(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリシル−ｔＲＮＡ合成酵素ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを含む、細胞活性を調節するための治療組成物であって、該ポリペプチドは、全長ヒトグリシル−ｔＲＮＡ合成酵素のフラグメントであって、かつ、配列番号１のアミノ酸残基３６７〜４３８を含むか、または、全長ヒトグリシル−ｔＲＮＡ合成酵素のフラグメントであって、かつ、配列番号１のアミノ酸残基３６７〜４３８に対して少なくとも９０％同一な配列を含むその活性な改変体であり、該ポリペプチドは、細胞増殖の調節、アポトーシスの調節、細胞シグナル伝達の調節、細胞遊走の調節、細胞活性化ならびにサイトカインの産生および／または放出の調節からなる群より選択される非正準的な生物学的活性を有する、組成物。
【請求項２】
前記細胞活性が、Ａｋｔ媒介性細胞シグナル伝達の調節、Ｅｒｋ１／２媒介性の細胞シグナル伝達の調節およびＧＰＣＲ媒介性の細胞シグナル伝達の調節、ＣＤ７１の調節およびＣＤ８０の調節からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記細胞活性が、サイトカインの産生および／または放出の調節からなる群より選択され、ここで該サイトカインが、ＴＮＦ−α、ＩＬ１−β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０、ＭＩＰ１−α、ＭＩＰ−１β、ＧＲＯ−α、ＭＣＰ−１およびＩＬ−１ｒａからなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、全長ヒトグリシル−ｔＲＮＡ合成酵素のフラグメントであって、かつ、配列番号１のアミノ酸残基３６７〜４３８を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、長さ約５００アミノ酸までであり、かつ、配列番号１のアミノ酸残基３６７〜４３８、２１４〜４３８、２１４〜６８５、２３９〜６８５、２６５〜６８５、３１１〜６８５、もしくは３３３〜６８５、または、配列番号１の残基３６７〜４３８、２１４〜４３８、２１４〜６８５、２３９〜６８５、２６５〜６８５、３１１〜６８５、もしくは３３３〜６８５に対して少なくとも９０％同一な配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、長さ約４００アミノ酸までであり、かつ、配列番号１のアミノ酸残基３６７〜４３８、２１４〜４３８、３１１〜６８５、もしくは３３３〜６８５、または、配列番号１の残基３６７〜４３８、２１４〜４３８、３１１〜６８５、もしくは３３３〜６８５に対して少なくとも９０％同一な配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記ポリペプチドが、長さ約３００アミノ酸までであり、かつ、配列番号１のアミノ酸残基３６７〜４３８、もしくは２１４〜４３８、または、配列番号１の残基３６７〜４３８、もしくは２１４〜４３８に対して少なくとも９０％同一な配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、長さ約２００アミノ酸までであり、かつ、配列番号１のアミノ酸残基３６７〜４３８、または、配列番号１の残基３６７〜４３８に対して少なくとも９０％同一な配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、長さ約１００アミノ酸までであり、かつ、配列番号１のアミノ酸残基３６７〜４３８、または、配列番号１の残基３６７〜４３８に対して少なくとも９０％同一な配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸残基５７〜６８５、２１４〜６８５、２３９〜６８５、３１１〜６８５、２１４〜４３８、３６７〜４３８、３３３〜６８５、１２８〜６８５、もしくは２６５〜６８５、または、配列番号１のアミノ酸残基５７〜６８５、２１４〜６８５、２３９〜６８５、３１１〜６８５、２１４〜４３８、３６７〜４３８、３３３〜６８５、１２８〜６８５、もしくは２６５〜６８５に対して少なくとも９０％同一な配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物であって、前記ポリペプチドが、異種融合パートナーと融合されて融合タンパク質を形成する、組成物。
【請求項１２】
前記異種融合パートナーがＦｃ領域を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ポリヌクレオチドがＲＮＡポリヌクレオチドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ＲＮＡポリヌクレオチドが、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチド間連結を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組成物であって、さらに生理学的に受容可能なキャリアを含む、組成物。
【請求項１６】
前記細胞活性が細胞増殖の調節、アポトーシスの調節、細胞シグナル伝達の調節、細胞遊走の調節、細胞活性化ならびにサイトカインの産生および／または放出の調節からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
状態を処置するための請求項１〜１６のいずれか１項に記載の組成物であって、ここで該状態は、炎症性疾患、自己免疫疾患、腫瘍性疾患、代謝病、神経性疾患、感染、心臓血管疾患および異常な脈管形成に関連する疾患からなる群より選択される、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２００８年９月９日に出願された米国仮特許出願第６１／０９５，５４８号および２００８年６月２６日に出願された米国仮特許出願第６１／０７６，０９８号（これら（２つ）の仮出願は、それらの全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
配列表に関する声明
本出願に関連する配列表は、紙のコピーの代わりにテキスト・フォーマットで提供され、かつそれによって本明細書に参照によって援用される。配列表を含むテキストファイルの名称は１２０１６１＿４０８ＰＣ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔ．である。このテキストファイルは２２ＫＢであり、２００９年６月２６日に作製され、かつ本明細書の提出と同時にＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電気的に提出されている。
【０００３】
発明の分野
本発明は概して、グリシル−ｔＲＮＡ合成酵素（ＧｌｙＲＳ）ポリペプチド、このようなポリペプチドを含む組成物、およびこれらを用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
関連技術の説明
ｔＲＮＡ分子のアミノアシル化を触媒するアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、翻訳のプロセスの間に遺伝子情報を解読するために必須である。真核生物ｔＲＮＡ合成酵素の各々は、コア酵素（ｔＲＮＡ合成酵素の原核生物の対応物に密接に関連する）と、追加のドメイン（このコア酵素のアミノ末端またはカルボキシ末端に付加されている）とからなる。例えば、ヒトチロシル−ｔＲＮＡ合成酵素（ＴｙｒＲＳ）は、原核生物および下等な真核生物のＴｙｒＲＳ分子の一部ではないカルボキシ末端ドメインを有する。
【０００５】
いくつかのアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、翻訳におけるそれらの関与とは別個に非正準的な（ｎｏｎ−ｃａｎｏｎｉｃａｌ）機能を有することが実証されている。例えば、アミノ酸残基１〜３６４に相当し、かつ多形核細胞エラスターゼおよびプラスミンによって切断されるＴｙｒＲＳのＮ末端ドメインであるミニ−チロシルｔＲＮＡ合成酵素（ミニ−ＴｙｒＲＳ）は、全長タンパク質に見出されない非正準的な生物学を呈する。インビトロでは、ミニ−ＴｙｒＲＳは、好中球活性化および走化性、内皮の細胞増殖および遊走を刺激することが示されており、かつ、ニワトリ漿尿膜（ＣＡＭ）およびマウスマトリゲルアッセイにおいて血管形成促進性である。Ｍｉｎｉ−ＴｙｒＲＳは、ＥＬＲモチーフ（ＩＬ−８などのＣＸＣ−ケモカインのように、そのケモカインおよび血管新生活性の多くに関与する）を有する。他のＥＬＲ含有サイトカインにおいてと同様に、このモチーフの変異は、白血球および血管形成に対するミニ−ＴｙｒＲＳ結合ならびに白血球および血管形成の刺激を阻害する。
【０００６】
さらに、ＴｒｐＲＳの短縮型は、抗血管形成の特性を有することが示されている。正常なヒト細胞では、以下のような検出され得るＴｒｐＲＳの２つの型がある：全長分子（アミノ酸残基１〜４７１）からなる主要型およびマイナーな短縮型。このマイナー型は、プレｍＲＮＡの選択的スプライシングを通じてアミノ末端ドメインの欠失によって生成され、かつミニ−ＴｒｐＲＳと命名される。ミニＴｒｐＲＳのアミノ末端は、全長ＴｒｐＲＳ分子の４８位置でメチオニン残基であることが決定されている。あるいは、短縮型ＴｒｐＲＳは、タンパク質分解によって生成され得る。例えば、ウシＴｒｐＲＳは、膵臓で高度に発現されて、かつ膵液中に分泌され、これによって短縮型ＴｒｐＲＳ分子の産生が生じる。さらなる研究によって、ミニ−ＴｒｐＲＳがＶＥＧＦ誘発性の細胞増殖および遊走を阻害することが示される（非特許文献１）。詳細には、ニワトリのＣＡＭアッセイによって、ミニＴｒｐＲＳがＶＥＧＦの血管形成の活性をブロックすることが示される。対照的に、全長ＴｒｐＲＳは血管形成を阻害しない。従って、最初の４８アミノ酸残基の除去によって、ＴｒｐＲＳの抗血管形成の活性が露呈される。従って、ＴｙｒＲＳと同様に、特定の形態のＴｒｐＲＳはｔＲＮＡのアミノアシル化以外の活性を保有する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｗａｋａｓｕｇｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（２００２）９９：１７３〜１７７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
別の形態のＴｙｒＲＳおよびＴｒｐＲＳに関連する非正準的なおよび治療上関連する活性のこれらの観察を考慮すれば、このファミリーのタンパク質の完全な治療的能力を開拓するために、他のアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素タンパク質の生物学的に関連する形態を特定する必要がある。従って、本発明は、これらの要件に取り組み、かつ他の関連する利点を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の要旨
本発明は、グリシル−ｔＲＮＡ合成酵素（ＧｌｙＲＳ）およびＧｌｙＲＳ由来の特定のポリペプチドが治療関連性の非正準的な生物学的活性を保有するという発見から生じる。従って、一局面によれば、本発明は、少なくとも１つの非正準的な生物学的活性を有する単離されたＧｌｙＲＳポリペプチド、ならびにこのような非正準的な活性を実質的に保持するその活性なフラグメントおよび改変体を提供する。「非正準的な活性」とは本明細書において用いる場合、一般に、ｔＲＮＡＧｌｙ分子上へのグリシンの付加以外である本発明のＧｌｙＲＳポリペプチドによって保有される活性を指す。本明細書において詳細であるとおり、特定の実施形態では、本発明のＧｌｙＲＳポリペプチドによって示される非正準的な生物学的活性は、限定するものではないが、細胞増殖の調節、アポトーシスの調節、細胞遊走の調節、細胞シグナル伝達の調節ならびに／あるいはサイトカイン産生および／または分泌の調節を挙げることができる。さらに具体的な実施形態では、この活性としては、Ａｋｔ媒介性細胞シグナル伝達の調節、Ｅｒｋ１／２媒介性の細胞シグナル伝達の調節、およびＧＰＣＲ媒介性の細胞シグナル伝達の調節、内皮の細胞管形成の調節、ならびに細胞結合の調節が挙げられる。他の具体的な実施形態では、この活性としては、ＣＤ７１および／またはＣＤ８０の調節が挙げられる。さらに他の具体的な実施形態では、この活性はサイトカインの産生および／または放出の調節を包含し、ここでこのサイトカインはＴＮＦ−α、ＩＬ１−β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０、ＭＩＰ１−α、ＭＩＰ−１β、ＧＲＯ−α、ＭＣＰ−１およびＩＬ−１ｒａからなる群より選択される。
【００１０】
ある実施形態では、本発明のＧｌｙＲＳポリペプチドは、全長哺乳動物ＧｌｙＲＳタンパク質の連続フラグメントである。さらに具体的な実施形態では、このＧｌｙＲＳポリペプチドは、配列番号１に示されるヒトＧｌｙＲＳタンパク質配列の連続フラグメントである。例示的には、このフラグメントは、本質的に任意の長さであってもよく、さらに目的の少なくとも１つの非正準的な生物学的活性を保持するフラグメントが提供されてもよい。特定の例示的な実施形態では、本発明のＧｌｙＲＳポリペプチドは、約５０〜１００、５０〜２００、５０〜３００、５０〜４００、５０〜５００または５０〜６００アミノ酸長のサイズにおよぶ。他の実施形態では、本発明のＧｌｙＲＳポリペプチドは、約１００〜２００、１００〜３００、１００〜４００、１００〜５００または１００〜６００アミノ酸長のサイズにおよぶ。さらに他の例示的な実施形態では、本発明のＧｌｙＲＳポリペプチドは、約２００〜３００、２００〜４００、２００〜５００または２００〜６００アミノ酸長のサイズにおよぶ。
【００１１】
本発明のさらなる実施形態では、ＧｌｙＲＳポリペプチドは、配列番号１に示されるヒトＧｌｙＲＳタンパク質配列などのＧｌｙＲＳタンパク質配列のフラグメントの活性な改変体（すなわち、目的の少なくとも１つの非正準的な生物学的活性を保持する）を含む。さらに具体的な実施形態では、この活性な改変体は、配列番号１に示されるヒトグリシル−ｔＲＮＡ合成酵素配列に対してその長さに沿って少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有するポリペプチドである。
【００１２】
本発明の他の実施形態は、天然に存在しようと、または天然に存在しまいと、本明細書に記載される１つ以上の非正準的な活性を保有する、ＧｌｙＲＳスプライスバリアントおよび変異体を提供する。
【００１３】
本発明のさらに具体的な実施形態では、ＧｌｙＲＳポリペプチドは、ＧｌｙＲＳ配列（例えば、配列番号１）のフラグメントを含み、これは本質的に、アミノ酸残基５７〜６８５、２１４〜６８５、２３９〜６８５、３１１〜６８５、４３９〜６８５、５１１〜６５８、２１４〜４３８、３６７〜４３８、２１４〜４２０、２１４〜３３８、８５〜１２７もしくは２５〜５６、１〜２１３、１〜６１、８５〜２１４、３３３〜６８５、１２８〜６８５、２６５〜６８５もしくは４８３〜６８５、または目的の少なくとも１つの非正準的な生物学的活性を実質的に保持するその活性なフラグメントもしくは改変体からなる。
【００１４】
他の具体的な実施形態では、このＧｌｙＲＳポリペプチドは、ＮＣＢＩ番号ＣＲ５９４９４７、Ｕ０９５８７および／またはＵ０９５１０のいずれか１つに示されるポリペプチドではない。
【００１５】
本発明の別の局面では、本明細書に記載される少なくとも１つのＧｌｙＲＳポリペプチドと異種の融合パートナーとを含む融合タンパク質が提供される。
【００１６】
本発明の別の局面によれば、本明細書に記載されるポリペプチドおよび融合タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド、ならびにこのようなポリヌクレオチドを含む発現ベクター、およびこのような発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。
【００１７】
本発明のさらに別の局面によれば、生理学的に受容可能なキャリア、および本明細書に記載されるような、本発明の単離されたポリペプチド、融合タンパク質、抗体、単離されたポリヌクレオチド、発現ベクター、宿主細胞などのうちの少なくとも１つを含む組成物、例えば薬学的組成物が提供される。
【００１８】
また、本発明によって、他の局面では、細胞または組織を、本明細書に記載されるような本発明の組成物と接触させることによって細胞活性を調節するための方法も提供され、ここで調節されるべきこの細胞活性は、細胞増殖、アポトーシスの調節、細胞遊走の調節、細胞シグナル伝達の調節ならびに／またはサイトカイン産生および／もしくは分泌の調節からなる群より選択される。さらに具体的な実施形態では、この細胞活性は、Ａｋｔ媒介性細胞シグナル伝達の調節、Ｅｒｋ１／２媒介性の細胞シグナル伝達、ＧＰＣＲ媒介性の細胞シグナル伝達の調節、内皮の細胞管形成の調節、および細胞結合の調節からなる群より選択される。他の具体的な実施形態では、この細胞活性は、ＣＤ７１および／またはＣＤ８０の調節からなる群より選択される。さらに他の具体的な実施形態では、この細胞活性は、サイトカインの産生および／または放出の調節からなる群より選択され、例えば、ここでこのサイトカインは、ＴＮＦ−α、ＩＬ１−β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０、ＭＩＰ１−α、ＭＩＰ−１β、ＧＲＯ−α、ＭＣＰ−１およびＩＬ−１ｒａからなる群より選択される。
【００１９】
他の局面では、本発明は、疾患、障害または他の状態を処置するための方法であって、それを必要とする被験体において、本発明による組成物を投与することによる方法を提供する。実例としては、このような疾患、障害または状態としては、限定するものではないが、癌、炎症性疾患、免疫疾患（自己免疫疾患を含む）、異常な造血活性に関連する疾患、神経形成または神経保護が所望される疾患、代謝性障害および／または異常な血管形成に関連する状態を挙げることが可能である。
【００２０】
さらに他の局面では、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体および／または他の組成物は、当該分野で公知でありかつ利用可能な本質的に任意のタイプのスクリーニングアッセイで用いられ得る。例えば、本発明の組成物（例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび／または抗体）は、本発明による処置を受け入れ可能な適切な細胞タイプおよび／または疾患状態を特定するために公知のスクリーニング方法論と組み合わせて用いられ得る。他の例では、本発明の組成物（例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび／または抗体）は、本明細書の組成物の非正準的な活性を直接または間接的に媒介または調節する、アゴニスト、アンタゴニスト、結合パートナー、競合的インヒビター、細胞エフェクターなどを特定するために公知のスクリーニング方法論と組み合わせて用いられ得る。例えば、特定の実施形態では、試験化合物を、本発明の組成物と、調節されるその結合パートナー、細胞エフェクターおよび／または細胞タイプの１つ以上との間の非正準的な活性または相互作用のインヒビターあるいは増強因子として特定するためのスクリーニング方法が提供される。この方法は、例えば、反応混合物であって：（ｉ）本発明の組成物、（ｉｉ）このような組成物によって結合および／または調節されることが公知の結合パートナー、細胞エフェクター、および／または細胞タイプ、ならびに（ｉｉｉ）試験化合物を含む反応混合物を形成する工程と；この試験化合物の存在下で、結合および／または調節が増大されるかまたは減少されるかを検出する工程とを包含し得る。試験化合物の存在下での活性または調節における、試験化合物の非存在下での効果に対する、統計学的に有意な変化（増強または阻害）は、結合および／または活性の強力なアゴニスト（模倣物または増強因子）またはアンタゴニスト（インヒビター）を示す。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
非正準的な生物学的活性を有する単離されたグリシル−ｔＲＮＡ合成酵素ポリペプチド、またはその活性な改変体。
（項目２）
前記非正準的な生物学的活性が、細胞増殖の調節、アポトーシスの調節、細胞シグナル伝達の調節、細胞遊走の調節、細胞活性化ならびにサイトカインの産生および／または放出の調節からなる群より選択される、項目１に記載の単離されたグリシル−ｔＲＮＡ合成酵素ポリペプチド。
（項目３）
前記非正準的な生物学的活性が、Ａｋｔ媒介性細胞シグナル伝達の調節、Ｅｒｋ１／２媒介性の細胞シグナル伝達の調節およびＧＰＣＲ媒介性の細胞シグナル伝達の調節、ＣＤ７１の調節およびＣＤ８０の調節からなる群より選択される、項目１に記載の単離されたグリシル−ｔＲＮＡ合成酵素ポリペプチド。
（項目４）
前記非正準的な生物学的活性が、サイトカインの産生および／または放出の調節からなる群より選択され、ここで該サイトカインが、ＴＮＦ−α、ＩＬ１−β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０、ＭＩＰ１−α、ＭＩＰ−１β、ＧＲＯ−α、ＭＣＰ−１およびＩＬ−１ｒａからなる群より選択される、項目１に記載の単離されたグリシル−ｔＲＮＡ合成酵素ポリペプチド。
（項目５）
前記ポリペプチドが、配列番号１に示される全長ヒトグリシル−ｔＲＮＡ合成酵素配列のフラグメントである、項目１に記載の単離されたグリシル−ｔＲＮＡ合成酵素ポリペプチド。
（項目６）
項目１に記載の単離されたグリシル−ｔＲＮＡ合成酵素ポリペプチドであって、その活性改変体が、配列番号１に示されるヒトグリシルｔＲＮＡ合成酵素配列に対してその長さに沿って少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドである、グリシル−ｔＲＮＡ合成酵素ポリペプチド。
（項目７）
前記ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸残基５７〜６８５、２１４〜６８５、２３９〜６８５、３１１〜６８５、４３９〜６８５、５１１〜６５８、２１４〜４３８、３６７〜４３８、２１４〜４２０、２１４〜３３８、８５〜１２７  １〜２１３、１〜６１、８５〜２１４、３３３〜６８５、１２８〜６８５、２６５〜６８５、４８３〜６８５もしくは２５〜５６、またはその活性なフラグメントを含む、項目１に記載の単離されたグリシル−ｔＲＮＡ合成酵素ポリペプチド。
（項目８）
前記ポリペプチドが、全長ヒトグリシル−ｔＲＮＡ合成酵素のフラグメントであり、かつ配列番号１のアミノ酸残基３６７〜４３８、またはその活性なフラグメントを含む、項目３に記載の単離されたグリシル−ｔＲＮＡ合成酵素ポリペプチド。
（項目９）
項目１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチドと、異種融合パートナーとを含む融合タンパク質。
（項目１０）
項目１〜９のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
（項目１１）
項目１０に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
（項目１２）
項目１１に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
（項目１３）
