(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで患者の細胞または組織における膜結合転写因子ペプチダーゼ、部位１（ＭＢＴＰＳ１）ポリヌクレオチドの機能および／または発現をアップレギュレートする方法において使用するための２１〜３０ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、
前記方法は、配列番号２を有する膜結合転写因子ペプチダーゼ、部位１（ＭＢＴＰＳ１）ポリヌクレオチドの天然アンチセンスポリヌクレオチドの領域を標的とする前記アンチセンスオリゴヌクレオチドに、前記細胞または組織を接触させ、それによって、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで患者の細胞または組織における膜結合転写因子ペプチダーゼ、部位１（ＭＢＴＰＳ１）ポリヌクレオチドの機能および／または発現をアップレギュレートすることを含み、
膜結合転写因子ペプチダーゼ、部位１（ＭＢＴＰＳ１）の発現および／または機能が対照と比較してｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで増大し、
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号４に示されるオリゴヌクレオチド配列を含む、
アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの修飾された糖部分、少なくとも１つの修飾されたヌクレオシド間結合、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドおよびそれらの組み合わせから選択される１以上の修飾を含む、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
１以上の修飾が、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾糖部分、２’−メトキシ修飾糖部分、２’−Ｏ−アルキル修飾糖部分、二環性糖部分およびそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの修飾された糖部分を含む、請求項２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
１以上の修飾が、ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、ホスホラミデート、カルバミン酸、炭酸、リン酸トリエステル、アセトアミデート、カルボキシメチルエステルおよびそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの修飾されたヌクレオシド間結合を含む、請求項２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
１以上の修飾が、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、アラビノ核酸（ＦＡＮＡ）、およびそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを含む、請求項２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで哺乳動物の細胞または組織における膜結合転写因子ペプチダーゼ、部位１（ＭＢＴＰＳ１）遺伝子の機能および／または発現をアップレギュレートする方法において使用するための２１〜３０ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、
前記方法は、配列番号２を有する膜結合転写因子ペプチダーゼ、部位１（ＭＢＴＰＳ１）ポリヌクレオチドの天然アンチセンスポリヌクレオチドに特異的な前記アンチセンスオリゴヌクレオチドに、前記細胞または組織を接触させることと、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで哺乳動物の細胞または組織における膜結合転写因子ペプチダーゼ、部位１（ＭＢＴＰＳ１）遺伝子の機能および／または発現をアップレギュレートすることと、を含み、
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号４に示されるオリゴヌクレオチド配列を含む、
アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
少なくとも１つの修飾を含む、２１〜３０ヌクレオチド長の合成修飾オリゴヌクレオチドであって、
少なくとも１つの修飾が少なくとも１つの修飾された糖部分、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドおよびそれらの組み合わせから選択され、
前記オリゴヌクレオチドは、配列番号２を有する膜結合転写因子ペプチダーゼ、部位１（ＭＢＴＰＳ１）ポリヌクレオチドの天然アンチセンスポリヌクレオチドにハイブリダイズし、かつ正常対照と比較してｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで膜結合転写因子ペプチダーゼ、部位１（ＭＢＴＰＳ１）遺伝子の機能および／または発現をアップレギュレートするアンチセンス化合物であり、
前記オリゴヌクレオチドは、配列番号４に示されるオリゴヌクレオチド配列を含む、
オリゴヌクレオチド。
【請求項８】
少なくとも１つの修飾が、ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、ホスホラミデート、カルバミン酸、炭酸、リン酸トリエステル、アセトアミデート、カルボキシメチルエステルおよびそれらの組み合わせからなる群から選択されるヌクレオチド間結合を含む、請求項７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
ホスホロチオエートヌクレオチド間結合の骨格を含む、請求項７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
ペプチド核酸、ロックド核酸（ＬＮＡ）、およびそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを含む、請求項７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
オリゴヌクレオチドが、ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、ホスホラミデート、カルバミン酸、炭酸、リン酸トリエステル、アセトアミデート、カルボキシメチルエステルおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される修飾ヌクレオチドを有する複数の修飾を含む、請求項７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
オリゴヌクレオチドが、ペプチド核酸、ロックド核酸（ＬＮＡ）、およびそれらの組み合わせから選択される修飾ヌクレオチドを有する複数の修飾を含む、請求項７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
オリゴヌクレオチドが、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾糖部分、２’−メトキシ修飾糖部分、２’−Ｏ−アルキル修飾糖部分、二環性糖部分およびそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの修飾糖部分を含む、請求項７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
オリゴヌクレオチドが、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾糖部分、２’−メトキシ修飾糖部分、２’−Ｏ−アルキル修飾糖部分、二環性糖部分およびそれらの組み合わせから選択される、複数の修飾を含む、請求項７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
１種以上の、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドと、薬学的に許容される賦形剤と、を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００９年１２月１６日に提出された米国仮特許出願第６１／２８６９２４号の優先権を主張し、その全体が参照によって本明細書において組み込まれる。
【０００２】
本発明の実施形態は、ＭＢＴＰＳ１および関連分子の発現および／または機能を調整するオリゴヌクレオチドを含む。
【背景技術】
【０００３】
ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションは、ＤＮＡ複製、転写、および翻訳を含む核酸機能の多くの側面にとって重要である。ハイブリダイゼーションはまた、特定の核酸を検出するまたはその発現を改変する様々な技術の中心にもなる。アンチセンスヌクレオチドは、例えば、標的ＲＮＡにハイブリダイズすることによって遺伝子発現を破壊し、それによって、ＲＮＡスプライシング、転写、翻訳、および複製に干渉する。アンチセンスＤＮＡは、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドが、ほとんどの細胞型中に存在する活性である、リボヌクレアーゼＨによる消化のために基質として果たすという付加的な特徴を有する。アンチセンス分子は、オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の場合のように、細胞に送達することができるまたはそれらは、ＲＮＡ分子として内因性遺伝子から発現させることができる。ＦＤＡは、最近、アンチセンス薬、ＶＩＴＲＡＶＥＮＥ（商標）（サイトメガロウイルス網膜炎の治療用）を承認しており、アンチセンスが治療上の有用性を有することを反映している。
【発明の概要】
【０００４】
本概要は、本発明の特徴および要旨を簡潔に示すために、本発明の要約を示すために提供される。それは、それが、請求項の範囲または意味を解釈するまたは限定するように使用されないという条件を伴って提出される。
【０００５】
一実施形態では、本発明は、天然アンチセンス転写物の任意の領域を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチド（複数可）を使用することによって、天然アンチセンス転写物の作用を阻害し、対応するセンス遺伝子のアップレギュレーションを生じさせるための方法を提供する。本発明の範囲内にあると考えられるｓｉＲＮＡ、リボザイム、および小分子によって天然アンチセンス転写物の阻害を達成することができることもまた、本明細書において企図される。
【０００６】
一実施形態は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、患者の細胞または組織におけるＭＢＴＰＳ１ポリヌクレオチドの機能および／または発現を調整するための方法であって、当該細胞または組織を、長さが５〜３０のヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させるステップを含み、当該オリゴヌクレオチドは、配列番号２のヌクレオチド１〜１２４０のヌクレオチド内の５〜３０の連続ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの逆相補体に対して少なくとも５０％の配列同一性を有し、それによって、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、患者の細胞または組織におけるＭＢＴＰＳ１ポリヌクレオチドの機能および／または発現を調整する方法を提供する。
【０００７】
他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＭＢＴＰＳ１ポリヌクレオチドの天然アンチセンス配列、例えば配列番号２において記載されるヌクレオチドならびに任意の変異体、対立遺伝子、相同体、突然変異体、誘導体、断片、およびそれに対する相補配列を標的にする。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号３〜６として記載される。
【０００８】
他の実施形態は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、患者の細胞または組織におけるＭＢＴＰＳ１ポリヌクレオチドの機能および／または発現を調整するための方法であって、当該細胞または組織を、長さが５〜３０のヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させるステップを含み、当該オリゴヌクレオチドは、ＭＢＴＰＳ１ポリヌクレオチドのアンチセンスの逆相補体に対して少なくとも５０％の配列同一性を有し、それによって、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、患者の細胞または組織におけるＭＢＴＰＳ１ポリヌクレオチドの機能および／または発現を調整する方法を提供する。
【０００９】
他の実施形態は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、患者の細胞または組織におけるＭＢＴＰＳ１ポリヌクレオチドの機能および／または発現を調整するための方法であって、当該細胞または組織を、長さが５〜３０のヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させるステップを含み、当該オリゴヌクレオチドは、ＭＢＴＰＳ１アンチセンスポリヌクレオチドに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドに対して少なくとも５０％の配列同一性を有し、それによって、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、患者の細胞または組織におけるＭＢＴＰＳ１ポリヌクレオチドの機能および／または発現を調整する方法を提供する。
【００１０】
一実施形態では、組成物は、センスおよび／またはアンチセンスＭＢＴＰＳ１ポリヌクレオチドに結合する１つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。
【００１１】
他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドまたは置換ヌクレオチドを含む。
【００１２】
他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の修飾結合を含む。
【００１３】
他の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ペプチド核酸、２’−Ｏ−メチル、フルオロ−もしくは炭素、メチレン、または他のロックド核酸（ＬＮＡ）分子を含む修飾塩基を含む。好ましくは、修飾ヌクレオチドは、α−Ｌ−ＬＮＡを含むロックド核酸分子である。
【００１４】
他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、患者に、皮下、筋肉内、静脈内、または腹腔内投与される。
【００１５】
他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、医薬組成物で投与される。治療レジメンは、患者に、少なくとも１回、アンチセンス化合物を投与することを含むが、この治療は、ある期間にわたって複数回の用量を含むように修飾されてもよい。治療は、１つまたは複数の他のタイプの療法と組み合わせることができる。
【００１６】
他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、リポソーム中に封入されるまたはキャリヤー分子（例えばコレステロール、ＴＡＴペプチド）に付加される。
【００１７】
他の態様は、以下に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】対照と比較した、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を使用して導入されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを用いるＨｅｐＧ２細胞の処理後のＭＢＴＰＳ１  ｍＲＮＡにおける倍数変化＋標準偏差を示すリアルタイムＰＣＲ結果を示す図である。リアルタイムＰＣＲ結果は、ＭＢＴＰＳ１アンチセンスＨｓ．５６８３６９に対して設計されたオリゴのうちの１つを用いる処理の４８時間後に、ＨｅｐＧ２細胞におけるＭＢＴＰＳ１  ｍＲＮＡのレベルが有意に増加することを示す。ＣＵＲ−１３１７、ＣＵＲ−１３１５、ＣＵＲ−１３１６、およびＣＵＲ−１３１８と示されるバーは、それぞれ、配列番号３〜６を用いて処理された試料に対応する。
【００１９】
配列表の説明配列番号１：ホモサピエンス膜結合転写因子ペプチダーゼ、部位１（ＭＢＴＰＳ１）、ｍＲＮＡ．（ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿００３７９１）；配列番号２：天然ＭＢＴＰＳ１アンチセンス配列（Ｈｓ．５６８３６９）；配列番号３〜６．アンチセンスオリゴヌクレオチド。＊は、ホスホロチオエート結合を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明のいくつかの態様は、例証のために、実施例の適用に関連して下記に記載される。多数の特定の細部、関係、および方法は、本発明についての十分な理解を提供するために記載されることが理解されたい。しかしながら、当業者は、１つもしくは複数の特定の細部なしでまたは他の方法を用いて本発明を実施することができることを容易に認識するであろう。本発明は、いくつかの作用が異なる順序でおよび／または他の作用もしくは事象と同時に行われてもよいように、作用または事象の順序によって限定されない。さらに、すべての示される作用または事象が、本発明に従う方法を実行するために必要とされるとは限らない。
【００２１】
本明細書において開示される遺伝子、遺伝子名、および遺伝子産物はすべて、本明細書において開示される組成物および方法が、適用可能である任意の種由来の相同体に対応するように意図される。したがって、これらの用語は、ヒトおよびマウス由来の遺伝子および遺伝子産物を含むが、これらに限定されない。特定の種由来の遺伝子または遺伝子産物が開示される場合、本開示は、例示的となるように意図されるのみであり、それが現われる文脈が明確に示さない限り、限定として解釈されないことが理解される。したがって、例えば、いくつかの実施形態では、哺乳動物の核酸配列およびアミノ酸配列に関係する、本明細書において開示される遺伝子は、相同および／またはオルソロガス遺伝子ならびに他の哺乳動物、魚、両生動物、爬虫類動物、および鳥を含むが、これらに限定されない他の動物由来の遺伝子産物を包含するように意図される。実施形態では、遺伝子または核酸配列は、ヒトである。
定義
【００２２】
本明細書において使用される術語は、特定の実施形態を説明する目的のみのものであり、本発明を限定するようには意図されない。本明細書において使用される、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が他に明確に示さない限り、同様に、複数形を含むように意図される。さらに、用語「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「を有する（ｗｉｔｈ）」、またはその変形が、発明を実施するための形態および／または請求項において使用される場合、そのような用語は、用語「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」に類似して、包括的となるように意図される。
【００２３】
用語「約」または「およそ」は、当業者によって決定されるように、特定の値について許容される誤差範囲の範囲内にあることを意味し、これは、値が測定されるまたは決定される方法、つまり、測定システムの限界に部分的に依存するであろう。例えば、「約」は、当技術分野における実施当たり、１または１を超える標準偏差の範囲内にあることを意味することができる。その代わりに、「約」は、所与の値の２０％までの、好ましくは１０％までの、より好ましくは５％までの、より好ましくは１％までの範囲を意味することができる。その代わりに、特に生物系またはプロセスに関して、用語は、値の、１桁の範囲内に、好ましくは５倍の範囲内に、より好ましくは２倍の範囲内にあることを意味することができる。特定の値が出願および請求項において記載される場合、他に述べられない限り、特定の値について許容される誤差範囲の範囲内を意味する用語「約」が、想定されたい。
【００２４】
本明細書において使用される、用語「ｍＲＮＡ」は、標的遺伝子の現在知られているｍＲＮＡ転写物（複数可）および解明されるかもしれない任意のさらなる転写物を意味する。
【００２５】
「アンチセンスオリゴヌクレオチド」または「アンチセンス化合物」によって、他のＲＮＡまたはＤＮＡ（標的ＲＮＡ、ＤＮＡ）に結合するＲＮＡまたはＤＮＡ分子が意味される。例えば、それがＲＮＡオリゴヌクレオチドである場合、それは、ＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用の手段によって他のＲＮＡ標的に結合し、標的ＲＮＡの活性を改変する（Ｅｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６０，  ６３１−６５２）。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、特定のポリヌクレオチドの発現および／または機能をアップレギュレートするまたはダウンレギュレートすることができる。定義は、治療上、診断上、または他の見解から有用である任意の外来ＲＮＡ分子または外来ＤＮＡ分子を含むように意味される。そのような分子は、例えばアンチセンスＲＮＡ分子またはアンチセンスＤＮＡ分子、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、マイクロＲＮＡ、デコイＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ、酵素ＲＮＡ、治療用エディティングＲＮＡならびにアゴニストＲＮＡおよびアンタゴニストＲＮＡ、アンチセンスオリゴマー化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、外部ガイド配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド、代替スプライサー、プライマー、プローブ、ならびに標的核酸の少なくとも一部にハイブリダイズする他のオリゴマー化合物を含む。そのため、これらの化合物は、一本鎖、二本鎖、部分的に一本鎖、環状オリゴマー化合物の形態で導入されてもよい。
【００２６】
本発明の文脈において、用語「オリゴヌクレオチド」は、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはそのミメティックのオリゴマーまたはポリマーを指す。用語「オリゴヌクレオチド」はまた、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、その置換形態およびアルファ−アノマー形態、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ならびにその他同種のものを含む、天然のおよび／または修飾されたモノマーまたは連結の直鎖状または環状オリゴマーを含む。オリゴヌクレオチドは、ワトソンクリック型の塩基対形成、フーグスティーンもしくは逆フーグスティーン型の塩基対形成、またはその他同種のものなどのような、規則的なパターンのモノマー間相互作用を通して、標的ポリヌクレオチドに特異的に結合することができる。
【００２７】
オリゴヌクレオチドは、異なる領域から構成される「キメラ」であってもよい。本発明の文脈において、「キメラ」化合物は、２つ以上の化学的な領域、例えばＤＮＡ領域（複数可）、ＲＮＡ領域（複数可）、ＰＮＡ領域（複数可）などを含有するオリゴヌクレオチドである。化学的な領域はそれぞれ、少なくとも１つのモノマー単位、つまり、オリゴヌクレオチド化合物の場合にはヌクレオチドから構成される。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的に、オリゴヌクレオチドが１つまたは複数の所望の特性を示すように修飾されている少なくとも１つの領域を含む。オリゴヌクレオチドの所望の特性は、例えば、ヌクレアーゼ分解に対する抵抗性の増加、細胞の取り込みの増加、および／または標的核酸に対する結合親和性の増加を含むが、これらに限定されない。したがって、オリゴヌクレオチドの異なる領域は、異なる特性を有していてもよい。本発明のキメラオリゴヌクレオチドは、上記に記載される２つ以上のオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、および／またはオリゴヌクレオチドアナログの混合構造物として形成することができる。
