(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
出口開口部および入口開口部を有するチャンバーを画定する少なくとも１つの壁を有するハウジングと、
湿潤バリアと前記出口開口部との間にある分離媒体空間と、湿潤バリアと前記入口開口部との間にある試料受入領域とを画定するように、前記出口開口部と前記入口開口部との間に配置される湿潤バリアと、
前記湿潤バリアに近接した前記分離媒体空間内に保持され、リン脂質に対して特異的親和性を有する分離媒体と、
前記湿潤バリアに組み込まれかつ前記湿潤バリアの一部である、少なくとも１つのフリットと
を含み、
前記湿潤バリアが、（ｉ）第１の力の下で、試料受入領域において、液体試料およびタンパク質沈殿剤を保持し、これにより、タンパク質沈殿物および処理された試料の形成を容易にし、ここで前記第１の力は、前記チャンバーにわたる流体差圧またはこれに等しい遠心力であり、（ｉｉ）第１の力よりも大きい第２の力の下で、処理された試料を湿潤バリアおよび分離媒体に流し、これにより、試料受入領域においてタンパク質沈殿物を保持し、分離媒体においてリン脂質を保持し、小分子を溶出するように適合され、ここで前記第２の力は、前記チャンバーにわたる１３５４４Ｐａ（４”Ｈｇ）より大きい流体差圧またはこれに等しい遠心力であり、
前記フリットが複数の開口部を含むことにより、前記フリットが前記湿潤バリアと協働して、第２の力よりも大きい第３の力の下で、前記試料受入領域においてタンパク質沈殿剤を保持できるようにし、ここで前記第３の力は、前記チャンバーにわたる少なくとも６７７２０Ｐａ（２０”Ｈｇ）の流体差圧またはこれに等しい遠心力である
ことを特徴とする、１種以上のタンパク質、リン脂質および小分子を潜在的に含む液体試料を分離するための機器。
【請求項２】
リン脂質を保持することが、分離媒体において、リン脂質の少なくとも８５％を保持することを含む、請求項１に記載の機器。
【請求項３】
リン脂質を保持することが、分離媒体において、リン脂質の少なくとも９０％を保持することを含む、請求項１に記載の機器。
【請求項４】
リン脂質を保持することが、分離媒体において、リン脂質の少なくとも９５％を保持することを含む、請求項１に記載の機器。
【請求項５】
（ｉ）出口開口部および入口開口部を有するチャンバーを画定する少なくとも１つの壁を有するハウジング、（ｉｉ）湿潤バリアと前記出口開口部との間にある分離媒体空間と、湿潤バリアと前記入口開口部との間にある試料受入領域とを画定するように、前記出口開口部と前記入口開口部との間に配置される湿潤バリア、（ｉｉｉ）前記湿潤バリアに近接した前記分離媒体空間内に保持され、リン脂質に対して特異的親和性を有する分離媒体、および（ｉｖ）前記湿潤バリアに組み込まれかつ前記湿潤バリアの一部である、少なくとも１つのフリットを提供するステップ、
第１の力の下で、試料受入領域において、液体試料およびタンパク質沈殿剤を接触させ、これにより、タンパク質沈殿物および処理された試料を形成し、ここで前記第１の力は、前記チャンバーにわたる流体差圧またはこれに等しい遠心力であるステップ、および
第１の力よりも大きい第２の力の下で、処理された試料を湿潤バリアおよび分離媒体に流し、これにより、試料受入領域において、タンパク質沈殿物の少なくとも一部を保持し、分離媒体においてリン脂質を保持し、小分子を溶出し、ここで前記第２の力は、前記チャンバーにわたる１３５４４Ｐａ（４”Ｈｇ）より大きい流体差圧またはこれに等しい遠心力であるステップ
を含み、
前記フリットが複数の開口部を含むことにより、前記フリットが前記湿潤バリアと協働して、第２の力よりも大きい第３の力の下で、前記試料受入領域においてタンパク質沈殿剤を保持できるようにし、ここで前記第３の力は、前記チャンバーにわたる少なくとも６７７２０Ｐａ（２０”Ｈｇ）の流体差圧またはこれに等しい遠心力である
ことを特徴とする、１種以上のタンパク質、リン脂質および小分子を潜在的に含む液体試料を分離するための方法。
【請求項６】
リン脂質を保持することが、分離媒体において、リン脂質の少なくとも８５％を保持することを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
リン脂質を保持することが、分離媒体において、リン脂質の少なくとも９０％を保持することを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
リン脂質を保持することが、分離媒体において、リン脂質の少なくとも９５％を保持することを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記分離媒体が、下式１に表すコア組成物および表面組成物
Ｗ−［Ｘ］−Ｑ
式１
（上で使用する、Ｘは、コア組成物を表し、ＷおよびＱは、Ｘではないコアまたは表面組成物の自由原子価を占有する；ＷおよびＱが前記表面組成物を形成するように、Ｗは、水素またはヒドロキシル基であり、Ｑは、水素、ヒドロキシルおよび脂肪族シラン基の群から選択される。）
を有する、請求項１に記載の機器。
【請求項１０】
Ｑが、脂肪族シラン基であり、前記脂肪族基が、６から３０個の炭素を含む、請求項９に記載の機器。
【請求項１１】
Ｑが、Ｚ−Ｒ１およびＺ−Ｒ２から選択され、式中、Ｒ１が、高級アルキルであり、Ｒ２が、低級アルキルであり、Ｚが、コア材料Ｘに結合したシリコン、シロキサン、金属または金属酸化物を表し、および前記Ｚの開放原子価が、水素またはヒドロキシル、Ｒ１またはＲ２である、請求項１０に記載の機器。
【請求項１２】
Ｗが、少なくとも１つの極性基を有するように選択され、Ｑが、少なくとも１つの疎水性基を有するように選択され、前記極性基および疎水性基が３．５−１３．６の比率を定義する、請求項１０に記載の機器。
【請求項１３】
前記分離媒体が、０．００１−０．５ｍｍの直径を有する粒子形態をとる、請求項１に記載の機器。
【請求項１４】
少なくとも一部分のＷが、ヒドロキシルであり、およびＱが、脂肪族基であり、前記ヒドロキシルおよび脂肪族基が、濃度比率を形成する、前記表面上の濃度を有し、Ｓｉ−Ｒ１に対するヒドロキシルの前記比率が、３．５−１３．６である、請求項９に記載の機器。
【請求項１５】
前記分離媒体が、０．５から１．７ｃｍ３／ｇの細孔容積を有する多孔質モノリス材料である、請求項１に記載の機器。
【請求項１６】
前記分離媒体が、下式１に表すコア組成物および表面組成物
Ｗ−［Ｘ］−Ｑ
式１
（上で使用する、Ｘは、コア組成物を表し、ＷおよびＱは、Ｘではないコアまたは表面組成物の自由原子価を占有する；ＷおよびＱが前記表面組成物を形成するように、Ｗは、水素またはヒドロキシル基であり、Ｑは、水素、ヒドロキシルおよび脂肪族シラン基の群から選択される。）
を有する、請求項５に記載の方法。
【請求項１７】
Ｑが、脂肪族シラン基であり、前記脂肪族基が、６から３０個の炭素を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
Ｑが、Ｚ−Ｒ１およびＺ−Ｒ２から選択され、式中、Ｒ１が、高級アルキルであり、Ｒ２が、低級アルキルであり、Ｚが、コア材料Ｘに結合したシリコン、シロキサン、金属または金属酸化物を表し、および前記Ｚの開放原子価が、水素またはヒドロキシル、Ｒ１またはＲ２である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
Ｗが、少なくとも１つの極性基を有するように選択され、Ｑが、少なくとも１つの疎水性基を有するように選択され、前記極性基および疎水性基が３．５−１３．６の比率を定義する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記分離媒体が、０．００１−０．５ｍｍの直径を有する粒子形態をとる、請求項５に記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも一部分のＷが、ヒドロキシルであり、およびＱが、脂肪族基であり、前記ヒドロキシルおよび脂肪族基が、濃度比率を形成する、前記表面上の濃度を有し、Ｓｉ−Ｒ１に対するヒドロキシルの前記比率が、３．５−１３．６である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記分離媒体が、０．５から１．７ｃｍ３／ｇの細孔容積を有する多孔質モノリス材料である、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クロマトグラフィーを行うための装置および方法を対象とする。より詳細には、本発明の実施形態は、リン脂質を試料の他の成分から分離するための装置および方法を特徴とする。
【背景技術】
【０００２】
多くの生体試料（例えば、臨床、診断および研究の場における）は、タンパク質、ペプチドおよびリン脂質などのマトリックス化合物を含む。そのような試料としては、例えば、血漿、血清、分泌物、体液、細胞および組織がある。しかし、より広い意味では、試料には、個人が分離または分析することを望む、いかなる混合物も含めることができる。混合物は、１種以上の溶解または懸濁化合物（例えば、対象化合物または分析物）を含む、（例えば、水および／または他の液体、および気体を含めた）流体であり得る。そのような試料を調査および／または分析するために、少なくとも１種のマトリックス化合物は、分離、除去、濃縮および／または単離することができる。混合物または試料に存在する１種以上の化合物を分離、除去、濃縮および／または単離するそのような方法は、クロマトグラフィーとして一般に知られている。
【０００３】
クロマトグラフィーは、試料に対する化合物の親和性と、第２相（例えば、クロマトグラフィー媒体）に対する化合物の親和性との違いに基づいて、化合物を分離、除去、濃縮および／または単離することができる。クロマトグラフィーは、試料と第２相の相対的移動によって容易にすることができる。例えば、混合物（例えば、移動相）は、粒子充填層または多孔質モノリス構造（例えば、固定相）に対して一般に移動させる。
【０００４】
血液、血漿、組織、分泌物などの生体由来の試料は、様々なタンパク質、ペプチドおよび／またはリン脂質の組み合わせを含むことが多い。そのような試料はまた、より小さい分子、および／または他の対象化合物も含み得る。タンパク質およびペプチドは、アミノ酸のポリマーであり、試料中に存在することが多い。リン脂質は、リン酸官能基および疎水性の高い官能基を含有する、脂質の一種である。別の分類の脂質、グリセロリン脂質は、誘導体化されたリン酸極性頭部基をＣ−１の位置に有するグリセロール残基に結合した、１本または２本の長い飽和および／または不飽和炭化水素尾部を含有する。その極性頭部基の組成は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリンまたはホスファチジルエタノールアミン脂質を形成するために、それぞれ、コリン、セリンまたはエタノールアミンによって誘導体化されたリン酸基である。より小さい分子（例えば、薬剤または薬剤候補などの有機小分子）は、広範囲の化学的および物理的特性を有し得る。そのような構成成分の混合物間の化学的および物理的特性が広く異なることにより、クロマトグラフィー上の課題が生じ得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の実施形態は、リン脂質分離のための媒体、方法、装置およびキットを特徴とする。例えば、本発明は、リン脂質を試料の他の成分から分離するために使用することができる。試料の他の成分としては、タンパク質、ペプチド、核酸、オリゴヌクレオチド、および／または、有機分子、既知の薬剤化合物、有望な薬剤化合物、脂質、糖、炭水化物、他のバイオ分子およびバイオポリマーなどの他の対象化合物などを挙げることができる。
