(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
妊娠対象が約１週間から４週間以内に妊娠高血圧腎症のリスクをもたないかどうかを診断するための、下記を含む方法：
ａ）その対象の試料中のｓＦｌｔ−１、エンドグリンおよびＰｌＧＦからなる群から選択される少なくとも１種類の血管形成バイオマーカーの量を決定する；そして
ｂ）その量を基準と比較し、それにより、ｓＦｌｔ−１およびエンドグリンの場合はその量が基準と比較して等しいかまたは少なければ、またＰｌＧＦの場合は等しいかまたは多ければ、対象は約１週間から４週間以内に妊娠高血圧腎症を発症するリスクをもたないと診断し、その際、基準は少なくとも約９８％の陰性的中率で診断を行なうことができる。
【請求項２】
その方法が、段階ａ）において対象の試料中のｓＦｌｔ−１またはエンドグリンおよびＰｌＧＦの量を決定し、段階ｂ）においてｓＦｌｔ−１／ＰｌＧＦ比の値またはエンドグリン／ＰｌＧＦ比の値を基準値と比較し、それにより、ｓＦｌｔ−１／ＰｌＧＦ比の値またはエンドグリン／ＰｌＧＦ比の値が基準値と比較して等しいかまたは低ければ対象は約１週間から４週間以内に妊娠高血圧腎症を発症するリスクをもたないと診断することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
その方法が、段階ｂ）の前に、段階ａ）において決定したｓＦｌｔ−１またはエンドグリンおよびＰｌＧＦの量から比を計算するさらなる段階を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ｓＦｌｔ−１／ＰｌＧＦ比のための基準値が約４６以下である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
ｓＦｌｔ−１／ＰｌＧＦ比のための基準値が約３８以下である、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ｓＦｌｔ−１／ＰｌＧＦ比のための基準値が約３８である、請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ｓＦｌｔ−１／ＰｌＧＦ比のための基準値が約３３である、請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
約１週間から約２週間以内に対象が妊娠高血圧腎症を発症するリスクをもたないかどうかを診断することを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
妊娠対象が妊娠の約２０週目〜約４０週目である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
試料が血液、血漿、血清または尿の試料である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
診断結果が、適用される患者管理措置を推奨するための指標である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
患者管理措置は、（ｉ）対象が妊娠高血圧腎症を発症するリスクをもたないと診断されなければ下記の措置の群から選択され：緊密なモニタリング、入院、降圧薬の投与、および生活様式推奨事項、（ｉｉ）対象が妊娠高血圧腎症を発症するリスクをもたないと診断されれば外来通院モニタリングである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
妊娠対象が約１週間から４週間以内に妊娠高血圧腎症を発症するリスクをもたないかどうかを診断するための、妊娠対象の試料中の少なくとも１種類のバイオマーカーｓＦｌｔ−１、エンドグリンおよびＰｌＧＦ、またはそれに特異的に結合する少なくとも１種類のそれの検出剤の使用。
【請求項１４】
対象が、異常なドップラー超音波診断結果に基づいて妊娠高血圧腎症、子癇および／またはＨＥＬＬＰ症候群を発症するリスクをもつと同定されている、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法または請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
請求項１〜１２または１４のいずれか１項に記載の方法を実施することにより妊娠対象が約１週間から４週間以内に妊娠高血圧腎症を発症するリスクをもたないかどうかを診断するために適合させた、下記のものを含むデバイス：
ａ）ｓＦｌｔ−１、エンドグリンおよびＰｌＧＦからなる群から選択される少なくとも１種類の血管形成バイオマーカーに特異的に結合する少なくとも１種類の検出剤を含む分析ユニットであって、妊娠対象の試料中のｓＦｌｔ−１、エンドグリンおよび／またはＰｌＧＦの量を決定するために適合させたユニット；ならびに
ｂ）下記のためのアルゴリズムを実装したデータプロセッサーを含む評価ユニット：前記の量を基準と比較し、それにより、ｓＦｌｔ−１およびエンドグリンの場合はその量が基準と比較して等しいかまたは少なければ、またＰｌＧＦの場合は等しいかまたは多ければ、対象は約１週間から４週間以内に妊娠高血圧腎症を発症するリスクをもたないと診断し、その際、基準は少なくとも約９８％の陰性的中率で診断を行なうことができる。
【請求項１６】
分析ユニットが、対象の試料中のバイオマーカーｓＦｌｔ−１またはエンドグリンおよびＰｌＧＦの量を決定するための検出剤を含み、評価ユニットに実装されたアルゴリズムがｓＦｌｔ−１またはエンドグリンとＰｌＧＦの量の比の値を基準値と比較し、それにより、ｓＦｌｔ−１／ＰｌＧＦ比の値またはエンドグリン／ＰｌＧＦ比の値が基準値と比較して等しいかまたは低ければ対象は約１週間から４週間以内に妊娠高血圧腎症を発症するリスクをもたないと診断する、請求項１５に記載のデバイス。
【請求項１７】
評価ユニットに実装されたアルゴリズムが、さらにｓＦｌｔ−１またはエンドグリンとＰｌＧＦの量の比を計算する、請求項１５または１６に記載のデバイス。
【請求項１８】
請求項１〜１２または１４のいずれか１項に記載の方法を実施するために適合させたキットであって、ｓＦｌｔ−１、エンドグリンおよびＰｌＧＦからなる群から選択される血管形成バイオマーカーの量を決定するための少なくとも１種類の検出剤、ならびにその方法を実施するための指示を含むキット。
【請求項１９】
キットが妊娠対象の試料中のｓＦｌｔ−１および／またはエンドグリンの量を決定するための検出剤ならびにＰｌＧＦの量を決定するための検出剤を含む、請求項１８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、妊娠高血圧腎症の出生前診断のための診断アッセイの分野に関する。特に、本発明は妊娠対象が短かい時間ウインドウ以内に妊娠高血圧腎症のリスクをもたないかどうかを診断するための、下記を含む方法に関する：ａ）その対象の試料中のｓＦｌｔ−１、エンドグリン(Endoglin)およびＰｌＧＦからなる群から選択される少なくとも１種類の血管形成バイオマーカーの量を決定する；そしてｂ）その量を基準と比較し、それにより、ｓＦｌｔ−１およびエンドグリンの場合はその量が基準と比較して等しいかまたは少なければ、またＰｌＧＦの場合は等しいかまたは多ければ、対象は短期間以内に妊娠高血圧腎症を発症するリスクをもたないと診断し、その際、基準は少なくとも約９８％の陰性的中率(negative predictive value)で診断を行なうことができる。さらに、その方法を実施するためのデバイスおよびキットが考慮される。
【背景技術】
【０００２】
妊娠はさまざまな形で合併症を伴なう可能性があり、それは一方では妊婦の妊娠関連死亡に関連し、他方では新生児の罹病率および死亡率の増大にも関連する。母体死亡は１００．０００例の出生当たり１４，５例の割合であり、３９歳を超える妊婦ではより高頻度であり、出血、血栓性肺塞栓症、感染症、心筋障害、ならびに心血管状態および非−心血管状態により起きる可能性があり、また高血圧性障害により起きる可能性もあり、そのうち妊娠高血圧腎症が最も高頻度である(Berg 2010, Obstetrics and Gynecology: 116: 1302 - 1309)。
【０００３】
妊娠高血圧腎症は妊娠全体の約２〜８パーセントで合併し、世界的に母体および胎児の死亡に対する主な原因である(Duley 2009, Semin Perinatol: 33: 130-37)。妊娠高血圧腎症は、一般に、妊娠２０週目以後に発症する妊娠関連または妊娠誘発性の高血圧症およびタンパク尿症と定義される。これに関して、高血圧症は２回の独立した測定における１４０ｍｍＨｇ（収縮期）および／または９０ｍｍＨｇ（拡張期）以上の血圧と定義され、その際、これらの２回の測定は少なくとも６時間空けて行なわれたものである。タンパク尿症は、２４時間の尿試料における３００ｍｇ以上のタンパク質を指標とする。しかし、妊娠高血圧腎症の定義は論争中であり、学会間で異なる可能性がある。詳細は標準医学書および各種臨床学会のガイドライン中にも見られる；たとえば、ACOG Practice Bulletin, Clinical Management Guidelines for Obstetrician - Gynecologists, no.: 33, January 2002、またはLeitlinien, Empfehlungen, Stellungnahmen of the Deutschen Gesellschaft fuer Gynaekologie und Geburtshilfe e.V., August 2008、NICE Clinical Guideline Hypertension in pregnancy: the management of hypertensive disorders during pregnancy, August 2010 (revised reprint January 2011)。
【０００４】
妊娠高血圧腎症の病因はほとんど分かっていない。しかし、それはらせん動脈のリモデリングの欠陥に関連する胎盤機能障害により引き起こされると考えられる。妊娠高血圧腎症の発症過程で起きる血流異常が虚血を随伴し、その結果、最終的に抗血管形成因子、たとえばｓＦｌｔ−１およびエンドグリンが循環中へ放出される。
【０００５】
現在までの妊娠高血圧腎症の唯一の治療法は、早期の経膣分娩または帝王切開分娩のいずれかによる妊娠終止である。前記のように、妊娠３４週目以前の妊娠高血圧腎症の症例では母体のリスクおよび胎児生存率が著しく損なわれる。したがって、出産を遅らせて、それにより新生児の生存率を向上させる試みを行なうべきである。
【０００６】
妊娠高血圧腎症の早期かつ信頼性のある診断、特に妊娠２０〜４０週目という早い時期に起きる妊娠高血圧腎症の除外(rule-out)は、この疾患を臨床管理するために決定的に重要である。妊娠高血圧腎症に罹患している妊婦が緊密なモニタリング、支持療法措置など特別なケアを必要とし、重篤な妊娠高血圧腎症に進行する症例では母体−胎児集中治療室(maternal fetal intensive care unit)（ＭＦＩＣＵ）を備えた専門病院への入院が必要であることは理解されるであろう。特に、早発性妊娠高血圧腎症は、重篤な副作用およびそれに付随する有害な転帰からみて、臨床医にとって難題である。さらに、妊娠高血圧腎症の早期かつ信頼性のある診断および妊娠高血圧腎症の予測は、予防介入または治療介入の試験を計画するために決定的に重要である(Ohkuchi 2011, Hypertension 58: 859-866)。他方で、特定の時間ウインドウ以内における妊娠高血圧腎症の高リスクを除外できるリスクグループに属する患者は、特別なケアの必要性がより低いはずであり、大部分は外来通院（ambulant、out patient setting）で治療できる場合が多い。
【０００７】
異常な子宮血流を伴なう患者を同定するためにドップラー超音波診断が適用されており、ドップラー超音波診断により同定された異常な血流を示す患者は妊娠高血圧腎症、子癇および／またはＨＥＬＬＰ症候群を発症するリスクをもつことが示唆された(Stepan 2007, Hypertension, 49: 818-824; Stepan 2008, Am J Obstet Gynecol 198: 175.el-l)。しかし、ドップラー超音波診断の欠点は、実施および結果の評価のために高度の専門医が必要とされることである。
【０００８】
最近になって、血管形成因子および抗血管形成因子が妊娠高血圧腎症の指標であることが示唆された。特に、胎盤増殖因子(Placenta growth factor)（ＰｌＧＦ）、エンドグリン、および可溶性ｆｓｍ様チロシンキナーゼ１(soluble fms-like tyrosine kinase 1)（ｓＦｌｔ−１）は妊娠高血圧腎症に罹患している患者において変化していることが報告された。健康な個体および妊娠高血圧腎症に罹患している患者または妊娠高血圧腎症を発症するリスクをもつ患者における個々の因子およびそれらの変化のレポート(たとえば、下記を参照：Rana 2007, Hypertension 50: 137-142; WO2004/008946)のほかに、ｓＦｌｔ−１とＰｌＧＦの比またはエンドグリンとＰｌＧＦの比が診断または予後のパラメーターとして報告された(参照：Young 2010, J Matern Fetal Neonatal Med 23(5): 366-370; Hagmann 2012, Clinical Chemistry 58(5): 1-9)。
【０００９】
ｓＦｌｔ−１とＰｌＧＦの単一の比が妊娠初期の妊娠高血圧腎症に対する予後の確定(rule-in)因子として報告された(Crispi 2008, Ultrasound Obstet Gynecol 31: 303-309)。さらに、異なる妊娠時点における個々のｓＦｌｔ−１とＰｌＧＦの比が、妊娠高血圧腎症のリスクと個々に相関していた(DeVivo 2008, Acta Obstetricia et Gynecologica 87: 837-842; Ohkuchi 2011, 前掲; Kusanovic 2009, J of Maternal- Fetal and Neonatal Medicine 22(11): 1021-1038, Chaiworapongsa 2011, J Maternal-Fetal and Neonatal Medicine 24(10): 1187-1207; Benton 2011, American Journal of Obstetrics & Gynecology 205: l.el)。さらに、それらの変化度が妊娠高血圧腎症の予後(Kusanovic 2009, 前掲)、または切迫分娩のリスク(Verlohren 2012, American Journal of Obstetrics & Gynecology 206(1): 58.el-58.e8)に関して調査された。
