(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
センダイウイルスのP遺伝子の直後に、順にKLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子が挿入されたセンダイウイルスベクターを含む、多能性幹細胞の誘導における遺伝子導入に使用するための組成物であり、
MYC遺伝子がL遺伝子の直前又は直後に挿入された別のセンダイウイルスベクターと組み合わせて用いられる組成物。
【請求項２】
センダイウイルスのP遺伝子の直後に、順にOCT遺伝子、SOX遺伝子、およびKLF遺伝子が挿入されたセンダイウイルスベクターを含む、多能性幹細胞の誘導における遺伝子導入に使用するための組成物であり、
MYC遺伝子がL遺伝子の直前に挿入された別のセンダイウイルスベクターと組み合わせて用いられる組成物。
【請求項３】
KLF遺伝子が挿入された別のセンダイウイルスベクターと組み合わせて用いられる、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
KLF遺伝子がセンダイウイルスのN遺伝子の上流に挿入されている、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
多能性幹細胞の誘導における遺伝子導入細胞の製造方法であって、センダイウイルスのP遺伝子の直後に、順にKLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子が挿入されたセンダイウイルスベクターを細胞に導入すること、ならびに
センダイウイルスのL遺伝子の直前又は直後にMYC遺伝子が挿入されたもう一つのセンダイウイルスベクターを該細胞に導入すること
を含む方法。
【請求項６】
多能性幹細胞の誘導における遺伝子導入細胞の製造方法であって、センダイウイルスのP遺伝子の直後に、順にOCT遺伝子、SOX遺伝子、およびKLF遺伝子が挿入されたセンダイウイルスベクターを細胞に導入すること、ならびに
センダイウイルスのL遺伝子の直前にMYC遺伝子が挿入されたもう一つのセンダイウイルスベクターを該細胞に導入すること
を含む方法。
【請求項７】
KLF遺伝子が挿入されたもう一つのセンダイウイルスベクターを該細胞に導入することをさらに含む、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
KLF遺伝子がセンダイウイルスのN遺伝子の上流に挿入されている、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
センダイウイルスのP遺伝子の直後に、順にKLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子が挿入されたセンダイウイルスベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載のセンダイウイルスベクターのゲノムまたはアンチゲノムをコードする核酸。
【請求項１１】
センダイウイルスのP遺伝子の直後に、順にKLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子が挿入されたセンダイウイルスベクター、ならびにMYC遺伝子がL遺伝子の直前又は直後に挿入された別のセンダイウイルスベクターを含む、多能性幹細胞の誘導における遺伝子導入に使用するためのキット。
【請求項１２】
センダイウイルスのP遺伝子の直後に、順にOCT遺伝子、SOX遺伝子、およびKLF遺伝子が挿入されたセンダイウイルスベクター、ならびにMYC遺伝子がL遺伝子の直前に挿入された別のセンダイウイルスベクターを含む、多能性幹細胞の誘導における遺伝子導入に使用するためのキット。
【請求項１３】
KLF遺伝子が挿入された別のセンダイウイルスベクターをさらに含む、請求項１１または１２に記載のキット。
【請求項１４】
KLF遺伝子がセンダイウイルスのN遺伝子の上流に挿入されている、請求項１３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性幹細胞の誘導において用いられる遺伝子導入用組成物およびその使用に関する。また本発明は、多能性幹細胞の誘導において用いられる遺伝子導入ベクターに関する。本発明は具体的には、リプログラミング因子をコードする遺伝子が特定の配置で組み込まれたセンダイウイルスベクター、および該ベクターを含む、多能性幹細胞の誘導において用いられる遺伝子導入用組成物およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
体細胞からの多能性幹細胞（induced pluripotent stem (iPS) cells）（人工多能性幹細胞あるいは誘導多能性幹細胞とも言う）の誘導が報告されて以来（非特許文献1）、これまでヒトやマウスを含む様々な哺乳動物細胞において、リプログラミング因子の導入によりiPS細胞が作製されてきた（非特許文献1-9）。その多くはレトロウイルスベクターを用いてリプログラミング因子を導入するものであるが、レトロウイルスベクターは宿主ゲノムへのインテグレーションにより腫瘍発生のリスクがあることで、その使用は制限されてしまう（非特許文献3）。この問題を解決するために、これまでアデノウイルスベクターやプラスミドを用いてiPS細胞を誘導する試みが行われているが、DNA型のベクターを使う限りゲノムへのインテグレーションの懸念を完全に払拭することはできない。また、これらのベクターによるiPS細胞の誘導効率は極めて低い（非特許文献10-13）。【０００３】
このような問題を解決することを目指して、本発明者らは以前、RNA型ウイルスの１つであるセンダイウイルスベクターを用いてiPS細胞を誘導する系を開発している（特許文献1）。センダイウイルスベクターを用いたiPS細胞の誘導効率は、それまでの他のベクターを用いた場合と比べて有意に高いものであった。またセンダイウイルスベクターは、ライフサイクルにおいてDNAフェーズを持たず、宿主ゲノムにインテグレーションされる懸念がないため安全性に優れ、またiPS細胞の誘導後にベクターを除去することも簡単である。しかしセンダイウイルスベクターを用いたiPS細胞の誘導効率を、さらに高める技術は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開WO 2010/008054
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Takahashi, K. and Yamanaka, S. (2006) Cell 126, 663-676
【非特許文献２】Maherali, N. et al. (2007) Cell Stem Cell 1, 55-70
【非特許文献３】Okita, K. et al. (2007) Nature 448, 313-317
【非特許文献４】Wernig, M. et al. (2007)  Nature 448, 318-324
【非特許文献５】Takahashi, K. et al. (2007)  Cell 131, 861-872
【非特許文献６】Yu, J. et al. (2007) Science 318, 1917-1920
