(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
パンクレリパーゼ固形組成物から溶出溶媒中に放出される消化酵素の量を測定する方法において、前記組成物から前記溶出溶媒中に放出される消化酵素の前記量を測定するために蛍光分光法を使用するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記パンクレリパーゼ固形組成物は腸溶性パンクレリパーゼ組成物であることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１又は２の方法において、前記溶出溶媒は水、ＨＣｌ溶液、人工胃液、緩衝液、人工腸液、少なくとも１種の界面活性剤を含む水溶液または緩衝液であることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１、２又は３に記載の方法において、（ａ）前記固形パンクレリパーゼ組成物から前記消化酵素を前記溶出溶媒中に放出させるステップと、ｂ）前記蛍光を読み取り前記溶媒中の消化酵素の前記量を測定するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１、２、３又は４に記載の方法において、前記溶出溶媒は経時的に用いられる少なくとも２種の溶媒からなることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法において、ａ）前記固形パンクレリパーゼ組成物を第１の溶出溶媒に加えるステップと、ｂ）前記懸濁液を第２の溶出溶媒に移すステップと、ｃ）前記消化酵素の前記放出を引き起こすステップと、ｄ）溶出溶媒のアリコートをサンプリングするステップと、ｅ）３４６ｎｍで蛍光を読み取るステップと、ｆ）放出された消化酵素の前記量を算出するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法において、前記第１の溶出溶媒はｐＨ約１〜約４．５を有する水性溶媒であり、前記第２の溶出溶媒は約５を超えるｐＨを有する水性緩衝液であることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項６又は７に記載の方法において、前記第１の溶出溶媒はｐＨ約１〜約２を有する水性溶媒であることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項６、７又は８に記載の方法において、前記第２の溶出溶媒はｐＨ約５．５〜約６．８を有する水性緩衝液であることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項６、７、８又は９に記載の方法において、前記第１の溶出溶媒はｐＨ約１．２を有する水性溶媒であり、前記第２の溶出溶媒はｐＨ約６を有する水性緩衝液であることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０に記載の方法において、前記パンクレリパーゼ組成物は合計で約７５０ＵＳＰリパーゼ単位、約３，０００ＵＳＰリパーゼ単位、約４，２００ＵＳＰリパーゼ単位、約５，０００ＵＳＰリパーゼ単位、約６，０００ＵＳＰリパーゼ単位、約１０，０００ＵＳＰリパーゼ単位、約１０，５００ＵＳＰリパーゼ単位、約１５，０００ＵＳＰリパーゼ単位、約１６，８００ＵＳＰリパーゼ単位、約２０，０００ＵＳＰリパーゼ単位、約２１，０００ＵＳＰリパーゼ単位、約２４，０００ＵＳＰリパーゼ単位、もしくは約２５，０００、もしくは約４０，０００ＵＳＰリパーゼ単位またはこれらの倍数、あるいは約５，０００ＰｈＥｕｒリパーゼ単位、もしくは約１０，０００ＰｈＥｕｒリパーゼ単位、もしくは約１５，０００ＰｈＥｕｒリパーゼ単位もしくは約２０，０００ＰｈＥｕｒリパーゼ単位もしくは約３０，０００ＰｈＥｕｒリパーゼ単位、もしくは約４０，０００ＰｈＥｕｒリパーゼ単位またはこれらの倍数を有することを特徴とする方法。
【請求項１２】
腸溶性（ｇａｓｔｒｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）試験と組み合わせた請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９，１０又は１１に記載の方法において、腸溶性が水性溶媒中の前記組成物の残存リパーゼ活性を特定のリパーゼアッセイ法で決定することにより測定されることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法において、前記水性溶媒はｐＨ約１〜約２を有することを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１２に記載の方法において、前記水性溶媒はｐＨ約１．２を有することを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１３又は１４に記載の方法において、前記固形組成物から溶出溶媒中に放出される消化酵素の量の蛍光分光法による前記測定は、前記腸溶性（ｇａｓｔｒｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）試験の前あるいは後に行われることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１３、１４又は１５に記載の方法において、前記固形組成物から溶出溶媒中に放出される消化酵素の量の蛍光分光法による前記測定は、経時的に使用される少なくとも２種の溶媒からなる溶出溶媒中で行われることを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法において、前記第１の溶出溶媒は酸性ｐＨ約１〜約４．５を有する水性溶媒であることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１６又は１７に記載の方法において、前記第１の溶出溶媒はｐＨ約１〜約２を有する水性溶媒であることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１６、１７又は１８に記載の方法において、前記第２の溶出溶媒は約５を超えるｐＨを有する水性緩衝液であることを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１６、１７、１８又は１９に記載の方法において、前記第２の溶出溶媒はｐＨ約５．５〜約６．８を有する水溶液であることを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項１６、１７、１８、１９又は２０に記載の方法において、前記第１の溶出溶媒はｐＨ約１．２を有する水性溶媒であり、前記第２の溶出溶媒はｐＨ約６を有する水性緩衝液であることを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２１に記載の方法において、前記パンクレリパーゼ組成物は合計で約７５０ＵＳＰリパーゼ単位、約３，０００ＵＳＰリパーゼ単位、約４，２００ＵＳＰリパーゼ単位、約５，０００ＵＳＰリパーゼ単位、約６，０００ＵＳＰリパーゼ単位、約１０，０００ＵＳＰリパーゼ単位、約１０，５００ＵＳＰリパーゼ単位、約１５，０００ＵＳＰリパーゼ単位、約１６，８００ＵＳＰリパーゼ単位、約２０，０００ＵＳＰリパーゼ単位、約２１，０００ＵＳＰリパーゼ単位、約２４，０００ＵＳＰリパーゼ単位、約２５，０００ＵＳＰリパーゼ単位、もしくは約４０，０００ＵＳＰリパーゼ単位またはこれらの倍数、あるいは約５，０００ＰｈＥｕｒリパーゼ単位、もしくは約１０，０００ＰｈＥｕｒリパーゼ単位、もしくは約１５，０００ＰｈＥｕｒリパーゼ単位もしくは約２０，０００ＰｈＥｕｒリパーゼ単位もしくは約３０，０００ＰｈＥｕｒリパーゼ単位、もしくは約４０，０００ＰｈＥｕｒリパーゼ単位またはこれらの倍数を有することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固形組成物から溶出溶媒中に放出される消化酵素の量を蛍光分光法により測定する方法を対象とする。本発明はさらに、パンクレリパーゼを含む固形組成物の溶出および腸溶性（ｇａｓｔｒｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）の両方を測定するための組み合わせた方法も対象とする。
【背景技術】
【０００２】
錠剤またはカプセル剤などの固形医薬組成物または剤形は一般に、活性成分（単数または複数）と賦形剤（単数または複数）との混合物からなる。経口投与後の固形組成物からの活性成分（薬剤）の吸着に関する再現性は、生理条件下での組成物からの薬剤の放出、および薬剤の溶出または可溶化などいくつかの因子によって決まる。組成物からの薬剤の放出、および薬剤の溶出または可溶化は決定的な性質であるため、溶出試験はインビボでの薬剤の性能を予測するのに非常に意義がある。ＦＤＡおよびＥＭＡなどの薬剤承認機関は、多くの場合、承認を得るために新しい医薬組成物の薬物放出特性を判定するように製薬会社に要求する。また、これらの試験は、製品の承認、生物学的同等性の要件の免除、または推奨要件以外の生物学的同等性要件の要求の立証を目的として、医薬組成物のバッチ間の品質を評価するＵＳＰ品質パラメーターとしても要求されることがある。
