(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象者におけるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染症またはＨＢＶ感染に起因する少なくとも１つの症状を治療するための医薬の製造における免疫療法組成物の使用であって、前記治療はＨＢＶに感染した対象者に前記免疫療法組成物を投与することを含み、前記免疫療法組成物は、
ａ）融合タンパク質を含む酵母ビヒクルを含み、かつ
ｂ）前記融合タンパク質はＨＢＶ抗原を含み、前記ＨＢＶ抗原は、
ｉ）配列番号１３０の１位〜６０位と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するＨＢＶ  Ｘ抗原と、
ｉｉ）配列番号１３０の６３位〜４６１位と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するＨＢＶ表面抗原と、
ｉｉｉ）配列番号１３０の４６２位〜６４３位と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原とからなる、
使用。
【請求項２】
前記治療が、前記対象者に抗ウイルス化合物を投与することをさらに含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記対象者が、０．１Ｙ．Ｕ．〜１００Ｙ．Ｕ．の用量の前記免疫療法組成物を投与される、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記対象者が、２Ｙ．Ｕ．〜８０Ｙ．Ｕ．の用量の前記免疫療法組成物を投与される、請求項１または２に記載の使用。
【請求項５】
前記対象者が、２Ｙ．Ｕ．、１０Ｙ．Ｕ．、４０Ｙ．Ｕ．、または８０Ｙ．Ｕ．の用量の前記免疫療法組成物を投与される、請求項１または２に記載の使用。
【請求項６】
前記免疫療法組成物が毎週投与される、請求項１または２に記載の使用。
【請求項７】
前記免疫療法組成物が隔週で投与される、請求項１または２に記載の使用。
【請求項８】
前記免疫療法組成物が３週間毎に投与される、請求項１または２に記載の使用。
【請求項９】
前記免疫療法組成物が毎月投与される、請求項１または２に記載の使用。
【請求項１０】
前記免疫療法組成物が前記対象者の２か所以上に投与される、請求項１または２に記載の使用。
【請求項１１】
前記ＨＢＶ  Ｘ抗原のアミノ酸配列が、配列番号１３０の１位〜６０位と少なくとも９５％同一である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項１２】
前記ＨＢＶ  Ｘ抗原のアミノ酸配列が、配列番号１３０の１位〜６０位からなる、請求項１または２に記載の使用。
【請求項１３】
前記ＨＢＶ表面抗原のアミノ酸配列が、配列番号１３０の６３位〜４６１位と少なくとも９５％同一である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項１４】
前記ＨＢＶ表面抗原のアミノ酸配列が、配列番号１３０の６３位〜４６１位からなる、請求項１または２に記載の使用。
【請求項１５】
前記ＨＢＶコア抗原のアミノ酸配列が、配列番号１３０の４６２位〜６４３位と少なくとも９５％同一である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項１６】
前記ＨＢＶコア抗原のアミノ酸配列が、配列番号１３０の４６２位〜６４３位からなる、請求項１または２に記載の使用。
【請求項１７】
請求項１または２に記載の使用であって、前記ＨＢＶ抗原が、
ｉ）配列番号１３０の１位〜６０位と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するＨＢＶ  Ｘ抗原と、
ｉｉ）配列番号１３０の６３位〜４６１位と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するＨＢＶ表面抗原と、
ｉｉｉ）配列番号１３０の４６２位〜６４３位と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原とからなる、
使用。
【請求項１８】
前記ＨＢＶ抗原が、配列番号１３０と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列からなる、請求項１または２に記載の使用。
【請求項１９】
前記ＨＢＶ抗原が、配列番号１３０と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列からなる、請求項１または２に記載の使用。
【請求項２０】
前記ＨＢＶ抗原が、配列番号１３０のアミノ酸配列からなる、請求項１または２に記載の使用。
【請求項２１】
前記融合タンパク質が、配列番号１３０のアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の使用。
【請求項２２】
前記融合タンパク質が、配列番号１５０のアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の使用。
【請求項２３】
前記融合タンパク質が、配列番号１５０のアミノ酸配列からなる、請求項１または２に記載の使用。
【請求項２４】
前記ＨＢＶ抗原は、前記融合タンパク質中においてＮ末端からＣ末端に向かって、ＨＢＶ  Ｘ抗原、ＨＢＶ表面抗原、ＨＢＶコア抗原、の順に配置されている、請求項１または２に記載の使用。
【請求項２５】
前記酵母ビヒクルが全酵母である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項２６】
前記全酵母は加熱不活性化されている、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
前記全酵母は凍結乾燥されている、請求項２５に記載の使用。
【請求項２８】
前記全酵母はサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）に由来する、請求項２５に記載の使用。
【請求項２９】
前記酵母ビヒクルはサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）に由来する、請求項１または２に記載の使用。
【請求項３０】
対象者におけるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染症を治療するための医薬の製造における免疫療法組成物の使用であって、前記治療は対象者に前記免疫療法組成物を投与することを含み、前記免疫療法組成物は、
ａ）融合タンパク質を含む酵母を含み、かつ
ｂ）前記融合タンパク質は、配列番号１３０と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、使用。
【請求項３１】
前記融合タンパク質は、配列番号１３０と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３０に記載の使用。
【請求項３２】
前記融合タンパク質は、配列番号１５０と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３０に記載の使用。
【請求項３３】
前記融合タンパク質は、配列番号１５０と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３０に記載の使用。
【請求項３４】
前記対象者が、２Ｙ．Ｕ．、１０Ｙ．Ｕ．、４０Ｙ．Ｕ．、または８０Ｙ．Ｕ．の用量の前記免疫療法組成物を投与される、請求項３０に記載の使用。
【請求項３５】
前記免疫療法組成物が毎月投与される、請求項３０に記載の使用。
【請求項３６】
前記免疫療法組成物が前記対象者の２か所以上に投与される、請求項３０に記載の使用。
【請求項３７】
前記酵母はサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）に由来する加熱不活性化された全酵母である、請求項３０に記載の使用。
【請求項３８】
対象者における慢性Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染症を治療するための医薬の製造における免疫療法組成物の使用であって、前記治療は対象者に前記免疫療法組成物を投与することを含み、前記免疫療法組成物は、
ａ）融合タンパク質を含むサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）に由来する加熱不活性化された全酵母を含み、かつ
ｂ）前記融合タンパク質は前記酵母によって発現されるとともに配列番号１３０を含む、
使用。
【請求項３９】
前記融合タンパク質は配列番号１５０を含む、請求項３８に記載の使用。
【請求項４０】
前記治療が、前記対象者に抗ウイルス化合物を投与することをさらに含む、請求項３８に記載の使用。
【請求項４１】
前記抗ウイルス化合物がヌクレオチドアナログ系逆転写酵素阻害薬である、請求項２または４０に記載の使用。
【請求項４２】
前記抗ウイルス化合物がフマル酸テノホビルジソプロキシル（ＴＤＦ）である、請求項２または４０に記載の使用。
【請求項４３】
前記対象者が、前記免疫療法組成物の投与の前に抗ウイルス化合物の投与を受けている、請求項２または４０に記載の使用。
【請求項４４】
前記対象者が、前記免疫療法組成物の投与の少なくとも１年前に抗ウイルス化合物の投与を受けている、請求項４３に記載の使用。
【請求項４５】
前記対象者が、以前にＨＢＶに対する抗ウイルス治療を受けていない、請求項２に記載の使用。
【請求項４６】
前記対象者がＨＢＶに慢性的に感染している、請求項２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染の予防および治療のうち少なくとも一方を行うための免疫療法組成物および免疫療法に関する。
配列表の参照
本願は、ＥＦＳ‐Ｗｅｂによりテキストファイルとして電子提出される配列表を包含する。該テキストファイル（ファイル名：3923-32-PCT_ST25）はバイト数４７６ＫＢのサイズであり、２０１２年２月７日に記録されたものである。該テキストファイルに含まれる情報は、米国特許法施行規則第１．５２条第ｅ項第５号に準じ参照によりその全体が本願に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）はヘパドナウイルス科に属し、世界中に広がる急性および慢性肝炎の病原体である。ＨＢＶの流行はアジアおよびアフリカにおいて広まっており、ＨＢＶ感染症は中国においては風土病である（非特許文献１）。２０億人を超える人々が該ウイルスに感染しており、世界中に３億５０００万人の慢性ＨＢＶ感染者がいると推測される（非特許文献２；非特許文献３）。感染経路は、輸血およびＩＶ薬物使用を含む血液および体液の接触、性的感染、咬傷および外傷、ならびに垂直感染（例えば出産）による。
【０００３】
ＨＢＶはそのエンベロープタンパク質内の抗原エピトープに基づいて決まる４つの主な血清型（ａｄｒ、ａｄｗ、ａｙｒ、ａｙｗ）のうちの１つとして見出される。ゲノム内のヌクレオチド配列変異に基づいた８つの異なる遺伝子型（Ａ‐Ｈ）がある。遺伝子型の違いは、疾患重症度、疾患の経過および合併症の可能性、治療に対する応答ならびにおそらくはワクチン接種に対する応答に、影響を及ぼす（非特許文献４；非特許文献５）。
【０００４】
ＨＢＶの臨床潜伏期は通常２〜３か月であり；急性感染者のおよそ３分の２は無症候または軽い亜臨床症状である。急性感染者の残りの３分の１は、黄疸、肝臓の炎症、嘔吐、疼痛、および微熱を生じうるが、この疾患はほとんどの成人においては最終的には解消し、肝不全に至ることはまれである。実際、およそ９５％の成人はＨＢＶ感染症から完全に回復し、慢性感染には至らない。しかしながら、およそ９０％の乳児および２５％〜５０％の１〜５歳児はＨＢＶの慢性感染を維持することになる（２０１０年９月時点、米国疾病管理予防センター（Centers for Disease Control and Prevention））。小児期に慢性感染に至る人のおよそ２５％および小児期より後に慢性感染に至る人の１５％は肝硬変または肝細胞癌で早期に死亡し、慢性感染者の大多数は肝硬変または末期肝臓疾患の発病まで無症候のままである（２０１０年９月時点、ＣＤＣ）。世界中で年間１００万人の死亡（米国では年間約２０００〜４０００人の死亡）が慢性ＨＢＶ感染症を原因とする。慢性感染者は、血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）のレベル（肝損傷のマーカー）の上昇、肝臓の炎症、および肝生検時の線維症のうち少なくともいずれかを有する。硬変を発症する患者については、５年生存率は約５０％である。
【０００５】
ＨＢＶ感染およびその治療は、典型的にはウイルス抗原および該抗原に対する抗体のうち少なくとも一方の検出によってモニタリングされる。ＨＢＶに感染すると、最初の検出可能な抗原はＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、続いてＢ型肝炎「ｅ」抗原（ＨＢｅＡｇ）である。ウイルスの排除は、セロコンバージョンとしても知られているＨＢｓＡｇおよびコア抗原（ＨＢｃＡｇ）に対する血清中ＩｇＧ抗体の出現によって示される。数多くの研究から、ＨＢＶ感染者におけるウイルスの複製、ウイルス血症のレベルおよび慢性状態への進行は、ＣＤ４＋ヘルパーＴリンパ球（ＴＨ）およびＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球
（ＣＴＬ）を介したＨＢＶ特異的な細胞性免疫によって直接的・間接的に影響を受けることが示されている。慢性疾患に進行する患者は、急性感染症を排除する患者と比較して、ＨＢＶ特異的なＴ細胞応答が存在しないか、弱いか、または対象が限られている傾向がある。例えば、非特許文献６〜１４を参照のこと。
【０００６】
ＨＢＶの予防用ワクチン剤は１９８０年代の初め以来市販されてきた。現在の市販のワクチン剤は、精製された組換えＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を提供する非感染性サブユニットウイルスワクチンであり、出生時から投与可能である。該ワクチン剤は、このワクチンがごく普通に投与される国々での感染率の低減に有効であった。いくつかの免疫療法薬が開発中であり、例えば様々なＨＢＶタンパク質またはエピトープのワクチン剤およびサイトカインが挙げられるが、米国には活動性ＨＢＶ感染症の治療用に承認された免疫療法薬は現在存在しない。
【０００７】
ＨＢＶ感染症についての現在の標準治療（ＳＯＣ）の治療法には、第１に抗ウイルス薬、例えばテノフォビル（ＶＩＲＥＡＤ（登録商標））、ラミブジン（ＥＰＩＶＩＲ（登録商標））、アデフォビル（ＨＥＰＳＥＲＡ（登録商標））、テルビブジン（ＴＹＺＥＫＡ（登録商標））およびエンテカビル（ＢＡＲＡＣＬＵＤＥ（登録商標））など、ならびにインターフェロンα２ａおよびＰＥＧ化インターフェロンα２ａ（ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標））が挙げられる。これらの薬物、特に抗ウイルス薬は、典型的には長期間（例えば１〜５年以上にわたり毎日または毎週）投与され、また、ウイルス複製を遅延または停止させるものの一般に完全な「治癒（cure）」またはウイルスの根絶はもたらさない。インターフェロンを用いる手法は毒性を有し、寛解率はわずかである。抗ウイルス薬療法はウイルスの複製を抑制し、かつインターフェロンよりも忍容性に優れるが、上述のようにこれらの薬物は一般に完全なウイルス治療はなさず、場合によっては長期的な寛解率は達成されない。さらに、場合によっては、続いて薬物抵抗性の出現が起こる。例えば、ラミブジンはＨＢＶ逆転写酵素（Ｐｏｌ）を阻害する強力な経口抗ウイルス薬である。ラミブジンは忍容性が良好であり、また今やジェネリックな薬物であるので、ラミブジンは開発途上国におけるＨＢＶ抗ウイルス療法の１つの選択肢である。しかしながら、Ｐｏｌ配列の点突然変異により毎年２０％の割合でウイルスが抵抗性となることから、ＨＢＶについてのラミブジンの有用性は制限される。さらに、現在の抗ウイルス薬治療およびインターフェロン治療に対する応答は、ＨＢＶ遺伝子型の間で有効性が異なっており（非特許文献１５）、患者によっては、感染症が排除された後でもＢ型肝炎ウイルスＤＮＡが体内に残存しうるので、時間を経てウイルスの再活性化が生じる可能性がある。
【０００８】
従って、標準治療（ＳＯＣ）の治療法により、現在承認されている最良の治療が慢性ＨＢＶ患者に提供される一方で、該レジメンの治療期間の長さおよび著しい副作用は、ウイルスの回避、ウイルスの再活性化、および治療法に対して依然応答しないかまたは応答を持続しない患者とも相まって、ノンコンプライアンス、用量減少、および治療中断をもたらす可能性がある。したがって、ＨＢＶ感染症の治療処置の改善は当分野において必要とされ続けている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】ウィリアムズ、Ｒ．（Williams, R.）、「肝臓病という地球規模の難題（Global challenges in liver disease）」、ヘパトロジー（Hepatology）（米国メリーランド州ボルティモア）、２００６年、第４４巻、第３号、ｐ．５２１−５２６
【非特許文献２】「Ｂ型肝炎（Hepatitis B）」、世界保健機関、２００９年
【非特許文献３】「Ｂ型肝炎に関するＦＡＱ（FAQ About Hepatitis B）」、スタンフォード大学医学部、２００８年７月１０日
【非特許文献４】クランビス（Kramvis）ら、ワクチン（Vaccine）、２００５年、第２３巻、第１９号、ｐ．２４０９−２４２３
【非特許文献５】マグニウス（Magnius）およびノーダー（Norder）、インターヴィロロジー（Intervirology）、１９９５年、第３８巻、第１−２号、ｐ．２４−３４
【非特許文献６】チャイサリ（Chisari）、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（J Clin Invest）、１９９７年、第９９巻、ｐ．１４７２−１４７７
【非特許文献７】マイニ（Maini）ら、ガストロエンテロロジー（Gastroenterology）、１９９９年、第１１７巻、ｐ．１３８６−１３９６
【非特許文献８】レヘルマン（Rehermann）ら、ネイチャー・レビューズ・イムノロジー（Nat Rev Immunol）、２００５年、第５巻、ｐ．２１５−２２９
【非特許文献９】ジン（Thimme）ら、ジャーナル・オブ・ヴィロロジー（J Virol）、２００１年、第７５巻、ｐ．３９８４−３９８７
【非特許文献１０】ウルバニ（Urbani）ら、ジャーナル・オブ・ヴィロロジー（J Virol）、２００２年、第７６巻、ｐ．１２４２３−１２４３４
【非特許文献１１】ヴィーラント（Wieland）およびチャイサリ（Chisari）、ジャーナル・オブ・ヴィロロジー（J Virol）、２００５年、第７９巻、ｐ．９３６９−９３８０
【非特許文献１２】ウェブスター（Webster）ら、ヘパトロジー（Hepatology）、２０００年、第３２巻、ｐ．１１１７−１１２４
【非特許文献１３】ペンナ（Penna）ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（J Clin Invest）、１９９６年、第９８巻、ｐ．１１８５−１１９４
【非特許文献１４】シュプレンガー（Sprengers）ら、ジャーナル・オブ・ヘパトロジー（J Hepatol）、２００６年、第４５巻、ｐ．１８２−１８９
【非特許文献１５】ツアオ（Cao）、ワールド・ジャーナル・オブ・ガストロエンテロロジー（World Journal of Gastroenterology）、２００９年、第１５巻、第４６号、ｐ．５７６１−９
【発明の概要】
【００１０】
本発明の１つの実施形態は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染症および／またはＨＢＶ感染症の症状の、治療および予防のうち少なくとも一方のための免疫療法組成物に関する。該免疫療法組成物は、（ａ）酵母ビヒクル、および（ｂ）１以上のＨＢＶ抗原を含む。１つの態様では、該ＨＢＶ抗原は１以上の融合タンパク質として提供されるが、単一タンパク質のＨＢＶ抗原も提供されうる。該ＨＢＶ抗原は、（ｉ）完全長のＨＢＶ大型（Ｌ）表面抗原、中型（Ｍ）表面抗原および小型（Ｓ）表面抗原のうち少なくともいずれかの少なくとも１つの免疫原性ドメインを含むＨＢＶ表面抗原；（ｉｉ）完全長ＨＢＶポリメラーゼまたはそのドメイン（例えば逆転写酵素（ＲＴ）ドメイン）の少なくとも１つの免疫原性ドメインを含むＨＢＶポリメラーゼ抗原；（ｉｉｉ）ＨＢＶコア抗原またはＨＢＶ  ｅ抗原であって、それぞれ完全長ＨＢＶコアタンパク質および完全長ＨＢＶ  ｅ抗原のうち少なくとも一方の少なくとも１つの免疫原性ドメインを含む、ＨＢＶコア抗原またはＨＢＶ  ｅ抗原；ならびに、（ｉｖ）完全長ＨＢＶ  Ｘ抗原の少なくとも１つの免疫原性ドメインを含むＨＢＶ  Ｘ抗原、のうち少なくともいずれかで構成される。組成物は、該組成物中の１つ以上のＨＢＶ抗原、および、個体に感染済みであるかまたは感染する可能性のあるＢ型肝炎ウイルスの１つ以上の抗原、のうち少なくともいずれかに対するＨＢＶ特異的免疫応答を誘発する。
【００１１】
本明細書中に記載された本発明の実施形態のうちいずれか、例えば、免疫療法組成物、ＨＢＶ抗原、融合タンパク質、または、そのような組成物、ＨＢＶ抗原もしくは融合タンパク質の使用に関する任意の実施形態において、１つの態様では、ＨＢＶ大型表面抗原（Ｌ）のアミノ酸配列は、限定するものではないが、配列番号（SEQ ID NO:）３、配列番号７、配列番号１１、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２３、配列番号２７もしくは配列番号３１で表わされるアミノ酸配列、または別のＨＢＶ株／単離株由来の対応する配列を含みうる。ＨＢＶポリメラーゼのアミノ酸配列は、限定するものではないが、配列番号２、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２６もしくは配列番号３０で表わされるアミノ酸配列、これらの配列のドメイン、例えば逆転写酵素（ＲＴ）ドメイン、または別のＨＢＶ株／単離株由来の対応する配列を含みうる。ＨＢＶコアタンパク質配列およびＨＢＶ  ｅ抗原配列の両方を含んでいるＨＢＶプレコアタンパク質のアミノ酸配列は、限定するものではないが、配列番号１、配列番号５、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２５、もしくは配列番号２９で表わされるアミノ酸配列、または別のＨＢＶ株／単離株由来の対応する配列を含みうる。ＨＢＶ  Ｘ抗原のアミノ酸配列は、限定するものではないが、配列番号４、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２４、配列番号２８もしくは配列番号３２で表わされるアミノ酸配列、または別のＨＢＶ株／単離株由来の対応する配列を含みうる。
【００１２】
本明細書中に記載された本発明の実施形態のうちいずれか、例えば、免疫療法組成物、ＨＢＶ抗原、融合タンパク質、または、そのような組成物、ＨＢＶ抗原もしくは融合タンパク質の使用に関する任意の実施形態において、１つの態様では、ＨＢＶ抗原として有用な、または本発明の融合タンパク質もしくは免疫療法組成物において有用なＨＢＶ表面抗原のアミノ酸は、限定するものではないが、配列番号３、配列番号７、配列番号１１、配列番号１１の２１〜４７位、配列番号１１の１７６〜４００位、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２３、配列番号２７、配列番号３１、配列番号３４の９〜４０７位、配列番号３６の６〜２５７位、配列番号４１の６〜２５７位、配列番号９２の９２〜３４３位、配列番号９３の９０〜４８８位、配列番号９７、配列番号１０１の９０〜３３８位、配列番号１０２の７〜２５４位、配列番号１０７の１〜２４９位、配列番号１０８の１〜２４９位、配列番号１０９の１〜２４９位、配列番号１１０の１〜２４９位、配列番号１１２の１〜３９９位、配列番号１１４の１〜３９９位、または配列番号１１６の１〜３９９位、配列番号１１８の１〜３９９位、配列番号１２０の１〜３９９位、配列番号１２２の１〜３９９位、配列番号１２４の１〜３９９位、配列番号１２６の１〜３９９位、配列番号１２８の２３１〜６２９位、配列番号１３０の６３〜４６１位、配列番号１３２の２８９〜６８７位、配列番号１３４の２８９〜６８７位、または異なるＨＢＶ株由来の対応する配列、を含みうる。
【００１３】
本明細書中に記載された本発明の実施形態のうちいずれか、例えば、免疫療法組成物、ＨＢＶ抗原、融合タンパク質、または、そのような組成物、ＨＢＶ抗原もしくは融合タンパク質の使用に関する任意の実施形態において、１つの態様では、ＨＢＶ抗原として有用な、または本発明の融合タンパク質もしくは免疫療法組成物において有用なＨＢＶポリメラーゼ抗原のアミノ酸は、限定するものではないが、配列番号２の３８３〜６０２位、配列番号６の３８１〜６００位、配列番号１０の３８１〜６００位、配列番号１０の４５３〜６８０位、配列番号１４の３７０〜５８９位、配列番号１８の３８０〜５９９位、配列番号２２の３８１〜６００位、配列番号２６の３８０〜５９９位、配列番号３０の３８１〜６００位、配列番号３６の２６０〜６０４位、配列番号３８の７〜３５１位、配列番号４０の７〜３５１位、配列番号４１の２６０〜６０４位、配列番号９２の３４６〜６９０位、配列番号９４の９０〜４３４位、配列番号９８、配列番号１０１の３３９〜５６６位、配列番号１０２の２５５〜４８２位、配列番号１０７の２５０〜４７７位、配列番号１０８の２５０〜４７７位、配列番号１０９の２５０〜４７７位、配列番号１１０の２５０〜４７７位、配列番号１２０の５８２〜８０９位、配列番号１２４の５８２〜８０９位、配列番号１２６の６４２〜８６９位、配列番号１２８の１〜２２８位、配列番号１３２の１〜２２８位、配列番号１３４の６１〜２８８位、または異なるＨＢＶ株由来の対応する配列、を含みうる。
【００１４】
本明細書中に記載された本発明の実施形態のうちいずれか、例えば、免疫療法組成物、ＨＢＶ抗原、融合タンパク質、または、そのような組成物、ＨＢＶ抗原もしくは融合タンパク質の使用に関する任意の実施形態において、１つの態様では、ＨＢＶ抗原として有用な、または本発明の融合タンパク質もしくは免疫療法組成物において有用なＨＢＶコア抗原のアミノ酸は、限定するものではないが、配列番号１の３１〜２１２位、配列番号５の３１〜２１２位、配列番号９の３１〜２１２位、配列番号９の３７〜１８８位、配列番号１３の３１〜２１２位、配列番号１７の３１〜２１２位、配列番号２１の３１〜２１２位、配列番号２５の１４〜１９４位、配列番号２９の３１〜２１２位、配列番号３４の４０８〜５８９位、配列番号３６の６０５〜７８６位、配列番号３８の３５２〜５３３位、配列番号３９の１６０〜３４１位、配列番号４１の６０５〜７８６位、配列番号９２の６９１〜８７２位、配列番号９５の９０〜２７１位、配列番号９９、配列番号１０１の５６７〜７１８位、配列番号１０２の４８３〜６３４位、配列番号１０５の２〜１８３位、配列番号１０５の１８４〜３９５位、配列番号１０５の３９６〜５７８位、配列番号１０５の５７９〜７６１位、配列番号１０６の２〜１８３位、配列番号１０６の３３８〜５２０位、配列番号１０７の４７８〜６２９位、配列番号１０８の４７８〜６２９位、配列番号１０９の４７８〜６２９位、配列番号１１０の４７８〜６２９位、配列番号１１２の４００〜５８１位、配列番号１１４の４００〜５８１位、配列番号１１６の４００〜５８１位、配列番号１１８の４００〜５８１位、配列番号１２０の４００〜５８１位、配列番号１２２の４００〜５８１位、配列番号１２４の４００〜５８１位、配列番号１２６の４００〜５８１位、配列番号１２８の６３０〜８１１位、配列番号１３０の４６２〜６４３位、配列番号１３２の６８８〜８６９位、配列番号１３４の６８８〜８６９位、または異なるＨＢＶ株由来の対応する配列、を含みうる。
【００１５】
本明細書中に記載された本発明の実施形態のうちいずれか、例えば、免疫療法組成物、ＨＢＶ抗原、融合タンパク質、または、そのような組成物、ＨＢＶ抗原もしくは融合タンパク質の使用に関する任意の実施形態において、１つの態様では、ＨＢＶ抗原として有用な、または本発明の融合タンパク質もしくは免疫療法組成物において有用なＨＢＶ  Ｘ抗原のアミノ酸は、限定するものではないが、配列番号４、配列番号８、配列番号１２、配列番号１２の２〜１５４位、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２４、配列番号２８、配列番号３２、配列番号４の５２〜６８位と後続する８４〜１２６位、配列番号８の５２〜６８位と後続する８４〜１２６位、配列番号１２の５２〜６８位と後続する８４〜１２６位、配列番号１６の５２〜６８位と後続する８４〜１２６位、配列番号２０の５２〜６８位と後続する８４〜１２６位、配列番号２４の５２〜６８位と後続する８４〜１２６位、配列番号２８の５２〜６８位と後続する８４〜１２６位、配列番号３２の５２〜６８位と後続する８４〜１２６位、配列番号３６の７８７〜９３９位、配列番号３９の７〜１５９位、配列番号９２の８７３〜１０２５位、配列番号９６の９０〜２４２位、配列番号１００、配列番号１０１の７１９〜７７８位、配列番号１０２の６３５〜６９４位、配列番号１０６の１８４〜３３７位、配列番号１０６の５２１〜６７４位、配列番号１０７の６３０〜６８９位、配列番号１０８の６３０〜６８９位、配列番号１０９の６３０〜６８９位、配列番号１１０の６３０〜６８９位、配列番号１２２の５８２〜６４１位、配列番号１２４の８１０〜８６９位、配列番号１２６の５８２〜６４１位、配列番号１３０の１〜６０位、配列番号１３２の２２９〜２８８位、配列番号１３４の１〜６０位、または異なるＨＢＶ株由来の対応する配列、を含みうる。
【００１６】
１つの実施形態では、本発明は、免疫療法組成物であって、（ａ）酵母ビヒクル、および（ｂ）ＨＢＶ抗原を含む融合タンパク質であって、該ＨＢＶ抗原は、（ｉ）完全長ＨＢＶ  Ｘ抗原の少なくとも１つの免疫原性ドメインを含むＨＢＶ  Ｘ抗原と、（ｉｉ）完全長ＨＢＶ大型表面抗原（Ｌ）の少なくとも１つの免疫原性ドメインを含むＨＢＶ表面抗原と、（ｉｉｉ）完全長ＨＢＶコアタンパク質の少なくとも１つの免疫原性ドメインを含むＨＢＶコア抗原とで構成されている融合タンパク質、を含む免疫療法組成物を含む。この実施形態の１つの態様では、免疫療法組成物は、（ａ）酵母ビヒクル、および（ｂ）ＨＢＶ抗原を含む融合タンパク質であって、該ＨＢＶ抗原は、（ｉ）完全長ＨＢＶ  Ｘの抗原の５２〜１２６位と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するＨＢＶ  Ｘ抗原と、（ｉｉ）完全長ＨＢＶ大型表面抗原（Ｌ）のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するＨＢＶ表面抗原と、（ｉｉｉ）完全長ＨＢＶコアタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原とで構成されている融合タンパク質、を含む。該組成物はＨＢＶ特異的免疫応答を誘発する。
【００１７】
本発明のこの実施形態の１つの態様では、ＨＢＶ  Ｘ抗原のアミノ酸配列は、以下すなわち：配列番号１３０の１〜６０位、配列番号１１０の６３０〜６８９位、配列番号１２２の５８２〜６４１位、配列番号１０７の６３０〜６８９位、配列番号１０８の６３０〜６８９位、配列番号１０９の６３０〜６８９位、配列番号４の５２〜６８位と後続する８４〜１２６位、配列番号８の５２〜６８位と後続する８４〜１２６位、配列番号１２の５２〜６８位と後続する８４〜１２６位、配列番号１６の５２〜６８位と後続する８４〜１２６位、配列番号２０の５２〜６８位と後続する８４〜１２６位、配列番号２４の５２〜６８位と後続する８４〜１２６位、配列番号２８の５２〜６８位と後続する８４〜１２６位、配列番号３２の５２〜６８位と後続する８４〜１２６位、配列番号１００、配列番号１０１の７１９〜７７８位、配列番号１０２の６３５〜６９４位、配列番号１２４の８１０〜８６９位、配列番号１２６の５８２〜６４１位、配列番号１３２の２２９〜２８８位、配列番号１３４の１〜６０位、または異なるＨＢＶ株由来の対応する配列、から選択されたアミノ酸配列と少なくとも９５％同一、または少なくとも９６％同一、または少なくとも９７％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一、または同一である。１つの態様では、ＨＢＶ  Ｘ抗原のアミノ酸配列は、以下すなわち：配列番号１３０の１〜６０位、配列番号１１０の６３０〜６８９位、配列番号１２２の５８２〜６４１位、配列番号１０９の６３０〜６８９位、配列番号１０８の６３０〜６８９位、配列番号１０７の６３０〜６８９位、配列番号１００、または異なるＨＢＶ株由来の対応する配列、から選択される。
【００１８】
本発明のこの実施形態の１つの態様では、ＨＢＶ表面抗原のアミノ酸配列は、以下すなわち：配列番号１３０の６３〜４６１位、配列番号１１８の１〜３９９位、配列番号１２２の１〜３９９位、配列番号３４の９〜４０７位、配列番号１１２の１〜３９９位、配列番号１１４の１〜３９９位、配列番号１１６の１〜３９９位、配列番号３、配列番号７、配列番号１１、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２３、配列番号２７、配列番号３１、配列番号９３の９０〜４８８位、配列番号１２０の１〜３９９位、配列番号１２４の１〜３９９位、配列番号１２６の１〜３９９位、配列番号１２８の２３１〜６２９位、配列番号１３２の２８９〜６８７位、配列番号１３４の２８９〜６８７位、または異なるＨＢＶ株由来の対応する配列、から選択されたアミノ酸配列と少なくとも９５％同一、または少なくとも９６％同一、または少なくとも９７％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一、または同一である。１つの態様では、ＨＢＶ表面抗原のアミノ酸配列は、以下すなわち：配列番号１３０の６３〜４６１位、配列番号１１８の１〜３９９位、配列番号１２２の１〜３９９位、配列番号３４の９〜４０７位、配列番号１１２の１〜３９９位、配列番号１１４の１〜３９９位、配列番号１１６の１〜３９９位、または異なるＨＢＶ株由来の対応する配列、から選択される。
【００１９】
本発明のこの実施形態の１つの態様では、ＨＢＶコア抗原のアミノ酸配列は、以下すなわち：配列番号１３０の４６２〜６４３位、配列番号１１８の４００〜５８１位、配列番号１２２の４００〜５８１位、配列番号３４の４０８〜５８９位、配列番号１１２の４００〜５８１位、配列番号１１４の４００〜５８１位、配列番号１１６の４００〜５８１位、配列番号１の３１〜２１２位、配列番号５の３１〜２１２位、配列番号９の３１〜２１２位、配列番号１３の３１〜２１２位、配列番号１７の３１〜２１２位、配列番号２１の３１〜２１２位、配列番号２５の１４〜１９４位、配列番号２９の３１〜２１２位、配列番号３６の６０５〜７８６位、配列番号３８の３５２〜５３３位、配列番号３９の１６０〜３４１位、配列番号４１の６０５〜７８６位、配列番号９２の６９１〜８７２位、配列番号９５の９０〜２７１位、配列番号１０５の２〜１８３位、配列番号１０５の１８４〜３９５位、配列番号１０５の３９６〜５７８位、配列番号１０５の５７９〜７６１位、配列番号１０６の２〜１８３位、配列番号１０６の３３８〜５２０位、配列番号１２０の４００〜５８１位、配列番号１２４の４００〜５８１位、配列番号１２６の４００〜５８１位、配列番号１２８の６３０〜８１１位、配列番号１３２の６８８〜８６９位、配列番号１３４の６８８〜８６９位、または異なるＨＢＶ株由来の対応する配列、から選択されたアミノ酸配列と少なくとも９５％同一、または少なくとも９６％同一、または少なくとも９７％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一、または同一である。１つの態様では、ＨＢＶコア抗原のアミノ酸配列は、以下すなわち：配列番号１３０の４６２〜６４３位、配列番号１１８の４００〜５８１位、配列番号１２２の４００〜５８１位、配列番号３４の４０８〜５８９位、配列番号１１６の４００〜５８１位、配列番号１１２の４００〜５８１位、配列番号１１４の４００〜５８１位、または異なるＨＢＶ株由来の対応する配列、から選択される。
【００２０】
本発明のこの実施形態の１つの態様では、ＨＢＶ抗原は、融合タンパク質中においてＮ末端からＣ末端へ以下すなわち：ＨＢＶ  Ｘ抗原、ＨＢＶ表面抗原、ＨＢＶコア抗原、の順序に配置構成されている。本発明のこの実施形態の１つの態様では、ＨＢＶ抗原は、融合タンパク質中においてＮ末端からＣ末端へ以下すなわち：ＨＢＶ表面抗原、ＨＢＶコア抗原、ＨＢＶ  Ｘ抗原、の順序に配置構成されている。
【００２１】
本発明のこの実施形態の１つの態様では、融合タンパク質は、配列番号１３０、配列番号１２２、または配列番号１５０から選択されたアミノ酸配列と、少なくとも９５％同一、または少なくとも９６％同一、または少なくとも９７％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一、または同一であるアミノ酸配列を含む。
【００２２】
本発明のさらに別の実施形態は、（ａ）サッカロマイセス・セレビシエ由来の加熱不活性化された全酵母；および（ｂ）該酵母によって発現される、配列番号１３０を含むＨＢＶ融合タンパク質、を含む免疫療法組成物に関する。
【００２３】
本発明の別の実施形態は、（ａ）サッカロマイセス・セレビシエ由来の加熱不活性化された全酵母；および（ｂ）該酵母によって発現される、配列番号１５０を含むＨＢＶ融合タンパク質、を含む免疫療法組成物に関する。
【００２４】
本発明のさらに別の実施形態は、（ａ）サッカロマイセス・セレビシエ由来の加熱不活性化された全酵母；および（ｂ）該酵母によって発現される、配列番号１２２を含むＨＢＶ融合タンパク質、を含む免疫療法組成物に関する。１つの態様では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端までインフレームで融合された以下の配列すなわち：（１）配列番号３７のアミノ酸配列、（２）スレオニン‐セリンの２アミノ酸リンカーペプチド、（３）配列番号１２２のアミノ酸配列、および（４）ヘキサヒスチジンペプチド、を備えた単一ポリペプチドである。
【００２５】
本発明の別の実施形態では、免疫療法組成物は、（ａ）酵母ビヒクル、および（ｂ）融合タンパク質であって、（ｉ）ＨＢＶ大型表面抗原（Ｌ）の少なくとも１つの免疫原性ドメインと、（ｉｉ）ＨＢＶコアタンパク質またはＨＢＶ  ｅ抗原の少なくとも１つの免疫原性ドメインとで構成されているＨＢＶ抗原を含む融合タンパク質、を含んでいる。該組成物は、ＨＢＶ特異的免疫応答、例えばＨＢＶ大型表面抗原（Ｌ）および／またはＨＢＶコアタンパク質もしくはＨＢＶ  ｅ抗原に対する免疫応答を誘発する。
【００２６】
１つの実施形態では、本発明は、免疫療法組成物であって、（ａ）酵母ビヒクル、および（ｂ）融合タンパク質であって、（ｉ）完全長ＨＢＶ大型表面抗原（Ｌ）のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するＨＢＶ表面抗原と、（ｉｉ）完全長ＨＢＶコアタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原とで構成されているＨＢＶ抗原を含む融合タンパク質、を含む組成物を含む。該組成物はＨＢＶ特異的免疫応答を誘発する。この実施形態の１つの態様では、ＨＢＶ抗原は、完全長ＨＢＶコアタンパク質またはＨＢＶ  ｅ抗原の少なくとも９５％を含むアミノ酸配列に融合された、完全長ＨＢＶ大型表面抗原（Ｌ）の少なくとも９５％を含むアミノ酸配列で構成されている。この実施形態の１つの態様では、ＨＢＶ抗原は、完全長ＨＢＶコアタンパク質の少なくとも９５％を含むアミノ酸配列のＮ末端に融合された、完全長ＨＢＶ大型表面抗原（Ｌ）の少なくとも９５％を含むアミノ酸配列で構成されている。１つの態様では、ＨＢＶ抗原は、ＨＢＶ大型表面抗原（Ｌ）のアミノ酸２〜４００；およびＨＢＶコアタンパク質とＨＢＶ  ｅ抗原の一部とを含むＨＢＶプレコアタンパク質のアミノ酸３１〜２１２で構成されている。
【００２７】
本発明のこの実施形態の１つの態様では、ＨＢＶ表面抗原のアミノ酸配列は、以下すなわち：配列番号１１８の１〜３９９位、配列番号３４の９〜４０７位、配列番号１１６の１〜３９９位、配列番号１１２の１〜３９９位、配列番号１１４の１〜３９９位、配列番号３もしくは配列番号３の２〜４００位、配列番号７もしくは配列番号７の２〜４００位、配列番号１１もしくは配列番号１１の２〜４００位、配列番号１５もしくは配列番号１５の２〜３８９位、配列番号１９もしくは配列番号１９の２〜３９９位、配列番号２３もしくは配列番号２３の２〜４００位、配列番号２７もしくは配列番号２７の２〜３９９位、配列番号３１もしくは配列番号３１の２〜４００位、配列番号９３の９０〜４８８位、配列番号１２０の１〜３９９位、配列番号１２２の１〜３９９位、配列番号１２４の１〜３９９位、配列番号１２６の１〜３９９位、配列番号１２８の２３１〜６２９位、配列番号１３０の６３〜４６１位、配列番号１３２の２８９〜６８７位、配列番号１３４の２８９〜６８７位、または異なるＨＢＶ株由来の対応する配列、から選択されたアミノ酸配列と少なくとも９５％同一、または少なくとも９６％同一、または少なくとも９７％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一、または同一である。１つの態様では、ＨＢＶ表面抗原のアミノ酸配列は、以下すなわち：配列番号１１８の１〜３９９位、配列番号３４の９〜４０７位、配列番号１１２の１〜３９９位、配列番号１１４の１〜３９９位、配列番号１１６の１〜３９９位、または異なるＨＢＶ株由来の対応する配列、から選択される。
【００２８】
本発明のこの実施形態の１つの態様では、ＨＢＶコア抗原のアミノ酸配列は、以下すなわち：配列番号１１８の４００〜５８１位、配列番号３４の４０８〜５８９位、配列番号１１６の４００〜５８１位、配列番号１１２の４００〜５８１位、配列番号１１４の４００〜５８１位、配列番号１の３１〜２１２位、配列番号５の３１〜２１２位、配列番号９の３１〜２１２位、配列番号１３の３１〜２１２位、配列番号１７の３１〜２１２位、配列番号２１の３１〜２１２位、配列番号２５の１４〜１９４位、配列番号２９の３１〜２１２位、配列番号３６の６０５〜７８６位、配列番号３８の３５２〜５３３位、配列番号３９の１６０〜３４１位、配列番号４１の６０５〜７８６位、配列番号９２の６９１〜８７２位、配列番号９５の９０〜２７１位、配列番号１０５の２〜１８３位、配列番号１０５の１８４〜３９５位、配列番号１０５の３９６〜５７８位、配列番号１０５の５７９〜７６１位、配列番号１０６の２〜１８３位、配列番号１０６の３３８〜５２０位、配列番号１２０の４００〜５８１位、配列番号１２２の４００〜５８１位、配列番号１２４の４００〜５８１位、配列番号１２６の４００〜５８１位、配列番号１２８の６３０〜８１１位、配列番号１３０の４６２〜６４３位、配列番号１３２の６８８〜８６９位、配列番号１３４の６８８〜８６９位、または異なるＨＢＶ株由来の対応する配列、から選択されたアミノ酸配列と少なくとも９５％同一、または少なくとも９６％同一、または少なくとも９７％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一、または同一である。１つの態様では、ＨＢＶコア抗原のアミノ酸配列は、以下すなわち：配列番号１１８の４００〜５８１位、配列番号３４の４０８〜５８９位、配列番号１１６の４００〜５８１位、配列番号１１２の４００〜５８１位、配列番号１１４の４００〜５８１位、または異なるＨＢＶ株由来の対応する配列、から選択される。
【００２９】
本発明のこの実施形態の１つの態様では、ＨＢＶ抗原は、配列番号３４のアミノ酸９〜５８９、または異なるＨＢＶ株由来の対応する配列で構成されている。１つの態様では、ＨＢＶ抗原は、以下すなわち：配列番号１１８、配列番号１１６、配列番号３４の９〜５８９位、配列番号１１２、配列番号１１４、または異なるＨＢＶ株の対応する配列から選択されたアミノ酸配列と、少なくとも９５％同一、または少なくとも９６％同一、または少なくとも９７％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一、または同一であるアミノ酸配列で構成されている。１つの態様では、ＨＢＶ抗原は、完全長またはほぼ完全長のＨＢＶ大型表面抗原（Ｌ）および完全長またはほぼ完全長のＨＢＶコアタンパク質で構成されている。
【００３０】
本発明のこの実施形態の１つの態様では、融合タンパク質はいずれも、配列番号３７の（融合タンパク質のＮ末端に付加された）Ｎ末端アミノ酸配列を含むことができる。別の態様では、融合タンパク質はいずれも、配列番号８９または配列番号９０から選択されたＮ末端アミノ酸配列を含むことができる。１つの態様では、融合タンパク質は配列番号１５１のアミノ酸配列を含む。
【００３１】
本発明のさらに別の実施形態は、（ａ）サッカロマイセス・セレビシエ由来の加熱不活性化された全酵母；および（ｂ）該酵母によって発現される、配列番号１１８を含むＨＢＶ融合タンパク質、を含む免疫療法組成物に関する。
【００３２】
本発明の別の実施形態は、（ａ）サッカロマイセス・セレビシエ由来の加熱不活性化された全酵母；および（ｂ）該酵母によって発現される、配列番号１５１を含むＨＢＶ融合タンパク質、を含む免疫療法組成物に関する。
【００３３】
本発明のさらに別の実施形態は、（ａ）サッカロマイセス・セレビシエ由来の加熱不活性化された全酵母；および（ｂ）該酵母によって発現される、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＢＶ融合タンパク質、を含む免疫療法組成物に関する。
【００３４】
別の実施形態では、本発明は、（ａ）酵母ビヒクル、および（ｂ）ＨＢＶ抗原を含む融合タンパク質、を含む免疫療法組成物を含む。該ＨＢＶ抗原は、（ｉ）完全長のＨＢＶ大型（Ｌ）、中型（Ｍ）または小型（Ｓ）表面抗原の少なくとも１つの免疫原性ドメインで構成されているＨＢＶ表面抗原と；（ｉｉ）完全長ＨＢＶポリメラーゼまたはＨＢＶポリメラーゼの逆転写酵素（ＲＴ）ドメインの、少なくとも１つの免疫原性ドメインで構成されているＨＢＶポリメラーゼ抗原と；（ｉｉｉ）完全長ＨＢＶコアタンパク質または完全長ＨＢＶ  ｅ抗原の、少なくとも１つの免疫原性ドメインで構成されているＨＢＶコア抗原と；（ｉｖ）完全長ＨＢＶ  Ｘ抗原の少なくとも１つの免疫原性ドメインで構成されているＨＢＶ  Ｘ抗原と、で構成されている。該組成物はＨＢＶ特異的免疫応答を誘発する。この実施形態の１つの態様では、ＨＢＶ表面抗原は、ＨＢＶ大型表面抗原（Ｌ）のＰｒｅ‐Ｓ１の肝細胞受容体領域の少なくとも１つの免疫原性ドメインおよびＨＢＶ小型表面抗原（Ｓ）の少なくとも１つの免疫原性ドメインを含む。
【００３５】
この実施形態の１つの態様では、ＨＢＶ抗原は、ＨＢＶ大型表面抗原（Ｌ）のＰｒｅ‐Ｓ１の完全長肝細胞受容体の少なくとも９５％、完全長ＨＢＶ小型表面抗原（Ｓ）の少なくとも９５％、ＨＢＶポリメラーゼの逆転写酵素ドメインの少なくとも９５％、完全長ＨＢＶコアタンパク質またはＨＢＶ  ｅ抗原の少なくとも９５％、および完全長Ｘ抗原の少なくとも９５％で構成されている。１つの態様では、ＨＢＶ抗原は、ＨＢＶ大型表面抗原（Ｌ）のアミノ酸１２０〜３６８のうち少なくとも９５％を含むＨＢＶ大型表面抗原（Ｌ）；ＨＢＶポリメラーゼのＲＴドメインのアミノ酸４５３〜６８０のうち少なくとも９５％を含むＨＢＶポリメラーゼのＲＴドメイン；ＨＢＶコアタンパク質のアミノ酸３７〜１８８のうち少なくとも９５％を含むＨＢＶコアタンパク質；および、ＨＢＶ  Ｘ抗原のアミノ酸５２〜１２７のうち少なくとも８０％を含むＨＢＶ  Ｘ抗原で構成されている。１つの態様では、ＨＢＶ抗原は、Ｐｒｅ‐Ｓ１の肝細胞受容体ドメインを含むＨＢＶ大型表面抗原（Ｌ）のアミノ酸２１〜４７；ＨＢＶ小型表面抗原（Ｓ）を含むＨＢＶ大型表面抗原（Ｌ）のアミノ酸１７６〜４００；逆転写酵素ドメインを含むＨＢＶポリメラーゼのアミノ酸２４７〜６９１；ＨＢＶコアタンパク質およびＨＢＶ  ｅ抗原の一部を含むＨＢＶプレコアタンパク質のアミノ酸３１〜２１２；ならびにＨＢＶ  Ｘ抗原のアミノ酸２〜１５４、で構成されている。１つの態様では、ＨＢＶ抗原は、ＨＢＶ大型表面抗原（Ｌ）のアミノ酸１２０〜３６８と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、ＨＢＶポリメラーゼのＲＴドメインのアミノ酸４５３〜６８０と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、ＨＢＶコアタンパク質のアミノ酸３７〜１８８と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、および、ＨＢＶ  Ｘ抗原のアミノ酸５２〜１２７と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列、で構成されている。１つの態様では、ＨＢＶ抗原は、表５に示されかつ本明細書中で配列番号４２〜８８または配列番号１３５〜１４０で表わされた１つ以上のＴ細胞エピトープを組込むように改変されている。１つの態様では、ＨＢＶ大型表面抗原（Ｌ）は、配列番号９７のアミノ酸配列または配列番号９７と９５％同一である配列を含む。１つの態様では、ＨＢＶポリメラーゼのＲＴドメインは、配列番号９８のアミノ酸配列または配列番号９８と９５％同一である配列を含む。１つの態様では、ＨＢＶコアタンパク質は、配列番号９９のアミノ酸配列または配列番号９９と９５％同一である配列を含む。１つの態様では、ＨＢＶ  Ｘ抗原は、配列番号１００のアミノ酸配列または配列番号１００と９５％同一である配列を含む。
【００３６】
本発明のこの実施形態の１つの態様では、ＨＢＶ表面抗原のアミノ酸配列は、完全長ＨＢＶ大型表面抗原（Ｌ）のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である。１つの態様では、ＨＢＶ表面抗原のアミノ酸配列は、以下すなわち：配列番号１２４の１〜３９９位、配列番号１２６の１〜３９９位、配列番号１３２の２８９〜６８７位、配列番号１３４の２８９〜６８７位、配列番号３、配列番号７、配列番号１１、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２３、配列番号２７、配列番号３１、配列番号３４の９〜４０７位、配列番号９３の９０〜４８８位、配列番号１１２の１〜３９９位、配列番号１１４の１〜３９９位、配列番号１１６の１〜３９９位、配列番号１１８の１〜３９９位、配列番号１２０の１〜３９９位、配列番号１２２の１〜３９９位、配列番号１２８の２３１〜６２９位、配列番号１３０の６３〜４６１位、または異なるＨＢＶ株由来の対応する配列、から選択されたアミノ酸配列と、少なくとも９５％同一、または少なくとも９６％同一、または少なくとも９７％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一、または同一である。
【００３７】
この実施形態の１つの態様では、ＨＢＶ表面抗原のアミノ酸配列は、配列番号９７、配列番号１０７の１〜２４９位、配列番号１０８の１〜２４９位、配列番号１０９の１〜２４９位、配列番号１１０の１〜２４９位、配列番号１１の２１〜４７位、配列番号１１の１７６〜４００位、配列番号３６の６〜２５７位、配列番号４１の６〜２５７位、配列番号９２の９２〜３４３位、配列番号１０１の９０〜３３８位、配列番号１０２の７〜２５４位、または異なるＨＢＶ株由来の対応する配列、から選択されたアミノ酸配列と、少なくとも９５％同一、または少なくとも９６％同一、または少なくとも９７％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一、または同一である。
【００３８】
この実施形態の１つの態様では、ＨＢＶポリメラーゼ抗原は、ＨＢＶポリメラーゼのＲＴドメインの少なくとも１つの免疫原性ドメインで構成されている。１つの態様では、ＨＢＶポリメラーゼ抗原のアミノ酸配列は、配列番号９８、配列番号１２４の５８２〜８０９位、配列番号１２６の６４２〜８６９位、配列番号１３２の１〜２２８位、配列番号１３４の６１〜２８８位、配列番号１０７の２５０〜４７７位、配列番号１０８の２５０〜４７７位、配列番号１０９の２５０〜４７７位、配列番号１１０の２５０〜４７７位、配列番号２の３８３〜６０２位、配列番号６の３８１〜６００位、配列番号１０の３８１〜６００位、配列番号１０の４５３〜６８０位、配列番号１４の３７０〜５８９位、配列番号１８の３８０〜５９９位、配列番号２２の３８１〜６００位、配列番号２６の３８０〜５９９位、配列番号３０の３８１〜６００位、配列番号３６の２６０〜６０４位、配列番号３８の７〜３５１位、配列番号４０の７〜３５１位、配列番号４１の２６０〜６０４位、配列番号９２の３４６〜６９０位、配列番号９４の９０〜４３４位、配列番号１０１の３３９〜５６６位、配列番号１０２の２５５〜４８２位、配列番号１２０の５８２〜８０９位、配列番号１２８の１〜２２８位、または異なるＨＢＶ株由来の対応する配列、から選択されたアミノ酸配列と、少なくとも９５％同一、または少なくとも９６％同一、または少なくとも９７％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一、または同一である。
【００３９】
この実施形態の１つの態様では、ＨＢＶコア抗原のアミノ酸配列は、完全長ＨＢＶコアタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である。１つの態様では、ＨＢＶコア抗原のアミノ酸配列は、配列番号１２４の４００〜５８１位、配列番号１２６の４００〜５８１位、配列番号１３２の６８８〜８６９位、配列番号１３４の６８８〜８６９位、配列番号３４の４０８〜５８９位、配列番号１１２の４００〜５８１位、配列番号１１４の４００〜５８１位、配列番号１１６の４００〜５８１位、配列番号１１８の４００〜５８１位、配列番号１の３１〜２１２位、配列番号５の３１〜２１２位、配列番号９の３１〜２１２位、配列番号１３の３１〜２１２位、配列番号１７の３１〜２１２位、配列番号２１の３１〜２１２位、配列番号２５の１４〜１９４位、配列番号２９の３１〜２１２位、配列番号３６の６０５〜７８６位、配列番号３８の３５２〜５３３位、配列番号３９の１６０〜３４１位、配列番号４１の６０５〜７８６位、配列番号９２の６９１〜８７２位、配列番号９５の９０〜２７１位、配列番号１０５の２〜１８３位、配列番号１０５の１８４〜３９５位、配列番号１０５の３９６〜５７８位、配列番号１０５の５７９〜７６１位、配列番号１０６の２〜１８３位、配列番号１０６の３３８〜５２０位、配列番号１２０の４００〜５８１位、配列番号１２２の４００〜５８１位、配列番号１２８の６３０〜８１１位、配列番号１３０の４６２〜６４３位、または異なるＨＢＶ株由来の対応する配列、から選択されたアミノ酸配列と、少なくとも９５％同一、または少なくとも９６％同一、または少なくとも９７％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一、または同一である。
【００４０】
この実施形態の１つの態様では、ＨＢＶコア抗原のアミノ酸配列は、配列番号９９、配列番号９の３７〜１８８位、配列番号１０１の５６７〜７１８位、配列番号１０２の４８３〜６３４位、配列番号１０７の４７８〜６２９位、配列番号１０８の４７８〜６２９位、配列番号１０９の４７８〜６２９位、配列番号１１０の４７８〜６２９位、または異なるＨＢＶ株由来の対応する配列から選択されたアミノ酸配列と、少なくとも９５％同一、または少なくとも９６％同一、または少なくとも９７％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一、または同一である。
【００４１】
この実施形態の１つの態様では、ＨＢＶ  Ｘ抗原は、完全長ＨＢＶ  Ｘ抗原と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列で構成されている。１つの態様では、ＨＢＶ  Ｘ抗原は、配列番号４、配列番号８、配列番号１２、配列番号１２の２〜１５４位、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２４、配列番号２８、配列番号３２、配列番号３６の７８７〜９３９位、配列番号３９の７〜１５９位、配列番号９２の８７３〜１０２５位、配列番号９６の９０〜２４２位、配列番号１０６の１８４〜３３７位、配列番号１０６の５２１〜６７４位、または異なるＨＢＶ株由来の対応する配列、から選択されたアミノ酸配列と、少なくとも９５％同一、または少なくとも９６％同一、または少なくとも９７％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一、または同一である。
【００４２】
１つの態様では、ＨＢＶ  Ｘ抗原は、完全長ＨＢＶ  Ｘ抗原の５２〜１２６位と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列で構成されている。１つの態様では、ＨＢＶ  Ｘ抗原のアミノ酸配列は、配列番号１００、配列番号１２４の８１０〜８６９位、配列番号１２６の５８２〜６４１位、配列番号１３２の２２９〜２８８位、配列番号１３４の１〜６０位、配列番号１０７の６３０〜６８９位、配列番号１０８の６３０〜６８９位、配列番号１０９の６３０〜６８９位、配列番号１１０の６３０〜６８９位、配列番号４の５２〜６８位と後続する８４〜１２６位、配列番号８の５２〜６８位と後続する８４〜１２６位、配列番号１２の５２〜６８位と後続する８４〜１２６位、配列番号１６の５２〜６８位と後続する８４〜１２６位、配列番号２０の５２〜６８位と後続する８４〜１２６位、配列番号２４の５２〜６８位と後続する８４〜１２６位、配列番号２８の５２〜６８位と後続する８４〜１２６位、配列番号３２の５２〜６８位と後続する８４〜１２６位、配列番号１０１の７１９〜７７８位、配列番号１０２の６３５〜６９４位、配列番号１２２の５８２〜６４１位、配列番号１３０の１〜６０位、または異なるＨＢＶ株由来の対応する配列、から選択されたアミノ酸配列と、少なくとも９５％同一、または少なくとも９６％同一、または少なくとも９７％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一、または同一である。
【００４３】
この実施形態の１つの態様では、ＨＢＶ抗原は、配列番号３６の６〜９３９位、配列番号９２の９２〜１０２５位、配列番号１０１の９０〜７７８位、配列番号１０２の７〜６９４位、または異なるＨＢＶ株由来の対応する配列、から選択されたアミノ酸配列と、少なくとも９５％同一、または少なくとも９６％同一、または少なくとも９７％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一、または同一であるアミノ酸配列を有する。
【００４４】
この実施形態の１つの態様では、融合タンパク質は、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１３２または配列番号１３４、から選択されたアミノ酸配列と、少なくとも９５％同一、または少なくとも９６％同一、または少なくとも９７％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一、または同一であるアミノ酸配列を含む。
【００４５】
いずれの融合タンパク質も、１つの態様では、配列番号３７、配列番号８９、または配列番号９０から選択されたＮ末端配列を含むことができる。
この実施形態の１つの態様では、融合タンパク質は、配列番号３６、配列番号９２、配列番号１０１、または配列番号１０２、から選択されたアミノ酸配列と、少なくとも９５％同一、または少なくとも９６％同一、または少なくとも９７％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一、または同一であるアミノ酸配列を含む。
【００４６】
本発明の別の実施形態は、（ａ）酵母ビヒクル、ならびに（ｂ）ＨＢＶ抗原を含む融合タンパク質であって、該ＨＢＶ抗原は、（ｉ）ＨＢＶ大型表面抗原（Ｌ）のＰｒｅ‐Ｓ１の肝細胞受容体領域の少なくとも１つの免疫原性ドメインおよびＨＢＶ小型表面抗原（Ｓ）の少なくとも１つの免疫原性ドメインで構成されているＨＢＶ表面抗原と、（ｉｉ）ＨＢＶポリメラーゼの逆転写酵素ドメインの少なくとも１つの免疫原性ドメインで構成されているＨＢＶポリメラーゼ抗原と、（ｉｉｉ）ＨＢＶコアタンパク質の少なくとも１つの免疫原性ドメインで構成されているＨＢＶコア抗原とで構成されている融合タンパク質、を含む免疫療法組成物に関する。該組成物はＨＢＶ特異的免疫応答を誘発する。１つの態様では、該ＨＢＶ抗原は、ＨＢＶ大型表面抗原（Ｌ）のＰｒｅ‐Ｓ１の完全長肝細胞受容体の少なくとも９５％と、完全長ＨＢＶ小型表面抗原の少なくとも９５％と、ＨＢＶポリメラーゼの完全長逆転写酵素ドメインの少なくとも９５％と、完全長ＨＢＶコアタンパク質の少なくとも９５％とで構成されている。１つの態様では、該ＨＢＶ抗原は、完全長ＨＢＶ大型表面抗原（Ｌ）の少なくとも９５％と、ＨＢＶポリメラーゼの完全長逆転写酵素ドメインの少なくとも９５％と、完全長ＨＢＶコアタンパク質の少なくとも９５％とで構成されている。
【００４７】
この実施形態の１つの態様では、ＨＢＶ表面抗原のアミノ酸配列は、配列番号１２０の１〜３９９位、配列番号１２８の２３１〜６２９位、配列番号１１２の１〜３９９位、配列番号１１４の１〜３９９位、配列番号１１６の１〜３９９位、配列番号１１８の１〜３９９位、配列番号４１の６〜２５７位、配列番号３、配列番号７、配列番号１１、配列番号１１の２１〜４７位、配列番号１１の１７６〜４００位、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２３、配列番号２７、配列番号３１、配列番号３４の９〜４０７位、配列番号３６の６〜２５７位、配列番号９２の９２〜３４３位、配列番号９３の９０〜４８８位、配列番号９７、配列番号１０１の９０〜３３８位、配列番号１０２の７〜２５４位、配列番号１０７の１〜２４９位、配列番号１０８の１〜２４９位、配列番号１０９の１〜２４９位、配列番号１１０の１〜２４９位、配列番号１２２の１〜３９９位、配列番号１２４の１〜３９９位、配列番号１２６の１〜３９９位、配列番号１３０の６３〜４６１位、配列番号１３２の２８９〜６８７位、配列番号１３４の２８９〜６８７位、または異なるＨＢＶ株由来の対応する配列、から選択されたアミノ酸配列と、少なくとも９５％同一、または少なくとも９６％同一、または少なくとも９７％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一、または同一である。
【００４８】
本発明のこの実施形態の１つの態様では、ＨＢＶポリメラーゼ抗原のアミノ酸配列は、配列番号１２０の５８２〜８０９位、配列番号１２８の１〜２２８位、配列番号１０７の２５０〜４７７位、配列番号１０８の２５０〜４７７位、配列番号１０９の２５０〜４７７位、配列番号１１０の２５０〜４７７位、配列番号４１の２６０〜６０４位、配列番号２の３８３〜６０２位、配列番号６の３８１〜６００位、配列番号１０の３８１〜６００位、配列番号１０の４５３〜６８０位、配列番号１４の３７０〜５８９位、配列番号１８の３８０〜５９９位、配列番号２２の３８１〜６００位、配列番号２６の３８０〜５９９位、配列番号３０の３８１〜６００位、配列番号３６の２６０〜６０４位、配列番号３８の７〜３５１位、配列番号４０の７〜３５１位、配列番号９２の３４６〜６９０位、配列番号９４の９０〜４３４位、配列番号９８、配列番号１０１の３３９〜５６６位、配列番号１０２の２５５〜４８２位、配列番号１２４の５８２〜８０９位、配列番号１２６の６４２〜８６９位、配列番号１３２の１〜２２８位、配列番号１３４の６１〜２８８位、または異なるＨＢＶ株由来の対応する配列、から選択されたアミノ酸配列と、少なくとも９５％同一、または少なくとも９６％同一、または少なくとも９７％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一、または同一である。
【００４９】
本発明のこの実施形態の１つの態様では、ＨＢＶコア抗原のアミノ酸配列は、配列番号１２０の４００〜５８１位、配列番号１２８の６３０〜８１１位、配列番号１１２の４００〜５８１位、配列番号１１４の４００〜５８１位、配列番号１１６の４００〜５８１位、配列番号１１８の４００〜５８１位、配列番号４１の６０５〜７８６位、配列番号１の３１〜２１２位、配列番号５の３１〜２１２位、配列番号９の３１〜２１２位、配列番号９の３７〜１８８位、配列番号１３の３１〜２１２位、配列番号１７の３１〜２１２位、配列番号２１の３１〜２１２位、配列番号２５の１４〜１９４位、配列番号２９の３１〜２１２位、配列番号３４の４０８〜５８９位、配列番号３６の６０５〜７８６位、配列番号３８の３５２〜５３３位、配列番号３９の１６０〜３４１位、配列番号９２の６９１〜８７２位、配列番号９５の９０〜２７１位、配列番号９９、配列番号１０１の５６７〜７１８位、配列番号１０２の４８３〜６３４位、配列番号１０５の２〜１８３位、配列番号１０５の１８４〜３９５位、配列番号１０５の３９６〜５７８位、配列番号１０５の５７９〜７６１位、配列番号１０６の２〜１８３位、配列番号１０６の３３８〜５２０位、配列番号１０７の４７８〜６２９位、配列番号１０８の４７８〜６２９位、配列番号１０９の４７８〜６２９位、配列番号１１０の４７８〜６２９位、配列番号１２２の４００〜５８１位、配列番号１２４の４００〜５８１位、配列番号１２６の４００〜５８１位、配列番号１３０の４６２〜６４３位、配列番号１３２の６８８〜８６９位、配列番号１３４の６８８〜８６９位、または異なるＨＢＶ株由来の対応する配列、から選択されたアミノ酸配列と、少なくとも９５％同一、または少なくとも９６％同一、または少なくとも９７％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一、または同一である。
【００５０】
本発明のこの実施形態の１つの態様では、融合タンパク質は、配列番号１２０、配列番号１２８、配列番号４１の６〜７８６位、もしくは配列番号４１、または異なるＨＢＶ株由来の対応する配列、から選択されたアミノ酸配列と、少なくとも９５％同一、または少なくとも９６％同一、または少なくとも９７％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一、または同一であるアミノ酸配列を有する。
【００５１】
本発明の別の実施形態は、（ａ）酵母ビヒクル、および（ｂ）ＨＢＶ抗原を含む融合タンパク質であって、該ＨＢＶ抗原は（ｉ）ＨＢＶポリメラーゼの逆転写酵素（ＲＴ）ドメインの少なくとも１つの免疫原性ドメインで構成されているＨＢＶポリメラーゼ抗原と、（ｉｉ）ＨＢＶコアタンパク質の少なくとも１つの免疫原性ドメインで構成されているＨＢＶコア抗原とで構成されている融合タンパク質、を含む免疫療法組成物に関する。該組成物はＨＢＶ特異的免疫応答を誘発する。本発明のこの実施形態の１つの態様では、ＨＢＶ抗原は、ＨＢＶポリメラーゼの完全長ＲＴドメインと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列と、完全長ＨＢＶコアタンパク質と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列とで構成されている。
【００５２】
本発明のこの実施形態の１つの態様では、ＨＢＶポリメラーゼ抗原のアミノ酸配列は、配列番号３８の７〜３５１位、配列番号２の３８３〜６０２位、配列番号６の３８１〜６００位、配列番号１０の３８１〜６００位、配列番号１０の４５３〜６８０位、配列番号１４の３７０〜５８９位、配列番号１８の３８０〜５９９位、配列番号２２の３８１〜６００位、配列番号２６の３８０〜５９９位、配列番号３０の３８１〜６００位、配列番号３６の２６０〜６０４位、配列番号４０の７〜３５１位、配列番号４１の２６０〜６０４位、配列番号９２の３４６〜６９０位、配列番号９４の９０〜４３４位、配列番号９８、配列番号１０１の３３９〜５６６位、配列番号１０２の２５５〜４８２位、配列番号１０７の２５０〜４７７位、配列番号１０８の２５０〜４７７位、配列番号１０９の２５０〜４７７位、配列番号１１０の２５０〜４７７位、配列番号１２０の５８２〜８０９位、配列番号１２４の５８２〜８０９位、配列番号１２６の６４２〜８６９位、配列番号１２８の１〜２２８位、配列番号１３２の１〜２２８位、配列番号１３４の６１〜２８８位、または異なるＨＢＶ株由来の対応する配列、から選択されたアミノ酸配列と、少なくとも９５％同一、または少なくとも９６％同一、または少なくとも９７％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一、または同一である。
【００５３】
本発明のこの実施形態の１つの態様では、ＨＢＶコア抗原のアミノ酸配列は、配列番号３８の３５２〜５３３位、配列番号１の３１〜２１２位、配列番号５の３１〜２１２位、配列番号９の３１〜２１２位、配列番号９の３７〜１８８位、配列番号１３の３１〜２１２位、配列番号１７の３１〜２１２位、配列番号２１の３１〜２１２位、配列番号２５の１４〜１９４位、配列番号２９の３１〜２１２位、配列番号３４の４０８〜５８９位、配列番号３６の６０５〜７８６位、配列番号３９の１６０〜３４１位、配列番号４１の６０５〜７８６位、配列番号９２の６９１〜８７２位、配列番号９５の９０〜２７１位、配列番号９９、配列番号１０１の５６７〜７１８位、配列番号１０２の４８３〜６３４位、配列番号１０５の２〜１８３位、配列番号１０５の１８４〜３９５位、配列番号１０５の３９６〜５７８位、配列番号１０５の５７９〜７６１位、配列番号１０６の２〜１８３位、配列番号１０６の３３８〜５２０位、配列番号１０７の４７８〜６２９位、配列番号１０８の４７８〜６２９位、配列番号１０９の４７８〜６２９位、配列番号１１０の４７８〜６２９位、配列番号１１２の４００〜５８１位、配列番号１１４の４００〜５８１位、配列番号１１６の４００〜５８１位、配列番号１１８の４００〜５８１位、配列番号１２０の４００〜５８１位、配列番号１２２の４００〜５８１位、配列番号１２４の４００〜５８１位、配列番号１２６の４００〜５８１位、配列番号１２８の６３０〜８１１位、配列番号１３０の４６２〜６４３位、配列番号１３２の６８８〜８６９位、配列番号１３４の６８８〜８６９位、または異なるＨＢＶ株由来の対応する配列、から選択されたアミノ酸配列と、少なくとも９５％同一、または少なくとも９６％同一、または少なくとも９７％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一、または同一である。
【００５４】
本発明のこの実施形態の１つの態様では、融合タンパク質は、配列番号３８のアミノ酸配列、または異なるＨＢＶ株由来の対応する配列と、少なくとも９５％同一、または少なくとも９６％同一、または少なくとも９７％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一、または同一であるアミノ酸配列を有する。
【００５５】
本発明のさらに別の実施形態は、（ａ）酵母ビヒクル、および（ｂ）ＨＢＶ抗原を含む融合タンパク質であって、該ＨＢＶ抗原は（ｉ）ＨＢＶ  Ｘ抗原の少なくとも１つの免疫原性ドメインで構成されているＨＢＶ  Ｘ抗原と、（ｉｉ）ＨＢＶコアタンパク質の少なくとも１つの免疫原性ドメインで構成されているＨＢＶコア抗原とで構成されている融合タンパク質、を含む免疫療法組成物に関する。該組成物はＨＢＶ特異的免疫応答を誘発する。この実施形態の１つの態様では、ＨＢＶ抗原は、完全長ＨＢＶ  Ｘ抗原と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列と、完全長ＨＢＶコアタンパク質と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列とで構成されている。
【００５６】
本発明のこの実施形態の１つの態様では、ＨＢＶコア抗原のアミノ酸配列は、配列番号３９の１６０〜３４１位、配列番号１の３１〜２１２位、配列番号５の３１〜２１２位、配列番号９の３１〜２１２位、配列番号９の３７〜１８８位、配列番号１３の３１〜２１２位、配列番号１７の３１〜２１２位、配列番号２１の３１〜２１２位、配列番号２５の１４〜１９４位、配列番号２９の３１〜２１２位、配列番号３４の４０８〜５８９位、配列番号３６の６０５〜７８６位、配列番号３８の３５２〜５３３位、配列番号４１の６０５〜７８６位、配列番号９２の６９１〜８７２位、配列番号９５の９０〜２７１位、配列番号９９、配列番号１０１の５６７〜７１８位、配列番号１０２の４８３〜６３４位、配列番号１０５の２〜１８３位、配列番号１０５の１８４〜３９５位、配列番号１０５の３９６〜５７８位、配列番号１０５の５７９〜７６１位、配列番号１０６の２〜１８３位、配列番号１０６の３３８〜５２０位、配列番号１０７の４７８〜６２９位、配列番号１０８の４７８〜６２９位、配列番号１０９の４７８〜６２９位、配列番号１１０の４７８〜６２９位、配列番号１１２の４００〜５８１位、配列番号１１４の４００〜５８１位、配列番号１１６の４００〜５８１位、配列番号１１８の４００〜５８１位、配列番号１２０の４００〜５８１位、配列番号１２２の４００〜５８１位、配列番号１２４の４００〜５８１位、配列番号１２６の４００〜５８１位、配列番号１２８の６３０〜８１１位、配列番号１３０の４６２〜６４３位、配列番号１３２の６８８〜８６９位、配列番号１３４の６８８〜８６９位、または異なるＨＢＶ株由来の対応する配列、から選択されたアミノ酸配列と、少なくとも９５％同一、または少なくとも９６％同一、または少なくとも９７％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一、または同一である。
【００５７】
本発明のこの実施形態の１つの態様では、ＨＢＶ  Ｘ抗原のアミノ酸配列は、配列番号３９の７〜１５９位、配列番号４、配列番号８、配列番号１２、配列番号１２の２〜１５４位、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２４、配列番号２８、配列番号３２、配列番号４の５２〜６８位と後続する８４〜１２６位、配列番号８の５２〜６８位と後続する８４〜１２６位、配列番号１２の５２〜６８位と後続する８４〜１２６位、配列番号１６の５２〜６８位と後続する８４〜１２６位、配列番号２０の５２〜６８位と後続する８４〜１２６位、配列番号２４の５２〜６８位と後続する８４〜１２６位、配列番号２８の５２〜６８位と後続する８４〜１２６位、配列番号３２の５２〜６８位と後続する８４〜１２６位、配列番号３６の７８７〜９３９位、配列番号９２の８７３〜１０２５位、配列番号９６の９０〜２４２位、配列番号１００、配列番号１０１の７１９〜７７８位、配列番号１０２の６３５〜６９４位、配列番号１０６の１８４〜３３７位、配列番号１０６の５２１〜６７４位、配列番号１０７の６３０〜６８９位、配列番号１０８の６３０〜６８９位、配列番号１０９の６３０〜６８９位、配列番号１１０の６３０〜６８９位、配列番号１２２の５８２〜６４１位、配列番号１２４の８１０〜８６９位、配列番号１２６の５８２〜６４１位、配列番号１３０の１〜６０位、配列番号１３２の２２９〜２８８位、配列番号１３４の１〜６０位、または異なるＨＢＶ株由来の対応する配列、から選択されたアミノ酸配列と、少なくとも９５％同一、または少なくとも９６％同一、または少なくとも９７％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一、または同一である。
