(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１から６のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、
前記オリゴヌクレオチドの３’末端側に直接付加した、ペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドをコードするオリゴヌクレオチドとを含む、
ヒト由来タンパク質を発現させるためのベクター。
【請求項２】
ペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドが、配列番号７から９のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドである、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
ヒト由来タンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入した請求項１または２に記載のベクターを用いて宿主を形質転換して得られる、ヒト由来タンパク質を発現可能な形質転換体。
【請求項４】
宿主が大腸菌である、請求項３に記載の形質転換体。
【請求項５】
ヒト由来タンパク質がヒトＦｃ結合性タンパク質である、請求項３または４に記載の形質転換体。
【請求項６】
ヒト由来タンパク質がヒトエリスロポエチン結合性タンパク質である、請求項３または４に記載の形質転換体。
【請求項７】
請求項３または４に記載の形質転換体を培養する工程を含む、ヒト由来タンパク質の製造方法。
【請求項８】
請求項５に記載の形質転換体を培養する工程を含む、ヒトＦｃ結合性タンパク質の製造方法。
【請求項９】
請求項６に記載の形質転換体を培養する工程を含む、ヒトエリスロポエチン結合性タンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えタンパク質を発現させるための新規なベクター、およびそれを用いて宿主を形質転換して得られる形質転換体により、タンパク質を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子工学的手法を用いて製造された組換えタンパク質は、医薬、農薬、研究試薬等に数多く用いられている。組換えタンパク質を製造するために用いる宿主としては主に、細菌、酵母、糸状菌、動物細胞などが用いられる。なかでも、大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（以下、本明細書では単に大腸菌とする）は組換えタンパク質を製造するための宿主として代表的に用いられており、研究例も豊富である。しかしながら、ヒト等の異種生物に由来した組換えタンパク質を大腸菌の細胞質内で発現させようとすると、しばしば、前記組換えタンパク質が不活性型の封入体として発現することがある。封入体として発現した不活性型タンパク質を活性型タンパク質に変換するには、リフォールディング工程を経る必要があり、作業が非常に煩雑となる。
【０００３】
細胞質内で封入体として発現する組換えタンパク質であっても、ペリプラズムであれば可溶性の活性型タンパク質として発現する場合がある（非特許文献１）。特に製造対象の組換えタンパク質がジスルフィド結合を有している場合、酸化的環境であり、かつジスルフィド結合形成に関与するタンパク質が存在するペリプラズムにおいて、前記タンパク質にジスルフィド結合が形成されることで、活性型タンパク質として発現する傾向がある。
【０００４】
組換えタンパク質をペリプラズムに分泌発現させるためには、組換えタンパク質を、そのＮ末端側に、ペリプラズムへの分泌発現を促進させるシグナルペプチドを付加した状態で発現させる必要がある。なお、前記シグナルペプチドは、組換えタンパク質がペリプラズムへ分泌発現される際、シグナルペプチダーゼにより、組換えタンパク質から切除されるため、最終的には前記シグナルペプチドのない、組換えタンパク質が得られる。しかしながら、ペリプラズムに分泌発現させる方法を用いた場合、活性型組換えタンパク質の製造効率が低いという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０００−０８３６７０号公報
【特許文献２】特開平８−３２２５８６号公報
【特許文献３】特開２００１−０６１４８７号公報
【特許文献４】特開２００８−２４５５８０号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｃｈｏｉ，Ｊ．Ｈ．  ａｎｄ  Ｌｅｅ，Ｓ．Ｙ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，６４，６２５−６３５，２００４
【非特許文献２】Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３０，ｅ４３，２００２
【非特許文献３】Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６７，１５６５−１５７０，２０００
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
宿主のペリプラズムへ分泌発現させる方法を用いて組換えタンパク質を製造する際、その効率を改善する方法として、ジスルフィド結合形成に関係するＤｓｂタンパク質と共発現させる方法（特許文献１）、グルタチオンレダクターゼと共発現させる方法（特許文献２）、分子シャペロンと共発現させる方法（特許文献３）等が報告されている。しかしながら、いずれの方法も共発現系の構築や共発現条件の最適化など、煩雑な操作を必要とした。
【０００８】
そこで本発明は、組換えタンパク質を宿主において高効率で分泌発現可能な新規なベクター、およびそれを用いて得られる形質転換体により組換えタンパク質を高効率に製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ペリプラズムにタンパク質を分泌させるためのシグナルペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを含むベクターに、さらに新規なオリゴヌクレオチドを挿入することで、組換えタンパク質を宿主において高効率に分泌させることができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、以下の態様を包含する：
（１）配列番号１から６のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、ペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドをコードするオリゴヌクレオチドとを含む、ヒト由来タンパク質を発現させるためのベクター。
【００１１】
（２）ペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドが、配列番号７から９のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドである、（１）に記載のベクター。
【００１２】
（３）ヒト由来タンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入した（１）または（２）に記載のベクターを用いて宿主を形質転換して得られる、ヒト由来タンパク質を発現可能な形質転換体。
【００１３】
（４）宿主が大腸菌である、（３）に記載の形質転換体。
【００１４】
（５）ヒト由来タンパク質がヒトＦｃ結合性タンパク質である、（３）または（４）に記載の形質転換体。
【００１５】
（６）ヒト由来タンパク質がヒトエリスロポエチン結合性タンパク質である、（３）または（４）に記載の形質転換体。
【００１６】
（７）（３）または（４）に記載の形質転換体を培養する工程を含む、ヒト由来タンパク質の製造方法。
【００１７】
（８）（５）に記載の形質転換体を培養する工程を含む、ヒトＦｃ結合性タンパク質の製造方法。
【００１８】
（９）（６）に記載の形質転換体を培養する工程を含む、ヒトエリスロポエチン結合性タンパク質の製造方法。
【００１９】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００２０】
本発明のベクターは、配列番号１（５’−ＣＴＴＴＡＡＧＡＡＣＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴ−３’）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、配列番号２（５’−ＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＣＡＴ−３’）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、配列番号３（５’−ＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＡＡＴＡＣＡＴ−３’）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、配列番号４（５’−ＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＡＴＡＣＡＴ−３’）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、配列番号５（５’−ＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＡＴＡＡＴＡＣＡＴ−３’）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、配列番号６（５’−ＣＴＴＴＡＡＧＡＡＣＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＡＴＡＣＡＴ−３’）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのうちのいずれかと、ペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドをコードするオリゴヌクレオチドと、を含んでいることを特徴としている。なお、本願出願前に公開されていたＤＮＡ配列データベース（ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ、アクセス日：２０１０年１０月２２日）を用いて、先行技術を調査したところ、配列番号１から６のいずれかに記載の塩基配列とペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドをコードするオリゴヌクレオチドとを含むベクターは開示されておらず、本発明のベクターは新規なベクターであることを確認している。
【００２１】
本発明のベクターに含まれる、配列番号１から６のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチドＡ）と、ペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドをコードするオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチドＢ）は、オリゴヌクレオチドＡの３’末端側にオリゴヌクレオチドＢを直接付加する形で含んでいると好ましい。また、オリゴヌクレオチドＢの３’末端側直後に制限酵素サイトを設け、発現させるヒト由来タンパク質をコードするポリヌクレオチドを前記サイトに挿入できるようにするとより好ましい。
【００２２】
本発明のベクターに含まれる、配列番号１から６に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは、いずれもその３’末端側にある、ヒト由来タンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現の翻訳効率を制御する機能を有するオリゴヌクレオチドである。なお、配列番号１から６に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのうち、どのオリゴヌクレオチドを選択するかにより、ヒト由来タンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現の翻訳効率は変化する。例えば、宿主が大腸菌の場合、翻訳効率が高い順に、配列番号３、配列番号２、配列番号４、配列番号１、配列番号５、配列番号６となる（参考例参照）。配列番号１から６に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのうち、どのオリゴヌクレオチドを選択するかについては、発現させるヒト由来タンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現の翻訳効率や、前記タンパク質を発現させるための宿主を考慮し、適宜選択すればよい。
【００２３】
本発明のベクターは、配列番号１から６のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとペリプラズムにタンパク質を分泌させるためのオリゴヌクレオチドとを少なくも含んでいればよいが、前記２つのオリゴヌクレオチドの他に、転写開始に必要なプロモーターの機能を有するポリヌクレオチド、転写終結に必要なターミネーターの機能を有するポリヌクレオチド、複製起点の機能を有するポリヌクレオチド、抗生物質耐性遺伝子等の選択マーカーの機能を有するポリヌクレオチド、複数の制限酵素サイトを有したマルチクローニングサイトを構成するポリヌクレオチド等を、さらに含んでいると好ましい。
【００２４】
本発明のベクターは、例えば、前述した、プロモーター、ターミネーター、複製起点、選択マーカー、マルチクローニングサイト等の機能を有するポリヌクレオチドを含む、市販のベクターの適切な箇所に、配列番号１から６のいずれかに記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド、およびペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを、遺伝子工学的手法を用いて挿入することで作製できる。前記市販のベクターは、形質転換する宿主に好ましいベクターを適宜選択すればよく、宿主が大腸菌の場合は、ｐＵＣ、ｐＥＴ、ｐＢＢＲ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＴｒｃ９９ａなどのプラスミドベクターが例示できる。本発明のベクターを作製する具体的な方法の一例として、配列番号１から６のいずれかに記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの３’末端側にペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを直接結合したオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲ法で作製し、前記作製したオリゴヌクレオチドを市販の制限酵素やライゲーション試薬等を用いて、市販のベクター中の適切な位置（例えばプロモーターとターミネーターとの間）に挿入する方法があげられる。
【００２５】
