(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）
【化１】
0006004422.tif 000008
（式（１）中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｃ１〜Ｃ３アルキル基もしくは水素原子を示し、互いに結合して環を形成してもよい（ただし、Ｒ１およびＲ２の両方が水素原子であることは除く）。Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基を示す。）
で表される化合物またはその医薬的に許容される塩を含有する、ヌクレオチド除去修復阻害剤。
【請求項２】
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、メチル基、エチル基、プロピル基または水素原子である（ただし、Ｒ１およびＲ２の両方が水素原子であることは除く）請求項１に記載のヌクレオチド除去修復阻害剤。
【請求項３】
Ｒ１およびＲ２は、互いに結合して５〜７員環を形成している請求項１に記載のヌクレオチド除去修復阻害剤。
【請求項４】
Ｒ３は、炭素数１〜３のアルコキシ基である、請求項１〜３のいずれか一に記載のヌクレオチド除去修復阻害剤。
【請求項５】
Ｒ３は、メトキシ基である、請求項４に記載のヌクレオチド除去修復阻害剤。
【請求項６】
Ｒ１はメチル基、Ｒ２はメチル基及びＲ３はメトキシ基である請求項１に記載のヌクレオチド除去修復阻害剤。
【請求項７】
Ｒ１はエチル基、Ｒ２は水素原子及びＲ３はメトキシ基である請求項１に記載のヌクレオチド除去修復阻害剤。
【請求項８】
Ｒ１はメチル基、Ｒ２は水素原子及びＲ３はメトキシ基である請求項１に記載のヌクレオチド除去修復阻害剤。
【請求項９】
Ｒ１はプロピル基、Ｒ２は水素原子及びＲ３はメトキシ基である請求項１に記載のヌクレオチド除去修復阻害剤。
【請求項１０】
Ｒ１及びＲ２は互いに結合して６員環を形成し、Ｒ３はメトキシ基である請求項１に記載のヌクレオチド除去修復阻害剤。
【請求項１１】
腫瘍の治療用である、請求項１〜１０のいずれか一に記載のヌクレオチド除去修復阻害剤。
【請求項１２】
一般式（１）
【化２】
0006004422.tif 000009
（式（１）中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｃ１〜Ｃ３アルキル基もしくは水素原子を示し、互いに結合して環を形成してもよい（ただし、Ｒ１およびＲ２の両方が水素原子であることは除く）。Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基を示す。）
で表される化合物またはその医薬的に許容される塩を有効成分とする、抗腫瘍剤の増強剤または紫外線治療の増強剤。
【請求項１３】
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、メチル基、エチル基、プロピル基または水素原子である（ただし、Ｒ１およびＲ２の両方が水素原子であることは除く）請求項１２に記載の増強剤。
【請求項１４】
Ｒ１およびＲ２は、互いに結合して５〜７員環を形成している請求項１２に記載の増強剤。
【請求項１５】
Ｒ３は、炭素数１〜３のアルコキシ基である、請求項１２〜１４のいずれか一に記載の増強剤。
【請求項１６】
Ｒ３は、メトキシ基である、請求項１５に記載の増強剤。
【請求項１７】
Ｒ１はメチル基、Ｒ２はメチル基及びＲ３はメトキシ基である請求項１２に記載の増強剤。
【請求項１８】
Ｒ１はエチル基、Ｒ２は水素原子及びＲ３はメトキシ基である請求項１２に記載の増強剤。
【請求項１９】
Ｒ１はメチル基、Ｒ２は水素原子及びＲ３はメトキシ基である請求項１２に記載の増強剤。
【請求項２０】
Ｒ１はプロピル基、Ｒ２は水素原子及びＲ３はメトキシ基である請求項１２に記載の増強剤。
【請求項２１】
Ｒ１及びＲ２は互いに結合して６員環を形成し、Ｒ３はメトキシ基である請求項１２に記載の増強剤。
【請求項２２】
