(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
メラノーマ治療剤候補化合物を同定する方法であって、
ａ）候補化合物をメラノーマ細胞培養物、またはメラノーマ細胞に由来する細胞株と接触させる工程と、
ｂ）以下のパラメータｉ〜ｉｉｉ：
ｉ．ＭＤＡ−５の活性化のレベル；
ｉｉ．ＮＯＸＡ発現のレベル；
ｉｉｉ．またはこれらの組合せ
のうちの少なくとも１つを決定する工程と、
ｃ）工程ｂ）で得られたデータを、同様に前記候補化合物の非存在下で処理された同じ細胞の対照で観察されるデータと比較する工程と、
ｄ）前記対照と比較して、工程ｂ）で決定されたパラメータの顕著な増大を生じさせた化合物を選択する工程とを含み、
前記候補化合物は、正常なメラノサイトに影響を及ぼすことなく、メラノーマ細胞において、またはメラノーマ細胞に由来する細胞株においてオートファジーを誘導する
ことを特徴とするメラノーマ治療剤候補化合物を同定する方法。
【請求項２】
選択された化合物が、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）またはその類似体とポリカチオンの組合せを含む
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記選択された化合物が、ポリイノシン−ポリシチジル酸（ｐＩＣ）とポリエチレンイミン（ＰＥＩ）の組合せを含む
請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記候補化合物が、ポリイノシン−ポリシチジル酸と線状ポリエチレンイミンの組合せを１〜５のＮ／Ｐ比で含む複合体である
請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記オートファジー誘導の決定が、発現レベル、翻訳後修飾の存在またはタンパク質オートファジーの細胞内局在を調べることによって行なわれる
請求項１ないし４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記オートファジーの誘導が、以下の群：
ｉ．タンパク質ＬＣ３の電気泳動移動度の変化、または
ｉｉ．タンパク質ＬＣ３のフォーカス形成の検出
から選択される手法によって決定される
請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記オートファジーの誘導が、オートファゴソームの存在をその顕微鏡観察によって調べることによって決定される
請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＭＤＡ−５の活性化レベル、ＮＯＸＡの発現レベル及びオートファジーの誘導が決定される
請求項１ないし７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記メラノーマ細胞に由来する細胞株が、ヒト細胞株：ＳＫ−Ｍｅｌ−１９、ＳＫ−Ｍｅｌ−２８、ＳＫ−Ｍｅｌ−１０３及びＳＫ−Ｍｅｌ−１４７、ならびにＢ１６マウス細胞の群から選択される
請求項１ないし８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
以下の群：
ａ）膵癌細胞株ＩＭＩＭＰＣ２、ＭｉａＰａＣａ２、ＡｓｐｃＩ、Ａ６Ｌ、ＳＫＰＣＩ及びＰａｎｃ−１；
ｂ）大腸癌細胞株ＣＡＣＯ、ＳＷ４８０及びＳＷ１２２２；
ｃ）膀胱癌細胞株ＲＴＩ  １２、ＭＧＨＵ４、６３９Ｖ、２５３Ｊ、ＭＧＨｕ３及びＳＷＩ  １７０；
ｄ）神経膠腫細胞株Ｕ８７ＭＧ、Ｕ２５１及びＴ９８Ｇ；
ｅ）乳癌細胞株ＭＤＡ２３１、ＭＣＦ７及びＴ４７Ｄ；
ｆ）前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰ、ＰＣ３及びＤＵ１４５；
ｇ）肺癌細胞株Ｈ１２９９及びＮＣＩ  Ｈ４６０；または
ｈ）卵巣癌細胞株ＮＣＩ  Ｈ２３、ＣＨＱＫＩ及びＳＫ−ＯＶ−３
から選択される細胞株においてオートファジー及びアポトーシスをさらに誘導する化合物の同定のための
請求項１ないし９のいずれかに記載の方法の使用。
【請求項１１】
以下の種類の癌：膵癌、大腸癌、膀胱癌、神経膠腫、乳癌、前立腺癌、肺癌及び卵巣癌のうちの少なくとも１つを治療するための治療剤として使用すべき化合物を同定するための
請求項１０に記載の方法の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍学分野に関するものであり、様々な種類の癌、例えば、メラノーマ、膵癌、大腸癌、膀胱癌、神経膠腫、乳癌、前立腺癌、肺癌及び卵巣癌を治療するために使用することができる化合物を同定することに特に関する。
【０００２】
さらに、本発明は、そのようなプロセスによって同定される化合物、例えば、上に示された全ての種類の癌において明らかな腫瘍細胞の死を促進することができる化合物ＢＯ−１１０（後述）にも及ぶ。
【背景技術】
【０００３】
メラノーマは、発生率がますます増加し、進行期では極めて予後が悪い固形癌の原型であり続けている（Ｊｅｍａｌら、２００８（非特許文献１））。メラノーマの化学耐性及び免疫耐性の背後にある分子決定因子の同定に相当な努力が注がれてきた。米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって転移性メラノーマの治療用に承認された唯一の薬剤は、アルキル化剤のデカルバジン（ＤＴＩＣ）と免疫調節物質のＩＬ−２である（Ｔａｗｂｉ及びＫｉｒｋｗｏｏｄ、２００７（非特許文献２））。しかし、転移性メラノーマにおける持続的でかつ完全な応答が５％を超える患者の利益になることは稀であり、副次的な毒性は重篤である可能性がある。その結果として、転移性メラノーマ患者の現在の平均生存期間は６〜１０カ月であり、そのため、改善された治療の開発は、この疾患において優先すべき事項である（Ｊｅｍａｌら、２００７）。
【０００４】
ｐＩＣ（ポリイノシン−ポリシチジル酸）と呼ばれるウイルスｄｓＲＮＡ合成類似体は、インターフェロン（ＩＦＮ）とは独立に免疫系を刺激するために４０年以上にわたって使用されている化合物であるが（Ｆｉｅｌｄら、１９６７（非特許文献３））、これは、当初、メラノーマに対する有望な治療剤であると考えられた。残念なことに、裸のｐＩＣを用いた臨床試験により、その低い安定性、低いＩＦＮ誘導及びメラノーマに対する抗腫瘍効果の欠如が明らかになった（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、１９７６（非特許文献４））。したがって、ｐＩＣは、単剤としては、メラノーマに対する不良な薬剤とみなされた。
【０００５】
ハイスループットな組織学的解析及び体系的な機能研究により、メラノーマのイニシエーション及び進行ならびに治療失敗と関連するその複雑な機構について、我々の理解は顕著に深まった（Ｆｅｃｈｅｒら、２００７（非特許文献５）；Ｇｒａｙ−Ｓｃｈｏｐｆｅｒら、２００７（非特許文献６））。ＢＲＡＦ／ＭＡＰＫ；ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ、ＮＦ−κＢまたはＮＯＴＣＨシグナル伝達カスケードにおける共通した欠陥及び変化が同定されつつあり、合理的な薬物設計のための素晴らしいプラットフォームが提供されている（Ｇｒａｙ−Ｓｃｈｏｐｆｅｒら、２００７（非特許文献６））。しかしながら、標的治療は、メラノーマの治験で効果があることがまだ証明されていない（Ｆｌａｈｅｒｔｙ、２００６）。ミトコンドリアによって及び／または小胞体によって制御される死のプログラムも評価されているが、インビボではいつも効果がない（Ｈｅｒｓｅｙ及びＺｈａｎｇ、２００８（非特許文献８））。その結果として、現在の抗癌剤は、生産性の高い様式ではその標的に到達しないか、または正常な細胞コンパートメントに対して耐え難い毒性をもたらす投与スケジュールで投与しなければならないかのどちらかである（Ｔａｗｂｉ及びＫｉｒｋｗｏｏｄ、２００７（非特許文献２））。重要なのは、治療中に代償機構が活性化されて、さらにより高い化学療法耐性を有する細胞集団が選択され得ることである（Ｌｅｖら、２００４（非特許文献９）；Ｓｃｈａｔｔｏｎら、２００８（非特許文献１０）；Ｗｏｌｔｅｒら、２００７（非特許文献１１））。
【０００６】
実際、メラノーマは、様々な経路を通じてアポトーシスから逃れる強い能力を有すると考えられており、これらの経路によって、進行し、転移を形成し、かつ様々な療法による治療から生き残る能力がメラノーマに与えられている（Ｉｖａｎｏｖら、２００３（非特許文献１２）によって概説されている）。
【０００７】
主に「内部」から（すなわち、内在性の細胞死のプログラムを活性化することによって）腫瘍細胞を死滅させることを目的とする標準的な化学療法とは対照的に、免疫療法は、従来、細胞−細胞相互作用の間接的なカスケードを必要としてきた。メラノーマにおいて、ほとんどの努力は、２つのコンパートメント、すなわち、抗原提示細胞と細胞傷害性Ｔ細胞のレベルまたは機能的効力を高めることに注がれてきた（Ｗｉｌｃｏｘ及びＭａｒｋｏｖｉｃ、２００７（非特許文献１３））。抑制性免疫調節物質（例えば、ＣＴＬ４）に対するワクチン及び抗体も試験中であるが、フェーズＩＶ臨床試験では失望させるような結果が出ている（Ｋｉｒｋｗｏｏｄら、２００８（非特許文献１４））。最近では、ナチュラルキラー（ＮＫ）、樹状細胞（ＤＣ）及びＴ細胞によるメラノーマ細胞の細胞傷害性破壊を支持するために、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）−３、−４、−７及び９の活性化による自然免疫系の刺激が追求されている（Ｋｉｒｋｗｏｏｄら、２００８（非特許文献１４）、及びＴｏｒｍｏら、２００７）。
しかしながら、本発明者ら自身の研究を含む複数の研究から、免疫反応性表面マーカーを下方調節する（編集する）ことによって免疫学的療法を回避する細胞の先天的な能力が証明された。メラノーマもまた、宿主に対する抑制的効果（例えば、抗原提示細胞の成熟の阻害または完全なＴ細胞活性化の阻止）を発揮することができる（Ｔｏｒｍｏら、２００６（非特許文献１５）；Ｉｌｋｏｖｉｔｃｈ及びＬｏｐｅｚ、２００８（非特許文献１６）；Ｖｅｒｍａら、２００８（非特許文献１７））。したがって、メラノーマは、免疫調節物質の抗腫瘍活性を回避する遺伝的能力を示す。
【０００８】
免疫療法の分野において、その増加がメラノーマ治療のための潜在的なプラスの因子として研究されている分子の１つは、もともとはメラノーマ分化と関連する遺伝子として記載された産物であるＭＤＡ−５（メラノーマ分化関連遺伝子５）である（Ｋａｎｇら、２００２（非特許文献１８））。ＭＤＡ−５は、長い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を認識し、それによって活性化されるヘリカーゼである（Ｙｏｎｅｙａｍａら、２００５（非特許文献１９））。他のＲＮＡヘリカーゼは、短いｄｓＲＮＡの裸の３つのリン酸エステルを認識するＲＩＧ−１（レチノイン酸誘導性タンパク質１、別名Ｄｓｘ５８）、及びｄｓＲＮＡセンシングにおける負の調節因子であるＬＧＰ２（別名Ｄｈｘ５８）である。
【０００９】
長いｄｓＲＮＡは、ウイルス感染によって及びウイルス感染時に生成され得るので、ＭＤＡ−５は、ウイルス病原体に対する自然免疫の最前線の機能を果たす（Ａｋｉｒａら、２００６（非特許文献２０））。さらに、ＭＤＡ−５は、カスパーゼ活性化動員ドメイン（ＣＡＲＤ）を有する。つまり、ヘリカーゼドメイン及びＣＡＲＤドメインは、ＮＦ−κＢ及びサイトカイン調節に関与する他の転写因子を活性化する（Ｋａｗａｉら、２００５（非特許文献２１））。このように、ＭＤＡ−５の最もよく知られた機能は免疫刺激である。
【００１０】
治療予測から、ＩＦＮ−βとｄｓＲＮＡは両方とも、Ｍｄａ−５遺伝子の転写を誘導することが知られている。そのため、ｄｓＲＮＡは、ＩＦＮ誘導性の増殖阻害におけるＭｄａ−５発現の増加に役割を果たすことが提唱されている。さらに、ＩＦＮ−βによる内在性ＭＤＡ−５の誘導が、細胞増殖抑制性である（言い換えれば、細胞周期を停止させる）ことが示されている（Ｋａｎｇら、２００２（非特許文献１８））。したがって、腫瘍細胞死を活性化するためには、ＭＤＡ−５を高レベルで異所性に過剰発現させなければならなかった（Ｋｏｖａｃｓｏｖｉｃｓら、２００２（非特許文献２２））。さらに、こうしたＭＤＡ−５の異所発現のアポトーシス促進活性は、メラノーマの場合と同じく（Ｃｈｉｎら、２００６（非特許文献２３））、非常に活発なＲＡＳ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路を有する腫瘍細胞では効果がない（Ｌｉｎら、２００６（非特許文献２４））。したがって、この分野における懸案は、（正常細胞における副次的な毒性を誘導することなく）腫瘍コンパートメントにだけ限定された様式で、化学療法剤を用いて、いかにして内在性ＭＤＡ−５を活性化するかということであった。
【００１１】
米国特許出願第２００７／０２５９３７２号（特許文献１）では、ＭＤＡ−５の発現を増強することができる化合物によるＩＦＮ−β、ＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−γのアゴニストまたはアンタゴニストの同定が提案されている。特許文献１は、（そのプロモーターによる）Ｍｄａ−５遺伝子発現の誘導物質は、腫瘍細胞の最終分化の誘導のための候補化合物とみなすことができることも示唆している。特許文献１は、そのＣＡＲＤドメインを通じたアポトーシスシグナルの生成におけるＭＤＡ−５の考えられる役割も示唆している。
しかしながら、これまでのところ、どれがアポトーシスを誘発することができるＭＤＡ−５の標的であるのかということ、及び腫瘍細胞について追跡可能でかつ選択的な方法で、いかにしてそれを活性化するのかということが知られていなかった。さらに、メラノーマ細胞は、（ＭＤＡ−５を阻害する）活発なＲＡＳ／ＭＥＫ／ＥＲＫ活性経路、及びアポトーシスによる細胞死を回避する際立った能力を有するので、ＭＤＡ−５によって仲介されるアポトーシスシグナルが、メラノーマに対する治療のための有効な機構であることが明らかでなかった。そのため、ＭＤＡ−５の調節と機能に関するこれまでの情報から、このタンパク質は、メラノーマに対する治療剤の候補を同定する手順のための強力な標的として現われなかった。
【００１２】
オートファジーは、癌細胞の内在性の死の機構を働かせるための代替戦略として浮上している。
【００１３】
この過程は、後のリソソームによる分解のために細胞質構成要素の隔離を最終的にもたらす一連の複雑な事象を含む（Ｘｉｅ及びＫｌｉｏｎｓｋｙ、２００７（非特許文献２５））。オートリソソームに送達されるカーゴの飲込みの機構及びこのようなカーゴの性質によって、オートファジーの複数の機構が記載されている。抗癌治療との関連で、マクロオートファジー、すなわち、細胞オルガネラ及びタンパク質凝集物の大量分解は、重要なオルガネラ（例えば、小胞体またはミトコンドリア）の機能障害または過剰喪失によって細胞の生存を危うくするその潜在能力のために関心が高まっている（Ｈｏｙｅｒ−Ｈａｎｓｅｎ、２００８（非特許文献２６））。
【００１４】
しかしながら、オートファジーがどのように調節されているのかは不明であり、その治療的潜在能力は、明瞭でも単純でもない（Ｈｉｐｐｅｒｔら、２００６（非特許文献２７））。他方、マクロオートファジー（以下、本発明者らは単に「オートファジー」と称することにする）は、抗癌剤を含む、多種多様な攻撃性の細胞内及び細胞外シグナルに対して細胞を保護する顕著な潜在能力を示している。この活性により、オートファジーは、腫瘍の発達を促進することができる（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａら、２００８（非特許文献２８）；Ｋｒｏｅｍｅｒ及びＬｅｖｉｎｅ、２００８（非特許文献２９））。
【００１５】
逆説的に、オートファジーは、細胞死とも関連付けられている（Ｋｒｏｍｅｒら、２００９（非特許文献３０））。したがって、過剰なまたは持続的なオートファジーは、重要なオルガネラ（すなわち、小胞体またはミトコンドリア）の喪失による細胞の死滅、生存シグナルの再構築、リソソーム酵素の脱調節、及び／またはカスパーゼ依存的アポトーシスプログラムの活性化を促進することができる（Ｘｉｅ及びＫｌｉｏｎｓｋｙ、２００７（非特許文献２５））。
【００１６】
その結果として、オートファジーが、治療応答を改善する代わりに、メラノーマの化学及び免疫耐性を悪化させるか否かが明瞭でなかった。さらに、哺乳動物細胞で最新に記載されている２０を超えるオートファジー遺伝子の中に、メラノーマで詳細に特徴付けされているものはない。そのため、治療的介入のための新しい窓を開く、メラノーマ及び正常細胞における異なる様式でのオートファジーの調節の有無は不明である。同様の状況は、侵襲性の癌（例えば、膵臓、膀胱、前立腺及び脳を侵す癌）に当てはまる。
【００１７】
こうした状況で、既に承認され、特に、免疫不全患者の治療に有効な治療剤に代わる、癌を治療するための治療剤の同定が残されている。また、新しい治療標的候補を同定して、これらの標的に作用することができる化合物の中から癌を治療するための候補治療剤を同定するための手順を開発する必要も残されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】米国特許第２００７／０２５９３７２号
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Ｊｅｍａｌ，Ａ．，Ｓｉｅｇｅｌ，Ｒ．，Ｗａｒｄ，Ｅ．，Ｈａｏ，Ｙ．，Ｘｕ，Ｊ．，Ｍｕｒｒａｙ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｔｈｕｎ，Ｍ．Ｊ．２００８．Ｃａｎｃｅｒ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，２００８．ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  ５８：７１−９６
【非特許文献２】Ｔａｗｂｉ，Ｈ．Ａ．，ａｎｄ  Ｋｉｒｋｗｏｏｄ，Ｊ．Ｍ．２００７．Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ３４：５３２−５４５
【非特許文献３】Ｆｉｅｌｄ，Ａ．Ｋ．，Ｔｙｔｅｌｌ，Ａ．Ａ．，Ｌａｍｐｓｏｎ，Ｇ．Ｐ．，ａｎｄ  Ｈｉｌｌｅｍａｎ，Ｍ．Ｒ．１９６７．Ｉｎｄｕｃｅｒｓ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｎｄ  ｈｏｓｔ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．ＩＩ．Ｍｕｌｔｉｓｔｒａｎｄｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ５８：１００４−１０１０
【非特許文献４】Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｒ．Ａ．，ＤｅＶｉｔａ，Ｖ．Ｔ．，Ｌｅｖｙ，Ｈ．Ｂ．，Ｂａｒｏｎ，Ｓ．，Ｈｕｂｂａｒｄ，Ｓ．Ｐ．，ａｎｄ  Ｌｅｖｉｎｅ，Ａ．Ｓ．１９７６．Ａ  ｐｈａｓｅ  Ｉ−ＩＩ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ−ｄｏｓｅ  ｐｏｌｙｒｉｂｏｉｎｏｓｉｃ−ｐｏｌｙｒｉｂｏｃｙｔｉｄｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｏｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｏｒ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  ５７：５９９−６０２