本発明のベクターに含まれる、ペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドは、組換えタンパク質を発現させる宿主により適宜選択すればよい。組換えタンパク質を製造するための宿主として大腸菌を用いる場合、大腸菌のペリプラズム分泌経路としてＳｅｃＹＥＧ複合体を介した分泌経路とツインアルギニン輸送（Ｔａｔ）系を介した分泌経路が知られている（非特許文献１）ことから、前記経路を利用するシグナルペプチドを用いると好ましい。具体的には、ＰｅｌＢシグナルペプチド（ＭＫＹＬＬＰＴＡＡＡＧＬＬＬＬＡＡＱＰＡＭＡ：ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｎｏ．Ｐ０Ｃ１Ｃ１の１番目から２２番目までの領域、配列番号７）、ＭａｌＥシグナルペプチド（ＭＫＩＫＴＧＡＲＩＬＡＬＳＡＬＴＴＭＭＦＳＡＳＡＬＡ：ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｎｏ．Ｐ０ＡＥＸ９の１番目から２６番目までの領域、配列番号８）、ＴｏｒＴシグナルペプチド（ＭＲＶＬＬＦＬＬＬＳＬＦＭＬＰＡＦＳ：ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｎｏ．Ｐ３８６８３の１番目から１８番目の領域、配列番号９）があげられる。
【００２６】
本発明のベクターを用いて組換えタンパク質を製造するには、本発明のベクターに含まれる、ペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドをコードするオリゴヌクレオチドの３’末端側に直接、または任意のリンカーペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを介して、組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド（組換えタンパク遺伝子）を挿入し、前記遺伝子を挿入したベクターを用いて宿主を形質転換して得られる形質転換体を、培養して製造すればよい。
【００２７】
本発明のベクターを用いて製造する組換えタンパク質は、ヒト由来タンパク質のように従来の発現方法では活性型タンパク質としての発現が困難または発現量が少ないタンパク質に対して適用すると、本発明の効果を発揮できる点で好ましい。また、本発明のベクターを用いて製造する組換えタンパク質は、その由来する生物（例えば、ヒト）において細胞外に分泌発現されるタンパク質、または発現後にタンパク質の構造の一部分が細胞外に露出するタンパク質が、宿主のペリプラズムにおいて活性型タンパク質としての発現が期待できる点で好ましい。
【００２８】
本発明のベクターを用いて製造するヒト由来タンパク質の一例として、インシュリン、インターフェロン、インターロイキン、抗体、エリスロポエチン、成長ホルモン、およびそれらの受容体のタンパク質等があげられる。なお、本発明のベクターを用いて製造するヒト由来タンパク質は、前記タンパク質の完全体であってもよいし、前記タンパク質の機能に重要な部分のみから構成されるタンパク質であってもよいし、さらに前記タンパク質を構成するアミノ酸残基の一つ以上が欠失および／または挿入および／または置換されていてもよい。本発明のベクターを用いて製造するヒト由来タンパク質の好ましい一例である、ヒトＦｃ結合性タンパク質の場合、該タンパク質は、ヒトＦｃ結合性タンパク質の一つであるヒトＦｃγＲＩの全領域（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｎｏ．Ｐ１２３１４、配列番号７６）であってもよく、ヒトＦｃγＲＩの一部領域（例えば、配列番号７６に記載のアミノ酸配列のうち、１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸からなるタンパク質）であってもよく、ヒトＦｃγＲＩの全領域または一部領域のアミノ酸のうちの一つ以上が欠失および／または挿入および／または置換されたヒトＦｃγＲＩであってもよい。また、本発明のベクターを用いて製造するヒト由来タンパク質の別の好ましい一例である、ヒトエリスロポエチン結合性タンパク質の場合、該タンパク質は、ヒトエリスロポエチン受容体の全領域（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｎｏ．Ｐ１９２３５）であってもよく、ヒトエリスロポエチン受容体の一部領域（例えば、配列番号７７）であってもよく、ヒトエリスロポエチン受容体の全領域または一部領域のアミノ酸のうち一つ以上が欠失および／または挿入および／または置換されたものであってもよい。なお、本発明のベクターを用いて製造するヒト由来タンパク質に、簡便な精製や定量を容易にするためのタグ配列を付加してもよい。前記タグ配列の一例として、ポリヒスチジンタグやｃ−ｍｙｃタグといった遺伝子工学で多用されるオリゴペプチドがあげられる。
【００２９】
本発明のベクターに挿入する、ヒト由来タンパク質をコードするポリヌクレオチドを作製する方法としては、
（Ｉ）ヒト由来タンパク質のアミノ酸配列から塩基配列に変換し、前記塩基配列を含むポリヌクレオチドを人工的に合成して作製する方法や、
（ＩＩ）ヒト由来タンパク質の全体または部分配列を含むポリヌクレオチドを直接人工的に、またはヒト由来タンパク質のｃＤＮＡなどからＰＣＲ法といったＤＮＡ増幅法を用いて調製し、調製した前記ポリヌクレオチドを適当な方法で連結し作製する方法、
を例示することができる。なお、アミノ酸配列から塩基配列に変換する際は、形質転換させる宿主におけるコドンの使用頻度を考慮して変換するのが好ましい。一例として、宿主が大腸菌の場合は、アルギニン（Ａｒｇ）ではＡＧＡ／ＡＧＧ／ＣＧＧ／ＣＧＡが、イソロイシン（Ｉｌｅ）ではＡＴＡが、ロイシン（Ｌｅｕ）ではＣＴＡが、グリシン（Ｇｌｙ）ではＧＧＡが、プロリン（Ｐｒｏ）ではＣＣＣが、それぞれ使用頻度が少ないため（いわゆるレアコドンであるため）、それらのコドンを避けるように変換すればよい。コドンの使用頻度の解析は公的データベース（例えば、かずさＤＮＡ研究所のホームページにあるＣｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅなど）を利用することによっても可能である。
【００３０】
本発明のベクターに、ヒト由来タンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入したベクターを用いて形質転換させる宿主としては、前記ヒト由来タンパク質の発現に適した宿主を適宜選択すればよく、ＣＯＳ細胞やＣＨＯ細胞に代表される動物細胞、バチルス属（ブレビバチルス属細菌やパエニバチルス属細菌のような広義のバチルス属細菌も含む）や大腸菌に代表される細菌、サッカロマイセス属、ピキア属、シゾサッカロマイセス属に代表される酵母、麹菌に代表される糸状菌が例示できるが、取扱いの簡便な大腸菌を宿主とするのが好ましい。なお、宿主を大腸菌とした場合、ＢＬ２１（ＤＥ３）株、ＪＭ１０９株、ＨＢ１０１株といった遺伝子型が明らかとなっている株が特に好ましい。
【００３１】
本発明のベクターにヒト由来タンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入したベクターを用いて宿主を形質転換させる方法としては、遺伝子組換え技術において慣用されている方法に準じて実施すればよく、具体的には塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法等を例示することができる。これにより、前記ヒト由来タンパク質を発現可能な形質転換体（以下、単に本発明の形質転換体とする）が得られる。
【００３２】
本発明の形質転換体は、当該技術分野で周知であり、かつ、選択した宿主細胞の培養に適した培地で増殖させればよい。一例として宿主が大腸菌の場合は、好ましい培地の一例として、必要な栄養源を補ったＬＢ（ルリア−ベルターニ）培地があげられる。本発明のベクターに抗生物質耐性遺伝子等の選択マーカーの機能を有するポリヌクレオチドが挿入されている場合は、前記選択マーカーに対応する薬剤を培地に添加した状態で培養すると、本発明の形質転換体を選択的に増殖できるため好ましい。例えば、形質転換に用いた本発明のベクターが、選択マーカーとしてカナマイシン耐性遺伝子を挿入していた場合、培地にカナマイシンを添加することで、本発明の形質転換体を選択的に増殖させることができる。なお、培地には、炭素、窒素および無機塩供給源の他に、適当な栄養源を加えてもよい。さらに、所望により、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレート、及びジチオスレイトールからなる群から選択される一種類以上の還元剤を含んでもよい。また、培地にはグリシンといった、宿主から培養液へのタンパク質漏出を促す試薬を加えてもよい。
【００３３】
本発明の形質転換体の培養温度および培地のｐＨについても、形質転換に用いた宿主に好ましい条件で行なえばよい。一例として宿主が大腸菌の場合、培養温度は１０℃から４０℃の範囲が好ましいが、特に形質転換体を増殖させるには３０℃から３８℃の範囲がより好ましく、形質転換体から組換えタンパク質を発現させるには１５℃から２５℃の範囲がより好ましい。また、培地のｐＨはｐＨ６．５からｐＨ７．５の範囲が好ましく、ｐＨ６．８からｐＨ７．２の範囲がさらに好ましい。
【００３４】
本発明の形質転換体を作製するときに用いる宿主が好気性生物または通性嫌気性生物である場合、培養液に通気する必要があるが、その方法としては、宿主が細菌の場合、綿栓等の通気性のある栓をしたバッフル付三角フラスコを培養容器に用い、培養中、当該容器を振とうすることで培養液に通気を行なう方法が例示できる。
【００３５】
本発明のベクターに、誘導可能なプロモーターの機能を有するポリヌクレオチドを含んでいる場合は、前記プロモーターによりヒト由来タンパク質を効率的に発現できるような条件下で誘導をかけ、培養するのが好ましい。一例として、本発明のベクターに、ｌａｃプロモーターやｔｒｃプロモーターを含んでいる場合は、ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を培地に添加することで誘導をかけ、培養すればよい。具体的には、培養液の濁度（Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  ａｔ  ６００ｎｍ、ＯＤ６００）を測定し、約０．５から１．０となったときに、適当量のＩＰＴＧを添加後、引き続き培養することで、ヒト由来タンパク質の発現を誘導することができる。ＩＰＴＧの添加濃度は０．００５ｍＭから１．０ｍＭの範囲から適宜選択すればよいが、０．０１ｍＭから０．０５ｍＭの範囲が好ましい。ＩＰＴＧ誘導に関する種々の条件は当該技術分野において周知の条件で行なえばよい。
【００３６】
本発明の形質転換体の培養液からヒト由来タンパク質を回収するには、発現の形態によって一般的な抽出方法を適宜選択して用いればよい。例えばヒト由来タンパク質が宿主細胞のペリプラズムに発現する場合には、遠心分離操作により宿主細胞を集めた後、酵素や界面活性剤等を添加し、超音波破砕処理により宿主細胞を破砕して、当該組換えタンパク質を抽出すればよい。一方、ヒト由来タンパク質が細胞のペリプラズムから培養上清に漏出する場合は、宿主細胞を遠心分離操作によって分離し、得られる培養上清から当該ヒト由来タンパク質を抽出すればよい。
【００３７】
前記タンパク質抽出物からヒト由来タンパク質を分離・精製するには、当該技術分野において公知の方法を用いればよい。一例として、液体クロマトグラフィーを用いた分離・精製があげられる。液体クロマトグラフィーとしては、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどがあげられる。これらのクロマトグラフィーを組み合わせて精製操作を行なうことによって、ヒト由来タンパク質を高純度に調製することができる。
【発明の効果】
【００３８】
本発明のベクターは、新規なオリゴヌクレオチドである配列番号１から６のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、ペリプラズムにタンパク質を分泌させるためのオリゴヌクレオチドと、を含んでいることを特徴としている。本発明のベクターは、ヒト由来タンパク質といった、従来の発現方法では活性型タンパク質としての発現が困難または発現量が少ないタンパク質であっても、前記タンパク質を効率的に発現させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥおよびｐＥＴＭａｌＥ−ｐ７の概要とその作製工程を示した図である。
【図２】組換えプラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｐ７の概要とその作製工程を示した図である。
【図３】組換えプラスミドベクターｐＥＴＧＦＰ−ｐ７の概要とその作製工程を示した図である。
【図４】ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）をレポータータンパク質として用いた翻訳効率の評価方法の概略図である。
【図５】形質転換体より発現したＧＦＰ量を培養液濁度あたりの蛍光強度で評価した結果を示した図である。
【図６】プラスミドベクターｐＵＣ−ＥＰＯＲの概要とその作製工程を示した図である。
【図７】プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥ−ｐ７−Ｅの概要とその作製工程を示した図である。
【図８】プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥ−ｐ７−ＥＰＯＲの概要とその作製工程を示した図である。
【実施例】
【００４０】
以下、実施例および比較例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、参考例は本発明を構成するものではない。
【００４１】
実施例１
配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むヒトＦｃ結合性タンパク質発現ベクター、および前記ベクターにより得られる形質転換体を以下の方法で作製した。
（１）ペリプラズムにタンパク質を分泌させるためのシグナルペプチドとして、ＭａｌＥシグナルペプチド（配列番号８）を選択し、下記に示す二段階ＰＣＲにより、前記シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを作製した。
（１−１）一段階目のＰＣＲを、表１の反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第一ステップ、５５℃で５秒間の第二ステップ、７２℃で１分間の第三ステップを１サイクルとした反応を５サイクル行なった後、４℃に冷却することで行なった。なお、オリゴヌクレオチドは、配列番号１０（５’−ＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＣＡＧＧＴＧＣＡＣＧＣＡＴＣＣ−３’）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、配列番号１１（５’−ＧＣＡＴＴＡＡＣＧＡＣＧＡＴＧＡＴＧＴＴＴＴＣＣＧＣＣＴＣＧＧＣＴＣＴＣＧＣＣ−３’）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、配列番号１２（５’−ＡＴＣＧＴＣＧＴＴＡＡＴＧＣＧＧＡＴＡＡＴＧＣＧＡＧＧＡＴＧＣＧＴＧＣＡＣＣＴＧ−３’）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および配列番号１３（５’−ＴＴＧＴＣＣＣＡＴＧＧＣＴＴＣＴＴＣＧＡＴＴＴＴＧＧＣＧＡＧＡＧＣＣＧ−３’）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。
