(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１：５’−ＴＣＴＣＣＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’の配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、または配列番号１と比較して９０％もしくは９５％超の同一性を有し、かつ配列番号１としてＩＲＳ−１遺伝子発現を阻害する能力を保存している９〜３０個のヌクレオチドからなる任意の機能保存配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを治療的有効量含み、後眼部内への投与によってそれを必要としているヒト対象に投与される、少なくとも１種の眼の内部の病的血管新生に関連する病気の治療および／または予防に使用するための医薬組成物。
【請求項２】
配列番号１の前記機能保存配列は５’−ＴＡＴＣＣＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号２）である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
配列番号１の前記機能保存配列は以下からなる群から選択される、請求項１に記載の医薬組成物：
５’−ＴＣＴＣＣＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣ−３’（配列番号３）
５’−ＴＣＴＣＣＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧ−３’（配列番号４）
５’−ＴＣＴＣＣＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴ−３’（配列番号５）
５’−ＴＣＴＣＣＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣ−３’（配列番号６）
５’−ＴＣＴＣＣＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧ−３’（配列番号７）
５’−ＴＣＴＣＣＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴ−３’（配列番号８）
５’−ＣＴＣＣＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号９）
５’−ＴＣＣＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号１０）
５’−ＣＣＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号１１）
５’−ＣＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号１２）
５’−ＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号１３）
５’−ＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号１４）
５’−ＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号１５）
５’−ＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号１６）
５’−ＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号１７）
５’−ＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号１８）
５’−ＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号１９）
５’−ＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号２０）。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチドは約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌの濃度である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
１回の投与につき注射される組成物の体積は１〜５００μｌの範囲である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記後眼部内への投与は硝子体内注射である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記組成物は、１週間に最高１回注射される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記組成物は、２週間に最高１回注射される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記組成物は、３週間に最高１回注射される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記組成物は、１ヶ月に最高１回注射される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記組成物は、２ヶ月に最高１回注射される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記組成物は単位用量の形態で包装されている、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記単位用量は使い捨て注射器である、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記組成物は無菌である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記病的血管新生に関連する病気は、ブドウ膜炎、脈絡膜炎、網脈絡膜炎、脈絡網膜炎、網膜変性、ＡＭＤ、網膜剥離、網膜血管新生、増殖性硝子体網膜症、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、糖尿病性網膜症、後部外傷、網膜血管病変、眼内炎、黄斑浮腫、網膜の炎症性病変、網膜に影響を及ぼす全身性病変であってもよい、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に眼科分野における病的血管新生に関連する病気の治療に関する。