(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験サンプルにおける甲状腺ホルモン阻害免疫グロブリン（ＴＢＩ）を検出するための方法であって、
ａ）
ｉ）１つ以上の発現ベクターにより安定してトランスフェクトされたトランスジェニック細胞であって、該発現ベクターは、
１）レポーターをコードする第１のヌクレオチド配列であって、該第１のヌクレオチド配列は、ｃＡＭＰ誘導性プロモーターに対して作動可能に連結されている、第１のヌクレオチド配列、および
２）キメラＴＳＨ受容体（ＴＳＨＲ）をコードする第２のヌクレオチド配列であって、該第２のヌクレオチド配列は、配列番号２を含み、かつ、構成的プロモーターに対して作動可能に連結されている、第２のヌクレオチド配列
を含み、該細胞が、細胞膜上に該キメラＴＳＨＲを発現する、トランスジェニック細胞、
ｉｉ）該ＴＳＨＲに結合すると該キメラＴＳＨＲを刺激する甲状腺刺激ポリペプチドであって、該甲状腺刺激ポリペプチドは、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、甲状腺刺激モノクローナル抗体、および、甲状腺刺激ポリクローナル抗体からなる群より選択される、甲状腺刺激ポリペプチド、ならびに
ｉｉｉ）サンプルであって、該サンプルが、コントロールサンプル、または試験サンプルである、サンプル、
を組み合わせるステップであって、
該トランスジェニック細胞および該ＴＳＨを、
Ａ）該コントロールサンプルと組み合わせると第１のサンプルが生成し、および
Ｂ）該試験サンプルと組み合わせると第２のサンプルが生成し、そして、
該組み合わせるステップが、該キメラＴＳＨＲに対する該ＴＳＨの結合のための条件下にある、ステップ、ならびに
ｂ）該第１のサンプルおよび該第２のサンプルにおける該レポーターの発現のレベルを測定するステップであって、該第１のサンプルと比較して、該第２のサンプルにおいて、該レポーターの発現のレベルが低下していることが、該試験サンプルにおけるＴＢＩの存在を示す、ステップを含む方法。
【請求項２】
ＴＢＩを検出する前記方法が、前記キメラＴＳＨＲを発現する前記トランスジェニック細胞を、野生型ＴＳＨＲを発現する細胞で置換するステップを含む前記方法においてＴＢＩを検出する場合のＴＢＩ  ＩＣ５０の５〜１５分の１のＴＢＩ  ＩＣ５０を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＴＢＩを検出する前記方法が、抗ＴＢＩモノクローナル抗体とのＴＢＩの特異的な結合を検出するステップを含む方法においてＴＢＩを検出する場合のＴＢＩ  ＩＣ５０の１０〜３０分の１のＴＢＩ  ＩＣ５０を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記方法が、前記第１のサンプルと比較して、前記第２のサンプルにおいて、前記レポーターの発現のレベルが低下していることを検出するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記方法が、
ａ）前記試験サンプルと組み合わせた後の前記レポーターの発現のレベルを、
ｂ）それぞれが既知濃度のＴＳＨを含有する１つ以上の標準サンプルと前記トランスジェニック細胞を組み合わせた後の該レポーターの発現のレベルと
比較することによって、該試験サンプルにおけるＴＢＩのレベルを決定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記方法が、ＴＢＩ特異的である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＴＳＨが、１００ｍＩＵ／ｍｌ未満の濃度を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記レポーターの前記発現が、生物発光タンパク質の発現を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記生物発光タンパク質が、レニラルシフェラーゼアミノ酸配列の配列番号０３を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記トランスジェニック細胞が、ＣＨＯ細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＴＳＨが、甲状腺刺激モノクローナル抗体で置き換えられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＴＳＨが、甲状腺刺激ポリクローナル抗体で置き換えられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
サンプルにおける甲状腺ホルモン阻害免疫グロブリン（ＴＢＩ）および甲状腺ホルモン刺激免疫グロブリン（ＴＳＩ）を検出するための方法であって、
ａ）
ｉ）１つ以上の発現ベクターにより安定してトランスフェクトされたトランスジェニック細胞であって、該発現ベクターは、
１）レポーターをコードする第１のヌクレオチド配列であって、該第１のヌクレオチド配列は、ｃＡＭＰ誘導性プロモーターに対して作動可能に連結されている、第１のヌクレオチド配列、および
２）キメラＴＳＨ受容体（ＴＳＨＲ）をコードする第２のヌクレオチド配列であって、該第２のヌクレオチド配列は、配列番号２を含み、かつ、構成的プロモーターに対して作動可能に連結されている、第２のヌクレオチド配列
を含み、該細胞が、細胞膜上にキメラＴＳＨＲを発現する、トランスジェニック細胞、
ｉｉ）甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、
ｉｉｉ）コントロールサンプル、または試験サンプル、
を組み合わせるステップであって、
該トランスジェニック細胞および該ＴＳＨを、
Ａ）該コントロールサンプルと組み合わせると第１のサンプルが生成し、および
Ｂ）該試験サンプルと組み合わせると第２のサンプルが生成し、そして、
該組み合わせるステップが、該キメラＴＳＨＲに対する該ＴＳＨの結合のための条件下にある、ステップ、ならびに
ｂ）該組み合わせる前および該組み合わせた後の、該トランスジェニック細胞における該レポーターの発現のレベルを測定するステップであって、
ｉ）該第１のサンプルと比較して、該第２のサンプルにおいて、該レポーターの発現のレベルが低下していることが、該試験サンプルにおけるＴＢＩの存在を示し、
ｉｉ）該第１のサンプルと比較して、該第２のサンプルにおいて、該レポーターの発現のレベルが上昇していることが、該試験サンプルにおけるＴＳＩの存在を示す、ステップを含む方法。
【請求項１４】
前記方法が、前記第１のサンプルと比較して、前記第２のサンプルにおいて、前記レポーターの発現のレベルが低下していることを検出するステップをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記トランスジェニック細胞が、ＣＨＯ細胞を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
キットであって、
ａ）１つ以上の発現ベクターにより安定してトランスフェクトされたトランスジェニック細胞であって、該発現ベクターは、
ｉ）ｃＡＭＰ誘導性プロモーターに対して作動可能に連結されたレポーター遺伝子および
ｉｉ）配列番号２を含み、かつ、構成的プロモーターに対して作動可能に連結されたキメラＴＳＨ受容体（ＴＳＨＲ）遺伝子
を含み、該細胞が、細胞膜上にキメラＴＳＨＲを発現する、トランスジェニック細胞、ならびに
ｂ）甲状腺ホルモン阻害免疫グロブリン（ＴＢＩ）を検出するために該トランスジェニック細胞を使用するための説明書であって、該説明書が、
Ａ）
ｉ）１つ以上の発現ベクターにより安定してトランスフェクトされたトランスジェニック細胞であって、該発現ベクターは、
１）レポーターをコードする第１のヌクレオチド配列であって、該第１のヌクレオチド配列は、ｃＡＭＰ誘導性プロモーターに対して作動可能に連結されている、第１のヌクレオチド配列、および
２）キメラＴＳＨ受容体（ＴＳＨＲ）をコードする第２のヌクレオチド配列であって、該第２のヌクレオチド配列は、配列番号２を含み、かつ、構成的プロモーターに対して作動可能に連結されている、第２のヌクレオチド配列
を含み、該細胞が、細胞膜上に該キメラＴＳＨＲを発現する、トランスジェニック細胞、
ｉｉ）該ＴＳＨＲに結合すると該キメラＴＳＨＲを刺激する甲状腺刺激ポリペプチドであって、該甲状腺刺激ポリペプチドは、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、甲状腺刺激モノクローナル抗体、および、甲状腺刺激ポリクローナル抗体からなる群より選択される、甲状腺刺激ポリペプチド、ならびに
ｉｉｉ）サンプルであって、該サンプルが、コントロールサンプル、または試験サンプルである、サンプル、
を組み合わせることであって、
該トランスジェニック細胞および該ＴＳＨを、
ａ）該コントロールサンプルと組み合わせると第１のサンプルが生成し、および
ｂ）該試験サンプルと組み合わせると第２のサンプルが生成し、そして、
該組み合わせることが、該キメラＴＳＨＲに対する該ＴＳＨの結合のための条件下にある、こと、ならびに
Ｂ）該第１のサンプルおよび該第２のサンプルにおける該レポーターの発現のレベルを測定することであって、該第１のサンプルと比較して、該第２のサンプルにおいて、該レポーターの発現のレベルが低下していることが、該試験サンプルにおけるＴＢＩの存在を示す、こと
のための指示を含む、説明書
を備えるキット。
【請求項１７】
前記キットが、甲状腺ホルモン阻害免疫グロブリン（ＴＢＩ）を含有するポジティブコントロールサンプルをさらに含む、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
前記キットが、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）をさらに含む、請求項１６に記載のキット。
【請求項１９】
前記キットが、サンプルにおける甲状腺ホルモン刺激免疫グロブリン（ＴＳＩ）を検出するための説明書をさらに含む、請求項１６に記載のキット。
【請求項２０】
前記キットが、甲状腺ホルモン刺激免疫グロブリン（ＴＳＩ）を含有するポジティブコントロールサンプルをさらに含む、請求項１９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、甲状腺ホルモン阻害免疫グロブリン（ｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）（ＴＢＩ）を検出するための組成物および方法を提供する。本発明の方法は、ＴＢＩに対して高感度であり、かつ特異的であり、ＴＢＩおよび甲状腺刺激免疫グロブリン（ＴＳＩ）の両方の二重検出に使用されてもよい。本発明の組成物および方法は、ＴＢＩおよび／またはＴＳＩの存在と関連する疾患の診断に、疾患および／または処置レジメン、治療薬、ワクチンなどの進行をモニターするのに、ならびに臨床医が処置決定を下すのを支援するのに有用である。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
かなりの数の人口が、グレーブス病、橋本甲状腺炎、甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症（新生児甲状腺機能低下症を含む）、非甲状腺腫性甲状腺機能低下症、甲状腺機能正常または甲状腺機能低下自己免疫性甲状腺炎、原発性粘液水腫、および特発性粘液水腫を含む甲状腺疾患に罹患している。これらの疾患は、甲状腺上に存在する受容体を認識し、かつそれらに結合する自己抗体（甲状腺阻害免疫グロブリン（ＴＢＩ）および／または甲状腺刺激免疫グロブリン（ＴＳＩ））の作用を伴い、甲状腺ホルモンの産生における望ましくない変化をもたらす。
【０００３】
診断技術は、これらの疾患のうちのいくつかに利用可能であるが、これらの技術は、それにもかかわらず、扱いにくく、骨が折れ、十分な感度および／または特異度を欠く。
【０００４】
したがって、高感度でありかつ特異的であるならびにＴＢＩおよびＴＳＩの両方の二重検出に使用されてもよい、甲状腺ホルモン阻害免疫グロブリン（ＴＢＩ）および／または甲状腺刺激免疫グロブリン（ＴＳＩ）を検出するための組成物および方法についての必要性が残っている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の概要