抗腫瘍剤の投与前または紫外線治療前に、該化合物が投与されるように用いられることを特徴とする、請求項１２〜２１のいずれか一に記載の増強剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヌクレオチド除去修復阻害剤、ならびに、抗腫瘍剤の増強剤及び紫外線治療の増強剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）は、太陽光紫外線で生じるシクロブタン型ピリミジンダイマー（ＣＰＤ）や６−４光産物（６−４ＰＰ）などの二量体型ピリミジン損傷や、アフラトキシンＢ１、ベンゾ［ａ］ピレン、アセチルアミノフルオレン、シスプラチンなど多様な化学物質で生じる塩基付加体を取り除く普遍的なＤＮＡ修復機構である。この修復反応は、ＤＮＡ損傷の認識、損傷部位の二本鎖巻き戻し、ＤＮＡ損傷の両側切断、一本鎖ギャップのＤＮＡ合成、親鎖との連結からなり、試験管内の再構成反応系においても、１個のＤＮＡ損傷の修復に約３０種類ものポリペプチドが必要となる複雑な反応である。また、細胞内ではクロマチンリモデリング因子やユビキチンＥ３リガーゼなどさらに多くの因子が関与することが知られている。この修復機構に先天的異常があると高発がん性の劣性遺伝疾患・色素性乾皮症（xeroderma pigmentosum）を発症し、健常人の数千倍もの頻度で太陽露光部に皮膚癌を生じ、内部の癌も数倍から数十倍頻度が高い。
【０００３】
紫外線損傷に特異的なモノクローナル抗体を用いた多くの免疫測定法が開発され、細胞ヌクレオチド除去修復活性の分析のために広く使われている。本発明者等は、近赤外蛍光画像処理システムと連動する損傷特異抗体を用いた間接的免疫蛍光染色に基づく、マイクロプレートフォーマット細胞ベース免疫測定法（microplate-formatted  cell-based  immunoassay  for  NER  of  UV  photoproducts、Ｍ−ＣＩＮＵＰ）を開発した。この免疫測定法は、少量の細胞であっても迅速で定量分析可能なＮＥＲ活性測定方法である（特許文献１）。
【０００４】
抗腫瘍剤の種類やその作用機序は数多く知られており、ＤＮＡのアルキル化、架橋化等もその一つである。シスプラチンは広く用いられている抗腫瘍剤であり、９０％以上のＤＮＡ鎖内架橋、５％以下のＤＮＡ鎖間架橋からなる塩基付加体を形成する（非特許文献１、非特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１０−１６４３３７号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Jung, Y. and S. J. Lippard(2007)  Chem. Rev. 107, 1387-1407
【非特許文献２】Koberle, B., M. T. Tomicic, S. Usanova, B. Kaina (2010) Biochim. Biophys. Acta 1806, 172-182
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
新規ヌクレオチド除去修復阻害剤、新規抗腫瘍剤の増強剤、および新規紫外線治療の増強剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は以下からなる。
１．一般式（１）
【化１】
0006004422.tif 000002
（式（１）中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、置換基を有していてもよいＣ１〜Ｃ３アルキル基もしくは水素原子を示し、互いに結合して環を形成してもよい。Ｒ３は、置換基を有していてもよいＣ１〜Ｃ６アルコキシ基を示す。）
で表される化合物またはその医薬的に許容される塩を含有する、ヌクレオチド除去修復阻害剤。
２．Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、メチル基、エチル基、プロピル基または水素原子である前項１に記載のヌクレオチド除去修復阻害剤。
３．Ｒ１およびＲ２は、互いに結合して５〜７員環を形成している前項１に記載のヌクレオチド除去修復阻害剤。
４．Ｒ３は、炭素数１〜３のアルコキシ基である、前項１〜３のいずれか一に記載のヌクレオチド除去修復阻害剤。
５．Ｒ３は、メトキシ基である、前項４に記載のヌクレオチド除去修復阻害剤。
６．Ｒ１はメチル基、Ｒ２はメチル基及びＲ３はメトキシ基である前項１に記載のヌクレオチド除去修復阻害剤。
７．Ｒ１はエチル基、Ｒ２は水素原子及びＲ３はメトキシ基である前項１に記載のヌクレオチド除去修復阻害剤。