【００４２】
【表１】
0005865002.tif 000002
【００４３】
（１−２）二段階目のＰＣＲを、表２の反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第一ステップ、５５℃で５秒間の第二ステップ、７２℃で１分間の第三ステップを１サイクルとした反応を３０サイクル行なった後、４℃に冷却することで行なった。なお、鋳型としては一段階目のＰＣＲ産物を用い、ＰＣＲプライマーとしては配列番号１０に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号１３に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。
【００４４】
【表２】
0005865002.tif 000003
【００４５】
（２）二段階ＰＣＲにより作製した、ＭａｌＥシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを、制限酵素ＮｄｅＩとＮｃｏＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＮｄｅＩとＮｃｏＩで消化したｐＥＴ−２６ｂ（＋）プラスミドベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にライゲーションし、これを用いて塩化カルシウム法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を形質転換した。
（３）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養後、菌体からプラスミドを抽出し、このプラスミドをプラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥとした。プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥの概要とその作製工程を図１に示す。
（４）鋳型としてプラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥ（図１）を、ＰＣＲプライマーとして配列番号１４（５’−ＡＧＴＡＧＴＡＧＧＴＴＧＡＧＧＣＣＧＴＴＧＡＧ−３’）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号１５（５’−ＴＴＴＴＣＡＴＡＴＧＴＡＴＴＡＴＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＡＡ−３’）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いて、表２の反応組成のもと、９８℃で１０秒間の第一ステップ、５５℃で５秒間の第二ステップ、７２℃で１分間の第三ステップを１サイクルとした反応を３０サイクル行なった後、４℃に冷却することでＰＣＲを行なった。
（５）（４）のＰＣＲ産物を制限酵素ＳｐｈＩとＮｄｅＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＳｐｈＩとＮｄｅＩで消化したｐＥＴＭａｌＥにライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（６）（５）の形質転換体を培養後、プラスミドを抽出し、このプラスミドをプラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥ−ｐ７とした。プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥ−ｐ７には、配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、ＭａｌＥシグナルペプチド（配列番号８）をコードするオリゴヌクレオチドと、を含んでいる。プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥ−ｐ７の概要とその作製工程を図１に示す。また、プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥ−ｐ７（図１）のうち、制限酵素ＢｇｌＩＩ認識サイトからＢｐｕ１１０２Ｉ認識サイトまでのポリヌクレオチドの塩基配列を配列番号１６に示す。なお、配列番号１６に記載の塩基配列のうち、８８番目から１１５番目までのヌクレオチドが配列番号４に相当し、１１６番目から１９３番目までのヌクレオチドがＭａｌＥシグナルペプチド（配列番号８）をコードするオリゴヌクレオチドに相当する。
（７）下記の方法により組換えプラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｐ７およびその形質転換体を作製した。
（７−１）特開２００８−２４５５８０号公報（特許文献４）に開示の方法に従い、コドンを大腸菌型に変換したヒトＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドベクターｐＥＣＦｃＲを作製した。
（７−２）鋳型としてプラスミドベクターｐＥＣＦｃＲを、ＰＣＲプライマーとして配列番号１７（５’−ＴＣＡＧＣＣＡＴＧＧＧＡＣＡＡＧＴＡＧＡＴＡＣＣＡＣＣＡＡＡＧＣＴＧＴＧＡＴＴＡ−３’）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号１８（５’−ＣＣＡＡＧＣＴＴＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＡＣＣＧＧＧＧＴＣＧＧＣＡＧＴＴＧＡＡＧＡＣＣＣＡＧ−３’）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いて、表２の反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第一ステップ、５５℃で５秒間の第二ステップ、７２℃で１分間の第三ステップを１サイクルとした反応を３０サイクル行なった後、４℃に冷却することでＰＣＲを行ない、Ｃ末端側にポリヒスチジンタグを付加した、ヒトＦｃγＲＩの細胞外領域（配列番号７６に記載のアミノ酸配列のうち、１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでの領域）を含むポリペプチドをコードする塩基配列を含む、ポリヌクレオチドを作製した。
（７−３）（７−２）で得られたポリヌクレオチドを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したプラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥ−ｐ７（図１）にライゲーションすることで、プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｐ７を作製した。プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｐ７の概要とその作製工程を図２に示す。
（８）プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｐ７（図２）を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を塩化カルシウム法により形質転換し、ｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｐ７の形質転換体を作製した。
【００４６】
プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｐ７により発現される組換えタンパク質は、ヒトＦｃγＲＩの細胞外領域からなる抗体結合性タンパク質であり、以降、本明細書では当該タンパク質をｒｈＦｃγＲＩと略記する。プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｐ７（図２）には、５’末端側から、配列番号４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド、ＭａｌＥシグナルペプチド（配列番号８）をコードするオリゴヌクレオチド、ｒｈＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチド、ポリヒスチジンタグをコードするオリゴヌクレオチドの順に配置されている。プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｐ７（図２）のうち、制限酵素ＢｇｌＩＩ認識サイトからＨｉｎｄＩＩＩ認識サイトまでの塩基配列を、配列番号１９に示す。なお、配列番号１９に記載の塩基配列のうち、８８番目から１１５番目までのヌクレオチドが配列番号４に相当し、１１６番目から１９３番目までのヌクレオチドがＭａｌＥシグナルペプチド（配列番号８）をコードするオリゴヌクレオチドに相当し、２１５番目から１０３６番目までのヌクレオチドがｒｈＦｃγＲＩ（配列番号７６に記載のアミノ酸配列のうち、１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでの領域）をコードするオリゴヌクレオチドに相当し、１０３７番目から１０５４番目のヌクレオチドがポリヒスチジンタグをコードするオリゴヌクレオチドに相当する。
【００４７】
実施例２
配列番号１に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むヒトＦｃ結合性タンパク質発現ベクター、および前記ベクターにより得られる形質転換体を以下の方法で作製した。
（１）鋳型として実施例１で作製したプラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥ−ｐ７（図１）を、ＰＣＲプライマーとして配列番号１４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号２１（５’−ＡＴＴＴＴＣＡＴＡＴＧＴＡＴＡＴＣＴＣＧＴＴＣＴＴＡＡＡ−３’）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いて、表２の反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第一ステップ、５５℃で５秒間の第二ステップ、７２℃で１分間の第三ステップを１サイクルとした反応を３０サイクル行なった後、４℃に冷却することでＰＣＲを行なった。
（２）ＰＣＲ産物を制限酵素ＳｐｈＩとＮｄｅＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＳｐｈＩとＮｄｅＩで消化した組換えプラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｐ７（図２）にライゲーションすることで、プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｒｂｓを作製した。プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｒｂｓは、プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｐ７（図２）に含まれる配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの部分を、配列番号１に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドに置換した構造である。
（３）プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｒｂｓを用いて、塩化カルシウム法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、ｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｒｂｓの形質転換体を作製した。
【００４８】
実施例３
配列番号２に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むヒトＦｃ結合性タンパク質発現ベクター、および前記ベクターにより得られる形質転換体を以下の方法で作製した。
（１）ＰＣＲプライマーとして、配列番号１４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号２２（５’−ＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＡＡＧＴＴ−３’）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いたほかは、実施例２と同様の方法により、プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｍ４を作製した。プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｍ４は、プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｐ７（図２）に含まれる配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの部分を、配列番号２に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドに置換した構造である。
（２）プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｍ４を用いて、塩化カルシウム法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、ｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｍ４形質転換体を作製した。
【００４９】
実施例４
配列番号３に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むヒトＦｃ結合性タンパク質発現ベクター、および前記ベクターにより得られる形質転換体を以下の方法で作製した。（１）ＰＣＲプライマーとして、配列番号１４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号２３（５’−ＴＴＴＴＡＣＡＴＡＴＧＴＡＴＴＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＡ−３’）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いたほかは、実施例２と同様の方法により、プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｐ４を作製した。プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｐ４は、プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｐ７（図２）に含まれる配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの部分を、配列番号３に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドに置換した構造である。