本発明は、試験サンプルにおける甲状腺ホルモン阻害免疫グロブリン（ＴＢＩ）を検出するための方法であって、ａ）ｉ）１つ以上の発現ベクターにより安定してトランスフェクトされたトランスジェニック細胞であって、該発現ベクターは、１）ｃＡＭＰ誘導性プロモーターに対して作動可能に連結されたレポーター遺伝子および２）構成的プロモーターに対して作動可能に連結されたキメラＴＳＨ受容体（ＴＳＨＲ）遺伝子を含み、であって、該細胞が、細胞膜上にキメラＴＳＨＲを発現する、トランスジェニック細胞、ｉｉ）甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、ｉｉｉ）コントロールサンプル、ならびにｉｖ）試験サンプル、を提供するステップ、ｂ）トランスジェニック細胞およびＴＳＨを、ｉ）該コントロールサンプルと接触させて第１のサンプルを生成し、およびｉｉ）該第２のサンプルをもたらす試験サンプルと接触させて第２のサンプルを生成するステップであって、該接触が、該キメラＴＳＨＲに対する該ＴＳＨの結合のための条件下にある、ステップ、ならびにｃ）該第１のサンプルおよび該第２のサンプルにおける該レポーター遺伝子の発現のレベルを測定するステップであって、該第１のサンプルと比較して、該第２のサンプルにおいて、該レポーター遺伝子の発現のレベルが低下していることが、該試験サンプルにおけるＴＢＩの存在を示す、ステップを含む方法を提供する。一実施形態において、ＴＢＩを検出する方法が、キメラＴＳＨＲを発現するトランスジェニック細胞を野生型ＴＳＨＲを発現する細胞で置換するステップを含む方法においてＴＢＩを検出する場合のＴＢＩ  ＩＣ５０の５〜１５分の一のＴＢＩ  ＩＣ５０を有する。他の実施形態において、ＴＢＩを検出する方法が、抗ＴＢＩモノクローナル抗体とＴＢＩの特異的な結合を検出するステップを含む方法においてＴＢＩを検出する場合のＴＢＩ  ＩＣ５０の１０〜３０分の一のＴＢＩ  ＩＣ５０を有する。さらなる実施形態において、方法が、第１のサンプルと比較して、第２のサンプルにおいて、レポーター遺伝子の発現のレベルが低下していることを検出するステップをさらに含む。さらに他の実施形態において、方法が、ａ）試験サンプルと接触させた後のレポーター遺伝子の発現のレベルを、ｂ）それぞれが既知濃度のＴＳＨを含有する１つ以上の標準サンプルとトランスジェニック細胞を接触させた後のレポーター遺伝子の発現のレベルと比較することによって、試験サンプルにおけるＴＢＩのレベルを決定するステップをさらに含む。さらなる実施形態において、方法が、ＴＢＩ特異的である。他の実施形態において、ＴＳＨが、１００ｍＩＵ／ｍｌ未満の濃度を有する。代替の実施形態において、レポーター遺伝子の発現が、生物発光タンパク質の発現を含む。さらなる実施形態において、生物発光タンパク質が、レニラルシフェラーゼアミノ酸配列の配列番号０３を含む。他の実施形態において、トランスジェニック細胞が、ＣＨＯ−ＭＣ４細胞およびＲＤ−ＭＣ４細胞から選択される細胞を含む。いくつかの実施形態において、ＴＳＨが、甲状腺刺激モノクローナル抗体および／または甲状腺刺激ポリクローナル抗体で置き換えられる。
【０００６】
本発明は、試験サンプルにおける甲状腺ホルモン阻害免疫グロブリン（ＴＢＩ）および甲状腺ホルモン刺激免疫グロブリン（ｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）（ＴＳＩ）を検出するための方法であって、ａ）ｉ）１つ以上の発現ベクターにより安定してトランスフェクトされたトランスジェニック細胞であって、該発現ベクターが、１）ｃＡＭＰ誘導性プロモーターに対して作動可能に連結されたレポーター遺伝子および２）構成的プロモーターに対して作動可能に連結されたキメラＴＳＨ受容体（ＴＳＨＲ）遺伝子を含み、該細胞が、細胞膜上にキメラＴＳＨＲを発現する、トランスジェニック細胞、ｉｉ）甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、ｉｉｉ）コントロールサンプル、ならびにｉｖ）試験サンプル、を提供するステップ、ｂ）該トランスジェニック細胞および該ＴＳＨを、ｉ）該コントロールサンプルと接触させて、第１のサンプルを生成し、およびｉｉ）該試験サンプルと接触させて、第２のサンプルを生成するステップであって、該接触が、該キメラＴＳＨＲに対する該ＴＳＨの結合のための条件下にある、ステップ、ならびにｃ）該接触前および該接触後の、該トランスジェニック細胞における該レポーター遺伝子の発現のレベルを測定するステップであって、ｉ）該第１のサンプルと比較して、該第２のサンプルにおいて、該レポーター遺伝子の発現のレベルが低下していることが、該試験サンプルにおけるＴＢＩの存在を示し、ｉｉ）該第１のサンプルと比較して、該第２のサンプルにおいて、該レポーター遺伝子の発現のレベルが上昇していることが、該試験サンプルにおけるＴＳＩの存在を示す、ステップを含む方法をさらに提供する。一実施形態において、前記方法が、第１のサンプルと比較して、第２のサンプルにおいて、レポーター遺伝子の発現のレベルが低下していることを検出するステップをさらに含む。特定の実施形態において、トランスジェニック細胞が、ＣＨＯ−ＭＣ４細胞およびＲＤ−ＭＣ４細胞から選択される細胞を含む。
【０００７】
キットであって、ａ）１つ以上の発現ベクターにより安定してトランスフェクトされたトランスジェニック細胞であって、該発現ベクターは、ｉ）ｃＡＭＰ誘導性プロモーターに対して作動可能に連結されたレポーター遺伝子およびｉｉ）構成的プロモーターに対して作動可能に連結されたキメラＴＳＨ受容体（ＴＳＨＲ）遺伝子を含み、該細胞が、細胞膜上にキメラＴＳＨＲを発現する、トランスジェニック細胞、ならびにｂ）甲状腺ホルモン阻害免疫グロブリン（ＴＢＩ）を検出するために該トランスジェニック細胞を使用するための説明書を備えるキットもまた、本明細書において提供される。一実施形態において、キットが、甲状腺ホルモン阻害免疫グロブリン（ＴＢＩ）を含有するポジティブコント
ロールサンプルをさらに含む。他の実施形態において、キットが、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）をさらに含む。さらなる実施形態において、キットが、試験サンプルにおける甲状腺ホルモン刺激免疫グロブリン（ＴＳＩ）を検出するための説明書をさらに含む。他の実施形態において、キットが、甲状腺ホルモン刺激免疫グロブリン（ＴＳＩ）を含有するポジティブコントロールサンプルをさらに含む。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
試験サンプルにおける甲状腺ホルモン阻害免疫グロブリン（ＴＢＩ）を検出するための方法であって、
ａ）
ｉ）１つ以上の発現ベクターにより安定してトランスフェクトされたトランスジェニック細胞であって、該発現ベクターは、
１）ｃＡＭＰ誘導性プロモーターに対して作動可能に連結されたレポーター遺伝子、および
２）構成的プロモーターに対して作動可能に連結されたキメラＴＳＨ受容体（ＴＳＨＲ）遺伝子
を含み、該細胞が、細胞膜上にキメラＴＳＨＲを発現する、トランスジェニック細胞、
ｉｉ）甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、
ｉｉｉ）コントロールサンプル、ならびに
ｉｖ）試験サンプル、
を提供するステップ、
ｂ）前記トランスジェニック細胞および前記ＴＳＨを、
ｉ）該コントロールサンプルと接触させて第１のサンプルを生成し、および
ｉｉ）該試験サンプルと接触させて第２のサンプルを生成するステップであって、
該接触が、該キメラＴＳＨＲに対する該ＴＳＨの結合のための条件下にある、ステップ、ならびに
ｃ）該第１のサンプルおよび該第２のサンプルにおける該レポーター遺伝子の発現のレベルを測定するステップであって、該第１のサンプルと比較して、該第２のサンプルにおいて、該レポーター遺伝子の発現のレベルが低下していることが、該試験サンプルにおけるＴＢＩの存在を示す、ステップを含む方法。
（項目２）
ＴＢＩを検出する前記方法が、前記キメラＴＳＨＲを発現する前記トランスジェニック細胞を、野生型ＴＳＨＲを発現する細胞で置換するステップを含む前記方法においてＴＢＩを検出する場合のＴＢＩ  ＩＣ５０の５〜１５分の一の該ＴＢＩ  ＩＣ５０を有する、項目１に記載の方法。
（項目３）
ＴＢＩを検出する前記方法が、抗ＴＢＩモノクローナル抗体とのＴＢＩの特異的な結合を検出するステップを含む方法においてＴＢＩを検出する場合のＴＢＩ  ＩＣ５０の１０〜３０分の一のＴＢＩ  ＩＣ５０を有する、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記方法が、前記第１のサンプルと比較して、前記第２のサンプルにおいて、前記レポーター遺伝子の発現のレベルが低下していることを検出するステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記方法が、
ａ）前記試験サンプルとの前記接触の後の前記レポーター遺伝子の発現のレベルを、
ｂ）それぞれが既知濃度のＴＳＨを含有する１つ以上の標準サンプルと前記トランスジェニック細胞を接触させた後の該レポーター遺伝子の発現のレベルと
比較することによって、該試験サンプルにおけるＴＢＩのレベルを決定するステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記方法が、ＴＢＩ特異的である、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記ＴＳＨが、１００ｍＩＵ／ｍｌ未満の濃度を有する、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記レポーター遺伝子の前記発現が、生物発光タンパク質の発現を含む、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記生物発光タンパク質が、レニラルシフェラーゼアミノ酸配列の配列番号０３を含む、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記トランスジェニック細胞が、ＣＨＯ−ＭＣ４細胞およびＲＤ−ＭＣ４細胞からなる群から選択される細胞を含む、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記ＴＳＨが、甲状腺刺激モノクローナル抗体で置き換えられる、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記ＴＳＨが、甲状腺刺激ポリクローナル抗体で置き換えられる、項目１に記載の方法。
（項目１３）
試験サンプルにおける甲状腺ホルモン阻害免疫グロブリン（ＴＢＩ）および甲状腺ホルモン刺激免疫グロブリン（ＴＳＩ）を検出するための方法であって、
ａ）
ｉ）１つ以上の発現ベクターにより安定してトランスフェクトされたトランスジェニック細胞であって、該発現ベクターは、
１）ｃＡＭＰ誘導性プロモーターに対して作動可能に連結されたレポーター遺伝子および
２）構成的プロモーターに対して作動可能に連結されたキメラＴＳＨ受容体（ＴＳＨＲ）遺伝子を含み、該細胞が、細胞膜上にキメラＴＳＨＲを発現する、トランスジェニック細胞、
ｉｉ）甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、
ｉｉｉ）コントロールサンプル、ならびに
ｉｖ）試験サンプル、
を提供するステップ、
ｂ）該トランスジェニック細胞および該ＴＳＨを、
ｉ）該コントロールサンプルと接触させて、第１のサンプルを生成し、および
ｉｉ）該試験サンプルと接触させて、第２のサンプルを生成するステップであって、
該接触が、該キメラＴＳＨＲに対する該ＴＳＨの結合のための条件下にある、ステップ、ならびに
ｃ）該接触前および該接触後の、該トランスジェニック細胞における該レポーター遺伝子の発現のレベルを測定するステップであって、
ｉ）該第１のサンプルと比較して、該第２のサンプルにおいて、該レポーター遺伝子の発現のレベルが低下していることが、該試験サンプルにおけるＴＢＩの存在を示し、
ｉｉ）該第１のサンプルと比較して、該第２のサンプルにおいて、該レポーター遺伝子の発現のレベルが上昇していることが、該試験サンプルにおけるＴＳＩの存在を示す、ステップを含む方法。
（項目１４）
前記方法が、前記第１のサンプルと比較して、前記第２のサンプルにおいて、前記レポーター遺伝子の発現のレベルが低下していることを検出するステップをさらに含む、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記トランスジェニック細胞が、ＣＨＯ−ＭＣ４細胞およびＲＤ−ＭＣ４細胞からなる群から選択される細胞を含む、項目１３に記載の方法。
（項目１６）
キットであって、
ａ）１つ以上の発現ベクターにより安定してトランスフェクトされたトランスジェニック細胞であって、該発現ベクターは、
ｉ）ｃＡＭＰ誘導性プロモーターに対して作動可能に連結されたレポーター遺伝子および
