(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゼラチンを主成分とするゼラチンビトリゲルの製造方法であって、以下の工程：
（１）精製ゼラチンを生理的な塩濃度と水素イオン濃度（pH）を保持する平衡塩類溶液に溶解させた後に、不溶性コラーゲンまたは再線維化が可能なコラーゲンを含む水溶液を添加して得た混和水溶液を冷却することでゲル化させ、ゼラチンを主成分とするゼラチンゲルを作製する工程；
（２）ゼラチンゲルを乾燥させ、ガラス化したゼラチンゲル乾燥体を作製する工程；
（３）ゼラチンゲル乾燥体に紫外線を照射する工程；および
（４）前記工程（３）を経たゼラチンゲル乾燥体を再水和し、ゼラチンビトリゲルを作製する工程
を含むことを特徴とするゼラチンビトリゲルの製造方法。
【請求項２】
前記工程（３）は、ゼラチンゲル乾燥体の両面に紫外線を照射することを特徴とする請求項１のゼラチンビトリゲルの製造方法。
【請求項３】
ゼラチンゲル乾燥体の両面に照射する紫外線の量は、ゼラチンゲル乾燥体の片面ごとに、それぞれ800 mJ/cm2以上であることを特徴とする請求項２のゼラチンビトリゲルの製造方法。
【請求項４】
ゼラチンを主成分とし、ゼラチンビトリゲルを作製可能なゼラチンゲル乾燥体の製造方法であって、以下の工程：
（１）精製ゼラチンを生理的な塩濃度と水素イオン濃度（pH）を保持する平衡塩類溶液に溶解させた後に、不溶性コラーゲンまたは再線維化が可能なコラーゲンを含む水溶液を添加して得た混和水溶液を冷却することでゲル化させ、ゼラチンを主成分とするゼラチンゲルを作製する工程；
（２）ゼラチンゲルを乾燥させ、ガラス化したゼラチンゲル乾燥体を作製する工程；および
（３）ゼラチンゲル乾燥体に紫外線を照射する工程
を含むことを特徴とするゼラチンゲル乾燥体の製造方法。
【請求項５】
ゼラチンを主成分とするゼラチンビトリゲル乾燥体の製造方法であって、以下の工程：
（１）精製ゼラチンを生理的な塩濃度と水素イオン濃度（pH）を保持する平衡塩類溶液に溶解させた後に、不溶性コラーゲンまたは再線維化が可能なコラーゲンを含む水溶液を添加して得た混和水溶液を冷却することでゲル化させ、ゼラチンを主成分とするゼラチンゲルを作製する工程；
（２）ゼラチンゲルを乾燥させ、ガラス化したゼラチンゲル乾燥体を作製する工程；
（３）ゼラチンゲル乾燥体に紫外線を照射する工程；
（４）前記工程（３）を経たゼラチンゲル乾燥体を再水和し、ゼラチンビトリゲルを作製する工程；および
（５）ゼラチンビトリゲルを再乾燥し、ガラス化したゼラチンビトリゲル乾燥体を作製する工程
を含むことを特徴とするゼラチンビトリゲル乾燥体の製造方法。
【請求項６】
さらに、（６）ゼラチンビトリゲル乾燥体に紫外線を照射する工程を含むことを特徴とする請求項５のゼラチンビトリゲル乾燥体の製造方法。
【請求項７】
前記工程（３）において、ゼラチンゲル乾燥体の一方の面に紫外線を照射し、前記工程（６）において、ゼラチンビトリゲル乾燥体の他方の面に紫外線を照射することを特徴とする請求項６のゼラチンビトリゲル乾燥体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゼラチンビトリゲルとその製造方法、ゼラチンビトリゲルを利用した医療用素材、香粧品および食品素材と、ゼラチンゲル乾燥体、ゼラチンビトリゲル乾燥体とその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
本発明者は、低温でゲル化（gelation）に至適な塩濃度と水素イオン濃度（pH）を付与したコラーゲンのゾルを培養シャーレ内に注入して、さらに至適な温度に保温することでコラーゲンのゾルをゲル化した後、低温で十分に乾燥させることで自由水のみならず結合水も徐々に除去してガラス化（vitrification）し、さらに再水和（rehydration）することで、コラーゲンゲルの物性を、強度と透明性に優れた薄膜に再現性良く変換する技術を確立している（特許文献１）。
【０００３】
そして、本発明者は、ハイドロゲルであればコラーゲン以外の成分のゲルでも、ガラス化した後に再水和することで、ゲルを安定した新しい物性状態に変換することができるので、このガラス化工程を経て作製された新しい物性状態のゲルをビトリゲル（vitrigel）と命名しており（非特許文献１）、この名称は、新しい学術用語として既に定着している。
【０００４】
また、本発明者は、ビトリゲルに関する技術をさらに発展させ、コラーゲンビトリゲル膜の透明性、作製再現性を向上させるための技術（特許文献２）や、コラーゲンビトリゲルを膜形状ではなく糸状あるいは管状の形状に作製する技術（特許文献３）なども確立している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平8−228768号公報
【特許文献２】WO2005／014774
【特許文献３】特開2007−204881号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Takezawa T, et al., Cell Transplant. 13: 463-473, 2004
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このように、ビトリゲルは、例えば、ウシまたはブタなどのネイティブコラーゲンまたはアテロコラーゲンなどを使用して各種の研究がなされ、多方面への応用が期待されているが、コラーゲンは比較的高価であるため、コラーゲンを原料としたコラーゲンビトリゲルの場合にはコストを抑制することが難しいという問題がある。したがって、ビトリゲルを応用した各種の製品を市場に流通させるためには、コストを安価に抑えることが求められている。
【０００８】
そこで、本発明者らは、ビトリゲルの原料として安価なゼラチンに着目した。ゼラチンを原料として使用できることは、例えば特許文献２などにも記載されてはいるが、ゼラチンは高温では溶解してしまうため、ゼラチンを原料としたゼラチンビトリゲルを、生体温度（およそ３７℃）で使用される医療用素材や香粧品などへ応用するためには、熱安定性についてのさらなる改良が必要であると考えられた。
【０００９】
また、ゼラチンビトリゲルの熱安定性を高めることができれば、例えば、加熱調理しても溶解しないゼラチンとして、全く新しい食品素材を創出できるとも考えられる。
【００１０】
本発明は、以上のような事情に鑑みてなされたものであり、安価で、熱安定性に優れたゼラチンビトリゲルおよびこの製造方法を提供し、さらに、このゼラチンビトリゲルを利用した医療用素材、香粧品および食品素材を提供することを課題としている。また、このようなゼラチンビトリゲルを得ることが可能なゼラチンゲル乾燥体、ゼラチンビトリゲルゲル乾燥体とその製造方法を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記の課題を解決するため、本発明のゼラチンビトリゲルの製造方法は、以下のことを特徴としている。
