(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジエチレングリコールを１ｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌの濃度で含有する培地を用いて１，４−ジオキサン分解菌を増やすことを特徴とする１，４−ジオキサン分解菌の培養方法。
【請求項２】
前記培地が液体培地であることを特徴とする請求項１に記載の培養方法。
【請求項３】
前記培地が、コーンスティープリカー、カザミノ酸、酵母エキス、ペプトンの少なくとも１種を含有することを特徴とする請求項１または２に記載の培養方法。
【請求項４】
前記１，４−ジオキサン分解菌が、マイコバクテリウム属（Mycobacterium sp.）、または、シュードノカルディア属（Pseudonocardia sp.）であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の培養方法。
【請求項５】
前記１，４−ジオキサン分解菌が、マイコバクテリウム属（Mycobacterium sp.）D11（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１９２６）、シュードノカルディア属（Pseudonocardia sp.）D17（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１９２７）、シュードノカルディア  ジオキサニヴォランズ（Pseudonocardia dioxanivorans）CB1190の少なくとも１種であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の培養方法。
【請求項６】
液体培地を供給しながら、該液体培地の供給量と同量の培養液を取り出す連続培養であることを特徴とする請求項２〜５のいずれかに記載の培養方法。
【請求項７】
１，４−ジオキサンを含む水、または土壌に、前記水中、または前記土壌中において１ｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌの濃度となるようにジエチレングリコールを注入し、
前記１，４−ジオキサンを含む水、または土壌に存在する１，４−ジオキサン分解菌の増殖を促進することを特徴とする１，４−ジオキサン処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１，４−ジオキサン分解菌の培養方法、培地、１，４−ジオキサン分解菌を利用する１，４−ジオキサン処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
１，４−ジオキサンは、下記式（１）で表される環状エーテルである。１，４−ジオキサンは、水や有機溶媒との相溶性に優れており、主に有機合成の反応溶剤として使用されている。
【０００３】
【化１】
0005877918.tif 000002
【０００４】
２０１０年度の日本国における１，４−ジオキサンの製造・輸入量は、約４５００ｔ／年であり、約３００ｔ／年が環境中へ放出されたと推測される。１，４−ジオキサンは、水溶性であるため、水環境中へ放出されると広域に拡散してしまう。また、揮発性、固体への吸着性、光分解性、加水分解性、生分解性がいずれも低いため、水中からの除去が困難である。１，４−ジオキサンは急性毒性及び慢性毒性を有する上、発がん性も指摘されていることから、１，４−ジオキサンによる水環境の汚染は、人や動植物に悪影響を及ぼすことが懸念されている。そのため、日本国では、水道水質基準（０．０５ｍｇ／Ｌ以下）、環境基準（０．０５ｍｇ／Ｌ以下）及び排水基準（０．５ｍｇ／Ｌ以下）により、１，４−ジオキサンの規制がなされている。
【０００５】
従来の活性汚泥法や活性炭吸着法等の処理方法では、水中から１，４−ジオキサンを十分に除去することができない。過酸化水素を添加してのオゾン処理（Ｏ３／Ｈ２Ｏ２）、紫外線照射下でのオゾン処理（Ｏ３／ＵＶ）、放射線や超音波照射下でのオゾン処理等、複数の物理化学的な酸化方法を併用する促進酸化法においてのみ、１，４−ジオキサン処理の有効性が確認されている。しかし、促進酸化法はイニシャルコストおよびランニングコストが高いことから普及に至っていない。また、非特許文献１では、１，４−ジオキサン以外の有機物が存在すると、促進酸化法による１，４−ジオキサンの処理効率が低下すると報告されている。
【０００６】
低コストかつ安定的に１，４−ジオキサンを含む水を処理する方法が求められており、特許文献１、非特許文献２では、１，４−ジオキサン分解菌による生物処理が提案されている。
【０００７】
１，４−ジオキサン分解菌は、１，４−ジオキサンを単一炭素源として分解及び資化可能な菌と、テトラヒドロフランなどの他の成分の存在下で共代謝反応によって１，４−ジオキサンの分解を行う菌との２種に大別される。非特許文献３、４では、これらの１，４−ジオキサン分解菌が有するＴＨＦモノオキシゲナーゼが１，４−ジオキサンの分解に関与していることが報告されている。ＴＨＦモノオキシゲナーゼは、多様な炭化水素類の初発酸化を担っている可溶性鉄（II）モノオキシゲナーゼ（ＳＤＩＭＯ）の一種に分類されており、ＳＤＩＭＯには他にメタン／プロパンモノオキシゲナーゼ等が含まれている（非特許文献５）。また、非特許文献６では、ＴＨＦモノオキシゲナーゼ以外のＳＤＩＭＯを有する菌も１，４−ジオキサンを分解する可能性のあることが報告されている。
【０００８】
１，４−ジオキサン分解菌は増殖が極めて遅く、他の微生物が混入していると他の微生物が優先的に増殖してしまうため、１，４−ジオキサン分解菌を培養するには、他の雑菌が混入しないように、事前に培養装置や培地を十分に滅菌する必要がある。滅菌処理には、オートクレーブを用いる蒸気滅菌、オーブン等で加熱する乾熱滅菌、ガンマ線を用いる放射線滅菌、エチレンオキサイドガスを用いる化学滅菌等の方法がある。しかし、滅菌のための設備が大規模になりすぎる、エネルギーコストがかかりすぎる、使用する薬品量が膨大となりコスト・安全性の点で問題がある等、いずれの滅菌方法も、大規模スケールで行うことは困難である。そのため、実際の１，４−ジオキサン汚染現場で必要とされるだけの大量の１，４−ジオキサン分解菌を供給するのは困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００８−３０６９３９号公報
【００１０】
【非特許文献１】K. KOSAKA, H. YAMADA, S.MATSUI, and K. SHISHIDA: The effects of the co-existing compounds on the decomposition of micropollutants using the ozone/hydrogen peroxide process. Water Sci. Technol., 42, pp.353-361, 2000.
