(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの組織又は器官への候補物質の毒性評価の方法であり、前記方法は次のステップ：
（ａ）  少なくとも１つのバイオリアクターにより、前記組織又は器官の代謝活性の模倣又はモデル化により人工生物組織又は器官を得るステップ；
（ｂ）  前記人工生物組織又は器官を前記物質に暴露するステップ；
（ｃ）  前記人工生物組織又は器官の代謝応答を観察し、及び先験的ではなく関連する多次元データセットを取得するステップ；
（ｄ）  多変量解析方法の手段により、既定の変数と定量的に関連付けられる前記多次元データセットの成分を同定するステップ；
（ｅ）  既定の変数と実際に選択されたデータセットの成分との間の関数にある、実際に選択されるデータセットの成分に基づいて予想モデルを生成するステップ；
（ｆ）  信頼性を推定する少なくとも１つの統計的手法により前記モデルの予測性質を試験するステップ；
（ｇ）  前記モデルについて選択された前記データセットの成分と関連付けられるバイオマーカーの形で、前記人工生物組織又は器官の代謝応答を同定するステップ、を含むことを特徴とする、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であり、ステップ（ｄ）で使用される多変量解析方法が部分最小二乗判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）であることを特徴とする、方法。
【請求項３】
請求項１又は２のいずれか一項に記載の方法であり、ステップ（ｄ）は、前記多次元データセットの異常点を見つけて除去するステップ（ｄ１）により先行されることを特徴とする、方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であり、ステップ（ｄ１）は教師なし主成分分析（ＰＣＡ）を含むことを特徴とする、方法。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法であり、ステップ（ｄ）で使用される信頼性の推定のための前記統計方法の１つは、相互検証であることを特徴とする、方法。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれか一項に記載の方法であり、ステップ（ｄ）で使用される信頼性の推定のための前記統計方法の１つは、帰無仮説による検証であることを特徴とする、方法。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれか一項に記載の方法であり、ステップ（ｄ）で使用される信頼性の推定のための前記統計方法の１つは、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線下の面積の計算を含むことを特徴とする、方法。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれか一項に記載の方法であり、ステップ（ｄ）で使用される前記既定の変数は、培地条件、人工生物組織又は器官の細胞タイプ、前記物質のタイプ及びその量から選択されることを特徴とする、方法。
【請求項９】
請求項１乃至８のいずれか一項に記載の方法であり、ステップ（ｃ）は、プロトンＮＭＲスペクトル、炭素ＮＭＲ、マススペクトル、ガスクロマトグラフ、液相クロマトグラフ、及び多重検出方法からなる技術の群から選択される少なくとも１つの分析化学技術により実施されることを特徴とする、方法。
【請求項１０】
請求項１乃至９のいずれか一項に記載の方法であり、ステップ（ｃ）は、細胞外の代謝応答を観察するために前記バイオリアクターを出る培地で実施されることを特徴とする、方法。
【請求項１１】
請求項１乃至９のいずれか一項に記載の方法であり、ステップ（ｃ）は、細胞内内因性代謝応答を観察するために細胞ペレットで実施されることを特徴とする、方法。
【請求項１２】
請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の方法であり、前記方法はさらに、ステップ（ｇ）で得られたバイオマーカーのリストから前記物質の特定の毒性シグネチャーを得るステップ（ｈ）を含むことを特徴とする、方法。
【請求項１３】
請求項１乃至１２のいずれか一項に記載の方法であり、前記方法はさらに、前記先行するステップで得られた情報を用いてマーカー及び／又は毒性シグネチャーのバンクを作成するステップ（ｉ）を含むことを特徴とする、方法。
【請求項１４】
少なくとも１つの組織又は器官への候補物質の毒性スクリーニングの方法であり、前記方法が次のステップ：
（ａ）  少なくとも１つのバイオリアクターにより、前記組織又は器官の代謝活性の模倣又はモデル化により人工生物組織又は器官を得るステップ；
（ｂ）  前記人工生物組織又は器官を前記物質に暴露するステップ；
（ｃ）  前記人工生物組織又は器官の代謝応答を観察し、及び先験的ではなく関連する多次元データセットを取得するステップ；
（ｄ）  多変量解析方法の手段により、既定の変数と定量的に関連付けられる前記多次元データセットの成分を同定するステップ；
（ｅ）  既定の変数と実際に選択されたデータセットの成分との間の関数にある、実際に選択されるデータセットの成分に基づいて予想モデルを生成するステップ；
（ｆ）  信頼性を推定する少なくとも１つの統計的手法により前記モデルも予測性質を試験するステップ；
（ｇ）  前記モデルについて選択された前記データセットの成分と関連付けられるバイオマーカーの形で、前記人工生物組織又は器官の代謝応答を同定するステップ；
（ｈ）  ステップ（ｇ）で得られたバイオマーカーのリストから前記物質の特定に毒性シグネチャーを得るステップ；
（ｉ）  前記バイオマーカー及び／又は前記特定の毒性シグネチャーをマーカー及び／又は毒性シグネチャーのバンクと比較して前記物質を同定するステップ、を含むことを特徴とする、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であり、前記マーカー及び／又は毒性シグネチャーのバンクが、請求項１乃至１３のいずれかによる少なくとも１つの方法を実施することで確立されることを特徴とする、方法。