【非特許文献５】Ｆｅｃｈｅｒ，Ｌ．Ａ．，Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｓ．Ｄ．，Ｋｅｅｆｅ，Ｍ．Ｊ．，ａｎｄ  Ａｌａｎｉ，Ｒ．Ｍ．２００７．Ｔｏｗａｒｄ  ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２５：１６０６−１６２０
【非特許文献６】Ｇｒａｙ−Ｓｃｈｏｐｆｅｒ，Ｖ．，Ｗｅｌｌｂｒｏｃｋ，Ｃ，ａｎｄ  Ｍａｒａｉｓ，Ｒ．２００７．Ｍｅｌａｎｏｍａ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｎｅｗ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔｕｒｅ  ４４５：８５１−８５７
【非特許文献７】Ｆｌａｈｅｒｔｙ，Ｋ．Ｔ．２００６．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １２：２３６６ｓ−２３７０ｓ
【非特許文献８】Ｈｅｒｓｅｙ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｚｈａｎｇ，Ｘ．Ｄ．２００８．Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ  ｔｏ  ＥＲ  ｓｔｒｅｓｓ  ａｓ  ａ  ｄｒｉｖｅｒ  ｏｆ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ  ａｎｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｐｉｇｍｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｒｅｓ  ２１：３５８−３６７
【非特許文献９】Ｌｅｖ，Ｄ．Ｃ，Ｏｎｎ，Ａ．，Ｍｅｌｉｎｋｏｖａ，Ｖ．Ｏ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｃ，Ｓｔｏｎｅ，Ｖ．，Ｒｕｉｚ，Ｍ．，ＭｃＧａｒｙ，Ｅ．Ｃ，Ａｎａｎｔｈａｓｗａｍｙ，Ｈ．Ｎ．，Ｐｒｉｃｅ，Ｊ．Ｅ．，ａｎｄ  Ｂａｒ−Ｅｌｉ，Ｍ．２００４．Ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｏｆ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２２：２０９２−２１００
【非特許文献１０】Ｓｃｈａｔｔｏｎ，Ｔ．，Ｍｕｒｐｈｙ，Ｇ．Ｆ．，Ｆｒａｎｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｙａｍａｕｒａ，Ｋ．，Ｗａａｇａ−Ｇａｓｓｅｒ，Ａ．Ｍ．，Ｇａｓｓｅｒ，Ｍ．，Ｚｈａｎ，Ｑ．，Ｊｏｒｄａｎ，Ｓ．，Ｄｕｎｃａｎ，Ｌ．Ｍ．，Ｗｅｉｓｈａｕｐｔ，Ｃ，ｅｔ  ａｌ．２００８．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｍａｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４５１：３４５−３４９
【非特許文献１１】Ｗｏｌｔｅｒ，Ｋ．Ｇ．，Ｖｅｒｈａｅｇｅｎ，Ｍ．，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｙ．，Ｎｉｋｏｌｏｖｓｋａ−Ｃｏｌｅｓｋａ，Ｚ．，Ｒｉｂｌｅｔｔ，Ｍ．，ｄｅ  ｌａ  Ｖｅｇａ，Ｃ．Ｍ．，Ｗａｎｇ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｓｏｅｎｇａｓ，Ｍ．Ｓ．２００７．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｗｉｎｄｏｗ  ｆｏｒ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｐｒｏｖｉｄｅｄ  ｂｙ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｏｎ  Ｂｃｌ−２  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ  １４：１６０５−１６１６
【非特許文献１２】Ｉｖａｎｏｖ  ．Ｖ．Ｎ．，Ｂｈｏｕｍｉｋ  Ａ  ａｎｄ  Ｒｏｎａｉ  Ｚｅ’ｅｖ．２００３．Ｄｅａｔｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２：３１５２−３１６１
【非特許文献１３】Ｗｉｌｃｏｘ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｍａｒｋｏｖｉｃ，Ｓ．Ｎ．２００７．Ｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ：ｏｎ  ｔｈｅ  ｄａｗｎ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｅｒａ？  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ９：７０−７８
【非特許文献１４】Ｋｉｒｋｗｏｏｄ，Ｊ．Ｍ．，Ｔａｒｈｉｎｉ，Ａ．Ａ．，Ｐａｎｅｌｌｉ，Ｍ．Ｃ，Ｍｏｓｃｈｏｓ，Ｓ．Ｊ．，Ｚａｒｏｕｒ，Ｈ．Ｍ．，Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ，Ｌ．Ｈ．，ａｎｄ  Ｇｏｇａｓ，Ｈ．Ｊ．２００８．Ｎｅｘｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２６：３４４５−３４５５
【非特許文献１５】Ｔｏｒｍｏ，Ｄ．，Ｆｅｒｒｅｒ，Ａ．，Ｂｏｓｃｈ，Ｐ．，Ｇａｆｆａｌ，Ｅ．，Ｂａｓｎｅｒ−Ｔｓｃｈａｋａｒｊａｎ，Ｅ．，Ｗｅｎｚｅｌ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｔｕｔｉｎｇ，Ｔ．２００６．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ  ａｎｄ  ａｕｔｏｃｈｔｈｏｎｏｕｓ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６６：５４２７−５４３５
【非特許文献１６】Ｉｌｋｏｖｉｔｃｈ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｌｏｐｅｚ，Ｄ．Ｍ．２００８．Ｉｍｍｕｎｅ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｍｅｌａｎｏｍａ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆａｃｔｏｒｓ．Ｅｘｐ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．
【非特許文献１７】Ｖｅｒｍａ，Ｓ  ．，Ｐｅｔｒｅｌｌａ，Ｔ  ．，Ｈａｍｍ，Ｃ．  ，Ｂａｋ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｃｈａｒｅｔｔｅ，Ｍ．２００８．Ｂｉｏｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｍｅｌａｎｏｍａ：ａ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ．Ｃｕｒｒ  Ｏｎｃｏｌ  １５：８５−８９
【非特許文献１８】Ｋａｎｇ，Ｄ．Ｃ，Ｇｏｐａｌｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｒ．Ｖ．，Ｗｕ，Ｑ．，Ｊａｎｋｏｗｓｋｙ，Ｅ．，ＰｙＩｅ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｆｉｓｈｅｒ，Ｐ．Ｂ．２００２．ｍｄａ−５：Ａｎ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ＲＮＡ  ｈｅｌｉｃａｓｅ  ｗｉｔｈ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＡＴＰａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｇｒｏｗｔｈ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：６３７−６４２
【非特許文献１９】Ｙｏｎｅｙａｍａ，Ｍ．，Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｍ．，Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｋ．，Ｉｍａｉｚｕｍｉ，Ｔ．，Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ，Ｍ．，Ｔａｉｒａ，Ｋ．，Ｆｏｙ，Ｅ．，Ｌｏｏ，Ｙ．Ｍ．，Ｇａｌｅ，Ｍ．，Ｊｒ．，Ａｋｉｒａ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．２００５．Ｓｈａｒｅｄ  ａｎｄ  ｕｎｉｑｕｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＤＥｘＤ／Ｈ−ｂｏｘ  ｈｅｌｉｃａｓｅｓ  ＲＩＧ−Ｉ，ＭＤＡ５，ａｎｄ  ＬＧＰ２  ｉｎ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７５：２８５１−２８５８
【非特許文献２０】Ａｋｉｒａ，Ｓ．，Ｕｅｍａｔｓｕ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｏ．２００６．Ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｃｅｌｌ  １２４：７８３−８０１Ｂａｒｒａｌ，Ｐ．Ｍ．，Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｄｒａｈｏｓ，Ｊ．，Ｇｕｐｔａ，Ｐ．，Ｓａｒｋａｒ，Ｄ．，Ｆｉｓｈｅｒ，Ｐ．Ｂ．，ａｎｄ  Ｒａｃａｎｉｅｌｌｏ，Ｖ．Ｒ．２００７．ＭＤＡ−５  ｉｓ  ｃｌｅａｖｅｄ  ｉｎ  ｐｏｌｉｏ  ｖｉｒｕｓ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８１：３６７７−３６８４
【非特許文献２１】Ｋａｗａｉ，Ｔ．，Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．，Ｓａｔｏ，Ｓ．，Ｃｏｂａｎ，Ｃ，Ｋｕｍａｒ，Ｈ．，Ｋａｔｏ，Ｈ．，Ｉｓｈｉｉ，Ｋ．Ｊ．，Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｏ．，ａｎｄ  Ａｋｉｒａ，Ｓ．２００５．ＩＰＳ−Ｉ，ａｎ  ａｄａｐｔｏｒ  ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ  ＲＩＧ−Ｉ−  ａｎｄ  Ｍｄａ５−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ．Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６：９８１−９８８
【非特許文献２２】Ｋｏｖａｃｓｏｖｉｃｓ，Ｍ．，Ｍａｒｔｉｎｏｎ，Ｆ．，Ｍｉｃｈｅａｕ，Ｏ．，Ｂｏｄｍｅｒ，Ｊ．Ｌ．，Ｈｏｆｍａｎｎ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｔｓｃｈｏｐｐ，Ｊ．２００２．Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｌｉｃａｒｄ，ａ  ＣＡＲＤ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｈｅｌｉｃａｓｅ  ｃｌｅａｖｅｄ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ  ＤＮＡ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １２：８３８−８４３
【非特許文献２３】Ｃｈｉｎ，Ｌ．，Ｇａｒｒａｗａｙ，Ｌ．Ａ．，ａｎｄ  Ｆｉｓｈｅｒ，Ｄ．Ｅ．２００６．Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｍｅｌａｎｏｍａ：ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｅｒａ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ２０：２１４９−２１８２
【非特許文献２４】Ｌｉｎ，Ｌ．，Ｓｕ，Ｚ．，Ｌｅｂｅｄｅｖａ，Ｉ．Ｖ．，Ｇｕｐｔａ，Ｐ．，Ｂｏｕｋｅｒｃｈｅ，Ｈ．，Ｒａｉ，Ｔ．，Ｂａｒｂｅｒ，Ｇ．Ｎ．，Ｄｅｎｔ，Ｐ．，Ｓａｒｋａｒ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｆｉｓｈｅｒ，Ｐ．Ｂ．２００６．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒａｓ／Ｒａｆ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ−５−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ  １３：１９８２−１９９３
【非特許文献２５】Ｘｉｅ，Ｚ．，ａｎｄ  Ｋｌｉｏｎｓｋｙ，Ｄ．Ｊ．２００７．Ａｕｔｏｐｈａｇｏｓｏｍｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ：ｃｏｒｅ  ｍａｃｈｉｎｅｒｙ  ａｎｄ  ａｄａｐｔａｔｉｏｎｓ．Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ９：１１０２−１１０９
【非特許文献２６】Ｈｏｙｅｒ−Ｈａｎｓｅｎ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｊａａｔｔｅｌａ，Ｍ．２００８．Ａｕｔｏｐｈａｇｙ：ａｎ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ４：５７４−５８０
【非特許文献２７】Ｈｉｐｐｅｒｔ，Ｍ．Ｍ．，Ｏ’Ｔｏｏｌｅ，Ｐ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｔｈｏｒｂｕｒｎ，Ａ．２００６．Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ：ｇｏｏｄ，ｂａｄ，ｏｒ  ｂｏｔｈ？  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６６：９３４９−９３５１
【非特許文献２８】Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｎ．，Ｌｅｖｉｎｅ，Ｂ．，Ｃｕｅｒｖｏ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｋｌｉｏｎｓｋｙ，Ｄ．Ｊ．２００８．Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｆｉｇｈｔｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｅｌｆ−ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ４５１：１０６９−１０７５
【非特許文献２９】Ｋｒｏｅｍｅｒ，Ｇ．ａｎｄ  Ｌｅｖｉｎｅ，Ｂ．（２００８）．Ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ：ｔｈｅ  ｓｔｏｒｙ  ｏｆ  ａ  ｍｉｓｎｏｍｅｒ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ９：１００４−１０１０
【非特許文献３０】Ｋｒｏｅｍｅｒ，Ｇ．，Ｇａｌｌｕｚｉ，Ｌ．，Ｖａｎｄｅｎａｂｅｅｌｅ，Ｐ．，Ａｂｒａｍｓ，Ｊ．，Ａｌｎｅｍｒｉ，Ｅ．Ｓ．，Ｂａｅｈｒｅｃｋｅ，Ｅ．Ｈ．，Ｂｌａｇｏｓｋｌｏｎｎｙ，Ｍ．Ｖ．，Ｅｌ−Ｄｅｉｔｙ，Ｗ．Ｓ．，Ｇｏｌｓｔｅｉｎ，Ｐ．，Ｇｒｅｅｎ，Ｄ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．（２００９）．Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ：ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ  ｆｏ  ｔｈｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  ２００９．Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ  １６：３−１１
【非特許文献３１】Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｙ．，Ｖｅｒｈａｅｇｅｎ，Ｍ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｔ．Ｐ．，Ｒｕｓｈ，Ｊ．Ｌ．，Ｓｔｅｉｎｅｒ，Ｐ．，Ｏｐｉｐａｒｉ，Ａ．Ｗ．，Ｊｒ．，Ｌｏｗｅ，Ｓ．Ｗ．，ａｎｄ  Ｓｏｅｎｇａｓ，Ｍ．Ｓ．２００５．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｘａ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ：ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６５：６２９４−６３０４
【非特許文献３２】Ｄｅｎｏｙｅｌｌｅ，Ｃ，Ａｂｏｕ−Ｒｊａｉｌｙ，Ｇ．，Ｂｅｚｒｏｏｋｏｖｅ，Ｖ．，Ｖｅｒｈａｅｇｅｎ，Ｍ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｔ．Ｍ．，Ｆｕｌｌｅｎ，Ｄ．Ｒ．，Ｐｏｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｎ．，Ｇｒｕｂｅｒ，Ｓ．Ｂ．，Ｓｕ，Ｌ．Ｄ．，Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．２００６．Ａｎｔｉ−ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｂｙ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＭＡＰＫ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ８：１０５３−１０６３
【非特許文献３３】Ａｌｏｎｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００７
【非特許文献３４】Ａｃｋｅｒｍａｎｎ，Ｊ．，Ｆｒｕｔｓｃｈｉ，Ｍ．，Ｋａｌｏｕｌｉｓ，Ｋ．，ＭｃＫｅｅ，Ｔ．，Ｔｒｕｍｐｐ，Ａ．，ａｎｄ  Ｂｅｅｒｍａｎｎ，Ｆ．（２００５）．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｚｉｎｇ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｎ−ＲａｓＱ６１Ｋ  ｏｎ  ａｎ  ＩＮＫ４ａ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６５，４００５−４０１１