【０００６】
一実施形態は、流体試料に溶解または懸濁して潜在的に含まれている、タンパク質およびリン脂質の分離を行って、小分子分析物の分析を可能にするための装置を対象とする。該装置は、以下の要素、すなわち、ハウジング、少なくとも１つの湿潤バリア（ｗｅｔｔｉｎｇ  ｂａｒｒｉｅｒ）、分離媒体および少なくとも１つの第１フリットを含む。ハウジングは、出口開口部および入口開口部を有するチャンバーを画定する少なくとも１つの壁を有する。少なくとも１つの湿潤バリア要素は、出口開口部に近い、チャンバー内の分離媒体空間と、入口開口部に近い試料受入領域とを画定するために、チャンバーの中に位置する。試料受入領域は、少なくとも１つの試料および少なくとも１種のタンパク質沈殿剤を受け入れるためにある。少なくとも１つの湿潤バリア要素は、試料受入領域において、少なくとも１つの試料、少なくとも１種のタンパク質沈殿剤および１種以上の沈殿タンパク質を留めておき、処理された試料を放出および形成するためにある。処理された試料は、４”Ｈｇより大きい、チャンバーにわたるガス差圧またはこれに等しい遠心力の適用時に、分離媒体に放出される。分離媒体は、チャンバーの分離空間に入っている。分離媒体は、リン脂質に対して特異的親和性を有する。少なくとも１つの第１フリットは、組み込まれて、少なくとも１つの湿潤要素の一部である、または分離媒体と入口開口部との間に位置する。その少なくとも１つの第１フリットは、少なくとも２０”Ｈｇの圧力差またはこれに等しい遠心力をチャンバーに適用した時に、湿潤バリア要素と組み合わせた前記フリットがタンパク質沈殿薬を保持することを可能にするために、タンパク質沈殿薬を保持する大きさを有する複数の第１フリット開口部を有する。該装置は、試料受入領域において、試料および少なくとも１種のタンパク質沈殿剤を受け入れ、タンパク質が試料受入領域内に存在した場合に、沈殿タンパク質を形成し、チャンバーにわたる４”Ｈｇより大きいガス差圧またはこれに等しい遠心力の適用時に、該フリット上で沈殿タンパク質を収集して、前記分離媒体上にリン脂質を保持するように適合され、小分子が出口開口部から溶出するのを可能にする。
【０００７】
種々の実施形態では、リン脂質に対する特異的親和性は、リン脂質の高い保持（例えば、＞８５％、＞９０％、＞９５％）の実現に反映される。種々の実施形態では、リン脂質に対する特異的親和性は、少なくとも２つの同時に存在する特定のタイプの相互作用物により、リン脂質が分離媒体と相互作用した結果として生じる。分離媒体上の２つのタイプの相互作用基としては、これらだけに限定されないが、（ｉ）シラノール基または他の極性基、および（ｉｉ）Ｃ１８基または他の疎水性基を挙げることができる。これらの少なくとも２つの同時に存在する特定のタイプの相互作用物の組み合わせは、非リン脂質様構造を有する類似の非極性分子の保持よりも、リン脂質の保持を高めることができる。
【０００８】
種々の実施形態では、湿潤バリアは、（ｉ）第１の力の下で、液体試料を保持し、（ｉｉ）第１の力よりも大きい第２の力の下で、その試料を湿潤バリアに流すように適合される。正確な力は、試料溶媒および組成、湿潤バリア材料および機器構成（例えば、試料受入領域における湿潤バリア表面）を含めた、いくつかの要因に基づいて変わる。種々の実施形態では、湿潤バリアは、試料、および、少なくとも７５体積％アセトニトリルを含有する試料とアセトニトリルとの混合物と、９０°より大きい接触角（非湿潤）を示す多孔質要素であり得る。多孔質要素の細孔径は、４”Ｈｇより大きいガス差圧またはこれに等しい遠心力が流体に適用されるまで、分離媒体の上方の試料混合物を保持するように選択され、浸透を妨げる。本明細書に記述した例について、この力は、一般に、約２．５ｌｂｓ／インチ２に等しい。
【０００９】
いくつかの実施形態では、フリット開口部は、タンパク質沈殿薬の形成、およびタンパク質沈殿薬を形成する条件と協働するように選択される。大きなタンパク質沈殿薬には、穏やかな混合および／またはより長い反応時間が好適であり得る。例示的装置は、約５から５００ミクロン、または１０から１００ミクロンの開口部を有する、第１フリットおよび少なくとも１つの湿潤バリア要素を特徴とすることができる。タンパク質沈殿薬およびリン脂質を保持することなどの、保持するという用語は、本明細書で使用する場合、必ずしも完全（例えば、１００％保持）ではない。この用語は、例えば、５０％、または７５％、好ましくは９０％のタンパク質沈殿薬および／またはリン脂質の保持を示すのに使用することができる。他の例としては、５５、６５、７０、８０、８５、８６、８７、８８、８９、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％保持がある。
【００１０】
該装置の一態様は、第１フリット上のフルオロカーボンポリマー被覆物である、少なくとも１つの湿潤バリア要素を特徴とする。該装置の別の態様は、フリット、穴あきシート、スクリーン、膜、布およびフィルターの群から選択される、少なくとも１つの湿潤バリア要素を特徴とする。該装置の別の態様は、前記試料と接触して置かれる、疎水性である表面を有し、また、接触角および表面張力と組み合わさって、少なくとも７５体積％アセトニトリルを含有する試料混合物による、分離媒体の浸透を妨げる細孔径も場合によって有する、少なくとも１つの湿潤バリア要素を対象とする。１つのそうした疎水性表面は、フルオロカーボンポリマーである。このフルオロポリマー表面は、湿潤バリア要素の全体にわたって保有または存在することができる、または被覆物として存在することができる。
【００１１】
出口開口部の近くに位置する第２フリットをさらに含む、本装置の一態様。第２フリットは、チャンバー内の分離媒体を維持する。第２フリットとしては、例えば、１つ以上のフリット、膜、穴あきシート、スクリーン、フィルターおよびこれらの同等物を挙げることができる。
【００１２】
本装置の実施形態は、単一のチャンバー、または、複数のチャンバーを有するハウジングを示すことができる。本発明の一態様は、９６個のチャンバー、または８個のチャンバーの他の倍数個を有するように構成され、配置されるハウジングを特徴とする。該装置は、プレート状形式におけるチャンバーを与えるように構成され、配置される。
【００１３】
本装置の一態様は、（例えば、チャンバーが試料を受け入れた後にチャンバーを閉じる）キャップを特徴とする。一態様では、キャップは、チャンバーにわたる圧力差（例えば、チャンバーの入口で適用される正圧）を生み出すために流体圧源を受け入れるように構成され、配置される。別の態様では、キャップは、チャンバーにわたる圧力差（例えば、チャンバーの出口で適用される負圧または吸入力）を生み出すために負の流体圧力の適用を支えるように構成され、配置される。一態様では、装置は、単一のチャンバーと単一のキャップ；または単一のハウジング中の複数のチャンバーと複数のキャップ；または単一のハウジング中の複数のチャンバーと、チャンバーと協働するように配置される、単一のキャップ部品中の複数のキャップ要素；を有するように構成され、配置される。
【００１４】
本装置の一態様は、遠心機に合うように構成され、配置されるハウジングである。該装置は、単一のチャンバーを有するハウジングを与える。本発明の別態様は、前記チャンバーを空にするために真空源と協働するように構成され、配置される装置である。
【００１５】
該装置の一態様は、下式１に示すコア組成物および表面組成物を有する、吸着剤を対象とする：
Ｗ−［Ｘ］−Ｑ  式１
【００１６】
上で使用する、Ｘは、コア組成物を表し、ＷおよびＱは、Ｘではないコアまたは表面組成物の自由原子価を占有する、または、ＷおよびＱが表面組成物を形成するように、Ｗは、水素またはヒドロキシル基であり、Ｑは、水素、ヒドロキシルおよび脂肪族シラン基の群から選択される。
【００１７】
好ましいＸは、無機（シリカ、アルミナ、チタニア、ジルコニア）または無機／有機ハイブリッド材料である、モノリシックで、球状の、粒状で、表面上多孔質で、不規則な材料である。また、これに含まれるのは、多孔質の無機（シリカ、アルミナ、チタニア、ジルコニア）または無機／有機ハイブリッド材料のコア材料上に、無機（シリカ、アルミナ、チタニア、ジルコニア）または無機／有機ハイブリッド材料表面層を独立に有する材料である。
【００１８】
その式の一態様は、式中、少なくともＱの一部分が、脂肪族シラン基である。好ましい脂肪族基は、６から３０個の炭素を有し、本発明の一態様では、脂肪族基は、１８個の炭素を有する。
【００１９】
一態様では、Ｑは、Ｚ−Ｒ１およびＺ−Ｒ２から選択され、式中、Ｒ１は、高級アルキルであり、Ｒ２は、低級アルキルであり、Ｚは、コア材料Ｘに結合したシリコン、シロキサン、金属または金属酸化物を表し、そのようなＺの開放原子価（ｏｐｅｎ  ｖａｌｅｎｃｅｓ）は、水素またはヒドロキシル、Ｒ１またはＲ２である。本明細書で使用する、用語「低級アルキル」は、１から１０個の炭素を有する炭素基を指し、用語「高級アルキル」は、１０から４０個の炭素を有する炭素基を指す。
【００２０】
好ましいＺは、シランである。好ましくは、表面組成物は、Ｓｉ−Ｒ１とＳｉ−Ｒ２を組み合わせた表面濃度が、１平方メートルあたり０．４０から３．２マイクロモルである。より好ましくは、１平方メートルあたり０．５から２．７マイクロモル、さらに好ましくは、１平方メートルあたり０．６から２．２マイクロモル。
【００２１】
一態様では、Ｗは、少なくとも１つの極性基を有するように選択され、Ｑは、少なくとも１つの疎水性基を有するように選択される。一態様では、極性基および疎水基は、２５％または５０％または９０％よりもほぼ高い比率を定める。１つの例は、少なくとも一部分のＷが、ヒドロキシル、および前記表面組成物上のヒドロキシルであり、Ｑが脂肪族基である場合である。
【００２２】
極性基および疎水性基は、比率として定めることもできる。本発明の一態様では、ヒドロキシルおよび脂肪族基が、濃度の比率を形成する、前記表面上の濃度を有し、組み合わせたＳｉ−Ｒ１および／またはＳｉＲ２に対するヒドロキシルのその比率が、２．０−２６、２．３−１８、３．５−１４、２．５−２０または４．５−１２となる。
【００２３】
該装置の一態様は、粒子形態の分離媒体、または多孔質モノリス材料としての分離媒体を特徴とする。一態様では、粒子は、０．４−３．０ｍｍの直径を有する。一態様では、分離媒体は、０．５−１．７ｃｍ３／ｇの細孔容積を有する。
【００２４】
本発明の実施形態は、流体試料に溶解または懸濁して潜在的に含まれている、タンパク質およびリン脂質を分離して、１種以上の小分子分析物の分析を可能にする方法を特徴とする。該方法は、既述した通りのハウジング、少なくとも１つの湿潤バリア要素、分離媒体および少なくとも１つの第１フリットをもつ装置を提供するステップを有する。該方法は、試料とタンパク質沈殿剤とを試料受入領域において組み合わせて、タンパク質の存在下でタンパク質沈殿薬、および処理された試料を形成するステップを有する。次いで、処理された試料は、チャンバーにわたる４”Ｈｇより大きいガス差圧またはこれに等しい遠心力の適用下で、湿潤バリア要素を通過させられる。処理された試料に潜在的に存在するリン脂質は、分離媒体において保持され、沈殿タンパク質は、該フリット、湿潤バリアまたは分離媒体に、またはこれらの辺りに保持される。小分子分析物は、出口開口部に移される。
【００２５】