【非特許文献２】清和成、池道彦：１，４−ジオキサン分解菌を用いた汚染地下水の生物処理・浄化技術の可能性，用水と廃水，Vol.53, No.7, 2011.
【非特許文献３】H. MASUDA, K. McCLAY, R. J. STEFFAN, and G. J. ZYLSTRA: Biodegradation of tetrahydrofuran and 1,4-dioxane by soluble diiron monooxygenase in Pseudonocardiasp. strain ENV478. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 22(5), pp. 312-316, 2012.
【非特許文献４】A. GROSTERN, C. M. SALES, W.-Q. ZHUANG, O. ERBILGIN, and L. ALVAREZ-COHEN: Glyoxylate metabolism is a key feature of the metabolic degradation of 1,4-dioxane by Pseudonocardiadioxanivorans strain CB1190. Appl. Environ. Microbiol., 78(9), pp. 3298-3308, 2012.
【非特許文献５】N. V. COLEMAN, N. B. BUI, and A. J. HOLMES:  Soluble di-iron monooxygenase gene diversity in soils, sediments and ethane enrichments. Environ. Microbiol., 8(7), pp. 1228-1239, 2006.
【非特許文献６】S. MAHENDRA, and L. ALVAREZ-COHEN: Kinetics of 1,4-dioxane biodegradation by monooxygenase-expressing bacteria. Environ. Sci. Technol., 40(17), pp. 5435-5442, 2006.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
１，４−ジオキサン分解菌の効率的な培養方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
１．ジエチレングリコールを含有する培地を用いて１，４−ジオキサン分解菌を増やすことを特徴とする１，４−ジオキサン分解菌の培養方法。
２．前記培地が液体培地であることを特徴とする１．に記載の培養方法。
３．前記ジエチレングリコールの濃度が０．０１ｍｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌであることを特徴とする２．に記載の培養方法。
４．前記培地が、コーンスティープリカー、カザミノ酸、酵母エキス、ペプトンの少なくとも１種を含有することを特徴とする１．〜３．のいずれかに記載の培養方法。
５．前記１，４−ジオキサン分解菌が、Mycobacterium sp. D11（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１９２６）、Pseudonocardia sp. D17（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１９２７）、Pseudonocardia dioxanivorans CB1190の少なくとも１種であることを特徴とする１．〜４．のいずれかに記載の培養方法。
６．液体培地を供給しながら、該液体培地の供給量と同量の培養液を取り出す連続培養であることを特徴とする２．〜５．のいずれかに記載の培養方法。
７．ジエチレングリコールを含有することを特徴とする培地。
８．液体培地であることを特徴とする７．に記載の培地。
９．前記ジエチレングリコールの濃度が０．０１ｍｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌであることを特徴とする８．に記載の培地。
１０．コーンスティープリカー、カザミノ酸、酵母エキス、ペプトンの少なくとも１種を含有することを特徴とする７．〜９．のいずれかに記載の培地。
１１．１，４−ジオキサンを含む水に、１．〜６．のいずれかに記載の培養方法で培養した１，４−ジオキサン分解菌を注入することを特徴とする水処理方法。
１２．前記１，４−ジオキサン分解菌とともに、ジエチレングリコールを注入することを特徴とする１１．に記載の水処理方法。
１３．１，４−ジオキサンを含む土壌に、１．〜６．のいずれかに記載の培養方法で培養した１，４−ジオキサン分解菌を注入することを特徴とする土壌処理方法。
１４．前記１，４−ジオキサン分解菌とともに、ジエチレングリコールを注入することを特徴とする１３．に記載の土壌処理方法。
１５．１．〜６．のいずれかに記載の培養方法により培養した１，４−ジオキサン分解菌。