【００２８】
オリゴヌクレオチドは、「正確な位置合わせ」で、すなわち、天然ＤＮＡでのように、モノマーが連続して連結される場合に、連結することができるまたはスペーサーを介して連結することができる領域から構成することができる。スペーサーは、領域の間の共有結合「ブリッジ」を構成するように意図され、好ましい場合では、約１００炭素原子を超過しない長さを有する。スペーサーは、異なる機能性を保持してもよく、例えば正または負電荷を有し、特有の核酸結合特性（干渉物質、溝結合剤、毒素、蛍光体など）を保持し、親油性であり、例えば、アルファヘリックスを誘発するアラニン含有ペプチドのように、特有の二次構造を誘発する。
【００２９】
本明細書において使用される、「ＭＢＴＰＳ１」および「膜結合転写因子ペプチダーゼ、部位１」は、すべてのファミリーメンバー、突然変異体、対立遺伝子、断片、種、コードおよび非コード化配列、センスおよびアンチセンスポリヌクレオチド鎖などを含む。
【００３０】
本明細書において使用される、膜結合転写因子ペプチダーゼ、部位１；ＭＢＴＰＳ１、ＫＩＡＡ００９１、膜結合転写因子部位１プロテアーゼ、ＭＧＣ１３８７１１、ＭＧＣ１３８７１２、ＰＣＳＫ８、Ｓ１Ｐ、Ｓ１Ｐエンドペプチダーゼ、部位１プロテアーゼ、ＳＫＩ１、ＳＫＩ−１、サブチリシン／ケキシンアイソザイム１という語は、本出願において区別なく使用される。
【００３１】
本明細書において使用される、用語「〜に特異的なオリゴヌクレオチド」または「〜を標的にするオリゴヌクレオチド」は、（ｉ）標的遺伝子の一部と安定した複合体を形成することができるまたは（ｉｉ）標的遺伝子のｍＲＮＡの転写物の一部と安定した二重鎖を形成することができる配列を有するオリゴヌクレオチドを指す。複合体および二重鎖の安定性は、理論的な計算および／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイによって決定することができる。ハイブリダイゼーション複合体および二重鎖の安定性を決定するための例示的なアッセイは、下記の実施例において記載される。
【００３２】
本明細書において使用される、用語「標的核酸」は、ＤＮＡ、そのようなＤＮＡから転写されるＲＮＡ（プレｍＲＮＡおよびｍＲＮＡを含む）、ならびにさらに、そのようなＲＮＡに由来するｃＤＮＡ、コード配列、非コード化配列、センスポリヌクレオチド、またはアンチセンスポリヌクレオチドを包含する。その標的核酸とのオリゴマー化合物の特異的なハイブリダイゼーションは、核酸の正常な機能に干渉する。それに特異的にハイブリダイズする化合物による標的核酸の機能のこの調整は、一般に、「アンチセンス」と呼ばれる。干渉されることとなるＤＮＡの機能は、例えば、複製および転写を含む。干渉されることとなるＲＮＡの機能は、例えば、タンパク質翻訳の部位へのＲＮＡの移動、ＲＮＡからのタンパク質の翻訳、１つまたは複数のｍＲＮＡ種を得るためのＲＮＡのスプライシング、およびＲＮＡに関与してもよいまたはそれによって促進されてもよい触媒活性などのような、すべての生体機能を含む。標的核酸機能へのそのような干渉の全体的な効果は、コード産物またはオリゴヌクレオチドの発現の調整である。
【００３３】
ＲＮＡ干渉「ＲＮＡｉ」は、それらの「標的」核酸配列に対して配列特異的な相同性を有する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子によって媒介される（Ｃａｐｌｅｎ，  Ｎ．  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９８：９７４２−９７４７）。本発明のある実施形態では、媒介物質は、５〜２５ヌクレオチドの「低分子干渉」ＲＮＡ二重鎖（ｓｉＲＮＡ）である。ｓｉＲＮＡは、ダイサーとして知られているＲＮアーゼ酵素によってｄｓＲＮＡの処理から誘導される（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，  Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３６３−３６６）。ｓｉＲＮＡ二重鎖産物は、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体）と称される多重タンパク質ｓｉＲＮＡ複合体の中に入る。あらゆる特定の理論によって束縛されることを望むものではないが、次いで、ＲＩＳＣは、標的核酸（適宜、ｍＲＮＡ）に導かれると考えられ、ｓｉＲＮＡ二重鎖は、触媒作用的な方法において、切断を媒介するために、配列特異的な方法で相互作用する（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，  Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３６３−３６６；  Ｂｏｕｔｌａ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｃｕｒｒ．  Ｂｉｏｌ．  １１：１７７６−１７８０）。本発明に従って使用することができる低分子干渉ＲＮＡは、合成することができ、当技術分野において周知であり、当業者によく知られている手順に従って使用することができる。本発明の方法において使用される低分子干渉ＲＮＡは、適宜、約１〜約５０のヌクレオチド（ｎｔ）を含む。非限定的な実施形態の例では、ｓｉＲＮＡは、約５〜約４０ｎｔ、約５〜約３０ｎｔ、約１０〜約３０ｎｔ、約１５〜約２５ｎｔ、または約２０〜２５のヌクレオチドを含むことができる。
【００３４】
適切なオリゴヌクレオチドの選択は、核酸配列を自動的にアライメントし、同一性または相同性の領域を示すコンピュータープログラムを使用することによって促進される。そのようなプログラムは、例えば、ＧｅｎＢａｎｋなどのようなデータベースを検索することによってまたはＰＣＲ産物を配列決定することによって得られる核酸配列を比較するために使用される。一連の種由来の核酸配列の比較は、種の間の、適正な程度の同一性を示す核酸配列の選択を可能にする。配列決定されていない遺伝子の場合には、サザンブロットは、標的種および他の種における遺伝子の間の同一性の程度の決定を可能にするために実行される。当技術分野において周知のように、様々な程度のストリンジェンシーでサザンブロットを実行することによって、同一性のおよその測定値を得ることが可能である。これらの手順は、制御されることとなる対象における標的核酸配列に対して高度の相補性および他の種における対応する核酸配列に対する低度の相補性を示すオリゴヌクレオチドの選択を可能にする。当業者は、本発明において使用するための遺伝子の適切な領域を選択する際に相当な許容範囲があることを理解するであろう。
【００３５】
「酵素ＲＮＡ」によって、酵素活性を有するＲＮＡ分子を意味する（Ｃｅｃｈ，  （１９８８）  Ｊ．  Ａｍｅｒｉｃａｎ．  Ｍｅｄ．  Ａｓｓｏｃ．  ２６０，  ３０３０−３０３５）。酵素核酸（リボザイム）は、最初に標的ＲＮＡに結合することによって作用する。そのような結合は、標的ＲＮＡを切断するように作用する分子の酵素部分の近くに保持される、酵素核酸の標的結合部分を通して生じる。したがって、酵素核酸は、最初に、標的ＲＮＡを認識し、次いで、塩基対形成を通してそれに結合し、一度、正確な部位に結合したら、酵素的に作用して、標的ＲＮＡを切断する。
【００３６】
「デコイＲＮＡ」によって、リガンドに対する天然結合ドメインを模倣するＲＮＡ分子を意味する。そのため、デコイＲＮＡは、特異的なリガンドの結合について天然結合標的と競合する。例えば、過剰発現したＨＩＶトランス活性化応答（ＴＡＲ）ＲＮＡは、「デコイ」として作用することができ、ＨＩＶ  ｔａｔタンパク質に効率的に結合し、それによって、それが、ＨＩＶ  ＲＮＡにおいてコードされるＴＡＲ配列に結合するのを予防することが示されている（Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｃｅｌｌ，  ６３，  ６０１−  ６０８）。これは、特定の例であると意図される。当業者らは、これが、ほんの１つの例であり、他の実施形態は、当技術分野において一般に知られている技術を使用して、容易に得ることができることを認識するであろう。
【００３７】
本明細書において使用される、用語「モノマー」は、ホスホジエステル結合またはそのアナログによって連結され、サイズが、少数のモノマー単位から、例えば、約３〜４から約数百のモノマー単位の範囲のオリゴヌクレオチドを形成するモノマーを典型的に示す。ホスホジエステル連結のアナログは、より十分に下記に記載されるように、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホロセレノエート、ホスホロアミデート、およびその他同種のものを含む。
【００３８】
用語「ヌクレオチド」は、天然に存在するヌクレオチドおよび天然に存在しないヌクレオチドを包含する。「天然に存在しない」と以前に考えられていた様々なヌクレオチドが、後に、自然界において見つけられていることは、当業者に明らかであるはずである。したがって、「ヌクレオチド」は、知られているプリンおよびピリミジンヘテロ環含有分子だけではなく、そのヘテロ環式類似体および互変異性体をも含む。他のタイプのヌクレオチドの例証となる例は、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、ウラシル、プリン、キサンチン、ジアミノプリン、８−オキソ−Ｎ６−メチルアデニン、７−デアザキサンチン、７−デアザグアニン、Ｎ４，Ｎ４−エタノシトシン、Ｎ６，Ｎ６−エタノ−２，６−ジアミノプリン、５−メチルシトシン、５−（Ｃ３−Ｃ６）−アルキニルシトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロムウラシル、プソイドイソシトシン、２−ヒドロキシ−５−メチル−４−トリアゾロピリジン、イソシトシン、イソグアニン、イノシン、およびＢｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，４３２，２７２号明細書に記載される「天然に存在しない」ヌクレオチドを含有する分子である。用語「ヌクレオチド」は、ありとあらゆるこれらの例ならびにその類似体および互変異性体を包含するように意図される。とりわけ興味あるヌクレオチドは、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、およびウラシルを含有するものであり、これらは、ヒトにおいて治療上および診断上の適用に関して、天然に存在するヌクレオチドと見なされる。ヌクレオチドは、例えば、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ，  ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．  （Ｆｒｅｅｍａｎ，  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  １９９２）において記載される天然２’−デオキシおよび２’−ヒドロキシル糖ならびにそれらのアナログを含む。
【００３９】
ヌクレオチドに関する「アナログ」は、修飾塩基部分および／または修飾糖部分（例えば、一般に、Ｓｃｈｅｉｔ，  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｓ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８０；  Ｆｒｅｉｅｒ  ＆  Ａｌｔｍａｎｎ，  （１９９７）  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ．  Ｒｅｓ．，  ２５（２２），  ４４２９−  ４４４３，  Ｔｏｕｌｍｅ，  Ｊ．Ｊ．，  （２００１）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９：１７−１８；  Ｍａｎｏｈａｒａｎ  Ｍ．，  （１９９９）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １４８９：１１７−１３９；  Ｆｒｅｉｅｒ  Ｓ．  Ｍ．，  （１９９７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２５：４４２９−４４４３，  Ｕｈｌｍａｎ，  Ｅ．，  （２０００）  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  ３：  ２０３−２１３，  Ｈｅｒｄｅｗｉｎ  Ｐ．，  （２０００）  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＆  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．，  １０：２９７−３１０によって記載され、これらを参照されたい）；２’−Ｏ，３’−Ｃ−連結［３．２．０］ビシクロアラビノヌクレオシド（例えばＮ．Ｋ  Ｃｈｒｉｓｔｉｅｎｓｅｎ．  ，  ｅｔ  ａｌ，  （１９９８）  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １２０：  ５４５８−５４６３；  Ｐｒａｋａｓｈ  ＴＰ，  Ｂｈａｔ  Ｂ．  （２００７）  Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．  ７（７）：６４１−９；  Ｃｈｏ  ＥＪ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２，  ２４１−２６４を参照されたい）を有する合成ヌクレオチドを含む。そのようなアナログは、結合特性、例えば二重鎖もしくは三重鎖安定性、特異性、またはその他同種のものを増強するために設計された合成ヌクレオチドを含む。
【００４０】
本明細書において使用される、「ハイブリダイゼーション」は、オリゴマー化合物の実質的に相補的な鎖の対形成を意味する。対形成の１つのメカニズムは、オリゴマー化合物の鎖の相補的なヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基（ヌクレオチド）の間の、ワトソンクリック、フーグスティーン、または逆フーグスティーン水素結合であってもよい水素結合を含む。例えば、アデニンおよびチミンは、水素結合の形成を通して対になる相補的なヌクレオチドである。ハイブリダイゼーションは、様々な環境下で生じ得る。
【００４１】
アンチセンス化合物は、標的核酸への化合物の結合が、標的核酸の正常な機能に干渉して、機能および／または活性の調整を引き起こす場合、「特異的にハイブリダイズすることができる」、また、特異的な結合が所望される条件下で、つまり、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイまたは治療上の処理の場合には生理学的条件下でおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの場合にはアッセイが実行される条件下で、非標的核酸配列へのアンチセンス化合物の非特異的な結合を回避するのに十分な程度の相補性がある。
【００４２】
本明細書において使用される、語句「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」または「ストリンジェントな条件」は、本発明の化合物が、最小限の数の他の配列にハイブリダイズするが、その標的配列にハイブリダイズする条件を指す。ストリンジェントな条件は、配列依存的であり、様々な環境において異なるであろう、また、本発明との関連において、オリゴマー化合物が標的配列にハイブリダイズする「ストリンジェントな条件」は、オリゴマー化合物の特徴および組成ならびにそれらが調査されているアッセイによって決定される。一般に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、Ｎａ＋＋またはＫ＋＋などのような低濃度（＜０．１５Ｍ）の無機陽イオンとの塩（つまり低イオン強度）、オリゴマー化合物：標的配列複合体のＴｍ未満の、２０℃〜２５℃よりも高い温度、およびホルムアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、または硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）界面活性剤などのような変性剤の存在を含む。例えば、ハイブリダイゼーション率は、１％ホルムアミド毎に１．１％減少する。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の例は、３０分間、６０℃での、０．１×塩化ナトリウム−クエン酸ナトリウムバッファー（ＳＳＣ）／０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳである。
【００４３】
本明細書において使用される「相補的な」は、１つまたは２つのオリゴマー鎖上での、２つのヌクレオチドの間の正確な対形成についての能力を指す。例えば、アンチセンス化合物のある位置の核酸塩基が、標的核酸のある位置の核酸塩基と水素結合することができる場合、当該標的核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはオリゴヌクレオチド分子であるが、オリゴヌクレオチドおよび標的核酸の間の水素結合の位置は、相補的な位置であると考えられる。それぞれの分子における、十分な数の相補的な位置が、互いに水素結合するヌクレオチドによって占められる場合、オリゴマー化合物およびさらなるＤＮＡ、ＲＮＡｍまたはオリゴヌクレオチド分子は、互いに相補的である。したがって、「特異的にハイブリダイズすることができる」および「相補的な」は、オリゴマー化合物および標的核酸の間に安定した特異的な結合が生じるような、十分な数のヌクレオチドにわたる、十分な程度の正確な対形成または相補性を示すために使用される用語である。
【００４４】
オリゴマー化合物の配列は、特異的にハイブリダイズすることができるものとなるように、その標的核酸に対して１００％相補的である必要がないことが、当技術分野において理解される。さらに、オリゴヌクレオチドは、介在または隣接セグメントがハイブリダイゼーション事象に関与しないように、１つまたは複数のセグメントに対してハイブリダイズしてもよい（例えばループ構造、ミスマッチ、またはヘアピン構造）。本発明のオリゴマー化合物は、それらが標的にする標的核酸配列内の標的部位に対して、少なくとも約７０％または少なくとも約７５％または少なくとも約８０％または少なくとも約８５％または少なくとも約９０％または少なくとも約９５％または少なくとも約９９％の配列相補性を含む。例えば、アンチセンス化合物の２０ヌクレオチドのうちの１８が標的部位に対して相補的であり、そのため、特異的にハイブリダイズするであろうアンチセンス化合物は、９０パーセントの相補性を示すであろう。この例において、残りの非相補的ヌクレオチドは、密集していてもよくまたは相補的なヌクレオチドが点在していてもよく、互いにまたは相補的なヌクレオチドに隣接している必要がない。そのため、標的核酸と完全に相補性の２つの領域が側面に位置する４つの（４）非相補的ヌクレオチドを有する長さが１８のヌクレオチドであるアンチセンス化合物は、標的核酸との７７．８％の全体的な相補性を有し、したがって、本発明の範囲内にあるであろう。標的核酸の領域とのアンチセンス化合物の相補性パーセントは、当技術分野において知られているＢＬＡＳＴプログラム（基本的なローカルアライメント検索ツール）およびＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラムを使用してルーチン的に決定することができる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９０）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２１５，  ４０３−４１０；  Ｚｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｄｄｅｎ，  （１９９７）  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，  ７，  ６４９−６５６）。相同性、配列同一性、または相補性パーセントは、例えば、デフォルト設定を使用し、Ｇａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ、Ｍａｄｉｓｏｎ  Ｗｉｓ．）によって決定することができ、これは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ  （Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．，  （１９８１）  ２，  ４８２−４８９）のアルゴリズムを使用している。
【００４５】
本明細書において使用される、用語「熱融点（Ｔｍ）」は、標的配列に相補的な５０％のオリゴヌクレオチドが、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする、定義されるイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下の温度を指す。典型的に、ストリンジェントな条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０〜８．３で、少なくとも約０．０１〜１．０Ｍ  Ｎａイオン濃度（または他の塩）であり、温度が、短いオリゴヌクレオチド（例えば１０〜５０のヌクレオチド）について少なくとも約３０℃である条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどのような不安定化剤の追加により達成されてもよい。
【００４６】
本明細書において使用される、「修飾」は、遺伝子の発現における増加（刺激）または減少（阻害）のいずれかを意味する。
【００４７】
用語「変異体」は、ポリヌクレオチド配列との関連において使用される場合、野生型遺伝子と関係するポリヌクレオチド配列を包含してもよい。この定義はまた、例えば、「対立遺伝子」、「スプライス」、「種」、または「多型」変異体を含んでいてもよい。スプライス変異体は、参照分子に対して著しい同一性を有していてもよいが、一般に、ｍＲＮＡの処理の間のエキソンの選択的スプライシングにより、ポリヌクレオチドの数が多いまたは少ないであろう。対応するポリペプチドは、追加の機能的なドメインを有していてもよいまたはドメインが不在であってもよい。種変異体は、種によって変化するポリヌクレオチド配列である。野生型遺伝子産物の変異体は、本発明において特に有用である。変異体は、核酸配列における少なくとも１つの突然変異に起因してもよく、改変されたｍＲＮＡまたは構造もしくは機能が改変されてもよいもしくは改変されなくてもよいポリペプチドをもたらしてもよい。所与の天然または組換え遺伝子は、対立形質を有していなくてもよい、１つ、または多くの対立形質を有していてもよい。変異体を生じる一般的な突然変異による変化は、一般に、ヌクレオチドの天然の欠失、追加、または置換に基づく。それぞれのこれらのタイプの変化は、所与の配列において、１回または複数回、単独でまたは他と組み合わせて生じてもよい。
【００４８】
結果として生じるポリペプチドは、一般に、互いに関して、著しいアミノ酸同一性を有するであろう。多型変異体は、所与の種の個体の間の特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列における変異である。多型変異体はまた、ポリヌクレオチド配列が１つの塩基によって異なる「一塩基変異多型」（ＳＮＰ）または一塩基突然変異を包含していてもよい。ＳＮＰの存在は、例えば、感受性対抵抗性とする、疾患状態に対する傾向を有するある種の集団を示してもよい。
【００４９】
誘導体ポリヌクレオチドは、化学的修飾、例えば、アルキル、アシル、またはアミノ基による水素の置換にさらされた核酸を含む。誘導体、例えば誘導体オリゴヌクレオチドは、改変された糖部分または糖間連結などのような天然に存在しない部分を含んでいてもよい。これらの中で例示的なものは、ホスホロチオエートおよび当技術分野において知られている他の硫黄含有種である。誘導体核酸はまた、放射性ヌクレオチド、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤、基質、補助因子、阻害剤、磁気微粒子、およびその他同種のものを含む標識を含有していてもよい。