【非特許文献３５】Ｃｅｌａｄａ，Ａ．，Ｇｒａｙ，Ｐ．Ｗ．，Ｒｉｎｄｅｒｋｎｅｃｈｔ，Ｅ．，ａｎｄ  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｒ．Ｄ．１９８４．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａ  ｇａｍｍａ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｈａｔ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｔｕｍｏｒｉｃｉｄａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １６０：５５−７４
【非特許文献３６】Ｓｏｅｎｇａｓ，Ｍ．Ｓ．，Ｃａｐｏｄｉｅｃｉ，Ｐ．，Ｐｏｌｓｋｙ，Ｄ．，Ｍｏｒａ，Ｊ．，Ｅｓｔｅｌｌｅｒ，Ｍ．，Ｏｐｉｔｚ−Ａｒａｙａ，Ｘ．，ＭｃＣｏｍｂｉｅ，Ｒ．，Ｈｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｇ．，Ｇｅｒａｌｄ，Ｗ．Ｌ．，Ｌａｚｅｂｎｉｋ，Ｙ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．２００１．Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ａｐａｆ−１  ｉｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：２０７−２１１
【非特許文献３７】Ｋｌｉｏｎｓｋｙ，Ｄ．Ｊ．，Ａｂｅｌｉｏｖｉｃｈ，Ｈ．，Ａｇｏｓｔｉｎｉｓ，Ｐ．，Ａｇｒａｗａｌ，Ｄ．Ｋ．，Ａｌｉｅｖ，Ｇ．，Ａｓｋｅｗ，Ｄ．Ｓ．，Ｂａｂａ，Ｍ．，Ｂａｅｈｒｅｃｋｅ，Ｅ．Ｈ．，Ｂａｈｒ，Ｂ．Ａ．，Ｂａｌｌａｂｉｏ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．２００８．Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｉｎ  ｈｉｇｈｅｒ  ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ．Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ４：１５１−１７５
【非特許文献３８】Ｓｏｅｎｇａｓ，Ｍ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｌｏｗｅ，Ｓ．Ｗ．２００３．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｃｈｅｍｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２：３１３８−３１５１
【非特許文献３９】Ｗｅｎｚｅｌ，Ｊ．，Ｔｏｒｍｏ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｔｕｔｉｎｇ，Ｔ．２００８．Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｇｏｎｉｓｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｋｉｎ  ｃａｎｃｅｒ：ｈｉｓｔｏｒｙ，ｃｕｒｒｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ．Ｈａｎｄｂ  Ｅｘｐ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ：２０１−２２０
【非特許文献４０】Ｐａｙｎｅ，Ｃ．Ｋ．２００７．Ｉｍａｇｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｗｉｔｈ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．Ｎａｎｏｍｅｄ  ２：８４７−８６０
【非特許文献４１】Ｍａｉｕｒｉ，Ｍ．Ｃ，Ｚａｌｃｋｖａｒ，Ｅ．，Ｋｉｍｃｈｉ，Ａ．，ａｎｄ  Ｋｒｏｅｍｅｒ，Ｇ．２００７．Ｓｅｌｆ−ｅａｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｅｌｆｋｉｌｌｉｎｇ：ｃｒｏｓｓｔａｌｋ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ａｎｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ８：７４１−７５２
【非特許文献４２】Ｆｅｈｒｅｎｂａｃｈｅｒ，Ｎ．，ａｎｄ  Ｊａａｔｔｅｌａ，Ｍ．２００５．Ｌｙｓｏｓｏｍｅｓ  ａｓ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６５：２９９３−２９９５
【非特許文献４４】Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｙ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｔ．Ｐ．，Ｄｅｎｏｙｅｌｌｅ，Ｃ，Ｅｓｔｅｂａｎ，Ｊ．Ａ．，Ｔａｎｇ，Ｗ．Ｈ．，Ｂｅｎｇｓｔｏｎ，Ａ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｓｏｅｎｇａｓ，Ｍ．Ｓ．２００６．Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｌｏｃｋａｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ：ｉｍｐａｃｔ  ｏｎ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１：１１０７−１１１８
【非特許文献４５】Ｓｏｅｎｇａｓ，Ｍ．Ｓ．，Ｇｅｒａｌｄ，Ｗ．Ｌ．，Ｃｏｒｄｏｎ−Ｃａｒｄｏ，Ｃ，Ｌａｚｅｂｎｉｋ，Ｙ．，ａｎｄ  Ｌｏｗｅ，Ｓ．Ｗ．２００６．Ａｐａｆ−１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ  １３：３５２−３５３
【非特許文献４６】Ｑｉｎ，Ｊ．Ｚ．，Ｚｉｆｆｒａ，Ｊ．，Ｓｔｅｎｎｅｔｔ，Ｌ．，Ｂｏｄｎｅｒ，Ｂ．，Ｂｏｎｉｓｈ，Ｂ．Ｋ．，Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉ，Ｖ．，Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｆ．，Ｐｏｌｌｏｃｋ，Ｐ．Ｍ．，Ｔｒｅｎｔ，Ｊ．Ｍ．，Ｈｅｎｄｒｉｘ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．２００５．Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｔｒｉｇｇｅｒ  ＮＯＸＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ａｎｄ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６５：６２８２−６２９３
【非特許文献４７】Ｑｉｎ，Ｊ．Ｚ．，Ｘｉｎ，Ｈ．，Ｓｉｔａｉｌｏ，Ｌ．Ａ．，Ｄｅｎｎｉｎｇ，Ｍ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ，Ｂ．Ｊ．２００６．Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｋｉｌｌｉｎｇ  ｏｆ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｍｃｌ−１  ａｎｄ  ＮＯＸＡ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６６：９６３６−９６４５
【非特許文献４８】Ｃｒｏｙ，Ｂ．Ａ．，ａｎｄ  Ｃｈａｐｅａｕ，Ｃ．１９９０．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｅｇｎａｎｃｙ  ｉｍｍｕｎｏｔｒｏｐｈｉｓｍ  ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ  ｂｙ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｏｆ  ｙｏｕｎｇ  ａｄｕｌｔ  ｍｉｃｅ  ｏｆ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ  ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ．ｂｇ／ｂｇ．Ｊ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｆｅｒｔｉｌ  ８８：２３１−２３９
【非特許文献４８】Ｋａｎｇ，Ｄ．Ｃ，Ｇｏｐａｌｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｒ．Ｖ．，Ｌｉｎ，Ｌ．，Ｒａｎｄｏｌｐｈ，Ａ．，Ｖａｌｅｒｉｅ，Ｋ．，Ｐｅｓｔｋａ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｆｉｓｈｅｒ，Ｐ．Ｂ．（２００４）．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ−５，ｍｄａ−５：ａ  ｎｏｖｅｌ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｇｅｎｅ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２３，１７８９−１８００
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明は、上述の両方の問題の解決法を提示することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
上に言及したように、本発明はまず、（これらの治療標的、マーカーまたはパラメータに作用することができる化合物の中からの）癌を治療することができる化合物の同定に有用なプロセスの開発の基礎を定める、治療標的、マーカー、またはパラメータの同定に重点を置いている。
【００２２】
癌を治療することができる化合物の同定に有用であり、本発明で同定されるマーカーの１つは、ファミリーヘリカーゼＭＤＡ−５の活性化のレベルである。このパラメータは、ヘリカーゼドメインとカスパーゼドメインの分離をもたらすタンパク質のタンパク質分解的切断の存在を調べることによって決定することができ、癌を治療するための治療剤となるべき候補化合物は、タンパク質分解的切断をもたらすはずである。このタンパク質分解的切断は、それが癌細胞の死をもたらすオートファジー機構やアポトーシス機構の活性化を引き起こすことができることの表れである。この試験の考えられる方法は、細胞培養物のタンパク質抽出物のイムノブロッティング（ウェスタンブロッティング）ならびに全タンパク質に対応するシグナルバンドとヘリカーゼドメイン及びカスパーゼドメインに対応する断片の検討である。具体的には、実施例３に示すように、３０ｋＤのバンドの出現が、タンパク質分解的切断の存在を示すものである。あるいは、それは、ＭＤＡ−５の他のヘリカーゼファミリー（例えば、ＲＩＧ−ＩまたはＬＧＰ２）の活性化を決定することもできる。
【００２３】
癌を治療することができる化合物の同定に同じく有用であり、本発明で同定される別のマーカーは、ＮＯＸＡ発現のレベルである。その論理的根拠は、オートファジー及びアポトーシスの機構が活性化されたときの対応する遺伝子の発現レベルの増加である。これらのタンパク質の発現レベルの決定を行なうことができ、例えば、対応するメッセンジャーＲＮＡの濃度（これは、例えば、ノーザンブロットもしくはＲＴ−ＰＣＲによって実施することができる）、または対応する細胞培養物のタンパク質抽出物中のタンパク質自体の濃度（例えば、ウェスタンブロットのような転写による）を決定することができる。さらに、ＮＯＸＡを免疫組織化学によって（組織標本において）インサイチュで検出することができる。
【００２４】
本発明の好ましい一実施形態では、オートファジーとアポトーシスの機構が活性化されている証拠として、ＭＤＡ−５とＮＯＸＡを両方とも調べるが、それは、ＭＤＡ−５がそれらの間の連結点であると考えられるからである。
【００２５】
さらに、本発明は、癌に対して使用すべき候補化合物によるオートファジーの誘導を決定する工程を含んでいてもよい。オートファジーの誘導は、いくつかの手法によって決定することができる。これらの手法は、以下を含む。
・オートファジー遺伝子８（これは、ＡＴＧ８またはＬＣ３と称される）によって発現されるタンパク質の翻訳後修飾をモニタリングすること。ＬＣ３タンパク質は、オートファゴソームに挿入されたときに、プロセシングされ、脂質化される。オートファゴソームは、オートファジーの間、細胞構成要素が運ばれる膜構造である。このタンパク質の立体構造と電気泳動移動度が脂質化によって変化するので、オートファジーの誘導を検証するための考えられる手法の１つは、このタンパク質に対する抗体を用いるイムノブロット法の使用である。この手法によって、電気泳動を実施した後の、タンパク質に対応するバンドが、化合物によってオートファジーが誘導されたと考えられる試料と比較して、対照試料で異なることを検証することができる。あるいは、抗体がオートファゴソームの形を特異的に認識する場合、抗体の結合は、候補化合物で処理した試料におけるオートファジーの誘導を裏付ける。
・ＬＣ３タンパク質の細胞内分布の変化をモニタリングすること。その理由は、オートファジーの別の顕著な特徴が、細胞質から新たに形成されたオートファゴソームへのＬＣ３の再配置であることである（Ｘｉｅ及びＫｌｉｏｎｓｋｙ、２００７（非特許文献２５））。したがって、タンパク質フォーカスの形成は、特に初期段階での、オートファゴソームの形成を示すものと考えることができる。これは、固定細胞または固定組織に対する免疫蛍光または免疫組織化学によって内在性ＬＣ３をモニタリングすることにより検出することができる。あるいは、オートファジーは、ＬＣ３の蛍光誘導体の細胞内局在を明らかにすることによって、生きた細胞で可視化することができる。蛍光顕微鏡観察によるオートファジーの追跡を可能にする蛍光タンパク質ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）またはＲＦＰ（赤色蛍光タンパク質）として用いることは一般的であり、拡散したパターンから局所的な染色への細胞蛍光分布の変化は、オートファジーの誘導を示すものである。本発明では、この手法は、融合タンパク質の一過性発現を可能にするベクター（例えば、プラスミドもしくは組換えウイルス）をトランスフェクトしておいた細胞、またはレポータータンパク質とＬＣ３によって形成される融合タンパク質を発現することができるＤＮＡセグメントが安定な形でゲノムに組み込まれた細胞のいずれかの使用を含む。この戦略の一例は、下記の実施例１に示されており、その場合には、細胞に予め組換えレトロウイルスをトランスフェクトした。これによって、融合タンパク質を細胞ゲノムＤＮＡ中に導くように、タンパク質ＧＦＰとＬＣ３のコード部分をともに含むＤＮＡ断片の、細胞ゲノムへの挿入が起こった。このように、安定にトランスフェクトされた細胞を用いる細胞内分布変化の検討を実施することができる。
・細胞内への候補化合物の侵入を検出するための透過電子顕微鏡法の使用。この状況は、より進行した段階のオートファジーの過程におけるオートファゴソーム形成を導く。高密度構造の蓄積（膜結合型）の可視化は、オートファゴソーム形成の指標となる特徴と考えられる。オートファジーの過程は、この過程のより後の段階で（すなわち、試験しようとする化合物で処理してから２４または３０時間後に）確認することができ、その時点では、電子顕微鏡によって、細胞崩壊を示す巨大な食空胞の形成が示されるはずである。
【００２６】
上記の考察を踏まえて、本発明の第１の実施形態は、癌の治療に使用すべき化合物を同定するためのプロセス（以下、本発明のプロセス）であって、
ａ）候補化合物を癌細胞培養物、または癌細胞に由来する癌細胞株と接触させる工程と、
ｂ）以下のパラメータ：
ｉ．ファミリーヘリカーゼＭＤＡ−５の活性化のレベル、
ｉｉ．ＮＯＸＡ発現のレベル、
ｉｉｉ．またはこれらの組合せ
のうちの少なくとも１つを決定する工程と、
ｃ）工程ｂ）で得られたデータを、同様にではあるが、候補化合物の非存在下で処理された同じ細胞の対照で観察されるデータと比較する工程と、
ｄ）対照と比較して、工程ｂ）で決定されたパラメータ（単数または複数）の顕著な増大を生じさせた化合物を選択する工程と、を含むプロセスを指す。
【００２７】
候補化合物で処理した細胞培養物から得られるデータと未処理の対照から得られるデータの違いは、解析によってｐ＜０．０５という値が得られる場合、統計的に有意であると考えられる。
【００２８】
好ましい一実施形態では、本発明のプロセスはまた、候補化合物が、癌細胞、癌細胞に由来する細胞株、または癌モデルマウスにおいてオートファジーを誘導するか否かを決定する。上で説明したように、オートファジー誘導の決定は、オートファジータンパク質の発現レベル、翻訳後修飾の存在または細胞内局在を調べることによって行なうことができる。より具体的には、オートファジーの誘導は、タンパク質ＬＣ３の電気泳動移動度の変化またはタンパク質ＬＣ３のフォーカス形成の検出から選択される手法によって決定される。あるいは、オートファジーの誘導は、例えば、透過電子顕微鏡法を用いる、その顕微鏡観察によってオートファゴソームの存在を調べることにより決定される。
【００２９】
さらに好ましい一実施形態では、本発明の上記のプロセスは、３つの工程：ＭＤＡ−５の活性化レベルの決定、ＮＯＸＡの発現レベルの決定及びオートファジーの誘導の決定を含む。
【００３０】
本発明のプロセスは、いくつかの種類の癌、例えば、メラノーマ、膵癌、大腸癌、膀胱癌、乳癌、前立腺癌、肺癌及び卵巣癌を治療するための治療剤として使用すべき化合物の同定に用いることができる。
【００３１】
そのため、本発明が、メラノーマを治療するための治療剤として使用すべき化合物を同定することを目的とする場合、本発明は、以下の工程：
ａ）候補化合物をメラノーマ細胞培養物、またはメラノーマ細胞に由来する細胞株と接触させる工程：
ｂ）以下のパラメータ：
ｉ．ファミリーヘリカーゼＭＤＡ−５の活性化のレベル、
ｉｉ．ＮＯＸＡ発現のレベル、
ｉｉｉ．またはこれらの組合せ
のうちの少なくとも１つを決定する工程：
ｃ）工程ｂ）で得られたデータを、同様にではあるが、候補化合物の非存在下で処理された同じ細胞の対照で観察されるデータと比較する工程：
ｄ）前記対照と比較して、工程ｂ）で決定されたパラメータ（単数または複数）の顕著な増大を生じさせた化合物を選択する工程を含む。
【００３２】
有効な細胞株に関しては、それを任意のメラノーマ細胞株から、好ましくは、ヒト起源から得て用いることができる。本発明の実施例で用いられる有効な細胞株の例は、ヒト細胞株ＳＫ−Ｍｅｌ−１９、ＳＫ−Ｍｅｌ−２８、ＳＫ−Ｍｅｌ−１０３及びＳＫ−Ｍｅｌ−１４７、ならびにマウスＢ１６細胞である。正常細胞対照は、通常、癌治療の副次的な毒性の部位に相当する、メラノサイトまたは他の皮膚細胞、及び免疫系の細胞である。
【００３３】
あるいは、本発明のプロセスは、以下の種類の癌：膵癌、大腸癌、膀胱癌、乳癌、前立腺癌、肺癌及び卵巣癌のうちの少なくとも１つを治療するための治療剤として使用すべき化合物の同定に重点を置くことができる。
この場合、本発明のプロセスは、以下の工程：
ａ）候補化合物を上で言及した種類の癌のうちの少なくとも１つに由来する癌細胞培養物、または上で言及した種類の癌のうちの少なくとも１つに由来する細胞株と接触させる工程、