（２）プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｐ４を用いて、塩化カルシウム法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、ｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｐ４形質転換体を作製した。
【００５０】
実施例５
配列番号５に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むヒトＦｃ結合性タンパク質発現ベクター、および前記ベクターにより得られる形質転換体を以下の方法で作製した。（１）ＰＣＲプライマーとして、配列番号１４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号２４（５’−ＴＴＴＴＣＡＴＡＴＧＴＡＴＴＡＴＴＡＴＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡ−３’）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いたほかは、実施例２と同様の方法により、プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｐ１０を作製した。プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｐ１０は、プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｐ７（図２）に含まれる配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの部分を、配列番号５に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドに置換した構造である。
（２）プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｐ１０を用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を塩化カルシウム法により形質転換し、ｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｐ１０形質転換体を作製した。
【００５１】
実施例６
配列番号６に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むヒトＦｃ結合性タンパク質発現ベクター、および前記ベクターにより得られる形質転換体を以下の方法で作製した。
（１）ＰＣＲプライマーとして、配列番号１４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号２５（５’−ＴＴＴＴＣＡＴＡＴＧＴＡＴＴＡＴＧＴＡＴＡＴＣＴＣＧＴＴＣＴＴＡＡＡ−３’）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いたほかは、実施例２と同様の方法により、プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｒｂｓｐ７を作製した。プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｒｂｓｐ７は、プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｐ７（図２）に含まれる配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの部分を、配列番号６に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドに置換した構造である。
（２）プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｒｂｓｐ７を用いて、塩化カルシウム法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、ｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｒｂｓｐ７の形質転換体を作製した。
【００５２】
実施例７
実施例１から実施例６で作製した各形質転換体を用いて、ｒｈＦｃγＲＩを発現させ、その量を評価した。
（１）実施例１で作製したｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｐ７形質転換体、実施例２で作製したｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｒｂｓ形質転換体、実施例３で作製したｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｍ４形質転換体、実施例４で作製したｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｐ４形質転換体、実施例５で作製したｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｐ１０形質転換体、および実施例６で作製したｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｒｂｓｐ７形質転換体、それぞれに対して、下記の方法により各形質転換体の培養および発現の誘導を行なった。
（１−１）各形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地に接種し、３７℃で一晩振とう培養し、前培養液とした。
（１−２）新たに５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地に、前培養液を接種し３７℃で振とう培養した。
（１−３）培養液の濁度（ＯＤ６００）の値が約０．５になったところで、培養温度を２０℃にして３０分培養後、ＩＰＴＧを終濃度０．０１ｍＭとなるように培養液に添加することで発現の誘導を行ない、引き続き２０℃で２２時間振とう培養した。
（１−４）培養後、遠心操作により得られた各形質転換体の菌体から、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を用いて可溶性タンパク質抽出液を調製した。
（２）可溶性タンパク質抽出液中のｒｈＦｃγＲＩのタンパク質量を下記に示すＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）法により評価した。
（２−１）９６穴マイクロプレートのウェルに、抗体であるガンマグロブリン（化学及血清療法研究所製）を濃度１μｇ／ｗｅｌｌで固定し（４℃、１８時間）、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒｓ（ＰＩＥＲＣＥ社製）によりブロッキングした。
（２−２）ブロッキング後、（１−４）で調製した可溶性タンパク質抽出液を段階希釈し、ＥＬＩＳＡ反応に供した（３０℃、２時間）。
（２−３）続いて０．２％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ  ２０と１５０ｍＭのＮａＣｌを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄後、Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  抗Ｈｉｓ−Ｔａｇ抗体試薬（ＢＥＴＨＹＬ社製）を添加し、３０℃で２時間反応した。
（２−４）反応後、（２−３）で使用した緩衝液で洗浄を行ない、ＴＭＢ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を添加し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
（２−５）既知濃度のｒｈＦｃγＲＩ市販品（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  ＦｃγＲＩ／ＣＤ６４；Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を基準とし、測定吸光度から可溶性タンパク質抽出液中のｒｈＦｃγＲＩのタンパク質濃度を算出することで、培養液あたりのｒｈＦｃγＲＩの発現量を算出した。
【００５３】
ｎ＝４で測定を行なった結果、各形質転換体による培養液あたりのｒｈＦｃγＲＩの発現量は、多い順に、ｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｐ１０形質転換体（実施例５／配列番号５：８２３±１５８μｇ／Ｌ）、ｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｒｂｓｐ７形質転換体（実施例６／配列番号６：７００±８９μｇ／Ｌ）、ｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｒｂｓ形質転換体（実施例２／配列番号１：５３９±５０μｇ／Ｌ）、ｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｍ４形質転換体（実施例３／配列番号２：４９０±６５μｇ／Ｌ）、ｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｐ７形質転換体（実施例１／配列番号４：４６６±２３μｇ／Ｌ）、ｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｐ４形質転換体（実施例４／配列番号３：４１０±８４μｇ／Ｌ）、であった。実施例１から実施例６で作製した形質転換体のうち、実施例５で作製したｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｐ１０形質転換体が、特に効率よくｒｈＦｃγＲＩを発現できることがわかる。
【００５４】
比較例１
実施例１で作製したプラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｐ７に含まれる配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの部分を、配列番号２６に記載の塩基配列からなるプラスミドベクターｐＥＴ−２６ｂ（＋）由来の既存のオリゴヌクレオチド（５’−ＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴ−３’）に置換した構造である、プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ、および前記ベクターにより得られる形質転換体を、下記の方法により作製した。
（１）実施例１で作製した組換えプラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｐ７（図２）を制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化することで、配列番号２０に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド断片を作製した。なお、配列番号２０に記載のアミノ酸配列のうち、１番目のメチオニンから２６番目までのアラニンまでがＭａｌＥシグナルペプチド（配列番号８）に相当し、３４番目のグルタミンから３０７番目のバリンまでがｒｈＦｃγＲＩ（配列番号７６に記載のアミノ酸配列のうち、１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでの領域）に相当し、３０８番目から３１３番目のヒスチジンがポリヒスチジンタグに相当する。
（２）（１）で作製した断片を、あらかじめ制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＥＴ−２６ｂ（＋）プラスミドベクターにライゲーションすることで、プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥＦｃＲを作製した。
（３）プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥＦｃＲを用いて、塩化カルシウム法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、ｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ形質転換体を作製した。
（４）ｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ形質転換体を用いて、実施例７と同様の方法で、ｒｈＦｃγＲＩの発現および発現量の評価を行なった。
【００５５】
ｎ＝４で測定を行なった結果、ｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ形質転換体による培養液あたりのｒｈＦｃγＲＩ発現量は２９３±１０μｇ／Ｌであり、前記発現量は、実施例１から実施例６で作製した、本発明のベクターを用いて得られた形質転換体によるｒｈＦｃγＲＩの発現量に比べて少なかった。すなわち、ｒｈＦｃγＲＩを発現可能な形質転換体において、配列番号１から６のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプラスミドベクターで形質転換して得られた形質転換体（実施例１から実施例６で作製した形質転換体）は、配列番号１から６に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含まないプラスミドベクター（ｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ）で形質転換して得られた形質転換体（本比較例で作製した形質転換体）と比較し、より高効率にｒｈＦｃγＲＩを発現させることができることがわかる。
【００５６】
実施例８
配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むヒトＦｃ結合性タンパク質発現ベクター、および前記ベクターにより得られる形質転換体を以下の方法で作製した。
（１）ペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドとして、ＰｅｌＢシグナルペプチド（配列番号７）を選択し、下記に示す二段階ＰＣＲにより、前記シグナルペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを作製した。