８．Ｒ１はメチル基、Ｒ２は水素原子及びＲ３はメトキシ基である前項１に記載のヌクレオチド除去修復阻害剤。
９．Ｒ１はプロピル基、Ｒ２は水素原子及びＲ３はメトキシ基である前項１に記載のヌクレオチド除去修復阻害剤。
１０．Ｒ１及びＲ２は互いに結合して６員環を形成し、Ｒ３はメトキシ基である前項１に記載のヌクレオチド除去修復阻害剤。
１１．腫瘍の治療用である、前項１〜１０のいずれか一に記載のヌクレオチド除去修復阻害剤。
１２．一般式（１）
【化２】
0006004422.tif 000003
（式（１）中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、置換基を有していてもよいＣ１〜Ｃ３アルキル基もしくは水素原子を示し、互いに結合して環を形成してもよい。Ｒ３は、置換基を有していてもよいＣ１〜Ｃ６アルコキシ基を示す。）
で表される化合物またはその医薬的に許容される塩を有効成分とする、抗腫瘍剤または紫外線治療の増強剤。
１３．Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、メチル基、エチル基、プロピル基または水素原子である前項１２に記載の増強剤。
１４．Ｒ１およびＲ２は、互いに結合して５〜７員環を形成している前項１２に記載の増強剤。
１５．Ｒ３は、炭素数１〜３のアルコキシ基である、前項１２〜１４のいずれか一に記載の増強剤。
１６．Ｒ３は、メトキシ基である、前項１５に記載の増強剤。
１７．Ｒ１はメチル基、Ｒ２はメチル基及びＲ３はメトキシ基である前項１２に記載の増強剤。
１８．Ｒ１はエチル基、Ｒ２は水素原子及びＲ３はメトキシ基である前項１２に記載の増強剤。
１９．Ｒ１はメチル基、Ｒ２は水素原子及びＲ３はメトキシ基である前項１２に記載の増強剤。
２０．Ｒ１はプロピル基、Ｒ２は水素原子及びＲ３はメトキシ基である前項１２に記載の増強剤。
２１．Ｒ１及びＲ２は互いに結合して６員環を形成し、Ｒ３はメトキシ基である前項１２に記載の増強剤。
２２．抗腫瘍剤の投与前または紫外線治療前に、該化合物が投与されるように用いられることを特徴とする、前項１２〜２１のいずれか一に記載の増強剤。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のヌクレオチド除去修復剤は、ヌクレオチド除去修復効果に優れ、単独で腫瘍の治療剤として用いることができる。さらに、他の抗腫瘍剤の抗腫瘍効果を増強することができる。また、皮膚の腫瘍の紫外線治療の効果を増強することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】化合物ライブラリーからヌクレオチド除去修復阻害活性を有する物質をスクリーニングするシステムの説明図である。
【図２】ＮＰＤ４００５の６−４ＰＰ修復阻害効果を表すグラフである。９６ウェルマイクロプレート中のＨｅＬａ細胞を５０μｇ／ｍｌ（◆）もしくはｌ００μｇ／ｍｌ（■）のＮＰＤ４００５、またはＤＭＳＯ（□）で前処理し、６−４ＰＰの修復動態を分析した。
【図３】ＮＰＤ１３４０５の胃癌細胞における６−４ＰＰ修復動態と細胞毒性を表すグラフである。（Ａ）ＫＫＬＳ細胞をＮＰＤ１３４０５（５０μｇ／ｍｌ）（■）またはＤＭＳＯ（□）により１２時間前処理し、１０Ｊ／ｍ２のＵＶ−Ｃを照射し、６―４ＰＰ修復動態をＥＬＩＳＡにより分析した。各値は３つの独立した実験の平均値であり、エラーバーは標準偏差を示す。（Ｂ）ＫＫＬＳ細胞を６０ｍｍプレートに播種（２００細胞／プレート）し、６時間培養後、種々の濃度のＮＰＤ１３４０５を添加した。７〜８日間培養した後固定しギムザ染色液で染色してコロニー数を計測した。各値は３つの独立した実験の平均値であり、エラーバーは標準偏差を示す。
【図４】ＮＰＤ１３４０５前処理によるＵＶとシスプラチンの細胞毒性効果増強作用を表すグラフである。ＫＫＬＳ細胞をＮＰＤ１３４０５（１０μｇ／ｍｌ）（■）またはＤＭＳＯ（□）で１２時間前処理し、６０ｍｍプレートに播種した。６時間培養後、種々の線量のＵＶ−Ｃを照射し（Ａ）、または、種々の濃度のシスプラチンで２４時間処理した（Ｂ）。培地を交換後さらに７〜８日間培養してコロニー数を計測した。各値は３つの独立した実験の平均値であり、エラーバーは標準偏差を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
