(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
デハロコッコイデス属細菌における１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をコードする配列番号１で示される塩基配列のうち３１５番目から１４１０番目の塩基配列に含まれる標的領域（Ａ）をＬＡＭＰ法により増幅させる、配列番号１６から配列番号１９で表される各塩基配列からなる４種のプライマー、又は、前記４種のプライマーとそれぞれ９５％以上の相同性を有する４種のプライマーで構成されるプライマーセット（Ｉ）と、
デハロコッコイデス属細菌におけるｂｖｃＡ遺伝子をコードする配列番号２で示される塩基配列のうち５０８番目から１２６０番目の塩基配列に含まれる標的配列（Ｂ）をＬＡＭＰ法により増幅させる、配列番号２０から配列番号２３で表される各塩基配列からなる４種のプライマー、又は、前記４種のプライマーとそれぞれ９５％以上の相同性を有する４種のプライマーで構成されるプライマーセット（ＩＩ）及びｖｃｒＡ遺伝子をコードする配列番号３で示される塩基配列のうち１２６０番目から１６８４番目の塩基配列に含まれる標的配列（Ｃ）をＬＡＭＰ法により増幅させる、配列番号２８から配列番号３１で表される各塩基配列からなる４種のプライマー、又は、前記４種のプライマーとそれぞれ９５％以上の相同性を有する４種のプライマーで構成されるプライマーセット（ＩＩＩ）から選ばれる少なくとも一方のプライマーセットと、
を含むデハロコッコイデス属細菌検出用プライマーセット。
【請求項２】
前記標的領域（Ａ）が配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７で表される塩基配列を含み、前記標的配列（Ｂ）が配列番号８、配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１で表される塩基配列を含み、前記標的配列（Ｃ）が配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５で表される塩基配列を含む請求項１に記載のデハロコッコイデス属細菌検出用プライマーセット。
【請求項３】
請求項１又は請求項２に記載のプライマーセットを用いて、ＬＡＭＰ法により試料核酸を増幅して、デハロコッコイデス属細菌を検出することを含むデハロコッコイデス属細菌の検出方法。
【請求項４】
前記検出が、濁度又は蛍光強度を測定することを含む請求項３に記載のデハロコッコイデス属細菌の検出方法。
【請求項５】
さらに、前記検出することにより得られた結果に基づいて、検量線を作成してデハロコッコイデス属細菌を定量することを含む請求項３又は請求項４に記載のデハロコッコイデス属細菌の検出方法。
【請求項６】
浄化対象領域からの試料核酸を準備すること、
該試料核酸から請求項３から請求項５のいずれか一項に記載の検出方法を用いてデハロコッコイデス属細菌を検出すること、及び
検出結果に基づき土壌又は地下水の浄化期間を算出することを含む浄化対象領域の浄化計画を設計する方法。
【請求項７】
（Ｉ）浄化対象領域から得られた評価用試料を用いて、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥの濃度を測定すること、
（ＩＩ）請求項３から請求項５のいずれか一項に記載の検出方法を用いて、前記評価用試料中のデハロコッコイデス属細菌を検出すること、
（ＩＩＩ）前記検出方法により検出された前記デハロコッコイデス属細菌の細菌数を算出すること、
（ＩＶ）前記検出方法により検出された前記デハロコッコイデス属細菌によるｃｉｓ−１，２−ＤＣＥの分解速度を算出すること、
（Ｖ）前記算出されたデハロコッコイデス属細菌の細菌数と前記算出されたｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解速度とに基づき、前記デハロコッコイデス属細菌による前記浄化対象領域の浄化に必要な施工期間を算出すること、及び
（ＶＩ）前記浄化に必要な施工期間に基づき、浄化のための工法を選択し実行することを含む浄化対象領域の浄化方法。
【請求項８】
前記（Ｉ）の後に、請求項３から請求項５のいずれか一項に記載の検出方法を用いて、前記評価用試料中のデハロコッコイデス属細菌を検出すること、
前記検出方法により検出された前記デハロコッコイデス属細菌の細菌数を算出すること、
前記算出されたデハロコッコイデス属細菌の細菌数に基づき、デハロコッコイデス属細菌によるｃｉｓ−１，２−ＤＣＥの分解速度を予測すること、
前記算出されたデハロコッコイデス属細菌の細菌数及び前記予測されたｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解速度に基づき、前記デハロコッコイデス属細菌による前記浄化対象領域の浄化に必要な予測施工期間を得ること、
前記予測施工期間を得た後に、前記（ＩＩ）から前記（ＩＶ）を行うこと、
前記（ＩＩ）から前記（ＩＶ）で得られた結果に基づき、前記デハロコッコイデス属細菌による前記浄化対象領域の浄化に必要な施工期間を確認すること、
前記（ＶＩ）を行うこと、
を含む請求項７に記載の浄化対象領域の浄化方法。
【請求項９】
さらに、前記（ＶＩ）の後に、前記浄化対象領域のｃｉｓ−１，２−ＤＣＥの濃度をモニタリングすること、及び
請求項３から請求項５のいずれか一項に記載の検出方法を用いて、前記浄化対象領域のデハロコッコイデス属細菌の細菌数をモニタリングすることを含む請求項７又は請求項８に記載の浄化対象領域の浄化方法。
【請求項１０】
請求項１又は請求項２に記載のプライマーセットを含むデハロコッコイデス属細菌検出用試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デハロコッコイデス属細菌検出用プライマーセットに関する。
【背景技術】
【０００２】
トリクロロエチレン（ＴＣＥ）やテトラクロロエチレン（ＰＣＥ）等に代表される揮発性有機塩素化合物（ＶＯＣ）の使用による土壌汚染や水質汚濁の発生に対応するための方策の一つとして、バイオレメディエーションが挙げられる。バイオレメディエーションは、汚染サイトに存在しない菌を外部から持ち込むバイオオーギュメンテーションと汚染サイトに存在する菌を利用するバイオスティミュレーションに区分される。
【０００３】
塩素化エチレン類に対する嫌気性バイオスティミュレーションを実施した場合には、速やかにｃｉｓ−１，２−ジクロロエチレン（ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ）まで微生物分解が進行する。ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥは、その後の微生物分解により塩化ビニルモノマーを経由して、毒性のないエチレンにさらに還元し、分解される。増殖速度の遅い細菌であるデハロコッコイデス（Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ）属の一部の細菌が、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥの還元及び分解に関与する唯一の嫌気性微生物として知られている。
【０００４】
塩化ビニルモノマーは、強い発ガン性を有し、その毒性はＰＣＥ、ＴＣＥ又はＤＣＥよりも高い。
ＰＣＥやＴＣＥなどの汚染物質を浄化するために嫌気性バイオスティミュレーションを適用した場合、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ以降の分解が思うように進まず、より毒性の高い塩化ビニルモノマーが土壌中または地下水中に長期間蓄積する結果となっているケースが多々見受けられる。
【０００５】
そのため、嫌気性バイオスティミュレーションによる浄化方法の適合性を判断する際には、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥや塩化ビニルモノマーの脱塩素化反応を行うデハロコッコイデス属細菌の汚染サイトにおける存在の有無等を、核酸増幅によるＤＮＡ検出技術により、予め確かめることが重要となる。
デハロコッコイデス属細菌の汚染サイトにおける存在の有無を検出する方法として、デハロコッコイデス属細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を標的として、Ｒｅａｌ-ｔｉｍｅ ＰＣＲ法により定量分析を行うことが知られている（例えば、特許文献１参照）。
また、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解遺伝子として、デハロコッコイデス属  ＶＳ株の保有するｖｃｒＡ遺伝子及びデハロコッコイデス属  ＢＡＶ１株の保有するｂｖｃＡ遺伝子がそれぞれ報告されている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００６】
核酸増幅方法としては、ＰＣＲ法のほかに、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ-Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法が知られており、該ＬＡＭＰ法を用いて、迅速且つ正確にＥ型肝炎ウイルスを検出する方法等が知られている（例えば、特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００８−１５４５２１号公報
【特許文献２】特開２００８−１５４５６６号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｒｉｔａｌａｈｔｉ, Ｋ. Ｍ. ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，（２００６） ｖｏｌ．７２，２７６５−２７７４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
特許文献１及び非特許文献１には、Ｒｅａｌ-ｔｉｍｅ ＰＣＲ法を用いた核酸増幅方法が記載されている。しかしながら、Ｒｅａｌ-ｔｉｍｅ ＰＣＲ法を用いるためには、特定の施設のみでの使用に限られるＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒやＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒ等の高価な機器が必要とされ、簡便性に欠けるという問題点がある。
また、上記特許文献１及び非特許文献１に記載のプライマーは、Ｒｅａｌ-ｔｉｍｅ ＰＣＲ法用のプライマーであるため、ＬＡＭＰ法のプライマーセットとして用いることはできない。
【００１０】
特許文献２には、ＬＡＭＰ法を用いたＥ型肝炎ウイルスの検出方法が記載されているが、ここに記載されているプライマーセットは、Ｅ型肝炎ウイルスの検出のためのプライマーセットであり、当然のことながら他の生物の核酸増幅方法には利用することができない。また、特許文献２に記載のプライマーを用いた方法では、濁度測定により、簡便に増幅の有無を確認する定性評価を行うことは可能であるが、定量評価を行うことはできない。さらに、土壌又は地下水から得られたサンプルを用いて、ＬＡＭＰ法により核酸増幅を行ったという例はこれまでのところ知られていない。
【００１１】
これらの現状を踏まえ、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解能を有するデハロコッコイデス属細菌の存在を、土壌汚染対策を実施している敷地あるいはサイト内等の様々な場所において高い感度で、迅速且つ簡便に検出するとともに、定量できる方法の開発が待ち望まれていた。
【００１２】
本発明は、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解能を有するデハロコッコイデス属細菌を、高い感度で、迅速且つ簡便に検出することを可能にするデハロコッコイデス属細菌検出用プライマーセット、これを用いるデハロコッコイデス属細菌の検出方法を提供することを課題とする。また、本発明は、当該検出方法を用いた浄化対象領域の浄化計画を設計する方法を提供することを課題とする。また、本発明は、当該検出方法を用いた浄化対象領域の浄化方法を提供することを課題とする。さらに本発明は、当該検出用プライマーセットを用いたデハロコッコイデス属細菌検出用試薬キットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は以下のとおりである。