１６．１５．に記載の１，４−ジオキサン分解菌を固定化した固定化担体。
１７．１，４−ジオキサンを含む水、または土壌に、ジエチレングリコールを注入し、
前記１，４−ジオキサンを含む水、または土壌中に存在する１，４−ジオキサン分解菌の増殖を促進することを特徴とする１，４−ジオキサン処理方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の培養方法により、１，４−ジオキサン分解菌を効率よく増やすことができる。他の微生物が存在しても、１，４−ジオキサン分解菌を優先的に増やすことができ、滅菌設備が不要なため、大規模設備にて１，４−ジオキサン分解菌を増やすことが可能であり、下水処理場、工場排水処理施設、汚染現場等における１，４−ジオキサン処理に必要とされる大量の１，４−ジオキサン分解菌を供給することができる。培養した１，４−ジオキサン分解菌を水、または土壌に注入するだけで１，４−ジオキサンを処理することができるため、簡便で低コストに１，４−ジオキサンを処理することができる。
【００１４】
１，４−ジオキサンで汚染された水、または土壌に、ジエチレングリコールを注入することで、汚染環境下に従来存在している分解菌の増殖を促進し、分解菌を優先的に増やすことができる。そして、分解菌の菌体量が増えることにより、分解菌による１，４−ジオキサン処理を促進することができる。ジエチレングリコールを加えるだけでよいため、非常に低コストである。また、従来存在している分解菌を増やすだけであるため、生態系への影響を抑えることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】標準活性汚泥法における汚染水処理フロー図。
【図２】１，４−ジオキサン分解菌におけるジエチレングリコール存在下での増殖性を示す図。
【図３】１，４−ジオキサン分解菌における１，４−ジオキサン分解活性の経時変化を示す図。
【図４】（右）ジエチレングリコール、（左）グルコースを含有する培養液中で１，４−ジオキサン分解菌を培養中のリアクターの写真。
【図５】培養液中のジエチレングリコール濃度と１，４−ジオキサン分解菌のΔ菌体濃度の関係を示す図。
【図６】１，４−ジオキサン分解菌の培養中に、コーンスティープリカーを添加した時の１，４−ジオキサン分解活性の経時変化を示す図。
【図７】１，４−ジオキサン分解菌の培養中に、コーンスティープリカーを添加した時のジエチレングリコール濃度と菌体濃度の経時変化を示す図。
【図８】ジエチレングリコールを添加した液体培地中における土壌試料１〜７の培養前後（０日、６日後）におけるＳＤＩＭＯ遺伝子のＰＣＲ増幅産物の電気泳動の結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下に、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
本発明は、ジエチレングリコールを含有する培地を用いて１，４−ジオキサン分解菌を増やすことを特徴とする。
【００１８】
従来、１，４−ジオキサン分解菌（以下、分解菌という。）を増やすには、他の微生物が混入しないように、事前に十分に滅菌する必要があった。
本発明は、分解菌が、ジエチレングリコール存在下で他の微生物よりも優れた増殖性を示すという、これまでに知られていない全く新規な知見に基づくものである。分解菌が、ジエチレングリコール存在下で増殖性に優れている理由は不明であるが、分解菌は、他の微生物よりもジエチレングリコールを炭素源として利用する能力に優れているため、ジエチレングリコール存在下で優先的に増殖することができると推測される。そのため、ジエチレングリコール存在下では、他の微生物が生息していても分解菌を増やすことができる。すなわち、ジエチレングリコール存在下では、他の微生物を滅菌することなく、分解菌を増やすことができる。
【００１９】
ジエチレングリコールは、下記式（２）で表されるグリコールである。
【化２】
0005877918.tif 000003
【００２０】
分解菌は自然界に存在しており、１，４−ジオキサンで汚染された水中や土壌中から採取した汚泥等を、炭素源として１，４−ジオキサンのみを含む培地で培養することでスクリーニングすることができる。分解菌は、１，４−ジオキサンを単一炭素源として分解及び資化可能な菌と、テトラヒドロフランなどの他の成分の存在下で共代謝反応によって１，４−ジオキサンの分解を行う菌との２種に大別される。本発明で使用する分解菌としては特に制限されないが、１，４−ジオキサンを単一炭素源として利用する菌が好ましく、Mycobacterium sp. D11、Pseudonocardia sp. D17、Mycobacterium sp.D6、Pseudonocardia dioxanivorans CB1190、Afipia sp. D1、Mycobacterium sp. PH-06、などが好ましい。これらの中で、１，４−ジオキサンの分解能が比較的高いPseudonocardia sp. D17、Mycobacterium sp. D11及びPseudonocardia dioxanivorans CB1190が好ましい。