キャップを特徴とする本方法の態様では、キャップは、チャンバーが試料を受け入れた後に、チャンバー上に置かれる。一態様は、該方法が、キャップを通して、前記試料受入領域と分離媒体空間との間の４”Ｈｇの圧力差をかけることを含むチャンバーに、圧力差をかけるためのキャップを特徴とする。
【００２６】
遠心機に合うように構成され、配置されるハウジングを特徴とする、本発明の態様では、該方法は、ハウジングを遠心機に入れて、遠心機を作動させて、処理された試料を前記分離媒体へと移動させ、通過させるステップを含む。
【００２７】
チャンバーを空にするために真空源と協働するように構成され、配置されるハウジングを特徴とする、本発明の態様では、該方法は、前記チャンバー内の圧力差を生み出すために、真空源と連通する出口分離媒体空間を置くステップを含む。
【００２８】
本発明の装置は、キットに組み込むことによく適している。キットは、装置、および／または、例として、タンパク質沈殿試薬もしくはタンパク質沈殿剤、緩衝剤などの１種以上の薬剤もしくは試薬などの構成要素をこれらの使用説明書と共に含む、組立部品一式である。組立部品一式は、通常、最終使用者による使用のために、単一ユニットとして包装される。
【００２９】
本発明は、１種以上のタンパク質、リン脂質および小分子を潜在的に含んだ、液体試料を分離するための機器を含む。該機器は、（ｉ）出口および入口を有するチャンバーを画定する少なくとも１つの壁、（ｉｉ）湿潤バリアと出口との間にある分離媒体空間と、湿潤バリアと入口との間にある試料受入領域とを画定するように、出口と入口との間に配置される湿潤バリア、および（ｉｉｉ）湿潤バリアに近接して配置され、リン脂質に対して特異的親和性を有する分離媒体を含む。湿潤バリアは、（ｉ）第１の力の下で、試料受入領域において、液体試料およびタンパク質沈殿剤を保持し、これにより、タンパク質沈殿物および処理された試料の形成を容易にし、（ｉｉ）第１の力よりも大きい第２の力の下で、処理された試料を湿潤バリアおよび分離媒体に流し、これにより、試料受入領域においてタンパク質沈殿物を保持し、分離媒体においてリン脂質を保持し、小分子を溶出するように適合される。
【００３０】
本発明は、１種以上のタンパク質、リン脂質および小分子を潜在的に含んだ、液体試料を分離するための方法を含む。該方法は、（ｉ）出口および入口を有するチャンバーを画定する少なくとも１つの壁、（ｉｉ）湿潤バリアと出口との間にある分離媒体空間と、湿潤バリアと入口との間にある試料受入領域とを画定するように、出口と入口との間に配置される湿潤バリア、および（ｉｉｉ）湿潤バリアに近接して配置され、リン脂質に対して特異的親和性を有する分離媒体を提供することを含む。さらに、該方法は、第１の力の下で、試料受入領域において、液体試料およびタンパク質沈殿剤を接触させ、これにより、タンパク質沈殿物および処理された試料を形成することを含む。さらに、該方法は、第１の力よりも大きい第２の力の下で、処理された試料を湿潤バリアおよび分離媒体に流し、これにより、試料受入領域において、タンパク質沈殿物の少なくとも一部を保持し、分離媒体においてリン脂質を保持し、小分子を溶出することを含む。
【００３１】
種々の実施形態では、第１の力は、チャンバーにわたる４”Ｈｇより大きい流体差圧またはこれに事実上等しい遠心力である。
【００３２】
いくつかの実施形態では、機器は、湿潤バリアと一体化したまたは分離媒体と入口との間に配置される、第１フリットを含み、そこでは、第１フリットは、第２の力よりも大きい第３の力の下で、試料受入領域において、タンパク質沈殿薬を保持するように適合された複数の開口部を含む。方法は、そのようなフリットを提供することを含むことができる。第３の力は、チャンバーにわたる少なくとも２０”Ｈｇの流体差圧またはこれに事実上等しい遠心力であり得る。
【００３３】
ある種の実施形態では、リン脂質を保持することは、分離媒体において、リン脂質の少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％を保持することを含む。
【００３４】
本明細書に記述した種々の態様および特徴は、本発明の種々の実施形態に適合し、これらと組み合わせることができることが、当業者によって理解される。これらおよび他の特徴および利点は、以下の詳細な説明を読み、以下に簡単に説明する図面を見ると、当業者に明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】本発明の特徴を具体化している装置を示す断面図である。
【図２】本発明の特徴を具体化している装置を示す図である。
【図３】本発明の特徴を具体化しているキットを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
これから、好ましい実施形態、および本発明を作製し、使用する最良の形態に関して、本発明を詳細に説明する。当業者は、説明した実施形態が、本明細書中の教示から逸脱することなく、改変および変更できることを認識する。
【００３７】
ここで、図１を見ると、数字１１で概して示される、本発明の特徴を具体化している装置が、断面図で表されている。装置１１は、流体試料に溶解または懸濁して潜在的に含まれている、タンパク質およびリン脂質の分離を行うことができ、小分子分析物の分析を可能にする。装置１１は、以下の要素、すなわち、ハウジング１５、第１フリット要素１７、第２フリット要素１９、湿潤バリア要素２１、分離媒体２３およびキャップ要素２５を含む。一般に、本発明は、リン脂質を他の試料成分から分離するために使用することができる。他の試料成分としては、タンパク質、ペプチド、核酸、オリゴヌクレオチド、および／または、有機分子、既知の薬剤化合物、有望な薬剤化合物、脂質、糖、炭水化物および他のバイオポリマーなどの他の対象化合物を挙げることができる。
【００３８】
ハウジング１５は、チャンバー２９を画定する少なくとも１つの壁２７、出口開口部３１および入口開口部３３を含む。ハウジング１５は、少なくとも１つの壁が、単一のチャンバー２９を画定している図１に表されている。図２は、複数のチャンバー２９’を有するハウジング１５’を画定する、少なくとも１つの壁２７’を有する装置１１’を表す。これらのチャンバー２９’は、９６ウェルプレート形式において構成され、配置される。しかし、当業者は、壁２９’によって、任意の数のチャンバー２９’を画定できることを認識する。チャンバーの数は、９６個または別の８の倍数個であり得る。他の倍数個は可能であり、使用者の要求に基づいて選択することができる。
【００３９】
図１に関する以下の検討は、チャンバー２９’が多数であることにより、同程度に詳述できない図２にも、同様に適用される。ここで図１を参照すると、ハウジング１５は、ガラス、金属および／またはプラスチックなどの実質的に硬い材料で形成される。ＰＥＥＫなどの成型可能なプラスチックが、当技術分野で知られている。
【００４０】
装置１１は、出口開口部３１に近い、チャンバー２９内の分離媒体空間３５と、入口開口部３３に近い試料受入領域３７とを画定するためにチャンバー２９の中に位置する、少なくとも１つの湿潤バリア要素２１を有する。試料受入領域３７は、少なくとも１つの試料および少なくとも１種のタンパク質沈殿剤［図１および２に図示せず］を受け入れるように適合される。少なくとも１つの湿潤バリア要素２１は、試料受入領域３７において、少なくとも１つの試料、少なくとも１種のタンパク質沈殿剤および１種以上の沈殿タンパク質を留めておき、これにより、処理された試料の形成を容易にする。処理された試料は、溶解および／または懸濁して含まれるタンパク質が、全体または一部でタンパク質沈殿薬を形成しているおよび／または形成した試料であり得る。
【００４１】
種々の実施形態では、湿潤バリアは、（ｉ）第１の力の下で、液体試料を保持し、（ｉｉ）第１の力よりも大きい第２の力の下で、その試料を湿潤バリアに流すように適合される。正確な力は、試料溶媒および組成、湿潤バリア材料および機器構成（例えば、試料受入領域における湿潤バリア表面）を含めた、いくつかの要因に基づいて変わる。種々の実施形態では、湿潤バリアは、試料、および、少なくとも７５体積％アセトニトリルを含有する試料とアセトニトリルとの混合物と、９０°より大きい接触角（非湿潤）を示す多孔質要素であり得る。多孔質要素の細孔径は、４”Ｈｇより大きいガス差圧またはこれに等しい遠心力が流体に適用されるまで、分離媒体の上方の試料混合物を保持するように選択され、浸透を妨げる。本明細書に記述した例について、この力は、約２．５ｌｂｓ／インチ２と同等であり得る。
【００４２】
例えば、湿潤バリア要素２１は、表面張力、細孔径および／または接触角により、流れに抵抗することによって、試料、１種以上のタンパク質沈殿剤、タンパク質沈殿薬および処理された試料を留めておく。処理された試料は、チャンバー２９にわたる４”Ｈｇより大きいガス差圧またはこれに等しい遠心力の適用時に、分離媒体２３に放出される。
【００４３】
湿潤バリア要素２１は、フリット、スクリーン、膜、穴あきシート、布、フィルターおよび充填層などの多孔質または穴のある構造の群から選択することができる。好ましい湿潤バリア要素２１は、フルオロカーボンポリマーで形成される、またはフルオロカーボンポリマーの表面を有する。フルオロカーボンポリマーは、当技術分野で既知であり、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）（ＤｕＰｏｎｔ、Ｄｅｌａｗａｒｅ、ＵＳＡ）などの様々な商標で市販されている。例えば、限定されないが、湿潤バリア要素２１は、ビーズもしくは粒子を被覆されたフルオロカーボンポリマーの充てん層、またはフルオロカーボンで形成されたビーズおよび粒子の充てん層、フルオロカーボンで被覆もしくは形成された、スクリーン、フリット、膜、穴あきシート、布、フィルターなどを含むことができる。スクリーン、フリット、膜、穴あきシート、布、フィルターは、金属（例えば、ステンレス鋼）、プラスチックおよびシリケートで好ましくはできている。
【００４４】
分離媒体２３は、チャンバー２９の分離空間３５に含まれている。分離媒体２３は、リン脂質に対して特異的親和性を有する。分離媒体２３はまた、タンパク質に対して非特異的親和性を示すこともてきる、および／またはタンパク質沈殿薬を物理的に保持することができる。
【００４５】
種々の実施形態では、リン脂質に対する特異的親和性は、リン脂質の高い保持（例えば、＞８５％、＞９０％、＞９５％）の実現に反映される。種々の実施形態では、リン脂質に対する特異的親和性は、少なくとも２つの同時に存在する特定のタイプの相互作用物により、リン脂質が分離媒体と相互作用した結果として生じる。分離媒体上の２つのタイプの相互作用基としては、これらだけに限定されないが、（ｉ）シラノール基または他の極性基、および（ｉｉ）Ｃ１８基または他の疎水性基を挙げることができる。これらの少なくとも２つの同時に存在する特定のタイプの相互作用物の組み合わせは、非リン脂質様構造を有する類似の非極性分子の保持よりも、リン脂質の保持を高めることができる。
【００４６】
分離媒体２３は、湿潤バリア要素２１と第２フリット１９との間に入っている。第２フリット１９は、粒子状である分離媒体２３の、層の完全性を維持する。分離媒体２３が、多孔質モノリス材料である、または第２フリットの支持を必要としない類似の材料である実施形態では、第２フリット１９は、必要とされない。
【００４７】
少なくとも１つの第１フリット１７は、湿潤バリア要素２１の上に示されている。種々の実施形態では、第１フリット１７は、湿潤バリア要素２１の位置を維持するために使用することができる。しかし、第１フリット１７と湿潤バリア要素２１の相対的な位置は、交換することができる。他の実施形態では、少なくとも１つの湿潤バリア要素は、少なくとも１つの第１フリットとしても機能する、または少なくとも１つの第１フリットは、組み込まれて、少なくとも１つの湿潤バリア要素２１の一部である。例えば、少なくとも１つの第１フリット１７は、フルオロカーボンポリマーで被覆することができる。そのような実施形態では、別個の第１フリットは、必要とされない。