ｉｉ）構成的プロモーターに対して作動可能に連結されたキメラＴＳＨ受容体（ＴＳＨＲ）遺伝子を含み、該細胞が、細胞膜上にキメラＴＳＨＲを発現する、トランスジェニック細胞、ならびに
ｂ）甲状腺ホルモン阻害免疫グロブリン（ＴＢＩ）を検出するために該トランスジェニック細胞を使用するための説明書
を備えるキット。
（項目１７）
前記キットが、甲状腺ホルモン阻害免疫グロブリン（ＴＢＩ）を含有するポジティブコントロールサンプルをさらに含む、項目１６に記載のキット。
（項目１８）
前記キットが、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）をさらに含む、項目１６に記載のキット。
（項目１９）
前記キットが、試験サンプルにおける甲状腺ホルモン刺激免疫グロブリン（ＴＳＩ）を検出するための説明書をさらに含む、項目１６に記載のキット。
（項目２０）
前記キットが、甲状腺ホルモン刺激免疫グロブリン（ＴＳＩ）を含有するポジティブコントロールサンプルをさらに含む、項目１９に記載のキット。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、ＣＨＯ−ＭＣ４細胞を使用する、ｂＴＳＨ用量応答曲線を示す。
【図２−１】図２は、（Ａ）７３０アミノ酸残基を含有するキメラＴＳＨＲのアミノ酸配列（配列番号０１）、（Ｂ）終止コドンを含む、２１９３塩基を含有するキメラＴＳＨＲのＤＮＡ配列（配列番号０２）、（Ｃ）５５０アミノ酸を含有するレニラルシフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号０３）、および（Ｄ）終止コドンを含む、１６５３塩基を含有するキメラＴＳＨＲのＤＮＡ配列（配列番号０４）を示す。
【図２−２】図２は、（Ａ）７３０アミノ酸残基を含有するキメラＴＳＨＲのアミノ酸配列（配列番号０１）、（Ｂ）終止コドンを含む、２１９３塩基を含有するキメラＴＳＨＲのＤＮＡ配列（配列番号０２）、（Ｃ）５５０アミノ酸を含有するレニラルシフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号０３）、および（Ｄ）終止コドンを含む、１６５３塩基を含有するキメラＴＳＨＲのＤＮＡ配列（配列番号０４）を示す。
【図２−３】図２は、（Ａ）７３０アミノ酸残基を含有するキメラＴＳＨＲのアミノ酸配列（配列番号０１）、（Ｂ）終止コドンを含む、２１９３塩基を含有するキメラＴＳＨＲのＤＮＡ配列（配列番号０２）、（Ｃ）５５０アミノ酸を含有するレニラルシフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号０３）、および（Ｄ）終止コドンを含む、１６５３塩基を含有するキメラＴＳＨＲのＤＮＡ配列（配列番号０４）を示す。
【図３】ＣＨＯ−ＭＣ４およびＴＳＨＲｗｔ細胞（Ｈ１０）における、甲状腺阻害モノクローナル抗体（ＭＡｂ）Ｋ１−７０による、甲状腺阻害免疫グロブリン（ＴＢＩ）アッセイの検出感度の比較。
【図４】ＭＣ４およびＨ１０細胞における、阻害抗体含有血清によるＴＢＩアッセイの検出感度の比較。
【図５】甲状腺阻害モノクローナル抗体Ｋ１−７０用量応答曲線：ＴＢＩアッセイ対ＴＲＡｂアッセイの比較。
【図６】段階希釈（Ａ）甲状腺刺激モノクローナル抗体Ｍ２２または（Ｂ）ＴＳＩポジティブ患者血清によるＴＢＩアッセイ。
【図７】１７１  ＴＳＩポジティブ血清サンプルについてのＴＳＩおよびＴＢＩアッセイの間の相関。
【図８】様々な比の甲状腺刺激モノクローナル抗体Ｍ２２および甲状腺阻害モノクローナル抗体Ｋ１−７０によるＴＢＩアッセイ。
【図９】ｂＴＳＨの代わりにＭ２２モノクローナル抗体を使用して実行したＴＢＩアッセイ。
【図１０】サンプル１８ＨＭ  ｂＴＳＨ対ＴＳＩポジティブ血清の希釈液によるＴＢＩアッセイ。血清サンプル１８ＨＭ（ＴＲＡｂポジティブおよびＴＳＩネガティブ）は、正常血清中で１：４４〜１：９０１１２まで希釈し、次いで、Ａ．ｂＴＳＨ（４０ｍＩＵ／ｍｌ）と混合したまたはＢ．ＴＳＩポジティブ血清（４．５４ｍｌ／ウェル）と混合した。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
定義
【００１０】
本発明についての理解を容易にするために、多くの用語を下記に定義する。
【００１１】
細胞に関して使用される場合の用語「トランスジェニック」は、トランスジーンを含有するまたはそのゲノムが「トランスジーン」の導入によって改変された細胞を指す。トランスジェニック細胞は、ヒト介入を介した、標的細胞の中への核酸（通常ＤＮＡ）を含む「トランスジーン」の導入または標的細胞の染色体の中へのトランスジーンの統合を含む、いくつかの方法によって産生されてもよい。
【００１２】
本明細書において使用される場合、用語「トランスジーン」は、実験的な操作によって細胞の中に導入される任意の核酸配列を指す。トランスジーンは、「内因性ＤＮＡ配列」または「異種ＤＮＡ配列」（つまり「外来性ＤＮＡ」）であってもよい。用語「内因性ＤＮＡ配列」は、それが、天然に存在する配列に比べていくつかの修飾（たとえば点突然変異、選択可能なマーカー遺伝子の存在など）を含有していない限り、それが導入される細胞において天然に見つけられるヌクレオチド配列を指す。用語「異種ＤＮＡ配列」は、自然の中でライゲーションされていないまたは自然の中で異なる位置でライゲーションされている核酸配列にライゲーションされる、または操作されてライゲーションされるようになるヌクレオチド配列を指す。異種ＤＮＡは、それが導入される細胞に対して内因性ではないが、他の細胞から得られたものである。異種ＤＮＡはまた、いくつかの修飾を含有する内因性ＤＮＡ配列を含む。一般に、必ずしもではないが、異種ＤＮＡは、それが発現される細胞によって通常産生されないＲＮＡおよびタンパク質をコードする。異種ＤＮＡの例は、レポーター遺伝子、転写および翻訳調節配列、選択可能なマーカータンパク質（たとえば薬剤抵抗性を付与するタンパク質）などを含む。
【００１３】
「キメラ」、「融合」、および「ハイブリッド」配列（たとえばアミノ酸配列および／またはヌクレオチド配列に関する場合）は、異なる起源由来の部分を含有する配列を指す。一実施形態において、その部分が、同じ生物、同じ組織、同じ細胞、同じウイルスなどに由来する、異なるタンパク質および／またはゲノム配列であってもよい。一実施形態において、キメラタンパク質が、アミノ酸配列をコードする、作動可能に連結されたヌクレオチド配列の発現によって産生される組換えタンパク質である。たとえば、「キメラＴＳＨ受容体」、「キメラＴＳＨＲ」、および「キメラＭＣ４受容体」は、異なる生物由来のアミノ酸配列を含有するＴＳＨＲを区別なく指す。一実施形態において、キメラＴＳＨＲが、以前に記載される（２００８年８月７日に公開された米国特許出願公開第２００８−０１８７９４２号明細書）ように、ｈＴＳＨＲのアミノ酸残基２６２〜３３５が、ラット黄体形成ホルモン絨毛性ゴナドトロピン（ＬＨ／ＣＧ）受容体由来の、対応する７３アミノ酸残基と置換されたヒトＴＳＨＲ（ｈＴＳＨＲ）タンパク質配列によって例証される。好ましい実施形態において、キメラＭＣ４受容体が、ＤＮＡ配列（配列番号０２）（終止コドンを含む２１９３塩基対）によってコードされる、７３０アミノ酸配列の配列番号０１（図２Ａ）によって例証される。
【００１４】
「ＭＣ−４」細胞は、キメラＴＳＨ受容体を発現する細胞を指す。たとえば、「ＣＨＯ−ＭＣ４」細胞および「ＲＤ−ＭＣ４」細胞は、以前に記載される（２００８年８月７日に公開された米国特許出願公開第２００８−０１８７９４２号明細書）ように、それぞれ、キメラＴＳＨ受容体を発現するトランスジェニックチャイニーズハムスター卵巣細胞およびトランスジェニックヒト横紋筋肉腫細胞を指す。
【００１５】
「レポーター配列」および「マーカー配列」は、酵素（たとえばＥＬＩＳＡおよび酵素ベースの組織化学的アッセイ）、蛍光、ならびに発光系を含むが、これらに限定されない、任意の検出系において検出可能であるＤＮＡ、ＲＮＡ、ならびに／またはポリペプチド配列を指すために区別なく使用される。例示的なレポーター遺伝子は、たとえばβ−グルクロニダーゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）遺伝子、ハロバクテリウムβ−ガラクトシダーゼ遺伝子、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｐｓｏｒａ）チロシナーゼ遺伝子、ヒト胎盤アルカリホスファターゼ遺伝子、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、エクオリン（クラゲ生物発光）遺伝子、アメリカホタル、ホチナス  ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）由来のホタルルシフェラーゼ（ＥＣ  １．１３．１２．７）、ウミシイタケ、レニラ  レニフォルミス由来のレニラルシフェラーゼ（ＥＣ  １．１３．１２．５）、ならびにＰｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ由来の細菌ルシフェラーゼ（ＥＣ  １．１４．１４．３）を含む。好ましい実施形態において、ルシフェラーゼ遺伝子が、レニラルシフェラーゼアミノ酸配列の配列番号０３をコードする。
【００１６】
「生物発光遺伝子」は、エクオリン（クラゲ）生物発光遺伝子およびルシフェラーゼ遺伝子などのような、発光性の反応を触媒するタンパク質をコードするレポーター遺伝子を指す。
【００１７】
「ルシフェラーゼ遺伝子」は、アメリカホタル、ホチナス  ピラリス由来のホタルルシフェラーゼ（ＥＣ  １．１３．１２．７）、ウミシイタケ、レニラ  レニフォルミス由来のレニラルシフェラーゼ（ＥＣ  １．１３．１２．５）、およびＰｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ由来の細菌ルシフェラーゼ（ＥＣ  １．１４．１４．３）などのような、発光性の反応を触媒する、モノオキシゲナーゼ酵素をコードする遺伝子を指す。好ましい実施形態において、ルシフェラーゼ遺伝子が、レニラルシフェラーゼアミノ酸配列の配列番号０３をコードする。
【００１８】
本明細書において使用される場合、「プロモーター」、「プロモーターエレメント」、または「プロモーター配列」は、関心のあるヌクレオチド配列にライゲーションされた場合に、関心のあるヌクレオチド配列のｍＲＮＡへの転写をコントロールすることができるＤＮＡ配列を指す。プロモーターは、典型的に、必ずしもではないが、それがｍＲＮＡへの転写をコントロールする関心のあるヌクレオチド配列の５’（つまり、上流）に位置し、また、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写の開始のための他の転写因子による特異的な結合のための部位を提供する。
【００１９】
「誘導性プロモーター」は、刺激の非存在下と比較して、刺激（たとえば熱ショック、化学物質など）の存在下において、作動可能に連結された核酸配列のより高いレベルの転写を指示することができるプロモーターを指す。たとえば、「ｃＡＭＰ誘導性プロモーター」は、ｃＡＭＰの非存在下と比較して、ｃＡＭＰの存在下において、作動可能に連結された核酸配列のより高いレベルの転写を指示することができるプロモーターを指す。例示的なｃＡＭＰ誘導性プロモーターは、ＰＥＰＣＫプロモーター（Ｒｏｅｓｌｅｒら（１９９８）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７３、１４９５０−１４９５７）；ヒトサイクリンＤ２プロモーターの翻訳開始部位に関して−２９４位に位置するｃＡＭＰ応答性エレメント（ＣＲＥ）を含有するプロモーター（Ｍｕｎｉｚら（２００６）Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ７５（２）：２７９−２８８）；および乳酸デヒドロゲナーゼＡサブユニットプロモーターのｃＡＭＰ応答性エレメント（ＣＲＥ）を含有するプロモーター（Ｗｅｌｆｅｌｄら（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４（１２）：６９４１−７を含む。好ましい実施形態において、例示的なｃＡＭＰ誘導性プロモーターが、２００８年８月７日に公開された米国特許出願公開第２００８−０１８７９４２号明細書において記載されるように、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）調節エレメント（ＣＲＥ）（ＡＦ４０１９９１）を含有する２３６ヌクレオチド糖タンパク質ホルモンアルファサブユニットプロモーターを含む。
【００２０】
