(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
移植可能な医療用製品の少なくとも一部上に形成させたコーティングを含む前記移植可能な医療用製品であって、
前記コーティングが、下記：
（ｉ）次の式：
−Ｒ1Ｒ2ＮＲ3Ｒ4
（式中、Ｒ1は、下記：
【化１】
0005908664.tif 000012
であり；
Ｒ2は、Ｃ1〜Ｃ8の直鎖又は分岐鎖のアルキレンであり；そして
Ｒ3及びＲ4は両方とも前記窒素に結合し、かつＨである）
を有する少なくとも１種のペンダント型アミン含有基；及び
（ｉｉ）前記コーティングを形成するように結合している、少なくとも１種のペンダント型の潜在性の光反応性基の光反応した基の残基であって、該結合が、該移植可能な医療用製品の表面への結合、あるいは前記移植可能な医療用製品の表面上にプレコートされているパリレンまたはオルガノシラン物質への結合を含む残基：
を含む非生分解性ポリマーを含む、前記移植可能な医療用製品。
【請求項２】
前記ペンダント型アミン含有基が、次の式：
−Ｒ1Ｒ2ＮＲ3Ｒ4
を有し、そして
Ｒ1が、下記：
【化２】
0005908664.tif 000013
であり、
Ｒ2が、Ｃ2〜Ｃ4の直鎖又は分岐鎖のアルキレンであり；そして
Ｒ3及びＲ4が、両方とも前記窒素に結合し、そしてそれぞれ、Ｈである、請求項１に記載の移植可能な医療用製品。
【請求項３】
前記ポリマーが、３−アミノプロピルメタクリルアミド、及び３−アミノエチルメタクリルアミドから成る群から選択される１種又は２種以上のモノマーを含む、請求項２に記載の移植可能な医療用製品。
【請求項４】
前記ポリマーが、重合された３−アミノプロピルメタクリルアミド（ＡＰＭＡ）を含む、請求項３に記載の移植可能な医療用製品。
【請求項５】
前記ペンダント型アミン含有基が、前記ポリマー中の総モノマーユニットに基づいて、前記ポリマーの１０％以上のモル濃度量で存在する、請求項１に記載の移植可能な医療用製品。
【請求項６】
前記ペンダント型アミン含有基が、前記ポリマー中の総モノマーユニットに基づいて、前記ポリマーの５０％以上のモル濃度量で存在する、請求項５に記載の移植可能な医療用製品。
【請求項７】
前記ペンダント型アミン含有基が、前記ポリマー中の総モノマーユニットに基づいて、前記ポリマーの９０％〜９９．９５％の範囲のモル濃度量で存在する、請求項６に記載の移植可能な医療用製品。
【請求項８】
前記光反応した基が、アセトフェノン、ベンゾフェノン、アントラキノン、アントロン及びアントロン様複素環、並びにそれらの置換された誘導体から成る群から選択された光反応性基の残基である、請求項１に記載の移植可能な医療用製品。
【請求項９】
前記光反応した基の残基が、前記ポリマー中の総モノマーユニットに基づいて、０．１％〜１０％の範囲のモル濃度量で存在する、請求項８に記載の移植可能な医療用製品。
【請求項１０】
前記ポリマーが、２０ｋＤａ〜２０００ｋＤａの範囲の分子量を有する、請求項１に記載の移植可能な医療用製品。
【請求項１１】
前記コーティングが人工血管上に存在する、請求項１に記載の移植可能な医療用製品。
【請求項１２】
前記製品が、多孔質構造を有しており、かつ前記コーティングが該多孔質構造上に存在する、請求項１に記載の移植可能な医療用製品。
【請求項１３】
前記コーティングが、該コーティング中にマトリックスたんぱく質を含む、請求項１に記載の移植可能な医療用製品。
【請求項１４】
移植可能な医療用製品上にコーティングを形成させる方法であって、
次の各ステップ；
（ａ）製品を得るステップ；
（ｂ）前記製品の少なくとも一部上にコーティング組成物を配置するステップ、前記コーティング組成物は、下記を有する非生分解性ポリマーを含む；
（ｉ）次の式：
−Ｒ1Ｒ2ＮＲ3Ｒ4
（式中、Ｒ1は、下記：
【化３】
0005908664.tif 000014
であり、
Ｒ2は、Ｃ1〜Ｃ8の直鎖又は分岐鎖のアルキレンであり；そして
Ｒ3及びＲ4は両方とも前記窒素に結合し、かつＨである）
を有する、少なくとも１種のペンダント型アミン含有基；及び
（ｉｉ）少なくとも１種のペンダント型潜在性光反応性基；そして
（ｃ）前記ペンダント型潜在性光反応性基を活性化して前記ポリマーを結合させ、それにより前記コーティングを形成させるために、前記コーティング組成物を処理するステップ、ここで該結合は、該移植可能な医療用製品の表面への結合、あるいは前記移植可能な医療用製品の表面上にプレコートされているパリレンまたはオルガノシラン物質への結合を含み、そして前記コーティングは、細胞が当該コーティングに１４日超の期間にわたり接着することを促進するために十分である：
を含む、方法。
【請求項１５】
前記ポリマーが、１０μｇ／ｍＬ〜２０ｍｇ／ｍＬの範囲において、前記コーティング組成物中に存在する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記処理するステップが、前記光反応性基に、１９０ｎｍ〜３６０ｎｍの範囲の紫外線を照射することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記処理するステップが、前記光反応性基に、０．１ｍＷ／ｃｍ2〜２０ｍＷ／ｃｍ2の範囲における紫外線の線量を照射することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ポリエステル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリウレタン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリアミド、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ナイロン、およびベロアからなる群から選ばれた材料を含むカテーテルを含む、請求項１記載の移植可能な医療用製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願のクロスリファレンス
本出願は、「ポリマーコーティング並びに細胞維持及び分化のための方法」と題する、２００５年７月２０日に出願された、シリアルナンバー第６０／７００，８６０号を有する米国仮出願の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、非生分解性アミン提供ポリマー（ａｍｉｎｅ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｐｏｌｙｍｅｒ）を含むコーティングと、これらのコーティングを含む表面への細胞の付着を促進するための方法とに関する。本発明はまた、細胞を分化する方法と、これらのコーティングを有する表面への細胞を維持するための方法とに関する。
【背景技術】
【０００３】
細胞接着及び増殖に好適な表面を提供するために、種々のアプローチが用いられている。多くの細胞は足場依存的であり、それらが、増殖又は分化のために、基剤へのいくつかのタイプの接着を証明しなければならないことを意味する。ｉｎ  ｖｉｖｏで、細胞は、上にある上皮又は内皮を支持する構造体である基底膜中に存在するたんぱく因子に接着することができる。上記基底膜は、基底板と称される膜と、下にあるコラーゲン原線維のネットワークとから成る。細胞接着及び増殖のための優れた基剤を提供することができるため、基底膜内に見出される成分に基づいた、細胞接着用の人工表面が作成されている。上記人工表面は、ｉｎ  ｖｉｖｏ、例えば、移植可能な医療装置、及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ、例えば、細胞培養製品中で用いられている。
【０００４】
細胞を基層に接着させるために、荷電表面が用いられている。しかし、培養工程の際に、荷電表面の全てが、細胞の十分な接着に好適というわけではない。例えば、いくつかのマイナスに帯電した表面は、好適な基剤を供給しない。というのは、多くの細胞は、細胞が表面に接着することを媒介するために十分な量の、正に帯電したタンパク質を示さないからである。
【０００５】
天然のポリペプチド系細胞接着因子、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン及びラミニンが、細胞の基剤への接着を強化するために用いられている。生分解性合成ポリマーカチオン、例えば、ポリリジン及びポリオルニチンが、種々の足場依存性細胞種の接着を促進するコーティングを提供するために用いられている。これらの種類のポリマー物質を用いることに伴う課題の一つは、当該物質が、培養の液体培地内に存在することとなる場合があるプロテアーゼか、又は血清中にｉｎ  ｖｉｖｏで存在するプロテアーゼにより、長期間にわたり分解されうることである。従って、これらの物質を含む表面は、限定的な期間のみ、細胞接着のために有用である場合がある。細胞付着性に関連する特性は、上記コーティング内に存在する物質の分解により、ある程度解決することができる。
【０００６】
さらに、細胞接着を促進するために用いられているいくつかのコーティングはまた、コーティング物質が上記製品の表面に適切に接着しないと、当該コーティングから失われる場合があるとの観点から問題となる場合がある。次いで、これらの物質が、液体培地又は体液中に存在し、そして当該体液と接触する細胞に影響を与える可能性がある。例えば、上記コーティングから失われたポリマー物質は、上記細胞の表面と結合し、そして細胞が上記基剤に接着することに影響を与える可能性があるか、又は培養物中の細胞−細胞相互作用に影響を与える可能性がある。いくつかのポリマー物質はまた、細胞の生存に有害な場合がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、細胞を培養することを含む工程において用いられる製品向けの、改良されたポリマーコーティングを提供する必要がある。上記改良されたコーティングは、一次細胞、培養することが難しい細胞系、及び幹細胞の維持及び分化を含む方法の利益となる有用な細胞培養製品を規定することができる。上記コーティングをまた、ｉｎ  ｖｉｖｏで使用するための移植可能な医療用製品の表面をコーティングするために用いることができる。従って、上記コーティングは、数多くの疾患及び病気を治療するための、組織特異再生技術の利益となるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
態様の一つでは、本発明は、細胞を培養するための方法、そして特に、長期間（長期間培養）の培養において、細胞を保持するための方法に有用な細胞培養製品向けのコーティングを提供する。本明細書において、培養は、代謝的に活性な細胞を、本明細書に記載されるようなポリマーコーティングを有する細胞培養製品に置くことを含む方法を指す。本発明のポリマーコーティングは、それらの安定性に由来する、長期間の細胞培養のための理想の表面を供給し、細胞接着のために優れた表面を提供し、そして多種多様の細胞種を培養するために用いることができることを示している。
【０００９】
コーティングと同時に、細胞を液体培地内で培養して、所望の代謝的に活性な状態を作り出す。上記コーティングを用いて、上記細胞が、休止（非増殖及び非分化状態）、細胞増殖の状態、及び細胞分化の状態にある状態を含む、１種又は２種以上の代謝的に活性な細胞状態を促進することができる。
【００１０】
本発明の別の態様では、上記コーティングを、移植可能な医療装置上に適用する。いくつかの方式では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで提供されるような上記コーティングの機能と同様に、上記コーティングを医療用製品の表面に用いて、細胞接着を促進することができる。これは、組織形成、上皮形成及び血管形成の促進を含む、多くの用途に有用である。
【００１１】
本発明のコーティングは、ペンダント型アミン基を有する非生分解性ポリマーを含み、上記コーティングはまた、１種又は２種以上の潜在性反応性基（ｌａｔｅｎｔ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｇｒｏｕｐ）を含む。上記潜在性反応性基を用いて、上記ポリマーを、製品の表面、例えば、細胞培養デバイス若しくは機器の一部、移植可能な医療装置の一部に共有結合させる。上記潜在性反応性基を、ペンダント型潜在性反応性基として、上記ポリマーに供給することができる。あるいは、ペンダント型潜在性反応性基を、上記ポリマーから独立した化合物に含ませ、次いで上記ポリマーを基剤表面と結合させるために用いることができる。
【００１２】
上記ペンダント型潜在性反応性基を介した結合により、上記ポリマーを上記表面に最適に形成させ、細胞付着性を促進させるコーティングが提供される。いくつかの態様では、上記ペンダント型潜在性反応性基は、光反応性基である。そこで、本発明のコーティングは、細胞接着のための方法に概して用いられ、上記細胞は、長期間、上記表面に接着し続けることができる。
【００１３】
本発明のいくつかの態様では、本発明のポリマーは、次の式：
−Ｒ1Ｒ2ＮＲ3Ｒ4
（式中、Ｒ1は下記：
【化１】
0005908664.tif 000002
であり、
Ｒ2は、Ｃ1〜Ｃ8の直鎖又は分岐鎖のアルキルであり；そして
Ｒ3及びＲ4は、個々に、Ｈ又はＣ1〜Ｃ6の直鎖若しくは分岐鎖アルキルである）
のペンダント型アミン含有基を含む。
【００１４】
いくつかの態様では、Ｒ1は下記：
【化２】
0005908664.tif 000003
であり、Ｒ2は、Ｃ2〜Ｃ4の直鎖又は分岐鎖のアルキルであり；そしてＲ3及びＲ4は、個々に、Ｈ又はＣＨ3である。
【００１５】
例示的なアミン含有基には、重合性モノマー、例えば、３−アミノプロピルメタクリルアミド（ＡＰＭＡ）、３−アミノエチルメタクリルアミド（ＡＥＭＡ）及びジメチルアミノプロピルメタクリルアミド（ＤＭＡＰＭＡ）上に見出されるものが含まれる。いくつかの態様では、ペンダント型アミン基及び潜在性反応性基を含むポリマーは、上記基−Ｒ1Ｒ2ＮＲ3Ｒ4を有するモノマーを、潜在性反応性基を有するコモノマーと共重合することにより生成されうる。他の態様では、ポリマーは、式Ｒ1Ｒ2ＮＲ3Ｒ4を有するモノマーを重合させ、次いで１種又は２種以上のペンダント型アミン基を、潜在性反応性基を有する化合物と反応させて生成されうる。
