(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテインホスファターゼ５の機能の調節方法であって、
カルシウムイオン存在下、プロテインホスファターゼ５に、Ｓ１００タンパク質を結合させることで、前記プロテインホスファターゼ５の活性を増強することを特徴とする調節方法。ただし、人間の治療を除く。
【請求項２】
プロテインホスファターゼ５の機能調節物質のスクリーニング方法であって、
候補物質、カルシウムイオンおよびＳ１００タンパク質の共存下、プロテインホスファターゼ５の脱リン酸化活性を分析する分析工程
を含み、
前記分析工程において、前記候補物質存在下におけるプロテインホスファターゼ５の脱リン酸化活性と、前記候補物質非存在下におけるプロテインホスファターゼ５の脱リン酸化活性とを比較し、前記候補物質非存在下に対して前記活性を増強したものをプロテインホスファターゼ５の活性化剤として選択し、前記候補物質非存在下に対して前記活性を低下させたものをプロテインホスファターゼ５の阻害剤として選択する
ことを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項３】
式（３）、（４）、（１３）〜（１５）、（１７）〜（２１）、（２３）、および（３２）からなる群から選択される少なくとも一つの化合物を含み、カルシウムイオンおよびＳ１００タンパク質の共存下、プロテインホスファターゼ５の活性を増強することを特徴とするプロテインホスファターゼ５の活性化剤。
【請求項４】
式（６）、（１１）、（４２）〜（４３）、および（４９）からなる群から選択される少なくとも一つの化合物を含み、カルシウムイオンおよびＳ１００タンパク質の共存下、プロテインホスファターゼ５の活性を低下させることを特徴とするプロテインホスファターゼ５の阻害剤。
【請求項５】
式（１０）、（１６）、（２２）、および（２４）からなる群から選択される少なくとも一つの化合物を含み、Ｓ１００タンパク質の非共存下、プロテインホスファターゼ５の活性を増強し、カルシウムイオンおよびＳ１００タンパク質との共存下、プロテインホスファターゼ５の活性を低下させることを特徴とするプロテインホスファターゼ５の機能調節剤。
【請求項６】
式（１）および（５）の少なくとも一方の化合物を含み、Ｓ１００タンパク質の非共存下、プロテインホスファターゼ５の活性を低下させ、カルシウムイオンおよびＳ１００タンパク質との共存下、プロテインホスファターゼ５の活性を増強することを特徴とするプロテインホスファターゼ５の機能調節剤。
【請求項７】
式（１２）、（２５）〜（３１）、および（３３）〜（３６）からなる群から選択される少なくとも一つの化合物を含み、Ｓ１００タンパク質の非共存下、プロテインホスファターゼ５の活性を増強することを特徴とするプロテインホスファターゼ５の活性化剤。
【請求項８】
式（３７）、（３８）、（４０）、（４１）、および（４５）〜（４８）からなる群から選択される少なくとも一つの化合物を含み、Ｓ１００タンパク質の非共存下、プロテインホスファターゼ５の活性を低下させることを特徴とするプロテインホスファターゼ５の阻害剤。
【請求項９】
式（２）の化合物を含み、カルシウムイオンおよびＳ１００タンパク質の共存下、プロテインホスファターゼ５の活性を増強することを特徴とするプロテインホスファターゼ５の活性化剤。
【請求項１０】
式（７）〜（９）、（３９）、および（５０）からなる群から選択される少なくとも一つの化合物を含み、カルシウムイオンおよびＳ１００タンパク質の共存下、プロテインホスファターゼ５の活性を低下させることを特徴とするプロテインホスファターゼ５の阻害剤。
【請求項１１】
式（２）の化合物を含み、カルシウムイオンの存在下、Ｓ１００タンパク質の活性を増強することを特徴とするＳ１００タンパク質の活性化剤。
【請求項１２】
式（７）〜（９）、（３９）、および（５０）からなる群から選択される少なくとも一つの化合物を含み、カルシウムイオンの存在下、Ｓ１００タンパク質の活性を低下させることを特徴とするＳ１００タンパク質の阻害剤。
【請求項１３】
Ｓ１００タンパク質の機能調節物質のスクリーニング方法であって、
候補物質、カルシウムイオンおよびＳ１００タンパク質の共存下、プロテインホスファターゼ５の脱リン酸化活性を分析する分析工程
を含み、
前記分析工程において、前記Ｓ１００タンパク質の非存在下であり且つ前記候補物質の存在下におけるプロテインホスファターゼ５の活性と、前記Ｓ１００タンパク質の非存在下であり且つ前記候補物質の非存在下におけるプロテインホスファターゼ５の活性とを比較し、前記候補物質非存在下に対して異なる活性を示さず、且つ、前記Ｓ１００タンパク質と前記候補物質との共存下におけるプロテインホスファターゼ５の活性と、前記Ｓ１００タンパク質の存在下であり且つ前記候補物質の非存在下におけるプロテインホスファターゼ５の活性とを比較し、前記候補物質非存在下に対して前記活性を増強または低下させるものについて、前記活性を増強する物質をＳ１００活性化剤、前記活性を低下させる物質をＳ１００阻害剤として選択することを特徴とするスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＰＲモチーフタンパク質の機能の調節方法、ＴＰＲモチーフタンパク質の機能調節物質のスクリーニング方法、および機能調節物質に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的に、細胞の機能は、タンパク質リン酸化酵素によるタンパク質のリン酸化でスイッチがＯＮとなり、タンパク質脱リン酸化酵素によるタンパク質の脱リン酸化でスイッチがＯＦＦとなる。ＴＰＲ（tetratricopeptide  repeat）モチーフを有するタンパク質（以下、「ＴＰＲモチーフタンパク質」という）の一種であるプロテインホスファターゼ５（以下、ＰＰ５またはＰＰ５タンパク質という）は、後者の脱リン酸化に関わる酵素であり、生体内のほとんど全ての細胞に存在することが知られている（非特許文献１〜６）。しかしながら、ＰＰ５は、通常、低活性であるが、どのような活性化機構により、活性が増強されているのかが不明であった。
【０００３】
ＰＰ５は、これまでに、癌、アルツハイマー病における神経細胞死、細胞の代謝調節に関与することが報告されている。このため、ＰＰ５の活性化機構を解明し、ＰＰ５の活性調節物質をスクリーニングすることは、生化学等の研究分野および臨床分野のいずれにおいても重要である。また、ＰＰ５に限らず、他のＴＰＲモチーフタンパク質についても同様のことが言える。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ramsey,  A.J.,  and  Chinkers,  M.  (2002).  Identification  of  Potential  Physiological  Activators  of  Protein  Phosphatase  5.  Biochem.  41,  5625-5632.
【非特許文献２】Kang  H,  Sayner  SL,  Gross  KL,  Russell  LC,  Chinkers  M.  (2001).  Identification  of  amino  acids  in  the  tetratricopeptide  repeat  and  C-terminal  domains  of  protein  phosphatase  5  involved  in  autoinhibition  and  lipid  activation.  Biochemistry.  2001  Sep  4;40(35):10485-90.
【非特許文献３】Chinkers,  M.  (2001).  Protein  phosphatase  5  in  signal  transduction.  Trends  Endocrinol.  Metab.  12,  28-32.
【非特許文献４】Morita,  K.,  Saitoh,  M.,  Tobiume,  K,  Matsuura,  H.,  Enomoto,  S.,  Nishitoh,  and  H.,  Ichijo,  H.(2001)  .  Negative  feedback  regulation  of  ASK1  by  protein  phosphatase  5  (PP5)  in  response  to  oxidative  stress.  EMBO  J.  20(21),  6028-6036.
【非特許文献５】Liu  F,  Grundke-Iqbal  I,  Iqbal  K,  Gong  CX.  (2005).  Contributions  of  protein  phosphatases  PP1,  PP2A,  PP2B  and  PP5  to  the  regulation  of  tau  phosphorylation.  Eur  J  Neurosci.  22(8),  1942-50.
