(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
自給式の循環システム（１）において、
ａ．少なくとも２つの微小注入口（３）及び２つの微小排出口（４）を有する少なくとも１つの毛細血管成長セクション（２）と、
ｂ．指向性ポンプ装置（５）と、
ｃ．前記指向性ポンプ装置（５）と前記少なくとも２つの注入口（３）を接続する細動脈輸送チャネル（６）及び前記指向性ポンプ装置（５）と前記少なくとも２つの排出口（４）を接続する細静脈輸送チャネル（７）と、
を有し；
微小注入口（３）及び排出口（４）を欠いたサブセクション（１６）が前記毛細血管成長セクション（２）内に設けられ；および
前記サブセクション（１６）は、前記サブセクション内において前記毛細血管（１４）の形成が損なわれるように、対応する微小注入口（３）及び微小排出口（４）から十分遠くに離れている；
ことを特徴とする循環システム（１）。
【請求項２】
請求項１に記載の循環システム（１）において、前記循環システム（１）は、少なくとも２つの毛細血管成長セクション（２）を有することを特徴とする循環システム（１）。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の循環システム（１）において、１つの毛細血管成長セクション（２）は、少なくとも部分的にガス透過性を有することを特徴とする循環システム（１）。
【請求項４】
請求項１乃至３の何れか１項に記載の循環システム（１）において、前記毛細血管成長セクション（２）は、半固体の生体適合性マトリックス（８）及び／又は半固体の生体適合性中空繊維（９）を有するか又はこれらから構成されることを特徴とする循環システム（１）。
【請求項５】
請求項４に記載の循環システム（１）において、前記生体適合性マトリックス（８）は、内皮細胞による毛細血管（１４）の形成を許容する微小チャネル、構造、及び／又はネットワークを有することを特徴とする循環システム（１）。
【請求項６】
請求項１乃至５の何れか１項に記載の循環システム（１）において、前記毛細血管成長セクション（２）は、毛細血管外流体及び／又は排泄物収集装置（１０）を更に有することを特徴とする循環システム（１）。
【請求項７】
請求項６に記載の循環システム（１）において、前記毛細血管外流体及び／又は排泄物収集装置（１０）は、細胞保持膜により、又は細胞排除チャネル（１１）により、前記生体適合性マトリックス（８）及び／又は前記生体適合性中空繊維（９）から分離されていることを特徴とする循環システム（１）。
【請求項８】
請求項７に記載の循環システム（１）において、少なくとも１つのセンサ（１２）が前記毛細血管外流体及び／又は排泄物収集装置（１０）内に配置されることを特徴とする循環システム（１）。
【請求項９】
請求項１乃至８の何れか１項に記載の循環システム（１）において、前記毛細血管成長セクション（２）内に形成された毛細血管（１４）及び／又はオルガノイド（１５）を更に有することを特徴とする循環システム（１）。
【請求項１０】
請求項１乃至９の何れか１項に記載の循環システム（１）において、複数の異なる組織及び／又はオルガノイド（１５）が、１つの自給式システム内において維持され、同一の循環流体によって潅流されることを特徴とする循環システム（１）。
【請求項１１】
請求項１乃至１０の何れか１項に記載の循環システム（１）において、前記サブセクション（１６）は、前記微小注入口（３）及び／又は前記微小排出口（４）から、少なくとも１００μｍから最大で５００μｍの、好ましくは、１００μｍから３００μｍの距離を有することを特徴とする循環システム（１）。
【請求項１２】
請求項１乃至１１の何れか１項に記載の循環システム（１）において、それぞれ、前記細動脈輸送チャネル（６）は、前記少なくとも２つの注入口（３）と接続するために少なくとも１回だけ分岐しており、且つ、前記細静脈輸送チャネル（７）は、前記少なくとも２つの排出口（４）と接続するために少なくとも１回だけ分岐していることを特徴とする循環システム（１）。
【請求項１３】
請求項１２に記載の循環システム（１）において、前記分岐地点（１３）の後の前記細動脈チャネルの合計断面積は、前記分岐地点（１３）の前の前記細動脈チャネルの断面積と本質的に同一であると共に／又は、前記分岐地点（１３）の後の前記細静脈輸送チャネル（７）の合計断面積は、前記分岐地点（１３）の前の前記細静脈チャネルの断面積と本質的に同一であることを特徴とする循環システム（１）。
【請求項１４】
請求項１２又は１３に記載の循環システム（１）において、すべての注入口（３）の合計断面積は、前記１つの及び／又は複数の細動脈チャネルの断面積と本質的に同一であり、且つ、すべての排出口（４）の合計断面積は、前記１つ及び／又は複数の細静脈チャネルの断面積と本質的に同一であり、好ましくは、前記細動脈及び細静脈チャネルの断面積は、同一であることを特徴とする循環システム（１）。
【請求項１５】
請求項１乃至１４の何れか１項に記載の循環システム（１）を確立する方法において、
ａ．内皮細胞を前記循環システム（１）内に接種するステップと、
ｂ．少なくとも、毛細血管（１４）が前記毛細血管成長セクション（２）内に形成される時点まで、且つ／又は、内皮細胞層が前記輸送チャネル内に形成される時点まで、且つ／又は、内皮細胞層が前記ポンプ装置（５）のすべての内側表面をカバーする時点まで、培養するステップと、
を有することを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の循環システム（１）を確立する方法において、全血を前記循環システム内に注入するステップを更に有することを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１５又は１６に記載の循環システム（１）を確立する方法において、前記ステップｂ）がせん断力が印加された状態において実行されることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１乃至１４の何れか１項に記載の前記循環システム（１）の使用であって、１つ又は複数の試験化合物の効果を監視するための且つ／又は効き目、副作用、生物学的安全性、代謝産物、動作モード、又は器官再生を判定するためであることを特徴とする使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、毛細血管成長セクション内における毛細血管の形成をサポートし、且つ、１つ又は複数の試験化合物の効果を監視するために且つ効き目、副作用、生物学的な安全性、代謝産物、動作モード、又は器官再生を判定するために微小オルガノイド及び／又は微小組織セクションの形成を許容する自給式の循環システムと、前記自給式循環システム内においてこのような微小オルガノイド及び／又は微小組織を確立する方法と、に関する。
【背景技術】
【０００２】
体外培養された組織の生理学的栄養素供給及び排泄物除去のための循環システムを開発するために莫大な努力が払われている。これらの開発は、物質の試験、器官再生に関する研究、又は移植臓器の製造のための肝臓やリンパ節（Ｇｉｅｓｅ他、２０１０年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４８、３８〜４５）及び肺（Ｈｕｈ他、２０１０年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、（３２８）５９８６、１６６２〜１６６９頁）などの器官等価物又はさらには多器官系（Ｓｏｎｎｔａｇ他、２０１０年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４８、７０〜７５）の体外生成を目的としている。これらの目的には、当初、膜、中空繊維（Ｃａｔａｐａｎｏ  ａｎｄ  Ｇｅｒｌａｃｈ．Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｌｉｖｅｒ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．２．Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第３巻、２００７．１〜４２、Ｎ  Ａｓｈａｍｍａｋｈｉ、Ｒ  Ｒｅｉｓ及びＥ  Ｃｈｉｅｌｌｉｎｉ編集）、又は微小チャネルのネットワーク（Ｄｕ他、Ｃｈａｐｔｅｒ  ７：「Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｖａｓｃｕｌａｒｉｚｅｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ」、２００８年（Ｂｏｏｋ  ｃｈａｐｔｅｒ））に基づいた専門的な潅流システムが使用されていた。
【０００３】
Ｇｅｒｌａｃｈ及び共同研究者によって開発された肝臓サポートシステムにおいては、中空繊維の３つの束を相互に交差織りすることにより、血漿潅流及び酸素供給のための同一の複数の微小培養空間を形成している。ヒト血漿潅流は、微小濾過中空繊維膜の２つの束によって保証されており、酸化は、液体不透過性の酸素輸送膜を通じて行われている。この原理に基づいた肝臓サポートシステムは、患者の血漿流路内に包含された状態において、数週間にわたって十分に稼働している。
