(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料から発せられる観察光を受光する受光部を有し、該受光部により受光された前記観察光を光電変換してその光量に応じた大きさの電流信号を出力する光電変換部と、
該光電変換部から出力される前記電流信号に含まれる光子数を計測する光子計測処理部と、
前記受光部において前記観察光が露光される露光時間を入力する入力部と、
基準となる所定の露光時間である基準露光時間に対する前記入力部により入力された実際の露光時間である実露光時間の比率の逆数を、前記光子計測処理部により計測された前記光子数に乗算して得られる輝度値に基づいて、前記試料の画像を構築する画像構築部とを備える光検出システム。
【請求項２】
前記画像構築部が、露光時間ごとに前記光子数と前記輝度値とを対応付けた複数のルックアップテーブルを備え、前記実露光時間により選択されたルックアップテーブルから、前記光子計測処理部により計測された前記光子数に対応付けられた前記輝度値を読み出す請求項１に記載の光検出システム。
【請求項３】
前記画像構築部が、前記光子計測処理部により計測された光子数と、前記実露光時間と、前記基準露光時間とを演算処理して前記輝度値を算出する請求項１に記載の光検出システム。
【請求項４】
請求項１から請求項３のいずれかに記載の光検出システムと、
光源から発せられた照明光を反射して前記試料上で走査させる走査部と、
該走査部により反射された前記照明光を前記試料に照射し、該試料から発せられて前記光電変換部の前記受光部により受光される前記観察光を集光する対物レンズとを備え、
前記実露光時間として、前記走査部による前記試料上での前記照明光の走査時間を用いる顕微鏡システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光検出システムおよび顕微鏡システムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、生物系研究分野、特に顕微鏡を使った研究市場において、生体のより速い動的反応を観察する要求が増えている。顕微鏡は、フレームレートが上がると１フレーム画像を取得するのに要する検出時間が短くなる。そのため、検出器には、より微弱な光を検出することが求められており、例えば、フォトンカウンティング（光子計測）の技術が使われている。
【０００３】
また、同じ光の入射条件で露光時間（例えば、レーザ走査型顕微鏡においては走査速度。）を変えると、１画素内に入射する光子数が変化することから、これに応じて入射光子数に対応する画像輝度が変化する。そのため、使用者はスキャン速度を変更する度に観察条件（ＨＶ（ＨＩＧＨ  ＶＯＬＴＡＧＥ、広義でアナログゲイン。）やレーザ光量。）を変える必要があり、煩わしさがあった。
【０００４】
これに対し、特許文献１に記載の走査型レーザ顕微鏡は、露光時間に応じてＨＶを変化させたり、あるいは、検出器に入射する光量を変化させたりすることにより、スキャン速度によらず、ＧＵＩ（Ｇｒａｐｈｉｃａｌ  Ｕｓｅｒ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）に表示される輝度値を一定にすることとしている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００５−２１５３５７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献１に記載の走査型レーザ顕微鏡では、フォトンカウンティングの場合も上記と同様に露光時間に応じて入射する光子数が増減して画像輝度が変化するが、ＨＶを変化させても波高値が変わるだけで、得られる光子数は変化しないという不都合がある。また、検出器に入射する光量を変化させると、短い露光時間のときに検出器への入射光量を増やすことになるので、マルチフォトンイベントを誘発する可能性があり、結果として輝度のリニアリティに欠ける画像となるという不都合がある。
【０００７】
本発明は、フォトンカウンティング検出に際して、露光時間を変更しても表示する画像の明るさを一定に保つことができる光検出システムおよび顕微鏡システムを提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、試料から発せられる観察光を受光する受光部を有し、該受光部により受光された前記観察光を光電変換してその光量に応じた大きさの電流信号を出力する光電変換部と、該光電変換部から出力される前記電流信号に含まれる光子数を計測する光子計測処理部と、前記受光部において前記観察光が露光される露光時間を入力する入力部と、基準となる所定の露光時間である基準露光時間に対する前記入力部により入力された実際の露光時間である実露光時間の比率の逆数を、前記光子計測処理部により計測された前記光子数に乗算して得られる輝度値に基づいて、前記試料の画像を構築する画像構築部とを備える光検出システムを提供する。
