濃度で１００％切断に達しなかった。これは、高純度のｉＰＳ神経細胞による可能性が高い。故に、４〜１４日間成熟させた細胞は、ＢｏＮＴ／Ａ１検出および定量化のための、再現性があり高感受性の細胞ベースのモデルを提供する。さらに、４つの異なるｉＰＳ細胞ロット試験は、ＢｏＮＴ／Ａ１感受性の大きな違いを示さなかった。
【０１０９】
ｉＰＳ神経細胞の感受性は曝露時間が長くなるにつれて増加する：ｉＰＳ神経細胞におけるＢｏＮＴ検出の時間依存性を、該細胞を連続ＢｏＮＴ／Ａ１希釈物に曝露させ、毒素添加の６、１６、２４、および４８時間後に試料を回収して調べた。得られたデータは、４８時間曝露が最も高い感受性をもたらし、２４時間アッセイと比べて約３倍、１６時間アッセイと比べて約６倍増加することを一貫して示した（図４）。６時間毒素曝露は、ＥＣ５０約４０単位であり、感受性の約１３０倍の減少をもたらした。
【０１１０】
ｉＰＳ神経細胞はＲＳＣ細胞より速いＢｏＮＴ／Ａ１取り込み速度を有する：ＲＳＣ細胞と比べたｉＰＳ神経細胞へのＢｏＮＴ／Ａ１取り込み速度は、ｉＰＳ神経細胞およびＲＳＣ細胞を８２ＵのＢｏＮＴ／Ａ１に並行して曝露させ、２、４、６、８、および１０時間目でＳＮＡＰ−２５切断を評価して調べた。神経細胞活性はより速いＢｏＮＴの取り込みをもたらすことが報告されているため（Ｋｅｌｌｅｒら、（２００４）、上記参照）、２つの異なる培地を使用して活性依存性と非依存性の毒素取り込みを区別した。第１の培地は神経培地（ＮＭ）であり、第２の培地は、神経細胞活性を化学的に刺激するために５６ｍＭ  ＫＣｌおよび２．２ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有する改変型の神経培地である細胞刺激培地（ＣＳＭ）であった。
【０１１１】
ｉＰＳ神経細胞は、ＲＳＣ細胞より著しく早期の完全なＳＮＡＰ−２５切断をもたらした。ｉＰＳ神経細胞では、１００％のＳＮＡＰ−２５切断が８時間目、５０％ＳＮＡＰ−２５切断が約４時間目で得られた（図５）。ＲＳＣ細胞は、対照的に、１０時間後に約７０〜８０％ＳＮＡＰ−２５切断に達するのみであり、ＳＮＡＰ−２５の５０％切断は６時間目で観察された。どちらの細胞タイプについても、神経培地と細胞刺激培地の間に違いは観察されず、試験した時間枠では神経細胞活性は細胞へのＢｏＮＴ取り込みに影響を与えないことを示している。これらのデータは、ｉＰＳ神経細胞はＲＳＣ細胞よりＢｏＮＴ／Ａに著しく感受性であり、より速い速度で該毒素を取り込むが、このアッセイは、より速い毒素取り込みとＳＮＡＰ−２５のより速い切断を区別しないことを示すものである。
【０１１２】
ｉＰＳ神経細胞は活性依存性アッセイにおいてＲＳＣ細胞より著しく速くＢｏＮＴ／Ａ１を取り込む：ｉＰＳ神経細胞が活性依存性様式でＢｏＮＴを取り込むかどうかをさらに調べるために、４日間成熟させたｉＰＳ神経細胞およびＲＳＣ細胞を、それぞれ細胞刺激培地中で５５および２７５ＵのＢｏＮＴ／Ａ１に曝露させた。細胞を毒素に１、５、１０または１５分間曝露させ、この後毒素を完全に除去し、神経培地で２４時間インキュベートしてＳＮＡＰ−２５切断を可能にした。著しいＳＮＡＰ−２５切断が、５５ＵのＢｏＮＴ／Ａ１との曝露の早くも１分後にｉＰＳ神経細胞で観察された（図６Ａ）。５分後、ＳＮＡＰ−２５の約７５％が切断され、より長い毒素曝露による著しい変化はなく、５分以内に取り込みを完了したことを示している。２７５Ｕへの曝露は、試験した全ての曝露時間で完全なＳＮＡＰ−２５切断をもたらした（図６Ａ）。対照的に、ＢｏＮＴ／Ａ１の５５単位へのＲＳＣ細胞の曝露は、最大１５分の曝露時間後、顕著なＳＮＡＰ−２５切断をもたらさず、２７５Ｕへの少なくとも１０分の曝露後にＳＮＡＰ−２５の約３０〜４０％のみが切断された（図６Ａ）。これは、ｉＰＳ神経細胞が活性依存性様式でＢｏＮＴ／Ａ１を取り込むこと、この取り込みがＲＳＣ細胞より著しく効率的および急速に生じることを示している。