＜１＞ゼラチンを主成分とするゼラチンビトリゲルの製造方法であって、以下の工程：
（１）精製ゼラチンを生理的な塩濃度と水素イオン濃度（pH）を保持する平衡塩類溶液に溶解させた後に、不溶性コラーゲンまたは再線維化が可能なコラーゲンを含む水溶液を添加して得た混和水溶液を冷却することでゲル化させ、ゼラチンを主成分とするゼラチンゲルを作製する工程；
（２）ゼラチンゲルを乾燥させ、ガラス化したゼラチンゲル乾燥体を作製する工程；
（３）ゼラチンゲル乾燥体に紫外線を照射する工程；および
（４）前記工程（３）を経たゼラチンゲル乾燥体を再水和し、ゼラチンビトリゲルを作製する工程
を含む。
＜２＞前記工程（３）は、ゼラチンゲル乾燥体の両面に紫外線を照射する。
＜３＞ゼラチンゲル乾燥体の両面に照射する紫外線の量は、ゼラチンゲル乾燥体の片面ごとに、それぞれ800 mJ/cm2以上である。
【００１６】
本発明のゼラチンゲル乾燥体の製造方法は、以下のことを特徴としている。
＜４＞ゼラチンを主成分とし、ゼラチンビトリゲルを作製可能なゼラチンゲル乾燥体の製造方法であって、以下の工程：
（１）精製ゼラチンを生理的な塩濃度と水素イオン濃度（pH）を保持する平衡塩類溶液に溶解させた後に、不溶性コラーゲンまたは再線維化が可能なコラーゲンを含む水溶液を添加して得た混和水溶液を冷却することでゲル化させ、ゼラチンを主成分とするゼラチンゲルを作製する工程；
（２）ゼラチンゲルを乾燥させ、ガラス化したゼラチンゲル乾燥体を作製する工程；および
（３）ゼラチンゲル乾燥体に紫外線を照射する工程
を含む。
【００１８】
本発明のゼラチンビトリゲル乾燥体の製造方法は、以下のことを特徴としている。
＜５＞ゼラチンを主成分とするゼラチンビトリゲル乾燥体の製造方法であって、以下の工程：
（１）精製ゼラチンを生理的な塩濃度と水素イオン濃度（pH）を保持する平衡塩類溶液に溶解させた後に、不溶性コラーゲンまたは再線維化が可能なコラーゲンを含む水溶液を添加して得た混和水溶液を冷却することでゲル化させ、ゼラチンを主成分とするゼラチンゲルを作製する工程；
（２）ゼラチンゲルを乾燥させ、ガラス化したゼラチンゲル乾燥体を作製する工程；
（３）ゼラチンゲル乾燥体に紫外線を照射する工程；
（４）前記工程（３）を経たゼラチンゲル乾燥体を再水和し、ゼラチンビトリゲルを作製する工程；および
（５）ゼラチンビトリゲルを再乾燥し、ガラス化したゼラチンビトリゲル乾燥体を作製する工程
を含む。
＜６＞さらに、（６）ゼラチンビトリゲル乾燥体に紫外線を照射する工程を含む。
＜７＞前記工程（３）において、ゼラチンゲル乾燥体の一方の面に紫外線を照射し、前記工程（６）において、ゼラチンビトリゲル乾燥体の他方の面に紫外線を照射する。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の製造方法によれば、安価で、熱安定性に優れたゼラチンビトリゲルを製造することができる。また、本発明のゼラチンビトリゲルは、安価で、熱安定性に優れているため、医療用素材、香粧品および食品素材などへの応用することができる。さらに、本発明のゼラチンゲル乾燥体およびゼラチンビトリゲル乾燥体は、再水和することでゼラチンビトリゲルに変換可能であり、産業上有効に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】実施例１で使用したゼラチン溶液に含まれる不溶性の残渣を示した位相差顕微鏡写真である。図中のBarは0.2ｍｍを示している。
【図２】実施例１で作製したゼラチンビトリゲルをピンセットでつまみ上げた様子を示す巨視的写真である。
【図３】実施例１で作製したゼラチンビトリゲルの上方からの巨視的写真である。
【図４】実施例１で作製したゼラチンビトリゲルを37℃のインキュベーター内に移し入れてから２時間後の状態を示す巨視的写真である。
【図５】比較例１において、実施例１で使用したゼラチンビトリゲル中の不溶性残渣をフィルターで除去した状態を示した位相差顕微鏡写真である。図中のBarは0.2ｍｍを示している。
【図６】不溶性残渣を含まないゼラチンゲルが溶解した状態を示す巨視的写真である。
【図７】200mJ/cm2の積算照射量で紫外線を照射したゼラチンゲル乾燥体を4℃のPBSで再水和した後、37℃のインキュベーター内に移し入れてから２時間後の状態を示す巨視的写真である。
【図８】400mJ/cm2の積算照射量で紫外線を照射したゼラチンゲル乾燥体を4℃のPBSで再水和した後、37℃のインキュベーター内に移し入れてから２時間後の状態を示す巨視的写真である。
【図９】400mJ/cm2の積算照射量で紫外線を照射したゼラチンゲル乾燥体を4℃のPBSで再水和した後、37℃のインキュベーター内に移し入れてから２時間後の状態を示す巨視的写真である。
【図１０】800mJ/cm2の積算照射量で紫外線を照射したゼラチンゲル乾燥体を4℃のPBSで再水和した後、37℃のインキュベーター内に移し入れてから２時間後の状態を示す巨視的写真である。
【図１１】800mJ/cm2の積算照射量で紫外線を照射したゼラチンゲル乾燥体を4℃のPBSで再水和した後、37℃のインキュベーター内に移し入れてから２日目の状態を示す巨視的写真である。
【図１２】800mJ/cm2の積算照射量で紫外線を照射したゼラチンゲル乾燥体を4℃のPBSで再水和した後、37℃のインキュベーター内に移し入れてから３日目の状態を示す巨視的写真である。
【図１３】800mJ/cm2の積算照射量で紫外線を照射したゼラチンゲル乾燥体を4℃のPBSで再水和した後、37℃のインキュベーター内に移し入れてから７日目の状態を示す巨視的写真である。
【図１４】1,600mJ/cm2の積算照射量で紫外線を照射したゼラチンゲル乾燥体を4℃のPBSで再水和した後、37℃のインキュベーター内に移し入れてから２時間後の状態を示す巨視的写真である。
【図１５】1,600mJ/cm2の積算照射量で紫外線を照射したゼラチンゲル乾燥体を4℃のPBSで再水和した後、37℃のインキュベーター内に移し入れてから７日目の状態を示す巨視的写真である。
【図１６】不溶性残渣を除去したゼラチンゲル乾燥体に800mJ/cm2の積算照射量で紫外線を照射した後、4℃のPBSで再水和した状態を示す巨視的写真である。
【図１７】不溶性残渣を除去したゼラチンゲル乾燥体に1,600mJ/cm2の積算照射量で紫外線を照射した後、4℃のPBSで再水和した状態を示す巨視的写真である。