【０００４】
Ｄｕ他は、ヒドロゲル及び微小製造法に基づいて微小血管新生された組織構造体を生成するための流体プラットフォームについて概説している。この概説は、組織培養を通じた効率的な液体潅流のために血液−毛細血管−ネットワーク様のチャネル構造をポリマー材料内に形成するための専門的な能力を強調している。結果的に得られる微小システムの大部分は、内皮細胞を含まない高効率の専門的な潅流に使用されている。
【０００５】
このようなシステムは、培養媒質又は血漿の使用に限定されており、凝固現象に起因して、全血の潅流を許容しない。更には、これらは、体内においては閉じた内皮細胞層によって構成される天然の血液組織障壁を提供しない。これは、細胞層を通じた能動的な輸送と、組織から毛細血管ネットワーク内へのシグナリングと、を許容する。専門的な潅流システム（Ｓｏｎｇ他、２００５年、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、２００５年、７７、３９９３〜３９９９）或いは合成又は生体マトリックス（Ｚｈａｎｇ他、２００９年、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、３０（１９）：３２１３〜３２２３；Ｗａｌｌｅｓ、２０１０年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４８、５６〜６３）を内皮細胞と整列させるために様々な方法が開発されている。
【０００６】
Ｓｏｎｇ及び共同研究者は、規定のせん断応力が印加された状態において内皮細胞を培養するための微小循環サポート装置を開発している。専門的な輸送チャネルの間に配置された個別の細胞培養コンパートメント内において閉じた内皮細胞の単一層を確立することに成功している。
【０００７】
組織工学的な手法による人工血管（Ｔｉｓｓｕｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｇｒａｆｔ：ＴＧＶＧ）を生成するために、Ｚｈａｎｇ他は、適切な機械的特性を有する管状のエレクトロスピニングされた絹フィブロイン足場を使用して血管の構造に似た組織工学的な手法による構造体を開発している。彼らは、ヒト冠動脈平滑筋細胞（Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｒｏｎａｒｙ  Ａｒｔｅｒｙ  Ｓｍｏｏｔｈ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｃｅｌｌ：ＨＣＡＳＭＣ）及びヒト大動脈内皮細胞（Ｈｕｍａｎ  Ａｏｒｔｉｃ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ：ＨＡＥＣ）を管状の足場の管腔表面上に接種し、且つ、外部チューブ及びポンプを使用してデュアルループバイオリアクタ内において生成された生理学的脈動流の下において、培養している。
【０００８】
Ｗａｌｌｅｓ他は、体外における内皮化脈管構造の確立のための完全に生物学的なマトリックスを使用することにより、ポリマーチューブ及び制御されたポンプシステムを非細胞化動物腸セグメントに接続している。このシステムにおいては、内皮細胞によって完全にカバーされた毛細血管は、バイオマトリックスの機能的に関連したエリアに限定されている。
【０００９】
しかしながら、従来技術による循環システムは、いずれも、本出願において提供されている全血に基づいた長期の組織培養に適してはいない。
【００１０】
本発明は、組織レベルにおいて脊椎動物の天然の血液潅流環境をエミュレートする閉じした且つ自給式の循環システムに関する。本システムは、小型化された生理学的な血液循環を使用し、マイクロリットルレベルの容積の循環を提供して数ミリグラムの組織をサポートする。これは、チップに適合した微小スケールにおいて数リットルの血液容積が数キログラムの組織をサポートしている人間の生理学的な比率に似ている。この自給式循環システムは、本システムの微小注入口と微小排出口の間に配置された少なくとも１つの毛細血管成長セクションを含む。
【００１１】
栄養素の交換をサポートする毛細血管の形成のための毛細血管成長セクションは、小型化されたポンプ及び輸送チャネルと共に、循環内に統合されている。
【発明の概要】
【００１２】
第１の態様においては、本発明は、循環システム（１）に関し、この循環システム（１）は、自給式であり、且つ、
ａ．少なくとも２つの微小注入口（３）及び２つの微小排出口（４）を有する少なくとも１つの毛細血管成長セクション（２）と、
ｂ．指向性ポンプ装置（５）と、
ｃ．指向性ポンプ装置（５）と少なくとも２つの注入口（３）を接続する細動脈輸送チャネル（６）及び指向性ポンプ装置（５）と少なくとも２つの排出口（４）を接続する細静脈輸送チャネル（７）と、
を有する。
【００１３】
第２の態様においては、本発明は、本発明の循環システム（１）を確立する方法に関し、この方法は、
ａ．内皮細胞を循環システム（１）内に接種するステップと、
ｂ．少なくとも、毛細血管（１４）が毛細血管成長セクション（２）内に形成される時点まで、且つ／又は、内皮細胞層が輸送チャネル内に形成される時点まで、且つ／又は、内皮細胞層がポンプ装置（５）のすべての内側表面をカバーする時点まで、培養するステップと、
を有する。
【００１４】
第３の態様においては、本発明は、本発明の方法によって製造可能な循環システム（１）に関する。
【００１５】
第４の態様においては、本発明は、１つ又は複数の試験化合物の効果を監視するための且つ／又は効き目、副作用、生物学的な安全性、代謝産物、動作モード、又は器官再生を判定するための本発明による又は本発明に従って製造可能な循環システム（１）の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、２つの毛細血管成長セクション（２）と、指向性ポンプ装置（５）と、細動脈輸送チャネル（６）と、細静脈輸送チャネル（７）と、を有する自給式の循環システム（１）の好適な実施形態の平面図である。好適な実施形態においては、ポンプ装置（５）及び２つの毛細血管成長セクション（２）は、平行に配置されている。輸送チャネル（６、７）は、指向性ポンプ装置（５）と毛細血管成長セクション（２）の間における接続部として機能する。好適な実施形態においては、例えば、緩衝のサポートのための注入ポート（１７）が微小ポンプの近傍に配置されている。通常、指向性ポンプ装置（５）に接続された細動脈チャネル（６）又は細静脈チャネル（７）は、分岐地点（１３）において、２つ又は３つの更に小さな直径の細動脈及び細静脈チャネルに分岐している。毛細血管成長セクション（２）には、好ましくは、異なる組織及び／又はオルガノイド（１５）が導入され、同一の循環流体によって潅流され、従って、毛細血管成長セクション（２）は、例えば、複数のオルガノイドに対する１つの化合物の効果の同時試験を許容する。
【図２】図２は、自給式循環システム（１）の毛細血管成長セクション（２）の好適な実施形態の平面図である。毛細血管成長セクション（２）は、例えば、微小注入口（３）と微小排出口（４）の間における内皮細胞による毛細血管（１４）の生成のために設けられた空間である。毛細血管（１４）の成長のための適切な環境を提供するために、毛細血管成長セクション（２）は、半固体の生体適合性マトリックス（８）を有するか又はこれから構成されていることが好ましい。或いは、この代わりに、一側において微小注入口（３）に、且つ、他側においては、微小排出口（４）に、接続された生体適合性中空繊維（９）が設けられる。毛細血管（１４）の流入端部から最も離れた組織サイトは、毛細血管成長セクション（２）内に、血管新生領域（１６）を、即ち、循環内における毛細血管（１４）の基礎の確立の際に毛細血管（１４）が形成されないセクションを、生成する。好ましくは、毛細血管成長セクション（２）は、細胞保持膜（１１）によって残りの毛細血管成長セクション（２）から分離された毛細血管外流体及び／又は排泄物収集装置（１０）を更に有する。システムの状態を監視するために、１つ又は複数のセンサ（１２）が毛細血管外流体及び／又は排泄物収集装置（１０）内に配置される。
【図３】図３は、蠕動ポンプ（５）、液体の移動のための３つの弁、挿入体（１５）、及びシステムの充填及び洗浄をサポートする２つの収集装置（１０）を備えた例示用の実験において使用される自給式循環システムの好適な実施形態の平面図である。
【図４】図４は、７日間の潅流培養の後のヒト内皮細胞によって完全にカバーされた自給式微小循環システムのチャネルの特定のセグメントのＣａｌｃｅｉｎＡＭ生存染色である。
【図５】図５は、７日間の潅流の後のヒト内皮細胞によって完全にカバーされた自給式循環システムチップのＣｅｌｌＭａｓｋ（著作権）蛍光形質膜染色である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明について詳細に後述するに当たり、本明細書に記述されている特定の方法、手順、及び試薬は、変化してもよいことから、本発明は、これらに限定されるものではないことを理解されたい。又、本明細書において使用されている用語は、特定の実施形態について記述することを目的としたものに過ぎず、従って、添付の請求項によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことを理解されたい。特記されていない限り、本明細書において使用されているすべての技術的且つ科学的な用語は、当業者が一般的に理解しているものと同一の意味を有する。