【００４８】
少なくとも１つの第１フリット１７および／または湿潤バリア要素２１は、タンパク質沈殿薬を保持するように適合された大きさを有する、複数の開口部［図示せず］を有することができる。より詳細には、湿潤バリア要素２１と組み合わせた少なくとも１つの第１フリット１７は、少なくとも２０”Ｈｇの圧力差またはこれに等しい遠心力をチャンバー２９に適用した時に、タンパク質沈殿薬を保持できるように適合させることができる。第１フリット１７開口部は、タンパク質沈殿薬の形成、およびタンパク質沈殿薬を形成する条件と協働するように選択される。例えば、細孔が小さすぎる場合、沈殿物が第１フリットをふさぎ、試料は流れることができない。反対に、細孔が大きすぎる場合、沈殿物が、湿潤バリアに流れ、これをふさぐ。したがって、細孔の大きさは、使用者が保持したい沈殿物の大きさに基づいて選択することができる。使用者も、沈殿物の大きさをある程度制御する。例えば、より大きなタンパク質沈殿薬には、穏やかな混合およびより長い反応時間が好適であり得る。
【００４９】
１つの装置は、約５から５００ミクロン、より好ましくは１０から１００ミクロンの開口部を有する、第１フリット１７および少なくとも１つの湿潤バリア要素２１を特徴とする。タンパク質沈殿薬およびリン脂質を保持することなどの、保持するという用語は、本明細書で使用する場合、必ずしも完全（例えば、１００％保持）ではない。この用語は、例えば、５０％、または７５％、好ましくは９０％のタンパク質沈殿薬および／またはリン脂質の保持を示すのに使用することができる。他の例としては、５５、６５、７０、８０、８５、８６、８７、８８、８９、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％保持がある。
【００５０】
一実施形態は、湿潤バリア要素２１および少なくとも１つの第１フリット１７の開口部と類似または同一の大きさの開口部［図示せず］を有する、タンパク質沈殿薬を除去するための、第２フリット１９を特徴とする。第２フリット１９は、出口開口部３１の近くに位置する。第２フリット１９としては、１つ以上のフリット、膜、穴あきシート、スクリーン、フィルターおよびこれらの同等物を挙げることができる。
【００５１】
第３フリット［図示せず］は、例えば、湿潤バリア要素２１の移動を制限するために、湿潤バリア要素２１と分離媒体２３との間に置くことができる。第３フリット［図示せず］は、好ましくは、少なくとも１つの第１フリットと同一または類似のものであり、第１フリット１７、湿潤バリア要素２１および第３フリット［図示せず］が、順序に関係なくチャンバー２９の中に置くことができる集合体を形成することを可能にする。そのような集合体は、本質的に無方向性（例えば、上部面および底部面が本質的に同じであるという点で非対称性）であり、このことは、集合を容易にする。なぜなら、集合体の配向は、集合体がチャンバーに挿入される時に、調節される必要がないからである。
【００５２】
装置１１は、試料受入領域３７において、試料および少なくとも１種のタンパク質沈殿剤を受け入れ、タンパク質が試料受入領域３７内に存在した場合に、沈殿タンパク質を形成し、チャンバー２９にわたる４”Ｈｇより大きいガス差圧またはこれに等しい遠心力の適用時に、少なくとも１つの第１フリット１７上で沈殿タンパク質を収集して、分離媒体２３上にリン脂質を保持することができ、小分子が出口開口部３１から溶出するのを可能にする。
【００５３】
図１は、チャンバー２９が試料を受け入れた後にチャンバー２９を閉じるキャップ２５を有する装置１１を表す。一態様では、キャップ２５は、チャンバー内の圧力差を生み出すために流体圧源［図示せず］を受け入れるように構成され、配置される。例えば、一実施形態は、大気などのガスが受け入れられて、通過できる多孔質マットを有するキャップ２５を特徴とする。ハウジング１５は、チャンバー２９の試料受入部分３７に加圧して、湿潤バリア要素２１に流体を通過させるために、圧力源と関連するマニホールドに置かれる。代替では、キャップ２５は、圧力源と連通して置かれるホース接続部［図示せず］を有する。代替では、ハウジング１５は、圧力源と関連するマニホールドに置かれ、圧力差が、出口開口部３１を通る真空によって生み出される。
【００５４】
図１に表す通り、例示的装置１１は、単一のチャンバー２９および単一のキャップを有するように構成され、配置される。図２において、単一のハウジング１５中に複数のチャンバー２９を有する例示的装置１１’は、複数のキャップ［図示せず］；またはチャンバー２９’と協働するように配置される、単一のキャップ部品中の複数のキャップ要素を有する、単一または一群のキャップのハウジング［図示せず］；を有することができる。
【００５５】
ここで図１に戻ると、装置１１は、遠心機に合うように構成され、配置されるハウジング１５を有する。ハウジング１５は、遠心機における、バイアルなどのための従来の開口部と協働するように、直径が約０．５から２．０センチメートルで、長さが４．０から２０センチメートルである一般的な円筒形を有する。しかし、他の形、大きさおよび構成を使用することができる。保留領域５１と示される、第２フリット１９の下の領域は、試料が、少なくとも１つの第１フリット１７、湿潤バリア要素２１、分離媒体２３および第２フリット１９を流れた後に、その試料を収集することができる。
【００５６】
分離媒体２３は、下式１に示すコア組成物および表面組成物を有する吸着剤であり得る：
Ｗ−［Ｘ］−Ｑ  式１
【００５７】
上で使用する、Ｘは、コア組成物を表し、ＷおよびＱは、Ｘではないコアまたは表面組成物の自由原子価を占有する。ＷおよびＱが表面組成物を形成するように、Ｗは、水素またはヒドロキシル基であり、Ｑは、水素、ヒドロキシルおよび脂肪族シラン基の群から選択される。
【００５８】
種々の実施形態では、少なくともＱの一部分は、脂肪族シラン基であり得る。好ましい脂肪族基は、６から３０個の炭素を有する。１つの例では、脂肪族基は、１８個の炭素を有する。
【００５９】
いくつかの実施形態では、Ｑは、Ｚ−Ｒ１およびＺ−Ｒ２から選択され、式中、Ｒ１は、高級アルキルであり、Ｒ２は、低級アルキルであり、Ｚは、コア材料Ｘに結合したシリコン、シロキサン、金属または金属酸化物を表し、そのようなＺの開放原子価は、水素またはヒドロキシル、Ｒ１またはＲ２である。本明細書で使用する、用語「低級アルキル」は、１から１０個の炭素を有する炭素基を指し、用語「高級アルキル」は、１０から４０個の炭素を有する炭素基を指す。
【００６０】
いくつかの実施形態では、Ｗは、少なくとも１つの極性基を有するように選択され、Ｑは、少なくとも１つの疎水性基を有するように選択される。一態様では、極性基および疎水基は、２５％または５０％または９０％よりもほぼ高い比率を定める。ある種の実施形態では、疎水性基に対する極性基の比率は、０．２０、０．２５、０．３０、０．３５、０．４０、０．４５、０．５０、０．５５、０．６０、０．６５、０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０または０．９５であり得る。１つの例では、少なくともＷの一部分は、ヒドロキシルであり、Ｑは、脂肪族基である。
【００６１】
極性基および疎水性基は、比率として定めることもできる。本発明の一態様では、ヒドロキシルおよび脂肪族基が、濃度の比率を形成する、前記表面上の濃度を有し、組み合わせたＳｉ−Ｒ１および／またはＳｉＲ２に対するヒドロキシルのその比率が、２．０−２６、２．３−１８、３．５−１４、２．５−２０または４．５−１２となる。
【００６２】
該装置の一態様は、粒子形態の分離媒体、または多孔質モノリス材料としての分離媒体を特徴とする。一態様では、粒子は、０．４−３．０ｍｍの直径を有する。一態様では、分離媒体は、０．５から１．７ｃｍ３／ｇの細孔容積を有する。
【００６３】
本発明の操作、および装置１１の使用方法は、流体試料に溶解または懸濁して潜在的に含まれている、タンパク質およびリン脂質を分離して、１種以上の小分子分析物の分析を可能にする方法に関して説明される。ここで、図１を参照すると、該方法は、既述した通りのハウジング１５、少なくとも１つの湿潤バリア要素２１、分離媒体２３および少なくとも１つの第１フリット１７をもつ装置１１を提供するステップを有する。試料は、試料受入領域３７において、タンパク質沈殿剤と組み合わされて、タンパク質の存在下でタンパク質沈殿薬、および処理された試料を形成する。次いで、処理された試料は、４”Ｈｇより大きいガス差圧またはこれに等しい遠心力の適用下で、湿潤バリア要素２１を通過させられる。処理された試料に潜在的に存在するリン脂質は、分離媒体２３において保持され、いかなる沈殿タンパク質も、少なくとも１つのフリット１７、湿潤バリア要素２１または分離媒体２３に、またはこれらの辺りに保持される。小分子分析物は、存在する場合、最終試料の状態で、出口開口部に移される。
【００６４】
種々の実施形態では、キャップ２５は、チャンバー２９が試料を受け入れた後に、チャンバー２９に置かれる。キャップ２５は、試料受入領域３７と分離媒体空間２３との間の４”Ｈｇより大きい、チャンバーにわたる圧力差を支えるように適合させることができる。圧力差は、キャップ２５を通して正圧を適用することによって、または出口開口部３１を通して真空を適用することによって生み出すことができる。
【００６５】
遠心機に合うように構成され、配置されるハウジング１５を特徴とする、本発明の態様では、該方法は、ハウジング１５を遠心機に入れる、および／または遠心機を作動させて、処理された試料を前記分離媒体２３へと移動させ、通過させるステップを含むことができる。遠心機によって試料に適用される力は、チャンバーにわたる４”Ｈｇより大きい圧力差に事実上等しい遠心力（例えば、湿潤バリアに試料を流すのに十分な力）であり得る。
【００６６】
本発明による装置は、キットに組み込むことによく適している。一般に、キットは、装置、および／または１種以上の薬剤もしくは試薬（例えば、タンパク質沈殿試薬またはタンパク質沈殿剤、緩衝剤など）および／または使用説明書などの構成要素一式を含むことができる。例示のキット５５は、図３に表されている。キット５５は、使用者による使用のために、箱６１、容器、包装紙、袋または他の手段［図示せず］に単一ユニットとして包装された、装置１１、キャップ２５、タンパク質沈殿試薬の１つ以上のバイアル（そのうち１つだけが数字５７を有して表されている。）、装置１１、キャップ２５およびバイアル５７の使用説明書５９を含む。一般に、キットは、使用または販売のために、本質的に、これらの構成要素、または本明細書で検討した他の構成要素のいかなる組み合わせも含むことができる。
【実施例】
【００６７】
プロトコル：本発明を、とりわけ多孔質のクロマトグラフィー材料の表面改質を説明している、以下の非限定的なプロトコルによって、さらに例示する。
【００６８】
材料：特に断りのない限り、すべての試薬を、そのまま使用した。当業者は、以下の供給品および供給業者の同等のものが存在し、したがって、以下に挙げた供給業者が限定的であると解釈されるべきではないことを認識する。
【００６９】
物理的特徴付け：当業者は、以下の器械および供給業者の同等のものが存在し、したがって、以下に挙げた機器が限定的であると解釈されるべきではないことを認識する。
【００７０】
