(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｈｅｒ２＋サブタイプおよびＨｅｒ−２−Ｅサブタイプの存在を、乳癌の処置を必要とする被験体におけるアントラサイクリンを含む乳癌処置の指標として使用するための方法であって、
（ａ）前記被験体由来の生物学的サンプルをアッセイして、前記生物学的サンプルがＨｅｒ２＋サブタイプとして分類されるか否かを検出するステップと、
（ｂ）前記生物学的サンプルをアッセイして、前記生物学的サンプルがＨｅｒ−２−Ｅサブタイプとして分類されるか否かを検出するステップと、を含み、
前記生物学的サンプルが、Ｈｅｒ２＋サブタイプおよびＨｅｒ−２−Ｅサブタイプの両方として分類される場合は、アントラサイクリンを含む乳癌処置が前記被験体に施され、前記生物学的サンプルが、Ｈｅｒ２＋サブタイプおよびＨｅｒ−２−Ｅサブタイプの両方ではない場合は、アントラサイクリンを含まない乳癌処置が前記被験体に施され、これにより前記被験体の乳癌が処置される、方法。
【請求項２】
前記生物学的サンプルをアッセイして、前記生物学的サンプルがＨｅｒ２＋サブタイプとして分類されるか否かを検出する前記ステップが、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）または免疫組織化学（ＩＨＣ）を用いて行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生物学的サンプルをアッセイして、前記生物学的サンプルがＨｅｒ−２−Ｅサブタイプとして分類されるか否かを検出する前記ステップが、表１に列記されている固有遺伝子を検出することによって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記アントラサイクリンが、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、バルルビシン、およびミトキサントロンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記アントラサイクリンがエピルビシンである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
アントラサイクリンを含む前記乳癌処置が、シクロホスファミド、フルオロウラシル（または５−フルオロウラシルまたは５−ＦＵ）、メトトレキセート、チオテパ、カルボプラチン、シスプラチン、タキサン、パクリタキセル、タンパク結合パクリタキセル、ドセタキセル、ビノレルビン、タモキシフェン、ラロキシフェン、トレミフェン、フルベストラント、ゲムシタビン、イリノテカン、イキサベピロン、テモゾロミド、トポテカン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エリブリン、ムタマイシン、カペシタビン、カペシタビン、アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、ロイプロリド、アバレリクス、ブセレリン、ゴセレリン、酢酸メゲストロール、リセドロネート、パミドロネート、イバンドロネート、アレンドロネート、デノスマブ、ゾレドロネート、トラスツズマブ、タイケルブ、またはベバシズマブ、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の抗癌剤をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
アントラサイクリンを含む前記乳癌処置が、シクロホスファミドおよび５−フルオロウラシルからなる群から選択される１つ以上の抗癌剤をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
アントラサイクリンを含まない前記乳癌処置が、シクロホスファミド、フルオロウラシル（または５−フルオロウラシルまたは５−ＦＵ）、メトトレキセート、チオテパ、カルボプラチン、シスプラチン、タキサン、パクリタキセル、タンパク結合パクリタキセル、ドセタキセル、ビノレルビン、タモキシフェン、ラロキシフェン、トレミフェン、フルベストラント、ゲムシタビン、イリノテカン、イキサベピロン、テモゾロミド、トポテカン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エリブリン、ムタマイシン、カペシタビン、カペシタビン、アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、ロイプロリド、アバレリクス、ブセレリン、ゴセレリン、酢酸メゲストロール、リセドロネート、パミドロネート、イバンドロネート、アレンドロネート、デノスマブ、ゾレドロネート、トラスツズマブ、タイケルブ、またはベバシズマブ、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の抗癌剤をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
アントラサイクリンを含まない前記乳癌処置が、シクロホスファミド、５−フルオロウラシル、およびメトトレキセートからなる群の１つ以上の抗癌剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記生物学的サンプルが、細胞、組織、および体液からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記組織が生検から得られる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記体液が、血液、リンパ液、尿、唾液、および乳頭吸引液からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
Ｈｅｒ２＋サブタイプおよびＨｅｒ−２−Ｅサブタイプの存在を、乳癌の処置を必要とする被験体において、アントラサイクリンを含む乳癌処置が有効である可能性の指標として使用するための方法であって、
（ａ）前記被験体由来の生物学的サンプルをアッセイして、前記生物学的サンプルがＨｅｒ２＋サブタイプとして分類されるか否かを検出するステップと、
（ｂ）前記生物学的サンプルをアッセイして、前記生物学的サンプルがＨｅｒ−２−Ｅサブタイプとして分類されるか否かを検出するステップと、を含み、
前記生物学的サンプルが、Ｈｅｒ２＋サブタイプおよびＨｅｒ−２−Ｅサブタイプの両方として分類される場合は、アントラサイクリンを含む前記乳癌処置が、前記被験体に有効である可能性が高い、方法。
【請求項１４】
前記生物学的サンプルをアッセイして、前記生物学的サンプルがＨｅｒ２＋サブタイプとして分類されるか否かを検出する前記ステップが、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）または免疫組織化学（ＩＨＣ）を用いて行われる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記生物学的サンプルをアッセイして、前記生物学的サンプルがＨｅｒ−２−Ｅサブタイプとして分類されるか否かを検出する前記ステップが、表１に列記されている固有遺伝子を検出することによって行われる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記アントラサイクリンが、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、バルルビシン、およびミトキサントロンからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記アントラサイクリンがエピルビシンである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
アントラサイクリンを含む前記乳癌処置が、シクロホスファミド、フルオロウラシル（または５−フルオロウラシルまたは５−ＦＵ）、メトトレキセート、チオテパ、カルボプラチン、シスプラチン、タキサン、パクリタキセル、タンパク結合パクリタキセル、ドセタキセル、ビノレルビン、タモキシフェン、ラロキシフェン、トレミフェン、フルベストラント、ゲムシタビン、イリノテカン、イキサベピロン、テモゾロミド、トポテカン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エリブリン、ムタマイシン、カペシタビン、カペシタビン、アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、ロイプロリド、アバレリクス、ブセレリン、ゴセレリン、酢酸メゲストロール、リセドロネート、パミドロネート、イバンドロネート、アレンドロネート、デノスマブ、ゾレドロネート、トラスツズマブ、タイケルブ、またはベバシズマブ、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の抗癌剤をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
アントラサイクリンを含む前記乳癌処置が、シクロホスファミドおよび５−フルオロウラシルからなる群の１つ以上の抗癌剤をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記生物学的サンプルが、細胞、組織、および体液からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
前記組織が生検から得られる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記体液が、血液、リンパ液、尿、唾液、および乳頭吸引液からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
表１に列記されている固有遺伝子の検出に十分な試薬およびＨｅｒ２の発現量の検出に十分な試薬を含む、アントラサイクリンを含む乳癌処置が有効である可能性についてスクリーニングするためのキット。
【請求項２４】
表１に列記されている固有遺伝子の検出に十分な前記試薬がマイクロアレイを含む、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
Ｈｅｒ２の発現量の検出に十分な前記試薬がＨｅｒ２抗体を含む、請求項２３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
この出願は、２０１１年３月１５日に出願された米国仮出願第６１／４５３，０３５号（この内容は、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本開示は、一般的には癌生物学の分野に関し、詳細には、特定の癌細胞表現型の検出および同定、ならびに適切な療法との相関の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
アントラサイクリン療法は、多くの種類の腫瘍に対して効果的であることが証明されている。しかしながら、心毒性、二次性白血病、および嘔吐を含むアントラサイクリン療法に関連した副作用は深刻である。副作用がそれほど深刻ではない代替療法も知られている。したがって、アントラサイクリンをベースとする療法に対して最適に応答する癌の種類、およびアントラサイクリンに基づかない療法で治療する方が良い癌の種類を決定する必要性が当分野に存在する。本発明はこれらの必要性に対応する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、乳癌処置を必要とする被験体において乳癌を処置する方法を提供する。この方法は、被験体由来の生物学的サンプルを提供するステップ；この生物学的サンプルをアッセイして、この生物学的サンプルがＨｅｒ２＋サブタイプとして分類されるか否かを決定するステップ；この生物学的サンプルをアッセイして、この生物学的サンプルがＨｅｒ−２−Ｅサブタイプとして分類されるか否かを決定するステップ；および被験体に乳癌治療を施すステップを含む。生物学的サンプルが、Ｈｅｒ２＋サブタイプおよびＨｅｒ−２−Ｅサブタイプの両方として分類される場合は、アントラサイクリンを含む乳癌処置が被験体に施される。生物学的サンプルが、Ｈｅｒ２＋サブタイプおよびＨｅｒ−２−Ｅサブタイプの両方ではない場合は、アントラサイクリンを含まない乳癌処置が被験体に施される。
【０００５】
生物学的サンプルがＨｅｒ２＋サブタイプとして分類されるか否かを決定する生物学的サンプルのアッセイは、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）または免疫組織化学（ＩＨＣ）を用いて行われる。生物学的サンプルがＨｅｒ−２−Ｅサブタイプとして分類されるか否かを決定する生物学的サンプルのアッセイは、表１に列記されている固有遺伝子の少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、または５０すべてを検出することによって行われる。好ましくは、検出は、表１に列記されている固有遺伝子の５０すべての検出である。表１の固有遺伝子リストのメンバーの発現を、ナノレポーターコードシステム（ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）分析システム）を用いて決定することができる。
【０００６】
アントラサイクリンは、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、バルルビシン、およびミトキサントロンからなる群から選択される。好ましくは、アントラサイクリンはエピルビシンである。
【０００７】
アントラサイクリンを含む乳癌処置はまた、シクロホスファミド、フルオロウラシル（または５−フルオロウラシルまたは５−ＦＵ）、メトトレキセート、チオテパ、カルボプラチン、シスプラチン、タキサン、パクリタキセル、タンパク結合パクリタキセル、ドセタキセル、ビノレルビン、タモキシフェン、ラロキシフェン、トレミフェン、フルベストラント、ゲムシタビン、イリノテカン、イキサベピロン、テモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌｍｉｄｅ）、トポテカン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エリブリン、ムタマイシン、カペシタビン、カペシタビン、アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、ロイプロリド、アバレリクス、ブセレリン（ｂｕｓｅｒｌｉｎ）、ゴセレリン、酢酸メゲストロール、リセドロネート（ｒｉｓｅｄｒｏｎａｔｅ）、パミドロネート（ｐａｍｉｄｒｏｎａｔｅ）、イバンドロネート（ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ）、アレンドロネート（ａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ）、デノスマブ（ｄｅｎｏｓｕｍａｂ）、ゾレドロネート（ｚｏｌｅｄｒｏｎａｔｅ）、トラスツズマブ、タイケルブ（ｔｙｋｅｒｂ）、またはベバシズマブ、またはこれらの組み合わせも含み得る。好ましくは、アントラサイクリンを含む処置は、シクロホスファミドおよび／または５−フルオロウラシルからなる群の１つ以上の抗癌剤も含む。アントラサイクリンを含まない乳癌処置は、シクロホスファミド、フルオロウラシル（または５−フルオロウラシルまたは５−ＦＵ）、メトトレキセート、チオテパ、カルボプラチン、シスプラチン、タキサン、パクリタキセル、タンパク結合パクリタキセル、ドセタキセル、ビノレルビン、タモキシフェン、ラロキシフェン、トレミフェン、フルベストラント、ゲムシタビン、イリノテカン、イキサベピロン、テモゾロマイド、トポテカン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エリブリン、ムタマイシン、カペシタビン、カペシタビン、アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、ロイプロリド、アバレリクス、ブセレリン、ゴセレリン、酢酸メゲストロール、リセドロネート、パミドロネート、イバンドロネート、アレンドロネート、デノスマブ、ゾレドロネート、トラスツズマブ、タイケルブ、またはベバシズマブ、またはこれらの組み合わせも含む。好ましくは、アントラサイクリンを含まない処置は、シクロホスファミド、５−フルオロウラシル、及びメトトレキセートからなる群の１つ以上の抗癌剤を含む。
【０００８】
生物学的サンプルは、細胞、組織、または体液とすることができる。組織は、生検または塗沫標本から得ることができる。サンプルは、体液の抽出見本とすることもできる。これらの体液は、血液、リンパ液、尿、唾液、乳頭吸引液、および婦人科液体（ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｌｕｉｄ）を含み得る。
【０００９】
本発明はまた、乳癌処置を必要とする被験体において、アントラサイクリンを含む乳癌処置が有効である可能性についてスクリーニングする方法も提供する。この方法は、被験体由来の生物学的サンプルを提供するステップ；この生物学的サンプルをアッセイして、この生物学的サンプルがＨｅｒ２＋サブタイプとして分類されるか否かを決定するステップ；およびこの生物学的サンプルをアッセイして、この生物学的サンプルがＨｅｒ−２−Ｅサブタイプとして分類されるか否かを決定するステップを含む。生物学的サンプルが、Ｈｅｒ２＋サブタイプおよびＨｅｒ−２−Ｅサブタイプの両方として分類される場合は、アントラサイクリンを含む乳癌処置が、この被験体に有効である可能性が高い。
