(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式（Ｉ）を有するアミノ脂質：
【化１】
0005885833.tif 000020
ここで、Ｒ１及びＲ２は、同一のもの又は異なるものであり、独立に、任意にＣ１〜Ｃ６ヒドロカルビル基で置換されていてよいＣ６〜Ｃ２４アルキル、Ｃ６〜Ｃ２４アルケニル、Ｃ６〜Ｃ２４アルキニル又はＣ６〜Ｃ２４アシルであり、
Ｘ１及びＸ２は同一のもの又は異なるものであり、Ｓ又はＳ＝Ｏ又はＳ（＝Ｏ）２のいずれかであり、
Ｙは、アミド、エステル又は次式の複素環式アミドのいずれかであり：
【化２】
0005885833.tif 000021
（式中、ｋ及びｌは０〜２の整数である。）
Ｒ３及びＲ４は、同一のもの又は異なるものであり、独立に、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ１〜Ｃ１２アルケニル若しくはＣ１〜Ｃ１２アルキニルであり、ここで、アルキル、アルケニル若しくはアルキニルは、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロカルビル基で任意に置換されていてよく、又はＲ３とＲ４とは一緒になって３〜１０個の原子並びに窒素、チオール及び酸素から選択される０〜６個のヘテロ原子の任意に置換された複素環を形成することができ、
Ｒ５は、存在しないか、或いは水素又は第四級アミンを与えるようにＣ１〜Ｃ１２アルキルのいずれかであり、
ｍは１〜１２の整数であり、ｎは２〜１２の整数である。
【請求項２】
Ｒ１及びＲ２は同一のもの又は異なるものであり、独立に、任意にＣ１〜Ｃ６ヒドロカルビル基で置換されていてよいＣ６〜Ｃ２４アルキルである、請求項１に記載のアミノ脂質。
【請求項３】
次式（ＩＩ）：
【化３】
0005885833.tif 000022
（式中、Ｒ１及びＲ２は同じＣ６〜Ｃ１８アルキルであり、
Ｙは、アミド、エステル又は次式の複素環式アミドのいずれかであり：
【化４】
0005885833.tif 000023
Ｒ３及びＲ４は同一の又は異なるＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、ここで、アルキルはＣ１〜Ｃ６ヒドロカルビル基で任意に置換されていてよく、又はＲ３とＲ４とは一緒になって３〜１０個の原子並びに窒素、チオール及び酸素から選択される０〜６個のヘテロ原子の、任意に置換された複素環を形成することができ、
ｍは１〜１２の整数であり、ｎは２〜１２の整数である。）
の構造を有する、請求項１又は２に記載のアミノ脂質。
【請求項４】
次式（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）又は（ＩＩＩｃ）：
【化５】
0005885833.tif 000024
（式中、Ｒ１及びＲ２は同じＣ１１〜Ｃ１２アルキルであり、
Ｒ３及びＲ４は同じＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、
ｍは１〜２の整数であり、ｎは２〜３の整数である。）
の構造を有する、請求項１〜３のいずれかに記載のアミノ脂質。
【請求項５】
次の工程：
（ａ）一般式（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）又は（ＩＶｃ）のアルキン：
【化６】
0005885833.tif 000025
（式中、ｎは２〜１２の整数である。）
と、一般式ＨＳ−Ｒ１及びＨＳ−Ｒ２の化合物（ここで、Ｒ１及びＲ２は、同一のもの又は異なるものであり、独立に、任意にＣ１〜Ｃ６ヒドロカルビル基で置換されていてよいＣ６〜Ｃ２４アルキル、Ｃ６〜Ｃ２４アルケニル、Ｃ６〜Ｃ２４アルキニル又はＣ６〜Ｃ２４アシルである。）とを紫外線照射下で又はラジカル開始剤を使用して反応させて、一般式（Ｖａ）、（Ｖｂ）又は（Ｖｃ）の化合物：
【化７】
0005885833.tif 000026
（式中、ｎ、Ｒ１及びＲ２は、上記のとおりに定義される。）
を生じさせ、
（ｂ）該式Ｖａの工程（ａ）の生成物と一般式（Ｒ３Ｒ４Ｒ５Ｎ）（ＣＨ２）ｍＺ（ここで、ｍは１〜１２の整数であり、ＺはＮＨ２、ＯＨ又は次式：
【化８】
0005885833.tif 000027
（式中、ｋ及びｌは０〜２の整数である。）
の第二級複素環式アミンである。）のアミン又はアルコールとを縮合反応させ、或いは、該式Ｖｂ及びＶｃの工程（ａ）の生成物と一般式（Ｒ３Ｒ４Ｒ５Ｎ）（ＣＨ２）ｍＺ（ここで、ｍは１〜１２の整数であり、ＺはＣＯＯＨである。）のカルボン酸とを縮合反応させて
［ここで、上記一般式において、Ｒ３及びＲ４は、同一のもの又は異なるものであり、独立に、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロカルビル基で任意に置換されていてよいＣ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ１〜Ｃ１２アルケニル若しくはＣ１〜Ｃ１２アルキニルであり、又は、Ｒ３及びＲ４は一緒になって３〜１０個の炭素原子並びに窒素、チオール及び酸素から選択される０〜６個のヘテロ原子の環を形成することができ、Ｒ５は、存在しないか、或いは水素又は第四級アミンを与えるようにＣ１〜Ｃ１２アルキルのいずれかである。］、一般式（ＶＩ）：
【化９】
0005885833.tif 000028
（式中、ｎ、ｍ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は上記のとおり定義される。）
の化合物を生じさせること
を含み、
Ｙは、アミド、エステル又は次式の複素環式アミドのいずれかである
【化１０】
0005885833.tif 000029
請求項１〜４のいずれかに記載のアミノ脂質の合成方法。
【請求項６】
前記一般式（ＶＩ）のチオエーテル（工程ｂの生成物）を、酸化試薬を使用してスルホキシド（Ｓ＝Ｏ）及び／又はスルホン（Ｓ（＝Ｏ）２）に酸化させる任意工程（ｃ）を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれかに記載のアミノ脂質を含有する脂質粒子。
【請求項８】
前記脂質粒子がリポソームである、請求項７に記載の脂質粒子。
【請求項９】
。
非陽イオン性脂質をさらに含む、請求項７又は８に記載の脂質粒子。
【請求項１０】
ステロールをさらに含む、請求項７〜９のいずれかに記載の脂質粒子。
【請求項１１】
生物活性剤をさらに含む、請求項７〜１０のいずれかに記載の脂質粒子。
【請求項１２】
前記生物活性剤が核酸、抗腫瘍薬、抗生物質、免疫調節薬、抗炎症薬、中枢神経系に作用する薬剤、ポリペプチド又はポリペプトイドよりなる群から随意に選択されるものである、請求項１１に記載の脂質粒子。
【請求項１３】
請求項７〜１２のいずれかに記載の脂質粒子の、生物活性剤を細胞に送達するための使用。
【請求項１４】
薬剤として使用するための、請求項７〜１２のいずれかに記載の脂質粒子。
【請求項１５】