【００２１】
Mycobacterium sp. D11、Pseudonocardia sp. D17は、それぞれ受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１９２６、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１９２７として、独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８（郵便番号２９２−０８１８））に、２０１４年８月２９日付で国際寄託されている。
Pseudonocardia dioxanivorans CB1190（以下、ＣＢ１１９０株という。）は、米国ＡＴＣＣから購入することができる（ＡＴＣＣ  ５５４８６）。また、米国ＡＴＣＣの他に、ＪＣＭ（独立行政法人  理化学研究所  バイオリソースセンター  微生物材料開発室）やドイツのＤＳＭにおいても購入可能である。
【００２２】
分解菌を増やす条件は、ジエチレングリコールが存在する環境下であれば特に制限されない。例えば、液体培地、固体培地が挙げられる。また、滅菌処理されておらず、他の微生物が存在していてもよい。培地としては、分解菌を培養できるものであれば特に限定されず、ＭＧＹ培地やＣＧＹ培地等の公知の培地に、ジエチレングリコールを添加したものを使用することができる。
分解菌を大量に増やすためには液体培地を使用することが好ましく、液体培地を供給しながら、液体培地の供給量と同量の分解菌を含む培養液を取り出す連続培養で１，４−ジオキサン分解菌を増やすことがさらに好ましい。
【００２３】
分解菌を増やす際のジエチレングリコール濃度は特に限定されないが、液体培地であれば０．０１ｍｇ／Ｌ以上１００ｇ／Ｌ以下が好ましい。ジエチレングリコール濃度の下限値は、１ｇ／Ｌ以上であることがより好ましく、５ｇ／Ｌ以上であることがさらに好ましく、１０ｇ／Ｌ以上であることが最も好ましい。ジエチレングリコール濃度の上限値は６０ｇ／Ｌ以下であることがより好ましく、３０ｇ／Ｌ以下であることがさらに好ましく、２０ｇ／Ｌ以下であることが最も好ましい。また、固体培地であれば０．１ｗｔ％以上１０ｗｔ％以下が好ましい。
【００２４】
分解菌を増やす際には、分解菌の活動に必要な無機物質や有機物質を添加することができる。微生物の活動量は、必要な栄養素等の因子のうち、最も少ない因子によって制限されるので、不足する栄養素を添加することで、増殖を促進することができる。添加する無機物質としては特に制限されず、Ｋ２ＨＰＯ４、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ＦｅＣｌ３、ＣａＣｌ２、ＮａＣｌなどが挙げられる。
【００２５】
添加する有機物質としては、特に制限されないが、コーンスティープリカー、カザミノ酸、酵母エキス、ペプトンが好ましい。ジエチレングリコール以外の有機物質を添加することで分解菌の増殖速度を早くすることができる。ジエチレングリコールと、ジエチレングリコール以外の添加する有機物質との重量比は、６０：４０〜９９：１であることが好ましく、７０：３０〜９８：２であることがより好ましく、７５：２５〜９５：５であることがさらに好ましく、８０：２０〜９０：１０であることが最も好ましい。
【００２６】
分解菌の培養は１５〜４５℃で行うことが好ましい。２０〜４０℃がより好ましく、２５〜３５℃が最も好ましい。また、ｐＨは５〜８が好ましく、６〜８がより好ましい。培養時間は、必要な菌体量が得られるならば、特に制限されない。閉鎖系で分解菌を増やす場合、３〜３０日間が好ましい。
【００２７】
本発明の培養方法は、他の微生物を滅菌することなく分解菌を増やすことができ、滅菌装置が不要である。そのため、大規模スケールでの培養が容易であり、下水処理場や工場排水処理施設、汚染土壌の処理現場等での１，４−ジオキサン処理に必要な大量の菌体を供給することができる。
【００２８】
培養した分解菌を、１，４−ジオキサンで汚染された水に注入し、好気的環境下とすることで、分解菌による１，４−ジオキサンの生物処理を行うことができる。一般的な下水や工場排水等の水は栄養塩類を含んでいることが多いが、栄養塩類の濃度が低ければ必要な栄養塩類を注入することで、分解菌の代謝・資化による１，４−ジオキサン処理を促進することができる。また、分解菌とともにジエチレングリコールを注入することで、他の微生物も存在する水中においても分解菌の１，４−ジオキサン分解活性を維持することができる。なお、ジエチレングリコールは、生分解性に優れており環境中で素早く分解されるため、ジエチレングリコールによる環境への負荷は非常に小さい。
【００２９】