【非特許文献６】Sanchez-Ortiz,  E.,  Hahm,  B.K.,  Armstrong,  D.L.,  and  Rossie,  S.  (2009).  Protein  phosphatase  5  protects  neurons  against  amyloid-βtoxicity.    J.  Neurochem.  111,  391-402.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明は、ＰＰ５をはじめとするＴＰＲモチーフタンパク質の機能の調節方法、ＴＰＲモチーフタンパク質の機能調節物質のスクリーニング方法ならびにＴＰＲモチーフタンパク質の機能調節物質の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記目的を達成するために、本発明の調節方法は、ＴＰＲモチーフタンパク質の機能の調節方法であって、ＴＰＲモチーフタンパク質に、Ｓ１００タンパク質（以下、「Ｓ１００」ともいう）を結合させることを特徴とする。
【０００７】
本発明のスクリーニング方法は、ＴＰＲモチーフタンパク質の機能調節物質のスクリーニング方法であって、候補物質存在下、ＴＰＲモチーフタンパク質の機能を分析する分析工程を含むことを特徴とする。
【０００８】
本発明の機能調節剤は、ＴＰＲモチーフタンパク質の機能調節剤であり、式（１）〜（５０）からなる群から選択される少なくとも一つの化合物を含むことを特徴とする。
【０００９】
本発明のスクリーニング方法は、Ｓ１００の機能調節物質のスクリーニング方法であって、前記Ｓ１００と候補物質との共存下、ＴＰＲモチーフタンパク質の機能を分析する分析工程を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明者らは、鋭意研究の結果、細胞内カルシウム受容体タンパク質であるＳ１００が、ＴＰＲモチーフタンパク質の一種であるＰＰ５に結合することによって、ＰＰ５活性が、増強されることを見出した。この知見に基づいて、Ｓ１００によるＴＰＲモチーフタンパク質の機能の調節方法を達成するに至った。さらに、この知見に基づいて、例えば、Ｓ１００の拮抗化合物等、ＴＰＲモチーフタンパク質の様々な機能調節物質のスクリーニング方法を構築し、この方法によって、種々の機能調節物質を提供するに至った。ＰＰ５をはじめとするＴＰＲモチーフタンパク質は、前述のように、癌等の疾患に関連することから、本発明は、生化学等の研究分野および臨床分野のいずれにおいて、極めて重要な技術と言える。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、実施例１におけるプルダウンアッセイの結果である。
【図２】図２は、実施例１におけるＳＰＲの結果である。
【図３】図３（Ａ）は、実施例１におけるＧＳＴ融合タンパク質の概略であり、図３（Ｂ）は、プルダウンアッセイの結果である。
【図４】図４（Ａ）は、実施例１におけるプルダウンアッセイの結果であり、図４（Ｂ）は、ウエスタンブロットの結果である。
【図５】図５（Ａ）および（Ｂ）は、実施例１におけるプルダウンアッセイの結果である。
【図６】図６（Ａ）〜（Ｃ）は、実施例１におけるＰＰ５の脱リン酸化活性を示すグラフである。
【図７】図７（Ａ）および（Ｂ）は、実施例１におけるウエスタンブロットの結果であり、図７（Ｃ）は、コントロールに対する脱リン酸の相対値を示すグラフである。
【図８】図８（Ａ）〜（Ｃ）は、実施例１におけるウエスタンブロットの結果である。
【図９】図９は、実施例２において、調節物質の存在下におけるＰＰ５の脱リン酸化活性を示すグラフである。
【図１０】図１０（Ａ）および（Ｂ）は、実施例２において、調節物質の存在下におけるＰＰ５の脱リン酸化活性を示すグラフである。
【図１１】図１１（Ａ）〜（Ｃ）は、実施例３において、調節物質の存在下におけるＰＰ５の脱リン酸化活性を示すグラフである。
【図１２】図１２（Ａ）〜（Ｄ）は、実施例３において、調節物質の存在下におけるＰＰ５の脱リン酸化活性を示すグラフである。
【図１３】図１３は、実施例３において、調節物質の存在下におけるＰＰ５の脱リン酸化活性を示すグラフである。
【図１４】図１４（Ａ）〜（Ｄ）は、実施例３において、調節物質の存在下におけるＰＰ５の脱リン酸化活性を示すグラフである。
【図１５】図１５は、実施例４において、調節物質の存在下におけるＰＰ５の脱リン酸化活性を示すグラフである。
【図１６】図１６（Ａ）および（Ｂ）は、実施例５において、調節物質の存在下におけるＰＰ５の脱リン酸化活性を示すグラフである。
【図１７】図１７（Ａ）および（Ｂ）は、実施例５において、調節物質の存在下におけるＰＰ５の脱リン酸化活性を示すグラフである。
【図１８】図１８（Ａ）〜（Ｃ）は、実施例６において、調節物質の存在下におけるＰＰ５の脱リン酸化活性を示すグラフである。
【図１９】図１９（Ａ）および（Ｂ）は、実施例７において、調節物質の存在下におけるＰＰ５の脱リン酸化活性を示すグラフである。
【図２０】図２０は、実施例８において、調節物質の存在下におけるＰＰ５の脱リン酸化活性の相対値を示すグラフである。
【図２１】図２１は、実施例８において、調節物質の存在下におけるＰＰ５の脱リン酸化活性の相対値を示すグラフである。
【図２２】図２２は、実施例８において、調節物質の存在下におけるＰＰ５の脱リン酸化活性の相対値を示すグラフである。
【図２３】図２３は、実施例８において、調節物質の存在下におけるＰＰ５の脱リン酸化活性の相対値を示すグラフである。
【図２４】図２４は、実施例８において、調節物質の存在下におけるＰＰ５の脱リン酸化活性の相対値を示すグラフである。
【図２５】図２５は、実施例８において、調節物質の存在下におけるＰＰ５の脱リン酸化活性の相対値を示すグラフである。
【図２６】図２６は、実施例８において、調節物質の存在下におけるＰＰ５の脱リン酸化活性の相対値を示すグラフである。
【図２７】図２７は、実施例８において、調節物質の存在下におけるＰＰ５の脱リン酸化活性の相対値を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（ＴＰＲモチーフタンパク質の機能の調節方法）
本発明のＴＰＲモチーフタンパク質の機能の調節方法は、前述のように、ＴＰＲモチーフタンパク質に、Ｓ１００を結合させることを特徴とする。
【００１３】
ＴＰＲモチーフタンパク質とＳ１００との結合は、ＴＰＲモチーフタンパク質とＳ１００とを接触させることにより行える。ＴＰＲモチーフタンパク質とＳ１００との接触は、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏでもよいし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでもよい。ｉｎ  ｖｉｖｏの場合、例えば、生体に、ＴＰＲモチーフタンパク質および／またはＳ１００を投与することにより行うことができる。この場合、ＴＰＲモチーフタンパク質およびＳ１００は、一方（例えば、ＴＰＲモチーフタンパク質）が前記生体由来であり、他方（例えば、Ｓ１００）が前記生体外から投与されてもよく、ともに前記生体外から投与されてもよい。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの場合、例えば、ＴＰＲモチーフタンパク質とＳ１００との接触は、例えば、試験管、培養器等の人工的環境下でもよいし、培養細胞等の細胞（組織の意味も含む）で行うことができる。後者の場合、ＴＰＲモチーフタンパク質およびＳ１００は、例えば、両方が、細胞由来でもよいし、一方が、細胞由来であり、他方が、細胞外から投与されてもよいし、両方が、前記細胞外から投与されてもよい。投与とは、例えば、タンパク質としての投与でもよいし、前記タンパク質のコード遺伝子の投与でもよく、後者の場合、例えば、前記コード遺伝子から前記タンパク質を発現させればよい。前記コード遺伝子は、例えば、ベクターにより投与してもよい。
【００１４】
ＴＰＲモチーフタンパク質は、前述のように、ＴＰＲモチーフを有するタンパク質である。本発明において、ＴＰＲモチーフタンパク質の種類は、特に制限されず、例えば、ＰＰ５、ＦＫＢＰ５２、Ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ４０、ｋｉｎｅｓｉｎ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ等があげられる。本発明において、Ｓ１００は、ＴＰＲモチーフタンパク質のＴＰＲドメインに結合することによって、その機能を調節していると解される。
【００１５】
ＰＰ５は、タンパク質の脱リン酸化酵素である。ＰＰ５は、ＴＰＲドメインと触媒ドメイン（ＣＤ）とを有している。ＰＰ５の場合、Ｓ１００は、そのＴＰＲドメインに結合することによって、ＰＰ５の脱リン酸化活性を増強していると解される。
【００１６】
ＴＰＲモチーフタンパク質の由来は、特に制限されず、ヒト由来、または、ヒト以外の非ヒト動物由来があげられる。前記非ヒト動物は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ヒツジ等の非ヒト哺乳類があげられる。具体例として、ヒト由来ＰＰ５は、例えば、ＮＣＢＩ  アクセッション番号ＢＣ００１９７０で登録されており、配列番号１で示すことができる。配列番号１において、１番目〜１８１番目の領域（下線部）が、ＴＰＲドメインであり、１８２番目〜４９９番目の領域が、触媒ドメインである。
【００１７】
配列番号１（ＰＰ５）：ＢＣ００１９７０
MAMAEGERTECAEPPRDEPPADGALKRAEELKTQANDYFKAKDYENAIKF
YSQAIELNPSNAIYYGNRSLAYLRTECYGYALGDATRAIELDKKYIKGYY
RRAASNMALGKFRAALRDYETVVKVKPHDKDAKMKYQECNKIVKQKAFER
AIAGDEHKRSVVDSLDIESMTIEDEYSGPKLEDGKVTISFMKELMQWYKD
QKKLHRKCAYQILVQVKEVLSKLSTLVETTLKETEKITVCGDTHGQFYDL
LNIFELNGLPSETNPYIFNGDFVDRGSFSVEVILTLFGFKLLYPDHFHLL
RGNHETDNMNQIYGFEGEVKAKYTAQMYELFSEVFEWLPLAQCINGKVLI
MHGGLFSEDGVTLDDIRKIERNRQPPDSGPMCDLLWSDPQPQNGRSISKR
GVSCQFGPDVTKAFLEENNLDYIIRSHEVKAEGYEVAHGGRCVTVFSAPN
YCDQMGNKASYIHLQGSDLRPQFHQFTAVPHPNVKPMAYANTLLQLGMM
【００１８】
ＰＰ５を、以下に例示するが、本発明は、これには制限されない。ＰＰ５は、例えば、下記（Ａ１）〜（Ａ３）からなる群から選択される少なくとも一つのタンパク質があげられる。
（Ａ１）配列番号１で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質