＜１＞  デハロコッコイデス属細菌における１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をコードする配列番号１で示される塩基配列のうち３１５番目から１４１０番目の塩基配列に含まれる標的領域（Ａ）をＬＡＭＰ法により増幅させる、配列番号１６から配列番号１９で表される各塩基配列からなる４種のプライマー、又は、前記４種のプライマーとそれぞれ９５％以上の相同性を有する４種のプライマーで構成されるプライマーセット（Ｉ）と、
デハロコッコイデス属細菌におけるｂｖｃＡ遺伝子をコードする配列番号２で示される塩基配列のうち５０８番目から１２６０番目の塩基配列に含まれる標的配列（Ｂ）をＬＡＭＰ法により増幅させる、配列番号２０から配列番号２３で表される各塩基配列からなる４種のプライマー、又は、前記４種のプライマーとそれぞれ９５％以上の相同性を有する４種のプライマーで構成されるプライマーセット（ＩＩ）及びｖｃｒＡ遺伝子をコードする配列番号３で示される塩基配列のうち１２６０番目から１６８４番目の塩基配列に含まれる標的配列（Ｃ）をＬＡＭＰ法により増幅させる、配列番号２８から配列番号３１で表される各塩基配列からなる４種のプライマー、又は、前記４種のプライマーとそれぞれ９５％以上の相同性を有する４種のプライマーで構成されるプライマーセット（ＩＩＩ）から選ばれる少なくとも一方のプライマーセットと、
を含むデハロコッコイデス属細菌検出用プライマーセット。
＜２＞  前記標的領域（Ａ）が配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７で表される塩基配列を含み、前記標的配列（Ｂ）が配列番号８、配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１で表される塩基配列を含み、前記標的配列（Ｃ）が配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５で表される塩基配列を含む＜１＞に記載のデハロコッコイデス属細菌検出用プライマーセット。
＜３＞  ＜１＞又は＜２＞に記載のプライマーセットを用いて、ＬＡＭＰ法により試料核酸を増幅して、デハロコッコイデス属細菌を検出することを含むデハロコッコイデス属細菌の検出方法。
＜４＞  前記検出が、濁度又は蛍光強度を測定することを含む＜３＞に記載のデハロコッコイデス属細菌の検出方法。
＜５＞  さらに、前記検出することにより得られた結果に基づいて、検量線を作成してデハロコッコイデス属細菌を定量することを含む＜３＞又は＜４＞に記載のデハロコッコイデス属細菌の検出方法。
＜６＞  浄化対象領域からの試料核酸を準備すること、
該試料核酸から＜３＞から＜５＞のいずれかに記載の検出方法を用いてデハロコッコイデス属細菌を検出すること、及び
検出結果に基づき土壌又は地下水の浄化期間を算出することを含む浄化対象領域の浄化計画を設計する方法。
＜７＞  （Ｉ）浄化対象領域から得られた評価用試料を用いて、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥの濃度を測定すること、
（ＩＩ）＜３＞から＜５＞のいずれかに記載の検出方法を用いて、前記評価用試料中のデハロコッコイデス属細菌を検出すること、
（ＩＩＩ）前記検出方法により検出された前記デハロコッコイデス属細菌の細菌数を算出すること、
（ＩＶ）前記検出方法により検出された前記デハロコッコイデス属細菌によるｃｉｓ−１，２−ＤＣＥの分解速度を算出すること、
（Ｖ）前記算出されたデハロコッコイデス属細菌の細菌数と前記算出されたｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解速度とに基づき、前記デハロコッコイデス属細菌による前記浄化対象領域の浄化に必要な施工期間を算出すること、及び
（ＶＩ）前記浄化に必要な施工期間に基づき、浄化のための工法を選択し実行することを含む浄化対象領域の浄化方法。
＜８＞  前記（Ｉ）の後に、＜３＞から＜５＞のいずれかに記載の検出方法を用いて、前記評価用試料中のデハロコッコイデス属細菌を検出すること、
前記検出方法により検出された前記デハロコッコイデス属細菌の細菌数を算出すること、
前記算出されたデハロコッコイデス属細菌の細菌数に基づき、デハロコッコイデス属細菌によるｃｉｓ−１，２−ＤＣＥの分解速度を予測すること、
前記算出されたデハロコッコイデス属細菌の細菌数及び前記予測されたｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解速度に基づき、前記デハロコッコイデス属細菌による前記浄化対象領域の浄化に必要な予測施工期間を得ること、
前記予測施工期間を得た後に、前記（ＩＩ）から前記（ＩＶ）を行うこと、
前記（ＩＩ）から前記（ＩＶ）で得られた結果に基づき、前記デハロコッコイデス属細菌による前記浄化対象領域の浄化に必要な施工期間を確認すること、
前記（ＶＩ）を行うこと、
を含む＜７＞に記載の浄化対象領域の浄化方法。
＜９＞  さらに、前記（ＶＩ）の後に、前記浄化対象領域のｃｉｓ−１，２−ＤＣＥの濃度をモニタリングすること、及び
＜３＞から＜５＞のいずれかに記載の検出方法を用いて、前記浄化対象領域のデハロコッコイデス属細菌の細菌数をモニタリングすることを含む＜７＞又は＜８＞に記載の浄化対象領域の浄化方法。
＜１０＞  ＜１＞又は＜２＞に記載のプライマーセットを含むデハロコッコイデス属細菌検出用試薬キット。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解能を有するデハロコッコイデス属細菌を、迅速、簡便且つ高感度で検出することを可能にするデハロコッコイデス属細菌検出用プライマーセット、これを用いるデハロコッコイデス属細菌の検出方法を提供することができる。また、本発明は、当該検出方法を用いた浄化対象領域の浄化計画を設計する方法を提供することができる。また、本発明は、当該検出方法を用いた浄化対象領域の浄化方法を提供することができる。さらに本発明は、当該検出用プライマーセットを用いたデハロコッコイデス属細菌検出用試薬キットを提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明にかかるデハロコッコイデス属細菌検出用プライマーセットは、デハロコッコイデス属細菌における１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をコードする配列番号１で示される塩基配列のうち３１５番目から１４１０番目の塩基配列に含まれる標的領域（Ａ）をＬＡＭＰ法により増幅させるプライマーセット（Ｉ）と、デハロコッコイデス属細菌におけるｂｖｃＡ遺伝子をコードする配列番号２で示される塩基配列のうち５０８番目から１２６０番目の塩基配列に含まれる標的配列（Ｂ）をＬＡＭＰ法により増幅させるプライマーセット（ＩＩ）及びｖｃｒＡ遺伝子をコードする配列番号３で示される塩基配列のうち１２６０番目から１６８４番目の塩基配列に含まれる標的配列（Ｃ）をＬＡＭＰ法により増幅させるプライマーセット（ＩＩＩ）から選ばれる少なくとも一方のプライマーセットと、を含むものである。
本発明にかかるデハロコッコイデス属細菌の検出方法は、前記デハロコッコイデス属細菌検出用プライマーセットを用いてｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解能を有するデハロコッコイデス属細菌を検出することを含む方法である。
本発明にかかる浄化対象領域の浄化計画を設計する方法は、浄化対象領域からの試料核酸を準備すること、該試料核酸から前記検出方法を用いてデハロコッコイデス属細菌を検出すること、及び検出結果に基づき土壌又は地下水の浄化期間を算出することを含む方法である。
本発明にかかるデハロコッコイデス属細菌検出用試薬キットは、デハロコッコイデス属細菌を検出するためのプライマーセットを含むものである。
【００１６】
本発明において、検出対象となる試料中の試料核酸又はプライマーの個々の配列に関して、これら互いの相補的な関係に基づいて記述された事項は、特に断らない限り、それぞれの配列と、各配列に対して相補的な配列とについても適用される。各配列に対して相補的な当該配列について本発明の事項を適用する際には、当該相補的な配列が認識する配列について、当業者にとっての技術常識の範囲内で、対応する本明細書に記載された配列に相補的な配列として、明細書全体を読み替えるものとする。
【００１７】
本発明においてＬＡＭＰ法とは、Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎの略であり、４種類のプライマー（即ち、ＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマー及びＢＩＰプライマー）で構成されるプライマーセットを用いて、一定温度で反応させて試料核酸を増幅させる方法である。本発明において使用されるＬＡＭＰ法は一般的に当業者に公知の方法、またはその一部を改変した方法などを含んでよい。
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても本工程の所期の作用が達成されれば、本用語に含まれる。
本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
本明細書において、組成物中の各成分の量について言及する場合、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
本明細書において、地下水とは、地中の土砂や岩石のすきまや割れ目などに存在する水の総称を意味する。
本明細書において、バイオスティミュレーションとは、土着微生物を活性化させて浄化する方法を意味し、例えば、汚染土壌や地下水に生息する、油分を分解する能力を有する微生物に、栄養剤となる化合物を与えて微生物を増殖、活性化させ、汚染物質である油分の分解を促進する方法などを含む。
本明細書において、バイオオーグメンテーションとは、外来微生物及び栄養剤となる化合物を導入して浄化する方法を意味し、例えば、外部で大量に増殖、活性化させた、油分を分解する能力を有する微生物を、栄養剤となる化合物と共に汚染土壌又は地下水に注入して浄化する方法などを含む。
本明細書において、細菌数とは、ＬＡＭＰ法により検出される標的領域のコピー数を意味する。
以下、本発明について説明する。
【００１８】
＜デハロコッコイデス属細菌検出用プライマーセット＞
本発明のデハロコッコイデス属細菌検出用プライマーセット（以下、単に「検出用プライマーセット」ともいう。）は、デハロコッコイデス属細菌における１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をコードする配列番号１で示される塩基配列のうち３１５番目から１４１０番目の塩基配列に含まれる標的領域（Ａ）をＬＡＭＰ法により増幅させる、配列番号１６から配列番号１９で表される各塩基配列からなる４種のプライマー、又は、前記４種のプライマーとそれぞれ９５％以上の相同性を有する４種のプライマーで構成されるプライマーセット（Ｉ）とデハロコッコイデス属細菌におけるｂｖｃＡ遺伝子をコードする配列番号２で示される塩基配列のうち５０８番目から１２６０番目の塩基配列に含まれる標的配列（Ｂ）をＬＡＭＰ法により増幅させる、配列番号２０から配列番号２３で表される各塩基配列からなる４種のプライマー、又は、前記４種のプライマーとそれぞれ９５％以上の相同性を有する４種のプライマーで構成されるプライマーセット（ＩＩ）及びｖｃｒＡ遺伝子をコードする配列番号３で示される塩基配列のうち１２６０番目から１６８４番目の塩基配列に含まれる標的配列（Ｃ）をＬＡＭＰ法により増幅させる、配列番号２８から配列番号３１で表される各塩基配列からなる４種のプライマー、又は、前記４種のプライマーとそれぞれ９５％以上の相同性を有する４種のプライマーで構成されるプライマーセット（ＩＩＩ）から選ばれる少なくとも一方のプライマーセットとを含む検出用プライマーセットである。
