(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃｒｙ１Ｆコア毒素含有タンパク質およびＣｒｙ１Ｄコア毒素含有タンパク質の両方の殺虫活性量を発現する細胞を含む、鱗翅類の有害生物を防除するための組成物であって、前記鱗翅類がＣｒｙ１ＤまたはＣｒｙ１Ｆのどちらかに抵抗性であるフォールアーミーワームである、組成物。
【請求項２】
Ｃｒｙ１Ｆコア毒素含有タンパク質およびＣｒｙ１Ｄコア毒素含有タンパク質の両方を発現するように形質転換された、微生物または植物細胞である宿主を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
鱗翅類の有害生物を防除する方法であって、前記有害生物に、または前記有害生物の環境に請求項１に記載の組成物の殺虫活性量を提示することを含む方法であって、前記鱗翅類がＣｒｙ１ＤまたはＣｒｙ１Ｆのどちらかに抵抗性であるフォールアーミーワームである、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
人は、食物用途およびエネルギー用途のためにトウモロコシを栽培する。人は、ダイズおよびワタを含む他の多くの作物も栽培する。昆虫は、植物を食べて損傷し、それによってこれらの人の努力を台無しにする。害虫を防除するために毎年何１０億ドルも費やされ、害虫が与える損傷に対してさらに数１０億ドルが失われる。合成有機化学殺虫剤は、害虫を防除するために用いられる主な手段であったが、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）（Ｂｔ）に由来する殺虫性タンパク質などの生物殺虫剤が一部の領域である重要な役割を演じてきた。Ｂｔ殺虫性タンパク質遺伝子による形質転換を通して昆虫抵抗性植物を作出できたことにより、現代農業が革新され、殺虫性タンパク質およびその遺伝子の重要性および価値が高まっている。
【０００２】
今日までに登録され商品化に至った昆虫抵抗性のトランスジェニック植物を作製するために、数種のＢｔタンパク質が用いられてきた。このＢｔタンパク質としては、トウモロコシのＣｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ａｃ、Ｃｒｙ１ＦおよびＣｒｙ３Ｂｂ、ワタのＣｒｙ１ＡｃおよびＣｒｙ２Ａｂ、ならびにジャガイモのＣｒｙ３Ａが挙げられる。
【０００３】
これらのタンパク質を発現する市販製品は、２種のタンパク質の組合せ殺虫スペクトルが所望である場合（例えば、それぞれ鱗翅目害虫およびルートワームへの抵抗性を付与するために組み合わされた、トウモロコシのＣｒｙ１ＡｂおよびＣｒｙ３Ｂｂ）を除き、または２種のタンパク質のそれぞれ独立した作用により、これらのタンパク質が感受性を示す昆虫集団での抵抗性の発達を遅らせるための手段として有用となる場合（例えば、オオタバコガのための抵抗性管理を付与するために組み合わされた、ワタのＣｒｙ１ＡｃおよびＣｒｙ２Ａｂ）を除いて、単一のタンパク質しか発現しない。
【０００４】
すなわち、この技術の急速で広範囲な採用をもたらした昆虫抵抗性トランスジェニック植物の特質のいくつかは、これらの植物によって生成される殺虫性タンパク質に対する抵抗性を有害生物集団が発達させるという懸念も生む。高用量のタンパク質を、緩衝帯と組み合わせて、異なる毒素と交互にまたは同時利用で利用することを含め、Ｂｔに基づく昆虫抵抗性形質の有用性を保存するためのいくつかの戦略が提案されている（McGaugheyら (1998), "B.t. Resistance Management," Nature Biotechnol. 16:144-146）。
【０００５】
あるタンパク質に対して発達した抵抗性が別のタンパク質に対する抵抗性を付与しない（すなわち、タンパク質に対する交差抵抗性がない）ように、ＩＲＭスタックで用いるために選択されるタンパク質は、それらの殺虫効果を独立して発揮する必要がある。例えば、「タンパク質Ａ」に対する抵抗性について選択される有害生物集団が「タンパク質Ｂ」に感受性である場合、そこには交差抵抗性がなく、タンパク質Ａおよびタンパク質Ｂの組合せがタンパク質Ａ単独に対する抵抗性を遅らせるのに有効であろうと結論付けられるであろう。
【０００６】
抵抗性を示す昆虫集団が存在しない場合、作用機構および交差抵抗性能力に関連すると推測される他の特性に基づいて評価を行うことができる。交差抵抗性を示す可能性のない殺虫性タンパク質を同定することにおける受容体媒介結合の有用性が示唆されている（van Mellaertら 1999）。この手法に特有の交差抵抗性の欠如の重要な予測因子は、殺虫性タンパク質が感受性昆虫種の受容体をめぐって競合しないことである。
【０００７】
２つのＢｔ毒素が同じ受容体をめぐって競合する場合には、毒素の１つがその受容体にもはや結合せず、したがって昆虫に対してもはや殺虫性でないように該昆虫におけるその受容体が突然変異するならば、該昆虫は他方の毒素（同じ受容体に競合的に結合する）にも抵抗性になる場合もある。すなわち、昆虫は両方のＢｔ毒素に交差抵抗性であると言われる。しかし、２つの毒素が２つの異なる受容体に結合する場合には、これは昆虫がそれら２つの毒素に同時に抵抗性にならないことを示す指標であろう。
【０００８】
Ｃｒｙ１Ｆａは、ヨーロピアンコーンボーラー（ＥＣＢ；オストリニア・ヌビラリス（Ostrinia nubilalis）（Ｈｕｅｂｎｅｒ））およびフォールアーミーワーム（ＦＡＷ；スポドプテラ・フルジペルダ（Spodoptera frugiperda））を含む多くの鱗翅目害虫の種の防除で有用であり、シュガーケーンボーラー（ＳＣＢ；ジアトラエア・サッカラリス（Diatraea saccharalis））に対する活性を有する。ＴＣ１５０７イベントを含むトウモロコシ植物で生成されるようなＣｒｙ１Ｆａタンパク質は、ＦＡＷ防除のための業界をリードする昆虫抵抗性形質を担う。Ｃｒｙ１Ｆａは、Ｈｅｒｃｕｌｅｘ（登録商標）、ＳｍａｒｔＳｔａｘ（商標）およびＷｉｄｅＳｔｒｉｋｅ（商標）製品でさらに利用されている。
【０００９】
受容体結合性アッセイでの検出のためのタンパク質を標識するのに利用できる最も一般的な技術がＣｒｙ１Ｆａタンパク質の殺虫活性を不活性化するので、Ｃｒｙ１Ｆａタンパク質を用いる（競合的または相同的）受容体結合性試験を行う能力は制限される。
【００１０】
さらなるＣｒｙ毒素は、公式なＢ．ｔ．命名委員会のウェブサイト（Crickmoreら; lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/）に記載されている。添付の付録Ａを参照されたい。ほぼ６０個の主要群の「Ｃｒｙ」毒素（Ｃｒｙ１〜Ｃｒｙ５９）が現在あり、さらなるＣｙｔ毒素およびＶＩＰ毒素などがある。数字で表した各群の多くは大文字のサブグループを有し、大文字のサブグループは小文字のサブサブグループを有する。（例えば、Ｃｒｙ１はＡ〜Ｌを有し、Ｃｒｙ１Ａはａ〜ｉを有する）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、一部、Ｃｒｙ１Ｆａタンパク質の殺虫活性への抵抗性のために選択されるフォールアーミーワーム（スポドプテラ・フルジペルダ（Spodoptera frugiperda）；ＦＡＷ）集団が、Ｃｒｙ１Ｄａタンパク質の殺虫活性に抵抗性でないという意外な発見に関する。当業者であればこの開示を考慮すると認識するように、これらの２つの殺虫性タンパク質またはその殺虫性部分を発現する植物は、これらの殺虫性タンパク質のいずれか単独に対する抵抗性の発達を遅らせるか阻止することにおいて有益となる。
【００１２】
本発明は、Ｃｒｙ１ＦａおよびＣｒｙ１ＤａがＦＡＷ由来の腸管内受容体の結合を互いに競合しないという発見によっても支えられる。
【００１３】
本発明はまた、一部、基礎的な組であるＣｒｙ１ＦａおよびＣｒｙ１Ｄａ毒素を伴う３つ（以上）の毒素の三重スタックまたは「ピラミッド」に関する。１つの好ましいピラミッドは、２つの有害生物ＦＡＷおよびＥＣＢ（ヨーロピアンコーンボーラー；オストリニア・ヌビラリス（Ostrinia nubilalis））に対する非交差抵抗性の活性を提供する少なくとも２つのタンパク質を提供する：Ｃｒｙ１Ｆａ＋Ｃｒｙ１Ｄａ＋Ｃｒｙ１Ａｂなどの１つまたは複数の抗ＥＣＢ毒素。一部の好ましいピラミッドの実施形態では、選択される毒素は、ＦＡＷに対して３つの別々の作用様式を有する。これらの好ましい「３つの作用様式」のピラミッド組合せは、Ｃｒｙ１Ｆａ＋Ｃｒｙ１Ｄ＋Ｖｉｐ３Ａｂ、Ｃｒｙ１Ｃ、Ｃｒｙ１ＢｅおよびＣｒｙ１Ｅからなる群から選択される別の毒素／遺伝子である。これらの３つの毒素を生成する植物（およびそのような植物を植える土地）は、本発明の範囲内に含まれる。さらなる毒素／遺伝子を加えることもできるが、本発明によるこれらの特定の三重スタックは、都合よく、および意外にもＦＡＷに対して３つの作用様式を提供する。これは、緩衝帯面積に対する要件を低減または除去するのを助けることができる。本発明は、単一の標的有害生物に対して互いに競合しない３つの殺虫性タンパク質（一部の好ましい実施形態ではＣｒｙタンパク質）の使用にも一般に関する。
【００１４】
したがって、Ｃｒｙ１Ｄａは、トウモロコシおよび他の植物（例えばワタおよびダイズ）のための３遺伝子組合せの場合のように用いられ得る。Ｃｒｙ１Ｄａ遺伝子は、例えばＨｅｒｃｕｌｅｘ（登録商標）、ＳｍａｒｔＳｔａｘ（商標）およびＷｉｄｅＳｔｒｉｋｅ（商標）などのＣｒｙ１Ｆａ製品に組み込まれ得る。したがって、Ｃｒｙ１Ｄａの使用は、他の商品化タンパク質への淘汰圧を低減することにおいて有意となり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＦＡＷ（青色の棒）またはｒＦＡＷ（紫色の棒）が食害したトウモロコシ葉部分への傷害（平均葉傷害％＋ＳＥＭ）を示す図。番号「５１６３」に続く全ての処理は、Ｃｒｙ１Ｄａを含む構築物で形質転換された植物からの葉部分である。Ｃｒｙ１Ｄａの発現が検出されなかった植物は、グラフの左端にまとめた。Ｃｒｙ１Ｄａの発現が検出された植物は、グラフの中央にまとめた。非トランスジェニック（すなわち、陰性）対照はグラフの右端にあり、「Ｂ１０４」、「ＨｉＩＩ」および「同質遺伝子系統」と表示される。Ｃｒｙ１Ｆａを含む市販の近交系は、右の最初の処理（「Ｈｅｒｃｕｌｅｘ  Ｉ」と表示）であり、「同質遺伝子系統」と表示される非トランスジェニック対照と同じ遺伝的背景である。
【図２】Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素、Ｃｒｙ１Ｄａコア毒素および１２５Ｉ標識Ｃｒｙ１Ｄａコア毒素タンパク質によるスポドプテラ・フルジペルダ（Spodoptera frugiperda）ＢＢＭＶへの結合のための競合を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書で報告されるように、トランスジェニックトウモロコシ（および他の植物；例えばワタおよびダイズ）で生成されたＣｒｙ１Ｄａ毒素は、Ｃｒｙ１Ｆａ活性への抵抗性を発達させたフォールアーミーワーム（ＦＡＷ；Spodoptera frugiperda）を防除することにおいて非常に有効である。したがって、本発明は、一部、Ｃｒｙ１Ｆａに抵抗性のフォールアーミーワームがＣｒｙ１Ｄａに感受性である（すなわち、交差抵抗性でない）という意外な発見に関する。