特に、本発明は、眼の病的血管新生に関連する病気を予防および／または治療するためにインスリン受容体基質−１（ＩＲＳ−１）の発現を阻害することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドＧＳ−１０１を含有する注射可能な医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管新生は、新しい血管が形成される基本的なプロセスである。このプロセスは、生殖、発生およびさらに創傷治癒などの複数の正常な生理的現象に不可欠である。
【０００３】
内皮細胞による血管新生は、内皮細胞の遊走、増殖および分化を伴う。これらの生物学的現象の制御には、インスリン受容体、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）受容体、プロラクチン受容体、成長ホルモン（ＧＨ）受容体、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体、インテグリン受容体ファミリーのメンバーおよび選択されたサイトカイン受容体などの活性化された細胞表面受容体の下流において不可欠なシグナル伝達中間体として機能する細胞質ドッキングタンパク質であるインスリン受容体基質−１（ＩＲＳ−１）が関与している。
【０００４】
血管新生は正常な生理的プロセスの場合もあるが、病的血管新生は、複数の疾患、特に眼科では危機的状況である。
【０００５】
眼科では、後眼部の病変、特に網膜病変は、現代社会の中でより生活に支障をきたす病変のうちの１つである。これらの病変には、漏出または出血を引き起こし得る機能障害性血管新生を結果的に生じさせる網膜、虹彩および脈絡膜の異常な血管新生を特徴とするもの、あるいは視力の低下を引き起こす網膜浮腫、網膜／硝子体出血または網膜剥離を伴い得るものが含まれる(Survey of
Ophthalmology, Jan. 2007, Vol. 52, S1, S3-S19)。眼の病的血管新生は、ヒトの失明の主要な原因のうちの１つとしても知られており、多様な眼疾患で認められる(Bradley, et al., 2007, Angiogenesis 10:141-8; Chen and Smith, 2007,
Angiogenesis 10:133-40; Friedlander et al., 2007, Angiogenesis 10:89-101)。
【０００６】
ブドウ膜炎、黄斑変性症および黄斑浮腫などの眼の後部の障害を治療するために現在実施されている治療法の１つは、コルチコステロイドの硝子体内注射である。
【０００７】
しかし、コルチコステロイドには周知の欠点があり、病的血管新生に関連する病気である眼の内部の障害、病気または疾患を治療するための新しい治療法がなお必要とされている。
【０００８】
本発明によって解決法が得られる。局所投与でＩＲＳ−１遺伝子発現を阻害できることが既に知られているＧＳ−１０１と呼ばれる特異的オリゴヌクレオチド（例えば、欧州特許第１４０９６７２号、Bock et al.,
Ophthalmologe, 2007, 104:336-44、Al-Mahmood et al., The
journal of pharmacology and experimental therapeutics, 2009, 329:496-504、Cursiefen et al., Ophthalmology, 2009, 116(9):1630-7を参照）は、病的血管新生に関連する眼の内部の病変の治療のために眼内投与すると特に興味深いことが分かった。生体外での内皮細胞に対するＧＳ−１０１の効果は、インキュベートから２４時間後に最大となり、かつ一過性であるため、これは驚くべきものであった。これらの結果によれば、後眼部内に投与された場合にＧＳ−１０１の長期効果は期待されていなかった。
【０００９】
眼内経路により、治療的に有効であるが低量の有効成分を患者に投与することが可能になるというさらなる利点も得られる。また、眼内経路には、正確な投与量を制御し、かつ患者の治療へのあらゆる不履行を回避するというさらなる利点もある。
【発明の概要】
【００１０】
従って、本発明は、配列番号１：５’−ＴＣＴＣＣＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’または配列番号１と比較して７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９５％超、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有し、かつ配列番号１としてＩＲＳ−１遺伝子発現を阻害する能力を保存している９〜３０個のヌクレオチドからなる任意の機能保存配列を有する治療的有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、後眼部内への投与によってそれを必要としている対象に投与される、少なくとも１種の眼の内部の病的血管新生に関連する病気の治療および／または予防で使用される医薬組成物に関する。
【００１１】
