(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記リボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ａ）に多糖合成酵素（Ｂ）を作用させて多糖を製造する方法において、（Ａ）に（Ｂ）を作用させる時間中の１０〜１００％の時間において、反応溶液中のリボヌクレオシド２リン酸の濃度が多糖合成酵素（Ｂ）の下記阻害濃度ＩＣ５０の１００倍未満であり、
前記リボヌクレオシド２リン酸を下記化合物（Ｃ）に変換する活性を有するリボヌクレオシド２リン酸変換酵素（Ｄ）の存在下で（Ｂ）を作用させ、
前記リボヌクレオシド２リン酸変換酵素（Ｄ）は、リボヌクレオシド２リン酸をリボヌクレオシドに変換する活性を有する酵素（Ｄ２）、リボヌクレオシド２リン酸をリボヌクレオシド１リン酸に変換する活性を有する酵素（Ｄ３）、リボヌクレオシド２リン酸をリボヌクレオシド３リン酸に変換する活性を有する酵素（Ｄ４）、リボヌクレオシド２リン酸をポリリボヌクレオチドに変換する活性を有する酵素（Ｄ５）及びＮ−アシルニューラミネートシチジリルトランスフェラーゼからなる群から選択される少なくとも１種であり、
前記反応溶液中の前記多糖合成酵素（Ｂ）の酵素量（Ｕ）と前記リボヌクレオシド２リン酸変換酵素（Ｄ）の酵素量（Ｕ）との比が、多糖合成酵素（Ｂ）：リボヌクレオシド２リン酸変換酵素（Ｄ）＝１：１〜１：２である、酵素合成法による多糖の製造方法。
阻害濃度ＩＣ５０：多糖合成酵素（Ｂ）をリボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ａ）に作用させる際の（Ｂ）の濃度において、基質としてリボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ａ）を用いて、阻害剤としてリボヌクレオシド２リン酸を用いて求めた、（Ｂ）の酵素活性が半減するときのリボヌクレオシド２リン酸の濃度。
リボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ａ）：トリオース（ａ−１）、テトロース（ａ−２）、ペントース（ａ−３）、ヘキソース（ａ−４）、ヘプトース（ａ−５）及び下記単糖（ａ−６）からなる群より選ばれる少なくとも１種の単糖（ａ）が有する少なくとも１つのヒドロキシル基のプロトンが下記化学式（１）〜（５）のいずれか１つの官能基で置換された糖ヌクレオチド。
【化１】
0006000948.tif 000014
【化２】
0006000948.tif 000015
【化３】
0006000948.tif 000016
【化４】
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【化５】
0006000948.tif 000018
単糖（ａ−６）：（ａ−１）、（ａ−２）、（ａ−３）、（ａ−４）及び（ａ−５）からなる群より選ばれる単糖において、この単糖が有するプロトン、ヒドロキシル基及びヒドロキシメチル基からなる群より選ばれる少なくとも１種が下記置換基（Ｅ）で置換された単糖。
置換基（Ｅ）：カルボキシル基、アミノ基、Ｎ−アセチルアミノ基、スルファート基、メチルエステル基、Ｎ−グリコリル基、メチル基、１，２，３−トリヒドロキシプロピル基、リン酸基及び２−カルボキシ−２−ヒドロキシエチル基からなる群より選ばれる少なくとも１種の置換基。
化合物（Ｃ）：リボヌクレオシド（Ｃ−２）、リボヌクレオシド１リン酸（Ｃ−３）、リボヌクレオシド３リン酸（Ｃ−４）、ポリリボヌクレオチド（Ｃ−５）及びリボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ｃ−７）からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物。
【請求項２】
下記酵素活性Ｖｍａｘ１及び下記酵素活性Ｖｍａｘ２を用いて下記数式（１）から算出した酵素活性比（Ｙ１）が０．１以上である請求項１に記載の多糖の製造方法。
酵素活性比（Ｙ１）＝Ｖｍａｘ１／Ｖｍａｘ２  （１）
酵素活性Ｖｍａｘ１：リボヌクレオシド２リン酸変換酵素（Ｄ）のリボヌクレオシド２リン酸に対する酵素活性。
酵素活性Ｖｍａｘ２：リボヌクレオシド２リン酸変換酵素（Ｄ）のリボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ａ）に対する酵素活性。
【請求項３】
下記酵素活性Ｖｍａｘ１及び下記酵素活性Ｖｍａｘ３を用いて下記数式（２）から算出した酵素活性比（Ｙ２）が０．１以上である請求項１又は２に記載の多糖の製造方法。
酵素活性比（Ｙ２）＝Ｖｍａｘ１／Ｖｍａｘ３  （２）
酵素活性Ｖｍａｘ１：リボヌクレオシド２リン酸変換酵素（Ｄ）のリボヌクレオシド２リン酸に対する酵素活性。
酵素活性Ｖｍａｘ３：多糖合成酵素（Ｂ）のリボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ａ）に対する酵素活性。
【請求項４】
リボヌクレオシド２リン酸変換酵素（Ｄ）がウリジン３リン酸合成酵素（Ｄ４−１）であり、化合物（Ｃ）がウリジン３リン酸であり、リボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ａ）がウリジン２リン酸−単糖であり、下記ミカエリス定数Ｋｍが下記阻害濃度ＩＣ５０の１００倍未満である請求項１〜３のいずれかに記載の多糖の製造方法。
ミカエリス定数Ｋｍ：ウリジン２リン酸を基質とし、（Ｄ４−１）を酵素とし、リン酸基含有化合物（Ｆ）の存在下でウリジン３リン酸を合成する反応におけるミカエリス定数。
阻害濃度ＩＣ５０：多糖合成酵素（Ｂ）をウリジン２リン酸−単糖に作用させる際の（Ｂ）の濃度において、基質としてウリジン２リン酸−単糖を用いて、阻害剤としてウリジン２リン酸を用いて求めた、（Ｂ）の酵素活性が半減するときのウリジン２リン酸の濃度。
【請求項５】
多糖がヒアルロン酸であり、リボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ａ）が、ウリジン２リン酸−グルクロン酸及びウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンであり、多糖合成酵素（Ｂ）がヒアルロン酸合成酵素（Ｂ−１）であり、化合物（Ｃ）がウリジン３リン酸であり、リボヌクレオシド２リン酸変換酵素（Ｄ）がウリジン３リン酸合成酵素（Ｄ４−１）である請求項１〜４のいずれかに記載の多糖の製造方法。
【請求項６】
反応溶液中に、さらにリン酸基含有化合物（Ｆ）、１−ホスホ−グルクロン酸及びウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（Ｇ）を含有させる請求項５に記載の多糖の製造方法。
【請求項７】
下記工程（１）〜（３）を同時に行う請求項６に記載の多糖の製造方法。
工程（１）：ウリジン２リン酸−グルクロン酸とウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンとにヒアルロン酸合成酵素（Ｂ−１）を作用させて、ヒアルロン酸及びウリジン２リン酸を得る工程。
工程（２）：ウリジン２リン酸とリン酸基含有化合物（Ｆ）とにウリジン３リン酸合成酵素（Ｄ４−１）を作用させてウリジン３リン酸を得る工程。
工程（３）：ウリジン３リン酸と１−ホスホ−グルクロン酸とにウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（Ｇ）を作用させてウリジン２リン酸−グルクロン酸を得る工程。
【請求項８】
下記ミカエリス定数Ｋｍが下記阻害濃度ＩＣ５０の１００倍未満である請求項７に記載の多糖の製造方法。
ミカエリス定数Ｋｍ：ウリジン２リン酸を基質とし、（Ｄ４−１）を酵素とし、リン酸基含有化合物（Ｆ）の存在下でウリジン３リン酸を合成する反応におけるミカエリス定数。
阻害濃度ＩＣ５０：（Ｂ−１）をウリジン２リン酸−グルクロン酸及びウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンに作用させる際の（Ｂ−１）の濃度において、基質としてウリジン２リン酸−グルクロン酸及びウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンを用いて、阻害剤としてウリジン２リン酸を用いて求めた、（Ｂ−１）の酵素活性が半減するときのウリジン２リン酸の濃度。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は多糖の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多糖としては、植物由来の多糖（デンプン及びセルロース等）、微生物由来の多糖（キサンタン等）、高等生物由来の多糖（ヒアルロン酸、ヘパリン及びコンドロイチン等）など、様々な種類の多糖が知られている。これらの多糖は、医薬品・食品から一般工業用途まで様々な用途において用いられている。【０００３】
例えば、ヒアルロン酸は牛の眼球、鶏冠、動物の緩衝組織、胎盤、癌細胞及び皮膚などの生体組織に多量に含まれているもので、グルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンとがβ１，３結合とβ１，４結合とで交互に結合した直鎖状の多糖であり、分子量が１０５〜１０６Ｄａの高分子量のグルコサミノグリカンである。ヒアルロン酸は、粘度が高く、高い保湿効果を有し、物理的摩擦に対する潤滑効果及び細菌などの侵入に対する保護効果が優れているという性質を持つ。
ヒアルロン酸はこれらの性質を持つので、化粧品添加剤、医薬品添加剤（関節炎治療剤、創傷被覆剤、眼科手術用手術補助剤及び外科手術後の癒着阻止剤等）として広範囲に使用される。【０００４】
ヒアルロン酸の生産方法としては、
（１）前記の生体組織から抽出する方法（抽出法）（特許文献１及び２）、
（２）グルコース等の糖の存在下で、ヒアルロン酸を生成する能力を有する微生物を培養してヒアルロン酸を生産し、回収する方法（微生物培養方法）（特許文献３及び４）
が多く知られている。【０００５】
しかしながら、（１）の抽出法により得られたヒアルロン酸には、コンドロイチンサルフェートやグリコサミノグリカンサルフェート等の不純物が含まれており、これらを除去するには複雑な精製過程を要するという問題がある。
また、（２）の微生物培養方法によるヒアルロン酸の生産では、ヒアルロン酸が生産されるのに伴って、培養溶液の粘度が上昇するため、通気攪拌が困難になる。さらに、通気攪拌が困難になることにより、ヒアルロン酸の生産が停止する。したがって、微生物培養方法は、ヒアルロン酸の生産効率が非常に低い問題がある。また、培養液の粘度が高いため、用いた微生物の除去に複雑な精製過程を要する問題がある。さらに、微生物の有するヒアルロン酸分解酵素により、生産されたヒアルロン酸が分解されるため、ヒアルロン酸の分子量が大きくならない、分子量の不均一性が高くなる等の問題もある。
ヒアルロン酸以外の多糖についても同様に、抽出法では不純物が多く混入してしまう問題があり、微生物培養方法では生産効率が低い、分子量が大きくならない、分子量の不均一性が高くなる等の問題がある。【０００６】
そこで、生体組織からの抽出や微生物培養によらない第３の多糖の生産方法として、多糖合成酵素を用いた方法（酵素合成法）が検討されている。例えば、ヒアルロン酸合成酵素を用いた方法が知られている（非特許文献１）。しかしながら酵素合成法では、酵素が多量に必要である、生産効率が低く生産量が少ない等の問題があるため、研究レベルに留まっており、工業化の検討はされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第４，１４１，９７３号明細書
【特許文献２】米国特許第４，３０３，６７６号明細書
【特許文献３】特開昭５８−０５６６９２号公報
【特許文献４】国際公開第８６／８６０４３５５号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８，Ｖｏｌ．２７３，Ｎｏ．１４，Ｐ８４５４−８４５８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、多糖合成酵素を用いた多糖の製造方法であって、多糖を効率よく生産できる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記の目的を達成するべく検討を行った結果、本発明に到達した。
すなわち、本発明の多糖の製造方法は、下記リボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ａ）に多糖合成酵素（Ｂ）を作用させて多糖を製造する方法において、（Ａ）に（Ｂ）を作用させる時間中の１０〜１００％の時間において、反応溶液中のリボヌクレオシド２リン酸の濃度が多糖合成酵素（Ｂ）の下記阻害濃度ＩＣ５０の１００倍未満である多糖の製造方法である。
阻害濃度ＩＣ５０：多糖合成酵素（Ｂ）をリボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ａ）に作用させる際の（Ｂ）の濃度において、基質としてリボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ａ）を用いて、阻害剤としてリボヌクレオシド２リン酸を用いて求めた、（Ｂ）の酵素活性が半減するときのリボヌクレオシド２リン酸の濃度。
リボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ａ）：トリオース（ａ−１）、テトロース（ａ−２）、ペントース（ａ−３）、ヘキソース（ａ−４）、ヘプトース（ａ−５）及び下記単糖（ａ−６）からなる群より選ばれる少なくとも１種の単糖（ａ）が有する少なくとも１つのヒドロキシル基のプロトンが下記化学式（１）〜（５）のいずれか１つの官能基で置換された糖ヌクレオチド。
【化１】
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【化２】
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【化３】
0006000948.tif 000004
【化４】
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【化５】
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単糖（ａ−６）：（ａ−１）、（ａ−２）、（ａ−３）、（ａ−４）及び（ａ−５）からなる群より選ばれる単糖において、この単糖が有するプロトン、ヒドロキシル基及びヒドロキシメチル基からなる群より選ばれる少なくとも１種が下記置換基（Ｅ）で置換された単糖。
置換基（Ｅ）：カルボキシル基、アミノ基、Ｎ−アセチルアミノ基、スルファート基、メチルエステル基、Ｎ−グリコリル基、メチル基、１，２，３−トリヒドロキシプロピル基、リン酸基及び２−カルボキシ−２−ヒドロキシエチル基からなる群より選ばれる少なくとも１種の置換基。  
【発明の効果】
【００１１】
本発明の多糖の製造方法は、単位酵素あたりの多糖の生産量が多いという効果を奏する。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の多糖の製造方法は、下記リボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ａ）に多糖合成酵素（Ｂ）を作用させて多糖を製造する方法において、（Ａ）に（Ｂ）を作用させる時間中の１０〜１００％の時間において、反応溶液中のリボヌクレオシド２リン酸の濃度が多糖合成酵素（Ｂ）の下記阻害濃度ＩＣ５０の１００倍未満である多糖の製造方法である。
阻害濃度ＩＣ５０：多糖合成酵素（Ｂ）をリボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ａ）に作用させる際の（Ｂ）の濃度において、基質としてリボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ａ）を用いて、阻害剤としてリボヌクレオシド２リン酸を用いて求めた、（Ｂ）の酵素活性が半減するときのリボヌクレオシド２リン酸の濃度。
リボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ａ）：トリオース（ａ−１）、テトロース（ａ−２）、ペントース（ａ−３）、ヘキソース（ａ−４）、ヘプトース（ａ−５）及び下記単糖（ａ−６）からなる群より選ばれる少なくとも１種の単糖（ａ）が有する少なくとも１つのヒドロキシル基のプロトンが下記化学式（１）〜（５）のいずれか１つの官能基で置換された糖ヌクレオチド。
【化６】
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【化７】
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【化８】
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【化９】
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【化１０】
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単糖（ａ−６）：（ａ−１）、（ａ−２）、（ａ−３）、（ａ−４）及び（ａ−５）からなる群より選ばれる単糖において、この単糖が有するプロトン、ヒドロキシル基及びヒドロキシメチル基からなる群より選ばれる少なくとも１種が下記置換基（Ｅ）で置換された単糖。
