(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
線維症を発症するリスクのある、または線維症を有する対象を処置するための医薬組成物であって、カドヘリン１１アンタゴニストを、線維症に関連する症状の発現を予防するもしくは遅延させる、または線維症を低減するのに有効な量で含み、ここで、カドヘリン１１アンタゴニストが、カドヘリン１１結合ペプチドまたはカドヘリン１１核酸アンタゴニストである、前記医薬組成物。
【請求項２】
線維症が皮膚線維症である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
対象が、強皮症を有する、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
線維症が、（ａ）非皮膚の線維症、（ｂ）肺線維症、（ｃ）肝線維症、（ｄ）特発性肺線維症または（ｅ）重篤な特発性肺線維症である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
カドヘリン１１アンタゴニストが、カドヘリン１１結合ペプチドである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
カドヘリン１１結合ペプチドが、（ａ）抗カドヘリン１１抗体もしくは抗原結合性抗体断片である、（ｂ）カドヘリン１１融合タンパク質である、または（ｃ）全長カドヘリン１１もしくはその断片を含む、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
カドヘリン１１アンタゴニストが、カドヘリン１１核酸アンタゴニストである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
カドヘリン１１核酸アンタゴニストが、（ａ）カドヘリン１１ｓｉＲＮＡ、（ｂ）カドヘリン１１リボザイム、（ｃ）カドヘリン１１アンチセンス分子、または（ｄ）全長カドヘリン１１もしくはその断片をコードする核酸である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
医薬組成物が、（ａ）吸入によりもしくは鼻腔内に、または（ｂ）腹腔内に投与されるものである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
免疫抑制剤をさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
免疫抑制剤がステロイドである、請求項１０に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、35 U.S.C. §119(e)の元で、２０１０年５月４日に出願された米国仮特許出願第61/331355号、名称「Detection and treatment of non-dermal fibrosis」、および２０１０年５月４日に出願された米国仮特許出願第61/331357号、名称「Detection and treatment of fibrosis」に基づく優先権を主張する；これらの各々の内容全体は、参照により組み込まれる。
【０００２】
連邦支援研究
本発明は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）からの認可番号RO1 AR048114のもとで政府の支援によりなされた。政府は本発明に対して一定の権利を有する。
発明分野
本発明は、カドヘリン１１結合を含むカドヘリン１１活性を用いた干渉により、線維症を診断、モニタリングおよび処置するための方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
現在、びまん性増殖性肺疾患として知られている間質性肺疾患は、種々の程度の肺線維症を特徴とする、びまん性実質性肺疾患に含まれる３。肺線維症は、様々な間質性肺炎（pneumonias）の要素である３。これらの疾病は様々な程度の炎症、異常な線維芽細胞増殖、および細胞外マトリックス沈着を特徴とし、これらにより肺の機能を低下させる肺構造の変形がもたらされる３，４。肺線維症には多くの原因があり、線維症誘発剤、例えばシリカ５、炭塵６、放射線７、および一定の化学療法剤７などへの暴露を含む。有病率にも関わらず、肺線維症の病因は完全には理解されておらず、肺線維症解決のための処置のオプションは不足している。
【０００４】
間質性肺疾患の約３５％は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）１２として知られている状態に分類することができる。ＩＰＦの発生率を調査した包括的な疫学調査では、１００，０００人当たり約２０例の一般的な有病率が明らかにされた１２。この発生率は７５歳以上の個人において高く、１００，０００人当たり１７５例が認められた。より最近の研究では、１００，０００人当たり約４３例の有病率と、１年に１００，０００患者当たり１６．３例の発生率が示された１３。これらのデータは、ＩＰＦの発生率および有病率が上昇していることを示唆する。ＩＰＦは、間質性肺疾患の慢性的かつ特に壊滅的な形態である。これは主に治療不可能であり、診断の３〜８年以内に死に至る１４。 ＩＰＦに対する効果的な疾患修飾性治療法は存在しない。
【発明の開示】
【０００５】
発明の概要
本発明は部分的に、カドヘリン１１が、肺（lungまたはpulmonary）線維症などの非皮膚の線維症を含む線維化病態に関与し、その結果カドヘリン１１は、かかる病態についての診断マーカー、予後マーカー、および治療標的であるという、予想外の発見に基づく。本明細書にさらに詳細に記載されているように、カドヘリン１１は線維症において上方制御されることが見出され、カドヘリン１１を欠く対象は、実験的に誘発された線維症に影響されにくいことが見出された。したがって本発明は、線維症発症のリスクを評価する、および線維症を診断、モニタリングおよび処置するための、組成物および方法を提供する。線維症は、肺線維症を含む非皮膚の線維症であってよいが、これに限定はされない。
【０００６】
本発明はさらに、カドヘリン１１が、共に気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）中に存在する肺胞マクロファージおよび肺胞上皮細胞に発現しているという、もう一つの予想外の発見に部分的に基づく。したがって、肺線維症または肺線維症発症リスクの存在は、ＢＡＬ試料中のカドヘリン１１レベルを分析することによって決定でき、肺組織の生検は必要としないことがわかった。かかる分析は、カドヘリン１１を発現する細胞の同定を、含んでも含まなくてもよい。
したがって、一つの側面において、本発明は、線維症を発症するリスクのある対象を処置する方法であって、該対象に対して、線維症に関連する症状の発現を予防または遅延させるのに有効な量のカドヘリン１１アンタゴニストを投与することを含む、前記方法を提供する。関連する側面において、本発明は、非皮膚の線維症を発症するリスクのある対象を処置する方法であって、該対象に対して、非皮膚の線維症に関連する症状の発現を予防または遅延させるのに有効な量のカドヘリン１１アンタゴニストを投与することを含む、前記方法を提供する。
【０００７】
別の態様において、本発明は、線維症を有する対象を処置するための方法であって、これを必要とする対象に対して、線維症を低減するのに有効な量のカドヘリン１１アンタゴニストを投与することを含む、前記方法を提供する。一態様において、線維症は皮膚線維症である。一態様において、対象は強皮症を有する。関連する側面において、本発明は、非皮膚の線維症を有する対象を処置するための方法であって、これを必要とする対象に対して、非皮膚の線維症を低減するのに有効な量のカドヘリン１１アンタゴニストを投与することを含む、前記方法を提供する。一態様において、非皮膚の線維症は肺線維症または肝線維症である。一部の態様において、非皮膚の線維症は肺線維症であり、さらに具体的には特発性肺線維症であり、さらに具体的には重篤な特発性肺線維症である。
一態様において、カドヘリン１１アンタゴニストは、カドヘリン１１結合ペプチドである。一態様において、カドヘリン１１結合ペプチドは、抗カドヘリン１１抗体または抗原結合性抗体断片である。一態様において、カドヘリン１１結合ペプチドは、カドヘリン１１融合タンパク質である。一態様において、カドヘリン１１結合ペプチドは、全長カドヘリンまたはその断片を含む。
【０００８】
一態様において、カドヘリン１１アンタゴニストは、カドヘリン１１核酸アンタゴニストである。一態様において、カドヘリン１１核酸アンタゴニストは、カドヘリン１１ｓｉＲＮＡである。一態様において、カドヘリン１１核酸アンタゴニストは、カドヘリン１１リボザイムである。一態様において、カドヘリン１１核酸アンタゴニストは、カドヘリン１１アンチセンス分子である。一態様において、カドヘリン１１核酸アンタゴニストは、全長カドヘリン１１またはその断片をコードする核酸である。一態様において、カドヘリン１１核酸アンタゴニストはアプタマーである。
一態様において、カドヘリン１１アンタゴニストは小分子である。
一態様において、カドヘリン１１アンタゴニストは、吸入によりまたは鼻腔内に投与される。一態様において、カドヘリン１１アンタゴニストは腹腔内に投与される。
【０００９】
一態様において、方法はさらに、対象に対して第２の治療剤を投与することを含む。一態様において、第２治療剤は免疫抑制剤である。一態様において、免疫抑制剤はステロイドである。
他の側面において、本発明は、対象から収集した試料中のカドヘリン１１レベルを測定すること、および試料中のカドヘリン１１レベルを正常対照と比較することを含む方法であって、ここで、正常対照におけるカドヘリン１１レベルよりも高い、対象から収集した試料中のカドヘリン１１レベルが、線維症または線維症発症のリスクを示す、前記方法を提供する。一態様において、試料は皮膚または真皮試料である。関連する側面において、本発明は、対象から収集した試料中のカドヘリン１１レベルを測定すること、および試料中のカドヘリン１１レベルを正常対照と比較することを含む方法であって、ここで、正常対照におけるカドヘリン１１レベルよりも高い、対象から収集した試料中のカドヘリン１１レベルが、非皮膚の線維症または非皮膚線維症発症のリスクを示す、前記方法を提供する。一態様において、試料は肺の試料である。一態様において、試料は気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）試料である。一態様において、試料は肺胞マクロファージおよび／または肺胞上皮細胞を含む。一態様において、試料は肝臓試料である。
【００１０】
種々の側面において、カドヘリン１１レベルは、例えば、試料中の細胞を溶解し、かかる溶解産物の含量を当分野に知られた技術を用いてアッセイすることを含む、試料の操作により測定される。
一態様において、カドヘリン１１レベルは、カドヘリン１１タンパク質レベルである。一態様において、カドヘリン１１レベルは、カドヘリン１１ｍＲＮＡレベルである。
一態様において、正常対照は、対象からの正常な組織または細胞の試料である。一態様において、正常対照は、対象の集団におけるカドヘリン１１レベルである。
一態様において、カドヘリン１１レベルは、免疫組織化学を用いて測定する。
一態様において、正常対照よりも高い、対象から収集した試料中のカドヘリン１１レベルは、対象が線維症を有することを示す。線維症は、皮膚線維症または、肺線維症もしくは肝臓線維症などの非皮膚の線維症であってよい。
【００１１】
一態様において、正常対照よりも高い、対象から収集した試料中のカドヘリン１１レベルは、対象が線維症を発症するリスクを有することを示す。線維症は、皮膚線維症または、肺線維症もしくは肝臓線維症などの非皮膚の線維症であってよい。
別の側面において、本発明は、線維芽細胞からの筋線維芽細胞の発達（または分化）をカドヘリン１１アンタゴニストを用いて阻害する方法を提供する。重要な態様において、線維芽細胞から筋線維芽細胞への分化は、線維症の発症に関連する。阻害の程度は、カドヘリン１１アンタゴニストとの接触後に筋線維芽細胞の絶対数または相対数またはパーセンテージを測定することにより、決定できる。一部の例において、阻害は、筋線維芽細胞の発達の遅延（または動態の減速）を含むことができる。
【００１２】
別の態様において、本発明は、上皮間葉移行（ＥＭＴ）を阻害する方法を提供する。重要な態様において、ＥＭＴは線維症の発症に関連する。一部の例において、阻害は、ＥＭＴの遅延（または動態の減速）を含むことができる。ＥＭＴのマーカーとしては、表現型（例えば、上皮細胞極性の減少）、細胞の相互の分離、増殖因子の発現、（例えばＴＧＦ−βおよびｗｎｔ）、転写因子の発現（例えば、ＳＮＡＩＬＳ、ＳＭＡＤ、ＬＥＦ、および核βカテニン）、接着分子の発現（例えばＥカドヘリン）などが挙げられる。これらのマーカーは、当業者に知られている。
前記の概念および以下により詳細に議論される追加の概念の全ての組み合わせは（かかる概念が互いに矛盾しない場合）、本明細書に開示される発明の主題の一部として意図されることが、理解されるべきである。特に、本開示の末尾にクレームされた主題の全ての組み合わせは、本明細書に開示される発明の主題の一部分として意図される。本明細書で明示的に用いられ、また参照により組み込まれる任意の開示にも表れる用語は、本明細書に開示された特定の概念と最も整合する意味を与えられるべきであることもまた、理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
図は必ずしも一定の縮尺ではなく、本明細書に開示された種々の概念を一般的に説明することを重視していることが理解されるべきである。
【図１】タンパク質溶解物は、生理食塩水またはブレオマイシンを気管内経路により投与した野生型マウスの肺から単離した。肺は１２日目に収集した。タンパク質溶解物は、電気泳動法により１０％アクリルアミドゲル上で分離し、次いで、アイソタイプ対照抗体、抗カドヘリン１１抗体（Invitrogen）または抗ＧＡＰＤＨ抗体を用いるウェスタンブロッティング用に、膜に移した。野生型およびカドヘリン１１ヌルの線維芽細胞様滑膜細胞を、カドヘリン１１発現についての陽性および陰性対照として用いた。ブレオマイシン肺は、カドヘリン１１レベルの増加を示したが、ＧＡＰＤＨレベルは同程度であり、カドヘリン１１が肺線維症の経過の間に増加することを示す。
【００１４】
【図２】生理食塩水またはブレオマイシンを気管内経路により投与した野生型マウスの肺の、免疫組織化学分析。肺は１２日目に収集した。気管内経路でブレオマイシンを投与したマウスからの肺切片は、線維化病巣を形成する領域の線維芽細胞様細胞上に、カドヘリン１１の顕著な染色を実証した（赤色染色）。
【図３】健常対照（ｎ＝９）と比較した、強皮症患者（ｎ＝６）からの皮膚生検材料におけるカドヘリン１１の発現の増加。全ＲＮＡは皮膚生検材料から単離し、線維症に関連する２つの遺伝子ｃｏｌ１ａ１およびＣＴＧＦ、ならびにカドヘリン１１のレベルについて評価した。
【００１５】
【図４】強皮症および健常対照の皮膚生検材料の、カドヘリン１１についての免疫組織染色。皮膚生検材料は、ウサギポリクローナル抗カドヘリン１１抗体と、続いてＨＲＰ抱合第２抗体で染色した。陽性細胞は、赤褐色に標識される。（Ａ）正常皮膚、低倍率、抗カドヘリン１１抗体で染色。（Ｂ）正常皮膚、高倍率、抗カドヘリン１１抗体で染色。（Ｃ）ＳＳＣ皮膚、低倍率、抗カドヘリン１１抗体で染色。（Ｄ）および（Ｅ）ＳＳＣ皮膚、高倍率、抗カドヘリン１１抗体で染色。切片は、４つの対照および４つのＳＳＣの皮膚生検材料の代表例である。
【図５】ヘマトキシリンおよびエオジンで染色されたブレオマイシン皮膚線維症モデルのマウスからの代表的皮膚生検材料。（Ａ）ＰＢＳを注射した野生型マウス（ｎ＝７マウス）、（Ｂ）ＰＢＳを注射したＣａｄ−１１ＫＯマウス（ｎ＝８マウス）、（Ｃ）ブレオマイシンを注射した野生型マウス（ｎ＝１１マウス）、（Ｄ）ブレオマイシンを注射したＣａｄ−１１ＫＯマウス（ｎ＝１０マウス）。
【００１６】
【図６】ブレオマイシン皮膚線維症モデルにおける真皮厚さ（Ａ）および線維症（Ｂ、Sircolアッセイにより決定したコラーゲン含量）の定量。ｎ＝６の野生型マウスにはＢＰＳを注射、ｎ＝８の野生型マウスにはブレオマイシンを注射、ｎ＝７のＣａｄ−１１ＫＯマウスにはＢＰＳを注射、ｎ＝８のＣａｄ−１１ＫＯマウスにはブレオマイシンを注射（ｎ＝１０マウス）。データは平均値で示し、エラーバーは平均値の標準誤差を表す。Ｐ値は、ブレオマイシンを注射した野生型とＣａｄ−１１ＫＯマウススを比較してスチューデントｔ検定を用いて決定した。
【図７】肺組織のＣｏｌ１ａ１およびカドヘリン１１のｍＲＮＡレベルは、重症ＩＰＦの患者において増加する。肺組織は、Lung Tissue Researchh Consortiumから、軽症ＩＰＦおよび正常な肺機能の８人の対象（対照、青色）、および重症ＩＰＦおよび異常な肺機能の１０人の対象（ＩＰＦ、赤色）から得た。Ｃｏｌ１ａ１は対照として用い、重症ＩＰＦ患者において増加した。カドヘリン１１レベルも重症ＩＰＦ患者において増加した。Ｐ値は、スチューデントｔ検定を用いて決定した。
【００１７】
【図８】軽症（Ａ）および重症ＩＰＦ患者（Ｂ、Ｃ）の肺における、カドヘリン１１発現の免疫学的局在決定。矢印は、肺胞マクロファージ（Ｃ）および過形成肺胞上皮細胞（Ｂ）に存在する染色を示す。スケールバー＝１００μｍ。表示の切片は、ｎ＝１０（軽症ＩＰＦ）およびｎ＝１０（重症ＩＰＦ）の代表例である。
【図９】生理食塩水またはブレオマイシンを気管内投与した野生型マウスの肺における、カドヘリン１１発現の免疫学的局在決定。矢印は、過形成肺胞上皮細胞に存在する染色を示す。スケールバー＝５０μｍ。表示の切片は、ｎ＝１２（生理食塩水）およびｎ＝２０（ブレオマイシン）の代表例である。
【００１８】
【図１０】肺線維症におけるカドヘリン１１依存性組織病理像。肺の組織学的切片は、ブレオマイシン誘発性肺線維症モデルにおける、野生型およびＣｄｈ１１-/-マウスからのものである。肺は、３．５Ｕのブレオマイシン導入の２１日後にマウスから採取し、切片化およびＨ＆Ｅ染色用に処理した。（Ａ）生理食塩水を気管内投与した野生型マウス（ｎ＝６）、（Ｂ）生理食塩水を気管内投与したＣｄｈ１１-/-マウス（ｎ＝６）、（Ｃ）ブレオマイシンを気管内投与した野生型マウス（ｎ＝１３）、（Ｄ）生理食塩水を気管内投与したＣｄｈ１１-/-マウス（ｎ＝１１）。スケールバー＝５００μｍ。切片は、ｎ＝６ＷＴ生理食塩水およびｎ＝６Ｃｄｈ１１-/-生理食塩水、ｎ＝１３ＷＴブレオマイシンおよびｎ＝１１Ｃｄｈ１１-/-ブレオマイシンの代表例である。