【００１７】
本発明は、一部、Ｃｒｙ１Ｄａ毒素がＣｒｙ１Ｆａ抵抗性のフォールアーミーワームによる傷害から植物（メイズ植物など）を保護することにおいて有効であるという意外な発見にも関する。この有害生物の議論については、例えばTabashnik, PNAS (2008), vol. 105 no. 49, 19029-19030を参照。
【００１８】
本発明は、フォールアーミーワームによる食害、またはＣｒｙ１Ｆａ抵抗性を発達させたフォールアーミーワーム集団によって引き起こされる傷害および収量減からトウモロコシおよび他の経済的に重要な植物種を保護するための、Ｃｒｙ１Ｄａ毒素の使用を含む。
【００１９】
したがって、本発明は、フォールアーミーワームによるＣｒｙ１Ｆａおよび／またはＣｒｙ１Ｄａへの抵抗性の発達を阻止または軽減するためのＩＲＭスタックを教示する。
【００２０】
本発明は、Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素含有タンパク質およびＣｒｙ１Ｄａコア毒素含有タンパク質を生成する細胞を含む、鱗翅目害虫を防除するための組成物を提供する。
【００２１】
本発明は、Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素含有タンパク質およびＣｒｙ１Ｄａコア毒素含有タンパク質の両方を生成するように形質転換された、微生物または植物細胞である宿主をさらに含む。対象ｃｒｙ１Ｆａポリヌクレオチドおよび対象ｃｒｙ１Ｄａポリヌクレオチドは、好ましくは非バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）プロモーター（複数可）の制御下にある（それに作動可能に連結する／それを含む）遺伝子構築物中にある。対象ポリヌクレオチドは、植物での強化された発現のためのコドン使用頻度を含むことができる。
【００２２】
本発明は、鱗翅目害虫を防除する方法であって、前記鱗翅目害虫または前記鱗翅目害虫の環境を、Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素含有タンパク質を含み、さらにＣｒｙ１Ｄａコア毒素含有タンパク質を含む組成物の有効量と接触させることを含む方法を提供することがさらに意図される。
【００２３】
本発明の実施形態は、植物で発現可能なＣｒｙ１Ｄａコア毒素含有タンパク質をコードする遺伝子および、植物で発現可能なＣｒｙ１Ｆａコア毒素含有タンパク質をコードする遺伝子を含むメイズ植物、およびそのような植物の種子を含む。
【００２４】
本発明のさらなる実施形態は、Ｃｒｙ１Ｄａコア毒素含有タンパク質をコードする、植物による発現が可能な遺伝子およびＣｒｙ１Ｆａコア毒素含有タンパク質をコードする、植物による発現が可能な遺伝子が移入されたメイズ植物、およびそのような植物の種子を含む。
【００２５】
昆虫受容体。実施例に記載されているように、放射性標識されたＣｒｙ１Ｄａコア毒素タンパク質を用いる競合的受容体結合性試験は、Ｃｒｙ１Ｄａが結合するＦＡＷ昆虫組織に存在する高親和性結合部位によりＣｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質は競合しないことを示す。これらの結果は、Ｃｒｙ１ＦａおよびＣｒｙ１Ｄａタンパク質の組合せが、ＦＡＷ集団でのＣｒｙ１Ｆａへの抵抗性の発達（および同様に、Ｃｒｙ１Ｄａへの抵抗性の発達）を軽減する有効手段であること、および両タンパク質を発現するトウモロコシ植物でこの有害生物への抵抗性のレベルを増加させるであろうことを示す。
【００２６】
したがって、上記および本明細書の他に記載のデータに一部基づき、Ｃｒｙ１ＤａおよびＣｒｙ１Ｆａタンパク質の同時生成（スタッキング）をＦＡＷのための高用量ＩＲＭスタックを生成するために用いることができると考えられる。昆虫防除スペクトルを拡張するために、他のタンパク質をこの組合せに加えることができる。例えばトウモロコシでは、Ｃｒｙ１Ａｂの追加は、ヨーロピアンコーンボーラーの防除のためのＩＲＭピラミッドを形成する。
【００２７】
別の展開オプションは、別の第三の毒素／遺伝子と組み合わせてＣｒｙ１ＦａおよびＣｒｙ１Ｄａタンパク質を用いること、およびこれらの毒素のいずれかに対するＦＡＷでの抵抗性の発達を軽減するためにこの三重スタックを用いることであろう。したがって、本発明の別の利用選択肢は、ＦＡＷが抵抗性集団を発達させることができる作物栽培地域で、これらのタンパク質の１つ、２つ、または３つ（以上）を用いることであろう。したがって、本発明は、一部、基礎となる組であるＣｒｙ１ＦａおよびＣｒｙ１Ｄａ毒素を伴う３つ（以上）の毒素の三重スタックまたは「ピラミッド」にも関する。１つの好ましいピラミッドは、２つの有害生物ＦＡＷおよびＥＣＢ（ヨーロピアンコーンボーラー；オストリニア・ヌビラリス（Ostrinia nubilalis））に対する非交差抵抗性の活性を提供する少なくとも２つのタンパク質を提供する：Ｃｒｙ１Ｆａ＋Ｃｒｙ１Ｄａ＋Ｃｒｙ１Ａｂなどの１つまたは複数の抗ＥＣＢ毒素（ＵＳ２００８０３１１０９６を参照）。Ｃｒｙ１Ｆは両昆虫に活性である。他のＥＣＢ毒素には、Ｃｒｙ１Ｂｅ（ＵＳＳＮ６１／２８４，２９０を参照；２００９年１２月１６日に出願）、Ｃｒｙ１Ｉ（ＵＳＳＮ６１／２８４，２７８を参照；２００９年１２月１６日に出願）、Ｃｒｙ２Ａａ（ＵＳＳＮ６１／２８４，２７８を参照；２００９年１２月１６日に出願）およびＤＩＧ−３（ＵＳ２０１０００２６９２２３を参照）が含まれる。一部の好ましいピラミッドの実施形態では、選択される毒素は、ＦＡＷに対して３つの別々の作用様式を有する。これらの好ましい「３つの作用様式」のピラミッド組合せは、Ｃｒｙ１Ｆａ＋Ｃｒｙ１Ｄ＋Ｖｉｐ３Ａｂ、Ｃｒｙ１Ｃ（ＵＳＳＮ６１／２８４，２８１を参照；２００９年１２月１６日に出願）、Ｃｒｙ１ＢｅおよびＣｒｙ１Ｅ（ＵＳＳＮ６１／２８４，２７８を参照；２００９年１２月１６日に出願）からなる群から選択される別の毒素／遺伝子である。これらの３つの毒素を生成する植物（およびそのような植物を植える土地）は、本発明の範囲内に含まれる。さらなる毒素／遺伝子を加えることもできるが、本発明によるこれらの特定の三重スタックは、ＦＡＷに対して３つの作用様式を都合よく、および意外にも提供する。これは、緩衝帯地所の要件を低減または除去するのを助けることができる。したがって、１０エーカー以上のこのように植えられる圃場は、本発明に含まれる。
【００２８】
したがって、Ｃｒｙ１Ｄａは、現在新しい形質開発過程の開発Ｉにある、トウモロコシのための３遺伝子組合せの場合のように用いられ得る。Ｃｒｙ１Ｆａは、Ｈｅｒｃｕｌｅｘ（登録商標）、ＳｍａｒｔＳｔａｘ（商標）およびＷｉｄｅｓＳｔｒｉｋｅ（商標）製品中にある。したがって、Ｃｒｙ１Ｄａの使用は、他の商品化タンパク質への淘汰圧を低減することにおいて有意となり得る。
【００２９】
他のＶｉｐ３毒素は、例えば、添付されている付録Ａに記載されている。本明細書で開示または指摘される遺伝子およびタンパク質のいずれかの配列を得るために、それらのＧＥＮＢＡＮＫ番号を用いることもできる。
【００３０】
米国特許第５，１８８，９６０号および米国特許第５，８２７，５１４号は、本発明の実施で使用するために適するＣｒｙ１Ｆａコア毒素含有タンパク質を記載する。米国特許第６，２１８，１８８号は、本発明で使用するために適するＣｒｙ１Ｆａコア毒素含有タンパク質をコードする植物最適化ＤＮＡ配列を記載する。
【００３１】
本発明に記載される毒素の組合せは、鱗翅目害虫を防除するために用いることができる。成体の鱗翅目、例えばチョウおよびガは、主に花蜜を食し、受粉の重要な実行者である。ほとんど全ての鱗翅目幼虫、すなわちイモムシは植物を食し、多くは重大な有害生物である。イモムシは、植物の葉の表面もしくは内部、または根部または茎を食し、植物から栄養を奪い、多くの場合植物の物理的支持構造物を破壊する。さらに、イモムシは果物、織物ならびに保存された穀物および小麦粉を食し、売物のこれらの商品を破壊するかそれらの価値を激減させる。本明細書で用いるように、鱗翅目害虫への言及は、幼虫期を含めた、鱗翅目害虫の様々なライフステージを指す。
【００３２】
本発明の一部のキメラ毒素は、Ｂｔ毒素の完全なＮ末端コア毒素部分を含み、コア毒素部分の末端を過ぎたある場所で、タンパク質は異種プロトキシン配列への移行を有する。Ｂｔ毒素のＮ末端の殺虫活性毒素部分は、「コア」毒素と呼ばれる。コア毒素セグメントから異種プロトキシンセグメントへの移行は、ほぼ毒素／プロトキシン接合部で起こることができるか、代わりに、元のプロトキシンの部分（コア毒素部分を過ぎて伸長する）を保持することができ、異種プロトキシン部分への移行は下流で起こる。
【００３３】
例えば、本発明の１つのキメラ毒素は、Ｃｒｙ１Ｄａの完全なコア毒素部分（アミノ酸１〜６０１）および異種プロトキシン（アミノ酸６０２からＣ末端）である。好ましい一実施形態では、プロトキシンを含むキメラ毒素の部分は、Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質毒素に由来する。第二の例として、本発明の第二のキメラ毒素は、Ｃｒｙ１Ｄａの完全なコア毒素部分（アミノ酸１〜６１９）および非相同プロトキシン（アミノ酸６２０からＣ末端）を有する。好ましい実施形態では、プロトキシンを含むキメラ毒素の部分は、Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質毒素に由来する。
【００３４】
Ｂｔ毒素は、Ｃｒｙ１Ｆなどの特定のクラス内でさえ、長さおよびコア毒素部分からプロトキシン部分への移行の正確な位置が多少異なることを、当分野の技術者は認識する。一般的に、Ｃｒｙ１ＤａおよびＣｒｙ１Ｆａ毒素は、長さが約１１５０から約１２００アミノ酸である。コア毒素部分からプロトキシン部分への移行は、完全長毒素の約５０％から約６０％の間で一般的に起こる。本発明のキメラ毒素は、このＮ末端コア毒素部分の全長を含む。したがって、キメラ毒素は、Ｃｒｙ１Ｆａ  Ｂｔ毒素タンパク質の完全長の少なくとも約５０％、またはＣｒｙ１Ｄａ  Ｂｔ毒素タンパク質の完全長の少なくとも約５０％を含む。これは、一般的に少なくとも約５９０アミノ酸である。プロトキシン部分に関して、Ｃｒｙ１Ａｂプロトキシン部分の全長は、コア毒素部分の末端から分子のＣ末端まで伸びる。
【００３５】
遺伝子および毒素。本発明による有用な遺伝子および毒素には、開示される完全長配列だけでなく、本明細書で具体的に例示される毒素の特徴的な殺虫活性を保持するこれらの配列の断片、変異体（variants）、突然変異体(mutants)、および融合タンパク質も含まれる。本明細書で用いるように、遺伝子の「変異体」または「変形形態(variations)」という用語は、同じ毒素をコードするか、殺虫活性を有する等価な毒素をコードするヌクレオチド配列を指す。本明細書で用いるように、用語「等価な毒素」は、標的有害生物に対して請求されている毒素と同じか実質的に同一である生物的活性を有する毒素を指す。
【００３６】
本明細書で用いるように、「Revision of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins」、N. Crickmore, D.R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum, and D.H. Dean. Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998) Vol 62: 807-813、により、境界は約９５％（Ｃｒｙ１Ｆａおよび１Ｄａ）、７８％（Ｃｒｙ１ＦおよびＣｒｙ１Ｄ）および４５％（Ｃｒｙ１）の配列同一性を表す。これらのカットオフは、（Ｃｒｙ１ＦおよびＣｒｙ１Ｄ毒素に対する）コア毒素だけに適用することもできる。