％Ｃ値を、Ｃｏｕｌｏｍｅｔｒｉｃ  Ｃａｒｂｏｎ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（モジュールＣＭ５３００、ＣＭ５０１４、ＵＩＣ  Ｉｎｃ．、Ｊｏｌｉｅｔ、ＩＬ）または同等の分析器によって測定した。これらの材料の比表面積（ＳＳＡ）、比細孔容積（ＳＰＶ）および平均細孔直径（ＡＰＤ）を、多点Ｎ２収着法（Ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ  ＡＳＡＰ  ２４００；Ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、ＧＡ）を使用して測定した。ＳＳＡは、ＢＥＴ法を使用して算出し、ＳＰＶは、Ｐ／Ｐ０＞０．９８について決定した一点値であり、ＡＰＤは、ＢＪＨ法を使用して、等温線の脱着レッグ（ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｌｅｇ）から算出した。粒度を、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ  ３分析器（Ｍｉａｍｉ、ＦＬ）を使用して測定した。粒子直径（ｄｐ）を、体積基準粒度分布の５０％累積径として測定した。シリカ上のシラノール濃度を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＴＡＣ  ７／ＤＸ熱分析コントローラーを有するＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＴＧＡ  ７熱重量分析器（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して、１８５−１０００℃の温度範囲で測定した重量喪失、およびＳＳＡによって決定した。
【００７１】
タンパク質沈殿の化学薬品および手順：ラットの血漿（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ−Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．、Ｋｅｒｒｖｉｌｌｅ  ＴＸ）試料に、９つの分析物をスパイクし、表１に示した濃度にした。分析物は、カフェイン（Ａｌｆａ  ａｅｓａｒ、Ｗａｒｄ  Ｈｉｌｌ、ＭＡ）を除いて、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。ギ酸を、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、ＮＪから購入した。アセトニトリルおよびメタノールを、Ｆｉｓｈｅｒ、Ｆａｉｒ  Ｌａｗｎ、ＮＪから購入した。
【００７２】
【表１】
0005908461.tif 000002
【００７３】
１ｃｃカートリッジについては、１部のプランク血漿と、１％（ｖ／ｖ）ギ酸（ＦＡ）を含有する３部のアセトニトリル（ＡＣＮ）とを組み合わせることによって、タンパク質沈殿試料を調製した。これらの試料をボルテックスし、次いで、遠心機にかけて、沈殿物を除去した。半分の上清を、表１に列挙した分析物でスパイクまたは補強した。あとの半分は、ブランクのままにしておき、装置に通した後に、分析物混合物をスパイクした。８５０μＬの分量の補強済み上清、または８００μＬのブランク上清を、２つのポリエチレンフリットの間に挟まれた３０ｍｇの合成吸着剤を含有する１ｃｃカートリッジに加えた。重力供給を使用して、１ｃｃカートリッジの出口で、抽出物を収集した。５０μＬの分析物混合物を、ブランク血漿試料からの抽出物に加えた。抽出物を、窒素流下で蒸発させ、２００μＬの８０％メタノール水溶液を使用して再構成した。
【００７４】
Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）フリットを使用して集めた、９６ウェルプレート試料については、タンパク質沈殿ステップを、ウェルの中で実施した。テフロンフリットの目的は、出口開口部での４”Ｈｇより大きい真空、または入口開口部での４”Ｈｇより大きい正圧が超過されるまで、試料による層の浸透を妨げることである。テフロンフリットの使用は、４”Ｈｇより大きい真空または４”Ｈｇより大きい正圧が超過されるまで、試料による層の浸透を妨げる能力を有する、任意の他の十分に疎水性のフリット材料、膜、スクリーン、もしくはモノリシック構造、または部分の組み合わせなどの多孔質要素の非限定的例とみなす。
【００７５】
補強済みまたはスパイク済み血漿を、１０倍濃度の分析物混合物を加えて、これを血漿で１：１０に希釈することによって調製した。２２０μＬの補強済み血漿を各ウェルに加え、その後に、６００μＬの１％ＦＡのＡＣＮを加えた。回収のために参照標準として使用されるウェルに対して、２００μＬのブランク血漿を各ウェルに加え、その後に、６００μＬの１％ＦＡのＡＣＮを加えた。自動ピペットを使用して、各ウェル中の６００μＬの試料を１０回吸引および吐出することによって、試料を混合した。満たされていないまたは使用されていないウェルを粘着フィルムで覆ってから、真空マニホールド上の２ｍＬ９６ウェル試料収集プレートの上にプレートを置いた。１５−２０”Ｈｇの真空を、５分間適用した。ブランク血漿ウェルからの抽出物に、分析混合物２０μＬ／ウェルを加えた。抽出物を、窒素流下で蒸発させ、８０％メタノール水溶液２００μＬ／ウェルを使用して再構成した。
【００７６】
９６ウェルプレートでの混合は、ボルテックスすることを通して遂行することができる。沈殿溶媒を加えた後に、通気孔のないキャップマットを使用して、ウェルを密閉する。プレートを約１分間ボルテックスし、２ｍＬ収集プレートの上の真空マニホールド上に置いた。１５−２０”Ｈｇの真空を適用し、次いで、大気に解放した。この連続作業を、５分間にわたって３回行う。真空の解放は、試料の上方の空間が、大気圧と再び平衡することを可能にする。これは、すでに空になっているウェルを通して空気損失を妨げることにより、十分に利用可能な真空を、最低速排出ウェルにわたって下ろすことが可能となることによって、各ウェルを空にすることを容易にする。キャップマットは、真空下での膨張に利用可能な空間を増やすための隔壁を有することができるが、通気孔をつけるべきではない。
【００７７】
リン脂質および分析物の分析：再構成した試料２μＬを、以下の条件（表２）およびグラジエント法（表３）を実行するＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ  ＭＡ）上の１．８μｍのＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ（登録商標）ＨＳＳ  Ｔ３カラム（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ  ＭＡ）に注入した。
【００７８】
【表２】
0005908461.tif 000003
【００７９】
【表３】
0005908461.tif 000004
【００８０】
モニタリングのために選択した５種類のリン脂質（ＰＬ）は、グリセロリン脂質と呼ばれるリン脂質のクラス、特に、ホスファチジルコリンと呼ばれるサブクラスに属し、すべてが、トリメチルアンモニウムエチルホスフェート頭部基（ｍ／ｚ１８４）を含有する。ホスファチジルコリンは、血漿中の全リン脂質の６０−７０％を占め、また、マトリックス効果の大部分についての原因であると考えられていることが当技術分野で広く知られている。選択した５種類のホスファチジルコリンのうちの２つは、リゾホスファチジルコリン（ｍ／ｚ４９６およびｍ／ｚ５２４）であり、これらは、Ｃ−２の位置に脂肪酸エステルがないので、５種類のうちで最も疎水性が低い。
【００８１】
グラジエントにおける２つの異なる領域を使用する、正確な定量を可能にするために、９つの分析物（２．４分と７．０分の間に溶出する）および５種類のリン脂質（７．５分と１２分の間に溶出する）を、上述のクロマトグラフィー条件およびグラジエントを使用して、互いから分離させる。ＭａｓｓＬｙｎｘ（商標）ＭＳ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｖ４．１を使用して、エレクトロスプレーポジティブ（ＥＳ＋）モードにおける、単一イオン記録（ＳＩＲ）ｍ／ｚ４９６→ｍ／ｚ１８４、ｍ／ｚ５２４→ｍ／ｚ１８４、ｍ／ｚ７０４→ｍ／ｚ１８４、ｍ／ｚ７５８→ｍ／ｚ１８４、およびｍ／ｚ８０６→ｍ／ｚ１８４をモニタリングする、Ｗａｔｅｒｓ  Ｑｕａｔｔｒｏ  ｍｉｃｒｏ（商標）Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（ＭＳ）を使用して、再構成試料および対照を、以下のリン脂質に関して分析した。吸着剤を通過した後の試料中に残っている（保持されない）リン脂質を、吸着剤を通過しなかった血漿上清（タンパク質沈殿物、ｐｐｔ）中のリン脂質に対して定量した。リン脂質の分析に使用するＭＳ条件を、下表に示す。リン脂質の結果は、吸着剤によって保持されたリン脂質％として報告し、下式に従って算出する。
【００８２】
【数１】
0005908461.tif 000005
式中、ＰＬｐｐｔは、吸着剤を通過する前の試料中の５つのＰＬの総面積であり、ＰＬ吸着剤は、吸着剤を通過した後の試料中に残っている５つのＰＬの総面積である。
【００８３】
【表４】
0005908461.tif 000006
【００８４】
Ｗａｔｅｒｓ  ＡＣＱＵＩＴＹ  ＰＤＡ検出器を使用して得られたクロマトグラムからのピーク面積を使用して、回収を算出した。回収％を、以下の式を使用して、各分析物に関して算出した：再構成した補強済み試料の分析物ピーク面積／蒸発および再構成前を除き、吸着剤を通過した後に分析物をスパイクした、再構成したブランク試料の分析物ピーク面積。
【００８５】
［実施例１］
多孔質シリカ粒子（タイプＡ：４４μｍの不規則粒子２０ｇ；ＳＳＡ＝５１１ｍ２／ｇ；ＳＰＶ＝０．７３ｃｍ３／ｇ；ＡＰＤ＝５０Å、またはタイプＢ：２０μｍの球状粒子２０ｇ；ＳＳＡ＝３３８−３４５ｍ２／ｇ；ＳＰＶ＝１．０４ｃｍ３／ｇ；ＡＰＤ＝１０１Å）を、トルエン（１７５ｍＬ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｆａｉｒｌａｗｎ、ＮＪ）中で、１時間還流した。Ｄｅａｎ−Ｓｔａｒｋトラップを使用して、混合物から、７５ｍＬの微量の水およびトルエンを除去した。冷却時に、イミダゾール（Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）およびオクタデシルジメチルクロロシラン（ＯＤＭＣＳ、Ｇｅｌｅｓｔ  Ｉｎｃ．、Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ、ＰＡ）を加えた。次いで、反応物を、１６−１８時間加熱還流した。次いで、反応物を冷却し、生成物を濾過し、トルエン、水およびアセトン（すべて、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製の溶媒）で連続的に洗浄した。次いで、生成物を、減圧下で、７０℃で、１６時間乾燥させた。さらに、１ｂの試料を、アセトン／０．１２Ｍ酢酸アンモニウム水溶液（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）中で２時間還流した。次いで、反応物を冷却し、生成物を濾過し、水およびアセトン（すべて、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製の溶媒）で連続的に洗浄した。次いで、生成物１ｄを、減圧下で、７０℃で、１６時間乾燥させた。反応物および生成物の分析データを、表４に示す。Ｃ１８基の表面被覆率は、元素分析により測定した、表面改質の前および後の粒子％Ｃの違いによって決定した。