【００１８】
好ましくは、本明細書において使用されている用語は、「Ａ  ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｕａｌ  ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｅｒｍｓ：（ＩＵＰＡＣ  Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ）」Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｈ．Ｇ．Ｗ、Ｎａｇｅｌ，Ｂ．、及びＫｌｂｌ，Ｈ．編集（１９９５年）、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ、ＣＨ−４０１０  Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に記述されている通り、且つ、Ａｘｅｌ  Ｋｌｅｅｍａｎｎ及びＪｕｒｇｅｎ  Ｅｎｇｅｌによる「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ，Ｐａｔｅｎｔｓ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｔｈｉｅｍｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、１９９９年；Ｓｕｓａｎ  Ｂｕｄａｖａｒｉ他によって編集された「Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ：Ａｎ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｄｒｕｇｓ，ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ」、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６年、及びｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍｃｏｐｅｉａｌ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  Ｍｄ．によって２００１年に出版されたｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ−２５／Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ−２０に記述されている通りに定義される。
【００１９】
本明細書及び添付の請求項の全体を通じて、文脈によって規定されていない限り、「有する（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語、並びに、「有する（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「有する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、記述されている特徴、整数、又はステップ、或いは、特徴、整数、又はステップの群の包含を意味しており、任意のその他の特徴、整数、又はステップ、或いは、整数又はステップの群の排除を意味するものではないと理解されたい。以下の各節においては、本発明の様々な態様について更に詳細に規定している。このように規定されたそれぞれの態様は、特記されていない限り、任意のその他の１つ又は複数の態様と組み合わせてもよい。特に、好ましい又は有利であると示されている任意の特徴を好ましい又は有利であると示されている任意のその他の１つ又は複数の特徴と組み合わせてもよい。
【００２０】
本明細書の本文の全体を通じて、いくつかの文書を引用している。本明細書に引用されている（すべての特許、特許出願、科学的出版物、製造者の仕様書、指示書などを含む）文書のそれぞれは、前掲されるか又は後掲されるかを問わず、引用により、そのすべてが本明細書に包含される。本明細書に記述されている内容は、先行発明を理由として本発明がそのような開示に先行しないことの自認として解釈してはならない。
【００２１】
本明細書において頻繁に使用されているいくつかの用語の定義を以下に提供する。これらの用語は、本明細書の残りの部分において、その使用のそれぞれのケースにおいて、以下のような個別に規定された意味及び好適な意味を有する。
【００２２】
「細胞」とは、脊椎動物又は無脊椎動物の細胞系又は初代細胞を意味している。
【００２３】
「オルガノイド」とは、少なくとも１つの器官又は組織機能を示す、好ましくは、器官又は組織機能の大半又は本質的にすべてを示す体外における様々なタイプの細胞の人工的な新規に生成された機能的細胞集合体を意味している。
【００２４】
「組織」とは、患者又は動物或いは体外生成された組織から採取された生検材料又はエクスプラントを意味している。
【００２５】
「分化」とは、培養された細胞の組織固有の機能の発生を意味している。
【００２６】
「維持」とは、好ましくは細胞の死及び／又はアポトーシスの有意な兆候を伴うことなしに、所与の細胞培養ロセスにおいて所与の組織のすべての機能を一定に維持するための能力を意味している。
【００２７】
「媒質（ｍｅｄｉｕｍ）」（複数形「媒質（ｍｅｄｉａ）」）は、細胞の培養のための栄養素及び物質を有する成長サポート液体を意味している。適切な媒質の例は、ＤＭＥＭ、ハムＦ１２、及びＲＰＭＩを有する。
【００２８】
「マトリックス」とは、生存能力を維持し、細胞及び/又はオルガノイドの増殖、分化、及び働き、或いは、器官形成を向上させる物質又は物質の混合物を意味している。マトリックス材料は、好ましくは、毛細血管成長セクション（２）の空間をファイルするのに適し得る形態において提供される。本発明の文脈において使用可能なマトリックスは、例えば、ヒドロゲル、発泡体、織物、又は不織布を含む様々な形状であってよい。マトリックス材料は、細胞外マトリックスタンパク質のような天然起源のマトリックス物質、好ましくは、コラーゲン、ラミニン、エラスチン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、小マトリックスセルラータンパク質、小インテグリン結合糖タンパク質、成長因子、又はプロテオグリカンを有してもよく、或いは、ポリアミド繊維、メチルセルロース、アガロース又はアルギン酸ゲルなどの非分解性ポリマー、或いは、例えば、ポリラクチドなどの分解性ポリマーのような人工的なマトリックス物質を含んでもよい。
【００２９】
「内側表面」とは、循環する媒質、血漿、及び／又は、例えば、全血などの血液と直接的な接触状態となる循環システム（１）の表面を意味している。
【００３０】
従来技術による細胞培養システムに関連した問題点を克服するために、本発明は、循環システム（１）を提供し、この循環システム（１）は、自給式であり、且つ、
ａ．少なくとも２つの微小注入口（３）及び２つの微小排出口（４）を有する少なくとも１つの毛細血管成長セクション（２）と、
ｂ．指向性ポンプ装置（５）と、
ｃ．指向性ポンプ装置（５）と少なくとも２つの注入口（３）を接続する細動脈輸送チャネル（６）及び指向性ポンプ装置（５）と少なくとも２つの排出口（４）を接続する細静脈輸送チャネル（７）と、
を有する。
【００３１】
「自給式」とは、システム内の流体が、システム内において、即ち、指向性ポンプ装置（５）と１つ又は複数の毛細血管成長セクション（２）の間において、循環し、且つ、好ましくは、外部の流体リザーバから循環システム（１）内に、例えば、媒質や血液などの流体を継続的に供給するための流体接続が存在していないという事実を意味している。この文脈における「外部の」とは、流体リザーバが循環システムの一体的な部分ではなく、例えば、チューブを介して循環システムに接続されていることを意味している。
【００３２】