ウイルス感染、肝臓病若しくは肝臓疾患又は癌を治療する際の薬剤として使用するための、請求項７〜１２のいずれかに記載の脂質粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、新規アミノ脂質及びそれらの合成を提供する。これらの（陽イオン性）アミノ脂質は、トランスフェクション剤として良好な特性を有する。これらのものを使用して、生物活性剤を細胞に送達することを可能にする脂質粒子、特にリポソームを生成させることができる。その合成の単純さにより、アミノ脂質のコンビナトリアルライブラリーをキットのような方法で開発することが可能になる。このライブラリーに含まれる化合物は、特に様々な細胞株のトランスフェクションのための特定の性質に対してスクリーニングできる。また、本発明は、（陽イオン性）アミノ脂質の薬剤としての使用も包含する。
【背景技術】
【０００２】
背景
細胞に核酸などの生物活性剤をトランスフェクトするために使用される様々な試薬のうち、リポソーム仲介デリバリーに基づくものが最も有効であることが広く認められている。これは、主としてこれらの有効性及び使用の容易さによるものである。リポソームは、脂質二重層から構成される、人工的に調製された球状ベシクルである。これらの分子を作用部位に届けるために、脂質二重層は、細胞膜などの他の二重層と融合し、リポソームの内容物を細胞内部に届けることができる。
【０００３】
リポソームは、それらのユニークな特性のため、ドラッグデリバリーのために使用されている。リポソームは、疎水性膜内に水溶性の領域をカプセル化している；溶解した親水性の溶質は、容易には脂質を通過できない。疎水性化学物質は膜に溶解でき、そしてこの方法で、リポソームは疎水性分子と親水性分子の両方を運ぶことができる。リポソームは、薬剤、核酸、ペプチドなどといった生物活性剤と混合でき、また、これらの薬剤を細胞の生化学的経路の調節のために送達するように使用できる。これは、新規な疾患治療のための可能性を開く。
【０００４】
Ｇｅｒｓｈｏｎ外（Ｇｅｒｓｈｏｎ  Ｈ外，Ｍｏｄｅ  ｏｆ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ＤＮＡ−Ｃａｔｉｏｎｉｃ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｕｓｅｄ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３，３２：７１４３−７１５１）には、陽イオン性リポソームと核酸との間で形成されるナノ粒子がＤＮＡ及びＲＮＡを細胞に送達するための効率的なビヒクルとなることが記載されている。陽イオン性リポソームは、最初にＤＮＡ分子に結合して、この核酸に沿って凝集したベシクルのクラスターを形成する。リポソーム臨界密度では、２つのプロセス、すなわち、ＤＮＡ誘導膜融合及びリポソーム誘導ＤＮＡ凝縮が起こる。ＤＮＡ凝縮は、この融合した脂質二重層により完全にカプセル化できる凝縮構造を迅速で非常に協同的なプロセスで形成させることになる。
【０００５】
負に荷電した核酸のデリバリーについては、陽イオン性脂質が最も効果的なトランスフェクション剤である。陽イオン性脂質は、ＤＮＡデリバリーのための有望な合成物質群の典型である。今までに、製品化された陽イオン性脂質がいくつか存在しているが、遺伝子の安全で効果的なデリバリーのための陽イオン性脂質の数は依然として限られている。
【０００６】
「Ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ」（Ｍｉｌｌｅｒ  ＡＤ、Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ著，１９９８，３７：１７６８−１７８５）には、一般的に使用されかつ市販されているトランスフェクション剤のほとんどが記載されている。しかし、従来の脂質合成は、典型的には、化学的保護及び脱保護、触媒の使用及び除去、溶媒の交換及び精製といった時間集中的な手順を含めて、個々に最適化された多段階合成を必要とする。
【０００７】
国際公開第０１／４２２００号には、陽イオン性両親媒性化合物の例及びこれらをトランスフェクション剤として医薬組成物に使用することが記載されている。この文献に記載された化合物は、時間のかかる多段階合成で作製されている。
【０００８】
陽イオン性脂質は、細胞膜にさらに効率的に取り込まれることのできるリポソームを形成するために天然リン脂質（ヘルパー脂質と呼ばれる）と組み合わされる必要がある。リポソームと、単独では標的細胞の膜を通じて拡散できないＤＮＡや薬剤とを組み合わせることによって、これらは、脂質二重層を越えて（無差別に）送達できる。ＤＮＡの宿主細胞への形質転換又はトランスフェクションのためのリポソームの使用は、リポフェクションとして知られている。
【０００９】
リポソーム試薬は、細胞トランスフェクション剤についての技術常識となるものであるが、これらには次の欠点がある：
１．多くの細胞株（初代細胞など）は、リポソーム試薬であっても即座に効率的にトランスフェクトできないこと。
２．これらのものは、合成するのが比較的困難で、しかも費用がかかり、エンドユーザーにとっては高価な場合が多いこと。
【００１０】
２番目の点の結果として、多くの研究室がトランスフェクションのために効率の低い、安価な代替物（例えばリン酸カルシウム）を使用している。合成するのが容易で、かつ、幅広い細胞のタイプにわたって良好なトランスフェクション収率を有する新規なトランスフェクション剤に対する具体的な要求が存在する。選択肢として、様々な異なる化合物の生成を可能にするトランスフェクション剤の容易なコンビナトリアル合成を取り扱うことが有益であろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第０１／４２２００号パンフレット
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｇｅｒｓｈｏｎ  Ｈ外，Ｍｏｄｅ  ｏｆ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ＤＮＡ−Ｃａｔｉｏｎｉｃ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｕｓｅｄ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３，３２：７１４３−７１５１
【非特許文献２】Ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ」（Ｍｉｌｌｅｒ  ＡＤ、Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ著，１９９８，３７：１７６８−１７８５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的
これらの従来技術の不利益を克服するために、新規な陽イオン性アミノ脂質及びそれらの合成方法を提供することが本発明の目的である。この方法は、一般的で、経済的で、しかも実施するのが容易でなければならない。この一般的な方法は、陽イオン性アミノ脂質のライブラリーを開発することを可能にする。このような脂質ライブラリー（数百の異なる脂質分子を含有する）の作製は、最適なトランスフェクション試薬特性を持つ脂質の同定を大きく向上させる。
【００１４】
該陽イオン性アミノ脂質を含有する脂質粒子、特にリポソームを提供することが本発明のさらなる目的である。特に、これらの脂質粒子又はリポソームは、細胞膜を通して生物活性剤を送達することができなければならない。別の目的は、脂質粒子又はリポソームの、疾患の治療のための使用である。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の説明