「構成的プロモーター」は、刺激（たとえば熱ショック、化学物質など）の非存在下において、作動可能に連結された核酸配列の継続的な転写を指示するプロモーターを指す。構成的プロモーターは、大腸菌（σ７０、σＳ、σ３２、σ５４、およびσＡ）プロモーター、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  σＢプロモーター、サルモネラＰｓｐｖ２およびＰｓｐｖプロモーター、バクテリオファージＴ７（Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによって認識される）、バクテリオファージＳＰ６（ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼによって認識される）、酵母（ｐＡｄｈ、ＡＤＨ１、ｃｙｃ１００、ｐＰＧＫ１、ｐＣＹＣ）プロモーター、ならびにＳＶ４０プロモーター由来のものを含む。好ましい実施形態において、構成的プロモーターが、ＳＶ４０プロモーターである。
【００２１】
「安定した形質転換」および「安定したトランスフェクション」および文法上の等価物は、細胞のゲノムの中への、関心のある１つ以上のヌクレオチド配列の導入および統合を指す。したがって、「安定した形質転換体」は、安定した形質転換体由来のゲノムＤＮＡが、関心のある１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含有するが、一過性の形質転換体由来のゲノムＤＮＡが、関心のある異種ヌクレオチド配列を含有しないという点で、一過性の形質転換体と区別される。細胞の安定した形質転換は、１つ以上の、関心のあるヌクレオチド配列に対して結合することができる核酸配列との、細胞のゲノムＤＮＡのサザンブロットハイブリダイゼーションによって検出されてもよい。その代わりに、細胞の安定した形質転換はまた、関心のあるヌクレオチド配列を増幅するための、細胞のゲノムＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応によって検出されてもよい。
【００２２】
「ＴＢＩ」、「甲状腺阻害免疫グロブリン」、「甲状腺阻害抗体」（「ＴＢＡｂ」）、「チロトロピン受容体阻害抗体」、「ＴＳＨ結合抑制免疫グロブリン」、「チロトロピン結合抑制免疫グロブリン」（「ＴＢＩＩ」）、「阻害性チロトロピン受容体抗体」（「ＴＳＨＲＡｂ」）は、甲状腺刺激ホルモン受容体（「ＴＳＨ受容体」または「ＴＳＨＲ」または「チロトロピン受容体」とも呼ばれる）上のエピトープに対して特異的に結合し、かつその甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）リガンドに対するこの受容体の結合を抑制する（つまり低下させる）抗体を指すために区別なく使用される。ＴＢＩは、Ｋ１−７０モノクローナル抗体によって例証される。
【００２３】
「ＴＳＩ」、「甲状腺刺激免疫グロブリン」、「甲状腺刺激抗体」（「ＴＳＡｂ」）、「刺激性チロトロピン受容体抗体」（「ＴＳＨＲＡｂ」）は、甲状腺刺激ホルモン受容体（「ＴＳＨ受容体」または「ＴＳＨＲ」または「チロトロピン受容体」とも呼ばれる）上のエピトープに対して特異的に結合し、かつその甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）リガンドに対するこの受容体の結合を刺激する（つまり増加させる）抗体を指すために区別なく使用される。甲状腺刺激抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってもよい。したがって、「甲状腺刺激モノクローナル抗体」および「モノクローナル甲状腺刺激抗体」は、Ｍ２２抗体によって例証されるように、ＴＳＨ結合部位内のＴＳＨＲのエピトープに対して結合するモノクローナル甲状腺刺激抗体を区別なく指す。
【００２４】
「甲状腺刺激ホルモン」（「ＴＳＨ」）は、以前に記載されるように、例示的なアミノ酸配列を有するヒトＴＳＨ（ｈＴＳＨ）およびウシＴＳＨ（ｂＴＳＨ）によって例証される（Ｓｚｋｕｄｌｉｎｓｋｉら（１９９６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：１２５７−１２６３）。
【００２５】
「抗体」および「免疫グロブリン」は、糖タンパク質（たとえばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤなど）および／または抗原に対して結合するための「可変ドメイン」（「ＦＶ領域」とも呼ばれる）を含有するその一部分を指す。一実施形態において、抗体が、「ポリクローナル抗体」、つまり形質細胞（たとえばＢリンパ球）の１つを超えるクローンによって産生される免疫グロブリンである。他の実施形態において、抗体が、「モノクローナル抗体」（「ＭＡｂ」）、つまり、ハイブリドーマ細胞の１つのクローンによって産生される免疫グロブリンである。他の実施形態において、抗体が、対象によって産生される「自己抗体」であり、同じ対象によって産生される抗原（「自己」抗原）と結合することができる。
【００２６】
分子に関してなされる場合の「抗原」および「免疫原」は、特異的な液性免疫応答（可溶性抗体応答を誘起することを含む）および／または細胞性免疫応答（ＣＴＬ応答を誘起することを含む）を誘導することができる任意の物質を指す。
【００２７】
「特異的に結合する」および「特異的な結合」は、分子（たとえばペプチド）に対する抗体の結合またはペプチドに対する細胞（たとえばＴ細胞）の結合に関してなされる場合、相互作用が分子上の特定の構造の存在に依存性である、分子上の１つ以上のエピトープとの抗体または細胞の相互作用を指す。たとえば、抗体が、分子上のエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、標識された「Ａ」および抗体を含有する反応における、エピトープＡ（または遊離非標識Ａ）を含有するタンパク質の存在は、抗体に対して結合する、標識されたＡの量を低下させるであろう。一実施形態において、分子に対して抗体が結合するレベルが、「ＩＣ５０」、つまり、所与の生物学的プロセスまたはプロセスの構成成分（たとえば酵素、抗体、細胞、細胞受容体、微生物など）の５０％の抑制をもたらす、物質（たとえば抑制剤、アンタゴニストなど）の濃度を指す「最大抑制濃度の半分」を使用して決定される。それは、アンタゴニスト物質の効力の基準として共通して使用される。
【００２８】
本明細書において使用される場合、「サンプル」および「検体」は、化学反応混合物などのような任意の組成物、生物学的および／または環境的供給源由来の組成物、ならびにこれらの組成物と接触するサンプリングデバイス（たとえばスワブ）を含むように、それらの最も広い意味で使用される。「生物学的サンプル」は、体液（尿、血液、プラスマ、糞便、脳脊髄液（ＣＳＦ）、精液、痰、および唾液など）ならびに固体組織を含む、対象から得られるものを含む。生物学的サンプルはまた、細胞（細胞株、単離された細胞が組織からの単離後に培養されるかどうかにかかわらず、組織から単離された細胞、組織学的および／または免疫組織化学的分析のために固定された細胞などのような固定細胞など）、組織（生検材料など）、細胞抽出物、組織抽出物、ならびに細胞および／または組織から単離された核酸（たとえばＤＮＡおよびＲＮＡ）などをも含む。これらの例は、例証であり、本発明に適用可能なサンプルのタイプを限定するものとして解釈されないものとする。
【００２９】
「コントロールサンプル」は、ある現象についてこの変動する１つ以上の変数について原因となる有意性を推測するために、１つ以上の特定の変数以外、コントロールおよび他のサンプルにおいて同じ条件を維持することによって、他のサンプルと比較するために使用されるサンプルを指す。たとえば、「ポジティブコントロールサンプル」は、現象が起こることが期待されるコントロールサンプルである。たとえば、「ネガティブコントロールサンプル」は、現象が起こることが期待されないコントロールサンプルである。
【００３０】
「標準サンプル」は、他のサンプル（試験サンプルなど）を評価するためにレファレンスとして使用されるサンプルを指す。たとえば、それぞれが既知濃度および／または量のＴＳＨを含有する１つ以上の標準サンプルは、試験サンプルにおけるＴＳＨの濃度および／または量を評価するためのレファレンスとして使用されてもよい。
【００３１】
用語「低下させる」、「抑制する」、「小さくする」、「抑える」、「減少させる」、および文法上の等価物（「より低い」、「より小さな」などを含む）は、第１のサンプルにおける（または第１の対象における）任意の分子（たとえばアミノ酸配列および核酸配列、抗体など）、細胞、ならびに／または現象（たとえば遺伝子の発現のレベル、疾患症状、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）リガンドの、その甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨ受容体）に対する結合などのような、２つの分子の結合のレベル、２つの分子の結合の特異度、２つの分子の結合の親和性、疾患症状、疾患に対する特異度、疾患に対する感度、結合の親和性、酵素活性など）の、第２のサンプルと比べた（または第２の対象に比べた）レベルに関する場合、第１のサンプルにおける（または第１の対象における）分子、細胞、および／または現象の量が、任意の当技術分野により許容されている、分析についての統計的方法を使用すると、統計的に有意な任意の量だけ、第２のサンプルにおける（または第２の対象における）ものよりも低いことを意味する。一実施形態において、第１のサンプルにおける（または第１の対象における）分子、細胞、および／または現象の量が、第２のサンプルにおける（または第２の対象における）同じ分子、細胞、および／または現象の量よりも、少なくとも１０％低い、少なくとも２５％低い、少なくとも５０％低い、少なくとも７５％低い、および／または少なくとも９０％低い。他の実施形態において、第１のサンプルにおける（または第１の対象における）分子、細胞、および／または現象の量が、第２のサンプルにおける（または第２の対象における）同じ分子、細胞、および／または現象の量よりも、これらに限定されないが、１０％〜１００％、２０％〜１００％、３０％〜１００％、４０％〜１００％、５０％〜１００％、６０％〜１００％、７０％〜１００％、８０％〜１００％、および９０％〜１００％低いなどのように、５％〜１００％の任意の数のパーセンテージだけ低い。一実施形態において、第１のサンプル（または第１の対象）が、限定されないが、本発明の組成物および／または方法を使用して操作されたサンプル（または対象）によって例証される。さらなる実施形態において、第２のサンプル（または第２の対象）が、限定されないが、本発明の組成物および／または方法を使用して操作されていないサンプル（または対象）によって例証される。代替の実施形態において、第２のサンプル（または第２の対象）が、限定されないが、第１の対象と比較して、異なる投薬量でおよび／または異なる期間および／または異なるルートの投与によって、本発明の組成物および／または方法を使用して操作されたサンプル（または対象）によって例証される。一実施形態において、第１および第２のサンプル（または対象）が、本発明の組成物および／または方法の異なるレジメン（たとえば投薬量、期間、投与のルートなどの）の効果が、一方のサンプル（または対象）について決定することが求められる場合などのように、同じであってもよい。他の実施形態において、第１および第２のサンプル（または対象）が、一方のサンプル（対象）、たとえば、臨床試験に参加している患者および入院中の他の個人に対する、本発明の組成物および／または方法の効果を比較する場合などのように、異なってもよい。
【００３２】