【００３７】
活性毒素をコードする遺伝子は、いくつかの手段を通して同定し、得ることができることは、当分野の技術者に明らかとなるはずである。本明細書で例示される具体的な遺伝子または遺伝子部分は、培養株保管所に寄託されている分離株から得ることができる。これらの遺伝子、またはその部分もしくは変異体は、合成的に、例えば遺伝子合成装置を用いて構築することもできる。遺伝子の変形形態は、点突然変異を作製する標準技術を用いて、容易に構築することができる。また、これらの遺伝子の断片は、市販のエキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼを標準手順に従って用いることによって作製することができる。例えば、これらの遺伝子の末端からヌクレオチドを体系的に切断するために、Ｂａｌ３１などの酵素または部位特異的突然変異誘発を用いることができる。活性断片をコードする遺伝子は、様々な制限酵素を用いて得ることもできる。これらのタンパク質毒素の活性断片を直接的に得るために、プロテアーゼを用いることができる。
【００３８】
例示される毒素の殺虫活性を保持する断片および同等物は、本発明の範囲内である。また、遺伝子コードの冗長性のため、様々な異なるＤＮＡ配列が本明細書で開示されるアミノ酸配列をコードすることができる。同じか実質的に同一である毒素をコードするこれらの代替ＤＮＡ配列を作製することは、当業者の技術の範囲内である。これらの変異体ＤＮＡ配列は、本発明の範囲内である。本明細書で用いるように、「実質的に同一」配列への言及は、殺虫活性に実質的な影響を及ぼさないアミノ酸の置換、欠失、付加または挿入を有する配列を指す。殺虫活性を保持するタンパク質をコードする遺伝子の断片も、この定義に含まれる。
【００３９】
本発明により有用な毒素をコードする遺伝子および遺伝子部分を同定するためのさらなる方法は、オリゴヌクレオチドプローブを用いることによるものである。これらのプローブは、検出可能なヌクレオチド配列である。これらの配列は、適当な標識によって検出可能になることができるか、国際出願公開第９３／１６０９４号に記載されているように本来的に蛍光性にすることができる。当技術分野で周知であるように、プローブ分子および核酸試料が２つの分子間で強力な結合を形成することによってハイブリダイズする場合、プローブおよび試料は実質的な相同性を有すると合理的に仮定することができる。好ましくは、ハイブリダイゼーションは、例えばKeller, G. H., M. M. Manak (1987) DNA Probes, StocktonPress, New York, N.Y., pp. 169- 170に記載されているような、当分野で周知の技術によってストリンジェント条件の下で行われる。塩濃度および温度の組合せの一部の例は、以下の通りである（ストリンジェンシーの低い順序で）：室温で２×ＳＳＰＥまたはＳＳＣ；４２℃で１×ＳＳＰＥまたはＳＳＣ；４２℃で０．１×ＳＳＰＥまたはＳＳＣ；６５℃で０．１×ＳＳＰＥまたはＳＳＣ。プローブの検出は、ハイブリダイゼーションが起こったかどうかを既知の方法で判定するための手段を提供する。そのようなプローブ分析は、本発明の毒素コード遺伝子を同定するための迅速な方法を提供する。本発明によるプローブとして用いられるヌクレオチドセグメントは、ＤＮＡ合成装置および標準手順を用いて合成することができる。本発明の遺伝子を増幅するＰＣＲプライマーとして、これらのヌクレオチド配列を用いることもできる。
【００４０】
変異体毒素。本発明の特定の毒素が、本明細書で具体的に例示されている。これらの毒素は本発明の毒素の例示にすぎないので、本発明が例示毒素と同じか類似した殺虫活性を有する変異体または等価な毒素（および等価な毒素をコードするヌクレオチド配列）を含むことは容易に明らかなはずである。等価な毒素は、例示される毒素とのアミノ酸相同性を有する。このアミノ酸相同性は、一般的に７５％を超え、好ましくは９０％を超え、最も好ましくは９５％を超える。アミノ酸相同性は、生物的活性を担うか、最終的に生物的活性を担う３次元構造の決定に関与する毒素の重要な領域で最も高くなる。この点に関しては、それらの置換が活性に重要でない領域にあるか、分子の３次元構造に影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換であるならば、特定のアミノ酸置換が許容され、予想することができる。例えば、アミノ酸は以下のクラスに入れることができる：無極性、無電荷極性、塩基性および酸性。１つのクラスのアミノ酸が同じ種類の別のアミノ酸で置換される保存的置換は、その置換が化合物の生物的活性を実質的に変更しない限り本発明の範囲内である。下記は、各クラスに属するアミノ酸の例のリストである。
【００４１】
【表１】
0005908409.tif 000002
【００４２】
場合によっては、非保存的置換を加えることもできる。重要な因子は、これらの置換が毒素の生物的活性をあまり損なってはならないということである。
【００４３】
組換え体宿主。本発明の毒素をコードする遺伝子は、多種類の微生物または植物宿主に導入することができる。毒素遺伝子の発現は、直接または間接的に、殺虫剤の細胞内での生成および維持をもたらす。本発明の両毒素を発現するＢｔ株を作製するために、接合転移および組換え転移を用いることができる。他の宿主生物体を毒素遺伝子の一方または両方で形質転換し、次に相乗効果を達成するために用いることもできる。適する微生物宿主、例えばシュードモナス（Pseudomonas）で、微生物を有害生物の位置へ施用することができ、そこでそれらは増殖して摂取される。結果は、有害生物の防除である。あるいは、毒素遺伝子を受け入れる微生物は、毒素の活性を長引かせ、細胞を安定させる条件の下で処理することができる。毒性活性を保持する処理細胞は、次に標的有害生物の環境に施用することができる。
【００４４】
Ｂｔ毒素遺伝子が適するベクターを通して微生物宿主に導入され、前記宿主が生きた状態で環境へ施用される場合、特定の宿主微生物が用いられることが必須である。対象の１つまたは複数の作物の「植物圏」（葉面、葉圏、根圏および／または根面）を占めることが知られている微生物宿主が選択される。これらの微生物は、特定の環境（作物および他の昆虫生息地）で野生型微生物とよく競合することが可能であるように、ポリペプチド殺虫剤を発現する遺伝子の安定した維持および発現を提供するように、および、望ましくは環境中での分解および不活性化からの殺虫剤の向上した保護を提供するように選択される。
【００４５】
多数の微生物が、多種類の重要作物の葉面（植物葉の表面）および／または根圏（植物根を囲む土）に生息することが知られている。これらの微生物には、細菌、藻および真菌類が含まれる。特に関心があるものは、細菌、例えばシュードモナス属（Pseudomonas）、エルウィニア属（Erwinia）、セラチア属（Serratia）、クレブシェラ属（Klebsiella）、キサントモナス属（Xanthomonas）、ストレプトマイセス属（Streptomyces）、根粒菌属（Rhizobium）、ロドシュードモナス属（Rhodopseudomonas）、メチロフィリウス（Methylophilius）、アグロバクテナム属（Agrobactenum）、アセトバクター属（Acetobacter）、ラクトバシラス属（Lactobacillus）、アルトロバクター属（Arthrobacter）、アゾトバクター属（Azotobacter）、ロイコノストック属（Leuconostoc）およびアルカリゲネス属（Alcaligenes）；真菌類、特に酵母、例えばサッカロミセス属（Saccharomyces）、クリプトコックス属（Cryptococcus）、クルイベロミセス属（Kluyveromyces）、スポロボロミセス属（Sporobolomyces）、ロドトルラ属（Rhodotorula）およびオーレオバシジウム属（Aureobasidium）などの微生物である。特に関心があるものは、シュードモナス・シリンゲ（Pseudomonas syringae）、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）、セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）、アセトバクター・キシリナム（Acetobacter xylinum）、アグロバクテニウム・ツメファシエンス（Agrobactenium tumefaciens）、ロドシュードモナス・スフェロイデス（Rhodopseudomonas spheroides）、キサントモナス・カンペストリス（Xanthomonas campestris）、リゾビウム・メリオチ（Rhizobium melioti）、アルカリゲネス・エントロファス（Alcaligenes entrophus）およびアゾトバクター・ビンランジ（Azotobacter vinlandii）のような植物圏細菌種；ならびにロドトルラ・ルブラ（Rhodotorula rubra）、Ｒ．グルチニス（R. glutinis）、Ｒ．マリーナ（R. marina）、Ｒ．オーランチアカ（R. aurantiaca）、クリプトコックス・アルビダス（Cryptococcus albidus）、Ｃ．ジフルエンス（C. diffluens）、Ｃ．ローレンチ（C. laurentii）、サッカロミセス・ロゼイ（Saccharomyces rosei）、Ｓ．プレトリエンシス（S. pretoriensis）、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）、スポロボロミセス・ロゼウス（Sporobolomyces roseus）、Ｓ．オドルス（S. odorus）、クルイベロミセス・ベロネ（Kluyveromyces veronae）およびオーレオバシジウム・ポルランス（Aureobasidium pollulans）などの植物圏酵母種である。色の着いた微生物が、特に関心がある。
【００４６】
遺伝子の安定した維持および発現を可能にする条件の下で、毒素をコードするＢｔ遺伝子を微生物宿主に導入するために、多種類の方法を利用できる。これらの方法は当業者に周知であり、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，１３５，８６７号に記載されている。
【００４７】
細胞の処理。Ｂｔ毒素を発現するバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）または組換え体の細胞は、毒素活性を長引かせ、細胞を安定させるために処理することができる。形成される殺虫剤マイクロカプセルは、安定化され、マイクロカプセルが標的有害生物の環境へ施用されるときに毒素を保護する細胞構造の中にＢｔ毒素（複数可）を含む。適する宿主細胞には、原核生物または真核生物のいずれかが含まれてよく、通常、哺乳動物などの高等生物体に有毒である物質を生成しない細胞に限定される。しかし、毒性物質が不安定であるか、哺乳動物宿主への毒性のいかなる可能性も避けるために施用量が十分に低い場合、高等生物体にとって有毒である物質を生成する生物体が用いられるかもしれない。宿主としては、原核生物および真菌類などの下等真核生物が特に関心がある。