本発明は、次式（Ｉ）を有する新規アミノ脂質を提供する：
【００１６】
【化１】
0005885833.tif 000002
ここで、Ｒ１及びＲ２は、同一のもの又は異なるものであり、独立に、任意にＣ１〜Ｃ６ヒドロカルビル基で置換されていてよいＣ６〜Ｃ２４アルキル、Ｃ６〜Ｃ２４アルケニル、Ｃ６〜Ｃ２４アルキニル又はＣ６〜Ｃ２４アシルであり、
Ｘ１及びＸ２は同一のもの又は異なるものであり、Ｓ又はＳ＝Ｏ又はＳ（＝Ｏ）２のいずれかであり、
Ｙは、アミド、エステル又は次式の複素環式アミドのいずれかであり：
【００１７】
【化２】
0005885833.tif 000003
（式中、ｋ及びｌは０〜２の整数である。）
Ｒ３及びＲ４は、同一のもの又は異なるものであり、独立に、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ１〜Ｃ１２アルケニル若しくはＣ１〜Ｃ１２アルキニルであり、ここで、アルキル、アルケニル若しくはアルキニルは、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロカルビル基で任意に置換されていてよく、又はＲ３とＲ４とは一緒になって３〜１０個の原子並びに窒素、チオール及び酸素から選択される０〜６個のヘテロ原子の任意に置換された複素環を形成することができ、
Ｒ５は、存在しないか、或いは水素又は第四級アミンを与えるようにＣ１〜Ｃ１２アルキルのいずれかであり、
ｍは１〜１２の整数であり、ｎは２〜１２の整数である。
【００１８】
本発明の好ましい実施形態では、Ｒ１及びＲ２は同一のもの又は異なるものであり、独立にＣ６〜Ｃ２４アルキルであり、より好ましくは、Ｒ１及びＲ２は、同じＣ６〜Ｃ１８アルキルである。
【００１９】
また、本発明は、一般式（ＩＩ）のアミノ脂質を提供する：
【００２０】
【化３】
0005885833.tif 000004
Ｒ１及びＲ２は同じＣ６〜Ｃ１８アルキルであり
Ｙは、アミド、エステル又は次式の複素環式アミドのいずれかであり：
【００２１】
【化４】
0005885833.tif 000005
（式中、ｋ及びｌは０〜２の整数である。）
Ｒ３及びＲ４は同一の又は異なるＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、ここで、アルキルはＣ１〜Ｃ６ヒドロカルビル基で任意に置換されていてよく、又はＲ３とＲ４とは一緒になって３〜１０個の原子並びに窒素、チオール及び酸素から選択される０〜６個のヘテロ原子の任意に置換された複素環を形成することができ、
ｍは１〜１２の整数であり、ｎは２〜１２の整数である。
【００２２】
本発明の別の好ましい実施形態では、Ｙはアミドである。
【００２３】
式（Ｉ）及び（ＩＩ）に従う化合物の好ましい実施形態では、ｎ及びｍは、独立に２又は３の整数である。
【００２４】
最も好ましい実施形態は、式（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）又は（ＩＩＩｃ）の構造に相当する：
【００２５】
【化５】
0005885833.tif 000006
（式中、Ｒ１及びＲ２は同じＣ１１〜Ｃ１２アルキルであり、
Ｒ３及びＲ４は同じＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、
ｍは１〜２の整数であり、ｎは２〜３の整数である。）。
【００２６】
本発明は、請求項１〜４のいずれかに記載のアミノ脂質の合成方法を提供する。この方法は、次の工程を含む、クロマトグラフィー精製なしで液相コンビナトリアル合成でチオール−イン化学に基づきイオン性陽イオン性アミノ脂質の大きなライブラリーを第１並行合成することに相当する：
第１工程は、一般式（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）又は（ＩＶｃ）のアルキン：
【００２７】
【化６】
0005885833.tif 000007
（式中、ｎは２〜１２の整数である。）
と、一般式ＨＳ−Ｒ１及びＨＳ−Ｒ２の化合物
（式中、Ｒ１及びＲ２は、同一のもの又は異なるものであり、独立に、任意にＣ１〜Ｃ６ヒドロカルビル基で置換されていてよいＣ６〜Ｃ２４アルキル、Ｃ６〜Ｃ２４アルケニル、Ｃ６〜Ｃ２４アルキニル又はＣ６〜Ｃ２４アシルである。）
とを、紫外線照射下で又はラジカル開始剤を使用して反応させて、一般式（Ｖａ）、（Ｖｂ）又は（Ｖｃ）の化合物：
【００２８】
【化７】
0005885833.tif 000008
（式中、ｎ、Ｒ１及びＲ２は、上記のとおりに定義される。）
を生じさせることである。
【００２９】
この反応は、ラジカル機構により実施される。この反応を開始させるために化学ラジカル源を添加することができ、或いは単に太陽光下で実施できる。好ましい実施形態では、この反応は、紫外線照射により開始される。
【００３０】
第２工程は、第１工程の生成物（式Ｖａ）と、一般式（Ｒ３Ｒ４Ｒ５Ｎ）（ＣＨ２）ｍＺ（ここで、ｍは１〜１２の整数であり、ＺはＮＨ２、ＯＨ又は次式の第二級複素環式アミン
【００３１】
【化８】
0005885833.tif 000009
（式中、ｋ及びｌは０〜２の整数である。）である。）のアミン又はアルコールとを縮合反応させ、或いは第１工程の生成物（式Ｖｂ又はＶｃ）と一般式（Ｒ３Ｒ４Ｒ５Ｎ）（ＣＨ２）ｍＺ（ｍは１〜１２の整数であり、ＺはＣＯＯＨである。）のカルボン酸とを縮合反応させて
［上記一般式において、Ｒ３及びＲ４は、同一のもの又は異なるものであり、独立に、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロカルビル基で任意に置換されていてよいＣ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ１〜Ｃ１２アルケニル若しくはＣ１〜Ｃ１２アルキニルであり、又は、Ｒ３及びＲ４は一緒にになって３〜１０個の炭素原子並びに窒素、チオール及び酸素から選択される０〜６個のヘテロ原子の環を形成することができ、
Ｒ５は、存在しないか、或いは水素又は第四級アミンを与えるようにＣ１〜Ｃ１２アルキルのいずれかである。］
一般式（ＶＩ）：
【００３２】
【化９】
0005885833.tif 000010
（式中、ｎ、ｍ、Ｙ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は上記のとおり定義される。）
の化合物を生じさせることである。
【００３３】
第２工程は、好ましくは、室温でジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）などの溶媒中において実行される。好ましい実施形態では、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を反応混合物に添加する。
【００３４】
任意の第３工程は、第２工程の生成物のチオエーテル基を酸化剤で酸化反応させて一般式（Ｉ）（式中、ｎ、ｍ、Ｙ、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は上記のとおり定義される。）の化合物を生じさせることである。この第３工程は、好ましくは室温で水性過酸化水素によりメタノールなどの溶媒中で実施される。
【００３５】