【００１９】
【図１１】肺線維症におけるカドヘリン１１依存性組織病理像。肺の組織学的切片は、ブレオマイシン誘発性肺線維症モデルにおける、野生型およびＣｄｈ１１-/-マウスからのものである。肺は、３．５Ｕのブレオマイシン導入の２１日後にマウスから採取し、切片化および、マッソントリクローム染色法（Ａ、Ｂ）または筋線維芽細胞のマーカーであるα平滑筋アクチンのためのＩＨＣ分析用（Ｃ、Ｄ）に処理した。スケールバー＝２００μｍ。切片は、ｎ＝１３ＷＴブレオマイシン、およびｎ＝１１Ｃｄｈ１１-/-ブレオマイシンの代表例である。
【図１２】Ｃｄｈ１１の遺伝的除去に関連する、定量可能な線維化エンドポイント。線維症は、（Ａ）比色分析によるＢＡＬコラーゲン、および（Ｂ）Ｈ＆Ｅ染色した肺切片のアシュクロフトのスコアの決定により定量した。スコアは、マウス肺あたり２０画像で決定した。ｎ＝６ＷＴ生理食塩水、ｎ＝６Ｃｄｈ１１-/-生理食塩水、ｎ＝１３ＷＴブレオマイシン、ｎ＝１１Ｃｄｈ１１-/-ブレオマイシン。＊Ｐ≦０．０５、対ＷＴ生理食塩水；＃Ｐ≦０．０５、対ＷＴブレオマイシン。
【００２０】
【図１３】カドヘリン１１遮断抗体は、確立された肺線維症を改善する。カドヘリン１１遮断抗体（２３Ｃ６または１３Ｃ２）の全身送達を伴うブレオマイシン誘発性肺線維症において、アイソタイプ対照と比べて、組織病理的改善が顕著であった。マウスは、ブレオマイシンへの暴露の１０日後から開始して１日おきに抗体を与えた。２１日目に肺を採取し、切片化およびＨ＆Ｇ染色用に処理した。スケールバー＝５００μｍ。切片は、ｎ＝６生理食塩水、ｎ＝７ブレオ＋アイソタイプ、ｎ＝８ブレオ＋１３Ｃ２、ｎ＝６ブレオ＋２３Ｃ６の代表例である。
【図１４】カドヘリン１１遮断抗体は、肺のコラーゲンおよび筋線維芽細胞を低減する。ブレオマイシン＋全身的に抗体を与えたマウス肺を処理し、（Ａ）コラーゲン沈着（マッソントリクローム染色法）および（Ｂ）筋線維芽細胞（α−ＳＭＡ免疫組織化学）について染色した。スケールバー＝２００μｍ。（Ｃ）ＢＡＬ流体中の溶解性コラーゲンを、比色分析により定量した。ｎ＝６生理食塩水、ｎ＝７ブレオ＋アイソタイプ、ｎ＝８ブレオ＋１３Ｃ２、およびｎ＝６ブレオ＋２３Ｃ６。＊Ｐ≦０．０５、対生理食塩水；＃Ｐ≦０．０５、対ブレオマイシン＋アイソタイプ。
【００２１】
【図１５】Ａ５４９肺上皮細胞中でのＴＧＦ−β誘発性ＥＭＴおよびＣｄｈ１１発現。Ａ５４９肺上皮細胞をＴＧＦ−β（１０ｎｇ／ｍｌ）により刺激し、２４時間後にＲＮＡを単離し、倍率変化転写物（対ＢＳＡ）を（Ａ）Ｅカドヘリン、（Ｂ）Ｎカドヘリン、（Ｃ）α１プロコラーゲン、および（Ｄ）カドヘリン１１について決定した。＊Ｐ＜０．０５、対ＢＳＡ。＊＊Ｐ＝０．０６、対ＢＳＡ。データは３つの個別実験の代表である。
【図１６】Ｃｄｈ１１ノックダウンは肺上皮細胞のＴＧＦ−β誘発性ＥＭＴを予防する。Ａ５４９肺上皮細胞を、Ｃｄｈ１１または対照ｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、続いてＴＧＦ−βで刺激し、２４時間後にＲＮＡを単離し、倍率変化転写物（対ＢＳＡ＋対照ｓｉＲＮＡ）を（Ａ）Ｅカドヘリン、（Ｂ）Ｎカドヘリン、（Ｃ）α１プロコラーゲン、および（Ｄ）カドヘリン１１について決定した。データは３つの個別実験の代表である。
【００２２】
【図１７】Ｃｄｈ１１ノックダウンは、肺上皮細胞におけるＴＧＦ−β誘発性の間葉細胞形態への移行を予防する。Ａ５４９肺上皮細胞を、Ｃｄｈ１１または対照ｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、続いてＴＧＦ−βで刺激した。２４時間後に、細胞形態を位相差顕微鏡法により評価した。
【図１８】Ｃｄｈ１１ノックダウンは、肺上皮細胞におけるＴＧＦ−β誘発性のＳＮＡＩＬ２上方制御を予防する。Ａ５４９肺上皮細胞を、Ｃｄｈ１１または対照ｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、続いてＴＧＦ−βで刺激し、２４時間後にＲＮＡを単離し、倍率変化転写物（対ＢＳＡ＋対照ｓｉＲＮＡ）を、ＥＭＴ転写因子であるＳＮＡＩＬ２について決定した。データは３つの個別実験の代表である。
【図１９】ヒトカドヘリン１１のヌクレオチド配列（配列番号１）。
【図２０】ヒトカドヘリン１１のアミノ酸配列（配列番号２）。
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明は、カドヘリン１１が、肺（lungまたはpulmonary）線維症などの非皮膚の線維症を含む線維症において上方制御され、カドヘリン１１の欠如は、肺（lungまたはpulmonary）線維症などの非皮膚の線維症を含む実験的に誘発された線維症に、いくらかの抵抗性を提供するという、予想外の発見に部分的に基づく。これらの所見に基づき、本発明は、カドヘリン１１アンタゴニストを用いた線維症を処置する組成物および方法を意図し、これを提供する。付随する例は、特に、重症の特発性肺線維症の患者からの肺組織および、強皮症を有するヒト患者からの皮膚組織が、カドヘリン１１レベルの増加を有し、実験的に誘発された肺および／または皮膚線維症を有するマウスもまた、それぞれの組織において、カドヘリン１１レベルの増加を有することを実証する。さらに驚くべきことには、カドヘリン１１が欠如したマウス（すなわちカドヘリン１１ノックアウトマウス）は、この同じ実験モデルにおいて組織の線維化が低減していた。例はさらに、抗カドヘリン１１抗体などのカドヘリン１１アンタゴニストが、線維症が確立した後であっても、その処置に有効である（例えば、低減する）ことを示す。これらのデータは、特に、カドヘリン１１が線維症の鍵となるメディエーターであるだけでなく、肺（lung／pulmonary）線維症を含む線維症の処置において治療標的となることの、初めての証拠である。
【００２４】
線維症
線維症は、器官または組織における過剰な線維性結合組織の発達を指す。これは多くの疾患状態の根底にある兆候である。線維症は様々な組織または器官で発生し得る。これらの線維化状態には、皮膚線維症（例えば、強皮症に関連する）が含まれる。皮膚線維症は、皮膚（または真皮）に生じる線維症である。線維化状態はまた、肥厚性瘢痕、ケロイド、熱傷、ペイロニー病、デュピュイトラン拘縮を含む。
線維化状態はまた、非皮膚の線維症も含む。非皮膚の線維症は、皮膚（または真皮）以外の器官に生じる線維症である。非皮膚線維症の重要な例は、肺（lung）（または肺（pulmonary））線維症である。肺線維症は、間質性肺疾患およびびまん性増殖性肺疾患に関連付けることができる。肺線維症の例は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）であり、これは重度の気道制限を有するＩＰＦ（本明細書において重症ＩＰＦと呼ぶ）を含む。
【００２５】
非皮膚の線維症の他の例としては、肝臓/／肝線維症、眼の線維症、消化管の線維症、腎臓／腎線維症、膵線維症、血管線維症、心筋線維症、骨髄線維症などが挙げられる。
線維症の一部の形態は、間質性線維症と呼ばれ、これには皮膚または非皮膚の間質性線維症が含まれる。
線維症は、その病因により、かかる病因が知られている範囲内で、さらに分類することができる。例えば、線維症は感染に関連するかまたはこれに起因してよく（例えば、ウイルス感染や寄生虫感染）、または薬剤誘発性線維症（例えば化学療法）であってもよく、または物質の乱用に関連するかまたはこれに起因してよく（例えば、アルコール誘発性線維症）、または、外科手術もしくはその他の侵襲的手技に関連するかまたはこれに起因してよく、または基礎疾患もしくは事象（例えば、心筋梗塞または糖尿病）に関連するかまたはこれに起因してよく、または放射線被ばく（例えば、癌の放射線治療）に関連するかまたはこれに起因してよい。例としては、アルコール消費に関連する肝臓／肝線維症、ウイルス性肝炎および／または住血吸虫症；心筋梗塞後の心臓線維症；糖尿病に関連する腎臓／腎線維症；および炎症後の腎臓／腎線維症が挙げられる。
【００２６】
線維症は、移植によって誘発され得、または移植とは独立して（すなわち、移植を受けていない対象において、および移植を必要としない対象において）起こり得る。本発明の一部の態様において、対象は腎臓（または腎移植）を受けておらず、かかる移植を必要とする対象でもない。さらに他の態様において、対象は、心臓移植を受けておらず、かかる移植を必要とする対象でもない。さらに他の態様において、対象は、関節リウマチなどの炎症性関節疾患を有しておらず、および／またはこれを発症するリスクが高くはない。さらに他の態様において、対象は、癌を有さず、および／または癌を発症するリスクが高くはない。
本発明の種々の側面は、線維症を有するか、これに影響されやすい任意の対象における線維症を、検出（たとえば診断）、および／またはモニタリング、および／または処置（予防を含む）することを意図する。対象は、ヒトおよび非ヒト対象であってよい。非ヒト対象としては、限定はされないが、ペット（例えば、イヌおよびネコ）、農業用および競走用動物（例えば、ウシ、ウマなど）を含む。
【００２７】
本発明は、細胞、器官または組織におけるカドヘリン１１の異常に上昇したレベルの存在に基づいて線維症を検出するための方法を意図することを理解すべきである。解析対象とする細胞、器官または組織は、存在または発症の疑いがあるか、または存在することが知られている線維症の種類に部分的に依存する。例えば、細胞、器官または組織は、皮膚組織にある線維芽細胞または線維芽細胞様細胞を含む、皮膚組織または皮膚細胞であってよい。別の例としては、細胞、器官または組織は、肺胞マクロファージおよび肺胞上皮細胞などの肺組織または細胞であってよい。これらの後者の細胞型は気管支肺胞洗浄中に得ることができる。かかる方法は、本来は診断的であってよく（すなわち、対象が線維症を有することを、単独で、または他の症状もしくは兆候と共に、示すことができる）、または予後診断的であってよい（すなわち、対象が線維症を発症しやすいことを、単独で、または患者の病歴の情報と共に、示すことができる）。本発明はさらに、線維症を有するかまたは発症リスクのある対象を、かかる対象に対して、本明細書でより詳細に記載されるようにカドヘリン１１アンタゴニストを投与することにより、処置することを意図する。
【００２８】
カドヘリン１１：
カドヘリン１１は古典的なＩＩ型カドヘリンである。これは、短い細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞外ドメインを含む。細胞外ドメインは５個のサブドメイン（これら自身がドメインと呼ばれる場合もある）から構成され、その各々は約１１０個のアミノ酸からなる。ヒトおよびマウスのカドヘリン１１の遺伝子は、既に単離され配列決定されている（Suzuki S. et al. Cell Reg 2:26170, 1991）。ヒトカドヘリン１１のｃＤＮＡについてはGenbankアクセッション番号NM_001797を、および推定のアミノ酸配列（配列番号２および配列番号１）をそれぞれ参照のこと。カドヘリン１１はまた、ＯＢカドヘリン、骨芽細胞カドヘリン、ＯＳＦ−４、およびＣＤＨ１１とも呼ばれる。
【００２９】
カドヘリンの主な機能は、１つの細胞の別の細胞への、時には類似の細胞への接着を促進することである。カドヘリンは、胚形成中の細胞間接触と細胞侵入に関与する。出生後の組織では、これらは上皮構造における細胞間の接触を維持するように働く。カドヘリンは、細胞間接着以外の別の機能も有するようである。例えば、例に記載するように、カドヘリン１１は、線維症の発症中の上皮間葉移行（ＥＭＴ）に関与する。また例に示すように、カドヘリン１１は線維芽細胞からの筋線維芽細胞の分化にも関与する。
【００３０】
カドヘリン１１アンタゴニスト：
本明細書において、アンタゴニストの用語は、他の分子の機能、活性および／または発現を遮断、阻害、低減または中和する、任意のタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド模倣物、糖タンパク質、抗体、抗体断片、炭水化物、核酸、有機分子、無機分子、巨大分子、または小分子を指す。本明細書において、カドヘリン１１アンタゴニストは、カドヘリン１１の機能、活性および／または発現を遮断、阻害、低減または中和する剤である。前述したように、カドヘリン１１は細胞の接着、相互作用および／または遊走に関与している。カドヘリン１１は、同種親和性または同型（ホモタイプ）結合と言及されるものにおいて、それ自体に結合することが知られている。カドヘリン１１アンタゴニストは、カドヘリン１１同型結合または異型結合（すなわち、カドヘリン１１の、カドヘリン１１ではないカウンター受容体へ結合）を妨害し得る。カドヘリン１１アンタゴニストは、細胞が発現するカドヘリン１１の量を低減することにより、またはカドヘリン１１（またはそのカウンター受容体）と相互作用し、これによりカドヘリン１１のその標的との相互作用を防ぐことにより、カドヘリン１１の機能を妨害し得る。したがって、カドヘリン１１アンタゴニストは、その全体または一部が、カドヘリン１１の転写、またはカドヘリン１１の翻訳を妨害し得（これによりカドヘリン１１の発現を妨害する）、またはカドヘリン１１の別のカドヘリン１１に、または別のカドヘリン１１カウンター受容体に結合する能力を妨害し得る。カドヘリン１１アンタゴニストは、カドヘリン１１の機能または活性を、ＰＢＳなどの対照と比べて約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％減少させることができる。カドヘリン１１アンタゴニストは、カドヘリン１１の機能または活性をほぼこれらの量だけ減少させるような量で、使用してよいことが理解される。いくつかのカドヘリン１１アンタゴニストはin vitroで用いるのが好ましく、別のものは本明細書で提供されるin vivo方法により適していることが、さらに理解される。
【００３１】
いくつかのカドヘリン１１アンタゴニストは、カドヘリン１１の細胞外ドメインに結合し、いくつかはカドヘリン１１の細胞外ドメインの特定の領域に結合する。本明細書で論じるように、カドヘリン１１の細胞外ドメインは、それぞれがおよそ１１０個のアミノ酸のサイズの５つのサブドメインから構成されている。（例えば、米国特許第7589074号およびYagi et al. Genes and Development, 14:1169-1180, 2000を参照）。本発明は、カドヘリン１１ＥＣ１に、またはカドヘリン１１ＥＣ１の断片（例えば、ＥＣ１のおよそ最初の３３から最初の３７のアミノ酸からなる断片）に、またはＥＣ１（もしくはＥＣ１の最初の３３〜３７アミノ酸）を含むカドヘリン１１の断片に結合する、カドヘリン１１アンタゴニストの使用を意図する。一部の態様において、アンタゴニストは、アミノ酸配列：GWVWN QFFVI EEYTG PDPVL VGRLH SDIDS GDGN（配列番号３、ＥＣ１の最初の３４のアミノ酸）を有するＥＣ１の領域に結合する。代替的に、または追加して、アンタゴニストは、このアミノ酸配列の一部または全部を含んでもよい。
【００３２】
カドヘリン１１アンタゴニストは、ペプチドまたはタンパク質であってよく、または核酸であってもよく、または有機または無機小分子であってもよい。アンタゴニストは、天然または非天然であってよい。これらは天然源から単離することができ、またはin vitroで合成してもよい。
カドヘリン１１アンタゴニストは、造影剤または細胞障害剤などの他の剤に抱合させてもよい。造影剤は、in vitro（例えば、免疫組織化学的分析のために）またはin vivo（例えば、身体のイメージング用）でのカドヘリン１１の発現を可視化するために用いることができる。例としては、放射性核種、造影剤、および医療用画像処理で日常的に使用される微粒子を含む。細胞障害剤は、細胞に対して毒性の剤である。例としては、化学療法剤、毒素などが挙げられる。カドヘリン１１アンタゴニストに抱合されたこれらの剤の使用は、かかる剤を、線維性組織や細胞に標的化させる。これらの例において、治療上の利点は、カウンター受容体に結合するカドヘリン１１の能力を妨害するカドヘリン１１アンタゴニストと、細胞に対して直接毒性である細胞障害剤との組み合わせによって、提供され得る。
【００３３】
カドヘリン１１結合ペプチド：
天然においてペプチドまたはタンパク質であるカドヘリン１１アンタゴニストとしては、以下が挙げられる：（１）全長カドヘリン１１タンパク質、（２）全長タンパク質の断片、ここで断片は、カドヘリン１１の膜貫通ドメインまたは、例えばＥＣ１を含むかこれからなる断片（例えば、ＥＣ１を含む断片、ＥＣ１とＥＣ２を含む断片、ＥＣ１〜ＥＣ３を含む断片、ＥＣ１〜ＥＣ４を含む断片、ＥＣ１〜ＥＣ５を含む断片、ＥＣ１とＥＣ３を含む断片、ＥＣ１とＥＣ４を含む断片、ＥＣ１とＥＣ５を含む断片、）などの細胞外ドメインの断片を含む、（３）全長タンパク質の断片、ここで断片は、１または２以上のカドヘリン１１細胞外サブドメイン（例えば、カドヘリン１１の５つの細胞外サブドメインのＥＣ１、ＥＣ２、ＥＣ３、ＥＣ４、もしくはＥＣ５、またはこれらの任意の組み合わせ）を含む、（４）全長カドヘリン１１またはその断片を含む融合タンパク質、および（５）抗体およびその断片。重要な態様において、カドヘリン１１アンタゴニストは、カドヘリン１１のＥＣ１ドメインまたはその断片（例えば、本明細書で提供される配列番号３など）に、結合するか、および／またはこれを含む。
【００３４】
カドヘリン１１への優先的（または選択的）結合とは、ペプチドまたはタンパク質が、他のタンパク質に対するよりも大きいな親和性でカドヘリン１１に結合することを意味する。一部の例において、ペプチドまたはタンパク質は、カドヘリン１１に対して、カドヘリン１１ではないタンパク質または任意の他の部分に対するよりも、約２倍以上、約３倍以上、約４倍以上、約５倍以上、約１０倍以上、約２５倍以上、約５０倍以上、約１００倍以上、約１０００倍以上高い親和性で結合する。親和性におけるかかる差は、in vivoで生じるような生理学的条件下で現れるのが好ましい。一部の態様において、カドヘリン１１結合ペプチドは、カドヘリン１１のＥＣ１に結合し、任意に、本明細書に提供される配列番号２に示されるように、カドヘリン１１のＥＣ１の最初の３３〜３７のアミノ酸（最初の３３、最初の３４、最初の３５、最初の３６、または最初の３７のアミノ酸を含む）に結合する。カドヘリン１１のこの領域への結合は、カドヘリン１１のこの領域に結合することが知られており例えばWO2009/089062に記載されているような他の結合剤を用いて、競合結合アッセイを通して決定することができる。前述のアンタゴニストは、まとめてカドヘリン１１結合ペプチドと呼ばれる。カドヘリン１１結合ペプチドは、天然の源から収集して単離することができ、またはこれは、合成して、カドヘリン１１に結合する能力についてスクリーニングすることができる。