【００１９】
本発明の検出用プライマーセットは、デハロコッコイデス属細菌における１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子と、デハロコッコイデス属細菌におけるｂｖｃＡ遺伝子及びｖｃｒＡ遺伝子から選ばれる少なくとも一方の遺伝子とのそれぞれにおける特定の標的配列をＬＡＭＰ法により増幅するものである。
すなわち、前記標的領域（Ａ）と、前記標的配列（Ｂ）及び前記標的配列（Ｃ）から選ばれる少なくとも一方の標的領域とを増幅させることにより、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解能を有するデハロコッコイデス属細菌の存在を適正に評価することが可能になると推測される。加えて、プライマーセット（Ｉ）と、前記プライマーセット（ＩＩ）及び前記プライマーセット（ＩＩＩ）から選ばれる少なくとも一方のプライマーセットとを用いることにより、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解能を有するデハロコッコイデス属細菌を、迅速、簡便且つ高感度で検出することが可能になると推測される。
【００２０】
配列表の配列番号１で示される塩基配列は、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ００４９２８の１番目から１４３４番目の塩基からなる塩基配列であり、デハロコッコイデス・エテノジェネス(Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ｅｔｈｅｎｏｇｅｎｅｓ)由来の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をコードする部分的な塩基配列である。該塩基配列に含まれる標的領域（Ａ）を標的とすることにより、検出対象となる試料中に含まれるデハロコッコイデス属細菌の存在を漏れなく拾うことができるものと推測される。
【００２１】
標的領域（Ａ）は、配列番号１で示される塩基配列のうち、３１５番目から１４１０番目の塩基からなる塩基配列に含まれる領域であり、その範囲の全部又は一部とすることができる。
また、標的領域（Ａ）は、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解能を有するデハロコッコイデス属細菌の存在をより適正に評価するという観点より、下記表１に示される配列表の配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７で表される塩基配列を含んでいることが好ましい。
【００２２】
【表１】
0005911707.tif 000002
【００２３】
プライマーセット（Ｉ）は、前記標的領域（Ａ）をＬＡＭＰ法により増幅させるプライマーセットである。
【００２４】
プライマーセット（Ｉ）におけるＦ３プライマーの塩基数は、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解能を有するデハロコッコイデス属細菌を、より迅速、簡便且つ高感度で検出することができるという観点より、１０ｍｅｒ〜４０ｍｅｒであることが好ましく、１６ｍｅｒ〜３０ｍｅｒであることがより好ましく、１８ｍｅｒ〜２３ｍｅｒであることがさらに好ましい。
【００２５】
プライマーセット（Ｉ）におけるＢ３プライマーの塩基数は、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解能を有するデハロコッコイデス属細菌を、より迅速、簡便且つ高感度で検出することができるという観点より、１０ｍｅｒ〜４０ｍｅｒであることが好ましく、１６ｍｅｒ〜３０ｍｅｒであることがより好ましく、１８ｍｅｒ〜２３ｍｅｒであることがさらに好ましい。
【００２６】
プライマーセット（Ｉ）におけるＦＩＰプライマーの塩基数は、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解能を有するデハロコッコイデス属細菌を、より迅速、簡便且つ高感度で検出することができるという観点より、３０ｍｅｒ〜６０ｍｅｒであることが好ましく、３５ｍｅｒ〜５５ｍｅｒであることがより好ましく、４０ｍｅｒ〜５０ｍｅｒであることがさらに好ましい。
【００２７】
プライマーセット（Ｉ）におけるＢＩＰプライマーの塩基数は、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解能を有するデハロコッコイデス属細菌を、より迅速、簡便且つ高感度で検出することができるという観点より、３０ｍｅｒ〜６０ｍｅｒであることが好ましく、３５ｍｅｒ〜５５ｍｅｒであることがより好ましく、４０ｍｅｒ〜５０ｍｅｒであることがさらに好ましい。
【００２８】
プライマーセット（Ｉ）は、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解能を有するデハロコッコイデス属細菌を、より迅速、簡便且つ高感度で検出することができるという観点より、下記表２に示される配列表の配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８及び配列番号１９で表される各塩基配列を有する４種のプライマーを少なくとも含むものであることが好ましい。なお、プライマーセット（Ｉ）は、前記４種のプライマーの他に、標的領域（Ａ）にハイブリダイズするものの、前記４種のプライマーとは異なる塩基配列を有するプライマーを含んでいてもよい。
【００２９】
検出感度の観点より、プライマーセット（Ｉ）は、配列表の配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８及び配列番号１９で表される各塩基配列からなる４種のプライマーより成るものであることが更に好ましい。なお、プライマーセット（Ｉ）はこれら４種のプライマーで構成されていればよく、前記４種のプライマーと同種のプライマーがさらに含まれていてもよい。
【００３０】
【表２】
0005911707.tif 000003
【００３１】
本発明における前記プライマーセット（Ｉ）としては、例えば配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８及び配列番号１９で表される各塩基配列からなる４種のプライマーのぞれぞれと相同性が認められる各塩基配列からなる４種のオリゴヌクレオチドより成るセットも、本発明におけるプライマーセット（Ｉ）に包含される。
相同性が認められるとは、例えば配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８及び配列番号１９で表される各塩基配列からなる４種のプライマーのぞれぞれと同等程度の作用を示せばよい。好ましくは配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８及び配列番号１９で表される各塩基配列からなる４種のプライマーとそれぞれ、８０％以上の相同性、より好ましくは９０％以上の相同性、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する４種のプライマーで構成されるプライマーセットが挙げられる。８０％以上の相同性を示すことにより、前記標的領域（Ａ）を迅速、簡便且つ高感度で増幅することができる等の利点がある。
【００３２】
また、本発明における前記プライマーセット（Ｉ）としては、例えば配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８及び配列番号１９で表される各塩基配列からなる４種のプライマーのぞれぞれと同等程度の作用を示すものであれば、配列番号１６の相補配列、配列番号１７の相補配列、配列番号１８の相補配列及び配列番号１９の相補配列で表される各塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする４種のオリゴヌクレオチドより成るセットも本発明におけるプライマーセット（Ｉ）に包含される。
【００３３】
ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング(Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ)２ｎｄ (Ｊ.  Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ． Ｐｒｅｓｓ， １９８９) に記載の方法等に従って行うことができる。
ストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９ｍＭ〜約４０ｍＭ、好ましくは約１９ｍＭ〜約２０ｍＭで、温度が約５０℃〜約７０℃、好ましくは約６０℃〜約６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合がもっとも好ましい。
【００３４】
さらに、本発明における前記プライマーセット（Ｉ）としては、例えば配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８及び配列番号１９で表される各塩基配列からなる４種のプライマーのそれぞれと同等程度の作用を示すものであれば、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８及び配列番号１９で表される各塩基配列に塩基が挿入、欠失又は置換した４種のオリゴヌクレオチドのセットも、本発明におけるプライマーセット（Ｉ）に包含される。
塩基が挿入、欠失又は置換されている場合、その挿入、欠失又は置換の位置は、特に限定されない。挿入、欠失又は置換した塩基の数としては１塩基又は２塩基以上が挙げられ、プライマーセットに含まれる各プライマーそれぞれの全体の長さによって異なるが、例えば１塩基〜１０塩基、好ましくは１塩基〜５塩基が挙げられる。
【００３５】
配列表の配列番号２で示される塩基配列は、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＹ５６３５６２の１番目から１５５１番目の塩基からなる塩基配列であり、デハロコッコイデス属  ＢＡＶ株のｂｖｃＡ遺伝子をコードする塩基配列である。ｂｖｃＡ遺伝子は、塩化ビニルからエチレンへの脱塩素反応を担う酵素をコードしている。該遺伝子をコードする塩基配列に含まれる標的配列（Ｂ）を標的とすることにより、検出対象となる試料中に含まれるｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解能を有する細菌の存在を漏れなく拾うことができるものと推測される。
【００３６】
標的配列（Ｂ）は、配列番号２で示される塩基配列のうち、５０８番目から１２６０番目の塩基からなる塩基配列に含まれる領域であり、その範囲の全部又は一部とすることができる。
また、標的配列（Ｂ）は、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解能を有するデハロコッコイデス属細菌の存在をより適正に評価するという観点より、下記表３に示される配列表の配列番号８、配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１で表される塩基配列を含んでいることが好ましい。
【００３７】
【表３】
0005911707.tif 000004
【００３８】
プライマーセット（ＩＩ）は、前記標的配列（Ｂ）をＬＡＭＰ法により増幅させるプライマーセットである。
【００３９】
プライマーセット（ＩＩ）におけるＦ３プライマーの塩基数は、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解能を有するデハロコッコイデス属細菌を、より迅速、簡便且つ高感度で検出することができるという観点より、１０ｍｅｒ〜４０ｍｅｒであることが好ましく、１６ｍｅｒ〜３０ｍｅｒであることがより好ましく、１８ｍｅｒ〜２３ｍｅｒであることがさらに好ましい。
【００４０】
