(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
SEQ ID NO:2に示すバシラスレンタススブチリシン（Bacillus lentus subtilisin）のスブチリシン変異体を含む洗浄組成物であって、前記スブチリシン変異体のアミノ酸の置換が下記から選択される置換の組み合わせのみからなり：
S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S24W/S101L/Q109K, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/S101L/Q109R/N185R/A215R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/Q109R/S164I, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101Y/Q109R/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/S101Y/Q109L/N185R/A215R, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S101K/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S24W/S101L/Q109L, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/S101Y/Q109R/N185R/A215R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101L/Q109R/S164I, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101Y/Q109R/S188D/T213E/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N76D, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S24W/S101Y/Q109K, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N43S/P52V/S101R/Q109R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101Y/Q109R/S164I, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101L/Q109L/S188D/N248R,  S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N76D/S101L, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S24W/S101Y/Q109L, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N76D/S164I, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/N76D/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101Y/Q109L/S188D/N248R, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/V118R/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N76D/S101M, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/N76D/G97P/N185R/A215R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101L/S164I, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S101L/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101Y/Q109L/S188D/T213E/N248R, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/Q109L/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/S101L/N185R/A215R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101Y/S164I, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101Y/T213E/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101L/Q109L/S164I, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S101V/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/S101Y/N185R/A215R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101V/S164I, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101L/T213E/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101Y/Q109L/S164I, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S101H/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/Q109R/N185R/A215R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101H/S164I, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101L/Q109R/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/S101L/Q109L/N185R/A215R, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S101M/S188D/N248R, N76D/S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/N248K, S87N/G118V/G127S/S128L/P129Q/S130A, S87N/S101H/G118V/S128L/P129Q/S130A, S87N/S101K/G118V/S128L/P129Q/S130A, S87N/S101V/G118V/S128L/P129Q/S130A, S87N/S101Y/G118V/S128L/P129Q/S130A, S87N/S101L/G118V/S128L/P129Q/S130A, I72V/S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A//S164I、ここで、これらの位置番号は、SEQ ID NO:1に示すB. アミロリケファシエンス・スブチリシンBPN’のアミノ酸配列に対応して賦与される、洗浄剤組成物。
【請求項２】
前記洗浄組成物が、液体、ゲル、錠剤、粉末、及び／又は顆粒状洗剤からなる、請求項１の洗浄組成物。
【請求項３】
前記洗浄組成物が衣類洗剤及び食器洗剤から選択される、請求項１または２の洗浄組成物。
【請求項４】
前記洗浄組成物が衣類洗剤である、請求項３の洗浄組成物。
【請求項５】
前記洗浄組成物が食器洗剤であり、前記食器洗剤が手洗い食器洗浄洗剤及び自動食器洗浄機用洗剤から選択される食器洗剤である、請求項３の洗浄組成物。
【請求項６】
さらに少なくとも１つの漂白剤を含有する、請求項１から５のいずれか１項の洗浄組成物。
【請求項７】
前記洗浄組成物が低温水洗剤である、請求項１から６のいずれか１項の洗浄組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は2008年11月11日出願の米国仮出願61/113,545号、61/113,552号、61/113,548号、及び2009年6月19日出願の米国仮出願61/218,802号に基づく優先権を主張し、これらを本願に参照として組み込む。この発明はタンパク質工学に関する方法、及びこれにより製造されるセリンプロテアーゼ変異体に関する。特に、この発明は参照セリンプロテアーゼとの比較において1以上の置換を有するセリンプロテアーゼ変異体に関する。さらに、これらのセリンプロテアーゼ変異体を含む組成物に関する。いくつかの実施形態では、この発明はこれらのセリンプロテアーゼ変異体を少なくとも１含む洗浄組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
様々なタンパク質工学的手法が当業者に知られている。一般に、所望のタンパク質特性を得るために、タンパク質を修飾する。大部分の方法では、タンパク質をコードするクローン化された遺伝子のヌクレオチド配列を突然変異誘発し、この変成された遺伝子を発現させて突然変異体を生成させる。そしてこの突然変異体について対象とする活性に関するスクリーニングを行う。通常、突然変異体の特性と、野生型タンパク質の特性とを比較する。
【０００３】
歴史的に、タンパク質設計プロセスは、全てのタンパク質空間中から所望の用途に最適な配列を見出すことに等しい問題になってきている。この問題は極端に難しく、「NP困難」である。複雑性理論では、クラスPと定義される問題は簡単とされ、これらを解決するための有効な多項式時間アルゴリズムが存在する。NP困難問題とは現在有効な多項式時間アルゴリズムが知られていない問題であり、もしいずれかのNP困難問題を解決することができれば、全てのNP困難問題を解決することができるであろう(例えばPierce and Winfree, Protein Engineer., 15:779-782, 2002参照)。現在、ライブラリーの構築とスクリーニングの方法には、タンパク質配列の多様性を全配列にわたって無作為に生成させるか、またはタンパク質内の複数の特定の位置において無作為比較となるように生成させることが含まれる。このようなライブラリーには通常、対象とする性質に関しては「ネガティブ」なメンバーが多数含まれており、相対的に少量のポジティブな変異体を見つけるためには多数回のスクリーニングが必要である。通常、ネガティブな変異体は無視し、ポジティブなメンバーについてのみ配列情報を得る。
【０００４】
飽和突然変異誘発（Estell et al.，in World Biotech Report 1984，vol. 2: USA， Online Publications，London，pp 181-187, 1984； 及び Wells et al，Gene 34:315-323, 1985）は、タンパク質のいくつかの性質を最適化する突然変異誘発を行うためのタンパク質空間を探す際に用いることができる技術のひとつである。いくつかの研究グループにより、飽和突然誘発変異により変化させる部位を同定するための方法が開発されている（Reetz et al., Angew. Chem. Int Edn, 44:4192-4196, 2005; Kato et al., J Mol Biol, 351:683-692, 2005; 及びSandberg et al., Proc Natl Acad Sci USA, 90:8367-8371, 1993）。しかし、部位を特定するための一般化された方法は提言されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
更に、大部分のタンパク質工学的手法では多数のアミノ酸変異体が生成されるため、所望のタンパク質特性を得るためには多数の変異体のスクリーニングを行う必要があった。通常、有益な変異体を得るためのスクリーニングが何度も繰り返される。したがって、大部分の方法は困難であり、時間がかかるものであった。効率的で所望の結果を得ることが可能なタンパク質工学的手法が引き続き求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
この発明は、タンパク質工学的手法に関する。特に、この発明により部位評価ライブラリーを使用する方法が提供される。詳しくは、この発明により、所望の性質を最適化するためのライブラリーを合理的かつ効率的に設計するために、多数の所望の性質に関して得られた情報を使用する手段が提供される。いくつかの実施形態では、この発明により、少なくとも2種の所望の性質が改善されたライブラリーを設計する手段が提供される。またこの発明により、本願に開示するタンパク質工学的手法を用いて製造され、参照セリンプロテアーゼと比較して1以上の置換を有するセリンプロテアーゼが提供される。
【０００７】
この発明により、タンパク質のアミノ酸配列内において、そのタンパク質の所望の性質の改善に関与するアミノ酸の位置を特定する手段が提供される。いくつかの好ましい実施形態では、この発明により、所望の性質と、改善された性質とを有するタンパク質を製造するためにはどのような突然変異が好ましいかを決める手段が提供される。いくつかの特に好ましい実施形態では、この発明により、野生型タンパク質より特定のパーセンテージで改良される (例えば1の性質について野生型より約110%改良される) アミノ酸位置及び突然変異を特定する手段が提供される。またさらに好ましい実施形態では、この発明により、少なくとも1の大幅に改良された性質と、野生型タンパク質と比較して顕著に悪化していない少なくとも1の別の性質（例えば1の性質が野生型より110%改良され、野生型の別の性質が野生型の90％よりは悪くない）を有する突然変異を特定する手段が提供される。またさらに好ましい実施形態では、この情報に基づいてライブラリーを構築する。いくつかの実施形態では、特定された全ての突然変異を用いてライブラリーを構築し、別の実施形態では、特定された突然変異の一部を用いてライブラリーを構築する。本願のライブラリーを、特定の数及び／又は種類の突然変異に限定することは意図していない。
【０００８】
この発明により、タンパク質工学的方法であって：タンパク質変異体のライブラリーを供給するステップと；タンパク質変異体のライブラリーについて、少なくとも1の対象とする性質を、対象とする試験によりテストするステップと；少なくとも1の対象とする性質について数値範囲を特定するステップと；対象とする試験における有益な結果に関する数値範囲内の最小値を特定するステップと；少なくとも1の対象とする性質の数値範囲の最小値より大きい少なくとも1の突然変異を有する複数のタンパク質変異体を供給するステップとを備え、これにより少なくとも1の突然変異を有する変異体のライブラリーが提供され、対象とする試験において有益な結果を有するメンバーによって、このライブラリーが豊富化される方法が提供される。いくつかの実施形態では、有益な結果は、上記の第1ステップに示した試験において観察された最大値の約50%, 約60%, 約70%, 約80%, 約90%, 又は約95%より大きい値に相当する。別の実施形態では、この発明の方法において、1以上の対象とする試験を行なう。好ましい実施形態では、タンパク質は酵素である。特に好ましい実施形態では、酵素はプロテアーゼ、トランスフェラーゼ、メタロプロテアーゼ、エステラーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ、クチナーゼ、及びリパーゼから選択される。
【０００９】
また、この発明によりタンパク質工学的方法であって：タンパク質変異体を供給するステップと；タンパク質変異体のライブラリーについて、少なくとも2の対象とする性質を、対象とする試験によりテストするステップと；少なくとも2の対象とする性質について数値範囲を特定するステップと；対象とする試験における有益な結果に関する数値範囲内の最小値を特定するステップと；少なくとも2の対象とする性質の数値範囲の最小値より大きい複数のタンパク質変異体を供給するステップとを備え、これにより対象とする試験において有益な結果を有するメンバーによりこのライブラリーが豊富化される方法が提供される。いくつかの好ましい実施形態では、有益な結果は、上記の第1ステップに示した試験において観察された最大値の約50%, 約60%, 約70%, 約80%, 約90%, 又は約95%より大きい値に相当する。好ましい実施形態では、タンパク質は酵素である。特に好ましい実施形態では、酵素はプロテアーゼ、トランスフェラーゼ、メタロプロテアーゼ、エステラーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ、クチナーゼ、及びリパーゼから選択される
【００１０】
またこの発明によりタンパク質工学的方法であって：野生型タンパク質と、この野生型タンパク質のタンパク質変異体のライブラリーとを供給するステップと；タンパク質変異体のライブラリー及び野生型タンパク質について、少なくとも1の対象とする性質を、対象とする試験によりテストするステップと；少なくとも1の対象とする性質について数値範囲を特定するステップと；対象とする試験における有益な結果に関する数値範囲内の最小値を特定するステップと；野生型について得られた結果と比較して有益な結果を有するタンパク質変異体を特定するステップであって、有益な結果が改良された対象とする性質であるステップと；少なくとも1の対象とする性質の数値範囲の最小値より大きい複数のタンパク質変異体を供給するステップとを備え、これにより対象とする試験において有益な結果を有するメンバーで豊富化された、改良されたタンパク質変異体のライブラリーが提供される方法が提供される。いくつかの好ましい実施形態では、この発明の方法にはさらに性能指数を求めるステップが含まれ、ここで性能指数は、改良された各タンパク質変異体について得られた値と野生型タンパク質について得られた値とを割り算して求められる。特に好ましい実施形態では、この発明の方法にはさらに改良されたタンパク質変異体を特定するステップが含まれ、ここで改良されたタンパク質変異体は対象とする試験において約1.1より大きな性能指数を示す。また別の実施形態では、タンパク質は酵素である。特に好ましい実施形態では、酵素はプロテアーゼ、トランスフェラーゼ、メタロプロテアーゼ、エステラーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ、クチナーゼ、及びリパーゼから選択される。また別の実施形態では、タンパク質は抗体及び成長因子から選択される。また別の好ましい実施形態では、野生型タンパク質はプロテアーゼ、トランスフェラーゼ、メタロプロテアーゼ、エステラーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ、クチナーゼ、及びリパーゼから選択される酵素の成熟形態である。いくつかの好ましい実施形態では、対象とする性質は電荷, 洗浄性能, 硬質表面洗浄性能, 熱安定性, 貯蔵安定性, 洗剤安定性, 基質結合性, 酵素阻害性, 発現量, 反応速度, 及び基質分解性から選択される。いくつかの実施形態では、野生型タンパク質及びタンパク
質変異体は、少なくとも1の洗浄組成物の成分である。いくつかの好ましい実施形態では、粉末又は液体洗剤として処方され、pHが約5から約12.0の洗剤組成物を用いて洗浄性能を試験する。
【００１１】
またこの発明により、タンパク質折畳み構造が改良された参照タンパク質変異体を製造する方法であって：対象とする分析における幅広い対象とする性質に関するタンパク質折畳み構造内の被検タンパク質の多数の変異体を分析するステップと；対象とする分析における有益な結果に関する最小値であって、対象とする性質の範囲内における最小値を特定するステップと；対象とする分析におけるタンパク質折畳み構造の参照タンパク質を分析するステップと；参照タンパク質中にアミノ酸置換を導入することにより、改良された変異体が対象とする性質の範囲の最小値より大きくなるようにして、改良された参照タンパク質の変異体を製造するステップとからなる方法が提供される。いくつかの実施形態では、参照タンパク質は被検タンパク質とは異なる。いくつかの実施形態では、この方法には性能指数を求めるステップであって、性能指数を改良されたタンパク質変異体について求められた値を参照タンパク質について求められた値で割って求めるステップがさらに含まれる。いくつかの実施形態では、被検タンパク質及び参照タンパク質は酵素である。特に好ましい実施形態では、酵素はプロテアーゼ、トランスフェラーゼ、メタロプロテアーゼ、エステラーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ、クチナーゼ、及びリパーゼから選択される。また別の実施形態では、被検タンパク質及び参照タンパク質は抗体及び成長因子から選択される。また別の好ましい実施形態では、参照タンパク質はプロテアーゼ、トランスフェラーゼ、メタロプロテアーゼ、エステラーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ、クチナーゼ、及びリパーゼから選択される酵素の成熟形態である。いくつかの好ましい実施形態では、対象とする性質は電荷, 洗浄性能, 硬質表面洗浄性能, 熱安定性, 貯蔵安定性, 洗剤安定性, 基質結合性, 酵素阻害性, 発現量, 反応速度, 及び基質分解性から選択される。いくつかの実施形態では、被検タンパク質及び参照タンパク質は、少なくとも1の洗浄組成物の成分である。いくつかの別の実施形態では、改良されたタンパク質変異体は、洗浄組成物の成分である。いくつかの好ましい実施形態では、粉末又は液体洗剤として処方され、pHが約5から約12.0の洗剤組成物を用いて洗浄性能を試験する。
【００１２】
いくつかの実施形態では、この発明により、本願に開示する少なくとも1のセリンプロテアーゼ変異体を含む洗剤組成物が提供される。いくつかの好ましい実施形態では、洗剤組成物は衣類洗剤である。いくつかの下位概念の実施形態では、衣類洗剤は冷水用洗剤、低pH用洗剤、または濃縮洗剤である。別の実施形態では、洗剤組成物は食器洗浄用洗剤である。いくつかの実施形態では、食器洗浄用洗剤は無リン酸洗剤であり、別の実施形態では食器洗浄用洗剤はリン酸含有洗剤である。いくつかの好ましい実施形態では、洗剤組成物にはさらに、少なくとも1の別の酵素が含まれ、特に好ましい実施形態では、この別の酵素は、中性メタロプロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、及びペルオキシダーゼから選択される。またこの発明により、せりプロテアーゼ変異体をコードする単離された核酸、この核酸を含む発現ベクター、及びこの発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。
【００１３】
さらにこの発明により、バシラスセリンプロテアーゼのセリンプロテアーゼ変異体を製造する方法であって、セリンプロテアーゼ変異体をコードする核酸を含む発現ベクターにより宿主細胞を形質転換するステップと；セリンプロテアーゼ変異体の産出に適した条件下において、形質転換した宿主細胞を培養するステップを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、この方法にはさらに、産出されたセリンプロテアーゼ変異体を回収するステップが含まれる。いくつかの実施形態では、宿主細胞はバシラス属であり、これらの実施形態の下位の実施形態では、バシラス属はB. スブチリス（subtilis）である。さらにこの発明により、洗浄方法であって、織物からなる表面及び／又は物品を、単離されたセリンプロテアーゼ変異体を含む洗剤組成物に接触させるステップを含む方法が提供される。別の実施形態では、洗浄方法であって、食器類の表面及び／又は物品を、単離されたセリンプロテアーゼ変異体を含む洗剤組成物に接触させるステップを含む方法が提供される。
【００１４】
この発明によりさらに、プロテアーゼ・エンジニアリング方法であって：a) 複数の部位評価ライブラリー(SEL)のそれぞれがプロテアーゼの同一アミノ酸位置に異なる置換を有する複数のプロテアーゼ変異体を含んでいる、複数の部位評価ライブラリーを準備するステップと；b) SELの各プロテアーゼ変異体、及び標準プロテアーゼを、対象とする性質に関し試験するステップと；c) 試験した各プロテアーゼ変異体の性能指数(PI)を求めるステップと；d) 2以上のアミノ酸位置を非制限的位置（non-restrictive position）として特定するステップであって、2つのSELのそれぞれに含まれる複数のプロテアーゼ変異体の内の少なくとも1のPIが約0.5より大きいステップと；f) 複数の多重置換プロテアーゼ変異体であって、それぞれが2以上の非制限的位置に置換を有する複数の多重置換プロテアーゼ変異体を含む多重突然変異ライブラリーを準備するステップとを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、試験には、汚れ除去分析（小見本片）、LAS安定性分析、洗剤安定性分析、及び比活性度分析から選択される2以上の異なる分析が含まれる。いくつかの実施形態では、さらに、及び／又は別の分析方法が用いられる。
【００１５】
いくつかの実施形態では、この発明により、バシラスセリンプロテアーゼの多重置換セリンプロテアーゼ変異体を産出する方法であって、複数の単一置換セリンプロテアーゼ変異体を、第1の性質に関する第1テスト及び第2の性質に関する第2テストにおいて試験するステップであって、各テストにおいて、参照セリンプロテアーゼの性質に値1が賦与され、有益な第1又は第2の性質は1.0より大きな値を有し、過度に無益な第1又は第2の性質は約0.80未満、又はいくつかの好ましい実施形態では約0.60未満の値を有するステップと；有益な第1の性質を備え、過度に無益な第2の性質を備えていない少なくとも1の単一置換セリンプロテアーゼ変異体における置換基を特定するステップと；有益な第2の性質を備え、過度に無益な第1の性質を備えていない少なくとも1の単一置換セリンプロテアーゼ変異体における置換基を特定するステップと；前段の各ステップで特定した置換基をセリンプロテアーゼに導入して多重置換セリンプロテアーゼ変異体を産出するステップからなる方法が提供される。いくつかの実施形態では、この方法にはさらに、第1テスト及び第2テストにおいて多重置換セリンプロテアーゼ変異体の試験であって、改良されたセリンプロテアーゼ変異体は第1及び第2テストにおいて約1.0より大きな値を示すか、又は第1テストにおいて約1.0より大きな値を示し、第2テストにおいて約0.80から約1.0の値を示す試験を行なうステップが含まれる。いくつかの実施形態では、この方法にはさらに、改良されたセリンプロテアーゼ変異体を産出するステップが含まれる。いくつかの実施形態では、第1及び第2の性質は不の相関を示す。いくつかの実施形態では、有益な第1及び第2の性質は約1.2より大きな値を示す。いくつかの実施形態では、過度に無益な第1又は第2の性質は約0.40未満の値を示す。いくつかの実施形態では、第1の性質は安定性で、第2の性質は洗浄性能である。下位の実施形態では、安定性は洗剤中での安定性であり、洗浄性能は洗剤中での血−ミルク−インク(BMI) 洗浄性能である。いくつかの実施形態では、参照バクテリア性セリンプロテアーゼは、SEQ ID NO:1に示すアミノ酸配列を有する野生型B. アミロリケファシエンス(amyloliquefaciens)セリンプロテアーゼBPN’の成熟形態である。別の実施形態では、参照バクテリア性セリンプロテアーゼは、SEQ ID NO:2に示すアミノ酸配列を有する野生型GG36セリンプロテアーゼ（すなわち、「GG36変異体」の産出に用いられた参照バクテリア性セリンプロテアーゼ）である。この発明のいくつかの実施形態では、洗浄性能の試験は、pHが約5から約12.0の粉末又は液状洗剤組成物中で行う。上記の順序で各ステップを行うことは意図しておらず、この発明では任意の適切な順序で行うことができる。しかしいくつかの好ましい実施形態では、複数の置換基は、溶媒接触可能表面積(SAS)が約50%より大きいか、又は約65%より大きい参照セリンプロテアーゼ内に位置する。
【００１６】
さらに、この発明によりスブチリシン変異体が提供され、このスブチリシン変異体はタンパク質分解活性を有する成熟形態であり、次の位置から選択される1以上の位置（好ましくは1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, またはそれ以上の位置）に置換を有する：1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 66, 67, 68, 69, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274 及び 275。ここで、これらの位置番号は、SEQ ID NO:1に示すB. アミロリケファシエンス・スブチリシンBPN’のアミノ酸配列に対応して賦与される。
【００１７】
いくつかの好ましい実施形態では、置換には次の1以上が含まれる：X001A, X001C, X001E, X001F, X001G, X001H, X001I, X001K, X001L, X001N, X001P, X001Q, X001R, X001S, X001T, X001V, X001Y, X002A, X002C, X002E, X002G, X002K, X002L, X002M, X002N, X002P, X002Q, X002R, X002S, X002T, X002V, X002W, X002Y, X003D, X003E, X003F, X003G, X003H, X003I, X003L, X003M, X003N, X003P, X003R, X003S, X003T, X003V, X003W, X003Y, X004A, X004C, X004D, X004E, X004F, X004G, X004H, X004K, X004L, X004N, X004P, X004R, X004S, X004T, X004V, X004W, X005A, X005C, X005D, X005E, X005G, X005I, X005M, X005P, X005Q, X005S, X005T, X005W, X005Y, X006A, X006D, X006E, X006M, X006W, X007A, X007C, X007D, X007G, X007H, X007N, X007P, X007Q, X007S, X007T, X008A, X008F, X008G, X008I, X008L, X008M, X008Q, X008T, X008V, X008W, X008Y, X009A, X009C, X009D, X009E, X009F, X009G, X009H, X009L, X009N, X009P, X009Q, X009R, X009S, X009T, X009V, X009W, X009Y, X010A, X010C, X010F, X010G, X010H, X010I, X010K, X010L, X010M, X010N, X010Q, X010R, X010S, X010T, X010V, X010W, X010Y, X011A, X011C, X011D, X011G, X011I, X011M, X011R, X011S, X011T, X011V, X011Y, X012D, X012F, X012G, X012H, X012I, X012K, X012L, X012M, X012N, X012P, X012Q, X012R, X012S, X012T, X012V, X012W, X012Y, X013A, X013G, X013I, X013M, X013Q, X013T, X013V, X014A, X014C, X014D, X014E, X014F, X014G, X014H, X014I, X014K, X014L, X014P, X014Q, X014S, X014T, X014V, X014Y, X015A, X015D, X015F, X015G, X015I, X015K, X015L, X015M, X015P, X015Q, X015R, X015S, X015V, X015W, X016A, X016D, X016E, X016G, X016L, X016N, X016P, X016Q, X016R, X016S, X016T, X016V, X017A, X017D, X017E, X017F, X017G, X017H, X017I, X017K, X017M, X017N, X017R, X017S, X017T, X017V, X017W, X017Y, X018A, X018C, X018D, X018E, X018F, X018G, X018H, X018I, X018K, X018L, X018M, X018N, X018P, X018Q, X018R, X018S, X018T, X018V, X018W, X018Y, X019A, X019C, X019D, X019E, X019F, X019G, X019H, X019K, X019L, X019M, X019N, X019P, X019R, X019S, X019T, X019V, X019W, X019Y, X020A, X020C, X020D, X020F, X020G, X020I, X020K, X020L, X020M, X020P, X020Q, X020R, X020S, X020T, X020V, X020W, X020Y, X021A, X021C, X021D, X021E, X021G, X021H, X021I, X021K, X021L, X021M, X021N, X021P, X021Q, X021R, X021S, X021T, X021V, X021W, X022A, X022C, X022G, X022I, X022K, X022L, X022M, X022N, X022P, X022Q, X022R, X022S, X022T, X022V, X022W, X022Y, X023A, X023G, X023S, X024A, X024C, X024D, X024F, X024G, X024H, X024L, X024M, X024N, X024P, X024Q, X024R, X024S, X024T, X024V, X024W, X025C, X025D, X025E, X025F, X025G, X025H, X025K, X025L, X025M, X025N, X025Q, X025R, X025S, X025T, X025V, X025W, X026C, X026F, X026G, X026I, X026L, X026M, X026N, X026P, X026R, X026S, X026T, X026V, X027A, X027C, X027D, X027F, X027G, X027I, X027K, X027L, X027M, X027N, X027P, X027R, X027S, X027T, X027V, X027W, X027Y, X028A, X028E, X028G, X028H, X028I, X028L, X028M, X028N, X028P, X028S, X028V, X028Y, X029A, X029C, X029G, X029I, X029K, X029S, X029T, X029V, X030A, X030C, X030D, X030E, X030F, X030G, X030L, X030M, X030Q, X030S, X030T, X030V, X031A, X031F, X031I, X031L, X031M, X031S, X031T, X031V, X032A, X032C, X032D, X032E, X032G, X032V, X032W, X033A, X033C, X033D, X033E, X033G, X033H, X033I, X033L, X033M, X033N, X033Q, X033R, X033S, X033T, X033V, X033Y, X034E, X034G, X034H, X034L, X034Q, X034S, X035A, X035F, X035H, X035I, X035K, X035L, X035M, X035P, X035Q, X035R, X035S, X035A, X035C, X035E, X035F, X035G, X035H, X035I, X035L, X035M, X035N, X035P, X035Q, X035R, X035T, X035V, X035W, X035Y, X038C, X038F, X038G, X038H, X038I, X038K, X038L, X038M, X038N, X038Q, X038R, X038T, X038V, X038W, X038Y, X039A, X039E, X039G, X039H, X039L, X039M, X039N, X039Q, X039S, X039T, X039V, X039Y, X040A, X040C, X040D, X040E, X040G, X040H, X040I, X040K, X040L, X040M, X040N, X040P, X040R, X040S, X040T, X040V, X040W, X040Y, X041C, X041D, X041E, X041N, X041P, X041Q, X041S, X042A, X042C, X042F, X042G, X042H, X042I, X042L, X042M, X042N, X042Q, X042S, X042T, X042V, X042Y, X043A, X043C, X043D, X043E, X043F, X043G, X043I, X043L, X043M, X043N, X043P, X043R, X043S, X043T, X043V, X043W, X043Y, X044A, X044C, X044D, 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24L, X224M, X224N, X224P, X224S, X224T, X225A, X225C, X225G, X225I, X225N, X225P, X225S, X225T, X225V, X226C, X226F, X226G, X226H, X226I, X226L, X226M, X226N, X226R, X226S, X226T, X226V, X226Y, X227A, X227C, X227F, X227G, X227I, X227L, X227M, X227P, X227Q, X227S, X227T, X227V, X227Y, X228A, X228C, X228G, X228I, X228L, X228M, X228P, X228S, X228V, X229A, X229G, X229P, X229S, X230A, X230D, X230E, X230F, X230G, X230H, X230I, X230L, X230N, X230P, X230Q, X230S, X230T, X230V, X230W, X230Y, X231A, X231C, X231F, X231G, X231H, X231I, X231L, X231S, X231T, X231W, X231Y, X232A, X232G, X232H, X232K, X232L, X232M, X232P, X232S, X232V, X233A, X233C, X233E, X233F, X233G, X233I, X233L, X233M, X233N, X233P, X233Q, X233R, X233S, X233T, X233V, X233Y, X234D, X234F, X234G, X234H, X234L, X234M, X234N, X234P, X234Q, X234S, X234T, X234V, X234Y, X235C, X235D, X235E, X235F, X235G, X235H, X235I, X235K, X235L, X235M, X235N, X235Q, X235R, X235S, X235V, X235W, X235Y, X236A, X236C, X236E, X236F, X236G, X236H, X236K, X236L, X236N, X236P, X236Q, X236R, X236S, X236T, X236V, X236W, X236Y, X237A, X237C, X237F, X237G, X237H, X237I, X237K, X237L, X237M, X237P, X237Q, X237R, X237S, X237T, X237V, X237W, X237Y, X238C, X238D, X238E, X238F, X238G, X238H, X238I, X238K, X238L, X238M, X238N, X238Q, X238R, X238S, X238T, X238V, X238Y, X239C, X239D, X239F, X239G, X239H, X239I, X239K, X239L, X239M, X239N, X239P, X239Q, X239R, X239S, X239T, X239V, X239W, X239Y, X240A, X240C, X240E, X240F, X240I, X240K, X240L, X240M, X240N, X240Q, X240R, X240S, X240T, X240W, X240Y, X241A, X241C, X241D, X241E, X241F, X241G, X241H, X241I, X241K, X241L, X241M, X241N, X241P, X241Q, X241R, X241S, X241T, X241V, X241W, X241Y, X242A, X242C, X242D, X242F, X242G, X242H, X242I, X242L, X242M, X242P, X242Q, X242R, X242S, X242T, X242V, X242W, X243C, X243D, X243E, X243F, X243G, X243H, X243I, X243K, X243L, X243M, X243N, X243P, X243Q, X243R, X243S, X243T, X243V, X243W, X244A, X244D, X244E, X244F, X244H, X244I, X244L, X244M, X244N, X244P, X244Q, X244R, X244S, X244T, X244V, X244W, X244Y, X245A, X245C, X245E, X245G, X245H, X245K, X245L, X245P, X245Q, X245R, X245S, X245V, X245W, X245Y, X246A, X246C, X246E, X246F, X246G, X246H, X246I, X246L, X246M, X246N, X246P, X246Q, X246R, X246S, X246T, X246V, X246W, X246Y, X247A, X247C, X247D, X247E, X247F, X247G, X247H, X247I, X247K, X247L, X247M, X247N, X247P, X247Q, X247R, X247S, X247T, X247V, X247W, X247Y, X248C, X248D, X248E, X248G, X248H, X248I, X248K, X248L, X248M, X248N, X248P, X248R, X248S, X248T, X248V, X248W, X248Y, X249A, X249D, X249E, X249F, X249G, X249H, X249I, X249K, X249L, X249M, X249N, X249Q, X249R, X249S, X249T, X249V, X249W, X249Y, X250A, X250C, X250E, X250F, X250G, X250H, X250I, X250L, X250M, X250N, X250Q, X250S, X250V, X250Y, X251A, X251D, X251E, X251F, X251G, X251K, X251L, X251M, X251P, X251Q, X251R, X251S, X251T, X251V, X251Y, X252A, X252C, X252D, X252F, X252G, X252H, X252I, X252K, X252L, X252M, X252N, X252P, X252R, X252S, X252V, X252W, X252Y, X253A, X253D, X253E, X253F, X253G, X253H, X253I, X253K, X253M, X253R, X253S, X253T, X253V, X253W, X254A, X254C, X254D, X254E, X254G, X254N, X254P, X254S, X254T, X254V, X255A, X255C, X255D, X255E, X255F, X255H, X255I, X255L, X255N, X255P, X255Q, X255R, X255S, X255T, X255V, X255W, X255Y, X256A, X256C, X256D, X256E, X256G, X256H, X256I, X256K, X256L, X256M, X256N, X256P, X256R, X256S, X256T, X256V, X256W, X256Y, X257A, X257C, X257E, X257F, X257G, X257H, X257I, X257K, X257L, X257M, X257P, X257S, X257T, X257V, X257W, X257Y, X258A, X258C, X258D, X258E, X258F, X258G, X258H, X258I, X258L, X258M, X258P, X258Q, X258R, X258S, X258T, X258V, X258W, X258Y, X259A, X259C, X259E, X259G, X259I, X259L, X259M, X259P, X259Q, X259R, X259S, X259T, X259V, X260A, X260D, X260E, X260F, X260H, X260I, X260L, X260M, X260N, X260P, X260R, X260S, X260T, X260V, X260Y, X261A, X261C, X261E, X261F, X261G, X261I, X261K, X261L, X261N, X261P, X261Q, X261R, X261S, X261T, X261V, X261W, X261Y, X262A, X262C, X262D, X262F, X262G, X262H, X262I, X262K, X262L, X262M, X262P, X262Q, X262R, X262S, X262T, X262V, X262W, X262Y, X263A, X263C, X263D, X263F, X263G, X263H, X263I, X263K, X263L, X263M, X263N, X263P, X263Q, X263R, X263W, X263Y, X264A, X264C, X264E, X264F, X264G, X264H, X264I, X264L, X264P, X264Q, X264S, X264T, X264V, X264Y, X265A, X265C, X265D, X265F, X265G, X265H, X265I, X265K, X265L, X265M, X265N, X265P, X265Q, X265R, X265S, X265T, X265V, X265W, X265Y, X266G, X266W, X266Y, X267A, X267C, X267D, X267E, X267F, X267G, X267H, X267I, X267K, X267L, X267M, X267N, X267S, X267T, X267V, X267Y, X268A, X268D, X268E, X268G, X268H, X268K, X268L, X268M, X268N, X268P, X268Q, X268R, X268S, X268V, X268W, X268Y, X269C, X269D, X269F, X269G, X269H, X269I, X269L, X269M, X269N, X269Q, X269R, X269S, X269T, X269V, X270A, X270C, X270D, X270E, X270F, X270G, X270H, X270I, X270L, X270M, X270N, X270P, X270Q, X270S, X270T, X270V, X271A, X271C, X271E, X271F, X271G, X271H, X271I, X271K, X271L, X271M, X271N, X271P, X271T, X271V, X271Y, X272A, X272C, X272D, X272E, X272F, X272G, X272H, X272K, X272L, X272M, X272N, X272P, X272R, X272S, X272T, X272W, X272Y, X273A, X273C, X273D, X273E, X273F, X273G, X273H, X273I, X273K, X273L, X273R, X273S, X273T, X273V, X273W, X273Y, X274A, X274C, X274D, X274E, X274G, X274H, X274K, X274L, X274M, X274N, X274P, X274Q, X274R, X274S, X274T, X274W, X275A, X275C, X275D, X275E, X275F, X275G, X275H, X275K, X275L, X275M, X275P, X275Q, X275R, X275V, 及び X275W。
【００１８】
又この発明により、スブチリシン変異体を含有する食器洗浄組成物、及びスブチリシン変異体を含有する衣類洗浄組成物が提供される。いくつかの好ましい実施形態では、食器洗浄用及び衣類洗浄組成物にはさらに、少なくとも1の追加の酵素が含有されている。いくつかの好ましい実施形態では、追加の酵素はプロテアーゼ (例えば中性メタロプロテアーゼ、 野生型セリンプロテアーゼ、又は第2のセリンプロテアーゼ変異体) 、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、及びペルオキシダーゼから選択される。さらに、この発明により、食器洗浄方法であって：i) スブチリシン変異体を含有する食器洗浄組成物と、ii) 洗浄が必要な食器とを準備するステップと；食器の洗浄を行うために有効な条件下で食器と食器洗浄組成物とを接触させるステップとを含む、食器洗浄方法が提供される。同様に、この発明により衣類洗浄方法であって：i) スブチリシン変異体を含有する衣類洗浄組成物と、ii) 洗浄が必要な衣類とを準備するステップと；衣類の洗浄を行うために有効な条件下で衣類と衣類洗浄組成物とを接触させるステップとを含む、衣類洗浄方法が提供される。また別の実施形態では、この発明によりスブチリシン変異体をコードする単離された核酸、プロモータに操作可能に結合された前記単離された核酸を備える発現ベクター、及び／又はこの発現ベクターを備える宿主細胞が提供される。
【００１９】
又この発明により、バシラス・スブチリシンの単離されたスブチリシン変異体が提供され、このスブチリシン変異体はタンパク質分解活性を有する成熟形態であり、次の位置から選択される3以上の位置に複数の置換を有する：1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 及び275。ここで、これらの位置番号は、SEQ ID NO:1に示すB. アミロリケファシエンス・スブチリシンBPN’のアミノ酸配列に対応して賦与される。いくつかの実施形態では、このスブチリシン変異体には、4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 箇所、またはそれ以上の上記の位置が含まれる。
【００２０】
いくつかの実施形態では、スブチリシン変異体はタンパク質分解活性を有する成熟形態であり、次の位置から選択される3箇所以上の位置に置換を有する：1, 3, 4, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 35, 36, 38, 40, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 59, 61, 62, 68, 69, 72, 73, 76, 78, 84, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 124, 126, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 156, 158, 159, 160, 165, 166, 167, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 180, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 191, 194, 195, 198, 199, 203, 204, 206, 209, 210, 211, 212, 213, 215, 216, 217, 218, 222, 223, 224, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 255, 256, 258, 259, 260, 261, 262, 265, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 及び275。ここで、これらの位置番号は、SEQ ID NO:1に示すB. アミロリケファシエンス・スブチリシンBPN’のアミノ酸配列に対応して賦与される。いくつかの実施形態では、このスブチリシン変異体には、4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 箇所、またはそれ以上の上記の位置が含まれる。
【００２１】
またこの発明により単離されたスブチリシン変異体が提供され、このスブチリシン変異体はタンパク質分解活性を有する成熟形態であり、次の位置から選択される3箇所以上の位置に置換を有する：1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 35, 36, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 59, 60, 61, 62, 63, 66, 68, 69, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 156, 158, 159, 160, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 191, 192, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 220, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 及び 275。ここで、これらの位置番号は、SEQ ID NO:1に示すB. アミロリケファシエンス・スブチリシンBPN’のアミノ酸配列に対応して賦与される。いくつかの実施形態では、このスブチリシン変異体には、4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 箇所、またはそれ以上の上記の位置が含まれる。
【００２２】