置換基（Ｅ）：カルボキシル基、アミノ基、Ｎ−アセチルアミノ基、スルファート基、メチルエステル基、Ｎ−グリコリル基、メチル基、１，２，３−トリヒドロキシプロピル基、リン酸基及び２−カルボキシ−２−ヒドロキシエチル基からなる群より選ばれる少なくとも１種の置換基。
単糖（ａ）には、光学異性体及び立体異性体が含まれる。
【００１３】
トリオース（ａ−１）は、炭素数３の単糖であり、具体的には、ジヒドロキシアセトン及びグリセルアルデヒド等が挙げられる。
テトロース（ａ−２）は、炭素数４の単糖であり、具体的には、エリトロース、トレオース及びエリトルロース等が挙げられる。
ペントース（ａ−３）は、炭素数５の単糖であり、具体的には、アラビノース、キシロース、リボース、キシルロース、リブロース及びデオキシリボース等が挙げられる。
ヘキソース（ａ−４）は、炭素数６の単糖であり、具体的には、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ソルボース、タガトース、フコース、フクロース及びラムノース等が挙げられる。
ヘプトース（ａ−５）は、炭素数７の単糖であり、具体的には、セドヘプツロース等が挙げられる。
【００１４】
置換基（Ｅ）で置換された単糖（ａ−６）には、上記単糖（ａ−１）〜（ａ−５）の分子中のプロトン（−Ｈ）、ヒドロキシル基（−ＯＨ）及びヒドロキシメチル基（−ＣＨ２ＯＨ）のうち少なくとも１つが、カルボキシル基、アミノ基、Ｎ−アセチルアミノ基、スルファート基、メチルエステル基、Ｎ−グリコリル基、メチル基、１，２，３−トリヒドロキシプロピル基、リン酸基及び２−カルボキシ−２−ヒドロキシエチル基からなる群より選ばれる少なくとも１種の置換基で置換された下記（ａ−６−１）〜（ａ−６−１０）及び下記（ａ−６−１１）が含まれる。
（ａ−６−１）：カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）で置換された単糖
（ａ−６−２）：アミノ基（−ＮＨ２）で置換された単糖
（ａ−６−３）：Ｎ−アセチルアミノ基（−ＮＨＣＯＣＨ３）で置換された単糖
（ａ−６−４）：スルファート基（−ＯＳＯ３Ｈ）で置換された単糖
（ａ−６−５）：メチルエステル基（−ＣＯＯＣＨ３）で置換された単糖
（ａ−６−６）：Ｎ−グリコリル基（−ＮＨＣＯＣＨ２ＯＨ）で置換された単糖
（ａ−６−７）：メチル基で置換された単糖
（ａ−６−８）：１，２，３−トリヒドロキシプロピル基（−ＣＨＯＨＣＨＯＨＣＨ２ＯＨ）で置換された単糖
（ａ−６−９）：リン酸基（−ＯＰＯ３Ｈ２）で置換された単糖
（ａ−６−１０）：２−カルボキシ−２−ヒドロキシエチル基（−ＣＨ２ＣＨＯＨＣＯＯＨ）で置換された単糖
（ａ−６−１１）：（ａ−１）〜（ａ−５）の分子中のプロトン、ヒドロキシル基及びヒドロキシメチル基のうち少なくとも２つが２種以上の置換基（Ｅ）で置換された単糖
【００１５】
（ａ−６−１）として、具体的には、グルクロン酸、イズロン酸、マンヌロン酸及びガラクツロン酸等のウロン酸等が挙げられる。
（ａ−６−２）として、具体的には、グルコサミン、ガラクトサミン及びマンノサミン等のアミノ糖等が挙げられる。
（ａ−６−３）として、具体的には、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン及びＮ−アセチルガラクトサミン等が挙げられる。
（ａ−６−４）として、具体的には、ガラクトース−３−硫酸等が挙げられる。
（ａ−６−５）として、具体的には、グルコースメチルエステル及び（ａ−６−１）中のカルボン酸をメチルエステル化したもの等が挙げられる。
（ａ−６−１１）として、具体的には、Ｎ−アセチルムラミン酸、ムラミン酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−４−硫酸、イズロン酸−２−硫酸、グルクロン酸−２−硫酸、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−硫酸、シアル酸、ノイラミン酸、Ｎ−グライコリルノイラミン酸及びＮ−アセチルノイラミン酸等が挙げられる。
【００１６】
（ａ−６）が、置換基（Ｅ）としてアニオン基であるカルボキシル基、リン酸基、２−カルボキシ−２−ヒドロキシエチル基及びスルファート基からなる群より選ばれる少なくとも１種を有する場合、アニオン基のプロトンがアルカリ金属（Ｌｉ、Ｎａ及びＫ等）カチオン及び／又はアルカリ土類金属（Ｃａ等）カチオンで置換されていてもいい。
【００１７】
リボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ａ）は、上記単糖（ａ−１）〜（ａ−６）の有する少なくとも１つのヒドロキシル基のプロトンが、上記化学式（１）〜（５）で置換された糖ヌクレオチド（Ａ−１）〜（Ａ−６）である。
（Ａ−３）として、具体的には、ウリジン２リン酸−キシロース等が挙げられる。
（Ａ−４）として、具体的には、シチジン２リン酸−グルコース、グアノシン２リン酸−マンノース、グアノシン２リン酸−フコース、アデノシン２リン酸−グルコース、ウリジン２リン酸−グルコース、ウリジン２リン酸−ガラクトース及びウリジン２リン酸−マンノース等が挙げられる。
（Ａ−６）として、具体的には、ウリジン２リン酸−グルクロン酸、ウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン、ウリジン２リン酸−ウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルガラクトサミン及びウリジン２リン酸−イズロン酸等が挙げられる。
【００１８】
本発明の製造方法において、（Ａ）は１種を使用してもよく、２種以上を使用してもいい。また、１種の（Ａ）を使用して、１種の単糖が複数連なった多糖を製造してもよく、２種の（Ａ）を使用して、２種の単糖がランダム又は交互に連なった多糖を製造してもよく、３種以上の（Ａ）を使用して、３種以上の単糖がランダム又は規則的に連なった多糖を製造してもいい。また、２種以上の（Ａ）及び２種以上の（Ｂ）を使用して、複数種類の多糖を製造してもいい。
【００１９】
多糖合成酵素（Ｂ）は、上記（Ａ）から多糖を合成する多糖合成活性を有する酵素である。本発明において多糖とは、上記単糖（ａ−１）〜（ａ−６）が２〜１０，０００，０００個結合したものであり、重量平均分子量２００〜１，０００，０００，０００のものが含まれる。さらに、多糖にポリペプチドや脂質などが結合した構造の化合物も含まれ、多糖部分を有していれば良い。
多糖合成酵素（Ｂ）には、合成する多糖がヒアルロン酸であるヒアルロン酸合成酵素（Ｂ−１）、合成する多糖がコンドロイチンであるコンドロイチン合成酵素（Ｂ−２）、合成する多糖がキサンタンであるキサンタン合成酵素（Ｂ−３）、合成する多糖がセルロースであるセルロース合成酵素（Ｂ−４）、デンプン合成酵素（Ｂ−５）及びヘパリン合成酵素（Ｂ−６）が含まれる。また、（Ｂ）には、（Ｂ−１）〜（Ｂ−６）以外にも、単糖から多糖を合成する活性を有する酵素が含まれる。
【００２０】
ヒアルロン酸合成酵素（Ｂ−１）は、リボヌクレオシド２リン酸−グルクロン酸とリボヌクレオシド２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンとから、ヒアルロン酸を合成するヒアルロン酸合成活性を有する酵素である。ヒアルロン酸合成活性は、具体的には、リボヌクレオシド２リン酸−グルクロン酸及びリボヌクレオシド２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンを糖供与体として、グルクロン酸がβ１，３結合でＮ−アセチルグルコサミンに結合した二糖単位の、β１，４結合による繰り返し構造を有するオリゴ糖を合成する能力をいう。
（Ｂ−１）としては、従来のヒアルロン酸合成酵素を使用でき、ヒアルロン酸合成活性を有するものであれば特に限定されない。具体的には、非特許文献（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００７，Ｖｏｌ．２８２，Ｎｏ．５１，Ｐ３６７７７−３６７８１）に記載されているクラスＩ及びクラスＩＩのヒアルロン酸合成酵素等が挙げられる。クラスＩ及びクラスＩＩは、酵素のアミノ酸配列の相同性によって分類されたものである。クラスＩのヒアルロン酸合成酵素として、具体的には、ストレプトコッカスピロジェネシス由来、ストレプトコッカスエクイシミリス由来及び藻類ウイルス由来のヒアルロン酸合成酵素等が挙げられる。また、クラスＩＩのヒアルロン酸合成酵素として、具体的には、パスツレラ・ムルトシダ由来のヒアルロン酸合成酵素等が挙げられる。
【００２１】
本発明の製造方法において、（Ｂ）として（Ｂ−１）を用いてヒアルロン酸を製造する場合、単位酵素あたりの多糖の生産量の観点から、用いる（Ａ）としては、リボヌクレオシド２リン酸−グルクロン酸及びリボヌクレオシド２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンが好ましく、さらに好ましくはウリジン２リン酸−グルクロン酸及びウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンである。
【００２２】
コンドロイチン合成酵素（Ｂ−２）は、リボヌクレオシド２リン酸−グルクロン酸とリボヌクレオシド２リン酸−Ｎ−アセチルガラクトサミンとから、コンドロイチンを合成するコンドロイチン合成活性を有する酵素である。コンドロイチン合成活性は、具体的には、リボヌクレオシド２リン酸−グルクロン酸及びリボヌクレオシド２リン酸−Ｎ−アセチルガラクトサミンを糖供与体として、グルクロン酸がβ１，３結合でＮ−アセチルガラクトサミンに結合した二糖単位の、β１，４結合による繰り返し構造を有するオリゴ糖を合成する能力をいう。（Ｂ−２）としては、従来のコンドロイチン合成酵素を使用でき、コンドロイチン合成活性を有するものであれば特に限定されない。具体的には、ストレプトコッカスエクイシミリス由来のコンドロイチン合成酵素及びパスツレラ・ムルトシダ由来のコンドロイチン合成酵素等が挙げられる。
【００２３】
本発明の製造方法において、（Ｂ）として（Ｂ−２）を用いてコンドロイチンを製造する場合、用いる（Ａ）としては、単位酵素あたりの多糖の生産量の観点から、リボヌクレオシド２リン酸−グルクロン酸及びリボヌクレオシド２リン酸−Ｎ−アセチルガラクトサミンが好ましく、さらに好ましくはウリジン２リン酸−グルクロン酸及びウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルガラクトサミンである。
【００２４】
キサンタン合成酵素（Ｂ−３）は、リボヌクレオシド２リン酸−グルコース、リボヌクレオシド２リン酸−マンノース及びリボヌクレオシド２リン酸−グルクロン酸から、キサンタンを合成するキサンタン合成活性を有する酵素である。キサンタン合成活性は、具体的には、リボヌクレオシド２リン酸−グルコース、リボヌクレオシド２リン酸−マンノース及びリボヌクレオシド２リン酸−グルクロン酸を糖供与体としてキサンタンを合成する活性である。（Ｂ−３）としては、従来のキサンタン合成酵素を使用でき、キサンタン合成活性を有するものであれば特に限定されない。具体的には、キサンタン・カムペストリスから得られるキサンタン合成酵素等が挙げられる。
【００２５】
本発明の製造方法において、（Ｂ）として（Ｂ−３）を用いてキサンタンを製造する場合、単位酵素あたりの多糖の生産量の観点から、用いる（Ａ）としては、リボヌクレオシド２リン酸−グルコース、リボヌクレオシド２リン酸−マンノース及びリボヌクレオシド２リン酸−グルクロン酸が好ましく、さらに好ましくはウリジン２リン酸−グルコース、グアノシン２リン酸−マンノース及びウリジン２リン酸−グルクロン酸である。
【００２６】
セルロース合成酵素（Ｂ−４）は、リボヌクレオシド２リン酸−β−グルコースをグリコシド結合により直鎖状に結合させたセルロースを合成するセルロース合成活性を有する酵素である。セルロース合成活性は、具体的には、リボヌクレオシド２リン酸グルコースを糖供与体としてβ１，４結合を形成する活性である。（Ｂ−４）としては、従来のセルロース合成酵素を使用でき、セルロース合成活性を有するものであれば特に限定されない。具体的には、酢酸菌由来のセルロース合成酵素等が挙げられる。
【００２７】
本発明の製造方法において、（Ｂ）として（Ｂ−４）を用いてセルロースを製造する場合、単位酵素あたりの多糖の生産量の観点から、用いる（Ａ）としては、リボヌクレオシド２リン酸−β−グルコースが好ましく、さらに好ましくはウリジン２リン酸−β−グルコースである。
【００２８】
デンプン合成酵素（Ｂ−５）は、リボヌクレオシド２リン酸−α−グルコースをグリコシド結合により直鎖状に結合させたデンプンを合成するデンプン合成活性を有する酵素である。デンプン合成活性は、具体的には、リボヌクレオシド２リン酸−α−グルコースを糖供与体としてα１，６結合を形成する活性である。（Ｂ−５）としては、従来のデンプン合成酵素を使用でき、デンプン合成活性を有するものであれば特に限定されない。具体的には、トウモロコシ由来のデンプン合成酵素等が挙げられる。
【００２９】
本発明の製造方法において、（Ｂ）として（Ｂ−５）を用いてデンプンを製造する場合は、単位酵素あたりの多糖の生産量の観点から、用いる（Ａ）としては、リボヌクレオシド２リン酸−α−グルコースが好ましく、さらに好ましくはウリジン２リン酸−α−グルコースである。
【００３０】
ヘパリン合成酵素（Ｂ−６）は、リボヌクレオシド２リン酸−グルクロン酸又はリボヌクレオシド２リン酸−イズロン酸とリボヌクレオシド２リン酸−グルコサミンとからヘパリンを合成するヘパリン合成活性を有する酵素である。ヘパリン合成活性は、具体的には、リボヌクレオシド２リン酸−グルクロン酸（β−Ｄ−）又はリボヌクレオシド２リン酸イズロン酸（α−Ｌ−）とリボヌクレオシド２リン酸−グルコサミン（Ｄ−グルコサミン）を糖供与体として１，４結合を形成する活性である。（Ｂ−６）としては、従来のヘパリン合成酵素を使用でき、ヘパリン合成活性を有するものであれば特に限定されない。具体的には、ヒト由来のヘパリン合成酵素等が挙げられる。
【００３１】
本発明の製造方法において、（Ｂ）として（Ｂ−６）を用いてヘパリンを製造する場合、単位酵素あたりの多糖の生産量の観点から、用いる（Ａ）としては、リボヌクレオシド２リン酸−グルクロン酸又はリボヌクレオシド２リン酸−イズロン酸とリボヌクレオシド２リン酸−グルコサミンとであることが好ましく、さらに好ましくはウリジン２リン酸−グルクロン酸又はウリジン２リン酸−イズロン酸とウリジン２リン酸−グルコサミンとであることである。
【００３２】
上記糖ヌクレオチド（Ａ）及び上記多糖合成酵素（Ｂ）は、製造する多糖に応じて適宜選択する。
【００３３】
本発明の製造方法において、反応溶液中のリボヌクレオシド２リン酸の濃度は、多糖合成酵素（Ｂ）の下記阻害濃度ＩＣ５０の１００倍未満である。
阻害濃度ＩＣ５０：多糖合成酵素（Ｂ）をリボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ａ）に作用させる際の（Ｂ）の濃度において、基質としてリボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ａ）を用いて、阻害剤としてリボヌクレオシド２リン酸を用いて求めた、（Ｂ）の酵素活性が半減するときのリボヌクレオシド２リン酸の濃度。
阻害濃度ＩＣ５０は、（Ｂ）を（Ａ）に作用させる工程の開始時から終了時までのいずれかの時点での、（Ｂ）を作用させる際と同じ（Ｂ）の濃度、温度及びｐＨの条件下で、下記測定を行うことにより求められる。
＜阻害濃度ＩＣ５０の測定方法＞
一定量の多糖合成酵素（Ｂ）、リボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ａ）、リボヌクレオシド２リン酸、ｐＨ調整剤（Ｋ）及び水を含む一定の温度及びｐＨに調整した酵素反応溶液（Ｉ）を作成する。
酵素反応溶液（Ｉ）の温度は、製造工程中で（Ｂ）を（Ａ）に作用させる工程の開始時から終了時までのいずれかの時点での温度と同じ温度に調整する。
酵素反応溶液（Ｉ）のｐＨは、製造工程中で（Ｂ）を（Ａ）に作用させる工程の開始時から終了時までのいずれかの時点でのｐＨと同じｐＨに調整する。
酵素反応溶液（Ｉ）中の（Ｂ）のモル濃度は、（Ｂ）を（Ａ）に作用させる工程の開始時から終了時までのいずれかの時点での濃度と同じ濃度に調整する。
酵素反応溶液（Ｉ）中のリボヌクレオシド２リン酸の含有量（モル濃度）は、リボヌクレオシド２リン酸が０Ｍの酵素反応溶液（Ｉ）、及びリボヌクレオシド２リン酸の濃度が０Ｍから多糖合成酵素（Ｂ）の活性が０になる（多糖の生成が観測できなくなる）リボヌクレオシド２リン酸の濃度との間で、リボヌクレオシド２リン酸の濃度が異なる４種類以上の酵素反応溶液（Ｉ）、合計５種類以上の酵素反応溶液（Ｉ）を作成する。また、類似の多糖合成酵素に対するリボヌクレオシド２リン酸の阻害定数Ｋｉが分かっている場合は、リボヌクレオシド２リン酸の濃度が０Ｍのもの、類似の多糖合成酵素のＫｉ未満で０Ｍより大きい濃度範囲で２種類以上、Ｋｉ以上及びＫｉの１０倍以下の濃度範囲で２種類以上、合計５種類以上作成すればいい。
酵素反応溶液（Ｉ）中のリボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ａ）の含有量は、経時的なピーク面積変化を観測できる濃度を１点選べばよい。測定に使用する（Ｂ）と類似の多糖合成酵素のミカエリス定数Ｋｍが分かっている場合は、Ｋｍ以上及びＫｍの５倍以下の濃度範囲の間で選べばよい。
酵素反応溶液（Ｉ）に用いるｐＨ調整剤（Ｋ）は、扱いやすさ及び酵素の安定性の観点から、リン酸塩、ホウ酸塩、ＨＥＰＥＳバッファー及びＭＥＳバッファー等のＧｏｏｄバッファーが好ましい。酵素反応溶液（Ｉ）中の（Ｋ）の含有量（モル濃度）は、１０〜５００ｍＭである。
