(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
真性多血症後骨髄線維症（ＰＶ後ＭＦ）、および本態性血小板血症後骨髄線維症（ＥＴ後ＭＦ）からなる群から選択される、被験体における骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）の診断を補助する方法であって、配列番号：２の配列を有するポリペプチドをコードするＡＳＸＬ１（ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ  ｓｅｘ  ｃｏｍｂｓ様１）遺伝子中の変異の存在または非存在の決定によって該被験体から採取された生物学的サンプルを分析する工程であって、かかる変異の存在を真性多血症後骨髄線維症（ＰＶ後ＭＦ）、および本態性血小板血症後骨髄線維症（ＥＴ後ＭＦ）からなる群から選択される骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）と相関させる、工程を含む、方法。
【請求項２】
前記被験体がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＭＰＮが真性多血症後骨髄線維症（ＰＶ後ＭＦ）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＭＰＮが本態性血小板血症後骨髄線維症（ＥＴ後ＭＦ）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記生物学的サンプルが骨髄サンプルである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記変異がミスセンス変異およびナンセンス変異に対応する挿入、欠失および点変異から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記変異が変異したＡＳＸＬ１タンパク質の発現をもたらし、該変異したＡＳＸＬ１タンパク質がＰＨＤドメイン（配列番号：３）またはその断片を含まない、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記変異がＡＳＸＬ１タンパク質のオープンリーディングフレームにおいて終止コドン（Ｘ）の導入をもたらすナンセンス変異である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記変異したタンパク質が、ＡＳＸＬ１遺伝子中への挿入または欠失に起因するフレームシフト（ＦＳ）に由来する、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記決定工程がゲノムＤＮＡ、またはＡＳＸＬ１  ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ上で行われる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記決定工程がＡＳＸＬ１タンパク質上で達成される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１つの核酸プローブもしくはオリゴヌクレオチドまたは少なくとも１つの抗体を含む、真性多血症後骨髄線維症（ＰＶ後ＭＦ）、および本態性血小板血症後骨髄線維症（ＥＴ後ＭＦ）からなる群から選択される、被験体における骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）を診断するためのキットであって、配列番号：２の配列を有するポリペプチドをコードするＡＳＸＬ１（ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ  ｓｅｘ  ｃｏｍｂｓ様１）遺伝子中の変異の存在または非存在を決定し、かかる変異の存在を真性多血症後骨髄線維症（ＰＶ後ＭＦ）、および本態性血小板血症後骨髄線維症（ＥＴ後ＭＦ）からなる群から選択される骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）と相関させるための、請求項１〜１１のいずれか一項において定義される方法において使用することができるキット。
【請求項１３】
被験体における真性多血症後骨髄線維症（ＰＶ後ＭＦ）への真性多血症（ＰＶ）の進行の予測のための方法であって、配列番号：２の配列を有するポリペプチドをコードするＡＳＸＬ１（ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ  ｓｅｘ  ｃｏｍｂｓ様１）遺伝子中の変異の存在または非存在の決定によってＰＶを患う該被験体から採取された生物学的サンプルを分析する工程であって、ＡＳＸＬ１変異の存在は該ＰＶのＰＶ後ＭＦへの進行のリスクを示す、工程を含む、方法。
【請求項１４】
被験体における本態性血小板血症（ＥＴ）の本態性血小板血症後骨髄線維症（ＥＴ後ＭＦ）への進行の予測のための方法であって、配列番号：２の配列を有するポリペプチドをコードするＡＳＸＬ１（ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ  ｓｅｘ  ｃｏｍｂｓ様１）遺伝子中の変異の存在または非存在の決定によってＥＴを患う該被験体から採取された生物学的サンプルを分析する工程であって、ＡＳＸＬ１変異の存在は該ＥＴのＥＴ後ＭＦへの進行のリスクを示す、工程を含む、方法。
【請求項１５】
真性多血症後骨髄線維症（ＰＶ後ＭＦ）、および本態性血小板血症後骨髄線維症（ＥＴ後ＭＦ）からなる群から選択される、被験体における骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）のための治療への応答を予測する方法であって、配列番号：２の配列を有するポリペプチドをコードするＡＳＸＬ１（ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ  ｓｅｘ  ｃｏｍｂｓ様１）遺伝子中の変異の存在または非存在の決定によって該被験体から採取された生物学的サンプルを分析する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、２０１０年２月１２日に出願された米国仮出願第６１／３０３，９７１号（参照として本明細書に援用される）の優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は骨髄性腫瘍を診断する遺伝的マーカー、より詳細には新規同定された腫瘍抑制遺伝子に関する。より詳細には、本発明は、ＭＤＳ、ＣＭＭＬ、ＭＰＮおよびＡＭＬの診断に有用な新規マーカーＡＳＸＬ１に関する。
【背景技術】
【０００３】
造血は、造血幹細胞（ＨＳＣ）が多能性祖先を生じさせる階層システムによって維持され、そして多能性祖先はすべてのタイプの成熟血球へと分化する。多能性、自己更新、休止およびＨＳＣコミットメントを制御する分子機構は、広く研究されている。しかしながら、検討されるべき多数の問題は残っており、同定されるべきこれらのプロセスを調節する重要な遺伝子は残ったままである。
【０００４】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）および骨髄異形成／骨髄増殖性疾患は、クローン性幹細胞悪性疾患である。
【０００５】
複数の遺伝的変異がＡＭＬに関連づけられ、以下の４グループが認識されている。（ｉ）再発性遺伝的異常を伴うＡＭＬ（ＲＵＮＸ１−ＥＴＯ融合遺伝子によるｔ（８；２１）（ｑ２２；ｑ２２）を伴うＡＭＬ；異常な骨髄好酸球およびＣＢＦＢ／ＭＹＨ１１再構成によるｉｎｖ（１６）（ｐ１３；ｑ２２）またはｔ（１６；１６）（ｐ１３；ｑ２２）を伴うＡＭＬ；ｔ（１５；１７）（ｑ２２；ｑ１２）ＰＭＬ／ＲＡＲＡを伴う急性前骨髄球性白血病ＡＰＬ；１１ｑ２３（ＭＬＬ）異常を伴うＡＭＬ）；（ｉｉ）ＭＤＳもしくはＭＤＳ／ＭＰＮ後の、またはＭＤＳもしくはＭＰＮの経歴なしの、多系列の異形成を伴うＡＭＬ；（ｉｉｉ）治療法に関連するＡＭＬまたはＭＤおよび（ｉｖ）他の未分類のＡＭＬ（正常核型を持ち、予後はＦＬＴ３−ＩＴＤまたはＮＰＭ１の変異等の癌遺伝子の分子解析に基づくＡＭＬのグループを含む）。
【０００６】
骨髄異形成／骨髄増殖性腫瘍は、ＷＨＯによって１９９９年にグループ化された以下の４つの骨髄疾患を含む。慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、若年性骨髄単球性白血病（ＪＭＭＬ）、異型慢性骨髄性白血病（ａＣＭＬ）および未分類の骨髄異形成／骨髄増殖性症候群（Ｕ−ＭＤＳ  ＭＰＳ）。
【０００７】
ＭＰＮは慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、真性多血症（ＰＶ）、本態性血小板減少症（ＥＴ）および特発性骨髄線維症（ＩＭＦ）を含む。ＭＰＮは１つまたは複数の骨髄性系列の増殖増加によって特徴づけられ、および、真性多血症におけるＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ変異によって例示されるように、一般に後天性の構成的キナーゼ活性と関連する。
【０００８】
ＭＤＳは、不応性貧血（ＲＡ）、および多系列の異形成を伴う難治性血球減少（ＲＣＭＤ）、および芽球増加型ＲＡ（ＲＡＥＢ）を含む複数のクラスへと分類される。ＭＤＳは、１つまたは複数の骨髄系列における無駄な造血によって特徴づけられるが、根本的な分子的な欠陥はまだよく理解されていない。形態学的特徴以外の生物学的マーカーは、早期診断および予後について現在利用可能ではない。
