(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺高血圧症の治療および/または予防のためのカテプシンK阻害剤を含む医薬組成物。
【請求項２】
肺高血圧症の治療および/または予防のための、式(I)から(XV)の化合物を含む医薬組成物：
【表１】
0006000340.tif 000010
【表２】
0006000340.tif 000011
【表３】
0006000340.tif 000012
MIV 701 (X)、Ono 5334 (XI)、RO 4383315 (XII)、SAR-114137 (XIII)、MIV 710 (XIV)、またはMIV 711 (XV)。
【請求項３】
肺高血圧症の治療および/または予防のための、式 (I)の化合物：
【化１】
0006000340.tif 000013
またはそれらの塩、溶媒和物および塩の溶媒和物を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肺高血圧症および/または心不全の治療および/または予防のための方法におけるカテプシンKおよび/またはカテプシンS阻害剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
カテプシンプロテアーゼ
カテプシン(Cathepsin) (古代ギリシャ語では、 kataは、「down」であり、hepseinは、「boil」である; CTSと略される) はプロテアーゼであり：すべての動物におけるものを含む多くのタイプの細胞においてみられる、そのほかのタンパク質を分解するタンパク質である。このファミリーにはおよそ12のメンバーがあり、それらは、それらの構造、触媒メカニズム、およびそれらが切断するタンパク質によって区別される。ほとんどのメンバーはリソソームにおいてみられる低pHにて活性化される。したがって、このファミリーの活性はかかるオルガネラのなかにほとんど完全に存在する。カテプシンは、哺乳類の細胞代謝回転(turnover)、例えば、骨吸収において極めて重要な役割を有する。それらはポリペプチドを分解し、それらの基質特異性によって区別される。
【０００３】
2003年に公表されたヒトゲノムの完全な配列は、全部で11のシステインカテプシン (B、H、L、S、C、K、O、F、V、XおよびW)をコードしている。これらは、リソソームプロテアーゼとしても知られ、パパイン様プロテアーゼファミリーに属する。
【０００４】
カテプシンは以下に関与していると記載されている： 癌、脳卒中、アルツハイマー病、関節炎、エボラ、(カテプシン L および程度は低いがカテプシン B は、ウイルスが宿主細胞に侵入するために必要であることが判明している)、COPD 、慢性歯周炎、およびいくつかの眼疾患： 円錐角膜、網膜剥離、加齢性黄斑変性症、緑内障およびその他のもの。
【０００５】
カテプシン K (CTSK)
CTSKと略称される、カテプシン K (genbank 受入番号： NM_000396.3 (ポリヌクレオチド)およびNP_000387.1 (ポリペプチド))は、ヒトにおいてはCTSK遺伝子によってコードされる酵素である。この遺伝子によってコードされるタンパク質は、骨再形成および吸収に関与しているリソソームシステインプロテアーゼである。ペプチダーゼ C1 タンパク質ファミリーのメンバーであるこのタンパク質は、主に破骨細胞において発現している。
【０００６】
ヒトカテプシン K は、およそ 12.1 kbのゲノム DNAによってコードされ、染色体 1q21にマッピングされる。ゲノム DNA 配列の分析は、８つのエクソンおよび７つのイントロンがその遺伝子に位置することを示している。転写産物は、 1.7 kb長である。TATA/CAAT ボックスは、転写開始部位(start)の50末端(end)にはみられないが、２つのコンセンサス Sp1 結合部位および１つのGtCリッチ領域(rich GtC region) (42.5％)がプロモーター領域において潜在的調節要素として同定されている。プライマーエクステンション分析は、メチオニンの58 bp 上流に位置する転写開始部位を示している。転写の開始は、いくつかの以下の推定転写調節要素によって増進されている可能性がある： AP1、AP3、H-APF-1、PU.1、ETS-1、PEA3、Mitf、TFE3。カテプシン K は、分子量が38 kuの、329 アミノ酸(aa)を含有する、不活性プレ-プロ酵素として合成される。それは、15-アミノ酸のシグナル配列、99-アミノ酸プロペプチドおよび触媒部位の全体の構成(organization)を含む。触媒部位は、「V」-型活性部位裂け目配置を一緒になって与えるようフォールディングされた２つのドメインからなる。中央ヘリックスは、左側ドメインのもっとも顕著な特徴であり、一方、右側ドメインは主にb-バレルモチーフによって大部分が占められる。活性部位は、２つのドメインの間の接触面に存在する。プロペプチドは、マンノース 6-リン酸受容体経路を介して、不活性プロ酵素をリソソームへと標的化している可能性がある一つの保存された N-糖鎖付加部位を含有する。99 aaのプロペプチドは、Arg114とAla115との間で切断されて、215 アミノ酸の成熟形態となる[1]。システインカテプシンは厳密にはリソソームではなく、このプロテアーゼは、ファゴソーム、エンドソームおよびリソソームの間を輸送され、個々の酵素は、特定の生理学的環境下で特定のオルガネラ中に蓄積している可能性がある。システインカテプシンはまた、外因性酸化剤(活性酸素種)によってもたらされるリソソーム漏出(leakage)の後に細胞質へと放出される。
【０００７】
カテプシン Kは、骨吸収に関与する、キニンに対するその高い特異性によって規定されるプロテアーゼである。エラスチン、コラーゲン、およびゼラチンを異化するその酵素の能力により、それが骨および軟骨を分解することを可能とする。この異化活性はまた、部分的には、肺気腫における肺弾性および反動の喪失の原因である。カテプシン K 阻害剤、例えば、オダナカチブ(odanacatib)は、骨粗しょう症の治療において大きな潜在力を示す。カテプシン Kはまた、ヒト乳癌のかなりの割合において発現しており、そこではそれは、腫瘍侵襲性に寄与している可能性がある。この遺伝子における突然変異は、骨硬化症(osteosclerosis)および小人症によって特徴づけられる常染色体劣性疾患である、濃化異骨症の原因である。カテプシン K 発現は、組織傷害の後に放出される炎症性サイトカインによって刺激される。
【０００８】
CTSKの調節
破骨細胞分化の際に、骨芽細胞/間質細胞は、マクロファージ-コロニー-刺激因子 (M-CSF) およびNF-jB リガンドの受容体活性化因子(RANKL)を含み、前駆細胞の増殖および成熟破骨細胞への分化を誘導および調節するサイトカインを産生する。そのRANKLとの相互作用による細胞内 RANK シグナル伝達は、多数のシグナル伝達カスケード、例えば、MAPK、NF-jB、Src、およびAktの活性化を導く、細胞質腫瘍壊死因子受容体-関連因子(TRAF)の動員および活性化を誘導する。RANKLは、用量および時間依存的に、CTSK 発現およびプロモーター活性を刺激する可能性がある。骨芽細胞および間質細胞によるRANKLの産生を調節する多数の作用因子(agent)はまた、カテプシン Kの発現を調節している可能性がある。刺激因子には、ビタミン D、副甲状腺ホルモン、TNF-a、グルココルチコイド、IL-1、IL-11、甲状腺ホルモン、プロスタグランジン E2、リポ多糖、線維芽細胞増殖因子-2、ヒスタミン、インスリン様増殖因子-1、ヒスタミン、および無重力が含まれる。RANKL 発現の阻害剤には、エストロゲンおよび形質転換増殖因子- bが含まれる。RANKL は、多数の機構を介してカテプシン K遺伝子の転写を刺激しているようである。RANKL-媒介シグナル伝達における初期および近接(proximal)事象は、RANKLの同族(cognate) 受容体に対する重要なアダプター分子であるTRAF6 の活性化を伴う。TRAF6の過剰発現は、カテプシン K プロモーター活性を刺激し、カテプシン K プロモーター活性のRANKL 刺激は、ドミナントネガティブ TRAF6の過剰発現によって阻害される。RANKLによるカテプシン Kの活性化はまた、ドミナントネガティブ c-fosによって阻害されている可能性がある。JunB は単独で、定常(basal) カテプシン K プロモーター活性を刺激したが、一方、c-jun、JunDまたはc-fosはいずれも単独では刺激しなかった。しかしながら、これらのjun-ファミリーメンバーのいずれかと c-fos (AP-1)との共トランスフェクションは、カテプシン K プロモーター発現を顕著に上昇させた。c-junまたはjunBに対して標的化されたsiRNAは、RANKL-媒介カテプシン K 発現を抑制し、それゆえ、AP-1は、カテプシン K遺伝子発現の基底(basal)およびRANKL-媒介刺激を調節するのを助けている。シグナル伝達経路におけるより遠位では(distally)、RANKLは、 p38によるNFAT2のリン酸化を導くことができ、それにより、NFAT2の核への転座およびそれに続くヒトカテプシン K プロモーターのトランス活性化を誘導している。このNFAT2のリン酸化は、カルシニューリンが、核転座およびそれに続く一連の遺伝子のプロモーター活性化を導く、NFAT1とNFAT2との両方を脱リン酸化する、古典的パラダイムと対照的である。しかしながら、NFAT2の異なる部分の脱リン酸化とリン酸化との両方が、転座およびそれに続く転写のトランス活性化を誘導しうるということは可能である。細胞のRANKL 処理はまた、p38を介する小眼球症転写因子 (Mitf)のリン酸化を誘導する。Mitfは、ヒトカテプシン K プロモーターにおける三つのE-ボックスモチーフに結合することができた。培養破骨細胞における野生型 Mitfの過剰発現は、顕著にカテプシン K 発現を増進した。骨生理において活性のさらなる作用因子(agent)はまた、カテプシン K 発現、例えば、レチノイン酸、間欠的機械的伸長および細胞外マトリックスタンパク質 (I型コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、オステオポ��チン)を刺激することができた。破骨細胞分化および活性化の生理的阻害剤、例えば、OPG、IL-6、INF-cもまた、直接的にカテプシン K 発現を抑制することができる [1]。