例えば、栄養素及び／又は流体などの物質を培養の最中に補充しなければならない場合には、それらの栄養素又は流体が注入ポート（１７）を通じて非連続的に供給されることが好ましく、注入ポート（１７）は、好ましくは、細動脈又は細静脈輸送チャネル内に配置されるか又は毛細血管成長セクションに対して結合される。前者の場合には、例えば、栄養素及び／又は流体などの物質は、毛細血管の内部に直接的に注入される。この注入は、潜在的に、循環システム（１）の内側表面上において注入ポート（１７）の開口部を覆っている内皮細胞の損傷をもたらす。後者の場合には、注入は、毛細血管成長セクション内に形成される毛細血管の周りの毛細血管外空間内の流体圧力を増大させる。流体及び栄養素は、毛細血管外空間内における増大した分圧に起因して、毛細血管を通じて循環内に分散することになる。時間に伴う且つ補充対象物質の反復注入によるシステム内の圧力の増大を回避するために、循環システムが圧力補償リザーバを更に有することが好ましい。注入ポート（１７）が毛細血管の内部への注入を許容するように構成されている場合には、圧力補償リザーバは毛細血管外空間に対して接続されることが好ましい。逆に、注入ポート（１７）が毛細血管外空間内への注入を許容するように構成されている場合には、圧力補償リザーバは内部または毛細血管に接続されていることが好ましい。いくつかの好適な実施形態においては、圧力補償リザーバは、圧力補償リザーバからガスを放出するために、開口部を、好ましくは、小さなボア孔又は一方弁を、有する。この開口部は、好ましくは、設定された閾値圧力に到達した場合にのみ周辺にガスを放出するように構成されている。適切な手段は、例えば、スプリング付勢された一方弁又はスリットを有するシリコンプラグである。この手段によれば、循環システムを過剰に加圧することを防止することが可能であり、過剰な加圧は、形成された毛細血管を損傷する場合がある。システムに含まれる合計液体容積が小さい場合には、例えば、合計容積の１０％未満などの非常に小さな容積を任意の所与の時点において注入することが好ましい。流体及び／又は細胞を循環に導入するための好ましい方法は、内皮細胞の運動速度に対して調節された注入器の運動速度による注入器の、好ましくは、注入針の注入ポートへの導入及び循環への流体及び／又は細胞の注入である。これは、閉じた内皮細胞の単一層の形成が完了した場合に、特に好ましい。注入ポートは、自己封止型である、即ち、例えば、注射器などの注入装置が引き抜かれると、液体と、好ましくは、空気と、を密封状態で閉じ込めることが好ましい。このような自己封止型の注入ポートの例は、当技術分野において周知であり、且つ、一方弁及びシリコンプラック（ｐｌｕｃｋ）を含む。
【００３３】
好適な実施形態においては、注入ポート（１７）及び／又は圧力補償リザーバは、細胞保持膜により、即ち、本発明の循環システム（１）内において成長する細胞の平均サイズよりも小さな平均気孔サイズを有する膜により、或いは、閉塞又は細胞の逃避を防止するために本発明の循環システム（１）内において成長する細胞を排除するようにサイズ設定された細胞排除チャネルにより、循環又は毛細血管外空間から分離されている。
【００３４】
システムの初期充填の際に、或いは、その後の注入の際に、流体と共に一緒にガスを注入することができる。捕獲されたガスの泡による循環の遮断を回避するために、ガスの泡のための１つ又は複数の捕獲装置を循環システム（１）内に設けることが好ましい。このような捕獲装置は、細動脈又は細静脈輸送チャネルの上向きの面上における空洞又は切欠きの形態を有してもよい。
【００３５】
更には、例えば、ガス透過性の生体適合性マトリックス（８）を通じた及び／又は細動脈輸送チャネル（６）を通じた毛細血管成長セクション（２）内への拡散によるなどの受動的な方式により、例えば、Ｏ２／ＣＯ２などのガス媒質を毛細血管成長セクション（２）に供給することが好ましい。
【００３６】
１つの自給式システム内において複数の異なる組織及び／又はオルガノイド（１５）を維持することができることが循環システム（１）の１つの利点であり、これらの組織及び／又はオルガノイド（１５）は、同一の循環流体によって潅流され、且つ、従って、自然な環境におけると同様に、流体接続状態にある。毛細血管成長セクション（２）の数は、一般に、維持対象の別個の組織及び／又はオルガノイド（１５）の数によって決定される。従って、本発明の循環システム（１）の好適な実施形態においては、循環システム（１）は、少なくとも２つの毛細血管成長セクション（２）を有しており、好ましくは、循環システム（１）は、３個の、４個の、５個の、６個の、７個の、８個の、９個の、又は１０個の毛細血管成長セクション（２）を有する。
【００３７】
例えば、Ｏ２／ＣＯ２などのガスの交換は、好ましくは、ガス透過性の胞状及び細静脈輸送チャネル（７）を設けることにより、実現され、即ち、胞状及び細静脈輸送チャネルは、ガス透過性材料を有するか又はこれから構成されている。システム内における合計流体容積及び輸送チャネル（５、６）の合計表面積に応じて、輸送チャネルの内側表面を通じたＯ２／ＣＯ２の潅流が、循環システム（１）内において細胞及び／又はオルガノイド（１５）を維持するために十分ではない場合がある。このような場合には、毛細血管成長セクション（２）のうちの１つの毛細血管成長セクションの材料が少なくとも部分的にガス透過性を有し、且つ、これにより、循環システム（１）の全体に対してＯ２を供給する「微小肺（ｍｉｃｒｏ−ｌｕｎｇ）」として機能することが好ましい。従って、毛細血管成長セクションの１つ又は複数の壁がガス透過性材料を有するか又はこれから構成されることが好ましい。適切なガス透過性材料については、当技術分野において既知である。好ましくは、毛細血管成長セクションの１つ又は複数の壁を形成するのに使用される材料は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）である。
【００３８】
毛細血管成長セクション（２）は、システム内に接種される内皮細胞及び任意選択の平滑筋細胞による毛細血管（１４）の生成のために設けられた空間である。毛細血管成長セクションは、好ましくは、マトリックス（８）によって充填され、このマトリックス（８）は、内皮細胞がシステム内に接種されると共に流体が毛細血管成長セクション（２）を通じて循環された場合に自然に形成される毛細血管（１４）のための成長足場を提供するという目的に資する。従って、生体適合性マトリックス（８）は、内皮細胞による毛細血管（１４）の形成を許容及びサポートする微小チャネル、構造、及び／又はネットワークを有することが好ましい。好ましくは、これらの構造は、それ自体が後の毛細血管の形状を有するものでなく、形成される毛細血管の付着地点及び／又はガイダンスを提供するのみである。毛細血管成長セクション（２）は、半固体の生体適合性マトリックス（８）を有するか又はこれから構成されることが好ましい。内皮細胞がシステム内に接種されると、毛細血管（１４）は、通常、その形成が微小注入口（３）において始まり、且つ、流体の流れによって方向付けされる状態で成長し、最終的に微小排出口（４）のうちの１つと接続することになる。或いは、この代わりに、上述のように、生体適合性中空繊維（９）が単独で設けられるか又は生体適合性マトリクス（８）内に埋め込まれる。これらは、好ましくは、一側において微小注入口に、且つ、他側において、微小排出口（４）に接続されることにより、内皮細胞の成長をガイドする。結果的に得られる毛細血管（１４）の弾性を維持するために、生体適合性中空繊維（９）の材料は、生物分解性を有することが好ましく、その理由は、その場合には、毛細血管が形成された後の時間に伴うその除去が可能となるためである。
【００３９】
好ましくは、生体適合性マトリックス（８）は、マトリゲル、フィブリンゲル、アガロースゲル、アルギン酸ゲル、合成ゲル、架橋可能なポリマーを有するか又はこれらから構成されており、且つ、生体適合性中空繊維（９）は、好ましくは、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリラクチド−ｃｏ−グリコリド（ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、及びポリ（フマル酸−ｃｏ−セバシン酸無水物、ポリビニルアルコール、アクリル酸エチレンコポリマー、ポリアクリル酸、ポリグリコリド、ポリラクチド、セルロース派生物、カルボメトキシ／エチル／ヒドロキシプロピル、ヒアルロン酸、葉酸連結シクロデキストリン／デキストラン、サルコシン／アミノ酸スペースドポリマー、カラゲナン、ペクチン／キトサン、キトサン、デキストラン、コラーゲン、又はこれらの混合物からなる群から選択された材料から構成される。好ましい架橋可能なポリマーは、ＰＥＧ−（ＤＣＲ−ＣＧ）ｎという式のＰＥＧ派生物であり、ここで、ＰＥＧは、ポリ（エチレングリコール）であり、ＤＣＲは、分解制御領域であり、ＣＧは、架橋基であり、且つ、ｎは、３以上である。生体適合性中空繊維（９）用の特に好適な材料は、ＰＬＡ及びＰＬＧＡである。
【００４０】
これらのマトリックス及び／又は中空繊維の材料並びに細動脈又は細静脈輸送チャネルの材料の選択肢によれば、本発明の循環システムの内側表面は、確実に内皮細胞によって迅速且つ完全にカバーされる。
【００４１】