作成した酵素反応溶液（Ｉ）について、（Ｉ）を作成直後及び一定時間（例えば５分）ごとに溶液の一部（例えば１００μＬ）を取り出し、取り出したものを１００℃で１分間熱処理し、酵素反応を停止する。液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと略記する）を用いて、取り出した反応溶液中の多糖の量を定量する。酵素反応溶液（Ｉ）を作成直後のピーク面積をＰ０、ｈ時間後のピーク面積をＰｈとし、ピーク面積の変化ΔＰ（ΔＰ＝Ｐｈ−Ｐ０）と多糖のピーク面積に対する検量線を用いて酵素反応初速度ｖ（Ｍ／ｓ）を算出する。
さらに、リボヌクレオシド２リン酸の濃度が異なる酵素反応溶液（Ｉ）を用いて同様に測定し、酵素反応初速度ｖを算出する。
横軸に（ｘ軸）に酵素反応溶液（Ｉ）中のそれぞれのリボヌクレオシド２リン酸の濃度、縦軸（ｙ軸）にリボヌクレオシド２リン酸の濃度が０の時の酵素反応初速度ｖを１００（％）としたときの相対活性をプロットする。プロットを直線でつなぎ、ｙ＝５０（％）となるときのリボヌクレオシド２リン酸の濃度を阻害濃度ＩＣ５０とする。
【００３４】
本発明において、反応溶液中のリボヌクレオシド２リン酸の濃度は、多糖を効率よく製造する観点から、阻害濃度ＩＣ５０の１００倍未満が好ましく、さらに好ましくは１０倍以下である。
リボヌクレオシド２リン酸の濃度が高くなればなるほど、多糖合成酵素（Ｂ）の活性が抑制される。ＩＣ５０の１００倍のリボヌクレオシド２リン酸が存在すれば、多糖合成酵素の活性は１００分の１に抑制される。したがって、ＩＣ５０の１００倍のリボヌクレオシド２リン酸が存在すれば、多糖合成酵素を１００倍必要とする。さらに、多糖合成酵素溶液に含まれる夾雑酵素も同時に反応系に組み込まれる。つまり、多糖合成酵素の純度９９％として、リボヌクレオシド２リン酸がＩＣ５０の１００倍存在する場合、（リボヌクレオシド２リン酸が存在しない条件の）１００倍多糖合成酵素を添加すると、夾雑酵素はリボヌクレオシド２リン酸が存在しない時に添加する多糖合成酵素の量と同程度含まれることになる。よって、夾雑酵素による望まない反応が問題になってくる。多糖合成酵素の精製度を上げればこの問題は解決するのだが、工業的に酵素を精製する場合、純度９９％以上を達成する事は非常に困難である。よって、リボヌクレオシド２リン酸の濃度は１００倍未満にする必要がある。
また、複数種類の（Ｂ）を用いる場合は、全ての（Ｂ）の阻害濃度ＩＣ５０を測定し、少なくとも１つの（Ｂ）の阻害濃度ＩＣ５０について上記範囲であることが好ましい。
また、（Ａ）に（Ｂ）を作用させる工程において、リボヌクレオシド２リン酸の濃度が上記範囲である時間は、（Ａ）に（Ｂ）を作用させる時間中の１０〜１００％の時間であるが、反応効率の観点から、３０〜１００％の時間であることが好ましく、さらに好ましくは５０〜１００％の時間であり、特に好ましくは８０〜１００％の時間であり、最も好ましくは９０〜１００％の時間である。
多糖合成酵素（Ｂ）を用いた従来の生産方法は、副生成物であるリボヌクレオシド２リン酸により、（Ｂ）の活性が阻害されるため、多糖の生産効率が低い、生産量が少ない、（Ｂ）が大量に必要である等の問題があるが、本発明では、（Ａ）に（Ｂ）を作用させる際の反応溶液中のリボヌクレオシド２リン酸の濃度が上記範囲であることにより、リボヌクレオシド２リン酸が（Ｂ）の活性を阻害しにくく、従来の生産方法よりも生産効率が高い。また、（Ｂ）の活性が阻害されにくいので、単位酵素あたりの多糖の生産量が多く、（Ｂ）を多量に使用する必要がない。
【００３５】
本発明の製造方法において、リボヌクレオシド２リン酸の濃度を上記範囲にする方法としては、下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の方法等が挙げられる。
（ｉ）リボヌクレオシド２リン酸変換酵素（Ｄ）を用いてリボヌクレオシド２リン酸を後述する化合物（Ｃ）に変換する方法
（ｉｉ）シリカゲル担体等を用いて反応溶液中のリボヌクレオシド２リン酸を吸着させる方法
（ｉｉｉ）化学反応によりリボヌクレオシド２リン酸を他の化合物に変換する方法
【００３６】
（ｉｉ）の方法においては、シリカゲル担体以外にも、活性炭及びゼオライトなど、リボヌクレオシド２リン酸を吸着できるものであれば制限なく利用できる。
（ｉｉｉ）の方法においては、リボヌクレオシド２リン酸を他の化合物に変換することができる化学反応であれば、一般的に知られている化学反応を制限無く用いることができる。
【００３７】
本発明において、リボヌクレオシド２リン酸の濃度を上記範囲にする方法としては、反応の基質特異性が高く、基質（リボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ａ））が分解されるなどの問題が少ないという観点から、（ｉ）の方法が好ましい。
【００３８】
（ｉ）のリボヌクレオシド２リン酸変換酵素（Ｄ）を用いてリボヌクレオシド２リン酸を化合物（Ｃ）に変換する方法とは、具体的には下記方法が含まれる。
リボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ａ）に多糖合成酵素（Ｂ）を作用させて多糖を製造する方法において、リボヌクレオシド２リン酸を下記化合物（Ｃ）に変換する活性を有するリボヌクレオシド２リン酸変換酵素（Ｄ）の存在下で（Ｂ）を作用させる多糖の製造方法。
化合物（Ｃ）：プリン塩基又はピリミジン塩基（Ｃ−１）、リボヌクレオシド（Ｃ−２）、リボヌクレオシド１リン酸（Ｃ−３）、リボヌクレオシド３リン酸（Ｃ−４）、ポリリボヌクレオチド（Ｃ−５）、デオキシリボヌクレオシド２リン酸（Ｃ−６）及びリボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ｃ−７）からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物。
【００３９】
（Ｃ−１）には、プリン塩基（アデニン及びグアニン等）並びにピリミジン塩基（チミン、シトシン及びウラシル等）等が含まれる。
（Ｃ−２）は、（Ｃ−１）の塩基と単糖が結合した化合物であり、具体的には、ウリジン、アデノシン、リボチミジン、シチジン及びグアノシン等が挙げられる。
（Ｃ−３）は、（Ｃ−２）のモノリン酸エステル化物であり、具体的には、ウリジル酸（ウリジン５’−リン酸）、アデノシン１リン酸（アデノシン５’−リン酸）、リボチミジル酸（リボチミジン５’−リン酸）、シチジン１リン酸（シチジン５’−リン酸）及びグアノシン１リン酸（グアノシン５’−リン酸）等が挙げられる。
（Ｃ−４）は、（Ｃ−２）のトリリン酸エステル化物であり、具体的には、ウリジン３リン酸（ウリジン５’−３リン酸）、アデノシン３リン酸（アデノシン５’−３リン酸）、リボチミジン−３リン酸（リボチミジン５’−３リン酸）、シチジン３リン酸（シチジン５’−３リン酸）及びグアノシン３リン酸（グアノシン５’−３リン酸）等が挙げられる。
（Ｃ−５）は、（Ｃ−３）がホスホジエステル結合で重合したポリマーであり、具体的には、ポリウリジル酸、ポリアデニル酸、ポリチミジル酸、ポリシチジル酸及びポリグアニル酸等が挙げられる。
（Ｃ−６）は、リボヌクレオシド２リン酸分子中のリボースが２−デオキシリボースとなったものであり、具体的には、デオキシウリジン２リン酸、デオキシアデノシン２リン酸、デオキシグアノシン２リン酸、デオキシシチジン２リン酸及びチミジン２リン酸等が挙げられる。
（Ｃ−７）には、上記リボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ａ）が含まれる。
【００４０】
リボヌクレオシド２リン酸変換酵素（Ｄ）には、下記（Ｄ１）〜（Ｄ７）が含まれる。
（Ｄ１）リボヌクレオシド２リン酸をプリン塩基又はピリミジン塩基に変換する活性を有する酵素
（Ｄ２）リボヌクレオシド２リン酸をリボヌクレオシドに変換する活性を有する酵素
（Ｄ３）リボヌクレオシド２リン酸をリボヌクレオシド１リン酸に変換する活性を有する酵素
（Ｄ４）リボヌクレオシド２リン酸をリボヌクレオシド３リン酸に変換する活性を有する酵素
（Ｄ５）リボヌクレオシド２リン酸をポリリボヌクレオチドに変換する活性を有する酵素
（Ｄ６）リボヌクレオシド２リン酸をデオキシリボヌクレオシド２リン酸に変換する活性を有する酵素
（Ｄ７）リボヌクレオシド２リン酸をリボヌクレオシド２リン酸−単糖に変換する活性を有する酵素
【００４１】
（Ｄ２）は、リボヌクレオチド中の糖とリン酸との間のリン酸エステル結合を加水分解して、ヌクレオシドとリン酸にする反応を触媒する酵素である。（Ｄ２）として、具体的には、アピラーゼ等が挙げられる。
【００４２】
（Ｄ３）は、リボヌクレオシド２リン酸等のリン酸ジエステルを加水分解してリン酸モノエステルとする反応を触媒する酵素である。（Ｄ３）として、具体的には、アデノシン２リン酸（ＡＤＰ）特異的ホスホフルクトキナーゼ及びヌクレオチダーゼ等が挙げられる。
【００４３】
（Ｄ４）は、リン酸基を有する化合物から、リボヌクレオシド２リン酸にリン酸基を転移させてリボヌクレオシド３リン酸とする反応を触媒する酵素である。（Ｄ４）として、具体的には、ヌクレオシド２リン酸キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、アルギニンキナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、カルバミン酸キナーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ及びホスホクレアチンキナーゼ等が含まれる。
また、（Ｄ４）には、ウリジン３リン酸合成酵素（Ｄ４−１）が含まれる。（Ｄ４−１）は、作用するリボヌクレオシド２リン酸がウリジン２リン酸であり、ウリジン３リン酸を合成する反応を触媒する酵素である。
【００４４】
ヌクレオシド２リン酸キナーゼは、ヌクレオシド３リン酸からヌクレオシド２リン酸にリン酸基を転移する酵素である。ヌクレオシド２リン酸キナーゼとして、具体的には、生物由来のもの｛動物由来のもの（例えば、ヒト由来、ウシ由来及びラット由来のもの等）、植物由来のもの（例えば、シロイヌナズナ由来及びコメ由来のもの等）及び微生物由来のもの（例えば、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属由来、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属由来、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属由来及びサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属由来のもの等）等｝、生物由来のものを化学修飾したもの（例えば、カルボジイミド化合物、無水コハク酸、ヨード酢酸及びイミダゾール化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種を作用させて化学修飾したもの等）及び生物由来のものを遺伝子的に修飾したもの｛例えば、Ｓｍｉｔｈらの方法（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８，Ｖｏｌ．２５３，Ｎｏ．１８，Ｐ６５５１−６５６０）を用いて遺伝子を改変して得たもの等｝等が挙げられる。
【００４５】
ポリリン酸キナーゼは、リボヌクレオシド２リン酸とポリリン酸とから、リボヌクレオシド３リン酸と、重合度の１つ少ないポリリン酸とを生成する活性を有する酵素である。ポリリン酸キナーゼとして、具体的には、生物由来のもの｛植物由来のもの（例えば、タバコ由来のもの等）及び微生物由来のもの（エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属由来、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属由来、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属由来及びサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属由来のもの等）等｝、生物由来のものを化学修飾したもの（例えば、カルボジイミド化合物、無水コハク酸、ヨード酢酸及びイミダゾール化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種を作用させて化学修飾したもの等）並びに生物由来のものを遺伝子的に修飾したもの｛例えば、Ｓｍｉｔｈらの方法（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８，Ｖｏｌ．２５３，Ｎｏ．１８，Ｐ６５５１−６５６０）を用いて遺伝子を改変して得たもの等｝等が挙げられる。
【００４６】
アルギニンキナーゼは、リボヌクレオシド２リン酸とω−ホスホノ−Ｌ−アルギニンからリボヌクレオシド３リン酸とＬ−アルギニンを生成する活性を有する酵素である。アルギニンキナーゼとして、具体的には、生物由来のもの｛動物由来のもの（例えば、ショウジョウバエ由来、エビ由来及びノミ由来のもの等）、植物由来のもの（例えば、ケヤリ由来のもの等）及び微生物由来のもの（例えば、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属由来のもの等）等｝、生物由来のものを化学修飾したもの（例えば、カルボジイミド化合物、無水コハク酸、ヨード酢酸及びイミダゾール化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種を作用させて化学修飾したもの等）並びに生物由来のものを遺伝子的に修飾したもの｛例えば、Ｓｍｉｔｈらの方法（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８，Ｖｏｌ．２５３，Ｎｏ．１８，Ｐ６５５１−６５６０）を用いて遺伝子を改変して得たもの等｝等が挙げられる。
【００４７】
ピルビン酸キナーゼは、リボヌクレオシド２リン酸とホスホエノールピルビン酸からリボヌクレオシド３リン酸とピルビン酸を生成する活性を有する酵素である。ピルビン酸キナーゼとして、具体的には、生物由来のもの｛動物由来のもの（例えば、ヒト由来、ウシ由来及びラット由来のもの等）、植物由来のもの（例えば、シロイヌナズナ由来及びトウゴマ由来のもの等）及び微生物由来のもの（例えば、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属由来及びサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属由来のもの等）等｝、生物由来のものを化学修飾したもの（例えば、カルボジイミド化合物、無水コハク酸、ヨード酢酸及びイミダゾール化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種を作用させて化学修飾したもの等）並びに生物由来のものを遺伝子的に修飾したもの｛例えば、Ｓｍｉｔｈらの方法（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８，Ｖｏｌ．２５３，Ｎｏ．１８，Ｐ６５５１−６５６０）を用いて遺伝子を改変して得たもの等｝等が挙げられる。
【００４８】
カルバミン酸キナーゼは、カルバモイルリン酸とリボヌクレオシド２リン酸からリボヌクレオシド３リン酸、二酸化炭素、及びアンモニアを生成する活性を有する酵素である。カルバミン酸キナーゼとして、具体的には、生物由来のもの｛動物由来のもの（例えば、ラット由来のもの等）及び微生物由来のもの（例えば、ピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属由来、及びラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属由来のもの等）等｝、生物由来のものを化学修飾したもの（例えば、カルボジイミド化合物、無水コハク酸、ヨード酢酸及びイミダゾール化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種を作用させて化学修飾したもの等）並びに生物由来のものを遺伝子的に修飾したもの｛例えば、Ｓｍｉｔｈらの方法（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８，Ｖｏｌ．２５３，Ｎｏ．１８，Ｐ６５５１−６５６０）を用いて遺伝子を改変して得たもの等｝等が挙げられる。
【００４９】
ホスホグリセリン酸キナーゼは、３−ホスホグリセロールリン酸とリボヌクレオシド２リン酸からリボヌクレオシド３リン酸及び３−ホスホグリセリン酸を生成する活性を有する酵素である。ホスホグリセリン酸キナーゼとして、具体的には、生物由来のもの｛動物由来のもの（例えば、ラット由来のもの等）及び微生物由来のもの（例えば、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属由来のもの等）等｝、生物由来のものを化学修飾したもの（例えば、カルボジイミド化合物、無水コハク酸、ヨード酢酸及びイミダゾール化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種を作用させて化学修飾したもの等）並びに生物由来のものを遺伝子的に修飾したもの｛例えば、Ｓｍｉｔｈらの方法（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８，Ｖｏｌ．２５３，Ｎｏ．１８，Ｐ６５５１−６５６０）を用いて遺伝子を改変して得たもの等｝等が挙げられる。
【００５０】
