(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘモグロビン含有試料に、カチオン性界面活性剤存在下に、タンパク質分解酵素を作用させた後、フルクトシルペプチド酸化酵素を作用させる反応において、当該反応を下記式（Ｉ）で表されるイソチアゾリノン誘導体存在下に行い、生成した過酸化水素を測定することを特徴とする、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法。
【化１】
0005871800.tif 000014
（式中、Ａ１は、水素原子、又は、炭素数１〜８のアルキルを表し、Ａ１が水素原子の場合には、Ａ２とＡ３は、一緒になってベンゼン環を形成し、Ａ１が炭素数１〜８のアルキルの場合には、Ａ２とＡ３は、同一又は異なって、水素原子又はハロゲン原子を表す。）
【請求項２】
式（Ｉ）で表わされるイソチアゾリノン誘導体が、２−アルキル−４−イソチアゾリン−３−オン（ここで、アルキルは炭素数１〜８のアルキルを表す）、１，２−ベンゾイソチアゾール−３（２Ｈ）−オン、及び、２−アルキル−４，５−ジハロゲノ−４−イソチアゾリン−３−オン（ここで、アルキルは炭素数１〜８のアルキルを表す）からなる群より選ばれるイソチアゾリノン誘導体である請求項１記載の測定方法。
【請求項３】
過酸化水素の測定が、過酸化水素測定試薬により行われる、請求項１又は２記載の測定方法。
【請求項４】
過酸化水素測定試薬が、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬である請求項３記載の測定方法。
【請求項５】
ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを測定するための試薬であって、タンパク質分解酵素、フルクトシルペプチド酸化酵素、下記式（Ｉ）で表されるイソチアゾリノン誘導体、及び、カチオン性界面活性剤を含むことを特徴とする糖化ヘモグロビン測定試薬。
【化２】
0005871800.tif 000015
（式中、Ａ１は、水素原子、又は、炭素数１〜８のアルキルを表し、Ａ１が水素原子の場合には、Ａ２とＡ３は、一緒になってベンゼン環を形成し、Ａ１が炭素数１〜８のアルキルの場合には、Ａ２とＡ３は、同一又は異なって、水素原子又はハロゲン原子を表す。）
【請求項６】
式（Ｉ）で表わされるイソチアゾリノン誘導体が、２−アルキル−４−イソチアゾリン−３−オン（ここで、アルキルは炭素数１〜８のアルキルを表す）、１，２−ベンゾイソチアゾール−３（２Ｈ）−オン、及び、２−アルキル−４，５−ジハロゲノ−４−イソチアゾリン−３−オン（ここで、アルキルは炭素数１〜８のアルキルを表す）からなる群より選ばれるイソチアゾリノン誘導体である請求項５記載の測定試薬。
【請求項７】
さらに、過酸化水素測定試薬を含む、請求項５又は６記載の測定試薬。
【請求項８】
過酸化水素測定試薬が、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬である請求項７記載の試薬。
【請求項９】
ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを測定するためのキットであって、タンパク質分解酵素、下記式（Ｉ）で表されるイソチアゾリノン誘導体、及び、カチオン性界面活性剤を含む第１試薬と、フルクトシルペプチド酸化酵素を含む第２試薬とを含むことを特徴とする糖化ヘモグロビン測定キット。
【化３】
0005871800.tif 000016
（式中、Ａ１は、水素原子、又は、炭素数１〜８のアルキルを表し、Ａ１が水素原子の場合には、Ａ２とＡ３は、一緒になってベンゼン環を形成し、Ａ１が炭素数１〜８のアルキルの場合には、Ａ２とＡ３は、同一又は異なって、水素原子又はハロゲン原子を表す。）
【請求項１０】
ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを測定するためのキットであって、タンパク質分解酵素、及び、カチオン性界面活性剤を含む第１試薬と、フルクトシルペプチド酸化酵素、及び、下記式（Ｉ）で表されるイソチアゾリノン誘導体を含む第２試薬とを含むことを特徴とする糖化ヘモグロビン測定キット。
【化４】
0005871800.tif 000017
（式中、Ａ１は、水素原子、又は、炭素数１〜８のアルキルを表し、Ａ１が水素原子の場合には、Ａ２とＡ３は、一緒になってベンゼン環を形成し、Ａ１が炭素数１〜８のアルキルの場合には、Ａ２とＡ３は、同一又は異なって、水素原子又はハロゲン原子を表す。）
【請求項１１】
式（Ｉ）で表わされるイソチアゾリノン誘導体が、２−アルキル−４−イソチアゾリン−３−オン（ここで、アルキルは炭素数１〜８のアルキルを表す）、１，２−ベンゾイソチアゾール−３（２Ｈ）−オン、及び、２−アルキル−４，５−ジハロゲノ−４−イソチアゾリン−３−オン（ここで、アルキルは炭素数１〜８のアルキルを表す）からなる群より選ばれるイソチアゾリノン誘導体である請求項９又は１０記載の測定キット。
【請求項１２】
さらに、ペルオキシダーゼ及びロイコ型色原体が、それぞれ第１試薬と第２試薬、又は、第２試薬と第１試薬に含まれる、請求項９〜１１のいずれかに記載の測定キット。
【請求項１３】
ヘモグロビン含有試料に、カチオン性界面活性剤存在下に、タンパク質分解酵素を作用させた後、フルク卜シルペプチド酸化酵素を作用させる反応を、下記式（Ｉ）で表されるイソチアゾリノン誘導体の存在下に行うことを特徴とする、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定におけるヘモグロビンの影響抑制方法。
【化５】
0005871800.tif 000018
（式中、Ａ１は、水素原子、又は、炭素数１〜８のアルキルを表し、Ａ１が水素原子の場合には、Ａ２とＡ３は、一緒になってベンゼン環を形成し、Ａ１が炭素数１〜８のアルキルの場合には、Ａ２とＡ３は、同一又は異なって、水素原子又はハロゲン原子を表す。）
【請求項１４】
式（Ｉ）で表わされるイソチアゾリノン誘導体が、２−アルキル−４−イソチアゾリン−３−オン（ここで、アルキルは炭素数１〜８のアルキルを表す）、１，２−ベンゾイソチアゾール−３（２Ｈ）−オン、及び、２−アルキル−４，５−ジハロゲノ−４−イソチアゾリン−３−オン（ここで、アルキルは炭素数１〜８のアルキルを表す）からなる群より選ばれるイソチアゾリノン誘導体である請求項１３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖化ヘモグロビンの測定方法、測定試薬、及び、測定キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
糖化ヘモグロビンは、ヘモグロビンにグルコースが結合した糖化物である。ヘモグロビンはα鎖、β鎖からなる四量体の構造を取っているが、β鎖のＮ末端が糖化したものはヘモグロビンＡ１ｃと呼ばれ、血糖値が高い程、増加することから、糖尿病マーカーとして、臨床検査において測定されている。【０００３】
糖化ヘモグロビンの測定方法としては、ＨＰＬＣ法等のクロマトグラフィ法、電気泳動法、ラテックス免疫凝集法など抗体を利用する免疫測定法、糖化タンパク質に作用する酵素と、糖化ペプチド及び／又は糖化アミノ酸に作用する酵素とを用いる酵素測定法等が知られている。【０００４】
糖化ヘモグロビンの酵素測定法としては、先ず、ヘモグロビン含有試料中のヘモグロビンを変性剤により変性させ、変性したヘモグロビンにタンパク質分解酵素を作用させ、次いで生成した糖化ペプチドに糖化ペプチド酸化酵素を作用させ、生成した過酸化水素をペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下に、酸化発色型色原体と反応させて色素に導き、生成した色素の吸光度から糖化ヘモグロビンを測定する方法（吸光度法）等が知られている。【０００５】
しかしながら、この吸光度法による糖化ヘモグロビンの測定においては、試料中に大量に存在するヘモグロビンの干渉が問題となる。この課題に対する解決手段としては、例えば、カチオン性界面活性剤及び／又は両性界面活性剤を用いる方法（特許文献１）、スルホン化合物及び／又はニトロ化合物を用いる方法（特許文献２、特許文献３）、テトラゾリウム化合物を用いる方法（特許文献４）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩類等の特定の陰イオン系界面活性剤を用いる方法（特許文献５）等が知られている。【０００６】
しかしながら、これらの方法においても、必ずしもヘモグロビンの影響が回避される訳ではなく、ヘモグロビンの影響を受けない、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの正確な測定方法が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平３−０１０６９６号公報
【特許文献２】ＷＯ２００３／１０７０１１パンフレット
【特許文献３】特開２００７−１４７６３０号公報
【特許文献４】特開２０００−２１０１００号公報
【特許文献５】ＷＯ２００５／０４９８５８パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを、ヘモグロビンの影響を受けることなく、正確、かつ、高感度に測定するための方法及び試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは鋭意検討したところ、界面活性剤存在下に、ヘモグロビン含有試料にタンパク質分解酵素を作用させた後、フルクトシルペプチド酸化酵素を作用させる反応において、当該反応をイソチアゾリノン誘導体存在下に行い、生成した過酸化水素を測定することにより、ヘモグロビンの影響を受けることなく、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを正確、かつ、高感度に測定できる、という知見を見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、以下の［１］〜［１５］に関する。【００１０】
［１］  ヘモグロビン含有試料に、界面活性剤存在下に、タンパク質分解酵素を作用させた後、フルクトシルペプチド酸化酵素を作用させる反応において、当該反応をイソチアゾリノン誘導体存在下に行い、生成した過酸化水素を測定することを特徴とする、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法。
［２］  イソチアゾリノン誘導体が、下記式（Ｉ）で表わされる化合物である［１］記載の測定方法。【００１１】
【化１】
0005871800.tif 000002
【００１２】
式中、Ａ１は、水素原子、又は、置換若しくは非置換のアルキルを表し、Ａ２とＡ３は、同一又は異なって、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、ハロゲン原子を表すか、または、一緒になって環構造を形成する）
［３］  式（Ｉ）で表わされる化合物が、２−アルキル−４−イソチアゾリン−３−オン、１，２−ベンゾイソチアゾール−３（２Ｈ）−オン、及び、２−アルキル−４，５−ジハロゲノ−４−イソチアゾリン−３−オンからなる群より選ばれるイソチアゾリノン誘導体である［２］記載の測定方法。
［４］  過酸化水素の測定が、過酸化水素測定試薬により行われる、［１］〜［３］のいずれかに記載の測定方法。
［５］  過酸化水素測定試薬が、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬である［４］記載の測定方法。【００１３】
［６］  ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを測定するための試薬であって、タンパク質分解酵素、フルクトシルペプチド酸化酵素、イソチアゾリノン誘導体、及び、界面活性剤を含むことを特徴とする糖化ヘモグロビン測定試薬。
［７］  イソチアゾリノン誘導体が、下記式（Ｉ）で表わされる化合物である［６］記載の測定試薬。【００１４】
【化２】
0005871800.tif 000003
【００１５】
式中、Ａ１は、水素原子、又は、置換若しくは非置換のアルキルを表し、Ａ２とＡ３は、同一又は異なって、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、ハロゲン原子を表すか、または、一緒になって環構造を形成する）
［８］  式（Ｉ）で表わされる化合物が、２−アルキル−４−イソチアゾリン−３−オン、１，２−ベンゾイソチアゾール−３（２Ｈ）−オン、及び、２−アルキル−４，５−ジハロゲノ−４−イソチアゾリン−３−オンからなる群より選ばれるイソチアゾリノン誘導体である［７］記載の測定試薬。
［９］  さらに、過酸化水素測定試薬を含む、［６］〜［８］のいずれかに記載の測定試薬。
［１０］  過酸化水素測定試薬が、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬である［９］記載の試薬。【００１６】
［１１］  ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを測定するためのキットであって、タンパク質分解酵素、イソチアゾリノン誘導体、及び、界面活性剤を含む第１試薬と、フルクトシルペプチド酸化酵素を含む第２試薬とを含むことを特徴とする糖化ヘモグロビン測定キット。
［１２］  ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを測定するためのキットであって、タンパク質分解酵素、及び、界面活性剤を含む第１試薬と、フルクトシルペプチド酸化酵素、及び、イソチアゾリノン誘導体を含む第２試薬とを含むことを特徴とする糖化ヘモグロビン測定キット。
［１３］  イソチアゾリノン誘導体が、下記式（Ｉ）で表わされる化合物である［１１］又は［１２］記載の測定キット。【００１７】
【化３】
0005871800.tif 000004
【００１８】
（式中、Ａ１は、水素原子、又は、置換若しくは非置換のアルキルを表し、Ａ２とＡ３は、同一又は異なって、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、ハロゲン原子を表すか、または、一緒になって環構造を形成する）
［１４］  式（Ｉ）で表わされる化合物が、２−アルキル−４−イソチアゾリン−３−オン、１，２−ベンゾイソチアゾール−３（２Ｈ）−オン、及び、２−アルキル−４，５−ジハロゲノ−４−イソチアゾリン−３−オンからなる群より選ばれるイソチアゾリノン誘導体である［１３］記載の測定キット。
［１５］  さらに、ペルオキシダーゼ及びロイコ型色原体が、それぞれ第１試薬と第２試薬、又は、第２試薬と第１試薬に含まれる、［１１］〜［１４］のいずれかに記載の測定キット。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、ヘモグロビンの影響を受けることなく、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを正確、かつ、高感度に測定するための方法、試薬及びキットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】実施例１、実施例２、及び、比較例１のキットを用いる検体中のヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃとも記す）の測定における、ヘモグロビン濃度と反応吸光度との関係を示すグラフである。●は、比較例１のキット、△は、実施例１のキット、■は、実施例２のキットを用いた測定をそれぞれ表し、縦軸は反応吸光度（×１０−４Ａｂｓ）を、横軸はヘモグロビン濃度（ｍｇ／ｍＬ）を表す。