酸素輸送の分析は、毛細血管の流入端部から最も離れた組織サイトが致命的なコーナー（ｌｅｔｈａｌ  ｃｏｒｎｅｒ）を構築するという概念に結び付いている（Ｉｎｔａｇｌｉｅｔｔａ他、１９９６年、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３２、６３２〜６４３）。例えば、腫瘍組織などの身体内には、低Ｏ２分圧のエリアも存在することから、毛細血管成長セクション（2）内に、所謂「血管新生」領域（１６）を、即ち、本発明の循環システム（１）内における毛細血管（１４）の初期の確立の際に毛細血管（１４）が形成されないセクションを、確立することが本発明の１つの目的である。これは、微小注入口（３）及び排出口（４）が欠けているサブセクション（１６）を毛細血管成長セクション（２）内に設けることによって実現される。このサブセクション（１６）が対応する微小注入口（３）及び微小排出口（４）から十分遠くに離れている場合には、毛細血管（１４）の形成は、このサブセクション内において損なわれる。サブセクションは、その内部に毛細血管が形成されない場合に、十分遠くに離れており、好ましくは、サブセクションは、少なくとも１００μｍだけ、且つ、最大で５００μｍだけ、離れており、好ましくは、サブセクションは、微小注入口（３）及び／又は微小排出口から、１００μｍ〜３００μｍの範囲の距離を有する。次いで、このエリア内に、例えば、腫瘍組織などの選択された任意の組織又はオルガノイドを配置し、毛細血管（１４）の生成のための手掛かりを又は再生プロセスを調査することができる。更に詳細に後述される通り、毛細血管成長セクション（２）の境界を定める材料の一部を除去して毛細血管成長セクション（２）に対するアクセスを許容できることが望ましい。細胞及び／又はオルガノイドは、この開口部を通じて、毛細血管成長セクション（２）に導入されるものと想定される。この後に、開口部は、流体密となるようにカバーされる。カバーの材料は、好ましくは、顕微鏡法による毛細血管成長セクション（２）の顕微鏡検査を許容する、例えば、ガラス又はプラスチックなどの半透明な材料から選択される。好ましくは、材料は、ガス透過性を有していない。但し、１つ又は複数の毛細血管成長セクションが「微小肺」の機能を有している実施形態においては、それらの毛細血管成長セクションは、ガス透過性のカバーによってカバーされる。好ましくは、毛細血管成長セクション（２）は、好ましくは、直方体の形態で、所与の材料の非中空ブロックとして成形又は研磨される。この実施形態においては、開口部が、ブロックの上側に位置し、且つ、毛細血管成長セクション（２）の表面エリアの全体にわたって延在していることが好ましい。
【００４２】
内皮細胞による毛細血管（１４）の形成は、血管新生対象のエリアに酸素が供給されない場合に促進される。更には、毛細血管（１４）の最大長は、４ｍｍを超過してはならず、その理由は、天然の密度を有する周囲の組織が、その距離内においてそれらの毛細血管（１４）を通じて提供される栄養素を、特に、酸素を、すべて消費するためである。
【００４３】
従って、好適な実施形態においては、新しく形成される毛細血管（１４）によって接続される微小注入口（３）と微小排出口（４）の間の距離は、毛細血管（１４）の成長を助長するために、この最大距離を超過してはならない。従って、微小注入口（３）と最も近い微小排出口（４）の間の距離は、０．２ｍｍ〜４ｍｍの、更に好ましくは、０．３〜２ｍｍの、更に好ましくは、０．４ｍｍ〜１ｍｍの範囲であることが好ましく、好ましくは、約０．５ｍｍである。毛細血管成長セクション（２）の幅は、０．５ｍｍ〜１．５ｍｍであり、好ましくは、１．０ｍｍであると共に／又は、毛細血管成長セクション（２）の高さは、０．３〜０．７ｍｍであり、好ましくは、０．５ｍｍである。毛細血管成長セクション（２）の容積は、０．０３μｌ〜４．２μｌであり、好ましくは、０．５μｌ〜１．０μｌである。毛細血管成長セクション（２）、細動脈輸送チャネル（６）、細静脈輸送チャネル（７）、及び指向性ポンプ装置（５）の合計容積は、１．０μｌ〜１００μｌであり、好ましくは、５．０μｌ〜１５μｌである。
【００４４】
線形の毛細血管接続の成長を促進するために、微小注入口（３）及び微小排出口（４）のそれぞれは、毛細血管成長セクション（２）の両端部に配置されることが好ましい。毛細血管成長セクションは、本質的に直方体の、好ましくは、立方体の形状を有することが好ましい。好ましくは、微小注入口及び微小排出口は、直方体の反対側の面上に配置される。この結果、直方体の長さは、微小注入口と微小排出口の間の距離によって決定される。それぞれの微小注入口（３）が、対応する微小排出口（４）と直接的に整列されていることが特に好ましい。
【００４５】
酸素が毛細血管を通じて毛細血管成長セクションに供給されることが望ましく、従って、毛細血管成長セクションの壁を形成する材料が、低ガス透過性を有するか、又はガス透過性を有していないことが好ましい。但し、１つ又は複数の毛細血管成長セクションが微小肺の機能を有している場合には、これらの成長セクションは、先程概説したように設計される。好ましくは、壁の材料は、ガラス又はプラスチックから構成された群から選択される。
【００４６】
上述のように、毛細血管（１４）は、毛細血管成長セクションに内皮細胞が接種されると、毛細血管成長セクション（２）内において自律的に形成される。内皮細胞用の重要な指向性の手掛かりは、システムを通じた流体の流れである。正しいサイズの毛細血管（１４）の成長を促進するために、微小注入口（３）及び／又は微小排出口（４）の直径は、５μｍ〜５０μｍであり、更に好ましくは、１５μｍ〜３０μｍであることが好ましい。形成される毛細血管（１４）は、１〜１０μｍの、好ましくは、５〜６μｍの範囲の直径を有する。後段で更に詳述する通り、毛細血管成長セクション内における微小注入口及び微小排出口の数は、細動脈及び細静脈輸送チャネルの表面積に対応している。十分な酸素を組織に供給するために、微小注入口及び微小排出口の個々の数は、好ましくは、毛細血管成長チャンバの個々の側部の表面にわたって分散されている。同様の理由から、形成される２つの毛細血管の間の距離は、３０μｍ未満であってはならない。従って、微小注入口（３）の間の距離は、３０μｍ〜５００μｍの範囲、好ましくは、８０μｍ〜２００μｍの範囲であり、且つ／又は、微小排出口（４）の間の距離は、３０μｍ〜５００μｍの範囲、好ましくは、８０μｍ〜２００μｍの範囲であることが好ましい。好適な実施形態においては、微小注入口（３）及び／又は微小排出口（４）は、１つの、２つの、３つの、又は４つの列として構成されている。
【００４７】
組織及び／又はオルガノイド（１５）は、１つ又は複数の毛細血管成長セクション（２）内に配置され、それぞれの自然な機能を実行することになるものと想定される。従って、好適な実施形態においては、毛細血管成長セクション（２）は、毛細血管外流体及び／又は排泄物収集装置（１０）を更に有する。毛細血管外流体の排出は、毛細血管内の圧力差によって駆動される。これは、例えば、毛細血管外流体を分泌する膵臓、腎臓、腸などの組織及び／又はオルガノイド（１５）から離れるように流体を排出するという目的に資する。好ましくは、排泄物収集装置（１０）は、毛細血管成長セクション（２）からの血液細胞及び／又は組織又はオルガノイド細胞の流出を防止するような方式により、生体適合性マトリックス（８）及び／又は生体適合性中空繊維（９）から分離されている。好ましくは、毛細血管外流体及び／又は排泄物収集装置（１０）は、細胞保持膜（１１）により、即ち、本発明の循環システム（１）内において成長する細胞の平均サイズよりも小さな平均気孔サイズを有する膜により、或いは、本発明の循環システム（１）内において成長する細胞を排除するようにサイズ設定された細胞排除チャネルにより、残りの毛細血管成長セクション（２）から分離されている。
【００４８】
システムの状態を監視するために、１つ又は複数のセンサ（１２）が、本発明の循環システム（１）内に、好ましくは、胞状及び／又は細静脈輸送チャネル（７）内に、毛細血管外流体及び／又は排泄物収集装置（１０）内に、及び／又は指向性ポンプ装置内に、配置されることが好ましい。使用してもよいセンサ（１１）は、限定を伴うことなしに、ｐＨセンサ、ｐＯ２センサ、検体キャプチャセンサ、導電率センサ、プラズモン共鳴センサ、温度センサ、ＣＯ２センサ、ＮＯセンサ、走化性センサ、サイトカインセンサ、イオンセンサ、圧力センサ、電位差測定センサ、電流測定センサ、フロースルーセンサ、フィルセンサ、インピーダンスセンサ、導電率センサ、電磁界センサ、表面弾性波センサ、及び代謝センサを含む。このシステム内において使用されるセンサ（１２）は、毛細血管成長セクション（２）及び／又は毛細血管成長セクション（２）から流出する媒質を監視するセンサであってよく、或いは、排泄物チャネル及び／又はリザーバ（１０）内に配置されるセンサ（１２）であってもよい。
【００４９】
輸送チャネルは、血管系の相対的に小さな動脈及び静脈に似ており、且つ、指向性ポンプ装置（５）と毛細血管成長セクション（２）の間の接続部として機能する。従って、輸送チャネルは、平滑筋細胞及び内皮細胞による被覆に適していることが好ましい。所望の直径及び形態の輸送チャネルは、生体適合性マトリックス（８）内において個別の構造を微細加工することによって設けることが可能であり、或いは、生体適合性中空繊維（９）であってもよい。但し、脱細胞化された生体細動脈及び／又は細静脈を使用することもできる。輸送チャネル（６、７）の表面積は、過剰に多くの毛細血管成長セクション（２）が存在していない限り、必要とされるＯ２を大部分のシステムに供給するのに十分である。従って、前記生体適合性マトリックス（８）又は生体適合性中空繊維（９）は、少なくとも部分的にガス透過性を有し、好ましくは、ＰＤＭＳを有するか又はこれから構成されることが好ましい。ＰＤＭＳは、シリコンに基づいた有機ポリマーであり、光学的に透明であって、粘弾性を有し、且つ、例えば、表面電荷リソグラフィにより、直接的にパターン化することができる。