図１に、曝気槽を用いる標準活性汚泥法における汚染水処理フローを示す。標準活性汚泥法では、曝気槽において有用微生物による生物処理を行っている。曝気槽には、散気管が配設されており、散気管から気泡が曝気槽内の水に供給され、この気泡から水中に酸素が溶解し、有用微生物による代謝・資化により、有機物が処理される。曝気槽は好気的環境下であるため、曝気槽に分解菌を注入するだけで、汚染水中に含まれる１，４−ジオキサンを処理することができる。図１には、分解菌を含む培養液を注入するフローを示したが、連続培養により取り出した培養液を連続的に注入してもよい。また、培養液ではなく、培養液からろ別等した分解菌をそのまま、または、分解菌を樹脂等に固定化した固定化担体として注入してもよい。
【００３０】
培養した分解菌を曝気槽に注入するだけで、１，４−ジオキサン処理を行うことができるため、従来の標準活性汚泥法で用いられる設備をほとんどそのまま活用することができる。本発明の培養方法は、滅菌処理のための設備や薬品が不要なため、イニシャルコスト、ランニングコストともに抑えることができる。そのため、本発明の培養方法で培養した分解菌による生物処理法は、複数の酸化剤を用いる促進酸化法と比較して低コストである。また、分解菌の培養装置も市販のものをそのまま利用することができるため、低コストである。
【００３１】
培養した分解菌を、１，４−ジオキサンで汚染された土壌中に注入して１，４−ジオキサンを処理することができる。通常の土壌処理方法は、現場プラントの建設、土壌の掘削、無害化、埋め戻し等、膨大な手間とコストが必要であるが、本発明の方法では、土壌中に分解菌を注入するだけで１，４−ジオキサンを生物処理することができる。一般に土壌中には栄養素が不足しているため、分解菌とともにジエチレングリコールを注入することが好ましい。また、無機物質、及び／又は有機物質等、必要な栄養素を注入してもよい。
【００３２】
上記したように、分解菌は自然界に存在している。１，４−ジオキサンで汚染された水、または土壌にジエチレングリコールを注入することにより、自然界に存在する分解菌の増殖を促進し、分解菌を優先的に増やすことができる。分解菌の菌体量が増えると、分解菌による１，４−ジオキサン処理が促進される。ジエチレングリコールを加えるだけでよく、分解菌を培養する必要がないため、非常に低コストである。また、従来存在している分解菌を増やすだけであり、新たな分解菌を移入することがないため、生態系への影響を抑えることができる。
【００３３】
次に、本発明を実施例に基づいて、さらに具体的に説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。
【実施例】
【００３４】
「実施例１」
ＣＢ１１９０株、Ｄ１１株、Ｄ１７株を１，４−ジオキサン分解菌として使用した。１，４−ジオキサンを５００ｍｇ／Ｌの濃度で含むＣＧＹ培地（カシトン：５ｇ／Ｌ、グリセリン：５ｇ／Ｌ、酵母エキス：１ｇ／Ｌ）を用いて各分解菌を１０日間培養した。培養後、遠心分離機にて集菌・洗浄し、菌体を２０ｍＬの生理食塩水と混合したものを植菌液とした。なお、植菌液は、分光光度計を用いて濁度を統一したもの（ＯＤ６００：およそ１０）を用いた。
【００３５】
３００ｍＬ容量のバッフル付の三角フラスコに液体培地（培地組成：Ｋ２ＨＰＯ４：１ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４：１ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ：５０ｍｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：２００ｍｇ／Ｌ、ＦｅＣｌ３：１０ｍｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２：５０ｍｇ／Ｌ、ｐＨ：７．３）を１００ｍＬ加え、オートクレーブで滅菌した。その後、１ｇ／Ｌになるように所定濃度のジエチレングリコール溶液を添加した後、植菌液を１ｍＬ加えて２８℃、１２０ｒｐｍにて回転振盪培養を９日間行った。
【００３６】
培養終了後に吸引濾過にて培養液中の菌体をろ物として回収し、１０５℃で一晩乾燥した後、菌体重量を測定し菌体濃度（ｍｇ-ｄｒｙ  ｃｅｌｌ／Ｌ）を求めた。培養９日目の菌体濃度から初期菌体濃度を差し引いたΔ菌体濃度により、菌体の増殖性を評価した。
【００３７】
図２に各分解菌のジエチレングリコール存在下での増殖性を示す。すべての分解菌において菌体濃度が増加しており、分解菌がジエチレングリコールを炭素源として利用し、増殖できることを確認できた。特に、Ｄ１７株は非常に高い増殖性を示した。
【００３８】
「実施例２」
Ｄ１７株を、ＭＧＹ培地（Ｍａｌｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ：１０ｇ／Ｌ、グルコース：４ｇ／Ｌ、Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ：４ｇ／Ｌ）で２週間培養した。