【００５０】
「誘導体」ポリペプチドまたはペプチドは、例えば、グリコシル化、ペグ化、リン酸化、硫酸化、還元／アルキル化、アシル化、化学的カップリング、または穏やかなホルマリン処理によって修飾されたポリペプチドまたはペプチドである。誘導体はまた、放射性同位体、蛍光、および酵素標識を含むが、これらに限定されない、検出可能な標識を直接または間接的に含有するように修飾されてもよい。
【００５１】
本明細書において使用される、用語「動物」または「患者」は、例えば、ヒト、ヒツジ、オオシカ、シカ、ミュールジカ、ミンク、哺乳動物、サル、ウマ、ウシ、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、鳥、ニワトリ、爬虫類動物、魚、昆虫、およびクモ形類動物を含むように意味する。
【００５２】
「哺乳動物」は、典型的に、診療下にある温血哺乳動物（例えばヒトおよび飼育動物）を包含する。例として、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、およびヒトならびに単にヒトを含む。
【００５３】
「治療すること」または「治療」は、哺乳動物における疾患状態の治療を包含し、（ａ）特に、そのような哺乳動物が、疾患状態に罹患しやすいが、それを有するとしてまだ診断されていない場合に、疾患状態が哺乳動物において生じるのを予防すること；（ｂ）疾患状態を阻害すること、例えば、それの発症を阻止すること；および／または（ｃ）疾患状態を軽減すること、例えば、所望のエンドポイントに到達するまで、疾患状態の後退を引き起こすことを含む。治療はまた、疾患の症状の回復をも含み（例えば、痛みまたは不快感を和らげる）、そのような回復は、疾患（例えば原因、伝染、発現など）に直接影響してもよいまたは影響しなくてもよい。
ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドの組成物および分子
【００５４】
標的：一実施形態では、標的は、限定を伴うことなく、ＭＢＴＰＳ１と関連するセンスおよび／またはアンチセンス非コードおよび／またはコード配列を含む、膜結合転写因子ペプチダーゼ、部位１（ＭＢＴＰＳ１）の核酸配列を含む。
【００５５】
ＭＢＴＰＳ１またはサブチリシン／ケキシンアイソザイム１（ＳＫＩ−１）としても広く知られているヒト部位１プロテアーゼ（Ｓ１Ｐ）は、９つの哺乳動物プロタンパク質コンバターゼのグループに属する膜結合サブチリシン関連性セリンプロテアーゼである。これらのプロテアーゼの中で、Ｓ１Ｐは、非塩基性アミノ酸の後での優先的な切断を示すことによって、特有の基質特異性を示す。Ｓ１Ｐは、膜、細胞、および血液のコレステロール含有量を制御するタンパク分解性経路において重要な役割を果たす。Ｓ１Ｐは、コレステロールおよび脂質代謝に関与する様々な遺伝子の発現を調節する２つの転写因子であるステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）１および２への前駆物質のタンパク分解性活性化を媒介するゴルジプロテイナーゼである。
【００５６】
アンチセンス化合物を使用して得られた幹細胞から再生された細胞／組織を用いて治療することができる、例示的な膜結合転写因子ペプチダーゼ、部位１（ＭＢＴＰＳ１）媒介性の疾患および障害は、ＥＲストレス応答と関連する疾患または障害、炎症性腸疾患（例えば大腸炎）、代謝疾患または障害、脂質代謝疾患または障害（例えば肥満、糖尿病、高コレステロール血症、異脂肪血症）、ステロール調節性エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）の機能障害と関連する疾患または障害、心血管疾患または障害、出血熱（例えばクリミア−コンゴ出血性熱など）、肝疾患または障害、軟骨性骨発生疾患または障害（例えば軟骨異形成症、軟骨アポトーシス、無秩序なコラーゲンネットワーク）を含む。
【００５７】
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＭＢＴＰＳ１のポリヌクレオチドに対して特異的であり、これは、限定を伴うことなく、非コード領域を含む。ＭＢＴＰＳ１標的は、ＭＢＴＰＳ１の変異体；ＳＮＰを含むＭＢＴＰＳ１の突然変異体；ＭＢＴＰＳ１の非コード化配列；対立遺伝子、断片、およびその他同種のものを含む。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、アンチセンスＲＮＡ分子である。
【００５８】
本発明の実施形態に従って、標的核酸分子は、ＭＢＴＰＳ１ポリヌクレオチドのみに限定されず、ＭＢＴＰＳ１のアイソフォーム、受容体、相同体、非コード領域、およびその他同種のもののいずれにも及ぶ。
【００５９】
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、限定を伴うことなく、変異体、対立遺伝子、相同体、突然変異体、誘導体、断片、およびそれに対する相補配列を含むＭＢＴＰＳ１標的の天然アンチセンス配列（コードおよび非コード領域に対する天然アンチセンス）を標的にする。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、アンチセンスＲＮＡ分子またはアンチセンスＤＮＡ分子である。
【００６０】
一実施形態では、本発明のオリゴマー化合物はまた、異なる塩基が化合物中の１つまたは複数のヌクレオチド位置に存在する変異体を含む。例えば、第１のヌクレオチドがアデニンである場合、この位置にチミジン、グアノシン、シチジン、または他の天然もしくは非天然ヌクレオチドを含有する変異体が、産生されてもよい。これは、アンチセンス化合物の位置のいずれにおいてももたらされてもよい。次いで、これらの化合物は、標的核酸の発現を阻害するそれらの能力を決定するために本明細書において記載される方法を使用して試験される。
【００６１】
いくつかの実施形態では、アンチセンス化合物および標的の間の相同性、配列同一性、または相補性は、約５０％〜約６０％である。いくつかの実施形態では、相同性、配列同一性、または相補性は、約６０％〜約７０％である。いくつかの実施形態では、相同性、配列同一性、または相補性は、約７０％〜約８０％である。いくつかの実施形態では、相同性、配列同一性、または相補性は、約８０％〜約９０％である。いくつかの実施形態では、相同性、配列同一性、または相補性は、約９０％、約９２％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％である。
【００６２】
アンチセンス化合物は、標的核酸への化合物の結合が、標的核酸の正常な機能に干渉して、活性の損失を引き起こす場合、特異的にハイブリダイズすることができ、特異的な結合が所望される条件下で、非標的核酸配列へのアンチセンス化合物の非特異的な結合を回避するための十分な程度の相補性がある。そのような条件は、つまり、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイまたは治療上の処置の場合には、生理学的条件およびｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの場合にはアッセイが実行される条件を含む。
【００６３】
アンチセンス化合物は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、キメラ、置換などかどうかに関わらず、標的ＤＮＡ分子または標的ＲＮＡ分子への化合物の結合が標的ＤＮＡまたは標的ＲＮＡの正常な機能に干渉して、有用性の損失を引き起こす場合、特異的にハイブリダイズすることができ、特異的な結合が所望される条件下で、つまり、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイまたは治療上の処置の場合には、生理学的条件下でおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの場合にはアッセイが実行される条件下で、非標的配列へのアンチセンス化合物の非特異的結合を回避するのに十分な程度に相補的である。
【００６４】
一実施形態では、限定を伴うことなく、例えばＰＣＲ、ハイブリダイゼーションなどを使用して、同定され、伸長するアンチセンス配列、１つまたは複数の配列番号２として記載される配列、およびその他同種のものを含むＭＢＴＰＳ１のターゲティングは、ＭＢＴＰＳ１の発現または機能を調整する。一実施形態では、発現または機能は、対照と比較してアップレギュレートされる。一実施形態では、発現または機能は、対照と比較してダウンレギュレートされる。
【００６５】
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、例えばＰＣＲ、ハイブリダイゼーションなどを使用して、同定され、伸長するアンチセンス配列を含む、配列番号３〜６として記載される核酸配列を含む。これらのオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の修飾ヌクレオチド、より短いまたはより長い断片、修飾結合、およびその他同種のものを含むことができる。修飾結合または修飾ヌクレオチド間連結の例は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、またはその他同種のものを含む。一実施形態では、ヌクレオチドはリン誘導体を含む。本発明の修飾オリゴヌクレオチドにおける糖または糖アナログ部分に付加されてもよいリン誘導体（または修飾リン酸基）は、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、アルキルホスフェート、アルカンホスフェート、ホスホロチオエート、およびその他同種のものであってもよい。上記に述べられるホスフェートアナログの調製ならびにヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドの中へのそれらの組み込みもまた、それ自体、知られており、本明細書に記載する必要はない。
【００６６】
アンチセンスの特異性および感受性もまた、治療上の使用のために当業者らによって利用される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、動物および人における疾患状態の治療において治療成分として用いられてきた。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、安全で有効にヒトに投与されており、多数の臨床試験が現在進行中である。したがって、オリゴヌクレオチドが、細胞、組織、および動物、とりわけヒトの治療のための治療プログラムにおいて有用となるように設計することができる有用な治療手段となり得ることが立証される。
【００６７】
本発明の実施形態では、オリゴマーアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドは、標的核酸分子に結合し、かつ標的遺伝子によってコードされる分子の発現および／または機能を調整する。干渉されることとなるＤＮＡの機能は、例えば、複製および転写を含む。干渉されることとなるＲＮＡの機能は、例えば、タンパク質翻訳の部位へのＲＮＡの移動、ＲＮＡからのタンパク質の翻訳、１つまたは複数のｍＲＮＡ種を得るためのＲＮＡのスプライシング、およびＲＮＡに関与してもよいまたはそれによって促進されてもよい触媒活性などのような、すべての生体機能を含む。機能は、所望の機能に依存して、アップレギュレートされてもよいまたは阻害されてもよい。
【００６８】
アンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴマー化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、外部ガイド配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド、代替スプライサー、プライマー、プローブ、ならびに標的核酸の少なくとも一部にハイブリダイズする他のオリゴマー化合物を含む。そのため、これらの化合物は、一本鎖、二本鎖、部分的に一本鎖、環状オリゴマー化合物の形態で導入されてもよい。
【００６９】
本発明との関連における、特定の核酸分子へのアンチセンス化合物のターゲティングは、多段階のプロセスとすることができる。プロセスは、通常、その機能が調整されることとなる標的核酸の同定から始まる。この標的核酸は、例えば、その発現が特定の障害または疾患状態と関連する細胞遺伝子（もしくは遺伝子から転写されるｍＲＮＡ）または感染病原体由来の核酸分子であってもよい。本発明では、標的核酸は、膜結合転写因子ペプチダーゼ、部位１（ＭＢＴＰＳ１）をコードする。
【００７０】
ターゲティングプロセスはまた、通常、所望の効果、例えば発現の修飾が結果として生じるように、アンチセンス相互作用が起こるように、標的核酸内の少なくとも１つの標的部位、セグメント、または部位の決定を含む。本発明の文脈内では、用語「領域」は、少なくとも１つの同定可能な構造、機能、または特徴を有する標的核酸の一部として定義される。セグメントは、標的核酸の領域内にある。「セグメント」は、標的核酸内の領域のより小さな部分または下位部分として定義される。本発明において使用される「部位」は、標的核酸内の位置として定義される。
【００７１】
一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、膜結合転写因子ペプチダーゼ、部位１（ＭＢＴＰＳ１）の天然アンチセンス配列に結合し、ＭＢＴＰＳ１（配列番号１）の発現および／または機能を調整する。アンチセンス配列の例は、配列番号２〜６を含む。
【００７２】
一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、膜結合転写因子ペプチダーゼ、部位１（ＭＢＴＰＳ１）ポリヌクレオチドの１つまたは複数のセグメントに結合し、ＭＢＴＰＳ１の発現および／または機能を調整する。セグメントは、ＭＢＴＰＳ１センスポリヌクレオチドまたはＭＢＴＰＳ１アンチセンスポリヌクレオチドの少なくとも５つの連続ヌクレオチドを含む。
【００７３】
一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＭＢＴＰＳ１の天然アンチセンス配列に対して特異的であり、ＭＢＴＰＳ１の天然アンチセンス配列へのオリゴヌクレオチドの結合は、ＭＢＴＰＳ１の発現および／または機能を調整する。
【００７４】
一実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物は、配列番号３〜６として記載される配列、例えばＰＣＲ、ハイブリダイゼーションなどを使用して、同定され、伸長するアンチセンス配列を含む。これらのオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の修飾ヌクレオチド、より短いまたはより長い断片、修飾結合、およびその他同種のものを含むことができる。修飾結合または修飾ヌクレオチド間連結の例は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、またはその他同種のものを含む。一実施形態では、ヌクレオチドはリン誘導体を含む。本発明の修飾オリゴヌクレオチドにおける糖または糖アナログ部分に付加されてもよいリン誘導体（または修飾リン酸基）は、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、アルキルホスフェート、アルカンホスフェート、ホスホロチオエート、およびその他同種のものであってもよい。上記に述べられるホスフェートアナログの調製ならびにヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドの中へのそれらの組み込みもまた、それ自体、知られており、本明細書に記載する必要はない。
【００７５】
以来、当技術分野において知られているように、翻訳開始コドンは、典型的に、５’−ＡＵＧであり（転写ｍＲＮＡ分子において；対応するＤＮＡ分子において５’−ＡＴＧ）、翻訳開始コドンはまた、「ＡＵＧコドン」、「開始コドン」、または「ＡＵＧ開始コドン」とも呼ばれる。少数の遺伝子は、ＲＮＡ配列５’−ＧＵＧ、５’−ＵＵＧ、または５’−ＣＵＧを有する翻訳開始コドンを有し、５’−ＡＵＡ、５’−ＡＣＧ、および５’−ＣＵＧは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて機能することが示されている。したがって、それぞれの実例における開始因子アミノ酸が、典型的に、メチオニン（真核生物において）またはホルミルメチオニン（原核生物において）であるが、用語「翻訳開始コドン」および「開始コドン」は、多くのコドン配列を包含することができる。真核生物および原核生物の遺伝子は、２つ以上の代替の開始コドンを有していてもよく、これらのいずれか１つが、特定の細胞型もしくは組織においてまたは特定のセットの条件下で、翻訳開始のために優先的に利用されてもよい。本発明の文脈において、「開始コドン」および「翻訳開始コドン」は、そのようなコドンの配列（複数可）に関わらず、膜結合転写因子ペプチダーゼ、部位１（ＭＢＴＰＳ１）をコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳を始めるためにｉｎ  ｖｉｖｏにおいて使用されるコドン（複数可）を指す。遺伝子の翻訳終止コドン（または「ストップコドン」）は、３つの配列、つまり５’−ＵＡＡ、５’−ＵＡＧ、および５’−ＵＧＡのうちの１つを有していてもよい（対応するＤＮＡ配列は、それぞれ、５’−ＴＡＡ、５’−ＴＡＧ、および５’−ＴＧＡである）。
【００７６】
用語「開始コドン領域」および「翻訳開始コドン領域」は、翻訳開始コドンからどちらかの方向（つまり５’または３’）に約２５〜約５０の隣接するヌクレオチドを包含する、ｍＲＮＡまたは遺伝子の一部を指す。同様に、用語「ストップコドン領域」および「翻訳終止コドン領域」は、翻訳終止コドンからどちらかの方向（つまり５’または３’）に約２５〜約５０の隣接するヌクレオチドを包含する、ｍＲＮＡまたは遺伝子の一部を指す。したがって、「開始コドン領域」（または「翻訳開始コドン領域」）および「ストップコドン領域」（または「翻訳終止コドン領域」）はすべて、本発明のアンチセンス化合物を用いて有効に標的にされてもよい領域である。
【００７７】
当技術分野において、翻訳開始コドンおよび翻訳終止コドンの間の領域を指すことが知られているオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）または「コード領域」もまた、有効に標的にされてもよい領域である。本発明の文脈内では、標的領域は、遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の翻訳開始コドンまたは翻訳終止コドンを包含する遺伝子内の領域である。
【００７８】
他の標的領域は、当技術分野において、翻訳開始コドンから５’方向のｍＲＮＡの一部を指すことが知られている５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）を含み、したがって、ｍＲＮＡの５’キャップ部位および翻訳開始コドンの間のヌクレオチド（または遺伝子上の対応するヌクレオチド）を含む。他の標的領域は、当技術分野において、翻訳終止コドンから３’方向のｍＲＮＡの一部を指すことが知られている３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を含み、したがって、ｍＲＮＡの翻訳終止コドンおよび３’末端の間のヌクレオチド（または遺伝子上の対応するヌクレオチド）を含む。ｍＲＮＡの５’キャップ部位は、５’−５’三リン酸連結を介してｍＲＮＡの最も５’の残基に結合されたＮ７メチル化グアノシン残基を含む。ｍＲＮＡの５’キャップ領域は、５’キャップ構造自体およびキャップ部位に近接する最初の５０ヌクレオチドを含むと考えられる。本発明のための他の標的領域は、５’キャップ領域である。
【００７９】
いくつかの真核生物ｍＲＮＡ転写物は、直接翻訳されるが、多数は、それが翻訳される前に、転写物から切り取られる「イントロン」として知られている１つまたは複数の領域を含む。残りの（そのため、翻訳される）領域は、「エキソン」として知られており、ともにスプライスされて、連続的なｍＲＮＡ配列を形成する。一実施形態では、標的スプライス部位、つまりイントロン−エキソンジャンクションまたはエキソン−イントロンジャンクションは、異常なスプライシングが疾患に関係するまたは特定のスプライス産物の過剰産生が疾患に関係する状況において特に有用である。再配列または欠失による異常な融合ジャンクションは、標的部位の他の実施形態である。異なる遺伝子源由来の２つ（またはそれ以上の）ｍＲＮＡのスプライシングのプロセスを介して産生されるｍＲＮＡの転写物は、「融合転写物」として知られている。イントロンは、例えばＤＮＡまたはプレｍＲＮＡを標的にするアンチセンス化合物を使用して有効に標的にすることができる。
【００８０】
一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドのコードおよび／または非コード領域に結合し、標的分子の発現および／または機能を調整する。
【００８１】
一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、天然アンチセンスポリヌクレオチドに結合し、標的分子の発現および／または機能を調整する。
【００８２】
一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、センスポリヌクレオチドに結合し、標的分子の発現および／または機能を調整する。
【００８３】
選択的ＲＮＡ転写物は、ＤＮＡの同じゲノム領域から産生することができる。これらの選択的転写物は、「変異体」として一般に知られている。特に、「プレｍＲＮＡ変異体」は、それらの開始またはストップ位置のどちらかにおいて、同じゲノムＤＮＡから産生された他の転写物と異なり、イントロン配列およびエキソン配列の両方を含む、同じゲノムＤＮＡから産生された転写物である。
【００８４】
スプライシングの間の、１つもしくは複数のエキソン領域もしくはイントロン領域またはその一部の切除に際して、プレｍＲＮＡ変異体は、より小さな「ｍＲＮＡ変異体」を産生する。したがって、ｍＲＮＡ変異体は、処理されたプレｍＲＮＡ変異体であり、特有のプレｍＲＮＡ変異体はそれぞれ、スプライシングの結果として、特有のｍＲＮＡ変異体を常に産生するにちがいない。これらのｍＲＮＡ変異体はまた、「選択的スプライス変異体」としても知られている。プレｍＲＮＡ変異体のスプライシングが行われない場合、プレｍＲＮＡ変異体は、ｍＲＮＡ変異体と同一となる。
【００８５】
変異体は、転写を開始するまたは停止するための選択的シグナルの使用を通して産生することができる。プレｍＲＮＡおよびｍＲＮＡは、１つを超える開始コドンまたはストップコドンを有することができる。選択的開始コドンを使用するプレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡに由来する変異体は、そのプレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡの「選択的開始変異体」として知られている。選択的ストップコドンを使用する転写物は、そのプレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡの「選択的ストップ変異体」として知られている。ある特定のタイプの選択的ストップ変異体は、産生される複数の転写物が、転写機構による「ポリＡストップシグナル」のうちの１つの代替選択に起因する「ポリＡ変異体」であり、それによって、特有のポリＡ部位で終結する転写物が産生される。本発明の文脈内では、本明細書において記載される変異体のタイプもまた、標的核酸の実施形態である。
【００８６】
アンチセンス化合物がハイブリダイズする標的核酸上の位置は、活性アンチセンス化合物が標的にする、標的領域の少なくとも１つの５ヌクレオチド長の部分として定義される。
【００８７】
ある種の例示的な標的セグメントの特異的配列が本明細書において記載されるが、当業者は、これらが、本発明の範囲内の特定の実施形態を示し、説明するために果たすものであることを認識するであろう。追加の標的セグメントは、本開示を考慮し、当業者によって容易に同定可能である。
【００８８】
例証となる好ましい標的セグメント内から選択される、少なくとも５つの（５）連続ヌクレオチドのストレッチを含む長さが５〜１００ヌクレオチドの標的セグメントは、同様に、ターゲティングに適していると考えられる。
【００８９】