【図２】実施例９、実施例１０、及び、比較例５のキットを用いる検体中のＨｂＡ１ｃの測定における、ヘモグロビン濃度と反応吸光度との関係を示すグラフである。●は、比較例５のキット、▲は、実施例９のキット、□は、実施例１０のキットを用いた測定をそれぞれ表し、縦軸は反応吸光度（×１０−４Ａｂｓ）を、横軸はヘモグロビン濃度（ｍｇ／ｍＬ）を表す。
【図３】実施例７、実施例８、及び、比較例４のキットを用いる検体中のＨｂＡ１ｃの測定における、ヘモグロビン濃度と反応吸光度との関係を示すグラフである。●は、比較例４のキット、△は、実施例７のキット、■は、実施例８のキットを用いた測定をそれぞれ表し、縦軸は反応吸光度（×１０−４Ａｂｓ）を、横軸はヘモグロビン濃度（ｍｇ／ｍＬ）を表す。
【図４】実施例１５、実施例１６、及び、比較例８のキットを用いる検体中のＨｂＡ１ｃの測定における、ヘモグロビン濃度と反応吸光度との関係を示すグラフである。●は、比較例８のキット、▲は、実施例１５のキット、■は、実施例１６のキットを用いた測定をそれぞれ表し、縦軸は反応吸光度（×１０−４Ａｂｓ）を、横軸はヘモグロビン濃度（ｍｇ／ｍＬ）を表す。
【図５】実施例２１、実施例２２、及び、比較例１１のキットを用いる検体中のＨｂＡ１ｃの測定における、ヘモグロビン濃度と反応吸光度との関係を示すグラフである。●は、比較例１１のキット、■は、実施例２１のキット、▲は、実施例２２のキットを用いた測定をそれぞれ表し、縦軸は反応吸光度（×１０−４Ａｂｓ）を、横軸はヘモグロビン濃度（ｍｇ／ｍＬ）を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
（１）ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法
本発明の、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法は、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンに、界面活性剤存在下に、タンパク質分解酵素を作用させた後、フルクトシルペプチド酸化酵素を作用させる反応において、当該反応をイソチアゾリノン誘導体存在下に行い、生成する過酸化水素を測定する方法である。イソチアゾリノン誘導体は、フルクトシルペプチド酸化酵素を作用させる反応に存在させても、タンパク質分解酵素を作用させる反応とフルクトシルペプチド酸化酵素を作用させる反応の両方の反応に存在させてもよい。
具体的には、以下の工程を含む測定方法が例示される。
【００２２】
＜測定方法１＞
（１）ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンに、界面活性剤存在下に、タンパク質分解酵素を作用させる工程；
（２）工程（１）で得られる反応生成物に、イソチアゾリノン誘導体存在下に、フルクトシルペプチド酸化酵素を作用させ、過酸化水素を生成させる工程；
（３）工程（２）で生成した過酸化水素を測定する工程；及び、
（４）既知濃度の糖化ヘモグロビンを用いて予め作成した、過酸化水素量と糖化ヘモグロビン濃度との関係を表す検量線に基づき、工程（３）で測定した過酸化水素量から、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン濃度を決定する工程。
【００２３】
＜測定方法２＞
（１）ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンに、イソチアゾリノン誘導体及び界面活性剤の存在下に、タンパク質分解酵素を作用させる工程；
（２）工程（１）で得られる反応生成物に、フルクトシルペプチド酸化酵素と反応させ、過酸化水素を生成させる工程；
（３）工程（２）で生成した過酸化水素を測定する工程；及び、
（４）既知濃度の糖化ヘモグロビンを用いて予め作成した、過酸化水素量と糖化ヘモグロビン濃度との関係を表す検量線に基づき、工程（３）で測定した過酸化水素量から、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン濃度を決定する工程。
【００２４】
また、本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法は、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン量の総ヘモグロビン（すなわち、ヘモグロビンと糖化ヘモグロビンを合わせた総ヘモグロビン）量に対する割合を算出する方法をも包含する。この場合、本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法は、具体的には、以下の工程を含む測定方法である。
【００２５】
＜測定方法３＞
（１）ヘモグロビン含有試料中の総ヘモグロビン（すなわち、ヘモグロビンと糖化ヘモグロビンを合わせた総ヘモグロビン）量を決定する工程；
（２）ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンに、界面活性剤存在下、タンパク質分解酵素を作用させる工程；
（３）工程（２）で得られる反応生成物に、イソチアゾリノン誘導体存在下に、フルクトシルペプチド酸化酵素を作用させ、過酸化水素を生成させる工程；
（４）工程（３）で生成した過酸化水素を測定する工程；及び、
（５）既知量の糖化ヘモグロビンを用いて予め作成した、過酸化水素量と糖化ヘモグロビン量との関係を表す検量線に基づき、工程（４）で測定した過酸化水素量から、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン量を決定する工程；及び、
（６）工程（１）で決定した総ヘモグロビン量と、工程（５）で決定した糖化ヘモグロビン量から、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン量の総ヘモグロビン量に対する割合を算出する工程。
上記工程（１）の総ヘモグロビン量の決定は、工程（２）の後に行うこともできる。
【００２６】
＜測定方法４＞
（１）ヘモグロビン含有試料中の総ヘモグロビン（すなわち、ヘモグロビンと糖化ヘモグロビンを合わせた総ヘモグロビン）量を決定する工程；
（２）ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンに、イソチアゾリノン誘導体と界面活性剤存在下、タンパク質分解酵素を作用させる工程；
（３）工程（２）で得られる反応生成物に、フルクトシルペプチド酸化酵素を作用させ、過酸化水素を生成させる工程；
（４）工程（３）で生成した過酸化水素を測定する工程；及び、
（５）既知量の糖化ヘモグロビンを用いて予め作成した、過酸化水素量と糖化ヘモグロビン量との関係を表す検量線に基づき、工程（４）で測定した過酸化水素量から、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン量を決定する工程；及び、
（６）工程（１）で決定した総ヘモグロビン量と、工程（５）で決定した糖化ヘモグロビン量から、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン量の総ヘモグロビン量に対する割合を算出する工程。
上記工程（１）の総ヘモグロビン量の決定は、工程（２）の後に行うこともできる。
【００２７】
本発明の測定方法におけるヘモグロビン含有試料は、ヘモグロビンを含有し、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法が適用可能な試料であれば特に制限はなく、例えば全血、血球、血球に血漿が混在した試料、これらの試料を溶血処理した試料等が挙げられる。溶血処理としては、全血、血球、血球に血漿が混在した試料を溶血させる処理であれば特に制限はなく、例えば物理的方法、化学的方法、生物学的方法等が挙げられる。物理的方法としては、例えば蒸留水等の低張液を用いる方法、超音波を用いる方法等が挙げられる。化学的方法としては、例えばメタノール、エタノール、アセトン等の有機溶媒を用いる方法、ポリオキシエチレン系界面活性剤を用いる方法等が挙げられる。生物学的方法としては、例えば抗体や補体を用いる方法等が挙げられる。
【００２８】
本発明における糖化ヘモグロビンは、ヘモグロビンにグルコース等の糖が結合して生成したものであり、ヘモグロビンＡ１ａ、ヘモグロビンＡ１ｂ、ヘモグロビンＡ１ｃ等が挙げられ、ヘモグロビンＡ１ｃが好ましい。
【００２９】
本発明におけるイソチアゾリノン誘導体としては、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法を可能とするイソチアゾリノン誘導体であれば特に制限はないが、例えば、下記式（Ｉ）で表わされる化合物［以下、化合物（Ｉ）という］が挙げられる。
【００３０】
【化４】
0005871800.tif 000005
【００３１】
（式中、Ａ１は、水素原子、又は、置換若しくは非置換のアルキルを表し、Ａ２とＡ３は、同一又は異なって、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、ハロゲン原子を表すか、または、一緒になって環構造を形成する）
【００３２】
化合物（Ｉ）におけるＡ１は置換若しくは非置換のアルキルを表し、Ａ２とＡ３は、同一又は異なって、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、ハロゲン原子を表すか、または、一緒になって環構造を形成する。置換若しくは非置換のアルキルにおけるアルキルとしては、例えば炭素数１〜２０の直鎖アルキル、炭素数３〜２０の分岐アルキル等が挙げられる。炭素数１〜２０の直鎖アルキルとしては、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、ノナデシル、イコシル等が挙げられる。炭素数３〜２０の分岐アルキルとしては、例えばイソプロピル、イソブチル、イソペンチル、イソヘキシル、イソヘプチル、イソオクチル、イソノニル、イソデシル、イソウンデシル、イソドデシル、イソトリデシル、イソテトラデシル、イソペンタデシル、イソヘキサデシル、イソヘプタデシル、イソオクタデシル、イソノナデシル、イソイコシル、オクチルドデシル等が挙げられる。ハロゲン原子としては、例えば塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。置換アルキルにおける置換基としては、例えばフェニル基、水酸基、スルホ基、シアノ基、ハロゲン原子等が挙げられる。ハロゲン原子としては、例えば前述のハロゲン原子等が挙げられる。
【００３３】
Ａ２とＡ３とが一緒になって形成される環構造としては、例えばベンゼン環、ナフタレン環等が挙げられる。
【００３４】
化合物（Ｉ）の具体例としては、例えば２−アルキル−４−イソチアゾリン−３−オン、１，２−ベンゾイソチアゾール−３（２Ｈ）−オン、２−アルキル−４，５−ジハロゲノ−４−イソチアゾリン−３−オン等が挙げられる。市販の化合物（Ｉ）としては、例えば２−オクチル−４−イソチアゾリン−３−オン（東京化成社製）、１，２−ベンゾイソチアゾール−３（２Ｈ）−オン（和光純薬工業社製）、４，５−ジクロロ−２−オクチル−４−イソチアゾリン−３−オン（ハイケム社製）等が挙げられる。
【００３５】
本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法において、イソチアゾリノン誘導体の反応液中の濃度としては、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法を可能とする濃度であれば、特に制限はないが、通常０．００５〜２０ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．０１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００３６】
本発明における界面活性剤としては、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法を可能とする界面活性剤であれば特に制限はなく、例えば陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤等が挙げられる。
【００３７】
陽イオン性界面活性剤としては、例えば第四級アンモニウム塩、ピリジニウム塩、ホスホニウム塩、イミダゾリウム塩、イソキノリニウム塩等が挙げられ、第四級アンモニウム塩、ピリジニウム塩、ホスホニウム塩が好ましい。
【００３８】
第四級アンモニウム塩としては、炭素数８〜２０の直鎖アルキルを少なくとも１つ有する第四級アンモニウム塩が好ましい。炭素数８〜２０の直鎖アルキルとしては、例えばオクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、ノナデシル、イコシル等が挙げられる。
【００３９】
第四級アンモニウム塩の具体例（製品）としては、例えばデシルトリメチルアンモニウム  クロライド、デシルトリメチルアンモニウム  ブロマイド（以下、Ｃ１０ＴＭＡと記す）、ドデシルトリメチルアンモニウム  クロライド、ドデシルトリメチルアンモニウム  ブロマイド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウム  クロライド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウム  ブロマイド、ジデシルジメチルアンモニウム  クロライド、ジデシルジメチルアンモニウム  ブロマイド、ジドデシルジメチルアンモニウム  クロライド、ジドデシルジメチルアンモニウム  ブロマイド（いずれも、東京化成社製）等が挙げられる。
【００４０】
ピリジニウム塩としては、以下の一般式（ＩＩ）で表わされるピリジニウム塩［以下、化合物（ＩＩ）という］が使用される。
【００４１】
【化５】
0005871800.tif 000006
【００４２】
式中、Ｒ１は、置換若しくは非置換のアルキル、又は置換若しくは非置換のアルケニル、Ｒａは、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、又は置換若しくは非置換のアルケニル、ｎは、１〜５の整数、Ｘ−は、１価のアニオンをそれぞれ表す。
【００４３】
Ｒ１において、置換若しくは非置換のアルキルにおけるアルキルとしては、例えば炭素数１〜２０の直鎖アルキル、炭素数３〜２０の分岐アルキル等が挙げられ、炭素数８〜２０の直鎖アルキル、炭素数８〜２０の分岐アルキルが好ましい。炭素数１〜２０の直鎖アルキルとしては、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、ノナデシル、イコシル等が挙げられる。炭素数３〜２０の分岐アルキルとしては、例えばイソプロピル、イソブチル、イソペンチル、イソヘキシル、イソヘプチル、イソオクチル、イソノニル、イソデシル、イソウンデシル、イソドデシル、イソトリデシル、イソテトラデシル、イソペンタデシル、イソヘキサデシル、イソヘプタデシル、イソオクタデシル、イソノナデシル、イソイコシル、オクチルドデシル等が挙げられる。炭素数８〜２０の直鎖アルキルとしては、例えば前述の炭素数８〜２０の直鎖アルキル等が挙げられる。炭素数８〜２０の分岐アルキルとしては、例えばイソオクチル、イソノニル、イソデシル、イソウンデシル、イソドデシル、イソトリデシル、イソテトラデシル、イソペンタデシル、イソヘキサデシル、イソヘプタデシル、イソオクタデシル、イソノナデシル、イソイコシル、オクチルドデシル等が挙げられる。