（１−１）一段階目のＰＣＲを、表１の反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第一ステップ、５５℃で５秒間の第二ステップ、７２℃で１分間の第三ステップを１サイクルとした反応を５サイクル行なった後、４℃に冷却することで行なった。なお、オリゴヌクレオチドとして、配列番号２７（５’−ＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＡＡＴＡＣＣＴＡＴＴＧＣＣＴＡＣＧＧＣＡＧＣＣＧＣＴ−３’）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、配列番号２８（５’−ＡＴＴＧＴＴＡＴＴＡＣＴＣＧＣＴＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＣＧＡＴＧＧＣＣ−３’）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、配列番号２９（５’−ＧＣＡＧＣＧＡＧＴＡＡＴＡＡＣＡＡＴＣＣＡＧＣＧＧＣＴＧＣＣＧＴＡＧＧＣＡ−３’）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および配列番号３０（５’−ＴＴＴＧＧＴＧＧＴＡＴＣＴＡＣＴＴＧＧＧＣＣＡＴＣＧＣＴＧＧＴ−３’）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。
（１−２）二段階目のＰＣＲを、表２の反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第一ステップ、５５℃で５秒間の第二ステップ、７２℃で１分間の第三ステップを１サイクルとした反応を３０サイクル行なった後、４℃に冷却することで行ない、ＰｅｌＢシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを作製した。なお、鋳型としては一段階目のＰＣＲ産物を用い、ＰＣＲプライマーとしては配列番号２７に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号３０に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。
（２）鋳型として実施例１で作製したプラスミドベクターｐＥＣＦｃＲ（図２）を、ＰＣＲプライマーとして配列番号３１（５’−ＣＡＡＧＴＡＧＡＴＡＣＣＡＣＣＡＡＡＧＣＴＧＴＧＡＴＴＡＣＧＣＴＧＣＡＡＣＣＡＣＣＧＴ−３’）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号１８に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用い、表２の反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第一ステップ、５５℃で５秒間の第二ステップ、７２℃で１分間の第三ステップを１サイクルとした反応を３０サイクル行なった後、４℃に冷却するＰＣＲを行なうことで、Ｃ末端側にポリヒスチジンタグを付加したｒｈＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドを作製した。
（３）（２）で作製したＣ末端側にポリヒスチジンタグを付加したｒｈＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドと、（１）で作製したＰｅｌＢシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドとを下記に示す二段階ＰＣＲで連結した。
（３−１）一段階目のＰＣＲを、前記二つのポリヌクレオチドを用いて、表３の反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第一ステップ、５５℃で５秒間の第二ステップ、７２℃で１分間の第三ステップを１サイクルとした反応を５サイクル行なった後、４℃に冷却することで行なった。
【００５７】
【表３】
0005865002.tif 000004
【００５８】
（３−２）二段階目のＰＣＲを、鋳型として一段階目のＰＣＲ産物を、ＰＣＲプライマーとして配列番号２７に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号１８に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いて、表２の反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第一ステップ、５５℃で５秒間の第二ステップ、７２℃で１分間の第三ステップを１サイクルとした反応を３０サイクル行なった後、４℃に冷却することで行なった。
この二段階ＰＣＲにより、ＰｅｌＢシグナルペプチド、ｒｈＦｃγＲＩおよびポリヒスチジンタグからなる一連のポリペプチド（配列番号３３）をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド（配列番号３２）を作製した。なお、配列番号３３に記載のアミノ酸配列のうち、１番目のメチオニンから２２番目までのアラニンまでがＰｅｌＢシグナルペプチド（配列番号７）に相当し、２３番目のグルタミンから２９６番目のバリンまでがｒｈＦｃγＲＩ（配列番号７６に記載のアミノ酸配列のうち、１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでの領域）に相当し、２９７番目から３０２番目までのヒスチジンがポリヒスチジンタグに相当する。
（４）（３）で作製した配列番号３２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した実施例１で作製したプラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥ−ｐ７（図２）にライゲーションすることで、プラスミドベクターｐＥＴＰｅｌＢＦｃＲ−ｐ７を作製した。プラスミドベクターｐＥＴＰｅｌＢＦｃＲ−ｐ７には、５’末端側から、配列番号４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド、ＰｅｌＢシグナルペプチド（配列番号７）をコードするオリゴヌクレオチド、ｒｈＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチド、ポリヒスチジンタグをコードするオリゴヌクレオチドの順に配置されている。
（５）プラスミドベクターｐＥＴＰｅｌＢＦｃＲ−ｐ７を用いて、塩化カルシウム法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換することで、ｐＥＴＰｅｌＢＦｃＲ−ｐ７形質転換体を作製した。
【００５９】
ｐＥＴＰｅｌＢＦｃＲ−ｐ７形質転換体を用いて、実施例７と同様の方法により活性型ｒｈＦｃγＲＩを発現させ、その発現量を評価した。ｎ＝３で測定を行なった結果、ｐＥＴＰｅｌＢＦｃＲ−ｐ７形質転換体による培養液あたりの活性型ｒｈＦｃγＲＩの発現量は２９２±３６μｇ／Ｌであった。
【００６０】
比較例２
実施例８で作製したプラスミドベクターｐＥＴＰｅｌＢＦｃＲ−ｐ７に含まれる配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの部分を、配列番号２６に記載の塩基配列からなるプラスミドベクターｐＥＴ−２６ｂ（＋）由来の既存のオリゴヌクレオチド（５’−ＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴ−３’）に置換した構造である、プラスミドベクターｐＥＴＰｅｌＢＦｃＲ、および前記ベクターにより得られる形質転換体を、下記の方法により作製した。
（１）実施例８で作製した、配列番号３２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＥＴ−２６ｂ（＋）プラスミドベクターにライゲーションすることで、プラスミドベクターｐＥＴＰｅｌＢＦｃＲを作製した。
（２）プラスミドベクターｐＥＴＰｅｌＢＦｃＲを用いて、塩化カルシウム法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、ｐＥＴＰｅｌＢＦｃＲ形質転換体を作製した。
このｐＥＴＰｅｌＢＦｃＲの形質転換体を用いて、実施例７と同様の方法によりｒｈＦｃγＲＩを発現させ、その発現量を評価した。ｎ＝３で測定を行なった結果、ｐＥＴＰｅｌＢＦｃＲ形質転換体による培養液あたりのｒｈＦｃγＲＩの発現量は４８±３μｇ／Ｌであり、前記発現量は、実施例８で作製した、本発明のベクターを用いて得られた形質転換体によるｒｈＦｃγＲＩの発現量に比べて少なかった。すなわち、ｒｈＦｃγＲＩを発現可能な形質転換体において、配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプラスミドベクター（ｐＥＴＰｅｌＢＦｃＲ−ｐ７）で形質転換して得られた形質転換体（実施例８で作製した形質転換体）は、配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含まないプラスミドベクター（ｐＥＴＰｅｌＢＦｃＲ）で形質転換して得られた形質転換体（本比較例で作製した形質転換体）と比較し、より高効率にｒｈＦｃγＲＩを発現させることができることがわかる。
【００６１】
実施例９
配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むヒトＦｃ結合性タンパク質発現ベクター、および前記ベクターにより得られる形質転換体を以下の方法で作製した。
（１）ペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドとして、ＴｏｒＴシグナルペプチド（配列番号９）を選択し、以下に示す二段階ＰＣＲにより、ＴｏｒＴシグナルペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを作製した。
（１−１）一段階目のＰＣＲを、表１の反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第一ステップ、５５℃で５秒間の第二ステップ、７２℃で１分間の第三ステップを１サイクルとした反応を５サイクル行なった後、４℃に冷却することで行なった。なお、オリゴヌクレオチドとして、配列番号３４（５’−ＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＣＧＣＧＴＡＣＴＧＣＴＡＴＴＴＴＴＡＣ−３’）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、配列番号３５（５’−ＴＴＣＴＴＴＣＣＣＴＴＴＴＣＡＴＧＴＴＧＣＣＧＧＣＡＴＴＴＴＣＧ−３’）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、配列番号３６（５’−ＴＧＡＡＡＡＧＧＧＡＡＡＧＡＡＧＴＡＡＡＡＡＴＡＧＣＡＧＴＡＣＧ−３’）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および配列番号３７（５’−ＴＴＴＧＧＴＧＧＴＡＴＣＴＡＣＴＴＧＣＧＡＡＡＡＴＧＣＣＧＧＣＡＡＣＡ−３’）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。
（１−２）二段階目のＰＣＲを、表２の反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第一ステップ、５５℃で５秒間の第二ステップ、７２℃で１分間の第三ステップを１サイクルとした反応を３０サイクル行なった後、４℃に冷却することで行ない、ＴｏｒＴシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを作製した。なお、鋳型としては一段階目のＰＣＲ産物を用い、ＰＣＲプライマーとしては配列番号３４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号３７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。
（２）ＴｏｒＴシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドと、実施例８で作製したＣ末端にポリヒスチジンタグを付加したｒｈＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドを下記に示す二段階ＰＣＲで連結した。
（３−１）一段階目のＰＣＲを、前記二つのポリヌクレオチドを用いて、表３の反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第一ステップ、５５℃で５秒間の第二ステップ、７２℃で１分間の第三ステップを１サイクルとした反応を５サイクル行なった後、４℃に冷却することで行なった。
（３−２）二段階目のＰＣＲを、鋳型として一段階目のＰＣＲ産物を、ＰＣＲプライマーとして配列番号３４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号１８に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いて、表２の反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第一ステップ、５５℃で５秒間の第二ステップ、７２℃で１分間の第三ステップを１サイクルとした反応を３０サイクル行なった後、４℃に冷却することで行なった。
この二段階ＰＣＲにより、ＴｏｒＴシグナルペプチド、ｒｈＦｃγＲＩおよびＨｉｓタグペプチドからなる一連のポリペプチド（配列番号３９）をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド（配列番号３８）を作製した。なお、配列番号３９に記載のアミノ酸配列のうち、１番目のメチオニンから１８番目までのセリンまでがＴｏｒＴシグナルペプチド（配列番号９）に相当し、１９番目のグルタミンから２９２番目のバリンまでがｒｈＦｃγＲＩ（配列番号７６に記載のアミノ酸配列のうち、１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでの領域）に相当し、２９３番目から２９８番目までのヒスチジンがポリヒスチジンタグに相当する。
（４）（３）で作製した配列番号３８に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した実施例１で作製したプラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥ−ｐ７（図２）にライゲーションすることで、プラスミドベクターｐＥＴＴｏｒＴＦｃＲ−ｐ７を作製した。プラスミドベクターｐＥＴＴｏｒＴＦｃＲ−ｐ７には、５’末端側から、配列番号４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド、ＴｏｒＴシグナルペプチド（配列番号９）をコードするオリゴヌクレオチド、ｒｈＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチド、Ｈｉｓタグペプチドをコードするオリゴヌクレオチドの順に配置されている。
（５）組換えプラスミドベクターｐＥＴＴｏｒＴＦｃＲ−ｐ７を用いて、塩化カルシウム法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、ｐＥＴＴｏｒＴＦｃＲ−ｐ７形質転換体を作製した。
（６）ｐＥＴＴｏｒＴＦｃＲ−ｐ７形質転換体を用いて、実施例７と同様の方法によりｒｈＦｃγＲＩを発現させ、その発現量を評価した。ｎ＝３で測定を行なった結果、ｐＥＴＴｏｒＴＦｃＲ−ｐ７の形質転換体による培養液あたりのｒｈＦｃγＲＩの発現量は３２０±６１μｇ／Ｌであった。
【００６２】
比較例３