【００８６】
【表５】
0005908461.tif 000007
【００８７】
１ｃｃカートリッジについて前述した手順を使用して、表５からの吸着剤を、１％ＦＡのＡＣＮ：タンパク質沈殿試料であるラット血漿が３：１の上清で試験した。３：１の比率は、ＬＣカラム入口がタンパク質で汚れるのを防止するために、ＬＣ／ＭＳの分析前に、血漿試料からのタンパク質を沈殿させるのに使用されることが多い。１％のギ酸を加えることは、残留シラノールと強く相互作用するおよび／またはタンパク質と強く結合すると思われる、分析物を回収する助けとなり、したがって、その手順が、一般に適用可能（一般的）となる。分析の結果は、表６に示す。
【００８８】
【表６】
0005908461.tif 000008
【００８９】
リン脂質の十分な保持、および分析物の回収（通過）が、吸着剤１ａ−１ｄ上で得られた。タンパク質沈殿試料から、有害レベルのリン脂質を除去するように設計された、装置における吸着剤の使用に成功したというには、最も極性の高いリン脂質を＞９５％保持すること、およびすべての分析物について＞７０％回収することが必要である。
【００９０】
吸着剤上のＣ１８のμｍｏｌ／ｍ２［Ｃ１８］に対する、結合後の残留シラノールのμｍｏｌ／ｍ２［Ｓｉ−ＯＨｒｅｓ］の比率を、以下の式を使用して、単官能性Ｃ１８が結合した吸着剤に関して算出した：
【００９１】
【数２】
0005908461.tif 000009
【００９２】
表５の吸着剤に関して算出したＳｉ−ＯＨｒｅｓ／Ｃ１８の比率は、５．９から９．４の範囲であった。このＳｉ−ＯＨｒｅｓ／Ｃ１８の比率の範囲は、７５％アセトニトリルを含有するタンパク質沈殿試料を使用しながら、様々な分析物が装置を通過するのを可能にしつつ、リン脂質の保持に優れている。
【００９３】
［実施例２］
多孔質シリカ粒子（タイプＡ：４４μｍの不規則粒子２０ｇ；ＳＳＡ＝５１１ｍ２／ｇ；ＳＰＶ＝０．７３ｃｍ３／ｇ；ＡＰＤ＝５０Å）を、様々な量のオクタデシルジメチルクロロシラン（ＯＤＭＣＳ、Ｇｅｌｅｓｔ  Ｉｎｃ．、Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ、ＰＡ）を使用して結合させ、粒子表面上に様々な量のリガンドを生成させた。実施例１で前述した一般手順を使用して、表７の材料を生成した。反応物および生成物の分析データを、表７に示す。Ｃ１８基の表面被覆率は、元素分析により測定した、表面改質の前および後の粒子％Ｃの違いによって決定した。
【００９４】
【表７】
0005908461.tif 000010
【００９５】
１ｃｃカートリッジについて前述した手順を使用して、表７からの吸着剤を、１％ＦＡのＡＣＮ：タンパク質沈殿試料であるラット血漿が３：１の上清で試験した。結果を表８に示す。
【００９６】
【表８】
0005908461.tif 000011
【００９７】
表８のデータは、非結合型シリカを含めた、列挙したすべての吸着剤が、本発明者らの試験混合物中のすべての分析物を、良好に回収することを示している。そのデータはまた、Ｓｉ−ＯＨｒｅｓ／Ｃ１８の比率が低下するほど、リン脂質、特に、ｍ／ｚ４９６を有するリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）により表８に示された、最も極性の高いリン脂質を除去することに対する吸着剤の効率が低下することも示している。焦点を、極性のリン脂質に当てる。なぜなら、これらは、ＬＣカラム上で、分析物が溶出する同じ領域で、Ｌｉｔｔｌｅらによって述べられている通り、逆相クロマトグラフィーで［Ｊ．Ｌｉｔｔｌｅ，Ｍ．Ｗｅｍｐｅ、Ｃ．Ｂｕｃｈａｎａｎ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ  ８３３（２００６）２１９］、およびＷｅｎｇらによって述べられている通り、ＨＩＬＩＣクロマトグラフィーで［Ｗ．Ｊｉａｎ、Ｒ．Ｗ．Ｅｄｏｍ、Ｙ．ｇ  Ｘｕ、Ｎ．Ｗｅｎｇ、Ｊ．Ｓｅｐ．Ｓｃｉ．２０１０、３３、１−１７］、溶出する可能性が高いからである。
【００９８】
Ｓｉ−ＯＨｒｅｓ／Ｃ１８の比率が３．５と２．４の間で、ｍ／ｚ４９６のＬＰＣについての保持の、非常に劇的な喪失が存在し、最も疎水性の高い吸着剤２ｄは、所望の保持を達成せず、吸着剤２ｃは、この適用に依然として有用なままである。最も疎水性の高い吸着剤（２ｄ）上で極性のＬＰＣを保持することに失敗したことは、吸着剤のリン脂質親和性（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｏｔｒｏｐｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）が、表面のＣ１８鎖との相互作用による、極性ＬＰＣの疎水性尾部の保持に依存するだけではないことを示している。
【００９９】
表８から、１３．６のような高いＳｉ−ＯＨｒｅｓ／Ｃ１８の比率に関して、吸着剤（２ａ）は、ｍ／ｚ４９６のＬＰＣについての保持を幾らか失うことを示すことがさらに分かる。シリカＡに関するデータから、モニタリングされたリン脂質は、シリカだけによって保持されないことが明らかである。非結合型シリカおよび最も疎水性の高い吸着剤（２ｄ）で得られた、リン脂質保持の結果を合理的に説明することにより、表面のシラノールとＣ１８基の両方が、本発明に要する、リン脂質の保持の向上に必要であることを主張することが、不合理とならない。特定の比率のＳｉ−ＯＨｒｅｓ／Ｃ１８を含有する吸着剤のみが、タンパク質沈殿血漿／血清試料からのリン脂質の除去に理想的である。
【０１００】
［実施例３］
多孔質シリカ粒子（２０μｍの球状粒子４０ｇ；ＳＳＡ＝３３８ｍ２／ｇ；ＳＰＶ＝１．０４ｃｍ３／ｇ；ＡＰＤ＝１０１Å）を、トルエン（２７５ｍＬ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｆａｉｒｌａｗｎ、ＮＪ）中で、１時間還流した。Ｄｅａｎ−Ｓｔａｒｋトラップを使用して、混合物から、７５ｍＬの微量の水およびトルエンを除去した。冷却時に、イミダゾール（１．８ｇ、Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）およびカルボメトキシエチルトリクロロシラン（ＣＭＴＣＳ、３．１ｇ、Ｇｅｌｅｓｔ  Ｉｎｃ．、Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ、ＰＡ）を加えた。次いで、反応物を、１９．５時間加熱還流した。次いで、反応物を冷却し、生成物を濾過し、トルエン、水およびアセトン（すべて、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製の溶媒）で連続的に洗浄した。次いで、材料を、アセトン／０．１２Ｍ酢酸アンモニウム水溶液（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）中で２時間還流した。次いで、反応物を冷却し、生成物を濾過し、水およびアセトン（すべて、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製の溶媒）で連続的に洗浄した。次いで、生成物２ａを、減圧下で、７０℃で、１６時間乾燥させた。反応物および生成物の分析データを、表９に示す。表面被覆率（１．５５μｍｏｌ／ｍ２）は、元素分析により測定した、ＯＤＭＣＳ表面改質の前および後の粒子％Ｃの違いによって決定した。
【０１０１】
この材料の試料（１０ｇ）を、トルエン（２７５ｍＬ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｆａｉｒｌａｗｎ、ＮＪ）中で、１時間還流した。Ｄｅａｎ−Ｓｔａｒｋトラップを使用して、混合物から、７５ｍＬの微量の水およびトルエンを除去した。冷却時、イミダゾール（０．４６ｇ、Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）およびオクタデシルジメチルクロロシラン（１．２ｇ、ＯＤＭＣＳ、Ｇｅｌｅｓｔ  Ｉｎｃ．、Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ、ＰＡ）を加えた。次いで、反応物を、４時間加熱還流した。次いで、反応物を冷却し、生成物を濾過し、トルエン、水およびアセトン（すべて、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製の溶媒）で連続的に洗浄した。次いで、生成物２ｂを、減圧下で、７０℃で、１６時間乾燥させた。反応物および生成物の分析データを、表９に示す。Ｃ１８基による追加の表面被覆率（０．８６μｍｏｌ／ｍ２）は、元素分析により測定した、ＯＤＭＣＳ表面改質の前および後の粒子％Ｃの違いによって決定した。
【０１０２】
【表９】
0005908461.tif 000012
【０１０３】
１ｃｃカートリッジについて前述した手順を使用して、表９からの吸着剤を、１％ＦＡのＡＣＮ：タンパク質沈殿試料であるラット血漿が３：１の上清で試験した。結果を表１０に示す。
【０１０４】
【表１０】
0005908461.tif 000013
【０１０５】
表１０の非結合型シリカＢおよびすべての結合型吸着剤は、そのすべての分析物を、良好に回収する。シリカＢおよび吸着剤３ａは、疎水性のＣ１８基がないので、リン脂質を十分に保持しなかった。吸着剤３ｂ上に、Ｃ１８に加えて、カルボン酸および／またはこのエステルが存在することは、リン脂質の保持に不利益となっておらず、ＣＢＡ＋エステル基に置換されるシラノール基と同じように作用する。吸着剤３ｂと異なり、吸着剤３ｃ上に、Ｃ１８基に加えて、トリメチル（ＴＭＳ）エンドキャップ基が存在することは、リン脂質の保持に不利益となっており、ＴＭＳ基が、リン脂質に対する保持の向上をもたらす２つの基の相互作用に必要とされる、シラノール基への接近を妨害していることを示している。
【０１０６】
データは、カルボン酸および／またはこのエステルが、吸着剤３ｂのリン脂質親和性を維持する一方で、吸着剤上のトリメチルシリル基の存在は、それを維持しないことを示している。吸着剤３ｂと３ｃ上の総被覆量は、２．４１μｍｏｌ／ｍ２であり、どちらも、表面上に、０．９μｍｏｌ／ｍ２のＣ１８を有するが、それらの吸着剤の一方だけが、リン脂質に対して十分な保持を維持していることを指摘することが重要である。これらの吸着剤はいずれも、Ｓｉ−ＯＨｒｅｓ／Ｃ１８の比率が、約７．８であり、この比率は、許容範囲にすでに入っている。カルボン酸および／またはこのエステルは、シラノールにより与えられる極性基と同様の極性基を与えるようなので、吸着剤３ｂは、ＰＬ保持を維持する。しかし、吸着剤３ｃは、リン脂質親和性がないので、Ｓｉ−ＯＨｒｅｓ／Ｃ１８の比率が２．８の吸着剤として振る舞い（下表１１を参照）、その比率は、ＰＬ保持が最適でない比率範囲に明らかに入っている。
【０１０７】
シラノールおよびＣ１８基へのリン脂質親和力は、これらの基だけに特有ではなく、上述のデータは、ＴＭＳ基が、疎水性基の濃度を高めると仮定して、要約することができる。図１１の比率は、極性基について合わせた被覆率（この場合では、［Ｓｉ−ＯＨｒｅｓ＋ＣＢＡおよびエステル］。）を、疎水性基の合わせた被覆率（この場合では、［Ｃ１８＋ＴＭＳ］。）で割ったものとして表した。保持されたＰＬ％のデータを基にすると、ここで、表１１のすべての吸着剤についての比率は、シリカ上にＣ１８基だけを使用して作製された生成物に合う。全体として、データは、疎水性基の任意の数の組み合わせと共に極性基の任意の数の組み合わせが、リン脂質の保持の向上に要する、２つの基の相互作用として一緒になることができることを示している。