本発明の一実施形態では、配列番号１の機能保存配列は、５’−ＴＡＴＣＣＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号２）である。
【００１２】
本発明の一実施形態では、配列番号１の機能保存配列は、以下からなる群から選択される：
５’−ＴＣＴＣＣＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣ−３’（配列番号３）
５’−ＴＣＴＣＣＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧ−３’（配列番号４）
５’−ＴＣＴＣＣＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴ−３’（配列番号５）
５’−ＴＣＴＣＣＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣ−３’（配列番号６）
５’−ＴＣＴＣＣＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧ−３’（配列番号７）
５’−ＴＣＴＣＣＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴ−３’（配列番号８）
５’−ＣＴＣＣＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号９）
５’−ＴＣＣＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号１０）
５’−ＣＣＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号１１）
５’−ＣＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号１２）
５’−ＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号１３）
５’−ＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号１４）
５’−ＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号１５）
５’−ＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号１６）
５’−ＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号１７）
５’−ＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号１８）
５’−ＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号１９）
５’−ＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号２０）
【００１３】
本発明の一実施形態では、本発明の医薬組成物に含まれるオリゴヌクレオチドは、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌの濃度である。
【００１４】
本発明の一実施形態では、１回の投与につき注射される組成物の体積は、１〜５００μｌの範囲である。
【００１５】
本発明の一実施形態では、後眼部内への投与は硝子体内注射である。
【００１６】
本発明の一実施形態では、１週間に最高１回、好ましくは２週間に１回、より好ましくは３週間に１回、さらにより好ましくは１ヶ月に１回、なおさらにより好ましくは２ヵ月に１回、上記組成物が注射される。
【００１７】
本発明の一実施形態では、本組成物は単位用量の形態で包装されており、好ましくは、単位用量は使い捨て注射器である。本組成物が無菌であると有利である。
【００１８】
本発明の一実施形態によれば、病的血管新生に関連する病気は、ブドウ膜炎、脈絡膜炎、網脈絡膜炎、脈絡網膜炎、網膜変性、ＡＭＤ、網膜剥離、網膜血管新生、増殖性硝子体網膜症、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、糖尿病性網膜症、後部外傷、網膜血管病変、眼内炎、黄斑浮腫、網膜の炎症性病変、網膜に影響を及ぼす全身性病変であってもよい。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
従って、本発明は、治療的有効量のＧＳ−１０１を含み、それを必要としている対象に眼内経路によって投与される、病的血管新生に関連する眼の内部の眼障害を治療するための医薬組成物またはその治療に使用される医薬組成物に関する。本発明の一実施形態では、前記眼内経路とは、眼の内部への投与、好ましくは後眼部内への投与、より好ましくは硝子体内への投与を指す。好ましくは、前記投与は注射である。
【００２０】
一実施形態では、本発明の組成物によって治療される眼障害は、病的網膜血管新生に関連する網膜の障害である。
【００２１】
本発明によれば、本組成物は、眼内注射に適した形態に製剤化される。第１の実施形態によれば、本組成物は水溶液である。水溶液の例としては、ＧＳ−１０１のＮａＣｌ溶液、好ましくは０．９％ＮａＣｌ溶液が挙げられるが、これらに限定されない。第２の実施形態によれば、本組成物はインプラント内に含まれている。第３の実施形態によれば、本組成物は、徐放システム、組成物もしくは装置に関連している。第４の実施形態によれば、本組成物は、ＧＳ−１０１および高分子剤を含んでいてもよい。
【００２２】
本発明によれば、ＧＳ−１０１は、配列番号１：５’−ＴＣＴＣＣＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’または配列番号１と比較して７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９５％超、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有し、かつ配列番号１として病的血管新生を阻害する能力を保存している９〜３０個のヌクレオチドからなる任意の機能保存配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００２３】