【００５８】
本発明のこの実施形態の１つの態様では、融合タンパク質は、配列番号３９のアミノ酸配列、または異なるＨＢＶ株由来の対応する配列と、少なくとも９５％同一、または少なくとも９６％同一、または少なくとも９７％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一、または同一であるアミノ酸配列を有する。
【００５９】
本発明の別の実施形態は、（ａ）酵母ビヒクル、および（ｂ）ＨＢＶ大型表面抗原（Ｌ）の少なくとも１つの免疫原性ドメインで構成されているＨＢＶ表面抗原を含む融合タンパク質、を含み、ＨＢＶ特異的免疫応答を誘発する免疫療法組成物に関する。この実施形態の１つの態様では、ＨＢＶ表面抗原は、完全長ＨＢＶ大型表面抗原（Ｌ）の少なくとも９５％で構成されている。１つの態様では、ＨＢＶ表面抗原のアミノ酸配列は、配列番号９３の９０〜４８８位、配列番号３、配列番号７、配列番号１１、配列番号１１の２１〜４７位、配列番号１１の１７６〜４００位、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２３、配列番号２７、配列番号３１、配列番号３４の９〜４０７位、配列番号３６の６〜２５７位、配列番号４１の６〜２５７位、配列番号９２の９２〜３４３位、配列番号９３の９０〜４８８位、配列番号９７、配列番号１０１の９０〜３３８位、配列番号１０２の７〜２５４位、配列番号１０７の１〜２４９位、配列番号１０８の１〜２４９位、配列番号１０９の１〜２４９位、配列番号１１０の１〜２４９位、配列番号１１２の１〜３９９位、配列番号１１４の１〜３９９位、配列番号１１６の１〜３９９位、配列番号１１８の１〜３９９位、配列番号１２０の１〜３９９位、配列番号１２２の１〜３９９位、配列番号１２４の１〜３９９位、配列番号１２６の１〜３９９位、配列番号１２８の２３１〜６２９位、配列番号１３０の６３〜４６１位、配列番号１３２の２８９〜６８７位、配列番号１３４の２８９〜６８７位、または異なるＨＢＶ株由来の対応する配列、から選択されたアミノ酸配列と、少なくとも９５％同一、または少なくとも９６％同一、または少なくとも９７％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一、または同一である。１つの態様では、融合タンパク質は、配列番号９３のアミノ酸配列、または異なるＨＢＶ株由来の対応する配列と、少なくとも９５％同一、または少なくとも９６％同一、または少なくとも９７％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一、または同一であるアミノ酸配列を有する。
【００６０】
本発明のさらに別の実施形態は、（ａ）酵母ビヒクル、および（ｂ）ＨＢＶポリメラーゼの逆転写酵素ドメインの少なくとも１つの免疫原性ドメインで構成されているＨＢＶポリメラーゼ抗原を含む融合タンパク質、を含み、ＨＢＶ特異的免疫応答を誘発する免疫療法組成物に関する。本発明のこの実施形態の１つの態様では、ＨＢＶポリメラーゼ抗原は、ＨＢＶポリメラーゼの完全長逆転写酵素ドメインの少なくとも９５％で構成されている。１つの態様では、ＨＢＶポリメラーゼ抗原のアミノ酸配列は、配列番号４０の７〜３５１位、配列番号９４の９０〜４３４位、配列番号２の３８３〜６０２位、配列番号６の３８１〜６００位、配列番号１０の３８１〜６００位、配列番号１０の４５３〜６８０位、配列番号１４の３７０〜５８９位、配列番号１８の３８０〜５９９位、配列番号２２の３８１〜６００位、配列番号２６の３８０〜５９９位、配列番号３０の３８１〜６００位、配列番号３６の２６０〜６０４位、配列番号３８の７〜３５１位、配列番号４１の２６０〜６０４位、配列番号９２の３４６〜６９０位、配列番号９８、配列番号１０１の３３９〜５６６位、配列番号１０２の２５５〜４８２位、配列番号１０７の２５０〜４７７位、配列番号１０８の２５０〜４７７位、配列番号１０９の２５０〜４７７位、配列番号１１０の２５０〜４７７位、配列番号１２０の５８２〜８０９位、配列番号１２４の５８２〜８０９位、配列番号１２６の６４２〜８６９位、配列番号１２８の１〜２２８位、配列番号１３２の１〜２２８位、配列番号１３４の６１〜２８８位、または異なるＨＢＶ株由来の対応する配列、から選択されたアミノ酸配列と、少なくとも９５％同一、または少なくとも９６％同一、または少なくとも９７％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一、または同一である。１つの態様では、融合タンパク質は、配列番号４０もしくは配列番号９４のアミノ酸配列、または異なるＨＢＶ株由来の対応する配列と、少なくとも９５％同一、または少なくとも９６％同一、または少なくとも９７％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一、または同一であるアミノ酸配列を有する。
【００６１】
本発明の別の実施形態は、（ａ）酵母ビヒクル、および（ｂ）ＨＢＶコアタンパク質の少なくとも１つの免疫原性ドメインで構成されているＨＢＶコア抗原を含む融合タンパク質、を含み、ＨＢＶ特異的免疫応答を誘発する免疫療法組成物に関する。本発明のこの実施形態の１つの態様では、ＨＢＶ抗原は、完全長ＨＢＶコアタンパク質の少なくとも９５％で構成されている。１つの態様では、ＨＢＶコア抗原のアミノ酸配列は、配列番号９５の９０〜２７１位、配列番号１の３１〜２１２位、配列番号５の３１〜２１２位、配列番号９の３１〜２１２位、配列番号９の３７〜１８８位、配列番号１３の３１〜２１２位、配列番号１７の３１〜２１２位、配列番号２１の３１〜２１２位、配列番号２５の１４〜１９４位、配列番号２９の３１〜２１２位、配列番号３４の４０８〜５８９位、配列番号３６の６０５〜７８６位、配列番号３８の３５２〜５３３位、配列番号３９の１６０〜３４１位、配列番号４１の６０５〜７８６位、配列番号９２の６９１〜８７２位、配列番号９９、配列番号１０１の５６７〜７１８位、配列番号１０２の４８３〜６３４位、配列番号１０５の２〜１８３位、配列番号１０５の１８４〜３９５位、配列番号１０５の３９６〜５７８位、配列番号１０５の５７９〜７６１位、配列番号１０６の２〜１８３位、配列番号１０６の３３８〜５２０位、配列番号１０７の４７８〜６２９位、配列番号１０８の４７８〜６２９位、配列番号１０９の４７８〜６２９位、配列番号１１０の４７８〜６２９位、配列番号１１２の４００〜５８１位、配列番号１１４の４００〜５８１位、配列番号１１６の４００〜５８１位、配列番号１１８の４００〜５８１位、配列番号１２０の４００〜５８１位、配列番号１２２の４００〜５８１位、配列番号１２４の４００〜５８１位、配列番号１２６の４００〜５８１位、配列番号１２８の６３０〜８１１位、配列番号１３０の４６２〜６４３位、配列番号１３２の６８８〜８６９位、配列番号１３４の６８８〜８６９位、または異なるＨＢＶ株由来の対応する配列、から選択されたアミノ酸配列と、少なくとも９５％同一、または少なくとも９６％同一、または少なくとも９７％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一、または同一である。１つの態様では、該タンパク質は、配列番号９５のアミノ酸配列、または異なるＨＢＶ株由来の対応する配列と、少なくとも９５％同一、または少なくとも９６％同一、または少なくとも９７％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一、または同一であるアミノ酸配列を有する。
【００６２】
本発明のさらに別の実施形態は、（ａ）酵母ビヒクル、および（ｂ）完全長ＨＢＶ  Ｘ抗原の少なくとも１つの免疫原性ドメインで構成されているＨＢＶ  Ｘ抗原を含む融合タンパク質、を含み、ＨＢＶ特異的免疫応答を誘発する免疫療法組成物に関する。１つの態様では、ＨＢＶ抗原は完全長ＨＢＶ  Ｘ抗原の少なくとも９５％で構成されている。１つの態様では、ＨＢＶ  Ｘ抗原のアミノ酸配列は、配列番号９６の９０〜２４２位、配列番号４、配列番号８、配列番号１２、配列番号１２の２〜１５４位、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２４、配列番号２８、配列番号３２、配列番号４の５２〜６８位と後続する８４〜１２６位、配列番号８の５２〜６８位と後続する８４〜１２６位、配列番号１２の５２〜６８位と後続する８４〜１２６位、配列番号１６の５２〜６８位と後続する８４〜１２６位、配列番号２０の５２〜６８位と後続する８４〜１２６位、配列番号２４の５２〜６８位と後続する８４〜１２６位、配列番号２８の５２〜６８位と後続する８４〜１２６位、配列番号３２の５２〜６８位と後続する８４〜１２６位、配列番号３６の７８７〜９３９位、配列番号３９の７〜１５９位、配列番号９２の８７３〜１０２５位、配列番号１００、配列番号１０１の７１９〜７７８位、配列番号１０２の６３５〜６９４位、配列番号１０６の１８４〜３３７位、配列番号１０６の５２１〜６７４位、配列番号１０７の６３０〜６８９位、配列番号１０８の６３０〜６８９位、配列番号１０９の６３０〜６８９位、配列番号１１０の６３０〜６８９位、配列番号１２２の５８２〜６４１位、配列番号１２４の８１０〜８６９位、配列番号１２６の５８２〜６４１位、配列番号１３０の１〜６０位、配列番号１３２の２２９〜２８８位、配列番号１３４の１〜６０位、または異なるＨＢＶ株由来の対応する配列、から選択されたアミノ酸配列と、少なくとも９５％同一、または少なくとも９６％同一、または少なくとも９７％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一、または同一である。１つの態様では、該タンパク質は、配列番号９６のアミノ酸配列、または異なるＨＢＶ株由来の対応する配列と、少なくとも９５％同一、または少なくとも９６％同一、または少なくとも９７％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一、または同一であるアミノ酸配列を有する。
【００６３】
本発明の別の実施形態は、上記または本明細書中他所に記載された免疫療法組成物のうち任意の２個、３個または４個、特に、単一のＨＢＶタンパク質に関して上述された免疫療法組成物のうち任意の２個、３個または４個を含む免疫療法組成物に関する。
【００６４】
本発明のさらに別の実施形態は、（ａ）酵母ビヒクル、および（ｂ）ＨＢＶ抗原を含む融合タンパク質であって、該ＨＢＶ抗原は、各々が異なるＨＢＶ遺伝子型に由来する２個、３個または４個のＨＢＶ表面抗原タンパク質の少なくとも１つの免疫原性ドメインで構成されている融合タンパク質、を含む免疫療法組成物に関する。該組成物はＨＢＶ特異的免疫応答を誘発する。
【００６５】
本発明のさらに別の実施形態は、（ａ）酵母ビヒクル、および（ｂ）ＨＢＶ抗原を含む融合タンパク質であって、該ＨＢＶ抗原は、各々が異なるＨＢＶ遺伝子型に由来する２個、３個または４個のＨＢＶポリメラーゼタンパク質の少なくとも１つの免疫原性ドメインで構成されている融合タンパク質、を含む免疫療法組成物に関する。該組成物はＨＢＶ特異的免疫応答を誘発する。
【００６６】
本発明のさらに別の実施形態は、（ａ）酵母ビヒクル、および（ｂ）ＨＢＶ抗原を含む融合タンパク質であって、該ＨＢＶ抗原は、各々が異なるＨＢＶ遺伝子型に由来する２個、３個または４個のＨＢＶ  Ｘ抗原の少なくとも１つの免疫原性ドメインで構成されている融合タンパク質、を含む免疫療法組成物に関する。該組成物はＨＢＶ特異的免疫応答を誘発する。
【００６７】
本発明のさらに別の実施形態は、（ａ）酵母ビヒクル、および（ｂ）ＨＢＶ抗原を含む融合タンパク質であって、該ＨＢＶ抗原は、各々が異なるＨＢＶ遺伝子型に由来する２個、３個または４個のＨＢＶコアタンパク質の少なくとも１つの免疫原性ドメインで構成されている融合タンパク質、を含む免疫療法組成物に関する。該組成物はＨＢＶ特異的免疫応答を誘発する。１つの態様では、各々のＨＢＶコアタンパク質は、完全長ＨＢＶコアタンパク質の少なくとも９５％で構成されている。１つの態様では、各々のＨＢＶコアタンパク質は、ＨＢＶコアタンパク質のアミノ酸３１〜２１２で構成されている。１つの態様では、ＨＢＶ遺伝子型は遺伝子型Ｃを含み、また１つの態様では、ＨＢＶ遺伝子型は遺伝子型Ｄを含み、また１つの態様では、ＨＢＶ遺伝子型は遺伝子型Ａを含み、また１つの態様では、ＨＢＶ遺伝子型は遺伝子型Ｂを含む。１つの態様では、各々のＨＢＶコアタンパク質は、ＨＢＶコアタンパク質のアミノ酸３７〜１８８で構成されている。１つの態様では、融合タンパク質は、遺伝子型Ａ、遺伝子型Ｂ、遺伝子型Ｃおよび遺伝子型Ｄに由来する４つのＨＢＶコアタンパク質を含む。
【００６８】
本発明のこの実施形態の１つの態様では、任意の１つ以上のＨＢＶコア抗原のアミノ酸配列は、配列番号９５の９０〜２７１位、配列番号１の３１〜２１２位、配列番号５の３１〜２１２位、配列番号９の３１〜２１２位、配列番号９の３７〜１８８位、配列番号１３の３１〜２１２位、配列番号１７の３１〜２１２位、配列番号２１の３１〜２１２位、配列番号２５の１４〜１９４位、配列番号２９の３１〜２１２位、配列番号３４の４０８〜５８９位、配列番号３６の６０５〜７８６位、配列番号３８の３５２〜５３３位、配列番号３９の１６０〜３４１位、配列番号４１の６０５〜７８６位、配列番号９２の６９１〜８７２位、配列番号９９、配列番号１０１の５６７〜７１８位、配列番号１０２の４８３〜６３４位、配列番号１０５の２〜１８３位、配列番号１０５の１８４〜３９５位、配列番号１０５の３９６〜５７８位、配列番号１０５の５７９〜７６１位、配列番号１０６の２〜１８３位、配列番号１０６の３３８〜５２０位、配列番号１０７の４７８〜６２９位、配列番号１０８の４７８〜６２９位、配列番号１０９の４７８〜６２９位、配列番号１１０の４７８〜６２９位、配列番号１１２の４００〜５８１位、配列番号１１４の４００〜５８１位、配列番号１１６の４００〜５８１位、配列番号１１８の４００〜５８１位、配列番号１２０の４００〜５８１位、配列番号１２２の４００〜５８１位、配列番号１２４の４００〜５８１位、配列番号１２６の４００〜５８１位、配列番号１２８の６３０〜８１１位、配列番号１３０の４６２〜６４３位、配列番号１３２の６８８〜８６９位、配列番号１３４の６８８〜８６９位、または異なるＨＢＶ株由来の対応する配列、から選択されたアミノ酸配列と、少なくとも９５％同一、または少なくとも９６％同一、または少なくとも９７％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一、または同一である。１つの態様では、該ＨＢＶ抗原は、配列番号１０５のアミノ酸配列、または異なるＨＢＶ株由来の対応する配列と、少なくとも９５％同一、または少なくとも９６％同一、または少なくとも９７％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一、または同一であるアミノ酸配列を有する。
【００６９】
本発明のさらに別の実施形態は、（ａ）酵母ビヒクル、および（ｂ）少なくとも２個のＨＢＶコアタンパク質と少なくとも２個のＨＢＶ  Ｘ抗原とを含む融合タンパク質であって、各々のＨＢＶコアタンパク質は異なるＨＢＶ遺伝子型に由来し、かつ各々のＨＢＶ  Ｘ抗原は異なるＨＢＶ遺伝子型に由来する融合タンパク質、を含む免疫療法組成物に関する。該組成物はＨＢＶ特異的免疫応答を誘発する。１つの態様では、ＨＢＶ遺伝子型は遺伝子型Ｃを含み、１つの態様では、ＨＢＶ遺伝子型は遺伝子型Ｄを含み、１つの態様では、ＨＢＶ遺伝子型は遺伝子型Ａを含み、１つの態様では、ＨＢＶ遺伝子型は遺伝子型Ｂを含む。１つの態様では、各々のＨＢＶコアタンパク質は完全長ＨＢＶコアタンパク質の少なくとも９５％で構成されている。１つの態様では、各々のＨＢＶコアタンパク質はＨＢＶコアタンパク質のアミノ酸３１〜２１２を含む。１つの態様では、各々のＨＢＶコアタンパク質はＨＢＶコアタンパク質のアミノ酸３７〜１８８を含む。１つの態様では、各々のＨＢＶ  Ｘ抗原は完全長ＨＢＶ  Ｘ抗原の少なくとも９５％を含む。１つの態様では、各々のＨＢＶ  Ｘ抗原はＨＢＶ  Ｘ抗原のアミノ酸５２〜１２７を含む。
【００７０】
１つの態様では、ＨＢＶコア抗原のアミノ酸配列は、配列番号９５の９０〜２７１位、配列番号１の３１〜２１２位、配列番号５の３１〜２１２位、配列番号９の３１〜２１２位、配列番号９の３７〜１８８位、配列番号１３の３１〜２１２位、配列番号１７の３１〜２１２位、配列番号２１の３１〜２１２位、配列番号２５の１４〜１９４位、配列番号２９の３１〜２１２位、配列番号３４の４０８〜５８９位、配列番号３６の６０５〜７８６位、配列番号３８の３５２〜５３３位、配列番号３９の１６０〜３４１位、配列番号４１の６０５〜７８６位、配列番号９２の６９１〜８７２位、配列番号９９、配列番号１０１の５６７〜７１８位、配列番号１０２の４８３〜６３４位、配列番号１０５の２〜１８３位、配列番号１０５の１８４〜３９５位、配列番号１０５の３９６〜５７８位、配列番号１０５の５７９〜７６１位、配列番号１０６の２〜１８３位、配列番号１０６の３３８〜５２０位、配列番号１０７の４７８〜６２９位、配列番号１０８の４７８〜６２９位、配列番号１０９の４７８〜６２９位、配列番号１１０の４７８〜６２９位、配列番号１１２の４００〜５８１位、配列番号１１４の４００〜５８１位、配列番号１１６の４００〜５８１位、配列番号１１８の４００〜５８１位、配列番号１２０の４００〜５８１位、配列番号１２２の４００〜５８１位、配列番号１２４の４００〜５８１位、配列番号１２６の４００〜５８１位、配列番号１２８の６３０〜８１１位、配列番号１３０の４６２〜６４３位、配列番号１３２の６８８〜８６９位、配列番号１３４の６８８〜８６９位、または異なるＨＢＶ株由来の対応する配列、から選択されたアミノ酸配列と、少なくとも９５％同一、または少なくとも９６％同一、または少なくとも９７％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一、または同一である。
【００７１】
１つの態様では、ＨＢＶ  Ｘ抗原のアミノ酸配列は、配列番号９６の９０〜２４２位、配列番号４、配列番号８、配列番号１２、配列番号１２の２〜１５４位、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２４、配列番号２８、配列番号３２、配列番号４の５２〜６８位と後続する８４〜１２６位、配列番号８の５２〜６８位と後続する８４〜１２６位、配列番号１２の５２〜６８位と後続する８４〜１２６位、配列番号１６の５２〜６８位と後続する８４〜１２６位、配列番号２０の５２〜６８位と後続する８４〜１２６位、配列番号２４の５２〜６８位と後続する８４〜１２６位、配列番号２８の５２〜６８位と後続する８４〜１２６位、配列番号３２の５２〜６８位と後続する８４〜１２６位、配列番号３６の７８７〜９３９位、配列番号３９の７〜１５９位、配列番号９２の８７３〜１０２５位、配列番号１００、配列番号１０１の７１９〜７７８位、配列番号１０２の６３５〜６９４位、配列番号１０６の１８４〜３３７位、配列番号１０６の５２１〜６７４位、配列番号１０７の６３０〜６８９位、配列番号１０８の６３０〜６８９位、配列番号１０９の６３０〜６８９位、配列番号１１０の６３０〜６８９位、配列番号１２２の５８２〜６４１位、配列番号１２４の８１０〜８６９位、配列番号１２６の５８２〜６４１位、配列番号１３０の１〜６０位、配列番号１３２の２２９〜２８８位、配列番号１３４の１〜６０位、または異なるＨＢＶ株由来の対応する配列、から選択されたアミノ酸配列と、少なくとも９５％同一、または少なくとも９６％同一、または少なくとも９７％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一、または同一である。
【００７２】
本発明のこの実施形態の１つの態様では、融合タンパク質は、配列番号１０６のアミノ酸配列、または異なるＨＢＶ株由来の対応する配列と、少なくとも９５％同一、または少なくとも９６％同一、または少なくとも９７％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一、または同一であるアミノ酸配列を有する。
【００７３】
融合タンパク質、ＨＢＶ抗原、またはそのような融合タンパク質もしくはＨＢＶ抗原を含む免疫療法組成物に関して、本明細書中に、例えば上記および下記に記載された実施形態のうちいずれにおいても、１つのさらなる実施形態では、融合タンパク質は、付加配列を加えるために該融合タンパク質のＮ末端において付加がなされてもよい。１つの態様では、該Ｎ末端配列は、配列番号３７と９５％同一であるアミノ酸配列、配列番号８９と９５％同一であるアミノ酸配列、または配列番号９０と９５％同一であるアミノ酸配列から選択される。１つの態様では、Ｎ末端配列は、配列番号３７、配列番号３７の１〜５位、配列番号８９、もしくは配列番号９０、または異なるＨＢＶ株由来の対応する配列から選択される。
【００７４】
上記または本明細書中の他所に記載された本発明の実施形態のうちいずれかの１つの態様では、融合タンパク質は酵母ビヒクルによって発現される。上記または本明細書中の他所に記載された本発明の実施形態のうちいずれかの別の態様では、酵母ビヒクルは全酵母である。全酵母は、１つの態様では、殺処理される。１つの態様では、全酵母は加熱不活性化される。
【００７５】
上記または本明細書中の他所に記載された本発明の実施形態のうちいずれかの１つの態様では、酵母ビヒクルは、サッカロマイセス属（Saccharomyces）、カンジダ属（Candida）、クリプトコックス属（Cryptococcus）、ハンゼヌラ属（Hansenula）、クルイベロマイセス属（Kluyveromyces）、ピチア属（Pichia）、ロドトルラ属（Rhodotorula）、シゾサッカロマイセス属（Schizosaccharomyces）およびヤロウィア属（Yarrowia）から選択された属の酵母に由来するものであってよい。１つの態様では、酵母ビヒクルはサッカロマイセス属に由来する。１つの態様では、酵母ビヒクルはサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）に由来する。
【００７６】
上記または本明細書中の他所に記載された本発明の実施形態のうちいずれかの１つの態様では、組成物は対象者（被験者）または患者に投与するために製剤化される。１つの態様では、組成物は、対象者または患者への注射により（例えば、皮下、腹腔内もしくは筋肉内注射のような非経口的経路により）投与するために製剤化される。１つの態様では、組成物は、ヒトへの投与に適した薬学的に許容可能な賦形剤中で製剤化される。１つの態様では、組成物は９０％を越える酵母タンパク質を含有する。１つの態様では、組成物は９０％を越える酵母タンパク質を含有し、かつ患者に投与するために製剤化される。
【００７７】
上記または本明細書中の他所に記載された本発明の実施形態のうちいずれかの１つの態様では、融合タンパク質は酵母内で凝集していない。１つの態様では、融合タンパク質は酵母内で封入体を形成しない。１つの態様では、融合タンパク質は酵母内でＶＬＰまたはその他の大型抗原粒子を形成しない。１つの態様では、融合タンパク質は酵母内でＶＬＰまたはその他の大型抗原粒子を形成する。
【００７８】
上記または本明細書中の他所に記載された本発明の任意の実施形態の１つの態様では、ＨＢＶ配列はＨＢＶ遺伝子型Ａに由来する。別の態様では、ＨＢＶ配列はＨＢＶ遺伝子型Ｂに由来する。別の態様では、ＨＢＶ配列はＨＢＶ遺伝子型Ｃに由来する。別の態様では、ＨＢＶ配列はＨＢＶ遺伝子型Ｄに由来する。別の態様では、ＨＢＶ配列はＨＢＶ遺伝子型Ｅに由来する。別の態様では、ＨＢＶ配列はＨＢＶ遺伝子型Ｆに由来する。別の態様では、ＨＢＶ配列はＨＢＶ遺伝子型Ｇに由来する。別の態様では、ＨＢＶ配列はＨＢＶ遺伝子型Ｈに由来する。１つの態様では、ＨＢＶ配列は、上記のＨＢＶ遺伝子型のうち任意のものの組み合わせ、または任意の既知のＨＢＶ遺伝子型もしくは遺伝子亜型のうち任意のものの組み合わせに由来する。
【００７９】
本発明の別の実施形態は、本発明の免疫療法組成物の一部として上記に、または本明細書中の他所に記載された融合タンパク質のうちいずれかに関する。この実施形態の１つの態様では、融合タンパク質はＨＢＶ抗原を含み、該ＨＢＶ抗原は、限定するものではないが、（ａ）ＨＢＶ大型表面抗原（Ｌ）、ＨＢＶコアタンパク質およびＨＢＶ  Ｘ抗原で構成されているＨＢＶ抗原、（ｂ）ＨＢＶ大型表面抗原（Ｌ）およびＨＢＶコアタンパク質で構成されているＨＢＶ抗原、（ｃ）ＨＢＶ大型表面抗原（Ｌ）のＰｒｅ‐Ｓ１の肝細胞受容体、ＨＢＶ小型表面抗原（Ｓ）、ＨＢＶポリメラーゼの逆転写酵素ドメイン、ＨＢＶコアタンパク質またはＨＢＶ  ｅ抗原、およびＨＢＶ  Ｘ抗原で構成されているＨＢＶ抗原、（ｄ）ＨＢＶ大型表面抗原（Ｌ）、ＨＢＶポリメラーゼの逆転写酵素ドメイン、ＨＢＶコアタンパク質またはＨＢＶ  ｅ抗原、およびＨＢＶ  Ｘ抗原で構成されているＨＢＶ抗原、（ｅ）ＨＢＶ大型表面抗原（Ｌ）、ＨＢＶポリメラーゼの逆転写酵素ドメイン、およびＨＢＶコアタンパク質で構成されているＨＢＶ抗原、（ｆ）ＨＢＶポリメラーゼ（ＲＴドメイン）およびＨＢＶコアタンパク質で構成されているＨＢＶ抗原、（ｇ）ＨＢＶ  Ｘ抗原およびＨＢＶコアタンパク質で構成されているＨＢＶ抗原、（ｈ）ＨＢＶ大型表面抗原（Ｌ）のＰｒｅ‐Ｓ１の肝細胞受容体、ＨＢＶ小型表面抗原（Ｓ）、ＨＢＶポリメラーゼの逆転写酵素ドメイン、およびＨＢＶコアタンパク質またはＨＢＶ  ｅ抗原で構成されているＨＢＶ抗原、（ｉ）ＨＢＶ大型表面抗原（Ｌ）で構成されているＨＢＶ抗原、（ｊ）ＨＢＶコア抗原で構成されているＨＢＶ抗原、（ｋ）逆転写酵素ドメインを含むＨＢＶポリメラーゼで構成されているＨＢＶ抗原、（ｌ）ＨＢＶ  Ｘ抗原で構成されているＨＢＶ抗原、（ｍ）２〜４個のＨＢＶ表面抗原、ＨＢＶポリメラーゼ抗原、ＨＢＶコア抗原、またはＨＢＶ  Ｘ抗原で構成されているＨＢＶ抗原であって、２〜４個のＨＢＶ抗原はそれぞれ異なるＨＢＶ遺伝子型に由来する、ＨＢＶ抗原、ならびに（ｎ）２個のＨＢＶコア抗原および２個のＨＢＶ  Ｘ抗原で構成されているＨＢＶ抗原であって、２個のＨＢＶコア抗原の各々および２個のＨＢＶ  Ｘ抗原の各々は異なるＨＢＶ遺伝子型に由来する、ＨＢＶ抗原、から選択される。これらの抗原において有用な様々な配列などの、ＨＢＶ抗原の各々に関する本発明の態様は、上記に記載されている。
【００８０】
本発明のこの実施形態の１つの態様では、融合タンパク質は、配列番号１３０、配列番号１５０、配列番号１１８、配列番号１５１、配列番号３４、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号３６、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、および配列番号１１０、から選択されたアミノ酸配列と、少なくとも９５％同一、または少なくとも９６％同一、または少なくとも９７％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一、または同一であるアミノ酸配列を含む。
【００８１】
本発明の別の実施形態は、本明細書中に記載された融合タンパク質のうちいずれかをコードする組換え核酸分子に関する。１つの態様では、該組換え核酸分子は、限定するものではないが、配列番号３３、配列番号３５、配列番号９１、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、または配列番号１３３から選択された核酸配列を含む。
【００８２】
本発明のさらに別の実施形態は、本明細書中に記載された組換え核酸分子のうちいずれかを用いてトランスフェクトされた単離細胞に関する。１つの態様では、該細胞は酵母細胞である。
【００８３】
本発明の別の実施形態は、本明細書中に記載された融合タンパク質のうちいずれかを含む組成物に関する。本発明のさらに別の実施形態は、本明細書中に記載された組換え核酸分子のうちいずれかを含む組成物に関する。本発明の別の実施形態は、本明細書中に記載された単離細胞のうちいずれかを含む組成物に関する。
【００８４】
本発明のさらに別の実施形態は、対象者においてＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染またはＨＢＶ感染に起因する少なくとも１つの症状を治療する方法であって、ＨＢＶに感染している対象者に、本明細書中に記載された、任意の免疫療法組成物のうちの少なくとも１つ、例えば任意のＨＢＶ抗原、融合タンパク質、または酵母系免疫療法組成物、を投与することを含む方法に関する。対象者への組成物の投与により、対象者におけるＨＢＶ感染またはＨＢＶ感染に起因する少なくとも１つの症状が軽減される。
【００８５】
本発明のさらに別の実施形態は、ＨＢＶ抗原に対する抗原特異的細胞性免疫応答を誘発する方法であって、対象者に、本明細書中に記載された、任意の１つ以上の組成物、例えば任意のＨＢＶ抗原、融合タンパク質、または酵母系免疫療法組成物、を投与することを含む方法に関する。
【００８６】
本発明のさらに別の実施形態は、対象者においてＨＢＶ感染を予防する方法であって、ＨＢＶに感染したことのない対象者に、本明細書中に記載された、任意の１つ以上の組成物、例えば任意のＨＢＶ抗原、融合タンパク質、または酵母系免疫療法組成物、を投与することを含む方法に関する。
【００８７】
本発明の別の実施形態は、個体集団をＨＢＶに対して免疫する方法であって、該個体集団に、本明細書中に記載された、任意の１つ以上の組成物、例えば任意のＨＢＶ抗原、融合タンパク質、または酵母系免疫療法組成物、を投与することを含む方法に関する。
【００８８】
本発明の別の実施形態は、ＨＢＶ感染またはＨＢＶ感染の症状の治療のために使用するための、本明細書中に記載された、任意の１つ以上の組成物、例えば任意のＨＢＶ抗原、融合タンパク質、または酵母系免疫療法組成物に関する。
【００８９】
本発明の別の実施形態は、ＨＢＶ感染またはＨＢＶ感染の症状の予防のために使用するための、本明細書中に記載された、任意の１つ以上の組成物、例えば任意のＨＢＶ抗原、融合タンパク質、または酵母系免疫療法組成物に関する。
【００９０】
本発明のさらに別の実施形態は、ＨＢＶ感染またはＨＢＶ感染の症状を治療するための医薬の調製における、本明細書中に記載された、任意の１つ以上の組成物、例えば任意のＨＢＶ抗原、融合タンパク質、または酵母系免疫療法組成物の使用に関する。
【００９１】
本発明のさらに別の実施形態は、ＨＢＶ感染またはＨＢＶ感染の症状を予防するための医薬の調製における、本明細書中に記載された、任意の１つ以上の組成物、例えば任意のＨＢＶ抗原、融合タンパク質、または酵母系免疫療法組成物の使用に関する。
【００９２】
上記または本明細書中の他所に記載された本発明の方法または使用に関する実施形態のうちいずれかの１つの態様では、該方法は、本明細書中に記載された、少なくとも２個、３個または４個以上の組成物、例えば任意のＨＢＶ抗原、融合タンパク質、または酵母系免疫療法組成物の投与を含みうる。１つの態様では、ＨＢＶ感染の予防または治療に有用な追加の組成物または化合物が投与されてもよい（例えば、抗ウイルス化合物、インターフェロン、その他の免疫療法組成物、またはこれらの組み合わせ）。１つの態様では、様々な組成物または化合物が個体に同時に投与される。１つの態様では、様々な組成物または化合物が個体に順次投与される。１つの態様では、様々な組成物はそれぞれ個体の異なる部位への注射によって投与される。１つの態様では、本発明の酵母系ＨＢＶ免疫療法組成物の１回量は合計４０Ｙ．Ｕ．〜合計８０Ｙ．Ｕ．であり、投与量ごとに個体の異なる２、３または４つの部位に等分して投与される。
【００９３】
上記または本明細書中の他所に記載された本発明の方法または使用に関する実施形態のうちいずれかの１つの態様では、対象者への組成物の投与により、該対象者においてセロコンバージョンが引き起こされるか、または対象者集団におけるセロコンバージョン率が改善する。１つの態様では、対象者への組成物の投与により、該対象者において血清ＨＢｓＡｇの低減もしくは血清ＨＢｓＡｇの消失がもたらされるか、または対象者集団における血清ＨＢｓＡｇの消失率が改善する。１つの態様では、対象者への組成物の投与により、該対象者において血清ＨＢｅＡｇの低減もしくは血清ＨＢｅＡｇの消失がもたらされるか、または対象者集団における血清ＨＢｅＡｇの消失率が改善する。１つの態様では、対象者への組成物の投与により、該対象者においてＨＢＶウイルス負荷が低減されるか、または対象者集団におけるＨＢＶウイルス負荷の低減率が改善する。１つの態様では、対象者への組成物の投与により、該対象者において感染細胞中のＨＢＶ  ＤＮＡが検出不能となるか、または対象者集団におけるＨＢＶ  ＤＮＡ陰性の割合が高まる。１つの態様では、対象者への組成物の投与により、該対象者において肝損傷の低減もしくは肝機能の改善がもたらされるか、または対象者集団における肝損傷率の低減もしくは肝機能改善率の上昇がもたらされる。１つの態様では、対象者への組成物の投与は、対象者または対象者集団におけるＡＬＴの正常化を高める。
【００９４】
本明細書中に記載された、ＨＢＶ抗原、融合タンパク質、免疫療法組成物、または、ＨＢＶ抗原、融合タンパク質もしくは免疫療法組成物の任意の使用方法に関する実施形態のうちいずれかにおいて、１つの態様では、該組成物は、少なくとも１つの生体応答調整物質をさらに含むか、または該生体応答調整物質と併用される。１つの態様では、組成物は、ＨＢＶ感染の症状を治療または改善するのに有用な１つ以上の追加の化合物をさらに含むか、または該化合物と併用される。１つの態様では、組成物は、少なくとも１つの抗ウイルス化合物をさらに含むか、または該抗ウイルス化合物と併用される。１つの態様では、該抗ウイルス薬はヌクレオチドアナログ系逆転写酵素阻害薬である。抗ウイルス化合物には、限定するものではないが、テノフォビル、ラミブジン、アデフォビル、テルビブジン、エンテカビル、およびこれらの組み合わせが挙げられる。１つの態様では、抗ウイルス化合物はテノフォビルである。１つの態様では、抗ウイルス化合物はエンテカビルである。１つの態様では、組成物は、少なくとも１つのインターフェロンをさらに含むか、または該インターフェロンと併用される。１つの態様では、インターフェロンはインターフェロン‐αである。１つの態様では、インターフェロンはＰＥＧ化インターフェロン‐α２ａである。１つの態様では、インターフェロンはインターフェロン‐λである。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】Ｂ型肝炎ウイルスゲノムの配置構成を示す概略図。
【図２】本発明の酵母系免疫療法組成物に有用なＨＢＶ表面抗原／コア融合タンパク質をコードする組換え核酸分子の基本構造を示す概略図。
【図３】本発明の酵母系免疫療法組成物に有用なＨＢＶ表面抗原／ポリメラーゼ／コア／Ｘ融合タンパク質をコードする組換え核酸分子の基本構造を示す概略図。
【図４】本発明の酵母系免疫療法組成物に有用なＨＢＶポリメラーゼ／コア融合タンパク質をコードする組換え核酸分子の基本構造を示す概略図。
【図５】本発明の酵母系免疫療法組成物に有用なＨＢＶ  Ｘ／コア融合タンパク質をコードする組換え核酸分子の基本構造を示す概略図。
【図６】本発明の酵母系免疫療法組成物に有用なＨＢＶポリメラーゼ融合タンパク質をコードする組換え核酸分子の基本構造を示す概略図。
【図７】本発明の酵母系免疫療法組成物に有用なＨＢＶ表面抗原／ポリメラーゼ／コア融合タンパク質をコードする組換え核酸分子の基本構造を示す概略図。
【図８】本発明の酵母系免疫療法組成物に有用なＨＢＶ表面抗原／コア／ポリメラーゼ融合タンパク質をコードする組換え核酸分子の基本構造を示す概略図。
【図９】本発明の酵母系免疫療法組成物に有用なＨＢＶ表面抗原／コア／Ｘ融合タンパク質をコードする組換え核酸分子の基本構造を示す概略図。
【図１０】本発明の酵母系免疫療法組成物に有用なＨＢＶ表面抗原／コア／ポリメラーゼ／Ｘ融合タンパク質をコードする組換え核酸分子の基本構造を示す概略図。
【図１１】本発明の酵母系免疫療法組成物に有用なＨＢＶ表面抗原／コア／Ｘ／ポリメラーゼ融合タンパク質をコードする組換え核酸分子の基本構造を示す概略図。
【図１２】本発明の酵母系免疫療法組成物に有用なＨＢＶポリメラーゼ／表面抗原／コア融合タンパク質をコードする組換え核酸分子の基本構造を示す概略図。
【図１３】本発明の酵母系免疫療法組成物に有用なＨＢＶ  Ｘ／表面抗原／コア融合タンパク質をコードする組換え核酸分子の基本構造を示す概略図。
【図１４】本発明の酵母系免疫療法組成物に有用なＨＢＶポリメラーゼ／Ｘ／表面抗原／コア融合タンパク質をコードする組換え核酸分子の基本構造を示す概略図。
【図１５】本発明の酵母系免疫療法組成物に有用なＨＢＶ  Ｘ／ポリメラーゼ／表面抗原／コア融合タンパク質をコードする組換え核酸分子の基本構造を示す概略図。
【図１６】ＨＢＶ表面抗原／コア融合タンパク質を発現するいくつかの酵母系免疫療法組成物の発現を示すウエスタンブロットのデジタル画像（加熱殺菌処理、全酵母）。
【図１７】ＨＢＶ表面抗原／コア融合タンパク質を発現するいくつかの酵母系免疫療法組成物の発現を示すウエスタンブロットのデジタル画像（生菌、全酵母）。
【図１８】ＨＢＶ表面抗原／ポリメラーゼ／コア／Ｘ融合タンパク質を発現するいくつかの酵母系免疫療法組成物の発現を示すウエスタンブロットのデジタル画像。
【図１９】ＨＢＶ表面抗原／ポリメラーゼ／コア／Ｘ融合タンパク質を発現するいくつかの酵母系免疫療法組成物の発現を示すウエスタンブロットのデジタル画像。
【図２０】表面‐コア融合タンパク質（Ｓｃ）または表面‐ポリメラーゼ‐コア‐Ｘ融合タンパク質（Ｓｐ）を含むＨＢＶ抗原を発現するいくつかの酵母系免疫療法組成物の発現を示すウエスタンブロットのデジタル画像。
【図２１】ＵＬ２培地で培養された、いくつかの酵母系ＨＢＶ免疫療法組成物からの、ＨＢＶ抗原の発現を示すウエスタンブロットのデジタル画像。
【図２２】ＵＬ２培地またはＵ２培地で培養された、いくつかの酵母系ＨＢＶ免疫療法組成物からの、ＨＢＶ抗原の平均的発現を示す棒グラフ（エラーバーは標準偏差である）。
【図２３】ＨＢＶ表面‐コア抗原（ＳＣＯＲＥ）を発現している酵母系免疫療法産物で免疫されたマウス由来の脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞の、Ｓ／コア抗原混合物またはＭＨＣクラスＩＩ  ＳＡｇミモトープ（mimetope）ペプチドに対しての増殖を示すグラフ（エラーバーは標準偏差である）。
【図２４】ＨＢＶ表面‐コア抗原（ＳＣＯＲＥ）を発現している酵母系免疫療法産物で免疫されたマウス由来のリンパ節Ｔ細胞の、Ｓ／コア抗原混合物またはＭＨＣクラスＩＩ  ＳＡｇミモトープペプチドに対しての増殖を示すグラフ（エラーバーは標準偏差である）。
【図２５】ＨＢＶ表面‐コア抗原（ＳＣＯＲＥ）を発現している酵母系免疫療法産物で免疫されたマウス由来のリンパ節Ｔ細胞の、Ｓ／コア抗原混合物またはＭＨＣクラスＩＩ  ＳＡｇミモトープペプチドに対してのインターフェロン‐γ（ＩＦＮ‐γ）ＥＬＩＳｐｏｔ応答を示すグラフ。
【図２６】ＨＢＶ表面‐Ｐｏｌ‐コア‐Ｘ抗原を発現している酵母系免疫療法産物（ａ‐Ｓｐｅｘと表示）で免疫されたマウス由来の脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞の、Ｓ／コア抗原混合物またはＭＨＣクラスＩＩ  ＳＡｇミモトープペプチドに対しての増殖を示すグラフ（エラーバーは標準偏差である）。
【図２７】（ａ）ＨＢＶ表面‐Ｐｏｌ‐Ｅ／コア‐Ｘ抗原を発現している酵母系免疫療法産物（Ｓｐと表示、左側の列）、または（ｂ）ＨＢＶ表面‐コア抗原を発現している酵母系免疫療法産物（Ｓｃと表示）を用いて免疫されたマウス由来の脾細胞におけるＩＬ‐１β産生を示すグラフ（エラーバーは標準偏差である）。
【図２８】（ａ）ＨＢＶ表面‐Ｐｏｌ‐コア‐Ｘ抗原を発現している酵母系免疫療法産物（Ｓｐと表示、左側の列）、または（ｂ）ＨＢＶ表面‐コア抗原を発現している酵母系免疫療法産物（Ｓｃと表示）を用いて免疫されたマウス由来の脾細胞におけるＩＬ‐１２ｐ７０の産生を示すグラフ（エラーバーは標準偏差である）。
【図２９Ａ】ＨＢＶ表面‐コア抗原を発現している酵母系免疫療法産物（Ｓｃと表示）で免疫されたマウス由来の脾細胞におけるインターフェロン‐γ（ＩＦＮ‐γ）産生を示すグラフ（エラーバーは標準偏差である）。
【図２９Ｂ】ＨＢＶ表面‐Ｐｏｌ‐コア‐Ｘ抗原を発現している酵母系免疫療法産物（Ｓｐと表示）で免疫されたマウス由来の脾細胞におけるインターフェロン‐γ（ＩＦＮ‐γ）産生を示すグラフ（エラーバーは標準偏差である）。
【図３０Ａ】（ａ）ＨＢＶ表面‐Ｐｏｌ‐コア‐Ｘ抗原を発現している酵母系免疫療法産物（Ｓｐと表示、左側の列）、または（ｂ）ＨＢＶ表面‐コア抗原を発現している酵母系免疫療法産物（Ｓｃと表示）で免疫されたマウス由来の脾細胞におけるＩＬ‐１β産生を示すグラフ。
【図３０Ｂ】（ａ）ＨＢＶ表面‐Ｐｏｌ‐コア‐Ｘ抗原を発現している酵母系免疫療法産物（Ｓｐと表示、左側の列）、または（ｂ）ＨＢＶ表面‐コア抗原を発現している酵母系免疫療法産物（Ｓｃと表示）で免疫されたマウス由来の脾細胞におけるＩＬ‐６産生を示すグラフ。
【図３０Ｃ】（ａ）ＨＢＶ表面‐Ｐｏｌ‐コア‐Ｘ抗原（Ｓｐと表示）を発現している酵母系免疫療法産物（左側の列）、または（ｂ）ＨＢＶ表面‐コア抗原（Ｓｃと表示）を発現している酵母系免疫療法産物で免疫されたマウス由来の脾細胞におけるＩＬ‐１３産生を示すグラフ。
【図３０Ｄ】（ａ）ＨＢＶ表面‐Ｐｏｌ‐コア‐Ｘ抗原を発現している酵母系免疫療法産物（Ｓｐと表示、左側の列）、または（ｂ）ＨＢＶ表面‐コア抗原を発現している酵母系免疫療法産物（Ｓｃと表示）で免疫されたマウス由来の脾細胞におけるＩＬ‐１２ｐ７０産生を示すグラフ。
【図３１】ＧＩ‐１３００２またはＧＩ‐１３００２＋抗ＣＤ４０抗体で免疫されたマウスは標的ＨＢＶ抗原を発現しているＥＬ４腫瘍を用いたチャレンジからの同程度の防御を誘発したが、ＹＶＥＣで免疫されたマウスは誘発しなかったことを示す棒グラフ（エラーバーは標準偏差である）。
【図３２】様々なＨＢＶペプチドおよび抗原を使用して、ＧＩ‐１３００８（ＳＣＯＲＥ‐Ｃ）およびＧＩ‐１３０１３（ＳＰＥＸｖ２）で免疫されたマウスのＴ細胞応答を、ＹＶＥＣを用いた免疫に対して比較する、ＩＦＮ‐γＥＬＩＳｐｏｔアッセイの結果を示す棒グラフ（エラーバーは標準偏差である）。
【図３３】予防的ＨＢＶワクチンを用いた免疫の前後およびブースター免疫後のヒト対象者からの、ＧＩ‐１３００２を用いた刺激に対するＩＦＮ‐γＥＬＩＳｐｏｔ応答を示す棒グラフ。
【図３４】ＧＩ‐１３００９（ＳＣＯＲＥ‐Ｄ）またはＧＩ‐１３０２０（Ｘ‐ＳＣＯＲＥ）で免疫されたＨＬＡ‐Ａ２トランスジェニックマウスから単離されたリンパ節細胞からのＨＢＶ抗原特異的なＩＦＮ‐γＥＬＩＳｐｏｔ応答を、酵母対照（ＹＶＥＣ）で免疫されたマウスと比較して示す棒グラフ（エラーバーは標準偏差である）。
【図３５】ＧＩ‐１３００９（ＳＣＯＲＥ‐Ｄ）で免疫されたＨＬＡ‐Ａ２トランスジェニックマウスから単離された脾臓細胞からのＨＢＶ抗原特異的なＩＦＮ‐γＥＬＩＳｐｏｔ応答を、酵母対照（ＹＶＥＣ）で免疫されたマウスと比較して示す棒グラフ（エラーバーは標準偏差である）。
【図３６】ＧＩ‐１３００９（ＳＣＯＲＥ‐Ｄ）またはＧＩ‐１３０２０（Ｘ‐ＳＣＯＲＥ）で免疫されたＣ５７ＢＬ／６マウスから単離されたリンパ節細胞からのＨＢＶ抗原特異的なＩＦＮ‐γＥＬＩＳｐｏｔ応答を、酵母対照（ＹＶＥＣ）で免疫されたマウスまたは無処置のマウスと比較して示す棒グラフ（エラーバーは標準偏差である）。
【図３７】ＧＩ‐１３００９（ＳＣＯＲＥ‐Ｄ）またはＧＩ‐１３０２０（Ｘ‐ＳＣＯＲＥ）で免疫されたＣ５７ＢＬ／６マウスにおける、ＭＨＣクラスＩ拘束性ＨＢＶペプチドに対するＨＢＶ抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を、酵母対照（ＹＶＥＣ）またはオボアルブミンを発現する酵母系免疫療法薬（ＯＶＡＸ）で免疫されたマウスと比較して示す折線グラフ。
【図３８】ＧＩ‐１３００９（ＳＣＯＲＥ‐Ｄ）またはＧＩ‐１３０２０（Ｘ‐ＳＣＯＲＥ）で免疫されたＣ５７ＢＬ／６マウスにおける、ＭＨＣクラスＩＩ拘束性ＨＢＶペプチドに対するＨＢＶ抗原特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞応答を、酵母対照（ＹＶＥＣ）またはオボアルブミンを発現する酵母系免疫療法薬（ＯＶＡＸ）で免疫されたマウスと比較して示す棒グラフ。
【発明を実施するための形態】
【００９６】
発明の詳細な説明
本発明は、概して、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染の予防および治療のうち少なくとも一方を行うための組成物および方法に関する。本発明は、酵母系免疫療法組成物（「酵母系ＨＢＶ免疫療法」とも呼ばれる）であって、酵母ビヒクルと、個体においてＨＢＶ感染に対する予防的および／または治療的免疫応答を誘発するように設計されたＨＢＶ抗原とを含む組成物、ならびに、ＨＢＶ感染およびＨＢＶ感染に関連する症状の予防および／または治療を行うためのそのような組成物の使用を含む。本発明はさらに、本発明の酵母系組成物において使用される組換え核酸分子、ならびに該核酸分子によってコードされるタンパク質および融合タンパク質であって、ＨＢＶ感染のための任意の免疫療法組成物かつ／または任意の治療もしくは予防プロトコールにおいて、例えば、本発明のＨＢＶ特異的な酵母系組成物をＨＢＶ感染のための任意の１つ以上の他の治療用もしくは予防用の組成物、作用物質、薬物、化合物、およびプロトコールのうち少なくともいずれかと組み合わせる任意の治療もしくは予防プロトコールなどにおいて、使用するためのものも含んでいる。
【００９７】
酵母系ＨＢＶ特異的な免疫療法組成物は、本発明のこれらの組成物が、先天性免疫応答のほかに、ＣＤ４依存的なＴＨ１７およびＴＨ１型Ｔ細胞応答ならびに抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を含むＨＢＶを特異標的とする適応的免疫応答をも引き起こすという点において、様々な種類の免疫療法の中でも独特である。ＨＢＶ特異的な酵母系免疫療法によって誘発される免疫応答の範囲は、ＨＢＶを標的とするのに十分適している。第１に、ＨＢＶは、先天性免疫に直接対抗するというよりは先天性の応答から「隠れる（hiding）」ことにより、従って該応答を引き起こさないことにより、感染初期に先天性免疫応答を回避すると考えられている（ヴィーラント（Wieland）およびチャイサリ（Chisari）、ジャーナル・オブ・ヴィロロジー（J Virol）、２００５年、第１５巻、ｐ．９３６９−９３８０；ヴィーラント（Wieland）ら、米国科学アカデミー紀要（PNAS USA）、２００４年、第１０１巻、ｐ．６６６９−６６７４）。従って先天性免疫応答が、別のメカニズム、すなわち本発明の酵母系免疫療法組成物によって活性化されれば、ＨＢＶは先天性免疫応答に感受性となるであろうことが期待できる。第２に、ＨＢＶは感染宿主細胞において適応的免疫応答に認識されると予想される高レベルの抗原発現をもたらし（ギドッティ（Guidotti）ら、サイエンス（Science）、１９９９年、第２８４巻、ｐ．８２５−８２９；ジン（Thimme）ら、ジャーナル・オブ・ヴィロロジー（J Virol）、２００３年、第７７巻、ｐ．６８−７６）、かつ、急性感染の排除（クリアランス）は強健なＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答に関連付けられてきた（マイニ（Maini）ら、ガストロエンテロロジー（Gastroenterology）、１９９９年、第１１７巻、ｐ．１３８６−１３９６；レヘルマン（Rehermann）ら、ザ・ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（J. Exp. Med.）、１９９５年、第１８１巻、ｐ．１０４７−１０５８；ジン、２００３年、ジャーナル・オブ・ヴィロロジー（J Virol）、第７７巻、ｐ．６８−７６；ヴィーラント（Wieland）およびチャイサリ（Chisari）、ジャーナル・オブ・ヴィロロジー（J Virol）、２００５年、第１５巻、ｐ．９３６９−９３８０）。したがって、酵母系ＨＢＶ免疫療法は、適応的免疫応答の活性化によって、ＨＢＶ感染細胞を有効に破壊の標的とすると予想され、かつ／またはウイルス排除を有効に増強すると予想される。さらに、酵母系免疫療法によって生成される免疫応答は、インターフェロン非依存性およびインターフェロン依存性であると考えられ（タンブリーニ（Tamburini）ら、ジャーナル・オブ・イムノセラピー（J. Immunother.）、２０１２年、第３５巻、第１号、ｐ．１４−２２）；従って、ＨＢＶについての標準的治療処置の１つであるインターフェロンを用いる治療法に個体が応答する能力、または該能力の欠如は、対象者が本発明の酵母系免疫療法に応答する能力に直接影響を及ぼすとは考えられない。加えて、本明細書中に記載された酵母系ＨＢＶ免疫療法組成物は、ＨＢＶの免疫原性でありかつ保存された領域である複数のＣＴＬエピトープを標的とするように設計され、かつ、エスケープのための標的となりうるＨＢＶの領域を含んで（そのようなエスケープ変異体を標的とするために必要な組成物の改��を可能にして）、このウイルスに対する有効な免疫応答の機会を最適化する、ＨＢＶに高度に適応しうる治療法となっている。
【００９８】
さらに、また理論に束縛されるものではないが、酵母系ＨＢＶの免疫療法は、酵母系免疫療法産物によって運ばれる標的抗原に対して特異的に向けられるだけでなく、ウイルス上の他の（すなわち酵母‐抗原組成物によって運ばれるもの以外の）免疫学的エピトープを対象としても生じる、免疫応答を引き起こすと考えられる。換言すれば、酵母系酵母系免疫療法薬に含まれる抗原およびエピトープのうち少なくとも一方に対する一次性の細胞性免疫応答は、治療を受けた対象者の感染細胞中に存在するが酵母系免疫療法薬中には存在しない抗原およびエピトープのうち少なくとも一方に対する二次性の細胞性免疫応答をもたらし、その結果として、治療を受けた各対象者に特有な、複雑かつ予測不能な免疫応答プロファイルを生じさせることができる。これらの二次性免疫応答は、治療を受けた各対象者におけるＨＢＶ感染の分子プロファイルに特異的であり、また酵母系免疫療法薬は、他の免疫療法手法を含む他の治療法と比較すると独特の方式で上記の下流効果を促進することができる。この現象は一般に「エピトープ拡大（epitope spreading）」とも呼ばれ、また酵母系ＨＢＶ免疫療法を用いる利点に相当するが、その理由は、（例えば酵母免疫療法薬に関してはその抗原を提供することによる）特定のＨＢＶ抗原に対する、また更には特定のＨＢＶ遺伝子型に対する免疫応答の誘導が、様々なさらなるＨＢＶ抗原に対する免疫系の連鎖的な標的化をもたらし、このことが、酵母系免疫療法組成物中に表される抗原とは異なるＨＢＶ遺伝子型またはＨＢＶ株に由来する抗原に対する有効な免疫応答をもたらしうると予想されるからである。
【００９９】
上記に議論されるように、ＨＢＶの慢性感染に至る患者は、ＨＢＶ特異的なＴ細胞を介した免疫がより弱く（または存在せず）、かつより限られている傾向がある。従って、本発明の酵母系ＨＢＶ免疫療法組成物は、慢性感染者を含むＨＢＶに感染して発病した患者を治療するための治療用組成物の必要性に対処し、さらには永続的な記憶免疫応答の生成に関して有利となりうるＨＢＶ感染予防のための新たなワクチンを提供する。実際、本発明の酵母系ＨＢＶ免疫療法組成物は、感染を予防することができるだけでなく、慢性感染患者をウイルスの再活性化から保護することができるという長期にわたる利益を提供することが可能な、ＨＢＶに対する永続的な記憶Ｔ細胞応答を促進すると予想される。単独療法としての、またはＨＢＶ治療のための他の治療手法との併用（例えば抗ウイルス化合物との併用）における、酵母系ＨＢＶ免疫療法組成物は、ＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇの排除を達成する慢性感染患者、完全なセロコンバージョンを達成する慢性感染患者、ならびに治療完了後に少なくとも６か月間のウイルス排除の維持を達成する慢性感染患者、のうち少なくともいずれかの割合（％）を高めると予想される。
【０１００】
従って、酵母系ＨＢＶ免疫療法は、個体におけるウイルス負荷を免疫系がより有効に処理することができるレベルに低減するために、抗ウイルス薬および／またはインターフェロン療法、ならびにＨＢＶのための他の治療法と組み合わされてもよい。ＨＢＶウイルスの力価は典型的には非常に高く（１０１１個もの肝細胞が感染する場合がある）、よって有効なＣＴＬ応答を開始する個体の能力を圧倒する場合があり；従って、酵母系免疫療法を使用したＨＢＶ特異的ＣＴＬ活性の誘導と併せて抗ウイルス薬を使用してウイルス負荷を低減することは、感染個体にとって有益であると予想される。加えて、抗ウイルス薬の使用によるウイルス負荷の低減は、多数の感染肝細胞が破壊の標的とされることを背景とした免疫活性化の負の効果があったとしても、この負の効果を低減することもできる。酵母系ＨＢＶ免疫療法はまた、ウイルス感染が潜伏しているコンパートメントの縮小および排除のうち少なくとも一方を行う際に役割を果たすことも予想される。例えば、ＰＣＲによってＨＢＶ陽性であると示されており、かつＨＢＶ再活性化の逃げ場になりうると考えられる多くの組織がある。ＨＢＶ  ＤＮＡは宿主ゲノムにインテグレートすることが可能であって、このことはＨＢＶの潜伏存続をもたらし、また、ｃｃｃＤＮＡはＨＢＶゲノムのスーパーコイル状の休止形態であって該形態は潜伏にも寄与する。理論に束縛されるものではないが、本発明者らは、本明細書中に記載された酵母系ＨＢＶ免疫療法が、現行の抗ウイルス戦略で観察される無病治癒率の低さに恐らく寄与している上記種類のＨＢＶの「逃げ場」をすべて排除するにあたって役割を果たすであろうと考えている。
【０１０１】
別の計画では、本発明の酵母系ＨＢＶ免疫療法薬の使用は、単独で、または抗ウイルス治療薬もしくはその他のＨＢＶ治療薬との併用において、ＨＢｓＡｇの完全な排除を達成するのには十分であるが抗ＨＢ産生を達成するのには十分でない場合に、完全なセロコンバージョンを達成するために既存の予防的サブユニットワクチンが後から用いられてもよいし、該ワクチンがさらに併用されてもよい。別例として、本明細書中に記載された融合タンパク質のうちいずれかが、完全なセロコンバージョンを達成するための、またはＨＢＶ感染から対象者を防御するための、サブユニットワクチンとして、単独で、または本発明の酵母系ＨＢＶ免疫療法薬との併用で、使用されてもよい。最終的には、本発明の免疫療法組成物は、抗ウイルス薬を用いた治療によって誘発されるＨＢＶのエスケープ変異を処理するための、改変および本明細書中に記載された任意のものを含む追加の免疫療法組成物との併用のうち少なくともいずれかによく適している。
【０１０２】
酵母系免疫療法組成物は、生物製剤または薬学的に許容可能な組成物として投与される。従って、酵母を抗原産生システムとして使用した後に該酵母から抗原を精製するよりも、本明細書中に記載されるような酵母ビヒクル全体が、患者への投与に適しているはずであり、かつ患者へ投与するために製剤化されるべきである。対照的に、既存の市販のＨＢＶワクチン剤および開発中の多くのＨＢＶワクチン剤は、サッカロマイセス・セレビシエにおいて生産されるがその後破砕により酵母から放出されて該酵母から精製される組換えＨＢＶタンパク質（例えばＨＢｓＡｇタンパク質）を含み、その結果として、アジュバント（例えばアルミニウムヒドロキシホスファート硫酸塩または水酸化アルミニウム）と組み合わされた最終的なワクチンは、検出可能な酵母ＤＮＡを含有せず、またわずか１〜５％の酵母タンパク質しか含有しない。他方、本発明の酵母系ＨＢＶ免疫療法組成物は、容易に検出可能な酵母ＤＮＡを含有し、かつ十分５％を超える酵母タンパク質を含有しており；概して、本発明の酵母系免疫療法薬は、７０％超、８０％超、または概ね９０％を超える酵母タンパク質を含有する。
【０１０３】
酵母系免疫療法組成物は、治療および予防のうち少なくとも一方の目的で患者を免疫するために、該患者に投与される。本発明の１つの実施形態では、酵母系組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤または製剤に含めて投与するために製剤化される。該組成物は、１つの態様では、ヒト被験者への投与に適切であるように製剤化されるべきである（例えば、製造条件はヒトで使用するのに適しているべきであり、かつ、組成物の仕上げおよび投与のための適用量の免疫療法薬の調製のうち少なくともいずれかに使用されるいかなる賦形剤または製剤もヒトでの使用に適しているべきである）。本発明の１つの態様では、酵母系免疫療法組成物は、患者または対象者の注射による、例えば非経口経路による（例えば、皮下、腹腔内、筋肉内もしくは皮内注射、または別の適切な非経口経路による）投与のために製剤化される。
【０１０４】
１つの実施形態では、酵母は抗原（例えば、ウエスタンブロットによって検出可能なもの）を発現し、かつ、該抗原は酵母内で凝集せず、該抗原は酵母内で封入体を形成せず、および／または酵母内で極めて大型の粒子（ＶＬＰ）もしくは他の大型の抗原粒子を形成しない。１つの実施形態では、抗原は酵母内で可溶性タンパク質として生産され、かつ／または、酵母から分泌されないか、酵母からほとんどもしくはあまり分泌されない。別の実施形態では、理論によって束縛されるものではないが、本発明者らは、本明細書中に詳細に記載される表面抗原およびコア抗原などのＨＢＶ融合タンパク質中の抗原の特定の組み合わせ、および恐らくは配置構成は、該抗原を発現している酵母内でＶＬＰの形成またはある程度の凝集をなすことができると考えている。その結果、酵母によって発現される抗原は、該抗原の全体的な構造および形態と関係するようである免疫原性を、該抗原内に担持される免疫エピトープ（例えばＴ細胞エピトープ）の免疫原性とは別の特性として有する。そのような融合タンパク質を発現する酵母が本発明の酵母系ＨＢＶ免疫療法薬の中に提供されると、該免疫療法組成物は、（本明細書中に記載された全ての酵母系免疫療法薬と同様に）上記に議論されるような酵母ビヒクルからだけでなく、部分的には融合タンパク質抗原構造物からも（例えば、酵母内で発現されるような表面‐コア融合タンパク質もアジュバント様の特性を有する）、先天性免疫システムを活性化する特性を引き出し；加えて、該免疫療法組成物は、本明細書中に記載された全ての酵母系免疫療法薬と同様に、融合タンパク質から（様々なＴ細胞エピトープの提供による）抗原特異的な方式で適応免疫システムを活性化する特性を引き出す。特性のこの特定の組み合わせは、本明細書中に記載されたＨＢＶ由来の特定の表面‐コア融合タンパク質を発現している酵母系免疫療法薬に特有のようである。しかしながら、本明細書中に記載された本発明の実施形態全てにおいて、酵母系免疫療法薬は、免疫システムの樹状細胞によって容易に貪食されるはずであり、かつ該酵母および抗原は、ＨＢＶに対する有効な免疫応答を誘発するために、そのような樹状細胞によって容易に処理されるはずである。
【０１０５】
《本発明の組成物》
本発明の１つの実施形態は、ＨＢＶ感染の予防および治療のうち少なくとも一方を行うために、かつ／またはＨＢＶ感染に起因する少なくとも１つの症状を緩和するために使用することができる、酵母系免疫療法組成物に関する。該組成物は、（ａ）酵母ビヒクル、ならびに（ｂ）ＨＢＶタンパク質および該タンパク質の免疫原性ドメインのうち少なくとも一方を含む１つ以上の抗原、を含む。酵母ビヒクルとの併用において、ＨＢＶタンパク質は、最も典型的には酵母ビヒクルによって（例えば、酵母完全体または酵母スフェロプラスト（任意選択でさらに処理されて酵母サイトプラスト、酵母ゴースト、または酵母膜抽出物もしくはそのフラクションとされてもよい）によって）組換えタンパク質として発現されるが、１つ以上のそのようなＨＢＶタンパク質が、本発明の組成物を形成するために、酵母ビヒクル内に入れられること、または他の方法で酵母ビヒクルと複合体形成、付着、混合されるか、もしくは酵母ビヒクルとともに投与されることは、本発明の実施形態である。本発明によれば、本発明の酵母ビヒクルに関して「異種（の）」タンパク質または「異種（の）」抗原、例えば異種の融合タンパク質などを指す場合、該タンパク質または抗原は天然において酵母によって発現されるタンパク質や抗原ではないことを意味するが、異種抗原または異種タンパク質を含む融合タンパク質は、天然においても酵母によって発現される酵母の配列もしくはタンパク質またはその一部（例えば本明細書中に記載されるようなαファクタープレプロ配列）を含むこともできる。
【０１０６】
本発明の１つの実施形態は様々なＨＢＶ融合タンパク質に関する。１つの態様では、そのようなＨＢＶ融合タンパク質は本発明の酵母系免疫療法組成物において有用である。そのような融合タンパク質、およびそのようなタンパク質をコードする組換え核酸分子のうち少なくとも一方は、酵母を用いない免疫療法組成物において、該組成物と組み合わせて、または該組成物を生産するために使用される可能性もあり、該組成物には、限定するものではないが、ＤＮＡワクチン、タンパク質サブユニットワクチン、組換えウイルスを用いる免疫療法組成物、殺処理もしくは不活化処理された病原体ワクチン、および樹状細胞ワクチンのうち少なくともいずれかが挙げられる。別の実施形態では、そのような融合タンパク質は、ＨＢＶの診断アッセイにおいて、かつ／または、ＨＢＶに対する抗体を生成するために、使用されうる。本明細書中に記載されるのは、ＨＢＶ抗原の選択された部分、例えば、ポリメラーゼの選択部分および／または改変されたポリメラーゼ；表面抗原の選択部分および／または改変された表面抗原；コアの選択部分および／または改変されたコア（ｅ抗原の少なくとも一部もしくは大部分を含む）；Ｘ抗原の選択部分および／または改変されたＸ抗原；ならびに、該抗原（表面抗原、コア、Ｘおよびポリメラーゼ）のうち任意の１、２、３または４個全ての選択された部分および／または配置構成物、例えば、限定するものではないが、表面抗原およびコア（ｅ抗原の少なくとも一部もしくは大部分を含む）の選択部分および／または配置構成物；表面抗原、コア（ｅ抗原の少なくとも一部もしくは大部分を含む）、ポリメラーゼおよびＸ抗原の選択部分および／または配置構成物；表面抗原、コア（ｅ抗原の少なくとも一部もしくは大部分を含む）、およびポリメラーゼの選択部分および／または配置構成物；ならびに表面抗原、コア（ｅ抗原の少なくとも一部もしくは大部分を含む）、およびＸ抗原の選択部分および／または配置構成物、を提供する典型的なＨＢＶ融合タンパク質である。
【０１０７】
１つの実施形態では、本明細書中に記載されるようなＨＢＶ抗原、例えば完全長タンパク質の免疫原性ドメインは、ＨＢＶに感染した宿主細胞中で過剰発現されるが非感染宿主細胞においては過剰発現されない宿主タンパク質に融合される。１つの実施形態では、本明細書中に記載されるようなＨＢＶ抗原、例えば完全長タンパク質の免疫原性ドメインは、タンパク質Ｒ２（ＨＢＶ複製に必要な宿主因子）に融合され、該タンパク質は１つの実施形態では肝細胞中で発現される。Ｒ２はリボヌクレオチドリダクターゼ（ＲＮＲ）のタンパク質成分であり、ＨＢＶの生活環に不可欠である（例えばコーエン（Cohen）ら、ヘパトロジー（Hepatol.）、２０１０年、第５１巻、第５号、ｐ．１５３８−１５４６を参照）。本発明の他の実施形態は、本明細書中に提供される開示内容に照らせば明白となろう。
【０１０８】
［Ｂ型肝炎ウイルス、遺伝子、およびタンパク質］  Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）はウイルスのヘパドナウイルス科（ヘパドナウイルス）に属し、ヒトおよび類人猿において肝臓の一時的および慢性的感染症を引き起こす。哺乳動物に感染するヘパドナウイルスは類似のＤＮＡ塩基配列およびゲノム構造を有し、オルソヘパドナウイルス属に分類される。Ｂ型肝炎ウイルス粒子は、脂質およびＨＢｓＡｇとして知られる表面抗原粒子を含有する外側エンベロープを有する。コアタンパク質（ＨＢｃＡｇ）を含有するヌクレオカプシドコアは、ウイルスＤＮＡおよび逆転写酵素活性を備えたＤＮＡポリメラーゼを取り囲んでいる。シーガー（Seeger）およびメーソン（Mason）、マイクロバイオロジー・アンド・モレキュラー・バイオロジー・レビュー（Microbiol. Mol. Biol. Rev.）、２０００年、第６４巻、第１号、ｐ．５１−６８において総括されるように、ＨＢＶは３．２ｋｂの部分的に二本鎖の弛緩型環状ＤＮＡ（ｒｃＤＮＡ）ゲノムを有し、該ウイルスゲノムは感染肝細胞の核に送達されると共有結合閉環状二本鎖ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）分子に変換される。宿主細胞のＲＮＡポリメラーゼＩＩはｃｃｃＤＮＡテンプレートから４個のウイルスＲＮＡを転写し、該ＲＮＡは宿主細胞の細胞質に輸送される。該ウイルスＲＮＡはｍＲＮＡを含み、該ｍＲＮＡは転写されてウイルスのコアおよびエンベロープの構造タンパク質、ならびにプレコア、ポリメラーゼおよびＸの非構造ウイルスタンパク質を生産する。翻訳されてコアおよびポリメラーゼを生産するＲＮＡは、さらに逆転写の鋳型であるプレゲノムＲＮＡ（ｐｇＲＮＡ）としての役割も果たす。ｐｇＲＮＡおよびポリメラーゼはコアタンパク質によって包み込まれてウイルスのヌクレオカプシドを生じ、ここでｐｇＲＮＡは逆転写されてｒｃＤＮＡとなる。その後、これらのｒｃＤＮＡを含有するヌクレオカプシドはエンベロープタンパク質によって取り囲まれ、成熟ウイルス粒子として宿主細胞から分泌されるかまたはウイルスｃｃｃＤＮＡを増幅するために核との間を往復する。
【０１０９】
ＨＢＶゲノムによって産生される構造タンパク質および非構造タンパク質は表１に示されている。部分的に二重鎖構造のＨＢＶゲノムは、Ｃ、Ｘ、ＰおよびＳとして知られる４個の遺伝子を包含している（図１も参照のこと）。
【０１１０】
【表１】
0005911983.tif 000002
遺伝子Ｃは、２つの密接に関連する抗原すなわち：ウイルスのカプシドを形成する「コアタンパク質」または「コア抗原」（ＨＢｃＡｇ）と呼ばれる２１ｋＤａのタンパク質、および、ダイマーを形成するがアセンブリしてカプシドとなることはないｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）と呼ばれる１７ｋＤａタンパク質、をコードする。完全長コアタンパク質はおよそ１８３アミノ酸のタンパク質であって、ｅ抗原のＮ末端１０アミノ酸以外を全て含み、かつＣ末端にｅ抗原の産生においてはタンパク質分解により切断されるおよそ３４個の追加のアミノ酸を含む。換言すると、コアタンパク質およびｅ抗原は共通する１４９アミノ酸残基（この区域は肝炎コア抗原と呼ばれることもある）を有するが、Ｎ末端およびＣ末端領域は異なっている。プレコアタンパク質は、コアおよびｅ抗原の両方に由来する配列を含むアミノ酸配列を含む前駆体タンパク質であって、ｅ抗原は該前駆体タンパク質からタンパク質分解によるプロセシングを介して生産される。細胞内のＨＢｅＡｇはプレコア残基−２９〜−１（この具体的説明における残基の番号付けは、プレコアタンパク質内のコアタンパク質の最初のアミノ酸残基を「１」位として表示して提供されている）を含み、これはアミノ酸−２９〜−１１が切断される場所である小胞体へと該タンパク質を方向付けるシグナル配列を含有し、アミノ酸１４９とアミノ酸１５０との間の別のタンパク質分解による切断はプレコアのＣ末端部分（完全長コアタンパク質中に存在する）を除去し、次いで残りのＨＢｅＡｇ（プレコアのアミノ酸−１０〜−１およびＨＢｃＡｇまたはコアのアミノ酸１〜１４９で構成される）はｅ抗原として分泌される（スタンディング（Standing）ら、米国科学アカデミー紀要（PNAS USA）、１９８８年、第８５巻、ｐ．８４０５−８４０９；オウ（Ou）ら、米国科学アカデミー紀要（PNAS USA）、１９８６年、第８３巻、ｐ．１５７８−１５８２；ブラス（Bruss）およびゲーリッヒ（Gerlich）、ヴィロロジー（Virology）、１９８８年、第１６３巻、ｐ．２６８−２７５；タカハシ（Takahashi）ら、ジャーナル・オブ・イムノロジー（J. Immunol.）、１９８３年、第１３０巻、ｐ．２９０３−２９０７）。プレコア領域全体で構成されるＨＢｅＡｇもヒト血清中に見出されている（タカハシ（Takahashi）ら、ジャーナル・オブ・イムノロジー（J. Immunol.）、１９９２年、第１４７巻、ｐ．３１５６−３１６０）。上述のように、ＨＢｃＡｇ（コア）はアセンブリしてウイルスのカプシドとなるダイマーを形成し、ポリメラーゼおよびウイルスＤＮＡまたはｐｇＲＮＡを内包する。ＨＢｅＡｇ（ｅ抗原）の機能は未知であるが、ＨＢＶの複製または感染には必要とされず、免疫システムによる攻撃からＨＢＶを防御する免疫抑制因子であると考えられている（ミリヒ（Milich）ら、米国科学アカデミー紀要（PNAS USA）、１９９０年、第８７巻、ｐ．６５９９−６６０３；チェ（Che）ら、米国科学アカデミー紀要（PNAS USA）、２００４年、第１０１巻、ｐ．１４９１３−１４９１８；ヴィーラント（Wieland）およびチャイサリ（Chisari）、ジャーナル・オブ・ヴィロロジー（J Virol）、２００５年、第７９巻、９３６９−９３８０）。明確にするために、本明細書中に記載されるＨＢＶ配列（例えば表３を参照）においては、代表的なＨＢＶ遺伝子型に由来するプレコアの配列が提示されており、コアタンパク質およびｅ抗原の部位は、プレコアの最初のアミノ酸を１位と指定して、プレコア配列内に表示されている。
【０１１１】
遺伝子Ｐは、スペーサーによって連結された２つの主要ドメインで構成されているＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ）をコードする。該ポリメラーゼのＮ末端ドメイン（「末端タンパク質」またはＴＰとも呼ばれる）は、ｐｇＲＮＡのパッケージングおよび非センス鎖ＤＮＡの準備に関与する。Ｃ末端ドメインはＲＮａｓｅＨ（ＲＨ）活性を有する逆転写酵素（ＲＴ）である。
【０１１２】
遺伝子Ｓは多数の開始コドンを有し、かつＳ、ＭおよびＬで表示される３個のエンベロープタンパク質（本明細書中では概して「表面タンパク質」または「表面抗原」とも呼ばれる）をコードするが、該タンパク質はいずれもデーン粒子としても知られる感染性ウイルス粒子の成分である。Ｓは、単独で、またＭおよびＬと一緒に、感染細胞から多量に分泌されうる表面抗原粒子（ＨＢｓＡｇ）も形成する（シーガー（Seeger）およびメーソン（Mason）、マイクロバイオロジー・アンド・モレキュラー・バイオロジー・レビュー（Microbiol. Mol. Biol. Rev.）、２０００年、第６４巻、第１号、ｐ．５１−６８；ベック（Beck）、「Ｂ型肝炎ウイルスの複製（Hepatitis B virus replication）」、ワールド・ジャーナル・オブ・ガストロエンテロロジー（World Journal of Gastroenterology : WJG）、２００７年、第１３巻、第１号、ｐ．４８−６４）。ＭおよびＬのコドンは、Ｓの開始コドン上流のおよそ１６５（Ｍ）および４８９（Ｌ）ヌクレオチドにそれぞれ位置している。Ｓまたは「小型」表面抗原は、表面抗原の中で最も小さくかつ最も豊富である。この抗原に対して産生される抗体は、感染者においてセロコンバージョンを表わす。Ｍまたは「中型」表面抗原は、Ｓと比較するとｐｒｅ‐Ｓ２という余分なタンパク質ドメインを有し、またＬまたは「大型」表面抗原に特有のタンパク質ドメインはｐｒｅ‐Ｓ１として知られている（したがってＬは、ｐｒｅ‐Ｓ２ならびにＭおよびＳに属するさらなる配列も含有する）。Ｐｒｅ‐Ｓ１はウイルスの肝細胞受容体ドメイン（肝細胞受容体結合部位）を含有し、該ドメインはおよそＰｒｅ‐Ｓ１のアミノ酸２１位と４７位との間に位置する。ｐｒｅ‐Ｓ１の中のエピトープはウイルス中和抗体を誘発することができる。加えて、ｐｒｅ‐Ｓ１ドメインはウイルスエンベロープのアセンブリの際にコア粒子にリガンドを供給する。表面抗原粒子（ＨＢｓＡｇ）は、高用量トレラゲンとして機能することにより感染細胞の免疫異物除去を抑制することもできる（レニャ（Reignat）ら、ザ・ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（J. Exp. Med.）、２００２年、第１９５巻、ｐ．１０８９−１１０１；ウェブスター（Webster）ら、ジャーナル・オブ・ヴィロロジー（J Virol）、２００４年、第７８巻、ｐ．５７０７−５７１９）。
【０１１３】
遺伝子ＸはＸ抗原（ＨＢｘ）（「Ｘタンパク質」と呼ばれることもある）をコードし、Ｘ抗原は、転写のトランス活性化、ＤＮＡ修復経路の調節、細胞質カルシウムレベルの上昇、タンパク質分解経路の変調、ならびに、ＨＢＶ複製の刺激を増強する、宿主細胞における細胞周期進行および細胞増殖経路の変調（ギアハート（Gearhart）ら、ジャーナル・オブ・ヴィロロジー（J Virol）、２０１０年）に関与する。ＨＢｘは肝臓がんの発症にも関係している（キム（Kim）ら、ネイチャー（Nature）、１９９１年、第３５１巻、ｐ．３１７−３２０；テラディロス（Terradillos）ら、オンコジーン（Oncogene）、１９９７年、第１４巻、ｐ．３９５−４０４）。
【０１１４】
ＨＢＶは、そのエンベロープタンパク質内の抗原エピトープに基づいて決定される４つの主な血清型（ａｄｒ、ａｄｗ、ａｙｒ、ａｙｗ）のうちの１つとして見出される。ゲノム内のヌクレオチド配列変異に基づいた８つの異なるＨＢＶ遺伝子型（Ａ〜Ｈ）が存在する。遺伝子型の地理的分布は表２に示されている（クランビス（Kramvis）ら、ワクチン（Vaccine）、２００５年、第２３巻、第１９号、ｐ．２４０９−２４２３；マグニウス（Magnius）およびノーダー（Norder）、インターヴィロロジー（Intervirology）、１９９５年、第３８巻、第１−２号、ｐ．２４−３４；サカモト（Sakamoto）ら、２００６年、ジャーナル・オブ・ジェネラル・ヴィロロジー（J. Gen. Virol.）、第８７巻、ｐ．１８７３−１８８２；リム（Lim）ら、インターナショナル・ジャーナル・オブ・メディカル・サイエンス（Int. J. Med. Sci.）、２００６年、第３、ｐ．１４−２０）。
【０１１５】
【表２】
0005911983.tif 000003
ＨＢＶ遺伝子および該遺伝子によってコードされるタンパク質の核酸配列およびアミノ酸配列は、既知の遺伝子型それぞれについて当分野において既知である。表３は、ＨＢＶの８つの既知遺伝子型それぞれにおけるＨＢＶの構造タンパク質および非構造タンパク質全ての典型的な（代表的な）アミノ酸配列の配列識別子を提示し、さらに一定の構造ドメインの部位を示している。同じＨＢＶ遺伝子型由来の同じタンパク質またはドメインについて、異なるウイルス単離物間のアミノ酸配列にわずかな変異が生じうることが知られている。しかしながら、上記に議論されるように、ＨＢＶの株および血清型ならびにＨＢＶの遺伝子型は、血清型と遺伝子型との間でさえ高いアミノ酸同一性を示している（例えば表４を参照）。したがって、本明細書中に提示された手引きを使用しかつ典型的なＨＢＶ配列を参照すれば、当業者は、本発明の組成物および方法において使用するための、ＨＢＶに基づいた様々なタンパク質、例えば任意のＨＢＶ株（単離物）、血清型、または遺伝子型に由来する融合タンパク質を容易に生産することが可能であろうし、またそれゆえに、本発明は本明細書中に開示された具体的な配列に限定されるものではない。本開示中のいかなる場所におけるＨＢＶタンパク質もしくはＨＢＶ抗原、または該タンパク質もしくは抗原の任意の機能的、構造的、もしくは免疫原性ドメインへの言及も、本開示において示された配列のうち１つ以上に由来する特定の配列に言及することにより、または異なるＨＢＶ単離物（株）に由来する同一、類似もしくは対応する配列に言及することにより、適宜なされることができる。