【００４８】
処理時、細胞は通常そのままの状態であり、胞子の形態ではなく実質的に増殖形であるが、一部の例では胞子を利用してもよい。
【００４９】
微生物細胞、例えばＢ．ｔ．毒素遺伝子（複数可）を含む微生物の処理は、その技術が毒素の特性に悪い影響を及ぼさず、毒素を保護する細胞の能力も低下させない限り、化学的または物理的な手段に、または化学的および／または物理的な手段の組合せによることができる。化学試薬の例は、ハロゲン化剤、特に原子番号１７〜８０のハロゲン原子である。より詳しくは、温和条件の下で、および所望の結果を達成するのに十分な時間、ヨウ素を用いることができる。他の適する技術には、グルタルアルデヒドなどのアルデヒド；塩化ゼフィランおよび塩化セチルピリジニウムなどの消毒剤；イソプロピルおよびエタノールなどのアルコール；ルゴールヨウ素、ブアン固定液、様々な酸およびヘリー固定液などの様々な組織固定剤（Humason, Gretchen L., Animal Tissue Techniques, W. H. Freeman and Company, 1967を参照）；または細胞が宿主環境に投与されるときに細胞で生成される毒素の活性を保存し、長引かせる物理的（熱）および化学的作用因子の組合せによる処理が含まれる。物理的手段の例は、ガンマ線放射およびＸ線放射などの短波長放射、凍結、ＵＶ照射、凍結乾燥である。微生物細胞の処理のための方法は、米国特許第４，６９５，４５５号および４，６９５，４６２号で開示され、それらは参照により本明細書に組み込まれる。
【００５０】
細胞は、環境条件への抵抗性を増強する強化された構造安定性を一般に有する。殺虫剤がプロ型である場合、細胞処理の方法は、標的有害生物の病原体による殺虫剤のプロ型から成熟型への加工を妨げないように選択されるべきである。例えば、ホルムアルデヒドはタンパク質を架橋し、ポリペプチド殺虫剤のプロ型の加工を妨げることができる。処理の方法は、毒素の生物学的利用能または生物活性の少なくとも実質的な部分を保持するべきである。
【００５１】
生成のための宿主細胞の選択で特に関心がある特性には、Ｂ．ｔ．遺伝子（複数可）を宿主に導入することの容易さ、発現系の入手可能性、発現効率、宿主での殺虫剤の安定性および補助的遺伝子能力の存在が含まれる。殺虫剤マイクロカプセルとして用いるための関心がある特性には、厚い細胞壁、着色および細胞内パッケージングまたは封入体形成などの殺虫剤保護特性；水性環境での生存；人畜毒性の欠如；摂取のための有害生物への誘引効果；殺滅の容易さおよび毒素を害さずに固着させること；などが含まれる。他の考慮事項には、製剤および取扱いの容易さ、経済性、貯蔵安定性などが含まれる。
【００５２】
細胞の増殖。Ｂ．ｔ．殺虫性遺伝子（複数可）を含む細胞宿主は、ＤＮＡ構築物が選択有利性を提供し、細胞の実質的に全てまたは全てがＢ．ｔ．遺伝子を保持するように選択培地を提供する、任意の便利な栄養培地で増殖させることができる。これらの細胞は、従来の方法に従って次に収穫することができる。あるいは、収穫する前に細胞を処理することができる。
【００５３】
本発明の毒素を生成するＢ．ｔ．細胞は、標準技術の培地および発酵技術を用いて培養することができる。発酵サイクルの終了後、最初に当技術分野で周知である手段によってＢ．ｔ．胞子および結晶を発酵培養液から分離することによって細菌を収穫することができる。取扱いおよび特定の標的有害生物への施用を容易にするために、界面活性剤、分散剤、不活性担体および他の構成成分の添加によって、回収されたＢ．ｔ．胞子および結晶を水和剤、濃厚液剤、粒剤または他の製剤に製剤化することができる。これらの製剤および施用手法は、全て当技術分野で周知である。
【００５４】
製剤。誘引剤ならびにＢ．ｔ．分離株の胞子、結晶および毒素、または本明細書で開示されるＢ．ｔ．分離株から入手できる遺伝子を含む組換え体微生物を含む製剤化された餌粒剤は、土に施用することができる。製剤化された製品は、種子コーティングまたは作物サイクルの後期段階で根部処理もしくは植物全体処理として施用することもできる。Ｂ．ｔ．細胞の植物および土壌処理は、様々な不活性の材料、例えば無機鉱物（フィロシリケート、炭酸塩、硫酸塩、リン酸塩など）または植物材料（粉末状の穂軸、籾殻、クルミ殻など）と混合することによって、水和剤、粒剤または粉剤として使用することができる。製剤は、展着助剤、安定化剤、他の殺虫性添加剤または界面活性剤を含むことができる。液体製剤は水性または非水性であってよく、フォーム、ゲル、懸濁液、乳剤などとして使用することができる。成分には、流体力学的剤、界面活性剤、乳化剤、分散剤またはポリマーが含まれてよい。
【００５５】
当分野の技術者によって認識されるように、特定の製剤の性質、特にそれが濃厚剤であるか直接的に用いられるものであるかによって、殺虫剤濃度は広く変動する。殺虫剤は少なくとも１重量％で存在し、１００重量％であってもよい。乾燥製剤は約１〜９５重量％の殺虫剤を有するが、液体製剤は一般に液相中に約１〜６０重量％の固形分である。製剤は、１ｍｇにつき約１０２から約１０４細胞を一般に有する。これらの製剤は、１ヘクタールにつき約５０ｍｇ（液体または乾燥）から１ｋｇ以上で投与される。
【００５６】
製剤は、噴霧、散粉、散水その他によって、鱗翅目害虫の環境、例えば葉または土へ施用することができる。
【００５７】
植物の形質転換。本発明の殺虫性タンパク質の生成のための好ましい組換え体宿主は、形質転換された植物である。本明細書で開示されるようなＢｔ毒素タンパク質をコードする遺伝子は、当技術分野で周知である様々な技術を用いて植物細胞に挿入することができる。例えば、大腸菌（Escherichia coli）の複製系および形質転換細胞の選択を可能にするマーカーを含む多数のクローニングベクターが、高等植物への外来遺伝子の挿入のための調製のために利用できる。ベクターは、例えば、とりわけｐＢＲ３２２、ｐＵＣシリーズ、Ｍ１３ｍｐシリーズ、ｐＡＣＹＣ１８４を含む。したがって、Ｂｔ毒素タンパク質をコードする配列を有するＤＮＡ断片は、適する制限部位でベクターに挿入することができる。生じたプラスミドは、大腸菌（E. coli）への形質転換のために用いられる。大腸菌（E. coli）細胞は適する栄養培地で培養され、次に収穫され、溶解される。プラスミドを回収する。配列分析、制限酵素解析、電気泳動および他の生化学的分子生物学的方法が、分析方法として一般に実行される。各操作の後、用いたＤＮＡ配列を切断して次のＤＮＡ配列に連結することができる。各プラスミド配列は、同じか他のプラスミドにクローニングすることができる。植物への所望の遺伝子の挿入の方法に従い、他のＤＮＡ配列が必要なこともある。例えば、植物細胞の形質転換のためにＴｉまたはＲｉプラスミドが用いられるならば、ＴｉまたはＲｉプラスミドＴ−ＤＮＡの少なくとも右の境界、しかし多くの場合右および左の境界が、挿入される遺伝子の隣接領域として連結されなければならない。植物細胞の形質転換のためのＴ−ＤＮＡの使用は集中的に研究されており、ＥＰ１２０５１６、Lee and Gelvin (2008)、Hoekema (1985)、Fraleyら, (1986)およびAnら, (1985)で十分に記載され、当技術分野でよく確立されている。
【００５８】
挿入されたＤＮＡが植物ゲノムに組み込まれると、それは比較的安定である。形質転換ベクターは、形質転換された植物細胞に、とりわけビアラホス、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシンまたはハイグロマイシンなどの生物致死剤または抗生物質への抵抗性を付与する選択マーカーを通常含む。したがって、個々に使用されるマーカーは、挿入されたＤＮＡを含まない細胞ではなく形質転換された細胞の選択を可能にするはずである。
【００５９】
ＤＮＡを植物宿主細胞に挿入するために、多数の技術を利用できる。それらの技術には、形質転換因子としてアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）もしくはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）を用いるＴ−ＤＮＡによる形質転換、融合、注射、微粒子銃（微小粒子衝撃）、またはエレクトロポレーションならびに他の可能な方法が含まれる。アグロバクテリウムが形質転換のために用いられる場合、挿入されるＤＮＡは特別なプラスミド、すなわち中間型ベクターまたはバイナリーベクターのいずれかにクローニングされなければならない。中間型ベクターは、Ｔ−ＤＮＡの配列に相同的である配列のために、相同組み換えによってＴｉまたはＲｉプラスミドに組み込むことができる。ＴｉまたはＲｉプラスミドは、Ｔ−ＤＮＡの転移のために必要なｖｉｒ領域も含む。中間型ベクターは、アグロバクテリウムではそれ自身を複製することができない。中間型ベクターは、ヘルパープラスミド（コンジュゲーション）によってアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）に移動させることができる。バイナリーベクターは、大腸菌（E. coli）およびアグロバクテリウムの両方でそれ自身を複製することができる。それらは、左右のＴ−ＤＮＡ境界領域によって組まれる選択マーカー遺伝子およびリンカーまたはポリリンカーを含む。それらは、アグロバクテリウムに直接に形質転換させることができる（Holstersら, 1978）。宿主細胞として用いられるアグロバクテリウムは、ｖｉｒ領域を運ぶプラスミドを含むものとする。ｖｉｒ領域は、植物細胞へのＴ−ＤＮＡの転移のために必要である。さらなるＴ−ＤＮＡが含まれてもよい。そのように形質転換される細菌は、植物細胞の形質転換のために用いられる。植物外植片は、植物細胞へのＤＮＡの転移のために、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）と都合よく培養することができる。選択のための抗生物質または生物致死剤を含んでもよい適する培地で、感染植物材料（例えば、葉片、茎、根の断片だけでなく、プロトプラストまたは懸濁培養細胞も）から完全体植物を次に再生させることができる。そのように得られる植物は、挿入されたＤＮＡの存在について次に試験することができる。注射およびエレクトロポレーションの場合、プラスミドに特別に要求されるものはない。通常のプラスミド、例えばｐＵＣ誘導体を用いることができる。
【００６０】
形質転換細胞は、植物内で通常の方法で増殖する。それらは胚細胞を形成することができ、後代植物へ形質転換形質（複数可）を伝えることができる。そのような植物は通常の方法で増殖させること、および同じ形質転換遺伝因子または他の遺伝因子を有する植物と交配することができる。生じる雑種個体は、対応する表現型特性を有する。
【００６１】