【０００９】
本発明によれば、入力部により入力する光電変換部の受光部の露光時間が変化すると、光電変換部により観察光を光電変換して得られる電流信号に含まれる光子数がその露光時間に応じて変化するが、光子計測処理部により光電変換部からの電流信号に含まれる光子数を計測し、画像構築部により、その光子数に基準露光時間に対する実露光時間の比率の逆数を乗算することで、光子数の変化に関わらず画像構築のための輝度値を一定にすることができる。したがって、この輝度値に基づいて試料の画像を構築することで、光電変換部の受光部における観察光の露光時間に関わらず一定の明るさの画像を取得することができる。
【００１０】
上記発明においては、前記画像構築部が、露光時間ごとに前記光子数と前記輝度値とを対応付けた複数のルックアップテーブルを備え、前記実露光時間により選択されたルックアップテーブルから、前記光子計測処理部により計測された前記光子数に対応付けられた前記輝度値を読み出すこととしてもよい。
【００１１】
このように構成することで、想定される複数のルックアップテーブルを予め用意しておくだけで、演算処理にかかる時間を省いて簡易に輝度値を決定し、試料の画像を迅速に構築することができる。
【００１２】
また、上記発明においては、前記画像構築部が、前記光子計測処理部により計測された光子数と、前記実露光時間と、前記基準露光時間とを演算処理して前記輝度値を算出することとしてもよい。
このように構成することで、実際の光子数および露光時間に合わせて臨機応変に適切な輝度値を決定し、試料の画像を精度よく構築することができる。
【００１３】
本発明は、上記いずれかの光検出システムと、光源から発せられた照明光を反射して前記試料上で走査させる走査部と、該走査部により反射された前記照明光を前記試料に照射し、該試料から発せられて前記光電変換部の前記受光部により受光される前記観察光を集光する対物レンズとを備え、前記実露光時間として、前記走査部による前記試料上での前記照明光の走査時間を用いる顕微鏡システムを提供する。
【００１４】
本発明によれば、走査部により試料上で照明光が走査された範囲の画像を取得することができる。この場合において、走査部による試料上での照明光の走査時間を変更しても、変更の前後で試料の画像の明るさを一定に保つことができる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、フォトンカウンティング検出に際して、露光時間を変更しても表示する画像の明るさを一定に保つことができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の第１実施形態に係る顕微鏡システムを示す概略構成図である。
【図２】図１の光検出システムを示すブロック図である。
【図３】実本発明の第１実施形態に係る露光時間と表示最大階調と光子数とを関連付けたルックアップテーブルを示す図表である。
【図４】光子数と表示階調との関係を示すグラフである。
【図５】本発明の第２実施形態に係る光検出システムを示すブロック図である。
【図６】本発明の第２実施形態に係る実露光時間と表示最大階調と光子数とを関連付けたルックアップテーブルを示す図表である。
【図７】光子数と表示階調との関係を示すグラフである。
【図８】光子数と表示階調との関係を示す別のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
〔第１実施形態〕
本発明の第１実施形態に係る光検出システムおよび顕微鏡システムについて図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡システム１００は、図１に示されるように、レーザ光を発する光源ユニット１０と、光源ユニット１０から発せられたレーザ光を試料Ｓに照射する顕微鏡装置２０と、顕微鏡装置２０によりレーザ光が照射された試料Ｓにおいて発生する蛍光（観察光）を検出する光検出システム４０と、光検出システム４０により蛍光が検出された試料Ｓの画像を表示するモニタ４９とを備えている。
【００１８】
光源ユニット１０としては、例えば、多波長レーザ光源が用いられる。光源ユニット１０は、レーザ光を発生するスーパコンティニュムレーザ等の光源１１Ａ，１１Ｂと、光源１１Ａから発生されたレーザを反射する反射ミラー１３と、反射ミラー１３により反射されたレーザ光を透過する一方、光源１１Ｂから発生されたレーザ光を反射し、これらの各レーザ光の光路を合成するダイクロイックミラー（ＤＭ）１５と、ダイクロイックミラー１５により光路が合成されたレーザ光を調光する音響光学素子のような調光部１７とを備えている。