標的セグメントは、例証となる好ましい標的セグメントのうちの１つの５’末端から５つの連続ヌクレオチドを少なくとも含むＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列を含むことができる（残りのヌクレオチドは、標的セグメントの５’末端のすぐ上流で始まり、ＤＮＡまたはＲＮＡが約５〜約１００ヌクレオチドを含有するまで続く同じＤＮＡまたはＲＮＡの連続するストレッチである）。同様に、好ましい標的セグメントは、例証となる好ましい標的セグメントのうちの１つの３’末端から５つの連続ヌクレオチドを少なくとも含むＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列によって示される（残りのヌクレオチドは、標的セグメントの３’末端のすぐ下流で始まり、ＤＮＡまたはＲＮＡが約５〜約１００ヌクレオチドを含有するまで続く同じＤＮＡまたはＲＮＡの連続するストレッチである）。本明細書において示される標的セグメントを持つ当業者は、不必要な実験作業を伴わないで、さらに好ましい標的セグメントを同定することができるであろう。
【００９０】
一度、１つまたは複数の標的領域、セグメント、または部位が同定されたら、標的に対して十分に相補的であり、つまり、十分によくかつ十分な特異性でハイブリダイズし、所望の効果を示すアンチセンス化合物が、選ばれる。
【００９１】
本発明の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、特定の標的のアンチセンス鎖に結合する。オリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも５つのヌクレオチドであり、合成することができ、そのため、オリゴヌクレオチドはそれぞれ、重複する配列を標的にし、オリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドの全長を包含するように合成される。標的はまた、コード領域および非コード領域を含む。
【００９２】
一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドによって特異的な核酸を標的にすることが好ましい。特定の核酸に対するアンチセンス化合物のターゲティングは、多段階のプロセスである。プロセスは、通常、その機能が調整されることとなる核酸配列の同定から始まる。これは、例えば、その発現が特定の障害もしくは疾患状態と関連する細胞遺伝子（もしくは遺伝子から転写されるｍＲＮＡ）または例えば非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）などのような非コードポリヌクレオチドであってもよい。
【００９３】
ＲＮＡは、（１）タンパク質に翻訳されるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）および（２）非タンパク質コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）に分類することができる。ｎｃＲＮＡは、マイクロＲＮＡ、アンチセンス転写物、および高密度のストップコドンを含有し、いかなる広範囲な「オープンリーディングフレーム」をも欠く他の転写ユニット（ＴＵ）を含む。多くのｎｃＲＮＡは、タンパク質コード座の３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）における開始部位から開始するように見える。ｎｃＲＮＡは、まれであることが多く、ＦＡＮＴＯＭコンソーシアムによって配列決定されたｎｃＲＮＡの少なくとも半分は、ポリアデニル化されていないように見える。ほとんどの研究者は、明らかな理由で、処理され、細胞質に輸送されるポリアデニル化ｍＲＮＡに注目した。最近、非ポリアデニル化核内ＲＮＡのセットは、非常に大きいかもしれず、多くのそのような転写物は、いわゆる遺伝子間領域から生じることが示された。ｎｃＲＮＡが遺伝子発現を調節するかもしれないメカニズムは、標的転写物との塩基対形成によるものである。塩基対形成によって機能するＲＮＡは、（１）それらが作用するＲＮＡに対して反対の鎖上であるが、同じ遺伝子位置でコードされ、そのため、それらの標的に対して完全な相補性を示すシスコードＲＮＡおよび（２）それらが作用するＲＮＡとは異なる染色体の位置でコードされ、一般に、それらの標的との完全な塩基対形成潜在能力を示さないトランスコードＲＮＡに分類することができる。
【００９４】
理論によって束縛されることを望むものではないが、本明細書において記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドによるアンチセンスポリヌクレオチドの混乱は、対応するセンスメッセンジャーＲＮＡの発現を改変することができる。しかしながら、この調節は、不調和となり得る（アンチセンスノックダウンは、メッセンジャーＲＮＡの上昇を結果として生じる）または調和し得る（アンチセンスノックダウンは、同時のメッセンジャーＲＮＡの低下を結果として生じる）。これらの場合では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンス転写物の重複または非重複部分を標的にし、そのノックダウンまたは除去を結果として生じ得る。非コードアンチセンスおよびコードアンチセンスは、同一の方法で標的にすることができ、どちらの種類も、調和しているまたは非調和性の方法で、対応するセンス転写物を調節することができる。標的に対して使用するための新しいオリゴヌクレオチドを同定するのに用いられる戦略は、アンチセンスオリゴヌクレオチドによるアンチセンスＲＮＡ転写物のノックダウンまたは所望の標的を調整する任意の他の手段に基づくものとすることができる。
【００９５】
戦略１：不調和な調節の場合には、アンチセンス転写物のノックダウンは、通常の（センス）遺伝子の発現を上昇させる。後者の遺伝子が、知られているまたは推定上の薬剤標的をコードする場合、そのアンチセンス対応物のノックダウンは、おそらく、受容体アゴニストまたは酵素刺激薬の作用を模倣することができる。
【００９６】
戦略２：調和した調節の場合には、アンチセンス転写物およびセンス転写物の両方を同時にノックダウンし、それによって、通常の（センス）遺伝子発現の共同的な低下を達成することができる。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドがノックダウンを達成するために使用される場合、この戦略は、センス転写物を標的にする一方のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび対応するアンチセンス転写物に対する他方のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは重複するセンス転写物およびアンチセンス転写物を同時に標的にする、単一のエネルギー的に対称なアンチセンスオリゴヌクレオチドを適用するために使用することができる。
【００９７】
本発明によれば、アンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、外部ガイド配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ化合物、ｓｉＲＮＡ化合物などのような一本鎖または二本鎖ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）化合物、ならびに標的核酸の少なくとも一部にハイブリダイズし、その機能を調整する他のオリゴマー化合物を含む。そのため、それらは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ様、ＲＮＡ様、もしくはその混合物またはこれらの１つもしくは複数のミメティックであってもよい。これらの化合物は、一本鎖、二本鎖、環状、ヘアピンオリゴマー化合物であってもよく、内部または末端のバルジ、ミスマッチ、またはループなどのような構造エレメントを含有していてもよい。アンチセンス化合物は、ルーチン的に、直線的に調製されるが、結合することができるまたはその他に、環状および／または分岐となるように調製される。アンチセンス化合物は、例えば、ハイブリダイズし、全体としてもしくは部分的に二本鎖化合物を形成する２つの鎖またはハイブリダイゼーションおよび完全にもしくは部分的に二本鎖の化合物の形成を可能にするのに十分な自己相補性を有する単一の鎖などのような構築物を含むことができる。２つの鎖は、内部で連結して、遊離３’または５’末端を残すことができるまたは連結して、連続的なヘアピン構造もしくはループを形成することができる。ヘアピン構造は、５’または３’末端のいずれかの上にオーバーハングを含有し、一本鎖様式の伸長をもたらしてもよい。二本鎖化合物は、任意選択で、末端上にオーバーハングを含むことができる。さらなる修飾は、末端、選択されたヌクレオチド位置、糖位置のうちの１つまたはヌクレオシド間連結のうちの１つに付加されるコンジュゲート基を含むことができる。あるいは、２つの鎖は、非核酸部分またはリンカー基を介して連結することができる。ｄｓＲＮＡは、１つのみの鎖から形成される場合、それ自体、折り返して、二重鎖を形成する自己相補的なヘアピン型分子の形態をとることができる。したがって、ｄｓＲＮＡは、完全にまたは部分的に二本鎖となることができる。遺伝子発現の特異的な修飾は、トランスジェニック細胞系におけるｄｓＲＮＡヘアピンの安定した発現によって達成することができるが、いくつかの実施形態では、遺伝子発現または機能は、アップレギュレートされる。それ自体、折り返して、二重鎖を形成する自己相補的なヘアピン型分子の形態をとる２つの鎖または単一の鎖から形成される場合、２つの鎖（または単一の鎖の二重鎖形成領域）は、ワトソンクリック様式で塩基対形成する相補的ＲＮＡ鎖である。
【００９８】
一度、系に導入されたら、本発明の化合物は、標的核酸の切断もしくは他の修飾を達成するために、１つもしくは複数の酵素もしくは構造タンパク質の作用を誘発してもよいまたは占有ベースのメカニズムを介して作用してもよい。一般に、核酸（オリゴヌクレオチドを含む）は、「ＤＮＡ様」（つまり、１つもしくは複数の２’−デオキシ糖および一般にＵ塩基ではなくＴ塩基を一般に有する）または「ＲＮＡ様」（つまり、１つもしくは複数の２’−ヒドロキシルもしくは２’−修飾糖および一般にＴ塩基ではなくＵ塩基を一般に有する）と記載されてもよい。核酸ヘリックスは、１つを超えるタイプの構造、最も一般に、ＡおよびＢ形構造をとることができる。一般に、Ｂ形様構造を有するオリゴヌクレオチドは、「ＤＮＡ様」であり、Ａ形様構造を有するものは「ＲＮＡ様」であると考えられる。いくつかの（キメラの）実施形態では、アンチセンス化合物は、ＡおよびＢ形構造領域の両方を含有していてもよい。
【００９９】
一実施形態では、所望のオリゴヌクレオチドまたはアンチセンス化合物は、少なくとも１つの：アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、キメラアンチセンスオリゴヌクレオチド、修飾連結を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）；マイクロ干渉ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）；小分子ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）；もしくは低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）；小型ＲＮＡ誘発性遺伝子活性化（ＲＮＡａ）；小型活性化ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ＲＮＡ）（ｓａＲＮＡ）、またはその組み合わせを含む。
【０１００】
ｄｓＲＮＡはまた、遺伝子発現、「小型ＲＮＡ誘発性遺伝子活性化」またはＲＮＡａと称されるメカニズムを活性化することができる。遺伝子プロモーターを標的にするｄｓＲＮＡは、関連する遺伝子の強力な転写活性化を誘発する。ＲＮＡａは、「小型活性化ＲＮＡ」（ｓａＲＮＡ）と称される合成ｄｓＲＮＡを使用してヒト細胞において実証された。ＲＮＡａが他の生物において保存されているかどうかは現在、知られていない。
【０１０１】
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）などのような小さな二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られている、進化的に保存されたメカニズムのトリガーであることが分かった。ＲＮＡｉは、クロマチンを再構築し、それによって転写を抑制すること、相補的ｍＲＮＡを分解すること、またはタンパク質翻訳をブロックすることを介して、常に、遺伝子サイレンシングを導く。しかしながら、続く実施例の部において詳細に説明される実例では、オリゴヌクレオチドは、膜結合転写因子ペプチダーゼ、部位１（ＭＢＴＰＳ１）ポリヌクレオチドおよびそのコード産物の発現および／または機能を増加させることが示される。ｄｓＲＮＡはまた、小型活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）として作用してもよい。理論によって束縛されることを望むものではないが、遺伝子プロモーター中の配列を標的にすることによって、ｓａＲＮＡは、ｄｓＲＮＡ誘発性転写活性化（ＲＮＡａ）と呼ばれる事象において標的遺伝子発現を誘発するであろう。
【０１０２】
さらなる実施形態では、本明細書において同定される「好ましい標的セグメント」は、膜結合転写因子ペプチダーゼ、部位１（ＭＢＴＰＳ１）ポリヌクレオチドの発現を調整する追加の化合物についてのスクリーニングにおいて用いられてもよい。「修飾因子」は、ＭＢＴＰＳ１をコードする核酸分子の発現を減少させまたは増加させ、好ましい標的セグメントに対して相補的な少なくとも１つの５ヌクレオチド部分を含む化合物である。スクリーニング方法は、ＭＢＴＰＳ１のセンスまたは天然アンチセンスポリヌクレオチドをコードする核酸分子の好ましい標的セグメントを１つまたは複数の候補修飾因子と接触させるステップおよびＭＢＴＰＳ１ポリヌクレオチドをコードする核酸分子の発現を減少させるまたは増加させる１つまたは複数の候補修飾因子、例えば配列番号３〜６を選択するステップを含む。一度、候補修飾因子（複数可）が、ＭＢＴＰＳ１ポリヌクレオチドをコードする核酸分子の発現を調整することができること（例えば減少させるまたは増加させる）が示されたら、修飾因子は、ＭＢＴＰＳ１ポリヌクレオチドの機能に関するさらなる調査研究においてまたは本発明に従って、研究剤、診断剤、もしくは治療剤として使用するために用いられてもよい。
【０１０３】
天然アンチセンス配列のターゲティングは、好ましくは、標的遺伝子の機能を調整する。例えば、ＭＢＴＰＳ１遺伝子（例えば受入番号ＮＭ＿００３７９１）。一実施形態では、標的は、ＭＢＴＰＳ１遺伝子のアンチセンスポリヌクレオチドである。一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＭＢＴＰＳ１ポリヌクレオチド（例えば受入番号ＮＭ＿００３７９１）、変異体、対立遺伝子、アイソフォーム、相同体、突然変異体、誘導体、断片、およびそれに対する相補配列のセンスおよび／または天然アンチセンス配列を標的にする。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、アンチセンス分子であり、標的は、アンチセンスＭＢＴＰＳ１ポリヌクレオチドおよび／またはセンスＭＢＴＰＳ１ポリヌクレオチドのコード領域および非コード領域を含む。
【０１０４】
本発明の好ましい標的セグメントはまた、安定化した二本鎖（二重）オリゴヌクレオチドを形成するために、本発明のそれぞれの相補的アンチセンス化合物と組み合わせられてもよい。
【０１０５】
そのような二本鎖オリゴヌクレオチド部分は、標的発現を調整し、アンチセンスメカニズムを介して翻訳およびＲＮＡプロセシングを調節することが当技術分野において示されている。さらに、二本鎖部分は、化学修飾にかけられてもよい。例えば、そのような二本鎖部分は、二重鎖のうちのアンチセンス鎖の標的への典型的なハイブリダイゼーションによって、標的を阻害し、それによって、標的の酵素分解を引き起こすことが示された。
【０１０６】
一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、膜結合転写因子ペプチダーゼ、部位１（ＭＢＴＰＳ１）ポリヌクレオチド（例えば受入番号ＮＭ＿００３７９１）、変異体、対立遺伝子、アイソフォーム、相同体、突然変異体、誘導体、断片、およびそれに対する相補配列を標的にする。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、アンチセンス分子である。
【０１０７】
本発明の実施形態に従って、標的核酸分子は、ＭＢＴＰＳ１のみに限定されず、ＭＢＴＰＳ１分子のアイソフォーム、受容体、相同体、およびその他同種のもののいずれにも及ぶ。
【０１０８】
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＭＢＴＰＳ１ポリヌクレオチドの天然アンチセンス配列、例えば配列番号２として記載されるポリヌクレオチドならびに任意の変異体、対立遺伝子、相同体、突然変異体、誘導体、断片、およびそれに対する相補配列を標的にする。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号３〜６として記載される。
【０１０９】
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、限界を伴うことなく、ＭＢＴＰＳ１ポリヌクレオチドと関連する非コードセンス配列および／または非コードアンチセンス配列を含むＭＢＴＰＳ１アンチセンスの核酸配列に相補的でありまたはそれに結合し、ＭＢＴＰＳ１分子の発現および／または機能を調整する。
【０１１０】
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号２として記載されるＭＢＴＰＳ１天然アンチセンスの核酸配列に相補的でありまたはそれに結合し、ＭＢＴＰＳ１分子の発現および／または機能を調整する。
【０１１１】
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号３〜６の少なくとも５つの連続ヌクレオチドの配列を含み、ＭＢＴＰＳ１分子の発現および／または機能を調整する。
【０１１２】
ポリヌクレオチド標的は、そのファミリーメンバー、ＭＢＴＰＳ１の変異体；ＳＮＰを含むＭＢＴＰＳ１の突然変異体；ＭＢＴＰＳ１の非コード化配列；ＭＢＴＰＳ１の対立遺伝子；種変異体、断片、およびその他同種のものを含むＭＢＴＰＳ１を含む。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、アンチセンス分子である。
【０１１３】
一実施形態では、ＭＢＴＰＳ１ポリヌクレオチドを標的にするオリゴヌクレオチドは、アンチセンスＲＮＡ、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）；マイクロ干渉ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）；小分子ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）；もしくは低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）；小型ＲＮＡ誘発性遺伝子活性化（ＲＮＡａ）；または小型活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）を含む。
【０１１４】
一実施形態では、膜結合転写因子ペプチダーゼ、部位１（ＭＢＴＰＳ１）ポリヌクレオチド、例えば配列番号２のターゲティングは、これらの標的の発現または機能を調整する。一実施形態では、発現または機能は、対照と比較してアップレギュレートされる。一実施形態では、発現または機能は、対照と比較してダウンレギュレートされる。
【０１１５】
一実施形態では、アンチセンス化合物は、配列番号３〜６として記載される配列を含む。これらのオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の修飾ヌクレオチド、より短いまたはより長い断片、修飾結合、およびその他同種のものを含むことができる。
【０１１６】
一実施形態において、配列番号３〜６は、１つまたは複数のＬＮＡヌクレオチドを含む。
【０１１７】
所望の標的核酸の修飾は、当技術分野において知られているいくつかの方法において実行することができる。例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡなど、酵素核酸分子（例えばリボザイム）は、ヌクレオチド塩基配列特異的な方法において、他の別々の核酸分子を繰り返し切断する能力を含めて、１つまたは複数の様々な反応を触媒することができる核酸分子である。そのような酵素核酸分子は、例えば、事実上あらゆるＲＮＡ転写物を標的にするために使用することができる。
【０１１８】
それらの配列特異性のために、トランス切断酵素核酸分子は、ヒト疾患のための治療剤としての見込みを示す（Ｕｓｍａｎ  ＆  ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ，  （１９９５）  Ａｎｎ．  Ｒｅｐ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ３０，  ２８５−２９４；  Ｃｈｒｉｓｔｏｆｆｅｒｓｅｎ  ａｎｄ  Ｍａｒｒ，  （１９９５）  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ３８，  ２０２３−２０３７）。酵素核酸分子は、細胞ＲＮＡの環境内で特異的なＲＮＡ標的を切断するように設計することができる。そのような切断事象は、ｍＲＮＡを非機能性にし、そのＲＮＡからのタンパク質発現を抑止する。このように、疾患状態と関連するタンパク質の合成は、選択的に阻害することができる。
【０１１９】
一般に、ＲＮＡ切断活性を有する酵素核酸は、最初に標的ＲＮＡに結合することによって作用する。そのような結合は、標的ＲＮＡを切断するように作用する分子の酵素部分の近くに保持される、酵素核酸の標的結合部分を通して生じる。したがって、酵素核酸は、最初に、標的ＲＮＡを認識し、次いで、相補的塩基対形成を通してそれに結合し、一度、正確な部位に結合したら、酵素的に作用して、標的ＲＮＡを切断する。そのような標的ＲＮＡの戦略的切断は、コードされたタンパク質の合成を指示するその能力を破壊するであろう。酵素核酸がそのＲＮＡ標的に結合し、それを切断した後、それは、そのＲＮＡから放出され、他の標的を探索し、新しい標的に繰り返し結合し、切断することができる。
【０１２０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択（進化）戦略などのようないくつかのアプローチ（Ｏｒｇｅｌ，  （１９７９）  Ｐｒｏｃ．  Ｒ．  Ｓｏｃ．  Ｌｏｎｄｏｎ，  Ｂ  ２０５，  ４３５）は、ホスホジエステル連結およびアミド連結の切断およびライゲーションなどのような、様々な反応を触媒することができる新しい核酸触媒を進化させるために使用されてきた。
【０１２１】
触媒活性に最適なリボザイムの開発は、遺伝子発現を調節する目的でＲＮＡを切断するリボザイムを用いるあらゆる戦略に有意に寄与するであろう。ハンマーヘッド型リボザイムは、例えば、飽和濃度（１０ｍＭ）のＭｇ２＋補助因子の存在下において約１分−１の触媒反応速度（ｋｃａｔ）で機能する。人工「ＲＮＡリガーゼ」リボザイムは、約１００分−１の速度で対応する自己修飾反応を触媒することが示された。さらに、ＤＮＡから構成される基質結合アームを有するある種の修飾ハンマーヘッド型リボザイムは、１００分−１に近い、複数回の交換回数でＲＮＡ切断を触媒することが知られている。最後に、ハンマーヘッドの触媒コア内の特異的な残基のある種のヌクレオチド類似体との交換は、触媒反応速度における１０倍もの改善を示す修飾リボザイムを生ずる。これらの発見は、リボザイムが、ほとんどの天然自己切断リボザイムによってｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて示されるものよりも、有意に高い触媒反応速度で、化学変化を促進することができることを実証する。次いで、可能性として、ある種の自己切断リボザイムの構造は、最大の触媒活性を生ずるように最適化されてもよいまたはＲＮＡホスホジエステル切断について有意により速い速度を示す全く新しいＲＮＡモチーフを作製することができる。
【０１２２】
「ハンマーヘッド」モデルに適合するＲＮＡ触媒によるＲＮＡ基質の分子間切断は、１９８７年において最初に示された（Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，  Ｏ．  Ｃ．  （１９８７）  Ｎａｔｕｒｅ，  ３２８：  ５９６−６００）。ＲＮＡ触媒は、回収され、複数のＲＮＡ分子と反応させ、それが本当に触媒作用的であったことを実証した。
【０１２３】