【０００９】
ヒト CTSK 多型
破骨細胞機能におけるカテプシン Kの重要な役割は、最初に、この遺伝子における突然変異が濃化異骨症を引き起こすことができたという知見によって示唆された。ヒトの障害である濃化異骨症は、稀な、常染色体の、劣性の、カテプシン Kにおける突然変異に起因する骨障害である。現在のところ、本発明者らは、ヒトにおいて６つの異なる突然変異を同定している： (1) cDNA 位置 1095における A-G 変化(transition) (2) ヌクレオチド 541におけるG-C 変化(3) ヌクレオチドにおける C-T 変化(4) ヌクレオチド 935における C-T 変化 (5) ヌクレオチド 236におけるG-A 変化(6) ヌクレオチド 926におけるT-C 変化。これらの遺伝子における突然変異は、骨格系の代謝に影響を及ぼし、骨吸収および骨再形成における欠陥を引き起こす。臨床においては、濃化異骨症は、小人症、骨硬化症、肢端骨溶解症、脊椎分離症、泉門が開いている分離頭蓋縫合(separated cranial suture)、骨脆弱症、および下顎角の喪失によって特徴づけられる。カテプシン K 突然変異は、破骨細胞遺伝子、例えば、c-src または Atp6iと関連するそのほかの疾患においてみられるように、単純な大理石骨病ではなく、独特の濃化異骨症障害を引き起こす。カテプシン K 突然変異のこの特徴は、骨、卵巣、心臓、胎盤、肺、骨格筋、結腸および小腸を含む様々な組織におけるカテプシン K mRNAの検出とともに、カテプシン Kが、濃化異骨症の独特の表現型をもたらしうる、単なるマトリックスタンパク質分解を超えたそのほかの機能を構成しうることを示唆している[1]。
【００１０】
触媒メカニズム
カテプシン Kの触媒三残基(catalytic triad) (Cys25、His159、Asn175、パパイン番号付け)は、古典的には、２つのドメインを分離する裂け目に収容され(housed)、Cys25が、左側ドメインの長い、保存された、N-末端 a-へリックスに位置し、一方 His159はもう一方のドメインにおいて位置する。Cys25および His159は、His159との水素結合を介してAsn175によって安定化される、チオラートイミダゾリウム(thiolateeimidazolium) イオン対として存在すると考えられている。システインスルフヒドリル基は、部分的には、低い pKa (w3.7) の原因である。簡単に説明すると、チオラートアニオンが、基質結合のカルボニル炭素を攻撃して、それが切断されて4面体型中間体を形成する。この中間体はまず、オキシアニオンホール(oxyanion hole)によって安定化され、次いでアシル酵素へと変換されるとともに、プロトン化された脱離(leaving)アミンが放出される。水分子による求核攻撃の結果、第二の4面体型中間体が形成される。これは最終的には、分離して、遊離の酵素および基質の第二の部分 (R-COOH) を生成する[2]。
【００１１】
基質特異性
ほとんどのC1 システインカテプシンは、エンドペプチダーゼ (L、S、K、V、F)であるが、一方、カテプシン Xは、カルボキシペプチダーゼであり、カテプシンB、C および H は、エンドペプチダーゼ- およびエキソペプチダーゼ活性の両方を有する。システインカテプシンの基質-結合領域は、切ることができる結合の両側 (N-およびC-)における、ペプチド基質アミノ酸(PeP0)についての結合サブサイト(SeS0)の配置(arrangement)として規定され、それは、パパインのS4 から S30の7部位のストレッチを含む。多数の基質類似体阻害剤の結晶構造が入手可能であるため、その定義は改定および再規定されてきており、基質残基のサブサイトS2eS10への結合に限定しており、そこでは主鎖および側鎖原子の両方が関与している。しかしながら、最近の研究により、基質特異性を決定するためのカテプシン K 部位 S3の重要性が示された。一方、S2 結合部位は、真の深いポケットであり、他方の部位は、結合表面を提供する。さらに、S2およびS10 部位は特異性の主な決定因子であるが、S1は、基質のアフィニティーおよび効率的な触媒のために重要である。部位 S3におけるP3 残基の位置決めは、サブサイト S20におけるように、比較的広い領域にわたる側鎖接触によってのみ媒介される。カテプシンK、L、SおよびVは、部分的にはオーバーラップする特異性を有することにより、それらをインビボで識別することを困難としている。カテプシン Kは、 カテプシンL およびV (これらはともに、Phe を好み、疎水性残基を受容する)と異なり、脂肪族アミノ酸(Leu、Ile、Val)を有する部位を攻撃し、また、S2 サブサイトにおけるProを収容する。カテプシン Kは、それが P2 位置においてProを有する基質を切断することができるという点で、システインカテプシンのなかで稀であるが、カテプシン Kと類似のアミノ酸配列 (65％の相同性) および生化学的特性を有するコンゴトリパノソーマ(Trypanosoma congolense)からのシステインプロテアーゼであるコンゴパイン(congopain)も同様にそうであることが報告されている。カテプシン Kのもう一つの特徴は、P3 位置においてGlyを好むことである [2]。
【００１２】
組織および細胞分布
システインカテプシンは厳密にはリソソームではなく、これらプロテアーゼは、ファゴソーム、エンドソームおよびリソソームの間を輸送され、個々の酵素は、特定の生理学的環境下にて特定のオルガネラにおいて蓄積しうる。システインカテプシンはまた、外因性酸化剤 (活性酸素種) に起因するリソソーム漏出の後に細胞質へと放出される。単球由来マクロファージ、肺マクロファージおよび破骨細胞の細胞周囲のスペースの酸性化は、カテプシン Kの放出を増進して、細胞外タンパク質分解を促進する。
【化１】
0006000340.tif 000002
ポンプは、プロトンを細胞質から細胞外スペースへと移動させることにより、酸性細胞内スペースの産生に関与している可能性がある。免疫学的局在決定、インサイチュハイブリダイゼーションおよび蛍光顕微鏡研究により、カテプシン Kは、カテプシンB、L および Sと比較して、骨吸収窩に沿った破骨細胞がかなりより豊富であることが示された。カテプシン K mRNAは、骨、卵巣、心臓、胎盤、肺、骨格筋、結腸および小腸を含む様々な組織において検出された。高濃度のカテプシン Kが、破骨細胞、破骨細胞-様細胞(多核巨細胞)において、そしてまた、関節の軟骨の病的びらんに関与する、滑膜線維芽細胞および関節リウマチの(rheumatoid arthritic) 関節、および、肺や甲状腺などの器官系の類上皮細胞においても見出された。カテプシン Kはまた、大動脈平滑筋細胞において、マクロファージにおいて、気管支肺胞洗浄液においてもみられ、細胞外マトリックスの再構成のためにかなり重要でありうる、マクロファージによって分泌される[2]。
【００１３】
カテプシン S (CTSS)
CTSSとしても知られる、カテプシン Sは、ヒトにおいてはCTSS遺伝子 (遺伝子 ID： 1520)によってコードされるタンパク質である。この遺伝子によってコードされるタンパク質である、ペプチダーゼ C1 ファミリーのメンバーは、抗原性タンパク質のMHC クラス II 分子に提示されるペプチドへの分解に関与しうるリソソームシステインプロテアーゼである。コードされるタンパク質は、肺胞マクロファージにおいて広い pH 範囲にわたってエラスターゼとして機能することができる。選択的ポリアデニル化シグナルを利用する転写変異体が、この遺伝子のために存在する。カテプシン Sは、IV型星状細胞腫(多形性膠芽腫) の患者にとっての有意な予後因子であることが示されており、その阻害は、生存期間を平均(mean average)5 か月改善させることが示されている。これは、システイン酵素が、脳細胞外マトリックスを分解するそのほかのプロテアーゼとともにはもはや作用しえないからである。したがって腫瘍の蔓延が止められる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
CTSK 阻害剤
カテプシン K 阻害剤は、文献に広く記載され、これらに限定されないが、骨疾患の治療である。
【００１５】
WO 2004/007477には、代謝酵素(とりわけ、カテプシン K)のための阻害剤としての、とりわけ、心血管疾患の治療のための、アシルヒドラジノチオフェン誘導体が記載されている。WO 2006/076796は、カテプシン K 阻害剤が肥満および関連障害の治療のために有用でありうることに言及している。
【００１６】
選択的カテプシン K阻害剤である、オダナカチブ(Odanacatib)およびその骨粗しょう症の治療のための使用は、J. Bone Miner. Res.  25 (5)  937-947 (2010)に記載されている。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、肺高血圧症および心不全の治療および/または予防における、好ましくは選択的な、カテプシン K 阻害剤の使用、および、肺高血圧症および/または急性および/または慢性心不全の治療および/または予防におけるその使用に関する。