【００１９】
この光源ユニット１０は、レーザ光源１１Ａ，１１Ｂからレーザ光を発生させて調光部１７によりその波長選択および強度調整を制御することにより、所定の波長域で所定の強度のレーザ光を発することができるようになっている。
【００２０】
顕微鏡装置２０は、試料Ｓを載置するステージ３１を有する顕微鏡本体３０と、光源ユニット１０から発せられたレーザ光を反射して試料Ｓ上で走査させるスキャナ（走査部）２１と、スキャナ２１により反射されたレーザ光を集光する瞳投影レンズ（ＰＬ）２３と、瞳投影レンズ２３により集光されたレーザ光を顕微鏡本体３０に向けて反射する反射ミラー２５とを備えている。スキャナ２１としては、例えば、ガルバノミラー、共振スキャナ、または、ＡＯＤ（Ａｃｏｕｓｔｏ−Ｏｐｔｉｃ  Ｄｅｆｌｅｃｔｏｒ、音響光学偏向素子）等を用いることができる。
【００２１】
顕微鏡本体３０は、ステージ３１の他に、反射ミラー２５により入射されるレーザ光を平行光に変換する結像レンズ（ＴＬ）３３と、結像レンズ３３により平行光に変換されたレーザ光を試料Ｓに照射し、試料Ｓにおいて発生する蛍光を集光する複数の対物レンズ３５とを備えている。符合３６は、対物レンズ３５が取付けられ、レーザ光の光路上に複数の対物レンズ３５を択一的に配置可能なレボルバを示している。
【００２２】
また、顕微鏡装置２０には、光源ユニット１０からのレーザ光を反射してスキャナ２１に入射させる一方、対物レンズ３５により集光されて結像レンズ３３、反射ミラー２５、瞳投影レンズ２３およびスキャナ２１を介してレーザ光の光路を逆方向に戻る蛍光を透過させてレーザ光の光路から分岐させるダイクロイックミラー（ＤＭ）２７と、ダイクロイックミラー２７を透過した蛍光を集光する集光レンズ（ＣＦＬ）２９と、集光レンズ２９により集光された蛍光の一部を通過させるピンホール（ＰＨ）３７と、ピンホール３７を通過した蛍光を平行光に変換して光検出システム４０に入射させるコリメートレンズ（ＣＯＬ）３９とを備えている。
【００２３】
光検出システム４０は、コリメートレンズ３９により平行光に変換された蛍光を検出して電流信号を出力する検出器（Ｄｅｔｅｃｔｏｒ、光電変換部）４１と、検出器４１から出力される電流信号を処理する光検出回路５０と、光源ユニット１０の調光部１７やスキャナ２１の揺動角度等を制御する制御部４３と、試料Ｓの画像を構築するＰＣ（Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ、画像構築部）４５とを備えている。この光検出システム４０には、ユーザにより入力される検出器４１における露光時間に関する情報をＰＣ４５に入力する入力部４７と、ＰＣ４５により構築された画像を表示するモニタ４９とが接続されている。
【００２４】
検出器４１としては、例えば、ＰＭＴ（Ｐｈｏｔｏ  Ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ  Ｔｕｂｅ）やＰＤ（Ｐｈｏｔｏ  Ｄｉｏｄｅ）を用いることができる。この検出器４１は、蛍光を受光する受光部４２を有しており、受光部４２により受光された蛍光を光電変換してその光量に応じた大きさの電流信号を出力するようになっている。
【００２５】
光検出回路５０は、図２に示すように、検出器４１から送られてくる電流信号を電圧信号に変換する増幅器（Ｐｒｅ−Ａｍｐ）５１と、増幅器５１により増幅された電圧信号と基準となる電圧信号（Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｌｅｖｅｌ）とを比較し、比較結果に応じた電圧信号を出力する比較器（Ｃｏｍｐａｒａｔｏｒ）５３と、比較器５３から出力される電圧信号に含まれる光子数を計測する計測器（Ｃｏｕｎｔｅｒ、光子計測処理部）５５とを備えている。
計測器５５は、計測した光子数の計測データ（ｐｉｘｅｌ  ｂｒｉｇｈｔｎｅｓｓ  ｄａｔａ）を制御部４３を介してＰＣ４５に送るようになっている。
【００２６】
制御部４３は、計測器５５から送られてきた光子数の計測データをＰＣ４５に送るようになっている。
入力部４７は、ユーザにより入力される受光部４２の露光時間（以下、ユーザにより入力される実際の露光時間を「実露光時間」という。）と、基準となる所定の露光時間（以下、基準となる所定の露光時間を「基準露光時間」という。）とをＰＣ４５に入力するようになっている。
【００２７】
ＰＣ４５は、図３に示すように、受光部４２における１画素の実露光時間（μｓ）ごとに、計測器５５により計測された光子数（入射光子数）と、その光子数に基準露光時間に対する実露光時間の比率の逆数を乗算して得られる輝度値（本実施形態においては、輝度の表示最大階調）とを対応付けたルックアップテーブルを自動生成するようになっている。図３は、１画素の露光時間（μｓ）が２００μｓの場合のルックアップテーブルと、２０μｓの場合のルックアップテーブルと、２μｓの場合のルックアップテーブルを例示している。図６において同様である。