「ハンマーヘッド」モチーフに基づいて設計された触媒ＲＮＡは、標的配列との必要な塩基対形成を維持するために、触媒ＲＮＡにおいて適切な塩基の変化を加えることによって特異的な標的配列を切断するために使用されてきた。これは、触媒ＲＮＡの使用により、特異的な標的配列を切断することを可能にし、「ハンマーヘッド」モデルに従って設計された触媒ＲＮＡが、おそらく、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて特異的な基質ＲＮＡを切断するかもしれないことを示す。
【０１２４】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、哺乳動物および哺乳動物細胞において遺伝子発現を調整するための強力なツールになった。このアプローチは、発現プラスミドまたはウイルスおよびｓｉＲＮＡに処理される低分子ヘアピン型ＲＮＡについてのコード配列を使用する、ＲＮＡ自体またはＤＮＡとしての低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の送達を必要とする。この系は、細胞質へのプレｓｉＲＮＡの効率的な運搬を可能にし、ここで、それらは、遺伝子発現のために、活性となり、調節性組織特異的プロモーターの使用を可能にする。
【０１２５】
一実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはアンチセンス化合物は、リボ核酸（ＲＮＡ）および／もしくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはそのミメティック、キメラ、アナログ、もしくは相同体のオリゴマーまたはポリマーを含む。この用語は、天然に存在するヌクレオチド、糖、および共有結合ヌクレオシド間（主鎖）連結から構成されるオリゴヌクレオチドならびに同様に機能する天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドを含む。そのような修飾オリゴヌクレオチドまたは置換オリゴヌクレオチドは、例えば、細胞取り込みの増強、標的核酸に対する親和性の増強、およびヌクレアーゼの存在下における安定性の増加などのような、望ましい特性のために、天然の形態よりも所望されることが多い。
【０１２６】
本発明によれば、オリゴヌクレオチドまたは「アンチセンス化合物」は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（例えばＲＮＡ、ＤＮＡ、ミメティック、キメラ、アナログ、またはその相同体）、リボザイム、外部ガイド配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ化合物、ｓｉＲＮＡ化合物などのような一本鎖または二本鎖ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）化合物、ｓａＲＮＡ、ａＲＮＡ、および標的核酸の少なくとも一部にハイブリダイズし、その機能を調整する他のオリゴマー化合物を含む。そのため、それらは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ様、ＲＮＡ様、もしくはその混合物またはこれらの１つもしくは複数のミメティックであってもよい。これらの化合物は、一本鎖、二本鎖、環状、ヘアピンオリゴマー化合物であってもよく、内部または末端のバルジ、ミスマッチ、またはループなどのような構造エレメントを含有していてもよい。アンチセンス化合物は、ルーチン的に、直線的に調製されるが、結合することができるまたはその他に、環状および／または分岐となるように調製される。アンチセンス化合物は、例えば、ハイブリダイズし、全体としてもしくは部分的に二本鎖化合物を形成する２つの鎖またはハイブリダイゼーションおよび完全にもしくは部分的に二本鎖の化合物の形成を可能にするのに十分な自己相補性を有する単一の鎖などのような構築物を含むことができる。２つの鎖は、内部で連結して、遊離３’または５’末端を残すことができるまたは連結して、連続的なヘアピン構造もしくはループを形成することができる。ヘアピン構造は、５’または３’末端のいずれかの上にオーバーハングを含有し、一本鎖様式の伸長をもたらしてもよい。二本鎖化合物は、任意選択で、末端上にオーバーハングを含むことができる。さらなる修飾は、末端、選択されたヌクレオチド位置、糖位置のうちの１つまたはヌクレオシド間連結のうちの１つに付加されるコンジュゲート基を含むことができる。あるいは、２つの鎖は、非核酸部分またはリンカー基を介して連結することができる。ｄｓＲＮＡは、１つのみの鎖から形成される場合、それ自体、折り返して、二重鎖を形成する自己相補的なヘアピン型分子の形態をとることができる。したがって、ｄｓＲＮＡは、完全にまたは部分的に二本鎖となることができる。遺伝子発現の特異的な修飾は、トランスジェニック細胞系におけるｄｓＲＮＡヘアピンの安定した発現によって達成することができる。それ自体、折り返して、二重鎖を形成する自己相補的なヘアピン型分子の形態をとる２つの鎖または単一の鎖から形成される場合、２つの鎖（または単一の鎖の二重鎖形成領域）は、ワトソンクリック様式で塩基対形成する相補的ＲＮＡ鎖である。
【０１２７】
一度、系に導入されたら、本発明の化合物は、標的核酸の切断もしくは他の修飾を達成するために、１つもしくは複数の酵素もしくは構造タンパク質の作用を誘発してもよいまたは占有ベースのメカニズムを介して作用してもよい。一般に、核酸（オリゴヌクレオチドを含む）は、「ＤＮＡ様」（つまり、１つもしくは複数の２’−デオキシ糖および一般にＵ塩基ではなくＴ塩基を一般に有する）または「ＲＮＡ様」（つまり、１つもしくは複数の２’−ヒドロキシルもしくは２’−修飾糖および一般にＴ塩基ではなくＵ塩基を一般に有する）と記載されてもよい。核酸ヘリックスは、１つを超えるタイプの構造、最も一般に、ＡおよびＢ形構造をとることができる。一般に、Ｂ形様構造を有するオリゴヌクレオチドは、「ＤＮＡ様」であり、Ａ形様構造を有するものは「ＲＮＡ様」であると考えられる。いくつかの（キメラの）実施形態では、アンチセンス化合物は、ＡおよびＢ形構造領域の両方を含有していてもよい。
【０１２８】
本発明に従うアンチセンス化合物は、長さが約５〜約８０ヌクレオチド（つまり約５〜約８０の連結ヌクレオシド〜）のアンチセンス部分を含むことができる。これは、アンチセンス鎖またはアンチセンス化合物の一部の長さを指す。言いかえれば、本発明の一本鎖アンチセンス化合物は、５〜約８０のヌクレオチドを含み、本発明の二本鎖アンチセンス化合物（例えばｄｓＲＮＡなど）は、長さが５〜約８０ヌクレオチドのセンス鎖およびアンチセンス鎖またはその一部を含む。当業者は、これが、長さが５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、もしくは８０ヌクレオチドのまたはその内の任意の範囲の、アンチセンスの一部を包含することを十分に理解するであろう。
【０１２９】
一実施形態では、本発明のアンチセンス化合物は、長さが１０〜５０ヌクレオチドの、アンチセンス部分を有する。当業者は、これが、長さが１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０ヌクレオチドのまたはその内の任意の範囲の、アンチセンス一部を有するオリゴヌクレオチドを包含することを十分に理解するであろう。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが１５ヌクレオチドである。
【０１３０】
一実施形態では、本発明のアンチセンス化合物は、長さが１２または１３〜３０ヌクレオチドの、アンチセンス部分を有する。当業者は、これが、長さが１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０ヌクレオチドのまたはその内の任意の範囲のアンチセンス部分を有するアンチセンス化合物を包含することを十分に理解するであろう。
【０１３１】
一実施形態では、本発明のオリゴマー化合物はまた、異なる塩基が化合物中の１つまたは複数のヌクレオチド位置に存在する変異体を含む。例えば、第１のヌクレオチドがアデノシンである場合、この位置にチミジン、グアノシン、またはシチジンを含有する変異体が、産生されてもよい。これは、アンチセンス化合物またはｄｓＲＮＡ化合物の位置のいずれにおいてももたらされてもよい。次いで、これらの化合物は、標的核酸の発現を阻害するそれらの能力を決定するために本明細書において記載される方法を使用して試験される。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、アンチセンス化合物および標的の間の相同性、配列同一性、または相補性は、約４０％〜約６０％である。いくつかの実施形態では、相同性、配列同一性、または相補性は、約６０％〜約７０％である。いくつかの実施形態では、相同性、配列同一性、または相補性は、約７０％〜約８０％である。いくつかの実施形態では、相同性、配列同一性、または相補性は、約８０％〜約９０％である。いくつかの実施形態では、相同性、配列同一性、または相補性は、約９０％、約９２％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％である。
【０１３３】
一実施形態において、例えば配列番号２〜６において記載される核酸分子などのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の置換または修飾を含む。一実施形態では、ヌクレオチドは、ロックド核酸（ＬＮＡ）と置換される。
【０１３４】
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＭＢＴＰＳ１と関連するコード配列および／または非コード配列の核酸分子センスおよび／またはアンチセンスならびに配列番号１および２として記載される配列の１つまたは複数の領域を標的にする。オリゴヌクレオチドはまた、配列番号１および２の重複領域を標的にする。
【０１３５】
本発明のある種の好ましいオリゴヌクレオチドは、キメラオリゴヌクレオチドである。本発明との関連における「キメラオリゴヌクレオチド」または「キメラ」は、それぞれ少なくとも１つのヌクレオチドから構成される２つ以上の化学的に別個の領域を含有するオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的に、１つまたは複数の有益な特性（例えば、ヌクレアーゼ抵抗性の増加、細胞への取り込みの増加、標的に対する結合親和性の増加など）を与える、修飾ヌクレオチドの少なくとも１つの領域およびＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することができる酵素に対する基質である領域を含有する。例として、ＲＮアーゼＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。ＲＮアーゼＨの活性化は、そのため、ＲＮＡ標的の切断を結果として生じ、それによって、遺伝子発現のアンチセンス修飾の効率を大幅に増強する。したがって、同じ標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドと比較して、キメラオリゴヌクレオチドが使用される場合、同等の結果は、より短いオリゴヌクレオチドにより得ることができる。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動および必要な場合、当技術分野において知られている関連する核酸ハイブリダイゼーション技術によってルーチン的に検出することができる。一実施形態では、キメラオリゴヌクレオチドは、標的結合親和性を増加させるために修飾された少なくとも１つの領域および通常、ＲＮアーゼＨに対する基質として作用する領域を含む。その標的（この場合ｒａｓをコードする核酸）に対するオリゴヌクレオチドの親和性は、オリゴヌクレオチドおよび標的が解離する温度である、オリゴヌクレオチド／標的対のＴｍを測定することによってルーチン的に決定され、解離は、分光光度的に検出される。Ｔｍが高いほど、標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性は大きい。
【０１３６】
本発明のキメラアンチセンス化合物は、２つ以上の上記に記載されるオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、および／またはオリゴヌクレオチドミメティックの複合構造として形成されてもよい。そのような化合物はまた、当技術分野においてハイブリッドまたはギャップマーと呼ばれてきた。そのようなハイブリッド構造の調製を教示する代表的な米国の特許は、米国特許第５，０１３，８３０号；第５，１４９，７９７号；第５，２２０，００７号；第５，２５６，７７５号；第５，３６６，８７８号；第５，４０３，７１１号；第５，４９１，１３３号；第５，５６５，３５０号；第５，６２３，０６５号；第５，６５２，３５５号；第５，６５２，３５６号；および第５，７００，９２２号明細書を含み、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれるが、これらに限定されない。
【０１３７】
一実施形態では、修飾されるオリゴヌクレオチドの領域は、糖の２’位で修飾される少なくとも１つのヌクレオチド、最も好ましくは、２’−Ｏアルキル、２’−Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル、または２’−フルオロ修飾ヌクレオチドを含む。他の一実施形態では、ＲＮＡ修飾は、ピリミジンのリボース上の２’−フルオロ、２’−アミノ、および２’Ｏ−メチル修飾、脱塩基残基、またはＲＮＡの３’末端の逆位塩基を含む。そのような修飾は、オリゴヌクレオチドにルーチン的に組み込まれ、これらのオリゴヌクレオチドは、所与の標的に対して、２’−デオキシオリゴヌクレオチドよりも高いＴｍ（つまり、より高い標的結合親和性）を有することが示された。そのような親和性の増加の効果は、遺伝子発現のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド阻害を大幅に増強することである。ＲＮアーゼＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼであり、この酵素の活性化は、そのため、ＲＮＡ標的の切断を結果として生じ、したがって、ＲＮＡｉ阻害の効率を大幅に増強することができる。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動によってルーチン的に実証することができる。一実施形態では、キメラオリゴヌクレオチドはまた、ヌクレアーゼ抵抗性を増強するために修飾される。細胞は、核酸を分解することができる様々なエキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼを含有する。多くのヌクレオチドおよびヌクレオシドの修飾は、それらが組み込まれるオリゴヌクレオチドを、天然のオリゴデオキシヌクレオチドよりもヌクレアーゼ分解に対してより抵抗性にすることが示された。ヌクレアーゼ抵抗性は、細胞抽出物または単離ヌクレアーゼ溶液とオリゴヌクレオチドをインキュベートし、通常ゲル電気泳動によって、ある期間にわたって残る無傷のオリゴヌクレオチドの程度を測定することによってルーチン的に測定される。それらのヌクレアーゼ抵抗性を増強するように修飾されたオリゴヌクレオチドは、非修飾オリゴヌクレオチドよりも長い時間、無傷で耐える。様々なオリゴヌクレオチド修飾は、ヌクレアーゼ抵抗性を増強するまたは与えることが実証されている。少なくとも１つのホスホロチオエート修飾を含有するオリゴヌクレオチドは、現在もっと好ましい。ある場合には、標的結合親和性を増強するオリゴヌクレオチド修飾はまた、独立して、ヌクレアーゼ抵抗性を増強することができる。
【０１３８】
本発明のために構想されるいくつかの好ましいオリゴヌクレオチドの特定の例は、修飾主鎖、例えばホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、短鎖アルキルもしくはシクロアルキル糖間連結、または短鎖ヘテロ原子もしくはヘテロ環式糖間連結を含むものを含む。ホスホロチオエート主鎖を有するオリゴヌクレオチドおよびヘテロ原子主鎖を有するもの、特に、ＣＨ２  −−ＮＨ−−Ｏ−−ＣＨ２、ＣＨ、−−Ｎ（ＣＨ３）−−Ｏ−−ＣＨ２［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ主鎖として知られている］、ＣＨ２−−Ｏ−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２、ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２、およびＯ−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−ＣＨ２  主鎖が最も好ましく、天然のホスホジエステル主鎖は、Ｏ−−Ｐ−−Ｏ−−ＣＨとして示される。Ｄｅ  Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）  Ａｃｃ．  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｓ．  ２８：３６６−３７４によって開示されるアミド主鎖もまた、好ましい。モルホリノ主鎖構造を有するオリゴヌクレオチドもまた、好ましい（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｅｒ、米国特許第５，０３４，５０６号明細書）。他の一実施形態では、ペプチド核酸（ＰＮＡ）主鎖などのように、オリゴヌクレオチドのホスホジエステル主鎖は、ポリアミド主鎖と交換され、ヌクレオチドは、ポリアミド主鎖のアザ窒素原子に直接または間接的に結合される。オリゴヌクレオチドはまた、１つまたは複数の置換糖部分を含んでいてもよい。好ましいオリゴヌクレオチドは、２’位に以下：ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ３、Ｆ、ＯＣＮ、ＯＣＨ３  ＯＣＨ３、ＯＣＨ３  Ｏ（ＣＨ２）ｎ  ＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎ  ＮＨ２、またはＯ（ＣＨ２）ｎ  ＣＨ３、ここで、ｎは、１〜約１０である、Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、アルコキシアルコキシ、置換低級アルキル、アルカリール、またはアラルキル；Ｃｌ；  Ｂｒ；  ＣＮ；  ＣＦ３  ；  ＯＣＦ３；Ｏ−−、Ｓ−−、またはＮ−アルキル；Ｏ−−、Ｓ−−、またはＮ−アルケニル；ＳＯＣＨ３；ＳＯ２  ＣＨ３；ＯＮＯ２；ＮＯ２；Ｎ３；ＮＨ２；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリール；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換シリル；ＲＮＡ切断基；レポーター基；干渉物質；オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改善するための基；またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基、および同様の特性を有する他の置換基のうちの１つを含む。好ましい修飾は、２’−メトキシエトキシ［２’−Ｏ−ＣＨ２  ＣＨ２  ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）としても知られている］を含む。他の好ましい修飾は、２’−メトキシ（２’−Ｏ−−ＣＨ３）、２’−プロポキシ（２’−ＯＣＨ２  ＣＨ２ＣＨ３）、および２’−フルオロ（２’−Ｆ）を含む。同様の修飾はまた、オリゴヌクレオチド上の他の位置、特に、３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位および５’末端ヌクレオチドの５’位で成されてもよい。オリゴヌクレオチドはまた、ペントフラノシル基の代わりにシクロブチルなどのような糖ミメティックを有していてもよい。
【０１３９】
オリゴヌクレオチドはまた、さらにまたはその代わりに、核酸塩基（当技術分野において単に「塩基」と呼ばれることが多い）の修飾または置換をも含んでいてもよい。本明細書において使用される、「非修飾」または「天然」ヌクレオチドは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）を含む。修飾ヌクレオチドは、天然の核酸においてまれにまたは一時的にのみ見つけられるヌクレオチド、例えばヒポキサンチン、６−メチルアデニン、５−Ｍｅピリミジン、特に５−メチルシトシン（５−メチル−２’デオキシシトシンとも呼ばれ、当技術分野において５−Ｍｅ−Ｃと呼ばれることが多い）、５−ヒドロキシメチルシトシン（ＨＭＣ）、グリコシルＨＭＣ、およびゲントブシルＨＭＣならびに合成ヌクレオチド、例えば２−アミノアデニン、２−（メチルアミノ）アデニン、２−（イミダゾリルアルキル）アデニン、２−（アミノアルキルアミノ）アデニン、他のヘテロ置換アルキルアデニン、２−チオウラシル、２−チオチミン、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、８−アザグアニン、７−デアザグアニン、Ｎ６（６−アミノヘキシル）アデニン、および２，６−ジアミノプリンを含む。当技術分野において知られている「一般的な」塩基、例えばイノシンが含まれていてもよい。５−Ｍｅ−Ｃ置換は、０．６〜１．２℃、核酸二重鎖安定性を増加させることが示され、現在好ましい塩基置換である。
【０１４０】
本発明のオリゴヌクレオチドの他の修飾は、オリゴヌクレオチドの活性または細胞の取り込みを増強する、１つまたは複数の部分またはコンジュゲートをオリゴヌクレオチドに化学的に連結することを伴う。そのような部分は、コレステロール部分、コレステリル部分、脂肪鎖、例えばドデカンジオール残基もしくはウンデシル残基、ポリアミン鎖もしくはポリエチレングリコール鎖、またはアダマンタン酢酸などのような脂質部分を含むが、これらに限定されない。親油性部分を含むオリゴヌクレオチドおよびそのようなオリゴヌクレオチドを調製するための方法は、当技術分野、例えば米国特許第５，１３８，０４５号、第５，２１８，１０５号、および第５，４５９，２５５号明細書において知られている。
【０１４１】
所与のオリゴヌクレオチドにおけるすべての位置が均一に修飾される必要はなく、実際、１つを超える前述の修飾は、単一のオリゴヌクレオチド中にまたはオリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシド内にさえ組み込まれてもよい。本発明はまた、上文に定義されるキメラオリゴヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドを含む。
【０１４２】
他の実施形態では、本発明の核酸分子は、脱塩基ヌクレオチド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、脂質、またはポリ炭化水素化合物を含むが、これらに限定されない他の部分とコンジュゲートされる。当業者らは、これらの分子を、糖、塩基、またはリン酸基上のいくつかの位置に、核酸分子を含む１つまたは複数の任意のヌクレオチドに連結することができることを認識するであろう。
【０１４３】
本発明に従って使用されるオリゴヌクレオチドは、固相合成のよく知られている技術を通して好都合にかつルーチン的に作製されてもよい。そのような合成のための設備は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓを含むいくつかのベンダーによって販売されている。そのような合成のための任意の他の手段もまた、用いられてもよい；オリゴヌクレオチドの実際の合成は、十分に、当業者の能力の範囲内にある。ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体などのような他のオリゴヌクレオチドを調製するための同様の技術を使用することもまた、よく知られている。蛍光標識オリゴヌクレオチド、ビオチン化オリゴヌクレオチド、またはコレステロール修飾オリゴヌクレオチドなどのような他の修飾オリゴヌクレオチドを合成するために、ビオチン、フルオレセイン、アクリジン、もしくはソラレン修飾アミダイトおよび／またはＣＰＧ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ  ＶＡから入手可能）などのような、類似する技術および市販で入手可能な修飾アミダイトおよび多孔性ガラス（ＣＰＧ）製品を使用することもまた、よく知られている。
【０１４４】
