(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
梅毒トレポネーマトリプレット抗原をコード化する、組換えプラスミドであって、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、及び配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列をコード化する、核酸を含む、組換えプラスミド。
【請求項２】
前記アミノ酸配列が、配列番号７である、請求項１に記載の組換えプラスミド。
【請求項３】
前記アミノ酸配列が、配列番号８である、請求項１に記載の組換えプラスミド。
【請求項４】
前記アミノ酸配列が、配列番号９である、請求項１に記載の組換えプラスミド。
【請求項５】
前記アミノ酸配列が、配列番号１０である、請求項１に記載の組換えプラスミド。
【請求項６】
前記アミノ酸配列が、配列番号１１である、請求項１に記載の組換えプラスミド。
【請求項７】
前記アミノ酸配列が、配列番号１２である、請求項１に記載の組換えプラスミド。
【請求項８】
前記核酸が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、及び配列番号６からなる群から選択される、ヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の組換えプラスミド。
【請求項９】
前記核酸が、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の組換えプラスミド。
【請求項１０】
前記核酸が、配列番号２に示されるヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の組換えプラスミド。
【請求項１１】
前記核酸が、配列番号３に示されるヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の組換えプラスミド。
【請求項１２】
前記核酸が、配列番号４に示されるヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の組換えプラスミド。
【請求項１３】
前記核酸が、配列番号５に示されるヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の組換えプラスミド。
【請求項１４】
前記核酸が、配列番号６に示されるヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の組換えプラスミド。
【請求項１５】
請求項１に記載の組換えプラスミドを含む、宿主細胞。
【請求項１６】
前記宿主細胞が、大腸菌である、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
梅毒トレポネーマトリプレット抗原を産生する方法であって、前記梅毒トレポネーマトリプレット抗原の発現に好適な条件下で、請求項１５に記載の宿主細胞を培養することと、前記細胞培養物から前記梅毒トレポネーマトリプレット抗原を回収することと、を含む、方法。
【請求項１８】
梅毒トレポネーマトリプレット抗原をコード化する組換えプラスミドであって、
ｐ２６１ｎＳ−ＴＰ１７−１５−４７に指定され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１５９０としてアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託されている、プラスミド、及び
ｐ２６１ｎＳ−ＴＰ４７−１７−１５に指定され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１５８９としてアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託されている、プラスミド、からなる群から選択される、組換えプラスミド。
【請求項１９】
ｐ２６１ｎＳ−ＴＰ１７−１５−４７に指定され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１５９０としてアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託されている、請求項１８に記載の組換えプラスミド。
【請求項２０】
ｐ２６１ｎＳ−ＴＰ４７−１７−１５に指定され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１５８９としてアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託されている、請求項１８に記載の組換えプラスミド。
【請求項２１】
請求項１８に記載の組換えプラスミドを含む、宿主細胞。
【請求項２２】
前記宿主細胞が、大腸菌である、請求項２１に記載の宿主細胞。
【請求項２３】
梅毒トレポネーマトリプレット抗原を産生する方法であって、前記梅毒トレポネーマトリプレット抗原の発現に好適な条件下で、請求項２１に記載の宿主細胞を培養することと、前記細胞培養物から前記梅毒トレポネーマトリプレット抗原を回収することと、を含む、方法。
【請求項２４】
配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、及び配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、梅毒トレポネーマトリプレット抗原。
【請求項２５】
配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する、請求項２４に記載の梅毒トレポネーマトリプレット抗原。
【請求項２６】
配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する、請求項２４に記載の梅毒トレポネーマトリプレット抗原。
【請求項２７】
配列番号９に示されるアミノ酸配列を有する、請求項２４に記載の梅毒トレポネーマトリプレット抗原。
【請求項２８】
配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有する、請求項２４に記載の梅毒トレポネーマトリプレット抗原。
【請求項２９】
配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有する、請求項２４に記載の梅毒トレポネーマトリプレット抗原。
【請求項３０】
配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する、請求項２４に記載の梅毒トレポネーマトリプレット抗原。
【請求項３１】
検出可能なマーカーで標識される、請求項２４に記載の梅毒トレポネーマトリプレット抗原。
【請求項３２】
前記検出可能なマーカーが、セイヨウワサビペルオキシダーゼである、請求項３１に記載の梅毒トレポネーマトリプレット抗原。
【請求項３３】
試料中の梅毒トレポネーマ抗体の存在を検出する方法であって、
前記試料を、請求項２４に記載の梅毒トレポネーマトリプレット抗原と接触させることであって、前記試料中に存在する梅毒トレポネーマ抗体が、前記梅毒トレポネーマトリプレット抗原と結合し、抗体／抗原複合体を形成する、ことと、
前記抗体／抗原複合体を検出し、それにより、梅毒トレポネーマ抗体の存在を検出することと、を含む、方法。
【請求項３４】
前記梅毒トレポネーマトリプレット抗原が、固体支持体上で固定化される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記抗体／抗原複合体を検出することが、
前記抗体／抗原複合体を、請求項２４に記載の第２の梅毒トレポネーマトリプレット抗原と接触させることであって、前記第２の梅毒トレポネーマトリプレット抗原が、検出可能なマーカーで標識され、前記第２の梅毒トレポネーマトリプレット抗原が、前記抗体／抗原複合体中に存在する抗体と結合し、抗原／抗体／標識抗原複合体を形成する、ことと、
前記抗原／抗体／標識抗原複合体を検出し、それにより、梅毒トレポネーマ抗体の存在を検出することと、を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記抗体／抗原複合体を検出することが、
前記抗体／抗原複合体を、標識抗ヒト抗体と接触させることであって、前記標識抗ヒト抗体が、前記抗体／抗原複合体中に存在する前記抗体と結合し、抗原／抗体／標識抗抗体複合体を形成する、ことと、
前記抗原／抗体／標識抗抗体複合体を検出し、それにより、梅毒トレポネーマ抗体の存在を検出することと、を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
梅毒トレポネーマ抗体の検出のためのキットの構成要素であって、請求項２４に記載の梅毒トレポネーマトリプレット抗原を含む、構成要素。
【請求項３８】
梅毒トレポネーマ抗体の検出のためのキットであって、
請求項２４に記載の梅毒トレポネーマトリプレット抗原と、
請求項２４に記載の第２の梅毒トレポネーマトリプレット抗原であって、検出可能なマーカーで標識される、第２の梅毒トレポネーマトリプレット抗原と、を含む、キット。
【請求項３９】
陽性又は陰性対照を更に含む、請求項３８に記載のキット。
【請求項４０】
校正試料を更に含む、請求項３８に記載のキット。
【請求項４１】
酵素抱合体、酵素抱合体の基質、緩衝溶液、及び洗浄液のうちの１つ又は２つ以上を更に含む、請求項３８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は２０１１年１月１３日に出願された米国仮特許出願第６１／４３２，５７０号の利益を主張するものである。