プライマーセット（ＩＩ）におけるＢ３プライマーの塩基数は、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解能を有するデハロコッコイデス属細菌を、より迅速、簡便且つ高感度で検出することができるという観点より、１０ｍｅｒ〜４０ｍｅｒであることが好ましく、１６ｍｅｒ〜３０ｍｅｒであることがより好ましく、１８ｍｅｒ〜２３ｍｅｒであることがさらに好ましい。
【００４１】
プライマーセット（ＩＩ）におけるＦＩＰプライマーの塩基数は、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解能を有するデハロコッコイデス属細菌を、より迅速、簡便且つ高感度で検出することができるという観点より、３０ｍｅｒ〜６０ｍｅｒであることが好ましく、３５ｍｅｒ〜５５ｍｅｒであることがより好ましく、４０ｍｅｒ〜５０ｍｅｒであることがさらに好ましい。
【００４２】
プライマーセット（ＩＩ）におけるＢＩＰプライマーの塩基数は、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解能を有するデハロコッコイデス属細菌を、より迅速、簡便且つ高感度で検出することができるという観点より、３０ｍｅｒ〜６０ｍｅｒであることが好ましく、３５ｍｅｒ〜５５ｍｅｒであることがより好ましく、４０ｍｅｒ〜５０ｍｅｒであることがさらに好ましい。
【００４３】
プライマーセット（ＩＩ）は、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解能を有するデハロコッコイデス属細菌を、より迅速、簡便且つ高感度で検出することができるという観点より、下記表４に示される配列表の配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２及び配列番号２３で表される各塩基配列を有する４種のプライマー、又は下記表５に示される配列表の配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６及び配列番号２７で表される各塩基配列を有する４種のプライマーのいずれかを含むものであることが好ましい。
なお、プライマーセット（ＩＩ）は、前記４種のプライマーの他に、標的配列（Ｂ）にハイブリダイズするものの、前記４種のプライマーとは異なる塩基配列を有するプライマーを含んでいてもよい。
【００４４】
検出感度の観点より、プライマーセット（ＩＩ）は、配列表の配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２及び配列番号２３で表される各塩基配列からなる４種のプライマーを含むものであることが更に好ましい。また、プライマーセット（ＩＩ）は、配列表の配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２及び配列番号２３で表される各塩基配列からなる４種のプライマーより成るものであることが最も好ましい。なお、プライマーセット（ＩＩ）はこれら４種のプライマーで構成されていればよく、前記４種のプライマーと同種のプライマーがさらに含まれていてもよい。
【００４５】
【表４】
0005911707.tif 000005
【００４６】
【表５】
0005911707.tif 000006
【００４７】
本発明における前記プライマーセット（ＩＩ）としては、例えば配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２及び配列番号２３で表される各塩基配列からなる４種のプライマー又は、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６及び配列番号２７で表される各塩基配列からなる４種のプライマーのぞれぞれと相同性が認められる各塩基配列からなる４種のオリゴヌクレオチドより成るセットも、本発明におけるプライマーセット（ＩＩ）に包含される。
なお、相同性の程度等については、前記プライマーセット（Ｉ）についての説明を引用するものとする。
【００４８】
また、本発明における前記プライマーセット（ＩＩ）としては、例えば配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２及び配列番号２３で表される各塩基配列からなる４種のプライマー又は、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６及び配列番号２７で表される各塩基配列からなる４種のプライマーのぞれぞれと同等程度の作用を示すものであれば、配列番号２０の相補配列、配列番号２１の相補配列、配列番号２２の相補配列及び配列番号２３の相補配列で表される各塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする４種のオリゴヌクレオチドより成るセットも本発明におけるプライマーセット（ＩＩ）に包含される。
なお、ハイブリダイゼーションやストリンジェントの条件については、前記プライマーセット（Ｉ）についての説明を引用するものとする。
【００４９】
さらに、本発明における前記プライマーセット（ＩＩ）としては、例えば配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２及び配列番号２３で表される各塩基配列からなる４種のプライマー又は、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６及び配列番号２７で表される各塩基配列からなる４種のプライマーのぞれぞれと同等程度の作用を示すものであれば、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２及び配列番号２３で表される各塩基配列に塩基が挿入、欠失又は置換した４種のオリゴヌクレオチドのセットも、本発明におけるプライマーセット（ＩＩ）に包含される。
なお、挿入、欠失又は置換等の範囲については、前記プライマーセット（Ｉ）についての説明を引用するものとする。
【００５０】
配列表の配列番号３で示される塩基配列は、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＹ３２２３６４の１番目から１９８０番目の塩基からなる塩基配列であり、デハロコッコイデス属  ＶＳ株のｖｃｒＡ遺伝子をコードする塩基配列である。ｖｃｒＡ遺伝子は、ｂｖｃＡ遺伝子と同様に塩化ビニルからエチレンへの脱塩素反応を担う酵素をコードしている。該遺伝子をコードする塩基配列に含まれる標的配列（Ｃ）を標的とすることにより、検出対象となる試料中に含まれるｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解能を有する細菌の存在を漏れなく拾うことができるものと推測される。
【００５１】
標的配列（Ｃ）は、配列番号３で示される塩基配列のうち、１２６０番目から１６８４番目の塩基からなる塩基配列に含まれる領域であり、その範囲の全部又は一部とすることができる。
また、標的配列（Ｃ）は、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解能を有するデハロコッコイデス属細菌の存在をより適正に評価するという観点より、下記表６に示される配列表の配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５で表される塩基配列を含んでいることが好ましい。
【００５２】
【表６】
0005911707.tif 000007
【００５３】
プライマーセット（ＩＩＩ）は、前記標的配列（Ｃ）をＬＡＭＰ法により増幅させるプライマーセットである。
【００５４】
プライマーセット（ＩＩＩ）におけるＦ３プライマーの塩基数は、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解能を有するデハロコッコイデス属細菌を、より迅速、簡便且つ高感度で検出することができるという観点より、１０ｍｅｒ〜４０ｍｅｒであることが好ましく、１５ｍｅｒ〜３０ｍｅｒであることがより好ましく、１８ｍｅｒ〜２３ｍｅｒであることがさらに好ましい。
【００５５】
プライマーセット（ＩＩＩ）におけるＢ３プライマーの塩基数は、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解能を有するデハロコッコイデス属細菌を、より迅速、簡便且つ高感度で検出することができるという観点より、１０ｍｅｒ〜４０ｍｅｒであることが好ましく、１５ｍｅｒ〜３０ｍｅｒであることがより好ましく、１８ｍｅｒ〜２３ｍｅｒであることがさらに好ましい。
【００５６】
プライマーセット（ＩＩＩ）におけるＦＩＰプライマーの塩基数は、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解能を有するデハロコッコイデス属細菌を、より迅速、簡便且つ高感度で検出することができるという観点より、３０ｍｅｒ〜６０ｍｅｒであることが好ましく、３５ｍｅｒ〜５５ｍｅｒであることがより好ましく、４０ｍｅｒ〜５０ｍｅｒであることがさらに好ましい。
【００５７】
プライマーセット（ＩＩＩ）におけるＢＩＰプライマーの塩基数は、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解能を有するデハロコッコイデス属細菌を、より迅速、簡便且つ高感度で検出することができるという観点より、３０ｍｅｒ〜６０ｍｅｒであることが好ましく、３５ｍｅｒ〜５５ｍｅｒであることがより好ましく、４０ｍｅｒ〜５０ｍｅｒであることがさらに好ましい。
【００５８】
プライマーセット（ＩＩＩ）は、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解能を有するデハロコッコイデス属細菌を、より迅速、簡便且つ高感度で検出することができるという観点より、下記表７に示される配列表の配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０及び配列番号３１で表される各塩基配列を有する４種のプライマーを少なくとも含むものであることが好ましい。なお、プライマーセット（ＩＩＩ）は、前記４種のプライマーの他に、標的配列（Ｃ）にハイブリダイズするものの、前記４種のプライマーとは異なる塩基配列を有するプライマーを含んでいてもよい。
【００５９】
検出感度の観点より、プライマーセット（ＩＩＩ）は、配列表の配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０及び配列番号３１で表される各塩基配列からなる４種のプライマーより成るものであることが更に好ましい。なお、プライマーセット（ＩＩＩ）はこれら４種のプライマーで構成されていればよく、前記４種のプライマーと同種のプライマーがさらに含まれていてもよい。
【００６０】
【表７】
0005911707.tif 000008
【００６１】
本発明における前記プライマーセット（ＩＩＩ）としては、例えば配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０及び配列番号３１で表される各塩基配列からなる４種のプライマーのぞれぞれと相同性が認められる各塩基配列からなる４種のオリゴヌクレオチドより成るセットも、本発明におけるプライマーセット（ＩＩＩ）に包含される。
なお、相同性の程度等については、前記プライマーセット（Ｉ）についての説明を引用するものとする。
【００６２】
また、本発明における前記プライマーセット（ＩＩＩ）としては、例えば配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０及び配列番号３１で表される各塩基配列からなる４種のプライマーのぞれぞれと同等程度の作用を示すものであれば、配列番号２８の相補配列、配列番号２９の相補配列、配列番号３０の相補配列及び配列番号３１の相補配列で表される各塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする４種のオリゴヌクレオチドより成るセットも本発明におけるプライマーセット（ＩＩＩ）に包含される。