【００１０】
生物学的サンプルがＨｅｒ２＋サブタイプとして分類されるか否かを決定する生物学的サンプルのアッセイは、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）または免疫組織化学（ＩＨＣ）を用いて行われる。生物学的サンプルがＨｅｒ−２−Ｅサブタイプとして分類されるか否かを決定する生物学的サンプルのアッセイは、表１に列記されている固有遺伝子の少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、または５０すべてを検出することによって行われる。好ましくは、検出は、表１に列記されている固有遺伝子の５０すべての検出である。表１の固有遺伝子リストのメンバーの発現を、ナノレポーターコードシステム（ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）分析システム）を用いて決定することができる。
【００１１】
アントラサイクリンは、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、バルルビシン、およびミトキサントロンからなる群から選択される。好ましくは、アントラサイクリンはエピルビシンである。
【００１２】
アントラサイクリンを含む乳癌処置はまた、シクロホスファミド、フルオロウラシル（または５−フルオロウラシルまたは５−ＦＵ）、メトトレキセート、チオテパ、カルボプラチン、シスプラチン、タキサン、パクリタキセル、タンパク結合パクリタキセル、ドセタキセル、ビノレルビン、タモキシフェン、ラロキシフェン、トレミフェン、フルベストラント、ゲムシタビン、イリノテカン、イキサベピロン、テモゾロミド、トポテカン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エリブリン、ムタマイシン、カペシタビン、カペシタビン、アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、ロイプロリド、アバレリクス、ブセレリン、ゴセレリン、酢酸メゲストロール、リセドロネート、パミドロネート、イバンドロネート、アレンドロネート、デノスマブ、ゾレドロネート、トラスツズマブ、タイケルブ、またはベバシズマブ、またはこれらの組み合わせも含み得る。好ましくは、アントラサイクリンを含む処置は、シクロホスファミドおよび／または５−フルオロウラシルからなる群の１つ以上の抗癌剤も含む。
【００１３】
生物学的サンプルは、細胞、組織、または体液とすることができる。組織は、腫瘍生検または外科標本から得ることができる。サンプルは、体液の抽出見本とすることもできる。これらの体液は、血液、リンパ液、尿、唾液、および乳頭吸引液を含み得る。
【００１４】
本発明はまた、固有遺伝子の少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、または５０すべての検出に十分な試薬およびＨｅｒ２の発現量の検出に十分な試薬を含む乳癌処置が有効である可能性についてスクリーニングするキットも提供する。好ましくは、このキットは、表１に列記されている固有遺伝子の５０すべての検出に十分な試薬を含む。表１に列記されている固有遺伝子の少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、または５０すべての検出に十分な試薬は、マイクロアレイを含み得る。Ｈｅｒ２の発現量の検出に十分な試薬は、Ｈｅｒ２抗体とすることができる。
【００１５】
別段の記載がなければ、本明細書で使用されるすべての科学技術用語は、本発明が属する分野の一般的な技術者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書では、単数形は、明確な別段の記載がなければ、複数形も含む。本明細書で説明される方法および材料と同様または等価の方法および材料は、本発明の実施または検査に使用することができるが、適切な方法および材料を以下に説明する。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照により本明細書に組み入れられるものとする。本明細書で引用される参考文献は、請求される発明の先行技術として認められるものではない。対立する場合は、定義を含む本明細書が優先する。加えて、材料、方法、および例は、単なる例示であり、限定を意図するものではない。本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲より明らかになるであろう。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
乳癌の処置を必要とする被験体の乳癌を処置する方法であって、
（ａ）上記被験体由来の生物学的サンプルを提供するステップと、
（ｂ）上記生物学的サンプルをアッセイして、上記生物学的サンプルがＨｅｒ２＋サブタイプとして分類されるか否かを決定するステップと、
（ｃ）上記生物学的サンプルをアッセイして、上記生物学的サンプルがＨｅｒ−２−Ｅサブタイプとして分類されるか否かを決定するステップと、
（ｄ）上記被験体に乳癌処置を施すステップと、を含み、
上記生物学的サンプルが、Ｈｅｒ２＋サブタイプおよびＨｅｒ−２−Ｅサブタイプの両方として分類される場合は、アントラサイクリンを含む乳癌処置を上記被験体に施し、上記生物学的サンプルが、Ｈｅｒ２＋サブタイプおよびＨｅｒ−２−Ｅサブタイプの両方ではない場合は、アントラサイクリンを含まない乳癌処置を上記被験体に施し、これにより上記被験体の乳癌を処置する、方法。
（項目２）
上記生物学的サンプルをアッセイして、上記生物学的サンプルがＨｅｒ２＋サブタイプとして分類されるか否かを決定する上記ステップが、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）または免疫組織化学（ＩＨＣ）を用いて行われる、項目１に記載の方法。
（項目３）
上記生物学的サンプルをアッセイして、上記生物学的サンプルがＨｅｒ−２−Ｅサブタイプとして分類されるか否かを決定する上記ステップが、表１に列記されている固有遺伝子を検出することによって行われる、項目１に記載の方法。
（項目４）
上記アントラサイクリンが、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、バルルビシン、およびミトキサントロンからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目５）
上記アントラサイクリンがエピルビシンである、項目４に記載の方法。
（項目６）
アントラサイクリンを含む上記乳癌処置が、シクロホスファミド、フルオロウラシル（または５−フルオロウラシルまたは５−ＦＵ）、メトトレキセート、チオテパ、カルボプラチン、シスプラチン、タキサン、パクリタキセル、タンパク結合パクリタキセル、ドセタキセル、ビノレルビン、タモキシフェン、ラロキシフェン、トレミフェン、フルベストラント、ゲムシタビン、イリノテカン、イキサベピロン、テモゾロミド、トポテカン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エリブリン、ムタマイシン、カペシタビン、カペシタビン、アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、ロイプロリド、アバレリクス、ブセレリン、ゴセレリン、酢酸メゲストロール、リセドロネート、パミドロネート、イバンドロネート、アレンドロネート、デノスマブ、ゾレドロネート、トラスツズマブ、タイケルブ、またはベバシズマブ、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の抗癌剤をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目７）
アントラサイクリンを含む上記乳癌処置が、シクロホスファミドおよび５−フルオロウラシルからなる群から選択される１つ以上の抗癌剤をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目８）
アントラサイクリンを含まない上記乳癌処置が、シクロホスファミド、フルオロウラシル（または５−フルオロウラシルまたは５−ＦＵ）、メトトレキセート、チオテパ、カルボプラチン、シスプラチン、タキサン、パクリタキセル、タンパク結合パクリタキセル、ドセタキセル、ビノレルビン、タモキシフェン、ラロキシフェン、トレミフェン、フルベストラント、ゲムシタビン、イリノテカン、イキサベピロン、テモゾロミド、トポテカン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エリブリン、ムタマイシン、カペシタビン、カペシタビン、アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、ロイプロリド、アバレリクス、ブセレリン、ゴセレリン、酢酸メゲストロール、リセドロネート、パミドロネート、イバンドロネート、アレンドロネート、デノスマブ、ゾレドロネート、トラスツズマブ、タイケルブ、またはベバシズマブ、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の抗癌剤をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目９）
アントラサイクリンを含まない上記乳癌処置が、シクロホスファミド、５−フルオロウラシル、およびメトトレキセートからなる群の１つ以上の抗癌剤を含む、項目１に記載の方法。
（項目１０）
上記生物学的サンプルが、細胞、組織、および体液からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目１１）
上記組織が生検から得られる、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
上記体液が、血液、リンパ液、尿、唾液、および乳頭吸引液からなる群から選択される、項目１０に記載の方法。
（項目１３）
乳癌の処置を必要とする被験体において、アントラサイクリンを含む乳癌処置が有効である可能性についてスクリーニングする方法であって、
（ａ）上記被験体由来の生物学的サンプルを提供するステップと、
（ｂ）上記生物学的サンプルをアッセイして、上記生物学的サンプルがＨｅｒ２＋サブタイプとして分類されるか否かを決定するステップと、
（ｃ）上記生物学的サンプルをアッセイして、上記生物学的サンプルがＨｅｒ−２−Ｅサブタイプとして分類されるか否かを決定するステップと、を含み、
上記生物学的サンプルが、Ｈｅｒ２＋サブタイプおよびＨｅｒ−２−Ｅサブタイプの両方として分類される場合は、アントラサイクリンを含む上記乳癌処置が、上記被験体に有効である可能性が高い、方法。
（項目１４）
上記生物学的サンプルをアッセイして、上記生物学的サンプルがＨｅｒ２＋サブタイプとして分類されるか否かを決定する上記ステップが、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）または免疫組織化学（ＩＨＣ）を用いて行われる、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
上記生物学的サンプルをアッセイして、上記生物学的サンプルがＨｅｒ−２−Ｅサブタイプとして分類されるか否かを決定する上記ステップが、表１に列記されている固有遺伝子を検出することによって行われる、項目１３に記載の方法。
（項目１６）
上記アントラサイクリンが、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、バルルビシン、およびミトキサントロンからなる群から選択される、項目１３に記載の方法。
（項目１７）
上記アントラサイクリンがエピルビシンである、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
アントラサイクリンを含む上記乳癌処置が、シクロホスファミド、フルオロウラシル（または５−フルオロウラシルまたは５−ＦＵ）、メトトレキセート、チオテパ、カルボプラチン、シスプラチン、タキサン、パクリタキセル、タンパク結合パクリタキセル、ドセタキセル、ビノレルビン、タモキシフェン、ラロキシフェン、トレミフェン、フルベストラント、ゲムシタビン、イリノテカン、イキサベピロン、テモゾロミド、トポテカン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エリブリン、ムタマイシン、カペシタビン、カペシタビン、アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、ロイプロリド、アバレリクス、ブセレリン、ゴセレリン、酢酸メゲストロール、リセドロネート、パミドロネート、イバンドロネート、アレンドロネート、デノスマブ、ゾレドロネート、トラスツズマブ、タイケルブ、またはベバシズマブ、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の抗癌剤をさらに含む、項目１３に記載の方法。
（項目１９）
アントラサイクリンを含む上記乳癌処置が、シクロホスファミドおよび５−フルオロウラシルからなる群の１つ以上の抗癌剤をさらに含む、項目１３に記載の方法。
（項目２０）
上記生物学的サンプルが、細胞、組織、および体液からなる群から選択される、項目１３に記載の方法。
（項目２１）
上記組織が生検から得られる、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
上記体液が、血液、リンパ液、尿、唾液、および乳頭吸引液からなる群から選択される、項目２０に記載の方法。
（項目２３）
表１に列記されている固有遺伝子の検出に十分な試薬およびＨｅｒ２の発現量の検出に十分な試薬を含む、アントラサイクリンを含む乳癌処置が有効である可能性についてスクリーニングするためのキット。
（項目２４）
表１に列記されている固有遺伝子の検出に十分な上記試薬がマイクロアレイを含む、項目２３に記載のキット。
（項目２５）
Ｈｅｒ２の発現量の検出に十分な上記試薬がＨｅｒ２抗体を含む、項目２３に記載のキット。
（項目２６）
乳癌の処置を必要とする被験体において、アントラサイクリンを含む乳癌処置が有効である可能性についてスクリーニングする方法であって、
（ａ）上記被験体由来の生物学的サンプルを提供するステップと、
（ｂ）上記生物学的サンプルをアッセイして、上記生物学的サンプルが基底様サブタイプとして分類されるか否かを決定するステップと、を含み、
上記生物学的サンプルが、基底様サブタイプとして分類される場合は、アントラサイクリンを含む上記乳癌処置が、上記被験体に有害である可能性が高い、方法。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、試験デザインの解説図（ＲＥＭＡＲＫ  Ｄｉａｇｒａｍ）を示す略図である。
【図２Ａ】図２Ａは、シクロホスファミド、メトトレキセート、および５−フルオロウラシル（ＣＭＦ）処置計画を受けた患者における、ＰＡＭ５０固有遺伝子を用いて決定されたリスククラシファイア再発リスクスコア（ＲＯＲ−Ｓ）の無再発生存率のカプラン−マイヤー（Ｋ−Ｍ）曲線を示す線グラフである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＣＭＦ処置計画を受けた患者における、ＰＡＭ５０固有遺伝子を用いて決定されたリスククラシファイアＲＯＲ−Ｓの全生存率のＫ−Ｍ曲線を示す線グラフである。
【図２Ｃ】図２Ｃは、シクロホスファミド、エピルビシン、および５−フルオロウラシル（ＣＥＦ）処置計画を受けた患者における、ＰＡＭ５０固有遺伝子を用いて決定されたリスククラシファイアＲＯＲ−Ｓの無再発生存率のＫ−Ｍ曲線を示す線グラフである。
【図２Ｄ】図２Ｄは、ＣＥＦ処置計画を受けた患者における、ＰＡＭ５０固有遺伝子を用いて決定されたリスククラシファイアＲＯＲ−Ｓの全生存率のＫ−Ｍ曲線を示す線グラフである。
【図３Ａ】図３Ａは、臨床病理学的変数で補正された、ＰＡＭ５０固有サブタイプによる多変量コックス回帰分析修正無再発生存率（ＲＦＳ）ハザード比のプロットを示している。
【図３Ｂ】図３Ｂは、臨床病理学的変数で補正された、ＰＡＭ５０固有サブタイプによる多変量コックス回帰分析修正全生存率（ＯＳ）ハザード比のプロットを示している。
【図４−１】図４Ａは、ＨＥＲ２−Ｅサブタイプにおける処置群ＣＥＦとＣＭＦの無再発生存率のＫ−Ｍ曲線を示す線グラフである。図４Ｂは、基底様サブタイプにおける処置群ＣＥＦとＣＭＦの無再発生存率のＫ−Ｍ曲線を示す線グラフである。図４Ｃは、ＬｕｍＢサブタイプにおける処置群ＣＥＦとＣＭＦの無再発生存率のＫ−Ｍ曲線を示す線グラフである。図４Ｄは、ＬｕｍＡサブタイプにおける処置群ＣＥＦとＣＭＦの無再発生存率のＫ−Ｍ曲線を示す線グラフである。図４Ｅは、ＨＥＲ２−Ｅサブタイプにおける処置群ＣＥＦとＣＭＦの全生存率のＫ−Ｍ曲線を示す線グラフである。図４Ｆは、基底様サブタイプにおける処置群ＣＥＦとＣＭＦの全生存率のＫ−Ｍ曲線を示す線グラフである。図４Ｇは、ＬｕｍＢサブタイプにおける処置群ＣＥＦとＣＭＦの全生存率のＫ−Ｍ曲線を示す線グラフである。図４Ｈは、ＬｕｍＡサブタイプにおける処置群ＣＥＦとＣＭＦの全生存率のＫ−Ｍ曲線を示す線グラフである。