ホスホクレアチンキナーゼは、ホスホクレアチンとリボヌクレオシド２リン酸からリボヌクレオシド３リン酸及びクレアチンを生成する活性を有する酵素である。ホスホクレアチンキナーゼとして、具体的には、生物由来のもの｛動物由来のもの（例えば、ラット由来のもの等）等｝、生物由来のものを化学修飾したもの（例えば、カルボジイミド化合物、無水コハク酸、ヨード酢酸及びイミダゾール化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種を作用させて化学修飾したもの等）並びに生物由来のものを遺伝子的に修飾したもの｛例えば、Ｓｍｉｔｈらの方法（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８，Ｖｏｌ．２５３，Ｎｏ．１８，Ｐ６５５１−６５６０）を用いて遺伝子を改変して得たもの等｝等が挙げられる。
【００５１】
（Ｄ４）は、１種を使用してもよく、２種以上を使用してもいい。
（Ｄ４）のうち、リボヌクレオシド３リン酸合成活性の高さの観点から、アルギニンキナーゼ、ヌクレオシド２リン酸キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ及びカルバミン酸キナーゼが好ましい。
【００５２】
（Ｄ４）を作用させる際、必要により、リボヌクレオシド２リン酸にリン酸基を与えるリン酸基含有化合物（Ｆ）を用いてもいい。（Ｆ）はリン酸基を有する化合物である。（Ｆ）としては、（Ｄ４）の基質特異性の観点から、リボヌクレオシド２リン酸にリン酸基を供与し得る化合物が好ましい。（Ｆ）としては、例えば、トリアミノホスフィンオキシド、リン酸化したアミノ酸（例えばω−ホスホノ−Ｌ−アルギニン等）、ポリリン酸、ホスホエノールピルビン酸及びその塩（例えば、リチウム塩、ナトリウム塩及びカリウム塩等）、カルバモイルリン酸、３−ホスホグリセロールリン酸、ホスホクレアチン並びにヌクレオシド３リン酸（例えばグアノシン３リン酸及びアデノシン３リン酸等）等が挙げられる。
リン酸基含有化合物（Ｆ）を用いる場合、（Ｄ４）と（Ｆ）との組み合わせとしては、ヌクレオシド２リン酸キナーゼとヌクレオシド３リン酸との組み合わせ、ポリリン酸キナーゼとポリリン酸との組み合わせ、アルギニンキナーゼとω−ホスホノ−Ｌ−アルギニンとの組み合わせ、ピルビン酸キナーゼとホスホエノールピルビン酸及びその塩との組み合わせ、カルバミン酸キナーゼとカルバモイルリン酸との組み合わせ、ホスホグリセリン酸キナーゼと３−ホスホグリセロールリン酸との組み合わせ、ホスホグリセリン酸キナーゼと３−ホスホグリセロールリン酸との組み合わせ並びにホスホクレアチンキナーゼとホスホクレアチンとの組み合わせが好ましい。
【００５３】
リボヌクレオシド２リン酸変換酵素（Ｄ）がウリジン３リン酸合成酵素（Ｄ４−１）であり、化合物（Ｃ）がウリジン３リン酸であり、リボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ａ）がウリジン２リン酸−単糖である場合、下記ミカエリス定数Ｋｍが下記阻害濃度ＩＣ５０の１００倍未満であることが好ましい。
ミカエリス定数Ｋｍ：ウリジン２リン酸を基質とし、（Ｄ４−１）を酵素とし、リン酸基含有化合物（Ｆ）の存在下でウリジン３リン酸を合成する反応におけるミカエリス定数。
阻害濃度ＩＣ５０：多糖合成酵素（Ｂ）をウリジン２リン酸−単糖に作用させる際の（Ｂ）の濃度において、基質としてウリジン２リン酸−単糖を用いて、阻害剤としてウリジン２リン酸を用いて求めた、（Ｂ）の酵素活性が半減するときのウリジン２リン酸の濃度。
【００５４】
ミカエリス定数Ｋｍは、Ａｇａｒｗａｌらによって報告された方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９７８，Ｖｏｌ．５１，Ｐ４８３−４９１に記載の方法）で酵素反応初速度の基質濃度依存性を求めることによって求められる。ミカエリス定数Ｋｍの測定に用いる（Ｄ４−１）の形態としては、精製酵素を用いる。また、阻害濃度ＩＣ５０は、上述の方法によって求める。
【００５５】
（Ｄ５）は、リボヌクレオシド２リン酸等のリボヌクレオシド２リン酸をリボヌクレオシド１リン酸の共重合物（ポリリボヌクレオチド等）及び無機リン酸とする反応を触媒する酵素である。（Ｄ５）として、具体的には、ポリリボヌクレオチドヌクレオチジルトランスフェラーゼ等が挙げられる。
【００５６】
（Ｄ６）は、リボヌクレオシド２リン酸等のリボヌクレオチドを還元してデオキシリボヌクレオチド（デオキシウリジン２リン酸等）とする反応を触媒する酵素である。（Ｄ６）として、具体的には、リボヌクレオシドジホスホリダクターゼ等が挙げられる。
【００５７】
リボヌクレオシド２リン酸変換酵素（Ｄ）として（Ｄ６）を用いる場合、還元剤（ｄ６）を用いる必要がある。（ｄ６）としては、電子伝達タンパク質を用いることができ、例えば、還元型チオレドキシン等が挙げられる。
【００５８】
（Ｄ７）は、リボヌクレオシド２リン酸等のリボヌクレオシド２リン酸と糖又は糖リン酸とから糖核酸（リボヌクレオシド２リン酸−単糖）を合成する反応を触媒する酵素である。（Ｄ７）として、具体的には、スクロースシンターゼ及びＮ−アシルニューラミネートシチジリルトランスフェラーゼ等が挙げられる。
【００５９】
リボヌクレオシド２リン酸変換酵素（Ｄ）として（Ｄ７）を用いる場合、糖核酸の原料（ｄ７）として、糖（ｄ７−１）又は糖リン酸（ｄ７−２）を用いる必要がある。
（ｄ７−１）には、単糖、二糖及びオリゴ糖等が含まれ、具体的には、スクロース等が挙げられる。
（ｄ７−２）は、単糖の有するヒドロキシル基のうち１つに１つのリン酸が結合した化合物であり、例えば、グルクロン酸１リン酸（１−ホスホ−α−Ｄ−グルクロン酸等）、Ｎ−アセチルグルコサミン１リン酸（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン−１−ホスファート等）等が挙げられる。
（Ｄ７）により合成されるリボヌクレオシド２リン酸−単糖は、本発明の製造方法の原料である（Ａ）と同じでもよく、（Ａ）と異なってもいい。糖（ｄ７−１）又は糖リン酸（ｄ７−２）として、本発明の製造方法の原料であるリボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ａ）と同じ単糖（ａ）のヒドロキシル基に、１つのリン酸が結合した化合物である場合は、（Ａ）が合成される。
【００６０】
上記リボヌクレオシド２リン酸変換酵素（Ｄ）のうち、多糖を効率よく製造する観点及び工業化しやすいという観点から、（Ｄ２）、（Ｄ３）、（Ｄ４）、（Ｄ５）及び（Ｄ７）が好ましく、さらに好ましくは（Ｄ４）、特に好ましくは（Ｄ４−１）である。
（Ｄ）は、１種を使用してもよく、２種以上を併用してもいい。
【００６１】
本発明において、リボヌクレオシド２リン酸変換酵素（Ｄ）を用いる場合、下記酵素活性Ｖｍａｘ１及び下記酵素活性Ｖｍａｘ２を用いて下記数式（１）から算出した酵素活性比（Ｙ１）が、多糖を効率よく製造する観点及び基質（リボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ａ））を有効利用する観点から、０．１以上であることが好ましい。
酵素活性比（Ｙ１）＝Ｖｍａｘ１／Ｖｍａｘ２  （１）
酵素活性Ｖｍａｘ１：リボヌクレオシド２リン酸変換酵素（Ｄ）のリボヌクレオシド２リン酸に対する酵素活性。
酵素活性Ｖｍａｘ２：リボヌクレオシド２リン酸変換酵素（Ｄ）のリボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ａ）に対する酵素活性。
なお、酵素活性Ｖｍａｘ１及びＶｍａｘ２は下記酵素活性Ｖｍａｘの測定法により測定できる。
【００６２】
＜酵素活性Ｖｍａｘの測定法＞
一定量の基質（リボヌクレオシド２リン酸又はウリジン２リン酸−単糖（Ａ））、酵素（多糖合成酵素（Ｂ）又はリボヌクレオシド２リン酸変換酵素（Ｄ））、ｐＨ調整剤（Ｋ）及び水を含む、一定の温度及び一定のｐＨに調整した酵素反応溶液（ＩＩ）を作成する。酵素反応溶液（ＩＩ）中において、用いる酵素が（Ｄ４）である場合は必要によりリン酸基含有化合物（Ｆ）を添加し、酵素が（Ｄ６）である場合は還元剤（ｄ６）を添加し、（Ｄ７）である場合は糖核酸の原料（ｄ７）を添加する。
酵素反応溶液（ＩＩ）を作成後、静置し、１分〜１００時間酵素反応させる。次に、反応後の反応生成物量（Ｘ）を測定して酵素反応初速度ｖを求める。同様に、基質の濃度が異なる酵素反応溶液（ＩＩ）を用いて、酵素反応初速度ｖを求める。得られた酵素反応初速度ｖと基質の濃度とからラインウェバー−バークプロットを作成し、酵素活性Ｖｍａｘを求める。
ここで、酵素反応溶液（ＩＩ）の温度は、０〜１００℃の範囲内で、酵素の活性が失活せず、活性がある温度で、酵素反応溶液（ＩＩ）作成時から測定終了までの間、一定温度に保つことができればいい。
酵素反応溶液（ＩＩ）のｐＨは、ｐＨ３〜１２の範囲内であればいい。後述する多糖合成酵素（Ｂ）の最適ｐＨがわかっている場合は、最適ｐＨであることが好ましい。
酵素反応溶液（ＩＩ）に用いるｐＨ調整剤（Ｋ）は、扱いやすさ及び酵素の安定性の観点から、ＨＥＰＥＳバッファー、ＭＥＳバッファーなどのＧｏｏｄバッファーが好ましい。酵素反応溶液（ＩＩ）中のｐＨ調整剤（Ｋ）の濃度（モル濃度）は、２５〜５００ｍＭである。
酵素反応溶液（ＩＩ）中の酵素の濃度（モル濃度）は、使用する（Ｄ）の種類によって適宜選択されるが、後述する反応生成物量（Ｘ）を縦軸に、時間ｈを横軸にプロットした場合、プロットが一次関数となる濃度を選ぶ。
酵素が（Ｄ４）であり、リン酸基含有化合物（Ｆ）を添加する場合、酵素反応溶液（ＩＩ）中の（Ｆ）の濃度（モル濃度）は、１ｎＭ〜１０Ｍである。また、（Ｆ）の濃度は、（Ｆ）の濃度を２倍又は１／２倍に変化させても、反応速度が変化しない程度の濃度とする。
酵素が（Ｄ６）である場合、酵素反応溶液（ＩＩ）中の還元剤（ｄ６）の濃度（モル濃度）は、１ｎＭ〜１０Ｍである。また、（ｄ６）の濃度は、（ｄ６）の濃度を２倍又は１／２倍に変化させても、反応速度が変化しない程度の濃度とする。
酵素が（Ｄ７）である場合、酵素反応溶液（ＩＩ）中の糖核酸の原料（ｄ７）の濃度（モル濃度）は、１ｎＭ〜１０Ｍである。また、（ｄ７）の濃度は、（ｄ７）の濃度を２倍又は１／２倍に変化させても、反応速度が変化しない程度の濃度とする。
酵素反応溶液（ＩＩ）中の基質の濃度（モル濃度）は、経時的に反応生成物量（Ｘ）を観測できる最小の基質濃度から最大の基質濃度の間で３点以上選べばよい。
反応時間は、短すぎると、反応生成物量（Ｘ）の正確な値が測定できない。また、反応時間が長すぎると、酵素が失活したり基質が枯渇するという問題が存在する。したがって、反応時間は反応生成物量（Ｘ）を縦軸に、時間を横軸にプロットした場合、プロットが一次関数となる反応時間とする。
反応生成物量（Ｘ）は、反応生成物の量を定量的に測定する目的で適切な条件下でＨＰＬＣを用いて解析を行うことにより求める。ここにおいて、反応生成物とは、多糖合成酵素（Ｂ）又はリボヌクレオシド２リン酸変換酵素（Ｄ）が有する活性により基質が変換されて生成したものである。
酵素活性Ｖｍａｘ（Ｍ／ｓ）はミカエリスメンテン式から派生したラインウェバー−バーク（Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ）プロットを用いて求める。ラインウェバー−バークプロットは、横軸（ｘ軸）にそれぞれの基質の濃度の逆数（１／［Ｓ］）、縦軸（ｙ軸）にそれぞれの基質濃度での酵素反応初速度の逆数（１／ｖ）をプロットしたものであり、プロットの近似直線とｙ軸との交点が酵素活性Ｖｍａｘの逆数（１／Ｖｍａｘ）である。
【００６３】
上記測定において、酵素としてリボヌクレオシド２リン酸変換酵素（Ｄ）を用いて、基質としてリボヌクレオシド２リン酸を用いて求めたものがＶｍａｘ１である。また、酵素としてリボヌクレオシド２リン酸変換酵素（Ｄ）を用いて、基質としてリボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ａ）を用いて求めたものがＶｍａｘ２である。２種以上のリボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ａ）を用いる場合は、それぞれのリボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ａ）についてそれぞれＶｍａｘ２を求める。また、それぞれのＶｍａｘ２を用いて、数式（１）からそれぞれ酵素活性比（Ｙ１）を求める。酵素活性比（Ｙ１）は、多糖を効率よく製造する観点及び基質（リボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ａ））を有効利用する観点から、全ての酵素活性比（Ｙ１）が０．１以上であることが好ましい。
また、多糖の製造において、２種以上の（Ｄ）を用いる場合は、それぞれの（Ｄ）について酵素活性比（Ｙ１）を求める。多糖を効率よく製造する観点及び基質（リボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ａ））を有効利用する観点から、少なくとも１種の（Ｄ）について酵素活性比（Ｙ１）が０．１以上であることが好ましく、さらに好ましくは全ての（Ｄ）について酵素活性比（Ｙ１）が０．１以上であることが好ましい。
【００６４】
＜多糖合成酵素（Ｂ）の最適ｐＨ測定法＞
一定量のリボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ａ）、多糖合成酵素（Ｂ）、ｐＨ調整剤（Ｋ）及び水を含み、ｐＨがそれぞれ３〜１２である酵素反応溶液（ＩＩＩ）を作成する。次に、酵素反応溶液（ＩＩＩ）を静置して、１分〜１００時間反応を行う。さらに、酵素反応溶液（ＩＩＩ）中に生成した多糖の量をそれぞれ測定する。縦軸に多糖の生成量、横軸にｐＨをプロットし、多糖の生成量が極大値となるｐＨが最適ｐＨである。
酵素反応溶液（ＩＩＩ）の温度は、０〜１００℃の範囲内で、多糖合成酵素（Ｂ）の活性が失活せず、活性があり、吸光度の測定ができる温度で、酵素反応溶液（ＩＩＩ）作成時から測定終了までの間、一定温度に保つことができればいい。
酵素反応溶液（ＩＩＩ）に用いるｐＨ調整剤（Ｋ）は、扱いやすさ及び安定性の観点から、ＨＥＰＥＳバッファー及びＭＥＳバッファー等のＧｏｏｄバッファーが好ましい。酵素反応溶液（ＩＩＩ）中のｐＨ調整剤（Ｋ）の濃度（モル濃度）は、２５〜５００ｍＭである。
酵素反応溶液（ＩＩＩ）中のリボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ａ）の濃度（モル濃度）は、１０ｍＭである。また、複数種類の（Ａ）を用いる場合は、それぞれの濃度（モル濃度）が１０ｍＭである。（Ａ）としては、（Ｂ）を作用させる（Ａ）を適宜選択して用いる（例えば、（Ｂ）が（Ｂ−１）である場合は、（Ａ）としてリボヌクレオシド２リン酸−グルクロン酸及びリボヌクレオシド２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンを用いる）。
酵素反応溶液（ＩＩＩ）中の多糖合成酵素（Ｂ）の濃度（Ｕ／Ｌ）は０．００１〜１０，０００Ｕ／Ｌである。（但し１Ｕとは１分間に１μｍｏｌのリボヌクレオシド２リン酸−糖からリボヌクレオシド２リン酸を生成する酵素量である。）
反応時間は、短すぎると多糖の生成量の正確な値が測定できない。また、反応時間が長すぎると、酵素が失活したり基質が枯渇するという問題が存在する。したがって、多糖の生成量を縦軸に、時間を横軸にプロットした場合、プロットが一次関数となる反応時間で、多糖の生成量の正確な値が測定できる反応時間とする。
多糖の生成量は、放射性同位体でラベルしたリボヌクレオシド２リン酸−単糖を用いることで測定できる。例えば、１４Ｃで単糖（例えばグルクロン酸）をラベルしたリボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ａ）（例えばリボヌクレオシド２リン酸−グルクロン酸）を用いて多糖合成を行い、ろ紙を用いたペーパークロマトグラフィー法で未反応の基質（リボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ａ））と多糖を分離し、多糖の生成量を測定する。
それぞれのｐＨ（ｐＨ３〜１２）の酵素反応溶液（ＩＩＩ）について、同様に多糖の生成量を測定する。
縦軸に多糖の合成量、横軸にｐＨをプロットし、多糖の合成量が極大値となるｐＨが最適ｐＨである。
【００６５】
また、本発明において、上記酵素活性Ｖｍａｘ１及び下記酵素活性Ｖｍａｘ３を用いて下記数式（２）から算出した酵素活性比（Ｙ２）が０．１以上であることが好ましい。
酵素活性比（Ｙ２）＝Ｖｍａｘ１／Ｖｍａｘ３  （２）
酵素活性Ｖｍａｘ３：多糖合成酵素（Ｂ）のリボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ａ）に対する酵素活性。
なお、酵素活性Ｖｍａｘ３は上記酵素活性Ｖｍａｘの測定法において、酵素として多糖合成酵素（Ｂ）を用いて、基質としてリボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ａ）を用いることにより測定できる。
【００６６】
２種以上のリボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ａ）を用いる場合は、それぞれのリボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ａ）についてそれぞれＶｍａｘ３を求める。また、それぞれのＶｍａｘ３を用いて、数式（２）からそれぞれ酵素活性比（Ｙ２）を求める。酵素活性比（Ｙ２）は、多糖を効率よく製造する観点及び基質（リボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ａ））を有効利用する観点から、全ての酵素活性比（Ｙ２）が０．１以上であることが好ましい。