なお、ハイブリダイゼーションやストリンジェントの条件については、前記プライマーセット（Ｉ）についての説明を引用するものとする。
【００６３】
さらに、本発明における前記プライマーセット（ＩＩＩ）としては、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０及び配列番号３１で表される各塩基配列からなる４種のプライマーのぞれぞれと同等程度の作用を示すものであれば、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０及び配列番号３１で表される各塩基配列に塩基が挿入、欠失又は置換した４種のオリゴヌクレオチドのセットも、本発明におけるプライマーセット（ＩＩＩ）に包含される。
なお、挿入、欠失又は置換等の範囲については、前記プライマーセット（Ｉ）についての説明を引用するものとする。
【００６４】
本発明のデハロコッコイデス属細菌検出用プライマーセットは、前記プライマーセット（Ｉ）と、前記プライマーセット（ＩＩ）及び前記プライマーセット（ＩＩＩ）から選ばれる少なくとも一方のプライマーセットとを含む。
ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解に関連する遺伝子をコードする塩基配列を増幅可能な、前記プライマーセット（ＩＩ）又は前記プライマーセット（ＩＩＩ）を含むことにより、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解能を有するデハロコッコイデス属細菌を高感度で検出することが可能になると推測される。
【００６５】
本発明のデハロコッコイデス属細菌検出用プライマーセットの好ましい態様としては、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解能を有するデハロコッコイデス属細菌を、より迅速に、より高感度で且つ簡便に検出することができるという観点より、前記プライマーセット（Ｉ）に加えて、前記プライマーセット（ＩＩ）及び前記プライマーセット（ＩＩＩ）を含む。
【００６６】
前記検出用プライマーセットは、デハロコッコイデス属細菌の検出方法に使用することができる。デハロコッコイデス属細菌の検出方法について、以下に説明する。
【００６７】
＜デハロコッコイデス属細菌の検出方法＞
本発明にかかるデハロコッコイデス属細菌の検出方法（以下、単に「検出方法」ともいう。）は、前記検出用プライマーセットを用いて、ＬＡＭＰ法により試料核酸を増幅して、デハロコッコイデス属細菌を検出することを含むデハロコッコイデス属細菌の検出方法である。
本発明にかかるデハロコッコイデス属細菌の検出方法は、前記検出用プライマーセットを用いて、ＬＡＭＰ法による試料核酸の増幅をすることにより、デハロコッコイデス属細菌を検出するものである。当該検出方法により、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解能を有するデハロコッコイデス属細菌を高い感度で、迅速且つ簡便に検出することができる。
【００６８】
試料核酸は、検出対象となる試料から公知の方法に従い準備することが可能である。準備する方法としては、検出対象となる試料からの試料核酸を調製するものであれば、どのような方法でもよく、例えば化学的溶菌（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋなど）処理、物理的破砕（ビーズ破砕など）処理、アルカリ溶解、ボイリングなどの方法で単離した核酸を、フェノール・クロロホルム抽出、磁性ビーズ、シリカメンブレンなどを用いて精製する方法が挙げられる。
【００６９】
抽出する方法としては、特に制限はされないが、例えばフェノール−クロロホルム法などの液−液抽出法、担体を用いる固−液抽出法などを使用することができる。また、市販の核酸抽出キットＩＳＯＩＬ  ｆｏｒ  Ｂｅａｄｓ  Ｂｅａｔｉｎｇ（ニッポンジーン製）、Ｅｘｔｒａｐ  Ｓｏｉｌ  ＤＮＡ  Ｋｉｔ  Ｐｌｕｓ  ｖｅｒ．２（日鉄環境エンジニアリング製）などを利用することも可能である。
【００７０】
検出対象となる試料は、血液、組織、細胞、動物、植物のような生体由来試料、食品、排水、土壌又は地下水等の広範囲な場所から採取することができるが、バイオスティミレーションを実施するという観点から、デハロコッコイデス属細菌が本来存在しうる土壌又は地下水から採取することが好ましい。
採取の方法は、特に限定されない。例えば、土壌から試料を採取する場合にはロータリーボーリング、打撃貫入式ボーリング、ハンドオーガを利用する方法を用いることができる。地下水から試料を採取する場合には後述する井戸からエアーリフトポンプ、水中ポンプ、ピストンポンプ、ベーラーなどを利用する方法を用いることができる。土壌又は地下水から採取するという観点からは分析試料の二次汚染を防止する方法により採取するという観点より、ボーリング時にはケーシングやセメンチングを実施することが好ましい。
【００７１】
試料核酸を、ＬＡＭＰ法により増幅させる場合には、例えば、次のような条件で行うことが好ましい。
ＬＡＭＰ法により試料核酸を増幅させる場合の温度としては、例えば約６０℃〜約６５℃が挙げられ、６２℃〜６４℃であることが好ましい。
反応時間としては、例えば０．５時間〜１．５時間が挙げられ、１時間〜１．４時間がより好ましい。
【００７２】
試料核酸を増幅させる際に使用する試薬としては前記プライマーセットの他に、ポリメラーゼ、バッファー、ｄＮＴＰｓ、ＭｇＳＯ４等が挙げられる。
使用する試薬の濃度は、反応容量、反応時間などに合わせて適宜調製することが可能である。
【００７３】
試料核酸を増幅させる際に使用するポリメラーゼは、公知のものを適宜使用することができる。例えば、Ｂｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（栄研化学社製）、Ｃｓａ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ニッポンジーン社製）などを使用することができる。
正確な濁度又は蛍光強度の測定を行うという観点からは、前記プライマーセット及び前記ポリメラーゼを除く、核酸増幅に必要な全ての試薬が混合されたＲｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘ．(ＲＭ)（栄研化学社製）を用いることが好ましい。
【００７４】
なお、プライマーセットとしては、前述した検出用プライマーセットについての説明を引用するものとする。
【００７５】
デハロコッコイデス属細菌を検出することは、前記検出用プライマーセットを用いてＬＡＭＰ法により増幅させた増幅産物の有無を確認することを含む。前記検出用プライマーセットを用いることによりｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解能を有するデハロコッコイデス属細菌を高い感度で迅速且つ簡便に検出することが可能となる。
前記検出用プライマーセットを用いてＬＡＭＰ法により増幅させた増幅産物の有無を確認することは、例えば単に増幅産物の有無を検出することだけではなく、該増幅産物の量を測定すること等を含んでいてもよい。
前記増幅産物の有無を確認するための方法としては、特に制限されず、公知の方法を用いることができる。例えば、濁度を測定する方法、蛍光目視検出方法、増幅された塩基配列を特異的に認識する標識オリゴヌクレオチドや蛍光性インターカレーターを用いる方法、反応終了後の反応液をそのままアガロースゲル電気泳動にかける方法などによって確認することができる。
【００７６】
前記検出の好ましい態様としては、濁度又は蛍光強度を測定することが含まれる。
濁度を測定することは、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解能を有するデハロコッコイデス属細菌の存在を、土壌汚染対策を実施している敷地あるいはサイト内等の仮設された施設等においても簡便に測定することができるとともに、迅速且つ高感度に検出することもできるという点で好ましい。
【００７７】
濁度を測定するための方法としては、公知の方法を適用することができる。例えば、Ｌｏｏｐａｍｐ濁度測定装置ＲＴ−１６０Ｃ（栄研化学社製）、Ｌｏｏｐａｍｐリアルタイム濁度測定装置ＬＡ−２００（テラメックス株式会社製）、Ｒｅａｌｏｏｐ−３０（モリテックス社製）等を使用することにより、濁度を測定することができる。蛍光強度を測定するための方法としては、公知の方法を適用することができる。例えば、ＧｅｎｉｅＩＩ（ニッポンジーン社製）等を使用することにより、蛍光強度を測定することができる。
【００７８】
本発明のデハロコッコイデス属細菌の検出方法の好ましい態様としては、前記検出することにより得られた結果に基づいて、デハロコッコイデス属細菌を定量することが挙げられる。
このようなデハロコッコイデス属細菌の定量は、前記検出用プライマーセットを用いて得られた前記増幅産物の量の測定結果に基づいて行うものであるため、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解能を有するデハロコッコイデス属細菌の量を正確に把握することができる。
前記デハロコッコイデス属細菌の定量は、例えば、増幅産物の量を単に測定するものであってもよく、該増幅産物から具体的なｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解能を有するデハロコッコイデス属細菌の細菌数を算出するものであってもよい。
前記増幅産物の量を測定する方法としては、特に制限されず公知の方法を用いることができる。例えば、一例として、前記検出することにより得られた結果に基づいて、検量線を作成して定量する方法、内部標準を用いる方法、段階希釈試料を用いたＭＰＮ（最確値）法等の公知の方法が挙げられる。
【００７９】
前記検量線を作成して定量する方法は、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解能を有するデハロコッコイデス属細菌の存在量を正確に把握できるというだけではなく、簡便であるという点でも好ましい。
ここで、検量線を作成して定量する方法の場合、前記試料核酸について、ＬＡＭＰ法で検出する対象領域を含む領域をＰＣＲ法により増幅させ、増幅産物量を測定した試料を適宜希釈し、例えば一反応あたり１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６コピーずつ添加した系を調製してＬＡＭＰ法を行うことにより、定量のための検量線が作成できる。ただし、検量線の作成方法は、これに制限されるものではなく、公知の方法を用いることができる。
【００８０】
前記増幅産物の量から具体的なｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解能を有するデハロコッコイデス属細菌の細菌数を算出する場合には、前記検量線を作成して定量する方法に続き、測定時の希釈倍率や土壌含水比から地下水１ｍｌ当り、あるいは乾燥土壌１ｇ当りの細菌数として算出する。なお、前記細菌数の算出方法は、これに限定されるものではない。
前記デハロコッコイデス属細菌の検出方法は、各種試料中におけるデハロコッコイデス属細菌の検出、浄化対象領域の浄化計画を設計する方法などの様々な方法に使用することができる。デハロコッコイデス属細菌の検出方法を用いて浄化対象領域の浄化計画を設計する方法について、以下に説明する。
【００８１】
＜浄化対象領域の浄化計画を設計する方法＞
浄化対象領域の浄化計画を設計する方法としては、浄化対象領域からの試料核酸を準備すること、該試料核酸から前記検出方法を用いてデハロコッコイデス属細菌を検出すること、及び検出結果に基づき土壌又は地下水の浄化期間を算出することを含む。
本発明の浄化対象領域の浄化計画を設計する方法は、前記プライマーセットを用いた前記検出方法を、土壌又は地下水の浄化期間の算出に適用するものである。前記検出方法を適用することにより、浄化対象領域に存在するｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解能を有するデハロコッコイデス属細菌を、高い感度で、迅速且つ簡便に検出できる。これにより、前記デハロコッコイデス属細菌によって土壌又は地下水の浄化を行う期間をより正確に算出することができるため、成功確度の高い浄化対象領域の浄化計画を、迅速に立てることが可能になる。