【００１６】
他の態様では、ペンダント型アミン基を有するポリマーは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）及びポリアミドアミンから選択される。ＰＥＩは、エチレンイミンを重合して生成させることができ；所望により、重合性基及び潜在性反応性基を有するモノマーをエチレンイミンと共重合して、ペンダント型潜在性反応性基を有するＰＥＩを生成することができる。特定の態様の一つでは、上記ポリマーには、１種又は２種以上の潜在性光反応性基を有するポリエチレンイミンが含まれる。
【００１７】
潜在性反応性基は、特定の適用された外部刺激に応答し、活性種の生成をうける基を指し、ターゲットとの得られた共有結合を有する。上記潜在性反応性基は、外部の電磁気又は運動（熱）エネルギーを吸収した際に、活性種、例えば、フリーラジカル、ニトレン、カルベン、及びケトンの励起状態を発生させる。態様の一つでは、上記潜在性反応性基は、上記ポリマー及び細胞培養製品の表面を結合させるための活性状態に活性化することができる光反応性基である。例示的な光反応性基には、アリールケトン、例えば、アセトフェノン、ベンゾフェノン、アントラキノン、アントロン及びアントロン様複素環（例えば、アントロンの複素環式類似体、例えば、１０位に窒素、酸素又は硫黄を有するもの）、又はそれらの置換（例えば、環置換された）誘導体が含まれる。
【００１８】
任意の好適な方法を用いて、ペンダント型アミン及び１種又は２種以上の潜在性反応性基を有するポリマーを、製品の表面に結合させることができる。方法の一つには、事前生成したポリマーを、上記表面に配置し、次いで上記潜在性反応性基を活性化し、上記ポリマーを上記表面に結合させることが含まれる。これらのケースでは、上記潜在性反応性基は、ペンダント型又は独立したポリマーであることができる。あるいは、モノマー物質を上記表面で重合させ、上記ポリマーを当該表面に結合させるペンダント型アミン及び１種又は２種以上の潜在性反応性基を有するポリマーを生成することができる。
【００１９】
本発明のポリマーコーティングは、種々の細胞培養製品の調製に有用であることが示された。いくつかの態様では、上記細胞培養製品は、コーティング面を有する製品を指す、２次元の細胞培養製品であり、そこでは、細胞は、２次元の表面の単一面で増殖する。上記２次元の細胞培養製品には、複数のウェルの細胞培養プレート、細胞培養皿及び細胞培養瓶が含まれる。他の態様では、上記細胞培養製品は、コーティング面を有する製品を指す３次元の細胞培養製品であり、そこでは、細胞が上記製品上の一つ超の面で増殖をする。
【００２０】
３次元の細胞培養製品のコーティング面は、細胞が接着することができる足場と似ている場合がある。上記製品は、ミクロ又はナノ構造を有する物質、例えば、繊維から生成させたものを含む、表面形態、合成又は天然の微孔質又はナノ多孔質物質から生成されうる。
【００２１】
ペンダント型アミン基を有するポリマーは、培養工程の際に、細胞の優れた付着を促進することができる。これにより、上記コーティングに接着するためのある程度の足場依存性を示し、そして培養される細胞の種類及び当該細胞が培養される培地の種類にもよるが１種又は２種以上の代謝活性を示す細胞が可能となる。従って、上記コーティングは、非付着性であるか、付着性に乏しいか、又は適度な付着性である細胞を培養するために特に有用である。本発明のコーティングはまた、細胞増殖及び分化を可能とするコーティングを提供するために特に有用である。
【００２２】
本発明は、非常に安定であり、且つ細胞培養工程に有用であるコーティングを提供する。従って、本発明のコーティングは、長期間の細胞の培養を含む手順に特に有用である。
【００２３】
これらの態様では、上記アミン供給ポリマーが、培養培地の存在下で分解せず、従って、相当の期間にわたる培養において細胞の付着を促進するために用いることができるので、本発明のコーティングは特に有利であることが見出された。これは、分解性天然ポリマー、例えば、ポリペプチド及び多糖類、並びに生分解性合成ポリマーから主として構成されるコーティングとの比較である。これらの種類の生分解性コーティングは、より短期間（例えば、数週間）で分解し、そして培養において細胞の付着を促進するそれらの能力を失う場合がある。
【００２４】
さらに、本発明のポリマーは上記培養製品の表面と共有結合しているので、当該表面からアミン供給ポリマーの損失が最小であるか、又は当該ポリマーの損失がない。これは、多くの点で有利である；第一に、培養期間の間、上記表面に接着するか又は接着して残る上記細胞の能力が変化しないであろう。すなわち、上記表面に接着するアミン供給ポリマーの量は、長期にわたって有意に変化しないであろう。第二に、上記培養中に、アミン提供ポリマーが損失するリスクが最小である。これはまた有利である、というのは、そうでないと、上記培養中に失われたポリマーが、上記細胞の特性を変化させる可能性があるからである。
【００２５】
例えば、上記細胞は、非付着性となりうるか、又は上記細胞の表面のたんぱく質により運搬される他の特性を失う場合がある。さらに、ある場合には、上記コーティングから、上記培地中に失われたポリマーが、上記細胞に対する毒性を有する可能性がある。例えば、種々の培養系における２５ｋＤａ以上の分子量を有するいくつかのポリエチレンイミンの場合、ＰＥＩを細胞外に添加した場合に、毒性が報告されている（Ｆｉｓｃｈｅｒらの「Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．」（１９９８）４８，１０８；Ｆｉｓｃｈｅｒらの「Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．」（１９９９）１６，１７２３−１７２９）。従って、本発明のポリマーコーティングは、先行技術において細胞接着及び培養を促進するために従来用いられているコーティングに見出されるいくつかの欠点を克服する。
【００２６】
本発明のコーティングは、非生分解性アミン提供ポリマーに基づくが、他の非生分解性物質又は分解性物質、例えば、生分解性ポリマーが、上記コーティング中に存在することができる。培養の際、例えば、生分解性ポリマーが、上記コーティング中に存在し、そしてより短期間、細胞を培養するための優位性を提供することができる一方で、上記非生分解性ポリマーは、上記コーティングに存在したままであり、そして長期間、付着面を供給することができる。
【００２７】
いくつかの態様では、本発明は、細胞の長期間の培養のための方法を提供する。当該方法には、上記ポリマーを上記製品の表面に結合させる複数のアミン基及び潜在性反応性基を有する非生分解性合成ポリマーを含むコーティングを有する細胞培養製品を得る段階が含まれる。当該方法は、環境（液体培地）内で、上記表面に細胞を配置させる段階をさらに含む。配置させる段階に続いて、上記細胞が維持することができるか、又は所望の生理状態を有するように誘導されることができるように、当該細胞を、上記コーティングに付着させることができる。次いで、上記方法は、長期間、上記細胞を液体培地内で培養する段階を含む。「長期間」は、１４日超の期間を指すのが一般的である。
【００２８】
適応があれば、「長期間」は、２１日超、２８日超、３５日超、４２日超、４９日超又は５６日超であることができる。従って、いくつかの態様では、上記細胞をまた、約１４〜約６０日の範囲にわたる期間、培養物中に保持することができる。本発明の明確に区別できる優位性は、細胞付着を促進することができる新鮮なコーティングを有する新しい培養製品に、上記細胞を移動させる必要がないことである。しかし、長期間の培養の際には、上記液体培地を、例えば、置換又は補給により変化させて、所望の生理状態を得るために好適な環境を提供することができる。
【００２９】
いくつかの態様では、上記培養工程の期間、上記方法を用いて、細胞を、代謝活性が低い状態に維持（例えば、休止細胞の維持）することができる。すなわち、いくつかの態様では、上記細胞内の代謝性変化、例えば、上記細胞の形態を変化させることができるものを促進することなく、適切な培地中で、上記コーティング面に細胞を維持することができる。この方法はまた、細胞を維持するために有用であることができ、そして細胞増殖により細胞の個体群を増やすことができる。本発明のポリマーコーティングを用いた細胞培養において維持することができる例示的な細胞種には、未分化細胞、例えば、幹細胞、又は部分的若しくは完全に分化した細胞種、例えば、肝細胞、膵島細胞、神経細胞及び星状細胞が含まれる。上記未分化細胞は、多分化能、全能又は多能性の細胞種を含むことができる。
【００３０】
この点では、上記コーティングは、一定の期間にわたり、コーティングされた製品を置き換える必要がない、細胞の長期間の維持のために用いられうるコーティングされた製品を提供するという点で特に有用である。
【００３１】
他の態様では、培養工程の期間、上記方法を用いて、細胞の分化を促進することができる。任意の好適な事前分化又は前駆細胞種を用いることができる。上記方法は、コーティング面を得る段階、次いで事前分化細胞を上記コーティング面に置く段階を含むことができ、そこでは、上記細胞が上記コーティングに付着する。上記方法はまた、上記細胞の代謝活性を変化させることができる成分を含む環境（液体培地）の存在下で、上記細胞を培養する段階を含み、１種又は２種以上の細胞の態様、例えば、細胞形態に変化がもたらされる。上記成分は、上記事前分化細胞の成熟を、部分的又は完全に分化した状態へと促進させる任意の種類の成分を指す分化因子でありうる。
【００３２】
次いで、上記方法は、長期間にわたり、上記コーティング面と接触している上記細胞を分化させる段階を含む。適応があれば、長期間は、１４日超、２１日超、２８日超、３５日超、４２日超、４９日超又は５６日超であることができる。いくつかの態様では、上記細胞の初期接種密度にもよるが、上記細胞をまた、約１４〜約６０日の範囲の期間、培養物中に保持することができる。長期間の培養の間、上記液体培地を、例えば、置換又は補給により変化させ、所望の生理状態を得るために好適な環境を提供することができる。
【００３３】
本発明に従って分化させることができる例示的な細胞種には、一次細胞、神経前駆細胞、骨髄細胞、幹細胞、例えば、胚（胚盤胞由来）幹細胞等が含まれる。
【００３４】
いくつかの態様では、上記方法は、神経前駆細胞の成熟を、所望の分化した神経細胞種へと促進させるために用いられる。本発明のポリマーコーティングは、神経前駆細胞の接着を促進し、次いで、１種又は２種以上の所望の分化因子の存在下で、長期間培養することができることが示された。本発明のコーティングは、神経突起の外殖及び／又は伸張を促進する一方で、同一培地条件の下で従来型のコーティングがなされた製品上で培養した神経前駆細胞は生き残らなかった。本発明のコーティングはまた、コーティングされた基剤上で増殖する一部の神経細胞内の成熟した神経細胞マーカーの発生を促進する。本発明のコーティングはまた、神経前駆細胞の構造を星状細胞へと促進させることが示された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
以下に記載される本発明の実施形態は、次の詳細な説明に開示される正確な形態に本発明を制限するか、又は網羅的であることを目的とするものではない。むしろ、上記実施形態は、当業者が本発明の原理及び実施を正しく評価し、かつ理解することができるように選択及び記載されている。
本明細書で言及される全ての出版物及び特許を、参照により本明細書に組み入れる。本明細書に開示される出版物及び特許は、単にそれらの公表のために提供されている。発明者が、先行する任意の出版物及び／又は特許（本明細書で引用される任意の出版物及び／又は特許を含む）に権利を与えないことの自認として解釈される。
【００３６】
いくつかの態様では、本発明は、細胞培養製品の表面にコーティングを付与するための試薬及び方法を提供し、当該コーティングは、上記細胞培養製品の表面に上記ポリマーを結合させるために用いられる少なくとも１種の潜在性反応性基と、複数のペンダント型アミン基とを有するポリマー物質を含む。
【００３７】
本発明のポリマーコーティングを、任意の種類の細胞培養製品上に生成することができる。しかし、いくつかの態様では、細胞の増殖及び分化のために十分な表面を提供する細胞培養製品を提供することが望ましい。当該製品は、分化する細胞の形態を支持する表面を理想的に有する。例えば、神経前駆細胞の分化の場合には、上記表面により、神経突起の形成、又は１０μｍ超若しくは２００μｍ超である神経性細胞の他の特徴が可能となる。
【００３８】
２次元の細胞培養のための例示的な細胞培養製品には、複数のウェルのプレート、例えば、６個のウェル及び１２個のウェルの培養プレート、並びにより小さいウェルの培養プレート、例えば、９６、３８４及び１５３６個のウェルのプレート、培養ジャー、培養皿、培養フラスコ、培養プレート、培養ローラーボトル、培養スライド、培養管及びペトリ皿が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００３９】
本発明のコーティングをまた、細胞を製品の一つ超の面で増殖させる３次元の細胞培養製品上に生成させることができる。３次元の細胞培養製品のコーティング面を、細胞が接着することができる足場に似せることができる。上記製品を、ミクロ構造又はナノ構造を有する物質、例えば、表面形態を作り出すように処理されるポリマー物質から生成したもの、合成又は天然のミクロ又はナノ多孔質物質、例えば、ポリアミド繊維を含む繊維から生成させたものから製造することができる。
【００４０】
例示的な３次元の細胞培養製品には、複層カーボンナノチューブ（ｍｕｌｔｉｗａｌｌｅｄ  ｃａｒｂｏｎ  ｎａｎｏｔｕｂｅ，ＭＷＣＮ；Ｃｈｅｎらの「Ｓｃｉｅｎｃｅ」（１９９８）２８２：９５を参照せよ）；ヒドロキシアパタイト微粒子表面（Ｒｏｓａらの「Ｄｅｎｔａｌ  Ｍａｔｅｒ．」（２００３）１９：７６８−７７２）が含まれる。上記ポリマーコーティングをまた、天然物質、例えば、自己集合性のペプチドナノ繊維骨格（Ｇｅｎｏｖｅらの「Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ」（２００５）２６：３３４１−３３５１）及びコラーゲン／ヒアルロン酸高分子電解質複層（Ｚｈｅｎｇらの「Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ」（２００５）２６：３３５３−６１）の表面上に生成させることができる。他の場合では、上記３次元の表面を、微粒子の安定化層から製造することができる。