【０００２】
（連邦政府支援研究又は開発に関する陳述）
該当なし。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、組換え抗原の分野に関し、より具体的には、梅毒トレポネーマトリプレット抗原構築物、及び梅毒の検出のための免疫測定法におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
過去半世紀にわたって、有効な抗生物質による治療計画により、米国において梅毒が比較的まれなものとなり、２００３年には、７，１００件未満の一次及び二次症例が診断された。しかしながら、近年のデータは、報告された症例が母集団のサブセット中で再び増加しており、梅毒の周期的な流行が数十年にわたって生じていることを示している。１９９５年、世界中の梅毒の新しい症例は、１年当たり１，２００万件と推定された。未治療の場合、梅毒は、局所一次病巣（下疳）から、二次、潜在性、及び三次の形態を含む、播種性、慢性感染症に進展する可能性がある。
【０００５】
梅毒感染がヒトにおいて可変範囲の症状を引き起こす可能性がある為、臨床試験がしばしば、感染症を確実に診断するために必要とされる。原因微生物である、梅毒トレポネーマ（Ｔ．トレポネーマ）（ＴＰ）をインビトロで培養することが不可能であるため、種々の臨床材料中のＴ．トレポネーマの検出のためのインビトロ法の開発及び最適化の必要性がある［Ｍｏｒｓｅ，Ｓａｌｕｄ  Ｐｕｂｌｉｃａ  Ｍｅｘ  ５（Ｓｕｐｐｌ  ４５）：Ｓ６９８〜Ｓ７０８，２００３］。トレポネーマに対する酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）が市販されているが、それらは、異なる病期で異なる有効性を示す［Ｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３８：１２７９〜１２８２（２０００）］。９３．３％〜１００％の感度、及び９５．５％〜９９．８％の特異度を示す、全細胞溶解液に基づくいくつかのＥＬＩＳＡが開発された［Ｃａｓｔｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４１：２５０〜２５３（２００３）］。
【０００６】
近年、いくつかの主要抗原及び推定的に病原体特異的なＴ．トレポネーマの膜リポタンパク質が、梅毒患者及び先天性梅毒児において同定されている。これらの患者及び乳児は、抗原特異的抗体を発症し、それは、免疫ブロット法及び酵素免疫測定法によって検出され得た。したがって、近年の検出法は、トレポネーマＥＬＩＳＡ試験において、組換え抗原、主に、膜統合タンパク質４７ｋＤａ、１７ｋＤａ、及び１５ｋＤａ（それぞれＴＰ４７、ＴＰ１７、及びＴＰ１５）を使用する。ＴＰ４７は最も早く同定され、加えて最も豊富かつ高度に免疫原性であったが［Ｎｏｒｇａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ５４：５００〜５０６（１９８６）］、後に同定された、より少量で存在するＴＰ１５及びＴＰ１７もまた、免疫原性が強い［Ｐｕｒｃｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ５７：３７０８〜３７１４（１９８９）、Ａｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６１：１２０２〜１２１０（１９９３）］。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
報告された梅毒の症例の増加及び周期的な流行、並びに疾病の重症度を考えると、梅毒トレポネーマの検出のための高感度かつ特異的な免疫測定法の必要性が引き続きある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
そのため、本発明は、梅毒トレポネーマトリプレット抗原をコード化する組換えプラスミドを提供する。プラスミドは、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、及び配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列をコード化する、核酸を含む。
【０００９】
本発明は更に、梅毒トレポネーマトリプレット抗原をコード化する組換えプラスミドを提供し、組換えプラスミドは、ｐ２６１ｎＳ−ＴＰ１７−１５−４７に指定され、２０１１年１月１２日にＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１５９０としてアメリカンタイプカルチャーコレクション（「ＡＴＣＣ」）に寄託されているプラスミド；ｐ２６１ｎＳ−ＴＰ４７−１７−１５に指定され、２０１１年１月１２日にＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１５８９としてアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託されているプラスミド；ｐ２６１ｎＳ−ＴＰ１７−４７−１５に指定されているプラスミド；ｐ２６１ｎＳ−ＴＰ４７−１５−１７に指定されているプラスミド；ｐ２６１ｎＳ−ＴＰ１５−１７−４７に指定されているプラスミド；及びｐ２６１ｎＳ−ＴＰ１５−４７−１７に指定されているプラスミド；からなる群から選択される。
【００１０】
宿主細胞を使用した、ベクター、宿主細胞、及びトリプレット抗原産生方法も提供する。
【００１１】
加えて、本発明は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、及び配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、梅毒トレポネーマトリプレット抗原を提供する。試料中の梅毒トレポネーマ抗体の存在を検出する方法を更に提供し、それは、梅毒トレポネーマトリプレット抗原、並びにかかる検出用のキットを使用する。
【００１２】
本発明の更なる特徴及び利点は、添付の図面と併せて考慮される時、以下の発明を実施するための形態から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＶＩＴＲＯＳ（登録商標）梅毒ＴＰＡ試験に対する反応スキーム。
【図２】ｐＵＣ５７−ＴＰ１５のプラスミドマップ。
【図３】ｐＵＣ５７−ＴＰ１７のプラスミドマップ。
【図４】ｐＵＣ５７−ＴＰ４７のプラスミドマップ。
【図５】ｐＵＣ５７−ｈＳＯＤのプラスミドマップ。
【図６】ｐＢ１０ＧへのクローニングのためのＴＰ構築物。
【図７】ｐＢ１０ＧトリプレットプラスミドへのクローニングのためのｈＳＯＤ構築物。
【図８】ｐＢ１０Ｇのプラスミドマップ。
【図９】ｐＢ１０Ｇ−ＴＰ（１）のプラスミドマップ。
【図１０】ｐＢ１０Ｇ−ＴＰ（２）のプラスミドマップ。
【図１１】ｐＢ１０Ｇ−ＴＰ（３）のプラスミドマップ。
【図１２】ｐＢ１０Ｇ−ＴＰ（２）へのクローニングのためのＴＰ（１）構築物。
【図１３】ｐＢ１０Ｇ−ＴＰ（１−２）のプラスミドマップ。
【図１４】ｐＢ１０Ｇ−ＴＰ（１−２）へのクローニングのためのＴＰ（３）構築物。
【図１５】ｐＢ１０Ｇ−ＴＰ（１−２−３）のプラスミドマップ。
【図１６】特異的制限酵素部位を有する、ｐＢ１０Ｇ−ＴＰ（１−２−３）のプラスミドマップ。
【図１７】ｐ２６１ｎＳ−ＴＰ（１−２−３）のプラスミドマップ。
【図１８】本発明に従った直接アッセイ形式。
【図１９】本発明に従った間接アッセイ形式。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のアッセイ（検出法）は、患者試料、抗ＩｇＧ、抗ＩｇＭ、及び抗ＩｇＡ抗体を検出するために、組換え梅毒トレポネーマ（ＴＰ）（梅毒の原因物質）外膜タンパク質抗原を使用する。対象の組換えタンパク質抗原は、１５キロダルトンの抗原（ＴＰ１５）、１７キロダルトンの抗原（ＴＰ１７）、及び４７キロダルトンの抗原（ＴＰ４７）である。対象の３つの抗原、並びにヒト銅・亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ（ｈＳＯＤ）を組み込む、融合組換え抗原構築物が開発されている。梅毒トレポネーマ抗原配列及びｈＳＯＤに加えて、ウエスタンブロット法及びＥＬＩＳＡによる評価を促進するために、かつ所望に応じて、親和性精製のための手段を提供するために、融合抗原構築物のＮ末端に１０アミノ酸タグ（「２６１配列」）が存在する。本発明のアッセイは、この融合組換え抗原構築物を使用する。
【００１５】