ヌクレオチド除去修復は普遍的なＤＮＡ修復機構であり、１個のＤＮＡ損傷の修復に約３０種類ものポリペプチドが必要となる複雑な反応である。また、細胞内ではクロマチンリモデリング因子やユビキチンＥ３リガーゼなどさらに多くの因子が関与することが知られている。本発明における、ヌクレオチド除去修復阻害剤（ＮＥＲ阻害剤）は、ＮＥＲ機構そのものか、その調節機構を直接的あるいは間接的に阻害してＤＮＡ損傷の修復を阻害するものである。
【００１２】
本発明のヌクレオチド除去修復阻害剤の有効成分、ならびに本発明の抗腫瘍剤または紫外線治療の増強剤の有効成分は、下記の一般式（１）で表される化合物である。
【００１３】
【化３】
0006004422.tif 000004
【００１４】
（式（１）中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、置換基を有していてもよいＣ１〜Ｃ３アルキル基もしくは水素原子を示し、互いに結合して環を形成してもよい。Ｒ３は、置換基を有していてもよいＣ１〜Ｃ６アルコキシ基を示す。）
【００１５】
本明細書において、「置換基を有していてもよいＣ１〜Ｃ３アルキル基」の「Ｃ１〜Ｃ３アルキル基」とは、直鎖または分枝鎖の炭素数１〜３のアルキル基である。置換基は限定されるものではないが、１または複数個のハロゲン原子、ヒドロキシ基、アミノ基等が挙げられる。Ｒ１としてはメチル基、エチル基またはプロピル基が好ましい。Ｒ２としては好ましくはメチル基または水素原子である。好ましくは、Ｒ１およびＲ２のいずれかが水素であるときは、他方はアルキル基である。
【００１６】
本明細書において、「互いに結合して環を形成してもよい」とは、Ｒ１とＲ２の炭素原子が互いに結合して環を形成してもよいという意味であり、５〜８員環の形成が挙げられる。５〜７員環が好ましく６員環がより好ましい。これら環は置換基を有していてもよく、置換基は限定されるものではないが、１または複数個のハロゲン原子、ヒドロキシ基、アミノ基等が挙げられる。
【００１７】
本明細書において、「置換基を有していてもよいＣ１〜Ｃ６アルコキシ基」の「Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基」とは、直鎖または分枝鎖の炭素数１〜６のアルコキシ基である。置換基は限定されるものではないが、１または複数個のハロゲン原子、ヒドロキシ基、アミノ基等が挙げられる。Ｒ３としては炭素数１〜３のアルコキシ基が好ましく、より好ましくは、メトキシ基である。
【００１８】
さらに一般式（１）の化合物は次の下記群から選ばれる化合物であることが好ましい。ＮＰＤ４００５、Ｐ２０００Ｎ−３７９２４およびＮＰＤ１３４０５がより好ましく、ＮＰＤ１３４０５が最も好ましい。
【００１９】
【化４】
0006004422.tif 000005
【００２０】
本発明の一般式（１）で表される化合物は、所望により医薬的に許容される塩とすることができる。その医薬的に許容される塩とは、塩を形成し得るに十分な塩基性度または酸性度を有する場合の医薬的に許容される塩を意味し、例えば無機酸又は有機酸との酸付加塩が挙げられる。無機酸との塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩又はリン酸塩等が挙げられる。有機酸との塩としては、例えば、ぎ酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、プロピオン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、クエン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩又はベンゼンスルホン酸塩等が挙げられる。また、式（１）で表される化合物にカルボキシル基等の酸性官能基が存在する場合は、塩基との塩とすることもできる。塩基との塩としては、例えばアルギニン、リジン又はトリエチルアンモニウム等の有機塩基との塩、アルカリ金属（ナトリウム又はカリウム等）又はアルカリ土類金属（カルシウム又はバリウム等）等の無機塩基との塩、又はアンモニウム塩等が挙げられる。式（１）で表される化合物、又はその医薬的に許容される塩は、それらの水和物等の溶媒和物の形態をとってもよい。
【００２１】
