(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定のフィルターに大気中の浮遊粒子状物質を付着させる採取ステップと、
前記浮遊粒子状物質に結合した蛋白質を所定のシートに転写させる転写ステップと、
前記シートに転写された前記蛋白質中の３−ニトロチロシンに化学発光体を結合させる結合ステップと、
前記化学発光体による発光量に基づいて前記３−ニトロチロシンの量を算定することで大気中の窒素酸化物の量を測定する測定ステップと
を有する大気窒素酸化物測定法。
【請求項２】
前記測定ステップでは、前記採取ステップで採取した前記浮遊粒子状物質の量に応じて、算定される前記３−ニトロチロシンの量を補正している請求項１に記載の大気窒素酸化物測定法。
【請求項３】
大気中の浮遊粒子状物質を付着させるフィルターと、
このフィルターに付着した前記浮遊粒子状物質に結合した蛋白質を転写させるシートと、
このシートに転写された蛋白質中の３−ニトロチロシンに化学発光体を結合させる結合剤と、
それぞれ濃度の異なる複数の３−ニトロチロシン溶液を前記フィルターと同質素材のフィルターに含有させた検量線用フィルターと
を備えた大気窒素酸化物測定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大気窒素酸化物測定法及び大気窒素酸化物測定キットに関するものであり、特に大気中の蛋白質のニトロ化修飾を利用した大気窒素酸化物測定法及び大気窒素酸化物測定キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
昨今、中国での大気汚染の影響が日本にも及び、大気汚染の状況に関して一般的な関心が高まっている。
【０００３】
大気汚染の中でも窒素酸化物による大気汚染の測定は、専用の窒素酸化物測定機やガスクロマトグラフ等を用いることで測定可能であるが、専門的な知識や訓練が必要となるため、より簡便な測定方法として、ザルツマン試薬等の発色試薬を用い、比色計を用いる方法が提案されている。
【０００４】
特に、比色計を用いる窒素酸化物測定法では、窒素酸化物捕集器を改良することで、より簡便で高精度な測定を可能とすることが提案されている（例えば、特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００４−０６９３４５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者は、大気環境の健康への影響を研究している中で、大気中に浮遊している粒子状物質に結合した蛋白質のうち、アミノ酸であるチロシンが大気中の窒素酸化物と反応することによってニトロ化することを知見した。窒素酸化物は、粒子状物質と共に大気中に共存しており、チロシンがニトロ化した３−ニトロチロシンの量は、大気中の平均窒素酸化物の濃度を反映していると考えられる。
【０００７】
特に、大気中の窒素酸化物の量を窒素酸化物測定機やガスクロマトグラフ等を用いて測定した場合には、短時間で高精度に窒素酸化物の量を検出可能ではあるが、窒素酸化物の濃度が風の向きや強さの影響を受けることで変動しやすく、測定結果が適正であるかどうかが問題となるおそれがあるのに対して、３−ニトロチロシンの量に基づいて窒素酸化物の濃度を測定することで、窒素酸化物の濃度を正確に反映させやすく、大気環境の評価法として有用である。
【０００８】
このように、本発明者は、３−ニトロチロシンの量から大気中の平均窒素酸化物の濃度を測定可能であることから、本発明を成したものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の大気窒素酸化物測定法では、所定のフィルターに大気中の浮遊粒子状物質を付着させる採取ステップと、浮遊粒子状物質に結合した蛋白質を所定のシートに転写させる転写ステップと、シートに転写された蛋白質中の３−ニトロチロシンに化学発光体を結合させる結合ステップと、化学発光体による発光量に基づいて３−ニトロチロシンの量を算定することで大気中の窒素酸化物の量を測定する測定ステップとを有するものである。