【０００３】
インビトロ溶出試験を行うための様々なプロトコルが開発されており、製品開発および品質管理の両方に日常的に応用されている。薬剤溶出試験は主に、米国薬局方および欧州薬局方、たとえばＵＳＰ３４＜７１１＞およびＥＰ７．２、２．９．３などの推奨されるコンペンディアの方法および装置を用いて行われる。こうした試験に典型的に使用される溶出溶媒は、たとえば水、およびリン酸塩緩衝液またはクエン酸塩緩衝液などの緩衝液である。様々な撹拌方法に基づき様々な種類の溶出装置が市販されており、コンペンディアの方法により認められている。こうした装置として、パドル、バスケット、フロースルー、およびｒｅｃｉｐｒｏｃａｔｉｎｇ  ｃｙｌｉｎｄｅｒが挙げられる。厳密な手順（プロトコル）および装置は異なるが、薬剤の溶出試験の方法はすべて医薬組成物または剤形を溶出溶媒に加え、試験中の薬剤の崩壊および溶出を促すため溶出溶媒にある程度の撹拌を施すことを含む。
【０００４】
溶出溶媒と、溶出溶媒中に放出された薬剤の量を判定する検出方法とは、薬剤の化学的性質によって異なり（選択され）、適切な選択を行うには、物理的考察および安定性に関する考察も非常に重要である。
【０００５】
パンクレリパーゼ遅延放出カプセルなどの経口投与形態の医薬品から放出される消化酵素の判定に関するｐａｎｃｒｅｌｉｐａｓｅ  Ｄｅｌａｙｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｃａｐｓｕｌｅ，ＵＳＰ  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈに含まれる試験は、リパーゼ活性の特定の測定に基づく。こうした方法は長い解析時間を必要とし、いくつかの欠点による影響を受ける。主な欠点は溶出溶媒における、より正確には腸溶性段階緩衝液（ｐＨ６．０）溶出溶媒におけるマーカー−リパーゼの不安定性である。リパーゼ分解の程度を確認し、その後、溶出の算出に補正係数を導入して試験中のリパーゼ活性の損失を説明する必要がある。さらに、方法の複雑さ（試薬／基質の調製と定量分析との両方）により、結果の変動性が非常に大きくなり、実験室内／実験室間の結果の再現性も低下する。さらに、リパーゼアッセイは直線性範囲も狭く（８〜１６ＵＳＰ単位／ｍＬ）、これは、このアッセイが６，４００〜１２，８００ＵＳＰ  ＵＩ／カプセルの範囲のカプセルの力価しかカバーせず、したがって単一ユニットの試験アプローチを実施できないため、大きな制約となる。本方法の長い解析時間により、多点溶出プロファイルの判定に本方法を使用する可能性が限定される。
【０００６】
固形組成物からの消化酵素の放出を判定する際のこれらの欠点を克服する方法について記載した方法／手順は存在しない。
【０００７】
パンクレリパーゼおよび他の膵酵素製剤（ＰＥＰ）などの消化酵素は膵外分泌不全（ＥＰＩ）に罹患している患者に投与してもよく、消化酵素補充剤を投与すると、患者はより効率的に食物を消化することができる。
【０００８】
ＦＤＡによれば２００，０００人を超える米国人が罹患していると推計される膵外分泌不全（ＥＰＩ）は、膵臓で作られる消化酵素の欠乏により食物を適切に消化できない生理的障害を伴う。こうした消化酵素の欠乏は栄養素の消化不良および吸収障害などの障害をきたし、栄養不良およびその結果それに関連する他の望ましくない生理的状態に至る。これらの障害は、嚢胞性線維症（ＣＦ）および膵臓の外分泌機能を損なっている他の状態、たとえば膵癌、膵切除および膵炎の人によく見られる。栄養不良は、特に乳児およびＣＦ患者の場合、未治療で放置すると生命を危うくする恐れがあり、本障害は、成長障害、免疫応答の低下および平均余命の短縮につながることがある。
【０００９】
消化酵素、たとえばパンクレリパーゼおよび他の膵酵素製剤（ＰＥＰ）を投与すれば、ＥＰＩの少なくとも一部を治療することができる。投与された消化酵素により、患者はより効率的に食物を消化することができる。
【００１０】
失われた消化機能を補うためＥＰＩの処置に使用されてきた膵酵素は、６０年を超えて使用されている。膵酵素の使用は最近まで、安全性と有効性と製造管理とに基づき薬剤の承認を規定する現在の規制ガイドラインの対象ではなかった。このほど、膵酵素補充療法剤は、米国および欧州の規制当局の取り組みの対象になった。この取り組みは、市販の膵酵素製剤の商業的取引を引き続き行うためには、現在の医薬品承認審査を経るように要求するものである。Ｚｅｎｐｅｐ（登録商標）、Ｃｒｅｏｎ（登録商標）およびＰａｎｃｒｅａｚｅ（登録商標）は、ＦＤＡが定めた審査を通過し、米国での販売が承認された３つの製品である。やはり同様の取り組みが進行中であるか、または今のところ実施していない他の地域／国では、依然として種々の膵酵素製剤を入手することができる。
【００１１】
パンクレリパーゼなどの消化酵素を含むカプセル剤は、経口投与用に開発されてきた。しかしながら、患者がカプセル剤を嚥下できない場合、各カプセル剤を開けて、内容物を少量の食物、通常軟らかい酸性食物（たとえば市販されているアップルソース）にふりかけて、スプーンで患者に経口投与してもよい。あるいは、こうした薬は、シリンジ装置により投与しやすい溶媒に懸濁した内容物を含むシリンジ装置を使用して乳児および小児に経口投与してもよい。
【００１２】
パンクレリパーゼ製品は一般に、３つの酵素クラス、リパーゼ、アミラーゼおよびプロテアーゼを含むものとして表示され、そのレベルまたは力価が記載される。これらの酵素は、脂肪のグリセロールおよび脂肪酸への加水分解、デンプンのデキストリンおよび糖への加水分解、およびタンパク質のアミノ酸および誘導物質への加水分解を触媒する。消化は一方で、正しい消化機能に寄与し、かつ様々な消化産物を作る多くの他の酵素および基質が関与する複雑なプロセスである。パンクレリパーゼに含まれる他の酵素としては、特にトリプシン、カルボキシペプチダーゼ、エラスターゼ、ホスホリパーゼおよびコールエステラーゼ、ならびに様々な補助因子およびコエンザイムが挙げられる。これらの物質は、膵臓で自然に作られ、正しい消化機能にも寄与する。
【００１３】
パンクレリパーゼは典型的には、ブタの膵腺から調製されるが、他の供給源、たとえば各々その全体をあらゆる目的において本明細書に援用する米国特許第６，０５１，２２０号明細書、米国特許出願公開第２００４／００５７９４４号明細書、米国特許出願公開第２００１／００４６４９３号明細書、および国際公開第２００６０４４５２９号パンフレットに記載されたものを使用してもよい。
【００１４】
膵酵素は、中性に近い若干アルカリ性の条件下で最適な活性を示す。胃条件下では、膵酵素は不活化し、結果として生物活性を失うことがある。したがって、外部から投与される酵素は一般に胃の不活性化を防止し、胃から十二指腸への移動の間に未変化の状態が続く。よって、膵酵素をコーティングすると望ましい。膵リパーゼは胃の不活性化に対して最も感受性があり、吸収障害の処置に重要な酵素である。リパーゼ活性は典型的には、リパーゼを含む酵素組成物の安定性を判定するためにモニターされる。Ｏｒｔｅｎｚｉ  ｅｔ  ａｌ．に付与された米国特許第７，６５８，９１８号明細書の内容全体は、明示的にその全体をあらゆる目的において援用する。そこには安定な消化酵素組成物が記載されており、経口投与されるある種の微粒子薬物が患者の胃を通過し、その後腸内に放出されるように設計されること説明している。こうした微粒子薬物の患者、特に乳児および小児への適切な投与量の投与は、可能な限り正確であるべきである。
【００１５】
残念ながら、固形医薬組成物または剤形から放出される消化酵素の量を優れた精度および高感度で測定し、かつ異なる実験室間ですぐに行える方法は、記載されていない。
【発明の概要】
【００１６】
本発明は、固形組成物から溶出溶媒中に放出される消化酵素の量を蛍光分光法により測定する方法を対象とする。本発明はさらに、パンクレリパーゼを含む固形組成物の溶出および腸溶性（ｇａｓｔｒｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）の両方を測定するための組み合わせた方法も対象とする。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】パンクレリパーゼビーズ（Ｚｅｎｐｅｐ（登録商標）ミニ錠剤）−プロテアーゼアッセイの溶出プロファイル（平均曲線）である。
【図２】パンクレリパーゼビーズ（Ｚｅｎｐｅｐ（登録商標）ミニ錠剤）−リパーゼアッセイの溶出プロファイル（平均曲線）である。
【図３】蛍光分光法によるパンクレリパーゼビーズ（Ｚｅｎｐｅｐ（登録商標）ミニ錠剤）−総タンパク質アッセイの溶出プロファイル（平均曲線）である。
【図４ａ】パンクレリパーゼビーズ（Ｚｅｎｐｅｐ（登録商標）ミニ錠剤）：酵素特異的測定と総タンパク質量の蛍光定量の溶出プロファイルである。
【図４ｂ】パンクレリパーゼビーズ（Ｚｅｎｐｅｐ（登録商標）ミニ錠剤）：リパーゼアッセイと総タンパク質量の蛍光定量の溶出プロファイルである。
【図４ｃ】パンクレリパーゼビーズ（Ｚｅｎｐｅｐ（登録商標）ミニ錠剤）：プロテアーゼアッセイと総タンパク質量の蛍光定量の溶出プロファイルである。