【００３５】
ペプチドおよびタンパク質に関して本明細書で用いる場合、用語「単離された」とは、その天然の環境から十分に純粋な形態で分離されて、本発明の目的のいずれかのために操作または使用できることを意味する。
結合ペプチドはまた、抗体技術以外の供給源に由来することができる。例えば、結合ペプチドは、変性ペプチド（degenerate peptide）ライブラリから提供することができ、これは、細菌の鞭毛ペプチドディスプレイライブラリとして、またはファージディスプレイライブラリとして、溶液中に固定化された形で容易に調製することができる。組み合わせライブラリも、１または２以上のアミノ酸を含有するペプチドから合成することができる。ペプチドおよび非ペプチド合成部分で構成されたライブラリも、作製することができる。
カドヘリン１１またはその断片はまた、他のカドヘリン１１結合ペプチドまたはパートナーを単離するために用いることができる。結合パートナーの単離は、周知の方法に従って行うことができる。例えば、カドヘリン１１またはその断片（例えば、細胞外断片）を基質に付着させ、次いで推定カドヘリン１１結合ペプチドを基質に適用することができる。カドヘリン１１結合ペプチドが存在すれば、これは基質に結合したカドヘリン１１に結合するので、次いで分離してさらに分析することができる。
【００３６】
全長カドヘリン１１およびカドヘリン１１断片：
カドヘリン１１の既知のヌクレオチドおよびアミノ酸配列に基づき、従来技術を用いて、カドヘリン１１の好適な断片を同定し生成することができる。参照としては、米国特許第5597725号、第5639634号、第5646250号、第6787136号、第6946768号、第7488478号、および第7589074号、ならびにＰＣＴ特許公開WO93/21302およびWO2009/089062が挙げられ、カドヘリン１１ヌクレオチドおよびアミノ酸配列および断片に関連するこれらの教示は、参照により本明細書に組み込まれる。
好適な断片の例としては以下を含む：カドヘリンＥＣ１のアミノ酸１〜４０、１〜３９、１〜３８、１〜３７、１〜３６、１〜３５、１〜３４、１〜３３、１〜３２、１〜３１、または１〜３０からなるか、これを含む物、またはカドヘリンＥＣ１のアミノ酸１５〜３４、１５〜３５、１５〜３６、１５〜３７、１５〜３８、１５〜３９、または１５〜４０からなるか、これを含む物。本明細書に提供される配列番号２において、ＥＣ１の最初の４０個のアミノ酸には下線を引き、ＥＣ１の最初の３５個のアミノ酸は太字で示す。好適な断片の例はまた、WO2009/089062に提供され（アミノ酸配列番号３、１０、１２および１３により表され、US2009/0253200にも記載されている）、この配列は本明細書に参照により組み込まれる。その他の断片は、配列番号２のアミノ酸１〜１６０、または１〜２５９、または１〜２６９を含んでよく、任意に、ヒトカドヘリン１１のリーダーおよびプロ領域を表す、配列番号２のアミノ酸１〜５３を欠如していてよい。
【００３７】
カドヘリン１１結合ペプチドはまた、全長カドヘリン１１またはカドヘリン１１断片の変異体であってもよい。かかる変異体は、カドヘリン１１のアミノ酸配列とは一定程度異なってよい。例えば、変異体は、全長カドヘリン１１またはカドヘリン１１断片に対して、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一であることができる。変異体は、断片のアミノおよび／またはカルボキシ末端において、カドヘリン１１断片および追加の隣接する成分を含んでもよい。かかる成分は、本質的にアミノ酸であってもよい。すべての例において、変異体はカドヘリン１１に結合し、カドヘリン１１の機能または活性を妨害する。
カドヘリン１１結合ペプチドは、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０のアミノ酸長またはそれ以上であってよい。例えば、これはおよそまたは少なくとも２２０、３３０、４０、５５０のアミノ酸長であってよい。
【００３８】
いくつかの重要な態様において、カドヘリン１１阻害剤は、カドヘリン１１の機能的に等価なペプチドアナログである。本明細書において、用語「機能的に等価なペプチドアナログ」は、カドヘリン１１の例えばそれ自身への結合を阻害することができる、ペプチドアナログを指す。カドヘリン１１の機能的に等価なペプチドアナログは、例えば、in vitroの接着アッセイを用いて同定され、これは、カドヘリン１１を発現する細胞間の、または単離されたカドヘリン１１タンパク質間の、またはこれらのいくつかの組み合わせの間の、カドヘリン１１媒介性接着を阻害するペプチドアナログの能力を測定するアッセイである。したがって、カドヘリン１１の機能的に等価なペプチドアナログの例としては、全長カドヘリン１１またはカドヘリン１１断片のアナログであって、例えば、野生型配列に対する保存的アミノ酸置換を含むものが挙げられる。
さらに他のカドヘリン１１結合ペプチドは、ＰＣＴ公開出願WO99/57149、WO2004/048411、およびWO2009/089062において提供され、カドヘリン１１結合ペプチドおよびアンタゴニストに関連するこれらの特定の教示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００３９】
カドヘリン１１融合タンパク質：
カドヘリン１１結合ペプチドは、融合タンパク質であることができる。融合タンパク質は、本明細書で使用する場合、少なくとも２つの異なるタンパク質からのペプチド領域を含むタンパク質である。例えば、カドヘリン１１融合タンパク質は、カドヘリン１１および少なくとも１つの非カドヘリン１１タンパク質のアミノ酸配列を含んでいる。かかる融合タンパク質は、カドヘリン１１からのコード配列を非カドヘリン１１タンパク質のコード配列に、通常ヌクレオチドレベルで融合させることにより形成することができる。カドヘリン１１融合タンパク質の例としては、カドヘリン１１ ＧＳＴ融合タンパク質、カドヘリン１１ Ｆｃ融合タンパク質、カドヘリン１１ βガラクトシダーゼ融合タンパク質、カドヘリン１１ ポリＨｉｓ融合タンパク質、およびカドヘリン１１ ＧＦＰ融合タンパク質が含まれる。 Ｆｃ融合タンパク質はＩｇ定常ドメインの領域を含んでもよく、これは限定することなく、ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、および／またはＣＨ３ドメインを含み、これらは任意に、ヒンジドメインを介してカドヘリン１１断片に抱合されている。Ｆｃ部分は、ヒト抗体または非ヒト抗体に由来することができる。抗体はＩｇＧ１またはＩｇＧ２であってもよいが、しかしこれに限定はされない。Ｆｃ融合タンパク質を作製する方法は当分野で知られており、少なくともEP0464533に記載されている。
【００４０】
一部の態様において、カドヘリン１１融合タンパク質は、カドヘリン１１の細胞外ドメイン全体を含む。一部の態様において、カドヘリン１１融合タンパク質は、カドヘリン１１の１または２以上の細胞外サブドメイン、例えばＥＣ１を含む。例としては、ＥＣ１、ＥＣ１／２、ＥＣ１〜３、ＥＣ１〜４、ＥＣ１／３、ＥＣ１／４、およびＥＣ１／５、またはＥＣ１の断片を含む、融合タンパク質が挙げられる。重要な態様において、融合タンパク質は、カドヘリン１１のＥＣ１ドメインに結合する。カドヘリン１１融合タンパク質の例としては、カドヘリン１１−ＥＣ１−Ｆｃ融合タンパク質（カドヘリン１１のＥＣ１ドメインを含む）、カドヘリン１１−ＥＣ１／２−Ｆｃ融合タンパク質（カドヘリン１１のＥＣ１およびＥＣ２ドメインを含む）、およびカドヘリン１１−ＥＣ１〜５−Ｆｃ融合タンパク質（カドヘリン１１のＥＣ１、ＥＣ２、ＥＣ３、ＥＣ４、およびＥＣ５ドメインを含む）が挙げられる。いくつかの融合タンパク質は、WO 2009/089062に記載されているように、カドヘリン１１のＥＣ１ドメインの最初の４０の、最初の３９の、最初の３８の、最初の３７の、最初の３６の、最初の３５の、または最初の３４のアミノ酸を含んでよい。
カドヘリン１１融合タンパク質の合成方法は、少なくとも米国特許第5597725号、第5639634号、第5646250号、第6787136号、第6946768号、第7488478号、および第7589074号、ならびにＰＣＴ特許公開公報WO93/21302およびWO2009/089062に記載されており（例えば配列番号６および７を参照、これは、ヒトカドヘリン１１−ＥＣ１−ｈＩｇＧ２−Ｆｃ融合タンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列である）、カドヘリン１１融合タンパク質に関連するこれらの教示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００４１】
カドヘリン１１抗体および抗体断片：
カドヘリン１１結合ペプチドであるカドヘリン１１アンタゴニストは、抗体または抗原結合性抗体断片であってよい。抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であってよい。これらは、ヒト化抗体を含むキメラ抗体であってもよい。これらは、２つの重鎖と２つの軽鎖からなる４本鎖抗体であってもよく、または、２つの重鎖からなる（例えばラクダ科動物抗体）、または１つの軽鎖に結合した１つの重鎖からなる（例えば単鎖Ｆｖｓ）、２本鎖抗体であってもよい。これらは、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスであることができる。後述するように、これらの様々な抗体形態は、従来の方法に従って調製することができる。抗体および抗体断片は天然であってよく、または、例えば組換え的に産生された抗体および断片を含む非天然であってもよい。
【００４２】
重要なのは、当該技術分野でよく知られているように、抗体分子の小さな部分であるパラトープのみが、抗体のそのエピトープへの結合に関与していることである（一般的に、Clark, W.R. (1986) The Experimental Foundations of Modern Immunology Wiley & Sons, Inc., New York；Roitt, I. (1991) Essential Immunology, 7th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxfordを参照）。例えばｐＨｃ’およびＦｃ領域は、補体カスケードのエフェクターであるが、抗原結合に関与していない。ｐＨｃ’'領域が酵素的に切断された、またはｐＨｃ’領域なしで作製された抗体は、Ｆ（ａｂ’）２断片と呼ばれ、無傷の抗体の両方の抗原結合部位を保持している。同様に、Ｆｃ領域が酵素的に切断されたか、またはＦｃ領域なしに作製された、Ｆａｂ断片と呼ばれる抗体は、無傷の抗体分子の抗原結合部位の１つを保持している。さらに進むと、Ｆａｂ断片は、共有結合した抗体軽鎖とＦｄと呼ばれる抗体重鎖の部分からなる。Ｆｄ断片は、抗体特異性の主要な決定要因であり（単一のＦｄ断片は、抗体の特異性を変化させずに１０個までの異なる軽鎖と結びつくことができる）、Ｆｄ断片は、単独でエピトープ結合能力を保持する。
【００４３】
用語Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｃ、Ｆｄ、ｐＦｃ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、およびｄＡｂは、標準的な免疫学的意味で用いられる［Klein, Immunology (John Wiley, New York, NY, 1982)；Clark, W.R. (1986) The Experimental Foundations of Modern Immunology (Wiley & Sons, Inc., New York)；Roitt, I. (1991) Essential Immunology, 7th Ed., (Blackwell Scientific Publications, Oxford)］。周知の機能的に活性な抗体断片としては、限定することなく、抗体のＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、およびＦｄ断片が挙げられる。無傷の抗体のＦｃ断片が欠如しているこれらの断片は、循環からより迅速に取り除かれ、無傷の抗体よりも少ない非特異的組織結合を有し得る（(Wahl et al., J. Nucl. Med. 24:316-325 (1983)）。例えば、単鎖抗体は、Ladnerらへの米国特許第4,946,778号に記載の方法に従って構成することができる。かかる単鎖抗体は、フレキシブルなリンカー部分により結合された軽鎖と重鎖の可変領域を含む。
【００４４】
単離された可変重鎖単一ドメインを含む、単一ドメイン抗体（「Ｆｄ」）を得るための方法も、報告されている（例えば、Ward et al., Nature 341:644-646 (1989)を参照、これには、抗体重鎖可変領域（ＶＨ単一ドメイン抗体）を、単離された形態においてそこに結合するための標的エピトープに対する十分な親和性を有して同定するために、スクリーニングする方法が開示されている）。既知の抗体重鎖および軽鎖可変領域配列に基づき、組み換えＦｖ断片を作製するための方法は当分野に知られており、例えば、Mooreらの米国特許第 4,462,334号に記載されている。抗体断片の使用および生成について記載するその他の参考文献としては、例えば、Ｆａｂ断片（Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevieer, Amsterdam, 1985)）、Ｆｖ断片（Hochman et al., Biochemistry 12: 1130 (1973)；Sharon et al., Biochemistry 15: 1591 (1976)；Ehrilch et al., 米国特許第4,355,023号）、および抗体分子の一部（Audilore-Hargreaves, 米国特許第4,470,925号）がある。したがって当業者は、抗体の特異性を損なうことなく、無傷の抗体の種々の部分から抗体断片を作製することができる。
【００４５】
抗体の抗原結合部分内に、当分野において知られているように、抗原のエピトープと直接相互作用する相補性決定領域（ＣＤＲ）と、パラトープの三次構造を維持するフレームワーク領域（ＦＲ）が存在する（一般的にClark, 1986; Roitt, 1991を参照）。重鎖Ｆｄ断片とＩｇＧ免疫グロブリンの軽鎖の両方において、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）によってそれぞれ区切られた４つのフレームワーク領域（ＦＲ１〜ＦＲ４）が存在する。ＣＤＲ、特にＣＤ３領域、およびより特に重鎖ＣＤＲ３は、抗体特異性に大きく関与する。
【００４６】
現在当分野で十分に確立されているのは、哺乳動物抗体の非ＣＤＲ領域が、同種または異種抗体の類似領域で置き換えることができて、かつオリジナル抗体のエピトープ特異性を保持していることである。これは、非ヒトＣＤＲがヒトＦＲおよび／またはＦｃ／ｐＦｃ’'領域に共有結合で結合されて、機能的抗体を生産する、「ヒト化」抗体の開発および使用において、最も明確に示されている。したがって、例えば、ＰＣＴ国際公開WO92/04381および公開された欧州特許出願EP0239400は、マウスＦＲ領域の少なくとも一部が、ヒト由来のＦＲ領域によって置き換えられたヒト化マウス抗体の産生および使用について教示する。抗原結合能を有する無傷の抗体の断片を含む、かかる抗体は、しばしば「キメラ」抗体と呼ばれている。米国の事業体においては、ヒト化抗体を特定のマウス抗体領域から商業的に合成する予定であり、例えばProtein Design Labs (Mountain View California)、 Abgenix、および Medarexなどがある。
【００４７】
したがって、当業者に明らかであるように、本発明は以下も提供する：Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、およびＦｄ断片；Ｆｃおよび／またはＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が、相同なヒトまたは非ヒト配列によって置き換えられているキメラ抗体；ＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が、相同なヒトまたは非ヒト配列によって置き換えられているキメラＦ（ａｂ’）２断片抗体；ＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が、相同なヒトまたは非ヒト配列によって置き換えられているキメラＦａｂ断片抗体；およびＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２領域が、相同なヒトまたは非ヒト配列によって置き換えられているキメラＦｄ断片抗体。本発明はまた、単鎖抗体も含む。
【００４８】
さらに、ヒトモノクローナル抗体は、当分野に知られている任意の方法により作製してよく、例えば、以下に記載の方法である：Borrebaeckらに発行された米国特許第5,567,610号、Ostbergに発行された米国特許第565,354号、Bakerらに発行された米国特許第5,571,893号、Kozber, J. Immunol. 133: 3001 (1984)、Brodeur, et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, p. 51-63 (Marcel Dekker, Inc, new York, 1987)、およびBoerner et al., J. Immunol., 147: 86-95 (1991)。ヒトモノクローナル抗体を調製するための従来方法に加えて、かかる抗体はまた、ヒト抗体を産生することのできる遺伝子導入動物を免疫化することによっても調製できる（例えば、Jakobovits et al., PNAS USA, 90: 2551 (1993)、Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993)、Bruggermann et al., Year in Immunol., 7:33 (1993)およびLonbergに発行された米国特許第 5,569,825号）。