【０１１６】
【表３−１】
0005911983.tif 000004
【０１１７】
【表３−２】
0005911983.tif 000005
【０１１８】
【表３−３】
0005911983.tif 000006
［Ｂ型肝炎ウイルスの抗原および構築物］  本発明の１つの実施形態は、新規なＨＢＶ抗原および融合タンパク質、ならびにこれらの抗原およびタンパク質をコードする組換え核酸分子に関する。本明細書中に記載されるのは、酵母系免疫療法組成物または他の組成物（例えば他の免疫療法組成物または診断用組成物）において使用されるいくつかの異なる新規なＨＢＶ抗原であって、同一の融合タンパク質内にすべて含められかつ同一の組換え核酸構築物（組換え核酸分子）によってコードされる、１つ以上のタンパク質に由来する１または複数（２、３、４、５、６、７、８、９またはそれ以上）の抗原および免疫原性ドメインのうち少なくともいずれかを提供するＨＢＶ抗原である。本発明の組成物において使用される抗原は、動物を（予防的または治療的に）免疫するための少なくとも１つのＨＢＶタンパク質または該タンパク質の免疫原性ドメインを含む。該組成物は、１個、２個、３個、４個、少数個、数個もしくは複数個のＨＢＶ抗原、例えば、１個、２個、３個もしくは４個以上のＨＢＶタンパク質の、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれ以上の免疫原性ドメインを含みうる。いくつかの実施形態では、抗原は融合タンパク質である。本発明の１つの態様では、融合タンパク質は２以上のタンパク質を含むことができる。１つの態様では、融合タンパク質は、１以上のタンパク質の２以上の免疫原性ドメインおよび２以上のエピトープのうち少なくともいずれかを含むことができる。そのような抗原を含有する免疫療法組成物は、広く様々な患者において抗原特異的な免疫をもたらす可能性がある。例えば、本発明に包含される抗原または融合タンパク質には、以下すなわち：ＨＢＶ表面タンパク質（表面抗原またはエンベロープタンパク質またはＨＢｓＡｇとも呼ばれる）、例えば大型（Ｌ）、中型（Ｍ）および／または小型（Ｓ）の形態の表面タンパク質、ならびに該表面タンパク質のＰｒｅ‐Ｓ１および／またはＰｒｅ‐Ｓ２ドメイン、のうち少なくともいずれか；ＨＢＶプレコアタンパク質；ＨＢＶコアタンパク質（コア抗原またはＨＢｃＡｇとも呼ばれる）；ＨＢＶ  ｅ抗原（ＨＢｅＡｇとも呼ばれる）；ＨＢＶポリメラーゼ（例えば、該ポリメラーゼのＲＴドメインおよびＴＰドメインと呼ばれるドメインのうち一方または両方）；ＨＢＶ  Ｘ抗原（Ｘ、Ｘ抗原、またはＨＢｘとも呼ばれる）；ならびに、上記のＨＢＶタンパク質のうちいずれか１以上の任意の１以上の免疫原性ドメイン、のうち少なくともいずれかから選択された任意の１つ以上のＨＢＶタンパク質の少なくとも一部、または完全長の該ＨＢＶタンパク質が含まれうる。１つの実施形態では、本発明の免疫療法組成物に有用な抗原は単一のＨＢＶタンパク質に由来する（完全長、ほぼ完全長の該タンパク質、または該タンパク質の一部分であって完全長タンパク質の少なくとも１個、２個、３個、４個またはそれ以上の免疫原性ドメインを含むもの）。本発明の１つの実施形態では、免疫療法組成物は、１個、２個、３個、４個、５個またはそれ以上の個別の酵母ビヒクルであって各々が異なるＨＢＶ抗原を発現または含有している酵母ビヒクルを含む。
【０１１９】
本発明に有用なＨＢＶ抗原の組み合わせには、限定されるものではないが、（融合タンパク質内での順序は任意として）
（１）表面タンパク質（Ｌ、ＭおよびＳのうち少なくともいずれか１つ、ならびに／または、それらの機能ドメインおよび／もしくは免疫学的ドメインのうち任意の１つもしくは組み合わせであって、例えば、限定されるものではないがＰｒｅ‐Ｓ１およびＰｒｅ‐Ｓ２のうち少なくとも一方、ならびに／またはＰｒｅ‐Ｓ１の肝細胞受容体ドメイン）と、（ａ）プレコア／コア／ｅ（プレコア、コア、ｅ抗原、ならびに／または、それらの機能ドメインおよび／もしくは免疫学的ドメインのうち任意の１つもしくは組み合わせ）；（ｂ）ポリメラーゼ（完全長、ＲＴドメイン、ＴＰドメインならびに／または、それらの機能ドメインおよび／もしくは免疫学的ドメインのうち任意の１つもしくは組み合わせ）；ならびに、（ｃ）Ｘ抗原（またはその機能ドメインおよび／もしくは免疫学的ドメインのうち任意の１つもしくは組み合わせ）、のうちいずれか１つ以上との組み合わせ、
（２）プレコア／コア／ｅ（プレコア、コア、ｅ抗原、ならびに／または、それらの機能ドメインおよび／もしくは免疫学的ドメインのうち任意の１つもしくは組み合わせ）と、（ａ）表面タンパク質（Ｌ、ＭおよびＳのうち少なくともいずれか１つ、ならびに／または、それらの機能ドメインおよび／もしくは免疫学的ドメインのうち任意の１つもしくは組み合わせであって、例えば、限定されるものではないがＰｒｅ‐Ｓ１およびＰｒｅ‐Ｓ２のうち少なくとも一方、ならびに／またはＰｒｅ‐Ｓ１の肝細胞受容体ドメイン）；（ｂ）ポリメラーゼ（完全長、ＲＴドメイン、ＴＰドメインならびに／または、それらの機能ドメインおよび／もしくは免疫学的ドメインのうち任意の１つもしくは組み合わせ）；ならびに、（ｃ）Ｘ抗原（またはその機能ドメインおよび／もしくは免疫学的ドメインのうち任意の１つもしくは組み合わせ）、のうちいずれか１つ以上との組み合わせ、
（３）ポリメラーゼ（完全長、ＲＴドメイン、ＴＰドメインならびに／または、それらの機能ドメインおよび／もしくは免疫学的ドメインのうち任意の１つもしくは組み合わせ）と、（ａ）表面タンパク質（Ｌ、ＭおよびＳのうち少なくともいずれか１つ、ならびに／または、それらの機能ドメインおよび／もしくは免疫学的ドメインのうち任意の１つもしくは組み合わせであって、例えば、限定されるものではないがＰｒｅ‐Ｓ１およびＰｒｅ‐Ｓ２のうち少なくとも一方、ならびに／またはＰｒｅ‐Ｓ１の肝細胞受容体ドメイン）；（ｂ）プレコア／コア／ｅ（プレコア、コア、ｅ抗原、ならびに／または、それらの機能ドメインおよび／もしくは免疫学的ドメインのうち任意の１つもしくは組み合わせ）；ならびに、（ｃ）Ｘ抗原（またはその機能ドメインおよび／もしくは免疫学的ドメインのうち任意の１つもしくは組み合わせ）、のうちいずれか１つ以上との組み合わせ、または、
（４）Ｘ抗原（またはその機能ドメインおよび／もしくは免疫学的ドメインのうち任意の１つもしくは組み合わせ）と、（ａ）表面タンパク質（Ｌ、ＭおよびＳのうち少なくともいずれか１つ、ならびに／または、それらの機能ドメインおよび／もしくは免疫学的ドメインのうち任意の１つもしくは組み合わせであって、例えば、限定されるものではないがＰｒｅ‐Ｓ１およびＰｒｅ‐Ｓ２のうち少なくとも一方、ならびに／またはＰｒｅ‐Ｓ１の肝細胞受容体ドメイン）；（ｂ）ポリメラーゼ（完全長、ＲＴドメイン、ＴＰドメインならびに／または、それらの機能ドメインおよび／もしくは免疫学的ドメインのうち任意の１つもしくは組み合わせ）；ならびに、（ｃ）プレコア／コア／ｅ（プレコア、コア、ｅ抗原、ならびに／または、それらの機能ドメインおよび／もしくは免疫学的ドメインのうち任意の１つもしくは組み合わせ）、のうちいずれか１つ以上との組み合わせ、
が挙げられる。
【０１２０】
本発明の１つの実施形態としての組換え核酸分子および該核酸分子によってコードされるタンパク質、例えば融合タンパク質は、酵母系免疫療法組成物において、またはＨＢＶ抗原に関する任意の他の適切な目的のために、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、抗体の産生のために、もしくは、本明細書中に記載された酵母系免疫療法を基礎としない別の免疫療法組成物、例えば別のワクチンにおいて、使用されうる。酵母によるタンパク質の発現は１つの好ましい実施形態であるが、他の発現系が、酵母系免疫療法組成物以外の適用のためにタンパク質を生産するために使用されてもよい。
【０１２１】
本発明によれば、本明細書中における用語「抗原」の一般的使用は：天然に存在するかまたは合成により得られるタンパク質の任意の部分（ペプチド、部分的タンパク質、完全長タンパク質）、細胞構成成分（細胞全体、細胞溶解物もしくは破壊された細胞）、生物体（生物体全体、溶解物もしくは破壊された細胞）、または炭水化物、もしくはその他の分子、もしくはそれらの一部を指す。抗原は、免疫システムの構成要素（例えばＴ細胞、抗体）が出会う同一または類似の抗原に対する抗原特異的免疫応答（例えば、体液性免疫応答および細胞性免疫応答のうち少なくとも一方）を誘発することができる。
【０１２２】
抗原は、単一エピトープほどの大きさしかなくてもよいし、単一の免疫原性ドメインほどであっても、またはより大きくてもよく、複数のエピトープまたは免疫原性ドメインを含むことができる。そのため、抗原の大きさは約８〜１２アミノ酸（すなわちペプチド）ほどの大きさしかなくてもよいし、完全長タンパク質、マルチマー、融合タンパク質、キメラタンパク質、細胞全体、微生物全体、またはこれらの任意の一部分（例えば細胞全体の溶解産物または微生物の抽出物）ほどの大きさがあってもよい。さらに、抗原は炭水化物を含んでもよく、該炭水化物は酵母ビヒクル内または本発明の組成物内に入れられてもよい。当然のことであるが、いくつかの実施形態においては（例えば抗原が組換え核酸分子から酵母ビヒクルによって発現される場合）、抗原は細胞全体または微生物全体ではなく、タンパク質、融合タンパク質、キメラタンパク質またはこれらのフラグメントである。
【０１２３】
抗原が酵母内で発現されるようになっている場合、抗原は酵母内で組換え発現されうる最小サイズのものであり、典型的には少なくとも２５アミノ酸長以上、もしくは少なくとも２６アミノ酸長以上、少なくとも２７アミノ酸長以上、少なくとも２８アミノ酸長以上、少なくとも２９アミノ酸長以上、少なくとも３０アミノ酸長以上、少なくとも３１アミノ酸長以上、少なくとも３２アミノ酸長以上、少なくとも３３アミノ酸長以上、少なくとも３４アミノ酸長以上、少なくとも３５アミノ酸長以上、少なくとも３６アミノ酸長以上、少なくとも３７アミノ酸長以上、少なくとも３８アミノ酸長以上、少なくとも３９アミノ酸長以上、少なくとも４０アミノ酸長以上、少なくとも４１アミノ酸長以上、少なくとも４２アミノ酸長以上、少なくとも４３アミノ酸長以上、少なくとも４４アミノ酸長以上、少なくとも４５アミノ酸長以上、少なくとも４６アミノ酸長以上、少なくとも４７アミノ酸長以上、少なくとも４８アミノ酸長以上、少なくとも４９アミノ酸長以上、少なくとも５０アミノ酸長以上であるか、または少なくとも２５〜５０アミノ酸長、少なくとも３０〜５０アミノ酸長、または少なくとも３５〜５０アミノ酸長、または少なくとも４０〜５０アミノ酸長、または少なくとも４５〜５０アミノ酸長である。比較的小さなタンパク質が発現されてもよく、またかなり大きなタンパク質（例えば数百アミノ酸長または実に数千アミノ酸長）が発現される場合もある。１つの態様では、完全長タンパク質、またはその構造ドメインもしくは機能ドメイン、もしくはその免疫原性ドメインであって、そのＮ末端およびＣ末端のうち少なくともいずれか一方から１以上のアミノ酸が欠けているものが発現されてもよい（例えば、Ｎ末端およびＣ末端のうち少なくともいずれか一方から約１〜約２０アミノ酸が欠けているもの）。さらに、融合タンパク質およびキメラタンパク質も本発明で発現されうる抗原である。「標的抗原」とは、本発明の免疫療法組成物によって特異的に標的化される抗原（すなわち免疫応答の誘発が望まれる対象の抗原）である。「ＨＢＶ抗原」とは、その抗原を標的とすることがＢ型肝炎ウイルスを標的とすることでもあるような、１以上のＨＢＶタンパク質に由来するか、該タンパク質から設計されるか、または該タンパク質から生産される抗原である。
【０１２４】
免疫応答の刺激に言及する場合、用語「免疫原」は用語「抗原」のサブセットであり、したがって、場合によっては用語「抗原」と互換的に使用可能である。免疫原とは、本明細書中で使用されるように、体液性および細胞性のうち少なくとも一方の免疫応答を誘発する（すなわち免疫原性である）抗原を表し、個体への該免疫原の投与が、該個体の免疫システムが遭遇する同一または類似の抗原に対する抗原特異的免疫応答を開始するようになっているものである。１つの実施形態では、免疫原は、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答（例えばＴＨ１、ＴＨ２およびＴＨ１７のうち少なくともいずれか）および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞応答（例えばＣＴＬ応答）などの細胞性免疫応答を誘発する。
【０１２５】
所与の抗原の「免疫原性ドメイン」とは、動物に投与された時に免疫原として作用する少なくとも１つのエピトープを含有する、抗原の任意の部分、フラグメントまたはエピトープ（例えばペプチドフラグメントもしくはサブユニット、または抗体エピトープもしくはその他の立体構造依存的エピトープ）であってよい。したがって、免疫原性ドメインは単一アミノ酸より大きく、かつ少なくとも、免疫原として作用することができる少なくとも１つのエピトープを含有するのに十分な大きさである。例えば、単一タンパク質は複数の異なる免疫原性ドメインを含有することができる。免疫原性ドメインは、立体構造依存的なドメインが考えられる体液性免疫応答の場合など、タンパク質内において直線状の配列である必要はない。
【０１２６】
所与のタンパク質の「機能ドメイン」とは、該タンパク質に関連するか、該タンパク質に帰するか、または該タンパク質によって行なわれる少なくとも１つの生物学的または化学的機能の直接または間接的原因である配列または構造を備えている、該タンパク質の一部または機能単位である。例えば、機能ドメインは、酵素活性の活性部位、リガンド結合部位、受容体結合部位、カルシウムのような分子もしくは構成部分の結合部位、リン酸化部位、またはトランス活性化ドメインを含むことができる。ＨＢＶ機能ドメインの例には、限定するものではないが、ｐｒｅ‐Ｓ１内のウイルスの肝細胞受容体ドメイン、またはポリメラーゼの逆転写酵素ドメインもしくはＲＮａｓｅＨドメインが挙げられる。
【０１２７】
所与のタンパク質の「構造ドメイン」とは、同定可能な構造（例えば、該構造はある種類またはファミリーのタンパク質群に属しかつそのタンパク質群内のいくつかのタンパク質を示している一次または三次構造であってよい）を有し、自己安定化し、かつ／または該タンパク質の残りの部分とは独立にフォールディングしうる、該タンパク質の一部もしくは該タンパク質の全体的構造の中の要素である。構造ドメインは、該ドメインが属するタンパク質の生物学的機能と関連することが多いか、または該機能において極めて重要な役割を果たす。
【０１２８】
エピトープは、免疫システムに対して提示された時に適切な共刺激シグナルおよび該免疫システムの活性化細胞のうち少なくとも一方と関連して免疫応答を誘発するのに十分な、所与の抗原内の単一の免疫原性部位として、本明細書中において定義される。換言すれば、エピトープは、免疫システムの構成成分によって実際に認識される、抗原の一部分であり、抗原決定基と呼ばれる場合もある。当業者であれば、Ｔ細胞エピトープはＢ細胞または抗体エピトープとは大きさおよび組成において異なっていること、ＭＨＣクラスＩ経路を通じて提示されるエピトープはＭＨＣクラスＩＩ経路を通じて提示されるエピトープとは大きさおよび構造的属性において異なっていることを認識するであろう。例えば、ＭＨＣクラスＩ分子によって提示されるＴ細胞エピトープは典型的には長さ８〜１１アミノ酸であるが、ＭＨＣクラスＩＩ分子によって示されるエピトープは長さの制約がより少なく、８アミノ酸から最大２５アミノ酸以上となりうる。さらに、Ｔ細胞エピトープは該エピトープが結合する特定のＭＨＣ分子に応じて予測される構造特性を有する。多数の異なるＴ細胞エピトープが、様々なＨＢＶ株において、また多数のヒトＨＬＡ型について同定されており、そのうちのいくつかは表５に特定されている。さらに、ネズミ科動物のある種のＭＨＣハプロタイプについてのエピトープが本願において新たに発見されており、同じく表５または実施例に示されている。エピトープは直線状配列のエピトープであってもよいし、立体構造依存的エピトープ（保存された結合領域）であってもよい。ほとんどの抗体は立体構造依存的エピトープを認識する。
【０１２９】
本発明の典型的な１つの実施形態は、多重タンパク質ＨＢＶ抗原であり、かつこの実施例では、以下に詳細に記載される、疎水性の膜貫通ドメインをすべて含むＨＢＶ大型（Ｌ）表面抗原とコア抗原（ＨＢｃＡｇ）とからなる融合体である、ＨＢＶ抗原を含む融合タンパク質に関する。表面抗原およびコアは感染細胞の中で豊富に発現され、ウイルスの複製に必要であり、複数のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含有している。さらに、これらの抗原、特に表面抗原は、抗ウイルス薬療法によって誘導される可能性のある既知の突然変異部位を含有し；したがってこれらの領域は、必要に応じて、「回避」突然変異を標的とするための追加の免疫療法組成物を提供するために、改変可能である。これらのタンパク質を、特に単一の免疫療法組成物において両方のタンパク質を、標的とすることのさらなる利点は、様々なＨＢＶ遺伝子型の間で、アミノ酸レベルで高度に保存されていることである。コアおよび表面（Ｌ）タンパク質はいずれも、例えば（表４を参照）、南北アメリカおよびアジアにおいて一般的な遺伝子型である（表２）ＨＢＶ遺伝子型ＡおよびＣの間、またはＡおよびＨの間で高度に保存されている。コアタンパク質は、遺伝子型ＡおよびＣ、ならびに遺伝子型ＡおよびＨの間で９５％のアミノ酸同一性を示す。大型（Ｌ）表面タンパク質も異なるＨＢＶ遺伝子型の間で高度に保存されている、すなわち；遺伝子型ＡおよびＣの間に９０％のアミノ酸同一性が存在し、遺伝子型ＡおよびＨの間に８２％のアミノ酸同一性が存在する。
【０１３０】
【表４】
0005911983.tif 000007
したがって、１つのＨＢＶ遺伝子型を使用して設計された１つの免疫療法組成物は、保存されたエピトープを直接標的とすることにより、または遺伝子型の間で保存されたエピトープを初めに標的とする結果としてのエピトープ拡大により、極めて類似したＨＢＶ遺伝子型に対して有効な免疫応答を誘導すると予想できる。別例として、本発明の酵母系免疫療法組成物の製造は簡便であるので、該免疫療法の広い適用可能性を高めるために、異なる遺伝子型由来のタンパク質、ドメインもしくはエピトープをコードするために配列を改変すること、または、同じ構築物中に異なるＴ細胞エピトープもしくは２以上の異なるＨＢＶ遺伝子型由来のドメインおよびタンパク質のうち少なくともいずれかを全て含めることが簡単である。そのようなＨＢＶ抗原の例は、以下に詳細に説明かつ例証される。本発明のある免疫療法組成物は、単一産物中において２つのＨＢＶ抗原すなわち表面およびコアタンパク質を標的とするように設計されたが、この手法は、さらに広範囲の細胞性免疫応答をもたらすようにその他の重要な保存された免疫原性のＨＢＶウイルスタンパク質のタンパク質配列を組込むように、容易に拡張されうる。そのような追加の融合タンパク質および免疫療法組成物は本明細書中に説明かつ例証される。
【０１３１】
本発明の１つの実施形態では、本発明の組成物または方法に使用されるＨＢＶ抗原は、例えば酵母系免疫療法組成物との関連において、臨床用製品としての有用性を最適化または増強するように設計されたＨＢＶ抗原から選択される。そのようなＨＢＶ抗原は、以下の目標すなわち：（１）組換え治療薬またはワクチンにおいては感染性因子のゲノムの３分の２（２／３）以下が使用可能である、という米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）の組換えＤＮＡ諮問委員会（ＲＡＣ）のガイドラインの順守；（２）急性／自己限定的ＨＢＶ感染および慢性ＨＢＶ感染のうち少なくとも一方に対する免疫応答に関連する既知のＴ細胞エピトープを（下記に議論されるように、１つの態様では急性／自己限定的エピトープレパートリーに基づいた優先順位を備えて）最大数含めること；（３）標的の遺伝子型の間で最も重要な配列の違いを対象に含めるために、ＨＢＶの遺伝子型および／もしくは遺伝子亜型の中で最も保存されているか、または容易にコンセンサス配列に改変されうるかもしくは２以上の形態に含まれうる、免疫原性ドメイン、特にＴ細胞エピトープ（ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋エピトープ、ならびにドミナントおよび／またはサブドミナントエピトープ）を含めることを最大限または優先とすること；ならびに／または、（４）産物中のＨＢＶ抗原の配列内の不自然な接合部の数を最小限にすること、のうち１つ以上を達成する、酵母系ＨＢＶ免疫療法産物を製造するために設計されている。
【０１３２】
従って、本発明は、いくつかの実施形態において、上述の基準のうち１つ以上を満たすためだけでなく、本明細書中に別記された設計要素および抗原設計基準のうち少なくともいずれかを含めるために、所与の株におけるＨＢＶ抗原の天然に存在する配列すなわち野生型配列からの改変を含んでいる。そのような基準および抗原設計指針は、個々のＨＢＶタンパク質またはドメインであるＨＢＶ抗原のほかに、ＨＢＶタンパク質またはドメインの組み合わせおよび特に多重タンパク抗原／融合タンパク質を含むＨＢＶ抗原（例えば、２以上の異なるＨＢＶタンパク質および／または該タンパク質のドメインに由来するＨＢＶ抗原、例えばＨＢＶの表面タンパク質、ポリメラーゼ、コア、ｅ抗原、およびＸ抗原のうち少なくともいずれかに由来する抗原の組み合わせなど）を含む、酵母系免疫療法薬に適用可能である。当然のことであるが、ＨＢＶ抗原の複雑さが増すにつれて、上記基準のうちより多くの利用が抗原の構築において実現される。
【０１３３】
したがって、本発明の１つの実施形態では、酵母によって発現されるタンパク質または融合タンパク質として本発明に有用なＨＢＶ抗原は、ＨＢＶゲノムの３分の２（２／３）未満に相当するヌクレオチド配列によってコードされるＨＢＶ配列を含む（すなわち、該抗原は、全体でＨＢＶゲノムの３分の２（２／３）未満を占めるかまたは組換え治療薬および予防薬に関するＲＡＣの要求事項を満たす核酸配列によってコードされる）。１つの態様では、この実施形態は、酵母系免疫療法薬において発現するために、完全長またはほぼ完全長の形態でＲＡＣの要求事項を満たすＨＢＶ抗原を選択することにより達成されうる（例えば、Ｘ抗原は小さく、単独で使用されるとＲＡＣの要求事項を満たすことになる）。別の態様では、この実施形態は、ＨＢＶ抗原に含められるタンパク質および／またはドメインの構造を、例えば、タンパク質を短縮するための配列の削除もしくはタンパク質からの内部配列の除去によって、タンパク質の選択された機能ドメイン、構造ドメインもしくは免疫原性ドメインのみを含めることによって、または、要するに抗原構築物中における特定のタンパク質を含めないことを選択することによって、改変することにより達成される。さらに、酵母系ＨＢＶ免疫療法薬は、１つの実施形態では、個々の抗原構築物として生産され、次いでウイルスゲノムに関係するいかなる制約にも反しない方式で併用されてもよい。
【０１３４】
本発明の別の実施形態では、上記に議論されるように、例えば免疫療法薬中に含まれるＨＢＶ抗原が上記に議論されたＲＡＣの要求事項のような別の設計上の留意事項を満たすために改変済みである場合、ＨＢＶ抗原構築物（タンパク質または融合タンパク質）中へのＴ細胞エピトープの包含は最大化される。この実施形態では、酵母系免疫療法薬に有用なＨＢＶ抗原は、免疫原性ドメインの数、および１つの態様ではＨＢＶ抗原中に保持されるＴ細胞エピトープの数を、最大化するという目標で改変される。１つの態様では、ＨＢＶ抗原中のＴ細胞エピトープの包含は以下すなわち：
急性／自己限定的ＨＢＶ感染および慢性ＨＢＶ感染の両方への免疫応答において同定されたエピトープ  ＞  急性／自己限定的ＨＢＶ感染への免疫応答において同定されたエピトープ  ＞  慢性ＨＢＶ感染への免疫応答において同定されたエピトープ、
のように優先順位が付けられる。この実施形態では、理論によって束縛されるものではないが、本発明者らは、急性または自己限定的ＨＢＶ感染の個体の免疫応答が、慢性ＨＢＶ感染の個体の免疫応答よりもウイルス感染の排除においてより有効である可能性があると考えている。したがって、これらの急性または自己限定的な感染においてウイルスの排除に関係しているように見えるＴ細胞エピトープ（ドミナントであれサブドミナントであれ）の包含は、免疫された個体において有益な免疫応答を誘発する可能性がより高そうであるとして優先される。さらに、この場合も理論によって束縛されるものではないが、本発明者らは、酵母系免疫療法を使用する１以上のＨＢＶ標的抗原に対する免疫応答の生成は、免疫された個体において、酵母系免疫療法薬中に含まれたエピトープに対してだけではなく、個体の体内に存在する他のＨＢＶエピトープに対しても免疫応答をもたらすであろうと考えている。この現象は、「エピトープ拡大」と呼ばれ、治療上の有益性に最も適切と思われるエピトープに集中したＨＢＶ抗原の設計を可能にし、かつ、ひいては酵母系免疫療法生成物の作用機序から、免疫システムが免疫応答を拡張して追加の標的エピトープを対象に含めることでＨＢＶに対する治療上有効または有益な免疫応答を増強することが可能となる。
【０１３５】
従って、１つの実施形態におけるＨＢＶ抗原は、１以上のＣＴＬエピトープ（例えば、適切なＭＨＣクラスＩ分子に関連して提示された場合、細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）のＴ細胞受容体によって認識されるエピトープ）を含む。１つの態様では、ＨＢＶ抗原は１以上のＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ（例えば、適切なＭＨＣクラスＩＩ分子に関連する場合、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＴ細胞受容体によって認識されるエピトープ）を含む。１つの態様では、ＨＢＶ抗原は１以上のＣＴＬエピトープおよび１以上のＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む。１つの態様では、本発明の免疫療法組成物に有用なＨＢＶ抗原は、表５に記載された１以上の典型的なＨＢＶ  ＣＴＬエピトープを含む。当業者であれば、以下に提供される手引きを前提として、任意の遺伝子型、遺伝子亜型、または株／単離物の所与のＨＢＶ配列中の、表５の各エピトープに対応する配列の部位を、いくつかのアミノ酸が表５のものとは相違する場合があるにせよ、容易に識別することができるであろう。そのような相違の例は表５に例証されている。本発明はこれらのエピトープを含む抗原に限定されない、というのも他のエピトープが当分野で知られるようになり、かつ本発明での使用を企図されるからである。１つの実施形態では、エピトープは、遺伝子型、遺伝子亜型または株／単離物の間でエピトープに１以上のアミノ酸の相違が存在する可能性があることから、ＨＢＶの所与の遺伝子型、遺伝子亜型または株／単離物内のこれらのエピトープの配列に対応するように改変されてもよい。
【０１３６】
【表５−１】
0005911983.tif 000008
【０１３７】
【表５−２】
0005911983.tif 000009
【０１３８】
【表５−３】
0005911983.tif 000010
【０１３９】
【表５−４】
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【０１４０】
【表５−５】
0005911983.tif 000012
【０１４１】
【表５−６】
0005911983.tif 000013
本発明の１つの実施形態では、有用なＨＢＶ抗原は、１または複数の酵母系免疫療法組成物において、「ドミナント」エピトープであるとされているかまたは「ドミナント」エピトープと決定された１または複数のＴ細胞エピトープ（すなわち、タンパク質全体に対するＴ細胞応答の発現に寄与するＴ細胞エピトープ、および、「イムノドミナントエピトープ」とも呼ばれる、潜在的エピトープの大集団の中でＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答を最も誘発しやすいかまたは最も容易に誘発する比較的少数のＴ細胞エピトープ群の中にあるＴ細胞エピトープ、のうち少なくとも一方であるＴ細胞エピトープ）を含む抗原を含みうる。別の実施形態では、本発明において有用なＨＢＶ抗原は、同一の、または異なるかもしくは追加の酵母系組成物において、「サブドミナント」エピトープであるとされているかまたは「サブドミナント」エピトープと決定された１または複数のＴ細胞エピトープ（すなわち、免疫原性であるがイムノドミナントエピトープほどではないＴ細胞エピトープ；該サブドミナントエピトープによって生成される免疫応答は、イムノドミナントエピトープへの免疫応答によって抑制される、または競合に負ける場合もある）を含むＨＢＶ抗原を含みうる。マウスにおけるＨＢＶ  Ｔ細胞エピトープに対するＣＴＬ応答を伴うこの作用の例については、シルムベック、Ｒ．（Schirmbeck R.）ら、ザ・ジャーナル・オブ・イムノロジー（J. immunology）、２０１０年第１６８巻、ｐ．６２５３−６２６２；またはセテ（Sette）ら、ザ・ジャーナル・オブ・イムノロジー（J. immunology）、２００１年、第１６６巻、ｐ．１３８９−１３９７、を参照のこと。本発明の１つの態様では、イムノドミナントまたはサブドミナントのエピトープを含む様々な組成物が、個体において同一の部位に投与されること、または、１つの実施形態では、個体において異なる部位に投与されること（すなわち、ドミナントエピトープを含む組成物がある部位に投与され、サブドミナントエピトープを含む組成物が異なる部位に投与されること）が考えられる。ある場合には、サブドミナントエピトープがドミナントエピトープよりも治療上有益な免疫応答を誘発する場合もある。したがって、別個の部位に投与される場合、そのような投与は、ドミナントエピトープに対する免疫応答がサブドミナントエピトープに対する免疫応答を抑制するかまたは競合して勝ることになる機会を減少させ、その結果、全体として免疫応答を最大化し、かつ個体における防御的または治療的有益性を最大化する可能性がある。異なる組成物中の異なる抗原を個体の異なる部位に投与するこの手法は、すべてのエピトープがドミナントまたはサブドミナントであっても利用することができる。イムノドミナントエピトープおよびサブドミナントエピトープはＨＢＶ感染および免疫応答において役割を果たすと認識されている（例えば、上述のセテ（Sette）ら、２００１年、および上述のシルムベック（Schirmbeck）ら、２００２年を参照されたい）。
【０１４２】
本発明の１つの実施形態では、酵母系免疫療法薬において有用なＨＢＶ抗原は、遺伝子型および遺伝子亜型のうち少なくとも一方の間で保存された免疫原性ドメイン、特にＴ細胞エピトープを最大限に含み、かつ／または、いくつかの異なる遺伝子型および遺伝子亜型のうち少なくとも一方に由来する免疫原性ドメインを含み、かつ／または、いくつかの小さな点では異なっているが様々な個体もしくは個体集団に感染するＨＢＶ遺伝子型もしくは遺伝子亜型に基づいてそのような個体もしくは個体集団を治療するように調整されている複数の酵母系免疫療法生成物を製造するために容易に改変可能な免疫原性ドメインを含んでいる。例えば、ＨＢＶ抗原は、保護または治療を受ける個体または個体集団の間で最も一般的な遺伝子型または遺伝子亜型に基づいて製造されることが可能であり、該ＨＢＶ抗原はそれらの遺伝子型に由来する最も保存された免疫原性ドメインを含む。別例として、または加えて、免疫原性ドメインはそのドメインまたはエピトープのコンセンサス配列に対応するように改変されてもよいし、２以上の改変型エピトープが構築物中に含められてもよい。
【０１４３】
酵母系免疫療法組成物のためのＨＢＶ抗原の設計に関係する本発明の任意の実施形態において、１つの態様では、ＨＢＶ抗原を含む融合タンパク質のセグメント間の人為的接合部は最小化される（すなわち、非天然の配列を含めるのは可能な程度まで制限または最小化される）。理論によって束縛されるものではないが、自然状態における進化は：ｉ）酵母のような別の細胞において良好に発現される可能性が最も高い、ウイルス内の連続した配列、およびｉｉ）それらの配列を適切に消化して免疫システムに提示することができる抗原提示細胞内のイムノプロテアソーム、をもたらしたと考えられている。本発明の酵母系免疫療法産物は、宿主の免疫システムが標的抗原を処理して提示することを可能としており；従って、多数の非天然の接合部を備えた融合タンパク質は、天然のＨＢＶタンパク質配列をより多く保持するものと比較して、酵母系免疫療法薬においてあまり有用ではない可能性がある。
【０１４４】
該融合タンパク質のうち任意のものを含む本明細書中に記載されたＨＢＶ抗原のうちいずれにおいても、以下のさらなる実施形態が適用されうる。第１に、一部の融合タンパク質に含まれるＮ末端発現配列およびＣ末端タグは任意選択であり、使用される場合は、タンパク質の発現、安定性を高めるため、かつ／または、タンパク質の同定および精製のうち少なくとも一方を可能にするための本明細書中に別記されたいくつかの異なる配列から選択されうる。別例として、Ｎ末端またはＣ末端の配列のうち一方または両方が完全に省略される。加えて、酵母で使用するのに適した様々なプロモーターが当分野で知られており、本発明によるＨＢＶ抗原の発現用に包含される。更に、短い介在型リンカー配列（例えば１、２、３、４、もしくは５アミノ酸、またはそれ以上のペプチド）が、構築物のクローニングおよび将来的な操作を容易にするための制限酵素切断部位の導入などの様々な理由で、融合タンパク質の部分間に導入されてもよい。最後に、本明細書中他所に詳細に議論されるように、本明細書中に記載された配列は例示であり、また該配列は、ＨＢＶ遺伝子型、ＨＢＶ遺伝子亜型、ＨＢＶ株もしくは単離物、またはコンセンサス配列についての優先度、ならびにドミナントおよびサブドミナントのうち少なくとも一方のＴ細胞エピトープを含む好ましいＴ細胞エピトープの包含に対応するために、配列に置換、付加、欠失を行うべく本明細書中に詳細に別記されるようにして改変されてもよい。本発明において有用ないくつかの異なる例示のＨＢＶ抗原の説明は以下に提供される。
【０１４５】
本明細書中に記載された本発明の実施形態のうちいずれか、例えば免疫療法組成物、ＨＢＶ抗原、融合タンパク質、またはそのような組成物、ＨＢＶ抗原もしくは融合タンパク質の使用に関する任意の実施形態において、１つの態様では、本発明のＨＢＶ抗原として、または融合タンパク質中もしくは免疫療法組成物中において有用なＨＢＶ表面抗原のアミノ酸は、限定するものではないが、配列番号３、配列番号７、配列番号１１、配列番号１１の２１〜４７位、配列番号１１の１７６〜４００位、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２３、配列番号２７、配列番号３１、配列番号３４の９〜４０７位、配列番号３６の６〜２５７位、配列番号４１の６〜２５７位、配列番号９２の９２〜３４３位、配列番号９３の９０〜４８８位、配列番号９７、配列番号１０１の９０〜３３８位、配列番号１０２の７〜２５４位、配列番号１０７の１〜２４９位、配列番号１０８の１〜２４９位、配列番号１０９の１〜２４９位、配列番号１１０の１〜２４９位、配列番号１１２の１〜３９９位、配列番号１１４の１〜３９９位、または配列番号１１６の１〜３９９位、配列番号１１８の１〜３９９位、配列番号１２０の１〜３９９位、配列番号１２２の１〜３９９位、配列番号１２４の１〜３９９位、配列番号１２６の１〜３９９位、配列番号１２８の２３１〜６２９位、配列番号１３０の６３〜４６１位、配列番号１３２の２８９〜６８７位、配列番号１３４の２８９〜６８７位、または異なるＨＢＶ株由来の対応する配列、を含みうる。
【０１４６】
本明細書中に記載された本発明の実施形態のうちいずれか、例えば免疫療法組成物、ＨＢＶ抗原、融合タンパク質、またはそのような組成物、ＨＢＶ抗原もしくは融合タンパク質の使用に関する任意の実施形態において、１つの態様では、本発明のＨＢＶ抗原として、または融合タンパク質中もしくは免疫療法組成物中において有用なＨＢＶポリメラーゼ抗原のアミノ酸は、限定するものではないが、配列番号２の３８３〜６０２位、配列番号６の３８１〜６００位、配列番号１０の３８１〜６００位、配列番号１０の４５３〜６８０位、配列番号１４の３７０〜５８９位、配列番号１８の３８０〜５９９位、配列番号２２の３８１〜６００位、配列番号２６の３８０〜５９９位、配列番号３０の３８１〜６００位、配列番号３６の２６０〜６０４位、配列番号３８の７〜３５１位、配列番号４０の７〜３５１位、配列番号４１の２６０〜６０４位、配列番号９２の３４６〜６９０位、配列番号９４の９０〜４３４位、配列番号９８、配列番号１０１の３３９〜５６６位、配列番号１０２の２５５〜４８２位、配列番号１０７の２５０〜４７７位、配列番号１０８の２５０〜４７７位、配列番号１０９の２５０〜４７７位、配列番号１１０の２５０〜４７７位、配列番号１２０の５８２〜８０９位、配列番号１２４の５８２〜８０９位、配列番号１２６の６４２〜８６９位、配列番号１２８の１〜２２８位、配列番号１３２の１〜２２８位、配列番号１３４の６１〜２８８位、または異なるＨＢＶ株由来の対応する配列、を含みうる。
【０１４７】
本明細書中に記載された本発明の実施形態のうちいずれか、例えば免疫療法組成物、ＨＢＶ抗原、融合タンパク質、またはそのような組成物、ＨＢＶ抗原もしくは融合タンパク質の使用に関する任意の実施形態において、１つの態様では、本発明のＨＢＶ抗原として、または融合タンパク質中もしくは免疫療法組成物中において有用なＨＢＶコア抗原のアミノ酸は、限定するものではないが、配列番号１の３１〜２１２位、配列番号５の３１〜２１２位、配列番号９の３１〜２１２位、配列番号９の３７〜１８８位、配列番号１３の３１〜２１２位、配列番号１７の３１〜２１２位、配列番号２１の３１〜２１２位、配列番号２５の１４〜１９４位、配列番号２９の３１〜２１２位、配列番号３４の４０８〜５８９位、配列番号３６の６０５〜７８６位、配列番号３８の３５２〜５３３位、配列番号３９の１６０〜３４１位、配列番号４１の６０５〜７８６位、配列番号９２の６９１〜８７２位、配列番号９５の９０〜２７１位、配列番号９９、配列番号１０１の５６７〜７１８位、配列番号１０２の４８３〜６３４位、配列番号１０５の２〜１８３位、配列番号１０５の１８４〜３９５位、配列番号１０５の３９６〜５７８位、配列番号１０５の５７９〜７６１位、配列番号１０６の２〜１８３位、配列番号１０６の３３８〜５２０位、配列番号１０７の４７８〜６２９位、配列番号１０８の４７８〜６２９位、配列番号１０９の４７８〜６２９位、配列番号１１０の４７８〜６２９位、配列番号１１２の４００〜５８１位、配列番号１１４の４００〜５８１位、配列番号１１６の４００〜５８１位、配列番号１１８の４００〜５８１位、配列番号１２０の４００〜５８１位、配列番号１２２の４００〜５８１位、配列番号１２４の４００〜５８１位、配列番号１２６の４００〜５８１位、配列番号１２８の６３０〜８１１位、配列番号１３０の４６２〜６４３位、配列番号１３２の６８８〜８６９位、配列番号１３４の６８８〜８６９位、または異なるＨＢＶ株由来の対応する配列、を含みうる。
【０１４８】
本明細書中に記載された本発明の実施形態のうちいずれか、例えば免疫療法組成物、ＨＢＶ抗原、融合タンパク質、またはそのような組成物、ＨＢＶ抗原もしくは融合タンパク質の使用に関する任意の実施形態において、１つの態様では、本発明のＨＢＶ抗原として、または融合タンパク質中もしくは免疫療法組成物中において有用なＨＢＶ  Ｘ抗原のアミノ酸は、限定するものではないが、配列番号４、配列番号８、配列番号１２、配列番号１２の２〜１５４位、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２４、配列番号２８、配列番号３２、配列番号４の５２〜６８位と後続する８４〜１２６位、配列番号８の５２〜６８位と後続する８４〜１２６位、配列番号１２の５２〜６８位と後続する８４〜１２６位、配列番号１６の５２〜６８位と後続する８４〜１２６位、配列番号２０の５２〜６８位と後続する８４〜１２６位、配列番号２４の５２〜６８位と後続する８４〜１２６位、配列番号２８の５２〜６８位と後続する８４〜１２６位、配列番号３２の５２〜６８位と後続する８４〜１２６位、配列番号３６の７８７〜９３９位、配列番号３９の７〜１５９位、配列番号９２の８７３〜１０２５位、配列番号９６の９０〜２４２位、配列番号１００、配列番号１０１の７１９〜７７８位、配列番号１０２の６３５〜６９４位、配列番号１０６の１８４〜３３７位、配列番号１０６の５２１〜６７４位、配列番号１０７の６３０〜６８９位、配列番号１０８の６３０〜６８９位、配列番号１０９の６３０〜６８９位、配列番号１１０の６３０〜６８９位、配列番号１２２の５８２〜６４１位、配列番号１２４の８１０〜８６９位、配列番号１２６の５８２〜６４１位、配列番号１３０の１〜６０位、配列番号１３２の２２９〜２８８位、配列番号１３４の１〜６０位、または異なるＨＢＶ株由来の対応する配列、を含みうる。
【０１４９】
［表面抗原およびコアタンパク質を含むＨＢＶ抗原］  本発明の１つの実施形態では、本発明の組成物または方法において使用されるＨＢＶ抗原は、ＨＢＶ抗原を含む融合タンパク質であって、該ＨＢＶ抗原は、ＨＢＶ大型（Ｌ）表面抗原もしくはその少なくとも１つの免疫原性ドメインおよびＨＢＶコアタンパク質（ＨＢｃＡｇ）もしくはその少なくとも１つの免疫原性ドメインを含むか、または、ＨＢＶ大型（Ｌ）表面抗原もしくはその少なくとも１つの免疫原性ドメインおよびＨＢＶコアタンパク質（ＨＢｃＡｇ）もしくはその少なくとも１つの免疫原性ドメインで構成される、融合タンパク質である。１つの態様では、ＨＢＶ大型（Ｌ）表面抗原およびＨＢＶコアタンパク質のうち少なくとも一方は完全長またはほぼ完全長である。本発明の任意の実施形態によれば、「完全長」タンパク質（または完全長の機能ドメインもしくは完全長の免疫学的ドメイン）に言及する場合は、本明細書中に記載されるような、またその他のかたちで既知であるかもしくは公に利用可能な配列に記載されているような、そのタンパク質または機能ドメインもしくは免疫学的ドメインの完全長アミノ酸配列を含む。タンパク質の一種の相同体でもある、「ほぼ完全長」のタンパク質またはドメインは、完全長のタンパク質またはドメインとは、そのような完全長タンパク質または完全長ドメインのＮ／Ｃ末端からの１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸の付加または欠失すなわち脱落によって、異なっている。一般にタンパク質またはドメインに言及する場合は、完全長またはほぼ完全長の両方のタンパク質、および該タンパク質のその他の相同体を含むことができる。
【０１５０】
１つの態様では、ＨＢＶ大型（Ｌ）表面抗原またはＨＢＶコアタンパク質は、それぞれ、完全長のＨＢＶ大型（Ｌ）表面抗原もしくはＨＢＶコアタンパク質の直鎖状配列の、または、Ｐｒｅ‐Ｓ１の肝細胞受容体結合部分を含むＨＢＶ大型表面抗原の一部分およびＨＢＶ小型（Ｓ）表面抗原の全てもしくは一部分の直鎖状配列の、または、配列番号９７（最適化されたＨＢＶ表面抗原、以下に記載）、配列番号９９（最適化されたコアタンパク質、以下に記載）、もしくは場合に応じて別のＨＢＶ株由来の対応する配列によって表わされる直鎖状アミノ酸配列の、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む。本発明において有用な適切なＨＢＶ表面抗原およびＨＢＶコア抗原のための様々な他の配列は、本明細書中に記載されている。１つの態様では、ＨＢＶ大型（Ｌ）表面抗原またはＨＢＶコアタンパク質は、それぞれ完全長のＨＢＶ大型（Ｌ）表面抗原もしくはＨＢＶコアタンパク質と、または本明細書中に記載された別のＨＢＶ表面抗原もしくはＨＢＶコア抗原、例えば配列番号９７（最適化されたＨＢＶ表面抗原、以下に記載）、配列番号９９（最適化されたコアタンパク質、以下に記載）、もしくは場合に応じて別のＨＢＶ株由来の対応する配列によって表わされるアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。
【０１５１】
そのような融合タンパク質は図２に概略的に表わされている。そのような融合タンパク質を含む組成物の一例は実施例１に記載されている。この実施形態では、酵母（例えばサッカロマイセス・セレビシエ）は、銅誘導性プロモーターＣＵＰ１またはＴＥＦ２プロモーターの制御下で図２に示されるような様々なＨＢＶ表面‐コア融合タンパク質を発現するように、遺伝子組換え処理された。各事例において、ＨＢＶ融合タンパク質は、配列番号３４で表わされる、Ｎ末端からＣ末端までインフレームで融合された以下の配列要素：（１）プロテアソーム分解に対する抵抗性を付与し、かつ発現を安定させるＮ末端ペプチド（例えば配列番号３４の１〜６位）；２）ＳｐｅＩ制限酵素切断部位を導入する２アミノ酸スペーサー；３）ほぼ完全長の（１位を差し引いた）ＨＢＶ遺伝子型Ｃの大型（Ｌ）表面抗原のアミノ酸配列（例えば配列番号３４の９〜４０７位：または配列番号１１の２〜４００位（配列番号１１は３５０〜３５１位において配列番号１１のＬｅｕ‐Ｖａｌ配列が配列番号３４の３５７〜３５８位のＧｌｎ‐Ａｌａ配列に置き換えられている点で配列番号３４とは異なっている））；４）ＨＢＶコア抗原のアミノ酸配列（例えば、配列番号９の３１〜２１２位または配列番号３４の４０８〜５８９位）；および、５）ヘキサヒスチジンタグ（例えば配列番号３４の５９０〜５９５位）、を備えた単一ポリペプチドであった。配列番号３４の２８〜５４位は、大型（Ｌ）表面タンパク質の肝細胞受容体部分を含む。配列番号３４は、融合タンパク質の免疫原性を増強すると考えられる複数のエピトープまたはドメインを含有する。例えば、配列番号３４に関して２０９〜２２０位、３８９〜３９７位、３６０〜３６７位、および４９９〜５０６位は、既知のＭＨＣクラスＩ結合性エピトープおよびＣＴＬエピトープのうち少なくとも一方をなす。配列番号３４の３０５〜３２８位は抗体エピトープをなす。配列番号３４の融合タンパク質をコードする核酸配列（酵母での発現用にコドンを最適化）は、本明細書中に配列番号３３で表わされている。この融合タンパク質を発現する、酵母系免疫療法組成物は、本明細書中ではＧＩ‐１３００２とも呼ばれる。
【０１５２】
本明細書中に記載された融合タンパク質のうち任意のものにおいて使用されるアミノ酸セグメントは、任意のドメインのいずれかの端部に隣接する付加アミノ酸の使用によって改変可能であり；本明細書中に提供される記載が実例である。例えば、この実施形態による融合タンパク質は、１）ほぼ完全長の（１位を差し引いた）ＨＢＶ遺伝子型Ｃの大型（Ｌ）表面抗原のアミノ酸配列（例えば配列番号１１の２〜４００位または配列番号３４の９〜４０７位）；および２）ＨＢＶコア抗原のアミノ酸配列（例えば、配列番号９の３１〜２１２位または配列番号３４の４０８〜５８９位）、を含み、かつ、Ｎ末端もしくはＣ末端配列を利用しないか、または異なるＮ末端もしくはＣ末端配列およびリンカーのうち少なくともいずれかを利用するか、ＨＢＶ配列間にリンカーを利用しないものであってよい。１つの実施形態では、配列番号３４の１〜６位で表わされるＮ末端ペプチドの代わりに、配列番号８９または配列番号９０で表わされるＮ末端ペプチドが利用されて、その後に融合タンパク質の残りの部分が続き、ヘキサヒスチジンのＣ末端タグは含まれても含まれなくてもよい。該融合タンパク質はさらに、ＨＢＶタンパク質またはドメインの間に１、２、３、４、５、６個またはそれ以上のリンカー（スペーサー）アミノ酸を含むこともできる。同じ代替実施形態は、本明細書中に記載されるような本発明で使用される任意の融合タンパク質またはＨＢＶ抗原構築物に当てはまる。
【０１５３】
この融合タンパク質の設計に使用されるＨＢＶ配列ならびに本明細書中において記載および例証のうち少なくとも一方がなされる多数のその他の配列は、特定のＨＢＶ遺伝子型（例えば遺伝子型Ａ、Ｂ、ＣまたはＤ）の単離物に基づくものである。しかしながら、１つの特定の遺伝子型、遺伝子亜型、もしくは株に基づくかまたは由来する本明細書中に記載されたＨＢＶ抗原の任意の部分に、任意の他のＨＢＶ遺伝子型、遺伝子亜型、もしくは株由来の対応する配列、または対応する配列内に生じる単一もしくは小規模なアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失の、付加または置換を行うことは、本発明の実施形態である。１つの実施形態では、ＨＢＶ抗原は、本明細書中に記載されたＨＢＶ抗原の全配列を、１つ以上の異なるＨＢＶ遺伝子型、遺伝子亜型または株／単離物由来の対応する配列で置換することにより生産されてもよい。１つのＨＢＶ遺伝子型または遺伝子亜型に由来する配列に付加または配列置換を行って別のものとすることにより、例えば、特定の個体または個体集団（例えば、所与の国または国内地域において最も一般的なＨＢＶ遺伝子型を標的とするための、その国または国内地域の個体集団）のための免疫療法組成物の特注生産が可能となる。同様に、所与のＨＢＶ株、遺伝子型もしくは亜型に由来するか、そのようなＨＢＶ株、遺伝子型もしくは亜型により決定されたか、またはそのようなＨＢＶ株、遺伝子型もしくは亜型について公開されたコンセンサス配列の全体または一部を使用して、該コンセンサス配列とより緊密または正確に一致するように所与のＨＢＶ抗原の配列に変更を加えることも、本発明の実施形態である。本発明によれば、また当分野で一般に理解されるように、「コンセンサス配列」とは、典型的には、複数の配列がアラインメントされた後に所与の配列の特定の部位において最も一般的なヌクレオチドまたはアミノ酸を基にした配列である。
【０１５４】
上記種類の改変の具体例として、ＨＢＶ抗原は、ある単離物由来の所与の配列中のＴ細胞エピトープを異なる単離物由来のＴ細胞エピトープとより緊密もしくは正確に一致するように、または該Ｔ細胞エピトープのコンセンサス配列とより緊密もしくは正確に一致するように、変更するために改変されうる。そのようなＴ細胞エピトープにはドミナントエピトープおよびサブドミナントエピトープのうち少なくとも一方が挙げられる。実際に、本発明によれば、様々なＨＢＶ遺伝子型および亜型のうち少なくとも一方に由来するコンセンサス配列、または様々なＨＢＶ遺伝子型および亜型のうち少なくとも一方に由来する配列の混合物、を組込むＨＢＶ抗原が設計されうる。主要な既知の遺伝子型それぞれに由来する典型的な配列全体にわたる主要なＨＢＶタンパク質のアラインメントは、例えば、コンセンサス配列の生成について情報が得られる公的に利用可能なソフトウェアを使用して、容易に生成されうる。更に、数多くのＨＢＶタンパク質についてのコンセンサス配列が公開されている。様々なＨＢＶ遺伝子型、遺伝子亜型および株の間でアミノ酸レベルで高度に保存がなされているので、本明細書中に記載されたものと類似または同一の全体的構造を有するＨＢＶ抗原を作出するために、本明細書中に例証されたもの以外の遺伝子型、遺伝子亜型、または株に由来するＨＢＶタンパク質の対応する部分を使用することは簡単である。そのような改変の例は本明細書中で説明および実証される。
【０１５５】
例として、同じ血清型および遺伝子型の中でさえ（すなわち、株または単離物のばらつきに起因して）同じタンパク質の配列の間に僅かな相違がある場合があるが、配列同一性におけるそのような相違は比較される配列の長さ全体にわたって典型的には２０％未満であり（すなわち、配列は少なくとも８０％同一となる）、より典型的には、配列は、比較される配列の長さ全体にわたって、少なくとも８５％同一、９０％同一、９１％同一、９２％同一、９３％同一、９４％同一、９５％同一、９６％同一、９７％同一、９８％同一、９９％同一、１００％同一となる。例えば、上述の融合タンパク質（配列番号３４）では、該融合物中で使用された大型（Ｌ）表面抗原の配列（配列番号３４の９〜４０７位）はＨＢＶ遺伝子型Ｃの単離物に由来し、かつ、同じくＨＢＶ遺伝子型Ｃの単離物由来の大型（Ｌ）表面抗原に由来する配列番号１１の２〜４００位と約９９％同一である（すなわち、配列番号１１の３５０〜３５１位（Ｇｌｎ‐Ａｌａ）には配列番号３４の３５７〜３５８位（Ｌｅｕ‐Ｖａｌ）と比較して２つの異なるアミノ酸が存在する）。しかしながら、いずれの配列も、他のＨＢＶ株由来の配列がそうであるように、本明細書中に記載された融合タンパク質での使用に適している。従って、１つの実施形態では、本明細書中に記載された融合タンパク質のうち任意のものなど、本明細書中に記載されたＨＢＶ抗原のうち任意のものにおいて利用される配列は、１つ以上の異なるＨＢＶ遺伝子型、遺伝子亜型、または株に由来する対応する配列を含むことができる。
【０１５６】
上述の、コンセンサス配列および個々のＨＢＶ遺伝子型の利用は、本明細書中に記載された様々なＨＢＶ抗原に適用されている。例えば、コンセンサス配列の設計は、配列番号３４に関して上述されたＨＢＶ表面タンパク質およびＨＢＶコアタンパク質を含有する融合タンパク質に適用された。実施例７は、配列番号３４で表わされる融合タンパク質と設計上類似しているがＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、ＣおよびＤのコンセンサス配列にそれぞれ基づいているさらなる融合タンパク質について説明している。ＨＢＶ遺伝子型Ａのコンセンサス配列に基づく、ＨＢＶ表面タンパク質およびコアタンパク質を含む融合タンパク質（図２にも概略的に示されている）は、配列番号１１２で表わされる（ＨＢＶ配列でない任意選択の配列は配列番号１１２の基本配列には含まれないが、実施例７に記載された構築物中のように本配列に加えられてもよい）、Ｎ末端からＣ末端までインフレームで融合された以下の配列要素すなわち：（１）任意選択で、プロテアソーム分解に対する抵抗性を付与し、かつ発現を安定させるように設計された、配列番号３７で表わされる合成のＮ末端ペプチドであるＮ末端ペプチドであって、配列番号８９、配列番号９０で表わされるＮ末端ペプチド、または本明細書中に記載されるような酵母系免疫療法薬とともに使用するのに適した別のＮ末端ペプチドによって置き換えられることも可能な、Ｎ末端ペプチド；（２）任意選択で、１〜３アミノ酸以上のリンカーペプチド  １個、２個、３個またはそれ以上のアミノ酸のリンカー配列、例えば２アミノ酸リンカーであるＴｈｒ‐Ｓｅｒ；（３）配列番号１１２の１〜３９９位で表わされる、ＨＢＶ遺伝子型Ａの大型（Ｌ）表面抗原のほぼ完全長の（１位を差し引いた）コンセンサス配列のアミノ酸配列；（４）配列番号１１２の４００〜５８１位で表わされるＨＢＶ遺伝子型Ａのコア抗原のコンセンサス配列のアミノ酸配列；および（５）任意選択で、ヘキサヒスチジンタグ、を備えた単一ポリペプチドである。配列番号１１２の融合タンパク質をコードする核酸配列（酵母での発現用にコドンを最適化）は、本明細書中に配列番号１１１で表わされている。この融合タンパク質を発現する、酵母系免疫療法組成物は、本明細書中ではＧＩ‐１３００６とも呼ばれる。
【０１５７】
実施例７はさらに、配列番号３４で表わされる融合タンパク質に設計上類似しているがＨＢＶ遺伝子型Ｂのコンセンサス配列に基づくものである融合タンパク質についても述べている。図２にも概略的に示されているこの融合タンパク質は、配列番号１１４で表わされる（ＨＢＶ配列でない任意選択の配列は配列番号１１４の基本配列には含まれないが、実施例７に記載された構築物中のように本配列に加えられてもよい）、Ｎ末端からＣ末端までインフレームで融合された以下の配列要素すなわち：（１）任意選択で、プロテアソーム分解に対する抵抗性を付与し、かつ発現を安定させるように設計された、配列番号３７で表わされる合成のＮ末端ペプチドであるＮ末端ペプチドであって、配列番号８９、配列番号９０で表わされるＮ末端ペプチド、または本明細書中に記載されるような酵母系免疫療法薬とともに使用するのに適した別のＮ末端ペプチドによって置き換えられることも可能な、Ｎ末端ペプチド；（２）任意選択で、１〜３アミノ酸以上のリンカーペプチド  １個、２個、３個またはそれ以上のアミノ酸のリンカー配列、例えば２アミノ酸リンカーであるＴｈｒ‐Ｓｅｒ；（３）配列番号１１４の１〜３９９位で表わされる、ＨＢＶ遺伝子型Ｂの大型（Ｌ）表面抗原のほぼ完全長の（１位を差し引いた）コンセンサス配列のアミノ酸配列；（４）配列番号１１４の４００〜５８１位で表わされるＨＢＶ遺伝子型Ｂのコア抗原のコンセンサス配列のアミノ酸配列；および（５）任意選択で、ヘキサヒスチジンタグ、を備えた単一ポリペプチドである。配列番号１１４の融合タンパク質をコードする核酸配列（酵母での発現用にコドンを最適化）は、本明細書中に配列番号１１３で表わされている。この融合タンパク質を発現する、酵母系免疫療法組成物は、本明細書中ではＧＩ‐１３００７とも呼ばれる。
【０１５８】
実施例７は、配列番号３４で表わされる融合タンパク質に設計上類似しているがＨＢＶ遺伝子型Ｃのコンセンサス配列に基づくものである融合タンパク質について述べている。図２にも概略的に示されているこの融合タンパク質は、配列番号１１６で表わされる（ＨＢＶ配列でない任意選択の配列は配列番号１１６の基本配列には含まれないが、実施例７に記載された構築物中のように本配列に加えられてもよい）、Ｎ末端からＣ末端までインフレームで融合された以下の配列要素すなわち：（１）任意選択で、プロテアソーム分解に対する抵抗性を付与し、かつ発現を安定させるように設計された、配列番号３７で表わされる合成のＮ末端ペプチドであるＮ末端ペプチドであって、配列番号８９、配列番号９０で表わされるＮ末端ペプチド、または本明細書中に記載されるような酵母系免疫療法薬とともに使用するのに適した別のＮ末端ペプチドによって置き換えられることも可能な、Ｎ末端ペプチド；（２）任意選択で、１〜３アミノ酸以上のリンカーペプチド  １個、２個、３個またはそれ以上のアミノ酸のリンカー配列、例えば２アミノ酸リンカーであるＴｈｒ‐Ｓｅｒ；（３）配列番号１１６の１〜３９９位で表わされる、ＨＢＶ遺伝子型Ｃの大型（Ｌ）表面抗原のほぼ完全長の（１位を差し引いた）コンセンサス配列のアミノ酸配列；（４）配列番号１１６の４００〜５８１位で表わされるＨＢＶ遺伝子型Ｃのコア抗原のコンセンサス配列のアミノ酸配列；および（５）任意選択で、ヘキサヒスチジンタグ、を備えた単一ポリペプチドである。配列番号１１６の融合タンパク質をコードする核酸配列（酵母での発現用にコドンを最適化）は、本明細書中に配列番号１１５で表わされている。この融合タンパク質を発現する、酵母系免疫療法組成物は、本明細書中ではＧＩ‐１３００８とも呼ばれる。
【０１５９】
実施例７は、配列番号３４で表わされる融合タンパク質に設計上類似しているがＨＢＶ遺伝子型Ｄのコンセンサス配列に基づくものである融合タンパク質についても述べている。図２にも概略的に示されているこの融合タンパク質は、配列番号１１８で表わされる（ＨＢＶ配列でない任意選択の配列は配列番号１１８の基本配列には含まれないが、実施例７に記載された構築物中のように本配列に加えられてもよい）、Ｎ末端からＣ末端までインフレームで融合された以下の配列要素すなわち：（１）任意選択で、プロテアソーム分解に対する抵抗性を付与し、かつ発現を安定させるように設計された、配列番号３７で表わされる合成のＮ末端ペプチドであるＮ末端ペプチドであって、配列番号８９、配列番号９０で表わされるＮ末端ペプチド、または本明細書中に記載されるような酵母系免疫療法薬とともに使用するのに適した別のＮ末端ペプチドによって置き換えられることも可能な、Ｎ末端ペプチド；（２）任意選択で、１〜３アミノ酸以上のリンカーペプチド  １個、２個、３個またはそれ以上のアミノ酸のリンカー配列、例えば２アミノ酸リンカーであるＴｈｒ‐Ｓｅｒ；（３）配列番号１１８の１〜３９９位で表わされる、ＨＢＶ遺伝子型Ｄの大型（Ｌ）表面抗原のほぼ完全長の（１位を差し引いた）コンセンサス配列のアミノ酸配列；（４）配列番号１１８の４００〜５８１位で表わされるＨＢＶ遺伝子型Ｄのコア抗原のコンセンサス配列のアミノ酸配列；および（５）任意選択で、ヘキサヒスチジンタグ、を備えた単一ポリペプチドである。配列番号１１８を含みかつＮ末端およびＣ末端のペプチドおよびリンカーを備えている実施例７に記載された完全な融合タンパク質のアミノ酸配列は、本明細書中に配列番号１５１で表わされている。配列番号１１８または配列番号１５１の融合タンパク質をコードする核酸配列（酵母での発現用にコドンを最適化）は、本明細書中に配列番号１１７で表わされている。この融合タンパク質を発現する、酵母系免疫療法組成物は、本明細書中ではＧＩ‐１３００９とも呼ばれる。
【０１６０】
［表面抗原、コアタンパク質、ポリメラーゼおよびＸ抗原を含むＨＢＶ抗原］  本発明の１つの実施形態では、本発明の組成物または方法において使用されるＨＢＶ抗原は、ＨＢＶ抗原を含む融合タンパク質であり、該ＨＢＶ抗原は、以下すなわち：ＨＢＶ表面抗原（大型（Ｌ）、中型（Ｍ）、もしくは小型（Ｓ））もしくはその少なくとも１つの構造ドメイン、機能ドメイン、もしくは免疫原性ドメイン）、ＨＢＶポリメラーゼもしくはその少なくとも１つの構造ドメイン、機能ドメイン、もしくは免疫原性ドメイン、ＨＢＶコアタンパク質（ＨＢｃＡｇ）もしくはＨＢＶ  ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）もしくはその少なくとも１つの構造ドメイン、機能ドメイン、もしくは免疫原性ドメイン、およびＨＢＶ  Ｘ抗原（ＨＢｘ）もしくはその少なくとも１つの構造ドメイン、機能ドメイン、免疫原性ドメイン、を含むか、または、前記抗原もしくはドメインで構成される。１つの態様では、ＨＢＶ表面抗原、ＨＢＶポリメラーゼ、ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶ  ｅ抗原、ＨＢＶ  Ｘ抗原またはこれらのドメインのうちの任意の１つ以上は完全長またはほぼ完全長である。１つの態様では、ＨＢＶ表面抗原、ＨＢＶポリメラーゼ、ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶ  ｅ抗原、ＨＢＶ  Ｘ抗原またはこれらのドメインのうちの任意の１つ以上は、それぞれ完全長のＨＢＶ表面抗原、ＨＢＶポリメラーゼ、ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶ  ｅ抗原、ＨＢＶ  Ｘ抗原もしくはこれらのドメインの直鎖状配列の、または、配列番号９７（最適化されたＨＢＶ表面抗原、後述）、配列番号９８（最適化されたＨＢＶポリメラーゼ、後述）、配列番号９９（最適化されたコアタンパク質、後述）、もしくは配列番号１００（最適化されたＸ抗原、後述）で表わされる直鎖状アミノ酸配列、もしくは場合に応じて別のＨＢＶ株由来の対応する配列の、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％を含む。１つの態様では、ＨＢＶ表面抗原、ＨＢＶポリメラーゼ、ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶ  ｅ抗原、ＨＢＶ  Ｘ抗原またはこれらのドメインのうちの任意の１つ以上は、それぞれ完全長のＨＢＶ表面抗原、ＨＢＶポリメラーゼ、ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶ  ｅ抗原、ＨＢＶ  Ｘ抗原もしくはこれらのドメインと、または、配列番号９７（最適化されたＨＢＶ表面抗原、後述）、配列番号９８（最適化されたＨＢＶポリメラーゼ、後述）、配列番号９９（最適化されたコアタンパク質、後述）、もしくは配列番号１００（最適化されたＸ抗原、後述）で表わされるアミノ酸配列、もしくは場合に応じて別のＨＢＶ株由来の対応する配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である。ＨＢＶ表面抗原、ＨＢＶポリメラーゼ抗原、ＨＢＶコア抗原、およびＨＢＶ  Ｘ抗原に適した実例となる様々な配列は本明細書中に記載されている。
【０１６１】
本発明の１つの実施形態では、本発明の組成物または方法において使用されるＨＢＶ抗原は、ＨＢＶ抗原を含む融合タンパク質であり、該ＨＢＶ抗原は、以下すなわち：ＨＢＶ大型（Ｌ）表面抗原のＰｒｅ‐Ｓ１の肝細胞受容体部分もしくはその少なくとも１つの免疫原性ドメイン、ＨＢＶ小型（Ｓ）表面抗原（ＨＢｓＡｇ）もしくはその少なくとも１つの免疫原性ドメイン、ＨＢＶポリメラーゼの逆転写酵素（ＲＴ）ドメインもしくはその少なくとも１つの免疫原性ドメイン、ＨＢＶコアタンパク質（ＨＢｃＡｇ）もしくはその少なくとも１つの免疫原性ドメイン、およびＨＢＶ  Ｘ抗原（ＨＢｘ）もしくはその少なくとも１つの免疫原性ドメイン、を含むか、または、前記の抗原もしくはドメインで構成される。１つの態様では、ＨＢＶ大型（Ｌ）表面抗原のＰｒｅ‐Ｓ１の肝細胞受容体部分、ＨＢＶ小型（Ｓ）表面抗原、ＨＢＶポリメラーゼのＲＴドメイン、ＨＢＶコアタンパク質、Ｘ抗原、またはこれらのドメインのうち任意の１つ以上は完全長またはほぼ完全長である。１つの態様では、ＨＢＶ大型（Ｌ）表面抗原のＰｒｅ‐Ｓ１の肝細胞受容体部分、ＨＢＶ小型（Ｓ）表面抗原、ＨＢＶポリメラーゼのＲＴドメイン、ＨＢＶコアタンパク質、Ｘ抗原、またはこれらのドメインのうち任意の１つ以上は、それぞれ完全長のＨＢＶ大型（Ｌ）表面抗原のＰｒｅ‐Ｓ１の肝細胞受容体部分、ＨＢＶ小型（Ｓ）表面抗原、ＨＢＶポリメラーゼのＲＴドメイン、ＨＢＶコアタンパク質、Ｘ抗原もしくはこれらのドメインの直鎖状配列の、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％を含む。１つの態様では、ＨＢＶ大型（Ｌ）表面抗原のＰｒｅ‐Ｓ１の肝細胞受容体部分、ＨＢＶ小型（Ｓ）表面抗原、ＨＢＶポリメラーゼのＲＴドメイン、ＨＢＶコアタンパク質、Ｘ抗原、またはこれらのドメインのうち任意の１つ以上は、それぞれ完全長のＨＢＶ大型（Ｌ）表面抗原のＰｒｅ‐Ｓ１の肝細胞受容体部分、ＨＢＶ小型（Ｓ）表面抗原、ＨＢＶポリメラーゼのＲＴドメイン、ＨＢＶコアタンパク質、Ｘ抗原もしくはこれらのドメインと、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である。
【０１６２】
そのような融合タンパク質は図３に概略的に示されている。この融合タンパク質を含む組成物の一例は実施例２に記載されている。この実施形態では、酵母（例えばサッカロマイセス・セレビシエ）は、銅誘導性プロモーターＣＵＰ１またはＴＥＦ２プロモーターの制御下で図３に概略的に示されるような様々なＨＢＶ融合タンパク質を発現するように遺伝子組換え処理された。一例において、該融合タンパク質は、配列番号３６で表わされる、Ｎ末端からＣ末端までインフレームで融合された以下の配列要素：（１）プロテアソーム分解に対する抵抗性を付与し、かつ発現を安定させるＮ末端ペプチド（例えば配列番号３６の１〜５位）；２）ＨＢＶ遺伝子型Ｃの、ＨＢＶ大型（Ｌ）表面タンパク質のｐｒｅ‐Ｓ１部分の肝細胞受容体ドメインのアミノ酸配列（Ｌに特有）（例えば配列番号１１の２１〜４７位または配列番号３６の６〜３２位）；３）完全長のＨＢＶ遺伝子型Ｃの小型（Ｓ）表面抗原のアミノ酸配列（例えば配列番号１１の１７６〜４００位または配列番号３６の３３〜２５７位）；４）配列のクローニングおよび操作を容易にする２アミノ酸スペーサー／リンカー（例えば配列番号３６の２５８および２５９位）；５）ＨＢＶ遺伝子型Ｃのポリメラーゼの逆転写酵素ドメインを含む部分のアミノ酸配列（例えば配列番号１０の２４７〜６９１位または配列番号３６の２６０〜６０４位）；６）ＨＢＶ遺伝子型Ｃのコアタンパク質（例えば配列番号９の３１〜２１２位または配列番号３６の６０５〜７８６位）；７）ＨＢＶ遺伝子型ＣのＸ抗原のアミノ酸配列（例えば配列番号１２の２〜１５４位または配列番号３６の７８７〜９３９位）；および、８）ヘキサヒスチジンタグ（例えば配列番号３６の９４０〜９４５位）、を備えた単一ポリペプチドである。配列番号３６の融合タンパク質をコードする核酸配列（酵母での発現用にコドンを最適化）は、本明細書中に配列番号３５で表されている。この融合タンパク質を発現する、酵母系免疫療法組成物は、本明細書中ではＧＩ‐１３００５とも呼ばれる。
【０１６３】
この実施形態１つの代替実施例では、上述の実施形態によるかまたは後述の融合タンパク質は、１）ＨＢＶ遺伝子型Ｃの、ＨＢＶ大型（Ｌ）表面タンパク質のｐｒｅ‐Ｓ１部分の肝細胞受容体ドメインのアミノ酸配列（Ｌに特有）（例えば配列番号１１の２１〜４７位または配列番号３６の６〜３２位）；２）完全長のＨＢＶ遺伝子型Ｃの小型（Ｓ）表面抗原のアミノ酸配列（例えば配列番号１１の１７６〜４００位または配列番号３６の３３〜２５７位）；３）ＨＢＶ遺伝子型Ｃのポリメラーゼの逆転写酵素ドメインを含む部分のアミノ酸配列（例えば配列番号１０の２４７〜６９１位または配列番号３６の２６０〜６０４位）；４）ＨＢＶ遺伝子型Ｃのコアタンパク質（例えば配列番号９の３１〜２１２位または配列番号３６の６０５〜７８６位）；および５）ＨＢＶ遺伝子型ＣのＸ抗原のアミノ酸配列（例えば配列番号１２の２〜１５４位または配列番号３６の７８７〜９３９位）を含むことが可能であり、かつ、Ｎ末端もしくはＣ末端配列を利用しないか、または異なるＮ末端もしくはＣ末端配列を利用するか、および／または、ＨＢＶ配列間にリンカーを使用するかもしくは使用しない。
【０１６４】
１つの実施形態では、配列番号３６の１〜５位で表わされるＮ末端ペプチドの代わりに、配列番号８９または配列番号９０で表わされるＮ末端ペプチドが利用されて（またはその相同体）、その後に、説明した融合タンパク質の残りの部分が続く。実施例２はそのような融合タンパク質について説明しており、該融合タンパク質は図３の構築物の概略図でも例証されている。この実施形態では、酵母（例えばサッカロマイセス・セレビシエ）は、この場合も、銅誘導性プロモーターＣＵＰ１またはＴＥＦ２プロモーターの制御下で図３に概略的に示されるような様々なＨＢＶ融合タンパク質を発現するように遺伝子組換え処理された。この第２の例では、該融合タンパク質は、配列番号９２で表わされる、Ｎ末端からＣ末端までインフレームで融合された以下の配列要素：（１）プロテアソーム分解に対する抵抗性を付与し、かつ発現を安定または増強させるＮ末端ペプチド（配列番号８９、配列番号９２の１〜８９位）；２）配列のクローニングおよび操作を容易にする２アミノ酸スペーサー／リンカー（Ｔｈｒ‐Ｓｅｒ）（配列番号９２の９０〜９１位）；３）ＨＢＶ遺伝子型ＣのＨＢＶ大型（Ｌ）表面タンパク質のｐｒｅ‐Ｓ１部分の肝細胞受容体ドメインのアミノ酸配列（Ｌに特有）（例えば配列番号１１の２１〜４７位または配列番号９２の９２〜１１８位）；４）完全長のＨＢＶ遺伝子型Ｃの小型（Ｓ）表面抗原のアミノ酸配列（例えば配列番号１１の１７６〜４００位または配列番号９２の１１９〜３４３位）；５）配列のクローニングおよび操作を容易にする２アミノ酸スペーサー／リンカー（Ｌｅｕ‐Ｇｌｕ）（例えば配列番号９２の３４４‐３４５位）；６）ＨＢＶ遺伝子型Ｃのポリメラーゼの逆転写酵素ドメインを含む部分のアミノ酸配列（例えば配列番号１０の２４７〜６９１位または配列番号９２の３４６〜６９０位）；７）ＨＢＶ遺伝子型Ｃのコアタンパク質（例えば配列番号９の３１〜２１２位または配列番号９２の６９１〜８７２位）；８）ＨＢＶ遺伝子型ＣのＸ抗原のアミノ酸配列（例えば、配列番号１２の２〜１５４位または配列番号９２の８７３〜１０２５位）；および、９）ヘキサヒスチジンタグ（例えば配列番号９２の１０２６〜１０３１位）、を備えた単一ポリペプチドである。配列番号９２の融合タンパク質をコードする核酸配列（酵母での発現用にコドンを最適化）は、本明細書中に配列番号９１で表されている。この融合タンパク質を発現する、酵母系免疫療法組成物は、本明細書中ではＧＩ‐１３００４とも呼ばれる。
【０１６５】
配列番号３６および配列番号９２は、配列番号３４について上述されたいくつかのものなど、融合タンパク質の免疫原性を増強すると考えられる複数のエピトープまたはドメインを含有する。加えて、この融合タンパク質中に使用される逆転写酵素ドメインは、様々な抗ウイルス薬を用いた治療に対する薬物抵抗性の応答として突然変異に至ることが知られている数か所のアミノ酸部位を含有しており、したがって、これらのうち任意の１つ以上を、特定の薬剤抵抗性（回避）突然変異を標的とする治療的または予防的な免疫療法薬を提供するためにこの融合タンパク質中で変異させてもよい。これらのアミノ酸部位は、配列番号３６に関しては、アミノ酸４３２位（Ｖａｌ、ラミブジン治療後にＬｅｕに突然変異することが知られている）；４３９位（Ｌｅｕ、ラミブジン治療後にＭｅｔに突然変異することが知られている）；４５３位（Ａｌａ、テノフォビル治療後にＴｈｒに突然変異することが知られている）；４６３位（Ｍｅｔ、ラミブジン治療後にＩｌｅまたはＶａｌに突然変異することが知られている）；および４９５位（Ａｓｎ、アデフォビル治療後にＴｈｒに突然変異することが知られている）である。これらのアミノ酸部位は、配列番号９２に関しては、アミノ酸５１８位（Ｖａｌ、ラミブジン治療後にＬｅｕに突然変異することが知られている）；５２５位（Ｌｅｕ、ラミブジン治療後にＭｅｔに突然変異することが知られている）；５３９位（Ａｌａ、テノフォビル治療後にＴｈｒに突然変異することが知られている）；５４９位（Ｍｅｔ、ラミブジン治療後にＩｌｅまたはＶａｌに突然変異することが知られている）；および５８１位（Ａｓｎ、アデフォビル治療後にＴｈｒに突然変異することが知られている）である。同定されるかまたは同定済みのさらなる薬物抵抗性突然変異が、必要に応じて、本明細書中に提供される手引きを使用してそのような突然変異を標的とするさらなる免疫療法薬を作出するために、加えられてもよい。
【０１６６】
本発明の１つの実施形態では、配列番号３６の９０１位のバリンまたは配列番号９２の９８７位のバリン（または配列番号１２の１１６位のバリンもしくは任意のＸ抗原もしくはそのドメインであってこの対応する部位を含んでいるもの）は、配列番号５１として同定されたＴ細胞エピトープを作出するためにロイシンに置換される（表５を参照）。
【０１６７】
上記に議論されるように、本発明は、臨床的有用性を高めるかまたは感染因子に関する治療薬もしくは予防薬に必要な基準を満たす酵母系免疫療法薬に含めるための、天然に存在する配列または野生型配列からのＨＢＶ抗原の改変を含む。例として、以下の議論および実施例５〜８は、ＲＡＣの要求事項のうち１つ以上の基準、最も有益な免疫応答に関係する免疫原性ドメインの最大化、保存されたＴ細胞エピトープの最大化、特定のＨＢＶ遺伝子型についてのコンセンサス配列の利用、ならびにＨＢＶ抗原内の人為的接合部の最少化、のうち少なくともいずれかを考慮に入れる、酵母系免疫療法薬の設計および構築について説明している。例えば、以下の酵母系免疫療法組成物は、上記に指定された目的の要求事項を満たし、かつＨＢＶの主要タンパク質すなわちＨＢＶ表面抗原、ポリメラーゼ、
コアおよびＸ抗原の各々の一部を含むＨＢＶ融合タンパク質を例証する。この融合タンパク質を設計するために、該融合物内の個々のＨＢＶ抗原は、タンパク質中のセグメントの大きさを縮小するために（例えばタンパク質がＨＢＶゲノムの２／３未満に相当することが確実となるように）、また、急性／自己限定的ＨＢＶ感染および慢性ＨＢＶ感染のうち少なくとも一方における免疫応答に関係しているＴ細胞エピトープを最大限含むため、保存されたエピトープを最大限にするため、ならびに非天然の配列を最小限にするために、最適化または改変された。当業者であれば、この手引きを使用して、本発明のＨＢＶ抗原で使用するための別例の最適化されたＨＢＶタンパク質を製造することが可能である。
【０１６８】