【図１８】800 mJ/cm2（片面400 mJ/cm2 ×2）の積算照射量で紫外線を照射する工程を経て作製したゼラチンビトリゲルを37℃のインキュベーター内に移し入れてから１日目の状態を示す巨視的写真である。
【図１９】800 mJ/cm2（片面400 mJ/cm2 ×2）の積算照射量で紫外線を照射する工程を経て作製したゼラチンビトリゲルを37℃のインキュベーター内に移し入れてから２日目の状態を示す巨視的写真である。
【図２０】800 mJ/cm2（片面400 mJ/cm2 ×2）の積算照射量で紫外線を照射する工程を経て作製したゼラチンビトリゲルを37℃のインキュベーター内に移し入れてから３日目の状態を示す巨視的写真である。
【図２１】800 mJ/cm2（片面400 mJ/cm2 ×2）の積算照射量で紫外線を照射する工程を経て作製したゼラチンビトリゲルを37℃のインキュベーター内に移し入れてから７日目の状態を示す巨視的写真である。
【図２２】1,600 mJ/cm2（片面800 mJ/cm2 ×2）の積算照射量で紫外線を照射する工程を経て作製したゼラチンビトリゲルを37℃のインキュベーター内に移し入れてから７日目の状態を示す巨視的写真である。
【図２３】1,600 mJ/cm2（片面800 mJ/cm2 ×2）の積算照射量で紫外線を照射する工程を経て作製したゼラチンビトリゲルを５０℃で２４時間加温し続けた状態を示す巨視的写真である。
【図２４】1,600 mJ/cm2（片面800 mJ/cm2 ×2）の積算照射量で紫外線を照射する工程を経て作製したゼラチンビトリゲルを９５℃で３分間加温し続けた状態を示す巨視的写真である。
【図２５】1,600 mJ/cm2（片面800 mJ/cm2 ×2）の積算照射量で紫外線を照射する工程を経て作製したゼラチンビトリゲルを９５℃で３分間加温し続けた後に、ピンセットで摘み上げた状態を示す巨視的写真である。
【図２６】1,600 mJ/cm2（片面800 mJ/cm2 ×2）の積算照射量で紫外線を照射する工程を経て作製したゼラチンビトリゲルを約2.5x1.0cmにナイフで切断した後、180℃の食用油中で約１分間素揚げして取り出した状態を示した巨視的写真である。
【図２７】1,600 mJ/cm2（片面800 mJ/cm2 ×2）の積算照射量で紫外線を照射する工程を経て作製したマグロ由来ゼラチンビトリゲル上に、ヒト真皮由来線維芽細胞を播種して３日間培養した後に、calcein-AM およびethidium homodimer を用いて蛍光染色した細胞の形態を蛍光顕微鏡により観察した顕微鏡写真である。図中のBarは0.2ｍｍを示している。
【図２８】1,600 mJ/cm2（片面800 mJ/cm2 ×2）の積算照射量で紫外線を照射する工程を経て作製したマグロ由来ゼラチンビトリゲル上に、ヒト真皮由来線維芽細胞を播種して３日間培養した後に、位相差顕微鏡により観察した顕微鏡写真である。図中のBarは0.2ｍｍを示している。
【図２９】バラエキス溶液に５分間浸潤させたマグロ由来ゼラチンビトリゲル膜の巨視的写真である。
【図３０】バラエキス溶液が浸潤したゼラチンビトリゲル膜をヒト皮膚表面に吸着させた直後の巨視的写真である。
【図３１】ヒト皮膚表面に密着したバラエキス含有ゼラチンビトリゲル膜の巨視的写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明のゼラチンビトリゲルの製造方法は、ゼラチンを主成分とするゼラチンビトリゲルの製造方法であって、以下の工程：
（１）不溶性コラーゲンまたは再線維化が可能なコラーゲンを含むゼラチン水溶液を冷却することでゲル化させ、ゼラチンを主成分とするゼラチンゲルを作製する工程；
（２）ゼラチンゲルを乾燥させ、ガラス化したゼラチンゲル乾燥体を作製する工程；
（３）ゼラチンゲル乾燥体に紫外線を照射する工程；および
（４）前記工程（３）を経たゼラチンゲル乾燥体を再水和し、ゼラチンビトリゲルを作製する工程を含む。
【００２４】
以下、本発明のゼラチンビトリゲルの製造方法の一実施形態について、上記の各工程に沿って説明する。
【００２５】
工程（１）では、不溶性コラーゲンまたは再線維化が可能なコラーゲンを含むゼラチン水溶液を冷却することでゲル化させ、ゼラチンを主成分とするゼラチンゲルを作製する。
【００２６】
工程（１）で使用するゼラチン水溶液は、動物の原皮に由来する不溶性残渣としての不溶性コラーゲンを含む粗抽出ゼラチン水溶液、または、精製ゼラチンを溶媒に溶解させた後に不溶性コラーゲンまたは再線維化が可能なコラーゲンを含む水溶液を添加した混和水溶液であることが好ましい。また、不溶性コラーゲンまたは再線維化が可能なコラーゲンを含む混和水溶液は、未変性の酸可溶性コラーゲン水溶液を少量添加した均一水溶液であることが好ましい。
【００２７】
ゼラチンは、例えば、従来知られている公知のものを用途に応じて適宜使用することができ、具体的には、ウシ、ブタ、トリ等の畜産物や魚介類等の水産物に由来するものを例示することができる。
【００２８】
なかでも、コストを低く抑えるためには、魚類由来の原皮を原料とした粗抽出ゼラチン水溶液を使用することが好ましい。ここで、魚類由来の原皮には、ゼラチンを含む魚の皮膚や鱗が含まれる。
【００２９】
魚類由来の原皮を原料とする場合、魚の種類は特に限定されない。具体的には、例えば、マグロ、ティラピア、コイ、ナイルパーチ(Nile perch)、サケ、シタビラメ、熱帯シタビラメ、ポーラック(pollack)、メルルーサ、サバなどの魚を使用することができるが、コラーゲンの変性温度の観点からは、マグロ、ティラピアなどが特に好ましい。特に、マグロは、我が国において最も利用されている魚種でありその利用量は、水揚げ・輸入を含め、４８万トンが供給されている。しかしながら、その皮膚部分は約５０％が廃棄物に、残り約５０％が飼料となる以外、有効利用されているものは１％程度に過ぎない。したがって、バイオマスの有効利用の観点からは、マグロ由来のゼラチンを利用することが特に好ましい。
【００３０】
また、粗抽出ゼラチンに含まれる不溶性残渣は、不溶性コラーゲン、ハイドロキシアパタイトなどを例示することができる。ここで、加温しても溶解しないゼラチンビトリゲルを作製するためには、特に、少量の不溶性コラーゲンおよび／または再線維化が可能なコラーゲンが含まれるゼラチン水溶液を用いる必要がある。このゼラチン水溶液中のゼラチン含量、および不溶性コラーゲン、再線維化が可能なコラーゲンの量は、作製するゼラチンビトリゲルの厚さなどを考慮して適宜調節することができる。
【００３１】
粗抽出ゼラチンに含まれる不溶性残渣の割合は、原料や抽出方法などにより変動するが、ゼラチンビトリゲルの用途などに応じて適宜、不溶性残渣の割合を調節することができる。例えば、動物の原皮を細切した後にアルカリ処理して加熱処理によりゼラチンを粗抽出し、さらにろ過により大きな不溶物を除去した場合には、不溶性残渣は、ゼラチン水溶液の体積の0.1％〜20％程度とすることができる。