【００１８】
より具体的には、本発明は、肺高血圧症、心不全および/またはそれらの組み合わせの治療および/または予防における使用のための、式(I)から(XV) の化合物に関する。
【００１９】
【表１】
0006000340.tif 000003
【００２０】
【表２】
0006000340.tif 000004
【００２１】
【表３】
0006000340.tif 000005
【００２２】
MIV 701 (X)、Ono 5334 (XI)、RO 4383315 (XII)、SAR-114137 (XIII)、MIV 710 (XIV) またはMIV 711 (XV)。
【００２３】
好ましい態様において、本発明は、肺高血圧症および/または急性または慢性心不全の治療および/または予防のための方法における使用のための、式 (I)の化合物に関する：
【化２】
0006000340.tif 000006
オダナカチブ  (I)。
【００２４】
より好ましい態様において、本発明は、肺高血圧症の治療および/または予防のための方法における使用のための式 (I)の化合物に関する：
【化３】
0006000340.tif 000007
オダナカチブ  (I)。
【００２５】
置換パターンに応じて、式 (I)の化合物は立体異性体にて存在し得、それらは像および鏡像として挙動するか(エナンチオマー)、あるいは、像および鏡像として挙動しない(ジアステレオマー)。本発明は、エナンチオマーまたはジアステレオマーおよびそれらのそれぞれの混合物のいずれの使用にも関する。ジアステレオマーとまったく同様に、ラセミ体は、立体異性的に均一な構成成分へと公知の方法にて分離することができる。同様に、本発明はまた、式 (I)の化合物の他方の互変異性体およびそれらの塩の使用にも関する。
【００２６】
式 (I)の化合物の塩は、本発明による物質と、鉱酸、カルボン酸またはスルホン酸との生理的に許容される塩でありうる。特に好ましい塩は、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、トリフルオロ酢酸、酢酸、プロピオン酸、乳酸、酒石酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸または安息香酸との塩である。
【００２７】
本発明の化合物は、好ましくは、塩酸塩またはトリフルオロ酢酸塩として現れる。
【００２８】
言及しうる塩はまた、常套の塩基との塩であり、例えば、アルカリ金属塩 (例えば、ナトリウムまたはカリウム塩)、アルカリ土類金属塩 (例えば、カルシウムまたはマグネシウム塩) または、アンモニアまたは有機アミン、例えば、ジエチルアミン、トリエチルアミン、エチルジイソプロピルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、N-メチルモルホリン、ジヒドロアビエチルアミン(dihydroabietylamine)、1-エフェンアミン(ephenamine) またはメチルピぺリジンなど由来のアンモニウム塩、などである。
【００２９】
水和物または溶媒和物は、本発明によると、固体または液体状態において、水との水和または溶媒分子による配位により分子化合物または錯体(complex)を形成する式 (I)の化合物の形態として指定される。水和物の例は、セスキ水和物、一水和物、二水和物または三水和物である。同様に、本発明による化合物の塩の水和物または溶媒和物もまた好適である。
【００３０】
動物モデル
モルモットにおける低酸素状態(Hypoxia)-誘導性肺高血圧症 
慢性低酸素状態は、肺高血圧症のための文献に記載され、受け入れられた動物モデルであり、様々な種について記載されている (Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 297： L1013-L1032、2009; J Pharmacol Sci 107、8 - 14 (2008); Pharmacology ＆ Therapeutics 92 (2001) 1- 20)。急性低酸素状態は、肺動脈収縮を介して肺動脈圧を上昇させる。慢性低酸素状態は、血管構造変化および血液中のヘマトクリット値 (Hct)の上昇を介するより重篤な肺高血圧症を引き起こす。構造変化には、筋性肺動脈における内側肥大(medial thickening) および、以前には筋肉化していなかったか(non-muscularized)、または部分的には筋肉化していた(muscularized) 小動脈における新しい内側(medial) 平滑筋の出現が含まれる。この後者の現象は筋肉拡張(muscle extension)と称される。これらの変化は、血管平滑筋細胞または平滑筋前駆細胞、例えば、周皮細胞の肥大、過形成、および遠位遊走(distal migration) に起因する。Thompson et al.は、モルモットモデルにおいてこれらの効果 (右心室重量の上昇を含む)を示している(J. Appl. Physiol. 74(2)： 916-921、1993)。
【００３１】
イヌにおけるペーシング(Pacing)-誘導性心不全
イヌにおける高頻度(rapid) 心室ペーシングによって誘導される実験的心不全の結果、低心拍出量心筋症(cardiomyopathic) 状態となる。心筋再構成(remodeling)および室拡張(chamber dilatation) が起こり、上昇した壁張力に対抗する。これらの変化とともに、心室収縮性が低下する(depressed)。これらの変化は、ヒトおよび天然イヌ拡張型心筋症 (DCM)の両方において観察されるものに類似している。心筋症は、心室壁および乳頭筋全体にわたる筋細胞の進行性消失と関連している(Cardiovascular Research 49 (2001) 127-134)。
【００３２】
肺高血圧症モルモットモデルにおけるCTSK 阻害剤 (オダナカチブ) 
CTSK 阻害剤、オダナカチブ(Odanacatib)を、実施例セクションに記載されているように、肺高血圧症についてモルモットモデルにおいて試験した。体重およそ 250 gの雄のDunkin Hartley モルモットを無作為に３つの異なる処置群に分けた(n=7-8 動物/群; 対照 + プラセボ、低酸素状態 + プラセボ、低酸素状態 + オダナカチブ)。慢性低酸素状態への暴露のために、モルモットを、換気したチャンバー中で28 日間、常圧(normobaric) 低酸素状態 (10 ％ O2)下に維持した。対照動物は、室内空気中に維持した。餌および水は自由に与えた。モルモットは、0日目から28日目まで、浸透圧ミニポンプの植え込みによる持続注入を介して、オダナカチブまたはプラセボのいずれかを受け取った。28日目に、動物を放血させ、心臓を摘出した。心臓を切開し、左心室＋中隔(septum) 重量に対する右心室の比(RV/LV + S)を、右心室肥大の指標として算出した。右心室を、RNA 抽出および定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応のために、ドライアイス上で新鮮凍結した。4 週間の低酸素状態の後、RV/LV+S比は、0.28 ± 0.01 (平均 ± SEM、正常酸素圧(normoxic) 対照群)から 0.37 ± 0.01 (平均 ± SEM、低酸素プラセボ群)まで上昇した。オダナカチブによる処置は、著しくかつ驚くべきことに RV/LV+S比を0.30 ± 0.01 (平均 ± SEM)まで低下させた。結果を図24に示す。 対照：酸素正常状態下での、心臓右心室重量 vs中隔を含む左心室重量の比; プラセボ：低酸素状態下での、 心臓右心室重量 vs 中隔を含む左心室重量の比; オダナカチブ：低酸素状態下でのオダナカチブ(Odacatib) 処置の、心臓右心室重量 vs 中隔を含む左心室重量の比。有意な可能性は星印により示す。
【００３３】
動物の疾患状態を分析し、オダナカチブ処置の有効性を判定するために、マーカー遺伝子の発現を行った。ANPの発現は、低酸素状態に維持された動物からの心臓において上昇しており、一方、オダナカチブ処置は、著しく低下した低酸素状態下での発現 (プラセボ群との比較)を導く。結果を図25に示す。LTBP2の発現は、低酸素状態に維持された動物からの心臓において上昇しており、一方、オダナカチブ処置は、著しく低下した低酸素状態下での発現 (プラセボ群との比較)を導く。結果を図26に示す。CTSKの発現は、低酸素状態に維持された動物からの心臓において上昇しており、一方、オダナカチブ処置は、著しく低下した低酸素状態下での発現 (プラセボ群との比較)を導く。結果を図27に示す。ANP レベルの上昇と、心不全患者および動物モデルにおける病期との公知の相関関係により、CTSKの上昇した発現は、肺高血圧症と相互に関連があるようである。低酸素状態-誘導性肺高血圧症動物のオダナカチブによる処置は、プラセボ処置動物と比較して右心室重量の低下を導く。ここで、本発明者らは、オダナカチブおよびCTSK 阻害剤と本発明において示されたそのほかのものは、肺高血圧症の治療のために有用であることを示す。
【００３４】
イヌにおけるペーシング-誘導性心不全におけるCTSK 発現
ペーシング-誘導性心不全イヌからの心臓サンプルにおけるCTSKの発現を、心不全におけるCTSKの関連性を分析するために行った。実験は実施例セクション (実施例動物モデルA-4) において記載されているようにして行った。
【００３５】