また、多糖の製造において、２種以上の（Ｂ）及び／又は２種以上の（Ｄ）を用いる場合は、それぞれの（Ｂ）及び（Ｄ）について酵素活性比（Ｙ２）を求める。多糖を効率よく製造する観点及び基質（リボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ａ））を有効利用する観点から、少なくとも１種の（Ｂ）及び（Ｄ）の関係について酵素活性比（Ｙ２）が０．１以上であることが好ましく、さらに好ましくは全ての（Ｂ）及び（Ｄ）の関係において酵素活性比（Ｙ２）が０．１以上であることが好ましい。
【００６７】
本発明の製造方法は、反応溶液中のリボヌクレオシド２リン酸の濃度が多糖合成酵素（Ｂ）の阻害濃度ＩＣ５０の１００倍未満であれば、従来のリボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ａ）に多糖合成酵素（Ｂ）を作用させる多糖の製造方法と同様でいい。例えば、リボヌクレオシド２リン酸変換酵素（Ｄ）を用いて、下記工程（ａ）〜（ｃ）により製造する方法が含まれる。下記において、（Ａ）に（Ｂ）を作用させる工程は、工程（ａ）及び（ｂ）であり、リボヌクレオシド２リン酸変換酵素（Ｄ）の存在下で（Ｂ）を作用させる工程は、工程（ａ）及び（ｂ）である。
工程（ａ）：所定量のリボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ａ）、多糖合成酵素（Ｂ）、リボヌクレオシド２リン酸変換酵素（Ｄ）及び溶剤（Ｈ）を混合して反応溶液（Ｚ）とし、所定の温度、所定のｐＨに調整する。本工程では、必要により攪拌してもいい。
リボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ａ）及び溶剤（Ｈ）を混合し、温度及びｐＨを調整した後、（Ｂ）及び（Ｄ）を添加してもいい。さらに、（Ｂ）及び（Ｄ）は、そのまま添加してもよく、溶剤（Ｈ）で希釈してから添加してもいい。
また、反応溶液（Ｚ）中には、使用する（Ｄ）が（Ｄ４）である場合は、リン酸基含有化合物（Ｆ）を含んでもいい。また、使用する（Ｄ）が（Ｄ６）である場合は、還元剤（ｄ６）を含む。また、使用する（Ｄ）が（Ｄ７）である場合は、糖核酸の原料（ｄ７）を含む。
さらに、反応溶液（Ｚ）中には、脂質（Ｌ）、糖類（Ｍ）及びオリゴ糖（Ｎ）を含んでもいい。
工程（ｂ）：反応溶液（Ｚ）の温度を調整しながら、所定の時間、リボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ａ）に多糖合成酵素（Ｂ）を作用させる。本工程では、必要により攪拌してもいい。
工程（ｃ）：生成した多糖を精製する。多糖の精製方法としては、適量のアルコール（炭素数１〜１０のアルコール）などの溶剤を加えて沈殿させる方法や膜（具体的には、セラミック膜等）を用いて溶液交換をする方法等が挙げられる。
【００６８】
反応溶液（Ｚ）中のリボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ａ）の含有量（モル濃度）は、多糖を効率よく製造する観点及び多糖合成酵素（Ｂ）を効率よく作用させる観点から、０．１ｍＭ〜２Ｍが好ましい。複数種類の（Ａ）を含む場合は、それぞれの含有量（モル濃度）が０．１ｍＭ〜２Ｍであることが好ましい。
反応溶液（Ｚ）中の多糖合成酵素（Ｂ）の含有量（重量％）は、多糖を効率よく製造する観点及び多糖合成酵素（Ｂ）を効率よく作用させる観点から、０．１〜１００，０００Ｕ／Ｌが好ましい。
ここで１Ｕは、１分間に１μｍｏｌの基質（リボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ａ））を多糖に変換する酵素量を意味する。例えば、（Ｂ）が（Ｂ−１）であり、（Ａ）としてウリジン２リン酸−グルクロン酸及びウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンを用いる場合、１分間にウリジン２リン酸−グルクロン酸及びウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンを合計１μｍｏｌ、多糖に変換する酵素量を意味する。
反応溶液（Ｚ）中のリボヌクレオシド２リン酸変換酵素（Ｄ）の含有量（Ｕ／Ｌ）は、多糖を効率よく製造する観点及び多糖合成酵素（Ｂ）を効率よく作用させる観点から、０．１〜１００，０００Ｕ／Ｌが好ましい。
１Ｕは、１分間に１μｍｏｌの基質（リボヌクレオシド２リン酸）を化合物（Ｃ）に変換する酵素量を意味する。
【００６９】
反応溶液（Ｚ）中のリン酸基含有化合物（Ｆ）、還元剤（ｄ６）及び糖核酸の原料（ｄ７）のそれぞれの含有量（モル濃度）は、多糖を効率よく製造する観点及び多糖合成酵素（Ｂ）を効率よく作用させる観点から、それぞれ０．０１ｎＭ〜１０Ｍが好ましい。
【００７０】
溶剤（Ｈ）としては、水及びｐＨ調整剤（Ｋ）を含有した水が含まれる。ｐＨ調整剤としては、従来のｐＨ調整剤が使用でき、例えば、ホウ酸バッファー、リン酸バッファー、酢酸バッファー、Ｔｒｉｓバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、硫酸、塩酸、クエン酸、乳酸、ピルビン酸、蟻酸、塩化ナトリウム、塩化カリウム、モノエタノールアミン及びジエタノールアミン等が挙げられる。
【００７１】
反応溶液（Ｚ）の温度は、（Ｂ）及び（Ｄ）の安定性並びに反応速度の観点から、０〜１００℃が好ましい。
【００７２】
反応溶液（Ｚ）のｐＨは、反応の至適条件である観点から、ｐＨ３〜１２が好ましい。また、効率よく多糖を製造する観点から、（Ｂ）の最適ｐＨであることが好ましい。
【００７３】
上記工程（ａ）及び（ｂ）において、上記ウリジン２リン酸−単糖（Ａ）、多糖合成酵素（Ｂ）、リボヌクレオシド２リン酸変換酵素（Ｄ）、リン酸基含有化合物（Ｆ）、還元剤（ｄ６）及び糖核酸の原料（ｄ７）以外に、酵素の安定化及び酵素の活性化の観点から、脂質（Ｌ）、糖類（Ｍ）及びオリゴ糖（Ｎ）を用いてもよい。
【００７４】
脂質（Ｌ）としては、例えば、カルディオピン及びオレイン酸等が挙げられる。
糖類（Ｍ）としては、例えば、グリセリン等が挙げられる。
オリゴ糖（Ｎ）としては、例えば、オリゴヒアルロン酸等が挙げられる。
【００７５】
反応溶液（Ｚ）中の脂質（Ｌ）の含有量（重量％）は、酵素の安定化及び酵素の活性化の観点から、０〜１が好ましい。
反応溶液（Ｚ）中の糖類（Ｍ）の含有量（重量％）は、酵素の安定化及び酵素の活性化の観点から、０〜３０が好ましい。
反応溶液（Ｚ）中のオリゴ糖（Ｎ）の含有量（重量％）は、酵素の安定化及び酵素の活性化の観点から、０〜１が好ましい。
【００７６】
工程（ｂ）において、多糖合成酵素（Ｂ）を作用させる時間は、多糖合成酵素（Ｂ）の活性、反応溶液（Ｚ）の温度、多糖合成酵素（Ｂ）及びリボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ａ）の量比等によって異なる。反応溶液（Ｚ）の温度を、多糖合成酵素（Ｂ）の活性が高く、反応速度が速い温度に調整すれば、反応時間を短くすることができる。また、反応溶液（Ｚ）中のリボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ａ）に対する多糖合成酵素（Ｂ）の量が多いほど、反応は速くなり、反応時間は短くなる。
【００７７】
本発明の製造方法では、リボヌクレオシド２リン酸の濃度を阻害濃度ＩＣ５０の１００倍未満とすることで、多糖合成酵素（Ｂ）の活性が阻害されにくく、単位酵素当たりのリボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ａ）への作用効率が高く、多糖を効率よく製造することができる。また、本発明の製造方法では、反応溶液中にコンドロイチンサルフェート、グリコサミノグリカンサルフェート及び微生物等の不純物が含まれておらず、精製が容易である。また、従来の多糖合成酵素を用いた製造方法に比べて、多糖合成酵素（Ｂ）の活性が阻害されにくく、多糖合成酵素（Ｂ）を大量に使用する必要がないため、多糖の製造コストが低い。
【００７８】
本発明の製造方法において、多糖がヒアルロン酸であり、リボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ａ）がウリジン２リン酸−グルクロン酸及びウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンであり、多糖合成酵素（Ｂ）がヒアルロン酸合成酵素（Ｂ−１）であり、化合物（Ｃ）がウリジン３リン酸であり、リボヌクレオシド２リン酸変換酵素（Ｄ）がウリジン３リン酸合成酵素（Ｄ４−１）であることが好ましい。この場合、多糖であるヒアルロン酸を効率よく製造する観点から、上記反応溶液（Ｚ）中に、さらにリン酸基含有化合物（Ｆ）、１−ホスホ−グルクロン酸及びウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（Ｇ）を含んでいることがより好ましい。
【００７９】
１−ホスホ−グルクロン酸は、グルクロン酸の１位のヒドロキシル基がリン酸でリン酸エステル化されたものである。
【００８０】
ウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（Ｇ）は、ウリジン３リン酸と１−ホスホ−グルクロン酸からウリジン２リン酸−グルクロン酸を生成する活性を有する酵素であれば特に限定されない。動物起源の動物ウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（Ｇ−１）、植物起源の植物ウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（Ｇ−２）、微生物起源の微生物ウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（Ｇ−３）、（Ｇ−１）〜（Ｇ−３）が化学的に修飾された変異体（Ｇ−４）及び（Ｇ−１）〜（Ｇ−３）が遺伝子的に修飾された変異体（Ｇ−５）が含まれる。
【００８１】
動物ウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（Ｇ−１）としては、例えば、ブタ由来のもの等が挙げられる。
【００８２】
植物ウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（Ｇ−２）としては、例えば、シロイヌナズナ由来、エンドウマメ由来及びオオムギ由来のもの等が挙げられる。
【００８３】
微生物ウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（Ｇ−３）としては、例えば、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属由来のもの等が挙げられる。
【００８４】
化学的に修飾したウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（Ｇ−４）として、例えば上記ウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼにカルボジイミド化合物、無水コハク酸、ヨード酢酸及びイミダゾール化合物等を作用させて化学修飾したもの等が挙げられる。
【００８５】
遺伝子的に修飾したウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（Ｇ−５）として、Ｓｍｉｔｈらの方法（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８，Ｖｏｌ．２５３，Ｎｏ．１８，Ｐ６５５１−６５６０）で上記ウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼの遺伝子を改変してアミノ酸を置換したもの等が挙げられる。
【００８６】
上記ウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（Ｇ）のうち、ウリジン２リン酸−グルクロン酸を合成する活性の高さの観点から、（Ｇ−２）が好ましく、さらに好ましくはシロイヌナズナ由来のヌクレオシド−２−リン酸キナーゼである。
また、ウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（Ｇ）は、２種以上を用いてもいい。
【００８７】
反応溶液（Ｚ）中の１−ホスホ−グルクロン酸の含有量（モル濃度）は、ウリジン２リン酸−グルクロン酸に変換されやすくする観点から、０．０００１ｍＭ〜１Ｍが好ましく、さらに好ましくは０．０１ｍＭ〜１００ｍＭである。
反応溶液（Ｚ）中のウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（Ｇ）の含有量（Ｕ／ｍＬ）はウリジン２リン酸―グルクロン酸の変換効率を良くする観点から、０．００００１Ｕ／ｍＬ〜１０，０００Ｕ／ｍＬが好ましく、さらに好ましくは０．００１Ｕ／ｍＬ〜１，０００Ｕ／ｍＬである。
１Ｕとは、１分間に１μｍｏｌのウリジン３リン酸及び１μｍｏｌの１−ホスホ−グルクロン酸をウリジン２リン酸−グルクロン酸にする酵素量である。
【００８８】
本発明の製造方法において、リボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ａ）としてウリジン２リン酸−グルクロン酸及びウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン、多糖合成酵素（Ｂ）としてヒアルロン酸合成酵素（Ｂ−１）、化合物（Ｃ）としてウリジン３リン酸、リボヌクレオシド２リン酸変換酵素（Ｄ）としてウリジン３リン酸合成酵素（Ｄ４−１）を用いて、リン酸基含有化合物（Ｆ）、１−ホスホ−グルクロン酸及びウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（Ｇ）を含む反応溶液（Ｚ）中で多糖であるヒアルロン酸を製造する場合、ヒアルロン酸を効率よく製造する観点から、下記工程（１）〜（３）を同時に行う製造方法であることが好ましい。
工程（１）：ウリジン２リン酸−グルクロン酸とウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンとにヒアルロン酸合成酵素（Ｂ−１）を作用させて、ヒアルロン酸及びウリジン２リン酸を得る工程。
工程（２）：ウリジン２リン酸とリン酸基含有化合物（Ｆ）とにウリジン３リン酸合成酵素（Ｄ４−１）を作用させてウリジン３リン酸を得る工程。
工程（３）：ウリジン３リン酸と１−ホスホ−グルクロン酸とにウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（Ｇ）を作用させてウリジン２リン酸−グルクロン酸を得る工程。
【００８９】
また、上記工程（１）〜（３）を同時に行う製造方法である場合、下記ミカエリス定数Ｋｍが下記阻害濃度ＩＣ５０の１００倍未満であることが好ましい。
ミカエリス定数Ｋｍ：ウリジン２リン酸を基質とし、（Ｄ４−１）を酵素とし、リン酸基含有化合物（Ｆ）の存在下でウリジン３リン酸を合成する反応におけるミカエリス定数。
阻害濃度ＩＣ５０：（Ｂ−１）をウリジン２リン酸−グルクロン酸及びウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンに作用させる際の（Ｂ−１）の濃度において、基質としてウリジン２リン酸−グルクロン酸及びウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンを用いて、阻害剤としてウリジン２リン酸を用いて求めた、（Ｂ−１）の酵素活性が半減するときのウリジン２リン酸の濃度。
【００９０】
ミカエリス定数Ｋｍは、Ａｇａｒｗａｌらによって報告された方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９７８，Ｖｏｌ．５１，Ｐ４８３−４９１に記載の方法）で酵素反応初速度の基質濃度依存性を求めることによって求められる。ミカエリス定数Ｋｍの測定に用いる（Ｄ４−１）の形態としては、精製酵素を用いる。
【００９１】
上記工程（１）〜（３）を同時に行うヒアルロン酸の製造方法は、工程（１）〜（３）の反応を同じ反応溶液中で行っていれば特に制限なく実施できる。具体的一例としては、リン酸基含有化合物（Ｆ）、ウリジン３リン酸合成酵素（Ｄ４−１）、１−ホスホ−グルクロン酸、ウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（Ｇ）、ウリジン２リン酸−グルクロン酸、ウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン、ヒアルロン酸合成酵素（Ｂ−１）及び溶剤（Ｈ）を仕込んで反応溶液（Ｚ’）として、ヒアルロン酸を製造する方法が挙げられる。反応溶液（Ｚ’）には、ピロリン酸分解酵素、脂質（Ｌ）、糖類（Ｍ）及びオリゴ糖（Ｎ）を含有してもいい。反応溶液（Ｚ）中の各成分の濃度、反応条件等は上記工程（ａ）〜（ｃ）を含む製造方法と同様である。
【００９２】
上記工程（１）〜（３）を同時に行う製造方法では、副生成物としてピロリン酸が生成し、ピロリン酸が酵素｛（Ｂ−１）、（Ｄ４−１）及び（Ｇ）｝の活性を阻害してしまう場合がある。本発明の製造方法でピロリン酸分解酵素を用いると、ピロリン酸を分解し、ピロリン酸が（Ｂ−１）、（Ｄ４−１）及び（Ｇ）の酵素活性を阻害することを緩和することができるので好ましい。
ピロリン酸分解酵素としては、ＥＣ３．１．３及びＥＣ３．６．１に分類される酵素が挙げられ、具体的にはアルカリホスファターゼ、アピラーゼ、フィターゼ及びジホスファターゼ等が挙げられる。
