(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リンカーを介して輸送タンパク質にペプチドホルモンを融合することによって得られる融合タンパク質であって、前記ペプチドホルモンは配列番号１で示すアミノ酸配列を有するエキセンジン−４であり、前記ペプチドホルモンは血糖を下げることができ、前記輸送タンパク質は免疫グロブリンＩｇＧ２のＦｃ部分であり、前記リンカーは、配列番号３で示すアミノ酸配列を有するペプチドであり、血糖を下げることができる融合タンパク質。
【請求項２】
配列番号３で示すアミノ酸配列のＸａａがＡｌａである請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記免疫グロブリンＩｇＧ２のＦｃ部分は、ヒト由来である請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
配列番号４で示すアミノ酸配列を有する請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項５に記載のポリヌクレオチドを含むベクターで受容細胞をトランスフェクトすることによって生成され、前記受容細胞はＣＨＯ細胞である宿主細胞。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の融合タンパク質と、薬理学的に許容できる賦型剤とを含む医薬組成物。
【請求項８】
局所投与、エアロゾルまたは注射として投与される請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
腹腔注射、皮下注射、筋肉注射および静脈注射で投与されることを特徴とする請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
糖尿病および肥満症に対する薬剤の製造における請求項１〜４のいずれか１項に記載の融合タンパク質の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、融合タンパク質、その調製方法および使用に関する。特に本発明は、エキセンジン−４の長時間作用型融合タンパク質、その類似体、当該融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列、ベクター、宿主細胞および医薬組成物、これらの調製方法および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
エキセンジン−４はペプチドホルモンであり、３９個のアミノ酸を含み、インスリン分泌を刺激することができる。２００５年には、エキセナチド注射剤Ｂｙｅｔｔａ（登録商標）（合成エキセナチド−４）が、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ社およびＡｍｙｌｉｎ社によって共同開発され、糖尿病治療用に認可されている。しかし、分子量が小さいため、エキセナチド−４は腎臓で除去される傾向があることから、ＧＬＰ−１Ｒを持続して刺激することができない。このため、許容効果は１日当り２回の注射で得るしかなく、臨床治療に多くの不都合が生じている。したがって、エキセンジン−４の長時間作用型製剤を開発することは、１型糖尿病および２型糖尿病の治療効果を改善するのに有用であると考えられる。薬理学分野の研究者らは、抗糖尿病薬としてｉｎ  ｖｉｖｏで作用する薬剤の持続効果を分子構造の修飾によって延長させようと試みている。
【０００３】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのＧＬＰ−１またはエキセンジン−４の半減期が短かいという状況に対して、研究者らは国際公開第２００２／４６２２７号パンフレットまたは国際公開第２００５／０００８９２号パンフレットに記載されるＧＬＰ−１アルブミン融合タンパク質またはＧＬＰ−１−ＩｇＧ４融合タンパク質（Ｋｉｍら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ．２００３；５２（３）：７５１−７５９）などの対応する融合タンパク質を開発しているものの、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの結合活性は比較的低く、その効果はエキセンジン−４より低い。理想的な発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの薬剤の半減期を大幅に延長でき、エキセンジン−４の抗糖尿病効果を維持でき、インスリンに対する身体の感受性を改善できるものであることから、ｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性が安定したエキセンジン−４の長時間作用型要素およびその類似体を開発するためにさらに一層の努力をするように奨励されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性が安定したエキセンジン−４の長時間作用型融合タンパク質およびその類似体、対応するヌクレオチド配列、ベクター、宿主細胞、医薬組成物、その調製方法および使用を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明におけるエキセンジン−４およびその類似体の融合タンパク質は、リンカーを介して免疫グロブリンＩｇＧ２のＦｃ部分にエキセンジン−４およびその類似体を融合することによって得られ、糖尿病および肥満症と、血漿グルコース値を下げ、胃腸運動および胃排出能を阻害することから便益が得られると考えられる他のあらゆる疾患の治療に使用される。