ANPおよびCTSKの発現分析を、左心房、右心房、左心室および右心室について実施例セクションに記載されているようにして行った。結果をCTSKの発現について図28に、ANPについて図29に示す。CTSK の発現は、ペーシングされた(paced) イヌの左心房、右心房、左心室および右心室において、ペーシングされていない(unpaced) イヌからの組織と比較して上昇している。ANPの発現は、ペーシングされた(paced)イヌからの右房および左房において、ペーシングされていない(unpaced)イヌからの組織と比較して上昇している。ANP レベルの上昇と、心不全患者および動物モデルの病期との公知の相関関係により、CTSKの 上昇した発現は、心不全と相互に関連があるようである。ここで、本発明者らは、CTSK 発現は心不全において上方制御されること、および、これらに限定されないがオダナカチブなどの阻害剤(本発明において示される)によるCTSKの阻害は、心不全の治療のために有用であることを示す。
【００３６】
適応症
急性低酸素状態は、強い肺動脈血管収縮を引き起こし、肺動脈圧を上昇させる [5]。このいわゆる Euler-Liljestrand 機構は、換気と肺血液循環 (かん流)との間の関係を説明し、低酸素肺血管収縮としても知られている [6]。慢性低酸素状態の結果、広範な血管再構成、肺高血圧症、および肺性心がもたらされる [7]。血管再構成プロセスは主に、肺動脈の遠位枝(distal braches) に影響を及ぼす： 血管平滑筋細胞(VSMC) と外膜線維芽細胞との両方が、これらの状況下で増殖する[8]。
【００３７】
肺高血圧症 (肺高血圧症の臨床的分類(Clinical Classification of Pulmonary Hypertension)、Dana Point 2008)は、様々な原因を有しうる進行性肺障害であり、治療されずにいると、死に至る。それは心力不全へと進行する右心不全を有する右心に対する過重負担と関連し、その結果、死に至りうる。定義によると、慢性肺高血圧症においては、平均肺動脈圧 (mPAP)が安静時で＞25 mmHgであり、運動時で＞30 mmHg (正常値 ＜20 mmHg)である。肺動脈血管収縮と肺血管の構造再構成との両方が、この疾患において上昇している肺動脈圧に寄与する病理過程の必須の(integral)特徴である。再構成は、筋肉新生(neomuscularization)、内側(medial)肥大および外膜肥厚によって特徴づけられる。この肺循環の増加する閉塞の結果、右心に対して進行性ストレスがもたらされ、右心による拍出量の低下を導き、最終的には、右心不全の転帰をとる。
【００３８】
特定できる原因がなく起こる、いわゆる突発性肺動脈高血圧 (PAH)は、極めてまれな障害であり、有病率は百万あたり1-2人である[3]。患者の平均年齢は、36歳であると見積もられており、患者の10％のみが60 歳を超える者であった。明らかに女性が男性よりもよく侵される。肺高血圧症の続発性型は、それらの基礎となっている原因の多様性と一致して、様々な経過を示すが、いずれの症例においても、それは死亡率の高い重篤な障害である。
【００３９】
肺高血圧症の治療におけるあらゆる前進にもかかわらず、この重篤な障害を治癒させる見込みはいまだに存在しない。肺高血圧症のための市場において入手可能な特定の治療(例えば、プロスタサイクリン類似体、エンドセリン受容体アンタゴニスト、ホスホジエステラーゼ阻害剤)は、しかしながら、患者の生活の質、運動耐容能および予後を改善することができる。しかしながら、これらの医薬の有用性は、いくつかの症例においては重篤な副作用および/または複雑な投与形態によって制限されている。患者の臨床的症状が特定の治療によって改善または安定化することができる期間は限定されている。最終的には、治療は段階的に増大し、したがって、複数の医薬を同時に与えなくてはならない、併用療法が適用される。新規な併用療法は、肺動脈高血圧の治療のためのもっとも有望な将来の治療選択肢の一つである[4]。新規な治療の開発において、それらが公知のものと組み合わせることができ、かつ、代謝と関連するなんらかの問題を生じないこと、例えば、非常にわずかな程度しか、あるいはまったくP450 CYP 酵素を阻害しないこと(ボセンタンとワルファリンとの併用療法と関連する医薬相互作用を比較されたい)、がますます重要になっている。
【００４０】
「肺高血圧症」という用語は、肺高血圧症の臨床的分類(Clinical Classification of Pulmonary Hypertension)、Dana Point 2008によって規定される肺高血圧症の特定の形態を含む。言及されうる例は、肺動脈高血圧、左心障害と関連する肺高血圧症、肺疾患および/または低酸素状態(hypoxia)と関連する肺高血圧症、慢性血栓塞栓症 (CTEPH)に起因する肺高血圧症および/または不明な多因子機構を伴う肺高血圧症である。
【００４１】
「肺動脈高血圧」は、突発性肺動脈高血圧 (IPAH、以前は、原発性肺高血圧症とも称された)、遺伝性肺動脈高血圧、薬物-および毒素-誘導性肺動脈高血圧および結合組織疾患、先天性心臓疾患、門脈圧亢進症、HIV 感染症、住血吸虫症、慢性溶血性貧血と関連する随伴性肺動脈高血圧 (APAH) を含み、これら障害には顕著に静脈/毛細血管が関与し、例えば、肺静脈閉塞疾患および肺毛細血管腫症、および/または新生児の持続性肺高血圧症が関与する。
【００４２】
左心障害と関連する肺高血圧症は、収縮機能障害、拡張機能障害および弁膜疾患を伴う障害を含む。肺疾患および/または低酸素状態(hypoxia)と関連する肺高血圧症は、慢性閉塞性肺障害、間質性肺疾患、拘束性および閉塞性の混合性パターンを伴うその他の肺疾患、睡眠時無呼吸症候群、肺胞低換気、慢性高山病および体質異常を含む。慢性血栓塞栓症 (CTEPH)に起因する肺高血圧症は、近位(proximal)肺動脈の血栓塞栓性閉塞、遠位(distal) 肺動脈の血栓塞栓性閉塞および/または非血栓性肺塞栓症 (腫瘍、寄生生物、異物)を含む。
【００４３】
不明な多因子機構を伴う肺高血圧症は、血液障害(骨髄増殖性疾患、脾臓摘出)、全身性障害 (サルコイドーシス、肺ランゲルハンス細胞組織球増殖症、リンパ脈管筋腫症、神経線維腫症、脈管炎)、代謝障害 (甲状腺障害、グリコーゲン貯蔵症、ゴーシェ病) および/または腫瘍性閉塞症、縦隔線維症(fibrosing mediastinitis)、透析を受けている慢性腎不全などのその他の障害を含む。
【００４４】
「心不全」という用語は、特定の形態の心不全を含む。言及されうる例は、急性非代償性心不全、右心不全、左心不全、両心室不全、虚血性心筋症、拡張型心筋症、肥大型心筋症、突発性心筋症、先天性心臓疾患、拡張期心不全、収縮期心不全、鬱血性心不全、および/または弁膜疾患、僧帽弁狭窄、僧帽弁閉鎖不全症、大動脈弁狭窄、大動脈弁閉鎖不全症、三尖弁狭窄、三尖弁閉鎖不全、肺弁狭窄、肺機能不全、連合弁膜症、心筋炎、急性心筋炎、慢性心筋炎、ウイルス性心筋炎、糖尿病(diabetis)、薬物乱用、例えば、アルコールおよびコカイン、医薬乱用、例えば、化学療法剤、結合組織疾患、HIV および蓄積症と関連する心不全である。 
【００４５】
併用療法
本発明はさらに、本発明による化合物および一以上のさらなる活性成分を含む、特に上記障害の治療および/または予防のための医薬に関する。好ましくは言及しうる好適な組み合わせ活性成分の例は以下である： 
・脂質異常症治療薬、特に HMG-CoA (3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル補酵素 A) レダクターゼ阻害剤;
・冠動脈治療薬/血管拡張剤、特に ACE (アンジオテンシン変換酵素) 阻害剤、AII (アンジオテンシン II) 受容体アンタゴニスト; □-アドレナリン受容体アンタゴニスト; アルファ-1 アドレナリン受容体アンタゴニスト; 利尿薬; カルシウムチャンネル遮断薬; エンドセリン受容体アンタゴニスト、鉱質コルチコイド-受容体アンタゴニスト、レンニン-阻害剤、rho-キナーゼ-阻害剤およびサイクリックグアノシン一リン酸 (cGMP)の上昇をもたらす物質、例えば、可溶性グアニル酸シクラーゼの刺激因子または活性化因子など;
・プラスミノーゲン活性化因子(血栓溶解剤/線維素溶解剤(fibrinolytic))および血栓溶解/線維素溶解を上昇させる化合物、例えば、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤の阻害剤(PAI 阻害剤)、トロンビン-活性化線維素溶解阻害剤の阻害剤(TAFI 阻害剤)および因子 Xa 阻害剤;
・抗凝固活性を有する物質 (抗凝固剤);
・血小板凝集-阻害性物質(血小板凝集阻害剤);
・フィブリノゲン受容体アンタゴニスト (糖タンパク質 IIb/IIIa アンタゴニスト);
・不整脈治療薬(antiarrhythmics); 
・キナーゼ阻害剤;
・可溶性グアニル酸シクラーゼの刺激因子および活性化因子;
・プロスタサイクリン類似体;
・エンドセリン受容体アンタゴニスト;
・エラスターゼ阻害剤
・およびホスホジエステラーゼ阻害剤
・マトリックスメタロプロテイナーゼ-阻害剤
・セロトニン-受容体アンタゴニスト
・利尿薬
・有機硝酸塩(nitrates)およびNO-ドナー
・陽性変力薬、例えば、ジギタリスグリコシド(digitales glycoside) (ジゴキシン)、ドーパミン、ドブタミンおよびドーパミン作動薬、ベータアドレナリン作動性アゴニスト、アドレナリン、ノルアドレナリン
・ナトリウム利尿ペプチド
・カルシウム増感剤、例えば、レボシメンダン
・CTSS 阻害剤
・気管支拡張剤、例えば、アルブテロール、メタプロテレノール、テルブタリン、サルメテロール、ホルモテロール、バンブテロール
・抗炎症薬、例えば、グルココルチコイド。
【００４６】