【図４−２】図４Ａは、ＨＥＲ２−Ｅサブタイプにおける処置群ＣＥＦとＣＭＦの無再発生存率のＫ−Ｍ曲線を示す線グラフである。図４Ｂは、基底様サブタイプにおける処置群ＣＥＦとＣＭＦの無再発生存率のＫ−Ｍ曲線を示す線グラフである。図４Ｃは、ＬｕｍＢサブタイプにおける処置群ＣＥＦとＣＭＦの無再発生存率のＫ−Ｍ曲線を示す線グラフである。図４Ｄは、ＬｕｍＡサブタイプにおける処置群ＣＥＦとＣＭＦの無再発生存率のＫ−Ｍ曲線を示す線グラフである。図４Ｅは、ＨＥＲ２−Ｅサブタイプにおける処置群ＣＥＦとＣＭＦの全生存率のＫ−Ｍ曲線を示す線グラフである。図４Ｆは、基底様サブタイプにおける処置群ＣＥＦとＣＭＦの全生存率のＫ−Ｍ曲線を示す線グラフである。図４Ｇは、ＬｕｍＢサブタイプにおける処置群ＣＥＦとＣＭＦの全生存率のＫ−Ｍ曲線を示す線グラフである。図４Ｈは、ＬｕｍＡサブタイプにおける処置群ＣＥＦとＣＭＦの全生存率のＫ−Ｍ曲線を示す線グラフである。
【図４−３】図４Ａは、ＨＥＲ２−Ｅサブタイプにおける処置群ＣＥＦとＣＭＦの無再発生存率のＫ−Ｍ曲線を示す線グラフである。図４Ｂは、基底様サブタイプにおける処置群ＣＥＦとＣＭＦの無再発生存率のＫ−Ｍ曲線を示す線グラフである。図４Ｃは、ＬｕｍＢサブタイプにおける処置群ＣＥＦとＣＭＦの無再発生存率のＫ−Ｍ曲線を示す線グラフである。図４Ｄは、ＬｕｍＡサブタイプにおける処置群ＣＥＦとＣＭＦの無再発生存率のＫ−Ｍ曲線を示す線グラフである。図４Ｅは、ＨＥＲ２−Ｅサブタイプにおける処置群ＣＥＦとＣＭＦの全生存率のＫ−Ｍ曲線を示す線グラフである。図４Ｆは、基底様サブタイプにおける処置群ＣＥＦとＣＭＦの全生存率のＫ−Ｍ曲線を示す線グラフである。図４Ｇは、ＬｕｍＢサブタイプにおける処置群ＣＥＦとＣＭＦの全生存率のＫ−Ｍ曲線を示す線グラフである。図４Ｈは、ＬｕｍＡサブタイプにおける処置群ＣＥＦとＣＭＦの全生存率のＫ−Ｍ曲線を示す線グラフである。
【図４−４】図４Ａは、ＨＥＲ２−Ｅサブタイプにおける処置群ＣＥＦとＣＭＦの無再発生存率のＫ−Ｍ曲線を示す線グラフである。図４Ｂは、基底様サブタイプにおける処置群ＣＥＦとＣＭＦの無再発生存率のＫ−Ｍ曲線を示す線グラフである。図４Ｃは、ＬｕｍＢサブタイプにおける処置群ＣＥＦとＣＭＦの無再発生存率のＫ−Ｍ曲線を示す線グラフである。図４Ｄは、ＬｕｍＡサブタイプにおける処置群ＣＥＦとＣＭＦの無再発生存率のＫ−Ｍ曲線を示す線グラフである。図４Ｅは、ＨＥＲ２−Ｅサブタイプにおける処置群ＣＥＦとＣＭＦの全生存率のＫ−Ｍ曲線を示す線グラフである。図４Ｆは、基底様サブタイプにおける処置群ＣＥＦとＣＭＦの全生存率のＫ−Ｍ曲線を示す線グラフである。図４Ｇは、ＬｕｍＢサブタイプにおける処置群ＣＥＦとＣＭＦの全生存率のＫ−Ｍ曲線を示す線グラフである。図４Ｈは、ＬｕｍＡサブタイプにおける処置群ＣＥＦとＣＭＦの全生存率のＫ−Ｍ曲線を示す線グラフである。
【図５】図５Ａは、アジュバントＣＥＦ処置およびアジュバントＣＭＦ処置によって階層化されたＨＥＲ２−Ｅサブタイプセントロイド（ｃｅｎｔｒｏｉｄ）に対する相関の連続関数として無再発生存率の予測値を示す線グラフである。図５Ｂは、アジュバントＣＥＦ処置およびアジュバントＣＭＦ処置によって階層化されたＨＥＲ２−Ｅサブタイプセントロイドに対する相関の連続関数として全生存率の予測値を示す線グラフである。連続関数は、標準的な臨床病理学的変数およびＨＥＲ２−Ｅセントロイドを含む多変量コックスモデルから作成した。Ｘ軸は、腫瘍のＨＥＲ２−Ｅセントロイドに対する相関を示している；すなわち、正の相関値が高ければ高いほど、そのサンプル内のＨＥＲ２−Ｅサブタイプ成分が多い。Ｙ軸は、個々の患者の５年における予測無再発生存率および予測全生存率を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、アントラサイクリンを含む乳癌処置が、乳癌に罹患している患者に投与するのに最適であるか否かを決定する方法を提供する。乳癌患者が、アントラサイクリンを含む処置を受けるべきであるか否かの決定は、固有遺伝子発現セットを用いた乳癌のサブタイプの決定、および蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）または免疫組織化学（ＩＨＣ）を用いることによる乳癌のＨｅｒ２状態の決定を含む。本開示はまた、乳癌患者が、アントラサイクリンを含む処置を受けるべきであるか否かを決定し、そしてこの決定に基づいて患者に最適な乳癌処置を施すことによって乳癌を治療する方法を提供する。
【００１８】
Ｐｅｒｏｕら、（２０００）  Ｎａｔｕｒｅ  ４０６：７４７−７５２で説明されている固有遺伝子は、同一個体からの生物学的サンプル複製物間での発現の変動が小さく、かつ異なる個体からのサンプル全体での発現の変動が大きいものが統計学的に選択される。したがって、固有遺伝子は、乳癌の分類のためのクラシファイア遺伝子として使用される。臨床情報は、乳癌固有サブタイプを導き出すためには使用されなかったが、この分類は、予後に重要であることを証明している。固有遺伝子スクリーニングを使用して、乳癌を様々なサブタイプに分類することができる。乳癌の主要な固有サブタイプは、管腔Ａ（ＬｕｍＡ）、管腔Ｂ（ＬｕｍＢ）、ＨＥＲ２富化（Ｈｅｒ−２−Ｅ）、基底様（Ｂａｓａｌ−ｌｉｋｅ）、および正常様（Ｎｏｒｍａｌ−ｌｉｋｅ）と呼ばれる（Ｐｅｒｏｕら、Ｎａｔｕｒｅ，４０６（６７９７）：７４７−５２  （２０００）；Ｓｏｒｌｉｅら、ＰＮＡＳ，９８（１９）：１０８６９−７４  （２００１））。
【００１９】
ＰＡＭ５０遺伝子発現アッセイ（それぞれ参照により本明細書に組み入れられる、Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．，２７（８）：１１６０−７  （２００９）および米国特許出願公開第２０１１／０１４５１７６号）は、標準的なホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍組織から固有サブタイプを同定することができる。この方法は、教師付きアルゴリズム（ｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を使用して乳癌固有サブタイプに従って被験体サンプルを分類する。このアルゴリズムは、本明細書ではＰＡＭ５０分類モデルと呼ばれ、乳癌固有サブタイプの分類に優れているとして本明細書で同定された、固有遺伝子の指定サブセットの遺伝子発現プロフィールに基づいている。この遺伝子のサブセットおよびそれらの検出専用のプライマーが表１に示されている。
【００２０】
【表１−１】
0005971769.tif 000002
【００２１】
【表１−２】
0005971769.tif 000003
【００２２】
【表１−３】
0005971769.tif 000004
【００２３】
【表１−４】
0005971769.tif 000005
表２は、表１のＰＡＭ５０遺伝子の選択配列を示す
【００２４】
【表２−１】
0005971769.tif 000006
【００２５】
【表２−２】
0005971769.tif 000007
【００２６】
【表２−３】
0005971769.tif 000008
【００２７】
【表２−４】
0005971769.tif 000009
【００２８】
【表２−５】
0005971769.tif 000010
【００２９】
【表２−６】
0005971769.tif 000011
【００３０】
【表２−７】
0005971769.tif 000012
【００３１】
【表２−８】
0005971769.tif 000013
【００３２】
【表２−９】
0005971769.tif 000014
【００３３】
【表２−１０】
0005971769.tif 000015
【００３４】
【表２−１１】
0005971769.tif 000016
【００３５】
【表２−１２】
0005971769.tif 000017
【００３６】
【表２−１３】
0005971769.tif 000018
【００３７】
【表２−１４】
0005971769.tif 000019
【００３８】
【表２−１５】
0005971769.tif 000020
【００３９】
【表２−１６】
0005971769.tif 000021
【００４０】
【表２−１７】
0005971769.tif 000022
【００４１】
【表２−１８】
0005971769.tif 000023
【００４２】
【表２−１９】
0005971769.tif 000024
【００４３】
【表２−２０】
0005971769.tif 000025
【００４４】
【表２−２１】
0005971769.tif 000026
【００４５】
【表２−２２】
0005971769.tif 000027
【００４６】
【表２−２３】
0005971769.tif 000028
【００４７】
【表２−２４】
0005971769.tif 000029
【００４８】
【表２−２５】
0005971769.tif 000030
【００４９】
【表２−２６】
0005971769.tif 000031
【００５０】
【表２−２７】
0005971769.tif 000032
【００５１】
【表２−２８】
0005971769.tif 000033
【００５２】
【表２−２９】
0005971769.tif 000034
【００５３】
【表２−３０】
0005971769.tif 000035
【００５４】
【表２−３１】
0005971769.tif 000036
【００５５】
【表２−３２】
0005971769.tif 000037
【００５６】
【表２−３３】
0005971769.tif 000038
【００５７】
【表２−３４】
0005971769.tif 000039
【００５８】
【表２−３５】
0005971769.tif 000040
【００５９】
【表２−３６】
0005971769.tif 000041
【００６０】
【表２−３７】
0005971769.tif 000042
【００６１】
【表２−３８】
0005971769.tif 000043
【００６２】
【表２−３９】
0005971769.tif 000044
【００６３】
【表２−４０】
0005971769.tif 000045
【００６４】
【表２−４１】
0005971769.tif 000046
【００６５】
【表２−４２】
0005971769.tif 000047
乳癌を分類するために、患者からのサンプルに対してＦＩＳＨ分析またはＩＨＣを行った。Ｈｅｒ２に対して２．０を超える増幅比を示したサンプルをＨｅｒ２＋と分類した。広範囲の固定剤および処理技術を用いた多数の標本源が存在するため、「減算スコアリング（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ  ｓｃｏｒｉｎｇ）」を使用した（Ｙａｚｉｊｉら、ＪＡＭＡ  ２９１（１６）：１９７２−１９７７  （Ａｐｒ．２００４）を参照）。この方法を使用して、非腫瘍性乳房上皮のすべての可視シグナルを陰性としてカウントし、腫瘍細胞のスコアを良性細胞のスコアから減算する。減算スコアが２＋の場合は、細胞をＨｅｒ２＋として分類した。
【００６６】
固有遺伝子解析によって分類されたＨｅｒ−２−Ｅサブタイプに適合する乳癌腫瘍の被験体は、驚くべきことに、アントラサイクリンを含む乳癌処置で処置された場合、平均して良好な予後を有することが分かった。他のサブタイプは、アントラサイクリンを含む乳癌処置とアントラサイクリンを含まない乳癌処置との間で予後に有意な差異を示さなかった。ＦＩＳＨ分析またはＩＨＣを用いてＨｅｒ２＋であることが示された被験体も、驚くべきことに、アントラサイクリンを含む乳癌処置で処置された場合、平均して良好な予後を有していた。
【００６７】
また、Ｈｅｒ−２−Ｅとして分類された腫瘍のすべてがＨｅｒ２＋でもあるとは限らないことも分かった。Ｈｅｒ−２−Ｅ発現サブタイプであるが臨床的Ｈｅｒ２−である患者からのサンプルの中では、被験体がアントラサイクリンで処置された場合、平均して予後の有意な改善が見られなかった。しかしながら、Ｈｅｒ−２−ＥおよびＨｅｒ２＋の両方である腫瘍を有していた被験体の中では、アントラサイクリンでの処置は、平均して良好な予後を示した。アントラサイクリンを含む乳癌処置が施されたＨｅｒ−２−Ｅ／Ｈｅｒ２−癌の乳癌患者の臨床転帰とＨｅｒ−２−Ｅ／Ｈｅｒ２＋癌の乳癌患者の臨床転帰とを区別することにより、この乳癌処置が治療効果を改善せず、悪い副作用を伴い得る場合に、何千人もの患者の臨床転帰および生活の質が改善される。
【００６８】
定義
本開示において、「乳癌」は、例えば、生検または組織学によって悪性病変として分類される状態を含む。乳癌診断の臨床的描写は医学の分野で周知である。当業者であれば、乳癌が、例えば、癌腫および肉腫を含む乳房組織のあらゆる悪性腫瘍を指すことを理解されよう。乳癌の特定の具体例は、非浸潤性腺管癌（ｄｕｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎ  ｓｉｔｕ）（ＤＣＩＳ）、上皮内小葉癌（ＬＣＩＳ）、または粘液性癌腫を含む。乳癌はまた、浸潤性乳管癌（ＩＤＣ）、小葉新生物、または浸潤性小葉癌（ＩＬＣ）も指す。本開示の殆ど実施形態では、目的の被験体は、乳癌の疑いのあるヒト患者、または実際に乳癌と診断されたヒト患者である。
【００６９】
乳癌は、すべての形態の乳房の癌を含む。乳癌は、原発性上皮乳癌（ｐｒｉｍａｒｙ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ）を含み得る。乳癌は、乳房が他の腫瘍、例えば、リンパ腫、肉腫、または黒色腫に侵された癌を含み得る。乳癌は、乳房の癌、乳房の腺管癌、乳房の小葉癌、乳房の未分化癌、乳房の葉状嚢肉腫、乳房の血管肉腫、および乳房の原発性リンパ腫を含み得る。乳癌は、ステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩＩＩＡ、ステージＩＩＩＢ、ステージＩＩＩＣ、およびステージＩＶの乳癌を含み得る。乳房の腺管癌は、浸潤性癌、乳管内癌細胞が優勢な浸潤性癌（ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｗｉｔｈ  ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ  ｉｎｔｒａｄｕｃｔａｌ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）、炎症性乳癌、ならびに組織型が面皰、粘液性（膠様）、髄様、リンパ球浸潤（ｌｙｍｐｈｃｙｔｉｃ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｅ）を伴う髄様、乳頭、硬性、および管状からなる群から選択される乳房の腺管癌を含み得る。乳房の小葉癌は、上皮内成分が優勢な浸潤性小葉癌（ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｌｏｂｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｗｉｔｈ  ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）、および炎症性小葉癌を含み得る。乳癌は、パジェット病、腺管内癌を伴うパジェット病、および浸潤性腺管癌を伴うパジェット病を含み得る。乳癌は、組織学的および超微細構造的不均質性（例えば、混合細胞型）を有する乳房新生物を含み得る。
【００７０】
処置されるべき乳癌は、家族性乳癌を含み得る。処置されるべき乳癌は、散発性乳癌を含み得る。処置されるべき乳癌は、男性被験体で発症し得る。処置されるべき乳癌は、女性被験体で発症し得る。処置されるべき乳癌は、閉経前の女性被験体または閉経後の女性被験体で発症し得る。
【００７１】
処置されるべき乳癌は、乳房の局所腫瘍を含み得る。処置されるべき乳癌は、陰性センチネルリンパ節（ＳＬＮ）生検に関連した乳房の腫瘍を含み得る。治療されるべき乳癌は、陽性センチネルリンパ節（ＳＬＮ）生検に関連した乳房の腫瘍を含み得る。処置されるべき乳癌は、１つ以上の陽性腋窩リンパ節に関連した乳房の腫瘍を含み得、この腋窩リンパ節は、任意の適用可能な方法によって病期分類される。処置されるべき乳癌は、結節陰性状態（例えば、結節−陰性）または結節陽性状態（例えば、結節−陽性）を有するとして分類された乳房の腫瘍を含み得る。処置されるべき乳癌は、体の他の部位に転移した乳房の腫瘍を含み得る。治療されるべき乳癌は、骨、肺、肝臓、または脳からなる群から選択される部位に転移しているとして分類することができる。治療されるべき乳癌は、転移性、限局性、局所性、限局−局所性、限局進行性、遠隔性、多中心性、両側性、同側性、反対側性、新たに診断された、再発性、および手術不能からなる群から選択される特徴に従って分類することができる。
【００７２】
本開示において、「アントラサイクリン」は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ細菌に由来する、癌化学療法に使用される薬物のクラスである。これらの薬物は、乳癌を含む多様な癌を処置するために使用される。しかしながら、このクラスの薬物は、極めて毒性が強く、心臓障害および嘔吐を含む著しく有害な副作用をもたらす。アントラサイクリンは、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、バルルビシン、およびミトキサントロンを含む。