１，４−ジオキサンを含む実地下水（ｐＨ：７．３８、１，４−ジオキサン：０．１６ｍｇ／Ｌ、リン酸イオン：０．０８ｍｇ／Ｌ、全窒素：３６．５ｍｇ／Ｌ、全有機炭素量：１１ｍｇ／Ｌ、化学的酸素要求量：３３ｍｇ／Ｌ）に、硫酸アンモニウムおよびリン酸水素二カリウムをそれぞれ１ｇ／Ｌの濃度になるように添加した後、ジエチレングリコールを２０ｇ／Ｌになるように加えて培養液を作成した。
この培養液６５０ｍＬを１Ｌ容量のリアクターに加え、Ｄ１７株を添加して（菌体濃度：１５７ｍｇ−ｄｒｙ  ｃｅｌｌ／Ｌ）、６日間培養を行った。培養中は、２８℃、ｐＨ７．０に制御し、０．６５Ｌ／ｍｉｎのエアレーションを行った。
【００３９】
「比較例１」
ジエチレングリコールをグルコースとした以外は実施例２と同様にして、分解菌を培養した。
【００４０】
「１，４−ジオキサン分解活性の測定１」
実施例２、比較例１の培養液から、それぞれ１ｍＬサンプリングし、１，４−ジオキサン分解活性を測定した。サンプリングは培養開始直後と、培養開始してから１〜６日目に行った。分解活性の測定方法は以下のとおりである。
【００４１】
１００ｍＬ容量のバッフル付の三角フラスコに、１００ｍｇ／Ｌの１，４−ジオキサンを含む液体培地（培地組成：Ｋ２ＨＰＯ４：１ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４：１ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ：５０ｍｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：２００ｍｇ／Ｌ、ＦｅＣｌ３：１０ｍｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２：５０ｍｇ／Ｌ、ｐＨ：７．３）１９ｍＬと、サンプリングした培養液１ｍＬを加え、２８℃、１２０ｒｐｍにて２４時間、回転振盪培養を行った。なお、三角フラスコは全部で３本用意し、同様の手順で試験を実施した。
【００４２】
培養終了後の溶液中の１，４−ジオキサン濃度をヘッドスペースガスクロマトグラフ質量分析計（島津製作所：ＧＣ／ＭＳ−ＱＰ２０１０  ＰＬＵＳ、ＴＵＲＢＯＭＡＴＲＩＸ  ＨＳ４０）にて測定した。また、培養液を添加しないブランク系も同様の手順にて試験を実施し、下記の式にて、１，４−ジオキサンの分解活性を求めた。本測定方法において、分解活性は、１ｍｌの培養液が２４時間で分解した１，４−ジオキサンの量を表す。測定結果の相加平均値（ｎ＝３）を図３に示す。また、培養３日目のリアクターの写真を図４に示す。図４において、右がジエチレングリコールを用いた実施例２、左がグルコースを用いた比較例１のリアクターである。
【００４３】
１，４−ジオキサン分解活性（ｍｇ−１，４−Ｄｉｏｘａｎｅ／ｍＬ−培養液）
＝（Ｃ０−Ｃ２４）×２０ｍＬ／１０００ｍＬ
Ｃ０（ｍｇ／Ｌ）：培養液を添加していないブランク系を、２４時間回転振盪培養した後の１，４−ジオキサン濃度。
Ｃ２４（ｍｇ／Ｌ）：培養液を添加した系を、２４時間回転振盪培養した後の１，４−ジオキサン濃度。
【００４４】
ジエチレングリコールを炭素源とする実施例２は、培養開始直後０．０４であった分解活性が日数の経過とともに上昇し、培養６日目には１．６３まで上昇した。加熱等の滅菌処理を行っていないため、実地下水中に生息していた他の微生物は滅菌されていないが、分解活性が上昇していることから、ジエチレングリコール存在下でＤ１７株が優先的に増殖していることが明らかとなった。また、図４（右）に示すように、培養３日目の培養液は若干白濁していたが、透明性を有していた。
【００４５】
グルコースを炭素源とする比較例１は、培養期間中の分解活性は０．１５〜０．２９の範囲で変動したものの、分解活性の上昇は認められなかった。これは、Ｄ１７株が実地下水中に存在している他の微生物よりもグルコースを利用する能力に劣るため、Ｄ１７株が増殖できなかったためである。また、培養液は徐々に濁り始め、３日目の培養液は、図４（左）に示すように著しく白濁した。これは、その他の微生物が優先的に増殖したためである。
【００４６】
培養６日目の分解活性は、実施例２が１．６３、比較例１が０．２０と、実施例２は比較例１に比べて８倍以上優れていた。これは、Ｄ１７株が他の微生物と比べて、ジエチレングリコールを炭素源として利用する能力に優れており、Ｄ１７株の菌体量が増加したためであると考えられる。
【００４７】
「実施例３」
３００ｍＬ容量のバッフル付の三角フラスコに、１ｇ／Ｌジエチレングリコールを含む液体培地（培地組成：Ｋ２ＨＰＯ４：１ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４：１ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ：５０ｍｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：２００ｍｇ／Ｌ、ＦｅＣｌ３：１０ｍｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２：５０ｍｇ／Ｌ、ｐＨ：７．３）を１００ｍＬ加え、事前にＭＧＹ培地で培養したＤ１７株を植菌して（初期菌体濃度：１１１ｍｇ−ｄｒｙ  ｃｅｌｌ／Ｌ）、２８℃、１２０ｒｐｍにて７日間、回転振盪培養を行った。