半減期が短かいため、エキセンジン−４およびその類似体は、効果を維持するために毎日注射する必要があることから、臨床診療の制限がある程度存在する。この薬剤の治療効果を高めるために、出願人は、さらに研究を行い、本発明におけるエキセンジン−４の融合タンパク質およびその類似体を開発した。この融合タンパク質は、ｉｎ  ｖｉｖｏでは安定性が高く、半減期がさらに長いことから、ｉｎ  ｖｉｖｏでのグルコース値に従って膵島β細胞の再生および修復を容易にし、膵島β細胞の量を増加することが可能である。このため、インスリンの分泌を促進して、インスリンに対する身体の感受性を高めることから、さらに良好な抗糖尿病効果が得られ、低血糖リスクを最小限に抑えられる。さらにこの融合タンパク質は、体重を減少させることが可能であり、脂質低下作用および血圧低下作用を及ぼしうることから、心血管系を保護するとともに、中枢神経系に作用することによって安息機能および記憶機能を高めて神経系を保護する。
【０００６】
本発明は、リンカーを介して輸送タンパク質にペプチドホルモンを融合することによって得られ、ペプチドホルモンは、エキセンジン−４またはエキセンジン−４の類似体であり、ペプチドホルモンは、血糖を下げることができ、輸送タンパク質は免疫グロブリンＩｇＧ２のＦｃ部分であり、融合タンパク質は血糖を下げることができる融合タンパク質を提供する。
【０００７】
本発明で提供するエキセンジン−４およびその類似体の融合タンパク質は、リンカーを介して免疫グロブリンＩｇＧ２のＦｃ部分にエキセンジン−４およびその類似体を融合することによって得られる。
【０００８】
エキセンジン−４は、配列番号１で示すアミノ酸配列を有し、エキセンジン−４の類似体は、配列番号１で示すアミノ酸配列の誘導配列、配列番号２で示すアミノ酸配列、配列番号２で示すアミノ酸配列の誘導配列、ＤＰＰ−ＩＶに対して抗原性のあるＧＬＰ−１のアミノ酸配列およびＤＰＰ−ＩＶに対して抗原性のあるＧＬＰ−１のアミノ酸配列の誘導配列からなる群から選択されるいずれか１つを有する。
【０００９】
融合タンパク質の一部として、エキセンジン−４またはその類似体は、エキセンジン−４［配列番号１］、ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2［配列番号２］、ＤＰＰ−ＩＶに対して抗原性のあるＧＬＰ−１ならびにそれらの誘導体および断片からなる群から選択されるいずれか１つである。
【００１０】
本発明では、エキセンジン−４およびその類似体は、エキセンジン−４、ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2、ＤＰＰ−ＩＶに対して抗原性のあるＧＬＰ−１のあらゆる誘導体またはその断片を含み、その原体と同じような生物学的作用（すなわち血糖降下作用）があるものとして理解すべきであることに留意する必要がある。誘導体は通常のアミノ酸置換、アミノ酸の直接置換および化学修飾などを含むが、これらに限定されない。
【００１１】
エキセンジン−４およびその類似体は、配列番号１で示すエキセンジン−４配列ならびにその誘導体および断片であってよい。エキセンジン−４の誘導体は通常、配列番号１で示す配列との差が６箇所以下のペプチドであるのが好ましく、配列番号１で示す配列との差が５箇所以下のペプチドであるのがさらに好ましく、配列番号１で示す配列との差が４、３、２または１箇所のペプチドであるのが最も好ましい。すなわち、配列番号１で示すアミノ酸配列の誘導配列と、配列番号１で示すアミノ酸配列とのアミノ酸部位の差が、６箇所以下であるのが好ましく、５箇所以下であるのがさらに好ましく、これよりも４箇所以下であるのがさらに好ましく、これよりも３箇所以下であるのがさらに好ましく、これよりも２箇所以下であるのがさらに好ましく、１箇所以下であるのが最も好ましい。
【００１２】
配列番号１で示すアミノ酸配列の誘導配列は、配列番号１で示すアミノ酸配列の断片であるのが好ましく、配列番号１で示すアミノ酸配列のＮ末端でアミノ酸１からアミノ酸２０まで続くポリペプチドのアミノ酸配列であるのがさらに好ましい。
【００１３】
エキセンジン−４の断片は、配列番号１で示すアミノ酸配列のＮ末端でアミノ酸１からアミノ酸２０まで続くポリペプチドであるのが好ましい。
【００１４】
エキセンジン−４およびその類似体は、配列番号１で示すアミノ酸配列を有するエキセンジン−４である。
【００１５】
エキセンジン−４およびその類似体は、配列番号２で示すＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2配列、その断片および誘導体であってよい。
【００１６】
ＤＰＰ−ＩＶに対して抗原性のあるＧＬＰ−１はＧＬＰ−１Ａ８Ｇである。
【００１７】