【０００９】
遺伝子のＡＳＸＬ（ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ  ｓｅｘ  ｃｏｍｂｓ）ファミリーはヒトにおいて３つのメンバーを有し、Ｃ末端ＰＨＤフィンガー（植物ホメオドメイン）を含むあまり特徴づけられていないタンパク質をコードする。これらのＡＳＸＬタンパク質がクロマチンリモデリングを調節し、転写の調節に結びつく可能性があることが現在期待される。
【００１０】
より具体的には、ＡＳＸＬ１（ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ  ｓｅｘ  ｃｏｍｂｓ様１）遺伝子（ＫＩＡＡ０９７８；ＭＧＣ７１１１１；ＭＧＣ１１７２８０としても公知である）は、染色体領域２０ｑ１１に位置し、約１００ｋｂにわたって１２エクソンを含む。この遺伝子はアクセッション番号ＩＤ１７１０２３下で参照され、そのｃＤＮＡ（アクセッション番号ＮＭ＿０１５３３８、配列番号：１）は、１５４１アミノ酸（アクセッション番号ＮＰ＿０５６１５３、配列番号：２）のタンパク質をコードする。
【００１１】
ＡＳＸＬ１タンパク質は特異的ドメインへポリコーム複合体およびトリソラックス複合体の動員を支援し、ｉ）ＡＳＸＮドメイン（アミノ酸１〜８６）、ｉｉ）ＡＳＸＭ（アミノ酸２５０〜３６１）、ｉｉｉ）ＮＲボックス（アミノ酸１１０７〜１１１２）およびｉ）ＰＨＤドメイン（アミノ酸１５０６〜１５４１、配列番号：３）が存在する４つの保存ドメインを共有する。ＡＳＸＬ１タンパク質は、分化（例えばレチノイン酸経路）および自己更新プログラムの転写調節における役割を果たす。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明者は、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄異形成／骨髄増殖性腫瘍（すなわち慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、ＭＰＮ、および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）におけるＡＳＸＬ１遺伝子の変異を本明細書において報告する。
【００１３】
本発明は、被験体における骨髄性癌を診断する方法であって、配列番号：２の配列を有するポリペプチドをコードするＡＳＸＬ１（ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ  ｓｅｘ  ｃｏｍｂｓ様１）遺伝子中の変異の存在または非存在の決定によって該被験体からの生物学的サンプルを分析し、そこでかかる変異の存在を骨髄性癌と相関させる工程を含む方法に関する。変異の存在または非存在の同定は、正常な対照（例えば該変異を含まない細胞株）への比較によって実行することができる。方法は、特定の位置での前記変異の存在または非存在を記録する工程をさらに含むことができる。
【００１４】
有利には、前記骨髄性癌は、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄異形成／骨髄増殖性腫瘍、骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）からなる群において選択される。
【００１５】
第１の好ましい実施形態において、前記方法は被験体における骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）の診断のためのものである。
【００１６】
第２の好ましい実施形態において、前記方法は被験体における骨髄異形成／骨髄増殖性腫瘍、好ましくは慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）を診断するためのものであり、最も好ましくはＭＰ−ＣＭＭＬをＭＤ−ＣＭＭＬから鑑別するためのものである。
【００１７】
第３の好ましい実施形態において、前記方法が被験体における骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）を診断するためのものであり、好ましくは該ＭＰＮは、原発性骨髄線維症（ＰＭＦ）、真性多血症後骨髄線維症（ＰＶ後ＭＦ）または本態性血小板血症後骨髄線維症（ＥＴ後ＭＦ）である。
【００１８】
第４の好ましい実施形態において、前記方法は被験体における急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を診断するためのものであり、より好ましくは該ＡＭＬは続発性ＡＭＬであり、さらに好ましくは慢性骨髄疾患に後続する続発性ＡＭＬである。
【００１９】
有利には、前記変異は、挿入、欠失、ならびにミスセンス変異およびナンセンス変異に対応する点変異からなる群において、好ましくは挿入、欠失およびナンセンス変異からなる群において選択される。
【００２０】
好ましくは、前記変異は変異したＡＳＸＬ１タンパク質の発現をもたらし、該変異したＡＳＸＬ１タンパク質はその植物ホメオドメイン（ＰＨＤドメイン、配列番号：３）またはその断片をもはや含まない。
【００２１】
第２の態様において、本発明は、少なくとも１つの核酸プローブもしくはオリゴヌクレオチドまたは少なくとも１つの抗体を含む被験体における骨髄性癌を診断するためのキットであり、配列番号：２の配列を有するポリペプチドをコードするＡＳＸＬ１（ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ  ｓｅｘ  ｃｏｍｂｓ様１）遺伝子中の変異の存在または非存在を決定し、そこでかかる変異の存在を骨髄性癌と相関させるための先に定義されるような方法において使用することができるキットに関する。
【００２２】
第３の態様において、本発明は、被験体における骨髄性癌の転帰の予後のための方法であって、配列番号：２の配列を有するポリペプチドをコードするＡＳＸＬ１（ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ  ｓｅｘ  ｃｏｍｂｓ様１）遺伝子中の変異の存在または非存在の決定によって該被験体からの生物学的サンプルを分析し、そこで変異の存在は該患者の予後不良を示し、変異の非存在は該患者の予後良好を示唆する工程を含む方法を提供する。前記予後のために好適な変異はＡＳＸＬ１遺伝子中の開示された変異を含むが、これらに限定されない。変異の存在または非存在は、正常な対照（例えば該変異を含まない細胞株）への比較によって実行することができる。方法は、特定の位置での前記変異の存在または非存在を記録する工程をさらに含むことができる。
【００２３】
有利には、前記骨髄性癌はＭＤＳであり、本発明の方法は該ＭＤＳの不応性貧血への、好ましくは芽球増加型不応性貧血２型（ＲＡＥＢ）への進行の予後のためのものである。Ｇｌｙ６４６Ｔｒｐ  ＦＳ等のＡＳＸＬ１変異の存在は前記ＭＤＳのＲＡＥＢ２への進行のリスクを示す。
【００２４】
さらに有利には、前記骨髄性癌はＭＤＳであり、本発明の方法は該ＭＤＳのＡＭＬへの、好ましくは続発性貧血への進行の予後のためのものである。
【００２５】
さらに有利には、前記骨髄性癌はＣＭＭＬであり、本発明の方法は該ＣＭＭＬ、好ましくはＭＰ−ＣＭＭＬの、ＡＭＬへの進行の予後のためのものである。Ｇｌｙ６４６Ｔｒｐ  ＦＳ等のＡＳＸＬ１変異の存在は前記ＣＭＭＬのＡＭＬへの進行のリスクを示す。
【００２６】
さらに有利には、前記骨髄性癌はＣＭＭＬであり、本発明の方法は前記患者の転帰の予後のためのものである。Ｇｌｙ６４６Ｔｒｐ  ＦＳ等のＡＳＸＬ１変異の存在は転帰不良と関連していた。
【００２７】
さらに有利には、前記骨髄性癌は真性多血症（ＰＶ）であり、本発明の方法は該ＰＶの真性多血症後骨髄線維症（ＰＶ後ＭＦ）への進行の予後のためのものである。ＡＳＸＬ１変異の存在は前記ＰＶのＰＶ後ＭＦへの進行のリスクを示す。
【００２８】
さらに有利には、前記骨髄性癌は本態性血小板血症（ＥＴ）であり、本発明の方法は該ＰＶの本態性血小板血症後骨髄線維症（ＥＴ後ＭＦ）への進行の予後のためのものである。ＡＳＸＬ１変異の存在は前記ＥＴのＰＶ後ＥＴへの進行のリスクを示す。
【００２９】
第４の態様において、本発明は、被験体における骨髄性癌のための治療への応答を予測する方法であって、配列番号：２の配列を有するポリペプチドをコードするＡＳＸＬ１（ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ  ｓｅｘ  ｃｏｍｂｓ様１）遺伝子中の変異の存在または非存在の決定によって該被験体からの生物学的サンプルを分析する工程を含む方法を提供する。方法は、特定の位置での前記変異の存在または非存在を記録する工程をさらに含むことができる。前記予測のために好適な変異はＡＳＸＬ１遺伝子中の変異を含むが、これらに限定されず、該変異は後成的修飾をもたらす可能性がある。好ましくは、ＡＳＸＬ１変異の検出は、脱メチル化剤およびＨＤＡＣ（ヒストン脱アセチル化酵素）阻害剤またはその組合わせが存在する群内で選択される１つまたは複数の薬物を使用する治療のための優れた予後徴候をもたらす。脱メチル化剤は、例えば骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）の治療のための５−アザシチジン（アザシチジンＶＩＤＡＺＡ）および５−アザデオキシシチジン（デシタビン、ＤＡＣＯＧＥＮ）等のシチジンアナログ、またはプロカインを含み得る。ＨＤＡＣ阻害剤は、ＩＴＦ２３５７（Ｇｉｖｉｎｏｖａｓ、ＩＴＡＬＦＡＲＭＡＣＯ）、バルプロ酸、パノビノスタットロミデプシン、ヴォリノスタットを含み得る。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】公知のモチーフおよびドメインを備えたＡＳＸＬ１タンパク質の説明を示した図である。表ＩはＡＳＸＬ１遺伝子の増幅およびシークエンスに使用したプライマー配列のペアを示した表である。表ＩＩは研究したＭＤＳの４０症例の分子的特徴を示した表である。表ＩＩＩはＣＭＭＬ中のＡＳＸＬ１の変異を示した表である。表ＩＶはＡＳＸＬ１変異のある１１２名のＭＰＮ患者の臨床的および分子的なデータを示した表である。表ＶはＡＳＸＬ１が変異したおよび変異していないＣＭＭＬ患者の臨床的および生物学的な特徴を示した表である。