【非特許文献７】Lowry, W.E. et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 2883-2888
【非特許文献８】Park, I.H. et al. (2008) Nature 451, 141-146
【非特許文献９】Masaki, H. et al. (2008) Stem Cell Res. 1, 105-115
【非特許文献１０】Stadtfeld, M. et al. (2008) Science 322, 945-949
【非特許文献１１】Okita, K. et al. (2008) Science 322, 949-953
【非特許文献１２】Yu, J. et al. (2009) Science 324, 797-801
【非特許文献１３】Zhou, W. et al. (2009) stem cells 27, 2667-2674
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、多能性幹細胞の誘導において用いられる新しい遺伝子導入用組成物およびその使用を提供することを課題とする。また本発明は、多能性幹細胞の誘導において用いられる新しい遺伝子導入ベクターを提供することを課題とする。本発明は具体的には、多能性幹細胞を誘導するためのリプログラミング因子をコードする遺伝子が特定の配置で組み込まれたセンダイウイルスベクター、および該ベクターを含む、多能性幹細胞の誘導において用いられる遺伝子導入用組成物およびその使用を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、リプログラミング因子であるKLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子を、センダイウイルスのゲノム上に配置したセンダイウイルスベクターを用いると、これらの3つの遺伝子を別々のベクターで導入するよりも有意に高い効率でiPS細胞を誘導することが可能であることを見出した。また、このベクターを、MYC遺伝子を発現するベクターを組み合わせて用いた場合にも、KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子を別々のセンダイウイルスベクターに搭載させるよりも、顕著に高い効率でiPS細胞を誘導できることを見出した。また、MYC遺伝子の代わりにGlis1遺伝子（Maekawa et al., Nature, 474: 225-229, 2011）を発現するベクターを組み合わせてもよい。
特にKLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をこの順番、あるいはOCT遺伝子、SOX遺伝子、およびKLF遺伝子の順番で１つのセンダイウイルスベクターに挿入したベクターを用いることにより、iPS細胞の誘導効率を有意に上昇させることが可能である。また、MYC遺伝子がセンダイウイルスのL遺伝子のすぐ上流（マイナス鎖RNAゲノムのすぐ3'側）に挿入された別のセンダイウイルスベクターと組み合わせて用いた場合には、図１(条件２)に示したように、極めて高い割合でiPS細胞のコロニーが出現した。また、OCT遺伝子、SOX遺伝子、およびKLF遺伝子の順番で１つのセンダイウイルスベクターに挿入したベクターを用いる場合は、KLF遺伝子を搭載するセンダイウイルスベクターをさらに組み合わせることができる。
このようにKLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子を１つのセンダイウイルスベクターに挿入したベクターを用いることにより、iPS細胞の誘導効率を有意に上昇させることが可能である。
すなわち本発明は、多能性幹細胞の誘導において用いられる新規な遺伝子導入用組成物およびその使用、および遺伝子導入ベクター等に関し、より具体的には請求項の各項に記載の発明に関する。なお同一の請求項を引用する請求項に記載の発明の２つまたはそれ以上の任意の組み合わせからなる発明も、本明細書において意図された発明である。すなわち本発明は、
〔１〕  センダイウイルスのP遺伝子の直後に、順にKLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子、あるいは順にOCT遺伝子、SOX遺伝子、およびKLF遺伝子、が挿入されたセンダイウイルスベクターを含む、多能性幹細胞の誘導における遺伝子導入に使用するための組成物、
〔２〕  MYC遺伝子またはGlis1遺伝子が挿入された別のセンダイウイルスベクターと組み合わせて用いられる、〔１〕に記載の組成物、
〔３〕  該MYC遺伝子またはGlis1遺伝子がセンダイウイルスのL遺伝子の直前に挿入されている、〔２〕に記載の組成物、
〔４〕  多能性幹細胞の誘導における遺伝子導入細胞の製造方法であって、センダイウイルスのP遺伝子の直後に、順にKLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子、あるいは順にOCT遺伝子、SOX遺伝子、およびKLF遺伝子、が挿入されたセンダイウイルスベクターを細胞に導入することを含む方法、
〔５〕  MYC遺伝子またはGlis1遺伝子が挿入されたもう一つのセンダイウイルスベクターを該細胞に導入することをさらに含む、〔４〕に記載の方法、
〔６〕  該MYC遺伝子またはGlis1遺伝子がセンダイウイルスのL遺伝子の直前に挿入されている、〔５〕に記載の方法、
〔７〕  センダイウイルスのP遺伝子の直後に、順にKLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子、あるいは順にOCT遺伝子、SOX遺伝子、およびKLF遺伝子、が挿入されたセンダイウイルスベクター、
〔８〕  〔７〕に記載のセンダイウイルスベクターのゲノムまたはアンチゲノムをコードする核酸、
〔９〕  〔７〕に記載のセンダイウイルスベクターおよびMYC遺伝子またはGlis1遺伝子が挿入された別のセンダイウイルスベクターを含む、多能性幹細胞の誘導における遺伝子導入に使用するためのキット、
〔１０〕  該MYC遺伝子またはGlis1遺伝子がセンダイウイルスのL遺伝子の直前に挿入されている、〔９〕に記載のキット、に関する。【０００８】
なお、本明細書に記載した任意の技術的事項およびその任意の組み合わせは、本明細書に意図されている。また、それらの発明において、本明細書に記載の任意の事項またはその任意の組み合わせを除外した発明も、本明細書に意図されている。また本発明に関して、明細書中に記載されたある特定の態様は、それを開示するのみならず、その態様を含むより上位の本明細書に開示された発明から、その態様を除外した発明も開示するものである。
【発明の効果】
【０００９】
センダイウイルスベクターは宿主ゲノムに組み込まれる懸念がない安全性に優れたベクターであって、このベクターを用いてより高い効率でiPS細胞を誘導することができれば極めて実用性が高い。本発明はセンダイウイルスベクターによるiPS細胞の誘導効率を一段と上昇させることを可能とすると同時に、複数のリプログラミング遺伝子を一つのセンダイウイルスベクターに集約することを実現するもので、iPS細胞の誘導操作の簡略化および再現性向上にも貢献する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ベクター感染14日後の細胞の状態を示した図である。左パネルは従来のベクターを使用した場合（条件11）、右パネルは本発明のベクターを使用した場合（条件2）である。