項目１に記載の少なくとも１つの単離されたグリシル−ｔＲＮＡ合成酵素ポリペプチドを含む二量体または多量体の複合体。
（項目１４）
生理学的に受容可能なキャリアと、以下：
（ｉ）項目１に記載の単離されたポリペプチド；
（ｉｉ）項目９に記載の融合タンパク質；
（ｉｉｉ）項目１０に記載の単離されたポリヌクレオチド；
（ｉｖ）項目１１に記載の発現ベクター；
（ｖ）項目１３に記載の二量体または多量体の複合体；および
（ｖｉ）項目１に記載のポリペプチドに結合する抗体またはその抗原結合フラグメントからなる群より選択される少なくとも１つの成分と、
を含む、組成物。
（項目１５）
細胞活性を調節するための方法であって、細胞または組織を項目１４に記載の組成物と接触させる工程を包含する、方法。
（項目１６）
前記細胞活性が細胞増殖の調節、アポトーシスの調節、細胞シグナル伝達の調節、細胞遊走の調節、細胞活性化ならびにサイトカインの産生および／または放出の調節からなる群より選択される、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記細胞活性が、Ａｋｔ媒介性細胞シグナル伝達の調節、Ｅｒｋ１／２媒介性の細胞シグナル伝達の調節およびＧＰＣＲ媒介性の細胞シグナル伝達の調節、ＣＤ７１の調節およびＣＤ８０の調節からなる群より選択される、項目１５に記載の方法。
（項目１８）
前記細胞活性が、サイトカインの産生および／または放出の調節であり、ここで該サイトカインが、ＴＮＦ−α、ＩＬ１−β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０、ＭＩＰ１−α、ＭＩＰ−１β、ＧＲＯ−α、ＭＣＰ−１、およびＩＬ−１ｒａからなる群より選択される、項目１５に記載の方法。
（項目１９）
ＧｌｙＲＳポリペプチドの１つ以上の非正準的な活性を調節するための方法であって、該ＧｌｙＲＳポリペプチドを発現する細胞を、調節剤と接触させる工程を包含し、ここで、該調節剤が、抗体またはその抗原結合フラグメント、干渉性ＲＮＡ分子、ドミナント・ネガティブポリペプチドおよび低分子からなる群より選択される、方法。
（項目２０）
状態を処置するための方法であって、項目１４に記載の組成物を、それを必要とする被験体に対して投与する工程を包含し、ここで該状態は、炎症性疾患、自己免疫疾患、腫瘍性疾患、代謝病、神経性疾患、感染、心臓血管疾患および異常な脈管形成に関連する疾患からなる群より選択される、方法。
（項目２１）
活性な試験化合物を同定するためのスクリーニング方法であって、以下の工程：
（ａ）．反応混合物を形成する工程であって、該反応混合物は：
（ｉ）項目１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチド；項目７に記載のポリヌクレオチド；および／または項目１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントからなる群より選択される成分と；
（ｉｉ）該成分によって結合されるか、および／または調節されることが公知の結合パートナー、細胞エフェクターおよび／または細胞タイプと；
（ｉｉｉ）試験化合物と
を含む、工程と；
（ｂ）．該試験化合物の存在下で、該成分による結合および／または調節の増大または減少を検出する工程であって、該試験化合物の非存在下における結合および／または調節と比較しての、該試験化合物の存在下における結合および／または調節における変化が、それによって活性な試験化合物を同定する、工程と；
を包含する、スクリーニング方法。
【００２１】
配列の識別子の簡単な説明
配列番号１はヒト細胞質グリシル−ｔＲＮＡ合成酵素（ＧｌｙＲＳ）の全長アミノ酸配列である。
【００２２】
配列番号２は配列番号１のＧｌｙＲＳポリペプチドをコードする核酸配列である。
【００２３】
配列番号３〜９はＧｌｙＲＳフラグメントの境界域を決定するのにおいて分析される例示的なペプチド配列を示す（実施例４および表１を参照のこと）。
【００２４】
配列番号１０および１１は、ＬＰＳ−処理したマウスマクロファージ細胞から分泌されたフラグメントを特定するのに用いられるＧｌｙＲＳ配列である（実施例１２および図１６を参照のこと）。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｄは、ＧｌｙＲＳタンパク質のドメイン構造およびアミノ酸配列を示しており（図１Ｂ；配列番号１）、かつヒト好中球エラスターゼでの全長ＧｌｙＲＳタンパク質の制御されたタンパク質分解によって生成されたＧｌｙＲＳのフラグメントのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離を示す。
【図１Ｂ】図１Ａ〜１Ｄは、ＧｌｙＲＳタンパク質のドメイン構造およびアミノ酸配列を示しており（図１Ｂ；配列番号１）、かつヒト好中球エラスターゼでの全長ＧｌｙＲＳタンパク質の制御されたタンパク質分解によって生成されたＧｌｙＲＳのフラグメントのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離を示す。
【図１Ｃ】図１Ａ〜１Ｄは、ＧｌｙＲＳタンパク質のドメイン構造およびアミノ酸配列を示しており（図１Ｂ；配列番号１）、かつヒト好中球エラスターゼでの全長ＧｌｙＲＳタンパク質の制御されたタンパク質分解によって生成されたＧｌｙＲＳのフラグメントのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離を示す。
【図１Ｄ】図１Ａ〜１Ｄは、ＧｌｙＲＳタンパク質のドメイン構造およびアミノ酸配列を示しており（図１Ｂ；配列番号１）、かつヒト好中球エラスターゼでの全長ＧｌｙＲＳタンパク質の制御されたタンパク質分解によって生成されたＧｌｙＲＳのフラグメントのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離を示す。
【図２】図２Ａ〜２Ｂは、本発明のＧｌｙＲＳフラグメントで処理された内皮細胞における、それぞれＡｋｔおよびＧｉ−ＧＰＣＲの活性化を示す。
【図３】図３は、本発明のＧｌｙＲＳフラグメントで処理された単球細胞におけるＥｒｋ１／２（マイトジェン活性化プロテインキナーゼＥｒｋ１およびＥｒｋ２）の活性を示す。
【図４−１】図４Ａは、ＧｌｙＲＳフラグメント境界域を決定するためにＧｌｙＲＳペプチド（例えば、配列番号９）を分析するためのプロセスの概要を示す。
【図４−２】図４Ａは、ＧｌｙＲＳフラグメント境界域を決定するためにＧｌｙＲＳペプチド（例えば、配列番号９）を分析するためのプロセスの概要を示す。
【図４−３】図４Ｂは、全長ヒトＧｌｙＲＳ二量体の結晶構造内の、アミノ酸２１４〜４３８に相当するＧｌｙＲＳフラグメントＧ６の構造を示す。
【図５】図５は、アミノ酸２１４〜４３８に相当するＧｌｙＲＳフラグメントＧ６が内皮細胞に結合することを示す。
【図６】図６は、ＧｌｙＲＳフラグメントＧ６が単球細胞の遊走を調節することを示す。図６（差し込み図）は、ＧｌｙＲＳフラグメントＧ６が、選択ケモカインレセプターを通じてシグナル伝達することを示す。
【図７Ａ】図７Ａは、ＣＤ４１＋コロニーの代表的な染色を示す。図７Ｂは、小、中および大のコロニーの定量の結果を示しており、かつＧｌｙＲＳフラグメントＧ６が、巨核球前駆細胞のコロニー形成に影響することを示す。
【図７Ｂ】図７Ａは、ＣＤ４１＋コロニーの代表的な染色を示す。図７Ｂは、小、中および大のコロニーの定量の結果を示しており、かつＧｌｙＲＳフラグメントＧ６が、巨核球前駆細胞のコロニー形成に影響することを示す。
【図８】図８は、抗ＣＤ７１−ＦＩＴＣ抗体での染色およびフローサイトメトリーによる分析後のＧ６−３処理単球におけるＣＤ７１増殖マーカーの上方制御を示す。
【図９】図９は、抗ＣＤ８０−ＦＩＴＣ抗体での染色およびフローサイトメトリーによる分析後のＧ６−３処理単球におけるＣＤ８０活性化マーカーの上方制御を示す。
【図１０】図１０は、ＧｌｙＲＳおよびＧ６フラグメントがＩＬ１−β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０、ＭＩＰ１−α、ＭＩＰ−１β、ＧＲＯ−α、ＭＣＰ−１、およびＩＬ−１ｒａを含む多数のサイトカインの分泌を刺激することを示す。
【図１１Ａ】図１１Ａおよび図１１Ｂは、ＧｌｙＲＳフラグメントＧ６およびＧ６−３がマウス白血病マクロファージ細胞の遊走を誘導することを示す。
【図１１Ｂ】図１１Ａおよび図１１Ｂは、ＧｌｙＲＳフラグメントＧ６およびＧ６−３がマウス白血病マクロファージ細胞の遊走を誘導することを示す。
【図１２】図１２は、ＧｌｙＲＳフラグメントＧ６がＨＬ−６０前骨髄球性白血病細胞の遊走を誘発することを示す。
【図１３】図１３は、ＧｌｙＲＳがマウスマクロファージの細胞溶解物および培地の両方で検出されたことを示しており、このことは、全長ＧｌｙＲＳの内因性の分泌を示している。
【図１４】図１４は、マウスマクロファージのＬＰＳ処理の際に、ＧｌｙＲＳの特異的なフラグメントが、分泌された培地では見出され得るが、細胞溶解物中では見出され得ないことを示しており、このことはＧｌｙＲＳフラグメントの作製および分泌を示している。
【図１５】図１５は、全長タンパク質の一部を特定するためのＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析の結果であって、この分析からフラグメントがマウスマクロファージのＬＰＳ処理後に生成されたことが示される。
【図１６】図１６Ａは、約４５〜５０ｋｄの分子量を有するＧＲＳフラグメントである、上清のバンド９の配列情報を示しており、ここでは関連のペプチド配列は太字で示している。図１６Ｂは、約１５ｋｄの分子量を有するＧＲＳフラグメントである、上清のバンド１８の配列情報を示しており、ここでは関連のペプチド配列は太字で示している。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明の実施は、特段逆に示さない限り、その多くが例示の目的のために下に記載されている、当該分野の技術の範囲内の分子生物学および組換えＤＮＡ技術の従来の方法を使用し、この多くは例示の目的について下に記載されている。このような技術は文献中に詳細に説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第１巻および第２巻（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ編集）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ編集、１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編集、１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編集、１９８４）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編集、１９８６）；Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ編集、１９８４）を参照のこと。
【００２７】
本明細書に引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、その全体が参照によって本明細書に援用される。
【００２８】
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる場合、単数形「不定冠詞：１つの、ある（ａ、ａｎ）」および「定冠詞：この、その（ｔｈｅ）」は、その文脈が明確に他を示すのでない限り、複数の言及を包含する。
【００２９】
本明細書において用いる場合、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、従来の意味に従って、すなわち、アミノ酸の配列として用いられる。ポリペプチドは、特定の長さに限定されないが、本発明の状況では、代表的には、全長のタンパク質のフラグメントを示し、かつ翻訳後の修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など、ならびに当該分野で公知の他の修飾（天然に生じる修飾および天然に存在しない修飾）を包含し得る。本発明のポリペプチドおよびタンパク質は、任意の種々の周知の組換えおよび／または合成の技術を用いて調製され得、その例示的な実施例は以下にさらに考察される。
【００３０】
グリシル−ｔＲＮＡ合成酵素ポリペプチド
本発明は一般に、単離されたＧｌｙＲＳポリペプチド、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、このようなポリペプチドに結合する結合因子、このようなポリペプチドのアナログ、改変体およびフラグメントなど、ならびに前述のいずれかを用いる組成物および方法に関する。
【００３１】
従って、本発明の一局面によれば、治療剤関連性の非正準的な活性を有するＧｌｙＲＳポリペプチド、ならびにこれを含む組成物が提供される。ある実施形態では、このＧｌｙＲＳポリペプチドは、ＧｌｙＲＳタンパク質の短縮型である。「短縮された」ＧｌｙＲＳとは、本明細書において用いる場合、その対応する全長ＧｌｙＲＳタンパク質よりも、例えば、そのＮ末端および／またはＣ末端からのアミノ酸の除去に起因して短いグリシル−ｔＲＮＡ合成酵素タンパク質を指す。短縮の程度、すなわち、全長のＧｌｙＲＳタンパク質から除かれたＮ末端および／またはＣ末端のアミノ酸残基の数は、本明細書に記載されたように、細胞、組織または被験体に投与された場合、所望の細胞効果を依然としてもたらしながらも、相当変化することが可能である。ある実施形態では、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０アミノ酸以上（これには全ての中間の長さを含む）が、全長ＧｌｙＲＳタンパク質のＮ末端および／またはＣ末端から短縮される。中間の長さとは、例えば、６、７、８など、５１、５２、５３など、２０１、２０２、２０３などの間の全ての整数を含むものとする。
【００３２】
ある例示的な実施形態では、短縮型ＧｌｙＲＳポリペプチドは、当該分野で公知でありかつ利用可能な技術を用いて任意の種々のタンパク質分解性酵素を用いて生成され得る。例示的なプロテアーゼとしては例えば、アクロモペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、アンクロッド、アンジオテンシン変換酵素、ブロメラチン、カルパイン、カルパインＩ、カルパインＩＩ、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＢ、カルボキシペプチダーゼＧ、カルボキシペプチダーゼＰ、カルボキシペプチダーゼＷ、カルボキシペプチダーゼＹ、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１１、カスパーゼ１２、カスパーゼ１３、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＧ、カテプシンＨ、カテプシンＬ、キモパパイン、キマーゼ、キモトリプシン、クロストリパイン、コラゲナーゼ、補体Ｃ１ｒ、補体Ｃ１ｓ、補体Ｄ因子、補体Ｉ因子、ククミシン、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ、エラスターゼ（白血球）、エラスターゼ（膵臓の）、エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、エンテロキナーゼ、第Ｘａ因子、フィシン、フリン、グランザイムＡ、グランザイムＢ、ＨＩＶプロテアーゼ、ＩＧａｓｅ、カリクレイン組織、ロイシンアミノペプチダーゼ（一般）、ロイシンアミノペプチダーゼ（サイトゾル）、ロイシンアミノペプチダーゼ（ミクロソームの）、マトリクスメタロプロテアーゼ、メチオニンアミノペプチダーゼ、ニュートラーゼ、パパイン、ペプシン、プラスミン、プロリダーゼ、プロナーゼＥ、前立腺特異的抗原、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ由来の好アルカリ性プロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来のプロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓａｉｔｏｉ由来のプロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ由来のプロテアーゼ、プロテアーゼ（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（アルカリまたはアルカラーゼ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ由来のプロテアーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ由来のプロテアーゼ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｐ．由来のプロテアーゼ、プロテアーゼＳ、プロテアソーム類、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来のプロテイナーゼ、プロテイナーゼ３、プロテイナーゼＡ、プロテイナーゼＫ、プロテインＣ、ピログルタメートアミノペプチダーゼ、レンニン、レンニン、ストレプトキナーゼ、サブチリシン、サーモリシン、トロンビン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、トリプシン、トリプターゼおよびウロキナーゼが挙げられる。
【００３３】
ある実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるＧｌｙＲＳポリペプチドの改変体を提供する。本発明のある例示的な実施形態によって包含されるポリペプチド改変体は、代表的には、配列番号１のような、野性型ＧｌｙＲＳタンパク質の対応する領域に対して、その長さに沿って、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性（下記のように決定）を呈する。
【００３４】
ポリペプチド改変体は、１つ以上の置換、欠失、付加および／または挿入において天然に存在するＧｌｙＲＳポリペプチドとは異なり得る。このような改変体は、天然に存在してもよいし、または当該分野で周知の任意の多数の技術を用いて、例えば、本発明の上記のポリペプチド配列のうちの１つ以上を修飾すること、および本明細書に記載のそれらの生物学的活性を評価することによって合成的に生成されてもよい。
【００３５】
他の例示的な実施形態では、ＧｌｙＲＳ改変体は、天然に存在しようと、天然に存在しまいと、スプライス改変体であってもよく、ここでこのスプライス改変体は、例えば、本明細書において記載されるような少なくとも１つの非正準的な活性を保有する。
【００３６】
他の例示的な実施形態では、この改変体は、天然に存在しようと、天然に存在しまいと、野性型ＧｌｙＲＳポリペプチド配列に対する１つ以上の点変異を含み、ここでこの改変体ポリペプチドは、例えば、本明細書において記載されるような少なくとも１つの非正準的な活性を保有する。
【００３７】
ある実施形態では、改変体は、保存的置換を含む。「保存的置換」とは、あるアミノ酸が類似の特性を有する別のアミノ酸で置換され、その結果当業者はそのポリペプチドの二次構造および疎水性親水性の性質が実質的に未変化であると予想するような置換である。修飾は本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの構造内でなされてもよく、かつ所望の特徴を有している改変体または誘導体的なポリペプチドをコードする機能的な分子をまだ得ることができる。本発明のＧｌｙＲＳポリペプチドの等価な、またはさらに改善された改変体を作製するためにあるポリペプチドのアミノ酸配列を変更することが所望される場合、当業者は例えば、表１に従ってＤＮＡ配列をコードするコドンのうちの１つ以上を変化し得る。
【００３８】
例えば、特定のアミノ酸は、基質分子上の抗体または結合部分の例えば、レセプター、抗原結合領域などのような構造を有する相互作用的な結合能力の感知できるほどの損失なしにタンパク質構造内の他のアミノ酸で置換され得る。なぜなら、これはタンパク質の相互作用的な能力および性質であって、それは、タンパク質の生物学的な機能的な活性、特定のアミノ酸配列置換が、タンパク質配列の中で、そして当然ながら、その背景にあるＤＮＡコード配列の中でなされてもよく、それにもかかわらず同様の特性を有するタンパク質が得られるということを一般的に規定するものであるからである。従って種々の変化が開示された組成物のポリペプチド配列、またはこのようなポリペプチドをコードする対応するＤＮＡ配列内で、所望の有用性または活性の検知できるほどの損失なしになされてもよいと考えられる。
【００３９】
【表１−１】
0006025889.tif 000002
このような変化を作製するのにおいて、アミノ酸の疎水性親水性指標もまた考慮され得る。タンパク質に対して相互作用的な生物学的機能を付与するのにおける疎水性親水性アミノ酸指標の重要性は一般に、当該分野で理解されている（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２、参照によって本明細書に援用される）。例えば、アミノ酸の相対的な疎水性親水性的性質は、得られるタンパク質の二次構造に寄与し、これが次に、他の分子、例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原などとのそのタンパク質の相互作用を規定することが公知である。各アミノ酸は、その疎水性および電荷特性に基づいて疎水性親水性指標を割り当てられている（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２）。これらの値は以下である：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。
【００４０】
特定のアミノ酸は類似の疎水性親水性指標またはスコアを有する他のアミノ酸によって置換され得、そしてなお類似の生物学的活性を有するタンパク質を生じる（すなわち、生物学的に機能的に等価なタンパク質をなお入手する）ことが、当該分野において公知である。このような変化を作製する際に、その疎水性親水性指標が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、その疎水性親水性指標が±１以内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、そしてその疎水性親水性指標が±０．５以内であるアミノ酸の置換がなおより特に好ましい。
【００４１】
同様なアミノ酸の置換が、親水性に基づいて有効になされ得ることもまた、当該分野で理解されている。米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されるように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。アミノ酸は、類似の親水性の値を有する別のアミノ酸に置換され得、そしてなお、生物学的に等価なタンパク質を得ることが理解される。このような変化において、その親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、その親水性値が±１以内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、そしてその親水性値が±０．５以内であるアミノ酸の置換がなおより特に好ましい。