「同一性」または「同一の」という用語は、２つ以上のヌクレオチド配列間の関係において使用されている場合、２つ以上の塩基からなる鎖間の一致数によって決定されるヌクレオチド配列間の配列類似性の程度を指す。「同一性」とは、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち「アルゴリズム」）によって扱われるギャップアラインメント（存在すれば）を有する２つ以上の配列のより短い配列間の完全な一致率の尺度である。関連するヌクレオチド配列の同一性は、公知の方法によって容易に計算することができる。そのような方法としては、Computational Molecular
Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988、Biocomputing:
Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York,
1993、Computer Analysis of Sequence Data, Part 1,
Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994、Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic
Press, 1987、Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and
Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991およびCarillo et al., SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988)に記載されているものが挙げられるが、これらに限定されない。同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間の最大の一致を与えるように設計されている。同一性の決定方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラムに記述されている。好ましいコンピュータプログラムによる２つの配列間の同一性決定方法としては、ＧＡＰ（Devereux
et al., Nucl. Acid. Res. 12:387 (1984)、Genetics
Computer Group社、ウィスコンシン大学、ウィスコンシン州マディソン）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ(Altschul et al., J. MoI. Biol. 215, 403-410 (1990))などのＧＣＧプログラムパッケージが挙げられる。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）および他の提供源（BLAST Manual, Altschul et al., NCIB NLM NIH, メリーランド州ベセズダ, 20894、Altschul et al.、上記参照）から公的に入手可能である。また、周知のSmith Watermanアルゴリズムを使用して同一性を決定してもよい。
【００２４】
配列番号１の機能保存配列の例は、配列番号２（５’−ＴＡＴＣＣＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’）である。配列番号１の機能保存配列の他の例は、以下の配列である：
５’−ＴＣＴＣＣＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣ−３’（配列番号３）
５’−ＴＣＴＣＣＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧ−３’（配列番号４）
５’−ＴＣＴＣＣＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴ−３’（配列番号５）
５’−ＴＣＴＣＣＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣ−３’（配列番号６）
５’−ＴＣＴＣＣＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧ−３’（配列番号７）
５’−ＴＣＴＣＣＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴ−３’（配列番号８）
５’−ＣＴＣＣＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号９）
５’−ＴＣＣＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号１０）
５’−ＣＣＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号１１）
５’−ＣＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号１２）
５’−ＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号１３）
５’−ＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号１４）
５’−ＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号１５）