一実施形態では、アッセイは、ＶＩＴＲＯＳ（登録商標）梅毒ＴＰＡ試験であり、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｈｅｃｋ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを使用した、ＶＩＴＲＯＳ（登録商標）ＥＣｉ／ＥＣｉＱ免疫診断システム、ＶＩＴＲＯＳ（登録商標）３６００免疫診断システム、又はＶＩＴＲＯＳ（登録商標）５６００集積システムを使用してアッセイを実施する。これらの分析器のそれぞれは、Ｏｒｔｈｏ−Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，１００  Ｉｎｄｉｇｏ  Ｃｒｅｅｋ  Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ  １４６２６から入手可能である。免疫計量的免疫測定技術を使用し、それは、試料中に存在するＩｇＧ、ＩｇＭ、又はＩｇＡ抗体の、ビオチン化組換えＴＰ抗原及びセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識組換えＴＰ抗原の抱合体との反応を伴う。抗体−抗原複合体は、ウェル（ＳＡＣウェル）上のストレプトアビジンによって捕捉される。非結合材料は、洗浄によって除去される。結合したＨＲＰ抱合体は、発光反応によって測定される。発光原基質（ルミノール誘導体及び過酸塩）並びに電子移動剤を含有する試薬が、ウェルに添加される。結合した抱合体中のＨＲＰは、ルミノール誘導体の酸化を触媒し、光を産生する。電子移動剤（置換アセトアニリド）は、産生される光レベルを増加し、その放出を延長する。光信号は、分析器によって読まれる。結合したＨＲＰ抱合体は、存在する抗ＴＰ抗体の濃度に正比例する。この反応スキームが図１に示され、ここで、１０は、ストレプトアビジン被覆ウェルを表し、１２は、ビオチン化ＴＰ抗原を表し、１４は、試料中の存在するＴＰ抗原に対する抗体を表し、１６は、ＨＲＰ標識ＴＰ抗原を表し、１８は、エンハンサーを有する信号試薬を表し、２０は、発光を表す。スーパーオキシドジスムターゼは、患者試料中に存在し得る抗ＳＯＤ抗体の結合を阻止するために、アッセイビオチン試薬製剤中に存在する。これは、疑似反応信号が生成されることを防止する。
【００１６】
本発明は、梅毒トレポネーマトリプレット抗原をコード化する、組換えプラスミドを提供する。プラスミドは、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、及び配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列をコード化する、核酸を含む。
【００１７】
一実施形態では、プラスミドは、ｐ２６１ｎＳ−ＴＰ１７−１５−４７に指定され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１５９０としてアメリカンタイプカルチャーコレクション（「ＡＴＣＣ」）に寄託されている。プラスミドｐ２６１ｎＳ−ＴＰ１７−１５−４７は、配列番号３に示されるヌクレオチド配列を有し、配列番号９に示されるアミノ酸配列を有するトリプレット抗原構築物をコード化する、核酸を含む。この特定の実施形態では、アミノ酸５〜１４は、２６１タグをコード化し、アミノ酸１７〜１５０は、ＴＰ１７をコード化し、アミノ酸１５５〜２７７は、ＴＰ１５をコード化し、アミノ酸２８２〜６９５は、ＴＰ４７をコード化し、アミノ酸６９７〜８４９は、ｈＳＯＤをコード化する。
【００１８】
別の実施形態では、プラスミドは、ｐ２６１ｎＳ−ＴＰ４７−１７−１５に指定され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１５８９としてアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託されている。プラスミドｐ２６１ｎＳ−ＴＰ４７−１７−１５は、配列番号６に示されるヌクレオチド配列を有し、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有するトリプレット抗原構築物をコード化する、核酸を含む。この特定の実施形態では、アミノ酸５〜１４は、２６１タグをコード化し、アミノ酸１７〜４３０は、ＴＰ４７をコード化し、アミノ酸４３５〜５６８は、ＴＰ１７をコード化し、アミノ酸５７３〜６９５は、ＴＰ１５をコード化し、アミノ酸６９７〜８４９は、ｈＳＯＤをコード化する。
【００１９】
更なる実施形態では、プラスミドは、ｐ２６１ｎＳ−ＴＰ１７−４７−１５に指定されている。プラスミドｐ２６１ｎＳ−ＴＰ１７−４７−１５は、配列番号４に示されるヌクレオチド配列を有し、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するトリプレット抗原構築物をコード化する、核酸を含む。この特定の実施形態では、アミノ酸５〜１４は、２６１タグをコード化し、アミノ酸１７〜１５０は、ＴＰ１７をコード化し、アミノ酸１５５〜５６８は、ＴＰ４７をコード化し、アミノ酸５７１〜６９３は、ＴＰ１５をコード化し、アミノ酸６９５〜８４７は、ｈＳＯＤをコード化する。
【００２０】
更に別の実施形態では、プラスミドは、ｐ２６１ｎＳ−ＴＰ４７−１５−１７に指定されている。プラスミドｐ２６１ｎＳ−ＴＰ４７−１５−１７は、配列番号５に示されるヌクレオチド配列を有し、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有するトリプレット抗原構築物をコード化する、核酸を含む。この特定の実施形態では、アミノ酸５〜１４は、２６１タグをコード化し、アミノ酸１７〜４３０は、ＴＰ４７をコード化し、アミノ酸４３５〜５５７は、ＴＰ１５をコード化し、アミノ酸５６０〜６９３は、ＴＰ１７をコード化し、アミノ酸６９５〜８４７は、ｈＳＯＤをコード化する。
【００２１】
更なる実施形態では、プラスミドは、ｐ２６１ｎＳ−ＴＰ１５−１７−４７に指定されている。プラスミドｐ２６１ｎＳ−ＴＰ１５−１７−４７は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有し、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有するトリプレット抗原構築物をコード化する、核酸を含む。この特定の実施形態では、アミノ酸５〜１４は、２６１タグをコード化し、アミノ酸１７〜１３９は、ＴＰ１５をコード化し、アミノ酸１４３〜２７６は、ＴＰ１７をコード化し、アミノ酸２８１〜６９４は、ＴＰ４７をコード化し、アミノ酸６９６〜８４８は、ｈＳＯＤをコード化する。
【００２２】
別の更なる実施形態では、プラスミドは、ｐ２６１ｎＳ−ＴＰ１５−４７−１７に指定されている。プラスミドｐ２６１ｎＳ−ＴＰ１５−４７−１７は、配列番号２に示されるヌクレオチド配列を有し、配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するトリプレット抗原構築物をコード化する、核酸を含む。この特定の実施形態では、アミノ酸５〜１４は、２６１タグをコード化し、アミノ酸１７〜１３９は、ＴＰ１５をコード化し、アミノ酸１４３〜５５６は、ＴＰ４７をコード化し、アミノ酸５５９〜６９２は、ＴＰ１７をコード化し、アミノ酸６９４〜８４６は、ｈＳＯＤをコード化する。
【００２３】
ＡＴＣＣは、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ  ２０１１０−２２０９  ＵＳＡに位置し、上記の寄託のそれぞれは、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約（「ブダペスト条約」）下で、２０１１年１月１２日に行われた。
【００２４】
各梅毒トレポネーマトリプレット抗原構築物は、３つの梅毒トレポネーマ抗原（ＴＰ１５、ＴＰ１７、及びＴＰ４７）を含む。それぞれがそのアミノ酸配列並びにヌクレオチド配列によって定義されているが、ＤＮＡ分子の翻訳に影響を及ぼさないようなヌクレオチド添加、欠失、及び／又は置換が、特定のヌクレオチド配列の範囲内であることは、容易に明らかであるはずである（すなわち、それによりコード化されるアミノ酸配列が、同じ状態のままである）。かかる添加、欠失、及び／又は置換は、例えば、当業者に既知の方法に従って行われる点突然変異の結果であり得る。また、ヌクレオチドを置換し、それによりコード化されるアミノ酸配列を変化させることが可能であり、置換されるアミノ酸は、同類置換であるか、又はアミノ酸相同性が保存されている。また、得られるトリプレットの機能（すなわち、抗ＴＰ１５、抗ＴＰ１７、及び／又は抗ＴＰ４７抗体を検出するためのその能力）を変化させない、少量のヌクレオチド添加、欠失、及び／又は置換を有することが可能である。
【００２５】
したがって、抗ＴＰ１５、抗ＴＰ１７、及び／又は抗ＴＰ４７抗体を検出する、得られるトリプレットの能力を打ち消さないアミノ酸添加、欠失、及び／又は置換は、特定のアミノ酸配列の範囲内である。かかる添加、欠失、及び／又は置換は、例えば、アミノ酸配列をコード化するＤＮＡ中の点突然変異の結果であり得、かかる点突然変異は、当業者に既知の方法に従って行われる。置換は、アミノ酸の同類置換であってもよい。２つのアミノ酸残基は、相互の同類置換であり、例えば、２つの残基は、同一種類のものである。この点で、プロリン、アラニン、グリシン、セリン、及びトレオニンは、全て中性、弱疎水性残基であり、同一種類のものである。グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、及びアスパラギン酸は、全て酸性、親水性残基であり、同一種類のものである。別の種類の残基は、塩基性、親水性アミノ酸残基であり、ヒスチジン、リシン、及びアルギニンを含む。ロイシン、イソロイシン、バリン、及びメチオニンは、全て疎水性、脂肪族アミノ酸残基であり、更に別の種類の残基を形成する。更に別の種類の残基は、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなり、全ては、疎水性、芳香族残基である。同類置換の概念の更なる説明は、Ｆｒｅｎｃｈ  ａｎｄ  Ｒｏｂｓｏｎ［Ｊ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  １９：１７１〜１７５（１９８３）］、Ｔａｙｌｏｒ［Ｊ  Ｔｈｅｏｒ  Ｂｉｏｌ  １１９：２０５〜２１８（１９８６）］、及びＢｏｒｄｏ  ａｎｄ  Ａｒｇｏｓ［Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１７：７２１〜７２９（１９９１）］によって示される。
【００２６】