この第３工程は、チタン含有ゼオライトなどの触媒によってさらに触媒できる。この反応は、Ｈｕｌｅａ外により既に提案されている（Ｈｕｌｅａ  Ｖ，Ｍｏｒｅａｕ  Ｐ，Ｒｅｎｚｏ  ＦＤ．Ｔｈｉｏｅｔｈｅｒ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｕｓｉｎｇ  ｔｉｔａｎｉｕｍ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｚｅｏｌｉｔｅｓ  ａｓ  ｃａｔａｌｙｓｔｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  Ａ：Ｃｈｅｍｃｉａｌ．１９９６，１１１：３２５−３３２）。驚くべきことに、この反応は、工程ｂ）のアミノ脂質の他の官能基には影響を及ぼさない。
【００３６】
この反応スキームは、非常に多用途である；これを使用して迅速な細胞スクリーニングアッセイのための陽イオン性アミノ脂質の大きなライブラリーを非常に安価な方法で合成することができる。得られた化合物は、全て、それらの長い非極性残基による疎水特性と、それらのアミノ基による親水特性との両方を有する。この両親媒特性を使用して、脂質粒子、例えば脂質二重層、ミセル、リポソームなどを形成させることができる。さらに、これらの化合物のアミノ基は、トランスフェクション剤のために有用な陽イオン電荷を付与する。この新規な特性を有する様々な化合物のライブラリーは、幅広い細胞のタイプのトランスフェクション能力について容易に試験できる。
【００３７】
本発明の別の実施形態は、請求項１〜４のいずれかに記載のアミノ脂質を含有する脂質粒子に関する。本発明の範囲内において、用語「脂質粒子」とは、水溶液に置かれるアミノ脂質からなるナノサイズの物体を意味する。これらの粒子は、とりわけ、脂質二重層ベシクル（リポソーム）、マルチラメラベシクル又はミセルである。
【００３８】
本発明の好ましい実施形態では、該ナノ粒子は、請求項１〜４のいずれかに記載のアミノ脂質を含有するリポソームである。本発明の範囲内においてリポソームは、親水性部分を取り囲む脂質両親媒性分子の二重層から構成されるマイクロベシクルである。
【００３９】
リポソーム形成は、自発的なプロセスではない。脂質ベシクルは、リン脂質などの脂質をまず水中に置き、その後それぞれが水分子で分離された１個の二重層又は一連の二重層を形成するときに形成される。リポソームは、脂質ベシクルを水中で超音波処理することにより作製できる。
【００４０】
本発明の範囲内において、用語「脂質二重層」とは、脂質分子の２つの層から構成される薄膜を意味する。
【００４１】
用語「ミセル」とは、液体コロイド中に分散された界面活性剤分子の集合体を意味する。水溶液中における典型的なミセルは、親水性頭部領域が水と接触し、ミセル中心にある疎水性単一テールを隔離する集合体を形成する。
【００４２】
本発明の範囲内において、用語「細胞」とは、一般名称を意味し、かつ、個々の細胞、組織、器官、昆虫細胞、鳥類細胞、魚類細胞、両生類細胞、ほ乳類細胞、初代細胞、連続細胞株、幹細胞及び／又は異種ポリペプチド若しくはタンパク質を発現する組換え細胞などの遺伝子組換え細胞の培養液を包含する。組換え細胞としては、例えば、成長因子又は血液因子などの異種ポリペプチド又はタンパク質を発現する細胞が挙げられる。
【００４３】
好ましい実施形態では、該脂質粒子又はリポソームは、ヘルパー脂質をさらに含む。好ましい実施形態では、該ヘルパー脂質は非陽イオン性脂質である。さらに好ましい実施形態では、該ヘルパー脂質は非陽イオン性リン脂質である。本発明の範囲内において、非陽イオン性脂質は、陽イオン性官能基（例えばアミノ基）を有することができるが、この分子を少なくとも中和するために陰イオン性官能基を有することが必要である。この脂質分子中における全ての官能基の全体は、非陽イオン性とすべきである。
【００４４】
陽イオン性アミノ脂質及び非陽イオン性（中性）リン脂質の混合物からなるリポソームが細胞への核酸デリバリーに最も効果的である。さらに好ましい実施形態では、該非陽イオン性脂質はＤＯＰＥである。
【００４５】
さらに好ましい実施形態では、脂質粒子又はリポソームは、ステロールをさらに含む。コレステロールのようなステロールは、細胞膜中の天然成分である。このものは、粒子を安定化させ、そして細胞膜との融合を促進させるために使用できる。
【００４６】
本発明の別の実施形態では、脂質粒子又はリポソームは、生物活性剤をさらに含有する。本発明の範囲内において、生物活性剤とは、細胞又は宿主に導入されたときに、例えば免疫反応や炎症反応を刺激し、酵素活性に影響を与え、又は変異を補うことなどによって生物学的効果を及ぼすものである。生物活性剤としては、特に、核酸、ペプチド、タンパク質、抗体及び小分子が挙げられる。
【００４７】
リポソームを使用して原薬を脂質二重層内又はリポソームの内部水性空間内のいずれかに封入する場合には、用語「リポソーム薬」を使用することができる。
【００４８】
最も好ましい実施形態では、生物活性剤は核酸である。別の好ましい実施形態では、該生物活性剤は、抗腫瘍薬、抗生物質、免疫調節薬、抗炎症薬、中枢神経系に作用する薬剤、ポリペプチド又はポリペプトイドよりなる群から随意に選択される一つである。
【００４９】
さらに別の実施形態では、脂質粒子又はリポソームは、少なくとも１種のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質をさらに含む。ＰＥＧ脂質は、粒子及びそれらのカーゴを試験管内又は生体内での分解から保護するのに役立つ。さらに、ＰＥＧは、リポソーム表面にわたって保護層を形成し、かつ、生体内での循環時間を増加させる。このものは、リポソームドラッグデリバリーで使用できる（ＰＥＧ−リポソーム）。
【００５０】
生物活性剤を含有する脂質粒子又はリポソームは、様々な治療薬のいずれかを細胞に送達するために使用できる。本発明は、上記のような脂質粒子、特にリポソームの、生物活性剤を細胞に送達するための使用を包含する。
【００５１】
好ましくは、該生物活性剤は核酸であり、核酸としては、ＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、プラスミド、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。また、生物活性剤は、抗腫瘍薬、抗生物質、免疫調節薬、抗炎症薬、中枢神経系に作用する薬剤、抗原又はそれらの断片、タンパク質、ペプチド、ポリペプトイド、ワクチン及び小分子又はそれらの混合物であることもできる。
【００５２】
上記のように、本発明で定義されるアミノ脂質を含有する脂質粒子又はリポソームは、生物活性剤を細胞に送達するのに好適である。言及した多用途合成方法によって合成できる様々な異なるアミノ脂質は、リポソームに与えられる特定の特性に対してスクリーニングできる。重要な特性は、例えばトランスフェクション効率、細胞毒性、細胞に送達される薬剤の付着、リポソームの安定性、リポソームのサイズなどである。この方法は、特定の用途に特に適合したリポソームを創作することを可能にする。
【００５３】
例えば、脂質粒子（リポソーム）は、多細胞組織又は生物トランスフェクトするために使用できる。これは、対象の新規治療の可能性を与える。
【００５４】