【００１０】
しかし、以上の先行技術は主に切迫妊娠高血圧腎症の確定診断またはその予測に関する。特定の時間ウインドウ以内における切迫妊娠高血圧腎症の除外に関して分かっていることはより少ない。ｓＦｌｔ−１とＰｌＧＦの特定の比に基づいて患者の受診日の切迫妊娠高血圧腎症を除外できることを示唆するかなり概括的なレポートはある(Stepan 2010, Z Geburtsh Neonatol 214: 234-238)。
【００１１】
しかし、見掛け上は健康な妊婦において特定期間以内の妊娠高血圧腎症を除外するための信頼性のあるアッセイ法はまだ得られていないが、それにもかかわらず強く要望されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】WO2004/008946
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Berg 2010, Obstetrics and Gynecology: 116: 1302 - 1309
【非特許文献２】Duley 2009, Semin Perinatol: 33: 130-37)
【非特許文献３】ACOG Practice Bulletin, Clinical Management Guidelines for Obstetrician - Gynecologists, no.: 33, January 2002
【非特許文献４】Leitlinien, Empfehlungen, Stellungnahmen of the Deutschen Gesellschaft fuer Gynaekologie und Geburtshilfe e.V., August 2008
【非特許文献５】NICE Clinical Guideline Hypertension in pregnancy: the management of hypertensive disorders during pregnancy, August 2010 (revised reprint January 2011)
【非特許文献６】Ohkuchi 2011, Hypertension 58: 859-866
【非特許文献７】Stepan 2007, Hypertension, 49: 818-824
【非特許文献８】Stepan 2008, Am J Obstet Gynecol 198: 175.el-l
【非特許文献９】Rana 2007, Hypertension 50: 137-142
【非特許文献１０】Young 2010, J Matern Fetal Neonatal Med 23(5): 366-370
【非特許文献１１】Hagmann 2012, Clinical Chemistry 58(5): 1-9
【非特許文献１２】Crispi 2008, Ultrasound Obstet Gynecol 31: 303-309
【非特許文献１３】DeVivo 2008, Acta Obstetricia et Gynecologica 87: 837-842
【非特許文献１４】Kusanovic 2009, J of Maternal- Fetal and Neonatal Medicine 22(11): 1021-1038
【非特許文献１５】Chaiworapongsa 2011, J Maternal-Fetal and Neonatal Medicine 24(10): 1187-1207
【非特許文献１６】Benton 2011, American Journal of Obstetrics & Gynecology 205: l.el
【非特許文献１７】Verlohren 2012, American Journal of Obstetrics & Gynecology 206(1): 58.el-58.e8
【非特許文献１８】Stepan 2010, Z Geburtsh Neonatol 214: 234-238
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の基礎となる技術的課題は、上記のニーズに応じる手段および方法を提供することであるとみることができる。この技術的課題は、特許請求の範囲および以下に明らかにする態様により解決される。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、妊娠対象が短かい時間ウインドウ以内に妊娠高血圧腎症のリスクをもたないかどうかを診断する（すなわち、妊娠高血圧腎症を除外する）ための、下記を含む方法に関する：
ａ）その対象の試料中のｓＦｌｔ−１、エンドグリンおよびＰｌＧＦからなる群から選択される少なくとも１種類の血管形成バイオマーカーの量を決定する；そして
ｂ）その量を基準と比較し、それにより、ｓＦｌｔ−１およびエンドグリンの場合はその量が基準と比較して等しいかまたは少なければ、またＰｌＧＦの場合は等しいかまたは多ければ、対象は短期間以内に妊娠高血圧腎症を発症するリスクをもたないと診断し、その際、基準は少なくとも約９８％の陰性的中率で診断を行なうことができる。
【００１６】
本発明の方法は、好ましくはエクスビボ法である。さらに、それは前記に明白に述べたものに追加した段階を含むことができる。たとえば、さらなる段階は試料の前処理または本方法により得られた結果の評価に関するものであってもよい。本方法は手動で実施でき、あるいは自動化により支援することができる。好ましくは、段階（ａ）および／または（ｂ）の全部または一部を自動化により支援することができる：たとえば、段階（ａ）における決定に適したロボット装置およびセンサー装置、段階（ｂ）におけるデータ処理デバイス上のコンピューター実装−計算アルゴリズム、ならびに／あるいはデータ処理デバイス上の比較および／または診断アルゴリズム。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】図１は、種々の妊娠週におけるｓＦｌｔ−ｌ／ＰｌＧＦの比を示す。中空の丸は試料を採取した（来院）後１週間以内に妊娠高血圧腎症（ＰＥ）が判定されなかった例、灰色の丸は妊娠高血圧腎症（ＰＥ）を伴なった例を表わす。（Ａ）ｎ＝９４；４６のカットオフより下でＰＥ症例は検出されなかった；（Ｂ）ｎ＝２６９；３８のカットオフより下で、わずかなＰＥ症例が検出されたにすぎない。
【図１Ｂ】図１は、種々の妊娠週におけるｓＦｌｔ−ｌ／ＰｌＧＦの比を示す。中空の丸は試料を採取した（来院）後１週間以内に妊娠高血圧腎症（ＰＥ）が判定されなかった例、灰色の丸は妊娠高血圧腎症（ＰＥ）を伴なった例を表わす。（Ａ）ｎ＝９４；４６のカットオフより下でＰＥ症例は検出されなかった；（Ｂ）ｎ＝２６９；３８のカットオフより下で、わずかなＰＥ症例が検出されたにすぎない。
【図２Ａ】図２は、種々の妊娠週におけるｓＦｌｔ−ｌ／ＰｌＧＦの比を示す。中空の丸は試料を採取した（来院）後２週間以内に妊娠高血圧腎症（ＰＥ）が判定されなかった例を表わす。灰色の丸は妊娠高血圧腎症（ＰＥ）を伴なった例を表わす。４６のカットオフより下でＰＥの症例は検出されなかった。（Ａ）ｎ＝９４；４６のカットオフより下でＰＥの症例は検出されなかった；（Ｂ）ｎ＝２６９；３８のカットオフより下で、わずかなＰＥの症例が検出されたにすぎない。
【図２Ｂ】図２は、種々の妊娠週におけるｓＦｌｔ−ｌ／ＰｌＧＦの比を示す。中空の丸は試料を採取した（来院）後２週間以内に妊娠高血圧腎症（ＰＥ）が判定されなかった例を表わす。灰色の丸は妊娠高血圧腎症（ＰＥ）を伴なった例を表わす。４６のカットオフより下でＰＥの症例は検出されなかった。（Ａ）ｎ＝９４；４６のカットオフより下でＰＥの症例は検出されなかった；（Ｂ）ｎ＝２６９；３８のカットオフより下で、わずかなＰＥの症例が検出されたにすぎない。
【図３Ａ】図３（Ａ）は、ｓＦｌｔ−ｌ／ＰｌＧＦ比の二変量分布分析および妊娠高血圧腎症（ＰＥ）発症までの日数を示す；（Ｂ）（Ａ）と同じであるが、より大きいコホートに関する。
【図３Ｂ】図３（Ａ）は、ｓＦｌｔ−ｌ／ＰｌＧＦ比の二変量分布分析および妊娠高血圧腎症（ＰＥ）発症までの日数を示す；（Ｂ）（Ａ）と同じであるが、より大きいコホートに関する。
【図４Ａ】図４（Ａ）は、試料を採取した（来院）後１週間以内に妊娠高血圧腎症（ＰＥ）が発症しなかったものについてのＲＯＣ曲線およびその統計分析を示す。１．０のＡＵＣ（曲線下面積）は完全な診断検査、０．５のＡＵＣは無効なものと認定される。ＡＵＣについての信頼区間は、このデータに基づく推定の精度を反映する；ｎ＝９４；（Ｂ）（Ａ）と同じであるが、ｎ＝２６９。
【図４Ｂ】図４（Ａ）は、試料を採取した（来院）後１週間以内に妊娠高血圧腎症（ＰＥ）が発症しなかったものについてのＲＯＣ曲線およびその統計分析を示す。１．０のＡＵＣ（曲線下面積）は完全な診断検査、０．５のＡＵＣは無効なものと認定される。ＡＵＣについての信頼区間は、このデータに基づく推定の精度を反映する；ｎ＝９４；（Ｂ）（Ａ）と同じであるが、ｎ＝２６９。
【図５Ａ】図５（Ａ）は、試料を採取した（来院）後２週間以内に妊娠高血圧腎症（ＰＥ）が発症しなかったものについてのＲＯＣ曲線およびその統計分析を示す。１．０のＡＵＣ（曲線下面積）は完全な診断検査、０．５のＡＵＣは無効なものと認定される。ＡＵＣについての信頼区間は、このデータに基づく推定の精度を反映する；ｎ＝９４；（Ｂ）（Ａ）と同じであるが、ｎ＝２６９。
【図５Ｂ】図５（Ａ）は、試料を採取した（来院）後２週間以内に妊娠高血圧腎症（ＰＥ）が発症しなかったものについてのＲＯＣ曲線およびその統計分析を示す。１．０のＡＵＣ（曲線下面積）は完全な診断検査、０．５のＡＵＣは無効なものと認定される。ＡＵＣについての信頼区間は、このデータに基づく推定の精度を反映する；ｎ＝９４；（Ｂ）（Ａ）と同じであるが、ｎ＝２６９。
【図６Ａ】図６は、ｓＦｌｔ−１／ＰｌＧＦ比（Ａ）およびエンドグリン／ＰｌＧＦ比（Ｂ）を用いたボックスプロットグラフを示す；１週目のＰＥについてｎ＝９４、４週目のＰＥについてｎ＝８８。各グラフの左手側は異常なドップラー超音波診断結果を伴なう患者からの測定値（ｍＰＩ−ＵｔＡ＞９５．パーセンタイル）を示し、右手側は正常な結果を伴なう患者からの測定値を示す。さらに、測定値は、それぞれ１週間以内（左のグラフ）および４週間以内（右のグラフ）にＰＥ／ＨＥＬＬＰを発症した患者（赤ボックス）または発症しなかった患者（緑ボックス）について分けられる。これらのグラフは、ｓＦｌｔ−１／ＰｌＧＦ比およびエンドグリン／ＰｌＧＦ比が両方とも、特に異常なドップラー超音波診断結果を伴なう患者において、１週間以内および４週間以内の両方で、患者がＰＥを発症するか否かを予測する効力をもつことを示す。ｓＦｌｔ−１／ＰｌＧＦ比は、特に４週間以内のＰＥ／ＨＥＬＬＰの予測について、エンドグリン／ＰｌＧＦ比より正確に区別すると思われる。
【図６Ｂ】図６は、ｓＦｌｔ−１／ＰｌＧＦ比（Ａ）およびエンドグリン／ＰｌＧＦ比（Ｂ）を用いたボックスプロットグラフを示す；１週目のＰＥについてｎ＝９４、４週目のＰＥについてｎ＝８８。各グラフの左手側は異常なドップラー超音波診断結果を伴なう患者からの測定値（ｍＰＩ−ＵｔＡ＞９５．パーセンタイル）を示し、右手側は正常な結果を伴なう患者からの測定値を示す。さらに、測定値は、それぞれ１週間以内（左のグラフ）および４週間以内（右のグラフ）にＰＥ／ＨＥＬＬＰを発症した患者（赤ボックス）または発症しなかった患者（緑ボックス）について分けられる。これらのグラフは、ｓＦｌｔ−１／ＰｌＧＦ比およびエンドグリン／ＰｌＧＦ比が両方とも、特に異常なドップラー超音波診断結果を伴なう患者において、１週間以内および４週間以内の両方で、患者がＰＥを発症するか否かを予測する効力をもつことを示す。ｓＦｌｔ−１／ＰｌＧＦ比は、特に４週間以内のＰＥ／ＨＥＬＬＰの予測について、エンドグリン／ＰｌＧＦ比より正確に区別すると思われる。
【図７Ａ】図７は、ｓＦｌｔ−１／ＰｌＧＦ比を用いたボックスプロットグラフを示す(図示したボックスプロットグラフ，ｎ＝２６９）。各グラフの左手側は異常なドップラー超音波診断結果を伴なう患者からの測定値（ｍＰＩ−ＵｔＡ＞９５．パーセンタイル）を示し、右手側は正常な結果を伴なう患者からの測定値を示す。さらに、測定値を、それぞれ１週間以内（Ａ）、２週間以内（Ｂ）および４週間以内（Ｃ）にＰＥ／ＨＥＬＬＰを発症する患者または発症しない患者について分けてある。これらのグラフは、ｓＦｌｔ−１／ＰｌＧＦが、特に異常なドップラー超音波診断結果を伴なう患者において、１週間以内、２週間以内および４週間以内ともに、患者がＰＥを発症するか否かを予測する効力をもつことを示す。
【図７Ｂ】図７は、ｓＦｌｔ−１／ＰｌＧＦ比を用いたボックスプロットグラフを示す(図示したボックスプロットグラフ，ｎ＝２６９）。各グラフの左手側は異常なドップラー超音波診断結果を伴なう患者からの測定値（ｍＰＩ−ＵｔＡ＞９５．パーセンタイル）を示し、右手側は正常な結果を伴なう患者からの測定値を示す。さらに、測定値を、それぞれ１週間以内（Ａ）、２週間以内（Ｂ）および４週間以内（Ｃ）にＰＥ／ＨＥＬＬＰを発症する患者または発症しない患者について分けてある。これらのグラフは、ｓＦｌｔ−１／ＰｌＧＦが、特に異常なドップラー超音波診断結果を伴なう患者において、１週間以内、２週間以内および４週間以内ともに、患者がＰＥを発症するか否かを予測する効力をもつことを示す。
【図７Ｃ】図７は、ｓＦｌｔ−１／ＰｌＧＦ比を用いたボックスプロットグラフを示す(図示したボックスプロットグラフ，ｎ＝２６９）。各グラフの左手側は異常なドップラー超音波診断結果を伴なう患者からの測定値（ｍＰＩ−ＵｔＡ＞９５．パーセンタイル）を示し、右手側は正常な結果を伴なう患者からの測定値を示す。さらに、測定値を、それぞれ１週間以内（Ａ）、２週間以内（Ｂ）および４週間以内（Ｃ）にＰＥ／ＨＥＬＬＰを発症する患者または発症しない患者について分けてある。これらのグラフは、ｓＦｌｔ−１／ＰｌＧＦが、特に異常なドップラー超音波診断結果を伴なう患者において、１週間以内、２週間以内および４週間以内ともに、患者がＰＥを発症するか否かを予測する効力をもつことを示す。