【００５０】
本発明の好適な実施形態においては、指向性ポンプ装置（５）とのその接続部における細動脈輸送チャネル（６）及び／又は細静脈輸送チャネル（７）の直径は、３００μｍ〜２．０ｍｍであり、好ましくは、５００μｍである。循環システム（１）内における流体の流速は、流体の循環の際にシステムの全体を通じて大きく変化しないことが望ましい。好ましくは、システム内における流量は、０．０２ｃｍ／ｓ〜０．１ｃｍ／ｓの、更に好ましくは、０．０３〜０．０７ｃｍ／ｓの範囲であり、最も好ましくは、約０．０５ｃｍ／ｓである。但し、微小注入口（３）及び微小排出口（４）は、一般に、それぞれ、細動脈微小注入口（３）及び細静脈微小排出口（４）よりも、小さな直径を、且つ、従って、小さな表面積を有しており、これは、流体が微小注入口（３）に進入した際に、流量の増大をもたらすことになろう。従って、それぞれ、細動脈輸送チャネル（６）は、少なくとも２つの注入口と接続するために少なくとも一回だけ分岐しており、且つ、細静脈輸送チャネル（７）は、少なくとも２つの排出口（４）と接続するために少なくとも１回だけ分岐していることが好ましい。流量の大きな変動を防止するために、分岐地点（１３）の後の細動脈チャネルの合計断面エリアが分岐地点（１３）の前の細動脈チャネルの断面積と本質的に同一であると共に／又は、分岐地点（１３）の後の細静脈輸送チャネル（７）の合計断面積が分岐地点（１３）の前の細静脈チャネルの断面積と本質的に同一であることが望ましい。通常は、指向性ポンプ装置（５）に接続された細動脈チャネル（６）又は細静脈チャネル（７）は、２つ又は３つの更に小さな直径の細動脈及び細静脈チャネル（６、７）内に分岐している。細動脈及び細静脈チャネルの直径を個々の微小注入口（３）及び微小排出口（４）の直径に低減するために必要とされる分岐地点（１３）の数及び／又は分岐の数は、細動脈チャネル（６）及び細静脈チャネル（７）の相対的な断面積及びそれらが接続しているそれぞれ微小注入口（３）及び微小排出口（４）の直径及び断面積によって決定される。例えば、細動脈チャネル（６）が１ｍｍの直径を有し、且つ、微小注入口（３）の直径が５０μｍである場合には、４００個の微小注入口（３）が、指向性ポンプ装置（５）において、細動脈チャネル（６）と同一の表面積を有している。従って、それぞれの個別の微小注入口を細動脈チャネルの分岐と接続するために必要なだけの２分岐の、３分岐の、４分岐の、又は更に多くの数の分岐の分岐地点（１３）を設けることが必要となる。好適な実施形態においては、分岐地点（１３）は、２分岐の分岐地点（１３）であり、且つ、従って、微小注入口（３）の数は、公式２ｎによって決定され、ここで、ｎは、それぞれの流路内における分岐地点（１３）の数である。循環システム（１）が２つ以上の毛細血管成長セクション（２）を有している場合には、流路は、両方の毛細血管成長セクション（２）に対して別個に接続するように分岐される。分岐地点（１３）の後の合計断面積が分岐地点（１３）の前の断面積と同一又は本質的に同一である限り、両方の分岐が同一の断面積を有することは必須ではない。例えば、「微小肺」が１つの毛細血管成長セクション（２）内に形成されている場合には、別のオルガノイド（１５）の毛細血管成長セクション（２）において、このオルガノイド（１５）に対して類似の量の流体を送る必要はないであろう。従って、分岐地点（１３）において、微小肺に関係したオルガノイドに接続する細動脈の分岐は、別の毛細血管成長セクション（２）に接続する細動脈の分岐よりも小さな表面積を有することになる。すべての注入口（３）の合計断面積は、前記１つ及び／又は複数の細動脈チャネルの断面積と本質的に同一であり、且つ、すべての排出口（４）の合計断面積は、前記１つ及び／又は複数の細静脈チャネルの断面積と本質的に同一であり、好ましくは、細動脈チャネル（６）及び細静脈チャネル（７）の断面積は、同一である。
【００５１】
好ましくは、指向性ポンプ装置（５）は、生物学的ポンプ、油圧ポンプ、圧電ポンプ、蠕動ポンプ、気圧ポンプ、電磁ポンプ、又は磁気ポンプである。生物学的ポンプは、例えば、心筋細胞によって形成され、これらの心筋細胞は、好ましくは、心筋細胞の収縮の際に脈動流をサポートする形状の弾性ポリマー上に接種される（Ｔａｎａｋａ他、２００６年、Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ、６、３６２〜３８６）。心筋細胞の痙攣は、ポンプ動作に必要とされる収縮を提供する。流れの指向性、即ち、ポンプ装置（５）の細静脈チャネルから細動脈チャネル内への指向性、は、ポンプ装置（５）の一側のみにおける流体の放出をもたらすポンプ（５）の動作モードによって確立してもよく、或いは、場合によっては、ポンプ装置（５）は、細動脈チャネル内への指向性の流れを助長する更なる要素によって単純に脈動する。従って、好適な実施形態においては、指向性ポンプ装置（５）は、好ましくは、ジェット様の要素及び一方弁要素から構成される群から選択される１つ又は複数の指向性流れ要素を有する。流れ要素は、指向性ポンプ装置（５）の前の細静脈輸送チャネル（７）から出る流路内に及び／又は指向性ポンプ装置（５）の後の細動脈チャネルに入る流路内に配置してもよい。ジェット様の要素の場合には、それらは指向性ポンプ装置（５）の両端部に配置されることが好ましい。好ましくは、ポンプメカニズムは、媒質の連続的な蠕動流を生成するためにポンプチャンバによって作動する好適な弾性ＰＤＭＳ−マトリックス／膜の脈動に基づいている。
【００５２】
好ましくは、前記輸送チャネル及び／又は指向性ポンプ装置（５）の内部表面は、生体適合性ポリマー上における細胞の接着を促進するペプチド又はタンパク質或いはこれらの混合物から構成された群から選択される物質によって被覆されている。細胞を維持するために適した接着分子は、インテグリン、アルブミン、フィブリン、アドヘシン、及び／又はコラーゲン、或いは、これらの混合物から構成された群から選択される。この被覆は、内皮細胞及び／又は平滑筋細胞による循環システム（１）の内側表面の完全なカバレージを助長する。
【００５３】
本発明の循環システム（１）の好適な実施形態は、毛細血管成長セクション（２）内に形成された毛細血管（１４）及び／又はオルガノイド（１５）を更に有する。
【００５４】
好ましくは、毛細血管成長セクション（２）、指向性ポンプ装置、１つ又は複数の細動脈輸送チャネル（６）、及び細静脈輸送チャネル（７）は、一片として製造される。この一片は、互いに接着する異なる材料から構成してもよい。例えば、指向性ポンプ装置（５）、１つ又は複数の細動脈輸送チャネル（６）、及び細静脈輸送チャネル（７）は、例えば、微細加工又は鋳造により、例えば、ＰＤＭＳなどのガス透過性材料のブロックとして、形成される。毛細血管成長セクション及び微小注入口及び微小排出口を有する部分は、非ガス透過性材料によって形成され、これは、それぞれの微小注入口及び微小排出口が、それぞれ、細動脈輸送チャネル（６）及び細静脈輸送チャネル（７）とアライメントするような方式により、その他の部分に接着する。又、毛細血管成長セクション内に配置されるマトリックス（８）及び／又は中空繊維が毛細血管成長セクションとは異なる材料から製造されることが好ましいことから、この部分が、別個に製造され、且つ、毛細血管成長セクションに挿入されることが好ましい。次いで、毛細血管成長セクションは、微小肺の機能を実行していない限り、好ましくは、非ガス透過性カバーによってカバーされる。
【００５５】
好ましくは、本発明の循環システム（１）の寸法は、その内側表面が、内皮細胞により、好ましくは、その単一層により、完全にカバーされているシステムを通じて、４〜８μｌの全血の連続した循環をサポートする。好ましくは、この循環システムは、数か月の培養にわたって、それぞれがマイクロリットルの規模である少なくとも２つの異なる微小オルガノイド用の栄養素を供給するように構成されている。血液の、好ましくは、全血の使用は、強力な緩衝システムを保証し、すべての必要な血漿のタンパク質を組織に対して供給し、赤血球を通じた酸素輸送をサポートし、且つ、白血球による汚染微生物に対する免疫学的な活動を提供する。
【００５６】
本発明は、循環システム（１）を確立する方法を提供し、この方法は、
ａ．内皮細胞を循環システム（１）内に接種するステップと、
ｂ．少なくとも、毛細血管（１４）が毛細血管成長セクション（２）内において形成される時点まで、且つ／又は、内皮細胞層が輸送チャネル内に形成される時点まで、且つ／又は、内皮細胞層がポンプ装置（５）のすべての内側表面をカバーする時点まで、培養するステップと、
を有する。
【００５７】