本発明によれば、対象は、好ましくはヒト、マウス、ラット、ブタ、ネコ、イヌ、ウマ、ヤギ、ウシ及びサル及び／又は他のものよりなる群から選択される任意のほ乳類とすることができる。最も好ましくは、対象はヒトである。
【００５５】
本発明の重要な実施形態は、式（Ｉ−ＩＩＩ）に従うアミノ脂質を含有する該脂質粒子又はリポソームの、薬剤として使用するための使用である。
【００５６】
特に、該脂質粒子又はリポソームは、遺伝子治療、遺伝子ワクチン、アンチセンス治療又は干渉ＲＮＡによる治療に使用するために対象に投与できる。また、本発明の脂質粒子は、核酸転移、例えば治療によるヒト又は動物身体の処置、特に遺伝疾患や遺伝子改変により生じた又はそれに関連する状態の処置に使用するための薬剤の製造のためにも使用できる。
【００５７】
遺伝子治療の標的はよく知られており、単一遺伝子障害、例えば、嚢胞性線維症、様々な癌及び感染症、例えば、ウイルス感染、例えば、ＨＩＶによるものが挙げられる。例えば、ｐ５３遺伝子のトランスフェクションは、癌治療に対する大きな可能性を与える。また、遺伝子ワクチン用の標的もよく知られており、天然源から誘導されるワクチンがヒトの使用に対して危険過ぎ、かつ、組換えワクチンが必ずしも有効であるとは限らない病原体、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）及び単純ヘルペスウイルスのワクチン接種が挙げられる。
【００５８】
また、アンチセンス治療の標的も知られている。遺伝子治療及びアンチセンス治療のさらなる標的が、遺伝子ワクチンのさらなる標的と同様に、疾患の遺伝的根拠の知識が増すにしたがって提案されてきている。
【００５９】
本発明の脂質粒子は、ワクチン接種の際に使用できる。したがって、本発明の脂質粒子又はリポソームを使用して抗原又は抗原をコードする核酸を送達することができる。これらの技術は、当業者によく知られている。リポソームワクチンの例は、Ｂｕｔｔｓ  Ｃ外，Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｐｈａｓｅ  ＩＩＢ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ＢＬＰ２５  ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  ｓｔａｇｅ  ＩＩＩＢ  ａｎｄ  ＩＶ  Ｎｏｎ−Ｓｍａｌｌ−Ｃｅｌｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２００５，２３：６６７４−６６８１及びＵ’Ｒｅｎ  Ｌ外，Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ＤＮＡ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｅｌｉｃｉｔｓ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２００６，１３：１０３３−１０４４に記載されている。
【００６０】
本発明の脂質粒子を使用して、癌、アレルギー、毒性並びにウイルス、細菌、真菌類及び他の病原性生物などの病原体による感染（これらに限定されない）を含めた多数の状態の治療及び／又は予防のために様々な抗原に対する免疫反応を引き出すことができる。
【００６１】
本発明の好ましい実施形態では、該脂質粒子又はリポソームは、ウイルス感染、肝臓病若しくは肝臓疾患又は癌の治療の際の薬剤として使用できる。肝臓病では、リポソームは、主として肝臓内に位置する細網内皮系の細胞によって捕捉され得る。リポソームは、そこに蓄積されることになる。
【００６２】
次の図及び実施例は、本発明の手順及び概念的見地の説明をよく理解するために与えられるものである。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】図１は、アミノリポソーム試薬及び２種の市販のトランスフェクション試薬の使用によるリポフェクションの結果を示す比較顕微鏡写真である。
【図２】図２は、市販の試薬と比較した、１２０種のトランスフェクション試薬のライブラリーのトランスフェクション効率の画像概観である。
【図３】図３は、ＨＥＫ２９３及びＭＥＦ細胞におけるｓｉＲＮＡ遺伝子抑制を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００６４】
合成
例１：Ｎ−（２−（ジメチルアミノ）エチル）−４，５−ビス（ドデシルチオ）ペンタンアミド（ＤＥＤＰＡ）の合成及びキャラクタリゼーション
【００６５】
【化１０】
0005885833.tif 000011
このアミノ脂質を２工程で合成した。第１工程は、４，５−ビス（ドデシルチオ）ペンタン酸を合成することである。０．５ｍｍｏｌの４−ペンチン酸、１ｍｍｏｌのドデカン−１−チオール及び５ｍｇの２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノン（ＤＭＰＡ）を１．５ｍｌのＴＨＦに溶解させ、そしてアルミホイルで覆われた２０ｍｌのガラス製の小瓶に添加した。この小瓶を５分間脱気し、アルゴン（Ａｒ）で３分間満たし、その後蓋で覆った。この混合物にＵＶ３６５ｎｍ下で１時間にわたり放射線照射し、その後、ＴＨＦを５０ｍｌのフラスコに移し、そして蒸発させた。
【００６６】
第２工程は、４，５−ビス（ドデシルチオ）ペンタン酸とＮ１，Ｎ１−ジメチルエタン−１，２−ジアミンとを結合させてＮ−（２−（ジメチルアミノ）エチル）−４，５−ビス（ドデシルチオ）ペンタンアミドを得ることである。第１工程からの４，５−ビス（ドデシルチオ）ペンタン酸を８ｍｌのジクロロメタン（ＤＣＭ）に溶解させた。この溶液の１ｍｌを４ｍｌのＤＣＭで希釈し、そして１１．６１μｌのＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）（０．０７５ｍｍｏｌ、１．２当量）を添加した。０．０６３ｍｍｏｌのＮ１，Ｎ１−ジメチルエタン−１，２−ジアミンをこの混合物に添加し、そしてボルテックスした。ヒドロキシルベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し（６０８μｌのＤＭＦ中３０４ｍｇ）、そしてこのＨＯＢｔ溶液の１９．４５μｌを添加した。続いて、この小瓶をアルミホイルで覆い、Ａｒで満たした。１６時間撹拌した後、ジクロロメタン（ＤＣＭ）を蒸発させ、残留物を２ｍｌのヘキサンに溶解させ、そして新しい小瓶に移した。生成物を遠心分離により分離し、そして上澄みを集め、ヘキサンをデジケーターで蒸発させた。生成物をパラフィルムでシールし、そしてＡｒ下で保存した。
【００６７】
この分子が所期のものであることを確認するために、粗生成物を質量分析により分析した。この分子イオンは、５７４．０ＭＷ／ｚであると明確に確認された。
【００６８】
例２〜７の化合物の合成を例１と同様に実施した。工程１を同じ方法で実施する。工程２は遊離体の点で異なるが、ただし、化学量論比は維持した。得られた化合物及び対応するＭＷ／ｚ値を表１にまとめる。
【００６９】
【表１】
0005885833.tif 000012
【００７０】
例８：Ｎ−（２−（ジメチルアミノ）エチル）−５，６−ビス（ドデシルチオ）ヘキサンアミドの合成及びキャラクタリゼーション
【００７１】
【化１１】
0005885833.tif 000013