またこの発明は単離されたスブチリシン変異体に関し、このスブチリシン変異体は次の位置のから選択される3箇所以上の位置に置換を有する：X001A, X001C, X001E, X001F, X001G, X001H, X001I, X001K, X001L, X001N, X001P, X001Q, X001R, X001S, X001T, X001V, X001Y, X002A, X002C, X002E, X002G, X002K, X002L, X002M, X002N, X002P, X002Q, X002R, X002S, X002T, X002V, X002W, X002Y, X003D, X003E, X003F, X003G, X003H, X003I, X003L, X003M, X003N, X003P, X003R, X003S, X003T, X003V, X003W, X003Y, X004A, X004C, X004D, X004E, X004F, X004G, X004H, X004K, X004L, X004N, X004P, X004R, X004S, X004T, X004V, X004W, X005A, X005C, X005D, X005E, X005G, X005I, X005M, X005P, X005Q, X005S, X005T, X005W, X005Y, X006A, X006D, X006E, X006M, X006W, X007A, X007C, X007D, X007G, X007H, X007N, X007P, X007Q, X007S, X007T, X008A, X008F, X008G, X008I, X008L, X008M, X008Q, X008T, X008V, X008W, X008Y, X009A, X009C, X009D, X009E, X009F, X009G, X009H, X009L, X009N, X009P, X009Q, X009R, X009S, X009T, X009V, X009W, X009Y, X010A, X010C, X010F, X010G, X010H, X010I, X010K, X010L, X010M, X010N, X010Q, X010R, X010S, X010T, X010V, X010W, X010Y, X011A, X011C, X011D, X011G, X011I, X011M, X011R, X011S, X011T, X011V, X011Y, X012D, X012F, X012G, X012H, X012I, X012K, X012L, X012M, X012N, X012P, X012Q, X012R, X012S, X012T, X012V, X012W, X012Y, X013A, X013G, X013I, X013M, X013Q, X013T, X013V, X014A, X014C, X014D, X014E, X014F, X014G, X014H, X014I, X014K, X014L, X014P, X014Q, X014S, X014T, X014V, X014Y, X015A, X015D, X015F, X015G, X015I, X015K, X015L, X015M, X015P, X015Q, X015R, X015S, X015V, X015W, X016A, X016D, X016E, X016G, X016L, X016N, X016P, X016Q, X016R, X016S, X016T, X016V, X017A, X017D, X017E, X017F, X017G, X017H, X017I, X017K, X017M, X017N, X017R, X017S, X017T, X017V, X017W, X017Y, X018A, X018C, X018D, X018E, X018F, X018G, X018H, X018I, X018K, X018L, X018M, X018N, X018P, X018Q, X018R, X018S, X018T, X018V, X018W, X018Y, X019A, X019C, X019D, X019E, X019F, X019G, X019H, X019K, X019L, X019M, X019N, X019P, X019R, X019S, X019T, X019V, X019W, X019Y, X020A, X020C, X020D, X020F, X020G, X020I, X020K, X020L, X020M, X020P, X020Q, X020R, X020S, X020T, X020V, X020W, X020Y, X021A, X021C, X021D, X021E, X021G, X021H, X021I, X021K, X021L, X021M, X021N, X021P, X021Q, X021R, X021S, X021T, X021V, X021W, X022A, X022C, X022G, X022I, X022K, X022L, X022M, X022N, X022P, X022Q, X022R, X022S, X022T, X022V, X022W, X022Y, X023A, X023G, X023S, X024A, X024C, X024D, X024F, X024G, X024H, X024L, X024M, X024N, X024P, X024Q, X024R, X024S, X024T, X024V, X024W, X025C, X025D, X025E, X025F, X025G, X025H, X025K, X025L, X025M, X025N, X025Q, X025R, X025S, X025T, X025V, X025W, X026C, X026F, X026G, X026I, X026L, X026M, X026N, X026P, X026R, X026S, X026T, X026V, X027A, X027C, X027D, X027F, X027G, X027I, X027K, X027L, X027M, X027N, X027P, X027R, X027S, X027T, X027V, X027W, X027Y, X028A, X028E, X028G, X028H, X028I, X028L, X028M, X028N, X028P, X028S, X028V, X028Y, X029A, X029C, X029G, X029I, X029K, X029S, X029T, X029V, X030A, X030C, X030D, X030E, X030F, X030G, X030L, X030M, X030Q, X030S, X030T, X030V, X031A, X031F, X031I, 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X210Q, X210R, X210S, X210V, X210W, X210Y, X211A, X211C, X211E, X211F, X211G, X211H, X211I, X211L, X211M, X211P, X211Q, X211R, X211T, X211V, X211W, X211Y, X212C, X212F, X212G, X212H, X212I, X212M, X212N, X212P, X212R, X212S, X212T, X212V, X212Y, X213A, X213C, X213D, X213E, X213F, X213G, X213I, X213K, X213L, X213M, X213N, X213P, X213Q, X213R, X213S, X213T, X213V, X213W, X213Y, X214A, X214C, X214E, X214F, X214G, X214H, X214I, X214K, X214L, X214M, X214N, X214P, X214Q, X214R, X214S, X214T, X214V, X214W, X214Y, X215A, X215C, X215D, X215E, X215F, X215G, X215H, X215I, X215K, X215M, X215N, X215P, X215R, X215S, X215T, X215V, X215W, X215Y, X216A, X216C, X216D, X216E, X216F, X216G, X216H, X216I, X216K, X216L, X216M, X216N, X216P, X216Q, X216R, X216S, X216V, X216W, X216Y, X217A, X217C, X217D, X217E, X217F, X217G, X217I, X217K, X217L, X217M, X217N, X217Q, X217S, X217T, X217V, X217Y, X218C, X218D, X218E, X218F, X218G, X218H, X218I, X218L, X218M, X218N, X218P, X218Q, X218R, X218S, X218T, X218V, X218W, X218Y, X219A, X219G, X219S, X220A, X220C, X220G, X220H, X220N, X220S, X220T, X220V, X221G, X221S, X221T, X222A, X222C, X222E, X222F, X222G, X222I, X222K, X222L, X222M, X222N, X222P, X222Q, X222R, X222S, X222T, X222V, X222W, X223A, X223
C, X223G, X223M, X223S, X223T, X224A, X224D, X224E, X224G, X224I, X224L, X224M, X224N, X224P, X224S, X224T, X225A, X225C, X225G, X225I, X225N, X225P, X225S, X225T, X225V, X226C, X226F, X226G, X226H, X226I, X226L, X226M, X226N, X226R, X226S, X226T, X226V, X226Y, X227A, X227C, X227F, X227G, X227I, X227L, X227M, X227P, X227Q, X227S, X227T, X227V, X227Y, X228A, X228C, X228G, X228I, X228L, X228M, X228P, X228S, X228V, X229A, X229G, X229P, X229S, X230A, X230D, X230E, X230F, X230G, X230H, X230I, X230L, X230N, X230P, X230Q, X230S, X230T, X230V, X230W, X230Y, X231A, X231C, X231F, X231G, X231H, X231I, X231L, X231S, X231T, X231W, X231Y, X232A, X232G, X232H, X232K, X232L, X232M, X232P, X232S, X232V, X233A, X233C, X233E, X233F, X233G, X233I, X233L, X233M, X233N, X233P, X233Q, X233R, X233S, X233T, X233V, X233Y, X234D, X234F, X234G, X234H, X234L, X234M, X234N, X234P, X234Q, X234S, X234T, X234V, X234Y, X235C, X235D, X235E, X235F, X235G, X235H, X235I, X235K, X235L, X235M, X235N, X235Q, X235R, X235S, 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X244E, X244F, X244H, X244I, X244L, X244M, X244N, X244P, X244Q, X244R, X244S, X244T, X244V, X244W, X244Y, X245A, X245C, X245E, X245G, X245H, X245K, X245L, X245P, X245Q, X245R, X245S, X245V, X245W, X245Y, X246A, X246C, X246E, X246F, X246G, X246H, X246I, X246L, X246M, X246N, X246P, X246Q, X246R, X246S, X246T, X246V, X246W, X246Y, X247A, X247C, X247D, X247E, X247F, X247G, X247H, X247I, X247K, X247L, X247M, X247N, X247P, X247Q, X247R, X247S, X247T, X247V, X247W, X247Y, X248C, X248D, X248E, X248G, X248H, X248I, X248K, X248L, X248M, X248N, X248P, X248R, X248S, X248T, X248V, X248W, X248Y, X249A, X249D, X249E, X249F, X249G, X249H, X249I, X249K, X249L, X249M, X249N, X249Q, X249R, X249S, X249T, X249V, X249W, X249Y, X250A, X250C, X250E, X250F, X250G, X250H, X250I, X250L, X250M, X250N, X250Q, X250S, X250V, X250Y, X251A, X251D, X251E, X251F, X251G, X251K, X251L, X251M, X251P, X251Q, X251R, X251S, X251T, X251V, X251Y, X252A, X252C, X252D, X252F, X252G, X252H, X252I, X252K, X252L, X252M, X252N, X252P, X252R, X252S, X252V, X252W, X252Y, X253A, X253D, X253E, X253F, X253G, X253H, X253I, X253K, X253M, X253R, X253S, X253T, X253V, X253W, X254A, X254C, X254D, X254E, X254G, X254N, X254P, X254S, X254T, X254V, X255A, X255C, X255D, X255E, X255F, X255H, X255I, X255L, X255N, X255P, X255Q, X255R, X255S, X255T, X255V, X255W, X255Y, X256A, X256C, X256D, X256E, X256G, X256H, X256I, X256K, X256L, X256M, X256N, X256P, X256R, X256S, X256T, X256V, X256W, X256Y, X257A, X257C, X257E, X257F, X257G, X257H, X257I, X257K, X257L, X257M, X257P, X257S, X257T, X257V, X257W, X257Y, X258A, X258C, X258D, X258E, X258F, X258G, X258H, X258I, X258L, X258M, X258P, X258Q, X258R, X258S, X258T, X258V, X258W, X258Y, X259A, X259C, X259E, X259G, X259I, X259L, X259M, X259P, X259Q, X259R, X259S, X259T, X259V, X260A, X260D, X260E, X260F, X260H, X260I, X260L, X260M, X260N, X260P, X260R, X260S, X260T, X260V, X260Y, X261A, X261C, X261E, X261F, X261G, X261I, X261K, X261L, X261N, X261P, X261Q, X261R, X261S, X261T, X261V, X261W, X261Y, X262A, X262C, X262D, X262F, X262G, X262H, X262I, X262K, X262L, X262M, X262P, X262Q, X262R, X262S, X262T, X262V, X262W, X262Y, X263A, X263C, X263D, X263F, X263G, X263H, X263I, X263K, X263L, X263M, X263N, X263P, X263Q, X263R, X263W, X263Y, X264A, X264C, X264E, X264F, X264G, X264H, X264I, X264L, X264P, X264Q, X264S, X264T, X264V, X264Y, X265A, X265C, X265D, X265F, X265G, X265H, X265I, X265K, X265L, X265M, X265N, X265P, X265Q, X265R, X265S, X265T, X265V, X265W, X265Y, X266G, X266W, X266Y, X267A, X267C, X267D, X267E, X267F, X267G, X267H, X267I, X267K, X267L, X267M, X267N, X267S, X267T, X267V, X267Y, X268A, X268D, X268E, X268G, X268H, X268K, X268L, X268M, X268N, X268P, X268Q, X268R, X268S, X268V, X268W, X268Y, X269C, X269D, X269F, X269G, X269H, X269I, X269L, X269M, X269N, X269Q, X269R, X269S, X269T, X269V, X270A, X270C, X270D, X270E, X270F, X270G, X270H, X270I, X270L, X270M, X270N, X270P, X270Q, X270S, X270T, X270V, X271A, X271C, X271E, X271F, X271G, X271H, X271I, X271K, X271L, X271M, X271N, X271P, X271T, X271V, X271Y, X272A, X272C, X272D, X272E, X272F, X272G, X272H, X272K, X272L, X272M, X272N, X272P, X272R, X272S, X272T, X272W, X272Y, X273A, X273C, X273D, X273E, X273F, X273G, X273H, X273I, X273K, X273L, X273R, X273S, X273T, X273V, X273W, X273Y, X274A, X274C, X274D, X274E, X274G, X274H, X274K, X274L, X274M, X274N, X274P, X274Q, X274R, X274S, X274T, X274W, X275A, X275C, X275D, X275E, X275F, X275G, X275H, X275K, X275L, X275M, X275P, X275Q, X275R, X275V, 及び X275W。ここで、これらの位置番号は、SEQ ID NO:1に示すB. アミロリケファシエンス・スブチリシンBPN’のアミノ酸配列に対応して賦与される。いくつかの実施形態では、このスブチリシン変異体には、4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 箇所、またはそれ以上の上記の位置が含まれる。
【００２３】
いくつかの好ましい実施形態では、この発明により単離されたスブチリシン変異体が提供され、このスブチリシン変異体はBMI分析、卵黄小見本片分析、及び／又は AAPF活性分析から選択される少なくとも1の分析において1より大きい性能指数を示し、またLAS安定性又はTCA分析において0.8より大きい性能指数を示す。ここで、スブチリシン変異体は次に示す位置の1以上の位置に、少なくとも1の置換を有する：1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 35, 36, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 59, 60, 61, 62, 63, 66, 68, 69, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 156, 158, 159, 160, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 191, 192, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 220, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 及び275。ここで、これらの位置番号は、SEQ ID NO:1に示すB. アミロリケファシエンス・スブチリシンBPN’のアミノ酸配列に対応して賦与される。いくつかの実施形態では、このスブチリシン変異体には、2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 箇所、またはそれ以上の上記の位置が含まれる。
【００２４】
いくつかの好ましい実施形態では、この発明により単離されたスブチリシン変異体が提供され、このスブチリシン変異体はBMI分析、卵黄小見本片分析、及び／又は AAPF活性分析から選択される少なくとも1の分析において1より大きい性能指数を示し、またLAS安定性及び／又はTCA分析において0.8より大きい性能指数を示す。ここで、スブチリシン変異体は次に示す位置の1以上の位置に、少なくとも1の置換を有する：1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 35, 36, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 59, 60, 61, 62, 63, 66, 68, 69, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 156, 158, 159, 160, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 191, 192, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 220, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 及び275。ここで、これらの位置番号は、SEQ ID NO:1に示すB. アミロリケファシエンス・スブチリシンBPN’のアミノ酸配列に対応して賦与される。いくつかの実施形態では、このスブチリシン変異体には、2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 箇所、またはそれ以上の上記の位置が含まれる。
【００２５】
いくつかの別の実施形態では、この発明により単離されたスブチリシン変異体が提供され、このスブチリシン変異体はBMI分析、卵黄小見本片分析、及び／又は AAPF活性分析から選択される少なくとも1の分析において1より大きい性能指数を示し、またLAS安定性及びTCA分析において0.8より大きい性能指数を示す。ここで、スブチリシン変異体は次に示す位置の1以上の位置に、少なくとも1の置換を有する：1, 3, 4, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 35, 36, 38, 40, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 59, 61, 62, 68, 69, 72, 73, 76, 78, 84, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 124, 126, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 156, 158, 159, 160, 165, 166, 167, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 180, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 191, 194, 195, 198, 199, 203, 204, 206, 209, 210, 211, 212, 213, 215, 216, 217, 218, 222, 223, 224, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 255, 256, 258, 259, 260, 261, 262, 265, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 及び275。ここで、これらの位置番号は、SEQ ID NO:1に示すB. アミロリケファシエンス・スブチリシンBPN’のアミノ酸配列に対応して賦与される。いくつかの実施形態では、このスブチリシン変異体には、2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 箇所、またはそれ以上の上記の位置が含まれる。
【００２６】
いくつかの別の実施形態では、この発明により単離されたスブチリシン変異体が提供され、このスブチリシン変異体はBMI分析、卵黄小見本片分析、及び／又は AAPF活性分析から選択される少なくとも1の分析において1より大きい性能指数を示し、またLAS/EDTA 安定性又はTCA分析において0.8より大きい性能指数を示す。ここで、スブチリシン変異体は次に示す位置の3以上の位置に、少なくとも1の置換を有する：X001A, X001C, X001E, X001F, X001G, X001H, X001I, X001K, X001L, X001N, X001Q, X001R, X001S, X001T, X001V, X001Y, X002A, X002C, X002E, X002G, X002K, X002L, X002M, X002N, X002P, X002Q, X002R, X002S, X002T, X002V, X002W, X002Y, X003D, X003E, X003F, X003G, X003H, X003I, X003L, X003M, X003N, X003P, X003R, X003S, X003T, X003V, X003W, X003Y, X004A, X004C, X004D, X004E, X004F, X004H, X004K, X004L, X004N, X004P, X004R, X004S, X004T, X004V, X004W, X005A, X005C, X005D, X005E, X005G, X005P, X005Q, X005S, X005T, X007A, X007C, X007D, X007G, X007H, X007N, X007S, X007T, X008A, X008F, X008I, X008L, X008M, X008T, X008V, X009D, X009E, X009F, X009G, X009H, X009L, X009N, X009P, X009Q, X009R, X009S, X009T, X009V, X009W, X009Y, X010A, X010C, X010G, X010H, X010K, X010M, X010N, X010Q, X010R, X010S, X010T, X010W, X011A, X011I, X011M, X011S, X011V, X012D, X012F, X012G, X012H, X012I, X012K, X012L, X012M, X012N, X012Q, X012R, X012S, X012T, X012V, X012W, X013A, X013G, X013I, X013T, X013V, X014A, X014D, X014E, X014F, X014H, X014I, X014K, X014L, X014P, X014Q, X014S, X014T, X014V, X014Y, X015A, X015D, X015F, X015G, X015I, X015K, X015L, X015M, X015P, X015Q, X015R, X015S, X015V, X015W, X016A, X016G, X016L, X016N, X016P, X016Q, X016S, X016T, X016V, X017A, X017F, X017H, X017I, X017K, X017M, X017N, X017R, X017S, X017V, X017W, X017Y, X018A, X018C, X018D, X018E, X018F, X018G, X018H, X018K, X018L, X018M, X018N, X018P, X018Q, X018R, X018S, X018T, X018V, X018W, X018Y, X019A, X019C, X019D, X019E, X019F, X019G, X019H, X019K, X019L, X019M, X019N, X019R, X019S, X019T, X019V, X019W, X019Y, X020A, X020C, X020D, X020F, X020G, X020I, X020K, X020L, X020M, X020P, X020Q, X020R, X020S, X020T, X020V, X020W, X020Y, X021A, X021C, X021D, X021E, X021G, X021H, X021I, X021K, X021L, X021M, X021N, X021P, X021Q, X021R, X021S, X021T, 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X156M, X156N, X156S, X156T, X158A, X158C, X158E, X158F, X158H, X158K, X158L, X158M, X158Q, X158R, X158S, X158T, X158V, X158W, X159A, X159C, X159E, X159G, X159H, X159M, X159P, X159Q, X159R, X159S, X159W, X160A, X160C, X160D, X160F, X160G, X160I, X160L, X160M, X160N, X160Q, X160R, X160S, X160T, X160V, X160Y, X165I, X165L, X165T, X165V, X166A, X166C, X166D, X166E, X166H, X166M, X166N, X166S, X167C, X167D, X167E, X167F, X167P, X167V, X167W, X167Y, X169A, X169G, X169S, X170A, X170D, X170E, X170G, X170H, X170K, X170L, X170P, X170Q, X170R, X170S, X170V, X170W, X170Y, X171C, X171F, X171L, X171N, X171Y, X172A, X172C, X172D, X172F, X172G, X172I, X172K, X172L, X172M, X172P, X172Q, X172R, X172S, X172T, X172V, X172Y, X173A, X173C, X173D, X173E, X173F, X173G, X173H, X173K, X173L, X173M, X173N, X173Q, X173R, X173T, X173V, X173W, X174A, X174G, X174S, X174T, X174V, X175A, X175C, X175I, X175L, X175M, X175Q, X175T, X175V, X175Y, X176A, X176G, X176S, X177A, X177C, X177I, X177T, X177V, X178A, X178G, X179A, X179G, X180C, X180I, X180L, X180S, X180T, X180V, X181D, X181N, X182A, X182D, X182E, X182F, X182G, X182H, X182I, X182K, X182L, X182M, X182N, X182P, X182Q, X182R, X182S, X182T, X182V, X182W, X182Y, X183A, X183D, X183F, X183G, X183H, X183I, X183K, X183L, X183M, X183N, X183Q, X183R, X183S, X183T, X183V, X183W, X183Y, X184D, X184N, X185A, X185C, X185E, X185F, X185G, X185H, X185I, X185K, X185L, X185M, X185N, X185Q, X185R, X185S, X185T, X185V, X185Y, X186H, X186I, X186K, X186L, X186R, X187A, X187P, X187W, X188A, X188D, X188E, X188F, X188G, X188H, X188I, X188K, X188L, X188P, X188Q, X188R, X188S, X188T, X188V, X188W, X188Y, X191D, X191Q, X192W, X192Y, X194A, X194C, X194D, X194E, X194F, X194G, X194H, X194I, X194L, X194M, X194P, X194Q, X194R, X194S, X194T, X194V, X194W, X194Y, X195A, X195C, X195D, X195E, X195G, X195Q, X195Y, X196L, X196M, X197A, X197C, X197D, X197E, X197G, X197N, X197Q, X197S, X197T, X198A, X198F, X198G, X198H, X198I, X198L, X198M, X198N, X198R, X198S, X198T, X198Y, X199A, X199C, X199I, X199M, X199S, X199T, X199V, X200A, X200C, X200G, X200S, X203A, X203C, X203E, X203I, X203L, X203S, X203T, X203V, X204A, X204C, X204E, X204F, X204G, X204I, X204K, X204L, X204N, X204R, X204S, X204T, X204W, X204Y, X205I, X205T, X205V, X206A, X206C, X206D, X206E, X206G, X206H, X206I, X206K, X206L, X206N, X206P, X206Q, X206R, X206S, X206T, X206V, X206W, X206Y, X207A, X207S, X208C, X208L, X208S, X208T, X208V, X209A, X209C, X209F, X209G, X209H, X209I, X209K, X209L, X209M, X209N, X209R, X209S, X209V, X209W, X209Y, X210A, X210C, X210E, X210G, X210H, X210I, X210L, X210M, X210N, X210P, X210R, X210S, X210V, X210Y, X211A, X211C, X211E, X211F, X211G, X211H, X211I, X211L, X211M, X211P, X211Q, X211R, X211T, X211V, X211W, X211Y, X212C, X212F, X212G, X212H, X212I, X212M, X212N, X212P, X212R, X212S, X212T, X212V, X212Y, X213A, X213C, X213D, X213E, X213F, X213G, X213I, X213K, X213L, X213M, X213N, X213Q, X213R, X213S, X213T, X213V, X213W, X213Y, X214F, X214L, X214W, X214Y, X215A, X215C, X215D, X215E, X215F, X215G, X215H, X215I, X215K, X215M, X215N, X215P, X215R, X215S, X215T, X215V, X215W, X215Y, X216A, X216C, X216D, X216E, X216F, X216G, X216H, X216I, X216K, X216L, X216M, X216N, X216P, X216Q, X216R, X216S, X216V, X216W, X216Y, X217A, X217C, X217E, X217F, X217G, X217I, X217K, X217L, X217M, X217Q, X218C, X218D, X218E, X218F, X218G, X218H, X218I, X218M, X218N, X218Q, X218R, X218S, X218T, X218V, X218Y, X220S, X220T, X222A, X222M, X222Q, X223A, X223G, X223S, X224A, X224G, X224L, X224N, X224S, X224T, X225C, X225P, X226C, X226F, X226H, X226M, X226V, X227A, X227C, X227G, X227I, X227L, X227M, X227S, X227T, X227V, X228A, X228C, X228G, X228I, X228S, X228V, X229A, X229G, X229P, X229S, X230A, X230D, X230E, X230G, X230H, X230I, X230L, X230N, X230Q, X230S, X230T, X230V, X231A, X231C, X231F, X231G, X231H, X231I, X231L, X231S, X231T, X231Y, X232A, X232G, X232H, X232L, X232M, X232S, X232V, X233A, X233C, X233E, X233F, X233G, X233I, X233L, X233M, X233N, X233P, X233Q, X233S, X233T, X233V, X233Y, X234D, X234F, X234G, X234H, X234L, X234M, X234N, X234Q, X234S, X234T, X234V, X234Y, X235C, X235D, X235E, X235F, X235G, X235H, X235I, X235K, X235L, X235M, X235N, X235Q, X235R, X235S, X235V, X235W, X235Y, X236A, X236C, X236E, X236F, X236H, X236K, X236N, X236P, X236Q, X236R, X236S, X236T, X236V, X236W, X236Y, X237A, X237C, X237F, X237G, X237H, X237I, X237K, X237L, X237M, X237P, X237Q, X237R, X237S, X237T, X237V, X237W, X237Y, X238C, X238D, X238E, X238F, X238G, X238H, X238I, X238K, X238L, X238M, X238N, X238Q, X238R, X238S, X238T, X238V, X238Y, X239C, X239D, X239F, X239G, X239H, X239I, X239K, X239L, X239M, X239N, X239P, X239Q, X239R, X239S, X239T, X239V, X239W, X239Y, X240A, X240C, X240E, X240F, X240I, X240K, X240L, X240M, X240N, X240Q, X240R, X240S, X240T, X240W, X240Y, X241A, X241C, X241D, X241E, X241F, X241G, X241H, X241I, X241K, X241L, X241M, X241N, X241P, X241Q, X241R, X241S, X241T, X241V, X241W, X241Y, X242A, X242C, X242D, X242F, X242G, X242H, X242I, X242L, X242M, X242P, X242Q, X242R, X242S, X242T, X242V, X242W, X243C, X243D, X243E, X243F, X243G, X243H, X243I, X243K, X243L, X243M, X243N, X243P, X243Q, X243R, X243S, X243T, X243V, X243W, X244A, X244D, X244E, X244F, X244H, X244I, X244L, X244M, X244N, X244P, X244Q, X244R, X244S, X244T, X244V, X244W, X244Y, X245A, X245C, X245E, X245G, X245H, X245K, X245L, X245P, X245Q, X245R, X245S, X245V, X245W, X245Y, X246A, X246C, X246E, X246F, X246G, X246H, X246I, X246L, X246M, X246N, X246Q, X246S, X246T, X246V, X246W, X246Y, X247A, X247C, X247D, X247E, X247F, X247G, X247H, X247I, X247K, X247L, X247M, X247N, X247P, X247Q, X247R, X247S, X247T, X247V, X247W, X247Y, X248C, X248D, X248E, X248G, X248H, X248I, X248K, X248L, X248N, X248P, X248R, X248S, X248T, X248V, X248W, X248Y, X249A, X249D, X249E, X249F, X249G, X249H, X249I, X249K, X249L, X249M, X249N, X249Q, X249R, X249S, X249T, X249V, X249W, X249Y, X250A, X250C, X250F, X250I, X250L, X250M, X250Q, X250S, X250V, X251A, X251D, X251E, X251F, X251G, X251K, X251L, X251M, X251Q, X251R, X251T, X251V, X251Y, X252A, X252C, X252D, X252F, X252G, X252H, X252I, X252K, X252L, X252M, X252N, X252R, X252S, X252V, X252W, X252Y, X253A, X253D, X253E, X253F, X253G, X253H, X253I, X253K, X253M, X253R, X253S, X253T, X253V, X253W, X254A, X254C, X254G, X254S, X254T, X255A, X255C, X255D, X255E, X255F, X255H, X255I, X255L, X255N, X255P, X255Q, X255R, X255S, X255T, X255V, X255W, X255Y, X256A, X256C, X256D, X256E, X256G, X256H, X256I, X256K, X256L, X256M, X256N, X256P, X256R, X256S, X256T, X256V, X256W, X256Y, X257C, X257F, X257I, X257K, X257L, X257M, X257V, X258A, X258C, X258D, X258E, X258F, X258G, X258H, X258I, X258L, X258M, X258P, X258Q, X258R, X258S, X258T, X258V, X258W, X258Y, X259A, X259C, X259E, X259G, X259I, X259L, X259M, X259P, X259Q, X259R, X259S, X259T, X259V, X260A, X260D, X260E, X260F, X260H, X260I, X260L, X260M, X260N, X260P, X260R, X260S, X260T, X260V, X260Y, X261A, X261C, X261E, X261F, X261G, X261I, X261K, X261L, X261N, X261P, X261Q, X261R, X261S, X261T, X261V, X261W, X261Y, X262A, X262C, X262D, X262F, X262G, X262H, X262I, X262K, X262L, X262M, X262Q, X262R, X262S, X262T, X262V, X262W, X262Y, X263C, X263F, X263L, X263Y, X264A, X264G, X265A, X265C, X265D, X265F, X265G, X265H, X265K, X265M, X265Q, X265R, X265S, X265T, X265W, X265Y, X267G, X267I, X267L, X267M, X267N, X267V, X268A, X268G, X268H, X268L, X268M, X268N, X268P, X268Q, X268S, X268V, X269C, X269D, X269F, X269G, X269H, X269I, X269L, X269M, X269N, X269Q, X269R, X269S, X269T, X269V, X270A, X270C, X270D, X270G, X270I, X270L, X270M, X270N, X270S, X270T, X270V, X271A, X271C, X271E, X271F, X271G, X271H, X271I, X271K, X271L, X271M, X271N, X271P, X271T, X271V, X271Y, X272A, X272C, X272D, X272E, X272F, X272G, X272H, X272K, X272L, X272M, X272N, X272P, X272R, X272S, X272T, X272W, X272Y, X273A, X273C, X273D, X273E, X273F, X273G, X273H, X273I, X273L, X273S, X273T, X273V, X274A, X274C, X274D, X274E, X274G, X274H, X274L, X274M, X274N, X274P, X274Q, X274R, X274S, X274T, X274W, X275A, X275C, X275D, X275E, X275F, X275G, X275H, X275K, X275L, X275M, X275P, X275Q, X275R, X275V, 及びX275W。ここで、これらの位置番号は、SEQ ID NO:1に示すB. アミロリケファシエンス・スブチリシンBPN’のアミノ酸配列に対応して賦与される。いくつかの実施形態では、このスブチリシン変異体には、2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 箇所、またはそれ以上の上記の位置が含まれる。
【００２７】
いくつかの別の実施形態では、この発明により単離されたスブチリシン変異体が提供され、このスブチリシン変異体はBMI分析、卵黄小見本片分析、及び／又は AAPF活性分析から選択される少なくとも1の分析において1より大きい性能指数を示し、またLAS/EDTA 安定性及びTCA分析において0.8より大きい性能指数を示す。ここで、スブチリシン変異体は次に示す位置の3以上の位置に、少なくとも1の置換を有する：X001A, X001E, X001G, X001H, X001Q, X001V, X003E, X003H, X003I, X003M, X003S, X003T, X003V, X004T, X004V, X008I, X008V, X009E, X009H, X009N, X009Q, X009S, X009T, X010A, X010C, X010G, X010H, X010K, X010M, X010N, X010R, X010S, X010T, X011I, X011V, X012G, X012I, X012N, X012Q, X012S, X012T, X012V, X013A, X013G, X015A, X015D, X015F, X015G, X015I, X015L, X015M, X015P, X015Q, X015S, X015V, X015W, X016A, X016G, X016N, X016P, X016S, X016T, X016V, X017H, X017I, X017M, X017N, X018A, X018C, X018D, X018E, X018G, X018H, X018L, X018M, X018N, X018P, X018Q, X018S, X018T, X018V, X018Y, X019A, X019C, X019D, X019E, X019F, X019G, X019H, X019K, X019L, X019M, X019N, X019R, X019S, X019V, X019W, X019Y, X020A, X020C, X020D, X020F, X020G, X020I, X020K, X020L, X020M, X020P, X020Q, X020R, X020S, X020T, X020V, X020W, X020Y, X021A, X021C, X021E, X021G, X021H, X021I, X021K, X021L, X021M, X021N, X021P, X021Q, X021S, X021T, X021V, X021W, X022A, X022C, X022G, X022I, X022L, X022M, X022N, X022P, X022Q, X022T, X022V, X022W, X023A, X023G, X023S, X024A, X024C, X024D, X024F, X024G, X024H, X024L, X024M, X024N, X024P, X024Q, X024R, X024S, X024T, X024V, X024W, X025C, X025D, X025E, X025F, X025G, X025K, X025L, X025M, X025Q, X025R, X025S, X025T, X025V, X025W, X026C, X026F, X026G, X026M, X026N, X026R, X026S, X026T, X026V, X027A, X027C, X027D, X027F, X027G, X027K, X027L, X027M, X027N, X027P, X027R, X027S, X027T, X027W, X028A, X028I, X028L, X028M, X028V, X029A, X029C, X029G, X029S, X029V, X030A, X030C, X030L, X030M, X030T, X030V, X031A, X031F, X031I, X031L, X031M, X031S, X031V, X033C, X033M, X033S, X033T, X035I, X035L, X035M, X035P, X036A, X036E, X036S, X036T, X036V, X038C, X038F, X038H, X038I, X038K, X038L, X038M, X038N, X038Q, X038R, X038T, X038V, X038Y, X040A, X040D, X040E, X040I, X040L, X040P, X040V, X043A, X043C, X043D, X043E, X043F, X043G, X043I, X043L, X043M, X043N, X043R, X043S, X043T, X043W, X043Y, X044A, X044C, X044D, X044F, X044G, X044I, X044K, X044L, X044M, X044N, X044Q, X044R, X044S, X044T, X044V, X044Y, X045A, X045D, X045F, X045G, X045H, X045I, X045K, X045L, X045M, X045N, X045P, X045Q, X045R, X045S, X045T, X045V, X045W, X045Y, X046C, X046D, X046E, X046G, X046H, X046I, X046K, X046L, X046M, X046N, X046P, X046Q, X046R, X046S, X046T, X046V, X047G, X047R, X048A, X048C, X048E, X048F, X048H, X048I, X048K, X048L, X048M, X048N, X048P, X048Q, X048R, X048S, X048T, X048V, X048Y, X049A, X049G, X049H, X049S, X049T, X050F, X050H, X050I, X050L, X050T, X050V, X050Y, X051F, X051H, X051K, X051L, X051R, X051S, X051T, X051V, X051W, X052A, X052C, X052E, X052F, X052G, X052H, X052I, X052L, X052M, X052N, X052P, X052Q, X052R, X052T, X052V, X052W, X052Y, X053A, X053C, X053D, X053E, X053G, X053H, X053K, X053L, X053M, X053Q, X053R, X053S, X053T, X053W, X053Y, X054A, X054C, X054D, X054E, X054F, X054H, X054M, X054N, X054Q, X054S, X055C, X055E, X055G, X055H, X055K, X055L, X055P, X055Q, X055S, X055T, X055W, X056A, X056C, X056D, X056E, X056H, X056L, X056M, X056N, X056P, X056Q, X056S, X056T, X057C, X057E, X057F, X057G, X057H, X057I, X057L, X057M, X057N, X057P, X057Q, X057R, X057S, X057T, X057V, X057W, X057Y, X059A, X059D, X059G, X059I, X059L, X059M, X059N, X059Q, X059R, X059S, X059T, X059V, X059W, X061A, X061C, X061D, X061F, X061G, X061H, X061I, X061L, X061M, X061N, X061P, X061R, X061S, X061T, X061V, X061Y, X062C, X062E, X062F, X062H, X062I, X062K, X062L, X062M, X062N, X062Q, X062R, X062S, X062T, X062V, X068I, X068L, X068V, X069A, X069G, X069S, X069T, X072I, X072L, X072T, X072V, X073A, X073C, X073S, X076D, X076N, X078A, X078C, X078E, X078H, X078L, X078M, X078N, X078Q, X078S, X078T, X084C, X084G, X084I, X084M, X084V, X086C, X086P, X087A, X087C, X087D, X087E, X087G, X087K, X087L, X087N, X087S, X087V, X088A, X088C, X088G, X088S, X089A, X089D, X089E, X089G, X089H, X089I, X089N, X089Q, X089R, X089S, X089T, X089W, X090C, X090I, X090L, X090M, X090Q, X090T, X090V, X091D, X091F, X091I, X091N, X091S, X091V, X091W, X091Y, X092A, X092G, X092P, X092R, X092V, X093A, X093C, X093G, X093L, X093M, X093T, X093V, X094K, X094R, X095A, X095C, X095I, X095S, X095V, X096F, X096I, X096L, X096M, X097A, X097D, X097E, X097F, X097G, X097H, X097K, X097L, X097M, X097N, X097P, X097Q, X097R, X097S, X097T, X097V, X097W, X097Y, X098A, X098C, X098D, X098E, X098F, X098G, X098K, X098L, X098N, X098P, X098Q, X098R, X098S, X098T, X098V, X098Y, X099A, X099C, X099F, X099G, X099K, X099M, X099P, X099Q, X099R, X099S, X099T, X099V, X099Y, X100D, X100E, X100G, X100I, X100K, X100N, X100R, X100S, X100T, X100V, X100Y, X101A, X101C, X101D, X101E, X101F, X101G, X101H, X101I, X101K, X101N, X101P, X101Q, X101R, X101S, X101T, X101V, X101Y, X102A, X102G, X102T, X103A, X103C, X103D, X103F, X103G, X103I, X103L, X103N, X103P, X103Q, X103R, X103S, X103T, X103V, X103W, X104C, X104F, X104H, X104I, X104L, X104R, X104S, X104T, X104V, X104W, X104Y, X105A, X105C, X105D, X105E, X105F, X105G, X105K, X105L, X105N, X105Q, X105R, X105S, X105T, X105V, X106A, X106D, X106E, X106G, X106I, X106L, X106R, X106S, X106T, X106V, X106W, X107A, X107C, X107F, X107I, X107L, X107M, X107Q, X107S, X107T, X107V, X108A, X108C, X108I, X108S, X108T, X108V, X109A, X109E, X109F, X109G, X109H, X109I, X109K, X109L, X109M, X109N, X109Q, X109R, X109S, X109T, X109W, X109Y, X110A, X110G, X111F, X111I, X111L, X111M, X112D, X112E, X112I, X112Q, X112V, X114A, X114C, X115C, X115E, X115G, X115L, X115M, X115P, X115Q, X115S, X115T, X115W, X115Y, X116A, X116C, X116D, X116F, X116G, X116I, X116K, X116L, X116M, X116N, X116Q, X116S, X116T, X116V, X116W, X117A, X117C, X117N, X117Q, X117R, X117T, X117Y, X118A, X118C, X118D, X118E, X118F, X118G, X118K, X118M, X118N, X118R, X118S, X118V, X118W, X119A, X119F, X119M, X119T, X120A, X120C, X120E, X120F, X120G, X120H, X120I, X120L, X120M, X120N, X120R, X120S, X120T, X120W, X121A, X121C, X121F, X121I, X121L, X121M, X121S, X121T, X121V, X122A, X122G, X122S, X122V, X124G, X124L, X124T, X126A, X126F, X126I, X126L, X126M, X126V, X128A, X128F, X128G, X128I, X128K, X128L, X128M, X128N, X128Q, X128R, X128S, X128T, X128W, X129A, X129E, X129F, X129G, X129M, X129N, X129P, X129R, X129S, X129Y, X130C, X130K, X130L, X130N, X130Q, X130R, X130S, X130V, X130W, X130Y, X131A, X131D, X131E, X131F, X131G, X131K, X131P, X131Q, X132A, X132H, X132I, X132N, X132Q, X132R, X132S, X132T, X133A, X133F, X133K, X133N, X133P, X133S, X133T, X133V, X133Y, X134A, X134S, X134T, X134V, X135L, X135M, X135W, X136E, X136Q, X137A, X137C, X137E, X137H, X137K, X137L, X137M, X137Q, X137R, X137S, X137W, X139C, X139I, X139V, X140D, X140E, X140N, X141D, X141E, X141G, X141H, X141I, X141K, X141L, X141N, X141Q, X141R, X141S, X141V, X141Y, X142A, X142C, X142V, X143C, X143D, X143F, X143H, X143N, X143T, X144A, X144C, X144D, X144G, X144H, X144I, X144L, X144M, X144N, X144R, X144S, X144T, X144V, X144Y, X145A, X145C, X145D, X145F, X145K, X145L, X145N, X145Q, X145R, X146D, X146G, X147I, X147L, X147T, X147V, X148C, X148I, X148L, X148M, X148N, X148V, X149C, X149I, X149L, X149V, X150A, X150L, X150T, X150V, X151A, X151S, X152A, X152S, X156D, X156E, X156L, X156N, X156S, X156T, X158A, X158C, X158E, X158F, X158H, X158K, X158L, X158M, X158Q, X158R, X158S, X158T, X158V, X159A, X159C, X159E, X159G, X159H, X159M, X159P, X159S, X160A, X160C, X160D, X160F, X160I, X160L, X160M, X160N, X160Q, X160S, X160T, X160V, X160Y, X165I, X165L, X165V, X166A, X166C, X166D, X166E, X166H, X166M, X166S, X166T, X167F, X167Y, X170A, X170D, X170E, X170G, X170H, X170K, X170Q, X170R, X170S, X170V, X170Y, X171C, X171Y, X172A, X172C, X172D, X172G, X172I, X172K, X172L, X172M, X172P, X172Q, X172R, X172S, X172V, X172Y, X173A, X173C, X173D, X173H, X173M, X173N, X173Q, X173T, X174A, X174S, X174T, X174V, X175L, X175M, X175V, X176A, X176S, X177C, X177V, X180T, X180V, X182A, X182D, X182E, X182Q, X183A, X183D, X183N, X183Q, X183S, X184D, X184N, X185A, X185C, X185E, X185H, X185K, X185M, X185N, X185Q, X185T, X185V, X186I, X186K, X186L, X186R, X187A, X187C, X188A, X188D, X188E, X188F, X188H, X188I, X188K, X188L, X188P, X188Q, X188S, X188T, X191A, X191D, X191Q, X191S, X194A, X194C, X194D, X194E, X194F, X194H, X194I, X194L, X194M, X194P, X194Q, X194R, X194S, X194T, X194W, X194Y, X195C, X195D, X195E, X195G, X195Q, X198I, X198L, X199C, X199M, X199S, X199V, X203C, X203E, X203T, X203V, X204A, X204C, X204E, X204G, X204N, X204S, X206D, X206E, X206H, X206L, X206N, X206Q, X206S, X209F, X209M, X209W, X209Y, X210A, X210C, X210I, X210L, X210M, X210N, X210P, X211A, X211C, X211E, X211G, X211H, X211I, X211M, X211P, X211Q, X211T, X211V, X212C, X212F, X212G, X212H, X212M, X212N, X212R, X212S, X212Y, X213A, X213D, X213E, X213N, X213Q, X213S, X213T, X215A, X215C, X215D, X215E, X215H, X215I, X215K, X215M, X215N, X215S, X215T, X215V, X215Y, X216A, X216C, X216D, X216E, X216F, X216H, X216I, X216L, X216M, X216N, X216Q, X216S, X216V, X216W, X216Y, X217A, X217C, X217D, X217E, X217F, X217K, X217L, X217M, X217Q, X218C, X218D, X218E, X218N, X218Q, X222C, X222M, X222S, X223A, X223S, X224A, X224N, X224S, X224T, X227A, X227C, X227V, X228A, X228G, X228S, X228V, X230A, X230G, X230N, X230S, X230T, X230V, X231A, X231C, X231F, X231G, X231S, X232A, X232L, X232M, X233A, X233C, X233E, X233G, X233I, X233L, X233N, X233Q, X233S, X233T, X233V, X234L, X234M, X234N, X234Q, X234S, X234T, X234V, X235C, X235F, X235G, X235H, X235I, X235K, X235L, X235M, X235N, X235Q, X235R, X235S, X235V, X235W, X235Y, X236A, X236C, X236E, X236F, X236H, X236N, X236Q, X236S, X236T, X236Y, X237A, X237C, X237F, X237G, X237H, X237I, X237K, X237L, X237M, X237Q, X237R, X237S, X237T, X237V, X237W, X237Y, X238C, X238D, X238E, X238F, X238G, X238H, X238I, X238K, X238L, X238M, X238N, X238Q, X238R, X238S, X238T, X238V, X238Y, X239C, X239D, X239F, X239G, X239H, X239K, X239L, X239M, X239N, X239P, X239Q, X239R, X239S, X239T, X239V, X239W, X239Y, X240A, X240C, X240E, X240F, X240I, X240K, X240M, X240N, X240Q, X240R, X240S, X240T, X240W, X240Y, X241A, X241C, X241D, X241E, X241F, X241G, X241H, X241I, X241K, X241L
, X241M, X241N, X241Q, X241R, X241S, X241T, X241V, X241W, X241Y, X242A, X242C, X242D, X242G, X242H, X242I, X242L, X242M, X242P, X242Q, X242S, X242T, X242V, X243C, X243D, X243E, X243F, X243G, X243H, X243I, X243L, X243M, X243N, X243P, X243Q, X243S, X243T, X243V, X243W, X244D, X244E, X244F, X244H, X244I, X244L, X244M, X244N, X244Q, X244S, X244T, X244V, X244W, X245A, X245C, X245E, X245G, X245H, X245K, X245L, X245P, X245Q, X245S, X245V, X245W, X245Y, X246A, X246C, X246I, X246L, X246M, X246T, X246V, X247A, X247C, X247F, X247G, X247H, X247K, X247L, X247M, X247N, X247R, X247S, X247T, X247V, X247W, X247Y, X248C, X248D, X248E, X248G, X248H, X248I, X248L, X248N, X248P, X248R, X248S, X248T, X248V, X248Y, X249A, X249D, X249E, X249F, X249G, X249H, X249I, X249K, X249L, X249M, X249N, X249Q, X249S, X249T, X249W, X249Y, X250C, X250I, X250L, X250M, X250V, X251A, X251D, X251E, X251F, X251G, X251K, X251L, X251M, X251Q, X251R, X251T, X251V, X251Y, X252A, X252C, X252D, X252F, X252G, X252H, X252I, X252K, X252L, X252M, X252N, X252R, X252S, X252V, X252W, X253A, X253E, X253H, X253M, X253S, X253T, X253W, X255A, X255C, X255D, X255E, X255I, X255L, X255N, X255Q, X255T, X255V, X255Y, X256A, X256C, X256D, X256E, X256G, X256H, X256I, X256K, X256L, X256M, X256N, X256P, X256S, X256V, X256W, X256Y, X258D, X258G, X259A, X259C, X259E, X259P, X259Q, X259S, X260A, X260D, X260E, X260H, X260I, X260N, X260P, X260S, X260T, X260V, X261A, X261C, X261E, X261F, X261I, X261K, X261L, X261N, X261P, X261Q, X261S, X261T, X261V, X261W, X261Y, X262A, X262C, X262D, X262F, X262H, X262I, X262L, X262M, X262Q, X262T, X262V, X262Y, X265A, X265D, X265S, X267I, X267L, X268A, X268L, X268V, X269D, X269H, X269N, X269Q, X269S, X270A, X270C, X270G, X270I, X270L, X270N, X270S, X270T, X270V, X271C, X271E, X272A, X272C, X272D, X272E, X272F, X272G, X272H, X272L, X272M, X272N, X272P, X272S, X27, 2T, X272W, X272Y, X273A, X273C, X273G, X273S, X274A, X274C, X274G, X274L, X274M, X274N, X274S, X274T, X275D, X275E, X275F, X275H, X275K, X275L, X275M, X275P, X275Q, 及び X275R。ここで、これらの位置番号は、SEQ ID NO:1に示すB. アミロリケファシエンス・スブチリシンBPN’のアミノ酸配列に対応して賦与される。いくつかの実施形態では、このスブチリシン変異体には、2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 、またはそれ以上の上記の位置が含まれる。
【００２８】
いくつかの実施形態では、この発明により単離されたスブチリシン変異体が提供され、このスブチリシン変異体はBMI分析、卵黄小見本片分析、及び／又は AAPF活性分析から選択される少なくとも1の分析において1より大きい性能指数を示し、またLAS 安定性又はTCA分析において0.8より大きい性能指数を示す。ここで、スブチリシン変異体は次に示す位置の3以上の位置に、少なくとも1の置換を有する： X001A, X001E, X001G, X001H, X001Q, X001V, X003E, X003H, X003I, X003M, X003S, X003T, X003V, X004T, X004V, X008I, X008V, X009E, X009H, X009N, X009Q, X009S, X009T, X010A, X010C, X010G, X010H, X010K, X010M, X010N, X010R, X010S, X010T, X011I, X011V, X012G, X012I, X012N, X012Q, X012S, X012T, X012V, X013A, X013G, X015A, X015D, X015F, X015G, X015I, X015L, X015M, X015P, X015Q, X015S, X015V, X015W, X016A, X016G, X016N, X016P, X016S, X016T, X016V, X017H, X017I, X017M, X017N, X018A, X018C, X018D, X018E, X018G, X018H, X018L, X018M, X018N, X018P, X018Q, X018S, X018T, X018V, X018Y, X019A, X019C, X019D, X019E, X019F, X019G, X019H, X019K, X019L, X019M, X019N, X019R, X019S, X019V, X019W, X019Y, X020A, X020C, X020D, X020F, X020G, X020I, X020K, X020L, X020M, X020P, X020Q, X020R, X020S, X020T, X020V, X020W, X020Y, X021A, X021C, X021E, X021G, X021H, X021I, X021K, X021L, X021M, X021N, X021P, X021Q, X021S, X021T, X021V, X021W, X022A, X022C, X022G, X022I, X022L, X022M, X022N, X022P, X022Q, X022T, X022V, X022W, X023A, X023G, X023S, X024A, X024C, X024D, X024F, X024G, X024H, X024L, X024M, X024N, X024P, X024Q, X024R, X024S, X024T, X024V, X024W, X025C, X025D, X025E, X025F, X025G, X025K, X025L, X025M, X025Q, X025R, X025S, X025T, X025V, X025W, X026C, X026F, X026G, X026M, X026N, X026R, X026S, X026T, X026V, X027A, X027C, X027D, X027F, X027G, X027K, X027L, X027M, X027N, X027P, X027R, X027S, X027T, X027W, X028A, X028I, X028L, X028M, X028V, X029A, X029C, X029G, X029S, X029V, X030A, X030C, X030L, X030M, X030T, X030V, X031A, X031F, X031I, X031L, X031M, X031S, X031V, X033C, X033M, X033S, X033T, X035I, X035L, X035M, X035P, X036A, X036E, X036S, X036T, X036V, X038C, X038F, X038H, X038I, X038K, X038L, X038M, X038N, X038Q, X038R, X038T, X038V, X038Y, X040A, X040D, X040E, X040I, X040L, X040P, X040V, X043A, X043C, X043D, 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X054S, X055C, X055E, X055G, X055H, X055K, X055L, X055P, X055Q, X055S, X055T, X055W, X056A, X056C, X056D, X056E, X056H, X056L, X056M, X056N, X056P, X056Q, X056S, X056T, X057C, X057E, X057F, X057G, X057H, X057I, X057L, X057M, X057N, X057P, X057Q, X057R, X057S, X057T, X057V, X057W, X057Y, X059A, X059D, X059G, X059I, X059L, X059M, X059N, X059Q, X059R, X059S, X059T, X059V, X059W, X061A, X061C, X061D, X061F, X061G, X061H, X061I, X061L, X061M, X061N, X061P, X061R, X061S, X061T, X061V, X061Y, X062C, X062E, X062F, X062H, X062I, X062K, X062L, X062M, X062N, X062Q, X062R, X062S, X062T, X062V, X068I, X068L, X068V, X069A, X069G, X069S, X069T, X072I, X072L, X072T, X072V, X073A, X073C, X073S, X076D, X076N, X078A, X078C, X078E, X078H, X078L, X078M, X078N, X078Q, X078S, X078T, X084C, X084G, X084I, X084M, X084V, X086C, X086P, X087A, X087C, X087D, X087E, X087G, X087K, X087L, X087N, X087S, X087V, X088A, X088C, X088G, X088S, X089A, X089D, X089E, X089G, X089H, X089I, X089N, X089Q, X089R, X089S, X089T, X089W, 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X241D, X241E, X241F, X241G, X241H, X241I, X241K, X241L, X241M,
X241N, X241Q, X241R, X241S, X241T, X241V, X241W, X241Y, X242A, X242C, X242D, X242G, X242H, X242I, X242L, X242M, X242P, X242Q, X242S, X242T, X242V, X243C, X243D, X243E, X243F, X243G, X243H, X243I, X243L, X243M, X243N, X243P, X243Q, X243S, X243T, X243V, X243W, X244D, X244E, X244F, X244H, X244I, X244L, X244M, X244N, X244Q, X244S, X244T, X244V, X244W, X245A, X245C, X245E, X245G, X245H, X245K, X245L, X245P, X245Q, X245S, X245V, X245W, X245Y, X246A, X246C, X246I, X246L, X246M, X246T, X246V, X247A, X247C, X247F, X247G, X247H, X247K, X247L, X247M, X247N, X247R, X247S, X247T, X247V, X247W, X247Y, X248C, X248D, X248E, X248G, X248H, X248I, X248L, X248N, X248P, X248R, X248S, X248T, X248V, X248Y, X249A, X249D, X249E, X249F, X249G, X249H, X249I, X249K, X249L, X249M, X249N, X249Q, X249S, X249T, X249W, X249Y, X250C, X250I, X250L, X250M, X250V, X251A, X251D, X251E, X251F, X251G, X251K, X251L, X251M, X251Q, X251R, X251T, X251V, X251Y, X252A, X252C, X252D, X252F, X252G, X252H, X252I, X252K, X252L, X252M, X252N, X252R, X252S, X252V, X252W, X253A, X253E, X253H, X253M, X253S, X253T, X253W, X255A, X255C, X255D, X255E, X255I, X255L, X255N, X255Q, X255T, X255V, X255Y, X256A, X256C, X256D, X256E, X256G, X256H, X256I, X256K, X256L, X256M, X256N, X256P, X256S, X256V, X256W, X256Y, X258D, X258G, X259A, X259C, X259E, X259P, X259Q, X259S, X260A, X260D, X260E, X260H, X260I, X260N, X260P, X260S, X260T, X260V, X261A, X261C, X261E, X261F, X261I, X261K, X261L, X261N, X261P, X261Q, X261S, X261T, X261V, X261W, X261Y, X262A, X262C, X262D, X262F, X262H, X262I, X262L, X262M, X262Q, X262T, X262V, X262Y, X265A, X265D, X265S, X267I, X267L, X268A, X268L, X268V, X269D, X269H, X269N, X269Q, X269S, X270A, X270C, X270G, X270I, X270L, X270N, X270S, X270T, X270V, X271C, X271E, X272A, X272C, X272D, X272E, X272F, X272G, X272H, X272L, X272M, X272N, X272P, X272S, X272T, X272W, X272Y, X273A, X273C, X273G, X273S, X274A, X274C, X274G, X274L, X274M, X274N, X274S, X274T, X275D, X275E, X275F, X275H, X275K, X275L, X275M, X275P, X275Q, 及び X275R。ここで、これらの位置番号は、SEQ ID NO:1に示すB. アミロリケファシエンス・スブチリシンBPN’のアミノ酸配列に対応して賦与される。いくつかの実施形態では、このスブチリシン変異体には、2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 箇所、またはそれ以上の上記の位置が含まれる。 
【００２９】
いくつかの実施形態では、スブチリシン変異体はさらに、18, 52, 72, 117, 119, 127, 144, 185, 209 及び213からなる群から選択される置換を有する。ここで、これらの位置番号は、SEQ ID NO:1に示すB. アミロリケファシエンス・スブチリシンBPN’のアミノ酸配列に対応して賦与される。
【００３０】
いくつかの特に好ましい実施形態では、上記の単離されたスブチリシン変異体はGG36変異体である。いくつかの好ましい実施形態では、GG36変異体はSEQ ID NO:2の変異体である。別の実施形態では、上記及び本願の単離されたスブチリシン変異体はBPN’ 変異体である。
【００３１】
又別の実施形態では、単離されたスブチリシン変異体は、次に示す群から選択される置換の組み合わせを備える：
S87N/Q109Q/G118D/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248R,
S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213R/N248D,
S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213T/N248N,
S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248N,
S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R,
S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248R,
S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213T/N248R,
S87R/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R,
S87R/Q109Q/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248R,
S87R/Q109R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248R,
S87N/Q109Q/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R,
S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213R/N248R,
S87R/Q109Q/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248R,
S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248N,
S87R/Q109Q/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R,
S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248R,
S87D/Q109D/G118D/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R,
S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213R/N248R,
S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213T/N248R,
S87R/Q109R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R,
S87R/Q109Q/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248N,
S87N/Q109R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R,
S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213E/N248N,
S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213E/N248R,
S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248N,
S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248D,
S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213T/N248R,
S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248R,
S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213T/N248N,
S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248D,
S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213R/N248N,
S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248N,
S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213T/N248D,
S87R/Q109D/G118D/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R,
S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213R/N248R,
S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213R/N248N,
S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248N,
S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213E/N248N,
S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248N,
S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248R,
S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248R,
S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213R/N248N,
S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213T/N248N,
S87R/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R,
S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R,
S87N/Q109D/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248N,
S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213T/N248D,
S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213E/N248D,
S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213R/N248D,
S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248N,
S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248D,
S87R/Q109D/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248N,
S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248R,
S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248N,
S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213T/N248R,
S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248R,
S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213R/N248D, 及び
S87N/Q109Q/G118V/S128LP129Q/S130A/S188R/T213E/N248R。
ここで、これらの位置番号は、SEQ ID NO:1に示すB. アミロリケファシエンス・スブチリシンBPN’のアミノ酸配列に対応して賦与される。
【００３２】
又別の実施形態では、単離されたスブチリシン変異体は、次に示す群から選択される置換の組み合わせを備える：
S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213T/N248D,
S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213R/N248N,
S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248D,
S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248D,
S87R/Q109D/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248R,
S87R/Q109D/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R,
S87N/Q109D/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248D, 及び
S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213E/N248D。
ここで、これらの位置番号は、SEQ ID NO:1に示すB. アミロリケファシエンス・スブチリシンBPN’のアミノ酸配列に対応して賦与される。
【００３３】
又別の実施形態では、単離されたスブチリシン変異体は、次に示す群から選択される置換の組み合わせを備える：
S87D/Q109D/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213E/N248D,
S87N/Q109D/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R,
S87D/Q109Q/G118D/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248D,
S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248D,
S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248D,
S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213T/N248D,
S87R/Q109D/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R,
S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213R/N248D, 及び
S87R/Q109D/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248R
ここで、これらの位置番号は、SEQ ID NO:1に示すB. アミロリケファシエンス・スブチリシンBPN’のアミノ酸配列に対応して賦与される。
【００３４】
又別の実施形態では、この発明により、次に示す群から選択される置換の組み合わせを備える単離されたスブチリシン変異体が提供される：
A001C/S024V/I107L, A001I/R045T/I107R/A172T, A001K/A172L, A001K/A172W, A001K/I072C/L126F, A001K/I072C/L126F/S164Q, A001K/I072C/V104I/L126F, A001K/I072C/V104I/L126F/S164Q, A001K/I072V, A001K/I072V/L126F, A001K/I072V/L126F/S164F, A001K/I072V/V104I, A001K/I072V/V104I/L126F/S164I, A001K/I072V/V104I/S164F, A001K/I072V/V104I/S164Q, A001K/I107T/A172Q, A001K/I107V/G127Q, A001K/I107V/G127Q/A172Q, A001K/I107V/G127R/A172Q, A001K/L126F, A001K/L126F/S164F, A001K/L126F/S164I, A001K/L126F/S164Q, A001K/R045F/I072C, A001K/R045F/I072C/L126F, A001K/R045F/I072C/V104I/S164F, A001K/R045F/I072V/L126F/S164I, A001K/R045F/I072V/L126F/S164Q, A001K/R045F/I072V/S164F, A001K/R045F/I072V/V104G/S164T, A001K/R045F/I107L/A172N, A001K/R045F/I107T, A001K/R045F/I107V/G127Q, A001K/R045F/L126F/S164F, A001K/R045F/L126F/S164I, A001K/R045F/S164F, A001K/R045F/V104I/L126F/S164Q, A001K/R045K/I072C/L126F/S164Q, A001K/R045K/I072V/L126F, A001K/R045K/I072V/L126F/S164F, A001K/R045K/I072V/L126F/S164Q, A001K/R045K/I072V/S164F, A001K/R045K/I072V/S164Q, A001K/R045K/I072V/V104I/L126F/S164F, A001K/R045K/I072V/V104I/L126F/S164I, A001K/R045K/I072V/V104I/L126F/S164Q, A001K/R045K/I107A/A172T, A001K/R045K/I107R/G127A/A172N, A001K/R045K/I107T/G127R, A001K/R045K/I107T/G127R/A172Q, A001K/R045K/L126F, A001K/R045K/L126F/S164I, A001K/R045K/L126F/S164P, A001K/R045K/L126F/S164Q, A001K/R045K/S164F, A001K/R045K/V104I/S164Q, A001K/R045K/V104L/S164A, A001K/R045N/I107T/G127Q, A001K/R045S/V104C/L126Y/S164F, A001K/S024H/I107T/G127Q, A001K/S024H/I107T/G127R, A001K/S024H/I107V, A001K/S024H/R045N/I107T, A001K/S024H/R045N/I107T/G127Q/A172Q, A001K/S024L/R045A, A001K/S024N/I107V/G127T, A001K/S024N/R045K/A172Y, A001K/S024R/I107T, A001K/S024R/R045N/A172C, A001K/S024R/R045N/I107T, A001K/S024R/R045N/I107T/G127R, A001K/S024T/I107T/G127Q/A172Q, A001K/S024T/R045N/G127Q/A172Q, A001K/S024W/I107T/G127R, A001K/S024W/I107V/G127T/A172Q, A001K/S164Q, A001K/V104E, A001K/V104I/L126F, A001K/V104I/L126F/S164I, A001K/V104I/L126F/S164Q, A001L/I072C, A001L/R045Q/G127H/A172R, A001L/S024D/R045Y/I107Y, A001M/R045S/I107E/A172D, A001P/A172V, A001Q/R045K/I107T, A001R/A172G, A001R/A172Q, A001R/I107T, A001R/I107T/A172Q, A001R/I107T/G127Q/A172Q, A001R/I107V/A172Q, A001R/R045F, A001R/R045K/A172Q, A001R/R045K/G127R, A001R/R045K/I107T/G127Q, A001R/R045K/I107V/G127R, A001R/R045N/A172K, A001R/R045N/A172Q, A001R/R045N/I107T, A001R/R045N/I107T/G127Q, A001R/R045N/I107V/A172V, A001R/R045N/I107V/G127Q/A172Q, A001R/R045N/I107V/G127R, A001R/S024H/I107T, A001R/S024H/R045K/I107T, A001R/S024H/R045K/I107T/A172Q, A001R/S024H/R045N/I107T/A172Q, A001R/S024N, A001R/S024R, A001R/S024R/A172H, A001R/S024R/A172Q, A001R/S024R/I107V/A172L, A001R/S024R/I107V/G127R, A001R/S024R/R045F/I107T/G127Q, A001R/S024R/R045F/I107T/G127R, A001R/S024R/R045K/I107T/G127Q, A001R/S024T/I107T/A172Q, A001R/S024T/R045K/A172Q, A001R/S024T/R045K/I107L/G127P/A172P, A001R/S024T/R045N/I107T/A172Q, A001R/S024W/I107V/A172S, A001R/S024W/R045F/I107V/G127Q, A001R/S024W/R045F/I107V/G127R, A001R/S024W/R045K, A001R/S024W/R045K/I107T/A172Q, A001R/S024W/R045N/I107T, A001S/A172V, A001S/S024L/I107Y/A172S, A001T/S024H/I107L/A172Y, A001V/I107L/A172I, G097P/N185Q/A215I, G097P/Y209W/A215V/S256W, G118L/G127R/S132L, G118T/G127Q, I107A/G127K/A172G, I107C/A172S, I107P/A172S, I107Q/A172D, L126A/S164N, L126F/S164V, M119F/N185R, M119F/N185R/Y209W/S256T, M119F/N185V/Y209W, M119F/S144T/N185V/S256I, M119F/S144W/N185R/S256L, M119F/Y209W, M119F/Y209W/S256I, N018K/A215I, N018K/A215R, N018K/A215V, N018K/G097P/A215I/S256W, N018K/G097P/N185K/S256W, N018K/G097P/N185K/Y209W/A215I/S256W, N018K/G097P/N185Q/Y209W/A215V/S256W, N018K/G097P/N185R/A215R/S256W, N018K/G097P/N185R/A215V/S256W, N018K/G097P/N185R/S256W, N018K/G097P/N185R/Y209W, N018K/G097P/N185R/Y209W/S256W, N018K/G097P/Y209W/A215V/S256W, N018K/N185K, N018K/N185K/A215V/S256W, N018K/N185K/S256W, N018K/N185K/Y209W/A215R, N018K/N185Q/A215R/S256W, N018K/N185Q/A215V/S256W, N018K/N185Q/S256W, N018K/N185Q/Y209W/S256W, N018K/N185R/A215I/S256W, N018K/N185R/A215R/S256W, N018K/N185R/A215V, N018K/N185R/Y209W/A215V/S256W, N018K/S256W, N018Q/G097P/N185K/A215V, N018Q/G097P/N185K/Y209W, N018Q/N185K, N018Q/N185K/S256W, N018Q/N185K/Y209W/A215I/S256W, N018Q/N185K/Y209W/A215V, N018Q/N185K/Y209W/A215V/S256W, N018Q/N185Q/A215V, N018Q/N185Q/S256W, N018Q/N185Q/Y209W/S256W, N018Q/N185R/A215R, N018Q/N185R/S256W, N018R/G097P/N185Q/A215I, N018R/G097P/Y209W/A215V, N018R/G097P/Y209W/S256W, N018R/N185K/A215V/S256W, N018R/N185K/S256W, N018R/N185Q/A215V/S256W, N018R/N185Q/Y209W/S256W, N018R/N185R/A215R, N018R/N185R/S256W, N018R/N185R/Y209W/S256W, N018R/Y209W/A215V/S256W, N018R/Y209W/S256W, N043E/S101E, N043E/S101E/N248K, N043E/S101F, N043E/S101N/N117Y, N043E/S101V, N043E/S101Y/N117I/N248K, N043E/S101Y/N117Y/N248K, N043F/N117I, N043F/S101E/N117I/N248K, N043F/S101R, N043I/N117Y, N043I/S101E/N248I, N043I/S101F/N117Y/N248K, N043I/S101N/N117Y/N248K, N043I/S101R/N248K, N043I/S101Y/N117I/N248I, N043I/S101Y/N117Y/N248K, N043S/N117Y/N248K, N043S/N248I, N043S/S101E, N043S/S101E/N117I/N248I, N043S/S101E/N117Y/N248K, N043S/S101E/N248K, N043S/S101F, N043S/S101F/N248K, N043S/S101N/N117I, N043S/S101R/N117I/N248K, N043S/S101V/N117I/N248I, N043S/S101Y, N043S/S101Y/N117I, N043S/S101Y/N117Y, N043S/S101Y/N248K, N043V/N117Y/N248I, N043V/N248I, N043V/N248K, N043V/S101E/N117I/N248K, N043V/S101E/N248I, N043V/S101F, N043V/S101F/N117I, N043V/S101F/N117Y, N043V/S101F/N248K, N043V/S101R/N117I/N248K, N043V/S101T/N248K, N043V/S101V/N117I, N043V/S101V/N248K, N043V/S101Y, N043V/S101Y/N117I, N043V/S101Y/N117I/N248K, N185K/A215V, N185K/Y209W/S256W, N185Q/A215R/S256W, N185Q/S256W, N185R/S256W, N185R/Y209W/A215I, N185R/Y209W/S256W, N185V/Y209W, P052I/M119F, P052I/M119F/S144T/N185R/Y209W, P052I/M119F/S144V/Y209W, P052I/M119F/S144Y/N185R, P052I/M119F/S144Y/N185R/Y209W/S256I, P052I/M119F/Y209W/S256I, P052I/N185R/Y209W/S256I, P052I/N185V/Y209W, P052I/N185V/Y209W/S256I, P052I/S144T, P052I/S144T/N185R/Y209W/S256T, P052I/S144T/N185V/Y209W/S256T, P052I/S144T/S256I, 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S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S164I, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S164Q, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/V104I, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/V104I/L126F/S164F, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/V104I/L126F/S164I, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/V104I/S164I, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/V104I/S164Q, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/Y209W, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/Y209W/A215I/S256W, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/Y209W/S256W, S099H/S103I/G118N, S099K/G118R, S099K/S103N/G118T, S099K/S103P/G118L/S132N, S099K/S103P/G127Q, S099K/S103P/S132H, S099K/S103R/G118A/S132P, S099N/S132R, S099Q/G118F/G127R, S099Q/G118T/G127Q, S099Q/S103N/G118R/S132N, S099Q/S103N/G118T, S099Q/S103N/G118T/S132H, S099Q/S103N/S132H, S099Q/S103P/G118R, S099Q/S103P/G118R/S132N, S099Q/S103P/S132H, S099Q/S132R, S099T/G118F, S099T/G118R/S132H, S099T/G118T/S132H, S099T/G118T/S132N, S099T/S103P, S099T/S103P/G118L/S132H, S101E/N117I, S101E/N117Y/N248K, S101F/N117I/N248I, S101F/N117Y/N248I, S101F/N117Y/N248K, S101F/N248K, S101R/N117I/N248K, S101R/N117Y, S101R/N248K, S101T/N117Y/N248K, S101T/N248I, S101V/N248K, S101Y/N117I/N248K, S101Y/N117Y, S101Y/N248K, S103G/G118I/G127E/S132E, S103L/S132E, S103R/S132P, S144T/N185R, S144T/N185R/Y209W/S256I, S144T/N185R/Y209W/S256T, S144T/N185V, S144V/N185R/S256I, S144V/N185R/Y209W, S144V/N185R/Y209W/S256T, S144V/S256I, S144V/Y209W, S144W/N185R/Y209W/S256T, S144W/N185V/Y209W/S256I, S144W/S256I, S144Y/Y209W/S256I, V104E/L126I/S164L。
ここで、これらの位置番号は、SEQ ID NO:1に示すB. アミロリケファシエンス・スブチリシンBPN’のアミノ酸配列に対応して賦与される。
【００３５】
又別の実施形態では、この発明により、次に示す群から選択される置換の組み合わせを備える単離されたスブチリシン変異体が提供される：