【図８】図８：予後試験（５００人の患者について）のために、４週間以内の妊娠高血圧腎症のｓＦｌｔ１−ＰｌＧＦ比に関するカットオフを決定し、それと共にこのカットオフの性能を判定した。オーバーフィッティングを避けるために、交差検定、すなわちモンテカルロ交差検定(Monte Carlo cross - validation)を適用した。このために、すべてのデータを２つの切り離したサブセット（トレーニングセットとテストセット）に２：１の比で分割した。この分割の後、トレーニングセットについてモデルを決定し、テストセットについて予測を査定した。ランダムに選択したトレーニングセット−テストセット分割についてこの手順を１９９９回繰り返した。その結果、ボックスプロットにより反映される１９９９のカットオフをもつ、たとえば中央値が約３８の１９９９の予測モデルが得られた。これは、１週間について妊娠高血圧腎症を除外するための大きなコホートにみられるものと同じカットオフである（実施例４）
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本明細書中で用いる用語“妊娠高血圧腎症”は、高血圧症およびタンパク尿症を特徴とする病的状態を表わす。妊娠高血圧腎症は妊婦対象において起き、この高血圧症は妊娠誘発性高血圧症とも呼ばれる。好ましくは、妊娠誘発性高血圧症は、２回の血圧測定値が１４０ｍｍＨｇ（収縮期）および／または９０ｍｍＨｇ（拡張期）以上であることにより対象に存在すると同定され、その際、これらの２回の測定は少なくとも６時間空けて行なわれたものである。タンパク尿症は、好ましくは２４時間の尿試料における３００ｍｇ以上のタンパク質により存在すると同定される。妊娠高血圧腎症は、子癇、すなわち強直−間代発作または昏睡状態の出現を特徴とする致命的障害にまで進行する可能性がある。重篤な妊娠高血圧腎症に関連する症状は、２４時間以内に５００ｍｌ未満の乏尿、脳障害または視覚障害、肺浮腫またはチアノーゼ、心窩部−または右上４分の１−疼痛、肝機能障害、血小板減少症、胎児成長制限である。肝併発を伴なう妊娠高血圧腎症に罹患している対象は、さらにＨＥＬＬＰ症候群を発症する可能性がある。したがって、本発明による妊娠高血圧腎症発症のリスクをもつ対象は、好ましくは潜在的にＨＥＬＬＰ症候群を発症するリスクも伴なう。ＨＥＬＬＰ症候群は、有害な転帰、たとえば胎盤剥離、腎不全、肝被膜下血腫、再発性妊娠高血圧腎症、早期産の高リスクに関連し、あるいは母体および／または胎児の死亡の高リスクにすら関連する。妊娠高血圧腎症および随伴症状、ならびに付随する疾患、たとえばＨＥＬＬＰ症候群または子癇のさらなる詳細は、標準医学書または関連医学会のガイドライン中に見られる。詳細は、たとえばACOG Practice Bulletin, Clinical Management Guidelines for Obstetrician - Gynecologists, no.: 33, January 2002、またはLeitlinien, Empfehlungen, Stellungnahmen of the Deutschen Gesellschaft fuer Gynaekologie und Geburtshilfe e.V., August 2008, NICE Clinical Guideline Hypertension in pregnancy: the management of hypertensive disorders during pregnancy, August 2010 (revised reprint January 2011)中に見ることができる。妊娠高血圧腎症は最大で妊娠の１０％において通常は第２または第３の３半期に起きる。しかし、若干の女性は妊娠２０週目という早い時期に妊娠高血圧腎症を発症する。
【００１９】
妊娠２０〜３４週目以内では妊娠高血圧腎症は早発性妊娠高血圧腎症とも呼ばれ、一方、妊娠３４週目以後に起きる妊娠高血圧腎症は遅発性妊娠高血圧腎症とも呼ばれる。早発性妊娠高血圧腎症は、通常は比較的軽症である遅発性妊娠高血圧腎症と比較して、通常はより重篤な副作用および有害な転帰を伴なうことは理解されるであろう。
【００２０】
“妊娠高血圧腎症を発症するリスクをもたない”という句は、妊娠高血圧腎症を発症するリスクをもつ妊娠対象と比較して、または被験対象を含む集団内での妊娠高血圧腎症の罹患率と比較して、統計的に有意に高い可能性で、将来、予後時間ウインドウ以内に妊娠高血圧腎症を発症しないであろう妊娠対象を表わす。
【００２１】
本明細書中で用いる用語“対象”は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトに関する。本発明による対象は、妊娠対象、すなわち妊婦のはずである。好ましくは、本発明による対象は、顕性の妊娠高血圧腎症、子癇またはＨＥＬＬＰ症候群を示していないはずである。好ましくは、本発明による対象は、異常な子宮血流を伴なうと同定された対象であり、より好ましくは、既に他の診断法により妊娠高血圧腎症、子癇および／またはＨＥＬＬＰ症候群を発症するリスクをもつと同定された対象である可能性がある。より好ましくは、対象は異常なドップラー超音波診断結果により妊娠高血圧腎症、子癇および／またはＨＥＬＬＰ症候群を発症するリスクをもつと同定されている。好ましくは、ドップラー超音波診断は腹式(transabdominal)で実施されたものである(たとえば、Albaiges 2000, Obstet Gynecol 96: 559-564を参照)。特に、子宮動脈の拍動指数(pulsatility indices)（ＰＩ）を測定し、それらの両動脈についての平均（ｍＰＩ−ＵｔＡ）を計算し、正常な結果と異常な結果を区別できる閾値と比較することができる。
【００２２】
より好ましくは、本発明による妊娠対象は妊娠の約２０〜約４０週目、好ましくは妊娠の約２４〜約４０週目である。したがって、本発明の方法により除外すべき妊娠高血圧腎症は、試料を対象から採取した妊娠週に応じて早発性妊娠高血圧腎症または遅発性妊娠高血圧腎症の可能性がある。
【００２３】
本発明の方法は、見掛け上は健康な妊娠対象のルーティンなスクリーニング法に使用できる。しかし、本発明により想定される妊娠対象は、より高い妊娠高血圧腎症罹患率をもつリスクグループに属する可能性もある。脂肪症、高血圧症、自己免疫疾患、たとえばエリテマトーデス、栓友病(thrombophilia)、または糖尿病に罹患している妊娠対象は、一般に妊娠高血圧腎症の発症率が高い。以前の妊娠で妊娠高血圧腎症、子癇および／またはＨＥＬＬＰ症候群に罹患した対象についても同じことが言える。さらに、初めて妊娠した高齢の女性も、妊娠高血圧腎症を発症する素因を実際に示す。しかし、妊娠高血圧腎症を発症する可能性は妊娠回数に伴なって低くなる。
【００２４】
本明細書中で用いる用語“診断する”は、対象が短期間以内に妊娠高血圧腎症を発症するリスクをもたないかどうかを査定することを意味する。好ましくは、その短期間は、４週間未満、好ましくは約１〜約２週間の期間である。当業者に理解されるように、そのような査定は通常は、診断すべき対象の１００％について正確であることを意図するものではない。しかしこの用語は、その査定が本明細書中の他のいずれかの箇所に述べた陰性的中率で特定部分の対象（たとえば、コホート研究におけるコホート）について正確であることを要求する。将来、特定の時間ウインドウ内に妊娠高血圧腎症を発症するリスクまたは発症しないことは、偽陽性／陰性および真の陽性／陰性査定に関して検査の性能を記述する要約統計学(summary statistics)を用いる本発明方法のような検査により診断できる。高い陰性的中率は、診断検査によってなされた陰性査定における高い信頼度の指標となる。陰性的中率は、真の陰性結果を真の陰性結果と偽陰性結果の和（すなわち、その診断検査により決定したすべての陰性転帰）で割った数値として表わすことができる。原則として、陰性的中率は、診断検査の感度および特異度ならびに特定のコホートにおける疾患または状態の罹患率に応じて計算できる。具体的には、陰性的中率は［（特異度）（１−罹患率）］／［（特異度）（１−罹患率）＋（１−感度）（罹患率）］である。罹患率予測値はコホート研究から得ることができ、これに対し症例対照研究では検査についての感度および／または特異度を得ることができる。特に、本発明の方法により確立された診断の陰性的中率は少なくとも約９８％、より好ましくは少なくとも約９９％、最も好ましくは１００％となるはずである。統計学についてのさらなる詳細は、標準テキスト、たとえばDowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983に記載され、あるいは本明細書の他のいずれかの箇所に見られる。
【００２５】
用語“試料”は、体液の試料、分離された細胞の試料、または組織もしくは臓器からの試料を表わす。体液の試料は周知の手法により得ることができ、好ましくは血液、血漿、血清または尿の試料、より好ましくは血液、血漿または血清の試料を含む。組織または臓器の試料は、いずれかの組織または臓器から、たとえば生検により得ることができる。分離された細胞は、体液または組織もしくは臓器から、遠心または細胞選別などの分離法により得ることができる。好ましくは、細胞、組織または臓器の試料は、本明細書中で述べるペプチドを発現または産生する細胞、組織または臓器から得られる。
【００２６】
本明細書中で用いる用語“ｓＦｌｔ−１”は、可溶性形態のｆｍｓ様チロシンキナーゼ１であるポリペプチドを表わす。このポリペプチドは、当技術分野で可溶性ＶＥＧＦ受容体１（ｓＶＥＧＦ  Ｒ１）とも呼ばれる（たとえば、下記を参照：Sunderji 2010, Am J Obstet Gynecol 202: 40e1-7)。それは、ヒト臍帯静脈内皮細胞の調整培地中で同定された。内因性ｓＦｌｔ１受容体は、クロマトグラフィー的および免疫学的に組換えヒトｓＦｌｔ１に類似し、［１２５Ｉ］ＶＥＧＦを同等な高い親和性で結合する。ヒトｓＦｌｔ１は、インビトロでＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の細胞外ドメインとＶＥＧＦ安定化された複合体を形成することが示された。好ましくは、ｓＦｌｔ１はKendall 1996, Biochem Biophs Res Commun 226(2): 324-328に記載されたヒトｓＦｌｔ１を表わす；アミノ酸配列については、たとえば下記も参照：ヒトｓＦｌｔ１についてはＧｅｎｅｂａｎｋ寄託番号Ｐ１７９４８，ＧＩ：１２５３６１、およびマウスｓＦｌｔ−１についてはＢＡＡ２４４９９．１，ＧＩ：２８０９０７１（ＧｅｎｅｂａｎｋはＮＣＢＩ，ＵＳＡから、www.ncbi.nlm.nih.gov/entrezで入手できる）。この用語には、前記のヒトｓＦｌｔ−１ポリペプチドのバリアントも含まれる。そのようなバリアントは、前記のｓＦｌｔ−１ポリペプチドと少なくとも同じ本質的な生物学的および免疫学的特性をもつ。特に、本明細書中に述べる同じ特異的アッセイ法により、たとえばそのｓＦｌｔ−１ポリペプチドを特異的に認識するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を用いるＥＬＩＳＡアッセイによりそれらを検出できれば、それらは同じ本質的な生物学的および免疫学的特性を共有する。さらに、本発明に従って述べるバリアントは、少なくとも１つのアミノ酸の置換、欠失および／または付加のため異なるアミノ酸配列をもつはずであり、そのバリアントのアミノ酸配列はなお、好ましくはそれぞれその特定のｓＦｌｔ−１ポリペプチドのアミノ酸配列と、好ましくはヒトｓＦｌｔ−１の全長にわたって、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であることを理解すべきである。２つのアミノ酸配列間の同一度は当技術分野で周知のアルゴリズムにより決定できる。好ましくは、同一度は最適状態でアラインさせた２つの配列を比較ウインドウにわたって比較することにより決定すべきであり、その際、その比較ウインドウ内のアミノ酸配列フラグメントは、最適アラインメントのために、基準配列（付加または欠失を含まないもの）と比較して付加または欠失（たとえば、ギャップまたはオーバーハング）を含むことができる。パーセントは、両配列中に同一アミノ酸残基が現われる位置の数を決定して一致位置の数を求め、その一致位置の数を比較ウインドウ内の位置の総数で割り、その算定結果に１００を掛けて配列同一パーセントを求めることにより計算される。比較のための最適な配列アラインメントは、下記により実施できる： Smith 1981, Add. APL. Math. 2:482により示された局所相同アルゴリズム(local homology algorithm)、Needleman 1970, J. Mol. Biol. 48:443の相同アラインメントアルゴリズム(homology alignment algorithm)、Pearson 1988, Proc. Natl. Acad Sci. (USA) 85: 2444の類似性検索法(search for similarity method)、これらのア��ゴリズムのコンピューター化実装（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴ、ＰＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ；Wisconsin Genetics Software Package中, Genetics Computer Group (GCG), 575   Science Dr., Madison, WI)、または目視検査。比較のための２つの配列が同定されると、好ましくはＧＡＰおよびＢＥＳＴＦＩＴを用いてそれらの最適アラインメントを決定し、こうして同一度を決定する。好ましくは、ギャップ重みにつき５．００、ギャップ重み長さにつき０．３０のデフォルト値を用いる。前記のバリアントは、対立遺伝子バリアント、または他のいずれかの種特異的なホモログ(homolog)、パラログ(paralog)もしくはオルソログ(ortholog)であってもよい。前記のバリアントは、対立遺伝子バリアント、または他のいずれかの種特異的なホモログ、パラログもしくはオルソログであってもよい。さらに、本明細書中で述べるバリアントには、特定のｓＦｌｔ−１ポリペプチドまたは前記タイプのバリアントの、フラグメントまたはサブユニットが含まれる；ただし、これらのフラグメントが前記の本質的な免疫学的および生物学的特性をもつ限りにおいてである。そのようなフラグメントは、たとえばｓＦｌｔ−１ポリペプチドの分解生成物であってもよい。バリアントは、本明細書中に述べる同じ特異的アッセイ法により、たとえばそのｓＦｌｔ−１ポリペプチドを特異的に認識するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を用いるＥＬＩＳＡアッセイによりそれらを検出できれば、同じ本質的な生物学的および免疫学的特性を共有するとみなされる。好ましいアッセイ法を、付随する実施例に記載する。さらに、翻訳後修飾、たとえばリン酸化またはミリスチル化のため異なるバリアントが含まれる。ｓＦｌｔ−１は、試料において結合形もしくは遊離形で、または総ｓＦｌｔ−１量として検出される可能性がある。