（Ａ２）前記（Ａ１）のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、前記（Ａ１）のタンパク質と同一の機能を有するタンパク質
（Ａ３）前記（Ａ１）のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、前記（Ａ１）のタンパク質と同一の機能を有するタンパク質
【００１９】
前記（Ａ２）および（Ａ３）において、「同一の機能」とは、脱リン酸化活性を示すことを意味する。
【００２０】
前記（Ａ２）において、「１個または数個」は、特に制限されず、例えば、１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個である。
【００２１】
前記（Ａ３）において、「同一性」は、例えば、比較する配列同士を適切にアライメントしたときの同一性の程度であり、前記配列間のアミノ酸の正確な一致の出現率（％）を意味する。同一性は、例えば、任意のアルゴリズムの利用により行うことができ、具体的に、ＢＬＡＳＴ等が使用できる。同一性の算出は、例えば、デフォルトのパラメーターが使用できる。以下、同様である。前記同一性は、例えば、８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上である。
【００２２】
Ｓ１００の由来は、特に制限されず、ヒト由来、または、ヒト以外の非ヒト動物由来があげられる。前記非ヒト動物は、前述のような非ヒト哺乳類があげられる。ヒト由来ＰＰ５は、例えば、Ｓ１００Ａ１、Ｓ１００Ａ２、Ｓ１００Ａ６、Ｓ１００Ｂ、Ｓ１００Ｐ等があげられる。例えば、Ｓ１００Ａ１は、ＮＣＢＩ  アクセッション番号ＢＣ０１４３９２で登録されており、配列番号２で示すことができ、Ｓ１００Ａ２は、ＮＣＢＩ  アクセッション番号ＢＣ１０５７８７で登録されており、配列番号３で示すことができ、Ｓ１００Ａ６は、ＮＣＢＩ  アクセッション番号ＢＣ００１４３１で登録されており、配列番号４で示すことができ、Ｓ１００Ｂは、ＮＣＢＩ  アクセッション番号ＢＣ００１７６６で登録されており、配列番号５で示すことができ、Ｓ１００Ｐは、ＮＣＢＩ  アクセッション番号ＢＣ００６８１９で登録されており、配列番号６で示すことができる。
【００２３】
配列番号２（Ｓ１００Ａ１）ＢＣ０１４３９２
MGSELETAMETLINVFHAHSGKEGDKYKLSKKELKELLQTELSGFLDAQKDVDAVDKVMKELDENGDGEVDFQEYVVLVAALTVACNNFFWENS
配列番号３（Ｓ１００Ａ２）ＢＣ１０５７８７
MMCSSLEQALAVLVTTFHKYSCQEGDKFKLSKGEMKELLHKELPSFVGEKVDEEGLKKLMGSLDENSDQQVDFQEYAVFLALITVMCNDFFQGCPDRP
配列番号４（Ｓ１００Ａ６）ＢＣ００１４３１
MACPLDQAIGLLVAIFHKYSGREGDKHTLSKKELKELIQKELTIGSKLQDAEIARLMEDLDRNKDQEVNFQEYVTFLGALALIYNEALKG
配列番号５（Ｓ１００Ｂ）ＢＣ００１７６６
MSELEKAMVALIDVFHQYSGREGDKHKLKKSELKELINNELSHFLEEIKEQEVVDKVMETLDNDGDGECDFQEFMAFVAMVTTACHEFFEHE
配列番号６（Ｓ１００Ｐ）ＢＣ００６８１９
MTELETAMGMIIDVFSRYSGSEGSTQTLTKGELKVLMEKELPGFLQSGKDKDAVDKLLKDLDANGDAQVDFSEFIVFVAAITSACHKYFEKAGLK
【００２４】
Ｓ１００を、以下に例示するが、本発明は、これには制限されない。Ｓ１００は、例えば、下記（Ｂ１）〜（Ｂ３）からなる群から選択される少なくとも一つのタンパク質があげられる。
（Ｂ１）配列番号２〜６のいずれかで表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質
（Ｂ２）前記（Ｂ１）のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、前記（Ｂ１）のタンパク質と同一の機能を有するタンパク質
（Ｂ３）前記（Ｂ１）のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、前記（Ｂ１）のタンパク質と同一の機能を有するタンパク質
【００２５】
前記（Ｂ２）および（Ｂ３）において、「同一の機能」とは、ＴＰＲモチーフタンパク質への結合によって、ＴＰＲモチーフタンパク質の機能を調節することを意味する。ＴＰＲモチーフタンパク質が、例えば、ＰＰ５の場合、「同一の機能」は、ＰＰ５への結合によって、ＰＰ５の脱リン酸化活性を増強することを意味する。
【００２６】
前記（Ｂ２）において、「１個または数個」は、特に制限されず、例えば、１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個である。
【００２７】
前記（Ｂ３）において、前記同一性は、例えば、８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上である。
【００２８】
本発明において、ＴＰＲモチーフタンパク質とＳ１００との組合せは、特に制限されない。前記組合せは、例えば、ＴＰＲモチーフタンパク質とＳ１００とが同じ由来であることが好ましい。
【００２９】
Ｓ１００は、細胞内カルシウム信号系に関与するカルシウム受容体タンパク質である。Ｓ１００は、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）非存在下でアポ型となり、カルシウムイオン存在下でホロ型となる。Ｓ１００は、例えば、ホロ型でＴＰＲモチーフタンパク質に結合するため、ＴＰＲモチーフタンパク質へのＳ１００の結合は、カルシウムイオン存在下で行うことが好ましい。または、Ｓ１００は、ホロ型Ｓ１００を使用することが好ましい。
【００３０】
本発明において、Ｓ１００は、前述のようにＴＰＲモチーフタンパク質の機能を調節できる。そこで、本発明の機能調節剤は、ＴＰＲモチーフタンパク質の機能調節剤であって、Ｓ１００を含むことを特徴とする。本発明の機能調節剤は、Ｓ１００を含むことが特徴であって、その他の構成は何ら制限されない。前記ＴＰＲモチーフタンパク質が、例えば、ＰＰ５の場合、本発明の機能調節剤は、ＰＰ５の活性増強剤といえる。
【００３１】
Ｓ１００は、例えば、ＴＰＲモチーフタンパク質の機能により直接的または間接的に生じる疾患の治療に使用できる。前記ＴＰＲモチーフタンパク質が、例えば、ＰＰ５の場合、前記疾患は、例えば、癌、アルツハイマー病等があげられる。そこで、Ｓ１００は、以下に示すような治療剤および治療方法に適用できる。
【００３２】
本発明の疾患の治療剤は、Ｓ１００を含むことを特徴とする。本発明の治療剤は、Ｓ１００を含むことが特徴であって、その他の構成は何ら制限されない。
【００３３】
本発明の治療剤は、例えば、必要に応じて、さらに、薬学上許容される添加剤を含んでもよい。前記添加剤は、特に制限されず、基剤原料、賦形剤、着色剤、安定化剤、保存剤、香料等があげられる。本発明において、Ｓ１００の配合量および前記添加剤の配合量は、Ｓ１００の機能を妨げるものでなければ、特に制限されない。
【００３４】
本発明の治療剤の投与条件は、特に制限されず、対象となる疾患の種類および程度等に応じて、投与形態、投与時期、投与量等を適宜設定できる。
【００３５】
本発明の治療剤の投与形態は、特に制限されず、例えば、経口投与でもよいし、非経口投与でもよい。前記非経口投与は、例えば、静脈注射、筋肉注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与、腹腔内投与、局所投与等があげられる。また、本発明の治療剤の投与対象は、特に制限されず、ヒト、または、非ヒト動物等があげられる。非ヒト動物は、例えば、前述のような非ヒト哺乳類等が例示できる。
【００３６】
本発明の治療剤の剤型は、特に制限されず、例えば、前記投与形態に応じて適宜決定できる。前記剤型は、特に制限されず、例えば、液体状、固体状があげられる。経口投与の場合、前記剤型は、例えば、錠剤、被覆錠剤、丸剤、細粒剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等があげられる。非経口投与の場合、前記剤型は、例えば、注射用製剤、点滴用製剤等があげられる。
【００３７】
本発明の疾患治療方法は、Ｓ１００を患者に投与する工程を含むことを特徴とする。本発明は、Ｓ１００を投与することが特徴であって、その他の条件および工程等は、特に制限されない。投与条件等は、特に制限されず、例えば、前記本発明の治療剤の記載を援用できる。前記患者は、例えば、ヒト、または、前述のような非ヒト動物があげられる。
【００３８】
（ＴＰＲモチーフタンパク質の機能調節物質のスクリーニング方法）
本発明のスクリーニング方法は、前述のように、ＴＰＲモチーフタンパク質の機能調節物質のスクリーニング方法であって、候補物質存在下、ＴＰＲモチーフタンパク質の機能を分析する分析工程を含むことを特徴とする。
【００３９】
前記分析工程において、分析対象の機能は、特に制限されず、ターゲットとなるＴＰＲモチーフタンパク質の種類に応じて設定できる。
【００４０】
本発明のスクリーニング方法によれば、例えば、以下の作用を示す機能調節物質をスクリーニングできる。
（ｘ１）ＴＰＲモチーフタンパク質に対するＳ１００の機能を増強する増強物質。
（ｘ２）Ｓ１００に結合して、ＴＰＲモチーフタンパク質に対するＳ１００の機能を失わせる物質。
（ｘ３）ＴＰＲモチーフタンパク質に対して、Ｓ１００と競合的に結合し、Ｓ１００のＴＰＲモチーフタンパク質への結合を阻害する物質。
（ｘ４）ＴＰＲモチーフタンパク質の機能を増強する物質。
（ｘ５）ＴＰＲモチーフタンパク質の機能調節部位に作用して、ＴＰＲモチーフタンパク質の機能を低下させる物質。
（ｘ６）ＴＰＲモチーフタンパク質の機能部位に作用して、ＴＰＲモチーフタンパク質の機能を阻害する物質。
【００４１】
前記候補物質は、特に制限されず、例えば、低分子化合物、高分子化合物等の化合物があげられる。前記候補物質は、例えば、天然由来でも、合成品でもよい。前記化合物は、例えば、塩、水和物でもよい。
【００４２】
本発明のスクリーニング方法は、例えば、前記分析工程において、前記候補物質存在下におけるＴＰＲモチーフタンパク質の機能と、前記候補物質非存在下におけるＴＰＲモチーフタンパク質の機能とを比較する工程を含むことが好ましい。また、前記分析工程において、さらに、前記候補物質非存在下に対して異なる機能を示したものを、前記機能調節物質として選択する選択工程を含むことが好ましい。このように、前記候補物質の存在下と非存在下との間で、機能を比較することで、前記候補物質の調節能を判断できる。
【００４３】
本発明のスクリーニング方法は、前記分析工程において、例えば、Ｓ１００の存在下、ＴＰＲモチーフタンパク質と前記候補物質とを接触させてもよいし、Ｓ１００の非存在下、ＴＰＲモチーフタンパク質と前記候補物質とを接触させてもよい。前記接触工程をＳ１００存在下で行う場合、例えば、Ｓ１００とカルシウムイオンとの共存下で行うことが好ましく、または、Ｓ１００として、カルシウムイオンと結合したホロ型Ｓ１００を使用することが好ましい。