【００３２】
また、精製ゼラチンに対する不溶性コラーゲン、再線維化が可能なコラーゲンの割合も、ゼラチンビトリゲルの用途などに応じて適宜設定することができる。具体的には、精製ゼラチン水溶液に対して、未変性の0.5(w/v)%酸可溶性コラーゲン水溶液（再線維化が可能なコラーゲンを含む水溶液）を添加する割合は、水溶液の体積比として、例えば、およそ0.01〜90％程度、好ましくは10〜70％程度の範囲を例示することができる。この値を精製ゼラチン水溶液に対する不溶性コラーゲンの含量として換算すると、0.005〜0.45(w/v)％程度、好ましくは0.05〜0.35(w/v)程度の範囲を好ましく例示することができる。つまり、精製ゼラチン水溶液に対する再線維化が可能なコラーゲンを含む水溶液の割合または不溶性コラーゲンの含量がこの範囲であると、ゼラチンビトリゲルの熱安定性が向上するため、医療用素材、香粧品、食品素材などとして産業上有効に利用することができる。
【００３３】
また、精製ゼラチンの粉末や凍結乾燥品を溶解させる溶媒としては、精製水、PBS（Phosphate Buffered Saline）、生理食塩水、HBSS（Hank’s Balanced Salt Solution）、基礎培養液、無血清培養液、あるいは血清含有培養液などを例示することができる。なかでも、生理的な塩濃度と水素イオン濃度（pH）を保持しているPBS等の平衡塩類溶液でゼラチンを溶解した場合には、酸可溶性コラーゲン水溶液と混和した際に未変性コラーゲンの再線維化を効果的に誘導できる。一方、平衡塩類溶液でない精製水等でゼラチンを溶解した場合には、コラーゲンの再線維化を誘導することが難しく、この場合には、不溶性コラーゲンを別途分散させることが好ましい。このようにして、精製ゼラチンを用いた場合も、熱安定性が保持されたゼラチンビトリゲルを作製できる。
【００３４】
そして、不溶性残渣としての不溶性コラーゲンを含有する粗抽出ゼラチン水溶液、または、少量の不溶性コラーゲンまたは再線維化が可能なコラーゲンが含まれるゼラチン水溶液を、例えば、プラスチック製の培養シャーレなどに所定量注入し、数時間以上20℃以下に冷却してゲル化させることで、ゼラチンゲルを作製する。一般的には、数時間以上20℃以下に冷却することでゼラチンのゲル化は完了するが、4℃の場合は２時間程度の冷却でゼラチンのゲル化は完了する。また、ゲル化させるゼラチン水溶液のｐＨは、６〜８程度が好ましい。
【００３５】
また、粗抽出ゼラチン水溶液および精製ゼラチンを溶解したゼラチン水溶液におけるゼラチンの濃度は、0.5〜5.0％、好ましくは1.5〜3.0％程度の範囲とすることができる。0.5％以下になると希薄すぎてゲル化が弱く、5.0％以上になると濃度が高すぎて均一化が困難になる。
【００３６】
工程（２）では、ゼラチンゲルを乾燥させ、ガラス化したゼラチンゲル乾燥体を作製する。
【００３７】
ゼラチンゲルの乾燥は、例えば、風乾、密閉容器内で乾燥（容器内の空気を循環させ、常に乾燥空気を供給する）、シリカゲルを置いた環境下で乾燥する等、種々の方法を用いることができる。例えば、風乾の方法としては、10℃、40％湿度で無菌に保たれたインキュベーターで数時間〜数日間乾燥させる方法や、無菌状態のクリーンベンチ内で一昼夜、20℃以下の室温で乾燥する方法などを例示することができる。
【００３８】
ゼラチンゲルを乾燥させることで、ゼラチンゲル中の自由水が除去された後にゼラチンやコラーゲンの分子より結合水が徐々に除去され始めることにより、ガラス化したゼラチンゲル乾燥体を作製することができる。このガラス化工程の期間を長くするほど、再水和した際には透明度、強度に優れたゼラチンビトリゲルを得ることができる。
【００３９】
工程（３）では、ゼラチンゲル乾燥体に紫外線を照射する。
【００４０】
ゼラチンゲル乾燥体に紫外線を照射することで、ゼラチンビトリゲルの熱安定性を向上させることができる。これは、紫外線照射によって、ゼラチンゲル乾燥体に架橋が導入されることによるものと考えられる。
【００４１】
ゼラチンゲル乾燥体への紫外線の照射量は、ゼラチンゲル乾燥体の大きさや厚さなどに応じて適宜設定することができるが、例えば、積算照射量で400mJ/cm2〜2000 mJ/cm2、好ましくは、800mJ/cm2以上とすることができる。
【００４２】
また、ゼラチンゲル乾燥体への紫外線の照射は、ゼラチンゲル乾燥体の両面（表裏面）に行うことが好ましい。この場合、ゼラチンゲル乾燥体の両面に照射する紫外線の量は、ゼラチンゲル乾燥体の片面ごとに、それぞれ800 mJ/cm2以上とすることが好ましい。これによって、ゼラチンビトリゲルの熱安定性を向上させることができる。
【００４３】
後述するように、ゼラチンゲル乾燥体は、必要なときに再水和することで熱安定性を有したゼラチンビトリゲルを作製することができるため、産業上有効に利用することができる。
【００４４】
工程（４）では、前記工程（３）を経たゼラチンゲル乾燥体を再水和し、ゼラチンビトリゲルを作製する。
【００４５】
ゼラチンゲル乾燥体を精製水、ＰＢＳ、培養液などで再水和することでゼラチンビトリゲルを作製することができる。
【００４６】
再水和する液体には、ゼラチンビトリゲルの用途に応じて各種の成分などが含まれていてもよい。
【００４７】
具体的には、ゼラチンビトリゲルを医療用素材として使用する場合には、例えば、抗生物質をはじめとする各種医薬品、細胞増殖因子、分化誘導因子、細胞接着因子、抗体、酵素、サイトカイン、ホルモン、レクチン、またはゲル化しない細胞外マトリックス成分としてファイブロネクチン、ビトロネクチン、エンタクチン、オステオポエチン等の生理活性物質が含まれていてもよい。
【００４８】
生理活性物質を含有するゼラチンビトリゲルは、細胞の接着・増殖・分化などに必要な因子をゼラチンビトリゲル側から供給することができるので、より良い培養環境を実現することができる。また、含有させた生理活性物質の細胞に対する影響を調べる試験を行うのに非常に有用である。また、生理活性物質を含んだゼラチンビトリゲルは、体内へ移植することで薬物送達システムとしても機能し得る。
【００４９】
さらに、ゼラチンビトリゲルは、分子量の大きな生理活性物質を透過することが可能であり、それにより、このゼラチンビトリゲルの表裏面に播種された各々の細胞の間での生理活性物質を介した相互作用の試験・研究に大きく貢献できる。
【００５０】