実施例５においてより詳細に記載されるように、ＨＢＶ表面抗原セグメントを構築するために、ＨＢＶ遺伝子型Ｃ由来の完全長の大型（Ｌ）表面抗原タンパク質は、急性／自己限定的感染に関連するＴ細胞エピトープを含めるための優先順位付けを使用して、Ｎ末端およびＣ末端配列の短縮により大きさが縮小される一方、既知のＭＨＣ  Ｔ細胞エピトープを最大限含むようになされた。得られた表面抗原セグメントは配列番号９７で表わされる。
【０１６９】
ＨＢＶポリメラーゼを含む融合タンパク質のセグメントを構築するために（実施例５を参照）、ＨＢＶ遺伝子型Ｃ由来の完全長ポリメラーゼのかなりの部分は（ＲＴドメイン由来の）活性部位ドメインを含めることに重点をおいた結果として除去されたが、この活性部位ドメインはＨＢＶ遺伝子型および単離物の間で最も保存された該タンパク質の領域であり、かつ薬物抵抗性突然変異が生じることが知られているいくつかの部位を含んでいる。該ＨＢＶポリメラーゼセグメントは、上記に議論された優先順位付け戦略を使用して既知のＴ細胞エピトープを最大限とし、かつ該Ｔ細胞エピトープのうち１つをアミノ酸が１つだけ異なる既知のＴ細胞エピトープと正確に一致させて改変するように、設計された。得られたＨＢＶポリメラーゼ抗原セグメントは配列番号９８で表わされる。
【０１７０】
ＨＢＶコア抗原を含む融合タンパク質のセグメントを構築するために（実施例５を参照）、ＨＢＶ遺伝子型Ｃ由来の完全長コアタンパク質は、該タンパク質の大きさを縮小するために改変され、その一方で特定の既知Ｔ細胞エピトープとの完全一致が作出されるように配列を包含および改変することによりＴ細胞エピトープの数が最大化された。加えて、アルギニンリッチである（正電荷を有する）ことの多い天然の酵母ＲＮＡ結合タンパク質との競合阻害により酵母に対して有毒となりうる、極端に正電荷の多いＣ末端を含有する配列は、除去された。得られたＨＢＶコア抗原セグメントは配列番号９９で表わされる。
【０１７１】
ＨＢＶ  Ｘ抗原を含む融合タンパク質のセグメントを構築するために（実施例５を参照）、ＨＢＶ遺伝子型Ｃ由来の完全長Ｘ抗原は、該タンパク質の大きさを縮小するために短縮され、その一方でほとんどの既知Ｔ細胞エピトープが最大限維持された。公開されているＴ細胞エピトープ配列に対応させるために単一アミノ酸の変更も導入され、セグメントの端部においてＴ細胞エピトープに隣接する配列は、抗原提示細胞による正確なエピトープの効率的な抗原処理および提示を容易にするために保持された。得られたＨＢＶ  Ｘ抗原セグメントは配列番号１００で表わされる。
【０１７２】
最後に、実施例５に記載されるように、完全な融合タンパク質は、上述の４つのＨＢＶセグメントを連結して臨床用に最適化された単一タンパク質を形成することにより構築された。２つの異なる実例の融合タンパク質が作出されたが、該タンパク質は各々、酵母内における該融合タンパク質の発現の増強および安定化のうち少なくとも一方のために付加された異なるＮ末端ペプチドを備えるものであった。本明細書中に記載された酵母系免疫療法組成物において使用されるその他のタンパク質全てに関して本明細書中で先述したように、Ｎ末端ペプチドは異なる合成もしくは天然のＮ末端ペプチドまたはその相同体に置き換えられても良いし、Ｎ末端ペプチドは全く含まれず部位１にメチオニンが含まれてもよい。加えて、１アミノ酸、２アミノ酸または３アミノ酸以上のリンカー配列が、必要に応じて融合タンパク質のセグメント間に付加されてもよい。例えば、Ｔｈｒ‐Ｓｅｒのような２アミノ酸リンカー配列が、融合タンパク質中のＮ末端ペプチドと最初のＨＢＶ抗原との間、および融合タンパク質中の２つのＨＢＶ抗原の間のうち少なくともいずれか一方に挿入されうる。さらに、上記の構築物は基本骨格として遺伝子型Ｃ由来のＨＢＶタンパク質を使用して設計されたが、任意の他のＨＢＶ遺伝子型、遺伝子亜型、または異なる株もしくは単離物由来のＨＢＶタンパク質がタンパク質セグメントを設計するために使用されてもよい。１つの態様では、以下のさらなる融合タンパク質において記載されているように、所与のＨＢＶ遺伝子型由来のコンセンサス配列がタンパク質セグメントの設計または形成に使用されてもよい。最後に、本明細書中に記載されるような融合タンパク質から１つ以上のセグメントが除外される場合は、残りのセグメント由来の配列は、追加のＴ細胞エピトープおよび残りのタンパク質のフランキング領域を含めるために、必要に応じて長さが拡張されてもよい。
【０１７３】
実施例５は、図３に構築物の概略図によっても示されているＨＢＶ融合タンパク質について記載しており、該ＨＢＶ融合タンパク質は、配列番号１０１で表わされる、Ｎ末端からＣ末端までインフレームで融合された以下の配列要素すなわち：（１）配列番号８９で表わされる、プロテアソーム分解に対する抵抗性を付与し、かつ発現を安定させるための、αファクタープレプロ配列であるＮ末端ペプチド（配列番号１０１の１〜８９位）；（２）配列番号９７で表わされる、ＨＢＶ大型（Ｌ）表面抗原の最適化された部分（配列番号１０１の９０〜３３８位、例えば、配列番号１１の１２０〜３６８位にエピトープの最適化を加えたものに相当）；（３）配列番号９８で表わされる、ＨＢＶポリメラーゼの逆転写酵素（ＲＴ）ドメインの最適化された部分（配列番号１０１の３３９〜５６６位、例えば、配列番号１０の４５３〜６８０位にエピトープの最適化を加えたものに相当）；（４）配列番号９９で表わされる、ＨＢＶコアタンパク質の最適化された部分（配列番号１０１の５６７〜７１８位、例えば、配列番号９の３７〜１８８位にエピトープの最適化を加えたものに相当）；（５）配列番号１００で表わされる、ＨＢＶ  Ｘ抗原の最適化された部分（配列番号１０１の７１９〜７７８位、例えば、配列番号１２の５２〜１２７位にエピトープの最適化を加えたものに相当）；および（６）ヘキサヒスチジンタグ（例えば配列番号１０１の７７９〜７８４位）、を備えた単一のポリペプチドである。１つの実施形態では、トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）‐セリン（ＳｅｒまたはＳ）のリンカー配列が配列番号８９のＮ末端ペプチドと最初のＨＢＶタンパク質（ＨＢＶ大型表面抗原の最適化された部分）との間に使用され、その結果配列番号１０１の全長は２アミノ酸分長くなっている。
【０１７４】
実施例５はさらに、図３に構築物の概略図によっても示されている融合タンパク質であって、配列番号１０２で表わされる、Ｎ末端からＣ末端までインフレームで融合された以下の配列要素すなわち：（１）配列番号３７で表わされる、プロテアソーム分解に対する抵抗性を付与し、かつ発現を安定化するように設計された合成Ｎ末端ペプチドであるＮ末端ペプチド（配列番号１０２の１〜６位）；（２）配列番号９７の２〜２４８位で表わされる、ＨＢＶ大型（Ｌ）表面抗原の最適化された部分（配列番号１０２の７〜２５４位、例えば、配列番号１１の１２０〜３６８位にエピトープの最適化を加えたものに相当）；（３）配列番号９８で表わされる、ＨＢＶポリメラーゼの逆転写酵素（ＲＴ）ドメインの最適化された部分（配列番号１０２の２５５〜４８２位、例えば、配列番号１０の４５３〜６８０位にエピトープの最適化を加えたものに相当）；（４）配列番号９９で表わされる、ＨＢＶコアタンパク質の最適化された部分（配列番号１０２の４８３〜６３４位、例えば、配列番号９の３７〜１８８位にエピトープの最適化を加えたものに相当）；（５）配列番号１００で表わされる、ＨＢＶ  Ｘ抗原の最適化された部分（配列番号１０２の６３５〜６９４位、例えば、配列番号１２の５２〜１２７位にエピトープの最適化を加えたものに相当）；および（６）ヘキサヒスチジンタグ（例えば配列番号１０２の６９５〜７００位）、を備えた単一のポリペプチドである融合タンパク質についても述べている。１つの実施形態では、トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）‐セリン（ＳｅｒまたはＳ）のリンカー配列が配列番号３７のＮ末端ペプチドと最初のＨＢＶタンパク質（ＨＢＶ大型表面抗原の最適化された部分）との間に使用され、その結果配列番号１０２の全長は２アミノ酸分長くなっている。１つの実施形態では、上述の融合タンパク質において使用されるＨＢＶ大型（Ｌ）表面抗原の最適化された部分は、配列番号９７の１〜２４８位で表わされる（その結果、配列番号１０２の全長は１アミノ酸分長くなる）。１つの実施形態では、Ｔ‐Ｓリンカーおよび配列番号９７の１〜２４８位の両方が配列番号１０２において使用される。
【０１７５】
上記に議論されるように、本発明は、タンパク質セグメントを設計または形成するために所与のＨＢＶ遺伝子型由来のコンセンサス配列を利用して、臨床的有用性を高めるかまたは感染因子に関する治療薬もしくは予防薬に必要な基準を満たす、酵母系免疫療法薬に含めるための、天然に存在する配列または野生型配列からのＨＢＶ抗原の改変を含む。例として、本発明の酵母系免疫療法薬において使用するためのさらなるＨＢＶ抗原が、この種の改変を例証するために設計された。上記に表されたＨＢＶ融合タンパク質の設計におけるように、上記さらなる融合タンパク質を生産するために、融合物内の個々のＨＢＶ抗原は、タンパク質中のセグメントの大きさを縮小するために（例えばタンパク質がＨＢＶゲノムの２／３未満に相当することが確実となるように）、また、急性／自己限定的ＨＢＶ感染および慢性ＨＢＶ感染のうち少なくとも一方における免疫応答に関連しているＴ細胞エピトープの包含を最大限にするため、保存されたエピトープを最大限にするため、非天然の配列を最小限にするため、ならびに、ＨＢＶ配列の複数供給源から構築された遺伝子型Ａ〜Ｄ各々についてのコンセンサス配列も利用するために、最適化または改変された（例えば、ユー（Yu）およびユエン（Yuan）ら、２０１０年、Ｓ、コアおよびＸについては、コンセンサス配列は３２２個のＨＢＶ配列から生成され、Ｐｏｌ（ＲＴ）については、スタンフォード大学ＨＩＶ薬物抵抗性データベース（Stanford University HIV Drug Resistance Database）のＨＢＶｓｅｑおよびＨＢＶ  Ｓｉｔｅリリースノートから生成された）。ＨＢＶ抗原を含む以下の４つの典型的な融合タンパク質を設計する際に、コンセンサス配列を使用しても既知の急性自己限定的Ｔ細胞エピトープのうちの１つまたは既知のポリメラーゼ回避突然変異部位のうちの１つが変化しない限りは、所与のＨＢＶ遺伝子型のコンセンサス配列が使用され、その場合、これらの部位は、これらのエピトープまたは突然変異部位について公開された配列に従うものとなされた。さらなる抗原は、コンセンサス配列のみに基づいて構築されることも考えられるし、他のエピトープが知られるようになるにつれて公開された他のエピトープを使用して構築されることも考えられる。
【０１７６】
実施例７は、配列番号１０１または配列番号１０２で表わされる融合タンパク質（図３によって概略的に示されている）に設計上類似しているがＨＢＶ遺伝子型Ａのコンセンサス配列に基づく融合タンパク質について記載している。この融合タンパク質は、配列番号１０７で表わされる（ＨＢＶ配列でない任意選択の配列は、配列番号１０７の基本配列には含まれないが、実施例７に記載された構築物中のように本配列に加えられてもよい）、Ｎ末端からＣ末端までインフレームで融合された以下の配列要素すなわち：（１）任意選択で、プロテアソーム分解に対する抵抗性を付与し、かつ発現を安定させるように設計された、配列番号３７で表わされる合成のＮ末端ペプチドであるＮ末端ペプチドであって、配列番号８９、配列番号９０で表わされるＮ末端ペプチド、または本明細書中に記載されるような酵母系免疫療法薬とともに使用するのに適した別のＮ末端ペプチドによって置き換えられることも可能な、Ｎ末端ペプチド；（２）任意選択で、１〜３アミノ酸以上のリンカーペプチド  １個、２個、３個またはそれ以上のアミノ酸のリンカー配列、例えば２アミノ酸リンカーであるＴｈｒ‐Ｓｅｒ；（３）配列番号１０７の１〜２４９位で表わされるＨＢＶ大型（Ｌ）表面抗原の最適化された部分であって、上記に議論された設計戦略を利用するＨＢＶ遺伝子型Ａのコンセンサス配列である部分；（４）配列番号１０７の２５０〜４７７位で表わされるＨＢＶポリメラーゼの逆転写酵素（ＲＴ）ドメインの最適化された部分であって、上記に議論された設計戦略を利用するＨＢＶ遺伝子型Ａのコンセンサス配列である部分；（５）配列番号１０７の４７８〜６２９位で表わされるＨＢＶコアタンパク質の最適化された部分であって、上記に議論された設計戦略を利用するＨＢＶ遺伝子型Ａのコンセンサス配列である部分；（６）配列番号１０７の６３０〜６８９位で表わされるＨＢＶ  Ｘ抗原の最適化された部分であって、上記に議論された設計戦略を利用するＨＢＶ遺伝子型Ａのコンセンサス配列である部分；および（７）任意選択で、ヘキサヒスチジンタグ、を備えた単一のポリペプチドである。この融合タンパク質を発現する、酵母系免疫療法組成物は、本明細書中ではＧＩ‐１３０１０とも呼ばれる。
【０１７７】
実施例７はさらに、配列番号１０１または配列番号１０２で表わされる融合タンパク質（図３によって概略的に示されている）に設計上類似しているがＨＢＶ遺伝子型Ｂのコンセンサス配列に基づく融合タンパク質について記載している。この融合タンパク質は、配列番号１０８で表わされる（ＨＢＶ配列でない任意選択の配列は配列番号１０８の基本配列には含まれないが、実施例７に記載された構築物中のように本配列に加えられてもよい）、Ｎ末端からＣ末端までインフレームで融合された以下の配列要素すなわち：（１）任意選択で、プロテアソーム分解に対する抵抗性を付与し、かつ発現を安定させるように設計された、配列番号３７で表わされる合成のＮ末端ペプチドであるＮ末端ペプチドであって、配列番号８９、配列番号９０で表わされるＮ末端ペプチド、または本明細書中に記載されるような酵母系免疫療法薬とともに使用するのに適した別のＮ末端ペプチドによって置き換えられることも可能な、Ｎ末端ペプチド；（２）任意選択で、１〜３アミノ酸以上のリンカーペプチド  １個、２個、３個またはそれ以上のアミノ酸のリンカー配列、例えば２アミノ酸リンカーであるＴｈｒ‐Ｓｅｒ；（３）配列番号１０８の１〜２４９位で表わされるＨＢＶ大型（Ｌ）表面抗原の最適化された部分であって、上記に議論された設計戦略を利用するＨＢＶ遺伝子型Ｂのコンセンサス配列である部分；（４）配列番号１０８の２５０〜４７７位で表わされるＨＢＶポリメラーゼの逆転写酵素（ＲＴ）ドメインの最適化された部分であって、上記に議論された設計戦略を利用するＨＢＶ遺伝子型Ｂのコンセンサス配列である部分；（５）配列番号１０８の４７８〜６２９位で表わされるＨＢＶコアタンパク質の最適化された部分であって、上記に議論された設計戦略を利用するＨＢＶ遺伝子型Ｂのコンセンサス配列である部分；（６）配列番号１０８の６３０〜６８９位で表わされるＨＢＶ  Ｘ抗原の最適化された部分であって、上記に議論された設計戦略を利用するＨＢＶ遺伝子型Ｂのコンセンサス配列である部分；および（７）任意選択で、ヘキサヒスチジンタグ、を備えた単一のポリペプチドである。この融合タンパク質を発現する、酵母系免疫療法組成物は、本明細書中ではＧＩ‐１３０１１とも呼ばれる。
【０１７８】
実施例７はさらに、配列番号１０１または配列番号１０２で表わされる融合タンパク質（図３によって概略的に示されている）に設計上類似しているがＨＢＶ遺伝子型Ｃのコンセンサス配列に基づく融合タンパク質について記載している。この融合タンパク質は、配列番号１０９で表わされる（ＨＢＶ配列でない任意選択の配列は、配列番号１０９の基本配列には含まれないが、実施例７に記載された構築物中のように本配列に加えられてもよい）、Ｎ末端からＣ末端までインフレームで融合された以下の配列要素すなわち：（１）任意選択で、プロテアソーム分解に対する抵抗性を付与し、かつ発現を安定させるように設計された、配列番号３７で表わされる合成のＮ末端ペプチドであるＮ末端ペプチドであって、配列番号８９、配列番号９０で表わされるＮ末端ペプチド、または本明細書中に記載されるような酵母系免疫療法薬とともに使用するのに適した別のＮ末端ペプチドによって置き換えられることも可能な、Ｎ末端ペプチド；（２）任意選択で、１〜３アミノ酸以上のリンカーペプチド  １個、２個、３個またはそれ以上のアミノ酸のリンカー配列、例えば２アミノ酸リンカーであるＴｈｒ‐Ｓｅｒ；（３）配列番号１０９の１〜２４９位で表わされるＨＢＶ大型（Ｌ）表面抗原の最適化された部分であって、上記に議論された設計戦略を利用するＨＢＶ遺伝子型Ｃのコンセンサス配列である部分；（４）配列番号１０９の２５０〜４７７位で表わされるＨＢＶポリメラーゼの逆転写酵素（ＲＴ）ドメインの最適化された部分であって、上記に議論された設計戦略を利用するＨＢＶ遺伝子型Ｃのコンセンサス配列である部分；（５）配列番号１０９の４７８〜６２９位で表わされるＨＢＶコアタンパク質の最適化された部分であって、上記に議論された設計戦略を利用するＨＢＶ遺伝子型Ｃのコンセンサス配列である部分；（６）配列番号１０９の６３０〜６８９位で表わされるＨＢＶ  Ｘ抗原の最適化された部分であって、上記に議論された設計戦略を利用するＨＢＶ遺伝子型Ｃのコンセンサス配列である部分；および（７）任意選択で、ヘキサヒスチジンタグ、を備えた単一のポリペプチドである。この融合タンパク質を発現する、酵母系免疫療法組成物は、本明細書中ではＧＩ‐１３０１２とも呼ばれる。
【０１７９】
実施例７はさらに、配列番号１０１または配列番号１０２で表わされる融合タンパク質（図３によって概略的に示されている）に設計上類似しているがＨＢＶ遺伝子型Ｄのコンセンサス配列に基づく融合タンパク質について記載している。この融合タンパク質は、配列番号１１０で表わされる（ＨＢＶ配列でない任意選択の配列は、配列番号１１０の基本配列には含まれないが、実施例７に記載された構築物中のように本配列に加えられてもよい）、Ｎ末端からＣ末端までインフレームで融合された以下の配列要素すなわち：（１）任意選択で、プロテアソーム分解に対する抵抗性を付与し、かつ発現を安定させるように設計された、配列番号３７で表わされる合成のＮ末端ペプチドであるＮ末端ペプチドであって、配列番号８９、配列番号９０で表わされるＮ末端ペプチド、または本明細書中に記載されるような酵母系免疫療法薬とともに使用するのに適した別のＮ末端ペプチドによって置き換えられることも可能な、Ｎ末端ペプチド；（２）任意選択で、１〜３アミノ酸以上のリンカーペプチド  １個、２個、３個またはそれ以上のアミノ酸のリンカー配列、例えば２アミノ酸リンカーであるＴｈｒ‐Ｓｅｒ；（３）配列番号１１０の１〜２４９位で表わされるＨＢＶ大型（Ｌ）表面抗原の最適化された部分であって、上記に議論された設計戦略を利用するＨＢＶ遺伝子型Ｄのコンセンサス配列である部分；（４）配列番号１１０の２５０〜４７７位で表わされるＨＢＶポリメラーゼの逆転写酵素（ＲＴ）ドメインの最適化された部分であって、上記に議論された設計戦略を利用するＨＢＶ遺伝子型Ｄのコンセンサス配列である部分；（５）配列番号１１０の４７８〜６２９位で表わされるＨＢＶコアタンパク質の最適化された部分であって、上記に議論された設計戦略を利用するＨＢＶ遺伝子型Ｄのコンセンサス配列である部分；（６）配列番号１１０の６３０〜６８９位で表わされるＨＢＶ  Ｘ抗原の最適化された部分であって、上記に議論された設計戦略を利用するＨＢＶ遺伝子型Ｄのコンセンサス配列である部分；および（７）任意選択で、ヘキサヒスチジンタグ、を備えた単一のポリペプチドである。配列番号３７で表わされるＮ末端配列を含むこの融合タンパク質を発現する、酵母系免疫療法組成物は、本明細書中ではＧＩ−１３０１３と呼ばれる。配列番号８９で表わされるＮ末端配列を含むこの融合タンパク質を発現する、酵母系免疫療法組成物は、本明細書中ではＧＩ−１３０１４と呼ばれる。
【０１８０】
上記に議論されるように、本明細書中に記載された融合タンパク質内のＨＢＶタンパク質セグメントの順序を変更することは本発明の１つの実施形態である。従って、上述のような４つのＨＢＶタンパク質を利用する構築物は、表面抗原がポリメラーゼ抗原に融合され、該ポリメラーゼ抗原がコア抗原に融合され、該コア抗原がＸ抗原に融合される順序で提供されているが、本発明は構築物内のこの特定の順序のタンパク質に限定されるものではなく、かつ実際に、融合セグメントの他の配置構成が使用されてもよく、いくつかの態様では、該配置構成により、得られる免疫療法組成物が改善される場合もある。例えば、融合タンパク質内のセグメントの再配置により、酵母におけるＨＢＶ抗原の発現が改善または改変される場合もあれば、ＨＢＶ抗原の免疫原性またはその他の機能的属性が改善または改変される場合もある。この実施形態の１つの態様では、本発明は、酵母における良好な発現および有益な機能的データの提供（例えば、免疫原性であること）のうち少なくとも一方をなす１つのＨＢＶ抗原を始めとして、かつそのＨＢＶ抗原に、ＨＢＶ抗原内に含まれる潜在的な抗原またはエピトープを拡張するために追加のＨＢＶタンパク質またはドメインを付加することを企図している。実施例８は、上述の４つのＨＢＶタンパク質のさらなる配置構成の例を提供する。
【０１８１】
実施例８は、ＨＢＶ表面抗原、コアタンパク質、ポリメラーゼおよびＸ抗原由来の配列を含有する融合タンパク質であって、該配列が配列番号１１０および配列番号１１８で表わされる融合タンパク質のセグメントに由来し、かつ該融合タンパク質が配列番号１１０と比較して異なる順序の融合セグメントを利用している、融合タンパク質について記載している。この抗原はＨＢＶ遺伝子型Ｄのコンセンサス配列に基づいているが、配列番号１０７もしくは配列番号１１２（遺伝子型Ａ）、配列番号１０８もしくは配列番号１１４（遺伝子型Ｂ）、配列番号１０９もしくは配列番号１１６（遺伝子型Ｃ）で表わされる融合タンパク質由来の対応する融合セグメントを使用して、または異なるＨＢＶ遺伝子型、遺伝子亜型、コンセンサス配列もしくは株由来の対応する配列を使用して、同様の全体構造を有する融合タンパク質を製造することは容易であろう。この実施例では、酵母（例えばサッカロマイセス・セレビシエ）は銅誘導性プロモーターＣＵＰ１の制御下でこの融合タンパク質を発現するように遺伝子組換え処理され、得られた酵母‐ＨＢＶ免疫療法組成物は本明細書中ではＧＩ‐１３０１７と呼ばれることもあり、図１０に概略的に示されている。配列番号１２４で表わされる該融合タンパク質は、順に、表面抗原、コア、ポリメラーゼおよびＸ抗原配列を、配列番号１２４で表わされる（ＨＢＶ配列でない任意選択の配列は配列番号１２４の基本配列には含まれないが、実施例８に記載された構築物中のように本配列に加えられてもよい）、Ｎ末端からＣ末端までインフレームで融合された以下の配列要素すなわち：（１）任意選択で、プロテアソーム分解に対する抵抗性を付与し、かつ発現を安定させるように設計された、（実施例８に記載の構築物中の）配列番号３７で表わされる合成のＮ末端ペプチドであるＮ末端ペプチドであって、配列番号８９、配列番号９０で表わされるＮ末端ペプチド、または本明細書中に記載されるような酵母系免疫療法薬とともに使用するのに適した別のＮ末端ペプチドによって置き換えられることも可能な、Ｎ末端ペプチド；（２）任意選択で、１〜３アミノ酸以上のリンカーペプチド、例えば（実施例８に記載の構築物中の）２アミノ酸リンカーであるＴｈｒ‐Ｓｅｒ；（３）配列番号１２４の１〜３９９位で表わされる、ＨＢＶ遺伝子型Ｄの大型（Ｌ）表面抗原のほぼ完全長の（１位を差し引いた）コンセンサス配列のアミノ酸配列（配列番号１１８の１〜３９９位に相当）；４）配列番号１２４の４００〜５８１位で表わされる、ＨＢＶ遺伝子型Ｄのコア抗原のコンセンサス配列のアミノ酸配列（配列番号１１８の４００〜５８１位に相当）；（５）配列番号１２４の５８２〜８０９位で表わされる、ＨＢＶ遺伝子型Ｄのコンセンサス配列を使用するＨＢＶポリメラーゼの逆転写酵素（ＲＴ）ドメインの最適化された部分（配列番号１１０の２５０〜４７７位に相当）；（６）配列番号１２４の８１０〜８６９位で表わされる、ＨＢＶ遺伝子型Ｄのコンセンサス配列を使用するＨＢＶ  Ｘ抗原の最適化された部分（配列番号１１０の６３０〜６８９位に相当）；および（７）任意選択で、（実施例８に記載の構築物中の）ヘキサヒスチジンタグ、を備えた単一のポリペプチドと���て含む。配列番号１２４は、表５に見ることができる多数のＴ細胞エピトープ（ヒトおよびネズミ科動物）を含有する。配列番号１２４の融合タンパク質をコードする核酸配列（酵母での発現用にコドンを最適化）は、本明細書中に配列番号１２３で表わされている。
【０１８２】
実施例８はさらに、ＨＢＶ表面抗原、コアタンパク質、Ｘ抗原、およびポリメラーゼ由来の配列を含有する別の融合タンパク質であって、該配列は配列番号１１０および配列番号１１８で表わされる融合タンパク質のセグメントに由来するが、該融合タンパク質は配列番号１１０と比較して異なる順序の融合セグメントを利用する、融合タンパク質についても記載している。この抗原もＨＢＶ遺伝子型Ｄのコンセンサス配列に基づいているが；配列番号１０７もしくは配列番号１１２（遺伝子型Ａ）、配列番号１０８もしくは配列番号１１４（遺伝子型Ｂ）、配列番号１０９もしくは配列番号１１６（遺伝子型Ｃ）で表わされる融合タンパク質由来の対応する融合セグメントを使用して、または異なるＨＢＶ遺伝子型、遺伝子亜型、コンセンサス配列もしくは株からの対応する配列を使用して、同様の全体構造を有する融合タンパク質を製造することは容易であろう。この実施例では、酵母（例えばサッカロマイセス・セレビシエ）は銅誘導性プロモーターＣＵＰ１の制御下でこの融合タンパク質を発現するように遺伝子組換え処理され、得られた酵母‐ＨＢＶ免疫療法組成物は本明細書中ではＧＩ−１３０１８と呼ばれることもあり、図１１に概略的に示されている。配列番号１２６で表わされる該融合タンパク質は、順に、表面抗原、コア、Ｘ抗原、およびポリメラーゼ配列を、配列番号１２６で表わされる（ＨＢＶ配列でない任意選択の配列は配列番号１２６の基本配列には含まれないが、実施例８に記載された構築物中のように本配列に加えられてもよい）、Ｎ末端からＣ末端までインフレームで融合された以下の配列要素すなわち：（１）任意選択で、プロテアソーム分解に対する抵抗性を付与し、かつ発現を安定させるように設計された、（実施例８に記載の構築物中の）配列番号３７で表わされる合成のＮ末端ペプチドであるＮ末端ペプチドであって、配列番号８９、配列番号９０で表わされるＮ末端ペプチド、または本明細書中に記載されるような酵母系免疫療法薬とともに使用するのに適した別のＮ末端ペプチドによって置き換えられることも可能な、Ｎ末端ペプチド；（２）任意選択で、１〜３アミノ酸以上のリンカーペプチド、例えば（実施例８に記載の構築物中の）２アミノ酸リンカーであるＴｈｒ‐Ｓｅｒ；（３）配列番号１２６の１〜３９９位で表わされる、ＨＢＶ遺伝子型Ｄの大型（Ｌ）表面抗原のほぼ完全長の（１位を差し引いた）コンセンサス配列のアミノ酸配列（配列番号１１８の１〜３９９位に相当）；４）配列番号１２６の４００〜５８１位で表わされる、ＨＢＶ遺伝子型Ｄのコア抗原のコンセンサス配列のアミノ酸配列（配列番号１１８の４００〜５８１位に相当）；（５）配列番号１２６の５８２〜６４１位で表わされる、ＨＢＶ遺伝子型Ｄのコンセンサス配列を使用するＨＢＶ  Ｘ抗原の最適化された部分（配列番号１１０の６３０〜６８９位に相当）；（５）配列番号１２６の６４２〜８６９位で表わされる、ＨＢＶ遺伝子型Ｄのコンセンサス配列を使用するＨＢＶポリメラーゼの逆転写酵素（ＲＴ）ドメインの最適化された部分（配列番号１１０の２５０〜４７７位に相当）；および（７）任意選択で、（実施例８に記載の構築物中の）ヘキサヒスチジンタグ、を備えた単一のポ���ペプチドとして含む。配列番号１２６は、表５に見ることができる多数のＴ細胞エピトープ（ヒトおよびネズミ科動物）を含有する。配列番号１２６の融合タンパク質をコードする核酸配列（酵母での発現用にコドンを最適化）は、配列番号１２５によって本明細書中に表わされている。
【０１８３】
実施例８は、ＨＢＶポリメラーゼ、Ｘ抗原、表面抗原、コアタンパク質由来の配列を含有する別の融合タンパク質であって、該配列は配列番号１１０および配列番号１１８で表わされる融合タンパク質のセグメントに由来するが、該融合タンパク質は配列番号１１０と比較して異なる順序の融合セグメントを利用する、融合タンパク質について記載している。この抗原はＨＢＶ遺伝子型Ｄのコンセンサス配列に基づいているが；配列番号１０７もしくは配列番号１１２（遺伝子型Ａ）、配列番号１０８もしくは配列番号１１４（遺伝子型Ｂ）、配列番号１０９もしくは配列番号１１６（遺伝子型Ｃ）で表わされる融合タンパク質由来の対応する融合セグメントを使用して、または異なるＨＢＶ遺伝子型、遺伝子亜型、コンセンサス配列もしくは株からの対応する配列を使用して、同様の全体構造を有する融合タンパク質を製造することは容易であろう。この実施例では、酵母（例えばサッカロマイセス・セレビシエ）は銅誘導性プロモーターＣＵＰ１の制御下でこの融合タンパク質を発現するように遺伝子組換え処理され、得られた酵母‐ＨＢＶ免疫療法組成物は本明細書中ではＧＩ‐１３０２１と呼ばれることもあり、図１４に概略的に示されている。配列番号１３２で表わされる該融合タンパク質は、順に、ポリメラーゼ、Ｘ抗原、表面抗原、およびコア配列を、配列番号１３２で表わされる（ＨＢＶ配列でない任意選択の配列は配列番号１３２の基本配列には含まれないが、実施例８に記載された構築物中のように本配列に加えられてもよい）、Ｎ末端からＣ末端までインフレームで融合された以下の配列要素すなわち：（１）任意選択で、プロテアソーム分解に対する抵抗性を付与し、かつ発現を安定させるように設計された、（実施例８に記載の構築物中の）配列番号３７で表わされる合成のＮ末端ペプチドであるＮ末端ペプチドであって、配列番号８９、配列番号９０で表わされるＮ末端ペプチド、または本明細書中に記載されるような酵母系免疫療法薬とともに使用するのに適した別のＮ末端ペプチドによって置き換えられることも可能な、Ｎ末端ペプチド；（２）任意選択で、１〜３アミノ酸以上のリンカーペプチド、例えば（実施例８に記載の構築物中の）２アミノ酸リンカーであるＴｈｒ‐Ｓｅｒ；（３）配列番号１３２の１〜２２８位で表わされる、ＨＢＶ遺伝子型Ｄのコンセンサス配列を使用するＨＢＶポリメラーゼの逆転写酵素（ＲＴ）ドメインの最適化された部分（配列番号１１０の２５０〜４７７位に相当）；（４）配列番号１３２の２２９〜２８８位で表わされる、ＨＢＶ遺伝子型Ｄのコンセンサス配列を使用するＨＢＶ  Ｘ抗原の最適化された部分（配列番号１１０の６３０〜６８９位に相当）；（５）配列番号１３２の２８９〜６８７位で表わされる、ＨＢＶ遺伝子型Ｄの大型（Ｌ）表面抗原のほぼ完全長の（１位を差し引いた）コンセンサス配列のアミノ酸配列（配列番号１１８の１〜３９９位に相当）；（６）配列番号１３２の６８８〜８６９位で表わされる、ＨＢＶ遺伝子型Ｄのコア抗原のコンセンサス配列のアミノ酸配列（配列番号１１８の４００〜５８１位に相当）；および（７）任意選択で、（実施例８に記載の構築物中の）ヘキサヒスチジンタグ、を備えた単一のポリペプチドと���て含む。配列番号１３２は、表５に見ることができる多数のＴ細胞エピトープ（ヒトおよびネズミ科動物）を含有する。配列番号１３２の融合タンパク質をコードする核酸配列（酵母での発現用にコドンを最適化）は、配列番号１３１によって本明細書中に表わされている。
【０１８４】
実施例８はさらに、ＨＢＶ  Ｘ抗原、ポリメラーゼ、表面抗原、およびコアタンパク質由来の配列を含有する融合タンパク質であって、該配列は配列番号１１０および配列番号１１８で表わされる融合タンパク質のセグメントに由来するが、該融合タンパク質は配列番号１１０と比較して異なる順序の融合セグメントを利用する、融合タンパク質についても記載している。この抗原はＨＢＶ遺伝子型Ｄのコンセンサス配列に基づいているが；配列番号１０７もしくは配列番号１１２（遺伝子型Ａ）、配列番号１０８もしくは配列番号１１４（遺伝子型Ｂ）、配列番号１０９もしくは配列番号１１６（遺伝子型Ｃ）で表わされる融合タンパク質由来の対応する融合セグメントを使用して、または異なるＨＢＶ遺伝子型、遺伝子亜型、コンセンサス配列もしくは株からの対応する配列を使用して、同様の全体構造を有する融合タンパク質を製造することは容易であろう。この実施例では、酵母（例えばサッカロマイセス・セレビシエ）は銅誘導性プロモーターＣＵＰ１の制御下でこの融合タンパク質を発現するように遺伝子組換え処理され、得られた酵母‐ＨＢＶ免疫療法組成物は本明細書中ではＧＩ‐１３０２２と呼ばれることもあり、図１５に概略的に示されている。配列番号１３４で表わされる該融合タンパク質は、順に、Ｘ抗原、ポリメラーゼ、表面抗原、およびコアタンパク質を、配列番号１３４で表わされる（ＨＢＶ配列でない任意選択の配列は配列番号１３４の基本配列には含まれないが、実施例８に記載された構築物中のように本配列に加えられてもよい）、Ｎ末端からＣ末端までインフレームで融合された以下の配列要素すなわち：（１）任意選択で、プロテアソーム分解に対する抵抗性を付与し、かつ発現を安定させるように設計された、（実施例８に記載の構築物中の）配列番号３７で表わされる合成のＮ末端ペプチドであるＮ末端ペプチドであって、配列番号８９、配列番号９０で表わされるＮ末端ペプチド、または本明細書中に記載されるような酵母系免疫療法薬とともに使用するのに適した別のＮ末端ペプチドによって置き換えられることも可能な、Ｎ末端ペプチド；（２）任意選択で、１〜３アミノ酸以上のリンカーペプチド、例えば（実施例８に記載の構築物中の）２アミノ酸リンカーであるＴｈｒ‐Ｓｅｒ；（３）配列番号１３４の１〜６０位で表わされる、ＨＢＶ遺伝子型Ｄのコンセンサス配列を使用するＨＢＶ  Ｘ抗原の最適化された部分（配列番号１１０の６３０〜６８９位に相当）；（４）配列番号１３４の６１〜２８８位で表わされる、ＨＢＶ遺伝子型Ｄのコンセンサス配列を使用するＨＢＶポリメラーゼの逆転写酵素（ＲＴ）ドメインの最適化された部分（配列番号１１０の２５０〜４７７位に相当）；（５）配列番号１３４の２８９〜６８７位で表わされる、ＨＢＶ遺伝子型Ｄの大型（Ｌ）表面抗原のほぼ完全長の（１位を差し引いた）コンセンサス配列のアミノ酸配列（配列番号１１８の１〜３９９位に相当）；（６）配列番号１３４の６８８〜８６９位で表わされる、ＨＢＶ遺伝子型Ｄのコア抗原のコンセンサス配列のアミノ酸配列（配列番号１１８の４００〜５８１位に相当）；および（７）任意選択で、（実施例８に記載の構築物中の）ヘキサヒスチジンタグ、を備えた単一の��リペプチドとして含む。配列番号１３４は、表５に見ることができる多数のＴ細胞エピトープ（ヒトおよびネズミ科動物）を含有する。配列番号１３４の融合タンパク質をコードする核酸配列（酵母での発現用にコドンを最適化）は、配列番号１３３によって本明細書中に表わされている。
【０１８５】
［表面抗原、コアタンパク質およびＸ抗原を含むＨＢＶ抗原］  本発明の１つの実施形態では、本発明の組成物または方法において使用されるＨＢＶ抗原は、ＨＢＶ抗原を含む融合タンパク質であり、該ＨＢＶ抗原は、ＨＢＶ表面抗原（大型（Ｌ）、中型（Ｍ）、もしくは小型（Ｓ））もしくはその少なくとも１つの構造ドメイン、機能ドメイン、もしくは免疫原性ドメイン）、ＨＢＶコアタンパク質（ＨＢｃＡｇ）もしくはＨＢＶ  ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）もしくはその少なくとも１つの構造ドメイン、機能ドメイン、もしくは免疫原性ドメイン、およびＨＢＶ  Ｘ抗原（ＨＢｘ）もしくはその少なくとも１つの構造ドメイン、機能ドメイン、もしくは免疫原性ドメイン、を含むか、または、前記抗原もしくはドメインで構成されている。１つの態様では、ＨＢＶ表面抗原、ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶ  ｅ抗原、ＨＢＶ  Ｘ抗原、またはこれらのドメインのうち任意の１つ以上は、完全長またはほぼ完全長である。１つの態様では、ＨＢＶ表面抗原、ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶ  ｅ抗原、ＨＢＶ  Ｘ抗原、またはこれらのドメインのうち任意の１つ以上は、それぞれ、完全長のＨＢＶ表面抗原、ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶ  ｅ抗原、ＨＢＶ  Ｘ抗原、もしくはこれらのドメインの直鎖状配列の、または、配列番号９７（最適化されたＨＢＶ表面抗原）、配列番号９９（最適化されたコアタンパク質）、配列番号１００（最適化されたＸ抗原）で表わされるアミノ酸配列、もしくは場合に応じて別のＨＢＶ株由来の対応する配列の、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む。１つの態様では、ＨＢＶ表面抗原、ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶ  ｅ抗原、ＨＢＶ  Ｘ抗原、またはこれらのドメインのうち任意の１つ以上は、それぞれ、完全長のＨＢＶ表面抗原、ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶ  ｅ抗原、ＨＢＶ  Ｘ抗原、もしくはこれらのドメインと、または、配列番号９７（最適化されたＨＢＶ表面抗原）、配列番号９９（最適化されたコアタンパク質）、配列番号１００（最適化されたＸ抗原）で表わされるアミノ酸配列、もしくは場合に応じて別のＨＢＶ株由来の対応する配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。本構築物において有用なさらなるＨＢＶ表面抗原、ＨＢＶコア抗原、およびＨＢＶ  Ｘ抗原についての様々な適切かつ典型的な配列は、本明細書中に記載されている。
【０１８６】
実施例８は、ＨＢＶ表面抗原、コアタンパク質、およびＸ抗原由来の配列を含有する融合タンパク質であって、該配列が配列番号１１０および配列番号１１８で表わされる融合タンパク質のセグメントに由来する融合タンパク質について記載している。この抗原はＨＢＶ遺伝子型Ｄのコンセンサス配列に基づいているが、配列番号１０７もしくは配列番号１１２（遺伝子型Ａ）、配列番号１０８もしくは配列番号１１４（遺伝子型Ｂ）、配列番号１０９もしくは配列番号１１６（遺伝子型Ｃ）で表わされる融合タンパク質由来の対応する融合セグメントを使用して、または異なるＨＢＶ遺伝子型、遺伝子亜型、コンセンサス配列もしくは株からの対応する配列を使用して、同様の全体構造を有する融合タンパク質を製造することは容易であろう。この実施例では、酵母（例えばサッカロマイセス・セレビシエ）は銅誘導性プロモーターＣＵＰ１の制御下でこの融合タンパク質を発現するように遺伝子組換え処理され、得られた酵母‐ＨＢＶ免疫療法組成物は本明細書中ではＧＩ‐１３０１６と呼ばれることもあり、図９に概略的に示されている。配列番号１２２で表わされる該融合タンパク質は、順に、表面抗原、コア、およびＸ抗原配列を、配列番号１２２で表わされる（ＨＢＶ配列でない任意選択の配列は配列番号１２２の基本配列には含まれないが、実施例８に記載された構築物中のように本配列に加えられてもよい）、Ｎ末端からＣ末端までインフレームで融合された以下の配列要素すなわち：（１）任意選択で、プロテアソーム分解に対する抵抗性を付与し、かつ発現を安定させるように設計された、（実施例８に記載の構築物中の）配列番号３７で表わされる合成のＮ末端ペプチドであるＮ末端ペプチドであって、配列番号８９、配列番号９０で表わされるＮ末端ペプチド、または本明細書中に記載されるような酵母系免疫療法薬とともに使用するのに適した別のＮ末端ペプチドによって置き換えられることも可能な、Ｎ末端ペプチド；（２）任意選択で、１〜３アミノ酸以上のリンカーペプチド、例えば（実施例８に記載の構築物中の）２アミノ酸リンカーであるＴｈｒ‐Ｓｅｒ；（３）配列番号１２２の１〜３９９位で表わされる、ＨＢＶ遺伝子型Ｄの大型（Ｌ）表面抗原のほぼ完全長の（１位を差し引いた）コンセンサス配列のアミノ酸配列（配列番号１１８の１〜３９９位に相当）；４）配列番号１２２の４００〜５８１位で表わされる、ＨＢＶ遺伝子型Ｄのコア抗原のコンセンサス配列のアミノ酸配列（配列番号１１８の４００〜５８１位に相当）；（５）配列番号１２２の５８２〜６４１位で表わされる、ＨＢＶ遺伝子型Ｄのコンセンサス配列を使用するＨＢＶ  Ｘ抗原の最適化された部分（配列番号１１０の６３０〜６８９位に相当）；および（６）任意選択で、（実施例８に記載の構築物中の）ヘキサヒスチジンタグ、を備えた単一のポリペプチドとして含む。配列番号１２２は、表５に見ることができる多数のＴ細胞エピトープ（ヒトおよびネズミ科動物）を含有する。配列番号１２２の融合タンパク質をコードする核酸配列（酵母での発現用にコドンを最適化）は、本明細書中に配列番号１２１で表わされている。
【０１８７】
実施例８はさらに、ＨＢＶ表面抗原、コアタンパク質、およびＸ抗原由来の配列を含有する融合タンパク質であって、配列番号１２２を含む融合タンパク質におけるように、該配列は配列番号１１０および配列番号１１８で表わされる融合タンパク質のセグメントに由来する、融合タンパク質について記載している。しかしながら、この融合タンパク質は、該融合タンパク質内の融合セグメントの配置構成において、配列番号１２２を含む融合タンパク質とは異なっている。この抗原はＨＢＶ遺伝子型Ｄのコンセンサス配列に基づいているが、配列番号１０７もしくは配列番号１１２（遺伝子型Ａ）、配列番号１０８もしくは配列番号１１４（遺伝子型Ｂ）、配列番号１０９もしくは配列番号１１６（遺伝子型Ｃ）で表わされる融合タンパク質由来の対応する融合セグメントを使用して、または異なるＨＢＶ遺伝子型、遺伝子亜型、コンセンサス配列もしくは株からの対応する配列を使用して、同様の全体構造を有する融合タンパク質を製造することは容易であろう。この実施例では、酵母（例えばサッカロマイセス・セレビシエ）は銅誘導性プロモーターＣＵＰ１の制御下でこの融合タンパク質を発現するように遺伝子組換え処理され、得られた酵母‐ＨＢＶ免疫療法組成物は本明細書中ではＧＩ‐１３０２０と呼ばれることもあり、図１３に概略的に示されている。配列番号１３０で表わされる該融合タンパク質は、順に、Ｘ抗原、表面抗原、およびコア抗原配列を、配列番号１３０で表わされる（ＨＢＶ配列でない任意選択の配列は、ここで例証される構築物中のＸ抗原セグメントと表面抗原セグメントとの間のＬｅｕ‐Ｇｌｕリンカーは別として配列番号１３０の基本配列には含まれないが、実施例８に記載された構築物中のように本配列に加えられてもよい）、Ｎ末端からＣ末端までインフレームで融合された以下の配列要素すなわち：（１）任意選択で、プロテアソーム分解に対する抵抗性を付与し、かつ発現を安定させるように設計された、（実施例８に記載の構築物中の）配列番号３７で表わされる合成のＮ末端ペプチドであるＮ末端ペプチドであって、配列番号８９、配列番号９０で表わされるＮ末端ペプチド、または本明細書中に記載されるような酵母系免疫療法薬とともに使用するのに適した別のＮ末端ペプチドによって置き換えられることも可能な、Ｎ末端ペプチド；（２）任意選択で、１〜３アミノ酸以上のリンカーペプチド、例えば（実施例８に記載の構築物中の）２アミノ酸リンカーであるＴｈｒ‐Ｓｅｒ；（３）配列番号１３０の１〜６０位で表わされる、ＨＢＶ遺伝子型Ｄのコンセンサス配列を使用するＨＢＶ  Ｘ抗原の最適化された部分（配列番号１１０の６３０〜６８９位に相当）；（４）任意選択で、１〜３アミノ酸以上のリンカーペプチド、例えば、配列番号１３０の６１〜６２位で表わされる、（実施例８に記載の構築物中の）２アミノ酸リンカーであるＬｅｕ‐Ｇｌｕ；（５）配列番号１３０の６３〜４６１位で表わされる、ＨＢＶ遺伝子型Ｄの大型（Ｌ）表面抗原のほぼ完全長の（１位を差し引いた）コンセンサス配列のアミノ酸配列（配列番号１１８の１〜３９９位に相当）；（６）配列番号１３０の４６２〜６４３位で表わされる、ＨＢＶ遺伝子型Ｄのコア抗原のコンセンサス���列のアミノ酸配列（配列番号１１８の４００〜５８１位に相当）；および（７）任意選択で、（実施例８に記載の構築物中の）ヘキサヒスチジンタグ、を備えた単一のポリペプチドとして含む。配列番号１３０は、表５に見ることができる多数のＴ細胞エピトープ（ヒトおよびネズミ科動物）を含有する。配列番号１３０を含みかつＮ末端およびＣ末端ペプチドならびにすべてのリンカーを備えている、実施例８に記載された完全な融合タンパク質のアミノ酸配列は、本明細書中に配列番号１５０で表わされている。配列番号１３０または配列番号１５０の融合タンパク質をコードする核酸配列（酵母での発現用にコドンを最適化）は、本明細書中に配列番号１２９で表わされている。
【０１８８】
［表面抗原、コアタンパク質およびポリメラーゼを含むＨＢＶ抗原］  本発明の１つの実施形態では、本発明の組成物または方法において使用されるＨＢＶ抗原は、ＨＢＶ抗原を含む融合タンパク質であり、該ＨＢＶ抗原は、以下すなわち：ＨＢＶ表面抗原（大型（Ｌ）、中型（Ｍ）、もしくは小型（Ｓ））もしくはその少なくとも１つの構造ドメイン、機能ドメイン、もしくは免疫原性ドメイン）、ＨＢＶコアタンパク質（ＨＢｃＡｇ）もしくはＨＢＶ  ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）もしくはその少なくとも１つの構造ドメイン、機能ドメイン、もしくは免疫原性ドメイン、およびＨＢＶポリメラーゼもしくはその少なくとも１つの構造ドメイン、機能ドメイン、もしくは免疫原性ドメイン（例えば逆転写酵素（ＲＴ）ドメイン）、を含むか、または、前記抗原もしくはそのドメインで構成されている。１つの態様では、ＨＢＶ表面抗原、ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶ  ｅ抗原、ＨＢＶポリメラーゼ、またはこれらのドメインのうち任意の１つ以上は、完全長またはほぼ完全長である。１つの態様では、ＨＢＶ表面抗原、ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶ  ｅ抗原、ＨＢＶポリメラーゼ、またはこれらのドメインのうち任意の１つ以上は、それぞれ、完全長のＨＢＶ表面抗原、ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶ  ｅ抗原、ＨＢＶポリメラーゼもしくはこれらのドメインの直鎖状配列の、または、配列番号９７（最適化されたＨＢＶ表面抗原）、配列番号９９（最適化されたコアタンパク質）、配列番号９８（最適化されたポリメラーゼ）で表わされるアミノ酸配列、もしくは場合に応じて別のＨＢＶ株由来の対応する配列の、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む。１つの態様では、ＨＢＶ表面抗原、ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶ  ｅ抗原、ＨＢＶポリメラーゼ、またはこれらのドメインのうち任意の１つ以上は、それぞれ、完全長のＨＢＶ表面抗原、ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶ  ｅ抗原、ＨＢＶポリメラーゼもしくはこれらのドメインと、または、配列番号９７（最適化されたＨＢＶ表面抗原）、配列番号９９（最適化されたコアタンパク質）、配列番号９８（最適化されたポリメラーゼ）で表わされるアミノ酸配列、もしくは場合に応じて別のＨＢＶ株由来の対応する配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。ＨＢＶ表面抗原、ＨＢＶポリメラーゼ抗原、およびＨＢＶコア抗原についての様々な適切かつ典型的な配列は、本明細書中に記載されている。
【０１８９】
そのような融合タンパク質の一例は図７に概略的に示されている。この融合タンパク質を含む組成物の一例は実施例３に記載されている。この実施形態では、酵母（例えばサッカロマイセス・セレビシエ）は、銅誘導性プロモーターＣＵＰ１またはＴＥＦ２プロモーターの制御下で様々なＨＢＶ表面‐ポリメラーゼ‐コア融合タンパク質を発現するように遺伝子組換え処理される。各事例において、該融合タンパク質は、配列番号４１で表わされる、Ｎ末端からＣ末端までインフレームで融合された以下の配列要素：（１）プロテアソーム分解に対する抵抗性を付与し、かつ発現を安定させるＮ末端ペプチド（例えば配列番号４１の１〜５位）；２）ＨＢＶ大型（Ｌ）表面タンパク質のｐｒｅ‐Ｓ１部分のアミノＨＢＶ肝細胞受容体ドメインのアミノ酸配列（Ｌに特有）（例えば配列番号１１の２１〜４７位または配列番号４１の６〜３２位）；３）ＨＢＶ小型（Ｓ）表面タンパク質のアミノ酸配列（例えば配列番号１１の１７６〜４００位または配列番号４１の３３〜２５７位）；４）配列のクローニングおよび操作を容易にする２アミノ酸スペーサー／リンカー（例えば配列番号４１の２５８および２５９位）；５）逆転写酵素ドメインを含むＨＢＶポリメラーゼのアミノ酸配列（例えば配列番号１０の２４７〜６９１位または配列番号４１の２６０〜６０４位）；６）ＨＢＶコアタンパク質のアミノ酸配列（例えば配列番号９の３１〜２１２位または配列番号４１の６０５〜７８６位）；および、７）ヘキサヒスチジンタグ（例えば配列番号４１の７８７〜７９２位）、を備えた単一のポリペプチドである。該配列はさらに、融合タンパク質の免疫原性を増強すると考えられるエピトープまたはドメインも含有する。加えて、１つの実施形態では、この構築物の配列は、以下の抗ウイルス薬耐性突然変異すなわち：ｒｔＭ２０４ｌ、ｒｔＬ１８０Ｍ、ｒｔＭ２０４Ｖ、ｒｔＶ１７３Ｌ、ｒｔＮ２３６Ｔ、ｒｔＡ１９４Ｔ（部位はＨＢＶポリメラーゼの完全長アミノ酸配列に関して付されている）のうち１以上または全てを導入するために改変されてもよい。１つの実施形態では、それぞれが上記突然変異のうち１つを含有している６つの異なる免疫療法組成物が作出される。他の実施形態では、該突然変異の全てまたはいくつかが単一の融合タンパク質に含められる。１つの実施形態では、この構築物はさらに、表面抗原における１以上の抗ウイルス薬耐性突然変異を含有する。本明細書中に記載された融合タンパク質のうち任意のものにおいて使用されるアミノ酸セグメントは、任意のドメインのいずれかの端部に隣接する追加のアミノ酸を使用することによって改変可能であり；本明細書中に提供される実施例は典型例である。例えば、この実施形態による融合タンパク質は、１）ＨＢＶ大型（Ｌ）表面タンパク質のｐｒｅ‐Ｓ１部分のアミノＨＢＶ肝細胞受容体ドメインのアミノ酸配列（Ｌに特有）（例えば配列番号１１の２１〜４７位もしくは配列番号４１の６〜３２位）；２）ＨＢＶ小型（Ｓ）表面タンパク質のアミノ酸配列（例えば配列番号１１の１７６〜４００位もしくは配列番号４１の３３〜２５７位）；３）ＨＢＶポリメラーゼの逆転写酵素ドメインを含むアミノ酸配列（例えば配列番号１０の２４７〜６９１位もしくは配列番号４１の２６０〜６０４位）；および４）ＨＢＶコアタンパク質のアミノ酸配列（例えば配列番号９の３１〜２１２位もしくは配列番号４１の６０５〜７８６位）を含むことが可能であり、かつ、Ｎ末端もしくはＣ末端配列を利用しなくても、異なるＮ末端もしくはＣ末端配列を利用してもよく、かつ／または、ＨＢＶ配列の間にリンカーを利用しても、リンカーを利用しなくてもよい。１つの実施形態では、配列番号４１の１〜５位で表わされるＮ末端ペプチドの代わりに、配列番号８９または配列番号９０で表わされるＮ末端ペプチドが利用されて、その後に、説明したような融合タンパク質の残りの部分が続いてもよい。
【０１９０】
そのような融合タンパク質の別の例は実施例８に記載されている。実施例８は、ＨＢＶ表面抗原、コアタンパク質、およびポリメラーゼ由来の配列を含有する融合タンパク質であって、該配列が配列番号１１０および配列番号１１８で表わされる融合タンパク質のセグメントに由来する、融合タンパク質について記載している。この抗原はＨＢＶ遺伝子型Ｄのコンセンサス配列に基づいているが、配列番号１０７もしくは配列番号１１２（遺伝子型Ａ）、配列番号１０８もしくは配列番号１１４（遺伝子型Ｂ）、配列番号１０９もしくは配列番号１１６（遺伝子型Ｃ）で表わされる融合タンパク質由来の対応する融合セグメントを使用して、または異なるＨＢＶ遺伝子型、遺伝子亜型、コンセンサス配列もしくは株からの対応する配列を使用して、同様の全体構造を有する融合タンパク質を製造することは容易であろう。この実施例では、酵母（例えばサッカロマイセス・セレビシエ）は銅誘導性プロモーターＣＵＰ１の制御下でこの融合タンパク質を発現するように遺伝子組換え処理され、得られた酵母‐ＨＢＶ免疫療法組成物は本明細書中ではＧＩ‐１３０１５と呼ばれることもあり、図８に概略的に示されている。配列番号１２０で表わされる該融合タンパク質は、順に、表面抗原、コアタンパク質、およびポリメラーゼ配列を、配列番号１２０で表わされる（ＨＢＶ配列でない任意選択の配列は配列番号１２０の基本配列には含まれないが、実施例８に記載された構築物中のように本配列に加えられてもよい）、Ｎ末端からＣ末端までインフレームで融合された以下の配列要素すなわち：（１）任意選択で、プロテアソーム分解に対する抵抗性を付与し、かつ発現を安定させるように設計された、（実施例８に記載の構築物中の）配列番号３７で表わされる合成のＮ末端ペプチドであるＮ末端ペプチドであって、配列番号８９、配列番号９０で表わされるＮ末端ペプチド、または本明細書中に記載されるような酵母系免疫療法薬とともに使用するのに適した別のＮ末端ペプチドによって置き換えられることも可能な、Ｎ末端ペプチド；（２）任意選択で、１〜３アミノ酸以上のリンカーペプチド、例えば（実施例８に記載の構築物中の）２アミノ酸リンカーであるＴｈｒ‐Ｓｅｒ；（３）配列番号１２０の１〜３９９位で表わされる、ＨＢＶ遺伝子型Ｄの大型（Ｌ）表面抗原のほぼ完全長の（１位を差し引いた）コンセンサス配列のアミノ酸配列（配列番号１１８の１〜３９９位に相当）；（４）配列番号１２０の４００〜５８１位で表わされる、ＨＢＶ遺伝子型Ｄのコア抗原のコンセンサス配列のアミノ酸配列（配列番号１１８の４００〜５８１位に相当）；（５）配列番号１２０の５８２〜８０９位で表わされる、ＨＢＶ遺伝子型Ｄのコンセンサス配列を使用するＨＢＶポリメラーゼの逆転写酵素（ＲＴ）ドメインの最適化された部分（配列番号１１０の２５０〜４７７位に相当）；および（６）任意選択で、（実施例８に記載の構築物中の）ヘキサヒスチジンタグ、を備えた単一のポリペプチドとして含む。配列番号１２０は、表５に見ることができる多数のＴ細胞エピトープ（ヒトおよびネズミ科動物）を含有する。配列番号１２０の融合タンパク質をコードする核酸配列（酵母での発現用にコドンを最適化）は、本明細書中に配列番号１１９で表わされている。
【０１９１】
そのような融合タンパク質のさらに別の例は実施例８に記載されている。実施例８は、ＨＢＶポリメラーゼ、表面抗原、およびコアタンパク質由来の配列を含有する融合タンパク質であって、該配列が配列番号１１０および配列番号１１８で表わされる融合タンパク質のセグメントに由来する、融合タンパク質について例示している。この融合タンパク質は、該融合タンパク質内の融合セグメントの配置構成において配列番号１２０を含む融合タンパク質とは異なっている。この抗原はＨＢＶ遺伝子型Ｄのコンセンサス配列に基づいているが；配列番号１０７もしくは配列番号１１２（遺伝子型Ａ）、配列番号１０８もしくは配列番号１１４（遺伝子型Ｂ）、配列番号１０９もしくは配列番号１１６（遺伝子型Ｃ）で表わされる融合タンパク質由来の対応する融合セグメントを使用して、または異なるＨＢＶ遺伝子型、遺伝子亜型、コンセンサス配列もしくは株からの対応する配列を使用して、同様の全体構造を有する融合タンパク質を製造することは容易であろう。この実施例では、酵母（例えばサッカロマイセス・セレビシエ）は銅誘導性プロモーターＣＵＰ１の制御下でこの融合タンパク質を発現するように遺伝子組換え処理され、得られた酵母‐ＨＢＶ免疫療法組成物は本明細書中ではＧＩ‐１３０１９と呼ばれることもあり、図１２に概略的に示されている。配列番号１２８で表わされる該融合タンパク質は、順に、ポリメラーゼ、表面抗原、およびコアの配列を、配列番号１２８で表わされる（ＨＢＶ配列でない任意選択の配列は、ここで例証される構築物中のポリメラーゼセグメントと表面抗原セグメントとの間のＬｅｕ‐Ｇｌｕリンカーは別として配列番号１２８の基本配列には含まれないが、実施例８に記載された構築物中のように本配列に加えられてもよい）、Ｎ末端からＣ末端までインフレームで融合された以下の配列要素すなわち：（１）任意選択で、プロテアソーム分解に対する抵抗性を付与し、かつ発現を安定させるように設計された、（実施例８に記載の構築物中の）配列番号３７で表わされる合成のＮ末端ペプチドであるＮ末端ペプチドであって、配列番号８９、配列番号９０で表わされるＮ末端ペプチド、または本明細書中に記載されるような酵母系免疫療法薬とともに使用するのに適した別のＮ末端ペプチドによって置き換えられることも可能な、Ｎ末端ペプチド；（２）任意選択で、１〜３アミノ酸以上のリンカーペプチド、例えば（実施例８に記載の構築物中の）２アミノ酸リンカーであるＴｈｒ‐Ｓｅｒ；（３）配列番号１２８の１〜２２８位で表わされる、ＨＢＶ遺伝子型Ｄのコンセンサス配列を使用するＨＢＶポリメラーゼの逆転写酵素（ＲＴ）ドメインの最適化された部分（配列番号１１０の２５０〜４７７位に相当）；（４）任意選択で、１〜３アミノ酸以上のリンカーペプチド、例えば、配列番号１２８の２２９〜２３０位で表わされる、（実施例８に記載の構築物中の）２アミノ酸リンカーであるＬｅｕ‐Ｇｌｕ；（５）配列番号１２８の２３１〜６２９位で表わされる、ＨＢＶ遺伝子型Ｄの大型（Ｌ）表面抗原のほぼ完全長の（１位を差し引いた）コンセンサス配列のアミノ酸配列（配列番号１１８の１〜３９９位に相当）；（６）配列番号１２８の６３０〜８１１位で表わされる、ＨＢＶ遺伝子型Ｄのコア抗原のコンセンサス配列のアミノ酸配列（配列番号１１８の４００〜５８１位に相当）；および（７）任意選択で、（実施例８に記載の構築物中の）ヘキサヒスチジンタグ、を備えた単一のポリペプチドとして含む。配列番号１２８は、表５に見ることができる多数のＴ細胞エピトープ（ヒトおよびネズミ科動物）を含有する。配列番号１２８の融合タンパク質をコードする核酸配列（酵母での発現用にコドンを最適化）は、本明細書中に配列番号１２７で表わされている。
【０１９２】
［ポリメラーゼおよびコアタンパク質を含むＨＢＶ抗原］  本発明の１つの実施形態では、本発明の組成物または方法において使用されるＨＢＶ抗原は、ＨＢＶ抗原を含む融合タンパク質であり、該ＨＢＶ抗原は、ＨＢＶポリメラーゼ（ＲＴドメイン）もしくはその少なくとも１つの免疫原性ドメインおよびＨＢＶコアタンパク質（ＨＢｃＡｇ）もしくはその少なくとも１つの免疫原性ドメインを含むか、または、ＨＢＶポリメラーゼ（ＲＴドメイン）もしくはその少なくとも１つの免疫原性ドメインおよびＨＢＶコアタンパク質（ＨＢｃＡｇ）もしくはその少なくとも１つの免疫原性ドメインで構成されている。１つの態様では、ＨＢＶポリメラーゼのＲＴドメインまたはＨＢＶコアタンパク質のうち一方または両方は、完全長またはほぼ完全長である。１つの態様では、ＨＢＶポリメラーゼのＲＴドメインもしくはＨＢＶコアタンパク質のうち一方もしくは両方またはそれらのドメインは、それぞれ、完全長のＨＢＶポリメラーゼのＲＴドメインもしくはＨＢＶコアタンパク質もしくはそれらのドメインの直鎖状配列の、または、配列番号９８（最適化されたＨＢＶポリメラーゼ）、配列番号９９（最適化されたコアタンパク質）で表わされるアミノ酸配列、もしくは場合に応じて別のＨＢＶ株由来の対応する配列の、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む。１つの態様では、ＨＢＶポリメラーゼのＲＴドメインもしくはＨＢＶコアタンパク質のうち一方もしくは両方またはそれらのドメインは、それぞれ、完全長のＨＢＶポリメラーゼのＲＴドメインもしくはＨＢＶコアタンパク質もしくはそれらのドメインと、または、配列番号９８（最適化されたＨＢＶポリメラーゼ）、配列番号９９（最適化されたコアタンパク質）で表わされるアミノ酸配列、もしくは場合に応じて別のＨＢＶ株由来の対応する配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。ＨＢＶポリメラーゼ抗原およびＨＢＶコア抗原についての様々な適切かつ典型的な配列は、本明細書中に記載されている。
【０１９３】
この抗原の一例は図４に概略的に表わされている。この融合タンパク質を含む組成物の一例は実施例３に記載されている。この実施形態では、酵母（例えばサッカロマイセス・セレビシエ）は、銅誘導性プロモーターＣＵＰ１またはＴＥＦ２プロモーターの制御下で図４に概略的に示されるような様々なＨＢＶポリメラーゼ‐コア融合タンパク質を発現するように遺伝子組換え処理される。各事例において、該融合タンパク質は、配列番号３８で表わされる、Ｎ末端からＣ末端までインフレームで融合された以下の配列要素：（１）プロテアソーム分解に対する抵抗性を付与し、かつ発現を安定させるＮ末端ペプチド（例えば配列番号３７、または配列番号３８の１〜６位）；２）ＨＢＶ遺伝子型Ｃのポリメラーゼの逆転写酵素ドメインを含む部分のアミノ酸配列（例えば配列番号１０の３４７〜６９１位または配列番号３８の７〜３５１位）；３）ＨＢＶ遺伝子型Ｃのコアタンパク質（例えば配列番号９の３１〜２１２位または配列番号３８の３５２〜５３３位）；および、４）ヘキサヒスチジンタグ（例えば配列番号３８の５３４〜５３９位）、を備えた単一のポリペプチドである。該配列はさらに、融合タンパク質の免疫原性を増強すると考えられるエピトープまたはドメインを含有する。本明細書中に記載された融合タンパク質のうち任意のものにおいて使用されるアミノ酸セグメントは、任意のドメインのいずれかの端部に隣接する追加のアミノ酸を使用することによって改変可能であり；本明細書中に提供される実施例は典型例である。例えば、この実施形態による融合タンパク質は、１）ＨＢＶ遺伝子型Ｃのポリメラーゼの逆転写酵素ドメインを含む部分のアミノ酸配列（例えば配列番号１０の３４７〜６９１位または配列番号３８の７〜３５１位）；および２）ＨＢＶ遺伝子型Ｃのコアタンパク質（例えば配列番号９の３１〜２１２位または配列番号３８の３５２〜５３３位）を含むことが可能であり、かつ、Ｎ末端もしくはＣ末端配列を利用しなくても、異なるＮ末端もしくはＣ末端配列を利用してもよく、かつ／または、ＨＢＶ配列の間にリンカーを利用しても、リンカーを利用しなくてもよい。１つの実施形態では、配列番号３７で表わされるＮ末端ペプチドの代わりに、配列番号８９または配列番号９０で表わされるＮ末端ペプチドが利用されて、その後に融合タンパク質の残りの部分が続く。
【０１９４】
［Ｘ抗原およびコアタンパク質を含むＨＢＶ抗原］  本発明の１つの実施形態では、本発明の組成物または方法において使用されるＨＢＶ抗原は、ＨＢＶ抗原を含む融合タンパク質であり、該ＨＢＶ抗原は、ＨＢＶ  Ｘ抗原もしくはその少なくとも１つの免疫原性ドメインおよびＨＢＶコアタンパク質（ＨＢｃＡｇ）もしくはその少なくとも１つの免疫原性ドメインを含むか、または、ＨＢＶ  Ｘ抗原もしくはその少なくとも１つの免疫原性ドメインおよびＨＢＶコアタンパク質（ＨＢｃＡｇ）もしくはその少なくとも１つの免疫原性ドメインで構成されている。１つの態様では、ＨＢＶ  Ｘ抗原またはＨＢＶコアタンパク質のうち一方または両方は、完全長またはほぼ完全長である。１つの態様では、ＨＢＶ
Ｘ抗原もしくはＨＢＶコアタンパク質のうち一方もしくは両方またはそれらのドメインは、それぞれ、完全長のＨＢＶ  Ｘ抗原もしくはＨＢＶコアタンパク質もしくはそれらのドメインの直鎖状配列の、または、配列番号９９（最適化されたコアタンパク質）、配列番号１００（最適化されたＸ抗原）で表わされるアミノ酸配列、もしくは場合に応じて別のＨＢＶ株由来の対応する配列の、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む。１つの態様では、ＨＢＶ  Ｘ抗原もしくはＨＢＶコアタンパク質のうち一方もしくは両方またはそれらのドメインは、それぞれ、完全長のＨＢＶ  Ｘ抗原もしくはＨＢＶコアタンパク質もしくはそれらのドメインと、または、配列番号９９（最適化されたコアタンパク質）、配列番号１００（最適化されたＸ抗原）で表わされるアミノ酸配列、もしくは場合に応じて別のＨＢＶ株由来の対応する配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。ＨＢＶコア抗原およびＨＢＶ  Ｘ抗原についての様々な適切かつ典型的な配列は、本明細書中に記載されている。
【０１９５】
この融合タンパク質は図５に概略的に表わされている。この融合タンパク質を含む組成物の一例は実施例３に記載されている。この実施形態では、酵母（例えばサッカロマイセス・セレビシエ）は、銅誘導性プロモーターＣＵＰ１またはＴＥＦ２プロモーターの制御下で図５に概略的に示されるような様々なＨＢＶ  Ｘ‐コア融合タンパク質を発現するように遺伝子組換え処理される。各事例において、該融合タンパク質は、配列番号３９で表わされる、Ｎ末端からＣ末端までインフレームで融合された以下の配列要素：（１）プロテアソーム分解に対する抵抗性を付与し、かつ発現を安定させるＮ末端ペプチド（例えば配列番号３７、または配列番号３９の１〜６位）；２）ほぼ完全長の（１位を差し引いた）ＨＢＶ遺伝子型ＣのＸ抗原のアミノ酸配列（例えば、配列番号１２の２〜１５４位または配列番号３９の７〜１５９位）；３）ＨＢＶ遺伝子型Ｃのコアタンパク質（例えば配列番号９の３１〜２１２位または配列番号３９の１６０〜３４１位）；および、４）ヘキサヒスチジンタグ（例えば配列番号３９の３４２〜３４７位）、を備えた単一のポリペプチドである。該配列はさらに、該融合タンパク質の免疫原性を増強すると考えられるエピトープまたはドメインを含有する。本明細書中に記載された融合タンパク質のうち任意のものにおいて使用されるアミノ酸セグメントは、任意のドメインのいずれかの端部に隣接する追加のアミノ酸を使用することによって改変可能であり；本明細書中に提供される実施例は典型例である。例えば、この実施形態による融合タンパク質は、１）ほぼ完全長の（１位を差し引いた）ＨＢＶ遺伝子型ＣのＸ抗原のアミノ酸配列（例えば、配列番号１２の２〜１５４位または配列番号３９の７〜１５９位）；および２）ＨＢＶ遺伝子型Ｃのコアタンパク質（例えば配列番号９の３１〜２１２位または配列番号３９の１６０〜３４１位）を含むことが可能であり、かつ、Ｎ末端もしくはＣ末端配列を利用しなくても、異なるＮ末端もしくはＣ末端配列を利用してもよく、かつ／または、ＨＢＶ配列の間にリンカーを利用しても、リンカーを利用しなくてもよい。１つの実施形態では、配列番号３７で表わされるＮ末端ペプチドの代わりに、配列番号８９または配列番号９０で表わされるＮ末端ペプチドが利用されて、その後に、説明した融合タンパク質の残りの部分が続く。
【０１９６】
［単一のＨＢＶタンパク質を含むＨＢＶ抗原］  本発明の１つの実施形態では、ＨＢＶ抗原は、単一のＨＢＶタンパク質（例えば表面、コア、ｅ抗原、ポリメラーゼ、もしくはＸ  抗原から選択された１つのＨＢＶタンパク質）または単一のＨＢＶタンパク質由来の１つ以上のドメイン（構造ドメイン、機能ドメインおよび免疫学的ドメインのうち少なくともいずれか）からなる。本発明のこの実施形態は、例えば、ＨＢＶの治療もしくは予防のための１つ以上の他の酵母系免疫療法組成物と組み合わせて、もしくはＨＢＶの治療もしくは予防のための１つ以上の他の酵母系免疫療法組成物とともに順を追って、または、患者が感染に至る場合には予防的手法の後に治療的手法を続けるために、使用することが可能な酵母系免疫療法組成物を作成するために、特に有用である。例えば、この実施形態のＨＢＶ表面抗原を含む酵母系免疫療法組成物は、ＨＢＶ  Ｘ抗原のような異なるＨＢＶタンパク質／抗原を含む第２の酵母系免疫療法組成物（後述）と組み合わせることが可能であり、さらに、必要に応じて追加の「単一のＨＢＶタンパク質」の酵母系免疫療法薬（例えばＨＢＶのプレコア、コアまたはｅ抗原を含む酵母系免疫療法組成物およびＨＢＶポリメラーゼ抗原またはそのドメインを含む酵母系免疫療法組成物のうち少なくともいずれか）と組み合わせることが可能である。これらの「単一のＨＢＶタンパク質の酵母免疫療法薬」は、互いに組み合わされるかもしくは順を追って、および／または、本明細書中の実施例その他に記載されるもののような他の多重ＨＢＶタンパク質の酵母系免疫療法薬と組み合わされるかもしくは順を追って、使用可能である。別例として、または加えて、このＨＢＶ表面抗原の酵母系免疫療法薬のような「単一のＨＢＶタンパク質の酵母系免疫療法薬」は、任意の所与の遺伝子型または遺伝子亜型のＨＢＶ配列を使用して製造可能であり、かつ、追加のＨＢＶ表面抗原の酵母系免疫療法薬は、任意の１つ以上の追加の遺伝子型または遺伝子亜型のＨＢＶ配列を使用して製造可能である。この方策により、様々なＨＢＶ抗原の「スパイスラック」が効率よく作出されて、該抗原それぞれについての遺伝子型および遺伝子亜型のうち少なくとも一方が、本発明の酵母系免疫療法薬に関して、または本発明の少なくとも１つの酵母系免疫療法薬を含む方策において、提供される。従って、これらの酵母系免疫療法薬の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上の任意の組み合わせが、ＨＢＶに感染している特定の患者または患者集団の治療に使用するために選択可能であり、このことは、特定の患者、患者集団、患者層、またはその他の患者群における必要性に対応するように特注生産または調整がなされるという本発明の融通性を示している。
【０１９７】
本発明の１つの実施形態では、本発明の組成物または方法において使用されるＨＢＶ抗原は、以下すなわち：（ａ）ＨＢＶ表面抗原タンパク質およびその１つ以上のドメイン（構造ドメイン、機能ドメイン、もしくは免疫原性ドメイン）のうち少なくともいずれかであって、ＨＢＶ大型（Ｌ）表面抗原のＰｒｅ‐Ｓ１の肝細胞受容体部分、ＨＢＶ大型（Ｌ）表面抗原、ＨＢＶ中型（Ｍ）表面抗原、ＨＢＶ小型（Ｓ）表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、もしくはこれらの任意のドメインもしくは組み合わせを含みうるもの；（ｂ）ＨＢＶポリメラーゼ抗原であって、ＨＢＶポリメラーゼの１つ以上のドメイン（構造ドメイン、機能ドメイン、もしくは免疫原性ドメイン）、例えばＨＢＶポリメラーゼの逆転写酵素（ＲＴ）ドメイン（機能ドメイン）を含みうるもの；（ｃ）ＨＢＶプレコア抗原、ＨＢＶコア抗原およびＨＢＶ  ｅ抗原のうち少なくともいずれか、もしくはこれらの１つ以上のドメイン（構造ドメイン、機能ドメイン、もしくは免疫原性ドメイン）であって、ＨＢＶコアおよびＨＢＶ  ｅ抗原の両方もしくはこれらのタンパク質の一方もしくは他方に由来する配列を含有している、ＨＢＶプレコアの１つ以上のドメインもしくは部分を含みうるもの；または、（ｄ）ＨＢＶ  Ｘ抗原であって、ＨＢＶ  Ｘ抗原の１つ以上のドメイン（構造ドメイン、機能ドメイン、もしくは免疫原性ドメイン）を含みうるもの、を含むか、または前記に列挙されたもので構成される、ＨＢＶ抗原である。１つの態様では、上記のタンパク質またはドメインのうち任意の１つ以上は、完全長またはほぼ完全長である。１つの態様では、上記のタンパク質またはドメインのうち１つ以上は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個またはそれ以上の免疫原性ドメインを含むかまたは該免疫原性ドメインで構成される。１つの態様では、上記のタンパク質またはドメインのうち任意の１つ以上は、対応する完全長の配列またはそのドメインの直鎖状配列の、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む。１つの態様では、上記のタンパク質またはドメインのうち任意の１つ以上は、対応する完全長の配列またはそのドメインと、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。ＨＢＶ表面抗原、ＨＢＶポリメラーゼ抗原、ＨＢＶコア抗原、およびＨＢＶ  Ｘ抗原についての様々な適切かつ典型的な配列は、本明細書中に記載されている。
【０１９８】
表面抗原タンパク質を含む組成物の一例は実施例５に記載されている。この実施形態では、酵母（例えばサッカロマイセス・セレビシエ）は、銅誘導性プロモーターＣＵＰ１またはＴＥＦ２プロモーターのような適切なプロモーターの制御下でＨＢＶ表面タンパク質を発現するように遺伝子組換え処理される。該タンパク質は、配列番号９３で表わされる、ＨＢＶのほぼ完全長のＨＢＶ大型（Ｌ）表面抗原（該抗原の発現を増強または安定させるために選択されたＮ末端配列の存在に合わせるためである）すなわち：（１）配列番号８９のＮ末端ペプチド（配列番号９３の１〜８９位）；２）ほぼ完全長の（１位を差し引いた）ＨＢＶ遺伝子型Ｃの大型（Ｌ）表面抗原のアミノ酸配列（例えば、配列番号１１の２〜４００位または配列番号９３の９０〜４８８位）；および、３）ヘキサヒスチジンタグ（例えば配列番号９３の４８９〜４９４位）、を含む単一のポリペプチドである。別例として、Ｎ末端ペプチドは、配列番号３７もしくはその相同体、または本明細書中に記載された別のＮ末端ペプチドに置き換えられてもよい。１つの実施形態では、この構築物はさらに、表面抗原に１つ以上の抗ウイルス薬耐性突然変異を含有する。この実施例は免疫システムによって生成される免疫原性エピトープの露出を最大限にするＨＢＶ抗原として大型（Ｌ）表面抗原を利用しているが、表面抗原の小さい部分、例えば表面抗原の任意のドメインまたはドメインの組み合わせが、本明細書中に提供される手引きを使用して生産されてもよい。加えて、例示の免疫療法薬は遺伝子型Ｃの配列を使用して示されているが、他の遺伝子型、遺伝子亜型、およびＨＢＶの株もしくは単離物のうち少なくともいずれかに由来する配列が代わりに使用されてもよい。
【０１９９】
ＨＢＶポリメラーゼ抗原を含む組成物の一例は実施例３に、また実施例５にも記載されている。実施例５に記載されたＨＢＶ抗原は図６に概略的に表わされている。この実施形態では、酵母（例えばサッカロマイセス・セレビシエ）は、銅誘導性プロモーターＣＵＰ１またはＴＥＦ２プロモーターの制御下で様々なＨＢＶポリメラーゼタンパク質を発現するように遺伝子組換え処理される。各事例において、該融合タンパク質は、配列番号４０で表わされる、Ｎ末端からＣ末端までインフレームで融合された以下の配列要素：（１）プロテアソーム分解に対する抵抗性を付与し、かつ発現を安定させるＮ末端ペプチド（配列番号３７、または配列番号４０の１〜６位）；２）ＨＢＶ遺伝子型Ｃのポリメラーゼの逆転写酵素ドメインを含む部分のアミノ酸配列（例えば配列番号１０の３４７〜６９１位または配列番号４０の７〜３５１位）；および、３）ヘキサヒスチジンタグ（例えば配列番号４０の３５２〜３５７位）、を備えた単一のポリペプチドである。該配列はさらに、該融合タンパク質の免疫原性を増強すると考えられるエピトープまたはドメインを含有する。加えて、１つの実施形態では、この構築物の配列は、以下の抗ウイルス薬耐性突然変異すなわち：ｒｔＭ２０４ｌ、ｒｔＬ１８０Ｍ、ｒｔＭ２０４Ｖ、ｒｔＶ１７３Ｌ、ｒｔＮ２３６Ｔ、ｒｔＡ１９４Ｔ（部位はＨＢＶポリメラーゼの完全長アミノ酸配列に関して付されている）のうち１以上または全てを導入するために改変されてもよい。１つの実施形態では、それぞれが上記突然変異のうち１つを含有している６つの異なる免疫療法組成物が作出される。他の実施形態では、該突然変異の全てまたはいくつかが単一の融合タンパク質に含まれている。本明細書中に記載された融合タンパク質のうち任意のものにおいて使用されるアミノ酸セグメントは、任意のドメインのいずれかの端部に隣接する追加のアミノ酸を使用することによって改変可能であり；本明細書中に提供される実施例は典型例である。例えば、この実施形態による融合タンパク質は、ＨＢＶ遺伝子型Ｃのポリメラーゼの逆転写酵素ドメインを含む部分のアミノ酸配列（例えば配列番号１０の３４７〜６９１位または配列番号４０の７〜３５１位）を含むことが可能であり、かつ、Ｎ末端もしくはＣ末端配列を利用しなくても、異なるＮ末端もしくはＣ末端配列を利用してもよく、かつ／または、ＨＢＶ配列の間にリンカーを利用しても、リンカーを利用しなくてもよい。１つの実施形態では、配列番号３７で表わされるＮ末端ペプチドの代わりに、配列番号８９または配列番号９０で表わされるＮ末端ペプチドが利用されて、その後に、説明した融合タンパク質の残りの部分が続く。
【０２００】