TS87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S24W/S101L/Q109K, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/S101L/Q109R/N185R/A215R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/Q109R/S164I, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101Y/Q109R/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/S101Y/Q109L/N185R/A215R, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S101K/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S24W/S101L/Q109L, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/S101Y/Q109R/N185R/A215R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101L/Q109R/S164I, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101Y/Q109R/S188D/T213E/N248R, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/I72V/S164I/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N76D, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S24W/S101Y/Q109K, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N43S/P52V/S101R/Q109R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101Y/Q109R/S164I, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101L/Q109L/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/Q109R/S164I/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N76D/S101L, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S24W/S101Y/Q109L, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N76D/S164I, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/N76D/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101Y/Q109L/S188D/N248R, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/V118R/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N76D/S101M, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/N76D/G97P/N185R/A215R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101L/S164I, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S101L/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101Y/Q109L/S188D/T213E/N248R, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/Q109L/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/S101L/N185R/A215R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101Y/S164I, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101Y/T213E/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101L/Q109L/S164I, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S101V/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/S101Y/N185R/A215R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101V/S164I, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101L/T213E/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101Y/Q109L/S164I, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S101H/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/Q109R/N185R/A215R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101H/S164I, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101L/Q109R/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/S101L/Q109L/N185R/A215R, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S101M/S188D/N248R, N76D/S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D, N76D/S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/N248K, S87N/G118V/G127S/S128L/P129Q/S130A, S87N/S101H/G118V/S128L/P129Q/S130A, S87N/S101K/G118V/S128L/P129Q/S130A, S87N/S101V/G118V/S128L/P129Q/S130A, S87N/S101Y/G118V/S128L/P129Q/S130A, S87N/S101L/G118V/S128L/P129Q/S130A, I72V/S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A//S164I。
ここで、これらの位置番号は、SEQ ID NO:1に示すB. アミロリケファシエンス・スブチリシンBPN’のアミノ酸配列に対応して賦与される。
【００３６】
又この発明により、上記及び本願に示すスブチリシン変異体をコードする単離された核酸が提供される。またこの発明により、上記及び本願に示すスブチリシン変異体をコードする核酸を備える発現ベクターが提供される。またこの発明によりさらに、上記及び本願に示すスブチリシン変異体をコードする核酸をコードする発現ベクターを有する宿主細胞が提供される。
【００３７】
又この発明により、本願のスブチリシン変異体を含有する洗浄組成物が提供される。いくつかの実施形態では、洗浄組成物には、液状、ゲル状、タブレット状、粉末状、及び／又は顆粒状の洗剤が含まれる。又別の実施形態では、洗浄組成物は衣類洗剤及び食器洗剤から選択される。いくつかの好ましい実施形態では、洗浄組成物は衣類洗剤からなる。いくつかの特に好ましい実施形態では、洗浄組成物は強力洗剤である。又別の実施形態では、洗浄組成物は手洗い用食器洗剤及び自動食器洗浄機用洗剤から選択される。別の好ましい実施形態では、本願の洗浄組成物はさらに少なくとも1の漂白剤を含有する。又別の実施形態では、本願の洗浄組成物は無リン酸洗剤であり、又別の実施形態では、本願の洗浄組成物はリン酸含有洗剤である。又別の実施形態では、本願の洗浄組成物は冷水用洗剤である。又別の実施形態では、本願の洗浄組成物は少なくとも1の追加の酵素を含有する。又別の実施形態では、本願の洗浄組成物は、ヘミセルラーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、ペルヒドロラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ペクテートリアーゼ、マンナナーゼ、ケラチナーゼ、リダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、β−グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、及びアミラーゼ、又はこれらの混合物から選択される少なくとも1の追加の酵素を含有する。
【００３８】
又この発明により、洗浄方法であって、洗浄する物品と、少なくとも1の本願に開示する洗浄組成物を含む組成物とを準備するステップと、前記物品の洗浄に有効な条件下で前記物品と前記組成物とを接触させるステップとを含む洗浄方法が提供される。いくつかの実施形態では、この洗浄方法にはさらに、物品を組成物に接触させた後、すすぎ洗いするステップが含まれる。いくつかの好ましい実施形態では、洗浄される物品には食器が含まれる。又別の実施形態では、洗浄される物品には織物が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】BPN’ (SEQ ID NO:1), GC GCI-P036 (SEQ ID NO:2), GCI-P037 (SEQ ID NO:3), 及び GCI-P038 (SEQ ID NO:4)を含む様々な参照プロテアーゼのアライメントを表す。特に断りの無い限り、置換位置はBPN’に対応して決められている。
【図２】pHPLT-GG36のマップを表す。
【図３】p2JH-GG36ciのマップを表す。
【図４】変異体プロテアーゼのエグリンc阻害分析により求めたプロテアーゼ濃度を表す。
【図５】変異体プロテアーゼの洗浄性能（BMI小見本片）を表す。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
この発明により、タンパク質工学的手法、及びこれにより調製されたセリンプロテアーゼ変異体が提供される。特に、この発明により参照セリンプロテアーゼと比較して1以上の置換を有するセリンプロテアーゼ変異体が提供される。さらに、この発明により、このようなセリンプロテアーゼ変異体を含有する組成物が提供される。いくつかの実施形態では、この発明により、少なくとも1のこのようなセリンプロテアーゼ変異体を含有する洗浄組成物が提供される。
【００４１】
実用上は、特定の用途に適したタンパク質を創生するために、タンパク質空間における最良の配列を見出すことは、必ずしも必要とされない。大部分の用途では、解決すべき課題は、多くの性質について要求される値と同じか、これを超える値を有する少なくとも1のタンパク質配列を特定することである。この課題を解決するためには、特定の性質に有用な突然変異に関する知見、及び所望の性質に対して好ましくない突然変異に関する知見が必要である。この発明により、主要な性質が改善され、他の性質の値が所望の範囲内にとどまるように変更可能なタンパク質中の位置を特定することにより、目標を達成できる手段が提供される。
【００４２】
この発明により、各部位について「部位評価ライブラリー」を構築することにより、対象とする全ての性質に関し、タンパク質中の全ての位置について評価を行える手段が提供される。好ましい実施形態では、このようなライブラリーには各位置について9から19の突然変異体が含まれ、またこのようなライブラリーは、タンパク質の組換え及びライブラリーの構築を行うための各位置の評価に用いられる。各性質は参照酵素と対比して測定され、各突然変異体に対する野生型の見掛け自由エネルギ差を計算により求める。次に、この見掛けデルタデルタG (すなわち ΔΔG)値を相加性の評価に用いる。
【００４３】
変異体を分析するための1つの理想的な方法は、対象とするプロセスにおいて変異体の自由エネルギと参照タンパク質の自由エネルギの差によるものである。あるプロセスのギブスの自由エネルギは、ある系が行なうことができる最大仕事量を表す。参照酵素に対する自由エネルギの変化 (ΔΔ G ) は次式で与えられる；
ΔΔ G  =  -RT ln  (kvariant/kreference )
ここで、kvariantは変異体酵素の速度定数、kreferenceは参照酵素の速度定数、Rは気体定数で、Tは絶対温度である。大部分の分析は真の自由エネルギを測定できるように計画されていないため、本願では次の量を用いた；
ΔΔ G app = -RT ln ( Pvariant/Preference )
ここで、Pvariantは変異体の性能値、Preferenceは同一条件下での参照酵素の性能値である。ΔΔ G app値は、データ分散及び相加性において、ΔΔ Gと同様の挙動を示すと考えられるであろう。しかし、ΔΔ Gは参照酵素との比較において変異体が行える最大の仕事量であるため、ΔΔ G app量は通常ΔΔ Gを過小評価していることになるため、2つの追加的位置の性質の相乗効果は、それらのΔΔ G app値を足し合わせた値から予想される値寄りも大きく現れる結果となる。
【００４４】
さらに、この発明によりスブチリシン変異体と、このスブチリシン変異体を含有する組成物が提供される。
【００４５】
＜定義＞
特に断りのない限り、この発明を実施する際、分子生物学、タンパク質工学、微生物学、及び組換えDNAの分野において当業者が一般に用いている公知技術が用いられる。このような技術は当業者にとって公知であり、当業者によく知られた多数の教科書及び総説に開示されている。本願に引用する特許、特許出願、記事、及び刊行物はすべて参照として本願に組み込まれる。
【００４６】
特に断りの無い限り、全ての技術用語及び科学用語は、この発明が属する技術分野における当業者が用いている通常の意味で用いる。多数の技術用語辞典が当業者に知られている。この発明を実施する際には、本願に開示した方法及び材料と同様または均等なものを用いることができるが、本願には好ましい方法及び材料を開示した。従って、下記の定義は、明細書全体を参照してより完全に定義される。また、特に断りの無い限り、原文の"a", "an,"及び"the"等の単数形には、複数形も含まれる。数値範囲には、その範囲を規定する数値も含まれる。特に断りの無い限り、核酸配列は5' から 3'方向が左から右方向になるように記載し、アミノ酸配列はアミノ基からカルボキシル基に向かう方向が左から右方向になるように記載する。この発明は本願に開示した特定の方法、手段、試薬に限定されず、当業者が用いる通常の法、手段、試薬により種々変更することができる。
【００４７】
特に断りのない限り、この発明を実施する際、公知のタンパク質精製技術、及び分子生物学、微生物学、DNA組換え技術、及びタンパク質シーケンシングが用いられる。
【００４８】
本明細書中の見出しは、発明の多様な態様または実施形態を制限するものではなく、本明細書の全体を参照することにより理解される。従って、以下に定義する語は、本明細書の全体を参照することにより、より完全に規定される。しかし、この発明を容易に理解できるようにするために、下記に種々の用語を定義する。
【００４９】
本明細書で「プロテアーゼ」、及び「タンパク質分解活性」と言うときは、ペプチド結合を有するペプチドや基質を加水分解する能力を有するタンパク質またはペプチドをいう。タンパク質分解活性を測定するための多数の周知の方法が存在する(Kalisz, "Microbial Proteinases," In: Fiechter (ed.), Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, [1988])。例えば、各プロテアーゼが市販の基質を加水分解する能力を比較分析する分析により、タンパク質分解活性を確認することが出来る。プロテアーゼ又はタンパク質分解活性の分析に有用な基質の例として、ジメチルカゼイン（Sigma社 C-9801）、ウシ・コラーゲン（Sigma社 C-9879）、ウシ・エラスチン（Sigma社 E-1625）、及びウシ・ケラチン（ICN Biomedical社 902111）が挙げられるが、これらに限定されない。これらの基質を用いた比色試験は、当該技術分野において周知である（例えばWO 99/34011 及びU.S. Pat. No. 6,376,450を参照されたい。両文献を参照として本願に組み込む）。pNA試験（例えばDel Mar et al., Anal. Biochem., 99:316-320 [1979]を参照）を、グラディエント溶離法で得られたフラクションの活性酵素濃度を測定するために用いることができる。この試験では、溶解性合成基質のスクシニル−アラニン−アラニン−プロリン−フェニルアラニン−ｐ−ニトロアニリド(suc-AAPF-pNA)の酵素による加水分解において、p-ニトロアナリンが放出される速度を測定する。加水分解反応による黄色の増加速度を分光光度計により410nmにおいて測定する。黄色の増加速度は活性酵素濃度に比例する。また280 nmで測定される吸光度により、全タンパク質濃度を測定することができる。活性酵素／全タンパク質比により酵素の純度を求めることができる。
【００５０】
本願でいう「スブチリシン」とは、MEROPS - The Peptidase Data base (Rawlings et al., MEROPS: the peptidase database, Nucl Acids Res, 34 Database issue, D270-272, 2006) に記載されたS8セリンプロテアーゼ科のいずれかのメンバーを意味する。このデータベースに記載されているように、S8ペプチド科にはセリンエンドペプチダーゼスブチリシン及びその相同体が含まれる (Biochem J, 290:205-218, 1993)。スブチリシン科としても知られるS8科はセリンプロテアーゼで2番目に大きな科であり、S8A亜科の典型例のスブチリシン (S08.001)及びS8B亜科の典型例のケキシン (S08.070) の2つの亜科に分類される。トリペプチジル-ペプチダーゼ II (TPP-II; S08.090)は第3亜科の典型例と考えられていたが 、その後、誤分類であると決定された。S8科のメンバーはAsp, His 及びSerの順の触媒トリアド(triad)を有し、この順序はS1, S9 及びS10科とは異なっている。S8A亜科では、活性部位残基はAsp-Thr/Ser-Gly モチーフ(クラン(clan)AAのアスパラギンエンドペプチダーゼ科の配列モチーフに似ている)、His-Gly-Thr-Hisモチーフ、及びGly-Thr-Ser-Met-Ala-Xaa-Proモチーフ中に生じる。S8B亜科では、活性部位残基はAsp-Asp-Glyモチーフ、及びHis-Gly-Thr-Arg 及び Gly-Thr-Ser-Ala/Val-Ala/Ser-Proモチーフ中に生じる。S8科の大部分のメンバーはエンドペプチダーゼであり、中性から中アルカリpHにおいて活性である。S8科の多くのペプチダーゼは熱安定性である。タンパク質基質としてカゼインが用いられることが多く、典型的な合成基質はsuc-AAPFである。S8科の大部分のメンバーは、疎水性基の後部を切断する傾向がある非特異的ペプチダーゼである。しかし、 ケキシン(S08.070) 及びフリン (S08.071) 等の S8B亜科のメンバーは、二塩基性アミノ酸の後部を切断する。 S8科の大部分のメンバーは、DFP及びPMSF等の一般的セリンペプチダーゼ阻害剤により阻害される。S8科の大部分のメンバーはカルシウムの結合により安定化されるため、EDTA 及びEGTAによる阻害が認められる。EDTA 及びEGTAはメタロペプチダーゼの特異的阻害剤とされることが多い。タンパク質阻害剤として、シチメンチョウオボムコイド第3ドメイン(I01.003)、ストレプトミセス(Streptomyces) スブチリシン阻害剤(I16.003)、及びエグリン C (I13.001) 及び オオムギ阻害剤 CI-1A (I13.005)等のI13科のメンバー等が挙げられ、これらの大部分はキモトリプシン(S01.001)も阻害する。スブチリシンはそれ自身阻害性であり、サッカロミセス(Saccharomyces)由来の相同のプロテイナーゼB 阻害剤は、セレビシン(S08.052)を阻害する。 現在、S8科のいくつかのメンバーの三次構造が分かっている。典型的なS8タンパク質の構造は、2層の螺旋に挟まれた7本のストランド状βシートを備えた3層からなる。スブチリシン(S08.001)は、クランSB (SB)の型構造である。構造が異なるにも関わらず、スブチリシンとキモトリプシン(S01.001)の活性部位を重なり合わせることができることから、類似性は分岐進化ではなく、収束進化の結果であることが示唆される。
【００５１】
本願で「プロテアーゼ変異体」及び「変異体プロテアーゼ」と言うときは、特に機能において参照プロテアーゼに類似しているが、そのアミノ酸配列に、野生型プロテアーゼの酸配列とは1から20箇所の位置においてアミノ配列に相違を生じる突然変異を有するプロテアーゼを意味する。いくつかの参照プロテアーゼの成熟領域のアミノ酸配列の例を、図1のアライメントに図示する。いくつかの好ましい実施形態では、この発明により「GG36 変異体」が提供され、突然変異はSEQ ID NO:2に示す成熟GG36配列中に存在する。
【００５２】
本願で言う「バシラス属」には、「バシラス」属に含まれる全ての公知の種が含まれ、バシラス・スブチリス（B.subtilis）、バシラス・リケニフォルミスス（B.licheniformis）、バシラス・レンタス（B.lentus）、バシラス・ブレビス（B.brevis）、バシラス・ステアロセレモフィリス（B.stearothermophilus）、バシラス・アルカロフィリス（B.alkalophilu）、バシラス・アミロリケファシエンス（B.amyloliquefaciens）、バシラス・クラウシ（B.clausii）、バシラス・ハロデュランス（B.halodurans）、バシラス・メガテリウム（B.megaterium）、バシラス・コアギュランス（B.coagulans）、バシラス・サーキュランス（B.circulans）、バシラス・ラウタス（B.lautus）、及びバシラス・ツリンギエンシス（B.thuringiensis）等が含まれるが、これらに限定されない。バシラス属は分類学上の再編成を受け続けている。従って、再分類された種もバシラス属に含まれるものとし、例えば今は「ゲオバシラスステアロセレモフィリス」（Geobacillus stearothermophilus）と命名されているバシラス・ステアロセレモフィリス（B.stearothermophilus）も含まれる。酸素の存在下で耐性芽胞を生成することがバシラス属を定義するときの特徴と考えられる。しかし、この特徴は最近アリシクロバシラス（Alicyclobacillus）、アンフィバシラス（Amphibacillus）、アニューリーニバシラス（Aneurinibacillu）、アノキシバシラス（Anoxy bacillus）、ブレビバシラス（Brevibacillus）、フィロバシラス（Filobacillus）、グラシリバシラス（Gracilibacillus）、ハロバシラス（Halobacillus）、ペニバシラス（Paenibacillus）、サリバシラス（Salibacillu）、サーモバシラス（Thermobacillus）、ウレーバシラス（Ureibacillus）及びヴァージバシラス（Virgibacillus）と命名されたものにも当てはまる。
【００５３】
「ポリヌクレオチド」と「核酸」は本願において同義で用いられ、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドの重合形態を意味する。これらの用語には、一本鎖、または二本鎖、または三本鎖のDNA、ゲノムDNA、cDNA、RNA、DNA-RNAハイブリッド、あるいはプリン及びピリミジン塩基を含むポリマー、または他の天然の核酸塩基、化学的または生物学的に修飾された非天然または誘導された核酸塩基を含むが、これらに限定されない。以下はポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片、エクソン、イントロン、mRNA、tRAN、rRNA、リボザイム、cDNA、組換え体ポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、単離DNA配列、単離RNA配列、核酸プローブ及びプライマー。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドには変性ヌクレオチドが含まれ、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体、ウラシル、その他の糖、及びフルオロリボース及びチオアートのような結合基、及びヌクレオチド分枝等が含まれる。別の実施形態では、ヌクレオチド配列には非ヌクレオチド成分が割り込んでいる。
【００５４】
本願では「DNA構築体」及び「形質転換DNA」を同義で用い、配列を宿主細胞または有機体内に導入するために用いるDNAを意味する。DNA構築体はPCRまたはその他の公知の技術によりin vitroで調製することができる。特に好ましい実施形態では、DNA構築体は対象とする配列（例えば入来配列）を備える。いくつかの実施形態では、この配列は制御要素（例えばプロモータ）等の別の要素に操作可能に結合されている。DNA構築体はさらに選択性マーカーを備える。DNA構築体はさらに相同ボックスに隣接するする入来配列を備える。さらに別の実施形態では、形質転換DNAは末端に付加されるその他の非相同配列を備える（例えばスタファ(stuffer)配列またはフランキング配列）。いくつかの実施形態では、入来配列の末端は、形質転換ＤＮＡが閉じた環を形成するように閉じられる。形質転換配列は、野生型、突然変異誘発、または変性のいずれかである。いくつかの実施形態では、DNA構築体は宿主細胞の染色体に相同な配列を備える。別の実施形態では、DNA構築体は非相同な配列を備える。in vitroで調製されたDNA構築体は、1) 宿主細胞の所望の標的配列中への非相同配列の挿入、及び／又は、2) 宿主細胞の染色体の突然変異誘発（すなわち、内在性配列の非相同配列による置換）、3) 標的遺伝子の切除、及び／又は4) 宿主中への複製プラスミドの導入に用いられる。
【００５５】
本願で言う「発現カセット」および「発現ベクター」は、標的細胞中での特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸エレメントを用いた組換え、または合成によって調製された核酸構築体を意味する。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアDNA、プラスミドDNA、ウイルス、または核酸フラグメントに組み込むことができる。通常、発現ベクターの発現カセット部位は、他の配列にも転写される核酸配列及びプロモータを備える。好ましい実施形態では、発現ベクターは宿主細胞中に非相同DNAフラグメントを導入し、発現させる能力を有する。多くの原核性及び真核性発現ベクターが市販されている。当業者であれば、適切な発現ベクターを選択することができる。本願では「発現カセット」と「DNA構築体」という用語は同義で用いられ、これらの用語の文法上の同義語も含まれる。当業者であれば、適切な発現ベクターを選択することができる。
【００５６】
本願で言う「ベクター」は、1つ以上の細胞タイプに核酸を導入するためにデザインされたポリヌクレオチド構築体を意味する。ベクターにはクローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、カセット等が含まれる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド構築体にはプロテアーゼ(例えば前駆体または成熟プロテアーゼ)をコードするDNA配列が含まれている。このDNA配列は、適切な宿主中でDNAを発現可能な適切なプロ配列（例えば分泌腺等）に操作可能に結合している。
【００５７】
本明細書で「プラスミド」と言うときは、クローニングベクターとして用いられる環状二本鎖（ds）DNA構築体であり、種々の原核及び真核生物内で染色体外自己複製遺伝子要素を形成し、または他の宿主細胞に組み込むことができるものを意味する。
【００５８】
本願で細胞内への核酸配列の導入に関し「導入された」というときは、細胞中への核酸配列の導入に適した任意の方法を意味する。このような核酸配列の導入の方法として、プロトプラスト融合、トランスフェクション、トランスフォーメーション、コンジュゲーション、及びトランスダクション等がある。(例えば Ferrari et al., "Genetics," in Hardwood et al, (eds.), Bacillus. Plenum Publishing Corp., pages 57-72, 1989参照)。
【００５９】
本願で「形質転換された」及び「安定的に形質転換された」というときは、そのゲノム、または少なくとも2世代にわたり維持されるエピソームプラスミドとして組み込まれた、非天然（非相同）ポリヌクレオチド配列を有する細胞を意味する。
【００６０】
この発明では、核酸が他の核酸配列と機能的に関連するように位置する場合、「操作可能に連結している」という。例えば、分泌リーダー（すなわち、シグナルぺプチド）をコードするDNAが、ポリぺプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現する場合、分泌リーダーをコードするDNAがポリぺプチドのDNAに操作可能に連結しており；プロモータまたはエンハンサーが配列転写に影響を与える場合、プロモータまたはエンハンサーはコード配列に操作可能に連結しており；またはリボソーム結合部位が翻訳を促進するように位置する場合、リボソーム結合部位はコード配列に操作可能に連結している。一般に「操作可能に結合する」とは、結合するDNA配列が隣接していることを意味し、分泌リーダーの場合、隣接かつ読取りフェーズにある。しかし、エンハンサーは隣接している必要はない。適切な制限酵素認識部位で結合することにより、結合が達成される。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを公知の方法に従って用いる。
【００６１】
本願で「遺伝子」というときは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、DNAセグメント）を意味し、コード領域の前後の領域だけでなく、個々のコードセグメント（エクソン）の間の介在配列（イントロン）を備えるポリヌクレオチドを意味する。
【００６２】
本願で「相同遺伝子」というときは、相違点は有るが、関連性を有する種に由来する一組の遺伝子を意味する。これらは互いに対応し、互いに同一であるか非常に似ている。この用語には、スペーシエーションにより分離された遺伝子（即ち、新たな種の開発）（例えば、オーソロガス遺伝子）だけでなく、遺伝子複製により分離された遺伝子（パラロガス遺伝子）も含む。
【００６３】
本願では、タンパク質が同一の配置において同一の主要2次構造を有し、同一のトポロジー的結合を有しているならば、共通の「折りたたみ構造」を有すると定義する。同一の折りたたみ構造を有する異なるタンパク質は、サイズ及び立体構造において異なる2次構造の末端エレメント及びターン領域を有する。幾つかのケースでは、これらの異なる末端領域は構造の半分を占めるであろう。同じ折りたたみ構造カテゴリに分類されるタンパク質は、共通の進化の祖先を有しているわけではない（例えば、タンパク質のパッキング構造及び連鎖トポロジーが好適になる物理的及び化学的性質に起因する構造的類似性）。
【００６４】
本願で「相同性」というときは、配列の類似性または同一性を意味し、同一であることが好ましい。この相同性は当業者にとって公知の標準的な方法で測定することができる（例えばSmith And Waterman,Adv. Appl. Math.,2:482 [1981]; Needleman And Wunsch，J. MoI. Biol．,48:443 [1970]; Pearson And Lipman,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 [1988];ウィスコンシンジェネチックソフトウェアパッケージに含まれるGAP,BESTFIT,FASTA,及びTFASTA等のプログラム(Genetics Computer Group, Madison,WI)；及びDevereux et al,Nucl. Acid Res.，12:387-395 [1984]参照）。
【００６５】
有用なアルゴリズムの１の例はPILEUP法である。PILEUP法によりプログレッシブ、あるいはペアワイズ・アライメントを用いて、関連する配列グループから複数の配列アライメントを作ることができる。また、配列アライメントに用いる集積性関係を示す系図をプロットすることもできる。PILEUP法では、Feng及びDoolittleのプログレッシブ・アライメント法を単純化して用いる(Feng and Doolittle, J. Mol. Evol., 35:351-360 [1987])。この方法は、HigginsとSharpらが開示した方法に似ている(Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-153, 1989)。有用なPILEUPパラメーターは、初期設定ギャップウエイト3.00、初期設定ギャップ長さウエイト0.10であり、加重エンドギャップを用いる。
【００６６】
他の有用なアルゴリズムの例はAltschulらのBLASTアルゴリズムである(Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410, [1990]; 及び Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 [1993])。特に有用なBLASTプログラムはWU-BLAST-2プログラムである(Altschul et al., Meth Enzymol, 266:460-480, 1996参照)。WU-BLAST-2ではいくつかのサーチパラメーターが用いられ、ほとんどは初期値に設定されている。調節可能なパラメーターを以下の値に設定する：オーバーラップスパン＝1、オーバーラップフラクション＝0.125、言語閾値（T）＝11。HSP S及びHSP S2パラメーターは動的値であり、特定配列の構成及び目的配列がサーチされる特定データベースの構成に応じてプログラム自体により設定される。しかし、これらの値を調節して感度を増加させることもできる。アミノ酸配列同一性%は、マッチする同一の残基の数を、アライメントさせた領域における「より長い」配列中の残基の合計数で割ることにより求められる。「より長い」配列は、アライメントさせた領域において実際に存在している残基を有する配列である（配列スコアを最大化するためにWU-BLAST-2により導入されたギャップは無視する）。
【００６７】
従って、「核酸配列同一性パーセント(%)」とは、開始配列（すなわち、対象とする配列）中の核酸残基と同一な、候補配列中の核酸残基のパーセンテージを意味する。好ましい方法では、初期値に設定され、オーバーラップスパン及びオーバーラップフラクションがそれぞれ1及び0.125のWU-BLAST-2のBLASTNモジュールを用いる。
【００６８】
本願でいう「組換え」とは、非相同の核酸の導入により修飾された細胞またはベクター、あるいはそのように修飾された細胞に由来する細胞を意味する。従って例えば組換え細胞は、その細胞の天然形態（非組換体）の遺伝子とは異なる遺伝子を発現するか、あるいは人工的な技術により過剰に発現するか、十分発現しないか、または全く発現しない遺伝子を発現する。「組換え」、「組換え操作」、及び「組み換えられた」核酸の生成は、2以上の核酸フラグメントの組合せであり、組合せによりキメラ遺伝子が生成する。
【００６９】
好ましい実施形態では、突然変異DNA配列は、少なくとも1のコドンにおける部位飽和変異誘発により生成される。別の好ましい実施形態では、部位変異誘発は2以上のコドンについて行われる。また別の実施形態では、突然変異DNA配列は野生型配列に対して、約50％以上、約55％以上、約60％以上、約65％以上、約70％以上、約75％以上、約80％以上、約85％以上、約90％以上、約95％以上、または約98％以上の相同性を有する。また別の実施形態では、突然変異DNAは、例えば放射線照射、ニトロソグアニジン等の既知の変異方法を用いてin vivoで生成される。その後所望のDNA配列を単離し、本願に開示する方法に用いる。
【００７０】
本願でいう「増幅」及び「遺伝子増幅」とは、特定のDNAにより、増幅遺伝子が初期ゲノムに存在した数より多いコピー数で存在するように均衡を破って複製されるプロセスをいう。いくつかの実施態様では、薬物存在下（例えば、阻害性酵素の阻害剤）での増殖による細胞の選択は、薬物存在下で増殖するために必要な遺伝子をコードする内因性遺伝子の増幅、またはこの遺伝子をコードする外因性（すなわち、入来）配列の増幅、または両方をもたらす。
【００７１】
「増幅」はテンプレート選択性を用いる核酸複製の特殊なケースである。これは非選択性テンプレート複製（すなわち、テンプレート依存性であるが特定のテンプレートに依存しない複製）と対比される。テンプレート選択性は、複製の忠実度（すなわち、適正なポリヌクレオチド配列の合成）及びヌクレオチド（リボ、またはデオキシリボ）選択性とは区別される。テンプレート選択性は「標的」選択性に関して説明されることが多い。標的配列は、それらがその他の核酸から選別するために探されるという意味において「標的」である。増幅技術はこの選別を第一に考えて設計されてきた。
【００７２】
本願で「プライマー」というときは、精製制限消化などにおいて自然に生じるオリゴヌクレオチド、または合成されたオリゴヌクレオチドを意味し、核酸鎖に相補的なプライマー伸長生成物の合成が開始される条件下に置かれた場合（すなわち、ヌクレオチド及びDNAポリメラーゼなどの誘発剤の存在下で、適した温度及びpHにおかれた場合）、合成開始点として作用することができる。プライマーは好ましくは増幅効率を最大にする1本鎖であるが、2本鎖であってもよい。2本鎖の場合、そのプライマーを伸長生成物を生成させるために用いる前に、ストランドを分離処理する。好ましくは、プライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは誘発剤の存在下で伸長生成物の合成を開始するために十分に長くなければならない。プライマーの正確な長さは、誘発温度、プライマーの供給源及び使用方法などの多くの因子に左右される。
【００７３】
本願で「プローブ」というときは、精製制限酵素消化などで自然に生じるオリゴヌクレオチド、または合成、組換えまたはPCR増幅により生成されるオリゴヌクレオチド（すなわちヌクレオチド配列）を意味し、別の目的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせることができる。プローブは1本鎖または2本鎖である。プローブは特定遺伝子配列の検出、同定及び単離に有用である。この発明で用るプローブは、例えば酵素（例えば、ELISA及び酵素ベースの組織化学的分析）、蛍光、放射性及び発光性システム等の検出システムで検出できるように、「リポーター分子」で標識される。この発明は、特定の検出システムや標識に限定されるものではない。
【００７４】
本願でポリメラーゼ連鎖反応に関して「標的」というときは、ポリメラーゼ連鎖反応に用いるプライマーが結合する核酸領域をいう。従って、「標的」はその他の核酸配列から探索されるものである。「セグメント」とは、標的配列内の核酸領域と定義される。
【００７５】
「ポリメラーゼ連鎖反応」（PCR）とは、本願に引用として組み込む米国特許4,683,195 4,683,202, 及び4,965,188に開示された方法を意味し、クローン化または精製することなくゲノムDNAの混合物中の標的配列のセグメント濃度を増加させる方法が含まれる。標的配列を増幅するためのプロセスは周知である。
【００７６】
本願で「増幅試薬」というときは、プライマー、核酸テンプレート及び増幅酵素以外の増幅に必要な試薬をいう（デオキシリボヌクレオチド3リン酸、バッファー等）。通常、増幅試薬はその他の反応成分と一緒に反応容器（試験管、マイクロウエル等）内に仕込まれる。
【００７７】
本願で「制限エンドヌクレアーゼ」及び「制限酵素」というときは、細菌性酵素をいい、いずれも2本鎖DNAを特定ヌクレオチド配列において切断し、または特定ヌクレオチド配列の近傍で切断する。
【００７８】
「制限酵素認識部位」とは、所定の制限エンドヌクレアーゼにより認識及び切断されるヌクレオチド配列を意味し、DNAフラグメントの挿入部位であることが多い。この発明の特定の実施形態において、制限酵素認識部位は選択マーカー内及びDNA構築体の5’及び3’末端内に組み込まれる。
【００７９】
「相同組み換え」とは、2つのDNA分子または一対の染色体の間のDNAフラグメントを、同一の部位または略同一の核酸配列の部位において交換することを意味する。好ましい実施形態では、染色体取込は相同組み換えである。
【００８０】
本願で「アミノ酸」というときは、ぺプチドまたはタンパク質配列またはそれらの一部をいう。「タンパク質」、「ぺプチド」及び「ポリぺプチド」という用語は同義で用いる。
【００８１】
本願で「対象タンパク質」及び「対象のタンパク質」というときは、所望及び／又は評価されるするタンパク質／ポリペプチドを意味する。いくつかの実施形態では、対象のタンパク質は細胞内に発現され、別の実施形態では対象のタンパク質は分泌されたポリペプチドである。特に好ましい実施形態では、これらの酵素にはこの発明のセリンプロテアーゼが含まれる。いくつかの実施形態では、対象のタンパク質はシグナルペプチドに融合された分泌ポリペプチド（すなわち、発現されるタンパク質のアミノ末端伸長）である。殆ど全ての分泌タンパク質が、タンパク質前駆体の標的化及び細胞幕を通過する細胞膜移動において重要な役割を果たす、アミノ末端タンパク質伸長を使用する。このタンパク質伸長は、細胞膜移動の間または直後に、シグナルペプチダーゼによりタンパク質分解されて除去される。
【００８２】
ポリヌクレオチドが、天然の状態において、又は当業者にとって公知の方法で操作されたとき、転写および／または翻訳されてRNA、ポリペプチド、又はそのフラグメントを生成する場合、RNA又はポリペプチドを「コードする」と言う。このような核酸のアンチセンスストランドも、この配列をコードすると言う。公知のように、DNAはRNAポリメラーゼにより転写されてRNAを生成する。しかし、RNAは逆転写酵素により逆転写されて、DNAを生成することもできる。従って、DNAはRNAをコードし、その逆も成立する。
【００８３】
本願で「宿主株」または「宿主細胞」というときは、この発明のDNAを備える発現ベクターに適した宿主を意味する。
【００８４】
酵素が細胞中において、対応する野生型細胞中よりも高いレベルで発現されたとき、酵素が宿主細胞中で「過剰発現された」と言う。
【００８５】
本願では「タンパク質」及び「ポリペプチド」は同義で用いる。本願では生化学の命名に関するIUPAC-IUB 共同委員会(IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature(JCBN))に従い定義されたアミノ酸を表す3文字のコードを用いる。遺伝子コードの縮重により、ポリペプチドは1以上のヌクレオチド配列でコードされ得る。
【００８６】
「プロ配列」はシグナル配列と、タンパクの分泌に必要とされる成熟タンパク質との間のアミノ酸配列である。このプロ配列が切断すると成熟活性タンパク質となる。
【００８７】
「シグナル配列」または「シグナルペプチド」とは、タンパク質の成熟または前駆型の分泌に関与する核酸配列及び／またはアミノ酸配列の任意の配列である。このシグナル配列の定義は機能的なものであり、タンパク質の分泌に関与するタンパク質遺伝子のN末端部分によりコードされるアミノ酸配列の全てを含むことを意味する。一般的ではないが、これらはタンパク質のN末タンパク質または前駆体タンパク質のN末部分に結合することがある。シグナル配列は内因性でも、外因性でもよい。シグナル配列はタンパク質（例えば、プロテアーゼ）に関係するものでもよいし、または別の分泌タンパク質をコードする遺伝子由来のものでもよい。外因性シグナル配列の一例として、バシラス・レンタス（Bacillus lentus）（ATCC21536）由来スブチリシンのシグナル配列の残部に融合したバシラス・スブチリス（BACILLUS subtilis）のスブチリシン由来のシグナル配列の最初の7つのアミノ酸残基が挙げられる。
【００８８】
「ハイブリッドシグナル配列」とは、シグナル配列であって、その配列の一部が発現される遺伝子のシグナル配列に融合した発現宿主から得られたシグナル配列を意味する。いくつかの実施形態では、合成された配列が用いられる。
【００８９】
「成熟」の語は、タンパク質またはペプチドの最終的に機能を発揮する形態を意味する。
【００９０】
タンパク質またはペプチドの「前駆体」型とは、タンパク質のアミノまたはカルボニル末端に操作可能に結合したプロ配列を有するタンパク質の成熟形態を意味する。この前駆体は、プロ配列のアミノ末端に操作可能に結合している「シグナル」配列も有する。この前駆体は翻訳後活性において含まれる付加的なポリヌクレオチド（例えば、タンパク質またはポリペプチドの成熟形態から切り離されたポリペプチド）も有する。
【００９１】
「天然酵素」は自然に見られるのと同一の修飾されていないアミノ酸配列を有する酵素を意味する。天然酵素には、自然発生酵素、特定の微生物中で自然発生的に発現される酵素、または見出される酵素が含まれる。
【００９２】
「〜由来の」または「〜より得られた」とは、問題の有機体の株から生成されたプロテアーゼ、または生成可能なプロテアーゼだけでなく、そのような株から単離されたDNA配列、及びそのようなDNA配列を含む宿主有機体により生成されたプロテアーゼも含む意味で用いる。更にこの用語は、合成DNA及び／またはcDNAによりコードされるプロテアーゼも含まれ、このプロテアーゼは問題のプロテアーゼを同定するための性質を有する。例えば、「バシラス種由来のプロテアーゼ」には、バシラス種から自然発生的に生成されたタンパク質分解活性を有する酵素が含まれる。また、バシラス源から同様にして生成されたセリンプロテアーゼであるが、遺伝子工学技術を用いてセリンプロテアーゼをコードする核酸配列を有する、形質転換された非バシラス有機体から生成されたセリンプロテアーゼも含まれる。
【００９３】
この定義の範囲内において、「誘導体」は、誘導体が野生型、天然、また参照型と同様の用途に使用可能であるという意味において、野生型、天然、または参照型において見られるタンパク質分解活性を保持している。セリンプロテアーゼの機能的な誘導体には、この発明のセリンプロテアーゼの一般的な性質を有する天然、合成、または組み換えにより生成されたポリペプチド、またはペプチドフラグメントが含まれる。
【００９４】
「機能的な誘導体」とは、セリンプロテアーゼをコードする核酸の機能的な性質を有する核酸の誘導体を意味する。この発明のセリンプロテアーゼをコードする核酸配列の機能的な誘導体には、天然、合成、または組み換えにより作られた核酸またはフラグメントが含まれ、この発明のセリンプロテアーゼ性質をコードする。この発明のセリンプロテアーゼをコードする野生型核酸には、自然発生対立遺伝子、及び公知の遺伝子コードの退縮に基づく相同体が含まれる。
【００９５】
2つの核酸配列またはポリヌクレオチド配列について「同一」というときは、以下説明する1つの配列比較または配列解析アルゴリズムを用いて測定し、最大対応となるようにアライメントしたときに、2つの配列中の残基が同じであることを意味する。
【００９６】
「最適アラインメント」とは、最も高い同一性のパーセンテージスコアを与えるアラインメントを意味する。
【００９７】
2つのアミノ酸、ポリヌクレオチド、及び／または遺伝子配列(必要に応じて)に関して「配列同一性パーセント」、「パーセントアミノ酸配列同一性」、「パーセント遺伝子配列同一性」及び／または「パーセント核酸／ポリヌクレオチド配列相同性」というときは、配列を最適にアラインメントしたときの、2つの配列において同一な残基のパーセンテージを意味する。従って80%のアミノ酸配列同一性とは、最適にアラインメントしたポリヌクレオチド配列において80%のアミノ酸が同一であることを意味する。
【００９８】
2つの核酸またはポリヌクレオチドについて「実質的に同一」であるというときは、標準的なパラメータを用いたプログラムまたはアルゴリズム（例えば、BLAST、ALIGN、CLUSTAL）で参照配列と比較したときに、少なくとも約70%の配列同一性、好ましくは少なくとも約75%の配列同一性、好ましくは少なくとも約80%の配列同一性、好ましくは少なくとも約85%の配列同一性、好ましくは少なくとも約90%の配列同一性、好ましくは少なくとも約95%の配列同一性、好ましくは少なくとも約97%の配列同一性、好ましくは少なくとも約98%の配列同一性、及び好ましくは少なくとも約99%の配列同一性を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチドを意味する。2つのポリヌクレオチドが実質的に同一であることは、第一ポリヌクレオチドが免疫学的に第二ポリペプチドに交差反応性があることで確認することができる。通常、同類アミノ酸置換とは異なるポリペプチドは、免疫学的に交差反応性がある。従って、2つのポリペプチドが同類置換によってのみ違う場合は、ポリペプチドは第二ポリペプチドに対して実質的に同一である。2つの核酸配列が実質的に同一であることを確認する他の同定法は、2つの分子がストリンジェントな条件においてハイブリダイズすることである（例えば、中程度から高度にストリンジェントな条件）。
【００９９】
この文脈において、「等価」とは、中程度から高度にストリンジェントな条件下においてSEQ ID NO:1 又はSEQ ID NO:5に示す配列を有するポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドでコードされたセリンプロテアーゼ酵素を意味する。例えば、等価であるとは、等価な成熟プロテアーゼが、SEQ ID NO:1 又はSEQ ID NO:2に示すアミノ酸配列を有する成熟BPN’ 又は GG36セリンプロテアーゼに対し、少なくとも約70%,少なくとも約75%,少なくとも約80%,少なくとも約85%,少なくとも約90%,少なくとも約91%,少なくとも約92%,少なくとも約93%,少なくとも約94%,少なくとも約95%,少なくとも約96%,少なくとも約97%,少なくとも約98%, 及び／又は少なくとも約99%の配列同一性を備えることを意味する。
【０１００】
「単離された」または「精製された」とは、本来の環境（例えば、それが天然の物であるならば自然環境）から切り離されている物質を意味する。例えば、この物質がある組成物中に、天然由来または野生型有機体との比較において低いまたは高い濃度で存在するか、または天然由来または野生型有機体から発現する場合には通常存在しない成分と組み合わされ存在する場合、「精製」されていると言う。例えば、生きている動物中に存在する天然由来ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていない。しかし自然システムにおいて共存している物質の幾つか又は全てから分離された同一のポリヌクレオチド又はポリペプチドは、単離されている。いくつかの実施形態では、このようなポリヌクレオチドはベクターの一部であり、及び／又はこのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の一部であり、このようなベクターや組成物は自然環境の一部ではない点で単離されている。好ましい実施形態では、核酸またはタンパク質は、例えば電気泳動ゲルまたはブロットにおいて１つのバンドを生じる場合、精製されていると言う。
【０１０１】
DNA配列について「単離された」というときは、本来の遺伝的環境から分離されたDNA配列を意味する。従って、単離されたDNA配列は他の入来または不要なコード配列を有しておらず、遺伝子工学によるタンパク質にの生成において有用な形態を有する。このような単離された分子は、それらの本来の環境から分離されており、cDNA及びゲノムクローンを含む。この発明の単離されたDNA分子は通常同伴する他の遺伝子を含まないが、プロモータ及びターミネーター等の天然由来5’及び3’未翻訳領域を含む。
同伴する領域の同定法は、当業者に良く知られている（例えば、Dynan and Tijan, Nature 316:774-78 [1985]参照）。「単離されたDNA配列」を、「クローンされたDNA配列」と言うこともある。
【０１０２】
タンパク質について「単離された」というときは、その本来の環境以外の環境で見られるタンパク質を意味する。好ましい実施形態では、単離されたタンパク質は実質的に他のタンパク質、特に他の相同タンパク質を含まない。単離されたタンパク質は、DSD-PAGEで測定したときの純度が約10%より高く、好ましくは約20%より高く、更に好ましくは約30%より高い。この発明の別の形態では、DSD-PAGEで測定したとき、タンパク質は高度に精製されている（すなわち純度が約40%より高く、約60%より高く、約80%より高く、約90%より高く、約95%より高く、約97%より高く、及び約99%より高い）。
【０１０３】
本願で「組合せ変異誘発」と言うときは、初期配列の変異体のライブラリーを生成する方法を意味する。これらのライブラリーにおいて、変異体は予め決められた変異体のセットから選択される1つまたは幾つかの変異を含む。更にこの方法により、変異体の予め決められたメンバーではないランダム変異体を導入する手段が提供される。いくつかの実施形態では、この方法には2000年10月26日に出願された米国特許出願番号09/699,250に記載された方法が含まれる。この文献を参照として本明細書に組み込む。別の実施形態では、組合せ変異誘発法には市販のキットが用いられる（例えば、QuikChange（商標）Multisite，Stratagene，San Diego，CA）。
【０１０４】
本願で「変異体のライブラリー」と言うときは、そのゲノムの大部分が同一であるが、1以上の遺伝子の別の相同体を含む細胞の集団を意味する。変異体のライブラリーは、例えば改善された性質を有する遺伝子またはオペロンの同定に用いることができる。
【０１０５】
本願で「開始遺伝子」と言うときは、この発明に用いる改善、または変更される対象のタンパク質をコードする対象とする遺伝子を意味する。
【０１０６】
本明細書において、「複数配列アラインメント（MSA）」はアルゴリズム（例えば、Clustal W）を用いてアライメントさせた開始遺伝子の複数の相同体の配列を意味する。
【０１０７】
「コンセンサス配列」及び「カノニカル配列」とは、比較される特定のタンパク質または対象とする配列の全ての変異体に対し、元型となるアミノ酸配列を意味する。また、「コンセンサス配列」及び「カノニカル配列」は対象とするDNA配列中に最も多く存在する配列を意味する。遺伝子の各位置において、コンセンサス配列はMSA中のその位置において最も高頻度で出現するアミノ酸である。
【０１０８】
本願で「コンセンサス変異体」と言うときは、開始遺伝子の配列とコンセンサス配列との違いを意味する。コンセンサス変異体は、開始遺伝子の配列とMSAにより得られたコンセンサス配列を比較することにより特定される。いくつかの実施形態では、コンセンサス変異体は、開始遺伝子がコンセンサス配列に類似するようにして、開始遺伝子に導入される。コンセンサス変異体には、開始遺伝子中のある位置に在るアミノ酸を、開始剤遺伝子におけるアミノ酸の頻度に対し、MSAでより高頻度に見出されるアミノ酸に変更するアミノ酸変異が含まれる。従って、コンセンサス変異体という用語には、MSAにおけるアミノ酸よりも高頻度で存在する1のアミノ酸で開始遺伝子のアミノ酸を置き換える、全ての単一のアミノ酸変異が含まれる。
【０１０９】
本願で「初期のヒット」（initial hit）と言うときは、組み合わせコンセンサス突然変異ライブラリーをスクリーニングすることにより同定される変異体を意味する。好ましい実施形態では、初期のヒットは、開始遺伝子と比べて改良された性質を有する。
【０１１０】
本願で「改良されたヒット」（improved hit）と言うときは、強化された組み合わせコンセンサス突然変異ライブラリーをスクリーニングすることにより同定される変異体を意味する。
【０１１１】
本願で「改良する突然変異」（improving mutation）及び「能力を高める突然変異」（performance-enhancing mutation）と言うときは、開始遺伝子に導入されたとき、改良された能力を生み出す突然変異を意味する。いくつかの好ましい実施形態では、これらの突然変異はこの発明の方法のスクリーニングステップにおいて同定されたヒットをシーケンシングすることにより同定される。殆どの実施形態において、ヒット中に高頻度で見出される突然変異体は、スクリーニングされていない組み合わせコンセンサス突然変異体ライブラリーとの比較において、改良する突然変異である可能性が高い。
【０１１２】
本願で「強化された組み合わせコンセンサス突然変異誘発ライブラリー（enhanced combinatorial consensus mutagenesis library）」と言うときは、CCM突然変異誘発及びスクリーニングの初期の段階におけるスクリーニング及び／又はシーケンシングの結果に基づいて設計及び構築されたCCMライブラリーを意味する。いくつかの実施形態では、強化されたCCMライブラリーは、初期段階のCCMで得られた初期ヒットの配列に基づく。又別の実施形態では、強化されたCCMは、初期段階の突然変異誘発及びスクリーニングの初期ヒットにおいて高頻度で観察される突然変異体が主となる様に設計される。いくつかの好ましい実施形態では、これは、初期のCCMライブラリーで使用される他のプライマーと比べて能力を低減する突然変異をコードするプライマーを除去し、又は能力を増大させる突然変異をコードするプライマーの濃度を増すことにより実現される。
【０１１３】
本願で「能力を低減する突然変異」（performance-reducing mutation）と言うときは、スクリーニングされていない組み合わせコンセンサス突然変異誘発ライブラリーと比べて、スクリーニングされたものから得られたヒットにおいて、組み合わせコンセンサス突然変異誘発ライブラリー中により低頻度で見られる突然変異を意味する。いくつかの好ましい実施形態では、スクリーニングプロセスにおいて「能力を低減する突然変異」を含む大量の変異体を除去し及び/又は低減させる。
【０１１４】
本願で「機能分析」と言うときは、タンパク質活性の指標を提供する分析を意味する。特に好ましい実施形態では、この用語はタンパク質がその通常の能力で機能する能力を分析する分析システムを意味する。例えば、酵素の場合、機能分析には反応を触媒する酵素の有効性を評価することが含まれる。
【０１１５】
本願で「目標特性」と言うときは、改変される開始遺伝子の特性を意味する。この発明をある特定の目標特性に限定することは意図していない。しかし、いくつかの好ましい実施形態では、、目標特性は遺伝子製品の安定性（例えば、変性、タンパク質分解又は他の分解要素に対する抵抗力）であり、別の実施形態では、生成宿主中の生成レベルを変化させる。この発明では、開始遺伝子の種々の特性を利用することを考慮する。
【０１１６】
本明細書で核酸について用いる「性質」又はこれと同義語は、選択又は検出される核酸の任意の性質又は特性を意味する。これらの性質は、ポリペプチドへの結合に影響する性質、特定の核酸を備える細胞に賦与された性質、遺伝子転写に影響する性質（例えば、プロモータ強度、プロモータ認識、プロモータ制御、エンハンサー機能）、RNAプロセッシングに影響する性質（例えば、RNAスプライシング、RNA安定性、RNAコンフォメーション、及び転写後変成）、翻訳に影響する性質（例えば、レベル、制御、mRNAのリボゾームタンパク質への結合、転写後変成）等であるが、これらに限定されない。例えば、所望の性質を創生するため、又は望ましくない性質を特定するために、核酸の転写因子、ポリメラーゼ、制御因子等の結合部位を改変する。