【００２７】
本明細書中で用いる用語“エンドグリン”は、非還元形態で１８０ｋＤａ、還元後形態で９５ｋＤａ、それの還元およびＮ−脱グリコシルされた形態で６６ｋＤａの分子量をもつポリペプチドを表わす。このポリペプチドは二量体を形成することができ、ＴＧＦ−βおよびＴＧＦ−β受容体に結合する。好ましくは、エンドグリンはヒト−エンドグリンを表わす。より好ましくは、ヒト−エンドグリンはＧｅｎｅｂａｎｋ寄託番号ＡＡＣ６３３８６．１，ＧＩ：３２０１４８９に示されるアミノ酸配列をもつ。２つのエンドグリンイソ型、Ｓ−エンドグリンおよびＬ−エンドグリンが記載されている。Ｌ−エンドグリンはアミノ酸４７個の細胞質テイルを備えた合計６３３個のアミノ酸からなり、一方、Ｓ−エンドグリンはアミノ酸１４個の細胞質テイルを備えた６００個のアミノ酸からなる。好ましくは、本発明に用いるエンドグリンは可溶性エンドグリンである。本明細書中で述べる可溶性エンドグリンは、好ましくはEP 1 804 836 B1に記載されている。さらに、本発明に従って述べるバリアントは、少なくとも１つのアミノ酸の置換、欠失および／または付加のため異なるアミノ酸配列をもつ可能性があり、そのバリアントのアミノ酸配列はなお、好ましくはその特定のエンドグリンのアミノ配列と、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であることを理解すべきである。バリアントは、対立遺伝子バリアント、スプライスバリアント、または他のいずれかの種特異的なホモログ、パラログもしくはオルソログであってもよい。さらに、本明細書中で述べるバリアントには、特定のエンドグリンまたは前記タイプのバリアントの、フラグメントが含まれる；ただし、これらのフラグメントが前記の本質的な免疫学的および生物学的特性をもつ限りにおいてである。そのようなフラグメントは、たとえばエンドグリンの分解生成物であってもよい。バリアントは、本明細書中に述べる同じ特異的アッセイ法により、たとえばそのエンドグリンポリペプチドを特異的に認識するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を用いるＥＬＩＳＡアッセイによりそれらを検出できれば、同じ本質的な生物学的および免疫学的特性を共有するとみなされる。好ましいアッセイ法を、付随する実施例に記載する。さらに、翻訳後修飾、たとえばリン酸化またはミリスチル化のため異なるバリアントが含まれる。エンドグリンは、試料において結合形もしくは遊離形で、または総エンドグリン量として検出される可能性がある。
【００２８】
本明細書中で用いる用語“ＰｌＧＦ（胎盤性増殖因子）”は胎盤由来の増殖因子を表わし、それは、アミノ酸１４９個の長さをもち、ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の血小板由来増殖因子様領域に対して相同性が高いポリペプチドである。ＶＥＧＦと同様に、ＰｌＧＦはインビトロおよびインビボで血管形成活性をもつ。たとえば、トランスフェクションしたＣＯＳ−１細胞に由来するＰｌＧＦの生化学的特性および機能特性の解明により、それはインビトロで内皮細胞増殖を刺激することができるグリコシル化された二量体型の分泌タンパク質であることが明らかになった(Maqlione 1993, Oncogene 8(4): 925-31)。好ましくは、ＰｌＧＦはヒトＰｌＧＦ、より好ましくはＧｅｎｅｂａｎｋ寄託番号Ｐ４９７６３，ＧＩ：１７３８０５５３に示されるアミノ酸配列をもつヒトＰｌＧＦを表わす。この用語には、その特定のヒトＰｌＧＦのバリアントが含まれる。そのようなバリアントは、少なくともその特定のＰｌＧＦポリペプチドと同じ本質的な免疫学的および生物学的特性をもつ。バリアントは、本明細書中に述べる同じ特異的アッセイ法により、たとえばそのＰｌＧＦポリペプチドを特異的に認識するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を用いるＥＬＩＳＡアッセイによりそれらを検出できれば、同じ本質的な生物学的および免疫学的特性を共有するとみなされる。好ましいアッセイ法を、付随する実施例に記載する。さらに、本発明に従って述べるバリアントは、少なくとも１つのアミノ酸の置換、欠失および／または付加のため異なるアミノ酸配列をもつはずであり、そのバリアントのアミノ酸配列はなお、好ましくはその特定のＰｌＧＦポリペプチドのアミノ配列と、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であることを理解すべきである。２つのアミノ酸配列間の同一度は、当技術分野で周知である本明細書の他のいずれかの箇所に記載するアルゴリズムにより決定できる。前記のバリアントは、対立遺伝子バリアント、または他のいずれかの種特異的なホモログ、パラログもしくはオルソログであってもよい。さらに、本明細書中で述べるバリアントには、特定のＰｌＧＦポリペプチドまたは前記タイプのバリアントの、フラグメントが含まれる；ただし、これらのフラグメントが前記の本質的な免疫学的および生物学的特性をもつ限りにおいてである。そのようなフラグメントは、たとえばＰｌＧＦポリペプチドの分解生成物またはスプライスバリアントであってもよい。さらに、翻訳後修飾、たとえばリン酸化またはミリスチル化のため異なるバリアントが含まれる。ＰｌＧＦは、試料において結合形もしくは遊離形で、または総ＰｌＧＦ量として検出される可能性がある。
【００２９】
本明細書中で述べるいずれかのペプチドまたはポリペプチドの量の決定は、量または濃度を、好ましくは半定量的または定量的に測定することに関する。測定は直接または間接的に行なうことができる。直接測定は、ペプチドまたはポリペプチド自体から得られる信号であってその強度が試料中に存在するペプチドの分子数と直接相関する信号に基づいて、ペプチドまたはポリペプチドの量または濃度を測定することに関する。そのような信号−本明細書中で時には強度信号と呼ぶ−は、たとえばペプチドまたはポリペプチドの特定の物理的または化学的特性の強度値を測定することによって得ることができる。間接測定には、二次成分（すなわち、そのペプチドまたはポリペプチド自体ではない成分）または生物学的読出し系、たとえば測定可能な細胞応答、リガンド、標識、または酵素反応生成物から得られる信号を測定することが含まれる。
【００３０】
本発明によれば、ペプチドまたはポリペプチドの量の決定は、試料中のペプチドの量を決定するためのあらゆる既知手段により達成できる。それらの手段には、標識分子を多様なサンドイッチ、競合その他のアッセイ様式で利用できるイムノアッセイのデバイスおよび方法が含まれる。それらのアッセイは、ペプチドまたはポリペプチドの存在または非存在の指標となる信号を発するであろう。さらに、信号強度を、好ましくは試料中に存在するポリペプチドの量に直接または間接的（たとえば、反比例）に相関させることができる。さらに他の適切な方法は、ペプチドまたはポリペプチドに特異的な物理的または化学的特性、たとえばそれの厳密な分子質量またはＮＭＲスペクトルを測定することを含む。それらの方法は、好ましくはバイオセンサー、イムノアッセイに連携した光学機器、バイオチップ、分析機器、たとえば質量分析計、ＮＭＲ分析器、またはクロマトグラフィー機器を含む。さらに、方法にはマイクロプレートＥＬＩＳＡベースの方法、全自動またはロボット式イムノアッセイ（たとえば、Ｅｌｅｃｓｙｓ（商標）分析器で得られる）、ＣＢＡ（酵素コバルト結合アッセイ(enzymatic Cobalt Binding Assay)、たとえばＲｏｃｈｅ−Ｈｉｔａｃｈｉ（商標）分析器で得られる）、およびラテックス凝集アッセイ（たとえば、Ｒｏｃｈｅ−Ｈｉｔａｃｈｉ（商標）分析器で得られる）が含まれる。
【００３１】
好ましくは、ペプチドまたはポリペプチドの量の決定は、下記の段階を含む：（ａ）その強度がペプチドまたはポリペプチドの量の指標となる細胞応答を誘発できる細胞を、適切な期間、そのペプチドまたはポリペプチドと接触させ、（ｂ）細胞応答を測定する。細胞応答を測定するために、試料または処理済み試料を、好ましくは細胞培養物に添加し、細胞内または細胞外の応答を測定する。細胞応答には、測定可能なレポーター遺伝子発現、または物質、たとえばペプチド、ポリペプチドもしくは小分子の分泌を含めることができる。この発現または物質は、ペプチドまたはポリペプチドの量に相関する強度信号を発すべきである。
【００３２】
同様に好ましくは、ペプチドまたはポリペプチドの量の決定は、試料中のペプチドまたはポリペプチドから得られる特異的な強度信号を測定する段階を含む。前記のように、そのような信号は、質量スペクトルにみられるペプチドもしくはポリペプチドに特異的なｍ／ｚ変数で観察される信号強度、またはペプチドもしくはポリペプチドに特異的なＮＭＲスペクトルであってもよい。
【００３３】
ペプチドまたはポリペプチドの量の決定は、好ましくは下記の段階を含むことができる：（ａ）ペプチドを特異的リガンドと接触させ、（ｂ）好ましくは、結合していないリガンドを除去し、（ｃ）結合したリガンドの量を測定する。結合したリガンドは強度信号を発するであろう。本発明による結合には、共有結合および非共有結合の両方が含まれる。本発明によるリガンドは、本明細書に記載するペプチドまたはポリペプチドに結合するいずれかの化合物、たとえばペプチド、ポリペプチド、核酸、または小分子であってもよい。好ましいリガンドには、抗体、核酸、ペプチドまたはポリペプチド、たとえば前記のペプチドまたはポリペプチドおよびそのフラグメントに対する受容体または結合パートナー（該ペプチドに対する結合ドメインを含むもの）、ならびにアプタマー、たとえば核酸アプタマーまたはペプチドアプタマーが含まれる。そのようなリガンドを作成する方法は当技術分野で周知である。たとえば、適切な抗体またはアプタマーの同定および作成は供給業者によっても提供される。当業者は、そのようなリガンドの、より高い親和性または特異性を備えた誘導体を開発する方法に精通している。たとえば、核酸、ペプチドまたはポリペプチドにランダム変異を導入することができる。これらの誘導体を、次いで当技術分野で既知のスクリーニング法、たとえばファージディスプレー法に従って、結合について試験することができる。本明細書中で述べる抗体には、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方、ならびにそのフラグメントであって抗原またはハプテンを結合できるもの、たとえばＦｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）２フラグメントが含まれる。本発明には、一本鎖抗体、および目的とする抗原特異性を示す非ヒト−ドナー抗体のアミノ酸配列をヒト−アクセプター抗体の配列と組み合わせたヒト化ハイブリッド抗体も含まれる。ドナー配列は通常は少なくともドナーの抗原結合性アミノ酸残基を含むであろうが、ドナー抗体の他の構造関連および／または機能関連アミノ酸残基も含むことができる。そのようなハイブリッドは、当技術分野で周知である幾つかの方法で作成できる。好ましくは、リガンドまたは作用剤は前記のペプチドまたはポリペプチドに特異的に結合する。本発明による特異的結合は、リガンドまたは作用剤が、被検試料中に存在する他のペプチド、ポリペプチドまたは物質に実質的に結合（すなわち、それらと“交差反応”）すべきではないことを意味する。好ましくは、特異的に結合されるペプチドまたはポリペプチドは、他のいずれかの関連ペプチドまたはポリペプチドより少なくとも３倍高い、より好ましくは少なくとも１０倍高い、よりさらに好ましくは少なくとも５０倍高い親和性で結合されるべきである。非特異的結合は、たとえばウェスタンブロット上でのそれのサイズに従って、または試料中での相対的に高いそれの存在量によって、それをなお明白に区別および測定できるならば、許容できる。リガンドの結合は、当技術分野で周知であるいずれかの方法により測定できる。好ましくは、その方法は半定量的または定量的である。ポリペプチドまたはペプチドの決定に適したさらに他の手法を以下に記載する。
【００３４】