一般式（１）で表される代表的な化合物の合成方法を以下に示す。下記化合物の合成方法から得られた化合物を、自体公知の方法により、置換基を変更することにより、一般式（１）で表される化合物を合成することができる。また、植物など天然物質の誘導体{参照：理化学研究所 ケミカルバイオロジー研究領域 天然化合物バンク(RIKEN NPDepo)の化合物データベース（http://npd.riken.jp/npedia/）}から合成してもよい。
【００２２】
【化５】
0006004422.tif 000006
【００２３】
本発明のヌクレオチド除去修復阻害剤の有効成分である一般式（１）で表される化合物は、ヌクレオチド除去修復阻害活性を有する。ヌクレオチド除去修復の阻害活性は、当業者に通常用いられる方法（例えば、免疫学的手法等）を用いて検出することができる。免疫学的手法を用いて調べる方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ（enzyme-linked  immune  sorbent  assay）（Mutat.Res.235,187-194）、ＩＳＢＡ（immunoslot  blot  assay）（J.Photochem.Photobiol.B24,25-31）、免疫蛍光染色法（Mutat.Res.236,99-105）が挙げられる。本発明者等が開発したＭ−ＣＩＮＵＰ（microplate-formatted  cell-based  immunoassay  for  NER  of  UV  photoproducts）も用いることができる。
【００２４】
本発明に係るヌクレオチド除去修復阻害剤は、腫瘍の治療に使用することができる。有効成分として一般式（１）で表される化合物を単独で腫瘍の治療に使用することができるヌクレオチド除去修復阻害剤である。また、他の抗腫瘍剤と混合または併用して腫瘍の治療に使用することができるヌクレオチド除去修復阻害剤である。一般式（１）で表される化合物を有効成分とする抗腫瘍剤も本発明に包含される。
【００２５】
抗腫瘍活性は、当業者に通常用いられる増殖阻害試験法を用いて調べることができる。細胞の増殖阻害活性は、試験化合物の存在下または非存在下における細胞（例えば、腫瘍細胞）の増殖の程度を比較することによって実施することができる。増殖の程度は、例えば、生細胞を測定する試験系を用いて調べることができる。生細胞の測定方法としては、例えば、［３Ｈ］−チミジンの取り込み試験、ＢｒｄＵ法またはＭＴＴアッセイまたはコロニー形成試験等が挙げられる。
【００２６】
また、ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍活性は、当業者に通常用いられる抗腫瘍試験法を用いて調べることができる。例えば、マウス、ラット等に各種腫瘍細胞を移植し、移植細胞の生着が確認された後に、対象化合物を経口投与、静脈内投与等し、数日〜数週間後に、薬剤無投与群における腫瘍増殖と化合物投与群における腫瘍増殖とを比較することによりｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍活性を確認することができる。
【００２７】
一般式（１）で表される化合物は、抗腫瘍剤の作用を増強することができる。抗腫瘍剤の作用増強は、抗腫瘍剤の抗腫瘍活性を増強する作用であり、この作用増強作用には、腫瘍細胞の抗腫瘍剤感受性を増強する作用、抗腫瘍剤の投与量を低減する作用、および抗腫瘍剤の副作用軽減作用も含まれる。
【００２８】
抗腫瘍剤の作用増強作用は、当業者に通常用いられる方法を用いて検出することができる。試験化合物の存在下または非存在下において抗腫瘍剤と腫瘍細胞を接触させ、腫瘍細胞の増殖の程度を比較することによって検出することができる。増殖の程度は、例えば、生細胞を測定する試験系を用いて調べることができる。生細胞の測定方法としては、例えば、［３Ｈ］−チミジンの取り込み試験、ＢｒｄＵ法またはＭＴＴアッセイまたはコロニー形成試験等が挙げられる。例えば、本発明に係る化合物で腫瘍細胞を前処理した後に、抗腫瘍剤で処理して腫瘍細胞の増殖の程度を測定する方法が挙げられる。
【００２９】
また、ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍剤の作用増強効果は、当業者に通常用いられる方法を用いて調べることができる。例えば、マウス、ラット等に各種腫瘍細胞を移植し、移植細胞の生着が確認された後に、対象化合物と抗腫瘍剤を投与（経口投与、静脈内投与等）し、数日〜数週間後に、化合物無投与群における腫瘍増殖と化合物投与群における腫瘍増殖とを比較することによりｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍剤の作用増強作用を確認することができる。対象化合物と抗腫瘍剤の投与は、同時または異なる時間に投与することが可能であり、投与経路も同一であっても異なっていてもよい。