また、ゼラチンビトリゲルは、細胞を培養する細胞培養担体として用いることができる。培養する細胞としては、初代培養細胞、株化細胞、受精卵、およびそれらの細胞に外来遺伝子を導入した細胞が挙げられる。さらにそれらの細胞が、未分化な幹細胞、分化過程にある細胞、終末分化した細胞、および脱分化した細胞であっても良い。また、それらの細胞の培養を開始する手段としては、細胞懸濁液、細切組織片、受精卵、または三次元再構築したゲル培養体あるいは多細胞性凝集塊（スフェロイド）の播種が挙げられる。つまり、既存の方法で培養できる接着性の細胞はゼラチンビトリゲル上で培養することが可能である。
【００５１】
さらに、例えば上記の細胞を、ゼラチンビトリゲルの片面はもちろんのこと、両面に１種類以上の細胞を培養することが可能である。両面培養においては、各々の面に異種の細胞を培養することが可能である。特に、ゼラチンビトリゲルの一方の面には上皮系細胞、他方の面には間充織細胞を培養することで、上皮間充織相互作用を有した経皮吸収モデルや腸管吸収モデルなど、また、一方の面には血管内皮細胞、他方の面にはガン細胞を培養することで、血管新生モデルやガン浸潤モデルなどの細胞機能アッセイを可能とする。
【００５２】
本発明のゼラチンビトリゲルは、熱安定性に優れ、例えば、生体温度（およそ３７℃）においても溶解することがないため、特に、再生医療分野などで有効利用できる医療用素材となり得る。
【００５３】
また、ゼラチンビトリゲルを香粧品として使用する場合には、例えば、通常化粧料で使用される任意の成分を含有することができる。このような任意成分としては、例えば、マカデミアナッツ油、アボガド油、トウモロコシ油、オリーブ油、ナタネ油、ゴマ油、ヒマシ油、サフラワー油、綿実油、ホホバ油、ヤシ油、パーム油、ハッカ油、液状ラノリン、硬化ヤシ油、硬化油、モクロウ、硬化ヒマシ油、ミツロウ、キャンデリラロウ、カルナウバロウ、イボタロウ、ラノリン、還元ラノリン、硬質ラノリン、ホホバロウ等のオイル、ワックス類、流動パラフィン、スクワラン、プリスタン、オゾケライト、パラフィン、セレシン、ワセリン、マイクロクリスタリンワックス等の炭化水素類、オレイン酸、イソステアリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、ウンデシレン酸等の高級脂肪酸類、セチルアルコール、ステアリルアルコール、イソステアリルアルコール、ベヘニルアルコール、オクチルドデカノール、ミリスチルアルコール、セトステアリルアルコール等の高級アルコール等、イソオクタン酸セチル、ミリスチン酸イソプロピル、イソステアリン酸ヘキシルデシル、アジピン酸ジイソプロピル、セバチン酸ジ−２−エチルヘキシル、乳酸セチル、リンゴ酸ジイソステアリル、ジ−２−エチルヘキサン酸エチレングリコール、ジカプリン酸ネオペンチルグリコール、ジ−２−ヘプチルウンデカン酸グリセリン、テトラ−２−エチルヘキサン酸ペンタンエリトリット等の合成エステル油類、ジメチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン、ジフェニルポリシロキサン等の鎖状ポリシロキサン、オクタメチルシクロテトラシロキサン、デカメチルシクロペンタシロキサン、ドデカメチルシクロヘキサンシロキサン等の環状ポリシロキサン、アミノ変性ポリシロキサン、ポリエーテル変性ポリシロキサン、アルキル変性ポリシロキサン、フッ素変性ポリシロキサン等の変性ポリシロキサン等のシリコーン油等の油剤類、脂肪酸セッケン（ラウリン酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム等）、ラウリル硫酸カリウム、アルキル硫酸トリエタノールアミンエーテル等のアニオン界面活性剤類、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、ラウリルアミンオキサイド等のカチオン界面活性剤類、イミダゾリン系両性界面活性剤（２−ココイル−２−イミダゾリニウムヒドロキサイド−１−カルボキシエチロキシ２ナトリウム塩等）、ベタイン系界面活性剤（アルキルベタイン、アミドベタイン、スルホベタイン等）、アシルメチルタウリン等の両性界面活性剤類、ポリエチレングリコール、グリセリン、１，３−ブチレングリコール、エリスリトール、ソルビトール、キシリトール、マルチトール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ジグリセリン、イソプレングリコール、１，２−ペンタンジオール、２，４−ヘキシレングリコール、１，２−ヘキサンジオール、１，２−オクタンジオール等の多価アルコール類、ピロリドンカルボン酸ナトリウム、乳酸、乳酸ナトリウム等の保湿成分類、グアガム、クインスシード、カラギーナン、ガラクタン、アラビアガム、ペクチン、マンナン、デンプン、キサンタンガム、カードラン、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルヒドロキシプロピルセルロース、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、グリコーゲン、ヘパラン硫酸、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸ナトリウム、トラガントガム、ケラタン硫酸、コンドロイチン、ムコイチン硫酸、ヒドロキシエチルグアガム、カルボキシメチルグアガム、デキストラン、ケラト硫酸，ローカストビーンガム，サクシノグルカン，カロニン酸，キチン，キトサン、カルボキシメチルキチン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、ベントナイト等の増粘剤、パラアミノ安息香酸系紫外線吸収剤、アントラニル酸系紫外線吸収剤、サリチル酸系紫外線吸収剤、桂皮酸系紫外線吸収剤、ベンゾフェノン系紫外線吸収剤、糖系紫外線吸収剤、２−（２’−ヒドロキシ−５’−ｔ−オクチルフェニル)ベンゾトリアゾール、４−メトキシ−４’−ｔ−ブチルジベンゾイルメタン等の紫外線吸収剤類、エタノール、イソプロパノール等の低級アルコール類、ビタミンＡ又はその誘導体、ビタミンＢ6塩酸塩，ビタミンＢ6トリパルミテート，ビタミンＢ6ジオクタノエート，ビタミンＢ2又はその誘導体，ビタミンＢ12，ビタミンＢ15又はその誘導体等のビタミンＢ類、ビタミンＥアセテート等のビタミンＥ類、ビタミンＤ類、ビタミンＨ、パントテン酸、パンテチン、ピロロキノリンキノン等のビタミン類などが好ましく例示できる。
【００５４】
本発明のゼラチンビトリゲルは、例えば、生体温度（およそ３７℃）においても熱安定性に優れ、全く溶解しないように調製することや徐々に溶解するように調製することが可能であるため、特に、医療用素材のみならず化粧品、香料などの香粧品にも有効利用することができる。
【００５５】
さらに、ゼラチンビトリゲルを食品素材として使用する場合には、例えば、糖や糖アルコール類、肉や魚のエキス類、タンパク質、ペプチド、アミノ酸類、食物繊維、ビタミン類、澱粉類、デキストリン、油脂類、アルコール類、塩類、調味料、香辛料、保存料、甘味料、着色料、品質改良剤、香料などの成分を含むことができる。