【００４１】
上記ポリマーコーティングを、多種多様の物質から作製することができる細胞培養製品上に生成させることができる。上記細胞培養製品の構造体を生成するために用いられる物質は、本明細書で、「製品物質」又は「装置物質」と称される一方で、本明細書において、上記ポリマーコーティングを生成させるために用いられる物質は、「コーティング物質」と称される。
【００４２】
その上に上記コーティングを生成させることができる製品を製造するために用いることができる物質の例には、オリゴマー、ホモポリマー及びコポリマー（付加重合又は縮合重合のどちらかから生成）を含む合成ポリマーが含まれる。好適な付加ポリマーの例には、アクリル、例えば、メチルアクリレート、メチルメタクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート、アクリル酸、メタクリル酸、グリセリルアクリレート、グリセリルメタクリレート、メタクリルアミド及びアクリルアミドから重合したもの；ビニル、例えば、エチレン、プロピレン、塩化ビニル及びスチレンが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４３】
細胞培養製品中で一般的に用いられる例示的なポリマー物質には、ポリスチレン及びポリプロピレンが含まれる。
縮合ポリマーの例には、ナイロン、例えば、ポリカプロラクタム、ポリラウリルラクタム、ポリヘキサメチレンアジポアミド及びポリヘキサメチレンドデカンジアミド、及びまたポリウレタン、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリスルホン、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリジメチルシロキサン及びポリエーテルケトンが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４４】
生分解性ポリマーをまた、製品物質として用いることができる。生分解性物質として検討されている合成ポリマーの種類の例には、ポリエステル、ポリアミド、ポリウレタン、ポリオルトエステル、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリイミノカーボネート、脂肪族カーボネート、ポリホスファゼン、ポリ無水物及びそれらのコポリマーが含まれる。移植可能な医療装置に関連して用いることができる生分解性物質の具体例には、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリジオキサノン（ｐｏｌｙｄｉｏｘａｎｏｎｅ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（グリコリド−ｃｏ−ポリジオキサノン）、ポリ無水物、ポリ（グリコリド−ｃｏ−トリメチレンカーボネート）及びポリ（グリコリド−ｃｏ−カプロラクトン）が含まれる。これらのポリマーと、他の生分解性ポリマーとのブレンドをまた、用いることができる。
【００４５】
本発明のポリマーコーティングをまた、異なるポリマー物質を用いてプレコートされている製品の表面に生成させることができる。例えば、製品を、パリレン又はオルガノシラン物質を用いてプリコートし、アミン含有ポリマーを配置させ、そして反応させるベースコートを供給することができる。例示的な物質には、金属、金属合金及びセラミックが含まれる。上記金属及び金属合金には、チタン、ニチノール、ステンレス鋼、タンタル及びコバルトクロムが含まれるが、これらに限定されるものではない。第二の種類の金属には、貴金属、例えば、金、銀、銅及び白金ウリジウム（ｕｒｉｄｉｕｍ）が含まれる。上記セラミックには、窒化ケイ素、炭化ケイ素、ジルコニア及びアルミナ、並びにガラス、シリカ及びサファイアが含まれるが、これらに限定されるものではない。セラミック及び金属の組み合わせ物は、別の種類の生体物質である。
【００４６】
本発明の他の態様では、上記ポリマーコーティングを、移植可能な医療用製品の表面に生成させる。上記移植可能な医療用製品を、本明細書に記載され、かつ人体内の使用に好適な任意の物質から製造することができる。例示的な医療用製品には、血管用インプラント及び移植片、移植片、外科用装置；合成人工器官；エンドプロテーゼ（ｅｎｄｏｐｒｏｓｔｈｅｓｉｓ）を含む人工血管、ステント移植皮弁、血管内のステント組み合わせ物；小径の移植片、腹部大動脈瘤用移植片；創傷被覆材及び創傷管理装置；止血用バリア；メッシュ及びヘルニアプラグ（ｈｅｒｎｉａ  ｐｌｕｇ）；子宮出血用パッチを含むパッチ、心房中隔欠損症（ＡＳＤ）用パッチ、卵円孔開存症（ＰＦＯ）用パッチ、心室中隔欠損症（ＶＳＤ）用パッチ及び他のジェネリックの心臓用パッチ；ＡＳＤ、ＰＦＯ及びＶＳＤクロージャ；経皮クロージャ装置、僧帽弁修復装置；左心耳フィルター；弁形成（ｖａｌｖｅ  ａｎｎｕｌｏｐｌａｓｔｙ）装置、カテーテル；中心静脈アクセス用カテーテル、血管アクセス用カテーテル、膿瘍排液用カテーテル、薬物注入用カテーテル、非経口的栄養補給用カテーテル、静脈用カテーテル（例えば、抗血栓薬を用いた処理）、脳卒中治療用カテーテル、血圧及びステント移植片カテーテル；吻合装置及び吻合用クロージャ；動脈瘤除外装置；グルコースセンサを含むバイオセンサ；心臓用センサ；受胎調節装置；前胸部用移植片；感染制御装置；膜；組織骨格（ｓｃａｆｆｏｌｄ）；組織関連物質；脳脊髄液（ＣＳＦ）シャントを含むシャント、緑内障排出シャント；歯科用装置及び歯科用移植片；耳用装置、例えば、耳用排液チューブ、中耳腔換気用ベントチューブ；眼用装置；排液チューブカフスを含む、装置のカフス及びカフス部分、移植された薬物注入用チューブカフス、カテーテルカフス、縫製カフス；脊椎及び神経学用装置；神経再生導管；神経学用カテーテル；神経用パッチ；整形外科用装置、例えば、整形外科の関節用移植片、骨修復／増大装置、軟骨修復装置；泌尿器用装置及び尿道用装置、例えば、泌尿器用移植片、膀胱用装置、腎臓部用装置及び血液透析装置、人工肛門袋取付け装置；胆汁排液製品が含まれる。
【００４７】
いくつかの態様では、上記医療用製品を、上記ポリマーコーティングをその上に生成させる布帛又は繊維表面に連結させる。例示的な布帛及び繊維を、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリウレタン、ポリテトラフルオロエチレン及びポリアミドから生成させることができる。ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）は、布帛内で一般的に用いられているポリマーである。布帛の構成において、繊維、例えば、モノフィラメント又はマルチフィラメント繊維の調製時に、これらのポリマーのブレンドをまた利用することができる。一般的に用いられる布帛には、例えば、ナイロン、ベロア及びＤＡＣＲＯＮ（商標）が含まれる。
【００４８】
上記コーティングを、ｉｎ  ｖｉｖｏで上記コーティングされた製品の表面に、細胞の接着を促進させるための方法において用いることができる。上記ポリマーコーティングが、細胞を長期間、接着させるので、本発明のコーティングは、長期間の埋め込み型装置、例えば、１ヶ月以上の期間、身体内に存在する装置に、特に好適である。ある場合には、内皮細胞を上記装置表面に接着するため、そして細胞の内皮層の安定な構造のために、上記コーティングを用いることができる。
【００４９】
いくつかの態様では、本発明のコーティングは、複数のペンダント型アミン基と、１種又は２種以上のペンダント型潜在性反応性基とを有する非生分解性ポリマーを含む。「非生分解性」は、一般的に、非酵素的に、加水分解的に又は酵素的に分解することができないポリマーを指す。例えば、上記非生分解性ポリマーは、プロテアーゼにより生じうる分解に対して抵抗性を有する。しかし、上記コーティングが非生分解性アミン提供ポリマーを含む一方で、上記コーティングは非生分解性物質に限定されず、従って、生分解性物質、例えば、天然又は合成の生分解性ポリマーをも含むことができることに留意すべきである。
【００５０】
上記コーティングは潜在性反応性基を含み、そこでは、少なくとも一部の基が、コーティング工程の際に活性化し、上記ポリマーを、上記装置の表面に結合させる。従って、生成したコーティングにおいて、活性化し、そしてターゲット部分との結合をうけた基をまた、「反応した基（ｒｅａｃｔｅｄ  ｇｒｏｕｐ）」と称することができる。
【００５１】
上記潜在性の反応した基を介して上記表面に結合することにより、固定されたポリマーが、上記製品の表面に、正に帯電したアミン基を供給することができる。この結合配置により、細胞接着において非常に耐久性が高く、且つ有効な表面の形成が可能となると考えられる。この表面は、上記コーティングされた製品上の細胞の維持及び分化を含む方法において、非常に有効であることが示された。
【００５２】
上記非生分解性ポリマー上の複数のペンダント型アミン基は、細胞培養のために好適なｐＨ条件において、上記コーティングに正電荷を供給することができる。例えば、上記非生分解性ポリマーは、ｐＨ約６．０〜ｐＨ約８．０の範囲の条件において正電荷を供給する。
上記非生分解性ポリマーは、第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン、又は上記ポリマーに由来するこれらのアミン基のペンダントの組み合わせを有することができる。
【００５３】
本発明の一態様では、例示的なアミン含有基は、次の式：
Ｒ1Ｒ2ＮＲ3Ｒ4
（式中、Ｒ1は、下記：
【化３】
0005908664.tif 000004
であり、
Ｒ2は、Ｃ1〜Ｃ8の直鎖又は分岐鎖のアルキルであり；そして
Ｒ3及びＲ4は、個々に、Ｈ又はＣ1〜Ｃ6の直鎖若しくは分岐鎖のアルキルである）
を有する。
上記ポリマーに由来するペンダントと同様に、上記アミン含有基を、次の式：
Ｐ−［Ｒ1Ｒ2ＮＲ3Ｒ4］
（式中、Ｐは、上記ポリマー主鎖の一部である）
により表すことができる。
【００５４】
いくつかのさらなる特有の態様において、Ｒ1は、下記：
【化４】
0005908664.tif 000005
であり；
Ｒ2は、Ｃ2〜Ｃ4の直鎖又は分岐鎖のアルキルであり；そして
Ｒ3及びＲ4は、個々に、Ｈ又はＣＨ3である。
【００５５】
例示的なアミン含有基には、重合性モノマー、例えば、３−アミノプロピルメタクリルアミド（ＡＰＭＡ）、３−アミノエチルメタクリルアミド（ＡＥＭＡ）、ジメチルアミノプロピルメタクリルアミド（ＤＭＡＰＭＡ）等に見出されるものが含まれる。従って、いくつかの態様では、ペンダント型アミン基含有ポリマー及び潜在性反応性基を含むポリマーは、上記基−Ｒ1Ｒ2ＮＲ3Ｒ4を有するモノマーを、潜在性反応性基を有するコモノマーと共重合して生成させることができる。所望により、他の非アミン又は非潜在性反応性基含有モノマーが、上記ポリマーに含まれうる。
【００５６】
態様の一つでは、約１０％以上のモル濃度量（ｍｏｌａｒ  ａｍｏｕｎｔ）におけるアミン含有モノマーを用いて上記ポリマーを生成させることができる。いくつかの態様では、上記アミン含有モノマーは、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上又は９５％以上の量で存在する。別の態様では、上記潜在性反応性基を含むモノマーが、最大約１０％の量、又は約５％の量で存在する。いくつかの態様では、上記ポリマーは、約９０％〜９９．９５％の範囲の量におけるアミン含有モノマーと、約１０％〜０．０５％の範囲の量における上記潜在性反応性基を含むモノマーの量とを含む。コポリマーの例示的な調製物は、約９８．４％のアミン含有モノマー、例えば、ＡＰＭＡ、ＡＥＭＡ又はＤＭＡＰＭＡと、約１．６％の上記潜在性反応性基を含むモノマーとを含む。
【００５７】
アミン基の量及び潜在性反応性基の量の規定されるコントロールは、アミン含有モノマーを、潜在性反応性基含有モノマー（及び所望により、非アミン又は非光反応性基含有モノマー）と共重合することにより行われうる。他の例示的なアミン含有ポリマーを、例えば、アミン含有モノマー（例えば、Ｎ−（２−アミノ−２−メチルプロピル）メタクリルアミド、ｐ−アミノスチレン、アリルアミン、又はそれらの組み合わせ）を、ペンダント型アミン基及び潜在性反応性基を有するポリマーを供給するためのペンダント型潜在性反応性基を有するモノマーと共重合させて生成することができる。
【００５８】
これらのアミン含有モノマーをまた、他の非第一級アミン含有モノマー、例えば、アクリルアミド、メタクリルアミド、ビニルピロリジノン又はそれらの誘導体と共重合して、所望の特性、例えば、所望のアミン基の密度及び光反応性基を有するポリマーを供給することができる。アミン基を有する他の好適なポリマーには、２−アミノメチルメタクリレート、３−（アミノプロピル）−メタクリルアミド及びジアリルアミン等のモノマーから生成させたポリマーが含まれる。感光性基（ｐｈｏｔｏｇｒｏｕｐ）及びペンダント型アミン基を含むデンドリマーをまた、用いることができる。
【００５９】
いくつかの態様では、ペンダント型アミン基及び疎水性の特性を有するポリマーを調製することができる。これは、上記ポリマーの合成のための１つ又は２つ以上のスキームにより得ることができる。例えば、ポリマーを、所望の量の疎水性モノマー、例えば、（アルキル）アクリレートモノマーと共に生成することができるか、又は上記アミン提供モノマーは、より長いアルキル鎖長を含むことができる。例えば、任意の１種又は２種以上の基Ｒ2、Ｒ3及び／又はＲ4は、３個又は４個以上の炭素原子のアルキル基を含むことができる。
【００６０】
上記非生分解性ポリマーを調製するための別の方法には、予備生成したポリマーを、潜在性反応性基を含む化合物を用いて誘導体化する段階が含まれる。例えば、ペンダント型アミン基を有するホモポリマー又はヘテロポリマーは、上記ペンダント型アミン基の一部を、光反応性基及びアミン基との反応性を有する基（例えば、４−ベンゾイルベンゾイルクロリド）を有する化合物と反応させることにより、当該光反応性基を用いて容易に誘導体化することができる。
【００６１】