用語「増加させる」、「上昇させる」、「上げる」、および文法上の等価物（「より高い」、「より大きな」などを含む）は、第１のサンプルにおける（または第１の対象における）任意の分子（たとえばアミノ酸配列および核酸配列、抗体など）、細胞、ならびに／または現象（たとえば遺伝子の発現のレベル、疾患症状、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）リガンドの、その甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨ受容体）に対する結合などのような、２つの分子の結合のレベル、２つの分子の結合の特異度、２つの分子の結合の親和性、疾患症状、疾患に対する特異度、疾患に対する感度、結合の親和性、酵素活性など）の、第２のサンプルと比べた（または第２の対象に比べた）レベルに関する場合、第１のサンプルにおける（または第１の対象における）分子、細胞、および／または現象の量が、任意の当技術分野により許容されている、分析についての統計的方法を使用すると、統計的に有意な任意の量だけ、第２のサンプルにおける（または第２の対象における）ものよりも高いことを意味する。一実施形態において、第１のサンプルにおける（または第１の対象における）分子、細胞、および／または現象の量が、第２のサンプルにおける（または第２の対象における）同じ分子、細胞、および／または現象の量よりも、少なくとも１０％大きい、少なくとも２５％大きい、少なくとも５０％大きい、少なくとも７５％大きい、および／または少なくとも９０％大きい。これは、限定を伴うことなく、第２のサンプルにおける（または第２の対象における）同じ分子、細胞、および／または現象の量よりも少なくとも１０％大きい、少なくとも１５％大きい、少なくとも２０％大きい、少なくとも２５％大きい、少なくとも３０％大きい、少なくとも３５％大きい、少なくとも４０％大きい、少なくとも４５％大きい、少なくとも５０％大きい、少なくとも５５％大きい、少なくとも６０％大きい、少なくとも６５％大きい、少なくとも７０％大きい、少なくとも７５％大きい、少なくとも８０％大きい、少なくとも８５％大きい、少なくとも９０％大きい、および／または少なくとも９５％大きい、第１のサンプルにおける（または第１の対象における）分子、細胞、および／または現象の量を含む。一実施形態において、第１のサンプル（または第１の対象）が、これに限定されないが、本発明の組成物および／または方法を使用して操作されたサンプル（または対象）によって例証される。さらなる実施形態において、第２のサンプル（または第２の対象）が、これに限定されないが、本発明の組成物および／または方法を使用して操作されていないサンプル（または対象）によって例証される。代替の実施形態において、第２のサンプル（または第２の対象）が、これに限定されないが、第１の対象と比較して、異なる投薬量でおよび／または異なる期間および／または異なるルートの投与によって、本発明の組成物および／または方法を使用して操作されたサンプル（または対象）によって例証される。一実施形態において、第１および第２のサンプル（または対象）が、本発明の組成物および／または方法の異なるレジメン（たとえば投薬量、期間、投与のルートなどの）の効果が、一方のサンプル（または対象）について決定することが求められる場合などのように、同じであってもよい。他の実施形態において、第１および第２のサンプル（または対象）が、一方のサンプル（対象）、たとえば、臨床試験に参加している患者および入院中の他の個人に対する、本発明の組成物および／または方法の効果を比較する場合などのように、異なってもよい。
【００３３】
用語「実質的に低下していない」は、第１のサンプルにおける（または第１の対象における）任意の分子（たとえばアミノ酸配列および核酸配列、抗体など）、細胞、ならびに／または現象（たとえば遺伝子の発現のレベル、疾患症状、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）リガンドの、その甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨ受容体）に対する結合などのような、２つの分子の結合のレベル、２つの分子の結合の特異度、２つの分子の結合の親和性、疾患症状、疾患に対する特異度、疾患に対する感度、結合の親和性、酵素活性など）の、第２のサンプルと比べた（または第２の対象に比べた）レベルに関する場合、第１のサンプルにおける（または第１の対象における）分子、細胞、および／または現象の量が、第２のサンプルにおける（または第２の対象における）量の９１％〜１００％であることを意味する。
【００３４】
用語「改変する」および「修飾する」は、任意の分子および／または現象のレベルに関する場合、上昇および／または減少を指す。
【００３５】
「実質的に同じ」は、第１のサンプルにおける（または第１の対象における）任意の分子（たとえばアミノ酸配列および核酸配列、抗体など）、細胞、ウイルス、ならびに／または現象（たとえば遺伝子の発現のレベル、疾患症状、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）リガンドの、その甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨ受容体）に対する結合などのような、２つの分子の結合のレベル、２つの分子の結合の特異度、２つの分子の結合の親和性、疾患症状、疾患に対する特異度、疾患に対する感度、結合の親和性、酵素活性など）の、第２のサンプルと比べた（または第２の対象に比べた）レベルに関する場合、第１のサンプルにおける（または第１の対象における）分子、細胞、および／または現象の量が、任意の当技術分野により許容されている、分析についての統計的方法を使用すると、第２のサンプルにおける（または第２の対象における）量と異ならないことを意味する。一実施形態において、第１のサンプルにおける（または第１の対象における）分子、細胞、および／または現象の量が、第２のサンプルにおける（または第２の対象における）量の９０％〜１００％（たとえば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、および１００％）である。
【００３６】
任意の数の範囲に対する本明細書における言及は、その範囲によって包含される、それぞれの数値（分数および整数を含む）を明確に含む。例証するために、また、限定を伴うことなく、「少なくとも５０」の範囲に対する本明細書における言及は、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０などの整数および分数５０．１、５０．２、５０．３、５０．４、５０．５、５０．６、５０．７、５０．８、５０．９などを含む。さらなる例証において、「５０未満」の範囲に対する本明細書における言及は、整数４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０などおよび分数４９．９、４９．８、４９．７、４９．６、４９．５、４９．４、４９．３、４９．２、４９．１、４９．０などを含む。さらに他の例証において、「５〜１０」の範囲に対する本明細書における言及は、５、６、７、８、９、および１０のそれぞれの整数ならびに５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９などのようなそれぞれの分数を含む。
【００３７】
発明の説明
本発明は、甲状腺ホルモン阻害免疫グロブリン（ＴＢＩ）を検出するための組成物および方法を提供する。本発明の方法は、ＴＢＩに対して高感度であり、かつ特異的であり、ＴＢＩおよび甲状腺刺激免疫グロブリン（ＴＳＩ）の両方の二重検出に使用されてもよい。本発明の組成物および方法は、ＴＢＩおよび／またはＴＳＩの存在と関連する疾患の診断に、疾患および／または処置レジメン、治療薬、ワクチンなどの進行をモニターするのに、ならびに臨床医が処置決定を下すのを支援するのに有用である。
【００３８】
本発明は、（Ａ）甲状腺阻害免疫グロブリン（ＴＢＩ）の検出のためのアッセイ、（Ｂ）甲状腺阻害免疫グロブリン（ＴＢＩ）および甲状腺刺激免疫グロブリン（ＴＳＩ）の二重検出のためのアッセイ、ならびに（Ｃ）キットの下で、さらに記載される。
【００３９】
Ａ．甲状腺阻害免疫グロブリン（ＴＢＩ）の検出のためのアッセイ
【００４０】
本発明は、試験サンプルにおける甲状腺ホルモン阻害免疫グロブリン（ＴＢＩ）を検出するための方法であって、ａ）ｉ）１）ｃＡＭＰ誘導性プロモーターに対して作動可能に連結されたレポーター遺伝子（たとえばルシフェラーゼ遺伝子）および２）構成的プロモーターに対して作動可能に連結されたキメラＴＳＨ受容体（ＴＳＨＲ）遺伝子を含む、１つ以上の発現ベクターにより安定してトランスフェクトされたトランスジェニック細胞であって、細胞が、細胞膜上にキメラＴＳＨＲを発現する、トランスジェニック細胞、ｉｉ）甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）（たとえばｂＴＳＨ）、およびｉｉｉ）コントロールサンプル、ならびにｉｖ）試験サンプル（たとえば、ＴＢＩを含有することが疑われる）を提供するステップ、ｂ）トランスジェニック細胞およびＴＳＨを、ｉ）第１のサンプルをもたらすコントロールサンプルおよびｉｉ）第２のサンプルをもたらす試験サンプルと接触させるステップであって、接触が、キメラＴＳＨＲに対するＴＳＨの結合のための条件下にある、ステップ、ならびにｃ）第１のサンプルおよび第２のサンプルにおけるレポーター遺伝子の発現のレベルを測定するステップであって、第１のサンプルと比較した、第２のサンプルにおけるレポーター遺伝子の発現のレベルの低下が、試験サンプルにおけるＴＢＩの存在を示す、ステップを含む方法を提供する。
【００４１】
一実施形態において、本発明のＴＢＩアッセイは、甲状腺阻害免疫グロブリンが、例示的なＣＨＯ−ＭＣ４細胞上に発現されるＴＳＨ受容体（ＴＳＨＲ）に対して結合する甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）と競合する、細胞ベースの免疫グロブリン競合アッセイである。いくつかの実施形態において、ＴＢＩアッセイが、ＣＨＯ−ＭＣ４細胞、細胞増殖培地、ｂＴＳＨ、Ｔｈｙｒｅｔａｉｎ（商標）反応バッファー（Ｑｕｉｄｅｌ  Ｃｏｒｐ．＆Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｈｙｂｒｉｄｓ，Ｉｎｃ．、Ｏｈｉｏ、ＵＳＡ）、ルシフェラーゼ基質、および患者血清サンプルを使用することを含む。本発明のＴＢＩアッセイの試薬および構成成分は、当業者に入手可能である（Ｔｈｙｒｅｔａｉｎ（商標）アッセイ；Ｑｕｉｄｅｌ  Ｃｏｒｐ．＆Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｈｙｂｒｉｄｓ，Ｉｎｃ．）。
【００４２】
本発明のアッセイは、実施例１において例証される。本発明のＴＢＩアッセイの例示的なＣＨＯ−ＭＣ４細胞は、キメラヒト／ラットＴＳＨＲおよび糖タンパク質ホルモンアルファサブユニットプロモーターによって駆動されるルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する、遺伝子的に操作されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。ＣＨＯ−ＭＣ４細胞は、Ｔｈｙｒｅｔａｉｎ（商標）アッセイ（Ｑｕｉｄｅｌ  Ｃｏｒｐ．＆Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｈｙｂｒｉｄｓ，Ｉｎｃ．）において使用される。
【００４３】
本発明の方法は、グレーブス病、橋本甲状腺炎（Ｅｎｄｏら（１９７８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ＆  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ４６（５）：７３４−７３９；Ｔａｋａｓｕら（１９８７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ＆  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ６４（２）：２３９−２４５）；甲状腺機能低下症（Ｔａｋａｓｕら（１９８４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ＆  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ５９９（１）：１４２−１４６）；新生児甲状腺機能低下症（Ｉｓｅｋｉら（１９８３）５７（２）：３８４−３８７；Ｍａｔｓｕｕｒａら（１９８０）Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３０３（１３）：７３８−７４１）；非甲状腺腫性甲状腺機能低下症（Ａｒｉｋａｗａら（１９８５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ＆  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ６０（５）：９５３−９５９）；甲状腺機能正常または甲状腺機能低下自己免疫性甲状腺炎（Ｃｈｉｏｖａｔｏら（１９９０）７１：４０−４５）；原発性粘液水腫（Ｄｒｅｘｈａｇｅら（１９８０）Ｎａｔｕｒｅ  ２８９：５９４−５９６；Ｋｏｎｉｓｈｉら（１９８３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ＆  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ５７（３）：５４４−５４９）；および特発性粘液水腫（Ｋｏｈｎら（２００３）Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３６：３３１−３３７）などのような、ＴＢＩの存在と関連する疾患の診断に有用である。