【００５６】
本発明のゼラチンビトリゲルは、熱安定性に優れ、例えば、およそ１００℃の沸騰水や、１８０℃以上の油によっても溶解せず、固形の形状を留めることができる。したがって、本発明のゼラチンビトリゲルは、加熱調理しても食感、食味が維持可能な全く新しい食品素材となり得る。
【００５７】
さらに、工程（５）として、上記の工程（１）〜（４）を含む方法によって作製されたゼラチンビトリゲルを再乾燥し、ガラス化させる工程を含むことで、ゼラチンビトリゲル乾燥体を作製することができる。このゼラチンビトリゲル乾燥体は、必要な時に再水和することで、再度ゼラチンビトリゲルに変換することができるため、産業上有効に利用することができる。
【００５８】
さらに、ゼラチンビトリゲル乾燥体の製造においては、工程（６）として、工程（５）で作製したゼラチンビトリゲル乾燥体に紫外線を照射する工程を含むことができる。例えば、工程（３）においては、ゼラチンゲル乾燥体が培養シャーレなどに付着することによってゼラチンゲル乾燥体の反転操作が難しい場合などに、ゼラチンゲル乾燥体の両面に紫外線を照射することが困難である場合もある。このような場合には、例えば、工程（３）において、ゼラチンゲル乾燥体の一方の面（片面）に所望の量の紫外線を照射し、工程（４）において、このゼラチンゲル乾燥体を再水和してゼラチンビトリゲルを作製し、このゼラチンビトリゲルを培養シャーレなどから取り出して表裏を反転させた後、工程（５）において、再度乾燥させることで、ガラス化したゼラチンビトリゲル乾燥体を得て、工程（６）において、このゼラチンゲル乾燥体の他方の面（工程（３）において紫外線が照射されていない面）に紫外線を照射することができる。このゼラチンビトリゲル乾燥体は、再度、再水和することで、ゼラチンビトリゲルを作製することができる。このような工程を経たゼラチンビトリゲルは、上記の通り、作製過程において両面（表裏面）から紫外線の照射を受けているため、熱安定性が向上している。なお、この場合も、紫外線の照射量は、ゼラチンゲル乾燥体およびゼラチンビトリゲル乾燥体の片面ごとに、それぞれ800 mJ/cm2以上とすることが好ましい。
【００５９】
本発明のゼラチンビトリゲルとその製造方法は、以上の形態に限定されることはなく、例えば、本発明者がこれまでに提案している形態（特許文献１、２、PCT/JP2011/069191）を踏まえることができる。
【００６０】
具体的には、例えば、上述のゼラチン水溶液には、ナイロン膜などからなる支持体を導入することができる。また、基板上に配置された壁面鋳型を利用して、その内部に溶解（ゾル化）したゼラチンを注入して、ゲル化、ガラス化、再水和を行うことができる（PCT/JP2011/069191）。さらに、ゼラチンゲル乾燥体の上に上述のゼラチン水溶液を重層してゲル化、ガラス化および再水和すること（PCT/JP2011/069191）、上述のゼラチン水溶液に既に作製したゼラチンビトリゲルあるいはその乾燥体を包埋してゲル化、ガラス化および再水和することによって、任意の厚さのゼラチンビトリゲルを作製することができる。また、ゼラチンゲル乾燥体やゼラチンビトリゲル乾燥体が剥離可能なフィルム上でガラス化することもできる（PCT/JP2011/069191）。この場合、ゼラチンゲル乾燥体の取り扱い性が向上し、ゼラチンゲル乾燥体への紫外線照射を容易に行うことができる。
【実施例】
【００６１】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００６２】
〔実施例１：お刺身コラーゲンスライス（株式会社エコ&ヘルスラボ製品  製品番号80924）より作製できるゼラチンビトリゲル]
冷凍製品として市販されているお刺身コラーゲンスライス（株式会社エコ&ヘルスラボ製品  製品番号80924）はマグロの皮を細切した後、アルカリ処理、加熱処理によりゼラチンを粗抽出し、ろ過により大きな不溶物を除去することにより調製されたマグロゼラチンを主成分とするゼラチンゲルである。このゼラチンゲルは上述の工程により調製されるため、約40℃に加温することにより溶液状態に容易に変換できるが、このゼラチン溶液には不溶性の小さな残渣が含まれている（図１）。
【００６３】
上述の40℃で可溶化したゼラチン溶液2ｍｌを直径35ｍｍの細胞培養用シャーレ（FALCON  Cat．No353001）に注ぎ蓋をして、4℃、2時間静置することによりゲル化させた。このゼラチンゲルを温度10℃湿度40％のインキュベーター内に蓋をはずした状態で2日間静置することにより、ゼラチンゲル内の自由水は2日目までに完全に除去されることで乾固状態となることが分かった。ここでガラス化は自由水が完全に除去された時点から進行しているので、ビトリゲル作製の定法に従えば、この乾固状態にある乾燥体（ゼラチンゲル乾燥体）を再水和することでゼラチンビトリゲルが作製できることになる。そこで、この自由水が完全に除去され、ガラス化が始まっている培養シャーレ内に4℃で2 mlのPBSを加えて再水和した。このゼラチンビトリゲルは培養シャーレの底面に吸着しているが、培養シャーレの壁面に沿ってピンセットの先端で底面側に傷をつけた後にピンセットでつまみ上げて剥離することができる（図２）。剥離したゼラチンビトリゲルは脆く、取扱いが困難であった（図３）。またこのゼラチンビトリゲルを再生医療用素材として応用する視点から、37℃のインキュベーター内に移し入れ、経時的に観察した結果2時間以内にほとんど全てがPBS中に溶解してしまい、ゼラチンビトリゲルとして維持できないことがわかった（図４）。
【００６４】
[比較例１：不溶性残渣を除去した実施例１のゼラチンからのビトリゲル作製の検討]
実施例１のゼラチン溶液内に存在する不溶性の小さな残渣は、ゼラチン溶液を遠心機にて処理［3000rpm（＝1400g）×30分］］し、その上清を0.45μmのフィルターでろ過することで除去できた（図５）。この残渣を除去したゼラチン溶液を用いて、実施例１と同様の方法にてゼラチンビトリゲルの作製を試みた。その結果、培養シャーレ内に4℃で2 mlのPBSを注いだところ、乾固状態にあった残渣のないゼラチンゲル乾燥体はPBS中にほとんど全てが溶解してしまい、ゼラチンビトリゲルとしては回収できなかった（図６）。このことからゼラチンビトリゲルの作製には、ゼラチン溶液中の不溶性の小さな残渣が必要であることが示唆された。次にこの不溶性残渣は上述の遠心処理後の沈殿物として回収できるので、その特性を解析した。その結果この沈殿物は希塩酸に容易に溶解することがわかった。実施例１記載のお刺身コラーゲンスライスの製造工程を考慮すると、この沈殿物（ゼラチン溶液中不溶性残渣）は希塩酸に溶解したことから不溶性コラーゲンであることが推察された。