Ｎ−（２−（ジメチルアミノ）エチル）−５，６−ビス（ドデシルチオ）ヘキサンアミドの合成手順は前の例と同様である。
【００７２】
第１工程は、５，６−ビス（ドデシルチオ）ヘキサン酸を合成することである。０．５ｍｍｏｌの５−ヘキシン酸、１ｍｍｏｌのドデカン−１−チオール及び５ｍｇのＤＭＰＡを１．５ｍｌのＴＨＦに溶解させ、そして２０ｍｌのガラス製の小瓶に添加した。この小瓶をアルミホイルで覆い、Ａｒで満たし、そしてＵＶ３６５ｎｍ下で１時間にわたり放射線照射した。その後、ＴＨＦを５０ｍｌのフラスコに移し、そして蒸発させた。
【００７３】
第２工程は、５，６−ビス（ドデシルチオ）ヘキサン酸とＮ１，Ｎ１−ジメチルエタン−１，２−ジアミンとを結合させてＮ−（２−（ジメチルアミノ）エチル）−５，６−ビス（ドデシルチオ）ヘキサンアミドを得ることである。この工程は、前の例と同様に実施した。化学量論比を維持した。
【００７４】
分子の同一性を確認するために、粗生成物を質量分析で試験した（ｍ／ｚ５８７．９）。
【００７５】
例９〜１４に従う合成を例８と同様に実施した。工程１を同じ方法で実施する。工程２は遊離体の点で異なるが、ただし、化学量論比は維持した。得られた化合物及び対応する分子イオンを表２にまとめる。
【００７６】
【表２】
0005885833.tif 000014
【００７７】
例１５：Ｎ−（２−（ジメチルアミノ）エチル）−４−（ドデシルスルフィニル）−５−（ドデシルチオ）ペンタンアミドの合成及びキャラクタリゼーション
【００７８】
【化１２】
0005885833.tif 000015
このアミノ脂質を一工程で合成する。１ｍｍｏｌのＮ−（２−（ジメチルアミノ）エチル）−４，５−ビス（ドデシルチオ）ペンタンアミド（ＤＥＤＰＡ、例１の生成物）を１０ｍｌメタノール中１０ｍｍｏｌの水性過酸化水素（３０％）と混合し、そして室温で１時間撹拌した。その後、この混合物を５０ｍｌのフラスコに移し、そして蒸発させた。
【００７９】
分子の同一性を確認するために、粗生成物を質量分析により分析した。この分子イオンは、５８９．７ＭＷ／ｚであると明確に確認された。
【００８０】
例１６：Ｎ−（２−（ジメチルアミノ）エチル）−４，５−ビス（ドデシルスルホニル）ペンタンアミドの合成及びキャラクタリゼーション
【００８１】
【化１３】
0005885833.tif 000016
このアミノ脂質を一工程で合成する。１ｍｍｏｌのＮ−（２−（ジメチルアミノ）エチル）−４，５−ビス（ドデシルチオ）ペンタンアミド（ＤＥＤＰＡ、例１の生成物）を１０ｍｌメタノール中１０ｍｍｏｌの水性過酸化水素（３０％）と混合し、そして室温で２日間撹拌した。その後、この混合物を５０ｍｌのフラスコに移し、そして蒸発させた。
【００８２】
分子の同一性を確認するために、粗生成物を質量分析により分析した。この分子イオンは、６３７．５ＭＷ／ｚであると明確に確認された。
【００８３】
細胞トランスフェクション用の陽イオン性脂質のスクリーニング
例１７：細胞トランスフェクションのための最適脂質比の仮決定
十分に裏付けられたＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞株を例１７及び１８のために使用した。
【００８４】
天然リン脂質ジオレオリルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ−構造を以下に示す）を必要な共脂質（ヘルパー脂質ともいう）として選択した。これは、リポソーム自体の安定性には必要ないが、むしろ、細胞のエンドサイトーシスコンパートメント（エンドソーム）内で脂質膜を破壊し、生物活性剤を細胞質ゾル及び／又は核に放出するのを可能にするために必要である。基本的に、このものは、本発明の陽イオン性アミノ脂質（ＤＥＤＰＡ）と共に安定なリポソーム形成にとって所望の効果のために必要である。ＤＯＰＥを代表的な陽イオン性アミノ脂質（構造を以下に示す）と様々な比率で混合した。両方の脂質をエタノールに５０ｍｇ／ｍｌで溶解させ、そして３０μｌの最終容量になるまで混合した。
【００８５】
ＤＯＰＥ（中性ヘルパー脂質）：
【００８６】
【化１４】
0005885833.tif 000017
代表的な新規陽イオン性アミノ脂質としてのＮ−（２−（ジメチルアミノ）エチル）−４，５−ビス（ドデシルチオ）ペンタンアミド（ＤＥＤＰＡ）：
【００８７】
【化１５】
0005885833.tif 000018
【００８８】
【表３】
0005885833.tif 000019
その後、これらの３０μｌエタノール混合物を７０μｌの０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に３０分間にわたり一定にボルテックスしながら添加し、５分間にわたり超音波処理してリポソームを形成させた。最終脂質含有量は２ｍｇ／ｍｌである。この最終２ｍｇ／ｍｌリポソーム試料を「脂質試薬」という。
【００８９】
上記脂質試薬の０．１μｌ、０．２μｌ、０．３μｌ、０．４μｌ及び０．５μｌを５０ｎｇ又は１００ｎｇのプラスミドＤＮＡ（ｐＣＳ−ＬａｃＺ及びｐＥＧＦＰ−Ｃ１プラスミドをそれぞれ９：１の比率で含む）のいずれかと一緒にし、そして以下に記載するとおりに細胞と混合した：
（示される量は９６ウェル培養プレートの１個のウェルについてのものである）
１．０．１μｌ〜０．５μｌの脂質試料を１０μｌの５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で希釈する。
２．２〜５分のインキュベーション後に、（１）からの希釈脂質試薬を５０ｎｇ又は１００ｎｇのプラスミドＤＮＡ（１０μｌの５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．０に溶解されたＤＮＡ）のいずれかに添加する。
３．試料を室温で３０分間放置して脂質／ＤＮＡトランスフェクション複合体を形成させた。ＤＮＡは負に荷電しているため、このものは、リポソーム中の陽イオン性脂質の正に荷電した頭部基と非特異的に結合する。
４．３０分後、５０μｌの新たに懸濁したＨＥＫ  ２９３細胞（１０％ウシ胎仔血清が加えられたＤＭＥＭ培地中において約５０，０００個の細胞）を脂質／ＤＮＡ複合体に添加し、ピペット作用により混合させ、そして細胞＋脂質／ＤＮＡ複合体の６５μｌを単一の９６ウェルに添加した。
【００９０】
脂質混合物がプラスミドＤＮＡを細胞に送達できることを評価するために、顕微鏡法を使用して緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）により放射される蛍光を最初のトランスフェクションの２０〜２４時間後に視覚化した。ＧＦＰタンパク質は、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１プラスミドによりコードされており、トランスフェクトが成功した細胞の細胞質内で効率的に合成され、かつ、そこに位置する。
【００９１】
結果：
アミノ脂質：ＤＯＰＥの最適比は１：１と特定され、最適脂質試薬：ＤＮＡ比は、５０ｎｇのＤＮＡ当たり０．４μｌの脂質試薬であった。したがって、以下の例１８に記載するように、これらの条件を一次スクリーニングのために使用して最も高い細胞トランスフェクション効率及び最も低い細胞毒性を有する脂質試薬を同定した。
【００９２】
例１８：新規脂質試薬を使用した一次スクリーニング
細胞株：ＨＥＫ２９３細胞