【００４９】
例示のカドヘリン１１およびかかる抗体を作製する方法は、米国特許第5597725号、第5639634号、第5646250号、第6787136号、第6946768号、第7488478号、および第7589074号、およびＰＣＴ特許公開WO 93/21302およびWO2009/089062に記載されており、カドヘリン１１抗体に関連するこれらの教示は、本明細書に参照により組み込まれる。カドヘリン１１抗体の例としては、以下が挙げられる：２３Ｃ６、１３Ｃ２、２７Ｆ３、５Ｆ８２（Lifespan Scienceより市販）、Ｈ１Ｍ１抗体（ＡＴＣＣアクセッション番号PTA-9699を有するハイブリドーマＨ１Ｍ１により産生されたカドヘリン１１ＥＣ１特異的抗体）、Ｈ１４抗体（ＡＴＣＣアクセッション番号PTA-9701を有するハイブリドーマＨ１４により産生されたカドヘリン１１ＥＣ１特異的抗体）、ＢＭ５０９６／１Ａ６（Acris Antibodies GmbHより市販）、２８３４１６（R&D Systemsより市販）、およびＭＡＢ２０１４（Milliporeより市販）。カドヘリン１１抗体断片の例としては、抗体２３Ｃ６、１３Ｃ２、２７Ｆ３、５Ｆ８２、Ｈ１Ｍ１抗体、Ｈ１４抗体、ＢＭ５０９６／１Ａ６、２８３４１６、およびＭＡＢ２０１４のＦａｂ断片が挙げられる。抗体または抗体断片は、US 2009/0253200に記載のようにＨ１Ｍ１またはＨ１４抗体などの既知の抗体からの１または２以上のＣＤＲを含むことができ、この文献のＣＤＲの開示は、本明細書に参照により組み込まれる。
【００５０】
カドヘリン１１のＥＣ１ドメインに結合する抗体および抗体断片は、US 2009/0253200およびWO2009/089062に記載されており、かかる開示は本明細書に参照により組み込まれる。
カドヘリン１１抗体はまた、２つの異なるエピトープにそれらの異なる抗原結合部位によって結合可能な、二重特異性または二機能性抗体であってよい。
さらに別のカドヘリン１１抗体は、ＰＣＴ公開WO 94/04678および米国特許公開第20080124324号に記載のラクダ科動物抗体、および、米国特許第5759808号にあるようなラクダ科動物ナノバディの形態におけるそれらの誘導体である。ラクダ科動物抗体およびラクダ科動物ナノバディは、Ablynx (Belgium)などの供給源から市販されている。カドヘリン１１ラクダ科動物抗体は、他の抗体種類について本明細書に記載されたものと同様の様式でヒト化可能であることが、理解される。
【００５１】
カドヘリン１１核酸アンタゴニスト：
カドヘリン１１アンタゴニストはまた、核酸であってもよい。これらのアンタゴニストは、以下のような核酸を含む：（１）カドヘリン１１ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸；（２）上記核酸分子の転写又は翻訳を阻害するカドヘリン１１アンチセンス分子である核酸；（３）カドヘリン１１阻害性ＲＮＡである核酸（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）；（４）カドヘリン１１リボザイムである核酸；（５）アプタマーであって、天然で核酸であるが、結合ペプチドのようにカドヘリン１１に結合して、カドヘリン１１の別のカドヘリン１１のへの、または別のカドヘリン１１カウンター受容体への結合を妨害する、前記アプタマーである核酸。一部の態様において、カドヘリン１１アンタゴニストは、（１）配列番号１の配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸、および（２）カドヘリン１１に特異的に結合することができるカドヘリン１１ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸である。
【００５２】
カドヘリン１１をコードする核酸：
カドヘリン１１アンタゴニストは、カドヘリン１１およびカドヘリン１１の断片をコードする核酸を含む。 カドヘリン１１全長ヌクレオチド配列を、配列番号１として提供する。配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸は、一例として、アンタゴニストとして用いることができる。本発明のカドヘリン１１アンタゴニストは、配列番号１の配列を含む核酸分子のホモログおよび対立遺伝子も含む。
カドヘリン１１核酸アンタゴニストは、可溶性カドヘリン１１ポリペプチド、または膜結合ペプチド、またはＥＣ１もしくはその断片（例えば、ＥＣ１の最初の３３〜３７のアミノ酸）からなるかこれを含む断片などのカドヘリン１１断片であるポリペプチドをコードすることができる。可溶性カドヘリン１１ポリペプチドは膜貫通ドメインを欠いており、最適には、ポリペプチドを可溶性にするさらなるアミノ酸を含む（例えば、カドヘリン１１の別のカドヘリン１１への結合を阻害する、カドヘリン１１の全体または一部を含む融合タンパク質）。膜結合（または膜関連）であるカドヘリン１１断片は、好ましくは膜貫通ドメインを含む。
【００５３】
カドヘリン１１核酸アンタゴニストはさらに、配列番号２（または例えば配列番号３）のアミノ酸配列を有するカドヘリン１１タンパク質をコードするが、しかし遺伝コードの縮退のために配列番号１の配列とは異なってよい、核酸分子を包含する。
一定のカドヘリン１１核酸アンタゴニストは、従来技術により、例えば、カドヘリン１１をコードしストリンジェントな条件下で配列番号１の配列を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸配列を同定することにより、同定することができる。本明細書において、用語「ストリンジェントな条件」とは、当分野で知られているパラメータを指す。より具体的には、本明細書で用いるストリンジェントな条件とは、６５℃のハイブリダイゼーション緩衝液中（３．５×ＳＳＣ、０．０２％ホルムアミド、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％ウシ血清アルブミン、２．５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７）、０．５％ＳＤＳ、２ｍＭのＥＤＴＡ）でのハイブリダイゼーションを指す。 ＳＳＣは０．１５Ｍの塩化ナトリウム／０．１５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７であり；ＳＤＳはドデシル硫酸ナトリウムであり；ＥＤＴＡはエチレンジアミン四酢酸である。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡが転移された膜は、室温にて２×ＳＳＣ、その後６５℃にて０．１×ＳＳＣ／０．１×ＳＤＳで洗浄する。
【００５４】
用いることのできる別の条件、試薬などがあり、同程度のストリンジェンシーが得られる。当業者はかかる条件に精通しており、したがってここには記載しない。しかし当業者には、本発明の核酸分子のホモログおよび対立遺伝子の明確な識別が可能となる様式で、条件を操作することができることが理解されるであろう。当業者はまた、単離および配列決定することができるさらなる核酸分子の発現のための、細胞のスクリーニングおよびライブラリのための方法論に精通している。例えばカドヘリン１１配列についてのスクリーニングでは、サザンブロット法を、放射性プローブと共に上記の条件を用いて行うことができる。ＤＮＡが最終的に転移された膜を洗浄した後、膜をＸ線フィルムに接して配置して、放射性シグナルを検出することができる。
【００５５】
一般に、カドヘリン１１ホモログおよび対立遺伝子は、典型的には、配列番号１と少なくとも７０％のヌクレオチド同一性を共有し；一部の例においては、少なくとも７５％のヌクレオチド同一性を共有し；さらに他の例においては、少なくとも８０％のヌクレオチド同一性を共有する。前述の核酸のワトソン・クリック補体もまた、本発明に包含される。好ましいカドヘリン１１ホモログは、配列番号１と少なくとも８５％の配列相同性を有する。さらに好ましくは、カドヘリン１１ホモログは、配列番号１と少なくとも９０％の、最も好ましくは少なくとも９５％の、配列相同性を有する。相同性は、インターネットを通して入手可能な、ＮＣＢＩ（Bethesda, Maryland）により開発された種々の公的に利用可能なソフトウェアツールを用いて、計算することができる。例示のツールとしては、ＮＣＢＩウェブサイトで入手可能なBLASTシステムが挙げられる。Pairwise and ClustalW alignments（BLOSUM30 matrix setting）、およびKyteDoolittle hydropathic analysisも、MacVector配列解析ソフトウェア（Oxford Molecular Group）を用いて得ることができる。
【００５６】
本発明はまた、代替的コドンを、例えばヒトカドヘリン１１ポリペプチドをコードする天然の核酸に存在するものの代わりに含んでいる、変性核酸も含む。当分野で知られているように、また例として、セリン残基は、コドンTCA、AGT、TCC、TCG、TCTおよびAGCによりコードされる。この６つのコドンの各々は、セリン残基をコードするという目的に対して等価である。したがって、当業者に明らかであるようにセリンをコードするヌクレオチドコドンの任意のものを用いて、in vitroまたはin vivoでタンパク質合成装置をセリン残基を組み込むように指向させることができる。同様に、他のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列トリプレットとしては、限定されないが、CCA、CCC、CCGおよびCCT（プロリンコドン）；CGA、CGC、CGG、CGT、AGAおよびAGG（アルギニンコドン）；ACA、ACC、ACGおよびACT（スレオニンコドン）；AACおよびAAT（アスパラギンコドン）；およびATA、ATCおよびATT（イソロイシンコドン）が挙げられる。他のアミノ酸残基を、複数のヌクレオチド配列により同様にコードすることができる。
【００５７】
本明細書において核酸に関して、用語「単離された」とは、以下を意味する：（１）例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってin vitroで増幅される；（ｉｉ）クローニングにより組み換え的に産生される；（ｉｉｉ）切断およびゲル分離によるなどで、精製される；または（ｉｖ）例えば化学合成により合成される。単離された核酸は、当分野に知られた組み換えＤＮＡ技術により容易に操作されるものである。したがって、５’または３’制限部位が知られているか、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー配列が開示されているベクターに含まれるヌクレオチド配列は、単離されたと考えられるが、核酸配列であって、その天然の状態で天然の宿主に存在しているものは、単離されたとは考えられない。単離された核酸は、実質的に精製されていてもよいが、その必要はない。例えば、クローニングまたは発現ベクター中に単離された核酸は、それが存在する細胞において物質の小さなパーセンテージのみを含み得るという点で、純粋ではない。かかる核酸はしかし、本明細書において用いる場合、当業者に知られた標準技術により容易に操作されるので、単離されている。
【００５８】
一態様においてカドヘリン１１核酸アンタゴニストは、真核細胞などの細胞内でカドヘリン１１核酸アンタゴニストの発現を指向させる遺伝子発現配列に、動作可能に結合している。「遺伝子発現配列」は、任意の制限ヌクレオチド配列であり、例えばプロモーター配列またはプロモーター−エンハンサーの組み合わせであって、それが動作可能に結合しているカドヘリン１１核酸アンタゴニストの効率的な転写および翻訳を促進するものである。遺伝子発現配列は、例えば、哺乳動物またはウイルスプロモーター、例えば構成的または誘導的プロモーターであってよい。構成的哺乳動物プロモーターとしては、限定することなく、次の遺伝子に対するプロモーターが挙げられる：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＴＲ）、アデノシンデアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、βアクチンプロモーターおよび他の構成的プロモーター。真核細胞において構成的に機能する例示的なウイルスプロモーターとしては、例えば、シミアンウイルス、パピローマウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ラウス肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）、および他のレトロウイルス、および単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターが挙げられる。他の構成的プロモーターは、当業者に知られている。本発明の遺伝子発現配列として有用なプロモーターは、誘導性プロモーターも含む。誘導性プロモーターは、誘導剤の存在下で発現される。例えば、メタロチオネインプロモーターは、ある金属イオンの存在下で転写および翻訳を促進するように誘導される。他の誘導性プロモーターは、当業者に知られている。
【００５９】
一般的に、遺伝子発現配列は、必要に応じて、転写及び翻訳の開始にそれぞれ関与する、５’非転写および５’非翻訳配列、例えばＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列などを含む。特に、かかる５’非転写配列は、動作可能に結合されたカドヘリン１１核酸アンタゴニストの転写制御のためのプロモーター配列を含む、プロモーター領域を含む。遺伝子発現配列は任意に、必要に応じてエンハンサー配列または上流アクチベーター配列を含む。
【００６０】
カドヘリン１１核酸アンタゴニストは、in vivoおよびin vitro法の両方で用いることができる。本発明の核酸分子は、in vitroで細胞に導入することができ、続いて細胞を線維症の部位へ移動させる。核酸分子を導入する細胞は、線維症の部位（例えば、線維芽細胞）から収集することができ、またはこれは、通常は炎症部位に存在しない細胞であってもよい。例えば肺などの、特定の組織（または細胞）内で核酸の発現を可能にする配列は、組織（または細胞）で選択的に転写活性なものであり、それによって組織（または細胞）での核酸の発現を引き起こす。当業者は、本明細書で述べたように、肺組織、肝臓組織、腎組織などでかかる核酸分子を発現することができる代替のプロモーターを、容易に識別することができる。あるいは、カドヘリン１１核酸アンタゴニストを形質導入した細胞を、カドヘリン１１タンパク質アンタゴニストを生成するためにin vitroで培養することができ、または、in vitroスクリーニングアッセイにおいて用いることができる。例えば、遺伝子発現配列は、本質的にはカドヘリン１１を発現しない細胞中でカドヘリン１１を発現するために用いることができる。
【００６１】
本発明の核酸分子配列および遺伝子発現配列は、これらが、遺伝子発現配列の影響または制御の下で、核酸アンタゴニスト（例えばカドヘリン１１コード配列）の転写および／または翻訳を配置するような様式で共有結合されている場合に、「動作可能に結合している」と言われる。核酸分子が機能的タンパク質に翻訳されることが望まれている場合、２つのＤＮＡ配列は、５’遺伝子発現配列でのプロモーターの誘導が核酸分子の転写をもたらし、および、２つのＤＮＡ配列の間の結合の性質が、（１）フレームシフト変異の導入をもたらさず、（２）核酸分子の転写を指向するプロモーター領域の能力を妨害せず、または（３）対応するＲＮＡ転写物の、ポリペプチドに翻訳される能力を妨害しない場合に、動作可能に結合していると言われる。したがって、遺伝子発現配列は、遺伝子発現配列がその核酸分子の転写に効力を及ぼすことができて、得られた転写物が所望のポリペプチドに翻訳され得る場合に、核酸分子に動作可能に結合されている。
【００６２】
カドヘリン１１ｓｉＲＮＡ：
本発明は、ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡなどのＲＮＡ干渉剤の、カドヘリン１１アンタゴニストとしての使用を意図する。ｓｉＲＮＡは、干渉を、したがって哺乳動物細胞を含む細胞内の特定遺伝子の転写後サイレンシングを引き起こすことができるＲＮＡ分子である。ｓｉＲＮＡは、典型的には５〜５０塩基対の、より典型的には１０〜４０塩基対の、およびさらにより典型的には１５〜３０塩基対の長さの二本鎖領域を含む。 ｓｉＲＮＡは、２０〜５０、２５〜５０、または３０〜４０塩基対の長さであってもよい。これらのｓｉＲＮＡは、ＲＮａｓｅＩＩＩダイサーにより消化されて、より小さな１９〜２８塩基対（１９塩基対、２１塩基対、２３塩基対、２５塩基対、および２７塩基対の長さを含む）の範囲のｓｉＲＮＡを生成することができる。このサイズ範囲のｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれる酵素複合体に組み込まれてこれにより作用することができ、標的ＲＮＡの分解および／またはそこからの任意のタンパク質翻訳の阻害という正味の結果を有することが知られている。同様の様式で、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）などの別の調節機能を有する二本鎖ＲＮＡも、用いることができる。ｓｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡを作製する方法の詳細については、Bass, Nature 411: 428-29 (2001)；Elbashir et al., Nature 411: 494-98 (2001)；Fire et al., Nature 391: 806-11 (1998)；WO 01/75164、および米国特許第6506559号、第7056704号、第7078196号、第7432250号を参照のこからカドヘリンに対するｓｉＲＮＡは、Dharmaconなどの供給源から市販されている。
【００６３】
ＲおよびＬ形態などのｓｉＲＮＡ形態は、一方または両方の末端に突出を有する場合がある。本明細書で議論されるように、Ｒ形態のｓｉＲＮＡは、そのアンチセンス鎖に３’突出を有する。これの他の末端は平滑であってよく、および／または他の末端において、ＤＮＡ残基を含有する突出を含む３’突出を有してもよい。代替的に、Ｌ形態ｓｉＲＮＡはそのセンス鎖に３’突出を有する。これの他の末端は平滑であってよく、および／または他の末端において、ＤＮＡ残基を含有する突出を含む３’突出を有してもよい。