いくつかの態様では、ペンダント型アミン基及び少なくとも１種の潜在性反応性基を有するポリマーを、ポリエチレンイミン、ポリプロピレンイミン及びポリアミドアミンから選択する。特定の態様の一つでは、上記ポリマー物質は、１種又は２種以上の潜在性反応性基を有するポリエチレンイミンを含む。
【００６２】
広義の潜在性反応性基は、特定の適用された外部刺激に応答し、ターゲットとの得られた共有結合を有する活性種の生成をうける基である。潜在性反応性基は、貯蔵の条件下ではそれらの共有結合を変化させずに保持するが、活性化の際に他の分子と共有結合を生成する、分子内の原子の基である。上記潜在性反応性基は、外部の電磁気又は運動（熱）エネルギーを吸収した際に、活性種、例えば、フリーラジカル、ニトレン、カルベン、及びケトンの励起状態を発生させる。
【００６３】
潜在性反応性基を、電磁スペクトルの種々の部分に応答するように選択することができ、そしてスペクトルの紫外線、可視光又は赤外線部分に応答する潜在性反応性基が好ましい。本明細書に記載されるものを含む潜在性反応性基は、当業界で周知である。例えば、米国特許第５，００２，５８２号明細書（Ｇｕｉｒｅらの「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ  Ｖｉａ  Ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ  Ａｔｔａｃｈｉｎｇ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ」）を参照せよ。本明細書に記載されるように、本発明は、本発明のコーティングを生成させるために好適な潜在性反応性基を使用することを企図する。
【００６４】
光反応性基は、電磁気エネルギーを吸収すると、活性種、例えば、フリーラジカル、そして特にニトレン、カルベン、及びケトンの励起状態を生じさせることができる。光反応性基を、電磁スペクトルの種々の部分に応答するように選択することができ、そしてスペクトルの紫外線、可視光又は赤外線部分に応答する潜在性反応性基が好ましい。
【００６５】
光反応性のアリールケトン、例えば、アセトフェノン、ベンゾフェノン、アントラキノン、アントロン及びアントロン様複素環（例えば、アントロンの複素環式類似体、例えば、１０位に窒素、酸素又は硫黄を有するもの）、又はそれらの置換（例えば、環置換された）誘導体が好ましい。好ましいアリールケトンの例には、アントロンの複素環式誘導体、例えば、アクリドン、キサントン及びチオキサントン、並びにそれらの環置換された誘導体が含まれる。いくつかの好ましい光反応性基は、約３６０ｎｍ超の励起エネルギーを有する、チオキサントン及びその誘導体である。
【００６６】
上記ケトンの官能基が好ましい。というのは、それらは、本明細書に記載される活性化／不活性化／再活性化サイクルを容易に受けることができるからである。ベンゾフェノンは、特に好ましい潜在性反応性部分である。というのは、当該ベンゾフェノンは、三重項状態への項間交差をうける励起一重項状態の初期構造を有する光化学系励起が可能だからである。上記励起三重項状態は、（例えば、支持体表面から）水素原子を引き抜くことにより、炭素−水素結合に挿入し、そのようにしてラジカル対を作り出すことができる。
【００６７】
次にラジカル対が崩壊し、新しい炭素−炭素結合が生成する。結合に、反応性結合（例えば、炭素−水素）が利用できないと、ベンゾフェノン基の紫外線により誘発された励起は可逆性であって、そしてエネルギー源を取り除くと、当該分子は基底状態のエネルギー準位に戻る。光活性化可能なアリールケトン、例えば、ベンゾフェノン及びアセトフェノンは、特に重要である。というのは、これらの基が、水中で複数の再活性化を受け、よって高いコーティング効率を付与するからである。
【００６８】
アジドが、別の種類の光反応性基を構成し、そしてアリールアジド（Ｃ6Ｒ5Ｎ3）、例えば、フェニルアジド及び４−フルオロ−３−ニトロフェニルアジド；アシルアジド（−ＣＯ−Ｎ3）、例えば、ベンゾイルアジド及びｐ−メチルベンゾイルアジド；アジドホルメート（−Ｏ−ＣＯ−Ｎ3）、例えば、エチルアジドホルメート及びフェニルアジドホルメート；スルホニルアジド（−ＳＯ2−Ｎ3）、例えば、ベンゼンスルホニルアジド；及びホスホリルアジド［（ＲＯ）2ＰＯＮ3］、例えば、ジフェニルホスホリルアジド及びジエチルホスホリルアジドを含む。
【００６９】
ジアゾ化合物は、別の種類の光反応性基を構成し、そしてジアゾアルカン（−ＣＨＮ2）、例えば、ジアゾメタン及びジフェニルジアゾメタン；ジアゾケトン（−ＣＯ−ＣＨＮ2）、例えば、ジアゾアセトフェノン及び１−トリフルオロメチル−１−ジアゾ−２−ペンタノン；ジアゾアセテート（−Ｏ−ＣＯ−ＣＨＮ2）、例えば、ｔ−ブチルジアゾアセテート及びフェニルジアゾアセテート；及びβ−ケト−α−ジアゾアセタトアセテート（−ＣＯ−ＣＮ2ＣＯ−Ｏ−）、例えば、ｔ−ブチル−α−ジアゾアセトアセテートを含む。
【００７０】
他の光反応性基には、ジアジリン（−ＣＨＮ2）、例えば、３−トリフルオロメチル−３−フェニルジアジリン；及びケテン（ＣＨ＝Ｃ＝Ｏ）、例えば、ケテン及びジフェニルケテンが含まれる。
【００７１】
パーオキシ化合物は、別の種類の潜在性反応性基として企図され、そしてジアルキルパーオキシド、例えば、ジ−ｔ−ブチルパーオキシド及びジシクロヘキシルパーオキシド及びジアシルパーオキシド、例えば、ジベンゾイルパーオキシド及びジアセチルパーオキシド及びパーオキシエステル、例えば、エチルパーオキシベンゾエートを含む。
【００７２】
任意の好適な方法を用いて、本発明のコーティングを、上記表面に生成させる。上述のように、ペンダント型アミン基及びペンダント型潜在性反応性基を有するポリマーを、製品の表面に配置させることができ、そして上記潜在性反応性基を活性化し、それにより上記ポリマーを上記装置の表面に結合させるように上記表面を処理することができる。
【００７３】
別の方法では、グラフト重合法により、上記装置の表面に、上記ポリマーを生成させる。例えば、潜在性反応性基及び重合性基を含むモノマーを、上記装置の表面に配置させ、そして結合させることができる。次いで、アミン基含有モノマーの組成物を、上記表面に配置することができ、そして重合反応を開始して、上記製品の表面からポリマー鎖を形成させ、そして当該製品の表面と結合させることができる。
【００７４】
さらに別の方法では、２個又は３個以上の潜在性反応性基を有する架橋剤を用いて上記コーティングを生成させることができ、上記架橋剤は、上記ポリマーを上記装置の表面に結合させるために用いられる。上記架橋剤は、本明細書に記載されるような、２個又は３個以上の潜在性反応性基を有することができる。上記ポリマーコーティングの生成において、上記架橋剤を上記装置の表面に配置させ、続いてペンダント型アミン基を有するポリマーを配置させることができ、若しくは上記架橋剤を上記ポリマーと組み合わせて配置することができ、又はその両方であることができる。
【００７５】
光反応性基が、上記架橋剤上に存在する場合には、当該光反応性基を、可逆性の光分解ホモリシスを受けるように適合させ、それによりポリマー物質に接着させる際に消費されなかった光反応性基を、不活性又は「潜在性」の状態に戻すことが好ましい。続いて、共有結合形成において、引き抜くことができる水素を有するポリマーに結合させるために、これらの光反応性基を活性化することができる。従って、上記光反応性基の励起は可逆性であり、そして当該基は、上記エネルギー源を取り除くと、基底状態のエネルギー準位に戻ることができる。
【００７６】
いくつかの実施形態では、好ましい架橋剤は、複数の活性化を受け、よって、高いコーティング効率を付与することができる基である。いくつかの実施形態では、上記光反応性部分は、上記ポリマー物質から独立しており、そして例えば、架橋剤であることができる。例示的な架橋剤は、本件出願人の米国特許第５，４１４，０７５号明細書（Ｓｗａｎら）、及び米国特許出願公開第２００３／０１６５６１３号明細書（Ｃｈａｐｐａら）に記載されている。また、米国特許第５，７１４，３６０号明細書（Ｓｗａｎら）及び同５，６３７，４６０号明細書（Ｓｗａｎら）を参照せよ。
【００７７】
ペンダント型アミン基を有する非生分解性ポリマーを、単体で、又は他の所望による成分と共に、基剤に結合させることができる。最も簡単な状態では、上記コーティング組成物は、例えば、（ｉ）複数のペンダント型アミン基と、１種若しくは２種以上の潜在性反応性基とを有する非生分解性ポリマー及び／又は（ｉｉ）複数のペンダント型アミン基と、２個若しくは３個若しくは４個以上の潜在性反応性基を有する架橋剤とを有する非生分解性ポリマーから成る。上記コーティング組成物に他の成分を添加して、上記コーティングの態様を変化させるか、又は改良することができる。上記成分は、ポリマー又は非ポリマー成分であることができる。
【００７８】
他の合成又は天然の、生分解性又は非生分解性ポリマーを上記組成物に添加して、コーティングを生成させることができる。「合成ポリマー」は、合成的に調製され、そして非天然モノマー単位を含むポリマーを指す。例えば、合成ポリマーは、非天然モノマー単位、例えば、アクリレート、アクリルアミド等を含むことができる。合成ポリマーは、従来の重合反応、例えば、付加重合、縮合重合又はラジカル重合により生成するのが典型的である。
【００７９】
合成ポリマーはまた、非天然モノマー単位（例えば、合成のペプチド、ヌクレオチド及び糖誘導体）と組み合わせた天然モノマー単位、例えば、天然のペプチド、ヌクレオチド、及び糖モノマー単位を有するものを含むことができる。このタイプの合成ポリマーを、標準的な合成技法、例えば、固相合成又は組換え（可能な場合）により生成させることができる。
【００８０】
「天然ポリマー」は、天然、組換により又は合成のいずれかにより調製され、そして上記ポリマー主鎖において天然のモノマー単位から成るポリマーを指す。ある場合には、上記天然ポリマーを、変性、加工、誘導又は処理して、上記天然ポリマーの化学的及び／又は物理的性質を変化させることができる。これらの例では、用語「天然ポリマー」は、上記天然ポリマーに対する変化を反映するように修正されうる（例えば、「誘導した天然ポリマー」又は「脱グルコシル化した天然ポリマー」）。
【００８１】
生分解性物質、例えば、生分解性ポリマーをまた、上記コーティングに存在させることができる。上記生分解性物質を、上記非生分解性アミン提供ポリマーと同一のコーティング層に、所望により存在させることができ、別のコーティング層（上記コーティングに含まれる場合）に存在させることができ、又はその両方に存在させることができる。例えば、生分解性ポリマーを含むコーティング層を、上記非生分解性アミン提供ポリマーを含むコーティング層と、製品表面との間で生成させることができるか、又は上記非生分解性アミン提供ポリマーを含むコーティング層の頂部に生成させることができる。培養の際、上記生分解性ポリマーが分解可能である一方で、上記非生分解性ポリマーは上記コーティングに存在したままであり、そして長期間の培養の際に、付着面を供給する。
【００８２】
いくつかの態様では、細胞接着用のコーティングを生成させるために従来用いられているポリマーを、上記コーティング組成物に含ませることができる。例えば、ポリペプチド系ポリマー、例えば、ポリリジン、コラーゲン、フィブロネクチン、インテグリン及びラミニンを、上記コーティングに含ませることができる。これらのポリペプチドのペプチド部分をまた、上記コーティング組成物に含ませることができる。マトリックスたんぱく質の例示的な結合ドメイン配列を、表１に示す。
【００８３】
【表１】
0005908664.tif 000006
【００８４】
上記コーティング組成物中に存在する試薬にもよるが、これらのポリペプチド系ポリマーは、誘導体化していない状態又は誘導化した状態であることができる。例えば、上記ポリペプチド系ポリマーを、潜在性反応性基を用いて誘導し、次いで、上記非生分解性ポリマーに由来する上記潜在性反応性基ペンダントと共に活性化して上記コーティングを生成することができる。例示的な組み合わせには、１種又は２種以上の感光性ポリリジン（ｐｈｏｔｏ−ｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅ）、感光性コラーゲン、感光性フィブロネクチン及び感光性ラミニン、又はポリペプチドの光誘導体化部分（ｐｈｏｔｏ−ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ  ｐｏｒｔｉｏｎｓ）（本明細書に記載されるものを含む）を用いた、感光性ポリ（アミノプロピルメタクリルアミド）又は感光性ポリ（エチレンイミン）が含まれうる。
【００８５】
光誘導体化ポリペプチド（ｐｈｏｔｏｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン及びラミニンを、米国特許第５，７４４，５１５号明細書（Ｃｌａｐｐｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ｉｍｐｌａｎｔａｂｌｅ  Ａｒｔｉｃｌｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｉｚａｔｉｏｎ）に記載されるように調製することができる。この特許に記載されるように、ヘテロ二官能性薬剤を、光誘導体化するためにたんぱく質を用いることができる。当該薬剤には、一方の端のベンゾフェノン光活性化可能基（ベンゾイル安息香酸、ＢＢＡ）、中間のスペーサー（ε−アミノカプロン酸、ＥＡＣ）、及び他方の端のアミン反応性熱化学結合基（Ｎ−オキシスクシンイミド、ＮＯＳ）が含まれる。ＢＢＡ−ＥＡＣを、４−ベンゾイルベンゾイルクロリド及び６−アミノカプロン酸から合成する。
【００８６】
次いで、ＢＢＡ−ＥＡＣのＮＯＳエステルが、カルボジイミド活性によるＢＢＡ−ＥＡＣのカルボキシ基を、Ｎ−ヒドロキシスクシミド（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｍｉｄｅ）とエステル化させることにより合成され、ＢＢＡ−ＥＡＣ−ＮＯＳが生じる。たんぱく質、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン等を、商業的な供給源から購入することができる。１モルのたんぱく質当たり、１０〜１５モルのＢＢＡ−ＥＡＣ−ＮＯＳ架橋剤の比で、ＢＢＡ−ＥＡＣ−ＮＯＳ架橋剤を添加することにより、上記たんぱく質を光誘導体化する。