ｂ）以下のパラメータ：
ｉ．ファミリーヘリカーゼＭＤＡ−５の活性化のレベル、
ｉｉ．ＮＯＸＡ発現のレベル、
ｉｉｉ．またはこれらの組合せ
のうちの少なくとも１つを決定する工程、
ｃ）工程ｂ）で得られたデータを、同様にではあるが、候補化合物の非存在下で処理された同じ細胞の対照で観察されるデータと比較する工程、
ｄ）対照と比較して工程ｂ）で決定されたパラメータ（単数または複数）の顕著な増加を生じさせる化合物を選択する工程を含む。
【００３４】
この場合、細胞株は、膵癌細胞株：ＩＭＩＭＰＣ２、ＭｉａＰａＣａ２、Ａｓｐｃ１、Ａ６Ｌ、ＳＫＰＣ１及びＰａｎｃ−１の群から、または大腸癌細胞株：ＣＡＣＯ、ＳＷ４８０及びＳＷ１２２２の群から、または膀胱癌細胞株：ＲＴ１１２、ＭＧＨＵ４、６３９Ｖ、２５３Ｊ、ＭＧＨｕ３及びＳＷ１１７０の群から、または神経膠腫細胞株：Ｕ８７ＭＧ、Ｕ２５１及びＴ９８Ｇの群から、または乳癌細胞株：ＭＤＡ２３１、ＭＣＦ７及びＴ４７Ｄの群から、または前立腺癌細胞株：ＬＮＣａＰ、ＰＣ３及びＤＵ１４５の群から、または肺癌細胞株：Ｈ１２９９及びＮＣＩ  Ｈ４６０の群から、または卵巣癌細胞株：ＮＣＩ  Ｈ２３、ＣＨＱＫ１及びＳＫ−ＯＶ−３の群から選択される。
【００３５】
本発明のプロセスを実施する好ましい方法は、以下、本発明の実施例に記載されている。そのような場合、本発明のプロセスは、ＭＤＡ−５活性化の決定と、遺伝子発現解析（ＮＯＸＡ発現の増加の観察）と、既に述べた３つの考えられる方法（イムノブロットによるＬＣ３タンパク質翻訳後修飾のモニタリング、蛍光タンパク質ＧＦＰによる蛍光の検出によるＬＣ３の細胞分布の変化の追跡（融合タンパク質ＧＦＰ−ＬＣ３を発現することができる構造を含む組換えレトロウイルスを事前にトランスフェクトされた細胞を用いる）、候補化合物による処理後５時間での電子透過顕微鏡観察によるオートファゴソーム形成の確認と処理後３０時間での食空胞の確認）によるオートファジー活性化の確認との組合せを用いて実施される。
【００３６】
注目すべきは、上で説明した本発明のプロセスによって、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、またはその類似体とポリカチオンの組合せを含む新しい化合物の同定が可能になったことである。本発明の好ましい一実施形態では、該化合物は、ポリイノシン−ポリシチジル酸（ｐＩＣ）とポリエチレンイミン（ＰＥＩ）の組合せを含む、ＢＯ−１１０（ｐＩＣＰＥＩ）である。
【００３７】
以下、本発明の実施例及び図面で示すように、ＢＯ−１１０は、様々な種類の癌、例えば、メラノーマ、膵癌、大腸癌、膀胱癌、乳癌、前立腺癌、肺癌及び卵巣癌を治療するために有効に用いることができる。
【００３８】
そのため、本発明はまた、癌、例えば、メラノーマ、膵癌、大腸癌、膀胱癌、乳癌、前立腺癌、肺癌及び卵巣癌の治療で用いられるＢＯ−１１０を含む医薬組成物に関する。この医薬組成物は、免疫不全患者を治療するのにも有用である。
【００３９】
驚くべきことに、ｐＩＣとＰＥＩの機能的な相互作用は、個々の特徴の技術的効果の総和を改善及び改変する相乗的な技術的効果を達成する。したがって、ＢＯ−１１０は、細胞に侵入し、その構成要素であるＰＥＩ及びｐＩＣとは異なる様式で作用する。具体的には、ＰＥＩには測定可能な細胞効果がなく、単独のｐＩＣシグナルは、最終的にインビボで生物学的効果がない免疫応答を一過性に誘導するが、ＢＯ−１１０は、腫瘍細胞を選択的に死滅させることができる。そのため、ＢＯ−１１０は、単剤としては活性を持たないが、組合せると、様々な、かつ治療的に利用可能な抗癌作用を有する遺伝子または化合物について記載されている合成致死の概念を説明するものである。
【００４０】
そのため、本発明の最も重要な点の１つは、ウイルスｄｓＲＮＡポリイノシン−ポリシチジル酸（ｐＩＣ）の模倣体が、腫瘍細胞へのその侵入及び送達の経路を変化させるという予想外の発見である。ＴＬＲ−３（Ｔｏｌｌ様受容体３）による標準的な認識から、このｄｓＲＮＡを細胞質送達を特異的に可能にする担体のファミリーと組み合わせると、ｐＩＣを（ＴＬＲ３とは異なる）ｄｓＲＮＡセンサーのファミリーに標的することができる。この活性は、重要でない免疫調節物質から腫瘍細胞の大量殺傷物質へとｄｓＲＮＡの作用様式を変化させる。抗癌活性は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）及びリポフェクトアミン、ポリフェクトまたはスーパーフェクトで立証された。これらの担体は、それらだけでは、治療剤として生体活性はなかったが、本発明は、そのような担体がオートファジー活性化を可能にする安定な形態にｐＩＣの分子を維持しつつ、それを保護することができることを示している。そのため、ＢＯ−１１０によって例示されるｄｓＲＮＡ／ポリカチオンの組合せは、抗癌効果を有する新しい分子実体に相当する。より重要なのは、ＢＯ−１１０の作用様式が予想外のものであったことである。この化合物は、正常なコンパートメントの生存に影響を及ぼすことなく、腫瘍細胞（限定するものではないが、特に、メラノーマ細胞）の協調的かつ選択的な死滅をもたらすオートファジーとアポトーシスの二重誘導を促進する。アポトーシス機構はタンパク質ＮＯＸＡを介して働いていた。他のＮＯＸＡ誘導性化学療法剤とは違って、ＢＯ−１１０は、腫瘍抑制タンパク質ｐ５３を必要としない。ｐ５３は、ヒトの癌の大半で突然変異しているか、欠失しているかまたは不活化しているので、これは重要な利点である。効果は、裸のウイルスＲＮＡに対する典型的な応答よりも明らかに優れており、これは、メラノーマを治療するための裸のｐＩＣの臨床研究の成績が悪いことを説明するものである。
【００４１】
したがって、ＢＯ−１１０は、免疫不全マウスでさえも、癌細胞の自己殺傷を促進し、かつインビボでの癌転移を阻止するのに十分であったが、複合体化していないｄｓＲＮＡは、そうではなかった。本発明で後に記載される遺伝子解析、機能解析及び微細構造的解析から、オートファジーの誘導は、ｐＩＣによって細胞を保護するようにではなく、腫瘍細胞を選択的に破壊するように誘発されることが示されている。これらの結果をさらに証明することとして、ｐＩＣは、ＩＦＮによって制御される免疫の誘導物質と考えられていたが、観察された効果は、ＩＦＮ−αの産生及び分泌のための経路の活性化とは無関係である。この観察と一致して、オートファジー経路の活性化は、免疫不全動物でさえも起こる。まとめると、これらのデータは、ＢＯ−１１０が、内在性の病原体認識プログラム、オートファジー及び腫瘍細胞死を臨床的に利用するための新しい介入点を標的とし、それを同定することを示している。
【００４２】
遺伝子研究及び機能研究により、ＢＯ−１１０によって駆動されるオートファジー経路とアポトーシス経路の間をつなぐものとして内在性ＭＤＡ−５が同定された。これはまた、外因性構成要素によるアポトーシス細胞死に限定されたＭＤＡ−５に関する以前の開示と異なっている。ＭＤＡ−５／ＮＯＸＡ相互作用もまた新規であった。
【００４３】
したがって、ＭＤＡ−５は、オート／リソソームプロテアーゼ及び内在性アポトーシスプロテアーゼによる腫瘍自己破壊を誘発するという特別な特徴を有する、癌を治療するための薬剤をスクリーニングするための好適な治療標的として提示される。先に述べたように、この戦略は、これらの機構のどちらかを独立に働かせる標準的な治療剤よりも優れた利点を有する。
【００４４】
同様に、それを活性化することができるという理由でこの経路の発見を可能にした実体は、複合体ＢＯ−１１０または、ｄｓＲＮＡの類似体とカチオン性担体の他の組合せである。そのため、これらの薬剤は、癌を治療するための医薬品の製造に使用すべき優れた候補である。
【００４５】
本発明で用いられるように、「二本鎖ＲＮＡの長い断片」という用語は、短いＲＮＡまたは干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡｓ）として知られるＲＮＡの断片に対立するものとして用いられる。そのため、二本鎖ＲＮＡ断片が、鎖１本につき少なくとも２５個のヌクレオチドを含む場合、二本鎖ＲＮＡ（二重鎖）は「長い」と考えられる。使用される断片は、ヘリカーゼファミリーのＭＤＡ−５の天然の基質であると思われるほとんどのＲＮＡウイルスの細胞周期の間に細胞に現われる二本鎖ＲＮＡ中間体と長さが同様であることが好ましく、そのため、本発明の二本鎖ＲＮＡは、とりわけ、鎖１本につき少なくとも１００個のヌクレオチドを含む場合、より特には、鎖１本につき少なくとも１０００個のヌクレオチドを含む場合、「長い」とみなされる。
【００４６】
天然に生じ、かつ本発明の使用に有用であり得る二本鎖ＲＮＡの断片は、パラミクソウイルス（例えば、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、センダイウイルス（ＳＤＶ））、ラブドウイルス（水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ））；フラボウイルス（Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ））、オルトミクソウイルス（インフルエンザウイルス）及びピコルナウイルス（脳−心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ））の細胞周期の間に生じる二本鎖ＲＮＡ中間体であってよい。
【００４７】
二本鎖ＲＮＡ類似体に関して、ポリイノシン酸−ポリシチジル酸（ｐＩＣ）以外に、他のｄｓＲＮＡ模倣物、すなわち、ａ）その骨格がリボースと類似した化合物、例えば、ＬＮＡ（ロックされた核酸：加水分解に耐性がある）、モルホリノ及びＰＮＡ（ペプチド核酸）に基づく化合物によって形成されるもの、ｂ）ＲＮＡのヌクレオチドの典型的な窒素塩基のうちの少なくとも１つが、天然の現象の異なる対形成をも生じさせ得る類似体、例えば、ジアミノプリン（３つの水素結合でウラシルと対形成する）、キサンチン／ジアミンピリミジン対（この対の中では、ケト／ケト型のプリンであるキサンチンが、アミン／アミンピリミジンとの３つの水素結合を形成している）、またはイソグアニン／イソシトシン対（この対の中では、アミン／ケト型のプリンであるイソグアニンが、ピリミジンケト−アミンであるイソシトシンとの３つの水素結合を形成している）に置き換えられているものが、本発明に有用であり得る。
【００４８】
ポリカチオン担体に関して、形質膜の透過性を変化させ、かつ／または二本鎖ＲＮＡもしくはその類似体の細胞への侵入を促進することによってエンドサイトーシスを誘導し、それらを細胞質に放出させ、それにより、二本鎖ＲＮＡの細胞質センサー（例えば、ヘリカーゼＭＤＡ−５）の活性化を増大させることができるもの全ての使用は、本発明の目的のために好適である。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）及びリポフェクトアミンに加えて、ポリ−Ｌ−リジン、ポリシラザン、ポリジヒドロイミダゾレニウム、ポリアリルアミン及びエトキシ化ポリエチレンイミン（ｅＰＥＩ）がこの定義に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１Ａ】ＰＥＩと複合体化したｐＩＣ（ＢＯ−１１０）１μｇ／ｍｌで１２時間処理したＳＫ−Ｍｅｌ−１０３メラノーマ細胞において、ｅＧＦＰ−ＬＣ３のオートファゴソーム様の局所的染色の落射蛍光による可視化を示す写真。単剤としてのＰＥＩで処理した細胞が参照対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）として示されている。ＢＯ−１１０によるマクロオートファジーの誘導はメラノーマ細胞死をもたらす。
【図１Ｂ】ＢＯ−１１０またはプラセボ対照による処理によってｅＧＦＰ−ＬＣ３の点状の蛍光放出を示すＳＫ−Ｍｅｌ−１０３細胞の時間依存的蓄積を示すグラフ。ラパマイシンは、標準的なオートファジー誘導物質として用いた。
【図１Ｃ】表示したように処理したＳＫ−Ｍｅｌ−１０３細胞から単離した全細胞抽出物のイムノブロットを示すグラフ。処理は各線の上に表示されている：対照（未処理：ビヒクルの存在下でのみインキュベートした細胞集団）、ｐＩＣまたはＢＯ−１１０処理細胞。解析したタンパク質は、パネルの左側に表示されている：未修飾ＡＴＧ８（ＬＣ３  Ｉ）、脂質化されたＡＴＧ８（ＬＣ３  ＩＩ）及びローディング対照（β−アクチン）。パネルの右側は分子量（単位ｋＤａ）である。
【図１Ｄ】ＢＯ−１１０またはＰＥＩ対照で処理したＳＫ−Ｍｅｌ−１０３細胞の電子顕微鏡写真。矢印は、膜に結合したオートファゴソーム及びオートリソソームを示す。
【図１Ｅ】ビヒクル（左側の列）またはＢＯ−１１０（右側の列）とともにインキュベーションしてから５時間後の高倍率（上）及び低倍率（下）のＳＫ−Ｍｅｌ−１０３細胞の顕微鏡写真。
【図１Ｆ】パネルＦは、写真に示したような３０時間の処理の後の細胞コロニーの明視野顕微鏡観察（左及び中央）ならびに電子顕微鏡観察（右）の代表的な顕微鏡写真を示す。
【図２】メラノーマ細胞におけるＢＯ−１１０によるオートファジー誘導の時間間隔を空けた顕微鏡観察写真。ｅＧＦＰ−ＬＣ３を発現するＳＫ−Ｍｅｌ−１０３メラノーマ細胞をＰＥＩ（対照）またはＢＯ−１１０で処理した後に表示した時間間隔で撮影した一連の顕微鏡写真であり、局所的な凝集は、オートファゴソーム形成を示す。矢印は、処理時の細胞の崩壊及び剥離（死にかけている細胞）を示す。
【図３Ａ】表示したような処理（ＮＴ：白い棒、ＰＥＩ処理：濃い灰色の棒、ｐＩＣ処理：薄い灰色の棒、ＢＯ−１１０：黒い棒）の２４及び４８時間後のトリパンブルー排出アッセイによって推定される細胞死のパーセンテージが示されたグラフ。データは、グラフの上に表示した異なる細胞株を用いた３回の独立した実験の平均±ＳＥＭ値として表されている。示したように、ＢＯ−１１０で処理したメラノーマ細胞集団のみが効率的に死ぬ。ＰＥＩの存在によるｐＩＣの細胞質への送達は、選択的な様式でメラノーマ細胞死を誘発する。
【図３Ｂ】ビヒクル（Ｃｔｒ）、ＰＥＩ、ｐＩＣまたはＢＯ−１１０で処理し、処理後１２時間で可視化したＳＫ−Ｍｅｌ−２８及びＳＫ−Ｍｅｌ−１０３細胞の電子顕微鏡写真。各々の細胞株について、２つの異なる倍率で撮影した写真が示されている。矢印は、ＢＯ−１１０処理細胞でのみ観察されるオートリソソームを示す。
【図４Ａ】表示したようなビヒクル、ＰＥＩ、ｐＩＣまたはＢＯ−１１０で処理した後のヒト包皮（上の列）、ヒトメラノーマ細胞ＳＫ−Ｍｅｌ−１０３（中央の列）及びマウスＢ１６メラノーマ株（下の列）から単離されたメラノサイトの代表的な明視野画像写真。腫瘍細胞に対するＢＯ−１１０の選択的な細胞傷害活性を示す。
【図４Ｂ】ＦＭ（包皮メラノサイト）及びＳＫ−Ｍｅｌ−１０３の、個々の薬剤または組み合わせた薬剤（ＢＯ−１１０）（各グラフの右側の棒グループ）としてのＰＥＩ及びｐＩＣ処理に対する用量応答曲線を示すグラフ。応答は、処理２４時間後の死細胞のパーセンテージとして表されている。
【図４Ｃ】処理を行なった２４時間後のトリパンブルー排出アッセイによって推定した細胞死のパーセンテージを表すグラフ（Ｃｔｒｌ：未処理；ＰＥＩ、ｐＩＣ、及びＢＯ−１１０）。データは、表示した細胞株（ＳＫ−Ｍｅｌ−１０３または包皮線維芽細胞）を用いて行なわれた３回の独立した実験の平均±ＳＥＭとして表されている。パネルＡに示したように、ＢＯ−１１０で処理したメラノーマ細胞集団のみが効率的に死ぬ。
【図５Ａ】異なる線で示されるように、未処理（ＮＴ）のまたはＰＥＩ、ｐＩＣ、ＢＯ−１１０もしくはボルテゾミブ（Ｂｏｒ）で処理したＳＫ−Ｍｅｌ−２８（上の写真）及びＳＫ−Ｍｅｌ−１４７（下）から単離された全細胞抽出物のイムノブロットを示す写真。アステリスクは、非特異的バンドに対応する。矢印は、ＭＤＡ−５切断を示す３０ｋＤａのバンドが観察されるべき位置を示す。ＭＤＡ−５はメラノーマ細胞におけるＢＯ−１１０細胞毒性のセンサー及びドライバーである。
【図５Ｂ】表示したようなｐＩＣ、ＢＯ−１１０またはビヒクルで処理した後の細胞抽出物のイムノブロッティングによって可視化した、未感染のまたはスクランブルのｓｈＲＮＡもしくはＭＤＡ−５  ｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスに感染させたＳＫ−Ｍｅｌ−１４７細胞におけるＭＤＡ−５のプロセッシングを示す写真。図５Ａに示すように、アステリスクは非特異的バンドを示し、矢印は、ＭＤＡ−５切断を示す３０ｋＤａバンドの位置を示す。
【図５Ｃ】ｐＩＣのみ（灰色の棒）、ＢＯ−１１０Ｉ複合体（黒色の棒）による処理の２４時間後のまたは未処理細胞（白色の棒）のトリパンブルー排出アッセイによって検討した、ＢＯ−１１０によって誘導される標的化毒性に対するＭＤＡ−５  ｓｈＲＮＡの阻害的効果を示すグラフ。対照ｓｈＲＮＡ（「ｓｈ対照」）の感染から得た結果も示す。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＥＭとして表されている。
【図６Ａ】ＢＯ−１１０（黒色の棒）または緩衝液対照（白色の棒）で処理した１２時間後にＧＦＰ−ＬＣ３による蛍光フォーカスを有していたＳＫ−Ｍｅｌ−１０３細胞のパーセンテージから評価された、オートファゴソームにおけるＥＧＦＰ−ＬＣ３再配置に対する３−メチルアデニン（３−ＭＡ）及びクロロキン（Ｃｈｌｏｒ）の効果を示す写真。ＢＯ−１１０細胞傷害活性に対するオートファジーの薬理学的阻害剤の効果を示す。
【図６Ｂ】ビヒクル（白色の棒）またはＢＯ−１１０（黒色の棒）で処理した２０時間後のトリパンブルー排出によって推定される細胞死に対するクロロキン（Ｃｈｌｏｒ）、ペプスタチンＡ（ＰＥＰ）またはＥ６４ｄの阻害的効果を示す写真。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＥＭとして示されている。
【図６Ｃ】ＢＯ−１１０または２５ｎＭのラパマイシンで処理した後のオートファゴソーム形成（３５個の赤色と緑色のフォーカス）及びオートリソソーム（赤色のフォーカスのみ）を検出するためにＣｈｅｒｒｙ−ＧＦＰ−ＬＣ３をトランスフェクトしたＳＫ−Ｍｅｌ−１０３細胞の蛍光共焦点顕微鏡写真。
【図６Ｄ】ビヒクル（白色の棒）またはＢＯ−１１０（黒色の棒）で処理した２０時間後のトリパンブルー排出によって推定される細胞死に対する１００μＭの１００バフィロマイシン（Ｂａｆｉｌ）、２０μＭのクロロキン（Ｃｈｌｏｒ）または１０μｇ／ｍｌのペプスタチン（ＰＥＰ）の阻害的効果を示すグラフ。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＥＭとして示されている。
【図６Ｅ】ＢＯ−１１０（上の写真）もしくはクロロキン存在下のＢＯ−１１０（下の列の写真）で処理し、ＥＧＦＰ−Ｒａｂ５野生型を安定にトランスフェクトしたＳＫ−Ｍｅｌ−１０３細胞（図中、左の列）またはＲｅｄ  Ｆｌｕｏｒ標識したＢＯ−１１０とともにインキュベートしたＳＫ−Ｍｅｌ−１０３細胞（中央の列の写真）の共焦点蛍光画像写真。メラノーマ細胞におけるＢＯ−１１０の内在化をクロロキンの非存在下または存在下で観察することができる。
【図６Ｆ】ビヒクル（対照）で処理したＳＫ−Ｍｅｌ−１０３細胞とＢＯ−１１０で処理したＳＫ−Ｍｅｌ−１０３細胞の両方における（緑色蛍光を生じさせる）蛍光ＤＱ−ＢＳＡの切断及び放出の存在によってリソソーム依存的タンパク質分解を見るための共焦点蛍光画像写真。クロロキン（Ｃｈｌｏｒ：中央の列の写真）の存在下において、蛍光シグナルは、ＤＱ−ＢＳＡの列（中央の列）で観察されない。リソソーム区画を示すためのリソトラッカー−Ｒｅｄ（ＬＴＲ−Ｒｅｄ：左の列の写真）の存在下における細胞の同時画像。リソトラッカー−Ｒｅｄは、３列全ての写真でシグナルを生じさせた。