【００６４】
ｓｉＲＮＡは、リボヌクレオチドから、またはリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドの組み合わせから、一部の例においては１つまたは両方の修飾バージョンを含んで、構成されてよい。例としては、例えば５位において修飾されたウリジンおよび／またはシチジンなどの天然にない塩基を（天然の塩基の代わりに）含有するリボヌクレオチド、例えば５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ブロモウリジン；または８位において修飾されたアデノシンおよび／またはグアノシン、例えば８−ブロモグアノシン；またはデアザヌクレオチド、例えば７−デアザ−アデノシン；またはＯ−およびＮ−アルキル化ヌクレオチド、例えばＮ６−メチルアデノシンは、ｓｉＲＮＡに組み込むことができる。別の例としては、糖修飾されたリボヌクレオチドであって、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２またはＣＮから選択される基によって置き換えられた２’ＯＨ基を有し、ここでＲは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、ハロはＦ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである。さらに他の例として、骨格を修飾して、限定はしないがホスホロチオエートなどの修飾骨格結合を含むことができる。ｓｉＲＮＡは、塩基、糖、および／または骨格において修飾を含むことができ、これには多様なかかる修飾を含む。
【００６５】
したがって、ｓｉＲＮＡ分子は、１または２以上の単離された小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）二本鎖デュプレックスとして、より長い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＮＲＡ）として、またはＤＮＡプラスミド中の転写カセットから転写されたｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡとしてのものを含む、１または２以上の形態として、および／またはこれに由来して、提供することができる。ｓｉＲＮＡ分子は、突出を有してよく（例えば、Elbashir et al., Genes Dev., 15:188 (2001)またはNykanen et al., Cell, 107:309 (2001)に記載されているような、３’または５’突出）、または、突出を欠いていてもよい（すなわち、平滑末端を有する）。当業者は、かかる出発供給源をいかにして修飾して、本明細書に記載のようなＲおよびＬ形態に到達できるかを認識し、理解する。
そのデュプレックス（または二本鎖）のヌクレオチド配列の全てまたは一部が、カドヘリン１１などの標的遺伝子のヌクレオチド配列に相補的である場合、ｓｉＲＮＡはin vivoまたはin vitroで遺伝子に標的化される。ｓｉＲＮＡは、タンパク質またはその他の遺伝子産物をコードする核酸の、既知の（または推定された）ヌクレオチド配列に基づいて合成され得る。配列は、標的における翻訳または非翻訳配列に相補的であってよい。ｓｉＲＮＡと標的の間の相補性の程度は、標的において標的特異的サイレンシングを媒介するのに十分な同一性が存在すれば、１００％または１００％未満であってよい。その標的に対して１００％未満相補的な、有効なｓｉＲＮＡは、当分野でよく知られている。
【００６６】
サイレンシングまたは干渉のレベルは、ｍＲＮＡ種および／またはタンパク質種の定量化を含む、任意数の方法により測定することができる。一部の例において、タンパク質が細胞内であるかまたはその他で観察および／またはアッセイが困難である場合には特に、ｍＲＮＡ定量化が好ましい。ｍＲＮＡレベルは、例えばＲＴ−ＰＣＲまたはＰＡＧＥを用いて測定してよい。タンパク質レベルは、免疫組織化学的染色を用いて測定してよい。ｍＲＮＡまたはタンパク質レベルは、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％、低減してよい。用途に依存して、外因的に適用されるｓｉＲＮＡが不在の場合のレベルと比べて、部分的低減（すなわち１００％未満）でも十分な場合がある。一部の態様において、レベルは、外因的に適用されたｓｉＲＮＡに暴露されていない対照と比べて、８０％またはそれ以上、低減される。
【００６７】
カドヘリン１１リボザイム：
カドヘリン１１リボザイムは、カドヘリン１１ＲＮＡの特異的切断を触媒することができる、酵素ＲＮＡ分子である。カドヘリン１１リボザイムは、配列特異的様式でカドヘリン１１ＲＮＡに結合し（すなわち配列特異的ハイブリダイゼーションを介して）、これに続いてカドヘリン１１ＲＮＡのヌクレオチド鎖切断が生じる。リボザイムの例としは、改変されたヘアピンまたはハンマーヘッドモチーフリボザイムが挙げられる。カドヘリン１１などの標的に相補的なリボザイム配列は、リボザイム切断部位（例えばＧＵＡ、ＧＵＵ、およびＧＵＣ）についての標的をスキャンすることにより同定することができ、次いで、切断部位にわたる約１５〜２０のリボヌクレオチドを有する配列が生成される。
【００６８】
カドヘリン１１アンチセンス：
カドヘリン１１核酸アンタゴニストは、アンチセンス分子（またはオリゴヌクレオチド）であってよい。カドヘリン１１ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸分子に選択的に結合して、カドヘリン１１活性または機能を減少させるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本発明により包含される。本明細書において、用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」または「アンチセンス」とは、オリゴリボヌクレオチド、オリゴデオキシリボヌクレオチド、修飾オリゴリボヌクレオチド、または修飾オリゴデオキシリボヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドであって、生理学的条件下で特定遺伝子を含むＤＮＡまたはその遺伝子のｍＲＮＡ転写物にハイブリダイズして、これにより、その遺伝子の転写および／またはそのｍＲＮＡの翻訳を阻害する、前記オリゴヌクレオチドを指す。アンチセンス分子は、標的遺伝子または転写物とのハイブリダイゼ―ションにより、標的遺伝子の転写または翻訳を妨害するよう、デザインされる。当業者は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの正確な長さおよび標的に対する相補性の程度が、標的の配列およびその配列を含有する特定の塩基を含む、選択された特定の標的に依存することを認識する。アンチセンスオリゴヌクレオチドが、生理学的条件下で標的と選択的に結合するよう、構成および配置されることが好ましく、すなわち、生理学的条件下で標的細胞中の任意の他の配列よりも、実質的により多くの標的配列とハイブリダイズすることが好ましい。配列番号１に、または対立遺伝子もしくは相同な遺伝子および／もしくはｃＤＮＡの配列に基づいて、当業者は容易に、本発明に従って用いるための多くの適切なアンチセンス分子を選択および合成することができる。阻害のために十分に選択的で強力であるために、かかるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１０、およびより好ましくは少なくとも１５の、標的に相補的な連続塩基を含むべきであるが、しかしある場合においては、７塩基長という短い修飾オリゴヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチドとして成功して用いられている（Wagner et al., Nat. Med. 1(11):11161118, 1995）。最も好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、２０〜３０塩基の相補配列を含む。
【００６９】
オリゴヌクレオチドは、遺伝子またはｍＲＮＡ転写物の任意の領域にアンチセンスであるように選ぶことができるが、好ましい態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、翻訳開始、転写開始またはプロモーター部位などのＮ末端または５’上流部位に対応する。さらに、３’非翻訳領域を、アンチセンスオリゴヌクレオチドにより標的化することができる。ｍＲＮＡスプライシング部位への標的化は当分野でも用いられているが、代替的なｍＲＮＡスプライシングが生じる場合にはあまり好ましくない。さらに、アンチセンスは、好ましくはｍＲＮＡ二次構造が推定されず（例えば、Sainio et al., Cell Mol. Neurobiol. 14(5):439-457, 1994を参照）、かつタンパク質が結合することが推定されない部位を標的とする。最後に、配列番号１はｃＤＮＡ配列を開示するが、当業者は容易に、この配列に対応するゲノムＤＮＡを誘導することができる。したがって、本発明はまた、配列番号１に対応するゲノムＤＮＡに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドも提供する。同様に、カドヘリン１１の対立遺伝子またはホモログに対するアンチセンス、または代替的に、カドヘリン１１カウンター受容体ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡが、過度の実験なしに可能となる。
【００７０】
１セットの態様において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、「天然の」デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはこれらの任意の組み合わせから構成されてよい。すなわち、１つの天然のヌクレオチドの５’末端と、別の天然のヌクレオチドの３’末端を、天然の系におけるように、ホスホジエステルヌクレオチド間結合を介して共有結合で結合することができる。これらのオリゴヌクレオチドは、手動により、または自動合成器により実施することのできる、当分野で認識された方法によって調製してよい。これらはまた、ベクターにより組み換え的に産生してもよい。
好ましい態様においてはしかし、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、「修飾」オリゴヌクレオチドも含んでよい。すなわち、オリゴヌクレオチドは、これらをその標的にハイブリダイズすることを妨害しないが、その安定性または標的化を増強し、またはその治療的有効性をその他で増強する、多数の方法で修飾してもよい。
【００７１】
本明細書において用語「修飾オリゴヌクレオチド」は、（１）そのヌクレオチドの少なくとも２つが合成ヌクレオシド間結合（すなわち、１つのヌクレオチドの５’末端と別のヌクレオチドの３’末端の間のホスホジエステル結合以外の結合）を介して共有結合されており、および／または（２）通常は核酸と結びつかない化学基が、オリゴヌクレオチドに共有結合で結合している、オリゴヌクレオチドを記述する。好ましい合成ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、ホスホロジチオエート、リン酸エステル、アルキルホスホノチオエート、ホスホルアミデート、カルバメート、カーボネート、リン酸トリエステル、アセトアミデート、カルボキシメチルエステルおよびペプチドである。
用語「修飾オリゴヌクレオチド」はまた、共有結合で修飾された塩基および／または糖を有するオリゴヌクレオチドも包含する。例えば、修飾オリゴヌクレオチドは、３’位のヒドロキシル基以外の、および、５’位のリン酸基以外の低分子量の有機基に、共有結合で結合している骨格糖を有するオリゴヌクレオチドを含む。したがって、修飾オリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−アルキル化リボース基を含むことができる。また、修飾オリゴヌクレオチドは、例えばリボースの代わりのアラビノースなどの糖類を含んでもよい。
【００７２】
カドヘリン１１アンタゴニストの送達：
核酸アンタゴニストは、単独で、またはベクターと結ばれて、対象に送達することができる。その最も広い意味で、「ベクター」は、（１）核酸分子の標的細胞への送達、および／または（２）核酸分子の標的細胞による取り込みを促進することができる、任意のビヒクルである。好ましくはベクターは、カドヘリン１１核酸アンタゴニストを、ベクターがない場合に比べて低減された分解の度合いで、標的細胞へと輸送する。任意に、「標的化リガンド」はベクターに結合できて、該ベクターを、前記標的化リガンド用の同族受容体をその表面で発現する細胞へと、選択的に送達する。標的化のための方法論は、米国特許第5391723号に記載されているような抱合体を含む。いくつかの例において、本発明の核酸分子は、罹患した肺、肝臓、腎臓などの線維化組織への送達のために標的化される。
【００７３】
一般に、本発明において有用なベクターは２つのクラス、生物学的ベクターおよび化学的／物理的ベクターに分類される。生物学的ベクターは、標的細胞への／による、核酸の送達／取り込みのために有用である。生物学的ベクターとしては、限定はしないが以下が挙げられる：プラスミド、ファージミド、ウイルス、本発明の核酸配列の挿入または組み込みによって操作された、ウイルスまたは細菌の供給源に由来する他のビヒクル、および、本発明の核酸配列に結合させることができる追加の核酸断片（例えば、エンハンサー、プロモーター）。ウイルスベクターは、生物学的ベクターの好ましい種類であり、限定することなく、以下のウイルスからの核酸配列が含まれる：アデノウイルス；アデノ随伴ウイルス；モロニーマウス白血病ウイルスなどのレトロウイルス；ハーベイマウス肉腫ウイルス；マウス乳腺腫瘍ウイルス；ラウス肉腫ウイルス；ＳＶ４０型ウイルス；ポリオーマウイルス；エプスタイン・バーウイルス；パピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；およびレトロウイルスなどのＲＮＡウイルスである。名称を挙げていないが当分野で知られている他のベクターも、容易に用いることができる。
【００７４】
特定の用途のために特に好ましいウイルスは、二本鎖ＤＮＡウイルスであるアデノ随伴ウイルスである。アデノ随伴ウイルスは、広範囲の細胞型および種に感染することができ、複製欠損となるように改変することができる。さらに、熱および脂質溶媒に対する安定性、造血細胞を含む多様な系統の細胞における高い伝達頻度、および、重複感染阻害の欠如により、複数の系列の形質導入を可能にするなどの利点を有する。報告によれば、アデノ随伴ウイルスは、ヒト細胞ＤＮＡ中に部位特異的な様式で組み込むことができ、これにより、挿入突然変異および挿入された遺伝子発現の変動の可能性を最小限に抑えることができる。さらに、野生型アデノ随伴ウイルス感染は、選択圧の非存在下で１００を超える継代組織培養において追跡されて、アデノ随伴ウイルスのゲノム組込みが比較的安定したイベントであることを示唆した。アデノ随伴ウイルスはまた、染色体外様式で機能することができる。
【００７５】
一般的に、他の好ましいウイルスベクターは、非必須遺伝子が目的の遺伝子と置き換えられた、非細胞変性真核生物ウイルスに基づく。非細胞変性ウイルスはレトロウイルスを含み、そのライフサイクルには、ウイルスのゲノムＲＮＡのＤＮＡ中への逆転写と、続いて宿主細胞ＤＮＡへのプロウイルスの組み込みが関与する。アデノウイルスおよびレトロウイルスは、ヒトの遺伝子治療の臨床試験用に承認されている。一般的には、レトロウイルスは複製欠損性である（すなわち、所望のタンパク質の合成を指向することができるが、感染性粒子は製造できない）。このような遺伝的に改変されたレトロウイルス発現ベクターは、in vivoでの遺伝子の高効率な形質導入に一般的な有用性を有する。複製欠損レトロウイルスを産生するための標準プロトコル（外来遺伝物質のプラスミドへの組み込み、パッケージング細胞株のプラスミドを用いたトランスフェクション、パッケージング細胞株による組換えレトロウイルスの産生、組織培養培地からのウイルス粒子の収集、および標的細胞のウイルス粒子による感染の行程を含む）は、Kriegler, M., “Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual,” W.H. Freeman C.O., New York (1990)およびMurry, E.J. Ed. “Methods in Molecular Biology,” vol. 7, Humana Press, Inc., Cliffton, New Jersey (1991)に提供されている。別の好ましいレトロウイルスベクターは、Nabel, E.G., et al., Science, v. 249, p. 1285-1288 (1990)に記載されているモロニーマウス白血病ウイルス由来のベクターである。
【００７６】
生物学的ベクターに加えて、化学的／物理的ベクターは、核酸またはポリペプチドの、標的細胞への／からの、送達／取り込みに有用である。本明細書において、「化学的／物理的ベクター」とは、細菌またはウイルス源に由来する以外の天然または合成分子であって、カドヘリン１１アンタゴニストを細胞に送達することができるものを指す。
【００７７】
本発明の好ましい化学的／物理的ベクターは、コロイド分散系である。コロイド分散系としては、水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含む脂質ベースの系を含む。本発明の好ましいコロイド系は、リポソームである。リポソームは、in vivoまたはin vitroの送達ベクターとして有用な人工の膜管（membrane vessel）である。０．２〜４．０μＭのサイズ範囲の大きな単層管（ＬＵＶ）は、大きな高分子をカプセル化することができる。ＲＮＡ、ＤＮＡおよび無傷のビリオンを水性の内部にカプセル化して、生物学的に活性な形態で細胞に送達することができる（Fraley, et al., Trends Biochem. Sci., v. 6, p. 77 (1981)）。リポソームが効率的な遺伝子導入ベクターであるためには、１または２以上の次の特性が存在しなければならない：（１）生物学的活性を保持しつつ、目的遺伝子を高効率でカプセル化；（２）非標的細胞と比較して、標的細胞への優先的かつ実質的な結合；（３）ベシクルの水性内容物の、標的細胞の細胞質への高効率での送達；および（４）遺伝情報の、正確かつ効果的な発現。