５’−ＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号１６）
５’−ＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号１７）
５’−ＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号１８）
５’−ＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号１９）
５’−ＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号２０）
【００２５】
一実施形態によれば、９〜３０個のヌクレオチドからなる前記機能保存配列は、Ｃ末端およびＮ末端において他の核酸間に配列番号１または配列番号２を含む配列である。また、前記機能保存配列は、配列番号１または配列番号２の９〜１２個の隣接ヌクレオチド断片であってもよい。
【００２６】
本医薬組成物は、眼内経路のための任意の医薬的に許容される賦形剤と共に、上記ＧＳ−１０１または上記その機能保存配列を含んでいてもよい。本発明の一実施形態では、前記眼内経路は、眼の内部への投与、好ましくは後眼部内への投与、より好ましくは硝子体内への投与である。好ましくは、前記投与は硝子体内注射である。
【００２７】
本発明は、医薬的に許容される賦形剤と共に上記ＧＳ−１０１または上記その機能保存配列を含む治療的有効量の組成物を、それを必要としている対象に投与することを含み、前記組成物は眼内経路によって投与される、当該対象における眼の内部の病的血管新生に関連する病気の治療方法にも関する。本発明の一実施形態では、前記眼内経路は、眼の内部への投与、好ましくは後眼部内への投与、より好ましくは硝子体内への投与である。好ましくは、前記投与は硝子体内注射である。
【００２８】
一実施形態では、眼の内部の病的血管新生に関連する前記病気は、ブドウ膜炎、脈絡膜炎、網脈絡膜炎、脈絡網膜炎、網膜変性、ＡＭＤ、網膜剥離、網膜血管新生、増殖性硝子体網膜症、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、糖尿病性網膜症、後部外傷、網膜血管病変、眼内炎、黄斑浮腫、網膜の炎症性病変、および網膜に影響を及ぼす全身性病変の中から選択される。
【００２９】
一実施形態によれば、上記ＧＳ−１０１またはその機能保存配列は、本発明の組成物中に、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．１ｍｇ／ｍｌ〜８０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは６〜６０ｍｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは約８〜約１２ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。
【００３０】
一実施形態によれば、１回の投与につき注射される本組成物の体積は、１〜５００μｌ、好ましくは約５〜４００μｌ、より好ましくは５〜３００μｌの範囲である。一実施形態によれば、注射される本組成物の体積は約５０μｌである。
【００３１】
一実施形態によれば、１回の投与につき注射されるＧＳ−１０１の量は、１０〜５０００μｇ、好ましくは約５０〜４０００μｇ、より好ましくは５０〜３０００μｇの範囲である。一実施形態によれば、注射されるＧＳ−１０１の量は約５００μｇである。
【００３２】
一実施形態では、本医薬組成物は、眼内投与が硝子体内への投与となるような組成物である。
【００３３】
一実施形態によれば、本組成物は、３週間に最高１回、好ましくは４週間に最高１回、さらにより好ましくは８週間に１回注射される。
【００３４】
実施例に示すように、本発明の組成物により、３週間に最高１回の注射を行う最適な治療が得られる。内皮細胞がＧＳ−１０１と共に生体外でインキュベートされる場合、その効果がインキュベートから２４時間後に最大となり、かつ単に一過性であるため、この結果は驚くべきものである。
【００３５】
一実施形態によれば、当該患者は、２〜５ヶ月、好ましくは３ヶ月の間、３週間に１回の注射、好ましくは４週間に１回の注射で治療される。
【００３６】
一実施形態によれば、治療期間は３〜６ヶ月である。患者の視力の低下が認められた場合に治療を再開してもよい。
【００３７】
本発明の一実施形態では、本明細書に上述されている前記医薬組成物は、単位用量の形態で包装されている。
【００３８】
別の実施形態では、前記単位用量は使い捨て注射器である。
【００３９】
前記単位用量が無菌であると有利である。
【００４０】
定義
本発明によれば、以下の用語は以下の意味を有する。
【００４１】
「約」とは、そのように数値化された数、パラメータまたは特性の±１０％を意味する。
【００４２】
「眼の内部」とは、眼の前部または後部を含む眼球内に位置する任意の領域を意味し、一般に、眼球内に存在する任意の機能性（例えば視覚のため）組織または構造組織、あるいは眼球の内部を部分的もしくは完全に覆う組織層または細胞層が挙げられるが、これらに限定されない。領域の具体例としては、前眼房、後眼房、硝子体腔、脈絡膜、黄斑および網膜ならびに眼の後方領域もしくは部位に血管新生するか神経分布する血管および神経が挙げられる。好ましい実施形態によれば、眼の内部とは、後眼房、硝子体腔、脈絡膜、黄斑および網膜ならびに眼の後方領域もしくは部位に血管新生するか神経分布する血管および神経を含む後眼部を意味する。好ましくは、「眼の内部の疾患」という表現は、網膜および／または脈絡膜および／または黄斑および／または後眼房の疾患を指す。
【００４３】
「病的血管新生に関連する病気(Conditions related to
pathological neovascularization)」または「病的血管新生に関連する病気(pathological