内皮細胞は、成長足場、栄養素、及び酸素、並びに、任意選択により、ＦＧＦ及び／又はＶＥＣ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌ  Ｃａｄｈｅｒｉｎｅ）のような血管新生因子を供給する環境内に配置された場合に、毛細血管（１４）を形成する能力を有する。従って、内皮細胞は、優先的にアクセスポートを通じてシステム内に接種され、且つ、毛細血管（１４）が形成される時点まで培養されるが、これには、接種される内皮細胞の数、接続される微小注入口（３）と微小排出口（４）の間の距離、及び内皮細胞によってカバーされる本発明の循環システム（１）の合計内側表面に応じて、通常、２〜１０日間が、好ましくは、２〜６日間が所要される。通常、５００〜５，０００の範囲の細胞がシステム内に接種され、合計流体容積は、１μｌ〜１００μｌの範囲であり、好ましくは、５μｌ〜５０μｌの範囲である。当然のことながら、細動脈及び細静脈は、内皮細胞のみから構成されてはおらず、平滑筋細胞及び生体適合性マトリックスをも有する。平滑筋細胞は、柔軟性を細動脈及び細静脈に対して提供すると共にこれらを流体不透過性とする。従って、本方法の好適な実施形態は、内皮細胞の前に、内皮細胞と同時に、又は内皮細胞の後に、平滑筋細胞を接種するステップを更に有する。好ましくは、接種される内皮細胞及び平滑筋細胞の比率は、５対１〜０．５対１であり、好ましくは、２対１である。
【００５８】
好ましくは、本発明の方法は、すべての表面が内皮細胞の単一層によってカバーされると、全血を微小循環に注入するステップを更に有する。培養期間中においては、内皮細胞は、機械的な力に対して常に晒されている場合に、完全な毛細血管（１４）を形成する可能性が高く、従って、好ましくは、ステップｂ）は、せん断力が印加された状態において実行される。せん断力は、媒質を本発明の循環システム（１）を通じて循環させることによって生成される。好ましくは、微小注入口（３）及び微小排出口（４）における流れは、５〜２０ｄｙｎ／ｃｍ２の範囲である。循環システム（１）の内側表面への細胞の接着及び／又は毛細血管成長チャンバ（２）への移動を許容するために、循環システム（１）は、流体によって充填される。従って、好適な実施形態においては、接種細胞は、媒質、血漿、又は血液、好ましくは、全血に含まれている。毛細血管（１４）の形成をもたらす培養ステップにおいても使用される特定の好ましい「接種媒質」は、例えば、ヒドロコルチゾンによって補充されたＥＭＢ−２（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ−２）、ＦＣＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ）、ブタＶＥＧＦ、ｈｂＦＧＦ（ｈｕｍａｎ  ｂａｓｉｃ  Ｆｉｂｒｏｂｒａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）、ｈＥＧＦ（ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）、インスリン様の成長因子（Ｒ３  ＩＧＦ）、アスコルビン酸、ペニシリン、ストレプトマイシンを含み、接種媒質が血漿又は血液である場合には、これらは、上述の物質のうちの１つ又は複数によって補充されることが好ましい。毛細血管（１４）がステップｂ）において形成されているかどうかを判定するために、微小センサ（１２）及び／又は視覚的検査を使用する。適切な微小センサ（１２）は、ＴＥＥＲ（Ｔｒａｎｓｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）を計測する。好ましくは、毛細血管成長セクション（２）内において組織及び／又はオルガノイド（１５）を確立するために、１つ又は複数の非内皮細胞タイプを循環システム（１）に、好ましくは、毛細血管成長セクション（２）内に、接種する。この更なる細胞は、ステップａ）の前に、ステップａ）と同時に、ステップａ）の後に、或いは、ステップｂ）の後に接種してもよい。細胞が導出される組織タイプは、好ましくは、肝臓、皮膚、肺、腎臓、腸、ニューロン、心筋、及び／又は腫瘍から構成された群から選択される。
【００５９】
本発明は、例えば、確立された毛細血管及び／又はオルガノイドを有する循環システムなどの上述の方法によって製造可能な循環システム（１）を提供する。
【００６０】
本発明は、１つ又は複数の試験化合物の効果を監視するための且つ／又は効き目、副作用、生物学的安全性、代謝産物、動作モード、又は器官再生を判定するための循環システム（１）の使用を提供する。好ましくは、このような試験は、１つ又は複数の試験化合物を注入ポートを通じて注入することによって実行される。
【００６１】
項目１は、循環システム（１）に関し、このシステムは、自給式であり、且つ、
ａ．少なくとも２つの微小注入口（３）及び２つの微小排出口（４）を有する少なくとも１つの毛細血管成長セクション（２）と、
ｂ．指向性ポンプ装置（５）と、
ｃ．指向性ポンプ装置（５）と少なくとも２つの注入口（３）を接続する細動脈輸送チャネル（６）及び指向性ポンプ装置（５）と少なくとも２つの排出口（４）を接続する静静脈輸送チャネル（７）と、
を有する。
【００６２】
項目２は、項目１の循環システム（１）に関し、循環システム（１）は、少なくとも２つの毛細血管成長セクション（２）を有する。
【００６３】
項目３は、項目１又は２のいずれかに記載の循環システム（１）に関し、１つの毛細血管成長セクション（２）は、少なくとも部分的にガス透過性を有する。
【００６４】
項目４は、項目１乃至３のいずれかに記載の循環システム（１）に関し、毛細血管成長セクション（２）は、半固体の生体適合性マトリックス（８）及び／又は半固体の生体適合性中空繊維（９）を有するか又はこれらから構成される。
【００６５】
項目５は、項目４に記載の循環システム（１）に関し、生体適合性中空繊維（９）は生物分解性を有する。
【００６６】
項目６は、項目４又は５に記載の循環システムに関し、生体適合性マトリックス（８）は、マトリゲル、フィブリンゲル、アガロースゲル、アルギン酸ゲル、合成ゲル、架橋可能なポリマーから構成された群から選択された材料を有するか又はこれらから構成されており、且つ、生体適合性中空繊維（９）は、ポリ乳酸、ポリラクチド−ｃｏ−グリコリド、又はこれらの混合物から構成された群から選択された材料から構成される。
【００６７】
項目７は、項目４乃至６のいずれかに記載の循環システム（１）に関し、生体適合性マトリックス（８）は、内皮細胞による毛細血管（１４）の形成を許容する微小チャネル、構造、及び／又はネットワークを有する。
【００６８】
項目８は、項目１乃至７のいずれかに記載の循環システム（１）に関し、毛細血管成長セクション（２）の１つのセクションは、微小注入口（３）及び排出口（４）を欠いている。
【００６９】
項目９は、項目１乃至８のいずれかに記載の循環システム（１）に関し、微小注入口（３）と微小排出口（４）の間の距離は、０．２ｍｍ〜４ｍｍ、好ましくは、０．５ｍｍである。
【００７０】
項目１０は、項目１乃至９のいずれかに記載の循環システム（１）に関し、毛細血管成長セクション（２）の幅は、０．５ｍｍ〜１．５ｍｍ、好ましくは、１．０ｍｍであると共に／又は、毛細血管成長セクション（２）の高さは、０．３〜０．７ｍｍ、好ましくは、０．５ｍｍである。
【００７１】
項目１１は、項目１乃至１０のいずれかに記載の循環システム（１）に関し、毛細血管成長セクション（２）の容積は、０．０３μｌ〜４．２μｌである。
【００７２】
項目１２は、項目１乃至１１のいずれかに記載の循環システム（１）に関し、微小注入口（３）及び微小排出口（４）は、毛細血管成長セクション（２）の両端部に配置される。
【００７３】
項目１３は、項目１乃至１２のいずれかに記載の循環システム（１）に関し、微小注入口（３）及び／又は微小排出口（４）の直径は、１０〜５０μｍである。
【００７４】
項目１４は、項目１乃至１３のいずれかに記載の循環システム（１）に関し、毛細血管成長セクション（２）は、毛細血管外流体及び／又は排泄物収集装置（１０）を更に有する。
【００７５】
項目１５は、項目１乃至１４のいずれかに記載の循環システム（１）に関し、毛細血管外流体及び／又は排泄物収集装置（１０）は、細胞保持膜により、又は細胞排除チャネル（１１）により、生体適合性マトリックス（８）及び／又は生体適合性中空繊維（９）から分離される。
【００７６】
項目１６は、項目１４又は１５に記載の循環システム（１）に関し、少なくとも１つのセンサ（１２）が毛細血管外流体及び／又は排泄物収集装置（１０）内に配置される。
【００７７】
項目１７は、項目１６に記載の循環システム（１）に関し、少なくとも１つのセンサ（１２）が、ｐＨセンサ、ｐＯ２センサ、検体キャプチャセンサ、導電率センサ、プラズモン共鳴センサ、温度センサ、ＣＯ２センサ、ＮＯセンサ、走化性センサ、サイトカインセンサ、イオンセンサ、圧力センサ、電位差測定センサ、電流測定センサ、フロースルーセンサ、フィルセンサ、インピーダンスセンサ、導電率センサ、電磁界センサ、表面弾性波センサ、及び代謝センサから構成された群から選択される。
【００７８】
項目１８は、項目１乃至１７のいずれかに記載の循環システム（１）に関し、輸送チャネルは、生体適合性マトリックス（８）内に微細加工されており、或いは、生体適合性中空繊維（９）であり、前記生体適合性マトリックス（８）又は生体適合性中空繊維（９）は、少なくとも部分的にガス透過性を有し、好ましくは、ＰＤＭＳを有するか又はこれから構成される。
【００７９】
項目１９は、項目１乃至１８のいずれかに記載の循環システム（１）に関し、指向性ポンプ装置（５）とのその接続部における細動脈輸送チャネル（６）及び／又は細静脈輸送チャネル（７）の直径は、３００μｍ〜２．０ｍｍ、好ましくは、５００μｍである。