【００４２】
上記で概説したように、アミノ酸置換は、アミノ酸側鎖置換基の相対的な類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、大きさ、などに基づいてもよい。前述の種々の特徴を考慮する例示的な置換は当業者に周知であり、そして以下を含む：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびトレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン。
【００４３】
アミノ酸置換はさらに、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および／または両親媒性特性の類似性に基づいてなされてもよい。例えば、負に荷電したアミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ；正に荷電したアミノ酸としては、リジンおよびアルギニンが挙げられ；そして類似の親水性値を有する非荷電性の極性ヘッド基を有するアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシンおよびバリン；グリシンおよびアラニン；アスパラギンおよびグルタミン；ならびにセリン、トレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンが挙げられる。保存的変化を示し得るアミノ酸の他のグループとしては以下が挙げられる：（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；（３）ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；および（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓ。改変体はまた、あるいは、非保存的変化を含んでもよい。好ましい実施形態では、改変体ポリペプチドは、５アミノ酸またはそれより少ないアミノ酸の置換、欠失または付加によって、ネイティブの配列とは異なる。改変体はまた（あるいは）、例えば、ポリペプチドの二次構造および疎水性親水性特性に対して有する影響が最小であるアミノ酸の欠失または付加によって、改変され得る。
【００４４】
ポリペプチドは、タンパク質のＮ末端にシグナル（または、リーダー）配列を含んでもよく、この配列は、翻訳と同時に、または翻訳後に、そのタンパク質の転移を指向する。このポリペプチドはまた、このポリペプチドの合成、精製または同定を容易にするために（例えば、ポリＨｉｓ）、またはこのポリペプチドの固体支持体への結合を増強するために、リンカー配列または他の配列にコンジュゲート化されてもよい。例えば、ポリペプチドは、免疫グロブリンＦｃ領域に結合体化され得る。
【００４５】
ポリペプチド配列が比較される場合、以下に記載されるように最大の一致で整列するときに２つの配列中のアミノ酸の配列が同じである場合、２つの配列は、「同一」であるといわれる。２つの配列間の比較は、代表的には、比較ウインドウ上で配列を比較して、配列類似性の局所的領域を同定および比較することによって行われる。本明細書中で使用される「比較ウインドウ」とは、少なくとも約２０、通常は３０〜約７５、４０〜約５０の連続する位置のセグメントをいい、ここで、配列は、２つの配列が最適に整列された後、同じ数の連続する位置の参照配列と比較され得る。
【００４６】
比較のための配列の最適な整列は、例えば、バイオインフォマティクス・ソフトウエアのＬａｓｅｒｇｅｎｅスイート（ｓｕｉｔｅ）におけるＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて、デフォルトパラメーターを用いて行われ得る。このプログラムは、以下の参考文献に記載のいくつかの整列スキームを統合する：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（編）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ、第５巻、補遺３、３４５〜３５８頁におけるＤａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（１９７８）Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ；Ｈｅｉｎ  Ｊ．（１９９０）Ｕｎｉｆｉｅｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ、６２６〜６４５頁、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１８３巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１〜１５３；Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．およびＭｕｌｌｅｒ  Ｗ．（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．（１９７１）Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ  １１：１０５；Ｓａｎｔｏｕ，Ｎ．Ｎｅｓ，Ｍ．（１９８７）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４：４０６−４２５；Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．およびＳｏｋａｌ，Ｒ．Ｒ．（１９７３）Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ−ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ、Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ；Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．（，）Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：７２６〜７３０。
【００４７】
あるいは、比較のための配列の最適な整列は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｄ．ＡＰＬ．Ｍａｔｈ  ２：４８２の部分的同一性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の同一性整列アルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化した実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または検査によって行われてもよい。
【００４８】
配列同一性および配列類似性の割合を決定するために適切なアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらはそれぞれＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９７７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２およびＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０に記載される。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドについての配列同一性の割合を決定するために、例えば、本明細書中に記載のパラメーターを用いて用いられ得る。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウエアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎを通して公的に利用可能である。アミノ酸配列について、スコアリングマトリクスが累積スコアを算出するために用いられてもよい。各指示におけるワードヒットの拡大は、以下の場合に停止する：累積整列スコアが、その最大到達値から量Ｘだけ低下した場合；累積スコアが、１以上の負のスコアリングの残基整列の累積に起因してゼロ以下になった場合；またはいずれかの配列の末端に到達した場合。このＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは、整列の感度および速度を決定する。
【００４９】
１つの例示的なアプローチにおいて、「配列同一性のパーセンテージ」は、少なくとも２０位置の比較ウインドウにわたって２つの最適に整列した配列を比較することによって決定され、ここで比較ウインドウ中のポリペプチド配列の部分は、参照配列（これは、付加または欠失を含まない）と比較して、２つの配列の最適な整列について２０パーセント以下、通常は５〜１５パーセント、または１０〜１２パーセントの付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。このパーセンテージは、両方の配列で同一のアミノ酸残基が生じる位置の数を決定して一致する位置の数を得、この一致する位置の数を参照配列における位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で除算し、そしてこの結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出される。
【００５０】
本発明のある実施形態では、融合ポリペプチド、および融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。融合ポリペプチドとは、１つ以上の異種ポリペプチド配列（融合パートナー）に対して、アミノ酸リンカーを介して直接的にまたは間接的に共有結合されている本発明のポリペプチドを指す。融合タンパク質を形成するポリペプチドは代表的には、Ｎ末端に対してＣ末端に連結されるが、それらはまた、Ｃ末端に対してＣ末端、Ｎ末端に対してＮ末端、またはＣ末端に対してＮ末端に連結されてもよい。この融合タンパク質のポリペプチドは、任意の順序であってもよい。
【００５１】
融合パートナーは、本質的に任意の所望の目的のために設計され、かつ含まれ、ただし、それらは、そのポリペプチドの所望の活性に有害に影響しない。例えば、一実施形態では、融合パートナーは、ネイティブの組換えタンパク質よりも高い収率でタンパク質を発現するのを補助する配列（発現エンハンサー）を含む。他の融合パートナーは、タンパク質の溶解性を増大するように、またはそのタンパク質が所望の細胞内コンパートメントに標的化されることを可能にするように選択され得る。なおさらなる融合パートナーとしては、そのタンパク質の精製を容易にする親和性タグが挙げられる。
【００５２】
融合タンパク質は、一般に、標準的な技術を用いて調製され得る。例えば、所望の融合物のポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列は、別々にアセンブルされて、適切な発現ベクターへと連結されてもよい。１つのポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の３’末端は、ペプチドリンカーを用いてまたは用いずに、第２のポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の５’末端に対して、これらの配列のリーディングフレームがインフェーズであるように連結される。これによって、両方の成分ポリペプチドの生物学的活性を保持する単一の融合タンパク質への翻訳が可能になる。
【００５３】
ペプチドリンカー配列は、各ポリペプチドが、必要であれば、その二次構造および三次構造へと折り畳まれるのを保証するために十分な距離で第一および第二のポリペプチド成分を隔てるために用いられ得る。このようなペプチドリンカー配列は、当該分野で周知の標準的な技術を用いて融合タンパク質中に組み込まれる。特定のペプチドリンカー配列は、以下の因子に基づいて選択され得る：（１）可塑性の伸長した高次構造をとる能力；（２）第一および第二のポリペプチド上の機能的なエピトープと相互作用し得る二次構造をとることができないこと；ならびに（３）ポリペプチドの機能的なエピトープと反応し得る疎水性または荷電した残基の欠失。好ましいペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ、ＡｓｎおよびＳｅｒ残基を含む。ＴｈｒおよびＡｌａのような中性に近い他のアミノ酸もまた、リンカー配列に用いられ得る。リンカーとして有用に用いられ得るアミノ酸配列としては、Ｍａｒａｔｅａら、Ｇｅｎｅ  ４０：３９  ４６、１９８５；Ｍｕｒｐｈｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：８２５８  ８２６２、１９８６；米国特許第４，９３５，２３３号および米国特許第４，７５１，１８０号に開示されるアミノ酸配列が挙げられる。リンカー配列は、一般的に１から約５０アミノ酸長であってもよい。リンカー配列は、第一および第二のポリペプチドが、機能的ドメインを分離するため、および立体的な干渉を防ぐために用いられ得る非必須Ｎ末端アミノ酸領域を有する場合、必要ではない。
【００５４】
連結されたＤＮＡ配列は、適切な転写または翻訳調節エレメントに作動可能に連結される。ＤＮＡの発現を担う調節エレメントは、第一のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の５’側に位置する。同様に、翻訳および転写終結シグナルを終了するために必要とされる終止コドンは、第二のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の３’側に存在する。
【００５５】
一般には、ポリペプチドおよび融合ポリペプチド（ならびにそれらのコードするポリヌクレオチド）が単離される。「単離された」ポリペプチドまたはポリヌクレオチドとは、その元来の環境から取り出されたものである。例えば、天然に存在するタンパク質は、それが天然の系の中で共存する物質のいくつかまたは全てから分離されている場合、単離されている。好ましくは、このようなポリペプチドは、少なくとも約９０％純粋、より好ましくは少なくとも約９５％純粋、そして最も好ましくは少なくとも約９９％純粋である。ポリヌクレオチドは、例えば、それらが天然の環境の一部ではないベクター中にクローニングされている場合、単離されているとみなされる。
【００５６】
さらに他の実施形態では、本発明のＧｌｙＲＳポリペプチドは二量体の一部であってもよい。二量体としては、例えば、２つの同一のＧｌｙＲＳポリペプチドの間のホモ二量体、２つの異なるＧｌｙＲＳポリペプチドの間のヘテロ二量体（例えば、全長ＧｌｙＲＳポリペプチドおよび短縮型ＧｌｙＲＳポリペプチド、または２つの異なる短縮型ＧｌｙＲＳポリペプチド）、および／またはＧｌｙＲＳポリペプチドと異種ポリペプチドとの間の異種二量体を挙げることができる。この単量体および／または二量体は、可溶性であってもよく、単離されるかまたは均質に精製されてもよい。特定の異種二量体、例えば、ＧｌｙＲＳポリペプチドと異種ポリペプチドとの間の異種二量体は、二機能性である場合もある。
【００５７】
他の実施形態では、本発明のＧｌｙＲＳポリペプチドは、マルチユニットの複合体の一部であってもよい。本発明のマルチユニットの複合体としては、例えば、少なくとも２、３、４、または５以上の単量体を挙げることができる。この単量体および／またはマルチユニットの複合体は、可溶性であってもよく、単離されるかまたは均質に精製されてもよい。マルチユニットの複合体の単量体単位は、お互いと異なっても、相同であっても、実質的に相同であっても、またはお互いに同一であってもよい。しかし、本発明のマルチユニットの複合体は、本明細書に記載されるようなＧｌｙＲＳポリペプチドを含む少なくとも１つの単量体、または他の実施形態では、本明細書に記載されるような少なくとも２つ以上のＧｌｙＲＳポリペプチドを含む。
【００５８】
共有結合される単量体は、直接的に（結合によって）連結されても、または間接的に（例えば、リンカーを介して）連結されてもよい。本明細書のポリペプチド単量体を直接連結するには、二量体化または多量体化を増強するために本明細書のポリペプチドを修飾することが有益であり得る。例えば、ＧｌｙＲＳポリペプチドの１つ以上のアミノ酸残基は、１つ以上のシステインの付加または置換によって修飾されてもよい。アミノ酸置換、例えば、システイン置換、または連結を容易にするための他の修飾を作製するための方法は、当業者に周知である。
【００５９】
本発明のある実施形態はまた、修飾されたＧｌｙＲＳポリペプチドの使用を考慮し、この修飾としては、本明細書に記載されるようなＧｌｙＲＳポリペプチドの所望の特徴を改善する修飾が挙げられる。本発明のＧｌｙＲＳポリペプチドの例示的な修飾としては限定するものではないが、１つ以上の構成アミノ酸での化学的誘導体化および／または酵素的誘導体化が挙げられ、この誘導体化としては側鎖修飾、骨格修飾ならびにＮ末端およびＣ末端の修飾、例としては、アセチル化、ヒドロキシル化、メチル化、アミド化、および糖質または脂質部分、補因子などの付加が挙げられる。例示的な修飾はまた、ＧｌｙＲＳ−ポリペプチドのペグ化が挙げられる（例えば、本明細書において参照によって援用される、ＶｅｒｏｎｅｓｅおよびＨａｒｒｉｓ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５４：４５３〜４５６、２００２を参照のこと）。
【００６０】
ある局面では、化学選択的なライゲーション技術を利用して、例えば、部位特異的な方式および制御された方式でポリマーを結合することによって、本発明の短縮型ＧｌｙＲＳポリペプチドを修飾してもよい。このような技術は代表的には、化学的手段または組換え手段のいずれかによる、タンパク質骨格中への化学選択的なアンカーの組み込み、および相補的なリンカーを担持するポリマーでの引き続く修飾に依拠する。結果として、アセンブリのプロセスおよび得られたタンパク質−ポリマーのコンジュゲートの共有結合構造は制御され得、それによって有効性および薬物動態学的特性などのような薬物特性の合理的な最適化が可能になる（例えば、Ｋｏｃｈｅｎｄｏｅｒｆｅｒ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９：５５５〜５６０、２００５を参照のこと）。
【００６１】
ポリヌクレオチド組成物
本発明はまた、本発明のＧｌｙＲＳポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド、ならびにこのようなポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。
【００６２】
本明細書において用いる場合、「ＤＮＡ」および「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、特定の種の総ゲノムＤＮＡから単離されているＤＮＡ分子を指す。従って、ポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントとは、そのＤＮＡセグメントが得られる種の総ゲノムＤＮＡから実質的に単離されるか、または精製されている１つ以上のコード配列を含むＤＮＡセグメントを指す。「ＤＮＡセグメント」および「ポリヌクレオチド」という用語内に含まれるのは、ＤＮＡセグメントおよびこのようなセグメントの小さいフラグメント、ならびにまた組換えベクター、例としては、例えば、プラスミド、コスミド、ファージミド、ファージ、ウイルスなどである。
【００６３】
当業者に理解されるように、本発明のポリヌクレオチド配列としては、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドなどを発現するか、または発現し得るように適応されたゲノム配列、ゲノム外配列およびプラスミドにコードされる配列、ならびにより小さな操作された遺伝子セグメントを挙げることができる。このようなセグメントは、自然に単離されてもよいし、または人の手によって合成的に改変されてもよい。
【００６４】
当業者に認識されるとおり、ポリヌクレオチドは、一本鎖（コードもしくはアンチセンス）であっても、または二本鎖であってもよく、そしてＤＮＡ分子（ゲノム、ｃＤＮＡもしくは合成）またはＲＮＡ分子であってもよい。さらなるコード配列または非コード配列が、本発明のポリヌクレオチド内に、その必要はないが存在してもよく、そしてポリヌクレオチドは、他の分子および／または支持材料に、その必要はないが、連結されてもよい。
【００６５】
ポリヌクレオチドは、ネイティブの配列（すなわち、ＧｌｙＲＳまたはその一部をコードする内因性配列）を含んでもよいし、またはこのような配列の改変体もしくは生物学的に機能的な等価物を含んでもよい。ポリペプチド改変体は、下にさらに記載されるように、好ましくは、このコードされたポリペプチドの所望の活性が、未修飾のポリペプチドに対して実質的に低減されないような、１つ以上の置換、付加、欠失および／または挿入を含んでもよい。コードされるポリペプチドの活性の効果は一般に、本明細書において記載されるように評価され得る。
【００６６】
さらなる実施形態では、本発明は、グリシル−ｔＲＮＡ合成酵素に対して同一であるかまたは相補的な配列の種々の長さの連続ストレッチを含む単離されたポリヌクレオチドを提供し、ここでこの単離されたポリヌクレオチドは本明細書に記載されるようなＧｌｙＲＳをコードする。
【００６７】
例えば、本発明のＧｌｙＲＳポリペプチドの少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０または５００以上の連続アミノ酸残基、ならびにその間の全ての中間の長さの残基をコードするポリヌクレオチドが本発明によって提供される。「中間の長さ」とはこの文脈では、提示された値の間の任意の長さ、例えば、１０１、１０２、１０３など；１５１、１５２、１５３など；２０１、２０２、２０３などを意味することが容易に理解される。
【００６８】
他の実施形態では、本発明は、本明細書において提供されるポリヌクレオチド配列、またはそのフラグメント、またはその相補的な配列に対して、中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドに関する。ハイブリダイゼーション技術は、分子生物学の当該分野において周知である。例示の目的であるが、他のポリヌクレオチドと本発明のポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを試験するために適切な中程度にストリンジェントな条件は、５×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳ、１．０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中での事前洗浄；５０℃〜６５℃、５×ＳＳＣでの、一晩のハイブリダイゼーション；続いて、０．１％のＳＤＳを含有する２×、０．５×および０．２×ＳＳＣのそれぞれを用いた、６５℃で２０分間の２回の洗浄を含む。
【００６９】
本発明のポリヌクレオチドは、そのコード配列自体の長さに関わらず、他のＤＮＡ配列、例えば、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、さらなる制限酵素部位、マルチクローニング部位、他のコードセグメントなどと組み合わされてもよく、その結果、その全体の長さは、相当変化し得る。従って、ほとんどいずれの長さのポリヌクレオチドフラグメントも使用してよいと考えられ、その全長は、好ましくは意図した組換えＤＮＡプロトコールにおける調製および使用の容易さによって制限される。