neovascularization-related conditions)」は、望ましくない血管新生が存在する疾患であり、以下の疾患：ブドウ膜炎、脈絡膜炎、網脈絡膜炎、脈絡網膜炎、網膜変性、ＡＭＤ、網膜剥離、網膜血管新生、増殖性硝子体網膜症、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、糖尿病性網膜症、後部外傷、網膜血管病変、眼内炎、黄斑浮腫、網膜の炎症性病変、網膜に影響を及ぼす全身性病変が挙げられ、場合により同じ病変の治療のための他の治療法と併用して治療される。特に、本発明は、血液およびリンパの血管新生に取り組むことを目的とする。
【００４４】
「疾患を治療すること」とは、臓器、組織もしくは細胞機能の欠損または欠如に関連する疾患、障害または病気の少なくとも１つの悪影響または症状を予防（すなわち、起こらないようにする）、減少または軽減することを意味する。
【００４５】
「治療的有効量」とは、標的に対して顕著なマイナスもしくは有害な副作用を引き起こすことなく、（１）病的血管新生に関連する疾患、障害または病気の発症を遅らせるまたは予防する、（２）病的血管新生に関連する疾患、障害または病気の１つ以上の症状の進行、激化または悪化を減速または停止する、（３）病的血管新生に関連する疾患、障害または病気の症状を改善させる、（４）病的血管新生に関連する疾患、障害または病気の重症度または発生率を低下させる、あるいは（５）病的血管新生に関連する疾患、障害または病気を治癒することを目的とした薬剤の濃度または量を意味する。予防もしくは予防的措置のために、病的血管新生に関連する疾患、障害または病気の発症前に治療的有効量を投与してもよい。代わりまたは追加として、治療措置のために、病的血管新生に関連する疾患、障害または病気の開始後に治療的有効量を投与してもよい。一実施形態では、当該標的は眼の内部であり、本実施形態では、ＧＳ−１０１の治療的有効量は、眼の内部の病的血管新生に関連する病気の少なくとも１つの症状を減少させるのに有効な量である。
【００４６】
「眼内に」とは、眼内投与経路を意味する。一実施形態では、眼内投与経路は、眼の内部への投与、好ましくは後眼部内への投与、より好ましくは硝子体内への投与である。好ましい眼内経路は硝子体内注射である。本発明によれば、眼内経路は、有効成分（すなわち、ＧＳ−１０１またはその機能保存配列）のかなり低量で治療的に正確な投与を実現し、最適な治療が得られるという点で特に興味深い。実際に、実施例に示すように、本発明の組成物では３週間に最高１回の注射で最適な治療が得られる。細胞がＧＳ−１０１と共にインキュベートされた場合、その効果はインキュベートから２４時間後に最大となり、かつ単に一過性であるため、この結果は驚くべきものである。
【００４７】
「対象」とは、哺乳類、好ましくはヒトを指すが、例えばペットなどの動物を指すこともできる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】ＯＩＲ後の網膜血管新生に対するＧＳ−１０１またはその溶媒（ＮａＣｌ）の２種類の眼内注射の効果を示すヒストグラムである。結果は平均値±標準誤差である。＊：溶媒と比較してＰ＜０．０１、‡：スクランブルと比較してＰ＜０．０５。（スクランブルは、ＧＳ−１０１と同じ塩基を有するが同じ配列ではないオリゴヌクレオチドであり、そのような理由から「スクランブル」という用語が考案された）。
【図２】レーザー処置から２２／２３日後の病変の後期フルオレセイン信号強度に対するＧＳ−１０１の硝子体内注射の効果を示すヒストグラムである。縦棒は標準誤差を示す。
【図３】ＩＲＳ−１の経時的発現に対するＧＳ−１０１（１０μＭ）またはスクランブルオリゴヌクレオチド（１０μＭ）の単回投与によるヒトの内皮細胞の治療効果を示すヒストグラムである。ＩＲＳ−１タンパク質はＥＬＩＳＡで定量化した。結果は対照（溶媒と共にインキュベートした細胞）に対する割合として表し、３回の実験の平均を表す。縦棒は標準誤差を示す。ｎｓ＝示さず。
【実施例】
【００４９】
実施例１：実験的手法
手順および実験計画書は施設内治験審査委員会によって承認されたものであり、施設のガイドラインとフランスおよびカナダの実験動物の管理と使用に関するガイドライン(the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)に従って行った。餌および水を自由に与えながら標準的な条件（２４℃、１２：１２時間の明暗周期）に動物を維持した。
【００５０】
ラットにおける酸素誘発性網膜症
酸素誘発性網膜症（ＯＩＲ）ラットモデルを先に記載したように使用した(Dorfman A, Dembinska O,
Chemtob S, Lachapelle P. Early manifestations of postnatal hyperoxia on the
retinal structure and function of the neonatal rat. Invest Ophthalmol Vis Sci
2008;49:458-466)。一腹子数の新生児ＳＤラット（Charles River