本発明に従って、作用の効力、特異性、および期間を増強し、ＭＯＥ、ＡＮＡ、ＦＡＮＡ、ＰＳなどのような現行の化学的性質から構成されるオリゴヌクレオチドの投与のルートを広げるためのＬＮＡモノマーの使用などのような修飾体の使用。これは、ＬＮＡモノマーによって現行のオリゴヌクレオチド中のモノマーのうちのいくつかを置換することによって達成することができる。ＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドは、親化合物に類似するサイズを有してもよいまたはより大きくてもよいもしくは好ましくはより小さくてもよい。そのようなＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドは、約７０％未満、より好ましくは約６０％未満、最も好ましくは約５０％未満のＬＮＡモノマーを含有し、それらのサイズは、約５〜２５ヌクレオチド、より好ましくは約１２〜２０ヌクレオチドであることが好ましい。
【０１４５】
好ましい修飾オリゴヌクレオチド主鎖は、通常の３’−５’連結、これらの２’−５’連結アナログ、ならびに逆の方向性を有するものを有するホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデートを含むホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびにボラノホスフェートを含むが、これらに限定されず、ヌクレオシド単位の近接する対は、３’−５’〜５’−３’または２’−５’〜５’−２’で連結される。様々な塩、混合塩、および遊離酸形態もまた、含まれる。
【０１４６】
上記のリン含有連結の調製を教示する代表的な米国特許は、米国特許第３，６８７，８０８号；第４，４６９，８６３号；第４，４７６，３０１号；第５，０２３，２４３号；第５，１７７，１９６号；第５，１８８，８９７号；第５，２６４，４２３号；第５，２７６，０１９号；第５，２７８，３０２号；第５，２８６，７１７号；第５，３２１，１３１号；第５，３９９，６７６号；第５，４０５，９３９号；第５，４５３，４９６号；第５，４５５，２３３号；第５，４６６，６７７号；第５，４７６，９２５号；第５，５１９，１２６号；第５，５３６，８２１号；第５，５４１，３０６号；第５，５５０，１１１号；第５，５６３，２５３号；第５，５７１，７９９号；第５，５８７，３６１号；および第５，６２５，０５０号明細書を含み、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれるが、これらに限定されない。
【０１４７】
その中にリン原子を含んでいない好ましい修飾オリゴヌクレオチド主鎖は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルが混合されたヌクレオシド間連結または１つもしくは複数の短鎖ヘテロ原子もしくはヘテロ環式ヌクレオシド間連結によって形成される主鎖を有する。これらは、モルホリノ連結（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）を有するもの；シロキサン主鎖；スルフィド、スルホキシド、およびスルホン主鎖；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；アルケン含有主鎖；スルファメート主鎖；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ主鎖；スルホネートおよびスルホンアミド主鎖；アミド主鎖；ならびにＮ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ２構成部品が混合された他のものを含む。
【０１４８】
上記のオリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許は、米国特許第５，０３４，５０６号；第５，１６６，３１５号；第５，１８５，４４４号；第５，２１４，１３４号；第５，２１６，１４１号；第５，２３５，０３３号；第５，２６４，５６２号；第５，２６４，５６４号；第５，４０５，９３８号；第５，４３４，２５７号；第５，４６６，６７７号；第５，４７０，９６７号；第５，４８９，６７７号；第５，５４１，３０７号；第５，５６１，２２５号；第５，５９６，０８６号；第５，６０２，２４０号；第５，６１０，２８９号；第５，６０２，２４０号；第５，６０８，０４６号；第５，６１０，２８９号；第５，６１８，７０４号；第５，６２３，０７０号；第５，６６３，３１２号；第５，６３３，３６０号；第５，６７７，４３７号；および第５，６７７，４３９号明細書を含み、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれるが、これらに限定されない。
【０１４９】
他の好ましいオリゴヌクレオチドミメティックでは、糖およびヌクレオシド間連結の両方、つまり主鎖は、ヌクレオチド単位の新規な基と交換される。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。１つのそのようなオリゴマー化合物、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチドミメティックは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物では、オリゴヌクレオチドの糖主鎖は、アミド含有主鎖、特にアミノエチルグリシン主鎖と交換される。核酸塩基は保持され、主鎖のアミド部分のアザ窒素原子に直接または間接的に結合される。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許は、米国特許第５，５３９，０８２号；第５，７１４，３３１号；および第５，７１９，２６２号明細書を含み、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれるが、これらに限定されない。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４，  １４９７−１５００において見つけることができる。
【０１５０】
本発明の一実施形態では、ホスホロチオエート主鎖を有するオリゴヌクレオチドおよびヘテロ原子主鎖を有するオリゴヌクレオシドならびに特に、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ主鎖として知られている−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）  ＣＨ２−、および−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−、ここで、天然ホスホジエステル主鎖は、上で引用した米国特許第５，４８９，６７７号明細書の−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ２−および上で引用した米国特許第５，６０２，２４０号明細書のアミド主鎖として示される。上で引用した米国特許第５，０３４，５０６号明細書のモルホリノ主鎖構造を有するオリゴヌクレオチドもまた、好ましい。
【０１５１】
修飾オリゴヌクレオチドはまた、１つまたは複数の置換糖部分を含有していてもよい。好ましいオリゴヌクレオチドは、２’位に以下：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル；Ｏ、−Ｓ−、もしくはＮ−アルキニル；またはＯアルキル−Ｏ−アルキル、ここで、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換または非置換Ｃ〜ＣＯアルキルまたはＣ２〜ＣＯアルケニルおよびアルキニルであってもよい、のうちの１つを含む。Ｏ（ＣＨ２）ｎＯｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎ、ＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２ｎＯＮ（ＣＨ２）ｎＣＨ３）２は、特に好ましく、ここで、ｎおよびｍは、１〜約１０とすることができる。他の好ましいオリゴヌクレオチドは、２’位に以下：Ｃ〜ＣＯ、（低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリール、またはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、干渉物質、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改善するための基、オリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基、同様の特性を有する他の置換基のうちの１つを含む。好ましい修飾は、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても知られている）、つまり、アルコキシアルコキシ基を含む。さらに好ましい修飾は、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、つまり、下記の本明細書における実施例において記載されるように、２’−ＤＭＡＯＥとしても知られているＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基および２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても当技術分野において知られている）、つまり、２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２）２を含む。
【０１５２】
他の好ましい修飾は、２’−メトキシ（２’−ＯＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、および２’−フルオロ（２’−Ｆ）を含む。同様の修飾はまた、オリゴヌクレオチド上の他の位置、特に、３’末端ヌクレオチド上のまたは２’−５’連結オリゴヌクレオチドにおける糖の３’位および５’末端ヌクレオチドの５’位で成されてもよい。オリゴヌクレオチドはまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などのような糖ミメティックを有していてもよい。そのような修飾糖構造の調製を教示する代表的な米国特許は、米国特許第４，９８１，９５７号；第５，１１８，８００号；第５，３１９，０８０号；第５，３５９，０４４号；第５，３９３，８７８号；第５，４４６，１３７号；第５，４６６，７８６号；第５，５１４，  ７８５号；第５，５１９，１３４号；第５，５６７，８１１号；第５，５７６，４２７号；第５，５９１，７２２号；第５，５９７，９０９号；第５，６１０，３００号；第５，６２７，０５３号；第５，６３９，８７３号；第５，６４６，  ２６５号；第５，６５８，８７３号；第５，６７０，６３３号；および第５，７００，９２０号明細書を含み、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれるが、これらに限定されない。
【０１５３】
オリゴヌクレオチドはまた、核酸塩基（当技術分野において単に「塩基」と呼ばれることが多い）の修飾または置換をも含んでいてもよい。本明細書において使用される、「非修飾」または「天然」ヌクレオチドは、プリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）ならびにピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）を含む。修飾ヌクレオチドは、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５‐ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシン、およびチミン、５−ウラシル（偽ウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル、および他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンなどのような他の合成ならびに天然ヌクレオチドを含む。
【０１５４】
さらに、ヌクレオチドは、米国特許第３，６８７，８０８号明細書に開示されるもの、’Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ’，  ｐａｇｅｓ  ８５８−８５９，  Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，  Ｊ．Ｉ．，  ｅｄ．  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  １９９０において開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ’Ａｎｇｅｗａｎｄｌｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ’，  １９９１，  ３０，  ｐａｇｅ  ６１３によって開示されるもの、およびＳａｎｇｈｖｉ，  Ｙ．Ｓ．，  Ｃｈａｐｔｅｒ  １５，  ’Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ’，  ｐａｇｅｓ  ２８９−３０２，  Ｃｒｏｏｋｅ，  Ｓ．Ｔ．  ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，  Ｂ．  ｅａ．，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９３によって開示されるものを含む。いくつかのこれらのヌクレオチドは、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増加させるのに特に有用である。これらは、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、および５−プロピニルシトシンを含む、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびにＮ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換プリンを含む。５−メチルシトシン置換は、０．６〜１．２℃、核酸二重鎖安定性を増加させることが示され（Ｓａｎｇｈｖｉ，  Ｙ．Ｓ．，  Ｃｒｏｏｋｅ，  Ｓ．Ｔ．  ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，  Ｂ．，  ｅｄｓ，  ’Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ’，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  １９９３，  ｐｐ．  ２７６−２７８）、現在好ましい塩基置換であり、特に、２’−Ｏメトキシエチル糖修飾と組み合わせられた場合、さらに好ましい。
【０１５５】
上記の修飾ヌクレオチドおよび他の修飾ヌクレオチドの調製を教示する代表的な米国特許は、それぞれ、米国特許第３，６８７，８０８号ならびに第４，８４５，２０５号；第５，１３０，３０２号；第５，１３４，０６６号；第５，１７５，２７３号；第５，３６７，０６６号；第５，４３２，２７２号；第５，４５７，１８７号；第５，４５９，２５５号；第５，４８４，９０８号；第５，５０２，１７７号；第５，５２５，７１１号；第５，５５２，５４０号；第５，５８７，４６９号；第５，５９６，０９１号；第５，６１４，６１７号；第５，７５０，６９２号、および第５，６８１，９４１号明細書を含み、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれるが、これらに限定されない。
【０１５６】
本発明のオリゴヌクレオチドの他の修飾は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または細胞の取り込みを増強する、１つまたは複数の部分またはコンジュゲートをオリゴヌクレオチドに化学的に連結することを伴う。
【０１５７】
そのような部分は、コレステロール部分、コール酸、チオエーテル、例えばヘキシル−Ｓ−トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪鎖、例えばドデカンジオールもしくはウンデシル残基、リン脂質、例えばジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖、またはアダマンタン酢酸、パルミチル部分、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−ｔオキシコレステロール部分などのような脂質部分を含むが、これらに限定されない。
【０１５８】
そのようなオリゴヌクレオチドコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許は、米国特許第４，８２８，９７９号；第４，９４８，８８２号；第５，２１８，１０５号；第５，５２５，４６５号；第５，５４１，３１３号；第５，５４５，７３０号；第５，５５２，５３８号；第５，５７８，７１７、第５，５８０，７３１号；第５，５８０，７３１号；第５，５９１，５８４号；第５，１０９，１２４号；第５，１１８，８０２号；第５，１３８，０４５号；第５，４１４，０７７号；第５，４８６，６０３号；第５，５１２，４３９号；第５，５７８，７１８号；第５，６０８，０４６号；第４，５８７，０４４号；第４，６０５，７３５号；第４，６６７，０２５号；第４，７６２，７７９号；第４，７８９，７３７号；第４，８２４，９４１号；第４，８３５，２６３号；第４，８７６，３３５号；第４，９０４，５８２号；第４，９５８，０１３号；第５，０８２，８３０号；第５，１１２，９６３号；第５，２１４，１３６号；第５，０８２，８３０号；第５，１１２，９６３号；第５，２１４，１３６号；第５，２４５，０２２号；第５，２５４，４６９号；第５，２５８，５０６号；第５，２６２，５３６号；第５，２７２，２５０号；第５，２９２，８７３号；第５，３１７，０９８号；第５，３７１，２４１号、第５，３９１，７２３号；第５，４１６，２０３、第５，４５１，４６３号；第５，５１０，４７５号；第５，５１２，６６７号；第５，５１４，７８５号；第５，５６５，５５２号；第５，５６７，８１０号；第５，５７４，１４２号；第５，５８５，４８１号；第５，５８７，３７１号；第５，５９５，７２６号；第５，５９７，６９６号；第５，５９９，９２３号；第５，５９９，９２８号、および第５，６８８，９４１号明細書を含み、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれるが、これらに限定されない。
【０１５９】
創薬：本発明の化合物は、創薬および標的検証の分野にも応用されうる。本発明は、本明細書において同定する化合物および好ましい標的セグメントの、膜結合転写因子ペプチダーゼ、部位１（ＭＢＴＰＳ１）ポリヌクレオチドと病態、表現型または状態との間に存在する関係性を解明するための創薬努力における使用を包含する。これらの方法は、試料、組織、細胞または生体を本発明の化合物と接触させるステップ、膜結合転写因子ペプチダーゼ、部位１（ＭＢＴＰＳ１）ポリヌクレオチドの核酸またはタンパク質レベルおよび／または関連する表現型もしくは化学的な評価項目を処置後のある時期に測定するステップ、ならびに場合により測定値を未処置試料または本発明のさらなる化合物で処置した試料と比較するステップを含む、膜結合転写因子ペプチダーゼ、部位１（ＭＢＴＰＳ１）ポリヌクレオチドの検出または調節を含む。これらの方法は、標的検証のプロセスのために未知の遺伝子の機能を決定するために、または特定の疾患、状態もしくは表現型の治療もしくは予防のための標的としての特定の遺伝子産物の妥当性を決定するために他の実験と並行でまたは組み合わせて実施されうる。
【０１６０】
遺伝子発現の上方制御または抑制の評価：外来性核酸の宿主細胞または生体への輸送は、細胞中または生体中の核酸を直接検出するステップによって評価されうる。そのような検出は、当該技術分野において周知のいくつかの方法によって達成されうる。例えば、外来性核酸の存在は、サザンブロットまたは核酸に関連するヌクレオチド配列を特異的に増幅するプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術によって検出されうる。外来性核酸の発現も遺伝子発現分析を含む従来法を使用して測定されうる。例えば外来性核酸から産生されるｍＲＮＡはノーザンブロットおよび逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して検出および定量されうる。
【０１６１】
外来性核酸からのＲＮＡの発現も、酵素活性またはレポータータンパク質活性を測定することによって検出されうる。例えば、アンチセンス調節活性は、外来性核酸がエフェクターＲＮＡを産生していることの指標としての標的核酸発現における減少または増加として間接的に測定されうる。配列保存に基づいてプライマーは設計可能であり、標的遺伝子のコード領域を増幅するために使用されうる。任意の翻訳または非コード領域が使用されうるが、最初に各遺伝子から最も高く発現されるコード領域がモデル制御遺伝子を構築するために使用されうる。各制御遺伝子は、各コード領域をレポーターコード領域とそのポリ（Ａ）シグナルとの間に挿入することによって組み立てられる。これらのプラスミドは、レポーター遺伝子を遺伝子の上流部分に、および潜在的ＲＮＡｉ標的を３’非コード領域に有するｍＲＮＡを産生する。個々のアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果は、レポーター遺伝子の調節によって評価される。本発明の方法において有用なレポーター遺伝子は、アセトヒドロキシ酸合成酵素（ＡＨＡＳ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ベータガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、ベータグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、クロラムフェニコールアセチル基転移酵素（ＣＡＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）、オクトピン合成酵素（ＯＣＳ）、およびそれらの誘導体を含む。アンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、メトトレキサート、ホスフィノトリシン、ピューロマイシンおよびテトラサイクリンに耐性を付与する多重選択マーカー（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ  ｍａｒｋｅｒｓ）は、利用可能である。レポーター遺伝子の調節を測定するための方法は、当該技術分野において十分に周知であり、限定するものではないが、蛍光定量的方法（例えば蛍光分光法、蛍光励起細胞分取（ＦＡＣＳ）、蛍光顕微鏡）、抗生物質耐性測定（antibiotic resistance determination）を含む。
【０１６２】
ＭＢＴＰＳ１のタンパク質およびｍＲＮＡの発現は、当業者には周知であり本明細書の別の場所に記載の方法を用いて調べることができる。例えば、ＥＬＩＳＡのような免疫測定法を用いれば、タンパク質濃度を測定することができる。ＭＢＴＰＳ１  ＥＬＩＳＡアッセイキットが、例えばＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネソタ州ミネアポリス所在）から市販されている。
【０１６３】
各種実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドを用いて処理した試料（例えばｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞または組織）におけるＭＢＴＰＳ１発現（例えばｍＲＮＡまたはタンパク質）は、対照試料中のＭＢＴＰＳ１発現との比較により評価される。
例えば、タンパク質または核酸の発現は、当業者には周知の方法を用いて、擬処理または未処理の試料と比較される。あるいは、対照のアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば配列が変えられたかまたは異なっているもの）で処理した試料との比較は、所望の情報に応じて行われる。他の実施形態において、処理済の試料と未処理の試料とのＭＢＴＰＳ１のタンパク質または核酸の発現の違いは、処理済の試料と未処理の試料との異なる核酸（研究者が適切とみなした任意の標準（例えばハウスキーピング遺伝子）など）の発現の違いと比較可能である。
【０１６４】