すなわち、ペプチドホルモンは次の式Ｉで示す配列を含む。
【００１８】
Ｈｉｓ−Ｘａａ2−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｘａａ10−Ｓｅｒ−Ｘａａ12−Ｘａａ13−Ｘａａ14−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｘａａ19−Ｘａａ20−Ｘａａ21−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｘａａ24−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ27−Ｘａａ28−Ｇｌｙ−Ｘａａ30−Ｘａａ31−Ｘａａ32−Ｘａａ33−Ｘａａ34−Ｘａａ35−Ｘａａ36−Ｘａａ37−Ｘａａ38−Ｘａａ39
式Ｉ
【００１９】
式中、Ｘａａ2は、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＬｙｓであってよく、
Ｘａａ10は、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＧｌｕまたはＬｙｓであってよく、
Ｘａａ12は、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＣｙｓであってよく、
Ｘａａ13は、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＬｙｓであってよく、
Ｘａａ14は、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、ＩｌｅまたはＬｙｓであってよく、
Ｘａａ19は、Ｖａｌ、Ｃｙｓ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＬｙｓであってよく、
Ｘａａ20は、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＬｙｓであってよく、
Ｘａａ21は、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＨｉｓまたはＬｙｓであってよく、
Ｘａａ24は、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、ＬｙｓまたはＩｌｅであってよく、
Ｘａａ27は、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、ＩｌｅまたはＬｙｓであってよく、
Ｘａａ28は、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＬｙｓであってよく、
Ｘａａ30は、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＡｒｇであってよく、
Ｘａａ31は、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＬｙｓであってよく、
Ｘａａ32は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、ＬｙｓまたはＩｌｅであってよく、
Ｘａａ33は、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＬｙｓであってよく、
Ｘａａ34は、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＬｙｓであってよく、
Ｘａａ35は、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＰｈｅであってよく、
Ｘａａ36は、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＣｙｓであってよく、
Ｘａａ37は、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、ＬｙｓまたはＩｌｅであってよく、
Ｘａａ38は、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、ＬｙｓまたはＩｌｅであってよく、
Ｘａａ39は、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、ＩｌｅまたはＬｙｓであってよい。
【００２０】
リンカーは、（Ｇｌｙ）m−Ｘａａ−（Ｇｌｙ）nで示す配列を有するペプチドであり、ｍは３〜８の整数であり、ｎは３〜８の整数であり、Ｘａａは、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ＡｌａおよびＴｈｒからなる群から選択されるいずれか１つである。式Ｉで示す配列は、配列番号２３で示す配列である。
【００２１】
ｍは４〜６の整数であるのが好ましく、ｎは４〜６の整数であるのが好ましい。
【００２２】
リンカーは、配列番号３で示すアミノ酸配列を有するのが好ましい。融合タンパク質は、配列番号４で示すアミノ酸配列を有するのが最も好ましい。
【００２３】
融合タンパク質の一部としてのＩｇＧ２のＦｃ部分は、ヒト由来である。
【００２４】