【００７０】
さらに、遺伝コードの縮重の結果として、本明細書中に記載されるようなポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列が存在することが、当業者に理解される。これらのポリヌクレオチドのうちいくつかは、任意のネイティブな遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を保有する。それにもかかわらず、コドンの用法における差異に起因して変化するポリヌクレオチド、例えば、ヒトおよび／または霊長類のコドン選択について最適化されるポリヌクレオチドは、本発明によって具体的に意図される。さらに、本明細書中に提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子は、本発明の範囲内である。対立遺伝子とは、１以上の変異、例えば、ヌクレオチドの欠失、付加および／または置換の結果として変化する内因性遺伝子である。得られたｍＲＮＡおよびタンパク質は、変化した構造または機能を有してもよいが、有する必要はない。対立遺伝子は、標準的な技術（例えば、ハイブリダイゼーション、増幅および／またはデータベース配列比較）を用いて、同定され得る。
【００７１】
ポリヌクレオチドおよびその融合物は、当該分野で公知でありかつ利用可能な任意の種々の十分確立された技術を用いて、調製、操作および／または発現され得る。例えば、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、またはその融合タンパク質もしくは機能的な等価物は、適切な宿主細胞においてＧｌｙＲＳポリペプチドの発現を指向する組換えＤＮＡ分子中で用いられ得る。遺伝コードの固有の縮重に起因して、実質的に同じか、または機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列が産生され得、そしてこれらの配列を用いて所定のポリペプチドをクローン化し、そして発現させ得る。
【００７２】
当業者によって理解されるように、いくつかの場合において、天然に存在しないコドンを保有するポリペプチドコードヌクレオチド配列を作製することが有利である場合がある。例えば、特定の原核生物宿主または真核生物宿主に優先されるコドンが、タンパク質発現の速度を増加させるためか、または所望の特性（例えば、天然に存在する配列から生成される転写物の半減期よりも長い半減期）を有する組換えＲＮＡ転写物を産生するように選択され得る。
【００７３】
さらに、本発明のポリヌクレオチド配列は、種々の理由（遺伝子産物のクローニング、プロセシング、発現、および／または活性を変更する改変が挙げられるが、それらに限定されない）のためにポリペプチドコード配列を変更するために、当該分野において一般的に公知の方法を使用して操作され得る。
【００７４】
所望のポリペプチドを発現させるために、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列または機能的等価物を、適切な発現ベクター（すなわち、挿入されたコード配列の転写および翻訳のために必要なエレメントを含むベクター）内に挿入してもよい。当業者に周知である方法を用いて、目的のポリペプチドをコードする配列ならびに適切な転写制御エレメントおよび翻訳制御エレメントを含む発現ベクターを構築し得る。これらの方法としては、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換えが挙げられる。そのような技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８９）、およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８９）に記載される。
【００７５】
種々の発現ベクター／宿主系が公知であって、かつポリヌクレオチド配列を含み、そして発現させるために利用され得る。これらとしては、限定するものではないが以下が挙げられる：微生物、例えば、組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌；酵母発現ベクターで形質転換した酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ（；）、タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）または細菌発現ベクター（例えば、ＴｉもしくはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換した植物細胞系；あるいは動物細胞系。
【００７６】
発現ベクター内に存在する「制御エレメント」または「調節配列」は、転写および翻訳を実行するように宿主細胞タンパク質と相互作用する、それらのベクターの非翻訳領域（エンハンサー、プロモーター、５’および３’非翻訳領域）である。そのようなエレメントは、その長さおよび特異性を変更し得る。利用されるベクター系および宿主に依存して、多数の適切な転写エレメントおよび翻訳エレメント（構成的プロモーターおよび誘導性プロモーターを含む）が用いられ得る。例えば、細菌系においてクローニングする場合、誘導性プロモーター、例えば、ＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴファージミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）またはＰＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｇｉｂｃｏ
ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）などのハイブリッドｌａｃＺプロモーターが用いられてもよい。哺乳動物細胞系において、哺乳動物遺伝子または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーターが、一般的に好ましい。ポリペプチドをコードする配列の複数のコピーを含む細胞株を生成することが必要とされる場合、ＳＶ４０またはＥＢＶベースのベクターが、適切な選択マーカーと共に有利に用いられ得る。
【００７７】
細菌系において、多数の発現ベクターが、発現されるポリペプチドに対して意図される使用に依存して選択され得る。例えば、大量に必要とされる場合、容易に精製される融合タンパク質の高レベルの発現を指向するベクターが用いられてもよい。そのようなベクターとしては、限定するものではないが以下が挙げられる：多機能性Ｅ．ｃｏｌｉクローニングベクターおよび発現ベクター、例えば、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ここでは目的のポリペプチドをコードする配列が、β−ガラクトシダーゼのアミノ末端Ｍｅｔおよびそれに引続く７残基についての配列とインフレームでベクター内に連結され得、その結果、ハイブリッドタンパク質が産生される）；ｐＩＮベクター（Ｖａｎ  ＨｅｅｋｅおよびＳｃｈｕｓｔｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：５５０３  ５５０９（１９８９））；など。ｐＧＥＸベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）もまた、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させるために用いられてもよい。一般的に、そのような融合タンパク質は、可溶性であり、そしてグルタチオン−アガロースビーズに吸着させ、次に遊離のグルタチオンの存在下において溶出させることによって、溶解した細胞から容易に精製され得る。そのような系において作製されたタンパク質は、クローニングされた目的のポリペプチドが、随意にＧＳＴ部分から放出され得るように、ヘパリン、トロンビン、または第ＸＡ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計されてもよい。
【００７８】
酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター、例えば、α因子、アルコールオキシダーゼおよびＰＧＨを含む多数のベクターが用いられ得る。概説については、Ａｕｓｕｂｅｌら、（前出）およびＧｒａｎｔら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６〜５４４（１９８７）を参照のこと。
【００７９】
植物発現ベクターを用いる場合、ポリペプチドをコードする配列の発現は、任意の多数のプロモーターにより駆動され得る。例えば、ウイルスプロモーター、例えば、ＣａＭＶの３５Ｓプロモーターおよび１９Ｓプロモーターは、単独で用いられてもよいし、またはＴＭＶに由来するωリーダー配列と組み合わせて用いられてもよい（Ｔａｋａｍａｔｓｕ、ＥＭＢＯ  Ｊ．６：３０７〜３１１（１９８７））。あるいは、植物プロモーター、例えば、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットまたは熱ショックプロモーターを用いてもよい（Ｃｏｒｕｚｚｉ，Ｇ．ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．３：１６７１〜１６８０（１９８４）；Ｂｒｏｇｌｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４：８３８〜８４３（１９８４）；およびＷｉｎｔｅｒら、Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．１７：８５〜１０５（１９９１））。これらの構築物は、直接的ＤＮＡ形質転換または病原体媒介性トランスフェクションによって植物細胞内に導入され得る。そのような技術は、多数の一般的に入手可能な概説に記載されている（例えば、Ｈｏｂｂｓ  ｉｎ  ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ、Ｙｅａｒｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９１〜１９６頁（１９９２）を参照のこと）。
【００８０】
昆虫系はまた、目的のポリペプチドを発現させるために用いられ得る。例えば、そのような１つの系において、オートグラファカリフォルニア核発汗病ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）（ＡｃＮＰＶ）が、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｌａｒｖａｅにおいて外来遺伝子を発現させるベクターとして用いられる。ポリペプチドをコードする配列は、ウイルスの非必須領域内（例えば、ポリへドリン（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ）遺伝子）にクローニングされてもよく、ポリへドリンプロモーターの制御下に置かれてもよい。ポリペプチドコード配列の首尾良い挿入は、ポリへドリン遺伝子を不活性化し、そしてコートタンパク質を欠損している組換えウイルスを産生する。次いで、この組換えウイルスを用いて、例えば、目的のポリペプチドが発現され得る、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｌａｒｖａｅに感染してもよい（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：３２２４〜３２２７（１９９４））。
【００８１】
哺乳動物宿主細胞において、多数のウイルスベースの発現系が一般的に利用可能である。例えば、アデノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合、目的のポリペプチドをコードする配列は、後期プロモーターおよび３部からなるリーダー配列から構成されるアデノウイルス転写／翻訳複合体内に連結され得る。ウイルスゲノムの非必須Ｅ１またはＥ３領域における挿入を用いて、感染した宿主細胞においてポリペプチドを発現し得る、生存可能なウイルスを得てもよい（ＬｏｇａｎおよびＳｈｅｎｋ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：３６５５〜３６５９（１９８４））。さらに、転写エンハンサー、例えば、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞における発現を増大させてもよい。
【００８２】
特定の開始シグナルをまた、目的のポリペプチドをコードする配列のより効率的な翻訳を達成するために用いてもよい。そのようなシグナルとしては、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が挙げられる。ポリペプチドをコードする配列、その開始コドンおよび上流配列が適切な発現ベクター内に挿入される場合、さらなる転写制御シグナルまたは翻訳制御シグナルは必要でない場合がある。しかし、コード配列のみ、またはその一部のみが挿入される場合、ＡＴＧ開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルが提供されるべきである。さらに、開始コドンは、インサート全体の翻訳を確実にするために、正確なリーディングフレーム内にあるべきである。外因性翻訳エレメントおよび開始コドンは、種々の起源（天然および合成の両方）に由来し得る。発現の効率は、用いられる特定の細胞系に適切なエンハンサー（例えば、文献（Ｓｃｈａｒｆら、Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．２０：１２５〜１６２（１９９４））に記載されるエンハンサー）の封入によって増強され得る。
【００８３】
さらに、宿主細胞株は、挿入された配列の発現を調節するか、または所望の様式において発現されたタンパク質をプロセシングするその能力について選択され得る。ポリペプチドのそのような改変としては、限定するものではないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化が挙げられる。タンパク質の「プレプロ」形態を切断する翻訳後プロセシングはまた、正確な挿入、折り畳みおよび／または機能を促進させるために用いられ得る。異なる宿主細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３およびＷ１３８）（これらは、そのような翻訳後活性についての特定の細胞機構（ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）および特徴的機構（ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ）を有する）は、正確な改変および外来タンパク質のプロセシングを確実にするように選択され得る。
【００８４】
長期間の組換えタンパク質の高収率の産生のためには、安定な発現が一般的に好ましい。例えば、目的のポリヌクレオチドを安定に発現する細胞株が、ウイルス複製起点および／または内因性発現エレメントならびに同じかもしくは別個のベクター上の選択マーカー遺伝子を含み得る、発現ベクターを用いて形質転換され得る。そのベクターの導入後、細胞は、富化（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）培地において１〜２日間増殖することを可能にされてもよく、その後にそれらは選択培地に切換えられる。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を与えることであり、そしてその存在が、導入された配列を首尾良く発現する細胞の増殖および回収を可能とする。安定に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適切な組織培養技術を用いて、増殖され得る。
【００８５】
多数の選択系を用いて、形質転換細胞株を回収し得る。これらの選択系としては、それぞれ、ｔｋ−細胞またはａｐｒｔ−細胞において使用され得る、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ  １１：２２３〜２３２（１９７７））およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら、Ｃｅｌｌ  ２２：８１７〜８２３（１９９０））遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。また、代謝拮抗剤耐性、抗生物質耐性または除草剤耐性が選択のための基礎として用いられてもよい；例えば、ｄｈｆｒ（これは、メトトレキセートに対する耐性を与える（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７７：３５６７〜７０（１９８０））；ｎｐｔ（これは、アミノグリコシド、ネオマイシンおよびＧ−４１８に対する耐性を与える（Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１〜１４（１９８１））；ならびにａｌｓまたはｐａｔ（これらは、それぞれ、クロルスルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を与える（Ｍｕｒｒｙ、前出））。さらなる選択遺伝子が記載されている。例えば、ｔｒｐＢ（これは、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にする）、またはｈｉｓＤ（これは、細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にする）（ＨａｒｔｍａｎおよびＭｕｌｌｉｇａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：８０４７〜５１（１９８８））。アントシアニン、β−グルクロニダーゼおよびその基質のＧＵＳ、ならびにルシフェラーゼおよびその基質のルシフェリンのようなマーカーを用いる、可視マーカーの使用の人気が高まっており、形質転換体を同定するためのみならず、特定のベクター系に起因し得る一過性のタンパク質発現または安定なタンパク質発現の量を定量するためにもまた広範に用いられている（Ｒｈｏｄｅｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５５：１２１〜１３１（１９９５））。
【００８６】
ポリヌクレオチドがコードする産物に特異的なポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体のいずれかを用いて、そのポリヌクレオチドがコードする産物の発現を検出および測定するための種々のプロトコールは、当該分野において公知である。例としては、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）が挙げられる。これらのアッセイおよび他のアッセイは、とりわけＨａｍｐｔｏｎら、Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９０）およびＭａｄｄｏｘら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５８：１２１１〜１２１６（１９８３）に記載される。
【００８７】
広範な種々の標識技術およびコンジュゲーション技術が、当業者に公知であり、かつ種々の核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイにおいて用いられ得る。ポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための標識されたハイブリダイゼーションまたはＰＣＲプローブを作製するための手段としては、オリゴ標識（ｏｌｉｇｏｌａｂｅｌｉｎｇ）、ニックトランスレーション、末端標識または標識されたヌクレオチドを使用するＰＣＲ増幅が挙げられる。あるいは、ｍＲＮＡプローブの産生のために、配列またはその任意の部分が、ベクター内にクローニングされ得る。そのようなベクターは、当該分野において公知であり、市販されており、そして適切なＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６）および標識されたヌクレオチドを添加することにより、ＲＮＡプローブをインビトロで合成するために用いられ得る。これらの手順は、種々の市販キットを用いて実施され得る。用いられ得る適切なレポーター分子または標識としては、放射性核種、酵素、蛍光、化学発光、または色素形成剤ならびに基質、補因子、インヒビター、磁気粒子などが挙げられる。
【００８８】
目的のポリヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、タンパク質の発現および細胞培養物からの回収に適した条件下で培養され得る。組換え細胞により産生されたタンパク質は、用いられた配列および／またはベクターに依存して、細胞内に分泌されてもよいし、または含まれてもよい。当業者によって理解されるように、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核細胞膜または真核細胞膜を通じて、コードされたポリペプチドの分泌を指向するシグナル配列を含むように設計され得る。他の組換え構築物を用いて、目的のポリペプチドをコードする配列を、可溶性タンパク質の精製を促進するポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に結合させてもよい。
【００８９】
組換え産生方法に加えて、本発明のポリペプチドおよびそのフラグメントは、固相技術（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９〜２１５４（１９６３））を用いる、直接的ペプチド合成によって産生され得る。タンパク質合成は、手動技術を用いてか、または自動化によって実施され得る。自動化合成は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３１Ａペプチド合成装置（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて、達成され得る。あるいは、種々のフラグメントは、別々に化学的に合成されて、全長分子を産生するために化学的方法を用いて組み合わせられてもよい。
【００９０】
本発明の別の局面によれば、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えば、遺伝子治療技術を用いてインビボで被験体に送達され得る。遺伝子治療とは、一般には、このような治療が探求される障害または状態を有する、哺乳動物、特にヒトの特定の細胞、標的細胞に対する異種の核酸の移入を指す。核酸は、異種のＤＮＡが発現され、それによってコードされる治療産物が産生されるような方式で選択された標的細胞に導入される。
【００９１】