本発明はさらに、有効量の少なくとも一つの式(I)から(XV)の選択的カテプシン K阻害剤、または、不活性で非毒性の医薬上好適な賦形剤と組み合わせて少なくとも一つの選択的カテプシン K阻害剤を含む医薬を投与することによるヒトおよび動物における肺高血圧症の治療および/または予防のための方法に関する。
【００４７】
本発明はさらに、有効量の式 (I)の化合物、または、不活性で非毒性の医薬上好適な賦形剤と組み合わせて少なくとも一つの本発明の化合物を含む医薬の投与を介するヒトおよび動物における肺高血圧症の治療および/または予防のための方法に関する。
【００４８】
本発明による使用にしたがって製造されるか、または、本発明にしたがって使用される、医薬は、通常は一以上の不活性で非毒性の医薬上好適な賦形剤とともに少なくとも一つの本発明の化合物を含む。
【００４９】
本発明による化合物は、全身的および/または局所的に作用しうる。この目的のために、これらは、好適な方法、例えば、経口、非経口、肺、経鼻、舌下、舌(lingual)、口腔、直腸、皮膚(dermal)、経皮(transdermal)、結膜または耳経路などによって、あるいは、インプラントまたはステントなどとして投与されうる。
【００５０】
本発明による化合物は、これらの投与経路のために好適な投与形態において投与されうる。
【００５１】
経口投与のために好適なものは、従来技術にしたがって機能し、本発明による化合物を迅速におよび/または改変された様式にて送達し、かつ、本発明による化合物を結晶および/または非晶質 (amorphized)および/または溶解形態、例えば、錠剤 (非被覆または被覆錠、例えば、腸溶コーティングまたは不溶性または遅延して溶解し、本発明による化合物の放出を制御するコーティングを有するもの)、口内で迅速に崩壊する錠剤、またはフィルム/ウエハース、フィルム/凍結乾燥物、カプセル (例えば、ハードまたはソフトゼラチンカプセル)、糖-被覆錠、顆粒、ペレット、粉末、乳濁液、懸濁液、エアロゾルまたは溶液などにおいて含有する投与形態である。
【００５２】
非経口投与は、吸収工程を避けて(例えば、静脈内、動脈内、心臓内、髄腔内または腰椎内)、または吸収を含めて (例えば、筋肉内、皮下、皮内、経皮または腹腔内)、行うことができる。非経口投与のために好適な投与形態は、とりわけ、溶液、懸濁液、乳濁液、凍結乾燥物または無菌粉末の形態における注射および注入のための調製物である。
【００５３】
他方の投与経路のために好適なものは、例えば、吸入のための医薬形態 (とりわけ、粉末吸入器、噴霧器)、点鼻薬、溶液またはスプレー、錠剤、フィルム/ウエハースまたは舌(lingual)、舌下または口腔経路によって投与されるべきカプセル、坐薬、眼または耳用の調製物、膣用カプセル、水性懸濁液 (ローション、シェーキング混合物)、脂溶性懸濁液、軟膏、クリーム、経皮(transdermal) 治療システム(例えば、パッチ)、乳液、ペースト、フォーム、散布剤、インプラントまたはステントである。
【００５４】
より好ましい態様において、本発明は、肺動脈高血圧、左心障害と関連する肺高血圧症、肺疾患および/または低酸素状態(hypoxia)と関連する肺高血圧症、および慢性血栓塞栓症 (CTEPH)に起因する肺高血圧症からなる疾患の群に含まれる疾患の治療および/または予防のための方法における使用のための上記化合物または医薬組成物/医薬に関する。さらにより好ましい態様は、肺動脈高血圧の治療および/または予防のための方法におけるかかる使用である。
【００５５】
より好ましい態様において、本発明は、慢性心不全の治療および/または予防のための方法における使用のための上記化合物または医薬組成物/医薬に関する。
【００５６】
より好ましい態様において、本発明は、拡張型心筋症の治療および/または予防のための方法における使用のための上記化合物または医薬組成物/医薬に関する。
【００５７】
診断
別の態様において、CTSKに特異的に結合する抗体を、肺高血圧症または心不全の診断のために、あるいは、CTSK 阻害剤によって治療すべき患者を監視するためのアッセイにおいて、使用することができる。診断目的のために有用な抗体は、治療について上記に記載されているものと同様にして調製することができる。CTSKのための診断アッセイは、ヒト体液における、または細胞または組織の抽出物における、好ましくは心臓組織における、より好ましくは心室 (左および/または右)における、およびさらにより好ましくは右心室における、CTSKを検出するための抗体および標識を使用する方法を含む。抗体は、修飾をして使用しても修飾せずに使用してもよく、レポーター分子との共有結合または非共有結合によって標識してもよい。
【００５８】
ELISA、RIA、およびFACS を含む、CTSKを測定するための様々なプロトコールが、当該技術分野において公知であり、変化したかまたは異常なレベルのCTSK 発現を診断するための基礎を提供する。CTSK 発現のための正常または標準値は、正常哺乳類対象、好ましくはヒトから採取した体液または細胞抽出物と、CTSKに対する抗体とを、複合体形成のために好適な条件下で一緒にすることによって確立される。標準複合体形成の量は、様々な方法により、好ましくは測光手段により、定量することができる。生検組織からの対象サンプルにおいて発現しているCTSKの量が、標準値と比較される。標準値と対象値との間の偏差が、疾患を診断するためのパラメーターを確立する。
【００５９】
本発明の別の態様において、CTSKをコードするポリヌクレオチドは、診断目的のために使用することができる。使用されうるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、相補的RNA およびDNA 分子、および PNAが含まれる。ポリヌクレオチドは、生検組織、好ましくは、CTSKの発現が、疾患と相互に関連がある上記心臓サンプルの生検組織における遺伝子発現を検出および定量するために使用される。診断アッセイは、 CTSKの非存在、存在、および過剰発現を識別するために、および、治療的介入の際のCTSK レベルの調節を監視するために使用されうる。
【００６０】
CTSKをコードするポリヌクレオチド配列は、CTSKの発現と関連する、末梢および中枢神経系の障害、血液(hematology)疾患、癌疾患および心血管疾患の診断のために使用することができる。CTSKをコードするポリヌクレオチド配列は、サザン、ノザン、またはドット-ブロット分析、またはその他のメンブレンに基づく技術において; PCR 技術において;試験紙(dipstick)、ピン、および ELISA アッセイにおいて;およびマイクロアレイにおいて、変化したCTSK 発現を検出するために患者生検からの液体または組織を利用して使用することができる。かかる定性的または定量的方法は、当該技術分野において周知である。
【００６１】
特定の側面において、CTSKをコードするヌクレオチド配列は、肺高血圧症または心不全を診断するアッセイにおいて有用でありうる。CTSKをコードするヌクレオチド配列は、標準方法により標識され得、ハイブリダイゼーション複合体の形成のために好適な条件下で、患者からの液体または組織サンプルに添加され得る。好適なインキュベーション期間の後、サンプルは洗浄され、シグナルが定量され、標準値と比較される。患者サンプルにおけるシグナルの量が、同等の対照サンプルのシグナルの量から有意に変化している場合、ヌクレオチド配列は、サンプル中のヌクレオチド配列とハイブリダイズし、サンプル中のCTSKをコードするヌクレオチド配列の変化したレベルの存在は、関連する障害の存在を示す。かかるアッセイはまた、動物研究において、臨床試験において、あるいは個々の患者の治療の監視において、特定の治療的処方計画の有効性を評価するために使用されうる。
【００６２】
肺高血圧症または心不全の診断のための基礎を提供するために、発現についての正常または標準プロファイルを確立する。これは、動物またはヒトのいずれかの正常対象から採取された体液または細胞抽出物と、CTSKをコードする配列またはその断片とを、ハイブリダイゼーションまたは増幅のために好適な条件下で一緒にすることにより達成されうる。標準ハイブリダイゼーションは、正常対象から得られた値と、既知量の実質的に精製されたポリヌクレオチドが使用される実験からの値とを比較することによって定量することができる。正常サンプルから得られた標準値を、障害の症状を示す患者からのサンプルから得られた値と比較するとよい。標準値と比較して上昇した値を、上記障害の存在であると診断する。
【００６３】
本発明の別の目的は、哺乳類における、肺高血圧症、肺動脈高血圧、左心障害と関連する肺高血圧症、肺疾患および/または低酸素状態(hypoxia)と関連する肺高血圧症、慢性血栓塞栓症 (CTEPH)に起因する肺高血圧症および心不全からなる疾患の群に含まれる疾患を診断する方法であり、その方法は、 (i)該哺乳類から採取されたサンプルにおけるCTSK ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの量を決定する工程、(ii)健康および/または疾患哺乳類におけるCTSK ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの量を決定する工程を含む。好ましい態様は、肺動脈高血圧または慢性または急性心不全の診断である。疾患哺乳類と比較して、該被験哺乳類におけるCTSK ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの量において実質的な類似性が存在すれば、疾患であると診断される。健康哺乳類と比較して、該被験哺乳類におけるCTSK ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの量が上昇していれば、疾患であると診断される。好ましい態様において、CTSK ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの量は、少なくとも 1.5 倍上昇する。