【００４４】
Ｓ１００存在下で前記接触工程を行う場合、例えば、ＴＰＲモチーフタンパク質の機能を活性化する活性化物質、ＰＰ５を不活性化する不活性化物質をスクリーニングできる。前者は、例えば、前記（ｘ１）の物質、後者は、例えば、前記（ｘ２）、前記（ｘ３）の物質があげられる。前記比較工程において、前記候補物質存在下のＴＰＲモチーフタンパク質の機能が、前記候補物質非存在下のＴＰＲモチーフタンパク質の機能よりも高い場合、前記候補物質は、前記活性化物質と判断できる。また、前記比較工程において、前記候補物質存在下のＴＰＲモチーフタンパク質の活性が、前記候補物質非存在下のＴＰＲモチーフタンパク質の活性よりも低い場合、前記候補物質は、前記不活性化物質と判断できる。
【００４５】
Ｓ１００非存在下で前記接触工程を行う場合、例えば、ＴＰＲモチーフタンパク質の機能を活性化する活性化物質、ＴＰＲモチーフタンパク質の機能を不活性化する不活性化物質をスクリーニングできる。前者は、例えば、前記（ｘ４）の物質があげられる。後者は、例えば、前記（ｘ５）の物質または前記（ｘ６）の物質があげられる。前記比較工程において、前記候補物質存在下のＴＰＲモチーフタンパク質の機能が、前記候補物質非存在下のＴＰＲモチーフタンパク質の機能よりも高い場合、前記候補物質は、前記活性化物質と判断できる。また、前記比較工程において、前記候補物質存在下のＴＰＲモチーフタンパク質の活性が、前記候補物質非存在下のＴＰＲモチーフタンパク質の活性よりも低い場合、前記候補物質は、前記不活性化物質と判断できる。
【００４６】
前記接触工程は、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏで行ってもよいし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行ってもよい。ｉｎ  ｖｉｖｏの場合、例えば、生体に、前記候補物質を投与することにより行うことができる。この場合、ＴＰＲモチーフタンパク質およびＳ１００は、ともに前記生体由来でもよいし、ともに前記生体外から投与されてもよいし、ＴＰＲモチーフタンパク質およびＳ１００の一方が前記生体由来であり、他方が前記生体外から投与されてもよい。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの場合、例えば、ＴＰＲモチーフタンパク質とＳ１００との接触は、例えば、試験管、培養器等の人工的環境下でもよいし、培養細胞等の細胞、培養組織等の組織で行うことができる。また、後者の場合、ＴＰＲモチーフタンパク質とＳ１００は、それぞれ、前記細胞または前記組織由来でもよいし、前記細胞または前記組織外から投与されてもよい。
【００４７】
本発明のスクリーニング方法において、ＴＰＲモチーフタンパク質は、例えば、全長アミノ酸配列からなるタンパク質でもよいし、一部の領域を欠失した欠失タンパク質でもよい。前記欠失タンパク質は、例えば、ＴＰＲドメインを欠失するタンパク質、機能ドメインを欠失するタンパク質等があげられる。
【００４８】
本発明のスクリーニング方法において、ＴＰＲモチーフタンパク質の種類は、特に制限されず、前述のようなタンパク質があげられる。以下に、具体例として、ターゲットのＴＰＲモチーフタンパク質がＰＰ５の例を示す。
【００４９】
本発明のスクリーニング方法は、ＴＰＲモチーフタンパク質がＰＰ５の場合、前記機能調節物質が、ＰＰ５の前記活性調節物質であり、前記分析工程において、ＰＰ５の脱リン酸化活性を分析することが好ましい。
【００５０】
本発明のスクリーニング方法によれば、例えば、ＰＰ５に対して、以下の作用を示す活性調節物質をスクリーニングできる。
（ｘ１’）Ｓ１００によるＰＰ５の活性化を増強する増強物質。以下、Ｓ１００ポテンシエーター（potentiator）ともいう。
（ｘ２’）Ｓ１００に結合してＳ１００の活性化機能を失わせる物質。以下、Ｓ１００アンタゴニストともいう。
（ｘ３’）ＰＰ５に対して、Ｓ１００と競合的に結合し、Ｓ１００のＰＰ５への結合を阻害する物質。以下、Ｓ１００バインディング  アンタゴニストともいう。
（ｘ４’）ＰＰ５の活性を増強する物質。以下、ＰＰ５  アクティベーター、Ｓ１００ミミックまたはＳ１００アゴニストともいう。
（ｘ５’）ＰＰ５の活性調節部位に作用して、ＰＰ５の活性を低下させる物質。以下、アロステリックＰＰ５インヒビターともいう。
（ｘ６’）ＰＰ５の活性部位に作用して、ＰＰ５の活性を阻害する物質。以下、ＰＰ５カタリティックインヒビターともいう。
【００５１】
本発明のスクリーニング方法は、例えば、さらに、前記候補物質の非存在下におけるＰＰ５の活性と、前記候補物質の存在下におけるＰＰ５の活性とを比較する工程を含む。前記比較工程において、前記候補物質存在下のＰＰ５の活性が、前記候補物質非存在下のＰＰ５の活性よりも高い場合、前記候補物質は、ＰＰ５の活性化物質と判断でき、また、前記候補物質存在下のＰＰ５の活性が、前記候補物質非存在下のＰＰ５の活性よりも低い場合、前記候補物質は、ＰＰ５不活性化物質と判断できる。
【００５２】
本発明のスクリーニング方法は、前記接触工程において、例えば、Ｓ１００の存在下、ＰＰ５と前記候補物質とを接触させてもよいし、Ｓ１００の非存在下、ＰＰ５と前記候補物質とを接触させてもよい。前記接触工程をＳ１００存在下で行う場合、例えば、Ｓ１００とカルシウムイオンとの共存下で行うことが好ましく、または、Ｓ１００として、カルシウムイオンと結合したホロ型Ｓ１００を使用することが好ましい。
【００５３】
Ｓ１００存在下で前記接触工程を行う場合、例えば、ＰＰ５を活性化する活性化物質、ＰＰ５を不活性化する不活性化物質をスクリーニングできる。前者は、例えば、前記（ｘ１’）Ｓ１００によるＰＰ５の活性化を増強する増強物質（Ｓ１００ポテンシエーター）があげられる。後者は、例えば、前記（ｘ２’）Ｓ１００に結合してＳ１００の活性化機能を失わせる物質（Ｓ１００アンタゴニスト）、前記（ｘ３’）ＰＰ５に対して、Ｓ１００と競合的に結合し、Ｓ１００のＰＰ５への結合を阻害する物質（Ｓ１００バインディング  アンタゴニスト）があげられる。前記比較工程において、前記候補物質存在下のＰＰ５タンパク質の活性が、前記候補物質非存在下のＰＰ５タンパク質の活性よりも高い場合、前記候補物質は、前記活性化物質と判断できる。また、前記比較工程において、前記候補物質存在下のＰＰ５タンパク質の活性が、前記候補物質非存在下のＰＰ５タンパク質の活性よりも低い場合、前記候補物質は、前記不活性化物質と判断できる。
【００５４】
Ｓ１００非存在下で前記接触工程を行う場合、例えば、ＰＰ５を活性化する活性化物質、ＰＰ５を不活性化する不活性化物質をスクリーニングできる。前者は、例えば、前記（ｘ４’）ＰＰ５の活性を増強する物質（ＰＰ５  アクティベーター、Ｓ１００ミミックまたはＳ１００アゴニスト）があげられる。後者は、例えば、前記（ｘ５’）ＰＰ５の活性調節部位に作用して、ＰＰ５の活性を低下させる物質（アロステリックＰＰ５インヒビター）または前記（ｘ６’）ＰＰ５の活性部位に作用して、ＰＰ５の活性を阻害する物質（ＰＰ５カタリティックインヒビター）があげられる。前記比較工程において、前記候補物質存在下のＰＰ５の活性が、前記候補物質非存在下のＰＰ５の活性よりも高い場合、前記候補物質は、前記活性化物質と判断できる。また、前記比較工程において、前記候補物質存在下のＰＰ５の活性が、前記候補物質非存在下のＰＰ５の活性よりも低い場合、前記候補物質は、前記不活性化物質と判断できる。
【００５５】
前記分析工程において、ＰＰ５のホスファターゼ活性の分析方法は、特に制限されず、公知の手法が採用できる。前記活性の分析は、例えば、市販のキットを使用し、そのプロトコールにしたがって行うことができる。前記キットは、例えば、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Upstate）等があげられる。
【００５６】
ホスファターゼ活性の分析は、例えば、以下のような方法で行うことができる。基質として、リン酸化されたホスホペプチド（配列番号７：ＫＲｐＴＩＲＲ）を使用する。そして、前記ホスホペプチドと、候補物質および／またはＰＰ５とを、緩衝液に添加し、この混合液をインキュベートする。前記緩衝液の組成は、例えば、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０、および１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＣａＣｌ２である。インキュベート後、前記混合液に所定濃度のＳ１００を添加し、インキュベートする。そして、インキュベート後の反応液に、ｍａｌａｃｈｉｔｅ  ｇｒｅｅｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加した後、６３０ｎｍにおけるサンプルの吸光度を測定する。前記ｍａｌａｃｈｉｔｅ  ｇｒｅｅｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎの組成は、例えば、０．０３４％  ｍａｌａｃｈｉｔｅ  ｇｒｅｅｎ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｍｏｌｙｂｄａｔｅ、１ｍｏｌ／Ｌ  ＨＣｌ、３．４％  エタノールおよび０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０とする。そして、放出されたリン酸塩の量を、既知量のリン酸塩から準備したリン酸塩標準曲線を用いて算出する。これをホスファターゼ活性として評価できる。
【００５７】
本発明のスクリーニング方法において、ＰＰ５は、例えば、本発明の調節方法に記載したタンパク質でもよいし、例えば、以下に示す欠失ＰＰ５でもよい。前記欠失ＰＰ５は、例えば、ＴＰＲドメインを欠失するＰＰ５−ΔＴＰＲ、触媒ドメイン（ＣＤ）を欠失するＰＰ５−ΔＣＤ等があげられる。
【００５８】
本発明のスクリーニング方法において、Ｓ１００は、例えば、本発明の調節方法に記載したタンパク質が例示できる。
【００５９】
（ＴＰＲモチーフタンパク質の機能調節剤）
本発明のＴＰＲモチーフタンパク質の機能調節剤は、ＴＰＲモチーフタンパク質の機能を調節する調節剤であり、ＴＰＲモチーフタンパク質の機能を活性化する活性化剤、または、ＴＰＲモチーフタンパク質の機能を不活性化する不活性化剤があげられる。
【００６０】
ＴＰＲモチーフタンパク質がＰＰ５の場合、本発明の機能調節剤は、ＰＰ５の活性を調節する調節剤であり、ＰＰ５活性を活性化する活性化剤、または、ＰＰ５の活性を不活性化する不活性化剤があげられる。
【００６１】