【図５】パンクレリパーゼ組成物（Ｚｅｎｐｅｐ（登録商標）およびＣｒｅｏｎ（登録商標））の溶出プロファイルである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、固形組成物から溶出溶媒中に放出される消化酵素の量を蛍光分光法により測定する方法を対象とする。その量は、固形組成物または剤形または単一ユニット形態から放出される消化酵素の％として測定する。
【００１９】
本発明の方法の別の実施形態では、固形組成物はパンクレリパーゼを含む製剤であり、より詳細には固形組成物は薬学的に不活性な賦形剤を含む腸溶性パンクレリパーゼ組成物である。
【００２０】
別の実施形態では、本方法は、（ａ）固形パンクレリパーゼ組成物から消化酵素を溶出溶媒中に放出させるステップと、（ｂ）蛍光を読み取り溶媒中の消化酵素の量を測定するステップとを含む。
【００２１】
本発明の別の実施形態では、溶出溶媒は水、ＨＣｌ溶液、人工胃液、緩衝液、人工腸液、または少なくとも１種の界面活性剤を含む水溶液もしくは緩衝液である。
【００２２】
別の実施形態では、溶出溶媒は経時的に用いられる少なくとも２種の溶媒からなる。また、本方法を用いて２段階の溶出試験を行ってもよい。第１の段階は酸性段階であり、溶出溶媒は酸性ｐＨ、たとえばｐＨ約１〜約４．５もしくは約１〜約２の範囲、またはｐＨ約１．２の水性溶媒である。第２の段階は、５を超えるｐＨ、またはｐＨ約５．５〜約６．８、またはｐＨ約６の水性緩衝液である第２の溶出溶媒を用いて行う。
【００２３】
本発明による方法では、組成物から溶出溶媒中に放出される消化酵素の検出に使用する技術は蛍光分光法である。
【００２４】
分子は、エネルギー準位と呼ばれる様々な状態を有する。蛍光分光法は主に電子状態および振動状態と関係している。一般に、調査される化学種は基底電子状態およびより高エネルギーの励起電子状態を有する。これら各々の電子状態において様々な振動状態がある。蛍光分光法では、化学種が最初に光子を吸収して、その基底電子状態から励起電子状態における様々な振動状態の１つに励起する。その後分子は基底電子状態の様々な振動準位の１つに再び戻り、この過程で光子を放出する。分子が基底状態におけるいくつかの振動準位のいずれか戻ることができると、放出された光子は異なるエネルギーを有し、したがって異なる周波数を有する。タンパク質の蛍光反応は、芳香族部分（トリプトファン、チロシンまたはフェニルアラニン）を含むアミノ酸の存在による。タンパク質の蛍光反応は一般に励起波長２８０ｎｍを用いて測定する。蛍光発光の大部分は、トリプトファン残基の励起によるものであり、チロシンおよびフェニルアラニンがわずかに寄与している。
【００２５】
本明細書に開示される蛍光測定法は、消化酵素（パンクレリパーゼ、ＡＰＩ）を含む組成物または剤形から溶出溶媒中に放出される前記酵素の総タンパク質量の測定に基づく。本明細書に使用する「総タンパク質」という語句は、薬剤製品により放出される全タンパク質、すなわちリパーゼ、プロテアーゼおよびアミラーゼなど出発固形組成物中に存在する全タンパク質を表す。放出されたＡＰＩの値を直接得るには、試験される薬剤製品と同じロットを用いる一方、これを粉砕し、同じ溶出溶媒に注ぎ１００％溶出ＡＰＩを得て、本方法に使用するのが好ましい標準を調製する。試験されるバッチの溶出は、標準に対する比率（％）として測定される。
【００２６】
本発明の方法は、薬学的に不活性な賦形剤を含んでもよいパンクレリパーゼ固形組成物、たとえば、消化酵素を含む任意の好適な経口剤形に適用することができる。好適な剤形の非限定的な例としては、錠剤、カプセル剤、サッシェ剤または単一ユニット剤が挙げられる。特定の実施形態では、剤形はカプセル剤である。各剤形は、ＡＰＩ（薬剤）の消化酵素ビーズ（ユニットともいう）を含む。本発明では、消化酵素ビーズは任意の種類の微粒子である。「ビーズ」という用語は、顆粒、粒子、錠剤、球体、ミニ錠剤、マイクロ錠剤、微小粒子、マイクロスフェア、ミニマイクロスフェア、マイクロカプセルおよびマイクロペレットを含む、。ビーズは、特に約５０〜約５，０００μｍの範囲の大きさを有する任意の好適な粒度または形状であってもよく、より詳細にはビーズは、約２〜約５ｍｍの範囲、または約２ｍｍ未満、たとえば約１〜２ｍｍの公称（たとえば、平均）粒子直径を有する。「ミニマイクロスフェア」は最小メジアン径が１．１５ｍｍであり、あるいは「マイクロ錠剤」は最大径２．６３ｍｍであり、これらも本方法に好適である。ビーズは、約８００μｍ未満、好ましくは５００μｍ未満、好ましくは約４００μｍ〜約６００μｍまたは約２５０μｍ〜約５００μｍの平均サイズを有してもよい。これらのビーズは、４００μｍ以上の体積粒径（ｄ（ｖ，０．１）（体積分布の１０％がこの値未満であり、９０％がこの値より大きい直径と定義される）で、９００μｍ以下の体積粒径ｄ（ｖ，０．９）、（体積分布の９０％がこの値未満であり、１０％がこの値より大きい直径と定義される）を有してもよい。
【００２７】
医薬品の調製に好適なすべての消化酵素ビーズ、より詳細にはパンクレリパーゼ酵素ビーズは、腸溶層でコーティングしてもよい。パンクレリパーゼ素錠を腸溶コーティングで囲む実施形態では、コーティングがバリアとして働き、薬剤を胃の酸性環境から保護し、薬物が小腸に到達する前の薬物の放出を実質的に防止する。腸溶コーティング組成物と他のコーティング組成物との好適な組み合わせを用いて、薬物放出または治療効果に対して所望の種類の制御を得てもよい。腸溶コーティングは少なくとも１つの腸溶性ポリマー、およびさらに賦形剤を含む。「腸溶性ポリマー」という語句は、消化酵素を胃内容物から保護するポリマー、たとえば酸性ｐＨで安定であるが、より高いｐＨで速やかに分解し得るポリマー、あるいは、胃腸管の他の部分と対照的に胃内にとどまっている間は胃内容物と消化酵素との接触が相対的に小さくなるように、水和または腐食の速度が十分に緩慢であるポリマーを意味する。腸溶性（ｇａｓｔｒｏ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）ポリマーの非限定的な例として、セルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート、ポリビニルアセテートフタレート、メタクリル酸のコポリマー、メチルメタクリレートのエステルおよびセラックが挙げられる。これらのポリマーは以下のような様々な商品名で市販されている：Ｃｅｌｌａｃｅｆａｔｅ（登録商標）（セルロースアセテートフタレート）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｌ１００、Ｓ１００、Ｌ３０Ｄ、ＦＳ３０Ｄ、Ｌ１００−５５（メタクリル酸のコポリマー）、Ａｑｕａｔｅｒｉｃ（登録商標）（セルロースアセテートフタレート）、Ａｑｏａｔ（登録商標）（ヒドロキシプロピルメチルセルロアセテートスクシネート）、ＨＰ５５（登録商標）（ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート）。好ましくは腸溶コーティングは、１０〜２０ｗｔ．％の少なくとも１つの腸溶性ポリマーを含む。前記各ｗｔ．％はコーティングされた粒子の総重量に基づく。コーティングは、親油性作用物質、たとえば脂肪族カルボン酸およびアルコールから選択されるＣ６〜Ｃ３０親油性低分子量分子、好ましくはＣ１４〜Ｃ１８カルボン酸またはアルコール、たとえばステアリン酸、ミリスチン酸、ミリスチン酸アルコールまたはステアリルアルコールをさらに含んでもよい。コーティングの他の任意成分としては、可塑剤、滑沢剤（たとえばタルク、ステアリン酸マグネシウム、コロイド状二酸化ケイ素およびこれらの組み合わせ；さらに任意に低粘度エチルセルロース）がある。好適な可塑剤の非限定的な例として、トリアセチン、クエン酸トリブチル、クエン酸トリエチル、アセチルトリ−ｎ−ブチルシトレート、フタル酸ジエチル、セバシン酸ジブチル、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ヒマシ油、アセチル化モノ−およびジ−グリセリド、セチルアルコール、ミリスチルアルコールおよびこれらの混合物が挙げられる。好ましい可塑剤は、非フタル酸系可塑剤またはその混合物である。
【００２８】
コーティングされた安定化消化酵素粒子は、その後カプセル剤として製剤化してもよい。特定の安定化消化酵素粒子の剤形は、腸溶性パンクレリパーゼ酵素ビーズの入ったカプセル剤である。約６ｗｔ％以下の含水量を有する、たとえばより詳細には約４ｗｔ％以下の含水量を有する、さらに詳細には約２ｗｔ％以下の含水量を有するヒドロキシプロピルメチルセルロースからなる腸溶性コーティングパンクレリパーゼ酵素を含むカプセル剤は、製剤の特定の実施形態である。
【００２９】
本明細書に使用する「消化酵素」という用語は、生体が摂取または吸収できるように食物の成分を分解する消化管の酵素を示す。消化酵素の非限定的な例として、パンクレリパーゼ（パンクレアチンとも呼ばれる）、リパーゼ、コリパーゼ、トリプシン、キモトリプシン、キモトリプシンＢ、パンクレアトペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＢ、グリセロールエステル加水分解酵素、ホスホリパーゼ、ステロールエステル加水分解酵素、エラスターゼ、キニノゲナーゼ、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、α−アミラーゼ、パパイン、キモパパイン、グルテナーゼ、ブロメライン、フィシン、β−アミラーゼ、セルラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、イソマルターゼおよびこれらの混合物が挙げられる。これらは、膵臓または膵液からの抽出により得られるか、あるいは、膵臓以外の供給源、たとえば微生物、細菌、カビ、真菌、植物または他の動物組織、遺伝子改変微生物、真菌もしくは植物から人工的に製造するかまたは得られる。