【図６Ｇ】図６Ｆの被験細胞におけるＤＱ−ＢＳＡ及びＲｅｄ−リソトラッカーシグナルの対応物の共局在を表すグラフ（Ｃｔｒｌ：対照、黒色の棒；Ｃｈｌ：クロロキン、白色の棒；ＢＯ−１１０、灰色の棒）。共局在は、２回の独立した実験における最低１５０個の細胞において推定され、対照細胞において得られた値に対して表される（ＡＵ：蛍光任意単位）。
【図６Ｈ】ＢＯ−１１０または緩衝液対照で処理した後のＳＫ−ｍｅｌ−１０３におけるＧＦＰ−ＬＣ３（もとのシグナルで緑色、オートファゴソームの位置を示す）及びリソトラッカー（もとのシグナルでは赤色、リソソームの存在を示す）による蛍光フォーカスの共焦点免疫蛍光画像写真。核は、Ｈｏｅｓｃｈｔ（上の写真、もとは青色のシグナル）で染色した。下の列に、３つの前の画像の重ね合わせが示されている。これらの画像は、緑色及び赤色のシグナルを有していた部分、すなわち、それぞれ、ＧＦＰ−ＬＣ３及びリソトラッカーに対応する画像中で黄色またはオレンジ色を生じており、ＧＦＰ−ＬＣ３及びリソトラッカーに対応するシグナルが同じ部分に位置することを示している。
【図６Ｉ】ｐＩＣを含む緩衝液対照（「対照」）またはＢＯ−１１０のいずれかで処理し、画像上に示すような、リソトラッカー（もとは赤色のシグナル）またはＨｏｅｓｃｈｔ（もとは青色のシグナル）の存在下でインキュベートしたＥＧＦＰ−ＬＣ３（もとは緑色のシグナル）を発現するＳＫ−Ｍｅｌ−１０３細胞の、リアルタイムで撮影した共焦点顕微鏡画像写真。３つの画像の重ね合わせ（各処理の右下、対照またはＢＯ−１１０）から、裸のｐＩＣで処理した後ではなく、ＢＯ−１１０で処理した後に、（オートリソソームの形成によって予想されるような）ＧＦＰ−ＬＣ３とリソソームの間の強い共局在（黄色のシグナル）が明らかになった。重ね合わせ画像の結果の下にある３列目のパネルには、所与の平面での緑色（ＥＧＦＰ−ＬＣ３についてはグラフを「ＧＦＰ」とラベルする）及び赤色（リソトラッカーについてはグラフを「ＬＹＳＯ」と示す）のチャンネルの全細胞蛍光強度を定量することによって得られたグラフが示されている。ＢＯ−１１０で処理した細胞で得られたグラフの場合、両方のシグナル（ｅＧＦＰＬＣ３及びリソトラッカー）の類似した分布は、共局在を示すものであり、そのため、オートファゴソームとリソソームの融合を示すものである。
【図６Ｊ】ＥＧＦＰ−ＬＣ３（緑色蛍光、ｘ軸）及びリソトラッカー（赤色のシグナル、Ｙ軸）のシグナル強度を表す、ｐＩＣ（対照）またはＢＯ−１１０で処理したＳＫ−Ｍｅｌ−１０３細胞の集団ベースの解析の表示を示す写真。四角には、両方のマーカーで二重染色される細胞が含まれる。
【図７Ａ】ＢＯ−１１０またはビヒクル対照による処理後の表示した時間で、リアルタイム蛍光顕微鏡法によって記録したＥＧＦＰ−Ｒａｂ７を発現するＳＫ−Ｍｅｌ−１０３メラノーマ細胞の連続画像写真。留意すべきことに、ＢＯ−１１０は、多数の小胞の生成をもたらした。アステリスクは、エンドソームとエンドソームの融合を示す（明瞭にするために、一部の例だけを示す）。ＢＯ−１１０処理によるエンドソームの交通ならびにアンフィソームの生成及び分割を示す。
【図７Ｂ】レトロウイルスを安定にトランスフェクトしたＳＫ−Ｍｅｌ−１０３細胞の共焦点顕微鏡写真。このレトロウイルスは、ＥＧＦＰ−Ｒａｂ７  ｗｔ融合タンパク質（野生型Ｒａｂ７）（左から１列目及び３列目の写真、２つ目の場合、写真は、列の上に表示したように、リソトラッカー−レッドの存在下で得られたものである）またはリソトラッカーの存在下でインキュベートした融合体ＥＧＦＰ−Ｒａｂ７  Ｔ２２Ｎ（右列の写真）による緑色蛍光の発現をもたらした。細胞は、ＢＯ−１１０（下の列のパネル）またはビヒクル対照（上のパネル）でさらに処理された。画像は、ＢＯ−１１０による処理の１０時間後に記録された。右にある２列の写真は、Ｒａｂ７で装飾された小胞内に含まれる平均面積に対応する値を含む。
【図７Ｃ】表示した時間間隔（秒で表す）で撮影した一連の共焦点顕微鏡写真。これらの写真は、ＢＯ−１１０で処理した後のＲａｂ７陽性小胞へのリソソームの融合及び取込みを示している。
【図７Ｄ】ＢＯ−１１０で処理し、ＧＦＰ−Ｒａｂ７ｗｔ（写真中のＧＦＰ−Ｒａｂ７）、Ｃｈｅｒｒｙ−ＬＣ３（写真中のＣｈ−ＬＣ３）によって得られるような緑色蛍光または赤色蛍光、またはリソトラッカー−ブルーによる青色蛍光（図中のＬＴＲ−Ｂｌｕｅ）を生じさせるレトロウイルスを安定にトランスフェクトしたＳＫ−Ｍｅｌ−１０３のリアルタイム蛍光顕微鏡画像写真。画像は、処理の１時間後に、表示された時間（分）で撮影された。矢印は、表示した各マーカーを可視化することができた最初のシーケンスを示す。
【図７Ｅ】内在化及びその後の分解の前のエンドソームＲａｂ７による小胞表面のＬＣ３の取込みを示す写真。これらのエンドソーム／ＬＣ３ハイブリッド構造（アンフィソーム）は、ＥＧＦＰ−Ｒａｂ７またはＣｈｅｒｒｙ−ＬＣ３（写真中のＣｈ−ＬＣ３）を発現する細胞ＳＫ−Ｍｅｌ−１０３のリアルタイム顕微鏡蛍光によって可視化された。
【図８Ａ】ビヒクル（ＰＥＩを含まない対照緩衝液）（左のグラフ）、ビタミンＥ（＋Ｖｉｔｅ、中央のグラフ）またはカスパーゼ阻害剤ＺＶＡＤ−ｆｍｋ（＋ＺＶＡＤ、右のグラフ）の存在下における緩衝液対照としてのＰＥＩ（Ｃｔｒ、白色の棒で表す）、ｐＩＣ（灰色の棒）または複合体ＢＯ−１１０（黒色の棒）によるＳＫ−Ｍｅｌ−１４７細胞の処理によって引き起こされた細胞死のパーセンテージを示すグラフ。全ての場合において、パーセンテージは、トリパンブルー排出で測定された。ＢＯ−１１０細胞毒性はエフェクター及び調節性カスパーゼの活性化に依存する。
【図８Ｂ】（左側に表示した）転移性メラノーマ細胞株抽出物のイムノブロットの結果を示す。これらは、表示した処理後時間（各レーン上に、時間（ｈｏｕｒ）で表す）で細胞を回収することによって得られた。処理は、これらの時間の上に表示されている：ＮＴ（未処理：緩衝液の存在下でインキュベートした対照細胞集団）、ＰＥＩ、ｐＩＣ、複合体ＢＯ−１１０またはＢｏｒ（ボルテゾミブ、２５ｍＭ）写真。各写真の横に、解析したタンパク質が示されている：ｃａｓｐ−９（カスパーゼ９）、ｃａｓｐ−８（カスパーゼ８）またはチューブリン（ローディング対照）。右側の数字は、その高さで存在するタンパク質バンドに対応する相対質量（単位ｋＤａ）を示す。
【図８Ｃ】時間（２４及び４８時間）で表示した処理の後に細胞を回収することによって得られたＳＫ−Ｍｅｌ−１０３細胞株抽出物のイムノブロットの結果を示す写真。処理は、時間の下、レールの上に表示されている：ＮＴ（未処理：緩衝液のみの存在下でインキュベートした対照細胞集団）、ＰＥＩ、ｐＩＣ及び複合体ＢＯ−１１０。各写真の横に、解析したタンパク質が示されている：ｃａｓｐ−９（カスパーゼ９）、ｃａｓｐ−８（カスパーゼ８）、ｃａｓｐ−７（カスパーゼ７）、Ｃａｓｐ−３（カスパーゼ３）またはチューブリン（ローディング対照）。
【図９Ａ】処理後の表示した時間（時間（ｈｏｕｒ）で表す）で細胞を回収することによって得られたＳＫ−Ｍｅｌ−２８細胞（上）またはＳＫ−Ｍｅｌ−１４７（下）のイムノブロットの写真。処理は、時間の上に表示されている：ＮＴ（未処理：緩衝液の存在下でインキュベートした対照細胞集団）、ＰＥＩ、ｐＩＣ、複合体ＢＯ−１１０またはＢｏｒ（ボルテゾミブ、２５ｍＭ）。各写真の横に、そのレベルが解析されたタンパク質が示されている：ＮＯＸＡ、Ｍｃｌ−１またはチューブリン（ローディング対照）。ＢＯ−１１０は、ｐ５３状況とは独立に、かつＭＣＬ−１の代償活性化を誘導することなくＮＯＸＡを介するアポトーシスを誘発する。
【図９Ｂ】処理が未処理の対照細胞で得られた対応する値を参照したパーセンテージとして表示されているために、ＳＫ−Ｍｅｌ−２８細胞から得られたイムノブロッティング後のデンシトメトリーによって時間の関数として算出されたＭｃｌ−１（上）及びＮＯＸＡ（下のグラフ）の相対レベルを表している２つの別々のグラフ。各曲線の横に、対応する処理が表示されている。
【図９Ｃ】各処理群について、処理（時間（ｈｏｕｒ）で表示した時間）後の細胞を回収することによって得られたＳＫ−Ｍｅｌ−１０３全細胞抽出物のイムノブロッティングから撮影した写真。処理は、各レーンの上に表示されている：ＮＴ（未処理：緩衝液の存在下でインキュベートした対照細胞集団）、ＰＥＩ、ｐＩＣ、複合体ＢＯ−１１０またはＢｏｒ（ボルテゾミブ、２５ｍＭ）。各写真の横に、そのレベルが解析されたタンパク質が示されている：ＮＯＸＡ、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−２またはチューブリン（ローディング対照）。パネルの下に、処理後に観察された細胞死のパーセンテージが表示されている。
【図９Ｄ】ＮＯＸＡタンパク質の発現を評価するためにデザインされたイムノブロットの写真。抽出物は、不活性ｓｈＲＮＡ（ｓｈ  Ｃｔｒｌ）またはＮＯＸＡに対して向けられたｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスベクターを感染させた２日後に、ｐＩＣまたはＢＯ−１１０で２４時間処理したＳＫ−Ｍｅｌ−１０３メラノーマ細胞から得られた。
【図９Ｅ】対照ｓｈＲＮＡ（灰色の棒）またはＮＯＸＡに対して向けられたｓｈＲＮＡ（黒色の棒）のいずれかを形質導入し、ｐＩＣまたはＢＯ−１１０とともに２４時間インキュベートしたＳＫ−Ｍｅｌ−１０３メラノーマ細胞の死亡率（死細胞のパーセンテージとして表す）を表すグラフ（ＮＴ：未処理、投与のビヒクルとともにインキュベートした細胞）。
【図９Ｆ】ｓｈＲＮＡ対照またはＭＤＡ−５に対して向けられたｓｈＲＮＡを形質導入したＳＫ−Ｍｅｌ−１０３細胞におけるＮＯＸＡレベル（任意単位、ａｕで表す）で表し、ＢＯ−１１０によるＮＯＸＡの誘導に対するＭＤＡ−５下方調節の阻害的効果に対応するグラフ。ＮＯＸＡレベルは、デンシトメトリーによって測定され、未処理対照（Ｎ  Ｉｎｆ：干渉なし、裸のｐＩＣによる処理の場合は値１、ＢＯ−１１０処理の場合は値１００を与えるレベル）に対して表された。
【図１０Ａ】上のパネル：同系Ｃ５７ＢＬ／６でＢ１６メラノーマ細胞の皮下異種移植片を生じさせるための実験アプローチの概略グラフ。（１００μｌ中）５０μｇ（２ｎｇ／ｋｇ）の裸のｐＩＣ及びＰＥＩと複合体化したｐＩＣの腫瘍周辺注射のための処理時間も表示されている。対照群には、１００μｌの５％グルコースまたはＰＥＩのみを投与した。免疫適格マウスにおけるＢＯ−１１０抗メラノーマ活性を示す。  下のパネル：表示した時点でのキャリパー測定で推定された腫瘍増殖を示すグラフ。実験群１つ当たり１０個の腫瘍を解析した。通常通り、腫瘍体積が１０００ｍｍ３を超えたときに、マウスを屠殺した。実験を２回繰り返して、同様の結果を得た。
【図１０Ｂ】後に表示した時点で（１００μｌ中）１０μｇ（１ｎｇ／ｋｇ）のｐＩＣまたはＢＯ−１１０を用いて静脈内処置するための同系Ｃ５７ＢＬ／６におけるＢ１６−ＥＧＦＰメラノーマ細胞の静脈内移植を示す写真。対照群には、５％グルコース中のＰＥＩを投与した。細胞を接種してから１４日後、マウスを安楽死させ、蛍光イメージング用に肺を処理した。
【図１０Ｃ】外部転移を手作業で計数して得られた各処理群で観察された肺転移の数を表す棒グラフ（Ｃ）。（ＮＴ／ＰＥＩとＢＯ−１１０の間のＰ＊＜０．０１；ｎ＝５；一般化されたマン−ホイットニー検定）。
【図１１Ａ】ｐＩＣまたはＢＯ−１１０で処理したＢ１６メラノーマ細胞及び骨髄由来マクロファージを示すグラフ。ＲＮＡを単離し、ＩＦＮ標的のＩＦＩＴ−１について定量的ＰＣＲを行なった。対照未処理細胞に対して推定されたＩＦＩＴ−１の相対ｍＲＮＡレベルが示されている。ＩＦＮ−αはＢＯ−１１０によって誘導されるが、メラノーマ細胞死を促進するには十分でない。
【図１１Ｂ】ＥＬＩＳＡで決定されるＢＯ−１１０処理細胞におけるＩＦＮ−αの分泌量よりも既に高い１０ｐｇ／ｍｌから始まる表示した濃度のヒト組換えＩＦＮ−αで処理したＳＫ−Ｍｅｌ−１０３メラノーマ細胞を示すグラフ。処理の２４時間後に、細胞死を決定した。対照として、細胞をＢＯ−１１０で同時に処理した（２４時間）。高レベルのＩＦＮ−αはメラノーマ細胞に対して細胞傷害性がなく、ＢＯ−１１０による効率的な死滅を再現することができない。
【図１１Ｃ】ｐＩＣ及びＢＯ−１１０のマイクロアレイ試験結果を示す説明図。
【図１２Ａ】ＳＣＩＤベージュマウス（ＮＫ細胞、Ｂ細胞及びＴ細胞について重症免疫不全）におけるＢ１６によって誘起されるメラノーマ肺転移の発生及び処置を示す写真。画像は、Ｂ１６メラノーマ細胞を静脈内に接種し、ＰＥＩ、ｐＩＣまたはＢＯ−１１０で処理したマウスの代表的な肺の、可視光または蛍光下での写真に対応する。画像は、細胞を注射してから１４日後に記録された。免疫抑制はメラノーマの転移性播種を阻止するＢＯ−１１０の能力に支障を来さない。
【図１２Ｂ】図１２Ａに表示したようなＢ１６によって誘導された転移の平均数の表示を示すグラフ（ＰＥＩ処理群とｐＩＣ処理群とＢＯ−１１０処理群の間でＰ＊＜０．０１；ｎ＝５；一般化されたマン−ホイットニー検定）。
【図１２Ｃ】ＰＥＩ、ｐＩＣまたはＢＯ−１１０で処理したマウスにおけるＢ１６によって誘起される肺の組織学的解析を示す写真。表示した処理群に由来し、２つの異なる倍率（１０倍及び４０倍）で可視化した肺の代表的なＨ＆Ｅ染色が示されている。
【図１２Ｄ】ＳＣＩＤベージュマウス（ＮＫ細胞、Ｂ細胞及びＴ細胞について重症免疫不全）におけるＳＫ−Ｍｅｌ−１０３によるメラノーマ肺転移の発生及び処置を示す写真。画像は、ＳＫ−Ｍｅｌ−１０３メラノーマ細胞を静脈内に接種し、ＰＥＩ、ｐＩＣまたはＢＯ−１１０で処理したマウスの代表的な肺の蛍光または可視Ｈ＆Ｅ染色（下の線）下での写真に対応する。
【図１２Ｅ】図１２Ｄに表示したようなＳＫ−Ｍｅｌ−１０３によって誘導された転移の平均数の表示を示すグラフ（Ｐ＊＜０．０１；ｎ＝５；一般化されたマン−ホイットニー検定）。
【図１３Ａ】ＤＭＢＡで処理して色素沈着した病変を誘導し、その後、５％グルコース中のＰＥＩ（対照：Ｃｔｒｌ．）、ｐＩＣまたはＢＯ−１１０で処理したＴｙｒ：：ＲａｓＱ６１Ｋ×ＩＮＫ４ａ／ＡＲＦ−／−マウスにおける転移の無進行生存についてのカプラン−マイヤープロットを示すグラフ。Ｔｙｒ：：ＮＲＡＳＱ６１Ｋ×ＩＮＫ４ａ／ＡＲＦ−／−マウスにおける、ＢＯ−１１０によって広められる転移性播種の阻害。
【図１３Ｂ】図１３Ａの被験群の各々が発生させる皮膚のメラノサイト新生物の累積平均数についての棒グラフ。５日ごとに計数を行ない、グラフに表示したようなサイズ範囲によって腫瘍をグループ化した。
【図１３Ｃ】５％グルコース中のＰＥＩ（対照）、裸のｐＩＣまたはＢＯ−１１０で処置した代表的なマウス例の代謝活性（１８Ｆ−ＦＤＧの取込み）を検討することを目的としたＰＥＴ／ＣＴによって得られた横断面（左の列）及び冠状断面（右の列）の代表的な画像写真。腫瘍は、白い点線で囲まれている。アステリスクは、動物の心臓の位置を示す。
【図１３Ｄ】図１３Ａに記載された処置群の各々から採取したメラノサイト病変試料のヘマトキシリン−エオシン染色を示す写真。
【図１３Ｅ】５％グルコースビヒクル（対照）またはＢＯ−１１０で処理したマウスの（写真の左側に表示されているような）皮膚組織試料、心臓、肝臓または肺のヘマトキシリン−エオシン染色を示す写真。これにより、正常な細胞コンパートメントではＢＯ−１１０処置と関連する毒性がないことが示されている。
【図１４Ａ】ＢＯ−１１０処理の１８時間後（左の棒）及び３０時間後（右の棒）に実施されたトリパンブルー排出アッセイによって推定された、様々な腫瘍細胞株：膵癌（Ｐａ）、大腸癌（Ｃ）、膀胱癌（Ｂｌ）、神経膠腫（Ｇ）、乳癌（Ｂｒ）、メラノーマ（Ｍ）、前立腺癌（Ｐｒ）、肺癌（Ｌ）及び卵巣癌（Ｏ）における細胞死のパーセンテージを表すグラフ。データは、表示した細胞株を用いて行なわれた３回の独立した実験の平均±ＳＥＭとして表されている。種々の腫瘍細胞に対するＢＯ−１１０の細胞傷害活性を示す。
【図１４Ｂ】ビヒクルまたはＢＯ−１１０による処理の２４時間後の以下の腫瘍細胞株：ＭｉａＰａＣａ（膵臓）、ＢＴ５４９（乳房）、６３９Ｖ（膀胱）及びＴ９８Ｇ（膠芽細胞腫）の代表的な明視野画像写真。ＢＴ５４９は最初はＢＯ−１１０に耐性があったが、最終的に長期の生死判別アッセイで崩壊する（パネルＢ参照）。６３９Ｖ及びＴ９８Ｇは、ＢＯ−１１０の細胞傷害効果に対して感受性が高い。
【図１４Ｃ】ビヒクルまたはＢＯ−１１０による処理の２４時間後の表示した腫瘍細胞株の生死判別アッセイを示す写真。短期の生死判別アッセイの場合は、処理の２４時間後に処理細胞を固定し、コロニー細胞形成を可視化するためにクリスタルバイオレットで染色した。長期の生死判別アッセイの場合は、２４時間処理した細胞の１０分の１をプレーティングし、固定し、クリスタルバイオレットで４８時間染色した。
【図１５】ビヒクル（「−」と表示）またはＢＯ−１１０（「＋」と表示）による処理の２４時間後の以下の腫瘍細胞株：ＢＴ５４９（乳房）、６３９Ｖ（膀胱）及びＴ９８Ｇ（膠芽細胞腫）から単離された全細胞抽出物のイムノブロットを示す写真。解析したタンパク質は、ＭＤＡ−５ＦＬ（ＭＤＡ−５全長）、ＭＤＡ−５Ｃ（ＭＤＡ−５切断）、ＮＯＸＡ、カスパーゼ−９またはチューブリン（ローディング対照）であった。ＮＯＸＡ及びＭＤＡ−５ＦＬのより大きい誘導ならびにカスパーゼ−９及びＭＤＡ−５Ｃの切断は、ＢＯ−１１０により感受性の高い腫瘍細胞で生じる。ＢＯ−１１０誘導性細胞死は、腫瘍細胞株におけるＭＤＡ−５、Ｎｏｘａ及びオートファジーの活性化に依存する。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
以下に、本発明を実施例及び図面によって詳細に説明する。
【００５１】
下記の実施例のアッセイは、以下の材料及び実験手法を用いて実施した。
【００５２】
細胞及び細胞培養：
ヒト転移性メラノーマ細胞株ＳＫ−Ｍｅｌ−１９、ＳＫ−Ｍｅｌ−２８、ＳＫ−Ｍｅｌ−１０３及びＳＫ−Ｍｅｌ−１４７ならびにマウスＢ１６細胞は以前に記載されている（Ｓｏｅｎｇａｓら、２００１）。これらの細胞は、１０％胎仔ウシ血清（Ｎｏｖａ−Ｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）を補充したダルベッコの改変イーグル培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）中で培養した。
【００５３】
ヒトメラノサイトをヒト新生児包皮から、記載されているように単離し（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら、２００５（非特許文献３１））、メラノサイト増殖因子（ＨＭＧ−Ｉ）を補充した、１０ｎｇ／ｍｌのホルボール１２−ミリスタート１３−アセタート（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ，ＵＳＡ）を含む、Ｍｅｄｉｕｍ  ２５４中で維持した。
【００５４】
ヒト線維芽細胞をヒト新生児包皮から単離し、１０％胎仔ウシ血清を補充したＤＭＥＭ培地中で維持した。
【００５５】
さらに、他の腫瘍タイプ由来の細胞を、国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（ＮＣＩ）の抗癌剤スクリーニングプログラム（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｐｒｏｇｒａｍ）によって用いられた、９種の腫瘍組織型に相当する６０のヒト腫瘍細胞株のパネルから単離した。選択された細胞株は、膵臓腫瘍については、ＩＭＩＭＰＣ２、ＭｉａＰａＣａ、Ａｓｐｃ１、Ａ６Ｌ、ＳＫＰＣ−１及びＰａｎｃ−１であり、大腸癌については、ＣＡＣＯ、ＳＷ４８０及びＳＷ１２２２であり、膀胱癌については、ＲＴ１１２、ＭＧＨＵ４、６３９Ｖ、２５３Ｊ、ＭＧＨｕ３及びＳＷ１１７０であり、神経膠腫及び膠芽細胞腫については、Ｕ８７ＭＧ、Ｕ２５１及びＴ９８Ｇであり、乳癌については、ＭＤＡ−２３１、ＭＣＦ７及びＴ４７Ｄであり、前立腺癌については、ＬＮＣａＰ、ＰＣ３及びＤＵ１４５であり、肺癌については、Ｈ１２９９及びＮＣＩ  Ｈ４６０であり、卵巣癌については、ＮＣＩ  Ｈ２３及びＳＫ−ＯＶ−３であった。