【００８７】
いくつかの態様では、上記コーティング組成物に、他の所望による成分を添加する場合には、上記非生分解性ポリマーが、当該組成物中で主成分であることが一般的に望ましい。上記コーティングがいくつかの生分解性成分を含む場合には、これらの成分を、一定の期間にわたって分解することができるが、上記非生分解性ポリマーは、上記コーティングの主成分として残る。
【００８８】
上記コーティング組成物の試薬、例えば、上記ポリマー物質を、好適な液体、例えば、水性又はアルコール系液体の中で調製することができる。例えば、上記ポリマー物質を、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度で溶解することができる。しかし、さらに典型的に用いられる濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬの範囲にある。
【００８９】
上記コーティングを、浸漬コーティング、インソリューション（ｉｎ−ｓｏｌｕｔｉｏｎ）コーティング及びスプレーコーティングを含む任意の好適な方法により生成することができる。
上記コーティングが光反応性基を含む場合には、照射段階を、当該光反応性基の活性化を促進する量の化学線を上記光反応性基に当て、そしてターゲット部分（例えば、上記細胞培養製品のプラスチック表面）と結合させることにより実施することができる。
【００９０】
化学線は、上記光反応性基の活性化を促進する任意の好適な光源により供給されうる。好ましい光源（例えば、Ｄｙｍａｘ  Ｃｏｒｐ．から入手できるもの）は、１９０ｎｍ〜３６０ｎｍの範囲のＵＶを照射する。好適な放射線量は、約１０ｎｍのバンド幅を有し、３３５ｎｍバンドパスフィルターを取り付けた線量計を用いて測定され、約０．１ｍＷ／ｃｍ2〜約２０ｍＷ／ｃｍ2の範囲にある。
【００９１】
いくつかの態様では、上記光反応性基を活性化する段階に関連して、フィルターを用いることが望ましい場合がある。フィルターの使用は、当該フィルターが、活性化工程の際に上記コーティングに供給される一又は複数の特定の波長の放射線の量を選択的に最小化することができる観点から有益でありうる。これは、上記コーティングの１種又は２種以上の成分が、一又は複数の特定の波長の放射線に対する感度が高く、そしてそれらが曝露の際に分解又は変質する可能性がある場合に有益であることができる。
【００９２】
典型的には、フィルターを透過させる光の波長により、フィルターを特定することができる。本発明に関連して用いることができるフィルターの２種の実例は、カットオフフィルター及びバンドパスフィルターである。一般的に、カットオフフィルターは、光線透過率が最高透過率の約２５％であるカットオフ透過率により分類されている。バンドパスフィルターの場合、波長の範囲は、当該フィルターに関して特定されており、そして中心波長は、上記フィルターを通過できる波長の中点値である。
【００９３】
上記コーティングされた製品の調製に続いて、上記基剤の表面に共有結合していない可能性がある過剰の物質を取り除くため、洗浄段階を実施することができる。上記コーティングされた製品をまた、さらなるＵＶ照射等により上記製品を殺菌するために処理することができる。
【００９４】
本発明のいくつかの優位性は、多種多様の細胞種に付着性コーティングを供給するために特に有用であるコーティングを生成することに関連する。上記コーティングの安定性のために、上記コーティング方法を実施してコーティングされた細胞培養製品を供給することができ、次いで、上記コーティングされた製品を、使用者に提供するか、又は使用前の一定の期間貯蔵することができる。他のケースでは、上記コーティング試薬（少なくとも上記非生分解性ポリマーを含む）を、キット内で、使用者に供給し、次いで、当該使用者が、上記コーティング方法を、１種又は２種以上の所望の製品に実施することができる。従って、本発明はまた、非生分解性ポリマー含有コーティングを調製するためのキットを提供することができる。上記キットには、上記コーティングを生成するための指示書が含まれることができ、そして所望により、当該キットの試薬を用いてコーティングされた製品を用いて、細胞を培養するための方法が含まれうる。
【００９５】
概して、本発明は、これらのコーティングを用いた細胞を培養するためのコーティング及び方法を提供し、そこでは、当該コーティングは、細胞接着のための優れた基剤を提供し、そして上記コーティングは、上記細胞が相当な期間（例えば、１４日超、２１日超、２８日超、３５日超、４２日超、４９日超又は５６日超）、上記コーティングと接触して保持することができる方法において用いられうる。いくつかの態様では、上記細胞をまた、約１４〜約６０日の範囲の期間、培養物中で保持することができる。例えば、上記細胞を、コーティング面に配置することができ、そこでは、当該細胞は、上記コーティングに付着し、そして適切な培地の存在下で生存が保たれる。ある場合には、上記細胞は、増殖により増えることができるが、一般的に、上記細胞の表現型は変化しない。
【００９６】
本発明のコーティングに関連して、上記細胞は、細胞を維持するか、又は所望の細胞種の形成を促進するために好適である液体培地の中で培養されるのが典型的である。種々のベース液体培地、血清、アミノ酸、微量元素、ホルモン、抗生物質、塩、緩衝剤及び増殖因子を補うことができるＲＰＭＩ等を用いることができる。細胞の機能（例えば、増殖及び分化）の態様に作用しうる因子をまた、上記液体培地に添加することができる。これらの因子には、ニューロトロフィン、サイトカイン（例えば、インターロイキン）、インスリン様増殖因子、形質転換増殖因子、上皮細胞増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、ヘパリン結合性増殖因子、チロシンキナーゼ受容体配位子、血小板由来増殖因子及び血管内皮増殖因子及びセマフォリンが含まれうる。
【００９７】
例示的なニューロトロフィンには、神経増殖因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン及び脳誘導神経向性因子が含まれる；例示的な上皮細胞増殖因子には、ニューレグリン、形質転換増殖因子α及びネトリンが含まれる；例示的なサイトカインには、インターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５及びＧ−ＣＳＦ、白血病抑制因子、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、カルディオトロフィン−１（ｃａｒｄｉｏｔｒｏｐｈｉｎ−１）及びオンコスタチン−Ｍが含まれる；例示的な形質転換増殖因子には、グリア細胞株由来神経栄養因子（ｇｌｉａｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ，ＧＤＮＦ）、アルテミン、ニュールツリン（ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ）及びパーセフィンが含まれる。
【００９８】
本発明のいくつかの態様では、上記方法は、適切な培地の存在下で、本明細書に記載されるように、コーティングされた基剤上で幹細胞を培養することを含む。幹細胞は、多分化能を有し且つ成形的である（それらが種々の細胞種に分化することを誘導する）。幹細胞には、胚幹細胞、例えば、胚盤胞から得られるもの、及び成体の身体中の種々の組織から得ることができる成体幹細胞、例えば、造血幹細胞源を供給する骨髄が含まれる。
【００９９】
胚幹細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで本質的に無限の増殖能を有し、従って、適用、例えば、組織再生を含む適用において、大きく増やすことができる。本発明のコーティングは、これらの細胞を培養するための理想の基剤を提供する。というのは、他の基剤よりも相当長い期間、コーティングされた基剤上で、上記細胞を維持し、且つ伸長させることができるからである。従って、上記コーティングは、所望の用途、例えば、細胞移植又は再生医療のために、多くの幹細胞を得ることを顕著に促進することができる。
【０１００】
本発明の方法に従って培養された細胞をまた、ドラッグデリバリー、遺伝子同定のため、そして抗体生産のために用いることができる。
本発明のコーティングはまた、クローン又は少数の細胞をコーティングされた製品容器に接種し、そして培養において、集密状態（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ  ｓｔａｔｅ）に到達する前の上記細胞を収穫、分割又は希釈する前に、より長い期間を可能とする。上記細胞を、本明細書に記載される任意の２次元又は３次元の製品上で増やすことができる。
【０１０１】
ある場合には、上記細胞を上記コーティング面上に配置させる前に、当該細胞を細胞のフィーダー層に保持することができる。上記フィーダー層上で一定の期間、培養することに続いて、本明細書に記載される本発明のコーティングを有する細胞培養製品に、上記細胞を移動させることができる。本発明に従って、上記コーティングされた基剤上で、新鮮なコーティング面を供給する必要なく、最大約３０日の期間、上記細胞を培養することができることが見出された。
【０１０２】
本発明の他の態様では、本発明は、神経前駆細胞及び幹細胞の分化のための方法に関する。本発明に従うと、部分的又は完全に成熟した神経細胞表現型の形態学又は生化学的変化の特徴を誘発する１種又は２種以上の因子（例えば、神経栄養増殖因子）及び本発明のコーティングの存在下で、神経前駆細胞を培養することができる。
【０１０３】
さらに具体的には、いくつかの態様では、乏突起神経膠芽細胞、星状細胞及び神経細胞に分化させるために誘導することができる多分化能の神経上皮幹細胞及び系統限定中間前駆細胞を培養するために、上記コーティングを用いることができる。上記前駆細胞は、種々の発育段階においてＣＮＳ中に存在する。
本発明の一態様では、上記方法を、神経突起の伸張を促進するために用いることができる。
【０１０４】
プラスチックに弱く付着するＰＣ１２細胞（褐色細胞腫細胞）が、本明細書に記載されるコーティングされた基剤に良好に付着することを実証することができた。一般的に、ＰＣ１２細胞は増殖が遅く、そしてＮＧＦ及びｃＡＭＰの共働作用を用いて、分化させることができる。一度分化したＰＣ１２細胞を、約１４日間維持することができる。デキサメタゾンは、非神経系リネージの分化を誘導する。本明細書に記載される結果はまた、上記非生分解性ポリマーアミン含有コーティング及び神経増殖因子（ＮＧＦ）の存在下の、神経性前駆物質ＰＣ１２細胞が、神経突起伸張及び交感神経系神経細胞表現型の生化学的標識の発現を示すことを教示している。
【実施例】
【０１０５】
例１
感光性ポリマー試薬
Ｉ．感光性ポリ（ＡＰＭＡ）
感光性ポリ（アミノプロピルメタクリルアミド）（感光性ポリ（ＡＰＭＡ）／ＡＰＯ２）の調製を、Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミドヒドロクロリド（ＡＰＭＡ−ＨＣｌ）及びＮ−［３−（４−ベンゾイルベンズアミド）プロピル］メタクリルアミド（ＢＢＡ−ＡＰＭＡ）の共重合により実施した。これらの調製は、同一出願人による米国特許第５，８５８，６５３号明細書の、それぞれ、例２及び例３に記載されている。
【０１０６】
２Ｌのフラスコに、２．３７８ｇのＢＢＡ−ＡＰＭＡ（６．７８７７ミリモル）、０．８４９の２，２’−アゾビス（２−メチル−プロピオニトリル）（ＡＩＢＮ）（５．１７４８ミリモル）及び０．８４９ｇのＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）（６．７７ミリモル）を添加し、次いで、当該成分を溶解させるために７８６ｇのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加して共重合を行った。次いで、当該内容物を撹拌し、そして少なくとも５分の間、ヘリウムスパージャを用いて酸素を除去した。別個のフラスコにおいて、窒素スパージャを用いて、３０６ｇのＤＩ水の中に、７２．４ｇのＡＰＭＡ−ＨＣｌ（４０５．２１５ミリモル）を溶解させた。溶解したＡＰＭＡ−ＨＣｌを、ＢＢＡ−ＡＰＭＡを含む混合物に移動し、続いて少なくとも１０分間、ヘリウムスパージャを行った。続いて、密封した容器を、５５℃で一晩中加熱して重合を完了させた。
【０１０７】
次いで、１８０ｍＬの量の上記ポリマー溶液を、１８０ｍＬのＤＩ水で希釈し、そして毎分１．２５〜０．３５ガロンの一定流量を用いて、５５ガロンのタンクの中で、少なくとも９６時間の間、１２，０００〜１４，０００の分子量カットオフチューブを用いて、脱イオン水で透析した。
１０μｇ／ｍＬ〜２０ｍｇ／ｍＬの範囲にわたる上記感光性ポリ（ＡＰＭＡ）ポリマーを有する種々のコーティング溶液を、水中で調製した。
【０１０８】
ＩＩ−ＩＶ．感光性コラーゲン、感光性フィブロネクチン及び感光性ラミニン
感光性コラーゲン、感光性フィブロネクチン及び感光性ラミニンを、同一出願人による米国特許第５，７４４，５１５号明細書の例１に記載されるように調製した。
２５μｇ／ｍＬ〜３００μｇ／ｍＬの範囲にわたる種々の感光性ラミニンコーティング溶液を、水中で調製した。
感光性フィブロネクチンコーティング溶液を、水中において、２５μｇ／ｍＬに調製した。
感光性コラーゲンコーティング溶液を、０．０１２ＮのＨＣｌ中において、２５μｇ／ｍＬに調製した。
【０１０９】
Ｖ．感光性ＰＥＩ
最初に、減圧下でポリエチレンイミン（ＰＥＩ；２４．２ｗｔ．％  固形分；２０００ｋｇ／モル  Ｍｗ；ＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐ．）を乾燥させ、次いで、１９ｍＬの９０：１０（ｖ／ｖ）クロロホルム：メタノール溶液に１．０９ｇのＰＥＩを溶解して、感光性ＰＥＩを調製した。次いで、当該ＰＥＩ溶液を、氷浴中で０℃まで冷却した。撹拌すべき６２ｍｇのＢＢＡ−Ｃｌ（４−ベンゾイルベンゾイルクロリド；その調製は、米国特許第５，８５８，６５３号明細書に記載されている）を、２．８ｍＬのクロロホルムに添加した。ＢＢＡ−Ｃｌ溶液を冷却し、撹拌しているＰＥＩ溶液に添加した。
【０１１０】