【図２】ベクター感染21日後の細胞（BJ細胞）をアルカリホスファターゼ染色した結果を示す図である。KLF4遺伝子、OCT3/4遺伝子、およびSOX2遺伝子をこの順番で挿入されたセンダイウイルスベクターを用いた場合は、実験したすべての条件でアルカリホスファターゼ陽性コロニーが検出された（条件1〜5）。また、違う順番で挿入されたセンダイウイルスベクターを用いた場合（条件6〜10）や、各遺伝子を別々のセンダイウイルスベクターで導入した場合（条件11）に比べて、アルカリホスファターゼ陽性コロニーの出現頻度は顕著に高かった。特に、c-MYC遺伝子がセンダイウイルスのL遺伝子の直前または直後に挿入された別のセンダイウイルスベクターと組み合わせて用いた場合（条件2〜4）に、アルカリホスファターゼ陽性コロニーの出現頻度は有意に高かった。
【図３】アルカリホスファターゼ染色したコロニーを示した図である。条件6、10、および12ではアルカリホスファターゼ陽性コロニーは検出されなかった。
【図４】アルカリホスファターゼ陽性コロニーの誘導効率を示した図である。BJ細胞からの多能性幹細胞の誘導効率を示した。各条件は図３と同じである。
【図５】ベクター感染27日後の細胞（MRC-5細胞）をアルカリホスファターゼ染色した結果を示す図である。従来の方法（条件9）と比較して、3遺伝子搭載した条件下（条件1〜8）、特にMOI 90未満（条件1〜3, 5〜7）では、有意に高い効率でヒトES細胞様のコロニーが出現した。また、KLF4遺伝子、OCT3/4遺伝子、およびSOX2遺伝子が、この順番で挿入されたセンダイウイルスベクターを用いた場合は、有意に高い効率でアルカリホスファターゼ陽性コロニーが誘導された。またOCT3/4遺伝子、SOX2遺伝子、KLF4遺伝子の順番で挿入されたセンダイウイルスベクターを用いた場合でも、別々のセンダイウイルスベクターを用いて導入した場合よりも明らかに高い効率でアルカリホスファターゼ陽性コロニーが誘導された。
【図６】アルカリホスファターゼ陽性コロニーの誘導効率を示した図である。MRC-5細胞からの多能性幹細胞の誘導効率を示した。各条件は図５と同じである。
【図７】ベクター感染後の細胞をアルカリホスファターゼ染色した結果を示す図である。
【図８】アルカリホスファターゼ陽性コロニーの誘導効率を示した図である。
【図９】ESマーカー遺伝子の発現を解析した結果を示す図である。
【図１０】ESマーカー遺伝子の発現を解析した結果を示す図である。
【図１１】ESマーカー遺伝子の発現を解析した結果を示す図である。
【図１２】iPS細胞クローンのESマーカータンパク質の発現を解析した結果を示す図である。
【図１３】iPS細胞クローンのESマーカータンパク質の発現を解析した結果を示す図である。
【図１４】iPS細胞クローンのESマーカータンパク質の発現を解析した結果を示す図である。
【図１５】iPS細胞クローンの胚様体の形成を示す図である。
【図１６】iPS細胞クローンのテラトーマ形成を示す図である。
【図１７】iPS細胞クローンのテラトーマ形成を示す図である。
【図１８】iPS細胞クローンのテラトーマ形成を示す図である。
【図１９】iPS細胞クローンの核型解析の結果を示す図である。
【図２０】Oct3/4プロモーターのメチル化解析の結果を示す図である。
【図２１】iPS細胞からのベクターの除去を示す図である。
【図２２】iPS細胞からのベクターの自然脱落を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【００１２】
本発明は、核リプログラミング因子（nuclear reprogramming factors）（KLF、OCT、およびSOX）遺伝子が特定の配置で組み込まれたセンダイウイルスベクター、および該ベクターを用いて、分化した細胞のリプログラミングの誘導において該リプログラミング因子遺伝子を導入する方法、特に体細胞からの多能性幹細胞の製造において該リプログラミング因子の遺伝子を導入する方法を提供する。具体的にはこの方法は、少なくとも３つのリプログラミング因子をコードする遺伝子、すなわちKLF、OCT、およびSOXをコードする遺伝子が、この順番、あるいはOCT遺伝子、SOX遺伝子、およびKLF遺伝子の順番で組み込まれたセンダイウイルスベクターを、体細胞等の分化した細胞に接触させる工程を含む方法である。より具体的には本発明は、細胞のリプログラミングにおいて該リプログラミング因子遺伝子を導入するための方法であって、その必要のある細胞に、当該センダイウイルスベクターを用いて該３つのリプログラミング因子遺伝子を導入することを含む方法、およびその使用のための当該センダイウイルスベクターを含む組成物を提供する。
【００１３】
本発明において多能性幹細胞とは、動物の胚盤胞期の胚の内部細胞塊より作られる幹細胞またはそれと類似した表現型を有する細胞を言う。具体的には、本発明において誘導される多能性幹細胞は、ＥＳ様細胞の指標であるアルカリホスファターゼを発現する細胞である。また好ましくは、多能性幹細胞は、培養することにより、細胞質に比べ核の容量の比率が高い細胞からなる扁平なコロニーを形成する。培養は、適宜フィーダーと共に培養してもよい。またMEFなどの培養細胞が数週間で増殖が停止するのに対し、多能性幹細胞は長期間の継代が可能であり、例えば３日ごとの継代で１５回以上、好ましくは２０回以上、２５回以上、３０回以上、３５回以上、または４０回以上継代しても、増殖性が失なわれないことにより確認することができる。また多能性幹細胞は、好ましくは内在性のOCT3/4またはNanog、より好ましくはその両方を発現する。また多能性幹細胞は、好ましくはTERTを発現し、テロメラーゼ活性（テロメリックリピート配列を合成する活性）を示す。また多能性幹細胞は、好ましくは三胚葉（内胚葉、中胚葉、外胚葉）に分化する能力（例えばテラトーマ形成および／または胚様体形成において）を持つ。より好ましくは、多能性幹細胞は、胚盤胞に移植することにより生殖系列キメラを生成する。Germline transmissionが可能な多能性幹細胞は、germline-competentな多能性幹細胞と言う。これらの表現型の確認は、周知の方法により実施することができる（WO2007/69666; Ichisaka T et al., Nature 448(7151):313-7, 2007）。
【００１４】
また本発明において分化したとは、それ以前よりも分化段階が進んだことを言い、例えば多能性幹細胞よりも分化していることであってよく、複数の細胞系列に分化する能力をまだ持っている状態（例えば体性幹細胞など）、および最終分化した状態を含む。分化した細胞とは、多能性幹細胞から由来する（多能性幹細胞以外の）細胞である。分化した細胞は、例えば三胚葉（内胚葉、中胚葉、外胚葉）に分化する能力を持たないものであってよい。このような細胞は、初期化（reprogramming）されなければ三胚葉を形成する能力を持たない。また分化した細胞は、例えば自身が属する胚葉型以外の細胞を生成できない細胞であってよい。分化した細胞は体細胞であってよく、例えば生殖細胞以外の細胞であってよい。
【００１５】