【００６５】
[実施例２：熱安定性および取扱い性に優れたゼラチンビトリゲル]
実施例１と同様の方法にて直径35mm の細胞培養用シャーレに40℃で可溶化したゼラチン溶液2 mlを注ぎ、蓋をして4℃で2時間静置することによりゲル化した後、このゼラチンゲルを温度10℃湿度40％のインキュベーター内に蓋をはずした状態で2日間静置することでゼラチンゲル内の自由水を完全に除去してガラス化を進行させ、乾固状態とした（ゼラチンゲル乾燥体）。次に、細胞培養用シャーレの蓋をはずした後、この乾固状態にあるゼラチンゲル乾燥体にFUNA‐UV  LINKER（フナコシ株式会社製  製品コードFS-1500）にて積算照射量が200、400、800および1,600 mJ/cm2となるように紫外線を照射した。各積算照射量で紫外線を照射した後、実施例１と同様に細胞培養用シャーレ内に4℃で2 mlのPBSを加え再水和することで剥離した。この剥離工程において、200mJ/cm2の積算照射量で紫外線を照射したゼラチンビトリゲルの取扱い性は紫外線を照射していない実施例１のゼラチンビトリゲルの取扱い性とほぼ同様で脆かったが、400mJ/cm2以上の積算照射量で紫外線を照射したゼラチンビトリゲルの取扱い性は積算照射量の増加に伴い向上した。これら紫外線を照射したゼラチンビトリゲルを37℃のインキュベーター内に移し入れ、経時的に観察した。その結果、200mJ/cm2の積算照射量で紫外線を照射したゼラチンビトリゲルは、2時間以内にほとんど全てがＰＢＳ中に溶解してしまい、ゼラチンビトリゲルとして維持できないことが分かった（図７）。400mJ/cm2の積算照射量で紫外線を照射したゼラチンビトリゲルは、2時間目の時点では膜状の形態として確認されたが（図８）、24時間目の時点では、ほとんど全てがPBS中に溶解してしまった（図９）。800mJ/cm2の積算照射量で紫外線を照射したゼラチンビトリゲルは、1日目、2日目および3日目の時点では膜状の形態として確認されたが（図１０、図１１、図１２）、7日目の時点では膜状の形態が確認できるものの、厚さはかなり薄くなっていた（図１３）。一方、1,600mJ/cm2の積算照射量で紫外線を照射したゼラチンビトリゲルは、2時間目の時点で、周囲がめくれ上がった膜状形態への変化が確認されるものの（図１４）7日目の時点においても同様の形態が維持されていることを確認した（図１５）。
【００６６】
[比較例２：不溶性残渣を除去した実施例２のゼラチンからのビトリゲル作製の検討]
比較例１と同様に実施例１のゼラチン溶液内に存在する不溶性の小さな残渣を除去したゼラチン溶液を用いて、実施例２と同様の方法にて800 mJ/cm2および1,600mJ/cm2の積算照射量で紫外線を照射した後に、ゼラチンビトリゲルの作製を試みた。
【００６７】
その結果、比較例１と同様に、培養シャーレ内に4℃で2 mlのPBSを注いだところ、乾固状態にあった残渣のないゼラチンゲル乾燥体はＰＢＳ中にほとんど全てが溶解してしまい、ゼラチンビトリゲルとしては回収できなかった（図１６、図１７）。
【００６８】
[実施例３：形状安定性、熱安定性および取扱い性に優れたゼラチンビトリゲル]
実施例２と同様の方法にて、直径35 mmの細胞培養用シャーレにゼラチン2 mlに由来するゼラチンゲル乾燥体を作製し、積算照射量が400 mJ/cm2および800 mJ/cm2となるように紫外線を照射した。この細胞培養用シャーレ内に4℃で2 mlのPBSを加え、再水和することで、膜状形態のゼラチンビトリゲルを剥離し、新たに用意した細胞培養用シャーレの底面に反転して伸展した。この細胞培養用シャーレの蓋を外した状態で、温度10℃湿度40%のインキュベーター内に2日間静置することで、反転したゼラチンビトリゲル内の自由水を完全に除去して、再度ガラス化を進行させ乾固状態とした（ゼラチンビトリゲル乾燥体）。次に細胞培養用シャーレの蓋を外した後、この乾固状態にあるゼラチンビトリゲル乾燥体に積算照射量が前回400 mJ/cm2で照射したゼラチンビトリゲル乾燥体には前回同様400 mJ/cm2となる様、また前回800 mJ/cm2で照射したゼラチンビトリゲル乾燥体には前回同様800 mJ/cm2となる様、紫外線を照射することでそれぞれ両面の積算照射量が800 mJ/cm2（片面400 mJ/cm2×2）および1,600 mJ/cm2（片面800 mJ/cm2 ×2）となる様に紫外線を照射した。その後、実施例２と同様に細胞培養用シャーレに4℃で2 mlのPBSを加え再水和した結果、いずれの細胞培養用シャーレからも膜状形態のゼラチンビトリゲルを剥離することができた。これら両面に紫外線を照射した後に、膜状形態として回収されたゼラチンビトリゲルを、37℃のインキュベーター内に移し入れ、経時的に観察した。その結果、800 mJ/cm2（片面400 mJ/cm2 ×2）の積算照射量で紫外線を照射したゼラチンビトリゲルは1日目、2日目および3日目の時点では膜状の形態として確認されたが（図１８、図１９、図２０）、厚さは徐々に薄くなり、7日目の時点では膜状の形態が確認できないまでにPBS中に溶解していた（図２１）。一方、1,600 mJ/cm2（片面800 mJ/cm2 ×2）の積算照射量で紫外線を照射したゼラチンビトリゲルは、37℃においては周囲がめくれ上がる等の形態変化もなく、7日目の時点においても剥離直後の膜状形態が維持されていることを確認した（図２２）。
【００６９】
また、上述の1,600 mJ/cm2（片面800 mJ/cm2 ×2）の積算照射量で紫外線を照射したゼラチンビトリゲルは、５０℃まで温度を上昇させて２４時間に渡り加温し続けた後でも、殆ど形態変化なく剥離直後の膜状形態が維持されることを確認した（図２３）。さらに、９５℃まで温度を上昇させて３分間加温し続けると、周辺部が少し萎縮した形態に変化したが（図２４）、このゼラチンビトリゲル膜は溶けたり砕けたりすることなくピンセットで摘み上げられることを確認した（図２５）。そこで、室温で再水和したゼラチンビトリゲル膜の周囲の過剰な水分を拭き取り、ゼラチンビトリゲル膜を約2.5×1.0cmにナイフで切断した後、180℃に調製した食用油中で浮遊して音が静まるまで約１分間素揚げしてみた。その結果、ゼラチンビトリゲル膜は溶けることなく少し萎縮した形態に変化することを確認した（図２６）。
【００７０】
本発明のゼラチンビトリゲルは、熱安定性に優れ、高温でも溶解せず形状を維持できることから、例えば、新たな食品素材などとして有効利用できることが確認された。
【００７１】
[実施例４：形状安定性、熱安定性および取扱いに優れたゼラチンビトリゲル上でのヒト真皮由来線維芽細胞の培養]