本発明の好ましい実施形態では、植物は遺伝子で形質転換され、そこではコドン使用頻度が植物のために最適化されている。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５３８０８３１号を参照。一部のトランケーションされた毒素が本明細書で例示されるが、１３０ｋＤａ型（完全長）毒素がコア毒素であるＮ末端半分およびプロトキシン「尾部」であるＣ末端半分を有することは、Ｂｔ技術の分野では周知である。したがって、適当な「尾部」を、本発明のトランケーションされた／コア毒素と用いることができる。例えば米国特許第６２１８１８８号および米国特許第６６７３９９０号を参照。さらに、植物で使用するための合成Ｂｔ遺伝子の作製方法が当技術分野で公知である（Stewart and Burgin, 2007）。好ましい形質転換植物の１つの非限定例は、Ｃｒｙ１Ｆａタンパク質をコードする植物で発現可能な遺伝子を含み、さらにＣｒｙ１Ｄａタンパク質をコードする第二の植物で発現可能な遺伝子を含む稔性のメイズ植物である。
【００６２】
近交系メイズ系統へのＣｒｙ１ＦａおよびＣｒｙ１Ｄａ決定形質（複数可）の転移（または遺伝子移入）は、回帰性の選抜育種、例えば戻し交配によって達成することができる。この場合には、所望の反復親が、Ｃｒｙ１ＦおよびＣｒｙ１Ｄ決定形質のための適当な遺伝子（複数可）を運ぶドナーの近交系（一回親）と先ず交配される。この交配の後代は、次に反復親と戻し交配され、続いて生じる後代において、一回親から移される所望の形質（複数可）について選択される。所望の形質（複数可）の選択を伴う反復親との３世代、好ましくは４世代、より好ましくは５世代以上の戻し交配の後、後代は移される形質（複数可）を支配する遺伝子座が異型接合的になるが、ほとんどまたはほとんど全ての他の遺伝子については反復親と同様である（例えば、Poehlman & Sleper (1995) Breeding Field Crops, 4th Ed., 172-175、Fehr (1987) Principles of Cultivar Development, Vol. 1 : Theory and Technique, 360-376を参照）。
【００６３】
昆虫抵抗性管理（ＩＲＭ）戦略。例えばRoushらは、「ピラミッド化」または「スタッキング」とも呼ばれる、殺虫性トランスジェニック作物の管理のための２毒素戦略を概説している。（The Royal Society. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. (1998) 353, 1777-1786）。
【００６４】
彼らのウェブサイトで、米国環境保護庁（epa.gov/oppbppdl/biopesticides/pips bt_corn_refuge_2006.htm）は、標的有害生物に対して活性である単一のＢｔタンパク質を生成するトランスジェニック作物で用いるための非トランスジェニック（すなわち、非Ｂ．ｔ．）緩衝帯（非Ｂｔ作物／トウモロコシの区域）を提供するための以下の要件を公表する。
「コーンボーラー保護Ｂｔ（Ｃｒｙ１ＡｂまたはＣｒｙ１Ｆ）トウモロコシ製品の特定の構造化要件は、以下の通りである：
構造化緩衝帯：
コーンベルトで２０％の非鱗翅目Ｂｔトウモロコシ緩衝帯；
コットンベルトで５０％の非鱗翅目Ｂｔ緩衝帯
ブロック
内部（すなわち、Ｂｔ圃場内）
外部（すなわち、任意交配を最大にするためにＢｔ圃場から１／２マイル（可能であれば１／４マイル）以内に別個の圃場）
圃場内の帯状地
幼虫の移動の影響を低減するために、帯状地は少なくとも４列(rows)（好ましくは６列）の幅でなければならない」
【００６５】
さらに、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｎ  Ｇｒｏｗｅｒｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎも、彼らのウェブサイト：（ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn）で、
緩衝帯要件に関して類似した指針を提供する。例えば：
「コーンボーラーＩＲＭの要件：
・トウモロコシ畑地の少なくとも２０％に緩衝帯雑種を植える
・綿花生産地では、緩衝帯は５０％でなければならない
・緩衝帯雑種の１／２マイル以内に植えなければならない
・緩衝帯は、Ｂｔ圃場内に帯状地として植えることができる；緩衝帯の帯状地は少なくとも４列の幅でなければならない
・標的昆虫の経済的許容限界に到達する場合だけ、緩衝帯を従来の殺虫剤で処理することができる
・Ｂｔベースの噴霧可能な殺虫剤を緩衝帯トウモロコシで用いることはできない
・Ｂｔトウモロコシのあらゆる農場に適当な緩衝帯を設けなければならない」
【００６６】
Roushら（例えば、１７８０頁および１７８４頁の右欄）によって述べられているように、標的有害生物に各々有効で、ほとんど交差抵抗性のない２つの異なるタンパク質のスタッキングまたはピラミッド化は、より小さな緩衝帯の使用を可能にする。成功したスタックは、緩衝帯１０％未満の緩衝帯サイズが、単一（非ピラミッド化）形質のための約５０％の緩衝帯と同等の抵抗性管理を提供することができることをＲｏｕｓｈは示唆する。今日利用できるピラミッド化Ｂｔトウモロコシ製品については、米国環境保護庁は単一形質製品（一般に２０％）についてよりもかなり低く（一般に５％）構造化された非Ｂｔトウモロコシの緩衝帯を設けることを要求している。
【００６７】
Roushら（前掲）および米国特許第６，５５１，９６２号によってさらに論じられているように、圃場での様々な幾何学的栽植様式（上記のような）および袋入種子混合物を含む、緩衝帯のＩＲＭ効果を提供する様々な方法がある。
【００６８】
上記の百分率または類似した緩衝帯比率は、対象の二重または三重のスタックまたはピラミッドのために用いることができる。単一の標的有害生物に対して３つの作用様式を有する三重スタックについては、目標は緩衝帯がゼロ（または、例えば５％未満の緩衝帯）である。これは、例えば１０エーカー以上の商業用の土地に特にあてはまる。
【００６９】
本明細書で参照または引用される全ての特許、特許出願、仮出願および刊行物は、それらがこの明細書の明白な教示と矛盾しない範囲で、参照により全体が組み込まれる。
【００７０】
以下は、本発明を実施するための手法を例示する実施例である。これらの実施例は、限定するものと解釈されるべきでない。特記されない限り全ての百分率は重量によるものであり、全ての溶媒混合割合は容量によるものである。全ての温度は、摂氏温度である。
【００７１】
具体的に示されるか含意されない限り、本明細書で用いられるように、用語「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は「少なくとも１つ」を示す。
【実施例１】
【００７２】
バイオアッセイデータ
トランスジェニックトウモロコシで発現されるＣｒｙ１Ｄａ（ｐＤＡＳ５１６３）は、フォールアーミーワーム（ＦＡＷ）、スポドプテラ・フルジペルダ（Spodoptera frugiperda）（Ｊ．Ｅ．Ｓｍｉｔｈ）による食害からの保護を提供する。同じ事象はＣｒｙ１Ｆａへの抵抗性を発達させたＦＡＷを防除することにおいてより有効であり、おそらくＦＡＷ防除のための業界をリードする昆虫抵抗性形質であるＴＣ１５０７イベントを含むトウモロコシ植物より明らかに優れる。
【００７３】
我々は、Ｃｒｙ１Ｆａ（組換え体蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）株ＤＲ１６４９からのタンパク質；プラスミドｐＤＡＢ１８１７）およびＣｒｙ１Ｄａ（組換え体蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）株ＤＣ７８２からのタンパク質）が、人工食バイオアッセイでＦＡＷを防除することにおいて両方とも有効であること、ならびにその組合せの効力がそれらの個々の効力から予想されるものより大きいことも実証した。
【００７４】
上記のデータに基づき、Ｃｒｙ１ＤａおよびＣｒｙ１Ｆａの同時発現は、ＦＡＷ、他の重要なスポドプテラ（Spodoptera）属の種、およびおそらく他の鱗翅類有害生物のために高用量ＩＲＭスタックを生成することができる。スペクトルを拡張するために、他のタンパク質をこの組合せに加えることができる。例えばトウモロコシでは、Ｃｒｙ１Ａｂの追加は、ヨーロピアンコーンボーラー（ＥＣＢ）、オストリニア・ヌビラリス（Ostrinia nubilalis）（Ｈｕｂｎｅｒ）のためのＩＲＭスタックを形成する。
【００７５】
図１に示すように、ＦＡＷ（青色の棒）またはｒＦＡＷ（紫色の棒）が食害したトウモロコシ葉部分への傷害（平均葉傷害％＋ＳＥＭ）。番号「５１６３」に続く全ての処理は、Ｃｒｙ１Ｄａを含む構築物で形質転換された植物からの葉部分である。Ｃｒｙ１Ｄａの発現が検出されなかった植物は、グラフの左端にまとめた。Ｃｒｙ１Ｄａの発現が検出された植物は、グラフの中央にまとめた。非トランスジェニック（すなわち、陰性）対照はグラフの右端にあり、「Ｂ１０４」、「ＨｉＩＩ」および「同質遺伝子系統」と表示される。Ｃｒｙ１Ｆａを含む市販の近交系は、右の最初の処理（「Ｈｅｒｃｕｌｅｘ  Ｉ」と表示）であり、「同質遺伝子系統」と表示される非トランスジェニック対照と同じ遺伝的背景である。
【００７６】
Ｃｒｙ１Ｄａのトリプシン切断制限毒素のコード配列、およびＣｒｙ１ＡｂのＣ末端プロトキシン領域のコード配列からなるプロトキシンキメラを作製して、トウモロコシでの発現を指示することが可能な発現カセットに組み入れた（ｐＤＡＳ５１６３）。トウモロコシはアグロバクテリウム・ツメファシアンス（Agrobacterium tumefacians）を用いて形質転換され、Ｃｒｙ１Ｄａ／１Ａｂキメラを含む事象が特定された。再生植物からの葉切片は、野生型フォールアーミーワーム（ＦＡＷ）またはＣｒｙ１Ｆａ抵抗性であったフォールアーミーワーム集団（ｒＦＡＷ）からの幼虫で生物検定された。Ｃｒｙ１Ｄａ／１Ａｂ形質転換植物は、ＦＡＷによる食害を確かに低減したが、２コピーのＣｒｙ１Ｆａを含む近交系ほど有効でなかった（図１）。（試験されたＣｒｙ１Ｄａ事象は導入遺伝子についてヘミ接合性であったが、変換された近交系はＴＣ１５０７イベントについてホモ接合性であった。）対照的に、Ｃｒｙ１Ｄａ／１Ａｂを含む同じ事象は、ｒＦＡＷによる食害を低減することにおいて、Ｃｒｙ１Ｆａを含む近交系より一般に非常に有効であった（図１）。
【００７７】
Ｃｒｙ１Ｆａ（組換え体蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）株ＤＲ１６４９からのタンパク質；プラスミドｐＤＡＢ１８１７）、Ｃｒｙ１Ｄａ（組換え体蛍光菌（P. fluorescens）株ＤＣ７８２からのタンパク質）および１：１（ｗ：ｗ）の２つの組合せの殺虫活性を、効力を評価するために用いられた標準の人工食バイオアッセイで試験した。ＬＣ５０推定値およびＬＣ５０の上下限（９５％）を生成したＬＯＧＩＴ分析（ＪＭＰ（登録商標）８．０、ＳＡＳ  Ｉｎｃ．２００８）を用いて、効力推定値を求めた。組合せの効力の期待値が各構成成分単独の効力を用いて計算される、Tabashnik (1992)によって記載される方法を用いて、相乗作用についての試験を実施した。推定された組合せの信頼上限が計算された期待効力より低い場合、組合せは相乗的とみなされる。フォールアーミーワーム（ＦＡＷ）およびＣｒｙ１Ｆａに抵抗性であったフォールアーミーワームの集団（ｒＦＡＷ）の場合、組合せのＬＣ５０の信頼上限は推定された効力より低く（表１と２）、それによってこれらの２つの集団に対するＣｒｙ１ＦａおよびＣｒｙ１Ｄａの組合せは相乗的であるという結論が導かれた。
【００７８】