ピロリン酸分解酵素としては、反応生成物（ウリジン３リン酸及びヒアルロン酸）を分解しにくいという観点から、ジホスファターゼが好ましい。
反応溶液（Ｚ）中のピロリン酸分解酵素の含有量（Ｕ／ｍＬ）は、反応生成物（ウリジン３リン酸、ウリジン２リン酸−グルクロン酸及びヒアルロン酸）を分解せずにピロリン酸を分解する観点から、０．００００１〜１００が好ましい。
ピロリン酸分解酵素において、１Ｕは、１分間に１μｍｏｌのピロリン酸を分解する酵素量である。
【００９３】
本発明の多糖の製造方法によれば、多糖を高効率で生産できる。また、本発明の製造方法により得られた多糖は、化粧品、医薬部外品、医薬品及び医療機器だけでなく、食品等にも用いることができる。
【実施例】
【００９４】
以下、実施例及び比較例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００９５】
＜製造例１＞
ストレプトコッカスエクイシミリス由来の配列番号１のアミノ酸配列をコードする遺伝子にＦＬＡＧタグを融合した遺伝子をｐＫＫ２２３−３に組み込んだプラスミドを大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉＳＵＲＥに形質転換して、３０℃で５時間培養し、培養液の濁度（濁度計：島津製作所社製「ＵＶ−１７００」、１ｍｌの石英セル）が０．５に達したところで、発現誘導した。その後、遠心分離機［ＫＵＢＯＴＡ社製「５９２２」（以下同じ）、４℃、６０００×ｇ、１５分間］を用いて大腸菌を回収した。回収した大腸菌を、緩衝液Ａ｛１００ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭの塩化マグネシウム、１０ｍＭのドデシルマルトシド、５ｍＭのオレイン酸を含む１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）｝に再懸濁して、超音波破砕（１３０Ｗ、１０分）を行った。その後、抗ＦＬＡＧ抗体カラムで精製を行い、ヒアルロン酸合成酵素水溶液（Ｂ−１）を得た。【００９６】
＜ヒアルロン酸合成酵素水溶液（Ｂ−１）の比活性測定＞
水溶液Ｓ｛１ｍＭのウリジン２リン酸−グルクロン酸（１４Ｃでラベルした放射性同位体を含むウリジン２リン酸−グルクロン酸、放射能３００ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）、１ｍＭのウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン、１００ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭの塩化マグネシウム、１０ｍＭのドデシルマルトシド、５ｍＭのオレイン酸を含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）｝１ｍＬに、製造例１で得たヒアルロン酸合成酵素水溶液（Ｂ−１）を１０μＬ加えて、反応溶液（１）としたものを４つ作成し、それぞれ３０℃で５分、１０分、１５分、２０分反応を行った。ろ紙（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｎｏ．３ＭＭ、以下同じ）を用いたペーパークロマトグラフィー法（展開溶媒：１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ５．５）：エタノール＝７：１３、以下同じ）で未反応の基質とヒアルロン酸とを分離した後、原点部を切り出し、液体シンチレーションカクテルに浸漬させた後、液体シンチレーションカウンターを用いて放射性同位体を測定した。１４Ｃでラベルしたグルクロン酸の取り込み量から、ヒアルロン酸の合成量を算出したところ、それぞれ５分後１．６ｍｇ、１０分後２．９ｍｇ、１５分後４．２ｍｇ、２０分後５．５ｍｇであった。ヒアルロン酸の合成量と反応時間との関係から、ヒアルロン酸合成酵素水溶液（Ｂ−１）の比活性を計算した。その結果、０．１５Ｕ／μｌであった。【００９７】
＜ヒアルロン酸合成酵素の阻害濃度ＩＣ５０の測定＞
１．５ｍＬ容量のチューブ中で９４０μＬの水溶液１［５ｍＭの塩化マグネシウムと０．０５ｍＭのウリジン２リン酸ナトリウムを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５、２５℃）］に、製造例１で得たヒアルロン酸合成酵素水溶液（Ｂ−１）を１．５Ｕ／ｍＬとなるように溶解し、恒温水槽を用いてチューブを４０℃で２０分静置した。ここに、４０℃に温調した基質溶液［１−１］［ウリジン２リン酸−グルクロン酸ナトリウム塩及びウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンを緩衝液Ｂ｛５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５、２５℃）｝に溶解してそれぞれ２０ｍＭの濃度にしたもの］を５０μＬ添加し、酵素反応溶液（Ｉ−１）とした。（Ｉ−１）を作成直後及び５分おきに１００μＬずつ取り出し、取り出した溶液は、１００℃で２分間加熱して酵素反応を停止した。酵素反応を停止した溶液について、遠心分離器（４℃、１２，０００×ｇ、１０分）を用いて遠心し、不純物を沈殿させた。上清８０μＬを下記条件でＨＰＬＣにより分析し、ヒアルロン酸のピーク面積を記録した。
＜ＨＰＬＣの測定条件＞
以下において、ＨＰＬＣの測定条件は全て同じである。
装置：ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣシステム
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ  ＯＨｐａｋ  ＳＢ−８０６Ｍ  ＨＱ
移動相：０．１Ｍ  ＮａＮＯ３
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出器：ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＲＩＤ検出器
温度：４０℃
水溶液１において、ウリジン２リン酸ナトリウムの濃度が異なる溶液｛０ｍＭ（水溶液２）、０．１５ｍＭ（水溶液３）、３ｍＭ（水溶液４）、１ｍＭ（水溶液５）及び３ｍＭ（水溶液６）｝を作成した。水溶液１に代えて水溶液２〜６を用いる以外は同様にして酵素反応溶液（Ｉ−２）〜（Ｉ−６）を作成した。酵素反応溶液（Ｉ−２）〜（Ｉ−６）についても、酵素反応溶液（Ｉ−１）の場合と同様にして、ヒアルロン酸のピーク面積を記録した。
ヒアルロン酸ナトリウム（フナコシ社製、「ヒアロース」、分子質量：１７５ｋＤａ）を緩衝液Ｂに溶解し、それぞれ０．００１μｇ／ｍＬ、０．０１μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ及び５μｇ／ｍＬの濃度にしたものを作成し、ヒアルロン酸標準溶液（１）〜（４）とした。（１）〜（４）を、ＨＰＬＣにより分析し、ヒアルロン酸のピーク面積をそれぞれ記録した。横軸（ｘ軸）にそれぞれのヒアルロン酸濃度（μｇ）、縦軸（ｙ軸）にそれぞれのピーク面積Ｐをプロットし、直線の傾き「ｋ」を算出した。
（Ｉ−１）〜（Ｉ−６）を作成直後のウリジン３リン酸のピーク面積をＰ０、「ｍ」分後のピーク面積をＰｈとし、それぞれピーク面積の変化ΔＰ（ΔＰ＝Ｐｈ−Ｐ０）と上記直線の傾きを用いて下記数式（１）からそれぞれの酵素反応初速度ｖ（μｇ／ｓ）を算出した。
ｖ＝ΔＰ／（ｋ×ｍ×６０）（１）
酵素反応溶液（Ｉ−２）を用いて測定した酵素反応初速度ｖを１００％とし、酵素反応溶液（Ｉ−１）及び（Ｉ−３）〜（Ｉ−６）を用いて測定した酵素反応初速度の相対値（％）を算出した。算出した相対値を用いて、横軸（ｘ軸）にそれぞれのウリジン２リン酸濃度［Ｓ］、縦軸（ｙ軸）に酵素反応溶液（Ｉ−１）〜（Ｉ−６）での酵素反応初速度ｖの相対値をプロットした。プロットの近似曲線と直線ｙ＝５０（％）との交点でのウリジン２リン酸の濃度が阻害濃度ＩＣ５０であり、阻害濃度ＩＣ５０は０．１１ｍＭであった。
また、上記において、「ヒアルロン酸合成酵素水溶液（Ｂ−１）を１．５Ｕ／ｍＬ」に代えて「ヒアルロン酸合成酵素水溶液（Ｂ−１）を４５Ｕ／ｍＬ」とする以外は同様にして、阻害濃度ＩＣ５０を測定したところ、０．１１ｍＭであった。【００９８】
＜ヒアルロン酸合成酵素の酵素活性Ｖｍａｘ３、酵素活性比（Ｙ２）の測定＞
下記の「スクロースシンターゼの酵素活性Ｖｍａｘ１、Ｖｍａｘ２、酵素活性比（Ｙ１）の測定」において、「スクロースシンターゼ水溶液（Ｄ７−１）」に代えて「ヒアルロン酸合成酵素水溶液（Ｂ−１）」を用いて、基質として、「ウリジン２リン酸」に代えて「ウリジン２リン酸−グルクロン酸及びウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン」を用いて、また、「スクロース」を用いない以外は同様にして、ウリジン２リン酸−グルクロン酸及びウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンに対する酵素活性Ｖｍａｘ３を求めた。
得られた酵素活性Ｖｍａｘ３と、後述する（Ｄ２−１）、（Ｄ３−１）、（Ｄ４−１−１）〜（４−１−３）、（Ｄ５−１）、（Ｄ６−１）及び（Ｄ７−１）について求めた酵素活性Ｖｍａｘ１とから、酵素活性比（Ｙ２）を求めた。酵素活性比（Ｙ２）は全て０．１以上であった。【００９９】
＜製造例２＞
製造例１において、「ストレプトコッカスエクイシミリス由来の配列番号１のアミノ酸配列をコードする遺伝子」に代えて「ソラマメ由来の配列番号２のアミノ酸配列をコードする遺伝子」を用いる以外は同様にして、スクロースシンターゼ水溶液（Ｄ７−１）を得た。【０１００】
＜スクロースシンターゼ水溶液（Ｄ７−１）の比活性測定＞
水溶液Ｒ｛１００ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭの塩化マグネシウム、１ｍＭのウリジン２リン酸を含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）｝１ｍＬに、１Ｍのスクロース水溶液を１０μＬ及びスクロースシンターゼ水溶液（Ｄ７−１）を１０μＬ加えて反応溶液（２）としたものを３つ作成し、それぞれ３０℃で５分、１０分、１５分反応を行った。化合物（Ｃ−７）である反応生成物（ウリジン２リン酸−グルコース）の量は、ＴＬＣ（Ｓｉｇｍａ社製、ＰＥＩ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅプレート、以下同じ）で展開して（展開溶媒：１ＭのＬｉＣｌ、１Ｍのギ酸を含む水溶液、以下同じ）、ＵＶライト（２６０ｎｍ）で検出して求めた。化合物（Ｃ−７）の生成量と反応時間との関係から、スクロースシンターゼ水溶液（Ｄ７−１）の比活性を計算したところ、０．３Ｕ／μｌであった。【０１０１】
＜スクロースシンターゼの酵素活性Ｖｍａｘ１、Ｖｍａｘ２、酵素活性比（Ｙ１）の測定＞
水溶液Ｐ｛１００ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭの塩化マグネシウムを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）｝１ｍＬに、溶液中の濃度が０．５ｍＭとなるように基質（ウリジン２リン酸）を加え、スクロース（和光純薬工業社製）を溶液中の濃度が１００ｍＭとなるように加え、スクロースシンターゼ水溶液（Ｄ７−１）を１μＬ加えて酵素反応溶液（ＩＩ−１）とし、反応を開始した。酵素反応溶液（ＩＩ−１）を３０℃で静置し、ＨＰＬＣを用いて反応生成物（ウリジン２リン酸−グルコース）の量を５分毎に測定しながら３０分酵素反応させ、酵素反応初速度ｖを算出した。さらに、酵素反応溶液（ＩＩ−１）中のウリジン２リン酸の濃度が０．３ｍＭ、０．１ｍＭ、０．０５ｍＭのもの（ＩＩ−２）〜（ＩＩ−４）について、同様に酵素反応初速度ｖを算出した。
横軸（ｘ軸）にそれぞれ酵素反応溶液（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−４）の基質（ウリジン２リン酸）の濃度の逆数（１／［Ｓ］）、縦軸（ｙ軸）にそれぞれの基質濃度での酵素反応初速度の逆数（１／ｖ）をプロットしたＬｉｎｅｗａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットを作成した。プロットの近似直線とｙ軸との交点から、酵素活性Ｖｍａｘ１の逆数（１／Ｖｍａｘ１）を求めた。
基質として、「ウリジン２リン酸」に代えて「ウリジン２リン酸−グルクロン酸」を用いる以外は同様にしてＶｍａｘ２を求めた。求めたＶｍａｘ１及びＶｍａｘ２から酵素活性比（Ｙ１）を算出したところ、１０以上であった。
また、基質として、「ウリジン２リン酸」に代えて「ウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン」を用いる以外は同様にしてＶｍａｘ２を求めた。求めたＶｍａｘ１及びＶｍａｘ２から酵素活性比（Ｙ１）を算出したところ、１０以上であった。【０１０２】
＜製造例３＞
製造例１において、「ストレプトコッカスエクイシミリス由来の配列番号１のアミノ酸配列をコードする遺伝子」に代えて「コリネバクテリウム・グルタミカス由来の配列番号３のアミノ酸配列をコードする遺伝子」を用いる以外は同様にして、リボヌクレオチド２リン酸リダクターゼ水溶液（Ｄ６−１）を得た。【０１０３】
＜リボヌクレオチド２リン酸リダクターゼ水溶液（Ｄ６−１）の比活性測定＞
１ｍＬの水溶液Ｒに、還元型チオレドキシンを０．１ｍｇと、リボヌクレオチド２リン酸リダクターゼ水溶液（Ｄ６−１）を１０μＬ加えて、反応溶液（３）としたものを３つ作成し、それぞれ３０℃で５分、１０分、１５分反応を行った。化合物（Ｃ−６）である反応生成物（デオキシウリジン２リン酸）の量は、ＴＬＣで展開して、ＵＶライト（２６０ｎｍ）で検出して求めた。化合物（Ｃ−６）の生成量と反応時間との関係から、リボヌクレオチド２リン酸リダクターゼ水溶液（Ｄ６−１）の比活性を計算したところ、０．３Ｕ／μｌであった。【０１０４】
＜リボヌクレオチド２リン酸リダクターゼの酵素活性Ｖｍａｘ１、Ｖｍａｘ２、酵素活性比（Ｙ１）の測定＞
「スクロースシンターゼの酵素活性Ｖｍａｘ１、Ｖｍａｘ２、酵素活性比（Ｙ１）の測定」において、「スクロースシンターゼ水溶液（Ｄ７−１）」に代えて「リボヌクレオチド２リン酸リダクターゼ水溶液（Ｄ６−１）」を用いて、また、「スクロース」に代えて「還元型チオレドキシン」を用いる以外は同様にして、ウリジン２リン酸に対する酵素活性Ｖｍａｘ１を求めた。
さらに、基質として、「ウリジン２リン酸」に代えて「ウリジン２リン酸−グルクロン酸」及び「ウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン」をそれぞれ用いる以外は同様にしてＶｍａｘ２を求めた。求めたＶｍａｘ１及びＶｍａｘ２から酵素活性比（Ｙ１）を算出したところ、全て１０以上であった。【０１０５】
＜製造例４＞
製造例１において、「ストレプトコッカスエクイシミリス由来の配列番号１のアミノ酸配列をコードする遺伝子」に代えて「大腸菌由来の配列番号４のアミノ酸配列をコードする遺伝子」を用いる以外は同様にして、ピルビン酸キナーゼ水溶液（Ｄ４−１−１）を得た。【０１０６】
＜ピルビン酸キナーゼ水溶液（Ｄ４−１−１）の比活性測定＞
１ｍＬの水溶液Ｒに、１Ｍのホスホエノールピルビン酸１カリウム水溶液（和光純薬工業社製）を１０μＬと、ピルビン酸キナーゼ水溶液（Ｄ４−１−１）を１０μＬ加えて、反応溶液（４）としたものを３つ作成し、それぞれ３０℃で５分、１０分、１５分反応を行った。化合物（Ｃ−４）である反応生成物（ウリジン３リン酸）の量は、ＴＬＣで展開して、ＵＶライト（２６０ｎｍ）で検出して求めた。化合物（Ｃ−４）の生成量と反応時間との関係から、ピルビン酸キナーゼ水溶液（Ｄ４−１−１）の比活性を計算したところ、０．３Ｕ／μｌであった。【０１０７】
＜ピルビン酸キナーゼの酵素活性Ｖｍａｘ１、Ｖｍａｘ２、酵素活性比（Ｙ１）の測定＞
「スクロースシンターゼの酵素活性Ｖｍａｘ１、Ｖｍａｘ２、酵素活性比（Ｙ１）の測定」において、「スクロースシンターゼ水溶液（Ｄ７−１）」に代えて「ピルビン酸キナーゼ水溶液（Ｄ４−１−１）」を用いて、また、「スクロース」に代えて「ホスホエノールピルビン酸１カリウム」を用いる以外は同様にして、ウリジン２リン酸に対する酵素活性Ｖｍａｘ１を求めた。
さらに、基質として、「ウリジン２リン酸」に代えて「ウリジン２リン酸−グルクロン酸」、「ウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン」、「ウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルガラクトサミン」、「ウリジン２リン酸−グルコース」、「ウリジン２リン酸−マンノース」及び「ウリジン２リン酸−グルコサミン」をそれぞれ用いる以外は同様にして、それぞれ酵素活性Ｖｍａｘ２を求め、酵素活性比（Ｙ１）を求めた。酵素活性比（Ｙ１）は全て１０以上であった。【０１０８】
＜製造例５＞
製造例１において、「ストレプトコッカスエクイシミリス由来の配列番号１のアミノ酸配列をコードする遺伝子」に代えて「大腸菌由来の配列番号５のアミノ酸配列をコードする遺伝子」を用いる以外は同様にして、ヌクレオチダーゼ水溶液（Ｄ３−１）を得た。【０１０９】
＜ヌクレオチダーゼ水溶液（Ｄ３−１）の比活性測定＞
１ｍＬの水溶液Ｒに、ヌクレオチダーゼ水溶液（Ｄ３−１）を１０μＬ加えて、反応溶液（５）としたものを３つ作成し、それぞれ３０℃で５分、１０分、１５分反応を行った。化合物（Ｃ−３）である反応生成物（ウリジン１リン酸）の量は、ＴＬＣで展開して、ＵＶライト（２６０ｎｍ）で検出して求めた。化合物（Ｃ−３）の生成量と反応時間との関係から、ヌクレオチダーゼ水溶液（Ｄ３−１）の比活性を計算したところ、０．３Ｕ／μｌであった。【０１１０】