本発明において初期化（リプログラミング；reprogramming）とは、ある細胞の分化状態を、それより未分化な状態にすることを言い、例えば分化した細胞が脱分化すること、例えば分化多能性を持たない細胞から持つ細胞、例えば多能性幹細胞を誘導することが含まれる。また本発明において脱分化とは、ある細胞を、より未熟な（例えば未分化な）状態にすることを言う。脱分化とは、ある細胞が分化して来た最初または途上の状態に戻すことであってよい。また脱分化とは、自身が属する胚葉型以外の細胞を生成できない細胞から、他の胚葉の細胞にも分化できる状態になることであってよい。脱分化には、例えば三胚葉分化能を持たない細胞が、三胚葉分化能を獲得することが含まれる。また脱分化には、多能性幹細胞の生成が含まれる。
【００１６】
また本発明において体細胞とは、例えば多能性幹細胞や生殖細胞以外の細胞である。体細胞には、例えば多細胞生物を構成する細胞のうち多能性幹細胞以外の細胞、およびその培養細胞が含まれる。体細胞には、例えば体性幹細胞および最終分化した細胞が含まれる。
【００１７】
本発明においてウイルスベクターは、当該ウイルスに由来するゲノム核酸を有し、該核酸に導入遺伝子を組み込むことにより、該遺伝子を発現させることができるベクターである。センダイウイルスベクターは、染色体非組み込み型ウイルスベクターであって、ベクターは細胞質中で発現されるので、導入遺伝子が宿主の染色体（核由来染色体）に組み込まれる危険性がない。従って安全性が高く、またリプログラミングの完了後にベクターを除去することが可能である。本発明においてセンダイウイルスベクターには、感染性ウイルス粒子の他、ウイルスコア、ウイルスゲノムとウイルス蛋白質との複合体、または非感染性ウイルス粒子などからなる複合体であって、細胞に導入することにより搭載する遺伝子を発現する能力を持つ複合体が含まれる。例えばセンダイウイルスにおいて、センダイウイルスゲノムとそれに結合するセンダイウイルス蛋白質（NP、P、およびL蛋白質）からなるリボヌクレオ蛋白質（ウイルスのコア部分）は、細胞に導入することにより細胞内で導入遺伝子を発現することができる（WO00/70055）。細胞への導入は、適宜トランスフェクション試薬等を用いて行えばよい。このようなリボヌクレオ蛋白質（RNP）も本発明においてセンダイウイルスベクターに含まれる。
【００１８】
センダイウイルスは、モノネガウイルス目(Mononegavirales)ウイルスの１つでパラミクソウイルス（Paramyxoviridae; Paramyxovirus, Morbillivirus, Rubulavirus, および Pneumovirus属等を含む）に属し、一本のマイナス鎖（ウイルス蛋白質をコードするセンス鎖に対するアンチセンス鎖）のRNAをゲノムとして含んでいる。マイナス鎖RNAはネガティブ鎖RNAとも呼ばれる。
【００１９】
モノネガウイルス目(Mononegavirales)には、パラミクソウイルス（パラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)ウイルス）の他に、ラブドウイルス（Rhabdoviridae; Vesiculovirus, Lyssavirus, および Ephemerovirus属等を含む）、フィロウイルス（Filoviridae）などの科に属するウイルスが含まれる（ウイルス  第57巻  第１号、pp29-36、2007; Annu. Rev. Genet. 32, 123-162, 1998; Fields virology fourth  edition, Philadelphia, Lippincott-Raven, 1305-1340,2001; Microbiol. Immunol. 43, 613-624, 1999; Field Virology, Third  edition pp1205-1241 1996）。センダイウイルス以外のパラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)ウイルスの例としては、ニューカッスル病ウイルス(Newcastle disease virus)、おたふくかぜウイルス(Mumps virus)、麻疹ウイルス(Measles virus)、RSウイルス(Respiratory syncytial virus)、牛疫ウイルス(rinderpest virus)、ジステンパーウイルス(distemper virus)、サルパラインフルエンザウイルス（SV5）、ヒトパラインフルエンザウイルス1,2,3型、オルトミクソウイルス科 (Orthomyxoviridae)のインフルエンザウイルス(Influenza virus)、ラブドウイルス科(Rhabdoviridae)の水疱性口内炎ウイルス(Vesicular stomatitis virus)、狂犬病ウイルス(Rabies virus)等が挙げられ、さらに具体的に例示すれば、例えば Sendai virus (SeV)、human parainfluenza virus-1 (HPIV-1)、human parainfluenza virus-3 (HPIV-3)、phocine distemper virus (PDV)、canine distemper virus (CDV)、dolphin molbillivirus (DMV)、peste-des-petits-ruminants virus (PDPR)、measles virus (MV)、rinderpest virus (RPV)、Hendra virus (Hendra)、Nipah virus (Nipah)、human parainfluenza virus-2 (HPIV-2)、simian parainfluenza virus 5 (SV5)、human parainfluenza virus-4a (HPIV-4a)、human parainfluenza virus-4b (HPIV-4b)、mumps virus (Mumps)、およびNewcastle disease virus (NDV) などが含まれる。より好ましくは、Sendai virus (SeV)、human parainfluenza virus-1 (HPIV-1)、human parainfluenza virus-3 (HPIV-3)、phocine distemper virus (PDV)、canine distemper virus (CDV)、dolphin molbillivirus (DMV)、peste-des-petits-ruminants virus (PDPR)、measles virus (MV)、rinderpest virus (RPV)、Hendra virus (Hendra)、および Nipah virus (Nipah) からなる群より選択されるウイルスが挙げられる。
【００２０】