実施例５に示される実施形態では、酵母（例えばサッカロマイセス・セレビシエ）は、銅誘導性プロモーターＣＵＰ１またはＴＥＦ２プロモーターのような適切なプロモーターの制御下でＨＢＶポリメラーゼタンパク質を発現するように遺伝子組換え処理される。該タンパク質は、配列番号９４すなわち：（１）配列番号８９のＮ末端ペプチド（配列番号９４の１〜８９位）；２）ＨＢＶ遺伝子型Ｃのポリメラーゼの逆転写酵素ドメインを含む部分のアミノ酸配列（例えば配列番号１０の３４７〜６９１位または配列番号９４の９０〜４３４位）；および、３）ヘキサヒスチジンタグ（例えば配列番号９４の４３５〜４４０位）、で表わされる、ポリメラーゼ（Ｐｏｌ）のＨＢＶ逆転写酵素（ＲＴ）ドメインを含む単一のポリペプチドである。該配列はさらに、該融合タンパク質の免疫原性を増強すると考えられるエピトープまたはドメインを含有する。加えて、１つの実施形態では、この構築物の配列は、以下の抗ウイルス薬耐性突然変異すなわち：ｒｔＭ２０４ｌ、ｒｔＬ１８０Ｍ、ｒｔＭ２０４Ｖ、ｒｔＶ１７３Ｌ、ｒｔＮ２３６Ｔ、ｒｔＡ１９４Ｔ（部位はＨＢＶポリメラーゼの完全長アミノ酸配列に関して付されている）のうち１以上または全てを導入するために改変されてもよい。別例として、Ｎ末端ペプチドは、配列番号３７もしくはその相同体、または本明細書中に記載された別のＮ末端ペプチドに置き換えられてもよい。
【０２０１】
ＨＢＶプレコア、コアまたはｅ抗原を含む組成物の一例は、実施例５に記載されている。酵母（例えばサッカロマイセス・セレビシエ）は、銅誘導性プロモーターＣＵＰ１またはＴＥＦ２プロモーターのような適切なプロモーターの制御下でＨＢＶコアタンパク質を発現するように遺伝子組換え処理される。該タンパク質は、配列番号９５すなわち：（１）配列番号８９のＮ末端ペプチド（配列番号９５の１〜８９位）；２）ＨＢＶ遺伝子型Ｃのコアタンパク質の一部のアミノ酸配列（例えば配列番号９の３１〜２１２位または配列番号９５の９０〜２７１位）；および、３）ヘキサヒスチジンタグ（例えば配列番号９５の２７２〜２７７位）、で表わされる、ほぼ完全長のＨＢＶコアタンパク質を含む単一のポリペプチドである。該配列はさらに、該融合タンパク質の免疫原性を増強すると考えられるエピトープまたはドメインを含有する。別例として、Ｎ末端ペプチドは、配列番号３７もしくはその相同体、または本明細書中に記載された別のＮ末端ペプチドに置き換えられてもよい。
【０２０２】
ＨＢＶ  Ｘ抗原を含む、酵母系免疫療法組成物の一例は、実施例５に記載されている。酵母（例えばサッカロマイセス・セレビシエ）は、銅誘導性プロモーターＣＵＰ１またはＴＥＦ２プロモーターのような適切なプロモーターの制御下でＨＢＶ  Ｘ抗原を発現するように遺伝子組換え処理される。該タンパク質は、配列番号９６すなわち：（１）配列番号８９のＮ末端ペプチド：（配列番号９６の１〜８９位）；２）ＨＢＶ遺伝子型ＣのＸ抗原の一部のアミノ酸配列（例えば配列番号１２の２〜１５４位または配列番号９６の９０〜２４２位）；および、３）ヘキサヒスチジンタグ（例えば配列番号９６の２４３〜２４８位）、で表わされる、ほぼ完全長のＨＢＶ  Ｘ抗原を含む単一のポリペプチドである。該配列はさらに、該融合タンパク質の免疫原性を増強すると考えられるエピトープまたはドメインを含有する。別例として、Ｎ末端ペプチドは、配列番号３７もしくはその相同体、または本明細書中に記載された別のＮ末端ペプチドに置き換えられてもよい。
【０２０３】
［２以上の遺伝子型に由来するＨＢＶタンパク質を含むＨＢＶ抗原］  本発明の別の実施形態は、１つの組成物を使用して多数の個体または個体集団を治療する可能性を備えた組成物を提供するために、ＨＢＶ遺伝子型および遺伝子亜型のうち少なくとも一方を最大限に標的とする本発明の免疫療法組成物において使用するためのＨＢＶ抗原に関する。そのような組成物は、概して製造するのにより効率的であり（すなわち、多重抗原を備えることによる製造上の利点、および遺伝子型を標的化するための統一的手法のうち少なくとも一方を有する）、種々様々の臨床状況において利用するのにより効率的である（例えば、１つの組成物が多数の異なる地理的背景にある多数の異なる種類の患者集団に貢献する可能性がある）。上記に議論されるように、そのようなＨＢＶ抗原を製造するために、（ＨＢＶ遺伝子型の間で）保存された抗原および保存されたドメインのうち少なくとも一方が選択可能であり、かつ、該抗原は、保存された免疫学的ドメインを最大限含むように設計されうる。
【０２０４】
この実施形態の１つの態様では、単一の酵母系免疫療法薬中において、抗原構築物内で２、３、４、５回またはそれ以上反復されて反復ごとに異なるＨＢＶ遺伝子型または遺伝子亜型由来の配列が使用されている単一のＨＢＶタンパク質またはそのドメイン（例えば表面、ポリメラーゼ、コア／ｅまたはＸ）を備えたＨＢＶ抗原が提供される。この態様では、優性であるかまたは一般的な複数の遺伝子型が１つの酵母系免疫療法薬において標的化されて、臨床上および製造上の有効性を高めることができる。これらの抗原は、必要に応じて、遺伝子亜型、株または単離物の違いに起因する微妙な違いを含む場合のある該抗原内に、コンセンサスＴ細胞エピトープなどのコンセンサス配列を最大限含めるために改変されてもよい。
【０２０５】
従って、本発明の１つの実施形態では、本発明の組成物または方法において使用されるＨＢＶ抗原は、同じタンパク質またはドメインの、ただし異なるＨＢＶ遺伝子型の、２つ以上の反復したＨＢＶ抗原（例えば、ＨＢＶコアまたはｅ抗原の１つ以上のドメイン（構造ドメイン、機能ドメイン、または免疫原性ドメイン）を含みうる２以上のＨＢＶコアまたはｅ抗原であって、該抗原はＨＢＶ遺伝子型ＣおよびＨＢＶ遺伝子型Ｄそれぞれに由来する同一または類似の抗原を含んで、コアタンパク質がそれぞれ異なる遺伝子型であるコア‐コア融合物を形成するもの）を含むかまたは該ＨＢＶ抗原で構成されている、ＨＢＶ抗原である。１つの態様では、そのような構築物中で使用されるＨＢＶタンパク質は、完全長またはほぼ完全長のタンパク質またはドメインである。１つの態様では、ＨＢＶ抗原は、１、２、３、４、５、６、７、８、９個、または１０個以上の免疫原性ドメインを含むかまたは該免疫原性ドメインで構成される。１つの態様では、これらのタンパク質またはドメインのうち任意の１つ以上が、対応する完全長配列の直鎖状配列の少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む。１つの態様では、これらのタンパク質またはドメインのうち任意の１つ以上が、対応する完全長配列の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。
【０２０６】
そのような抗原は実施例６に例証されている。この実施形態では、酵母（例えばサッカロマイセス・セレビシエ）は、銅誘導性プロモーターＣＵＰ１またはＴＥＦ２プロモーターのような適切なプロモーターの制御下でＨＢＶ融合タンパク質を発現するように遺伝子組換え処理される。該タンパク質は、各々が異なる遺伝子型（ＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）に由来する４つのコア抗原を含む、配列番号１０５すなわち：１）配列番号１０５の１位のＮ末端メチオニン；２）ＨＢＶ遺伝子型Ａ由来のほぼ完全長のコアタンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号１の３１〜２１２位または配列番号１０５の２〜１８３位）；３）ＨＢＶ遺伝子型Ｂ由来のほぼ完全長のコアタンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号５の３０〜２１２位または配列番号１０５の１８４〜３９５位）；４）ＨＢＶ遺伝子型Ｃ由来のほぼ完全長のコアタンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号９の３０〜２１２位または配列番号１０５の３９６〜５７８位）；５）ＨＢＶ遺伝子型Ｄ由来のほぼ完全長のコアタンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号１３の３０〜２１２位または配列番号１０５の５７９〜７６１位）；および、５）ヘキサヒスチジンタグ（例えば配列番号１０５の７６２〜７６７位）、で表わされる単一のポリペプチドである。該配列はさらに、該融合タンパク質の免疫原性を増強すると考えられるエピトープまたはドメインを含有する。１位のＮ末端メチオニンは、配列番号３７もしくはその相同体で、または配列番号８９もしくは配列番号９０のαプレプロ配列、もしくはその相同体、もしくは必要に応じて他の適切なＮ末端配列で、置き換えられてもよい。加えて、リンカー配列が、構築物のクローニングおよび操作を容易にするために必要に応じてＨＢＶタンパク質の間に挿入されてもよい。これは例示の構築物である、というのも、広範囲の臨床適用可能性および製造上効率的な設計を備えた単一抗原の酵母系ＨＢＶ免疫療法薬産物を構築するために、任意の他のＨＢＶ遺伝子型および／または遺伝子亜型の組み合わせが必要に応じてこの設計物において代用されうるからである。配列番号１０５のアミノ酸配列はさらに、いくつかの既知のＴ細胞エピトープも含有し、ある種のエピトープは所与のエピトープについて公開された配列（表５を参照）に相当するように改変済みである。
【０２０７】
この実施形態の別の態様では、単一のＨＢＶ遺伝子型に由来する２以上のタンパク質またはドメインが、本発明において有用なＨＢＶ抗原に含められ、該タンパク質またはドメインは、ＨＢＶゲノムによってコードされる最も保存されたタンパク質配列を最大限にするように、または抗原内の治療上もしくは予防上有用な免疫原性ドメインを最大限含むように、選択されうる。次いでこれらの抗原は、同じ融合タンパク質内で、ただし異なるＨＢＶ遺伝子型または遺伝子亜型に由来する同一または類似の配列を使用して、反復される。この態様では、多数の優性または一般的な遺伝子型が同様に１つの酵母系免疫療法薬において標的化されて、この場合も臨床上および製造上の有効性を高めることができる。これらの抗原も、必要に応じて、遺伝子亜型、株または単離物の違いに起因する微妙な違いを含む場合のある該抗原内に、コンセンサスＴ細胞エピトープを最大限含めるために改変されてもよい。
【０２０８】
従って、本発明の１つの実施形態では、本発明の組成物または方法において使用されるＨＢＶ抗原は、各々が２回以上反復されているが反復された配列は異なるＨＢＶ遺伝子型に由来している、少なくとも２つの異なるＨＢＶタンパク質もしくはそのドメインを含むかまたは該タンパク質もしくはドメインで構成されている、ＨＢＶ抗原である（例えば、２以上のＨＢＶコアおよび２以上のＸ抗原、またはこれらのドメインであって、該抗原はＨＢＶ遺伝子型ＣおよびＨＢＶ遺伝子型Ｄそれぞれに由来する同一または類似の抗原を含んで、各コアタンパク質が異なる遺伝子型であり、かつ各Ｘ抗原が異なる遺伝子型である、コア‐Ｘ‐コア‐Ｘ融合物（または融合物内で任意の他の順序のセグメント）を形成する）。１つの態様では、そのような構築物中で使用されるＨＢＶタンパク質は、完全長またはほぼ完全長のタンパク質またはドメインである。１つの態様では、ＨＢＶ抗原は、１、２、３、４、５、６、７、８、９個、または１０個以上の免疫原性ドメインを含むかまたは該ドメインで構成される。１つの態様では、これらのタンパク質またはドメインのうち任意の１つ以上は、対応する完全長配列の直鎖状配列の少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む。１つの態様では、これらのタンパク質またはドメインのうち任意の１つ以上は、対応する完全長配列の配列の少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である。
【０２０９】
そのような抗原は実施例６に例証されている。この実施形態では、酵母（例えばサッカロマイセス・セレビシエ）は、銅誘導性プロモーターＣＵＰ１またはＴＥＦ２プロモーターのような適切なプロモーターの制御下でＨＢＶ融合タンパク質を発現するように遺伝子組換え処理される。該タンパク質は、対の各々が異なる遺伝子型（ＨＢＶ遺伝子型ＡおよびＣ）に由来する２個のコア抗原および２個のＸ抗原を含む、配列番号１０６すなわち：１）配列番号１０６の１位のＮ末端メチオニン；２）ＨＢＶ遺伝子型Ａ由来のほぼ完全長のコアタンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号１の３１〜２１２位または配列番号１０６の２〜１８３位）；３）ＨＢＶ遺伝子型Ａ由来の完全長のＸ抗原のアミノ酸配列（例えば、配列番号４または配列番号１０６の１８４〜３３７位）；４）ＨＢＶ遺伝子型Ｃ由来のほぼ完全長のコアタンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号９の３０〜２１２位または配列番号１０６の３３８〜５２０位）；５）ＨＢＶ遺伝子型Ｃ由来の完全長のＸ抗原のアミノ酸配列（例えば、配列番号８または配列番号１０６の５２１〜６７４位）；および、５）ヘキサヒスチジンタグ（例えば配列番号１０６の６７５〜６８０位）、で表わされる単一ポリペプチドである。該配列はさらに、該融合タンパク質の免疫原性を増強すると考えられるエピトープまたはドメインを含有する。１位のＮ末端メチオニンは、配列番号３７もしくはその相同体で、または配列番号８９もしくは配列番号９０のαプレプロ配列、もしくはその相同体で、置き換えられてもよい。配列番号１０６のアミノ酸配列はさらに、いくつかの既知のＴ細胞エピトープも含有し、ある種のエピトープは所与のエピトープについて公開された配列（表５を参照）に相当するように改変済みである。
【０２１０】
［ＨＢＶ抗原に関するさらなる実施形態］  本発明のいくつかの態様では、野生型または参照ＨＢＶタンパク質の１、２、３、４、５、６、７、８、９個または１０個以上のアミノ酸について、得られるＨＢＶタンパク質が本発明の酵母‐ＨＢＶ免疫療法組成物中の抗原として使用された時に該標的すなわち野生型または参照ＨＢＶタンパク質に対する免疫応答（増強された免疫応答でも、低下した免疫応答でも、ほとんど同じ免疫応答でもよい）を誘発するという条件で、アミノ酸の挿入、欠失、および置換のうち少なくともいずれかがなされてもよい。例えば、本発明は、ＨＢＶアゴニスト抗原の使用を含み、該抗原には、１つ以上のＴ細胞エピトープであって、ＭＨＣ分子に対する、またはＭＨＣ提示に関連してエピトープを認識するＴ細胞受容体に対する、該エピトープの結合力または親和性を改善することなどにより、ＨＢＶアゴニストに対するＴ細胞応答を増強するように変異させたＴ細胞エピトープが含まれうる。したがって、ＨＢＶタンパク質アゴニストは、宿主を感染させる天然のＨＢＶタンパク質に対するＴ細胞応答の効力または効率を改善することができる。
【０２１１】
上述のＨＢＶ抗原のうち任意のもの、例えば配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号９２、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１５０または配列番号１５１を含むかまたは該配列番号で表わされるアミノ酸配列を有する融合タンパク質に関して、該融合タンパク質内の個々のＨＢＶタンパク質に由来する（例えばＨＢＶ表面抗原、ＨＢＶポリメラーゼ、ＨＢＶコア／ｅ抗原、およびＨＢＶ  Ｘ抗原のうち少なくともいずれかに由来する）１つ以上のＨＢＶ抗原を使用して、「単一タンパク質」抗原（例えば上記ＨＢＶタンパク質のうち１つだけに由来する抗原）を構築すること、または所与の参照融合タンパク質に適用可能な場合はＨＢＶタンパク質セグメントのうち２個または３個だけを使用して融合タンパク質を構築することは、本発明の態様である。融合タンパク質内でＨＢＶタンパク質セグメントの順序を変更することも本発明の態様である。別の設計代案として、融合タンパク質を構築するために２個、３個、４個またはそれ以上の遺伝子型およびコンセンサス配列のうち少なくとも一方が使用される場合、ＨＢＶの遺伝子型およびコンセンサス配列のうち少なくとも一方が組み合わされてもよい。
【０２１２】
本発明はさらに、上述の融合タンパク質のうちいずれかの相同体も含み、ならびに、そのような融合タンパク質の一部であるかまたはそうでなければ本明細書中に記載されている個々のＨＢＶタンパク質またはその一部分（任意の機能ドメインおよび免疫原性ドメインのうち少なくとも一方を含む）の相同体、バリアントまたは突然変異体の使用も含んでいる。１つの態様では、本発明は、本明細書中に記載された融合タンパク質または個々のＨＢＶタンパク質もしくはＨＢＶ抗原のうちのいずれか１つのアミノ酸配列と、それぞれ少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有する融合タンパク質または個々の（単一の）ＨＢＶタンパク質もしくはＨＢＶ抗原であって、例えば、融合タンパク質の全長にわたって、または融合タンパク質の一部を形成する該融合タンパク質中の規定のセグメントまたは規定のタンパク質もしくはそのドメイン（免疫原性ドメインもしくは機能ドメイン（すなわち少なくとも１つの生物学的活性を備えたドメイン））に関して、本明細書中の固有の配列識別子によって参照されるＨＢＶタンパク質、ＨＢＶ抗原および融合タンパク質のうちいずれかを使用することを含んでいる。数多くのＣＴＬエピトープ（ＨＢＶに感染した患者由来の細胞傷害性リンパ球によって認識されるエピトープ）および回避突然変異（抗ウイルス薬からの選択圧によりＨＢＶタンパク質中に発生する突然変異）が当分野において知られており、この情報も、本発明のＨＢＶ抗原に特定の配列を提供するために、本明細書中に記載されたＨＢＶ抗原の置換体の作製やバリアントまたは相同体の作出を行うために使用されうる。
【０２１３】
［酵母系免疫療法組成物］  本発明の様々な実施形態において、本発明は、少なくとも１つの「酵母系免疫療法組成物」（この言葉は「酵母系免疫療法産物」、「酵母系免疫治療組成物」、「酵母系組成物」、「酵母系免疫療法薬」、「酵母系ワクチン」、またはこれらの言葉の派生語と互換的に使用されうる）の使用を含んでいる。「免疫療法組成物」は、対象者において少なくとも１つの治療上の利益を達成するのに十分な免疫応答を誘発する組成物である。本明細書中で使用されるように、酵母系免疫療法組成物とは、酵母ビヒクル成分を含み、かつ対象者において少なくとも１つの治療上の利益を達成するのに十分な免疫応答を誘発する組成物を指す。より具体的には、酵母系免疫療法組成物は、酵母ビヒクル成分を含み、細胞性免疫応答、例えば限定するものではないがＴ細胞を介した細胞性免疫応答などの免疫応答を誘発または誘導することができる、組成物である。１つの態様では、本発明において有用な酵母系免疫療法組成物は、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋のうち少なくとも一方のＴ細胞を介した免疫応答を、また１つの態様ではＣＤ８＋およびＣＤ４＋のＴ細胞を介した免疫応答を、誘導することが可能である。任意選択で、酵母系免疫療法組成物は体液性免疫応答を誘発することができる。本発明において有用な酵母系免疫療法組成物は、例えば、個体が、ＨＢＶ感染から保護されるように、かつ／またはＨＢＶ感染もしくはＨＢＶ感染に起因する症状について治療されるように、該個体において免疫応答を誘発することができる。
【０２１４】
本発明の酵母系免疫療法組成物は「予防的」または「治療的」のいずれかであってよい。予防的に提供される場合、本発明の組成物はＨＢＶ感染の任意の症状に先立って提供される。そのような組成物は、出生時、幼児期、または成人に対して投与されることが考えられる。免疫療法組成物の予防的投与は、その後のＨＢＶ感染の予防、結果としてＨＢＶ感染が起きた場合のより迅速またはより完全な感染の解消、および、結果として感染が起きた場合のＨＢＶ感染の症状の改善、のうち少なくともいずれかを行う役割を果たす。治療的に提供される場合、免疫療法組成物は、ＨＢＶ感染の発症時または発症後に、該感染の少なくとも１つの症状を改善することを目的として、かつ好ましくは、該感染の排除、感染の長期にわたる寛解の提供、および、その後の感染またはウイルスの再活性化に対する長期免疫の提供のうち少なくともいずれかを目的として、提供される。１つの態様では、治療の目的は、検出可能なＨＢＶウイルス負荷の消失またはＨＢＶウイルス負荷の低減（例えばＰＣＲによる検出可能レベル未満または＜２０００ＩＵ／ｍｌ）である。１つの態様では、治療の目的は、治療完了後少なくとも６か月間のウイルス排除の保持である。１つの態様では、治療の目的は、検出可能な血清ＨＢｅＡｇおよびＨＢｓＡｇタンパク質のうち少なくとも一方の消失である。１つの態様では、治療の目的は、Ｂ型肝炎表面抗原に対する抗体（抗ＨＢｓ抗体）およびＨＢｅＡｇに対する抗体のうち少なくとも一方の発現である。１つの態様では、治療の目的はセロコンバージョンであり、セロコンバージョンは以下すなわち：（ａ）ラジオイムノアッセイによって決定される１０以上のサンプルレシオユニット（ｓａｍｐｌｅ  ｒａｔｉｏ  ｕｎｉｔ：ＳＲＵ）；（ｂ）酵素免疫測定法によって決定される良好な結果；または（ｃ）≧１０ｍＩＵ／ｍｌの抗体濃度の検出（１０ＳＲＵは抗体１０ｍＩＵ／ｍＬに匹敵する）、によって定義されうる。１つの態様では、治療の目的は、血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルの正常化、肝臓の炎症の改善、および肝臓線維症の改善のうち少なくともいずれかである。
【０２１５】
典型的には、酵母系免疫療法組成物は、酵母ビヒクルと、該酵母ビヒクルによって発現されるか、該酵母ビヒクルに結合しているか、該酵母ビヒクルと混合された少なくとも１つの抗原またはその免疫原性ドメインとを含み、該抗原は酵母に対して異種であり、かつ該抗原は１つ以上のＨＢＶ抗原またはその免疫原性ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗原またはその免疫原性ドメインは融合タンパク質として提供される。本発明の組成物および方法における使用に適したいくつかのＨＢＶ融合タンパク質は上述されている。本発明の１つの態様では、融合タンパク質は２以上の抗原を含むことができる。１つの態様では、融合タンパク質は、１つ以上の抗原の２つ以上の免疫原性ドメイン、または１つ以上の抗原の２つ以上のエピトープを含むことができる。
【０２１６】
本発明において使用される酵母系免疫療法組成物のうち任意のものにおいて、酵母ビヒクルに関する以下の態様が本発明に含まれる。本発明によれば、酵母ビヒクルは、本発明の治療用組成物において１つ以上の抗原、その免疫原性ドメインもしくはそのエピトープと共に使用することができる任意の酵母細胞（例えば全細胞もしくは完全な細胞）もしくはその派生物（以下を参照）であり、１つの態様では、酵母ビヒクルは単独で使用されてもよいしアジュバントとして使用されてもよい。したがって、酵母ビヒクルは、限定するものではないが、生きている完全な（全体の）酵母微生物（すなわち細胞壁を含むその成分をすべて有している酵母細胞）、殺処理されている（死んでいる）かもしくは不活性化された完全な酵母微生物、または完全な酵母／全酵母の派生物であって例えば：酵母スフェロプラスト（すなわち細胞壁を欠く酵母細胞）、酵母サイトプラスト（すなわち細胞壁および核を欠く酵母細胞）、酵母ゴースト（すなわち細胞壁、核および細胞質を欠く酵母細胞）、細胞レベル以下の酵母細胞膜抽出物もしくはその画分（酵母膜粒子とも呼ばれ、以前は細胞レベル以下の酵母粒子とも呼ばれた）、任意の他の酵母粒子、もしくは酵母細胞壁調製物、を含みうる。
【０２１７】
酵母スフェロプラストは、典型的には酵母細胞壁の酵素消化によって生産される。そのような方法は、例えば、フランツゾフ（Franzusoff）ら、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Meth. Enzymol.）、１９９１年、第１９４巻、ｐ．６６２〜６７４（全体が参照により本願に援用される）に記載されている。
【０２１８】
酵母サイトプラストは、典型的には酵母細胞の脱核によって生産される。そのような方法は、例えば、クーン（Coon）、ジャーナル・オブ・ザ・ナショナル・キャンサー・インスティテュート・モノグラフ（Natl. Cancer Inst. Monogr.）、１９７８年、第４８巻、ｐ．４５〜５５（全体が参照により本願に援用される）に記載されている。
【０２１９】
酵母ゴーストは、典型的には透過処理または溶解処理された細胞を再密封することにより生産され、かつ、必ずしも必要ではないが、その細胞の細胞小器官のうちの少なくとも一部を含むことができる。そのような方法は、例えば、フランツゾフ（Franzusoff）ら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）、１９８３年、第２５８巻、ｐ．３６０８〜３６１４、およびバッセイ（Bussey）ら、バイオキミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ（Biochim. Biophys. Acta）、１９７９年、第５５３巻、ｐ．１８５〜１９６（それぞれ全体が参照により本願に援用される）に記載されている。
【０２２０】
酵母膜粒子（細胞レベル以下の酵母細胞膜抽出物もしくはその画分）とは、天然の核または細胞質を欠く酵母細胞膜を指す。該粒子は、天然の酵母細胞膜の大きさから、当業者に周知の音波処理またはその他の膜破壊方法とその後の再密封とによって生じた微粒子に至る範囲の大きさを含む、任意の大きさのものであってよい。細胞レベル以下の酵母細胞膜抽出物を生産する方法は、例えば、フランツゾフ（Franzusoff）ら、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Meth. Enzymol.）、１９９１年、第１９４巻、ｐ．６６２〜６７４に記載されている。さらに酵母膜粒子の画分を使用することも可能であり、該画分は、酵母膜部分を、および、抗原または他のタンパク質が酵母膜粒子の調製に先立って酵母により組換え発現される場合は対象とする抗原または他のタンパク質を、含有する。対象とする抗原または他のタンパク質は、膜の内側、膜のいずれかの表面上、またはこれらの組み合わせにおいて担持されうる（すなわち、タンパク質は、膜の内側および外側の両方にあってもよいし、かつ／または、酵母膜粒子の膜を貫通していてもよい）。１つの実施形態では、酵母膜粒子は組換え酵母膜粒子であって、少なくとも１つの所望の対象とする抗原または他のタンパク質を膜の表面上に、または膜内に少なくとも部分的に埋め込んで備えている、完全な酵母膜、破壊された酵母膜、または破壊および再密封された酵母膜であってよい。
【０２２１】
酵母細胞壁調製物の一例は、単離された酵母細胞壁であって、その表面上に、または細胞壁内に少なくとも部分的に埋め込んで抗原を担持している酵母細胞壁の調製物であり、該酵母細胞壁調製物は、動物に投与された時に疾患標的に対する所望の免疫応答を刺激するようになっている。
【０２２２】
本発明の酵母ビヒクルを生産するために任意の酵母株を使用することができる。酵母は、３つの綱すなわち：子嚢菌類（Ascomycetes）、担子菌類（Basidiomycetes）および不完全菌類（Fungi Imperfecti）のうちの１つに属する単細胞微生物である。免疫調節剤として使用するための酵母の種類の選択に対する１つの留意事項は、酵母の病原性である。１つの実施形態では、酵母はサッカロマイセス・セレビシエのような非病原性の株である。非病原性の酵母株の選択は、酵母ビヒクルが投与される個体への何らかの副作用を最小限にする。しかしながら、酵母の病原性が当業者に周知の任意の手段によって無効とされうる場合（例えば突然変異株）、病原性酵母が使用されてもよい。
【０２２３】
本発明において使用されうる酵母菌株の属には、限定するものではないが、サッカロマイセス属（Saccharomyces）、カンジダ属（Candida）、クリプトコックス属（Cryptococcus）、ハンゼヌラ属（Hansenula）、クルイベロマイセス属（Kluyveromyces）、ピチア属（Pichia）、ロドトルラ属（Rhodotorula）、シゾサッカロマイセス属（Schizosaccharomyces）およびヤロウィア属（Yarrowia）が挙げられる。１つの態様では、酵母の属はサッカロマイセス属、カンジダ属、ハンゼヌラ属、ピチア属またはシゾサッカロマイセス属から選択され、１つの態様では、酵母の属はサッカロマイセス属、ハンゼヌラ属およびピチア属から選択され、１つの態様ではサッカロマイセス属が使用される。本発明において使用されうる酵母菌株の種には、限定するものではないが、サッカロマイセス・セレビシエ、サッカロマイセス・カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、カンジダ・ケフィル（Candida kefyr）、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、クリプトコックス・ラウレンティ（Cryptococcus laurentii）、クリプトコックス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、ハンゼヌラ・アノマラ（Hansenula anomala）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、クルイベロマイセス・フラギリス（Kluyveromyces fragilis）、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、クルイベロマイセス・マルキシアヌスのラクティス種（Kluyveromyces marxianus var. lactis）、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）、ロドトルラ・ルブラ（Rhodotorula rubra）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）およびヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）が挙げられる。当然のことであるが、いくつかの上記生物種は前述の生物種の内に含まれるように意図される様々な亜種、タイプ、サブタイプなどを含む。１つの態様では、本発明において使用される酵母の種にはＳ．セレビシエ、Ｃ．アルビカンス、Ｈ．ポリモルファ、Ｐ．パストリスおよびＳ．ポンベが挙げられる。Ｓ．セレビシエは、取扱が比較的簡単であり、かつ食品添加物としての使用について「安全性認定（Generally Recognized As Safe）」すなわち「ＧＲＡＳ」（ＧＲＡＳ、ＦＤＡ規則案６２ＦＲ１８９３８、１９９７年４月１７日）であることから、有用である。本発明の１つの実施形態は、Ｓ．セレビシエｃｉｒ○株のような、プラスミドを極めて多くのコピー数へと複製することができる酵母株である。このＳ．セレビシエ株は、１つ以上の標的抗原および／または抗原融合タンパク質および／またはその他のタンパク質が高レベルで発現されることを可能にする発現ベクターを担持することができるような株の１つである。加えて、任意の突然変異酵母株、例えばＮ結合型グリコシル化を伸長する酵素における変異のような、発現される標的抗原またはその他のタンパク質の翻訳後修飾の低減を示す突然変異酵母株などが、本発明で使用されてもよい。
【０２２４】
本発明のほとんどの実施形態では、酵母系免疫療法組成物は、少なくとも１つの抗原、その免疫原性ドメイン、またはそのエピトープを含んでいる。本発明での使用が企図される抗原には、ＨＢＶタンパク質もしくはそのドメインの突然変異体、バリアントおよびアゴニストを含む、任意のＨＢＶ抗原またはその免疫原性ドメインであって、ＨＢＶ感染に対して宿主を予防的もしくは治療的に免疫する目的で誘発することが望まれる免疫応答の対象であるものが挙げられる。本発明の様々な実施形態において有用なＨＢＶ抗原は、上記に詳細に記載されている。
【０２２５】
任意選択で、本発明の酵母系免疫療法組成物の構成成分として使用されるタンパク質、例えば融合タンパク質は、酵母内における組換え抗原の発現または発現の安定性を改善または増強するのに特に有用である構築物を使用して生産される。典型的には、所望の抗原性タンパク質またはペプチドは、そのアミノ末端において以下すなわち：（ａ）酵母ビヒクル内における融合タンパク質の発現を安定させるか、または発現された融合タンパク質の翻訳後修飾を防止する特定の合成ペプチド（そのようなペプチドは、例えば２００４年８月１２日に公開された米国特許出願公開第２００４−０１５６８５８Ａ１号明細書（全体が参照により本願に援用される）に詳細に記載されている）；（ｂ）内在性酵母タンパク質の少なくとも一部分、例えば、限定するものではないがαファクターであって、いずれの融合パートナーも酵母内におけるタンパク質の発現の安定性の改善をもたらし、かつ／または酵母細胞による該タンパク質の翻訳後修飾を防止するもの（そのようなタンパク質も上述の米国特許出願公開第２００４−０１５６８５８Ａ１号明細書に詳細に記載されている）；ならびに（ｃ）融合タンパク質が酵母の表面で発現されるようにする酵母タンパク質（例えば本明細書中により詳細に記載されたＡｇａタンパク質）の少なくとも一部、のうち少なくともいずれかに融合される。加えて、本発明は、特にタンパク質の選択および同定に使用するために、抗原をコードする構築物のＣ末端に融合されるペプチドの使用を任意選択で含む。そのようなペプチドには、限定するものではないが、任意の合成または天然ペプチド、例えばペプチドタグ（例えばヘキサヒスチジン）または任意の他の短いエピトープタグが挙げられる。本発明による抗原のＣ末端に取り付けられるペプチドは、上記に議論されたＮ末端ペプチドの付加の有無にかかわらず使用されうる。
【０２２６】
１つの実施形態では、融合タンパク質において有用な、抗原とは異種の少なくとも２つのアミノ酸残基で構成されている合成ペプチドが抗原のＮ末端に連結され、該ペプチドは酵母ビヒクル内における融合タンパク質の発現を安定させるかまたは発現された融合タンパク質の翻訳後修飾を防止する。該合成ペプチドおよび抗原のＮ末端部分はともに、以下の必要条件すなわち：（１）融合タンパク質の１位のアミノ酸残基はメチオニンであること（すなわち合成ペプチド中の第１のアミノ酸がメチオニンであること）；（２）融合タンパク質の２位のアミノ酸残基はグリシンまたはプロリンではないこと（すなわち合成ペプチド中の第２のアミノ酸はグリシンまたはプロリンではないこと）；（３）融合タンパク質の２〜６位のアミノ酸残基はいずれもメチオニンではないこと（すなわち、２〜６位のアミノ酸は、合成ペプチドの一部であれ、合成ペプチドが６アミノ酸より短い場合はタンパク質であれ、メチオニンを含まないこと）；および（４）融合タンパク質の２〜６位のアミノ酸はいずれもリジンまたはアルギニンではないこと（すなわち、２〜６位のアミノ酸は、合成ペプチドの一部であれ、合成ペプチドが５アミノ酸より短い場合はタンパク質であれ、リジンまたはアルギニンを含まないこと）、を有する融合タンパク質を形成する。合成ペプチドは２アミノ酸ほどの短さであってもよいが、１つの態様では、２〜６アミノ酸（３アミノ酸、４アミノ酸、５アミノ酸を含む）であり、また６アミノ酸より長く、全ての整数で最大約２００アミノ酸、３００アミノ酸、４００アミノ酸、５００アミノ酸まで、またはそれ以上であってもよい。
【０２２７】
１つの実施形態では、融合タンパク質は、Ｍ‐Ｘ２‐Ｘ３‐Ｘ４‐Ｘ５‐Ｘ６のアミノ酸配列を含み、前記配列中、Ｍはメチオニンであり；Ｘ２は、グリシン、プロリン、リジンまたはアルギニン以外の任意のアミノ酸であり；Ｘ３は、メチオニン、リジンまたはアルギニン以外の任意のアミノ酸であり；Ｘ４は、メチオニン、リジンまたはアルギニン以外の任意のアミノ酸であり；Ｘ５は、メチオニン、リジンまたはアルギニン以外の任意のアミノ酸であり；Ｘ６は、メチオニン、リジンまたはアルギニン以外の任意のアミノ酸である。１つの実施形態では、Ｘ６残基はプロリンである。酵母における抗原の発現の安定性を増強し、かつ／または酵母における該タンパク質の翻訳後修飾を防止する例示の合成配列には、配列Ｍ‐Ａ‐Ｄ‐Ｅ‐Ａ‐Ｐ（配列番号３７）が挙げられる。同じ特性を備えた別の例示の合成配列はＭ‐Ｖである。発現産物の安定性の増強に加えて、これらの融合パートナーは、構築物中の免疫抗原に対する免疫応答に悪影響を及ぼさないようである。加えて、合成融合ペプチドは、抗体のような選択作用物質によって認識されうるエピトープを提供するように設計可能である。
【０２２８】
１つの実施形態では、ＨＢＶ抗原は、Ｎ末端においてαファクタープレプロ配列（αファクターシグナルリーダー配列とも呼ばれ、そのアミノ酸配列は配列番号８９または配列番号９０によって本明細書中に例証されている）のような酵母タンパク質に連結される。酵母のαファクタープレプロ配列の他の配列も当分野において周知であり、本発明における使用のために含まれる。
【０２２９】
本発明の１つの態様では、酵母ビヒクルは、発現されたタンパク質産物の送達または移動によって、部分的または全体的に、酵母ビヒクルの表面上に抗原が発現または提供されるように操作される（細胞外発現）。本発明のこの態様を遂行する１つの方法は、酵母ビヒクルの表面に１つ以上のタンパク質を配置するためのスペーサーアームを使用することである。例えば、抗原または対象とする他のタンパク質と、該抗原または対象とする他のタンパク質を酵母細胞壁へ向けて方向付けるタンパク質との融合タンパク質を作出するために、スペーサーアームを使用することができる。例えば、他のタンパク質の方向付けを行うために使用されうるような１つのタンパク質は、抗原または他のタンパク質が酵母の表面に位置するように、該抗原または他のタンパク質が酵母細胞壁へ向けて方向付けられることを可能にする酵母タンパク質（例えば細胞壁タンパク質（cell wall protein）２（ｃｗｐ２）、Ａｇａ２、Ｐｉｒ４またはＦｌｏ１タンパク質）である。酵母タンパク質以外のタンパク質がスペーサーアームに使用されてもよいが；いかなるスペーサーアームタンパク質についても、最も望ましいのは免疫原性応答（immunogenic response）をスペーサーアームタンパク質ではなく標的抗原に対して向かわせることである。そのため、他のタンパク質がスペーサーアームに使用される場合、使用されるスペーサーアームタンパク質は、標的抗原に対する免疫応答が圧倒されるほど大きな免疫応答をスペーサーアームタンパク質自体に対して生成するべきではない。当業者は、スペーサーアームタンパク質に対して、標的抗原に関する免疫応答に比べて小さな免疫応答となるように目指すべきである。スペーサーアームは、必要に応じて、抗原が酵母から容易に採取または移出処理されることを可能にする切断部位（例えばプロテアーゼ切断部位）を有するように構築されうる。免疫応答の大きさを決定する任意の既知の方法が使用可能であり（例えば抗体産生、溶解アッセイなど）、かつ当業者によく知られている。
【０２３０】
標的抗原または他のタンパク質を酵母表面上に露出されるように位置決めする別の方法は、標的物を酵母細胞壁につなぎ留めるためにグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）のようなシグナル配列を使用することである。別例として、位置決めは、抗原または対象とする他のタンパク質を小胞体（ＥＲ）内への移動を介して分泌経路へと方向付け、その結果該抗原が細胞壁に結合されるタンパク質（例えばｃｗｐ）に結合するようにするシグナル配列を追加することにより、遂行されてもよい。
【０２３１】
１つの態様では、スペーサーアームタンパク質は酵母タンパク質である。該酵母タンパク質は、約２アミノ酸〜約８００アミノ酸の酵母タンパク質で構成されうる。１つの実施形態では、該酵母タンパク質は約１０〜７００アミノ酸である。別の実施形態では、該酵母タンパク質は約４０〜６００アミノ酸である。本発明の他の実施形態は、少なくとも２５０アミノ酸、少なくとも３００アミノ酸、少なくとも３５０アミノ酸、少なくとも４００アミノ酸、少なくとも４５０アミノ酸、少なくとも５００アミノ酸、少なくとも５５０アミノ酸、少なくとも６００アミノ酸、または少なくとも６５０アミノ酸である酵母タンパク質を含む。１つの実施形態では、酵母タンパク質は少なくとも４５０アミノ酸の長さである。抗原の表面発現の最適化に関する別の留意事項は、必要な場合には、抗原およびスペーサーアームの組み合わせが、モノマーとして、もしくはダイマーとして、もしくはトライマーとして発現されるべきか、または互いに連結された更に多数のユニットとして発現されるべきか、ということである。このモノマー、ダイマー、トライマーなどの使用は、抗原の適切な間隔（スペーシング）または折りたたみを可能とし、その結果として該抗原の（全てではないにせよ）ある部分がより免疫原性となる様式で酵母ビヒクルの表面に提示されるようになっている。
【０２３２】
酵母タンパク質の使用は、酵母ビヒクル中の融合タンパク質の発現を安定させることを可能とし、発現された融合タンパク質の翻訳後修飾を防止し、かつ／または、融合タンパク質を酵母内の特定のコンパートメントへ方向付ける（例えば酵母細胞の表面で発現されるようにする）。酵母の分泌経路内への送達については、使用する例示の酵母タンパク質には、限定するものではないが、Ａｇａ（例えば、限定するものではないが、ＡｇａｌおよびＡｇａ２のうち少なくとも一方）；ＳＵＣ２（酵母インベルターゼ）；αファクターシグナルリーダー配列；ＣＰＹ；細胞壁内への局在および保持のためにはＣｗｐ２ｐ；娘細胞形成の初期段階における酵母細胞の芽への局在のためにはＢＵＤ遺伝子群；Ｆｌｏ１ｐ；Ｐｉｒ２ｐ；ならびにＰｉｒ４ｐ、が挙げられる。
【０２３３】
他の配列は、タンパク質を酵母ビヒクルの他の部分へ、例えば、サイトゾル内またはミトコンドリアまたは小胞体または核へと方向付け、保持し、かつ／または安定させるために、使用されうる。上記の実施形態のうちいずれかに使用されうる適切な酵母タンパク質の例には、限定するものではないが、ＴＫ、ＡＦ、ＳＥＣ７；グルコース抑制性の発現（repressible expression in glucose）およびサイトゾル局在のためにはホスホエノールピルビル酸カルボキシキナーゼＰＣＫ１、ホスホグリセロキナーゼＰＧＫおよびトリオースリン酸イソメラーゼＴＰＩ遺伝子産物；細胞が熱処理に供されると発現が誘導され、かつそのタンパク質は熱安定性が高い、熱ショック蛋白質ＳＳＡ１、ＳＳＡ３、ＳＳＡ４、ＳＳＣ１；ミトコンドリア内への移行のためにはミトコンドリアタンパク質ＣＹＣ１；ＡＣＴ１、が挙げられる。
【０２３４】
酵母系免疫療法組成物を製造するために、酵母ビヒクルを製造し、かつ酵母ビヒクルを抗原ならびに対象とする他のタンパク質および／または作用物質のうち少なくともいずれかとともに、発現、組み合わせ、および関連付けのうち少なくともいずれかを行う方法が、本発明によって企図される。
【０２３５】
本発明によれば、用語「酵母ビヒクル‐抗原複合体」または「酵母‐抗原複合体」は、酵母ビヒクルの抗原との任意の関連を述べるために総称的に使用され、また、そのような組成物が上述のような免疫応答を誘発するために使用される場合は、「酵母系免疫療法組成物」と互換的に使用されうる。そのような関連には、酵母（組換え酵母）による該抗原の発現、酵母内への抗原の導入、酵母への抗原の物理的結合、ならびに、バッファーもしくは他の溶液中または調合物中などにおける酵母および抗原の混合が含まれる。この種の複合体は以下に詳細に説明される。
【０２３６】
１つの実施形態では、酵母ビヒクルを調製するために使用される酵母細胞は、タンパク質（例えば抗原）が該酵母細胞によって発現されるように、該タンパク質をコードする異種核酸分子でトランスフェクトされる。そのような酵母は本明細書中において組換え酵母または組換え酵母ビヒクルとも呼ばれる。その後、酵母細胞は完全な細胞として樹状細胞内に入れられてもよいし、酵母細胞は殺処理されてもよく、または例えば酵母スフェロプラスト、サイトプラスト、ゴーストもしくは細胞レベル以下の粒子の形成などによって派生物化されることも可能であり、該派生物はいずれもその後樹状細胞内に入れられる。酵母スフェロプラストは、抗原または他のタンパク質を発現する組換えスフェロプラストを生産するために、組換え核酸分子を用いて直接トランスフェクトされてもよい（例えば、スフェロプラストが全酵母から製造され、次いでトランスフェクトされる）。
【０２３７】
一般に、酵母ビヒクルならびに抗原および他の作用物質のうち少なくとも一方は、本明細書中に記載された任意の技術によって関連付けることができる。１つの態様では、酵母ビヒクルに、抗原および作用物質のうち少なくとも一方の細胞内封入がなされた。別の態様では、抗原および作用物質のうち少なくとも一方を、共有結合または非共有結合により酵母ビヒクルに結合させた。さらに別の態様では、酵母ビヒクルと、抗原および他の作用物質のうち少なくとも一方は、混合によって関連付けがなされた。別の態様、および１つの実施形態では、抗原および作用物質のうち少なくとも一方が、酵母ビヒクルによって、または酵母ビヒクルが得られる元の酵母細胞もしくは酵母スフェロプラストによって、組換え発現される。
【０２３８】
本発明の酵母ビヒクルによって産生されるいくつかの抗原および／または他のタンパク質は、酵母ビヒクルによって合理的に産生されうる任意の数の抗原および／または他のタンパク質であり、典型的には少なくとも１個〜少なくとも約６個またはそれ以上の範囲であり、例えば約２個〜約６個の異種抗原および／または他のタンパク質である。
【０２３９】
本発明の酵母ビヒクルにおける抗原または他のタンパク質の発現は、当業者に周知の技術を使用して遂行される。簡潔に述べると、少なくとも１つの所望の抗原または他のタンパク質をコードする核酸分子は、宿主酵母細胞内に形質転換された時に該核酸分子の構成的発現または調節された発現のいずれかを行うことができるように該核酸分子が転写調節配列に作動可能に連結される様式で、発現ベクター内に挿入される。１つ以上の抗原および他のタンパク質のうち少なくとも一方をコードする核酸分子は、１つ以上の発現調節配列に作動可能に連結された１つ以上の発現ベクター上に存在しうる。特に重要な発現調節配列は、プロモーターおよび上流活性化配列のような、転写開始を制御するものである。任意の適切な酵母プロモーターが本発明において使用可能であり、様々なそのようなプロモーターは当業者に周知である。サッカロマイセス・セレビシエにおける発現のためのプロモーターには、限定するものではないが、以下の酵母タンパク質：アルコール脱水素酵素Ｉ（ＡＤＨ１）もしくはＩＩ（ＡＤＨ２）、ＣＵＰ１、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、翻訳伸長因子ＥＦ‐１α（ＴＥＦ２）、グリセリンアルデヒド‐３‐リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ；トリオースリン酸デヒドロゲナーゼについてはＴＤＨ３とも呼ばれる）、ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、ガラクトース‐１‐リン酸ウリジルトランスフェラーゼ（ＧＡＬ７）、ＵＤＰガラクトースエピメラーゼ（ＧＡＬ１０）、チトクロムｃ１（ＣＹＣ１）、Ｓｅｃ７タンパク質（ＳＥＣ７）および酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ５）をコードする遺伝子のプロモーター、例えばＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターおよびＣＹＣ１／ＧＡＬ１０プロモーターのようなハイブリッドプロモーター、ならびに例えば細胞内グルコース濃度が低いとき（例えば約０．１〜約０．２パーセント）に誘導されるＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーター、さらにはＣＵＰ１プロモーターおよびＴＥＦ２プロモーターが挙げられる。同様に、エンハンサーとも呼ばれるいくつかの上流活性化配列（ＵＡＳ）が知られている。サッカロマイセス・セレビシエにおける発現のための上流活性化配列には、限定するものではないが、以下のタンパク質すなわち：ＰＣＫ１、ＴＰＩ、ＴＤＨ３、ＣＹＣ１、ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、ＳＵＣ２、ＧＡＬ１、ＧＡＬ７およびＧＡＬ１０をコードする遺伝子のＵＡＳ、さらには、１つの態様で使用されているＡＤＨ２のＵＡＳと共に、ＧＡＬ４遺伝子産物によって活性化される他のＵＡＳ、が挙げられる。ＡＤＨ２のＵＡＳはＡＤＲ１遺伝子産物によって活性化されるので、異種遺伝子がＡＤＨ２のＵＡＳに作動可能に連結されている場合はＡＤＲ１遺伝子を過剰発現させることが好ましい場合がある。サッカロマイセス・セレビシエにおける発現のための転写終止配列には、αファクター、ＧＡＰＤＨおよびＣＹＣ１遺伝子の終止配列が含まれる。
【０２４０】
メチル栄養性（methyltrophic）酵母において遺伝子を発現させる転写調節配列には、
アルコールオキシダーゼおよびギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の転写調節領域が含まれる。
【０２４１】
本発明による酵母細胞内への核酸分子のトランスフェクションは、核酸分子が細胞内へ導入されうる任意の方法、例えば、限定するものではないが、拡散、能動輸送、浴槽音波処理、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、吸着、およびプロトプラスト融合によって遂行されうる。トランスフェクトされる核酸分子は、酵母染色体に統合されてもよいし、当業者に周知の技術を使用して染色体外のベクター上に維持されてもよい。そのような核酸分子を担持している酵母ビヒクルの例は本明細書中に詳細に開示されている。上記に議論されるように、酵母サイトプラスト、酵母ゴースト、および酵母膜粒子すなわち細胞壁調製物も、所望の核酸分子を用いて完全体の酵母微生物または酵母スフェロプラストをトランスフェクトし、その中で抗原を生産し、次いで当業者に周知の技術を使用して該微生物またはスフェロプラストをさらに操作して、所望の抗原または他のタンパク質を含有するサイトプラスト、ゴーストまたは細胞レベル以下の酵母細胞膜抽出物もしくはその画分を製造することにより、組換え生産されうる。
【０２４２】
組換え酵母ビヒクルの製造ならびに該酵母ビヒクルによる抗原および他のタンパク質のうち少なくとも一方の発現のための有効な条件には、酵母株を培養可能な有効な培地が含まれる。有効な培地とは、典型的には、同化可能な炭水化物、窒素およびリン酸供給源のほかに適切な塩類、無機質、金属、ならびにビタミンおよび成長因子のような他の栄養素を含む水性の培地である。培地は複合栄養素を含むことも可能であるし、規定の最少培地であってもよい。本発明の酵母株は、様々な容器の中で、例えば、限定するものではないがバイオリアクタ、エルレンマイヤーフラスコ、試験管、マイクロタイターディッシュ、およびペトリ皿において培養されうる。培養は、その酵母株について適切な温度、ｐＨおよび酸素含量で行なわれる。そのような培養条件は、十分に当業者の専門知識の範囲内にある（例えば、ガスリー（Guthrie）ら（編）、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology）、１９９１年、第１９４巻、米国サンディエゴのアカデミックプレス（Academic Press）、を参照）。
【０２４３】
本発明のいくつかの実施形態では、酵母を中性のｐＨ条件下で増殖させる。本明細書中で使用されるように、用語「中性のｐＨ」の一般的な使用法は約ｐＨ５．５〜約ｐＨ８のｐＨ範囲を指し、１つの態様では、約ｐＨ６〜約８の範囲を指す。当業者は、ｐＨ計で測定する場合には軽微な変動（例えば１０分の１程度または１００分の１程度）が生じうることを認識しているであろう。そのため、酵母細胞を増殖させるための中性のｐＨの使用とは、酵母細胞が培養状態にある時間の大部分の間、該酵母細胞が中性のｐＨにおいて増殖することを意味している。１つの実施形態では、酵母を、少なくともｐＨ５．５のレベルに維持された培地（すなわち、培地のｐＨは、ｐＨ５．５未満に低下することは許されない）において増殖させる。別の態様では、酵母を約６、６．５、７、７．５または８に維持されたｐＨレベルで増殖させる。酵母の培養における中性のｐＨの使用は、免疫調節のために酵母をビヒクルとして使用するのに望ましい特徴であるいくつかの生物学的作用を促進する。例えば、中性のｐＨにおける酵母の培養は、細胞世代時間に対する悪影響（例えば、倍加時間の遅延）を伴わない酵母の良好な増殖を可能にする。酵母は、自身の細胞壁の柔軟性（pliability）を失うことなく高密度に増殖し続けることができる。中性のｐＨの使用は、すべての集菌密度において、柔軟な細胞壁を備えた酵母および細胞壁溶解酵素（例えばグルカナーゼ）への感受性の高い酵母のうち少なくとも一方の生産を可能にする。この特質が望ましいのは、可撓性を有する（flexible）細胞壁を備えた酵母が、より酸性の条件下で増殖させた酵母と比較して、例えば酵母を貪食した抗原提示細胞によるサイトカイン（例えばＴＨ１型サイトカイン、例えば、限定するものではないが、ＩＦＮ‐γ、インターロイキン１２（ＩＬ‐１２）およびＩＬ‐２、さらにはＩＬ‐６のような炎症誘発性サイトカイン）の分泌を促進することにより、様々な免疫応答または免疫応答の増大を引き起こしうるからである。加えて、細胞壁内にある抗原をより利用しやすくなることも、そのような培養方法によってもたらされる。別の態様では、いくつかの抗原について中性のｐＨを使用することで、そのような抗原を発現する酵母が低いｐＨ（例えばｐＨ５）の培地で培養される場合には不可能である、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を用いた処理によるジスルフィド結合した抗原の解放が可能となる。
【０２４４】
１つの実施形態では、酵母のグリコシル化量の制御が、酵母による、特に表面上での抗原の発現を制御するために使用される。酵母のグリコシル化量は、糖部分が嵩高になりやすいことから、表面上に発現された抗原の免疫原性および抗原性に影響を及ぼす可能性がある。そのため、酵母表面上の糖部分の存在、およびその存在による標的抗原周辺の三次元空間への影響は、本発明による酵母の調節において考慮されるべきである。酵母のグリコシル化量を低減する（または、必要であれば増大させる）ために任意の方法が使用されうる。例えば、グリコシル化が低いものとして選択された酵母突然変異株（例えばｍｎｎ１、ｏｃｈ１およびｍｎｎ９突然変異体）を使用することも考えられるし、突然変異によって標的抗原上のグリコシル化受容体配列を排除することも考えられる。別例として、簡略化されたグリコシル化パターンを備えた酵母（例えばピチア属）を使用することも考えられる。さらに、グリコシル化を低減または変更する方法を用いて酵母を処理することも可能である。
【０２４５】
本発明の１つの実施形態では、酵母ビヒクルにおける抗原または他のタンパク質の組換え発現の代わりとして、酵母ビヒクルに、タンパク質もしくはペプチドが、または抗原としての役割を果たしかつ／もしくは本発明による免疫調節物質もしくは生体応答修飾物質として有用である炭水化物もしくは他の分子が、細胞内に入れられる。続いて、今や細胞内に抗原および他のタンパク質のうち少なくとも一方を含有している酵母ビヒクルは、個体に投与されてもよいし、樹状細胞のような担体に入れられてもよい。ペプチドおよびタンパク質は、当業者に周知の技術により、例えば拡散、能動輸送、リポソーム融合、エレクトロポレーション、貧食作用、結氷融解サイクルおよび浴槽音波処理などにより、本発明の酵母ビヒクルに直接挿入されうる。ペプチド、タンパク質、炭水化物、または他の分子を直接入れることが可能な酵母ビヒクルには、完全体の酵母のほかに、スフェロプラスト、ゴーストまたはサイトプラストが含まれ、これらは生成させた後で抗原および他の作用物質を入れることができる。別例として、完全体の酵母に抗原および／または作用物質が入れられ、次いでそこからスフェロプラスト、ゴースト、サイトプラストまたは細胞レベル以下の粒子が調製されてもよい。任意の数の抗原および／または他の作用物質、例えば、微生物またはその一部への封入によって提供されるであろうような、少なくとも１、２、３、４個または任意の全ての整数であって何百もしくは何千までの抗原および／または他の作用物質が、本実施形態の酵母ビヒクルに封入可能である。
【０２４６】
本発明の別の実施形態では、抗原および他の作用物質のうち少なくとも一方は酵母ビヒクルに物理的に取り付けられる。抗原および他の作用物質のうち少なくとも一方の酵母ビヒクルへの物理的結合は、共有結合および非共有結合による結合法を含む当分野における任意の適切な方法、例えば、限定するものではないが、抗原および他の作用物質のうち少なくとも一方を酵母ビヒクルの外側表面に化学的に架橋すること、または、抗原および他の作用物質のうち少なくとも一方を酵母ビヒクルの外側表面に、例えば抗体もしくは他の結合パートナーの使用によって生物学的に連結すること、によって遂行されうる。化学的架橋は、例えば、グルタルアルデヒド結合、フォトアフィニティーラベリング、カルボジイミドによる処理、ジスルフィド結合を形成可能な化学物質による処理、および当分野において標準的な他の化学架橋剤による処理を含む方法によって達成されうる。別例として、酵母細胞膜の脂質二重層の電荷または細胞壁の組成を変化させる化学物質を酵母ビヒクルと接触させることにより、酵母の外側表面を特定の電荷特性を有する抗原および／または他の作用物質と融合または結合しやすくしてもよい。抗体、結合ペプチド、可溶性受容体、および他のリガンドのような標的を有する物質も、融合タンパク質として抗原に組み込まれる場合もあれば、他の方法で、酵母ビヒクルへの抗原の結合のために抗原に結合させる場合もある。
【０２４７】
抗原または他のタンパク質が酵母の表面上で発現されるかまたは該表面に物理的に取り付けられる場合、１つの態様では、スペーサーアームは、該表面における抗原または他のタンパク質の発現または含有量を最適化するように注意深く選択されうる。スペーサーアームの大きさは、酵母の表面上において結合をなすために抗原または他のタンパク質がどの程度露出されるかに影響を及ぼす可能性がある。よって、どの抗原または他のタンパク質が使用されているかに応じて、当業者は、酵母表面上における該抗原または他のタンパク質のための適切な間隔をもたらすスペーサーアームを選択することになる。１つの実施形態では、スペーサーアームは少なくとも４５０アミノ酸の酵母タンパク質である。スペーサーアームについては上記に詳細に議論されている。
【０２４８】
さらに別の実施形態では、酵母ビヒクルおよび抗原または他のタンパク質は、より受動的、非特異的または非共有結合性の結合メカニズムによって、例えば酵母ビヒクルおよび抗原または他のタンパク質をともにバッファー中または他の適切な調合物（例えば混合剤）の中で穏やかに混合することによって、互いに関連付けられる。
【０２４９】
本発明の１つの実施形態では、酵母ビヒクルおよび抗原または他のタンパク質はいずれも樹状細胞またはマクロファージのような担体内に細胞内封入されて、本発明の治療用組成物またはワクチンを形成する。別例として、抗原または他のタンパク質は酵母ビヒクルが存在しない状態で樹状細胞内に入れられてもよい。
【０２５０】
１つの実施形態では、完全体の酵母（異種の抗原または他のタンパク質の発現の有無に関わらず）は、酵母細胞壁調製物、酵母膜粒子または酵母フラグメント（すなわち、完全体ではないもの）を製造するような方法で粉砕または加工処理されることが可能であり、酵母フラグメントは、いくつかの実施形態では、免疫応答を増強するために抗原を含む他の組成物（例えばＤＮＡワクチン剤、サブユニットタンパク質ワクチン剤、殺処理または不活性化された病原体）とともに提供されてもよいし、前記組成物とともに投与されてもよい。例えば、酵素処理、化学処理または物理的力（例えば機械的分断または音波処理）が、酵母を破壊してアジュバントとして使用される分割物とするために使用されてもよい。
【０２５１】
本発明の１つの実施形態では、本発明において有用な酵母ビヒクルには、殺処理または不活性化済みの酵母ビヒクルが含まれる。酵母の殺処理または不活性化は、当分野で既知の様々な適切な方法のうちいずれかによって為されうる。例えば、酵母の熱不活性化は酵母を不活性化する標準的な方法であり、当業者は、必要に応じて、当分野で既知の標準法によって標的抗原の構造変化をモニタリングすることができる。別例として、酵母を不活性化する他の方法、例えば化学的方法、電気的方法、放射活性を用いる方法、ＵＶを用いる方法などが使用されうる。例えば、「メソッズ・オブ・エンザイモロジー（Methods of Enzymology）」、１９９０年、第１９４巻、コールド・スプリング・ハーバー出版（Cold Spring Harbor Publishing）のような標準的な酵母培養の教科書に開示されている方法論を参照のこと。使用される不活性化方策のうちいかなるものも、標的抗原の二次、三次、または四次構造を考慮してその免疫原性を最適化するような構造を保存するべきである。
【０２５２】
酵母ビヒクルは、当業者に既知のいくつかの技術を使用して、本発明の酵母系免疫療法組成物または免疫療法産物、例えば対象者に直接投与されるかまたは最初に樹状細胞のような担体に入れられる調製物に、製剤化されうる。例えば、酵母ビヒクルは凍結乾燥法によって乾燥されてもよい。酵母ビヒクルを含む製剤は、製パン作業または醸造作業に使用される酵母について行われるような、固形物またはタブレット中に酵母をパッキングすることによっても調製されうる。加えて、酵母ビヒクルは、宿主または宿主細胞によって忍容される等張バッファーのような薬学的に許容可能な賦形剤と混合されてもよい。そのような賦形剤の例には、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、ハンクス溶液、およびその他の水性の生理学的に平衡な塩類溶液が挙げられる。固定油、ゴマ油、オレイン酸エチル、またはトリグリセリドのような非水性ビヒクルも使用されうる。他の有用な調合物には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、グリセロールまたはデキストランのような粘性促進剤を含有する懸濁剤が挙げられる。賦形剤は、微量の添加剤、例えば等張性および化学的安定性を増強する物質なども含有することができる。バッファーの例には、リン酸緩衝液、重炭酸緩衝液およびトリス緩衝液が挙げられる一方、保存剤の例にはチメロサール、ｍ‐またはｏ‐クレゾール、ホルマリンおよびベンジルアルコールが挙げられる。標準的な調合物は、液体注射剤、または注射用の懸濁剤もしくは溶液剤として適切な液体中に取り込まれうる固形剤、のいずれであってもよい。したがって、非液体の調合物では、賦形剤は例えば、投与に先立って滅菌水もしくは生理食塩水を加えることが可能な、デキストロース、ヒト血清アルブミン、および／または保存剤を含むことができる。
【０２５３】
本発明の１つの実施形態では、組成物は、生体応答修飾化合物とも呼ばれうる追加の作用物質を含むか、またはそのような作用物質／修飾物質を産生する能力を備えることができる。例えば、酵母ビヒクルが少なくとも１つの抗原および少なくとも１つの作用物質／生体応答修飾化合物を用いてトランスフェクトまたは封入されてもよいし、本発明の組成物が少なくとも１つの作用物質／生体応答修飾物質と共に投与されてもよい。生体応答修飾物質には、免疫応答を調節することができるアジュバントおよび他の化合物であって免疫調節化合物と呼ばれうるもの、および、酵母系免疫療法薬のような別の化合物または作用物質の生物学的活性（そのような生物学的活性は免疫システムの作用には限定されない）を修飾する化合物が含まれる。ある免疫調節化合物は防御免疫応答を刺激することができる一方、他の免疫調節化合物は有害な免疫応答を抑制することが可能であり、免疫調節薬が所与の酵母系免疫療法薬との組み合わせにおいて有用であるかどうかは、少なくとも部分的には、治療もしくは予防される病状もしくは病態、および治療される個体のうち少なくともいずれかに依存しうる。ある種の生体応答修飾物質は優先的に細胞性免疫応答を増強し、他の生体応答修飾物質は優先的に体液性免疫応答を増強する（すなわち、細胞性免疫が体液性免疫と比較して高レベルである免疫応答を刺激することができる、またはその逆）。ある種の生体応答修飾物質は、酵母系免疫療法薬の生物学的特性と共通した１つ以上の特性を有するか、または酵母系免疫療法薬の生物学的特性を増強もしくは補完する。免疫応答の刺激または抑制を測定するための、ならびに、細胞性免疫応答と体液性免疫応答とを区別するため、および、あるタイプの細胞性応答を別のものと区別する（例えばＴＨ１７応答とＴＨ１応答）ための、当業者に既知のいくつかの技術が存在する。
【０２５４】
本発明において有用な作用物質／生体応答修飾物質には、限定するものではないが、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、脂質誘導体、ペプチド、タンパク質、多糖類、低分子薬物、抗体およびその抗原結合フラグメント（例えば、限定するものではないが、抗サイトカイン抗体、抗サイトカイン受容体抗体、抗ケモカイン抗体）、ビタミン、ポリヌクレオチド、核酸結合性の構成部分、アプタマー、ならびに増殖調節因子が挙げられる。いくつかの適切な作用物質には、限定するものではないが、ＩＬ‐１またはＩＬ‐１もしくはＩＬ‐１Ｒのアゴニスト、抗ＩＬ‐１または他のＩＬ‐１アンタゴニスト；ＩＬ‐６またはＩＬ‐６もしくはＩＬ‐６Ｒのアゴニスト、抗ＩＬ‐６または他のＩＬ‐６アンタゴニスト；ＩＬ‐１２またはＩＬ‐１２もしくはＩＬ‐１２Ｒのアゴニスト、抗ＩＬ‐１２または他のＩＬ‐１２アンタゴニスト；ＩＬ‐１７またはＩＬ‐１７もしくはＩＬ‐１７Ｒのアゴニスト、抗ＩＬ‐１７または他のＩＬ‐１７アンタゴニスト；ＩＬ‐２１またはＩＬ‐２１もしくはＩＬ‐２１Ｒのアゴニスト、抗ＩＬ‐２１または他のＩＬ‐２１アンタゴニスト；ＩＬ‐２２またはＩＬ‐２２もしくはＩＬ‐２２Ｒのアゴニスト、抗ＩＬ‐２２または他のＩＬ‐２２アンタゴニスト；ＩＬ‐２３またはＩＬ‐２３もしくはＩＬ‐２３Ｒのアゴニスト、抗ＩＬ‐２３または他のＩＬ‐２３アンタゴニスト；ＩＬ‐２５またはＩＬ‐２５もしくはＩＬ‐２５Ｒのアゴニスト、抗ＩＬ‐２５または他のＩＬ‐２５アンタゴニスト；ＩＬ‐２７またはＩＬ‐２７もしくはＩＬ‐２７Ｒのアゴニスト、抗ＩＬ‐２７または他のＩＬ‐２７アンタゴニスト；Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ‐αを含む）またはＩ型インターフェロンもしくはその受容体のアゴニストもしくはアンタゴニスト；ＩＩ型インターフェロン（ＩＦＮ‐γを含む）またはＩＩ型インターフェロンもしくはその受容体のアゴニストもしくはアンタゴニスト；抗ＣＤ４０抗体、ＣＤ４０Ｌ、抗ＣＴＬＡ‐４抗体（例えば無反応性Ｔ細胞を放出するため）；Ｔ細胞共刺激因子（例えば抗ＣＤ１３７、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ４０）；アレムツズマブ（例えばＣａｍＰａｔｈ（登録商標））、デニロイキンジフチトクス（例えばＯＮＴＡＫ（商標））；抗ＣＤ４；抗ＣＤ２５；抗ＰＤ‐１、抗ＰＤ‐Ｌ１、抗ＰＤ‐Ｌ２；ＦＯＸＰ３を阻害する作用物質（例えばＣＤ４＋／ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の活性無効化／死滅させるため）；Ｆｌｔ３リガンド、イミキモド（Ａｌｄａｒａ（商標））、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ‐ＣＳＦ）；顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ‐ＣＳＦ）、サルグラモスチム（Ｌｅｕｋｉｎｅ（商標））；ホルモン、例えば限定するものではないがプロラクチンおよび成長ホルモン；Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、例えば限定するものではないが、ＴＬＲ‐２アゴニスト、ＴＬＲ‐４アゴニスト、ＴＬＲ‐７アゴニスト、およびＴＬＲ‐９アゴニスト；ＴＬＲアンタゴニスト、例えば限定するものではないが、ＴＬＲ‐２アンタゴニスト、ＴＬＲ‐４アンタゴニスト、ＴＬＲ‐７アンタゴニストおよびＴＬＲ‐９アンタゴニスト；抗炎症薬および免疫調節薬、例えば、限定するものではないが、ＣＯＸ‐２阻害薬（例えばセ��コキシブ、ＮＳＡＩＤＳ）、グルココルチコイド、スタチン、ならびにサリドマイドおよびそのアナログであって例えばＩＭｉＤ（商標）（サリドマイドの構造的および機能的アナログ（例えばＲＥＶＬＩＭＩＤ（登録商標）（レナリドマイド）、ＡＣＴＩＭＩＤ（登録商標）（ポマリドマイド））；炎症誘発性物質、例えば真菌成分もしくは細菌成分、または任意の炎症誘発性サイトカインもしくはケモカイン；免疫療法ワクチン剤、例えば、限定するものではないが、ウイルス由来のワクチン剤、細菌由来のワクチン剤、または抗体由来のワクチン剤；ならびに、任意の他の免疫調節薬、免疫強化物質、抗炎症薬、および炎症誘発性物質のうち少なくともいずれか、が挙げられる。そのような作用物質の任意の組み合わせも本発明によって企図され、またそのような作用物質のうち任意のものであって酵母系免疫療法薬と組み合わされたもの、または該免疫療法薬とともに手順に従って（例えば、同時に、連続して、または他の形式で）投与されるものは、本発明に包含される組成物である。そのような作用物質は当分野において良く知られている。これらの作用物質は単独で使用されてもよいし、本明細書中に記載された他の作用物質と組み合わされてもよい。
【０２５５】
作用物質には、所与のタンパク質もしくはペプチドまたはそのドメインの、アゴニストおよびアンタゴニストが含まれうる。本明細書中で使用されるように、「アゴニスト」とは、例えば、限定するものではないが、受容体またはリガンドに結合して反応を生成または誘発する低分子、タンパク質、ペプチド、抗体、核酸結合物質などの任意の化合物または作用物質であって、該受容体またはリガンドに結合する天然の物質の作用を模倣する物質を含みうる。「アンタゴニスト」とは、例えば、限定するものではないが、アゴニストの作用を阻止もしくは阻害または低減する低分子、タンパク質、ペプチド、抗体、核酸結合物質などの任意の化合物または作用物質である。
【０２５６】
本発明の組成物は、ＨＢＶ感染の予防もしくは治療に有用な任意の他の化合物もしくは組成物、またはＨＢＶ感染の任意の症状を治療もしくは改善する任意の化合物を、さらに含んでもよいし、または該化合物もしくは組成物とともに（同時に、連続して、または断続的に）投与されてもよい。様々な作用物質が、ＨＢＶ感染の予防および／または治療もしくは改善に有用であることが知られている。そのような作用物質には、限定するものではないが、抗ウイルス化合物、例えば、ヌクレオチドアナログ逆転写酵素阻害薬（ｎＲＴＩ）が挙げられるが、これに限定はされない。本発明の１つの態様では、適切な抗ウイルス化合物には、限定するものではないが：テノフォビル（ＶＩＲＥＡＤ（登録商標））、ラミブジン（ＥＰＩＶＩＲ（登録商標））、アデフォビル（ＨＥＰＳＥＲＡ（登録商標））、テルビブジン（ＴＹＺＥＫＡ（登録商標））、エンテカビル（ＢＡＲＡＣＬＵＤＥ（登録商標））、およびこれらの組み合わせ、ならびに／または、インターフェロン、例えばインターフェロンα２ａもしくはＰＥＧ化インターフェロンα２ａ（ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標））またはインターフェロンλなどが挙げられる。これらの作用物質は、典型的には長期間（例えば、１〜５年またはそれ以上にわたって毎日または毎週）投与される。加えて、本発明の組成物は、予防的免疫療法および治療的免疫療法のうち少なくとも一方を含む他の免疫療法組成物とともに使用されてもよい。例えば、ＨＢＶの予防的ワクチン剤は１９８０年代の初め以来市販されてきた。これら市販のワクチン剤は、精製された組換えＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を提供する非感染性のサブユニットウイルスワクチンであり、出生時より投与されうる。治療用の免疫療法組成物はＨＢＶ治療について米国で承認されていないが、そのような組成物には、ＨＢＶタンパク質もしくはエピトープのサブユニットワクチン、ＨＢＶウイルスベクターワクチン、サイトカイン、およびその他の免疫調節物質（例えばＴＬＲアゴニスト、免疫調節薬剤）が含まれうる。
【０２５７】
本発明はさらに、本明細書中に記載された組成物のうち任意のもの、または本明細書中に記載された組成物の個々の成分のうち任意のもの、を含むキットを含む。
《本発明の組成物の投与または使用のための方法》
本発明の組成物であって、本明細書中に記載された酵母系免疫療法組成物、ＨＢＶタンパク質および融合タンパク質を含むＨＢＶ抗原、ならびに上述のそのようなＨＢＶタンパク質または融合タンパク質をコードする組換え核酸分子、のうち少なくともいずれかの任意の１つ以上（例えば２、３、４、５個以上の組み合わせ）を含みうる組成物、ならびに、本明細書中に記載されるそのような酵母系組成物、抗原、タンパク質、融合タンパク質、または組換え分子を含む他の組成物は、様々なｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法において、例えば、限定するものではないが、ＨＢＶ感染症およびその後遺症の治療および予防のうち少なくとも一方を行うために、ＨＢＶの診断アッセイにおいて、または、ＨＢＶに対する抗体を生産するために、使用可能である。
【０２５８】
本発明の１つの実施形態は、個体または個体集団において、慢性のＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染の治療、および、慢性のＨＢＶ感染の少なくとも１つの症状の予防、改善または治療、のうち少なくともいずれかを行う方法に関する。該方法は、ＨＢＶに慢性感染している個体または個体集団に、本発明の１つ以上の免疫療法組成物を投与するステップを含む。１つの態様では、該組成物は、本明細書中に記載されるような１つ以上のＨＢＶ抗原を含む免疫療法組成物であって、該組成物には酵母系免疫療法組成物が含まれうる。１つの態様では、該組成物は、本明細書中に記載されるようなＨＢＶ抗原を含むタンパク質または融合タンパク質、および、そのようなタンパク質または融合タンパク質をコードする組換え核酸分子、のうち少なくともいずれかを含む。１つの実施形態では、個体または個体集団は慢性ＨＢＶ感染症に罹患している。１つの態様では、個体または個体集団は、ＨＢＶ感染の治療に有用な少なくとも１つの他の治療化合物を用いてさらに治療される。そのような治療化合物には、限定するものではないが、直接作用する抗ウイルス薬（例えば、上記または本明細書中他所に記載されたもの）、ならびに、インターフェロンおよび／またはその他の免疫療法薬もしくは免疫調節薬剤、のうち少なくともいずれかが挙げられる。１つの態様では、そのような治療化合物には、宿主を標的とした治療薬（例えば、ウイルス複製を妨害することができるシクロフィリン阻害剤、またはウイルスの生活環（再感染）を妨害することができる再侵入阻害剤（re-entry inhibitor））が挙げられる。
【０２５９】