本明細書で教示されるような遺伝子治療に利用可能な種々のウイルスベクターとしては、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、または好ましくはレトロウイルスのようなＲＮＡウイルスが挙げられる。好ましくは、レトロウイルスベクターは、マウスもしくはトリのレトロウイルスの誘導体であるか、またはレンチウイルスベクターである。好ましいレトロウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。単一の外因性遺伝子が導入され得るレトロウイルスベクターの例としては、限定するものではないが、以下が挙げられる：モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、ＳＩＶ、ＢＩＶ、ＨＩＶおよびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）。多数のさらなるレトロウイルスベクターが複数の遺伝子を組み込み得る。これらすべてのベクターは、形質導入細胞が同定され、作成され得るように選択マーカーの遺伝子を導入しても、または組み込んでもよい。目的の亜鉛フィンガー由来のＤＮＡ結合ポリペプチド配列をウイルス性ベクターに、特定の標的細胞のレセプターのためのリガンドをコードする他の遺伝子、例えばベクターと共に、導入することにより、標的特異性が生じ得る。レトロウイルスベクターは、例えば、タンパク質（二量体）をコードするポリヌクレオチドを挿入することにより標的特異性となり得る。例示的な標的化は、レトロウイルスベクターを標的とする抗体を用いることによって達成できる。当業者は、亜鉛フィンガーヌクレオチド結合タンパク質ポリヌクレオチドを含むレトロウイルスベクターを標的特異的に送達し得るよう、レトロウイルスゲノム中に挿入し得る特異的ポリヌクレオチド配列について精通しており、過度の実験を行うことなく容易に確認することができる。
【００９２】
組換え体レトロウイルスは欠損しているため、感染ベクター粒子を産生するための補助が必要である。この補助は、例えば、ＬＴＲ内の調節配列の制御下で、レトロウイルスの構造遺伝子すべてをコードするプラスミドを含むヘルパー細胞系を用いることにより、提供され得る。これらプラスミドは、カプセル化のためのＲＮＡ転写産物を認識するパッケージング機構を可能とするヌクレオチド配列を喪失している。パッケージングシグナルを欠損しているヘルパー細胞株としては、限定するものではないが、例えば、ＰＳＩ．２、ＰＡ３１７およびＰＡ１２が挙げられる。これらの細胞株は、ゲノムがパッケージングされていないため、空のビリオンを生じる。レトロウイルスベクターは、パッケージングシグナルがインタクトであるが、構造遺伝子が目的の他の遺伝子に置換わっている細胞中に導入されるならば、そのベクターはパッケージされ、ベクタービリオンを生じ得る。次いで、この方法により産生するベクタービリオンを用い、ＮＩＨ３Ｔ３細胞のような組織細胞系を感染させ、多量のキメラレトロウイルスビリオンを産生し得る。
【００９３】
遺伝子治療のための「非ウイルス性」送達技術、例えば、ＤＮＡリガンド複合体、アデノウイルスリガンドＤＮＡ複合体、ＤＮＡの直接導入、ＣａＰＯ４沈殿、遺伝子銃技術、エレクトロポレーション、リポソーム法およびリポフェクションなどもまた用いられ得る。任意のこれらの方法は、当業者に利用可能であり、本明細書の使用に適当である。他の適当な方法が当業者に利用可能であり、本発明は、任意の利用可能なトランスフェクション方法を用いて達成され得ることが理解されるべきである。リポフェクションは、リポソーム粒子中に単離されたＤＮＡ分子をカプセル化すること、およびこのリポソーム粒子を標的細胞の細胞膜と接触させることにより達成できる。リポソームは、自己集合するコロイド状粒子であり、この粒子では、ホスファチジルセリンまたはホスファチジルクロリンのような両親媒性分子を構成する脂質二重層が、周囲媒体の一部をカプセル化し、その結果、脂質二重層が親水性内部を包む。単層または多層リポソームが構成され得、その結果、内部には、所望の化学物質、薬物または、本発明にあるような単離されたＤＮＡ分子が含まれる。
【００９４】
結合因子および修飾因子
別の局面によれば、本発明はさらに、本明細書中で開示されるＧｌｙＲＳのポリヌクレオチド（スプライス改変体種を含む）またはポリペプチドに対して、またはその一部、改変体もしくは誘導体に対して結合特異性を呈する結合因子および修飾因子、例えば、抗体およびその抗原結合フラグメント、可溶性レセプター、ドミナント・ネガティブポリペプチド、干渉ＲＮＡなど、ならびにこれらを用いる方法を提供する。好ましくは、このような結合因子は、本発明のＧｌｙＲＳポリヌクレオチドまたはポリペプチドによって媒介される１つ以上の非正準的な活性を調節するために有効であり、それによって所望の細胞効果および／または治療効果をもたらす。
【００９５】
ある実施形態では、例えば、結合因子とは、本発明のＧｌｙＲＳポリヌクレオチドまたはポリペプチドに結合し、それが目的の１つ以上の非正準的活性を媒介する能力を調節する（例えば、阻害または増強する）因子である。例えば、いくつかの実施形態では、この結合因子とは、ＧｌｙＲＳのポリヌクレオチドまたはポリペプチドに結合して、それがその細胞結合パートナーの１つ以上に結合する能力を調節する因子である。他の実施形態では、この結合因子とは、本発明のＧｌｙＲＳのポリヌクレオチドまたはポリペプチドに結合して、その発現および／または活性を調節する因子である。従って、このような結合因子は、本発明のＧｌｙＲＳのポリヌクレオチドまたはポリペプチドによって媒介させるか、またはそれらと会合させて、その活性を調節することによって、疾患、障害または他の状態を処置または予防するために用いられ得る。
【００９６】
ある例示的な実施形態では、この結合因子は、本発明のＧｌｙＲＳポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントである。抗体またはその抗原結合フラグメントは、それが検出可能なレベルで（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ内で）ポリペプチドと反応し、同様の条件下で無関係のポリペプチドとは検出できるほど反応しない場合に、本発明のポリペプチドと「特異的に結合する」、「免疫学的に結合する」および／または「免疫学的に反応性」といわれる。
【００９７】
この文脈で用いられる場合、免疫学的結合は、一般に、免疫グロブリン分子と、この免疫グロブリンが特異的である抗原との間で起こるタイプの非共有結合的な相互作用をいう。免疫学的結合相互作用の強度または親和性は、相互作用の解離定数（Ｋｄ）の観点から表現され得、ここで、より小さいＫｄは、より大きな親和性を示す。選択されたポリペプチドの免疫学的結合特性は、当該分野で周知の方法を用いて、定量され得る。１つのこのような方法は、抗原結合部位／抗原複合体形成および解離の速度を測定する工程を必要とし、ここで、これらの速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性、および両方の方向における速度に等しく影響を与える幾何学的パラメーターに依存する。従って、「会合速度定数（ｏｎ  ｒａｔｅ  ｃｏｎｓｔａｎｔ）」（ｋｏｎ）および「解離速度定数（ｏｆｆ  ｒａｔｅ  ｃｏｎｓｔａｎｔ）」（ｋｏｆｆ）の両方が、濃度ならびに会合および解離の実際の速度を計算することによって決定され得る。ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比は、親和性に関係しない全てのパラメーターの排除を可能にし、従って、解離定数Ｋｄに等しい。一般的には、Ｄａｖｉｅｓら（１９９０）、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：４３９〜４７３を参照のこと。
【００９８】
抗体の「抗原結合部位」または「結合部分」とは、抗原結合に関係する免疫グロブリン分子の部分を指す。この抗原結合部位は、重鎖（「Ｈ」）および軽鎖（「Ｌ」）のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。重鎖および軽鎖のＶ領域内の３つの高度に分岐したストレッチが、「超可変領域」といわれ、これは、「フレームワーク領域」または「ＦＲ」として公知のより保存された隣接ストレッチの間に挿入される。従って、「ＦＲ」という用語は、免疫グロブリンの超可変領域の間で、それに隣接して天然に見出されるアミノ酸配列をいう。抗体分子において、軽鎖の３つの超可変領域および重鎖の３つの超可変領域が、３次元空間において互いに相対的に配置されて、抗原結合表面が形成される。この抗原結合表面は、結合した抗原の３次元表面に相補的であり、そして重鎖および軽鎖の各々の３つの超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と呼ばれる。
【００９９】
結合因子は、例えば、リボソームであってもよく、ペプチド成分、ＲＮＡ分子またはポリペプチドの有無がある。好ましい実施形態では、結合因子は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。抗体は、当業者に公知の任意の種々の技術によって調製され得る。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８を参照のこと。一般に、抗体は、細胞培養技術（本明細書に記載されるようなモノクローナル抗体の生成を含む）によって、または組換え抗体の生成を可能にするために、適切な細菌細胞宿主または哺乳動物細胞宿主への抗体遺伝子のトランスフェクションを介して、生成され得る。１つの技術において、このポリペプチドを含む免疫原が、最初に、広範な種々の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジまたはヤギ）のいずれかに注射される。この工程において、本発明のポリペプチドは、改変を有さない免疫原として機能し得る。あるいは、特に、比較的短いポリペプチドについて、優れた免疫応答は、このポリペプチドがキャリアタンパク質、例えば、ウシ血清アルブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニンに結合される場合に、惹起され得る。この免疫原は、好ましくは、１回以上のブースター免疫を組み込む所定のスケジュールに従って、動物宿主に注射され、そしてこの動物は、定期的に採血される。このポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体は、次いで、例えば、適切な固体支持体に結合されたポリペプチドを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって、このような抗血清から精製され得る。
【０１００】
目的のポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体は、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１〜５１９、１９７６の技術およびその改良技術を用いて、調製され得る。要するに、これらの方法は、所望の特異性（すなわち、目的のポリペプチドとの反応性）を有する抗体を生成し得る不死細胞株の調製を含む。このような細胞株は、例えば、上記のように免疫された動物から得られる脾臓細胞から生成され得る。次いで、この脾臓細胞が、例えば、骨髄腫細胞融合パートナー、好ましくは、免疫された動物と同系であるものとの融合によって不死化される。種々の融合技術が使用され得る。例えば、脾臓細胞および骨髄腫細胞は、数分間、非イオン性洗浄剤と組み合わされてもよく、次いで、ハイブリッド細胞の増殖は支持するが、骨髄腫細胞の増殖は支持しない選択培地に低密度でプレートされ得る。好ましい選択技術は、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選択を用いる。十分な時間の後、通常、約１〜２週間の後、ハイブリッドのコロニーが観察される。単一コロニーを選択し、そしてそれらの培養上清を、このポリペプチドに対する結合活性について試験する。高い反応性および特異性を有するハイブリドーマが好ましい。
【０１０１】
モノクローナル抗体は、増殖ハイブリドーマコロニーの上清から単離されてもよい。さらに、種々の技術が、収量を増加させるために用いられ得、この技術とは、例えば、適切な脊椎動物宿主（例えば、マウス）の腹腔へのハイブリドーマ細胞株の注入である。次いで、モノクローナル抗体が、腹水または血液から回収され得る。混入物が、従来の技術、例えば、クロマトグラフィー、ゲル濾過、沈澱、および抽出によって抗体から除去され得る。本発明のポリペプチドは、例えば、アフィニティートクロマトグラフィー工程における精製プロセスにおいて用いられ得る。
【０１０２】
抗体分子の免疫学的結合特性を示し得る抗原結合部位を含む多くの治療的に有効な分子が、当該分野で公知である。このタンパク質分解性酵素パパインは、優先的に、ＩｇＧ分子を切断して、いくつかのフラグメントを生じさせ、これら（「Ｆ（ａｂ）」フラグメント）のうちの２つの各々は、インタクトな抗原結合部位を含む共有結合ヘテロダイマーを含む。酵素ペプシンは、ＩｇＧ分子を切断して、いくつかのフラグメント（両方の抗原結合部位を含む「Ｆ（ａｂ’）２」フラグメントを含む）を提供し得る。「Ｆｖ」フラグメントは、ＩｇＭ、および稀有な場合にはＩｇＧまたはＩｇＡ免疫グロブリン分子の優先的なタンパク質分解的切断によって生成され得る。しかし、Ｆｖフラグメントは、当該分野で公知の組換え技術を用いて、より一般的に誘導される。Ｆｖフラグメントは、非共有結合的なＶＨ：：ＶＬヘテロダイマーを含み、このヘテロダイマーは、ネイティブな抗体分子の抗原認識および結合能力のほとんどを保持する抗原結合部位を含む。Ｉｎｂａｒら（１９７２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９：２６５９〜２６６２；Ｈｏｃｈｍａｎら（１９７６）、Ｂｉｏｃｈｅｍ  １５：２７０６〜２７１０；およびＥｈｒｌｉｃｈら（１９８０）、Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９：４０９１〜４０９６。
【０１０３】
単鎖Ｆｖ（「ｓＦｖ」）ポリペプチドは、共有結合されたＶＨ：：ＶＬヘテロダイマーであり、このヘテロダイマーは、ペプチドをコードするリンカーによって連結されたＶＨをコードする遺伝子およびＶＬをコードする遺伝子を含む遺伝子融合物から発現される。Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５（１６）：５８７９〜５８８３。抗体Ｖ領域由来の自然に凝集する（ただし化学的には分離されている）軽鎖および重鎖のポリペプチドを、ｓＦｖ分子（抗原結合部位の構造に実質的に同様である３次元構造に折り畳まれる）に変換するための化学構造を識別するための多くの方法が記述されている。例えば、米国特許第５，０９１，５１３号および同第５，１３２，４０５号（Ｈｕｓｔｏｎら）；ならびに米国特許第４，９４６，７７８号（Ｌａｄｎｅｒら）を参照のこと。
【０１０４】
上記分子の各々は、重鎖および軽鎖ＣＤＲセットを含み、このセットの各々は、ＣＤＲＳへの支持を提供し、そして互いに対してＣＤＲの空間的関係を規定する重鎖および軽鎖ＦＲセットの間に挿入されている。本明細書中で用いられる場合、「ＣＤＲセット」という用語は、重鎖または軽鎖Ｖ領域の３つの超可変領域を指す。重鎖または軽鎖のＮ末端から進んで、これらの領域は、それぞれ、「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」および「ＣＤＲ３」と表記される。従って、抗原結合部位は、６つのＣＤＲを含み、この６つのＣＤＲは、重鎖および軽鎖Ｖ領域の各々由来のＣＤＲセットを含む。単一ＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３）を含むポリペプチドは、本明細書中で「分子認識ユニット」と呼ばれる。多くの抗原−抗体複合体の結晶学的分析により、ＣＤＲのアミノ酸残基は、結合した抗原との広範な接触を形成することが立証され、ここで、最も広範な抗原接触は、重鎖ＣＤＲ３とである。従って、分子認識ユニットが、主に、抗原結合部位の特異性を担う。
【０１０５】
本明細書中で用いられる場合、「ＦＲセット」という用語は、重鎖または軽鎖のＶ領域のＣＤＲセットのＣＤＲを構成する、４つの隣接アミノ酸配列をいう。いくつかのＦＲ残基は、結合した抗原と接触し得る；しかし、ＦＲは主に、Ｖ領域を抗原結合部位、特にＣＤＲＳに直接隣接するＦＲ残基に折り畳むことを担う。ＦＲにおいて、特定のアミノ酸残基および特定の構造的特徴が、非常に高度に保存される。この点において、全てのＶ領域配列は、約９０アミノ酸残基の内部ジスルフィドループを含む。Ｖ領域が、結合部位に折り畳まれる場合、このＣＤＲは、抗原結合表面を形成する突出したループモチーフとして提示される。正確なＣＤＲアミノ酸配列に関わらず、特定の「正準的な」構造に折り畳まれたＣＤＲループの形状に影響するＦＲの保存された構造的領域が存在することが一般的に認識される。さらに、特定のＦＲ残基は、抗体重鎖および軽鎖の相互作用を安定化する非共有結合的なドメイン間接触に関係することが公知である。
【０１０６】
非ヒト免疫ブログリン由来の抗原結合部位を含む、多数の「ヒト化」抗体分子が記載されており、この抗体分子としては、げっ歯類Ｖ領域およびヒト定常領域に融合されたそれらの会合したＣＤＲ（Ｗｉｎｔｅｒら（１９９１）、Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３〜２９９；Ｌｏｂｕｇｌｉｏら（１９８９）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８６：４２２０〜４２２４；Ｓｈａｗら（１９８７）、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：４５３４〜４５３８；およびＢｒｏｗｎら（１９８７）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：３５７７〜３５８３）、適切なヒト抗体定常ドメインとの融合の前に、ヒト支持ＦＲにグラフトされたげっ歯類ＣＤＲ（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３〜３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４〜１５３６；およびＪｏｎｅｓら（１９８６）、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２〜５２５）、ならびに組換え的にベニヤリングされた（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｌｙ  ｖｅｎｅｅｒｅｄ）げっ歯類ＦＲによって支持されるげっ歯類ＣＤＲ（１９９２年１２月２３日公開、欧州特許公開番号５１９，５９６）を有するキメラ抗体が挙げられる。これらの「ヒト化」分子は、ヒトレシピエントにおけるこれらの部分の治療的適用の持続期間および有効性を制限する、げっ歯類抗ヒト抗体分子に対する所望されない免疫学的応答を最小化するように設計される。
【０１０７】
本明細書中で用いられる場合、「ベニヤリングされたＦＲ」および「組換えベニヤリングされたＦＲ」という用語は、ネイティブのＦＲポリペプチド折り畳み構造の実質的に全てを保持する抗原結合部位を含む異種分子を提供するための、例えば、げっ歯類重鎖または軽鎖のＶ領域からのＦＲ残基のヒトＦＲ残基での選択的置換をいう。ベニヤリング技術は、抗原結合部位のリガンド結合特徴が、主に抗原結合表面内の重鎖および軽鎖のＣＤＲセットの構造および相対的な配置によって決定されるという理解に基づく。Ｄａｖｉｅｓら（１９９０）、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：４３９〜４７３。従って、抗原結合特異性は、ＣＤＲ構造、互いとのそれらの相互作用、およびＶ領域ドメインの残りとのそれらの相互作用が注意深く維持されるヒト化抗体のみにおいて保存され得る。ベニヤリング技術を用いることによって、外部（例えば、溶媒がアクセス可能な）ＦＲ残基（これは、免疫系に容易に遭遇する）が、ヒト残基で選択的に置換されて、弱い免疫原性ベニヤリング表面または実質的に非免疫原性のベニヤリング表面のいずれかを含むハイブリッド分子が得られる。
【０１０８】
本発明の別の実施形態では、本発明のモノクローナル抗体は、１つ以上の目的の因子に結合されてもよい。例えば、治療剤は、適切なモノクローナル抗体に直接的または間接的に（例えば、リンカー基を介して）のいずれかで結合（例えば、共有結合）され得る。因子と抗体との間の直接的な反応は、各々が他のものと反応し得る置換基を有する場合に可能である。例えば、一方の上の求核基（例えば、アミノ基またはスルフヒドリル基）は、他方の上のカルボニル含有基（例えば、酸無水物または酸ハロゲン化物）と、または良好な脱離基（例えば、ハロゲン化物）を含むアルキル基と反応し得る。
【０１０９】
あるいは、リンカー基を介して治療剤を抗体と結合させることが望ましい場合がある。リンカー基は、結合の可能性を妨げることを回避するために、抗体を薬剤から隔てるためのスペーサーとして機能し得る。リンカー基はまた、薬剤または抗体上の置換基の化学的反応性を増加させるように働き得、従って結合効率を増大させ得る。化学的反応性の増大はまた、薬剤または薬剤上の官能基の使用を促進し得る（そうでなければ、不可能である）。
【０１１０】
種々の二官能性または多官能性試薬、ホモ官能性とヘテロ官能性との両方（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬのカタログ中に記載されるもの）が、リンカー基として使用されてもよいことが当業者には明らかである。結合は、例えば、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、または酸化された炭水化物残基を介してもたらされ得る。このような方法論を記載する多数の参考文献（例えば、Ｒｏｄｗｅｌｌらへの米国特許第４，６７１，９５８号）が存在する。
【０１１１】
本発明の免疫結合体の抗体部分がないときに治療剤がより強力である場合、細胞中へのインターナリゼーションの間に、またはその際に切断可能なリンカー基を用いることが望ましい場合がある。多数の異なる切断可能なリンカー基が記載されている。これらのリンカー基からの薬剤の細胞内放出についての機構は、ジスルフィド結合の還元による（例えば、Ｓｐｉｔｌｅｒへの米国特許第４，４８９，７１０号）、感光性結合の照射による（例えば、Ｓｅｎｔｅｒらへの米国特許第４，６２５，０１４号）、誘導体化されたアミノ酸側鎖の加水分解による（例えば、Ｋｏｈｎらへの米国特許第４，６３８，０４５号）、血清補体媒介性加水分解による（例えば、Ｒｏｄｗｅｌｌらへの米国特許第４，６７１，９５８号）、および酸触媒加水分解による（例えば、Ｂｌａｔｔｌｅｒらへの米国特許第４，５６９，７８９号）切断を含む。
【０１１２】
２つ以上の因子を抗体に結合させることが望ましい場合がある。一実施形態では、ある因子の複数の分子が１つの抗体分子に結合される。別の実施形態では、２つ以上のタイプの因子が１つの抗体に結合されてもよい。特定の実施形態に関わらず、２つ以上の因子を有する免疫結合体は、種々の方法で調製され得る。例えば、２つ以上の因子が、抗体分子に直接的に結合されてもよいし、または付着のための複数の部位を提供するリンカーが用いられてもよい。
【０１１３】
本発明の他の局面では、本発明による調節因子／結合因子は、ＧｌｙＲＳポリヌクレオチドに特異的な１つ以上の干渉性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）配列を含んでもよい。干渉性ＲＮＡｉ分子を用いるＲＮＡ干渉の方法を用いて、所望の細胞および／または治療効果を達成するために、ＧｌｙＲＳ遺伝子またはスプライスバリアントなどの、所望の遺伝子または目的のポリヌクレオチドの発現を破壊してもよい。