【００４４】
本発明の方法はまた、疾患および／または処置レジメン、治療薬、ワクチンなどの進行をモニターするのにならびに臨床医が処置決定を下すのを支援する際にも有用である。
【００４５】
当技術分野は、本発明においても使用されるＭＣ４キメラ受容体を使用する、甲状腺ホルモン自己抗体についてのアッセイを記載している（２００８年８月７日に公開された米国特許出願公開第２００８−０１８７９４２号明細書）。しかしながら、当技術分野のアッセイは、ＭＣ４キメラ受容体が、刺激抗体に対してのみ反応性であり、かつ、甲状腺ホルモン阻害抗体の結合が、排除されているおよび／または低下しているという見解に基づいて、甲状腺ホルモン刺激（阻害ではなく）免疫グロブリン（ＴＳＩ）を測定するように設計されたものなので、本発明の方法は、驚くべきものである。さらに、当技術分野は、ＴＳＩを検出するその方法の特異度が、刺激自己抗体に対して優先的に結合する（つまり阻害自己抗体とは対照的に）ことによって、野生型受容体よりも大きな特異度をもたらすキメラＭＣ４受容体を発現する細胞を使用することの結果であると述べた。また、当技術分野は、ＴＳＩを検出するその方法の感度が、刺激自己抗体に対して優先的に結合する（つまり阻害自己抗体とは対照的に）ことによって、野生型受容体よりも大きな感度をもたらすキメラＭＣ４受容体を発現する細胞を使用することの結果であると述べた。
【００４６】
ＴＢＩを検出する際の本発明の方法の驚くべき側面に加えて、本発明の方法は、ＴＢＩを検出するのに高感度であることの驚くべき利点を提供する。したがって、一実施形態において、ＴＢＩを検出するための本発明の方法が、野生型ＴＳＨＲを発現する細胞で、キメラＴＳＨＲを発現するトランスジェニック細胞を置換するステップを含む方法においてＴＢＩを検出する場合のＴＢＩ  ＩＣ５０の５〜１５分の一の（最も好ましくは７．５分の一の）ＴＢＩ  ＩＣ５０を有する。本明細書におけるデータは、ＣＨＯ−ＭＣ４細胞によって発現されるキメラＴＳＨＲが、ＴＢＩを検出する際に、野生型ＴＳＨＲよりも有用であることを実証する（実施例２および４）。たとえば、本明細書におけるデータは、野生型ＴＳＨＲを発現するＨ１０細胞と比較して、キメラＴＳＨＲを発現するＣＨＯ−ＭＣ４細胞を使用する場合、ＴＢＩを検出する際に、感度がより高く、ＣＨＯ−ＭＣ４細胞のＩＣ５０が、Ｈ１０細胞の７．５分の一であったことを実証する。
【００４７】
ＴＢＩを検出するための本発明の感度に関しての他の驚くべき利点は、本発明の方法が、抗ＴＢＩモノクローナル抗体とＴＢＩの特異的な結合を検出するステップを含む方法において（ＥＬＩＳＡアッセイにおいてなど）ＴＢＩを検出する場合のＴＢＩ  ＩＣ５０の１０〜３０分の一の（最も好ましくは２２分の一の）ＴＢＩ  ＩＣ５０を有することである。本明細書におけるデータは、ＣＨＯ−ＭＣ４細胞を使用する本発明のＴＢＩアッセイのＩＣ５０が、１．３４４ｎｇ／ｍｌであり、これは、ＴＲＡｂアッセイの２２分の一であることを示す（実施例３および４）。
【００４８】
ＴＳＨ受容体（ＴＳＨＲ）がラットルテオトロピン−絨毛性ゴナドトロピン（ＬＨ−ＣＧ）受容体に対して連結されている、先行技術のキメラ受容体ＴＳＨＲ−ＬＨ／ＣＧＲが、ＴＳＩに対して高感度であるが、ＴＢＩに対して非常に感度が悪いことが報告されたので、本発明の方法について上記に議論される感度は、少なくとも部分的に驚くべきものである（Ｔａｈａｒａら（１９９１）ＢＢＲＣ  １７９：７０−７７；Ｔａｈａｒａら（１９９７）Ｔｈｙｒｏｉｄ  ７（６）：８６７−８７７）。さらに、先行技術は、本発明の例示的なトランスジェニック細胞（たとえばＣＨＯ−ＭＣ４細胞およびＲＤ−ＭＣ４細胞）によって発現されるＭＣ４キメラ受容体ＴＳＨＲ−ＬＨ／ＣＧＲが、ＴＳＩに対するエピトープを保持するが、ＴＢＩに対するエピトープを欠いたことを示唆した（Ｋｏｈｎら（２００３）Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３６：３３１−３３７；  Ｓａｎｄｅｒｓら（２０１１）Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．４６；８１−９９）。
【００４９】
必須ではないが、一実施形態において、本発明の方法が、ｄ）第１のサンプルと比較した、第２のサンプルにおけるレポーター遺伝子（たとえばルシフェラーゼ遺伝子）の発現のレベルの低下を検出するステップをさらに含む。
【００５０】
また、必要とされるわけではないが、一実施形態において、本発明の方法が、試験サンプルにおけるＴＢＩのレベルを決定するステップをさらに含む。これは、たとえば、１）試験サンプルと接触させた後の、レポーター遺伝子の発現のレベルを、２）それぞれが既知濃度のＴＳＨを含有する１つ以上の標準サンプルとトランスジェニック細胞を接触させた後の、レポーター遺伝子の発現のレベルと比較することによって行われてもよい。
【００５１】
本発明の方法のさらに驚くべき側面は、それらが、ＴＢＩ特異的であるということである。サンプルにおけるＴＢＩの存在を検出するための方法は、「ＴＢＩに対して特異的である」または「ＴＢＩ特異的である」とも表され、ここで、方法は、その受容体（キメラＴＳＨＲなどのようなＴＳＨＲ）に対するＴＳＨの特異的な結合の、ＴＢＩによる抑制を検出するステップを含み、ＴＢＩによる抑制のレベルは、１つ以上の黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、および卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の存在によって、実質的に改変されない（つまり、１％〜１０％増加しないまたは１％〜１０％減少しない）。
【００５２】
たとえば、本明細書におけるデータは、３つの糖タンパク質ホルモンＬＨ、ｈＣＧ、およびＦＳＨが、それらの最も高い、生物学的に正常な範囲の濃度でおよびそれらの最も高い、生物学的に正常範囲の濃度の２倍で本発明のＴＢＩアッセイにおいて試験された場合に、実質的な交差反応性も、ＴＳＨＲとのＴＳＨの結合のＴＢＩ抑制への干渉もなかったという点で、本発明のＴＢＩアッセイが、ｂＴＳＨに対して特異的であったことを実証する（実施例５）。より詳細には、本発明のアッセイが、ＴＢＩによる８６％の抑制を検出したが、ＬＨ、ｈＣＧ、およびＦＳＨのいずれか１つと共にＴＢＩを含有する混合物は、８１％〜８４％の範囲の抑制を検出した。
【００５３】
本発明のアッセイにおけるＴＳＨの濃度の範囲を限定することを意図するものではないが、一実施形態において、ＴＳＨが、１００ｍＩＵ／ｍｌ未満の、より好ましくは、０．２ｍＩＵ／ｍｌ〜１００ｍＩＵ／ｍｌの濃度を有する。図１Ｂは、ＴＳＨ濃度が、１００ｍＩＵ／ｍｌに等しいまたはそれよりも低い場合、生物発光遺伝子（たとえばルシフェラーゼ遺伝子）の発現およびＴＳＨ濃度の関係が、直線的であることを示す。
【００５４】
本発明の方法において使用されるトランスジェニック細胞が、任意の特定のレポーター遺伝子を含有するようには意図されない。しかしながら、一実施形態において、レポーター遺伝子が、レニラルシフェラーゼアミノ酸配列の配列番号０３を含むタンパク質などのような生物発光タンパク質を発現する。
【００５５】
本発明の方法において使用されるトランスジェニック細胞が、任意の特定のタイプに限定されるようには意図されない。しかしながら、一実施形態において、トランスジェニック細胞が、ＣＨＯ−ＭＣ４細胞およびＲＤ−ＭＣ４細胞によって例証される細胞を含む。
【００５６】
一実施形態において、本発明の方法が、ＴＳＨを、甲状腺刺激モノクローナル抗体（Ｍ２２など）および／または甲状腺刺激ポリクローナル抗体で置き換えることによって実行されてもよい（図９）。本明細書におけるデータは、本発明のＴＢＩアッセイが、ｂＴＳＨおよび／または甲状腺刺激免疫グロブリン（ＴＳＩ）による刺激を阻害する、例示的なサンプル１８ＨＭの能力を検出することができることを実証する（図１０）。
【００５７】
Ｂ．甲状腺阻害免疫グロブリン（ＴＢＩ）および甲状腺刺激免疫グロブリン（ＴＳＩ）の二重検出のためのアッセイ
【００５８】
本発明は、試験サンプルにおける甲状腺ホルモン阻害免疫グロブリン（ＴＢＩ）および甲状腺ホルモン刺激免疫グロブリン（ＴＳＩ）を検出するための方法であって、ａ）ｉ）１）ｃＡＭＰ誘導性プロモーターに対して作動可能に連結されたレポーター遺伝子（たとえばルシフェラーゼ遺伝子）および２）構成的プロモーターに対して作動可能に連結されたキメラＴＳＨ受容体（ＴＳＨＲ）遺伝子を含む、１つ以上の発現ベクターにより安定してトランスフェクトされたトランスジェニック細胞であって、細胞が、細胞膜上にキメラＴＳＨＲを発現する、トランスジェニック細胞、ｉｉ）甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、ならびにｉｉｉ）コントロールサンプル、ｉｖ）試験サンプル（たとえば、ＴＢＩおよび／またはＴＳＩを含有することが疑われる）を提供するステップ、ｂ）トランスジェニック細胞およびＴＳＨを、ｉ）第１のサンプルをもたらすコントロールサンプルおよびｉｉ）第２のサンプルをもたらす試験サンプルと接触させるステップであって、接触が、キメラＴＳＨＲに対するＴＳＨの結合のための条件下にある、ステップ、ならびにｃ）接触前および接触後の、トランスジェニック細胞におけるレポーター遺伝子の発現のレベルを測定する（たとえばルシフェラーゼ酵素活性から結果として生じる生物発光を検出することによって）ステップであって、ｉ）第１のサンプルと比較した、第２のサンプルにおけるレポーター遺伝子の発現のレベルの低下が、試験サンプルにおけるＴＢＩの存在を示し、ｉｉ）第１のサンプルと比較した、第２のサンプルにおけるレポーター遺伝子の発現のレベルの上昇が、試験サンプルにおけるＴＳＩの存在を示す、ステップを含む方法を提供する。
【００５９】
実施例６〜８における、本明細書におけるデータは、血清サンプルにおける検出を含む、ＴＢＩおよびＴＳＩの両方を検出するための、本発明のアッセイの使用を実証する（表８）。
【００６０】
本発明のＴＢＩおよびＴＳＩの両方の二重検出のための方法は、疾患および／または処置の進行をモニターするための、ならびに臨床医が処置決定を下すのを支援するための、グレーブス病および甲状腺機能亢進症などのような、ＴＳＩの存在と関連する疾患の診断に有用である。
【００６１】
トランスジェニック細胞を任意の特定のタイプに限定することを意図するものではないが、一実施形態において、トランスジェニック細胞が、ＣＨＯ−ＭＣ４細胞およびＲＤ−ＭＣ４細胞によって例証される細胞を含む。
【００６２】
Ｃ．キット
【００６３】
本発明は、本発明の方法を実施するのを支援するためのキットを提供する。一実施形態において、キットが、ｉ）１つ以上の発現ベクターにより安定してトランスフェクトされたトランスジェニック細胞であって、該発現ベクターが、１）ｃＡＭＰ誘導性プロモーターに対して作動可能に連結されたレポーター遺伝子および２）構成的プロモーターに対して作動可能に連結されたキメラＴＳＨ受容体（ＴＳＨＲ）遺伝子を含み、該細胞が、細胞膜上にキメラＴＳＨＲを発現する、トランスジェニック細胞、ならびにｉｉ）甲状腺ホルモン阻害免疫グロブリン（ＴＢＩ）を検出するためにトランスジェニック細胞を使用するための説明書を含む。
【００６４】
用語「キット」は、試薬および他の材料の組み合わせに関して使用される。キットは、緩衝剤、タンパク質安定化試薬、シグナル産生系（たとえば生物発光および／または蛍光生成系）、抗体、コントロールサンプルなどのような試薬ならびに試験容器（たとえばマイクロタイタープレートなど）を含んでいてもよいことが、企図される。
【００６５】
一実施形態において、キットが、甲状腺ホルモン阻害免疫グロブリン（ＴＢＩ）を含有するポジティブコントロールサンプルを含む。他の実施形態において、キットが、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）を含む。
【００６６】
ＴＢＩおよびＴＳＩの両方の二重検出が所望される場合、キットは、試験サンプルにおける甲状腺ホルモン刺激免疫グロブリン（ＴＳＩ）を検出するための説明書をさらに含んでいてもよい。他の実施形態において、キットが、甲状腺ホルモン刺激免疫グロブリン（ＴＳＩ）を検出するために含有するポジティブコントロールサンプルをさらに含んでいてもよい。
【実施例】
【００６７】
実験