「標準治療」または「ＳＯＣ」は、一般に、特定の疾患の治療に関する現在認められている標準治療を指す。慢性ＨＢＶ感染症では、ＳＯＣはいくつかの異なる承認された治療プロトコールのうちの１つであってよく、例えば、限定するものではないが、インターフェロン療法および抗ウイルス薬療法のうち少なくとも一方が挙げられる。ＨＢＶ感染の治療用に現在承認されている抗ウイルス薬には、テノフォビル（ＶＩＲＥＡＤ（登録商標））、ラミブジン（ＥＰＩＶＩＲ（登録商標））、アデフォビル（ＨＥＰＳＥＲＡ（登録商標））、テルビブジン（ＴＹＺＥＫＡ（登録商標））およびエンテカビル（ＢＡＲＡＣＬＵＤＥ（登録商標））が挙げられる。慢性ＨＢＶ感染について現時点で最も処方されることの多い抗ウイルス薬は、テノフォビルおよびエンテカビルである。慢性ＨＢＶ感染の治療に有用なインターフェロンには、インターフェロンαのようなＩ型インターフェロン、例えば、限定するものではないが、インターフェロンα２またはＰＥＧ化インターフェロンα２（例えばＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標））が挙げられる。１つの実施形態では、インターフェロンは、ＩＩＩ型インターフェロン、例えば、限定するものではないがインターフェロンλ１、インターフェロンλ２、およびインターフェロンλ３のうち少なくともいずれかである。本発明の免疫療法組成物は、１つ以上の抗ウイルス薬および／またはインターフェロンおよび／またはその他の免疫療法薬もしくは免疫調節薬剤に先立って、前記薬剤と同時に、前記薬剤とともに断続的に、および／または前記薬剤の後に、投与されうる。他の治療化合物も、本発明の免疫療法組成物を用いる治療に先立って、または該治療の後で、投与されうる。
【０２６０】
ＨＢＶ感染は、典型的には、感染者の血液中のＨＢｓＡｇ（Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原）およびＨＢｅＡｇ（ｅ抗原）のうち少なくとも一方の検出により、個体において診断される。血清中のＨＢｅＡｇの検出は活発なウイルス複製を反映しており、かつ感染の臨床転帰はｅ抗原の状態と相関しうるが、長期的な寛解（または治癒）については、現在の治療法を使用する場合はＨＢｓＡｇセロコンバージョンを用いるとより良好に予測される（以下を参照）。ＩｇＭコア抗体の検出も、感染の最初の６〜１２か月間に急性ＨＢＶ感染を検出するために使用されうる。６か月を超えて血液中にＨＢｓＡｇが持続すると、典型的には慢性ＨＢＶ感染と同定される。加えて、慢性ＨＢＶ感染はＨＢＶ  ＤＮＡの同定（＞２０００ＩＵ／ｍｌ）により診断可能であり、これは血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）のうち少なくとも一方のレベルの上昇（例えば正常の上限の二倍超）の検出または同定と組み合わされてもよい。
【０２６１】
ウイルス感染からの回復（完全寛解、またはＨＢＶ治療のエンドポイント）は、それぞれＨＢｅＡｇおよびＨＢｓＡｇの消失であるＨＢｅＡｇ／ＨＢｓＡｇセロコンバージョン、ならびにＢ型肝炎表面抗原に対する抗体（抗ＨＢｓ）およびＨＢｅＡｇに対する抗体のうち少なくとも一方の出現によって判断される。臨床研究から、セロコンバージョン、または防御抗体（抗ＨＢｓ）レベルは、以下すなわち：（ａ）ラジオイムノアッセイによって決定される１０以上のサンプルレシオユニット（ＳＲＵ）；（ｂ）酵素免疫測定法によって決定される良好な結果；または（ｃ）≧１０ｍＩＵ／ｍｌの抗体濃度の検出（１０ＳＲＵは抗体１０ｍＩＵ／ｍＬに匹敵する）、として定義されている。セロコンバージョンは、現在の標準治療（すなわち抗ウイルス薬またはインターフェロン）では慢性感染者において生じるのに数年を要する可能性がある。患者は、ウイルスＤＮＡの消失または著明な低減（ＰＣＲによる検出レベル未満または＜２０００ＩＵ／ｍｌ）、血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルの正常化、および肝臓の炎症および線維化の改善についてもモニタリングされうる。「ＡＬＴ」は十分に検証された肝損傷の尺度であり、肝臓の炎症の代用としての役割を果たす。過去の大規模な肝炎の治験では、ＡＬＴレベルの低下および正常化（ＡＬＴ正常化）のうち少なくとも一方が、連続生検によって決定されるような肝機能の改善および肝臓線維化の低減と相関することが示されている。
【０２６２】
本発明の別の実施形態は、個体または個体集団におけるＨＢＶ感染の予防、慢性ＨＢＶ感染の予防、およびＨＢＶ感染の重症度の低減のうち少なくともいずれかを行うために、個体または個体集団をＨＢＶに対して免疫する方法に関する。該方法は、ＨＢＶに感染していない（またはＨＢＶに感染していないと考えられる）個体または個体集団に、本発明の組成物を投与するステップを含む。１つの態様では、該組成物は、本明細書中に記載されるような１つ以上のＨＢＶ抗原を含む免疫療法組成物、例えば１つ以上の酵母系免疫療法組成物である。１つの態様では、該組成物は、本明細書中に記載されるようなＨＢＶ抗原を含む融合タンパク質、またはそのような融合タンパク質をコードする組換え核酸分子を含む。
【０２６３】
本明細書中で使用されるように、ＨＢＶ感染を「治療する」という言葉、またはその任意の言い換え（例えば、「ＨＢＶ感染について治療される」など）は、一般に、感染（急性または慢性）が生じてしまった時点で本発明の組成物を適用または投与することであって、検出可能なウイルス力価の低減または排除（例えばウイルスＤＮＡの低減（ＰＣＲによって検出可能なレベル未満または＜２０００ＩＵ／ｍｌ））、セロコンバージョンへの到達（ＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇのうち少なくとも一方に対する抗体の出現ならびに血清からのこれらのタンパク質の同時消失または低減）、個体における感染に起因する少なくとも１つの症状の低減、感染によって引き起こされる症状および下流の続発症のうち少なくとも一方の発症および／または重症度の遅延または予防、感染に起因する臓器または生理システムの障害（例えば硬変）の低減（例えば、異常なＡＬＴレベルの低減、肝臓の炎症の低減、肝臓の線維化の低減）、肝細胞癌（ＨＣＣ）の予防ならびに頻発および発病率の低減のうち少なくともいずれか、感染によって悪影響を受ける臓器またはシステム機能における改善（血清ＡＬＴレベルの正常化、肝臓の炎症の改善、肝臓の線維化の改善）、感染に対する免疫応答の改善、感染に対する長期記憶免疫応答の改善、ＨＢＶウイルスの再活性化の低減、ならびに、個体または個体集団の健康全般の改善、のうち少なくともいずれかを目的として行われることを指す。
【０２６４】
１つの態様では、治療の目的は、治療の完了後少なくとも６か月間にわたるウイルス排除の保持である。１つの態様では、治療の目的は、検出可能な血清ＨＢｅＡｇおよび／またはＨＢｓＡｇタンパク質の消失である。１つの態様では、治療の目的は、Ｂ型肝炎表面抗原に対する抗体（抗ＨＢｓ）および／またはＨＢｅＡｇに対する抗体の出現である。１つの態様では、治療の目的はセロコンバージョンであり、セロコンバージョンは以下すなわち：（ａ）ラジオイムノアッセイによって決定される１０以上のサンプルレシオユニット（ＳＲＵ）；（ｂ）酵素免疫測定法によって決定される良好な結果；または（ｃ）≧１０ｍＩＵ／ｍｌの抗体濃度の検出（１０ＳＲＵは抗体１０ｍＩＵ／ｍＬに匹敵する）によって定義されうる。
【０２６５】
ＨＢＶ感染を「予防する」こと、またはその任意の言い換え（例えば「ＨＢＶ感染の予防」など）は、一般に、ＨＢＶによる感染が生じてしまう前に本発明の組成物を適用または投与することであって、ＨＢＶによる感染の予防、ＨＢＶによる慢性感染の予防（すなわち、個体がそれ以上の治療介入を受けることなく急性ＨＢＶ感染を排除することを可能にすること）、または、後に万一感染が生じたとき、重症度、ならびに／または、慢性感染によってもたらされる感染期間および生理学的損傷のうち少なくともいずれかを少なくとも低減することであって、例えば、個体における感染に起因する少なくとも１つの症状の重症度もしくは発生率の予防または低減、ならびに、個体もしくは個体集団において、感染によって引き起こされる症状および下流の続発症のうち少なくとも一方の発症および／または重症度の遅延または予防、のうち少なくともいずれかを目的として行われることを指す。１つの態様では、本発明は、例えば本発明の組成物の投与後にＨＢＶ急性感染に至った個体が該感染を排除しかつ慢性感染に至らないことを可能にすることによって、慢性ＨＢＶ感染を予防するために使用されうる。
【０２６６】
本発明は、本発明の１つ以上の免疫療法組成物、例えば酵母系免疫療法組成物の、対象者への送達（投与、免疫処置）を含む。投与作業はｅｘ  ｖｉｖｏで実施されてもｉｎ  ｖｉｖｏで実施されてもよいが、典型的にはｉｎ  ｖｉｖｏで行なわれる。ｅｘ  ｖｉｖｏ投与とは、患者から取り出された細胞（樹状細胞）の集団に、酵母ビヒクル、抗原、および任意の他の作用物質または組成物が該細胞に入り込むような条件下で本発明の組成物を投与し、かつ該細胞を患者に戻すことのように、調節ステップの一部を患者の体外で実施することを指す。本発明の治療用組成物は、任意の適切な投与方式によって、患者に戻されてもよいし、患者に投与されてもよい。
【０２６７】
組成物の投与は、全身投与、粘膜投与、または標的部位の所在場所近く（例えば感染部位の近く）への投与のうち少なくともいずれかであってよい。適切な投与経路は、予防または治療される病態の種類、使用される抗原、および標的の細胞集団もしくは組織に応じて、当業者には明白となろう。様々な許容可能な投与方法には、限定するものではないが、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、リンパ節内（intranodal）投与、冠動脈内投与、動脈内投与（例えば頚動脈内）、皮下投与、経皮送達、気管内投与、関節内投与、脳室内投与、吸入（例えばエアロゾル）、頭蓋内、脊髄内、眼内、耳内（aural）、鼻腔内、経口、経肺投与、カテーテルの注入、および組織内への直接噴射、が挙げられる。１つの態様では、投与経路には以下すなわち：静脈内、腹腔内、皮下、皮内、リンパ節内、筋肉内、経皮、吸入、鼻腔内、経口、眼内、関節内、頭蓋内、および脊髄内、が含まれる。非経口送達には、皮内、筋肉内、腹腔内、胸膜腔内、肺内、静脈内、皮下、心房（atrial）カテーテルおよび静脈カテーテルの経路が挙げられる。耳内送達には点耳剤が挙げられ、鼻腔内送達には点鼻剤または鼻腔内注射が挙げられ、眼内送達には点眼剤が挙げられる。エアロゾル（吸入）送達も当分野において標準的な方法を用いて実施されうる（例えば、ストライブリング（Stribling）ら、米国科学アカデミー紀要（Proc. Natl. Acad. Sci. USA、１９９２年、第１８９巻、ｐ．１１２７７−１１２８１を参照）。粘膜免疫を調節する他の投与経路はウイルス感染の治療に有用となりうる。そのような経路には、気管支、皮内、筋肉内、鼻腔内、他の吸入式、直腸、皮下、局所、経皮、経膣および尿道の経路が含まれる。１つの態様では、本発明の免疫療法組成物は皮下投与される。
【０２６８】
本発明の酵母系免疫療法組成物に関し、一般に、適切な一回量は、適切な期間にわたって１回以上投与される場合、所与の種類の細胞、組織、または患者の身体の領域に、１つ以上のＨＢＶ抗原またはエピトープに対する抗原特異的な免疫応答を誘発するのに有効な量で酵母ビヒクルおよび抗原（含まれる場合）を有効に提供することができる用量である。例えば、１つの実施形態では、本発明の酵母ビヒクルの１回量は、組成物を投与されている生物体の体重１キログラムあたり約１×１０５〜約５×１０７個の酵母細胞相当量である。１つの態様では、本発明の酵母ビヒクルの１回量は、用量あたり（すなわち生物体あたり）約０．１Ｙ．Ｕ．（細胞１×１０６個）〜約１００Ｙ．Ｕ．（細胞１×１０９個）であって、細胞０．１×１０６個きざみとしてあらゆる中間的な用量を含む（すなわち１．１×１０６、１．２×１０６、１．３×１０６・・・）。１つの実施形態では、用量には、１Ｙ．Ｕ〜４０Ｙ．Ｕ．の用量、１Ｙ．Ｕ．〜５０Ｙ．Ｕ．の用量、１Ｙ．Ｕ．〜６０Ｙ．Ｕ．の用量、１Ｙ．Ｕ．〜７０Ｙ．Ｕ．の用量、または１Ｙ．Ｕ．〜８０Ｙ．Ｕ．の用量が含まれ、また１つの態様では、１０Ｙ．Ｕ．と、４０Ｙ．Ｕ．、５０Ｙ．Ｕ．、６０Ｙ．Ｕ．、７０Ｙ．Ｕ．、または８０Ｙ．Ｕ．との間が挙げられる。１つの実施形態では、該用量は、個体の異なる部位に、ただし同じ投与期間中に投与される。例えば、４０Ｙ．Ｕ．の用量が、１つの投与期間中に個体の４か所の異なる部位に１０Ｙ．Ｕ．用量を注射することによって投与されてもよいし、２０Ｙ．Ｕ．の用量が、同じ投与期間中に、個体の４か所の異なる部位に５Ｙ．Ｕ．用量を注射することにより、もしくは個体の２か所の異なる部位に１０Ｙ．Ｕ．用量を注射することにより、投与されてもよい。本発明は、一回量を形成するために、個体の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０か所またはそれ以上の異なる部位へ、ある量の酵母系免疫療法組成物（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９  １０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０  Ｙ．Ｕ．またはそれ以上）を投与することを含む。
【０２６９】
治療用組成物の「ブースター」または「ブースト」は、例えば、抗原に対する免疫応答が減弱したとき、または免疫応答を提供するためもしくは特定の１または複数の抗原に対する記憶応答を誘導するための必要に応じて、投与される。ブースターは、約１、２、３、４、５、６、７、または８週間隔から、月１回まで、隔月に１回まで、三月に１回まで、年１回まで、最初の投与の数年後まで、投与可能である。１つの実施形態では、投与スケジュールは、生物体の体重１ｋｇあたり約１×１０５〜約５×１０７個の酵母細胞に相当する組成物が、数週間から数か月、数年の期間にわたって少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回またはそれ以上投与されるものである。１つの実施形態では、用量は、週１回として１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回量またはそれ以上が投与され、続いてＨＢＶウイルスの所望の抑制または排除を達成するための必要に応じて、月１回の用量となる。例えば、用量は、個体がセロコンバージョンを達成するまで、ＨＢＶ  ＤＮＡの力価が２０００ＩＵ／ｍｌ未満に低下するまで、および、ＡＬＴレベルが正常化するまで、のうち少なくともいずれかとなるまで投与されうる。１つの実施形態では、用量は、４週のプロトコールで（４週ごと、すなわち第１日、第４週、第８週、第１２週などであって、２〜１０回用量または臨床医の決定によりそれ以上長く）投与される。個体がセロコンバージョンを達成した後でも、望ましい場合は追加用量が投与される可能性があるが、そのような投薬は必須ではない。
【０２７０】
本明細書中に記載された酵母系免疫療法組成物の投与に関し、単一の組成物が個体または個体集団に投与されてもよいし、そのような組成物の組み合わせが投与されてもよい。例えば、本発明は、いくつかの「単一タンパク質」組成物または特定の遺伝子型を対象とした組成物のほかに、複数タンパク質組成物および複数の遺伝子型または遺伝子亜型を標的とする組成物を提供する。従って、所与の個体または個体集団においてＨＢＶ感染を最も有効に予防または治療するために、「スパイスラック」手法で２以上の組成物が選択されてもよい。
【０２７１】
本発明の１つの態様では、１つ以上の追加の治療薬剤が、酵母系免疫療法組成物とともに連続して投与される。別の実施形態では、１つ以上の追加の治療薬剤は、酵母系免疫療法組成物が投与される前に投与される。別の実施形態では、１つ以上の追加の治療薬剤は、酵母系免疫療法組成物が投与された後に投与される。１つの実施形態では、１つ以上の追加の治療薬剤は、酵母系免疫療法組成物との交互の投薬で投与されるか、または、酵母系組成物が追加の治療薬の１回以上の連続した投薬の間に、もしくは該投薬とともに、所定間隔で投与されるか、もしくはその逆であるプロトコールにおいて、投与される。１つの実施形態では、酵母系免疫療法組成物は、追加の治療薬剤の投与を始める前のある期間にわたって１回以上の用量で投与される。換言すれば、酵母系免疫療法組成物がある期間の間に単独療法として投与され、次に該薬剤の投与が、新しい用量の酵母系免疫療法と同時に、または酵母系免疫療法との交互方式で、追加される。別例として、該薬剤は、酵母系免疫療法組成物の投与を始める前のある期間にわたって投与されてもよい。１つの態様では、該薬剤を発現もしくは担持するために酵母が遺伝子組換え処理されるか、または、異なる酵母が該薬剤を発現もしくは担持するために遺伝子組換え処理もしくは製造される。
【０２７２】
本発明の１つの態様では、インターフェロン療法または抗ウイルス化合物療法の治療過程が始まる時に、追加用量の免疫療法組成物が、同じ期間にわたって、またはその期間の少なくとも一部について投与され、かつ、インターフェロンまたは抗ウイルス化合物の治療過程が終了した時点で投与され続けてもよい。しかしながら、全期間を通じた免疫療法の投薬スケジュールは、インターフェロンまたは抗ウイルス化合物のスケジュールとは異なっていてよいし、典型的には異なるものと予想される。例えば、免疫療法組成物は、インターフェロンまたは抗ウイルス薬の最後の所定の（直近の）投薬の後で同じ日数または少なくとも３〜４日（または最後の投薬の後の任意の適切な日数）投与されてもよく、毎日、毎週、隔週、毎月、隔月、もしくは３〜６か月ごと、または医師により決定されるさらに長い間隔で、投与されうる。免疫療法組成物の単独療法投与が利用される場合は、その初期において、該免疫療法組成物は、４〜１２週間にわたって週１回、その後月１回投与されることが好ましい（追加のインターフェロン療法または抗ウイルス薬療法が該プロトコールに加えられるかどうかには関わらない）。１つの態様では、免疫療法組成物は、４〜５週間にわたって週１回投与され、その後完全な治療プロトコールの終了まで月１回投与される。
【０２７３】
本発明の態様では、免疫療法組成物および他の薬剤は一緒に（同時に）投与することができる。本明細書中で使用されるように、同時使用とは必ずしも全ての化合物の全ての用量が同日において同時に投与されることを意味しない。むしろ、同時使用とは、それぞれの治療要素（例えば免疫療法とインターフェロン療法、または免疫療法と抗ウイルス薬療法）がほぼ同じ時期（互いに数時間または最大でも１〜７日以内）に開始され、かつ同じ全体期間にわたって投与されることを意味し、留意すべきはそれぞれの要素が異なる投薬スケジュール（例えば、インターフェロンは週１回、免疫療法は月１回、抗ウイルス薬は毎日または毎週）を有しうることである。加えて、同時投与期間の前後に、該薬剤または免疫療法組成物のうちいずれか１つが他の薬剤を伴わずに投与されてもよい。
【０２７４】
本発明の免疫療法組成物をテノフォビルまたはエンテカビルのような抗ウイルス薬とともに使用することにより、該抗ウイルス薬を使用する時間経過をより短くすることを可能にすることが、本発明によって企図される。同様の結果は、本発明の免疫療法薬をインターフェロンと組み合わせる場合にも期待される。抗ウイルス薬またはインターフェロンについての投薬要件も、本発明の免疫療法薬と組み合わせる結果として低減または改変されて、該薬物に対する患者の忍容性を概ね改善する可能性がある。加えて、本発明の免疫療法組成物が、抗ウイルス療法のみではセロコンバージョンまたはウイルス応答の保持をなすことのできない患者についてこれらのエンドポイントを可能にするようになることが企図される。換言すれば、本発明の免疫療法組成物が抗ウイルス薬またはインターフェロンと組み合わされると、抗ウイルス薬またはインターフェロンを単独で用いてセロコンバージョンを達成するよりも多数の患者がセロコンバージョンを達成することになる。ＨＢＶ感染に関する現在のＳＯＣの下では、抗ウイルス薬は、６か月から１年、２年、３年、４年、５年またはより長く（例えば無期限に）投与される可能性がある。そのような治療を本発明の免疫療法組成物と組み合わせることによって、抗ウイルス薬の投与のための期間が数か月または数年短縮される可能性がある。単独療法としての、または、抗ウイルス薬および免疫調節薬を用いる方法のうち少なくともいずれかと組み合わせた、本発明の免疫療法組成物の使用は、ＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇのうち少なくとも一方の消失；ＨＢｅＡｇセロコンバージョン、ＨＢｓＡｇセロコンバージョン、または完全なセロコンバージョン；ならびに多数の個体における、治療の完了後少なくとも６か月にわたるウイルス排除の保持、を達成するのに有効であろうことが企図される。患者によっては、本発明による免疫療法は、単独療法として、または、抗ウイルス手法および免疫調節手法のうち少なくともいずれかと組み合わせて、使用された時、ＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇのうち少なくとも一方の消失は達成するがセロコンバージョン（抗ＨＢｓ抗体または抗ＨＢｅＡｇ抗体の出現）は達成しない場合がある。この状況では、患者において完全寛解を達成するために、現行の予防的組換えＨＢＶサブユニットワクチンのような薬剤を、単独で、または本発明の酵母系免疫療法および抗ウイルス薬もしくは他の免疫調節薬のうち少なくともいずれかと組み合わせて追加で使用することは、本発明の実施形態である。
【０２７５】
本明細書中で使用されるように、用語「抗ウイルス薬」とは、任意の化合物または薬物、典型的には低分子阻害剤または抗体であって、直接的な抗ウイルス治療効果を備えたウイルス生活環の１以上のステップを標的とするものを指す。本発明の１つの実施形態では、本発明の免疫療法組成物とともに同じ治療プロトコールにおいて投与される抗ウイルス化合物または薬物は、テノフォビル（ＶＩＲＥＡＤ（登録商標））、ラミブジン（ＥＰＩＶＩＲ（登録商標））、アデフォビル（ＨＥＰＳＥＲＡ（登録商標））、テルビブジン（ＴＹＺＥＫＡ（登録商標））およびエンテカビル（ＢＡＲＡＣＬＵＤＥ（登録商標））、もしくはこれらの任意のアナログもしくは誘導体、またはそのような化合物、薬物、アナログもしくは誘導体を含むかもしくは含有している任意の組成物から選択される。
【０２７６】
テノフォビル（フマル酸テノホビルジソプロキシルまたはＴＤＦ）、すなわち（｛［（２Ｒ）‐１‐（６‐アミノ‐９Ｈ‐プリン‐９‐イル）プロパン‐２‐イル］オキシ｝メチル）ホスホン酸は、ヌクレオチドアナログ逆転写酵素阻害剤（ｎＲＴＩ）である。ＨＢＶ感染の治療については、テノフォビルは、典型的には３００ｍｇ（フマル酸テノホビルジソプロキシル）の用量で毎日１回服用される丸剤として成人に投与される。小児患者についての用量決定は患者の体重に基づき（体重１ｋｇ当たり８ｍｇ、最大３００ｍｇまでを毎日１回）、錠剤または経口用粉剤として提供されうる。
【０２７７】
ラミブジン、すなわち２’，３’‐ジデオキシ‐３’‐チアシチジン（一般に３ＴＣと呼ばれる）は強力なヌクレオシドアナログ逆転写酵素阻害剤（ｎＲＴＩ）である。ＨＢＶ感染の治療については、ラミブジンは、１００ｍｇの用量で毎日１回（３か月〜１２歳の小児については３．１〜４．４ｍｇ／ｋｇ（１．４〜２ｍｇ／ポンド）で１日２回）服用される丸剤または経口液剤として投与される。
【０２７８】
アデフォビル（アデフォビルジピボキシル）、すなわち９‐［２‐［［ビス［（ピバロイルオキシ）メトキシ］‐ホスフィニル］‐メトキシ］エチル］アデニンは、経口投与されるヌクレオチドアナログ逆転写酵素阻害剤（ｎｔＲＴＩ）である。ＨＢＶ感染の治療については、アデフォビルは、１０ｍｇの用量で毎日１回服用される丸剤として投与される。
【０２７９】
テルビブジン、すなわち１‐（２‐デオキシ‐β‐Ｌ‐エリスロ‐ペントフラノシル）‐５‐メチルピリミジン‐２，４（１Ｈ，３Ｈ）‐ジオンは、合成チミジンヌクレオシドアナログ（チミジンのＬ‐異性体）である。ＨＢＶ感染の治療については、テルビブジンは、６００ｍｇの用量で毎日１回服用される丸剤または経口液剤として投与される。
【０２８０】
エンテカビル、すなわち２‐アミノ‐９‐［（１Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）‐４‐ヒドロキシ‐３‐（ヒドロキシメチル）‐２‐メチリデンシクロペンチル］‐６，９‐ジヒドロ‐３Ｈ‐プリン‐６‐オンは、ウイルスの逆転写、ＤＮＡ複製および転写を阻害するヌクレオシドアナログ（グアニンアナログ）である。ＨＢＶ感染の治療については、エンテカビルは、０．５ｍｇの用量で毎日１回（ラミブジン治療抵抗性またはテルビブジン耐性の突然変異については毎日１ｍｇ）服用される丸剤または経口液剤として投与される。
【０２８１】
本発明の１つの実施形態では、本発明の免疫療法組成物を用いる治療プロトコールにおいて投与されるインターフェロンは、インターフェロンであり、また１つの態様ではインターフェロンαであり、また１つの態様ではインターフェロンα２ｂであるか（皮下注射により週３回投与）；またはＰＥＧ化インターフェロンα２ａ（例えばＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標））である。本明細書中で使用されるように、用語「インターフェロン」は、二本鎖ＲＮＡの存在に応答して免疫システムの細胞および種々様々の細胞によって典型的に産生されるサイトカインを指す。インターフェロンは、宿主細胞内におけるウイルス複製を阻害すること、ナチュラルキラー細胞およびマクロファージを活性化すること、リンパ球への抗原提示を高めること、ならびにウイルス感染に対する宿主細胞の抵抗性を誘導することにより、免疫応答を支援する。Ｉ型インターフェロンにはインターフェロンαが挙げられる。ＩＩＩインターフェロンにはインターフェロンλが挙げられる。本発明の方法において有用なインターフェロンには、任意のＩ型またはＩＩＩ型インターフェロンであって、例えばインターフェロンα、インターフェロンα２が含まれ、１つの態様では、より長寿命の形態のインターフェロン、例えば、限定するものではないが、ＰＥＧ化インターフェロン、インターフェロン融合タンパク質（アルブミンに融合したインターフェロン）、およびインターフェロンを含む放出制御製剤（例えばミクロスフェア中のインターフェロンまたはポリアミノ酸ナノ粒子を備えたインターフェロン）、が挙げられる。１つのインターフェロン、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）（ＰＥＧ化インターフェロンα２ａ）は、遺伝子組換えインターフェロンα２ａ（およその分子量［ＭＷ］２０，０００ダルトン）を単一の分岐型ビス‐モノメトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖（およそのＭＷ４０，０００ダルトン）と共有結合によりコンジュゲートしたものである。ＰＥＧ部分は単一部位においてリジンへの安定したアミド結合を介してインターフェロンα部分に連結されている。ＰＥＧ化インターフェロンα２ａのおよその分子量は６０，０００ダルトンである。
【０２８２】
インターフェロンは典型的には筋肉内または皮下注射によって投与され、３００〜１０００万ユニットの用量で投与可能であり、１つの実施形態では３００万ユニットを用いることが好ましい。インターフェロンの用量は、１週間に１、２、３、４、５、または６回から、週１回、隔週、３週ごと、または毎月まで様々となりうる規則的なスケジュールで投与されうる。現在利用可能な、かつ、本発明によるインターフェロン用の好ましい投薬スケジュールである、インターフェロンの通常用量は、週１回で提供される。ＨＢＶの治療については、ＰＥＧ化インターフェロンα２ａは、現在、１８０ｍｇの用量（１．０ｍｌバイラルまたは０．５ｍｌの充填済みシリンジ）で週に一度、合計４８週間にわたって皮下投与される。投薬の量およびタイミングは、医師の選択および推奨によって、また使用される特定のインターフェロンに関する推奨に従って様々であってよく、かつ当業者が適正量を決定する能力の範囲内にある。本発明の免疫療法組成物とともにインターフェロン療法を使用することにより、インターフェロンの用量の濃度および投薬回数のうち少なくとも一方（インターフェロンに要する時間およびインターフェロンの投薬間隔のうち少なくとも一方）が低減されうることが企図される。
【０２８３】
本発明の方法では、組成物および治療用組成物は、任意の脊椎動物を含む動物に、特に脊椎動物哺乳綱に属する任意の動物であって、例えば、限定するものではないが、霊長類、げっ歯類、家畜および家庭のペットに、投与されうる。家畜には、食用の哺乳動物、または有用産物を生産する哺乳動物（例えば羊毛生産用の羊）が含まれる。治療または予防を行う哺乳動物には、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマおよびブタが含まれる。
【０２８４】
「個体」とは、哺乳動物のような脊椎動物であって、例えば、限定するものではないがヒトが含まれる。哺乳動物には、限定するものではないが家畜、競技用動物、ペット、霊長類、マウスおよびラットが挙げられる。用語「個体」は、用語「動物」、「対象者」または「患者」と互換的に使用することができる。
【０２８５】
［本発明において有用な一般的技法］
本発明の実施には、別途指定のないかぎり、従来の分子生物学的技法（組換え技法を含む）、微生物学的技法、細胞生物学的技法、生化学的技法、核酸化学的技法および免疫学的技法（当業者には良く知られている）を使用することになろう。そのような技法は文献に十分に説明されており、該文献は例えば、ガスリー（Guthrie）ら編、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods of Enzymology）、第１９４巻、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、１９９０年；スキナー（Skinner）ら編、「酵母の生物学および活動（Biology and activities of yeasts）」、アカデミックプレス（Academic Press）、１９８０年；ローズ（Rose）ら、「酵母の遺伝学における方法：実験コースマニュアル（Methods in yeast genetics : a laboratory course manual）」、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、１９９０年；プリングル（Pringle）ら編、「酵母サッカロマイセス属：細胞周期および細胞生物学（The Yeast Saccharomyces: Cell Cycle and Cell Biology）」、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、１９９７年；ジョーンズ（Jones）ら編、「酵母サッカロマイセス属：遺伝子発現（The Yeast Saccharomyces: Gene Expression）」、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、１９９３年；ブローチ（Broach）ら編、「酵母サッカロマイセス属：ゲノム動態、タンパク質合成、およびエネルギー論（The Yeast Saccharomyces: Genome Dynamics, Protein Synthesis, and Energetics）」、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、１９９２年；サムブルック（Sambrook）ら、「分子クローニング：実験の手引き（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」第二版、１９８９年ならびにサムブルック（Sambrook）およびラッセル（Russel）、「分子クローニング：実験の手引き（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」第三版、２００１年（合わせて本明細書中では「サムブルック」と呼ばれる）；Ｆ．Ｍ．オースベル（F.M. Ausubel）ら編、「分子生物学最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」、１９８７年（２００１年までの追補を含む）；マリス（Mullis）ら編、「ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応（PCR: The Polymerase Chain Reaction）」、１９９４年；ハーロー（Harlow）およびレーン（Lane）、「抗体、実験の手引き（Antibodies, A Laboratory Manual）」、米国ニューヨークのコールド・スプリング・ハーバー出版（Cold Spring Harbor Publications）、１９８８年；ハーロー（Harlow）およびレーン（Lane）、「抗体使用法：実験の手引き（Using Antibodies: A Laboratory Manual）」、米国ニューヨーク、コールド・スプリング・ハーバーのコールド・スプリング・ハーバー研究所出版（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、１９９９年（合わせて本明細書中では「ハーローおよびレーン」と呼ばれる）、ビューケージ（Beaucage）ら編、「核酸化学最新プロトコール（Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry）」、米国ニューヨーク、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ・インコーポレイテッド（John Wiley and Sons, Inc.）、２０００年；Ｃ．クラーセン（C. Klaassen）編、「カサレおよびドゥルの毒物学：毒物の基礎科学（Casarett and Doull's Toxicology The Basic Science of Poisons）」第６版、２００１年、ならびに、Ｓ．プロトキン（S. Plotkin）およ���Ｗ．オレンスタイン（W. Orenstein）編、「ワクチン（Vaccines）」第３版、１９９９年、である。
【０２８６】
［一般的定義］
「ＴＡＲＭＯＧＥＮ（商標）」（グローブイミューン・インコーポレイテッド（GlobeImmune, Inc.）、米国コロラド州ルイビル）は、一般に、酵母ビヒクルであって１つ以上の異種抗原を細胞外（該酵母ビヒクルの表面上に）、細胞内（内部もしくは細胞質に）、または細胞外および細胞内の両方に発現している酵母ビヒクルを指す。ＴＡＲＭＯＧＥＮ（商標）製品については広く説明されている（例えば米国特許第５，８３０，４６３号明細書を参照）。ある種の酵母系免疫療法組成物、ならびに該組成物の製造方法および一般的使用方法についても、例えば米国特許第５，８３０，４６３号明細書、米国特許第７，０８３，７８７号明細書に、米国特許第７，７３６，６４２号明細書、スタッブス（Stubbs）ら、ネイチャー・メディシン（Nat. Med.）、２００１年、第７巻、ｐ．６２５−６２９、ルー（Lu）ら、キャンサー・リサーチ（Cancer Research）、２００４年、第６４巻、ｐ．５０８４−５０８８、そしてバーンスタイン（Bernstein）ら、ワクチン（Vaccine）、２００８年１月２４日、第２６巻、第４号、ｐ．５０９−２１（前記文献はそれぞれ全体が参照により本願に援用される）に詳細に記載されている。
【０２８７】
本明細書中で使用されるように、用語「アナログ」とは、別の化合物に構造上類似しているが組成においてわずかに異なる化合物を指す（例えば１つの原子を異なる元素の原子に置き換える場合、または特定の官能基の存在下において、１つの官能基を別の官能基に置き換える場合など）。したがって、アナログは、基準の化合物に関して機能および外観は類似または同等であるが異なる構造または起原を有する化合物である。
【０２８８】
用語「置換（される）」、「置換誘導体」および「誘導体」は、化合物について述べるために使用される場合、非置換化合物に結合している少なくとも１つの水素が異なる原子または化学的構成部分に置き換えられることを意味する。
【０２８９】
誘導体は親化合物に類似した物理的構造を有するが、該誘導体は親化合物とは異なる化学的かつ／または生物学的特性を有する場合がある。そのような特性には、限定するものではないが、親化合物の活性の上昇または低下、親化合物と比較して新しい活性、バイオアベイラビリティの上昇または低下、有効性の増大または低減、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏのうち少なくとも一方における安定性の上昇または低下、ならびに吸収特性の増大または低減、のうち少なくともいずれかが挙げられる。
【０２９０】
一般に、用語「生物学的に活性」とは、化合物（タンパク質またはペプチドなど）が、ｉｎ  ｖｉｖｏ（すなわち自然な生理的環境下）またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ（すなわち実験室条件下）で測定または観察されるような、細胞または生物体の代謝その他のプロセスに影響を有する少なくとも１つの検出可能な活性を有することを示す。
【０２９１】
本発明によれば、用語「調節する、変調する（modulate）」は「調節する（regulate）」と互換的に使用可能であり、概して特定の活性の上方調節または下方調節を指す。本明細書中で使用されるように、用語「上方調節する（upregulate）」は、一般に以下すなわち：特定の活性に関する、誘発、開始、増大、増進、ブースティング、改善、増強、増幅、促進、または提供、のうちのいずれかを述べるために使用されうる。同様に、用語「下方調節する」は、一般に以下すなわち：特定の活性に関する、低下、低減、阻害、緩和、軽減、減少、阻止、または抑制、のうちのいずれかを述べるために使用されうる。
【０２９２】
本発明の１つの実施形態では、本明細書中に記載されたアミノ酸配列はいずれも、指定されたアミノ酸配列のＣ末端およびＮ末端のうち少なくとも一方に隣接する少なくとも１個から最大約２０個までの追加の異種アミノ酸を備えて生産されうる。生じるタンパク質またはポリペプチドについては、指定されたアミノ酸配列「〜で本質的に構成されている（consisting essentially of）」と称することが可能である。本発明によれば、異種アミノ酸とは、本来は指定のアミノ酸配列に隣接して見出されない（すなわち自然界でｉｎ  ｖｉｖｏでは見られない）か、または指定のアミノ酸配列の機能とは関係がないか、または、指定のアミノ酸配列をコードする天然に存在する核酸配列が遺伝子内に存在しているときに隣接しているヌクレオチドによっては（仮に天然に存在する配列中のそのようなヌクレオチドがその所与のアミノ酸配列の由来元である生物にとって標準的なコドン選択性を用いて翻訳されたとしても）コードされない、アミノ酸の配列である。同様に、「〜で本質的に構成されている（consisting essentially of）」という言葉は、本明細書中で核酸配列に関して使用される場合、指定されたアミノ酸配列をコードする核酸配列であって、指定されたアミノ酸配列をコードする核酸配列の５’末端および３’末端のうち少なくとも一方にそれぞれ少なくとも１個から最大で約６０個までの追加の異種ヌクレオチドが隣接しうる核酸配列を指す。該異種ヌクレオチドは、本来は指定のアミノ酸配列をコードする核酸配列が天然の遺伝子内に存在しているときには隣接して見出されない（すなわち自然界でｉｎ  ｖｉｖｏでは見られない）か、または、指定のアミノ酸配列を有するタンパク質に何らかの付加機能を付与するかもしくは該タンパク質の機能を変更するタンパク質をコードしない。
【０２９３】
本発明によれば、「〜に選択的に結合する（selectively binds to）」という言葉は、本発明の抗体、抗原結合フラグメントまたは結合パートナーが指定されたタンパク質に優先的に結合する能力を指す。より具体的には、「選択的に結合する」という言葉は、あるタンパク質（例えば抗体、該抗体のフラグメント、または抗原の結合パートナー）の別のタンパク質への特異的結合であって、任意の標準的なアッセイ（例えば免疫学的検定法）で測定されるような結合のレベルが、該アッセイのバックグラウンドの対照より統計的に有意に高いものを指す。例えば、免疫学的検定法を実施する場合、対照としては、典型的には、抗体または抗原結合フラグメントのみを含有する（すなわち抗原の非存在下にある）反応用ウェル／チューブが含まれ、この場合、抗原の非存在下における抗体または抗原結合フラグメントによる反応（例えば該ウェルへの非特異的な結合）の量がバックグラウンドであると考えられる。結合は、酵素免疫測定法（例えばＥＬＩＳＡ、イムノブロットアッセイなど）を含む、当分野において標準的な様々な方法を使用して測定されうる。
【０２９４】
本発明において使用されるタンパク質またはポリペプチドに言及する場合、完全長タンパク質、融合タンパク質、またはそのようなタンパク質の任意のフラグメント、ドメイン、立体構造依存的エピトープ、もしくは相同体、例えばタンパク質の機能ドメインおよび免疫学的ドメインなどが含まれる。より具体的には、単離タンパク質とは、本発明によれば、例えば、その本来の環境から取り出されている（すなわち、人為操作を受けている）タンパク質であり（ポリペプチドまたはペプチドを含む）、精製タンパク質、部分精製タンパク質、組換え生産されたタンパク質、および合成により生産されたタンパク質が含まれうる。それゆえ、「単離（された）」とはタンパク質が精製された程度を反映していない。好ましくは、本発明の単離タンパク質は組換え生産される。本発明によれば、「改変」および「突然変異」という用語は、特に本明細書中に記載されたタンパク質またはその一部のアミノ酸配列（または核酸配列）の改変／突然変異に関しては、互換的に使用することができる。
【０２９５】
本明細書中で使用されるように、用語「相同体」は、天然に存在するタンパク質またはペプチド（すなわち「原型」または「野生型」タンパク質）の軽微な改変により、天然に存在するタンパク質またはペプチドとは異なるが、天然に存在する形態の基本的なタンパク質および側鎖の構造を維持しているタンパク質またはペプチドを指すために使用される。そのような変更点には、例えば、限定するものではないが：１個または数個のアミノ酸側鎖の変更；１個または数個のアミノ酸の変更、例えば欠失（例えばタンパク質またはペプチドの短縮型）挿入および置換のうち少なくともいずれかなど；１個または数個の原子の立体化学の変更；ならびに、軽微な誘導体化、例えば、限定するものではないが：メチル化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ミリストイル化、プレニル化、パルミチン酸化（palmitation）、アミド化および／またはグリコシルホスファチジルイノシトールの付加；のうち少なくともいずれかが挙げられる。相同体は、天然に存在するタンパク質またはペプチドと比較して、増強された、低下した、またはほぼ同様の、特性を有することができる。相同体には、タンパク質のアゴニストまたはタンパク質のアンタゴニストも含まれうる。相同体は、タンパク質を製造するための当分野において既知の技法、例えば、限定するものではないが、単離された天然に存在するタンパク質の直接的改変、直接的タンパク質合成、または、例えばランダム突然変異誘発もしくは標的を定めた突然変異誘発を達成するための古典的もしくは組換えのＤＮＡ技法を使用した、タンパク質をコードする核酸配列の改変によって、製造されうる。
【０２９６】
所与のタンパク質の相同体は、基準タンパク質のアミノ酸配列と、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％同一、少なくとも約９２％同一、少なくとも約９３％同一、少なくとも約９４％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、または少なくとも約９９％同一（または４５％〜９９％の全ての整数区切りでの任意のパーセント同一率）であるアミノ酸配列を含むか、該アミノ酸配列で本質的に構成されるか、または該アミノ酸配列で構成されるものであってよい。１つの実施形態では、相同体は、基準タンパク質の天然に存在するアミノ酸配列と、１００％未満同一、約９９％未満同一、約９８％未満同一、約９７％未満同一、約９６％未満同一、約９５％未満同一など、１％区切りで約７０％未満同一までのアミノ酸配列を含むか、該アミノ酸配列で本質的に構成されるか、または該アミノ酸配列で構成される。
【０２９７】
相同体は、「ほぼ完全長」であるタンパク質またはタンパク質のドメインを含む場合があり、「ほぼ完全長」とは、そのような相同体が、完全長のタンパク質、機能ドメインまたは免疫学的ドメイン（そのようなタンパク質、機能ドメインまたは免疫学的ドメインは本明細書中に記載されているかまたはそうでなければ公に利用可能な配列において既知もしくは記載されている）に対して、そのような完全長タンパク質または完全長機能ドメインまたは完全長免疫学的ドメインのＮ末端およびＣ末端のうち少なくとも一方における１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸の付加または欠失により、異なっていることを意味している。
【０２９８】
本明細書中で使用されるように、別段の定めがない限り、パーセント（％）の同一性に言及する場合は以下すなわち：（１）標準デフォルトパラメータを用いてｂｌａｓｔｐをアミノ酸の検索に、ｂｌａｓｔｎを核酸の検索に使用するＢＬＡＳＴ  ２．０  Ｂａｓｉｃ  ＢＬＡＳＴ相同性検索であって、クエリ配列はデフォルトで複雑度の低い領域についてフィルタリングされるもの（アルトシュル、Ｓ．Ｆ．（Altschul, S.F.）、マッデン、Ｔ．Ｌ．（Madden, T.L.）、シェーファー、Ａ．Ａ．（Schaeaeffer, A.A.）、チャン、Ｊ．（Zhang, J.）、チャン、Ｚ．（Zhang, Z.）、ミラー、Ｗ．（Miller, W.）およびリプマン、Ｄ．Ｊ．（Lipman, D.J.）、「ギャップを許容するＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ‐ＢＬＡＳＴ：新世代タンパク質データベース検索プログラム（Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs.）」ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Nucleic Acids Res.）、１９９７年、第２５巻、ｐ．３３８９−３４０２、参照により全体が本願に援用される）（２）ＢＬＡＳＴ  ２アラインメント（後述のパラメータを使用）；（３）および標準デフォルトパラメータを備えたＰＳＩ‐ＢＬＡＳＴ（位置特異的反復ＢＬＡＳＴ）、のうち少なくともいずれかを使用して行なわれる相同性の評価を指す。ＢＬＡＳＴ  ２．０  Ｂａｓｉｃ  ＢＬＡＳＴとＢＬＡＳＴ  ２との間の標準パラメータの若干の相違により、２つの特定配列がＢＬＡＳＴ  ２プログラムを使用すると有意な相同性を有するものとして認識される可能性がある一方で、該配列のうちの１つをクエリ配列として使用してＢＬＡＳＴ  ２．０  Ｂａｓｉｃ  ＢＬＡＳＴで行われる検索は第２の配列を上位一致に同定しない可能性があることに留意すべきである。加えて、ＰＳＩ‐ＢＬＡＳＴは、自動化された使いやすい版の「プロファイル」検索を提供するが、これは配列相同体を探す感度のよい方法である。該プログラムは最初にギャップを許容するＢＬＡＳＴデータベース検索を実施する。ＰＳＩ‐ＢＬＡＳＴプログラムは、返されてきたあらゆる有意なアラインメントからの情報を使用して位置特異的なスコア行列を構築し、該スコア行列は次回のデータベース検索のためにクエリ配列を交換する。したがって、当然ながら上記プログラムのうちいずれか１つを使用することにより同一性（％）を決定することができる。
【０２９９】
２つの特定配列は、タツソワ（Tatusova）およびマッデン（Madden）、「タンパク質およびヌクレオチド配列を比較するための新しいツール、ＢＬＡＳＴ  ２配列（Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences）」、ＦＥＭＳ  マイクロバイオロジー・レターズ（FEMS Microbiol Lett.）、１９９９年、第１７４巻、ｐ．２４７−２５０（参照により全体が本願に援用される）に記載されるようなＢＬＡＳＴ  ２配列を使用して相互にアラインメントされうる。ＢＬＡＳＴ  ２配列アラインメントは、２つの配列の間で、得られるアラインメントにおいてギャップ（欠失および挿入）の導入を許容するＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ探索（ＢＬＡＳＴ  ２．０）を実施するために、ＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムを使用してｂｌａｓｔｐまたはｂｌａｓｔｎにおいて実施される。本明細書中では明確にするために、ＢＬＡＳＴ  ２配列アラインメントは以下の標準デフォルトパラメータを使用して行なわれる。
【０３００】
ｂｌａｓｔｎについては、ＢＬＯＳＵＭ６２行列０を使用：
一致に対する得点（Reward for match）＝１
不一致に対するペナルティ（Penalty for mismatch）＝−２
ギャップ開始（５）およびギャップ伸長（２）ペナルティ
ギャップｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ（５０）期待値（１０）ワードサイズ（１１）フィルタ（ｏｎ）
ｂｌａｓｔｐについては、ＢＬＯＳＵＭ６２行列０を使用：
ギャップ開始（１１）およびギャップ伸長（１）ペナルティ
ギャップｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ（５０）期待値（１０）ワードサイズ（３）フィルタ（ｏｎ）。
【０３０１】
単離核酸分子は、その本来の環境から取り出されている（すなわち、人為操作を受けている）核酸分子であり、その本来の環境とは自然界において該核酸分子が見出されるゲノムまたは染色体である。それゆえ、「単離（された）」とは、必ずしも該核酸分子が精製されている程度を反映せず、該分子が、自然界において該核酸分子が見出されるゲノム全体または染色体全体を含まないことを示す。単離核酸分子は遺伝子を含むことができる。遺伝子を含んでいる単離核酸分子は、そのような遺伝子を含む染色体のフラグメントではなく、該遺伝子に関連したコード領域および制御領域を含み、ただし同じ染色体上に本来見出される追加の遺伝子を含んでいない。単離核酸分子はさらに、指定の核酸配列と、該配列に隣接して（すなわち該配列の５’末端および３’末端のうち少なくとも一方に）、自然界において通常はその指定の核酸配列に隣接していない追加の核酸（すなわち異種配列）とを含むこともできる。単離核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）、またはＤＮＡもしくはＲＮＡのいずれかの誘導体（例えばｃＤＮＡ）を含むことができる。「核酸分子」という言葉は主として物理的な核酸分子を指し、「核酸配列」という言葉は主として核酸分子上のヌクレオチドの配列を指すが、この２つの言葉は、特にタンパク質またはタンパク質のドメインをコードすることができる核酸分子または核酸配列に関しては、互換的に使用可能である。
【０３０２】
組換え核酸分子とは、本明細書中に記載された任意の１つ以上のタンパク質をコードする任意の核酸配列のうち少なくとも１つであって、トランスフェクトされる細胞における該核酸分子の発現を有効に調節することができる任意の転写調節配列のうち少なくとも１つに作動可能なように連結されたもの、を含みうる分子である。「核酸分子」という言葉は主として物理的な核酸分子を指し、「核酸配列」という言葉は主として核酸分子上のヌクレオチドの配列を指すが、この２つの言葉は、特にタンパク質をコードすることができる核酸分子または核酸配列に関しては、互換的に使用可能である。加えて、「組換え分子」という言葉は主に、転写調節配列に作動可能なように連結された核酸分子を指すが、動物に投与される「核酸分子」という言葉と互換的に使用可能である。
【０３０３】
組換え核酸分子は組換えベクターを含むが、該ベクターは任意の核酸配列、典型的には異種配列であり、本発明の融合タンパク質をコードする単離核酸分子に作動可能なように連結され、該融合タンパク質の組換え生産を可能にする能力を有し、かつ、本発明による宿主細胞内に核酸分子を送達することができる。そのようなベクターは、天然においては該ベクター内に挿入されるべき単離核酸分子に隣接して見出されることのない核酸配列を含有することができる。ベクターは、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれであってもよく、原核生物のベクターまたは真核生物のベクターのいずれであってもよく、かつ、本発明においてはウイルスまたはプラスミドであることが好ましい。組換えベクターは、核酸分子のクローニング、配列決定およびその他の操作において使用可能であり、かつそのような分子の送達において（例えばＤＮＡ組成物またはウイルスベクターを用いる組成物などで）使用されうる。組換えベクターは、核酸分子の発現において使用されることが好ましく、発現ベクターと呼ぶこともできる。好ましい組換えベクターは、トランスフェクトされた宿主細胞中で発現される能力を有する。
【０３０４】
本発明の組換え分子において、核酸分子は、転写調節配列、翻訳調節配列、複製開始点、および他の調節配列であって宿主細胞との適合性を有しかつ本発明の核酸分子の発現を制御する調節配列などの調節配列を含有する発現ベクターに、作動可能なように連結される。特に、本発明の組換え分子は、１つ以上の発現調節配列に作動可能なように連結される核酸分子を含んでいる。「作動可能なように連結される」という言葉は、核酸分子を、宿主細胞内へトランスフェクトされた（すなわち、形質転換、形質導入またはトランスフェクトされた）時に該分子が発現されるような方式で発現調節配列に連結することを指す。
【０３０５】
本発明によれば、用語「トランスフェクション」は、外因性の核酸分子（すなわち組換え核酸分子）が細胞内に挿入されうる任意の方法を指すために使用される。用語「形質転換」は、当該用語が藻類、細菌および酵母のような微生物細胞内への核酸分子の導入を指して使用される場合、用語「トランスフェクション」と互換的に使用可能である。微生物系においては、用語「形質転換」は、微生物体による外因性の核酸の獲得を原因とする遺伝的変化について述べるために使用され、用語「トランスフェクション」と本質的に同義である。したがって、トランスフェクション技術には、限定するものではないが、形質転換、細胞の化学処理、粒子衝突、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、吸着、感染およびプロトプラスト融合が挙げられる。
【０３０６】
以降の実験結果は例示を目的として提供されるものであり、本発明の範囲を限定するようには意図されていない。
【実施例】
【０３０７】
実施例１
次の実施例は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染の治療または予防のための酵母系免疫療法組成物の製造について説明する。
【０３０８】
この実施形態では、酵母（例えばサッカロマイセス・セレビシエ）は、銅誘導性プロモーターＣＵＰ１またはＴＥＦ２プロモーターの制御下で、それぞれ図２に示された基本構造を有する様々なＨＢＶ表面‐コア融合タンパク質を発現するように遺伝子組換え処理された。各例において、ＨＢＶ融合タンパク質は、配列番号３４で表わされる、Ｎ末端からＣ末端までインフレームで融合された以下の配列要素：（１）プロテアソーム分解に対する抵抗性を付与し、かつ発現を安定させるＮ末端ペプチド（配列番号３４の１〜６位）；２）ＳｐｅＩ制限酵素切断部位を導入する２アミノ酸スペーサー（Ｔｈｅ‐Ｓｅｒ）；３）ほぼ完全長の（１位を差し引いた）ＨＢＶ遺伝子型Ｃの大型（Ｌ）表面抗原のアミノ酸配列（例えば配列番号３４の９〜４０７位であってこれは配列番号１１の２〜４００位に相当し、配列番号１１は３５０〜３５１位において配列番号１１のＬｅｕ‐Ｖａｌ配列が配列番号３４の３５７〜３５８位のＧｌｎ‐Ａｌａ配列に置き換わる点で配列番号３４とは異なっている）；４）ＨＢＶコア抗原のアミノ酸配列（例えば、配列番号３４の４０８〜５８９位または配列番号９の３１〜２１２位）；および、５）ヘキサヒスチジンタグ（配列番号３４の５９０〜５９５位）、を備えたおよそ５９５アミノ酸の単一ポリペプチドであった。配列番号３４の融合タンパク質をコードする核酸配列（酵母での発現用にコドンを最適化）は、本明細書中に配列番号３３で表わされている。配列番号３４の２８〜５４位は、大型（Ｌ）表面タンパク質の肝細胞受容体部分を含む。配列番号３４は、該融合タンパク質の免疫原性を増強すると考えられる複数のエピトープまたはドメインを含有する。例えば、配列番号３４に関して２０９〜２２０位、３８９〜３９７位、３６０〜３６７位、および４９９〜５０６位は、既知のＭＨＣクラスＩ結合性エピトープおよびＣＴＬエピトープのうち少なくとも一方を含む。配列番号３４の３０５〜３２８位は抗体エピトープを含む。この融合タンパク質およびこのタンパク質を含む対応する酵母系免疫療法薬は、本明細書中では一般に「Ｓｃｏｒｅ」、「ＭＡＤＥＡＰ‐Ｓｃｏｒｅ」、「Ｍ‐Ｓｃｏｒｅ」、または「ＧＩ‐１３００２」と呼ぶことができる。
【０３０９】
簡潔に述べると、完全長のコア抗原に融合されたほぼ完全長の大型表面抗原（Ｌ）をコードするＤＮＡは、酵母での発現用にコドンが最適化され、次いでＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化されて、酵母２ｕｍ発現ベクター中でＣＵＰ１プロモーター（ｐＧＩ‐１００）またはＴＥＦ２プロモーター（ｐＴＫ５７‐１）の後ろに挿入された。これらの構築物によりコードされた融合タンパク質は本明細書中に配列番号３４で表わされ（ヌクレオチド配列である配列番号３３によってコードされている）、かつ予想されるおよその分子量は６６ｋＤａである。生じるプラスミドは、酢酸リチウム／ポリエチレングリコール・トランスフェクションによりサッカロマイセス・セレビシエＷ３０３α酵母に導入され、初代トランスフェクタントはウラシルを欠く固体の最少プレート培地（ＵＤＭ；ウリジン欠落培地）で選択された。コロニーは、ＵＤＭまたはＵＬＤＭ（ウリジンおよびロイシン欠落培地）に再度画線播種され、３０℃で３日間増殖させた。ウリジンを欠いた液体培養（Ｕ２培地：２０ｇ／ｌグルコース；６．７ｇ／ｌの酵母窒素原基礎培地であって硫酸アンモニウム；各々０．０４ｍｇ／ｍＬのヒスチジン、ロイシン、トリプトファンおよびアデニンを含有）、またはウリジンおよびロイシンを欠いた液体培養（ＵＬ２培地：２０ｇ／ｌグルコース；６．７ｇ／ｌの酵母窒素原基礎培地であって硫酸アンモニウム；ならびに各々０．０４  ｍｇ／ｍＬのヒスチジン、トリプトファン、およびアデニンを含有）にプレートからの接種が行われ、スタータ培養物は３０℃、２５０ｒｐｍで２０時間増殖させた。４．２ｇ／ｌのビス‐トリスを含有するｐＨ緩衝培地（ＢＴ‐Ｕ２；ＢＴ‐ＵＬ２）も、中性ｐＨ条件下での該酵母の増殖を評価するために接種させた。初代培養物は同じ調合の最終培養物に接種するために使用され、密度または１．１〜４．０ＹＵ／ｍＬ（a density or 1.1 to 4.0 YU/mL）に到達するまで増殖が継続された。
【０３１０】
ＴＥＦ２株（構成的発現）については、細胞は回収され、洗浄され、ＰＢＳ中にて５６℃で１時間加熱殺処理された。生細胞も比較のために処理された。ＣＵＰ１株（誘導発現）については、発現を０．５ｍＭの硫酸銅を含んだ同じ培地中で３０℃、２５０ｒｐｍで５時間誘導した。細胞は回収され、洗浄され、ＰＢＳ中にて５６℃で１時間加熱殺処理された。生細胞も比較のために処理された。
【０３１１】
ＴＥＦ２およびＣＵＰ１培養物の加熱殺処理後、細胞はＰＢＳで３回洗浄された。全タンパク質発現量はＴＣＡ沈澱反応／ニトロセルロース結合アッセイによって測定され、抗原の発現は抗ヒスチジンタグモノクローナル抗体を使用するウエスタンブロット法により測定された。抗原の量は、同じウエスタンブロット上で処理された組換えのヘキサヒスチジンタグ付きＮＳ３タンパク質の標準曲線からの内挿法によって定量された。結果は図１６（加熱殺処理）および図１７（生酵母）に示されている。これらの図面は、本発明の酵母系免疫療法組成物が両プロモーターを使用してＨＢＶ表面‐コア融合タンパク質を良好に発現し、かつ加熱殺処理された細胞および生きている酵母細胞のいずれにおいてもウエスタンブロットによって識別可能であることを示している。計算された、この酵母系免疫療法薬による抗原発現は、１Ｙ．Ｕ．（酵母単位；１酵母単位（Ｙ．Ｕ．）は１×１０７個の酵母細胞または酵母細胞等価物である）あたり〜５０００ｎｇタンパク質、または１Ｙ．Ｕ．あたり７６ｐｍｏｌタンパク質であった。
【０３１２】
実施例２
次の実施例は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染の治療または予防のための別の酵母系免疫療法組成物の製造について説明する。
【０３１３】
酵母（例えばサッカロマイセス・セレビシエ）は、銅誘導性プロモーターＣＵＰ１またはＴＥＦ２プロモーターの制御下で、図３に概略的に示されるような構造をそれぞれ有している様々なＨＢＶ融合タンパク質を発現するように遺伝子組換え処理された。各事例において、融合タンパク質は、配列番号３６で表わされる、Ｎ末端からＣ末端までインフレームで融合された以下の配列要素：（１）プロテアソーム分解に対する抵抗性を付与し、かつ発現を安定させるＮ末端ペプチド（配列番号３６の１〜５位）；２）ＨＢＶ遺伝子型ＣのＨＢＶ大型（Ｌ）表面タンパク質のｐｒｅ‐Ｓ１部分の肝細胞受容体ドメインのアミノ酸配列（Ｌに特有）（例えば配列番号１１の２１〜４７位または配列番号３６の６〜３２位）；３）完全長のＨＢＶ遺伝子型Ｃの小型（Ｓ）表面抗原のアミノ酸配列（例えば配列番号１１の１７６〜４００位または配列番号３６の３３〜２５７位）；４）配列のクローニングおよび操作を容易にする２アミノ酸スペーサー／リンカー（Ｌｅｕ‐Ｇｌｕ）（配列番号３６の２５８および２５９位）；５）ＨＢＶ遺伝子型Ｃのポリメラーゼの逆転写酵素ドメインを含む部分のアミノ酸配列（例えば配列番号１０の２４７〜６９１位または配列番号３６の２６０〜６０４位）；６）ＨＢＶ遺伝子型Ｃのコアタンパク質（例えば配列番号９の３１〜２１２位または配列番号３６の６０５〜７８６位）；７）ＨＢＶ遺伝子型ＣのＸ抗原のアミノ酸配列（例えば、配列番号１２の２〜１５４位または配列番号３６の７８７〜９３９位）；ならびに８）ヘキサヒスチジンタグ（配列番号３６の９４０〜９４５位）、を備えたおよそ９４５アミノ酸の単一ポリペプチドであった。この融合タンパク質およびこのタンパク質を含む対応する酵母系免疫療法薬は、本明細書中では一般に「ＭＡＤＥＡＰ‐Ｓｐｅｘ」、「Ｍ‐Ｓｐｅｘ」、または「ＧＩ‐１３００５」と呼ぶことができる。
【０３１４】
配列番号３６の融合タンパク質をコードする核酸配列（酵母での発現用にコドンを最適化）は、本明細書中に配列番号３５で表わされている。配列番号３６の予想されるおよその分子量は１０６〜１０７ｋＤａである。配列番号３６は、融合タンパク質の免疫原性を増強すると考えられる複数のエピトープまたはドメイン、例えば配列番号３４について上述されたいくつかを含有している。加えて、この融合タンパク質に使用される逆転写酵素ドメインは、抗ウイルス薬を用いた治療に対する薬物抵抗性の応答として突然変異に至ることが知られており、したがって特定の薬剤抵抗性（回避）突然変異を標的とする治療的または予防的免疫療法薬を提供するためにこの融合タンパク質中で変異させる場合もある、いくつかのアミノ酸部位を含有している。これらのアミノ酸部位は、配列番号３６に関しては、アミノ酸部位で：４３２位（Ｖａｌ、ラミブジン治療後にＬｅｕに変異することが知られている）；４３９位（Ｌｅｕ、ラミブジン治療後にＭｅｔに変異することが知られている）；４５３位（Ａｌａ、テノフォビル治療後にＴｈｒに変異することが知られている）；４６３位（Ｍｅｔ、ラミブジン治療後にＩｌｅまたはＶａｌに変異することが知られている）；および、４９５位（Ａｓｎ、アデフォビル治療後にＴｈｒに変異することが知られている）である。
【０３１５】
該抗原に異なるＮ末端ペプチドを利用して第２の酵母系免疫治療薬を作出するために、酵母（例えばサッカロマイセス・セレビシエ）は、銅誘導性プロモーターＣＵＰ１またはＴＥＦ２プロモーターの制御下で、やはり図３に概略的に示されるような基本構造を有している様々なＨＢＶ融合タンパク質を発現するように遺伝子組換え処理された。この第２の事例では、配列番号３６で表わされる融合物中の上述の合成Ｎ末端ペプチドの代わりに、αファクタープレプロ配列（配列番号８９で表わされる）が使用された。簡潔に述べると、この新たな融合タンパク質は、配列番号９２で表わされる、Ｎ末端からＣ末端までインフレームで融合された以下の配列要素：（１）プロテアソーム分解に対する抵抗性を付与し、かつ発現を安定化または増強するＮ末端ペプチド（配列番号８９、配列番号９２の１〜８９位）；４）配列のクローニングおよび操作を容易にする２アミノ酸スペーサー／リンカー（Ｔｈｒ‐Ｓｅｒ）（配列番号９２の９０〜９１位）；３）ＨＢＶ遺伝子型ＣのＨＢＶ大型（Ｌ）表面タンパク質のｐｒｅ‐Ｓ１部分の肝細胞受容体ドメインのアミノ酸配列（Ｌに特有）（例えば配列番号１１の２１〜４７位または配列番号９２の９２〜１１８位）；４）完全長のＨＢＶ遺伝子型Ｃの小型（Ｓ）表面抗原のアミノ酸配列（例えば配列番号１１の１７６〜４００位または配列番号９２の１１９〜３４３位）；５）配列のクローニングおよび操作を容易にする２アミノ酸スペーサー／リンカー（Ｌｅｕ‐Ｇｌｕ）（例えば、配列番号９２の３４４〜３４５位）；６）ＨＢＶ遺伝子型Ｃのポリメラーゼの逆転写酵素ドメインを含む部分のアミノ酸配列（例えば配列番号１０の２４７〜６９１位または配列番号９２の３４６〜６９０位）；７）ＨＢＶ遺伝子型Ｃのコアタンパク質（例えば配列番号９の３１〜２１２位または配列番号９２の６９１〜８７２位）；８）ＨＢＶ遺伝子型ＣのＸ抗原のアミノ酸配列（例えば、配列番号１２の２〜１５４位または配列番号９２の８７３〜１０２５位）；ならびに、９）ヘキサヒスチジンタグ（例えば配列番号９２の１０２６〜１０３１位）、を備えた単一ポリペプチドであった。この融合タンパク質およびこのタンパク質を含む対応する酵母系免疫療法薬は、本明細書中では一般に「α‐Ｓｐｅｘ」、「ａ‐Ｓｐｅｘ」、または「ＧＩ‐１３００４」と呼ぶことができる。
【０３１６】
配列番号９２の融合タンパク質をコードする核酸配列（酵母での発現用にコドンを最適化）は、本明細書中に配列番号９１で表わされている。配列番号９２の予想されるおよその分子量は１２３ｋＤａである。配列番号９２は、融合タンパク質の免疫原性を増強すると考えられる複数のエピトープまたはドメイン、例えば配列番号３４および配列番号３６について上述されたいくつかを含有している。加えて、この融合タンパク質に使用される逆転写酵素ドメインは、抗ウイルス薬を用いた治療に対する薬物抵抗性の応答として突然変異に至ることが知られており、したがって特定の薬剤抵抗性（回避）突然変異を標的とする治療的または予防的免疫療法薬を提供するためにこの融合タンパク質中で変異させる場合もある、いくつかのアミノ酸部位を含有している。これらのアミノ酸部位は、配列番号９２に関しては、アミノ酸部位で：５１８位（Ｖａｌ、ラミブジン治療後にＬｅｕに変異することが知られている）；５２５位（Ｌｅｕ、ラミブジン治療後にＭｅｔに変異することが知られている）；５３９位（Ａｌａ、テノフォビル治療後にＴｈｒに変異することが知られている）；５４９位（Ｍｅｔ、ラミブジン治療後にＩｌｅまたはＶａｌに変異することが知られている）；および、５８１位（Ａｓｎ、アデフォビル治療後にＴｈｒに変異することが知られている）である。
【０３１７】
配列番号３６および配列番号９２で表わされるアミノ酸配列を含むこれらの免疫療法組成物を作出するために、表面抗原の上記保存領域（ｐｒｅ‐Ｓ１の肝細胞受容体領域または大型表面抗原（hepatocyte receptor region of pre-S1 or large surface antigen）、および完全長の小型表面抗原）ならびにポリメラーゼの逆転写酵素領域をコードするＤＮＡを、完全長コアおよび完全長Ｘ抗原に融合させた。該ＤＮＡは酵母での発現用にコドンを最適化され、次いでＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化されて、酵母２ｕｍ発現ベクター中でＣＵＰ１プロモーター（ｐＧＩ‐１００）またはＴＥＦ２プロモーター（ｐＴＫ５７‐１）の後ろに挿入された。生じるプラスミドは、酢酸リチウム／ポリエチレングリコール・トランスフェクションによりサッカロマイセス・セレビシエＷ３０３α酵母に導入され、初代トランスフェクタントはウラシルを欠く固体の最少プレート培地（ＵＤＭ；ウリジン欠落培地）で選択された。コロニーは、ＵＤＭまたはＵＬＤＭ（ウリジンおよびロイシン欠落培地）に再度画線播種され、３０℃で３日間増殖させた。
【０３１８】
ウリジンを欠いた液体培養（Ｕ２）またはウリジンおよびロイシンを欠いた液体培養（ＵＬ２）はプレートからの接種を受け、スタータ培養物は３０℃、２５０ｒｐｍで２０時間増殖させた。４．２ｇ／ｌのビス‐トリスを含有するｐＨ緩衝培地（ＢＴ‐Ｕ２；ＢＴ‐ＵＬ２）も、中性ｐＨ条件下での該酵母の増殖を評価するために接種させた（データは示さない）。初代培養物は同じ調合の最終培養物に接種するために使用され、密度または１．１〜４．０  ＹＵ／ｍＬ（a density or 1.1 to 4.0 YU/mL）に到達するまで増殖が継続された。ＴＥＦ２株（構成的発現）については、細胞は回収され、洗浄され、ＰＢＳ中にて５６℃で１時間加熱殺処理された。ＣＵＰ１株（誘導発現）については、発現を０．５ｍＭの硫酸銅を含んだ同じ培地中で３０℃、２５０ｒｐｍで５時間誘導した。細胞は回収され、洗浄され、ＰＢＳ中にて５６℃で１時間加熱殺処理された。生細胞も比較のために処理された。（データは示さない）。
【０３１９】
ＴＥＦ２およびＣＵＰ１培養物の加熱殺処理後、細胞はＰＢＳで３回洗浄された。全タンパク質発現量はＴＣＡ沈澱反応／ニトロセルロース結合アッセイによって測定され、抗原の発現は抗ヒスチジンタグモノクローナル抗体を使用するウエスタンブロット法により測定された。抗原の量は、同じウエスタンブロット上で処理された組換えのヘキサヒスチジンタグ付きＮＳ３タンパク質の標準曲線からの内挿法によって定量された。
【０３２０】
配列番号３６で表わされる融合タンパク質を発現する酵母系免疫療法薬（ＧＩ‐１３００５）について、結果は図１８に示されている。図１８は、本発明の酵母系免疫療法組成物がいずれのプロモーターを使用しても融合タンパク質を良好に発現し、かつ加熱殺処理された酵母細胞ではウエスタンブロットにより同定可能であることを示している（発現は生きた酵母細胞においても達成されたが、データは示されていない）。計算された、この酵母系免疫療法薬による抗原発現は、ＵＬ２での増殖については、１Ｙ．Ｕ．あたり〜１２００ｎｇタンパク質すなわち１Ｙ．Ｕ．あたり１１ｐｍｏｌタンパク質であった。
【０３２１】
配列番号９２で表わされる融合タンパク質を発現する酵母系免疫療法薬（ＧＩ‐１３００４）について、結果は図１９に示されている。図１９は、ＣＵＰ１プロモーターの制御下におけるこの酵母系免疫療法組成物の発現（図１９ではα‐ＳＰＥＸとして識別される）を、無関係な抗原を発現する酵母系免疫療法薬（対照酵母）、および配列番号３６で表わされるＨＢＶ融合タンパク質（ＳＰＥＸ）を発現している酵母系免疫療法組成物と、比較して示している。図１９は、酵母系免疫療法薬が適切な融合タンパク質を良好に発現し、かつ加熱殺処理された酵母細胞ではウエスタンブロットにより同定可能であることを示している。計算された、この酵母系免疫療法薬による抗原発現（α‐ＳＰＥＸ）は、ＵＬ２での増殖について１Ｙ．Ｕ．あたり〜５０００ｎｇタンパク質すなわち１Ｙ．Ｕ．あたり４１ｐｍｏｌタンパク質であった。
【０３２２】
実施例３
次の実施例は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染の治療または予防のためのさらなる酵母系免疫療法組成物の製造について説明する。
【０３２３】
この実験では、酵母（例えばサッカロマイセス・セレビシエ）は、銅誘導性プロモーターＣＵＰ１またはＴＥＦ２プロモーターの制御下で図４に概略的に示されるような様々なＨＢＶポリメラーゼ‐コア融合タンパク質を発現するように遺伝子組換え処理される。各事例において、融合タンパク質は、配列番号３８で表わされる、Ｎ末端からＣ末端までインフレームで融合された以下の配列要素：（１）プロテアソーム分解に対する抵抗性を付与し、かつ発現を安定させるＮ末端ペプチド（配列番号３７；配列番号３８の１〜６位）；２）ＨＢＶ遺伝子型Ｃのポリメラーゼの逆転写酵素ドメインを含む部分のアミノ酸配列（例えば配列番号１０の３４７〜６９１位または配列番号３８の７〜３５１位）；３）ＨＢＶ遺伝子型Ｃのコアタンパク質（例えば配列番号９の３１〜２１２位または配列番号３８の３５２〜５３３位）；および、４）ヘキサヒスチジンタグ（例えば配列番号３８の５３４〜５３９位）、を備えたおよそ５２７アミノ酸の単一ポリペプチドである。配列番号３８の予測される分子量はおよそ５８ｋＤａである。該配列はさらに、該融合タンパク質の免疫原性を増強すると考えられるエピトープまたはドメインを含有する。さらなる構築物では、配列番号３７のＮ末端ペプチドは、本明細書中に詳細に記載されているのと同じ配列番号３７の基本的構造要件を満たす配列番号３７の相同体に代表される異なる合成Ｎ末端ペプチドに置き換えられるか、または、配列番号３７のＮ末端ペプチドは配列番号８９もしくは配列番号９０のＮ末端ペプチドに置き換えられ、かつ、別の構築物においては、Ｎ末端ペプチドは省略されて１位にメチオニンが含まれる。
【０３２４】
別の実験では、酵母（例えばサッカロマイセス・セレビシエ）は、銅誘導性プロモーターＣＵＰ１またはＴＥＦ２プロモーターの制御下で図５に概略的に示されるような様々なＨＢＶ  Ｘ‐コア融合タンパク質を発現するように遺伝子組換え処理される。各事例において、融合タンパク質は、配列番号３９で表わされる、Ｎ末端からＣ末端までインフレームで融合された以下の配列要素：（１）プロテアソーム分解に対する抵抗性を付与し、かつ発現を安定させるＮ末端ペプチド（配列番号３７；配列番号３９の１〜６位）；２）ほぼ完全長の（１位を差し引いた）ＨＢＶ遺伝子型ＣのＸ抗原のアミノ酸配列（例えば、配列番号１２の２〜１５４位または配列番号３９の７〜１５９位）；３）ＨＢＶ遺伝子型Ｃのコアタンパク質（例えば配列番号９の３１〜２１２位または配列番号３９の１６０〜３４１位）；および４）ヘキサヒスチジンタグ（配列番号３９の３４２〜３４７位）、を備えたおよそ３３７アミノ酸の単一ポリペプチドである。配列番号３９の予測されるおよその分子量は３７ｋＤａである。該配列はさらに、該融合タンパク質の免疫原性を増強すると考えられるエピトープまたはドメインを含有する。さらなる構築物では、配列番号３７のＮ末端ペプチドは、本明細書中に詳細に記載されているのと同じ配列番号３７の基本的構造要件を満たす配列番号３７の相同体に代表される異なる合成Ｎ末端ペプチドに置き換えられるか、または、配列番号３７のＮ末端ペプチドは配列番号８９もしくは配列番号９０のＮ末端ペプチドに置き換えられ、かつ、別の構築物においては、Ｎ末端ペプチドは省略されて１位にメチオニンが含まれる。
【０３２５】