【０１１７】
ポリペプチド（タンパク質を含む）について用いる「性質」又はこの同義語は、選択又は検出されるポリペプチドの任意の性質又は特性を意味する。このような性質は、酸化安定性、基質特異性、触媒活性、熱安定性、アルカリ安定性、pH活性プロファイル、タンパク質分解に対する耐性、KM、KCAT、KCAT/KM比、タンパクの折り畳み構造、免疫誘導応答、リガンド結合能力、受容体結合能力、分泌能力、細胞表面上に出現する能力、オリゴマー化する能力、シグナルを発する能力、細胞増殖刺激能力、細胞増殖抑制能力、アポトーシス誘発能力、リン酸化又はグリコシル化により修飾される能力、疾病を治療する能力等であるが、これらに限定されない。
【０１１８】
本願では「スクリーニング」という用語は通常の意味で用いられ、一般に複数ステップのプロセスである。第一のステップでは突然変異核酸又はその変異ポリペプチドが準備される。第二のステップでは、突然変異核酸又はその変異ポリペプチドの性質が決定される。第三のステップでは、突然変異核酸を調製するために、前記決定された性質を、対応する前駆体核酸の性質、対応する天然由来のポリペプチドの性質、又は開始材料の性質（例えば、初期配列）と比較する。
【０１１９】
改変された性質を有する核酸又はタンパク質を得るためのスクリーニング方法は、突然変異核酸の生成を促進することを目的とした修飾の対象である、開始材料の性質によることは当業者に明らかである。したがって、当業者は、この発明はスクリーニングの対象を特定の性質に限定するものでなく以下に示す性質は単に例示に過ぎないことを理解するであろう。特定の性質をスクリーニングする方法は公知である。例えば、突然変異の前後の結合、pH，特異性等を測定した場合、変化が改変（alteration）の指標となる。好ましくは、スクリーニングは複数のサンプルが同時にスクリーニングされるような高速処理が可能な方法で実行され、例えばチップ、ファージディスプレイ、及び複数基質及び/又は測定器を用いる分析で実行されるが、これらに限定されない。
【０１２０】
本願のいくつかの実施形態では、スクリーニングは、対象とする変異体を変異体集団から濃縮する選択ステップを含む。これらの実施形態の例には、宿主有機体を成長し易くすることによる変異体の選択や、ファージ提示法、又は他の任意の提示法が含まれ、変異体がその結合又は触媒特性に基づき変異体集団から捕捉される。好ましい実施形態では、変異体のライブラリーはストレス（熱、プロテアーゼ、変性）に曝され、そして無傷の変異体はスクリーニングにより同定され、又は選択により濃縮される。この用語には、任意の好適な選択方法が含まれる。この発明は特定のスクリーニング方法に限定されるものではない。
【０１２１】
本願で「標的を定めたランダム化」と言うときは、一又は幾つかの位置がランダム化された複数の配列を生成するプロセスを意味する。いくつかの実施形態では、ランダム化は完全に行われる（すなわち、全ての4つのヌクレオチド、A,T,G及びCがランダム化された位置で生じる）。別の実施形態では、ヌクレオチドのランダム化は4つのヌクレオチドのサブセットに限定される。標的を定めたランダム化は、対象とする一又は幾つかのタンパク質をコードする配列の一又は幾つかのコドンに適用することができる。発現されたとき得られるライブラリーにより、1以上のアミノ酸の位置が、ランダム化されたコドンのランダム化スキームにより決定された全ての20のアミノ酸、又はサブセットのアミノ酸の混合物を含むタンパク質集団が生成される。いくつかの実施形態では、標的を定めたランダム化から得られる集団の個々のメンバーは、コドンの標的化挿入又はランダム挿入、又はコドンの欠失により、アミノ酸の数において異なる。さらに別の実施形態では、生成されるタンパク質集団に合成アミノ酸が含まれている。いくつかの好ましい実施形態では、標的を定めたランダム化から得られる集団の大半のメンバーは開始遺伝子よりもコンセンサス配列に対し、より大きな配列相同性を示す。いくつかの実施形態では、配列は対象とする一以上のタンパク質をコードする。別の実施形態では、タンパク質は異なる生物学的機能を有する。より好ましい実施形態では、入来配列は少なくとも一つの選択マーカーを備える。この配列は、対象とする1以上のタンパク質をコードすることができる。この配列は、異なる生物学的機能を有することができる。多くの場合、入来配列は、抗生物質に対する抵抗性等を付与する遺伝子等の、少なくとも一つの選択マーカーを備える。
【０１２２】
本願では「修飾された配列」及び「修飾された遺伝子」は同義で用いられ、天然由来核酸配列の欠失、挿入、又は中断を含む配列を意味する。いくつかの好ましい実施形態では、修飾された配列の発現生成物は短縮タンパク質（例えば、修飾が配列の欠失、又は中断である場合）である。特に好ましい実施形態では、短縮されたタンパク質は生物学的活性を保持している。別の実施形態では、修飾された配列の発現生成物は伸長されたタンパク質である（例えば、修飾が核酸配列中への挿入である場合）。いくつかの実施形態では、挿入により短縮タンパク質が生じる（例えば、挿入がストップコドンを形成する場合）。この様に、挿入による発現生成物として、短縮タンパク質又は伸張タンパク質のいずれかが生じる。
【０１２３】
本願では「突然変異配列」及び「突然変異遺伝子」は同義で用いられ、宿主細胞の野生型配列中に生じた少なくとも1のコドンの改変を有する配列を意味する。突然変異配列の発現生成物は野生型と比べて改変されたアミノ酸配列を有するタンパク質である。発現生成物は改変された機能的能力（例えば、強化された酵素活性）を有することがある。
【０１２４】
「変異プライマー」又は「変異オリゴヌクレオチド」(本願では同義で用いる)は鋳型配列の一部に対応し、かつ鋳型配列とハイブリッド化可能なオリゴヌクレオチド組成物を意味する。変異プライマーについて、変異プライマーは鋳型核酸と厳密にマッチするものでなく、用いられるプライマー中の1のミスマッチ又は複数のミスマッチが、核酸ライブラリーに所望の突然変異を導入するために用いられる。本願で言う「非変異プライマー」又は「非変異オリゴヌクレオチド」は、鋳型核酸と厳密にマッチするオリゴヌクレオチド組成を意味する。この発明のある実施形態では、変異プライマーのみが使用される。この発明の別の好ましい実施形態では、プライマーは、変異プライマーが含まれている少なくとも一つの領域において、オリゴヌクレオチド混合物に非変異プライマーも含まれる様に設計される。変異プライマーと、少なくとも1の変異プライマーに対応する非変異プライマーとの混合物を加えることにより、種々の組み合わせ突然変異パターンが生ずる核酸ライブラリーを生成することができる。例えば、変異核酸ライブラリーのメンバーの幾つかが特定の位置における前駆体配列を維持し、他のメンバーはその様な部位に変異を有することを望む場合、非変異プライマーが、ある残基の核酸ライブラリー内にある特定レベルの非変異メンバーが生じるようにすることができる。本願の方法は、その塩基の長さが通常10-50塩基、より好ましくは約15-45塩基の間の変異及び非変異オリゴヌクレオチドを用いる。しかし、所望の突然変異誘発の結果を得るためには10塩基より短い又は50塩基より長いプライマーを使用することが必要なこともある。対応する変異プライマー及び非変異プライマーについては、対応する複数のオリゴヌクレオチドは同一の長さである必要はないが、追加される変異に対応する領域に重複があることが必要である。プライマーは、本願により予め定められた比率で添加される。例えば、得られるライブラリーが同一又は異なる部位に顕著なレベルの特定の変異と、少量の別の変異とを有することを望む場合、添加するプライマーの量を調節することにより、このような偏りのあるライブラリーを生成させることができる。あるいは、より少量、又はより多量の非変異プライマーを添加することにより、変異核酸ライブラリー中において対応する変異が生成する頻度
を調節することができる。
【０１２５】
本願で「隣接変異」と言うときは、同じオリゴヌクレオチドプライマー内に現れる変異を言う。例えば、隣接変異は互いに隣接又は近接しているが、隣接変異は、得られる変異鋳型核酸中に同じプライマーによって導入される。
【０１２６】
本願で「非隣接変異」と言うときは、別々のオリゴヌクレオチドプライマーに現れる変異を意味する。例えば、非隣接変異は、得られる変異鋳型核酸中に別個に準備されたオリゴヌクレオチドプライマーによって導入される。
【０１２７】
本願では「野生型配列」又は「野生型遺伝子」は同義で用いられ、天然に存在し又は宿主細胞中で自然発生的に生じる配列を意味する。いくつかの実施形態では、野生型配列とはタンパク質組み換え計画の開始点の対象となる配列を意味する。野生型配列は相同タンパク質又は非相同タンパク質をコードする。相同タンパク質はインターベンションなしに宿主細胞が生成するタンパク質である。非相同タンパク質は、インターベンションがない場合には宿主細胞は生成しないタンパク質である。
【０１２８】
本願で「抗体」と言うときは、免疫グロブリンを意味する。抗体には、抗体を産生することが望まれるいずれかの種から直接得られる免疫グロブリンが含まれるが、これらに限定されない。加えて、この発明には修飾された抗体も含まれる。この用語はまた、完全な抗体が結合するエピトープに結合する能力を保持している抗体のフラグメントも意味し、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、抗イディオタイプ（抗-ID）抗体を含む。抗体のフラグメントには、相補性決定領域（CDR）、単一鎖フラグメント可変領域（scFv）、重鎖可変領域（VH）、軽鎖可変領域（VL）が含まれるが、これらに限定されない。ポリクローナルとモノクローナル抗体も本願発明に含まれる。好ましくは、抗体はモノクローナル抗体である。
【０１２９】
本願で「基質特異性の改変」と言うときは、酵素基質特異性の変化を意味する。いくつかの実施形態では、基質特異性の変化は、酵素の突然変異又は反応条件の変更により生じる、特定の基質に対するkcat及び／又はKmの変化と定義される。酵素の基質特異性は、酵素が異なる基質に対し示す触媒効率を比較することにより決定することができる。通常、対象とする基質に対してより大きなkcat/Km比を示す変異体酵素を生成することが好ましいため、このような決定方法は変異体酵素の効率の評価において有効である。しかしながら、この発明を特定の基質組成物又は特定の基質特異性に限定することは意図していない
【０１３０】
本願で「表面特性」と言うときは、タンパク質の表面に示される帯電や疎水性及び／又は親水性等の特性を意味する。
【０１３１】
本願で「・・・からなる群から独立して選択される」と言うときは、引用されるマーカッシュ群から選択される単位又は要素が、続いて示される例中の同一のものか、異なるものか、又は要素の任意の組み合わせとされることを意味する。
【０１３２】
R基を3つ有する分子であって、各R基はA, B 及び Cからなる群から独立して選択されるものとする。この場合、3つのR基はAAA, BBB, CCC, AAB, AAC, BBA, BBC, CCA, CCB, 又は ABCのいずれかである。
【０１３３】
本願で化学組成物について用いる「置換される」という用語は、その用語が用いられる有機組成物又は有機基が次のいずれかの場合である。
（ａ）少なくとも1の要素又は置換基を失って不飽和になること；又は
（ｂ）その化合物又は置換基中の少なくとも1の水素が（i）炭素（ii）酸素（iii）硫黄（iv）窒素又は（v）ハロゲン原子の1以上を含む基で置換されること；又は
（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の両者。
上記（ｂ）に記載した水素を置換する置換基であって、炭素と水素原子のみを含む置換基は炭化水素置換基であり、例えばアルキル、アルケニル、アルキニル、アルキルジエニル、シクロアルキル、フェニル、アルキルフェニル、ナフチル、アントリル、フェナントリル、フルオリル、ステロイド基、及びこれらの基の相互の組み合わせ及びアルキレン、アルキリデン、アルキリジン基のような多価の炭化水素基との組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。上記（ｂ）に記載した水素を置換する置換基であって、酸素原子を含む置換基にはヒドロキシル、アシル、又はケト、エーテル、エポキシ、カルボキシル、及びエステル基が含まれるが、これらに限定されない。上記（ｂ）に記載した水素を置換する置換基であって、硫黄原子を含む置換基には硫黄含有酸及び酸エステル基、チオエーテル基、メルカプト基及びチオケト基が含まれるが、これらに限定されない。上記（ｂ）に記載した水素を置換する置換基であって、窒素原子を含む置換基には、アミノ基、ニトロ基、アゾ基、アンモニウム基、アミド基、アジド基、イソシアネート基、シアノ基、及びニトリル基が含まれるが、これらに限定されない。上記（ｂ）に記載した水素を置換する置換基であって、ハロゲン原子を含む置換基には塩素、臭素、フッ素、ヨウ素基、及びペンダントアルキル基又は水素がハロ基によって置換され、安定した置換部位を形成し得るいずれかの置換基が含まれる。
【０１３４】
上記の(b)(i)から(b)(v)のいずれかの置換基は一価の置換、又は多価置換で水素を失うことによって互いに置換しあうことができ、有機化合物又はラジカル中の水素を置換できる別の一価の置換基を形成することができる。
【０１３５】
「酸化に対し安定」とは、この発明のプロテアーゼであって、タンパク質分解、加水分解、洗浄、又はこの発明の他のプロセスの条件下、例えば、漂白剤又は酸化剤に曝され又は接触している条件下において、一定の時間に亘り特定量の酵素活性を維持するプロテアーゼを意味する。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、漂白剤又は酸化剤と一定の時間、例えば少なくとも約1分、約3分、約5分、約8分、約12分、約16分、約20分間接触した後に、タンパク質分解活性を少なくとも約50%, 約60%, 約70%, 約75%, 約80%, 約85%, 約90%, 約92%, 約95%, 約96%, 約97%, 約98%,又は約99%を保持している。いくつかの実施形態では、安定性は実施例に示した方法で測定される。
【０１３６】
「キレート剤に対し安定」とは、この発明のプロテアーゼであって、タンパク質分解、加水分解、洗浄、又はこの発明の他のプロセスの条件下、例えばキレート剤に曝され又は接触している条件下において、一定の時間に亘り特定量の酵素活性を維持するプロテアーゼを意味する。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、キレート剤と一定の時間、例えば少なくとも約10分、約20分、約40分、約60分、約100分間接触した後に、タンパク質分解活性を少なくとも約50%, 約60%, 約70%, 約75%, 約80%, 約85%, 約90%, 約92%, 約95%, 約96%, 約97%, 約98%,又は約99%保持している。いくつかの実施形態では、キレート剤に対する安定性は、実施例に示した方法で測定される。
【０１３７】
「熱に対し安定」及び「熱安定的」とは、この発明のプロテアーゼであって、タンパク質分解、加水分解、洗浄、又はこの発明の他のプロセスの条件下、例えば変更された温度に曝される条件下において、プロテアーゼがある一定の時間に亘り特定の温度に曝された後に特定量の酵素活性を維持するプロテアーゼを意味する。変更された温度には、高温、又は低温が含まれる。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは変更された温度に一定の時間、例えば、少なくとも60分、120分、180分、240分、300分間曝された後に、タンパク質分解活性を少なくとも約50%, 約60%, 約70%, 約75%, 約80%, 約85%, 約90%, 約92%, 約95%, 約96%, 約97%, 約98%,又は約99%保持している。いくつかの実施形態では、熱安定性は、実施例に示した方法で測定される。
【０１３８】
酸化、キレート剤、熱及び/又はpH安定プロテアーゼについて「安定性が強化された」と言うときは、他のセリンプロテアーゼ（例えば、スブチリシン プロテアーゼ）及び/又は野生型酵素に比べて、時間が経過しても高いタンパク質分解活性を維持できることを意味する。
【０１３９】
酸化、キレート剤、熱及び/又はpH安定プロテアーゼについて「安定性が低下した」と言うときは、他のセリンプロテアーゼ（例えば、スブチリシン プロテアーゼ）及び/又は野生型酵素に比べて、時間の経過によりタンパク質分解活性がより大きく低下することを意味する
【０１４０】
「洗浄活性」とは、タンパク質分解、加水分解、洗浄又はこの発明の他のプロセスの条件下でプロテアーゼにより達成される洗浄能力を意味する。いくつかの実施形態では、洗浄能力は、汚れを標準の洗濯条件で処理した後に、種々のクロマトグラフィー、分光光度計又は他の数量測定法によって測定される、草、血液、ミルク、又は卵のタンパク質等の、酵素で分解される汚れに関する種々の洗浄分析により決定される。代表的な分析には、実施例に記載の方法及びWO 99/34011及び米国特許第6,605,458号（両文献を参照として本明細書に組み込む）に記載のものを含むがこれに限定されるものではない。
【０１４１】
プロテアーゼの「洗浄に効果的な量」とは上記で述べたプロテアーゼの量を意味し、特定の洗浄組成物において所望のレベルの酵素活性を達成できる量である。このような効果的な量は当業者により容易に確認され、また多くの要因、例えば、使用される特定のプロテアーゼ、洗浄方法、洗浄組成物中の特定の組成物、液体又は乾燥（例えば、粒状、棒状）組成物が必要か等に基づく。
【０１４２】
本願で「洗浄添加材料」と言うときは、特定のタイプの所望の洗浄組成物及び製品の形態（例えば、液体、粒状、粉末、棒状、ペースト、霧状、錠剤、ゲル、又は泡組成物）のために選択される任意の液体状、固体状又は気体状材料であって、その材料はまた好ましくは組成物中で用いられるプロテアーゼ酵素と適合性のあるものを意味する。いくつかの実施形態では、粒状組成物は「コンパクト」な形態のものであり、別の実施形態では液体組成物は「濃縮された」形態である。
【０１４３】
洗浄活性について「強化された性能」及び「改良された洗濯性能」と言うときは、標準の洗濯サイクル及び/又は複数の洗濯サイクルの後に通常の評価により決定される、ある酵素により分解される汚れ、例えば、卵、ミルク、草、血液の汚れに対して向上し又は増大した洗浄活性を意味する。
【０１４４】
洗浄活性について「低減した能力」と言うときは、標準の洗濯サイクルの後に通常の評価により決定される、ある酵素により分解される汚れ、例えば、卵、ミルク、草、血液の汚れに対して低減し又は低下した洗浄活性を意味する。
【０１４５】
洗浄活性について「相対的能力」と言うときは、参照プロテアーゼ（例えば、市販のプロテアーゼ）との比較において少なくとも60%, 少なくとも70%, 少なくとも80% 少なくとも90% 少なくとも95%の洗浄活性を意味する。参照プロテアーゼの例として、OPTIMASETM プロテアーゼ (Genencor社), PURAFECTTM protease products (Genencor社), SAVINASETM protease (Novozymes社), BPN’-variants (例えばU.S. Pat. No. Re 34,606参照), RELASETM, DURAZYMETM, EVERLASETM, KANNASETM プロテアーゼ (Novozymes社), MAXACALTM, MAXAPEMTM, PROPERASETM プロテアーゼ (Genencor社; U.S. Pat. No. Re 34,606, 及びU.S. Pat. Nos. 5,700,676; 5,955,340; 6,312,936; 及び 6,482,628参照), 及び B. レンタス変異体プロテアーゼの製品 (例えばWO 92/21760, WO 95/23221 及び／又は WO 97/07770に開示されている) が挙げられるが、これらに限定されない。洗浄性能は、この発明のプロテアーゼと、スブチリシンプロテアーゼとを、標準の洗濯サイクル条件を経た後に、通常の分光光度計又は他の分析測定法によって評価される、血液、ミルク、及び/又はインク等の酵素により分解される汚れについて種々の洗浄分析によって比較することにより決定することができる。
【０１４６】
本願で「洗剤組成物」及び「洗剤処方」というときは、織物、皿、コンタクトレンズ、他の固形物品、毛髪（シャンプー）、皮膚（石鹸及びクリーム）、歯（口腔洗浄、歯磨き粉）等の洗浄されるものから好ましくない化合物の除去に有用な組成物を意味する。「洗剤組成物」には、組成物中に用いられるプロテアーゼ及び他の酵素と適合性があることを条件に、所望の洗浄組成物の特定のタイプ、及びその製品の形態（例えば液体、ゲル、顆粒、又はスプレー組成物）に適合するように選択される任意の材料／化合物が含まれる。洗剤組成物の材料の選択は、洗浄される表面、物品、又は織物、及び使用時の洗浄条件に適合した洗剤組成物の好ましい形態を考慮することにより、容易に行うことができる。
【０１４７】
さらに、「洗剤組成物」及び「洗剤処方」という用語は、任意の物体及び／又は表面の洗浄、漂白、殺菌、及び／又は滅菌に適した任意の組成物を意味する。「洗剤組成物」及び「洗剤処方」という用語には洗剤組成物（例えば液体及び/又は固体洗濯洗剤、及び繊細な布地用の洗剤；硬質表面用の洗剤処方、例えばガラス、木材、陶器及び金属性のカウンターの天板及び窓、カーペット洗浄剤、オーブン洗浄剤、布地消臭剤、布地柔軟剤、及び布地と織物プレ−スポッター、及び食器洗剤）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４８】
本願で用いる「洗浄組成物」と用語には、特に断りのない限り、顆粒状または粉末状の汎用または強力洗濯剤、特に洗浄洗剤；液体、ゲル、またはペースト状の汎用洗濯用剤、特にいわゆる強力洗剤(HDL)；液状の繊細な布地用洗剤；手洗い用又は簡易洗浄用の食器洗剤、特に高泡立ちタイプの食器洗剤；家庭用及び業務用の種々の錠剤、顆粒、液体及びすすぎ補助タイプを含む自動食器洗浄機用洗剤；抗菌性手洗いタイプ、固形石鹸、うがい薬、入れ歯洗浄剤、車用シャンプー、カーペット用シャンプー、フロ洗浄剤を含む液体洗浄剤及び殺菌剤；ヒトまたは他の動物用ヘアシャンプー、及び／又はヘアリンス；シャワーゲル及び泡バス及び金属洗浄を含み、さらに漂白用添加剤及びステイン・スティック（stain stick）または前処理タイプ等の洗浄補助剤が含まれる。
【０１４９】
本願で言う「織物洗剤組成物」には、洗濯用添加組成物のほか、汚れた布地（例えば衣服、リネン及び他の繊維材料）の浸漬及び/又は前処理に適した組成物を含有する、手洗い及び機械洗い用洗濯洗剤組成物が含まれる。
【０１５０】
本願で言う「非布地洗浄剤組成物」には、織物（つまり布）ではない表面の洗浄剤組成物が含まれ、食器洗浄組成物、口腔洗浄組成物、義歯洗浄組成物及びパーソナルクレンジング組成物が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５１】
本願で「洗剤組成物」及び「洗剤処方」というときは、汚れた物のクリーニングのための洗浄手段としての使用を目的とした混合物を意味する。好ましい実施形態では、洗剤組成物という用語は、食器、刃物等の洗浄に使用する洗剤を意味する(例えば「食器洗剤」又は「食器洗い用洗剤」)。この発明をいずれかの特定の洗剤処方又は組成物に限定することは意図していない。実際、洗剤組成物という用語は、この発明のプロテアーゼを含有するほか、界面活性剤、トランスフェラーゼ、加水分解酵素、酸化還元酵素、ビルダー、漂白剤、漂白活性剤、青味剤と蛍光剤、凝固阻害剤、マスキング剤、酵素活性化剤、抗酸化剤及び可溶化剤を含有する洗剤を含む意味で用いられる。
【０１５２】
本願で「食器用洗浄組成物」というときは、刃物類を含む食器を洗浄するための、あらゆる形態の組成物を意味し、顆粒状、液状の組成物が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、食器洗浄組成物は、自動織機洗浄機での使用に適した「自動織機洗浄」用の組成物である。この発明をいずれかの特定のタイプの食器洗剤に限定することは意図していない。この発明は、非限定的例示としてセラミック, プラスチック, 金属, 陶器, ガラス, アクリル等が挙げられる任意の材質の食器（例えば皿, カップ, グラス, ボール等を含む食器類であるが、これらに限定されない）及び刃物（例えばスプーン, ナイフ, フォーク, 給仕用具を含む用具であるが、これらに限定されない）の洗浄に有用である。本願では「食器」という用語は食器及び刃物の双方を含む意味で用いる。
【０１５３】
本願で「漂白」というときは、材料を鮮やかにする（すなわち、白くする）及び／又は材料を洗浄するために、適切なpHと温度において、任意の表面又は材料（例えば、織物、洗濯物、パルプ等）を充分な時間処理をすることを意味する。漂白に適した薬品の例としてClO2、H2O2、過酸、NO2等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５４】
本願で変異体プロテアーゼの「洗浄性能」と言うときは、変異体プロテアーゼを添加していない洗剤との比較において、変異体プロテアーゼによる追加的洗浄能力への貢献度を意味する。洗浄性能は、共通の洗浄条件下で比較する。
【０１５５】
本願で「共通の洗浄条件」というときは、特に洗浄温度、時間、洗浄機器、泡濃度、洗剤のタイプ、及び水の硬度等の、食器洗剤の市場において家庭で実際に用いられている条件を意味する。
【０１５６】
本願で「改善された洗浄性能」と言うときは、共通の洗浄条件下で、汚れの除去についてより良い結果が得られること、あるいは、より少ない変異体プロテアーゼ、又は少ない重量で、対応する野生型プロテアーゼまたは親プロテアーゼと同じ結果が得られることを意味する。
【０１５７】
本願で「殺菌」と言うときは、表面から汚染物質を除去することだけでなく、物品表面の微生物を抑制又は殺菌することも意味する。この発明を、汚れを除去する特定の表面、物品、又は汚染物質または微生物に限定することは意図していない。
【０１５８】
本願の洗浄組成物の「コンパクト」な形態は、その密度、及び組成については無機充填塩の量に最も反映される。無機充填塩は粉末形態の洗剤組成物に従来用いられる成分である。従来の洗剤組成物では、充填塩は主要な分量で存在し、典型的には全組成物の重量の17-35%存在する。対照的に、コンパクトな組成物では、充填塩は全組成物の15%を超えない量で存在する。いくつかの実施形態では、充填塩は組成物の重量の約10%を超えない量で存在し、より好ましくは約5%を超えない量で存在する。いくつかの実施形態では、無機充填塩はアルカリ及びアルカリ土類金属の硫酸塩及び塩化物から選択される。好ましい充填塩は硫酸ナトリウムである。
【０１５９】
＜洗剤組成物＞
特に断りのない限り、本明細書に記載の成分または組成物のレベルはすべて、その成分または組成物の活性レベルに関するものであり、不純物、例えば、市販の商品に存在する残留溶媒または副生物を除いたものである。酵素成分の重量は全活性タンパク質に基づく。全てのパーセント及び比率は、特に断りのない限り重量に基づき計算される。全てのパーセント及び比率は、特に示さない限り全組成物に基づき計算される。例示した洗剤組成物においては、酵素レベルは全組成物の重量に対する純粋な酵素により表わし、特に断りのない限り、洗剤成分の量は全組成物の重量により表わす。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、この発明の洗浄組成物には洗浄補助剤が含まれている。洗浄補助剤の例として、界面活性剤、ビルダー、漂白剤、漂白活性化剤、漂白触媒、他の酵素、酵素安定化系、キレート化剤、光学的光沢剤、汚染除去ポリマー、染料移動剤、分散剤、泡抑制剤、染料、香料、染色剤、充填剤塩、向水性物質（hydrotrope）、光活性化剤、蛍光剤、織物調整剤、加水分解性界面活性剤、防腐剤、抗酸化剤、抗収縮剤、抗しわ剤、殺菌剤、抗かび剤、色汚れ剤（color speckles）、銀製品手入れ剤（silvercare）、変色防止剤及び／又は抗腐食剤、アルカリ源、可溶化剤、担体、加工助剤、色素、およびpH調整剤（例えばU.S. Pat. No. 6,610,642, 6,605,458, 5,705,464, 5,710,115, 5,698,504, 5,695,679, 5,686,014 及び5,646,101参照。これらを参照として本願に取り込む）が挙げられる。具体的な洗浄組成物物質の態様例の詳細は後述する。洗剤組成物中の洗浄補助剤とこの発明のプロテアーゼ変異体との適合性がない実施形態では、この2つの成分の組み合わせた物が使用されるまで、洗浄補助剤とプロテアーゼとを分離した（すなわち、互いに接しない）状態に保つ適切な方法を適用する。このような分離方法には、公知の適切な方法（例えばゲルキャップ、カプセル化、錠剤化、物理的分離等）が含まれる。
【０１６１】
この発明の洗浄組成物は、例えば洗濯用途、硬質表面の洗浄用途、食器洗浄用途、及び義歯、歯、毛髪、及び肌等の化粧用途に有用である。また、この発明の酵素は低温溶液での効率が向上していることを特徴とするので、洗濯用途に最適である。さらに、この発明の酵素は顆粒状及び液状組成物において有用である。
【０１６２】
また、この発明の酵素は洗浄用添加剤としても有用である。いくつかの実施形態では、低温溶液での洗浄用途に用いられる。いくつかの実施形態では、この発明により、少なくとも１のこの発明の酵素を含有する洗浄用添加剤が提供され、この洗浄用添加剤は、さらに漂白効果を得たいときに洗浄プロセスへ添加するために適している。この様な場合の例は低温溶液での洗浄であるが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、洗浄用添加剤は1以上のプロテアーゼの最も簡易な形態である。いくつかの実施形態では、洗浄用添加剤は洗浄プロセスへ添加するために調剤された形態にされている。いくつかの実施形態では、洗浄用添加剤は洗浄プロセスへ添加するために調剤された形態にされており、ここで過酸化物源が用いられ、向上した漂白効果が要求される。この発明では任意の適切な単一の調剤形態を用いることができ、例として丸薬、錠剤、ゲルキャップ、または予め計量された粉末及び／又は液体等の調剤形態が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、洗浄組成物の容量を増すために充填剤および／または担体材料を添加する。好適な充填剤または担体材料として、タルク、クレイ等のみならず種々の硫酸塩、炭酸塩及びケイ酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。液状組成物に適した充填剤及び／又は担体材料として、水、又はポリオール及びジオールを含む低分子量第一級及び/又は第二級アルコールが含まれるが、これらに限定されない。このようなアルコールの例として、メタノール、エタノール、プロパノール及びイソプロパノールが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、洗浄組成物にはこの様な材料が約5%から約90%含まれる。組成物のpHを低下させるために酸性充填剤が使用される。あるいは、いくつかの実施形態では、洗浄用添加剤には以下に詳しく述べる洗浄補助剤が含まれる。
【０１６３】
この発明の洗浄組成物及び洗浄添加剤は、効果的な量の少なくとも1の本願プロテアーゼ変異体を必要とし、単独の本願プロテアーゼ変異体、又は他のプロテアーゼ及び／又は追加の酵素と組み合わせた本願プロテアーゼ変異体を必要とする。酵素の必要レベルは、1以上の本願プロテアーゼ変異体の添加により達成される。典型的には、本願の洗浄組成物には、少なくとも1の本願プロテアーゼ変異体が、少なくとも約0.0001 重量%, 約0.0001 から約10, 約0.001 から約1, または約0.01から約0.1重量%含まれる。
【０１６４】
この発明の洗浄組成物は、水を用いて洗浄するとき、洗浄水のpHが約5.0から約11.5になるように処方され、あるいは洗浄水のpHが約7.5 から約10.5となるように処方される。液状洗剤製品処方では、原液のpHが約 3.0から約9.0になり、あるいは原液のpHが約3から約5になるように処方される。顆粒状の洗剤用製品は、pHが約9から約11になるように処方される。pHを推奨される使用レベルに制御する方法には、緩衝液、アルカリ、酸等を用いることが含まれ、これらの方法は当業者に周知である。
【０１６５】
好適な低pH洗浄組成物は通常約3から約5の原液pHを有し、通常はそのようなpH環境で加水分解してしまう表面活性剤を含有していない。このような界面活性剤として、1以上のエチレンオキシド部位またはさらに約1から約16モルのエチレンオキシドを含むアルキル硫酸ナトリウム表面活性剤が挙げられる。
このような洗浄組成物には通常、原液pHが約3から約5となるように、水酸化ナトリウム、モノエタノールアミンまたは塩酸のような十分な量のpH調整剤が含有されている。この洗浄組成物には通常、1以上の酸性下で安定な酵素が含有されている。いくつかの実施形態では組成物は液体であり、別の実施形態では固体である。液体組成物のpHは原液pHとして測定する。固体組成物のpHは、溶媒に蒸留水を用いて組成物の10%固体溶液として測定する。これらの実施形態では、特に断りのない限り、全てのpH測定は20℃で行う。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、プロテアーゼ変異体が顆粒状組成物または液状組成物として使用される場合、保存中に顆粒組成物の他の成分から酵素を保護するために、プロテアーゼ変異体をカプセルに収めた粒子の形態とすることが好ましい。さらに、カプセルに収めることは、洗浄するときにプロテアーゼ変異体の利用可能性を制御する手段となる。いくつかの実施形態では、カプセルに収めることによりプロテアーゼ変異体及び／又は追加の酵素の活性が強化される。このため、この発明のプロテアーゼ変異体は、適切な公知のカプセル化材料によりカプセルに収められる。いくつかの実施形態では、カプセル化材料により、この発明のプロテアーゼ変異体の触媒の少なくとも一部がカプセルに収められる。通常、カプセル化材料は水溶性及び/又は水中に分散性である。いくつかの実施形態では、カプセル化材料は0℃以上のガラス転移温度（Tg）を有するガラス転移温度についての詳細はWO 97/11151に記載されている。通常、カプセル化材料は炭水化物、天然または合成ゴム糊、キチン、キトサン、セルロース及びセルロース誘導体、ケイ酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、パラフィンワックス及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。カプセル化材料が炭水化物である場合、通常、炭水化物は単糖類、オリゴ糖、多糖類及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの典型的実施形態では、カプセル化材料は澱粉である（例えばEP 0 922 499; US 4,977,252; US 5,354,559, 及びUS 5,935,826を参照）。いくつかの実施形態では、カプセル化材料はプラスチックからなるミクロスフェアであり、プラスチックの例として、熱可塑性物質、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリロニトリル、及びこれらの混合物が挙げられる。市販の有用なミクロスフェアの例として、EXPANCEL（登録商標）(Stockviksverken社, Sweden), PM 6545, PM 6550, PM 7220, PM 7228, EXTENDOSPHERES（登録商標）, LUXSIL（登録商標）,Q-CEL（登録商標）及び SPHERICEL（登録商標）(PQ Corp.社, Valley Forge, PA)が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６７】
明細書に記載するように、この発明のプロテアーゼ変異体は非限定的例示として洗濯および食器洗剤が挙げられる洗浄産業において有用である。これらの用途では、酵素は様々な環境ストレスに曝される。この発明のプロテアーゼ変異体は様々な環境下で安定であるため、現在用いられる多くの酵素よりも優れている。
【０１６８】
実際、洗濯において、洗濯に用いられる酵素が曝される条件は様々であり、様々な洗剤処方、洗濯水量、洗濯水温、および洗濯時間の長さ等が挙げられる。さらに、異なる地域で用いられる洗剤製剤は、洗濯水中に存在する関連成分の濃度が異なる。例えば、ヨーロッパの洗剤は通常洗濯水中に約4500〜5000ppmの洗剤成分を含有するが、日本の洗剤は通常洗濯水中に約667ppmの洗剤成分を含有する。北アメリカ、特に米国では、洗剤は通常洗濯水中に約975ppmの洗剤成分を含有する。
【０１６９】
低洗剤濃度系の場合、約800ppm以下の洗剤成分が洗浄水中に存在する。日本の洗剤は、洗浄水中に通常約667ppmの洗剤成分が存在するので、低洗剤濃度系と考えられる。
【０１７０】
中洗剤濃度の場合、洗浄水中に約800ppmから約2000ppmの洗剤成分が存在する。北米の洗剤は、洗浄水中に通常約975ppmの洗剤成分が存在するので、中洗剤濃度系と考えられる。ブラジルでは通常約1500ppmの洗剤成分が洗浄水中に存在する。
【０１７１】
高洗剤濃度系の場合、約2000ppmの洗剤成分が洗浄水中に存在する。ヨーロッパの洗剤は通常、約4500〜5000ppmの洗剤成分を洗浄水中に含むので、高洗剤濃度系と考えられる。
【０１７２】
ラテンアメリカの洗剤は一般的に高リン酸泡ビルダー洗剤であり、ラテンアメリカで用いられる洗剤の範囲は、洗濯水中の洗剤成分が1500ppmから6000ppmであるため、中および高洗剤濃度の両方に該当し得る。上記のように、ブラジルでは典型的に約1500ppmの洗剤成分を洗濯水中に有する。しかしながら、他のラテンアメリカ諸国だけでなく、他の高リン酸泡ビルダー洗剤が用いられる地域では、洗濯水中に最大約6000ppmの洗剤成分が存在する、高洗剤濃度系を用いることができる。
【０１７３】
前述の観点から、世界中の典型的な洗濯溶液中の洗剤成分の濃度は、約800ppm未満の洗剤組成物（低洗剤濃度地域）、例えば日本の約667ppmから、約800ppmから約2000ppmの間（中洗剤濃度地域）、例えば米国の約975ppmおよびブラジルの約1500ppm、約2000ppmを超える（高洗剤濃度地域）、例えばヨーロッパの約4500から約5000ppm、及び高リン酸泡ビルダー洗剤地域の約6000ppmまで変化する。
【０１７４】
典型的な洗濯溶液の濃度は経験的に決められる。例えば米国では、典型的な洗濯機の洗濯溶液の容積は約64.4Lである。従って、洗濯溶液内の洗剤の濃度を約975ppmにするためには、64.4Lの洗濯溶液に約62.79gの洗剤組成物を加えなければならない。この量は、洗剤とともに供給される計量カップを用いて消費者により洗濯水中に量り取られる典型的な量である。
【０１７５】
更なる具体例として、異なる地域では異なる洗濯温度が用いられる。日本の洗濯水の温度は典型的にヨーロッパで用いられる温度よりも低い。例えば、北アメリカおよび日本の洗濯水の温度は約10から30℃の間であり、一方ヨーロッパの洗濯水の温度は通常30から60℃（例えば、約40℃）である。しかし、省エネルギーの観点から、多くの消費者が低温水の使用へ切り替えつつある。また別の地域では、低温水は洗濯だけでなく、食器洗いにも用いられている。いくつかの実施形態では、この発明の「低温水洗浄」で用いられるおんどは  約10℃から約40℃、又は約20℃から約30℃、又は約15℃から約25℃、又は別の組合せでは約15℃から約35℃であり、全て10℃から40℃の範囲内である。
【０１７６】
別の例として、異なる地域では通常水の硬度が異なる。水の硬度は通常、グレイン／ガロン混合 Ca2+/Mg2+で表される。水の硬度は水の中のカルシウム（Ca2+）およびマグネシウム（Mg2+Mg2+）の量の測定値である。米国のほとんどの水は硬質であるが、硬度は一定ではない。中度に硬質（60-120ppm）から硬質（121-181ppm）の水は、60から181ppm（parts per million）（ppmからグレイン／米国ガロンへの変換については、ppm数を17.1で割った値がグレイン／ガロンに等しい）の硬度のミネラルを含有する。
【表１】
0005911825.tif 000002
【０１７７】
ヨーロッパの水の硬度は通常約10.5（例えば、約10.5から約20.0）グレイン／ガロン混合Ca2+/Mg2+(例えば約15 グレイン／ガロン混合Ca2+/Mg2+ ).より大きい。北アメリカの水の硬度は通常日本の水の硬度よりも高いが、ヨーロッパの水の硬度よりも低い。例えば、北アメリカの水の硬度は約3から約10グレインの間、約3から約8グレイン、または約6グレインである。日本の水の硬度は通常北アメリカの水の硬度より低く、通常約4未満であり、例えば約3グレイン／ガロン混合Ca2+/Mg2+である。
【０１７８】
従って、いくつかの実施形態では、この発明により少なくとも1の洗濯条件（例えば、水温、水の硬度、及び/又は洗剤濃度）の組み合わせにおいて驚くべき洗浄性能を示すプロテアーゼ変異体が提供される。いくつかの実施形態では、この発明のプロテアーゼ変異体は、洗濯性能が他のスブチリシン・プロテアーゼに匹敵する。いくつかの実施形態では、この発明のプロテアーゼ変異体は、現在市販されているスブチリシン・プロテアーゼに比べて強化された洗浄性能を示す。従って、この発明のいくつかの好ましい実施形態では、この発明のプロテアーゼ変異体は、強化された酸化安定性、強化された温度安定性、および／または強化されたキレート安定性を示す。さらに、この発明の変異体プロテアーゼを単独で、又はビルダー及び安定剤と組み合わせることにより、洗剤を含有しない洗浄剤に使用することもできる。
【０１７９】
この発明の幾つかの実施形態では、洗浄組成物は組成物の重量に対し約0.00001%から約10%のレベルのこの発明のプロテアーゼ変異体を含有し、組成物の残余部は洗浄補助剤（例えば、重量約99.999重量%から約90.0重量%）からなる。この発明の別の態様では、この発明の洗浄組成物は、組成物の重量に対し約0.0001重量%から約10重量%、約0.001重量%から約5重量%、約0.001重量%から約2重量%、約0.005重量%から約0.5重量%のレベルのこの発明のプロテアーゼ変異体を少なくとも1含有し、洗浄組成物の残余部は洗浄補助剤（例えば、約99.9999重量%〜約90.0重量%、約99.999重量%〜約98重量%、約99.995重量%〜約99.5重量%）からなる。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、この発明の洗浄組成物には、洗浄性能及び／又は織物ケア及び／又は食器洗いに有益な、1以上の追加の洗浄酵素が含有される。好ましい酵素の例として、ヘミセルラーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ペクテートリアーゼ、マンナナーゼ、ケラチナーゼ、リダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、β−グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、およびアミラーゼ、またはこれらの混合物が挙げられる。いくつかの実施形態では、酵素の組合せ（すなわちカクテル）が用いられ、例えばプロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、および／またはセルラーゼのような従来から用いられている酵素と、アミラーゼとを組み合わせたカクテルが用いられる。
【０１８１】
この発明に開示するプロテアーゼ変異体に加え、本願の組成物に別の適切なプロテアーゼを用いることもできる。適したプロテアーゼには、動物、野菜、または微生物起源のプロテアーゼが含まれる。特に好ましい実施形態では、微生物プロテアーゼが用いられる。いくつかの実施形態では、化学的または遺伝子工学的に修飾された突然変異体が用いられる。いくつかの実施形態では、プロテアーゼはセリンプロテアーゼであり、好ましくはアルカリ微生物プロテアーゼまたはトリプシン様プロテアーゼである。アルカリプロテアーゼの例としてスブチリシンが挙げられ、特にバチルス由来のスブチリシン（例えば、スブチリシン、レントゥス、アミロリケファシエンス、スブチリシン・カールスバーク、スブチリシン309、スブチリシン147およびスブチリシン168）が挙げられる。別の例として、参照としてこの発明に組み込むU.S. Pat. No. RE 34,606, 5,955,340, 5,700,676, 6,312,936, 及び 6,482,628に開示されたがスブチリシンが挙げられる。別のプロテアーゼの例として、トリプシン（例えば、ブタまたはウシ由来）、およびWO 89/06270に開示されたフサリウム（Fusarium）プロテアーゼが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、この発明で有用な市販のプロテアーゼ酵素の非限定的例示として、MAXATASE（登録商標）, MAXACAL（商標）, MAXAPEM（商標）, OPTICLEAN（登録商標）, OPTIMASE（登録商標）, PROPERASE（登録商標）, PURAFECT（登録商標）, PURAFECT（登録商標） OXP, PURAMAX（商標）, EXCELLASE（商標）, 及び PURAFAST（商標） (Genencor社); ALCALASE（登録商標）, SAVINASE（登録商標）, PRIMASE（登録商標）, DURAZYM（商標）, POLARZYME（登録商標）, OVOZYME（登録商標）, KANNASE（登録商標）, LIQUANASE（登録商標）, NEUTRASE（登録商標）,  RELASE（登録商標）及びESPERASE（登録商標）  (Novozymes); 及び BLAP（商標） (Henkel Kommanditgesellschaft auf Aktien社, Duesseldorf, Germany)が挙げられる。様々なプロテアーゼが、WO95/23221, WO 92/21760, U.S. Pat. Publ. No. 2008/0090747, 及びU.S. Pat. No. 5,801,039, 5,340,735, 5,500,364, 5,855,625, US RE 34,606, 5,955,340, 5,700,676, 6,312,936, 及び6,482,628、及びその他の特許に開示されている。また別の実施形態では、この発明にメタロプロテアーゼを用いることができ、非限定的例示として WO 07/044993に開示された中性メタロプロテアーゼが挙げられる。
【０１８２】
さらに、この発明では適切な任意のリパーゼを用いることができる。好ましいリパーゼの非限定的例示として、細菌または真菌起源のリパーゼが挙げられる。この発明には、化学的又は遺伝子工学的に修飾された変異体も含まれる。有用なリパーゼの例として、フミコラ・ラヌジノサ・リパーゼ（Humicola lanuginose lipase：EP 258 068, 及びEP 305 216参照）、リゾムコル・ミエヘイ・リパーゼ（Rhizomucor miehei lipase：例えばEP 238 023参照）、C．アンチクティカ・リパーゼ（例えば、C. Antarctica lipase AまたはB：例えば、EP 214 761参照）等のカンディダ・リパーゼ（Candida lipase）、P．アルカリジェネス（alcaligenes）、P．シュードアルカリジェネス・リパーゼ( 例えば EP 218 272参照)、P．セパシア（cepacia）・リパーゼ (例えば EP 331 376参照)、P．ストゥツェリ（stutzeri）・リパーゼ (例えばGB 1,372,034参照)、P．フルオレセンス・リパーゼ、バチルス・リパーゼ（例えば、B.subtilis lipase、[Dartois et al., Biochem. Biophys. Acta 1131:253-260 [1993]参照）；B.stearothermophilis lipase[例えばJP 64/744992参照]；およびB. pumilus lipase：例えばWO 91/16422参照）等のシュードモナス・リパーゼが挙げられる。
【０１８３】
さらに、この発明のいくつかの実施形態では多くのクローンされたリパーゼを用いることができ、非限定的例示としてペニシリウム・カメンベルティ（Penicillium camembertii）・リパーゼ（Yamaguchi et al.,  Gene 103:61-67 [1991]参照）、ゲオトゥリクム・カンディドウム（Geotricum candidum）・リパーゼ（Schimada et al., J. Biochem., 106:383-388 [1989]参照）、及びR．デレマー（delemar）・リパーゼ（Hass et al., Gene 109:117-113 [1991]参照）、R．ニベウス（niveus）・リパーゼ（Kugimiya et al., Biosci. Biotech. Biochem. 56:716-719 [1992]参照）、及びR．オリザエ（oryzae）・リパーゼ等のR．リゾプス（Rhizopus）・リパーゼが挙げられる。
【０１８４】
この発明のいくつかの実施形態では、クチナーゼ等の別のタイプの脂肪分解酵素を用いることができ、非限定的例示としてシュードモナス・メンドシナ（mendicina：WO 88/09367参照）由来のクチナーゼ、及びフサリウム・ソラニ・ピシ（Fusarium solani pisi：WO 90/09446参照）由来のクチナーゼが挙げられる。
【０１８５】
別の好適なリパーゼとして、市販のM1 LIPASE（商標）、LUMA FAST（商標）、およびLIPOMAX（商標）（Genencor社）、LIPOLASE（登録商標）、及びLIPOLASE（登録商標）ULTRA（Novozymes社）、およびLIPASEP（商標）「Amano」（Amano Pharmaceutical Co. Ltd.社, Japan）が挙げられる。
【０１８６】
この発明の幾つかの実施形態では、この発明の洗浄組成物には、組成物の重量に対し約0.00001%から約10%のレベルの追加のリパーゼが含有され、重量の残余部は洗浄補助物剤からなる。この発明の別の態様では、この発明の洗浄組成物には、組成物の重量に対し約0.0001%から約10%、約0.001%から約5%、約0.001%から約2%、約0.005%から約0.5%のレベルのリパーゼが含有される。
【０１８７】
この発明の幾つかの実施形態では、適切な任意のアミラーゼを用いることができる。いくつかの実施形態では、アルカリ性溶液での使用に適した任意のアミラーゼ（例えばアルファおよび／またはベータ）を用いることができる。好適なアミラーゼとして細菌または真菌起源のアミラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態には、化学的または遺伝子工学的に修飾された変異体が含まれる。この発明に用いられるアミラーゼには、B.リケニフォルミス（例えば、GB1,296,839参照）から得られるα−アミラーゼが含まれるが、これに限定されない。この発明で使用可能な市販のアミラーゼの非限定的例示として、DURAMYL（登録商標）、TERMAMYL（登録商標）、FUNGAMYL（登録商標）およびBAN（商標）（Novozymes社）、およびRAPIDASE（登録商標）およびMAXAMYL（登録商標）P（Genencor社）が挙げられる。
【０１８８】
この発明のいくつかの実施形態では、この発明の洗浄組成物にはさらに、組成物の重量に対し約0.00001%から約10%のレベルの追加のアミラーゼアミラーゼが含有され、組成物の残部の重量は洗浄補助剤である。この発明の別の態様では、この発明の洗浄組成物には、組成物の重量に対し約0.0001%から約10%、約0.001%から約5%、約0.001%から約2%、約0.005%から約0.5%のレベルのアミラーゼが含有される。
【０１８９】
また別の実施形態では、この発明の洗浄組成物には適切な任意のセルラーゼを用いることができる。適切なセルラーゼには細菌または真菌起源のセルラーゼが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態には、化学的または遺伝子工学的に修飾された変異体が含まれる。適切なセルラーゼの非限定的例示として、フミコラ・インソレンス(Humicola insolens)・セルラーゼ（例えば、U.S. Pat. No. 4,435,307参照）が挙げられる。特に適切なセルラーゼは色ケアで有益なセルラーゼ（例えば、EP0495257参照）である。この発明に使用可能な市販のセルラーゼの非限定的例示として、CELLUZYME（登録商標）、CAREZYME（登録商標）（Novozymes社）、およびKAC-500（B）（商標）（Kao Corporation社）が挙げられる。いくつかの実施形態では、セルラーゼは成熟野生型またはセルラーゼ変異体の一部または断片として添加され、ここでN末端の部分は欠失される（例えばUS5,874,276参照）。いくつかの実施形態では、この発明の洗浄組成物には、組成物の重量に対し約0.00001%から約10%のレベルの追加のセルラーゼが含有され、組成物の残余の重量は洗浄補助剤である。この発明の別の態様では、この発明の洗浄組成物には、組成物の重量に対し約0.0001%から約10%、約0.001%から約5%、約0.001%から約2%、約0.005%から約0.5%のレベルのセルラーゼが含有される。
【０１９０】
この発明の洗浄組成物に、適切な任意のマンナナーゼを用いることができる。適切なマンナナーゼには細菌または真菌起源のマンナナーゼが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態には、化学的または遺伝子工学的に修飾された変異体が含まれる。様々なマンナナーゼが知られており、これらをこの発明に用いることができる。（例えば、US6,556,114、6,602,842、及び6,440,991参照。これらを参照としてこの発明に組み込む。）いくつかの実施形態では、この発明の洗浄組成物には、組成物の重量に対し約0.00001%から約10%のレベルの追加のマンナナーゼが含有され、組成物の残余の重量は洗浄補助剤である。この発明の別の態様では、この発明の洗浄組成物には、組成物の重量に対し約0.0001%から約10%、約0.001%から約5%、約0.001%から約2%、約0.005%から約0.5%のレベルのマンナナーゼが含有される。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、この発明の洗浄組成物には、ペルオキシダーゼを過酸化水素またはその発生源（例えば、過炭酸、過ホウ酸、または過硫酸）と組み合わせて用いる。別の実施形態では、オキシダーゼを酸素と組み合わせて用いる。両タイプの酵素は「溶液漂白」のため（すなわち、洗濯溶液中で、染色された織物から他の織物に布地の染料が移動するのを防ぐため）に用いられ、好ましくは増強剤（例えば、WO94/12621及びWO95/01426号参照）とともに用いられる。適切なペルオキシダーゼ／オキシダーゼには細菌または真菌起源のペルオキシダーゼ／オキシダーゼが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態には、化学的または遺伝子工学的に修飾された変異体が含まれる。いくつかの実施形態では、この発明の洗浄組成物には、組成物の重量に対し約0.00001%から約10%のレベルの追加のペルオキシダーゼ及び/又はオキシダーゼが含有され、組成物の残余の重量は洗浄補助剤である。この発明の別の態様では、この発明の洗浄組成物には、組成物の重量に対し約0.0001%から約10%、約0.001%から約5%、約0.001%から約2%、約0.005%から約0.5%のレベルのペルオキシダーゼ及び/又はオキシダーゼが含有される。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、有用な追加の酵素にはペルヒドロラーゼが含まれる（例えばWO 05/056782参照）。また、いくつかの特に好ましい実施形態では、この発明では上記の酵素の混合物が用いられ、特に１以上の実施形態ではの追加のプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、マンナナーゼ、及び／又は少なくとも1のセルラーゼが用いられる。実際、このような酵素の様々な混合物がこの発明において有用である。また、プロテアーゼ変異体及び1以上の追加の酵素のレベルはそれぞれ独立して約10%の範囲で変更され、洗浄組成物の残余部は洗浄補助剤である。具体的な洗浄補助剤の選択は、洗浄対象の表面、物品、又は織物と、洗浄組成物の使用時（例えば洗濯用洗剤）における望ましい形態とを考慮することにより容易に行うことができる。
【０１９３】
好適な洗浄補助剤の非限定的例示として、界面活性剤、ビルダー、漂白剤、漂白活性化剤、漂白触媒、他の酵素、酵素安定化系、キレート化剤、光学的光沢剤、汚染除去ポリマー、染料移動剤、染料移動禁止剤、触媒物質、過酸化水素、過酸化水素源、賦形過酸化物、ポリマー性分散剤、クレイ汚染除去剤、構造可塑剤、分散剤、泡抑制剤、染料、香料、染色剤、充填剤塩、向水性物質、光活性化剤、蛍光剤、織物調整剤、織物柔軟剤、担体、可溶化剤、加工助剤、溶剤、色素、加水分解性界面活性剤、保存料、抗酸化剤、抗収縮剤、抗しわ剤、殺菌剤、抗かび剤、色汚れ剤、白髪用剤、変色防止剤及び／又は耐腐食剤、アルカリ源、可溶化剤、担体、加工助剤、色素、及びｐＨ調整剤（例えば参照として本願に組み込むU.S. Pat. No. 6,610,642, 6,605,458, 5,705,464, 5,710,115, 5,698,504, 5,695,679, 5,686,014及び 5,646,101参照）が挙げられる。具体的な洗浄組成物の実施形態を以下に詳細に例示する。洗剤組成物中の洗浄補助剤とこの発明のプロテアーゼ変異体との適合性がない実施形態では、この2つの成分の組み合わせた物が使用されるまで、洗浄補助剤とプロテアーゼとを分離した（すなわち、互いに接しない）状態に保つ適切な方法を適用する。このような分離方法には、公知の適切な方法（例えばゲルキャップ、カプセル化、錠剤化、物理的分離等）が含まれる。
【０１９４】
いくつかの好ましい実施形態では、この発明の1以上のプロテアーゼ変異体の有効量が、タンパク質様の汚れを除去する必要がある様々な表面を洗浄するために有用な組成物に含まれている。このような洗浄組成物として、硬質表面、織物、および食器洗浄用の洗浄組成物が挙げられる。実際、いくつかの実施形態では、この発明により織物用洗浄組成物が提供され、一方別の実施形態では、この発明により非織物用の洗浄組成物が提供される。またこの発明により、口内ケア用（義歯洗浄組成物や、歯磨き粉、歯磨き、口洗浄等を含む）、皮膚用および髪用の洗浄組成物を含む、パーソナルケアに適した洗浄組成物が提供される。この発明には、任意の形態（すなわち、液体、顆粒、棒、半固体、ゲル、エマルジョン、錠剤、カプセル等）の洗剤組成物を包含する。