【００７３】
本開示において、「アントラサイクリンを含む乳癌処置」は、アントラサイクリンを含む乳癌の処置である。これらの処置は、他の抗癌剤または化学療法剤も含み得る。
【００７４】
本開示において、「アントラサイクリンを含まない乳癌処置」は、アントラサイクリンを一切含まない乳癌の処置である。これらの処置は、他の抗癌剤または化学療法剤を含む。
【００７５】
抗癌剤または化学療法剤のクラスは、アルキル化剤、プラチナ剤、タキサン、ビンカ剤、抗エストロゲン剤、アロマターゼ阻害剤、卵巣抑制剤、内分泌／ホルモン剤、ビスホスホネート（ｂｉｓｐｈｏｐｈｏｎａｔｅ）治療薬、および標的生物学的治療薬を含み得る。
【００７６】
特定の抗癌剤または化学療法剤は、シクロホスファミド、フルオロウラシル（または５−フルオロウラシルまたは５−ＦＵ）、メトトレキセート、チオテパ、カルボプラチン、シスプラチン、タキサン、パクリタキセル、タンパク結合パクリタキセル、ドセタキセル、ビノレルビン、タモキシフェン、ラロキシフェン、トレミフェン、フルベストラント、ゲムシタビン、イリノテカン、イキサベピロン、テモゾロマイド、トポテカン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エリブリン、ムタマイシン、カペシタビン、カペシタビン、アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、ロイプロリド、アバレリクス、ブセレリン、ゴセレリン、酢酸メゲストロール、リセドロネート、パミドロネート、イバンドロネート、アレンドロネート、デノスマブ、ゾレドロネート、トラスツズマブ、タイケルブ、またはベバシズマブ、またはこれらの組み合わせも含み得る。
【００７７】
併用抗癌療法または化学療法は、ＡＴ：Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標）（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）およびＴａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）（ドセタキセル）；ＡＣ：Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標）、Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）（シクロホスファミド）；ＡＣ＋Ｔａｘｏｌ（登録商標）；ＡＣ＋Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）；ＣＭＦ：Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）、メトトレキセート、５−フルオロウラシル；ＣＥＦ：Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）、Ｅｌｌｅｎｃｅ（登録商標）（エピルビシン）、およびフルオロウラシル；ＥＣ：Ｅｌｌｅｎｃｅ（登録商標）、Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）；ＦＡＣ：５−フルオロウラシル、Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標），およびＣｙｔｏｘａｎ（登録商標）；ＧＥＴ：Ｇｅｍｚａｒ（登録商標）（ゲムシタビン）、Ｅｌｌｅｎｃｅ（登録商標）、およびＴａｘｏｌ（登録商標）；ＴＣ：Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）、Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）；ＴＣ：Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）、Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標）（カルボプラチン）；ＴＡＣ：Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）、Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標）、Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）またはＴＣＨ：Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ）、およびＰａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標）を含み得る。転移性乳癌のさらなる併用化学療法は、Ｔａｘｏｌ（登録商標）およびＸｅｌｏｄａ（登録商標）（カペシタビン）；Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）およびＸｅｌｏｄａ（登録商標）；Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）およびＰａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標）；Ｔａｘｏｌ（登録商標）およびＰａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標）；Ｔａｘｏｌ（登録商標）およびＧｅｍｚａｒ（登録商標）；Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）（タンパク結合パクリタキセル）およびＸｅｌｏｄａ（登録商標）；Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）およびＰａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標）；Ｃａｍｐｔｏｓｏｒ（登録商標）（イリノテカン）およびＴｅｍｏｄａｒ（登録商標）（テモゾロミド）；Ｇｅｍｚａｒ（登録商標）およびＰａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標）またはＩｘｅｍｐｒａ（登録商標）（イキサベピロン）およびＸｅｌｏｄａ（登録商標）を含み得る。
【００７８】
好ましくは、抗癌剤または化学療法剤は、シクロホスファミドおよび５−フルオロウラシルを含むか、またはメトトレキセート、シクロホスファミド、および５−フルオロウラシルを含む。
【００７９】
１つ以上のアントラサイクリンは、本明細書に開示される乳癌処置で投与することができる。好ましくは、アントラサイクリンは、静脈内投与されるが、当分野で公知の任意の方法によって投与することもできる。アントラサイクリンは、１週間に１０ｍｇ／ｍ２〜３００ｍｇ／ｍ２の用量で投与することができる。アントラサイクリンは、１週間に２０ｍｇ／ｍ２〜２００ｍｇ／ｍ２、３０ｍｇ／ｍ２〜１００ｍｇ／ｍ２、または３５ｍｇ／ｍ２〜７５ｍｇ／ｍ２の用量で投与することができる。好ましくは、アントラサイクリンは、１週間に約６０ｍｇ／ｍ２で投与される。
【００８０】
好ましくは、メトトレキセートは、静脈内投与されるが、当分野で公知の任意の方法によって投与することもできる。メトトレキセートは、１ｍｇ／ｍ２〜５００ｍｇ／ｍ２で投与することができる。メトトレキセートは、１週間に１０ｍｇ／ｍ２〜２００ｍｇ／ｍ２、２０ｍｇ／ｍ２〜１００ｍｇ／ｍ２、または３０ｍｇ／ｍ２〜６０ｍｇ／ｍ２で投与することができる。好ましくは、メトトレキセートは、１週間に約４０ｍｇ／ｍ２で投与される。
【００８１】
好ましくは、５−フルオロウラシルは、静脈内投与されるが、当分野で公知の任意の方法によって投与することもできる。５−フルオロウラシルは、１週間に２５ｍｇ／ｍ２〜１０００ｍｇ／ｍ２の用量で投与することができる。５−フルオロウラシルは、１週間に５０ｍｇ／ｍ２〜９００ｍｇ／ｍ２、１００ｍｇ／ｍ２〜８００ｍｇ／ｍ２、３００ｍｇ／ｍ２〜７００ｍｇ／ｍ２、または４５０ｍｇ／ｍ２〜６５０ｍｇ／ｍ２で投与することができる。好ましくは、５−フルオロウラシルは、１週間に約５００ｍｇ／ｍ２で投与される。
【００８２】
好ましくは、シクロホスファミドは、経口投与されるが、当分野で公知の任意の方法によって投与することもできる。シクロホスファミドは、１日に１０ｍｇ／ｍ２〜３００ｍｇ／ｍ２の用量で投与することができる。シクロホスファミドは、１日に２０ｍｇ／ｍ２〜２００ｍｇ／ｍ２、３０ｍｇ／ｍ２〜１００ｍｇ／ｍ２、または４０ｍｇ／ｍ２〜８０ｍｇ／ｍ２で投与することができる。好ましくは、シクロホスファミドは、１日に約７５ｍｇ／ｍ２で投与される。
【００８３】
冠詞「ある（ａ）」および「ある（ａｎ）」は、１つまたは複数（すなわち、少なくとも１つ）のその冠詞の文法上の目的語を指すために本明細書で使用される。一例として、「ある要素」は、１つ以上の要素を意味する。
【００８４】
本明細書を通して、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または語尾変化、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、述べられた要素、整数、またはステップ、あるいは一群の要素、複数の整数、または複数のステップを含むが、他の要素、整数、またはステップ、あるいは他の一群の要素、複数の整数、または複数のステップを除外することを意味するのではないことを理解されたい。
【００８５】
臨床的変数
本明細書で説明されるＰＡＭ５０分類モデルは、臨床的変数に関する情報とさらに組み合わせて、持続的な再発リスク（ＲＯＲ）予測因子を作成することができる。本明細書に説明されているように、多数の臨床乳癌因子および予後乳癌因子は、当分野で公知であり、治療結果および疾患の再発の可能性を予測するために使用される。このような因子は、例えば、リンパ節転移、腫瘍サイズ、組織学的悪性度、エストロゲンおよびプロゲステロンホルモン受容体の状態、ＨＥＲ−２レベル、および腫瘍倍数性を含む。一実施形態では、再発のリスク（ＲＯＲ）スコアは、乳癌と診断された被験体または乳癌の疑いがある被験体に対して付与される。このスコアは、リンパ節の状態（Ｎ）および腫瘍サイズ（Ｔ）の臨床因子と組み合わせてＰＡＭ５０分類モデルを使用する。臨床的変数の評価は、乳癌の病期分類用の対癌米国合同委員会（ＡＪＣＣ）標準システムに基づいている。このシステムでは、原発腫瘍サイズは、０〜４の等級（Ｔ０：原発腫瘍の証拠がない；Ｔ１：＜２ｃｍ；Ｔ２：＞２ｃｍ−＜５ｃｍ；Ｔ３：＞５ｃｍ；Ｔ４：胸壁または皮膚に直接転移したあらゆるサイズの腫瘍）に分類される。リンパ節の状態は、Ｎ０〜Ｎ３（Ｎ０：局所リンパ節が転移していない；Ｎ１：移動可能な同側腋窩リンパ節（複数可）への転移；Ｎ２：互いにまたは他の構造に固定された同側リンパ節（複数可）への転移；Ｎ３：胸骨下の同側リンパ節への転移）として分類される。乳癌患者の識別方法および疾患の病期分類方法は、周知であり、指診、生検、患者の病歴および／または家族歴の精査、およびイメージング技術、例えば、マンモグラフィー、磁気共鳴影像法（ＭＲＩ）、およびポジトロン放射型断層撮影法（ＰＥＴ）を含み得る。
【００８６】
サンプル源
本開示の一実施形態では、乳癌サブタイプは、１つ以上の被験体サンプルにおける表１に列記されている固有遺伝子の発現パターンまたは発現プロフィールの評価、および／または癌のＨｅｒ−２状態を確認するために行われるＦＩＳＨ分析またはＩＨＣによって評価される。考察において、用語、被験体または被験体サンプルは、健常および／または疾患状態を問わない個体を指す。被験体は、被験体、試験参加者、コントロール被験体、スクリーニング被験体、またはサンプルが採取されて本開示の文脈で評価される他のクラスの個体とすることができる。したがって、被験体は、乳癌と診断され得る、乳癌の１つ以上の症状または素因、例えば、家族歴（遺伝的）因子もしくは病歴（医学的）因子を示し得る、乳癌の処置または療法を受け得る、または同様のものであり得る。したがって、被験体は、乳癌の処置または乳癌の検出を必要とする被験体である。あるいは、被験体は、いずれかの上記の因子または基準に対して健常であり得る。本明細書で使用される用語「健常」は、あらゆる絶対評価または状態に一致するように定義できないため、用語「健常」は乳癌の状態に対して相対的であることを理解されたい。したがって、あらゆる指定の疾患または疾患基準に対して健常として定義される個体は、実際に他の１つ以上の疾患と診断されても良いし、または乳癌以外の１つ以上の癌を含め、他の１つ以上の疾患基準を示しても良い。しかしながら、健常コントロールは、好ましくは、他の癌に罹患していない。
【００８７】
本明細書で使用される「それを必要とする被験体」は、乳癌に罹患している被験体、または乳癌の１つ以上の症状を示す被験体、あるいは全人口に対して乳癌を発症するリスクが高い被験体である。好ましくは、それを必要とする被験体は、乳癌に罹患している。「被験体」は、哺乳動物を含む。哺乳動物は、例えば、任意の哺乳動物、例えば、ヒト、霊長類、トリ、マウス、ラット、ニワトリ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヤギ、ラクダ、ヒツジ、またはブタであり得る。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００８８】
特定の実施形態では、乳癌固有サブタイプまたはＨｅｒ−２状態を予測する方法は、癌細胞または組織を含む生物学的サンプル、例えば、乳房組織サンプルまたは原発性乳房腫瘍組織サンプルを採取することを含む。「生物学的サンプル」とは、固有遺伝子の発現を検出できる細胞、組織、または体液の任意の抽出見本のことである。このような生物学的サンプルの例は、限定されるものではないが、生検または塗沫標本である。本開示に有用な体液は、血液、リンパ液、尿、唾液、乳頭吸引液、婦人科液体、または他の分泌液、またはそれらの派生物を含み得る。血液は、全血、血漿、血清、または血液の任意の派生物を含み得る。一部の実施形態では、生物学的サンプルは、乳房細胞、特に生検による乳房組織、例えば、乳房腫瘍組織サンプルを含む。生物学的サンプルは、例えば、ある部位の擦り取りもしくは拭き取り、針を使用した細胞もしくは体液の吸引、または組織サンプルの除去（すなわち、生検）を含む様々な技術によって被験体から得ることができる。様々な生物学的サンプルを採取する方法は、当分野で周知である。一部の実施形態では、乳房組織サンプルは、例えば、微細針吸引生検、針生検、または切除生検によって得られる。標本の保存および検査を容易にするために、細胞または組織を固定液および染色液に浸漬する。生物学的サンプル、特に乳房組織サンプルは、顕微鏡下で観察するためにスライドガラスに移すことができる。一実施形態では、生物学的サンプルは、ホルマリン固定されたパラフィン包埋乳房組織サンプル、特に原発性乳房腫瘍サンプルである。様々な実施形態では、組織サンプルは、病理医によってガイドされた組織コアサンプルから得られる。
【００８９】
発現プロファイリング
様々な実施形態では、本開示は、被験体の乳癌を分類する方法、予後を判定する方法、または監視する方法を提供する。この実施形態では、固有遺伝子の発現の分析から得られるデータを、１つ以上のパターン認識アルゴリズムを用いて評価する。このような分析方法を使用して、予測モデルを形成することができ、この予測モデルを用いて試験データを分類することができる。例えば、特に有効な１つの便利な分類方法は、多変量統計解析モデリングを利用し、先ず既知のサブタイプのサンプル（例えば、特定の乳癌固有サブタイプ：ＬｕｍＡ、ＬｕｍＢ、基底様、ＨＥＲ２富化、または正常様を有する既知の被験体に由来する）からデータ（「モデリングデータ」）を用いてモデル（「予測数学モデル」）を作成し、次いでサブタイプに従って未知のサンプル（例えば、「試験サンプル」）を分類する。パターン認識方法は、例えば、言語学、フィンガープリンティング、化学、および心理学に及ぶ多くの異なる種類の問題を特徴付けるために広く使用されている。本明細書で説明される方法の文脈では、パターン認識は、パラメトリックおよびノンパラメトリックの両方の多変量統計学を使用してデータを解析し、これによりサンプルを分類し、そして一連の観察された測定値に基づいて一部の従属変数の値を予測する。２つの主な手法がある。１組の方法は、「教師なし」と呼ばれ、これらは、データの複雑さを合理的な方法で単純に緩和すると共に、人間の眼で解釈できる表示プロットを作成する。しかしながら、このタイプの手法は、予測アルゴリズムの訓練に使用される初期のサンプル集団とは独立した被験体に由来するサンプルを分類するために使用することができる臨床アッセイの開発には適していないであろう。
【００９０】
もう１つの手法は、「教師付き」と呼ばれ、クラスまたは結果が既知であるサンプルの訓練セットを使用して数学モデルを作成し、次いで独立バリデーションデータセットを用いて評価する。ここで、固有遺伝子発現データの「訓練セット」を用いて、各サンプルの「サブタイプ」を正確に予測する統計モデルを構築する。次いで、この訓練セットを独立データ（試験セットまたはバリデーションセットと呼ぶ）で試験してコンピュータベースのモデルの頑強性を決定する。これらのモデルは、時には「エキスパートシステム」と呼ばれることもあるが、一連の異なる数学的手順に基づいても良い。教師付き方法は、次元が下げられたデータセット（例えば、最初の２、３の主成分）を使用することができるが、典型的には、次元が下げられていない全次元のデータを使用する。どの場合でも、この方法は、固有遺伝子発現プロフィールに関して各サブタイプを特徴付けて区別する多変量境界の定量的記述を可能にする。また、任意の予測、例えば、適合度に当てはめられる確率のレベルに対する信頼限界を得ることも可能である。予測モデルの頑強性はまた、選択されたサンプルを分析から除外することによって、クロス確認を用いてチェックすることもできる。