実施例９で作製したプラスミドベクターｐＥＴＴｏｒＴＦｃＲ−ｐ７に含まれる配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの部分を、配列番号２６に記載の塩基配列からなるプラスミドベクターｐＥＴ−２６ｂ（＋）由来の既存のオリゴヌクレオチド（５’−ＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴ−３’）に置換した構造である、プラスミドベクターｐＥＴＴｏｒＴＦｃＲ、および前記ベクターにより得られる形質転換体を、下記の方法により作製した。
（６）実施例９で作製した配列番号３８に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを、制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＥＴ−２６ｂ（＋）プラスミドベクターにライゲーションすることで、プラスミドベクターｐＥＴＴｏｒＴＦｃＲを作製した。
（７）プラスミドベクターｐＥＴＴｏｒＴＦｃＲを用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、ｐＥＴＴｏｒＴＦｃＲ形質転換体を作製した。
ｐＥＴＴｏｒＴＦｃＲ形質転換体を用いて、実施例７と同様の方法によりｒｈＦｃγＲＩを発現させ、その発現量を評価した。ｎ＝３で測定を行なった結果、ｐＥＴＴｏｒＴＦｃＲ形質転換体による培養液あたりの活性型ｒｈＦｃγＲＩの発現量は１３±１μｇ／Ｌであった。前記発現量は、実施例９で作製した、本発明のベクターを用いて得られた形質転換体によるｒｈＦｃγＲＩの発現量に比べて少なかった。すなわち、ｒｈＦｃγＲＩを発現可能な形質転換体において、配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプラスミドベクター（ｐＥＴＴｏｒＴＦｃＲ−ｐ７）で形質転換して得られた形質転換体（実施例９で作製した形質転換体）は、配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含まないプラスミドベクター（ｐＥＴＴｏｒＴＦｃＲ）で形質転換して得られた形質転換体（本比較例で作製した形質転換体）と比較し、より高効率にｒｈＦｃγＲＩを発現させることができることがわかる。
【００６３】
参考例
本例は、単に、配列番号１から６に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの、大腸菌を宿主としたときの翻訳効率の高さを評価したものであり、本発明を構成するものではない。
【００６４】
配列番号１から６および２６に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをヒト由来タンパク質以外タンパク質をコードするポリヌクレオチドの５’末端側に隣接させることによる、前記ポリヌクレオチドの発現の翻訳効率への影響を評価した。本例ではポリヌクレオチドとして、緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＧＦＰ）遺伝子を用いた。ＧＦＰは大腸菌宿主の細胞質内で活性型として良好に発現することが知られている。
（１）ＤＮＡｗｏｒｋｓ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３０，ｅ４３，２００２：非特許文献２）により大腸菌型コドンからなるＧＦＰをコードするポリヌクレオチド（ＧＦＰ遺伝子）を設計した。
（２）（１）で設計したＧＦＰ遺伝子を作製するために、配列番号４０から７３に記載の配列からなる、合計３４種類のオリゴヌクレオチドを合成した。
（３）（２）で合成したオリゴヌクレオチドから、下記に示す二段階ＰＣＲにより、ＧＦＰ遺伝子を含むポリヌクレオチドを作製した。
（３−１）一段階目のＰＣＲを、表４の反応液組成のもと、９４℃で５分間の熱処理、引き続き９４℃で３０秒間の第一ステップ、６５℃で３０秒間の第二ステップ、７２℃で１分間の第三ステップを１サイクルとした反応を２５サイクル行ない、７２℃で７分間保持後、４℃に冷却することで行なった。なお、表４に記載のＤＮＡミックスは、配列番号４０から７３に記載の配列からなる各合成オリゴヌクレオチド（計３４種類）の溶液（濃度：５０ｐｍｏｌ/μＬ）をそれぞれ一定量採取し、混合した溶液を指す。
【００６５】
【表４】
0005865002.tif 000005
【００６６】
（３−２）第二段階目のＰＣＲを、表５の反応液組成のもと、９４℃で５分間の熱処理、引き続き９４℃で３０秒間の第一ステップ、６０℃で３０秒間の第二ステップ、７２℃で１分間の第三ステップを１サイクルとした反応を２５サイクル行ない、７２℃で７分間保持後、４℃に冷却することで行なった。なお、鋳型としては一段階目のＰＣＲ反応液を用い、ＰＣＲプライマーとしては配列番号４０（５’−ＧＣＴＣＡＴＡＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＡＧＡＧＣＴＧＴＴＣＡＣＣＧＧＣＧ−３’）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号７３（５’−ＧＡＡＡＡＧＣＴＴＴＴＣＣＡＧＡＣＣＣＧＣＣＴＴＡＴＡＣＡＧＴＴＣＡＴＣＣＡＴＧＣＣ−３’）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。この二段階ＰＣＲにより、ＧＦＰ遺伝子を含むポリヌクレオチドを作製した。
【００６７】
【表５】
0005865002.tif 000006
【００６８】
（４）配列番号１から６および２６に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのうちのいずれかと、ＧＦＰ遺伝子とを含むプラスミドベクター、および前記ベクターによる形質転換体の作製を以下の方法により行なった。
（４−１）（３）で作製したＧＦＰ遺伝子を含むポリヌクレオチドを、制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した実施例１で作製したプラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｐ７（図２）にライゲーションすることで、プラスミドベクターｐＥＴＧＦＰ−ｐ７を作製した。プラスミドベクターｐＥＴＧＦＰ−ｐ７の概要とその作製工程を図３に示す。
（４−２）組換えプラスミドベクターｐＥＴＧＦＰ−ｐ７を用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、ｐＥＴＧＦＰ−ｐ７形質転換体を作製した。プラスミドベクターｐＥＴＧＦＰ−ｐ７（図３）には、Ｃ末端側にポリヒスチジンタグが付加されたＧＦＰ遺伝子（配列番号７５）が含まれ、配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの３’末端に前記ＧＦＰ遺伝子が連続するよう配置した。プラスミドベクターｐＥＴＧＦＰ−ｐ７中の、制限酵素ＢｇｌＩＩ認識サイトからＢｐｕ１１０２Ｉ認識サイトまでの塩基配列を配列番号７４に示す。配列番号７４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドには、Ｃ末端側にＨｉｓタグペプチドが付加されたＧＦＰ遺伝子（配列番号７５）と、その５’末端側に配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、が含まれている。
（４−３）前述したＧＦＰ遺伝子を含むポリヌクレオチド（配列番号７４）を制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した実施例２で作製したプラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｒｂｓにライゲーションすることで、プラスミドベクターｐＥＴＧＦＰ−ｒｂｓを作製した。プラスミドベクターｐＥＴＧＦＰ−ｒｂｓは、ｐＥＴＧＦＰ−ｐ７に含まれる配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの部分を、配列番号１に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドに置換した構造である。その後、プラスミドベクターｐＥＴＧＦＰ−ｒｂｓを用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、ｐＥＴＧＦＰ−ｒｂｓ形質転換体を作製した。
（４−４）前述したＧＦＰ遺伝子を含むポリヌクレオチド（配列番号７４）を制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した実施例３で作製したプラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｍ４にライゲーションすることで、プラスミドベクターｐＥＴＧＦＰ−ｍ４を作製した。プラスミドベクターｐＥＴＧＦＰ−ｍ４は、ｐＥＴＧＦＰ−ｐ７に含まれる配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの部分を、配列番号２に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドに置換した構造である。その後、プラスミドベクターｐＥＴＧＦＰ−ｍ４を用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、ｐＥＴＧＦＰ−ｍ４形質転換体を作製した。
（４−５）前述したＧＦＰ遺伝子を含むポリヌクレオチド（配列番号７４）を制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した実施例４で作製したプラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｐ４にライゲーションすることで、プラスミドベクターｐＥＴＧＦＰ−ｐ４を作製した。プラスミドベクターｐＥＴＧＦＰ−ｐ４は、ｐＥＴＧＦＰ−ｐ７に含まれる配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの部分を、配列番号３に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドに置換した構造である。その後、プラスミドベクターｐＥＴＧＦＰ−ｐ４を用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、ｐＥＴＧＦＰ−ｐ４形質転換体を作製した。
（４−６）前述したＧＦＰ遺伝子を含むポリヌクレオチド（配列番号７４）を制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した実施例５で作製したプラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｐ１０にライゲーションすることで、プラスミドベクターｐＥＴＧＦＰ−ｐ１０を作製した。プラスミドベクターｐＥＴＧＦＰ−ｐ１０は、ｐＥＴＧＦＰ−ｐ７に含まれる配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの部分を、配列番号５に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドに置換した構造である。その後、プラスミドベクターｐＥＴＧＦＰ−ｐ１０を用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、ｐＥＴＧＦＰ−ｐ１０形質転換体を作製した。
（４−７）前述したＧＦＰ遺伝子を含むポリヌクレオチド（配列番号７４）を制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した実施例６で作製したプラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｒｂｓｐ７にライゲーションすることで、プラスミドベクターｐＥＴＧＦＰ−ｒｂｓｐ７を作製した。プラスミドベクターｐＥＴＧＦＰ−ｒｂｓｐ７は、ｐＥＴＧＦＰ−ｐ７に含まれる配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの部分を、配列番号６に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドに置換した構造である。その後、プラスミドベクターｐＥＴＧＦＰ−ｒｂｓｐ７を用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、ｐＥＴＧＦＰ−ｒｂｓｐ７形質転換体を作製した。
（４−８）前述したＧＦＰ遺伝子を含むポリヌクレオチド（配列番号７４）を制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した比較例１で作製したプラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥＦｃＲにライゲーションすることで、プラスミドベクターｐＥＴＧＦＰを作製した。プラスミドベクターｐＥＴＧＦＰは、ｐＥＴＧＦＰ−ｐ７に含まれる配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの部分を、配列番号２６に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドに置換した構造である。その後、プラスミドベクターｐＥＴＧＦＰを用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、ｐＥＴＧＦＰ形質転換体を作製した。
（５）配列番号１から６および２６に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドが、３’末端に隣接するＧＦＰ遺伝子の発現の翻訳効率に与える影響を評価した。図４には該翻訳効率の評価方法の概略図を示す。ＧＦＰ発現量が翻訳効率を反映するように、転写効率はｐＥＴシステム（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を利用し、培養液へのＩＰＴＧの添加量により制御した。発現されるＧＦＰのタンパク量と蛍光強度には相関があることから（Ｓｃｈｏｌｚ，Ｏ．ら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６７，１５６５−１５７０，２０００、非特許文献３）、ＧＦＰの蛍光強度によりＧＦＰの発現量（翻訳効率）を評価した。
（５−１）作製したｐＥＴＧＦＰ形質転換体、ｐＥＴＧＦＰ−ｒｂｓ形質転換体、ｐＥＴＧＦＰ−ｍ４形質転換体、ｐＥＴＧＦＰ−ｐ４形質転換体、ｐＥＴＧＦＰ−ｐ７形質転換体、ｐＥＴＧＦＰ−ｐ１０形質転換体、およびｐＥＴＧＦＰ−ｒｂｓｐ７形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地に接種し、３７℃で一晩振とう培養することで前培養液を得た。
（５−２）９６穴ディープウェルプレートの各ウェルに、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地８００μＬを入れ、各形質転換体の前培養液を２０μＬ接種した。これをＢｉｏｓｈａｋｅｒ  Ｍ・ＢＲ−０２２ＵＰ（ＴＡＩＴＥＣ社製）を用いて、３７℃で１．５時間、１０００ｒｐｍで振とう培養した。
（５−３）培養開始から１．５時間後に温度を２０℃に変えて、１０００ｒｐｍで３０分間振とう培養後、ＩＰＴＧを添加して発現の誘導を行なった。ＩＰＴＧの添加は、培養液の終濃度で０．０１ｍＭ、０．０５ｍＭまたは０．１ｍＭとなるように、ＩＰＴＧ濃縮液（５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地に溶解）を各８０μＬずつ添加することで行なった。