【０１９５】
実施例により、本願のプロテアーゼが用いられた数種の洗浄組成物を以下に詳細に説明する。いくつかの実施形態では、本願の洗浄組成物は洗濯機による洗濯に適した組成物として処方され、本願の組成物は、少なくとも1の界面活性剤、少なくとも1のビルダー化合物、及び1以上の洗浄助剤を含有し、洗浄助剤は好ましくは有機ポリマー性化合物、漂白剤、追加の酵素、泡抑制剤、分散剤、石灰石鹸分散剤、汚れ懸濁液、および抗再沈殿剤および腐食阻害剤から選択される。いくつかの実施形態では、洗濯洗剤用組成物には柔軟剤（すなわち追加の洗浄補助剤）が含有される。この発明の組成物はまた、固体または液体形態の洗剤用添加に用いることができる。このような洗剤用添加は、従来の洗剤組成物の性能を補助および／または増強することが目的とされ、洗浄過程の任意の段階で添加することができる。いくつかの実施形態では、本願の洗濯洗剤用組成物の密度は約400から約1200g/リットルの範囲にあり、別の実施形態では、20℃で測定したときの組成物の密度は500から950g/リットルの範囲にある。
【０１９６】
洗浄組成物が手洗い用食器洗剤として処方された実施形態では、本願の組成物は、好ましくは少なくとも1の界面活性剤と、好ましくは少なくとも1の追加の洗浄補助剤を含有し、洗浄補助剤は有機ポリマー性化合物、泡増強剤、第II族金属イオン、溶媒、向水性物質、及び追加の酵素から選択される。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、US6,605,458に開示された洗浄組成物等、様々な洗浄組成物を本願のプロテアーゼとともに用いることができる。従っていくつかの実施形態では、本願のプロテアーゼ変異体を少なくとも1含む組成物は、コンパクトな顆粒状の織物用洗浄組成物であり、別の実施形態では、本願の組成物は染色された織物の洗濯に有用な顆粒状の織物用洗浄組成物であり、また別の実施形態では、本願の組成物は洗濯性能を通じて柔軟化を提供する顆粒状の織物用洗浄組成物であり、また別の実施形態では本願の組成物は液状で織物用の強力洗浄組成物である。いくつかの実施形態では、本願のプロテアーゼ変異体を少なくとも1含む組成物はUS6,610,642及び6,376,450に開示されているような、織物用洗浄組成物である。さらに、この発明のプロテアーゼ変異体は、ヨーロッパおよび日本の洗濯条件下で特に有用な顆粒状の洗濯洗剤組成物に用いられる（例えばU.S. Pat. No.  6,610,642参照）。
【０１９８】
別の実施形態では、この発明により、本願のプロテアーゼ変異体を少なくとも1含む、硬質表面用の洗浄組成物が提供される。従っていくつかの実施形態では、本願のプロテアーゼ変異体を少なくとも1含む組成物は、U.S. Pat. Nos. 6,610,642, 6,376,450, 及び6,376,450 に開示されているような、硬質表面用の洗浄組成物である。
【０１９９】
又別の実施形態では、この発明により、本願のプロテアーゼ変異体を少なくとも1含む、食器洗浄用の洗浄組成物が提供される。従っていくつかの実施形態では、本願のプロテアーゼ変異体を少なくとも1含む組成物は、U.S. Pat. Nos. 6,610,642,及び6,376,450 に開示されているような、硬質表面用の洗浄組成物である。又別の実施形態では、この発明により、本願のプロテアーゼ変異体を少なくとも1含む、食器洗浄用の洗浄組成物が提供される。いくつかの実施形態では、本願のプロテアーゼ変異体を少なくとも1含む組成物は、U.S. Pat. No. 6,376,450, 及び6,376,450 に開示されているような、オーラルケア用の洗浄組成物である。上記のUS Pat. No. 6,376,450, 6,605,458, 6,605,458, 及び 6,610,642に開示された化合物や洗浄補助剤、及び処方を、本願のプロテアーゼ変異体に適用することができる。。
【０２００】
この発明の洗浄組成物は、処方業者によって選択される任意のプロセスによって任意の適切な形態に処方され、このようなプロセスの非限定的例示として、本願に参照として組み込むU.S. Pat. No. 5,879,584, 5,691,297, 5,574,005, 5,569,645, 5,565,422, 5,516,448, 5,489,392, 及び 5,486,303に開示されたプロセスが挙げられる。低pＨ洗浄組成物が望まれる実施形態では、洗浄組成物のpHをモノメタノールアミンや、HCl等の酸性物質を添加することにより調整する。
【０２０１】
本願にとって必須ではないが、いくつかの実施形態では、本明細書に非限定的に例示する洗浄補助剤を本願の洗浄組成物に用いることができる。いくつかの実施形態では、洗浄補助剤は洗浄性能を助け、及び／又はその機能を向上させ、洗浄される物体を処理し、又は香水、顔料、染料等のように洗浄組成物の美観を整えるために添加される。洗浄補助剤はこの発明のプロテアーゼ変異体に追加して用いられる。これらの洗浄補助剤の性質及び添加量は、組成物の物理的形態、および／または洗浄補助剤が用いられる洗浄作業の性質による。好適な洗浄補助剤の非限定的例示として、界面活性剤、ビルダー、キレート化剤、染料移動阻害剤、沈殿剤、分散剤、追加の酵素、及び酵素安定剤、触媒物質、漂白活性化剤、漂白促進剤、過酸化水素、過酸化水素源、賦形過酸化物、ポリマー性分散剤、クレイ汚染除去/再沈防止剤、増白剤、泡抑制剤、染料、香料、構造可塑化剤、織物柔軟剤、担体、向水性物質、加工助剤、及び／又は色素が挙げられる。下記の開示に加え、このような他の洗浄組成物及びその使用レベルの適切な例は、本願に参照として組み込むU.S. Patent No. 5,576,282, 6,306,812, 及び6,326,348 に開示されている。いくつかの実施形態では、上記の洗浄補助剤は本願の洗浄組成物の残余部の構成成分となる。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、この発明の洗浄組成物には少なくとも一つの界面活性剤または界面活性剤システムが含まれ、界面活性剤はノンイオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤、両性イオン界面活性剤、半極性ノンイオン性活性剤、及びこれらの混合物から選択される。低pＨ洗浄組成物（例えば原液のpHが約3から約5の組成物）の実施形態では、洗浄組成物にはアルキルエトキシ硫酸塩が含まれていない。これは、アルキルエトキシ硫酸塩等の界面活性剤は、組成物中の酸性物質により加水分解されると考えられているためである。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、洗浄組成物の重量に基づき約0.1％から約60％存在し、別の実施形態では約1％から約50％存在し、さらに別の実施形態では約5％から約40％存在する。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、、この発明の洗剤組成物には一以上の洗浄ビルダーまたはビルダーシステムが含まれる。いくつかの実施形態では、少なくとも1のビルダーが使用され、洗剤組成物には、洗剤組成物の全重量に対し、少なくとも約1％、約3% から約60%または約5%から約40%のビルダーが含まれる。ビルダーには、アルカリ金属、アンモニウム及びポリリン酸のアルカノールアンモニア塩、アルカリ金属ケイ酸塩、アルカリ土類及びアルカリ金属炭酸塩、アルミノケイ酸ビルダー、ポリカルボン酸化合物、ヒドロオキシポリカルボン酸塩エーテル、エチレンまたはビニルメチルエーテルを有する無水マレイン酸のコポリマー、1, 3, 5-トリヒドロキシベンゼン-2, 4, 6-トリスルホン酸、及びカルボキシメチルオキシコハク酸、及び種々のアルカリ金属、アンモニアエチレンジアミン テトラ酢酸及びニトリロトリ酢酸の様なポリ酢酸、アンモニア置換塩、並びにメリト酸、コハク酸、クエン酸、オキシジコハク酸、ポリマレイン酸、ベンゼン1,3,5-トリカルボン酸及びカルボキシメチルオキシコハク酸及びそれらの可溶性塩が含まれるが、これらに限定されない。実際本願では任意の適切なビルダーが用いられる。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、ビルダーは、クエン酸塩及び ポリリン酸塩(例えばトリポリリン酸ナトリウム及びトリポリリン酸ナトリウム6水和物、トリポリリン酸カリウム、及びトリポリリン酸ナトリウムとトリポリリン酸カリウムの混合物等) のように、水溶性の硬水イオン錯体を形成する（例えば捕捉ビルダー）。この発明では、公知のビルダー（例えばEP 2 100 949参照）を含め、任意の適切なビルダーを用いることができる。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、この発明の洗剤組成物には少なくとも一つのキレート剤が含まれる。好適なキレート剤には銅、鉄及び/またはマンガンキレート剤及びこれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。少なくとも1のキレート剤が使用される場合、洗剤組成物にはその洗剤組成物の重量に対し約0.1から約15％または約3.0から約10％のキレート剤が含まれる。
【０２０６】
いくつかの別の実施形態では、この発明の洗剤組成物には沈殿助剤が含まれる。好適な沈殿助剤として、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリカルボン酸塩、ポリテレフタル酸の様な防汚ポリマー、カオリナイト、モンモリナイト、アタプルガイト、イライト、ベントナイト、ハロイサイト、及びこれらの混合物等のクレイが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、本願に示すように、この発明では再沈防止剤を用いることができる。いくつかの好ましい実施形態では、非イオン性界面活性剤が用いられる。例えば自動織機洗浄機での実施形態では、非イオン性界面活性剤は表面改質に有用であり、特にフィルム形成やスポット汚れを防止して光沢を改善するための膜形成に有用である。これらの非イオン性界面活性剤は、汚れの再沈防止にも有用である。いくつかの好ましい実施形態では、再沈防止剤は公知の非イオン性界面活性剤（例えばEP 2 100 949参照）である。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、この発明の洗浄組成物には、1以上の染料転移阻害剤が含有される。好適なポリマー性染料転移阻害剤には、ポリビニルピロリドン・ポリマー、ポリアミン-N-オキシド・ポリマー、N-ビニルピロリドンおよびN-ビニルイミダゾールのコポリマー、ポリビニルオキサゾリドンおよびポリビニルイミダゾール、またはこれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。少なくとも1の染料転移阻害剤が用いられる場合、染料阻害剤は洗浄組成物の重量に対し約0.0001%から約10%、約0.01%から約5%、または約0.1%から約3%含まれる。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、この発明の洗浄組成物にはケイ酸塩が含有される。このような実施形態では、ケイ酸ナトリウム（例えば二ケイ酸ナトリウム、メタケイ酸ナトリウム、及び結晶性フィロケイ酸塩）を用いることができる。いくつかの実施形態では、ケイ酸塩は約1%から約20%のレベルで存在する。いくつかの好ましい実施形態では、ケイ酸塩は洗浄組成物の重量に対し約5%から約15%のレベルで存在する。
【０２１０】
いくつかの別の実施形態では、この発明の洗剤組成物には分散剤が含まれる。好適な水溶性有機材料には、単独重合体酸、又は共重合体酸、又はその塩が含まれ、この場合、ポリカルボン酸には少なくとも2つのカルボキシル基が含まれ、このカルボキシル基同士は炭素原子数が2個以上離れていない。
【０２１１】
又別の実施形態では、洗剤に用いられる酵素は、適切な技術により安定化される。いくつかの実施形態では、この発明で用いられる酵素は、酵素にイオンを供給可能な水溶性のカルシウムイオン及び/又はマグネシウムイオン源を最終組成物中に存在させるにより、安定化させることができる。いくつかの実施形態では、酵素安定剤として、オリゴ糖、多糖類、及びカルシウム塩等のアルカリ土類金属を含む無機二価金属塩が挙げられる。この発明では、様々な酵素安定化技術を用いることができる。例えば、いくつかの実施形態では、水溶性の亜鉛(II)，カルシウム(II)及び/またはマグネシウム(II)イオン、及び/他の金属イオン（例えば、バリウム(II)，スカンジウム(II)，鉄(II)，マンガン(II)，アルミニウム(III)，スズ(II)，コバルト(II)，銅(II)、ニッケル(II)，及びオキソバナジウム(IV)）を最終組成物中に存在させ、このようなイオンを酵素に供給することにより、この発明で用いる酵素を安定化させる。この発明のいくつかの実施形態では、塩化物及び硫酸塩を用いることができる。適切なオリゴ糖及び多糖類（例えばデキストリン）の例は公知である（例えばWO 07/145964参照）。いくつかの実施形態では、ホウ素含有化合物（例えばホウ酸塩、4-フォルミルフェニルホウ酸）及び／又はトリペプチドアルデヒド等の可逆的プロテアーゼ阻害剤を、所望により用いることができる。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、この発明の洗剤組成物には漂白剤、漂白剤活性剤、及び／又は漂白触媒が含まれる。いくつかの実施形態では、この発明の洗剤組成物には無機及び／又は有機漂白剤が含まれる。無機漂白剤の非限定的例示として、ペルハイドレート（perhydrate）塩（例えばペルボレート、ペルカーボネート、ペルフォスフェート、ペルスルフェート、及びペルシリケート塩）が挙げられる。いくつかの実施形態では、無機ペルハイドレート塩はアルカリ金属塩である。いくつかの実施形態では、無機ペルハイドレート塩は付加的に保護されていない結晶性固体として含有されるが、別の実施形態ではこの塩は被覆されている。任意の適切な公知の塩をこの発明に用いることができる（例えばEP 2 100 949参照）。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、この発明の洗剤組成物には漂白活性剤が用いられる。漂白活性剤は通常有機過酸前駆体であり、60℃以下での洗浄において漂白作用を強化する。本願に適した漂白活性剤は、過加水分解（perhydrolysis）条件下で、好ましくは炭素原子を約1から約10個、特に好ましくは約2から約4個有する脂肪族ペルオキシカルボン酸を生じ、及び／又は任意に置換されたペル安息香酸を生じる化合物である。さらなる漂白活性剤も公知であり、この発明に用いることができる（例えばEP 2 100 949参照）。
【０２１４】
さらに、いくつかの実施形態では本願に開示するように、この発明の洗浄組成物には少なくとも1の漂白触媒が含有される。いくつかの実施形態では、マンガントリアザシクロノナン錯体及び関連する錯体を用いることができ、コバルト、銅、マンガン、及び鉄錯体を用いることもできる。別の漂白触媒もこの発明に用いることができる（例えばUS 4,246,612, 5,227,084, 4,810410, WO 99/06521, 及びEP 2 100 949参照）。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、この発明の洗浄組成物には一以上の触媒金属複合体が含まれる。いくつかの実施形態では、金属含有漂白触媒が用いられる。いくつかの好ましい実施形態では、金属含有漂白触媒には、所定の漂白触媒活性の遷移金属カチオン（例えば、銅、鉄、チタン、ルテニウム、タングステン、モリブデンまたはマンガンカチオン）、漂白触媒活性をほとんどまたは全く持たない補助的金属カチオン（例えば、亜鉛、アルミニウムカチオン）、及び触媒及び補助的金属カチオンの所定の安定係数を有するセクエストレート（sequestrate）を含む触媒システム、特にエチレンジアミンテトラ酢酸、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）及びこれらの可水溶塩が用いられる（例えばUS Patent No. 4,430,243を参照）。いくつかの実施形態では、この発明の洗浄組成物はマンガン化合物により触媒される。このようなマンガン化合物及びその使用量は公知である（例えば、米国特許第5,576,282号を参照）。別の実施形態では、コバルト漂白触媒をこの発明の洗浄組成物に用いることができる。種々のコバルト漂白触媒が知られており（例えば、米国特許第5,597,936号及び第5,595,967号を参照)、公知の方法で容易に製造することができる。
【０２１６】
別の実施形態では、この発明の洗浄組成物には、マクロ多還式剛直リガンド（MRL）の遷移金属複合体が含まれる。いくつかの実施形態では、この発明の組成物及び洗浄プロセスでは、水性洗濯媒体中において活性MRLが少なくとも1ppmオーダーで含有されるように調整され、ある好ましい実施形態では、洗濯液中に約0.005 ppmから約25ppm、より好ましくは約0.05 ppmから約10ppm、最も好ましくは約0.1ppmから約5ppmのMRLが含有されるが、これらに限定されない。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、遷移金属漂白触媒中の好ましい遷移金属はマンガン、鉄、及びクロム等であるが、これらに限定されない。また好ましいMRLとして架橋を有する特別な超剛直リガンド(例えば、5,12-ジエチル-l,5,8,12-テトラアザビシクロ [6.6.2]ヘキサデカン)が挙げられるが、これに限定されない。好ましい遷移金属MRLは公知の方法で容易に製造することができる（例えば、WO 00/32601, 及びUS Patent No. 6,225,464を参照)。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、この発明の洗浄組成物にはメタルケア（metal care）剤が含有される。メタルケア剤は、アルミニウム、ステンレス、及び非鉄金属（例えば銀や銅）等の金属の変色、腐食、及び／又は酸化の防止及び／又は低減に有用である。適切なメタルケア剤として、EP 2 100 949, WO 9426860 及び WO 94/26859に開示されたメタルケア剤が挙げられる。いくつかの実施形態では、メタルケア剤は亜鉛の塩である。また別の実施形態では、この発明の洗浄組成物には、1以上のメタルケア剤が約0.1重量%から約5重量%含有される。
【０２１９】
上記のように、この発明の洗浄組成物は任意の適切な形態に処方され、また処方業者によって選択された任意のプロセスにより製造される。このようなプロセスの非限定的例示として、参照として本願に組み込むU.S. Pat. No. 5,879,584, 5,691,297, 5,574,005, 5,569,645, 5,516,448, 5,489,392, 及び5,486,303 に開示されたプロセスが挙げられる。いくつかの実施形態では、低pHの洗浄組成物が望まれる場合には、その洗浄組成物のpHを、塩酸等の酸性物質の添加により調整する。
【０２２０】
この発明に開示された洗浄組成物は、部位（例えば表面、食器または織物）を洗浄するために用いることができる。通常は、部位の少なくとも一部分が、原液または洗濯溶液に希釈された状態のこの発明の洗浄組成物の態様と接触し、次にその部位が洗浄され、及び/又は漱がれる。この発明では、「洗浄」には擦り洗いおよび機械的な撹拌が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本願の洗浄組成物は通常、約500ppmから約15,000ppmの溶液濃度で用いられる。洗濯溶液が水の場合、水温は通常約5℃から約90℃であり、部位が織物の場合、水に対する織物の重量比は通常約1:1から約30:1である。
【実施例】
【０２２１】
以下の実施例に、この発明をさらに詳細に開示する。これらの実施例は、特許請求の範囲に係る発明を限定することを意図したものではない。
【０２２２】
以下の実施例では、下記の略号を用いる。PI (プロテイナーゼ 阻害物質、インヒビター)；ppm (百万分の一)；M (モル濃度)；mM (ミリモル)；μM (マイクロモル)；nM (ナノモル)；mol (モル)；mmol (ミリモル);μmol (マイクロモル)；nmol (ナノモル)；gm (グラム)；mg (ミリグラム)；μg (マイクログラム); pg (ピコグラム)；L (リットル)；mlとmL(ミリリットル)；μlとμL (マイクロリットル)；cm (センチメートル)；mm (ミリメートル)；μm (マイクロメートル)；nm (ナノメートル)；U (単位 ユニット)；V (ボルト)；MW (分子量)；sec (秒)；min(s) (分)；h(s)とhr(s) (時間)； ℃ (摂氏)；QS (十分な量)；ND (実施せず)；rpm (毎分回転数)；H2O (水)；dH2O (脱イオン水)；HCl (塩酸)；aa (アミノ酸)；bp (塩基対)；kb (キロ塩基対)；kD (キロダルトン)；cDNA (コピーまたは相補的DNA)；DNA (デオキシリボ核酸)；ssDNA (単鎖DNA)；dsDNA (二本鎖DNA)；dNTP (デオキシリボヌクレオチド三リン酸)；RNA (リボ核酸)；MgCl2 (塩化マグネシウム)；NaCl(塩化ナトリウム); w/v (重量対容積)；v/v (容積対容積); g (重力)；OD (光学濃度)；ダルベッコ−リン酸緩衝液 (DPBS)；SOC (2%バクト−トリプトン，0.5%バクト−酵母エキス，10mM NaCl，2.5mM KCl)；Terrific培地 (TB;12g/lバクト−トリプトン，24 g/l グリセロール，2.31g/l KH2PO4，および12.54g/l K2HPO4)；OD280 (280nmでの光学濃度)；OD600 (600nmでの光学濃度)；A405 (405nmでの吸光度)；Vmax (酵素による触媒反応の最大初期反応速度); PAGE (ポリアクリルアミドゲル電気泳動)；PBS (リン酸緩衝生理食塩水［150mM NaCl，10mM リン酸ナトリウム緩衝液，pH7.2］)；PBST (PBS+0.25% TWEEN（登録商標）20)；PEG (ポリエチレングリコール)；PCR (ポリメラーゼ連鎖反応)；RT-PCR (逆転写PCR)；SDS (ドデシル硫酸ナトリウム)；Tris (トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン)；HEPES (N-[2-ヒドロキシエチル]ピペラジン-N-[2-エタンスルホン酸])；HBS（HEPES緩衝食塩水)；Tris-HCl (トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン−塩酸塩)； Tricine (N-［トリス−(ヒドロキシメチル)−メチル］− グリシン)；CHES (2-(N-シクロ−ヘキシルアミノ) エタンスルホン酸)；TAPS (3-{[トリス−(ヒドロキシメチル)− メチル]−アミノ}−プロパンスルホン酸)；CAPS (3-(シクロ−ヘキシルアミノ)−プロパン−スルホン酸；DMSO (ジメチルスルホキシド)；DTT (l，4-ジチオ-DL-トレイトール)；SA (シナピン酸(s，5-ジメトキシ-4-ヒドロキシ桂皮酸)；TCA (トリクロロ酢酸)；GlutとGSH (還元グルタチオン)；GSSG (酸化グルタチオン)；TCEP (トリス[2-カルボキシエチル]ホスフィン)；Ci (キュリー)；mCi (ミリキュリー)；μCi (マイクロキュリー); HPLC (高圧液体クロマトグラフィー)；RP-HPLC (逆相高圧液体クロマトグラフィー)；TLC (薄層クロマトグラフィー)；MALDI-TOF (マトリクス支援レーザー脱離イオン化質量分析法)；Ts (トシル)；Bn (ベンジル)；Ph (フェニル)；Ms (メシル)；Et (エチル), Me (メチル); Taq (好熱菌DNAポリメラーゼ)；Klenow (DNAポリメラーゼI ラージ(クレノー)フラグメント);EGTA (エチレングリコール−ビス(β−アミノエチルエーテル) N，N，N’，N’−四酢酸);EDTA (エチレンジアミン四酢酸)；bla (β−ラクタマーゼまたは抗アンピシリン遺伝子)；HDL (高密度液体)；MJ Research (MJ Research社,Reno，ネバダ)；Baseclear (Baseclear BV, Inc社，Leiden，オランダ)；PerSeptive (PerSeptive Biosystems社，Framingham，マサチューセッツ)；ThermoFinnigan (ThermoFinnigan社，San Jose，カリフォルニア)；Argo (Argo BioAnalytica社，Morris Plains，ニュージャ���ジ)；Seitz EKS (SeitzSchenk Filtersystems GmbH社，Bad Kreuznach，ドイツ)；Pall (Pall Corp．社，East Hills，ニューヨーク)；Spectrum(Spectrum Laboratories社，Dominguez Rancho，カリフォルニア)；Molecular Structure(Molecular Structure Corp社，Woodlands，テキサス)；Accelrys(Accelrys，Inc．社，San Diego，カリフォルニア); Chemical Computing (Chemical Computing Corp.社，Montreal，カナダ)；New Brunswick (New Brunswick Scientific, Co.社，Edison，ニュージャージ)；CFT (Center for Test Materials社，Vlaardingen，オランダ)；Procter & Gamble (Procter & Gamble, Inc.社，Cincinnati, オハイオ)；GE Healthcare (GE Healthcare社, Chalfont St. Giles，イギリス)；DNA2.0 (DNA2.0社，Menlo Park，カリフォルニア)；OXOID (Oxoid社，Basingstoke，Hampshire，イギリス)；Megazyme (Megazyme International Ireland Ltd社， Bray Business Park, Bray, Co.社，Wicklow，アイルランド)；Finnzymes (Finnzymes Oy社，Espoo，フィンランド)；Kelco (CP Kelco社，Wilmington，デラウエア)；Corning (Corning Life Sciences社，Corning，ニューヨーク)；NEN (NEN Life Science Products社，Boston，マサチューセッツ)；Pharma AS (Pharma AS社，Oslo，ノルーウェイ)；Dynal (Dynal社，Oslo, ノルーウェイ)；Bio-Synthesis (Bio-Synthesis社，Lewisville，テキサス)；ATCC (American Type Culture Collection社，Rockville， メリーランド)；Gibco/BRL (Gibco/BRL社，Grand Island，ニューヨーク)；Sigma (Sigma Chemical Co. 社，St. Louis，ミズーリ)；Pharmacia (Pharmacia Biotech社，Piscataway，ニュージャージ)；NCBI (National Center for Biotechnology Information)；Applied Biosystems (Applied Biosystems社，Foster City，カリフォルニア)；BD Biosciencesおよび／またはClontech (BD Biosciences CLONTECH Laboratories社，Palo Alto，カリフォルニア)；Operon Technologies (Operon Technologies, Inc.社，Alameda，カリフォルニア)；MWG Biotech (MWG Biotech社，High Point，ノースカロライナ)；Oligos Etc (Oligos Etc. Inc社，Wilsonville，オレゴン)；Bachem (Bachem Bioscience, Inc. 社，King of Prussia，ペンシルベニア)；Difco (Difco Laboratories社，Detroit，ミシガン)；Mediatech (Mediatech社，Hemdon，ヴァージニア)；Santa Cruz (Santa Cruz Biotechnology, Inc. 社，Santa Cruz，カリフォルニア)；Oxoid (Oxoid Inc. 社，Ogdensburg，ニューヨーク)；Worthington (Worthington Biochemical Corp.社，Freehold，ニュージャージ)；GIBCO BRLまたはGibco BRL (Life Technologies, Inc.社，Gaithersburg，メリ−ランド)；Millipore (Millipore社，Billerica，マサチューセッツ)；Bio-Rad (Bio-Rad社，Hercules，カリフォルニア)；lnvitrogen (Invitrogen Corp.社，San Diego，カリフォルニア)；NEB (New England Biolabs社，Beverly，マサチューセッツ)；Sigma (Sigma Chemical Co.社，St. Louis，ミズーリ)；Pierce (Pierce Biotechnology社，Rockford，イリノイ)；Takara (タカラバイオ社，大津，日本)；Roche (Hoffmann-La Roche社，Basel，スイス)；EM Science (EM Science社，Gibbstown，ニュージャージ)；Qiagen (Qiagen, Inc.社，Valencia，カリフォルニア)；Biodesign (Biodesign Intl.社，Saco，メイン)；Aptagen (Aptagen, Inc.社，Herndon，ヴァージニア)；Sorvall (Sorvallブランドの製品，Kendro Laboratory Products社製，Asheville，ノースカロライナ)；Molecular Devices (Molecular Devices, Corp.社，Sunnyvale，カリフォルニア)；R&D Systems (R&D Systems社，Minneapolis，ミネソタ)；Stratagene (Stratagene Cloning Systems社，La Jolla，カリフォルニア)；Marsh (Marsh Biosciences社，Rochester，ニューヨーク)；Geneart (Geneart GmbH社，Regensburg，ドイツ)；Bio- Tek (Bio-Tek Instruments社，Winooski，バーモント)；Biacore (Biacore, Inc.社，Piscataway，ニュージャージ)；PeproTech (PeproTech社，Rocky Hill，ニュージャージ)；SynPep (SynPep社，Dublin，カリフォルニア)；New Objective (New Objectiveブランドの製品)；Scientific Instrument Services, Inc.社製，Ringoes，ニュージャージ)；Waters (Waters, Inc.社，Milford，マサチューセッツ)；Matrix Science (Matrix Science社，Boston，マサチューセッツ)；Dionex (Dionex, Corp.社，Sunnyvale，カリフォルニア)；Monsanto (Monsanto Co.社，St. Louis，ミズーリ)；Wintershall (Wintershall AG社，Kassel，ドイツ)；BASF (BASF Co.社，Florham Park，ニュージャージ)；Huntsman (Huntsman Petrochemical Corp.社，Salt Lake City，ユタ)；Enichem (Enichem Iberica社，Barcelona，スペイン)；Fluka Chemie AG (Fluka Chemie AG社，Buchs，スイス)；Gist-Brocades (Gist-Brocades，NV社，Delft，オランダ)；Dow Corning (Dow Corning Corp.社，Midland，ミシガン)； および、Microsoft (Microsoft, Inc.社，Redmond，ワシントン)。
【０２２３】
本願の配列表のいくつかでは、各部位を3桁の数字で位置表示するために、最初に「0」を表示した（例えば「0001」は「1」と同じであり、従って「A001C」は「A1C」と同じである）。いくつかの配列表には最初の「0」は記載していない。また本願では、「X」は任意のアミノ酸を意味する。
【０２２４】
本願に例示する洗浄組成物では、酵素のレベルを全組成物の重量に対する純粋な酵素の重量で表し、特に断りの無い限り、洗剤成分の重量を全組成物の重量に対する純粋な酵素の重量で表す。各成分の略号の意味は次の通りである。
【表２】
0005911825.tif 000003
0005911825.tif 000004
【０２２５】
＜実施例１＞
＜分析＞
以下の実施例では、理解を容易にするために下記に示した様々な分析を用いた。下記に示した手順を変更したときは、その旨記を記載した。
【０２２６】
＜A.  96-ウエルマイクロタイタープレートにおけるタンパク質含有量測定のTCA分析＞
BPN’（例えば参照プロテアーゼ）及びその変異体について、加湿エアレーション下で、230 rpmで振蕩しながら33℃で3-4日間培養したマイクロタイタープレートからろ過して調製した培養上清液を用いて、TCA分析を開始した。この分析には、新品の96-ウエル平底マイクロタイタープレートを用いた。最初に100μL/ウエルの0.25 N HCIをウエルに入れた。次に、50μLのろ過された培養ブロスをウエルに加えた。「ブランク」の測定地を求めるために、405nm（プレートリーダーの5秒のミキシングモードを使用）での光散乱／吸光度を測定した。測定では、15% (w/v) トリクロロ酢酸 (TCA)を100μL /ウエルでマイクロタイタープレートに加え、室温で5から30分間インキュベートした。次に、405nm（プレートリーダーの5秒のミキシングモードを使用）での光散乱／吸光度を測定した。
【０２２７】
GCI-P036及びその変異体のTCA分析によるタンパク質濃度測定を、加湿エアレーション下で、300 rpmで振蕩しながら37℃で3日間培養したマイクロタイタープレートからろ過して調製した培養上清液を用いて行った。この分析では、100μL/ウエルの0.25 M  HCIを、96-ウエル平底マイクロタイタープレートの各ウエルに入れた。次に、ろ過された培養上清（プロテアーゼを含有する）25μLをウエルに加えた。「ブランク」の測定値を求めるために、405nm（プレートリーダーの5秒のミキシングモードを使用）での光散乱／吸光度を測定した。この測定の後、100μL の30% (w/v) TCAを各ウエルに加え、マイクロタイタープレートを室温で5から15分間インキュベートした。最後に、405nm（プレートリーダーの5秒のミキシングモードを使用）での光散乱／吸光度を測定した。使用した装置は、Biomek FX Robot (Beckman Coulter) 及びSpectraMAX (type 340; Molecular Devices) MTP Reader であり、マイクロタイタープレート（MTP）はCostar社製 (type 9017) であった。
【０２２８】
計算は、TCAを含有するサンプルの測定値からブランク（TCA無添加）の値を差し引き、サンプル中のタンパク質含有量の相対値を求めることにより行った。必要に応じて、換算率が公知のクローンのAAPF分析によるTCA測定値を較正することによって標準曲線を作ることができる。しかし、TCAの結果は50から500マイクログラム/ミリリットル（ppm）のタンパク質濃度範囲で直線性を示すため、機能が良好な変異体を選択することを目的とする場合、酵素性能に対して直接プロットできる。サンプル中の濁度/光散乱の増加は、培養液上清中での沈降性タンパク質の総量に相関する。
【０２２９】
＜B.  96-ウエルマイクロタイタープレートでのAAPFプロテアーゼ分析（AAPF分析）＞
プロテアーゼ、及びこの発明のプロテアーゼ変異体のプロテアーゼ活性を評価するために、N-サクシニル-L-アラニル-L-アラニル-L-プロリル-L-フェニル-p-ニトロアニリド (suc-AAPF-pNA) の加水分解を測定した。使用した試薬溶液は：100 mM Tris/HCl、pH 8.6、0.005% TWEENTM-80 (Tris 希釈緩衝液)含有；100 mM Tris 緩衝液、pH 8.6、10 mM CaCl2及び 0.005% TWEENTM-80 (Tris/Ca 緩衝液)含有； 及び160 mM suc-AAPF-pNAのDMSO溶液 (suc-AAPF-pNAストック溶液) (Sigma: S-7388)であった。suc-AAPF-pNAワーキμング溶液を調製するため、1 ml のsuc-AAPF-pNA溶液を100 mlのTris/Ca緩衝液に加え、少なくとも10秒間、よく撹拌した。分析は、希釈したプロテアーゼ溶液10 μlを各ウエルに加え、直ちに1 mg/ml suc-AAPF-pNAワーキング溶液190μLを加えることにより行った。溶液を5秒間撹拌し、410 nmにおいてキネティック・モード(5分間に20回測定)での吸光度変化を、25℃のMTPリーダー中で測定した。プロテアーゼ活性はAU (活性 = ΔOD・min-1 ml-1)で表した。
【０２３０】
＜AAPF加水分解方法＞
プロセス変異体を68℃で1時間インキュベートした後、AAPF分析を用いてプロテアーゼ活性を分析することにより、セリンプロテアーゼの熱安定性を評価した。この分析条件下では、参照プロテアーゼ(例えば野生型 GG36 ＝ GCI-P036)の残留活性は約50%であった。使用した装置は：平底MTP (Costar No. 9017)、Biomek FX 及び／又は Biomek FXp Robot (Beckman Coulter社)、Spectramax Plus 384 MTP リーダー (Molecular Devices社)、iEMS インキュベーター/シェーカー (振幅1 mm) (Thermo/Labsystems社), シーリングテープ (Nunc No. 236366)、及び氷浴であった。グリシン緩衝液を、960mlの水にグリシン(Merck No. 1.04201.1000) 3.75gを溶解させて調製した。このグリシン緩衝液に、1 mlの5% Tween 80 (Sigma No. P-8074)と、10 ml の1000 mM CaCl2 (Merck No. 1.02382.1000) (200 ml 中に29.4 g 溶解) ストック溶液とを加えた。4N NaOHでpHを10.5に調整し、容積を1000mlにした。グリシン、CaCl2及びTWEENTM-80の最終濃度は、それぞれ50 mM, 10 mM 及び 0.005%であった。複数のインキュベーターを、68℃（インキュベート用）及び25℃（AAPF分析用）に設定した。90μL と 190μLのグリシン緩衝液を、それぞれ空の希釈プレートとインキュベーションプレートに入れた。次に上清10μLを希釈プレートに加えた後、希釈プレートから採取した10μLをインキュベーションプレートに移した。インキュベーションプレートから採取した混合物10μLを、予熱しsuc-AAPF-pNA基質を入れたプレートに加えた。このsuc-AAPF-pNAプレートを、410 nm (t = 0測定)においてMTPリーダーで測定した。インキュベーションプレートをテープで覆い、68℃、400 rpmで1時間インキュベートした。インキュベート完了後、プレートをインキュベーターから取り出し、氷上で少なくとも5分間冷却した。インキュベーションプレートから採取した混合物10μLをsuc-AAPF-pNA基質を入れたプレートに移し、このプレートを410 nm (t=60 測定)   において測定した。パーセント残留活性を：%残留活性: (t=60におけるmOD.min-1) / (t=0におけるmOD.min-1) x 100として計算した。
【０２３１】
＜C.   LAS/EDTA安定性分析 (「LAS/EDTA分析」又は 「LAS-EDTA Assay分析」又は「LAS分析」)＞
LAS/EDTA安定性は、被検プロテアーゼをLAS/EDTAそれぞれの存在下でインキュベートした後、AAPF分析により求めた残留活性の関数として評価した。
【０２３２】
代表的アニオン性界面活性剤(LAS=直鎖アルキルスルホン酸塩、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム-DOBS)と、EDTA二ナトリウムとの存在下におけるプロテアーゼ変異体の安定性を、所定の条件下でインキュベートした後測定し、AAPF分析により残留活性を測定した。使用した試薬は、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム塩(DOBS, Sigma No. D-2525)、TWEENTM-80 (Sigma No. P-8074)、EDTA二ナトリウム(Siegfried Handel No. 164599-02)、HEPES (Sigma No. H-7523)、無ストレス緩衝液：50 mM HEPES (11.9 g/l) + 0.005% TWEENTM-80, pH 8.0、ストレス緩衝液：50 mM HEPES (11.9 g/l), 0.1% (w/v) DOBS (1 g/l), 10 mM EDTA (3.36 g/l), pH 8.0, 200 - 400 μg/mlのタンパク質を含有する参照プロテアーゼ及びプロテアーゼ変異体培養上清であった。使用した機器は、希釈プレートとしてV-又はU-底MTP(それぞれGreiner 651101 及び 650161)、無ストレス及びLAS/EDTA緩衝液及びsuc-AAPF-pNAプレートとして平底MTP (Corning 9017)、Biomek FX (Beckman Coulter), Spectramax Plus 384 MTPリーダー(Molecular Devices), Thermo Electron Corporation社製 iEMS インキュベーター/シェーカー (振幅1 mm)、シーリングテープ: Nunc (236366)であった。
【０２３３】
iEMS インキュベーター/シェーカーを29℃に設定した。培養液の上清を、非ストレス緩衝液を入れたプレート中で濃度が~ 25 ppmになるように希釈した(マスター希釈プレート)。マスター希釈プレートから採取したサンプル20μLを、非ストレス緩衝液180μLを入れたプレート中に加え、濃度が2.5ppmの最終培養液を調整した。内容物を混合し、室温下に静置し、このプレートでAAPF分析を行った。また、マスター希釈プレートから採取したサンプル20μLを、ストレス緩衝液(50 mM HEPES (11.9 g/l), 0.1% (w/v) DOBS (1 g/l), 10 mM EDTA (3.36 g/l), pH 8.0) 180μLを入れたプレート中に加えた。この溶液を混合し、直ちに29℃、400 rpmのiEMSシェーカーに30分間取付けておいた。30分間インキュベートした後、ストレスプレート上でAAPF分析を行った。サンプルの安定性は、残留AAPF活性及び初期AAPF活性の比率を次式により計算して求めた：残留活性 (%) = [mOD.min-1 ストレス下]*100 / [mOD. min-1 非ストレス下]。
【０２３４】
＜D.  性状性能分析＞
プロテアーゼ変異体の汚れ除去性能を、市販の洗剤を用いて評価した。市販の洗剤処方品の熱不活性化により、タンパク質成分の酵素活性が破壊され、一方、非酵素成分の性質は保持された。従ってこの方法は、この発明の酵素変異体の試験に用いるための市販の洗剤の調整に適している。
【０２３５】
＜小見本片＞
直径1/4インチの円形の小見本片をCFT (Vlaardingen, The Netherlands)から購入した。シングル小見本片又は2つの小見本片を、96ウエルMTPの各ウエルに、表面積全体が露出するようにして置いた（すなわち、ウエルの底に広げたのではない）。
【０２３６】
＜BMI小見本片分析＞
直径0.25インチで、血液、牛乳及びインク（BMI）を含有する小見本片をCFT Vlaardingenから入手した。小見本片を切断する前に、織物(EMPA 116)を水で洗浄した。表面全体を暴露するために、ひとつの小見本片を96-ウエルのマイクロタイタープレートの各ウエルに垂直になるように置いた（すなわち、ウエルの底に広げたのではない）。所望の洗剤液を本願に開示する方法で調製した。Thermomixerを25℃の一定温度にした後、小見本片を入れたMTPの各ウエルに洗剤液190 μlを添加した。この混合液に希釈酵素溶液10 μlを加え、最終酵素濃度を1 μg/ml（BCA分析で測定）にした。MTPをテープでシールし、インキュベーターに取り付けて1400rpmで30分間攪拌した。適切な条件下でインキュベートした後、各ウエルから100μlの溶液を採取し、新しいMTPへ移した。各ウエルに溶液を100μl入れた新しいMTPを、MTP SpectraMax readerリーダーを用いて405nmにおいて測定した。ブランクコントロール、2つの小見本片からなるコントロール、及び酵素を含有しない洗剤も含め、評価した。
【０２３７】
＜加熱卵マイクロタイター分析＞
ニワトリ卵黄を用いて、96-ウエル加熱卵黄基質プレートを調製した。ニワトリ卵黄を卵白から分離し、卵黄膜を除き、Milli-Q水で20%（体積／重量）に希釈した。希釈した卵黄を、マグネティックスターラーを用いて室温で15分間攪拌した。8チャンネルピペットを用いて、5μlを注意深く96穴V底型プレート（Costar #3894）の各ウエルの中央に滴下した。プレートを90℃で1時間加熱し、室温で冷却した。加熱卵黄基質プレートを室温で保存し、調製後1週間以内に使用した。自動食器洗い機用洗剤を本明細書に記載の方法で調製し、50℃まで予熱した。8チャンネルピペット装置を用いて、洗剤液190μlを96-ウエルプレートの各ウエルに添加した。希釈した酵素10μlを、96チャンネルピペットを用いて各ウエルに添加した。このプレートを注意深く接着性ホイルシーラーで覆い、50℃で攪拌しながら30分間インキュベートした。この反応混合液120μlを新しい96-ウエル平底プレートに移し、吸光度／光散乱を405nmで測定した。405nmでの吸光度／光散乱は卵黄除去に比例する。
【０２３８】
＜卵黄小見本片分析(“CS-38 小見本片分析”; 又は “卵” 又は “食器”)＞
食器洗浄機用洗剤を、本願に開示した方法で調製した。用いた装置はNew Brunswick Innova 4230 シェーカー／インキュベーター及びＳSpectraMAX (type 340) MTPリーダーであった。Costar 社製(type 9017)のMTPを用いた。Center for Test Materials (Vlaardingen, Netherlands)から入手した染料含有熟成卵黄見本(CSp-8)を用いた。 布地を水で洗浄した後、0.25インチの円形の小見本片を切り出した。を96穴マイクロタイタープレートの各ウエルに小見本片を1つ置いた。試験洗剤を50℃にした。小見本片を入れたMTPの各ウエルに、洗剤液190μlを添加した。この液に希釈酵素溶液10μlを加えた。MTPを粘着ホイルでシールし、インキュベーターで30分間攪拌した。インキュベーションに続いて、各ウエルから溶液100μlを採取し、新しいMTPへ移した。このMTPをSpectraMax MTPリーダーを用いて405nmで測定した。ブランクコントロール、及び小見本片及び洗剤を含有するが酵素は含有していないコントロールも測定した。
【０２３９】
＜「予洗」小見本片＞
このタイプの小見本片は、室温において脱イオン水で20分間予備洗浄して調製した。予備洗浄ステップの後、見本片をペーパータオル上で乾燥させた。風乾した見本変を、打ち抜きパンチに取り付けた1/4インチ円形ダイで打ち抜いた。最後に、2つの小見本片を、96-ウエルMTPの各ウエルに、表面積全体が露出するようにして置いた（すなわち、ウエルの底に広げたのではない）。
【０２４０】
＜洗剤＞
北米(NA)及び西ヨーロッパ(WE)強力液体洗剤(HDL) について、予め秤量した（ガラス瓶に入れた）液体洗剤を95℃の水浴に2時間入れて熱不活性化した。実施例で用いた洗剤は、各地のスーパーマーケットで購入した市販の洗剤であった。上記のように、これらの洗剤に含まれていた酵素を加熱処理により不活性化した。北米(NA)及び日本(JPN)の顆粒状強力洗濯(HDG)洗剤の熱不活性化時間は8時間で、西ヨーロッパ(WE)のHDG洗剤の熱不活性化時間は5時間であった。NA及びWEの食器洗浄機 (ADW) 用洗剤を熱不活性化するときの加熱時間は8時間であった。非加熱及び加熱処理洗剤の両者について、不活性化のパーセンテージを性格に測定するために、洗剤を溶解させた後5分以内に評価した。酵素活性はAAPF分析により測定した。
【０２４１】
熱不活性化した洗剤中の酵素の活性を測定するために、熱不活性化ストック溶液からワーキング溶液を調製した。適切な量の水硬度（6 gpg 又は12 gpg）及び緩衝液を洗剤溶液に添加して、所望の条件にした。この溶液を、瓶を振るか又は逆さにすることにより混合した。Table 1-1に、ここで使用した市販の洗剤及び試験条件に関する情報を示す。下記の実施例に示すように、いくつかの実験では追加の及び／又は別の市販の洗剤を用いた
【表３】
0005911825.tif 000005
【０２４２】
＜酵素及び装置＞
GCI-P036のサンプル、及びその変異体のサンプルは、MTPプレートで培養した培養ブロスを濾過して調製した。使用した装置は、Biomek FX Robot (Beckman Coulter社)、SpectraMAX MTPリーダー (type 340; Molecular Devices社)、iEMSインキュベータ/シェーカー (Thermo/Labsystems社); 平底MTP (Costar社 type 9017、インキュベーション後の反応プレートの測定に使用）; 及びV-底MTP (Greiner社651101、上清の予備希釈に使用) であった。この分析では、プロテアーゼが基質を加水分解し、基質から色素と不溶性部粒子が放出される。従って、濁度の増加速度が酵素活性の指標となる。
【０２４３】
小見本片での参照セリンプロテアーゼと、その変異体の汚れ除去性能を、市販の洗剤(Calgonit 5 in1)を用いてMTPスケールで評価した。CFT Vlaardingenから入手した CS-38小見本片（卵黄及び色素、加熱により熟成）を基質に用いた。各ウエルに2つの小見本片を入れた。Calgonit 5in1のADW錠剤を用いて洗剤溶液を調整した。錠剤中のプロテアーゼ活性を不活性化させるために、水浴中で60℃に加熱したMilli-Q水に、錠剤21gを溶解させた。この溶液を室温まで冷却し、水で容積を700mlに調節した。この溶液をさらに水で希釈して、最終的に濃度を3 g/lとした。1.46 ml のCa/Mg-混合液 (Ca/Mg 混合物 [(3:1), 1.92 M CaCl2 =282.3 g/L CaCl2.2H20; 0.64 M MgCl2 = 130.1 g/L MgCl2.6H2O), 15000gpg]を添加することにより、水の硬度を21°GHに調節した。酵素のサンプルを予め10 mM NaCl, 0.1 mM CaCl2, 0.005% TWEENTM-80溶液で希釈しておき、適切な濃度においてテストした。
【０２４４】
インキュベーターは、所定の温度である50℃に設定した。希釈緩衝液72μLを空のV-底プレート（すなわち「希釈プレート」）を添加し、次に上清8μLを添加した。希釈プレートから採取した9μLの液を、171μLの洗剤溶液中でインキュベートした小見本片を入れたプレートに添加した。希釈プレートから採取した9μLの液を、上清の総希釈率が200倍になるようにして、小見本片を入れたプレートに添加した。小見本片プレート（洗剤及び酵素入り）をテープで覆い、1400 rpmのインキュベーター・シェーカーに30分間取付けた。インキュベーション後、反応混合液75μLを、からの平底プレートに移し、ヘアードライヤで泡を取り除いた後、MTPリーダーにより405 nmの吸光度を測定した。この試験では、1又は2の小見本片と、プロテアーゼのサンプルが無添加の洗剤とを有するブランクコントロールも含めて評価した。
【０２４５】
また、小見本片での参照セリンプロテアーゼ、及びその変異体の汚れ除去性能を、市販の洗剤(Calgonit 5 in1)を用いてMTPスケールで評価した。使用した試薬は、5 mM HEPES, pH 8.0 又は 5 mM MOPS, pH 7 緩衝液, 中程度の水硬度用3:1 Ca: Mg。(CaCl2: MgCl2・6H2O); 6 gpg に希釈した15000 グレイン・パー・ガロン (gpg)ストック溶液, 1つのプレートにつき2つの BMI (血/ミルク/インク)見本片: CFT製の EMPA-116 BMI コットン見本片: 1つのプレートにつき2つの、予備洗浄後パンチ抜きした見本片、及び熱不活性化してプロテアーゼ活性が無いことを確認した市販のTIDETM 2X Coldwater洗剤。
【表４】
0005911825.tif 000006
【０２４６】
インキュベーターを所定の温度(16℃又は32℃)に設定した。この試験では、~10 ppm酵素のマスター希釈プレートから採取したサンプル10μLを、上記のワーキング洗剤溶液190μLと、2つのBMI見本片とが入れられた核プレートに添加した。各分析プレート中の各変異体の最終濃度が0.5 ppmになるように容積を調節した。各プレートを直ちにiEMSインキュベーターに取付け、所定の温度において1400 rpmで30分間振蕩した。インキュベーション後、上清100μLを新しい96-ウエルプレートに移し、MTPリーダーで405nm 及び／又は 600nmの吸光度を測定した。この試験では、1又は2の小見本片と、プロテアーゼサンプル無添加の洗剤とを入れたコントロールのウエルも評価した。405 nmの測定値は高い値で、色素の放出の指標であり、一方、600 nmの測定値は濁度及び洗浄度の指標である。
【０２４７】
＜全小見本片分析での汚れ除去活性の算出＞
測定された吸光値をブランク値（酵素を含有しない基質）について修正し、加水分解活性を評価した。各サンプル（変異体）について性能指数を計算した。性能指数は、同一のタンパク質濃度における変異体の性能（実際の値）と、標準酵素（理論値）との比較である。さらに理論値は、標準酵素のラングミュア式のパラメータを使って計算できる。
【０２４８】
＜E.  プロテアーゼ及びその変異体の相対的比活性度＞
プロテアーゼ変異体を識別するために、野生型又は標準プロテアーゼに対するプロテアーゼ変異体の対比及び順位付けを可能にするsuc-AAPF-pNAを基質として用いて、相対的比活性度を計算した。suc-AAPF-pNA基質に対する比活性度は、上記の分析を用いてタンパク質分解活性を、各サンプルのTCA-測定値で割り算することにより求めた。これらの値を用いて、相対的比活性度を求めた（変異体の比活性度／参照プロテアーゼの比活性度）。
【０２４９】
＜F.  エグリンC（Eglin C）阻害分析＞
本願に開示するように、セリンプロテアーゼの濃度及び比活性度を、阻害剤の滴定により求めた。ヒルのヒルド メディシナリス（Hirudo medicinalis）由来のエグリンCは、 スブチリシンに強く結合するタンパク質阻害剤である。 (Heinz 他、Biochemistry, 31(37): 8755-66 [1992])。従って、エグリンCを酵素濃度測定に用いることができ、同様に、特異的酵素活性を計算することができる。簡潔に言えば、いくつかの既知濃度のエグリンCにより生じる酵素阻害の量を測定する。この情報から、完全な阻害に必要とされるエグリンCの濃度を算出することができる。この値はサンプルにおける酵素濃度と同等である。
【０２５０】
プロテアーゼ活性は、上記の発色AAPF分析を用いて測定した。エグシンCの遺伝子を合成し、標準的方法でE. coli中に発現させた。その性質と阻害能力は、Sigma社から購入したエグシンCと同じであった。エグシンCのストック溶液の濃度は、比活性度が既知のバシラス・レンタス・スブチリシンのサンプルに対する阻害を測定して求めた。次に、較正されたエグシンCサンプルを用いて、スブチリシン変異体の濃度及び比活性度を測定した。これらの測定値を基に、全ての変異体が同一の濃度になるように希釈された、正規化96-ウエル酵素ストック溶液を調製した。
【０２５１】
＜G.  性能指数＞
性能指数は、同一のタンパク質濃度における変異体の性能（実際の値）と、標準または参照プロテアーゼ（理論値）との対比である。また、理論値は、標準プロテアーゼのラングミュア式のパラメータを使って計算することができる。性能指数（PI）が1より大きい場合（ PI＞1）は、標準（例えば、野生型）と比較してより優れた変異体であるものとし、他方、PIが1である場合（ PI＝1）は、変異体は標準と同じように機能するものとし、及びPIが1より小さい場合（ PI＜1）は、変異体は標準よりも機能が低いものとする。従って、PIにより勝者と、一定の環境の下での使用に関してあまり望ましくない変異体とが特定される。
【０２５２】
＜実施例２＞
＜B.スブチリス中でのGCI-P036プロテアーゼの産出＞
この実施例では、B.スブチリス中でGCI-P036プロテアーゼを産出させるために行った実験について説明する。以前開示した方法(例えばWO 2002/014490参照)により、GCI-P036及びその変異体をコードする発現ベクターを、B.スブチリスの細胞中 (ΔaprE, ΔnprE, oppA, ΔspoIIE, degUHy32, ΔamyE::[xylR,pxylA-comK]) に形質転換した。
【０２５３】
＜GCI-P036 プロテアーゼ産出 − pAC-GCI-P036ci＞