【００９１】
本明細書で説明されるＰＡＭ５０分類モデルは、表１に列記されている固有遺伝子を用いた、複数の被験体サンプルの遺伝子発現プロフィールに基づいている。複数のサンプルは、各サブタイプクラスに属する被験体に由来する十分な数のサンプルを含む。この文脈における「十分なサンプル」または「代表的な数」とは、各サブタイプをその群の他のサブタイプから確実に区別できる分類モデルを構築するのに十分である、各サブタイプに由来するサンプルの数のことである。教師付き予測アルゴリズムは、このアルゴリズムを「訓練する」ための客観的に選択されたプロトタイプサンプルのプロフィールに基づいて開発されている。サンプルは、参照によりその全容が本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２００９／０２９９６４０号に開示されている方法に従って拡大固有遺伝子セットを用いて選択され、サブタイプに分類される。あるいは、サンプルは、乳癌のサブタイプを分類するための任意の既知のアッセイに従ってサブタイプに分類することができる。サブタイプに従って訓練サンプルを階層化した後、セントロイドをベースとする予測アルゴリズムを用いて、表１に記載されている固有遺伝子の発現プロフィールに基づいてセントロイドを作成する。
【００９２】
一実施形態では、予測アルゴリズムは、参照によりその全容が本明細書に組み入れられるＮａｒａｓｈｉｍａｎおよびＣｈｕ、（２００２）  ＰＮＡＳ  ９９：６５６７−６５７２に記載されているものに関連した最短セントロイド法である。本開示では、この方法は、各サブタイプについての標準セントロイドを計算する。このセントロイドは、各サブタイプ（または「クラス」）における各遺伝子の平均遺伝子発現をその遺伝子のクラス内の標準偏差で除算した値である。最短セントロイド分類は、新たなサンプルの遺伝子発現プロフィールを取り出して、このプロフィールをこれらのクラスの各セントロイドと比較する。サブタイプ予測は、５つのセントロイドに対して各テストケースのスペアマンの順位相関を計算し、次いで最短セントロイドに基づいてサンプルをサブタイプに割り当てることによって行われる。
【００９３】
固有遺伝子発現の検出
表１に列記されている固有遺伝子の発現を検出するための、当分野で利用可能なすべての方法が本明細書に含まれる。「発現の検出」とは、固有遺伝子のＲＮＡ転写物またはその発現産物の量または存在を決定することである。本開示の固有遺伝子の発現を検出する方法、すなわち遺伝子発現プロファイリングは、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション分析をベースとする方法、ポリヌクレオチドの配列決定をベースとする方法、免疫組織化学法、およびプロテオミクスをベースとする方法を含む。これらの方法は、一般に、表１に列記されている固有遺伝子の発現産物（例えば、ｍＲＮＡ）を検出する。好ましい実施形態では、ＰＣＲをベースとする方法、例えば、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）（Ｗｅｉｓら、ＴＩＧ  ８：２６３−６４，１９９２）、およびアレイをベースとする方法、例えば、マイクロアレイ（Ｓｃｈｅｎａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４６７−７０，１９９５）が使用される。「マイクロアレイ」とは、ハイブリダイズ可能なアレイ要素、例えば、ポリヌクレオチドプローブなどが基板上に規則的に配置されたもののことである。用語「プローブ」は、特に意図する標的生体分子、例えば、固有遺伝子によってコードされるか、または固有遺伝子に対応するヌクレオチド転写物またはタンパク質に選択的に結合できるあらゆる分子を指す。プローブは、当業者が合成することもできるし、または適切な生物学的標本から得ることもできる。プローブは、標識するように特別に設計することができる。プローブとして利用できる分子の例には、限定されるものではないが、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、抗体、および有機分子が含まれる。
【００９４】
多くの発現検出法は、単離ＲＮＡを使用する。開始材料は、典型的には、生物学的サンプル、例えば、腫瘍または腫瘍細胞株及び対応する正常組織または細胞株から単離された全ＲＮＡである。ＲＮＡ源が、原発性腫瘍である場合は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）は、例えば、凍結または保管されたパラフィン包埋されて固定（例えば、ホルマリン固定）された組織サンプル（例えば、病理医によってガイドされた組織コアサンプル）から抽出することができる。
【００９５】
ＲＮＡ抽出の一般的な方法は、当分野で周知であり、Ａｕｓｕｂｅｌら編集、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８７−１９９９を含む分子生物学の標準的な教科書に記載されている。パラフィン包埋組織からのＲＮＡ抽出の方法は、例えば、ＲｕｐｐおよびＬｏｃｋｅｒ、Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．５６：Ａ６７，（１９８７）；およびＤｅ  Ａｎｄｒｅｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １８：４２−４４，（１９９５）に開示されている。特に、ＲＮＡの単離は、商業製造業者、例えば、Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）社の精製キット、緩衝液セット、およびプロテアーゼを用いて、商業製造業者の説明書に従って行うことができる。例えば、培養細胞由来の全ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ社のＲＮｅａｓｙミニカラムを用いて単離することができる。他の市販のＲＮＡ単離キットには、ＭＡＳＴＥＲＰＵＲＥ（商標）ＤＮＡおよびＲＮＡ完全精製キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）およびパラフィンブロックＲＮＡ単離キット（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）が含まれる。組織サンプル由来の全ＲＮＡは、例えば、ＲＮＡ  Ｓｔａｔ−６０（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ，Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ，ＴＸ）を用いて単離することができる。腫瘍から調製したＲＮＡは、例えば、塩化セシウム密度勾配遠心法によって単離することができる。加えて、多数の組織サンプルを、当業者に周知の技術、例えば、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉの単一ステップＲＮＡ単離プロセス（米国特許第４，８４３，１５５号）などを用いて容易に処理することができる。単離ＲＮＡは、限定されるものではないが、ＰＣＲ分析およびプローブアレイを含むハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイに用いることができる。ＲＮＡレベルを検出する１つの方法では、検出され多遺伝子によってコードされるｍＲＮＡにハイブリダイズできる核酸分子（プローブ）に単離ＲＮＡを接触させる。核酸分子プローブは、例えば、完全長ｃＤＮＡ、または本開示の固有遺伝子または任意のＤＮＡもしくはＲＮＡ誘導体にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするのに十分である完全長ｃＤＮＡの一部、例えば、少なくとも７、１５、３０、６０、１００、２５０、もしくは５００のヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドとすることができる。ｍＲＮＡのプローブとのハイブリダイゼーションは、目的の固有遺伝子が発現されていることを示す。一実施形態では、ｍＲＮＡを固体表面に固定し、例えば、単離ｍＲＮＡをアガロースゲルに流してこのｍＲＮＡをゲルから膜、例えば、ニトロセルロースに移してプローブに接触させる。代替の実施形態では、プローブを固体表面に固定し、ｍＲＮＡを、例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ遺伝子チップアレイのプローブに接触させる。熟練技術者であれば、既知のｍＲＮＡ検出法を本開示の固有遺伝子の発現レベルの検出に用いるために容易に適応させることができる。
【００９６】
サンプルにおける固有遺伝子発現産物のレベルを決定する代替の方法では、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ（米国特許第４，６８３，２０２号）、リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８８：１８９−９３（１９９１））、自己持続配列複製法（ｓｅｌｆ  ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（Ｇｕａｔｅｌｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８７：１８７４−７８，（１９９０））、転写増幅システム（Ｋｗｏｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ  ＵＳＡ  ８６：１１７３−７７，（１９８９））、Ｑベータレプリカーゼ法（Ｌｉｚａｒｄｉら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７，（１９８８））、ローリングサークル複製法（米国特許第５，８５４，０３３号）、または任意の他の核酸増幅法による核酸増幅プロセスが行われ、続いて当業者に周知の技術を用いた増幅分子の検出が行われる。これらの検出スキームは、このような分子が非常に少ない数量で存在する場合には、核酸分子の検出に特に有用である。
【００９７】
本開示の特定の態様では、固有遺伝子発現は、定量ＲＴ−ＰＣＲによって評価される。多種多様なＰＣＲまたはＱＰＣＲプロトコルが当分野で公知であり、このようなプロトコルは、以下に例示され、表１に列記されている固有遺伝子の検出および／または定量に直接使用することもできるし、またはここで説明される組成物を用いて使用するように適応させることもできる。一般に、ＰＣＲでは、標的ポリヌクレオチド配列は、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーまたは一対のオリゴヌクレオチドプライマーとの反応によって増幅される。プライマー（複数可）は、標的核酸の相補領域にハイブリダイズし、そしてＤＮＡポリメラーゼが、プライマー（複数可）を伸長させて標的配列を増幅させる。ポリメラーゼをベースとする核酸増幅産物を提供するのに十分な条件下で、１つのサイズの核酸断片が、反応産物（増幅産物である標的ポリヌクレオチド配列）の大部分を占める。増幅サイクルを繰り返して、１つの標的ポリヌクレオチド配列の濃度を上昇させる。この反応は、ＰＣＲに一般的に使用される任意のサーモサイクラーで行うことができる。しかしながら、好ましくは、リアルタイム蛍光測定性能を有するサイクラー、例えば、ＳＭＡＲＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）（Ｃｅｐｈｅｉｄ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ  ＣＡ）、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）、ＲＯＴＯＲ−ＧＥＮＥ（商標）（Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｙｄｎｅｙ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ．）、ＩＣＹＣＬＥＲ（登録商標）（Ｂｉｏｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆ．）、およびＭＸ４０００（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）である。
【００９８】
本開示の別の実施形態では、マイクロアレイが発現プロファイリングに使用される。マイクロアレイは、様々な実験間での再現性から、特にこの目的に適している。ＤＮＡマイクロアレイは、多数の遺伝子の発現レベルを同時測定する１つの方法を提供する。各アレイは、固体支持体に取り付けられた捕捉プローブの再現可能なパターンからなる。標識ＲＮＡまたはＤＮＡが、アレイ上の相補プローブにハイブリダイズし、次いでレーザー走査によって検出される。アレイ上の各プローブのハイブリダイゼーション強度が決定され、相対遺伝子発現レベルを表す定量値に変換される。例えば、米国特許第６，０４０，１３８号、同第５，８００，９９２号、および同第６，０２０，１３５号、同第６，０３３，８６０号、および同第６，３４４，３１６号を参照されたい。サンプルにおける多数のＲＮＡの遺伝子発現プロフィールの決定には、高密度オリゴヌクレオチドアレイが特に有用である。
【００９９】
好ましい実施形態では、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）分析システムを用いて固有遺伝子発現を検出する。ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）分析システムの原理は、アッセイされる各核酸標的に割り当てられた一意のコードである（それぞれ参照によりそれらの全容が本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第２０１０／０１１２７１０号、およびＧｅｉｓｓら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２００８．２６（３）：３１７−３２５）。このコードは、アッセイされる各標的の一意のバーコードを作成する整列した一連の着色蛍光スポットから構成される。一対のプローブが、各ＤＮＡまたはＲＮＡ標的用に設計され、ビオチン化捕捉プローブおよびレポータープローブが、蛍光バーコードを備えている。このシステムは、本明細書では、ナノレポーターコードシステムとも呼ばれる。
【０１００】
特定のレポーターおよび捕捉プローブを、各標的について合成する。簡単に述べると、配列特異的ＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブは、コード特異的レポーター分子に付着する。捕捉プローブは、各標的に対する第２の配列特異的ＤＮＡオリゴヌクレオチドをビオチンを含むユニバーサルオリゴヌクレオチド（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）に結合することによって形成される。レポータープローブおよび捕捉プローブはすべて、１つのハイブリダイゼーション混合物、すなわち「プローブライブラリー」に集められる。
【０１０１】
各標的の相対的存在量を、１回の多重ハイブリダイゼーション反応で測定する。サンプルをプローブライブラリーと組み合わせて、溶液中でハイブリダイゼーションさせる。ハイブリダイゼーション後、３部分ハイブリダイズ複合体を、捕捉プローブおよびレポータープローブに存在するユニバーサル配列に相補的なオリゴヌクレオチドに連結された磁気ビーズを用いて２段階処置で精製する。この二重精製プロセスにより、標的特異的プローブが過剰に存在する状態でハイブリダイゼーション反応が完了するが、これらのプローブは最終的に除去され、従ってサンプルの結合およびイメージングは妨げられない。ハイブリダイゼーション後のステップはすべて、カスタム液体処理ロボット（Ｐｒｅｐ  Ｓｔａｔｉｏｎ，ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でロボット制御で行われる。
【０１０２】
精製反応物を、Ｐｒｅｐ  Ｓｔａｔｉｏｎによってサンプルカートリッジの個々のフローセル内に入れ、捕捉プローブを介してストレプトアビジン被覆表面に結合させ、電気泳動させてレポータープローブを伸ばし、そして固定する。処理後、サンプルカートリッジを、完全に自動化されたイメージング／データ収集装置（Ｄｉｇｉｔａｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ，ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｌｏｇｉｅｓ）に移す。標的の発現レベルを、各サンプルをイメージングしてその標的のコードが検出された回数をカウントすることによって測定する。各サンプルに対して、典型的には、６００視野（ＦＯＶ）がイメージングされ（１３７６×１０２４ピクセル）、約１０ｍ２の結合表面を表す。典型的なイメージング密度では、多重化、入力サンプルの量、および標的全体の存在度によって、１視野当たり１００〜１２００のレポーターがカウントされる。データは、各サンプルについて各標的当たりのカウント数を列記する単純な表計算形式で出力される。