【０１１４】
特定の実施形態では、干渉性ＲＮＡは低分子の干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。ＳｉＲＮＡは、代表的には１９〜３０ヌクレオチド長のＲＮＡ二重鎖であって、ＲＮＡｉ誘発性のサイレンシング複合体（ＲＮＡｉ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）（ＲＩＳＣ）として公知の細胞質マルチプロテイン複合体と会合し得る。ｓｉＲＮＡをロードしたＲＩＳＣは、同種のｍＲＮＡ転写物の分解を媒介する。従って、ｓｉＲＮＡは、タンパク質発現を高い特異性でノックダウンするように設計され得る。最初に記載されたＲＮＡｉ分子は、ＲＮＡセンスおよびＲＮＡアンチセンス鎖の両方を含むＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであったが、ＤＮＡセンス：ＲＮＡアンチセンスハイブリッド、ＲＮＡセンス：ＤＮＡアンチセンスハイブリッド、およびＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドがＲＮＡｉを媒介し得るということが現在実証されている（Ｌａｍｂｅｒｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．、およびＣｈｒｉｓｔｉａｎ，Ａ．Ｔ．（２００３）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２４：１１１〜１１９）。従って、本発明は、任意のこれらの異なるタイプの二本鎖分子を含むＲＮＡｉ分子の使用を包含する。さらに、ＲＮＡｉ分子を用いて、細胞に種々の形態で導入してもよいことが理解される。従って、本明細書において用いる場合、ＲＮＡｉ分子とは、細胞中でＲＮＡｉ応答を誘発し得る任意のかつ全ての分子を包含し、これに限定するものではないが、２つの別の鎖を含む二本鎖ポリヌクレオチド、すなわち、センス鎖およびアンチセンス鎖、例えば、低分子干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）；二本鎖領域を形成する、相補的配列のヘアピンループを含むポリヌクレオチド、例えば、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子、ならびに単独でまたは別のポリヌクレオチドと組み合わせて二本鎖ポリヌクレオチドを形成し得る１つ以上のポリヌクレオチドを発現する発現ベクターが挙げられる。
【０１１５】
特異的なＧｌｙＲＳポリヌクレオチドを標的とするＲＮＡｉ分子は、当該分野で公知の手順に従って容易に調製され得る。有効なｓｉＲＮＡ分子の構造的特徴は特定されている。Ｅｌｓｈａｂｉｒ，Ｓ．Ｍ．ら（２００１）、Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：４９４〜４９８およびＥｌｓｈａｂｉｒ，Ｓ．Ｍ．ら（２００１）、ＥＭＢＯ  ２０：６８７７〜６８８８。従って、当業者は、広範な種々の異なるｓｉＲＮＡ分子が特異的な遺伝子または転写物を標的するために用いられ得るということを理解する。ある実施形態では、本発明によるｓｉＲＮＡ分子は代表的には、二本鎖であって、かつ１６〜３０または１８〜２５ヌクレオチド長であり、この長さにはその間の各々の整数を含む。一実施形態では、ｓｉＲＮＡは約２１ヌクレオチド長である。ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは０〜７ヌクレオチドの３’オーバーハングまたは０〜４ヌクレオチドの５’オーバーハングを有する。一実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は２つのヌクレオチドの３’オーバーハングを有する。一実施形態では、ｓｉＲＮＡは２１ヌクレオチド長であって、ここで２つのヌクレオチドの３’オーバーハングがある（すなわち、それらは、センス鎖とアンチセンス鎖との間で１９ヌクレオチドの相補性領域を含む）。ある実施形態では、このオーバーハングはＵＵまたはｄＴｄＴ３’オーバーハングである。
【０１１６】
一実施形態では、ｓｉＲＮＡ標的部位は、ＡＡの２ヌクレオチド配列の出現について標的ｍＲＮＡ転写物の配列をスキャンすることによって選択される。３’に隣接するおよそ１９ヌクレオチドと組み合わせられた各々のＡＡの２ヌクレオチドの配列は、ｓｉＲＮＡ標的部位である可能性がある。一実施形態では、ｓｉＲＮＡ標的部位は、５’末端および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、または開始コドンに近い（およそ７５塩基以内）領域内には、優先的には配置されない。なぜなら、調節領域に結合するタンパク質は、ｓｉＲＮＰエンドヌクレアーゼ複合体の結合を妨害する可能性があるからである（Ｅｌｓｈａｂｉｒ，Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：４９４〜４９８（２００１）；Ｅｌｓｈａｂｉｒ，Ｓ．ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．２０：６８７７〜６８８８（２００１））。加えて、可能性のある標的部位は、適切なゲノムデータベース（例えば、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍでＮＣＢＩサーバーから利用できるＢＬＡＳＴＮ  ２．０．５）と比較することができ、他のコード配列に対して有意な相同性を有している可能性のある標的配列は排除される。
【０１１７】
特定の実施形態では、干渉性ＲＮＡは短いヘアピンＲＮＡである。ｓｈＲＮＡはステムループ構造を含む。ある実施形態では、これらには、様々なステムの長さ（代表的には、１９から２９ヌクレオチドの長さ、またはその間の任意の数）を含んでもよい。ある実施形態では、ヘアピンには、１９から２１ヌクレオチドのステムが含まれるが、他の実施形態では、ヘアピンには、２７から２９ヌクレオチドのステムが含まれる。ある実施形態にでは、ループの大きさは４から２３ヌクレオチドの長さであるが、ループの大きさは、サイレンシング活性に有意な影響なしに２３ヌクレオチドよりも大きい場合がある。ｓｈＲＮＡ分子には、ミスマッチ（例えば、効力を低下させることのない、ｓｈＲＮＡステムの２つの鎖の間でのＧ−Ｕミスマッチ）が含まれ得る。実際、ある実施形態では、例えば、細菌の中での増殖の間にヘアピンを安定化させるために、ｓｈＲＮＡは、ヘアピンステムの中に１つまたは数個のＧ−Ｕ対合が含まれるように設計される。しかし、標的ｍＲＮＡ（アンチセンス鎖）に結合するステムの部分とｍＲＮＡとの間での相補性が通常は必要であり、この領域の中のわずか１塩基対の不適合によってサイレンシングが回避される場合がある。５’および３’オーバーハングは、必要ではないが、存在する場合もある。
【０１１８】
ある局面では、干渉性ＲＮＡまたはｓｉＲＮＡは、１つ以上の修飾、例えば、修飾されたヌクレオシドまたは修飾されたリン酸塩結合を含む。一実施形態では、ｓｉＲＮＡは二本鎖領域中に少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、この修飾されたｓｉＲＮＡは、少なくとも１つの２’ＯＭｅプリンまたはピリミジンヌクレオチド、例えば、２’ＯＭｅ−グアノシン、２’ＯＭｅ−ウリジン、２’ＯＭｅ−アデノシン、および／または２’ＯＭｅ−シトシンヌクレオチドを含む。本発明における使用に適切な修飾されたヌクレオチドの例としては、限定するものではないが、２’−Ｏ−メチル（２’ＯＭｅ）、２’−デオキシ−２’−フルオロ（２’Ｆ）、２’−デオキシ、５−Ｃ−メチル、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）（ＭＯＥ）、４’−チオ、２’−アミノ、または２’−Ｃ−アリル基を有するリボヌクレオチドが挙げられる。
【０１１９】
本発明の干渉性ＲＮＡに存在し得るリン酸塩骨格修飾（すなわち、修飾されたヌクレオチド間連結合を生じる）の非限定的な例としては、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、モルホリノ、アミデート、カルバメート、カルボキシメチル、アセトアミデート、ポリアミド、スルホネート、スルホンアミド、スルファメート、ホルムアセタール、チオホルムアセタールおよびアルキルシリル置換基が挙げられる（例えば、Ｈｕｎｚｉｋｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ｉｎ  Ｍｏｄｅｒｎ
Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ＶＣＨ、３３１〜４１７（１９９５）；Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら、Ｎｏｖｅｌ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ｉｎ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＡＣＳ、２４〜３９（１９９４）を参照のこと）。このような化学的な修飾は、センス鎖、アンチセンス鎖またはｓｉＲＮＡの両方の鎖の５’末端および／または３’末端に存在し得る。
【０１２０】
特定の実施形態では、干渉性ＲＮＡは、細胞中で発現される特定のＧｌｙＲＳのｍＲＮＡを標的する。従って、干渉性ＲＮＡは、その干渉性ＲＮＡと接触した細胞中で標的遺伝子の発現の減少を生じる。特定の実施形態では、ＲＮＡ干渉が、その干渉性ＲＮＡに接触していない同じ細胞タイプによって発現された場合、標的遺伝子の量を９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、または１０％未満で発現するのに十分な条件および時間のもとで、細胞を、干渉性ＲＮＡと接触させた。発現は、タンパク質発現もしくはｍＲＮＡ発現のいずれかとして、またはマイクロＲＮＡ発現として測定され得る。標的遺伝子によって発現されるタンパク質のレベルは、例えば、ウエスタンブロットまたはＦＡＣＳなどのような慣用的な手順を用いて容易に決定され得る。標的された遺伝子によって発現されるＲＮＡのレベルはＲＴ−ＰＣＲなどの慣用的な手順を用いて容易に決定され得る。
【０１２１】
本発明で用いられる干渉性ＲＮＡは、標的ＧｌｙＲＳ遺伝子の領域に相当するか、または相補的である領域を含む。好ましい実施形態では、この相補性領域は、完全に相補性であるが、他の実施形態では、１つ以上のミスマッチを含む場合もある。ある実施形態では、この相補性領域は、１９〜２５塩基長、または１９〜２１塩基長である。
【０１２２】
本発明の調節因子／結合因子には、例えば、ドミナント・ネガティブ型のＧｌｙＲＳポリペプチド、例えば、本発明のＧｌｙＲＳポリペプチドに結合し得、その非正準的な活性の１つ以上を干渉するかまたは拮抗し得る変異型および／または短縮型のＧｌｙＲＳポリペプチドが含まれる。
【０１２３】
処方物および投与
本発明の組成物（例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体など）は一般には、細胞、組織または動物への投与のため、単独でまたは治療の１つ以上の他の様相と組み合わせてのいずれかで、薬学的に受容可能な溶液または生理学的に受容可能な溶液中に処方される。所望される場合、本発明の組成物は、他の薬剤（例えば、他のタンパク質もしくはポリペプチドまたは種々の薬学的に活性な薬剤など）と組み合わせても同様に投与され得ることも、理解される。事実、さらなる薬剤が本発明のＧｌｙＲＳポリペプチドに有害な影響をもたらさないのであれば、この組成物中にこれも含まれ得る他の成分に実質的に制限はない。
【０１２４】
本発明の薬学的組成物では、薬学的に受容可能な賦形剤およびキャリア溶液の処方は、当業者に周知であり、同様に、種々の処置計画で本明細書に記載の特定の組成物を用いるための適切な投薬計画および処置計画（例えば、経口、非経口、静脈内、鼻腔内、脳内および筋肉内の投与および処方物を含む）も開発中である。
【０１２５】
特定の適用では、本明細書に開示される薬学的組成物は、被験体に対して経口投与によって送達され得る。従って、これらの組成物は、不活性な希釈剤ともしくは吸収可能な食用のキャリアとともに処方されてもよく、またはそれらは、硬性もしくは軟性のシェルのゼラチンカプセル中に含まれてもよいし、またはそれらは錠剤に含まれてもよく、またはそれらは食餌の食品に直接組み込まれてもよい。
【０１２６】
特定の状況において、本明細書中で開示される薬学的組成物を、例えば、米国特許第５，５４３，１５８号；米国特許第５，６４１，５１５号および米国特許第５，３９９，３６３号（その各々がその全体として参照によって本明細書に詳細に援用される）にさらに記載されるとおり、非経口送達、静脈内送達、筋肉内送達またはさらに腹腔内送達することが所望される。遊離塩基または薬学的に受容可能な塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と適切に混合された水中で調製されてもよい。分散物はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中で、ならびにオイル中で調製されてもよい。保存および使用の通常の条件下では、これらの調製物は一般に、微生物の増殖を防止するために、防腐剤を含む。
【０１２７】
注入用途のために適切な薬学的形態としては、滅菌水性液剤または分散物および滅菌注射用液剤または分散物の即時調製のための滅菌散剤が挙げられる（例えば、その全体が参照によって本明細書に詳細に援用される、米国特許第５，４６６，４６８号を参照のこと）。全ての場合において、その形態は、無菌でなければならず、そして容易に注射することができる程度に、流動性でなければならない。それは、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、かつ微生物（例えば、細菌および真菌）の汚染作用に対して保存されなければならない。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および／もしくは植物油を含む溶媒または分散媒体であってもよい。適切な流動性は、例えば、コーティング（例えば、レシチン）の使用によって、分散物の場合には必要とされる粒子サイズの維持によって、そしてサーファクタントの使用によって、維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン（ｐａｒａｂｅｎ）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）によって促進され得る。多くの場合において、等張剤（例えば、糖または塩化ナトリウム）を含めることが、望ましい。注射可能な組成物の長期にわたる吸収は、組成物中での吸収遅延剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）の使用によって、もたらされ得る。
【０１２８】
水溶液の非経口投与のために、例えば、その溶液は、必要に応じて適切に緩衝化されるべきであり、そして液体希釈剤は、最初に、十分な生理食塩水またはグルコースで等張にされる。これらの特定の水溶液は、特に、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、および腹腔内投与に適切である。これに関連して、使用され得る滅菌水性媒体は、本開示の観点から当業者に公知である。例えば、一投薬量は、１ｍｌの等張性ＮａＣｌ溶液に溶解され得、そして１０００ｍｌの皮下注入流体に添加されてもよいし、または注入予定部位で注入されてもよい（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１５版、１０３５〜１０３８頁および１５７０〜１５８０頁を参照のこと）。処置されている被験体の状態に依存して投薬量におけるある程度の変化が必然的に生じる。投与の責任を負う人は、いかなる場合にも個々の被験体に適切な用量を決定する。さらに、ヒト投与について、調製物は、ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ｓｔａｎｄａｒｄｓによって要求されるような、無菌性、発熱性、ならびに一般的な安全性標準および純度標準を満たすべきである。
【０１２９】
無菌の注射溶液は、必要に応じて上記で列挙される種々の他の成分を有する適切な溶媒中で必要な量で活性化合物を組み込むこと、続いて濾過滅菌によって調製され得る。一般には、分散は、種々の滅菌の活性成分を、基礎の分散媒体および上記に列挙される必要な他の成分を含む滅菌ビヒクル中に組み込むことによって調製される。無菌の注射溶液の調製のための無菌粉末の場合には、調製の好ましい方法は、真空乾燥および凍結乾燥技術であり、これによって活性成分の粉末に加えてその以前に無菌濾過された溶液由来の任意の追加の所望の成分が得られる。
【０１３０】
本明細書中で開示される組成物は、中性型で処方されても、または塩型で処方されてもよい。薬学的に受容可能な塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基とともに形成される）が挙げられ、これらの塩は、無機酸（例えば、塩酸またはリン酸など）、または有機酸（酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など）と形成される。遊離カルボキシル基と形成される塩もまた、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化鉄など）、および有機塩基（イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなど）から誘導され得る。処方の際に、溶液は、投薬処方物と適合する様式でかつ治療的に有効な量で投与される。処方物は種々の剤形、例えば、注射溶液、薬物放出カプセルなどで容易に投与される。
【０１３１】
本明細書において用いる場合、「キャリア」とは、全てのかつ任意の溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝液、キャリア溶液、懸濁液、コロイドなどを包含する。薬学的活性物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が、活性成分と不適合である場合を除いては、治療組成物におけるその使用が、企図される。補助的活性成分もまた、これらの組成物に組み込まれてもよい。
【０１３２】
「薬学的に受容可能な」という句は、ヒトに投与される場合に、アレルギー反応または類似の厄介な反応を生じない分子実体および組成物をいう。活性成分としてタンパク質を含む水性の組成物の調製は当該分野で十分理解されている。代表的には、このような組成物は注射可能な液体溶液または懸濁物として調製され；注射前に液体中の溶液に適切な、または液体中の懸濁物に適切な固体型もまた調製されてもよい。この調製物はまた乳化されてもよい。
【０１３３】
ある実施形態では、薬学的組成物は、鼻腔内スプレー、吸入、および／または他のエアロゾル送達ビヒクルによって送達され得る。遺伝子、ポリヌクレオチドおよびペプチド組成物を、経鼻エアロゾルスプレーを介して肺に直接送達するための方法は、例えば、米国特許第５，７５６，３５３号および米国特許第５，８０４，２１２号に記載されている（各々が、その全体が参照によって本明細書に詳細に援用される）。同様に、鼻腔内微粒子樹脂（Ｔａｋｅｎａｇａら、１９９８）およびリゾホスファチジル−グリセロール化合物（その全体が参照によって本明細書に詳細に援用される、米国特許第５，７２５，８７１号）を用いる薬物の送達はまた、薬学分野で周知である。同様に、ポリテトラフルオロエチレン支持マトリックスの形態での経粘膜薬物送達は、米国特許第５，７８０，０４５号（その全体が参照によって本明細書に詳細に援用される）に記載される。
【０１３４】
ある実施形態では、送達は、適切な宿主細胞／生物への本発明の組成物の導入のためのリポソーム、ナノカプセル、微粒子、マイクロスフェア、脂質粒子、小胞などの使用によって行われてもよい。詳細には、本発明の組成物は、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフェア、またはナノ粒子などのいずれかにカプセル化して送達するために処方され得る。この処方物およびこのような送達ビヒクルの使用は、公知でありかつ従来の技術を用いて行われ得る。
【０１３５】
本発明の組成物を含むキット
本発明は他の局面では、本明細書に記載されるような、本発明の１つ以上のポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、マルチユニット複合体、その組成物などのうちの１つ以上で充填された１つ以上の容器を備えるキットを提供する。このキットは、このような組成物を使用するため（例えば、細胞のシグナル伝達、血管形成、癌、炎症性状態などを調整するため）の方法に対する書面の説明書を備えてもよい。
【０１３６】
本明細書におけるキットはまた、処置されている適用に適切であるかまたは所望される１つ以上の追加の治療剤または他の成分を含んでもよい。追加の治療剤は、必要に応じて第二の容器内に含まれてもよい。追加の治療剤の例としては限定するものではないが、抗悪性腫瘍剤、抗炎症剤、抗菌剤、抗ウイルス剤、血管形成剤などが挙げられる。
【０１３７】
本明細書のキットはまた、意図する送達方式（例えば、ステント、移植可能なデポなど）を容易にするために必要であるかまたは所望される１つ以上のシリンジまたは他の構成要素を備えてもよい。
【０１３８】
使用の方法
別の局面では、本発明は、所望の細胞効果および／または治療効果を達成するために細胞、組織または被験体を処置するために本発明の組成物（例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなど）、またはこのような組成物の結合因子もしくは他の調節因子（例えば、抗体、干渉性ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ドミナント・ネガティブポリペプチド、低分子調節因子など）を用いる方法に関する。本発明によって調節され得る細胞または組織は好ましくは哺乳動物細胞もしくは組織、またはさらに好ましくはヒトの細胞もしくは組織である。このような細胞または組織は、健常な状態であっても、または疾患状態であってもよい。
【０１３９】
ある実施形態では、例えば、細胞を本明細書に記載されるようなＧｌｙＲＳ組成物と接触させることによって治療関連細胞活性を調節するための方法が提供される。このような細胞活性としては、限定するものではないが、細胞の代謝、細胞の分化、細胞の増殖、細胞死、細胞動員、細胞遊走、細胞シグナル伝達、サイトカインの産生および／または分泌の調節、遺伝子転写、ｍＲＮＡ翻訳、細胞インピーダンスなどが挙げられる。さらに具体的な実施形態では、本発明に従って調節されるべき細胞活性としては、例えば、Ａｋｔ媒介性の細胞シグナル伝達、Ｅｒｋ１／２媒介性の細胞シグナル伝達、ＧＰＣＲ媒介性の細胞シグナル伝達、内皮の細胞管形成、および細胞結合が挙げられる。他の具体的な実施形態では、細胞の活性としては、例えば、ＣＤ７１および／またはＣＤ８０の調節が挙げられる。さらに他の具体的な実施形態では、細胞活性としては、例えば、サイトカインの産生および／または放出の調節が挙げられ、ここでこのサイトカインはＴＮＦ−α、ＩＬ１−β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０、ＭＩＰ１−α、ＭＩＰ−１β、ＧＲＯ−α、ＭＣＰ−１およびＩＬ−１ｒａからなる群より選択される。さらに他の特具体的な実施形態では、細胞活性としては、例えば、細胞のグルコース、グルカゴン、グリセロールおよび／または遊離脂肪酸の調節を通じた代謝調節が挙げられる。さらに他の具体的な実施形態では、細胞活性としては、例えば、神経形成または神経保護の調節が挙げられる。従って、ＧｌｙＲＳ組成物は、１つ以上のこのような活性の調節から利益を受ける本質的に任意の細胞または組織または被験体を処置するのに使用され得る。