上記反応溶液を、室温まで加温しながら一晩中撹拌した（上記反応のＴＬＣ分析により、２．５時間後に未反応のＢＢＡ−Ｃｌは存在しないことが示された）。翌日、上記反応溶液を大きなフラスコに移し、そして７７．５ｍＬの脱イオン水とともに、１当量の濃塩酸を添加した。水性ＰＥＩ溶液の外観が透明になるまで、有機溶媒を、４０℃、減圧下で取り除いた。次いで、水性ＰＥＩ溶液を、コーティング溶液として用いるための５ｍｇ／ｍＬの最終濃度に希釈した。
【０１１１】
Ｖ．感光性ＲＧＤ
感光性ＲＧＤを、同一出願人による米国特許第６，１２１，０２７号明細書の例１に記載されるように調製した。感光性ＲＧＤのコーティング溶液を、水中において、２５μｇ／ｍＬに調製した。
【０１１２】
例２
基剤コーティング
上記例１で調製された感光性ポリマー試薬を、平面（複数のウェルのプレート）及び３次元の基剤（高分子量ナノ繊維）上にコーティングした。
【０１１３】
平面をコーティングするため、１．０ｍＬの量の、例１に記載されるコーティング溶液を、１２個のウェルのプレート（ポリスチレン；Ｃｏｒｎｉｎｇ）のウェルに添加した。基剤コーティングにおいて、上記コーティング溶液の深さ（上記溶液の表面から、基剤、ポリスチレン又はナノ繊維のどちらかの表面までの距離）は、概して５ｍｍ以下、そして典型的には、約１〜２ｍｍの範囲にある。Ｄｙｍａｘ（商標）製ランプを使用して、１０ｎｍのバンド幅を有する３３５ｎｍのバンドパスフィルターを用いて評価されるような２００〜３００ｍＪのエネルギーを供給した（平均して、上記ウェルから２０ｃｍの距離に保たれているランプを用いて、約３〜４分間、上記ウェルを照射した）。次いで、上記ウェルを、ｐＨ７．２の緩衝食塩水を用いて洗浄し、結合していない試薬を取り除いた。次いで、上記ウェルを再度ＵＶ照射し、上述と同一の照射条件を用いて、上記ウェルを殺菌した。
【０１１４】
コーティングされていない１２個のウェルのプレートを、対照として用いた。３次元の表面をコーティングするため、０．５ｍＬの量の、例１に記載されるコーティング溶液を、ディスク状の（ｄｉｓｃ）ナノ繊維基剤（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ−ＥＣＭ（商標）、Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ  Ｃｏ．，ＭＮから市販されている）に添加した。約２０ｃｍの距離におけるＤｙｍａｘ（商標）製ランプを用いて、１分間、上記基剤を照射した。次いで、上記ディスクを、水で４回洗浄した。次いで、上記ナノ繊維基剤を、再度ＵＶ照射し、当該ナノ繊維基剤を殺菌した。
コーティングされていないナノ繊維基剤を、対照として使用した。
【０１１５】
例３
感光性ポリマーがコーティングされた基剤上のＰＣ１２細胞の接着アッセイ
付着性の乏しい細胞（ＰＣ１２細胞）を、種々の感光性ポリマー基剤上に平面培養する（ｐｌａｔｅ）効果を決定するために、接着アッセイを実施した。ＡＴＣＣ（登録＃ＣＲＬ  １７２１）から購入したラットＰＣ１２（褐色細胞腫）細胞を、１０％の馬血清、５％の牛血清、２ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＲＰＭＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の、コラーゲンがコーティングされたポリスチレンフラスコ（１５μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）内で前培養した。細胞を、５％ＣＯ2／９５％空気加湿チャンバー内で、３７℃でインキュベートした。上記培地を、１日おきに交換した。細胞が、８０％の密集度に到達したら、当該細胞をトリプシン処理し、そして継代培養した。例２に記載される方法に従ってコーティングされた１２個のウェルの基剤に、上記細胞を平面培養する前に、これらの培養条件を続けた。
【０１１６】
継代培養＃２及び継代培養＃１０の間のＰＣ１２細胞を、実施した全ての実験において用いた。上記細胞をトリプシン処理し、そして５００，０００個の細胞／ｍＬの濃度において、ＲＰＭＩ培地中の、１２個のウェルのプレート内に５００，０００個の細胞／ウェルの密度で接種した。４８時間の間、５％のＣＯ2を用いて、３７℃における加湿したチャンバー内で、細胞をインキュベートした。上記細胞は、平面培養する前に、多角形の形態を有し、少なくとも９９％が生存していた。
【０１１７】
細胞をナノ繊維上に接種するために、ＰＣ１２細胞をトリプシン処理し、そして２００μＬのＲＰＭＩ培地内に再懸濁させた。５００，０００個の細胞／１８ｍｍの密度の上記細胞懸濁液を、コーティングされた又はコーティングされていないナノ繊維（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ−ＥＣＭ（商標）、製品番号Ｐ６０９１９２、Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ  Ｃｏ．，ＭＮから市販されている）に注意深く添加し、そして上記細胞を、層流フードの下、室温で、１０分間、上記ナノ繊維に付着させた。１０分後、８００μＬの増殖培地を、上記ナノ繊維の周りにやさしく添加し、そして上記細胞を、３７℃において、加湿した５％ＣＯ2／９５％空気チャンバー内に置いた。上記培地を、１日おきに交換した。
【０１１８】
ＭＴＴ接着アッセイ
４８時間後、上記増殖培地を取り出し、そしてコーティングされた及びコーティングされていないポリスチレン上で増殖している上記細胞、コーティングされた及びコーティングされていないナノ繊維を、Ｃａ++−及びＭｇ++−フリーのＰＢＳを用いて、４回洗浄した。これらの複数回の洗浄により、上記ウェルから、ゆるく結合した又は結合していない細胞を除去した。コーティングされた基剤上で、洗浄により５％の細胞が除去された一方で、コーティングされていない基剤上では、洗浄により７０％が除去された。次いで、３７℃における加湿されたチャンバー内で、ＭＴＴを用いて、２時間の間、細胞をインキュベートした（増殖培地、Ｓｉｇｍａを用いて、１：１に希釈）。ＭＴＴを含む培地を取り出し、そして上記細胞を、ＰＢＳを用いてさらに洗浄し、フェノールレッドを取り除いた。５００μＬの染料可溶化剤（０．５ｍＬの０．０４ＮＨＣｌ／イソプロピルアルコール及び０．１２ｍＬの３％ＳＤＳ／水の混合物）を添加し、そして上記ウェルを、室温で３０分間（又は染料が完全に可溶化するまで）、３０ｒｐｍでやさしく揺り動かした。当該試料を、９６個のウェルの皿に移動し、そして分光光度計（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）内で、５７０ｎｍにおいて、吸光度を読取った。
【０１１９】
コーティングされた及びコーティングされていない平面（１２個のウェルのプレート）上の細胞接着の結果を、図１に示す。ＰＣ１２細胞の最良の接着は、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）を用いてコーティングしたウェルで実証され、感光性ラミニン及び感光性ＰＥＩ試薬が続いた。コーティングされていないウェル及び感光性フィブロネクチンによりコーティングされた基剤を、対照として用いた。ＰＣ１２細胞は、フィブロネクチンに良好に付着する他の細胞種と比較して、それらの表面に低濃度のフィブロネクチン受容体を発現させる（Ｔｏｍａｓｅｌｌｉ及びＲｅｉｃｈａｒｄｔの「Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．」（１９８７）１０５：２３４７−２３５８を参照せよ）。感光性ＲＧＤ及び感光性コラーゲンは、感光性ポリ（ＡＭＰＡ）と同様の、感光性コラーゲン及び感光性ラミニンと比較して感光性ポリ（ＡＭＰＡ）の接着能におおよそ２倍の差を有する実施されたコーティングを供給しなかったことを、当該結果は示している。
【０１２０】
３次元の表面（ナノ繊維）上の細胞接着の結果を、図２に示す。平面上の結果と同様に、上記感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされたナノ繊維は、コーティングされていない基剤と比較して、固定が弱い細胞を、強く接着させることが示された。
【０１２１】
図３は、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされたナノ繊維（３Ｂ）及びコーティングされていないナノ繊維（３Ａ）上で増殖するＰＣ１２細胞の明視野顕微鏡像を示す。２４時間後に、当該画像を撮影した。ＰＣ１２細胞は、上記感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされたナノ繊維上で、良好に広がることを実証したが、コーティングされていない表面では、上記細胞は、お互いに接着してクラスターを形成し、コーティングされていない基剤への接着は非常に弱かった。
【０１２２】
図４は、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされたナノ繊維上で２４時間の間増殖させ、そしてファロイジン（１：５００、分子プローブ）を用いた染色を受けたＰＣ１２細胞の蛍光顕微鏡像を示す。ファロイジンは、線維状アクチン（Ｆ−アクチン）に結合し、そして上記細胞の細胞骨格組織を可視化する。感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされたナノ繊維上で培養されたＰＣ１２細胞は、それらの通常の多角形形態を保持し、上記基剤の強い結合能力が細胞形態に影響を与えないことを示していることを、上記染色結果は示している。
【０１２３】
ファロイジン染色の場合、ＰＣ１２細胞を、４％のパラホルムアルデヒドを用いて２０分固定し、０．１ＭのＰＢＳで３回洗浄し、そして０．５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（商標）及び５％のヤギ血清を含むＰＢＳ内で希釈したＴＲＩＴＣと共役したファロイジンを用いて、室温で１時間の間インキュベートした。０．１ＭのＰＢＳを用いて細胞を洗浄し、そして倒立顕微鏡の下で観察した。
【０１２４】
上記細胞が３次元の基剤上で培養されると、アクチンは、大きく広がるのではなく、皮質の環の中で組織化することを、当該画像は示している。アクチンのこの組織化は、組織マトリックス又は組織様マトリックスのどちらかの中で観察される（Ｗａｌｐｉｔａ及びＨａｙの「Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．ＭｏＬ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．」（２００２）３：１３７−１４１；米国特許出願第２００５／００９５６９５号号明細書）。
【０１２５】
付着性の乏しい細胞系の付着性を特に改良した感光性試薬を実証するために、付着性の強い細胞系を上記感光性ポリマーがコーティングされた基剤上で平面培養した。ヒト包皮繊維芽細胞（ｈｕｍａｎ  ｆｏｒｅｓｋｉｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ，ＨＦＦ）を、ＰＣ１２細胞の場合に用いられる方法に従って、感光性ポリマーがコーティングされた基剤上で平面培養し、そしてＭＴＴ接着アッセイを、培養に続いて実施した。図５は、上記感光性試薬の存在により、むき出しのポリスチレンと比較して、ＨＦＦ細胞の付着性が概して改良されなかったことを示している。試験された種々のコーティングされた基剤上で、付着性の強い細胞系の接着に、利益は観察されなかった。
【０１２６】
例４
感光性ポリマーがコーティングされた表面のＰＣ１２細胞の増殖
ＰＣ１２細胞を、例３に記載されるように培養した。ＢｒｄＵ取り込みを、コーティングされた及びコーティングされていないナノ繊維（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ−ＥＣＭ（商標）、製品番号Ｐ６０９１８６、Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ  Ｃｏ．，ＭＮから市販される）、並びにコーティングされた及びコーティングされていないポリスチレン上で増殖した細胞に関して試験した。一日で、２，５−ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ、１μＭ濃度、Ｓｉｇｍａ）を、上記培養物に添加し、分裂細胞の数の測定を可能とした。免疫細胞化学を実施するために、４８時間の間、ＢｒｄＵを細胞に適用し、次いで、抗ＢｒｄＵ抗体を用いて染色した。
【０１２７】
ＰＣ１２細胞を、Ｓ．Ｐ  Ｍｅｍｂｅｒｇ＆Ａ．Ｋ．Ｈａｌｌ（「Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．」（１９９５）２７：２６−４３）の手順により透過化した（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅ）。細胞培養物を、１時間の間、ブロッキングバッファー（ＰＢＳ、０．５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（商標）、及び５％のヤギ血清）中の抗ＢｒｄＵ抗体（１：１００、Ｓｉｇｍａ）を用いてインキュベートし、ＰＢＳですすぎ、そして追加の時間、ブロッキングバッファー中の抗マウスＩｇＧｌ二次抗体（１：２００、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてインキュベートした。培養物を、ＰＢＳで３回すすぎ、そして標識付けた細胞を、倒立顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＤＭＬＡ）で観察した。
【０１２８】