【００７８】
リポソームは、リポソームを特定のリガンドに、例えば、特定の組織または細胞型に特異的なモノクローナル抗体、糖、糖脂質、またはタンパク質などに結合することによって、特定の組織に標的化することができる。さらにベクターは核標的ペプチドに結合することができ、これによりカドヘリン１１調節核酸分子を、宿主細胞の核に指向させる。
リポソームは、Gibco BRLから、例えばLIPOFECTIN（商標）およびLIPOFECTACE（商標）として市販されており、Ｎ−［１−（２，３ジオレイルオキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）およびジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）などのカチオン性脂質から形成されている。リポソームを作製するための方法は当分野でよく知られており、多くの刊行物に記載されている。リポソームはまた、Gregoriadis, G. in Trends in Biotechnology, V. 3, p. 235-241 (1985)に概説されている。
【００７９】
一般に、カドヘリン１１核酸アンタゴニストは、対象（任意の哺乳動物のレシピエント）に対して、ヒトにおける遺伝子治療に現在用いられているものと同じ投与様式（例えば、アデノウイルス媒介遺伝子治療）を用いて、投与することができる。ex vivo遺伝子治療を行うための特許された方法は、米国特許第5,399,346号および、この特許のファイル履歴に提出された添付書類に概説されている；これらは全て公開文書である。一般にex vivo遺伝子治療は、遺伝子またはその断片の機能的なコピーの、対象の１または２以上の細胞へのin vitroでの導入および、遺伝的に操作された１または２以上の細胞を該対象へ戻すことが関与する。遺伝子またはその断片の機能的なコピーは、調節要素の操作可能な制御下にあり、該調節要素は、遺伝子操作された１または２の細胞中において前記遺伝子の発現を可能とする。多数のトランスフェクションおよび形質導入技術、ならびに適切な発現ベクターは、当業者に知られており、そのうちのいくつかは、ＰＣＴ出願WO95/00654に記載されている。
【００８０】
実例として、核酸分子を含むベクターを、かかる遺伝子治療の候補である対象の線維症部位に送達する。次にベクターは、例えばカドヘリン１１などのＤＮＡコーディングにより、線維性環境内の１または２以上の細胞型を遺伝的に操作する。かかる遺伝子操作された細胞は、カドヘリン１１の別のカドヘリン１１への結合を妨害することが予想される。
別の態様において、初代ヒト細胞を、かかる遺伝子治療の候補である対象から得ることができる。次に、かかる細胞を、例えば全長カドヘリン１１のＤＮＡコーディングにより、ex vivoで遺伝子操作することができる。このような組換え細胞は、in vivoでカドヘリン１１媒介性の接着を阻害することが予想される。さらに別の例では、カドヘリン１１を発現しない別の細胞型をin vitroで遺伝的に操作して、カドヘリン１１アンタゴニストを発現させ、次いで線維症の部位に導入することができる。
標的細胞によるin vitroでの核酸の取り込みを促進するために用いることができる、例示の組成物としては、リン酸カルシウムおよびその他の細胞内輸送の化学的メディエーター、マイクロインジェクション組成物、エレクトロポレーションおよび相同組換え用組成物（例えば、核酸を、標的細胞の染色体内の予め選択された場所に組み込むため）が挙げられる。
【００８１】
医薬組成物、製剤、有効量：
本発明はさらに、カドヘリン１１アンタゴニストを含む医薬組成物（すなわち、医薬製剤）を提供する。組成物は、薬学的に許容し得る担体およびカドヘリン１１アンタゴニストを含む。
前述のように、医薬製剤は有効量で投与される。治療への応用のために、これは一般的に、医学的に望ましい結果を達成するのに十分な量である。一般に、治療有効量は、処置する特定の病態の発生を遅延させる、その進行を抑制する、またはこれ全体を停止させるのに十分な量である。例として、有効量は、処置または予防される疾患の症状の発現（例えば、痛み、炎症など）を、低減する、軽減する、または遅延させるのに役立つ量であってよい。有効量は、投与の様式、処置される特定の病態および望ましい結果に依存する。また、病態のステージ、病態の重症度、処置される対象の年齢および身体状況、もしある場合は併用療法の性質、処置の持続時間、特定の投与経路および医師の知識および経験内の類似の因子にも依存する。予防的な用途に対しては、予防する特定の病態の発生を遅延させる、その進行を抑制する、またはこれ全体を停止させるのに十分な量であり、症状の発現を予防するのに必要な量によって測定することができる。
【００８２】
一般に、本発明の活性化合物の用量は、１日当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ、および最も好ましくは約０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇで、１または２日以上にわたり、毎日１または２以上の用量の投与である。１〜５００ｍｇ／ｋｇの範囲の用量、好ましくは１〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲の用量、さらに好ましくは１〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量が、好適であると予想される。好ましい量は、当業者により、剤の最適投与量レベルを決定するための標準的技法に従って決定することができる。健全な医学的判断に従った最大の安全用量である、カドヘリン１１アンタゴニストの最大用量を用いることが、一般に好ましい。
【００８３】
カドヘリン１１アンタゴニストは、線維症の処置のための併用療法と組み合わせて、かかる処置を必要とする対象に対して投与することができる。併用療法は、侵襲的または非侵襲的（例えば薬物療法）であってよい。線維症の薬物療法の例としては、限定することなく、メチアゾール（methiazole）、ピペロングミン（piperlongumine）、アンチマイシンａ、チオストレプトン、ベンズブロマロン、ルテオリン、トルフェナム酸、シクロピロックスエタノールアミン、（ｒ）−（−）−アポモルフィンカルシフェロール、ＧＢＲ１２９０９、ハルモール、ヒカントン、フルフェナム酸、ハロファントリン、およびザルダベリンが含まれ、これらは米国特許公開第20100093613号に記載されている。免疫抑制剤も、線維症の治療に使用されてきた。例としては、ラパマイシン、メトトレキサート、アザチオプリン、シクロスポリン、ＦＫ−５０６、ＣＤＫ阻害剤、ならびにステロイド類およびコルチコステロイド類、例えばコルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、およびトリアムシノリン（triamcinoline）などが挙げられる。用いることのできる他の剤には、ＮＳＡＩＤなどの抗炎症剤が挙げられる。これらの薬物療法は当業者によく知られており、かかる業者に知られている様式によって投与される。薬物療法は、カドヘリン１１アンタゴニストとの組み合わせで、生理学的目標を達成するのに有効な量で投与される。したがって、いくつかの例においては、薬物療法が単独で投与された場合には線維症の生理学的影響を予防または低減できないが、カドヘリン１１アンタゴニストと組み合わせて投与した場合には影響を低減できるような量において、投与することができる。カドヘリン１１アンタゴニストは、かかる第２の治療剤と共に製剤化することができ、またはこれらは別々に製剤化してもよい。これらは、同時に、または別の時に投与してよい。例えば、カドヘリン１１アンタゴニストは、第２の治療剤の前に、および／またはこれと共に、および／またはこれの後に、投与してよい。代替的に、第２の治療剤は、カドヘリン１１アンタゴニストの前に、および／またはこれと共に、および／またはこれの後に、投与してよい。
【００８４】
カドヘリン１１アンタゴニストは、単独で、または上記の薬物療法と組み合わせて、医薬組成物の一部として投与してよい。かかる医薬組成物は、カドヘリン１１アンタゴニストを、当分野に知られている任意の標準の生理学的および／または薬学的に許容し得る坦体と組み合わせて含むことができる。組成物は無菌であるべきであり、患者への投与に好適な重量または容積の単位において、治療有効量のカドヘリン１１調節剤を含むべきである。
【００８５】
本明細書において、用語「薬学的に許容し得る坦体」は、ヒトまたは他の動物への投与に好適な、１または２以上の適合的な固体または液体の増量剤、希釈剤または封入物質を意味する。用語「薬学的に許容し得る」とは、活性成分の生物学的活性の有効性を妨害しない、非毒性材料を意味する。薬学的に許容し得るとはさらに、細胞、細胞培養物、組織または生物などの生体系と適合的な、非毒性材料を意味する。用語「坦体」は、有機または無機の成分であって、天然または合成の、これと活性成分が組み合わさって用途を促進するものを指す。坦体の特徴は、投与経路に依存する。医薬組成物の成分はまた、望ましい医薬的有効性を実質的に損なう相互作用がないような様式で、本発明の剤と、および互いに混ざり合うこともできる。薬学的に許容し得る坦体は、in vivoでの投与のために、無菌でなければならない。生理学的および薬学的に許容し得る坦体は、希釈剤、増量剤、塩、緩衝液、安定剤、溶解剤、および当分野で知られているその他の材料を含む。
【００８６】
非経口投与に適した組成物は、好ましくはレシピエントの血液と等張性である、カドヘリン１１調節剤の無菌水性調製物を含む。この水性調製物は、公知の方法に従って、好適な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を用いて製剤化することができる。無菌の注射用製剤も、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒、例えば、１，３−ブタンジオール中の、無菌の注射用溶液または懸濁液であってよい。使用可能な許容し得るビヒクルおよび溶媒としては、水、リンゲル液、および等張塩化ナトリウム溶液がある。さらに、無菌の固定油は、溶媒または懸濁媒体として便利に使用される。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む、任意の無刺激性の固定油を用いることができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸を、注射剤の調製に用いてよい。経口、皮下、静脈内、筋肉内等の投与に適した担体製剤は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PAに見出すことができる。
【００８７】
種々の投与経路が利用可能である。選択する特定の様式は、当然ながら、処置する線維症の特定の種類、処置する病態の重症度、および治療的有効性に必要な投与量に依存する。本発明の方法は、一般的には、医学的に許容される投与の任意の様式を用いて実施することができ、すなわち、臨床的に許容し得ない副作用を引き起こすことなく、活性化合物の有効レベルを生成する任意の様式を意味する。かかる投与様式は、局所、経口、直腸、経鼻、鼻腔内、吸入、または非経口経路を含む。用語 「非経口」は、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、または注入を含む。
【００８８】
医薬組成物は、単位剤形で便利に提供することができ、薬学の分野で周知の方法のいずれかによって調製することができる。すべての方法は、カドヘリン１１アンタゴニストを、１または２以上の副成分を構成する担体と関連させるステップを含む。一般に、組成物は、カドヘリン１１アンタゴニストを、液体坦体、微粉化した固体担体、または両方と、均一におよび密接に関連させることにより、次いで必要に応じて産物を成形することにより、調製される。経口投与に適した組成物は、個別の単位として、例えば、それぞれが所定量のカドヘリン１１アンタゴニストを含有するカプセル、錠剤、トローチ剤として、提示することができる。その他の組成物としては、シロップ剤、エリキシル剤または乳剤などの、水性液体または非水性液体中の懸濁物を含む
【００８９】
特定の一態様において、カドヘリン１１アンタゴニストの送達のための好適なビヒクルは、対象への移植に適する生体適合性微粒子またはインプラントである。本方法にしたがって有用な生体内分解性インプラントの例は、ＰＣＴ国際出願PCT/US/03307（公開番号WO 95/24929、表題「Polymeric Gene Delivery System」、１９９４年３月１５日出願の米国特許出願第213668号の優先権を主張）に記載されている。PCT/US/0307には、適当なプロモーターの制御下で外来遺伝子を含有するための、生体適合性の、好ましくは生分解性のポリマーマトリックスが記載されている。ポリマーマトリックスは、対象において外来遺伝子の持続的放出を実現するために使用される。本発明によれば、本明細書に記載のカドヘリン１１調節剤は、PCT/US/03307に開示された生体適合性、好ましくは生分解性のポリマーマトリックス内に封入または分散される。ポリマーマトリックスは、好ましくは、マイクロスフェア（ここでは例えば、カドヘリン１１阻害剤は固体ポリマーマトリックス中に分散されている）またはマイクロカプセル（ここでは例えば、カドヘリン１１阻害剤はポリマーシェルのコアに格納されている）などの、微粒子の形態である。カドヘリン１１調節剤を含有するためのポリマーマトリックスの他の形態は、フィルム、コーティング、ゲル、インプラント、およびステントを含む。ポリマーマトリックスデバイスのサイズおよび組成は、マトリックスデバイスが移植される組織において、良好な放出動態が得られるように選択される。ポリマーマトリックスデバイスのサイズはさらに、用いられる送達方法にしたがって選択され、これには例えば、鼻および／または肺の領域へのエアロゾルによる懸濁液の投与を含む。ポリマーマトリックス組成物は、良好な分解速度を有し、かつ生体接着性のある材料で形成されるように、選択することができる。マトリックス組成物はまた、分解するためではなく、むしろ長期間にわたり拡散によって放出されるように、選択することができる。
【００９０】
非生分解性及び生分解性両方のポリマーマトリックスを、カドヘリン１１アンタゴニストを対象に送達するために用いることができる。生分解性マトリックスが好ましい。かかるポリマーは、天然または合成ポリマーであってよい。合成ポリマーが好ましい。ポリマーは、放出が所望される時間に基づいて、一般に数時間から１年間以上のオーダーで選択される。典型的には、数時間から３〜１２ヶ月の間の期間にわたる放出が最も望ましい。ポリマーは任意にはヒドロゲルの形態であって、これは水中でその重量の約９０％までを吸収することができ、さらに、任意に多価イオンまたは他のポリマーと架橋されるものである。
【００９１】
一般に、カドヘリン１１アンタゴニストは、生体内分解性インプラントを用いて、ポリマーマトリックスの拡散により、またはより好ましくは分解により、送達される。生分解性送達システムを形成するために用いることができる例示の合成ポリマーとしては、以下が挙げられる：ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリビニルハライド、ポリビニルピロリドン、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタンおよびその共重合体、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、アクリル酸およびメタクリル酸エステルのポリマー、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、セルロースアセテート、セルロースプロピオネート、セルロースアセテートブチレート、セルロースアセテートフタレート、カルボキシルエチルセルロース、セルローストリアセテート、セルロース硫酸ナトリウム塩、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、およびポリビニルピロリドン。
【００９２】
生分解性ポリマーの例としては、合成ポリマー、例えば、乳酸およびグリコール酸のポリマー、ポリ無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリウレタン、ポリ（酪酸）（butic acid）、ポリ（吉草酸）、およびポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）など；および天然ポリマー、例えば、アルギン酸および、デキストランを含む他の多糖類、セルロース、コラーゲン、これらの化学誘導体（例えばアルキル、アルキレンなどの、化学基の置換、付加、ヒドロキシル化、酸化、および当業者が通常行うその他の修飾）、アルブミンおよび他の親水性タンパク質、ゼインおよび他のプロラミンおよび疎水性タンパク質、これらのコポリマーおよび混合物が挙げられる。一般に、これらの材料は、in vivoでの酵素加水分解または水への曝露のいずれかにより、表面又はバルク浸食によって分解する。
【００９３】
特に興味深い生体接着性ポリマーとしては、以下が挙げられる：生体内分解性ヒドロゲル（H.S. Sawhney, C.P. Pathak and J.A. Hubell in Macromolecules, 1993, 26, 581-587に記載されており、この教示は本明細書に組み込まれる）、ポリヒアルロン酸、カゼイン、ゼラチン、グルチン、ポリ無水物、ポリアクリル酸、アルギン酸、キトサン、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、およびポリ（オクタデシルアクリレート）。
非生分解性ポリマーの例としては、エチレンビニルアセテート、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリアミド、これらのコポリマーおよび混合物が挙げられる。
【００９４】