以下の実施例は、本発明のある好ましい実施形態および態様を実証し、かつさらに例証するために提供され、その範囲を限定するものとして解釈されないものとする。
【００６８】
続く実験の開示において、以下の略語が適用される：ｅｑ（等価物）；Ｍ（モル濃度）；μＭ（マイクロモル濃度）；Ｎ（正常）；ｍｏｌ（モル）；ｍｍｏｌ（ミリモル）；μｍｏｌ（マイクロモル）；ｎｍｏｌ（ナノモル）；ｇ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；μｇ（マイクログラム）；ｎｇ（ナノグラム）；またはＬ（リットル）；ｍｌ（ミリリットル）；μｌ（マイクロリットル）；μ（マイクロ）；ｍ（ミリ）；ＩＵ（国際単位）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；μｍ（マイクロメートル）；ｎｍ（ナノメートル）；℃（摂氏度）；ｓｅｃ．またはｓ（秒（複数可））；ｍｉｎ．およびｍ（分（複数可））；ＭＷ（分子量）；甲状腺刺激ホルモンまたはチロトロピン（ＴＳＨ）；ｂＴＳＨ（ウシＴＳＨ）；ＴＳＩ（甲状腺刺激免疫グロブリン）；ＴＳＡｂ（甲状腺刺激抗体）；ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）；ＲＬＵ／ｓｅｃ（１秒当たりの相対光単位（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｌｉｇｈｔ  ｕｎｉｔ））；ＧＭまたはＰＭ（増殖培地またはプランティング培地（Ｐｌａｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ））；ＳＭ（飢餓培地）；ＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩類溶液）；ＥＭＥＭ（イーグル最小必須培地）；ＦＢＳまたはＦＣＳ（ウシ胎児血清またはウシ胎仔血清）；ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）；ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞）；ＣＨＯ−Ｒ（ヒトＴＳＨ受容体によりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞）；ＣＨＯ−Ｒｌｕｃ（ｃｒｅ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子複合体によりトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｒ細胞）；Ｏｘｏｉｄ（Ｏｘｏｉｄ、Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ）；ＢＢＬ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｅ、ＭＥ））；ＤＩＦＣＯ（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、Ｎｉｌ）；Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）；Ｆｉｓｈｅｒ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）；Ｓｉｇｍａ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ．）；ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）；ＬＴＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）；ならびにＰｒｏｍｅｇａ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）。
【００６９】
以下の方法において、これらの方法において使用される溶液はすべて、無菌であり（ＴＳＨ、コントロール、患者検体を除いて）、無菌的に処理した。操作はすべて、無菌条件下で、バイオセイフティーキャビネット中で行った。細胞培養培地（たとえばＨａｍのＦ−１２、ＥＭＥＭなど）は、ＬＴＩから購入したが、非必須アミノ酸などのような添加試薬は、Ｓｉｇｍａから購入した。
【００７０】
細胞のフリーザーバイアルは、温度のサイクリングが生存能力の損失をもたらし得るので、本発明の方法における解凍および使用の直前まで、それらの−８０℃（またはそれ未満の）保存温度から暖めてはならない。それが、室温で不安定であるジチオトレイトールを含有するので、５×細胞溶解溶液は、１×溶液の調製のために必要とされる容量を取り出すのに十分な長さだけ、その−２０℃保存温度から取り出されるべきである。それもまた、ジチオトレイトールを含有するので、還元されたルシフェラーゼ基質溶液は、使用の直前まで−２０℃で凍結させたまま保つべきであり、使用の時に、それは、取り出され、解凍され、かつ室温に達するように、２５〜３７℃の水浴中に置かれてもよい。
【００７１】
一般に、ウェル（たとえばマイクロタイタープレートなど）から液体を除去する場合、液体は、ウェルから、バイオセイフティーフード中の入れ物の中に廃棄されてもよい。残留液は、無菌の吸収性のふきん上で、プレートを逆さまに置くことによって、流出させ、除去することができる。または、液体は、吸引器上で、細いチップを使用して、吸引によって除去されてもよい。吸引が使用される場合、プレートは、液体がウェルからあふれ出ないように、急な角度で保持され、吸引器チップは、液体を除去するために、ウェルの側面の下の方、ほぼ底に向けられ、最小限の残留物のみが残る。しかしながら、吸引器によって細胞が容易に除去され得るので、細胞単層の乱れを防ぐように注意を払わなければならない。
【００７２】
下記の方法において示されるように、必要とされるわけではないが、検体、標準物質、およびコントロールを三通り実行することが推奨される。溶液３（Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ３）の粘着性の性質およびウェルにおいて適切な混合を実現する際の困難さのために、合計三通りの容量が、これらの試薬の＋１０％（３３μｌ）であり、必要とされる三通りの容量＋１０％（３３０μｌ）の溶液３に移し、徹底的に混合し、１１０μｌを三通りのウェルに移した場合に、最良の再現性が、実現された。
【００７３】
細胞単層（たとえばマイクロタイタープレートのウェル内で）の調製において、細胞が、ウェル内で均一に分布させることが好ましい。したがって、不均一な細胞分布を回避するために、ウェルの中への細胞懸濁液の移動は、防振性のバイオセイフティーフードにおいて実行されるべきである。プレート中のウェルがすべて、細胞を収容した後、プレートをカバーし、３０分間、堅い防振性の表面上に注意深く置き、細胞を、ウェルの底にそのまま付着させた。これは、細胞の均一な分布がウェルのそれぞれにおいて存在することを確実にするのを助ける。
【００７４】
実施例１
サンプルにおけるＴＢＩを検出するための方法
【００７５】
甲状腺刺激免疫グロブリンを検出するための、キメラＴＳＨ受容体（ＴＳＨＲ）およびＣＲＥ依存性ルシフェラーゼを発現する、安定してトランスフェクトされた細胞株（ＣＨＯ−ＭＣ４）（ＴＳＩバイオアッセイ、Ｔｈｙｒｅｔａｉｎ（商標））は、以前に記載されている（２００８年８月７日に公開された米国特許出願公開第２００８−０１８７９４２号明細書）。補完的な甲状腺阻害抗体（ＴＢＩ）バイオアッセイを開発するために、発明者らは、キメラＴＳＨＲの性能を野生型（ｗｔ）ＴＳＨＲと比較した。
【００７６】
ｗｔまたはキメラＴＳＨＲおよびＣＲＥ依存性ルシフェラーゼを発現するＣＨＯ細胞を単離した。細胞を、１５〜１８時間、３７℃で増殖させ、次いで、ｂＴＳＨ、ＴＳＩ、ＴＢＩ、および／または患者血清と共にインキュベートした。ルシフェラーゼ発現は、３時間のインキュベーション後に測定した。阻害活性は、ｂＴＳＨのみによる誘導と比べた、ルシフェラーゼ発現の抑制パーセントとして定義した。
【００７７】
キメラおよびｗｔ細胞株の両方は、用量依存的な方式で、ｂＴＳＨに応じたルシフェラーゼの誘導を示したが、異なるレベルの感度および最大の誘導を示した。ｗｔ  ＴＳＨＲ発現細胞株は、０．８〜５０ｍＩＵ／ＬのｂＴＳＨの濃度に対して応答したのに対して、キメラＴＳＨＲ発現細胞株は、より広い動的な範囲（１．６〜２００ｍＩＵ／Ｌ）を有し、８倍高いレベルまで誘導された。両方の細胞株は、グレーブス病を有する患者由来の血清中のＴＳＩを検出した。細胞株をＴＳＩまたはｂＴＳＨにより刺激した場合、ルシフェラーゼ発現は、増加性の濃度の阻害ＭＡｂ、Ｋ１−７０（ＲＳＲ、Ｃａｒｄｉｆｆ、Ｕ．Ｋ．）またはＴＢＩを含有する血清の追加によって、用量依存的な方式で低下した。キメラ細胞株は、Ｋ１−７０の５０％抑制濃度（ＩＣ５０）がキメラ細胞株で３〜５分の一であったという点で、より高感度であった。また、ｗｔ細胞とは対照的に、キメラ細胞株は、ＴＢＩポジティブ血清により試験した場合に、３〜４倍高い抑制活性を示し、段階希釈阻害血清によりＳ字形用量−応答曲線を一様に示した。
【００７８】
結果は、ｗｔと比較して、キメラＴＳＨＲ細胞株が、より良好に働き、刺激および阻害バイオアッセイの両方を開発するための特有の媒介物となることを示す。
【００７９】
Ａ．血清サンプルにおけるＴＢＩを検出するための例示的なプロトコール：
１．１枚の黒色平／透明底９６ウェルプレートを、１００μｌ／ウェルの細胞付着溶液によりコーティングする（たとえば米国特許出願公開第２００８−０１８７９４２号明細書において記載されており、Ｑｕｉｄｅｌ  Ｃｏｒｐ．＆Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｈｙｂｒｉｄｓ，Ｉｎｃ．、Ｏｈｉｏ、ＵＳＡからＴｈｙｒｅｔａｉｎ（商標）細胞付着溶液として市販で入手可能である）。溶液を３０秒間、ウェル上でそのままにし、次いで、溶液をデカントする。
２．５ｍｌのＴｈｙｒｅｔａｉｎ（商標）増殖培地に、ＣＨＯ  ＭＣ４細胞の１本のフリーザーバイアルを追加する（たとえば米国特許出願公開第２００８−０１８７９４２号明細書において記載されており、Ｑｕｉｄｅｌ  Ｃｏｒｐ．＆Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｈｙｂｒｉｄｓ，Ｉｎｃ．、Ｏｈｉｏ、ＵＳＡからＴｈｙｒｅｔａｉｎ（商標）増殖培地として市販で入手可能である）。
３．４８ウェルフォーマット中に１００μｌ／ウェルで細胞を置く（プレートの一番上および一番下の行ならびにプレートの左手および右手の最初の２列を抜かす）。
４．３７℃で１６〜１８時間、細胞のプレートをインキュベートする。
５．一晩の増殖期間の終わりに、コンフルエンスについて細胞を顕微鏡で調査し、細胞に混入物がないことを確認する。プレートをインキュベーターに戻す。
６．４００μＩＵ／ｍｌ  ｂＴＳＨ（これは、それぞれのウェルにおいてｂＴＳＨの１００μＩＵ／ｍｌ最終濃度を可能にするであろう）を調製する。これが作業用ストックとなる。
７．ｂＴＳＨによりそれぞれのサンプルの１：１１希釈液を調製する−−４０μＬのそれぞれのサンプル、２２０μＬの４００μＩＵ／ｍｌ  ｂＴＳＨ、および１８０μＬ  Ｔｈｙｒｅｔａｉｎ（商標）反応バッファー（たとえば米国特許出願公開第２００８−０１８７９４２号明細書において記載されており、Ｑｕｉｄｅｌ  Ｃｏｒｐ．＆Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｈｙｂｒｉｄｓ，Ｉｎｃ．、Ｏｈｉｏ、ＵＳＡからＴｈｙｒｅｔａｉｎ（商標）反応バッファーとして市販で入手可能である）。
８．反応バッファーにおいて、正常血清を１：１１に希釈することによって、ブランクコントロールを調製する（４０μＬ血清および４００μＬ反応バッファー）。
９．４０μｌの正常血清、２２０μｌの４００μＩＵ／ｍｌ  ｂＴＳＨ、および１８０μＬ  Ｔｈｙｒｅｔａｉｎ（商標）反応バッファーを希釈することによって、ｂＴＳＨコントロールを調製する。注：プレートはまた、好ましくは、Ｔｈｙｒｅｔａｉｎ（商標）反応バッファーのみを含有する反復ウェルを含有する。
１０．インキュベーターからプレートを取り出し、１００μｌ／ウェルのＴｈｙｒｅｔａｉｎ（商標）反応バッファーにより細胞をすすぎ、次いで、それを細胞に再度供給する。
１１．１００μｌ／ウェルで三通り、細胞に、調製したサンプルを追加する。
１２．３時間、３７℃で、細胞をインキュベートする。
１３．３時間のインキュベーション後に、すべてのウェルの内容物をデカントする。
１４．それぞれのウェルに７５μｌ／ウェルＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）を追加する。