【００５６】
細胞は全て、１０％胎仔ウシ血清（Ｎｏｖａ−Ｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）を補充したダルベッコの改変イーグル培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）中で培養した。
【００５７】
ＰＥＩ複合体化ｐＩＣ（ＢＯ−１１０）の作製：
ｄｓＲＮＡの合成類似体であるｐＩＣは、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。反応性のｊｅｔＰＥＩ（商標）、ｊｅｔＰＥＩ−Ｆｌｕｏｒ（商標）及びｉｎｖｉｖｏ−ｊｅｔＰＥＩ（商標）は、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ（Ｉｋｉｒｃｈ，Ｆｒａｎｃｉａ）から取得した。ポリエチレンイミンの線形誘導体を含む、これらの製品を用いて、製造元のプロトコルに従って、インビトロ及びインビボで、１〜５のＮ／Ｐ比（ＲＮＡリン酸エステル１つ当たりのＪｅｔＰＥＩの窒素残基）でｐＩＣを複合体化した。
【００５８】
別途示さない限り、培養細胞で用いるｐＩＣの濃度は１μｇ／ｍｌとし、マウスでは１〜２ｎｇ／ｋｇとした。
【００５９】
薬物処理及び細胞死アッセイ：
ボルテゾミブ（ベルケード、かつてはＰＳ−３４１）は、Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）から、アドリアマイシン（ドキソルビシン）は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から、エトポシドは、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）から入手した。抗酸化剤のタイロン（Ｔｉｒｏｎ）とビタミンＥは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から、汎カスパーゼ阻害剤ＺＶＡＤは、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から購入した。３−メチルアデニン（３−ＭＡ）は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。クロロキンは、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から入手した。
【００６０】
薬物処理の少なくとも１２時間前にメラノサイト及びメラノーマ細胞を播種した後、薬物処理に応答した細胞生死判別アッセイを行なった。表示した時間及び処理濃度での細胞死のパーセンテージは、以前に記載されているような標準的なトリパンブルー排出アッセイ（Ｗｏｌｔｅｒら、２００７（非特許文献１１）；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら、２００５（非特許文献３１））によって推定した。
【００６１】
薬物処理の少なくとも１２時間前に腫瘍細胞を播種した後、薬物処理に応答した細胞増殖アッセイを行なった。表示した時間及び処理濃度での細胞の増殖をクリスタルバイオレット染色アッセイによって推定した。
【００６２】
タンパク質イムノブロッティング：
タンパク質レベルの変化を明らかにするために、２×１０６個の細胞を、表示したように処理し、処理後の様々な時間で採取した。全細胞ライセートを還元条件下にて１０％、１２％または４−１５％勾配ＳＤＳゲルでの電気泳動にかけ、その後、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）に転写した。タンパク質バンドは、ＥＣＬシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｂｕｃｋｉｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）で検出した。
【００６３】
一次抗体には、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ，ＣＯ，ＵＳＡ）製のｃａｓｐ−９及びｃａｓｐ−３；Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）製のｃａｓｐ−８（Ａｂ−３）；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）製のｃａｓｐ−７；ＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）製のＢｃｌ−ｘＬ；Ｄａｋｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）製のＢｌｃ−２；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）製のＮＯＸＡ；Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ，ＵＫ）製のＭＤＡｐ５３；ならびにＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）製のチューブリン（クローンＡＣ−７４）が含まれる。ＭＤＡ−５抗体は先に記載されている。
【００６４】
二次抗体は、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製の抗マウスまたは抗ウサギのいずれかであった。Ｉｍａｇｅ  Ｊを用いて、未処理の対照を基本的発現の参照として考えて、異なる処理によって誘導されたタンパク質レベルの変化を定量化した。
【００６５】
ＲＮＡ干渉：
ＮＯＸＡを下方調節するために使用したｓｈＲＮＡレンチウイルスベクターは、以前に報告されている（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら、２００５（非特許文献３１））。ＭＤＡ−５（標的配列、配列番号：１）を下方調節するために使用したｐｌｋｏレンチウイルスベクターは、ＯｐｅｎＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）から購入した。スクランブルオリゴヌクレオチドを設計して、対照ｓｈＲＮＡも作製した。ウイルスを記載されている通りに２９３ＦＴ細胞から生成させ、＞８０％の感染効力を与える条件下で使用した（Ｄｅｎｏｙｅｌｌｅら、２００６（非特許文献３２））。ＭＤＡ−５の下方調節は、イムノブロッティングとＲＴ−ＰＣＲ（配列番号：２のフォワードプライマー及び配列番号：３のリバースプライマー）で確認した。表示されている場合、ｐＩＣまたはＢＯ−１１０による処理は、対応するｓｈＲＮＡ発現ウイルスの感染３日後に開始された。
【００６６】
発現プロファイリングマイクロアレイ：
トータルＲＮＡを少なくとも２回の独立した実験から単離し、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｕｉａｇｅｎ）を用いて精製した。ＢＯ−１１０で処理した試料は、２．５ｍｇのＣｙ５−ＵＴＰで標識し、ＰＩＣまたはＰＥＬとのインキュベーションから得られるＣｙ３−ｄＵＴＰで標識した２．５ｇのＲＮＡとのハイブリダイゼーション反応における参照として用いた。マークしたＲＮＡを、製造元の指示に従って、Ａｇｉｌｅｎｔ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）の２色オリゴ完全ヒトゲノムマイクロアレイ（４×４４Ｋ）とハイブリダイズさせた。洗浄後、スライドをスキャンアレイ１０  ５０００  ＸＬ（ＧＳＩ  Ｌｕｍｏｎｉｃｓ  Ｋａｎａｔａ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）を用いてスキャンし、画像を以前に記載されているように（Ａｌｏｎｓｏら、２００７（非特許文献３３））、ＧｅｎｅＰｉｘ  ４．０プログラム（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．，Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）で解析した。蛍光の強度測定値を自動バックグラウンド減算に供した。Ｃｙ３：Ｃｙ５の関係性を全ての点の中央比の値に対して標準化した。標準化の後、両方のチャンネルの強度（中央値の合計）が局所的なバックグラウンドよりも低い点を捨てた。残りの点の関係を対数変換（底２）にかけ、２つ組の点のアレイを中央値に合わせて調整した。対照と被験試料の間で示差的に発現された遺伝子の加重しない対のグループ化（ＵＰＧＭＡ：非加重結合法）は、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｕｉｔｅ（ＧＥＰＡＳ）を用いて実施した。
【００６７】
インビボでの処理応答：
雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ＮＩＨ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ．ＭＡ）から購入した。ＮＫ細胞、Ｔ細胞及びＢ細胞リンパ球機能に障害のある雌ＳＣＩベージュマウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から得たものであった。全ての動物は、実験の開始時点で６〜１２週齢であった。動物の世話は、ミシガン大学がんセンター（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｈｉｇａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ）の施設手続きに準じて行なわれた。
【００６８】
皮膚における生着は、１０５個のＢｌ６メラノーマ細胞の皮下注射によって生じさせた。２ｎｇ／ｋｇのｐＩＣのみまたはｉｎｖｉｖｏＪｅｔＰＥＩと複合体化したｐＩＣを、腫瘍移植後７、１１、１５及び２１日目に、腫瘍周辺注射によって投与した。さらなる処置群には、単剤としてのＪｅｔＰＥＩ及びプラセボ対照が含まれた。腫瘍体積をキャリパー測定によって推定し、Ｖ＝Ｌ×Ｗ２／２（式中、Ｌ及びＷは、それぞれ、腫瘍の長さ及び幅を表す）として算出した。
【００６９】
肺転移の代用モデルを４×１０５個のＢ１６−ｅＧＦＰまたは５×１０５個のＳＫ−Ｍｅｌ−１０３−ｅＧＦＰメラノーマ細胞の静脈内注射によって作製した。処置は、３、６、及び９日目に、１ｎｇ／ｋｇのｐＩＣのみまたはｉｎｖｉｖｏＪｅｔＰＥＩと複合体化したｐＩＣの静脈内注射によって行なわれた。投与１４日後に肺を摘出し、外部転移を手作業で計数し、数及びサイズによって得点化した。あるいは、Ｉｌｌｕｍａｔｏｏｌ  ＴＬＳ  ＬＴ−９５００蛍光システム（Ｌｉｇｈｔｏｏｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｅｎｃｉｎｉｔａｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）及び腫瘍細胞からの放出蛍光をＨａｍａｍａｔｓｕ  Ｏｒｃａ  １００  ＣＣＤカメラで記録した。パラフィン切片のヘマトキシリン−エオシン染色の解析によって、転移性病変を独立にモニタリングした。実験を５匹のマウスからなる群で行ない、２〜４回繰り返した。対照集団が不快症状または呼吸欠陥の兆候を示した場合には、マウスを安楽死させた。
【００７０】
Ｔｙｒ：：Ｎ−ＲａｓＱ６１ＫマウスをＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドのＩｎｋ４ａ／Ａｒｆノックアウトマウスと交配して自然発症メラノーマを生じさせた（Ａｃｋｅｒｍａｎｎら、２００５（非特許文献３４））。皮膚でのメラノーマの誘導のために、マウスに、８〜１０週齢で、２２０ｍｇの７，１２−ジメチルベン［ａ］アントラセン（ＤＭＢＡ）を１回塗布した。初期のメラノサイト新生物（直径が少なくとも１ｍｍの病変）を発症した後、マウスを、単剤またはｉｎ  ｖｉｖｏＪｅｔＰＥＩと複合体化したｐＩＣとしての１ｎｇ／ｋｇの腹腔内注射で週に２回処置した。メラノーマ及びほくろ（母斑）を計数し、そのサイズをキャリパーを用いて２つの直径で測定し、ｍｍ３で表す平均径腫瘍として表した。
【００７１】
腫瘍のサイズは、ＰＥＴ−ＣＴ（陽電子放射断層撮影−コンピュータ断層撮影）でも評価した。ＰＥＴ−ＣＴ画像の探索及び取得は、小動物用のＰＥＴ−ＣＴシステムであるＶｉｅｗ  Ｅｘｐｌｏｒｅ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃｓ（Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ，ＵＳＡ）を用いて行なわれた。ＰＥＴ画像のイメージング及び取得のために１５ＭＢｑの１８Ｆ−ＦＤＧ（２−フルオロ−２−デオキシ−Ｄ−グルコース）を注射し、アルゴリズム３ＤＯＳＥＭを用いて再構築した。３５ＫｅＶ及び２００μＡのエネルギーを用いてＣＴ画像を１６枚の写真で取得し、これらの画像をＦＤＫアルゴリズムを用いて再構築した。メラノーマ、転移、及び他の臓器を、ヘマトキシリン−エオシンで染色したパラフィン切片の解析によって独立にモニタリングした。
【００７２】
透過電子顕微鏡法：
透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）については、表示した細胞集団を０．１ソーレンセン緩衝液（ｐＨ７．５）ですすぎ、２．５％グルタルアルデヒド中で１．５時間固定し、その後、脱水し、スパー樹脂に包埋した。次に、このブロックを６０〜１００ｎｍ超薄切片で薄切し、銅グリッド上に拾い上げた。ルーチン解析のために、超薄切片を２％酢酸ウラニル及びクエン酸鉛で染色した。Ｐｈｉｌｉｐｓ  ＣＭ−１００透過電子顕微鏡（ＦＥＩ，Ｈｉｌｌｓｂｒｏｕｇｈ，ＯＲ）及びＫｏｄａｋ  １．６  Ｍｅｇａｐｌｕｓデジタルカメラで電子顕微鏡写真を取得した。
【００７３】
共焦点及び蛍光顕微鏡法、ＧＦＰ−ＬＣ３点状ドットの定量：
ｐＣＮＡ発現ベクターにクローニングされたｅＧＦＰ−ＬＣ３融合体は、Ｇａｂｒｉｅｌ  Ｎｕｎｅｚ（ミシガン大学がんセンター（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｈｉｇａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ））から贈与されたものであった。ｅＧＦＰ−ＬＣ３ならびに断片のｅＧＦＰ−Ｒａｂ７ｗｔ、ｅＧＦＰ−Ｒａｂ７  Ｔ２２Ｎ、ｅＧＦＰ−Ｒａｂ５ｗｔ、ｅＧＦＰ−Ｃｈｅｒｒｙ−ＬＣ３及びＣｈｅｒｒｙ−ＬＣ３を、安定な遺伝子導入用のｐＬＶＯ−ｐｕｒｏレンチウイルスベクターにクローニングした。メラノーマ由来細胞（すなわち、ＳＫ−Ｍｅｌ−１０３）にｐＬＶＯ−ｅＧＦＰ−ＬＣ３を感染させ、ピューロマイシンで選択した。Ｌｅｉｃａ  ＡＦ６０００蛍光顕微鏡を用いてＧＦＰ−ＬＣ３と関連する蛍光放出をイメージングし、ＬＡＳ  ＡＦ  Ｖｌ．９（Ｌｅｉｃａ，Ｓｏｌｍｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で画像を解析した。共焦点リアルタイム顕微鏡観察のために、本発明者らは、ＣＯ２及び温度制御インキュベーションチャンバーに接続されたＬｅｉｃａ  ＴＣＳ−ＳＰ２−ＡＯＢＳ−ＵＶ超スペクトル顕微鏡を用いた。ＬＣＳ（Ｌｅｉｃａ，Ｓｏｌｍｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で画像を解析した。共局在実験のために、５０ｎＭまたは２００ｎＭの濃度のリソトラッカー（商標）レッドまたはブルー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂｒａｄ，ＣＡ）及びＨｏｅｓｃｈｔ  ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂｒａｄ，ＣＡ）を、イメージングの１０分前に５μｇ／ｍｌの濃度で添加した。共局在画像は、ＬＡＳ  ＡＦ  Ｖｌ．９（Ｌｅｉｃａ，Ｓｏｌｍｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて解析した。
【００７４】
サイトカイン発現：
ヒトインターフェロンαを酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって培養上清中で測定した。ヒトＩＦＮ−α  ＥＬＩＳＡキット及び組換えｈＩＦＮ−αをＰＢＬ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＹ）から購入し、製造元のプロトコルに従って用いた。ＩＦＮ−α発現レベルを骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）及びＢ１６メラノーマ細胞からリアルタイムＰＣＲで測定した。ＢＭＤＭは、以前に記載されているように調製し、プレーティングし、処理した（Ｃｅｌａｄａら、１９８４（非特許文献３５））。β−アクチンで標準化した後、ＴａｑＭａｎプライマー及びＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手したプローブを用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７７００配列検出器で、ＩＦＩＴ−１  ＲＮＡ転写物のリアルタイム定量ＰＣＲ解析を行なった。
【００７５】
統計解析：
生存データは、平均＋／−ｓ．ｅ．ｍとして表す。差の統計解析は、両側スチューデントｔ検定により求めた。Ｐ＜０．０５を有意とみなした。インビボでの腫瘍増殖及び転移の統計評価については、一般化したマン−ホイットニーウィルコクソン検定を用いて、２群間の連続変数の値を比較した。＜０．０５のＰ値を有意とみなした。
【実施例１】
【００７６】
ＬＣ３蛍光に基づく識別解析によるメラノーマ細胞におけるオートファジー誘導物質の同定、微細構造解析を通じたＢＯ−１１０によるオートファジー細胞死の確認：
先に論じたように、（細胞死の誘導と生存の両方に関する）オートファジーの顕著な特徴は、細胞質から新たに生成したオートファゴソームへのオートファジータンパク質遺伝子８（ＡＴＧ８）／ＬＣ３の再配置である。この観察に基づいて、ＧＦＰ−ＬＣ３融合タンパク質の細胞分布の変化（すなわち、拡散パターンから局所的染色への変化）が、初期段階のオートファジーのマーカーとして用いられる。オートファゴソームの存在は、電子顕微鏡観察または光学顕微鏡観察によっても確認することができる。
【００７７】
１．１．ＬＣ３に基づく蛍光解析：
薬物に対するメラノーマの応答におけるオートファジーの役割を検討するために、ＧＦＰ−ＬＣ３に基づく識別解析を用いて、市販の化学療法剤及び免疫調節物質をスクリーニングした。ＧＦＰが付いたオートファゴソームＬＣ３マーカーの誘導体を発現するレンチウイルスベクター（例えば、ｐＬＶＯ−ｅＧＦＰ−ＬＣ３）をメラノーマ細胞に安定にトランスフェクトした。
【００７８】
ヒト細胞株ＳＫ−Ｍｅｌ−１０３を、その高転移性及び化学療法耐性の表現型に基づいて、初期のスクリーニング用のモデル系として選択した（Ｓｏｅｎｇａｓら、２００１（非特許文献３６））。後のバリデーション研究は、多様な遺伝的バックグラウンドのヒト細胞株のパネルに対して行なわれた（下記参照）。
【００７９】
種々の抗癌剤が、細胞の生存に大した影響を及ぼすことなく、局所的なＧＦＰ−ＬＣ３蛍光放出を誘導することが分かった。しかしながら、死誘導物質の中で、ＰＥＩとｄｓＲＮＡ模倣体のポリイノシン−ポリシチジル酸の複合体（ＢＯ−１１０）は、ＧＦＰ−ＬＣ３フォーカスを働かせるのに特に有効であることが分かった。低用量（０．５〜１μｇ／ｍｌ）のＢＯ−１１０中でインキュベートしてから４〜６時間以内に、細胞の約５０％が顕著な点状のＧＦＰ−ＬＣ３染色を示した（図１Ａ、図１Ｂの代表的な顕微鏡写真及び定量を参照されたい）。実際、動力学的解析によって、オートファジー誘導の標準的な陽性対照であるラパマイシン（Ｋｌｉｏｎｓｋｙら、２００８（非特許文献３７））によるよりも速いＧＦＰ−ＬＣ３フォーカスの生成がＢＯ−１１０によって示された（図１Ｂ）。