【００６４】
図面の簡単な説明
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】図1は、モルモット CTSKのヌクレオチド配列(配列番号1)を示す。
【図２】図2は、モルモット CTSKのポリペプチド配列(配列番号2)を示す。
【図３】図3は、本発明のために有用なプライマーのヌクレオチド配列(モルモット(guninea pig) CTSK) (配列番号3)を示す。
【図４】図4は、本発明のために有用なプライマーのヌクレオチド配列(モルモット(guninea pig) CTSK) (配列番号4)を示す。
【図５】図5は、本発明のために有用なプライマーのヌクレオチド配列(モルモット(guninea pig) CTSK) (配列番号5)を示す。
【図６】図6は、本発明のために有用なプライマーのヌクレオチド配列(モルモット(guninea pig) ANP) (配列番号6)を示す。
【図７】図7は、本発明のために有用なプライマーのヌクレオチド配列(モルモット(guninea pig) ANP) (配列番号7)を示す。
【図８】図8は、本発明のために有用なプライマーのヌクレオチド配列(モルモット(guninea pig) ANP) (配列番号8)を示す。
【図９】図9は、本発明のために有用なプライマーのヌクレオチド配列(モルモット(guninea pig) LTBP2) (配列番号9)を示す。
【図１０】図10は、本発明のために有用なプライマーのヌクレオチド配列(モルモット(guninea pig) LTBP2) (配列番号10)を示す。
【図１１】図11は、本発明のために有用なプライマーのヌクレオチド配列(モルモット(guninea pig) LTBP2) (配列番号11)を示す。
【図１２】図12は、本発明のために有用なプライマーのヌクレオチド配列(モルモット(guninea pig) b-アクチン) (配列番号12)を示す。
【図１３】図13は、本発明のために有用なプライマーのヌクレオチド配列(モルモット(guninea pig) b-アクチン) (配列番号13)を示す。
【図１４】図14は、本発明のために有用なプライマーのヌクレオチド配列(モルモット(guninea pig) b-アクチン) (配列番号14)を示す。
【図１５】図15は、本発明のために有用なプライマーのヌクレオチド配列(イヌL32) (配列番号15)を示す。
【図１６】図16は、本発明のために有用なプライマーのヌクレオチド配列(イヌL32) (配列番号16)を示す。
【図１７】図17は、本発明のために有用なプライマーのヌクレオチド配列(イヌL32) (配列番号17)を示す。
【図１８】図18は、本発明のために有用なプライマーのヌクレオチド配列(イヌCTSK) (配列番号18)を示す。
【図１９】図19は、本発明のために有用なプライマーのヌクレオチド配列(イヌCTSK) (配列番号19)を示す。
【図２０】図20は、本発明のために有用なプライマーのヌクレオチド配列(イヌCTSK) (配列番号20)を示す。
【図２１】図21は、本発明のために有用なプライマーのヌクレオチド配列(イヌ ANP) (配列番号21)を示す。
【図２２】図22は、本発明のために有用なプライマーのヌクレオチド配列(イヌ ANP) (配列番号22)を示す。
【図２３】図23は、本発明のために有用なプライマーのヌクレオチド配列(イヌ ANP) (配列番号23)を示す。
【図２４】図24は、モルモットにおける低酸素状態-誘導性肺高血圧症モデルの心臓重量を示す。対照：酸素正常状態下での、心臓右心室重量 vs. 中隔を含む左心室重量の比; プラセボ：低酸素状態下およびプラセボ注入での、心臓右心室重量 vs. 中隔を含む左心室重量の比; オダナカチブ：低酸素状態下およびオダナカチブ(Odacatib) 処置での、心臓右心室重量 vs. 中隔を含む左心室重量の比。
【図２５】図25は、モルモットにおける低酸素状態-誘導性肺高血圧症モデルの心臓右心室におけるANPの相対的発現を示す(X 軸： 1= 対照、2： プラセボ、3： オダナカチブ; Y 軸： 相対的発現)。対照：酸素正常状態下で維持した動物; プラセボ： 低酸素状態下で維持しプラセボ注入した動物; オダナカチブ： 低酸素状態下で維持しオダナカチブ注入した動物。
【図２６】図26は、モルモットにおける低酸素状態-誘導性肺高血圧症モデルの心臓右心室におけるLTBP2の相対的発現を示す(X 軸： 1= 対照、2： プラセボ、3： オダナカチブ; Y 軸： 相対的発現)。対照：酸素正常状態下で維持した動物; プラセボ： 低酸素状態下で維持しプラセボ注入した動物; オダナカチブ： 低酸素状態下で維持しオダナカチブ注入した動物。
【図２７】図27は、モルモットにおける低酸素状態-誘導性肺高血圧症モデルの心臓右心室におけるCTSKの相対的発現を示す(X 軸： 1= 対照、2： プラセボ、3： オダナカチブ; Y 軸： 相対的発現)。対照：酸素正常状態下で維持した動物; プラセボ： 低酸素状態下で維持しプラセボ注入した動物; オダナカチブ： 低酸素状態下で維持しオダナカチブ注入した動物。
【図２８】図28は、イヌ心不全モデルの心臓右心室、左心室、右心房および左心房サンプルにおけるCTSKの相対的発現を示す。対照：ペーシングされていない動物; ペーシング(paced)： ペーシングされた動物。
【図２９】図29は、イヌ心不全モデルの心臓右心室、左心室、右心房および左心房サンプルにおけるANPの相対的発現を示す。対照：ペーシングされていない動物; ペーシング(paced)： ペーシングされた動物。
【図３０】図30は、イヌにおけるペーシング-誘導性心不全モデルについての急性実験設定を示す (Yatsu et al. Pharmacol Res 2002; 46：375-381 および Mondritzki et al. Am J Ther. 2010 Dec 29による)。
【実施例】
【００６６】
A：実験方法
A-1.実施例 1
発現分析
モルモットまたはイヌ組織を、液体窒素を用いてすりつぶすことによって粉砕した。トータルRNA を抽出し、DNase I 消化を行って、残余のゲノム DNAを除去し、RNA をランダムヘキサマー(hexomer)プライマーを用いて逆転写した。定量的 TaqMan RT-PCR 分析を、Applied Biosystems PRISM 7900 配列検出システムを用いて行った。温度プロトコールは以下のように設定した：2 分間、50℃、次いで 10 分間、95℃および、 40 サイクルまでの15 秒間、95℃および1 分間、60℃。結果を、L32 (イヌ)またはb-アクチン (モルモット) 対照に対して正規化し、相対的発現を以下の式にしたがって算出した： 相対的発現 = 2(20-(CT(プローブ)-CT(L32/b-アクチン)))。パラメーター CTは、増幅プロットが基準値を超える固定された閾値を通過するときのサイクル数として規定する。
【００６７】
A-2.実施例 2
心血管疾患 (低酸素状態(hypoxia)-誘導性肺高血圧症) における、バイオマーカー、治療および診断標的としての、LTBP2の使用
低酸素状態-誘導性肺高血圧症モデルは、動物モデルのセクション (A−3)に記載されている。
【００６８】
全(total)細胞RNA を、Trizol-試薬プロトコールを製造業者の仕様書 (Invitrogen; USA)にしたがって用いて単離した。Trizol-試薬プロトコールによって調製されたトータルRNA をDNAse Iで処理してゲノム DNA コンタミネーションを除去した。
【００６９】
LTBP2のmRNA 分布の相対的定量のために、各サンプルからのトータルRNAをまず逆転写した。1μgのトータルRNAを、ImProm-II Reverse Trascription System (Promega、USA) を製造業者のプロトコールにしたがって用いて逆転写した。最終体積を水を用いて200 μlに調整した。
【００７０】
LTBP2 mRNAの分布の相対的定量のために、Applied Bioscience ABI 7900HT 配列検出システムを製造業者の仕様書およびプロトコールにしたがって使用した。PCR 反応をLTBP2およびハウスキーピング遺伝子である b-アクチンを定量するように設定した。LTBP2のためのフォワードおよびリバースプライマーおよびプローブを、Applied Bioscience ABI Primer ExpressTM ソフトウェアを用いて設計し、Eurogentec (ベルギー)に合成させた。LTBP2 フォワードプライマー配列は： プライマー1 (配列番号9)であった。LTBP2 リバースプライマー配列は、プライマー2 (配列番号10)であった。レポーター色素としてFAM (カルボキシフルオセインサクシニミジルエステル)で、クエンチャーとしてTAMRA (カルボキシテトラメチルローダミン)で標識したプローブ1 (配列番号11)を、 LTBP2のためのプローブとして使用する。以下の試薬を合計20 μlとなるように調製した： 1x qPCR-MasterMix (Eurogentec; ベルギー)およびプローブ1 (配列番号11)、それぞれ200 nM のLTBP2 フォワードおよびリバースプライマー、200 nMの LTBP2 FAM/TAMRA-標識化プローブ、および 5 μlのテンプレート cDNA。サーマルサイクリングパラメーターは、2 分間、50℃、次いで、10 分間、95℃、次いで、40 サイクルまでの、95℃ 、15 秒間の融解および60℃、1 分間のアニーリング/伸長。