＜ヌクレオチダーゼの酵素活性Ｖｍａｘ１、Ｖｍａｘ２、酵素活性比（Ｙ１）の測定＞
「スクロースシンターゼの酵素活性Ｖｍａｘ１、Ｖｍａｘ２、酵素活性比（Ｙ１）の測定」において、「スクロースシンターゼ水溶液（Ｄ７−１）」に代えて「ヌクレオチダーゼ水溶液（Ｄ３−１）」を用いて、また、「スクロース」を用いない以外は同様にして、ウリジン２リン酸に対する酵素活性Ｖｍａｘ１を求めた。
さらに、基質として、「ウリジン２リン酸」に代えて「ウリジン２リン酸−グルクロン酸」及び「ウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン」をそれぞれ用いる以外は同様にして、それぞれ酵素活性Ｖｍａｘ２を求め、酵素活性比（Ｙ１）を求めた。酵素活性比（Ｙ１）は全て１０以上であった。【０１１１】
＜製造例６＞
製造例１において、「ストレプトコッカスエクイシミリス由来の配列番号１のアミノ酸配列をコードする遺伝子」に代えて「大腸菌由来の配列番号６のアミノ酸配列をコードする遺伝子」を用いる以外は同様にして、ポリリボヌクレオチドヌクレオチジルトランスフェラーゼ水溶液（Ｄ５−１）を得た。【０１１２】
＜ポリリボヌクレオチドヌクレオチジルトランスフェラーゼ水溶液（Ｄ５−１）の比活性測定＞
１ｍＬの水溶液Ｒに、ポリウリジン（Ｓｉｇｍａ社製、品名「ポリウリジリックアシッドポタジウムソルト」）を１ｍｇ、ポリリボヌクレオチドヌクレオチヂルトランスフェラーゼ水溶液（Ｄ５−１）を１０μＬ加えて、反応溶液（６）としたものを３つ作成し、それぞれ３０℃で５分、１０分、１５分反応を行った。化合物（Ｃ−５）である反応生成物（ポリウリジル酸）の量は、ＴＬＣで展開して、ＵＶライト（２６０ｎｍ）で検出して求めた。化合物（Ｃ−５）の生成量と反応時間との関係から、ポリリボヌクレオチドヌクレオチジルトランスフェラーゼ水溶液（Ｄ５−１）の比活性を計算したところ、０．３Ｕ／μｌであった。【０１１３】
＜ポリリボヌクレオチドヌクレオチジルトランスフェラーゼの酵素活性Ｖｍａｘ１、Ｖｍａｘ２、酵素活性比（Ｙ１）の測定＞
「スクロースシンターゼの酵素活性Ｖｍａｘ１、Ｖｍａｘ２、酵素活性比（Ｙ１）の測定」において、「スクロースシンターゼ水溶液（Ｄ７−１）」に代えて「ポリリボヌクレオチドヌクレオチジルトランスフェラーゼ水溶液（Ｄ５−１）」を用いて、また、「スクロース」を用いない以外は同様にして、ウリジン２リン酸に対する酵素活性Ｖｍａｘ１を求めた。
さらに、基質として、「ウリジン２リン酸」に代えて「ウリジン２リン酸−グルクロン酸」及び「ウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン」をそれぞれ用いる以外は同様にして、それぞれ酵素活性Ｖｍａｘ２を求め、酵素活性比（Ｙ１）を求めた。酵素活性比（Ｙ１）は全て１０以上であった。【０１１４】
＜製造例７＞
製造例１において、「ストレプトコッカスエクイシミリス由来の配列番号１のアミノ酸配列をコードする遺伝子」に代えて「アフリカツメガエル由来の配列番号７のアミノ酸配列をコードする遺伝子」を用いる以外は同様にして、アピラーゼ水溶液（Ｄ２−１）を得た。【０１１５】
＜アピラーゼ水溶液（Ｄ２−１）の比活性測定＞
１ｍＬの水溶液Ｒに、アピラーゼ水溶液（Ｄ２−１）を１０μＬ加えて、反応溶液（７）としたものを３つ作成し、それぞれ３０℃で５分、１０分、１５分反応を行った。化合物（Ｃ−２）である反応生成物（ウリジン）の量は、ＴＬＣで展開して、ＵＶライト（２６０ｎｍ）で検出して求めた。化合物（Ｃ−２）の生成量と反応時間との関係から、アピラーゼ水溶液（Ｄ２−１）の比活性を計算したところ、０．３Ｕ／μｌであった。【０１１６】
＜アピラーゼの酵素活性Ｖｍａｘ１、Ｖｍａｘ２、酵素活性比（Ｙ１）の測定＞
「スクロースシンターゼの酵素活性Ｖｍａｘ１、Ｖｍａｘ２、酵素活性比（Ｙ１）の測定」において、「スクロースシンターゼ水溶液（Ｄ７−１）」に代えて「アピラーゼ水溶液（Ｄ２−１）」を用いて、また、「スクロース」を用いない以外は同様にして、ウリジン２リン酸に対する酵素活性Ｖｍａｘ１を求めた。
さらに、基質として、「ウリジン２リン酸」に代えて「ウリジン２リン酸−グルクロン酸」及び「ウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン」をそれぞれ用いる以外は同様にして、それぞれ酵素活性Ｖｍａｘ２を求め、酵素活性比（Ｙ１）を求めた。酵素活性比（Ｙ１）は全て１０以上であった。【０１１７】
＜製造例８＞
製造例１において、「ストレプトコッカスエクイシミリス由来の配列番号１のアミノ酸配列をコードする遺伝子」に代えて「ラットすい臓由来の配列番号８のアミノ酸配列をコードする遺伝子」を用いる以外は同様にして、ヌクレオシド２リン酸キナーゼ水溶液（Ｄ４−１−２）を得た。【０１１８】
＜ヌクレオシド２リン酸キナーゼ水溶液（Ｄ４−１−２）の比活性測定＞
１ｍＬの水溶液Ｒに、５ｍＭのアデノシン３リン酸（Ｓｉｇｍａ社製）を含む溶液を作成し、ヌクレオシド２リン酸キナーゼ水溶液（Ｄ４−１−２）を１０μＬ加えて、反応溶液（８）としたものを３つ作成し、３０℃で５分、１０分、１５分反応を行った。化合物（Ｃ−４）である反応生成物（ウリジン３リン酸）の量は、ＴＬＣで展開して、ＵＶライト（２６０ｎｍ）で検出して求めた。化合物（Ｃ−４）の生成量と反応時間との関係から、ヌクレオシド２リン酸キナーゼ水溶液（Ｄ４−１−２）の比活性を計算したところ、０．３Ｕ／μｌであった。【０１１９】
＜ヌクレオシド２リン酸キナーゼの酵素活性Ｖｍａｘ１、Ｖｍａｘ２、酵素活性比（Ｙ１）の測定＞
「スクロースシンターゼの酵素活性Ｖｍａｘ１、Ｖｍａｘ２、酵素活性比（Ｙ１）の測定」において、「スクロースシンターゼ水溶液（Ｄ７−１）」に代えて「ヌクレオシド２リン酸キナーゼ水溶液（Ｄ４−１−２）」を用いて、また、「スクロース」に代えて「アデノシン３リン酸」を用いる以外は同様にして、ウリジン２リン酸に対する酵素活性Ｖｍａｘ１を求めた。
さらに、基質として、「ウリジン２リン酸」に代えて「ウリジン２リン酸−グルクロン酸」、「ウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン」、「ウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルガラクトサミン」、「ウリジン２リン酸−グルコース」、「ウリジン２リン酸−マンノース」及び「ウリジン２リン酸−グルコサミン」をそれぞれ用いる以外は同様にして、それぞれ酵素活性Ｖｍａｘ２を求め、酵素活性比（Ｙ１）を求めた。酵素活性比（Ｙ１）は全て１０以上であった。【０１２０】
＜製造例９＞
製造例１において、「ストレプトコッカスエクイシミリス由来の配列番号１のアミノ酸配列をコードする遺伝子」に代えて「トキソプラズマ属由来の配列番号９のアミノ酸配列をコードする遺伝子」を用いる以外は同様にして、アルギニンキナーゼ水溶液（Ｄ４−１−３）を得た。【０１２１】
＜アルギニンキナーゼ水溶液（Ｄ４−１−３）の比活性測定＞
水溶液Ｒを１ｍＬに、１Ｍのω−ホスホノ−Ｌ−アルギニン水溶液（Ｓｉｇｍａ社製）を含む溶液を作成し、アルギニンキナーゼ水溶液（Ｄ４−１−３）を１０μＬ加えて、反応溶液（９）としたものを３つ作成し、それぞれ３０℃で５分、１０分、１５分反応を行った。化合物（Ｃ−４）である反応生成物（ウリジン３リン酸）の量は、ＴＬＣで展開して、ＵＶライト（２６０ｎｍ）で検出して求めた。化合物（Ｃ−４）の生成量と反応時間との関係から、アルギニンキナーゼ水溶液（Ｄ４−１−３）の比活性を計算したところ、０．３Ｕ／μｌであった。【０１２２】
＜アルギニンキナーゼの酵素活性Ｖｍａｘ１、Ｖｍａｘ２、酵素活性比（Ｙ１）の測定＞
「スクロースシンターゼの酵素活性Ｖｍａｘ１、Ｖｍａｘ２、酵素活性比（Ｙ１）の測定」において、「スクロースシンターゼ水溶液（Ｄ７−１）」に代えて「アルギニンキナーゼ水溶液（Ｄ４−１−３）」を用いて、また、「スクロース」に代えて「ホスホエノールピルビン酸１カリウム」を用いる以外は同様にして、ウリジン２リン酸に対する酵素活性Ｖｍａｘ１を求めた。
さらに、基質として、「ウリジン２リン酸」に代えて「ウリジン２リン酸−グルクロン酸」、「ウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン」、「ウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルガラクトサミン」、「ウリジン２リン酸−グルコース」、「ウリジン２リン酸−マンノース」及び「ウリジン２リン酸−グルコサミン」をそれぞれ用いる以外は同様にして、それぞれ酵素活性Ｖｍａｘ２を求め、酵素活性比（Ｙ１）を求めた。酵素活性比（Ｙ１）は全て１０以上であった。【０１２３】
＜ヌクレオシド−２−リン酸キナーゼを用いたウリジン３リン酸を合成する反応におけるミカエリス定数Ｋｍの測定＞
製造例８で得たヌクレオシド−２−リン酸キナーゼ水溶液（Ｄ４−１−２）１０μＬを、１．５ｍＬのチューブ中で８９０μＬの水溶液７［５ｍＭの塩化マグネシウム、１００ｍＭのアデノシン３リン酸（Ｓｉｇｍａ社製）を含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５、２５℃）］に溶解し、恒温水槽を用いてチューブを３０℃で３分静置した。ここに、３０℃に温調した基質溶液［２−１］（ウリジン２リン酸ナトリウムを緩衝液Ｂに溶解して１０ｍＭの濃度にしたもの）を１００μＬ添加し、酵素反応溶液（ＩＶ−２−１）とした。（ＩＶ−２−１）を作成直後及び１分おきに１００μＬずつ取り出し、取り出した溶液を１００℃で２分間加熱して酵素反応を停止した。遠心分離器（４℃、１２，０００×ｇ、１０分）を用いて遠心し、不純物を沈殿させた。上清８０μＬをＨＰＬＣで分析し、ウリジン３リン酸のピーク面積を記録した。
基質溶液［２−１］において、ウリジン２リン酸ナトリウムのモル濃度を５ｍＭ（基質溶液［２−２］）、２ｍＭ（基質溶液［２−３］）、１ｍＭ（基質溶液［２−４］）及び０．３ｍＭ（基質溶液［２−５］）に変更した溶液を作成した。酵素反応溶液（ＩＶ−２−１）において、基質溶液［２−１］に代えて基質溶液［２−２］〜［２−５］を用いる以外は同様にして酵素反応溶液（ＩＶ−２−２）〜（ＩＶ−２−５）を作成した。酵素反応溶液（ＩＶ−２−２）〜（ＩＶ−２−５）についても、酵素反応溶液（ＩＶ−２−１）と同様にして、ウリジン３リン酸のピーク面積を記録した。
ウリジン３リン酸ナトリウム（和光純薬工業社製）を緩衝液Ｂに溶解し、０．００５ｍＭ、０．１ｍＭ、１ｍＭ及び５ｍＭの濃度にしたものを作成し、ウリジン３リン酸標準溶液（Ｍ−１）〜（Ｍ−４）とした。（Ｍ−１）〜（Ｍ−４）を８０μＬ、上記と同条件のＨＰＬＣで分析し、ウリジン３リン酸のピーク面積をそれぞれ記録した。横軸（ｘ軸）にそれぞれのウリジン３リン酸濃度（ｍＭ）、縦軸（ｙ軸）にそれぞれのピーク面積Ｐをプロットし、直線の傾き「ｋ’」を算出した。
酵素反応溶液（ＩＶ−２−１）〜（ＩＶ−２−５）を作成直後のウリジン３リン酸のピーク面積をＰ０、「ｍ’」分後のピーク面積をＰｈとし、それぞれピーク面積の変化ΔＰ（ΔＰ＝Ｐｈ−Ｐ０）と上記直線の傾き「ｋ’」を用いて下記数式（５）からそれぞれの酵素反応初速度ｖ（ｍＭ／ｓ）を算出した。
ｖ＝ΔＰ／（ｋ’×ｍ’×６０）（５）
算出した酵素反応初速度ｖを用いて、横軸（ｘ軸）にそれぞれの基質濃度［Ｓ］、縦軸（ｙ軸）にそれぞれの基質濃度での酵素反応初速度の逆数［Ｓ］／ｖをプロットし、Ｈａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットを作成した。プロットの近似直線とｘ軸との交点（−Ｋｍ）から、ミカエリス定数Ｋｍは０．２５ｍＭであった。【０１２４】
＜ピルビン酸キナーゼを用いてウリジン３リン酸を合成する反応におけるミカエリス定数Ｋｍ測定＞
「ヌクレオシド−２−リン酸キナーゼを用いたウリジン３リン酸を合成する反応におけるミカエリス定数Ｋｍの測定」において、「製造例８で得たヌクレオシド−２−リン酸キナーゼ水溶液（Ｄ４−１−２）」に代えて「製造例４で得たピルビン酸キナーゼ水溶液（Ｄ４−１−１）」を用いて、「アデノシン３リン酸」に代えて、「ホスホエノールピルビン酸１カリウム」を用いる以外は同様にして、ミカエリス定数Ｋｍを求めたところ、６ｍＭであった。【０１２５】
＜アルギニンキナーゼを用いてウリジン３リン酸を合成する反応におけるミカエリス定数Ｋｍ測定＞
「ヌクレオシド−２−リン酸キナーゼを用いたウリジン３リン酸を合成する反応におけるミカエリス定数Ｋｍの測定」において、「製造例８で得たヌクレオシド−２−リン酸キナーゼ水溶液（Ｄ４−１−１）」に代えて「製造例９で得たアルギニンキナーゼ水溶液（Ｄ４−１−３）」を用いて、「アデノシン３リン酸」に代えて、「ω−ホスホノ−Ｌ−アルギニン」を用いること以外は同様にして、ミカエリス定数Ｋｍを求めたところ、０．７１ｍＭであった。【０１２６】
＜実施例１＞
１ｍＬの水溶液Ｓに、１Ｍのスクロース水溶液を１００μＬ、製造例２で得たスクロースシンターゼ水溶液（Ｄ７−１）を１０μＬ及び製造例１で得たヒアルロン酸合成酵素水溶液（Ｂ−１）を１０μＬ加えて、反応溶液（Ｚ−１）とし、３０℃で２時間反応を行った。反応途中でサンプリングを行い、ＨＰＬＣを用いて反応溶液中のウリジン２リン酸の濃度を測定した。結果を表１に示す。
また、２時間反応した後、ろ紙を用いたペーパークロマトグラフィー法で未反応の基質とヒアルロン酸を分離した後、原点部を切り出し、液体シンチレーションカクテルに浸漬させた後、液体シンチレーションカウンターを用いて放射性同位体を測定し、１４Ｃでラベルしたグルクロン酸の取り込み量からヒアルロン酸の生成量を算出した。ヒアルロン酸の生成量は５．１ｍｇであった。【０１２７】
＜実施例２＞
実施例１において、「製造例２で得たスクロースシンターゼ水溶液（Ｄ７−１）を１０μＬ」に代えて「製造例３で得たリボヌクレオチド２リン酸リダクターゼ水溶液（Ｄ６−１）を１０μＬ」として、「１Ｍのスクロース水溶液を１００μＬ」に代えて「還元型チオレドキシンを１０ｍｇ」とする以外は実施例１と同様にして、ヒアルロン酸を合成した。ヒアルロン酸の生成量は５．３ｍｇであった。また、反応溶液中のウリジン２リン酸の濃度測定の結果を表１に示す。【０１２８】
＜実施例３＞
実施例１において、「製造例２で得たスクロースシンターゼ水溶液（Ｄ７−１）を１０μＬ」に代えて「製造例４で得たピルビン酸キナーゼ水溶液（Ｄ４−１−１）を１０μＬ」として、「１Ｍのスクロース水溶液を１００μＬ」に代えて「１Ｍのホスホエノールピルビン酸１カリウム水溶液を１００μＬ」とする以外は実施例１と同様にして、ヒアルロン酸を合成した。ヒアルロン酸の生成量は５．０ｍｇであった。また、反応溶液中のウリジン２リン酸の濃度測定の結果を表１に示す。【０１２９】
＜実施例４＞
実施例１において、「製造例２で得たスクロースシンターゼ水溶液（Ｄ７−１）を１０μＬ」に代えて「製造例５で得たヌクレオチダーゼ水溶液（Ｄ３−１）を１０μＬ」とし、「１Ｍのスクロース水溶液を１００μＬ」を用いない以外は実施例１と同様にして、ヒアルロン酸を合成した。ヒアルロン酸の生成量は４．８ｇであった。また、反応溶液中のウリジン２リン酸の濃度測定の結果を表１に示す。【０１３０】
＜実施例５＞
実施例１において、「製造例２で得たスクロースシンターゼ水溶液（Ｄ７−１）を１０μＬ」に代えて「製造例６で得たポリリボヌクレオチドヌクレオチジルトランスフェラーゼ水溶液（Ｄ５−１）を１０μＬ」とし、「１Ｍのスクロース水溶液を１００μＬ」を用いない以外は実施例１と同様にして、ヒアルロン酸を合成した。ヒアルロン酸の生成量は５．０ｍｇであった。また、反応溶液中のウリジン２リン酸の濃度測定の結果を表１に示す。【０１３１】
＜実施例６＞
実施例１において、「製造例２で得たスクロースシンターゼ水溶液（Ｄ７−１）を１０μＬ」に代えて「製造例７で得たアピラーゼ水溶液（Ｄ２−１）を１０μＬ」とし、「１Ｍ  スクロース水溶液を１００μＬ」を用いない以外は実施例１と同様にして、ヒアルロン酸を合成した。ヒアルロン酸の生成量は５．３ｍｇであった。また、反応溶液中のウリジン２リン酸の濃度測定の結果を表１に示す。【０１３２】
＜製造例１０＞
製造例１において、「ストレプトコッカスエクイシミリス由来の配列番号１のアミノ酸配列をコードする遺伝子」に代えて「シロイヌナズナ由来の配列番号１０のアミノ酸配列をコードする遺伝子」を用いる以外は同様にして、ウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ水溶液（Ｇ−１）を得た。【０１３３】
＜ウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ水溶液（Ｇ−１）の比活性測定＞
水溶液｛１００ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭの塩化マグネシウム、１０ｍＭのウリジン３リン酸、１０ｍＭのＮ−アセチルグルコサミン１リン酸を含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）｝１ｍＬに、製造例１０で得たウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ水溶液（Ｇ−１）を１０μＬ加えて、反応溶液（１０−１）としたものを３つ作成し、それぞれ３０℃で５分、１０分、１５分反応を行った。生成したウリジル２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンの定量はＨＰＬＣを用いて、ＵＶライト（２６０ｎｍ）で検出して求めた。ウリジル２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンの生成量から、ウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼのウリジル２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンを生成させる活性を求めたところ、０．１Ｕ／ｍｌであった。