【００８０】
興味深いことに、後の時点で、ＢＯ−１１０処理は、ＳＫ−Ｍｅｌ−１０３の場合のように、標準的なＤＮＡ損傷剤（例えば、ドキソルビシンまたはエトポシド）に対して本質的に耐性があるメラノーマ細胞株でさえも、細胞死を誘導することができた。
【００８１】
内在性ＬＣ３の解析により、オートファゴソーム形成時のこのタンパク質の特徴的な脂質化に対応する電気泳動移動度の変化（図１Ｃ）及びＧＦＬ−ＬＣ３フォーカス形成の生成に対するＡＴＧ５の必要性が示された。
【００８２】
本発明の著者らは、ｐＩＣを癌細胞におけるオートファジーと関連付けた過去の報告を知らなかった。そのため、以下の試験はこの化合物に重点を置いたが、それは、この化合物が、オートファジー及び腫瘍細胞死を誘導するｄｓＲＮＡの潜在的な細胞内センサーについての理解を深めるための新しい要素を明らかにする可能性があったからである。
【００８３】
１．２．細胞に対するＢＯ−１１０効果の微細構造解析：
先のパラグラフで記載したＢＯ−１１０で処理した細胞におけるＧＦＰ−ＬＣ３の局所的染色は、オートファゴソームの形成と一致している。しかしながら、異所性に発現したＧＦＰ−ＬＣ３の非特異的凝集（Ｋｌｉｏｎｓｋｙら、２００８（非特許文献３７））の可能性を排除するために、電子顕微鏡法によって応答を独立に解析した（図１Ｄ）。
【００８４】
ＢＯ−１１０に対する初期の応答（５時間）は、オートファゴソームの顕著な特徴である、細胞破片を隔離する膜に結合した電子密度の高い構造の際立った蓄積を伴った（図１Ｄ）。これらの構造のサイズ及び数は、光学顕微鏡観察でも細胞内顆粒として目に見えた（図１Ｅ）。
【００８５】
より後の時点で、ＢＯ−１１０による処理は細胞崩壊（図１Ｆ、中央のパネル）を誘導し、この崩壊は、直径が５００ｎｍよりも大きい巨大な食空胞の形成を伴うことが電子顕微鏡観察で分かった（図１Ｆ、右のパネル）。
【００８６】
図２は、様々な時間で撮影された選択された蛍光顕微鏡写真によるオートファジー誘導の時間的推移のまとめを示す。これらは、全体的な細胞崩壊に至るプロセスであるオートファゴソームの形成を示す、拡散した染色から局所的な凝集への、経時的なＥＧＦＰ再分布の顕微鏡写真に見ることができる。対照細胞は、実験期間の全体を通して、基礎レベルのＬＣ３の蓄積を示す拡散した染色を示した。
【００８７】
形質膜及び核膜の完全性が残っていたことと、ＢＯ−１１０で処理した細胞がアポトーシスプログラムの特徴的なクロマチン凝縮を示したことは興味深い。ＰＥＩ（対照）は、オートファゴソームの数またはサイズに対してわずかな影響しか及ぼさなかったので（図１Ｄ〜Ｆ）、オートファジーの誘導はＢＯ−１１０に依存的であった。総合すると、これらの知見は、オートファゴソームの形成と、それに次ぐアポトーシス様の特徴を有する細胞死を伴う、ＢＯ−１１０の細胞傷害効果を裏付ける。
【実施例２】
【００８８】
カチオン性分子と結合したｐＩＣを用いる様々なヒト及びマウスメラノーマ細胞株の感受性解析ならびにメラノサイトに対する選択性：
ＳＫ−Ｍｅｌ−１０３細胞を用いて実施した初期の研究で見出されたオートファジー促進性のＢＯ−１１０の活性が、より広範な抗メラノーマ活性の現われであったか否かを明らかにするために、さらなる細胞株のセットを試験した。
【００８９】
メラノーマの進行及び化学療法耐性に寄与することが知られている、ＢＲＡＦまたはＮＲＡＳの突然変異、ＩＮＫ４ａ／ＡＲＦもしくはＰＴＥＮ遺伝子座の欠失、または様々な抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーの上方調節などの、頻度の高いメラノーマ関連事象と関連付けるために、メラノーマ細胞を選択した。
【００９０】
Ｐ５３突然変異はメラノーマでは稀である（Ｓｏｅｎｇａｓ及びＬｏｗｅ、２００３（非特許文献３８））。しかしながら、ｐ５３はアポトーシス及びオートファジープログラムの活性化において重要な役割を果たし得るので、本発明者らは、この腫瘍抑制がＢＯ−１１０の抗メラノーマ活性に厳密に必要であるのか否かを明らかにするために、突然変異体ｐ５３を発現するＳＫ−Ｍｅｌ−２８細胞株に対しても試験を行なった。さらに、種間の違いと関連すると思われる処理応答の違いを評価するために、メラノーマの免疫療法で広く用いられるモデルの一例として（Ｗｅｎｚｅｌら、２００８（非特許文献３９））、マウス転移性メラノーマ細胞株Ｂ１６も解析に含めた。同時に、本発明者らは、ヒト包皮から単離したメラノサイトも解析した。
ヒト転移性メラノーマ細胞株の遺伝的バックグラウンドを、表１に示す。
【００９１】
【表１】
0005908398.tif 000002
【００９２】
ｐ５３突然変異状況は、ＲＴ−ＰＣＲでエキソン２〜１０を直接シークエンシングすることによって決定した。多型Ｐ７２Ｒを有する試料はＲと表示されている。ｐ５３の誘導性は、ドキソルビシン（０．５ｍｇ／ｍｌ、１２時間）で処理した抽出物のイムノブロッティングによって決定した。ｐ５３の内在性レベルが高い株は、アステリスクを付けて表示されている。ＰＴＥＮ、Ａｐａｆ−１、Ｃａｓｐ−８、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ及びＭｃｌ−１レベルをイムノブロッティングで測定し、対照メラノサイトに対して標準化した。ＢＲＡＦ及びＮＲＡＳの突然変異状況は、それぞれ、エキソン１５及び３のＰＣＲ増幅ゲノム断片を直接シークエンシングすることによって決定した。ドキソルビシン（ＤＯＸ；０．５μｇ／ｍｌ、３０時間）に対する応答は、それぞれ、１００〜７０、７０〜５０、５０〜３０及び＜３０％の細胞死のパーセンテージを表す、＋＋、＋、−／＋、−に分類されている。ＢＯ−１１０（１μｇ／ｍｌ、３０時間）に対する応答は、それぞれ、１００〜９０、９０〜６０及び６０〜４０％の細胞死のパーセンテージを表す、＋＋＋、＋＋、＋に分類されている。ｐ５３の内在性レベルが高い株は、アステリスクを付けて表示されている。
【００９３】
独立した薬剤としてまたは組み合わせて用いられるｐＩＣ及びＰＥＩに対するこれらの細胞の各々の感受性を検証するために、これらの株を用いて、ＳＫ−Ｍｅｌ−１０３細胞株について実施例１で記載したのと同様に試験を実施した。結果を図３にまとめる。
【００９４】
試験した５つのメラノーマ細胞株（ＳＫ−Ｍｅｌ−１９、ＳＫ−Ｍｅｌ−２８、ＳＫ−Ｍｅｌ−１０３、ＳＫ−Ｍｅｌ−１４７、及びＢ１６）は、ＢＯ−１１０による処理の後、同様の動力学及び感受性で死滅した（図３Ａ）。試験を実施した全てのメラノーマ株において、ＢＯ−１１０による初期のオートファジーの活性化の後には必ず細胞死が続いたことを指摘するのは重要なことである。
【００９５】
電子顕微鏡観察により、ｐ５３突然変異体株のＳＫ−Ｍｅｌ−２８の場合でも、明らかなオートファゴソームが示された（図３Ｂ）。図３Ａ及び（４つの独立した分離株に対応する株の代表的なデータを示す）図４Ｂに描かれた用量応答曲線に示すように、処理の２４時間後にＳＫ−Ｍｅｌ−１０３メラノーマ細胞の７０％の死を引き起こす条件下では、正常メラノサイトが依然として生存しており、オートファジーのマーカーを全く示さなかったことに留意することは重要なことである。
【００９６】
さらに、図４Ａに示すように、幅広い濃度のＢＯ−１１０に対して、メラノサイトにおける形態、顆粒化または細胞質ＧＦＰ−ＬＣ３分布の変化は観察されなかった。図４Ｃはまた、正常ヒト皮膚線維芽細胞にも、メラノーマ細胞よりも大きいＢＯ−１１０への耐性があったことを示している。
【００９７】
ＰＥＩがその選択性において腫瘍細胞にとって極めて重要であることがわかったのは興味深い。上に述べたように、ＰＥＩが処理に含まれない場合、ｐＩＣの抗メラノーマ活性は７０〜８０％低下した（図３Ａ）。ＰＥＩがない場合、裸のｐＩＣは、メラノーマ細胞及びメラノサイトでほぼ効果がなく、オートファジーの誘導物質としてわずかな活性しか示さなかった（図３Ｂ）。
【００９８】
ＰＥＩは、エンドサイトーシスによるＤＮＡ及びＲＮＡ分子の取込みを促進するその能力のために、遺伝子療法における標準的なビヒクルである（Ｐａｙｎｅ、２００７（非特許文献４０）に概説されている）。ＢＯ−１１０で処理したメラノーマ細胞に見られる多層構造（下の図２Ｂの写真参照）は、実際に、エンドソーム−リソソームハイブリッド（アンフィソーム）のオートファゴソームへの到達を含む複数の融合事象と一致している（Ｍａｉｕｒｉら、２００７（非特許文献４１））。
【実施例３】
【００９９】
ＰＥＩの非存在下及び存在下でのｐＩＣによるＭＤＡ−５の質的に異なる活性化：
ＤＮＡまたはＲＮＡ分子の好都合なエンドサイトーシスに加えて、ＰＥＩは、エンドソーム膨張を促進し、細胞質への遺伝材料の効率的な送達を可能にすることができる（Ｐａｙｎｅ、２００７に概説されている）。そのため、ＰＥＩは、ｐＩＣが細胞質内センサーに接近するのに有利に働くことができる。メラノーマ分化関連遺伝子−５（ＭＤＡ−５）は、これらのセンサーの１つであり（Ａｋｉｒａ、２００６）、そのため、著者らは、このタンパク質がＢＯ−１１０を介してメラノーマ細胞を死滅させるドライバーであるか否かを検討した。
【０１００】
記載されているように（Ｋｏｖａｓｏｖｉｃｓら、２００２；Ｂａｒｒａｌら、２００７）、細胞死の間、そのヘリカーゼドメインとカスパーゼ活性化動員ドメイン（ＣＡＲＤ）を分離するタンパク質分解的切断をモニタリングすることによって、ＭＤＡ−５の活性化を解析した。
【０１０１】
この解析は、ＰＥＩ、ｐＩＣまたはＢＯ−１１０で処理したＳＫ−Ｍｅｌ−２８及びＳＫ−Ｍｅｌ−１４７細胞由来の抽出物を、これらの抽出物を電気泳動にかけた後にイムノブロッティングすることによって実施された。細胞死の効率的な誘導の陽性対照としてボルテゾミブを用いた。結果を図５に示す。
【０１０２】
興味深いことに、タンパク質イムノブロッティングによって、ＭＤＡ−５のプロセッシングを誘導するＰＥＩ−ｐＩＣ複合体ＢＯ−１１０の強力かつ持続的な能力が明らかになった（図３Ａ）。裸のｐＩＣは、顕著により低いレベルまで、そして、試験した細胞の全てにおいてではなく、持続的な形でもないが、このプロセッシングを誘導することができたか（ＳＫ−Ｍｅｌ−２８細胞に対応するレーンはどれも、タンパク質分解的切断の存在の特徴となる３０ｋＤのバンド（これは、図５のパネルＡ及びＢの矢印の高さで出現するはずである）を示していない）、またはそれを持続することができなかった（図５Ａ参照。３０ｋＤのバンドの強度は、ＳＫ−Ｍｅｌ−１４７細胞におけるｐＩＣ処理の時間とともに減少する）。
【０１０３】
ＢＯ−１１０の細胞傷害活性に対するＭＤＡ−５の寄与を明確にするために、ＭＤＡ−５の安定なノックダウン用のレンチウイルスベクターを介してＭＤＡ−５に相補的な短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をメラノーマ細胞に形質導入した（図３Ｂのタンパク質イムノブロット参照）。ＭＤＡ−５  ｓｈＲＮＡは、対照細胞への検出可能な非特異的作用を伴わず、ＢＯ−１１０によるメラノーマ細胞死を顕著に低下させた（図３Ｃ、ｐ＜０．０５）。
【０１０４】
重要なことに、ＭＤＡ−５の誘導及びプロセッシングは、単に、メラノーマ細胞における死機構の活性化の結果というだけではなかった。ボルテゾミブ（メラノーマの内在性経路と死受容体によるアポトーシス経路の両方を活性化することができるプロテアソーム阻害剤）による処理は、ＭＤＡ−５のレベルまたはプロセッシングに効果がなかった（図５Ａ）。これらの結果は、ＢＯ−１１０及び他のアポトーシス促進性誘導物質による死プログラムの実行における主な機構的違いを示している。
【実施例４】
【０１０５】
オートファジーの薬理学的阻害剤はＢＯ−１１０の細胞傷害活性を含む：
次に、アッセイは、ＢＯ−１１０誘導性細胞死の実行に関与する機構に焦点を当てた。３−メチルアデニン（３−ＭＡ）及びクロロキンは、それぞれ、オートファゴソーム形成またはオートリソソーム活性を妨害するその能力によるオートファジー機構の独立した検証によく用いられる（Ｍａｉｕｒｉら、２００７（非特許文献４１）；Ｋｌｉｏｎｓｋｙら、２００８（非特許文献３７））。
【０１０６】
この干渉がＢＯ−１１０で処理したメラノーマ細胞で起こるか否かを調べるために、ＳＫ−Ｍｅｌ−１０３メラノーマ細胞に、ＢＯ−１１０または緩衝液対照（ビヒクル）による処理の１２時間後に、３−メチルアデニンまたはクロロキンによる処理を施した。結果を図６に示す。
【０１０７】
蛍光顕微鏡観察で示されるように（図６Ａ及び図６Ｂ）、３−ＭＡは、ＢＯ−１１０によるＧＦＰ−ＬＣ３フォーカス形成を阻止した。クロロキンの存在下で、オートファゴソームは蓄積したが、興味深いことに、この誘導は、死誘導物質として生産的ではなかった（図６Ｃ、クロロキンの存在下で観察された死細胞のパーセンテージは、ペプスタチンＡ、Ｅ６４ｄ、または両方の組合せで観察されるものよりも少ないことが観察された）。そのため、これらの結果は、ＢＯ−１１０の細胞傷害活性がオートファゴソーム形成の受動的な副産物ではなく、リソソームの溶解活性がＢＯ−１１０によるメラノーマ細胞死滅の不可欠なメディエーターであるというシナリオを支持する。
【実施例５】
【０１０８】
ＢＯ−１１０はオートファゴソーム／リソソーム融合を駆動して、後に死プログラムを働かせる：
オートリソソームがＢＯ−１１０の重要なドライバーであるならば、ＢＯ−１１０処理の間、リソソームヒドロラーゼの妨害によって、メラノーマ細胞が保護されるはずである。このオルガネラには、重複する標的を有する複数の酵素が局在することができるので、リソソーム依存的活性を全て妨害するのは実現可能ではない（Ｆｅｈｒｅｎｂａｃｈｅｒ及びＪａａｔｔｅｌｌａ、２００５（非特許文献４２））。それでも、リソソーム活性に関する有用な情報は、広域スペクトルのプロテアーゼ阻害剤であるＥ６４ｄ及びペプスタチンＡによって提供することができる。というのは、これらの化合物は、オートリソソーム中の様々なカテプシン（Ｂ、Ｄ、及びＬ）を効率的に妨害するからである（Ｋｌｉｏｎｓｋｙら、２００８（非特許文献３７））。
そのため、緩衝液対照またはＢＯ−１１０による処理の２０時間後、細胞死に対するクロロキン、ペプスタチンＡまたはＥ６４ｄの効果を比較するために、試験を実施した。結果を図６Ｃ（これは先に言及されている）に示す。注目すべきことに、ペプスタチンＡ及びＥ６４ｄは、ＢＯ−１１０による細胞死の程度を５０％低下させた。
【０１０９】
小胞が、（アンフィソームとして知られるハイブリッド構造を生成させるよう）複数のオートファゴソームを動員する、巨大なエンドソームを含む、以前に同定された巨大な多小胞構造に対応していたこと、及びこれらの小胞が、リソソームが動員されていないかもしくは機能不全であるかのいずれかの停止したオートファゴソームの結果ではなかったこと、またはオートファゴソームが、不十分な分解物質の蓄積の結果であったことを確認するために、メラノーマ細胞にＧＦＰとＣｈｅｒｒｙ−ＬＣ３の融合体をトランスフェクトした。Ｃｈｅｒｒｙ−ＧＦＰ−ＬＣ３シグナルは、２つの蛍光タンパク質（Ｃｈｅｒｒｙ及びＧＦＰ）が原因で、赤色と緑色の蛍光のオートファゴソームを生じさせるが、これらのシグナルは、オートリソソームの酸性環境では、ＧＦＰシグナル（緑色）を弱める。
【０１１０】
この戦略を用いて、図６Ｃの赤色のみのＬＣ３フォーカスの存在によって示されるように、実際に、ＢＯ−１１０は、ラパマイシンと同様、メラノーマ細胞におけるオートリソソームの形成を誘導することが明らかになった。クロロキンは、先の試験と一致して、このｄｓＲＮＡ模倣物のエンドソーム取込みに影響を及ぼすことなく（図６Ｄ）、ＢＯ−１１０によって誘発されるメラノーマ細胞死を阻止した（ＦｌｕｏＲｅｄ標識ＢＯ−１１０とＧＦＰ融合初期エンドソームタンパク質Ｒａｂ５との共局在によって明らかにされている（図６Ｅ））。同様の阻害的効果は、広域スペクトルのプロテアーゼ阻害剤であるＥ６４ｄ及びペプスタチンＡならびに空胞ＡＴＰアーゼ遮断薬バフィロマイシンを用いて観察され（図６Ｄ）、リソソームに依存的なＢＯ−１１０の新しい作用様式を裏付けた。
【０１１１】
ＢＯ−１１０処理の間のリソソーム活性を独立してモニタリングするために、細胞をＤＱ−ＢＳＡ（タンパク質分解酵素によって切断されない限り、その緑色蛍光がクエンチングされているＢＳＡの誘導体）をプロセッシングする能力について試験した。図６Ｆに示すように、ＤＱ−ＢＳＡは、ＢＯ−１１０の存在下で効率的に切断された。その細胞透過性がｐＨ依存的で、機能的リソソームの酸の中に取り込まれたときに赤色蛍光を放出する色素である、リソトラッカーレッドとの共局在によって示されているように、ＤＱ−ＢＳＡ放出がリソソームで検出された。この結果は、リソソーム活性をクロロキンで妨害したとき、ＢＯ−１１０で処理したＳＫ−Ｍｅｌ−１０３細胞で観察されたＤＱ−ＢＳＡによる最小限の蛍光放出と対照的である（図６Ｆ及び図６Ｇ）。
【０１１２】
オートファジー過程の開始及び完全な発達を引き起こすＢＯ−１１０の能力をさらに特徴付けるために、オートファゴソームとリソソームの融合を共焦点顕微鏡観察で可視化した。この目的のために、ＧＦＰ−ＬＣ３を安定に発現するＳＫ−Ｍｅｌ−１０３細胞を、ＢＯ−１１０または対照としての対応する緩衝液で処理し、リソトラッカー−レッドの存在下でインキュベートした。個々の細胞及び細胞集団に基づく、緑色蛍光と赤色蛍光（それぞれ、ＧＦＰ−ＬＣ３融合体とリソトラッカーを表す）の二重放出解析によって、オートファゴソームとリソソームの明らかな共局在が示された（図６Ｈ及び６Ｉの代表的な蛍光顕微鏡写真ならびに図６Ｊの対応する定量を参照されたい）。この共局在が、ＢＯ−１１０によって誘発される応答の初期事象（処理後４〜８時間で既に検出可能）であり、組織的な細胞崩壊の前に起こったのは重要なことである。
【０１１３】
オートファゴソームがＢＯ−１１０に応答して活性リソソームに融合することが明らかになったので、本発明者らは、これらのオルガネラがエンドソームと相互作用するのかまたはエンドソームに動員されるのかを評価した。
まず、後期エンドソームマーカーＲａｂ７（Ｌｕｚｉｏら、２００７（非特許文献４３））に融合したＧＦＰを発現するメラノーマ細胞において、エンドソーム動態を評価した。基礎のエンドソーム生成及び分割（すなわち、漸進的なサイズの減少）は未処理のメラノーマ細胞で検出された（図７Ａの左のパネル）。しかしながら、ＢＯ−１１０処理は、エンドソーム活性を著しく増強させ、エンドソームの持続的かつ多重的な生成を誘導した（図７Ａの中央及び右のパネル）。これらのエンドソームは、ＧＦＰ−Ｒａｂ７及びリソトラッカーレッドの二重イメージングによって明らかになるように、リソソームで満たされていることが分かった（図７Ｂ）。さらに、経時的顕微鏡観察によって、図７Ｃの連続的な一連の融合事象にも示されているような、ＧＦＰ−Ｒａｂ７で装飾されたエンドソームへのリソソームの多重動員の高速動態が明らかになった。重要なのは、図７Ｂ（右のパネル）に示すように、細胞がこのタンパク質の既知のドミナントネガティブ突然変異体であるＲａｂ７−Ｔ２２Ｎを過剰発現した場合、エンドソーム−リソソーム融合が顕著に阻害されたことである。全体として、これらの結果から、ＢＯ−１１０で処理した腫瘍細胞におけるエンド／リソソームコンパートメントの動的動員が明らかになった。
【実施例６】
【０１１４】
ＢＯ−１１０はオートファジーをアポトーシスカスパーゼと結び付ける：