図６は、ＰＣ１２細胞内のＢｒｄＵ取り込みの蛍光顕微鏡像を示す。当該画像には、コーティングされていないナノ繊維と比較して、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされたナノ繊維上でＢｒｄＵがより顕著に取り込まれたことが示されている。コーティングされていない表面と比較して、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされた表面のＢｒｄＵのより顕著な組み込みは、より多数の分裂細胞に関連し、そして上記感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされた表面上の上記細胞の接着が改良されたためであると考えられる。一定の範囲に存在する細胞の総数は、ＤＡＰＩ染色により示されている。上記感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされた基剤上で増殖した細胞は、感光性ポリリジンがコーティングされた基剤と比較して、６０％超のＢｒｄＵの取り込みを示した。
【０１２９】
例５
種々のコーティングされた表面及びコーティングされていない表面上のＰＣ１２細胞の分化
感光性ポリマーがコーティングされた及びコーティングされていないポリスチレン製の１２個のウェルのプレート、感光性ポリマーがコーティングされた及びコーティングされていないナノ繊維（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ−ＥＣＭ（商標）、製品番号Ｐ６０９１８６、Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ  Ｃｏ．，ＭＮから市販される）、ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、並びにＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で増殖するＰＣ１２細胞の分化を、ＮＧＦ（神経増殖因子）の存在下で評価した。
試験された他の感光性試薬には、感光性フィブロネクチン、感光性ラミニン、感光性コラーゲン、感光性ＰＥＩ及び感光性ＲＧＤが含まれていた。
【０１３０】
細胞をトリプシン処理し、そして当該細胞を、例３に記載されるそれらの通常の増殖培地内の３０，０００個の細胞／３５ｍｍウェルの密度で平面培養した。２４時間後、上記増殖培地を、分化培地（１％の馬血清、０．５％の牛血清、２μＭのＧｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＲＰＭＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））で置換した。細胞を、５％のＣＯ2／９５の％空気が加湿されたチャンバー内で、３７℃でインキュベートし、そして１日おきにＮＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し、１０日間分化させた。神経細胞への分化を評価するために、１０日間培養した後、上記細胞を、β−ＩＩＩチューブリンに関して染色した。
【０１３１】
免疫染色を実施するために、上記細胞を２０分間、４％のパラホルムアルデヒドで固定し、０．１ＭのＰＢＳで３回洗浄し、そして０．５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（商標）及び５％のヤギ血清を含むＰＢＳ内で、β−ＩＩＩチューブリン一次抗体（１：２００、Ｓｉｇｍａ）を用いて１時間の間インキュベートした。細胞を洗浄し、そして追加の時間、抗マウス二次抗体（ＩｇＧ２ｂ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてインキュベートした。細胞を洗浄し、そして倒立顕微鏡の下で観察し、β−ＩＩＩチューブリン染色を視覚化した。
【０１３２】
一般的に、上記感光性ポリマーでコーティングされた平坦又は３次元の表面により、神経細胞含有突起に富む、分化した培養物が生産された。これらの表面上の平均神経突起長は、コーティングされていない表面と比較して２倍であった。他の感光性試薬（感光性ラミニン、感光性ＰＥＩ及び感光性コラーゲン）がまた、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）よりも良好とまではいかないが、コーティングされていないポリスチレン又はナノ繊維よりも良好であることが見出された。
【０１３３】
よって、上記感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされた表面により、コーティングされていないポリスチレン、コーティングされていないナノ繊維、コラーゲン、ＰＥＩ及び市販のＰｕｒａｍａｔｒｉｘ及びＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）調製物と比較して、ＰＣ１２細胞が神経細胞に良好に分化した。
図７は、コーティングされていないポリスチレンと比較して、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）及び感光性ラミニンがコーティングされたポリスチレン上で、ＰＣ１２細胞が良好に分化することを示す。
【０１３４】
図８は、コーティングされていないナノ繊維と比較して、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）及び感光性ラミニンがコーティングされたナノ繊維上で、ＰＣ１２細胞が良好に分化することを示す。
図９は、ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（商標）及びＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）と比較して、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされたナノ繊維上で、ＰＣ１２細胞が良好に分化することを示している。感光性ＡＰＭＡは、ナノ繊維上で、より良好な細胞分化と、より長い神経突起伸張とを定量的に促進する。
β−ＩＩＩチューブリン染色、神経突起形態及び細胞分化の評価を、表２に要約する。
【０１３５】
【表２】
0005908664.tif 000007
【０１３６】
例６
感光性ポリマーがコーティングされた表面上のＥＳ−Ｄ３細胞の増殖
ＡＴＣＣ（登録番号ＣＲＬ−１９３４）に由来するＥＳ−Ｄ３細胞を、４日間、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ，Ｃａｍｂｒｅｘ）及び白血病抑制因子（ＬＩＦ，１０ｎｇ／ｍＬ，Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を有するＤＭＥＭ−Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内の懸濁皿（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｄｉｓｈ）（Ｎｕｎｃ）内で、集合体として増殖させた。次いで、上記培地を、ＮＥＰ基本培地（１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン、５μｇ／ｍＬのインスリン、１６μｇ／ｍＬのプトレシン、２０ｎＭのプロゲステロン、３０ｎＭの亜セレン酸、１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン、Ｂ２７及びＮ２添加剤を加えた２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦで補ったＤＭＥＭ−Ｆ−１２）と称される化学的に規定された培地に換え、そして上記細胞を、フィブロネクチン（１５μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）がコーティングされたポリスチレン皿、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされた及びコーティングされていないナノ繊維（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ−ＥＣＭ（商標）、製品番号Ｐ６１０３０４、Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ  Ｃｏ．，ＭＮから市販される）上に接種した。１日おきに培地を交換し、そして上記細胞を、５％のＣＯ2／９５％の空気が加湿されたチャンバー内で３７℃に維持した（Ｍｕｊｔａｂａ及びＲａｏの「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９９９）２１４：１１３〜１２７）。
感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされた表面を、ＥＳ−Ｄ３細胞と共に用いた。
【０１３７】
増殖性ＥＳ−Ｄ３細胞のためのネスチン染色
ＥＳ−Ｄ３細胞を、２４時間及び４８時間のところで分析した。ＥＳ−Ｄ３細胞を、次のように、ネスチン、未分化の幹細胞のマーカーの存在のために染色した（Ｕ．Ｌｅｎｄａｈｌらの「Ｃｅｌｌ」（１９９０）６０：５８５−９５）。４％のパラホルムアルデヒドを用いて、細胞を、室温で２０分間固定した。０．１ＭのＰＢＳを用いて、ｐＨ７．４で、それらを３回洗浄し、そして室温で２時間の間、０．５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（商標）及び５％のヤギ血清を含むＰＢＳ内で１：１に希釈されたラットネスチン（ラット４０１、ＤＳＨＢ）に対する一次抗体を用いてインキュベートした。
【０１３８】
次いで、細胞を、０．１ＭのＰＢＳを用いて５分間洗浄し、そして追加の時間、０，５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（商標）及び５％のヤギ血清を含むＰＢＳ内で希釈された抗マウス第二抗体（１：２００，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてインキュベートし、その後、０．１ＭのＰＢＳを用いてそれらを３回洗浄し、そして倒立顕微鏡（Ｌｅｉｃａ，ＤＭＬＡ）の下で観察した。ＢｒｄＵでネスチンを二重に標識付け、そして一次抗体の適切な組み合わせ、次いで交差反応をしない（ｎｏｎ−ｃｒｏｓｓ  ｒｅａｃｔｉｖｅ）二次抗体の中で細胞を同時にインキュベートして、二重標識実験を実施した。
【０１３９】
図１０は、コーティングされたナノ繊維上に、ネスチン／ＢｒｄＵ陽性ＥＳ−Ｄ３細胞が存在することを示す。上記細胞の大部分は、試験された他の全てのリネージマーカーに関して、ネスチン陽性及び陰性（ＧＦＡＰ、β−ＩＩＩチューブリン、及びＯ４）であり、未分化の幹細胞の培養物を、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）でコーティングした、これらの完全なる合成面上で維持することができることを示す。
【０１４０】
例７
コーティング面上のＥＳ−Ｄ３細胞の分化
ネスチン陽性ＥＳ−Ｄ３細胞を、基本培地（１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン、５μｇ／ｍＬのインスリン、１６μｇ／ｍＬのプトレシン、２０ｎＭのプロゲステロン、３０ｎＭの亜セレン酸、１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン、Ｂ２７及びＮ２添加剤を加えた２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦで補ったＤＭＥＭ−Ｆ−１２）内の感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされたナノ繊維（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ−ＥＣＭ（商標）、製品番号Ｐ６０９１９２、Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ  Ｃｏ．，ＭＮから市販される）上で増殖させた。
【０１４１】
細胞を誘導して、上記増殖培地からｂＦＧＦを取り除き、そしてレチノイン酸（１μＭ、Ｓｉｇｍａ）、ＰＤＧＦＢＢ（１０ｎｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）、ＣＮＴＦ（１０ｎｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）、１０％血清（ＦＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のいずれかを添加して分化させた（Ｍｕｊｔａｂａ及びＲａｏ，上記個所）。誘発剤を毎日添加して６日間培養した後、上記幹細胞は、神経細胞、乏突起神経膠芽細胞及び星状細胞に分化した。上記分化を、上記細胞の基剤を変えることなく達成した。
【０１４２】
β−ＩＩＩチューブリン染色
上記細胞を、４％のパラホルムアルデヒドを用いて２０分間固定し、０．１ＭのＰＢＳで３回洗浄し、そして室温で１時間の間、０．５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（商標）及び５％のヤギ血清を含むＰＢＳ内の神経細胞用のマーカー、β−ＩＩＩチューブリン（１：２００、Ｓｉｇｍａ）を用いてインキュベートした。細胞を洗浄し、そして追加の時間、抗マウス二次抗体（ＩｇＧ２ｂ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてインキュベートした。細胞を洗浄し、そして倒立顕微鏡の下で観察した。
【０１４３】
場合によっては、次のように、ＤＡＰＩを用いて染色した。上記のように調製した細胞を、ＤＡＰＩ溶液（１００％ＭｅＯＨ内で１：１０００に希釈、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で洗浄した。固定した細胞を、室温で１５分間、ＤＡＰＩ溶液を用いてインキュベートした。
【０１４４】
乏突起神経膠芽細胞のためのＯ４染色
４％のパラホルムアルデヒドを用いて、室温で１０分間、細胞を固定した。０．１ＭのＰＢＳ、ｐＨ７．４を用いて、５分間、細胞を３回洗浄した。室温で２時間の間、５％のＢＳＡを含む培地内で、Ｏ４（６μｇ／ｍＬ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）に対する一次抗体と共に、細胞をインキュベートした。次いで、０．１ＭのＰＢＳ、ｐＨ７．４を用いて、５分間、調製物を３回洗浄した。二次抗体と共に細胞をインキュベートし、そしてβ−ＩＩＩチューブリンに関して上述のようにさらに処理した。