上述の実施例３において1,600 mJ/cm2（片面800 mJ/cm2 ×2）の積算照射量で紫外線を照射する工程を経て作製したマグロ由来ゼラチンビトリゲル膜（お刺身コラーゲンスライスより加工）上に、ヒト真皮由来線維芽細胞を播種して３日間培養した後に位相差顕微鏡観察により細胞の形態を観察した。その後、calcein-AM およびethidium homodimer を用いた蛍光染色により細胞の生死判定を行った。その結果、マグロ由来ゼラチンビトリゲル膜上で大半のヒト真皮由来線維芽細胞は生存しており（図２７）、良好な伸展形態を呈していることが分かった（図２８）。すなわち、マグロ由来ゼラチンビトリゲル膜には細胞毒性が無く安全であることが示唆された。
【００７２】
[実施例５：ゼラチン（ゼライス社製ＲＭ−１００）とネイティブコラーゲン（高研社製I-AC）より作製できるビトリゲルの特性]
上述の実施例２において、マグロゼラチンを主成分とするゼラチン溶液を用いた場合、800mJ/cm2の積算照射量で紫外線を照射する工程を経て作製したゼラチンビトリゲルは、1日目、2日目および3日目の時点で膜状の形態として維持されることを確認した。しかし、比較例２において、ゼラチン溶液内に存在する不溶性の小さな残渣を除去したゼラチン溶液を用いた場合には、800mJ/cm2以上の積算照射量で紫外線を照射する工程を経て作製してもゼラチンビトリゲルは作製できないことを確認した。また、比較例１において、ゼラチン溶液内に存在する不溶性の小さな残渣は希塩酸に溶解したことから不溶性コラーゲンであると推察した。
【００７３】
以上の背景をもとに本実施例では、精製ゼラチン溶液に精製コラーゲン溶液を混合した混和液を4℃で2時間静置することによりゼラチンのゲル化を評価した後、さらに温度10℃湿度40％のインキュベーター内でガラス化させた後に800mJ/cm2の積算照射量で紫外線を照射してPBSで再水和することで37℃に安定なビトリゲルが作製できるか否かを検討することを目的とした。具体的には、ブタ由来精製ゼラチン（ゼライス社製ＲＭ−１００）を終濃度が2.5(w/v)%となるように40℃に加温した精製水あるいはPBSに溶解した後、この2.5%ゼラチン溶液に0.5%ウシ由来ネイティブコラーゲン溶液（高研社製I-AC）を容積比が10:0、9:1、8:2、7:3、5:5、3:7、および1:9となるように混合した混和液を用いて、上述のゼラチンのゲル化およびビトリゲルの作製を検討したところ、表１に示す結果を得た。
【００７４】
【表１】
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【００７５】
具体的には、コラーゲン溶液を全く含まないゼラチン溶液の場合は、溶媒に関係なく4℃冷却にてゼラチンゲルは調製できたが、さらにガラス化したゼラチンゲル乾燥体をPBSで再水和した際にはPBS中に溶解してしまいビトリゲルは調製できなかった。
【００７６】
また、ゼラチンを溶解する溶媒が精製水の場合は、＜１＞コラーゲン溶液が７割以上含まれる混和液では4℃に冷却してもゼラチンのゲル化が誘導されないが、引き続きガラス化してPBSで再水和した際には4℃でも37℃でも安定なビトリゲルが作製できること、＜２＞コラーゲン溶液が１割〜５割含まれる混和液では4℃冷却にてゼラチンゲルが調製でき、さらにガラス化してPBSで再水和した際にも4℃ではビトリゲルが調製できるものの、37℃に加温すると１時間以内に５割のコラーゲン溶液を含む混和液由来のビトリゲル以外はPBS中に溶解することが分かった。ここで、５割以上のコラーゲン溶液を含む混和液より37℃で安定なビトリゲルが作製できた理由としては、ガラス化した際のコラーゲン分子がPBSにて再水和された際に強度を有するゲル状態に線維化したことに起因することが考えられた。
【００７７】
さらに、ゼラチンを溶解する溶媒がPBSの場合は、＜１＞コラーゲン溶液が９割以上含まれる混和液では4℃に冷却してもゼラチンのゲル化が誘導されないが、引き続きガラス化してPBSで再水和した際には4℃でも37℃でも安定なビトリゲルが作製できること、＜２＞コラーゲン溶液が１割〜７割含まれる混和液では4℃冷却にてゼラチンゲルが調製でき、さらにガラス化してPBSで再水和した際には4℃でも37℃でも安定なビトリゲルが作製できることが分かった。ここで、１割〜７割のコラーゲン溶液を含む混和液よりゼラチンゲルが調製できた後のガラス化および再水和により37℃で安定なビトリゲルが作製できた理由としては、初期の混和液中のコラーゲン分子がゼラチンを溶解した溶媒のPBSによって徐々に線維化が進んでいたことに起因すると考えられた。
【００７８】
以上の結果より、ゼラチンを溶解する溶媒として精製水ではなくPBSを用いて、１割のコラーゲン溶液を含む混和液よりゼラチンを主成分とするゲルを調製した後にガラス化および再水和することで、37℃で安定なゼラチンを主成分とするビトリゲルを作製できることが分かった。
【００７９】
本発明のゼラチンビトリゲルは、溶解させた精製ゼラチンに不溶性コラーゲンまたは再線維化が可能なコラーゲンを含む水溶液を添加した混和水溶液を原料とすることもでき、熱安定性に優れ、37℃程度でも溶解することがないため、例えば、適宜、各種の生理活性物質を添加することで、医療用素材として有効利用できることが確認された。
【００８０】
[実施例６：ゼラチンビトリゲルの香粧品基材としての有用性]
上述の実施例３において1,600 mJ/cm2（片面800 mJ/cm2 ×2）の積算照射量で紫外線を照射する工程を経て作製したマグロ由来ゼラチンビトリゲル膜（お刺身コラーゲンスライスより加工）を、ビニールシート上で再ガラス化して膜状のゼラチンビトリゲル乾燥体を作製した。このゼラチンビトリゲル乾燥体をハッカ水やバラエキス溶液（ニチレイ・バラエキス紅香姫、株式会社ニチレイバイオサイエンス）に５分間浸潤させて（図２９）、ヒト皮膚への吸着性を評価した。ハッカ水は50mLのコニカルチューブに5mLのWATER(SIGMA,W3500)を注入した後に40μlのハッカ油（健栄製薬株式会社）を添加してよく混合することで調製した。
【００８１】
その結果、ハッカ水、バラエキス溶液への浸潤によって再水和した膜状のゼラチンビトリゲルはヒト皮膚へ容易に吸着させることが可能であった（図３０）。また、吸着したゼラチンビトリゲルは皮膚表面で徐々に乾燥するものの数時間以上に渡りで芳香性を保持し続けることが分かった（図３１）。また、乾燥して皮膚表面に張り付いたゼラチンビトリゲル乾燥体は痛み等の違和感なく容易に剥離できた。
【００８２】
本発明のゼラチンビトリゲルは、熱安定性に優れ、各種の香粧成分などを含有させることで香粧品として有効利用できることが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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