【００３０】
「パンクレリパーゼ」または「パンクレリパーゼ酵素」または「パンクレアチン」という用語は、アミラーゼ酵素、リパーゼ酵素およびプロテアーゼ酵素を含むいくつかの種類の酵素の混合物、または膵臓由来の酵素の混合物などを示す。パンクレリパーゼは、たとえばＮｏｒｄｍａｒｋ  Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ  ＧｍｂＨ、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＬＬＣまたはＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから市販されているが、ブタ、ウシまたは他の哺乳動物の供給源由来の同様の抽出物を使用してもよい。市販のパンクレリパーゼ製剤の例として、Ｚｅｎｐｅｐ、Ｖｉｏｋａｃｅ、Ｕｌｔｒａｓｅ、Ｃｒｅｏｎ、ＰａｎｃｒｅａｚｅおよびＰａｎｚｙｔｒａｔが挙げられる。より詳細には、経口投与用のＺｅｎｐｅｐカプセル剤は、腸溶性ビーズ（７５０、３，０００、５，０００ＵＳＰリパーゼ単位の１．８〜１．９ｍｍ、１０，０００、１５，０００、２０，０００、２５，０００および４０，０００ＵＳＰリパーゼ単位の２．２〜２．５ｍｍ）を含む。
【００３１】
「リパーゼ」という用語は、脂質のグリセロールおよび単純脂肪酸への加水分解を触媒する酵素を示す。本発明に好適なリパーゼの例としては、動物リパーゼ（たとえば、ブタリパーゼ）、細菌リパーゼ（たとえば、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）リパーゼおよび／またはバークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）リパーゼ）、真菌リパーゼ、植物リパーゼ、組換えリパーゼ（たとえば、微生物、細菌、酵母、真菌、植物、昆虫または哺乳動物宿主培養細胞のいずれか１つから選択される好適な宿主細胞で組換えＤＮＡ技術により製造されるもの、または天然配列と相同または実質的に同一であるアミノ酸配列を含む組換えリパーゼ、天然リパーゼをコードする核酸と相同または実質的に同一である核酸によりコードされたリパーゼ等）、合成リパーゼ、化学修飾リパーゼ、およびこれらの混合物があるが、これに限定されるものではない。「脂質」という用語は、脂肪、ワックス、ステロール、脂溶性ビタミン（たとえばビタミンＡ、Ｄ、ＥおよびＫ）、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリドス、リン脂質等の天然分子を広く含む。
【００３２】
「アミラーゼ」という用語は、デンプンを分解するグリコシドヒドロラーゼ酵素、たとえば、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、γ−アミラーゼ、酸α−グルコシダーゼ、唾液アミラーゼ、たとえばプチアリン等をいう。本発明に使用するのに好適なアミラーゼには、動物アミラーゼ、細菌アミラーゼ、真菌アミラーゼ（たとえば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）アミラーゼ、たとえば、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）アミラーゼ）、植物アミラーゼ、組換えアミラーゼ（たとえば、微生物である細菌、酵母、真菌、植物、昆虫または哺乳動物宿主培養細胞のいずれか１つから選択される好適な宿主細胞で組換えＤＮＡ技術により製造されるもの、または天然配列と相同または実質的に同一であるアミノ酸配列を含む組換えアミラーゼ、天然アミラーゼをコードする核酸と相同または実質的に  と同一である核酸によりコードされたアミラーゼ等）、化学修飾アミラーゼ、およびこれらの混合物があるが、これに限定されるものではない。
【００３３】
「プロテアーゼ」という用語は一般に、タンパク質のアミノ酸間のペプチド結合を破壊する酵素（たとえば、プロテイナーゼ、ペプチダーゼまたはタンパク質分解酵素）をいう。プロテアーゼは一般に、たとえば、アスパラギン酸ペプチダーゼ、システイン（チオール）ペプチダーゼ、メタロペプチダーゼ、セリンペプチダーゼ、トレオニンペプチダーゼ、アルカリまたはセミアルカリプロテアーゼ、触媒機構が不明の中性ペプチダーゼなど触媒の種類により区別される。本発明に使用するのに好適なプロテアーゼの非限定的な例として、セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ（たとえば、プラスメプシン）メタロプロテアーゼおよびグルタミン酸プロテアーゼが挙げられる。さらに、本発明に使用するのに好適なプロテアーゼとして、動物プロテアーゼ、細菌プロテアーゼ、真菌プロテアーゼ（たとえば、アスペルギルス・メレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｍｅｌｌｅｕｓ）プロテアーゼ）、植物プロテアーゼ、組換えプロテアーゼ（たとえば、細菌、酵母、真菌、植物、昆虫または哺乳動物宿主培養細胞いずれか１つから選択される好適な宿主細胞で組換えＤＮＡ技術により製造されるもの、または天然配列と相同または実質的に同一であるアミノ酸配列を含む組換えプロテアーゼ、天然プロテアーゼをコードする核酸と相同または実質的に  と同一である核酸によりコードされたプロテアーゼ等）、化学修飾プロテアーゼおよびこれらの混合物があるが、これに限定されるものではない。
【００３４】
本発明で解析される組成物または経口剤形のパンクレリパーゼ酵素は、１種もしくは複数種のリパーゼ（すなわち、１種のリパーゼ、または２種以上のリパーゼ）、または１種もしくは複数種のアミラーゼ（すなわち、１種のアミラーゼ、または２種以上のアミラーゼ）、または１種もしくは複数種のプロテアーゼ（すなわち、１種のプロテアーゼ、または２種以上のプロテアーゼ）のほか、これらの酵素の様々な組み合わせおよび比率の混合物を含んでもよい。
【００３５】
本明細書の方法により解析される組成物または剤形中のリパーゼ活性は、約６５０〜約４５，０００ＩＵ（ＵＳＰ法）、約６７５〜約８２５ＩＵ、約２，７００〜約３，３００ＩＵ、約４，５００〜約５，５００ＩＵ、約９，０００〜約１１，０００ＩＵ、約１３，５００〜約１６，５００ＩＵ、約１８，０００〜約２２，０００ＩＵ、約２２，５００〜約２７，５００ＩＵ、約３６，０００〜約４４，０００ＩＵ、ならびにこれらの間の範囲および部分範囲であってもよい。リパーゼ活性は、約７５０ＩＵ、約３，０００ＩＵ、約４，２００ＩＵ、約５，０００ＩＵ、約６，０００ＩＵ、約１０，０００ＩＵ、約１０，５００ＩＵ、約１５，０００ＩＵ、約１６，８００ＩＵ、約２０，０００ＩＵ、約２１，０００ＩＵ、約２４，０００ＩＵ、または約２５，０００ＩＵ、または約４０，０００ＩＵ（ＵＳＰ法）またはこれらの倍数の活性であってもよい。組成物または剤形中のアミラーゼ活性は、約１，６００〜約６，５７５ＩＵ（ＵＳＰ法）、約６，０００〜約２２５，０００ＩＵ、たとえば約６，４００〜約２６，３００ＩＵ、約１０，７００〜約４３，８００ＩＵ、約２１，５００〜約８７，５００ＩＵ、約３２，１００〜約１３１，３００ＩＵ、約４２，９００〜約１７５，０００ＩＵ、約５３，６００〜約２１８，７００ＩＵ、ならびにこれらの間の範囲および部分範囲であってもよい。組成物または剤形中のプロテアーゼ活性は、約１，２５０〜約３，８５０ＩＵ（ＵＳＰ法）、約５，０００〜約１３０，０００ＩＵ、たとえば約５，０００〜約１５，４００ＩＵ、約８，４００〜約２５，７００ＩＵ、約１６，８００〜約５１，３００ＩＵ、約２５，０００〜約７７，０００ＩＵ、約３３，５００〜約１０２，６００ＩＵ、約４１，８００ＩＵ〜約１２８，３００ＩＵ、ならびにこれらの間の範囲および部分範囲であってもよい。酵素を組み合わせた組成物は、以下を含む：（Ａ）リパーゼ活性が約６７５〜約８２５ＩＵの範囲であってもよく、アミラーゼ活性が約１，６００〜約６，５７５ＩＵの範囲であってもよく、プロテアーゼ活性が約１，２５０〜約３，８５０ＩＵ（ＵＳＰ法）の範囲であってもよいもの；（Ｂ）リパーゼ活性が約２，７００〜約３，３００ＩＵの範囲であってもよく、アミラーゼ活性が約６，４００〜約２６，３００ＩＵの範囲であってもよく、プロテアーゼ活性が約５，０００〜約１５，４００ＩＵ（ＵＳＰ法）の範囲であってもよいもの；（Ｃ）リパーゼ活性が約４，５００〜約５，５００ＩＵの範囲であってもよく、アミラーゼ活性が約１０，７００〜約４３，８００ＩＵの範囲であってもよく、プロテアーゼ活性が約８，４００〜約２５，７００ＩＵ（ＵＳＰ法）の範囲であってもよいもの；（Ｄ）リパーゼ活性が約９，０００〜約１１，０００ＩＵの範囲であってもよく、アミラーゼ活性が約２１，５００〜約８７，５００ＩＵの範囲であってもよく、プロテアーゼ活性が約１６，８００〜約５１，３００ＩＵ（ＵＳＰ法）の範囲であってもよいもの；（Ｅ）リパーゼ活性が約１３，５００〜約１６，５００ＩＵの範囲であってもよく、アミラーゼ活性が約３２，１００〜約１３１，３００ＩＵの範囲であってもよく、プロテアーゼ活性が約２５，０００〜約７７，０００ＩＵ（ＵＳＰ）の範囲であってもよいもの；（Ｆ）リパーゼ活性が約１８，０００〜約２２，０００ＩＵの範囲であってもよく、アミラーゼ活性が約４２，９００〜約１７５，０００ＩＵの範囲であってもよく、プロテアーゼ活性が約３３，５００〜約１０２，６００ＩＵ（ＵＳＰ）の範囲であってもよいもの；および（Ｇ）リパーゼ活性が約２２，５００〜約２７，５００ＩＵの範囲であってもよく、アミラーゼ活性が約５３，６００〜約２１８，７００ＩＵの範囲であってもよく、プロテアーゼ活性が約４１，８００ＩＵ〜約１２８，３００ＩＵ（ＵＳＰ）の範囲であってもよいもの。また、本明細書の方法により解析される組成物または剤形中のリパーゼ活性は、約５，０００ＰｈＥｕｒリパーゼ単位〜約４０，０００ＰｈＥｕｒリパーゼ単位の範囲であってもよく、リパーゼ活性は約５，０００ＰｈＥｕｒリパーゼ単位でも、あるいは約１０，０００ＰｈＥｕｒリパーゼ単位でも、あるいは約１５，０００ＰｈＥｕｒリパーゼ単位でも、あるいは約２０，０００ＰｈＥｕｒリパーゼ単位でも、あるいは約３０，０００ＰｈＥｕｒリパーゼ単位でも、あるいは約４０，０００ＰｈＥｕｒリパーゼ単位でもよい。