【００４４】
Ｒ１において、置換若しくは非置換のアルケニルにおけるアルケニルとしては、例えば炭素数２〜２０のアルケニル等が挙げられ、炭素数８〜２０のアルケニルが好ましい。炭素数２〜２０のアルケニルとしては、例えばビニル、プロペニル、アリル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、デセニル、ウンデセニル、ドデセニル、テトラデセニル、ペンタデセニル、ヘキサデセニル、ヘプタデセニル、オクタデセニル、オレイル、ノナデセニル、イコセニル等が挙げられる。炭素数８〜２０のアルケニルとしては、例えばオクテニル、ノネニル、デセニル、ウンデセニル、ドデセニル、テトラデセニル、ペンタデセニル、ヘキサデセニル、ヘプタデセニル、オクタデセニル、オレイル、ノナデセニル、イコセニル等が挙げられる。
【００４５】
Ｒ１において、置換アルキル及び置換アルケニルにおける置換基としては、例えばフェニル基、水酸基、スルホ基、シアノ基、ハロゲン原子等が挙げられる。ハロゲン原子としては、例えば塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
【００４６】
Ｒａにおいて、置換もしくは非置換のアルキルにおけるアルキルとしては、例えば炭素数１〜２０の直鎖アルキル、炭素数３〜２０の分岐アルキル等が挙げられる。炭素数１〜２０の直鎖アルキルとしては、例えば前述の炭素数１〜２０の直鎖アルキル等が挙げられる。炭素数３〜２０の分岐アルキルとしては、例えば前述の炭素数３〜２０の分岐アルキル等が挙げられる。
【００４７】
Ｒａにおいて、置換もしくは非置換のアルケニルにおけるアルケニルにとしては、例えば炭素数２〜２０のアルケニル等が挙げられる。炭素数２〜２０のアルケニルとしては、例えば前述の炭素数２〜２０の直鎖アルケニル等が挙げられる。
【００４８】
Ｒａにおいて、置換アルキル及び置換アルケニルにおける置換基としては、例えばフェニル基、水酸基、スルホ基、シアノ基、ハロゲン原子等が挙げられる。フェニル基置換アルキルとしては、例えばベンジル、１−フェニルエチル等が挙げられる。ハロゲン原子としては、例えば塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
【００４９】
ピリジン環上に２つ以上の置換基がある場合、置換基は同じであっても異なっていてもよい。化合物（ＩＩ）におけるＸ−は、１価のアニオンを表す。１価のアニオンとしては、例えばハロゲンイオン、OH-、PF6-、BF4-、CH3CH2OSO3-、(CF3SO2)2N-等のアニオンが挙げられる。ハロゲンイオンとしては、例えばCl-、Br-、I-等が挙げられる。
【００５０】
化合物（ＩＩ）の具体例（製品）としては、例えば１−ドデシルピリジニウムクロライド（以下、Ｃ１２ｐｙと記す；東京化成社製）、１−セチルピリジニウムクロライド、１−セチル−４−メチルピリジニウムクロライド（東京化成社製）、Ｎ−オクタデシル−４−スチルバゾールブロミド（東京化成社製）等が挙げられる。
【００５１】
ホスホニウム塩としては、以下の一般式（ＩＩＩ）で表わされるホスホニウム塩［以下、化合物（ＩＩＩ）という］が使用される。
【００５２】
【化６】
0005871800.tif 000007
【００５３】
式中、Ｒ２〜Ｒ５は、同一又は異なって、置換若しくは非置換のアルキルを表わす、Ｙ−は、１価のアニオンをそれぞれ表す。
【００５４】
Ｒ２において、置換若しくは非置換のアルキルにおけるアルキルとしては、例えば炭素数８〜２０の直鎖アルキル、炭素数８〜２０の分岐アルキル等が挙げられる。炭素数８〜２０の直鎖アルキルとしては、例えば前述の炭素数８〜２０の直鎖アルキル等が挙げられる。炭素数８〜２０の分岐アルキルとしては、例えば前述の炭素数８〜２０の分岐アルキル等が挙げられる。置換アルキルにおける置換基としては、例えばフェニル基、水酸基、スルホ基、シアノ基、ハロゲン原子等が挙げられる。フェニル基置換アルキルとしては、例えばベンジル、１−フェニルエチル等が挙げられる。ハロゲン原子としては、例えば塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
【００５５】
Ｒ３〜Ｒ５において、置換若しくは非置換のアルキルにおけるアルキルとしては、例えば炭素数１〜２０の直鎖アルキル、炭素数３〜２０の分岐アルキル等が挙げられる。炭素数１〜２０の直鎖アルキルとしては、例えば前述の炭素数１〜２０の直鎖アルキル等が挙げられる。炭素数３〜２０の分岐アルキルとしては、例えば前述の炭素数３〜２０の分岐アルキル等が挙げられる。置換アルキルにおける置換基としては、例えばフェニル基、水酸基、スルホ基、シアノ基、ハロゲン原子等が挙げられる。フェニル基置換アルキルとしては、例えばベンジル、１−フェニルエチル等が挙げられる。ハロゲン原子としては、例えば塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
【００５６】
Ｙ−は、１価のアニオンを表す。１価のアニオンとしては、例えばハロゲンイオン、OH-、PF6-、BF4-、CH3CH2OSO3-、(CF3SO2)2N-、B(C6H5)4-、ベンゾトリアゾレート等のアニオンが挙げられる。ハロゲンイオンとしては、例えばCl-、Br-、I-等が挙げられる。
【００５７】
化合物（ＩＩＩ）の具体例（製品）としては、例えばテトラオクチルホスホニウムブロマイド（東京化成社製）、トリブチルオクチルホスホニウムブロマイド（東京化成社製）、トリブチルドデシルホスホニウムブロマイド、トリブチルヘキサデシルホスホニウムブロマイド等が挙げられる。
【００５８】
イミダゾリウム塩としては、以下の一般式（ＩＶ）で表わされるイミダゾリウム塩［以下、化合物（ＩＶ）という］が使用される。
【００５９】
【化７】
0005871800.tif 000008
【００６０】
式中、Ｒ６とＲ８は同一又は異なって、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０は、水素原子、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換アルケニルを表し、Ｚ−は、１価のアニオンを表す。
【００６１】
Ｒ６において、置換若しくは非置換のアルキルにおけるアルキルとしては、例えば炭素数８〜２０の直鎖アルキル、炭素数８〜２０の分岐アルキル等が挙げられる。炭素数８〜２０の直鎖アルキルとしては、例えば前述の炭素数８〜２０の直鎖アルキル等が挙げられる。炭素数８〜２０の分岐アルキルとしては、例えば前述の炭素数８〜２０の分岐アルキル等が挙げられる。
【００６２】
Ｒ６において、置換若しくは非置換のアルケニルにおけるアルケニルとしては、例えば炭素数８〜２０のアルケニル等が挙げられる。炭素数８〜２０のアルケニルとしては、例えば前述の炭素数８〜２０のアルケニル等が挙げられる。
【００６３】
Ｒ６において、置換アルキル及び置換アルケニルにおける置換基としては、例えばフェニル基、水酸基、スルホ基、シアノ基、ハロゲン原子等が挙げられる。フェニル基置換アルキルとしては、例えばベンジル、１−フェニルエチル等が挙げられる。ハロゲン原子としては、例えば塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
【００６４】
Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０において、置換若しくは非置換のアルキルにおけるアルキルとしては、例えば炭素数１〜２０の直鎖アルキル、炭素数３〜２０の分岐アルキル等が挙げられる。炭素数１〜２０の直鎖アルキルとしては、前述の炭素数１〜２０の直鎖アルキル等が挙げられる。炭素数３〜２０の分岐アルキルとしては、例えば前述の炭素数３〜２０の分岐アルキル等が挙げられる。
【００６５】
Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０において、置換若しくは非置換のアルケニルにおけるアルケニルとしては、例えば炭素数２〜２０のアルケニル等が挙げられる。炭素数２〜２０のアルケニルとしては、例えば前述の炭素数２〜２０のアルケニル等が挙げられる。
【００６６】
Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０において、置換アルキル及び置換アルケニルにおける置換基としては、例えばフェニル基、水酸基、スルホ基、シアノ基、ハロゲン原子等が挙げられる。フェニル基置換アルキルとしては、例えばベンジル、１−フェニルエチル等が挙げられる。ハロゲン原子としては、例えば塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
【００６７】
Ｚ−は、１価のアニオンを表す。１価のアニオンとしては、例えばハロゲンイオン、OH-、PF6-、BF4-、CH3CH2OSO3-、(CF3SO2)2N-、(CH3O)2P(=O)O-、B(C6H5)4-、FeCl4-、CF3BF3-、CF3SO3-、(NC)2N-、CH3(OCH2CH2)2OSO3-、CH3CH2OSO3-、HSO4-、p-CH3C6H4SO3-等のアニオンが挙げられる。ハロゲンイオンとしては、例えばCl-、Br-、I-等が挙げられる。
【００６８】
化合物（ＩＶ）の具体例（製品）としては、例えば１−メチル−３−オクチルイミダゾリウムブロマイド（東京化成社製）、１−メチル−３−オクチルイミダゾリウムクロライド（東京化成社製）、１−ドデシル−２−メチル−３−ベンジルイミダゾリウムクロライド等が挙げられる。
【００６９】
イソキノリニウム塩としては、以下の一般式（Ｖ）で表わされるイソキノリニウム塩［以下、化合物（Ｖ）という］が使用される。
【００７０】
【化８】
0005871800.tif 000009
【００７１】
式中、Ｒ１１は、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｗ−は、１価のアニオンを表す。
【００７２】
Ｒ１１において、置換若しくは非置換のアルキルにおけるアルキルとしては、例えば炭素数８〜２０の直鎖アルキル、炭素数８〜２０の分岐アルキル等が挙げられる。炭素数８〜２０の直鎖アルキルとしては、例えば前述の炭素数８〜２０の直鎖アルキル等が挙げられる。炭素数８〜２０の分岐アルキルとしては、例えば前述の炭素数８〜２０の分岐アルキル等が挙げられる。
【００７３】
Ｒ１１において、置換若しくは非置換のアルケニルにおけるアルケニルとしては、例えば炭素数８〜２０のアルケニル等が挙げられる。炭素数８〜２０のアルケニルとしては、例えば前述の炭素数８〜２０のアルケニル等が挙げられる。
【００７４】
Ｒ１１において、置換アルキル及び置換アルケニルにおける置換基としては、例えばフェニル基、水酸基、スルホ基、シアノ基、ハロゲン原子等が挙げられる。フェニル基置換アルキルとしては、例えばベンジル、１−フェニルエチル等が挙げられる。ハロゲン原子としては、例えば塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
【００７５】
Ｗ−は、１価のアニオンを表す。１価のアニオンとしては、例えばハロゲンイオン等のアニオンが挙げられる。ハロゲンイオンとしては、例えばCl-、Br-、I-等が挙げられる。
【００７６】
化合物（Ｖ）の具体例（製品）としては、例えばＮ−ラウリルイソキノリニウムクロライド（日油社製）、Ｎ−ラルリルイソキノリニウムブロマイド（日油社製）等が挙げられる。
【００７７】
陰イオン性界面活性剤としては、例えば硫酸エステル塩、カルボン酸塩、スルホン酸塩、リン酸エステル塩、スルホコハク酸塩、Ｎ−メチルタウリン塩、Ｎ−アルカノイル−Ｎ−メチルタウリン塩等が挙げられる。
【００７８】
両性界面活性剤としては、例えば第三級アミンオキサイド、アルキルカルボキシベタイン等が挙げられる。
【００７９】
非イオン性界面活性剤としては、例えばポリオキシエチレンアルキルアミン、ポリオキシエチレンアルケニルアミン、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルケニルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、エチレンジアミンテトラポリオキシエチレン、ポリグリセリン脂肪酸エステル等が挙げられ、ポリオキシエチレンアルキルアミン、ポリオキシエチレンアルキルエーテルが好ましい。
【００８０】
ポリオキシエチレンアルキルアミンにおけるアルキルとしては、例えば炭素数８〜２０のアルキル等が挙げられる。炭素数８〜２０のアルキルとしては、例えばオクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、ノナデシル、イコシル等が挙げられる。
【００８１】
ポリオキシエチレンアルケニルアミンにおけるアルケニルとしては、例えば炭素数８〜２０のアルケニル等が挙げられる。炭素数８〜２０のアルケニルとしては、例えばオクテニル、ノネニル、デセニル、ウンデセニル、ドデセニル、テトラデセニル、ペンタデセニル、ヘキサデセニル、ヘプタデセニル、オクタデセニル、オレイル、ノナデセニル、イコセニル等が挙げられる。
【００８２】
ポリオキシエチレンアルキルエーテルにおけるアルキルとしては、例えば炭素数８〜２０のアルキル等が挙げられる。炭素数８〜２０のアルキルとしては、例えば前述の炭素数８〜２０のアルキル等が挙げられる。
ポリオキシエチレンアルケニルエーテルにおけるアルケニルとしては、例えば炭素数８〜２０のアルケニル等が挙げられる。炭素数８〜２０のアルケニルとしては、例えば前述の炭素数８〜２０のアルケニル等が挙げられる。
【００８３】
ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルにおけるアルキルとしては、例えば炭素数８〜２０のアルキル等が挙げられる。炭素数８〜２０のアルキルとしては、例えば前述の炭素数８〜２０のアルキル等が挙げられる。
【００８４】
総ヘモグロビン量は、公知の方法、例えばシアンメトヘモグロビン法、オキシヘモグロビン法、ＳＬＳ−ヘモグロビン法等によって決定することができる。総ヘモグロビン量は、ヘモグロビン含有試料そのもののみならず、ヘモグロビン含有試料にイソチアゾリノン誘導体及び／又は界面活性剤を添加して得られる試料、ヘモグロビン含有試料にイソチアゾリノン誘導体及び／又は界面活性剤とタンパク質分解酵素とを添加して得られる試料に対して、シアンメトヘモグロビン法、オキシヘモグロビン法、ＳＬＳ−ヘモグロビン法を適用することによっても決定することができる。
【００８５】
ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンに、上記界面活性剤存在下、タンパク質分解酵素を作用させる反応は、上記界面活性剤存在下にタンパク質分解酵素が糖化ヘモグロビンに作用し得る条件であれば、いかなる条件下でも行うことができる。ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、タンパク質分解酵素との反応は、水性媒体中で行われることが好ましい。水性媒体としては後述の水性媒体等が挙げられる。ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、タンパク質分解酵素との反応における反応温度は、通常１０〜５０℃であり、２０〜４０℃が好ましく、反応時間は、通常１分間〜３時間であり、２．５分間〜１時間が好ましい。タンパク質分解酵素の濃度としては、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、タンパク質分解酵素との反応が進行する濃度であれば特に制限はなく、通常５０〜２５０００ｋＵ／Ｌであり、好ましくは２５０〜１００００ｋＵ／Ｌである。
【００８６】
タンパク質分解酵素としては、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンに作用し、糖化ヘモグロビンから糖化ペプチドを生成させる酵素であれば特に制限はなく、例えばセリンプロテアーゼ（キモトリプシン、スブチリシン等）、システインプロテアーゼ（パパイン、カスパーゼ等）、アスパラギン酸プロテアーゼ（ペプシン、カテプシンＤ等）、メタロプロテアーゼ（サーモリシン等）、Ｎ−末端スレオニンプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ等が挙げられる。本発明においては、市販のタンパク質分解酵素も使用することができ、市販品としては例えばプロテアーゼＰ「アマノ」３Ｇ、プロテアーゼＫ「アマノ」（以上、天野エンザイム社製）、アクチナーゼＡＳ、アクチナーゼＥ（以上、科研ファルマ社製）、サーモリシン（大和化成社製）、スミチームMP(新日本化学工業社製)等が挙げられる。
【００８７】
上記タンパク質分解酵素を作用させる反応における界面活性剤の濃度としては、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、タンパク質分解酵素との反応が進行する濃度であれば特に制限はなく、通常０．０００１〜１０％であり、好ましくは０．０００５〜５％である。
【００８８】
ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、タンパク質分解酵素との反応により、糖化ペプチドを含む反応生成物が生成する。次いで、この反応生成物中の糖化ペプチドに、フルクトシルペプチド酸化酵素と反応し、過酸化水素が生成する。糖化ペプチドとフルクトシルペプチド酸化酵素との反応は、水性媒体中で行われることが好ましい。水性媒体としては後述の水性媒体等が挙げられる。
【００８９】
糖化ペプチドとフルクトシルペプチド酸化酵素との反応における反応温度は、通常１０〜５０℃であり、２０〜４０℃が好ましく、反応時間は、通常１分間〜３時間であり、２．５分間〜１時間が好ましい。フルクトシルペプチド酸化酵素の濃度としては、糖化ヘモグロビンとフルクトシルペプチド酸化酵素との反応が進行する濃度であれば特に制限はなく、通常０．１〜３０ｋＵ／Ｌであり、好ましくは０．２〜１５ｋＵ／Ｌである。
【００９０】
フルクトシルペプチド酸化酵素としては、糖化ペプチドに作用して過酸化水素を生成させる酵素であれば特に制限はなく、例えば糸状菌由来、酵母由来、放線菌由来、バクテリア由来、古細菌由来のフルクトシルペプチド酸化酵素等が挙げられる。本発明においては、市販のフルクトシルペプチド酸化酵素も使用することができ、市販品としては例えばＦＰＯＸ−ＣＥ（キッコーマン社製）、ＦＰＯＸ−ＥＥ（キッコーマン社製）、ＦＰＯＸ−ＣＥＴ（キッコーマン社製）等が挙げられる。
【００９１】
生成した過酸化水素の測定方法としては、例えば電極を用いる方法、過酸化水素測定用試薬を用いる方法等が挙げられ、過酸化水素測定用試薬を用いる方法が好ましい。過酸化水素測定用試薬は、過酸化水素を検出可能な物質に変換するための試薬である。検出可能な物質としては、例えば色素、光（発光）、蛍光等が挙げられ、色素が好ましい。
【００９２】
検出可能な物質が色素の場合、過酸化水素測定用試薬は、ペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質と酸化発色型色原体を含む試薬等が挙げられる。酸化発色型色原体としては、酸化カップリング型色原体、ロイコ型色原体等が挙げられ、ロイコ型色原体が好ましい。ロイコ型色原体としては、例えばフェノチアジン系色原体、トリフェニルメタン系色原体、ジフェニルアミン系色原体、ｏ−フェニレンジアミン、ヒドロキシプロピオン酸、ジアミノベンジジン、テトラメチルベンジジン等が挙げられ、フェノチアジン系色原体が好ましい。フェノチアジン系色原体としては、例えば１０−Ｎ−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＣＣＡＰ）、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、１０−Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン ナトリウム塩（ＤＡ−６７）等が挙げられる。フェノチアジン系色原体の中でも、１０−Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン ナトリウム塩（ＤＡ−６７）が特に好ましい。トリフェニルメタン系色原体としては、例えばＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−ヘキサ（３−スルホプロピル）−４，４’，４’’−トリアミノトリフェニルメタン（ＴＰＭ−ＰＳ）等が挙げられる。ジフェニルアミン系色原体としては、例えばＮ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン ナトリウム塩（ＤＡ−６４）、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス〔３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル〕アミン（ＢＣＭＡ）等が挙げられる。
【００９３】
検出可能な物質が光（発光）の場合、過酸化水素測定用試薬は、ペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質と化学発光物質を含む試薬等が挙げられる。化学発光物質としては、例えばルミノール、イソルミノール、ルシゲニン、アクリジニウムエステル等が挙げられる。
【００９４】
検出可能な物質が蛍光の場合、過酸化水素測定用試薬は、ペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質と蛍光物質を含む試薬等が挙げられる。蛍光物質としては、例えば４−ヒドロキシフェニル酢酸、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸、クマリン等が挙げられる。
【００９５】
（２）ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定試薬
本発明の、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定試薬は、タンパク質分解酵素、フルクトシルペプチド酸化酵素、イソチアゾリノン誘導体、及び、界面活性剤を含む試薬であり、本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法に用いられる。本発明の測定試薬は、さらに、過酸化水素測定試薬を含んでいてもよい。
【００９６】
本発明の測定試薬におけるタンパク質分解酵素、フルクトシルペプチド酸化酵素、イソチアゾリノン誘導体、界面活性剤、及び、過酸化水素測定試薬としては、例えば、それぞれ、前述のタンパク質分解酵素、フルクトシルペプチド酸化酵素、イソチアゾリノン誘導体、界面活性剤、及び、過酸化水素測定試薬等が挙げられる。
【００９７】
本発明の測定試薬におけるタンパク質分解酵素の濃度は、通常５０〜２５０００ｋＵ／Ｌであり、好ましくは２５０〜１００００ｋＵ／Ｌである。本発明の測定試薬におけるフルクトシルペプチド酸化酵素の濃度は、通常０．１〜３０ｋＵ／Ｌであり、好ましくは０．２〜１５ｋＵ／Ｌである。
【００９８】
本発明の測定試薬におけるイソチアゾリノン誘導体の濃度は、通常０．００５〜２０ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．０１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００９９】
本発明の測定試薬における界面活性剤の濃度は、通常０．０００１〜１０％であり、好ましくは０．０００５〜５％である。
【０１００】
本発明の測定試薬には、必要に応じて、水性媒体、安定化剤、防腐剤、塩類、干渉物質消去剤、有機溶媒等が含有されてもよい。
水性媒体としては、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等が挙げられ、緩衝液が好ましい。
【０１０１】
水性媒体のｐＨは、例えばｐＨ４〜１０である。水性媒体として緩衝液を用いる場合には、設定するｐＨに応じた緩衝剤を用いることが望ましい。緩衝液に用いる緩衝剤としては、例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッドの緩衝剤等が挙げられる。
【０１０２】
グッドの緩衝剤としては、例えば２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸〔（Ｈ）ＥＰＰＳ〕、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）等が挙げられる。
【０１０３】
緩衝液の濃度は、通常０．００１〜２．０ｍｏｌ／Ｌであり、０．００５〜１．０ｍｏｌ／Ｌが好ましい。
【０１０４】
安定化剤としては、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、シュークロース、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、硝酸カルシウム、フェロシアン化カリウム、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル等のポリオキシエチレン系界面活性剤等が挙げられる。防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム、抗生物質等があげられる。塩類としては、例えば塩化ナトリウム、硝酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、ギ酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化カリウム、硝酸カリウム、硫酸カリウム、炭酸カリウム、ギ酸カリウム、酢酸カリウム、等が挙げられる。干渉物質消去剤としては、例えばアスコルビン酸の影響を消去するためのアスコルビン酸オキシダーゼ等が挙げられる。有機溶媒としては、例えばロイコ型色原体の水性媒体への溶解補助剤のためのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキサイド（ＤＭＳＯ）、ジオキサン、アセトン、メタノール、エタノール等が挙げられる。
【０１０５】
（３）ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定キット
本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定試薬は、キットの形態で保存、流通及び使用されてよい。本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定キットは、本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法に用いられる。本発明の測定キットとしては、例えば２試薬系のキット、３試薬系のキット等が挙げられ、２試薬系キットが好ましい。
【０１０６】
本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定キットは、本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定方法を可能とするキットであれば、特に制限はなく、２試薬系キットの場合は、例えばタンパク質分解酵素を含む第１試薬と、フルクトシルペプチド酸化酵素、イソチアゾリノン誘導体、及び、界面活性剤を含む第２試薬とを含むキットや、タンパク質分解酵素、イソチアゾリノン誘導体、及び、界面活性剤を含む第１試薬と、フルクトシルペプチド酸化酵素を含む第２試薬とを含むキット等が挙げられる。
【０１０７】
さらに、本発明の糖化ヘモグロビン測定キットとして、これらのキットの第１試薬、第２試薬のいずれか又は両方に過酸化水素測定試薬が含まれるキットが挙げられる。特に、過酸化水素測定試薬として、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬を用いる場合は、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とは別々の試薬に含まれることが好ましい。すなわち、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とが、それぞれ第１試薬と第２試薬に、又は、第２試薬と第１試薬に含まれることが好ましい。
【０１０８】
本発明の測定キットを構成する試薬中のタンパク質分解酵素の濃度は、通常１００〜３００００ｋＵ／Ｌであり、好ましくは５００〜１００００ｋＵ／Ｌである。本発明の測定キットを構成する試薬中のフルクトシルペプチド酸化酵素の濃度は、通常０．５〜１００ｋＵ／Ｌであり、好ましくは１〜５０ｋＵ／Ｌである。
本発明の測定キットを構成する試薬中のイソチアゾリノン誘導体の濃度は、通常０．００５〜２０ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．０１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌである。
【０１０９】
本発明の測定キットを構成する試薬中の界面活性剤の濃度は、通常０．０００１〜４０％であり、好ましくは０．０００５〜２０％である。
【０１１０】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。
尚、本実施例、比較例及び試験例においては、下記メーカーの試薬及び酵素を使用した。
【０１１１】