トリプレット抗原構築物をコード化する核酸の提供のための現在好ましいベクター系が、プラスミドベクターである一方で、他のベクター系も使用され得る。更に、トリプレット抗原構築物の発現のための現在好ましい宿主細胞が、細菌宿主細胞、大腸菌である一方で、トリプレット抗原構築物を発現するために、任意の好適な宿主及び／又はベクター系が使用され得る。他の好適な細菌宿主、酵母宿主（サッカロマイセス・セレヴィシエ等）、並びに哺乳動物（例えば、ヒーラ細胞、Ｃｖ−１細胞、ＣＯＳ細胞）、及び昆虫宿主（ショウジョウバエ細胞株）が使用され得る。
【００２７】
核酸分子を宿主細胞に導入するための技術は、核酸分子を含む発現ベクターの使用を伴ってもよい。次いで、核酸分子を好適な宿主細胞に導入するために、これらの発現ベクター（プラスミド及びウイルス等、バクテリオファージを含むウイルス）が使用され得る。例えば、宿主細胞におけるトリプレット抗原の発現を得るために、トリプレット抗原をコード化するＤＮＡが、宿主細胞の核に注入されるか、若しくは好適なベクターを使用して宿主細胞に形質転換されてもよく、又はトリプレット抗原をコード化するｍＲＮＡが、宿主細胞に直接注入されてもよい。
【００２８】
核酸分子を宿主細胞に導入するための種々の方法が、当該技術分野において既知である。一方法は、顕微注入法であり、ここで、ＤＮＡは、細いガラス針を通して細胞の核に直接注入される（又は、ＲＮＡが、細胞の細胞質に直接注入される）。あるいは、ＤＮＡが、不活性炭水化物ポリマー（デキストラン）とインキュベートされてもよく、そこには、正電荷の化学基（ＤＥＡＥ、ジエチルアミノエチル）が結合されている。ＤＮＡは、その負電荷のリン酸基を介して、ＤＥＡＥ−デキストランに付着する。次に、これらの大きいＤＮＡ含有粒子は、細胞の表面に付着し、細胞は、エンドサイトーシスとして既知のプロセスによって、その中にそれらを取り込むと考えられている。ＤＮＡの一部は、細胞の細胞質における破壊を回避し、核へと逃げ、そこで、それは細胞中の任意の他の遺伝子等のＲＮＡに転写され得る。別の方法では、細胞は、リン酸カルシウムとの沈殿の形態で、ＤＮＡを効率的に取り込む。電気穿孔法において、細胞は、ＤＮＡを含有する溶液中に配置され、それらの膜において穴を一時的に開かせる、短い電気パルスに供される。ＤＮＡは穴を通して細胞質中に直接入り、ＤＥＡＥ−デキストラン及びリン酸カルシウム技法においてそれらが通過するエンドサイトーシス小胞を迂回する（これらの小胞が時にＤＮＡを破壊又は損傷し得る通路）。また、ＤＮＡは、人工の脂質小胞であるリポソームに組み込まれてもよく、それらは、細胞膜と融合して、それらの含有物を細胞質中に直接送達する。主に植物細胞及び組織で使用される、更により直接的なアプローチにおいて、ＤＮＡは、タングステン微小発射体の表面に吸収され、ショットガンに似たデバイスによって細胞中に発射される。
【００２９】
核酸分子を細胞中に導入するための更なる方法は、ウイルスベクターの使用を伴う。ウイルスの成長は、ウイルスゲノムを細胞中に取り込む能力によって決まるため、ウイルスは、それを行うための巧妙かつ効率的な方法を生み出した。タンパク質産生のために広く使用される１つのかかるウイルスは、昆虫ウイルス、バキュロウイルスである。バキュロウイルスは感染中に、その構造タンパク質（外被タンパク質）のうちの１つを驚異的なレベルまで産生するため、研究者らに注目された。外来遺伝子がこのウイルス遺伝子に置換される場合、それもまた、高レベルで産生されるはずである。ワクシニア等のバキュロウイルスは非常に大きく、したがって、外来遺伝子は、組換えによってウイルスゲノム中に配置されなければならない。バキュロウイルス中に外来遺伝子を発現させるために、対象の遺伝子は、ウイルスゲノムのほんの一部を担持するプラスミド中で、ウイルス外被タンパク質遺伝子の代わりにクローニングされる。組換えプラスミドは、野生型バキュロウイルスＤＮＡと、昆虫細胞に共導入される。低い頻度で、プラスミド及びウイルスＤＮＡは、相同配列を通して再結合し、ウイルスゲノムへの外来遺伝子の挿入をもたらす。ウイルスプラークが出現し、組換えウイルスを含有するプラークは、外被タンパク質を欠くため、異なって見える。組換えウイルスを有するプラークは選別され、膨張させられる。次いで、このウイルスストックは、昆虫細胞の新鮮培養物を感染させるために使用され、外来タンパク質の高発現をもたらす。バキュロウイルスベクターの再考察のために、Ｍｉｌｌｅｒ［Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  １１：９１〜９５（１９８９）］を参照されたい。種々のウイルスベクターもまた、バクテリオファージ、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス等、哺乳類細胞を形質転換するために使用されてきた。
【００３０】
示されるように、細胞を形質転換するこれらの方法のいくつかは、中間プラスミドベクターの使用を必要とする。Ｃｏｈｅｎ  ａｎｄ  Ｂｏｙｅｒの米国特許番号第４，２３７，２２４号は、制限酵素開裂及びＤＮＡリガーゼによるライゲーションを使用した、組換えプラスミドの形態の発現系の産生を記載する。次いで、これらの組換えプラスミドは、形質転換によって導入され、組織培養物中で成長する原核生物及び真核細胞を含む、単細胞培養物中で複製される。ＤＮＡ配列は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）］によって記載されるような、当該技術分野において既知の標準的クローニング手順を使用して、プラスミドベクターにクローニングされる。
【００３１】
トリプレット抗原を産生するために（すなわち、機能的に発現するために）、トリプレット抗原をコード化する核酸が導入された宿主細胞が使用され得る。
【００３２】
本発明は更に、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、及び配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、梅毒トレポネーマトリプレット抗原を提供する。トリプレット抗原の現在好ましい実施形態は、配列番号９及び配列番号１２によって表されるものである。これらの実施形態は、トリプレットのＴＰ１５部分の前に、トリプレットのＴＰ１７部分を示し、より高い抗体検出感度がこれらの構築物で達成される。全ての構築物は、リーダー配列を含む（１０個のアミノ酸のリーダー配列（タグ２６１）が現在好ましいが、他の好適なリーダーも置換され得る）。全ての構築物は更に、カルボキシ末端において、ヒト銅亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ（ｈＳＯＤ）、低免疫原性タンパク質を含む。ｈＳＯＤ中の１１個のリジン残基は、ビオチン付着及びＨＲＰ抱合のための部位を提供し、２つのシステイン残基は、鎖間タンパク質重合を防止するために、セリンに変異する（Ｃｙｓ  ４及びＣｙｓ  １１２）［Ｈａｌｌｅｗｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６４：５２６０〜５２６８（１９８９）］。したがって、この構築物は、梅毒感染症のインビトロ診断用に最適化される。ビオチン付着及びＨＲＰ抱合のための同様の部位を提供する、他の好適な低免疫原性タンパク質が、置換され得る。現在好ましいプラスミド構築において、トリプレット抗原は、Ｔ５プロモーターの調節下にある。
【００３３】
試料中の梅毒トレポネーマ抗体の存在を検出するためのアッセイの具体的詳細が以下に開示されるが、概して、本方法は、試料を、本発明の梅毒トレポネーマトリプレット抗原と接触させることであって、試料中に存在する梅毒トレポネーマ抗体が、梅毒トレポネーマトリプレット抗原に結合し、抗体／抗原複合体を形成する、ことと、抗体／抗原複合体を検出し、それにより、梅毒トレポネーマ抗体の存在を検出することと、を含む。梅毒トレポネーマに対する抗体の検出のためのアッセイ形式で使用するために、抗原トリプレットは、検出可能なマーカーで標識されてもよい。好適なマーカーとしては、例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ等の酵素標識、並びに蛍光標識（フルオレセイン、ローダミン、及び緑色蛍光タンパク質等）が挙げられる。
【００３４】
アッセイ形式はまた、固相に結合するトリプレット抗原の提供において、ビオチン／アビジン／ストレプトアビジンを利用してもよい。好適な固相としては、例えば、トリプレット抗原が結合し得る、任意の非水性マトリックスが挙げられる。かかる固相は、免疫測定法の分野においてよく知られており、例えば、ポリスチレンプレート、ポリアクリルアミド、ガラス、多糖、ポリビニルアルコール、及びシリコーンが挙げられる。マイクロスライド、マイクロウェル、及びマイクロチップは全て、免疫測定法において固相として使用される。
【００３５】
アッセイ形式は、抗体／抗原複合体の直接検出を伴ってもよく（図１８を参照されたい）、それは、抗体／抗原複合体を、本発明の第２の梅毒トレポネーマトリプレット抗原と接触させることを含むことができ、第２の梅毒トレポネーマトリプレット抗原が、検出可能なマーカーで標識される（示されるＨＲＰ）。第２の梅毒トレポネーマトリプレット抗原は、抗体／抗原複合体中に存在する抗体に結合し、抗原／抗体／標識抗原複合体を形成し、それは、次いで検出され、それにより、試料中の梅毒トレポネーマ抗体の存在を検出する。
【００３６】
アッセイ形式は、抗体／抗原複合体の間接検出を伴ってもよく（図１９を参照されたい）、それは、抗体／抗原複合体を、標識抗ヒト抗体と接触させることを含むことができる（示されるモノクローナルマウス抗ヒト抗体）。標識抗ヒト抗体は、抗体／抗原複合体中に存在する抗体に結合し、抗原／抗体／標識抗抗体複合体を形成し、それは、次いで検出され、それにより、試料中の梅毒トレポネーマ抗体の存在を検出する。