第１に、リガンドの結合は、直接的に、たとえばＮＭＲまたは表面プラズモン共鳴により測定できる。第２に、リガンドが、目的とするペプチドまたはポリペプチドの酵素活性の基質としても作用するならば、酵素反応生成物を測定してもよい（たとえば、プロテアーゼの量は開裂した基質の量をたとえばウェスタンブロットで測定することにより測定できる）。あるいは、リガンド自体が酵素特性を示してもよく、その“リガンド／ペプチドまたはポリペプチド”複合体、すなわちそれぞれペプチドまたはポリペプチドが結合したリガンドを、強度信号の発生により検出できる適切な基質と接触させることができる。酵素反応生成物の測定のためには、好ましくは基質の量は飽和状態である。反応前に基質を検出可能な標識で標識化することもできる。好ましくは、適切な期間、試料を基質と接触させる。適切な期間は、検出可能な、好ましくは測定可能な量の生成物が生成するのに必要な時間を表わす。生成物の量を測定する代わりに、一定の（たとえば、検出可能な）量の生成物が出現するのに必要な時間を測定することができる。第３に、リガンドを検出および測定できるようにする標識にリガンドを共有結合または非共有結合により結合させてもよい。標識化は、直接法または間接法により実施できる。直接標識化は、標識をリガンドに直接（共有結合または非共有結合により）結合させることを伴なう。間接標識化は、二次リガンドを一次リガンドに（共有結合または非共有結合により）結合させることを伴なう。二次リガンドは一次リガンドに特異的に結合すべきである。この二次リガンドは適切な標識と結合させることができ、および／または二次リガンドに結合する三次リガンドのターゲット（レセプター）であってもよい。二次、三次またはよりさらに高次のリガンドの使用は、信号を増強するためにしばしば採用される。適切な二次およびより高次のリガンドには、抗体、二次抗体、および周知のストレプトアビジン−ビオチン系（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を含めることができる。リガンドまたは基質に、当技術分野で既知である１種類以上のタグで“タグ付け”することもできる。その際、そのようなタグはより高次のリガンドにとってのターゲットであってもよい。適切なタグには、ビオチン、ジゴキシゲニン、Ｈｉｓ−タグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ＦＬＡＧ、ＧＦＰ、ｍｙｃ−タグ、インフルエンザＡウイルス−ヘマグルチニン（ＨＡ）、マルトース結合タンパク質などが含まれる。ペプチドまたはポリペプチドの場合、タグは好ましくはＮ末端および／またはＣ末端にある。適切な標識は、適切な検出法により検出できるいずれかの標識である。代表的な標識には、金粒子、ラテックスビーズ、アクリダン(acridan)エステル、ルミノール、ルテニウム、酵素活性標識、放射性標識、磁性標識（“たとえば、磁性ビーズ”；常磁性および超常磁性標識を含む）、および蛍光標識が含まれる。酵素活性標識には、たとえば西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、およびその誘導体が含まれる。検出に適した基質には、ジ−アミノ−ベンジジン（ＤＡＢ）、３，３’−５，５’−テトラメチルベ���ジジン、ＮＢＴ−ＢＣＩＰ（４−ニトロブルーテトラゾリウムクロリドおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスフェート；既製原液としてＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓから入手できる）、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＥＣＦ（商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）が含まれる。適切な酵素−基質の組合わせは有色反応生成物、蛍光または化学発光を生じることができ、それらを当技術分野で既知の方法に従って測定できる（たとえば、感光性フィルムまたは適切なカメラシステムを用いて）。酵素反応の測定については、前記に挙げた基準を同様に適用する。代表的な蛍光標識には、蛍光タンパク質（たとえば、ＧＦＰおよびそれの誘導体）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、テキサスレッド、フルオレセイン、およびＡｌｅｘａ色素（たとえば、Ａｌｅｘａ  ５６８）が含まれる。さらに他の蛍光標識を、たとえばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（オレゴン州）から入手できる。蛍光標識としての量子ドットの使用も考慮される。代表的な放射性標識には、３５Ｓ、１２５Ｉ、３２Ｐ、３３Ｐなどが含まれる。放射性標識は、いずれか既知の適切な方法、たとえば感光性フィルムまたはｐｈｏｓｐｈｏｒ  ｉｍａｇｅｒにより検出できる。本発明による適切な測定法には、下記のものも含まれる：沈降法（特に免疫沈降法）、電気化学発光（電気的に発生する化学発光）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベントアッセイ)、サンドイッチ酵素免疫試験、電気化学発光サンドイッチイムノアッセイ(electrochemiluminescence sandwich immunoassay)（ＥＣＬＩＡ）、解離増強型ランタニド蛍光イムノアッセイ(dissociation-enhanced lanthanide fluoro immuno assay)（ＤＥＬＦＩＡ）、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）、タービディメトリー（濁度測定）、ネフェロメトリー（比濁分析）、ラテックス増強型のタービディメトリーもしくはネフェロメトリー、または固相免疫試験。当技術分野で周知であるさらに他の方法（たとえば、ゲル電気泳動、２Ｄゲル電気泳動、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、ウェスタンブロット法、および質量分析）を、単独で、または前記の標識法もしくは他の検出法と組み合わせて使用できる。
【００３５】
ペプチドまたはポリペプチドの量は、同様に好ましくは下記により決定できる：（ａ）前記に明記したペプチドまたはポリペプチドに対するリガンドを含む固体支持体を、そのペプチドまたはポリペプチドを含む試料と接触させ、（ｂ）好ましくは、結合していないペプチドまたはポリペプチドおよび残りの試料材料を除去し、そして（ｃ）支持体に結合しているペプチドまたはポリペプチドの量を測定する。リガンドは、好ましくは核酸、ペプチド、ポリペプチド、抗体およびアプタマーからなる群から選択され、好ましくは固体支持体上に固定化された形態で存在する。固体支持体を作成するための材料は当技術分野で周知であり、特に市販のカラム材料、ポリスチレンビーズ、ラテックスビーズ、磁性ビーズ、コロイド金属粒子、ガラスおよび／またはシリコンのチップおよび表面、ニトロセルロースのストリップ、膜、シート、デュラサイト(duracyte)、反応トレーのウェルおよび壁、プラスチックチューブなどを含む。リガンドまたは作用剤を多種多様なキャリヤーに結合させることができる。周知のキャリヤーの例には、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキストラン、ナイロン、アミロース、天然および改質セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、および磁鉄鉱が含まれる。本発明の目的について、キャリヤーの性質は可溶性または不溶性のいずれであってもよい。リガンドを固定／固定化するのに適した方法は周知であり、イオン性、疎水性、共有結合性の相互作用などを含むが、これらに限定されない。本発明によるアレイとして“懸濁アレイ”を用いることも考慮される(Nolan 2002, Trends Biotechnol. 20(1): 9-12)。そのような懸濁アレイ中に、キャリヤー、たとえばマクイロビーズまたはマイクロスフェアが懸濁状態で存在する。アレイは、おそらく標識された状態で種々のリガンドを保有する種々のマクイロビーズまたはマイクロスフェアからなる。そのようなアレイを調製する方法、たとえば固相化学および光不安定保護基に基づくものが一般に知られている(US 5,744,305)。
【００３６】
好ましい態様によるリガンドの結合の測定は、本明細書に開示するシステムの分析ユニットにより実施される。その後、測定した結合の量を、本明細書に開示するシステムのコンピューティングデバイスにより計算することができる。
【００３７】
本明細書中で用いる用語“量”は、ポリペプチドまたはペプチドの絶対量、そのポリペプチドまたはペプチドの相対量または濃度、およびそれらに相関するかまたはそれらから誘導できるいずれかの数値またはパラメーターを包含する。そのような数値またはパラメーターは、それらのペプチドから直接測定により得られるあらゆる特異的な物理的または化学的特性からの強度信号値、たとえば質量スペクトルまたはＮＭＲスペクトルにおける強度値を含む。さらに、本明細書の他のいずれかの箇所に明記する間接測定により得られるすべての数値またはパラメーター、たとえばペプチドに応答した生物学的読出し系から決定される応答レベル、または特異的に結合したリガンドから得られる強度信号が包含される。前記の量またはパラメーターに相関する数値はあらゆる標準的な数理的操作により得られることも理解すべきである。本発明の好ましい態様によれば、“量”の決定は好ましくは本発明のシステムにより行なわれ、それによればそのシステムの１以上の分析ユニットにより実施される接触および測定の段階に基づいてコンピューティングデバイスが“量”を決定する。
【００３８】
本明細書中で用いる用語“比較する”は、本明細書に述べる少なくとも１種類の血管形成バイオマーカーについて決定した量を基準と比較することを包含する。本明細書中で用いる比較は、その量についての値と基準との間で行なわれるあらゆる種類の比較を表わすことを理解すべきである。ｓＦｌｔ−１およびエンドグリンの場合はその量について基準と比較して等しいかまたは少ない値、ＰｌＧＦの場合は等しいかまたは多い値が測定されれば、その妊娠対象は短かい時間ウインドウ以内に妊娠高血圧腎症を発症するリスクをもたない（妊娠高血圧腎症についての“除外(rule-out)”）。
【００３９】
本発明の方法の段階（ｂ）で述べる比較は、手動で、またはコンピューター支援により実施できる。この量の値と基準をたとえば互いに比較することができ、その比較は比較のためのアルゴリズムを実行するコンピュータープログラムにより自動的に実施できる。その評価を実施するコンピュータープログラムは、目的とする査定を適切な出力フォーマットで提供するであろう。好ましくは、本発明のデバイスの評価ユニットまたは本発明のシステムのコンピューティングデバイスを、その比較を実施するために使用できる。その評価を実施するコンピュータープログラムは、目的とする査定を適切な出力フォーマットで提供するであろう。コンピューター支援による比較のために、決定した量の値を、データベースに記憶されている適切な基準に対応する値とコンピュータープログラムにより比較することができる。コンピュータープログラムはさらに比較の結果を評価することができる；すなわち、目的とする査定を適切な出力フォーマットで自動的に提供する。決定した量と基準量の比較に基づいて、目的とする査定を行なうことができる。たとえば、比較の結果を生データ（絶対量または相対量）として、またある場合には特定の診断の指標となりうる言語、字句、記号または数値の形の指標として得ることができる。
【００４０】
本明細書中で用いる用語“基準”は、少なくとも約９８％の陰性的中率で診断を行なうためのカットオフとなる基準量または基準値を表わす。好ましくは、これに関して想定される陰性的中率は約９９％、または最も好ましくは１００％である。適切なカットオフ量またはカットオフ値は、好ましくは、前記に述べたように、調査対象の特定集団における妊娠高血圧腎症についての感度、特異度、および予想、既知（たとえば、文献から）または推定（たとえば、前向きコホート研究に基づく）罹患率に基づいて決定できる。基準として使用すべきカットオフ値またはカットオフ量は、当技術分野で既知の多様な方法により決定できる。好ましくは、受信者動作特性(receiver-operating characteristic)（ＲＯＣ）をカットオフ値またはカットオフ量の決定のために使用できる(特に、Zweig 1993, Clin. Chem. 39:561-577を参照)。ＲＯＣグラフは、決定閾値（すなわち、カットオフ値）を観察データの全範囲にわたって連続的に変化させることにより得られる感度および特異度の対をすべてプロットしたものである。ある診断法の臨床性能は、それの精度、すなわちそれが対象を特定の予後または診断に正確に割り当てる能力に依存する。ＲＯＣプロットは、区別を行なうのに適した閾値の全範囲について、感度を１−特異度に対してプロットすることにより、２つの分布（罹患および非罹患サブグループの結果）間のオーバーラップを指示する。ｙ軸には感度、または真の陽性画分があり、これは真の陽性試験結果の数と偽陰性試験結果の数の和に対する真の陽性試験結果の数の比として定義される。これは、ある疾患または状態の存在下での陽性度とも言われている。それは専ら罹患サブグループから計算される。ｘ軸には偽陽性画分、または１−特異度があり、これは真の陰性結果の数と偽陽性結果の数の和に対する偽陽性結果の数の比として定義される。それは特異度の指数であり、完全に非罹患サブグループから計算される。真の陽性画分と偽陽性画分は２つの異なるサブグループからの試験結果を用いて完全に分離して計算されるので、ＲＯＣプロットはそのコホートにおけるその事象の罹患率とは無関係である。ＲＯＣプロット上の各点は、特定の決定閾値に対応する感度と特異度の対を表わす。完全識別を伴なう試験（結果の２つの分布にオーバーラップがない）は、上左隅を通るＲＯＣプロットをもち、その際、真の陽性画分は１．０、すなわち１００％（完全感度）であり、偽陽性画分は０（完全特異度）である。識別されない試験についての理論的プロット（２グループについての結果が同一分布）は、下左隅から上右隅への４５°の対角線である。大部分のプロットはこれら両極端の間にある。ＲＯＣプロットが完全に４５°の対角線の下側にあれば、これは“陽性度”についての基準を“より大”から“より小”に逆転することによって容易に対処され、あるいはその逆も成り立つ。定性的に、プロットが上左隅に近づくほど、その試験の全般的精度は高くなる。カットオフ値をＲＯＣ曲線から導くことができ、これにより特定の事象についてそれぞれ感度と特異度の適正なバランスで診断または予測することができる。したがって、前記の本発明方法に使用すべき基準、すなわち高いリスクをもたない対象間の識別を可能にするカットオフ値は、好ましくはそのコホートについて前記のようにＲＯＣを確立し、それからカットオフ値量を導くことにより作成できる。診断法について希望する前選択した感度および特異度または対応する信頼限界に応じて、ＲＯＣプロットは適切なカットオフ値を導くことができる。ある対象を高いリスクをもつという理由で効果的に排除するためには（すなわち、除外(rule-out)）偽陰性のグループが最小であるように感度および特異度を調整し、これに対し、ある対象が高いリスクをもつと効果的に査定されるためには（すなわち、確定(rule-in)）偽陽性のグループが最小であるように感度および特異度を調整することは理解されるであろう。さらに、バイオマーカーのカットオフとは無関係な全般的性能の指標を与える曲線下面積（ＡＵＣ）値をＲＯＣプロットから導くことができる。さらに、ＲＯＣ曲線の各点は、特定のカットオフ値における感度および特異度の対を表わす。
【００４１】
本発明に関して用語“約”は、示したパラメーターまたは数値から±２０％、±１０％、±５％、±２％または±１％を意味する。これは、測定技術などにより生じる通常の偏差も考慮に入れる。ただし、この用語はその厳密に示したパラメーターまたは数値をも含む。
【００４２】