【００８２】
本発明において浄化対象領域とは、揮発性有機塩素化合物（ＶＯＣ）、重金属類、農薬、ＰＣＢ、油等の汚染物質による汚染が疑われる領域を意味する。具体的には、前記汚染物質よる汚染が疑われる土壌、前記汚染物質による汚染が疑われる地下水等が挙げられる。中でも前記汚染物質としては、揮発性有機塩素化合物（ＶＯＣ）が挙げられ、特に、ＰＣＥ、ＴＣＥ、ＤＣＥ、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥが挙げられる。
【００８３】
本発明において浄化とは、土壌又は地下水における前記汚染物質の濃度を、土壌汚染対策法に定められた基準以下とすることを意味する。具体的には、該汚染物質を分解し、該汚染物質の濃度を低減させることが挙げられる。基準としては具体的には、土壌においては土壌含有量基準、土壌溶出量基準が挙げられ、地下水においては地下水基準が挙げられる。
浄化計画とは、前記汚染物質による土壌汚染や水質汚濁の発生が確認された場所である浄化対象領域において、土壌汚染や水質汚濁を浄化するために立案された計画を意味する。具体的には、井戸配置の計画や地下水の揚水処理装置の設計等が挙げられる。また、前記浄化計画には、浄化対象領域の土壌汚染や水質汚濁に関する基本事項、施工数量、浄化品質、施工期間、薬剤量、薬剤注入条件、注入およびモニタリングに関する工程管理、資機材、施工費用、安全管理、周辺環境管理を含む計画等が包含される。
揮発性有機塩素化合物（ＶＯＣ）等の汚染物質の使用による土壌汚染や水質汚濁の発生の確認は、例えば、土壌汚染対策法に基づく表層ガス調査等により行うことができる。
【００８４】
浄化対象領域からの試料核酸の準備としては、浄化対象領域から、検出対象となる試料を採取し、該試料中から試料核酸を調製すること等が挙げられる。
検出対象となる試料を採取する方法や、該試料中から試料核酸を調製する方法については、前記検出方法においての説明を引用するものとする。
また、前記試料核酸から前記検出方法を用いてデハロコッコイデス属細菌を検出することについても、前記検出方法においての説明を引用するものとする。
【００８５】
前記検出結果に基づき土壌又は地下水の浄化期間を算出するとは、前記検出方法で得られた結果に基づき、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解能を有するデハロコッコイデス属細菌の細菌数と、該デハロコッコイデス属細菌によるｃｉｓ−１，２−ＤＣＥの分解速度と、エチレン生成濃度とを算出し、該デハロコッコイデス属細菌がｃｉｓ−１，２−ＤＣＥをエチレンに分解するまでの期間を算出することを意味する。
【００８６】
前記ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解能を有するデハロコッコイデス属細菌の細菌数を算出する方法としては、前記検量線を作成して定量する方法を含む。具体的には、前記検量線を作成して定量する方法に続き、測定時の希釈倍率や土壌含水比から地下水１ｍｌ当り、あるいは乾燥土壌１ｇ当りの細菌数として算出する等の方法により、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解能を有するデハロコッコイデス属細菌の数を算出することができる。
【００８７】
ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解能を有するデハロコッコイデス属細菌によるｃｉｓ−１，２−ＤＣＥの分解速度を算出する方法としては、公知の方法を使用することができ、特に制限はされるものではない。例えば、浄化対象領域の一部区画において井戸に浄化薬剤の注入を行い、一定期間経過後のデハロコッコイデス属細菌の細菌数と、ＰＣＥ、ＴＣＥ及びｃｉｓ−１，２−ＤＣＥの濃度とを測定し、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解速度を算出する方法、あるいは同じく一定期間経過後のエチレン生成速度からｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解量を算出する方法等により、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解速度の算出を行うことができる。また、浄化対象領域で浄化施工前にデハロコッコイデス属細菌を確認し、デハロコッコイデス属細菌の細菌数に、前記浄化対象領域以外で得られたデハロコッコイデス属細菌に基づく既往のｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解速度を乗じることにより算出を行うことができる。
ここで前記浄化薬剤としては、後述するバイオスティミュレーション用薬剤が挙げられる。
前記井戸としては公知のものを使用することができる。また、その設置方法などについては公知の方法を適用することができる。例えば、特開２０１１-０９９２１２号公報に記載されたものを適用することができる。
【００８８】
上記で得られた前記ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解能を有するデハロコッコイデス属細菌の細菌数と、該細菌によるｃｉｓ−１，２−ＤＣＥの分解速度との結果より、該細菌による土壌又は地下水の浄化期間の算出を行う方法としては、公知の方法を使用することができ、特に制限されるものではない。例えば、上記で得られた前記ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解能を有するデハロコッコイデス属細菌の細菌数と、該細菌によるｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解速度との結果より、ＰＣＥ、ＴＣＥ等の各ＶＯＣの分解の過程で生じるｃｉｓ−１，２−ＤＣＥの濃度を算出する。その後、算出により得られたｃｉｓ−１，２−ＤＣＥの濃度及び現在の土壌又は地下水中のｃｉｓ−１，２−ＤＣＥの濃度より、浄化対象領域で分解が必要なｃｉｓ−１，２−ＤＣＥの総量を算出する。この結果及び浄化対象領域におけるデハロコッコイデス属細菌によるｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解速度より、デハロコッコイデス属細菌による土壌又は地下水の浄化期間の算出を行うことができる。
【００８９】
また、本発明における浄化対象領域の浄化計画を設計する方法の好ましい態様としては、算出したデハロコッコイデス属細菌による土壌又は地下水の浄化に必要な施工期間及び浄化のための目標期間を比較することと、具体的な浄化のための方法を設計することとをさらに含んでいてもよい。
前記浄化に必要な施工期間を算出する方法としては、公知の方法を使用することができる。例えば、浄化に必要な施工期間は、上記で算出した前記浄化期間に加え、準備工事又は浄化実施後のモニタリングに必要な期間等を加味することにより算出することが可能である。
前記浄化のための目標期間としては、土壌汚染対策法に定められている汚染物質の暴露リスクの遮断についての緊急性から求められる期間、浄化対象領域における土地の形質変更を伴う土地利用計画又は形質変更の実施予定時期を考慮して許容される期間などが挙げられる。
【００９０】
前記具体的な浄化のための方法を設計することは、前記浄化期間と、前記浄化のための目標期間とを比較した結果を用いて、バイオスティミュレーションの施工又はバイオスティミュレーション以外の方法の施工のいずれかを選択することを含む。
前記具体的な浄化のための方法の設計としては、例えば、前記浄化のための目標期間の方が、前記浄化のための目標期間に比べて短い場合には、前記具体的な浄化のための方法として、バイオスティミュレーションを施工する。一方、前記浄化期間の方が、前記浄化のための目標期間に比べて長い場合には、前記具体的な浄化のための方法として、バイオスティミュレーション以外の方法（例えば、汚染部分の掘削除去など）を施工する。
【００９１】
前記バイオスティミュレーションの施工とは、特に限定はされないが、例えばバイオスティミュレーション用薬剤（以下、単に「薬剤」とも言う。）の注入と、デハロコッコイデス属細菌の細菌数やＶＯＣ濃度の観測とを行うことを目的として浄化対象領域に井戸を設置すること、バイオスティミュレーション用薬剤を該井戸から注入すること、汚染物質の分解促進を行うこと、デハロコッコイデス属細菌の細菌数およびＶＯＣ濃度をモニタリングすること等が挙げられる。
前記バイオスティミュレーション用薬剤としては、易生分解性の有機性物質および栄養塩類であれば特に限定されないが、例えばポリ乳酸エステル、酵母抽出物質、高級脂肪酸エステルなどの有機物および硝酸アンモニウム、尿素、リン酸一水素カリウムなどの栄養塩類が挙げられる。
【００９２】
前記薬剤浸透評価とは、特に限定はされないが、例えば前記井戸に試験的に前記薬剤を注入し、注入速度、周辺井戸までの到達範囲、到達濃度などを評価すること等が挙げられる。
前記薬剤移流解析とは、特に限定はされないが、例えば調査から得られた浄化対象領域の地盤条件に基づいて移流拡散解析を行うことにより、前記薬剤の浸透速度、浸透範囲、滞留時間及び濃度などを解析するもの等が挙げられる。
【００９３】
前記バイオスティミュレーションの施工には、薬剤浸透評価及び薬剤移流解析を前記バイオスティミュレーションの施工の前に行うことを含んでいてもよい。
バイオスティミュレーション以外の方法の施工としては、バイオオーギュメンテーションや、特開２０１１−１６７６４６号公報に記載のような酸化剤を用いて浄化する方法などが挙げられる。
バイオオーギュメンテーションの施工は、特開２００９-２１３４２７号公報等に記載の方法に従い実施することができる。
【００９４】
＜浄化対象領域の浄化方法＞
浄化対象領域の浄化方法としては、（Ｉ）浄化対象領域から得られた評価用試料を用いて、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥの濃度を測定すること（ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ濃度測定工程）、（ＩＩ）前記検出方法を用いて、前記評価用試料中のデハロコッコイデス属細菌を検出すること（細菌の検出工程）、（ＩＩＩ）前記検出方法により検出された前記デハロコッコイデス属細菌の細菌数を算出すること（細菌数算出工程）、（ＩＶ）前記検出方法により検出された前記デハロコッコイデス属細菌によるｃｉｓ−１，２−ＤＣＥの分解速度を算出すること（分解速度算出工程）、（Ｖ）前記算出されたデハロコッコイデス属細菌の細菌数と前記算出されたｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解速度とに基づき、前記デハロコッコイデス属細菌による前記浄化対象領域の浄化に必要な施工期間を算出すること（施工期間算出工程）、及び（ＶＩ）前記浄化に必要な施工期間に基づき、浄化のための工法を選択し実行すること（浄化工程）を含む。
【００９５】
本発明の浄化対象領域の浄化方法は、前記プライマーセットを用いた前記検出方法を、浄化対象領域の浄化に適用するものである。前記検出方法を適用することにより、浄化対象領域に存在するｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解能を有するデハロコッコイデス属細菌の細菌数を、高い感度で、迅速且つ簡便に検出できる。これにより、前記デハロコッコイデス属細菌によって行われる、浄化対象領域の浄化を行う期間をより正確に算出することができるため、成功確度の高い浄化のための工法を選択し実行することが可能になる。
【００９６】
本発明において評価用試料とは、前記浄化対象領域に含まれるいずれかの場所から採取された試料を意味する。評価用試料の採取は、浄化対象領域において１ヶ所のみ行ってもよく、複数箇所で行ってもよい。評価用試料の採取量は、各種分析項目に必要な量に応じて決定すればよい。例えば、地下水中のデハロコッコイデス属細菌の検出時には、２５０ｍｌの評価用試料を採取することが挙げられる。
【００９７】