Laboratories社、カナダのケベック州St-Constant）を、出生直後に８０％酸素（医療グレード１００％Ｏ２と酸素メーター（MaxO2 Ceramatec、ＯＭ２５−ＭＥモデル、Medicana社、カナダケベック州モントリオール）で測定した室内空気との混合物）に曝露した。簡単に言うと、３０分間の間隔で正常酸素条件下（２１％Ｏ２）において３回中断しながら、生まれてから生後１４日目まで毎日２２．５時間、高酸素（８０％Ｏ２）への曝露を続けた。高酸素に曝露した後、Ｐ１４で、動物を以下の実験に割り当てた。Ｐ１４およびＰ１６で、片方の眼に溶媒のみ（無菌の０．９％ＮａＣｌ）（ｎ＝８）、またはスクランブルＧＳ−１０１オリゴヌクレオチド（２ｍｇ／ｍｌ、２μｇの送達、ｎ＝４）もしくは０．５ｍｇ／ｍｌ（０．５μｇの送達、ｎ＝７）、１ｍｇ／ｍｌ（１μｇの送達、ｎ＝８）および２ｍｇ／ｍｌ（２μｇの送達、ｎ＝８）の濃度のＧＳ−１０１（配列番号２）のいずれか一方を含有する１μｌの硝子体内注射で動物を処理した。注射前に、ラットをハロセン（約２．５％）で麻酔し、約６０ゲージのガラス毛細管に取り付けた１０μｌのハミルトン注射器で注射した。処置期間中、ラットを周期的な照明環境（８０ルクス、１２時間の暗期／１２時間の明期）に維持した。最後に、高酸素環境で育てられた成体ラットに生じることが知られている肺の合併症を回避できるように、一腹子の母親を２４時間ごとに正常酸素条件下と高酸素条件下に交互に置いた。次いで、Ｐ１８で、全ての動物を安楽死させ、その眼を摘出し、前眼部を切開し、眼杯を４％ホルマリンで一晩固定した。上に詳述した用量は、推定される眼の体積（成体で約５０μｌに対して生後３週間目で約２５μｌ）に基づいている。
【００５１】
新生児ラットにおける発生的網膜血管新生
Ｐ１およびＰ３で、溶媒のみ（無菌の０．９％ＮａＣｌ）（ｎ＝６）または０．５ｍｇ／ｍｌ（０．５μｇの送達、ｎ＝８）の濃度のＧＳ−１０１を含有する１μｌを、ハロセン麻酔下で片方の眼に注射した。子ラットの眼の体積は、ヒトの成人の眼の体積の約０．３％である。
【００５２】
網膜のフラットマウント
次いで、網膜を単離し、アデノシンジホスファターゼ（ＡＤＰａｓｅ）で染色するためにフラットマウントを調製した。標本を乗せて撮影した（４０倍、Ａｘｉｏｐｈｏｔ顕微鏡、Carl
Zeiss Meditec社、ドイツのオーバーコッヘン）。発生実験のために、ImagePro Plus 4.5（Media Cybernetics社、メリーランド州シルバースプリング）を用いて網膜血管新生の面積および密度を評価した。ＯＩＲ実験のために、以下の判断基準：血管増殖、血管房状分岐(blood vessel tufts)、網膜外血管新生、中心血管収縮、網膜出血および血管の捻じれを評価する網膜評価法を用いて網膜症の重症度を評価した。さらに、血管房状分岐それ自体を網膜のフラットマウント上で評価した。
【００５３】
統計分析
ダネット多重比較法（GraphPad Software社、米国カリフォルニア州サンディエゴ）を用い、分散分析（ＡＮＯＶＡ）で統計分析を行った。Ｐ＜０．０５を有意であるとみなした。
【００５４】
ＯＩＲに罹患したラットにおいて網膜血管新生を阻害するために後眼房に必要なＧＳ−１０１の有効濃度を決定するために、ＧＳ−１０１をラットの眼に注射した。図１に示すように、０．５μｇの用量で病的血管新生が減少した。ラットの眼の体積（２５μｌ）を考慮すると、これは、ＯＩＲのラットモデルにおいて網膜血管新生を減少させるためには２０μｇ／ｍｌの濃度が必要であることを示唆している。
【００５５】
結果
【表１】
0005911866.tif 000002
Vasc Area：血管面積
【００５６】
表１に示されているように、ＧＳ−１０１の眼内注射により、ＯＩＲのラットモデルにおいて有効であることが分かっている濃度では網膜の血管新生の正常な進化は変化しない（図１）。従って、ＧＳ−１０１の安全性が認められる。
【００５７】
実施例２：実験的手法
この調査では、アフリカミドリザルにおけるレーザー誘発性脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）を滲出型加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）のモデルとして使用して、ＧＳ−１０１の有効性を評価した。
【００５８】
試験化合物
生理食塩水に懸濁させた被験物質ＧＳ−１０１（配列番号２）（１０μｇのＧＳ−１０１／１μｌの０．９％ＮａＣｌ溶液）は、Crid Pharma社（フランスのSt. Gely du Fesc）から提供されたものである。
【００５９】
サルにおけるレーザー誘発性脈絡膜血管新生
この調査では、体重が４．１５〜５．８１ｋｇの範囲で、年齢が４〜１２歳と推定される３匹の雄の成体アフリカミドリザルを使用した。１日目に、全ての動物に対して、両眼の耳側血管アーケード内の黄斑の解剖学的周辺部に、中心窩から約１．５乳頭径で同心円状に離間したレーザーによる火傷を６箇所与えた。８００ｍＷのレーザーエネルギー、１００ｍｓのパルス幅および５０μｍのスポットサイズを有するIridex Oculight TX 532nmレーザーを用いでレーザースポットを印加した。眼底写真を見直して、レーザー病変の黄斑周辺部(perimacular)配置を確認した。
【００６０】
レーザー光凝固の直後に、１０μｇ／μｌのＧＳ−１０１の無菌溶液を５０μｌの注射体積で硝子体内（ＩＶＴ）に投与した。基準日および２２日目に、直接的外観検査、細隙灯生体顕微鏡検査および間接的網膜検影法で眼を調べた。２２〜２３日目にＯＳ（左眼）、次いでＯＤ（右眼）の眼底画像および血管造影図を収集した。
【００６１】
血管造影図の段階的評価
２２／２３日目に収集した一連のフルオレセイン血管造影図に対して血管造影図の段階的評価を行い、一連の血管造影図間で眼の組織からフルオレセインを排出させるように連日で行った。各病変部位における後期フルオレセイン漏出の程度、すなわちＣＮＶに関連する血管造影の変化を、以下のようにＩ〜ＩＶの尺度で評価した：
−  Ｉ＝過蛍光は認められない
−  ＩＩ＝後期血管造影図中に過蛍光が認められるが、漏出および有意な残留染色は認められない
−  ＩＩＩ＝早期または移行時の過蛍光、後期漏出および有意な残留染色が認められる
−  ＩＶ＝早期または移行時の過蛍光および処置領域の境界を越えて広がる後期漏出が認められる
【００６２】
評価は、治療群から遮蔽されたままの２人の調査官によって行われた。
【００６３】
血管造影図のＩｍａｇｅＪ評価
ＩｍａｇｅＪ（Rasband W.S.、ＩｍａｇｅＪ、米国国立衛生研究所、米国メリーランド州ベセズダ）を用いて最初の血管造影図ｊｐｇファイルをさらに評価した。血管造影図中のバックグラウンド補正したスポット強度の評価により、相対的な後期フルオレセイン強度を定量化した。