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（同仁化学研究所社製）、ＡＤＡ（同仁化学研究所社製）、ＭＥＳ（同仁化学研究所社製）、塩化カルシウム２水和物（和光純薬工業社製）、酢酸カルシウム（和光純薬工業社製）、硝酸カルシウム（和光純薬工業社製）、ＤＡ−６７（和光純薬工業社製）、１−ドデシルピリジニウムクロライド（Ｃ１２ｐｙ）［化合物（ＩＩ）；東京化成社製］、デシルトリメチルアンモニウムブロマイド（Ｃ１０ＴＭＡ）（第四級アンモニウム塩；東京化成社製）、ＮＩＫＫＯＬ  ＬＭＴ（ＬＭＴ）［Ｎ−アルカノイル−Ｎ−メチルタウリン塩（Ｎ−ラウロイル−Ｎ−メチルタウリン  ナトリウム塩）；日光ケミカルズ社製］、アノンＢＬ［アルキルカルボキシベタイン（ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン）；日本油脂社製］、２−オクチル−４−イソチアゾリン−３−オン（イソチアゾリノン誘導体；東京化成社製）、１，２−ベンゾイソチアゾール−３（２Ｈ）−オン（イソチアゾリノン誘導体；和光純薬工業社製）、４，５−ジクロロ−２−オクチル−４−イソチアゾリン−３−オン（ハイオム社製）、サーモリシン（タンパク質分解酵素；大和化成社製）、アクチナーゼＥ（タンパク質分解酵素；科研ファルマ社製）、ＦＰＯＸ−ＣＥ（フルクトシルペプチド酸化酵素；キッコーマン社製）、ＦＰＯＸ−ＣＥＴ（フルクトシルペプチド酸化酵素；キッコーマン社製）、ペルオキシダーゼ（東洋紡績社製）、トリトンＸ−４０５（ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル；シグマ−アルドリッチ社製）。
【実施例１】
【０１１２】
以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）                  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｃ１２ｐｙ                                      １．６ｇ／Ｌ
２−オクチル−４−イソチアゾリン−３−オン      ０．２ｇ／Ｌ
塩化カルシウム２水和物                          １０ｍｍｏｌ／Ｌ
サーモリシン                                    １８００ｋＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                                ４０ｋＵ／Ｌ
第２試薬
ＡＤＡ（ｐＨ７．０）                            ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ−ＣＥ                                  ６ｋＵ／Ｌ
ＤＡ−６７                                      ６０μｍｏｌ／Ｌ
【実施例２】
【０１１３】
以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）                  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｃ１２ｐｙ                                      １．６ｇ／Ｌ
１，２−ベンゾイソチアゾール−３（２Ｈ）−オン  ０．４ｇ／Ｌ
塩化カルシウム２水和物                          １０ｍｍｏｌ／Ｌ
サーモリシン                                    １８００ｋＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                                ４０ｋＵ／Ｌ
第２試薬
ＡＤＡ（ｐＨ７．０）                            ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ−ＣＥ                                  ６ｋＵ／Ｌ
ＤＡ−６７                                      ６０μｍｏｌ／Ｌ
【実施例３】
【０１１４】
以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）                  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｃ１０ＴＭＡ                                    １６ｇ／Ｌ
２−オクチル−４−イソチアゾリン−３−オン      ０．２ｇ／Ｌ
塩化カルシウム２水和物                          １０ｍｍｏｌ／Ｌ
サーモリシン                                    １８００ｋＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                                ４０ｋＵ／Ｌ
第２試薬
ＡＤＡ（ｐＨ７．０）                            ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ−ＣＥ                                  ６ｋＵ／Ｌ
ＤＡ−６７                                      ６０μｍｏｌ／Ｌ
【実施例４】
【０１１５】
以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）                  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｃ１０ＴＭＡ                                    １６ｇ／Ｌ
１，２−ベンゾイソチアゾール−３（２Ｈ）−オン  ０．２ｇ／Ｌ
塩化カルシウム２水和物                          １０ｍｍｏｌ／Ｌ
サーモリシン                                    １８００ｋＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                                ４０ｋＵ／Ｌ
第２試薬
ＡＤＡ（ｐＨ７．０）                            ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ−ＣＥ                                  ６ｋＵ／Ｌ
ＤＡ−６７                                      ６０μｍｏｌ／Ｌ
【実施例５】
【０１１６】
以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）                  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＬＭＴ                                          ５ｇ／Ｌ
２−オクチル−４−イソチアゾリン−３−オン      ０．４ｇ／Ｌ
塩化カルシウム２水和物                          １０ｍｍｏｌ／Ｌ
サーモリシン                                    １８００ｋＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                                ４０ｋＵ／Ｌ
第２試薬
ＡＤＡ（ｐＨ７．０）                            ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ−ＣＥ                                  ６ｋＵ／Ｌ
ＤＡ−６７                                      ６０μｍｏｌ／Ｌ
【実施例６】
【０１１７】
以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）                  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＬＭＴ                                          ５ｇ／Ｌ
１，２−ベンゾイソチアゾール−３（２Ｈ）−オン  ０．２ｇ／Ｌ
塩化カルシウム２水和物                          １０ｍｍｏｌ／Ｌ
サーモリシン                                    １８００ｋＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                                ４０ｋＵ／Ｌ
第２試薬
ＡＤＡ（ｐＨ７．０）                            ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ−ＣＥ                                  ６ｋＵ／Ｌ
ＤＡ−６７                                      ６０μｍｏｌ／Ｌ
【実施例７】
【０１１８】
以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）                  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
アノンＢＬ                                      ５ｇ／Ｌ
２−オクチル−４−イソチアゾリン−３−オン      ０．２ｇ／Ｌ
塩化カルシウム２水和物                          １０ｍｍｏｌ／Ｌ
サーモリシン                                    １８００ｋＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                                ４０ｋＵ／Ｌ
第２試薬
ＡＤＡ（ｐＨ７．０）                            ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ−ＣＥ                                  ６ｋＵ／Ｌ
ＤＡ−６７                                      ６０μｍｏｌ／Ｌ
【実施例８】
【０１１９】
以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）                  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
アノンＢＬ                                      ５ｇ／Ｌ
１，２−ベンゾイソチアゾール−３（２Ｈ）−オン  ０．４ｇ／Ｌ
塩化カルシウム２水和物                          １０ｍｍｏｌ／Ｌ
サーモリシン                                    １８００ｋＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                                ４０ｋＵ／Ｌ
第２試薬
ＡＤＡ（ｐＨ７．０）                            ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ−ＣＥ                                  ６ｋＵ／Ｌ
ＤＡ−６７                                      ６０μｍｏｌ／Ｌ
【実施例９】
【０１２０】
以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）                  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｃ１２ｐｙ                                      １．６ｇ／Ｌ
２−オクチル−４−イソチアゾリン−３−オン      ０．４ｇ／Ｌ
塩化カルシウム２水和物                          １０ｍｍｏｌ／Ｌ
サーモリシン                                    １８００ｋＵ／Ｌ
ＤＡ−６７                                      ２０μｍｏｌ／Ｌ
第２試薬
ＡＤＡ（ｐＨ７．０）                            ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ−ＣＥ                                  ６ｋＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                                １２０ｋＵ／Ｌ
【実施例１０】
【０１２１】
以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）                  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｃ１２ｐｙ                                      １．６ｇ／Ｌ
１，２−ベンゾイソチアゾール−３（２Ｈ）−オン  ０．２ｇ／Ｌ
塩化カルシウム２水和物                          １０ｍｍｏｌ／Ｌ
サーモリシン                                    １８００ｋＵ／Ｌ
ＤＡ−６７                                      ２０μｍｏｌ／Ｌ
第２試薬
ＡＤＡ（ｐＨ７．０）                            ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ−ＣＥ                                  ６ｋＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                                １２０ｋＵ／Ｌ
【実施例１１】
【０１２２】
以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）                  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｃ１０ＴＭＡ                                    １６ｇ／Ｌ
２−オクチル−４−イソチアゾリン−３−オン      ０．４ｇ／Ｌ
塩化カルシウム２水和物                          １０ｍｍｏｌ／Ｌ
サーモリシン                                    １８００ｋＵ／Ｌ
ＤＡ−６７                                      ２０μｍｏｌ／Ｌ