【００３６】
本発明の別の実施形態ではさらに、本手順を用いて上記のアミラーゼ活性の一部を含む単一ユニットを解析してもよい。
【００３７】
本発明の別の実施形態ではさらに、本方法を用いて上記のアミラーゼ活性の一部を含む単一ユニットを解析してもよい。
【００３８】
組成物または剤形中のアミラーゼ活性／リパーゼ活性比は、約１〜約１０、たとえば約２．３８〜約８．７５（酵素アッセイはＵＳＰに従って行う）の範囲であってもよい。この比は、約１〜約８、たとえば約１．８６〜約５．１３（酵素アッセイはＵＳＰに従い行う）の範囲であってもよいし、あるいはその比は、約１でも、約２でも、約３でも、約４でも、約５でも、約６でも、約７でも、約８でも、約９でも、あるいは約１０でもよい。
【００３９】
製品の不活性成分として、クロスカルメロースナトリウム、水素添加ヒマシ油、コロイド状二酸化ケイ素、微結晶性セルロース、ステアリン酸マグネシウム、ヒプロメロースフタレート、タルクおよびクエン酸トリエチルが挙げられる。Ａｐｔａｌｉｓ  Ｐｈａｒｍａの調製物を１回分服用すると、非常に安定な製剤であるため患者および医師は、一定量の主要な膵酵素リパーゼ、プロテアーゼおよびアミラーゼが得られる。個別に用量を調整するためカプセル剤を開けて中身を分けてもよい。
【００４０】
本発明の別の実施形態、本方法は、（ａ）固形パンクレリパーゼ組成物から消化酵素を溶出溶媒に放出させるステップと、（ｂ）蛍光を読み取り酵素を検出し、溶媒中の消化酵素の量を測定するステップとを含む。溶出試験は、コンペンディアのＵＳＰ法またはＥＭＡ法に記載された溶出装置を用いて、または当該分野の専門家に知られ利用されているそうしたすべての装置およびプロトコルを用いて行う。溶出溶媒は、総タンパク質の溶出試験に好適な様々な溶液、たとえば水、ＨＣｌ溶液、人工胃液、緩衝液、人工腸液、界面活性剤を含む水溶液もしくは緩衝液の中から選択される。緩衝液は、たとえばリン酸塩緩衝液でも、あるいはクエン酸塩緩衝液でもよい
【００４１】
特定の実施形態では、溶出溶媒は、経時的（２段階）に使用される少なくとも２種の溶出溶媒からなる。第１の溶出溶媒は、酸性ｐＨ約１〜４．５、特に約１〜約２、より詳細にはｐＨ約１．２を有する水性溶媒であり（酸性段階）、第２の溶出溶媒は、約５．０を超えるｐＨ、特にｐＨ約５．５〜約６．８、より詳細にはｐＨ約６を有する水溶液である（緩衝腸溶性段階）。
【００４２】
本発明の別の実施形態では、第１の溶出溶媒は、ｐＨ約１〜約４．５を有する水性溶媒であり、第２の溶出溶媒は、約５を超えるｐＨを有する水性緩衝液である。
【００４３】
別の実施形態では、第１の溶出溶媒は、ｐＨ約１〜約４．５を有する水性溶媒であり、第２の溶出溶媒は、ｐＨ約５．５〜約６．８を有する水性緩衝液である。
【００４４】
本発明の別の実施形態では、第１の溶出溶媒は、ｐＨ約１〜約２を有する水性溶媒であり、第２の溶出溶媒は、約５を超えるｐＨを有する水性緩衝液である。
【００４５】
本発明の別の実施形態では、第１の溶出溶媒は、ｐＨ約１〜約２を有する水性溶媒であり、第２の溶出溶媒は、ｐＨ約５．５〜約６．８を有する水性緩衝液である。
【００４６】
本発明の別の実施形態では、第１の溶出溶媒は、ｐＨ約１．２を有する水性溶媒であり、第２の溶出溶媒は、ｐＨ約６を有する水性緩衝液である。
【００４７】
さらなる実施形態では、本方法は、ａ）固形パンクレリパーゼ組成物を第１の溶出溶媒に加えるステップ（酸性段階）と、ｂ）懸濁液を第２の溶出溶媒に移すステップ（腸溶性段階）と、ｃ）消化酵素の放出を引き起こすステップと、ｄ）溶出溶媒のアリコートをサンプリングするステップと、ｅ）３４６ｎｍで蛍光を読み取るステップと、ｄ）放出された消化酵素の量を算出するステップとを含む。算出は、実施例に報告するように行う。
【００４８】
薬剤製品を溶出試験に供する際に、ＵＳＰでは「Ｑ」値の算出を求めている。このＱ値は表示された力価に相関するものであり、現在の許容基準は、表示されたリパーゼ活性の７５％に固定されている。
【００４９】
本発明の蛍光測定法は、酵素活性の測定に専用のものでなくても、酵素溶出プロファイルに十分な相関性を示すもので、したがって総タンパク質の放出が酵素の放出に厳密に相関することが立証される。よって本方法の「Ｑ」値は、以下のように算出することができる：蛍光測定による溶出法のＱ」値：
0006004549.tif 000002
式中、溶出率（％）は放出されたＡＰＩの％であり、分析手順に示したように算出され；バッチリパーゼアッセイはバッチリパーゼ活性であり；表示リパーゼ活性は、薬剤製品のラベルに表示されたリパーゼ活性である。
【００５０】
本明細書に開示された蛍光測定法は、パンクレリパーゼ組成物の緩衝腸溶性段階の溶出試験を行っている間、酵素活性の測定と十分な相関を示し、したがってリパーゼ活性酵素試験を代用する方法と考えられるが、この方法は、リパーゼアッセイの場合と同様に、総タンパク質の蛍光測定が酸の膜透過による影響を受けないので、酸性段階で溶出中に起こる腸溶性（ｇａｓｔｒｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）の問題をまったく検出することができない。リパーゼ活性は、酸性液が保護膜を透過した場合に強く低下する。現在のＵＳＰ試験（リパーゼ活性測定）では、酸性段階で乏しいと考えられる腸溶性（ｇａｓｔｒｏ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）の作用を、緩衝腸溶性段階で起こるリパーゼの溶出現象および分解現象と共に、緩衝腸溶性段階の溶出の終了時に積算する。
【００５１】
したがって、本発明の別の実施形態は、腸溶性（ｇａｓｔｒｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）試験と組み合わせた蛍光分光法により固形パンクレリパーゼ組成物から溶出溶媒中に放出される消化酵素の量（％）を測定する方法であって、酸性溶媒曝露（酸性段階）後に特定のリパーゼアッセイ法で製品の残存リパーゼ活性を判定することにより腸溶性（ｇａｓｔｒｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）を測定する方法である。この実施形態では、２つの試験（溶出ＦＬ試験および腸溶性ＧＲ試験）を各々順番に行ってもよい。
【００５２】
ＦＬ試験：２段階（酸性および腸溶性）で行われる溶出試験。第１の酸性段階の溶出溶媒は、酸性ｐＨ約１〜約４．５、好ましくはｐＨ約１〜約２、好ましくはｐＨ約１．２を有する水性溶媒であり（酸性段階）；第２の腸溶性段階では、溶出溶媒は、約５を超えるｐＨ、好ましくはｐＨ約５．５〜約６．８、好ましくはｐＨ約６を有する水性緩衝液である（緩衝腸溶性段階）。腸溶性（ｇａｓｔｒｏ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）試験は、酸性ｐＨ約１〜約４．５、好ましくはｐＨ約１〜約２、好ましくはｐＨ約１．２を有する水性溶媒で行う。蛍光試験では、腸溶性段階の終了時に放出された消化酵素（ＡＰＩまたは薬剤）を測定する。許容基準のＱ値は、バッチ放出リパーゼ活性／表示リパーゼ活性の比により算出することができる。
【００５３】
ＧＲ試験：腸溶性（ｇａｓｔｒｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）試験を、溶出試験の酸性段階の条件下で行い（溶出溶媒は酸性ｐＨ約１〜約４．５を有する、特にｐＨ約１〜約２、より詳細にはｐＨ約１．２の水溶液である、リパーゼアッセイ法を用いて酸性溶媒の曝露後の製品の残存リパーゼ活性を判定することにより腸溶性（ｇａｓｔｒｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）（％）を測定し、許容基準は、ＵＳＰの遅延放出剤形の酸性段階に用いられる許容基準とする。
【００５４】
前述の説明および実験の部から、本蛍光解析法にいくつかの重要な利点があることが理解できよう。