B.スブチリス中でGCI-P036 (本願では「バシラス・レンタス・スブチリシン」及び「GG36」とも呼ぶ)を産出する方法を例示する。発現プラスミドpAC-GG36ciを、コンセンサスaprEプロモータの制御下にある aprEシグナル配列の8番目のコドンに融合したGCI-P036コドン改善遺伝子、及び BPN’ 転写ターミネータを用いて調製した。いかに示す配列では、太字及びイタリック体はコンセンサスaprEプロモータを表し、標準フォントはシグナル配列を表し、下線部のフォントはプロ配列を表し、太字のフォントはGCI-P036成熟プロテアーゼをコードするDNAを表し、下線部のイタリック体フォントはBPN’ ターミネータを表す。KpnI 及びクローン化のためのXhoI制限酵素認識部位が、GCI-P036成熟プロテアーゼのコード領域に隣接する：
【化１】
0005911825.tif 000007
【０２５４】
GCI-P036前駆体タンパク質のアミノ酸配列を下記に示す。この配列では、シグナルペプチドをイタリック体で表し（N-末端ホルミルメチオニンから開始する）、プロ配列は下線で表し、成熟GCI-P036プロテアーゼ配列は太字で表している：
【化２】
0005911825.tif 000008
【０２５５】
成熟GCI-P036プロテアーゼのアミノ酸配列は下記の通りである。
【化３】
0005911825.tif 000009
【０２５６】
プラスミドpAC-GG36ciのエレメントにはpUB110 = プラスミド pUB110由来のDNAフラグメント (McKenzie et al., Plasmid 15:93-103, 1986)、pBR322 = プラスミドpBR322由来のDNAフラグメント (Bolivar et al., Gene 2:95-113, 1977)、 pC194 = プラスミドpC194由来のDNAフラグメント(Horinouchi et al., J Bacteriol, 150:815-825, 1982) が含まれる。プラスミドは次のように特徴付けられる：B.スブチリスのOri = pUB110からの複製の起点、CAT = pC194由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子、 pMB1起点 = pBR322からの複製の起点、 bla = pBR322由来のベータ-ラクタマーゼ、ショートaprE プロモータ =コンセンサス転写プロモータ、シグナルペプチド= シグナルペプチド、プロペプチド = GCI-P036 プロ領域、 GG36ci 成熟ペプチド = 成熟GCI-P036 (本願において発現された各変異体のコード領域により複製される)、 BPN’ ターミネータ =スブチリシン BPN’由来の転写ターミネータ。
【０２５７】
＜GCI-P036プロテアーゼ産出−pHPLT-GCI-P036＞
B.スブチリス中でGCI-P036参照プロテアーゼを産出する別の方法について説明する。GCI-P036プロテアーゼ前駆体をコードする合成遺伝子を、合成オリゴヌクレオチド及びPCR産品から調製した。このフラグメントを、BsmBI 及び HindIII制限酵素認識部位を用いてプラスミド骨格pHPLT (U.S. Patent No. 5,024,943) 中にクローン化した。pHPLT-GCI-P036の成熟GCI-P036プロテアーゼ(SEQ ID NO:2)のアミノ酸配列は、pAC-GG36ciと同じである。pHPLT B.スブチリス発現ベクターにはthe B. リケニフォルミス LAT プロモータ(Plat)が含まれ、さらにレプリカーゼ遺伝子(reppUB)、ネオマイシン/カナマイシ耐性遺伝子(neo) 、及びブレオマイシン耐性マーカ(bleo)を備える、pUB110 (McKenzie et al., Plasmid, 15:93-103, 1986)由来の別の複数のエレメントが含まれる。Pure YieldTM Plasmid Midiprep kit (Promega社)を用いて、形質転換されたバクテリアからプラスミドDNAを精製し、公知のUV分光分析法によりDNA濃度を求めた。得られたベクター構築体をGCI-P036 遺伝子のDNA 配列により検証したところ、予想される配列に対し100%の配列同一性が認められた。pHPLT-GCI-P036のGCI-P036 プロテアーゼ遺伝子のDNA配列を以下に示し、クローン化部位SacI及びHindIIIに下線を付して示す：
【化４】
0005911825.tif 000010
【０２５８】
＜組換えプロテアーゼ− 2 mlスケール＞
プロテアーゼ発現ベクターを備えるB. スブチリスのクローンを、鉄製の96-ウエルのレプリケータを用い、グリセロールのストック溶液から、200 μl の LB培地 + 25 μg/ml クロラムフェニコールを入れた96-ウエルの培養プレート(BD, 353075)へ移し、密閉湿潤条件下、37℃、220rpmにおいて一夜培養した。一夜培養液からサンプル200μlを採取し、5mlのプラスチック培養チューブ中の2000μl合成培地+ 25μg/mlクロラムフェニコールに植菌した。培養培地はMOPS緩衝液に基づき、主要な窒素源としての尿素、主要な酸素源としての炭素、及び補助成分として細胞を健全に成長させるための1%ソイトンを含む半合成富栄養化培地であった。培養チューブは、37℃、220rpmにおいて60時間インキュベートした。インキュベーション後、培養ブロスを8000 x RCF以上で遠心分離した。上清液を15mlのポリプロピレン製コニカルチューブに静かに移して貯蔵した。これ以上の精製又は濃縮は行わなかった。上清ストック溶液を長期間安定化させるために、最終濃度40%プロピレングリコールとなるように処方し、4℃で保管した。
【０２５９】
＜組換えプロテアーゼ−マイクロタイタープレート (MTP) スケール＞
また、をMOPSに基づく合成培地(MBD)を200μL入れた96ウエルマイクロタイタープレート中でB.スブチリス形質転換体を培養することによりプロテアーゼ変異体を調製した。MBD培地は、基本の培地からNH4Cl2, FeSO4, 及び CaCl2 を除去し、3 mM K2HPO4 を用い、基本の培地に60 mM 尿素, 75 g/L グルコース、及び1% ソイトンを添加した点を除き、公知の方法(Neidhardt et al., J Bacteriol, 119: 736-747, 1974参照)により調製した。また微量栄養素を、100Xストック溶液中の1リットル中に400 mg FeSO4 .7H2O, 100 mg MnSO4 .H2O, 100 mg ZnSO4.7H2O, 50 mg CuCl2.2H2O, 100 mg CoCl2.6H2O, 100 mg NaMoO4.2H2O, 100 mg Na2B4O7.10H2O, 10 ml の 1M CaCl2,及び 10 ml の 0.5 Mクエン酸ナトリウム含まれるように添加した。プレートを37℃で68時間インキュベートし、細胞を遠心分離により分離し、培養培地から対象とするタンパク質を得た。
【０２６０】
＜実施例３＞
＜GCI-P036変異体の生成＞
この実施例に、プロテアーゼ変異体を生成させる方法を開示する。
【０２６１】
＜GCI-P036部位評価ライブラリー(SEL)の構築＞
SELの構築は、独自の方法(WO 2004/059556A3)を用いるGENEARTにより行った。PCRによりタンパク質を発現させるためにヌクレオチド配列を最適化するための方法及び装置、及びDNA分子の製造には、GENEART (European Patent No. 0 200 362 及び 0 201 184; 及び US Patent No. 4,683,195, 4,683,202 及び6,472,184)により所有されているか、又はライセンスされている技術を用いた。この実施例に開示するGCI-P036 SELの構築は、GENEARTの遺伝子最適化、遺伝子合成、及びライブラリー構築及び分析技術及び方法を用いて行った。
【０２６２】
GCI-P036 SELは、発明者が予め選択した位置において、GENEARTにより構築した。pHPLT-GCI-P036 プラスミドDNA (図2参照)を、SacI及びHindIII 制限酵素で消化して3.9kbのフラグメントを放出させ、次にこのフラグメントをQiagenゲル精製キットを用いたアガロースゲルにより精製した。成熟配列の各アミノ酸を、少なくとも16種の異なるアミノ酸に突然変異させた。GCI-P036 SELを構築するために、3段階のPCRを行った：2段階のPCRは成熟GCI-P036 DNA配列中に対象とする突然変異コドンを導入する突然変異反応であり、3段階目のPCR反応では、2つの突然変異PCR産品を融合させて成熟GCI-P036配列中に所望の突然変異コドンを有するpHPLT-GCI-P036発現ベクターを構築した。
【０２６３】
突然変異誘発方法はコドン-特異的突然変異誘発的アプローチに基づいており、この方法では、特定のDNAトリプレットにおいて可能な全突然変異の誘発を、長さが25から45ヌクレオチドのフォワード及びリバースオリゴヌクレオチドプライマーを用いて行い、突然変異誘発されるコドンの配列に対応し、対象とする特異的コドンへのヌクレオチドのランダムな導入が保証される、特異的に設計されたトリプレットDNA配列NNS ((A,C,T 又は G), (A,C,T 又は G), (C 又は G))を用いて行った。部位評価ライブラリーの構築に用いられる別の2つのプライマーは、SacI部位を備える上流プライマーと、HindIII部位を備える下流プライマーである。各SELの構築は、フォワードSacIプライマー及び特異的GCI-P036リバース突然変異誘発プライマーを用いた2段階の予備PCR増幅から初め、次のPCR反応ではリバースHindIIIプライマーと、特異的GCI-P036フォワード突然変異誘発プライマー (フォワード及びリバース突然変異誘発プライマーのGCI-P036成熟コドン位置に等しい)が用いられる。
【０２６４】
成熟GCI-P036配列への突然変異の導入は、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes社 カタログ No. F-530L)を用いて行った。全てのPCR反応は、ポリメラーゼとともに供給された製造者の取扱説明書に従って行った。PCRの条件は次の通りである：
予備PCR 1：
FW SacI プライマー、及び特異的 GCI-P036リバース突然変異誘発プライマー − いずれも1 μL (10 μM)；及び
予備PCR 2：
RV HindIIIプライマー、及び特異的GCI-P036フォワード突然変異誘発プライマー − いずれも1 μL (10 μM)。 
この実施例で用いたプライマー配列を下記に示す。
【表５】
0005911825.tif 000011
【表６】
0005911825.tif 000012
【０２６５】
各反応液には次記が含まれていた：5X Phusion HF 緩衝液10 μL、10 mM dNTP混合液1 μL、Phusion DNAポリメラーゼ0.75 μL (2 ユニット/ μL)、1 μLの原液DMSO、1 μLのpHPLT-GCI-P036テンプレートDNA (0.1 − 1 ng/ μL)、及びdH2Oで50 μLに定容。
【０２６６】
PCRはMJ Research PTC-200 Peltierサーマル・サイクラーを用いて、次のプログラムで行った：98°C で30秒間、30X (98°C で10秒間、55°Cで 20秒間、72°Cで 1分間) 及び72°Cで5分間。 これらの反応により、対象とするGCI-P036成熟コドンの周辺に約30ヌクレオチドのオーバーラップを有する約2から3 kbの2つのフラグメントが得られた。
【０２６７】
3段階目の反応において、前記の2つのフラグメントと、フォワード及びリバースSacI-Fw及びHindIII-Rv プライマーとを用いて、これらのフラグメントを融合した。融合PCR反応は： SacI-Fw 及びHindIII-Rv プライマー (10 μM)各1 μL 、5X Phusion HF緩衝液10 μL、10 mM dNTP混合液1 μL、PhusionTM DNAポリメラーゼ (2 ユニット/ μL) 0.75 μL、1 μLの原液DMSO、予備PCR 1反応混合液1 μL、予備PCR 2反応混合液1 μL、及び最終容積を50 μLにするためのdH2Oを含有する溶液を用いて行った。PCR融合のプログラムは次の通りであった： 98℃で30秒間、30X (98℃で10秒間、55℃で20秒間、72℃で40秒間) 及び72℃で5分間、MJ Research PTC-200 Peltierサーマルサイクラー使用。増幅した、GCI-P036遺伝子をコードする859 bp直鎖状フラグメントを精製し(QIAGENTM Qiaquick PCR purification kit, カタログNo. 28106使用)、SacI 及びHindIIII制限酵素で消化して、融合フラグメントの両端に付着端を形成した。約50ngのプラスミドpHPLT-GCI-P036を、SacI 及びHindIIII制限酵素で消化した。3.9kbのベクター骨格フラグメントを単離し、前記消化により得られ、変異体酵素をコードする859bpのフラグメントに結紮した。結紮は、T4 DNAリガーゼ (Invitrogen社)を付着端クローン化用の取扱説明書に従って用いて行った。次に、(WO 2002/014490)に開示されているように、結紮混合液をB. スブチリス細胞(ΔaprE, ΔnprE, oppA, ΔspoIIE, degUHy32, ΔamyE::[xylR,pxylA-comK])の形質転換に用いた。
【０２６８】
各ライブラリーについて96のシングルコロニーを採取して、TSB (トリプトン及び大豆ベースのブロス)液体培地において、次のDNA単離及び遺伝子配列分析のために、ネオマイシン選択条件下で培養した。ライブラリーの番号は1から269までであった。各番号は、突然変異誘発された成熟GCI-P036の配列のコドンを表す。各ライブラリーには最大19のGCI-P036変異体が含まれていた。
【０２６９】
＜GCI-P036多重突然変異ライブラリー(MML)の構築＞
各合成GCI-P036多重突然変異ライブラリーには、2以上の選択されたコドンが特定のDNA配列で置き換えられた、GCI-P036遺伝子の混合物が含まれている。組み合わせGCI-P036遺伝子のクローン化は、Sloning BioTechnology GmbH社によりSlonomax Technologyを用いて実施された。次のTables 3-1 及び 3-2に、MMLのメンバー中に存在する置換のリストを示す。これらの表中の番号はそれぞれ、GCI-P036参照配列及びBPN’ 参照配列に対応して賦与されている。
【表７】
0005911825.tif 000013
0005911825.tif 000014
【表８】
0005911825.tif 000015
0005911825.tif 000016
【０２７０】
＜実施例４＞
＜GCI-P036の性能＞
種々の単一置換GCI-P036変異体の汚れ除去性能を評価するために、BMI分析(TIDE 2XTM 低温水; 32℃, pH8) 及び CS-38小見本片分析 (CALGONITTM ; WE ADW)により行った実験を説明する。また、LAS/EDTA安定性、AAPF活性の性能指数、及びタンパク質含有量も測定した。全ての分析は実施例1の方法を用いて行った。
【０２７１】
Table 4-1に、269箇所の位置における4,210種のスブチリシンGCI-P036変異体の性能指数値を示す。GCI-P036変異体の性能を、野生型GCI-P036酵素と比較した。性能指数が1より大きい(PI >1)変異体は、改善された性能を有する。性能指数が0.05以下の場合は0.05であるものとし、表中に太字のイタリック体で示した。安定性評価では、安定性評価における活性の性能指数が0.05以下の場合の性能指数値はND（検出不能）と表記した。また、性能指数値を測定しなかった変異体についてもNDと表記した。
【０２７２】
性能指数(PI)は、変異体の性能の、親又は参照プロテアーゼの性能に対する比率である。下記の種々の用語を、突然変異の説明に用いる：上昇突然変異はPI > 1である；中立突然変異はPI > 0.5である；非有害突然変異はPI > 0.05である；有害突然変異はPI = 0.05である；結合突然変異とは、その変異体が少なくとも1の性質について性能指数値=0.5を有し、全ての性質について>0.05である変異体を意味する。結合突然変異の集合体は、複数種を組み合わせることにより1以上の所望の性質について適切な性能指数を有するタンパク質集合体が得られるような変異体である。突然変異が生じる場所の分類は次の通りである：非制限的位置は、少なくとも1の性質について≧ 20%の中立突然変異を有する；制限的位置は、活性と安定性について＜ 20%の中立突然変異を有する。
【０２７３】
これらのデータは、スブチリシン/スブチラーゼの設計に用いることができる。設計されるスブチラーゼが、特定の位置においてスブチリシンGCI-P036とは異なるアミノ酸を有する場合でも、これらのデータにより、GCI-P036野生型アミノ酸の置換を含め、最適の置換位置を特定して所望の性質を改変するための置換位置を見出すために用いることができる。
【表９】
0005911825.tif 000017
0005911825.tif 000018
0005911825.tif 000019
0005911825.tif 000020
0005911825.tif 000021
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0005911825.tif 000047
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0005911825.tif 000054
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0005911825.tif 000057
0005911825.tif 000058
0005911825.tif 000059
0005911825.tif 000060
【０２７４】
＜実施例５＞
＜GCI-P036変異体のデータの比較評価＞
この実施例では、GCI-P036及びGCI-PO36変異体のタンパク質発現、汚れ除去活性、LAS/EDTA安定性、及びAAPF活性 (対象とする性質の試験)について評価した実験結果を対比する。本願に開示するように、GCI-P036変異体の機能を、変異体及び参照プロテアーゼの性能の比である性能指数(PI)として定量した。本願でのPIの分類は：上昇突然変異(PI>1.0)；中立突然変異(PI>0.5)；非有害突然変異(PI>0.05);及び有害突然変異(PI≦0.05)である。
【０２７５】
GCI-PO36変異体の最初のスクリーニングでは、次に示す位置の少なくとも1の突然変異が、少なくとも1の性質について、1より大きい性能指数(PI > 1.0)に関係していた：1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 59, 60, 61, 62, 63, 66, 67, 68, 69, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 及び 275 (例えば上昇突然変異)。これらの位置の突然変異を組み合わせて、活性又は安定性又は発現を改善することが可能であろう。
【０２７６】
特に、GCI-P036における以下の置換が、少なくとも1の対象とする試験において好ましい結果に関係していた（例えば野生型酵素より優れている）。これらの突然変異は性能を個別に改善する場合に特に有用である。本願に記載しているように、以下のリストでは各部位を3桁の数字で位置表示するために、最初に「0」を表示した（例えば「0001」は「1」と同じであり、従って「A001C」は「A1C」と同じである）。また本願では、「X」は任意のアミノ酸残基を意味する。
X001A, X001C, X001E, X001F, X001G, X001H, X001I, X001K, X001L, X001N, X001P, X001Q, X001R, X001S, X001T, X001V, X001Y, X002A, X002C, X002E, X002G, X002K, X002L, X002M, X002N, X002P, X002Q, X002R, X002S, X002T, X002V, X002W, X002Y, X003D, X003E, X003F, X003G, X003H, X003I, X003L, X003M, X003N, X003P, X003R, X003S, X003T, X003V, X003W, X003Y, X004A, X004C, X004D, X004E, X004F, X004G, X004H, X004K, X004L, X004N, X004P, X004R, X004S, X004T, X004V, X004W, X005A, X005C, X005D, X005E, X005G, X005I, X005M, X005P, X005Q, X005S, X005T, X005W, X005Y, X006A, X006D, X006E, X006M, X006W, X007A, X007C, X007D, X007G, X007H, X007N, X007P, X007Q, X007S, X007T, X008A, X008F, X008G, X008I, X008L, X008M, X008Q, X008T, X008V, X008W, X008Y, X009A, X009C, X009D, X009E, X009F, X009G, X009H, X009L, X009N, X009P, X009Q, X009R, X009S, X009T, X009V, X009W, X009Y, X010A, X010C, X010F, X010G, X010H, X010I, X010K, X010L, X010M, X010N, X010Q, X010R, X010S, X010T, X010V, X010W, X010Y, X011A, X011C, X011D, X011G, X011I, X011M, X011S, X011T, X011V, X012D, X012F, X012G, X012H, X012I, X012K, X012L, X012M, X012N, X012P, X012Q, X012R, X012S, X012T, X012V, X012W, X013A, X013G, X013I, X013M, X013Q, X013T, X013V, X014A, X014C, X014D, X014E, X014F, X014G, X014H, X014I, X014K, X014L, X014P, X014Q, X014S, X014T, X014V, X014Y, X015A, X015D, X015F, X015G, X015I, X015K, X015L, X015M, X015P, X015Q, X015R, X015S, X015V, X015W, X016A, X016D, X016E, X016G, X016L, X016N, X016P, X016Q, X016R, X016S, X016T, X016V, X017A, X017D, X017E, X017F, X017G, X017H, X017I, X017K, X017M, X017N, X017R, X017S, X017T, X017V, X017W, X017Y, X018A, X018C, X018D, X018E, X018F, X018G, X018H, X018K, X018L, X018M, X018N, X018P, X018Q, X018R, X018S, X018T, X018V, X018W, X018Y, X019A, X019C, X019D, X019E, X019F, X019G, X019H, X019K, X019L, X019M, X019N, X019P, X019R, X019S, X019T, X019V, X019W, X019Y, X020A, X020C, X020D, X020F, X020G, X020I, X020K, X020L, X020M, X020P, X020Q, X020R, X020S, X020T, X020V, X020W, X020Y, X021A, X021C, X021D, X021E, 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X224E, X224G, X224I, X224L, X224N, X224P, X224S, X224T, X225A, X225C, X225G, X225N, X225P, X225S, X225T, X225V, X226C, X226F, X226G, X226H, X226I, X226L, X226M, X226N, X226R, X226S, X226T, X226V, X226Y, X227A, X227C, X227F, X227G, X227I, X227L, X227M, X227Q, X227S, X227T, X227V, X227Y, X228A, X228C, X228G, X228I, X228L, X228M, X228S, X228V, X229A, X229G, X229P, X229S, X230A, X230D, X230E, X230F, X230G, X230H, X230I, X230L, X230N, X230P, X230Q, X230S, X230T, X230V, X230W, X230Y, X231A, X231C, X231F, X231G, X231H, X231I, X231L, X231S, X231T, X231W, X231Y, X232A, X232G, X232H, X232L, X232M, X232S, X232V, X233A, X233C, X233E, X233F, X233G, X233I, X233L, X233M, X233N, X233P, X233Q, X233R, X233S, X233T, X233V, X233Y, X234D, X234F, X234G, X234H, X234L, X234M, X234N, X234P, X234Q, X234S, X234T, X234V, X234Y, X235C, X235D, X235E, X235F, X235G, X235H, X235I, X235K, X235L, X235M, X235N, X235Q, X235R, X235S, X235V, X235W, X235Y, X236A, X236C, X236E, X236F, X236G, X236H, X236K, X236L, X236N, X236P, 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X238M, X238N, X238Q, X238R, X238S, X238T, X238V, X238Y, X239C, X239D, X239F, X239G, X239H, X239I, X239K, X239L, X239M, X239N, X239P, X239Q, X239R, X239S, X239T, X239V, X239W, X239Y, X240A, X240C, X240E, X240F, X240I, X240K, X240L, X240M, X240N, X240Q, X240R, X240S, X240T, X240W, X240Y, X241A, X241C, X241D, X241E, X241F, X241G, X241H, X241I, X241K, X241L, X241M, X241N, X241P, X241Q, X241R, X241S, X241T, X241V, X241W, X241Y, X242A, X242C, X242D, X242F, X242G, X242H, X242I, X242L, X242M, X242P, X242Q, X242R, X242S, X242T, X242V, X242W, X243C, X243D, X243E, X243F, X243G, X243H, X243I, X243K, X243L, X243M, X243N, X243P, X243Q, X243R, X243S, X243T, X243V, X243W, X244A, X244D, X244E, X244F, X244H, X244I, X244L, X244M, X244N, X244P, X244Q, X244R, X244S, X244T, X244V, X244W, X244Y, X245A, X245C, X245E, X245G, X245H, X245K, X245L, X245P, X245Q, X245R, X245S, X245V, X245W, X245Y, X246A, X246C, X246E, X246F, X246G, X246H, X246I, X246L, X246M, X246N, X246P, X246Q, X246R, X246S, X246T, X246V, X246W, X246Y, X247A, X247C, X247D, X247E, X247F, X247G, X247H, X247I, X247K, X247L, X247M, X247N, X247P, X247Q, X247R, X247S, X247T, X247V, X247W, X247Y, X248C, X248D, X248E, X248G, X248H, X248I, X248K, X248L, X248M, X248N, X248P, X248R, X248S, X248T, X248V, X248W, X248Y, X249A, X249D, X249E, X249F, X249G, X249H, X249I, X249K, X249L, X249M, X249N, X249Q, X249R, X249S, X249T, X249V, X249W, X249Y, X250A, X250C, X250E, X250F, X250G, X250H, X250I, X250L, X250M, X250N, X250Q, X250S, X250V, X250Y, X251A, X251D, X251E, X251F, X251G, X251K, X251L, X251M, X251P, X251Q, X251R, X251S, X251T, X251V, X251Y, X252A, X252C, X252D, X252F, X252G, X252H, X252I, X252K, X252L, X252M, X252N, X252P, X252R, X252S, X252V, X252W, X252Y, X253A, X253D, X253E, X253F, X253G, X253H, X253I, X253K, X253M, X253R, X253S, X253T, X253V, X253W, X254A, X254C, X254D, X254G, X254N, X254P, X254S, X254T, X254V, X255A, X255C, X255D, X255E, X255F, X255H, X255I, X255L, X255N, X255P, X255Q, X255R, X255S, X255T, X255V, X255W, X255Y, X256A, X256C, X256D, X256E, X256G, X256H, X256I, X256K, X256L, X256M, X256N, X256P, X256R, X256S, X256T, X256V, X256W, X256Y, X257A, X257C, X257E, X257F, X257G, X257H, X257I, X257K, X257L, X257M, X257P, X257S, X257T, X257V, X257W, X257Y, X258A, X258C, X258D, X258E, X258F, X258G, X258H, X258I, X258L, X258M, X258P, X258Q, X258R, X258S, X258T, X258V, X258W, X258Y, X259A, X259C, X259E, X259G, X259I, X259L, X259M, X259P, X259Q, X259R, X259S, X259T, X259V, X260A, X260D, X260E, X260F, X260H, X260I, X260L, X260M, X260N, X260P, X260R, X260S, X260T, X260V, X260Y, X261A, X261C, X261E, X261F, X261G, X261I, X261K, X261L, X261N, X261P, X261Q, X261R, X261S, X261T, X261V, X261W, X261Y, X262A, X262C, X262D, X262F, X262G, X262H, X262I, X262K, X262L, X262M, X262P, X262Q, X262R, X262S, X262T, X262V, X262W, X262Y, X263A, X263C, X263D, X263F, X263G, X263H, X263I, X263L, X263M, X263N, X263P, X263Q, X263R, X263W, X263Y, X264A, X264C, X264E, X264F, X264G, X264H, X264I, X264P, X264Q, X264S, X264V, X264Y, X265A, X265C, X265D, X265F, X265G, X265H, X265I, X265K, X265L, X265M, X265P, X265Q, X265R, X265S, X265T, X265V, X265W, X265Y, X266G, X266W, X267A, X267C, X267D, X267E, X267F, X267G, X267H, X267I, X267K, X267L, X267M, X267N, X267S, X267T, X267V, X267Y, X268A, X268D, X268E, X268G, X268H, X268K, X268L, X268M, X268N, X268P, X268Q, X268R, X268S, X268V, X268W, X268Y, X269C, X269D, X269F, X269G, X269H, X269I, X269L, X269M, X269N, X269Q, X269R, X269S, X269T, X269V, X270A, X270C, X270D, X270E, X270F, X270G, X270H, X270I, X270L, X270M, X270N, X270P, X270Q, X270S, X270T, X270V, X271A, X271C, X271E, X271F, X271G, X271H, X271I, X271K, X271L, X271M, X271N, X271P, X271T, X271V, X271Y, X272A, X272C, X272D, X272E, X272F, X272G, X272H, X272K, X272L, X272M, X272N, X272P, X272R, X272S, X272T, X272W, X272Y, X273A, X273C, X273D, X273E, X273F, X273G, X273H, X273I, X273K, X273L, X273R, X273S, X273T, X273V, X273W, X273Y, X274A, X274C, X274D, X274E, X274G, X274H, X274K, X274L, X274M, X274N, X274P, X274Q, X274R, X274S, X274T, X274W, X275A, X275C, X275D, X275E, X275F, X275G, X275H, X275K, X275L, X275M, X275P, X275Q, X275R, X275V, X275W, X275W。
一方、位置64, 65 及び 70の最初のスクリーニングでは、少なくとも1の性質について性能指数が1.0より大きくなる(PI>1.0)突然変異は認められなかった。
【０２７７】
GCI-PO36変異体のスクリーニングにおいて、次の248箇所の内の少なくとも1の突然変異が、BMI, CS-38小見本片分析又は AAPF活性のいずれかの1より大きい性能指数に関係し、LAS安定性又は TCA 分析において0.8より大きい性能指数を有していた：1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 35, 36, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 59, 60, 61, 62, 63, 66, 68, 69, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 156, 158, 159, 160, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 191, 192, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 220, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 及び275。これらの位置における突然変異を組み合わせることにより、安定性又は発現性を維持しながら活性を改善することが可能であろう。またこれらの位置の突然変異を組み合わせることにより、安定性又は発現性が改善され、活性が維持又は強化された変異体を作ることが可能であろう。
【０２７８】
以下に、BMI, CS-38小見本片分析、又は AAPF活性のいずれかの性能指数が1より大きく、LAS 安定性又はTCA分析の性能指数が0.8より大きくなる置換のリストを示す（ここで「X」は任意のアミノ酸を表す）。これらの変異体を組み合わせて、安定性又は発現性を維持又は強化しながら活性を改善するか、又は、活性を維持又は強化しながら安定性又は発現性を改善することが可能であろう：X001A, X001C, X001E, X001F, X001G, X001H, X001I, X001K, X001L, X001N, X001Q, X001R, X001S, X001T, X001V, X001Y, X002A, X002C, X002E, X002G, X002K, X002L, X002M, X002N, X002P, X002Q, X002R, X002S, X002T, X002V, X002W, X002Y, X003D, X003E, X003F, X003G, X003H, X003I, X003L, X003M, X003N, X003P, X003R, X003S, X003T, X003V, X003W, X003Y, X004A, X004C, X004D, X004E, X004F, X004H, X004K, X004L, X004N, X004P, X004R, X004S, X004T, X004V, X004W, X005A, X005C, X005D, X005E, X005G, X005P, X005Q, X005S, X005T, X007A, X007C, X007D, X007G, X007H, X007N, X007S, X007T, X008A, X008F, X008I, X008L, X008M, X008T, X008V, X009D, X009E, X009F, X009G, X009H, X009L, X009N, X009P, X009Q, X009R, X009S, X009T, X009V, X009W, X009Y, X010A, X010C, X010G, X010H, X010K, X010M, X010N, X010Q, X010R, X010S, X010T, X010W, X011A, X011I, X011M, X011S, X011V, X012D, X012F, X012G, X012H, X012I, X012K, X012L, X012M, X012N, X012Q, X012R, X012S, X012T, X012V, X012W, X013A, X013G, X013I, X013T, X013V, X014A, X014D, X014E, X014F, X014H, X014I, X014K, X014L, X014P, X014Q, X014S, X014T, X014V, X014Y, X015A, X015D, X015F, X015G, X015I, X015K, X015L, X015M, X015P, X015Q, X015R, X015S, X015V, X015W, X016A, X016G, X016L, X016N, X016P, X016Q, X016S, X016T, X016V, X017A, X017F, X017H, X017I, X017K, X017M, X017N, X017R, X017S, X017V, X017W, X017Y, X018A, X018C, X018D, X018E, X018F, X018G, X018H, X018K, X018L, X018M, X018N, X018P, X018Q, X018R, X018S, X018T, X018V, X018W, X018Y, X019A, X019C, X019D, X019E, X019F, X019G, X019H, X019K, X019L, X019M, X019N, X019R, X019S, X019T, X019V, X019W, X019Y, X020A, X020C, X020D, X020F, X020G, X020I, X020K, X020L, X020M, X020P, X020Q, X020R, X020S, X020T, X020V, X020W, X020Y, X021A, X021C, X021D, X021E, X021G, X021H, X021I, X021K, X021L, X021M, X021N, X021P, X021Q, X021R, X021S, X021T, X021V, X021W, X022A, X022C, X022G, X022I, X022K, X022L, X022M, X022N, X022P, X022Q, X022R, X022S, X022T, X022V, X022W, X022Y, X023A, X023G, X023S, X024A, X024C, X024D, X024F, X024G, X024H, X024L, X024M, X024N, X024P, X024Q, X024R, X024S, X024T, X024V, X024W, X025C, X025D, X025E, X025F, X025G, X025H, X025K, X025L, X025M, X025N, X025Q, X025R, X025S, X025T, X025V, X025W, X026C, X026F, X026G, X026I, X026L, X026M, X026N, X026P, X026R, X026S, X026T, X026V, X027A, X027C, X027D, X027F, X027G, X027I, X027K, X027L, X027M, X027N, X027P, X027R, X027S, X027T, X027V, X027W, X027Y, X028A, X028E, X028H, X028I, X028L, X028M, X028N, X028S, X028V, X029A, X029C, X029G, X029S, X029V, X030C, X030E, X030L, X030S, X030T, X030V, X031A, X031F, X031I, X031L, X031M, X031S, X031T, X031V, X033A, X033D, X033E, X033G, X033H, X033M, X033N, X033Q, X033S, X033T, X033Y, X035A, X035F, X035I, X035L, X035M, X035P, X036A, X036C, X036E, X036F, X036G, X036H, X036I, X036L, X036M, X036N, X036Q, X036R, X036S, X036T, X036V, X038C, X038F, X038G, X038H, X038I, X038K, X038L, X038M, X038N, X038Q, X038R, X038T, X038V, X038W, X038Y, X039H, X039V, X040A, X040C, X040D, X040E, X040G, X040H, X040I, X040K, X040L, X040M, X040N, X040P, X040R, X040S, X040T, X040V, X040W, X040Y, X041D, X041E, X042C, X042H, X042I, X042L, X042M, X042N, X042T, X042V, X043A, X043C, X043D, X043E, X043F, X043G, X043I, X043L, X043M, X043N, X043P, X043R, X043S, X043T, X043V, X043W, X043Y, X044A, X044C, X044D, X044G, X044I, X044K, X044L, X044M, X044N, X044P, X044Q, X044R, X044S, X044T, X044V, X044W, X044Y, X045A, X045D, X045F, X045G, X045H, X045I, X045K, X045L, X045M, X045N, X045P, X045Q, X045R, X045S, X045T, X045V, X045W, X045Y, X046C, X046D, X046E, X046F, X046G, X046H, X046I, X046K, X046L, X046M, X046N, X046P, X046Q, X046R, X046S, X046T, X046V, X046W, X047A, X047F, X047G, X047N, X047R, X047S, X047T, X047W, X048A, X048C, X048E, X048F, X048G, X048H, X048I, X048K, X048L, X048M, X048N, X048P, X048Q, X048R, X048S, X048T, X048V, X048Y, X049A, X049F, X049G, X049L, X049M, X049P, X049S, X049T, X050C, X050F, X050H, X050I, X050L, X050N, X050T, X050V, X050Y, X051F, X051G, X051H, X051K, X051L, X051N, X051P, X051R, X051S, X051T, X051V, X051W, X052A, X052C, X052E, X052F, X052G, X052H, X052I, X052L, X052M, X052N, X052P, X052Q, X052R, X052T, X052V, X052W, X052Y, X053A, X053C, X053D, X053E, X053G, X053H, X053K, X053L, X053M, X053P, X053Q, X053R, X053S, X053T, X053V, X053W, X053Y, X054A, X054C, X054D, X054E, X054F, X054I, X054M, X054N, X054Q, X054S, X054V, X055A, X055C, X055E, X055F, X055G, X055H, X055I, X055K, X055L, X055M, X055N, X055P, X055Q, X055S, X055T, X055W, X055Y, X056A, X056C, X056D, X056E, X056H, X056L, X056M, X056N, X056P, X056Q, X056S, X056T, X057A, X057C, X057E, X057F, X057G, X057H, X057I, X057K, X057L, X057M, X057N, X057P, X057Q, X057R, X057S, X057T, X057V, X057W, X057Y, X059A, X059C, X059D, X059E, X059F, X059G, X059I, X059L, X059M, X059N, X059P, X059Q, X059R, X059S, X059T, X059V, X059W, X059Y, X060D, X060S, X060V, X061A, X061C, X061D, X061F, X061G, X061H, X061I, X061L, X061M, X061N, X061P, X061R, X061S, X061T, X061V, X061Y, X062C, X062E, X062F, X062G, X062H, X062I, X062K, X062L, X062M, X062N, X062P, X062Q, X062R, X062S, X062T, X062V, X062Y, X063A, X063C, X063D, X063E, X063F, X063G, X063H, X063K, X063M, X063Q, X063R, X063S, X063W, X066K, X066S, X066T, X068I, X068T, X068V, X069A, X069E, X069G, X069N, X069S, X069T, X071A, X071I, X071N, X071T, X071V, X072C, X072F, X072I, X072L, X072M, X072T, X072V, X073A, X073C, X073D, X073E, X073H, X073K, X073L, X073N, X073S, X073T, X073V, X074A, X074C, X074S, X075A, X075H, X075I, X075L, X075M, X075N, X075P, X075Q, X075R, X075S, X075V, X076D, X076E, X076F, X076G, X076H, X076K, X076M, X076N, X076Q, X076R, X076S, X076T, X076W, X076Y, X077D, X077N, X078A, X078C, X078E, X078F, X078G, X078H, X078I, X078K, X078L, X078M, X078N, X078P, X078Q, X078R, X078S, X078T, X078V, X078Y, X079C, X079D, X079E, X079F, X079G, X079I, X079K, X079L, X079N, X079Q, X079R, X079S, X079T, X079V, X079W, X079Y, X081C, X081G, X081H, 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X234M, X234N, X234Q, X234S, X234T, X234V, X234Y, X235C, X235D, X235E, X235F, X235G, X235H, X235I, X235K, X235L, X235M, X235N, X235Q, X235R, X235S, X235V, X235W, X235Y, X236A, X236C, X236E, X236F, X236H, X236K, X236N, X236P, X236Q, X236R, X236S, X236T, X236V, X236W, X236Y, X237A, X237C, X237F, X237G, X237H, X237I, X237K, X237L, X237M, X237P, X237Q, X237R, X237S, X237T, X237V, X237W, X237Y, X238C, X238D, X238E, X238F, X238G, X238H, X238I, X238K, X238L, X238M, X238N, X238Q, X238R, X238S, X238T, X238V, X238Y, X239C, X239D, X239F, X239G, X239H, X239I, X239K, X239L, X239M, X239N, X239P, X239Q, X239R, X239S, X239T, X239V, X239W, X239Y, X240A, X240C, X240E, X240F, X240I, X240K, X240L, X240M, X240N, X240Q, X240R, X240S, X240T, X240W, X240Y, X241A, X241C, X241D, X241E, X241F, X241G, X241H, X241I, X241K, X241L, X241M, X241N, X241P, X241Q, X241R, X241S, X241T, X241V, X241W, X241Y, X242A, X242C, X242D, X242F, X242G, X242H, X242I, X242L, X242M, X242P, X242Q, X242R, X242S, X242T, X242V, X242W, X243C, X243D, X243E, X243F, X243G, X243H, X243I, X243K, X243L, X243M, X243N, X243P, X243Q, X243R, X243S, X243T, X243V, X243W, X244A, X244D, X244E, X244F, X244H, X244I, X244L, X244M, X244N, X244P, X244Q, X244R, X244S, X244T, X244V, X244W, X244Y, X245A, X245C, X245E, X245G, X245H, X245K, X245L, X245P, X245Q, X245R, X245S, X245V, X245W, X245Y, X246A, X246C, X246E, X246F, X246G, X246H, X246I, X246L, X246M, X246N, X246Q, X246S, X246T, X246V, X246W, X246Y, X247A, X247C, X247D, X247E, X247F, X247G, X247H, X247I, X247K, X247L, X247M, X247N, X247P, X247Q, X247R, X247S, X247T, X247V, X247W, X247Y, X248C, X248D, X248E, X248G, X248H, X248I, X248K, X248L, X248N, X248P, X248R, X248S, X248T, X248V, X248W, X248Y, X249A, X249D, X249E, X249F, X249G, X249H, X249I, X249K, X249L, X249M, X249N, X249Q, X249R, X249S, X249T, X249V, X249W, X249Y, X250A, X250C, X250F, X250I, X250L, X250M, X250Q, X250S, X250V, X251A, X251D, X251E, X251F, X251G, X251K, X251L, X251M, X251Q, X251R, X251T, X251V, X251Y, X252A, X252C, X252D, X252F, X252G, X252H, X252I, X252K, X252L, X252M, X252N, X252R, X252S, X252V, X252W, X252Y, X253A, X253D, X253E, X253F, X253G, X253H, X253I, X253K, X253M, X253R, X253S, X253T, X253V, X253W, X254A, X254C, X254G, X254S, X254T, X255A, X255C, X255D, X255E, X255F, X255H, X255I, X255L, X255N, X255P, X255Q, X255R, X255S, X255T, X255V, X255W, X255Y, X256A, X256C, X256D, X256E, X256G, X256H, X256I, X256K, X256L, X256M, X256N, X256P, X256R, X256S, X256T, X256V, X256W, X256Y, X257C, X257F, X257I, X257K, X257L, X257M, X257V, X258A, X258C, X258D, X258E, X258F, X258G, X258H, X258I, X258L, X258M, X258P, X258Q, X258R, X258S, X258T, X258V, X258W, X258Y, X259A, X259C, X259E, X259G, X259I, X259L, X259M, X259P, X259Q, X259R, X259S, X259T, X259V, X260A, X260D, X260E, X260F, X260H, X260I, X260L, X260M, X260N, X260P, X260R, X260S, X260T, X260V, X260Y, X261A, X261C, X261E, X261F, X261G, X261I, X261K, X261L, X261N, X261P, X261Q, X261R, X261S, X261T, X261V, X261W, X261Y, X262A, X262C, X262D, X262F, X262G, X262H, X262I, X262K, X262L, X262M, X262Q, X262R, X262S, X262T, X262V, X262W, X262Y, X263C, X263F, X263L, X263Y, X264A, X264G, X265A, X265C, X265D, X265F, X265G, X265H, X265K, X265M, X265Q, X265R, X265S, X265T, X265W, X265Y, X267G, X267I, X267L, X267M, X267N, X267V, X268A, X268G, X268H, X268L, X268M, X268N, X268P, X268Q, X268S, X268V, X269C, X269D, X269F, X269G, X269H, X269I, X269L, X269M, X269N, X269Q, X269R, X269S, X269T, X269V, X270A, X270C, X270D, X270G, X270I, X270L, X270M, X270N, X270S, X270T, X270V, X271A, X271C, X271E, X271F, X271G, X271H, X271I, X271K, X271L, X271M, X271N, X271P, X271T, X271V, X271Y, X272A, X272C, X272D, X272E, X272F, X272G, X272H, X272K, X272L, X272M, X272N, X272P, X272R, X272S, X272T, X272W, X272Y, X273A, X273C, X273D, X273E, X273F, X273G, X273H, X273I, X273L, X273S, X273T, X273V, X274A, X274C, X274D, X274E, X274G, X274H, X274L, X274M, X274N, X274P, X274Q, X274R, X274S, X274T, X274W, X275A, X275C, X275D, X275E, X275F, X275G, X275H, X275K, X275L, X275M, X275P, X275Q, X275R, X275V, 及び X275W。