【００７１】
相対的発現の算出
CT (サイクル閾値) 値を、「核酸の定量的決定」のセクションに記載されているようにして算出する。
デルタCT =CTLTBP2 - CTb-アクチン
相対的発現 = 2^ (15-デルタCT) 
【００７２】
mRNA-定量 (発現プロファイリング)の結果を図26に示す。
【００７３】
動物モデル
本発明にしたがって使用することができる化合物の有利な薬理学的特性は、以下の方法によって確認することができる。
【００７４】
A-3.モルモットにおける低酸素状態(hypoxia)-誘導性肺高血圧症の動物モデル
CTSK 阻害剤による処置
体重およそ 250 gの雄のDunkin Hartley モルモットを無作為に３つの異なる処置群に分けた(n=7-8 動物/群; 対照 + プラセボ、低酸素状態 + プラセボ、低酸素状態 + オダナカチブ)。慢性低酸素状態への暴露のために、モルモットを、換気したチャンバー中で28 日間、常圧(normobaric) 低酸素状態 (10 ％ O2)下に維持した。対照動物は、室内空気中に維持した。餌および水は自由に与えた。モルモットは、0日目から28日目まで、浸透圧ミニポンプの植え込みによる持続注入を介して、オダナカチブまたはプラセボのいずれかを受け取った。28日目に、動物を放血させ、心臓を摘出した。心臓を切開し、左心室＋中隔(septum) 重量に対する右心室の比(RV/LV + S)を、右心室肥大の指標として算出した。右心室を、RNA 抽出および定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応のために、ドライアイス上で新鮮凍結した。4 週間の低酸素状態の後、RV/LV+S比は、0.28 ± 0.01 (平均 ± SEM、正常酸素圧(normoxic) 対照群)から 0.37 ± 0.01 (平均 ± SEM、低酸素プラセボ群)まで上昇した。オダナカチブによる処置は、著しくRV/LV+S比を0.30 ± 0.01 (平均 ± SEM)まで低下させた。結果を図24に示す。 対照：酸素正常状態下での、心臓右心室重量 vs中隔を含む左心室重量の比; プラセボ：低酸素状態下でプラセボ注入された、心臓右心室重量 vs 中隔を含む左心室重量の比; オダナカチブ：低酸素状態下でオダナカチブ(Odacatib)処置された、心臓右心室重量 vs 中隔を含む左心室重量の比。有意性は星印により示す。
【００７５】
A-4.ペーシングされた(Paced) イヌ
急性実験設定を図30に要約する。ペースメーカーの植え込み(0日目)および血行動態評価 (21日目)のために、体重25から32 kgの雑種イヌ (Marshall BioResources/USA)を、ペントバルビタール (効果を生じるために15 から 30 mg/kg)により麻酔した。麻酔補充は、 必要に応じて使用し、左橈側皮静脈を介して投与されるペントバルビタール (1-5 mg/kg/時)によって提供された。鎮痛のために、フェンタニル (10-40 μg/kg/時)を右橈側皮静脈を介して注入した。すべての実験手順の間、動物は、挿管され、Sulla 808 麻酔換気装置 (Draeger/ドイツ)を用いて室内空気により機械的に換気された。
【００７６】
ペースメーカー植え込み
透視下(OEC FlexiView 8800、GE Healthcare/USA)、かつ無菌条件下にて、ステロイド-溶出ペースメーカーリード (Setrox S60、Biotronik/ドイツ)を、腋窩静脈を介して右心室へと挿入し、ペースメーカー (Logos、Biotronik/ドイツ)に接続した。正しい配置を確認するために、捕捉(capture)閾値および心臓内シグナルを測定した。すべての動物は、非経口抗生物質 (エンロフロキサシン (Baytril（登録商標）)、Bayer/ドイツ; 5mg/kg; 皮下注射(s.c.)) および鎮痛剤 (メタミゾール (Metamizole-WDT（登録商標）) WDT/ドイツ; 50mg/kg; 筋肉内(i.m.)) 処置を、ペースメーカー植え込みの後、3 日間の期間にわたって受け取った。創傷治癒 (7日目)の後、ペースメーカーを活性化し、心臓は、14 日間、1分間あたりの拍動数 (BPM)が220の速度に連続的にペーシングされた。このペーシング期間の間に、イヌは安定な餌を食べる機会を維持され、水は不断に(ad lib)提供され、そしてイヌは遊び場に一日二回いけるようにされた。イヌを研究期間にわたって毎日観察し、臨床的に評価した。
【００７７】
急性実験設定
14 日間のペーシングの後、動物を、静脈内コニバプタン- (0.1 mg/kg 静脈内(i.v.))またはトルバプタン-ボーラス (0.1 mg/kg静脈内(i.v.))のそれぞれに対するそれらの血流力学および尿量応答を評価するために全身麻酔下で研究した。研究の当日、ペースメーカーを麻酔の誘導の1時間前に停止させた。無菌条件下で、動物に大腿動脈にアクセスできるように装着し(NaCl 0.9％充填シースイントロデューサー (Cordis、Waterloo/ベルギー)を介して動脈圧を測定するため)、左室機能(LV performance) (速度、収縮性ならびに弛緩)をECGおよび5F-マイクロチップカテーテル (Millar Instruments Inc.、Houston/USA)を用いて評価した。腋窩静脈を介して、Swan Ganz カテーテル (Vigilance-モニターを備えたCCOmbo、Edwards Lifescience/ USA)を導入して、心拍出量、肺動脈圧、中心静脈圧および体温を測定した。すべてのデータはGould AmplifierおよびACQ-16 Acquisition Interface Unitを用いて記録し、さらにPonemah ソフトウェア (すべて DSI/ St. Paul/ USA)を用いて分析した。膀胱カテーテルを挿入し、尿量を20 分毎に測定した。生理的効果は、Mondritzki et al. (Am J Ther. 2010 Dec 29.)に記載されている。
【００７８】
A-5.バイオマーカー
分類：
疾患バイオマーカー：疾患の臨床転帰または臨床的尺度に関連するバイオマーカー。
有効性バイオマーカー：所与の治療の有益な効果を反映するバイオマーカー。
病期診断バイオマーカー：慢性障害の異なる段階の間を区別するバイオマーカー。
代用(Surrogate)バイオマーカー：臨床転帰の尺度(measure)の有効な代用物であるとみなされるバイオマーカー。
毒性バイオマーカー：インビトロまたはインビボシステムに対する薬物の毒性効果を報告するバイオマーカー。
機構バイオマーカー：薬物の下流効果を報告するバイオマーカー。
標的バイオマーカー：薬物とその標的との相互作用を報告するバイオマーカー。
【００７９】
ANP
心房性ナトリウム利尿ペプチド (ANP)、心房性ナトリウム利尿因子 (ANF)、心房性ナトリウム利尿ホルモン (ANH)、あるいは心房性ナトリウム利尿ペプチド(atriopeptin)は、強力な血管拡張剤であり、心筋細胞によって分泌されるタンパク質 (ポリペプチド) ホルモンするである[11]。それは、体内水分、ナトリウム、カリウムおよび脂肪 (脂肪組織)のホメオスタティック・コントロールに関与する。それは、高い血圧に応答して、心臓の上方の房(chamber) (心房) における筋細胞(心房筋細胞)により放出される。ANPは、循環系に対する、水、ナトリウムおよび脂肪負荷を軽減するように作用し、それにより、血圧を低下させる。ANPは、特定のセットの受容体 - ANP 受容体に結合する。受容体-アゴニスト結合は、血液体積の低下を引き起こし、それゆえ心拍出量および全身性血圧が低下する。脂肪分解は上昇し、腎臓ナトリウム再吸収は低下する。ANPの身体に対する全体の効果は、レニン-アンギオテンシン系に起因する血圧および体積の上昇に対抗することである。
【００８０】
ANPは、肺高血圧症 (Pflugers Arch. 1997 May;434(1)：63-9.; Clin Chim Acta. 2000 Nov;301(1-2)：19-30.; Chest. 2004 Oct;126(4)：1330-6.) および心不全 (Clin. Cardiol. 33、11、700-707 (2010))についての、周知の疾患バイオマーカー、病期診断バイオマーカー、代用バイオマーカー、有効性バイオマーカーである。
【００８１】
腎臓：
糸球体輸入細動脈を拡張させ、糸球体輸出細動脈を収縮させ、そして、メサンギウム細胞を緩和する。これは糸球体毛細血管内の圧力を上昇させ、したがって糸球体ろ過量 (GFR)を上昇させ、その結果、ナトリウムおよび水がより多く排出される。溶質(NaClおよび尿素) を髄質間質から洗い出す直細血管を介する血流を上昇させる[6]。髄質間質のより低い浸透圧は、尿細管液(tubular fluid) の再吸収を少なくさせ、排出を上昇させる。近位尿細管におけるナトリウム再吸収、およびENaCのグアノシン 3',5'-環状一リン酸 (cGMP)依存的リン酸化を介するネフロンの皮質集合管を低下させる。レニン分泌を阻害し、それによりレニン-アンギオテンシン系を阻害する。副腎皮質によるアルドステロン分泌を低下させる。
【００８２】
血管：
細動脈および細静脈における血管平滑筋を： カテコールアミンの効果の血管平滑筋 cGMP阻害の膜受容体に媒介される上昇により緩和する。
【００８３】
心臓：
不適応心臓肥大を阻害する。心臓 NPRAを欠くマウスは、心筋重量の上昇および重篤な線維症を発症し、突然死亡する。NPRAの再-発現は表現型をレスキューする。それは単離心房アミロイド症と関連している可能性がある。
【００８４】
LTBP2