【００３０】
本発明の抗腫瘍剤の増強剤は、ＤＮＡに損傷を作るタイプの抗腫瘍剤の作用を増強することができる。特に大きな塩基付加体を誘発する抗腫瘍剤の作用を増強することができる。例えば、アルキル化剤、抗がん性抗生物質、プラチナ製剤があげられる。具体的には、アルキル化剤であるイホスファミド、シクロホスファミド、ダカルバジン、テモゾロミド、ニムスチン、ブスルファン、メルファラン等、プラチナ製剤であるオキサリプラチン、カルボプラチン、シスプラチン、ネダプラチン等が例示される。
【００３１】
本発明の抗腫瘍剤の増強剤は、抗腫瘍剤の投与と同時、抗腫瘍剤の投与の前、または後に投与することができる。抗腫瘍剤と混合して一つの製剤とすることもできる。好ましくは、抗腫瘍剤の投与前に投与される。より好ましくは、抗腫瘍剤投与の１〜２４時間前、さらに好ましくは、２〜１８時間前に投与される。
【００３２】
本発明の抗腫瘍剤の増強剤はさらに他の抗腫瘍剤と併用して用いてもよい。
【００３３】
本発明のヌクレオチド除去修復阻害剤および抗腫瘍剤の増強剤は、腫瘍または癌、例えば、肺癌、消化器癌、卵巣癌、子宮癌、乳癌、肝癌、頭頚部癌、血液癌、腎癌、睾丸腫瘍、前立腺癌、大腸癌、急性骨髄性白血病、悪性リンパ腫、網膜芽細胞腫、神経芽細胞腫、および肉腫の治療に使用することができるがこれらの癌に限定されない。
【００３４】
一般式（１）で表される化合物は、紫外線治療の作用を増強することができる。特に皮膚の腫瘍に対する紫外線治療の作用を増強することができる。紫外線治療はＵＢ−ＢやＵＶレーザーによる治療が例示される。皮膚の腫瘍の紫外線治療の作用増強作用には、腫瘍細胞の紫外線感受性を増強する作用、紫外線照射量を低減する作用、および紫外線治療の副作用軽減作用も含まれる。
【００３５】
紫外線治療の作用増強作用は、当業者に通常用いられる方法を用いて検出することができる。試験化合物の存在下または非存在下において紫外線照射した腫瘍細胞の増殖の程度を比較することによって検出することができる。増殖の程度は、例えば、生細胞を測定する試験系を用いて調べることができる。生細胞の測定方法としては、例えば、［３Ｈ］−チミジンの取り込み試験、ＢｒｄＵ法またはＭＴＴアッセイまたはコロニー形成試験等が挙げられる。例えば、本発明に係る化合物で腫瘍細胞を前処理した後に、紫外線を照射して腫瘍細胞の増殖の程度を測定する方法が挙げられる。
【００３６】
また、ｉｎ  ｖｉｖｏでの紫外線治療の作用増強効果は、当業者に通常用いられる方法を用いて調べることができる。例えば、マウス、ラット等に皮膚腫瘍細胞を移植し、移植細胞の生着が確認された後に、対象化合物を投与または塗布し、紫外線を照射し、数日〜数週間後に、化合物無投与群における腫瘍増殖と化合物投与群における腫瘍増殖とを比較することによりｉｎ  ｖｉｖｏでの作用増強作用を確認することができる。対象化合物の投与と紫外線照射は、同時でもよいが、異なる時間に行ってもよい。
【００３７】
本発明の紫外線治療の増強剤は、紫外線照射と同時、紫外線照射前、または紫外線照射後に投与することができる。好ましくは、紫外線照射の前に投与される。より好ましくは、紫外線照射の１〜２４時間前、さらに好ましくは、２〜１８時間前に投与される。
【００３８】
本発明の紫外線治療の増強剤はさらに抗腫瘍剤と併用して用いてもよい。
【００３９】
（投与経路）
本発明のヌクレオチド除去修復阻害剤、ならびに抗腫瘍剤または紫外線治療のための増強剤の投与経路は限定されない。例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、経口、経皮、経粘膜が挙げられる。皮膚腫瘍の場合は、経皮、直接塗布等も挙げられる。投与経路は抗腫瘍剤と同一であっても異なっていてもよい。
【００４０】
（製剤）
本発明のヌクレオチド除去修復阻害剤ならびに抗腫瘍剤または紫外線治療の増強剤は、一般式（１）で表される化合物と薬学的に許容し得る担体を含み製剤化することができる。薬学的に許容し得る担体とは、例えば、賦形剤、希釈剤、添加剤、溶媒等である。
【００４１】