例えばセンダイウイルスの各遺伝子の塩基配列のデータベースのアクセッション番号は、NP遺伝子については M29343、M30202, M30203, M30204, M51331, M55565, M69046, X17218、P遺伝子については M30202, M30203, M30204, M55565, M69046, X00583, X17007, X17008、M遺伝子については D11446, K02742, M30202, M30203, M30204, M69046, U31956, X00584, X53056、F遺伝子については D00152, D11446, D17334, D17335, M30202, M30203, M30204, M69046, X00152, X02131、HN遺伝子については D26475, M12397, M30202, M30203, M30204, M69046, X00586, X02808, X56131、L遺伝子については D00053, M30202, M30203, M30204, M69040, X00587, X58886を参照のこと。またその他のウイルスがコードするウイルス遺伝子を例示すれば、NP遺伝子（N遺伝子とも言う）については、CDV, AF014953; DMV, X75961; HPIV-1, D01070; HPIV-2, M55320; HPIV-3, D10025; Mapuera, X85128; Mumps, D86172; MV, K01711; NDV, AF064091; PDPR, X74443; PDV, X75717; RPV, X68311; SeV, X00087; SV5, M81442; および Tupaia, AF079780、P遺伝子については、CDV, X51869; DMV, Z47758; HPIV-l, M74081; HPIV-3, X04721; HPIV-4a, M55975; HPIV-4b, M55976; Mumps, D86173; MV, M89920; NDV, M20302; PDV, X75960; RPV, X68311; SeV, M30202; SV5, AF052755; および Tupaia, AF079780、C遺伝子については CDV, AF014953; DMV, Z47758; HPIV-1. M74081; HPIV-3, D00047; MV, ABO16162; RPV, X68311; SeV, AB005796; および Tupaia, AF079780、M遺伝子については CDV, M12669; DMV Z30087; HPIV-1, S38067; HPIV-2, M62734; HPIV-3, D00130; HPIV-4a, D10241; HPIV-4b, D10242; Mumps, D86171; MV, AB012948; NDV, AF089819; PDPR, Z47977; PDV, X75717; RPV, M34018; SeV, U31956; および SV5, M32248、F遺伝子については CDV, M21849; DMV, AJ224704; HPN-1. M22347; HPIV-2, M60182; HPIV-3. X05303, HPIV-4a, D49821; HPIV-4b, D49822; Mumps, D86169; MV, AB003178; NDV, AF048763; PDPR, Z37017; PDV, AJ224706; RPV, M21514; SeV, D17334; および SV5, AB021962、HN（HまたはG）遺伝子については CDV, AF112189; DMV, AJ224705; HPIV-1, U709498; HPIV-2. D000865; HPIV-3, AB012132; HPIV-4A, M34033; HPIV-4B, AB006954; Mumps, X99040; MV, K01711; NDV, AF204872; PDPR, Z81358; PDV, Z36979; RPV, AF132934; SeV, U06433; および SV-5, S76876 が例示できる。但し、各ウイルスは複数の株が知られており、株の違いにより上記に例示した以外の配列からなる遺伝子も存在する。これらのいずれかの遺伝子に由来するウイルス遺伝子を持つセンダイウイルスベクターは、本発明のベクターとして有用である。例えば本発明のセンダイウイルスベクターは、上記のいずれかのウイルス遺伝子のコード配列と、90％以上、好ましくは95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、または99％以上の同一性を持つ塩基配列を含む。また、本発明のセンダイウイルスベクターは、例えば上記のいずれかのウイルス遺伝子のコード配列がコードするアミノ酸配列と、90％以上、好ましくは95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、または99％以上の同一性を持つアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。また、本発明のセンダイウイルスベクターは、例えば上記のいずれかのウイルス遺伝子のコード配列がコードするアミノ酸配列において、10個以内、好ましくは9個以内、8個以内、7個以内、6個以内、5個以内、4個以内、3個以内、2個以内、または1個のアミノ酸が置換、挿入、欠失、および/または付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。
【００２１】
なお本明細書に記載した塩基配列およびアミノ酸配列などのデータベースアクセッション番号が参照された配列は、例えば本願の出願日および優先日における配列を参照するものであって、本願の出願日および優先日のいずれ時点における配列としても特定することができ、好ましくは本願の出願日における配列として特定される。各時点での配列はデータベースのリビジョンヒストリーを参照することにより特定することができる。
【００２２】
本発明において用いられるセンダイウイルスベクターは誘導体であってもよく、誘導体には、ウイルスによる遺伝子導入能を損なわないように、ウイルス遺伝子が改変されたウイルス、および化学修飾されたウイルス等が含まれる。
【００２３】
またセンダイウイルスは、天然株、野生株、変異株、ラボ継代株、および人為的に構築された株などに由来してもよい。例えばZ株が挙げられる（Medical Journal of Osaka University Vol.6, No.1, March 1955 p1-15）。つまり、当該ウイルスは、目的とするリプログラミングを誘導できる限り、天然から単離されたウイルスと同様の構造を持つウイルスベクターであっても、遺伝子組み換えにより人為的に改変したウイルスであってもよい。例えば、野生型ウイルスが持ついずれかの遺伝子に変異や欠損があるものであってよい。また、DI粒子（J.Virol. 68: 8413-8417, 1994）などの不完全ウイルスを用いることも可能である。例えば、ウイルスのエンベロープ蛋白質または外殻蛋白質をコードする少なくとも１つの遺伝子に変異または欠損を有するウイルスを好適に用いることができる。このようなウイルスベクターは、例えば感染細胞においてはゲノムを複製することはできるが、感染性ウイルス粒子を形成できないウイルスベクターである。このような伝搬能欠損型のウイルスベクターは、周囲に感染を拡大する懸念がないので安全性が高い。例えば、Fおよび/またはHNなどのエンベロープ蛋白質またはスパイク蛋白質をコードする少なくとも１つの遺伝子、あるいはそれらの組み合わせが含まれていないマイナス鎖RNAウイルスを用いることができる （WO00/70055 および WO00/70070; Li, H.-O. et al., J. Virol. 74(14) 6564-6569 (2000)）。ゲノム複製に必要な蛋白質（例えば N、P、およびL蛋白質）をゲノムRNAにコードしていれば、感染細胞においてゲノムを増幅することができる。欠損型ウイルスを製造するには、例えば、欠損している遺伝子産物またはそれを相補できる蛋白質をウイルス産生細胞において外来的に供給する（WO00/70055 および WO00/70070; Li, H.-O. et al., J. Virol. 74(14) 6564-6569 (2000)）。また、欠損するウイルス蛋白質を完全に相補することなく、非感染性のウイルス粒子（VLP）としてウイルスベクターを回収する方法も知られている（WO00/70070）。また、ウイルスベクターをRNP（例えば N、L、P蛋白質、およびゲノムRNAからなるRNP）として回収する場合は、エンベロープ蛋白質を相補することなくベクターを製造することができる。