別の実験では、酵母（例えばサッカロマイセス・セレビシエ）は、銅誘導性プロモーターＣＵＰ１またはＴＥＦ２プロモーターの制御下で図６に概略的に示されるような様々なＨＢＶポリメラーゼタンパク質を発現するように遺伝子組換え処理される。各事例において、該融合タンパク質は、配列番号４０で表わされる、Ｎ末端からＣ末端までインフレームで融合された以下の配列要素：（１）プロテアソーム分解に対する抵抗性を付与し、かつ発現を安定させるＮ末端ペプチド（配列番号３７、または配列番号４０の１〜６位）；２）ＨＢＶ遺伝子型Ｃのポリメラーゼの逆転写酵素ドメインを含む部分のアミノ酸配列（例えば配列番号１０の３４７〜６９１位または配列番号４０の７〜３５１位）；および３）ヘキサヒスチジンタグ（配列番号４０の３５２〜３５７位）、を備えた単一ポリペプチドである。該配列はさらに、該融合タンパク質の免疫原性を増強すると考えられるエピトープまたはドメインを含有する。加えて、１つの実施形態では、この構築物の配列は、以下の抗ウイルス薬抵抗性突然変異すなわち：ｒｔＭ２０４ｌ、ｒｔＬ１８０Ｍ、ｒｔＭ２０４Ｖ、ｒｔＶ１７３Ｌ、ｒｔＮ２３６Ｔ、ｒｔＡ１９４Ｔ（部位はＨＢＶポリメラーゼの完全長アミノ酸配列に関して付されている）のうち１以上または全てを導入するために改変されてもよい。１つの実施形態では、６つの異なる免疫療法組成物が作出され、該組成物それぞれが上記突然変異のうち１つを含有している。他の実施形態では、該突然変異の全てまたはいくつかが単一の融合タンパク質に含まれている。さらなる構築物では、配列番号３７のＮ末端ペプチドは、本明細書中に詳細に記載されているのと同じ配列番号３７の基本的構造要件を満たす配列番号３７の相同体に代表される異なる合成Ｎ末端ペプチドに置き換えられるか、または、配列番号３７のＮ末端ペプチドは配列番号８９もしくは配列番号９０のＮ末端ペプチドに置き換えられ、かつ、別の構築物においては、Ｎ末端ペプチドは省略されて１位にメチオニンが含まれる。
【０３２６】
別の実験では、酵母（例えばサッカロマイセス・セレビシエ）は、銅誘導性プロモーターＣＵＰ１またはＴＥＦ２プロモーターの制御下で図７に概略的に示されるような様々なＨＢＶポリメラーゼ‐表面‐コア融合タンパク質を発現するように遺伝子組換え処理される。各事例において、該融合タンパク質は、配列番号４１で表わされる、Ｎ末端からＣ末端までインフレームで融合された以下の配列要素：（１）プロテアソーム分解に対する抵抗性を付与し、かつ発現を安定させるＮ末端ペプチド（例えば配列番号４１の１〜５位）；２）ＨＢＶ大型（Ｌ）表面タンパク質のｐｒｅ‐Ｓ１部分のアミノＨＢＶ肝細胞受容体ドメインのアミノ酸配列（Ｌに特有）（例えば配列番号１１の２１〜４７位または配列番号４１の６〜３２位）；３）ＨＢＶ小型（Ｓ）表面タンパク質のアミノ酸配列（例えば配列番号１１の１７６〜４００位または配列番号４１の３３〜２５７位）；４）配列のクローニングおよび取扱を容易にする２アミノ酸スペーサー／リンカー（例えば配列番号４１の２５８および２５９位）；５）逆転写酵素ドメインを含むＨＢＶポリメラーゼのアミノ酸配列（例えば配列番号１０の２４７〜６９１位または配列番号４１の２６０〜６０４位）；６）ＨＢＶコアタンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号９の３１〜２１２位または配列番号４１の６０５〜７８６位）；ならびに、７）ヘキサヒスチジンタグ（例えば配列番号４１の７８７〜７９２位）、を備えた単一ポリペプチドである。該配列はさらに、該融合タンパク質の免疫原性を増強すると考えられるエピトープまたはドメインを含有する。加えて、１つの実施形態では、この構築物の配列は、以下の抗ウイルス薬抵抗性突然変異すなわち：ｒｔＭ２０４ｌ、ｒｔＬ１８０Ｍ、ｒｔＭ２０４Ｖ、ｒｔＶ１７３Ｌ、ｒｔＮ２３６Ｔ、ｒｔＡ１９４Ｔ（部位はＨＢＶポリメラーゼの完全長アミノ酸配列に関して付されている）のうち１以上または全てを導入するために改変されてもよい。１つの実施形態では、６つの異なる免疫療法組成物が作出され、該組成物それぞれが上記突然変異のうち１つを含有している。他の実施形態では、該突然変異の全てまたはいくつかが単一の融合タンパク質に含まれている。１つの実施形態では、この構築物はさらに、表面抗原における１以上の抗ウイルス薬抵抗性突然変異を含有する。さらなる構築物では、配列番号４１の１〜５位で表されるＮ末端ペプチドは、本明細書中に詳細に記載されているのと同じ配列番号４１の（もしくは配列番号３７の）１〜５位の基本的構造要件を満たす配列番号４１の１〜５位の相同体に代表される異なる合成Ｎ末端ペプチドに置き換えられるか、または、配列番号４１の１〜５位のＮ末端ペプチドは配列番号８９もしくは配列番号９０のＮ末端ペプチドに置き換えられ、かつ、別の構築物においては、Ｎ末端ペプチドは省略されて１位にメチオニンが含まれる。
【０３２７】
上述の融合タンパク質およびそのようなタンパク質を発現する酵母系免疫療法組成物のうちのいずれかを製造するために、簡潔に述べると、該融合タンパク質をコードするＤＮＡは酵母での発現用にコドンを最適化され、次いでＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化されて、酵母２ｕｍ発現ベクター中でＣＵＰ１プロモーター（ｐＧＩ‐１００）またはＴＥＦ２プロモーター（ｐＴＫ５７‐１）の後ろに挿入される。生じるプラスミドは、酢酸リチウム／ポリエチレングリコール・トランスフェクションによりサッカロマイセス・セレビシエＷ３０３α酵母に導入され、初代トランスフェクタントはウラシルを欠く固体の最少プレート培地（ＵＤＭ；ウリジン欠落培地）で選択される。コロニーは、ＵＤＭまたはＵＬＤＭ（ウリジンおよびロイシン欠落培地）に再度画線播種され、３０℃で３日間増殖させる。
【０３２８】
ウリジンを欠いた液体培養（Ｕ２）またはウリジンおよびロイシンを欠いた液体培養（ＵＬ２）はプレートからの接種を受け、スタータ培養物は３０℃、２５０ｒｐｍで２０時間増殖させる。４．２ｇ／ｌのビス‐トリスを含有するｐＨ緩衝培地（ＢＴ‐Ｕ２；ＢＴ‐ＵＬ２）も、中性ｐＨ条件下での酵母の増殖を評価するために接種されうる。初代培養物は同じ調合の最終培養物に接種するために使用され、密度または１．１〜４．０ＹＵ／ｍＬ（a density or 1.1 to 4.0 YU/mL）に到達するまで増殖が継続される。ＴＥＦ２株（構成的発現）については、細胞は回収され、洗浄され、ＰＢＳ中にて５６℃で１時間加熱殺処理される。ＣＵＰ１株（誘導発現）については、発現を０．５ｍＭの硫酸銅を含んだ同じ培地中で３０℃、２５０ｒｐｍで５時間誘導する。細胞は回収され、洗浄され、ＰＢＳ中にて５６℃で１時間加熱殺処理される。生細胞も比較のために処理される。
【０３２９】
ＴＥＦ２およびＣＵＰ１培養物の加熱殺処理後、細胞はＰＢＳで３回洗浄される。全タンパク質発現量はＴＣＡ沈澱反応／ニトロセルロース結合アッセイによって測定され、タンパク質の発現は抗ヒスチジンタグモノクローナル抗体を使用するウエスタンブロット法により測定される。融合タンパク質の量は、同じウエスタンブロット上で処理された組換えのヘキサヒスチジンタグ付きＮＳ３タンパク質の標準曲線からの内挿法によって定量される。
【０３３０】
実施例４
次の実施例は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染の治療または予防のためのさらなる酵母系免疫療法組成物の製造について述べている。
【０３３１】
本実施例は、それぞれが１つのＨＢＶタンパク質を発現するように設計された４つの異なる酵母系免疫療法組成物の製造について述べる。これらの「単一ＨＢＶタンパク質の酵母免疫療法薬」は、互いに組み合わせて、もしくは順を追って使用されてもよいし、かつ／または、他の酵母系免疫療法薬、例えば本明細書中に記載された多重ＨＢＶタンパク質の酵母系免疫療法薬を含む実施例１〜３および５〜８のうちいずれかに記載されたものとともに組み合わせて、もしくは順を追って使用されてもよい。加えて、本実施例に記載されるもののような「単一ＨＢＶタンパク質の酵母免疫療法薬」は任意の所与の遺伝子型または遺伝子亜型についてのＨＢＶ配列を使用して製造可能であり、かつ、さらなるＨＢＶ表面抗原の酵母系免疫療法薬が、それぞれ本発明の酵母系免疫療法薬に関連して提供されるかまたは本発明の少なくとも１つの酵母系免疫療法薬を含む免疫処置／投与の方策において提供される様々なＨＢＶ抗原ならびに遺伝子型および／もしくは遺伝子亜型の「スパイスラック」を提供するために、任意の１つ以上のさらなる遺伝子型または遺伝子亜型についてのＨＢＶ配列を使用して製造可能である。
【０３３２】
本実施例では、次の４種の酵母系免疫療法薬産物が製造される。
［ＨＢＶ表面抗原］  サッカロマイセス・セレビシエは、銅誘導性プロモーターＣＵＰ１またはＴＥＦ２プロモーターの制御下でＨＢＶ表面タンパク質を発現するように遺伝子組換え処理される。各事例において、該融合タンパク質は、配列番号９３で表わされる、Ｎ末端からＣ末端までインフレームで融合された以下の配列要素：１）配列番号８９のＮ末端ペプチド：（配列番号９３の１〜８９位）；２）ほぼ完全長の（１位を差し引いた）ＨＢＶ遺伝子型Ｃの大型（Ｌ）表面抗原のアミノ酸配列（例えば、配列番号１１の２〜４００位または配列番号９３の９０〜４８８位）；および、３）ヘキサヒスチジンタグ（例えば配列番号９３の４８９〜４９４位）、を備えた単一ポリペプチドである。別例として、Ｎ末端ペプチドは、配列番号３７もしくはその相同体、または本明細書中に記載された別のＮ末端ペプチドに、置き換えられてもよい。
【０３３３】
［ＨＢＶポリメラーゼ抗原］  サッカロマイセス・セレビシエは、銅誘導性プロモーターＣＵＰ１またはＴＥＦ２プロモーターの制御下で以下のＨＢＶポリメラーゼタンパク質を発現するように遺伝子組換え処理される。各事例において、該融合タンパク質は、配列番号９４で表わされる、Ｎ末端からＣ末端までインフレームで融合された以下の配列要素：１）配列番号８９のＮ末端ペプチド：（配列番号９４の１〜８９位）；２）ＨＢＶ遺伝子型Ｃのポリメラーゼの逆転写酵素ドメインを含む部分のアミノ酸配列（例えば配列番号１０の３４７〜６９１位または配列番号９４の９０〜４３４位）；および、３）ヘキサヒスチジンタグ（例えば配列番号９４の４３５〜４４０位）、を備えた単一ポリペプチドである。別例として、Ｎ末端ペプチドは、配列番号３７もしくはその相同体、または本明細書中に記載された別のＮ末端ペプチドに、置き換えられてもよい。
【０３３４】
［ＨＢＶコア抗原］  サッカロマイセス・セレビシエは、銅誘導性プロモーターＣＵＰ１またはＴＥＦ２プロモーターの制御下で以下のＨＢＶコアタンパク質を発現するように遺伝子組換え処理される。各事例において、該融合タンパク質は、配列番号９５で表わされる、Ｎ末端からＣ末端までインフレームで融合された以下の配列要素：１）配列番号８９のＮ末端ペプチド：（配列番号９５の１〜８９位）；２）ＨＢＶ遺伝子型Ｃのコアタンパク質の一部のアミノ酸配列（例えば配列番号９の３１〜２１２位または配列番号９５の９０〜２７１位）、および、３）ヘキサヒスチジンタグ（例えば配列番号９５の２７２〜２７７位）、を備えた単一ポリペプチドである。別例として、Ｎ末端ペプチドは、配列番号３７もしくはその相同体、または本明細書中に記載された別のＮ末端ペプチドに、置き換えられてもよい。
【０３３５】
［ＨＢＶ  Ｘ抗原］  サッカロマイセス・セレビシエは、銅誘導性プロモーターＣＵＰ１またはＴＥＦ２プロモーターの制御下で以下のＨＢＶ  Ｘ抗原を発現するように遺伝子組換え処理される。各事例において、該融合タンパク質は、配列番号９６で表わされる、Ｎ末端からＣ末端までインフレームで融合された以下の配列要素：１）配列番号８９のＮ末端ペプチド：（配列番号９６の１〜８９位）；２）ＨＢＶ遺伝子型ＣのＸ抗原の一部のアミノ酸配列（例えば、配列番号１２の２〜１５４位または配列番号９６の９０〜２４２位）；および、３）ヘキサヒスチジンタグ（例えば配列番号９６の２４３〜２４８位）、を備えた単一ポリペプチドである。別例として、Ｎ末端ペプチドは、配列番号３７もしくはその相同体、または本明細書中に記載された別のＮ末端ペプチドに、置き換えられてもよい。
【０３３６】
これらの免疫療法組成物を作出するために、簡潔に述べると、該融合タンパク質をコードするＤＮＡは酵母での発現用にコドンを最適化され、次いでＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化されて、酵母２ｕｍ発現ベクター中でＣＵＰ１プロモーター（ｐＧＩ‐１００）またはＴＥＦ２プロモーター（ｐＴＫ５７‐１）の後ろに挿入される。得られたプラスミドは、酢酸リチウム／ポリエチレングリコール・トランスフェクションにより酵母サッカロマイセス・セレビシエＷ３０３αに導入され、初代トランスフェクタントはウラシルを欠く固体の最少プレート培地（ＵＤＭ；ウリジン欠落培地）で選択される。コロニーは、ＵＤＭまたはＵＬＤＭ（ウリジンおよびロイシン欠落培地）に再度画線播種され、３０℃で３日間増殖させる。
【０３３７】
ウリジンを欠いた液体培養（Ｕ２）またはウリジンおよびロイシンを欠いた液体培養（ＵＬ２）はプレートからの接種を受け、スタータ培養物は３０℃、２５０ｒｐｍで２０時間増殖させる。４．２ｇ／ｌのビス‐トリスを含有するｐＨ緩衝培地（ＢＴ‐Ｕ２；ＢＴ‐ＵＬ２）にも、中性ｐＨ条件下での酵母の増殖を評価するために接種がなされてもよい。初代培養物は同じ調合の最終培養物に接種するために使用され、密度または１．１〜４．０  ＹＵ／ｍＬ（a density or 1.1 to 4.0 YU/mL）に到達するまで増殖が継続される。ＴＥＦ２株（構成的発現）については、細胞は回収され、洗浄され、ＰＢＳ中にて５６℃で１時間加熱殺処理される。ＣＵＰ１株（誘導発現）については、発現を０．５ｍＭの硫酸銅を含んだ同じ培地中で３０℃、２５０ｒｐｍで５時間誘導する。細胞は回収され、洗浄され、ＰＢＳ中にて５６℃で１時間加熱殺処理される。
生細胞も比較のために処理される。
【０３３８】
ＴＥＦ２およびＣＵＰ１培養物の加熱殺処理後、細胞はＰＢＳで３回洗浄される。全タンパク質発現量はＴＣＡ沈澱反応／ニトロセルロース結合アッセイによって測定され、タンパク質の発現は抗ヒスチジンタグモノクローナル抗体を使用するウエスタンブロット法により測定される。融合タンパク質の量は、同じウエスタンブロット上で処理された組換えのヘキサヒスチジンタグ付きＮＳ３タンパク質の標準曲線からの内挿法によって定量される。
【０３３９】
実施例５
次の実施例は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染の治療または予防のための、いくつかの異なる酵母系免疫療法組成物の製造について説明する。
【０３４０】
本実施例は、以下の目的すなわち：（１）必要に応じて、組換えＤＮＡ諮問委員会（Recombinant DNA Advisory Committee：ＲＡＣ）のガイドラインに準拠する酵母系免疫療法用臨床製品を製造するために、約６９０アミノ酸未満（ＨＢＶゲノムの３分の２未満に相当する）を含む多重抗原ＨＢＶ構築物を製造すること；（２）急性／自己限定的ＨＢＶ感染および慢性ＨＢＶ感染のうち少なくとも一方に対する免疫応答に関連する既知のＴ細胞エピトープを最大数含有する多重抗原ＨＢＶ構築物を製造すること；（３）遺伝子型の間で最も保存されているＴ細胞エピトープを含有する多重抗原ＨＢＶ構築物を製造すること；ならびに／または（４）１つ以上のコンセンサス配列、コンセンサスエピトープ、および特定の遺伝子型由来のエピトープのうち少なくともいずれかに一層厳密に一致するように改変された多重抗原ＨＢＶ構築物を製造すること；のうち１つ以上を達成するように設計されたタンパク質を発現する、酵母系免疫療法薬の製造について説明する。本実施例において実証された改変物は、本明細書中において記載または企図された任意の他の酵母系免疫療法薬に対して、個々に、または併せて、適用可能である。
【０３４１】
１つの実験では、上記に明示された目的の要件を満たし、かつＨＢＶの主要タンパク質すなわち：ＨＢＶ表面抗原、ポリメラーゼ、コアおよびＸ抗原の各々の一部を含む融合タンパク質を発現する酵母を含む、酵母系免疫療法組成物が設計された。この融合タンパク質を設計するために、該融合物中の個々のＨＢＶ抗原は（完全長と比較して）大きさが縮小され、また該融合セグメントは、表５に特定されたものに対応する既知のＴ細胞エピトープを最大限含めるように個々に改変された。この融合タンパク質にＴ細胞エピトープを含めるにあたっての優先順位は以下すなわち：
急性／自己限定的ＨＢＶ感染および慢性ＨＢＶ感染の両方に対する免疫応答において同定されたエピトープ  ＞  急性／自己限定的ＨＢＶ感染に対する免疫応答において同定されたエピトープ  ＞  慢性ＨＢＶ感染に対する免疫応答において同定されたエピトープである。
【０３４２】
人為的な結合部もこの融合タンパク質の各セグメントの設計においては最小限にとどめたが、その理由は、理論によって束縛されるものではないが、自然状態における進化は以下すなわち：ｉ）良好に発現するウイルス中の連続した配列；および、ｉｉ）それらの配列を適切に消化して免疫システムに提示することができる抗原提示細胞のイムノプロテアソーム、をもたらしてきたと考えられるからである。従って、多数の不自然な結合部を備えた融合タンパク質は、より自然なＨＢＶタンパク質配列を保持しているものと比較すると、酵母系免疫療法薬にはあまり有用ではない可能性がある。
【０３４３】
融合タンパク質に使用するためのＨＢＶ表面抗原を含むセグメントを構築するために、ＨＢＶ遺伝子型Ｃ由来の完全長の大型（Ｌ）表面抗原タンパク質は、Ｎ末端およびＣ末端配列の切捨てにより大きさが縮小された（例えば配列番号１１で表わされるもののような完全長のＬ表面抗原タンパク質と比較して、大型抗原の１〜１１９位および３６９〜４００位が除去された）。残りの部分は、一部には、上述のＴ細胞エピトープを含める優先順位を使用して、表５に特定されたものに相当する既知のＭＨＣクラスＩ  Ｔ細胞エピトープを最大限含めるように選択された。得られた表面抗原セグメントは配列番号９７で表わされる。
【０３４４】
融合タンパク質に使用するためのＨＢＶポリメラーゼを含むセグメントを構築するために、ＨＢＶ遺伝子型Ｃ由来の完全長ポリメラーゼ（約８４２アミノ酸の極めて大きなタンパク質である）のかなりの部分は、該タンパク質のＨＢＶ遺伝子型および単離物の間で最も保存された領域である活性部位ドメイン（ＲＴドメイン由来）を含めることに集中することにより、除去された。ＲＴドメインは、薬物抵抗性突然変異が生じることが知られているいくつかの部位も含んでおり；したがって、構築物のこの部分は、標的を設定した治療法の回避突然変異体を標的とするために、必要に応じ、別の構築物においてさらに改変されてもよい。より少数のＨＢＶタンパク質を含む融合タンパク質では、ポリメラーゼセグメントの大きさは、必要であれば拡張されてもよい。ＨＢＶポリメラーゼの選択された部分は、上記に議論された優先順位戦略を使用して、既知のＴ細胞エピトープが最大限となるように含められた。したがって省かれた完全長ポリメラーゼの配列には、ＲＴドメインの外側の配列、およびＲＴドメイン内の配列であって既知のＴ細胞エピトープを含有していないか、または２つのエピトープであって該エピトープが同定された遺伝子型Ａの患者においてそれぞれ１７％もしくは５％未満にしか同定されていないエピトープ（デズモンド（Desmond）ら、２００８年および表５を参照）を含む配列、が含まれた。ＨＢＶポリメラーゼの遺伝子型Ｃのセグメント内の残りのＴ細胞エピトープのうち１つを除いた全てが、遺伝子型Ａの分析に由来する公開されたエピトープと完全一致し、単一アミノ酸の不一致を備えた残る１つのエピトープは、公開されたエピトープに対応するように改変された。得られたＨＢＶポリメラーゼ抗原セグメントは配列番号９８で表わされる。
【０３４５】
融合タンパク質に使用するためのＨＢＶコア抗原を含むセグメントを構築するために、ＨＢＶ遺伝子型Ｃ由来の完全長コアタンパク質（例えば、配列番号９の３１〜２１２位置に類似）は、以下のように改変された、すなわち：ｉ）遺伝子型Ｃに由来するタンパク質のＴ細胞エピトープ内の単一アミノ酸が、表５に記載された既知のＴ細胞エピトープに完全一致するように改変され；ｉｉ）Ｔ細胞エピトープを含んでいないＮ末端の７アミノ酸が除去されて、タンパク質中の最初の既知Ｔ細胞エピトープのＮ末端側に隣接するいくつかのアミノ酸が保存され；かつ、ｉｉｉ）コアの２４個のＣ末端アミノ酸が除去されることにより、既知エピトープは欠失せず、極度に正に荷電したＣ末端が除去された。正に荷電したＣ末端は、酵母内で発現される抗原からの除去に適した候補である、というのも、そのような配列は、一部の構築物中では、アルギニン豊富である（正に荷電している）ことの多い天然の酵母ＲＮＡ結合タンパク質との競合的阻害により、酵母に対して有毒である可能性があるからである。従って、コアのこの部分の除去は許容可能である。得られたＨＢＶコア抗原セグメントは、配列番号９９で表わされる。
【０３４６】
融合タンパク質に使用するためのＨＢＶ  Ｘ抗原を含むセグメントを構築するために、ＨＢＶ遺伝子型Ｃ由来の完全長Ｘ抗原（例えば、配列番号１２に類似）は、Ｘ抗原の中でクラスター化している表５の既知Ｔ細胞エピトープのほとんどを備えたＸ抗原のセグメントを製造するために、Ｎ末端およびＣ末端が切り詰められた。該エピトープのうちの２つは公開されたＴ細胞エピトープ配列に対応させるために単一アミノ酸の変更による改変が施され、セグメントの端部においてＴ細胞エピトープに隣接する配列は、抗原提示細胞による効率的なプロセシングおよび正しいエピトープの提示を促進するために保持された。得られたＨＢＶ  Ｘ抗原セグメントは配列番号１００で表わされる。
【０３４７】
４つのＨＢＶタンパク質セグメントをすべて含有する完全な融合タンパク質を構築するために、上述の４つのＨＢＶセグメントは、ＨＢＶゲノムによってコードされる全てのタンパク質にわたるＴ細胞エピトープを最適に含み、かつ期待される臨床用途のためのウイルスタンパク質の基準を満たすことが予想される単一タンパク質を形成するために、連結された（表面‐ｐｏｌ‐コア‐Ｘ）。
【０３４８】
２つの異なる融合タンパク質が最終的に作出され、該融合タンパク質は各々、酵母における融合タンパク質の発現を増強および／または安定化するために付加された異なるＮ末端ペプチドを備えるものであった。加えて、ヘキサヒスチジンペプチドが、タンパク質の同定の助けとなるようにＣ末端に含められた。本明細書中に記載された酵母系免疫療法組成物において使用されるその他のタンパク質全てに関し、さらなる構築物では、本実施例において利用された配列番号３７または配列番号８９のＮ末端ペプチドは、異なる合成Ｎ末端ペプチド（例えば本明細書中に詳細に記載されているのと同じ配列番号３７の基本的構造要件を満たす配列番号３７の相同体）に置き換えられてもよいし、または、配列番号８９もしくは配列番号９０のＮ末端ペプチドの相同体に置き換えられてもよく、別の構築物においては、Ｎ末端ペプチドは省略されて１位にメチオニンが含まれる。加えて、１個、２個、３個またはそれ以上のアミノ酸のリンカー配列が、必要に応じて融合タンパク質のセグメント間に加えられてもよい。さらに、これらの構築物は遺伝子型ＣのＨＢＶタンパク質を骨格として用いて設計されたが、任意の他のＨＢＶ遺伝子型、遺伝子亜型、または異なる株もしくは単離物由来のＨＢＶタンパク質が、実施例７において例証されるように、これらのタンパク質セグメントを設計するために使用されてもよい。最後に、本明細書中に記載されるような融合タンパク質から１つ以上のセグメントが除外される場合、残りのセグメント由来の配列が拡張されて該タンパク質の追加のＴ細胞エピトープおよび隣接領域が含められてもよい（例えば、実施例８を参照）。
【０３４９】
上述のＨＢＶセグメントで構築された融合タンパク質を含む、酵母系免疫療法組成物を製造するために、酵母（例えばサッカロマイセス・セレビシエ）は、銅誘導性プロモーターＣＵＰ１またはＴＥＦ２プロモーターの制御下で上記に議論されるように最適化された様々なＨＢＶ表面‐ポリメラーゼ‐コア‐Ｘ融合タンパク質を発現するように遺伝子組換え処理される。
【０３５０】
１つの構築物では、該融合タンパク質は、配列番号１０１で表わされる、Ｎ末端からＣ末端までインフレームで融合された以下の配列要素：（１）配列番号８９で表わされる、プロテアソーム分解に対する抵抗性を付与し、かつ発現を安定させるための、αファクタープレプロ配列であるＮ末端ペプチド（配列番号１０１の１〜８９位）；（２）配列番号９７で表わされるＨＢＶの大型（Ｌ）表面抗原の最適化された部分（配列番号１０１の９０〜３３８位）；（３）配列番号９８で表わされるＨＢＶポリメラーゼの逆転写酵素（ＲＴ）ドメインの最適化された部分（配列番号１０１の３３９〜５６６位）；（４）配列番号９９で表わされるＨＢＶコアタンパク質の最適化された部分（配列番号１０１の５６７〜７１８位）；（５）配列番号１００で表わされるＨＢＶ  Ｘ抗原の最適化された部分（配列番号１０１の７１９〜７７８位）；および（６）ヘキサヒスチジンタグ（例えば配列番号１０１の７７９〜７８４位）、を備えた単一ポリペプチドである。
【０３５１】
第２の構築物では、該融合タンパク質は、配列番号１０２で表わされる、Ｎ末端からＣ末端までインフレームで融合された以下の配列要素：（１）配列番号３７で表わされる、プロテアソーム分解に対する抵抗性を付与し、かつ発現を安定させるように設計された合成Ｎ末端ペプチドであるＮ末端ペプチド（配列番号１０２の１〜６位）；（２）配列番号９７の２〜２４８位で表わされる、ＨＢＶの大型（Ｌ）表面抗原の最適化された部分（配列番号１０２の７〜２５４位）；（３）配列番号９８で表わされるＨＢＶポリメラーゼの逆転写酵素（ＲＴ）ドメインの最適化された部分（配列番号１０２の２５５〜４８２位）；（４）配列番号９９で表わされるＨＢＶコアタンパク質の最適化された部分（配列番号１０２の４８３〜６３４位）；（５）配列番号１００で表わされるＨＢＶ  Ｘ抗原の最適化された部分（配列番号１０２の６３５〜６９４位）；および（６）ヘキサヒスチジンタグ（例えば配列番号１０２の６９５〜７００位）、を備えた単一ポリペプチドである。
【０３５２】
これらの融合タンパク質を発現する、酵母系免疫療法組成物は、実施例１〜４に詳細に記載された同じプロトコールを使用して製造される。
実施例６
以下の実施例は、多数の個体または個体集団を治療する潜在能力を備えた単一組成物を提供するために、単一組成物に保存された抗原およびエピトープのうち少なくとも一方を含めることに関連してＨＢＶ遺伝子型および遺伝子亜型のうち少なくとも一方を最大限に標的化する、追加の酵母系ＨＢＶ免疫療法組成物の製造について述べる。
【０３５３】
同一の酵母系ＨＢＶ免疫療法薬中に複数の異なる遺伝子型を含む構築物を調製するために、酵母（例えばサッカロマイセス・セレビシエ）は、銅誘導性プロモーターＣＵＰ１またはＴＥＦ２プロモーターのような適切なプロモーターの制御下でＨＢＶ融合タンパク質を発現するように遺伝子組換え処理される。該タンパク質は、配列番号１０５で表わされる、それぞれ異なる遺伝子型（ＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）に由来する４つのコア抗原を含む、すなわち：１）配列番号１０５の１位のＮ末端メチオニン；２）ＨＢＶ遺伝子型Ａ由来のほぼ完全長のコアタンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号１の３１〜２１２位または配列番号１０５の２〜１８３位）；３）ＨＢＶ遺伝子型Ｂ由来のほぼ完全長のコアタンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号５の３０〜２１２位または配列番号１０５の１８４〜３９５位）；４）ＨＢＶ遺伝子型Ｃ由来のほぼ完全長のコアタンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号９の３０〜２１２位または配列番号１０５の３９６〜５７８位）；５）ＨＢＶ遺伝子型Ｄ由来のほぼ完全長のコアタンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号１３の３０〜２１２位または配列番号１０５の５７９〜７６１位）；および、５）ヘキサヒスチジンタグ（例えば配列番号１０５の７６２〜７６７位）、を含む単一ポリペプチドである。該配列はさらに、該融合タンパク質の免疫原性を増強すると考えられるエピトープまたはドメインを含有する。１位のＮ末端メチオニンは、配列番号３７もしくはその相同体で、または配列番号８９もしくは配列番号９０のαプレプロ配列もしくはその相同体、もしくは必要に応じて他の適切なＮ末端配列で、置き換えられてもよい。加えて、必要であれば、構築物のクローニングおよび操作を容易にするためにリンカー配列がＨＢＶタンパク質の間に挿入されてもよい。これは例示の構築物である、というのも、ＨＢＶ遺伝子型および遺伝子亜型のうち少なくとも一方の任意の他の組み合わせが必要に応じて本設計物に代わりに組込まれて、広範囲の臨床適用可能性および製造に有効な設計を備えた単一抗原の酵母系ＨＢＶ免疫療法薬産物を構築することも可能であるからである。配列番号１０５のアミノ酸配列はさらにいくつかの既知のＴ細胞エピトープも含有し、かつ、あるエピトープは、例えば、配列を表５に示されたエピトープと比較することにより同定可能な所与のエピトープについて、公開された配列に対応するように改変済みである。
【０３５４】
同一の酵母系ＨＢＶ免疫療法薬中に２以上のＨＢＶ抗原および２以上の遺伝子型を含む構築物を調製するために、酵母（例えばサッカロマイセス・セレビシエ）は、銅誘導性プロモーターＣＵＰ１またはＴＥＦ２プロモーターのような適切なプロモーターの制御下でＨＢＶ融合タンパク質を発現するように遺伝子組換え処理される。該タンパク質は、配列番号１０６で表わされる、２つのコア抗原および２つのＸ抗原であって対のうち各々１つが異なる遺伝子型（ＨＢＶ遺伝子型ＡおよびＣ）に由来するコア抗原およびＸ抗原を含む、すなわち：１）配列番号１０６の１位のＮ末端メチオニン；２）ＨＢＶ遺伝子型Ａ由来のほぼ完全長のコアタンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号１の３１〜２１２位または配列番号１０６の２〜１８３位）；３）ＨＢＶ遺伝子型Ａ由来の完全長Ｘ抗原のアミノ酸配列（例えば、配列番号４、または配列番号１０６の１８４〜３３７位）；４）ＨＢＶ遺伝子型Ｃ由来のほぼ完全長のコアタンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号９の３０〜２１２位または配列番号１０６の３３８〜５２０位）；５）ＨＢＶ遺伝子型Ｃ由来の完全長Ｘ抗原のアミノ酸配列（例えば、配列番号８、または配列番号１０６の５２１〜６７４位）；および、５）ヘキサヒスチジンタグ（例えば配列番号１０６の６７５〜６８０位）、を含む単一ポリペプチドである。該配列はさらに、該融合タンパク質の免疫原性を増強すると考えられるエピトープまたはドメインを含有する。１位のＮ末端メチオニンは、配列番号３７もしくはその相同体で、または配列番号８９もしくは配列番号９０のαプレプロ配列もしくはその相同体で、置き換えられてもよい。配列番号１０６のアミノ酸配列はさらにいくつかの既知のＴ細胞エピトープも含有し、かつ、あるエピトープは、例えば、配列を表５に示されたエピトープと比較することにより同定可能な所与のエピトープについて、公開された配列に対応するように改変済みである。
【０３５５】
これらの融合タンパク質を発現する、酵母系免疫療法組成物は、実施例１〜４に詳細に記載された同じプロトコールを使用して製造される。
実施例７
以下の実施例は、１つの組成物を用いて多数の個体または個体集団を治療する潜在能力を備えた組成物を提供するために、ＨＢＶ遺伝子型についてのコンセンサス配列を使用し、さらには、保存された抗原およびエピトープのうち少なくとも一方を含めることに関連してＨＢＶ遺伝子型および遺伝子亜型のうち少なくとも一方を最大限に標的化する、追加の酵母系ＨＢＶ免疫療法組成物の製造について述べる。
【０３５６】
表面タンパク質、コア、ポリメラーゼ、およびＸ抗原それぞれに由来するＨＢＶセグメントを含むいくつかの構築物を設計するために、配列番号１０１および配列番号１０２について実施例５に記載された融合タンパク質構造（ならびにしたがって配列番号９７（表面抗原）、配列番号９８（ポリメラーゼ）、配列番号９９（コア抗原）および配列番号１００（Ｘ抗原）で表わされる上記融合タンパク質の下位部分）が、鋳型として使用された。複数のＨＢＶ配列供給源から構築されたＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ各々のコンセンサス配列（例えば、Ｓ、コアおよびＸについてはユ（Yu）およびユエン（Yuan）ら、２０１０年（コンセンサス配列は３２２個のＨＢＶ配列から生成）、Ｐｏｌ（ＲＴ）については、スタンフォード大学ＨＩＶ薬物抵抗性データベース（Stanford University HIV Drug Resistance Database）のＨＢＶ配列およびＨＢＶ部位リリースノート（HBVseq and HBV Site Release Notes）から）に関して、鋳型構造物中の配列は、同じ部位に対応するコンセンサス配列に置き換えられ、ただし、コンセンサス配列の使用が既知の急性自己限定的Ｔ細胞エピトープのうちの１つまたは既知のポリメラーゼ回避突然変異部位のうちの１つを変更した場合は除き、この場合には、上記部位は、これらのエピトープまたは突然変異部位について公開された配列に従った。コンセンサス配列のみに基づいて、またはエピトープが知られるようになるにつれて他の公開されたエピトープを使用して、追加の抗原が構築されることも考えられる。
【０３５７】
ＨＢＶ遺伝子型Ａのコンセンサス配列に基づく第１の構築物は、以下のように設計された。融合セグメントの大きさを（完全長と比較して）縮小し、表５に特定されたものに相当する既知のＴ細胞エピトープを最大限含め（上記に議論されたような優先度）、かつ、人為的結合部を最小限とするように設計された、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９および配列番号１００を使用して、新たな融合セグメントがＨＢＶ遺伝子型Ａのコンセンサス配列に基づいて作出された。新たな表面抗原セグメントは配列番号１０７の１〜２４９位で表わされる。新たなポリメラーゼ（ＲＴ）セグメントは配列番号１０７の２５０〜４７７位で表わされる。新たなコアセグメントは配列番号１０７の４７８〜６２９位で表わされる。新たなＸ抗原セグメントは配列番号１０７の６３０〜６８９位で表わされる。この完全型融合タンパク質は、ＨＢＶ配列が配列番号１０７で表わされる、Ｎ末端からＣ末端までインフレームで融合された以下の配列要素（「任意選択」として表示される非ＨＢＶ配列は配列番号１０７の基本配列には含まれないが、実際には本実施例に記載される融合タンパク質に付加された）：（１）配列番号３７で表わされる、プロテアソーム分解に対する抵抗性を付与し、かつ発現を安定させるように設計された合成Ｎ末端ペプチドである任意選択のＮ末端ペプチド；（２）任意選択のＴｈｒ‐Ｓｅｒリンカーペプチド；（３）配列番号１０７の１〜２４９位で表わされるＨＢＶ大型（Ｌ）表面抗原の最適化された部分であって、上記に議論された設計方策を利用するＨＢＶ遺伝子型Ａのコンセンサス配列である部分；（４）配列番号１０７の２５０〜４７７位で表わされるＨＢＶポリメラーゼの逆転写酵素（ＲＴ）ドメインの最適化された部分であって、上記に議論された設計方策を利用するＨＢＶ遺伝子型Ａのコンセンサス配列である部分；（５）配列番号１０７の４７８〜６２９位で表わされるＨＢＶコアタンパク質の最適化された部分であって、上記に議論された設計方策を利用するＨＢＶ遺伝子型Ａのコンセンサス配列である部分；（６）配列番号１０７の６３０〜６８９位で表わされるＨＢＶ  Ｘ抗原の最適化された部分であって、上記に議論された設計方策を利用するＨＢＶ遺伝子型Ａのコンセンサス配列である部分；および（７）任意選択のヘキサヒスチジンタグ（配列番号１０７の６８９位に続く６個のヒスチジン残基、を備えた単一ポリペプチドである。この完全型融合タンパク質を発現する、酵母系免疫療法組成物は、本明細書中ではＧＩ‐１３０１０とも呼ばれる。該融合タンパク質および対応する酵母系免疫療法薬は、本明細書中において「ＳＰＥＸｖ２‐Ａ」または「Ｓｐｅｘ‐Ａ」と呼ばれることもある。
【０３５８】
ＨＢＶ遺伝子型Ｂのコンセンサス配列に基づく第２の構築物は、以下のように設計された。融合セグメントの大きさを（完全長と比較して）縮小し、表５に特定されたものに相当する既知のＴ細胞エピトープを最大限含め（上記に議論されたような優先度）、かつ、人為的結合部を最小限とするように設計された、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９および配列番号１００を使用して、新たな融合セグメントがＨＢＶ遺伝子型Ｂのコンセンサス配列に基づいて作出された。新たな表面抗原セグメントは配列番号１０８の１〜２４９位で表わされる。新たなポリメラーゼ（ＲＴ）セグメントは配列番号１０８の２５０〜４７７位で表わされる。新たなコアセグメントは配列番号１０８の４７８〜６２９位で表わされる。新たなＸ抗原セグメントは配列番号１０８の６３０〜６８９位で表わされる。この融合タンパク質は、配列番号１０８で表わされる、Ｎ末端からＣ末端までインフレームで融合された以下の配列要素（「任意選択」として表示される非ＨＢＶ配列は配列番号１０８の基本配列には含まれないが、実際には本実施例に記載される融合タンパク質に付加された）：（１）配列番号３７で表わされる、プロテアソーム分解に対する抵抗性を付与し、かつ発現を安定させるように設計された合成Ｎ末端ペプチドである任意選択のＮ末端ペプチド；（２）任意選択のＴｈｒ‐Ｓｅｒリンカーペプチド；（３）配列番号１０８の１〜２４９位で表わされるＨＢＶ大型（Ｌ）表面抗原の最適化された部分であって、上記に議論された設計方策を利用するＨＢＶ遺伝子型Ｂのコンセンサス配列である部分；（４）配列番号１０８の２５０〜４７７位で表わされるＨＢＶポリメラーゼの逆転写酵素（ＲＴ）ドメインの最適化された部分であって、上記に議論された設計方策を利用するＨＢＶ遺伝子型Ｂのコンセンサス配列である部分；（５）配列番号１０８の４７８〜６２９位で表わされるＨＢＶコアタンパク質の最適化された部分であって、上記に議論された設計方策を利用するＨＢＶ遺伝子型Ｂのコンセンサス配列である部分；（６）配列番号１０８の６３０〜６８９位で表わされるＨＢＶ  Ｘ抗原の最適化された部分であって、上記に議論された設計方策を利用するＨＢＶ遺伝子型Ｂのコンセンサス配列である部分；および（７）任意選択のヘキサヒスチジンタグ、を備えた単一ポリペプチドである。この完全型融合タンパク質を発現する、酵母系免疫療法組成物は、本明細書中ではＧＩ‐１３０１１とも呼ばれる。該融合タンパク質および対応する酵母系免疫療法薬は、本明細書中において「ＳＰＥＸｖ２‐Ｂ」または「Ｓｐｅｘ‐Ｂ」と呼ばれることもある。
【０３５９】
ＨＢＶ遺伝子型Ｃのコンセンサス配列に基づく第３の構築物は、以下のように設計された。融合セグメントの大きさを（完全長と比較して）縮小し、表５に特定されたものに相当する既知のＴ細胞エピトープを最大限含め（上記に議論されたような優先度）、かつ、人為的結合部を最小限とするように設計された、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９および配列番号１００を使用して、新たな融合セグメントがＨＢＶ遺伝子型Ｃのコンセンサス配列に基づいて作出された。新たな表面抗原セグメントは配列番号１０９の１〜２４９位で表わされる。新たなポリメラーゼ（ＲＴ）セグメントは配列番号１０９の２５０〜４７７位で表わされる。新たなコアセグメントは配列番号１０９の４７８〜６２９位で表わされる。新たなＸ抗原セグメントは配列番号１０９の６３０〜６８９位で表わされる。この融合タンパク質は、配列番号１０９で表わされる、Ｎ末端からＣ末端までインフレームで融合された以下の配列要素（「任意選択」として表示される非ＨＢＶ配列は配列番号１０９の基本配列には含まれないが、実際には本実施例に記載される融合タンパク質に付加された）：（１）配列番号３７で表わされる、プロテアソーム分解に対する抵抗性を付与し、かつ発現を安定させるように設計された合成Ｎ末端ペプチドである任意選択のＮ末端ペプチド；（２）任意選択のＴｈｒ‐Ｓｅｒリンカーペプチド；（３）配列番号１０９の１〜２４９位で表わされるＨＢＶ大型（Ｌ）表面抗原の最適化された部分であって、上記に議論された設計方策を利用するＨＢＶ遺伝子型Ｃのコンセンサス配列である部分；（４）配列番号１０９の２５０〜４７７位で表わされるＨＢＶポリメラーゼの逆転写酵素（ＲＴ）ドメインの最適化された部分であって、上記に議論された設計方策を利用するＨＢＶ遺伝子型Ｃのコンセンサス配列である部分；（５）配列番号１０９の４７８〜６２９位で表わされるＨＢＶコアタンパク質の最適化された部分であって、上記に議論された設計方策を利用するＨＢＶ遺伝子型Ｃのコンセンサス配列である部分；（６）配列番号１０９の６３０〜６８９位で表わされるＨＢＶ  Ｘ抗原の最適化された部分であって、上記に議論された設計方策を利用するＨＢＶ遺伝子型Ｃのコンセンサス配列である部分；および（７）任意選択のヘキサヒスチジンタグ、を備えた単一ポリペプチドである。この完全型融合タンパク質を発現する、酵母系免疫療法組成物は、本明細書中ではＧＩ‐１３０１２とも呼ばれる。該融合タンパク質および対応する酵母系免疫療法薬は、本明細書中において「ＳＰＥＸｖ２‐Ｃ」または「Ｓｐｅｘ‐Ｃ」と呼ばれることもある。
【０３６０】
ＨＢＶ遺伝子型Ｄのコンセンサス配列に基づく第４の構築物は、以下のように設計された。融合セグメントの大きさを（完全長と比較して）縮小し、表５に特定されたものに相当する既知のＴ細胞エピトープを最大限含め（上記に議論されたような優先度）、かつ、人為的結合部を最小限とするように設計された、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９および配列番号１００を使用して、新たな融合セグメントがＨＢＶ遺伝子型Ｄのコンセンサス配列に基づいて作出された。新たな表面抗原セグメントは配列番号１１０の１〜２４９位で表わされる。新たなポリメラーゼ（ＲＴ）セグメントは配列番号１１０の２５０〜４７７位で表わされる。新たなコアセグメントは配列番号１１０の４７８〜６２９位で表わされる。新たなＸ抗原セグメントは配列番号１１０の６３０〜６８９位で表わされる。この融合タンパク質は、配列番号１１０で表わされる、Ｎ末端からＣ末端までインフレームで融合された以下の配列要素（「任意選択」として表示される非ＨＢＶ配列は配列番号１１０の基本配列には含まれなかったが、実際には本実施例に記載される融合タンパク質に付加された）：（１）配列番号３７で表わされる、プロテアソーム分解に対する抵抗性を付与し、かつ発現を安定させるように設計された合成Ｎ末端ペプチドである任意選択のＮ末端ペプチド；（２）任意選択のＴｈｒ‐Ｓｅｒリンカーペプチド；（３）配列番号１１０の１〜２４９位で表わされるＨＢＶ大型（Ｌ）表面抗原の最適化された部分であって、上記に議論された設計方策を利用するＨＢＶ遺伝子型Ｄのコンセンサス配列である部分；（４）配列番号１１０の２５０〜４７７位で表わされるＨＢＶポリメラーゼの逆転写酵素（ＲＴ）ドメインの最適化された部分であって、上記に議論された設計方策を利用するＨＢＶ遺伝子型Ｄのコンセンサス配列である部分；（５）配列番号１１０の４７８〜６２９位で表わされるＨＢＶコアタンパク質の最適化された部分であって、上記に議論された設計方策を利用するＨＢＶ遺伝子型Ｄのコンセンサス配列である部分；（６）配列番号１１０の６３０〜６８９位で表わされるＨＢＶ  Ｘ抗原の最適化された部分であって、上記に議論された設計方策を利用するＨＢＶ遺伝子型Ｄのコンセンサス配列である部分；および（７）任意選択のヘキサヒスチジンタグ、を備えた単一ポリペプチドである。この完全型融合タンパク質を発現する、酵母系免疫療法組成物は、本明細書中ではＧＩ‐１３０１３とも呼ばれる。配列番号３７のＮ末端ペプチドが配列番号８９のαファクター配列と置き換えられることを除いて同様の融合タンパク質（配列番号１１０を含有する）を発現する、酵母系免疫療法組成物は、本明細書中でＧＩ‐１３０１４と呼ばれる。該融合タンパク質および対応する酵母系免疫療法薬は、本明細書中において「ＳＰＥＸｖ２‐Ｄ」、「Ｓｐｅｘ‐Ｄ」、または「Ｍ‐ＳＰＥＸｖ２‐Ｄ」（ＧＩ‐１３０１３について）もしくは「ａ‐ＳＰＥＸｖ２‐Ｄ」（ＧＩ‐１３０１４について）と呼ばれることもある。
【０３６１】
酵母系免疫療法薬に使用するためのさらなるＨＢＶ融合タンパク質は、上述の融合タンパク質（配列番号１０７〜１１０）においてなされたものと同様の変更が、様々なＨＢＶ融合タンパク質において、例えばＨＢＶ表面タンパク質およびＨＢＶコアタンパク質を含有する配列番号３４で表される融合タンパク質において、どのようになされうるかを実証するために、４つのＨＢＶ遺伝子型のコンセンサス配列の適用を用いて設計された。上記さらなるＨＢＶ抗原および対応する酵母系免疫療法組成物を設計するために、配列番号３４について上述された融合タンパク質構造（ならびに、したがって上記融合タンパク質の下位部分（表面抗原およびコア））が、鋳型として使用された。上記の構築物について上述されるように、ＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、ＣおよびＤそれぞれのコンセンサス配列が複数のＨＢＶ配列供給源から構築され（例えばＳおよびコアについては、ユ（Yu）およびユエン（Yuan）ら、２０１０年）、かつ、鋳型構造物中の配列は、同じ部位に対応するコンセンサス配列に置き換えられたが、ただし、コンセンサス配列の使用が既知の急性自己限定的Ｔ細胞エピトープのうちの１つまたは既知のポリメラーゼ回避突然変異部位のうちの１つを変更した場合は除き、この場合には、上記部位は、これらのエピトープまたは突然変異部位について公開された配列に従った。
【０３６２】
ＨＢＶ遺伝子型Ａのコンセンサス配列に基づく第１の構築物は、以下のように設計された。配列番号３４を鋳型として使用して、本明細書中では配列番号１１２で表わされる新たな融合タンパク質がＨＢＶ遺伝子型Ａのコンセンサス配列に基づいて作出された。この融合タンパク質は、配列番号１１２で表わされる、Ｎ末端からＣ末端までインフレームで融合された以下の配列要素（「任意選択」として表示される非ＨＢＶ配列は配列番号１１２の基本配列には含まれないが、実際には本実施例に記載される融合タンパク質に付加された）：（１）配列番号３７で表わされる、プロテアソーム分解に対する抵抗性を付与し、かつ発現を安定させるように設計された合成Ｎ末端ペプチドである任意選択のＮ末端ペプチド；（２）任意選択のＴｈｒ‐Ｓｅｒリンカーペプチド；（３）配列番号１１２の１〜３９９位で表わされるＨＢＶ遺伝子型Ａの大型（Ｌ）表面抗原のコンセンサス配列；４）配列番号１１２の４００〜５８１位で表わされるＨＢＶ遺伝子型Ａのコア抗原のコンセンサス配列のアミノ酸配列；および（５）任意選択のヘキサヒスチジンタグ、を備えた単一ポリペプチドである。配列番号１１２を含む融合タンパク質をコードする核酸配列（酵母での発現用にコドンを最適化）は、本明細書中に配列番号１１１で表わされている。この融合タンパク質を発現する、酵母系免疫療法組成物は、本明細書中ではＧＩ‐１３００６とも呼ばれる。該融合タンパク質および対応する酵母系免疫療法薬は、本明細書中において「Ｓｃｏｒｅ‐Ａ」とも呼ばれうる。
【０３６３】
ＨＢＶ遺伝子型Ｂのコンセンサス配列に基づく第２の構築物は、以下のように設計された。配列番号３４を鋳型として使用して、本明細書中では配列番号１１４で表わされる新たな融合タンパク質がＨＢＶ遺伝子型Ｂのコンセンサス配列に基づいて作出された。この融合タンパク質は、配列番号１１４で表わされる、Ｎ末端からＣ末端までインフレームで融合された以下の配列要素（「任意選択」として表示される非ＨＢＶ配列は配列番号１１４の基本配列には含まれないが、実際には本実施例に記載される融合タンパク質に付加された）：（１）配列番号３７で表わされる、プロテアソーム分解に対する抵抗性を付与し、かつ発現を安定させるように設計された合成Ｎ末端ペプチドである任意選択のＮ末端ペプチド；（２）任意選択のＴｈｒ‐Ｓｅｒリンカーペプチド；（３）配列番号１１４の１〜３９９位で表わされるＨＢＶ遺伝子型Ｂの大型（Ｌ）表面抗原のコンセンサス配列；４）配列番号１１４の４００〜５８１位で表わされるＨＢＶ遺伝子型Ｂのコア抗原のコンセンサス配列のアミノ酸配列；および（５）任意選択のヘキサヒスチジンタグ、を備えた単一ポリペプチドである。配列番号１１４を含む融合タンパク質をコードする核酸配列（酵母での発現用にコドンを最適化）は、本明細書中に配列番号１１３で表わされている。この融合タンパク質を発現する、酵母系免疫療法組成物は、本明細書中ではＧＩ‐１３００７とも呼ばれる。該融合タンパク質および対応する酵母系免疫療法薬は、本明細書中において「Ｓｃｏｒｅ‐Ｂ」とも呼ばれうる。
【０３６４】
ＨＢＶ遺伝子型Ｃのコンセンサス配列に基づく第３の構築物は、以下のように設計された。配列番号３４を鋳型として使用して、本明細書中では配列番号１１６で表わされる新たな融合タンパク質がＨＢＶ遺伝子型Ｃのコンセンサス配列に基づいて作出された。この融合タンパク質は、配列番号１１６で表わされる、Ｎ末端からＣ末端までインフレームで融合された以下の配列要素（「任意選択」として表示される非ＨＢＶ配列は配列番号１１６の基本配列には含まれないが、実際には本実施例に記載される融合タンパク質に付加された）：（１）配列番号３７で表わされる、プロテアソーム分解に対する抵抗性を付与し、かつ発現を安定させるように設計された合成Ｎ末端ペプチドである任意選択のＮ末端ペプチド；（２）任意選択のＴｈｒ‐Ｓｅｒリンカーペプチド；（３）配列番号１１６の１〜３９９位で表わされるＨＢＶ遺伝子型Ｃの大型（Ｌ）表面抗原のコンセンサス配列；４）配列番号１１６の４００〜５８１位で表わされるＨＢＶ遺伝子型Ｃのコア抗原のコンセンサス配列のアミノ酸配列；および（５）任意選択のヘキサヒスチジンタグ、を備えた単一ポリペプチドである。配列番号１１６を含む融合タンパク質をコードする核酸配列（酵母での発現用にコドンを最適化）は、本明細書中に配列番号１１５で表わされている。この融合タンパク質を発現する、酵母系免疫療法組成物は、本明細書中ではＧＩ‐１３００８とも呼ばれる。該融合タンパク質および対応する酵母系免疫療法薬は、本明細書中において「Ｓｃｏｒｅ‐Ｃ」とも呼ばれうる。
【０３６５】
ＨＢＶ遺伝子型Ｄのコンセンサス配列に基づく第４の構築物は、以下のように設計された。配列番号３４を鋳型として使用して、本明細書中では配列番号１１８で表わされる新たな融合タンパク質がＨＢＶ遺伝子型Ｄのコンセンサス配列に基づいて作出された。この融合タンパク質は、配列番号１１８で表わされる、Ｎ末端からＣ末端までインフレームで融合された以下の配列要素（「任意選択」として表示される非ＨＢＶ配列は配列番号１１８の基本配列には含まれないが、実際には本実施例に記載される融合タンパク質に付加された）：（１）配列番号３７で表わされる、プロテアソーム分解に対する抵抗性を付与し、かつ発現を安定させるように設計された合成Ｎ末端ペプチドである任意選択のＮ末端ペプチド；（２）任意選択のＴｈｒ‐Ｓｅｒリンカーペプチド；（３）配列番号１１８の１〜３９９位で表わされるＨＢＶ遺伝子型Ｄの大型（Ｌ）表面抗原のコンセンサス配列；４）配列番号１１８の４００〜５８１位で表わされるＨＢＶ遺伝子型Ｄのコア抗原のコンセンサス配列のアミノ酸配列；および（５）任意選択のヘキサヒスチジンタグ、を備えた単一ポリペプチドである。配列番号１１８ならびにＮ末端およびＣ末端のペプチドならびにリンカーペプチドを含む完全型融合タンパク質のアミノ酸配列は、本明細書中において配列番号１５１で表わされる。配列番号１１８または配列番号１５１を含む融合タンパク質をコードする核酸配列（酵母での発現用にコドンを最適化）は、配列番号１１７によって本明細書中に表わされている。この融合タンパク質を発現する、酵母系免疫療法組成物は、本明細書中ではＧＩ‐１３００９とも呼ばれる。該融合タンパク質および対応する酵母系免疫療法薬は、本明細書中において「Ｓｃｏｒｅ‐Ｄ」とも呼ばれうる。
【０３６６】
ＧＩ‐１３０１０（配列番号１０７を含む）、ＧＩ‐１３０１１（配列番号１０８を含む）、ＧＩ‐１３０１２（配列番号１０９を含む）、ＧＩ‐１３０１３（配列番号１１０を含む）、ＧＩ‐１３００６（配列番号１１２を含む）、ＧＩ‐１３００７（配列番号１１４を含む）、ＧＩ‐１３００８（配列番号１１６を含む）およびＧＩ‐１３００９（配列番号１１８を含む）の酵母系免疫療法組成物が、上記に他の組成物について説明したように製造された。簡潔に述べると、融合タンパク質をコードするＤＮＡは、酵母での発現用にコドンを最適化され、次いで酵母２ｕｍ発現ベクター内でＣＵＰ１プロモーター（ｐＧＩ‐１００）の後ろにに挿入された。得られたプラスミドは、酢酸リチウム／ポリエチレングリコールトランスフェクションにより酵母サッカロマイセス・セレビシエＷ３０３αに導入された。各プラスミドの酵母形質転換体はウラシルを欠く固体の最少プレート培地（ＵＤＭ；ウリジン欠落培地）で単離された。コロニーは、ＵＬＤＭ（ウリジンおよびロイシン欠落培地）に再度画線播種され、３０℃で３日間増殖させた。ウリジンおよびロイシンを欠くスタータ培養液（ＵＬ２；調合は実施例１に提示）にプレートから接種が行われ、スタータ培養物は３０℃、２５０ｒｐｍで１８時間増殖させた。初代培養物はＵＬ２の最終培養物に接種するために使用され、密度２ＹＵ／ｍＬに到達するまで増殖が継続された。培養物を０．５ｍＭ硫酸銅で３時間誘導し、次いで細胞はＰＢＳで洗浄され、５６℃で１時間加熱殺処理され、ＰＢＳで３回洗浄された。全タンパク質含量はＴＣＡ沈澱反応／ニトロセルロース結合アッセイで測定され、ＨＢＶ抗原発現は抗ｈｉｓタグモノクローナル抗体を使用したウエスタンブロット法で測定された。
【０３６７】
結果は図２０に示されている。図２０に示されたブロットのレーンは、次の酵母系免疫療法薬：レーン１（ｖ１．０；Ｓｃｏｒｅ）＝ＧＩ‐１３００２（配列番号３４を発現）；レーン２（ｖ２．０；ＳｃＡ）＝ＧＩ‐１３００６（配列番号１１２を発現）；レーン３（ｖ２．０；ＳｃＢ）＝ＧＩ‐１３００７（配列番号１１４を発現）；レーン４（ｖ２．０；ＳｃＣ）＝ＧＩ‐１３００８（配列番号１１６を発現）；レーン５（ｖ２．０；ＳｃＤ）＝ＧＩ‐１３００９（配列番号１１８を発現）；レーン６（ｖ１．０；Ｓｐ）＝ＧＩ‐１３００５（配列番号３６を発現）；レーン７（ｖ１．０；ａ‐Ｓｐ）＝ＧＩ‐１３００４（配列番号９２を発現）；レーン８（ｖ２．０；ＳｐＡ）＝ＧＩ‐１３０１０（配列番号１０７を発現）；レーン９（ｖ２．０；ＳｐＢ）＝ＧＩ‐１３０１１（配列番号１０８を発現）；レーン１０（ｖ２．０；ＳｐＣ）＝ＧＩ‐１３０１２（配列番号１０９を発現）；レーン１１（ｖ２．０；ＳｐＤ）＝ＧＩ‐１３０１３（配列番号１１０を発現）、に由来するタンパク質を含有する。
【０３６８】
結果は、表面抗原およびコアの組み合わせを含むそれぞれのＨＢＶ抗原（「Ｓｃｏｒｅ」抗原）、すなわちＧＩ‐１３００２（Ｓｃｏｒｅ）、ＧＩ‐１３００６（ＳｃＡ；Ｓｃｏｒｅ‐Ａ）、ＧＩ‐１３００７（ＳｃＢ；Ｓｃｏｒｅ‐Ｂ）、ＧＩ‐１３００８（ＳｃＣ；Ｓｃｏｒｅ‐Ｃ）、ＧＩ‐１３００９（ＳｃＤ；Ｓｃｏｒｅ‐Ｄ）が酵母において着実に発現したことを示している。上記および同様の実験における典型的なＳｃｏｒｅ  ｖ２．０発現レベルは、およそ９０〜１４０ｐｍｏｌ／ＹＵ（すなわち５９４０ｎｇ／ＹＵ〜９２４０ｎｇ／ＹＵ）の範囲であった。４つのＨＢＶタンパク質すべてを含むＨＢＶ抗原（表面、ポリメラーゼ、コアおよびＸ、すなわち「Ｓｐｅｘ」）の発現レベルは変動的であった。具体的には、ＧＩ‐１３０１０（ＳｐＡ；Ｓｐｅｘ‐Ａ）、ＧＩ‐１３０１１（ＳｐＢ；Ｓｐｅｘ‐Ｂ）、ＧＩ‐１３０１２（ＳｐＣ；Ｓｐｅｘ‐Ｄ）およびＧＩ‐１３０１３（ＳｐＤ；Ｓｐｅｘ‐Ｄ）からの抗原の発現は、「Ｓｃｏｒｅ」抗原、ならびにＧＩ‐１３００５（Ｓｐ；Ｓｐｅｘ）およびＧＩ‐１３００４（ａ‐Ｓｐ；ａ‐Ｓｐｅｘ）由来の抗原の発現よりもかなり低かった。ＧＩ‐１３０１２（ＳｐＣ；Ｓｐｅｘ‐Ｃ）における抗原の発現はかろうじて検出可能であった。総合すると、これらの結果から、群としては、表面抗原およびコアを含むＨＢＶ抗原は酵母において非常に良好に発現する一方、表面抗原、ポリメラーゼ、コアおよびＸすべてを含むＨＢＶ抗原は酵母における発現が変動的であり、概して「Ｓｃｏｒｅ」抗原ほど良好には発現しない。
【０３６９】
実施例８
以下の実施例は、ＨＢＶ遺伝子型のコンセンサス配列を使用し、かつ加えて、酵母におけるＨＢＶ抗原の発現の改変または改善、および該ＨＢＶ抗原の免疫原性または他の機能的属性の改善または改変、のうち少なくともいずれかを行うために、融合タンパク質内におけるＨＢＶタンパク質セグメントの代替構成／代替配置の使用を実証する、さらなる酵母系ＨＢＶ免疫療法組成物の製造について述べる。
【０３７０】
本実施例では、表面抗原がコアに融合された組み合わせのＮ末端またはＣ末端に、Ｘ抗原およびポリメラーゼ抗原のうち少なくとも一方を追加する、新たな融合タンパク質が設計された。これらの構築物は、一部には、本明細書中において通常「Ｓｃｏｒｅ」と呼ばれる構成に配置された融合タンパク質（例えば配列番号３４、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６および配列番号１１８）は酵母において非常に良好に発現するので、この基本構成（すなわち表面抗原がコアタンパク質に融合されたもの）を利用して、追加のＨＢＶタンパク質成分を含むＨＢＶ抗原を製造すると有利である可能性がある、という論理的根拠に基づいて設計された。そのような方策により、多重タンパク質抗原の発現の改善、および、免疫療法に関連したそのような抗原の機能性の改善または改変、のうち少なくともいずれかがなされる可能性がある。例えば、理論によって束縛されるものではないが、本発明者らは、３個または４個全てのＨＢＶタンパク質を使用するＨＢＶ抗原の発現が、基本要素として表面‐コア（順番通り）を使用し、次にこの構築物に他の抗原を追加して融合タンパク質を構築することにより改善される可能性も考えられることを提示した。
【０３７１】
従って、本発明のこの実施形態を例証するために、８種の新たな融合タンパク質が設計および構築され、これらのタンパク質を発現する酵母系免疫療法産物が製造された。各事例において、該融合タンパク質は、配列番号１１８で表わされる融合タンパク質のセグメントに由来する表面‐コア融合タンパク質であって、ＨＢＶ遺伝子型Ｄのコンセンサス配列を利用し、かつ保存された免疫学的エピトープを最大限使用するように最適化された、実施例７に記載された表面‐コア融合タンパク質を基本要素として使用した。この基本構成に、ポリメラーゼセグメントおよびＸ抗原セグメントのうち少なくとも一方の全ての可能な配置が、配列番号１１０で表わされる融合タンパク質（タンパク質セグメントの大きさを縮小し、保存された免疫学的エピトープを最大限使用し、かつＨＢＶ遺伝子型Ｄのコンセンサス配列を利用するために構築された実施例７に記載された多重タンパク質ＨＢＶ融合タンパク質である）に由来するセグメントを利用して追加された。得られたこれら８種の抗原はＨＢＶ遺伝子型Ｄのコンセンサス配列に基づいているが、配列番号１０７および配列番号１１２のうち少なくとも一方（遺伝子型Ａ）、配列番号１０８および配列番号１１４のうち少なくとも一方（遺伝子型Ｂ）、配列番号１０９および配列番号１１６のうち少なくとも一方（遺伝子型Ｃ）で表わされる融合タンパク質由来の対応する融合セグメントを使用して、または、異なるＨＢＶ遺伝子型、遺伝子亜型、コンセンサス配列もしくは株に由来する対応する配列を使用して、同様の全体構造を有する融合タンパク質を製造することは容易であろう。
【０３７２】
第１の組成物を製造するために、酵母（例えばサッカロマイセス・セレビシエ）は、銅誘導プロモーターＣＵＰ１の制御下で図８に概略的に示される新たなＨＢＶ融合タンパク質を発現するように、遺伝子組換え処理された。得られた酵母‐ＨＢＶ免疫療法組成物は本明細書中ではＧＩ‐１３０１５と呼ばれうる。本明細書中では「Ｓｃｏｒｅ‐Ｐｏｌ」とも呼ばれ、かつ配列番号１２０で表わされるこの融合タンパク質は、順に、表面抗原、コアタンパク質、およびポリメラーゼの配列を、Ｎ末端からＣ末端までインフレームで融合された以下の配列要素（「任意選択」として表示される非ＨＢＶ配列は配列番号１２０の基本配列に含まれなかったが、実際には本実施例に記載される融合タンパク質に付加された）：（１）配列番号３７で表わされる、プロテアソーム分解に対する抵抗性を付与し、かつ発現を安定させるように設計された合成Ｎ末端ペプチドである任意選択のＮ末端ペプチド；（２）任意選択のＴｈｒ‐Ｓｅｒリンカーペプチド；（３）配列番号１２０の１〜３９９位（配列番号１１８の１〜３９９位に相当）で表わされる、ＨＢＶ遺伝子型Ｄの大型（Ｌ）表面抗原のほぼ完全長の（１位を差し引いた）コンセンサス配列のアミノ酸配列；（４）配列番号１２０の４００〜５８１位で表わされる、ＨＢＶ遺伝子型Ｄのコア抗原のコンセンサス配列のアミノ酸配列（配列番号１１８の４００〜５８１位に相当）；（５）配列番号１２０の５８２〜８０９位で表わされる、ＨＢＶ遺伝子型Ｄのコンセンサス配列を使用するＨＢＶポリメラーゼの逆転写酵素（ＲＴ）ドメインの最適化された部分（配列番号１１０の２５０〜４７７位に相当）；および（６）任意選択のヘキサヒスチジンタグ、を備えた単一ポリペプチドとして含む。配列番号１２０は、表５に見ることができる多数のＴ細胞エピトープ（ヒトおよびネズミ科動物）を含有する。配列番号１２０の融合タンパク質をコードする核酸配列（酵母での発現用にコドンを最適化）は、本明細書中に配列番号１１９で表わされている。
【０３７３】
第２の組成物を製造するために、酵母（例えばサッカロマイセス・セレビシエ）は、銅誘導プロモーターＣＵＰ１の制御下で図９に概略的に示される新たなＨＢＶ融合タンパク質を発現するように、遺伝子組換え処理された。得られた酵母‐ＨＢＶ免疫療法組成物は本明細書中ではＧＩ‐１３０１６と呼ばれうる。本明細書中では「Ｓｃｏｒｅ‐Ｘ」とも呼ばれ、かつ配列番号１２２で表わされるこの融合タンパク質は、順に、表面抗原、コア、およびＸ抗原の配列を、Ｎ末端からＣ末端までインフレームで融合された以下の配列要素（「任意選択」として表示される非ＨＢＶ配列は配列番号１２２の基本配列に含まれなかったが、実際には本実施例に記載される融合タンパク質に付加された）：（１）配列番号３７で表わされる、プロテアソーム分解に対する抵抗性を付与し、かつ発現を安定させるように設計された合成Ｎ末端ペプチドである任意選択のＮ末端ペプチド；（２）任意選択のＴｈｒ‐Ｓｅｒリンカーペプチド；（３）配列番号１２２の１〜３９９位で表わされる、ＨＢＶ遺伝子型Ｄの大型（Ｌ）表面抗原のほぼ完全長の（１位を差し引いた）コンセンサス配列のアミノ酸配列（配列番号１１８の１〜３９９位に相当）；４）配列番号１２２の４００〜５８１位で表わされる、ＨＢＶ遺伝子型Ｄのコア抗原のコンセンサス配列のアミノ酸配列（配列番号１１８の４００〜５８１位に相当）；（５）配列番号１２２の５８２〜６４１位で表わされる、ＨＢＶ遺伝子型Ｄのコンセンサス配列を使用するＨＢＶ  Ｘ抗原の最適化された部分（配列番号１１０の６３０〜６８９位に相当）；および（６）任意選択のヘキサヒスチジンタグ、を備えた単一ポリペプチドとして含む。配列番号１２２は、表５に見ることができる多数のＴ細胞エピトープ（ヒトおよびネズミ科動物）を含有する。配列番号１２２を含む融合タンパク質をコードする核酸配列（酵母での発現用にコドンを最適化）は、本明細書中に配列番号１２１で表わされている。
【０３７４】
第３の組成物を製造するために、酵母（例えばサッカロマイセス・セレビシエ）は、銅誘導プロモーターＣＵＰ１の制御下で図１０に概略的に示される新たなＨＢＶ融合タンパク質を発現するように、遺伝子組換え処理された。得られた酵母‐ＨＢＶ免疫療法組成物は本明細書中ではＧＩ‐１３０１７と呼ばれうる。本明細書中では「Ｓｃｏｒｅ‐Ｐｏｌ‐Ｘ」とも呼ばれ、かつ配列番号１２４で表わされるこの融合タンパク質は、順に、表面抗原、コア、ポリメラーゼおよびＸ抗原の配列を、Ｎ末端からＣ末端までインフレームで融合された以下の配列要素（「任意選択」として表示される非ＨＢＶ配列は配列番号１２４の基本配列に含まれなかったが、実際には本実施例に記載される融合タンパク質に付加された）：（１）配列番号３７で表わされる、プロテアソーム分解に対する抵抗性を付与し、かつ発現を安定させるように設計された合成Ｎ末端ペプチドである任意選択のＮ末端ペプチド；（２）任意選択のＴｈｒ‐Ｓｅｒリンカーペプチド；（３）配列番号１２４の１〜３９９位で表わされる、ＨＢＶ遺伝子型Ｄの大型（Ｌ）表面抗原のほぼ完全長の（１位を差し引いた）コンセンサス配列のアミノ酸配列（配列番号１１８の１〜３９９位に相当）；４）配列番号１２４の４００〜５８１位で表わされる、ＨＢＶ遺伝子型Ｄのコア抗原のコンセンサス配列のアミノ酸配列（配列番号１１８の４００〜５８１位に相当）；（５）配列番号１２４の５８２〜８０９位で表わされる、ＨＢＶ遺伝子型Ｄのコンセンサス配列を使用するＨＢＶポリメラーゼの逆転写酵素（ＲＴ）ドメインの最適化された部分（配列番号１１０の２５０〜４７７位に相当）；（６）配列番号１２４の８１０〜８６９位で表わされる、ＨＢＶ遺伝子型Ｄのコンセンサス配列を使用するＨＢＶ  Ｘ抗原の最適化された部分（配列番号１１０の６３０〜６８９位に相当）；および（７）任意選択のヘキサヒスチジンタグ、を備えた単一ポリペプチドとして含む。配列番号１２４は、表５に見ることができる多数のＴ細胞エピトープ（ヒトおよびネズミ科動物）を含有する。配列番号１２４を含む融合タンパク質をコードする核酸配列（酵母での発現用にコドンを最適化）は、本明細書中に配列番号１２３で表わされている。
【０３７５】
第４の組成物を製造するために、酵母（例えばサッカロマイセス・セレビシエ）は、銅誘導プロモーターＣＵＰ１の制御下で図１１に概略的に示される新たなＨＢＶ融合タンパク質を発現するように、遺伝子組換え処理された。得られた酵母‐ＨＢＶ免疫療法組成物は本明細書中ではＧＩ‐１３０１８と呼ばれうる。本明細書中では「Ｓｃｏｒｅ‐Ｘ‐Ｐｏｌ」とも呼ばれ、かつ配列番号１２６で表わされるこの融合タンパク質は、順に、表面抗原、コア、Ｘ抗原、およびポリメラーゼの配列を、Ｎ末端からＣ末端までインフレームで融合された以下の配列要素（「任意選択」として表示される非ＨＢＶ配列は配列番号１２６の基本配列に含まれなかったが、実際には本実施例に記載される融合タンパク質に付加された）：（１）配列番号３７で表わされる、プロテアソーム分解に対する抵抗性を付与し、かつ発現を安定させるように設計された合成Ｎ末端ペプチドである任意選択のＮ末端ペプチド；（２）任意選択のＴｈｒ‐Ｓｅｒリンカーペプチド；（３）配列番号１２６の１〜３９９位で表わされる、ＨＢＶ遺伝子型Ｄの大型（Ｌ）表面抗原のほぼ完全長の（１位を差し引いた）コンセンサス配列のアミノ酸配列（配列番号１１８の１〜３９９位に相当）；４）配列番号１２６の４００〜５８１位で表わされる、ＨＢＶ遺伝子型Ｄのコア抗原のコンセンサス配列のアミノ酸配列（配列番号１１８の４００〜５８１位に相当）；（５）配列番号１２６の５８２〜６４１位で表わされる、ＨＢＶ遺伝子型Ｄのコンセンサス配列を使用するＨＢＶ  Ｘ抗原の最適化された部分（配列番号１１０の６３０〜６８９位に相当）；（５）配列番号１２６の６４２〜８６９位で表わされる、ＨＢＶ遺伝子型Ｄのコンセンサス配列を使用するＨＢＶポリメラーゼの逆転写酵素（ＲＴ）ドメインの最適化された部分（配列番号１１０の２５０〜４７７位に相当）；および（７）任意選択のヘキサヒスチジンタグ、を備えた単一ポリペプチドとして含む。配列番号１２６は、表５に見ることができる多数のＴ細胞エピトープ（ヒトおよびネズミ科動物）を含有する。配列番号１２６を含む融合タンパク質をコードする核酸配列（酵母での発現用にコドンを最適化）は、本明細書中に配列番号１２５で表わされている。
【０３７６】
第５の組成物を製造するために、酵母（例えばサッカロマイセス・セレビシエ）は、銅誘導プロモーターＣＵＰ１の制御下で図１２に概略的に示される新たなＨＢＶ融合タンパク質を発現するように、遺伝子組換え処理された。得られた酵母‐ＨＢＶ免疫療法組成物は本明細書中ではＧＩ‐１３０１９と呼ばれうる。本明細書中では「Ｐｏｌ‐Ｓｃｏｒｅ」とも呼ばれ、かつ配列番号１２８で表わされるこの融合タンパク質は、順に、ポリメラーゼ、表面抗原、およびコアの配列を、Ｎ末端からＣ末端までインフレームで融合された以下の配列要素（「任意選択」として表示される非ＨＢＶ配列は、ここで例示される構築物中のポリメラーゼセグメントと表面抗原セグメントとの間のＬｅｕ‐Ｇｌｕリンカーを例外として配列番号１２８の基本配列に含まれなかったが、実際には本実施例に記載される融合タンパク質に付加された）：（１）配列番号３７で表わされる、プロテアソーム分解に対する抵抗性を付与し、かつ発現を安定させるように設計された合成Ｎ末端ペプチドである任意選択のＮ末端ペプチド；（２）任意選択のＴｈｒ‐Ｓｅｒリンカーペプチド；（３）配列番号１２０の１〜２２８位で表わされる、ＨＢＶ遺伝子型Ｄのコンセンサス配列を使用するＨＢＶポリメラーゼの逆転写酵素（ＲＴ）ドメインの最適化された部分（配列番号１１０の２５０〜４７７位に相当）；（４）配列番号１２８の２２９〜２３０位で表わされるＬｅｕ‐Ｇｌｕのリンカーペプチド（任意選択）；（５）配列番号１２８の２３１〜６２９位で表わされる、ＨＢＶ遺伝子型Ｄの大型（Ｌ）表面抗原のほぼ完全長の（１位を差し引いた）コンセンサス配列のアミノ酸配列（配列番号１１８の１〜３９９位に相当）；（６）配列番号１２８の６３０〜８１１位で表わされる、ＨＢＶ遺伝子型Ｄのコア抗原のコンセンサス配列のアミノ酸配列（配列番号１１８の４００〜５８１位に相当）；および（７）任意選択のヘキサヒスチジンタグ、を備えた単一ポリペプチドとして含む。配列番号１２８は、表５に見ることができる多数のＴ細胞エピトープ（ヒトおよびネズミ科動物）を含有する。配列番号１２８を含む融合タンパク質をコードする核酸配列（酵母での発現用にコドンを最適化）は、本明細書中に配列番号１２７で表わされている。
【０３７７】
第６の組成物を製造するために、酵母（例えばサッカロマイセス・セレビシエ）は、銅誘導プロモーターＣＵＰ１の制御下で図１３に概略的に示される新たなＨＢＶ融合タンパク質を発現するように、遺伝子組換え処理された。得られた酵母‐ＨＢＶ免疫療法組成物は本明細書中ではＧＩ‐１３０２０と呼ばれうる。本明細書中では「Ｘ‐Ｓｃｏｒｅ」とも呼ばれ、かつ配列番号１３０で表わされるこの融合タンパク質は、順に、Ｘ抗原、表面抗原、およびコアの配列を、Ｎ末端からＣ末端までインフレームで融合された以下の配列要素（「任意選択」として表示される非ＨＢＶ配列は、ここで例示される構築物中のＸセグメントと表面抗原セグメントとの間のＬｅｕ‐Ｇｌｕリンカーを例外として配列番号１３０の基本配列に含まれなかったが、実際には本実施例に記載される融合タンパク質に付加された）：（１）配列番号３７で表わされる、プロテアソーム分解に対する抵抗性を付与し、かつ発現を安定させるように設計された合成Ｎ末端ペプチドである任意選択のＮ末端ペプチド；（２）任意選択のＴｈｒ‐Ｓｅｒリンカーペプチド；（３）配列番号１３０の１〜６０位で表わされる、ＨＢＶ遺伝子型Ｄのコンセンサス配列を使用するＨＢＶ  Ｘ抗原の最適化された部分（配列番号１１０の６３０〜６８９位に相当）；（４）配列番号１３０の６１〜６２位で表わされるＬｅｕ‐Ｇｌｕのリンカーペプチド（任意選択）；（５）配列番号１３０の６３〜４６１位で表わされる、ＨＢＶ遺伝子型Ｄの大型（Ｌ）表面抗原のほぼ完全長の（１位を差し引いた）コンセンサス配列のアミノ酸配列（配列番号１１８の１〜３９９位に相当）；（６）配列番号１３０の４６２〜６４３位で表わされる、ＨＢＶ遺伝子型Ｄのコア抗原のコンセンサス配列のアミノ酸配列（配列番号１１８の４００〜５８１位に相当）；および（７）任意選択のヘキサヒスチジンタグ、を備えた単一ポリペプチドとして含む。配列番号１３０は、表５に見ることができる多数のＴ細胞エピトープ（ヒトおよびネズミ科動物）を含有する。配列番号１３０ならびにＮ末端およびＣ末端のペプチドおよびリンカーを含む完全型融合タンパク質のアミノ酸配列は、本明細書中において配列番号１５０で表わされる。配列番号１３０または配列番号１５０を含む融合タンパク質をコードする核酸配列（酵母での発現用にコドンを最適化）は、本明細書中に配列番号１２９で表わされている。
【０３７８】
第７の組成物を製造するために、酵母（例えばサッカロマイセス・セレビシエ）は、銅誘導プロモーターＣＵＰ１の制御下で図１４に概略的に示される新たなＨＢＶ融合タンパク質を発現するように、遺伝子組換え処理された。得られた酵母‐ＨＢＶ免疫療法組成物は本明細書中ではＧＩ‐１３０２１と呼ばれうる。本明細書中では「Ｐｏｌ‐Ｘ‐Ｓｃｏｒｅ」とも呼ばれ、かつ配列番号１３２で表わされるこの融合タンパク質は、順に、ポリメラーゼ、Ｘ抗原、表面抗原、およびコアの配列を、Ｎ末端からＣ末端までインフレームで融合された以下の配列要素（「任意選択」として表示される非ＨＢＶ配列は配列番号１３２の基本配列に含まれなかったが、実際には本実施例に記載される融合タンパク質に付加された）：（１）配列番号３７で表わされる、プロテアソーム分解に対する抵抗性を付与し、かつ発現を安定させるように設計された合成Ｎ末端ペプチドである任意選択のＮ末端ペプチド；（２）任意選択のＴｈｒ‐Ｓｅｒリンカーペプチド；（３）配列番号１３２の１〜２２８位で表わされる、ＨＢＶ遺伝子型Ｄのコンセンサス配列を使用するＨＢＶポリメラーゼの逆転写酵素（ＲＴ）ドメインの最適化された部分（配列番号１１０の２５０〜４７７位に相当）；（４）配列番号１３２の２２９〜２８８位で表わされる、ＨＢＶ遺伝子型Ｄのコンセンサス配列を使用するＨＢＶ  Ｘ抗原の最適化された部分（配列番号１１０の６３０〜６８９位に相当）；（５）配列番号１３２の２８９〜６８７位で表わされる、ＨＢＶ遺伝子型Ｄの大型（Ｌ）表面抗原のほぼ完全長の（１位を差し引いた）コンセンサス配列のアミノ酸配列（配列番号１１８の１〜３９９位に相当）；（６）配列番号１３２の６８８〜８６９位で表わされる、ＨＢＶ遺伝子型Ｄのコア抗原のコンセンサス配列のアミノ酸配列（配列番号１１８の４００〜５８１位に相当）；および（７）任意選択のヘキサヒスチジンタグ、を備えた単一ポリペプチドとして含む。配列番号１３２は、表５に見ることができる多数のＴ細胞エピトープ（ヒトおよびネズミ科動物）を含有する。配列番号１３２を含む融合タンパク質をコードする核酸配列（酵母での発現用にコドンを最適化）は、本明細書中に配列番号１３１で表わされている。
【０３７９】
第８の組成物を製造するために、酵母（例えばサッカロマイセス・セレビシエ）は、銅誘導プロモーターＣＵＰ１の制御下で図１５に概略的に示される新たなＨＢＶ融合タンパク質を発現するように、遺伝子組換え処理された。得られた酵母‐ＨＢＶ免疫療法組成物は本明細書中ではＧＩ‐１３０２２と呼ばれうる。本明細書中では「Ｘ‐Ｐｏｌ‐Ｓｃｏｒｅ」とも呼ばれ、また配列番号１３４で表わされるこの融合タンパク質は、順に、Ｘ抗原、ポリメラーゼ、表面抗原、およびコアタンパク質を、Ｎ末端からＣ末端までインフレームで融合された以下の配列要素（「任意選択」として表示される非ＨＢＶ配列は配列番号１３４の基本配列に含まれなかったが、実際には本実施例に記載される融合タンパク質に付加された）：（１）配列番号３７で表わされる、プロテアソーム分解に対する抵抗性を付与し、かつ発現を安定させるように設計された合成Ｎ末端ペプチドである任意選択のＮ末端ペプチド；（２）任意選択のＴｈｒ‐Ｓｅｒリンカーペプチド；（３）配列番号１３４の１〜６０位で表わされる、ＨＢＶ遺伝子型Ｄのコンセンサス配列を使用するＨＢＶ  Ｘ抗原の最適化された部分（配列番号１１０の６３０〜６８９位に相当）；（４）配列番号１３４の６１〜２８８位で表わされる、ＨＢＶ遺伝子型Ｄのコンセンサス配列を使用するＨＢＶポリメラーゼの逆転写酵素（ＲＴ）ドメインの最適化された部分（配列番号１１０の２５０〜４７７位に相当）；（５）配列番号１３４の２８９〜６８７位で表わされる、ＨＢＶ遺伝子型Ｄの大型（Ｌ）表面抗原のほぼ完全長の（１位を差し引いた）コンセンサス配列のアミノ酸配列（配列番号１１８の１〜３９９位に相当）；（６）配列番号１３４の６８８〜８６９位で表わされる、ＨＢＶ遺伝子型Ｄのコア抗原のコンセンサス配列のアミノ酸配列（配列番号１１８の４００〜５８１位に相当）；および（７）任意選択のヘキサヒスチジンタグ、を備えた単一ポリペプチドとして含む。配列番号１３４は、表５に見ることができる多数のＴ細胞エピトープ（ヒトおよびネズミ科動物）を含有する。配列番号１３４を含む融合タンパク質をコードする核酸配列（酵母での発現用にコドンを最適化）は、本明細書中に配列番号１３３で表わされている。