【図２】ＡＳＸＬ１変異状態によるＣＭＭＬ患者のカプラン−マイヤー粗生存率曲線を示した図である。
【図３】疾患が急性白血病に発展していない患者におけるＡＳＸＬ１変異状態によるＣＭＭＬ患者のカプラン−マイヤー粗生存率曲線を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明は、ＭＤＳ、骨髄異形成／骨髄増殖性腫瘍、ＭＰＮまたはＡＭＬに罹患した患者において、多くの場合ＡＳＸＬ１遺伝子は腫瘍細胞における変異および／または欠失の標的になるという本発明者による解明に基づく。
【００３２】
したがって、一態様において、本発明は被験体における骨髄性癌を診断する方法であって、配列番号：２の配列を有するポリペプチドをコードするＡＳＸＬ１（ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ  ｓｅｘ  ｃｏｍｂｓ様１）遺伝子中の変異の存在または非存在の決定によって該被験体からの生物学的サンプルを分析し、そこでかかる変異の存在を骨髄性癌と相関させる工程を含む方法に関する。
【００３３】
本明細書において使用される時「被験体」という用語は、哺乳類、好ましくはヒトを指す。
【００３４】
前記被験体は健康であってもよいが、本発明の方法は骨髄性癌を発症するかまたは発症しやすいと考えられる被験体を試験するのに特に有用である。その症例において、本発明の方法は、前記被験体が骨髄性癌を発症するかまたは発症しやすいと確認することを可能にする。
【００３５】
好ましくは、前記骨髄性癌は、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄異形成／骨髄増殖性腫瘍、骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）からなる群において選択される。
【００３６】
第１の好ましい実施形態において、前記方法は被験体における骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、好ましくは芽球増加型不応性貧血２型（ＲＡＥＢ２）を診断するためのものである。
【００３７】
実際、本発明者は、ＭＤＳ患者の少なくとも１１％がＡＳＸＬ１変異を含むことをＭＤＳ患者パネル上で立証した。芽球増加型不応性貧血２型（ＲＡＥＢ２）において、本発明者は、患者の少なくとも４７％がＡＳＸＬ１変異を提示することを立証した。
【００３８】
好ましくは、ＡＳＸＬ１変異はＧｌｙ６４６Ｔｒｐ  ＦＳである。
【００３９】
第２の好ましい実施形態において、前記方法は骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、好ましくは被験体における慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）の診断のためのものである。
【００４０】
実際、本発明者は、ＣＭＭＬ患者の少なくとも４３％がＡＳＸＬ１変異を含むことをＣＭＭＬ患者パネル上で立証した。
【００４１】
さらに好ましくは、前記ＣＭＭＬはＣＭＭＬの骨髄増殖性形態（ＭＰ  ＣＭＭＬ）である。故に、本発明者は、ＭＰ  ＣＭＭＬ患者の少なくとも６２％がＡＳＸＬ１変異を含むことをＭＰ  ＣＭＭＬ患者パネル上で立証した。
【００４２】
有利には、本発明の方法は、ＡＳＸＬ１変異がＭＤ  ＣＭＭＬ患者においてよりまれであるので、ＭＰ−ＣＭＭＬをＭＤ−ＣＭＭＬと鑑別するためのものである。
【００４３】
第３の好ましい実施形態において、前記方法は被験体における骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）を診断するためのものである。
【００４４】
実際、本発明者は、ＭＰＮ患者の少なくとも８％がＡＳＸＬ１変異を含むことをＭＰＮ患者パネル上で立証した。
【００４５】
好ましくは、原発性骨髄線維症（ＰＭＦ）の少なくとも３３％がＡＳＸＬ１変異を含むことを本発明者がＰＭＦ患者パネル上で立証したので、前記ＭＰＮはＰＭＦである。
【００４６】
さらに好ましくは、真性多血症後骨髄線維症（ＰＶ後ＭＦ）の少なくとも６６％がＡＳＸＬ１変異を含むことを本発明者が立証したので、前記ＭＰＮはＰＶ後ＭＦである。
【００４７】
さらに好ましくは、本態性血小板血症後骨髄線維症（ＥＴ後ＭＦ）の少なくとも２５％がＡＳＸＬ１変異を含むことを本発明者が立証したので、前記ＭＰＮはＥＴ後ＭＦである。
【００４８】
さらに好ましくは、反応性血小板増加症（ＲＴ）患者がＡＳＸＬ１変異を共有しないことを本発明者が立証したので、前記ＭＰＮは本態性血小板血症（ＥＴ）であり、ＡＳＸＬ１遺伝子中の変異の存在は反応性血小板増加症を除外する。
【００４９】
第４の好ましい実施形態において、前記方法は被験体における急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を診断するためのものである。
【００５０】
実際、本発明者は、ＡＭＬ患者の少なくとも１９％がＡＳＸＬ１変異を含むことをＡＭＬ患者パネル上で立証した。
【００５１】
さらに好ましくは、前記ＡＭＬは続発性ＡＭＬであり、より好ましくは、慢性骨髄疾患に後続する続発性ＡＭＬである。実際、本発明者は、それらの少なくとも５３％がＡＳＸＬ１変異を含むことを続発性ＡＭＬ患者パネル上で立証した。さらに、慢性骨髄疾患に後続する続発性ＡＭＬ患者パネルの７５％はＡＳＸＬ１変異を含む。
【００５２】
本明細書において使用される時、「生物学的サンプル」という表現は、例えば肺生検等の固形組織；頬腔スワブ、例えば喀痰、誘発喀痰、血液、血清、血漿、尿等の液体および排泄物を指す。好ましくは、前記生物学的サンプルは、血液または骨髄サンプル、好ましくは骨髄サンプルである。好ましくは、試験される被験体からのゲノムＤＮＡ（任意でＲＮＡ）を含む細胞のみを含む生物学的サンプルが必要とされる。
【００５３】
本明細書において使用される時、「変異」という用語は、もとの核酸配列の配列中の任意の修飾に相当する。これらの変異は小規模変異、または大規模変異を含む。小規模変異は、ＤＮＡ中の１つまたは複数の追加のヌクレオチドの点変異、挿入または欠失を含む１つまたは少数のヌクレオチドにおいて遺伝子に影響を与えるものである。点変異は、サイレント変異、ミスセンス変異およびナンセンス変異であり得る。大規模変異は、遺伝子の重複、欠失、またはそれまでに分離されているＤＮＡ片を並置し、分離した遺伝子をともに集めて、機能的に別個の融合遺伝子を形成することを可能にする効果のある変異等のゲノム構造である。
【００５４】
好ましくは、前記変異は、挿入、欠失、ならびにミスセンス変異およびナンセンス変異に対応する点変異からなる群において選択される。
【００５５】
より好ましくは、前記変異は、挿入、欠失およびナンセンス変異からなる群において選択される。
【００５６】
さらに、本発明者は、研究した患者において、ＡＳＸＬ１タンパク質のＰＨＤドメインをコードする遺伝子のエクソン１２が有害変異の優先的な標的になることを立証した（実施例を参照されたい）。
【００５７】
したがっておよびさらに好ましくは、前記変異は、任意のＰＨＤドメイン（配列番号：３）を含まない変異したＡＳＸＬ１タンパク質またはその断片の発現をもたらす。
【００５８】
前記変異したタンパク質は、ＡＳＸＬ１タンパク質のオープンリーディングフレームにおいて終止コドン（Ｘ）の導入をもたらすナンセンス変異の導入に由来し得る。一例として、前記ナンセンス変異は、Ｔｙｒ５９１Ｘ、Ｇｌｎ５９２Ｘ、Ｌｙｓ６１８Ｘ、Ａｒｇ６９３Ｘ、Ｇｌｎ７５９Ｘ、Ｇｌｎ７６８Ｘ、Ｌｅｕ７７５ＸおよびＡｒｇｌ０６８Ｘを含む群において選択される。
【００５９】
前記変異したタンパク質は、ＡＳＸＬ１遺伝子中の欠失の挿入に起因するフレームシフト（ＦＳ）にも由来し得る。一例として、前記挿入または欠失は、以下の変異（Ｇｌｙ６４Ｔｒｐ  ＦＳ、Ａｒｇ５９６Ｐｒｏ  ＦＳ、Ａｌａ６１１Ａｒｇ  ＦＳ、Ｈｉｓ６３０Ｐｒｏ  ＦＳ、Ｇｌｙ６４６Ｔｒｐ  ＦＳ、Ｌｅｕ７６２Ｐｈｅ  ＦＳ、Ｔｒｐ７９６Ｇｌｙ  ＦＳ、Ｔｈｒ８２２Ａｓｎ  ＦＳ、Ｔｈｒ８３６Ｌｅｕ  ＦＳ、Ｓｅｒ８４６Ｇｌｎ  ＦＳ、Ａｓｐ８７９Ｇｌｕ  ＦＳ、Ｌｙｓ８８８Ｇｌｕ  ＦＳ、Ｌｅｕ１２１３Ｉｌｅ  ＦＳ、Ｐｒｏ１２６３Ｇｌｎ  ＦＳ、Ｌｅｕ１２６６Ｈｉｓ  ＦＳ、Ｔｒｐ１２７１Ｌｙｓ  ＦＳ、またはＳｅｒ１４５７Ｐｒｏ  ＦＳ）を持つ変異ＡＳＸＬ１タンパク質の発現を誘導する挿入または欠失の群において選択される。