【０１０３】
このシステムは、ナノレポーターと共に使用することができる。ナノレポーターに関するさらなる開示は、それぞれ参照によりそれらの全容が本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第２０１０／００１５６０７号および同第２０１０／０２６１０２６号で確認することができる。さらに、用語、核酸プローブおよびナノレポーターは、参照によりその全容が本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２０１０／００４７９２４号に開示されている合理的に設計されたもの（例えば、合成配列）を含み得る。
【０１０４】
データ処理
多くの場合、例えば、欠測データのアドレス指定、変換、スケーリング、正規化、重み付けなどによって遺伝子発現データを前処理することが有用である。多変量投影法、例えば、主成分分析（ＰＣＡ）および部分最小二乗法（ＰＬＳ）は、いわゆるスケーリング高感度法（ｓｃａｌｉｎｇ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｍｅｔｈｏｄ）と呼ばれる。試験データの種類についての従来の知識および経験を使用することにより、多変量モデリングの前のデータの質を、スケーリングおよび／または重み付けによって向上させることができる。十分なスケーリングおよび／または重み付けにより、データ内に隠れている重要で興味深い変動を明らかにすることができ、従って後続の多変量モデリングをより効率的にすることができる。スケーリングおよび重み付けを使用して、試験したシステムの知識および経験に基づいてデータを正しい測定基準（ｃｏｒｒｅｃｔ  ｍｅｔｒｉｃ）にし、これによりデータに元々存在するパターンを明らかにする。
【０１０５】
可能であれば、欠測データ、例えば、列の値における空白を回避するべきである。しかしながら、必要に応じて、このような欠測データを、例えば、列の平均値（「平均値充当」）；乱数値（「乱数値充当」）；または主成分分析に基づいた値（「主成分値充当」）で置き換えるまたは「充当する」ことができる。
【０１０６】
記述子座標軸の「変換」が有用であり得る。このような変換の例には、正規化および平均センタリングが含まれる。「正規化」を使用してサンプル間のばらつきを排除することができる。マイクロアレイデータの場合、正規化プロセスは、２つの標識色素の蛍光強度を釣り合わせることによってシステムエラーを排除することを目的とする。色素の偏りは、色素標識効率の差異、熱感度および光感受性、ならびに２つのチャネルを走査するためのスキャナ設定を含む様々な源から生じ得る。正規化因子を計算するために一般的に使用されている一部の方法は、（ｉ）アレイ上のすべての遺伝子を使用する全正規化；（ｉｉ）常に発現されるハウスキーピング／不変遺伝子を使用するハウスキーピング遺伝子の正規化；および（ｉｉｉ）ハイブリダイゼーション中に添加される既知量の外来制御遺伝子を使用する内部コントロール正規化を含む（Ｑｕａｃｋｅｎｂｕｓｈ  Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３２（Ｓｕｐｐｌ．），４９６−５０１（２００２））。一実施形態では、本明細書に開示される固有遺伝子を正規化してハウスキーピング遺伝子を制御することができる。例えば、参照によりその全容が本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２００８／００３２２９３号に記載されているハウスキーピング遺伝子を正規化に使用することができる。例示的なハウスキーピング遺伝子には、ＭＲＰＬ１９、ＰＳＭＣ４、ＳＦ３Ａ１、ＰＵＭｌ、ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤ、ＧＵＳＢ、ＲＰＬＰＯ、およびＴＦＲＣが含まれる。当業者であれば、本明細書に開示される方法が、特定のハウスキーピング遺伝子に対する正規化に縛られるものではなく、当分野で公知の任意の適切なハウスキーピング遺伝子（複数可）を使用できることを理解されよう。
【０１０７】
多数の正規化手法が可能であり、このよう正規化手法は、分析における任意のいくつかの点で適用できる場合が多い。一実施形態では、マイクロアレイデータは、ＬＯＷＥＳＳ法を用いて正規化され、このＬＯＷＥＳＳ法は、全局所的重み付け散布図平滑正規化関数（ｇｌｏｂａｌ  ｌｏｃａｌｌｙ  ｗｅｉｇｈｔｅｄ  ｓｃａｔｔｅｒｐｌｏｔ  ｓｍｏｏｔｈｉｎｇ  ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）である。別の実施形態では、ｑＰＣＲデータは、複数のハウスキーピング遺伝子のセットの幾何平均に対して正規化される。
【０１０８】
解釈を簡単にするために、「平均センタリング」を使用することもできる。通常、各記述子に対して、すべてのサンプルの記述子の平均値が減算される。この方法では、記述子の平均値が、原点に一致し、すべての記述子が、０に「中心」が合わされている。「単位分散スケーリング（ｕｎｉｔ  ｖａｒｉａｎｃｅ  ｓｃａｌｉｎｇ）」では、データを、同等の分散にスケーリングすることができる。通常、各記述子の値は、１／ＳｔＤｅｖによってスケーリングされ、ＳｔＤｅｖは、すべてのサンプルに対する記述子の標準偏差である。「パレートスケーリング」は、ある意味で、平均センタリングと単位分散スケーリングとの間の中間である。パレートスケーリングでは、各記述子の値は、ｌ／ｓｑｒｔ（ＳｔＤｅｖ）によってスケーリングされ、ＳｔＤｅｖは、すべてのサンプルに対する記述子の標準偏差である。この方法では、各記述子は、その最初の標準偏差に数値的に等しい分散を有する。パレートスケーリングは、例えば、生データまたは平均センタリングデータに対して行うことができる。
【０１０９】
データが正のスキューを有する場合および／またはデータが広範囲、例えば、数桁に跨る場合に解釈を容易にするために「対数スケーリング」を使用することができる。通常、各記述子に対して、値は、その値の対数に置き換えられる。「同等範囲スケーリング」では、各記述子は、すべてのサンプルの記述子の範囲によって除算される。この方法では、すべての記述子は、同じ範囲、すなわち１を有する。しかしながら、この方法は、外れ点の存在に影響される。「自動スケーリング」では、各データベクトルは、平均センタリングされ、単位分散スケーリングされる。この技術は、各記述子が等しく重み付けされ、大きい値と小さい値が等しい重要性で扱われるため、非常に有用である。これは、非常に低いが検出可能なレベルで発現される遺伝子にとって重要となることがある。
【０１１０】
一実施形態では、１つ以上の試験サンプルに関するデータが収集され、これらのデータが、本明細書で説明されるＰＡＭ５０分類モデルを用いて分類される。複数の分析からのデータを比較する（例えば、１つ以上の試験サンプルの発現プロフィールを、独立した試験で収集されて分析されたサンプルから構築されたセントロイドと比較する）場合、これらのデータセット全体に亘ってデータを正規化する必要がある。一部の実施形態では、これらのデータセットを一緒にするために距離重み付け区別（ＤＷＤ）が使用される（参照によりその全容が本明細書に組み入れられるＢｅｎｉｔｏら、（２００４）  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２０（１）：１０５−１１４）。ＤＷＤは、別々のデータセットに存在する系統的偏りを特定して、全体的に調整してこれらの偏りを補正することができる多変量解析ツールであり；本質的には、各別々のデータセットは、データポイントの多次元クラウド（ｍｕｌｔｉ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｃｌｏｕｄ）であり、ＤＷＤは、２つのポイントクラウドをとり、一方が他方により最適に重なるようにシフトさせる。
【０１１１】
本明細書で説明される方法は、この方法を実施することができ、かつ／または結果を記録することができる任意の装置を用いて実施することができ、かつ／または結果を記録することができる。使用できる装置の例には、限定されるものではないが、あらゆるタイプのコンピュータを含む電子計算装置が含まれ得る。本明細書で説明される方法が、コンピュータで実施され、かつ／または記録される場合は、この方法のステップを実施するためのコンピュータを構成するために使用できるコンピュータプログラムを、このコンピュータプログラムを保存できる任意のコンピュータ可読媒体に保存することができる。使用できるコンピュータ可読媒体の例には、限定されるものではないが、ディスケット、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、ならびに他のメモリおよびコンピュータ記憶装置が含まれる。この方法のステップを実施でき、かつ／または結果を記録するためのコンピュータを構成するために使用できるコンピュータプログラムは、電子ネットワーク、例えば、インターネット、イントラネット、または他のネットワークを介して提供することもできる。
【０１１２】
再発リスクの計算
固有サブタイプの文脈内での乳癌の転帰、および任意選択の他の臨床的変数を予測する方法が本明細書で提供される。転帰とは、全生存率または疾患特異的生存率、イベントフリー生存率、または特定の処置もしくは療法に応じた転帰のことである。特に、この方法は、長期に亘る無疾患生存確率を予測するために使用することができる。「乳癌患者の生存確率の予測」とは、原因となる乳癌の結果として患者が死亡するリスクを評価することである。「長期に亘る無疾患生存率」とは、最初の診断または処置から少なくとも５年、少なくとも１０年またはより長い年数の期間内に原因となる乳癌で患者が死亡しないし、患者が乳癌を再発もしないことを意味する。
【０１１３】
一実施形態では、転帰は、サブタイプに従った被験体の分類に基づいて予測される。この分類は、表１に列記されている固有遺伝子のリストを用いた発現プロファイリングに基づいている。サブタイプ割り当てを行うのに加えて、ＰＡＭ５０バイオインフォマティクスモデルは、試験サンプルの４つすべてのサブタイプに対する類似性の測定値を提供し、この測定値は、疾患状態および処置選択肢にかかわらず、あらゆる患者集団にも使用できる再発リスク（ＲＯＲ）スコアに変換される。固有サブタイプおよびＲＯＲはまた、例えば、ネオアジュバントのタキサンおよびアントラサイクリン化学療法（参照によりその全容が本明細書に組み入れられるＲｏｕｚｉｅｒら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２３：８３３１−９（２００５））で処置された女性における病理学的完全奏効の予測の値も提供する。したがって、本開示の様々な実施形態では、再発リスク（ＲＯＲ）モデルを使用して転帰を予測する。これらのリスクモデルを使用することにより、被験体を、低リスク、中リスク、および高リスク再発群に階層化することができる。ＲＯＲの計算は、処置の決定を導き、かつ／または療法に対する応答を監視するために予後情報を提供することができる。
【０１１４】
本明細書で説明される一部の実施形態では、ＰＡＭ５０によって決定された固有サブタイプおよび／または他の臨床パラメータの予後成績を、コックス比例ハザードモデル解析を利用して評価され、この解析は、ハザード比およびその信頼区間の推定を提供する生存データの回帰法である。このコックスモデルは、患者の生存と特定の変数との間の関係を利用する周知の統計技術である。この統計方法は、個体の予後変数（例えば、本明細書で説明される追加の臨床因子を有する、または有しない固有遺伝子発現プロフィール）が与えられた個体のハザード（すなわち、リスク）の推定を可能にする。「ハザード比」とは、特定の予後変数を示す患者のいずれかの時点での死のリスクのことである。一般的には、Ｓｐｒｕａｎｃｅら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ＆Ｃｈｅｍｏ．４８：２７８７−９２  （２００４）を参照されたい。
【０１１５】
本明細書で説明されるＰＡＭ５０分類モデルは、サブタイプ距離（または相関）のみを用いて、または上記説明された臨床的変数と共にサブタイプ距離を用いて再発のリスクについて訓練することができる。一実施形態では、試験サンプルのリスクスコアを、以下の式を用いて固有サブタイプ距離のみで計算することができる。
【０１１６】
ＲＯＲ＝０．０５＊基底＋０．１ｌ＊Ｈｅｒ２＋−０．２５＊ＬｕｍＡ＋０．０７＊ＬｕｍＢ＋−０．１ｌ＊正常
式中、変数「基底」、「Ｈｅｒ２」、「ＬｕｍＡ」、「ＬｕｍＢ」、および「正常」は、試験サンプルからの発現プロフィールが、アクセッション番号ＧＳＥ２８４５としてＧｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）に預けられた遺伝子発現データを用いて作成されたセントロイドに対して比較されたときのそれぞれのクラシファイアのセントロイドに対する距離である。
【０１１７】
リスクスコアは、同様に、以下の式を用いて、乳癌サブタイプと臨床的変数である腫瘍サイズ（Ｔ）とリンパ節状態（Ｎ）の組み合わせを用いて計算することができる。
ＲＯＲ（完全）＝０．０５＊基底＋０．１＊Ｈｅｒ２＋−０．１９＊ＬｕｍＡ＋０．０５＊ＬｕｍＢ＋−０．０９＊正常＋０．１６＊Ｔ＋０．０８＊Ｎ
同様に、試験発現プロフィールが、アクセッション番号ＧＳＥ２８４５としてＧＥＯに預けられた遺伝子発現データを用いて作成されたセントロイドに対して比較されたときのものである。
【０１１８】
なお別の実施形態では、試験サンプルのリスクスコアは、以下の式を用いて固有サブタイプ距離のみで計算される。
【０１１９】
ＲＯＲ−Ｓ＝０．０５＊基底＋０．１２＊Ｈｅｒ２＋−０．３４＊ＬｕｍＡ＋０．０．２３＊ＬｕｍＢ
式中、変数「基底」、「Ｈｅｒ２」、「ＬｕｍＡ」、および「ＬｕｍＢ」は、上記説明の通りであり、試験発現プロフィールが、アクセッション番号ＧＳＥ２８４５としてＧＥＯに預けられた遺伝子発現データを用いて作成されたセントロイドに対して比較される。なお別の実施形態では、リスクスコアは、以下の式（変数は上記説明のとおりである）を用いて、乳癌サブタイプと臨床的変数である腫瘍サイズ（Ｔ）との組み合わせを用いて計算することもできる。
ＲＯＲ−Ｃ＝０．０５＊基底＋０．１１＊Ｈｅｒ２＋−０．２３＊ＬｕｍＡ＋０．０９＊ＬｕｍＢ＋０．１７＊Ｔ
Ｈｅｒ２＋サブタイプの検出
エストロゲン（ＥＲ）、プロゲステロン（ＰｇＲ）、ＨＥＲ２、およびＫｉ６７の免疫組織化学を、色原体として３，３’−ジアミノベンジジンを用いる標準的なストレプトアビジン−ビオチン複合体法で連続切片に対して同時に行った。ＥＲ、ＰｇＲ、およびＨＥＲ２の解釈のための染色を、既に説明したように行うことができるが（Ｃｈｅａｎｇら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００８；１４（５）：１３６８-１３７６）、当分野で公知の任意の方法を使用することもできる。
【０１２０】
例えば、Ｋｉ６７抗体（クローンＳＰ６；ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）を１：２００の希釈となるように添加して３２分間インキュベートし、次いでＶｅｎｔａｎａ  Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ自動免疫染色装置（Ｖｅｎｔａｎａ，Ｔｕｃｓｏｎ  ＡＺ）の標準的なＣｅｌｌ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｒ  １（商品名ＣＣ１の緩衝液）プロトコルに従って９８℃で３０分間インキュベートした。ＥＲ抗体（クローンＳＰ１；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｆｒｅｍｏｎｔ  ＣＡ）を、１：２５０の希釈で使用し、１０分間インキュベートし、８分間のマイクロウエーブ後、抗原を１０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ  ６．０）で回収することができる。すぐに使用できるＰＲ抗体（クローン１Ｅ２；Ｖｅｎｔａｎａ）を、上記のようにＣＣ１プロトコルに従って使用することができる。ＨＥＲ２染色を、スチーマで３０分間、９５℃で加熱して０．０５Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ  １０．０）で抗原を回収した後に、１：１００に希釈したＳＰ３抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で行うことができる。ＨＥＲ２蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）アッセイでは、製造業者の取扱説明書に従うが、既に説明したように前処置およびハイブリダイゼーションに変更を加えて、ＰａｔｈＶｙｓｉｏｎ  ＨＥＲ−２  ＤＮＡプローブキット（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）を使用することにより、スライドを、プローブを用いてＬＳＩ（領域特異的プローブ（ｌｏｃｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ））ＨＥＲ２／ｎｅｕおよび動原体１７にハイブリダイズさせることができる（Ｂｒｏｗｎ  ＬＡ，Ｉｒｖｉｎｇ  Ｊ，Ｐａｒｋｅｒ  Ｒら、「高悪性度卵巣表面上皮癌におけるＥＭＳＹ、１１ｑ１３上の新規な癌遺伝子の増幅（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＥＭＳＹ，ａ  ｎｏｖｅｌ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｏｎ  １１ｑ１３，ｉｎ  ｈｉｇｈ  ｇｒａｄｅ  ｏｖａｒｉａｎ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．）」  Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｏｎｃｏｌ．２００６；１００（２）：２６４-２７０）。次いで、スライドを４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールで対比染色することができ、染色された物質を、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｌａｎ落射蛍光顕微鏡で可視化し、そしてＭｅｔａｆｅｒ画像収集システム（Ｍｅｔａｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｔｌｕｓｓｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）でシグナルを分析した。次いで、免疫組織化学アッセイによるバイオマーカーの発現に２人の病理学者がスコアを付けることができ、これらの病理学者は、臨床病理学的特性および転帰について盲検化され、他の乳癌のコホートに対して開発されたバイオマーカー発現レベルについての、既に確立されて公表された基準を使用した。