【００１０】
さらに、本発明の大気窒素酸化物測定法では、測定ステップにおいて、採取ステップで採取した浮遊粒子状物質の量に応じて、算定される３−ニトロチロシンの量を補正していることにも特徴を有するものである。
【００１１】
また、本発明の大気窒素酸化物測定キットでは、大気中の浮遊粒子状物質を付着させるフィルターと、このフィルターに付着した浮遊粒子状物質に結合した蛋白質を転写させるシートと、このシートに転写された蛋白質中の３−ニトロチロシンに化学発光体を結合させる結合剤と、それぞれ濃度の異なる複数の３−ニトロチロシン溶液を前記フィルターと同質素材のフィルターに含有させた検量線用フィルターとを備えるものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、３−ニトロチロシンを介して大気中の窒素酸化物の量を測定することで、ある一定期間中の大気中の窒素酸化物の量を測定可能であり、比較的簡便に大気環境の状態を判定できる。特に、風などの突発的な影響を受けにくく、大気環境の汚染状況を正しく評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】Ｘ線フィルムの現像写真である。
【図２】検量線片を用いて作成した検量線のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の大気窒素酸化物測定法及び大気窒素酸化物測定キットは、大気中の浮遊粒子状物質に付着した蛋白質を利用して、大気中の窒素酸化物の量を測定するものである。
【００１５】
すなわち、第１のステップである採取ステップにおいて所定のフィルターに大気中の浮遊粒子状物質を付着させ、次いで第２のステップである転写ステップにおいて浮遊粒子状物質に結合した蛋白質を所定のシートに転写させ、次いで第３のステップである結合ステップにおいてシートに転写された蛋白質中の３−ニトロチロシンに化学発光体を結合させ、次いで第４のステップである測定ステップにおいて化学発光体による発光量に基づいて３−ニトロチロシンの量を算定することで大気中の窒素酸化物の量を測定している。
【００１６】
また、採取ステップで用いるフィルターと、転写ステップで用いるシートと、結合ステップで用いる結合剤とともに、３−ニトロチロシンの量を算定するための検量線用としてそれぞれ濃度の異なる複数の３−ニトロチロシン溶液を含有させたフィルターとで大気窒素酸化物測定キットを構成している。
【００１７】
この大気窒素酸化物測定キットを用いることで、中学生あるいは小学校高学年であっても大気中の窒素酸化物の量を測定可能であり、環境問題が実感されやすくなるだけでなく、科学的な興味を抱かせやすくすることができる。
【００１８】
以下において本発明の実施形態をより詳細に説明する。
【００１９】
＜採取ステップ＞
採取ステップでは、所定のフィルターに大気中の浮遊粒子状物質を付着させる。ここでは、フィルターとして石英繊維のフィルターを用いた。また、浮遊粒子状物質をフィルターに効果的に付着させるために、本実施形態では柴田科学株式会社のエアサンプラー（ＨＶ−１０００Ｒ）を用い、フィルターに浮遊粒子状物質を付着させた。本実施形態では、エアサンプラーは１６８時間連続運転させて、浮遊粒子状物質をフィルターに付着させた。
【００２０】
本実施形態では、比較的長期間にわたって浮遊粒子状物質をフィルターに付着させたが、状況に応じて適宜の採取時間としてよい。また、エアサンプラーとして適宜の集塵装置を用いてよく、自作した集塵装置を用いてもよい。
【００２１】
本実施形態では、浮遊粒子状物質を付着させたフィルターを穿孔機で打ち抜くことで、所定の大きさとした試験片を切り出している。試験片は複数作成することが望ましい。
【００２２】
試験片の作成とともに検量線片も作成している。すなわち、検量線片は、浮遊粒子状物質の採取に用いたフィルターと同質素材のフィルターに、所定濃度とした３−ニトロチロシン溶液を含有させた後、穿孔機で打ち抜くことで所定の大きさに切り出すことで形成している。特に、それぞれ濃度の異なる複数の３−ニトロチロシン溶液を用意して、それぞれの検量線片を作成している。なお、検量線片は、所定濃度とした３−ニトロチロシン溶液を含有させたフィルターを穿孔機で打ち抜いて形成するのではなく、無垢のフィルターを穿孔機で打ち抜いて所定形状とした後に、所定濃度とした３−ニトロチロシン溶液に浸漬させて形成してもよい。