スクリーンフォーマット：９６ウェル
検出（読み出し）：全細胞数に対するＧＦＰ蛍光発光（核染料であるＨｏｅｃｈｓｔを使用して評価された全細胞数。図１参照。）
市販のリポソームトランスフェクション試薬を、製造者の指示に従って基準（基準試薬）として使用した。図１を参照。
【００９３】
方法：
全ての工程は、８又は１２チャネルマルチピペットを使用して９６チューブ／プレートフォーマットで実施した。示される量は、９６ウェルプレートの二重（２×）ウェルについてのものである。
１．０．８μｌの脂質試薬を２０μｌの５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ５．０）で希釈した。
２．（１）からの希釈脂質試薬を２０μｌのＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ５．０）中１００ｎｇのＤＮＡ（１０ｎｇのｐＥＧＦＰ−Ｃ１＋９０ｎｇのｐＣＳ−ＬａｃＺプラスミド）に添加し、ピペット作用により混合させた。
３．室温で３０分のインキュベーション後、１００μｌの新たに再懸濁された細胞（３〜５×１０５細胞／１０％ウシ胎仔血清が加えられた５０μｌのＤＭＥＭ培地）を添加し、ピペットで混合させた。
４．細胞＋脂質／ＤＮＡ複合体の二重６５μｌアリコートを直ちに９６ウェル培養プレートの別個のウェルに移し、そして５％のＣＯ２を有する３７℃のインキュベーター内に置いた。
５．５時間後、５０μｌの新たな細胞培地（１０％のＦＣＳが加えられたＤＭＥＭ）を添加した。
６．細胞の最初のトランスフェクションの２０〜２４時間後、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８染料を細胞に０．２μｇ／ｍｌの最終濃度で添加し、そして細胞を３７℃でさらに３０分間インキュベートした。続いて、細胞を倒立顕微鏡に置き、その細胞の画像の２つの独立したセットを図１に示すように各ウェルから撮る。
【００９４】
各試料について、次の３つの画像を撮った：細胞の明視野画像（図１の上のパネル）、全細胞核のＨｏｅｃｈｓｔ染料染色画像（図１の中央のパネル）及びプラスミドＤＮＡのトランスフェクトが成功しかつＧＦＰタンパク質を発現する細胞を示すＧＦＰ画像（図１の下のパネル）。
【００９５】
本発明の脂質分子の一つ（＃２９）のトランスフェクション効率及び毒性レベルの両方を示す、トランスフェクトを受けたＨＥＫ２９３細胞の顕微鏡画像を、一般的に使用されている市販のトランスフェクション試薬（基準試薬）と比較した。脂質試薬＃２９は、約９５％のトランスフェクション効率を有し、かつ、低い細胞毒性を有する（明るく染色されたアポトーシス核がほとんどない）。一般に、リポソーム試薬のトランスフェクション効率が高ければ高いほど、細胞毒性も大きい。このことは、高いパーセンテージの細胞がトランスフェクトされるが、結果として多くの有害なアポトーシス細胞が存在する基準試薬には自明である。
【００９６】
ＧＦＰシグナルを示す細胞数が増加していることのみならず、毒性が減少していることに注意すべきである。毒性は、全細胞数の減少のみならず、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色後に明るく染色された細胞として検出されるアポトーシス細胞の増加により観察される。
【００９７】
例１８で与えたプロとコールに従って、請求項１に従う１２０種の新たに合成された化合物のライブラリーについて、それらのＨＥＫ２９３細胞へのトランスフェクト能力を試験した。図２のグラフは、これらの脂質化合物の、市販のトランスフェクション試薬基準と比較したトランスフェクション効率を示している。脂質分子の１５種は、広く使用されている市販のトランスフェクション試薬と比較して、プラスミドＤＮＡ（ＧＦＰ遺伝子）をＨＥＫ２９３細胞に送達する点で有意に効率的である（実線で示される）。これら１５種の効率の高い新規トランスフェクション試薬のうち、特に１種が非常に低い毒性を持ち、かつ、ｓｉＲＮＡ分子を細胞に非常に効率的に送達する能力を有することが特定された（＃２９；図１及び図３参照）。
【００９８】
例１９：ｓｉＲＮＡをトランスフェクトする能力に対するライブラリー「ヒット」のスクリーニング
細胞及び全生物の両方における遺伝子機能の操作に関する重要な技術の一つは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）による遺伝子抑制である。低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子のほ乳類細胞への送達は、この技術に不可欠であり、かつ、重要な臨床的／治療的意義を持つ。
【００９９】
したがって、本発明者は、本発明の脂質をプラスミドＤＮＡ（遺伝子）のデリバリーに対してスクリーニングすることの他に、本発明のアミノ脂質をｓｉＲＮＡ分子（遺伝子サイレンサー）を効率的に送達できる能力に対してもスクリーニングした。
【０１００】
これに対してスクリーニングするために、２つの異なるタイプの細胞を使用して、本発明の脂質試薬の、ｓｉＲＮＡ標的低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質６（ＬＲＰ６）を送達する能力を試験した。これは、Ｗｎｔリガンドに対する２００ｋＤの１回膜貫通受容体であり、Ｗｎｔ／ｂ−カテニンシグナル経路を活性化する。このものは、ＨＥＫ２９３細胞内では比較的低レベルで発現し、ＭＥＦ細胞内では比較的高レベルで発現する。
【０１０１】
アッセイ１．ＨＥＫ２９３細胞内へのｓｉＲＮＡのトランスフェクション
方法：
全ての工程を１．５ｍＬのエッペンドルフチューブ及び２４ウェルプレートフォーマットで実行した。示される量は、２４ウェルプレートの１個のウェルについてのものである。
１．２μｌの脂質試薬を５０μｌの５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ５．０）で希釈した。
２．（１）からの希釈脂質試薬を、２０μｌのＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ５．０）中２０ｐｍｏｌ（２０ｕＭの１μｌ  ）ｓｉＲＮＡ  分子に添加し、そしてピペット作用で混合させた。使用したｓｉＲＮＡ分子は、任意の既知の遺伝子に特異的ではないスクランブルされた配列（Ｃｏｎ  ｓｉＲＮＡ）か、又はＬＲＰ６遺伝子からの内在性ｍＲＮＡを特異的に標的にする配列（ＬＲＰ６  ｓｉＲＮＡ）のいずれかを有する。
３．室温で３０分のインキュベーション後、４００μｌの新たに再懸濁した細胞（３〜５×１０５細胞／１０％ウシ胎仔血清が加えられた５０μｌのＤＭＥＭ培地）を加え、そしてピペットで混合させた。
４．脂質／ｓｉＲＮＡ複合体を２４ウェル培養プレートの別個のウェルに直ちに移し、そして５％のＣＯ２を有する３７℃のインキュベーター内に置いた。
５．最初のトランスフェクションの４８時間後に、細胞を５０μｌの洗剤緩衝液（プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤を含有する５０ｍＭのＴｒｉｓ、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１５  ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０）中で溶解させ、遠心させて不溶性細胞破片を除去し、そして３０μｌの清澄溶解物を１０μｌの４×ＳＤＳ添加液（２５０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ、４０％のグリセロール、８％のＳＤＳ、０．０１％のブロモフェノールブルー、５％の２−メルカプトエタノール、ｐＨ６．８）に添加した。