【００６０】
本発明の他の好ましい実施形態において、決定工程はゲノムＤＮＡ上で行う。
【００６１】
ＤＮＡ中の変異の存在の検出のための典型的な技法は、制限酵素断片長多型、ハイブリダイゼーション技法、ＤＮＡシークエンシング、エキソヌクレアーゼ抵抗性、マイクロシークエンシング、ｄｄＮＴＰを使用する固相伸長、ｄｄＮＴＰを使用する溶液中の伸長、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ、動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション等の一塩基変異多型を検出する方法、ライゲーション連鎖反応、ミニシークエンシング、ＤＮＡ「チップ」、高解像度融解（ＨＲＭ）法、増幅抵抗性変異システム（ＡＲＭＳ）方法、ＰＣＲまたは分子ビーコンと融合させた単一または二重標識プローブによる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ（登録商標）プローブ（ＤｘＳ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）、ＭＧＢ（登録商標）（マイナーグルーブ結合）プローブ（ＮＡＮＯＧＥＮ）および他のものを含み得る。
【００６２】
有利には、変異は、ＰＣＲおよびシークエンシング、ＳＮＰアレイまたはＣＧＨ（当業者にとってそれらのすべては周知である）のいずれかによってＡＳＸＬ１遺伝子のｃＤＮＡ上で検出される。
【００６３】
比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）は遺伝的変化について腫瘍をスクリーニングする分子的細胞遺伝学の方法である。この変化はＤＮＡ獲得および喪失として分類され、染色体レベルおよびサブ染色体レベルでの変異を含む特徴的パターンを明らかにする。方法は、蛍光標識された腫瘍ＤＮＡ（多くの場合フルオレセイン（ＦＩＴＣ））および正常なＤＮＡ（多くの場合はローダミンまたはテキサスレッド）を正常なヒト分裂中期調製物へハイブリダイゼーションすることに基づく。エピ蛍光顕微鏡検査および定量的イメージ分析を使用して、獲得／喪失ＤＮＡ対対照ＤＮＡの蛍光比の領域差を検出し、ゲノム中の異常な領域の同定のための使用することができる。ＣＧＨは不均衡染色体変化のみを検出するだろう。均衡のとれた相互転座または逆位等の構造的染色体異常は、系統的にコピー数を変化させないので、通常検出することができない。
【００６４】
本発明の他の好ましい実施形態において、決定工程は、ＡＳＸＬ１  ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ上で達成される。
【００６５】
かかる分析は、被験体からの生物学的サンプル中の細胞からのｍＲＮＡ／ｃＤＮＡの調製および参照ポリヌクレオチドとｍＲＮＡ／ｃＤＮＡとのハイブリダイズによって査定することができる。調製したｍＲＮＡ／ｃＤＮＡは、サザン分析またはノーザン分析、定量的ＰＣＲ（ＴＡＱＭＡＮ）等のポリメラーゼ連鎖反応分析、およびＧＥＮＥＣＨＩＰ  ＤＮＡアレイ（ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ）等のプローブアレイを含むが、これらに限定されないハイブリダイゼーションまたは増幅のアッセイにおいて使用することができる。
【００６６】
さらに本発明の他の好ましい実施形態において、決定工程はＡＳＸＬ１タンパク質上で達成される。
【００６７】
かかる分析は、ＡＳＸＬ１遺伝子（配列番号：２）から翻訳されたタンパク質および好ましくはＡＳＸＬ１タンパク質のＰＨＤドメイン（配列番号：３）に特異的に結合する、抗体（例えば放射性同位元素標識抗体、発色標識抗体、蛍光標識抗体または酵素標識抗体）、抗体誘導体（例えば基質とコンジュゲートされた抗体またはタンパク質とコンジュゲートされた抗体もしくはタンパク質／リガンドペア（例えばビオチン−ストレプトアビジン）のタンパク質のリガンドとコンジュゲートされた抗体）、または抗体断片（例えば一本鎖抗体および単離された抗体超可変領域など）を使用して査定することができる。
【００６８】
前記分析は、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、ウエスタンブロット分析および酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を含むが、これらに限定されない、当業者に周知の様々な技法によって査定することができる。
【００６９】
ポリクローナル抗体は、ＡＳＸＬ１タンパク質（配列番号：２）またはそのＰＨＤドメイン（配列番号：３）によりマウス、ウサギまたはヤギ等の好適な動物を免疫することによって調製できる。免疫された動物中の抗体力価は、固定化されたポリペプチドを使用して、ＥＬＩＳＡ等による標準的な技法によって経時的にモニターすることができる。免疫後に適切な時間で、例えば特異的抗体力価が最も高いときに、抗体産生細胞を動物から得て使用して標準的な技法によってモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を調製することができる。
【００７０】
当業者は、ＡＢＣＡＭまたはＳＡＮＴＡ  ＣＲＵＺ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ  Ｉｎｃ．によって市販されるモノクローナル抗体等の商業的に入手可能なＡＳＸＬ１モノクローナル抗体も使用することができる。
【００７１】
第２の態様において、本発明は、被験体における骨髄性癌の診断のための、少なくとも１つの核酸プローブもしくはオリゴヌクレオチドまたは少なくとも１つの抗体を含むキットであって、配列番号：２の配列を有するポリペプチドをコードするＡＳＸＬ１（ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ  ｓｅｘ  ｃｏｍｂｓ様１）遺伝子中の変異の存在または非存在を決定し、そこでかかる変異の存在を骨髄性癌と相関させるための先に定義されるような方法において使用することができるキットに言及する。
【００７２】
好ましくはオリゴヌクレオチドは、ＡＳＸＬ１遺伝子またはその断片の増幅を可能にする少なくとも１つのＰＣＲプライマー、好ましくは１セットのＰＣＲプライマーが提供される。当業者は、ＡＳＸＬ１遺伝子の核酸配列を周知しているならば（アクセッション番号ＮＣ＿００００２０．１０、ヌクレオチド３０，９４６，１５３〜３１，０２７，１２２；および対応するｃＤＮＡのアクセッション番号ＮＭ＿０１５３３８、配列番号：１）、ＡＳＸＬ１遺伝子の領域の増幅を許容する、かかるオリゴヌクレオチドまたはＰＣＲプライマーのセットを容易に提供する。
【００７３】
一例として、前記ペアのＰＣＲプライマーは配列番号：４および配列番号：５、配列番号：６および配列番号：７、配列番号：８および配列番号：９、配列番号：１０および配列番号：１１、配列番号：１２および配列番号：１３、配列番号：１４および配列番号：１５、配列番号：１６および配列番号：１７、配列番号：１８および配列番号：１９、配列番号：２０および配列番号：２１、配列番号：２２および配列番号：２３、配列番号：２４および配列番号：２５、配列番号：２６および配列番号：２７、配列番号：２８および配列番号：２９、配列番号：３０および配列番号：３１、ならびに配列番号：３２および配列番号：３３を含む群において選択される。かかるプライマーは表Ｉ中で開示される。
【００７４】
本明細書において使用される時、「キット」という用語は材料の運搬のための任意の運搬システムを指す。反応アッセイの文脈において、かかる運搬システムは、１つの場所から他の場所へ、反応試薬（例えば適切な容器中のオリゴヌクレオチド、酵素など）および／または支援材料（例えばバッファー、アッセイの実行のための書面の説明書など）の保存、輸送または運搬を可能にするシステムを含む。例えば、キットは、関連する反応試薬および／または支援材料を含む１つまたは複数の封入物（例えば箱）を含む。本明細書において使用される時、「分割されたキット」という用語は、各々が全キットコンポーネントのサブ部分を含む、２つ以上の分離した容器を含む運搬システムを指す。容器は、意図された受取人にともにまたは個別に配達することができる。例えば、第１の容器はアッセイで使用される酵素を含み、一方第２の容器はオリゴヌクレオチドを含み得る。「分割されたキット」という用語は、連邦食品・医薬品・化粧品法のセクション５２０（ｅ）下で規制される検体特異的試薬（ＡＳＲ）を含むキットを包含することを意図するが、これに限定されない。実際、各々が全キットコンポーネントのサブ部分を含む、２つ以上の分離した容器を含む任意の運搬システムは、「分割されたキット」という用語中に含まれる。これとは対照的に、「組合わせたキット」は、単一容器中に（例えば各々の所望のコンポーネントの単一ボックス筺体中に）すべての反応アッセイのコンポーネントを含む運搬システムを指す。「キット」という用語は分割されたキットおよび組合わせたキットの両方を含む。
【００７５】
本キットは、１つまたは複数の試薬、バッファー、ハイブリダイゼーション媒質、核酸、プライマー、ヌクレオチド、プローブ、分子量マーカー、酵素、固体支持体、データベース、分配順番の計算のためのコンピュータープログラムおよび／または本方法の実施を容易に促進するためのマルチウェルプレート等の使い捨ての実験用備品も含み得る。本キット中に含むことができる酵素はヌクレオチドポリメラーゼおよび同種のものを含む。固体支持体はビーズおよび同種のものを含むことができるが、分子量マーカーはコンジュゲート可能なマーカー（例えばビオチン、ストレプトアビジン、同種のもの）を含むことができる。