【００２４】
また、変異型のウイルス蛋白質遺伝子を搭載するウイルスベクターを用いることも好ましい。本発明は、特にウイルス遺伝子に変異および／または欠失を有するセンダイウイルスベクターを用いた、リプログラミングにおける遺伝子導入方法、リプログラムされた細胞の製造方法、組成物、およびキットを提供する。例えば、エンベロープ蛋白質や外殻蛋白質において弱毒化変異や温度感受性変異を含む多数の変異が知られている。これらの変異蛋白質遺伝子を有するセンダイウイルスを本発明において好適に用いることができる。本発明においては、望ましくは細胞傷害性を減弱したベクターを用い得る。細胞傷害性は、例えば細胞からの乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）の放出を定量することにより測定することができる。例えば細胞傷害性が野生型に比べ有意に減弱化したベクターを用いることができる。細胞傷害性の減弱化の程度は、例えば、ヒト由来  HeLa細胞（ATCC CCL-2）またはサル由来  CV-1細胞（ATCC CCL 70）にMOI（感染価） 3で感染させて３日間培養した培養液中のLDH放出量が野生型に比べ有意に低下したもの、例えば20％以上、25％以上、30％以上、35％以上、40％以上、または50％以上低下したベクターを用いることができる。また細胞傷害性を低下させる変異には、温度感受性変異も含まれる。温度感受性変異とは、低温 (例えば30℃ないし32℃) に比べ、ウイルス宿主の通常の温度（例えば37℃ないし38℃）において有意に活性が低下する変異のことである。このような、温度感受性変異を持つ蛋白質は、許容温度（低温）下でウイルスを作製することができるので便利である。本発明において有用な温度感受性変異を持つウイルスベクターは、例えば培養細胞において32℃で感染させた場合に比べ、37℃で感染させた場合に、増殖速度または遺伝子発現レベルが、少なくとも1/2以下、好ましくは1/3以下、より好ましくは1/5以下、より好ましくは1/10以下、より好ましくは1/20以下である。
【００２５】
本発明において用いられるセンダイウイルスベクターは、リプログラミングを阻害せず、リプログラミング因子によるリプログラミングを誘導または誘導を補助できる限り野生型でもよく、また、好ましくは少なくとも１つ、より好ましくは少なくとも２、３、４、５、またはそれ以上のウイルス遺伝子に欠失または変異を有する。欠失と変異は、各遺伝子に対して任意に組み合わせ導入してよい。ここで変異とは、機能低下型の変異または温度感受性変異であってよく、少なくとも37℃において、野生型に比べウイルスの増殖速度または搭載するいずれかの遺伝子の発現レベルを好ましくは1/2以下、より好ましくは1/3以下、より好ましくは1/5以下、より好ましくは1/10以下、より好ましくは1/20以下に低下させる変異である。このような改変ウイルスベクターを用いることは、特に多能性幹細胞の誘導には有用であり得る。例えば本発明において好適に用いられるセンダイウイルスベクターは、少なくとも２つのウイルス遺伝子が、欠失または変異している。このようなウイルスには、少なくとも２つのウイルス遺伝子が欠失しているもの、少なくとも２つのウイルス遺伝子が変異しているもの、少なくとも１つのウイルス遺伝子が変異しており少なくとも１つのウイルス遺伝子が欠失しているものが含まれる。変異または欠失している少なくとも２つのウイルス遺伝子は、好ましくはエンベロープ構成蛋白質をコードする遺伝子である。例えばF遺伝子を欠失し、Mおよび／またはHN遺伝子をさらに欠失するか、Mおよび／またはHN遺伝子に変異（例えば温度感受性変異）をさらに有するベクターは、本発明において好適に用いられる。また、例えばF遺伝子を欠失し、MまたはHN遺伝子をさらに欠失し、残るMおよび／またはHN遺伝子に変異（例えば温度感受性変異）をさらに有するベクターも、本発明において好適に用いられる。本発明において用いられるベクターは、より好ましくは、少なくとも３つのウイルス遺伝子（好ましくはエンベロープ構成蛋白質をコードする少なくとも３つの遺伝子；F, HN, およびM）が、欠失または変異している。このようなウイルスベクターには、少なくとも３つの遺伝子が欠失しているもの、少なくとも３つの遺伝子が変異しているもの、少なくとも１つの遺伝子が変異しており少なくとも２つの遺伝子が欠失しているもの、少なくとも２つの遺伝子が変異しており少なくとも１つの遺伝子が欠失しているものが含まれる。より好ましい態様を挙げれば、例えばF遺伝子を欠失し、MおよびHN遺伝子をさらに欠失するか、MおよびHN遺伝子に変異（例えば温度感受性変異）をさらに有するベクターは、本発明において好適に用いられる。また例えばF遺伝子を欠失し、MあるいはHN遺伝子をさらに欠失し、残るMあるいはHN遺伝子に変異（例えば温度感受性変異）をさらに有するベクターは、本発明において好適に用いられる。このような変異型のウイルスは、公知の方法に従って作製することが可能である。
【００２６】
例えば、センダイウイルスのM遺伝子の温度感受性変異としては、M蛋白質における69位（G69）、116位（T116）、および183位（A183）からなる群より任意に選択される部位のアミノ酸置換が挙げられる（Inoue, M. et al., J.Virol. 2003, 77: 3238-3246）。センダイウイルスのM蛋白質に上記の３つの部位のいずれか、好ましくは任意の２部位の組み合わせ、さらに好ましくは３つの部位全てのアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異M蛋白質をコードするゲノムを有するウイルスは、本発明において好適に用いられる。
【００２７】
アミノ酸変異は、側鎖の化学的性質の異なる他のアミノ酸への置換が好ましく、例えばBLOSUM62マトリックス（Henikoff, S. and Henikoff, J. G. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919）の値が３以下、好ましくは２以下、より好ましくは１以下、より好ましくは０個のアミノ酸に置換する。具体的には、センダイウイルスM蛋白質のG69、T116、およびA183を、それぞれGlu (E)、Ala (A)、およびSer (S) へ置換することができる。また、麻疹ウイルス温度感受性株 P253-505（Morikawa, Y. et al., Kitasato Arch. Exp. Med. 1991: 64; 15-30）のM蛋白質の変異と相同な変異を利用することも可能である。変異の導入は、例えばオリゴヌクレオチド等を用いて、公知の変異導入方法に従って実施すればよい。