【００５５】
本発明は、簡便かつ迅速な手順を提供するため、試薬調製に要する時間が大幅に短縮され、酵素アッセイに関する特定の解析の専門知識を必要としない。このため、解析法の移行が極めて容易である。提案する本方法は、リパーゼアッセイを行うより簡便かつ迅速であり、試薬調製に要する時間が大幅に短縮される。
【００５６】
マーカー（総タンパク質）は溶出溶媒中で安定であり、したがって、算出には分解を補正する補正係数（リパーゼアッセイ法に必要とされる）を必要としない。実際、蛍光測定でアッセイされるマーカー（総タンパク質）は、３７℃、ｐＨ６の腸溶性段階の溶媒緩衝液中で３０分後に３％未満の分解を示すのに対し、本方法を用いて測定されるリパーゼ酵素活性は、３７℃、ｐＨ６の腸溶性段階の溶媒緩衝液中で約１１％の分解を示す。
【００５７】
また、この新規な方法は正確であり、優れた感度を有するため、定量限界／直線性範囲は、単一ユニットの試験にも好適である。蛍光測定法は、リパーゼアッセイの使用濃度の約１／５０である０．３リパーゼＵＳＰ単位、約３μｇパンクレリパーゼ／ｍＬの使用濃度に関してリパーゼ酵素アッセイより優れた性能特性を示す。直線性範囲は、使用濃度の１０〜２００％であり、精度は、併行精度および中間精度のどちらも２，０％以下である（パンクレリパーゼ製剤、Ｚｅｎｐｅｐ（登録商標）の６種のロットの溶出結果で測定）。
【００５８】
さらに、こうした方法を用いれば、多点（＞３）試験溶出プロファイルを得ることもできる。
【００５９】
また、実験の部では、３つの測定方法により得られた溶出プロファイルの比較に基づき、総タンパク質量を検出する本発明の非特異的蛍光手順は、プロテアーゼ活性およびリパーゼ活性に基づく２つの酵素特異的アッセイ（現在のコンペンディアの方法）と性能に関して同等であることも示す。
【００６０】
上記の概要および以下の詳細な説明はどちらも、本発明の説明のためのものであるが、本発明を限定するものではないことが理解されよう。
【実施例】
【００６１】
機器、材料および方法
機器：ＬＳ  ５０Ｂ蛍光スペクトロメーター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）、ＬＳ  ５５蛍光スペクトロメーター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）、Ｌａｍｂｄａ  ２０  ＵＶ−ＶＩＳスペクトロメーター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）、７８６  Ｔｉｔｒａｎｄｏ  Ｐｏｔｅｎｔｉｏｍｅｔｒｉｃ  Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｅｔｒｏｈｍ）、ＶＫ−７０２５溶出槽（Ｖａｎｋｅｌ）、Ｐｒｅｍｉｅｒ  ５１００溶出槽（Ｄｉｓｔｅｋ）、ＵＳＰ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  １−バスケット（酸性段階用）；ＵＳＰ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ２−パドル（腸溶性段階用）。
【００６２】
溶出試験用の試薬。酸性段階の溶媒（ｐＨ１．２）：２．００ｇの塩化ナトリウムを８００ｍＬの精製水に加え、完全に可溶化するまで撹拌する。７ｍＬの３７％ＨＣｌを加え、混合する。溶液のｐＨを１ＮのＨＣｌまたは１ＮのＮａＯＨで１．２０±０．０５に調整する。精製水で１０００ｍＬに希釈し、ｐＨを点検し、必要ならば１ＮのＨＣｌまたは１ＮのＮａＯＨで１．２０±０．０５に調整する。
【００６３】
溶出試験用の試薬。腸溶性段階の溶媒（ｐＨ６．０）：９．２０ｇの一塩基リン酸カリウムおよび２．００ｇの塩化ナトリウムを８００ｍＬの精製水に加え、完全に可溶化するまで撹拌する。溶液のｐＨを１ＮのＮａＯＨで６．００±０．０５に調整する。精製水で１０００ｍＬに希釈し、ｐＨを点検し、必要ならば１ＮのＨＣｌまたは１ＮのＮａＯＨで６．００±０．０５に調整する。
【００６４】
例はすべて、腸溶性コーティングされたパンクレリパーゼビーズ、パンクレリパーゼミニ錠剤（ＭＴ）あるいはマイクロ錠剤（ＭＣＴ）を用いて行う。これらは、腸溶性ポリマーヒプロメロースフタレート（ＨＰ５５）でコーティングされた、パンクレリパーゼ原料と賦形剤（たとえば、クロスカルメロースナトリウム、水素添加ヒマシ油、コロイド状二酸化ケイ素、微結晶性セルロースおよびステアリン酸マグネシウム）とのブレンドである。これらのＭＴおよびＭＣＴは、ＨＰＭＣカプセルに入れられ、Ｚｅｎｐｅｐ（登録商標）という名称で市販されている。当業者であれば、腸溶性コーティングされたパンクレリパーゼビーズに別の腸溶性ポリマーおよび賦形剤を使用してもよいことが分かるであろう。
【００６５】
脂肪分解活性の測定は、パンクレリパーゼのＵＳＰモノグラフに記載されたリパーゼアッセイのコンペンディアの手順に基づく方法で行う。この手順は、ｐＨスタット法により、基質（オリーブ油）を使用してエステル化脂肪酸の加水分解から形成される遊離脂肪酸を滴定することに基づく。それは、リパーゼがトリグリセリドの加水分解を触媒し、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）が形成されるという原理に基づく。時間に応じて形成されたＦＦＡを滴定すると、リパーゼの酵素活性が判定され、これをユニットで表すことができ、１Ｕでは１分あたり１μモルのＦＦＡが形成される。この反応は、ｐＨ値が固定値と比較して変化するとＮａＯＨ（滴定液）を加える実験系により一定のｐＨ値を維持して行う（ｐＨスタット法）。時間に応じて加えた滴定液の量は、トリグリセリドに対するリパーゼの作用により形成されたＦＦＡの量に一致する。好適な量の基質を用いて酵素が安定である実験条件下で作業すれば、時間に応じたＦＦＡ形成の線形のカイネティクスを得ることができる。曲線の傾き｛加えた滴定液＝ｆ（量（ｍＬ）／時間（分））｝によりリパーゼ酵素活性が得られる。
【００６６】
タンパク質分解活性の測定は、パンクレリパーゼのＵＳＰモノグラフに記載されたコンペンディアの手順に従って行う。
【００６７】
実施例１
薬剤製品の標準液の調製
標準液は、解析中の剤形の中にある薬剤製品の同じロットを用いて調製する。７，０００ＵＳＰリパーゼ単位に相当する量のパンクレリパーゼビーズ（Ｚｅｎｐｅｐ（登録商標）ミニタブまたはマイクロタブ）を乳鉢に正確に秤量する。５〜６ｍＬの腸溶性段階の溶媒を加え、製品の完全な分散液が得られるまで粉砕する。この懸濁液を５００ｍＬのメスフラスコに移す。乳鉢を数ｍＬの腸溶性段階の溶媒で２〜３回リンスし、液体を５００ｍＬのメスフラスコに移す。メスフラスコに腸溶性段階の溶媒を全量が最終的に５００ｍＬになるまで加え、混合物を１０分間撹拌する。溶出溶媒からサンプリングするアリコートを腸溶性段階の溶媒でさらに１：５０に希釈する。この希釈によりＡＰＩの最終濃度は、約０．３ＵＳＰリパーゼ単位（約３μｇのパンクレリパーゼ／ｍＬ）になる。この最終希釈は、溶出試験−エンドポイントのみ、および溶出試験−多点（溶出プロファイル）で行う。
【００６８】
実施例２
溶出試験
バスケット装置を備えた溶出槽の各ベッセルに８００ｍＬの酸性段階の溶媒を加え、溶出溶媒を３７℃で平衡させる。１１，２００ＵＳＰリパーゼ単位（１４ＵＳＰリパーゼ単位／ｍＬ）に相当する量のパンクレリパーゼビーズ（Ｚｅｎｐｅｐミニタブまたはマイクロタブ）に重みを付加し、こうして６つの独立したサンプルを調製し、バスケットに入れる。装置は１００ｒｐｍで動作させる。１時間後、バスケットを溶媒から取り出し、数ミリリットルの水でリンスし、各バスケットの内容物を、パドル装置を備えた溶出槽の、腸溶性段階の溶媒８００ｍＬを３７℃で含む対応するベッセルに移す。装置は１００ｒｐｍで動作させる。３０分後、放出されたＡＰＩを測定するため、各ベッセルの溶出溶媒のアリコートをサンプリングする。溶出プロファイルの判定する際は、腸溶性段階の溶出溶媒の２．５ｍＬのアリコートを１０分、１２分、１５分、１８分、３０分にサンプリングする。試験中に溶媒の交換は行わず、算出の際には下記の補正係数により量の減少を考慮する。
0006004549.tif 000003
【００６９】
実施例３
溶出試験において放出された消化酵素（ＡＰＩ、活性成分）の蛍光分光法による判定（総タンパク質アッセイ）
実施例２に記載されているような各バスケットからサンプリングされた溶出溶媒の各アリコートを腸溶性段階の溶媒で１：５０に希釈する。以下の動作パラメーターで蛍光スペクトロメーターにて希釈溶液を読み取る：光路長１ｃｍの石英キュベット；励起波長：２８０ｎｍ；発光波長（測定）：３４６ｎｍ、励起スリット：６．０。エンドポイント：０．３ＵＳＰリパーゼ単位／ｍＬまたは約３μｇのパンクレリパーゼ／ｍＬでマーカーの標的濃度（ＡＰＩ＝パンクレリパーゼ；１００％放出）を以下の計算により得る：
0006004549.tif 000004
【００７０】
放出されたＡＰＩの量は、実施例１に記載されているように調製された標準液を対象として判定した。
【００７１】
溶出試験−エンドポイントでは、算出は以下の式を用いて行う。
0006004549.tif 000005
【００７２】
溶出試験−多点（溶出プロファイル）では、算出は以下の式を用いて行う：