【００２３】
＜転写ステップ＞
転写ステップでは、浮遊粒子状物質に結合した蛋白質を所定のシートに転写させる。具体的には、Western blottingと同様の方法で蛋白質を電気泳動させることで転写している。
【００２４】
すなわち、まず、電気泳動用緩衝液を浸透させたろ紙を用いて下側層を形成する。本実施形態では、３枚のろ紙を重ね、電気泳動用緩衝液を浸透させて下側層としている。
【００２５】
次いで、下側層の上面に、Western blottingで頻用されるニトロセルローズ膜を重ね合わせて載置する。このニトロセルローズ膜が、蛋白質が転写されるシートである。なお、ニトロセルローズ膜の代わりにＰＶＤ(Polyvinylidene Difluoride)膜を用いてもよい。
【００２６】
次いで、ニトロセルローズ膜の上面に、試験片及び検量線片を載置する。このとき、試験片は、浮遊粒子状物質が付着している面をニトロセルローズ膜に接触させて載置する。
【００２７】
次いで、試験片及び検量線片が載置されたニトロセルローズ膜の上面に、アクリルアミドゲルの膜を重ね合わせて載置する。
【００２８】
次いで、アクリルアミドゲルの膜の上面に、電気泳動用緩衝液を浸透させたろ紙を重ね合わせて載置して上側層を形成する。本実施形態では、３枚のろ紙を重ね、電気泳動用緩衝液を浸透させて上側層としている。
【００２９】
このように下側層と上側層とで挟まれた積層体を電気泳動用の電極板で挟み、所定電圧を印加することで、試験片及び検量線片に含まれている蛋白質をニトロセルローズ膜に転写している。本実施形態では、電気泳動の条件を１００Ｖ、１時間としている。
【００３０】
＜結合ステップ＞
結合ステップでは、ニトロセルローズ膜に転写された蛋白質中の３−ニトロチロシンに化学発光体を結合させる。具体的には、３−ニトロチロシンに化学発光体を直接的に結合しているのではなく、後述するように、２種類の抗体を介して化学発光体を３−ニトロチロシンに結合している。
【００３１】
はじめに、ニトロセルローズ膜はタンパク吸着力が高いため、今後の操作で抗体が意図しない部位に付着するのを防ぐために、ニトロセルローズ膜にブロッキング層を形成している。すなわち、ニトロセルローズ膜を、スキムミルクを溶解させた緩衝液に入れることで、ニトロセルローズ膜の表面にブロッキング層を形成している。ここで、緩衝液は、5 w/v%のスキムミルク液としている。
【００３２】
ブロッキング層が形成されたニトロセルローズ膜は、十分に洗浄することで過剰のスキムミルクを除去し、その後、抗ニトロチロシン抗体を含有した一次反応液に浸漬させて、ブロッキング層から露出している蛋白質の３−ニトロチロシンに、抗ニトロチロシン抗体を結合させた。一次反応液への浸漬時間は、本実施形態では一晩とした。なお、一次反応液の液温は、４℃に維持した。
【００３３】
抗ニトロチロシン抗体が結合されたニトロセルローズ膜は、十分に洗浄することで未反応の抗ニトロチロシン抗体を除去し、その後、ペルオキシダーゼの結合した標識二次抗体を含有した二次反応液に浸漬させて、抗ニトロチロシン抗体に標識二次抗体を結合させた。二次反応液への浸漬時間は、本実施形態では１時間とした。なお、二次反応液の液温は、室温に維持した。
【００３４】
標識二次抗体が結合されたニトロセルローズ膜は、十分に洗浄することで未反応の標識二次抗体を除去し、化学発光体キット(Perkinelmer Western lightning kit)を用いて、基質が標識二次抗体のペルオキシダーゼと反応して微弱な発光を呈する化学発光体を結合させることで、３−ニトロチロシンに化学発光体を結合させている。
【００３５】
なお、大気窒素酸化物測定キットを構成する結合剤は、スキムミルクを溶解させた緩衝液、抗ニトロチロシン抗体を含有した一次反応液、ペルオキシダーゼの結合した標識二次抗体を含有した二次反応液、化学発光体キットとで構成されるものである。