LTBP2 のヌクレオチド配列はデータベースにおいて受入番号 Z37976 (ヒト)により使用可能である。プライマー配列を配列番号9-11 (モルモット) に示す。
【００８５】
形質転換増殖因子ベータ (TGFβ)サイトカインは、正常および形質転換哺乳類細胞の両方に対して多種多様な効果を発揮する多機能ファミリーである。TGFβの分泌および活性化は、それらの潜伏関連タンパク質および潜在(latent) TGFβ 結合タンパク質 (LTBP) との結合(association) によって調節される。形質転換増殖因子 β (TGFβ)は、三つの哺乳類アイソフォーム (TGFβ1、TGFβ2 およびTGFβ 3)として存在する。これらのそれぞれは、通常、生物活性を有さず、以下の三つの成分を含む大型潜在型複合体(LLC)において分泌される：潜伏関連タンパク質 (LAP; 前駆体 TGFβのN-末端断片のホモダイマー)と非共有結合により結合した成熟 TGFβのジスルフィド結合したホモダイマーおよび潜在 TGFβ結合タンパク質 (LTBP)の共有結合により結合した分子。四つのLTBP遺伝子が同定されている： LTBP1から LTBP4である。LAPは成熟ホモダイマーを不活性にするのに十分であり、LAPおよびLTBPの両方の除去またはそれらの相互作用の調節はあらゆるTGFβ アイソフォームが機能するために必須である。TGFβ サイトカインは、多種多様な哺乳類細胞型の増殖および機能を調節する。近年、LTBPが、TGFβのアセンブリー、分泌およびそれが貯蔵および/または活性化される部位への標的化に関与している可能性があることが明白になった。したがってこれらのタンパク質は、TGFβの活性の制御および管理において重要な役割を果たしている可能性がある。LTBPはまた、TGFβと関連する効果とは独立の効果、例えば構造マトリックスタンパク質としての効果を発揮している可能性もある。
【００８６】
LTBP2の機能的役割については比較的わずかしか知られていない。他のLTBPと異なり、LTBP2 は小型潜在型 □□ TGFβと結合することができない。LTBP2はおもに肺において発現しており、程度は低いが、肝臓、骨格筋、胎盤および心臓にも発現している。□潜在 TGFβ 結合タンパク質 LTBP2は、線維芽細胞のフィブロネクチンへの接着を低下させる。LTBP2の機能的役割の解明はさらにLTBP2 のマウスにおける欠損は胚性致死性を導くという事実により制限されている。
【００８７】
心血管系におけるLTBP2の機能的役割について、LTBP2 合成が冠動脈血管形成術のブタモデルにおいて動脈損傷に応答して上昇したことが実証された[9]。したがって、心不全の発症におけるTGFβの周知の役割とともに[10]、TGFβ-機能を調節するLTBP2が、LVAD 心臓ならびに心不全の様々な動物モデルにおいてRNA レベルにて調節されるという本発明者らの知見は、LTBP2をCHFについての魅力的な候補バイオマーカーとするものである。
【００８８】
LTBP2は、(これらに限定されないが)特許WO 2004/075835 および WO 02/068579において公開されている。
【００８９】
図面の簡単な説明
図1は、モルモット CTSKのヌクレオチド配列(配列番号1)を示す。
図2は、モルモット CTSKのポリペプチド配列(配列番号2)を示す。
図3は、本発明のために有用なプライマーのヌクレオチド配列(モルモット(guninea pig) CTSK) (配列番号3)を示す。
図4は、本発明のために有用なプライマーのヌクレオチド配列(モルモット(guninea pig) CTSK) (配列番号4)を示す。
図5は、本発明のために有用なプライマーのヌクレオチド配列(モルモット(guninea pig) CTSK) (配列番号5)を示す。
図6は、本発明のために有用なプライマーのヌクレオチド配列(モルモット(guninea pig) ANP) (配列番号6)を示す。
図7は、本発明のために有用なプライマーのヌクレオチド配列(モルモット(guninea pig) ANP) (配列番号7)を示す。
図8は、本発明のために有用なプライマーのヌクレオチド配列(モルモット(guninea pig) ANP) (配列番号8)を示す。
図9は、本発明のために有用なプライマーのヌクレオチド配列(モルモット(guninea pig) LTBP2) (配列番号9)を示す。
図10は、本発明のために有用なプライマーのヌクレオチド配列(モルモット(guninea pig) LTBP2) (配列番号10)を示す。
図11は、本発明のために有用なプライマーのヌクレオチド配列(モルモット(guninea pig) LTBP2) (配列番号11)を示す。
図12は、本発明のために有用なプライマーのヌクレオチド配列(モルモット(guninea pig) b-アクチン) (配列番号12)を示す。
図13は、本発明のために有用なプライマーのヌクレオチド配列(モルモット(guninea pig) b-アクチン) (配列番号13)を示す。
図14は、本発明のために有用なプライマーのヌクレオチド配列(モルモット(guninea pig) b-アクチン) (配列番号14)を示す。
図15は、本発明のために有用なプライマーのヌクレオチド配列(イヌL32) (配列番号15)を示す。
図16は、本発明のために有用なプライマーのヌクレオチド配列(イヌL32) (配列番号16)を示す。
図17は、本発明のために有用なプライマーのヌクレオチド配列(イヌL32) (配列番号17)を示す。
図18は、本発明のために有用なプライマーのヌクレオチド配列(イヌCTSK) (配列番号18)を示す。
図19は、本発明のために有用なプライマーのヌクレオチド配列(イヌCTSK) (配列番号19)を示す。
図20は、本発明のために有用なプライマーのヌクレオチド配列(イヌCTSK) (配列番号20)を示す。
図21は、本発明のために有用なプライマーのヌクレオチド配列(イヌ ANP) (配列番号21)を示す。
図22は、本発明のために有用なプライマーのヌクレオチド配列(イヌ ANP) (配列番号22)を示す。
図23は、本発明のために有用なプライマーのヌクレオチド配列(イヌ ANP) (配列番号23)を示す。
図24は、モルモットにおける低酸素状態-誘導性肺高血圧症モデルの心臓重量を示す。対照：酸素正常状態下での、心臓右心室重量 vs. 中隔を含む左心室重量の比; プラセボ：低酸素状態下およびプラセボ注入での、心臓右心室重量 vs. 中隔を含む左心室重量の比; オダナカチブ：低酸素状態下およびオダナカチブ(Odacatib) 処置での、心臓右心室重量 vs. 中隔を含む左心室重量の比。
図25は、モルモットにおける低酸素状態-誘導性肺高血圧症モデルの心臓右心室におけるANPの相対的発現を示す(X 軸： 1= 対照、2： プラセボ、3： オダナカチブ; Y 軸： 相対的発現)。対照：酸素正常状態下で維持した動物; プラセボ： 低酸素状態下で維持しプラセボ注入した動物; オダナカチブ： 低酸素状態下で維持しオダナカチブ注入した動物。
図26は、モルモットにおける低酸素状態-誘導性肺高血圧症モデルの心臓右心室におけるLTBP2の相対的発現を示す(X 軸： 1= 対照、2： プラセボ、3： オダナカチブ; Y 軸： 相対的発現)。対照：酸素正常状態下で維持した動物; プラセボ： 低酸素状態下で維持しプラセボ注入した動物; オダナカチブ： 低酸素状態下で維持しオダナカチブ注入した動物。
図27は、モルモットにおける低酸素状態-誘導性肺高血圧症モデルの心臓右心室におけるCTSKの相対的発現を示す(X 軸： 1= 対照、2： プラセボ、3： オダナカチブ; Y 軸： 相対的発現)。対照：酸素正常状態下で維持した動物; プラセボ： 低酸素状態下で維持しプラセボ注入した動物; オダナカチブ： 低酸素状態下で維持しオダナカチブ注入した動物。
図28は、イヌ心不全モデルの心臓右心室、左心室、右心房および左心房サンプルにおけるCTSKの相対的発現を示す。対照：ペーシングされていない動物; ペーシング(paced)： ペーシングされた動物。
図29は、イヌ心不全モデルの心臓右心室、左心室、右心房および左心房サンプルにおけるANPの相対的発現を示す。対照：ペーシングされていない動物; ペーシング(paced)： ペーシングされた動物。
図30は、イヌにおけるペーシング-誘導性心不全モデルについての急性実験設定を示す (Yatsu et al. Pharmacol Res 2002; 46：375-381 および Mondritzki et al. Am J Ther. 2010 Dec 29による)。
【００９０】
参考文献：
【表４】
0006000340.tif 000008
【表５】
0006000340.tif 000009
【図２５】
0006000340.tif 000014
【図２６】
0006000340.tif 000015
【図２７】
0006000340.tif 000016
【図１】
0006000340.tif 000017
【図２】
0006000340.tif 000018
【図３】
0006000340.tif 000019
【図４】
0006000340.tif 000020
【図５】
0006000340.tif 000021
【図６】
0006000340.tif 000022
【図７】
0006000340.tif 000023
【図８】
0006000340.tif 000024
【図９】
0006000340.tif 000025
【図１０】
0006000340.tif 000026
【図１１】
0006000340.tif 000027
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
0006000340.tif 000043
【配列表】
0006000340000001.app