【００６４】
統計的方法
段階ＩＶもしくは段階ＩＩＩのいずれかまたは段階ＩＩＩとＩＶの両方の病変の発生に「はい」を割り当て、任意の他の段階に「いいえ」を割り当てて過去の溶媒対照データと比較するフィッシャーの直接確率計算法を用いて、病変の段階的（Ｉ〜ＩＶ）評価を分析した。段階Ｉもしくは段階ＩＩのいずれかまたは段階ＩとＩＩの両方の発生を同じ方法で評価した。
【００６５】
レーザー誘発性ＣＮＶモデルの検証により、ヒトでない霊長類における他のＣＮＶモデル化研究と同様に、臨床的に有意なＣＮＶが段階ＩＩＩおよび段階ＩＶの病変指数で表されることが実証された。２２／２３日目に、ＧＳ−１０１を投与した眼と溶媒を投与した眼との間で、ＣＮＶ発生率に対するレーザー出力の効果を比較した。Tukey-Kramer HSDを用いた多重比較と共に、Ｂｏｘ−Ｃｏｘ変換値に対して一方向ＡＮＯＶＡを用い、バックグラウンド補正した平均フルオレセイン強度およびＣＮＶ複雑領域のＩｍａｇｅＪに基づく分析を行った。全ての統計を統計分析ソフトウェアＪＭＰ（SAS Institute社、ノースカロライナ州ケアリー）を用いて行った。Ｐ値＜０．５を統計的に有意であるとみなした。
【００６６】
結果
以下の表２に示すように、溶媒を投与した眼よりもIVT GS-101を投与した眼において段階ＩＩＩ／ＩＶのＣＮＶ病変の有意に低い発生率が観察された（ｐ＝０．０００１８３）。表２は、血管造影図評価の総合的結果を示す。
【表２】
0005911866.tif 000003
【００６７】
より低い強度のＣＮＶを表す段階ＩＩの病変の発生率の評価により、溶媒を投与した眼に対してIVT GS-101を投与した眼における低い発生率も実証された（ｐ＝０．００６５４５）。対照の眼と比較してIVT GS-101を投与した眼では、２２／２３日目に段階ＩＶの病変は全く残っていなかった。さらに、段階ＩＩＩの病変の発生率は大きく減少した。
【００６８】
フルオレセイン血管造影図のＩｍａｇｅＪ分析によってＣＮＶの発生率を評価して、IVT GS-101および溶媒処理した眼の病変における相対的な後期フルオレセイン強度の比較を行った。図２に示すように、ＧＳ−１０１のＩＶＴ送達により、溶媒を投与した眼と比較して後期フルオレセイン信号強度の有意な減少が誘発された（ｐ＝０．０００００２５）。
【００６９】
これらのＧＳ−１０１効果から、眼の後極への直接送達の顕著な抗血管新生効果は明らかである。これらの発見により、ＧＳ−１０１によるＩＶＴ治療は、滲出型ＡＭＤおよび他の血管新生網膜疾患のための強力な抗血管新生治療を提供し得ることが示唆されている。
【００７０】
実施例３：実験的手法
細胞培養および治療
ＥＧＭ−２ＭＶ完全培地でヒトの内皮細胞（ｈＥＣ）を培養した。約８０％の集密で培地を破棄し、血清欠乏性培地と共に細胞層を３回洗浄した。次いで、５％のＣＯ２中、３７℃で、１％の血清を含有する培地と共に細胞層を一晩インキュベートした。
【００７１】
インキュベート後に、１０μＭの最終濃度でＧＳ−１０１（本発明の配列番号２）またはスクランブルオリゴヌクレオチド（ＰＢＳ溶液）を培養物に添加し、指示された時間にわたってインキュベートを続けた。
【００７２】
タンパク質の定量化
上記のとおり、５％ＣＯ２中、３７℃で、ＧＳ−１０１またはスクランブルオリゴヌクレオチドと共にヒトのＥＣをインキュベートした。指示された時間でインキュベートした後、細胞を氷冷したＰＢＳで３回洗浄し、タンパク質抽出緩衝液（ＰＥＢ）（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、１％のトリトン、２５ｍＭのピロリン酸ナトリウム、１ｍＭのβ−グリセロリン酸塩、１ｍＭのＮａ３Ｖｏ４、１μｇ／ｍｌのロイペプチン、１μＭのＰＭＳＦ）に懸濁した。ブラッドフォード法でタンパク質含有量を測定した。製造者の説明書に従ってPath-Scan Total
IRS-1サンドイッチＥＬＩＳＡキット（Cell Signaling technology社）により抽出物中のＩＲＳ−１濃度を測定した。二つ組で行った３回の別個の実験からデータを収集し、対照細胞（溶媒と共にインキュベートした細胞）に対して表した。
【００７３】
結果
ＥＬＩＳＡによるＩＲＳ−１タンパク質の定量化の結果が図３に示されている。これらの結果から、ＧＳ−１０１（１０μＭ）の単回用量で処理したヒトの内皮細胞が以下を含有していることが分かった：
−  ６時間のインキュベート後に対照に対して３１．４０±９．０７１％（ｐ＝０．０２５８、Ｎ＝３）少ないＩＲＳ−１タンパク質含有量、
−  １２時間のインキュベート後に対照に対して２３．８０±７．０５２％（ｐ＝０．０２７９、Ｎ＝３）少ないＩＲＳ−１タンパク質含有量、
−  ２４時間のインキュベート後に対照に対して６１．３０±１２．９９％（ｐ＝０．００９２、Ｎ＝３）少ないＩＲＳ−１タンパク質含有量、
−  ４８時間のインキュベート後に対照に対して５３．５０±１６．４５％（ｐ＝０．０３１３、Ｎ＝３）少ないＩＲＳ−１タンパク質含有量、
−  ７２時間のインキュベート後に対照に対して４１．１０±１３．７８％（ｐ＝０．０４０６、Ｎ＝３）少ないＩＲＳ−１タンパク質含有量。
【００７４】
１０μＭのスクランブルオリゴヌクレオチドで処理したヒトの内皮細胞のＩＲＳ−１タンパク質含有量において有意な変化（ｐ＞０．０５）は観察されなかった。
【００７５】
これらの結果から、ＩＲＳ−１の阻害はＧＳ−１０１とのインキュベートから２４時間後に最大となり、一過性であることが分かる。従って、このような生体外での結果から、アンチセンスの効果が一過性であり、よって制限的であるため、硝子体内注射でＧＳ−１０１アンチセンスの使用が推奨されていなかったものと思われる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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