0006004549.tif 000006
式中、ＥＳＭＰはサンプルのブランクを差し引いた蛍光測定値（３４６ｎｍの発光）；ＥＳＴＤは標準のブランクを差し引いた蛍光測定値（３４６ｎｍの発光）；ＷＳＭＰはサンプル重量（ｍｇ）；ＷＳＴＤは標準の重量（ｍｇ）；ＶＳＭＰはサンプの希釈量（ｍＬ）；ＶＳＴＤは標準の希釈量（ｍＬ）；ＦＣは補正係数である（表１を参照）。
0006004549.tif 000007
【００７３】
実施例４
蛍光分光法による総タンパク質アッセイのバリデーション試験
溶出試験でパンクレリパーゼ組成物（Ｚｅｎｐｅｐ（登録商標）製剤）から放出されたＡＰＩの総タンパク質量の蛍光定量の性能特性を以下のパラメーター：特異性、直線性、正確度、精度、定量限界、サンプルおよび標準液の安定性、標準液の調製における抽出の完全性の証明により評価し、結果を表２に要約する。
0006004549.tif 000008
0006004549.tif 000009
【００７４】
得られたバリデーションデータによりここで、パンクレリパーゼ剤形（Ｚｅｎｐｅｐ（登録商標）製剤）の溶出試験における総タンパク質量の判定用に提唱した蛍光測定法が目的の用途に好適であることが示される。
【００７５】
実施例５
３つの測定法を用いたパンクレリパーゼビーズ（Ｚｅｎｐｅｐ（登録商標）ミニタブの溶出プロファイル：蛍光分光法による（非特異的アッセイ）総タンパク質量、プロテアーゼアッセイ（酵素特異的アッセイ）によるタンパク質分解活性、およびリパーゼアッセイ（酵素特異的アッセイ）による脂肪分解活性
本溶出試験は、上述の方法に従い２．５ｍＬのアリコートを１０分、１２分、１５分、１８分、３０分にサンプリングすることにより行う（実施例２を参照）。試験中に溶媒の交換は行わない。ｆ２試験によって溶出プロファイルの類似性を証明するため、３つの方法の比較をＳＵＰＡＣアプローチ（Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ「ＳＵＰＡＣ  ＭＲ：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｓｏｌｉｄ  ｏｒａｌ  ｄｏｓａｇｅ  ｆｏｒｍｓ．Ｓｃａｌｅ−ｕｐ  ａｎｄ  ｐｏｓｔａｐｐｒｏｖａｌ  ｃｈａｎｇｅｓ：ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ，ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｔｅｓｔｉｎｇ，ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｂｉｏｅｑｕｉｖａｌｅｎｃｅ  ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ」  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＣＤＥＲ），Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １９９７）に従い行う。３つの測定法ごとに必要な数のデータを作成するため、１２の独立したサンプル（サンプル＝パンクレリパーゼビーズの量、１１，２００ＵＩに相当するＺｅｎｐｅｐ（登録商標）ミニタブ）を１回につき３サンプルの群で合計４回解析する。
【００７６】
実施例５．１  プロテアーゼアッセイによるパンクレリパーゼビーズ（Ｚｅｎｐｅｐ（登録商標）ミニ錠剤）の溶出プロファイル
試験した各時点でのそれぞれの溶出値および全体平均を表３にまとめる。平均曲線を図１に示す。
0006004549.tif 000010
【００７７】
実施例５．２．リパーゼアッセイによるパンクレリパーゼビーズ（Ｚｅｎｐｅｐ（登録商標）ミニ錠剤）の溶出プロファイル
試験した各時点でのそれぞれの溶出値および全体平均を表４にまとめる。平均曲線を図２に示す。算出の際は溶出試験中のリパーゼ分解を補正するため補正係数１．１２５を使用する。
0006004549.tif 000011
【００７８】
実施例５．３  総タンパク質量の蛍光定量によるパンクレリパーゼビーズ（Ｚｅｎｐｅｐ（登録商標）ミニ錠剤）の溶出プロファイル
試験した各時点でのそれぞれの溶出値および全体平均を表５にまとめる。平均曲線を図３に示す。
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【００７９】
実施例５．４  ３つの測定法で得られた溶出プロファイルの比較
３つのアッセイ法により各時点で測定されたパンクレリパーゼビーズ（Ｚｅｎｐｅｐ（登録商標）ミニ錠剤）の溶出データの平均を表６にまとめる。
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【００８０】
３つの溶出プロファイルは、図４ａ〜ｃの比較図に示したようにほぼ完全に重なっており、特に、リパーゼアッセイおよび蛍光アッセイの平均曲線は完全に重ね合わすことができ、プロテアーゼ平均曲線が一致しないのは、値＞１００％を示すエンドポイントでのみである。また、一連の各データのＣＶも、３つの測定法でよく類似しており、蛍光アッセイの値は小さい。
【００８１】
変更の前後の薬剤製品の性能の同等性を評価するのに使用するＳＵＰＡＣアプローチ（製品の溶出プロファイルを比較するための類似性試験ｆ２）を使用して、現在使用されているもの（リパーゼアッセイ）およびもう一方の酵素特異的測定（プロテアーゼアッセイ）と、Ｚｅｎｐｅｐ（登録商標）製剤の溶出試験における総タンパク質の蛍光定量のために新たに提案した方法との同等性を示す。
【００８２】
溶出プロファイルに関する類似性試験ｆ２を適用するため、ＦＤＡガイドライン（Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ「ＳＵＰＡＣ  ＭＲ：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｓｏｌｉｄ  ｏｒａｌ  ｄｏｓａｇｅ  ｆｏｒｍｓ．Ｓｃａｌｅ−ｕｐ  ａｎｄ  ｐｏｓｔａｐｐｒｏｖａｌ  ｃｈａｎｇｅｓ：ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ，ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｔｅｓｔｉｎｇ，ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｂｉｏｅｑｕｉｖａｌｅｎｃｅ  ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ」  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＣＤＥＲ），Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １９９７；Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ−ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｓｏｌｉｄ  Ｏｒａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＣＤＥＲ），Ａｕｇｕｓｔ  １９９７）は、以下の満たすべきいくつかの条件を示している：
ａ．各時間間隔で両曲線の平均溶出値（ｎ＝１２）を使用する、
ｂ．１回のみの測定は、８５％溶出時点より後に考慮すべきである、
ｃ．任意のサンプリング時点での溶出プロファイル間の平均差は１５％を超えないようにすべきである、
ｄ．平均データの使用を可能にするには、初期の時点での変動係数（％）が２０％を超えないようにし、他の時点では１０％を超えないようにすべきである。
【００８３】
本溶出データでは要件ａ、ｂおよびｃは満たされる。しかしながら、（ｄ）を許容するＣＶ値より大きなＣＶ値が、評価対象の全測定法の最初の３つの時点（１０分、１２分、１５分）で観察された。これらの時点で観察された高い変動性は、本溶出試験条件で製剤の１００％放出が非常に短時間（３０分）で得られることを考慮すれば、第１のサンプリング時間（１０分）でアナライトが非常に低濃度であることと、その後の１２分および１５分の時点の短い範囲の経過時間における製剤の内因性の変動性とで説明することができる。
【００８４】
上記の判断を踏まえて、３つの測定法で観察された類似の変動性が、得られた平均曲線を大きく変更させずに、十分な重なりを示したと想定してｆ２試験をとにかく適用する。次いで、ＳＵＰＡＣの要件を完全に満たすデータを用いてもｆ２試験に合格するかどうかを検証するため、最後の３時点（１５分、１８分、３０分）を考慮してさらに評価を行う。
【００８５】
実施例５．４．１．比較：蛍光定量内容とリパーゼアッセイ
蛍光定量とリパーゼアッセイ（標準）の溶出プロファイルに関するｆ２試験は、全時点を考慮すると２本の曲線間で８７．４％の類似性を示したのに対し、最後の３時点について算出すると類似性は８３．３％であった。
【００８６】
実施例５．４．２．比較：総タンパク質量の蛍光定量とプロテアーゼアッセイ