【０２７９】
GCI-PO36変異体のスクリーニングにおいて、次の204箇所の位置における少なくとも1の突然変異が、BMI, EGG又はAAPF活性のいずれかについて0.8より大きい性能指数に関係し、LAS安定性及びTCA分析の両者について、0.8より大きい性能指数を有していた：1, 3, 4, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 35, 36, 38, 40, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 59, 61, 62, 68, 69, 72, 73, 76, 78, 84, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 124, 126, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 156, 158, 159, 160, 165, 166, 167, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 180, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 191, 194, 195, 198, 199, 203, 204, 206, 209, 210, 211, 212, 213, 215, 216, 217, 218, 222, 223, 224, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 255, 256, 258, 259, 260, 261, 262, 265, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274,及び 275。
【０２８０】
これらの位置の突然変異を組み合わせることにより、安定性及び／又は発現性を維持しながら活性を改善することが可能であろう。またこれらの位置の突然変異を組み合わせることにより、改善された安定性及び／又は発現性を有し活性が維持又は強化された変異体を作ることが可能であろう。
【０２８１】
以下に、BMI, CS-38小見本片分析又はAAPF活性分析のいずれかの性能指数が0.8より大きく、LAS安定性及びTCA分析の性能指数が0.8より大きくなる置換のリストを示す。（ここで「X」は任意のアミノ酸を表す）。これらの変異体を組み合わせて、安定性及び／又は発現性を維持又は強化しながら活性を改善するか、又は、活性を維持又は強化しながら安定性及び／又は発現性を改善することが可能であろう：X001A, X001E, X001G, X001H, X001Q, X001V, X003E, X003H, X003I, X003M, X003S, X003T, X003V, X004T, X004V, X008I, X008V, X009E, X009H, X009N, X009Q, X009S, X009T, X010A, X010C, X010G, X010H, X010K, X010M, X010N, X010R, X010S, X010T, X011I, X011V, X012G, X012I, X012N, X012Q, X012S, X012T, X012V, X013A, X013G, X015A, X015D, X015F, X015G, X015I, X015L, X015M, X015P, X015Q, X015S, X015V, X015W, X016A, X016G, X016N, X016P, X016S, X016T, X016V, X017H, X017I, X017M, X017N, X018A, X018C, X018D, X018E, X018G, X018H, X018L, X018M, X018N, X018P, X018Q, X018S, X018T, X018V, X018Y, X019A, X019C, X019D, X019E, X019F, X019G, X019H, X019K, X019L, X019M, X019N, X019R, X019S, X019V, X019W, X019Y, X020A, X020C, X020D, X020F, X020G, X020I, X020K, X020L, X020M, X020P, X020Q, X020R, X020S, X020T, X020V, X020W, X020Y, X021A, X021C, X021E, X021G, X021H, X021I, X021K, X021L, X021M, X021N, X021P, X021Q, X021S, X021T, X021V, X021W, X022A, X022C, X022G, X022I, X022L, X022M, X022N, X022P, X022Q, X022T, X022V, X022W, X023A, X023G, X023S, X024A, X024C, X024D, X024F, X024G, X024H, X024L, X024M, X024N, X024P, X024Q, X024R, X024S, X024T, X024V, X024W, X025C, X025D, X025E, X025F, X025G, X025K, X025L, X025M, X025Q, X025R, X025S, X025T, X025V, X025W, X026C, X026F, X026G, X026M, X026N, X026R, X026S, X026T, X026V, X027A, X027C, X027D, X027F, X027G, X027K, X027L, X027M, X027N, X027P, X027R, X027S, X027T, X027W, X028A, X028I, X028L, X028M, X028V, X029A, X029C, X029G, X029S, X029V, X030A, X030C, X030L, X030M, X030T, X030V, X031A, X031F, X031I, X031L, X031M, X031S, X031V, X033C, X033M, X033S, X033T, X035I, X035L, X035M, X035P, X036A, X036E, X036S, X036T, X036V, X038C, X038F, X038H, X038I, X038K, X038L, X038M, X038N, X038Q, X038R, X038T, X038V, X038Y, X040A, X040D, X040E, X040I, X040L, X040P, X040V, X043A, X043C, X043D, X043E, X043F, X043G, X043I, X043L, X043M, X043N, X043R, X043S, X043T, X043W, X043Y, X044A, X044C, X044D, X044F, X044G, X044I, X044K, X044L, X044M, X044N, X044Q, X044R, X044S, X044T, X044V, X044Y, X045A, X045D, X045F, X045G, X045H, X045I, X045K, X045L, X045M, X045N, X045P, X045Q, X045R, X045S, X045T, X045V, X045W, X045Y, X046C, X046D, X046E, X046G, X046H, X046I, X046K, X046L, X046M, X046N, X046P, X046Q, X046R, X046S, X046T, X046V, X047G, X047R, X048A, X048C, X048E, X048F, X048H, X048I, X048K, X048L, X048M, X048N, X048P, X048Q, X048R, X048S, X048T, X048V, X048Y, X049A, X049G, X049H, X049S, X049T, X050F, X050H, X050I, X050L, X050T, X050V, X050Y, X051F, X051H, X051K, X051L, X051R, X051S, X051T, X051V, X051W, X052A, X052C, X052E, X052F, X052G, X052H, X052I, X052L, X052M, X052N, X052P, X052Q, X052R, X052T, X052V, X052W, X052Y, X053A, X053C, X053D, X053E, X053G, X053H, X053K, X053L, X053M, X053Q, X053R, X053S, X053T, X053W, X053Y, X054A, X054C, X054D, X054E, X054F, X054H, X054M, X054N, X054Q, X054S, X055C, X055E, X055G, X055H, X055K, X055L, X055P, X055Q, X055S, X055T, X055W, X056A, X056C, X056D, X056E, X056H, X056L, X056M, X056N, X056P, X056Q, X056S, X056T, X057C, X057E, X057F, X057G, X057H, X057I, X057L, X057M, X057N, X057P, X057Q, X057R, X057S, X057T, X057V, X057W, X057Y, X059A, X059D, X059G, X059I, X059L, X059M, X059N, X059Q, X059R, X059S, X059T, X059V, X059W, X061A, X061C, X061D, X061F, X061G, X061H, X061I, X061L, X061M, X061N, X061P, X061R, X061S, X061T, X061V, X061Y, X062C, X062E, X062F, X062H, X062I, X062K, X062L, X062M, X062N, X062Q, X062R, X062S, X062T, X062V, X068I, X068L, X068V, X069A, X069G, X069S, X069T, X072I, X072L, X072T, X072V, X073A, X073C, X073S, X076D, X076N, X078A, X078C, X078E, X078H, X078L, X078M, X078N, X078Q, X078S, X078T, X084C, X084G, X084I, X084M, X084V, X086C, X086P, X087A, X087C, X087D, X087E, X087G, X087K, X087L, X087N, X087S, X087V, X088A, X088C, X088G, X088S, X089A, X089D, X089E, X089G, X089H, X089I, X089N, X089Q, X089R, X089S, X089T, X089W, X090C, X090I, X090L, X090M, X090Q, X090T, X090V, X091D, X091F, X091I, X091N, X091S, X091V, X091W, X091Y, X092A, X092G, X092P, X092R, X092V, X093A, X093C, X093G, X093L, X093M, X093T, X093V, X094K, X094R, X095A, X095C, X095I, X095S, X095V, X096F, X096I, X096L, X096M, X097A, X097D, X097E, X097F, X097G, X097H, X097K, X097L, X097M, X097N, X097P, X097Q, X097R, X097S, X097T, X097V, X097W, X097Y, X098A, X098C, X098D, X098E, X098F, X098G, X098K, X098L, X098N, X098P, X098Q, X098R, X098S, X098T, X098V, X098Y, X099A, X099C, X099F, X099G, X099K, X099M, X099P, X099Q, X099R, X099S, X099T, X099V, X099Y, X100D, X100E, X100G, X100I, X100K, X100N, X100R, X100S, X100T, X100V, X100Y, X101A, X101C, X101D, X101E, X101F, X101G, X101H, X101I, X101K, X101N, X101P, X101Q, X101R, X101S, X101T, X101V, X101Y, X102A, X102G, X102T, X103A, X103C, X103D, X103F, X103G, X103I, X103L, X103N, X103P, X103Q, X103R, X103S, X103T, X103V, X103W, X104C, X104F, X104H, X104I, X104L, X104R, X104S, X104T, X104V, X104W, X104Y, X105A, X105C, X105D, X105E, X105F, X105G, X105K, X105L, X105N, X105Q, X105R, X105S, X105T, X105V, X106A, X106D, X106E, X106G, X106I, X106L, X106R, X106S, X106T, X106V, X106W, X107A, X107C, X107F, X107I, X107L, X107M, X107Q, X107S, X107T, X107V, X108A, X108C, X108I, X108S, X108T, X108V, X109A, X109E, X109F, X109G, X109H, X109I, X109K, X109L, X109M, X109N, X109Q, X109R, X109S, X109T, X109W, X109Y, X110A, X110G, X111F, X111I, X111L, X111M, X112D, X112E, X112I, X112Q, X112V, X114A, X114C, X115C, X115E, X115G, X115L, X115M, X115P, X115Q, X115S, X115T, X115W, X115Y, X116A, X116C, X116D, X116F, X116G, X116I, X116K, X116L, X116M, X116N, X116Q, X116S, X116T, X116V, X116W, X117A, X117C, X117N, X117Q, X117R, X117T, X117Y, X118A, X118C, X118D, X118E, X118F, X118G, X118K, X118M, X118N, X118R, X118S, X118V, X118W, X119A, X119F, X119M, X119T, X120A, X120C, X120E, X120F, X120G, X120H, X120I, X120L, X120M, X120N, X120R, X120S, X120T, X120W, X121A, X121C, X121F, X121I, X121L, X121M, X121S, X121T, X121V, X122A, X122G, X122S, X122V, X124G, X124L, X124T, X126A, X126F, X126I, X126L, X126M, X126V, X128A, X128F, X128G, X128I, X128K, X128L, X128M, X128N, X128Q, X128R, X128S, X128T, X128W, X129A, X129E, X129F, X129G, X129M, X129N, X129P, X129R, X129S, X129Y, X130C, X130K, X130L, X130N, X130Q, X130R, X130S, X130V, X130W, X130Y, X131A, X131D, X131E, X131F, X131G, X131K, X131P, X131Q, X132A, X132H, X132I, X132N, X132Q, X132R, X132S, X132T, X133A, X133F, X133K, X133N, X133P, X133S, X133T, X133V, X133Y, X134A, X134S, X134T, X134V, X135L, X135M, X135W, X136E, X136Q, X137A, X137C, X137E, X137H, X137K, X137L, X137M, X137Q, X137R, X137S, X137W, X139C, X139I, X139V, X140D, X140E, X140N, X141D, X141E, X141G, X141H, X141I, X141K, X141L, X141N, X141Q, X141R, X141S, X141V, X141Y, X142A, X142C, X142V, X143C, X143D, X143F, X143H, X143N, X143T, X144A, X144C, X144D, X144G, X144H, X144I, X144L, X144M, X144N, X144R, X144S, X144T, X144V, X144Y, X145A, X145C, X145D, X145F, X145K, X145L, X145N, X145Q, X145R, X146D, X146G, X147I, X147L, X147T, X147V, X148C, X148I, X148L, X148M, X148N, X148V, X149C, X149I, X149L, X149V, X150A, X150L, X150T, X150V, X151A, X151S, X152A, X152S, X156D, X156E, X156L, X156N, X156S, X156T, X158A, X158C, X158E, X158F, X158H, X158K, X158L, X158M, X158Q, X158R, X158S, X158T, X158V, X159A, X159C, X159E, X159G, X159H, X159M, X159P, X159S, X160A, X160C, X160D, X160F, X160I, X160L, X160M, X160N, X160Q, X160S, X160T, X160V, X160Y, X165I, X165L, X165V, X166A, X166C, X166D, X166E, X166H, X166M, X166S, X166T, X167F, X167Y, X170A, X170D, X170E, X170G, X170H, X170K, X170Q, X170R, X170S, X170V, X170Y, X171C, X171Y, X172A, X172C, X172D, X172G, X172I, X172K, X172L, X172M, X172P, X172Q, X172R, X172S, X172V, X172Y, X173A, X173C, X173D, X173H, X173M, X173N, X173Q, X173T, X174A, X174S, X174T, X174V, X175L, X175M, X175V, X176A, X176S, X177C, X177V, X180T, X180V, X182A, X182D, X182E, X182Q, X183A, X183D, X183N, X183Q, X183S, X184D, X184N, X185A, X185C, X185E, X185H, X185K, X185M, X185N, X185Q, X185T, X185V, X186I, X186K, X186L, X186R, X187A, X187C, X188A, X188D, X188E, X188F, X188H, X188I, X188K, X188L, X188P, X188Q, X188S, X188T, X191A, X191D, X191Q, X191S, X194A, X194C, X194D, X194E, X194F, X194H, X194I, X194L, X194M, X194P, X194Q, X194R, X194S, X194T, X194W, X194Y, X195C, X195D, X195E, X195G, X195Q, X198I, X198L, X199C, X199M, X199S, X199V, X203C, X203E, X203T, X203V, X204A, X204C, X204E, X204G, X204N, X204S, X206D, X206E, X206H, X206L, X206N, X206Q, X206S, X209F, X209M, X209W, X209Y, X210A, X210C, X210I, X210L, X210M, X210N, X210P, X211A, X211C, X211E, X211G, X211H, X211I, X211M, X211P, X211Q, X211T, X211V, X212C, X212F, X212G, X212H, X212M, X212N, X212R, X212S, X212Y, X213A, X213D, X213E, X213N, X213Q, X213S, X213T, X215A, X215C, X215D, X215E, X215H, X215I, X215K, X215M, X215N, X215S, X215T, X215V, X215Y, X216A, X216C, X216D, X216E, X216F, X216H, X216I, X216L, X216M, X216N, X216Q, X216S, X216V, X216W, X216Y, X217A, X217C, X217D, X217E, X217F, X217K, X217L, X217M, X217Q, X218C, X218D, X218E, X218N, X218Q, X222C, X222M, X222S, X223A, X223S, X224A, X224N, X224S, X224T, X227A, X227C, X227V, X228A, X228G, X228S, X228V, X230A, X230G, X230N, X230S, X230T, X230V, X231A, X231C, X231F, X231G, X231S, X232A, X232L, X232M, X233A, X233C, X233E, X233G, X233I, X233L, X233N, X233Q, X233S, X233T, X233V, X234L, X234M, X234N, X234Q, X234S, X234T, X234V, X235C, X235F, X235G, X235H, X235I, X235K, X235L, X235M, X235N, X235Q, X235R, X235S, X235V, X235W, X235Y, X236A, X236C, X236E, X236F, X236H, X236N, X236Q, X236S, X236T, X236Y, X237A, X237C, X237F, X237G, X237H, X237I, X237K, X237L, X237M, X237Q, X237R, X237S, X237T, X237V, X237W, X237Y, X238C, X238D, X238E, X238F, X238G, X238H, X238I, X238K, X238L, X238M, X238N, X238Q, X238R, X238S, X238T, X238V, X238Y, X239C, X239D, X239F, X239G, X239H, X239K, X239L, X239M, X239N, X239P, X239Q, X239R, X239S, X239T, X239V, X239W, X239Y, X240A, X240C, X240E, X240F, X240I, X240K, X240M, X240N, X240Q, X240R, X240S, X240T, X240W, X240Y, X241A, X241C, X241D, X241E, X241F, X241G, X241H, X241I, X241K, X241L, X241
M, X241N, X241Q, X241R, X241S, X241T, X241V, X241W, X241Y, X242A, X242C, X242D, X242G, X242H, X242I, X242L, X242M, X242P, X242Q, X242S, X242T, X242V, X243C, X243D, X243E, X243F, X243G, X243H, X243I, X243L, X243M, X243N, X243P, X243Q, X243S, X243T, X243V, X243W, X244D, X244E, X244F, X244H, X244I, X244L, X244M, X244N, X244Q, X244S, X244T, X244V, X244W, X245A, X245C, X245E, X245G, X245H, X245K, X245L, X245P, X245Q, X245S, X245V, X245W, X245Y, X246A, X246C, X246I, X246L, X246M, X246T, X246V, X247A, X247C, X247F, X247G, X247H, X247K, X247L, X247M, X247N, X247R, X247S, X247T, X247V, X247W, X247Y, X248C, X248D, X248E, X248G, X248H, X248I, X248L, X248N, X248P, X248R, X248S, X248T, X248V, X248Y, X249A, X249D, X249E, X249F, X249G, X249H, X249I, X249K, X249L, X249M, X249N, X249Q, X249S, X249T, X249W, X249Y, X250C, X250I, X250L, X250M, X250V, X251A, X251D, X251E, X251F, X251G, X251K, X251L, X251M, X251Q, X251R, X251T, X251V, X251Y, X252A, X252C, X252D, X252F, X252G, X252H, X252I, X252K, X252L, X252M, X252N, X252R, X252S, X252V, X252W, X253A, X253E, X253H, X253M, X253S, X253T, X253W, X255A, X255C, X255D, X255E, X255I, X255L, X255N, X255Q, X255T, X255V, X255Y, X256A, X256C, X256D, X256E, X256G, X256H, X256I, X256K, X256L, X256M, X256N, X256P, X256S, X256V, X256W, X256Y, X258D, X258G, X259A, X259C, X259E, X259P, X259Q, X259S, X260A, X260D, X260E, X260H, X260I, X260N, X260P, X260S, X260T, X260V, X261A, X261C, X261E, X261F, X261I, X261K, X261L, X261N, X261P, X261Q, X261S, X261T, X261V, X261W, X261Y, X262A, X262C, X262D, X262F, X262H, X262I, X262L, X262M, X262Q, X262T, X262V, X262Y, X265A, X265D, X265S, X267I, X267L, X268A, X268L, X268V, X269D, X269H, X269N, X269Q, X269S, X270A, X270C, X270G, X270I, X270L, X270N, X270S, X270T, X270V, X271C, X271E, X272A, X272C, X272D, X272E, X272F, X272G, X272H, X272L, X272M, X272N, X272P, X272S, X272T, X272W, X272Y, X273A, X273C, X273G, X273S, X274A, X274C, X274G, X274L, X274M, X274N, X274S, X274T, X275D, X275E, X275F, X275H, X275K, X275L, X275M, X275P, X275Q, X275R。
【０２８２】
＜実施例６＞
＜プロテアーゼ変異体のデータの対比評価＞
この実施例では、BPN’、GCI-P036及び変異体プロテアーゼの洗浄性能、LAS/EDTA安定性、 AAPF活性及びタンパク質含有量 (対象とする性質の試験) について評価した実験結果を対比する。使用した洗剤及び条件は実施例1に開示されている。下記の表では、「EGG」の結果は、Table 1-1に記載したCALGONITTM (WE ADW) におけるCS-38小見本片分析結果を意味する。本願に開示するように、GCI-P036変異体の機能を変異体及び参照プロテアーゼの性能の比である性能指数 (PI) として定量する。本願でのPIの分類は：上昇突然変異 (PI>1.0)；中立突然変異(PI>0.5)；非有害突然変異(PI>0.05);及び有害突然変異(PI≦0.05)である。BPN’変異体は、本願に参照として組み込むPCT/09/046066及びPCT/US09/046156に開示された方法で調製し、評価した。
【０２８３】
「生産的部位」とは、いずれかの性質について少なくとも1の上昇突然変異を有する部位である。「生産的、非制限的」部位とは、≧20%の中立突然変異(PI > 0.5)、及び試験したいずれかの性質（タンパク質発現性以外）について少なくとも1の上昇突然変異 (PI > 1.0)を有する部位である。下記に示すTable 6-1には、生産的、非制限的部位の定義に適合する部位を有する変異体の結果を、上昇突然変異(PI>1)の定義に適合する、試験した変異体のパーセンテージ(%)で示した。
【表１０】
0005911825.tif 000061
0005911825.tif 000062
0005911825.tif 000063
0005911825.tif 000064
【０２８４】
「高生産的」部位とは、タンパク質発現性以外の少なくとも1の性質(例えばTCA分析に示される)について、≧20% 上昇突然変異 (PI > 1) を有する部位である。下記に示すTable 6-2には、高生産的部位の定義に適合する部位を有する変異体の結果を、上昇突然変異(PI>1)の定義に適合する、試験した変異体のパーセンテージ(%)で示した。
【表１１】
0005911825.tif 000065
0005911825.tif 000066
0005911825.tif 000067
0005911825.tif 000068
【０２８５】
「制限的」部位とは、活性及び安定性について20%未満の中立突然変異を有する部位である。下記に示すTable 6-3には、制限的部位の定義に適合する部位を有する変異体の結果を、中立突然変異 (PI>0.5)の定義に適合する、評価した変異体のパーセンテージ(%)で示した。
【表１２】
0005911825.tif 000069
【０２８６】
要約すると、この発明の開発中に求められたように、2つの参照スブチリシンの成熟領域中の10箇所の位置が活性及び安定性に関して制限的位置である。従って、2つの参照スブチリシンの成熟領域中の残りの265箇所の位置は、活性及び安定性に関して非制限的位置(≧20%中立突然変異)である。
【０２８７】
＜実施例７＞
＜GCI P036組み合わせライブラリー変異体の汚れ除去効果の評価＞
この実施例には、GCI-P036の変異体の汚れ除去効果を、食器洗浄機及び液体衣類洗剤について評価した結果を示す。組み合わせライブラリーのクローン化は、Sloning BioTechnologyによりSlonomax Technologyを用いて実施された。プロテアーゼ変異体のサンプルは、上記のようにして調製した。簡単にいうと、組み合わせライブラリー変異体を、洗濯及び食器洗い機(ADW)用途の双方について、様々な地域市場を代表する洗剤（例えばpH、温度及び／又は水硬度の違い）に関して、血、ミルク、インク(BMI)小見本片及びCS-38小見本片分析を行った。本願に開示するように、プロテアーゼ変異体の機能を、変異体及び参照プロテアーゼの性能の比である性能指数(PI)として定量した。置換をBPN’の位置番号を用いてGCI-P036参照プロテアーゼに対し示し、PIはGCI-P036参照プロテアーゼとの関係において求めた。データをTables 7-1 から7-5に示す。
【表１３】
0005911825.tif 000070
0005911825.tif 000071
【表１４】
0005911825.tif 000072
【表１５】
0005911825.tif 000073
【表１６】
0005911825.tif 000074
0005911825.tif 000075
【表１７】
0005911825.tif 000076
0005911825.tif 000077
【０２８８】
＜GCI-P036の多重突然変異ライブラリー(MML)変異体による汚れ除去効果の評価＞
GCI-P036の変異体の汚れ除去効果を、洗浄用途について評価した。組み合わせライブラリーのクローン化は、Sloning BioTechnologyによりSlonomax Technologyを用いて実施された。プロテアーゼ変異体のサンプルは、上記のようにして調製した。簡単にいうと、MML変異体について、実施例1に示した方法により血、ミルク、インク(BMI)小見本片及びCS-38小見本片分析を行った。本願に開示するように、プロテアーゼ変異体の機能を、変異体及び参照プロテアーゼの性能の比である性能指数(PI)として定量した。置換をBPN’の位置番号を用いてGCI-P036参照プロテアーゼに対し示し、PIはGCI-P036参照プロテアーゼとの関係において求めた。データをTables 7-6と7-7に示す。
【表１８】
0005911825.tif 000078
0005911825.tif 000079
0005911825.tif 000080
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【表１９】
0005911825.tif 000087
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【０２８９】
＜GCI-P036の多重突然変異ライブラリー (MML) 変異体によるLAS/EDTA安定性の評価＞
LAS 及び EDTAを含有する組成物中で GCI-P036変異体をインキュベートした後、GCI-P036変異体の安定性を評価した。組み合わせライブラリーのクローン化は、Sloning BioTechnologyによりSlonomax Technologyを用いて実施された。プロテアーゼ変異体のサンプルは、上記のようにして調製した。簡単にいうと、MML変異体について、実施例1に示した方法によりLAS/EDTA安定性分析を行った。本願に開示するように、プロテアーゼ変異体の機能を、変異体及び参照プロテアーゼの性能の比である性能指数(PI)として定量した。置換をBPN’の位置番号を用いてGCI-P036参照プロテアーゼに対し示し、PIはGCI-P036参照プロテアーゼとの関係において求めた。結果をTables 7-8に示す。
【表２０】
0005911825.tif 000093
0005911825.tif 000094
0005911825.tif 000095
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【０２９０】
＜GCI-P036を発現する多重突然変異ライブラリー (MML) 変異体培養物のタンパク質含有量の評価＞
GCI-P036の変異体の組換え発現を、実施例1のTCA分析における培養物のタンパク質含有量を測定することにより評価した。組み合わせライブラリーのクローン化は、Sloning BioTechnologyによりSlonomax Technologyを用いて実施された。プロテアーゼ変異体のサンプルは、上記のようにして調製した。簡単にいうと、MML変異体について、実施例1に示した方法によりTCA分析を行った。本願に開示するように、プロテアーゼ変異体の機能を、変異体及び参照プロテアーゼの性能の比である性能指数(PI)として定量した。置換をBPN’の位置番号を用いてGCI-P036参照プロテアーゼに対し示し、PIはGCI-P036参照プロテアーゼとの関係において求めた。結果をTables 7-9に示す。
【表２１】
0005911825.tif 000099
0005911825.tif 000100
0005911825.tif 000101
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【０２９１】
＜実施例８＞
＜GCI-P036の多重突然変異体ライブラリー(MML)による汚れ除去効果の評価＞
Table 8-1に、GCI-P036の変異体について行った、汚れ除去活性(CS-38見本片を用い、食器洗浄機用洗剤の洗浄性能を評価する小見本片分析)、LAS/EDTA安定性、熱安定性、及びTCA分析によるタンパク質の同定 (対象とする性質の試験)の評価結果を示す。これらの結果は、実施例1に記載した方法を汚れ除去性能分析に関して次のように修正した方法により求めたものである。試験に用いた洗剤を熱不活性化(CALGONITTM 5 in 1及び CASCADETM Complete)し、MTPを粘着性膜でシールし、IEMSインキュベーターに取り付けて所定の温度で30分間振蕩した。
【０２９２】
変異体クローン1-44の、汚れ除去性能及び安定性の評価には、希釈濾過した培養液の上清を用いた。クローン100-105については、異なる濃度の精製したサンプルを用いた。クローン100-105を4ppm 及び 6 ppm添加したときの平均PI値の計算値を、表8-1に示す。クローン47-50及びクローン106については、超濾過濃縮処方(UFC)サンプルを用いた。クローン47-50を発現するバシラス・スブチリス 細胞の培養ブロスを9000xgで30分間遠心分離し、上清をBuchnerファネル中のSeitz-EKS Depthフィルター(Pall社)で濾過し、次に加圧下で滅菌Seitz-EKS Depthフィルターで濾過し、4℃で保管した。得られた細胞を含まない上清を、カット-オフが10 kDaのフィルターを用いて、PALL UF-濾過ユニットにより濃縮した。得られた超濾過濃縮物に、51% (W/W) プロピレングリコールと1.2 % (W/W)ギ酸ナトリウムを添加した。ギ酸ナトリウムは、pHを6.0まで下げるために用いた。
【０２９３】
本願に開示するように、GCI-P036変異体の機能を、変異体と親GCI-P036タンパク質の性能の比である性能指数(PI)として定量した。NDは「未測定」を意味する。
【表２２】
0005911825.tif 000108
0005911825.tif 000109
【０２９４】
＜実施例９＞
＜多重突然変異体ライブラリー(MML)による洗濯用途における汚れ除去効果の評価＞
Table 9-1に、GCI-P036変異体 (実施例8に示したクローン8, 47)の汚れ除去活性 (洗濯用途における洗浄効果を評価するための小見本片分析)を評価するために行った実験の結果を示す。実施例1の方法により、これらの結果を得た。試験に用いた洗剤は、熱不活性化したP&G TIDETM 2X (NA HDL) 及び P&G TIDETM (NA HDG)であった。BMI汚染小見本片による洗浄性能の評価は、0.2ppmの変異体を用いて、200uLの容積を25℃、1400rpmで30分間振蕩して行った。本願に開示するように、GCI-P036変異体の機能を、変異体と親GCI-P036タンパク質の性能の比である性能指数(PI)として定量した。スブチリシンFNA (BPN’-Y217L) 及び GCI-P036-S87N-G118V-S128L-P129Q-S130Aタンパク質も評価した。
【表２３】
0005911825.tif 000110
【０２９５】
＜実施例１０＞
＜増加した産出力価を有するプロテアーゼ＞
GCI-P036の成熟領域内の突然変異を、タンパク質力価の向上、又はマイクロタイタープレートで行ったスーパースクリーン(superscreen)において観察された小見本片洗浄性能の向上に基づいて選択した。前述の実施例で評価したプロテアーゼのサンプルを、複製プラスミド発現系を用いて調製した。この実施例に示す45種の変異体の発現には、GCI-P036ciでラベルされ、野生型GCI-P036タンパク質をコードする遺伝子を用いた。この「ci」合成遺伝子は、FNAコドンの使用（非常に高レベルで発現されるタンパク質）に基づく改良コドンからなる。これらの変異体をコードする核酸を、下記に説明するGCI-P036ci遺伝子テンプレート中に形質転換してp2JH骨格 (p2JH-GCI-P036ci, 図 3)に一連のプラスミド、大スケールでのタンパク質産出に従う組み込みベクターシステムを生成させる。この組み込みバシラス発現システムを用いて、振蕩フラスコ培養物からの培養ブロスについて、Table 9-1に示す変異体の評価を行った。タンパク質発現及び小見本片性能を再び評価した。いくつかの変異体のsuc-AAPF-pNA基質に対するプロテアーゼ活性が野生型と比べて低い値であったたため、エグリンc滴定分析によりプロテアーゼ濃度を求めた。エグリンc分析及びBMI分析の結果を、それぞれ図4と図5に示す。
【表２４】
0005911825.tif 000111
【０２９６】
＜組み込みプラスミド＞
組み込みプラスミドp2JH-GCI-P036ciを、AprEシグナル配列の8盤面のコドンに融合され、AprE プロモータ及びFNBaseターミネータの制御下にあるGCI-P036 コドン改良合成遺伝子(GCI-P036ci)を用いて組み立てた(Wells et al., Nucleic Acids Res, 11:7911-25, 1983)。以下に示すp2JH-GCI-P036ciのGCI-P036ci配列では、太字イタリック体はAprEプロモータを表し、標準字体はシグナル配列領域を表し、下線部はGCI-P036 プロ配列領域を表し、太字はGCI-P036成熟プロテアーゼ領域をコードするDNAを表し、下線を付したイタリック体はFNBaseターミネータを表す。
【化５】
0005911825.tif 000112
【０２９７】
p2JH-GCI-P036ciには以下が含まれる：CAT = pC194由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子、 pMB1 origin = pBR322由来の複製起点、bla = pBR322由来のベータ-ラクタナーゼ、 aprE promoter = 転写プロモータ、Signal Peptide= シグナルペプチド、Pro Peptide = GCI-P036プロ領域、GCI-P036ci Mature Peptide = 成熟GCI-P036、 FNBase Term = FNBase ターミネータ。GCI-P036前駆体及びGCI-P036成熟プロテアーゼのアミノ酸配列は、それぞれ上記のSEQ ID NOS: 6 及び SEQ ID NO: 2である。
【０２９８】
＜別のGCI-P036変異体の生成＞
Multi-site QuickChange Kit (Stratagene社)による部位特異的突然変異誘発を、テンプレート及び部位特異的プライマーセットとしてp2JH-GCI-P036ciを用い、Table 9-2に示す配列のフォワード(F)及びリバース(R) を用いて行った。5マイクロリットルの突然変異生成物を用いて化学的コンピテントTop10 E.coli 細胞 (Invitrogen社)を形質転換し、LA + 50 ppm カルベニシリンに塗布して選択条件下で培養した。プレートを37℃で一夜培養した。
【表２５】
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0005911825.tif 000114
【０２９９】
突然変異につき5つの形質転換体を選択し、製造者の指示に従ってPCR ビーズ (GE/Amersham)を用いて挿入の存在についてスクリーニングを行った。挿入PCRプライマーの配列は次の通りである：フォワードプライマー = ISH-PCR-GCI-P036-5832F 5’-acaaataggg gttccgcgca-3’ (SEQ ID NO: 97); 及び リバースプライマー = ISH-PCR-GCI-P036-1902R 5’-cgcaagaattg attggctcc-3’ (SEQ ID NO: 98)。サイクル条件は次の通りである：  95℃で 2 分間ホットスタート、95℃での変成を 1 分間、53℃でのプライマーアニールを 1 分間、72℃での伸長を1 分間のサイクルを40回、次いで4℃に保持。5マイクロリットルのPCR産品を、アガロースゲル電気泳動で分析した。フラグメントサイズ~2 Kbと予想されるPCR産品を精製し、配列を同定した。突然変異が検証されたクローンを、QiaPrep Spin Miniprep Kit (Qiagen社)を用いてプラスミドプレップについて展開した。
【０３００】
精製したプラスミドの配列を同定し、5μLのプラスミドをコンピテントB. スブチリス細胞 (表現型: ΔaprE, ΔnprE, oppA, ΔspoIIE, degUHy32, ΔamyE::[xylR,pxylA-comK]) 中に形質転換し、37℃のシェーカー(250 rpm)で1時間インキュベートし、LA + 1.6 スキムミルク + 5 ppm クロラムフェニコールの培地に塗布し、37℃で一夜培養した。ハロを生じた2つの形質転換体（突然変異毎）を採取し、LA + 1.6 スキムミルク + 25 ppm クロラムフェニコールの培地で培養して選択し、さらに遺伝子増幅を行った。
【０３０１】
新しいプレート（増幅後）からの単一コロニーを採取し、5 ml の LB ブロス + 25 ppm クロラムフェニコールの培地に移し、37℃のシェーカ(250 rpm)で6-7時間インキュベートして前培養液を調製した。前培養液800μLと50% (v/v) 無菌グリセロール400μLを混合して凍結ストック液を作った。半合成培地 (リン酸緩衝液大豆カスと尿素ベースの培地、塩含有) 25mLを入れた振蕩フラスコに前培養液1mLを植菌し、37℃のシェーカ(250 rpm)で48時間インキュベートした。サンプルを18, 24, 42 及び 48時間目に採取し、実施例１に示したSDS-PAGE、AAPF、EglinC阻害分析、及びBMI洗浄性能分析を行った。
【０３０２】
＜タンパク質分析＞
振蕩フラスコによるタンパク質発現の分析を、濃度が既知の精製GCI-P036の検量線に基づく力価により、SDS-PAGEを用いて行った。SDS-PAGEでは、45μLの培養液上清に10μLの2M HClを添加し、氷上で10分間インキュベートした。次に、各サンプルに2X グリシンサンプル緩衝液50μLを添加し、各サンプル混合液10μLを10 Bis-Trisゲル上に塗布し、MES緩衝液を用いて200Vで30分間展開した。ゲルを脱イオン水で3回洗浄し、SimplyBlue Safe染料(Invitrogen社)で1時間染色し、脱イオン水で一夜脱色した。
【０３０３】
また、タンパク質発現をエグリンc阻害分析により評価した。いくつかの突然変異誘発では、SDS PAGEによる変異体の推定量がsuc-AAPF-pNA基質に対する変異体の活性と一致しない場合、突然変異誘発によって合成基質のsuc-AAPF-pNAに対するプロテアーゼ活性の低下が生じていると考えられた。このため、エグリンc結合も測定し、AAPF分析において生じうる偏差を取り除いた。
【０３０４】
変異体の相対的比活性度は、突然変異体の比活性度を野生型コントロールの比活性度で割り算して求めた。較正（正規化）したプロテアーゼ力価は、AAPF活性分析の力価を、エグリンC阻害分析により求めた突然変異体の相対的比活性度で割り算して求めた。多重突然変異プロテアーゼの正規化タンパク質力価を図4に示す。
【０３０５】
1つのウエルに小見本片1枚を入れたこと、0.5ppmのプロテアーゼ変異体を添加したこと、及び室温でインキュベートしたことを除き、実施例1に記載した方法でBMI洗浄分析による変異体の性能評価を行った。EMPA 116 BMI小見本片を汚染源として用い、無リン酸酸ECE参照洗剤粉を用いて、アルカリ性条件下での洗浄性能をテストした。緩衝液はpH 10.5の2 mM炭酸ナトリウム(Na2CO3, MW=105.99 g/mol, 無水) 中で調製した。緩衝液成分の最終濃度は、次の通りであった：水硬度6 gpg 、無リン酸酸ECE-2洗剤粉6.16 g/L 、1.6 g/Lペルオキソホウ酸ナトリウム四水和物(PB4)、及び0.24 g/L テトラアセチルエチレンジアミン(TAED)。エグリンC阻害分析による較正力価に基づく酵素の希釈は、10 mM NaCl + 0.005 TWEENTM80緩衝液により行った。BMI分析の結果を図5に示す。いくつかのプロテアーゼ変異体 (GCI-P036による番号付与の場合 G95P, S126M, Q, 及び R, S9L 及び A106C = BPN’ による番号付与の場合G97P, S128M, Q, 及び R, S9L 及び A108C) は液体培地において、参照プロテアーゼのGCI-P036と同等の洗浄性能を維持しながら、向上した生産性を示した。
【０３０６】
＜実施例１１＞
＜GCI-P036の電荷ラダー変異体の産出＞
この実勢例では、GCI-P036の電荷ラダー及び組み合わせ電荷ライブラリーの生成について説明する。本願のプロテアーゼ変異体の試験は、プロテアーゼ変異体の性能指数(PI)を求めるために、参照プロテアーゼと比較しながら行った。
【０３０７】
＜電荷ラダー＞
対幅広い範囲の象とする物性を有する多数のタンパク質変異体を、既存のライブラリーから選択するか、又は公知の部位特異的突然変異誘発(例えばUS Appln. Ser/ No., 10/576,331, 11/581,102, 及び 11/583,334参照) により調製した。このように定義されたタンパク質プローブの集団を、対象とする試験により分析した。プロテアーゼの電荷ラダーの例を以下の表に示すとともに、本願の方法により分析した。下記の表では、電荷の変化は参照プロテアーゼに対するものであり、この実施例では参照プロテアーゼは野生型プロテアーゼである。
【表２６】
0005911825.tif 000115
【０３０８】
＜GCI-P036 組み合わせ電荷ライブラリー (CCL)の生成＞
コドン改良遺伝子を備えるpAC-GG36ciプラスミドを用いて、DNA 2.0によりCCLを生成させた。形質転換には、バシラス・スブチリス株 (遺伝子型: ΔaprE, ΔnprE, ΔspoIIE, amyE::xylRPxylAcomK-phleo) を用いた。さらに、Table 10-2に示す、GCI-P036プロテアーゼ中の4つの部位のそれぞれについての位置ライブラリ（positional library）を生成させた。変異体は、96-ウエルプレート中のグリセロールストック溶液として供給された。
【０３０９】
GCI-P036 CCL は、活性部位の外側に十分分散し、表面に露出し、非荷電の極性アミノ酸残基4つを特定することによりデザインした。これらの残基はSer-85, Gln-107, Ser-182, 及びAsn-242 (残基 87, 109, 188, 及び 248はBPN’ の位置番号に対応)である。メンバーを81含む組み合わせライブラリ (G-1からG-81) を、各部位における3つの可能性、すなわち野生型、アルギニン、又はアスパラギン酸の全ての組み合わせを作ることにより構築した。
【表２７】
0005911825.tif 000116
【０３１０】
＜実施例１２＞
＜GCI-P036電荷変異体の汚れ除去性能＞
この実施例では、様々な販売地域を代表する洗剤（例えば異なるpH、温度、及び／又は水硬度）であって、洗濯用洗剤及び食器洗浄機(ADW) 洗剤の双方について、GCI-P036変異体の血、ミルク、インク(BMI) 小見本片分析、及び加熱卵黄 小見本片分析を行った結果を説明する。この実施例の表に記載した販売地域には、Table 1-1に記載したNA（北米）、WE（西欧）、及びWE(ADW)が含まれる。Table 12-1では、食器洗浄（すなわち「PI食器洗浄」）の結果は、実施例1に示した40℃、12gpg、pH10でのCALGONITTM (Reckitt-Benckiser社)による加熱卵黄小見本片分析を行った結果である。
【表２８】
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【０３１１】
＜実施例１３＞
＜液体洗濯洗剤組成物＞
この実施例では、様々な液体洗濯洗剤組成物の処方を説明する。以下の本願の液体洗濯洗剤組成物は、下記のようにして調製される。これらの処方のいずれにおいても、少なくとも1の本願のプロテアーゼ変異体が、約0.0001から約 10重量パーセントの濃度範囲で含有されている。又いくつかの別の実施形態では、処方業者がニーズに基づいて決めた、異なる濃度で使用される。
【表２９】
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【０３１２】
＜実施例１４＞
＜食器手洗い用液体洗剤組成物＞
この実施例では、様々な食器手洗い用液体洗剤の処方を説明する。以下の本願の食器手洗い用液体洗剤組成物は、下記のようにして調製される。これらの処方のいずれにおいても、少なくとも1の本願のプロテアーゼ変異体が、約0.0001から約 10重量パーセントの濃度範囲で含有されている。いくつかの別の実施形態では、処方業者がニーズに基づいて決めた、異なる濃度で使用される。
【表３０】
0005911825.tif 000120
【０３１３】
＜実施例１５＞
＜食器洗浄機用液体洗剤組成物＞
この実施例では、様々な食器洗浄機用液体洗剤の処方を説明する。以下の本願の食器洗浄機用液体洗剤組成物は、下記のようにして調製される。これらの処方のいずれにおいても、少なくとも1の本願のプロテアーゼ変異体が、約0.0001から約 10重量パーセントの濃度範囲で含有されている。いくつかの別の実施形態では、処方業者がニーズに基づいて決めた、異なる濃度で使用される。
【表３１】
0005911825.tif 000121
【０３１４】
＜実施例１６＞
＜顆粒状及び／又は錠剤状洗剤組成物＞
この実施例では、様々な顆粒状及び／又は錠剤状洗剤の処方を説明する。以下の本願の顆粒状及び／又は錠剤状の洗剤組成物は、下記のようにして調製される。これらの処方のいずれにおいても、少なくとも1の本願のプロテアーゼ変異体が、約0.0001から約 10重量パーセントの濃度範囲で含有されている。いくつかの別の実施形態では、処方業者がニーズに基づいて決めた、異なる濃度で使用される。
【表３２】
0005911825.tif 000122
【０３１５】
＜実施例１７＞
＜液体洗濯洗剤＞
この実施例では、様々な液体洗濯洗剤の処方を説明する。以下の本願の液体洗濯洗剤は、下記のようにして調製される。これらの処方のいずれにおいても、少なくとも1の本願のプロテアーゼ変異体が、約0.0001から約 10重量パーセントの濃度範囲で含有されている。いくつかの別の実施形態では、処方業者がニーズに基づいて決めた、異なる濃度で使用される。
【表３３】
0005911825.tif 000123
【０３１６】
＜実施例１８＞
＜高密度食器洗浄洗剤＞
この実施例では、様々な高密度食器洗浄洗剤の処方を説明する。以下の本願の高密度食器洗浄洗剤は、下記のようにして調製される。これらの処方のいずれにおいても、少なくとも1の本願のプロテアーゼ変異体が、約0.0001から約 10重量パーセントの濃度範囲で含有されている。いくつかの別の実施形態では、処方業者がニーズに基づいて決めた、異なる濃度で使用される。
【表３４】
0005911825.tif 000124
【０３１７】
＜実施例１９＞
＜錠剤状洗剤組成物＞で圧縮すること
この実施例では、様々な錠剤状洗剤の処方を説明する。以下の本願の錠剤状洗剤組成物は、顆粒状食器洗浄洗剤を、標準的なヘッドが12個のロータリープレスを用いて圧力13KN/cm2で圧縮して調製される。これらの処方のいずれにおいても、少なくとも1の本願のプロテアーゼ変異体が、約0.0001から約 10重量パーセントの濃度範囲で含有されている。いくつかの別の実施形態では、処方業者がニーズに基づいて決めた、異なる濃度で使用される。
【表３５】
0005911825.tif 000125
【０３１８】
＜実施例２０＞
＜液体硬質表面洗浄洗剤＞
この実施例では、様々な液体硬質表面洗浄洗剤の処方を説明する。以下の本願の液体硬質表面洗浄洗剤組成物は、下記のようにして調製される。これらの処方のいずれにおいても、少なくとも1の本願のプロテアーゼ変異体が、約0.0001から約 10重量パーセントの濃度範囲で含有されている。いくつかの別の実施形態では、処方業者がニーズに基づいて決めた、異なる濃度で使用される。
［表３６］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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