表１。野生型フォールアーミーワーム（ＦＡＷ）、スポドプテラ・フルジペルダ（Spodoptera frugiperda）に対する、Ｃｒｙ１Ｆａ、Ｃｒｙ１Ｄａ、および１：１（ｗ：ｗ）の２つの組合せの効力推定値、９５％信頼区間の上下限（それぞれＬＣＬおよびＵＣＬ）。最後の欄は、Tabashnik (1992). Tabashnik BE. Evaluation of synergism among Bacillus thuringiensis toxins. Applied and Environmental Microbiology 58[10], 3343-3346. 1992、によって記載される式を用いる、各タンパク質単独の効力に基づくＬＣ５０期待値を含む。期待値が組合せの信頼上限より高い場合、組合せは相乗的とみなされる。
【００７９】
【表２】
0005908409.tif 000003
【００８０】
表２。Ｃｒｙ１Ｆａ抵抗性フォールアーミーワーム（ｒＦＡＷ）、スポドプテラ・フルジペルダ（Spodoptera frugiperda）に対する、Ｃｒｙ１Ｆａ、Ｃｒｙ１Ｄａ、および１：１（ｗ：ｗ）の２つの組合せの効力推定値、９５％信頼区間の上下限（それぞれＬＣＬおよびＵＣＬ）。最後の欄は、Tabashnik (1992)によって記載される式を用いる、各タンパク質単独の効力に基づくＬＣ５０期待値を含む。期待値が組合せの信頼上限より高い場合、組合せは相乗的とみなされる。
【００８１】
【表３】
0005908409.tif 000004
【実施例２】
【００８２】
結合データの要約
ＦＡＷから単離されたブラシ縁膜小胞（ＢＢＭＶ）を用いて１２５Ｉ標識Ｃｒｙ１Ｄａで実施された競合結合実験を下に記載する。これらの実験からの結果は、Ｃｒｙ１Ｄａがその受容体にタイトに結合し、Ｃｒｙ１ＦａはＣｒｙ１Ｄａと結合部位をめぐって競合しないことを実証する。Ｃｒｙ１Ｄａへの抵抗性がこれらの試験で観察される受容体への突然変異に基づくことができるならば、Ｃｒｙ１Ｆａがそのような抵抗性集団を管理するか、そのような抵抗性の発達を軽減するための優れたＩＲＭ手段となるであろうことを、これらのデータは示唆する。Ｃｒｙ１Ｆａ抵抗性のＦＡＷ（ｒＦＡＷ）によるバイオアッセイからの結果は、Ｃｒｙ１Ｄａがこの集団で活性であることを実証する。総合すると、Ｃｒｙ１ＦａおよびＣｒｙ１Ｄａがいずれかの殺虫性タンパク質への抵抗性の発達を効果的に軽減するＩＲＭスタックである可能性を、これらのデータは示唆する。
【００８３】
１２５Ｉ  Ｃｒｙ１Ｄａがその受容体（複数可）にタイトに結合し、非標識のＣｒｙ１Ｄａがそれを効果的に分断することができることを、受容体結合性アッセイは示す。Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１ＦａまたはＣｒｙ１ＢｅのいずれもＦＡＷ  ＢＢＭＶのその受容体部位（複数可）から１２５Ｉ  Ｃｒｙ１Ｄａを分断することができず、Ｃｒｙ１ＤａはＣｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１ＦおよびＣｒｙ１Ｂｅが競合しない特有の結合部位をＦＡＷの中腸に有することを示す。ｒＦＡＷは野生型ＦＡＷと同じくらいＣｒｙ１Ｄａに感受性であるので、ｒＦＡＷ昆虫で変更される推定上の受容体部位はＣｒｙ１Ｄａが結合する受容体部位でないことをこれは示す。したがって、Ｃｒｙ１Ｄａはその生物的活性を担う異なる標的部位で相互作用するので、それはＣｒｙ１Ｆａのための優れたスタッキングパートナーである。
【００８４】
１２５Ｉ  Ｃｒｙ１ＤａをＦＡＷ  ＢＢＭＶに加えたとき、非放射性標識Ｃｒｙ１Ｄａ自体だけが結合した１２５Ｉ  Ｃｒｙ１Ｄａを置換することができた。Ｃｒｙ１Ｆａ、Ｃｒｙ１ＡｂおよびＣｒｙ１Ｂｅが、結合した１２５Ｉ  Ｃｒｙ１ＤａをＢＢＭＶから置換することができないことは、ＦＡＷ中腸においては、これらの異なるＣｒｙ毒素の４つ全てがＦＡＷ幼虫に対して活性であるとしても、Ｃｒｙ１Ｆａ、Ｃｒｙ１ＡｂおよびＣｒｙ１Ｂｅが相互作用しない特有の受容体部位にＣｒｙ１Ｄａが結合することを示した。
【実施例３】
【００８５】
Ｃｒｙ１コア毒素および非相同的プロトキシンを含むキメラ毒素の設計
キメラ毒素。別のＣｒｙ毒素のプロトキシン部分と融合している１つのＣｒｙ毒素のコア毒素ドメインを利用するキメラタンパク質は、例えば、米国特許第５５９３８８１号および米国特許第５９３２２０９号で以前に報告されている。
【００８６】
本発明のＣｒｙ１Ｄａキメラタンパク質変異体には、コア毒素部分の末端を過ぎたある点で非相同的デルタエンドトキシンプロトキシン部分と融合したＣｒｙ１Ｄａ殺虫性毒素に由来するＮ末端コア毒素部分を含むキメラ毒素が含まれる。コア毒素から非相同的プロトキシン部分への移行は、ほぼ元のコア毒素／プロトキシン接合部で起こることができるか、代わりに、元のプロトキシンの部分（コア毒素部分を過ぎて伸長する）を保持することができ、非相同的プロトキシンへの移行は下流で起こる。変異体様式では、コア毒素およびプロトキシン部分は、それらが由来する元の毒素のアミノ酸配列を正に含むことができるか、お互いと融合したときにその部分の生物的機能を低下させず、強化することができる、アミノ酸付加、欠失または置換を含むことができる。
【００８７】
例えば、本発明のキメラ毒素は、Ｃｒｙ１Ｄａおよび非相同的プロトキシンに由来するコア毒素部分を含む。本発明の好ましい実施形態では、Ｃｒｙ１Ｄａ２に由来するコア毒素部分（５９４アミノ酸）は、Ｃｒｙ１Ａｂデルタエンドトキシンに由来するプロトキシン部分を含む非相同的部分（５４５アミノ酸）と融合される。キメラタンパク質の１１３９アミノ酸配列は、本明細書でＣｒｙ１Ｄａと呼ばれる。Ｃｒｙ１Ｄａ２コア毒素変異体およびＣｒｙ１Ａｂに由来するプロトキシンを含む他のキメラ融合体は、本発明の範囲内であることを理解すべきである。
【００８８】
本発明の第二のキメラタンパク質は、Ｃｒｙ１Ａｂデルタエンドトキシンに由来するプロトキシン部分を含む非相同的部分（５４５アミノ酸）と融合される、Ｃｒｙ１Ｆａに由来するコア毒素部分（６０３アミノ酸）を含む。キメラタンパク質の１１４８アミノ酸配列は、本明細書でＣｒｙ１Ｆａと呼ばれる。
【実施例４】
【００８９】
キメラタンパク質をコードする発現プラスミドの構築およびシュードモナス（Pseudomonas）での発現
完全長Ｃｒｙ１Ｄａキメラタンパク質を生成するように遺伝子操作された蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）（Ｐｆ）発現構築物ｐＤＯＷ２８４８の構築では、標準のクローニング法［例えばSambrookら, (1989)およびAusubelら, (1995)、およびその最新版に記載］を用いた。タンパク質生成は、米国特許第５１６９７６０号に開示される改変ラックオペロンの挿入を有する蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）株ＭＢ２１４（株ＭＢ１０１の誘導体；蛍光菌（P. fluorescens）生物型Ｉ）で実施された。基本的なクローニング戦略は、プラスミドベクターにＣｒｙ１Ｄａタンパク質をコードするＤＮＡ断片をサブクローニングすることを伴い、それにより、ＤＮＡ断片はプラスミドｐＫＫ２２３−３（ＰＬ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）からのＰｔａｃプロモーターおよびｒｒｎＢＴ１Ｔ２ターミネーターの発現制御下に置かれる。そのようなプラスミドの１つはｐＤＯＷ２８４８と名付けられ、このプラスミドを抱えるＭＢ２１４分離株はＤｐｆ１５０と名付けられる。
【００９０】
振盪フラスコでの増殖および発現分析。特徴付けおよび昆虫バイオアッセイのためのＣｒｙ１Ｄａタンパク質の生成は、振盪フラスコで増殖させた蛍光菌（P. fluorescens）株Ｄｐｆ１５０によって達成された。Ｐｔａｃプロモーターによって作動させられるＣｒｙ１Ｄａタンパク質の生成は、米国特許第５５２７８８３号で前に記載される通りに行われた。微生物学的操作の詳細は、参照により本明細書に組み込まれる、Squiresら, (2004)、米国特許出願公開第２００６０００８８７７号、米国特許出願公開第２００８０１９３９７４号および米国特許出願公開第２００８００５８２６２号で入手できる。振盪させながら３０度で２４時間の最初のインキュベーションの後、イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加によって発現を誘導した。培養物は、誘導時および誘導後の様々な時点で試料を採取した。細胞密度は、６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ６００）によって測定した。
【００９１】
振盪フラスコ試料の細胞分画およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。各試料採取時に、試料の細胞密度をＯＤ６００＝２０に調節し、１ｍＬの一定量を１４０００×ｇで５分間遠心分離した。細胞ペレットを−８０度で冷凍した。ＥａｓｙＬｙｓｅ（商標）細菌タンパク質抽出溶液（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて、冷凍振盪フラスコ細胞ペレット試料からの可溶性および不溶性分画を生成した。各細胞ペレットを１ｍＬのＥａｓｙＬｙｓｅ（商標）溶液に再懸濁し、溶解緩衝液でさらに１：４に希釈し、振盪させながら室温で３０分間インキュベートした。４度で２０分間、溶解物を１４，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を可溶性分画として回収した。ペレット（不溶性分画）を等量のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；１１．９ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４）に次に再懸濁した。
【００９２】
試料をβ−メルカプトエタノールを含む２×のＬａｅｍｍｌｉ試料緩衝液と１：１に混合し（Sambrookら、上記）、５分間沸騰させた後、Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＸＴビス−トリス１２％ゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）に加えた。推奨されたＸＴ  ＭＯＰＳ緩衝液で電気泳動を実施した。製造業者（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）のプロトコルに従ってゲルをＢｉｏ−Ｓａｆｅクマシー染色で染色し、Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ  Ｉｍａｇｉｎｇシステム（Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ、ＣＡ）を用いて画像化した。
【００９３】