他の送達システムとしては、時間放出、遅延放出または持続放出型の送達システムを含むことができる。かかるシステムは、上記のカドヘリン１１アンタゴニストの反復投与を避けることができ、対象および医師の利便性が向上される。多くの種類の放出送達システムが利用可能であり、当業者に知られている。これらは、上記のポリマーシステムならびに、例えば、ポリ（ラクチド−グリコリド）、コポリオキサレート（copolyoxalates）、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸、およびポリ無水物などのポリマーベースシステムを含む。薬物を含有する前述のポリマーのマイクロカプセルは、例えば、米国特許第5075109号に記載されている。送達システムは非ポリマーシステムも含み、以下である：例えばコレステロール、コレステロールエステルなどのステロールを含む脂質、および、例えばモノ、ジ、およびトリグリセリドなどの脂肪酸または中性脂肪；ヒドロゲル放出システム；シラスティックシステム；ペプチドベースのシステム；ワックスコーティング：従来の結合剤および賦形剤を用いた圧縮錠剤；部分的融合インプラントなど。具体例としては、限定はされないが以下である：（ａ）カドヘリン１１調節剤がマトリックス内の形態で含まれている浸食システム（erosional system）であり、例えば米国特許第4,452,775号、第4,675,189号および第5,736,152号に記載されているものなど、および（ｂ）活性成分が制御された速度でポリマーから浸透する拡散システムであり、例えば米国特許第3,854,480号、第5,133,974号および第5,407,686号に記載されているものなど。さらに、ポンプベースのハードウェア送達システムも用いることができ、これらの一部は、移植用に適合されている。
長期持続放出インプラントの使用は、慢性疾患の治療のために特に適する可能性がある。本明細書において長期的放出とは、インプラントが、活性成分の治療レベルを少なくとも３０日間、好ましくは６０日間、送達するように構成および配置されていることを意味する。長期持続放出インプラントは当業者に周知であり、上記の放出システムのいくつかを含む。
【００９５】
カドヘリン１１レベルの検出およびカドヘリン１１レベルの測定：
本明細書で論じるように、本発明は、対象が線維症を有するか（線維症の診断をもたらす）、または対象が線維症を発症する可能性があるか（線維症の予後診断をもたらす）を決定するために、対象の組織または細胞におけるカドヘリン１１レベルを検出することを意図する。また、上述のように、診断や予後診断には、線維症と同時期の症状、家族歴、または患者の病歴（線維症に寄与するか、これを引き起こすことが知られている病因に関する情報を含む）などのその他の要因も考慮することができる。
【００９６】
カドヘリン１１レベルの検出には、カドヘリン１１ゲノムＤＮＡレベル、ｍＲＮＡレベル、ｍｉＲＮＡレベル、および／またはタンパク質レベルの検出が関与することができる。前述のいずれかを検出するための方法は当分野で知られており、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、免疫組織化学、ＦＡＣＳ解析、ＥＬＩＳＡ法、サザン分析、ノーザン分析、ウェスタン分析、マイクロアレイ分析などを含む。線維症の診断および／または予後診断は、興味ある組織または細胞における異常に上昇したカドヘリン１１レベルの存在により示すことができる。異常に上昇したレベルとは、正常組織（または組織の部分）または非線維性の細胞におけるレベルよりも高いレベルとして定義される。したがって、カドヘリン１１のレベルが異常に上昇しているかどうかを判断するためには、一般に、正常な（非線維）組織（または組織の非線維性領域）におけるカドヘリン１１のレベル、あるいはカドヘリン１１の予め定められた正常なレベルと比較する。与えられた組織についてのカドヘリン１１の予め定められた正常なレベルは、人口調査や他の歴史的なデータに基づいて利用可能であり得る。したがって、比較は、厳密に対象における組織または細胞に対して行う必要はない。
【００９７】
対象におけるカドヘリン１１レベルは、通常、対象から収集した試料から決定される。試料の性質は、通常、存在もしくは発症が疑われるか、または存在することが知られている線維症の種類によって異なる。例えば、線維症が皮膚の線維症である場合、試料は皮膚試料であってよい。皮膚の「パンチ」の試料は、当分野で慣用である。別の例として、線維症が肺線維症である場合は、試料は例えば、肺生検、切除された肺組織であるか、または気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）試料であってもよい。本発明は、とりわけ、肺線維症を有する対象において、カドヘリン１１発現細胞が、どちらもＢＡＬ試料中で得られる肺胞マクロファージおよび肺胞上皮細胞を含むという、予想外の発見を提供する。かかる試料の収集は当分野で知られている。
【００９８】
カドヘリン１１の異常に上昇したレベルは、正常対照試料におけるレベルよりも約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％高い。カドヘリン１１レベルが上昇する程度は、疾患の程度を示し得て、例えば低い上昇レベルは疾患の発症を、一方より高い上昇レベルは疾患の確立を示し得る。
当業者には容易に明らかであるように、カドヘリン１１は、本明細書に記載されたカドヘリン１１アンタゴニストを用いて、検出および測定可能であることが理解されるべきである。
以下の実施例は例示の目的のために含まれており、本発明の範囲を限定することを意図しない。
例
【００９９】
例１
カドヘリン１１レベルが、肺線維症の過程で上方制御されているかどうかを調べるために、ブレオマイシン誘発性の肺線維症モデルを用いた。野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）に、気管内経路を介して生理食塩水（対照）またはブレオマイシンのどちらかを投与した。ブレオマイシンまたは生理食塩水投与の１２日後、マウスを人道的に殺処理し、肺を組織学およびウェスタンブロット分析のために処理して、このマウスモデルにおいてカドヘリン１１が肺線維症の間に増加しているかどうかを決定した。タンパク質溶解物を電気泳動により１０％アクリルアミドゲル上で分離し、その後アイソタイプ対照抗体、抗カドヘリン１１抗体（Invitrogen）または抗ＧＡＰＤＨ抗体を用いたウェスタンブロッティング用の膜上に移した。野生型およびカドヘリン１１ヌルの線維芽細胞様滑膜細胞を、カドヘリン１１発現の陽性および陰性対照として使用した。ブレオマイシン肺ではカドヘリン１１レベルは増加していたが、ＧＡＰＤＨレベルは同じであった（図１）。これらのデータは、カドヘリン１１が肺線維症の過程で増加したことを示している。
【０１００】
カドヘリン１１染色の細胞内局在を決定するために、組織を組織学的分析のために処理し、カドヘリン１１に対するウサギポリクローナル抗体またはアイソタイプ対照で染色した。図２に示すように、気管内にブレオマイシンを投与したマウスの肺の切片は、線維化病巣を形成している領域における線維芽細胞様細胞にカドヘリン１１の顕著な染色を示した（赤い染色）。生理食塩水を投与した肺の切片では、これらの領域にカドヘリン１１染色はみられない。
これらのデータは共に、カドヘリン１１レベルが、ブレオマイシン誘発性肺線維症モデルにおいて線維化肺の中で早期に（１２日目）増加することを実証し、カドヘリン１１が線維症の発症に関与しており、治療標的として役立ち得ることを強く示唆する。
【０１０１】
例２
この例では、カドヘリン１１レベルが、強皮症患者からの皮膚生検材料および特発性肺線維症患者からの肺において増加していることを示す。遺伝的にカドヘリン１１を欠くマウスおよび、皮膚および肺線維症のマウスモデルを用いて、我々はまた、カドヘリン１１が、皮膚および肺の線維症の重要なメディエーターであることを実証する。これらのデータは、カドヘリン１１が皮膚線維症および肺線維症の治療標的であることを示す。
【０１０２】
方法：
ヒト対象．ＲＮＡの単離のために、臨床的に関連のない皮膚の皮膚生検標本を、ＳＳｃ患者および自己免疫疾患の既往のない対照患者から得た。全てのＳＳｃ患者は、ＳＳｃについてのAmerican College of Rheumatologyの基準を満たしていた１６。免疫組織学的研究のための皮膚生検材料は、National Disease Research Interchangeより、４人の強皮症対象および４人の強皮症のない対象からの、パラフィン包埋した皮膚生検材料として得た。
外科的肺生検組織試料は、Lung Tissue Research Consortiumから入手した。患者は、スパイロメトリー、病理検査および高分解能ＣＴスキャンに従って、軽症ＩＰＦを有するものと重症ＩＰＦを有するものに分類した。気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液は、ＩＰＦまたは線維化肺疾患を有する患者の評価におけるルーチンの臨床目的のために取得した、廃棄ＢＡＬから得た。研究は、テキサス大学ヒューストン健康科学センター（University of Texas Health Science Center at Houston）の被験者の保護のための委員会（Committee for the Protection of Human Subjects）により承認された。
【０１０３】
マウス．６〜１０週齢の雌マウスをこれらの研究に使用した。カドヘリン１１ヌルマウスおよび対照のＢ６：１２９Ｆ１交雑マウスは、テキサス大学ヒューストン健康科学センターの動物飼育施設内で維持された１７。Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスは、Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME)で飼育された。全ての動物プロトコルは、テキサス大学ヒューストン健康科学センターの動物のケアおよび使用委員会（Animal Care and Use Committee）によって承認された。
ブレオマイシン皮膚線維症モデルマウス．６〜１０週齢の雌マウスをこれらの実験に使用した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Teva Parenteral Medicines, Irvine, CA）に溶解した、マウス当たり０．０２ｕのフィルター滅菌したブレオマイシンまたはＰＢＳを、２７ゲージの針を用いてマウスの剃毛した背中に皮下注射により毎日、２８日間投与した。実験の終了時に、マウスを人道的に殺処理し、皮膚病変部を分析のために処理した。
【０１０４】
ブレオマイシン肺線維症モデル．８〜１０週齢の雌マウスをこれらの実験に使用した。マウスは、アバチン（avertin）（２５０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）で麻酔し、５０μｌの無菌生理食塩水に希釈した３．５Ｕ／ｋｇのブレオマイシン（Teva Parenteral Medicines, Irvine, CA)）または生理食塩水のみを、気管内注入した。２１日目にマウスを人道的に殺処理し、分析用に肺を採取した。肺の採取の前に、気管支肺胞洗浄液を、０．４ｍｌのＰＢＳの３回の洗浄液を用いて取得した。 肺は次に、１０％緩衝ホルマリンを２５ｃｍの圧力で注入し、４℃で一晩固定した。
【０１０５】
免疫組織化学．皮膚生検材料は、National Disease Research Interchange (Philadelphia, PA)からの、４人のＳＳｃ患者および自己免疫疾患の既往歴のない４人の正常対象から得た。５μｍの切片は脱パラフィン化し、再水和し、ＴＢＳ−Ｔ緩衝液（トリス緩衝生理食塩水および０．１％Tween 20）中に浸漬し、標的賦活化溶液（target retrieval solution）（DAKO, Carpinteria, CA）で、９５℃で１０分間処理した。カドヘリン１１に対するウサギポリクローナル一次抗体（Invitrogen Inc）またはアイソタイプが一致した対照抗体（Abcam Inc., Cambridge, MA）を使用した。結合した抗体は、Dako Cytomation Envision System-HRPからの二次抗体(３，３−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド)を用いて検出した。切片をヘマトキシリンで対比染色した。
【０１０６】
ＲＮＡ単離および定量的リアルタイムＰＣＲ．RNALater（Qiagen, Valencia, CA）中に凍結させた組織生検材料を、ＲＮＡ単離のために用いた。ＲＮＡを、RNeasy Fibrous Tissue Mini Kitを用い、取扱説明書に従って（Qiagen, Valencia, CA）単離した。ＲＮＡ濃度および純度を、ナノドロップ法を用いて決定した。１μｇの全ＲＮＡを用いて、Quantitect逆転写キットを用い、取扱説明書に従って（Qiagen, Valencia, CA）、ｃＤＮＡを合成した。定量的リアルタイムＰＣＲ（ＱＲＴ−ＰＣＲ）を、興味ある特定遺伝子用に検証されたTaqMan Gene Expression Assaysを用いて実施し、シクロフィリン（Applied Biosystems Inc）に対して、Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems Inc)上で正規化した。シクロフィリンは、各試料の全ＲＮＡ転写レベルを正規化する内因性対照として用いた。データは比較ＣＴ法（２−ｄｄＣＴ法）を用いるSDS2.3ソフトウェアを用いて分析した。倍率変化は２ｄｄＣＴとして算出した。
【０１０７】
カドヘリン１１ｓｉＲＮＡノックダウン．Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ）を９６ウェルプレートに播種し、１０％ＦＢＳおよび１％抗生物質を含有するＤＭＥＭで一晩増殖させた。 Ｃｄｈ１１のｓｉＲＮＡノックダウンのために、細胞を抗生物質フリー培地で洗浄し、続いてOptimem (Invitrogen)とLipofectamine RNAiMax (Invitrogen)を、非標的ｓｉＲＮＡまたはヒトＣｄｈ１１ ｓｉＲＮＡ（アンチセンス配列：5'-UUUGAAUGGAGUCAUAAGGUU）（配列番号４）（Dharmacon RNAi Techynologies, Thermo）のどちらかと共に用いて、４８時間インキュベートした。次に、細胞をトリプシン処理し、抗生物質を含まない培地に再度播種した。６時間後、細胞を、０．１％ＢＳＡを含有するＤＭＥＭで一晩血清飢餓状態に置いた。次いで細胞を、ＤＭＥＭ＋０．１％ＢＳＡ中の１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β有または無で、２４時間刺激した。ＲＮＡは、Cell to Ct reagents (Ambion)を用い、取扱説明書に従って単離した。 ＣＤＨ１１、ＣＯＬ１Ａ１、Ｎカドヘリン（Ｃｄｈ２）、およびＥカドヘリン（Ｃｄｈ１）の転写物は、対応するTaqmanプローブ（Applied Biosystems）を用いて得、対照に対する平均倍率変化として提示した。Ａ５４９細胞のイメージングは、細胞の形態を決定するためのBX60倒立位相差顕微鏡（Olympus）を用いて行った。
【０１０８】
結果：
強皮症の皮膚におけるカドヘリン１１の上方制御．カドヘリン１１が、強皮症患者からの皮膚生検材料中で、健常対照に比べて高レベルで発現されたかどうかを判断するために、ＲＮＡを、６人の強皮症患者および９人の健常対照の上腕部の３ｍｍの皮膚生検材料から単離した。カドヘリン１１および２つの線維症関連遺伝子（Ｃｏｌ１ａ１およびＣＴＧＦ）の発現レベルを、定量的リアルタイムＰＣＲを用いて決定した。予想されたように、強皮症生検材料は、健常対照生検材料に比べて高いレベルのＣｏｌ１ａ１およびＣＴＧＦを有していた。（図３参照）。我々の仮説と一致して、カドヘリン１１の発現レベルもまた、強皮症皮膚生検材料で健常対照より上昇した。これらのデータは、カドヘリン１１の発現が強皮症患者からの皮膚において増加することを実証する。
【０１０９】
これらのデータは、皮膚生検材料を、免疫組織学的研究においてカドヘリン１１に特異的な抗体を用いて染色することにより、拡張および確認された。（図４参照）。図４に見られるように、健常対照者からの皮膚生検材料の染色は、正常な皮膚の真皮における線維芽細胞に、いかなるカドヘリン１１染色も示さなかった（図４Ａ：正常な皮膚の低倍率、図４Ｂ：正常な皮膚の高倍率）。これとは対照的に、カドヘリン１１発現は、強皮症の患者から得た皮膚の真皮にある線維芽細胞において認められた（赤褐色）（図４Ｃ：強皮症の皮膚の低倍率、図４Ｄ、Ｅ：強皮症の皮膚の高倍率）。これらのデータは共に、カドヘリン１１の発現が、健常対照皮膚と比べて、強皮症の皮膚で増加し、発現は、強皮症生検材料の皮膚線維芽細胞に顕著に局在していることを実証する。
【０１１０】
カドヘリン１１欠損マウスは皮膚線維症の発症が少ない．強皮症の皮膚におけるカドヘリン１１の発現の増加を考え、我々は次に、カドヘリン１１が皮膚線維症の発症に重要な役割を果たしているかどうかの確認を試みた。ブレオマイシン誘発性皮膚線維症モデルは、皮膚線維症の広く受け入れられているモデルであり、皮膚線維症と強皮症の病因についての我々の理解を促進するために用いられてきた。カドヘリン１１欠損マウスは、Brigham and Women’s Hospital (laboratory of Michael Brenner)からの許可と共に得た。これらのマウスに、上の方法の節で記述したように、ブレオマイシンまたはＰＢＳを２８日間皮下注射した。２８日目にマウスを人道的に殺処理し、皮膚は組織学的研究と量的研究用に処理して、皮膚線維症と細胞外マトリックスの沈着の程度を決定した。図５に見られるように、ブレオマイシンを２８日間注射した野生型マウス（Ｗｔ）（図５Ｃ）は、ＰＢＳを注射したＷｔマウス（図５Ａ）と比較して、真皮層の厚さ（矢印）の増加を有した。興味深いことに、ブレオマイシンを注射したカドヘリン１１（ｃａｄ−１１ＫＯ）マウス（図５Ｄ）は、ブレオマイシンを注射したＰＢＳ注射野生型マウスと比較して、Ｉ真皮の厚さの低減された増加を有した。これらのデータを図６Ａに、皮膚生検材料当たり５つのランダムな領域の皮膚厚さを測定することにより定量化した。組織学的な写真と同様に、これらのデータは、ブレオマイシンを２８日間毎日注射した場合に、カドヘリン１１欠損マウスはＷｔマウスに比べて、皮膚線維症の発症が少ないことを実証する。最後に、違いをさらに定量化するために、皮膚線維症の重要な細胞外マトリックス成分であるコラーゲンの量を、Sircolアッセイを用いて定量した。図６Ｂに見られるように、ブレオマイシン注射は野生型マウスにおいてコラーゲンの量を増加させ、カドヘリン１１欠損マウスでは、ブレオマイシンの皮膚への注射による皮膚のコラーゲン含量の増加の著しい減少が示された。これらのデータは、カドヘリン１１が、皮膚線維症の発症のために皮膚で発現される重要な分子であることを実証する。