【請求項１６】
システムであり、少なくとも１つのバイオリアクター、データ処理手段及びバイオマーカー検出装置を含み、請求項１乃至１３のいずれか一項による毒性評価の方法を実施することができることを特徴とする、システム。
【請求項１７】
請求項１６に記載のシステムであり、さらに、データ記憶装置を含み、請求項１４又は１５いずれか一項に記載の毒性スクリーニングの方法を実施することができることを特徴とする、システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳類、特に人の器官などの生体器官を刺激し得るバイオリアクターの分野に関する。
【０００２】
本発明は、前記刺激された器官の毒素のハイスループットスクリーニングのための前記バイオリアクターの使用に関する。
【０００３】
より具体的には、本発明は、人工生物器官を用いて、前記毒素の存在に関する内因性代謝障害を同定し定量化するための方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
細胞培養方法は、現在、化学物質又は生物材料の毒性評価を実施するため、即ちそれらの生命体へ有害な影響を与える可能性を測定するための、信頼のおける方法を１つの代表である。
【０００５】
動物又は人の組織や器官（そのような一つのシステムは、いわゆる「人工生体組織又は器官」と呼ばれ、例えば、対応する所謂「天然」の組織や器官の生物学的挙動即ち前記生命体内の天然環境で取られる挙動を模倣することができる人工組織や器官である）の細胞のインビトロ培養システムを着想することで、前記天然組織や器官の、生体異物、化粧品、医薬及びより一般的に全ての潜在的に活性な成分や試薬に対する反応が予測され得るようになり、従って特に有用なインビトロ試験及び分析モデルが開発され得る。
【０００６】
これらのモデルは医薬開発研究の全ての段階でますます使用されるようになってきており、その理由は、インビボモデル、即ち動物を実験に使用するものであり、経済的及び倫理的な外部圧力を受けているインビボモデルの有効な代替物であるからである。さらに、フランス及びヨーロッパにおける動物福祉に関する規則及び関連する保険サービスの推奨に適合させる条件下で、動物実験の関連費用及び流通の点から、この技術を利用することができなくなっている。
【０００７】
インビトロ毒性評価の現在の方法は一般的にペトリ皿を用いる。ペトリ皿は、栄養培地を含み、細胞成長に好ましい環境に置かれ、刺激されるべき組織又は器官の細胞が播種されている。細胞が成長すると、試験されるべき物質と一緒にされる。細胞への刺激は代謝物、即ち細胞による前記物質の変換及び／又は分解生成物をサンプリングし及び分析することにより決定される。この刺激の評価は、この場合では、所謂「代謝障害」で定性的に評価され、及び／又はこの場合例えば「代謝応答」に関して参照されるマーカーで定量的に評価される。用語「メタボローム」は、サンプル中に見られる全ての代謝物及び他の分子を意味する。
【０００８】
しかし、これらの技術は、特定の分子の毒性を評価し、前記器官、さらにより一般的には器官への影響を予測するには全く十分ではない。事実、研究は、ある特定の既定の代謝物のみに集中され、その他の重要であるかもしれないものを犠牲にして行われる。さらに、インビトロ細胞培養は、自然の環境での組織又は器官の挙動を再現する可能は小さい。インビトロ培養細胞は、明らかに、それが組織又は器官内にある際とは同じ環境ではなく、特に生体内ではそうである。しかし、環境条件は細胞の生物学的応答に直接影響を持つ。通常、自然な環境に置かれた生細胞は、多重の複雑な代謝経路で役割を演じ、これは合成培地内では再現され得ないことである。細胞の生物学的応答は従って、インビトロで培養されているかどうか、又は組織又は器官内に、より一般的には生体内にあるのかによって変化し得るものであり、場合によっては非常に大きく変化し得る。さらに、ペトリ皿上の細胞は、「静的」条件下で培養され（流体の循環がない）、「動的」条件下ではなく（流体循環がある）、これは、灌流される組織又は器官の実際の挙動の１つのみを反映するものであり得る。
【０００９】
これらの全ての理由のために、いくつかの最近の研究は、細胞を培養する手段としてペトリ皿をバイオリアクターに置換することを提案している。これらの装置は細胞成長に好ましい環境を再現し、ほとんどの場合特定の構成と材料を用いて動物又は人の組織又は器官の類似する環境を再現する。しかし、これらのシステムは、メタボローム分析技術とは比較的適合性がよくない。
【００１０】
例えば、Ｍａｊｏｒｓ、Ｐ．Ｄ．、ＭｃＬｅａｎ、Ｊ．Ｓ．、及びＳｃｈｏｌｔｅｎ、Ｊ．Ｃ．らの文献「ＮＭＲ  ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｌｉｖｅ  ｉｎ−ｓｉｔｕ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｊ  Ｍａｇｎ  Ｒｅｓｏｎ  １９２（１）、１５９−１６６（２００８））」では、核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルメータ内に設けられたバイオリアクターが提案されている。ＮＭＲスペクトルは、前記バイオリアクター培地を容易に分析することができるが、特に価格の点で制約される。実際、前記バイオリアクターは、ガラス以外の材料と同様にミクロ構造も持たず、これはペトリ皿の場合と比較してその可能性を制限するものである。
【００１１】
Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｏｐｏｕｌｏｓ、Ｐ．Ｋ．、Ｇｏｕｄａｒ、Ｃ．Ｔ．、及びＫｌａｐａ、Ｍ．Ｉ．らの文献「Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｔａｔｅ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｍｅｔａｂ  Ｅｎｇ（２００９）」に記載される他の方法は、ガスクロマトグラフ−質量スペクトル分析（ＧＣ−ＭＳ）を使用して、細胞代謝物のサンプリング及び分析が含まれる。このタイプのスペクトル計は、物資の同定に効果的であり、世界の空港で特に使用されている。しかし、この方法は同定されるべき成分が気体状態であることを必要とする。従って、Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｏｐｏｕｌｏｓのシステムでは、バイオリアクター内に存在するメタボロームは所謂「誘導体化」、即ち分子がより揮発性となるように前記分子のある官能基が変換されるが、これは、前記誘導体化される代謝物に限定されるから検出され得る代謝物の数を大きく減らすこととなる。
【００１２】
第３の方法は、Ｓｅａｇｌｅ、Ｃ．、Ｃｈｒｉｓｔｉｅ、Ｍ．Ａ．、Ｗｉｎｎｉｋｅ、Ｊ．Ｈ．、ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄ、Ｒ．Ｅ．、Ｌｕｄｌｏｗ、Ｊ．Ｗ．、Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ、Ｔ．Ｍ．、Ｇａｍｃｓｉｋ、Ｍ．Ｐ．、及びＭａｃＤｏｎａｌｄ、Ｊ．Ｍ．らによる文献「Ｈｉｇｈｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃ  ｆｏｏｔｐｒｉｎｔｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｐａｒｔ  Ｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １４（２００８））」に記載されており、人工生体器官の培地からの代謝物をＮＭＲ測定することを含む。
【００１３】
この測定は後に統計解析される。この考えは、得られたＮＭＲスペクトルの特定のピークを検出して従って試験された物質の効果を「見る」、ということである。しかし、これはＮＭＲスククトルの初歩的な単変量解析である。この方法では、多くの情報が失われたままで、非常に強い、高度に局在化された効果のみが検出され得る。代謝障害のより詳しい試験が望まれる場合には、その固有の不確実性の全てを持った標的化検出がなお必要である。
【００１４】
最後にこの方法は、全ての実施が毒性評価のための十分なアプリケーションを持たず、全ての実施が不適切である。
【００１５】
さらに、これらの方法は、毒性スクリーニングなどの「逆」分析、即ちその知られた毒性効果に基づき未知の物質を同定するための方法へ直接適用可能なものではない。このスクリーニングは、現在では、前記物質の効果を観察し（インビボ又はインビトロ）、かつ、十分な信頼性を持って類似する物質が見つかるまで、それらを種々の物質の知られる効果と比較することのみで可能である。
【００１６】
以上説明した全ての理由により、インビトロ技術は、いまだインビボ技術に取り替えられず改善されないままである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Ｍａｊｏｒｓ、Ｐ．Ｄ．、ＭｃＬｅａｎ、Ｊ．Ｓ．、  ａｎｄ  Ｓｃｈｏｌｔｅｎ、Ｊ．Ｃ．、“ＮＭＲ  ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｌｉｖｅ  ｉｎ−ｓｉｔｕ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ”、Ｊ  Ｍａｇｎ  Ｒｅｓｏｎ  １９２（１）、１５９−１６６（２００８）
【非特許文献２】Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｏｐｏｕｌｏｓ、Ｐ．Ｋ．、Ｇｏｕｄａｒ、Ｃ．Ｔ．、ａｎｄ  Ｋｌａｐａ、Ｍ．Ｉ．、“Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｔａｔｅ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”、Ｍｅｔａｂ  Ｅｎｇ（２００９）
【非特許文献３】Ｓｅａｇｌｅ、Ｃ．、Ｃｈｒｉｓｔｉｅ、Ｍ．Ａ．、Ｗｉｎｎｉｋｅ、Ｊ．Ｈ．、ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄ、Ｒ．Ｅ．、Ｌｕｄｌｏｗ、Ｊ．Ｗ．、  Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ、Ｔ．Ｍ．、Ｇａｍｃｓｉｋ、Ｍ．Ｐ．、ａｎｄ  ＭａｃＤｏｎａｌｄ、Ｊ．Ｍ．、“Ｈｉｇｈｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃ  ｆｏｏｔｐｒｉｎｔｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｐａｒｔ  Ｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １４（２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明の課題は、これらの従来技術の問題を解決する、実際の器官を完全に模倣する人工生物器官又は組織で毒性を評価する方法、及び前記代謝応答の分析への新たな方法を提案するものである。
【００１９】
本発明のさらなる課題は、完全に再現性のあるずっと容易に適用される結果を提供する、より迅速に、より安価に実施されより信頼性が高い方法を提案することである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、少なくとも１つの組織又は器官への候補物質の毒性評価の方法に関し、前記方法は次のステップ：
（ａ）  少なくとも１つのバイオリアクターにより、前記組織又は器官の代謝活性の模倣又はモデル化により人工生物組織又は器官を得るステップ；
（ｂ）  前記人工生物組織又は器官を前記物質に暴露するステップ；