ＩｇＧは、ＩｇＧのＦｃ部分またはＦｃの断片もしくは誘導体を含む。
【００２５】
また、本発明は上記の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を提供する。
【００２６】
また、本発明はポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。
【００２７】
また、本発明は上に記載するベクターによってトランスフェクトされた宿主細胞を提供し、記載する宿主細胞は、ＣＨＯ細胞であってもＮＳ０細胞であってもよい。
【００２８】
本発明によって提供する宿主細胞によれば、宿主細胞は、上に記載するベクターが受容細胞をトランスフェクトすることによって生成する。
【００２９】
本発明によって提供する宿主細胞によれば、受容細胞はＣＨＯ細胞である。
【００３０】
本発明によって提供する宿主細胞によれば、受容細胞はＮＳ０細胞である。
【００３１】
また、本発明は、エキセンジン−４の融合タンパク質およびその類似体の調製方法を提供し、ポリヌクレオチドを転写して翻訳する工程と、プロテインＡ法を使用して精製する工程とを含む。
【００３２】
また、本発明は上に記載する融合タンパク質の調製方法を提供し、（１）上に示すポリヌクレオチド配列を転写して変換する工程と、（２）プロテインＡ法を用いて上に示すポリヌクレオチド配列の翻訳生成物を精製する工程とを含む。
【００３３】
本発明における融合タンパク質が宿主細胞に発現した後にいくつかのタンパク質精製方法を使用してもよく、さらにこれらの精製方法は当該技術分野では周知のことであり、精製方法の選択は生成方法および生成する特定のタンパク質に依存する。例えば、Ｆｃ部分を含む融合タンパク質を効率的に精製するために、プロテインＡアフィニティーマトリックスまたはプロテインＧアフィニティーマトリックスを使用してもよい。アフィニティーマトリックスから融合タンパク質を溶出させるのに低ｐＨ緩衝液または高ｐＨ緩衝液を使用することが可能である。
【００３４】
本発明におけるエキセンジン−４の融合タンパク質を特徴付ける方法には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット、等電点電気泳動、ゲル浸透クロマトグラフィ、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣ−ＭＳ）が挙げられる。
【００３５】
また、本発明は医薬組成物を提供し、エキセンジン−４の融合タンパク質およびその類似体ならびに薬理学的に許容できる賦型剤を含む。記載する医薬組成物は、上に記載する融合タンパク質と薬理学的に許容できる賦型剤とを含む。
【００３６】
本出願で使用される「薬理学的に許容できる」という用語は、動物およびヒトに適切に投与した際に望ましくないアレルギーも他の有害事象も引き起こさない分子およびその組成物と定義する。本出願で使用される「賦型剤」は、本発明における融合タンパク質に適合する必要があり、すなわち通常、融合タンパク質に混合しても医薬組成物の効果を大幅に低下しない。
【００３７】
本発明における融合タンパク質は、１または複数の賦型剤とともに製剤化することが可能である。本発明における融合タンパク質は、溶液製剤に、あるいは適切な希釈剤によって再構成できる注射可能な凍結乾燥粉末製剤に製剤化することが可能である。
【００３８】
本発明における活性融合タンパク質は、医薬用緩衝液と混合してｐＨを調整し、非経口投薬に適した許容可能な安定性およびｐＨを得ることが可能である。１または複数の医薬用抗生物質製剤を添加することが可能である。１または複数の医薬用の食塩水を添加してイオン強度またはイオン張力を調整することが可能である。グリセリンなどの１または複数の賦型剤を添加してさらに等張性を調整することが可能である。
【００３９】
製剤の賦型剤に関して、増量剤には、乳糖、グルコースおよびスクロースなどの糖類と、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなどのデンプンと、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよびメチルセルロースなどのセルロースおよびその誘導体と、トラガント粉と、麦芽と、ゼラチンと、タルクと、ステアリン酸およびステアリン酸マグネシウムなどの固体潤滑剤と、硫酸カルシウムと、落花生油、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油などの植物油と、プロピレングリコール、グリセロール、ソルビトールアルコール、マンノースアルコール、ポリエチレングリコールなどのポリオールと、アルギン酸と、Ｔｗｅｅｎなどの乳化剤と、ラウリル硫酸ナトリウムなどの湿潤剤と、着色剤と、香味剤と、安定剤と、酸化防止剤と、防腐剤と、発熱物質非含有水と、等張塩溶液と、リン酸緩衝液などがありうる。
【００４０】
本発明における融合タンパク質の医薬塩形態は、本発明の範囲内である。酸付加塩の調製によく使用される酸は、塩酸、臭化水素酸、ヨウ素酸水素、硫酸、リン酸などの無機酸と、ｐ‐トルエンスルホン酸、シュウ酸、クエン酸、コハク酸、酢酸などの有機酸などである。
【００４１】