蛍光定量とプロテアーゼアッセイ（標準）の溶出プロファイルに関するｆ２試験は、全時点を考慮したときに２本の曲線間で７２．３％の類似性を示したのに対し、最後の３時点について算出すると類似性は６８．６％であった。一般に、ｆ２値が５０を超える（５０〜１００）と、２本の曲線の同一性または同等性、したがって試験の性能の同一性または同等性が保証される。よって、ｆ２試験によって溶出プロファイルの比較で得られた結果によれば、総タンパク質量の蛍光定量は、パンクレリパーゼ製剤（Ｚｅｎｐｅｐ（登録商標）製剤）の溶出試験におけるＡＰＩ放出の測定において、あらゆる点で酵素特異的方法と同等であるということができる。
【００８７】
実施例６
バリデーションデータの比較
新しい蛍光試験と既知の認められたリパーゼ活性酵素アッセイ（ＵＳＰ法）と間の比較を完全なものにするため、表７を示す。
【００８８】
0006004549.tif 000014
【００８９】
実施例７
パンクレリパーゼビーズに対する蛍光分光法による溶出試験。
さらに、異なる製剤の力価を有するＣｒｅｏｎ（登録商標）という名称で市販されている他のパンクレリパーゼ製剤を用いて上記の例に記載されているような蛍光解析法を行う。その結果をＺｅｎｐｅｐ（登録商標）として市販されているパンクレリパーゼビーズで得られた結果と比較し、図５に報告する。挙動の差は、製剤の力価の差および２つの製剤（Ｚｅｎｐｅｐ（登録商標）、Ｃｒｅｏｎ（登録商標））の粒子の表面積の差と一致する。力価の異なるＺｅｎｐｅｐ（登録商標）には、２つのビーズサイズが使用されており、５，０００ＵＩカプセル剤の中にはより速い溶出プロファイルを示す小さい方のサイズ（平均直径約１．８ｍｍ）が使用される一方、２０，０００ＵＩカプセル剤の中には大きい方のサイズ（平均直径約２．４）が使用されている。Ｃｒｅｏｎ（登録商標）ビーズは、平均直径約１ｍｍであるが、Ｚｅｎｐｅｐ（登録商標）ビーズより著しく不規則であり、したがってＺｅｎｐｅｐ（登録商標）より速い溶出プロファイルを示すが、バッチ間の再現性が低い（Ｃｒｅｏｎ（登録商標）の力価はすべて同じ顆粒を使用する）。
【００９０】
実施例８
腸溶性試験（ｇａｓｔｒｏ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）と組み合わせた溶出試験：ＦＬ試験とＧＲ試験
ＦＬ試験：蛍光測定による溶出試験
バスケット装置（ＵＳＰ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  １−バスケット）を備えた溶出槽の各ベッセルに８００ｍＬの酸性段階の溶媒を入れ、溶出溶媒（酸性段階）を３７℃で平衡させる。１１，２００ＵＳＰリパーゼ単位（１０カプセルのＺｅｎｐｅｐ（登録商標）ミニタブまたはマイクロタブ）に相当する量のパンクレリパーゼビーズを秤量し、Ａｐｐａｒａｔｕｓ  １の各バスケットに移す。装置は１００ｒｐｍで動作させる。１時間後、バスケットを溶媒から取り出し、数ミリリットルの水でリンスし、各バスケットの内容物を、パドル装置（ＵＳＰ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ２）を備えた溶出槽の、腸溶性段階の溶媒８００ｍＬを３７℃で含む溶出ベッセルに移す。装置は１００ｒｐｍで動作させる。３０分後１０ｍＬ分の試験中の溶液を取り出し、試験管に移し、室温で平衡させる。腸溶性段階の溶媒でさらに希釈を行い、適切な濃度（約０．３ＵＳＰ単位／ｍＬ）を得る。溶液を氷水浴に保存し、読み取る前に手で振盪する。希釈溶液は、以下の動作パラメーターを用いて蛍光スペクトロメーターで読み取る：光路長１ｃｍの石英キュベット；励起波長：＝２８０ｎｍ；発光波長（測定）＝３４６ｎｍ；励起スリット：＝６．０。
【００９１】
希釈試験溶液におけるマーカー（ＡＰＩ＝パンクレリパーゼ；１００％放出）の標的濃度は０．３ＵＳＰリパーゼ単位／ｍＬである。
【００９２】
標準液は、実施例１に記載されているように調製し、読み取るまで撹拌しながら氷水浴中に保存する。
【００９３】
パンクレリパーゼ固形組成物からの薬剤の放出量は、以下の通り算出する。
【００９４】
バルクミニタブ／マイクロタブの算出は下記式で行う。
0006004549.tif 000015
【００９５】
カプセル剤の算出は下記式で行う。
0006004549.tif 000016
式中、ＬＣはサンプルの蛍光測定値（３４６ｎｍの発光）であり；ＬＳは標準の蛍光測定値（３４６ｎｍの発光）であり；ＰＳは標準の重量（ｍｇ）であり；ＰＣはサンプル重量（ｍｇ）であり；ＵＳは標準の力価（リパーゼＵＳＰ単位／ｍｇ、バッチリパーゼアッセイ）であり；ＰＭはカプセル内容物の平均重量（ｍｇ／カプセル）であり；ＵＬは個々の投薬単位中のリパーゼの表示内容物（ＵＳＰ単位／カプセル）であり；ＶＣはサンプルの希釈量（ｍＬ）であり；ＶＳは標準の希釈量（ｍＬ）である。
【００９６】
ＧＲ試験：腸溶性（Ｇａｓｔｒｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）試験（リパーゼアッセイによる）
８００ｍＬの酸性溶媒を、バスケット装置を備えた溶出槽の各ベッセル（ＵＳＰ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  １−バスケット）に入れ、次いで溶出溶媒を３７℃で平衡させる。１１，２００ＵＳＰリパーゼ単位（１０カプセルのＺｅｎｐｅｐ（登録商標）ミニタブまたはマイクロタブ）に相当する量のパンクレリパーゼビーズを秤量し、Ａｐｐａｒａｔｕｓ  １の各バスケットに移す。装置は１００ｒｐｍで動作させる。１時間後、バスケットを溶媒から取り出し、４℃の冷精製水９００ｍＬを含む１，０００ｍＬのビーカーにバスケットを浸漬して短時間（約５秒間）サンプルをリンスし、リンス溶媒を交換することなく、この工程を３回繰り返す。各バスケットの内容物をセラミック乳鉢に定量的に移し、５〜６ｍＬの冷精製水を加える。サンプルの完全な分散液が得られるまでサンプル粉砕し、定量的に２００ｍＬのメスフラスコに集め、乳鉢の窪みをリンスする。この工程を２〜３回繰り返す。最終全量になるまで精製水を加える。適切な濃度（約１４ＵＳＰ単位／ｍＬ、製品の１００％の腸溶性（ｇａｓｔｒｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）を想定して利用できる理論的最高濃度）を得るため冷精製水でさらに希釈を行う。サンプル溶液は、滴定の直前に調製し、撹拌しながら氷水浴中に保存する。
【００９７】
標準液は以下の通り調製する：６，０００ＵＳＰ単位に相当する量のＵＳＰパンクレアチンリパーゼＲＳ、またはパンクレリパーゼの測定用標準に正確に重みを付加し、セラミック乳鉢に加え、約５〜６ｍＬの精製水を加え、その後粉砕する。乳鉢の液体を５００ｍＬのメスフラスコに注ぎ、乳鉢をさらにリンスする。この作業を２〜３回繰り返す。最終全量になるまで精製水を加える。標準液は、滴定の直前に調製し、撹拌しながら氷水浴中に保存する。
【００９８】
標準液の最終濃度は、約１２．０ＵＳＰ単位リパーゼ／ｍＬである。
【００９９】
リパーゼアッセイの場合：３０ｍＬの基質エマルジョン（３７°±０．１℃）を滴定装置のジャケット付きベッセルに注ぎ、マグネチックスターラーにより撹拌し、温度を３７°±０．１℃に維持する。０．１ＮのＮａＯＨを加えて電位差滴定によりｐＨを９．２０〜９．２３に調整する。１．０ｍＬのサンプルまたは標準液を加え、続いて０．１ＮのＮａＯＨを５分加えてｐＨを９．０に維持する。
【０１００】
算出は、以下の式を用いて行う：
0006004549.tif 000017
式中、ＶＭＣはサンプルにより１分あたりに消化される０．１ＮのＮａＯＨの量（ｍＬ／分）であり；ＡＶＭＳは標準により１分あたりに消化される０．１ＮのＮａＯＨの平均量（ｍＬ／分）であり；ＰＣはサンプルの重量（ｍｇ）であり、ＰＳは標準の重量（ｍｇ）であり；ＤＣはサンプルの希釈量（ｍＬ）であり；ＤＳは標準の希釈（ｍＬ）であり；ＵＳは標準の力価（リパーゼＵＳＰ単位／ｍｇ）であり；ＵＣはバッチリパーゼアッセイ（ＵＳＰリパーゼ単位／ｍｇ）である。
【０１０１】
ＵＳＰ，＜７１１＞  ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ−Ｄｅｌａｙｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｆｏｒｍｓ（ａｃｉｄ  ｓｔａｇｅ），Ａｃｃｅｐｔａｎｃｅ  Ｔａｂｌｅ  ３による許容基準は以下の通りである：
レベル１許容基準：個々のユニットのＧＲ％は９０％以下である；
レベル２許容基準：１２ユニット（レベル１が６ユニット、レベル２が６ユニット）のＧＲの平均値は９０％未満であり、各ユニットは７５％より低い；
レベル３許容基準：２４ユニット（レベル１が６ユニット、レベル２が６ユニット、レベル３が１２ユニット）のＧＲの平均値は９０％未満であり、各ユニットは７５％より低い。
【０１０２】
上記に報告したすべてのデータおよび考察に基づき、パンクレリパーゼビーズの溶出試験で放出される消化酵素のマーカーとしての総タンパク質量の蛍光測定は、リパーゼ活性のアッセイに基づき現在許容されているコンペンディアの測定法に代わる、信頼性が高く有利な測定法である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５】
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