（ｃ）  前記人工生物組織又は器官の前記代謝応答を観察し、及び先験的ではなく関連する多次元データセットを取得するステップ；
（ｄ）  多変量解析方法の手段により、既定の変数と定量的に関連付けられる前記多次元データの前記成分を同定するステップ；
（ｅ）  前記実際に選択されるデータセットの前記成分に基づいて予想モデルを生成するステップ；
（ｆ）  信頼性を推定する少なくとも１つの統計的手法により前記モデルの予測性質を試験するステップ；
（ｇ）  前記モデルについて選択された前記データセットの成分と関連付けられるバイオマーカーの形で、前記人工生体組織又は器官の代謝応答を同定するステップ、を含むことを特徴とする。
【００２１】
毒性物質及びその残留物（即ち、生体異物代謝物）をサンプリングすることにより前記標準評価、所謂直接評価は、酵素的方法により、又はクロマトグラフ分離方法と組み合わせて、又は組み合わせずにマススペクトル分析方法により実施される。これらの方法は、標的方法又は「先験的」方法とされる。というのはこれらの方法は特定の検出プロトコルが使用される物質の検出に依存するからである。他方、これらの方法は、上で説明したような未知物質の効果のマーカーの検出及び同定には不適切である。
【００２２】
この問題に対処するために、本発明は、人工生体器官を毒性物質に暴露する間接的な結果を、この物質の応答の前記代謝シグネチャーを特徴づけることで、研究することを提案する。
【００２３】
本発明は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル又はクロマトグラフと組み合わせるか組み合わせないマススペクトル（ＭＳ）などの所謂「非標的」方法を、内因性代謝物を最大の可能な数で検出するために、使用することに焦点を合わせている。前記代謝のスケール全体での応答を同定するために、その後、これらの種々の平行した測定値が多次元統計解析で分析される。これらの分析は、実際、数千の測定された変数を用いる実験パラメータを「説明」し、かつそれらから予想モデルから推定することを目的とする。これは実際に、判別分析、部分最小二乗（ＰＬＳ）回帰、人工ニューラルネットワークなどの教師ありパターン認識技術を用いることで可能となる。
【００２４】
その他の有利なかつ非制限的な特徴としては：
−  ステップ（ｄ）で使用される多変量解析方法は、部分最小二乗法判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）である；
−  ステップ（ｄ）は、前記多次元データセットの異常点を見つけて除去するステップ（ｄ１）により先行される；
−  ステップ（ｄ１）は教師なし主成分分析（ＰＣＡ）を含む；
−  ステップ（ｄ）で使用される信頼性の推定のための前記統計方法の１つは、相互検証である；
−  ステップ（ｄ）で使用される信頼性の推定のための前記統計方法の１つは、帰無仮説による検証である；
−  ステップ（ｄ）で使用される信頼性の推定のための前記統計方法の１つは、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線下の面積の計算を含む；
−  ステップ（ｄ）で使用される前記既定の変数は、培地条件、人工生体組織又は器官の細胞タイプ、前記物質のタイプ及びその量から選択される；
−  ステップ（ｃ）は、プロトンＮＭＲスペクトル、炭素ＮＭＲ、マススペクトル、ガスクロマトグラフ、液相クロマトグラフ、及び多重検出方法からなる技術の群から選択される少なくとも１つの分析化学技術により実施される；
−  ステップ（ｃ）は、細胞外の代謝応答を観察するために前記バイオリアクターを出る培地で実施される；
−  ステップ（ｃ）は、細胞内内因性代謝応答を観察するために細胞ペレットで実施される；
−  前記方法はさらに、ステップ（ｇ）で得られたバイオマーカーのリストから前記物質の特定の毒性シグネチャーを得るステップ（ｈ）を含む；
−  前記方法はさらに、前記先行するステップで得られた情報を用いてマーカー及び／又は毒性シグネチャーのバンクを作成するステップ（ｉ）を含む、が挙げられる。
【００２５】
本発明の課題はまた、第２の側面により、信頼性のあるハイスループット毒性スクリーニングを可能とすることである。
【００２６】
本発明は従って、さらに、少なくとも１つの組織又は器官の候補物質の毒性スクリーニングの方法に関し、前記方法は次のステップ：
（ａ）  少なくとも１つのバイオリアクターにより、前記組織又は器官の代謝活性の模倣又はモデル化により人工生物組織又は器官を得るステップ；
（ｂ）  前記人工生物組織又は器官を前記物質に暴露するステップ；
（ｃ）  前記人工生物組織又は器官の前記代謝応答を観察し、及び先験的ではなく関連する多次元データセットを取得するステップ；
（ｄ）  多変量解析方法の手段により、既定の変数と定量的に関連付けられる前記多次元データの前記成分を同定するステップ；
（ｅ）  前記実際に選択されるデータセットの前記成分に基づいて予想モデルを生成するステップ；
（ｆ）  信頼性を推定する少なくとも１つの統計的手法により前記モデルも予測性質を試験するステップ；
（ｇ）  前記モデルについて選択された前記データセットの成分と関連付けられるバイオマーカーの形で、前記人工生体組織又は器官の代謝応答を同定するステップ；
（ｈ）  ステップ（ｇ）で得られたバイオマーカーのリストから前記物質の特定に毒性シグネチャーを得るステップ；
（ｉ）  前記バイオマーカー及び／又は前記特定の毒性シグネチャーを前記マーカー及び／又は毒性シグネチャーのバンクとを比較して前記物質を同定するステップ、を含むことを特徴とする。
【００２７】
他の有利なかつ非限定的な特徴は：
−  前記マーカー及び／又は毒性シグネチャーのバンクが、本発明の第１の側面による少なくとも１つの方法の実施をすることで確立されたものである。
【００２８】
この物質のハイスループットスクリーニングは、先行する実験の結果を集めたデータベース又はバンクを構成することで可能となる。