第２試薬
ＡＤＡ（ｐＨ７．０）                            ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ−ＣＥ                                  ６ｋＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                                １２０ｋＵ／Ｌ
【実施例１２】
【０１２３】
以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）                  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｃ１０ＴＭＡ                                    １６ｇ／Ｌ
１，２−ベンゾイソチアゾール−３（２Ｈ）−オン  ０．２ｇ／Ｌ
塩化カルシウム２水和物                          １０ｍｍｏｌ／Ｌ
サーモリシン                                    １８００ｋＵ／Ｌ
ＤＡ−６７                                      ２０μｍｏｌ／Ｌ
第２試薬
ＡＤＡ（ｐＨ７．０）                            ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ−ＣＥ                                  ６ｋＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                                １２０ｋＵ／Ｌ
【実施例１３】
【０１２４】
以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）                  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＬＭＴ                                          ５ｇ／Ｌ
２−オクチル−４−イソチアゾリン−３−オン      ０．２ｇ／Ｌ
塩化カルシウム２水和物                          １０ｍｍｏｌ／Ｌ
サーモリシン                                    １８００ｋＵ／Ｌ
ＤＡ−６７                                      ２０μｍｏｌ／Ｌ
第２試薬
ＡＤＡ（ｐＨ７．０）                            ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ−ＣＥ                                  ６ｋＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                                １２０ｋＵ／Ｌ
【実施例１４】
【０１２５】
以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）                  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＬＭＴ                                          ５ｇ／Ｌ
１，２−ベンゾイソチアゾール−３（２Ｈ）−オン  ０．２ｇ／Ｌ
塩化カルシウム２水和物                          １０ｍｍｏｌ／Ｌ
サーモリシン                                    １８００ｋＵ／Ｌ
ＤＡ−６７                                      ２０μｍｏｌ／Ｌ
第２試薬
ＡＤＡ（ｐＨ７．０）                            ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ−ＣＥ                                  ６ｋＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                                １２０ｋＵ／Ｌ
【実施例１５】
【０１２６】
以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）                  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
アノンＢＬ                                      ５ｇ／Ｌ
２−オクチル−４−イソチアゾリン−３−オン      ０．４ｇ／Ｌ
塩化カルシウム２水和物                          １０ｍｍｏｌ／Ｌ
サーモリシン                                    １８００ｋＵ／Ｌ
ＤＡ−６７                                      ２０μｍｏｌ／Ｌ
第２試薬
ＡＤＡ（ｐＨ７．０）                            ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ−ＣＥ                                  ６ｋＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                                １２０ｋＵ／Ｌ
【実施例１６】
【０１２７】
以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）                  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
アノンＢＬ                                      ５ｇ／Ｌ
１，２−ベンゾイソチアゾール−３（２Ｈ）−オン  ０．４ｇ／Ｌ
塩化カルシウム２水和物                          １０ｍｍｏｌ／Ｌ
サーモリシン                                    １８００ｋＵ／Ｌ
ＤＡ−６７                                      ２０μｍｏｌ／Ｌ
第２試薬
ＡＤＡ（ｐＨ７．０）                            ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ−ＣＥ                                  ６ｋＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                                １２０ｋＵ／Ｌ
【実施例１７】
【０１２８】
以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
ＭＥＳ（ｐＨ６．０）                            ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｃ１２ｐｙ                                      １．２ｇ／Ｌ
２−オクチル−４−イソチアゾリン−３−オン      ０．２ｇ／Ｌ
酢酸カルシウム                                  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
硝酸ナトリウム                                  １００ｍｍｏｌ／Ｌ
アクチナーゼＥ                                  ３４０ｋＵ／Ｌ
ＤＡ−６７                                      ２０μｍｏｌ／Ｌ
第２試薬
ＡＤＡ（ｐＨ７．０）                            ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ−ＣＥＴ                                ２．５ｋＵ／Ｌ
トリトンＸ−４０５                              ７．１ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                                １２０ｋＵ／Ｌ
【実施例１８】
【０１２９】
以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
ＭＥＳ（ｐＨ６．０）                            ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｃ１２ｐｙ                                      １．２ｇ／Ｌ
１，２−ベンゾイソチアゾール−３（２Ｈ）−オン  ０．０４ｇ／Ｌ
酢酸カルシウム                                  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
硝酸ナトリウム                                  １００ｍｍｏｌ／Ｌ
アクチナーゼＥ                                  ３４０ｋＵ／Ｌ
ＤＡ−６７                                      ２０μｍｏｌ／Ｌ
第２試薬
ＡＤＡ（ｐＨ７．０）                            ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ−ＣＥＴ                                ２．５ｋＵ／Ｌ
トリトンＸ−４０５                              ７．１ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                                １２０ｋＵ／Ｌ
【実施例１９】
【０１３０】
以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
ＭＥＳ（ｐＨ６．５）                            ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｃ１２ｐｙ                                      １．６ｇ／Ｌ
２−オクチル−４−イソチアゾリン−３−オン      ０．２ｇ／Ｌ
硝酸カルシウム                                  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
硝酸ナトリウム                                  １００ｍｍｏｌ／Ｌ
サーモリシン                                    １８００ｋＵ／Ｌ
ＤＡ−６７                                      ２０μｍｏｌ／Ｌ
第２試薬
ＡＤＡ（ｐＨ７．０）                            ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ−ＣＥＴ                                ６ｋＵ／Ｌ
トリトンＸ−４０５                              ７．１ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                                １２０ｋＵ／Ｌ
【実施例２０】
【０１３１】
以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
ＭＥＳ（ｐＨ６．５）                            ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｃ１２ｐｙ                                      １．６ｇ／Ｌ
４，５−ジクロロ−２−オクチル−４−イソチアゾリン−３−オン
０．０４ｇ／Ｌ
硝酸カルシウム                                  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
硝酸ナトリウム                                  １００ｍｍｏｌ／Ｌ
サーモリシン                                    １８００ｋＵ／Ｌ
ＤＡ−６７                                      ２０μｍｏｌ／Ｌ
第２試薬
ＡＤＡ（ｐＨ７．０）                            ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ−ＣＥＴ                                ６ｋＵ／Ｌ
トリトンＸ−４０５                              ７．１ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                                １２０ｋＵ／Ｌ
【実施例２１】
【０１３２】
以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
ＭＥＳ（ｐＨ６．５）                            ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｃ１２ｐｙ                                      １．６ｇ／Ｌ
２−オクチル−４−イソチアゾリン−３−オン      ０．２ｇ／Ｌ
硝酸カルシウム                                  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
硝酸ナトリウム                                  １００ｍｍｏｌ／Ｌ
アクチナーゼＥ                                  ３４０ｋＵ／Ｌ
ＤＡ−６７                                      ２０μｍｏｌ／Ｌ
第２試薬