【０１４５】
星状細胞用のＧＦＡＰ染色
４％のパラホルムアルデヒドを用いて、室温で２０分間、細胞を固定した。０．１ＭのＰＢＳ、ｐＨ７．４を用いて、５分間、細胞を３回洗浄した。室温で２時間の間、０．５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（商標）及び５％のヤギ血清を含むＰＢＳで、ＧＦＡＰ（１：５００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）に対する一次抗体を用いて細胞をインキュベートした。細胞を洗浄し、そして抗マウス二次抗体と共にインキュベートし、そしてβ−ＩＩＩチューブリンに関して上述したようにさらに処理した。
【０１４６】
コーティングされていないナノ繊維と、ポリ−リジン（１５μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）及びラミニン（１５μｇ／ｍＬ、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を用いて二重にコーティングしたポリスチレンとを、対照として用いた。
適切な細胞種への良好な分化は、コーティングされていないナノ繊維及びポリリジン／ラミニンで二重にコーティングされている組織培養プラスチックと比較して、コーティングされたナノ繊維上で得られ、そしてこの分化は、適切な誘発剤を同一の基剤に単に添加するのみで達成される。
【０１４７】
図１１は、ＥＳ−Ｄ３細胞が、コーティングされていないナノ繊維上で増殖する神経細胞と比較して、より長い神経突起長を有する神経細胞含有突起（当該突起は、短く且つ切り株様（ｓｔｕｂｂｙ）である）に分化することを示す。
図１２は、ＥＳ−Ｄ３細胞が、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされたナノ繊維上で、タイプＩ及びタイプＩＩのＧＦＡＰ陽性星状細胞に分化することを示す。当該細胞は、コーティングされたナノ繊維上で、より明るいことに留意する。
【０１４８】
例８
クローン濃度（ｃｌｏｎａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ）におけるＰＣ１２細胞の増殖
ＰＣ１２細胞を、３５ｍｍウェル内に置いた３００個の細胞／３２ｍｍナノ繊維ディスク（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ−ＥＣＭ（商標）、製品番号Ｐ６０９１８６、Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ  Ｃｏ．，ＭＮから市販される）において平面培養し、そして１日おきにＮＧＦを添加して、３０分間分化させた（例５に記載されるように）。３０日後、上記細胞を２０分間、４％のパラホルムアルデヒドで固定し、０．１ＭのＰＢＳで３回洗浄し、そして室温で１時間の間、０．５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（商標）及び５％のヤギ血清を含むＰＢＳ内のβ−ＩＩＩチューブリン（１：２００、Ｓｉｇｍａ）を用いてインキュベートした。細胞を洗浄し、そして追加の時間、抗マウス二次抗体（ＩｇＧ２ｂ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてインキュベートした。細胞を洗浄し、そして倒立顕微鏡の下で観察した。単一細胞は、４日の培養後、クローンを生成し始めた。当該クローンは、迅速に増殖し、そして上記コーティング面にしっかりと接着したままであった。
【０１４９】
例９
感光性ポリマーコーティング上のＰＣ１２細胞の長期間培養
例８に記載されるように培養したＰＣ１２細胞を、４５日間維持し、そしてβ−ＩＩＩチューブリンに関して処理した。図１３は、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされた表面上で増殖する、分化したＰＣ１２細胞を示す。３０日の培養の後、上記細胞はしっかりしており、そして広範囲な神経突起を示した。
本発明は、以下の態様を含んでいる。
（１）移植可能な医療用製品の少なくとも一部上に生成させたコーティングを含む前記移植可能な医療用製品であって、
前記コーティングは、下記を含むポリマーを含む：
（ｉ）次の式：
−Ｒ1Ｒ2ＮＲ3Ｒ4
（式中、Ｒ1は、下記：
【化５】
0005908664.tif 000008
であり；
Ｒ2は、Ｃ1〜Ｃ8の直鎖又は分岐鎖のアルキルであり；そして
Ｒ3及びＲ4は両方とも前記窒素に結合し、そしてそれぞれ、Ｈ又はＣ1〜Ｃ6の直鎖若しくは分岐鎖のアルキルである）
を有する少なくとも１種のペンダント型アミン含有基：及び
（ｉｉ）前記コーティングを生成するように結合している、少なくとも１種のペンダント型の潜在性の反応した基。
（２）前記ペンダント型アミン含有基が、次の式：
−Ｒ1Ｒ2ＮＲ3Ｒ4
を有し、そして
Ｒ1が、下記：
【化６】
0005908664.tif 000009
であり、
Ｒ2が、Ｃ2〜Ｃ4の直鎖又は分岐鎖のアルキルであり；そして
Ｒ3及びＲ4が、両方とも前記窒素に結合し、そしてそれぞれ、Ｈ、ＣＨ3又はＣ2Ｈ5である、（１）に記載の移植可能な医療用製品。
（３）前記ポリマーが、３−アミノプロピルメタクリルアミド、３−アミノエチルメタクリルアミド及びジメチルアミノプロピルメタクリルアミドから成る群から選択される１種又は２種以上のモノマーを含む、（２）に記載の移植可能な医療用製品。
（４）前記ポリマーが、３−アミノプロピルメタクリルアミド（ＡＰＭＡ）を含む、（３）に記載の移植可能な医療用製品。
（５）前記ペンダント型アミン含有基が、前記ポリマー中の総モノマーユニットに基づいて、前記ポリマーの５０％以上のモル濃度量で存在する、（１）に記載の移植可能な医療用製品。
（６）前記ペンダント型アミン含有基が、前記ポリマー中の総モノマーユニットに基づいて、前記ポリマーの９０％〜９９．９５の範囲のモル濃度量で存在する、（５）に記載の移植可能な医療用製品。
（７）前記ペンダント型の潜在性の反応した基が、光反応した基を含む、（１）に記載の移植可能な医療用製品。
（８）前記光反応した基が、アセトフェノン、ベンゾフェノン、アントラキノン、アントロン及びアントロン様複素環、並びにそれらの置換された誘導体から成る群から選択される、（７）に記載の移植可能な医療用製品。
（９）前記光反応した基が、前記ポリマー中の総モノマーユニットに基づいて、０．１％〜１０％の範囲のモル濃度量で存在する、（８）に記載の移植可能な医療用製品。
（１０）前記ポリマーが、２０ｋＤａ〜２０００ｋＤａの範囲の分子量を有する、（１）に記載の移植可能な医療用製品。
（１１）前記コーティングが人工血管上に存在する、（１）に記載の移植可能な医療用製品。
（１２）前記コーティングが、前記製品の多孔質構造体に存在する、（１）に記載の移植可能な医療用製品。
（１３）マトリックスたんぱく質を含む、（１）に記載の移植可能な医療用製品。
（１４）移植可能な医療用製品の一部上にコーティングを含む前記移植可能な医療用製品であって、
前記コーティングは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）及びポリアミドアミンから成る群から選択されるポリマーを含み、
前記ポリマーは、前記コーティングを生成するように結合している、少なくとも１種のペンダント型の潜在性の反応した基を含む。
（１５）次の各段階；
（ａ）移植可能な医療用製品を得る段階、ここで当該製品の少なくとも一部上に、コーティングを生成させ、当該コーティングは、下記を含むポリマーを含み：
（ｉ）次の式：
−Ｒ1Ｒ2ＮＲ3Ｒ4
（式中、Ｒ1は下記：
【化７】
0005908664.tif 000010
であり、
Ｒ2は、Ｃ1〜Ｃ8の直鎖又は分岐鎖のアルキルであり；そして
Ｒ3及びＲ4は両方とも前記窒素に結合し、そしてそれぞれ、Ｈ又はＣ1〜Ｃ6の直鎖若しくは分岐鎖のアルキルである）
を有する少なくとも１種のペンダント型アミン含有基：及び
（ｉｉ）前記コーティングを生成するように結合している、少なくとも１種のペンダント型の潜在性の反応した基；そして
（ｂ）前記製品を患者に移植する段階：
を含む、前記移植可能な医療用製品を用いるための方法。
（１６）次の各段階；
（ａ）製品を得る段階；
（ｂ）前記製品の少なくとも一部上にコーティング組成物を配置する段階、前記コーティング組成物は、下記を有するポリマーを含む；
（ｉ）次の式：
−Ｒ1Ｒ2ＮＲ3Ｒ4
（式中、Ｒ1は、下記：
【化８】
0005908664.tif 000011
であり、
Ｒ2は、Ｃ1〜Ｃ8の直鎖又は分岐鎖のアルキルであり；そして
Ｒ3及びＲ4は両方とも前記窒素に結合し、そしてそれぞれ、Ｈ又はＣ1〜Ｃ6の直鎖若しくは分岐鎖のアルキルである）
を有する、少なくとも１種のペンダント型アミン含有基；及び
（ｉｉ）少なくとも１種のペンダント型潜在性反応性基；そして
ｃ）前記ペンダント型潜在性反応性基を活性化して前記ポリマーを結合させ、それにより前記コーティングを生成させるために、前記コーティング組成物を処理する段階、ここで前記コーティングは、細胞が当該コーティングに長期間にわたり接着することを促進するために十分である：
を含む、前記製品上にコーティングを生成させるための方法。
（１７）前記ポリマーが、１０μｇ／ｍＬ〜２０ｍｇ／ｍＬの範囲において、前記コーティング組成物中に存在する、（１６）に記載の方法。
（１８）前記潜在性反応性基が光反応性基である、（１６）に記載の方法。
（１９）前記処理する段階が、前記光反応性基に、１９０ｎｍ〜３６０ｎｍの範囲の紫外線を照射することを含む、（１８）に記載の方法。
（２０）前記処理する段階が、前記光反応性基に、０．１ｍＷ／ｃｍ2〜２０ｍＷ／ｃｍ2の範囲における紫外線の線量を照射することを含む、（１９）に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】図１は、種々の感光性ポリマーがコーティングされた及びコーティングされていない平面上のＰＣ１２細胞の接着の結果を示すグラフである。
【図２】図２は、感光性ポリマーがコーティングされた及びコーティングされていないナノ繊維基剤上のＰＣ１２細胞の接着の結果を示すグラフである。
【図３】図３は、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされたナノ繊維（３Ａ）及びコーティングされていないナノ繊維（３Ｂ）上で増殖するＰＣ１２細胞の明視野顕微鏡像である。
【０１５１】
【図４】図４は、２４時間の間、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされたナノ繊維上で増殖させた、ファロイジン染色したＰＣ１２細胞の蛍光顕微鏡像である。
【図５】図５は、種々の感光性ポリマーがコーティングされた及びコーティングされていない平面上のＨＦＦ細胞の接着の結果を示すグラフである。
【図６】図６は、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされたナノ繊維（Ａ）及びコーティングされていないナノ繊維（Ｂ）上で増殖するＰＣ１２細胞のＢｒｄＵ取り込み、並びにこれらの細胞（Ａ’）及び（Ｂ’）それぞれのＤＡＰＩ染色の蛍光顕微鏡像である。
【０１５２】
【図７】図７は、種々の感光性ポリマーがコーティングされた及びコーティングされていない平坦なポリスチレン表面上で増殖させた、β−ＩＩＩチューブリン染色したＰＣ１２細胞の蛍光顕微鏡像である。
【図８】図８は、種々の感光性ポリマーがコーティングされた及びコーティングされていない平坦なナノ繊維表面上で増殖させた、β−ＩＩＩチューブリン染色したＰＣ１２細胞の蛍光顕微鏡像である。
【図９】図９は、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされたナノ繊維対他の市販の細胞基剤上で増殖させた、β−ＩＩＩチューブリン染色したＰＣ１２細胞の蛍光顕微鏡像である。
【０１５３】
【図１０】図１０は、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされたナノ繊維上で増殖させた、ネスチン／ＢｒｄＵ染色したＥＳ−Ｄ３細胞の蛍光顕微鏡像である。
【図１１】図１１は、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされたナノ繊維及びコーティングされていないナノ繊維上で増殖させた、β−ＩＩＩチューブリン染色されたＥＳ−Ｄ３の神経突起形態を実証する蛍光顕微鏡像である。当該画像は、ＥＳ−Ｄ３細胞が、コーティングされていないナノ繊維上で増殖する神経細胞と比較して、より長い神経突起長を有する神経細胞含有突起（当該突起は、短く且つ切り株様である）に分化することを示す。
【０１５４】
【図１２】図１２は、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされたナノ繊維及びコーティングされていないナノ繊維上で増殖させた、ＧＦＡＰ染色したＥＳ−Ｄ３の蛍光顕微鏡像である。
【図１３】図１３は、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされたナノ繊維上で増殖させ、３０日分化させた、β−ＩＩＩチューブリン染色したＰＣ１２細胞の広範囲な神経突起形態を実証する蛍光顕微鏡像である。
【図１】
0005908664.tif 000015
【図２】
0005908664.tif 000016
【図３】
0005908664.tif 000017
【図４】
0005908664.tif 000018
【図５】
0005908664.tif 000019
【図６】
0005908664.tif 000020
【図７】
0005908664.tif 000021
【図８】
0005908664.tif 000022
【図９】
0005908664.tif 000023
【図１０】
0005908664.tif 000024
【図１１】
0005908664.tif 000025
【図１２】
0005908664.tif 000026
【図１３】
0005908664.tif 000027