【００３６】
＜測定ステップ＞
測定ステップでは、化学発光体による発光量に基づいて３−ニトロチロシンの量を算定することで大気中の窒素酸化物の量を測定する。
【００３７】
すなわち、化学発光体が結合されたニトロセルローズ膜にＸ線フィルムを重ね合わせ、化学発光体の発光によりＸ線フィルムを感光させた後、Ｘ線フィルムを現像する。露光時間は、数十秒から数分程度で十分である。図１は、Ｘ線フィルムの現像写真であり、上側三行は検量線片であり、その下側の３行は、それぞれ１つのフィルターから採取した３つの試験片である。
【００３８】
検量線片を用いて図２に示す検量線を作成し、この検量線に基づいて各フィルターの３−ニトロチロシンの量を算定する。そして算定された３−ニトロチロシンの量から、大気中の窒素酸化物の量を推定することができる。
【００３９】
なお、当然ながら、本発明の測定法では、大気中の窒素酸化物の量だけでなく、大気中の浮遊粒子状物質の濃度の影響を受けることとなっている。
【００４０】
そこで、試験片に付着した浮遊粒子状物質の量を計測し、この浮遊粒子状物質の量に応じて算定される３−ニトロチロシンの量を補正することが望ましい。
【００４１】
具体的には、採取ステップで使用するフィルターの採取前後での重量を測定し、その重量差から浮遊粒子状物質の量を推定することで、補正することができる。
【００４２】
あるいは、より精度良く浮遊粒子状物質の量を計測する方法として、採取ステップにおいてフィルターに付着した浮遊粒子状物質に吸着している蛋白質の量を計測することで、浮遊粒子状物質の量を推定することもできる。
【００４３】
すなわち、採取ステップで穿孔機を用いてフィルターから試験片を切り出す際に、蛋白質の量の計測用の試験片も合わせて切り出し、この試験片をマイクロチューブに入れ、さらにこのマイクロチューブにサーモサイエンティフィック社のＢＣＡ蛋白質分析試薬のワーキング試薬を入れて、インキュベーションを行う。インキュベーション条件は、37℃−30分である。
【００４４】
インキュベーションの終了後、フィルターから脱落した固形物を除去するため、遠心分離を行い、上清を回収する。ここで、遠心分離の条件は、約4℃として約9000xgとし、約10分とした。
【００４５】
回収した上清をマイクロプレートに分注して波長562nmにおける吸光度を測定することで蛋白質の濃度を算出する。
【００４６】
ここで、吸光度による検量用として、所定の濃度とした蛋白質の標準溶液を複数種類作成しておき、これらの標準溶液をマイクロチューブに入れて、さらにこのマイクロチューブにＢＣＡ蛋白質分析試薬のワーキング試薬を入れて、37℃−30分のインキュベーションを行い、マイクロプレートに分注してそれぞれの吸光度を測定することで、検量線を作成している。
【００４７】
検量線を用いて蛋白質の濃度を算出することで、計算により試験片に付着した浮遊粒子状物質に吸着している蛋白質の量を求めることができる。しかも、この蛋白質の量は、発明者らの研究の結果、試験片に付着した浮遊粒子状物質の量と相関係数ｒ＝0.836で強く相関していることが確認されている。
【００４８】
したがって、試験片に付着した蛋白質の量を用いて、試験片に付着した浮遊粒子状物質の量をかなり正確に算出することができる。この浮遊粒子状物質の量による補正を行うことで、大気中の窒素酸化物の量をより精度よく測定することができる。
【００４９】
このように、本発明によれば、３−ニトロチロシンを介して大気中の窒素酸化物の量を測定することで、ある一定期間中の大気中の窒素酸化物の量を測定可能であり、比較的簡便に大気環境の状態を判定できる。
【００５０】
また、本発明の大気窒素酸化物測定キットとしておくことで、中高生、場合によっては小学校高学年の児童が化学実験として実施可能であり、高い教育的価値を有するものとなっている。
【図２】
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【図１】
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