【００４８】
「実施例４」
液体培地中のジエチレングリコールの濃度を５ｇ／Ｌとした以外は実施例３と同様にして、分解菌を培養した。
「実施例５」
液体培地中のジエチレングリコールの濃度を１０ｇ／Ｌとした以外は実施例３と同様にして、分解菌を培養した。
「実施例６」
液体培地中のジエチレングリコールの濃度を２０ｇ／Ｌとした以外は実施例３と同様にして、分解菌を培養した。
「実施例７」
液体培地中のジエチレングリコールの濃度を３０ｇ／Ｌとした以外は実施例３と同様にして、分解菌を培養した。
【００４９】
「菌体濃度測定」
培養終了後、吸引濾過にて培養液中の菌体をろ物として回収し、１０５℃で一晩乾燥した後、回収した菌体重量を測定した。測定した菌体重量値から、菌体濃度（ｍｇ−ｄｒｙ  ｃｅｌｌ／Ｌ）を求めた。なお、各実施例では、同様の試験系を２本準備し、その平均値を菌体密度とした。培養７日目の菌体濃度から初期菌体濃度を差し引いたΔ菌体濃度により、菌体の増殖性を評価した。図５にΔ菌体濃度を示す。
【００５０】
ジエチレングルコール濃度が１ｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌと濃くなるにつれて、菌体濃度が上昇した。ジエチレングリコール濃度が１０ｇ／Ｌ〜３０ｇ／Ｌである実施例５〜７では、ジエチレングリコール濃度が大きくなっても菌体濃度がほとんど変わらなかった。実施例５〜７の培養終了後のｐＨを測定したところ、ｐＨが３．４２〜３．９１を示しており、ｐＨ低下によって増殖が阻害されたため、菌体濃度が同程度となったと推測される。
【００５１】
「実施例８」
実施例２で用いた１，４−ジオキサンを含む実地下水に、硫酸アンモニウムおよびリン酸水素二カリウムをそれぞれ１ｇ／Ｌの濃度になるように添加した後、１０ｇ／Ｌになるように所定濃度のジエチレングリコール溶液を加えて培養液を作成した。
この培養液８Ｌを１０Ｌ容量のリアクターに加え、Ｄ１７株を添加して（初期菌体濃度：４３．２ｍｇ−ｄｒｙ  ｃｅｌｌ／Ｌ）、４Ｌ／ｍｉｎのエアレーションを行いながら、２８℃にて９日間培養した。また、培養４日目に、コーンスティープリカーを濃度が５ｇ／Ｌになるように一度のみ添加した。なお、培養期間中は、ｐＨ７．０±０．２に制御した。
【００５２】
「１，４−ジオキサン分解活性の測定２」
培養液から１ｍＬサンプリングし、１，４−ジオキサン分解活性を上記「１，４−ジオキサン分解活性の測定１」と同様にして測定した。サンプリングは培養開始直後と、培養開始してから１、２、３、４、５、７、９日目に行った。なお、４日目のサンプリングは、ＣＳＬを添加する直前に行った。測定結果を図６に示す。
【００５３】
「ジエチレングリコール濃度の測定」
上記「１，４−ジオキサン分解活性の測定２」でサンプリングした培養液中のジエチレングリコール濃度を、高速液体クロマトグラフィー（Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ２６９５  検出器：ＲＩＤ）を用いて測定した。
「菌体濃度の測定」
培養開始直後と、培養開始してから４日目と９日目に培養液を１５０ｍＬサンプリングし、メスシリンダーにて正確に１００ｍＬ秤取った後、吸引濾過にて菌体をすべて回収・洗浄し、１０５℃で一晩乾燥した。なお、４日目のサンプリングは、コーンスティープリカーを添加する直前に行った。その後、乾燥重量を測定し、菌体濃度として算出した。
ジエチレングリコール濃度、および菌体濃度の経時変化を図７に示す。
【００５４】
培養直後の分解活性は０．０２と小さかったが、培養１日目の分解活性は０．３８、培養４日目の０．９３まで上昇した。コーンスティープリカーを添加してから２４時間後である培養５日目の分解活性は１．６１と大きく上昇し、７日目、９日目の分解活性は１．７３であった。７日目以降の分解活性は、実際にはさらに上昇しているが、１，４−ジオキサン濃度が定量限界値未満まで低下したため、正確な活性値として算出できなかった。このことから、コーンスティープリカーを添加することで、１，４−ジオキサンの分解活性が高まることが確かめられた。なお、本試験方法での１，４−ジオキサンの仕込み濃度は１００ｍｇ／Ｌであり、ブランク系での減少を考慮した分解活性値の上限は約１．７３である。
【００５５】
ジエチレングリコール濃度は、試験開始から４日目までは緩やかに減少した。培養４日目以降はジエチレングリコール濃度の低下が早まっており、コーンスティープリカーを添加することで、ジエチレングリコールの資化速度、すなわち、分解菌の増殖速度が早くなったことを確認した。
菌体濃度は、培養０日目では９４ｍｇ−ｄｒｙ  ｃｅｌｌ／Ｌ、４日目では２８８ｍｇ−ｄｒｙ  ｃｅｌｌ／Ｌであったが、培養９日目には２０４３ｍｇ−ｄｒｙ  ｃｅｌｌ／Ｌと増加した。そのためジエチレングリコール以外の有機物質を添加することで分解菌を高濃度に含む培養液を得られることが明らかとなった。
【００５６】
「実施例９」