【０１１３】
ｉＰＳ神経細胞における急速な取り込みが活性依存性であることを確認するために、神経細胞を細胞刺激培地または神経培地中で５５ＵのＢｏＮＴ／Ａに１、５、または１０分間曝露させた。細胞刺激培地で処理した細胞では著しく多くのＳＮＡＰ−２５切断があり、ＳＮＡＰ−２５の５０％切断は１分後に観察され、７０％切断は５分後に観察された（図６Ｂ）。神経培地では、対照的に、ＳＮＡＰ−２５の約２０％のみが１０分後に切断された（図６Ｂ）。これは、ｉＰＳ神経細胞へのＢｏＮＴ／Ａ１の急速な取り込みが活性依存性であることを示している。
【０１１４】
ｉＰＳ神経細胞による活性依存性ＢｏＮＴ／Ａ１取り込みの濃度依存性を測定するために、細胞を細胞刺激培地中で５分間、１．７〜５５ＵのＢｏＮＴ／Ａ１に曝露させた。毒素を除去した後、細胞を２４時間インキュベートしてＳＮＡＰ−２５切断が生じるようにした。ＳＮＡＰ−２５切断の濃度依存的増加は、毒素濃度が上昇するにつれて観察され、５０％ＳＮＡＰ−２５切断は約３０Ｕで生じた（図６Ｃ）。
【０１１５】
ＢｏＮＴ／Ａ１特異的抗体はＢｏＮＴ／Ａ１によるＳＮＡＰ−２５切断からｉＰＳ神経細胞を保護する：ｉＰＳ  ＢｏＮＴアッセイの特異性は、２つの異なるアッセイ形式を用いて抗体プロテクションアッセイにより確認した。第１のアッセイでは、ほぼ完全なＳＮＡＰ−２５切断を達成するのに必要な最低限量の毒素（１．５単位）を用いて、細胞を毒素抗体混合物に２４時間曝露させた。第２のアッセイでは、細胞を細胞刺激培地中で５５Ｕ  ＢｏＮＴ／Ａおよび連続希釈抗体の混合物に５分間曝露させ、この後、毒素を除去し、２４時間インキュベートした。第１のアッセイは、抗体検出における著しくより高い感受性を生じた。神経細胞は、わずか０．００２５μｌの抗体でＳＮＡＰ−２５の切断から完全に保護された。顕著な部分的保護が０．０００６２５μｌの抗体まで観察された（図７Ａ）。抗体を０．５ＵのＢｏＮＴ／Ａ１および４８時間曝露によりＲＳＣ細胞において試験したとき、同じ保護パターンが以前に観察された。マウスバイオアッセイによる同じ抗体希釈物の試験は、以前のデータも示しているように、マウスバイオアッセイと比べて細胞ベースのアッセイの少なくとも約１０倍高い感受性を示した。＋ＲＳＣアッセイは、中和抗体検出においてマウスバイオアッセイより感受性であることが示されている（Ｐｅｌｌｅｔｔ，Ｓ．２００７、上記参照）。第２（活性依存的）アッセイは感受性が約１０倍低く、完全保護には５０μｌ当たり０．０１６μｌの抗体を必要とし、部分的保護は０．００４μｌで観察された（図７Ｂ）。
【０１１６】
これは、このアッセイの特異性を裏付けるものであり、ｉＰＳ神経細胞が中和抗体検出のための優れた、高感受性のアッセイを提供すること、より少ない毒素とのより長い曝露は、より多くの毒素を必要とするが曝露時間がより短い活性依存性アッセイより感受性であることを示している。活性依存性アッセイは、細胞毒性であり得る化合物もしくは抗毒素、または経時的に神経細胞を傷害し得る溶媒に溶解する必要がある化合物もしくは抗毒素のスクリーニングなど、いくつかの目的に有用である。
【０１１７】
天然の複合体におけるＢｏＮＴ／Ａ１毒素の検出は精製毒素の検出より感受性である：ＢｏＮＴは、いくつかの他のタンパク質（ＢｏＮＴ／Ａの場合、非毒性非ゲマグルチニンタンパク質（ｎｏｎｇｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＮＴＮＨ）およびヘマグルチニン（ＨＡ））との複合体として、クロストリジウムにおいて発現される（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＥＡ  ＆  Ｂｒａｄｓｈａｗ  Ｍ（２００１）Ｔｏｘｉｃｏｎ  ３９：  １７０３〜１７２２頁に概説されている）。