【００３７】
本発明の全アッセイに対して、試料は、任意の好適な試料（例えば、血清、血漿、及びＥＤＴＡ又はヘパリン血漿）であってもよいが、好ましくは、血清試料である。
【００３８】
したがって、本発明の梅毒トレポネーマトリプレット抗原構築物は、梅毒トレポネーマ抗体の検出用のキットの構成要素として利用され得る。梅毒トレポネーマトリプレット抗原構築物、及び加えて、検出可能なマーカーで標識される第２の梅毒トレポネーマトリプレット抗原構築物（ＨＲＰ標識梅毒トレポネーマトリプレット抗原等の「酵素抱合体」）を含む、キットが提供される（マーカーに関する上記の考察を参照されたい）。キットはまた、好適な陽性及び／又は陰性対照、校正試料、酵素抱合体、酵素抱合体の基質（Ｏ−フェニレンジアミン等）、緩衝溶液、及び洗浄液を含むことができる。
【００３９】
トリプレット抗原の構築、及び患者試料中の梅毒トレポネーマ抗体の検出のためのアッセイでのその使用の詳細は、以下に記載される。
【００４０】
合成遺伝子。Ｔ．梅毒外膜タンパク質遺伝子ＴＰ１５、ＴＰ１７、及びＴＰ４７を、それぞれ中央データベースＵｎｉＰｒｏｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）で公開される、アミノ酸配列Ｐ１６０５５（アミノ酸１９〜１４１）、Ｐ２９７２２（アミノ酸２３〜１５６）、及びＰ２９７２３（アミノ酸２１〜４３４）に基づき、それぞれ合成した。重合を防止するために、２つのシステイン残基（アミノ酸７及び１１２）をセリンに変異させたことを除いて、ヒト銅亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ（ｈＳＯＤ）遺伝子を、アミノ酸配列Ｐ００４４１（アミノ酸２〜１５４）に基づき合成した。４つ全ての合成遺伝子コドンを、細菌発現のために最適化し、それぞれを、宿主プラスミドｐＵＣ５７上のＥｃｏＲ  Ｖ部位で挿入した。得られるプラスミド、ｐＵＣ５７−１５、ｐＵＣ５７−１７、ｐＵＣ５７−４５、及びｐＵＣ５７−ｈＳＯＤは、それぞれ図２〜５に示される。
【００４１】
４つの合成遺伝子は、終止コドン、及び以下に記載される後続のサブクローニングで使用した、任意の内部Ａｐａ  Ｉ、ＢａｍＨ  Ｉ、Ｂｇｌ  ＩＩ、ＥｃｏＲ  Ｉ、及びＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位を有しない。タグ遺伝子（２６１配列）を有する、又は有しない制限酵素部位を、４つの合成遺伝子に組み込んだ。
【００４２】
発現ベクター及びＴＰダブレット構築。ｐＵＣ５７からのＴＰ遺伝子のそれぞれを、Ｂｇｌ  ＩＩ及びＡｐａ  Ｉによって消化し（得られたＴＰ構築物に関して、図６を参照されたい）、Ｔ５プロモーターを含有した、すでに構築された発現ベクター、ｐＢ１０ＧのＢａｍＨ  Ｉ及びＡｐａ  Ｉ部位（図８を参照されたい）、ＡＴＧ開始部位、並びに特異的制限部位ＥｃｏＲ  Ｉ、ＢａｍＨ  Ｉ、Ａｐａ  Ｉ、及びＨｉｎｄ  ＩＩＩに別々にクローニングした。これは、生成された３つの発現ベクター、ｐＢ１０Ｇ−ＴＰ１５、ｐＢ１０Ｇ−ＴＰ１７、及びｐＢ１０Ｇ−ＴＰ４７（総称的に、それぞれ図９〜１１においてｐＢ１０Ｇ−ＴＰ（１）、ｐＢ１０Ｇ−ＴＰ（２）、及びｐＢ１０Ｇ−ＴＰ（３）として示される）を生成した。遺伝子断片の適合性のあるＢｇｌ  ＩＩ末端、及びプラスミド上のＢａｍＨ  Ｉ末端のライゲーションは、３つ全ての構築物中のＢｇｌ  ＩＩ／ＢａｍＨ  Ｉ制限酵素部位を排除する。ＴＰダブレットをサブクローニングによって作製した。ＴＰダブレットサブクローン（図１３を参照されたい）を構築するために、テンプレートとして第２の抗原発現ベクター、並びに一対の順方向及び逆方向プライマーを使用したＰＣＲ反応によって、ＤＮＡ遺伝子挿入物を産生した。順方向プライマーは、ＴＰ遺伝子の上流、Ｔ５プロモーター領域中に位置する、ＥｃｏＲ  Ｉ部位を覆った。逆方向プライマーは、ＴＰ遺伝子の末端に一致し、Ａｐａ  Ｉ部位をＢｇｌ  ＩＩ部位に変換した。次いで、このＰＣＲ生成物をＥｃｏＲ  Ｉ／Ｂｇｌ  ＩＩで消化し（得られたＴＰ−１構築物に関して、図１２を参照されたい）、別の抗原発現ベクターにクローニングし、それをＥｃｏＲ  Ｉ及びＢａｍＨ  Ｉで切断した。同様に、挿入物の適合性のあるＢｇｌ  ＩＩのライゲーション、及び宿主上のＢａｍＨ  Ｉは、両方の制限酵素部位を排除した。
【００４３】
ＴＰトリプレット構築。６つの最終トリプレット融合遺伝子を産生するために、４つのＴＰダブレットベクター、ｐＢ１０Ｇ−ＴＰ１７−ＴＰ４７、ｐＢ１０Ｇ−ＴＰ１５−ＴＰ４７、ｐＢ１０Ｇ−ＴＰ４７−ＴＰ１５、及びｐＢ１０Ｇ−ＴＰ１７−ＴＰ１５を宿主として使用し、第３のＴＰ遺伝子を、ＴＰダブレットの５’末端、又はＴＰダブレットの３’末端のいずれかで添加した。ＴＰ（１−２）ダブルベクターは、総称的に図１３に示され、ダブレットベクターへの挿入のためのＴＰ（３）構築物は、図１４に示される。３’末端で挿入物を添加するために、テンプレートとして第３の抗原発現ベクター、並びに一対の順方向及び逆方向プライマーを使用したＰＣＲ反応によって、ＤＮＡ遺伝子挿入物を産生した。順方向プライマーは、ＴＰ遺伝子の５’末端に一致し、Ａｐａ  Ｉ部位を含有した。逆方向プライマーは、ＴＰ遺伝子の３’末端に一致し、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ部位を含有した。次いで、このＰＣＲ生成物をＡｐａ  Ｉ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩで消化し、ダブレット発現ベクターにクローニングし、それを適切な制限酵素で切断した。トリプレットｐＢ１０Ｇ−ＴＰ１５−ＴＰ１７−ＴＰ４７、ｐＢ１０Ｇ−ＴＰ１７−ＴＰ１５−ＴＰ４７、及びｐＢ１０Ｇ−ＴＰ４７−ＴＰ１７−ＴＰ１５を、ダブレット５’末端で第３のＴＰ遺伝子を添加することによって作製し、一方で、トリプレットｐＢ１０Ｇ−ＴＰ１５−ＴＰ４７−ＴＰ１７、ｐＢ１０Ｇ−ＴＰ４７−ＴＰ１５−ＴＰ１７、及びｐＢ１０Ｇ−ＴＰ１７−ＴＰ４７−ＴＰ１５を、ダブレット３’末端で第３のＴＰ遺伝子を添加することによって作製した。ダブレット及びトリプレットの作製で使用されるＰＣＲプライマーは、表４、ＰＣＲプライマー、グループＡに記載される。このトリプレット構築物は、総称的に図１５に示される。
【００４４】
ＳＯＤ融合構築を有するＴＰトリプレット。Ｃ−末端ＳＯＤ融合タグを有するＴＰトリプレット（総称的に図１７に示される）を、「２ラウンド」ＰＣＲ及びクローニングによって作製した。Ｃ−末端ＴＰ３をＳＯＤと結び付けるために（ＳＯＤ構築物に関して、図７を参照されたい）、かつクローニングのための制限酵素部位を導入するために、「２ラウンドＰＣＲ」を実施した。ＰＣＲの第１ラウンドは、２つの別々のＰＣＲ反応からなり、一方のＰＣＲ反応における逆方向プライマー（表４、ＰＣＲプライマー、グループＢ）は、他方のＰＣＲ反応における順方向プライマー（表４、ＰＣＲプライマー、グループＣ）を補完する。ＰＣＲの第２ラウンドにおいて、第１ラウンドＰＣＲからの２つの生成物を組み合わせ、入れ子プライマー（表４、ＰＣＲプライマー、グループＤ）の第３のセットで増幅した。順方向プライマーは、ＴＰ３配列に一致し、特異的制限酵素（ＲＥ）部位を含有した。逆方向プライマーは、３’末端ＳＯＤに一致した。２つの終止コドン及びＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位は、新しいＤＮＡ挿入物を作製した（図１６を参照されたい）。ＳＯＤ遺伝子を既存のＴ．梅毒トリプレットと融合させるために、新しいＰＣＲ生成物を消化し、計画された特異的制限部位及びＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位で消化されたｐＢ１０Ｇ−ＴＰトリプレットプラスミドに直接クローニングし、ｐＢ１０Ｇ−ＴＰ（１−２−３）−ＳＯＤを得た（図１７を参照されたい）。本明細書で使用されるＴＰ１、ＴＰ２、及びＴＰ３は、任意の順序で、３つのＴ．梅毒抗原、ＴＰ１５、ＴＰ１７、及びＴＰ４７を表す。したがって、ＴＰ１はＴＰ１５であってもよく、ＴＰ２はＴＰ１７であってもよく、ＴＰ３はＴＰ４７であってもよい。他の組み合わせとしては以下が挙げられる。ＴＰ１はＴＰ１５であってもよく、ＴＰ２はＴＰ４７であってもよく、ＴＰ３はＴＰ１７であってもよい。ＴＰ１はＴＰ１７であってもよく、ＴＰ２はＴＰ１５であってもよく、ＴＰ３はＴＰ４７であってもよい。ＴＰ１はＴＰ１７であってもよく、ＴＰ２はＴＰ４７であってもよく、ＴＰ３はＴＰ１５であってもよい。ＴＰ１はＴＰ４７であってもよく、ＴＰ２はＴＰ１５であってもよく、ＴＰ３はＴＰ１７であってもよい。及びＴＰ１はＴＰ４７であってもよく、ＴＰ２はＴＰ１７であってもよく、ＴＰ３はＴＰ１５であってもよい。
【００４５】
３５回のＰＣＲサイクル：９５℃（１５秒）、５５℃（２０秒）、７２℃（３０秒）の標準配列を使用して、Ｔａｑポリメラーゼで全てのＰＣＲ増幅を実施した。ＰＣＲプライマーのヌクレオチド配列は、表４に記載される。特定のトリプレットの作製における各プライマーの使用が示される。Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲキットプロトコルに従って、全てのＰＣＲ生成物を精製した。全ての制限酵素を、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから購入した。Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮＡミニプレップキットを使用して、プラスミドを調製した。６つの全てのトリプレットコード領域を、ＤＮＡ配列し（配列番号１〜６）、アミノ酸配列を翻訳した（配列番号７〜１２）。