本発明の機能調節剤は、例えば、下記式（１）〜（５０）に示される化合物が例示できる。ＴＰＲモチーフタンパク質がＰＰ５の場合、以下の化合物は、それぞれ、前記（ｘ１’）Ｓ１００によるＰＰ５の活性化を増強するＳ１００ポテンシエーター、前記（ｘ２’）Ｓ１００に結合してＳ１００の活性化機能を失わせるＳ１００アンタゴニスト、前記（ｘ３’）ＰＰ５に対して、Ｓ１００と競合的に結合し、Ｓ１００のＰＰ５への結合を阻害するＳ１００バインディング  アンタゴニスト、前記（ｘ４’）ＰＰ５の活性を増強するＰＰ５アクティベーター、前記（ｘ５’）ＰＰ５の活性調節部位に作用して、ＰＰ５の活性を低下させるアロステリックＰＰ５インヒビター、前記（ｘ６’）ＰＰ５の活性部位に作用して、ＰＰ５の活性を阻害するＰＰ５カタリティックインヒビターに分類できる。なお、本発明は、これらには限定されない。
【００６２】
【化１】
0005971644.tif 000002
【００６３】
【化２】
0005971644.tif 000003
【００６４】
【化３】
0005971644.tif 000004
【００６５】
【化４−１】
0005971644.tif 000005
【００６６】
【化４−２】
0005971644.tif 000006
【００６７】
【化４−３】
0005971644.tif 000007
【００６８】
【化４−４】
0005971644.tif 000008
【００６９】
【化４−５】
0005971644.tif 000009
【００７０】
【化５】
0005971644.tif 000010
【００７１】
【化６−１】
0005971644.tif 000011
【００７２】
【化６−２】
0005971644.tif 000012
【００７３】
【化６−３】
0005971644.tif 000013
【００７４】
また、これらの化合物のうち、以下に示すものは、一般式で表わすことができる。
【化７】
0005971644.tif 000014
【００７５】
前記活性化剤は、例えば、式（１）〜（５）および（１２）〜（３６）からなる群から選択される少なくとも一つの化合物を含むことが好ましい。前記活性化剤は、例えば、１種類の化合物を含んでもよいし、２種類以上を併用してもよい。
【００７６】
前記不活性化剤は、式（６）〜（１１）および（３７）〜（５０）からなる群から選択される少なくとも一つの化合物を含むことが好ましい。前記不活性化剤は、例えば、１種類の化合物を含んでもよいし、２種類以上を併用してもよい。
【００７７】
本発明の機能調節剤は、これらの例示には制限されない。前記機能調節剤は、例えば、例示した化合物の誘導体でもよい。具体例として、前記化合物において、例えば、スルホン基およびアゾ基は、例えば、任意でもよい。
【００７８】
これらの機能調節剤を組合せて使用すれば、例えば、ＴＰＲモチーフタンパク質の機能のＯＮ−ＯＦＦを自由に設定することが可能となる。
【００７９】
本発明の機能調節剤は、例えば、前述のような化合物を含んでいればよく、その他の構成は、何ら制限されない。
【００８０】
本発明の機能調節剤は、例えば、ＴＰＲモチーフタンパク質の機能により直接的または間接的に生じる疾患の治療に使用できる。ＴＰＲモチーフタンパク質がＰＰ５の場合、前記疾患は、例えば、癌、アルツハイマー病等があげられる。そこで、前記機能調節剤は、以下に示すような治療剤および治療方法に適用できる。
【００８１】
本発明の疾患の治療剤は、前記機能調節剤を含むことを特徴とする。本発明の治療剤は、前記機能調節剤を含むことが特徴であって、その他の構成は何ら制限されない。
【００８２】
本発明の治療剤は、例えば、必要に応じて、さらに、薬学上許容される添加剤を含んでもよい。前記添加剤は、特に制限されず、前述と同様のものがあげられる。本発明において、前記機能調節剤の配合量および前記添加剤の配合量は、前記機能調節剤の機能を妨げるものでなければ、特に制限されない。本発明の治療剤の投与条件、投与形態、剤型は、特に制限されず、例えば、前述の記載が援用できる。
【００８３】
本発明の疾患治療方法は、前記機能調節剤を患者に投与する工程を含むことを特徴とする。本発明は、前記機能調節剤を投与することが特徴であって、その他の条件および工程等は、特に制限されない。投与条件、投与対象等は、特に制限されず、例えば、前述の記載が援用できる。
【００８４】
（Ｓ１００の機能調節物質のスクリーニング方法）
本発明のスクリーニング方法は、前述のように、Ｓ１００の機能調節物質のスクリーニング方法であって、Ｓ１００と候補物質との共存下、ＴＰＲモチーフタンパク質の機能を分析する分析工程を含むことを特徴とする。
【００８５】
本発明のスクリーニング方法によれば、例えば、ＴＰＲモチーフタンパク質に対するＳ１００の機能を調節する機能調節物質をスクリーニングできる。前記機能調節物質としては、例えば、前述したような前記（ｘ１）〜（ｘ３）等の物質があげられる。
（ｘ１）ＴＰＲモチーフタンパク質に対するＳ１００の機能を増強する増強物質。
（ｘ２）Ｓ１００に結合して、ＴＰＲモチーフタンパク質に対するＳ１００の機能を失わせる物質。
（ｘ３）ＴＰＲモチーフタンパク質に対して、Ｓ１００と競合的に結合し、Ｓ１００のＴＰＲモチーフタンパク質への結合を阻害する物質。
【００８６】
具体例として、ＴＰＲモチーフタンパク質がＰＰ５の場合、本発明のスクリーニング方法によれば、例えば、Ｓ１００がＰＰ５の活性を増強する機能に対する調節物質をスクリーニングできる。前記調節物質としては、例えば、前述したような前記（ｘ１’）〜（ｘ３’）等の物質があげられる。
（ｘ１’）Ｓ１００によるＰＰ５の活性化を増強するＳ１００ポテンシエーター。
（ｘ２’）Ｓ１００に結合してＳ１００の活性化機能を失わせるＳ１００アンタゴニスト。
（ｘ３’）ＰＰ５に対して、Ｓ１００と競合的に結合し、Ｓ１００のＰＰ５への結合を阻害するＳ１００バインディング  アンタゴニスト。
【実施例】
【００８７】
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。市販の試薬は、特に示さない限り、それらのプロトコールに基づいて使用した。
【００８８】
１．材料
グルタチオンセファロースおよびNickel-nitrilotriacetic  acid−アガロースは、それぞれ、GE  HealthcareおよびQiagenから購入した。抗体として、抗Ｓ１００Ａ１抗体（R&D  systems）、抗Ｓ１００Ａ２抗体（Sigma）、抗Ｓ１００Ａ６抗体（Sigma）、抗Ｓ１００Ｂ抗体（QED）、抗Ｈｓｐ９０抗体（Stressgen)、抗ＰＰ５抗体（BD  transduction  laboratories）、抗ｐＳｅｒ３９６  ｔａｕ抗体（Abcam）、抗ｐＳｅｒ４０９抗体（Invitrogen）、抗ｔａｕ抗体（Invitrogen）、抗ｐＴｈｒ８４５  ＡＳＫ１抗体（Cell  Signaling）、ＨＲＰ標識化抗マウスＩｇＧ（Cell  Signaling）、ＨＲＰ標識化抗ラビットＩｇＧ（Cell  Signaling）、抗ＨＡ−ＨＲＰ標識化抗体（Sigma）を使用した。ゲネチシンは、Invitrogenから、イオノマイシン、抗ＨＡ抗体アガロースおよび他の化学物質は、Sigmaから購入した。
【００８９】
２．細胞培養およびトランスフェクション
ＣＯＳ−７細胞は、ＪＣＲＢから購入した。ＣＯＳ−７細胞の培養は、９５％Ｏ２および５％ＣＯ２の加湿されたチャンバー、ならびに１０％ウシ胎仔血清、１％ペニシリンおよび１％ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ（Sigma）を使用した。トランスフェクションは、トランスフェクション試薬として、Ｆｕｇｅｎｅ６（Invitrogen）またはＨＤ  transfection  reagent（Invitrogen）を使用し、そのプロトコールに従って行った。
また、Ｔａｕタンパク質を安定的に発現するＣＯＳ−７細胞を調製するため、ＣＯＳ−７細胞は、トランスフェクション後の数週間、５００ｎｇ／ｍｌ  ゲネチシン共存下で培養した。なお、ｔａｕの発現は、ウエスタンブロットにより確認した。
【００９０】
３．組換えタンパク質
Ｓ１００として、Ｓ１００Ａ１、Ｓ１００Ａ２、Ｓ１００Ａ４、Ｓ１００Ａ６、Ｓ１００Ａ１０、Ｓ１００Ａ１１、Ｓ１００Ａ１３、Ｓ１００ＢおよびＳ１００Ｐを、下記文献に基づき、発現させて精製した。
Okada,  M.  et  al.,  (2004)  J.  Biol.  Chem.  279,  4221-4233
Yamashita,  K.  et  al.,  (1999)  Protein  Expr.  Purif.  16,  47-52
ＧＳＴを結合させたＧＳＴ−ＰＰ５およびＨｉｓタグ（６×Ｈｉｓ）を結合させたＨｉｓ−ＰＰ５は、製造者（GE  HealthcareおよびQiagen）のプロトコールに従って、発現させ精製した。組換えＧＳＫ−３βおよびＰＫＡは、それぞれ、SignalChemおよびPromegaから購入した。ヒトＨＳＰ９０は、下記文献に基づき調製した。
Shimamoto,  S.  et.  Al.,  (2008)  J.  Biol.  Chem.  283,  28246-28258
組換えｔａｕタンパク質は、ENZO  life  sciencesから購入した。
【００９１】
４．プラスミド
ヒトＰＰ５遺伝子を、ヒトｃＤＮＡライブラリからＰＣＲにより増幅し、ｐＥＴ１６ａ、ＰＧＥＸ-６Ｐ１、ｐＭＥ１８Ｓ-ＦｌａｇおよびｐＭＥ１８Ｓ-ＨＡベクターにクローニングした。ＧＳＴ-ＰＰ５遺伝子の変異体を、ＰＣＲにより調製した。前記変異体は、ＰＰ５におけるＴＰＲの１−１８１残基のうち、２８−１６０を欠失させた欠失変異体（ΔＴＰＲ）、および、３２、７４、９７または１０１番目のアミノ酸残基をアラニンに変異させた４種類のアラニン変異体（Ｋ３２Ａ、Ｒ７４Ａ、Ｋ９７ＡおよびＲ１０１Ａ）を調製した。また、Ｈｉｓ−ＰＰ５の触媒ドメインの変異体（Ｈｉｓ−ＰＰ５−ＣＤ）として、ヒトＰＰ５における１７１−４８６番目の変異体を作製した。ヒトＨｓｐ９０遺伝子を、文献（Shimamoto,  S.  et.  Al.,  (2008)  J.  Biol.  Chem.  283,  28246-28258）に基づいて、クローニングした。マウスＡＳＫ１遺伝子を、マウス脳ｃＤＮＡからＰＣＲにより増幅し、ｐＭＥ１８Ｓ−ｃＭｙｃベクターにクローニングした。ｐＥＴ１１ａ−Ｓ１００プラスミドおよびｐＭＥ１８Ｓ−Ｓ１００プラスミドの構築は、文献（Okada,  M.  et  al.,  (2004)  J.  Biol.  Chem.  279,  4221-4233）に基づいて行った。恒久的に活性なＳ１００Ｐ（Ｓ１００Ｐ−ＰＡ）の遺伝子は、文献（Austermann,  J.  et.  al.,  (2009)  Biochim.  Biophys.  Acta  1793,1078-1085）に基づいて調製した。pcDNA３−ｔａｕプラスミドは、ヒトｔａｕ４４１のｃＤＮＡ（Addgene）を、ｐｃＤＮＡ３ベクターにクローニングして調製した。
【００９２】
５．ＧＳＴプルダウン
Ｓ１００またはＨＳＰ９０について、ＰＰ５への結合分析を、以下のように行った。緩衝液中、ＧＳＴ−ＰＰ５（１２．５μｇ）と、Ｓ１００タンパク質（２５μｇ）またはＨｓｐ９０タンパク質（５０μｇ）と、グルタチオンセファロースビーズ（５０μｌ）とを、室温で１時間混合した。前記ＧＳＴ−ＰＰ５は、野生型（ＷＴ）または前記変異体を使用した。前記緩衝液の組成は、１００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０、および１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＣａＣｌ２またはＥＧＴＡとした。