非毒性複合体タンパク質は、胃腸管の分解性のｐＨから毒素を保護すると考えられている（Ｏｇｕｍａら、（２０００）Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｆｏｏｄｂｏｒｎｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ：  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｏｘｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ２７３〜２９３頁）。ＢｏＮＴ／Ａの最も一般的に使用されている医療用製剤（ＢＯＴＯＸ（登録商標）およびＤｙｓｐｏｒｔ（登録商標）製剤）は毒素複合体全体からなるが、精製ＢｏＮＴのみを含有するより新しい製剤（Ｘｅｏｍｉｎ（登録商標）製剤）がＦＤＡにより承認されている。天然の複合体中のＢｏＮＴ／Ａ１が、ｉＰＳ神経細胞中の純ＢｏＮＴ／Ａ１に等しい感受性で検出されるかどうかを判定するために、細胞を等量のＢｏＮＴ／Ａ１複合体または精製ＢｏＮＴ／Ａ１に並行して曝露させた。複合体は、デンシトメトリーにより測定するとき、約２４％のＢｏＮＴ／Ａ１および７６％の他の非毒性関連タンパク質からなる（図８Ａ）。精製ＢｏＮＴ／Ａ１製剤およびＢｏＮＴ／Ａ１複合体は、類似の特異的活性を有した（７×１０７Ｕ／ｍｇおよび７．３×１０７Ｕ／ｍｇ）。直接比較において、完全なＳＮＡＰ−２５切断（図８Ｂ）に達するのに、複合体の著しく少ない毒素成分が必要であった。この発見は、複合体の非毒性タンパク質が、恐らくは神経培地における保護効果により、このアッセイではＢｏＮＴ／１Ａ活性を増加させることを示している。
【０１１８】
ｉＰＳ神経細胞はＢｏＮＴ血清型Ｂ、Ｃ、およびＥを検出するための高感受性細胞モデルである：ＢｏＮＴ受容体分析は、ｉＰＳ神経細胞が全てのＢｏＮＴ血清型の細胞侵入に必要なＳＮＡＲＥタンパク質および受容体を発現することを示した（図１）。ＢｏＮＴ／Ａおよび／ＥはＳＮＡＰ−２５を切断し、ＢｏＮＴ／ＢはＶＡＭＰを切断し、ＢｏＮＴ／ＣはＳＮＡＰ−２５およびシンタキシンを切断する（Ｈｕｍｅａｕら、（２０００）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ８２：  ４２７〜４４６頁）。異なる血清型に対する神経細胞の感受性を試験するために、ＢｏＮＴ／Ｂ、Ｃ、またはＥの連続希釈物をｉＰＳ神経細胞またはＲＳＣ細胞に４８時間並行して添加し、細胞溶解物をそれぞれの神経細胞基質の切断についてウエスタンブロットによりアッセイした。ｉＰＳ神経細胞は、ＲＳＣ細胞に等しいまたはＲＳＣ細胞より高い感受性で全てのＢｏＮＴ血清型を一貫して検出した（図９）。ｉＰＳ神経細胞およびＲＳＣ細胞のＥＣ５０値は、ＢｏＮＴ／Ｂに対し１５．７１Ｕおよび２９．２２Ｕ（図９Ａ）、ＢｏＮＴ／Ｃに対し０．４Ｕおよび０．３６Ｕ（図９Ｂ）、ならびにｉＰＳ神経細胞においてＢｏＮＴ／Ｅに対し１．７９Ｕ（図９Ｃ）であった。ＲＳＣ細胞におけるＢｏＮＴ／Ｅに対するＥＣ５０値は、ＰＲＩＳＭソフトウェアを用いて得ることはできなかったが、ｉＰＳ神経細胞のＥＣ５０値に類似していると推定される（図９Ｃ）。
【０１１９】
上記の明細書に言及された全ての刊行物、特許、特許出願およびアクセッション番号は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。本発明は、特定の実施形態に関して記載してきたが、特許請求された本発明はこのような特定の実施形態に不当に限定されるべきでないことを理解すべきである。実際、本発明の記載された組成物および方法のさまざまな改変および変形形態は当業者に明らかであり、以下の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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