アルカリ付加塩には、アンモニウム、水酸化アルカリ金属または水酸化アルカリ土類金属などの無機塩から得られる塩が挙げられる。また、本発明における食塩水の調製に使用されるアルカリには、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、炭酸カリウムなどが挙げられる。
【００４２】
また、本発明は、医薬組成物の投与経路を提供し、局所投与、エアロゾルまたは注射として投与可能であり、注射は、腹腔注射、皮下注射、筋肉注射および静脈注射で投与してもよい。
【００４３】
医薬組成物は、局所投与、エアロゾルまたは注射として投与される。注射は、腹腔注射、皮下注射、筋肉注射および静脈注射で投与される。
【００４４】
この融合タンパク質の効果的な血糖降下剤の用量は、多くの因子に依存する。因子には、被検者の性別、体重、年齢、投与経路およびバイオアベイラビリティが含まれるが、これらに限定されない。
【００４５】
また、本発明は、糖尿病および肥満症に対する薬剤の製造における記載する融合タンパク質の使用を提供する。
【００４６】
本発明における融合タンパク質には生物学的活性がある。生物学的活性は、この融合タンパク質がＧＬＰ−１受容体を結合して活性化し、応答を引き起こすｉｎ  ｖｉｖｏ能と定義する。この応答には、インスリンの分泌、膵グルカゴンの抑制、食欲の抑制、体重の減少、満腹感の誘発、膵β細胞のアポトーシスの抑制、膵β細胞の増殖および再生の誘発が含まれるが、これらに限定されない。実施例４（１）では、融合タンパク質がヒトＧＬＰ１受容体と相互作用して活性化し、小島細胞がインスリンを分泌する誘発能に関するｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験を設けている。実施例４（２）では、糖尿病およびインスリン抵抗性モデルの肥満ｏｂ／ｏｂマウスのｉｎ  ｖｉｖｏでの血糖降下作用に関するデータが得られる。
【００４７】
本発明におけるエキセンジン−４およびその類似体の融合タンパク質は、有意な抗糖尿作用を示し、膵島β細胞の再生および修復を促進することによって、膵島β細胞量を増大させ、インスリンの分泌を刺激し、インスリンに対する身体の感受性を増大させ、これにより、２型糖尿病患者さらには１型糖尿病患者の血糖値を効果的に抑制し、長期治療効果をもたらす。本発明における融合タンパク質は、「ＧＬＰ−１」受容体に作用することによって生物学的活性に影響を及ぼし、糖尿病および肥満症の治療に使用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】ｐＨＴ１１２−ＳＰ−ＩｇＧＨ／エキセンジン−４／ＩｇＧ２−Ｆｃベクターの酵素消化産物のゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図２】エキセンジン−４の融合タンパク質の免疫学的同定パターンを示す図である。
【図３】エキセンジン−４の融合タンパク質の等電点電気泳動パターンを示す図である。
【図４】エキセンジン−４の融合タンパク質のゲルクロマトグラフィーパターンを示す図である。
【図５】エキセンジン−４の融合タンパク質で治療した後のＣＨＯ−ｈＧＬＰ１Ｒ細胞のｃＡＭＰ濃度の変化の結果を示す図である。
【図６】肥満糖尿病モデルのＫＫ−Ａｙマウスにエキセンジン−４の融合タンパク質を単回注射した際の血糖降下作用を示す図である。
【図７】肥満糖尿病モデルのＫＫ−Ａｙマウスにエキセンジン−４の融合タンパク質を投与した際の経口ブドウ糖負荷試験の結果を示す図である。
【図８】エキセンジン−エキセンジン−４の融合タンパク質の長期投与が肥満糖尿病モデルのＫＫ−Ａｙマウスの血糖値に及ぼす影響を示す図である。
【図９】エキセンジン−４の融合タンパク質の長期投与がマウスの摂餌量に及ぼす影響を示す図である。
【図１０】エキセンジン−４の融合タンパク質の長期投与がマウスの体重に及ぼす影響を示す図である。
【図１１】エキセンジン−４の融合タンパク質の長期投与治療後２４時間以内の経口ブドウ糖負荷試験の結果を示す図である。
【図１２】エキセンジン−４の融合タンパク質の長期投与治療後４８時間以内の経口ブドウ糖負荷試験の結果を示す図である。
【図１３】エキセンジン−４の融合タンパク質が肥満糖尿病モデルのｄｂ／ｄｂマウスの血糖値に及ぼす影響を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
本発明の実施形態を以下の実施例に記載する。ただし、他の変形例が、直接開示する内容および本願特許請求の範囲に基づいて当業者にとって周知であるか、あるいは明らかであることから、実施形態はこれらの実施例の特定の詳細に限定されないことに留意する必要がある。したがって、本発明の上記の内容に従って開発されるあらゆる技術は、本発明の範囲内である。本願明細書に引用する文献は、その全体が本願明細書の一部をなす。
【００５０】
特に明記しない限り、以下の実施例に記載する実験方法は、すべてよく知られた技術であり、記載する試薬および生物製剤はすべて市販されている。
【実施例１】
【００５１】
発現遺伝子の合成とエキセンジン−４の融合タンパク質のベクター構築
【００５２】
エキセンジン−４の融合タンパク質のＤＮＡ構築は、リガーゼ連鎖反応を利用して遺伝子合成することによって達成され、そのタンパク質配列は以下の通りである。