１，４−ジオキサン汚染サイトの異なる場所から採取した７種類の土壌において、ジエチレングリコールを添加した培地での培養によるＳＤＩＭＯ保有菌の増殖を調査した。なお、ＳＤＩＭＯ保有菌の増殖を、ＳＤＩＭＯをコードする遺伝子（ＳＤＩＭＯ遺伝子）に由来する約４２０ｂｐのＰＣＲ増幅産物の増加によって評価した。
９０ｍｌの液体培地（培地組成：Ｋ２ＨＰＯ４：１ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４：１ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ：５０ｍｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：２００ｍｇ／Ｌ、ＦｅＣｌ３：１０ｍｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２：５０ｍｇ／Ｌ、ｐＨ：７．０）を入れた３００ｍｌ三角フラスコに、湿重量１０ｇの土壌を投入し、ジエチレングリコールを終濃度２０ｇ／Ｌになるように添加して、２８℃、１２０ｒｐｍで回転振盪培養を行った。
【００５７】
ジエチレングリコール添加直後および６日後に５ｍｌを採取し、遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、５分）によって上清を除去した後、土壌０．５ｇ（湿重量）からＤＮＡを回収した。ＤＮＡ抽出には土壌ＤＮＡ抽出キット（株式会社ニッポン・ジーン製、商品名：ＩＳＯＩＬ  ｆｏｒ  Ｂｅａｄｓ  Ｂｅａｔｉｎｇ）を用い、抽出したＤＮＡはＤＮＡフラグメント精製キット（東洋紡株式会社製、商品名：ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ  ＆  Ｇｅｌ  Ｃｌｅａｎ  ｕｐ−）を用いて精製した。
【００５８】
ＳＤＩＭＯ遺伝子の検出は、上記非特許文献５に記載されたプライマーセット［ＮＶＣ５７，ＮＶＣ６６］を用いたＰＣＲによって行った。このプライマーセットを用いたＰＣＲにより、試料中にＳＤＩＭＯ遺伝子が存在する場合には約４２０ｂｐのＰＣＲ増幅産物が特異的に増幅される。ＰＣＲの反応系は５０μｌ（ＳａｐｐｈｉｒｅＡｍｐ  Ｆａｓｔ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（タカラバイオ株式会社製）２５μｌ、プライマー各０．５μＭ、ＤＮＡ１μｌ、滅菌超純水にて５０μｌにメスアップ）とし、ＰＣＲ増幅は、９４℃、５分の熱変性の後、９４℃、３０秒の熱変性、５７℃、３０秒のアニーリング、７２℃、１分の伸長を３５サイクル繰り返し、最後に７２℃、５分の伸長を行う条件で実施した。ＰＣＲ後のサンプルは、１．５％アガロースゲルを用いた電気泳動（１００Ｖ、３０分）を行い、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉにより１５分間染色した後、紫外線を照射して、約４２０ｂｐのＰＣＲ増幅産物の有無と強度を調べた。図８にジエチレングリコールを添加した液体培地中における土壌試料１〜７の培養前後（０日、６日後）におけるＳＤＩＭＯ遺伝子のＰＣＲ増幅結果を示す。なお、図８において、Ｍで示されるレーンは、ＤＮＡラダーマーカー（タカラバイオ株式会社製、商品名：１００ｂｐ  ＤＮＡ  ｌａｄｄｅｒ）、Ｐで示されるレーンは１，４−ジオキサン資化菌であるPseudonocardia sp. D17のＤＮＡ、Ｎで示されるレーンはＤＮＡなしのネガティブコントロールである。
【００５９】
培養前の土壌では、多くの場合に約４２０ｂｐのＰＣＲ増幅産物はごく僅かに検出されたのみであった。一方、培養後の土壌では、全ての試料において約４２０ｂｐのＰＣＲ増幅産物が明確に検出された。培養前後における約４２０ｂｐのＰＣＲ増幅産物量を比較すると、培養前に増幅産物量が多かった土壌試料４以外では、培養後に増幅産物量が顕著に増えていることが確認された。以上の結果から、ジエチレングリコールを用いて培養することで、土壌中にごく僅か存在するＳＤＩＭＯ保有菌が優先的に増殖したことが確認できた。すなわち、１，４−ジオキサンで汚染された水、または土壌に、ジエチレングリコールを注入することで、汚染環境下に従来存在している分解菌を優先的に増やすことができ、分解菌の菌体量が増えることで１，４−ジオキサン処理の分解を促進できることが確かめられた。
【要約】
【課題】１，４−ジオキサン分解菌の効率的な培養方法を提供する。
【解決手段】ジエチレングリコールを含有する培地を用いて１，４−ジオキサン分解菌を増やすことを特徴とする１，４−ジオキサン分解菌の培養方法。
【選択図】図１【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図４】
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【図８】
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