【００８０】
項目２０は、項目１乃至１９のいずれかに記載の循環システム（１）に関し、それぞれ、細動脈輸送チャネル（６）は、少なくとも２つの注入口（３）と接続するために少なくとも１回だけ分岐しており、且つ、細静脈輸送チャネル（７）は、少なくとも２つの排出口（４）と接続するために少なくとも１回だけ分岐している。
【００８１】
項目２１は、項目２０に記載の循環システム（１）に関し、分岐地点（１３）の後の細動脈チャネルの合計断面積は、分岐地点（１３）の前の細動脈チャネルの断面積と本質的に同一であると共に／又は、分岐地点（１３）の後の細静脈輸送チャネル（７）の合計断面積は、分岐地点（１３）の前の細静脈チャネルの断面積と本質的に同一である。
【００８２】
項目２２は、項目２０及び２１のいずれかに記載の循環システム（１）に関し、すべての注入口（３）の合計断面積は、前記１つ及び／又は複数の細動脈チャネルの断面積と本質的に等しく、且つ、すべての排出口（４）の合計断面積は、前記１つ及び／又は複数の細静脈チャネルの断面積と本質的に等しく、好ましくは、細動脈及び細静脈チャネルの断面積は等しい。
【００８３】
項目２３は、項目１乃至２２のいずれかに記載の循環システム（１）に関し、指向性ポンプ装置（５）は、生物学的ポンプ、油圧ポンプ、圧電ポンプ、蠕動ポンプ、気圧ポンプ、電磁ポンプ、又は磁気ポンプである。
【００８４】
項目２４は、項目１乃至２３のいずれかに記載の循環システム（１）に関し、指向性ポンプ装置（５）は、好ましくは、ジェット様の要素及び一方弁要素から構成された群から選択される１つ又は複数の指向性の流れ要素を有する。
【００８５】
項目２５は、項目１乃至２４のいずれかに記載の循環システム（１）に関し、前記輸送チャネル及び／又は指向性ポンプ装置（５）の少なくとも内側表面は、生体適合性ポリマー上における細胞の接着を促進するペプチド又はタンパク質又はこれらの混合物から構成された群から選択された物質によって被覆される。
【００８６】
項目２６は、項目２５に記載の循環システム（１）に関し、細胞の接着を促進するペプチド又はタンパク質は、インテグリン、アルブミン、フィブリン、アドヘシン、コラーゲンから構成された群から選択される。
【００８７】
項目２７は、項目１乃至〜２６のいずれかに記載の循環システム（１）に関し、これは、毛細血管成長セクション（２）内に形成された毛細血管（１４）及び／又はオルガノイド（１５）を更に有する。
【００８８】
項目２８は、項目１乃至２７のいずれかに記載の循環システム（１）を確立する方法に関し、この方法は、
ａ．内皮細胞を循環システム（１）内に接種するステップと、
ｂ．少なくとも、毛細血管（１４）が毛細血管成長セクション（２）内に形成される時点まで、且つ／又は、内皮細胞層が輸送チャネル内に形成される時点まで、且つ／又は、内皮細胞層がポンプ装置（５）のすべての内側表面をカバーする時点まで、培養するステップと、
を有する。
【００８９】
項目２９は、項目２８に記載の循環システム（１）を確立する方法に関し、接種細胞は、媒質又は血漿中に含まれる。
【００９０】
項目３０は、項目２８又は２９に記載の循環システム（１）を確立する方法に関し、方法は、ステップａ）の前に、ステップａ）と同時に、又はステップａ）の後に、平滑筋細胞を接種するステップを更に有する。
【００９１】
項目３１は、項目２８乃至３０のいずれかに記載の循環システム（１）を確立する方法に関し、方法は、全血を前記循環システムに注入するステップを更に有する。
【００９２】
項目３２は、項目２８乃至３１のいずれかに記載の循環システム（１）を確立する方法に関し、ステップｂ）は、せん断力が印加された状態において実行される。
【００９３】
項目３３は、項目２９乃至３２のいずれかに記載の循環システム（１）を確立する方法に関し、１つ又は複数の細胞タイプの細胞が、好ましくは、ステップｂ）の後に、前記毛細血管成長セクション（２）内に接種される。
【００９４】
項目３４は、項目３３に記載の循環システム（１）を確立する方法に関し、細胞は、肝臓細胞、皮膚細胞、肺細胞、腎臓細胞、腸細胞、ニューロン細胞、心筋細胞、及び／又は腫瘍細胞からなる群から選択される。
【００９５】
項目３５は、項目２８乃至３４のいずれかに記載の方法によって製造可能な循環システム（１）に関する。
【００９６】
項目３６は、１つ又は複数の試験化合物の効果を監視するための且つ効き目、副作用、生物学的安全性、代謝産物、動作モード、又は器官再生を判定するための項目２７又は３５に記載の循環システム（１）の使用に関する。
【実施例】
【００９７】
図３に示されているバイオリアクタプロトタイプチップのすべてのチャネル及び表面を無菌媒質中の生存しているヒト内皮細胞によって完全にカバーすることにより、１４日の期間にわたって自給式循環システム（１）を確立させた。蠕動微小ポンプ（５）を使用して組織培養空間（１５）を通じた液体の循環を生成した。弁Ａ、Ｂ、及びＣとの組合せにおいて外部流体及び排泄物用の収集装置（１０）を使用し、システム内における液体のレベル及び交換を管理した。チップは、型とＰＤＭＳを使用することによって鋳造した。次いで、ＰＤＭＳ層をガラススライド上に移し、且つ、ホルダに挿入した。細胞及び組織接種材料の金属挿入体（１５）及び外部流体又は排泄物収集装置（１０）をＰＤＭＳスライドの上部においてカーボネートプレートを通じてバイオリアクタチップに固定した。組立が完了した自給式循環システムチップが図４に示されている。
【００９８】
Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ社から入手したＨＤＭＥＣ（Ｈｕｍａｎ  Ｄｅｒｍａｌ  Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ）を通路４〜７の間において使用した。使用の前に、３７℃の内皮細胞成長媒質ＭＶ−２（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ社、５％のＦＣＳ、１％のペニシリン−ストレプトマイシン）及び５％のＣＯ２（加湿された培養器）により、ＨＤＭＥＣをＴ−７５フラスコ内において成長させ、且つ、８０％の培養密度において継代した。ＰＢＳによって一度洗浄し、且つ、２ｍｌの０．２５％のトリプシン／ＥＤＴＡ溶液を加えることにより、実験のために細胞を収集した。３７℃における５分以内の培養において細胞の分離が発生した。１０％のＦＣＳを含むＤＭＥＭによってトリプシン溶液を中和させた後に、細胞を３００ｘｇにおいて５分間にわたって遠心分離器にかけ、且つ、血球計を使用してカウントした。
【００９９】
無菌状態の自給式循環システムチップを１０分間にわたって８０％のエタノールによって洗浄した。次いで、注射器を使用することにより、ＰＢＳをチャネル内に注入し、且つ、更に１０分にわたって培養した。チャネルのＨＤＭＥＣ−Ｍｅｄｉｕｍによる洗浄によるＰＢＳの交換の後に、チップを４℃において一晩にわたって培養した。
【０１００】
ＨＤＭＥＣを微小チャネル内に接種するために、細胞ペレットをＨＤＭＥＣ−Ｍｅｄｉｕｍ中において２×１０７細胞／ｍｌの最終濃度にまで再懸濁させた。細胞懸濁液を空の挿入体に移した（図３の１５）。挿入体空間と収集装置（図３の１０）の間に静水圧の差を生成するために、収集装置の媒質を除去した。次いで、蠕動ポンプを開いて細胞をチャネルに充填した。更に、弁Ａを開いてチップ全体の均一な充填を保証した。
【０１０１】
チャネル表面上における内皮細胞の付着及び拡散を許容するために、自給式循環システムのチップを３７℃及び５％のＣＯ２において２時間にわたって培養した。その後に、上述のものと同様の方式により、５０μｌのＨＤＭＥＣ−Ｍｅｄｉｕｍを挿入体に追加し、且つ、細胞を再懸濁させてチャネルを充填した。次いで、収集装置を封止状態において媒質によって充填し、且つ、装置を裏返して細胞をチャネルの天井にも付着させた。静止状態における５時間の培養の後に、チップを気圧ポンプ装置に接続し、且つ、弁Ｂ及びＣを閉じて循環流を生成した。チップを０．１６Ｈｚのポンプ周波数及び０．３ｂａｒの圧力において１４日間にわたって培養した。挿入体及び収集装置空間の媒質を毎日交換した。
【０１０２】
蛍光顕微鏡法により、内皮細胞の形状及び内皮細胞によるすべてのチャネル表面の完全に閉じたカバレージに対するせん断の効果を判定した（図４及び図５）。
【符号の説明】
【０１０３】
１  自給式循環システム。
２  毛細血管成長セクション
３  微小注入口
４  微小排出口
５  指向性ポンプ装置
６  細動脈輸送チャネル
７  細静脈輸送チャネル
８  生体適合性マトリックス
９  生体適合性中空繊維
１０  外部流体及び／又は排泄物収集装置
１１  保持膜又は細胞排除チャネル
１２  センサ
１３  分岐地点
１４  毛細血管
１５  組織及び／又はオルガノイド
１６  血管新生領域
１７  注入ポート
【図１】
0006004442.tif 000002
【図２】
0006004442.tif 000003
【図３】
0006004442.tif 000004
【図４】
0006004442.tif 000005
【図５】
0006004442.tif 000006