【００５３】
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ＊［配列番号４］
【００５４】
配列番号４で示すアミノ酸配列では、ペプチドホルモンは１〜３９アミノ酸、すなわちエキセンジン−４であり、配列番号１で示す配列を有する。リンカーは４０〜４８アミノ酸であり、配列番号３で示す配列を有する（ＸａａはＡｌａである）。輸送タンパク質は４９〜２７１アミノ酸、すなわちＩｇＧ２のＦｃ部分である。
【００５５】
最初に、この融合タンパク質のために、エキセンジン−４とヒトＩｇＧ２−Ｆｃの融合タンパク質とをコードするベクターを構築する。ＩｇＧ２−Ｆｃドメインは、ＩｇＧ２の重鎖定常領域のＣＨ２部分およびＣＨ３部分からなる。ＩｇＧの主なペプチド配列ＳＰ−ＩｇＧＨをエキセンジン−４と融合し、分泌によって培地に合成した融合タンパク質を添加する。ＳＰ−ＩｇＧＨ／エキセンジン−４／ＩｇＧ２融合タンパク質をコードするｃＤＮＡ（リンカーのアミノ酸配列はエキセンジン−４とＩｇＧ２との間に存在する）をＰＣＲおよびＤＮＡ自動合成機で合成し、ｐＨＴ１１２ベクター（Ｙｉｈｕ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ社から購入）のＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位とＮｏｔ  Ｉ部位との間に挿入して、ｐＨＴ１１２−ＳＰ−ＩｇＧＨ／エキセンジン−４／ＩｇＧ２−Ｆベクターを構築する。分泌能を有するエキセンジン−４／ＩｇＧ２−ＦｃはＩｇＧ２の重鎖定常領域（ＣＨ２およびＣＨ３）を含む。ＳＰ−ＩｇＧＨの分泌を指示するペプチド配列は、エキセンジン−４配列を融合し、合成したタンパク質を細胞栄養液に分泌するのを誘発する。図１は、１対のエンドヌクレアーゼＨｉｎｄ  ＩＩＩおよびＮｏｔ  Ｉによって消化された後のアガロースゲル電気泳動に反映されたｐＨＴ１１２−ＳＰ−ＩｇＧＨ／エキセンジン−４／ＩｇＧ２−Ｆｃベクターの結果を示す。エンドヌクレアーゼ、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩおよびＮｏｔ  Ｉは、ＳＰ−ＩｇＧＨ／Ｅｘｅｎｄｉｎ−４／ＩｇＧ２−Ｆｃを含み、挿入したＤＮＡ８８０の塩基対を除去する。
【実施例２】
【００５６】
エキセンジン−４の融合タンパク質に生成するために遺伝子操作した細胞株の構築、発現および精製
【００５７】
１．エキセンジン−４の融合タンパク質を生成するために遺伝子操作した細胞株の構築
牛胎児血清（ＦＣＳ）を添加したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）全培養液１０％（体積百分率）でチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）を培養し、トランスフェクション前に、１ウェル当り３×１０5個の細胞で６ウェルプレートに均等に分散させる。トランスフェクションに関しては、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ  ２０００の取扱指示を参照する。トランスフェクション４８時間後、細胞を選択的基質（メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）２５μｍ）で約１週間加圧培養すると、空細胞はすべて壊死する。生存細胞を９６ウェルプレート（５０細胞／ウェル）に播種してさらに加圧培養する。細胞をクローン化後に、培養上清中のタンパク質発現量を定量するＥＬＩＳＡ試験を行い、高発現（発現量が２００ｍｇ／Ｌ超）のウェルを選別し、増幅培養のために２４ウェルプレートに移す。再度ＥＬＩＳＡを実施して上澄中のタンパク質発現量を定量し、参照文献（Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｅｓｓ、２００３）に従って、高発現（発現量が２００ｍｇ／Ｌ超）の細胞株を選別して増幅培養を継続する。懸濁培養液を徐々に熟成することによって、シードセルバンクを作製し、サブクローン化を実施してワーキングセルバンク（遺伝子操作したＣＨＯ細胞株からなる）を作製する。
【００５８】
２．エキセンジン−４の融合タンパク質の精製
上記で得た遺伝子操作したＣＨＯ細胞株を解凍して、容量が２５ｃｍ2のＴ型培養瓶に５ｍＬの細胞懸濁液で播種し、４〜５日間培養液を振とうさせた後、内容物を三角フラスコに入れて増幅し、７〜１０日間さらに培養する。参照文献（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｅｓｓ、２００２）に記載の手順に従って、融合タンパク質を含む細胞培養液を分離し、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィー培地（ＭａｂＳｕＲｅ（商標）、ＧＥ社）、アニオンクロマトグラフィー培地（Ｑ  Ｓｅｐｈｅｒｏｓｅ  ＦＦ、ＧＥ社）、カチオンクロマトグラフィー培地（ＳＰ  Ｓｅｐｈｅｒｏｓｅ  ＦＦ、ＧＥ社）によって連続精製する。その後、精製した融合タンパク質をＧ−２５ゲル濾過カラムによって製剤緩衝液に置換して得る。