有利なことに、本発明の基礎となる研究において、被検試料を採取した時点で妊娠高血圧腎症、子癇またはＨＥＬＬＰ症候群の臨床顕性症状を全くまたはわずかしか示していない妊娠対象におけるｓＦｌｔ−１、エンドグリンまたはＰｌＧＦの量、およびその比（後記も参照）、すなわちｓＦｌｔ１／ＰｌＧＦ比、またはエンドグリン／ＰｌＧＦ比は、切迫妊娠高血圧腎症、すなわち約１〜約２週間という短期間以内の妊娠高血圧腎症および／または切迫ＨＥＬＬＰ症候群の発症を除外するための指標であることが見出された。特に、前記マーカーを用いる場合、個々のバイオマーカーについてのカットオフ量またはカットオフ値を高い陰性的中率で確立することができる。さらに、約４６以下のｓＦｌｔ１／ＰｌＧＦ比は、または約３３以下のｓＦｌｔ１／ＰｌＧＦ比ですら、本発明方法の、ほぼ１００％の陰性的中率を可能にする特に価値ある指標であることが見出された。また、約３８のｓＦｌｔ１／ＰｌＧＦ比は、実施例、特に実施例４および図８に詳細に開示するように特に価値があることが見出された。したがって、本発明の方法は、確立すべき除外診断に関して特に高い信頼度で作動する。さらに、本発明の方法は対象の初回来院時に採取した試料についてだけでなく、その後の来院時に採取した各試料についても信頼性をもって採用できることが認められた。さらにまた、本発明による方法は、他の診断方法により、特に子宮ドップラー超音波診断により、妊娠高血圧腎症、子癇および／またはＨＥＬＬＰ症候群を発症するリスクをもつと誤って陽性診断された対象を同定するために採用できる。ドップラー超音波診断検査により妊娠高血圧腎症、子癇および／またはＨＥＬＬＰ症候群を発症するリスクをもつと診断された対象に本発明の方法を適用することにより、この診断が誤った陽性である対象を短い時間ウインドウ以内で効果的に除外することができる。
【００４３】
本発明のおかげで、切迫妊娠高血圧腎症のリスクをより信頼性をもって除外することができる。さらに、本発明の方法を診断の補助として適用すると、現在のスコアリング方式のような時間のかかる高額でやっかいな診断措置、または熟練した医師を必要とするドップラー超音波診断検査を避けることができる。これに関して、たとえばドップラー超音波診断検査と対照的に、本発明による方法は、高度の専門医を必要とするのではなく、自動的に、または医療支援スタッフにより実施することすらできることに注目すべきである。妊娠高血圧腎症に罹患しているかまたは発症のリスクをもつ妊婦に要求される集中的な特別のケア、たとえば緊密なモニタリングおよび入院の必要性をより良好に推定して健康管理のために考慮に入れることができるので、健康管理は本発明の方法から著しい有益性を受けるはずである。
【００４４】
前記および下記で行なう用語の定義および説明は、本明細書および付随する特許請求の範囲に記載するすべての態様にそれに応じて適用されることを理解すべきである。
本発明の方法の好ましい態様において、本方法は、段階ａ）においてその対象の試料中のバイオマーカーｓＦｌｔ−１またはエンドグリンおよびＰｌＧＦの量を決定し、そして段階ｂ）においてその対象の試料中のバイオマーカーｓＦｌｔ−１またはエンドグリンとＰｌＧＦの量の比の値を基準値と比較し、それにより、その比の値が基準と比較して等しいかまたは低ければ、対象は短期間以内に妊娠高血圧腎症を発症するリスクをもたないと診断する。より好ましくは、本方法は段階ｂ）の前に、段階ａ）で試料において決定したｓＦｌｔ−１またはエンドグリンおよびＰｌＧＦの量から比を計算するさらなる段階を含む。
【００４５】
本明細書中で述べる用語“比を計算する”は、下記によりｓＦｌｔ−１またはエンドグリンの量とＰｌＧＦの量との比を計算することに関する：それらの量を割るか、あるいはそれに匹敵する他のいずれかの数学計算であってｓＦｌｔ−１またはエンドグリンの量をＰｌＧＦの量に関係づける計算を実施する。好ましくは、その比を計算するためにｓＦｌｔ−１またはエンドグリンの量をＰｌＧＦの量で割る；すなわち、この比は、好ましくはｓＦｌｔ−１の量をＰｌＧＦの量で割ったもの（ｓＦｌｔ−１／ＰｌＧＦとも言う）またはエンドグリンの量をＰｌＧＦの量で割ったもの（エンドグリン／ＰｌＧＦとも言う）である。
【００４６】
本明細書中で用いる用語“比較する”は、この比を他のいずれかの箇所に定める基準と比較することを包含する。本明細書中で用いる比較するは、この比と基準との間で行なわれるあらゆる種類の比較を表わすことを理解すべきである。本発明の基礎となる研究において、妊娠高血圧腎症を発症するリスクが低いこと、または高くないことは、ｓＦｌｔ−１またはエンドグリンとＰｌＧＦについて決定した比が基準値と比較して等しいかまたは低いことと相関することが見出された。より好ましくは、この基準値は約４６以下、約４５以下、約４０以下、または約３５以下であり、好ましくはそれは約３３以下である。よりいっそう好ましくは、ｓＦｌｔ−１とＰｌＧＦについて決定した比に対する基準値は約３８以下である；最も好ましくは、ｓＦｌｔ−１とＰｌＧＦについて決定した比に対する基準値は約３８である。上記のカットオフ値は、先行技術における診察日での診断のための他の（非特異的）除外法について述べられたもの（たとえば、前掲のStepanを参照）と比較してかなり異なり、本発明の方法に適用すると予測のための驚異的に高い陰性的中率を達成する。
【００４７】
本発明方法のさらに好ましい態様において、本方法はさらにその診断に基づいて患者管理措置を推奨することを含む。
本明細書中で用いる用語“推奨する”は、対象に適用できる、または対象に適用してはならない、患者管理措置またはその組合わせの提唱を確立することを意味する。しかし、特定の１態様において、実際の管理措置の適用がいずれもこの用語に含まれるわけではないことを理解すべきである。本明細書中で用いる患者管理措置は、妊娠高血圧腎症に罹患している対象にその健康状態の治癒、回避または取扱いのために適用できるすべての措置を表わす。たとえば、患者管理措置には、モニタリングの程度（たとえば、緊密な、普通または軽度のモニタリング）、入院もしくは外来通院維持、薬物処置の適用もしくは差し控え、または生活様式推奨事項が含まれる。好ましくは、患者管理措置は、（ｉ）対象が妊娠高血圧腎症を発症するリスクをもたないと診断されなければ下記の措置の群から選択され：緊密なモニタリング、入院、降圧薬の投与、および生活様式推奨事項、（ｉｉ）対象が妊娠高血圧腎症を発症するリスクをもたないと診断されれば外来通院モニタリングである
本発明はさらに、妊娠高血圧腎症に罹患する疑いのある対象を管理する方法であって、妊娠対象が本明細書中で前記に述べた短い時間ウインドウ以内の妊娠高血圧腎症のリスクをもたないかどうかを診断する方法段階、および確立された診断に従って対象を管理するさらなる段階を含む方法に関する。好ましくは、その管理には、対象の外来通院維持、普通または軽度のモニタリング、薬物投与の差し控え、特に降圧薬または出産前コルチコステロイド（たとえば、ベタメタゾン(bethamethasone)）の投与の差し控えが含まれる；後者は、早期産のリスクをもつ女性において胎児肺成熟を促進するために適用される。
【００４８】
本発明はまた、妊娠対象が短期間以内に妊娠高血圧腎症を発症するリスクをもたないかどうかを診断するための、妊娠対象の試料中の少なくとも１種類のバイオマーカーｓＦｌｔ−１、エンドグリンおよびＰｌＧＦ、またはそれに特異的に結合する少なくとも１種類のそれの検出剤の使用に関する。本発明はまた、本明細書の他のいずれかの箇所に述べる患者管理措置を推奨するための、妊娠対象の試料中の少なくとも１種類のバイオマーカーｓＦｌｔ−１、エンドグリンおよびＰｌＧＦ、またはそれに特異的に結合する少なくとも１種類のそれの検出剤の使用を含む。
【００４９】
本発明はまた、妊娠対象が短期間以内に妊娠高血圧腎症を発症するリスクをもたないかどうかを診断するための診断剤もしくは薬剤または組成物を調製するための、妊娠対象の試料中の少なくとも１種類のバイオマーカーｓＦｌｔ−１、エンドグリンおよびＰｌＧＦ、またはそれに特異的に結合する少なくとも１種類のそれの検出剤の使用を考慮する。本発明はまた、本明細書の他のいずれかの箇所に述べる患者管理措置を推奨するための診断剤もしくは薬剤または組成物を調製するための、妊娠対象の試料中の少なくとも１種類のバイオマーカーｓＦｌｔ−１、エンドグリンおよびＰｌＧＦ、またはそれに特異的に結合する少なくとも１種類のそれの検出剤の使用を含む。
【００５０】
本発明は、本発明の方法を実施することにより妊娠対象が短期間以内に妊娠高血圧腎症を発症するリスクをもたないかどうかを診断するために適合させた、下記のものを含むデバイスに関する：
ａ）ｓＦｌｔ−１、エンドグリンおよびＰｌＧＦからなる群から選択される少なくとも１種類の血管形成バイオマーカーに特異的に結合する少なくとも１種類の検出剤を含む分析ユニットであって、妊娠対象の試料中のｓＦｌｔ−１、エンドグリンおよび／またはＰｌＧＦの量を決定するために適合させたユニット；ならびに
ｂ）下記のためのアルゴリズムを実装したデータプロセッサーを含む評価ユニット：前記の量を基準と比較し、それにより、ｓＦｌｔ−１およびエンドグリンの場合はその量が基準と比較して等しいかまたは少なければ、またＰｌＧＦの場合は等しいかまたは多ければ、対象は短期間以内に妊娠高血圧腎症を発症するリスクをもたないと診断し、その際、基準は少なくとも約９８％の陰性的中率で診断を行なうことができる。
【００５１】
本明細書中で用いる用語“デバイス”は、本発明の方法による診断が可能になるように互いに操作可能な状態で連結した前記ユニットを含むシステムに関する。分析ユニットに使用できる好ましい検出剤は本明細書の他の箇所に開示されている。分析ユニットは、好ましくは、その量を決定すべきバイオマーカーを含む試料に接触させる固体支持体に固定化された形態で、それらの検出剤を含む。さらに、分析ユニットはバイオマーカー（単数または複数）に特異的に結合した検出剤の量を決定する検出器をも含むことができる。決定された量を評価ユニットへ伝達することができる。その評価ユニットはデータ処理素子、たとえばコンピューターを含み、それには、本明細書の他のいずれかの箇所に詳細に述べた本発明方法の段階を実施するコンピューターベースのアルゴリズムの実装により比の計算、計算されたそれらの比の比較、およびその比較の結果の評価を行なうためのアルゴリズムが実装されている。結果をパラメトリック診断生データの出力として得ることができる。これらのデータは通常は臨床医による解釈を必要とすることを理解すべきである。しかし、出力が処理済みの診断生データを含み、その解釈に専門的な臨床医を必要としない、エキスパートシステムデバイスも想定される。
【００５２】
本発明のデバイスの好ましい態様において、分析ユニットはその対象の試料中のバイオマーカーｓＦｌｔ−１またはエンドグリンおよびＰｌＧＦの量を決定するための検出剤を含み、その際、評価ユニットに実装されたアルゴリズムはｓＦｌｔ−１またはエンドグリンとＰｌＧＦの量の比の値を基準値と比較し、それにより、その比の値が基準値と比較して等しいかまたは低ければ、対象は短期間以内に妊娠高血圧腎症を発症するリスクをもたないと診断される。好ましくは、評価ユニットに実装されたアルゴリズムは、さらにｓＦｌｔ−１またはエンドグリンとＰｌＧＦの量の比の値を計算する。
【００５３】
本発明の他の好ましい態様において、評価ユニットはさらに、本明細書の他のいずれかの箇所に述べるように診断に基づいて患者管理措置に関する推奨を行なう実装アルゴリズムを含む。
【００５４】
以上から、この開示内容のある態様によれば、本明細書に開示および記載した方法の幾つかの段階の一部をコンピューティングデバイスにより実施できることが分かる。コンピューティングデバイスは、たとえば汎用コンピューターまたはポータブルコンピューティングデバイスであってもよい。本明細書に開示する方法の１以上の段階を実施するために、多数のコンピューティングデバイスを、たとえばネットワークまたは他のデータ移送方法を介して一緒に使用できることも理解すべきである。代表的なコンピューティングデバイスには、デスクトップコンピューター、ラップトップコンピューター、パーソナルデータアシスタント(personal data assistant)（“ＰＤＡ”）、たとえばＢＬＡＣＫＢＥＲＲＹ銘柄のデバイス、セル方式デバイス、タブレットコンピューター、サーバーなどが含まれる。一般に、コンピューティングデバイスは複数の指示（たとえば、ソフトウェアのプログラム）を実行できるプロセッサーを含む。
【００５５】
コンピューティングデバイスはメモリーにアクセスできる。メモリーはコンピューター可読媒体であり、単一記憶デバイスまたは多重記憶デバイスを含むことができ、それらはコンピューティングデバイスと共に局所に配置され、あるいはたとえばネットワークを介してコンピューティングデバイスにアクセス可能であってもよい。コンピューター可読媒体はコンピューティングデバイスがアクセスできる入手可能ないかなる媒体であってもよく、これには持久性(volatile)および非持久性(non-volatile)の両方の媒体が含まれる。さらに、コンピューター可読媒体はリムーバブル媒体および非リムーバブル媒体のうちの一方または両方であってもよい。たとえば、限定ではなく、コンピューター可読媒体はコンピューター記憶媒体を含むことができる。代表的なコンピューター記憶媒体には下記のものが含まれるが、それらに限定されない：ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、フラッシュメモリーまたは他のいずれかの記憶テクノロジー、ＣＤ−ＲＯＭ、ディジタル多目的ディスク(Digital Versatile Disk)（ＤＶＤ）もしくは他の光ディスク記憶媒体、磁気カセット、磁気テープ、磁気ディスク記憶デバイスもしくは他の磁気記憶デバイス、またはコンピューティングデバイスがアクセスしてコンピューティングデバイスのプロセッサーにより実行できる複数の指示を記憶させるために使用できる他のいずれかの媒体。
【００５６】
本明細書に開示する態様によれば、ソフトウェアは、コンピューティングデバイスのプロセッサーにより実行された際に本明細書に開示する方法の１以上の段階を実施できる指示を含むことができる。ある指示は、他の機械の動作を制御する信号を発するように適合させることができ、こうしてそれらの制御信号によりコンピューター自体から遠く離れた資料を変換する操作を行なうことができる。これらの記述および表現は、データ処理技術分野の専門家が、たとえば彼らの作業の内容を最も効率的に他の当業者へ伝達するために用いる手段である。
【００５７】