【０１４０】
ＧｌｙＲＳ組成物はまた、任意の多数の治療状況、例としては、例えば、腫瘍性疾患、免疫系疾患（例えば、自己免疫疾患および炎症）、感染性疾患、代謝病、ニューロン／神経学的疾患、筋肉／心血管系の疾患、異常な造血と関連する疾患、異常な脈管形成に関連する疾患、異常な細胞生存に関連する疾患などの処置または予防に関連する治療状況において用いられ得る。
【０１４１】
例えば、ある例示的な実施形態では、本発明のＧｌｙＲＳ組成物は、例えば、内皮の細胞増殖および／またはシグナル伝達の調節を介して血管形成を調節するために用いられ得る。内皮細胞の増殖および／またはシグナル伝達は、適切な細胞株（例えば、ヒト微小血管内皮肺細胞（ＨＭＶＥＣ−Ｌ）およびヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ））を用いて、ならびに適切なアッセイ（例えば、内皮細胞遊走アッセイ、内皮細胞増殖アッセイ、管形成アッセイ、マトリゲル・プラグ（ｍａｔｒｉｇｅｌ  ｐｌｕｇ）アッセイなど）（これらの多くは当該分野で公知であり、かつ利用可能である）を用いてモニターされ得る。
【０１４２】
従って、関連の実施形態では、本発明の組成物は、血管形成の調節から利益を受ける本質的に任意の細胞または組織または被験体の処置において使用され得る。例えば、いくつかの実施形態では、血管形成（例えば、血管形成状態）を受けているかまたは受け易い細胞または組織または被験体は、血管形成状態を阻害するために本発明の適切な組成物と接触させられ得る。他の実施形態では、不十分な血管形成（例えば、血管新生抑制状態）を受けているか受け易い細胞または組織は、血管新生抑制効果を妨げるためおよび／または血管形成を促進するために本発明の適切な組成物と接触させられ得る。
【０１４３】
血管形成の状態の例示的な例としては、限定するものではないが、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、癌（固形および血液学的な癌の両方）、発生学的異常（器官形成）、糖尿病性失明、子宮内膜症、眼内血管新生、乾癬、関節リウマチ（ＲＡ）、および皮膚の退色（例えば、血管腫、焔状母斑、または単純母斑（ｎｅｖｕｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ））が挙げられる。抗血管形成の状態の例としては、限定するものではないが、心臓血管疾患、再狭窄、虚血性の組織または心不全の再灌流後の組織損傷、慢性の炎症および創傷治癒が挙げられる。
【０１４４】
本発明の組成物はまた、自己免疫および／または炎症性の疾患、状態および障害を直接または間接的に媒介する細胞を調節することによる抗炎症または炎症促進性の適応を処置するための免疫調節因子として有用であり得る。免疫調節因子としての本発明の組成物の有用性は、当該分野で公知かつ利用可能な任意の多数の技術を用いてモニターされ得、この技術としては例えば、遊走アッセイ（例えば、白血球またはリンパ球を用いる）、または細胞生存度アッセイ（例えば、Ｂ−細胞、Ｔ−細胞、単球またはＮＫ細胞を用いる）が挙げられる。
【０１４５】
本明細書によって処置され得る例示的な免疫系の疾患、障害または状態としては、限定するものではないが、原発性の免疫不全、免疫媒介性の血小板減少症、川崎症候群、骨髄移植（例えば、成人または小児における最近の骨髄移植）、慢性Ｂ細胞リンパ性白血病、ＨＩＶ感染（例えば、成人または小児のＨＩＶ感染）、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、輸血後紫斑病などが挙げられる。
【０１４６】
さらに、さらなる疾患、障害および状態としては、ギランバレー症候群、貧血（例えば、パルボウイルスＢ１９に関連する貧血、感染について高いリスクにある（例えば、再発性の感染）安定な多発性骨髄腫を有する患者、自己免疫溶血性貧血（例えば、温式自己免疫性溶血性貧血）、血小板減少症（例えば、新生児血小板減少症）、および免疫媒介性好中球減少症、移植（例えば、ＣＭＶ陽性の器官のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）陰性のレシピエント）、低ガンマグロブリン血症（例えば、感染または罹患のリスク要因を有する低ガンマグロブリン血症新生児）、てんかん（例えば、難治性てんかん）、全身性脈管性症候群、重症筋無力症（例えば、重症筋無力症の代償不全）、皮膚筋炎および多発性筋炎が挙げられる。
【０１４７】
さらなる自己免疫疾患、障害および状態としては、限定するものではないが、自己免疫溶血性貧血、自己免疫新生児血小板減少症、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫血球減少症、溶血性貧血、抗リン脂質症候群、皮膚炎、アレルギー性脳脊髄炎、心筋炎、再発性多発性軟骨炎、リウマチ性心疾患、糸球体腎炎（例えば、ＩｇＡ腎症）、多発性硬化症、神経炎、ブドウ膜炎眼炎、多腺性内分泌障害、紫斑病（例えば、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病）、ライター病、スティフマン症候群、自己免疫肺炎症、ギランバレー症候群、インスリン依存性糖尿病および自己免疫炎症性眼疾患が挙げられる。
【０１４８】
さらなる自己免疫の疾患、障害または状態としては、限定するものではないが、自己免疫甲状腺炎；甲状腺機能低下症、例としては、橋本甲状腺炎ならびに例えば、細胞媒介性および体液性甲状腺細胞毒性により特徴付けられる甲状腺炎；ＳＬＥ（例えば、循環および局所的に生成される免疫複合体によって多くの場合特徴付けられる）；グッドパスチャー症候群（例えば、抗基底膜抗体によって多くの場合特徴付けられる）；天疱瘡（例えば、表皮棘融解性抗体によって多くの場合特徴付けられる）；レセプター自己免疫、例えば、グレーブス病（例えば、甲状腺刺激ホルモンレセプターに対する抗体によって多くの場合特徴付けられる）、重症筋無力症（例えば、アセチルコリンレセプター抗体によって多くの場合特徴付けられる）など；インスリン耐性（例えば、インスリンレセプター抗体によって多くの場合特徴付けられる）；自己免疫溶血性貧血（例えば、抗体感受性の赤血球の食作用によって多くの場合特徴付けられる）；および自己免疫血小板減少性紫斑病（例えば、抗体感受性血小板の食作用によって多くの場合特徴付けられる）が挙げられる。
【０１４９】
さらなる自己免疫疾患、障害または状態としては、限定するものではないが、関節リウマチ（例えば、関節での免疫複合体によって多くの場合特徴付けられる）；抗コラーゲン抗体を伴う強皮症（例えば、核小体および他の核の抗体によって多くの場合特徴付けられる）；混合結合組織病（例えば、抽出可能な核抗原、例えば、リボ核タンパク質に対する抗体によって多くの場合特徴付けられる）；多発性筋炎／皮膚筋炎（例えば、非ヒストン抗核抗体によって多くの場合特徴付けられる）；悪性貧血（例えば、抗壁細胞、抗ミクロソーム、および抗内因子の抗体によって多くの場合特徴付けられる）；特発性アジソン病（例えば、体液性および細胞媒介性の副腎細胞毒性によって多くの場合特徴付けられる）；不妊（例えば、抗精子抗体によって多くの場合特徴付けられる）；糸球体腎炎（例えば、糸球体基底膜抗体または免疫複合体によって多くの場合特徴付けられる）；原発性糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症；水疱性類天疱瘡（例えば、ＩｇＧによっておよび基底膜での補体によって多くの場合特徴付けられる）；シェーグレン症候群（例えば、複数の組織抗体および／または特異的な非ヒストン抗核抗体（ＳＳ−Ｂ）によって多くの場合特徴付けられる）；糖尿病（例えば、細胞媒介性および体液性の島細胞抗体によって多くの場合特徴付けられる）；および喘息または嚢胞性線維症を伴うアドレナリン作動薬耐性を含む、アドレナリン作動薬耐性（例えば、βアドレナリン作動薬レセプター抗体によって多くの場合特徴付けられる）が挙げられる。
【０１５０】
なおさらなる自己免疫の疾患、障害または状態としては、限定するものではないが、慢性の活動性の肝炎（例えば、平滑筋抗体によって多くの場合特徴付けられる）；原発性胆汁性肝硬変（例えば、抗ミトコンドリア抗体によって多くの場合特徴付けられる）；他の内分泌腺不全（例えば、ある場合には特定の組織抗体によって特徴付けられる）；白斑（例えば、抗メラニン形成細胞抗体によって多くの場合特徴付けられる）；脈管炎（例えば、免疫グロブリンおよび血管壁における補体および／または低血清補体によって多くの場合特徴付けられる）；心筋梗塞後の状態（例えば、抗ミトコンドリア抗体によって多くの場合特徴付けられる）；開心術症候群（例えば、抗ミトコンドリア抗体によって多くの場合特徴付けられる）；蕁麻疹（例えば、ＩｇＥに対するＩｇＧ抗体およびＩｇＭ抗体によって多くの場合特徴付けられる）；アトピー性皮膚炎（例えば、ＩｇＥに対するＩｇＧおよびＩｇＭ抗体によって多くの場合特徴付けられる）；喘息（例えば、ＩｇＥに対するＩｇＧおよびＩｇＭ抗体によって多くの場合特徴付けられる）；炎症性筋障害；ならびに他の炎症、肉芽腫、変性および萎縮性の障害が挙げられる。
【０１５１】
他の実施形態では、本発明のＧｌｙＲＳ組成物は、細胞の増殖および／または生存を調節するため、従って、細胞の増殖および／または生存における異常によって特徴付けられる、疾患、障害または状態を処置または予防するために、用いられ得る。例えば、ある実施形態では、このＧｌｙＲＳ組成物は、アポトーシスを調節するため、および／または異常なアポトーシスに関連する疾患もしくは状態を処置するために用いられ得る。アポトーシスとは、プログラムされた細胞死として公知の細胞シグナル伝達カスケードを記述するために用いられる用語である。種々の治療適用がアポトーシスを誘発する分子（例えば、癌）、およびアポトーシスを阻害する分子（例えば、発作、心筋梗塞、敗血症など）について存在する。アポトーシスは、当該分野で公知でありかつ利用可能な任意の多数の利用可能な技術によってモニターされ得、この技術としては、例えば、ＤＮＡの断片化、膜の非対称の変化、アポトーシスのカスパーゼの活性化ならびに／またはチトクロムＣおよびＡＩＦの放出を測定するアッセイが挙げられる。
【０１５２】
細胞生存の増大、またはアポトーシスの阻害に関連する例示的な疾患としては、限定するものではないが、癌（例えば、濾胞性リンパ腫、癌腫およびホルモン依存性の腫瘍、例としては、限定するものではないが、結腸癌、心臓腫瘍、膵臓癌、黒色腫、網膜芽細胞腫、グリア芽細胞腫、肺癌、腸癌、精巣癌、胃癌、神経芽細胞腫、粘液腫、筋腫、リンパ腫、内皮腫、骨芽細胞腫、巨骨細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、腺腫、乳癌、前立腺癌、カポジ肉腫および卵巣癌）；自己免疫障害（例えば、多発性硬化症、シェーグレン症候群、グレーブス病、橋本甲状腺炎、自己免疫糖尿病、胆汁性肝硬変、ベーチェット病、クローン病、多発性筋炎、全身性エリテマトーデスおよび免疫関連糸球体腎炎、自己免疫胃炎、自己免疫血小板減少性紫斑病および関節リウマチ）、ウイルス感染（例えば、ヘルペスウイルス、ポックスウイルスおよびアデノウイルス）、炎症、宿主対移植片病（急性および／または慢性）、急性移植片拒絶、および慢性移植片拒絶が挙げられる。
【０１５３】
細胞生存の増大に関連するさらなる例示的な疾患または状態としては、限定するものではないが、悪性腫瘍および関連の障害、例えば白血病（例としては、急性白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、例としては、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病を含む））、および慢性白血病（例えば、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ球性白血病）、骨髄異形成症候群、真性赤血球増加症、リンパ腫（例えば、ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病および固形腫瘍、例としては、限定するものではないが、肉腫および癌腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、滑液腫瘍、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌腫、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、肝細胞癌腫、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫（セミノーマ）、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、神経膠星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫の進行および／または転移が挙げられる。
【０１５４】
アポトーシスの増大に関連する例示的な疾患としては、限定するものではないが、ＡＩＤＳ（例えば、ＨＩＶ誘発性神経障害およびＨＩＶ脳炎）、神経変性障害（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、小脳変性および脳腫瘍または以前に関連した疾患）、自己免疫障害、例えば、多発性硬化症、シェーグレン症候群、グレーブス病、橋本甲状腺炎、自己免疫糖尿病、胆汁性肝硬変、ベーチェット病（Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、クローン病、多発性筋炎、全身性エリテマトーデス、免疫関連糸球体腎炎、自己免疫胃炎、血小板減少性紫斑病、関節リウマチ、脊髄形成異常症候群（例えば、再生不良性貧血）、移植片対宿主病（急性および／または慢性）、虚血性傷害（心筋梗塞、発作および再灌流傷害によって生じるものなど）、肝臓傷害または疾患（例えば、肝炎関連肝臓傷害、肝硬変、虚血／再灌流傷害、胆汁うっ滞（ｃｈｏｌｅｓｔｏｓｉｓ）（胆管傷害）および肝臓癌）、毒物誘発性肝臓疾患（アルコールによって引き起こされるようなもの）、敗血症性ショック、潰瘍性大腸炎、悪液質および食欲不振が挙げられる。
【０１５５】
なおさらなる実施形態では、本発明の組成物は、ニューロン／神経学的な疾患または障害の処置に有用であり得、その例示的な例としては、パーキンソン病、アルツハイマー病、ピック病、クロイツフェルト・ヤコブ病、ハンチントン舞踏病、交代性片麻痺、筋萎縮性側索硬化症、運動失調、脳性麻痺、慢性疲労性症候群、慢性疼痛症候群、先天性神経学的異常、脳神経疾患、譫妄、認知症、脱髄疾患、自律神経障害、てんかん、頭痛、ハンチントン病、水頭症、髄膜炎、運動障害、筋疾患、神経系腫瘍、神経皮膚症候群、神経変性性疾患、神経毒性症候群、眼球運動障害、末梢神経系障害、下垂体障害、孔脳症、レット症候群、睡眠障害、脊髄障害、脳卒中、シデナム舞踏病、トゥレット・シンドローム、神経系の外傷および損傷などが挙げられる。
【０１５６】
さらに、追加の実施形態は、代謝性障害、例えば、糖尿病、肥満、コレステロールレベルの調節、副腎白質萎縮症、クラッベ病（球様細胞白質萎縮症）、異染性白質萎縮症、アレクサンダー病、カナバン病（海綿状白質萎縮症）、ペリツェウス・メルツバッハー病、コケーン症候群、ハーラー病、ロウ症候群、リー病、ウイルソン病、ハレルフォルデン・スパッツ病、テイ・サックス病などの処置における本発明の組成物の使用に関する。代謝性プロセスを調節するのにおける本発明の組成物の有用性は、当該分野で公知でありかつ利用可能な任意の種々の技術を用いてモニターされ得、この技術としては、例えば、脂肪細胞の脂質生合成または脂肪細胞の脂肪分解を測定するアッセイが挙げられる。
【０１５７】
本発明のさらに具体的な実施形態では、本発明のＧｌｙＲＳ組成物は、Ｇプロテインカップリングレセプター（ＧＰＣＲ）を調節するために用いられる。このＧＰＣＲレセプターファミリーは、レセプターにカップリングされるＧタンパク質に基づく３つの主なグループから構成される（Ｇｓ、ＧｉおよびＧｑ）。このＧｓグループはサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）のアデニレートサイクラーゼ産生の活性と連関しており、ＧｉグループはｃＡＭＰのアデニルシクラーゼ産生の阻害と連関している。従って、本発明のＧｌｙＲＳ組成物での処置の際に細胞内のｃＡＭＰの蓄積をモニターするためのアッセイを用いて、Ｇプロテインレセプターの２つの主なグループの活性化をモニターしてもよい。
【０１５８】
他の具体的な実施形態では、本発明のＧｌｙＲＳ組成物を用いて、例えば、ｖｉａキナーゼ経路（例えば、Ａｋｔ、Ｅｒｋ１／２など）を介して細胞性のシグナル伝達を調節してもよい。細胞シグナル伝達は、任意の多数の周知のアッセイを用いてモニターされ得る。例えば、一般的な細胞シグナル伝達事象の誘導は、種々の標的タンパク質の変更されたリン酸化パターンを通じてモニターされ得る。従って、ＧｌｙＲＳフラグメントによる細胞の処置に応答した細胞シグナル伝達活性の検出は、別個の生物学的効果の指標として機能する。このアッセイで用いられる標的タンパク質は、主要な細胞シグナル伝達カスケードの重要な構成要素を包含するように選択されてもよく、それによって細胞シグナル伝達の展望およびその治療的関連性の広範な図式が得られる。一般には、このようなアッセイは、ＧｌｙＲＳポリペプチドでの細胞処理、続いて標的タンパク質のリン酸化（活性化）型を特異的に検出する抗体での免疫検出を包含する。
【０１５９】
治療上関連する細胞シグナル伝達事象をモニタリングするために用いられる例示的な標的タンパク質としては、限定するものではないが以下が挙げられ得る：ｐ３８  ＭＡＰＫ（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ；細胞性のストレスおよび炎症性サイトカインにより活性化される；細胞分化およびアポトーシスに関与する）；ＳＡＰＫ／ＪＮＫ（ストレス活性化プロテインキナーゼ／Ｊｕｎ−アミノ末端キナーゼ；細胞性のストレスおよび炎症性サイトカインによって活性化される）；Ｅｒｋ１／２、ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ  Ｅｒｋ１およびＥｒｋ２；広範な種々の細胞外シグナルによって活性化される；細胞の増殖および分化の調節に関与する）；ならびにＡｋｔ（インスリンおよび種々の増殖因子または生存因子によって活性化される；アポトーシスの阻害、グリコーゲン合成の調節、細胞周期調節および細胞増殖に関与する）。チロシン残基の一般的なリン酸化はまた、リン酸化によって媒介される細胞シグナル伝達における変化の一般的な指標としてモニターされ得る。
【０１６０】
当然ながら、他のクラスのタンパク質、例えば、細胞接着分子（例えば、カドヘリン、インテグリン、クラウディン、カテニン、セレクチンなど）および／またはイオンチャネルタンパク質はまた、本発明の組成物によって媒介される細胞性事象または活性をモニタリングするためにアッセイされ得ることが理解される。
【０１６１】
本明細書に引用される全ての刊行物および特許出願は、あたかも各々の個々の刊行物または特許出願が参照によって援用されることが詳細にかつ個々に示されるかのように、参照によって本明細書に援用される。
【０１６２】
前述の発明は、理解を明確にする目的のための例示および例によってある程度詳細に記載してきたが、特定の変化および改変が添付の特許請求の範囲の趣旨からも範囲からも逸脱することなく、本発明に対してなされ得ることは、本発明の技術に照らして当業者に容易に明らかである。以下の実施例は、例示のためだけに提供するものであり、限定ではない。当業者は、本質的に類似の結果を生じるように変化または改変され得る種々の重要でないパラメーターを容易に認識するであろう。
【実施例】
【０１６３】
（実施例１）
ヒトグリシル−ｔＲＮＡ合成酵素（ＧｌｙＲＳ）フラグメントの生成
配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する全長組換えヒトＧｌｙＲＳは、ニッケルＩＭＡＣクロマトグラフィーを用いてＥ．ｃｏｌｉから発現され、精製された。制御されたタンパク質分解によるＧｌｙＲＳのフラグメントを生成するため、全長タンパク質を１６７ｎＭのヒト好中球エラスターゼを用いて３０分間処理し、その後にＳＤＳ−ＰＡＧＥによってフラグメントを分離した（図１Ａ〜Ｄ）。
【０１６４】
（実施例２）
ＧｌｙＲＳフラグメントは、ＡｋｔおよびＧｉ−ＧＰＣＲを内皮細胞中で活性化する。
【０１６５】
ＧｌｙＲＳフラグメントのプールは、４μｇの全長組換え体ＧｌｙＲＳに対して２５ｎｇの好中球エラスターゼを添加することによって３７℃で３０分間生成した。反応は、１０倍過剰のプロテアーゼ中のα１−アンチトリプシン（Ｓｅｒｐｉｎ  Ａ１）の添加によって停止した。ウシの大動脈内皮細胞（ｂＡＥＣ）を、好中球エラスターゼで未切断かまたは切断されている５０ｎＭの全長ＧｌｙＲＳタンパク質のプールを用いて処置した。細胞をＧｌｙＲＳフラグメントとともに１０分間インキュベートし、回収して、シグナル伝達分子Ａｋｔのリン酸化（活性化）型のみを特異的に認識する抗体によるウエスタンブロッティングに供した。この処置によって、リン酸化を介した、Ａｋｔの強力な再現性の活性化が生じた（図２Ａ）。この効果は、アポトーシスの阻害、グリコーゲン合成の調節、細胞周期調節、および細胞増殖におけるＡｋｔの役割に起因して重要である。
【０１６６】
好中球エラスターゼを用いる切断によって生成したＧｌｙＲＳフラグメントのプールが、内皮細胞上でＧプロテインカップリングレセプターを活性化する能力も評価した。ＧＰＣＲレセプターファミリーは、このレセプターにカップリングされるＧプロテインに基づいて３つの主なグループからなる（Ｇｓ、ＧｉおよびＧｑ）。このＧｓグループはサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）のアデニル酸シクラーゼ産生の活性と連関しており、ＧｉグループはｃＡＭＰのアデニル酸シクラーゼ産生の阻害と連関している。従って、ＧｌｙＲＳフラグメントでの処置に応答した内皮細胞におけるｃＡＭＰの蓄積（Ｇｓ−ＧＰＣＲシグナル伝達）、ならびにそのフラグメントがｃＡＭＰにおけるフォルスコリン誘発性の増大を阻害する能力を評価した（Ｇｉ−ＧＰＣＲ）。２５ｎＭおよび１００ｎＭの切断されたＧｌｙＲＳフラグメントでの内皮細胞の処置の際に、ＰＢＳ単独よりも２５ｎＭおよび１００ｎＭの未切断のＧｌｙＲＳ（約１０％）での処置に比較した場合、フォルスコリン刺激性のｃＡＭＰ産生の阻害における有意な増大が観察され（それぞれ、約３５％および約４０％、図２Ｂ）、このことはＧｉ−ＧＰＣＲの活性化を示している。未切断または切断ＧｌｙＲＳのいずれかを用いる内皮細胞の処置の際にｃＡＭＰ産生の刺激はなかった。
【０１６７】
（実施例３）
ＧｌｙＲＳフラグメントは、単球細胞においてＥｒｋ１／２（ｐ４４／４２ＭＡＰＫ）シグナル伝達を活性化する。
【０１６８】