【００７６】
一実施形態において、キットは、被験体における骨髄性癌の診断のための本明細書において記述された方法を行なうための説明書から構成される。説明書は、紙の上に印刷されたもの、コンピューターで読取り可能な媒体、または同種のもの等の有形的表現媒体を介する任意の分かりやすい形態で提供することができる。
【００７７】
別の実施形態において、前記骨髄性癌は、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄異形成／骨髄増殖性腫瘍、骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）からなる群において選択される。
【００７８】
第３の態様において、本発明は、被験体における骨髄性癌の転帰の予後のための方法であって、配列番号：２の配列を有するポリペプチドをコードするＡＳＸＬ１（ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ  ｓｅｘ  ｃｏｍｂｓ様１）遺伝子中の変異の存在または非存在の決定によって該被験体からの生物学的サンプルを分析し、そこで変異の存在は該患者の予後不良を示し、変異の非存在は該患者の予後良好を示唆する工程を含む方法を提供する。前記予後のために好適な変異はＡＳＸＬ１遺伝子中の開示された変異を含むが、これらに限定されない。変異の存在または非存在は、正常な対照（例えば該変異を含まない細胞株）への比較によって実行するととができる。方法は、特定の位置での前記変異の存在または非存在を記録する工程をさらに含むことができる。
【００７９】
有利には、前記骨髄性癌はＭＤＳであり、本発明の方法は該ＭＤＳの不応性貧血への、好ましくは芽球増加型不応性貧血２型（ＲＡＥＢ）への進行の予後のためのものである。Ｇｌｙ６４６Ｔｒｐ  ＦＳ等のＡＳＸＬ１変異の存在は前記ＭＤＳのＲＡＥＢ２への進行のリスクを示す。
【００８０】
さらに有利には、前記骨髄性癌はＭＤＳであり、本発明の方法は該ＭＤＳのＡＭＬへの、好ましくは続発性貧血への進行の予後のためのものである。
【００８１】
さらに有利には、前記骨髄性癌はＣＭＭＬであり、本発明の方法は該ＣＭＭＬ、好ましくはＭＰ−ＣＭＭＬの、ＡＭＬへの進行の予後のためのものである。Ｇｌｙ６４６Ｔｒｐ  ＦＳ等のＡＳＸＬ１変異の存在は前記ＣＭＭＬのＡＭＬへの進行のリスクを示す。実際、本発明者は、ＡＳＸＬ１遺伝子中に変異を持たないＣＭＭＬ患者の中で、患者のだれもＡＭＬに発展していないことを決定した。
【００８２】
さらに有利には、前記骨髄性癌はＣＭＭＬであり、本発明の方法は前記患者のための転帰の予後のためのものである。Ｇｌｙ６４６Ｔｒｐ  ＦＳ等のＡＳＸＬ１変異の存在は転帰不良と関連していた。
【００８３】
さらに有利には、前記骨髄性癌は真性多血症（ＰＶ）であり、本発明の方法は該ＰＶの真性多血症後骨髄線維症（ＰＶ後ＭＦ）への進行の予後のためのものである。ＡＳＸＬ１変異の存在は前記ＰＶのＰＶ後ＭＦへの進行のリスクを示す。
【００８４】
さらに有利には、前記骨髄性癌は本態性血小板血症（ＥＴ）であり、本発明の方法は、該ＰＶの本態性血小板血症後骨髄線維症（ＥＴ後ＭＦ）への進行の予後のためのものである。ＡＳＸＬ１変異の存在は前記ＥＴのＰＶ後ＥＴへの進行のリスクを示す。
【００８５】
第４の態様において、本発明は、被験体における骨髄性癌のための治療への応答を予測する方法であって、配列番号：２の配列を有するポリペプチドをコードするＡＳＸＬ１（ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ  ｓｅｘ  ｃｏｍｂｓ様１）遺伝子中の変異の存在または非存在の決定によって該被験体からの生物学的サンプルを分析する工程を含む方法を提供する。方法は、特定の位置での前記変異の存在または非存在を記録する工程をさらに含むことができる。前記予測のために好適な変異はＡＳＸＬ１遺伝子中の変異を含むが、これらに限定されず、該変異は後成的修飾をもたらす可能性がある。好ましくは、ＡＳＸＬ１変異の検出は、脱メチル化剤およびＨＤＡＣ（ヒストン脱アセチル化酵素）阻害剤またはその組合わせが存在する群内で選択される１つまたは複数の薬物を使用する治療のための優れた予後徴候をもたらす。脱メチル化剤は、例えば骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）の治療のための５−アザシチジン（アザシチジンＶＩＤＡＺＡ）および５−アザデオキシシチジン（デシタビン、ＤＡＣＯＧＥＮ）等のシチジンアナログ、またはプロカインを含み得る。ＨＤＡＣ阻害剤は、ＩＴＦ２３５７（Ｇｉｖｉｎｏｖａｓ、ＩＴＡＬＦＡＲＭＡＣＯ）、バルプロ酸、パノビノスタット、ロミデプシン、ヴォリノスタットを含み得る。
【００８６】
以下において、本発明はアミノ酸配列、核酸配列および実施例に関してより詳細に記述される。しかし、本発明は実施例の細部によって限定されないことが意図される。むしろ、本発明は、本明細書における実施例中で明示的に言及されないが、当業者が過度な努力なしに見出すような細部を含む任意の実施形態に関する。
【実施例】
【００８７】
１）ＭＤＳに罹患した患者中のＡＳＸＬ１遺伝子の変化
ＭＤＳにおける３タイプのａＣＨＧプロファイル
１シリーズの骨髄（ＢＭ）サンプルを、ＭＤＳに罹患した患者、多系列の異形成を伴うＡＭＬ（ＡＭＬ−ＭＬＤ）に罹患した患者、およびＣＭＭＬに続発したＡＭＬに罹患した患者から回収した。
【００８８】
仏米英（ＦＡＢ）およびＷＨＯの基準に従って、ＭＤＳのパネルは、３例のＲＡ、９例のＲＡＲＳ（特発性骨髄線維症を伴う１例含む）、３例のＲＣＭＤ（輪状鉄芽球を伴う２例を含む）、１０例のＲＡＥＢ１、８例のＲＡＥＢ２および２例のＭＤＳ−Ｕを含んでいた。
【００８９】
大部分ＭＤＳのサンプルは診断の時に回収され；いくつかは既知のＭＤＳの治療回避中であり、いくつかは対症療法下であった。固形腫瘍のための治療に続発した２症例以外は、すべてデノボである。
【００９０】
ゲノムワイド高密度アレイを使用して、３８名の患者からの４０のＭＤＳ／ＡＭＬのサンプルのａＣＧＨプロファイルを研究した。
【００９１】
供給業者によって推奨されるように、ＡＬＬＰＲＥＰ  ＤＮＡ／ＲＮＡ単離キットＭＡＣＨＥＲＥＹ  ＮＡＧＥＬによって全骨髄細胞からＤＮＡを抽出した。
【００９２】
２４４Ｋ  ＣＧＨ  ＭＩＣＲＯＡＲＲＡＹＳ（Ｈｕ−２４４Ａ；ＡＧＩＬＥＮＴ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）を使用するアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（ａＣＧＨ）によってＤＮＡ不均衡を分析し、分解能は最大６ｋｂであった。スキャニングをＡｇｉｌｅｎｔ  Ａｕｔｏｆｏｃｕｓ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｓｃａｎｎｅｒ（Ｇ２５６５ＢＡ；ＡＧＩＬＥＮＴ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）により行った。ＧＥＬＳＩ−ＢＯＹＥＲ  ｅｔ  ａｌ．（ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ，ｖｏｌ．８，ｐ：２９９−３１４，２００８）中に先に記載されていたようにデータ分析を行い、ＣＧＨ  ＡＮＡＬＹＴＩＣＳ  ３．４ソフトウェア（ＡＧＩＬＥＮＴ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）により可視化した。抽出データ（ｌｏｇ２比）はＣＧＨ解析論により行い、一方正規化およびフィルタリングしたｌｏｇ２比を、「ＦＥＡＴＵＲＥ  ＥＸＴＲＡＣＴＩＯＮ」ソフトウェア（ＡＧＩＬＥＮＴ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）から得た。ＧＥＬＳＩ−ＢＯＹＥＲ  ｅｔ  ａｌ（上述、２００８）において報告されたようにコピー数変化が特徴づけられた。
【００９３】
結果は表ＩＩ中で要約される。
【００９４】
これらの結果において、３つの主なタイプのプロファイルが観察された。
【００９５】
タイプ１プロファイルは、核型上で既に目視可能であり、８トリソミー、５ｑ腕および２０ｑ腕の一部の欠失、または染色体７の欠失もしくは複雑な再構成等のゲノムの大きな領域に影響を与える獲得または喪失を示した。５ｑ腕上の欠失はかなり大きく、ＲＰＳ１４、ＨＳＰＡ９Ｂ、およびＣＸＸＣ５（ＣＸＸＣフィンガー５）を含む他の多くの遺伝子が常に含まれた。
【００９６】
タイプ２プロファイルは、わずかな遺伝子にしか影響を与えないまれで限定された獲得または喪失を示した。ある症例（すなわち症例１９０）は、小さな欠失を持つ複数の領域を示した。これらの欠失は２０ｑ１１でのＡＳＸＬ１（ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ  ｓｅｘ  ｃｏｍｂｓ  １）およびＤＮＭＴ３Ｂ（ＤＮＡシトシン−５−メチルトランスフェラーゼ３β）遺伝子を、ならびに他の欠失は２ｐ２３でのＡＳＸＬ２およびＤＮＭＴ３Ａのパラロガス遺伝子を含んでいた。同じ症例は染色体腕２ｑ上のＢＡＺ２Ｂの欠失も示した。獲得も観察された（すなわち症例１６７におけるＭＡＰ３Ｋ４）が、欠失よりも頻度は少なかった。