【実施例３】
【００５９】
エキセンジン−４の融合タンパク質の構造分析
【００６０】
１．ウェスタンブロット分析
精製した融合タンパク質を非還元条件下で電気泳動すると、転送装置（ＧＥ社）（電流：２５ｍＡ、時間：２時間）によって、電気泳動バンドが、メタノールで活性したＰＶＤＦ膜に転写される。ＰＶＤＦ膜を脱脂乳５ｗｔ％に入れて２時間密閉し、予め希釈したアルカリホスファターゼの添加によって標識した抗ＩｇＧ２抗体を１時間培養し、ＴＢＳＴで洗浄する。洗浄時では、ＴＢＳＴを５分に１回新しいものに交換する必要がある。洗浄が終了した後に、ルミネセンス測定法用の基質ＣＤＰ−ｓｔａｒ（登録商標）を添加し、フィルムを押圧し、露出させて撮像する。結果を図２に示す。融合タンパク質はＩｇＧ２抗体に対して陽性を示す。
【００６１】
２．等電点電気泳動分析
精製した融合タンパク質は、高速電気泳動システム（Ｐｈａｓｔ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＧＥ）を用い、等電点電気泳動によって分析する。分析には、ｐＨ３〜１０に予め調製したゲルを使用した。焦点電気泳動を実施する場合は、予め調製したゲルをクマシー溶液で染色する。結果を図３に示す。融合タンパク質のメインバンドの等電点は５．８であり、期待値６．２に近い。
【００６２】
３．ゲルクロマトグラフィー精製分析
精製した融合タンパク質は、参照文献（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｅｓｓ、２００２）に記載の手順に従って、ゲルクロマトグラフィー（クロマトグラフ用カラムＴＳＫ３０００ｓｗ）により、負荷量１０μｇで分析する。結果を図４に示す。融合タンパク質は、ゲルクロマトグラフィーで単一の対称ピークを示し、保持時間は８．５分である。
【実施例４】
【００６３】
エキセンジン−４の融合タンパク質の生物学的活性
【００６４】
１．エキセンジン−４の融合タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性：
Ａ．ヒトＧＬＰ１受容体発現ＣＨＯ細胞におけるエキセンジン−４の融合タンパク質のｃＡＭＰ分泌試験
ＧＬＰ−１受容体発現ＣＨＯ−ｈＧＬＰ１Ｒ細胞を用いて、融合タンパク質の生物学的活性を（国際公開第２００７／０１７８９２号パンフレットに記載されるように）細胞レベルで試験し、下流効果のある産物（セカンドメッセンジャーｃＡＭＰ）のモル濃度と、本発明のＬＡＸ０９（すなわち、上に記載するようにして得られ、配列番号４で示すエキセンジン−４の融合タンパク質であり、以下同じである）のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの性能とを定量する。ＤＭＥＭ基質１０体積％を含有するＦＢＳを黒色透明の９６ウェルプレートに添加し、薬剤濃度が０．０１〜１０００ｎＭのエキセンジン−４およびＬＡＸ０９をそれぞれ基質に添加する。３０分培養すると細胞は崩壊することから、市販キット（Ｃｉｓｂｉｏ）によって細胞内のｃＡＭＰ濃度を測定する。結果を表１に示す。
【００６５】
【表１】
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【００６６】
ＬＡＸ９０のＥＣ５０は約４．５ｎＭであり、エキセンジン−４のＥＣ５０は約２．５ｎＭであり、この２つは近似している。したがって、本発明におけるＬＡＸ０９は、エキセンジン−４と同じような活性度のＧＬＰ１受容体を産生することができた。図５に示す。
【００６７】
Ｂ．ＬＡＸ０９とヒトＧＬＰ−１Ｒを発現する遺伝子操作したＣＨＯ細胞株との結合試験
ＬＡＸ０９とヒトＧＬＰ−１受容体の持続発現が可能な遺伝子操作したＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ−ｈＧＬＰ１Ｒ、以下同じ）との結合活性を試験し、本発明のＬＡＸ０９の精製試料の生物学的活性を定量する。
【００６８】
ＣＨＯ−ｈＧＬＰ１Ｒ細胞株結合試験：ヒトＧＬＰ−１Ｒを安定発現する遺伝子操作したＣＨＯ株を単個細胞浮遊液にし、細胞密度をＰＢＳで１０，０００，０００細胞／ｍＬに調整する。ＬＡＸ０９試料はさまざまな濃度勾配に希釈される。各バイラルでは、細胞懸濁液２０μＬをさまざまな濃度の試料２０μＬとそれぞれ混合し、４℃で３０分間培養した。ＰＢＳ洗浄後に、フルオレセインＦＩＴＣで標識したヒト免疫グロブリンγ鎖抗体を添加し、４℃で３０分間培養する。ＰＢＳ洗浄後に、１％パラホルムアルデヒドＰＢＳ溶液を添加し、十分に混合し、試料を添加し、フローサイトメトリーで選択領域内の各濃度の試料の平均蛍光強度を読み取る。結果を表２に示す。
【００６９】
【表２】
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【００７０】
２．エキセンジン−４の融合タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ活性：
Ａ．肥満糖尿病モデルのＫＫ−Ａｙマウス単回注射による低血糖試験