観察された違いは、対照との比較に用いるために、例えば比または分数の形式で必要に応じて表すことができる。各種実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した試料中のＭＢＴＰＳ１のｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルは、未処理の試料または対照の核酸で処理した試料と比較して約１．２５倍〜約１０倍以上増大または低下する。各種実施形態において、ＭＢＴＰＳ１のｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルは、少なくとも約１．２５倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約５．５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約６．５倍、少なくとも約７倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約８倍、少なくとも約８．５倍、少なくとも約９倍、少なくとも約９．５倍、または少なくとも約１０倍以上増大または低下する。
【０１６５】
キット、研究用試薬、診断および治療
本発明の化合物は、診断、治療および予防のためにならびに研究用試薬およびキットの構成要素として利用されうる。さらに、精緻な特異性を有して遺伝子発現を抑制できるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、当業者によって特定の遺伝子の機能を解明するため、または生物学的経路の種々のメンバー間の機能を区別するために使用されることが多い。
【０１６６】
キットおよび診断ならびに種々の生物学的系における使用のために、本発明の化合物は、単独でまたは他の化合物もしくは治療薬との組合せのいずれでも、細胞中および組織中で発現される遺伝子の部分的または全体的な相補体の発現様式を解明するための差次的および／またはコンビナトリアルな分析での手段として有用である。
【０１６７】
本明細書において使用される用語「生物学的系」または「系」は、膜結合転写因子ペプチダーゼ、部位１（ＭＢＴＰＳ１）の産物を発現するまたは発現できるようにされる任意の生体、細胞、細胞培養物または組織として定義される。これらは、限定するものではないが、ヒト、遺伝子導入動物、細胞、細胞培養物、組織、異種移植片、移植物およびそれらの組合せを含む。
【０１６８】
非限定的な一例として、１以上のアンチセンス化合物で処置した細胞中または組織中の発現様式は、アンチセンス化合物で処置していない対照細胞または組織と比較され、生じた様式は、それらが例えば検査される遺伝子の疾患関連性、シグナル経路、細胞内局在性、発現レベル、大きさ、構造または機能に関連することから、遺伝子発現の差次的レベルについて分析される。これらの分析は、刺激されたまたは刺激されていない細胞で、発現様式に影響する他の化合物の存在下または非存在下で実施されうる。
【０１６９】
当該技術分野において周知の遺伝子発現分析方法の例は、ＤＮＡアレイまたはマイクロアレイ、ＳＡＧＥ（遺伝子発現の連続的分析）、ＲＥＡＤＳ（消化ｃＤＮＡの制限酵素増幅）、ＴＯＧＡ（総遺伝子発現分析）、タンパク質アレイおよびプロテオミクス、発現された配列タグ（ＥＳＴ）配列決定、サブトラクティブＲＮＡフィンガープリンティング（ＳｕＲＦ）、サブトラクティブクローニング、ディファレンシャルディスプレイ（ＤＤ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、ＦＩＳＨ（蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）技術および質量分析法を含む。
【０１７０】
本発明の化合物は、これらの化合物が膜結合転写因子ペプチダーゼ、部位１（ＭＢＴＰＳ１）をコードする核酸にハイブリダイズすることから、研究および診断のために有用である。例えば、本明細書において開示のとおりの効率および条件下で効果的な膜結合転写因子ペプチダーゼ、部位１（ＭＢＴＰＳ１）調節因子としてハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは、遺伝子増幅または検出に好都合な条件下でそれぞれ効果的なプライマーまたはプローブである。これらのプライマーまたはプローブは、膜結合転写因子ペプチダーゼ、部位１（ＭＢＴＰＳ１）をコードする核酸分子の特異的検出を必要とする方法において、および膜結合転写因子ペプチダーゼ、部位１（ＭＢＴＰＳ１）のさらなる研究における検出または使用のための前記核酸分子の増幅において有用である。膜結合転写因子ペプチダーゼ、部位１（ＭＢＴＰＳ１）をコードする核酸と、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、詳細にはプライマーおよびプローブとのハイブリダイゼーションは当該技術分野において周知の手段によって検出されうる。そのような手段は、オリゴヌクレオチドへの酵素の複合、オリゴヌクレオチドの放射標識、または任意の他の適切な検出手段を含みうる。試料中の膜結合転写因子ペプチダーゼ、部位１（ＭＢＴＰＳ１）のレベルを検出するためにそのような検出手段を使用するキットも調製されうる。
【０１７１】
アンチセンスの特異性および感度は、治療用使用のために当業者によって利用される。アンチセンス化合物は、ヒトを含む動物の病態の治療における治療用成分として使用されている。アンチセンスオリゴヌクレオチド薬は、ヒトに安全かつ効果的に投与されており、多数の臨床試験が現在進行中である。したがって、アンチセンス化合物が細胞、組織および動物、特にヒトの治療用のための治療計画において有用であるように構成されうる有用な治療様式でありうることは確立されている。
【０１７２】
治療用に、膜結合転写因子ペプチダーゼ、部位１（ＭＢＴＰＳ１）ポリヌクレオチドの発現を調節することによって治療されうる疾患または障害を有すると疑われる動物（好ましくはヒト）は、本発明によるアンチセンス化合物を投与することによって治療される。例えば、非限定的一実施形態において方法は、治療を必要とする動物に治療有効量の膜結合転写因子ペプチダーゼ、部位１（ＭＢＴＰＳ１）調節物質を投与するステップを含む。本発明の膜結合転写因子ペプチダーゼ、部位１（ＭＢＴＰＳ１）調節物質は、膜結合転写因子ペプチダーゼ、部位１（ＭＢＴＰＳ１）の活性を効果的に調節するか、または膜結合転写因子ペプチダーゼ、部位１（ＭＢＴＰＳ１）タンパク質の発現を調節する。一実施形態において動物における膜結合転写因子ペプチダーゼ、部位１（ＭＢＴＰＳ１）の活性または発現は、対照と比較して約１０％抑制される。好ましくは動物における膜結合転写因子ペプチダーゼ、部位１（ＭＢＴＰＳ１）の活性または発現は、約３０％抑制される。より好ましくは動物における膜結合転写因子ペプチダーゼ、部位１（ＭＢＴＰＳ１）の活性または発現は、５０％またはそれを超えて抑制される。したがってオリゴマー化合物は、膜結合転写因子ペプチダーゼ、部位１（ＭＢＴＰＳ１）ｍＲＮＡの発現を対照と比較して少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％調節する。
【０１７３】
一実施形態において、膜結合転写因子ペプチダーゼ、部位１（ＭＢＴＰＳ１）の活性または発現および／または動物においては、対照と比較して少なくとも約１０％増加する。好ましくは動物における膜結合転写因子ペプチダーゼ、部位１（ＭＢＴＰＳ１）の活性または発現は、約３０％増加する。より好ましくは動物における膜結合転写因子ペプチダーゼ、部位１（ＭＢＴＰＳ１）の活性または発現は、約５０％またはそれを超えて増加する。したがってオリゴマー化合物は、膜結合転写因子ペプチダーゼ、部位１（ＭＢＴＰＳ１）ｍＲＮＡの発現を対照と比較して少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％調節する。
【０１７４】
例えば膜結合転写因子ペプチダーゼ、部位１（ＭＢＴＰＳ１）の発現の低下は、文献に記載され、当業者に公知の方法を使用して、動物の血清、血液、脂肪組織、肝臓または任意の他の体液、組織または器官において測定されうる。好ましくは、分析される前記体液、組織または器官中に含まれる細胞は、膜結合転写因子ペプチダーゼ、部位１（ＭＢＴＰＳ１）ペプチドをコードする核酸分子および／または膜結合転写因子ペプチダーゼ、部位１（ＭＢＴＰＳ１）タンパク質それ自体を含有する。
【０１７５】
本発明の化合物は、有効量の化合物を適切な薬学的に許容される希釈剤または担体に加えることによって医薬組成物中で利用されうる。本発明の化合物および方法の使用は、予防的にも有用である。
【０１７６】
複合体
本発明のオリゴヌクレオチドの他の修飾は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞への取り込みを増強する１以上の成分または複合体のオリゴヌクレオチドへの化学的連結を含む。これらの成分または複合体は、１級または２級ヒドロキシル基などの官能基に共有結合した複合基を含みうる。本発明の複合基は、干渉物質、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学特性を増強する基、およびオリゴマーの薬物動態特性を増強する基を含む。典型的な複合基は、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、および色素を含む。本発明の文脈において薬力学特性を増強する基は、取り込みを改善し、分解への耐性を増強し、および／または標的核酸との配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基を含む。本発明の文脈において薬物動態特性を増強する基は、本発明の化合物の取り込み、分布、代謝または排出を改善する基を含む。代表的な複合基は、両方が参照として本明細書に組み込まれる１９９２年１０月２３日出願の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６および米国特許第６，２８７，８６０号明細書に開示されている。複合体成分は、限定するものではないが、コレステロール成分、コール酸、チオエーテル、例えばヘキシル−Ｓ−トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基、リン脂質、例えばジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖、あるいはアダマンタン酢酸、パルミチル成分、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール成分などの脂質成分を含む。本発明のオリゴヌクレオチドは、活性原薬、例えばアスピリン、ワルファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、（Ｓ）−（＋）−プラノプロフェン、カプロフェン、ダンシルサルコシン、２，３，５−トリヨード安息香酸、フルフェナム酸、フォリン酸、ベンゾチアジアジド、クロロチアジド、ジアセピン、インドメチシン、バルビツール酸、セファロスポリン、サルファ剤、抗糖尿病薬、抗菌剤または抗生物質とも複合体化されうる。
【０１７７】
そのようなオリゴヌクレオチド複合体の調製を説明する代表的米国特許は、限定するものではないが、米国特許第４，８２８，９７９号；第４，９４８，８８２号；第５，２１８，１０５号；第５，５２５，４６５号；第５，５４１，３１３号；第５，５４５，７３０号；第５，５５２，５３８号；第５，５７８，７１７号、５，５８０，７３１号；第５，５８０，７３１号；第５，５９１，５８４号；第５，１０９，１２４号；第５，１１８，８０２号；第５，１３８，０４５号；第５，４１４，０７７号；第５，４８６，６０３号；第５，５１２，４３９号；第５，５７８，７１８号；第５，６０８，０４６号；第４，５８７，０４４号；第４，６０５，７３５号；第４，６６７，０２５号；第４，７６２，７７９号；第４，７８９，７３７号；第４，８２４，９４１号；第４，８３５，２６３号；第４，８７６，３３５号；第４，９０４，５８２号；第４，９５８，０１３号；第５，０８２，８３０号；第５，１１２，９６３号；第５，２１４，１３６号；第５，０８２，８３０号；第５，１１２，９６３号；第５，２１４，１３６号；第５，２４５，０２２号；第５，２５４，４６９号；第５，２５８，５０６号；第５，２６２，５３６号；第５，２７２，２５０号；第５，２９２，８７３号；第５，３１７，０９８号；第５，３７１，２４１号、第５，３９１，７２３号；第５，４１６，２０３号、第５，４５１，４６３号；第５，５１０，４７５号；第５，５１２，６６７号；第５，５１４，７８５号；第５，５６５，５５２号；第５，５６７，８１０号；第５，５７４，１４２号；第５，５８５，４８１号；第５，５８７，３７１号；第５，５９５，７２６号；第５，５９７，６９６号；第５，５９９，９２３号；第５，５９９，９２８号および第５，６８８，９４１号明細書を含む。
【０１７８】
製剤
本発明の化合物は、取り込み、分布および／または吸収の補助ために、例えばリポソーム、受容体−標的分子、経口、直腸、局所または他の製剤として、他の分子、分子構造または化合物と、混合物と混合、封入、複合体化または他の方法で付随されうる。そのような取り込み、分布および／または吸収を補助する製剤の調製を説明する代表的米国特許は、限定するものではないが、米国特許５，１０８，９２１号；第５，３５４，８４４号；第５，４１６，０１６号；第５，４５９，１２７号；第５，５２１，２９１号；第５，５４３，１６５号；第５，５４７，９３２号；第５，５８３，０２０号；第５，５９１，７２１号；第４，４２６，３３０号；第４，５３４，８９９号；第５，０１３，５５６号；第５，１０８，９２１号；第５，２１３，８０４号；第５，２２７，１７０号；第５，２６４，２２１号；第５，３５６，６３３号；第５，３９５，６１９号；第５，４１６，０１６号；第５，４１７，９７８号；第５，４６２，８５４号；第５，４６９，８５４号；第５；５１２，２９５号；第５，５２７，５２８号；第５，５３４，２５９号；第５，５４３，１５２号；第５，５５６，９４８号；第５，５８０，５７５号；および第５，５９５，７５６号明細書を含み、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的発現および／または機能を調節するためにベクターと関連して投与される必要はないが、本発明の実施形態は、プロモーター、ハイブリッドプロモーター遺伝子配列を含み、強い恒常的プロモーター活性または所望の場合に誘導されうるプロモーター活性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの発現のための発現ベクター構築物に関する。
【０１８０】
一実施形態において、発明の実施は、上述のアンチセンスオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つを適切な核酸送達系と共に投与するステップを含む。一実施形態において、その系はポリヌクレオチドに機能的に連結された非ウイルス性ベクターを含む。そのような非ウイルス性ベクターの例は、オリゴヌクレオチド単独（例えば、配列番号３〜６の任意の１以上）または適切なタンパク質、多糖類または脂質製剤との組合せを含む。
【０１８１】
追加の適切な核酸送達系には、ウイルスベクターを含み、典型的にはアデノウイルス、アデノウイルス関連ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルパー依存性アデノウイルス、レトロウイルスまたはセンダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソーム複合物の少なくとも１つ由来の配列が挙げられる。好ましくは、ウイルスベクターは、ポリヌクレオチドに機能的に連結された強力な真核生物プロモーター（例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター）を含む。
【０１８２】
追加の好ましいベクターには、ウイルスベクター、融合タンパク質および化学的複合体を含む。レトロウイルスベクターは、モロニーマウス白血病ウイルスおよびＨＩＶベースのウイルスを含む。１つの好ましいＨＩＶベースのウイルスベクターは、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子がＨＩＶゲノム由来であり、ｅｎｖ遺伝子が他のウイルス由来である少なくとも２つのベクターを含む。ＤＮＡウイルス性ベクターは好ましい。これらのベクターは、オルソポックスベクターまたはトリポックスベクターなどのポックスベクター、単純ヘルペスＩウイルス（ＨＳＶ）ベクターなどのヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびアデノ関連ウイルスベクターを含む。
【０１８３】
本発明のアンチセンス化合物は、任意の薬学的に許容される塩、エステルもしくはそのようなエステルの塩、またはヒトを含む動物への投与において生物学的に活性な代謝産物またはその残渣を（直接または間接的に）提供できる任意の他の化合物を包含する。
【０１８４】
用語「薬学的に許容される塩」は、本発明の化合物の生理学的かつ薬学的に許容される塩：すなわち親化合物の所望の生物学的活性を保持しており、望ましくない毒物学的な効果を与えない塩を意味する。オリゴヌクレオチドについて、薬学的に許容される塩の好ましい例およびそれらの使用は、米国特許第６，２８７，８６０号明細書にさらに記載されており、同文献は参照として本明細書に組み込まれる。
【０１８５】
本発明は、本発明のアンチセンス化合物を含む医薬組成物および製剤も含む。本発明の医薬組成物は、局所または全身処置のいずれが望ましいかおよび治療される場所に応じて多数の方法で投与されうる。投与は、局所（点眼および膣および直腸を含む粘膜送達を含む）、肺、例えば噴霧吸入器によるなど粉末剤またはエアロゾルの吸入または吹送法により；気管内、鼻腔内、上皮性および経皮性）、経口または非経口でありうる。非経口投与は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内もしくは筋肉内注射もしくは注入；または頭蓋内、例えば髄腔内もしくは脳室内投与を含む。
【０１８６】
中枢神経系の組織を治療するためには、例えば脳脊髄液への注射または注入によって投与することができる。脳脊髄液へのアンチセンスＲＮＡの投与については、例えば、全体を参照として援用した米国特許出願公開第２００７／０１１７７７２号明細書「家族性ＡＬＳ疾患の進行を遅らせる方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｓｌｏｗｉｎｇ  ｆａｍｉｌｉａｌ  ＡＬＳ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）」に記載されている。
【０１８７】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを中枢神経系の細胞に投与しようとする場合、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドが血液脳関門を透過するのを促すことができる１以上の薬剤を用いて投与が可能である。注射は、例えば、嗅内皮質または海馬に行うことができる。筋組織の運動神経への新経営用因子の送達については、例えば、参照として本願に援用した米国特許第６，６３２，４２７号明細書「アデノウイルスベクターを用いた延髄運動神経への遺伝子導入（Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ−ｖｅｃｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  ｍｅｄｕｌｌａｒｙ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎｓ）」に記載されている。脳（例えば、線条体、視床、海馬または黒質）へのベクターの直接送達は当技術では周知であり、例えば、参照として本願に援用した米国特許第６，７５６，５２３号明細書「特に脳の中枢神経系の細胞に外来遺伝子を導入するためのアデノウイルスベクター（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｆｏｒｅｉｇｎ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎｔｏ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｐａｒｔｉｃｕｌａｒｌｙ  ｉｎ  ｂｒａｉｎ）」に記載されている。投与は注射によって迅速にすることもできるし、緩やかな注入または徐放製剤などによってある期間にわたって行うこともできる。
【０１８８】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましい薬剤学的性質または薬力学的性質が得られる薬剤と結合または共役させてもよい。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドを血液脳関門への透過または輸送を促進するために当該分野では周知の任意の物質（例えば、抗トランスフェリン受容体抗体）と結合させ、静注により投与することができる。本発明のアンチセンス化合物は、例えば、アンチセンス化合物をより効果的にするかつ／または血液脳関門におけるアンチセンス化合物の輸送を増大させるウイルスベクターと結合させることができる。浸透圧による血液脳関門の破壊は、糖類（限定するものではないが、メソエリトリトール、キシリトール、Ｄ（＋）ガラクトース、Ｄ（＋）ラクトース、Ｄ（＋）キシロース、ズルシトール、ミオイノシトール、Ｌ（−）フルクトース、Ｄ（−）マンニトール、Ｄ（＋）グルコース、Ｄ（＋）アラビノース、Ｄ（−）アラビノース、セロビオース、Ｄ（＋）マルトース、Ｄ（＋）ラフィノース、Ｌ（＋）ラムノース、Ｄ（＋）メリビオース、Ｄ（−）リボース、アドニトール、Ｄ（＋）アラビトール、Ｌ（−）アラビトール、Ｄ（＋）フコース、Ｌ（−）フコース、Ｄ（−）リキソース、Ｌ（＋）リキソースおよびＬ（−）リキソース）またはアミノ酸類（限定するものではないが、グルタミン、リジン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、チロシン、バリン、およびタウリンの注入によって行うこともできる。血液脳関門の透過を増強する方法および材料については、いずれも全体を参照として本願に援用した米国特許第４，８６６，０４２号明細書「血液脳関門に遺伝子物質を送達させる方法（Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｔｅｒｉａｌ  ａｃｒｏｓｓ  ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ  ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ）」、第６，２９４，５２０号明細書「血液脳関門を通過する物質（Ｍａｔｅｒｉａｌ  ｆｏｒ  ｐａｓｓａｇｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ）」および第６，９３６，５８９号明細書「経口的送達系（Parenteral delivery systems）」に記載されている。
【０１８９】
本発明のアンチセンス化合物は、取り込み、分布および／または吸収しやすいように分子構造物または化合物の混合物（例えば、リポソーム、受容体標的分子（ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、経口、直腸、局所または他の製剤）と混合、カプセル封入（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ）、複合あるいは別の方法で一緒にしてもよい。オリゴヌクレオチドが取り込まれやすいように、例えば、陽イオン性脂質を製剤に含んでもよい。取り込みを促進することがわかっているそのような組成物の１つは、リポフェクチン（メリーランド州べテスタ所在のＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社から入手可能）である。
【０１９０】
少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を有するオリゴヌクレオチドは、経口投与に特に有用であると考えられている。局所投与のための医薬組成物および製剤は、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴薬、坐薬、噴霧剤、液薬および粉末剤を含みうる。従来の薬学的担体、液剤、粉末剤または油性基剤、増粘剤などは必要であるかまたは望ましい場合がある。コートされたコンドーム、手袋なども有用である場合がある。
【０１９１】
好都合には、単位投与形態で存在できる本発明の医薬製剤は、製薬業界において十分に周知の従来技術により調製されうる。そのような技術は、活性成分を（１以上の）薬学的担体または（１以上の）賦形剤と関連させるステップを含む。一般に製剤は、活性成分を均一かつ本質的に液体担体もしくは微粉化した固体担体またはその両方と関連させるステップ、次いで必要な場合は産物を成形するステップによって調製される。