【００９３】
Ｓ１００Ｂの結合アッセイは、ＧＳＴ−ＰＰ５  ５０μｇおよびＳ１００Ｂ  ５０μｇを使用した。そして、前記ビーズを複数回洗浄した後、ＳＤＳサンプルバッファーと共にボイルし、１０％トリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより分離し、クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）で染色した。競合的結合アッセイは、ＧＳＴ−ＰＰ５（２０μｇ）、Ｓ１００（５０μｇ）および所定量（０−１５０μｇ）のＨＳＰ９０を、前述と同様にして、グルタチオンセファロース（２５μｌ）とインキュベートした。同様の実験を、ＧＳＴ−ＰＰ５（２０μｇ）、ＨＳＰ９０（５０μｇ）および所定量（０−１５０μｇ）のＳ１００を用いて行った。
【００９４】
６．表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）
タンパク質の結合相互作用を、ＳＰＲ  Ｂｉａｃｏｒｅ２０００  ｓｙｓｔｅｍ（Biacore）を用いて行った。ＣＭ５  ｃｈｉｐ（Biacore）のデキストラン表面へのＰＰ５のアミンカップリングのために、Ｎ−エチル−Ｎ’−(３−ジエチルアミノプロピル)カルボジイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよびエタノールアミド−ＨＣｌ（Biacore）を使用した。Ｈｉｓ−ＰＰ５（１００μｇ／ｍｌ、１４０μｌ）を、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  酢酸アンモニウム（ｐＨ４．２）中で固定化し、応答ユニット２６００（０．３ｐｍｏｌ）まで結合させ、安定したベースラインを得た。全ての工程において、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、０．００５％  Ｔｗｅｅｎ２０、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＣａＣｌ２を、流速２０μｌ／ｍｉｎで用いた。組換えタンパク質Ｓ１００Ａ１、Ｓ１００Ａ２、Ｓ１００Ａ６およびＳ１００Ｂを、所定濃度（１．２５μｍｏｌ／Ｌ、６２５ｎｍｏｌ／Ｌ、３１３ｎｍｏｌ／Ｌ、１５６ｎｍｏｌ／Ｌ）で注入した。Ｈｉｓ−ＰＰ５をカップリングしたセンサーチップを、タンパク質インジェクションの間、応答ユニットがユニットインジェクション前のベースラインに戻るまで、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＯＨでの短時間（６０秒）の洗浄により、再生した。応答曲線は、コントロールフローセルで同時に発生したシグナルを差し引いて準備した。Biacoreセンサグラム曲線は、１：１  Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ｍｏｄｅｌを用いるBIA  evaluation  3.0において評価した。
【００９５】
７．ｉｎ  ｖｉｖｏでの競合的結合アッセイ
ＰＰ５結合アッセイのために、ｐＭＥ１８Ｓ−Ｓ１００およびｐＭＥ１８Ｓ−ＨＡ−ＰＰ５プラスミドを、ＣＯＳ−７細胞に共トランスフェクションした。トランスフェクションから４８時間後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、緩衝液で溶解した。前記緩衝液の組成は、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、０．５％  ＮＰ４０およびｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ（Roche）とした。溶解後のサンプルを、ソニケーションし、１４,０００ｒｐｍ、１０分間で遠心分離した。得られた上清を、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＣａＣｌ２またはＥＧＴＡ存在下、３０μｌの抗ＨＡ抗体アガロースと、１時間、室温でインキュベートした。そして、前記抗ＨＡ抗体アガロースを洗浄後、得られたサンプルを、抗ＨＳＰ９０抗体、抗ＨＡ−ＨＲＰ抗体または抗Ｓ１００タンパク質抗体により、ウエスタンブロットにより分析した。また、ＡＳＫ１結合アッセイのために、ｐＭＥ１８Ｓ−Ｆｌａｇ−ＰＰ５、ｐＭＥ１８Ｓ−ｃＭｙｃ−ＡＳＫ１およびｐＭＥ１８Ｓ−Ｓ１００Ａ１またはｐＭＥ１８Ｓ−Ｓ１００ＰもしくはｐＭＥ１８Ｓ−Ｓ１００Ｐ−ＰＡプラスミドを、共トランスフェクションした。タンパク質を精製し、３０μlの抗Ｆｌａｇ抗体アガロースでインキュベートした。得られたサンプルを、抗ＰＰ５抗体または抗ｃＭｙｃ−ＨＲＰ抗体によるウエスタンブロットにより分析した。
【００９６】
８．ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのホスファターゼアッセイ
ＰＰ５タンパク質（ＷＴ）またはＰＰ５変異体タンパク質（ＰＰ５−ＣＤ）のホスファターゼ活性を、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Upstate）を使用し、そのプロトコールに従って測定した。ホスホペプチド（配列番号７：ＫＲｐＴＩＲＲ）１００μｍｏｌ／Ｌを、緩衝液５０μｌ中で、２５０ｎｇのＨｉｓ−ＰＰ５（ＷＴ）または２５０ｎｇのＨｉｓ−ＰＰ５−ＣＤとインキュベートした。前記緩衝液の組成は、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０、および１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＣａＣｌ２またはＥＧＴＡとした。所定濃度（０−５０μｍｏｌ／Ｌ）のＳ１００タンパク質またはＨＳＰ９０を添加し、１０分間、３７℃でインキュベートした。ＨＳＰ９０は、ＨＳＰ９０−ＷＴおよびＨＳＰ  Ｃ９０を、それぞれ使用した。そして、１００μｌのｍａｌａｃｈｉｔｅ  ｇｒｅｅｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎの添加後、６３０ｎｍにおけるサンプルの吸光度を、マイクロプレートリーダーにより測定した。前記ｍａｌａｃｈｉｔｅ  ｇｒｅｅｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎの組成は、０．０３４％  ｍａｌａｃｈｉｔｅ  ｇｒｅｅｎ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｍｏｌｙｂｄａｔｅ、１ｍｏｌ／Ｌ  ＨＣｌ、３．４％  エタノールおよび０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０とした。放出されたリン酸塩の量を、既知量のリン酸塩から準備したリン酸塩標準曲線を用いて算出した。これをホスファターゼ活性として評価した。
【００９７】
９．ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのｔａｕ脱リン酸化
組換えｔａｕ４４１を、ＧＳＫ−３βまたはＰＫＡでリン酸化した。ｔａｕのＳｅｒ３９６のリン酸化のために、１０μｇのｔａｕを、緩衝液中で、１μｇのＧＳＫ−３βと９０分間、３０℃でインキュベートした。前記緩衝液の組成は、４０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＤＴＴおよび０．２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＡＴＰとした。ｔａｕのＳｅｒ４０９のリン酸化のために、前記タンパク質を、緩衝液中で、２５０ユニットのＰＫＡと、９０分間、３０℃でインキュベートした。前記緩衝液の組成は、４０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ６．８）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  β−メルカプロエタノール、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２および０．２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＡＴＰとした。リン酸化反応後、サンプルを、Amicon  ultra  spin  column（Millipore）で洗浄し、５００μｌの２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）および０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した。リン酸化されたｔａｕを、緩衝液中で、１００ｎｇのＨｉｓ−ＰＰ５とインキュベートした。前記緩衝液の組成は、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０、および１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＣａＣｌ２またはＥＧＴＡとした。Ｓ１００Ａ１、Ｓ１００Ａ２またはＳ１００Ａ６を、前記反応混合物に添加し、１０分間、３７℃でインキュベートした。得られたサンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、抗ｐＳｅｒ３９６抗体、抗ｐＳｅｒ４０９抗体または抗ｔａｕ抗体を用いて、ウエスタンブロットにより分析した。
【００９８】
１０．ｉｎ  ｖｉｖｏでの脱リン酸化
ｔａｕの脱リン酸化のために、安定的にｔａｕを発現するＣＯＳ−７細胞を、ｐＭＥ１８ＳまたはｐＭＥ１８Ｓ−Ｓ１００Ａ１発現プラスミドでトランスフェクションした。４８時間後、５μｍｏｌ／Ｌのイオノマイシンをアプライし、さらに、１５分間または６０分間インキュベートした。発現したタンパク質を、ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌおよびｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ（Pierce）を含む溶解用緩衝液を用いて精製した。ソニケーションおよび遠心分離の後、得られたサンプルを、抗ｐＳｅｒ３９６  ｔａｕ抗体、抗ｔａｕ抗体、抗Ｓ１００Ａ１抗体または抗ＰＰ５抗体を用いて、ウエスタンブロット分析を行った。
【００９９】
ＡＳＫ１の脱リン酸化のため、ｐＭＥ１８Ｓ−Ｆｌａｇ−ＰＰ５、ｐＭＥ１８Ｓ−ｃＭｙｃ−ＡＳＫ１、およびｐＭＥ１８Ｓ−Ｓ１００ＰまたはｐＭＥ１８Ｓ−Ｓ１００Ｐ−ＰＡプラスミドを、ＣＯＳ−７細胞に共トランスフェクションした。４８時間後、発現したタンパク質を精製し、得られたサンプルを、抗ｐＴｈｒ８４５−ＡＳＫ１抗体を用いて、ウエスタンブロット分析を行った。