【００２８】
例えば、１光子パルスが５ｎｓで分離可能であるとすると、２μｓ／Ｐｉｘｅｌのスキャンでは最大で４００カウントできるので、ＰＣ４５により、最大４００階調表示になるようなルックアップテーブルが自動生成される。図４は、２００μｓ／Ｐｉｘｅｌのときの入射光子数と表示階調との関係と、２０μｓ／Ｐｉｘｅｌのときの入射光子数と表示階調との通常の関係と、２０μｓ／Ｐｉｘｅｌのときの入射光子数と表示階調とのＬＵＴ変更後の関係とを示している。
【００２９】
また、ＰＣ４５には、各ピクセルの光子数を蓄積するとともに、生成したルックアップテーブルを保存するメモリ（Ｆｒａｍｅ  ｍｅｍｏｒｙ）４６が備えられている。ＰＣ４５は、入力部４７から入力される実露光時間に対応するルックアップテーブルをメモリ４６から選択し、選択したルックアップテーブルから、計測器５５により計測された光子数に対応付けられた表示最大階調を読み出すようになっている。そして、ＰＣ４５は、読み出した表示最大階調に基づいて、試料Ｓの画像を構築するようになっている。ＰＣ４５により構築された画像は、モニタ４９に表示されるようになっている。
【００３０】
このように構成された光検出システム４０および顕微鏡システム１００の作用について説明する。
本実施形態に係る顕微鏡システム１００により試料Ｓの画像を取得するには、まず、ステージ３１に試料Ｓを載置し、光源ユニット１０から所定の波長域で所定の強度のレーザ光を発生させる。
【００３１】
光源ユニット１０から発せられたレーザ光は、ダイクロイックミラー２７により反射された後、スキャナ２１により反射されて瞳投影レンズ２３により集光され、反射ミラー２５および結像レンズ３３を介して、対物レンズ３５により試料Ｓに照射される。
【００３２】
レーザ光が照射されることにより試料Ｓにおいて蛍光が発生すると、その蛍光は対物レンズ３５により集光され、結像レンズ３３、反射ミラー２５、瞳投影レンズ２３、スキャナ２１を介してレーザ光の光路を戻り、ダイクロイックミラー２７を透過してレーザ光の光路から分離される。
【００３３】
ダイクロイックミラー２７を透過した蛍光は、集光レンズ２９により集光され、その内の試料Ｓにおける対物レンズ３５の焦点位置において発生した蛍光のみがピンホール３７を通過する。ピンホール３７を通過した蛍光は、コリメートレンズ３９により平行光に変換され、検出器４１の受光部４２により受光される。
【００３４】
受光部４２により蛍光が受光されると、検出器４１から光量に応じた大きさの電流信号が出力され、増幅器５１により電流信号が電圧信号に変換される。電圧信号は、比較器５３を介して計測器５５に入力され、また、ユーザから入力部４７に入力された実露光時間もＰｉｘｅｌ  ｃｌｏｃｋとして計測器５５に入力される。計測器５５において電圧信号に含まれる光子数が露光時間分計測され、１ｐｉｘｅｌの輝度信号（ｐｉｘｅｌ  ｂｒｉｇｈｔｎｅｓｓ  ｄａｔａ）として、制御部４３を介してＰＣ４５に送られる。
【００３５】
また、入力部４７においては、ユーザにより基準露光時間が入力され、その基準露光時間と実露光時間とがＰＣ４５に入力される。
【００３６】
ＰＣ４５においては、入力された実露光時間に対応するルックアップテーブルがメモリ４６から選択され、選択されたルックアップテーブルから、計測データの光子数に対応付けられている表示最大階調が読み出される。そして、ＰＣ４５により、読み出した表示最大階調に基づいて試料Ｓの画像が構築され、モニタ４９に表示される。
【００３７】
この場合において、受光部４２の露光時間が変化すると、検出器４１により蛍光を光電変換して得られる電流信号に含まれる光子数がその実露光時間に応じて変化するが、ＰＣ４５により、実露光時間ごとに、電圧信号に含まれる光子数とその光子数に基準露光時間に対する実露光時間の比率の逆数を乗算して得られる輝度の表示最大階調とを対応付けてルックアップテーブルを生成することで、光子数の変化に関わらず画素ごとの輝度値を一定にすることができる。
【００３８】
したがって、ＰＣ４５により、ルックアップテーブルから読み出した表示最大階調に基づいて試料Ｓの画像を構築することで、検出器４１の受光部４２における蛍光の露光時間に関わらず一定の明るさの画像を取得することができる。これにより、ユーザはモニタ４９に表示された一定の明るさの画像を見ながら試料Ｓを観察することができる。
【００３９】