【０３８０】
上述の各々の酵母系免疫療法組成物を製造するために、各プラスミドの酵母形質転換体がウラシルを欠く固体の最少プレート培地（ＵＤＭ；ウリジン欠落培地）で単離された。コロニーは、ＵＬＤＭプレートおよびＵＤＭプレート上に再度画線播種され、３０℃で３日間増殖させた。ウリジンおよびロイシンを欠く（ＵＬ２）、またはウリジンを欠く（Ｕ２）スタータ培養液にプレートから接種が行われ、スタータ培養物は３０℃、２５０ｒｐｍで１８時間増殖させた。初代培養物はＵ２またはＵＬ２の中間培養物に接種するために使用され、密度およそ２ＹＵ／ｍＬに到達するまで増殖が継続された。中間培養物は密度０．０５ＹＵ／ｍＬとなるように最終培養物に接種するために使用され、最終培養物は細胞密度が１〜３ＹＵ／ｍＬに達するまでインキュベートされた。次いで最終培養物を０．５ｍＭ硫酸銅で３時間誘導し、細胞はＰＢＳ中で洗浄され、５６℃で１時間加熱殺処理され、ＰＢＳ中で３回洗浄された。全タンパク質含量はＴＣＡ沈澱反応／ニトロセルロース結合アッセイを用いて測定され、ＨＢＶ抗原発現は抗ｈｉｓタグモノクローナル抗体を使用したウエスタンブロット法で測定された。ＧＩ‐１３００８（配列番号１１６；「Ｓｃｏｒｅ‐Ｃ」）またはＧＩ‐１３００９（配列番号１１８；「Ｓｃｏｒｅ‐Ｄ」）として実施例７に記載された２つの酵母免疫療法組成物からの溶解産物が、基本の表面‐コア抗原産物を発現する酵母との比較の基準として使用された。
【０３８１】
図２１は、ＵＬ２培地中で培養された酵母における全８種の構築物の発現を、実施例７にＧＩ‐１３００９（配列番号１１８；「Ｓｃｏｒｅ‐Ｄ」）として記載された酵母免疫療法薬中の構築物の発現と比較して示すブロット（１μｇのタンパク質をローディング）である。図２１を参照すると、レーン１および２は分子量マーカーを含み、レーン４〜６は、これらのレーンから生成される標準曲線からの内挿法によって抗原を定量するために同じブロット上で処理された組換えヘキサヒスチジンタグ付きＮＳ３タンパク質を含む。レーン７〜１４は、ＵＬ２培地で増殖させた、番号（例えばＧＩ‐１３０１５）で表示されるそれぞれの酵母系免疫療法薬に由来する溶解産物を含み、レーン１５は、ＧＩ‐１３００９比較物からの溶解産物を含む。Ｕ２培地で培養された酵母由来のさらなるウエスタンブロット、およびゲル上への様々な量のタンパク質のローディングを評価する追加のブロットはここでは示さないが、全体として、結果から、８種の抗原全てが少なくとも１つの増殖培地において検出可能なレベルで発現されることが示された。
【０３８２】
全体的な発現結果は、Ｕ２またはＵＬ２培地において標的抗原の検出可能な発現をなした培養物についての、ＧＩ‐１３００８（Ｓｃｏｒｅ‐Ｃ）およびＧＩ‐１３００９（Ｓｃｏｒｅ‐Ｄ）における抗原の発現と比較した棒グラフとして、図２２にまとめられている。図２２を参照すると、ＨＢＶ抗原は、上記に各構築物について記載されたような融合タンパク質中の抗原の配置を指す表現を、該抗原を発現した対応する酵母の培養に使用された培地と共に使用して、それぞれの棒の下に表示されている（すなわち、「Ｐｏｌ‐Ｓｃｏｒｅ‐Ｕ２」は、配列番号１２８で表わされ、かつＵ２培地中でＧＩ‐１３０１９によって発現されたポリメラーゼ‐表面‐コア融合タンパク質であるＨＢＶ抗原を指す）。結果から、「Ｘ‐Ｓｃｏｒｅ」（ＧＩ‐１３０２０によって発現される；配列番号１３０）と表示された抗原の発現が〜１２２ｐｍｏｌ／ＹＵで特に活発であり、これはモル濃度ベースでＳｃｏｒｅ‐Ｃ（ＧＩ‐１３００８）またはＳｃｏｒｅ‐Ｄ（ＧＩ‐１３００９）について得られた発現レベルのおよそ７９〜８０％であることが示された（いずれの培地も）。Ｕ２培地でＧＩ‐１３０１５（Ｓｃｏｒｅ‐Ｐｏｌ；配列番号１２０）、ＧＩ‐１３０１６（Ｓｃｏｒｅ‐Ｘ；配列番号１２２）、ＧＩ‐１３０１７（Ｓｃｏｒｅ‐Ｐｏｌ‐Ｘ；配列番号１２４）およびＧＩ‐１３０１８（Ｓｃｏｒｅ‐Ｘ‐Ｐｏｌ；配列番号１２６）によって発現された抗原の発現は、本実験における定量化レベルを下回ったが、これらの抗原はそれぞれ、同一の酵母系免疫療法薬をＵＬ２培地で増殖させた場合には発現された（図２２を参照）。概して、ポリメラーゼ逆転写酵素（ＲＴ）ドメインを含有している抗原構成は、Ｘ抗原が加わるかどうかに関わらずＳ‐ｃｏｒｅのみを含有するものよりも蓄積が低レベルであった。本実施例および先行する実施例において示されたデータを全体として解釈すると、表面‐コア（「Ｓｃｏｒｅ」または「ＳＣＯＲＥ」；すべての同様の構築物）およびＸ‐表面‐コア（「Ｘ‐Ｓｃｏｒｅ」あるいは「Ｘ‐ＳＣＯＲＥ」；ＧＩ‐１３０２０）の抗原構成は、試験された全ての酵母系ＨＢＶ免疫療法薬の中で最も高発現する抗原構成であった。
【０３８３】
実施例９
以下の実施例は、本発明の酵母系ＨＢＶ免疫療法組成物の安全性、免疫原性およびｉｎ  ｖｉｖｏにおける有効性を実証するための、マウスでの前臨床実験について説明する。
【０３８４】
前臨床試験において酵母系ＨＢＶ免疫療法組成物を評価するために、本発明の酵母系ＨＢＶ免疫療法組成物による抗原特異的リンパ球の誘導を検出する様々なｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏのアッセイ、例えばリンパ球増殖、細胞媒介性細胞傷害、サイトカイン分泌、および腫瘍接種からの保護（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏでＨＢＶタンパク質を発現するように遺伝子組換え処理された腫瘍の殺滅）などが使用された。
【０３８５】
これらの試験を支援するために、当初は実施例１および２に記載された酵母系ＨＢＶ免疫療法組成物が使用され、さらなる試験は実施例７および８または本明細書中他所に記載された酵母系ＨＢＶ免疫療法組成物を使用して行なわれた。しかしながら、これらの試験は、本発明の任意の酵母系ＨＢＶ免疫療法組成物に容易に適用可能であり、本明細書中に提供された結果から、同じ基本抗原または類似の抗原構築物を含む他のＨＢＶ組成物を推定することができる。これらの初期実験の結果は下記に説明される。
【０３８６】
任意の酵母系ＨＢＶ免疫療法組成物に適応可能な一般的なプロトコールとして、マウス（例えばメスのＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６マウスのうち少なくとも一方）に、適切な量の酵母系ＨＢＶ免疫療法組成物、例えば４〜５ＹＵが注射される（２つの異なる注射部位に２〜２．５ＹＵの注射で皮下投与）。任意選択で、抗ＣＤ４０抗体の注射剤が該酵母組成物の翌日に投与される。マウスは毎週または隔週で１、２または３回投与で免疫され、最後のブースター投与は任意選択で毎週投与または隔週投与の最終回から３〜４週間後に投与される。マウスは最後の注射の７〜９日後に殺処理される。各群から集められた脾臓細胞懸濁液および／またはリンパ節懸濁液が調製されて、ＨＢＶ抗原を発現する酵母を含みうるＨＢＶペプチドおよび／またはＨＢＶ抗原の形態のＨＢＶ特異刺激を利用するｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激（ＩＶＳ）条件に供される。対照培養物は非ＨＢＶペプチドで刺激されるが、該ペプチドには、オボアルブミンペプチド、または無関係のウイルスのペプチド（例えばＨＩＶ由来のペプチド）が挙げられる。酵母系ＨＢＶ免疫療法組成物の投与によって誘導された免疫応答を評価するために標準的なアッセイが使用されるが、該アッセイには、３Ｈ‐チミジン取込み反応により評価されるリンパ球増殖、５１Ｃｒ‐標識された標的細胞（または終夜ＣＴＬのために標識された他の標的）を使用する細胞媒介性細胞傷害アッセイ（ＣＴＬアッセイ）、サイトカインアッセイまたはＥＬＩＳＰＯＴによるサイトカイン分泌の定量（例えばＩＦＮ‐γ、ＩＬ‐１２、ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐６、およびＩＬ‐２のうち少なくともいずれか、など）、ならびに腫瘍接種（例えば、ＨＢＶ抗原を発現するように遺伝子組換え処理された腫瘍細胞を用いたｉｎ  ｖｉｖｏ接種）からの保護、が挙げられる。
【０３８７】
酵母系ＨＢＶ免疫療法組成物は、上述のアッセイによって測定されるようなＨＢＶ抗原特異的Ｔ細胞応答を誘発する能力によって実証されるように、免疫原性であることが予想される。
【０３８８】
初期の実験では、実施例１および２に記載された酵母系ＨＢＶ免疫療法産物のうち２つについて、該産物を用いた免疫により抗原特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞増殖が誘発されるかどうかを判断するために、リンパ球増殖アッセイ（ＬＰＡ）で試験が行われた。より具体的には、ＣＵＰ１プロモーターの制御下にて配列番号３４で表わされる融合タンパク質を発現する酵母系免疫療法産物（ＧＩ‐１３００２）であって、「ＳＣＯＲＥ」としても知られ、かつより具体的には上記の実施例１に記載されているもの、および、ＣＵＰ１プロモーターの制御下にて配列番号９２で表わされる融合タンパク質を発現する酵母系免疫療法産物（ＧＩ‐１３００４）であって、「ａ‐ＳＰＥＸ」としても知られ、かつより具体的には実施例２に記載されているものをそれぞれ使用して、マウスを免疫し、リンパ球増殖アッセイ（ＬＰＡ）を使用して該産物両方において標的とされた表面抗原および／またはコア抗原に特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞を評価した。
【０３８９】
メスのＢＡＬＢ／ｃマウスは、５ＹＵの「ＳＣＯＲＥ」またはａ‐ＳＰＥＸを用いてマウスの２つの異なる部位（２．５ＹＵ／側腹部）の皮下に週１回として３回免疫された。対照マウスは、空ベクターの酵母を用いてワクチン接種されたか（「ＹＶＥＣ」と表示）、またはワクチン接種されなかった（「無処置」と表示）。３回目の免疫処置の１週間後に、マウスは安楽死処理され、脾臓ならびに大動脈周辺および鼠蹊部の流入領域リンパ節（ＬＮ）が採取および処理されて単個細胞浮遊液となされた。この２種類の結節由来のＬＮ細胞は合わされて、組換えのコアおよび表面抗原の混合物（「Ｓ／Ｃｏｒｅ混合」）、または、ＳＡｇで免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウス由来のＴ細胞の増殖を誘発することが過去に報告されているクラスＩＩ拘束性ミモトープペプチド（ＧＹＨＧＳＳＬＹ、配列番号１０３、「クラスＩＩ  ＳＡｇミモトープペプチド」と表示）（ラジャデイヤクシャ（Rajadhyaksha）ら、米国科学アカデミー紀要（PNAS）、１９９５年、第９２巻、ｐ．１５７５−１５７９）を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激された（ＩＶＳ）。
【０３９０】
脾臓細胞は磁気細胞分離法（Magnetic Activated Cell Sorting：ＭＡＣＳ）によるＣＤ４＋Ｔ細胞の富化に供され、ＬＮについて記載されたのと同じ抗原とともにインキュベートされた。４日間インキュベートされた後、ＩＶＳ培養物はトリチウム（３Ｈ）チミジンで１８時間パルス標識され、細胞内ＤＮＡがガラス繊維ミクロフィルター上に採取された。取り込まれた３Ｈチミジンのレベルはシンチレーション計数によって測定された。ＳＣＯＲＥで免疫されたマウス由来の同型のＬＮ培養物も並列してアッセイされた。Ｔ細胞の活性化を評価する追加の手段としてＥＬＩＳｐｏｔによるインターフェロンγ（ＩＦＮ‐γ）産生が使用された。
【０３９１】
図２３、図２４および図２６に示されるように、ＳＣＯＲＥまたはａ‐ＳＰＥＸで免疫されたマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞は、組換えＳ抗原およびコア抗原混合物に応答して増殖した。ＳＣＯＲＥで免疫されたマウス由来の脾臓Ｔ細胞（図２３）は、ＹＶＥＣで免疫されたマウス（空ベクターの対照）または無処置のマウス由来のＴ細胞よりも＞５倍の増殖レベルを示し、作用が表面‐コア融合タンパク質に特異的である（すなわち抗原特異的Ｔ細胞応答である）ことを示していた。ＨＢＶミモトープペプチドとともにインキュベートされた、ＳＣＯＲＥで免疫されたマウス由来のＴ細胞も、ペプチドでパルスされたＹＶＥＣ対照または無処置対照よりも高いレベルに増殖し、酵母系免疫療法産物の応答が抗原特異的であることのさらなる証拠を提示した。これらの作用はさらに、ＩＶＳに加えられた抗原の量に依存し、最適活性は３μｇ／ｍｌ（組換え抗原）または３０μｇ／ｍＬ（ペプチド）で生じている。
【０３９２】
図２４に示されるように、ＳＣＯＲＥで免疫されたマウス由来のＬＮ細胞も上記の同じ抗原を用いたＩＶＳに応答して増殖したが、ＳＣＯＲＥで免疫された動物と無処置またはＹＶＥＣで免疫された動物との間の増殖の差は、単離された脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞の場合よりも小さかった。
【０３９３】
ＥＬＩＳｐｏｔデータ（図２５）は、ＳＣＯＲＥで免疫されＳ＋Ｃ混合物で再刺激されたマウス由来のＬＮ調製物が、無処置の動物由来のＬＮよりも＞１０倍多くのＩＦＮ‐γ分泌細胞を含有することを示している。ＨＢＶペプチド（配列番号１０３）を用いたＩＶＳはＩＦＮ‐γ応答も誘発した。具体的には、ＳＣＯＲＥ  ＬＮ調製物は、無処置のＬＮ調製物よりも＞３．５倍多くのＩＦＮ‐γ産生細胞を含有していた（図２５）。これらのデータを総合すると、ＳＣＯＲＥ（表面抗原およびコアを含む融合タンパク質を発現する酵母系免疫療法）が脾臓およびＬＮの両方においてＨＢＶ抗原特異的なＴ細胞応答を誘発すること、ならびに、これらの応答は精製抗原を用いたＩＶＳによって用量依存的な様式で増幅されうることが示される。
【０３９４】
ａ‐ＳＰＥＸを用いた同様の分析（図２６）は、この酵母系ＨＢＶ免疫療法産物もＴ細胞増殖反応を誘発することを示した。ａ‐ＳＰＥＸは、組換え抗原混合物を用いて実施されたＩＶＳにおいて、ＹＶＥＣと比較して約３０％の増大を誘発した。全体として、ａ‐ＳＰＥＸで観察された応答はＳＣＯＲＥで観察されたものより低かった。応答の規模の差は、ａ‐ＳＰＥＸにおける抗原発現がモル濃度ベースでＳＣＯＲＥの抗原発現の半分未満であるという事実を反映している可能性がある。あるいは、理論によって束縛されるものではないが、これらの結果は、酵母によって発現される抗原の構成が、発現レベル、エンドソーム／プロテアソームによるプロセシング効率、またはその他の免疫応答のパラメータに影響を及ぼすことを示しているのかもしれない。１００μｇ／ｍＬのペプチドを使用したａ‐ＳＰＥＸマウス由来のＴ細胞の増殖は、ＹＶＥＣをワクチン接種されたマウスにおける増殖よりも少なくとも２倍大きかった（図２６、右側の３列）。
【０３９５】
実施例１０
以下の実施例は、本発明の２つの酵母系ＨＢＶ免疫療法薬についての、サイトカイン像を使用した免疫学的評価について述べる。
【０３９６】
本発明の酵母系ＨＢＶ免疫療法薬を用いた免疫処置の結果として誘発された細胞性免疫応答を特徴解析する１つの方法は、免疫された動物由来の脾臓調製物のｅｘ  ｖｉｖｏ刺激で産生されたサイトカイン像を評価することである。
【０３９７】
これらの実験では、メスのＣ５７Ｂｌ／６マウスは、ＧＩ‐１３００２（「ＳＣＯＲＥ」、配列番号３４で表わされるＨＢＶ表面‐コア融合タンパク質を発現する酵母系免疫療法薬、実施例１）、およびＧＩ‐１３００５（「Ｍ‐ＳＰＥＸ」、ＣＵＰ１プロモーターの制御下にて配列番号３６で表わされるＨＢＶ表面‐ｐｏｌ‐コア−Ｘ融合タンパク質を発現する酵母系免疫療法薬、実施例２）、ＹＶＥＣ（空ベクターの対照酵母）を用いて免疫されたか、または免疫されなかった（無処置）が、これは以下のとおりに行われた：２ＹＵの酵母系免疫療法薬または対照酵母が、第０日、第７日、および第２８日に動物の２つの異なる部位に皮下注射された。抗ＣＤ４０抗体が第１日目に腹腔内（ＩＰ）注射により投与されて、酵母系免疫療法薬により提供される活性化のレベルを越える樹状細胞（ＤＣ）の付加的活性化が提供された。抗ＣＤ４０抗体処理は任意選択であるが、該抗体の使用は、直接的なペンタマー染色による抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の検出を試みる場合（そのようなデータは本実験では示さない）、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のレベルをブーストすることができる。最後の免疫処置の９日後に、脾臓が採取および処理されて単個細胞浮遊液となされた。該細胞は、２つのＨＢＶペプチドプールの混合物とともに（図２７および図２８では「Ｐ」、および図２９Ａおよび２９Ｂでは「ＨＢＶＰ」と表示）、または、マイトマイシンＣ処理されたナイーブな同系脾細胞を２つのペプチドでパルスしたものとともに（図２７および図２８では「ＰＰＳ」、および図２９Ａおよび２９Ｂでは「ＨＰＰＳ」と表示）、４８時間のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激（ＩＶＳ）培養に供された。該ペプチドはＨ−２Ｋｂ拘束性であり、次の配列すなわち：ＩＬＳＰＦＬＰＬＬ（配列番号６５、表５を参照）およびＭＧＬＫＦＲＱＬ（配列番号１０４）を有していた。培養物は、ＩＬ１β、ＩＬ‐１２およびＩＦＮ‐γの反復的Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）分析に供された。
【０３９８】
これらのサイトカインは、該サイトカインが、ＨＢＶに対する生産的または有効な免疫応答に関係していると考えられる免疫応答の種類に関係していることから、評価が行われた。ＩＬ‐１βは抗原提示細胞によって産生される炎症誘発性サイトカインであり、酵母系免疫療法組成物を用いた免疫処置によって誘導されることが知られているサイトカインである。ＩＬ‐１２も抗原提示細胞によって産生され、ＣＤ８＋細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）活性を促進する。ＩＦＮ‐γは、適応的免疫応答の出現においてＣＤ８＋細胞傷害性リンパ球によって産生され、Ｔｈ１  ＣＤ４＋Ｔ細胞の分化も促進した。
【０３９９】
図２７（ＩＬ‐１β）、図２８（ＩＬ‐１２）、図２９Ａ（ＩＦＮ‐γ；ＳＣＯＲＥで免疫）、および図２９Ｂ（ＩＦＮ‐γ；Ｍ‐ＳＰＥＸで免疫）に示された結果は、３種全てのサイトカインが、Ｓｃｏｒｅで免疫されたマウス由来の脾細胞（図２７、図２８および図２９Ａに「Ｓｃ」で表示）によって、ペプチドプール単独を用いた直接的ＩＶＳに応答して産生されること、ならびに、該応答は、ＳＣＯＲＥで免疫されたマウスに関して、ＹＶＥＣ（図２７、図２８ならびに図２９Ａおよび２９Ｂに「Ｙ」で表示）または無処置の（図２７、図２８および図２９Ａの中の表示された「Ｎ」および２９Ｂ）マウスに関するよりも大きいことを示しており、ＳＣＯＲＥを用いた免疫処置はこれら３種のサイトカインの産生をもたらす抗原特異的免疫応答を誘発することが実証されている。ペプチドでパルスされた同系脾細胞を用いたＩＶＳも、低規模ではあるが抗原特異的応答を誘発した。Ｍ‐ＳＰＥＸをワクチン接種されたマウス由来の脾細胞（図２７、図２８および図２９Ｂに「Ｓｐ」で表示）は、ＳＣＯＲＥをワクチン接種されたマウス由来の脾細胞よりも全体的に低いレベルでサイトカインを産生した。しかしながら、Ｍ‐ＳＰＥＸに応答して産生されたＩＬ１２ｐ７０の量はＹＶＥＣまたは無処置によって産生された量よりも多く、抗原特異的免疫応答がこの酵母系免疫療法組成物によって誘導されたことを示している。高レベルの抗原を発現し、かつ実施例９に記載されたアッセイにおいてＣＤ４＋増殖反応を誘導したａ‐ＳＰＥＸ（ＧＩ‐１３００４；実施例２）は、高レベルのサイトカイン産生を誘発するであろうことが予想される。
【０４００】
さらなるサイトカインアッセイは、２つの同じ酵母系免疫療法産物のうち１つを用いて免疫されたメスのＢＡＬＢ／ｃマウスを使用して実施された。これらの実験では、メスのＢＡＬＢ／ｃマウスは、ＳＣＯＲＥ（ＧＩ‐１３００２；図３０Ａ〜３０Ｄにおいて「Ｓｃ」と表示）、Ｍ‐ＳＰＥＸ（ＧＩ‐１３００５；図３０Ａ〜３０Ｄにおいて「Ｓｐ」と表示）、ＹＶＥＣ（図３０Ａ〜３０Ｄにおいて「Ｙ」と表示）を用いて免疫されたか、または免疫処置は行われなかったが（無処置、図３０Ａ〜３０Ｄにおいて「Ｎ」と表示）、これは以下のとおりである：２ＹＵの酵母産物は、第０日、第１１日、第３９日、第４６日、第６０日および第６７日に２つの部位に投与された。上記の実験のように、抗ＣＤ４０抗体がｉ．ｐ．投与された。最後の免疫処置の９日後（第７６日）、脾臓が採取され、単個細胞浮遊液へと処理され、組換えＨＢＶ表面タンパク質およびコアタンパク質の混合物を用いて４８時間のＩＶＳに供された（図３０Ａ〜３０Ｄにおいて「ＨＢＶ  Ｓａｇ＋Ｃｏｒｅ  Ａｇ」と表示）。上清が収集され、ＩＬ１β、ＩＬ‐６、ＩＬ‐１３およびＩＬ１２ｐ７０の産生についてＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）により評価された。ＩＬ‐６は、抗原提示細胞およびＴ細胞によって産生される炎症誘発性サイトカインであり、酵母系免疫療法産物の作用機序における重要なサイトカインであると考えられる。ＩＬ‐１３もＴ細胞によって産生される炎症誘発性サイトカインであり、ＩＬ‐４、およびＴｈ２  ＣＤ４＋免疫応答の促進と密接に関係している。
【０４０１】
図３０Ａ（ＩＬ‐１β）、図３０Ｂ（ＩＬ‐６）、図３０Ｃ（ＩＬ‐１３）および図３０Ｄ（ＩＬ‐１２）に示された結果は、ＳＣＯＲＥで免疫されたマウス由来の脾細胞が表面およびコア抗原混合物に応答してＩＬ‐１β、ＩＬ‐６、ＩＬ１２ｐ７０およびＩＬ‐１３を産生したこと、ならびに、応答の規模はＹＶＥＣで免疫されたマウスまたは無処置のマウス由来の脾細胞に関するよりも高かったことを示している。この抗原特異性は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＬＰＡ（実施例９を参照）およびＣ５７Ｂｌ／６マウスにおけるサイトカイン放出アッセイ（上記参照）について得られた結果と一致している。
【０４０２】
Ｍ‐ＳＰＥＸで免疫されたマウス由来の脾細胞はＩＬ‐１βについて抗原特異的シグナルを生成したが（図３０Ａ）、他のサイトカインについては生成しなかった。Ｃ５７Ｂｌ／６における知見と同様に、ＳＣＯＲＥとＭ‐ＳＰＥＸとの間のこの明白な潜在能の差は、後者の抗原含量がより少ないことによって説明されるかもしれない。高レベルの抗原を発現するａ‐ＳＰＥＸ（配列番号９２で表わされる融合タンパク質を発現、実施例２に記載）は、改善された抗原特異的サイトカイン産生を誘導するであろうことが予想され、さらに、この産物または他のＨＢＶ抗原（ＨＢＶ  Ｘおよびポリメラーゼ抗原）を組込んだ他の産物によって発現されるさらなる抗原を特徴づけるＩＶＳアッセイは、さらなる免疫原性を明らかにすると予想される。
【０４０３】
実施例１１
次の実施例は、ＨＢＶに関する酵母系免疫療法組成物のｉｎ  ｖｉｖｏでの免疫原性試験について述べる。
【０４０４】
この実験では、ＣＵＰ１プロモーターの制御下にて配列番号３４で表わされる融合タンパク質を発現する酵母系免疫療法産物（ＧＩ‐１３００２）であって、「ＳＣＯＲＥ」としても知られ、またより具体的には実施例１に記載されている免疫療法産物は、ＳＣＯＲＥで免疫されたマウス由来のＴ細胞がレシピエントの重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスに移入された後で該ＳＣＩＤマウスに腫瘍移植がなされる、養子免疫細胞移入法において使用された。
【０４０５】
簡潔に述べると、メスのＣ５７ＢＬ／６マウス（４〜６週齢）は、第０日、第７日および第１４日に、２つの部位（２．５ＹＵを側腹部、２．５ＹＵを首筋）においてＧＩ‐１３００２（ＳＣＯＲＥ）、ＹＶＥＣ（空のベクターを含有する酵母）を用いて皮下に免疫されたか、または免疫処置されなかった（無処置）。ＳＣＯＲＥで免疫されたマウスの１コホートは、各免疫処置の１日後に５０μｇの抗ＣＤ４０抗体を用いてさらに腹腔内（ｉ．ｐ．）注射された。第２４日にマウスは殺処理され、全脾細胞が調製および計数された。２００μＬのＰＢＳ中に含めた２５００万個の脾細胞が、ナイーブなレシピエントである４〜６週齢のメスのＳＣＩＤマウスにｉ．ｐ．注射された。移入後２４時間で、該レシピエントに、３００，０００個のＳＣＯＲＥ抗原を発現するＥＬ４腫瘍細胞（「ＥＬ‐４‐Ｓｃｏｒｅ」と表示）または無関係のオボアルブミン抗原を発現する腫瘍細胞を用いて胸郭エリアに皮下（ｓ．ｃ．）接種がなされた。腫瘍の成長は、腫瘍接種後１０日から開始して１〜２日間隔でデジタルノギス測定によってモニタリングされた。
【０４０６】
図３１に示された腫瘍接種後１０日における結果から、ＧＩ‐１３００２（ＳＣＯＲＥ）またはＧＩ‐１３００２＋抗ＣＤ４０抗体で免疫されたマウス由来の脾細胞は、ＳＣＯＲＥ抗原を発現するＥＬ４腫瘍を用いた接種からの同程度の保護を誘発するが、ＹＶＥＣまたは無処置のマウス由来では誘発しないことが実証された（図３１、左から１番目および２番目の棒）。接種後１０日に腫瘍を有するマウスの数は、図３１の各棒の上に示されている。ＧＩ‐１３００２で免疫されたマウス由来のＴ細胞は、無関係な抗原を発現するＥＬ４腫瘍の成長に対しては効果がなかった（図示せず）。ＹＶＥＣで免疫されたマウス由来の脾細胞（図３１、中央の棒）は腫瘍の成長に影響しなかった、というのも、この群の腫瘍の大きさおよび数は、脾細胞を受け取っていないマウス（図３１、最も右の棒）または無処置のマウスから脾細胞を受け取ったマウス（図３１、右から２番目の棒）のものと同程度であったからである。これらの結果は、表面抗原‐コア融合タンパク質を発現する酵母系免疫療法組成物を使用した免疫処置により、腫瘍接種からＳＣＩＤマウスを保護する抗原特異的免疫応答が生成することを示している。樹状細胞（ＤＣ）を活性化する抗ＣＤ４０抗体の共同投与は、保護の程度に影響を及ぼさなかった。
【０４０７】
実施例１２
次の実施例は、インターフェロン‐γ（ＩＦＮ‐γ）ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを使用して、ＨＢＶに関する２つの酵母系免疫療法組成物の免疫原性試験について述べる。
【０４０８】
この実験は、実施例７に記載された２つの最適化された酵母系免疫療法組成物について、同組成物で免疫されたマウスにおいてＨＢＶ抗原特異的Ｔ細胞を誘導する能力を評価するために設計された。該実験はさらに、計算アルゴリズムを用いて設計された新規なＨＢＶペプチド配列および公開された出版物から得られた配列が、これらの免疫療法組成物によって生成されたＴ細胞応答を再刺激するために使用可能かどうかも試験した。
【０４０９】
この実験では、ＧＩ‐１３００８（「Ｓｃｏｒｅ‐Ｃ」、配列番号１１６を含む）として実施例７に記載された酵母系免疫療法組成物、およびＧＩ‐１３０１３（「Ｓｐｅｘ‐Ｄ」、配列番号１１０を含む）として実施例７に記載された酵母系免疫療法組成物が、免疫原性について評価された。この実験で使用されたペプチド配列は表７に示されている。ＺＧＰ‐５およびＺＧＰ‐７と表示された配列は公開出版物に由来し、残りのペプチドはＢＩＭＡＳまたはＳＹＦＰＥＩＴＨＩ予測アルゴリズムを用いて計算により同定された。接頭語「Ｄｂ」または「Ｋｂ」はＣ５７ＢＬ／６マウスのハプロタイプすなわち：それぞれＨ‐２ＤｂおよびＨ２‐Ｋｂを指す。
【０４１０】
【表６】
0005911983.tif 000014
メスのＣ５７ＢＬ／６マウス（４〜６週齢）は、第０日、第７日および第１４日に、２つの部位（２．５ＹＵを側腹部、２．５ＹＵを首筋）においてＧＩ‐１３００８（Ｓｃｏｒｅ‐Ｃ）、ＧＩ‐１３０１３（Ｓｐｅｘ‐Ｄ）、ＹＶＥＣ（空ベクターの酵母対照）を用いて皮下に免疫されたか、または免疫処置されなかった（無処置）。２０日目にマウスは殺処分され、全脾細胞が調製され、赤血球の除去が行われ、計数され、５％のウシ胎児血清を含有する完全ＲＰＭＩに、表７に列挙されたペプチド刺激剤（ＤｂおよびＫｂペプチドについては１０μＭ；ＺＧＰペプチドについては３０μｇ／ｍＬ）、または組換えＨＢＶ  ＳＡｇおよびコア抗原の混合物（合計で３μｇ／ｍＬ）を加えたものの中で細胞２００，０００個／ウェルとして４日間インキュベートされた。コンカナバリンＡが陽性対照の刺激剤として添加された。
【０４１１】
結果（図３２）は、ＧＩ‐１３００８（Ｓｃｏｒｅ‐Ｃ）を用いたＣ５７ＢＬ／６マウスの免疫処置が、次のペプチドすなわち：Ｄｂ９‐８４、Ｋｂ８‐２７７およびＫｂ８‐３４７のうち少なくともいずれか、ＺＧＰ‐５、ならびにＺＧＰ‐７に対する際立った特異性を備えた、ＨＢＶ表面（Ｓ）抗原およびコア抗原を対象とするＩＦＮ  ＥＬＩＳｐｏｔ反応を誘発することを示している。これらのペプチドは、培地のみが入ったウェルからの応答、またはＧＩ‐１３０１３（Ｓｐｅｘ‐Ｄ）で免疫されたマウス、ＹＶＥＣで免疫されたマウス、または免疫されていないマウス由来の脾細胞を含有するウェルからの応答よりも大きなＩＦＮ応答を誘発した。組換えＳ＋コア抗原混合物もＩＦＮ応答を誘発したが、ただしこの特定の刺激剤グループにおけるＹＶＥＣ対照細胞は、Ｓ＋コア抗原混合物に関する抗原特異的寄与の評価を妨げるバックグラウンド信号を生成した。これらのデータは、表面‐コア融合タンパク質を発現するＧＩ‐１３００８（Ｓｃｏｒｅ‐Ｃ）が、選択されたペプチドを用いてｅｘ  ｖｉｖｏで再刺激されうるＨＢＶ抗原特異的免疫応答を誘発すること、および、これらの応答がＧＩ‐１３０１３（Ｓｐｅｘ‐Ｄ）によって誘発されるものより容易に検出可能であることを示している。
【０４１２】
実施例１３
次の実施例は、ＨＢＶのための酵母系免疫療法組成物が、市販のＨＢＶ予防ワクチンの接種を受けた対象者由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＩＦＮγ産生を刺激する能力に関して試験された実験について述べる。
【０４１３】
この実験では、ＧＩ‐１３００２（「Ｓｃｏｒｅ」、配列番号３４を含む、実施例１）として知られる酵母系免疫療法産物は、アルミニウム系アジュバント上に吸着された組換え精製Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を含有する予防ワクチンである市販のＨＢＶ予防ワクチン（ＥＮＧＥＲＩＸ（登録商標）‐Ｂ、グラクソスミスクライン（GlaxoSmithKline））を接種された対象者から単離されたＰＢＭＣからのＩＦＮ産生を刺激する能力に関して試験された。
【０４１４】
簡潔に述べると、血液が採取され、ＨＬＡ‐Ａ＊０２０１対立遺伝子を発現する健康なＨＢＶ非感染のヒト対象者からＰＢＭＣが単離された。ＰＢＭＣは後の分析用に凍結された。次いで該対象者はＥＮＧＥＲＩＸ（登録商標）−Ｂのワクチン接種を受け（注射１）、注射後第１２日および第２９日に血液が採取され、ＰＢＭＣが単離および凍結された。対象者はＥＮＧＥＲＩＸ（登録商標）−Ｂを用いた２回目のワクチン接種を受け（注射２、「ブースト」）、ブースト後第１０、２１および３２日に血液が採取された。各時点についてＰＢＭＣが単離および凍結された。
【０４１５】
一連のＰＢＭＣ試料が得られて凍結された後、すべての時点の細胞が融解され、洗浄され、空ベクターの酵母対照（ＹＶＥＣ）またはＧＩ‐１３００２とともに酵母：ＰＢＭＣ比を５：１として、３７℃／５％ＣＯ２インキュベータ内で３日間インキュベートされた。その後、細胞はＩＦＮ  ＥＬＩＳｐｏｔプレートに移され、１８時間インキュベートされ、標準的手順に従ってＥＬＩＳｐｏｔを発色させるために処理された。
【０４１６】
図３３（縦の列は初回免疫の前後およびブースト後の時間を表示する）に示されるように、ＧＩ‐１３００２で処理されたＰＢＭＣについて、ブースト後２１日の時点においてＹＶＥＣで処理されたＰＢＭＣの応答より高い実質的なＥＬＩＳｐｏｔ応答が観察された（ＧＩ‐１３００２のＥＬＩＳｐｏｔからＹＶＥＣのＥＬＩＳｐｏｔを差し引いてＰＢＭＣ１００万個あたり〜２３０スポット）。ＹＶＥＣを差し引いたＳｃｏｒｅのＥＬＩＳｐｏｔのレベルは他の時点について観察された数を上回り、ワクチン接種前の試料について得られたシグナルを２．８倍上回った。ＧＩ‐１３００２およびＹＶＥＣの酵母系組成物間の唯一の実質的な構造上の差異は、ＧＩ‐１３００２が担持するベクター内に表面‐コア融合タンパク質（ＨＢＶ抗原）が存在する（すなわちＹＶＥＣは「空の」ベクターを有する）ことである。したがって、該結果は、ＧＩ‐１３００２が対象者のＰＢＭＣにおいてＴ細胞の抗原特異的刺激を誘発したことを示している。ＥＮＧＥＲＩＸ（登録商標）‐Ｂワクチンは組換え表面抗原を含有するがコア抗原は含まないことから、また対象者はＨＢＶウイルス陰性であった（ＨＢＶに感染したことがない）ことから、この結果は、観察されたＩＦＮ産生がコア抗原特異的ではなくＨＢｓＡｇ特異的（表面抗原特異的）なＴ細胞に由来したことを示している。
【０４１７】
実施例１４
次の実施例は、ネズミ科動物免疫処置モデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでのＨＢＶのための酵母系免疫療法組成物の評価について述べる。
【０４１８】
この実験では、ＧＩ‐１３００９（「ＳＣＯＲＥ‐Ｄ」、配列番号１１８を含む、実施例７）として知られる酵母系免疫療法産物、およびＧＩ‐１３０２０（「Ｘ‐ＳＣＯＲＥ」、配列番号１３０を含む、実施例８）として知られる酵母系免疫療法産物が、Ｃ５７ＢＬ／６マウス、ＢＡＬＢ／ｃマウス、およびＨＬＡ‐Ａ２トランスジェニックマウス（Ｂ６．Ｃｇ‐Ｔｇ（ＨＬＡ‐Ａ／Ｈ２‐Ｄ）２Ｅｎｇｅ／Ｊ；米国ジャクソン研究所（The Jackson Laboratory）、米国バージニア大学特許財団（University of Virginia Patent Foundation）のライセンスの下で提供）に投与された。上記の実験に使用されたＨＬＡ‐Ａ２トランスジェニックマウスは、ヒトＨＬＡ‐Ａ２．１遺伝子のα‐１ドメインおよびα‐２ドメインと、マウスＨ‐２Ｄｄ遺伝子のα‐３膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインとを含有する種間雑種のクラスＩＭＨＣ遺伝子ＡＡＤを、ヒトＨＬＡ‐Ａ２．１プロモーターの指揮下で発現する。このキメラ型ＨＬＡ‐Ａ２．１／Ｈ２‐Ｄｄ  ＭＨＣクラスＩ分子は、ＨＬＡ‐Ａ２．１クラスＩ分子によって提示されたペプチドを認識することが可能な一層完全なＴ細胞レパートリーを提供するために、マウスＴ細胞の効率的な正の選択を仲介する。ＨＬＡ‐Ａ２．１／Ｈ２‐ＤｄクラスＩ分子を背景としたマウスＴ細胞によって提示および認識されるペプチドエピトープは、ＨＬＡ‐Ａ２．１＋のヒトにおいて提示されるものと同じである。従って、このトランスジェニック系統は、ＨＬＡ‐Ａ２に提示される抗原に対するヒトのＴ細胞免疫応答のモデル化を可能にする。
【０４１９】
これらの実験の目的は、ヒトＭＨＣ（ＨＬＡ）分子を発現するものなど様々なＭＨＣ対立遺伝子を備えたマウスにおける、酵母系ＨＢＶ免疫療法薬を用いた免疫処置によって生成されるＨＢＶ抗原特異的免疫応答の広さおよび規模を評価することであった。免疫原性試験は、適切なＨＢＶ抗原を用いた脾臓細胞またはリンパ節細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ刺激によって免疫処置後に行われ、その後、ＩＦＮ‐γ／ＩＬ‐２二色式ＥＬＩＳｐｏｔ、リンパ球増殖アッセイ（ＬＰＡ）、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）多重サイトカイン分析、および細胞内サイトカイン染色（ＩＣＣＳ）のうち少なくともいずれかによってＴ細胞応答の評価が行われた。ＩＣＣＳはＩＦＮ‐γおよびＴＮＦ‐αの抗原特異的産生に対するＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の寄与を決定するために使用された。
【０４２０】
下記の実験それぞれにおいて、マウスは、酵母系ＨＢＶ免疫療法薬または酵母系対照物（後述）を用いて、同じレジメンに従って、すなわち１部位あたり２．５ＹＵの酵母組成物を２つの部位（側腹部、首筋）に週１回で３週間注射として、皮下へのワクチン接種を受けた。対照物には、ＹＶＥＣ（空のベクターを含有する（すなわち抗原を含まない）対照酵母）、ＯＶＡＸ２０１０（非ＨＢＶ抗原であるオボアルブミンを発現する対照の酵母免疫療法組成物）、ならびに可溶性組換え抗原（オボアルブミンまたはＨＢＶ抗原）を伴うＹＶＥＣおよび抗ＣＤ４０抗体の組み合わせ、が含まれた。具体的な実験および処置コホートは以下の表８および９に示されている。マウスは３回目の免疫処置の８日後（ＨＬＡ‐Ａ２トランスジェニック、実験１）または１４日後（Ｃ５７ＢＬ／６およびＢＡＬＢ／ｃ、実験２）に安楽死に供され、下記に示されるように、脾臓および鼠径リンパ節が切除されて様々な抗原刺激（ＨＢＶのクラスＩおよびクラスＩＩ  ＭＨＣ拘束性ペプチド、組換えタンパク質、およびＨＢＶ抗原を発現する腫瘍細胞株）とともに５日間インキュベートされた。Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）分析については、培養上清が採取され、抗原添加の４８時間後に１０種の異なるサイトカイン（Ｔｈ１型およびＴｈ２型）の産生について評価された。ＥＬＩＳｐｏｔアッセイについては、細胞は上記５日間のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激（ＩＶＳ）の最後の２４時間についてＩＦＮ‐γ抗体コーティングプレート上でインキュベートされ、その後標準化されたスポット検出および計数が行われた。ＬＰＡについては、細胞は上記５日間のＩＶＳの最後の１８時間について３Ｈチミジンでパルス標識され、次いで新たに合成されたＤＮＡに取り込まれたアイソトープの量がシンチレーション計数によって測定された。ＩＣＣＳについては、全７日間の刺激の後、死細胞を除去するためにフィコール勾配遠心分離に供され、次いで１ウェルあたり（９６ウェルのＵ底プレート）１００万個の生細胞が様々な濃度範囲の同じ抗原刺激とともに５時間インキュベートされ（力価測定）、次に透過処理され（permeablized）、細胞内のＩＦＮ‐γおよびＴＮＦ‐α＋細胞表面マーカーＣＤ４およびＣＤ８を認識する蛍光色素結合抗体を用いる染色に供された。サイトカインを発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の比率（％）はフローサイトメトリーによって決定された。
【０４２１】
表８は、実験１の実験コホートおよびプロトコールについて記載している。この実験では、マウスのＨＬＡ‐Ａ２コホートは上述のプロトコールを使用して免疫され、該マウスは３回目の免疫処置の８日後に免疫分析のために安楽死させた。Ａ群（「ＹＶＥＣ」）には、酵母ＹＶＥＣ対照物が上述の免疫処置スケジュールに従って接種され；Ｂ群（「ＳＣＯＲＥ‐Ｄ（ＧＩ‐１３００９‐ＵＬ２）」）には、ＵＬ２培地で増殖させたＧＩ‐１３００９（実施例７を参照）が上述の免疫処置スケジュールに従って接種され；Ｃ群（「Ｘ‐ＳＣＯＲＥ（ＧＩ‐１３０２０‐Ｕ２）」）には、Ｕ２培地で増殖させたＧＩ‐１３０２０（実施例８を参照）が上述の免疫処置スケジュールに従って接種された。
【０４２２】
【表７】
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実験１のマウスから採取されたリンパ節細胞のＩＦＮ‐γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ結果は図３４に示されている。この図は、様々なＨＢＶペプチドを用いた免疫処置マウス由来のリンパ節細胞の再刺激の結果を、培地対照と比較して示している（「ＴＫＯ２０」と表記されたペプチドは、免疫療法薬Ｘ‐ＳＣＯＲＥに含まれるがＳＣＯＲＥ‐Ｄには存在しないＸ抗原由来のペプチド（Ｘ５２〜６０）であることに留意されたい）。この結果から、ＳＣＯＲＥ‐Ｄ（ＧＩ‐１３００９）で免疫されたマウスおよびＸ‐ＳＣＯＲＥ（ＧＩ‐１３０２０）で免疫されたマウスのいずれに由来するリンパ節細胞も、各３μｇ／ｍｌの組換えＨＢＶ表面抗原およびコア抗原の混合物を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激に応答してＩＦＮ‐γを産生するＴ細胞を有することが示された（図３４；「Ｓ＆Ｃ３」と表示）。このＥＬＩＳｐｏｔ応答は、同じ刺激剤で処理されたＹＶＥＣで免疫されたマウス（酵母対照）について観察された応答よりも大きく、酵母系免疫療法組成物（ＳＣＯＲＥ‐ＤおよびＸ‐ＳＣＯＲＥ）中のＨＢＶ表面抗原およびコア抗原のうち少なくとも一方がＩＦＮ‐γ応答の誘導に必要であることが示された。更に、この結果から、ＩＶＳにおけるＨＢＶ抗原を使用する再刺激は、培地のみの入ったウェルがはるかに低いＥＬＩＳｐｏｔ応答を示したことから、効率的なＩＦＮ‐γ産生をもたらすことを示している。
【０４２３】
図３４はさらに、急性ＨＢＶ曝露でクリアランスを示す患者において重要であることが当分野において知られている、ＨＢＶコア由来の選択されたＨＬＡ‐Ａ２拘束性エピトープ（ＴＫＰ１６；コア：１１５〜１２４  ＶＬＥＹＬＶＳＦＧＶ；配列番号７５）は、Ｘ‐ＳＣＯＲＥで免疫されたマウスにおいて、培地のみのウェルで観察される応答よりも大きな応答を誘発することを示している。ＥＬＩＳｐｏｔアッセイについてのペプチド濃度およびインキュベート時間をさらに改良すると、これらの抗原について観察される応答の規模が増大し、かつ変動が小さくなると予想される。
【０４２４】
図３５は、実験１のＳＣＯＲＥ‐Ｄで免疫されたマウスから採取された脾臓細胞由来のＩＦＮ‐γＥＬＩＳｐｏｔアッセイ結果を示す。「Ｃｏｒｅ１１‐２７」と表示されたＨＢＶコアペプチド（ＡＴＶＥＬＬＳＦＬＰＳＤＦＦＰＳＶ（配列番号７２））はＳＣＯＲＥ‐Ｄによって発現される抗原内に含まれる一方、「Ｘ９２‐１００」と表示されたＨＢＶ  ＸペプチドはＳＣＯＲＥ‐Ｄによって発現される抗原内に含まれず、したがってこの実験においては対照ペプチドである。図３５に示されるように、ＳＣＯＲＥ‐Ｄで免疫されたＨＬＡ‐Ａ２トランスジェニックマウス由来の脾臓細胞は、「Ｃｏｒｅ１１‐２７」と表示される既知のＨＬＡ‐Ａ２拘束性ＨＢＶコアエピトープを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激に際してＩＦＮ‐γＥＬＩＳｐｏｔ応答を生じた。この応答は、無関係のペプチド（「Ｘ９２‐１００」と表示）を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激された脾臓細胞、培地のみ、またはＹＶＥＣで免疫されたマウス由来の脾細胞についての任意のＩＶＳ処理ウェルから観察される応答よりも大きかった。
【０４２５】
したがって、実験１の最初の結果は、ＳＣＯＲＥ‐ＤおよびＸ‐ＳＣＯＲＥはいずれも、酵母系免疫療法組成物で免疫されたＨＬＡ‐Ａ２トランスジェニックマウスにおいてＨＢＶ抗原特異的なＴ細胞応答を誘発することを示している。
【０４２６】
表９は、実験２の実験コホートおよびプロトコールについて記載している。この実験では、Ｃ５７ＢＬ／６およびＢＡＬＢ／ｃのマウスコホートは上述のプロトコールを使用して免疫され、マウスは３回目の免疫処置の２週間後に免疫分析のために安楽死させた。Ａ群（「無処置」）は処置を受けておらず；Ｂ群（「ＹＶＥＣ」）には、酵母ＹＶＥＣ対照物が上述の免疫処置スケジュールに従って接種され；Ｃ群（「Ｘ‐ＳＣＯＲＥ（ＧＩ‐１３０２０‐Ｕ２）」）には、Ｕ２培地で増殖させたＧＩ‐１３０２０（実施例８を参照）が上述の免疫処置スケジュールに従って接種され；Ｄ群（「ＳＣＯＲＥ‐Ｄ（ＧＩ‐１３００９‐ＵＬ２）」には、ＵＬ２培地で増殖させたＧＩ‐１３００９（実施例７を参照）が上述の免疫処置スケジュールに従って接種され；Ｅ群（「ＯＶＡＸ２０１０」）には、オボアルブミンを発現する酵母対照物が上述の免疫処置スケジュールに従って接種された。
【０４２７】
【表８】
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図３６は、実験２（表９）に示されるように免疫されたＣ５７ＢＬ／６マウスから単離されたリンパ節細胞についてのＥＬＩＳｐｏｔアッセイの結果を示す。これらの結果から、Ｘ‐ＳＣＯＲＥおよびＳＣＯＲＥ‐Ｄはいずれも野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてＩＦＮ‐γ応答を誘発することが実証された。精製された、ピチア・パストリスで発現された表面抗原およびコア抗原を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激された、Ｘ‐ＳＣＯＲＥで免疫されたマウス由来のリンパ節細胞は（ｙＳ＆Ｃと表示；ピチア属菌で発現された表面抗原およびコア抗原の１：１混合物を用いたＩＶＳ、各３μｇ／ｍＬ）、有意なＩＦＮ‐γ免疫応答を生じた。Ｘ‐ＳＣＯＲＥおよびＳＣＯＲＥ‐Ｄのいずれで免疫されたマウス由来の同じリンパ節細胞調製物も、大腸菌で発現された表面抗原およびコア抗原で刺激された場合（ｃＳ＆Ｃと表示；大腸菌で発現された表面およびコア抗原の１：１混合物を用いたＩＶＳ、各３μｇ／ｍＬ）、ピチア属で発現された組換え抗原について観察されるよりも全体に高いＥＬＩＳｐｏｔ応答を生じた。図３６の「無刺激」と表示された縦の列は、ｃＲＰＭＩ培地のみが提供された（抗原無しの）ＩＶＳ条件を示している。概して、Ｘ‐ＳＣＯＲＥを用いた免疫処置はＳＣＯＲＥ‐Ｄよりも高い作用を誘発し、いずれの酵母系ＨＢＶ免疫療法組成物も、ＹＶＥＣで免疫された（酵母対照）マウスまたは無処置のマウスについて観察されるよりも高い応答を誘発した。これらのデータから、ＳＣＯＲＥ‐ＤおよびＸ‐ＳＣＯＲＥはいずれも、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のｅｘ  ｖｉｖｏリンパ節細胞調製物において検出可能なＨＢＶ抗原特異的免疫応答を生じることが示される。
【０４２８】
図３７は、実験２（表９）で行われたＣ５７ＢＬ／６マウスの細胞内サイトカイン染色（ＩＣＣＳ）アッセイの結果を示す。該結果から、Ｘ‐ＳＣＯＲＥまたはＳＣＯＲＥ‐Ｄのいずれかを用いたＣ５７ＢＬ／６マウスの免疫処置により、「ＶＷＬ」と表示される表面抗原由来のＭＨＣクラスＩ分子Ｈ‐２Ｋｂ拘束性ペプチド（ＶＷＬＳＶＩＷＭ；配列番号１５２）に特異的なＩＦＮ‐γ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞が誘発されることが示された。この作用は、ＩＣＣＳの手順の５時間インキュベーションの間に細胞に添加されたペプチドの濃度に依存し；より濃度の高いペプチドほど、酵母系ＨＢＶ免疫療法薬（ＳＣＯＲＥ‐ＤおよびＸ‐ＳＣＯＲＥ）と、無関係な酵母対照物（ＯｖａｘおよびＹｖｅｃ）とで、ＩＦＮ‐γを産生するＣＤ８＋Ｔ細胞のレベルの差が大きくなり、ペプチド１０μｇ／ｍＬでは最大の隔たりが生じた。
【０４２９】
実験２のＩＣＣＳアッセイはさらに、Ｘ‐ＳＣＯＲＥおよびＳＣＯＲＥ‐Ｄを用いたＣ５７ＢＬ／６マウスの免疫処置により、ＩＣＣＳの手順の５時間インキュベーションの間に０．５μｇ／ｍＬのペプチドが添加される条件において、「ＺＧＰ‐５」と表示されるコアタンパク質由来のＭＨＣクラスＩＩ拘束性ＨＢＶペプチド（ＶＳＦＧＶＷＩＲＴＰＰＡＹＲＰＰＮＡＰＩＬ；配列番号１４８）に特異的なＩＦＮ‐γ産生ＣＤ４＋Ｔ細胞が誘発されることも示した（図３８）。
【０４３０】
上述のＥＬＩＳｐｏｔ結果と合わせると、これらのデータは、ＳＣＯＲＥ‐ＤおよびＸ‐ＳＣＯＲＥのいずれの酵母系免疫療法組成物も、組換えＨＢＶ抗原およびＨＢＶペプチドを用いたリンパ節および脾臓細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ刺激によって検出される、ＨＢＶ抗原特異的なエフェクターＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を誘発することを示している。Ｔ細胞応答は野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｈ２Ｋｂ）およびＨＬＡ‐Ａ２トランスジェニックマウスのいずれにおいても生じ、これらのワクチン剤が多様な主要組織適合型を背景として免疫応答を誘発する潜在能力を示している。
【０４３１】
本実施例において上述されたＨＬＡ‐Ａ２マウスおよびＣ５７ＢＬ／６マウスについての結果、ならびに実施例９、１０、１１および１２に記載された実験の結果に基づくと、ＳＣＯＲＥ‐ＤまたはＸ‐ＳＣＯＲＥのいずれかで免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスを用いた結果は、酵母系ＨＢＶ免疫療法組成物がこれらのマウスにおいてＨＢＶ抗原特異的なエフェクターＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を誘発することも実証するであろうことが予想される。実際に、ＢＡＬＢ／ｃコホートの初期の結果はＣＤ８＋Ｔ細胞応答について陽性であった（データは示さない）。さらに、リンパ球増殖アッセイおよびＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）サイトカイン放出分析は、ＳＣＯＲＥ‐ＤおよびＸ‐ＳＣＯＲＥがいずれも酵母免疫療法薬中に存在するＨＢＶ抗原配列を特異的標的とする免疫応答を誘導すること、およびこれらの応答は３種のマウス系統（ＨＬＡ‐Ａ２トランスジェニック、Ｃ５７ＢＬ／６およびＢＡＬＢ／ｃ）全てにおいて観察されるであろうことを示すことになると予想される。
【０４３２】
実施例１５
次の実施例は、ＨＢＶのための酵母系免疫療法組成物が、様々なＨＢＶ抗原に曝露された提供者から単離されたＰＢＭＣからのＩＦＮ産生を刺激する能力について評価される実験について述べる。
【０４３３】
この実験では、ＧＩ‐１３００９として知られる酵母系免疫療法産物（「Ｓｃｏｒｅ‐Ｄ」、配列番号１１８を含む、実施例７）、およびＧＩ‐１３０２０として知られる酵母系免疫療法産物（「Ｘ‐Ｓｃｏｒｅ」、配列番号１３０を含む、実施例８）は、該産物が様々なＨＢＶ抗原に曝露された提供者から単離されたＰＢＭＣからのＩＦＮγ産生を刺激する能力に関して試験される。この実験では、１群の提供者はＥＮＧＥＲＩＸ（登録商標）‐Ｂ（グラクソスミスクライン）またはＲＥＣＯＭＢＩＶＡＸ  ＨＢ（商標）（メルク・アンド・カンパニー（Merck and Co., Inc.））でワクチン接種済みであり、１群の提供者はＨＢＶ抗原と未接触（ナイーブ）であり（「正常」）、１群の提供者は慢性ＨＢＶ患者（ＨＢＶに慢性感染した対象者）である。ＥＮＧＥＲＩＸ（登録商標）‐Ｂは、酵母細胞で生産され、精製され、次いでアルミニウムベースのアジュバント上に吸着された組換え精製Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を含有する予防用組換えサブユニットワクチンである。ＲＥＣＯＭＢＩＶＡＸ  ＨＢ（商標）は、酵母細胞で生産されて含有する酵母タンパク質が１％未満となるように精製されたＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）に由来する予防用組換えサブユニットワクチンである。提供者は全員ＨＬＡ‐Ａ＊０２０１対立遺伝子を発現する。
【０４３４】
ドナーＰＢＭＣは、６ウェルの平底組織培養プレート（１０７個のＰＢＭＣ／ウェル）中で、１０％ウシ胎児血清を含有する完全ＲＰＭＩ培地中で５％ＣＯ２インキュベータにて３時間インキュベートされる。付着しない細胞は除去および廃棄され、付着した細胞は、未熟な樹状細胞（ｉＤＣ）を生成するために、組換えヒトインターロイキン‐４（ＩＬ‐４）および組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ‐ＣＳＦ）（それぞれ２０ｎｇ／ｍＬおよび５０ｎｇ／ｍＬ）で５日間処理される。次いで、ｉＤＣは、成熟ＤＣを生成するために、抗ＣＤ４０抗体（１μｇ／ｍｌ）、ＹＶＥＣ（空のベクターを含む酵母対照）、または酵母系産物ＧＩ‐１３０２０もしくはＧＩ‐１３００９とともに、３７℃の５％ＣＯ２インキュベータで４８時間インキュベートされる。抗ＣＤ４０抗体で処理されたＤＣについては、細胞は、標準的な方法を使用してＨＬＡ‐Ａ＊０２０１拘束性ＨＢＶペプチドでさらにパルスされる。全てのＤＣ群はＰＢＳで洗浄され、次いでセルハーベスタを用いてプレートからＰＢＳ中へ取り出される。細胞は放射線照射され（３０Ｇｙ）、１：１０のＤＣ：ＰＢＭＣ比で自己由来のドナーＰＢＭＣを刺激するために使用される。刺激は７日間実施され（第１ラウンド）、そのうち最後の４日間は組換えヒトＩＬ‐２を含有する培地中で実施される。刺激されたＰＢＭＣはその後フィコール勾配遠心分離に供され、単離された生細胞は上述のように調製された酵母パルスＤＣまたはペプチドパルスＤＣを用いる第２ラウンドのＩＶＳに供される。刺激されたＰＢＭＣはその後、ＩＦＮ‐γに特異的な抗体でコーティングされた９６ウェルプレート中で２０Ｕ／ｍＬのｒｈＩＬ‐２の存在下でＨＢＶペプチドまたは対照物とともにインキュベートされ、ＥＬＩＳｐｏｔ検出は標準的な製造者による手順を使用して実施される。ＳＣＯＲＥ‐ＤもしくはＸ‐ＳＣＯＲＥで処理された自己由来のＤＣを用いて、またはＨＢＶペプチドでパルスされたＤＣを用いて刺激されたＰＢＭＣは、ＹＶＥＣで処理されたＤＣまたはパルスされていないＤＣを用いて刺激されたＰＢＭＣよりも強く外因性ＨＢＶペプチドに応答するであろうこと、ならびに、この作用は、ＨＢＶ抗原に曝露していないナイーブな提供者よりもＨＢＶ  ＥＮＧＥＲＩＸ（登録商標）またはＲＥＣＯＭＢＩＶＡＸ  ＨＢ（商標）ワクチンの被接種者についてより顕著であろうことが予想される。
【０４３５】
実施例１６
次の実施例は、ヒトにおいて本発明の酵母系ＨＢＶ免疫療法組成物の免疫原性を実証するための、ヒトＰＢＭＣを使用する前臨床実験について述べる。
【０４３６】
具体的には、これらの実験は、ＨＢＶ表面抗原特異的および／またはＨＢＶコア抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞が、ＨＢＶキャリアの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）において、ＨＢＶ表面抗原およびＨＢＶコアを含有する酵母系ＨＢＶ免疫療法組成物を用いた２回のｉｎ
ｖｉｔｒｏ刺激（ＩＶＳ）の後に検出されうるかどうかを判定するために設計される。
【０４３７】
ＰＢＭＣは、（血清ＨＢｓＡｇの状態に基づいて）ＨＢＶについて陽性であると確認されたヒト提供者から得られる。全ＤＮＡが０．５ｍＬの全血から単離され、試験のための適切なＨＢＶペンタマーを同定するためにＨＬＡについて分類される（下記の表を参照）。
【０４３８】
【表９】
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樹状細胞（ＤＣ）は、上述の提供者から単離されたＰＢＭＣから、ＧＭ‐ＣＳＦおよびＩＬ‐４の存在下で５日間ＰＢＭＣを培養することにより調製される。続いてＤＣは、酵母系ＨＢＶ免疫療法組成物（例えば実施例１〜８のいずれかまたは本明細書中他所に記載されたもの）または対照酵母（例えば、空のベクターもしくは抗原をコードする挿入物を含まないベクターで形質転換されたサッカロマイセス・セレビシエ酵母である「ＹＶＥＣ」）とともに、１：１（酵母：ＤＣ）の比でインキュベートされる。対照のＤＣ培養物には、ＨＢＶペプチド、対照ペプチド（非ＨＢＶペプチド）とともに、または何も含めずにインキュベートされるＤＣも含まれる。
【０４３９】
４８時間の共培養の後、ＤＣは自己由来のＴ細胞（すなわち上記提供者からのＴ細胞）の刺激用の抗原提示細胞（ＡＰＣ）として使用される。ＩＶＳ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激）と呼ばれる刺激の各サイクルは、ＩＬ‐２の非存在下での３日間の培養と、その後の組換えＩＬ‐２（２０Ｕ／ｍｌ）存在下でのさらなる４日間とで構成される。ＩＶＳ  ２の終了時、Ｔ細胞は、対照のテトラマーもしくはペンタマー、または上記に同定されたＨＢＶペプチドエピトープに特異的なテトラマーもしくはペンタマーを用いて染色される。テトラマーまたはペンタマーで陽性に染色されるＣＤ８＋Ｔ細胞の比率（％）はフローサイトメトリーによって定量される。
【０４４０】
本発明の酵母‐ＨＢＶ免疫療法薬を用いた、ＨＢＶ陽性の提供者由来のドナーＴ細胞の刺激は、対照と比較して、提供者の少なくとも一部または大多数においてテトラマー／ペンタマーで陽性のＣＤ８＋Ｔ細胞の比率を高め、ＨＢＶ感染者由来のヒトＴ細胞が、酵母系免疫療法によって運ばれたＨＢＶタンパク質を免疫原として認識する能力を有することを示すことが予想される。
【０４４１】
上記に類似したさらなる実験が、正常な（ＨＢＶ非感染の）個体由来のドナーＰＢＭＣを使用して実行される。本発明の酵母‐ＨＢＶ免疫療法薬を用いた、正常な提供者由来のドナーＴ細胞の刺激は、対照と比較して、提供者の少なくとも一部または大多数においてテトラマー／ペンタマーで陽性のＣＤ８＋Ｔ細胞の比率を高め、非感染者由来のヒトＴ細胞も、酵母系免疫療法によって運ばれたＨＢＶタンパク質を免疫原として認識する能力を有することを示すことが予想される。
【０４４２】
さらなる実験では、上述の実験の提供者のうち３人に由来するＨＢＶ特異的Ｔ細胞を、酵母系ＨＢＶ免疫療法薬（例えば実施例１〜８のいずれかまたは本明細書中他所に記載されたもの）とともにインキュベートされたＤＣを使用して、（上述のように）ＩＶＳ  ２サイクルにわたってｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させる。３回目のＩＶＳは、ＣＤ４０Ｌの存在下で成熟させてＨＢＶペプチドでパルスされたＤＣを用いて実行される。５日目にＣＤ８＋Ｔ細胞が単離されて、ＨＢＶ抗原を発現する腫瘍細胞標的に対する一晩の細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）アッセイに、様々なエフェクター：標的（ＥＴ）比で使用される。対照テトラマー／ペンタマーとＨＢＶ特異的テトラマー／ペンタマーとを用いて陽性に染色されるＣＤ８＋Ｔ細胞の比率（％）が測定される。
【０４４３】
提供者の一部または全員に由来するＴ細胞が、ＨＢＶ抗原を発現する標的を殺滅することのできるＣＤ８＋ＣＴＬを生成する能力を有するであろうことが予想される。これらのデータは、酵母‐ＨＢＶ免疫療法組成物が、ＨＢＶ抗原を発現する腫瘍細胞を殺滅する能力を有するＨＢＶ特異的ＣＴＬを生成することができることを実証するであろう。
【０４４４】
実施例１７
次の実施例は、健康なボランティアにおける第１相臨床試験について述べる。
１２週間、非盲検の用量漸増第１相臨床試験は、ＧＩ‐１３００９として本明細書中に記載された酵母系ＨＢＶ免疫療法組成物（「ＳＣＯＲＥ‐Ｄ」、配列番号１１８を含む、実施例７）、またはその代わりに、ＧＩ‐１３０２０として本明細書中に記載された酵母系ＨＢＶ免疫療法組成物（「Ｘ‐ＳＣＯＲＥ」、配列番号１３０を含む、実施例８）を使用して実施される。本明細書中に記載されたその他の酵母系ＨＢＶ免疫療法組成物（例えば実施例１〜８に記載されたもののうちいずれか）が、同様の第１相臨床試験において利用されてもよい。第１相臨床試験のための酵母系ＨＢＶ免疫療法産物は、最も強力な正味の免疫応答プロファイル（例えば、陽性の結果を最も良く予測するＴ細胞エピトープについての応答の大きさ、およびある範囲のエピトープにわたる免疫応答の幅）を含む考察に基づいて、前臨床研究（例えば実施例９〜１７のうちのいずれか１つに記載されたもの）から選択される。
【０４４５】
対象者は、過去または現時点でＨＢＶ感染の兆候または記録を持たない、免疫が機能している健康なボランティアである。
上記基準を満たすおよそ４８人の対象者（６治療群、１群あたり対象者８人）に、酵母系ＨＢＶ免疫療法組成物が、２つの異なる投薬プロトコールのうち１つを用いて連続用量コホート漸増（sequential dose cohort escalation）プロトコールで、すなわち：
プロトコールＡ：初回‐ブースト投薬（１日目で開始して４回の週１回投薬、続いて４週および８週における２回の月１回投薬）
治療群１Ａ：２０Ｙ．Ｕ．（２か所の異なる部位に１０Ｙ．Ｕ．用量を投与）；
治療群２Ａ：４０Ｙ．Ｕ．（４か所の異なる部位に１０Ｙ．Ｕ．用量を投与）；
治療群３Ａ：８０Ｙ．Ｕ．（４か所の異なる部位に２０Ｙ．Ｕ．用量を投与）
４週毎の投薬（１日目、４週目および８週目に投与される全３回の投薬）
治療群１Ｂ：２０Ｙ．Ｕ．（２か所の異なる部位に１０Ｙ．Ｕ．用量を投与）；
治療群２Ｂ：４０Ｙ．Ｕ．（４か所の異なる部位に１０Ｙ．Ｕ．用量を投与）；
治療群３Ｂ：８０Ｙ．Ｕ．（４か所の異なる部位に２０Ｙ．Ｕ．用量を投与）、
のように投与される。
【０４４６】
用量はすべて皮下に投与され、かつ１回量は、上記のように身体上の２か所または４か所の部位に（診察時ごとに（every visit））分割される。安全性および免疫原性（例えばＥＬＩＳｐｏｔおよびＴ細胞増殖によって測定される抗原特異的Ｔ細胞応答）が評価される。具体的には、ＥＬＩＳｐｏｔに基づいたアルゴリズムが応答細胞分類別に（for categorical responders）開発されている。調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を測定するＥＬＩＳｐｏｔアッセイも評価され、またＨＢＶ抗原に応答したＣＤ４＋Ｔ細胞増殖が評価されて抗サッカロマイセス・セレビシエ抗体（ＡＳＣＡ）の出現と関連付けられる。
【０４４７】
酵母系ＨＢＶ免疫療法薬は、忍容性が良好であり、かつＥＬＩＳｐｏｔアッセイ、リンパ球増殖アッセイ（ＬＰＡ）、ＨＢＶ抗原によるｅｘ  ｖｉｖｏＴ細胞刺激、および／またはＡＳＣＡのうち１つ以上によって測定されるような免疫原性を示すであろうことが予想される。
【０４４８】
実施例１８
次の実施例は、Ｂ型肝炎ウイルスに慢性感染した対象者における第１ｂ／２ａ相臨床試験について述べる。
【０４４９】
ＨＢＶ感染者は該疾患の自然経過の一部として肝炎の不安定な増悪を経験しやすいことから、酵母系ＨＢＶ免疫療法は、抗ウイルス薬による治療法を用いた部分的または完全なウイルス制御からある程度の期間の後に、セロコンバージョン率を向上させるという主要有効性の目標（primary efficacy goal）とともに、開始される。この第１の強化療法では、酵母系ＨＢＶ免疫療法は、セロコンバージョン率が継続的な抗ウイルス薬療法との併用で改善されうるかどうかを判断するために、患者がＰＣＲによるＨＢＶ  ＤＮＡ陰性を達成した後で、該患者において使用される。
【０４５０】
非盲検の用量漸増第１ｂ／２ａ相臨床試験は、ＧＩ‐１３００９として本明細書中に記載された酵母系ＨＢＶ免疫療法組成物（「ＳＣＯＲＥ‐Ｄ」、配列番号１１８を含む、実施例７）を使用して実行されるか、またはその代わりに、ＧＩ‐１３０２０として本明細書中に記載された酵母系ＨＢＶ免疫療法組成物（「Ｘ‐ＳＣＯＲＥ」、配列番号１３０を含む、実施例８）が使用される。本明細書中に記載された他の酵母系ＨＢＶ免疫療法組成物（例えば実施例１〜８に記載されたもののうちいずれか）が、同様の第１相臨床試験において利用されてもよい。対象者は、免疫が機能しており、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に慢性感染しているがＨＢＶ  ＤＮＡレベルで測定されるように抗ウイルス薬療法（すなわち、フマル酸テノホビルジソプロキシル、またはＴＤＦ（ＶＩＲＥＡＤ（登録商標）））によって良好に制御されている。対象者は、ＨＢＶ  ＤＮＡについて陰性（ＰＣＲによる検出可能レベル未満または＜２０００ＩＵ／ｍｌ）であるが、本試験について適格であるためには、対象者は、ＨＢｅＡｇ陽性であってかつ肝硬変または代償不全の兆候のない者でなければならない。
【０４５１】
この試験の第１段階では、上記の基準を満たすおよそ４０人の対象者（１治療群あたり約５人の対象者）に、０．０５Ｙ．Ｕ．〜８０Ｙ．Ｕ．の範囲（例えば０．０５Ｙ．Ｕ．、１０Ｙ．Ｕ．、２０Ｙ．Ｕ．および４０〜８０Ｙ．Ｕ．）の用量を用いる連続用量コホート漸増プロトコールで、酵母系ＨＢＶ免疫療法組成物が投与される。１つのプロトコールでは、５回の週１回用量が皮下投与され（週１回投薬を４週間）、その後２〜４回の月１回用量も皮下投与され、酵母系ＨＢＶ免疫療法を用いた治療（初回‐ブーストプロトコール）の間も抗ウイルス薬療法が継続されることになろう。第２のプロトコールでは、４週毎投薬プロトコールに従って、対象者に、上述と同じ用量漸増法を使用して１日目、４週および８週に投与される合計３回分が投与される。任意選択で、１つの試験では、１つの患者コホート（患者５〜６人）は免疫療法＋抗ウイルス薬療法の継続と同じスケジュールで偽薬（ＰＢＳ）の皮下注射を受けることになる。慎重な停止規則がＡＬＴフレアおよび減圧症（decompression）の徴候について設けられる。
【０４５２】
この試験の第２段階では、対象者（ｎ＝６０）は、抗ウイルス薬（ＴＤＦ）単独または抗ウイルス薬＋酵母系ＨＢＶ免疫療法プロトコール（用量１および用量２）を４８週まで継続するために、１治療群あたり３０人に無作為化される。
【０４５３】
安全性、ＨＢＶ抗原の動態、ＨＢｅＡｇおよびＨＢｓＡｇセロコンバージョン、ならびに免疫原性（例えばＥＬＩＳｐｏｔによって測定される抗原特異的Ｔ細胞応答）が評価される。加えて、用量依存的な生化学的負荷（ＡＬＴ）およびウイルス負荷がモニタリングされる。具体的には、１２週、２４週、４８週における３つの治療群の間の治療中の血清ＨＢｓＡｇ低下の尺度が測定され、ＨＢｓＡｇの消失／セロコンバージョンは４８週において測定される。
【０４５４】
酵母系免疫療法およびＴＤＦを投与されている対象者における、ＨＢｓＡｇ消失速度の増大および４８週における＞２０％のセロコンバージョンのうち少なくとも一方は、ＴＤＦのみを投与されている対象者と比較すると、臨床的に有意な向上と考えられる。酵母系ＨＢＶ免疫療法組成物は、慢性的に感染したＨＢＶ患者に治療上の利点を提供するものと予想される。該免疫療法は、送達されるすべての用量において安全かつ忍容性が良好であると予想される。少なくとも最高用量の酵母系ＨＢＶ免疫療法を投与されている患者は、ＥＬＩＳＰＯＴによって決定されるような治療により出現するＨＢＶ特異的Ｔ細胞応答を示すと予想され、また事前にベースラインのＨＢＶ特異的Ｔ細胞応答を備えていた患者は、治療中にＨＢＶ特異的Ｔ細胞応答の向上を示すと予想される。酵母系ＨＢＶ免疫療法を受けている患者は、抗ウイルス薬の群と比較して、かつ／または、用いられる場合には偽薬対照群と比較して、セロコンバージョン率の向上を示すと予想される。ＡＬＴ正常化における向上が、酵母系ＨＢＶ免疫療法を受けている患者において予想される。
【０４５５】
別例の試験では、ＨＢｅＡｇ陰性の患者であって他の基準（免疫が機能している、ＨＢＶに慢性感染している、抗ウイルス薬で良好に制御されている、代償不全の徴候がない）を満たしている患者が、上述と同様の用量漸増試験において（または上述の試験で同定された最大耐用量もしくは最適用量で）治療される。患者は、安全性、免疫原性およびＨＢｓＡｇセロコンバージョンについてモニタリングされる。
【０４５６】
実施例１９
次の実施例はＢ型肝炎ウイルスに慢性感染した対象者における第１ｂ／２ａ相臨床試験について述べる。
【０４５７】
非盲検の用量漸増第１ｂ／２ａ相臨床試験は、ＧＩ‐１３００９として本明細書中に記載された酵母系ＨＢＶ免疫療法組成物（「ＳＣＯＲＥ‐Ｄ」、配列番号１１８を含む、実施例７）を使用して行われるか、またはその代わりに、ＧＩ‐１３０２０として本明細書中に記載された酵母系ＨＢＶ免疫療法組成物（「Ｘ‐ＳＣＯＲＥ」、配列番号１３０を含む、実施例８）が使用される。本明細書中に記載された他の酵母系ＨＢＶ免疫療法組成物（例えば実施例１〜８に記載されたもののうちいずれか）が、同様の第１ｂ／２ａ相臨床試験において利用されてもよい。対象者は、免疫が機能しており、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に慢性感染しているが抗ウイルス薬療法（例えばテノフォビル（ＶＩＲＥＡＤ（登録商標）））によって少なくとも３か月間制御されている。対象者は本試験に登録するためにウイルスを完全に排除している必要はない、すなわち、患者は、ＨＢＶ  ＤＮＡについて陽性であっても陰性であってもよい（陰性であることはＰＣＲによる検出可能レベル未満または＜２０００ＩＵ／ｍｌとして判定される）が；しかし本試験に適格であるためには、対象者は肝硬変または代償不全の兆候を有していない。患者はＨＢｅＡｇ陽性であるとよいが、ＨＢｅＡｇ陰性の患者が本試験に含まれることも可能である。
【０４５８】
上記の基準を満たしている３０〜４０人の対象者（１コホートあたり６〜１０人の患者）に、０．０５Ｙ．Ｕ．〜４０Ｙ．Ｕ．の範囲の用量（例えば０．０５Ｙ．Ｕ．、０．５Ｙ．Ｕ．、４Ｙ．Ｕ．、４０Ｙ．Ｕ．）を用いて、または０．０５Ｙ．Ｕ．〜８０Ｙ．Ｕ．の範囲の用量（例えば０．０５Ｙ．Ｕ．、１０Ｙ．Ｕ．、２０Ｙ．Ｕ．、４０／８０Ｙ．Ｕ．）を用いて、連続用量コホート漸増プロトコールで酵母系ＨＢＶ免疫療法組成物が投与される。１つのプロトコールでは、５回の週１回用量が皮下投与され（週１回投薬を４週間）、その後２〜４回の月１回用量も皮下投与され、酵母系ＨＢＶ免疫療法を用いた治療（初回‐ブーストプロトコール）の間も抗ウイルス薬療法が継続されることになろう。第２のプロトコールでは、４週毎投薬プロトコールに従って、対象者に、上述と同じ用量漸増法を使用して１日目、４週および８週に投与される合計３回分が投与される。１つの試験では、１つの患者コホート（患者５〜６人）は、免疫療法＋抗ウイルス薬療法の継続と同じスケジュールで偽薬（ＰＢＳ）の皮下注射を受けることになる。慎重な停止規則がＡＬＴフレアおよび減圧症（decompression）の徴候について設けられる。
【０４５９】
安全性、ＨＢｅＡｇおよびＨＢｓＡｇセロコンバージョン、ウイルス制御（例えばウイルス陰性の達成またはウイルス陰性へ向かう傾向）、ならびに免疫原性（例えばＥＬＩＳｐｏｔによって測定される抗原特異的なＴ細胞応答）が評価される。加えて、用量依存的な生化学的負荷（ＡＬＴ）およびウイルス負荷がモニタリングされる。
【０４６０】
２４週までにＨＢ‐ＳＡｇが＞１ｌｏｇ１０低減されること、または１２週までにＨＢ‐ｅＡｇが＞１ｌｏｇ１０低減されることが、第２ａ相のエンドポイントであると考えられる。ＨＢＶセロコンバージョンについては、２４週までに１０％、および４８週までに１５％のＳＡｇセロコンバージョン、ならびに、２４週までに２５％または４８週までに５０％のｅＡｇセロコンバージョン率が成功基準である。
【０４６１】
酵母系ＨＢＶ免疫療法組成物は、慢性感染したＨＢＶ患者に治療上の利点を提供するものと予想される。該免疫療法は、送達されるすべての用量において安全かつ忍容性が良好であると予想される。少なくとも最高用量の酵母系ＨＢＶ免疫療法を受ける患者は、ＥＬＩＳＰＯＴによって決定されるような治療により出現するＨＢＶ特異的Ｔ細胞応答を示すと予想され、また事前にベースラインのＨＢＶ特異的Ｔ細胞応答を備えていた患者は、治療中にＨＢＶ特異的Ｔ細胞応答の向上を示すと予想される。酵母系ＨＢＶ免疫療法を受ける患者は、与えられた抗ウイルス薬について利用可能な比較データと比較して、かつ／または、偽薬の対照群と比較して、セロコンバージョン率の改善を示すであろう。酵母系ＨＢＶ免疫療法を受ける患者は、ウイルスの消失（例えばＰＣＲによって測定されるようなウイルス陰性）における改善を示すであろう。ＡＬＴ正常化における向上が、酵母系ＨＢＶ免疫療法を受けている患者において予想される。
【０４６２】
実施例２０
次の実施例は、Ｂ型肝炎ウイルスに慢性感染した対象者における第２相臨床試験について述べる。
【０４６３】
ＨＢＶに慢性感染した患者における無作為化第２相臨床試験は、治療を受けたことのない、ＨＢｅＡｇ陽性（場合によってはＨＢｅＡｇ陰性）の、ＡＬＴ＞２×ＵＬＮおよびウイルス負荷＞１００万コピーである対象者を治療する。対象者（１治療群あたり約６０人の対象者は第１相試験のシグナルに基づいて調整）は、少なくとも６か月の事前の抗ウイルス薬療法を受けていなければならず、少なくとも１か月の間隔をあけて連続２回の診察時においてウイルス陰性でなければならない。対象者は２つの治療群に無作為化割付される。治療群１の患者は、２４〜４８週間の酵母系ＨＢＶ免疫療法を受ける（例えばＧＩ‐１３００９として本明細書中に記載された酵母系ＨＢＶ免疫療法組成物（「ＳＣＯＲＥ‐Ｄ」、配列番号１１８を含む、実施例７）、またはその代わりに、ＧＩ‐１３０２０として本明細書中に記載された酵母系ＨＢＶ免疫療法組成物（「Ｘ‐ＳＣＯＲＥ」、配列番号１３０を含む、実施例８））。免疫療法を受ける患者は全て抗ウイルス薬療法（例えばテノフォビル（ＶＩＲＥＡＤ（登録商標）））を継続する。治療群２の患者は、継続的な抗ウイルス薬療法とともに偽薬（ＰＢＳ対照の注射）を受ける。主要評価項目はセロコンバージョンおよびウイルス陰性であることである。本明細書中に記載されたさらなる酵母系ＨＢＶ免疫療法組成物（例えば実施例１〜８に記載されたもののうちいずれか）も、同様の設計の第２相臨床試験において利用されうる。
【０４６４】
セロコンバージョンを達成する患者は、酵母免疫療法および抗ウイルス薬（治療群１）または抗ウイルス薬のみ（治療群２）のいずれかの６〜１２か月の強化療法を受けた後に、６か月の治療休止日となる。６か月の休止日の終了後に依然として寛解状態である患者の数が、該試験の副次的評価項目を表わす。さらなる評価項目には、上記のヒト臨床試験について記載する実施例で議論されるように、安全性、免疫原性およびＡＬＴ正常化が含まれる。
【０４６５】
酵母系ＨＢＶ免疫療法組成物は、慢性的に感染したＨＢＶ患者に治療上の利点を提供するものと予想される。該免疫療法は、安全かつ忍容性が良好であると予想される。酵母系ＨＢＶ免疫療法を受ける患者は、ＥＬＩＳＰＯＴによって決定されるような治療により出現したＨＢＶ特異的Ｔ細胞応答を示すと予想され、また事前にベースラインのＨＢＶ特異的Ｔ細胞応答を備えていた患者は、治療中にＨＢＶ特異的Ｔ細胞応答の向上を示すと予想される。酵母系ＨＢＶ免疫療法を受ける患者は、偽薬対照群と比較して、セロコンバージョン率の改善を示すと予想される。酵母系ＨＢＶ免疫療法を受ける患者は、ウイルスの消失（例えばＰＣＲによって測定されるようなウイルス陰性）における改善を示すと予想される。ＡＬＴ正常化における向上が、酵母系ＨＢＶ免疫療法を受けている患者において予想される。
【０４６６】
本発明の様々な実施形態について詳細に説明してきたが、当然ながら当業者にはそれらの実施形態の改変形態および修正形態が思い浮かぶであろう。しかしながら、明らかに了解されることであるが、添付の特許請求の範囲に記載されるように、そのような改変形態および修正形態は本発明の範囲内にある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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【図３０Ｄ】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【配列表】
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