【０１９２】
本発明の組成物は、限定するものではないが、錠剤、カプセル、ゲルカプセル、液体シロップ、ソフトゲル、坐薬および浣腸などの任意の多数の可能な投与形態に製剤されうる。本発明の組成物は、水性懸濁剤、非水性または混合媒体としても製剤されうる。水性懸濁剤は、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストランが挙げられる懸濁剤の粘度を増大させる物質をさらに含有できる。懸濁剤は、安定剤も含みうる。
【０１９３】
本発明の医薬組成物は、限定するものではないが、液剤、乳剤、フォーム剤およびリポソーム含有製剤を含む。本発明の医薬組成物および製剤は、１以上の浸透促進剤、担体、賦形剤または他の活性もしくは不活性成分を含みうる。
【０１９４】
典型的には乳剤は、１つの液剤が他に通常直径０．１μｍを超える液滴の形態で分散された不均一系である。乳剤は、分散相に加えて追加的構成成分を含有でき、活性剤は水相中、油相中またはそれ自体としての分離相中に溶液として存在できる。マイクロエマルジョンは、本発明の実施形態として含まれる。乳剤およびそれらの使用は、当該技術分野において十分に周知であり、米国特許第６，２８７，８６０号明細書にさらに記載されている。
【０１９５】
本発明の製剤は、リポソーム製剤を含む。本発明において使用される用語「リポソーム」は、球状の１以上の二重層中に配置された両親媒性脂質から成る小胞を意味する。リポソームは、親油性物質および送達される組成物を含有する水性の内部から形成された膜を有する単層膜または多重膜ビヒクルである。カチオン性リポソームは、負に荷電したＤＮＡ分子と相互作用して安定な複合体を形成すると考えられる正に荷電したリポソームである。ｐＨ感受性または負に荷電したリポソームは、複合体化するよりもＤＮＡを捕捉すると考えられる。カチオン性および非カチオン性の両方のリポソームは、ＤＮＡを細胞に送達するために使用されている。
【０１９６】
リポソームは、「立体的に安定化された」リポソームも含み、用語は本明細書における使用で１以上の特殊化された脂質（specialized lipids）を含むリポソームを意味する。リポソームに組み込まれた場合、これらの特殊化された脂質は、そのような特殊化された脂質を欠いているリポソームと比較して増強された循環寿命を有するリポソームを生じる。立体的に安定化されたリポソームの例は、リポソームのビヒクル形成脂質部分の一部が１以上の糖脂質を含むか、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）成分などの１以上の親水性ポリマーで誘導体化されているものである。リポソームおよびそれらの使用は、米国特許第６，２８７，８６０号明細書にさらに記載されている。
【０１９７】
本発明の医薬製剤および組成物は、界面活性剤もさらに含みうる。薬剤製品、製剤および乳剤における界面活性剤の使用は、当該技術分野において十分に周知である。界面活性剤およびのそれらの使用は、参照として本明細書に組み込まれる米国特許第６，２８７，８６０号にさらに記載されている。
【０１９８】
一実施形態において、本発明は、核酸、具体的にはオリゴヌクレオチドの効率的な送達を行うために種々の浸透促進剤を使用する。非親油性薬剤の細胞膜を超える拡散の補助に加えて、浸透促進剤は親油性薬剤の浸透性も促進する。浸透促進剤は、５つの広い部類、すなわち界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤および非キレート非界面活性剤のうちの１つに属する物として分類されうる。浸透促進剤およびそれらの使用は米国特許第６，２８７，８６０号明細書にさらに記載されており、同文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１９９】
当業者には、製剤がそれらの目的とする使用、すなわち投与経路により日常的に設計されることが理解されよう。
【０２００】
局所投与のための好ましい製剤は、本発明のオリゴヌクレオチドが、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤および界面活性剤などの局所送達剤と混合されているものを含む。好ましい脂質およびリポソームは中性（例えばジオレオイル−ホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロイルホスファチジルコリン）陰性（例えばジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）およびカチオン性（例えばジオレオイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰおよびジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）を含む。
【０２０１】
局所または他の投与のために、本発明のオリゴヌクレオチドはリポソーム中に包含されうるか、またはそれら、詳細にはカチオン性リポソームと複合体を形成できる。別法としてオリゴヌクレオチドは、脂質中に、詳細にはカチオン性脂質に複合体化されうる。好ましい脂肪酸およびエステル、薬学的に許容されるそれらの塩ならびにそれらの使用は、米国特許第６，２８７，８６０号明細書にさらに記載されている。
【０２０２】
経口投与用の組成物および製剤は、粉剤もしくは顆粒剤、微粒子剤、ナノ粒子剤、水溶液中もしくは非水溶液中の懸濁剤もしくは液剤、カプセル、ゲルカプセル、サシェ（ｓａｃｈｅｔ）、錠剤またはミニ錠剤を含む。増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤または結合剤は、望ましい場合がある。好ましい経口製剤は、本発明のオリゴヌクレオチドが１以上の浸透促進界面活性剤およびキレート剤と共に投与されるものである。好ましい界面活性剤は、脂肪酸および／もしくはエステルまたはそれらの塩、胆汁酸および／またはそれらの塩を含む。好ましい胆汁酸／塩および脂肪酸ならびにそれらの使用は、参照として本明細書に組み込まれる米国特許第６，２８７，８６０号明細書にさらに記載されている。同様に好ましいのは、浸透促進剤の組合せ、例えば胆汁酸／塩との組合せでの脂肪酸／塩である。特に好ましい組合せは、ラウリン酸ナトリウム塩、カプリン酸およびＵＤＣＡである。さらなる浸透促進剤は、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルを含む。本発明のオリゴヌクレオチドは、噴霧乾燥された粒子を含む顆粒形態またはマイクロまたはナノ粒子を形成するように複合化されて経口送達されうる。オリゴヌクレオチド複合剤およびそれらの使用は、参照として本明細書に組み込まれる米国特許第６，２８７，８６０号明細書にさらに記載されている。
【０２０３】
非経口、髄腔内または脳室内投与のための組成物および製剤は、緩衝剤、希釈剤および他の適切な添加剤（限定するものではないが、浸透促進剤、担体化合物および他の薬学的に許容される担体または賦形剤など）も含有できる滅菌水性溶液を含みうる。
【０２０４】
本発明の特定の実施形態は、１以上のオリゴマー化合物および非アンチセンス機構により作用する１以上の他の化学療法剤を含有する医薬組成物を提供するような化学療法剤の例は、限定するものではないが、ダウノルビシン、ダウノマイシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、エソルビシン、ブレオマイシン、マホスファミド、イホスファミド、シトシンアラビノシド、ビスクロロエチル−ニトロソウレア、ブスルファン、ミトマイシンＣ、アクチノマイシンＤ、ミトラマイシン、プレドニゾン、ヒドロキシプレゲステロン、テストステロン、タモキシフェン、ダカルバシン、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラミン、ミトキサントロン、アムサクリン、クロランブシル、メチルシクロヘキシルニトロソウレア、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、シクロホスファミド、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−アザシチジン、ヒドロキシウレア、デオキシコホルマイシン、４−ヒドロキシペルオキシシクロ−ホスホラミド、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、５−フルオロデオキシウリジン（５−ＦＵｄＲ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、コルヒチン、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド（ＶＰ−１６）、トリメトレキサート、イリノテカン、トポテカン、ゲムシタビン、テニポシド、シスプラチンおよびジエチルスチルベステロール（ＤＥＳ）などの癌化学療法剤を含む。本発明の化合物と共に使用する場合、そのような化学療法剤は、個々に（例えば、５−ＦＵとオリゴヌクレオチド）、連続して（例えば、一定期間の５−ＦＵとオリゴヌクレオチドに続いてＭＴＸとオリゴヌクレオチド）、または１以上の他のそのような化学療法剤と組み合わせて（例えば、５−ＦＵ、ＭＴＸとオリゴヌクレオチドまたは５−ＦＵ、放射線療法とオリゴヌクレオチド）使用されうる。限定するものではないが、非ステロイド性抗炎症剤および副腎皮質ステロイドが挙げられる抗炎症剤ならびに、限定するものではないが、リビビリン（ribivirin）、ビダラビン、アシクロビルおよびガンシクロビルが挙げられる抗ウイルス剤も本発明の組成物に組合せられうる。アンチセンス化合物と他の非アンチセンス剤との組合せも本発明の範囲内である。２つ以上組み合わされた化合物は、一緒にまたは連続的に使用されうる。
【０２０５】
他の関連する実施形態において本発明の組成物は、第１の核酸にターゲッティングされる１以上のアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチド、および第２の核酸標的にターゲッティングされる１以上の追加的アンチセンス化合物を含有できる。例えば、第１の標的は、膜結合転写因子ペプチダーゼ、部位１（ＭＢＴＰＳ１）の特定のアンチセンス配列であることができ、第２の標的は他のヌクレオチド配列由来の領域でありうる。別法として本発明の組成物は、同じ膜結合転写因子ペプチダーゼ、部位１（ＭＢＴＰＳ１）核酸標的の異なる領域にターゲッティングされる２つ以上のアンチセンス化合物を含有できる。アンチセンス化合物の多数の例は、本明細書において例示され、他は当該技術分野において周知の適切な化合物中から選択されうる。２種以上の組み合わされた化合物を一緒にまたは連続的に用いてもよい。
【０２０６】
投薬
治療用組成物の処方およびそれらの続く投与（投薬）は、当業者の技能の範囲内であると考えられる。投薬は、数日間から数カ月間続くまたは治療が効果的になるもしくは病態の減退が達成されるまでの治療過程において、治療される病態の重症度および応答性に依存する。最適な投薬計画は、患者身体での薬剤蓄積の測定から算出されうる。当業者は、最適投与量、投薬方法および繰り返し率（repetition rate）を容易に決定できる。最適な投与量は、個々のオリゴヌクレオチドの相対的効力に応じて変動する場合があり、一般にｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ動物モデルにおいて効果的であると見出されたＥＣ５０に基づいて概算されうる。一般に投与量は、体重１ｋｇあたり０．０１μｇ〜１００ｇであり、１日に、１週間に、１カ月にもしくは１年に１回もしくは複数回またはさらに２〜２０年ごとに１回である場合がある。当業者は、測定された滞留時間および体液または組織における薬剤の濃度に基づいて投薬についての繰り返し率を容易に概算できる。治療の成功に続いて、病態の再発を予防するために患者に維持療法を受けさせることが望ましい場合があり、ここでオリゴヌクレオチドは維持投与において体重１ｋｇあたり０．０１μｇ〜１００ｇ、１日１回または複数回から２０年ごとに１回の範囲で投与される。
【０２０７】
各種実施形態において、患者は、少なくとも約１、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０または少なくとも約１００ｍｇ／ｋｇ体重の薬剤用量により治療される。アンチセンスオリゴヌクレオチドの特定の注射量は、例えば、全体を参照として本願に援用した米国特許第７、５６３、８８４号明細書「ＰＴＰ１Ｂ発現のアンチセンス調節（Antisense modulation of PTP1B expression）」に記載されている。
【０２０８】
本発明の種々の実施形態は上に記載されているが、それが例示の方法によってのみ表されており、限定でないことは理解されるべきである。開示された実施形態への多数の変更は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく本明細書における開示により作製されうる。したがって、本発明の広さおよび範囲は、上に記載の実施形態のいずれによっても限定されるべきではない。
【０２０９】
本明細書に記載の全ての文書は、参照として本明細書に援用される。本出願において引用する全ての刊行物および特許書類は、それぞれ個々の刊行物または特許書類が個々に記載された場合と同じ程度に全ての目的について参照として本明細書に援用される。この書類における種々の参考文献の引用によって、出願人らはいずれの特定の参考文献をも出願人らの発明の「先行技術」であることを承認しない。発明の組成物および方法の実施形態は、以下の実施例において例示される。
【０２１０】
（実施例）
以下の非限定的実施例は、本発明の選択された実施形態を例示するために利用できる。示される構成要素の割合における変動および構成要素における代替は当業者には明らかであり、本発明の実施形態の範囲内であることが理解される。
（実施例１）
膜結合転写因子ペプチダーゼ、部位１（ＭＢＴＰＳ１）および／またはＭＢＴＰＳ１ポリヌクレオチドのセンス鎖にアンチセンスな鎖核酸分子に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計
【０２１１】
上記のとおり、用語「に特異的なオリゴヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド標的」は、（ｉ）標的遺伝子の一部分と安定な複合体を形成できる配列、または（ｉｉ）標的遺伝子のｍＲＮＡ転写物の一部分と安定な２重鎖を形成できる配列を有するオリゴヌクレオチドを意味する。
【０２１２】
適切なオリゴヌクレオチドの選択は、核酸配列を自動的に配列比較し、同一または相同な領域を示すコンピュータープログラムを使用することによって促進される。そのようなプログラムは、例えばＧｅｎｂａｎｋなどのデータベースを検索することによって、またはＰＣＲ産物を配列決定することによって得られた核酸配列を比較するために使用される。さまざまな種由来の核酸配列の比較は、種の間で適切な程度の同一性を示す核酸配列の選択を可能にする。配列決定されていない遺伝子の場合は、標的種と他の種とでの遺伝子間の同一性の程度の決定を可能にするためにサザンブロットが実施される。さまざまな程度のストリンジェンシーでサザンブロットを実行することによって、当該技術分野において周知であるとおり、同一性の近似測定値を得ることが可能である。これらの手順は、制御される対象での標的核酸配列への高い程度の相補性、および他の種での対応する核酸配列への低い程度の相補性を示すオリゴヌクレオチドの選択を可能にする。当業者には、本発明における使用のために遺伝子の適切な領域を選択することには相当な許容範囲が存在することが理解されよう。
【０２１３】
アンチセンス化合物は、標的核酸への化合物の結合が標的核酸の通常の機能を干渉し、機能および／または活性の調節を生じる場合かつ特異的結合が望まれる条件下（すなわちｉｎ  ｖｉｖｏアッセイまたは治療的処置の場合での生理的条件下およびｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの場合でのアッセイが実施される条件下）で、非標的核酸配列へのアンチセンス化合物の非特異的結合を回避するために十分な程度の相補性がある場合に「特異的にハイブリダイズできる」。
【０２１４】
本明細書において記載するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性は、当該技術分野において周知の１以上のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイによって決定されうる。例えば本明細書において記載するオリゴヌクレオチドの特性は、標的天然アンチセンスと潜在的薬剤分子との間の結合強度を融解曲線アッセイにより測定することによって得られる。
【０２１５】
標的天然アンチセンスと潜在的薬剤分子（「分子」）との間の結合強度は、分子間相互作用の強度を測定する任意の確立された方法、例えば融解曲線アッセイを使用して概算することができる。
【０２１６】
融解曲線アッセイは、天然アンチセンス／「分子」複合体に関して２本鎖立体構造から１本鎖立体構造への急速な移行が生じる温度を決定する。この温度は、２分子間の相互作用強度の信頼できる測定値として広く認められている。
【０２１７】
融解曲線アッセイは、実際の天然アンチセンスＲＮＡ分子のｃＤＮＡ複製物または「分子」の結合部位に対応する合成ＤＮＡもしくはＲＮＡヌクレオチドを使用して実施されうる。このアッセイを実行するために必要な全ての試薬を含むマルチプルキットは、利用可能である（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．  ＭｅｌｔＤｏｃｔｏｒ  ｋｉｔ）。これらのキットは、２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）結合色素（ＡＢＩ  ＨＲＭ  ｄｙｅｓ、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ、ＳＹＴＯなど）の１つを含有する適切な緩衝液を含む。ｄｓＤＮＡ色素の特性は、それらは遊離形態ではほとんど蛍光を発光しないが、ｄｓＤＮＡに結合した場合は高度に蛍光性であるものである。
【０２１８】
アッセイを実施するために、ｃＤＮＡまたは対応するオリゴヌクレオチドを「分子」と詳細な製造者の手順書によって定められた濃度で混合する。混合物をすでに形成された全てのｄｓＤＮＡ複合体を解離させるため９５℃に加熱し、次いでＤＮＡ分子をアニールさせるために室温またはキット製造者によって定められた他の低い温度まで徐冷する。新たに形成された複合体を、次いで反応によって産生される蛍光量についてのデータを連続に収集しながら同時にゆっくりと９５℃まで加熱する。蛍光強度は、反応物中に存在するｄｓＤＮＡの量に反比例する。データは、キットに適合するリアルタイムＰＣＲ装置（例えば、ＡＢＩのＳｔｅｐＯｎｅ  Ｐｌｕｓ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ＳｙｓｔｅｍまたはＬｉｇｈｔＴｙｐｅｒ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、英国ルイス所在）を使用して収集できる。
【０２１９】
融解ピークは、適切なソフトウエア（例えば、ＬｉｇｈｔＴｙｐｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）またはＳＤＳ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｃｕｒｖｅ、ＡＢＩ）を使用して温度に関する蛍光の負の微分係数（−ｄ（蛍光）／ｄＴ）  ｙ軸）を温度（ｘ軸）に対してプロットすることによって描画する。データをｄｓＤＮＡ複合体から単鎖分子への急速な移行の温度を同定するために分析する。この温度をＴｍと称し、２分子間の相互作用の強度に正比例する。典型的にはＴｍは４０℃を超える。
【０２２０】
（実施例２）
ＭＢＴＰＳ１ポリヌクレオチドの調節
アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたＨＥＰＧ２細胞の処理
ＡＴＣＣ（ｃａｔ＃  ＨＢ−８０６５）由来のＨｅｐＧ２細胞を増殖培地（ＭＥＭ／ＥＢＳＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ  ｃａｔ  ＃ＳＨ３００２４またはＭｅｄｉａｔｅｃｈ  ｃａｔ＃ＭＴ−１０−０１０−ＣＶ）  ＋１０％  ＦＢＳ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  ｃａｔ＃  ＭＴ３５−０１１−ＣＶ）＋ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  ｃａｔ＃  ＭＴ３０−００２−ＣＩ））中、３７℃にて５％ＣＯ２で増殖させた。実験当日に６ウエルプレートの培地を新鮮増殖培地に交換した。全てのアンチセンスオリゴヌクレオチドを濃度２０μＭに希釈した。この溶液２μｌをＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ  ｃａｔ＃３１９８５−０７０）  ４００μｌおよびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃａｔ＃  １１６６８０１９）４μｌと室温で２０分間インキュベートし、ＨｅｐＧ２細胞を含む６ウエルプレートの各ウエルに添加した。オリゴヌクレオチド溶液の代わりに水２μｌを含む同様の混合物を偽形質移入対照用に使用した。３７℃、５％  ＣＯ２での３〜１８時間のインキュベーション後、培地を新鮮増殖培地に交換した。アンチセンスオリゴヌクレオチド添加の４８時間後、培地を除去し、ＲＮＡを細胞からＰｒｏｍｅｇａからのＳＶ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ｃａｔ  ＃  Ｚ３１０５）またはＱｉａｇｅｎからのＲＮｅａｓｙ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ｃａｔ＃  ７４１８１）を製造者の手順書に従って使用して抽出した。ＲＮＡ  ６００ｎｇをＴｈｅｒｍｏ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのＶｅｒｓｏ  ｃＤＮＡキット（ｃａｔ＃ＡＢ１４５３Ｂ）またはＨｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキット（ｃａｔ＃４３６８８１３）を製造者の手順書に記載のとおり使用して実施した逆転写反応に加えた。この逆転写反応からのｃＤＮＡをＡＢＩ  Ｔａｑｍａｎ  ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｉｘ（ｃａｔ＃４３６９５１０）およびＡＢＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｔａｑｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ：Ｈｓ００９２１６２６＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、カリフォルニア州フォスターシティ所在）によって設計されたプライマー／プローブを使用するリアルタイムＰＣＲによって遺伝子発現をモニターするために使用した。以下のＰＣＲサイクルを使用した：  ５０℃で２分間、９５℃で１０分間、（９５℃で１５秒間、６０℃で１分間）を４０サイクル、Ｍｘ４０００  ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用。アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた処理後の遺伝子発現の処理試料と偽導入試料との間の倍数変化を１８Ｓ−標準化ｄＣｔ値の差に基づいて算出した。
【０２２１】
結果：リアルタイムＰＣＲの結果からは、ＭＢＴＰＳ１アンチセンスＨｓ５６８３６９に対して設計したオリゴで処理した４８時間後、ＨｅｐＧ２細胞中のＭＢＴＰＳ１のｍＲＮＡのレベルは有意に増大したことがわかる。
【０２２２】
本発明は、１以上の実施に関して例示および記載しているが、本明細書および付属図を解釈および理解すれば、当業者には同等の変更および修正が想起されよう。加えて、本発明の特定の特性がいくつかの実施のうちの１つにだけ関連して開示されている場合があるがそのような特性は、他の実施の１以上の他の特性と、任意の所与のまたは特定の応用のために所望されかつ有利でありうるように組み合わされてよい。
【０２２３】
開示の要約によって、読者は技術的開示の性質を確認できる。開示の要約は、以下の特許請求の範囲の範囲または意味を解釈または限定するために使用されるものではないとの理解の下に提出される。
【図１】
0006025567.tif 000002