６．試料を９６℃で２分間にわたり変性させ、１０μｌを分子量に従ってタンパク質を分離するために９％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードした。分離されたタンパク質をウェスタン・ブロット（ＷＢ）分析のためにＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからニトロセルロース膜に転移させた。
７．ＷＢを、ＬＲＰ６に対する抗体を用いた自動ＢｉｏＬａｎｅ  ＨＴＩ装置を使用して実行する。ＨＲＰ結合二次抗体及び化学発光法を使用して膜上のタンパク質を検出した。
アッセイ２．マウス胚性線維芽（ＭＥＦ）細胞へのｓｉＲＮＡのトランスフェクション
【０１０２】
方法：
全ての工程を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ及び２４ウェルプレートフォーマットで実行した。示される量は、２４ウェルプレートの一つのウェルについてのものである。
１．２μｌの脂質試薬を５０μｌの５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ５．０）で希釈した。
２．（１）からの希釈脂質試薬を２０μｌのＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ５．０）中２０ｐｍｏｌ（２０μＭの１μｌ）ｓｉＲＮＡ分子に添加し、そしてピペット作用で混合した。使用したｓｉＲＮＡ分子は、任意の既知の遺伝子に特異的ではないスクランブルされた配列（Ｃｏｎ  ｓｉＲＮＡ）か、又はＬＲＰ６遺伝子からの内在性ｍＲＮＡを特異的に標的にする配列（ＬＲＰ６  ｓｉＲＮＡ）のいずれかを有する。
３．室温で３０分のインキュベーション後、１０％ウシ胎仔血清が加えられた４００μｌの新たなＤＭＥＭ培地を加え、ピペットで混合し、そして２４ウェルプレートの一つのウェル内にある付着ＭＥＦ細胞に添加し（５０〜７０％培養密度）、そして５％ＣＯ２を有する３７℃のインキュベーター内に置いた。
４．最初のトランスフェクションの４８時間後に、細胞を１００μｌの洗剤緩衝液（プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤を含有する５０ｍＭのＴｒｉｓ、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０）中で溶解させ、遠心させて不溶性細胞破片を除去し、そして３０μｌの清澄溶解物を１０μｌの４×ＳＤＳ添加液（２５０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ、４０％のグリセロール、８％のＳＤＳ、０．０１％のブロモフェノールブルー、５％の２−メルカプトエタノール、ｐＨ６．８）に添加した。
５．試料を９６℃で２分間にわたり加熱することにより変性させ、５μｌを分子量に従ってタンパク質を分離するために９％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードした。分離されたタンパク質をウェスタン・ブロット（ＷＢ）分析のためにＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからニトロセルロース膜に転移させた。
６．ＷＢを、ＬＲＰ６に対する抗体及びβ−アクチンタンパク質を用いた自動ＢｉｏＬａｎｅ  ＨＴＩ装置を使用して実行する。ＨＲＰ結合二次抗体及び化学発光法を使用して膜上のタンパク質を検出した。
【０１０３】
結果
図３Ａは、示されたｓｉＲＮＡ分子をトランスフェクトし、かつ、４８時間にわたってインキュベートされた２９３細胞の全溶解液からの内在性ＬＲＰ６タンパク質のウェスタン・ブロット（ＷＢ）分析を示す。ＬＲＰ６の内在性レベルは、試薬Ａを使用したＬＲＰ６ｓｉＲＮＡデリバリー後に強く下方調節されるが、この効果は、本発明に従う脂質試薬＃２９を使用するとより強くなる。Ｃｏｎとは、非標的スクランブルｓｉＲＮＡコントロールをいい、ローディングとは、非特異的タンパク質のバンドであって、同様のタンパク質の量を各試料についてロードしたことを示すために基準として使用されるものをいう（すなわち、ｓｉＲＮＡ標的の特異的なサイレンシングを実証する）。
【０１０４】
図３Ｂは、示されたｓｉＲＮＡ分子をトランスフェクトし、４８時間にわたって培養されたＭＥＦ（マウス胚性線維芽）細胞の全溶解液からのＬＲＰ６タンパク質のウェスタン・ブロット（ＷＢ）分析を示す。ここでも、脂質試薬＃２９は、ｓｉＲＮＡ仲介遺伝子抑制の点で市販の試薬Ａよりも効果的である。また、第２脂質試薬（＃３５）は、細胞にプラスミドＤＮＡを効率的にトランスフェクトできるという事実にもかかわらず、効果が小さいことも示されている。これは、関連するトランスフェクション試薬の特性における著しい相違を実証し、かつ、最適な特性（例えば非常に効率的なＤＮＡ及びｓｉＲＮＡのデリバリー並びに低い細胞毒性）を有するものを同定するためにスクリーニングできる数百の関連脂質を容易に合成するための本発明の新規方法を使用することの重要性を強調するものである。
【０１０５】
略語のリスト
Ａｒ        アルゴン
ＤＣＭ      ジクロロメタン
ＤＥＤＰＡ  Ｎ−（２−（ジメチルアミノ）エチル）−４，５−ビス（ドデシルチオ）ペンタンアミド
ＤＩＣ      Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド
ＤＭＥＭ    培地
ＤＭＦ      ジメチルホルムアミド
ＤＭＰＡ    ２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノン
ＤＮＡ      デオキシリボ核酸
ＤＯＰＥ    ジオレオリルホスファチジルエタノールアミン
ＥＧＦＰ    高感度ＧＦＰ
ＧＦＰ      緑色蛍光タンパク質
ＨＯＢｔ    ヒドロキシルベンゾトリアゾール
ＨＲＰ      ホースラディッシュペルオキシダーゼ
ｋＤ        キロダルトン
ＬＲＰ６    低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質６
ＭＥＦ      マウス胚性線維芽
ＰＥＧ      ポリエチレングリコール
ＲＮＡ      リボ核酸
ＲＮＡｉ    ＲＮＡ干渉
ｓｉＲＮＡ  低分子干渉ＲＮＡ
ＳＤＳ      ドデシル硫酸ナトリウム
ＴＨＦ      テトラヒドロフラン
ＷＢ        ウェスタン・ブロット
Ｗｎｔ      細胞分化におけるシグナルタンパク質
【図１】
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【図２】
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【図３】
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