複数の指示は、目的とする結果を導く自己矛盾しない一連のステップであると一般に考えられるアルゴリズムをも含むことができる。これらのステップは、理学的量の理学的操作を必要とするものである。通常は（必ずしもそうではないが）これらの量は、記憶、伝達、変換、結合、比較その他の形で操作できる電気的もしくは磁気的なパルスまたは信号の形をとる。それは時には、主に、これらの信号をそのような信号が具体化または発生する理学的事項または発現に対する基準としての数値、文字、ディスプレーデータ、番号などとして表わすための共用化という理由で、好都合になる。ただし、これらおよび類似の用語はすべて適宜な理学的量と関連づけられるものであり、ここではこれらの量に適用される好都合なラベルとして用いられるにすぎないことを留意すべきである。本明細書に開示するある態様によれば、本明細書に開示する１種類以上のマーカーの決定量と適切な基準との比較を実施するためのアルゴリズムは、指示を実行することによって具体化および実施される。その結果を、パラメトリック診断生データの出力として、または絶対量もしくは相対量として得ることができる。本明細書に開示するシステムの多様な態様によれば、“診断”は本明細書に開示するシステムのコンピューティングデバイスにより、計算“量”と基準または閾値との比較に基づいて提供できる。たとえば、あるシステムのコンピューティングデバイスは、特定の診断の指標となる言語、記号または数値の形の指標を提供できる。
【００５８】
コンピューティングデバイスは、出力デバイスにもアクセスできる。代表的な出力デバイスには、たとえばファックス機、ディスプレー、プリンター、およびファイルが含まれる。本明細書に開示するある態様によれば、コンピューティングデバイスは本明細書に開示する方法の１以上の段階を実施し、その後、本方法の結果、指示、比または他のファクターに関係する出力を出力デバイスにより提供することができる。
【００５９】
本発明はさらに、本発明の方法を実施することにより妊娠対象が短期間以内に妊娠高血圧腎症を発症するリスクをもたないかどうかを診断する補助を確立するための、下記のものを含むシステムに関する：
ａ）試料を、ｓＦｌｔ−１、エンドグリンおよびＰｌＧＦからなる群から選択される少なくとも１種類のマーカーに特異的に結合する検出剤（単数または複数）と、検出剤および試料由来の少なくとも１種類のマーカーの複合体を形成させるのに十分な時間接触させるように構成された分析ユニット、
ｂ）形成された複合体の量を測定するように構成された分析ユニット；その際、形成された複合体の量は試料中に存在する少なくとも１種類のマーカーの量に比例する、
ｃ）プロセッサーを備え、かつ操作可能な状態で上記の分析ユニット類と連絡する、コンピューティングデバイス、ならびに
ｄ）非一時性(non-transient)の機械可読媒体であって、プロセッサーにより実行可能な複数の指示、すなわち実行した際に、形成された複合体の量を、試料中に存在する少なくとも１種類のマーカーの量を反映する少なくとも１種類のマーカーの量に変換し、その量を基準と比較し、その基準との比較の結果に基づいて短期間以内に妊娠高血圧腎症を発症するリスクをもつ対象を分類するための臨床予測法則に基づくリスクアセスメントを最適化する補助を確立する指示を含む媒体。
【００６０】
本明細書に開示する好ましい態様は、妊娠高血圧腎症を発症するリスクをもつ対象を分類するための臨床予測法則に基づくリスクアセスメントを最適化するためのシステムを含む。システムの例には、化学反応もしくは生物反応の結果を検出するために、または化学反応もしくは生物反応の進行をモニターするために用いる、臨床化学分析器、凝固化学分析器、免疫化学分析器、尿分析器、核酸分析器が含まれる。より具体的には、ここに開示する代表的システムには、Ｒｏｃｈｅ  Ｅｌｅｃｓｙｓ（商標）システムおよびＣｏｂａｓ（登録商標）ｅイムノアッセイ分析器、Ａｂｂｏｔｔ  Ａｒｃｈｉｔｅｃｔ（商標）およびＡｘｓｙｍ（商標）分析器、Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｃｅｎｔａｕｒ（商標）およびＩｍｍｕｌｉｔｅ（商標）分析器、ならびにＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＵｎｉＣｅｌ（商標）およびＡｃｅｓｓ（商標）分析器などを含めることができる。
【００６１】
システムの態様は、本明細書の開示内容を実施するための１以上の分析ユニットを含むことができる。本明細書に開示するシステムの分析ユニットは、既知のように有線接続、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標）、ＬＡＮＳ、または無線信号のいずれかにより、本明細書に開示するコンピューティングデバイスと操作可能な状態で連絡している。さらに、本明細書の開示によれば、分析ユニットは独立型装置、または大型機器内のモジュールを含むことができ、これは診断目的での検出、たとえば試料の定性および／または定量評価のうち一方または両方を実施する。たとえば、分析ユニットは、試料および／または試薬のピペッティング、装入、混合を実施または支援することができる。分析ユニットは、アッセイを実施するための試薬を保持する試薬保持ユニットを含むことができる。試薬は、たとえば個々の試薬類または一群の試薬類を収容した容器またはカセットの形態で、貯蔵コンパートメントまたはコンベヤー内の適宜なレセプタクルまたは位置に置かれた状態に配置することができる。検出試薬は、試料と接触させる固体支持体に固定化された形態であってもよい。さらに、分析ユニットは、個々の分析に最適化できる処理用および／または検出用の構成要素を含むことができる。
【００６２】
ある態様によれば、分析ユニットは、試料について被検体、たとえばマーカーを光学検出するために構成できる。光学検出のために構成された代表的な分析ユニットは、電磁エネルギーを電気信号に変換するように構成されたデバイスを含み、それには単一素子および多重素子の両方またはアレイ状の光学検出器が含まれる。本明細書の開示によれば、光学検出器は、光路に配置された試料中の被検体の存在および／または濃度の指標となる光電磁信号をモニターし、そして電気的な出力信号または応答信号をベースライン信号に対比して提供することができる。そのようなデバイスには、たとえば下記のものも含めることができる：アバランシェフォトダイオード(avalanche photodiode)を含むフォトダイオード、フォトトランジスター、光伝導検出器、リニアセンサーアレイ、ＣＣＤ検出器、ＣＭＯＳアレイ検出器を含むＣＭＯＳ検出器、光電子増倍管、および光電子増倍管アレイ。特定の態様によれば、光学検出器、たとえばフォトダイオードまたは光電子増倍管は、信号の調整または処理用の追加エレクトロニクスを含むことができる。たとえば、光学検出器は少なくとも１つの前置増幅器、フィルター回路、または集積回路を含むことができる。適切な前置増幅器には、たとえば積分型、トランスインピーダンス型、および電流利得型(current gain)（カレントミラー(current mirror)）の前置増幅器が含まれる。
【００６３】
さらに、本明細書の開示による１以上の分析ユニットは、光を発するための光源を含むことができる。たとえば、分析ユニットの光源は、被検試料について被検体濃度を測定するための、またはエネルギー移動（たとえば、蛍光共鳴エネルギー移動による、または酵素の触媒作用による）を可能にするための、少なくとも１つの発光素子（たとえば、発光ダイオード、電源付き輻射線源、たとえば白熱電球、エレクトロルミネセントランプ、気体放電ランプ、高輝度放電ランプ、レーザー）からなることができる。
【００６４】
さらに、このシステムの分析ユニットは、１以上の保温ユニット（たとえば、試料または試薬を、特定した温度または温度範囲に保持するためのもの）を含むことができる。ある態様において、分析ユニットは、試料に反復温度サイクルを施してその試料について増幅生成物の量の変化をモニターするためのサーモサイクラー（リアルタイムサーモサイクラーを含む）を含むことができる。
【００６５】
さらに、本明細書に開示するシステムの分析ユニットは、反応器またはキュベットへの供給ユニットを含むことができ、あるいはそれに操作可能な状態で接続していてもよい。代表的な供給ユニットには、試料および／または試薬を反応器へ送達するための液体操作ユニット、たとえばピペッティングユニットが含まれる。ピペッティングユニットは、再利用可能な可洗ニードル、たとえばスチールニードル、または使い捨てピペットティップを含むことができる。分析ユニットは、さらに１以上の混合ユニット、たとえば液体を入れたキュベットを振とうするためのシェーカー、またはキュベットもしくは試薬容器内の液体を混合するための混合パドルを含むことができる。
【００６６】
本発明はまた、本発明の方法を実施するために適合させたキットであって、ｓＦｌｔ−１、エンドグリンおよびＰｌＧＦからなる群から選択される血管形成バイオマーカーの量を決定するための少なくとも１種類の検出剤、ならびにその方法を実施するための指示を含むキットに関する。
【００６７】
本明細書中で用いる用語“キット”は、前記構成要素の集合体であって、好ましくは個別に、または単一容器内で提供されるものを表わす。容器は本発明の方法を実施するための指示も含む。これらの指示は、マニュアルの形であってもよく、あるいはコンピューターまたはデータ処理デバイスに実装した際に本発明の方法において述べた計算および比較を実施してそれに従って診断を確立することができるコンピュータープログラムコードにより提供されてもよい。コンピュータープログラムコードは、データ記憶媒体またはデバイス、たとえば光学記憶媒体（たとえば、コンパクトディスク）上に、または直接にコンピューターまたはデータ処理デバイス上に提供することができる。さらにキットは、好ましくは、本明細書の他のいずれかの箇所に詳細に記載するバイオマーカーの標準量を検量の目的で含むことができる。
【００６８】
本発明のキットの好ましい態様において、キットは、妊娠対象の試料中のｓＦｌｔ−１および／またはエンドグリンの量を決定するための検出剤、およびＰｌＧＦの量を決定するための検出剤を含む。
【００６９】
ある態様において、本明細書に開示するキットは、開示された方法を実施するための少なくとも１つの構成要素、または構成要素類のパッケージされた組合わせを含む。“パッケージされた組合わせ”とは、そのキットが本明細書に開示する１以上の構成要素、たとえばプローブ（たとえば、抗体）、対照、緩衝液、試薬（たとえば、コンジュゲートおよび／または基質）、指示などの組合わせを収容した単一のパッケージを備えていることを意味する。単一の容器を収容したキットも“パッケージされた組合わせ”の定義に含まれる。ある態様において、キットは少なくとも１種類のプローブ、たとえば抗体（本明細書に開示するバイオマーカーのエピトープに対して特異的な親和性をもつもの）を含む。たとえば、キットは、蛍光体で標識した抗体、または融合タンパク質のメンバーである抗体を含むことができる。キットにおいて、プローブは固定化されていてもよく、特定のコンホメーションで固定化されていてもよい。たとえば、固定化されたプローブは、ターゲットタンパク質を特異的に結合するために、試料中のターゲットタンパク質を検出するために、および／またはターゲットタンパク質を試料から分離するために、キットに備えることができる。
【００７０】
ある態様によれば、キットは、固定化されていてもよい少なくとも１種類のプローブを少なくとも１つの容器内に含む。キットは、任意に固定化されていてもよい複数のプローブを１以上の容器内に含むこともできる。たとえば、複数のプローブは、たとえば単一の容器内または別個の容器内（その際、各容器は単一のプローブを収容している）に存在してもよい。
【００７１】
ある態様において、キットは１種類以上の固定化されていないプローブおよび１以上の固体支持体（固定化されたプローブを含むもの、または含まないもの）を含むことができる。そのようなある態様は、１種類以上のプローブを固体支持体に固定化するのに必要な試薬および補充用品の一部または全部、あるいは固定化されたプローブを試料中の特定のタンパク質に結合させるのに必要な試薬および補充用品の一部または全部を含むことができる。
【００７２】
特定の態様において、単一プローブ（同一プローブの複数コピーを含む）を単一の固体支持体に固定化し、単一容器に入れて提供することができる。他の態様において、２種類以上のプローブであって、それぞれが異なるターゲットタンパク質または異なる形態の単一のターゲットタンパク質（たとえば、特異的エピトープ）に対して特異的なプローブを、単一容器に入れて提供する。そのようなある態様において、固定化されたあるプローブを複数の異なる容器内に入れて提供することができ（たとえば、１回用形態）、あるいは複数種類の固定化されたプローブを複数の異なる容器に入れて提供することができる。さらなる態様において、プローブ類を複数の異なるタイプの固体支持体に固定化することができる。固定化されたプローブ（単数または複数）と容器（単数または複数）のいずれかの組合わせが本明細書に開示するキットについて考慮され、そのいずれかの組合わせは目的とする用途に適したキットを達成するように選択できる。
【００７３】
キットの容器は、たとえばプローブ（たとえば、抗体）、対照、緩衝液、試薬（たとえば、コンジュゲートおよび／または基質）を含めた本明細書に開示する１以上の構成要素をパッケージおよび／または収容するのに適したいかなる容器であってもよい。適切な材料にはガラス、プラスチック、厚紙その他の紙製品、木材、金属、およびそのいずれかのアロイが含まれるが、これらに限定されない。ある態様において、容器は固定化されたプローブ（単数または複数）を完全に包み込んでもよく、あるいは粉塵、油などによる汚染、および露光を最小限に抑えるためにプローブを覆うだけでもよい。あるさらなる態様において、キットは単一の容器または複数の容器を含むことができ、複数の容器が存在する場合、各容器は他のすべての容器と同一であってもよく、他の容器と異なってもよく、あるいは他のすべての容器ではなく一部の容器と異なってもよい。
【００７４】
本発明のある観点において、短かい時間ウインドウ以内の妊娠高血圧腎症を除外するための補助を確立する方法が考慮され、その方法は下記を含む：
ａ）妊娠対象の試料中の本明細書に述べる少なくとも１種類の血管形成バイオマーカーの量を決定し、その決定は下記を含む：（ｉ）試料を、少なくとも１種類の血管形成バイオマーカーに特異的に結合する検出剤と、検出剤および試料由来のバイオマーカーの複合体を形成させるのに十分な時間接触させる、（ｉｉ）形成された複合体の量を測定し、その際、形成された複合体の量は試料中に存在する少なくとも１種類のマーカーの量に比例する、ならびに（ｉｉｉ）形成された複合体の量を、試料中に存在する少なくとも１種類のバイオマーカーの量を反映する少なくとも１種類のバイオマーカーの量に変換する；
ｂ）その量を基準と比較する；そして
ｃ）段階ｂ）で行なった比較の結果に基づいて、短かい時間ウインドウ以内の妊娠高血圧腎症を除外するための補助を確立する。
【００７５】