【００９７】
タイプ３プロファイルを持つ症例において、ゲノムコピー数異常（ＣＮＡ）を検出することができなかった。このプロファイルは２２／４０症例（５５％）中に見出された。表Ｉ中で「ＣＮＡなし」としてこれを示した。
【００９８】
ＭＤＳにおける候補遺伝子の変異
ＭＤＳサンプル中の複数の候補遺伝子の配列を分析した。
【００９９】
ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＲＵＮＸ１、ＮＦＩＡ、ＣＴＮＮＢ１、ＴＥＴ２およびＡＳＸＬ１遺伝子の体細胞変異は、ゲノムＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅後に、エクソンおよびコンセンサススプライシング部位をシークエンスすることによって探索した（ＡＳＸＬ１についての表Ｉを参照）。ＰＣＲ増幅は、少なくとも５ｎｇの鋳型ＤＮＡ、Ｔａｑバッファー、２００μｍｏｌの各々のデオキシリボヌクレオチド３リン酸塩、２０ｐｍｏｌの各々のプライマーおよび１単位のＨＯＴ  ＳＴＡＲ  ＴＡＱ（ＱＩＡＧＥＮ）を含む２５μｌの全体積のＰＣＲ混合物中で行われた。
【０１００】
ＰＣＲ増幅条件は、９５℃１０分；９５℃３０秒、５５℃３０秒、ＰＣＲ産物長に依存して７２℃３０秒〜１分を３５サイクル；７２℃１０分であった。
【０１０１】
ＰＣＲ産物はＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  ＰＬＡＴＥ  ＭＳＮＵ０３０（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  ＳＡＳ）を使用して精製した。精製されたＰＣＲ産物の小分け（１μｌ）を、フォワードプライマーまたはリバースプライマーを含むＢＩＧ  ＤＹＥ  ＴＥＲＭＩＮＡＴＯＲ  Ｖ１．１キット（ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ）を使用するシークエンシングのために使用した。
【０１０２】
Ｇ５０精製後に、ＡＢＩ  ３１３０ＸＬ  ＡＵＴＯＭＡＴ（ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ）でシークエンスを行った。シークエンスデータファイルはＳＥＱＳＣＡＰＥソフトウェアを使用して分析し、すべての変異は独立したＰＣＲ産物上で確認された。
【０１０３】
結果は表Ｉ中で示され、３つのＲＡＳ遺伝子、ＮＦＩＡ遺伝子、またはＣＴＮＮＢ  １遺伝子で変異が見出されなかったことを示す。
【０１０４】
ＲＵＮＸ１変異は試験された２４症例のうちの１症例において見出された。
【０１０５】
複数の症例はＴＥＴ２が変異していたことが見出された（他の部分で詳細に報告される）。この遺伝子の変異および欠失は、ＭＤＳを含む様々な骨髄疾患の約１５〜２０％で最近見出されている。
【０１０６】
ＡＳＸＬ１遺伝子中の変異について探索し、そのうちで１つの対立遺伝子が症例１９０において欠失していた。５名の患者において６つの変異が見出された（これらの変異のうちの１つはＭＤＳおよび転化した状態の両方で見出された）（表ＩＩ）。変異はヌクレオチドの欠失または重複によって引き起こされていた。図１ＡおよびＢは、推定された変異の局在によるＡＳＸＬ１タンパク質の図式的な説明を示す。すべての変異は遺伝子のエクソン１２中で見出され、ＰＨＤフィンガーを含むタンパク質のＣ末端の短縮をもたらすはずである。
【０１０７】
最終的に、したがってＭＤＳの患者の１１％においてＡＳＸＬ１遺伝子中の変異が見出された。
【０１０８】
２）骨髄異形成／骨髄増殖性障害に罹患した患者におけるＡＳＸＬ１遺伝子の変化
ＣＭＭＬにおけるＡＳＸＬ１の変異
ＡＳＸＬ１変異がＭＤＳ以外に見出される得るかどうかを決定するために、以前に記述したように、ＣＭＭＬ（関連疾患）に罹患した患者の骨髄サンプル中のＡＳＸＬ１配列を分析した。
【０１０９】
ＦＡＢおよびＷＨＯの基準によれば、ＣＭＭＬのシリーズは、２１例の骨髄増殖性ＣＭＭＬ（ＭＰ−ＣＭＭＬ）形態、１８例の骨髄異形成ＣＭＭＬ（ＭＤ−ＣＭＭＬ）形態および７例の急性転化ＣＭＭＬ（ＡＴ−ＣＭＭＬ）を含んでいた。すべての患者はインフォームドコンセントに署名した。プロジェクトおよびサンプルの採取は現行の規制および倫理的な問題に従ってＰａｏｌｉ−Ｃａｌｍｅｔｔｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの独立した科学審査委員会によって精査された。
【０１１０】
合計１９の変異が４４名の患者（４６症例）（４３％）において見出された（表ＩＩＩ）。これらの変異の局在および性質は図１Ｃ中で示される。
【０１１１】
ＭＤＳでのように、すべての変異はエクソン１２中で見出され、ヌクレオチドの欠失、重複、挿入または置換であった。２１症例のＭＰ−ＣＭＭＬにおいて１３の変異（６２％）、１８症例のＭＤ−ＣＭＭＬにおいて４つの変異（２２％）および７症例のＡＴ−ＣＭＭＬにおいて２つの変異（２８％）が見出され、ＭＰ症例とＭＤ症例との間の差は有意であった。
【０１１２】
ＣＭＭＬにおけるＡＳＸＬ１変異と臨床的および生物学的特徴との間の相関性
５３名の患者（彼らはすべてインフォームドコンセントに署名した）から得られた１シリーズの連続した骨髄サンプルを回収した。ＦＡＢグループによって最初に定義されたように、それぞれ白血球カウントが１３Ｇ／Ｌより多いかまたは少ないかにより、これらの中で３１名はＭＰ−ＣＭＭＬであり、２２名はＭＤ−ＣＭＭＬであった。４０名の患者において正常核型が観察され（２０名のＭＰ−ＣＭＭＬおよび２０名のＭＤ−ＣＭＭＬ）；３名の患者（２名のＭＰ−ＣＭＭＬおよび１名のＭＤ−ＣＭＭＬ）においてｄｅｌ（２０ｑ）（ｑ１１；ｑ１３）が見出され；４名のＭＰ−ＣＭＭＬにおいて概して影響を受ける染色体（８、１９、２１）のトリソミーがあった。１名のＭＤ−ＣＭＭＬには１１ｑ逆位があり、１名のＭＰ−ＣＭＭＬにはｔ（１０；１１）（ｐ１２；ｐ１５）があり、１名のＭＰ−ＣＭＭＬにはｔ（１；３）（ｐ３６；ｑ２１）があった。
【０１１３】
先に記述されたように、５３例のＣＭＭＬ症例のうちの５１例のａＣＧＨプロファイルは確立され、均衡転座（ＨＤ−０２０１、ＨＤ−０３１６、ＨＤ−０１７８）を持つ３名の患者以外は従来の細胞遺伝学によって観察される変化（９／５１）が明らかにされ、ｄｅｌ（２０）（ｑ１１ｑ１３）を持つ症例ＨＤ−０３６７については、恐らく影響を受けた細胞が少数であることに起因してａＣＧＨは２０ｑで明白な欠失を示さなかった。
【０１１４】
９症例（１７％）については、まれで限定された喪失または獲得がａＣＧＨにより検出され、これらは核型では目視可能でなかった。それらは、公知の腫瘍抑制因子機能および白血病誘発活性を持ついくつかを含む非常に少数の遺伝子（ＮＦ１、ＲＢＩおよびＴＥＴ２）にしか影響を与えなかった。最終的に症例の７０％（３６／５１）においてコピー数異常は観察されなかった。
【０１１５】
結果は、従来の細胞遺伝学またはａＣＧＨによって検出されたゲノム変化は、３１例のＭＰ−ＣＭＭＬのうちの１５例の変化および２２例のＭＤ−ＣＭＭＬのうちの４例の変化により、ＭＰ−ＣＭＭＬおよびＭＤ−ＣＭＭＬで異なっていたことも示す。したがって、ＭＰ−ＣＭＭＬはＭＤ−ＣＭＭＬよりもより多くのゲノム変化を有していた（ｐ＝０．０４９）。
【０１１６】
５３症例で１３の遺伝子のコード配列を研究した。２５症例（４９％）で、ＡＳＸＬ１エクソン１２中で２０のフレームシフト（同じｐ．Ｇｌｙ６４６Ｔｒｐｆｓｘ１２を７回含む）および５つのナンセンス変異が見出された。ＣＢＬエクソン８の変異は症例の１０％（５／４７）で見出された。１症例（ＨＤ−０２２３）はホモ接合欠失を有していた。１症例（ＨＤ−０３６７）はＦＬＴ３の内部タンデム重複を有していた。４８症例（１０％）において５つのＩＤＨ変異が見出され；すべてはＩＤＨ２中に存在していた（同じｐ．Ａｒｇ１４０Ｇｌｎが４回）。５３症例のうちの７名の患者がＫＲＡＳまたはＮＲＡＳの変異を有していた（１３％）。５３名の患者のうちの１２名（２１％）は、ＲＵＮＸ１が変異し、患者の３６％はＴＥＴ２が変異していた。ＮＰＭ１、ＪＡＫ２およびＷＴ１において変異は見出されなかった。
【０１１７】
次いでＭＰ−ＣＭＭＬおよびＭＤ−ＣＭＭＬにおける変異した遺伝子の保有率を研究した。２５のＡＳＸＬ１変異のうちの１９は３０例のＭＰ−ＣＭＭＬにおいて、それに対して６は２２例のＭＤ−ＣＭＭＬにおいて見出された。ＡＳＸＬ１における変異はＭＤ−ＣＭＭＬよりもＭＰ−ＣＭＭにおいて頻度が高く（ｐ＝０．０３）、ＲＵＮＸ１またはＴＥＴ２における変異はそうではなかった。ＣＢＬ、ＦＬＴ３、ＩＤＨ１／２、ＰＴＰＮ１１、ＲＡＳ、ＲＵＮＸ１またはＴＥＴ２については、２つの形態の間で差は観察されなかった。全体的な変異の数（ＡＳＸＬ１および増殖遺伝子）はＭＤ−ＣＭＭＬ（２６／１７２）よりもＭＰ−ＣＭＭＬ（６９／２７３事象）において高かった（ｐ＝０．００１８）。
【０１１８】
ＣＭＭＬの分類は常に討論される問題であるので、したがって、ＡＳＸＬ１変異は、ＦＡＢグループによって最初に定義されたＭＰおよびＭＤの形態へのＣＭＭＬの分離についての分子的基盤に相当する。
【０１１９】
本研究において、ＡＳＸＬ１は、ＭＤＳと同様に、ＣＭＭＬにおいて最も高頻度で変異する遺伝子と思われた。
【０１２０】
５１のＣＭＭＬ症例の主な臨床的および生物学的な特徴をＡＳＸＬ１変異に関して検討した（表Ｖ）。