【００２８】
また、HN遺伝子の温度感受性変異としては、例えばセンダイウイルスのHN蛋白質の262位（A262）、264位（G264）、および461位（K461）からなる群より任意に選択される部位のアミノ酸置換が挙げられる（Inoue, M. et al., J.Virol. 2003, 77: 3238-3246）。３つの部位のいずれか１つ、好ましくは任意の２部位の組み合わせ、さらに好ましくは３つの部位全てのアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異HN蛋白質をコードするゲノムを有するウイルスは、本発明において好適に用いられる。上記と同様に、アミノ酸の置換は、側鎖の化学的性質の異なる他のアミノ酸への置換が好ましい。好ましい一例を挙げれば、センダイウイルス HN蛋白質のA262、G264、およびK461を、それぞれThr (T)、Arg (R)、およびGly (G) へ置換する。また、例えば、ムンプスウイルスの温度感受性ワクチン株 Urabe AM9を参考に、HN蛋白質の464及び468番目のアミノ酸に変異導入することもできる（Wright, K. E. et al., Virus Res. 2000: 67; 49-57）。
【００２９】
またセンダイウイルスは、P遺伝子および／またはL遺伝子に変異を有していてもよい。このような変異としては、具体的には、SeV P蛋白質の86番目のGlu（E86）の変異、SeV P蛋白質の511番目のLeu（L511）の他のアミノ酸への置換が挙げられる。上記と同様に、アミノ酸の置換は、側鎖の化学的性質の異なる他のアミノ酸への置換が好ましい。具体的には、86番目のアミノ酸のLysへの置換、511番目のアミノ酸のPheへの置換などが例示できる。またL蛋白質においては、SeV L蛋白質の1197番目のAsn（N1197）および／または1795番目のLys（K1795）の他のアミノ酸への置換が挙げられ、上記と同様に、アミノ酸の置換は、側鎖の化学的性質の異なる他のアミノ酸への置換が好ましい。具体的には、1197番目のアミノ酸のSerへの置換、1795番目のアミノ酸のGluへの置換などが例示できる。P遺伝子およびL遺伝子の変異は、持続感染性、２次粒子放出の抑制、または細胞傷害性の抑制の効果を顕著に高めることができる。さらに、エンベロープ蛋白質遺伝子の変異および／または欠損を組み合わせることで、これらの効果を劇的に上昇させることができる。またL遺伝子は、SeV L蛋白質の1214番目のTyr（Y1214）および／または1602番目のMet（M1602）の他のアミノ酸への置換が挙げられ、上記と同様に、アミノ酸の置換は、側鎖の化学的性質の異なる他のアミノ酸への置換が好ましい。具体的には、1214番目のアミノ酸のPheへの置換、1602番目のアミノ酸のLeuへの置換などが例示できる。以上に例示した変異は、任意に組み合わせることができる。
【００３０】
例えば、SeV M蛋白質の少なくとも69位のG、116位のT、及び183位のA、SeV HN蛋白質の少なくとも262位のA，264位のG，及び461位のK、SeV P蛋白質の少なくとも511位のL、SeV L蛋白質の少なくとも1197位のN及び1795位のKが、それぞれ他のアミノ酸に置換されており、かつF遺伝子を欠損または欠失するセンダイウイルスベクター、ならびに、細胞傷害性がこれらと同様またはそれ以下、および/または温度感受性がこれらと同様またはそれ以上のF遺伝子欠損または欠失センダイウイルスベクターは、本発明において核初期化因子（nuclear reprogramming factors）を発現させるために特に好適である。具体的な置換例を例示すれば、例えばM蛋白質についてはG69E，T116A，及びA183Sの置換を、HN蛋白質についてはA262T，G264R，及びK461Gの置換を、P蛋白質についてはL511Fの置換を、そしてL蛋白質についてはN1197S及びK1795Eの置換を挙げることができる。
【００３１】
また、L蛋白質の変異としては、SeV L蛋白質の942位（Y942）、1361位（L1361）、および1558位（L1558）から任意に選択される部位のアミノ酸の他のアミノ酸への置換も挙げられる。上記と同様に、アミノ酸の置換は、側鎖の化学的性質の異なる他のアミノ酸への置換が好ましい。具体的には、942番目のアミノ酸のHisへの置換、1361番目のアミノ酸のCysへの置換、1558番目のアミノ酸のIleへの置換などが例示できる。特に少なくとも942位または1558位が置換されたL蛋白質を好適に用いることができる。例えば1558位に加え、1361位も他のアミノ酸に置換された変異L蛋白質も好適である。また、942位に加え、1558位および/または1361位も他のアミノ酸に置換された変異L蛋白質も好適である。これらの変異により、L蛋白質の温度感受性を上昇させることができる。
またP蛋白質の変異としては、SeV P蛋白質の433位（D433）、434位（R434）、および437位（K437）から任意に選択される部位のアミノ酸の他のアミノ酸への置換が挙げられる。上記と同様に、アミノ酸の置換は、側鎖の化学的性質の異なる他のアミノ酸への置換が好ましい。具体的には、433番目のアミノ酸のAla (A) への置換、434番目のアミノ酸のAla (A) への置換、437番目のアミノ酸のAla (A) への置換などが例示できる。特にこれら３つの部位全てが置換されたP蛋白質を好適に用いることができる。これらの変異により、P蛋白質の温度感受性を上昇させることができる。
【００３２】
SeV P蛋白質の少なくとも433位のD、434位のR、および437位のKの３箇所が、他のアミノ酸に置換された変異P蛋白質、およびSeV L蛋白質の少なくとも1558位のLが置換された変異L蛋白質（好ましくは少なくとも1361位のLも他のアミノ酸に置換された変異L蛋白質）をコードする、F遺伝子を欠損または欠失するセンダイウイルスベクター、ならびに、細胞傷害性がこれと同様またはそれ以下、および/または温度感受性がこれと同様またはそれ以上のF遺伝子を欠損または欠失するセンダイウイルスベクターも、本発明において好適に用いられる。各ウイルス蛋白質は、上記の変異以外に他のアミノ酸（例えば10以内、5以内、4以内、3以内、2以内、または1アミノ酸）に変異を有していてもよい。上記に示した変異を有するベクターは高い温度感受性を示すので、リプログラミングが完了した後、細胞をやや高温（例えば37.5〜39℃、好ましくは38〜39℃、または38.5〜39℃）で培養することにより、ベクターを簡便に除去することができる。
より具体的に例を挙げれば、例えば
TS 7：L (Y942H/L1361C/L1558I)
TS 12：P(D433A/R434A/K437A)
TS 13：P(D433A/R434A/K437A), L(L1558I)
TS 14：P(D433A/R434A/K437A), L(L1361C)
TS 15：P(D433A/R434A/K437A), L(L1361C/L1558I)
などの変異を持つセンダイウイルスベクターを好適に用いることができる(国際公開番号 WO2010/008054)。