以上、本実施形態に係る光検出システム４０および顕微鏡システム１００によれば、フォトンカウンティング検出に際して、露光時間を変更しても表示する画像の明るさを一定に保ち、所望の明るさの画像により試料Ｓを観察することができる。また、想定される複数のルックアップテーブルを予め用意しておくだけで、演算処理にかかる時間を省いて簡易に輝度値を決定し、一定の明るさの試料Ｓの画像を迅速に構築することができる。
【００４０】
〔第２実施形態〕
次に、本発明の第２実施形態に係る光検出システムおよび顕微鏡システムについて説明する。
本実施形態に係る顕微鏡システム１００は、図５に示すように、光検出システム１４０の構成が第１実施形態と異なる。
以下、第１実施形態に係る光検出システム４０および顕微鏡システム１００と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。
【００４１】
光検出システム１４０は、ＰＣ４５に代えて、ＰＣ（画像構築部）１４５が、計測器５５により計測された光子数と、ユーザにより入力される受光部４２の実露光時間および基準露光時間とを演算処理して輝度値を算出するようになっている。
【００４２】
具体的には、ＰＣ１４５は、基準露光時間に対する実露光時間の比率の逆数を光子数に乗算して輝度値を算出するようになっている。例えば、２００μｓ／ｐｉｘで１０００カウントだった場合は、２μｓ／ｐｉｘでは１０カウントになるが、２００μｓ／ｐｉｘ（基準露光時間）に対する２μｓ／ｐｉｘ（実露光時間）の比率の逆数である１００が１０カウント（光子数）に乗算されて輝度値が算出される。
【００４３】
本実施形態においては、ＰＣ１４５において、図６に示すような露光時間ごとに光子数と輝度値（輝度の表示最大階調）とを対応付けた複数のルックアップテーブルをメモリ４６に保存しておき、演算処理と共にルックアップテーブルを参照することとしてもよい。図７は、２００μｓ／Ｐｉｘｅｌのときの入射光子数と表示階調との関係と、２０μｓ／Ｐｉｘｅｌのときの入射光子数と表示階調との通常の関係と、２０μｓ／Ｐｉｘｅｌのときの入射光子数と表示階調との演算処理後の関係とを示している。また、図８は、２００μｓ／Ｐｉｘｅｌのときの入射光子数と表示階調との関係と、２０μｓ／Ｐｉｘｅｌのときの入射光子数と表示階調との演算処理後の関係とを示している。
【００４４】
このように構成された光検出システム１４０および顕微鏡システム１００の作用について説明する。
本実施形態に係る顕微鏡システム１００により試料Ｓの画像を取得するには、第１実施形態と同様に、試料Ｓにレーザ光を照射し、試料Ｓにおいて発生した蛍光を検出器４１の受光部４２により受光する。
【００４５】
そして、検出器４１により得られた電圧信号に含まれる光子数を計測器５５により計測して、その計測データをＰＣ１４５に送るとともに、入力部４７により、ユーザによって入力される受光部４２の実露光時間と基準露光時間とをＰＣ１４５に入力する。
【００４６】
ＰＣ１４５においては、基準露光時間に対する実露光時間の比率の逆数が光子数に乗算されて輝度値が算出される。そして、算出された輝度値に基づいて試料Ｓの画像が構築され、モニタ４９に表示される。これにより、ユーザはモニタ４９に表示された画像を見ながら試料Ｓを観察することができる。
【００４７】
この場合において、ＰＣ１４５により、光子数に基準露光時間に対する実露光時間の比率の逆数を乗算することで、光子数の変化に関わらず画像構築のための輝度値を一定にすることができる。そして、この輝度値に基づいて試料Ｓの画像を構築することで、受光部４２における蛍光の露光時間に関わらず一定の明るさの画像を取得することができる。
【００４８】
これにより、本実施形態に係る光検出システム１４０および顕微鏡システム１００によれば、フォトンカウンティング検出に際して、露光時間を変更しても表示する画像の明るさを一定に保ち、所望の画像により試料Ｓを観察することができる。また、演算処理により、実際の光子数および露光時間に合わせて臨機応変に適切な輝度値を決定し、試料Ｓの画像を精度よく構築することができる。
【００４９】
以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。例えば、本発明を上記の各実施形態に適用したものに限定されることなく、これらの実施形態を適宜組み合わせた実施形態に適用してもよく、特に限定されるものではない。
【符号の説明】
【００５０】
２１    スキャナ（走査部）
３５    対物レンズ
４０，１４０    光検出システム
４１    検出器（光電変換部）
４２    受光部
４５    ＰＣ（画像構築部）
４７    入力部
５５    計測器（光子計測処理部）
１００    顕微鏡システム
【図１】
0006000671.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0006000671.tif 000009