リソソームプロテアーゼは、複数のレベルで死プログラムに影響を及ぼすことができる（Ｍａｉｕｒｉら、２００７（非特許文献４１）；Ｈｏｙｅｒ−Ｈａｎｓｅｎ及びＪａａｔｅｌｌａ、２００８（非特許文献２６））。ミトコンドリアの場合、それらは、活性酸素種（ＲＯＳ）の産生を脱調節し、かつ／または標準的なアポトーシスカスパーゼ（調節性ｃａｓｐ−９ならびにエフェクターｃａｓｐ−３及び７）を働かせることができる。ｃａｓｐ−８に依存的な外因経路も、リソソーム活性化に応答することができる（Ｆｅｈｒｅｎｂａｃｈｅｒ及びＪａａｔｔｅｌｌａ、２００５（非特許文献４２））。
ＢＯ−１１０の作用様式におけるＲＯＳの影響に取り組むために、ビタミンＥ、トロロクス（Ｔｒｏｌｏｘ）またはタイロン、異なる抗酸化活性を有するスカベンジャー及び汎カスパーゼ阻害剤ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋの存在下で処理を行なった。これらの場合の各々における細胞死に関する結果を解析したときの結果を図８Ａに示す。ビタミンＥで得られたデータは、ＲＯＳによって制御されたメラノーマにおけるアポトーシスを阻止するこれらの試薬の用量の言及された化学的抗酸化剤で得られた結果の代表例として示されている（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら、２００６（非特許文献４４））。図に示すように、これらの抗酸化剤の存在下では、ＢＯ−１１０による細胞死に対する顕著な効果は観察されなかった。その代わり、汎カスパーゼ阻害剤ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋは、ＢＯ−１１０による死滅を７０％阻害した。まとめると、これらの結果は、カスパーゼ依存的機構がオートファジープログラムの下流を活性化したことを裏付けている。
【０１１５】
未処理（ＮＴ）（ＰＥＩを含まない緩衝液対照を除く）またはＰＥＩ、ｐＩＣ、複合体ＢＯ−１１０もしくはカスパーゼ切断の既知の誘導物質であるボルテゾミブによる処理を受けてから様々な時間の後に回収された細胞抽出物のイムノブロッティングによって明らかにされているように、カスパーゼプロセッシングは、実際、ＢＯ−１１０によって効率的に促進された（図８Ｂ及び図８Ｃ）。図８Ｂでは、転移性メラノーマの様々な株におけるカスパーゼ８及び９のアポトーシスプロセッシングを誘導するＰＥＩ、ｐＩＣ及びＢＯ−１１０の能力が比較されている。カスパーゼ９及び８の効果的な活性化は、試験した全てのヒトメラノーマ細胞株において、ＢＯ−１１０による処理の２０時間後にはっきりと現われ、これは、ボルテゾミブで観察されたものと同様であった。さらに、ＢＯ−１１０によるカスパーゼプロセッシングの動力学及び程度は、ＢＲＡＦ（例えば、ＳＫ−Ｍｅｌ−１９）、ＮＲＡＳ（ＳＫ−Ｍｅｌ−１０３、−１４７）、またはｐ５３（ＳＫ−Ｍｅｌ−２８）の突然変異状況に関係なく、極めて一貫性があった（図５Ｂ）。
【０１１６】
図８Ｃは、ＳＫ−Ｍｅｌ−１０３株で実施した同様の試験の結果を示している。この試験では、アポトーシスカスパーゼ９及び８の他に、エフェクターカスパーゼ３及び７を含む、より完全な解析が行なわれた。同じ試験をＳＫ−Ｍｅｌ−１４７株で実施し、同様の結果が得られた。ＳＫ−Ｍｅｌ−１０３及び１４７におけるｃａｓｐ−９、−３及び７の効率的なプロセッシングは特に関連性があった。これらの株は、Ａｐａｆ−１のレベルが低く、標準的な抗癌剤（例えば、ドキソルビシン、エトポシドまたはシスプラチン）に応答してｃａｓｐ−９／Ａｐａｆ−１アポトソーム（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら、２００５（非特許文献３１）；Ｓｏｅｎｇａｓら、２００６（非特許文献４５））を働かせるのが極めて非効率的であった（図１Ｃのグラフを参照されたい）。そのため、これらの結果は、アポトーシスプログラムを活性化し、標準的な化学療法剤に対する固有の耐性機構を回避するＢＯ−１１０の優れた能力を示している。
【実施例７】
【０１１７】
抗アポトーシスＢｃｌ−２ファミリーメンバーに対する代償効果の非存在下におけるＢＯ−１１０による細胞死の活性化：
ＢＯ−１１０の作用様式をより詳細に解析するために、及びこの薬剤によって特有に活性化され得る事象を同定するために、薬物応答をボルテゾミブの効果と比較した。これもまた、メラノーマ細胞におけるアポトーシス機構の強力な活性化因子であるので、この薬剤を選択した（Ｗｏｌｔｅｒら、２００７（非特許文献１１）；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら、２００６（非特許文献４４））。
【０１１８】
しかしながら、本発明者らは、ボルテゾミブとＢＯ−１１０が機構的に別のものであると考えていた。ボルテゾミブは、プロテアソームを標的とし、リソソームを標的としない（Ｑｉｎら、２００５（非特許文献４６））。さらに、図５Ａに示すように、ボルテゾミブは、ＭＤＡ−５を誘導またはプロセッシングすることなくメラノーマ細胞を死滅させる。ボルテゾミブはまた、アポトーシス促進性ＮＯＸＡの大量蓄積を促進することができるが、Ｂｃｌ−２ファミリーのメンバーである、その抗アポトーシス性アンタゴニスト因子ＭＣＬ−１の迅速かつ大幅な上方調節も誘導する（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら、２００５（非特許文献３１））ので興味深い。重要なのは、ＭＣＬ−１は、プロテアソーム阻害に対する内部代償機構として働き、インビトロ及びインビボでのボルテゾミブの抗腫瘍形成効果を妨害することである（Ｗｏｌｔｅｒら、２００７（非特許文献１１）；Ｑｉｎら、２００６（非特許文献４７））。
【０１１９】
ボルテゾミブと（裸のまたはＰＥＩと複合体化した）ｐＩＣの類似性と相違を評価するために、メラノーマ細胞をこれらの化合物の各々とインキュベートし、処理後の様々な時点で抽出物を回収して、ＮＯＸＡ、ＭＣＬ−１、及び他のＢｃｌ−２ファミリーメンバー（Ｂｃｌ−ｘＬまたはＢｃｌ−２）のレベルを評価した。結果を図９に示す。
【０１２０】
図９のパネルＡ及びＢに示すように、裸のｐＩＣは、ＳＫ−Ｍｅｌ−２８またはＳＫ−Ｍｅｌ−１４７メラノーマ細胞（それぞれ、ｐ５３  Ｌ１４５Ｒ突然変異またはｐ５３ｗｔを発現する細胞）において、一貫してまたは持続的にＮＯＸＡを誘導しなかった。他方、ＢＯ−１１０は、それぞれ、ＳＫ−Ｍｅｌ−２８、ＳＫ−Ｍｅｌ−１４７及びＳＫ−Ｍｅｌ−１０３における基礎レベルよりも３５倍、１０倍及び５倍大きくＮＯＸＡを誘導し（図９のパネルＡ及びＣのイムノブロット、ならびにＳＫ−Ｍｅｌ−２８細胞で得られた結果の図９Ｂの代表的な定量を参照されたい）、この場合もやはり、裸のｐＩＣとＰＥＩと複合体化したｐＩＣの示差的な活性が強調された。
【０１２１】
ＮＯＸＡの抑制性調節因子に関して、ＭＣＬ−１レベルは、ＢＯ−１１０によってごくわずかしか誘導されなかった（図９Ａ、及び図９Ｂの最初のグラフ）。これは、ボルテゾミブとは対照的である。ボルテゾミブは、以前に記載されているように（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら、２００５（非特許文献３１））、ＮＯＸＡを強力に活性化するが、ＭＣＬ−１の同時蓄積を誘導する。他の抗アポトーシスＢｃｌ−２ファミリーメンバー（例えば、Ｂｃｌ−２及びＢｃｌ−ｘＬ）もまた、ＢＯ−１１０によって影響を受けなかった（図９ＣのＳＫ−Ｍｅｌ−１０３のイムノブロットを参照されたい）。
【０１２２】
代償機構の非存在下では、細胞死を促進するのに比較的低いレベルのＢＯ−１１０で誘導されるＮＯＸＡで十分である可能性がある。この仮説を検証するために、メラノーマ細胞に、ＮＯＸＡのｍＲＮＡ及びタンパク質を特異的に阻害することが以前に証明されているｓｈＲＮＡ（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら、２００５（非特許文献３１））を形質導入し、不活性なｓｈＲＮＡ対照を発現するレンチウイルスベクターを感染させた細胞を対照として用いた。図９Ｄに示すように、ｓｈＲＮＡによるＮＯＸＡタンパク質発現の５０％低下は、ＢＯ−１１０によるＮＯＸＡ上方調節を約５０％阻害し、ＢＯ−１１０毒性を阻害した（図９Ｅ）。
【０１２３】
次に、本発明者らは、ＢＯ−１１０によるＮＯＸＡの調節に対するこのタンパク質の必要性を明確にするために、ＭＤＡ−５に対するｓｈＲＮＡを用い、以前の通りにではあるが、ＮＯＸＡレベルを定量してアッセイを行なった。結果を図９Ｆのグラフに示す。興味深いことに、ＭＤＡ−５  ｓｈＲＮＡは、他のＢｃｌ−２ファミリーメンバーに対する副次的な作用を伴わずに、ＮＯＸＡタンパク質レベルを７０％阻害した（図９Ｆ）。
【０１２４】
まとめると、これらの結果は、ＮＯＸＡの誘導によって駆動されるアポトーシス機構におけるＭＤＡ−５の新しい作用点を明らかにした。
【実施例８】
【０１２５】
免疫適格マウスにおける裸のｐＩＣとＢＯ−１１０の示差的効力：
次に、ｐＩＣ及びＢＯ−１１０の抗メラノーマ活性をインビボで評価した。メラノーマモデルでは、自然免疫プログラムの効果的な活性化のために、裸のｐＩＣは、高用量でかまたは他の薬剤（例えば、タンパク質合成阻害剤）と組み合わせてかのいずれかで投与されなければならない。先の実施例で得られたデータは、ｐＩＣがＰＥＬの存在下で顕著により強力であることを示唆した。
【０１２６】
まず免疫適格バックグラウンドで処置応答を解析した。形質導入されていないかまたは（蛍光イメージングによる検出を容易にするために）ＧＦＰが形質導入されているかのいずれかのＢ１６マウスメラノーマ細胞を同系正常マウスに移植した。２つの戦略、すなわち、それぞれ、局所的な部位でのまたは遠隔転移としての腫瘍進行を評価するための、（ｉ）皮下（ｓ．ｃ．）または（ｉｉ）静脈内への腫瘍細胞の注射を用いた。マウスをＰＥＩ、ｐＩＣもしくはＢＯ−１１０または１００μｌのグルコース５％（ＮＴ群）で処理した。
【０１２７】
図１０Ａに、Ｂ１６による皮下異種移植片の作製のための実験戦略と投与及び処理スケジュールとをまとめる。処置時間で、２ｎｇ／ｋｇの裸のｐＩＣまたはＰＥＩと複合体化したｐＩＣの腫瘍周辺注射物を注射した。
【０１２８】
注目すべきことに、ＢＯ−１１０は、試験した全ての例でｐＩＣよりも優れていることが分かった。したがって、ビヒクル、ＰＥＩまたはｐＩＣのみを投与された、皮下で増殖するＢ１６メラノーマを有するマウスは、過剰な腫瘍増殖が原因で、移植後１５〜２５日以内に屠殺しなければならなかった（図１０Ａ）。同じ条件下で、ＢＯ−１１０処理群の皮下メラノーマは、検出されないかまたは顕著により小さいかのいずれかであった（図１０Ａ）。
【０１２９】
図１０Ｂに、Ｂｌ６−ｅＧＦＰメラノーマ細胞を静脈内に移植するための実験戦略とその後のｐＩＣ、ＰＥＩ、ＢＯ−１１０またはグルコース５％（ＮＴ群）による処理とをまとめる。この図には、屠殺した動物の肺の蛍光画像も示されている（図１０Ｂ及び肺転移定量（図１０Ｃ））。この実験において、ＢＯ−１１０は、蛍光イメージングで測定したとき、メラノーマ肺転移の代用モデルでも裸のｐＩＣよりも５倍強力であった。
【実施例９】
【０１３０】
ＩＦＮは、ＢＯ−１１０の死誘導特性を再現しない：
ｐＩＣは、ＩＦＮによって誘起される細胞免疫の標準的な誘導物質である（Ｗｅｎｚｅｌら、２００８）。しかしながら、これまでの実施例で明らかにされたデータによって、ｐＩＣが、ＰＥＩと複合体化されたときに、「プロフェッショナルな」免疫細胞におけるＩＦＮ媒介性応答とな異なり得る、細胞自律的な様式で作用することもできることが示唆された。この可能性を評価するために、Ｂ１６メラノーマ細胞及びマクロファージを、ＩＦＮ−αを分泌し、それに応答するその能力について試験した。ＲＴ−ＰＣＲによって、両方の細胞型が、ＢＯ−１１０による処理の後に、ＩＦＩＴ−１（テトラトリコペプチド反復を有するＩＦＮ誘導性タンパク質）などの標準的なＩＦＮ−α標的を活性化することが示された（図１１Ａ）。ＰＥＩは、マクロファージにおけるＩＦＮ標的のｐＩＣ媒介性誘導にとって不可欠ではなかった（図１１Ａ）。これらの細胞は、ウイルスｄｓＲＮＡを効率的に感知することができるので、これは予想される。しかしながら、メラノーマ細胞は、裸のｐＩＣだけではＩＦＩＴ−１を誘導することができなかった（図１１Ａ）。
【０１３１】
メラノーマ細胞によるＩＦＮ−α産生の直接的な評価のために、組換えヒトＩＦＮ−αを参照対象として用いて、Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイを行なった。ＢＯ−１１０処理の後にメラノーマ細胞によって分泌されるＩＦＮ−αレベルは、１０ｐｇ／ｍｌよりも少なかった。ＩＦＮ−αがＢＯ−１１０の代わりになることができるか否か（すなわち、ＩＦＮ−α分泌がメラノーマ細胞死の主要な誘導物質であるか否か）を明らかにするために、増加量のこのサイトカインをメラノーマ細胞に添加した。興味深いことに、高用量のＩＦＮ−α（ＢＯ−１１０処理の後に分泌されるレベルよりも１０倍多い）は、メラノーマ細胞生存に影響を及ぼすことができなかった（図１１Ｂ）。
【０１３２】
ｐＩＣに対する応答がごく一時的であることを除けば、図１１Ｃに示すように、含まれた全ての遺伝子に、インターフェロンに対するインターフェロン応答が期待されることがマイクロアレイ試験によって示されたことに留意することも興味深い。対照的に、ＢＯ−１１０の効果は、維持されることに加えて、さらなる転写物にまで及んだ。
【０１３３】
そのため、これらの結果は、マクロファージ及びメラノーマ細胞におけるｄｓＲＮＡ模倣物の認識及び感知の本質的相違を示している。
【実施例１０】
【０１３４】
ＢＯ−１１０は、重症免疫不全バックグランドで転移性増殖を阻害することができる：
メラノーマ細胞は免疫耐性であることが多いので、メラノーマ細胞に対するＢＯ−１１０の直接的な毒性が高度免疫不全バックグラウンドでも有効であるか否かを試験した。メラノーマ免疫寛容と関連する最もよく見られるエフェクター機構は、ＮＫ、Ｔ及びＢ細胞シグナル伝達の欠損である（Ｋｉｒｋｗｏｏｄら、２００８（非特許文献１４））。そのため、メラノーマ増殖を阻止する（単剤としてのまたはＰＥＩと複合体化した）ｐＩＣの効力を、ＮＫ、Ｔ及びＢ細胞リンパ球機能に障害があるマウス（ＳＣＩＤベージュマウス）で試験した。
【０１３５】
肺転移の制御における処置効力をモニタリングするために、メラノーマ細胞をＧＦＰで標識し、図１０に記載されているような処置スケジュールに従って静脈内注射した。Ｂ１６メラノーマ（図１２パネルＡ、Ｂ及びＣ）ならびにＳＫ−Ｍｅｌ−１０３（図１２、パネルＤ及びＥ）を、それぞれ、マウス及びヒトのメラノーマの代表例として解析した。
【０１３６】
両方の細胞モデルにおいて、ＢＯ−１１０は、肺におけるメラノーマの増殖を阻害することができた。図１２Ａは、ＢＯ−１１０処理後に肺表面に見られるＢ１６転移の数の著しい違いを示している（図１２Ｂの定量参照）。組織学的解析によっても、ＢＯ−１１０群におけるＢ１６によって誘起される肺結節の数及びサイズの低下が確認された（図１２Ｃ）。同様の解析により、ＳＫ−Ｍｅｌ−１０３の播種性増殖の制御における（複合体化していないｐＩＣではなく）ＢＯ−１１０の明らかな抗腫瘍効果が示された（図１２パネルＤ及びＥ）。まとめると、本発明者らのデータは、適格な免疫系が存在しないＳＣＩＤベージュマウス（Ｃｒｏｙ及びＣｈａｐｅａｕ、１９９０（非特許文献４８））においてインビボで強力な抗メラノーマ活性を誘導するｄｓＲＮＡ模倣物の新規の作用様式を証明している。
【実施例１１】
【０１３７】
ＢＯ−１１０ヒトメラノーマ動物モデルによる転移性増殖の阻害：
ｐＩＣとＢＯ−１１０の間の違いを比較するために、より関連性のある設定を用いた。Ｔｙｒ：：ＮＲＡＳＱ６１Ｋ×ＩＮＫ４ａ／ＡＲＦ−／−マウスは、ヒト疾患と同様の特徴を有するメラノーマを発症する（Ａｃｋｅｒｍａｎｎら、２００５（非特許文献３４））。マウスをＤＭＢＡ（Ｓｉｇｍａから入手した７，１２−ジメチルベンズ［ａ］アントラセン）の単回局所処置を用いて処置した。色素性病変が１ｍｍの直径に達したら、インビボ送達用に処方された対照ＰＥＩ、裸のｐＩＣまたはＰＥＩにコンジュゲートしたｐＩＣを腹腔内注射（ｉ．ｐ）によって週に２回投与した。
【０１３８】
この場合もやはり、腫瘍サイズの直接測定（図１３Ａ及び１３Ｂ）、ＰＥＴ−ＣＴによる腫瘍の代謝活性（図ｌ３Ｃ）ならびに組織学的解析（図１３Ａ）によって示されているように、ＢＯ−１１０の抗腫瘍活性は、裸のｐＩＣよりも顕著に高いことが観察された。
【０１３９】
興味深いことに、ＢＯ−１１０は、副次的な毒性シグナル伴わずに、使用した処置投与量で無進行病変（図１３Ａ）を有する時間枠を倍にした（図１３Ｄの解析参照）。
【０１４０】
これらの結果は、メラノーマ細胞の攻撃的挙動と戦うｄｓＲＮＡ類似体の投与に根拠を置く処置の実行可能性を支持する。
【実施例１２】
【０１４１】
種々の腫瘍細胞に対するＢＯ−１１０の細胞傷害活性：
メラノーマ中に存在し、ｄｓＲＮＡセンシング及びオートファジーに影響を及ぼす遺伝的及び後成的変化は、異なる癌タイプ間で保存されていない場合があるので、ＢＯ−１１０が他の新生物性悪性腫瘍で治療的に有効であることができるか否かは明白ではなかった。特に、膵臓、大腸、膀胱、脳、乳房、前立腺、肺及び卵巣の腫瘍は侵襲性が高く、また、１つには、死プログラムの活性化に多面性があるという理由で、種々の処理に耐性がある。
【０１４２】
ＢＯ−１１０が、幅広い作用スペクトルの新規の抗癌戦略に相当することができるか否かを明確にするために、上で言及した種類の癌に関する、一連の独立に単離された細胞株を、よく知られたＮＣＩ−６０パネルから選択した（図１４）。したがって、まとめると、これらの株は、異なる遺伝的バックグラウンドの種々の腫瘍（すなわち、膵癌、大腸癌、膀胱癌、乳癌、前立腺癌、肺癌及び卵巣癌）に及ぶ。図１４に示すように、解析した細胞株は、メラノーマ参照対照と同様のＢＯ−１１０に対する感受性を有していた。これらのデータから得られる当然の帰結は、ＢＯ−１１０は、オートファジーとアポトーシスの二重の誘導を働かせて、（正常コンパートメントの生存に影響を及ぼすことなく）メラノーマだけでなく、他の様々な腫瘍タイプ、例えば、膵癌、大腸癌、膀胱癌、乳癌、前立腺癌、肺癌及び卵巣癌に関する細胞の協調的かつ選択的死滅をもたらすことができるということである。
【実施例１３】
【０１４３】
ＢＯ−１１０誘導性細胞死は、腫瘍細胞株におけるＭＤＡ−５、Ｎｏｘａ及びオートファジーの活性化に依存的である：
ＢＯ−１１０に対する感受性は、事前に（すなわち、腫瘍細胞タイプをもとに）予測することができないので、ＢＯ−１１０に対する応答を仲介するシグナル伝達カスケードを明確にする必要があった。メラノーマ細胞における（ｃＤＮＡアレイに基づく）ハイスループットな遺伝子解析により、ＢＯ−１１０は、ｄｓＲＮＡセンサーのＭＤＡ−５、及びアポトーシス促進性因子のＮＯＸＡの強い上方調節を促進することができることが示された。興味深いことに、イムノブロッティングアッセイを用いて、本発明者らは、実際、（例えば、ＨＣＴ１１６株またはＭｉａＰａＣａ２株における）ＢＯ−１１０に対する感受性及び耐性は、ＭＤＡ−５及びＮＯＸＡを誘導する細胞の能力と相関することを証明した（図１５）。上で示したＢＯ−１１０のアポトーシス促進性の役割と一致して、感受性のある細胞株は、電気泳動移動度の変化として可視化することができるカスパーゼ−９の明らかなプロセッシングを示した（図１５）。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図６Ｉ】
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【図６Ｊ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５】
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【配列表】
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