【０１２１】
結果から、ＡＳＸＬ１変異の存在は、より高いＷＢＣ（３０ｇ／ｌ対１５ｇ／ｌ）（ｐ＝０．００６）、血液（ｐ＝０．００５）および骨髄（ｐ＝０．０４）におけるより高い単球増多症ならびにより低いレベルの血液ヘモグロビン（ｐ＝０．０３）と関連していることが示された。平均細胞体積、好中球および血小板の血球カウントまたは骨髄芽球において、差は示されなかった。ＭＰ−ＣＭＭＬにおいて、ＡＳＸＬ１変異は、より低いレベルのヘモグロビン（ｐ＝０．０３）および血小板数（ｐ＝０．００２）、より高い単球増多症（ｐ＝０．０４）と相関していた。ＭＤ−ＣＭＭＬにおいて、ＡＳＸＬ１変異との相関性は観察されなかった。
【０１２２】
ＡＳＸＬ１が変異した症例（２５／５１）の中で、１１例（９例のＭＰおよび２例のＭＤ）は急性転化に発展した（表Ｖ）が、急性転化は変異していない症例において観察されなかった。言いかえれば、転化した症例はすべてＡＳＸＬ１変異を有していたが、ＡＳＸＬ１が変異したすべての症例がＡＭＬに進行したとは限らなかった。
【０１２３】
したがってＡＳＸＬ１変異と急性転化は相関していた（ｐ＝０．０００５）。いくつかの変異のある症例が急性期に進まなかったならば、これは患者が急性白血病の発症前に死亡してしまったからかもしれない。
【０１２４】
粗生存率（２９．５か月の中央値フォローアップ）の分析を５３名の患者について行い、決定した中央値粗生存率は２７．６か月であった。５１名の患者についてサンプリング時にＡＳＸＬ１状態を決定することができた。カプラン−マイヤー分析から、ＡＳＸＬ１が変異した患者において粗生存率が低下し（図２）、急性転化は粗生存率に対して有意に影響しないこと（データ不掲載）が示された。この結果から、ＭＰ／ＭＤの形態に関しては、ＭＤ患者で良好な生存の傾向のみが観察されたことも示された（データ不掲載）。
【０１２５】
ＡＳＸＬ１が急性転化から独立して予後に影響を与えるかどうかを決定するために、ＡＳＸＬ１が変異しているが急性進行を経験していない患者の粗生存率を変異していない患者の粗生存率と比較した。ＡＳＸＬ１変異は転帰不良と関連していた（図３）。最終的に、ＭＰ−ＣＭＭＬ患者内では、ＡＳＸＬ１が変異した症例では変異していない症例よりも生存は低かった。ＴＥＴ２変異状態について同じ分析を行った。ＡＳＸＬ１とは対照的に、ＴＥＴ２は粗生存率に影響しなかった（データ不掲載）。
【０１２６】
３）ＭＰＮに罹患した患者におけるＡＳＸＬ１遺伝子の変化
ＭＰＮにおけるＡＳＸＬ１の変異
ＡＳＸＬ１が他のタイプの骨髄疾患に関与するかどうかを決定するために、６４例の骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）中のＡＳＸＬ１遺伝子を研究した。
【０１２７】
本シリーズは、１０症例の真性多血症、３５症例の本態性血小板血症（ＥＴ）、１０症例の原発性骨髄線維症（ＰＭＦ）、１症例の前線維ＰＭＦ、急性期で５例のＭＰＮ、および３例の分類できないＭＰＮを含んでいた。
【０１２８】
７例の続発性血小板増加症および５例の続発性赤血球増加症を含む、１２例の非ＭＰＮ症例における変異についても調査した。患者はすべてインフォームドコンセントに署名し、研究は所属機関の倫理委員会によって承認された。
【０１２９】
先に記述されたようなＡＳＸＬ１変異、ならびに同時にＪＡＫ２（Ｖ６１７Ｆ）およびＴＥＴ２（すべてのエクソン）変異について調査した。
【０１３０】
結果から、６４のＭＰＮ症例（６．２％）、２つのＥＴ症例および２つのＰＭＦ症例のうちの４例において、ヘテロ接合ＴＥＴ２フレームシフト変異が見出されることが示された。
【０１３１】
３５例のＥＴのうちの１例、１０例のＰＭＦのうちの３例（１例は加速期であった）および１例のＥＴ後急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を含む、５症例（７．８％）においてもＡＳＸＬ１のヘテロ接合フレームシフト変異が見出された。ＡＳＸＬ１が変異した５症例のどれもＪＡＫ２  Ｖ６１７Ｆ変異を保有せず、これらの５症例（ａＰＭＦ）のうちの１つのみがＴＥＴ２も変異していた。４つの他のＴＥＴ２ケースはＴＥＴ２変異がなかったが、それらのうちの２例は異常核型を示した。
【０１３２】
血球ＤＮＡにおいてＡＳＸＬ１および／またはＴＥＴ２変異を持つ３名の患者（ＨＤ−０４９６、ＨＤ−０５３６およびＨＤ−０５４０）のＣＤ３４精製細胞から抽出されたＤＮＡにおいて同じ配列を分析した。同じＡＳＸＬ１およびＴＥＴ２変異が対応するＣＤ３４  ＤＮＡにおいて検出された。これはＭＰＮの生理病理学で知られていることと一致しており、ＡＳＸＬ１変異が疾患発達の間の初期に起こることを示唆する。
【０１３３】
最終的に、ＡＳＸＬ１変異は、ＭＰＮに罹患した患者の約８％、および特にＰＭＦに罹患した患者の３３％において見出された。
【０１３４】
非ＣＭＬ  ＭＰＮにおけるＡＳＸＬ１の変異
先の分析は、９７例のＰＶ、ＥＴおよびＭＦ、９例の急性期ＰＶ／ＥＴ／ＭＦ、ならびに６例の未分類のＭＰＮおよびＭＰＮ／ＭＤＳ形態を含む、新規ＭＰＮの１１２症例について行われた。１０例の反応性血小板増加症（ＲＴ）および２２例の反応性赤血球増加症（ＲＥ）を含む、非ＭＰＮの３２症例における変異についても調査した。
【０１３５】
ＡＳＸＬ１変異は１３症例（１１．６％）において見出された。これらの変異はすべてヘテロ接合であり、植物ホメオドメインフィンガードメイン（ＰＨＤ）を含むＣ末端からタンパク質を短縮させることが推定される１０のフレームシフト（７つのｃ．１９３４ｄｕｐＧ  ｐ．Ｇｌｙ６４６ＴｒｐｆｓＸ１２を含む）またはナンセンス変異を含んでいた。（表ＩＶ）。
【０１３６】
疾患特異的変異頻度は、ＰＶにおいて８％、ＥＴにおいて４％、ＰＭＦにおいて１２％、ＰＶ後ＭＦにおいて６６％、ＥＴ後ＭＦにおいて２５％、急性期ＰＶ  ＥＴ／ＭＦにおいて２２％およびＭＰＮ／ＭＤＳにおいて６６％であった。ＴＥＴ２変異は１１２名の患者のうちの１１名（１０％）に存在した。興味深いことには、３２の反応性症例のどれもＡＳＸＬ１が変異していなかった。
【０１３７】
ＥＴ（ＭＰＮ）と反応性血小板増加症との間の鑑別診断が困難であるので、ＡＳＸＬ１変異の存在は反応性血小板増加症を除外するためのＭＰＮの診断を支援することができた。
【０１３８】
ＡＳＸＬ１変異の存在は白血球カウント、ヘモグロビンまたはヘマトクリットレベルに影響を及ぼさなかったが、血小板数はＡＳＸＬ１野生型（６２５×１０９細胞／リットル）と比較してＡＳＸＬ１が変異した症例で少なかった（４１６×１０９細胞／リットル、ｐ＝０．００９）。
【０１３９】
最終的に、ＰＭＦ、ＥＴ後ＭＦおよびＰＶ後ＭＦを含むＭＦ患者においてＡＳＸＬ１変異の発生率は高く、ＥＴおよびＰＶにおいて発生率が低いことが観察され、ＡＳＸＬ１がより悪性の表現型と関連し得ることを示唆する。さらに、ＡＳＸＬ１変異の比率はＰＶ後ＭＦおよびＥＴ後ＭＦにおいて高く（それぞれ、６６％および２５％）；ＡＳＸＬ１状態を使用してＰＶおよびＥＴがＭＦへ発達するリスクを予測できることを示唆する。
【０１４０】
４）ＡＭＬに罹患した患者におけるＡＳＸＬ１遺伝子の変化
ＡＳＸＬ１がＡＭＬに関与するかどうかを決定するために、先に記述されるようなＤＮＡシークエンシングおよびａＣＧＨを使用して、ＡＭＬの正常核型を持つ４６症例、および単独の核型異常として８トリソミー（ｎ＝１４）、９ｑ欠失（ＨＤ−０６３２）、１１トリソミー（ＨＤ−０３０４）または２０ｑ１１−１３欠失（ＨＤ−０３８１）を持つ１７症例における遺伝子の変異および欠失について検索した。
【０１４１】
６３例のＡＭＬは、４６例の原発性症例および１７例の既往の骨髄疾患の転化であった。治療法に関連するＡＭＬは含まれなかった。患者はすべてインフォームドコンセントに署名し、研究は施設内倫理委員会によって承認された。
【０１４２】
すべての中で、ａＣＧＨによって研究された５０症例のうちの４１例はコピー数異常を示さなかった（孤発性８トリソミーは考慮しなかった）。
【０１４３】
６３症例のうちの１１例（１７．５％）において、ＡＳＸＬ１のヘテロ接合のナンセンス変異またはフレームシフト変異が見出された。複数の置換症例も見出されたが、それらは多型性を表わし得るので考慮しなかった。染色体領域２０ｑ１１−１３（ＨＤ−０３８１）の欠失（核型で目視可能だった）はＡＳＸＬ１に含まれていた。したがって、合計で、６３症例のうちの１２例はＡＳＸＬ１変化を示した（１９％）。
【０１４４】
２症例において、ＡＳＸＬ１変異を持つ患者の頬側スミアから抽出されたＤＮＡ中のＡＳＸＬ１をシークエンスした。ＡＳＸＬ１は変異しておらず、変異が後天性であることが示された。
【０１４５】
正常な核型を持つＡＭＬについて知られていることに一致して、ほぼ半数の症例（６３例のうちの２８例、４４％）は、エクソン１２のＮＰＭ１変異を示した。ＮＰＭ１変異はＡＳＸＬ１変化と互いに排他的だった。ＮＰＭ１が変異した２８症例のどれもＡＳＸＬ１の変異または欠失を示さないが、ＮＰＭ１が変異していない３５症例のうちの１２例（３４％）はＡＳＸＬ１が変異または欠失していた。
【０１４６】
ＦＬＴ３変異および内部タンデム重複（ＩＴＤ）は１９症例（３０％）において見出され、１症例（ＨＤ−０２８２）以外はＡＳＸＬ１変異と共に観察されなかった。
【０１４７】
３症例はＫＲＡＳまたはＮＲＡＳのいずれか、および１症例ではＪＡＫ２が変異していた。ＣＥＢＰＡ（１１症例について利用可能）に関するデータからは変異が示されなかった。
【０１４８】