【０１００】
１１．統計
統計は、ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｔ  ｔｅｓｔおよびｐａｉｒｅｄ  ｔ  ｔｅｓｔを行った。そして、信頼水準ｐ＜０．０５を、統計学的に有意とした。
【０１０１】
［実施例１］
ＰＰ５のＴＰＲドメインに対するＳ１００の結合を確認した。
【０１０２】
（１）プルダウンアッセイ
プルダウンアッセイにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＣａＣｌ２またはＥＧＴＡの存在下、Ｓ１００がＰＰ５に直接結合するか否かの確認を行った。これらの結果を図１に示す。図１は、各種Ｓ１００とＧＳＴ−ＰＰ５との結合を示すプルダウンアッセイの結果である。図１（Ａ）に示すように、Ｓ１００Ａ２およびＳ１００Ａ６は、Ｃａ２＋存在下、ＰＰ５に結合した。また、Ｓ１００Ａ１は、Ｃａ２＋存在下だけでなく、Ｃａ２＋非存在下においても、ＰＰ５への結合が確認された。また、多量のＧＳＴ−ＰＰ５（５０μｇ）を用いた場合、図１（Ｂ）に示すように、Ｓ１００Ｂは、Ｃａ２＋存在下、ＰＰ５に結合した。
【０１０３】
（２）ＳＰＲ
ＰＰ５に対するＳ１００Ａ１、Ｓ１００Ａ２、Ｓ１００Ａ６およびＳ１００Ｂの結合について、ＳＰＲにより、リアルタイム結合反応速度論を解析した。この結果を、図２および下記表１に示す。表１に示すように、ＰＰ５に対する各Ｓ１００の会合速度定数（Ｋａ）は、類似していた。また、Ｓ１００Ａ６およびＳ１００Ａ２の解離は、Ｓ１００ＢおよびＳ１００Ａ１の解離と比較して、ゆっくり起こり、全体の結合親和性は、相対的に高くなっていることがわかる。この結果から、Ｓ１００Ａ１およびＳ１００Ｂと、Ｓ１００Ａ２とＳ１００Ａ６との間で、異なる相互作用メカニズムが存在すると考えらえる。
【０１０４】
【表１】
0005971644.tif 000015
【０１０５】
（３）ＰＰ５におけるＳ１００結合ドメインの決定
ＰＰ５は、Ｎ末端のＴＰＲおよびＣ末端の触媒ドメイン（ＣＤ）により構成される。そこで、ＰＰ５におけるＳ１００の結合ドメインを、プルダウンアッセイにより決定した。
【０１０６】
前記プルダウンアッセイには、ＧＳＴと融合させた４種類のタンパク質を使用した。これらのタンパク質の概略を図３（Ａ）に示す。野生型（ＷＴ）は、ＰＰ５とＧＳＴとの融合タンパク質、欠失体（ＴＰＲ）は、触媒ドメインを欠失するＴＰＲとＧＳＴとの融合タンパク質、欠失変異体（ΔＴＰＲ）は、ＴＰＲを欠失する触媒ドメインとＧＳＴとの融合タンパク質、ＧＳＴは、ＧＳＴのみから構成されるタンパク質とした。
【０１０７】
これらの結果を、図３（Ｂ）に示す。図３（Ｂ）は、プルダウンアッセイの結果である。図３（Ｂ）に示すように、いずれのＳ１００も、ＴＰＲを欠失する変異体への結合は確認できなかった。この結果から、Ｓ１００は、ＰＰ５のＴＰＲドメインに相互作用することがわかった。
【０１０８】
（４）ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、Ｓ１００による、ＰＰ５とＨＳＰ９０との相互作用の阻害
ＨＳＰ９０は、そのＣ末端のＥＥＶＤ残基を介して、ＰＰ５のＴＰＲドメインに結合することが知られている。Ｓ１００およびＨＳＰ９０は、ＴＰＲドメインを共有する。そこで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＨＳＰ９０またはＳ１００の量の増加に伴って、ＰＰ５との会合が阻害されるか否かを、プルダウンアッセイにより確認した。
【０１０９】
これらの結果を、図４（Ａ）に示す。図４（Ａ）は、プルダウンアッセイの結果である。図４（Ａ）に示すように、ＨＳＰ９０の量の増加に伴って、量依存的に、ＰＰ５からＳ１００Ａ１およびＳ１００Ａ２の置換が生じた。そして、Ｓ１００Ａ６に対しては、弱い結合阻害を示した。他方、Ｓ１００Ａ１およびＳ１００Ａ２の増加に伴って、ＰＰ５に対するＨＳＰ９０の会合を阻害した。
【０１１０】
さらに、哺乳類細胞におけるＰＰ５の競合的結合を確認するため、共免疫沈降を行った。具体的には、ＨＡ−ＰＰ５と、Ｓ１００Ａ１またはＳ１００Ａ２を共発現させたＣＯＳ−７細胞のライゼートについて行った。ＨＡ−ＰＰ５と共沈降された内因性ＨＳＰ９０を、抗ＨＳＰ９０抗体を用いて、ウエスタンブロット分析により検出した。
【０１１１】
これらの結果を、図４（Ｂ）に示す。図４（Ｂ）に示すように、前述のｉｎ  ｖｉｔｒｏの結果と同様に、Ｓ１００Ａ１またはＳ１００Ａ２の過剰発現により、ＰＰ５とＨＳＰ９０の相互作用が阻害された。
【０１１２】
（５）ＰＰ５変異体に対するＳ１００およびＨＳＰ９０の結合
ＨＳＰ９０は、ＰＰ５のＴＰＲドメインにおけるｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ  ｃｌａｍｐと呼ばれるモチーフに結合する。ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ  ｃｌａｍｐは、基本となる４つのアミノ酸残基、すなわち、Ｋ３２、Ｒ７４、Ｋ９７およびＲ１０１から構成される。ＰＰ５とＨＳＰ９０との結合が、Ｓ１００に阻害される際、Ｓ１００が、ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ  ｃｌａｍｐにおける前記４種類のアミノ酸残基の一つに、競合的に結合するか否かを確認した。
【０１１３】
ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ  ｃｌａｍｐのアラニン置換変異体として、アラニン変異体（Ｋ３２Ａ、Ｒ７４Ａ、Ｋ９７ＡおよびＲ１０１Ａ）を使用し、プルダウンアッセイを行った。これらの結果を、図５に示す。図５（Ａ）に示すように、ＨＳＰ９０は、いずれのアラニン変異体には結合しなかった。これに対して、図５（Ｂ）に示すように、Ｓ１００は、いずれのアラニン変異体にも結合した。この結果から、ＰＰ５におけるｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ  ｃｌａｍｐの点突然変異は、Ｓ１００の結合に影響を及ぼさないことがわかった。
【０１１４】
（６）Ｃａ２＋依存的なＳ１００によるＰＰ５の活性化
Ｓ１００によるＰＰ５の脱リン酸化活性に対する効果を確認した。具体的には、所定濃度のＨｉｓ−ＰＰ５と、基質となる合成ホスホペプチド（配列番号７：ＫＲｐＴＩＲＲ）とをインキュベートし、ホスファターゼ活性を測定した。これらの結果を図６に示す。
【０１１５】
図６（Ａ）において、黒丸は、Ｃａ２＋存在下の結果を示し、白丸は、Ｃａ２＋非存在下の結果を示す。図６（Ａ）に示すように、ＰＰ５の基礎ホスファターゼ活性は、１０ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇタンパク質であった。Ｓ１００Ａ１、Ｓ１００Ａ２、Ｓ１００Ａ６およびＳ１００Ｂは、それぞれ、Ｃａ２＋依存的に、ＰＰ５活性を著しく活性化した。
【０１１６】
ＴＰＲドメインは、ＰＰ５の触媒ドメイン（ＣＤ）を、ＴＰＲドメインの活性化および除去から保護している。そこで、Ｎ末端のＴＰＲドメインを除去し、Ｃ末端の触媒ドメイン（ＣＤ）を残した、変異体Ｈｉｓ−ＰＰ５を作製した。そして、この変異体Ｈｉｓ−ＰＰ５に対する各Ｓ１００の活性化を確認した。これらの結果を図６（Ｂ）に示す。
【０１１７】
図６（Ｂ）において、コントロールは、Ｓ１００非存在下の変異体Ｈｉｓ−ＰＰ５の結果である。この結果から、ＰＰ５は、ＴＰＲドメインの除去により、構造的に活性型となり、約６５０ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇタンパク質を示した。この変異体の活性は、野生型酵素の基礎活性の６５倍であった。
【０１１８】
つぎに、全長ＨＳＰ９０（１２ｋＤａ）およびＨＳＰ  Ｃ９０（ＨＳＰ９０のＣ末端ドメイン）が、ＰＰ５の活性を、活性化可能か否かを確認した。この結果を、図６（Ｃ）に示す。図６（Ｃ）の各グラフにおいて、右上の小さいグラフは、タンパク質の添加量が０〜２０μｇ／ｍｌの結果を示す。図６（Ｃ）に示すように、ＨＳＰ９０およびＨＳＰ  Ｃ９０による、Ｈｉｓ−ＰＰ５の用量依存性の活性化を示した。しかしながら、Ｓ１００と比較した結果、ＨＳＰ９０によるＰＰ５の活性化は弱く、約６．５倍でしかなかった。他方、ＨＳＰ  Ｃ９０は、１７．３倍の活性の誘導を示した。
【０１１９】
（７）ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、Ｓ１００によるＰＰ５の活性化ならびにｔａｕの脱リン酸化
ＰＰ５は、ｔａｕの脱リン酸化において、キーとなる役割を果たす。そして、過剰なリン酸化は、アルツハイマー病の要因となる。そこで、基質としてリン酸化されたｔａｕを使用し、Ｃａ２＋存在下でのＳ１００（Ｃａ２＋／Ｓ１００）による、ＰＰ５の活性化を確認した。
【０１２０】
ｔａｕの複数部位は、ＰＫＡ、ＧＳＫ−３β、ｃｄｋ５およびＣａＭＫII等のｔａｕキナーゼにより、リン酸化される。そこで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＰＰ５のホスファターゼアッセイのため、ＧＳＫ−３βおよびＰＫＡを、それぞれ、ｔａｕのＳｅｒ３９６およびＳｅｒ４０９のリン酸化に用いた。そして、リン酸化ｔａｕを、Ｈｉｓ−ＰＰ５、およびＳ１００Ａ１、Ｓ１００Ａ２またはＳ１００Ｂとインキュベートした。そして、ｔａｕのリン酸化状態を、抗ｐＳｅｒ３９６  ｔａｕ抗体または抗ｐＳｅｒ４０９  ｔａｕ抗体を用いて、ウエスタンブロットにより検出した。これらの結果を、図７（Ａ）に示す。
【０１２１】
図７（Ａ）に示すように、各Ｓ１００は、それぞれＰＰ５を活性化し、ｔａｕの脱リン酸化を増加させた。
【０１２２】
Ｓ１００Ａ１によるＰＰ５の活性化、およびｔａｕの脱リン酸化について、ｉｎ  ｖｉｖｏでの確認を行った。細胞は、ｔａｕ４４１を安定的に高レベルで発現する、トランスフェクションされたＣＯＳ−７細胞株を使用した。これらの結果を、図７（Ｂ）および（Ｃ）に示す。
【０１２３】
図７（Ｂ）および（Ｃ）に示すように、Ｓ１００非存在下のコントロールは、イオノマイシン処理によっても、ｐＳｅｒ３９６におけるｔａｕリン酸化状態に、変化は見られなかった（９５．３±２５．９％、Ｎ＝５）。また、Ｓ１００Ａ１を過剰発現した場合、イオノマイシン非存在下では、リン酸化状態に変化は見られなかった（１０６．０±１５．７％、Ｎ＝５）。しかしながら、１５分間のイオノマイシン処理により、ｐＳｅｒ３９６  ｔａｕのレベルが低下し（６９．０±１２．６％、Ｐ＜０．０５、Ｎ＝４）、さらに、６０分間の処理により、有意な低下が見られた（４６．４±４．６％、Ｐ＜０．０１、Ｎ＝５）。これらの結果から、Ｓ１００Ａ１は、Ｃａ２＋依存的に、ＰＰ５を活性化し、ｔａｕの脱リン酸化を増加させることがわかった。
【０１２４】
（８）ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＳ１００によるＰＰ５とＡＳＫ１との相互作用の阻害