これにより、毒性がこれまで示されてなかった物質の、毒性シグネチャー、即ち代謝応答の特定の表現である毒性シグネチャーが知られている参照物質と、迅速、即時に及び統計的に比較することで、分析的スクリーニングが可能となる。
【００２９】
最後に、本発明は、システムに関し、前記システムは、少なくとも１つのバイオリアクター、データ処理手段、及びバイオマーカーの検出装置を含み、本発明の第１の側面による毒性評価を実施することができることを特徴とし、かつ前記システムはさらにデータ記憶手段を含み、本発明の第２の側面による毒性スクリーニング法の実施をすることができることを特徴とする。
【００３０】
本発明のその他の特徴および利点は、以下の明細書の記載及び好ましい実施態様を考慮することにより明らかとなるであろう。本明細書では添付の図面が参照される。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、１ＨＮＭＲ（プロトンＮＭＲ）スペクトルの一例である。
【図２】図２は、本発明による毒性本発明床方法と、部分最小二乗回帰による１ＨＮＭＲスペクトルのモデル化を用いる、ペトリ皿を使用する類似の方法とを比較する第１の実験の結果を示す。
【図３】図３は、１ＨＮＭＲ及びＰＬＳ回帰による種々の細胞タイプを比較する第２の実験の結果を示すグラフである。
【図４ａ】図４ａは、１ＮＭＲ分析及びＰＬＳを回帰による同じ生体異物の種々の量への代謝応答を比較する第３の実験の結果を示す。
【図４ｂ】図４ｂは、１ＮＭＲ分析及びＰＬＳを回帰による同じ生体異物の種々の量への代謝応答を比較する第３の実験の結果を示す。
【図４ｃ】図４ｃは、１ＮＭＲ分析及びＰＬＳを回帰による同じ生体異物の種々の量への代謝応答を比較する第３の実験の結果を示す。
【図５ａ】図５ａは、本発明による毒性評価方法の１つの実施態様で使用される受信者動作特性曲線の１つの例を示す。
【図５ｂ】図５ｂは、本発明による毒性評価方法の１つの実施態様で使用される受信者操作特性曲線の１つの例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
毒性評価
本発明の第１の側面による毒性評価の方法は、前記物質が試験される、人工生体組織又は器官を得ることから開始される。この目的でバイオリアクターが使用される。バイオリアクターは、有利には培養チャンバを有し、これは細胞成長を促進するためのミクロ構造化された上部壁及び下部壁、細胞発達と成長のため及び毒性が調べられている物質への長期間の暴露の過程で必要な栄養物流体の通路を可能とする流体入口点及び出口点を有する。そのようなバイオリアクターは、２００９年６月２３日に出願された仏国特許出願ＦＲ０９５４２８８に詳細に記載されており、この内容は参照されて本明細書に援用される。本発明はしかしながら、このタイプにバイオリアクターに特に限定されるものではない。
【００３３】
バイオリアクターのミクロ構造により、実際のものと一致する精巧な細胞構造を持つ人工生体組織又は器官の発達が可能となる。成長は加速され、自律性である。バイオリアクターは、並列又は直列に容易に組み合わせられる。従って、一緒になって器官を模倣する種々の細胞のファミリーを次々に培養することを可能とする。生体器官は事実、一般には中でもその存在が必須の１つの主要な細胞タイプを保護している高度に複雑化されたシステムである。例えば肝臓の場合、８０％の細胞は所謂肝細胞であるが、また、内皮細胞、クッパー細胞、伊東細胞、肝リンパ球などが見出される。
【００３４】
より単純には、前記器官の機能の構造的再現よりはむしろ機能をモデル化することを目的とすることも可能である。例えば、腎臓の場合が参照され得る。
【００３５】
さらに、バイオリアクターの動的操作により、前記組織又は器官のより優れたシミュレーションに加えて、ある物質に暴露させ、その後前記バイオリアクターの流出流コネクタで培養細胞の代謝応答物の容易な回収を可能とする。この場合には、所謂細胞外代謝応答物が観察される。又は、内因性、即ち細胞内の代謝応答物を観察するために有用でもある。この場合には前記代謝応答物は直接細胞ペレット上に回収される。
【００３６】
人工生体組織又は器官は成熟するまで培養され、その後試験される物質に暴露される。前記試験プロトコルによる既定時間の後、サンプルは、流出流から、又は細胞内から回収される。
【００３７】
観察のためのサンプルの調製
説明したように、ＮＭＲ又はマススペクトルの所謂「非標的」方法が特に好ましい。これらの方法は、他の多くの方法と同様に、分析化学で広く使用され当業者には知られた方法である。人工生体器官の培地のサンプルのＮＭＲスペクトルは、例えば、数十の又は数百の代謝物のシグナルを平行にかつ非先験的に取得、例えば多次元取得することを可能とする。ＮＭＲは、粒子又は粒子の組みに応用される１つのスペクトル方法である。特に、器官分子に特徴的な原子、例えば水素や炭素などによるＮＭＲ技術は特に本発明に適用される。
【００３８】
代謝応答物に関連する「非先験的」データセットの取得は、全ての代謝応答物に関連する全てのデータの取得を意味し、代謝応答物の「予測された」成分に伴うデータのみではないことを、理解されるべきである。興味の対象となる生物学的又は毒性的応答に関与する代謝物に関してはなんらの仮定もなされていない。言い換えると、代謝応答物の非先験的データセットの取得は、未知代謝物質に対応するデータを取り込む取得である。非先験的方法は、標的とされていない全ての代謝物は無視される標的化方法（標的化メタボロミクス）よりは、基本的に難しい方法である。
【００３９】
上で説明されたように、とりわけＮＭＲ方法又はその他の方法は例えばＤＮＡチップの使用と比較して非先験的取得を可能とするものであり、ＤＮＡチップの使用は、チップ上に含まれる遺伝子の発現のみに関連するデータを取得する、言い換えると部分的な代謝応答物に関連するデータの取得である。その後多次元統計により、優位に影響される代謝シグナル及びその量を同定することを可能とする。従って、非先験的方法は、この毒性応答に伴う新たなマーカーを発見するという点で非常に有利である。標的化方法では、新たなマーカーを発見するという点では可能性は全くない。