また、評価用試料を採取する場合、汚染物質が存在する所定の深さにおける評価用試料の採取を行えばよい。複数箇所から評価用試料を採取する場合には、所定の間隔、例えば、間隔１ｍ或いはそれ以下、間隔５ｍ、間隔１０ｍ、間隔３０ｍ等で行うことができる。
【００９８】
評価用試料を採取する手段としては、公知の掘削装置を用いることができる。例えば特開２００５-０８７８４０号公報に記載の装置や、興亜開発株式会社製のジオプローブ、株式会社ワイビーエム製のＥＣＯ−３Ｖ等のように、所定の深さにおける評価用試料採取が可能であれば、いずれの装置を用いてもよい。なお、前記評価用試料を前記検出方法に供する場合には、前記評価用試料より、前記試料核酸を準備すればよい。前記試料核酸及び該試料核酸の準備の方法などについては、前記浄化対象領域の浄化計画を設計する方法においての説明を引用するものとする。
【００９９】
なお、前記（Ｉ）ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ濃度測定工程に用いられる評価用試料としては、何らの処理も施されていないものだけではなく、デハロコッコイデス属細菌の細菌数又はＶＯＣ濃度のモニタリングのために、前記バイオスティミュレーション用薬剤が予め注入されたものも包含する。
【０１００】
ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥの濃度測定は、公知の方法に従い測定することが可能である。例えば、「地下水に含まれる調査対象物質の量の測定方法を定める件」（平成１５年３月６日環境省告示第１７号）に準拠した方法等でｃｉｓ−１，２−ＤＣＥの濃度を測定できる。
【０１０１】
前記浄化対象領域、前記検出方法を用いたデハロコッコイデス属細菌の検出、デハロコッコイデス属細菌の細菌数の算出及びデハロコッコイデス属細菌によるｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解速度の算出については、前記浄化対象領域の浄化計画を設計する方法においての説明を引用するものとする。
【０１０２】
前記デハロコッコイデス属細菌による前記浄化対象領域の浄化に必要な施工期間の算出は、浄化対象領域におけるｃｉｓ−１，２−ＤＣＥの濃度、算出されたデハロコッコイデス属細菌の細菌数及び算出されたｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解速度に基づき算出することができる。具体的には、浄化対象領域におけるｃｉｓ−１，２−ＤＣＥの濃度を、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解速度あるいは算出されたデハロコッコイデス属細菌の細菌数から算出されたｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解速度あるいはエチレン生成速度から算出されたｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解速度で除することにより施工期間を確認することができる。
【０１０３】
浄化のための工法としては、公知の方法を用いることができ、特に制限されない。例えば、バイオスティミュレーション、バイオオーグメンテーション又は特開２０１１−１６７６４６号公報に記載のような酸化剤を用いた工法、還元剤を用いた工法、揚水ばっ気法等が挙げられる。前記バイオスティミュレーションの工法については、前記浄化対象領域の浄化計画を設計する方法においての説明を引用するものとする。
【０１０４】
浄化対象領域の浄化方法のより好ましい態様として、前記（Ｉ）ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ濃度測定工程の後に、前記検出方法を用いて、前記評価用試料中のデハロコッコイデス属細菌を検出すること（細菌の検出工程）、前記検出方法により検出された前記デハロコッコイデス属細菌の細菌数を算出すること（細菌数の算出工程）、前記算出されたデハロコッコイデス属細菌の細菌数に基づき、デハロコッコイデス属細菌によるｃｉｓ−１，２−ＤＣＥの分解速度を予測すること（分解速度予測工程）、前記算出されたデハロコッコイデス属細菌の細菌数及び前記予測されたｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解速度に基づき、前記デハロコッコイデス属細菌による前記浄化対象領域の浄化に必要な予測施工期間を得ること（施工期間予測工程）を行い、前記（ＩＩ）細菌の検出工程から前記（ＩＶ）分解速度算出工程を行うこと、前記（ＩＩ）から前記（ＩＶ）で得られた結果に基づき、前記デハロコッコイデス属細菌による前記浄化対象領域の浄化に必要な施工期間を確認すること（施工期間確認工程）、前記（ＶＩ）浄化工程と、を含んでいることが挙げられる。
【０１０５】
すなわち、浄化対象領域の浄化方法のより好ましい態様としては、前記（ＩＩ）細菌の検出工程から前記（ＶＩ）浄化工程の前に、予め分解速度予測工程及び施工期間予測工程を行うことを含んでいてもよい。これにより、その後に行う施工期間確認工程の精度が高くなり、より最適な工法を選択することができるという利点がある。
より好ましい態様における（Ｉ）ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ濃度測定工程、（ＩＩ）細菌の検出工程、（ＩＩＩ）細菌数の算出工程、（ＩＶ）分解速度算出工程及び（ＶＩ）浄化工程については、前記と同義である。また、より好ましい態様における前記細菌の検出工程及び前記細菌数の算出工程は、前記（ＩＩ）細菌の検出工程及び（ＩＩＩ）細菌数算出工程においての説明を引用するものとする。
【０１０６】
前記分解速度予測工程は、浄化対象領域における算出されたデハロコッコイデス属細菌の細菌数に基づき分解速度を予測するものである。
前記施工期間予測工程は、浄化対象領域におけるｃｉｓ−１，２−ＤＣＥの濃度、算出されたデハロコッコイデス属細菌の細菌数及び予測されたｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解速度に基づき施工期間を予測するものである。具体的には、浄化対象領域におけるｃｉｓ−１，２−ＤＣＥの濃度を、算出されたデハロコッコイデス属細菌の細菌数から予測されたｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解速度で除することにより施工期間を予測することができる。デハロコッコイデス属細菌による予測されたｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解速度については、過去に報告されている分解速度（例えば、Ｈｅ, Ｊ. ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，（２００３） ｖｏｌ．６９，９９６−１００３等）を用いることができる。
【０１０７】
前記施工期間確認工程は、前記（ＩＩ）細菌の検出工程から前記（ＩＶ）分解速度算出工程で得られた結果に基づき、前記デハロコッコイデス属細菌による前記浄化対象領域の浄化に必要な施工期間を確認するものである。すなわち、浄化対象領域におけるｃｉｓ−１，２−ＤＣＥの濃度、算出されたデハロコッコイデス属細菌の細菌数及び算出されたｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解速度に基づき確認することができる。具体的には、浄化対象領域におけるｃｉｓ−１，２−ＤＣＥの濃度を、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解速度で除すること、算出されたデハロコッコイデス属細菌の細菌数から算出されたｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解速度で除すること、又はエチレン生成速度から算出されたｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解速度で除することにより施工期間を確認することができ、前記施工期間予測工程において予測した施工期間を適宜修正することが可能となる。
【０１０８】
なお、本発明にかかる浄化対象領域の浄化方法は、前記（Ｉ）ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ濃度測定工程から前記（ＶＩ）浄化工程を含んでいればよい。前記（Ｉ）から前記（ＶＩ）の一連の工程には、前記（Ｉ）から前記（ＶＩ）の一連の工程に加えて再度前記（Ｉ）から前記（ＶＩ）の一連の工程を繰り返して行ってもよく、必要に応じて前記（Ｉ）から前記（ＶＩ）の一連の工程に加えて前記（Ｉ）から前記（ＶＩ）のうちの特定の工程のみを繰り返し行ってもよい。
【０１０９】
浄化対象領域の浄化方法のさらに好ましい態様としては、前記（ＶＩ）浄化工程の後に、前記浄化対象領域のｃｉｓ−１，２−ＤＣＥの濃度をモニタリングすること（ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ濃度モニタリング工程）、及び前記検出方法を用いて、前記浄化対象領域のデハロコッコイデス属細菌の細菌数をモニタリングすること（細菌数モニタリング工程）をさらに含んでいることが挙げられる。
【０１１０】
前記ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ濃度モニタリング工程としては、前記（Ｉ）ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ濃度測定工程において用いた方法と同様の方法を適用することにより、浄化のための工法を選択した後の前記浄化対象領域におけるｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ濃度をモニタリングすることが可能となる。
【０１１１】
前記細菌数モニタリング工程としては、前記細菌数算出工程において用いた方法と同様の方法を適用することにより、浄化のための工法を選択した後の前記浄化対象領域における前記デハロコッコイデス属細菌の細菌数をモニタリングすることが可能となる。
前記ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ濃度モニタリング工程及び前記細菌数モニタリング工程を行う場合には、前記浄化のための工法を実行後、１ヶ月〜３ヶ月ごとに行うことがより好ましい。
【０１１２】
浄化対象領域の浄化方法において、前記ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ濃度モニタリング工程及び前記細菌数モニタリング工程を行うことにより、浄化対象領域における浄化の完了及び別工法への切り替えを判定することが可能となる。
【０１１３】
浄化対象領域における浄化の完了は、ＰＣＥ、ＴＣＥ、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ濃度により判定が可能である。例えば、地下水中のＰＣＥ濃度、ＴＣＥ濃度、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ濃度がそれぞれ０．０１ｍｇ／Ｌ以下、０．０３ｍｇ／Ｌ以下、０．０４ｍｇ／Ｌ以下である場合には、浄化対象領域における浄化は完了したものと判定することが可能となる。
【０１１４】
また、浄化施工開始時から９０日後以降にｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ濃度が低下が見られず、かつ細菌数に増加が見られず、かつ地下水中からエチレンが検出されない場合には、バイオオーグメンテーション、特開２０１１−１６７６４６号公報に記載のような酸化剤を用いて浄化する方法、還元剤を用いて浄化する方法、揚水ばっ気にて浄化する方法等の別工法に切り替えることを検討する。
【０１１５】
＜デハロコッコイデス属細菌検出用試薬キット＞
本発明のデハロコッコイデス属細菌検出用試薬キットは、上述したデハロコッコイデス属細菌検出用プライマーセットを含む。