製剤の調製方法としては投与経路に応じ適当な製剤（例えば、経口剤または注射剤）を選択し、通常用いられている各種製剤の調製法にて調製できる。経口剤としては、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、トローチ剤、溶液剤、シロップ剤、エリキシル剤、乳剤、または油性ないし水性の懸濁液等を例示できる。経口投与の場合では遊離体のままでも、塩の型のいずれでもよい。水性製剤は薬学的に許容される酸と酸付加物を形成させるか、ナトリウム等のアルカリ金属塩とすることで調製できる。注射剤の場合は製剤中に安定剤、防腐剤または溶解補助剤等を使用することもできる。液状製剤としてよく、また、容器に収納後凍結乾燥等によって固形製剤として用時調製の製剤としてもよい。また、一回投与量を一の容器に収納してもよく、また複数回投与量を一の容器に収納してもよい。
【００４２】
固形製剤としては、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、またはトローチ剤が挙げられる。これらの固形製剤は、本発明の化合物とともに薬学的に許容し得る添加物を含んでもよい。添加物としては、例えば、充填剤類、増量剤類、結合剤類、崩壊剤類、溶解促進剤類、湿潤剤類または滑沢剤類が挙げられ、これらを必要に応じて選択して混合し、製剤化することができる。
【００４３】
液体製剤としては、例えば、溶液剤、シロップ剤、エリキシル剤、乳剤、または懸濁剤が挙げられる。これらの液体製剤は、本発明の化合物とともに薬学的に許容し得る添加物を含んでもよい。添加物としては、例えば、懸濁化剤または乳化剤が挙げられ、これらを必要に応じて選択して混合し、製剤化することができる。
【００４４】
（投与方法）
本発明の化合物は、哺乳類、特にヒトの腫瘍の治療に用いることができる。投与量および投与間隔は、疾患の場所、患者の身長、体重、性別または病歴によって、医師の判断により適宜選択され得る。本発明に係る化合物をヒトに投与する場合、例えば、投与量の範囲として、１日当たり、約０．０１μｇ／ｋｇ体重〜約５ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは、約０．１μｇ／ｋｇ体重〜約１ｍｇ／ｋｇ体重が挙げられる。ヒトに投与する場合、１日あたり１回、あるいは２回から４回、２〜３日に１回、１週間に１回、数週間に１回など、医師等の判断により適当な間隔で繰り返すのが好ましい。
【００４５】
以下に示す実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００４６】
理化学研究所化合物バンクＮＰＤｅｐｏからパイロットライブラリー（３７６化合物を含有する化合物ライブラリー）を入手し、ヌクレオチド除去修復阻害活性を有する化合物のスクリーニングに供した。
【００４７】
９６ウェルマイクロプレート３セットの各ウェルにＨｅＬａ細胞３×１０４を接種し２日培養した後、各化合物（４μｇ／ｍｌまたは４０μｇ／ｍｌ）で２ｈ前処理した。ＵＶ−Ｂを照射し、直後に、または、各化合物の存在下１時間または２時間の修復期間後に細胞を固定した。６−４ＰＰの修復動態をＭ−ＣＩＮＵＰにより分析した（図１）。対照にはＤＭＳＯで処理した細胞を用いた。Ｍ−ＣＩＮＵＰは本発明者等が開発したマイクロプレートフォーマット細胞ベース免疫測定法である（参照：特開２０１０−１６４３３７）。
【００４８】
上記スクリーニングにより選択された２１化合物について、各化合物の前処理条件を高濃度（１０μｇ／ｍｌまたは５０μｇ／ｍｌ）、長時間（１２ｈ）にした以外は前記と同様に再スクリーニングを行ったところ、顕著に高い阻害活性を示す化合物ＮＰＤ４００５を見出した。さらに、ＨｅＬａ細胞をＮＰＤ４００５（５０μｇ／ｍｌまたはｌ００μｇ／ｍｌ）で１２ｈ前処理して、ヌクレオチド除去修復阻害活性について分析し、強い阻害活性を確認した（図２）。
【００４９】
ＮＰＤ４００５の誘導体を理化学研究所ＮＰＤｅｐｏから８０化合物入手し、さらに、９化合物をナミキ商事を介して海外のサプライヤー(Pharmeks、Princeton、Vitas-Mの３社)から購入した。
【００５０】