【０１０８】
【表１１】
0005908461.tif 000014
【０１０９】
［実施例４］
実施例１に記述した一般手順は、様々な異なる多孔質材料に適用することができる。これに含まれるのは、無機（シリカ、アルミナ、チタニア、ジルコニア）または無機／有機ハイブリッド材料である、モノリシックで、球状の、粒状で、表面上多孔質で、不規則な材料である。また、これに含まれるのは、多孔質の無機（シリカ、アルミナ、チタニア、ジルコニア）または無機／有機ハイブリッド材料のコア材料上に、無機（シリカ、アルミナ、チタニア、ジルコニア）または無機／有機ハイブリッド材料表面層を独立に有する材料である。球状、粒状または不規則な材料の粒度は、１−５００μｍ、より好ましくは１−６０μｍ、より好ましくは１５−３０μｍと様々であり得る。これらの材料のＡＰＤは、３０から２，０００Å、より好ましくは４０から２００Å、より好ましくは４５から１６０Åまで様々であり得る。これらの材料のＳＳＡは、２０から１０００ｍ２／ｇ、より好ましくは９０から８００ｍ２／ｇ、より好ましくは１５０から６００ｍ２／ｇ、より好ましくは２００から５５０ｍ２／ｇまで様々であり得る。これらの材料のＴＰＶは、０．３から１．７ｃｍ３／ｇ、より好ましくは０．５から１．２ｃｍ３／ｇ、より好ましくは０．７から１．１ｃｍ３／ｇまで様々であり得る。モノリシック材料のマクロポア直径は、０．１から３０μｍ、より好ましくは０．５から２５μｍ、より好ましくは１から２０μｍまで様々であり得る。
【０１１０】
これらの反応物に使用する表面改質剤は、式（ＩＩ）
【０１１１】
【化１】
0005908461.tif 000015
もしくは式（ＩＩＩ）
【０１１２】
【化２】
0005908461.tif 000016
またはこれらの組み合わせ
［式中、
ｍ１は、５−３０、より好ましくは８−３０、より好ましくは１２−３０、より好ましくは１８からの整数であり、
ｍ２は、０−３０、より好ましくは０−１８、より好ましくは０−６からの整数であり、
Ｒ３およびＲ４の各存在は独立に、−ＯＨ、水素、メチル、エチル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソプロピル、テキシル、置換または非置換アリール、環状アルキル、分枝アルキル、低級アルキルまたはＹ基を表し、
Ｒ５およびＲ６の各存在は独立に、水素、メチル、エチル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｉ−プロピル、低級アルキルまたはＡ基を表し、
Ｒ７は独立に、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、置換または非置換アリール、シアノ、アミノ、ジオール、ニトロ、ニトロフェニル、カチオンまたはアニオン交換基、双性イオン基、単環式もしくは二環式の複素環系もしくはヘテロアリール環系、またはキラル部位を表し、
Ｙは、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＲ８、−ＮＲ８、−ＯＳＯ２ＣＦ３または−Ｃｌ（ここで、Ｒ８は、水素、メチル、エチル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソプロピル、テキシル、フェニル、分枝アルキルまたは低級アルキルを表す）を表し、
Ａは、保護化、プロトン化または塩形態の、カルボン酸基を含むアルキルまたはアリールカチオン交換基、フェノール、イミド、スルホン酸、ボロン酸、ホスホン酸、または−Ｒ９Ｒ１０ＳｉＯＨ（ここで、Ｒ９およびＲ１０は独立に、メチル、エチル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｉ−プロピルまたは低級アルキルを表す）を表し、
ｍ２＝０の場合、Ａは、有機基保護、プロトン化または塩形態の、カルボン酸基を含むアルキルまたはアリールカチオン交換基、フェノールまたは−ＯＨを表す。］
を有するシランを含む。
【０１１３】
カチオン交換基の保護基は、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ［Ｔ．Ｗ．ＧｒｅｅｎおよびＰ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ、１９９９］に記載されている通り、様々であり得る。
【０１１４】
多孔質材料を、Ｄｅａｎ−Ｓｔａｒｋトラップを使用して、トルエンを最低１時間還流させてから、乾燥させる。冷却時に、イミダゾールおよび表面改質剤を加える。表面改質剤の混合物を使用する反応物は、表面改質剤Ｉ／ＩＩの比率が、１：９９から９９：１の範囲であり得る。１つ以上のタイプの表面改質剤Ｉおよび／または１つ以上のタイプの表面改質剤ＩＩを使用する反応物は、タイプＩの合計（Ｉａ＋Ｉｂ・・・Ｉｊと定める）対タイプＩＩの合計（ＩＩａ＋ＩＩｂ・・・ＩＩｊと定める）の比率が、１：９９から９９：１の範囲である、表面改質剤Ｉの合計／ＩＩの合計の比率を有する。
【０１１５】
反応物を、トルエン中で１６−１８時間加熱還流する。反応物を冷却し、生成物を濾過し、トルエン、水およびアセトンで連続的に洗浄する。ｐＨ２−１０の間にｐＨ調節されたアセトン水溶液を使用して、５０℃で２−２０時間加水分解を行うことができる。反応物を冷却し、生成物を濾過し、トルエン、水およびアセトンで連続的に洗浄する。
【０１１６】
次いで、生成物を、減圧下で、７０℃で、１６時間乾燥させる。得られる表面被覆率は、元素分析により測定した、表面改質の前および後の粒子％Ｃの違いによって決定する。この手法によって得られる表面被覆率は、０．４から３．２μｍｏｌ／ｍ２、より好ましくは０．５から２．７μｍｏｌ／ｍ２、より好ましくは０．６から２．２μｍｏｌ／ｍ２の範囲である。
【０１１７】
【表１２】
0005908461.tif 000017
【０１１８】
［実施例５］
実施例１に記述した一般手順を使用して、実施例５における吸着剤を調製した。
【０１１９】
名目上細孔径が１０μｍである、厚さ１．５ｍｍのＴｅｆｌｏｎ（登録商標）フリットをウェル底部で使用し、２５ｍｇの下述の吸着剤５ａ、および、名目上細孔径が１０μｍである、厚さ１．０ｍｍのＴｅｆｌｏｎ（登録商標）上部フリットを使用して、９６ウェルプレートを作製した。Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）フリットは、ウェルの排出口先端での漏出により、試料を損失することなく、各ウェルにおける、血漿および１％ＦＡのＡＣＮ溶液の両方の充填および混合を可能にする。真空により、ウェルを空にする前の、１時間もの遅延時間によって、ウェルの排出口先端で、漏出する気配はなかった。加えて、漏出により試料を損失することなく、プレートを、３分までの間ボルテックスした。これまでの実施例とは異なり、タンパク質沈殿ステップを、プレート内で行った。手順の詳細は、前に示している。２２０μＬのスパイク済みラット血漿、その後に６００μＬの１％ＦＡのＡＣＮを、４つのウェルのそれぞれに加えた。別の４つのウェルに、２２０μＬのブランクのラット血漿、その後に６００μＬの１％ＦＡのＡＣＮを加えた。各ウェルの内容物を、６００μＬの容量を使用して、１０回吸引し、試料を混合した。粘着テープを使用して、プレートにおける、満たされていないまたは使用されていないウェルを覆った。プレートを、真空マニホールド上の２ｍＬ９６ウェル試料収集プレートの上に置いた。１５−２０”Ｈｇの真空を、５分間適用した。この時間以内に空になったすべてのウェル、および試料抽出物は、目に見えるほど明らかになった。ラット血漿に補強するのに使用される２０μＬの分析物混合物を、ブランクのラット血漿からの抽出物の各ウェルに加えた。抽出後にスパイクしたこれらのウェルは、分析物が吸着剤を通過したスパイク済みラット血漿試料について、回収の度合いを確定するために使用する。すべての試料が蒸発するまで、すべての抽出物を、５０℃のプレートで、窒素流下で乾燥させた。
【０１２０】
【表１３】
0005908461.tif 000018
【０１２１】
【表１４】
0005908461.tif 000019
【０１２２】
このプレート構成の１つの利点は、プレートを使用して、高スループットタンパク質沈殿を行うことができることである。実施例５で提示した方法は、標準フリットを使用して吸着剤上に試料上清を充填する前に必要とされる、試料の移動、ボルテックスおよび遠心分離のステップを回避することによって、ウェル中でのタンパク質沈殿を用いて、効率が向上することを明示している。対照的に、ピペットでプレートに移した後に１％ＦＡのＡＣＮの沈殿溶媒を加えた血漿を、吸引によって混合し、真空または正圧を使用して、試料収集プレートに溶出させる。試料は、そのままで分析することもできるし、検出感度を高めるために、蒸発させて、より小さい容量に再構成することもできる。このプロトコルは、市販のロボットシステムに完全に適合する。
【０１２３】
［実施例６］
実施例１に記述した一般手順は、様々な異なる多孔質材料に適用することができる。これに含まれるのは、実施例４に記述した通り、シリカまたは無機／有機ハイブリッド材料である、モノリシックで、球状の、粒状で、不規則な材料である。
【０１２４】
実施例４に記述した通りの多孔質材料を、Ｄｅａｎ−Ｓｔａｒｋトラップを使用して、トルエンを最低１時間還流させてから、乾燥させる。冷却時に、イミダゾール、および実施例４に記述した通りの表面改質剤ＩＩを加える。反応物を、トルエン中で１６−１８時間加熱還流する。反応物を冷却し、生成物を濾過し、トルエン、水およびアセトンで連続的に洗浄する。ｐＨ２−１０の間にｐＨ調節されたアセトン水溶液を使用して、５０℃で２−２０時間加水分解を行うことができる。次いで、生成物を、減圧下で、７０℃で、１６時間乾燥させる。代替的に、材料は、乾燥させずに使用することができる。得られる表面被覆率は、元素分析により測定した、表面改質の前および後の粒子％Ｃの違いによって決定する。この手法によって得られる表面被覆率は、０．５から３．２μｍｏｌ／ｍ２、より好ましくは０．６から２．７μｍｏｌ／ｍ２、より好ましくは０．８から２．２μｍｏｌ／ｍ２の範囲である。
【０１２５】
さらに、これらの材料を、Ｄｅａｎ−Ｓｔａｒｋトラップを使用して、トルエンを最低１時間還流させてから、乾燥させる。冷却時に、イミダゾール、および実施例４に記述した通りの表面改質剤Ｉを加える。反応物を、トルエン中で１６−１８時間加熱還流する。反応物を冷却し、生成物を濾過し、トルエン、水およびアセトンで連続的に洗浄する。ｐＨ２−１０の間にｐＨ調節されたアセトン水溶液を使用して、５０℃で２−２０時間加水分解を行うことができる。次いで、生成物を、減圧下で、７０℃で、１６時間乾燥させる。得られる表面被覆率は、元素分析により測定した、表面改質の前および後の粒子％Ｃの違いによって決定する。この手法によって得られる表面被覆率は、０．５から３．２μｍｏｌ／ｍ２、より好ましくは０．６から２．７μｍｏｌ／ｍ２、より好ましくは０．８から２．２μｍｏｌ／ｍ２の範囲である。
【０１２６】
［実施例７］
実施例１に記述した一般手順は、様々な異なる多孔質材料に適用することができる。これに含まれるのは、実施例４に記述した通り、シリカまたは無機／有機ハイブリッド材料である、モノリシックで、球状の、粒状で、不規則な材料である。
【０１２７】