本発明のデハロコッコイデス属細菌検出用試薬キットは、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解能を有するデハロコッコイデス属細菌検出用プライマーセットを含むものである。そのためデハロコッコイデス属細菌検出用試薬キットを用いることにより、高感度で、迅速且つ簡便にｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解能を有するデハロコッコイデス属細菌の検出を行うことができるなどの利点がある。
【０１１６】
本発明におけるデハロコッコイデス属細菌検出用試薬キットは、前記デハロコッコイデス属細菌検出用プライマーセットの他に、本発明の検出方法における核酸増幅を行うのに必要とされる試薬をさらに含んでいてもよい。
試薬としては、前記プライマーセットの他に、ポリメラーゼ、バッファー、ｄＮＴＰs、ＭｇＳＯ４等が挙げられる。
なお、ポリメラーゼやバッファーについては、前述した検出方法においての説明を引用するものとする。
【０１１７】
プライマーセット及びその他の試薬は、別個に収容されていてもよいし、それらの一部が混合物とされていてもよい。また、プライマーセットは、４種のプライマーから成るものであるが、これら４種のプライマーは、それぞれ別個に収容されていてもよいし、それらの一部が混合物とされていてもよい。
なお、「別個に収容」とは、プライマーセット及びその他の試薬が、必要に応じて相互に非接触状態を維持できるように区分けされたものであればよく、必ずしも独立して取り扱い可能な個別の容器に収容される必要はない。４種のプライマーが別個に収容される場合も同様である。
【０１１８】
本発明のデハロコッコイデス属細菌検出用試薬キットは、前記プライマーセットを用いてｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解能を有するデハロコッコイデス属細菌を検出することが記載された取扱い説明書、又は検出用試薬キットに含まれる若しくは追加的に含むことが可能な各種の試薬について記載された使用説明書を含むことが好ましい。
【実施例】
【０１１９】
以下、本発明を実施例にて詳細に説明する。しかしながら、本発明はそれらに何ら限定されるものではない。
【０１２０】
［実施例１］プライマーセット（Ｉ−１）の評価
試料核酸を含む溶液（サンプル溶液）を、以下の方法により調製した。地下水試料を０．２０μｍポリカーボネイト製フィルターにて吸引ろ過し、微生物がトラップされたフィルターを、ビーズチューブに加えてビーズ破砕を行った。その後、ＤＮＡ抽出キットＥｘｔｒａｐ Ｓｏｉｌ ＤＮＡ Ｋｉｔ Ｐｌｕｓ ｖｅｒ.２(日鉄環境エンジニアリング社製)を用いてＤＮＡを抽出し、サンプル溶液とした。
【０１２１】
次に、滅菌マイクロチューブに、表８に記載の試薬を混合し、マスターミックスを調製した。プライマーとして表９に示すプライマーを用いた。
【０１２２】
【表８】
0005911707.tif 000009
【０１２３】
【表９】
0005911707.tif 000010
【０１２４】
１テストサンプルにつき２３．０μＬを、Ｌｏｏｐａｍｐ反応チューブに注入した。該反応チューブに、上記で調製したサンプル溶液を２μＬ添加し、全量を２５μＬにした。
反応チューブを、Ｌｏｏｐａｍｐ濁度測定装置ＲＴ−１６０Ｃ（栄研化学社製）にセットし、６３℃、８０分反応させた後、ポリメラーゼを失活させるためにさらに８０℃、５分反応させた。
【０１２５】
その結果、表９に記載のプライマーセットを使用した場合には、濁度増加量の微分値が０．００８に達するまでの増幅立ち上がり時間が１×１０６コピーの系で２４５９秒と短かった。また、低濃度域における検出精度が、１×１０２コピーの系で３６０１秒と反応時間内での安定した検出が確認された。さらに、初期の遺伝子量に応じた増幅反応が、初期コピー数と立ち上がり時間との良好な相関関係（Ｒ２＝０．９９３５）を示し、優れていた。
【０１２６】
[実施例２から実施例４]プライマーセット（ＩＩ−１）、（ＩＩ−２）及び（ＩＩＩ−１）の評価
実施例１において表９に記載のプライマーセットを、表１０、表１１及び表１２に記載のプライマーセットに変更した以外は、実施例１と同様にして、表１０、表１１及び表１２に記載のプライマーセットの評価を行った。
【０１２７】
【表１０】
0005911707.tif 000011
【０１２８】
【表１１】
0005911707.tif 000012
【０１２９】
【表１２】
0005911707.tif 000013
【０１３０】
その結果、表１０に記載のプライマーセット（ＩＩ−１）を使用した場合には、濁度増加量の微分値が０．００８に達するまでの増幅立ち上がり時間が１×１０６コピーの系で１８１１秒と短かった。また、低濃度域における検出精度が、１×１０２コピーの系で２３０９秒と反応時間内での安定した検出が確認された。さらに、初期の遺伝子量に応じた増幅反応が、初期コピー数と立ち上がり時間との良好な相関関係（Ｒ２＝０．９４６１）を示し、優れていた。
【０１３１】
表１１に記載のプライマーセット（ＩＩ−２）を使用した場合には、濁度増加量の微分値が０．００８に達するまでの増幅立ち上がり時間が１×１０６コピーの系で２６７６秒であったが、低濃度域における検出精度は、１×１０２コピーの系で３４１６秒と反応時間内での安定した検出が確認された。さらに、初期の遺伝子量に応じた増幅反応が、初期コピー数と立ち上がり時間との良好な相関関係（Ｒ２＝０．９９０６）を示し、好ましかった。
【０１３２】
また、表１２に記載のプライマーセット（ＩＩＩ−１）を使用した場合には、濁度増加量の微分値が０．００８に達するまでの増幅立ち上がり時間が１×１０６コピーの系で１６８９秒と短かった。また、低濃度域における検出精度が、１×１０２コピーの系で３２５９秒と反応時間内での安定した検出が確認された。さらに、初期の遺伝子量に応じた増幅反応が、初期コピー数と立ち上がり時間との良好な相関関係（Ｒ２＝０．９９６３）を示し、優れていた。
【０１３３】
[実施例５]デハロコッコイデス属細菌の検出方法
ＴＣＥ、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥにより汚染された地下水が存在するサイトにおいて、汚染された深度の帯水層に設置した複数の井戸より栄養薬剤（ＥＤＣ、エコサイクル社製）を注入し、嫌気性バイオスティミュレーションによる浄化を行った。
サイトに設置した１０箇所の観測井戸（観測井戸Ａ〜観測井戸Ｊ）より採水器を用いて地下水試料（地下水Ａ〜地下水Ｊ）を採取した。地下水試料を０．２０μｍポリカーボネイト製フィルターにて吸引ろ過し、微生物のトラップされたフィルターをビーズチューブに加えてビーズ破砕を行い、ＤＮＡ抽出キットＥｘｔｒａｐ Ｓｏｉｌ ＤＮＡ Ｋｉｔ Ｐｌｕｓ ｖｅｒ．２（日鉄環境エンジニアリング社製）を用いてＤＮＡを抽出して試料核酸とした。
次に、上記表８に記載のマスターミックス２３．０μＬを、Ｌｏｏｐａｍｐ反応チューブに注入した。ここで、プライマーとしては上記表９に記載のプライマーセットを用いた。該反応チューブに、上記で調製したサンプル溶液を２μＬ添加し、全量を２５μＬにした。反応チューブを、Ｌｏｏｐａｍｐ濁度測定装置ＲＴ−１６０Ｃ（栄研化学社製）にセットし、６３℃、８０分反応させた後、ポリメラーゼを失活させるためにさらに８０℃、５分反応させた。各反応チューブの濁度の増幅曲線から地下水試料中のデハロコッコイデス属細菌の細菌数を定量した。
【０１３４】
その結果、下記表１３に示した通り、１０箇所の観測井戸のいずれからもデハロコッコイデス属細菌が検出され、本サイトにおいて広範囲にデハロコッコイデス属細菌が存在していることが明らかとなった。なお、表９に記載のプライマーセットは、実施例５に記載の条件下においては、濁度増加量の微分値が０．００８に達するまでの増幅立ち上がり時間が１×１０６コピーの系で２５５２秒と短かった。また、低濃度域における検出精度が、１×１０３コピーの系で、３７１７秒と反応時間内での安定した検出が確認された。さらに、初期の遺伝子量に応じた増幅反応が、初期コピー数と立ち上がり時間との良好な相関関係（Ｒ２＝０．９２４５）を示し、優れていた。
【０１３５】
【表１３】
0005911707.tif 000014
【０１３６】
[実施例６]地下水の浄化計画の設計方法
ＰＣＥ、ＴＣＥ、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥにより汚染された地下水が存在するサイトの一部区画において、汚染された深度の帯水層（ＰＣＥ＝０．０１ｍｇ／Ｌ以下、ＴＣＥ＝０．０１ｍｇ／Ｌ以下、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ＝０．０５ｍｇ／Ｌ、デハロコッコイデス属細菌の細菌数１．０×１０1ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌ以下）に設置した井戸より栄養薬剤（ＥＤＣ、エコサイクル社製）を注入する嫌気性バイオスティミュレーションを実施し、一定期間ごとにＶＯＣ類、デハロコッコイデス属細菌の細菌数の計測を行った。試料核酸の調製、ＬＡＭＰ法によるデハロコッコイデス属細菌の細菌数の定量は実施例１に準じて行った。
【０１３７】
薬剤注入箇所の近傍の井戸の地下水をモニタリングし、試験終了時までにデハロコッコイデス属細菌の細菌数は４．５×１０５ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌまで増加し（下記表１４）、エチレン生成速度０．０００７ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解速度０．００２３ｍｇ／Ｌ／ｄａｙの結果が得られた。
以上の結果を用いることにより、本サイトにおいて最も高濃度の地点（ＰＣＥ＝０．０２ｍｇ／Ｌ、ＴＣＥ＝０．０４ｍｇ／Ｌ、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ＝０．０８ｍｇ／Ｌ）でｃｉｓ−１，２−ＤＣＥの脱塩素化に必要な浄化期間は薬剤浸透後５３日間と算出された。
本サイトでは、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥの分解速度とあわせ、薬剤注入後にデハロコッコイデス属細菌の細菌数がｃｉｓ−１，２−ＤＣＥの完全脱塩素化が進む目安となる１×１０５ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌ以上まで増加していたことから、嫌気バイオスティミュレーションによる地下水浄化が適用可能であると判断した。
【０１３８】
なお、表９に記載のプライマーセットは、実施例６に記載の条件下においては、濁度増加量の微分値が０．００８に達するまでの増幅立ち上がり時間が１×１０６コピーの系で２４６９秒と短かった。また、低濃度域における検出精度が、１×１０４コピーの系で、３０４４秒と反応時間内での安定した検出が確認された。さらに、初期の遺伝子量に応じた増幅反応が、初期コピー数と立ち上がり時間との良好な相関関係（Ｒ２＝０．９６８４）を示し、優れていた。
【０１３９】
【表１４】
0005911707.tif 000015
【０１４０】
以上の結果より、本発明のプライマーセットを用いれば迅速、簡便且つ高感度でｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解能を有するデハロコッコイデス属細菌を検出することができることが明らかになった。また、本発明の検出方法を適用することにより、土壌又は地下水の浄化期間をより正確に算出することができるため、成功確度の高い浄化対象領域の浄化計画を、迅速に立てることが可能になるものと考えられる。また、本発明の検出方法を適用することにより、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ分解能を有するデハロコッコイデス属細菌の細菌数を、高い感度で、迅速且つ簡便に検出することができるため、浄化対象領域の浄化を行う期間をより正確に算出することができ、成功確度の高い浄化のための工法を選択し実行することが可能になるものと考えられる。
【配列表】
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