ＡＤＡ（ｐＨ７．０）                            ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ−ＣＥＴ                                ６ｋＵ／Ｌ
トリトンＸ−４０５                              ７．１ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                                １２０ｋＵ／Ｌ
【実施例２２】
【０１３３】
以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
ＭＥＳ（ｐＨ６．５）                            ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｃ１２ｐｙ                                      １．６ｇ／Ｌ
４，５−ジクロロ−２−オクチル−４−イソチアゾリン−３−オン
０．０４ｇ／Ｌ
硝酸カルシウム                                  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
硝酸ナトリウム                                  １００ｍｍｏｌ／Ｌ
アクチナーゼＥ                                  ３４０ｋＵ／Ｌ
ＤＡ−６７                                      ２０μｍｏｌ／Ｌ
第２試薬
ＡＤＡ（ｐＨ７．０）                            ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ−ＣＥＴ                                ６ｋＵ／Ｌ
トリトンＸ−４０５                              ７．１ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                                １２０ｋＵ／Ｌ
【実施例２３】
【０１３４】
ＨｂＡ１ｃ測定キットとして、実施例１のキットを、試料として、糖尿病が疑われる１０名の被験者由来の全血を用いて、以下の手順により、各試料におけるＨｂＡ１ｃ濃度（量）の総ヘモグロビン濃度（量）に対する割合［ＨｂＡ１ｃ（％）］を決定した。【０１３５】
（１）総ヘモグロビン濃度決定のための検量線の作成
測定キットとして、総ヘモグロビン測定用キットであるヘモグロビンＢ−テストワコー（ＳＬＳ−ヘモグロビン法）（和光純薬工業社製）を用いて、検体として、ヘモグロビンＢ−テストワコーに付属の標準品（ヘモグロビン濃度：１５．３ｍｇ／ｍＬ）を用いて、ヘモグロビン濃度と吸光度との関係を示す検量線を作成した。【０１３６】
（２）ＨｂＡ１ｃ濃度決定のための検量線の作成
ラテックス免疫凝集法と、血球画分の総ヘモグロビン値とから、ＨｂＡ１ｃ濃度が２．７７μｍｏｌ／Ｌ、６．３３μｍｏｌ／Ｌと値付けされた２つの血球画分について、実施例１のＨｂＡ１ｃ測定キットを用いて測定し、各血球画分に対する吸光度を測定した。当該血球画分の代わりに生理食塩水を用いて、生理食塩水に対するＨｂＡ１ｃ濃度を測定した。当該血球画分に対するそれぞれの吸光度から、生理食塩水に対する吸光度を差し引いて算出した値を、当該血球画分に対するブランク補正吸光度とした。当該血球画分に対するブランク補正吸光度と、生理食塩水に対するブランク補正吸光度（０ Ａｂｓ）とから、ＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）と吸光度との間の関係を示す検量線を作成した。【０１３７】
（３）各血球画分におけるヘモグロビン濃度の決定
各試料に対して、２５℃、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行い、血球画分を得た。各血球画分について、ヘモグロビンＢ−テストワコーを用いて測定し、得られた測定値と（１）の検量線とから、各血球画分中のヘモグロビン濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を決定した。【０１３８】
（４）各血球画分におけるＨｂＡ１ｃ濃度の決定
各血球画分について、実施例１の測定キットを用いて測定し、得られた測定値と（２）の検量線とから、各血球画分中のＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を決定した。【０１３９】
（５）ＨｂＡ１ｃ（％）（＝ＨｂＡ１ｃ濃度のヘモグロビン濃度に対する割合）の決定
上記（３）で決定した各血球画分におけるヘモグロビン濃度（μｍｏｌ／Ｌ）と、上記（４）で決定した各血球画分におけるＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）とから、以下の式により、日本糖尿病学会（Japan Diabetes Society；ＪＤＳ）値のＨｂＡ１ｃ（％）を算出した。【０１４０】
【数１】
0005871800.tif 000010
【０１４１】
（６）同一血球画分中のＨｂＡ１ｃ（％）の免疫測定法での決定
上記（５）でのＨｂＡ１ｃ（％）の決定に使用した血球画分と同一の血球画分を用いて、各血球画分中のＨｂＡ１ｃ（％）を、デタミナーＬ  ＨｂＡ１ｃ（協和メデックス社製）を用いる免疫測定法により、デタミナーＬ  ＨｂＡ１ｃの添付文書に記載の方法に従って決定した。【０１４２】
（７）本発明の測定方法と免疫測定法との相関
本発明の測定方法を用いて、上記（５）で決定したＨｂＡ１ｃ（％）と、免疫測定法を用いて、上記（６）で決定したＨｂＡ１ｃ（％）とから、本発明の測定方法と免疫測定法との間の相関関係を検証し、相関係数を決定した。【０１４３】
同様に、実施例１の測定キットの代わりに、実施例２〜２２の測定キットを用いて、デタミナーＬ  ＨｂＡ１ｃ（協和メデックス社製）を用いた測定との間の相関係数を決定した。その結果を第１表に示す。【０１４４】
【表１】
0005871800.tif 000011
【０１４５】
第１表に示す通り、実施例１〜２２の測定キットを用いる本発明の測定方法と、免疫測定法との間に良好な相関関係が認められた。従って、実施例１〜２２の測定キットを用いる本発明の測定方法により、試料中のＨｂＡ１ｃを正確、かつ、高感度に測定できることが明らかとなった。【０１４６】
［比較例１］
以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）                  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｃ１２ｐｙ                                      １．６ｇ／Ｌ
塩化カルシウム２水和物                          １０ｍｍｏｌ／Ｌ
サーモリシン                                    １８００ｋＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                                ４０ｋＵ／Ｌ
第２試薬
ＡＤＡ（ｐＨ７．０）                            ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ−ＣＥ                                  ６ｋＵ／Ｌ
ＤＡ−６７                                      ６０μｍｏｌ／Ｌ【０１４７】
［比較例２］
以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）                  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｃ１０ＴＭＡ                                    １６ｇ／Ｌ
塩化カルシウム２水和物                          １０ｍｍｏｌ／Ｌ
サーモリシン                                    １８００ｋＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                                ４０ｋＵ／Ｌ
第２試薬
ＡＤＡ（ｐＨ７．０）                            ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ−ＣＥ                                  ６ｋＵ／Ｌ
ＤＡ−６７                                      ６０μｍｏｌ／Ｌ【０１４８】
［比較例３］
以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）                  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＬＭＴ                                          ５ｇ／Ｌ
塩化カルシウム２水和物                          １０ｍｍｏｌ／Ｌ
サーモリシン                                    １８００ｋＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                                ４０ｋＵ／Ｌ
第２試薬
ＡＤＡ（ｐＨ７．０）                            ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ−ＣＥ                                  ６ｋＵ／Ｌ
ＤＡ−６７                                      ６０μｍｏｌ／Ｌ【０１４９】
［比較例４］
以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）                  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
アノンＢＬ                                      ５ｇ／Ｌ
塩化カルシウム２水和物                          １０ｍｍｏｌ／Ｌ
サーモリシン                                    １８００ｋＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                                ４０ｋＵ／Ｌ
第２試薬
ＡＤＡ（ｐＨ７．０）                            ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ−ＣＥ                                  ６ｋＵ／Ｌ
ＤＡ−６７                                      ６０μｍｏｌ／Ｌ【０１５０】
［比較例５］
以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）                  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｃ１２ｐｙ                                      １．６ｇ／Ｌ
塩化カルシウム２水和物                          １０ｍｍｏｌ／Ｌ
サーモリシン                                    １８００ｋＵ／Ｌ
ＤＡ−６７                                      ２０μｍｏｌ／Ｌ
第２試薬
ＡＤＡ（ｐＨ７．０）                            ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ−ＣＥ                                  ６ｋＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                                １２０ｋＵ／Ｌ【０１５１】
［比較例６］
以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）                  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｃ１０ＴＭＡ                                    １６ｇ／Ｌ
塩化カルシウム２水和物                          １０ｍｍｏｌ／Ｌ
サーモリシン                                    １８００ｋＵ／Ｌ
ＤＡ−６７                                      ２０μｍｏｌ／Ｌ
第２試薬
ＡＤＡ（ｐＨ７．０）                            ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ−ＣＥ                                  ６ｋＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                                １２０ｋＵ／Ｌ【０１５２】
［比較例７］
以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）                  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＬＭＴ                                          ５ｇ／Ｌ
塩化カルシウム２水和物                          １０ｍｍｏｌ／Ｌ
サーモリシン                                    １８００ｋＵ／Ｌ
ＤＡ−６７                                      ２０μｍｏｌ／Ｌ
第２試薬
ＡＤＡ（ｐＨ７．０）                            ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ−ＣＥ                                  ６ｋＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                                １２０ｋＵ／Ｌ【０１５３】