【００４０】
記載される好ましい実施態様では、１ＨＮＭＲスペクトル（プロトンＮＭＲ、水素原子を検出することが可能）が一連の試験を実施するために使用された。これらの試験には、２つの細胞株及び３つの潜在的毒性物質が含まれ、場合により前記２つの細胞株は共培養された。これらの細胞は、１つはＨＥＰＧ２／Ｃ３Ａ細胞、又は簡単にＣ３Ａとする人肝細胞であり、他方はＭａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞である。留意されるべきことは、本発明は人工生体肝臓及び腎臓に限定されるものではない、ということ、及び当業者は、本発明を全てのタイプの人工生体器官であって、バイオリアクターでシミュレートされ又はモデル化され得る器官へ適用することができる、ということである。
特に、すい臓、心臓、睾丸、脳の一部などが留意されるべきである。
【００４１】
試験で使用される細胞が暴露された生体異物は、アンモニア（ＮＨ３）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）及びＮ−アシル−パラアミノフェノール（ＡＰＡＰ）（これはよく知られているパラセタモールと命名されている）である。これらの３つの物質は、高濃度で肝臓障害効果を持つことが知られている。
【００４２】
培地サンプルは、例えば３５０μｌの培地に、９０％水（Ｈ２Ｏ）と１０％の重水（Ｄ２Ｏ）（キャリブレーション用）からなる生理的食塩水０．９ｇ／ｌの２００μｌを用いて調製される。その後前記５５０μｌの溶液をＮＭＲ分析チューブへ移される。
【００４３】
ＮＭＲをプロトンプローブを用いて７００ＭＨｚの周波数で取得する。１ＤＮＭＲスペクトルを、次のシーケンス：Ｔｒｄ−Ｐ９０−ｔ１−Ｐ９０−ｔｍ−Ｐ９０−Ｔａｑに従い前記水の共鳴をプレサチュレーションを用いて記録される。Ｔｒｄは、前記水の共鳴が選択的に照射される間の２秒の遅延を表し、Ｐ９０は９０°パルス周波数、及びｔ１は３μｓの遅延に対応する。水の共鳴は、混合時間（ｔｍ＝１００ｍｓ）及び取得時間１．９５秒の間照射される。それぞれのサンプルについて、１２８のインターフェログラムが積算されシグナル−ノイズ比を減少させる。これらのインターフェログラムが、０．３Ｈｚライン拡張に対応する指数関数で積算される。フーリエ変換を得る前に、スペクトルの分解能を低下させないように、インターフェログラムの幅が、インターフェログラムの端部に０点を加えることで２倍にされる。横軸スケールは１Ｈ化学シフトに対応する。このスケールは水の共鳴の回り１０ｐｐｍのウィンドウを拡張する。縦軸スケールは共鳴強度に対応し、サンプル中のそれぞれの分子の化学基について存在するプロトンの数に比例する。５．２３ｐｐｍのグルコースのベータアノマーのシグナルでのキャリブレーションの前に、スペクトルその後フェーズを合わせてベースラインを直線化する。水の残留シグナル回りの４．６７及び５ｐｐｍの間の領域は見栄えがよくなるように抑えて、得られるスペクトルを多次元データセットとして取り出す。
【００４４】
図１は、アンモニア暴露（２５μｌ／分、１０ｍＭのＮＨ３）されたＣ３Ａ細胞の培地上澄みのサンプルの１ＨＮＭＲスペクトルの一例を示す。芳香族性共鳴を含む領域（６．５と１０ｐｐｍの間）は拡大されている。主要な代謝物のピークは例示されている。ここで、Ｈｉｓ：ヒスチジン、Ｐｈｅ：フェニルアラニン、Ｔｙｒ：チロシン、Ｇｌｃ：グルコース、Ｌａｃ：ラクテート、Ｏｘａ：オキザロアセテート、Ｐｙｒ：ピルベート、Ｇｌｎ：グリシン、Ａｒｇ：アルギニン、Ａｌａ：アラニン、Ｅｔｈ：エタノール、Ｖａｌ：バリン、Ｌｅｕ：ロイシン、Ｉｌｅ：イソロイシンを表す。
【００４５】
統計解析は、第１に、前記多次元データセット内の異常点を見出すために教師なし主成分分析からなる。前記主成分分析は、前記データセットに存在する４００００冗長ＮＭＲを新たな正規直交基準に圧縮し、それぞれの軸は前記データセットの変数の主成分を表し、従って多次元となる。所謂教師つき多変量統計分析をその後実施して、培地条件又は投与グループを区別し、前記毒性効果に特異的な代謝物シグネチャーを同定する。この教師つき分析は、主に、部分最小二乗判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）を通じて部分最小二乗回帰を用いて実施されるが、これに限定されるものではない。ＰＬＳを回帰は、直線回帰のように、非説明変数（Ｙ）と定量的に関連する前記データセットの成分（説明変数、Ｘ）の成分、培地条件、人工生体器官の細胞タイプ、投与された処理のタイプ又は投与量かどうかを同定することを可能にする。人工ニューラルネットワーク構造がまた、この多変量解析を実行するようにプログラムされ得る。
【００４６】
教師つきモデル（ここではＰＬＳモデル）の予想的性質を試験するために、いくつかの方法が使用される。判別又は回帰規則が生成されると、この規則に伴う誤差の推定値がその検証のためのツールとなる。相互検証により、試験される個々のセットに頼ることなく前記判別又は回帰方法のロバスト性を理解することが可能となり、かつ前記モデルで限定された数の測定値の発生率を明らかにすることができる。それぞれのデータセットは無作為にいくつかの部分に分割される。前記分割部分はその後、前記モデルを較正するためか、又は前記モデルの予想の対象とするために繰り返し使用される。それぞれの相互検証のために、前記データセットの繰り返しは除かれる；前データセットの残りが前記モデルの較正のために使用される。前記判別又は回帰規則が前記較正サンプルを用いて生成されると、前記試験サンプルのセットの座標がその後計算され、これにより、これらの試験サンプルへの予想値（量又はグループ）を帰属させ、前記予想値の誤差を計算することが可能となる。前記予想値誤差は、誤差率（又は良い予測率）を計算することを可能とする混合行列の形で、又は通常Ｑ２である誤差の係数の計算の形で表されることが可能である。
【００４７】