【００４６】
本発明のアッセイは、３つのＴ．梅毒抗原、ＴＰ１５、ＴＰ１７、及びＴＰ４７に対する抗体の測定を提供する。抗原で予め被覆されたマイクロタイタープレート上で、アッセイを実施する。試料は、マイクロタイタープレートウェルに添加し、インキュベートする。Ｔ．梅毒ＩｇＧ／ＩｇＭ特異抗体が存在する場合、ウェル上で予め被覆される抗原と結合し、それによって固定化する。結合した抗体を、直接的な接合抗原サンドイッチ形式（図１８を参照されたい）、あるいはｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ抗ヒトＩｇＧ及びＩｇＭによって検出される間接的形式（図１９を参照されたい）で検出した。
【００４７】
より具体的には、組換えＴＰトリプレットを、捕捉抗原として、ＥＬＩＳＡ高結合プレートウェル表面上で受動的に被覆した。次いで、プレートを１％  ＢＳＡ／ＰＢＳでブロックし、全ての非結合ウェル表面を覆った。梅毒感染患者の血清又は血漿をウェル中に添加し、第１のインキュベーション期間にわたってインキュベートし、試料中のＴ．梅毒抗体（ＩｇＧ、ＩｇＭ、及びＩｇＡ）が、予め被覆されたトリプレット抗原と反応することを可能にした。第１のインキュベーション後、非結合材料を洗い流した。直接アッセイに対して、ＨＲＰ接合組換えＴＰトリプレットが検出器であり、ウェルに添加され、第２のインキュベーション期間にわたってインキュベートされた。第２のインキュベーション後、非結合トリプレット抱合体を洗い流した。ペルオキシダーゼ基質溶液を添加することによって、形成された抗原−ヒトＴ．梅毒抗体（ＩｇＧ／ＩｇＭ）−抗原複合体を測定し、次いで、反応を３０分後に停止し、光学密度を分析のために記録した。間接アッセイに対して、ＨＲＰ接合マウスモノクローナル抗ヒトＩｇＧ及びＨＲＰ接合マウスモノクローナル抗ヒトＩｇＭ混合物が検出器であり、ウェルに添加され、第２のインキュベーション期間にわたってインキュベートされた。第２のインキュベーション後、非結合複合体を洗い流した。ペルオキシダーゼ基質溶液を添加することによって、形成された抗ヒトＩｇＧ／ＩｇＭ−ヒトＴ．梅毒抗体（ＩｇＧ／ＩｇＭ）−抗原複合体を測定し、次いで、反応を３０分後に停止し、光学密度を分析のために記録した。
【００４８】
遺伝子工学的組換えＴ．梅毒トリプレットは、Ｎ末端において、１０個のアミノ酸のリーダー配列（タグ２６１）、及び各ＴＰ抗原間に２〜４つのアミノ酸リンカーを有する。タグ２６１配列は、ヒト胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）から得た。ヒト銅亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ（ｈＳＯＤ）を、Ｔ．梅毒抗原トリプレットのＣ−末端において組み込み、融合タンパク質を形成する。
【００４９】
ｈＳＯＤは、ＨＣＶ、ＨＩＶ等の感染性病原体に対する診断アッセイにおける種々の組換え抗原融合において、すでに使用されてきた。ｈＳＯＤは小型で、低免疫原性ヒト内因性タンパク質であり、約１６ｋＤの分子量で、１５３個のアミノ酸を有する。ｈＳＯＤ中の１１個のリジン残基は、ビオチン化及びＨＲＰ抱合のための追加の抱合部位を提供する。
【実施例】
【００５０】
（実施例Ｉ）
ＥＬＩＳＡアッセイ試薬、形式、及びプロトコル
アッセイ試薬：
・９６ウェルマイクロタイター高結合プレート（Ｃｏｓｔａｒ）
・コーティング緩衝液（１０ｍＭのリン酸、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ  ７．０）、遮断緩衝液（ＰＢＳ中１％のＢＳＡ、ｐＨ  ７．０）、洗浄液（０．０５％のｔｗｅｅｎ−２０を有するＰＢＳ）、試料緩衝液（０．０５％のｔｗｅｅｎ−２０を有するＰＢＳ中のブロッカーカゼイン、Ｐｉｅｒｃｅ）
・ＥＬＩＳＡ標本及び抱合体希釈剤：ＰｉｅｒｃｅからのＰＢＳ中のブロッカーカゼイン。使用前に、Ｔｗｅｅｎ  ２０を０．０５％の最終生成物に添加した。直接アッセイにおいて、ｈＳＯＤ溶解物を、ＨＲＰ接合ＴＰトリプレットと一緒に添加した。
・精製した組換えＴＰトリプレット融合、それらの配列をＤＮＡ塩基配列決定法によって確認した（配列番号１〜６を参照されたい）。タンパク質を原核大腸菌細胞中に発現させた。タンパク質純度を、ＳＤＳ  ＰＡＧＥによって、８７％を超えるように確認した。
・ＨＲＰ（セイヨウワサビペルオキシダーゼ）接合組換えＴＰトリプレット。
１５０ｎｇ／ｍＬ、リン酸、ｐＨ＝７．２、モル濃度＝５０ｍＭ
ＨＲＰ抱合体試薬緩衝液は、Ｈ２Ｏ、Ｋ２ＨＰＯ４（無水）、ＫＨ２ＰＯ４（無水）、ＮａＣｌ、ＢＳＡ液、ＫＦｅＣＮ、ＡＮＳ、Ｔｗｅｅｎ−２０、消泡剤２０４、ＰｒｏＣｌｉｎ  ９５０を含有する
・ＨＲＰ（セイヨウワサビペルオキシダーゼ）接合マウスモノクローナル抗２６１タグ
・ＨＲＰ（セイヨウワサビペルオキシダーゼ）接合マウスモノクローナル抗ヒトＩｇＧ
・ＨＲＰ（セイヨウワサビペルオキシダーゼ）接合マウスモノクローナル抗ヒトＩｇＭ
・ＨＲＰ（セイヨウワサビペルオキシダーゼ）基質タブレット（Ｏ−フェニレンジアミン−２ＨＣｌ）及び溶液及び停止溶液は、Ｏｒｔｈｏ−Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓの一般ＥＬＩＳＡ生成物からの構成成分である。
・標本：梅毒陽性血漿、梅毒陰性血漿、ＳｅｒａＣａｒｅ梅毒混合タイターパネル（ＰＳ  Ｃ２０２）、及びＺｅｐｔｏｍｅｔｒｉｘ梅毒混合タイターパネル（Ｋ−ＺＭＣ００２）
【００５１】
ＥＬＩＳＡアッセイ形式は、直接アッセイ形式及び間接アッセイ形式の両方が図１８及び１９に示される。
【００５２】
ＥＬＩＳＡアッセイプロトコル：プレートコーティング：１）２ｕｇ／ｍＬのＴＰトリプレット融合を含有する、１００ｕＬ／ウェルのコーティング溶液を、２５℃で、１８時間にわたって添加する。２）ウェルを洗浄緩衝液で一回洗浄し、２９０ｕＬ／ウェルの遮断緩衝液を、１時間／２５℃の遮断のために添加した。３）遮断緩衝液が吸引された後、低湿度のインキュベーター中で、４時間を超えてプレートを乾燥させた。４）使用するまで、プレートを気密性の密封バッグ中に入れた。
【００５３】
直接アッセイプロトコル：アッセイ：１）５０ｕＬのカゼイン（ＰＢＳ）標本希釈剤及び５０ｕＬの標本（又は対照）を各ウェルに添加する。プレートを振盪しながら３７℃で３０分間インキュベートした。２）洗浄液での６回の洗浄後、カゼイン（ＰＢＳ）中で希釈された１００ｕＬのＨＲＰ接合ＴＰトリプレット融合を、各ウェルに添加する。プレートを振盪しながら３７℃で３０分間インキュベートした。３）６回の洗浄後、１００ｕＬのＯＰＤ基質を添加し、２５℃で３０分間、暗室でインキュベートする。４）２５ｕＬの停止溶液を添加し、４９２ｎｍで光学密度（ＯＤ）を読み取る。
【００５４】
間接アッセイプロトコル：アッセイ：１）９０ｕＬのカゼイン（ＰＢＳ）標本希釈剤及び１０ｕＬの標本（又は対照）を各ウェルに添加する。プレートを振盪しながら３７℃で１５分間インキュベートした。２）洗浄液での６回の洗浄後、カゼイン（ＰＢＳ）中で希釈されたＨＲＰ−マウスモノクローナル抗ヒトＩｇＧ及びＨＲＰ−マウスモノクローナル抗ヒトＩｇＭを含有する、１００ｕＬのＨＲＰ抱合体混合物を、各ウェルに添加する。プレートを振盪しながら３７℃で１５分間インキュベートした。３）６回の洗浄後、１００ｕＬのＯＰＤ基質を添加し、２５℃で３０分間、暗室でインキュベートする。４）２５ｕＬの停止溶液を添加し、４９２ｎｍで光学密度（ＯＤ）を読み取る。
【００５５】
（実施例ＩＩ）
トリプレット構築物の評価
ＥＬＩＳＡ反応：（１）ウェルを６つのＴＰトリプレットの連続希釈で被覆し、ＰＢＳ中１％のＢＳＡで後被覆する。（２）カゼイン（ＰＢＳ）中で希釈された１００ｕｌのＨＲＰ接合マウスモノクローナル抗２６１タグを、抗原で予め被覆されたウェルに添加し、振盪しながら１５分間、３７℃でインキュベートする。（２）６回洗浄し、１００ｕＬのＯＰＤ基質溶液を添加し、暗室で１５分間、室温でインキュベートする。（４）２５ｕＬの４Ｎ硫酸停止溶液を添加し、４９０ｎｍで読み取る。
【００５６】
表１に示される結果は、ＯＤである。提案されたＴＰトリプレットコーティング濃度を、プレート上で固定化した抗原量を測るための計算から得、抗体アッセイ評価において、プレートコーティングで使用した。
【００５７】
ＥＬＩＳＡ反応：（１）ウェルを表１で定義された濃度で、６つのＴＰトリプレットで被覆し、ＰＢＳ中の１％のＢＳＡで後被覆した。（２）５０ｕＬのカゼイン（ＰＢＳ）及び５０ｕＬのパネル標本を、抗原で予め被覆されたウェルに添加し、振盪しながら１５分間、３７℃でインキュベートする。（３）６回洗浄し、１００ｕＬのＨＲＰ接合ＴＰトリプレット抗原を添加し、振盪しながら１５分間、３７℃でインキュベートする。ＨＲＰ合接抗原は、プレート上で被覆される抗原である。（４）６回洗浄し、１００ｕＬのＯＰＤ基質溶液を添加し、暗室で１５分間、室温でインキュベートする。（４）２５ｕＬの４Ｎ硫酸停止溶液を添加し、４９０ｎｍで読み取る。
【００５８】
表２に示される結果は、Ｓ／Ｃ値であった。Ｓは、ＯＤ信号であり、Ｃは、カットオフであり、３つの陰性対照によって与えられる平均ＯＤの５倍に等しい。
【００５９】
ＥＬＩＳＡ反応：（１）９０ｕＬのカゼイン及び１０ｕＬのパネル試料（正常なヒト血漿中、２倍連続希釈された）を、抗原で予め被覆されたウェルに添加し、振盪しながら１５分間、３７℃でインキュベートする。（２）６回洗浄し、ＨＲＰマウスモノクローナル抗ヒトＩｇＧ及びモノクローナル抗ヒトＩｇＭを含有する１００ｕＬの抱合体混合物を添加し、振盪しながら１５分間、３７℃でインキュベートする。（３）６回洗浄し、１００ｕＬのＯＰＤ基質溶液を添加し、暗室で１５分間、室温でインキュベートする。（４）２５ｕＬの４Ｎ硫酸停止溶液を添加し、４９０ｎｍで読み取る。