【０１１１】
図３〜６のデータは共に、カドヘリン１１の発現が強皮症患者の皮膚で増加し、カドヘリン１１が強皮症マウスモデルにおける皮膚線維症の重要なメディエーターであることを実証する。これらのデータは、カドヘリン１１が皮膚線維症および強皮症における治療標的であることを強く主張する。
【０１１２】
肺線維症．間質性肺疾患の患者の肺におけるカドヘリン１１の発現および局在。カドヘリン１１の発現が、肺線維症患者の肺においても、強皮症患者の皮膚におけるのと同様に増加しているかどうかを決定するため、カドヘリン１１のｍＲＮＡレベルを、重度の気道制限を有する特発性肺線維症（ＩＰＦ）患者の肺から単離した全ＲＮＡと、正常な肺機能のＩＰＦ患者（軽症ＩＰＦの肺は「対照」として用いた）で比較した。図７に見られるように、重症ＩＰＦ患者からの肺組織は、線維性細胞外マトリックスの主要成分であるＩ型コラーゲン（Ｃｏｌ１ａ１）のレベルの増加を有した。我々の仮説と一致して、重症ＩＰＦ患者の肺組織では、カドヘリン１１のレベルが上昇していた。
【０１１３】
ウサギポリクローナル抗カドヘリン１１抗体を用いて免疫学的局在決定を実施し、ＩＰＦ患者の肺においてカドヘリン１１を発現する細胞型を決定した。軽症ＩＰＦ患者（図８Ａ）は、肺胞マクロファージにのみ、カドヘリン１１の発現を示した。重症ＩＰＦ患者で同定されたカドヘリン１１を発現する細胞型は、肺胞マクロファージであったが（図８Ｃ）、線維化病巣に隣接する過形成性肺胞上皮細胞（ＡＥＣ）上でも、非常に顕著な発現があった（図８Ｂ）。図７および８からのデータは共に、カドヘリン１１の発現と疾患の重症度との関連を示し、罹患した患者の肺の過形成ＡＥＣおよび肺胞マクロファージの両方で、カドヘリン１１が発現していることを示す。
【０１１４】
肺線維症のブレオマイシン誘発性マウスモデルにおけるカドヘリン１１の発現．気管内ブレオマイシンモデルは、肺線維症および特発性肺線維症のメカニズムを研究するために一般的に利用されている動物モデルである。このモデルにおけるカドヘリン１１の役割を調べるために、初期の特徴付けを、気管内に生理食塩水またはブレオマイシンを与えられた野生型マウスにおける、カドヘリン１１の免疫局在化を用いて行った。ブレオマイシンを与えられたマウスの肺に対する免疫組織化学により、ＩＰＦのヒト対象と同様に、過形成ＡＥＣおよび肺胞マクロファージにおいて、顕著なカドヘリン１１の発現が示される（図９）。これらの結果は、このマウスモデルとヒトとの間の類似性を実証し、カドヘリン１１依存性の線維症のメカニズムに対処する場合におけるこれらの細胞型の分析を支持する。
【０１１５】
カドヘリン１１の肺線維症に対する寄与．重症ＩＰＦの肺およびブレオマイシン肺線維症モデルにおけるカドヘリン１１の発現の増加を考慮し、我々は次に、カドヘリン１１が、肺線維症の発症に関与するかどうかの決定を試みた。カドヘリン１１の肺線維症への寄与を調べるために、気管内ブレオマイシンをカドヘリン１１欠損マウス（Ｃｄｈ１１-/-）に投与し、ブレオマイシン投与した野生型マウスと比較した。全てのエンドポイントは、ブレオマイシンまたは生理食塩水の導入の２１日後に評価した。Ｈ＆Ｅ染色の結果は、生理食塩水を与えた野生型（ＷＴ）とＣｄｈ１１-/-マウスの間の肺胞組織学に検出可能な差を示さない（図１０ＡおよびＢ）。ブレオマイシンを与えた野生型（ＷＴ）マウスからの肺切片の試験は、炎症、線維化病巣と正常な肺胞構造の破壊を含む、肺線維症に整合する標準的な組織病理的特徴を示す（図１０Ｃ）。これらの組織学的エンドポイントは、Ｃｄｈ１１-/-マウスにおいて実質的に低減される（図１０Ｄ）。
【０１１６】
組織切片のマッソントリクローム染色（マトリックスは青色に、細胞は赤色に染色）は、ブレオマイシンを投与した野生型マウスにおけるコラーゲン沈着の増加を実証し、これは、ブレオマイシンを投与したＣｄｈ１１-/-マウスでは減少される（図１１Ａおよび１１Ｂ）。筋線維芽細胞のマーカーであるα平滑筋アクチンについてのＩＨＣ分析も行った。筋線維芽細胞は、炎症性サイトカインや細胞外マトリックスを作り出す線維症の病因における、重要な細胞メディエーターである。ブレオマイシンを投与した野生型マウスは、α平滑筋アクチン染色細胞の数が増加し（図１１Ｃ）、一方Ｃｄｈ１１-/-マウスのα平滑筋アクチン染色細胞の数は、野生型マウスと比べて大幅に減少していた（図１１Ｄ）。図１１のデータは、カドヘリン１１がこのマウスモデルにおける肺線維症の重要なメディエーターであるとの仮説を支持する。
【０１１７】
気管内ブレオマイシンを投与したＣｄｈ１１-/-マウスにおける、肺線維症の減弱をさらに定量化するために、生理食塩水またはブレオマイシンを投与した野生型およびＣｄｈ１１-/-マウスからの気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液において、Sircolアッセイを用いてコラーゲンレベルを決定した。図１２Ａに見られるように、気管内ブレオマイシンは、野生型マウスのＢＡＬ液中のコラーゲン量を著しく増加させた。これとは対照的に、ブレオマイシンを投与したＣｄｈ１１-/-マウスからのＢＡＬ液は、野生型マウスと比較して、統計的に有意なコラーゲン含有量の減少があった。最後に、我々は、モデル内の肺のＨ＆Ｅ染色切片で肺線維症の量を定量するために一般的に使用されるスコアリング法である、アシュクロフトのスコアを用いた。図１２Ｂに示すように、気管内ブレオマイシンを投与した野生型マウスからの肺は、ブレオマイシンを投与したＣｄｈ１１-/-マウスからの肺と比べて、有意に高いスコアを有した。図１０〜１２のデータは共に、カドヘリン１１が肺線維症の重要なメディエーターであることを示す。ヒトＩＰＦの肺におけるカドヘリン１１レベルの増加を考えると、これらのデータは、カドヘリン１１が肺線維症の治療標的であることを示唆する。
【０１１８】
ＣＤＨ１１遮断抗体の全身送達は、確立された肺線維症を改善する．図１０〜１２に示すデータは、Ｃｄｈ１１-/-マウスが、ブレオマイシン誘発性線維症モデルにおいて減弱した肺線維化応答を有することを明らかに示す。野生型とＣｄｈ１１-/-マウスの肺において肉眼的に組織学的な違いはないが、カドヘリン１１の遮断が、肺線維症も低減させるかどうかを判断することは重要である。さらに、カドヘリン１１の遮断が、Ｃｄｈ１１-/-マウスの研究で示唆されたように、線維症の発症を予防するのみでなく、肺線維症の処置にも有効であるかを決定することも興味深い。ブレオマイシンモデルにおいて、肺線維症はブレオマイシン導入の少なくとも７日後に確立される（A. Moeller et al., Int Journal of Biochem and Cell Biol. 2008）。したがって、確立された線維症を有するマウスが、カドヘリン１１を標的とすることにより成功して治療可能かどうかを判断するために、野生型マウスに対して、２種の全身的カドヘリン１１遮断抗体（クローン２３Ｃ６または１３Ｃ２）のいずれかを、ブレオマイシン導入の１０日後に開始して投与した。
【０１１９】
野生型マウスに、ブレオマイシンを気管内投与した。１０日目、線維症がすでに確立されている時点で、マウスに対して、５００μｇの２３Ｃ６、１３Ｃ２またはアイソタイプ対照抗体のいずれかを腹腔内経路を介して投与し、続いて１００μｇの抗体をＩＰで２１日目まで１日おきに投与した。マウスを殺処理し、肺を組織学用として処理した。Ｈ＆Ｅで染色した肺切片（図１３）は、ブレオマイシンおよびアイソタイプ抗体を投与した野生型マウスが肺線維症を発症し、これは、ブレオマイシンを投与し、続いて１０日目から２３Ｃ６または１３Ｃ２をＩＰで投与した野生型マウスにおいては、顕著に減弱したことを実証している。
【０１２０】
これらの実験の追加の分析により、２３Ｃ６および１３Ｃ２の、ブレオマイシンモデルにおける既存の肺線維症を処置する能力を確認した。図１４に示すように、マッソントリクローム染色された肺切片は、ブレオマイシンおよびアイソタイプ抗体を投与した野生型マウスの肺では、細胞外マトリックスの顕著な沈着増加を生じ、これは、ブレオマイシンに続いて１０日目から１３Ｃ２または２３Ｃ６をＩＰで投与した野生型マウスにおいては、顕著に減弱したことを実証した。さらに、筋線維芽細胞のマーカーであるα平滑筋アクチンの染色により、抗カドヘリン１１モノクローナル抗体、２３Ｃ６および１３Ｃ２が、アイソタイプ対照抗体と比べて、気管内ブレオマイシンを投与したマウスの肺における筋線維芽細胞の数を効果的に減少させたことが実証された。最後に、１３Ｃ２または２３Ｃ６抗カドヘリン１１モノクローナル抗体で処置したマウスからのＢＡＬ液のSircolアッセイにより決定された可溶性コラーゲンのレベルは、アイソタイプ対照抗体を与えられたマウスと比べて顕著に低下した。これらの結果は、Ｃｄｈ１１-/-マウスにおける、ＣＤＨ１１が肺線維症に寄与するとの所見を確認し、ブレオマイシン誘発性線維症モデルにおいて、カドヘリン１１遮断抗体の全身への送達が、確立された肺線維症を成功裡に処置することを実証する。
【０１２１】
上皮間葉移行（ＥＭＴ）．ＥＭＴは線維症の病因に関与しており、ＴＧＦβは、この移行プロセスに役割を果たし得る。ＥＭＴの間、Ｅカドヘリンの発現が減少および／または排除されることが知られている。図１５は、ＴＧＦβが、肺上皮細胞株であるＡ５４９細胞におけるカドヘリン１１の発現を増加させることを示す。さらに、Ｃｏｌ１ａ１の発現が増加し、Ｅカドヘリンの発現が（予想通り）減少し、Ｎカドヘリンの発現も増加する。図１６および１７は、例えばカドヘリン１１特異的ｓｉＲＮＡを用いることで、カドヘリン１１の発現がＡ５４９細胞においてブロックされている場合、細胞をＴＧＦβで刺激すると、ＴＧＦβによるＣｏｌ１ａ１発現の上方制御が顕著に減少することを示す。さらに、位相差顕微鏡を用いると、ｓｉＲＮＡによるカドヘリン１１ノックダウンが、ＴＧＦβによって誘発される間葉表現型の発生を防止することは明らかである。ＴＧＦβの存在下では、Ａ５４９細胞は細胞と細胞の接触を失い、紡錘形となって広がる。ｓｉＲＮＡによるカドヘリン１１レベルの低下はこれらの表現型の変化を防ぎ、こうして、カドヘリン１１ｓｉＲＮＡがＥＭＴを遮断し、カドヘリン１１がＥＭＴに関与し、潜在的にＥＭＴに介在することを示唆する。図１８は、カドヘリン１１が、鍵となるＥＭＴ転写因子であるＳＮＡＩＬ２の、ＴＧＦβ誘発性の上方制御もまた遮断することを示す。
【０１２２】
参考文献
【表１】
0005911848.tif 000002
【０１２３】
【表２】
0005911848.tif 000003
【０１２４】
均等物
本明細書に本発明のいくつかの態様を記載し説明したが、当業者は容易に、本明細書に記載の機能を実行し、および／または結果および／または１もしくは２以上の利点を得るための、種々のその他の方法および／または構造を想起し、かかる変更および／または改変の各々は、本明細書に記載された発明の態様の範囲内であるとみなされる。より一般的には、当業者は容易に、本明細書に記載されたすべてのパラメータ、寸法、材料及び構成は例示を意図し、実際のパラメータ、寸法、材料、および／または構成は、本発明の教示が使用されている特定の１または２以上の用途に依存することを理解する。当業者は、慣用の実験以上のものを用いることなく、本明細書に記載された特定の発明の態様の多くの均等物を認識し、または確認することができる。したがって、前述の態様は例としてのみ提示されており、添付のクレームおよびその均等物の範囲内で、本発明の態様は、具体的に記載されクレームされたもの以外でも実施できることが理解されるべきである。本開示の発明の態様は、本明細書に記載された個々の特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法に向けられる。さらに、かかる特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法が互いに矛盾しない場合には、かかる特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法の２または３以上の任意の組み合わせも、本開示の発明の範囲内に含められる。
【０１２５】
本明細書で定義されて使用されるすべての定義は、辞書の定義、参照により組み込まれる文書中の定義、および／または定義された用語の通常の意味を支配すると理解されるべきである。
本明細書に開示された全ての参考文献、特許および特許出願は、それぞれが引用される主題に関して参照により援用され、いくつかの場合には文書全体を包含することができる。
明細書および特許請求の範囲において、本明細書中で使用される不定冠詞「a」および「an」は、明確に逆の指示がない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解すべきである。
【０１２６】
本明細書および特許請求の範囲で用いる用語「および／または」は、こうして連接された要素、すなわち、ある場合には接続的に存在し、他の場合には離接的に存在する要素の、「いずれかまたは両方」を意味すると理解されるべきである。「および／または」と共にリストされた複数の要素は、同様のやり方で、すなわち、１または２以上のかかる連接された要素として、解釈すべきである。「および／または」の節により具体的に同定された要素とは別のものも、具体的に同定されているものと関連するか関連しないかに関わらず、任意に存在してよい。したがって、非限定的例として、「含む」などのオープンエンドの用語と共に用いる場合に、「Ａおよび／またはＢ」の言及は、一態様においてＡのみであり（任意にＢ以外の要素を含む）；別の態様においてＢのみであり（任意にＡ以外の要素を含む）；さらに別の態様においては、ＡとＢの両方（任意に別の要素を含む）である；などである。
【０１２７】
明細書及び特許請求の範囲で用いる場合、「または」は、上記定義の「および／または」と同一の意味を有すると理解されるべきである。例えば、リスト内の項目を分離する場合、「または」または「および／または」は、包含的であると解釈すべきであり、すなわち、多数またはリストされた要素の、少なくとも１つを含むが、１つより多くもまた含み、および任意に、追加のリストされていない項目も含むと解釈される。明確に逆が指示されている用語のみが、例えば「ただ１つのみ」または「正確に１つ」、または特許請求の範囲で用いる場合は「〜からなる」が、多数またはリストされた要素のうち正確に１つの要素のみの包含を示す。本明細書において、一般に用語「または」は、その前に排他性の用語、例えば「いずれか」、「の１つ」、「１つのみ」、または「正確に１つ」などが先行する場合には、排他的な選択肢（すなわち、「両方ではなくどちらか一方」）としてのみ解釈されるべきである。特許請求の範囲で用いる場合の「本質的に〜からなる」は、特許法の分野で用いられる通常の意味を有するものとする。
【０１２８】
本明細書及び特許請求の範囲で用いる場合、フレーズ「少なくとも一つ」は、１または２以上の要素のリストを参照する場合、要素のリスト中の任意の１または２以上の要素から選択された少なくとも１つの要素を意味すると理解されるべきであり、必ずしも、要素リスト内に具体的にリストされた全ての要素の各々を少なくとも１つ含む必要はなく、要素リスト中の要素の任意の組み合わせを除外しない。この定義はまた、フレーズ「少なくとも一つ」が参照する要素リスト中に具体的に同定されている要素以外に、具体的に同定された要素と関連するか関連しないかに関わらず、要素が任意に存在することを許容する。しがたって、非限定的例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または等価に「ＡまたはＢの少なくとも１つ」、または等価に「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）とは、一態様において、少なくとも１つの、および任意に２つ以上のＡで、Ｂはなし（および任意にＢ以外の要素を含む）であり；別の態様において、少なくとも１つの、および任意に２つ以上のＢで、Ａはなし（および任意にＡ以外の要素を含む）であり；さらに別の態様においては、少なくとも１つの、および任意に２つ以上のＡと、少なくとも１つの、および任意に２つ以上のＢの両方（および任意に別の要素を含む）である；などである。
【０１２９】
明確に反対の指示がない限り、１より多くのステップまたは行為を含む、本明細書にクレームされた任意の方法において、該方法のステップまたは行為の順序は必ずしも、提唱された方法のステップまたは行為の順序に限定されないこともまた、理解されるべきである。
特許請求の範囲において、また上の明細書において、「含む（comprising）」、「含む（including）」、「所有する」、「有する」、「含有する」、「関与する」、「保持する」、「構成される」などのすべての移行句は、オープンエンドであること、すなわち、これらを含むがそれに限定されないことが、理解されるべきである。「からなる」および「本質的に〜からなる」の移行句のみが、米国特許庁のManual of Patent Examining Proceduresのセクション2111.03に定めるように、それぞれ閉じた移行句または半閉鎖移行句とされる。
【図１】
0005911848.tif 000004
【図２】
0005911848.tif 000005
【図３】
0005911848.tif 000006
【図４】
0005911848.tif 000007
【図５】
0005911848.tif 000008
【図６】
0005911848.tif 000009
【図７】
0005911848.tif 000010
【図８】
0005911848.tif 000011
【図９】
0005911848.tif 000012
【図１０】
0005911848.tif 000013
【図１１】
0005911848.tif 000014
【図１２】
0005911848.tif 000015
【図１３】
0005911848.tif 000016
【図１４】
0005911848.tif 000017
【図１５】
0005911848.tif 000018
【図１６ＡＢ】
0005911848.tif 000019
【図１６ＣＤ】
0005911848.tif 000020
【図１７】
0005911848.tif 000021
【図１８】
0005911848.tif 000022
【図１９】
0005911848.tif 000023
【図２０】
0005911848.tif 000024
【配列表】
0005911848000001.app