従って、非説明変数Ｙが並び替えられた一連のデータセットを無作為に生成することで前記モデルのロバスト性を試験することも可能となる。従って、非説明変数Ｙと、説明変数Ｘとの間の関係はもはやなく、これは統計における帰無仮説による検証に対応する。通常、帰無仮説による一連の数百のモデルが生成され、それらのロバスト性が相互検証により評価される。従って、前記モデルがより無作為であるほど予想可能モデルを構築することがより難しくなることを示すことが可能である。従って、前記初期モデルは、全てがより強く前記初期モデルを検証する、帰無仮説による無作為モデルの大部分とは有意に相違することが示され得る。
【００４８】
特に有利な実施態様によると、受信者動作特性（ＲＯＣ）が使用され得る。これらの曲線は、当業者に知られており、バイナリー分類器の性能を評価するために使用される。ＲＯＣ曲線は、あるグループ内の正しい分類率（真陽性率）を、誤った分類の数の関数（偽陽性率）として与える。この曲線は、１の側面を持つ四角内に含まれ、（０、０）と（１、１）を通過する必要がある。これを本発明により生成されるモデルに適用するために、陽性又は偽サンプルが試験され、前記予想の正確さや不正確さにより分類され得る。
【００４９】
完全なモデルの場合には、前記ＲＯＣ曲線は（０、１）を通過する。無作為選択よりも良い結果を与えないモデルの場合には、前記ＲＯＣ曲線は直線ｙ＝ｘとなる。前記第１の場合には、前記曲線の０と１の間の積分は１となり、前記第２の場合には１／２となる。
【００５０】
前記曲線下の面積（ＡＵＣ）は、数学的には前記モデルが予想の間正しい確率に対応しており、測定され得る。この値は従って、モデルを検証する非常に優れたインジケータとなる。
【００５１】
前記モデルがその妥当性が証明されると、バイオマーカー同定のステップが続く。このステップにより、前記代謝応答の実際をより良く変換することが可能となる；というのはこれにより前記モデルについて選択されるデータセットの成分に関連する代謝物、即ち前記毒性物質への暴露の最も特徴的な代謝物を見出すことを可能とするからである。このステップは、例えば、ＮＭＲスペクトルの関連するピークを専門家に読み取らせることで実施される。
【００５２】
有利には、前記物質の特異的な毒性シグネチャーがこのバイオマーカーから推定されることである。毒性シグネチャーについてはなんら特徴的形式はなく、非常に単純に代謝物のリストを含み得るものであり、それぞれが相関係数で特徴付けられている（コントロール条件に関係して代謝物濃度の変動の方向）。また、これはグラフ的なシグネチャーであり、例えば多次元解析に本質的であるように思われる検出されたピークに低減されて単純化されたスペクトルであり得る。本発明は特に毒性シグネチャーに限定されるものではない。
【００５３】
なお有利にはこれらのシグネチャーは、シグネチャーバンクを構成するようにデータベースに記憶される。マーカーバンクは、それぞれのバイオマーカーが、関与した場合の物質の前記リストにより参照されることが想定される。そのようなバンクは本発明の他の側面において非常に有用であり、以下説明される。
【００５４】
実験結果
本発明の毒性評価の方法の効果を示すために、上で説明された実施態様による４実験が実施された。
１  人工生体器官とペトリ皿の間の代謝物シグネチャーの比較。
２  種々の人工生体器官（肝臓細胞Ｃ３Ａ、腎臓細胞ＭＤＣＫ及び肝臓及び腎臓細胞共培養）の代謝物シグネチャーの比較。
３  種々の人工生体器官（肝臓Ｃ３Ａ、腎臓ＭＤＣＫ及び肝臓及び腎臓共培養）への同一の物質（ＮＨ３）の特異的代謝応答物の比較。
４  人工生体肝臓細胞の種々の物質（ＮＨ３、ＤＭＳＯ、ＡＰＡＰ）への特異的代謝応答物の比較。
【００５５】
実験１から４の結果は表１に表されている。
【００５６】
第１に、バイオリアクターの人工生体器官の培地の代謝物シグネチャーと、ペトリ皿による標準培養のものと比較された。バイオリアクターのＣ３Ａ人工生体肝臓は、ペトリ皿の標準培地のＣ３Ａ細胞と比較された。２つの部分最小二乗判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）を構成し、ペトリ皿でのＣ３Ａの培地と最適流速１０μ／分でのバイオリアクターでのＣ３Ａの培地とを比較した（図２）。このＰＬＳ−ＤＡモデルは、ペトリ皿の培養細胞とバイオリアクターの細胞との明瞭な判別を示し、バイオリアクターの培地に直接結合された人工生体器官の内因性代謝物シグネチャーを示す。それぞれのＰＬＳをモデルの係数が、バイオリアクターでの培地で有意に影響される代謝物を見出すために分析された。
【００５７】
それぞれのバイオリアクター培養条件について代謝物のリストの比較（表１）は、人工生体器官は特異的な特徴ある代謝応答を有し、３次元器官の細胞生理学に関連し、それはペトリ皿での培養では再現されないものである。
【００５８】
図２はまた、この関係を、ペトリ皿とバイオリアクターが異なる代謝物シグネチャーを持つことで示している。個々のクラウドのグラフは２つのファミリー間の有意の差を示す。
【００５９】
【表１】
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第２に、種々の人工器官の代謝物シグネチャーが比較される；より正確には肝臓（Ｃ３Ａ細胞）、腎臓（ＭＤＣＫ細胞）及び肝臓−腎臓（Ｃ３Ａ／ＭＤＣＫ）完全に処理なしの共培養である。３つの部分最小二乗判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）が構成され、Ｃ３Ａの人工生体肝臓培養とＭＤＣＫ人工生体腎臓培養とＣｓＡ／ＭＤＣＫ共培養を１０μｌ／分の最適流速で比較された。前記ＰＬＳ−ＤＡモデルは、器官の３つのタイプの間で明確な区別を示す。それぞれのＰＬＳの係数は、人工生体器官間の有意な差を持つ代謝物を見出すために分析された。
【００６０】
それぞれの人工生体器官について代謝物のリストの比較は、特異的な代謝物シグネチャーを明らかにし、生命体全体のこの器官の生理的機能に直接結合されるそれぞれのタイプの人工生体器官に特異的な内因性代謝物の存在を示す（表２）。このことは図３で確認される。
【００６１】
【表２】