［比較例８］
以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）                  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
アノンＢＬ                                      ５ｇ／Ｌ
塩化カルシウム２水和物                          １０ｍｍｏｌ／Ｌ
サーモリシン                                    １８００ｋＵ／Ｌ
ＤＡ−６７                                      ２０μｍｏｌ／Ｌ
第２試薬
ＡＤＡ（ｐＨ７．０）                            ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ−ＣＥ                                  ６ｋＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                                １２０ｋＵ／Ｌ【０１５４】
［比較例９］
以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
ＭＥＳ（ｐＨ６．０）                            ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｃ１２ｐｙ                                      １．２ｇ／Ｌ
酢酸カルシウム                                  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
硝酸ナトリウム                                  １００ｍｍｏｌ／Ｌ
アクチナーゼＥ                                  ３４０ｋＵ／Ｌ
ＤＡ−６７                                      ２０μｍｏｌ／Ｌ
第２試薬
ＡＤＡ（ｐＨ７．０）                            ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ−ＣＥＴ                                ２．５ｋＵ／Ｌ
トリトンＸ−４０５                              ７．１ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                                １２０ｋＵ／Ｌ【０１５５】
［比較例１０］
以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
ＭＥＳ（ｐＨ６．５）                            ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｃ１２ｐｙ                                      １．６ｇ／Ｌ
硝酸カルシウム                                  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
硝酸ナトリウム                                  １００ｍｍｏｌ／Ｌ
サーモリシン                                    １８００ｋＵ／Ｌ
ＤＡ−６７                                      ２０μｍｏｌ／Ｌ
第２試薬
ＡＤＡ（ｐＨ７．０）                            ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ−ＣＥＴ                                ６ｋＵ／Ｌ
トリトンＸ−４０５                              ７．１ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                                １２０ｋＵ／Ｌ【０１５６】
［比較例１１］
以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定キットを調製した。
第１試薬
ＭＥＳ（ｐＨ６．５）                            ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｃ１２ｐｙ                                      １．６ｇ／Ｌ
硝酸カルシウム                                  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
硝酸ナトリウム                                  １００ｍｍｏｌ／Ｌ
アクチナーゼＥ                                  ３４０ｋＵ／Ｌ
ＤＡ−６７                                      ２０μｍｏｌ／Ｌ
第２試薬
ＡＤＡ（ｐＨ７．０）                            ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ−ＣＥＴ                                ６ｋＵ／Ｌ
トリトンＸ−４０５                              ７．１ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                                １２０ｋＵ／Ｌ【０１５７】
［試験例１］  イソチアゾリノン誘導体の効果（１）
（１）溶血検体の調製
ヒト血液を遠心分離して得られた血球画分を、ヘモグロビン測定試薬であるネスコート  ヘモキット−Ｎ（アルフレッサファーマ社製）を用いて測定し、該血球画分のヘモグロビン濃度を決定した。次いで、この値付けされた該血球画分を精製水で希釈して溶血させ、ヘモグロビン濃度が２ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、６ｍｇ／ｍＬ、８ｍｇ／ｍＬ及び１０ｍｇ／ｍＬの各溶血検体を調製した。【０１５８】
（２）溶血検体に対する反応吸光度の測定
キットとして、実施例１のキットを用いて、検体として、生理食塩水（ヘモグロビン濃度が０ｍｇ／ｍＬ）及び（１）で調製した溶血検体を用いて、以下の方法により、各検体に対する反応吸光度を測定した。【０１５９】
反応セルへ、検体９．６μＬと、実施例１のキットの第１試薬１２０μＬとを添加し、３７℃で５分間加温し（第一反応）、反応液の吸光度（Ｅ１）を主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍで測定し、次いでこの反応液に第２試薬４０μＬを添加しさらに３７℃で５分間加温し（第二反応）、反応液の吸光度（Ｅ２）を主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍで測定し、Ｅ２からＥ１を差し引いた吸光度差△Ｅ（＝Ｅ２−Ｅ１）を、各検体に対する反応吸光度とした。【０１６０】
キットとして、実施例１のキットの代わりに，実施例２及び比較例１の各キットを用いて、同様の方法により、各検体に対する反応吸光度を測定した。その結果を第１図に示す。【０１６１】
第１図から明らかな様に、イソチアゾリノン誘導体を含む実施例１及び２のキットを用いる本発明の測定方法においては、ヘモグロビン濃度に比例して反応吸光度が上昇したが、イソチアゾリノン誘導体を含まない比較例１のキットを用いる測定方法においては、ヘモグロビン濃度と反応吸光度との間に比例関係が認められなかった。測定に用いた溶血検体は、同一のヒト血液より調製されたものであるため、ＨｂＡ１ｃ濃度はヘモグロビン濃度に依存して高くなる。従って、イソチアゾリノン誘導体を含まない比較例１のキットを用いる測定方法は、ヘモグロビンの影響を強く受け、ＨｂＡ１ｃの正確な測定が困難であるのに対して、イソチアゾリノン誘導体を含む実施例１及び２のキットを用いる本発明の測定方法は、ヘモグロビンの影響を受けず、ＨｂＡ１ｃの正確な測定が可能であることが分かった。【０１６２】
さらに、キットとして、実施例１のキットの代わりに、実施例９、１０及び比較例５の各キットを用いて、同様の方法により、各検体に対する反応吸光度を測定した。その結果を第２図に示す。【０１６３】
第２図から明らかな様に、イソチアゾリノン誘導体を含む実施例９及び１０のキットを用いる本発明の測定方法においては、ヘモグロビン濃度に比例して反応吸光度が上昇したが、イソチアゾリノン誘導体を含まない比較例５のキットを用いる測定方法においては、ヘモグロビン濃度と反応吸光度との間に比例関係が認められなかった。測定に用いた溶血検体は、同一のヒト血液より調製されたものであるため、ＨｂＡ１ｃ濃度はヘモグロビン濃度に依存して高くなる。従って、イソチアゾリノン誘導体を含まない比較例５のキットを用いる測定方法は、ヘモグロビンの影響を強く受け、ＨｂＡ１ｃの正確な測定が困難であるのに対して、イソチアゾリノン誘導体を含む実施例９及び１０のキットを用いる本発明の測定方法は、ヘモグロビンの影響を受けず、ＨｂＡ１ｃの正確な測定が可能であることが分かった。【０１６４】
［試験例２］  イソチアゾリノン誘導体の効果（２）
キットとして、実施例１のキットを、検体として、試験例１の（１）で調製した溶血検体を用いて測定を行い、得られた測定値を基に、実施例９の（２）で作成したＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）と吸光度との間の関係を示す検量線から、各検体中のＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を決定した。一方、各検体中のヘモグロビン濃度を、ヘモグロビンＢ−テストワコーを用いて測定し、得られた測定値と実施例９の（１）で作成した検量線とから、各検体中のヘモグロビン濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を決定した。【０１６５】
決定した各検体中のＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）とヘモグロビン濃度（μｍｏｌ／Ｌ）とから、以下の式により、日本糖尿病学会（Japan Diabetes Society；ＪＤＳ）値のＨｂＡ１ｃ（％）を算出した。【０１６６】
【数２】
0005871800.tif 000012
【０１６７】
キットとして、実施例１のキットの代わりに、実施例２〜１３、１５、１７〜２２及び比較例１〜１１の各キットを用いて同様の測定を行い、それぞれのキットに対して、各検体中のＨｂＡ１ｃ濃度（％）を測定した。ヘモグロビン濃度が６ｍｇ／ｍＬである検体でのＨｂＡ１ｃ濃度（％）を基準０とし、その基準からの各検体のＨｂＡ１ｃ濃度（％）の差［△ＨｂＡ１ｃ濃度（％）］を算出した。その結果を第２表に示す。【０１６８】
【表２】
0005871800.tif 000013
【０１６９】
前述の通り、測定に用いた溶血検体は、同一のヒト血液より調製されたものであるため、総ヘモグロビンに対するＨｂＡ１ｃの割合（％）は、ヘモグロビン濃度に拠らず一定である。従って、△ＨｂＡ１ｃ濃度（％）が０に近い程、ＨｂＡ１ｃ測定方法がヘモグロビン濃度の影響を受けない、ということになる。第２表から明らかな通り、イソチアゾリノン誘導体を含む本発明のキットでは、イソチアゾリノン誘導体を含まない比較例のキットに比較して、ヘモグロビン濃度の影響を受けないことが判明した。【０１７０】
［試験例３］  イソチアゾリノン誘導体の効果（３）
キットとして、実施例７，８及び比較例４の各キットを、検体として、試験例１の（１）で調製した溶血検体を用いて、試験例１と同様の方法により、それぞれのキットにおいて、各検体に対する反応吸光度を測定した。その結果を第３図に示す。【０１７１】
同様に、キットとして、実施例１５、１６及び比較例８の各キットを、検体として、試験例１の（１）で調製した溶血検体を用いて、試験例１と同様の方法により、それぞれのキットにおいて、各検体に対する反応吸光度を測定した。その結果を第４図に示す。【０１７２】
同様に、キットとして、実施例２１、２２及び比較例１１の各キットを、検体として、試験例１の（１）で調製した溶血検体を用いて、試験例１と同様の方法により、それぞれのキットにおいて、各検体に対する反応吸光度を測定した。その結果を第５図に示す。【０１７３】
第３図及び第４図から明らかな通り、本発明のキット及び比較例のキットのいずれのキットにおいても、ヘモグロビン濃度に比例して反応吸光度が上昇したが、イソチアゾリノン誘導体を含む本発明のキットを用いる場合は、イソチアゾリノンを含まない比較例のキットを用いる場合に比較して、同一濃度のヘモグロビンの検体（すなわち、同一濃度のＨｂＡ１ｃの検体）において、反応吸光度が高いことが判明した。【０１７４】
前述の通り、測定に用いた溶血検体は、同一のヒト血液より調製されたものであるため、ＨｂＡ１ｃ濃度はヘモグロビン濃度に依存して高くなる。同一濃度のＨｂＡ１ｃの検体においては、反応吸光度が高い程、ヘモグロビンの影響を受けず、測定データとしての信頼度が高いことになる。特に、低濃度のＨｂＡ１ｃの検体においては、高い反応吸光度が得られることが重要となる。実施例７及び８のキットを用いる場合は、比較例４のキットを用いる場合に比較して、同一濃度のＨｂＡ１ｃの検体において、高い反応吸光度が得られた。同様に、実施例１５及び１６のキットを用いる場合は、比較例８のキットを用いる場合に比較して、実施例２１及び２２のキットを用いる場合は、比較例１１のキットを用いる場合に比較して、同一濃度のＨｂＡ１ｃの検体において、高い反応吸光度が得られた。従って、イソチアゾリノン誘導体を含む本発明のキットを用いる測定方法は、イソチアゾリノン誘導体を含まない比較例のキットを用いる測定方法と比較して、ヘモグロビンの影響を受けず、かつ、高感度なＨｂＡ１ｃの測定が可能となることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【０１７５】
本発明により、糖尿病の診断に有用な糖化ヘモグロビンの測定等に有用な、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法、測定試薬、及び、測定キットが提供される。
【図１】
0005871800.tif 000019
【図２】
0005871800.tif 000020
【図３】
0005871800.tif 000021
【図４】
0005871800.tif 000022
【図５】
0005871800.tif 000023