実施例４に記述した通りの多孔質材料を、Ｄｅａｎ−Ｓｔａｒｋトラップを使用して、トルエンを最低１時間還流させてから、乾燥させる。冷却時に、イミダゾール、および実施例４に記述した通りの表面改質剤Ｉを加える。反応物を、トルエン中で１６−１８時間加熱還流する。反応物を冷却し、生成物を濾過し、トルエン、水およびアセトンで連続的に洗浄する。ｐＨ２−１０の間にｐＨ調節されたアセトン水溶液を使用して、５０℃で２−２０時間加水分解を行うことができる。次いで、生成物を、減圧下で、７０℃で、１６時間乾燥させる。代替的に、材料は、乾燥させずに使用することができる。得られた表面被覆率は、元素分析により測定した、表面改質の前および後の粒子％Ｃの違いによって決定する。この手法によって得られる表面被覆率は、０．５から３．２μｍｏｌ／ｍ２、より好ましくは０．６から２．７μｍｏｌ／ｍ２、より好ましくは０．８から２．２μｍｏｌ／ｍ２の範囲である。
【０１２８】
さらに、これらの材料を、Ｄｅａｎ−Ｓｔａｒｋトラップを使用して、トルエンを最低１時間還流させてから、乾燥させる。冷却時に、イミダゾール、および実施例３に記述した通りの表面改質剤ＩＩを加える。反応物を、トルエン中で１６−１８時間加熱還流する。反応物を冷却し、生成物を濾過し、トルエン、水およびアセトンで連続的に洗浄する。ｐＨ２−１０の間にｐＨ調節されたアセトン水溶液を使用して、５０℃で２−２０時間加水分解を行うことができる。次いで、生成物を、減圧下で、７０℃で、１６時間乾燥させる。得られる表面被覆率は、元素分析により測定した、表面改質の前および後の粒子％Ｃの違いによって決定する。この手法によって得られる表面被覆率は、０．５から３．２μｍｏｌ／ｍ２、より好ましくは０．６から２．７μｍｏｌ／ｍ２、より好ましくは０．８から２．２μｍｏｌ／ｍ２の範囲である。
【０１２９】
［実施例８］
式ＳｉＯ２の球状の２０μｍ（タイプＢ）多孔質シリカ粒子（６０ｇ、Ｄａｉｓｏ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、大阪、日本；０％Ｃ；ＳＳＡ＝３４５ｍ２／ｇ；ＳＰＶ＝１．０３ｃｍ３／ｇ；ＡＰＤ＝９９Å）を、Ｇｅｌｅｓｔ  Ｉｎｃ．、Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ、ＰＡから購入したジルコニウムプロポキシドを使用して、米国特許出願ＵＳ２００８／０２１２９０６Ａ１に記載され、実施例１に記述した方法によって、ジルコニアで被覆した。
【０１３０】
ジルコニア被覆シリカの比表面積を、３２５ｍ２／ｇと測定した。ジルコニア被覆シリカのジルコニア含有率は、ＩＣＰ−ＡＣにより、２．９％であることが判明した。ジルコニア被覆シリカの炭素含有率を、２．３％と決定した。
【０１３１】
３０ｇのジルコニア被覆シリカを、トルエン（２５０ｍＬ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｆａｉｒｌａｗｎ、ＮＪ）中で、１．５時間還流した。Ｄｅａｎ−Ｓｔａｒｋトラップを使用して、混合物から、１００ｍＬの微量の水およびトルエンを除去した。冷却時に、１．３３グラムのイミダゾール（Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）および３．３８ｇのオクタデシルジメチルクロロシラン（Ｇｅｌｅｓｔ  Ｉｎｃ．、Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ、ＰＡ）を加えた。次いで、反応物を、４時間加熱還流した。次いで、反応物を冷却し、生成物を濾過し、トルエン、アセトン、１：１ｖ／ｖアセトン／水、およびアセトン（すべて、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製の溶媒）で連続的に洗浄した。次いで、生成物を、減圧下で、７０℃で、１６時間乾燥させた。
【０１３２】
オクタデシルジメチルクロロシラン結合後のジルコニア被覆シリカの炭素含有率を、８．３％と決定した。オクタデシルジメチルクロロシランの表面被覆率を、０．８４μｍｏｌ／ｍ２と決定した。
【０１３３】
【表１５】
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【０１３４】
【表１６】
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【０１３５】
実施例５に記述した、同じ９６ウェルプレート構成およびプロトコルを使用して、表１５のデータを生み出させた。シリカと異なり、ジルコニアは、リン脂質に対して親和性を有することが知られ、そのことは、６ａ上で、リン脂質を８３．４％除去していることによって実証されている。加えて、データは、０．８４μｍｏｌ／ｍ２のＣ１８を、吸着剤（６ｂ）に加えた時に、ジルコニア被覆シリカ（６ａ）上で、リン脂質の除去効率が高まったことを示している。ジルコニア被覆シリカにＣ１８を加えることは、分析物の回収に悪影響を与えなかった。Ｃ１８結合ジルコニア被覆シリカ（６ｂ）およびＣ１８結合シリカ（５ａ）上で、等量のリン脂質が除去されたが、Ｃ１８結合シリカ（５ａ）上の平均回収率が高かったのは、ジルコニア被覆媒体（６ａおよび６ｂ）上の回収を阻害するルイス酸、ルイス塩基相互作用が存在しなかったからであると推定される。
【０１３６】
［実施例９］
式ＳｉＯ２の不規則な４０μｍ多孔質シリカ粒子（２０ｇ、Ｄａｉｓｏ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、大阪、日本；０％Ｃ；ＳＳＡ＝４３３ｍ２／ｇ；ＳＰＶ＝０．６９ｃｍ３／ｇ；ＡＰＤ＝５２Å）を、トルエン（１７５ｍＬ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｆａｉｒｌａｗｎ、ＮＪ）中で、１時間還流した。Ｄｅａｎ−Ｓｔａｒｋトラップを使用して、混合物から、７５ｍＬの微量の水およびトルエンを除去した。冷却時に、１．１８グラムのイミダゾール（Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）および１．７９ｇのオクタデシルジメチルクロロシラン（Ｇｅｌｅｓｔ  Ｉｎｃ．、Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ、ＰＡ）を加えた。次いで、反応物を、４時間加熱還流した。次いで、反応物を冷却し、生成物を濾過し、トルエン、アセトン、１；１ｖ／ｖアセトン／水、およびアセトン（すべて、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製の溶媒）で連続的に洗浄した。次いで、生成物を、減圧下で、７０℃で、１６時間乾燥させた。反応物および生成物の分析データを、表１６に示す。
【０１３７】
式ＳｉＯ２の不規則な４０μｍ多孔質シリカ粒子（１００ｇ、Ｄａｉｓｏ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、大阪；０％Ｃ；ＳＳＡ＝４３３ｍ２／ｇ；ＳＰＶ＝０．６９ｃｍ３／ｇ；ＡＰＤ＝５２Å）を、トルエン（６００ｍＬ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｆａｉｒｌａｗｎ、ＮＪ）中で、１時間還流した。Ｄｅａｎ−Ｓｔａｒｋトラップを使用して、混合物から、１００ｍＬの微量の水およびトルエンを除去した。冷却時に、５．９グラムのイミダゾール（Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）および１５．０ｇのオクタデシルジメチルクロロシラン（Ｇｅｌｅｓｔ  Ｉｎｃ．、Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ、ＰＡ）を加えた。次いで、反応物を、４時間加熱還流した。次いで、反応物を冷却し、生成物を濾過し、トルエン、アセトン、１；１ｖ／ｖアセトン／水、およびアセトン（すべて、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製の溶媒）で連続的に洗浄した。次いで、生成物を、減圧下で、７０℃で、１６時間乾燥させた。反応物および生成物の分析データを、表１６に示す。
【０１３８】
【表１７】
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【０１３９】
【表１８】
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【０１４０】
表１７に示す通り、Ｃ８とＣ１８のＰＬ除去効率は等しくない。Ｃ８の疎水性は、比率は、許容されるＣ１８材料の比率の範囲内であるが、Ｃ１８の疎水性よりも低く、この特定の適用に望まれる成果を達成していない。
【０１４１】
［実施例１０］
不十分に低い被覆率のＣ１８結合材料がなかったので、提示したデータについての、その比率に対する除去されたリン脂質％のプロットは、観察される、この適用についてのリン脂質の保持を高める、狭い領域を説明することができない。しかし、逆数のプロットは、この点を確認するために、非結合型シリカ（比率＝無限大；１／比率＝０）を使用することができる。最も極性の高いリン脂質（リゾホスファチジルコリン）が、小分子のクロマトグラフ分析を妨げる可能性が最も高いので、その除去が、最も重要であり、所望の比率範囲を明示するために使用される。
【０１４２】
Ｃ１８表面濃度に対する残留シラノールの比率の逆数に対する、ｍ／ｚが４９６であるリン脂質の除去％のプロットを下に示す。除去が９０％を超えているグラフの領域は、１３．６から３．５の比率に対応する。１３．６より高く、３．５より低い比率は、９０％よりも高い、４９６ｍ／ｚリン脂質の除去をもたらす可能性があり、したがって、少なくともこの実施例においては、許容可能であると思われる。
【０１４３】
【化３】
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このプロットに加えるのは、シリカに関してこれまでに提示したデータからのポイントである。プロットにおける、材料についての包括的な一連のデータは、表１８に提示する。
【０１４４】
０と２．３μｍｏｌ／ｍ２の間のＣ１８被覆率の曲線を定める吸着剤は、Ｃ１８の相互作用に対するシラノールの比率を変えることの、最も極性の高いリン脂質、すなわち、リゾホスファチジルコリンの除去／保持の効力への効果を明示している。許容される成果が達成される、明白な領域が定められている。
【０１４５】
ＣＢＡ基が極性基として作用する吸着剤３ｂの成果などの、許容される成果を示す他のポイントを、プロットに加えた。ＣＢＡ基のみの被覆率は、Ｃ１８と同値であると仮定して、４．９の比率（１／比率＝０．２０）をもたらすと思われ、もし、ＣＢＡ基が、十分に疎水性が高ければ、リゾホスファチジルコリンの許容される除去を予測したと思われるが、今回の場合は、予想通り、所望の結果を与えなかった。
【０１４６】
７ａおよび７ｂのデータは、本発明における吸着剤の所望の成果が、Ｃ８結合シリカの使用によっても達成されないことを示している。本質的に同じ被覆率で、Ｃ１８と結合した同じシリカは、リン脂質に対して必要な保持をする。ここでの違いは、Ｃ８基が、十分に疎水性ではなく、また、吸着剤の保持力が、Ｃ８吸着剤ついての被覆率を増やすことによって増大し得るが、これが、今回の場合、必要なシラノール基を損失してなされると思われることである。
【０１４７】
【表１９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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