【００６０】
表３に示される結果は、正常なヒト血漿によるＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘパネル標本の最終希釈であり（１：Ｘ，Ｘ＝）その希釈において、標本が陽性であると決定した（カットオフを超える信号＞１）。カットオフは、３つの陰性対照によって与えられる平均ＯＤの５倍である。
【００６１】
（実施例ＩＩＩ）
ＶＩＴＲＯＳ（登録商標）梅毒ＴＰＡ試験の詳細
ＴＰ１５−ＴＰ１７−ＴＰ４７トリプレット構築物を使用した、ＶＩＴＲＯＳ（登録商標）梅毒ＴＰＡ試験の原理は、上記に記載され、かつ図１に示される通りである。試薬パック及びキャリブレーターを含むキットが提供される。試薬パックは、１００個の被覆ウェル（ストレプトアビジン、細菌性≧２ｎｇのビオチン／ウェルに結合）、ウシγグロブリン、ウシ血清アルブミン、及び抗菌剤を有する緩衝液中の１３．１ｍＬのビオチン化抗原試薬（ビオチン−組換えＴＰ抗原、０．１５ｕｇ／ｍＬ）、並びにウシ血清アルブミン及び抗菌剤を有する緩衝液中の２０．４ｍＬの抱合体試薬（ＨＲＰ−組換えＴＰ抗原、０．１５ｕｇ／ｍＬ）を含有する。キャリブレーターは、抗菌剤を有するＶＩＴＲＯＳ（登録商標）梅毒ＴＰＡキャリブレーター（ヒト梅毒ＩｇＧ陽性血漿、２．２ｍＬ）を含有する。試験は、各決定のために、２５ｕＬのキャリブレーターを使用する。
【００６２】
試験で使用するための好適な標本は、血清、ヘパリン血漿、ＥＤＴＡ血漿、及びクエン酸血漿である。試験は、各決定のために２５ｕＬの試料（標本）を使用する。
【００６３】
試験はまた、信号試薬（ＶＩＴＲＯＳ（登録商標）Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ等）、洗浄試薬（ＶＩＴＲＯＳ（登録商標）Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｗａｓｈ  Ｒｅａｇｅｎｔ等）、及び品質管理材料（ＶＩＴＲＯＳ（登録商標）Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｓｙｐｈｉｌｉｓ  ＴＰＡ  Ｃｏｎｔｒｏｌ等）を使用する。
【００６４】
試験は、第１の結果に対して３４分間の時間を伴い、１６分間の第１のインキュベーション期間、及び８分間の第２のインキュベーション期間を使用する。試験は、３７℃で実施される。
【００６５】
結果は、ＶＩＴＲＯＳ（登録商標）免疫診断及びＶＩＴＲＯＳ（登録商標）集積システムによって自動的に計算され、「試験試料に対する信号」／「カットオフにおける信号（カットオフ値）」を表す。＜０．８０の結果を有する試料は、「陰性」としてフラグ付けされ、≧０．８０及び＜１．２０の結果を有する試料は、「境界」としてフラグ付けされ、≧１．２０の結果を有する試料は、「反応性」としてフラグ付けされる。陰性は、梅毒トレポネーマによる活性又は以前の感染症を示さず、境界は、試験が、梅毒トレポネーマ感染症が生じたかを決定することが不可能であること、及び試料が再試験されるべきであることを示し、反応性は、梅毒トレポネーマによる活性又は以前の感染症を示す。
【００６６】
（実施例ＩＶ）
ＶＩＴＲＯＳ（登録商標）梅毒ＴＰＡ試験の性能特性
表５を参照すると、ＶＩＴＲＯＳ（登録商標）梅毒ＴＰＡ試験、及び梅毒トレポネーマに対する抗体に対する市販の免疫測定法（「ＩＡ  １」）を使用して、４２９０の試料の集団に対して初期感度及び特異度が評価された。ＶＩＴＲＯＳ（登録商標）梅毒ＴＰＡ試験における初期分析は、９９．９８％（正確には９５％、Ｃｌ  ９９．９〜１００．０％）の境界試料（４０１５／４０１６）を含む、初期特異度をもたらした。境界試料（２６６／２７４）を含む初期感度は、９７．０８％（正確には９５％、Ｃｌ  ９４．３〜９８．７％）であった。１つの（０．０２５％）試料は、ＶＩＴＲＯＳ（登録商標）梅毒ＴＰＡ試験において境界であった。市販の試験法は、境界領域を有さなかった。
【００６７】
表６を参照すると、解釈不可能な試料の分解後の、相対的特異度及び感度が評価された。これは、市販の試験とは分類が異なる試料を含んだ（反応性／陰性）（「不一致」と定義される）。相対的感度及び特異度を決定するために、不一致又は境界結果をもたらした試料（ＶＩＴＲＯＳ（登録商標）あるいはＩＡ  １試験において）を更に試験した。最初に二重でＶＩＴＲＯＳ（登録商標）梅毒ＴＰＡ試験を反復することによって、合計で９つの不一致及び境界試料を更に試験した。合計で９つの不一致及び境界試料は、ＶＩＴＲＯＳ（登録商標）梅毒ＴＰＡ試験における試験を反復した後、ＩＡ  １で不一致のままであった。また、９つの試料を、梅毒トレポネーマに対する抗体に対する、最大で４つの追加の市販アッセイで試験した。次いで、中央ＶＩＴＲＯＳ（登録商標）梅毒ＴＰＡ結果を、他の４つの市販の試験法のコンセンサス分類と比較した。このアルゴリズムを使用して、８つの試料が、梅毒抗体陰性として解決され、１つの試料が、ＶＩＴＲＯＳ（登録商標）梅毒ＴＰＡ試験において境界のままであった。不一致の結果の解決後、ＩＡ  １試験に対するＶＩＴＲＯＳ（登録商標）梅毒ＴＰＡ試験の相対的特異度（４０２３／４０２４）を、９９．９８％（正確にはＣｌ  ９９．９〜１００．０％）、及び相対的感度（２６６／２６６）を１００％（正確にはＣｌ  ９８．６〜１００．０％）と計算した。
【００６８】
表７を参照すると、潜在的に交差反応するサブグループを含有する１４９個の試料が、ＶＩＴＲＯＳ（登録商標）梅毒ＴＰＡ試験、及び市販の試験法（ＥＩＡ  １）において試験された。サブグループは、ＨＡＶ  ＩｇＧ及びＩｇＭ、ＨＢＶ  ＩｇＧ及びＩｇＭ、ＨＣＶ  ＩｇＧ及びＩｇＭ、ＥＢＶ  ＩｇＧ及びＩｇＭ、抗ＨＳＶ  ＩｇＧ及びＩｇＭ、抗ＨＩＶ  １／２  ＩｇＧ及びＩｇＭ、ＣＭＶ  ＩｇＧ及びＩｇＭ、風疹ＩｇＧ及びＩｇＭ、ＡＮＡ／ＳＬＥ、ボレリア・ブルグドルフェリ感染症（欧州及び米国系統）、トキソプラズマ・ゴンディ感染症ＩｇＧ及びＩｇＭ、異好性抗体／ＨＡＭＡ、並びにリウマチ因子を含んだ。特異度（１３７／１３７）は、１００．０％（９５％、Ｃｌ  ９７．３〜１００．０％）であり、感度（１２／１２）は、１００．０％（９５％、Ｃｌ  ７３．５％〜１００．０％）であった。不一致の試料は認められず、全ての結果が、市販の試験法における予測された臨床性能と一致した。したがって、ＶＩＴＲＯＳ（登録商標）梅毒ＴＰＡアッセイと交差反応し、結果の任意の誤分類を引き起こすと認められる試料はなかった。
【００６９】
ＶＩＴＲＯＳ（登録商標）ＥＣｉ／ＥＣｉＱ免疫診断システムにおける精度を評価した。少なくとも２０の異なる日において、１日当たり２つの別の場合において、４つの患者試料プール及び４つの対照試料のそれぞれの２つの複製を試験した。２つの異なるシステムにおいて、２つの試薬ロットを使用して、実験を実施した。ＶＩＴＲＯＳ（登録商標）３６００免疫診断システム、及びＶＩＴＲＯＳ（登録商標）５６００集積システムの精度もまた評価した。少なくとも２０の異なる日において、１日当たり２つの別の場合において、４つの患者試料プール及び４つの対照試料のそれぞれの２つの複製を試験した。各システムにおいて、１つの試薬ロットを使用して、実験を実施した。結果は、分析ラン内で１．６％（範囲０．９〜３．２％）、校正内で４．８％（範囲２．７〜９．０％）、及びラボ内で４．６％（範囲２．１〜９．０％）に平均化される、最大で強い陽性のカットオフにおける試料の精度を示した。したがって、ＶＩＴＲＯＳ（登録商標）梅毒ＴＰＡ試験は、全てのＶＩＴＲＯＳ（登録商標）システムに対して、境界及び反応性範囲にわたって、優れた精度をもたらす。
【００７０】
表８を参照すると、ＶＩＴＲＯＳ（登録商標）梅毒ＴＰＡ試験が、干渉に対して評価された。試験される化合物のうち、示される濃度で試験の臨床的解釈を妨げると認められるものはなかった。
【００７１】
また、ＣＡＰ及びＮＥＱＡＳからの２つのセットの能力試料、並びに２つの市販の性能パネル（Ｚｅｐｔｏｍｅｔｒｉｘ及びＢＢＩ−Ｓｅｒａｃａｒｅ）で、ＶＩＴＲＯＳ（登録商標）梅毒ＴＰＡ試験を評価した。これらの能力試料及び性能パネルによって、１００％の一致が得られた。
【００７２】
ＶＩＴＲＯＳ（登録商標）梅毒ＴＰＡ試験において、試料の種類もまた評価した。５つの正常提供者試料を、血清（ＳＳＴ、凝血活性化因子、及び凝血ガラス管上）、ヘパリン血漿（リチウム及びナトリウム）、ＥＤＴＡ血漿、並びにクエン酸血漿として採取した。５つの他の提供者から、５０ｍＬの全血を採取した。これを梅毒反応性血漿と混合し、梅毒反応性提供者を模倣するために、上記のものと同じ種類の管に入れた。試料種類の間のバイアスを評価した。血清と比較して試料種類間で大きな差は認められなかった。クエン酸試料に対して、血清に対する回収は、クエン酸の希釈効果のため低かった。これらの試料を使用した安定性研究は、用量結果の有意な損失又は臨床的分類の変化なく、試料が２〜８℃で７日間、及び−２０℃で４週間保管され得ることを実証した。
【００７３】
全ての性能特性を考慮すると、ＶＩＴＲＯＳ（登録商標）梅毒ＴＰＡ試験は、良好な分析及び臨床性能を、高速自動連続ランダムアクセス免疫測定法の操作の単純さと組み合わせる。
【００７４】
本発明の特定の実施形態が示されてきたが、当然のことながら、特に上記の教示を考慮して、当業者によって修正が行われ得ることから、本発明がそれに限定されないことが理解されるであろう。妥当な変更及び修正が、本発明の精神から逸脱することなく、本発明の上記の開示の範囲内で可能である。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【００７５】
〔実施の態様〕