【０１２１】
既に説明したように、腫瘍核の１％を超えて免疫染色が観察された場合、腫瘍は、ＥＲまたはＰＲに対して陽性であると見なされた。免疫染色が、ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ基準に従って３＋のスコアが付けられた場合は、腫瘍は、ＨＥＲ２に対して陽性であると見なされ、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの増幅比２．０以上が、免疫組織化学的に曖昧な腫瘍（２＋のスコア）を分離するために使用されるカットポイントである（Ｙａｚｉｊｉら、ＪＡＭＡ，２９１（１６）：１９７２-１９７７  （２００４））。Ｋｉ６７には、２人の病理学者によって、陽性免疫染色が背景レベルよりも高い腫瘍細胞核の割合について視覚的にスコアが付けられた。
【０１２２】
他の方法を用いても、Ｈｅｒ２＋サブタイプを検出することができる。これらの技術には、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、ノーザンブロット、またはＦＡＣＳ分析が含まれる。
【０１２３】
キット
本開示は、乳癌固有サブタイプの分類および／またはアントラサイクリンにより応答する乳癌を識別する予後情報の提供に有用なキットについて述べる。このようなキットは、細胞をＨｅｒ２＋として分類するために、表１に列記されている固有遺伝子に特異的な捕捉プローブおよび／またはプライマーのセット、ならびにＨｅｒ２の検出および／または定量を容易にするのに十分な試薬を含む。好ましくは、キットは、表１に列記されている少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５の固有遺伝子、もしくは５０すべての固有遺伝子に特異的な捕捉プローブおよび／またはプライマーのセットを含む。キットは、コンピュータ可読媒体をさらに含み得る。
【０１２４】
本開示の一実施形態では、捕捉プローブは、アレイ上に固定される。「アレイ」とは、ペプチドまたは核酸プローブが取り付けられた固体支持体または基板のことである。アレイは、典型的には、異なる既知の位置にある基板表面に結合された複数の異なる捕捉プローブを備えている。本開示のアレイは、固有遺伝子発現産物に特異的に結合できる複数の捕捉プローブを有する基板を含む。基板上の捕捉プローブの数は、アレイの意図する目的によって異なる。アレイは、低密度アレイであっても高密度アレイであっても良く、４以上、８以上、１２以上、１６以上、または３２以上のアドレスを備えることができるが、最小限でも、表１に列記されている少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５の固有遺伝子、もしくは５０すべての固有遺伝子に対する捕捉プローブを備える。
【０１２５】
機械合成法を用いるこのようなアレイの合成技術は、例えば、参照によりその全容が本明細書に組み入れられる米国特許第５，３８４，２６１号に記載されている。アレイは、実質的にあらゆる形状の表面、または複数の表面にさえも形成することができる。アレイは、ビーズ、ゲル、ポリマー表面、ファイバー、例えば、光ファイバー、ガラス、または任意の他の適切な基板上のプローブ（例えば、核酸結合プローブ）とすることができ、参照によりそれらの全容が本明細書に組み入れられる、米国特許第５，７７０，３５８号、同第５，７８９，１６２号、同第５，７０８，１５３号、同第６，０４０，１９３号、および同第５，８００，９９２号を参照されたい。アレイは、デバイス上で診断または他の操作ができるようにパッケージングすることができる。例えば、参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第５，８５６，１７４号および同第５，９２２，５９１号を参照されたい。
【０１２６】
別の実施形態では、キットは、表１に列記されている固有遺伝子のそれぞれの検出および／または定量に十分なオリゴヌクレオチドプライマーのセットを含む。好ましくは、キットは、表１に列記されている少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５の固有遺伝子、もしくは５０すべての固有遺伝子の検出および／または定量に十分なオリゴヌクレオチドプライマーのセットを含む。オリゴヌクレオチドプライマーは、凍結乾燥形態または水で戻す形態で提供しても良いし、あるいはヌクレオチド配列のセットとして提供しても良い。一実施形態では、プライマーは、マイクロプレート形式で提供され、各プライマーのセットが、マイクロプレートの１つのウェル（または、複製の場合には複数のウェル）を占有する。マイクロプレートは、以下に説明される１つ以上のハウスキーピング遺伝子の検出に十分なプライマーをさらに含み得る。キットは、表１に列記されている遺伝子の発現産物の増幅に十分な試薬および取扱説明書をさらに含み得る。
【０１２７】
例えば、比較、精査、回収、および／または変更のために容易なアクセスを促進するために、分子シグネチャ／発現プロフィールが、典型的には、データベースに記録される。最も典型的には、データベースは、計算機によってアクセス可能なリレーショナルデータベースであるが、他の形式、例えば、写真、アナログまたはデジタル画像読み出し情報などのような手動でアクセス可能な発現プロフィールのインデックスファイルも使用することができる。最初に記録される発現パターンの性質がアナログまたはデジタルであるかにかかわらず、発現パターン、発現プロフィール（集合的発現パターン）、および分子シグネチャ（相関した発現パターン）が、デジタルで記録され、データベースを介してアクセスされる。典型的には、データベースは、中心施設でコンパイルされて維持され、構内および／または遠隔からアクセス可能である。
【０１２８】
一定の実施形態では、キットは、Ｈｅｒ−２の発現レベルを見出すために使用される物質も含む。この物質は、抗体または核酸プローブとすることができる。このような物質は、ＦＩＳＨ、ＩＨＣ、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、ノーザンブロット、またはＦＡＣＳ分析を用いてＨｅｒ−２を検出するために使用することができる。任意選択で、キットは、サンプルにおいて、Ｈｅｒ−２発現の検出物質の検出およびＨｅｒ−２発現の定量を可能にする試薬も含む。
【実施例】
【０１２９】
実施例１．ＰＡＭ５０および免疫組織化学（ＩＨＣ）および蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いた腫瘍の分類
この試験では、ＰＡＭ５０遺伝子セットを、ＮＣＩＣ−ＣＴＧ  ＭＡ．５試験からの４７６の遡及的に収集された腫瘍標本に添加した。この試験は、閉経前の節陽性乳癌の女性を無作為に選択してＣＭＦアジュバント化学療法とＣＥＦアジュバント化学療法を比較する前向き臨床試験である。
【０１３０】
材料と方法
患者および処置計画
ＭＡ．５第ＩＩＩ相試験は、７１６人の閉経前の節陽性乳癌の女性に対する無作為対照試験とした（Ｌｅｖｉｎｅら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．，１６（８）：２６５１−８（１９９８）；Ｌｅｖｉｎｅら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．，２３（２２）：５１６６−７０  （２００５））。簡単に述べると、１９８９年〜１９９３年の間に発症した患者を無作為に選択して、ＣＥＦまたはＣＭＦ処置計画を実施した。アジュバントＣＥＦ処置計画は、第１日目と第８日目に共に静脈内投与されるエピルビシン  ６０ｍｇ／ｍ２および５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）  ５００ｍｇ／ｍ２、ならびに第１日目〜第１４日目まで毎日経口投与されるシクロホスファミド  ７５ｍｇ／ｍ２の６回のサイクルを含んでいた。アジュバントＣＭＦ投薬計画は、第１日目と第８日目に共に静脈内投与されるメトトレキセート  ４０ｍｇ／ｍ２および５−ＦＵ  ６００ｍｇ／ｍ２、ならびに第１日目〜第１４日目まで毎日経口投与されるシクロホスファミド  １００ｍｇ／ｍ２の６回のサイクルを含んでいた。
【０１３１】
免疫組織化学、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、および組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）
５４９の保存標本（７７％）を、組織マイクロアレイの構築のために入手した。ＴＭＡコホートとＭＡ．５試験患者との間には臨床病理学的特性の有意差は存在しなかった。免疫組織化学染色法、ならびにＥＲ、ＰｇＲ、Ｈｅｒ２、Ｋｉ−６７、ＥＧＦＲ、およびＣＫ  ５／６の解釈は、予め明示され、公表された方法を用いて行った（Ｃｈｅａｎｇら、Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，１０１（１０）：７３６−５０  （２００９）およびＣｈｅａｎｇら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１４（５）：１３６８−７６  （２００８））。Ｈｅｒ２／ＮｅｕおよびＴＯＰ２Ａの増幅を、既に説明したように蛍光ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によって測定した（Ｐｒｉｔｃｈａｒｄら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．，３５４（２０）：２１０３−１１  （２００６）；Ｏ’Ｍａｌｌｅｙら、Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，１０１（９）：６４４−５０  （２００９））。この試験においてＨｅｒ２状態を決定するために、ＦＩＳＨデータ（増幅比≧２．０）を使用して免疫組織化学的に曖昧な（２＋）結果を分離した。欠測バイオマーカーデータにより、３８のケースにおけるサブタイプ割り当てを除外した。バイオマーカー発現は、臨床転帰に対して盲検化された認定病理学者が解釈した。
【０１３２】
ＲＮＡ調製、ｑＲＴ−ＰＣＲ、および固有サブタイプの割り当て
ｑＲＴ−ＰＣＲをベースとするＰＡＭ５０遺伝子発現試験のために４７６の腫瘍（６７％）を入手した。ｑＲＴ−ＰＣＲコホートとＭＡ．５試験患者との間には臨床病理学的特性の有意差は存在しなかった（表３）。図１は、ＲｅＭＡＲＫガイドライン（ＭｃＳｈａｎｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．  ２００５；９７：１１８０−４）に従った試験デザインの要約である。患者の特徴を、ｑＲＴ−ＰＣＲ  ＰＡＭ５０アッセイにより、固有サブタイプによって階層化した。
【０１３３】
【表３−１】
0005971769.tif 000048
【０１３４】
【表３−２】
0005971769.tif 000049
各ブロックからのＨ＆Ｅ切片を病理学者（Ｔ．Ｏ．Ｎ．）が精査した。代表的な浸潤性乳癌を含む領域を選択し、ソースブロックを円で囲んだ。１．０ｍｍパンチ針を用いて、少なくとも２つの腫瘍コアを円で囲んだ領域から抽出した。パラフィンコアからのＲＮＡ調製の詳細、ＰＡＭ５０パネルおよび基準遺伝子についてのｑＲＴ−ＰＣＲアッセイ、ならびに腫瘍サンプルを、上記説明されたように管腔Ａ、管腔Ｂ、ＨＥＲ２富化、基底様、および正常様サブタイプに分類した（Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１６（２１）：５２２２−３２  （２０１０）；Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．，２７（８）：１１６０−７  （２００９））。また、ＲＯＲ−Ｓ（サブタイプに基づいたＲＯＲ）リスクスコア割り当てを、既に説明されたように各腫瘍について計算した。
ＲＯＲ−Ｓ＝（０．０５）＊基底＋（０．１２）＊ＨＥＲ２−Ｅ＋（−０．３４）＊ＬｕｍＡ＋（０．２３）＊ＬｕｍＢ
予め指定されたカットポイントにより、患者を、ＲＯＲ−Ｓスコアが２３未満の場合には低リスク、ＲＯＲ−Ｓスコアが２３〜５３の場合には中リスク、そしてＲＯＲ−Ｓが５３以上の場合には高リスクと分類した。すべての遺伝子発現の試験およびクラシファイアを、臨床転帰の情報なしで、すべての腫瘍標本に対して行った。
【０１３５】
固有サブタイプとリスククラシファイアの臨床的相関
固有サブタイプ、リスククラシファイア、およびバイオマーカーのデータを、予め定められた仮説の独立した分析のためにＮＣＩＣ臨床試験群統計センターに送った。ＭＡ．５の主要転帰は、無再発生存率（ＲＦＳ）および全生存率（ＯＳ）であった。ＲＦＳは、無作為割り当てから、限局胸壁再発、局所再発、または遠隔再発を含むあらゆる再発までの時間と定義した。ＯＳは、あらゆる原因によるすべての死と定義した。固有サブタイプの生存予測およびリスククラシファイアを、カプラン−マイヤー曲線を用いてプロットし、ログランク検定とウイルコクソン検定の両方によって比較した。単変量コックス比例ハザード回帰モデルを使用して、単一共変量のハザード比（ＨＲ）および関連する９５％信頼区間（ＣＩ）を得た。多変量コックス回帰分析を、共変量として処置、固有サブタイプ、およびそれらの相互作用と共に使用して、処置と固有サブタイプとの間の相互作用の有意性を決定した。これらの多変量コックスモデルを、年齢（≧５０歳と＜５０歳）、陽性リンパ節の数（＜４と≧４）、エストロゲン受容体レベル（≧１０ｆｍｏｌ／ｍｇと＜１０ｆｍｏｌ／ｍｇ）、外科手術の種類（全乳房切除術と女房部分切除術）、および腫瘍サイズ（Ｔ１、Ｔ２、またはＴ３）について調整した。臨床的変数のサブタイプとの関連性を、カイ二乗検定またはフィッシャーの直接確率検定を用いて調べた。
【０１３６】
Ｃ−インデックス（コンコーダンスインデックス）（Ｈａｒｒｅｌｌら、Ｓｔａｔ  Ｍｅｄ．，１５（４）：３６１−８７（１９９６））は、無作為対のメンバーに対するリスク割り当てが、それらの予後に従って正確にランク付けられる確率として定義した。一致対（障害の等級（ｏｒｄｅｒ  ｏｆ  ｆａｉｌｕｒｅ）とリスク割り当てが一致）の数、不一致対（障害の等級とリスク割り当てが不一致）の数、および情報に価値のない対の数を表にして基準を算出した。固有サブタイプ、ＲＯＲ−Ｓ、Ｈｅｒ２状態、およびＴＯＰ２ＡのＣ−インデックスを、各処置群によって階層化された患者の転帰におけるそれらの予測について比較した。固有サブタイプと標準的な臨床病理学的特性およびバイオマーカー発現との関連性を、カイ二乗検定またはフィッシャーの直接確率検定を用いて決定した。
【０１３７】
結果
ｑＲＴ−ＰＣＲをベースとするＰＡＭ５０遺伝子発現試験を用いて、４７６の腫瘍の３１％をＬｕｍＡサブタイプ、２３％をＬｕｍＢサブタイプ、２２％をＨｅｒ２−Ｅサブタイプ、２０％を基底様サブタイプ、そして４％を正常様サブタイプとして分類した。臨床ＥＲ状態は、当初は、デキストラン被覆チャコール（ＤＣＣ）アッセイを用いて発生時に決定した。予想通り、ＬｕｍＡ腫瘍の８８％およびＬｕｍＢ腫瘍の９６％がＥＲ陽性であり、Ｈｅｒ２−Ｅの５０％および基底様の９０％がＥＲ陰性であった（表３）。ＩＨＣによって評価されたＥＲ状態によると、ＬｕｍＡの９０％、ＬｕｍＢの９５％、ＨＥＲ２−Ｅの４４％、および基底様の９％が、１％カットオフを陽性に用いるとＥＲ陽性であった。ＲＴ−ｑＰＣＲによって測定されるＥＳＲ１遺伝子発現レベルとＤＣＣによるＥＲとが正に相関していた（ｒ＝０．７１、ｐ＜０．０００１）。ＬｕｍＢサブタイプ、Ｈｅｒ２−Ｅサブタイプ、および基底様サブタイプは、高悪性度腫瘍に関連していた。サブタイプと陽性リンパ節の数、外科手術の種類、およびアジュバント化学療法計画のそれぞれとに有意な関連性が存在しなかった。