（５−４）ＩＰＴＧ添加後、２０℃、１０００ｒｐｍでさらに２２時間、振とう培養した。なお、ブランク試験として、ＩＰＴＧ濃縮液の代わりに５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地８０μＬを添加して、２０℃、１０００ｒｐｍでさらに２２時間、振とう培養する試験を行なっている。
（５−５）誘導開始から２２時間後に各条件の培養液を採取し、０．８５％のＮａＣｌ溶液で３倍希釈後、９６穴プレートに１ウェルあたり１００μＬ入れ、蛍光マイクロプレートリーダー（ＩｎｆｉｎｉｔｅＭ２００，ＴＥＣＡＮ社製）を用いて、培養液の濁度（ＯＤ６００）と培養液のＧＦＰ蛍光強度（励起波長：４８８ｎｍ、蛍光波長：５３０ｎｍ）をｎ＝３で測定した。
【００６９】
誘導開始から２２時間後の培養液濁度あたりのＧＦＰ蛍光強度を図５に示す。図５に示すように、終濃度０．０１ｍＭ、０．０５ｍＭ、０．１ｍＭ、いずれのＩＰＴＧ濃度で誘導させても、ｐＥＴＧＦＰ形質転換体が培養液濁度あたりのＧＦＰ蛍光強度が強く、続いてｐＥＴＧＦＰ−ｐ４形質転換体、ｐＥＴＧＦＰ−ｍ４形質転換体、ｐＥＴＧＦＰ−ｐ７形質転換体、ｐＥＴＧＦＰ−ｐ１０形質転換体、ｐＥＴＧＦＰ−ｒｂｓ形質転換体、ｐＥＴＧＦＰ−ｒｂｓｐ７形質転換体の順に、培養液濁度あたりのＧＦＰ蛍光強度が強い傾向が認められた。
【００７０】
図５の結果から、ｐＥＴ−２６ｂ（＋）プラスミドベクター由来の既存の塩基配列（配列番号２６）のポリヌクレオチドが、その３’末端に隣接するＧＦＰ遺伝子の発現の翻訳効率を高く制御する一方、配列番号１から６に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは、配列番号２６に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドに比べ、いずれもＧＦＰ遺伝子の発現の翻訳効率が低いことがわかる。なお翻訳効率の高さは、高い順に、配列番号３、配列番号２、配列番号４、配列番号１、配列番号５、配列番号６であった。
【００７１】
実施例１０
配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むヒトエリスロポエチン結合性タンパク質発現ベクター、および前記ベクターにより得られる形質転換体を以下の方法で作製した。
（１）Ｃ末端側にポリヒスチジンタグを付加したヒトエリスロポエチン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドの合成を以下に示す二段階ＰＣＲによって行なった。
（１−１）一段階目のＰＣＲを、鋳型としてＥＰＯＲ  ｃＤＮＡ（Ｈｕｍａｎ）（ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、カタログ番号：ＳＣ１２５４４０）を、ＰＣＲプライマーとして配列番号７８（５’−ＣＡＧＧＡＴＣＣＣＣＣＧＧＧＡＧＡＧＣＴＣＣＧＣＣＧＣＣＴＡＡＣＣＴＣ−３’）に記載の制限酵素ＳａｃＩ認識配列を配した塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号７９（５’−ＴＴＡＴＣＴＡＧＡＴＴＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＴＣＣＡＧＧＴＣＧＣＴＡＧＧ−３’）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いて、表２の反応組成のもと、９８℃で１０秒間の第一ステップ、５５℃で５秒間の第二ステップ、７２℃で４４秒間の第三ステップを１サイクルとした反応を３０サイクル行なった。このＰＣＲ産物をＥＰＯＲ１とした。
（１−２）二段階目のＰＣＲを、鋳型としてＥＰＯＲ１を、ＰＣＲプライマーとして配列番号７８に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号８０（５’−ＴＴＡＴＣＴＡＧＡＣＣＴＡＧＧＴＴＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧ−３’）に記載の制限酵素ＸｂａＩ認識配列を含む塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いて、表２の反応組成のもと、９８℃で１０秒間の第一ステップ、５５℃で５秒間の第二ステップ、７２℃で４４秒間の第三ステップを１サイクルとした反応を３０サイクル行なった。このＰＣＲ産物をＥＰＯＲ２とした。
（２）ＥＰＯＲ２を、制限酵素ＳａｃＩとＸｂａＩで消化後、制限酵素ＳａｃＩとＸｂａＩで消化したプラスミドベクターｐＵＣ１９（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．Ｌ０９１３７）にライゲーションし、それを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。
（３）得られた形質転換体を培養後、定法に従って、Ｃ末端側にポリヒスチジンタグを付加したヒトエリスロポエチン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドベクターｐＵＣ−ＥＰＯＲを調製した。プラスミドベクターｐＵＣ−ＥＰＯＲの概要とその作製工程を図６に示す。
（４）鋳型としてプラスミドベクターｐＵＣ−ＥＰＯＲ（図６）を、ＰＣＲプライマーとして配列番号８１（５’−ＣＧＧＴＣＡＴＧＡＡＡＧＣＴＣＣＧＣＣＧＣＣＴＡＡＣＣＴＴＣＣＧＧＡＣ−３’）に記載の制限酵素ＢｓｐＨＩ認識配列を含む塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号８２（５’−ＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧ−３’）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いて、表２の反応組成に従い、９８℃で１０秒間の第一ステップ、５５℃で５秒間の第二ステップ、７２℃で４４秒間の第三ステップを１サイクルとした反応を３０サイクル行なった後、４℃に冷却することでＰＣＲを行なった。このＰＣＲ産物をＥＰＯＲ３とした。
（５）ＥＰＯＲ３を、制限酵素ＢｓｐＨＩ（消化後に制限酵素ＮｃｏＩ消化断片と結合可能な突出末端を形成）とＨｉｎｄＩＩＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した実施例１に記載のプラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥ−ｐ７（図１）にライゲーションし、それを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。
（６）得られた形質転換体を培養後、定法に従いプラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥ−ｐ７−Ｅを調製した。プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥ−ｐ７−Ｅの概要とその作製工程を図７に示した。
（７）鋳型としてプラスミドベクターｐＵＣ−ＥＰＯＲ（図６）を、ＰＣＲプライマーとして配列番号８３（５’−ＴＣＣＧＣＴＡＧＣＧＣＴＣＴＣＧＣＣＧＣＴＣＣＧＣＣＧＣＣＴＡＡＣＣＴ−３’）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号８２に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いて、表２の反応組成に従い、９８℃で１０秒間の第一ステップ、５５℃で５秒間の第二ステップ、７２℃で４４秒間の第三ステップを１サイクルとした反応を３０サイクル行なった。このＰＣＲ産物をＥＰＯＲ４とした。
（８）鋳型として実施例１に記載のプラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥ−ｐ７（図１）を、ＰＣＲプライマーとして配列番号８４（５’−ＣＣＣＴＣＴＡＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＣ−３’）に記載の制限酵素ＸｂａＩ認識配列を含む塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号８５（５’−ＧＧＣＧＡＧＡＧＣＧＣＴＡＧＣＧＧＡＡＡＡＣＡＴＣＡＴＣ−３’）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いて、表２の反応組成に従い、９８℃で１０秒間の第一ステップ、５５℃で５秒間の第二ステップ、７２℃で４４秒間の第三ステップを１サイクルとした反応を３０サイクル行なった。このＰＣＲ産物をＰＣＲＭａｌＥとした。
（９）ＰＣＲを用いて、ＰＣＲＭａｌＥとＥＰＯＲ４の連結を行なった。鋳型としてＥＰＯＲ４およびＰＣＲＭａｌＥの混合液を、ＰＣＲプライマーとして配列番号８４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号８２に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いて、表２の反応組成に従い、９８℃で１０秒間の第一ステップ、５５℃で５秒間の第二ステップ、７２℃で４４秒間の第三ステップを１サイクルとした反応を３０サイクル行なった。このＰＣＲ産物をＰＣＲＭａｌＥ−ＥＰＯＲとした。
（１０）ＰＣＲＭａｌＥ−ＥＰＯＲを制限酵素ＸｂａＩで消化後、制限酵素ＸｂａＩで消化しアルカリホスファターゼで脱リン酸化処理したプラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥ−ｐ７−Ｅ（図７）にライゲーションし、配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むヒトエリスロポエチン結合性タンパク質発現ベクターであるプラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥ−ｐ７−ＥＰＯＲを作製した。
（１１）プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥ−ｐ７−ＥＰＯＲを用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、ｐＥＴＭａｌＥ−ｐ７−ＥＰＯＲ形質転換体を作製した。プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥ−ｐ７−ＥＰＯＲの概要とその作製工程を図８に示す。
【００７２】
プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥ−ｐ７−ＥＰＯＲ（図８）には、５’末端側から、配列番号４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド、ＭａｌＥシグナルペプチド（配列番号８）をコードするオリゴヌクレオチド、ヒトエリスロポエチン結合性タンパク質（配列番号７７）をコードするポリヌクレオチド、ポリヒスチジンタグをコードするオリゴヌクレオチドの順に配置されている。プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥ−ｐ７−ＥＰＯＲ（図８）のうち、制限酵素ＢｇｌＩＩ認識サイトからＨｉｎｄＩＩＩ認識サイトまでの塩基配列を、配列番号８６に示す。なお、配列番号８６に記載の塩基配列のうち、８８番目から１１５番目までのヌクレオチドが配列番号４に相当し、１１６番目から１９３番目までのヌクレオチドがＭａｌＥシグナルペプチド（配列番号８）をコードするオリゴヌクレオチドに相当し、１９４番目から８６８番目までのヌクレオチドがヒトエリスロポエチン結合性タンパク質（配列番号７７）をコードするオリゴヌクレオチドに相当し、８６９番目から８８６番目のヌクレオチドがポリヒスチジンタグをコードするオリゴヌクレオチドに相当する。配列番号８７には配列番号８６に記載の塩基配列のうち、１１６番目から８８６番目までのヌクレオチドからの翻訳により得られるポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【００７３】
実施例１１
配列番号１に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むヒトエリスロポエチン結合性タンパク質発現ベクター、および前記ベクターにより得られる形質転換体を以下の方法で作製した。
（１）実施例１０で作製したｐＥＴＭａｌＥ−ｐ７−ＥＰＯＲ（図８）を制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、ヒトエリスロポエチン結合性タンパク質（配列番号７７）をコードするオリゴヌクレオチドを含むポリヌクレオチド断片を、あらかじめ制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した、実施例２で作製したプラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｒｂｓにライゲーションし、プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥ−ｒｂｓ−ＥＰＯＲを作製した。プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥ−ｒｂｓ−ＥＰＯＲは、プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥ−ｐ７−ＥＰＯＲ（図８）に含まれる配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの部分を、配列番号１に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドに置換した構造である。
（２）プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥ−ｒｂｓ−ＥＰＯＲを用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、ｐＥＴＭａｌＥ−ｒｂｓ−ＥＰＯＲ形質転換体を作製した。
【００７４】
実施例１２
配列番号２に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むヒトエリスロポエチン結合性タンパク質発現ベクター、および前記ベクターにより得られる形質転換体を以下の方法で作製した。
（１）実施例１０で作製したｐＥＴＭａｌＥ−ｐ７−ＥＰＯＲ（図８）を制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、ヒトエリスロポエチン結合性タンパク質（配列番号７７）をコードするオリゴヌクレオチドを含むポリヌクレオチド断片を、あらかじめ制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した、実施例３で作製したプラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｍ４にライゲーションし、プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥ−ｍ４−ＥＰＯＲを作製した。プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥ−ｍ４−ＥＰＯＲは、プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥ−ｐ７−ＥＰＯＲ（図８）に含まれる配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの部分を、配列番号２に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドに置換した構造である。