実際には、ＮＰＭ１とＡＳＸＬ１の変異の間の差というのは、同じ経路上でかわるがわる２回命中したためのものではなく、むしろ白血病誘発に２つの異なる経路があることを反映する。ＮＰＭ１変異は慢性骨髄疾患に続発したＡＭＬにおいて稀である。これとは対照的に、１７例の続発性ＡＭＬのうちの９例（すなわち５３％）はＡＳＸＬ１の変異または欠失を示し（混合系列の異形成を伴う症例を含む４６例の原発性ＡＭＬのうちの３例に対して）、ＡＳＸＬ１変化は慢性骨髄疾患に続発したＡＭＬにおいて顕著に観察される（１２例のうちの９例、７５％）が、ＮＰＭ１変異についてはそうではなかった（２８例のうちの２例）。
【０１４９】
この仮説はより多くの症例の研究によって検証され、ＡＳＸＬ１変異の検出は原発性ＡＭＬと続発性ＡＭＬの区別を支援し、したがって既知の慢性期がない場合でさえ予後を正しい方角に導くことを支援するだろう。
【０１５０】
これとは対照的に、１シリーズのＡＭＬにおけるＴＥＴ２変異は、ＮＰＭ１またはＦＬＴ３の変異の存在または非存在と相関せず、慢性骨髄疾患の経歴とも相関しないことが見出された。他のシリーズにおいて、４例のＴＥＴ２変異のうちの３例は続発性症例において見出された。
【０１５１】
ＴＥＴ２およびＡＳＸＬ１は後成的制御の類似した経路において機能し得るが、ＮＰＭ１とのそれらの相関関係において、および疾患の経過の間のそれらの作用のウィンドウにおいて差があってもよい。
【０１５２】
ＡＳＸＬ１およびＦＬＴ３変化の両方がある症例において、慢性期でＡＳＸＬ１変異は存在するがＦＬＴ３  ＩＴＤは存在しないことが決定され、ＡＳＸＬ１およびＦＬＴ３の変異がまれな症例において協調して働き得ることが示唆された。
【０１５３】
最終的に、まれなＲＡＳ変異が、原発性症例または続発性症例において差がなく起こった。１つはＡＳＸＬ１に変異させられた症例において見出されたが、ＲＡＳおよびＡＳＸＬ１の変異が共に起こり得ることが先に示されているので、それは意外ではなかった。白血病誘発のＮＰＭ１経路またはＡＳＸＬ１経路のいずれかと他の何の変化が関連しているかを決定することは現在興味が持たれている。
【０１５４】
５）フレームシフトｐ．Ｇｌｙ６４６Ｔｒｐｆｓｘ１２変異は強くＲＡＥＢ２と相関している
患者はすべてインフォームドコンセントに署名し、研究は施設内倫理委員会によって承認された。それらはＭＤＳの６５症例を含む。ＷＨＯの基準に従って、パネルは５例の不応性貧血（ＲＡ）、１３例の輪状鉄芽球を伴う不応性貧血（ＲＡＲＳ）（骨髄線維症を伴う１例を含む）、７例の多系列の異形成を伴う難治性血球減少（ＲＣＭＤ）、１６例の芽球増加型不応性貧血１型（ＲＡＥＢ１）、１９例の芽球増加型不応性貧血２型（ＲＡＥＢ２）および５例のＭＤＳ未分類の（ＭＤＳ−Ｕ）症例を含んでいた。６症例が造血系疾患または非造血系疾患に続発していた。大部分ＭＤＳのサンプルは診断時に回収され；いくつかは既知のＭＤＳの治療回避中であり、いくつかは対症療法下であった。１７症例はＩＰＰＳ低リスク（０）、２３症例は中間−１（０．５〜１）、１２症例は中間−２（１．５〜２）、および７症例は高リスク（＞２．５）であった。
【０１５５】
ＡＳＸＬ１、ＣＢＬ、ＦＬＴ３、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＪＡＫ２、ＫＲＡＳ、ＮＰＭ１、ＮＲＡＳ、ＲＵＮＸ１、ＴＥＴ２およびＷＴ１のエクソンをコードする配列のＤＮＡシークエンシングを、以下のように行った。骨髄細胞ＤＮＡのＰＣＲ増幅は、少なくとも５ｎｇの鋳型ＤＮＡ、Ｔａｑバッファー、２００μｍｏｌの各々のデオキシリボヌクレオチド３リン酸塩、２０ｐｍｏｌの各々のプライマーおよび１単位のＨｏｔ  Ｓｔａｒ  Ｔａｑ（Ｑｉａｇｅｎ）を含む２５μｌの全体積のＰＣＲ混合物の中で行われた。ＰＣＲ増幅条件は、９５℃１０分；９５℃３０秒、５５℃３０秒、ＰＣＲ産物長に依存して７２℃３０秒〜１分を３５サイクル；７２℃１０分であった。ＰＣＲ産物はＭＩＬＬＩＰＯＲＥプレートＭＳＮＵ０３０を使用して精製した。１マイクロリットルを精製されたＰＣＲ産物を、フォワードプライマーまたはリバースプライマーを含むＢｉｇ  Ｄｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ１．１キット（ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ）を使用するシークエンシングのために使用した。Ｇ５０精製後に、ＡＢＩ  ３１３０ＸＬ  ａｕｔｏｍａｔ（ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ）でシークエンスを行った。シークエンスデータファイルはＳＥＱＳＣＡＰＥおよびＰＨＲＥＤ／ＰＨＲＡＰ／ＣＯＮＳＥＤソフトウェアの両方を使用して分析し、すべての変異は独立したＰＣＲ産物上で確認された。
【０１５６】
ＡＳＸＬ１エクソン１２のフレームシフト変異（同じｐ．Ｇｌｙ６４６Ｔｒｐｆｓｘ１２が１１回）は、５例のＲＡのうちの１例（２０％）、１６例のＲＡＥＢ１のうちの２例（１２．５％）および１９例のＲＡＥＢ２のうちの９例（４７．４％））を含む、ＭＤＳの６５症例のうちの１２例（１８．５％）において観察された。
【０１５７】
ＴＥＴ２変異を持つ１２症例（１８．５％）およびＲＵＮＸ１変異を持つ４例（６．２％）が見出された。１名の患者（ＨＤ−０３１１）は２つのＴＥＴ２変異を有していた。ＴＥＴ２変異はＲＡＥＢ１（７／１６、４３．８％）において頻度が高かった。ＲＵＮＸ１およびＴＥＴ２中の変異は互いに排他的だったが、両者はＡＳＸＬ１変異と関連している可能性があった。２症例はＡＳＸＬ１およびＴＥＴ２変異の両方ならびに３症例はＡＳＸＬ１およびＲＵＮＸ１変異の両方を示した。１症例のＡＳＸＬ１欠失（ＨＤ−０１９０）および１症例のＴＥＴ２欠失（ＨＤ−０１４５）が報告された。１症例（ＨＤ−０２３２）はａＣＧＨによって検出されたＲＵＮＸ１中の切断部を有していた（図示せず）。
【０１５８】
ＦＬＴ３、ＮＰＭ１またはＷＴ１変異は見出されなかった。１例のＭＤＳ−ＵはＪＡＫ２変異、１症例のＲＣＭＤはＫＲＡＳ変異を有していた。５症例（すべてＲＡＥＢ２）はＣＢＬが変異していた。これらのうちの１例では変異はホモ接合だった。１つの置換が１１トリソミー（ＨＤ−０２６４）症例において起こり、野生型残基と２／３比を示し、変異した対立遺伝子は重複したことを示唆する。
【０１５９】
ＩＤＨ１中の２つの変異およびＩＤＨ２中の３つの変異を含む５つのＩＤＨ変異を６５症例（７．７％）において見出した。
【０１６０】
タンパク質の既知の機能に、従来のモデルおよび分類に変異がどこに存在したかに（ＭＤＳおよび／または続発性ＡＭＬおよび／または原発性ＡＭＬ）、およびそれらがどのように組み合わせられたかに基づいて、遺伝子を４つのクラスに仮に分類した。
【０１６１】
第１のクラス（「イニシエーター」と名付けた）はＲＵＮＸ１およびＴＥＴ２を含む。それらは造血幹細胞のクローン性拡大を引き起こし得る。
【０１６２】
ＡＳＸＬ１およびＮＰＭ１はクラスＩＩ（「セレクター」）を構成する。これらの遺伝子中の変異は、原発性ＡＭＬまたは続発性ＡＭＬのいずれかに導く白血病誘発経路を選択することができる。
【０１６３】
増殖と関連する遺伝子（ＣＢＬ、ＦＬＴ３、ＪＡＫ２、ＲＡＳ）はクラスＩＩＩ（「アンプリファイアー」）を指定する。ＪＡＫ２変異はＭＤＳおよびＮ−ＡＭＬにおいてわずかな役割を果たす。
【０１６４】
最終的に、推定上のクラスＩＶ中にＩＤＨ１、ＩＤＨ２およびＷＴ１をグループ化した３つの理由のために、仮に「ブースター」と呼んだ。第一に、ＩＤＨおよびＷＴ１の変異は排他的だったが、他のクラスからの遺伝子中の変異と共に起こり得る。第二に、それらが主としてＡＭＬにおいて起こり、ＭＤＳ（および骨髄増殖性腫瘍においても）においてまれであった。第三に、これらの遺伝子の変異はＨＩＦ１および酸素検知経路の修飾と関連し得る。むしろクラスＩＶ変異は急性期と関連している。
【０１６５】
全体として、ＡＭＬ症例は０、１または３つの変異を有していた。このために、そして４つの変異を有する症例はなかったが、−少なくとも−４つの協調して働く変異（各々のクラスから１つ）に続いて、ＡＭＬが発達すると提唱する。これは推測的であり、新規標的遺伝子の同定および他の研究がより正確な全体像をもたらすだろう。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図１−７】
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【図１−８】
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【図１−９】
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【図１−１０】
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【図１−１１】
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【図１−１２】
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【図１−１３】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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