封入体調製。ＳＤＳーＰＡＧＥおよびＭＡＬＤＩーＭＳ（マトリックス支援レーザ脱離／イオン化質量分析）によって実証されるように、不溶性Ｂｔ殺虫性タンパク質を生成した蛍光菌（P. fluorescens）発酵からの細胞で、Ｃｒｙ１Ｄａタンパク質封入体（ＩＢ）調製を実施した。蛍光菌（P. fluorescens）発酵ペレットを、３７度水浴で解凍した。細胞を、溶解緩衝液［５０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡジナトリウム塩（エチレンジアミン四酢酸）、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および５ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）；５ｍＬ／Ｌの細菌プロテアーゼ阻害剤カクテル（カタログ＃Ｐ８４６５；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を使用直前に加えた］中に２５ｗ／ｖ％で再懸濁した。携帯ホモジナイザー（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｅａｒｏｒ、ＢｉｏＳｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．、Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ、ＯＫ）を最も低い設定で用いて、細胞を懸濁した。金属スパチュラで混合することによってリゾチーム（２５ｍｇのＳｉｇｍａ  Ｌ７６５１、ニワトリ卵白から）を細胞懸濁液に加え、懸濁液を室温で１時間インキュベートした。懸濁液を氷上で１５分間冷却し、次にＢｒａｎｓｏｎ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  ２５０（５０％衝撃周期、３０％出力で２つの１分間のセッション）を用いて超音波処理した。細胞溶解を、鏡検によって検査した。さらなる２５ｍｇのリゾチームを必要に応じて加え、インキュベーションおよび超音波処理を繰り返した。鏡検による細胞溶解の確認の後、溶解物を１１，５００×ｇで２５分間（４度）遠心分離してＩＢペレットを形成し、上清を廃棄した。ＩＢペレットを１００ｍＬの溶解緩衝液で再懸濁し、携帯ミキサーでホモジナイズし、上記のように遠心分離した。上清が無色になり、ＩＢペレットが堅く、オフホワイト色になるまで、再懸濁（５０ｍＬ溶解緩衝液で）、ホモジナイゼーション、超音波処理および遠心によってＩＢペレットを繰り返し洗浄した。最終洗浄のために、ＩＢペレットを２ｍＭのＥＤＴＡを含む無菌濾過（０．２２μｍ）蒸留水に再懸濁し、遠心分離した。最終ペレットを２ｍＭのＥＤＴＡを含む無菌濾過蒸留水に再懸濁し、１ｍｌの一定分量で−８０度で保存した。
【００９４】
ＩＢペレットの１ｍＬの一定分量を解凍して、無菌濾過蒸留水で１：２０に希釈することによって、ＩＢ調製物中のタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析および定量化を実行した。希釈試料を４×の還元試料緩衝液［２５０ｍＭトリス、ｐＨ６．８、４０％グリセロール（ｖ／ｖ）、０．４％ブロモフェノールブルー（ｗ／ｖ）、８％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）および８％β−メルカプトエタノール（ｖ／ｖ）］で次に沸騰させ、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）４〜２０％トリス−グリシン、１２＋２ウェルゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に加え、１×のトリス／グリシン／ＳＤＳ緩衝液（ＢｉｏＲａｄ）で実行した。ゲルを２００ボルトで６０分間流し、次にクマシーブルー（４５％メタノール、１０％酢酸中に５０％Ｇ−２５０／５０％Ｒ−２５０）で染色し、蒸留水中の７％酢酸、５％メタノールで脱色した。標的バンドの定量化は、標準曲線を生成するのと同じゲルに流したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）標準試料に対して、バンドの濃度測定値を比較することによって実行した。
【００９５】
封入体の可溶化。ＰｆクローンＤＰｆ１５０からのＣｒｙ１Ｄａ封入体懸濁液の６ｍＬを、エッペンドルフモデル５４１５Ｃ微量遠心装置の最高設定（約１４，０００×ｇ）で遠心分離し、封入体をペレット化した。保存緩衝液上清を除去し、５０ｍＬ円錐管内で、２５ｍＬの１００ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液ｐＨ１１で置換した。ピペットを用いて封入体を再懸濁し、撹拌して完全に混合した。管を４度の低振盪プラットホームに一晩置き、標的タンパク質を抽出した。抽出物を４度で３０分間の３０，０００×ｇで遠心分離し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５再生セルロース遠心濾過装置（３０，０００の分子量カットオフ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、生じた上清を５倍に濃縮した。次に使い捨て式ＰＤ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いて、１０  ｍＭ  ＣＡＰＳ［３−（シクロヘキサミノ）１−プロパンスルホン酸］ｐＨ１０に試料緩衝液を変えた。
【００９６】
封入体タンパク質の可溶化およびトリプシン活性化。一部の場合、ＰｆクローンＤＰｆ１５０からのＣｒｙ１Ｄａ封入体懸濁液を、エッペンドルフモデル５４１５Ｃ微量遠心装置の最高設定（約１４，０００×ｇ）で遠心分離し、封入体をペレット化した。保存緩衝液上清を除去し、１００ｍＭのＣＡＰＳ、ｐＨ１１で置換して、約５０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を提供した。管を室温で３時間揺動させ、タンパク質を完全に可溶化させた。トリプシンを５％から１０％の量（ｗ：ｗ、ＩＢ粉末の初期重量に基づく）で加え、４度で一晩揺動させながらのインキュベーションによって、または室温で９０〜１２０分間揺動させることによって消化を達成した。不溶性物質を１５分間の１０，０００×ｇでの遠心によって除去し、上清をＭｏｎｏＱ陰イオン交換カラム（１０ｍｍ×１０ｃｍ）に加えた。活性化Ｃｒｙ１Ｄａタンパク質は、２５カラム容量にわたる１Ｍ  ＮａＣｌの０％〜１００％勾配によって溶出させた（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定、下記参照）。活性化タンパク質を含む分画をプールし、必要に応じて上記のＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５再生セルロース遠心濾過装置を用いて１０ｍＬ未満に濃縮した。次に、材料を、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．５％ツイーン２０および１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む緩衝液中のＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（１６ｍｍ×６０ｃｍ）に通した。活性化（酵素によって切断された）タンパク質が６５〜７０ｍＬで溶出することが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で判定された。活性化タンパク質を含む分画をプールし、上記の遠心濃縮装置を用いて濃縮した。
【００９７】
ゲル電気泳動。還元剤として５ｍＭのＤＴＴを含むＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳ試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で１：５０に希釈し、９５度で４分間加熱することによって、濃縮タンパク質調製物を電気泳動のために調製した。０．２μｇ〜２μｇ／レーンの５つのＢＳＡ標準（標準曲線生成のため）と一緒に、試料を４〜１２％ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ゲルの２反復のレーンに加えた。追跡用色素がゲルの底に到達するまで、ＭＯＰＳ  ＳＤＳランニング緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて２００Ｖの電圧を加えた。４５％メタノール、１０％酢酸中の０．２％クマシーブルーＧ−２５０でゲルを染色し、先ず４５％メタノール、１０％酢酸で短時間脱色し、次に７％酢酸、５％メタノールでバックグラウンドが消去されるまで十分に脱色した。脱色の後、ゲルをＢｉｏＲａｄ  Ｆｌｕｏｒ−Ｓ  ＭｕｌｔｉＩｍａｇｅｒでスキャンした。機器のＱｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅソフトウェアｖ．４．５．２を用いてバックグラウンドを引いた染色タンパク質バンドの容量を得、保存溶液中のキメラＣｒｙ１Ｄａタンパク質の濃度を計算するために用いたＢＳＡ標準曲線を生成した。
【実施例５】
【００９８】
Ｃｒｙ１ＦａおよびＣｒｙ１Ｄａコア毒素タンパク質の調製および競合的結合実験のためのスポドプテラ・フルジペルダ（Spodoptera frugiperda）ブラシ縁膜小胞の単離
以下の実施例は、昆虫腸組織での推定上の受容体へのＣｒｙ１コア毒素タンパク質の競合結合を評価する。スポドプテラ・フルジペルダ（Spodoptera frugiperda）（フォールアーミーワーム）から調製されるブラシ縁膜小胞（ＢＢＭＶ）に１２５Ｉ標識Ｃｒｙ１Ｄａコア毒素タンパク質が高い親和性で結合すること、およびＣｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質がこの結合で競合しないことが示される。
【００９９】
Ｃｒｙタンパク質の精製。キメラＣｒｙ１Ｄａタンパク質をコードする遺伝子は、実施例４に記載の蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）発現株で発現された。同様にして、Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素（６０３アミノ酸）およびＣｒｙ１Ａｂプロトキシン（５４５アミノ酸）を含むキメラタンパク質をコードする遺伝子は、Ｐｆ系で発現された。Ｃｒｙ１Ｆａの例では、発現プラスミドはｐＤＡＢ１８１７と名付けられ、ｐＤＡＢ１８１７を抱える蛍光菌（P. fluorescens）株はＤＰｆ１２９と名付けられた。タンパク質を実施例４の方法によって精製し、完全長タンパク質から活性化コア毒素を生成するトリプシン消化を次に実施し、実施例４に記載の方法によって生成物を精製した。実験によりＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定されたように、トリプシン処理（活性化コア毒素）タンパク質の調製物は９５％超純粋で、約６５ｋＤａの分子量を有した。本明細書で用いるように、Ｃｒｙ１Ｄａタンパク質から調製された活性化コア毒素はＣｒｙ１Ｄａコア毒素タンパク質と呼び、Ｃｒｙ１Ｆａタンパク質から調製された活性化コア毒素はＣｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質と呼ぶ。
【０１００】