【０１３８】
実施例２．ｑＲＴ−ＰＣＲ  ＰＡＭ５０による固有サブタイプと生存率およびサブセット分析との関連性
全コホートに対して分析すると、固有サブタイプは、異なる無再発生存率および全生存率の推定値と有意に関連していた（表４）。
【０１３９】
【表４】
0005971769.tif 000050
これらの結果により、投薬計画の種類にかかわらず、アジュバント化学療法で処置された患者のサブタイプの予後値が確認された。この試験では、ＲＯＲ−Ｓ低リスク群（ｎ＝７９）のすべてを、ＬｕｍＡとして分類した。ＲＯＲ−Ｓ中リスク群（ｎ＝２０２）では、３３％をＬｕｍＡ、３９％をＬｕｍＢ、２１％をＨＥＲ２−Ｅ、そして７％を基底様と分類した。ＲＯＲ−Ｓ高リスク群（ｎ＝１７４）では、３６％をＨＥＲ２−Ｅとして、４６％を基底様として、そして１８％をＬｕｍＢとして分類した。ＲＯＲ−Ｓリスククラシファイアは、明確な生存率の差異に有意に関連していた（ログランク  ｐ＜０．０００１）：低リスク群（５年でＲＦＳが７５％およびＯＳが９４％）は、中リスク群（５年でＲＦＳが５９％およびＯＳが８０％）および高リスク群（５年でＲＦＳが５１％およびＯＳが５３％）のそれぞれと比較して最も好ましい臨床転帰を示した（表４）。
【０１４０】
ＣＭＦ処置コホート内では、固有サブタイプは、有意で明確なＲＦＳおよびＯＳに関連していた（ログランク  ｐ＜０．０００１、表５）。ＨＥＲ２−Ｅ腫瘍を有する患者は、最も悪い臨床転帰であり、他の各サブタイプよりも有意に悪かった（表５）。ＨＥＲ２−Ｅ腫瘍を有する患者は、基底様群と比較して有意に悪い転帰をさらに有し、再発するハザード比が２．０８、死に至るハザード比が１．６９であった（表６）。対照的に、基底様サブタイプは、この非アントラサイクリン、ＣＭＦ処置群におけるＬｕｍＡまたはＬｕｍＢ腫瘍の患者と比較して、無再発生存率において統計学的に有意な差異がなかった。２つのＥＲ陽性サブタイプを比較すると、ＬｕｍＢ腫瘍は、ＬｕｍＡよりも悪い予後を有し、再発するハザード比が２．０、死に至るハザード比が２．４４であった（表６）。予め指定されたＲＯＲ−Ｓリスククラシファイアによって定義された３つの生存リスク群は、明確なＲＦＳおよびＯＳ推定値に有意に関連していた（図２ａ−図２ｂ）。低リスク群（ｎ＝４１）は、中リスク群（ｎ＝１０１）と比較すると５年ＲＦＳで絶対的に１２％高く、５年ＯＳで１６％高く、高リスク群（ｎ＝９２）と比較すると５年ＲＦＳで２９％高く、５年ＯＳで４３％高かった。
【０１４１】
ＣＥＦ処置群では、固有サブタイプは、両方のエンドポイントについてそれほど明確でない差異を示した（ログランクは、ＲＦＳに対してｐ＝０．６４、ＯＳに対してｐ＝０．０９、表５）。ＨＥＲ２−Ｅサブタイプ、基底様サブタイプ、およびＬｕｍＢサブタイプの患者は、臨床転帰が同等に不良であり、ＬｕｍＡサブタイプの患者は、予後が最良であった（表５）。ログランク検定により、基底様サブタイプのみが、ＬｕｍＡよりも統計的に有意に不良の予後であり、ＯＳエンドポイントで明らかであった（表６）。このＣＥＦ群では、ＲＯＲ−Ｓで定義されたリスク群は、有意に異なる生存率を有していた（図２ｃ−図２ｄ）。低リスク群（ｎ＝３８）は、中リスク群（ｎ＝１０１）と比較すると５年ＲＦＳで絶対的に２０％高く、５年ＯＳで１３％高く、高リスク群（ｎ＝８２）と比較すると５年ＲＦＳで１８％高く、５年ＯＳで３８％高かった。５年以内に発生した高リスク群における殆どすべての事象、および中リスク群と高リスク群との間の差異は、統計的有意に達しなかった。
【０１４２】
【表５】
0005971769.tif 000051
【０１４３】
【表６】
0005971769.tif 000052
実施例３．固有サブタイプ全体に亘る選択的な処置の恩恵
ＭＡ．５試験に利用可能なパラフィンブロックに包埋されたＭＡ．５試験サブセットでは、アントラサイクリンを含まない投薬計画よりもアントラサイクリンを含む投薬計画で生存率が改善される傾向であり、メトトレキセートを含むコントロール群（図３Ａおよび図３Ｂ）は、全体として臨床試験について既に報告された生存率と同等であった。ＨＥＲ２−Ｅ腫瘍では、ＣＥＦがＣＭＦよりも大きな恩恵をもたらすことを示し（図３Ａおよび図３Ｂ）、５年ＲＦＳで２１％高く、５年ＯＳで２０％高いことが観察された（図４Ａおよび図４Ｅ）。ＨＥＲ２−Ｅサブタイプとアントラサイクリン感受性との間の相互作用は、両方のエンドポイントにおいて有意であった（図３Ａおよび図３Ｂ、ｐ＝０．０３）。対照的に、基底様腫瘍では、ＣＥＦがＣＭＦに対して生存率で優位ではなく、ＣＭＦ群の方が５年ＯＳで１０％高いことが観察され、逆の傾向であった（図４ｆ）。増幅遺伝子の発現で著しく異なる２つの管腔サブタイプ間の処置効果の差異も比較した。多変量コックス回帰分析の結果は、ＬｕｍＢ腫瘍の患者が、ＣＥＦで処置された時により良い生存率の傾向であり、ＬｕｍＡ腫瘍の患者が、ＣＭＦで処置された時により良い生存率である傾向を示唆した（図３Ａおよび図３Ｂ、ならびに図４Ｃ−図４Ｄおよび図４ｇ−図４ｈ）。しかしながら、ＬｕｍＡおよびＬｕｍＢサブタイプによる処置についての相互作用試験は有意でなかった（ＲＦＳ  ｐ＝０．２５；ＯＳ  ｐ＝０．１１）。
【０１４４】
したがって、ＣＥＦのＣＭＦに対する比較に関連した、観察された相対的な無再発生存率および全生存率のリスクの低下は、ＨＥＲ２−Ｅでは、それぞれ４４％および３８％であり、ＬｕｍＢでは、それぞれ２４％および１７％であった。他方、ＣＭＦのＣＥＦに対する比較（すなわち、逆のパターンの薬物感受性、ＣＭＦが有利）に関連した、観察された相対的な無再発生存率および全生存率のリスクの低減は、基底様では、それぞれ１１％および２４％であり、ＬｕｍＡでは、それぞれ１２％および４２％であった。ＨＥＲ２−Ｅ群だけで、差異が統計的に有意に達した。
【０１４５】
実施例４．アントラサイクリン感受性の予測におけるＨｅｒ２−Ｅサブタイプの臨床Ｈｅｒ２状態に対する比較
ＰＡＭ５０によるＨＥＲ２−Ｅサブタイプは、臨床Ｈｅｒ２陽性に有意に関連していた（ｐ＜０．００１）。ＨＥＲ２−Ｅサブタイプ腫瘍の６８％（７１／１０５）が、ＩＨＣ／ＦＩＳＨ分析によって臨床的にＨｅｒ２陽性であった。他のサブタイプでは、ＬｕｍＡの６％（９／１４５）、ＬｕｍＢの７％（８／１１０）、および基底様の２％（２／９４）が、ＩＨＣ／ＦＩＳＨによってＨｅｒ２陽性であった。
【０１４６】
臨床Ｈｅｒ２状態は、ＭＡ．５においてＣＭＦよりもＣＥＦで改善された生存率であることの有意な予測因子であることを既に示し（Ｐｒｉｔｃｈａｒｄら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．  ２００６；３５４：２１０３−１１）、結果は、この試験のサブセットでも観察された（表７）。
【０１４７】
【表７】
0005971769.tif 000053
したがって、ＰＡＭ５０をベースとするＨＥＲ２−Ｅサブタイプおよび臨床Ｈｅｒ２状態の精度および有意性をバイオマーカーとして比較して患者の転帰を予測した。多変量コックス回帰分析を用いると、ＨＥＲ２−Ｅサブタイプで観察された処置相互作用が、臨床Ｈｅｒ２状態で補正したときに有意に独立したままであった（表８）。臨床Ｈｅｒ２状態における処置相互作用も、ＨＥＲ２−Ｅサブタイプ状態で補正したときに独立したままであった。これらの結果は、臨床Ｈｅｒ２状態および遺伝子発現ＨＥＲ２−Ｅサブタイプが、相関しているが同等ではないことを示唆し、さらに、遺伝子発現によって患者をＨＥＲ２−Ｅサブタイプとすることにより、Ｈｅｒ２試験単独で得られるものを超えた潜在的臨床的価値の独立情報が得られることを示唆している。
【０１４８】
【表８】
0005971769.tif 000054
アントラサイクリンの恩恵が、ＰＡＭ５０によりＨＥＲ２−Ｅとしても割り当てられたＨｅｒ２＋  腫瘍の殆どに与えられるという事後仮説をたてた。この仮説に一致して、ＣＥＦで処置されたＨｅｒ２＋  ＨＥＲ２−Ｅ腫瘍サブセットは、ＣＭＦに対して無作為化されたものと比較したときに、無再発生存率（５年ＲＦＳで絶対的に４０％高い）および全生存率（５年ＯＳで絶対的に３５％高い）において特に大きな恩恵を受けた（表９）。臨床Ｈｅｒ２陰性／弱い腫瘍の中で、ＰＡＭ５０によるＨＥＲ２−Ｅ腫瘍の患者は、ＣＥＦからＣＭＦに勝る恩恵を受けないようであった（表９）。試験数は少ないが、これらのデータは、ＨＥＲ２−Ｅ  ＰＡＭ５０サブタイプにも割り当てられた陽性臨床Ｈｅｒ２は、メトトレキセートの代わりであるアントラサイクリンの生存率の恩恵についての最良の予測因子であろう。各試験群における腫瘍のＨＥＲ２−Ｅサブタイプに対する相関と生存率との間に線形の関係が存在するか否かをさらに調べるために予備分析を行った。図５Ａおよび図５Ｂは、ＣＥＦのＣＭＦに勝る恩恵と、連続予測因子としてのプロトタイプＨＥＲ２−Ｅセントロイドに対する腫瘍の関連性との間の関係を例示している。予測された５年無再発生存率および全生存率は、腫瘍のＨＥＲ２−Ｅ成分を含むコックスモデルから推定した（すなわち、腫瘍中に存在するＨＥＲ２−Ｅ含量が多ければ多いほど、ＨＥＲ２−Ｅセントロイド値が大きくなる）。この分析は、腫瘍がＨＥＲ２−Ｅセントロイドに反相関する場合は、ＣＭＦの恩恵がＣＥＦの恩恵に僅かに勝ることを実証し、腫瘍がＨＥＲ２−Ｅセントロイドと正に相関する場合は、ＣＥＦの恩恵がＣＭＦの恩恵に著しく勝ることを実証している。腫瘍中のＨＥＲ２−Ｅの含量が多ければ多いほど、ＣＭＦで処置された場合の５年ＲＦＳ率およびＯＳ率が低くなる。
【０１４９】
【表９】
0005971769.tif 000055
考察
この試験では、アントラサイクリン化学療法と非アントラサイクリン化学療法に無作為に選択された患者のコホートにおいて固有サブタイプの予測値を試験した。ＰＡＭ５０アッセイを用いて識別された固有サブタイプ、特にＨｅｒ２−Ｅサブタイプは、アジュバントアントラサイクリンをベースとする化学療法から最も恩恵を受け得る患者を選択するためのさらなる重要な予測値を提供することが分かった。ＥＲ陽性腫瘍は、管腔Ａおよび管腔Ｂを含む、それらを構成する固有サブタイプに分類され、ＣＥＦで処置した場合は、これらのサブ群において統計的に有意な生存率の上昇を検出することができなかった。
【０１５０】
アントラサイクリンをベースとする化学療法は、恐らく、長期に亘る心毒性との有意な関連にもかかわらず、早期乳癌の最も一般的な通常のアジュバント療法である（Ｄｏｙｌｅら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．，２３（３４）：８５９７−６０５  （２００５））。臨床業務における処置のこの好ましい選択は、その殆どが、アントラサイクリンをベースとする化学療法が、非アントラサイクリンをベースとする療法よりも全生存率および無疾患生存率で４％高いことを示す無作為試験からのデータのメタ分析によって支持されている（ＥＢＣＴＣＧ，Ｌａｎｃｅｔ，３６５（９４７２）：１６８７−７１７  （２００５））。これまで、非アントラサイクリンをベースとする療法よりもアントラサイクリンをベースとする化学療法において、固有サブタイプ全体に対する選択的な処置の恩恵がもたらされるか否かについての報告は存在しない。
【０１５１】
ここで、ＭＡ．５試験の分析により、スピアマンのＨＥＲ２−Ｅセントロイドに対する相関（すなわち、典型的なＨＥＲ２−Ｅ腫瘍の平均発現プロフィールに類似した定量測定）が、アジュバントＣＭＦまたはＣＥＦに対する腫瘍の感受性を推定する有用なツールであることが示された。データは、アントラサイクリンの相対的感受性が、ＨＥＲ２−Ｅサブタイプセントロイド類似性の範囲全体に亘ってほぼ一定に維持されたことが実証した。他方、アジュバントＣＭＦの恩恵とＨＥＲ２−Ｅサブタイプセントロイドとの間に負の相関関係が存在するようであった。したがって、データは、標準的な臨床アッセイ、例えば、Ｈｅｒ２状態に加えて、アントラサイクリン感受性腫瘍を識別するための、定量測定としてＨＥＲ２−Ｅサブタイプセントロイドの推定値を示している。
【０１５２】
基底様乳癌は、ホルモン受容体およびＨｅｒ２陰性の両方であり、従って既存の標的療法に対して非感受性であるため、特定の臨床課題を提示する。乳癌におけるネオアジュバント化学療法の試験により、臨床的および病理学的応答率が、基底様癌では高い傾向であることが実証され（Ｒｏｕｚｉｅｒら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００５；１１：５６７８−８５、Ｃａｒｅｙら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００７；１３：２３２９−３４、Ｌｉｅｄｔｋｅら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．  ２００８；２６：１２７５−８１）、これらの腫瘍の通常の化学療法に対する感受性を裏付けている。本明細書に記載される結果は、アントラサイクリンが、基底様乳癌の処置に対する必須の化学療法成分ではない可能性があることを示した。ＣＥＦで処置されたこれらの腫瘍を有する患者は、ＣＭＦで処置された患者に比べて死亡率が相対的に３２％高い。ハザード比に対する９５％信頼区間は、０．７〜２．５の範囲である。データは、ＣＭＦが、これらの腫瘍に対してＣＥＦと同等またはＣＥＦよりも良好である可能性があるが、ＣＥＦが、基底様腫瘍ではＣＭＦに対して３０％良好から５０％不良までの範囲である可能性があることを示している。
【０１５３】
管腔Ｂ乳癌は、対応するＥＲ陽性／管腔Ａ腫瘍よりも有意に予後の悪い高増殖性ＥＲ陽性腫瘍である（Ｃｈｅａｎｇら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．  ２００９；１０１：７３６−５０）。これらの管腔Ｂ腫瘍は、化学的感受性があり、一般に細胞毒性薬に応答する。Ｐａｉｋらにより、Ｏｎｃｏｔｙｐｅ  Ｄｘ（登録商標）高リスク群が、追加アジュバントＣＭＦの大きな恩恵を受け、ＮＳＡＢＰ−Ｂ２０試験におけるタモキシフェン単独の群と比較した場合に遠位再発リスクが絶対的に２８％低下することが報告された（Ｐａｉｋら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ：ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．  ２００６；２４：３７２６−３４）。本明細書に記載されるデータは、管腔Ｂ腫瘍において、ＣＥＦで生存率が良好である傾向があるが、アントラサイクリンを含むアジュバント化学療法とアントラサイクリンを含まないアジュバント化学療法との間に大きな生存率の差異が存在しないことを示している。この試験における患者の３１％である管腔Ａ腫瘍は、アントラサイクリンをベースとする処置を行うことができる患者の別の大きなサブセットを構成するようである。
【０１５４】
本発明はまた、アジュバントＣＭＦ投薬計画およびアジュバントＣＥＦ投薬計画のそれぞれのＲＯＲ−Ｓリスククラシファイアの予後値の評価も提供する。ＲＯＲ−Ｓクラシファイアは、節陰性未処置患者の独立コホートを用いて固有サブタイプの生物学に基づいて既に作成され定義されていた（Ｐａｒｋｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ：ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．  ２００９；２７：１１６０−７））。データは、３つの予め定義されたリスク群が、両方の処置群の生存率の差異に有意に関連し、５年以内で最も顕著であることを立証した。ＲＯＲ−Ｓリスク群は、固有サブタイプクラシファイアに大いに関連しているが、データは、ＲＯＲ−Ｓが、アジュバントＣＭＦおよびＣＥＦに対する患者の生存率を推定するための予後情報を臨床医に提供できることも示した。
【０１５５】
本発明は、固有サブタイプが、臨床Ｈｅｒ２状態を超えて、アントラサイクリン化学療法と非アントラサイクリン化学療法とを対比する独立した推定値を提供することを実証した。データは、ＨＥＲ２−Ｅ遺伝子発現パターンおよびＨｅｒ２＋ＩＨＣ／ＦＩＳＨ状態の患者に対して、ＣＥＦがＣＭＦよりも恩恵をもたらすことを示している。化学療法感受性基底様腫瘍は、ＣＥＦとＣＭＦとのさらなる恩恵の比較を示さず、非アントラサイクリン投薬計画がこのサブタイプに十分であることを示唆している。
【図１】
0005971769.tif 000056
【図２Ａ】
0005971769.tif 000057
【図２Ｂ】
0005971769.tif 000058
【図２Ｃ】
0005971769.tif 000059
【図２Ｄ】
0005971769.tif 000060
【図３Ａ】
0005971769.tif 000061
【図３Ｂ】
0005971769.tif 000062
【図４−１】
0005971769.tif 000063
【図４−２】
0005971769.tif 000064
【図４−３】
0005971769.tif 000065
【図４−４】
0005971769.tif 000066
【図５】
0005971769.tif 000067
【配列表】
0005971769000001.app