入手した化合物をさらにスクリーニングしたところ、ＮＰＤ１３４０５、ＳＴＫ８８７６７０、ＮＰＤ１３４０３及びＰ２０００Ｎ−３７９２４が強い阻害活性を示した。特に、ＮＰＤ１３４０５およびＰ２０００Ｎ−３７９２４は、ＮＰＤ４００５、ＳＴＫ８８７６７０、およびＮＰＤ１３４０３より高い活性を示した。阻害活性の高い順は、ＮＰＤ１３４０５、Ｐ２０００Ｎ−３７９２４、ＮＰＤ４００５、ＳＴＫ８８７６７０、ＮＰＤ１３４０３であった。各々の化合物の構造を以下に示す。これら化合物は類似の構造を有しており、ピラノンの置換基がそれぞれ、エチル、ジメチル、メチル、テトラメチレンまたはプロピルであった。水素原子、ブチル基を有する化合物は阻害活性を有していなかった。
【００５１】
【化６】
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【００５２】
（試験例１）腫瘍細胞内のヌクレオチド除去修復阻害活性
ＨｅＬａ細胞で最も高い活性を示したＮＰＤ１３４０５の胃癌細胞株（ＫＫＬＳ）内のヌクレオチド除去修復阻害活性について検討した。ＫＫＬＳは金沢大学がん進展制御研究所から入手した。ＫＫＬＳは、１０％熱不活化ウシ胎児血清および５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン添加ＲＰＭＩ１６４０培地で３７度、５％ＣＯ２インキュベーター内で培養した。ＫＫＬＳ細胞を６０ｍｍプレートで培養し、５０μｇ／ｍｌの濃度のＮＰＤ１３４０５により１２時間前処理し、１０Ｊ／ｍ２のＵＶ−Ｃ（東芝ＧＬ−１０）を照射した。１時間または２時間培養後にゲノムＤＮＡを抽出（ＤＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ））し、６―４ＰＰの量を６４Ｍ−５抗体を用いてＥＬＩＳＡにより測定した（Photochem. Photobiol. 54, 225-232; J. Cell Sci. 120, 1104-1112）。ＮＰＤ１３４０５前処理によって６―４ＰＰ修復の著しい阻害効果が観察され（図３Ａ）、これによりＫＫＬＳ細胞内でのヌクレオチド除去修復に対するＮＰＤ１３４０５の強い阻害作用が確認された。
【００５３】
（試験例２）抗腫瘍活性
コロニー形成試験によって、胃癌細胞株ＫＫＬＳ細胞に対するＮＰＤ１３４０５の細胞障害活性を検討した。ＫＫＬＳ細胞を６０ｍｍプレートに２００細胞を播種し、６時間培養後、種々の濃度のＮＰＤ１３４０５を添加した。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で７〜８日間培養した後、９９％エタノールで細胞を固定しギムザ染色液で染色してコロニー数を計測した。ＮＰＤ１３４０５のＬＤ５０は約１０μｇ／ｍｌであり、１７．５μｇ／ｍｌを超えるとコロニーを観察することはできなかった（図３Ｂ）。ＮＰＤ１３４０５は抗腫瘍活性を有することが示された。
【００５４】
（試験例３）紫外線作用増強効果
ＫＫＬＳ細胞を１０μｇ／ｍｌのＮＰＤ１３４０５で１２時間前処理し、６０ｍｍプレートに播種した（２００細胞／プレート）。６時間培養後、種々の線量のＵＶ−Ｃを照射し、培地を交換後さらに７〜８日培養してコロニーを形成させた。試験例２と同様に固定および染色してコロニー数を測定した。ＵＶ−Ｃ照射に対する感受性はＮＰＤ１３４０５によって顕著に増強され（図４Ａ）、Ｄ３７（生存率を３７％まで減少させるのに必要な放射線量）は、ＮＰＤ１３４０５存在下では、４．５Ｊ／ｍ２、非存在下では８．５Ｊ／ｍ２であった。
【００５５】
（試験例４）抗腫瘍剤の作用増強効果
ＮＰＤ１３４０５のシスプラチン感受性増強作用を分析した。ＫＫＬＳ細胞を１０μｇ／ｍｌのＮＰＤ１３４０５で１２時間前処理し、６０ｍｍプレートに播種した（２００細胞／プレート）。６時間培養後、ＮＰＤ１３４０５（１０μｇ／ｍｌ）存在下、種々の濃度のシスプラチンで２４時間処理した。培地を交換後さらに７〜８日培養してコロニーを形成させた。試験例２と同様に固定および染色してコロニー数を計測した。ＮＰＤ１３４０５によってシスプラチン感受性は増強され、抗腫瘍作用が増強された（図４Ｂ）。
つ。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
一般式（１）で表される化合物は、ヌクレオチド除去修復阻害活性を有することより医薬に適応できる。特に腫瘍の治療に適用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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