糖尿病モデルのＫＫ−Ａｙマウス（Ｂｅｉｊｉｎｇ  ＨＦＫ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社（北京）から購入、以下同じ）を無作為化により、ＰＢＳ対照群１群とさまざまな勾配のエキセンジン−４の融合タンパク質（ＬＡＸ０９）実験群３群とを含む４群に割り付ける。２時間絶食させた後に、尾静脈から薬剤を２００μｌ／動物の用量で注射する。その後、０分、３０分、６０分、１２０分、１８０分および２４０分後のマウスの血糖値を測定する。結果を図６に示す。ＬＡＸ０９は、１ｍｇ／ｋｇで血糖降下作用が最良となり、マウスの血糖値が１０ｍｍｏｌ／Ｌ未満に抑制されている。
【００７１】
経口ブドウ糖負荷試験：糖尿病モデルのＫＫ−Ａｙマウスを無作為化により、ＰＢＳ対照群１群とさまざまな勾配のエキセンジン−４の融合タンパク質（ＬＡＸ０９）実験群３群とを含む４群に割り付ける。１６時間絶食させた後に、薬剤を２００μｌ／動物の用量で皮下注射する。６時間後に、体重（１ｍｇ／ｇ）に応じて胃管からグルコースを与える。その後、０分、３０分、６０分、１２０分、１８０分および２４０分後のマウスの血糖値を測定する。結果を図７に示す。１ｍｇ／ｋｇ群および０．１ｍｇ／ｋｇ群のマウスは、正常な血糖値を維持する良好な能力が同じようにある。
【００７２】
長期投与実験：糖尿病モデルのＫＫ−Ａｙマウスを無作為化により、ＰＢＳ対照群とエキセンジン−４の融合タンパク質（ＬＡＸ０９）１ｍｇ／Ｋｇの実験群とを含む２群に割り付ける。薬剤を週に２回与える。マウスを毎週水曜日に６時間絶食させ、空腹時血糖値を検査し、摂餌量と体重の変化とを記録する。結果を図８に示す。実験群のマウスの空腹時血糖値はＰＢＳ群と有意差がある。摂餌量は、図９に示すように低下する。体重は、図１０に示すように大幅に減少する。投薬２４時間後の経口ブドウ糖負荷試験の結果は、図１１に示す通りである。投薬４８時間後の経口ブドウ糖負荷試験の結果は、図１２に示す通りである。これらすべての結果は、エキセンジン−４の融合タンパク質の有意な効果を示している。
【００７３】
Ｂ．肥満糖尿病モデルのｄｂ−ｄｂマウス単回注射による低血糖試験
５〜６週齢の糖尿病モデルのｄｂ−ｄｂマウスを無作為化により、ＰＢＳ対照群１群とさまざまな勾配のエキセンジン−４の融合タンパク質（ＬＡＸ０９）実験群３群とを含む４群に割り付ける。２時間絶食させた後に、尾静脈から薬剤を２００μｌ／動物の用量で注射する。その後、０分、３０分、６０分、１２０分、１８０分および２４０分後のマウスの血糖値を測定する。結果を図１３に示す。１ｍｇ／ｋｇ群および０．１ｍｇ／ｋｇ群は、血糖降下作用が最良である。
【実施例５】
【００７４】
実施例１〜４で用いたサンプル手順に従って、表３の融合タンパク質を調製し、ｉｎ  ｖｉｖｏ活性およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を判断する。
【００７５】
【表３】
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【００７６】
＊相対生物学的活性は、肥満糖尿病モデルのＫＫ−Ａｙマウスのうち長期投与実験（糖尿病モデルのＫＫ−Ａｙマウス）で測定した融合タンパク質の空腹時血糖値減少量（空白対照群と比較）と実施例２で精製して得られた融合タンパク質の換算値との間の相対比と定義する。
【００７７】
具体的には、以下のプロトコールに従って長期投与を行う。糖尿病モデルのＫＫ−Ａｙマウスを無作為化により、空白対照群（ＰＢＳのみ注射）と実験群（表３の融合タンパク質１ｍｇ／ｋｇを注射）に割り付ける。薬剤を週に２回投与する。２週間後に、マウスを６時間絶食させてから空腹時血糖値を測定する。実験群の血糖減少量は、空白対照群の空腹時血糖値から実験群の空腹時血糖値を差し引くことによって算出する。
【００７８】
表中、配列番号６は、配列番号１と２箇所のアミノ酸部位で異なり、式Ｉの配列を有する。配列番号８は、配列番号１と３箇所のアミノ酸部位で異なり、式Ｉの配列を有する。配列番号１０は、配列番号１と４箇所のアミノ酸部位で異なり、式Ｉの配列を有する。配列番号１２は、配列番号１と６箇所のアミノ酸部位で異なり、式Ｉの配列を有する。配列番号１４はＧＬＰ−１Ａ８Ｇのアミノ酸配列である。配列番号１６は、配列番号２と３箇所のアミノ酸部位で異なる。配列番号１８は、配列番号２と３箇所のアミノ酸部位で異なる。配列番号２０は、配列番号２と２箇所のアミノ酸部位で異なる。
【００７９】
上に示す結果は、本発明で提供する融合タンパク質が血糖値を減少させる効果があることを示す。ペプチドホルモンが配列番号１で示すアミノ酸配列であり、輸送タンパク質がＩｇＧ２−Ｆｃである場合、薬剤のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を大幅に延長させ、インスリンに対する身体の感受性を増大させると同時にエキセンジン−４の血糖降下作用を維持することが可能である。しかし、輸送タンパク質がＩｇＧ４−Ｆｃである場合は、融合タンパク質の相対生物学的活性は低い。
【図５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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