（１）  梅毒トレポネーマトリプレット抗原をコード化する、組換えプラスミドであって、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、及び配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列をコード化する、核酸を含む、組換えプラスミド。
（２）  前記アミノ酸配列が、配列番号７である、実施態様１に記載の組換えプラスミド。
（３）  前記アミノ酸配列が、配列番号８である、実施態様１に記載の組換えプラスミド。
（４）  前記アミノ酸配列が、配列番号９である、実施態様１に記載の組換えプラスミド。
（５）  前記アミノ酸配列が、配列番号１０である、実施態様１に記載の組換えプラスミド。
【００７６】
（６）  前記アミノ酸配列が、配列番号１１である、実施態様１に記載の組換えプラスミド。
（７）  前記アミノ酸配列が、配列番号１２である、実施態様１に記載の組換えプラスミド。
（８）  前記核酸が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、及び配列番号６からなる群から選択される、ヌクレオチド配列を有する、実施態様１に記載の組換えプラスミド。
（９）  前記核酸が、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有する、実施態様１に記載の組換えプラスミド。
（１０）  前記核酸が、配列番号２に示されるヌクレオチド配列を有する、実施態様１に記載の組換えプラスミド。
【００７７】
（１１）  前記核酸が、配列番号３に示されるヌクレオチド配列を有する、実施態様１に記載の組換えプラスミド。
（１２）  前記核酸が、配列番号４に示されるヌクレオチド配列を有する、実施態様１に記載の組換えプラスミド。
（１３）  前記核酸が、配列番号５に示されるヌクレオチド配列を有する、実施態様１に記載の組換えプラスミド。
（１４）  前記核酸が、配列番号６に示されるヌクレオチド配列を有する、実施態様１に記載の組換えプラスミド。
（１５）  実施態様１に記載の組換えプラスミドを含む、宿主細胞。
【００７８】
（１６）  前記宿主細胞が、大腸菌である、実施態様１５に記載の宿主細胞。
（１７）  梅毒トレポネーマトリプレット抗原を産生する方法であって、前記梅毒トレポネーマトリプレット抗原の発現に好適な条件下で、実施態様１５に記載の宿主細胞を培養することと、前記細胞培養物から前記梅毒トレポネーマトリプレット抗原を回収することと、を含む、方法。
（１８）  梅毒トレポネーマトリプレット抗原をコード化する組換えプラスミドであって、
ｐ２６１ｎＳ−ＴＰ１７−１５−４７に指定され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１５９０としてアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託されている、プラスミド、
ｐ２６１ｎＳ−ＴＰ４７−１７−１５に指定され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１５８９としてアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託されている、プラスミド、
ｐ２６１ｎＳ−ＴＰ１７−４７−１５に指定されている、プラスミド、
ｐ２６１ｎＳ−ＴＰ４７−１５−１７に指定されている、プラスミド、
ｐ２６１ｎＳ−ＴＰ１５−１７−４７に指定されている、プラスミド、及び
ｐ２６１ｎＳ−ＴＰ１５−４７−１７に指定されている、プラスミド、からなる群から選択される、組換えプラスミド。
（１９）  ｐ２６１ｎＳ−ＴＰ１７−１５−４７に指定され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１５９０としてアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託されている、実施態様１８に記載の組換えプラスミド。
（２０）  ｐ２６１ｎＳ−ＴＰ４７−１７−１５に指定され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１５８９としてアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託されている、実施態様１８に記載の組換えプラスミド。
【００７９】
（２１）  ｐ２６１ｎＳ−ＴＰ１７−４７−１５に指定されている、実施態様１８に記載の組換えプラスミド。
（２２）  ｐ２６１ｎＳ−ＴＰ４７−１５−１７に指定されている、実施態様１８に記載の組換えプラスミド。
（２３）  ｐ２６１ｎＳ−ＴＰ１５−１７−４７に指定されている、実施態様１８に記載の組換えプラスミド。
（２４）  ｐ２６１ｎＳ−ＴＰ１５−４７−１７に指定されている、実施態様１８に記載の組換えプラスミド。
（２５）  実施態様１８に記載の組換えプラスミドを含む、宿主細胞。
【００８０】
（２６）  前記宿主細胞が、大腸菌である、実施態様２５に記載の宿主細胞。
（２７）  梅毒トレポネーマトリプレット抗原を産生する方法であって、前記梅毒トレポネーマトリプレット抗原の発現に好適な条件下で、実施態様２５に記載の宿主細胞を培養することと、前記細胞培養物から前記梅毒トレポネーマトリプレット抗原を回収することと、を含む、方法。
（２８）  配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、及び配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、梅毒トレポネーマトリプレット抗原。
（２９）  配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する、実施態様２８に記載の梅毒トレポネーマトリプレット抗原。
（３０）  配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する、実施態様２８に記載の梅毒トレポネーマトリプレット抗原。
【００８１】
（３１）  配列番号９に示されるアミノ酸配列を有する、実施態様２８に記載の梅毒トレポネーマトリプレット抗原。
（３２）  配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有する、実施態様２８に記載の梅毒トレポネーマトリプレット抗原。
（３３）  配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有する、実施態様２８に記載の梅毒トレポネーマトリプレット抗原。
（３４）  配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する、実施態様２８に記載の梅毒トレポネーマトリプレット抗原。
（３５）  検出可能なマーカーで標識される、実施態様２８に記載の梅毒トレポネーマトリプレット抗原。
【００８２】
（３６）  前記検出可能なマーカーが、セイヨウワサビペルオキシダーゼである、実施態様３５に記載の梅毒トレポネーマトリプレット抗原。
（３７）  試料中の梅毒トレポネーマ抗体の存在を検出する方法であって、
前記試料を、実施態様２８に記載の梅毒トレポネーマトリプレット抗原と接触させることであって、前記試料中に存在する梅毒トレポネーマ抗体が、前記梅毒トレポネーマトリプレット抗原と結合し、抗体／抗原複合体を形成する、ことと、
前記抗体／抗原複合体を検出し、それにより、梅毒トレポネーマ抗体の存在を検出することと、を含む、方法。
（３８）  前記梅毒トレポネーマトリプレット抗原が、固体支持体上で固定化される、実施態様３７に記載の方法。
（３９）  前記抗体／抗原複合体を検出することが、
前記抗体／抗原複合体を、実施態様２８に記載の第２の梅毒トレポネーマトリプレット抗原と接触させることであって、前記第２の梅毒トレポネーマトリプレット抗原が、検出可能なマーカーで標識され、前記第２の梅毒トレポネーマトリプレット抗原が、前記抗体／抗原複合体中に存在する抗体と結合し、抗原／抗体／標識抗原複合体を形成する、ことと、
前記抗原／抗体／標識抗原複合体を検出し、それにより、梅毒トレポネーマ抗体の存在を検出することと、を含む、実施態様３７に記載の方法。
（４０）  前記抗体／抗原複合体を検出することが、
前記抗体／抗原複合体を、標識抗ヒト抗体と接触させることであって、前記標識抗ヒト抗体が、前記抗体／抗原複合体中に存在する前記抗体と結合し、抗原／抗体／標識抗抗体複合体を形成する、ことと、
前記抗原／抗体／標識抗抗体複合体を検出し、それにより、梅毒トレポネーマ抗体の存在を検出することと、を含む、実施態様３７に記載の方法。
【００８３】
（４１）  梅毒トレポネーマ抗体の検出のためのキットの構成要素であって、実施態様２８に記載の梅毒トレポネーマトリプレット抗原を含む、構成要素。
（４２）  梅毒トレポネーマ抗体の検出のためのキットであって、
実施態様２８に記載の梅毒トレポネーマトリプレット抗原と、
実施態様２８に記載の第２の梅毒トレポネーマトリプレット抗原であって、検出可能なマーカーで標識される、第２の梅毒トレポネーマトリプレット抗原と、を含む、キット。
（４３）  陽性又は陰性対照を更に含む、実施態様４２に記載のキット。
（４４）  校正試料を更に含む、実施態様４２に記載のキット。
（４５）  酵素抱合体、酵素抱合体の基質、緩衝溶液、及び洗浄液のうちの１つ又は２つ以上を更に含む、実施態様４２に記載のキット。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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