ＡＳＫ１は、ＪＮＫキナーゼカスケードおよびｐ３８  ＭＡＰ  キナーゼカスケードを活性化するＭＡＰ３Ｋであり、Ｈ２Ｏ２等の酸化ストレスへの応答において活性化される。ＡＳＫ１の活性化は、キナーゼドメインに位置するＴｈｒ８４５の自己リン酸化に関連する。そして、酸化ストレスによるＡＳＫ１の活性化に続いて、ＰＰ５がＡＳＫ１に結合することで、ＡＳＫ１は脱リン酸化され、不活性化状態に戻る。
【０１２５】
そこで、ＣＯＳ−７細胞内で、Ｓ１００Ａ１、ＰＰ５およびＡＳＫ１を共発現させた。そして、細胞のイオノマイシン処理により、ＰＰ５とＡＳＫ１との結合が阻害されることを、ウエスタンブロットにより確認した。これらの結果を、図８（Ａ）に示す。
【０１２６】
図８（Ａ）に示すように、イオノマイシン処理していない場合、阻害は、確認されなかった。これは、イオノマイシンによる細胞内Ｃａ２＋濃度の増加により、ＰＰ５に対するＳ１００Ａ１の結合が刺激され、これによって、ＰＰ５−ＡＳＫ１の相互作用が阻害されるためと推測される。
【０１２７】
また、Ｓ１００として野生型Ｓ１００Ｐを使用した。この結果を、図８（Ｂ）に示す。図８（Ｂ）に示すように、野生型のＳ１００Ｐは、Ｓ１００Ａ１、Ｓ１００Ａ２、Ｓ１００Ａ６およびＳ１００Ｂと同様に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＧＳＴ−ＰＰ５に結合した。
【０１２８】
また、ＣＯＳ−７細胞について、野生型Ｓ１００ＰまたはＳ１００Ｐ−ＰＡを、ＰＰ５およびＡＳＫ１と共発現させた。この結果を、図８（Ｃ）に示す。図８（Ｃ）に示すように、Ｓ１００Ｐ−ＰＡは、ＰＰ５およびＡＳＫ１の結合を阻害した。一方、野生型Ｓ１００Ｐは、阻害がみられなかった。リン酸化されたＡＳＫ１のｐＴｈｒ８４５の増加に起因し、Ｓ１００Ｐ−ＰＡは、ＡＳＫ１からのＰＰ５の解離により、脱リン酸化を阻害すると解される。
【０１２９】
［実施例２］
Ｓ１００と調節物質との共存下、ＰＰ５のホスファターゼ活性を評価し、前記調節物質の機能を確認した。
【０１３０】
ＰＰ５（ＰＰ５−ＷＴ）のホスファターゼ活性を測定した。ホスファターゼ活性の測定方法は、特に示さない限り、前述の「８．ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのホスファターゼアッセイ」に従って行った。具体的には、前記ホスホペプチド（１００μｍｏｌ／Ｌ）、所定濃度（０−２００μｍｏｌ／Ｌ）の調節物質、０．２５μｍｏｌ／ＬのＳ１００Ａ１、０．０２μｍｏｌ／ＬのＰＰ５を、緩衝液５０μｌ中、３７℃で１０分間インキュベートした。そして、１００μｌのｍａｌａｃｈｉｔｅ  ｇｒｅｅｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎの添加後、６３０ｎｍにおけるサンプルの吸光度を、マイクロプレートリーダーにより測定した。前記緩衝液および前記ｍａｌａｃｈｉｔｅ  ｇｒｅｅｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎは、前述の通りとした。そして、放出されたリン酸塩の量を、既知量のリン酸塩から準備したリン酸塩標準曲線を用いて算出した。これをホスファターゼ活性として評価した。
【０１３１】
（１）Ｓ１００バインディング  アンタゴニスト
調節物質としてPonceau‐3Rを使用した。この結果を、図９に示す。図９に示すように、Ponceau-3Rを添加した結果、Ｓ１００のＰＰ５への結合が阻止され、ＰＰ５の活性が、定常活性に抑制された。この結果から、Ponceau-3Rは、Ｓ１００バインディング  アンタゴニストといえる。
【０１３２】
（２）Ｓ１００ポテンシエーター
調節物質として、Erythrosine  BおよびPhlosine  Bを使用した。これらの結果を、図１０に示す。図１０に示すように、ＰＰ５−ＷＴにおいて、Ｓ１００Ａ１と前記調節物質とを共存させた結果、前記調節物質未添加（０μｍｏｌ／Ｌ）の活性と比較して、グラフ内の矢印で示すように、活性の増強が確認された。これらの結果から、前記調節物質は、Ｓ１００によるＰＰ５の活性化を、増強していると解される。このため、前記調節物質は、Ｓ１００ポテンシエーターと言える。
【０１３３】
［実施例３］
調節物質の存在下、ＰＰ５のホスファターゼ活性を評価し、前記調節物質の機能を確認した。
【０１３４】
ホスファターゼ活性は、ＰＰ５（ＰＰ５−ＷＴ）およびＴＰＲドメインを欠失したＰＰ５（ＰＰ５−ΔＴＰＲ）について測定した。ホスファターゼ活性の測定方法は、特に示さない限り、前述の「８．ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのホスファターゼアッセイ」に従って行った。具体的には、所定濃度（０−２００μｍｏｌ／Ｌ）の調節物質、０．２５μｍｏｌ／ＬのＳ１００Ａ１、０．０２μｍｏｌ／ＬのＰＰ５−ＷＴまたはＰＰ５―ΔＴＰＲを、緩衝液５０μｌ中、３７℃で１０分間インキュベートした以外は、前記実施例２と同様に、ホスファターゼ活性を評価した。
【０１３５】
（１）ＰＰ５  アクティベーター
調節物質として、チオフラビン−Ｓ、α−ナフトールオレンジ、Direct  red80を使用した。
【０１３６】
これらの結果を、図１１に示す。図１１（Ａ）に示すように、チオフラビン−Ｓは、Ｓ１００と同様に、ＰＰ５に結合してＰＰ５の活性を増強した。また、ＰＰ５−ΔＴＰＲの活性も増強させたことから、チオフラビン−Ｓは、ＰＰ５における触媒ドメイン（ＣＤ）への結合による活性の増強も可能と考えられる。図１１（Ｂ）および（Ｃ）に示すように、α−ナフトールオレンジおよびDirect  red80は、Ｓ１００と同様に、ＰＰ５のＴＰＲに結合してＰＰ５の活性を増強した。これらの結果から、各調節物質は、ＰＰ５  アクティベーター、Ｓ１００ミミックまたはＳ１００アゴニストといえる。
【０１３７】
（２）ＰＰ５  アクティベーターとＰＰ５カタリティックインヒビターとを兼ねる調節物質
調節物質として、Congo-Red、Chrysamine-G、Evans-blue、４，４−ビス（２−スルフォナトスチリル）ビフェニルを使用した。これらの結果を、図１２に示す。図１２（Ａ）〜（Ｄ）に示すように、いずれの調節物質も、低濃度の添加でＰＰ５活性を増強し、一定量以上の添加で、ＰＰ５活性を阻害した。これらの結果から、各調節物質は、ＴＰＲへの結合によるＰＰ５活性の増強能と、触媒ドメイン（ＣＤ）への結合によるＰＰ５活性の阻害能とを有すると解される。
【０１３８】
（３）アロステリックＰＰ５インヒビター
調節物質として、Proflavineを使用した。これらの結果を、図１３に示す。図１３に示すように、前記調節物質は、ＴＰＲへの結合により、ＰＰ５活性を阻害した。この結果から、前記調節物質は、ＰＰ５の活性調節部位に作用する、アロステリックＰＰ５インヒビターと言える。
【０１３９】
（４）ＰＰ５カタリティックインヒビター
調節物質として、Ethyl  violet、Methyl  green、Acridine  Orange、Acridine  Yellowを使用した。これらの結果を、図１４に示す。図１４（Ａ）〜（Ｄ）に示すように、いずれの調節物質も、ＰＰ５活性を阻害した。これらの結果から、各調節物質は、ＰＰ５カタリティックインヒビターと言える。
【０１４０】
［実施例４］
調節物質として、トリフェニルメタン化合物である、TBPEを使用し、前記実施例２と同様にして、Ｓ１００の存在下、ＰＰ５の活性を確認した。これらの結果を、図１５に示す。図１５に示すように、ＰＰ５−ＷＴにおいて、Ｓ１００Ａ１と前記調節物質とを共存させた結果、前記調節物質未添加（０μｍｏｌ／Ｌ）の活性と比較して、活性の増強が確認された。
【０１４１】
［実施例５］
調節物質として、トリフェニルメタン化合物である、Fast  green  FCF、Acid  violet  6B、Guinea  green  B、Brilliant  milling  greenを使用した。これらの結果を、図１６および図１７に示す。図１６（Ａ）および（Ｂ）に示すように、Fast  green  FCF、Acid  violet  6Bは、ＰＰ５活性の減少が確認された。また、図１７（Ａ）および（Ｂ）に示すように、Guinea  green  B、Brilliant  milling  greenは、ＰＰ５の活性の増強が確認された。
【０１４２】
［実施例６］
調節物質として、アクリジン誘導体である、Acridine  Orange、Acridine  YellowおよびProflavinを使用し、前記実施例３と同様にして、Ｓ１００非存在下、ＰＰ５の活性を確認した。これらの結果を、図１８に示す。図１８に示すように、各調節物質は、ＰＰ５−ＷＴについて、同様にＰＰ５活性を阻害したが、ＰＰ５−ΔＴＰＲについては、Acridine  Orange、Acridine  YellowおよびProflavinの順番に、ＰＰ５の活性阻害が緩和された。
【０１４３】
［実施例７］
調節物質として、キサンテン化合物EosinおよびRose  Bengalを使用し、前記実施例２と同様にして、Ｓ１００存在下、ＰＰ５の活性を確認した。これらの結果を、図１９に示す。図１９（Ａ）に示すように、Eosinは、Ｓ１００の共存下、ＰＰ５活性を変化させず、Ｓ１００非存在下で、ＰＰ５を阻害した。他方、図１９（Ｂ）に示すように、Rose  Bengalは、Ｓ１００の共存下、ＰＰ５活性を増強し、所定量を超えると、ＰＰ５活性を阻害した。
【０１４４】
［実施例８］
また、各種調節物質について、前記実施例２および実施例３と同様の方法により、機能を確認した。
【０１４５】
具体的には、ＰＰ５（ＷＴ）、ＰＰ５−ΔＴＰＲ、ＰＰ５（ＷＴ）＋Ｓ１００Ａ１のそれぞれの条件について、ホスファターゼ活性を測定した。そして、ＰＰ５（ＷＴ）およびＰＰ５−ΔＴＰＲについては、前記調節物質未添加の活性を１００％として相対値を求めた。また、ＰＰ５（ＷＴ）＋Ｓ１００Ａ１については、下記式に基づいて相対値を求めた。
相対値（％）＝［Ｘ−Ｙ］／［Ｚ−Ｙ］×１００
Ｘ：ＰＰ５（ＷＴ）、Ｓ１００Ａ１および調節物質の共存下における活性
Ｙ：ＰＰ５（ＷＴ）の活性
Ｚ：ＰＰ５（ＷＴ）およびＳ１００Ａ１の共存下における活性
【０１４６】
これらの結果を、図２０〜２７に示す。各図に示すように、いずれもＰＰ５の活性に対して調節機能を示した。
【産業上の利用可能性】
【０１４７】
以上のように、本発明によれば、Ｓ１００によりＴＰＲモチーフタンパク質の機能の調節が可能である。また、本発明のスクリーニング方法によれば、例えば、Ｓ１００の拮抗化合物等、様々なＴＰＲモチーフタンパク質の機能調節物質をスクリーニングでき、種々の機能調節物質を提供可能である。ＴＰＲモチーフタンパク質の一種であるＰＰ５は、癌等の疾患に関連することから、本発明は、生化学等の研究分野および臨床分野のいずれにおいて、極めて重要な技術と言える。
【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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