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第３に、種々のＮＨ３暴露に対する種々の器官の代謝応答を調べた。ＮＨ３の３つの量がそれぞれの人工生体器官に投与された（０ｍＭ、５ｍＭ及び１０ｍＭ）。前記システムのロバスト性を強化するため、及び培地密度に関して代謝物の変動を避けるために、これらは数回、２０００００から１００００００細胞の種々の密度で繰り返した（図４ａ−ｃ、表３）。多次元部分最小二乗（ＰＬＳ）回帰モデルが構成され、投与されたＮＨ３の量とそれぞれの人工生体器官のタイプの定量的関係を同定した。結果は、３つのＰＬＳモデルでありそれぞれタイプの器官に特異的である：肝臓（Ｃ３Ａ、図３Ａ）、腎臓（ＭＤＣＫ、図３Ｂ）及び共培養（Ｃ３Ａ／ＭＤＣＫ。図３Ｃ）。
【００６２】
前記ＰＬＳ回帰モデルは、定量的な用量応答関係を示し、投与されたＮＨ３に定量的にリンクされた間接的内因性代謝物応答を示す。それぞれのＰＬＳモデルの係数は、ＮＨ３の量により有意に影響される代謝物を見出すために分析された。それぞれの人工生体器官について代謝物のリストの比較は、それぞれが、それぞれの器官に特異的な培養生理学及び毒性に関連して特異的なかつ特徴的な代謝応答を持つことを示す。
【００６３】
表３は、それぞれの代謝物について、人工生体器官が暴露されたＮＨ３の量が増加する場合にその濃度の変動の符号を示す。
【００６４】
【表３】
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第４に、種々の毒素へ暴露した人工生体肝臓の特異的代謝応答が特徴づけられた（表４）。いくつかの毒素物質（ＮＨ３（０．５及び１０ｍＭ）；ＤＭＳＯ（０％、１％、２％、４％）；ＡＰＡＰ（０．１ｍＭ））が、Ｃ３Ａ、細胞からなる人工生体肝臓へ投与された。ＡＰＡＰでの処置の場合には、人工生体肝臓の応答が、ペトリ皿での培地の肝臓細胞の応答と比較された。それぞれの暴露について、多次元部分最小二乗（ＰＬＳ）回帰モデルが構成され、投与されたそれぞれの物質の量と、人工生体器官のそれぞれのタイプの代謝応答との定量的関係を同定した。結果は、４つのＰＬＳをモデルであり、これらはそれぞれの処置のタイプ：Ｃ３Ａ人工生体肝臓へのＮＨ３、Ｃ３Ａ人工生体肝臓へのＤＭＳＯ、Ｃ３Ａ人工生体肝臓へのＡＰＡＰ、及び最後にペトリ皿でのＣ３Ａ培養細胞へのＡＰＡＰ、に特異的であった。前記ＰＬＳモデル回帰モデルは、定量的用量応答関係を示し、投与されたそれぞれの処置に定量的にリンクした人工生体肝臓の間接的内因性代謝応答を示す。それぞれのＰＬＳをモデルの係数は、１つの処置又は他の処理により有意に影響を受ける肝内因性代謝物を見出すために分析された。それぞれの処置について代謝物のリストの比較は、人工生体肝臓は、それぞれの毒性分子投与に特異的かつ特徴的応答を持つ、ということを示す（表４）。この表は、それぞれの代謝物について、実験での生体異物の量が増加すると、その濃度（括弧内）の変動の符号を示す。
【００６５】
これらの結果のそれぞれは、前記生体異物の毒性シグネチャーであり、それに特異的である。
【００６６】
【表４】
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これらの４つの実験に加えて、いくつかのモデルについてそれらの性能を評価するためにＲＯＣ曲線が計算された。例えば、毒性予測が１０ｍＭＡＰＡＰ及び５ｍＭＮＨ３への暴露のセットについてなされた。それぞれ得られたＲＯＣ曲線は図５ａ及び５ｂに示されている。
【００６７】
ＡＵＣはそれぞれ０．９４３７２３と０．９３３５９６８であり、ほとんど９５％の信頼度であった。１０ｍＭの毒性評価のための１つのモデルは、ＡＵＣは０．９９９４３１８（９９．９４％信頼度）であった。
【００６８】
このモデルの性能は従って完全に満足できるものである。
【００６９】
毒性学的スクリーニング
本発明の第２の側面により、毒性学的スクリーニング方法が提案される。
【００７０】
この考えは、非常に迅速に同定される生体異物と比較することによるシグネチャーのベースを構築することである。有利には、新たな物質が本発明の第１の側面による方法で評価されると、そのシグネチャーがデータベースに追加されることである。時間を経るにつれて完全なデータベースが完成する。
【００７１】
この目的が、未知物質の同定である場合には、第１のステップは、その毒性シグネチャーを得るために前記毒性評価のステップの全てを実行することである。次に、未知物質のシグネチャーと比較可能なシグネチャーが前記データベース内で検索され同定される。有利には、許容範囲閾値はユーザにより設定される。非常に低い許容レベルは、知られている物質でさえ検出しない確率を増加させるが、物質が実際検出される場合には高いレベルの信頼性を保証する。より低い許容レベルは、いくつかの回答を提案することができ、ユーザにそれから選択する余地を残す。又は、比較されるのはシグネチャーではなく、検出されたバイオマーカーのリストであるか、又は直接スペクトルである。
【００７２】
物質がすでに見出されたものである場合、この方法は、それをほんの数分で大きな確実性で同定することを可能とし、ハイスループットスクリーニングへの展望を開く。現在は未知物質の同定のための唯一の方法は、ユーザにより選択された一連の化学試験からなり、仮定に基づいて時間と資源を費やす方法である。
【００７３】
システム
本発明の最後の側面は、本発明の第１の側面による毒性評価の方法を実施するシステム、又は本発明の第２の側面による毒性学的スクリーニングの方法を実施するシステムを提案することである。これらのシステムは、少なくとも１つのバイオリアクター、データ処理手段及びバイオマーカー検出装置を含む。
【００７４】
毒性学的スクリーニングのためのこのシステムはさらに、データキ記憶装置を含み、これは例えば知られた生体異物のシグネチャーを含むデータベースを記憶することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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