ＧｌｙＲＳフラグメントのプールは、４μｇの全長組換え体ＧｌｙＲＳに対して２５ｎｇの好中球エラスターゼを添加することによって３７℃で３０分間生成した。反応は、１０倍過剰のプロテアーゼ中のα１−アンチトリプシン（Ｓｅｒｐｉｎ  Ａ１）の添加によって停止した。単球（ＴＨＰ−１）を、好中球エラスターゼで未切断かまたは切断されている５０ｎＭの全長ＧｌｙＲＳタンパク質のプールを用いて処置した。細胞をＧｌｙＲＳフラグメントとともに、０．５分、２分、５分、１０分、３０分および６０分間インキュベートし、回収して、シグナル伝達分子Ｅｒｋ１／２（マイトジェン活性化プロテインキナーゼＥｒｋ１およびＥｒｋ２）のリン酸化（活性化）型のみを特異的に認識する抗体によるウエスタンブロッティングに供した。この処置によって、リン酸化を介した、Ｅｒｋ１／２の強力な再現性の活性化が生じ（図３）、これは、処置の２分後に最強であった。この効果は、Ｅｒｋ１／２が広範な種々の細胞外シグナルによって活性化され、細胞の増殖および分化の調節において重要な役割を果たすという事実に起因して重要である。
【０１６９】
（実施例４）
ＧｌｙＲＳ上の好中球エラスターゼ切断部位の特定
好中球エラスターゼを用いた切断によって生成されたフラグメント（図１Ｄ）を、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて分析して各々のフラグメントについて正確な質量を決定した。さらに個々のフラグメントをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから切り出して、ゲル内トリプシン消化に、続いてＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析に供して、全長タンパク質の一部を特定し、それからフラグメントを生成して、好中球エラスターゼに寄与し得る非トリプシン切断部位を特定した。
【０１７０】
これらのペプチドの境界線の特定は表１にまとめられる；太字の残基は、非トリプシン切断部位であって、これによって、そのフラグメントのエラスターゼの正確な切断部位（従って、正確なＮ末端またはＣ末端）が特定されていることが示される。
【０１７１】
【表１−２】
0006025889.tif 000003
図４Ａは、ＧｌｙＲＳペプチド境界域を特定するための上記のプロセスの概略を示す。図４Ｂは全長ヒトＧｌｙＲＳ二量体の結晶構造内のアミノ酸２１４〜４３８に相当する、ＧｌｙＲＳフラグメントＧ６の構造の図を示す。
【０１７２】
（実施例５）
ＧｌｙＲＳフラグメントＧ６は内皮細胞に対して結合する
全長ＧｌｙＲＳおよびＧｌｙＲＳフラグメントを、ｂＡＥＣ細胞上で、結合アッセイで用いた。細胞を９６ウェルのプレート中に、３０，０００細胞／ウェルで一晩分けた。翌日、培地を取り出して、５０ｕｌ／ウェルのＺ−Ｆｉｘを各々のウェルに添加した。細胞を室温で１５分間インキュベートした。ウェルを吸引して、１×ＰＢＳＴを用いて１回洗浄した。細胞を５０ｕｌ／ウェルの１％ＢＳＡ／ＰＢＳを用いて１〜２時間室温でブロックした。そのブロッキング溶液を細胞から取り除き、１％のＢＳＡ／ＰＢＳ中で希釈したタンパク質サンプルをウェルに添加した。サンプルを室温で１時間インキュベートした。ウェルを１×ＰＢＳＴ中で１回洗浄した。抗６ｘ−Ｈｉｓ  ＨＲＰ（Ｒ＆Ｄ  ＃ＭＡＢ０５０Ｈ）を、１％のＢＳＡ／ＰＢＳ中で１：５００希釈された５０ｕｌ／ウェルで添加した。抗体のインキュベーションは室温で３０分間継続した。ウェルを１×ＰＢＳＴ中で３回洗浄した。タンパク質結合は、５０ｕｌ／ウェルの１：１希釈のＴＭＢ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  ＃  ３４０２１）を用いて検出した。その反応は、５０ｕｌ／ウェルの２Ｍ硫酸の添加によってクエンチし、吸光度をプレートリーダー上で、４０５ｎｍで読んだ。
【０１７３】
本研究の結果、図５に示されるとおり、アミノ酸２１４〜４３８に相当するＧｌｙＲＳフラグメントＧ６が内皮細胞に結合することが示される。
【０１７４】
（実施例６）
Ａ．ＧｌｙＲＳフラグメントＧ６はＴＨＰ−１単球を遊走し、百日咳毒素によって阻害される。
【０１７５】
ＴＨＰ−１単球細胞は、１ウェルあたり６×１０５個の細胞で、完全培地中で培養された。細胞を無血清培地で洗浄して、Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭ（１ｍｇ／ｍｌ）を２ｕｇ／ｍｌの最終濃度で用いてインキュベートした。細胞をインキュベーターに３０分間戻した。細胞を再度洗浄して、細胞培養皿の上部のチャンバ中に６×１０６細胞／ｍｌの濃度でプレートした。コントロールのケモカインおよびフラグメントＧ６（２００ｎＭ）を下部のチャンバに８０分間〜２時間添加した。細胞を下のチャンバからピペッティングの上下によって収集した。蛍光を５３０ｎｍのカットオフによってＥｘ４８５／Ｅｍ５３８で、プレートリーダー上で読んだ。
【０１７６】
本研究の結果は、図６に示されるとおり、Ｇ６が単球細胞遊走に影響することを示す。
【０１７７】
Ｂ．ＧｌｙＲＳフラグメントＧ６は、選択ケモカインレセプターを通じてシグナル伝達する。
【０１７８】
ケモカインレセプタースクリーニングは、補完と呼ばれる技術を用いて相同な非画像化アッセイフォーマットでＧＰＣＲの活性化をモニターするＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ  β−Ａｒｒｅｓｔｉｎアッセイ（ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて行った。この技術は、機能的レポーターとしてβガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）を用いる酵素フラグメント補完（ｅｎｚｙｍｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）（ＥＦＣ）アッセイを利用する。この酵素は、細胞中で融合タンパク質として発現される２つの相補的部位に分けられる。酵素アクセプター（Ｅｎｚｙｍｅ  Ａｃｃｅｐｔｏｒ）（ＥＡ）をβ−アレスチンに融合して、ＰｒｏＬｉｎｋドナーペプチドを目的のＧＰＣＲに融合する。ＧＰＣＲ刺激の際、β−アレスチンを脱感作のためにレセプターに対して補充し、β−Ｇａｌの２つのフラグメントを一緒にして、補完を可能にした。これによって、化学発光基質を変換し、かつ標準的なマイクロプレートリーダーで検出可能なアウトプットシグナルを生成し得る活性な酵素を生成する。ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ細胞株を標準的な手順に従ってＴ２５フラスコ中の凍結ストックから増殖させ、アッセイの前に選択的増殖培地で維持した。一旦その細胞が健常であり、かつ正常に増殖していることが確認されれば、細胞を、トリプシンを含まない細胞解離緩衝液を用いてフラスコから継代し、フラグメントＧ６プロファイリングのためにホワイト・ウォールの透明丸底３８４ウェルマイクロプレート中に播種した。プロファイリングのために、細胞を、２０μＬの総容積中で１ウェルあたり５０００個の細胞の密度で播種して、結合させ、そしてフラグメントＧ６の添加の前に一晩回収した。細胞を５００ｎＭのフラグメントＧ６の存在下で３７℃で９０分間インキュベートした。１５個のケモカインレセプター細胞株を最終濃度５００ｎＭで試験した。コントロールのウェルは、５０％のグリセロール、２ｍＭのＤＴＴ、０．５×ＰＢＳから構成される１％のビヒクルを含んだ。
【０１７９】
本研究の結果によって、図６（挿入）に示すとおり、ＧｌｙＲＳフラグメントＧ６が選択ケモカインレセプターを通じてシグナル伝達することが示される。
【０１８０】
（実施例７）
フラグメントＧ６は、巨核球前駆体のコロニー形成に影響する。
【０１８１】
本研究は、ヒト巨核球前駆体増殖に対するフラグメントＧ６（５００ｎＭ）の効果を評価した。巨核球のクローン原性前駆体（ＣＦＵ−Ｍｋ）系列を、サイトカインの最適の独自濃度を補充した無血清コラーゲンベースの培地ＭｅｇａＣｕｌｔ−Ｃ（登録商標）４９５０中で評価した。正常なヒト骨髄低密度細胞（Ｌｏｎｚａ  ｌｏｔ  ＃０７Ｂ２１１９５）をアッセイに必要になるまで−１５２℃で保管した。実験の日に、細胞を３７℃で急速に解凍し、バイアルの内容物を、２％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有する１０ｍｌのＩｓｃｏｖｅの改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）中に希釈して、遠心分離（１２００ｒ．ｐ．ｍ．１０分間、室温）によって洗浄した。上清を廃棄して、細胞ペレットを、２％のＦＢＳを含有する既知容積のＩＭＤＭに再懸濁した。フラグメントＧ６を、サイトカインｒｈＴｐｏ、ｒｈＩＬ−３、およびｒｈＩＬ−６を最適の独自濃度で補充した無血清コラーゲンベースの培地ＭｅｇａＣｕｌｔ−Ｃ（登録商標）４９５０の試験管に添加した。緩衝液コントロールの培養物（試験タンパク質は含まないが、等価な濃度の透析された５０％グリセロール／０．５×ＰＢＳ／２ｍＭ  ＤＴＴ緩衝液を含む）もまた示された。次いで骨髄細胞を培地の各々の試験管に添加して、スライド１つあたり１×１０５個の細胞の最終濃度を得る。次いで、ウシコラーゲンを添加し、試験管をボルテックスして、内容物を三連の二重チャンバスライドに分けた。全ての培養物を１０〜１２日間３７℃で、５％のＣＯ２でインキュベートした。インキュベーション後、培養物を、スライド上の脱水および固定の前にコロニー形成のために顕微鏡的に評価した。ＧＰＩＩａ／ＩＩＩｂ（ＣＤ４１）発現を検出するための抗体染色プロトコールを用いて、スライド上のコロニーを、アルカルホスファターゼ検出システムを用いて染色した。コロニー数をスコアリングして、評価した。コロニーを大きさおよび形態に基づいて以下の範疇に分けた；ＣＦＵ−Ｍｋ小（２〜２０）、ＣＦＵ−Ｍｋ中（２１〜４９）、ＣＦＵ−Ｍｋ大（＞５０）。
【０１８２】
図７Ａは、ＣＤ４１＋コロニーの代表的な染色を示す。図７Ｂは、小、中および大のコロニーの定量の結果を示す。本研究の結果によって、ＧｌｙＲＳフラグメントＧ６が巨核球前駆体細胞のコロニー形成に影響することが示される。
【０１８３】
（実施例８）
フラグメントＧ６およびＧ６−３は単球を活性化する。
【０１８４】
Ａ．ＧｌｙＲＳフラグメントは、単球においてＣＤ７１マーカーの上方制御を誘発する。
【０１８５】
末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ’ｓ）は、正常な血液ドナーから単離された。１．５×１０６個のＰＢＭＣを２００ｎＭの用量のＧｌｙＲＳフラグメントＧ６−３（残基３６７〜４３８からなる）を用いて２４時間処理した。ＰＢＭＣは、１ｕｇ／ｍＬの植物レクチン植物性血球凝集素（ＰＨＡ）、および０．１ｕｇ／ｍＬのタンパク質毒素ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌエンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）を陽性のコントロールとして用いて処理した。図８に示されるとおり、ＣＤ７１増殖マーカーの上方制御が、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎの抗ＣＤ７１−ＦＩＴＣ抗体での染色およびフローサイトメトリーによる分析後にＧ６−３処理した単球で見出された。同じサンプルのゲートしたリンパ球集団でＣＤ７１の上方制御の有意な増大はなかった。
【０１８６】
従って、ここで本発明者らによって、Ｇ６−３がＰＢＭＣ混合物中で単球を活性化する細胞型特異的な能力を有することが示された。
【０１８７】
Ｂ．ＧｌｙＲＳフラグメントは、単球においてＣＤ８０マーカーの上方制御を誘発する。
【０１８８】
末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）を正常な血液ドナーから単離した。１．５×１０６個のＰＢＭＣを２００ｎＭの用量のＧｌｙＲＳフラグメントＧ６（残基２１４〜４３８からなる）およびＧ６−３（３６７〜４３８）を用いて２４時間処理した。ＰＢＭＣを、１ｕｇ／ｍＬの植物レシチン植物性血球凝集素（ＰＨＡ）、および０．１ｕｇ／ｍＬのタンパク質毒素ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌエンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）を陽性のコントロールとして用いて処理した。図９に示されるとおり、ＣＤ８０活性化マーカーの上方制御が、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎの抗ＣＤ８０−ＦＩＴＣ抗体での染色およびフローサイトメトリーによる分析後にＧ６−３処理した単球で見出された。同じサンプルのゲートしたリンパ球集団でＣＤ８０の上方制御の有意な増大はなかった。
【０１８９】
この研究の結果によって、２つのＧｌｙＲＳフラグメントＧ６およびＧ６−３がＰＢＭＣ混合物中において細胞型特異的な方式で単球を活性化することが示される。
【０１９０】
（実施例９）
全長ＧｌｙＲＳおよびＧｌｙＲＳのフラグメントＧ６は、ＰＢＭＣからのサイトカインの分泌を誘発する。
【０１９１】
全長ＧｌｙＲＳ（１００ｎＭ）またはＧｌｙＲＳのフラグメント（残基２１４〜４３８）、Ｇ６（１００ｎＭ）を、１×１０６個の末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）とともに４時間インキュベートした。４時間のインキュベーション後、上清を回収して、液体窒素中で急速凍結した。次いでサンプルを多重サイトカイン分析（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）によって分析した。上清を２７個の別個のサイトカインについて測定して、緩衝液処理したＰＢＭＣ上清に比較した倍数の変化としてグラフ化した。エラーバーは２つの生物学的な複製の代表である。図１０に示されるとおり、全長ＧｌｙＲＳおよびＧ６フラグメントの両方で、ＰＢＳで処理した細胞上の多数のサイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ１−β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０、ＭＩＰ１−α、ＭＩＰ−１β、ＧＲＯ−α、ＭＣＰ−１、およびＩＬ−１ｒａ）の大きい刺激が示された。
【０１９２】
本研究の結果によって、本発明のＧｌｙＲＳポリペプチドが治療関連の多数のサイトカインの分泌を誘発し得ることが示される。
【０１９３】
（実施例１０）
ＧｌｙＲＳフラグメントＧ６およびＧ６−３は、ＲＡＷ２６４．７マウス白血病マクロファージ細胞の遊走を誘発する。
【０１９４】
インビトロでの細胞遊走を評価するために、ポリカーボネート膜（５μｍの細孔サイズ、Ｃｏｓｔａｒ）を備える２４ウェル  Ｔｒａｎｓｗｅｌｌチャンバを、ＰＢＳ中の０．５ｍｇ／ｍｌのゼラチンでコーティングして、風乾させた。剥離したＲＡＷ２６４．７細胞（マウス単球／マクロファージ細胞株）を、新鮮なＤＭＥＭを用いて１回洗浄し、０．１％ＢＳＡ／ＤＭＥＭを含む２×１０７細胞／ｍｌに懸濁した。ＧｌｙＲＳフラグメントを、０．１％のＢＳＡ／ＤＭＥＭを用いて図１１に示されるような種々の濃度に希釈した。ＲＡＷ細胞を上部チャンバ中に２×１０６細胞／１００ｕｌ／ウェルにプレートした。下のチャンバを、ＧｌｙＲＳフラグメントを用いて１ウェルあたり５００ｕｌで充てんした。２４時間、３７℃の遊走後、カルセイン（ｃａｌｃｅｉｎ）ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をセルインジケーター（ｃｅｌｌ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）として最終８ｕＭに下部のチャンバに添加した。３０分後、移動しない細胞をＴｒａｎｓｗｅｌｌ膜の上面から綿棒（ｃｏｔｔｏｎ  ｓｗａｂ）を用いて除去した。下部の膜表面上の遊走性の細胞を蛍光顕微鏡下で、高倍率視野でカウントした。
【０１９５】
本研究の結果、図１１で示されるとおり、Ｇ６およびＧ６−３は、マクロファージ細胞遊走を誘発することが示される。
【０１９６】
（実施例１１）
ＧｌｙＲＳフラグメントＧ６はＨＬ−６０前骨髄球性白血病細胞の遊走を誘発する。
【０１９７】
ＨＬ６０細胞（ヒト前骨髄球性白血病細胞株）を０．１％ＢＳＡ−ＲＰＭＩを用いて２回洗浄した。カルセインＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、８ｕＭで０．１％ＢＳＡ−ＲＰＭＩで添加して、ＨＬ６０細胞を３７℃で３時間インキュベートした。１回以上の洗浄後、細胞を０．１％ＢＳＡ−ＲＰＭＩを用いて１×１０７細胞／ｍｌに懸濁した。ＧＲＳまたはそのフラグメントを、０．１％のＢＳＡ−ＲＰＭＩを用いて図１１に示されるように種々の濃度に希釈した。ＨＬ６０細胞を、ポリカーボネート膜（５ｕｍの細孔サイズ、Ｃｏｓｔａｒ）を備えるＴｒａｎｓｗｅｌｌ  Ｐｅｒｍｅａｂｌｅ  Ｓｕｐｐｏｒｔの上部チャンバに１×１０６細胞／１００ｕｌ／ウェルで入れた。下部のチャンバをＧＲＳまたはフラグメントを用いて１ウェルあたり５００ｕｌで充填した。３０分、３７℃の遊走後、下部チャンバ中の遊走した細胞を、Ｅｘ４８５／Ｅｍ５３８で蛍光リーディングによって決定した。
【０１９８】
本研究の結果、図１２で示されるとおり、Ｇ６は、前骨髄球性白血病細胞の遊走を誘発し得ることが示される。
【０１９９】
（実施例１２）
ＲＡＷ２６４．７マウス白血病マクロファージ細胞由来の全長ＧｌｙＲＳおよびフラグメントの分泌
Ａ．ＲＡＷ２６３．７細胞由来の全長ＧｌｙＲＳの内因性の分泌
ＲＡＷ細胞（マウス単球／マクロファージ細胞株）をコンフルエンスになるまで６ウェルの組織培養皿中で増殖した。ＰＢＳを用いて２回洗浄した後、細胞を無血清ＤＭＥＭ（２ｍｌ／フラスコ）単独で、またはＴＮＦαもしくはＩＦＮ−γを補充したＤＭＥＭで４８時間インキュベートした。馴化培地を収集して、２０，０００×Ｇで３０分間、４℃で遠心分離して、細胞の細片を除去した。その上清を、ＴＣＡを用いて１０％の濃度で２０分間沈殿させた。アセトン洗浄の後、タンパク質ペレットをＳＤＳ−ＰＡＧＥのためにＳＤＳ−サンプル緩衝液中に溶解した。ヒトＧＲＳに対するマウスポリクローナル抗体（Ａｂｎｏｖａ）は、細胞溶解物または培地の両方でＧｌｙＲＳを検出し、このことはマウスマクロファージ由来の全長ＧｌｙＲＳの内因性の分泌を示している（図１３）。
【０２００】
Ｂ．ＧｌｙＲＳの全長およびフラグメントは、リポポリサッカライドでの処理の際、ＲＡＷ２６４．７マウス白血病マクロファージから分泌される。
【０２０１】
ＲＡＷ２６４．７細胞（マウス単球／マクロファージ細胞株）を、コンフルエンスになるまで６ウェルの組織培養皿中で増殖した。ＰＢＳを用いて２回洗浄した後、細胞を無血清ＤＭＥＭ（２ｍｌ／フラスコ）に加えてＬＰＳの１０ｎｇ／ｍｌで４８時間インキュベートした。馴化培地を収集して、２０，０００×Ｇで３０分間、４℃で遠心分離して、細胞の細片を除去した。その上清を、ＴＣＡを用いて１０％の濃度で２０分間沈殿させた。アセトン洗浄の後、タンパク質ペレットをＳＤＳ−ＰＡＧＥのためにＳＤＳ−サンプル緩衝液中に溶解した。ヒトＧＲＳに対するマウスポリクローナル抗体（Ａｂｎｏｖａ）は、細胞溶解物または培地の両方でＧｌｙＲＳを検出した。ＬＰＳ処理の際、ＧｌｙＲＳの特異的なフラグメントは、分泌された培地中では観察されるが細胞溶解物中では観察されず、このことは、ＬＰＳ処置の際のこれらのＧｌｙＲＳフラグメントの作製および分泌を示している（図１４）。
【０２０２】
Ｃ．ＬＰＳ処理したマウスマクロファージ細胞から分泌されたＧｌｙＲＳフラグメントのＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる特定
ＲＡＷ２４６．７細胞（マウス単球／マクロファージ細胞株）をコンフルエンスになるまでＴ２５フラスコ中で増殖した。Ｂで、上記で概説された条件を用いて、細胞を、ＬＰＳを用いてＧｌｙＲＳフラグメントを分泌するように誘導した。馴化培地を収集して、２０，０００×Ｇで３０分間、４℃で遠心分離して、細胞の細片を除去した。その上清（ＣＭ）を、ＴＣＡを用いて１０％の濃度で２０分間沈殿させた。アセトン洗浄の後、タンパク質ペレットをＳＤＳ−ＰＡＧＥのためにＳＤＳ−サンプル緩衝液中に溶解した。個々のフラグメントを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから切り出して、ゲル中でトリプシン消化に、続いてＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析に供して、全長タンパク質（これからフラグメントが生成された）の一部を特定した（図１５）。約４０〜５０ｋＤａのフラグメントから特定されたペプチドは、タンパク質の触媒性ドメイン内に位置し（図１５、１６Ａを参照のこと）、理論的な分子量の算出に基づいており、このフラグメントはＧｌｙＲＳの約２６５〜６８５由来のアミノ酸残基に相当するＮ末端で短縮されたタンパク質に相当する可能性が高いことが示される。約１５ｋＤａのフラグメントから特定されたペプチドは、タンパク質のＣ末端内に位置し（図１５、１６Ｂを参照のこと）、理論的な分子量の算出に基づいており、このフラグメントはＧｌｙＲＳの約４８３〜６８５由来のアミノ酸残基に相当するタンパク質のＣ末端に相当する可能性が高いことが示される。
【０２０３】
注記されるとおり、上記の開示は、記述的、実例的、かつ例示的であり、以下の添付の特許請求の範囲によって規定される範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【０２０４】
上記の種々の実施形態は、さらなる実施形態を提供するために組み合わされ得る。本明細書中で言及されるか、および／またはＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｄａｔａ  Ｓｈｅｅｔに列挙される全ての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物は、その全体が参照によって本明細書に援用される。この実施形態の局面は、必要に応じて、種々の特許、出願および刊行物の概念を使用して、さらなる実施形態を提供するように改変され得る。
【０２０５】
これらのおよび他の変更は、上記で詳述される説明に照らして実施形態に対してなされ得る。一般には、以下の特許請求の範囲では、用いられる用語は、明細書および特許請求の範囲に開示される特定の実施形態に対して特許請求の範囲を限定すると解釈されるべきではなく、このような特許請求の範囲が権利を有する等価物の全範囲に沿って全ての可能な実施形態を含むと解釈されるべきである。従って、特許請求の範囲は本開示によって限定されない。
【図１Ｂ】
0006025889.tif 000004
【図１Ｃ】
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【図４−３】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１６】
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【図１Ａ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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