適切な検出剤は、ある観点において、本発明の方法により調査する対象の試料中の少なくとも１種類の血管形成バイオマーカーに特異的に結合する抗体であってもよい。適用できる他の検出剤は、ある観点において、試料中の少なくとも１種類の血管形成バイオマーカーに特異的に結合するアプタマーであってもよい。さらにある観点において、検出剤と少なくとも１種類の血管形成バイオマーカーの間に形成された複合体から、形成された複合体の量を測定する前に、試料を分離する。したがって、ある観点において、検出剤を固体支持体に固定化することができる。さらにある観点において、洗浄溶液を適用することにより、固体支持体上に形成された複合体から試料を分離することができる。形成された複合体は、試料中に存在する少なくとも１種類の血管形成バイオマーカーの量に比例するはずである。適用する検出剤の特異度および／または感度が試料中に含まれる特異的に結合できる少なくとも１種類の血管形成バイオマーカーの比例度を規定することは理解されるであろう。決定をどのようにして実施できるかについてのさらなる詳細も、本明細書中の他のいずれかの箇所にある。形成された複合体の量を、試料中に実際に存在する量を反映する少なくとも１種類の血管形成バイオマーカーの量に変換すべきである。そのような量は、ある観点において、本質的にその試料中に存在する量であってもよく、あるいは他の観点において、形成された複合体と元の試料中に存在する量とは関係があるため、その一定割合の量であってもよい。
【００７６】
前記方法のさらにある観点において、段階ａ）は分析ユニット、ある観点において本明細書の他のいずれかの箇所に定める分析ユニットにより実施できる。他の観点において、段階ａ）〜ｃ）のいずれかまたは全部を本明細書の他のいずれかの箇所に定める分析ユニットにより実施できる。
【００７７】
本発明方法のある観点において、段階ａ）で測定した量を基準と比較する。ある観点において、基準は本明細書の他のいずれかの箇所に定める基準である。さらにある観点において、基準は複合体の測定量と元の試料中に存在する量の比例関係を考慮に入れる。したがって、本発明方法のある観点において適用される基準は、用いた検出剤の限界を反映するように適合させた人為的基準である。他の観点において、決定量の値と基準を実際に比較する前に、たとえば決定量について正規化および／または補正の計算段階を採用することにより比較を行なう際にも、その関係を考慮に入れることができる。この場合も、決定量についての正規化および／または補正の計算段階は、用いた検出剤の限界が適正に反映されるように比較段階を適合させる。ある観点において、比較は自動的に、たとえばコンピューターシステムなどにより支援して実施される。
【００７８】
診断のための補助は、段階ｂ）で実施する比較に基づいて、対象を短い時間ウインドウ以内に妊娠高血圧腎症を発症するリスクをもたない対象グループに確定的に割り当てることにより、あるいは対象をそのグループから不確定的に排除することにより確立される。既に本明細書の他のいずれかの箇所で考察したように、調査対象の割り当ては調査症例の１００％において正確でなければならないわけではない。調査対象が割り当てられる対象グループは、それらが統計学的考慮、すなわち本発明をそれに基づいて操作すべき特定の前選択した尤度に基づいて確立されるという点で、人為的グループである。こうして本方法は診断の補助を確立することができ、これはある観点において、他の手法によって診断をさらに強化することが要求される可能性がある。本発明のある観点において、本明細書に記載および開示するように、診断のための補助は自動的に、たとえばコンピューティングデバイスなどにより支援して確立される。
【００７９】
本発明方法のある観点において、その方法はさらに、段階ｃ）で確立された診断補助の結果に従って、本明細書の他のいずれかの箇所に述べるように対象を処置／処方／推奨または管理する段階を含む。
【００８０】
前記方法のある観点において、段階ｂ）および／またはｃ）は本明細書の他のいずれかの箇所に述べる１以上の評価ユニットにより実施される。
本明細書に引用するすべての参考文献を、それらの開示内容全体および本明細書中で具体的に言及した開示内容に関して本明細書に援用する。
【実施例】
【００８１】
以下の実施例は本発明を説明するものにすぎない。それらが本発明の範囲を限定すると決して解釈すべきではない。
実施例１：ｓＦｌｔ−１、エンドグリンおよびＰｌＧＦの血中レベルの決定
市販のイムノアッセイを用いてｓＦｌｔ−１、ＰｌＧＦおよびエンドグリンの血中レベルを決定した。特に下記のアッセイを用いた。
【００８２】
ｓＦｌｔ−１は、Ｒｏｃｈｅからの分析計Ｅｌｅｃｓｙｓ（商標）−またはｃｏｂａｓ  ｅ（商標）−シリーズを用いるサンドイッチイムノアッセイで決定された。このアッセイは、各ポリペプチドに対して特異的な２種類のモノクローナル抗体を含む。これらの抗体のうち第１はビオチニル化されており、第２のものはトリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム（ＩＩ）錯体で標識されている。最初のインキュベーション段階で両抗体を試料と共にインキュベートする。決定すべきペプチドおよび２種類の異なる抗体を含むサンドイッチ複合体が形成される。次のインキュベーション段階において、ストレプトアビジンでコートしたビーズをこの複合体に添加する。ビーズはこのサンドイッチ複合体に結合する。この反応混合物を次いで測定セル内へ吸引し、そこでビーズは電極の表面に磁気捕獲される。次いで電圧を印加するとルテニウム錯体からの化学発光が誘導され、これを光電子増倍管により測定する。発光量は電極上のサンドイッチ複合体の量に依存する。このｓＦｌｔ−１試験は、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ（ドイツ、マンハイム）から市販されている。このアッセイについてのさらなる詳細はパッケージ挿入物中にある。ｓＦｌｔ１の測定範囲には、１０〜８５，０００ｐｇ／ｍｌの量が含まれる。
【００８３】
エンドグリンは、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ（米国ミネアポリス）から市販されているＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ（商標）ヒト−エンドグリン／ＣＤ１０５イムノアッセイを用いて測定された。このアッセイは定量サンドイッチ酵素イムノアッセイ法を用いる。エンドグリンに対して特異的なモノクローナル抗体がマイクロプレート上にプレコートされていた。標準品および試料をピペットでウェルに入れると、存在するエンドグリンはいずれも固定化抗体により結合される。結合しなかった物質をいずれも洗浄除去した後、エンドグリンに対して特異的な酵素結合−モノクローナル抗体をウェルに添加する。結合しなかった抗体−酵素試薬をいずれも洗浄除去した後、基質溶液をウェルに添加すると、最初の段階で結合したエンドグリンに比例して発色する。発色を停止し、色の強度を測定する。このアッセイについてのさらなる詳細はパッケージ挿入物中にある。エンドグリンの測定範囲には、０．００１ｎｇ／Ｌ〜１０ｎｇ／ｍｌの量が含まれる。
【００８４】
ＰｌＧＦは、２種類のＰｌＧＦ特異的抗体を用いて、Ｅｌｅｃｓｙｓ（商標）−またはｃｏｂａｓ  ｅ（商標）−シリーズの分析器で実施するサンドイッチイムノアッセイで試験された（詳細については前記を参照）。このＰｌＧＦ試験は、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ（ドイツ、マンハイム）から市販されている。このアッセイについてのさらなる詳細はパッケージ挿入物中にある。ＰｌＧＦの測定範囲には、３〜１０，０００ｐｇ／ｍｌの量が含まれる。
【００８５】
実施例２：１週間以内の転帰としての妊娠高血圧腎症の分析
ＲＯＣ曲線を作成するために用いた表中で、目標ＮＰＶについてのカットオフ値を選択し、このカットオフにおける感度、特異度およびＰＰＶを推定することができる。これらすべての割合について、現サンプルサイズに基づく信頼区間が得られる。
【００８６】
妊娠後２４±０週目〜４０±０週目の患者について、初回来院時に得た試料において決定したｓＦｌｔ−１／ＰｌＧＦ比のカットオフ４５は、妊娠高血圧腎症を予測するためのＮＰＶ  １００％（下側９５％信頼限界(lower 95% confidence limit)９６．５８％）を与えた；感度推定率１００％（ＬＣＬ９５  ６６．３７％）および特異度推定率８０．９２％（ＬＣＬ９５  ７３．１３％）。ＰＰＶ推定率は２６．４７％（ＬＣＬ９５  １２．８８％）である。３４対１０６の対象がこのカットオフで検査陽性／陰性であり、３４中９はＰＥを発症すると予想されるが、１０６中にはなかった。
【００８７】
妊娠後２４±０週目〜４０±０週目の患者について、複数回来院時に得た試料において決定したｓＦｌｔ−１／ＰｌＧＦ比のカットオフ４５は、ｎｐｖ  ９９．４％（下側９５％信頼限界９７．９６％）を与えた；感度推定率８６．７％（ＬＣＬ９５  ６３．６６％）および特異度推定率８０．６０％（ＬＣＬ９５  ７６．５６％）。ＰＰＶ推定率は１３．４０％（ＬＣＬ９５  ７．３３％）である。９７対３５１の来院において対象はこのカットオフで陽性／陰性と検査され、９４中１３の来院はＰＥに先立っていたが、３５１中では２であった。
【００８８】
結果を次表にまとめる。
表１：ＡＵＣ、ＬＣＬ９５およびＵＣＬ９５値
【００８９】
【表１】
0005937756.tif 000002
【００９０】
PE within 1 week：1週間以内にPE
PE within 2 weeks：2週間以内にPE
PE within 4 weeks：4週間以内にPE
all visits：すべての来院
ratio_sFlt_1_PlGF：sFlt-1/PlGF比
ratio_endogl_PlGF：エンドグリン/PlGF比
tst_res_sFlt_1_pg_ml：検査結果sFlt-1 pg/ml
tst_res_PlGF_pg_ml：検査結果PlGF pg/ml
endogl_ng_ml：エンドグリン ng/ml
実施例３：妊婦における短かい時間ウインドウ以内のＰＥ／ＨＥＬＬＰの予測に関するバイオマーカー比、ｓＦｌｔ−１／ＰｌＧＦ比およびエンドグリン／ＰｌＧＦ比と、ドップラー超音波診断結果との診断性能の比較
患者が来院後１週間／４週間以内にＰＥ／ＨＥＬＬＰ症候群を発症するかどうかの分類子としてのｍＰＩ−ＵｔＡ、ｓＦｌｔ−１／ＰｌＧＦ比およびエンドグリン／ＰｌＧＦ比の比較（カットオフ値を使用）。この場合の集団は、ドップラー超音波診断結果を入手できる妊婦である。
【００９１】
表２：分類子としてのｍＰＩ−ＵｔＡ、ｓＦｌｔ−１／ＰｌＧＦ比およびエンドグリン／ＰｌＧＦ比の比較
【００９２】
【表２】
0005937756.tif 000003
【００９３】
両比とも両方の予測タスクに関してドップラー超音波診断結果より優れていると思われる。ｓＦｌｔ−１／ＰｌＧＦ比はエンドグリン／ＰｌＧＦ比より良好な性能をもつと思われる（選択したカットオフで）。
【００９４】
患者が来院後１週間／４週間以内にＰＥ／ＨＥＬＬＰ症候群を発症するかどうかの分類子としてのｓＦｌｔ−１／ＰｌＧＦ比およびエンドグリン／ＰｌＧＦ比（カットオフ値を使用）。この場合の集団はすべて、異常なドップラー超音波診断結果を伴なう妊婦である。
【００９５】
表３：分類子としてのｓＦｌｔ−１／ＰｌＧＦ比およびエンドグリン／ＰｌＧＦ比の比較
【００９６】
【表３】
0005937756.tif 000004
【００９７】
ｓＦｌｔ−１／ＰｌＧＦ比は、特に４週目の予測タスクにおいてエンドグリン／ＰｌＧＦ比より優れていると思われる。
表４：図４Ａに示した数値に関するＲＯＣ関連統計
【００９８】
【表４】
0005937756.tif 000005
【００９９】
ratio_sFlt_1_PlGF：sFlt-1/PlGF比
ratio_endogl_PlGF：エンドグリン/PlGF比
tst_res_sFlt_1_pg_ml：検査結果sFlt-1 pg/ml
tst_res_PlGF_pg_ml：検査結果PlGF pg/ml
endogl_ng_ml：エンドグリン ng/ml
表５：図５Ａに示した数値に関するＲＯＣ関連統計
【０１００】
【表５】
0005937756.tif 000006
【０１０１】
ratio_sFlt_1_PlGF：sFlt-1/PlGF比
ratio_endogl_PlGF：エンドグリン/PlGF比
tst_res_sFlt_1_pg_ml：検査結果sFlt-1 pg/ml
tst_res_PlGF_pg_ml：検査結果PlGF pg/ml
endogl_ng_ml：エンドグリン ng/ml
実施例４：１週間以内の転帰としての妊娠高血圧腎症の分析，大規模コホート（ｎ＝２６９）
ＲＯＣ曲線を作成するために用いた表中で、目標ＮＰＶについてのカットオフ値を選択し、このカットオフにおける感度、特異度およびＰＰＶを推定することができる。これらすべての割合について、現サンプルサイズに基づく信頼区間が得られる。
【０１０２】
妊娠後２４±０週目〜４０±０週目の患者について、初回来院時に得た試料において決定したｓＦｌｔ−１／ＰｌＧＦ比のカットオフ３８は、妊娠高血圧腎症を予測するためのＮＰＶ  ９８．９％（両側９５％信頼区間(two-sided 95% confidence interval)(ＬＣＬ９５)９７．３％）を与えた；感度推定率８８．２％（ＬＣＬ９５：７２．６％）および特異度推定率７９．８％（ＬＣＬ９５：７５．９％）。ＰＰＶ推定率は２４．４％（ＬＣＬ９５：１７．１％）である。１２３対３７２の対象がこのカットオフで検査陽性／陰性であり、１２３の検査陽性中３０、および３７２の検査陰性中４がＰＥを発症すると予想される。これらの結果を同様に次表にまとめる。
【０１０３】
表５：ＡＵＣ、ＬＣＬ９５およびＵＣＬ９５値，大規模コホート
【０１０４】
【表６】
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【０１０５】
PE within 1 week after visit 1：来院1の後、1週間以内にPE
PE within 2 weeks after visit 1：来院1の後、2週間以内にPE
PE within 4 weeks after visit 1：来院1の後、4週間以内にPE
Endoglin：エンドグリン
ratio_sFlt_1_PlGF：sFlt-1/PlGF比
ratio_Endogl_PlGF：エンドグリン/PlGF比
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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