１５．１０分間、室温で細胞をインキュベートし、次いで、Ｖｅｒｉｔａｓ（商標）プレート読み取り装置上でプレートを読み取る。
【００８０】
Ｂ．ＴＢＩアッセイにおける例示的なＴＳＨ濃度：
【００８１】
図１は、ＣＨＯ−ＭＣ４細胞を使用する、ｂＴＳＨ用量応答曲線を示す。図１Ａは、０．２ｍＩＵ／ｍｌ〜４００ｍＩＵ／ｍｌ濃度範囲のｂＴＳＨの段階２倍希釈によるルシフェラーゼ誘導を示し、図１Ｂは、０．２ｍＩＵ／ｍｌ〜１００ｍＩＵ／ｍｌのより狭い濃度のｂＴＳＨによるルシフェラーゼ誘導を示す。Ｓ／Ｂの比は、ルシフェラーゼのシグナル対バックグラウンド比を指し、これは、様々な実験から生成されるルシフェラーゼ活性（ＲＬＵで測定されるもの）を標準化する。
【００８２】
図１Ａは、ルシフェラーゼ誘導が、ｂＴＳＨの濃度と共に増加することを示す。ｂＴＳＨ濃度が１００ｍＩＵ／ｍｌに等しいまたはそれよりも低い場合、ルシフェラーゼ誘導およびｂＴＳＨ濃度の関係は、直線的である。ｂＴＳＨの濃度が、１００ｍＩＵ／ｍｌよりも高い場合、ルシフェラーゼ活性の上昇は、下がり、誘導は、次第に、プラトーに近づくが、完全にはプラトーに達しない。図１Ｂは、ｂＴＳＨ濃度が、１００ｍＩＵ／ｍｌに等しいまたはそれよりも低い場合の、図１Ａの直線部分を拡大したものである。Ｒ２（係数値）は、１に近い。
【００８３】
ＴＢＩアッセイにおいて、甲状腺阻害抗体は、細胞膜上に位置するＴＳＨ受容体の結合について、ｂＴＳＨと競合する。そのため、ｂＴＳＨの濃度は、アッセイ感度の決定のための重要な構成成分となる。図１Ｂにおいて示される、ルシフェラーゼ誘導のための直線的な範囲のｂＴＳＨ濃度は、ｂＴＳＨのより高い非直線的な濃度よりも、高い検出感度を有する。ｂＴＳＨの濃度の直線的な範囲内で、最も高い濃度が、アッセイのための１つの最適な濃度として使用されてもよい。直線的な濃度はすべて、同じｂＴＳＨ検出感度を有するが、より高いｂＴＳＨ濃度は、より大きなシグナル対バックグラウンド比を意味する。
【００８４】
実施例２
キメラＴＳＨＲは、ＴＢＩを検出する際に、野生型ＴＳＨＲよりも有用である
【００８５】
Ａ．ＭＣ４およびＴＳＨＲｗｔ細胞（Ｈ１０）における、Ｋ１−７０甲状腺阻害モノクローナル抗体（ＭＡｂ）による、甲状腺阻害免疫グロブリン（ＴＢＩ）アッセイの検出感度の比較
【００８６】
０．１〜１００ｎｇ／ｍｌの段階希釈甲状腺阻害ＭＡｂ  Ｋ１−７０を、ＣＨＯ−ＭＣ４細胞またはＨ１０細胞においてＴＢＩアッセイにより試験した。結果を図３に示す。
【００８７】
すべてのサンプルデータは、１：１１希釈正常血清を有する反応バッファーのバックグラウンドＲＬＵにより標準化した。抑制パーセンテージ（％）は、（ｂＴＳＨコントロールＲＬＵ−サンプルＲＬＵ）／ｂＴＳＨコントロールＲＬＵとして計算した。
【００８８】
結果は、ＣＨＯ−ＭＣ４細胞が、Ｈ１０細胞よりも、Ｋ１−７０に対して、はるかに高い検出感度を有することを示す。ＣＨＯ−ＭＣ４細胞のＩＣ５０は、Ｈ１０細胞よりも７．５分の一であった。
【００８９】
Ｂ．ＭＣ４およびＨ１０細胞における、阻害抗体含有血清によるＴＢＩアッセイの検出感度の比較
【００９０】
あるＴＢＩポジティブな患者の血清を、１：２２〜１：９０，０００に段階希釈し、ＭＣ４またはＨ１０細胞においてＴＢＩアッセイによって試験した。結果を図４に示す。
【００９１】
結果は、ＣＨＯ−ＭＣ４細胞における血清希釈液の抑制パーセンテージのＳ字形曲線を示し、これは、前の実験におけるＫ１−７０のものに類似している。しかしながら、それは、Ｈ１０細胞において同じ曲線を示さなかった。
【００９２】
この結果は、ＣＨＯ−ＭＣ４細胞が、Ｈ１０細胞よりも、ＴＢＩの検出においてより高感度であることを確認するものである。
【００９３】
実施例３
本発明のＴＢＩアッセイの感度は、Ｋｒｏｎｕｓ（商標）ＥＬＩＳＡアッセイなどのような競合的結合方法よりも高い
【００９４】
発明者らは、本発明のＴＢＩアッセイを、Ｋｒｏｎｕｓ（商標）ＥＬＩＳＡアッセイ（ＴＲＡｂアッセイ）などのような先行技術の競合的結合方法と比較するために、甲状腺阻害モノクローナル抗体Ｋ１−７０用量応答曲線の比較を行った。本実験において、Ｋ１−７０甲状腺刺激モノクローナル抗体を、ＣＨＯ−ＭＣ４細胞におけるＴＢＩアッセイおよびＴＲＡｂアッセイ（Ｋｒｏｎｕｓ（商標））の両方について試験する。結果を図５に示す。
【００９５】
結果は、ＣＨＯ−ＭＣ４細胞によるＴＢＩアッセイのＩＣ５０が、１．３４４ｎｇ／ｍｌであることを示し、これは、ＴＲＡｂアッセイよりも２２分の一であり、ＣＨＯ−ＭＣ４細胞が、ＴＲＡｂアッセイよりも高いＴＢＩ検出感度を有することを示す。
【００９６】
実施例４
本発明のＴＢＩアッセイの感度
【００９７】
以下のデータは、他のアッセイと、ＴＢＩを検出する際の本発明アッセイの感度を比較する。
【００９８】
【表１】
0005908590.tif 000002
【００９９】
【表２】
0005908590.tif 000003
【０１００】
【表３】
0005908590.tif 000004
【０１０１】
【表４】
0005908590.tif 000005
【０１０２】
実施例５
本発明のＴＢＩアッセイの特異度
【０１０３】
表５および６は、糖タンパク質ホルモンサブファミリー−−黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、および卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）を伴う、本発明のＴＢＩアッセイについての特異度試験の結果を示す。実験において、それぞれのホルモンの２つの濃度について試験した。一方の濃度は、正常範囲内の最も高いレベルとし、他方は、その濃度の２倍とする。Ｋ１−７０甲状腺阻害モノクローナル抗体は、ポジティブコントロールとして使用し、ホルモンは、反応バッファー中のＫ１−７０と共に試験した。
【０１０４】
ヒトにおけるそれぞれのホルモンの正常範囲は、以下のとおりである：ＬＨ  ５〜２０  ｍＩＵ／ｍｌ；ｈＣＧ  ０．１〜８０００ｍＩＵ／ｍｌ；ＦＳＨ  １．４〜１１６．３ｍＩＵ／ｍｌ。
【０１０５】
【表５】
0005908590.tif 000006
【０１０６】
【表６−１】
0005908590.tif 000007
【０１０７】
データは、３つの糖タンパク質ホルモンをＴＢＩアッセイにおいて試験した場合、実質的な交差反応性または干渉がなかったことを実証する。これらの結果は、ＴＢＩアッセイが、ｂＴＳＨに対して非常に特異的であることを示す。
【０１０８】
実施例６
本発明の二重バイオアッセイ方法は、ＴＢＩおよびＴＳＩの両方をうまく検出することができる
【０１０９】
ここで、発明者らは、キメラＴＳＨ受容体（ＴＳＨＲ）を発現し、かつ２００８年８月７日に公開された米国特許出願公開第２００８−０１８７９４２号明細書において記載される、同じトランスジェニック細胞ＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ−ＭＣ４）を使用して、甲状腺刺激免疫グロブリン（ＴＳＩ）および甲状腺阻害免疫グロブリン（ＴＢＩ）の両方を検出するためのアッセイについて記載する。
【０１１０】
方法：阻害活性を検出するために、ＣＨＯ−ＭＣ４細胞を、抗ＴＳＨＲ阻害ＭＡｂまたはヒト血清サンプルと混合したウシＴＳＨ（ｂＴＳＨ）により誘導した。阻害活性は、ｂＴＳＨのみによる誘導と比べた、ルシフェラーゼ発現の抑制パーセントとして定義した。ＭＡｂ  Ｋ１−７０およびＭ−２２は、ＲＳＲ（Ｃａｒｄｉｆｆ、Ｕ．Ｋ．）から購入した。すべてのサンプルはまた、ＴＳＨＲ自己抗体（ＴＲＡｂ）（ＥＬＩＳＡ、Ｋｒｏｎｕｓ（商標））およびＴＳＩ（Ｔｈｙｒｅｔａｉｎ（商標））についても測定した。
【０１１１】
結果：ｂＴＳＨにより刺激されたＣＨＯ−ＭＣ４細胞のルシフェラーゼ発現は、用量依存的な方式で、阻害ＭＡｂ  Ｋ１−７０に応じて減少した。５０の甲状腺機能正常コントロール血清は、７〜５２％の抑制を示し、発明者らが、５０％抑制について事前の９５パーセンタイルカットオフを確立するのを可能にした。自己免疫性甲状腺機能低下症を有する患者由来のＴＲＡｂポジティブおよびＴＳＩネガティブ血清は、ルシフェラーゼ発現をバックグラウンドレベル（１００％の抑制）まで低下させた。階段希釈実験は、１：２００までのこれらのサンプルにおける阻害活性の力価を実証した。ＴＢＩバイオアッセイは、Ｋ１−７０  ＭＡｂによるＴＲＡｂアッセイよりも、２０倍を超えて高感度であり、１．３４＋／−０．０９ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０対２９．７３＋／−３．２７ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０を示した。
【０１１２】
ＴＢＩバイオアッセイはまた、ＴＳＩを検出することもできた。刺激ＭＡｂ（Ｍ−２２）またはＴＳＩポジティブ血清を使用すると、発明者らは、ｂＴＳＨのみで見られるものを上回るルシフェラーゼ発現、つまりネガティブな抑制を観察した。両方のアッセイにおけるＭ−２２刺激活性についての用量−応答は、それぞれ、ＴＳＩおよびＴＢＩアッセイにおける０．１４ｎｇ／ｍｌおよび０．１６ｎｇ／ｍｌの５０％有効濃度（ＥＣ５０）と本質的に同一であった。両方のアッセイにおいて試験したＴＳＩポジティブ血清の階段希釈もまた、等価な用量−応答曲線を示した。
【０１１３】
Ａ．段階希釈Ｍ２２またはＴＳＩポジティブ患者血清によるＴＢＩアッセイ
【０１１４】
甲状腺刺激モノクローナル抗体Ｍ２２またはＴＳＩポジティブ血清を段階希釈し、ＣＨＯ−ＭＣ４細胞を使用し、本発明のＴＢＩアッセイを使用して試験した。結果は図６である。図６は、本発明のＴＢＩアッセイが、甲状腺刺激免疫グロブリン（ＴＳＩ）を検出することができることを両方の希釈曲線が実証することを示す。
Ｂ．１７１  ＴＳＩポジティブ血清サンプルを使用するＴＳＩおよびＴＢＩアッセイの間の相関
【０１１５】
本実験において、１７１  ＴＳＩポジティブ血清を調製し、ＴＳＩまたはＴＢＩアッセイで同時に試験した。結果を図７に示す。
【０１１６】
結果は、ＴＳＩおよびＴＢＩアッセイの間の高い相関を示し（Ｒ２＝０．９）、ＴＢＩアッセイが、ＴＳＩポジティブ血清を検出するために使用することができることを示す。
【０１１７】
実施例７
本発明の二重バイオアッセイ方法は、甲状腺を刺激するものおよび甲状腺の刺激を阻害するものに、抗ＴＳＨＲ自己抗体を区別することができる
【０１１８】
本実験において、甲状腺刺激モノクローナル抗体Ｍ２２および甲状腺阻害モノクローナル抗体Ｋ１−７０を、１００：０、９０：１０、８０：２０〜０：１００などのような様々な比でともに混合し、ＣＨＯ−ＭＣ４細胞を使用して、本発明のＴＢＩアッセイで試験した。結果を図８に示す。
【０１１９】
図８は、混合物中のＫ１−７０の部分が、０から１００％に増加すると（またはＭ２２が１００から０パーセントに）、ＴＢＩ抑制％は、マイナス１００％からプラス１００％まで次第に増加する。このことにより、ＴＢＩアッセイにおいて、それが、ネガティブな抑制が結果として生じるように、甲状腺刺激抗体を検出することができるだけではなく、阻害抗体をも示すことを示す。
【０１２０】
実施例８
ＴＢＩおよび／またはＴＳＩを検出するための本発明の二重バイオアッセイの感度
【０１２１】
以下の結果は、血清サンプルにおけるＴＢＩおよび／もしくはＴＳＩを検出するための（表６）またはモノクローナル抗体Ｍ２２およびＫ１−７０を使用した場合の（表５および７）、本発明の二重バイオアッセイの感度を示す。
【０１２２】
【表６−２】
0005908590.tif 000008
【０１２３】
【表７】
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【０１２４】
【表８】
0005908590.tif 000010
【０１２５】
上記の本明細書において言及される刊行物および特許はすべて、参照によって本明細書において組み込まれる。本発明の記載される方法および系の様々な修飾および変形は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者らに明らかになるであろう。本発明は、特定の好ましい実施形態に関して記載したが、主張される本発明がそのような特定の実施形態に不当に限定されないことが理解されたい。実際、当業者らに明らかな、本発明を実行するための記載されるモードの様々な修飾は、以下の請求項の範囲内にあることが意図される。
【図１】
0005908590.tif 000011
【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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