（２）プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥ−ｍ４−ＥＰＯＲを用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、ｐＥＴＭａｌＥ−ｍ４−ＥＰＯＲ形質転換体を作製した。
【００７５】
実施例１３
配列番号３に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むヒトエリスロポエチン結合性タンパク質発現ベクター、および前記ベクターにより得られる形質転換体を以下の方法で作製した。
（１）実施例１０で作製したｐＥＴＭａｌＥ−ｐ７−ＥＰＯＲ（図８）を制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、ヒトエリスロポエチン結合性タンパク質（配列番号７７）をコードするオリゴヌクレオチドを含むポリヌクレオチド断片を、あらかじめ制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した、実施例４で作製したプラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｐ４にライゲーションし、プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥ−ｐ４−ＥＰＯＲを作製した。プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥ−ｐ４−ＥＰＯＲは、プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥ−ｐ７−ＥＰＯＲ（図８）に含まれる配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの部分を、配列番号３に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドに置換した構造である。
（２）プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥ−ｐ４−ＥＰＯＲを用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、ｐＥＴＭａｌＥ−ｐ４−ＥＰＯＲ形質転換体を作製した。
【００７６】
実施例１４
配列番号５に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むヒトエリスロポエチン結合性タンパク質発現ベクター、および前記ベクターにより得られる形質転換体を以下の方法で作製した。
（１）実施例１０で作製したｐＥＴＭａｌＥ−ｐ７−ＥＰＯＲを制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、ヒトエリスロポエチン結合性タンパク質（配列番号７７）をコードするオリゴヌクレオチドを含むポリヌクレオチド断片を、あらかじめ制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した、実施例５で作製したプラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｐ１０にライゲーションし、プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥ−ｐ１０−ＥＰＯＲを作製した。プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥ−ｐ１０−ＥＰＯＲは、プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥ−ｐ７−ＥＰＯＲ（図８）に含まれる配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの部分を、配列番号５に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドに置換した構造である。
（２）プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥ−ｐ１０−ＥＰＯＲを用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、ｐＥＴＭａｌＥ−ｐ１０−ＥＰＯＲ形質転換体を作製した。
【００７７】
実施例１５
配列番号６に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むヒトエリスロポエチン結合性タンパク質発現ベクター、および前記ベクターにより得られる形質転換体を以下の方法で作製した。
（１）実施例１０で作製したｐＥＴＭａｌＥ−ｐ７−ＥＰＯＲ（図８）を制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、ヒトエリスロポエチン結合性タンパク質（配列番号７７）をコードするオリゴヌクレオチドを含むポリヌクレオチド断片を、あらかじめ制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した、実施例６で作製したプラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｒｂｓｐ７にライゲーションし、プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥ−ｒｂｓｐ７−ＥＰＯＲを作製した。プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥ−ｒｂｓｐ７−ＥＰＯＲは、プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥ−ｐ７−ＥＰＯＲに含まれる配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの部分を、配列番号６に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドに置換した構造である。
（２）プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥ−ｒｂｓｐ７−ＥＰＯＲを用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、ｐＥＴＭａｌＥ−ｒｂｓｐ７−ＥＰＯＲ形質転換体を作製した。
【００７８】
比較例４
配列番号２６に記載の塩基配列からなるプラスミドベクターｐＥＴ−２６ｂ（＋）由来の既存のオリゴヌクレオチド（５’−ＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴ−３’）を含むヒトエリスロポエチン結合性タンパク質発現ベクター、および前記ベクターにより得られる形質転換体を以下の方法で作製した。
（１）実施例１０で作製したプラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥ−ｐ７−ＥＰＯＲ（図８）を制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、ヒトエリスロポエチン結合性タンパク質（配列番号７７）をコードするオリゴヌクレオチドを含むポリヌクレオチド断片を、あらかじめ制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＥＴ−２６ｂ（＋）プラスミドベクターにライゲーションし、プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥ−ＥＰＯＲを作製した。プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥ−ＥＰＯＲは、プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥ−ｐ７−ＥＰＯＲ（図８）に含まれる配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの部分を、配列番号２６に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドに置換した構造である。
（２）プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥ−ＥＰＯＲを用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、ｐＥＴＭａｌＥ−ＥＰＯＲ形質転換体を作製した。
【００７９】
実施例１６
実施例１０から１５および比較例４で作製した各形質転換体を用いて、ヒトエリスロポエチン結合性タンパク質を発現させ、その量を評価した。
（１）実施例１０で作製したｐＥＴＭａｌＥ−ｐ７−ＥＰＯＲ形質転換体、実施例１１で作製したｐＥＴＭａｌＥ−ｒｂｓ−ＥＰＯＲ形質転換体、実施例１２で作製したｐＥＴＭａｌＥ−ｍ４−ＥＰＯＲ形質転換体、実施例１３で作製したｐＥＴＭａｌＥ−ｐ４−ＥＰＯＲ形質転換体、実施例１４で作製したｐＥＴＭａｌＥ−ｐ１０−ＥＰＯＲ形質転換体、実施例１５で作製したｐＥＴＭａｌＥ−ｒｂｓｐ７−ＥＰＯＲ形質転換体、および比較例４で作製したｐＥＴＭａｌＥ−ＥＰＯＲ形質転換体を、それぞれ５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地に接種し、３７℃で一晩振とう培養し、前培養液とした。
（２）新たに５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地に、（１）の培養液をそれぞれ接種し３７℃で振とう培養した。
（３）培養液の濁度（ＯＤ６００）の値が約０．５になったところで培養温度を３７℃から２０℃に変更し、さらに３０分培養後、ＩＰＴＧを終濃度０．０１ｍＭとなるように培養液に添加することでヒトエリスロポエチン結合性タンパク質の発現誘導を行ない、引き続き２０℃で２２時間振とう培養した。
（４）培養液を遠心操作することで得られた、各形質転換体の菌体から、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を用いて可溶性タンパク質抽出画分を調製した。
（５）可溶性タンパク質抽出画分中のヒトエリスロポエチン結合性タンパク質のタンパク質量を下記に示すＥＬＩＳＡ法により測定した。
（５−１）９６穴マイクロプレートのウェルに、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて希釈した抗エリスロポエチン受容体抗体（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  Ｅｐｏ  Ｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、カタログ番号ＭＡＢ３０７１）を濃度０．１μｇ／ｗｅｌｌで固定し（４℃、１８時間）、０．５％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＴＢＳ緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．６８ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．５）によりブロッキングした。
（５−２）ブロッキング後、（４）で調製した可溶性タンパク質抽出画分を０．５％ＢＳＡを含むＴＢＳ緩衝液で段階希釈し、ＥＬＩＳＡ反応に供した（３０℃、２時間）。
（５−３）０．２％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ  ２０と１５０ｍＭのＮａＣｌを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄後、Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  抗Ｈｉｓ−Ｔａｇ抗体試薬（ＢＥＴＨＹＬ社製）を添加し、３０℃で２時間反応させた。
（５−４）反応後、（５−３）で使用した緩衝液で洗浄を行ない、ＴＭＢ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を添加し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
（５−５）既知濃度のヒトエリスロポエチン結合性タンパク質（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  ＥＰＯ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ／ＥＰＯＲ）（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製、カタログ番号１０７０７−Ｈ０８Ｈ）を基準とし、測定吸光度から可溶性タンパク質抽出画分中のヒトエリスロポエチン結合性タンパク質のタンパク質濃度を算出することで、培養液あたりのヒトエリスロポエチン結合性タンパク質の発現量を算出した。
【００８０】
各形質転換体による培養液あたりのヒトエリスロポエチン結合性タンパク質の発現量は、ｐＥＴＭａｌＥ−ｐ１０−ＥＰＯＲ形質転換体（実施例１４／配列番号５：２．０７±０．３３ｍｇ／Ｌ）、ｐＥＴＭａｌＥ−ｐ７−ＥＰＯＲ形質転換体（実施例１０／配列番号４：１．２２±０．０９ｍｇ／Ｌ）、ｐＥＴＭａｌＥ−ｐ４−ＥＰＯＲ形質転換体（実施例１３／配列番号３：０．９７±０．０１ｍｇ／Ｌ）、ｐＥＴＭａｌＥ−ｒｂｓｐ７−ＥＰＯＲ形質転換体（実施例１５／配列番号６：０．８９±０．１５ｍｇ／Ｌ）、ｐＥＴＭａｌＥ−ｒｂｓ−ＥＰＯＲ形質転換体（実施例１１／配列番号１：０．６５±０．１１ｍｇ／Ｌ）、ｐＥＴＭａｌＥ−ｍ４−ＥＰＯＲ形質転換体（実施例１２／配列番号２：０．３２±０．０１ｍｇ／Ｌ）、ｐＥＴＭａｌＥ−ＥＰＯＲ形質転換体（比較例４／配列番号２６：０．１７±０．０１ｍｇ／Ｌ）であった。この結果から、プラスミドベクターｐＥＴ−２６ｂ（＋）由来の配列番号２６に記載の塩基配列からなる既存のオリゴヌクレオチドを含むヒトエリスロポエチン結合性タンパク質発現ベクターを用いるより、本発明の配列番号１から６のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むヒトエリスロポエチン結合性タンパク質発現ベクターを用いる方が、ヒトエリスロポエチン結合性タンパク質を大量に調製できることが判明した。なお、実施例１０から実施例１５で作製した形質転換体のうち、実施例１４で作製したｐＥＴＭａｌＥ−ｐ１０−ＥＰＯＲ形質転換体が、特に効率よくヒトエリスロポエチン結合性タンパク質を発現できることがわかる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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