上記において、「１０ｍＭのＮ−アセチルグルコサミン１リン酸」に代えて「１０ｍＭのグルクロン１リン酸」を含む水溶液を用いて、「ウリジル２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン」に代えて「ウリジル２リン酸−グルクロン酸」を定量する以外は同様にして、ウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼのウリジル２リン酸−グルクロン酸を生成させる活性を求めたところ、５Ｕ／μｌであった。【０１３４】
＜実施例７＞
緩衝液Ｂ（ｐＨ７．５、２５℃）中に、１ｍＭのウリジン２リン酸−グルクロン酸（１４Ｃでラベルした放射性同位体を含むウリジン２リン酸−グルクロン酸、放射能３００ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）、１ｍＭのウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン、１００ｍＭのアデノシン３リン酸、１００ｍＭの１−ホスホ−グルクロン酸、１００ｍＭのＮ−アセチルグルコサミン−１リン酸及び５ｍＭの塩化マグネシウムを含む１ｍＬの溶液に、製造例１で得たヒアルロン酸合成酵素水溶液（Ｂ−１）を１０μｌ、ピロリン酸分解酵素（ロシュアプライドサイエンス社製）を５μｌ、製造例８で得たヌクレオシド２リン酸キナーゼ水溶液（Ｄ４−１−２）を５μｌ、製造例１０で得たウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ水溶液（Ｇ−１）を５μＬ加えて反応溶液（Ｚ−７）を調製した。すべて混合してから２時間、３０℃の恒温水槽で温調し、酵素反応させた。反応途中でサンプリングを行い、ＨＰＬＣを用いて反応溶液中のウリジン２リン酸の濃度を測定した。結果を表１に示す。
また、２時間反応した後、ろ紙を用いたペーパークロマトグラフィー法で未反応の基質とヒアルロン酸を分離した後、原点部を切り出し、液体シンチレーションカクテルに浸漬させた後、液体シンチレーションカウンターを用いて放射性同位体を測定し、１４Ｃでラベルしたグルクロン酸の取り込み量からヒアルロン酸の生成量を算出した。ヒアルロン酸の生成量は１６ｍｇであった。【０１３５】
＜実施例８＞
実施例７において、「製造例８で得たヌクレオシド２リン酸キナーゼ水溶液（Ｄ４−１−２）を５μｌ」及び「１００ｍＭのアデノシン３リン酸」に代えて「製造例４で得たピルビン酸キナーゼ水溶液（Ｄ４−１−１）を５μｌ」及び「１００ｍＭのホスホエノールピルビン酸１カリウム水溶液」を用いたこと以外は実施例７と同様にして、ヒアルロン酸を生成した。ヒアルロン酸の生成量は１４ｍｇであった。また、反応溶液中のウリジン２リン酸の濃度測定の結果を表１に示す。【０１３６】
＜実施例９＞
実施例７において、「製造例８で得たヌクレオシド２リン酸キナーゼ水溶液（Ｄ４−１−２）を５μｌ」及び「１００ｍＭのアデノシン３リン酸」に代えて「製造例９で得たアルギニンキナーゼ水溶液（Ｄ４−１−３）を５μｌ」及び「１００ｍＭのω−ホスホノ−Ｌ−アルギニン水溶液」を用いたこと以外は実施例７と同様にして、ヒアルロン酸を生成した。ヒアルロン酸の生成量は１５ｍｇであった。また、反応溶液中のウリジン２リン酸の濃度測定の結果を表１に示す。【０１３７】
＜比較例１＞
実施例１において、「製造例２で得たスクロースシンターゼ水溶液（Ｄ７−１）を１０μＬ」及び「１Ｍ  スクロース水溶液を１０μＬ」を用いないこと、ヒアルロン酸合成酵素（Ｂ−１）を「１０μＬ」でなく「３００μＬ」用いた以外は実施例１と同様にして、ヒアルロン酸を合成した。ヒアルロン酸の生成量は３．０ｍｇであった。なお、反応溶液中のウリジン２リン酸の濃度を実施例１と同様に測定した。結果を表１に示す。【０１３８】
【表１】
0006000948.tif 000012
【０１３９】
＜製造例１１＞
製造例１において、「ストレプトコッカスエクイシミリス由来の配列番号１のアミノ酸配列をコードする遺伝子」に代えて「パスツレラ・ムルトシダ由来の配列番号１１のアミノ酸配列をコードする遺伝子」を用いる以外は同様にして、コンドロイチン合成酵素水溶液（Ｂ−２）を得た。【０１４０】
＜コンドロイチン合成酵素水溶液（Ｂ−２）の比活性測定＞
水溶液Ｔ｛１ｍＭのウリジン２リン酸−グルクロン酸（１４Ｃでラベルした放射性同位体を含むウリジン２リン酸−グルクロン酸、放射能３００ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）、１ｍＭのウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルガラクトサミン、１００ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭの塩化マグネシウム、１０ｍＭのドデシルマルトシド、５ｍＭのオレイン酸を含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）｝１ｍＬに、製造例１１で得たコンドロイチン合成酵素水溶液（Ｂ−２）を１０μＬ加えて、反応溶液（１１）としたものを３つ作成し、それぞれ３０℃で５分、１０分、１５分反応を行った。ろ紙を用いたペーパークロマトグラフィー法で未反応の基質とコンドロイチンを分離した。その後、原点部を切り出し、液体シンチレーションカクテルに浸漬させた後、液体シンチレーションカウンターを用いて放射性同位体を測定した。１４Ｃでラベルしたグルクロン酸の取り込み量からコンドロイチンの生成量を算出したところ、それぞれ５分後１．７μｇ、１０分後３．１μｇ、１５分後４．４μｇであった。コンドロイチンの生成量と反応時間との関係から、コンドロイチン合成酵素水溶液（Ｂ−２）の比活性を計算した。結果は０．１５Ｕ／ｍｌであった。【０１４１】
＜コンドロイチン合成酵素の阻害濃度ＩＣ５０の測定＞
「ヒアルロン酸合成酵素の阻害濃度ＩＣ５０の測定」において、「製造例１で得たヒアルロン酸合成酵素水溶液（Ｂ−１）」に代えて「製造例１１で得たコンドロイチン合成酵素水溶液（Ｂ−２）」を用いて、「基質溶液［１−１］」に代えて「基質溶液［１−２］（ウリジン２リン酸−グルクロン酸ナトリウム塩、ウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルガラクトサミンを緩衝液Ｂに溶解してそれぞれ２０ｍＭの濃度にしたもの）」を用いて、「ヒアルロン酸ナトリウム」に代えて「コンドロイチンナトリウム（和光純薬工業社製）」を用いて同様に測定した。阻害濃度ＩＣ５０は０．０８５ｍＭであった。
また、「コンドロイチン合成酵素水溶液（Ｂ−２）を１．５Ｕ／ｍＬ」に代えて「コンドロイチン合成酵素水溶液（Ｂ−２）を４５Ｕ／ｍＬ」とする以外は同様にして、阻害濃度ＩＣ５０を求めたところ、０．０８５ｍＭであった。【０１４２】
＜実施例１０＞
水溶液Ｔを１ｍＬに、１Ｍのホスホエノールピルビン酸１カリウム水溶液を１００μＬ、製造例４で得たピルビン酸キナーゼ水溶液（Ｄ４−１−１）を１０μＬ及び製造例１１で得たコンドロイチン合成酵素水溶液（Ｂ−２）を１０μＬ加えて、反応溶液（Ｚ−１０）とし、３０℃で２時間反応を行った。反応途中でサンプリングを行い、ＨＰＬＣを用いて（実施例１の条件と同じ）、反応溶液中のウリジン２リン酸の濃度を測定した。結果を表２に示す。
また、２時間反応した後、ろ紙を用いたペーパークロマトグラフィー法で未反応の基質とコンドロイチンを分離した後、原点部を切り出し、液体シンチレーションカクテルに浸漬させた後、液体シンチレーションカウンターを用いて放射性同位体を測定し、１４Ｃでラベルしたグルクロン酸の取り込み量からコンドロイチンの生成量を算出した。コンドロイチンの生成量は５．０ｍｇであった。【０１４３】
＜比較例２＞
実施例１０において、「製造例４で得たピルビン酸キナーゼ水溶液（Ｄ４−１−１）」及び「１Ｍのホスホエノールピルビン酸１カリウム水溶液」を用いないこと、コンドロイチン合成酵素水溶液（Ｂ−２）を「１０μｌ」でなく「３００μｌ」用いたこと以外は実施例１０と同様にして、コンドロイチンを合成した。コンドロイチンの生成量は２．５ｍｇであった。なお、反応溶液中のウリジン２リン酸の濃度を実施例１０と同様に測定した。結果を表２に示す。【０１４４】
＜製造例１２＞
製造例１において、「ストレプトコッカスエクイシミリス由来の配列番号１のアミノ酸配列をコードする遺伝子」に代えて「酢酸菌由来の配列番号１２のアミノ酸配列をコードする遺伝子」を用いる以外は同様にして、セルロース合成酵素水溶液（Ｂ−３）を得た。【０１４５】
＜セルロース合成酵素水溶液（Ｂ−３）の比活性測定＞
水溶液Ｕ｛１００ｍＭのウリジン２リン酸−β−グルコース（１４Ｃでラベルした放射性同位体を含むウリジン２リン酸−β−グルコース、放射能３００ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）、１００ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭの塩化マグネシウム、５ｍＭのオレイン酸を含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）｝１ｍＬに、製造例１２で得たセルロース合成酵素水溶液（Ｂ−３）を１０μＬ加えて、反応溶液（１２）としたものを４つ作成し、それぞれ３０℃で５分、１０分、１５分、２０分反応を行った。ろ紙を用いたペーパークロマトグラフィー法で未反応の基質とセルロースを分離した後、原点部を切り出し、液体シンチレーションカクテルに浸漬させた後、液体シンチレーションカウンターを用いて放射性同位体を測定し、１４Ｃでラベルしたグルコースの取り込み量からセルロースの生成量を算出したところ、５分後は１．３ｍｇ、１０分後は２．６ｍｇ、１５分後は３．７ｍｇ、２０分後は５．１ｍｇであった。セルロースの生成量と反応時間との関係から、セルロース合成酵素水溶液（Ｂ−３）の比活性を計算した。結果は０．１５Ｕ／μｌであった。【０１４６】
＜セルロース合成酵素の阻害濃度ＩＣ５０の測定＞
「ヒアルロン酸合成酵素の阻害濃度ＩＣ５０の測定」において、「製造例１で得たヒアルロン酸合成酵素水溶液（Ｂ−１）」に代えて「製造例１２で得たセルロース合成酵素水溶液（Ｂ−３）」を用いて、「基質溶液［１−１］」に代えて「基質溶液［１−３］（ウリジン２リン酸−β−グルコースを緩衝液Ｂに溶解して２０ｍＭの濃度にしたもの）」を用いて、「ヒアルロン酸ナトリウム」に代えて「酢酸菌由来のセルロース（東京化成工業社製）」を用いて同様に測定した。阻害濃度ＩＣ５０は０．１ｍＭであった。
また、「セルロース合成酵素水溶液（Ｂ−３）を１．５Ｕ／ｍＬ」に代えて「セルロース合成酵素水溶液（Ｂ−３）を４５Ｕ／ｍＬ」とする以外は同様にして、阻害濃度ＩＣ５０を求めたところ、０．１ｍＭであった。【０１４７】
＜実施例１１＞
水溶液Ｕを１ｍＬに、１Ｍのホスホエノールピルビン酸１カリウム水溶液を１０μＬ、製造例４で得たピルビン酸キナーゼ水溶液（Ｄ４−１−１）を１０μＬ及び製造例１２で得たセルロース合成酵素水溶液（Ｂ−３）を１０μＬ加えて、反応溶液（Ｚ−１１）とし、３０℃で２時間反応を行った。反応途中でサンプリングを行い、ＨＰＬＣを用いて（実施例１の条件と同じ）、反応溶液中のウリジン２リン酸の濃度を測定した。結果を表２に示す。
２時間反応した後、ろ紙を用いたペーパークロマトグラフィー法で未反応の基質とセルロースを分離した後、原点部を切り出し、液体シンチレーションカクテルに浸漬させた後、液体シンチレーションカウンターを用いて放射性同位体を測定し、１４Ｃでラベルしたグルコースの取り込み量からセルロースの生成量を算出した。セルロースの生成量は１０ｍｇであった。【０１４８】
＜比較例３＞
実施例１１において、「製造例４で得たピルビン酸キナーゼ水溶液（Ｄ４−１−１）」及び「１Ｍのホスホエノールピルビン酸１カリウム水溶液」を用いないこと、「製造例１２で得たセルロース合成酵素水溶液（Ｂ−３）」を「１０μｌ」から「３００μｌ」に変更した以外は実施例１１と同様にして、セルロースを合成した。セルロースの生成量は３．０ｍｇであった。なお、反応溶液中のウリジン２リン酸の濃度を実施例１１と同様に測定した。結果を表２に示す。【０１４９】
＜製造例１３＞
製造例１において、「ストレプトコッカスエクイシミリス由来の配列番号１のアミノ酸配列をコードする遺伝子」に代えて「サッカロマイセスセルビシエ由来の配列番号１３のアミノ酸配列をコードする遺伝子」を用いる以外は同様にして、デンプン合成酵素水溶液（Ｂ−４）を得た。【０１５０】
＜デンプン合成酵素水溶液（Ｂ−４）の比活性測定＞
水溶液Ｖ｛１００ｍＭのウリジン２リン酸−α−グルコース（１４Ｃでラベルした放射性同位体を含むウリジン２リン酸−α−グルコース、放射能３００ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）、１００ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭの塩化マグネシウム、５ｍＭのオレイン酸を含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）｝１ｍＬに、製造例１３で得たデンプン合成酵素水溶液（Ｂ−４）を１０μＬ加えて、反応溶液（１３）としたものを４つ作成し、それぞれ３０℃で５分、１０分、１５分、２０分反応を行った。ろ紙を用いたペーパークロマトグラフィー法で未反応の基質とデンプンを分離した後、原点部を切り出し、液体シンチレーションカクテルに浸漬させた後、液体シンチレーションカウンターを用いて放射性同位体を測定し、１４Ｃでラベルしたグルコースの取り込み量からデンプンの生成量を算出したところ、５分後は１．３ｍｇ、１０分後は２．５ｍｇ、１５分後は３．８ｍｇ、２０分後は５．２ｍｇであった。デンプンの生成量と反応時間との関係から、デンプン合成酵素水溶液（Ｂ−４）の比活性を計算した。結果は０．１５Ｕ／μｌであった。【０１５１】
＜デンプン合成酵素の阻害濃度ＩＣ５０の測定＞
「ヒアルロン酸合成酵素（Ｂ−１）の阻害濃度ＩＣ５０の測定」において、「製造例１で得たヒアルロン酸合成酵素水溶液（Ｂ−１）」に代えて「製造例１３で得たデンプン合成酵素水溶液（Ｂ−４）」を用いて、「基質溶液［１−１］」に代えて「基質溶液［１−４］（ウリジン２リン酸−α−グルコースを緩衝液Ｂに溶解して２０ｍＭの濃度にしたもの）」を用いて、「ヒアルロン酸ナトリウム」に代えて「デンプン（和光純薬工業社製）」を用いて同様に測定した。阻害濃度ＩＣ５０は０．２ｍＭであった。
また、「デンプン合成酵素水溶液（Ｂ−４）を１．５Ｕ／ｍＬ」に代えて「デンプン合成酵素水溶液（Ｂ−４）を７５Ｕ／ｍＬ」とする以外は同様にして、阻害濃度ＩＣ５０を求めたところ、０．２ｍＭであった。【０１５２】
＜実施例１２＞
水溶液Ｖを１ｍＬに、１Ｍのホスホエノールピルビン酸１カリウム水溶液を１０μＬ、製造例４で得たピルビン酸キナーゼ水溶液（Ｄ４−１−１）を１０μＬ及び製造例１３のデンプン合成酵素水溶液（Ｂ−４）を１０μＬ加えて、反応溶液（Ｚ−１２）とし、３０℃で２時間反応を行った。反応途中でサンプリングを行い、ＨＰＬＣを用いて（実施例１の条件と同じ）、反応溶液中のウリジン２リン酸の濃度を測定した。結果を表２に示す。
また、２時間反応した後、ろ紙を用いたペーパークロマトグラフィー法で未反応の基質とデンプンを分離した後、原点部を切り出し、液体シンチレーションカクテルに浸漬させた後、液体シンチレーションカウンターを用いて放射性同位体を測定し、１４Ｃでラベルしたグルコースの取り込み量からデンプンの生成量を算出した。デンプンの生成量は９．０ｍｇであった。【０１５３】
＜比較例４＞
実施例１２において、「製造例４で得たピルビン酸キナーゼ水溶液（Ｄ４−１−１）」及び「１Ｍのホスホエノールピルビン酸１カリウム水溶液」を用いないこと、「製造例１３で得たデンプン合成酵素水溶液（Ｂ−４）」を「１０μｌ」から「５００μｌ」に変更した以外は実施例１２と同様にして、デンプンを合成した。デンプンの生成量は６．０ｍｇであった。なお、反応溶液中のウリジン２リン酸の濃度を実施例１２と同様に測定した。結果を表２に示す。【０１５４】
【表２】
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【０１５５】
リボヌクレオシド２リン酸の濃度が阻害濃度ＩＣ５０の１００倍未満である実施例１〜１２は、比較例１〜４よりも、使用した多糖合成酵素（Ｂ）の量が少ないものの、多糖の生成量が多かった。したがって、単位酵素当たりの多糖の生産量が極めて多いことが分かる。また、多糖合成酵素（Ｂ）の種類によらず、リボヌクレオシド２リン酸の濃度を低くすることで、単位酵素あたりの多糖の生産量が多くなり、効率よく多糖を製造することができることがわかる。
また、リボヌクレオシド２リン酸変換酵素（Ｄ）の存在下で多糖合成酵素（Ｂ）を作用させることで、リボヌクレオシド２リン酸の濃度を低くすることができ、多糖の生成量が多くなることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【０１５６】
本発明の多糖の製造方法によれば、多糖を高効率で生産できる。また、本発明の製造方法により得られた多糖は、化粧品、医薬部外品、医薬品及び医療機器だけでなく、食品等にも用いることができる。
【配列表】
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