可溶性ＢＢＭＶの調製および分画。タンパク質定量化およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の標準方法は、例えばSambrookら (1989)およびAusubelら (1995)、およびその最新版で教示される通りに用いた。
【０１０１】
終齢Ｓ．フルジペルダ（S. frugiperda）幼虫を一晩絶食させ、その後、氷上で１５分間冷やしたのちに解剖した。中腸組織を体腔から取り出し、外皮に接着した後腸を残した。中腸を、仕入先の推奨通りに希釈したプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｐ−２７１４）を追加した、９倍容量の氷冷ホモジナイゼーション緩衝液（３００ｍＭマンニトール、５ｍＭ  ＥＧＴＡ、１７ｍＭトリス塩基、ｐＨ７．５）に入れた。１５ストロークのガラス組織ホモジナイザーで組織をホモジナイズした。ＢＢＭＶは、Wolfersberger (1993)のＭｇＣｌ２沈殿法によって調製した。簡潔には、３００ｍＭマンニトール中の等量の２４ｍＭ  ＭｇＣｌ２溶液を中腸ホモジネートと混合し、５分間撹拌し、氷上で１５分間静置させた。４度で１５分間、２，５００×ｇで溶液を遠心分離した。上清を保存し、元の容量の０．５倍希釈のホモジナイゼーション緩衝液にペレットを懸濁して再び遠心分離した。２つの上清を合わせ、４度で３０分間、２７，０００×ｇで遠心分離してＢＢＭＶ分画を形成した。ペレットをＢＢＭＶ保存緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１３０ｍＭ  ＫＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ７．４）に懸濁して、約３ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度にした。タンパク質濃度は、標準としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて測定した。ＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍ（商標）ＤＡＬＰ−２５０アルカリ性ホスファターゼアッセイキット（Ｇｅｎｔａｕｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｋａｍｐｅｎｈｏｕｔ、ＢＥ）を製造業者の説明書に従って用いて、試料を冷凍する前にアルカリ性ホスファターゼ（ＢＢＭＶ分画のマーカー酵素）を測定した。この酵素の比活性は、開始中腸ホモジネート分画で見られるものと比較して一般的に７倍増加した。ＢＢＭＶを２５０μＬの試料に等分し、液体窒素で瞬間冷凍し、−８０度で保存した。
【０１０２】
電気泳動。還元（すなわち、５％β−メルカプトエタノール、ＢＭＥ）および変性（すなわち、２％ＳＤＳの存在下で９０度で５分間加熱）条件の下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるタンパク質の分析を実行した。タンパク質を４％から２０％のトリス−グリシンポリアクリルアミドゲル（ＢｉｏＲａｄ；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）のウェルに加え、２００ボルトで６０分間分離した。クマシーブリリアントブルーＲ−２５０（ＢｉｏＲａｄ）で１時間の染色によってタンパク質のバンドを検出し、７％酢酸中の５％メタノールの溶液で脱色した。ＢｉｏＲａｄ  Ｆｌｕｒｏ−Ｓ  Ｍｕｌｔｉ  Ｉｍａｇｅｒ（商標）を用いてゲルを画像化し、分析した。タンパク質バンドの相対的な分子量は、ゲルの１つのウェルに加えられたＢｅｎｃｈＭａｒｋ（商標）タンパク質ラダー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）の試料で観察された既知の分子量のタンパク質の移動度との比較によって決定した。
【０１０３】
Ｃｒｙ１Ｄａコア毒素タンパク質のヨウ素化。精製されたＣｒｙ１Ｄａコア毒素タンパク質を、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｉｏｄｉｎａｔｉｏｎ  Ｂｅａｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いてヨウ素化した。簡潔には、２つのｌｏｄｉｎａｔｉｏｎ  Ｂｅａｄｓを５００μＬのＰＢＳ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で２回洗浄し、１００μＬのＰＢＳを有する１．５ｍＬ遠心管に入れた。０．５ｍＣｉの１２５Ｉ標識ヨウ化ナトリウムを加え、構成成分を室温で５分間反応させ、次に１μｇのＣｒｙ１Ｄａコア毒素タンパク質を溶液に加え、さらなる３〜５分間反応させた。Ｉｏｄｉｎａｔｉｏｎ  Ｂｅａｄｓから溶液をピペットで吸い取り、それを５０ｍＭ  ＣＡＰＳ、ｐＨ１０．０、１ｍＭ  ＤＴＴ（ジチオスレイトール）、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび５％グリセロールで平衡させたＺｅｂａ（商標）スピンカラム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に加えることによって、反応を停止した。Ｉｏｄｉｎａｔｉｏｎ  Ｂｅａｄｓを１０μＬのＰＢＳで２回洗浄し、洗浄溶液もＺｅｂａ（商標）脱塩カラムに加えた。放射性溶液を１，０００×ｇで２分間の遠心によってスピンカラムを通して溶出した。１２５Ｉ放射性標識Ｃｒｙ１Ｄａコア毒素タンパク質を、５０ｍＭ  ＣＡＰＳ、ｐＨ１０．０、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび５％グリセロールに対して次に透析した。
【０１０４】
画像化。ヨウ素化されたＣｒｙ１Ｄａコア毒素タンパク質の放射純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび蛍光画像化によって測定した。簡潔には、製造業者の説明書に従ってＢｉｏＲａｄゲル乾燥装置を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを乾燥させた。マイラー膜（厚さ１２μｍ）で包み、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ貯蔵蛍光スクリーン（３５ｃｍ×４３ｃｍ）の下でそれらを１時間露光させることによって、乾燥ゲルを画像化した。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｓｔｏｒｍ  ８２０蛍光造影装置を用いてプレートを現像し、像はＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（商標）ソフトウェアを用いて分析した。
【実施例６】
【０１０５】
スポドプテラ・フルジペルダ（Spodoptera frugiperda）からのＢＢＭＶへの１２５Ｉ標識Ｃｒｙ１コア毒素タンパク質の結合
Ｃｒｙ１ＤａおよびＣｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質による結合アッセイで用いるためにＢＢＭＶタンパク質の最適量を決定するために、飽和曲線を生成した。０．５ｎＭの１２５Ｉ放射性標識Ｃｒｙ１コア毒素タンパク質を、０μｇ／ｍＬから５００μｇ／ｍＬのＢＢＭＶタンパク質の量と一緒に、結合緩衝液（８ｍＭ  ＮａＨＰＯ４、２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％ＢＳＡ、ｐＨ７．４）中で２８度で１時間インキュベートした（０．５ｍＬの全容量）。反応混合液の１５０μＬを３反復で別々の１．５ｍＬ遠心管に採取し、室温で８分間の１４，０００×ｇで試料を遠心分離することによって、ＢＢＭＶタンパク質に結合した１２５Ｉ標識Ｃｒｙ１コア毒素タンパク質を未結合の分画から分離した。上清を静かに除去し、氷冷結合緩衝液でペレットを３回洗浄した。ペレットを含む遠心管の底を切り離し、１３×７５ｍｍガラス培養管に入れ、試料を各々ガンマ計数器で５分間数えた。得られたＣＰＭ（１分あたりのカウント数）からバックグラウンドＣＰＭ（ＢＢＭＶタンパク質のない反応）を引いたものを、ＢＢＭＶタンパク質濃度に対してプロットした。他の者（Luoら, 1999）によって報告された結果と一致して、結合アッセイで用いるＢＢＭＶタンパク質の最適濃度は、１５０μｇ／ｍＬであると決定された。
【実施例７】
【０１０６】
Ｃｒｙ１ＤａおよびＣｒｙ１Ｆａのコア毒素タンパク質によるＳ．フルジペルダ（S. frugiperda）からのＢＢＭＶへの競合結合アッセイ
相同的および非相同的競合結合アッセイは、１５０μｇ／ｍＬのＳ．フルジペルダ（S. frugiperda）ＢＢＭＶタンパク質および０．５ｎＭの１２５Ｉ放射性標識Ｃｒｙ１Ｄａコア毒素タンパク質を用いて実施した。真の結合競合を保証するために、反応混合液に加えられた競合的非放射性標識Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質の濃度は０．０４５ｎＭから１０００ｎＭであって、放射性Ｃｒｙ１Ｄａコア毒素タンパク質と同時に加えられた。インキュベーションを２８度で１時間実施し、ＢＢＭＶに結合した（特異的結合）１２５Ｉ標識Ｃｒｙ１Ｄａコア毒素タンパク質の量を前記のように測定した。１，０００ｎＭの非放射性標識Ｃｒｙ１Ｄａコア毒素タンパク質の存在下で得られたカウント数によって、非特異的結合を表した。１００パーセントの全結合は、いかなる競合者Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質もない場合の結合の量であるとみなされた。
【０１０７】
１２５Ｉ標識Ｃｒｙ１Ｄａコア毒素タンパク質を用いる受容体結合性アッセイは、Ｓ．フルジペルダ（S. frugiperda）からのＢＢＭＶの上のその結合部位からこの放射性標識リガンドを置換するＣｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質の能力を判定した。Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質が、１０００ｎＭ（放射性結合リガンドの濃度の２０００倍）という高い濃度で、結合した１２５Ｉ標識Ｃｒｙ１Ｄａコア毒素タンパク質をその受容体タンパク質（複数可）から置換しなかったことを結果は示す。予想通りに、非標識のＣｒｙ１Ｄａコア毒素タンパク質は放射性標識Ｃｒｙ１Ｄａコア毒素タンパク質をその結合タンパク質（複数可）から置換することができ、Ｓ字状用量反応曲線を示し、５０％置換は５ｎＭで起こった。
【０１０８】
したがって、Ｃｒｙ１Ｄａコア毒素タンパク質は、Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質に結合しないＳ．フルジペルダ（S. frugiperda）ＢＢＭＶの結合部位と相互作用することが示されている。
【０１０９】
【表４】
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【０１１０】
【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
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