【００３３】
具体的なベクターを例示すれば、例えばM蛋白質にG69E, T116A, 及びA183Sの変異を、HN蛋白質にA262T, G264R, 及びK461Gの変異を、P蛋白質にL511F変異を、そしてL蛋白質にN1197S及びK1795E変異を持つF遺伝子欠失型センダイウイルスベクター（例えばZ strain）であってよく、このベクターにさらにTS 7、TS 12、TS 13、TS 14、またはTS 15の変異を導入したベクターはより好ましい。具体的には、SeV18+/TSΔF（WO2010/008054、WO2003/025570）やSeV(PM)/TSΔF、および、これらにさらにTS 7、TS 12、TS 13、TS 14、またはTS 15の変異を導入したベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
なお「TSΔF」は、M蛋白質にG69E,T116A,及びA183Sの変異を、HN蛋白質にA262T,G264R,及びK461Gの変異を、P蛋白質にL511F変異を、そしてL蛋白質にN1197S及びK1795E変異を持ち、F遺伝子を欠失することを言う。特にSeV(PM)KOS/TSΔF、SeV(PM)KOS/TS7ΔF、SeV(PM)KOS/TS12ΔF、SeV(PM)OSK/TSΔFなどが好ましいベクターとして挙げられるが、これらに限定されない。またこのとき、SeV(HNL)c-rMYC/TS12ΔF、SeV(HNL)c-rMYC/TS13ΔF、またはSeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF等を用いてMYC遺伝子を導入することができる。また、さらにKLF遺伝子を発現するセンダイウイルスベクターを導入してもよい。特に、OCT遺伝子、SOX遺伝子、およびKLF遺伝子を順に含むセンダイウイルスベクターと組み合わせることで、好適な結果を得ることができる。KLF遺伝子は、センダイウイルスベクターのN遺伝子の上流（ゲノム上のN遺伝子の3'側）に挿入することができる。ベクターとしては、本明細書に記載した所望のF遺伝子欠失型および/または変異型ベクターを使用することができ、具体的にはSeV18+KLF4/TSΔFが挙げられるが、これに制限されない。
すなわち本発明は、
〔1〕 センダイウイルスのP遺伝子の直後に、順にOCT遺伝子、SOX遺伝子、およびKLF遺伝子が挿入されたセンダイウイルスベクターを含む、多能性幹細胞の誘導における遺伝子導入に使用するための組成物であって、KLF遺伝子が挿入された別のセンダイウイルスベクターと組み合わせて用いられる組成物、
〔2〕 MYC遺伝子またはGlis1遺伝子が挿入された別のセンダイウイルスベクターと組み合わせて用いられる、〔1〕に記載の組成物、
〔3〕 該MYC遺伝子またはGlis1遺伝子がセンダイウイルスのL遺伝子の直前に挿入されている、〔2〕に記載の組成物、
〔4〕 多能性幹細胞の誘導における遺伝子導入細胞の製造方法であって、センダイウイルスのP遺伝子の直後に、順にOCT遺伝子、SOX遺伝子、およびKLF遺伝子が挿入されたセンダイウイルスベクター、およびKLF遺伝子が挿入された別のセンダイウイルスベクターを細胞に導入することを含む方法、
〔5〕 MYC遺伝子またはGlis1遺伝子が挿入された別のセンダイウイルスベクターを該細胞に導入することをさらに含む、〔4〕に記載の方法、
〔6〕 該MYC遺伝子またはGlis1遺伝子がセンダイウイルスのL遺伝子の直前に挿入されている、〔5〕に記載の方法、
〔7〕 センダイウイルスのP遺伝子の直後に、順にOCT遺伝子、SOX遺伝子、およびKLF遺伝子、が挿入されたセンダイウイルスベクター、およびKLF遺伝子が挿入された別のセンダイウイルスベクターを含む、多能性幹細胞の誘導における遺伝子導入に使用するためのキット、
〔8〕 MYC遺伝子またはGlis1遺伝子が挿入された別のセンダイウイルスベクターを含む、〔7〕に記載のキット、
〔9〕 該MYC遺伝子またはGlis1遺伝子がセンダイウイルスのL遺伝子の直前に挿入されている、〔8〕に記載のキット、も提供する。
【００３４】
ベクターの細胞傷害性は、例えば細胞からの乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）の放出を定量することにより測定することができる。具体的には、例えばHeLa（ATCC CCL-2）またはサルCV-1（ATCC CCL 70）にMOI 3で感染させて３日間培養した培養液中のLDH放出量を測定する。LDH放出量が少ないほど細胞傷害性は低い。また温度感受性は、ウイルス宿主の通常の温度（例えば37℃ないし38℃）におけるウイルスの増殖速度または搭載遺伝子の発現レベルを測定することにより決定することができる。変異を有さないものに比べ、ウイルスの増殖速度および/または搭載遺伝子の発現レベルが低下するほど、温度感受性は高いと判断される。
【００３５】
またエンベロープウイルスを用いる場合は、ウイルスが本来持つエンベロープ蛋白質とは異なる蛋白質をエンベロープに含むウイルスを使用してもよい。例えば、ウイルス製造の際に、所望の外来性エンベロープ蛋白質をウイルス産生細胞で発現させることにより、これを含むウイルスを製造することができる。このような蛋白質に特に制限はなく、哺乳動物細胞への感染能を付与する所望の接着因子、リガンド、受容体等の蛋白質が用いられる。具体的には、例えば水疱性口内炎ウイルス（vesicular stomatitis virus; VSV）のG蛋白質（VSV-G）を挙げることができる。VSV-G蛋白質は、任意のVSV株に由来するものであってよく、例えば Indiana血清型株（J. Virology 39: 519-528 (1981)）由来のVSV-G蛋白を用いることができるが、これに限定されない。本発明において用いられるセンダイウイルスベクターは、他のウイルス由来のエンベロープ蛋白質を任意に組み合わせて含むことができる。
【００３６】
核初期化因子（nuclear reprogramming factors）を持つ組換えセンダイウイルスの再構成は公知の方法を利用して行えばよい。具体的な手順として、典型的には、（ａ）センダイウイルスゲノムRNA（マイナス鎖）またはその相補鎖（プラス鎖）をコードするcDNAを、ウイルス粒子形成に必要なウイルス蛋白質（N、P、およびL）を発現する細胞で転写させる工程、（ｂ）生成したウイルスを含む培養上清を回収する工程、により製造することができる。粒子形成に必要なウイルス蛋白質は、転写させたウイルスゲノムRNAから発現されてもよいし、ゲノムRNA以外からトランスに供給されてもよい。例えば、N、P、およびL蛋白質をコードする発現プラスミドを細胞に導入して供給することができる。ゲノムRNAにおいて粒子形成に必要なウイルス遺伝子が欠損している場合は、そのウイルス遺伝子をウイルス産生細胞で別途発現させ、粒子形成を相補することもできる。ウイルス蛋白質やRNAゲノムを細胞内で発現させるためには、該蛋白質やゲノムRNAをコードするDNAを宿主細胞で機能する適当なプロモーターの下流に連結したベクターを宿主細胞に導入する。転写されたゲノムRNAは、ウイルス蛋白質の存在下で複製され、感染性ウイルス粒子が形成される。エンベロープ蛋白質などの遺伝子を欠損する欠損型ウイルスを製造する場合は、欠損する蛋白質またはその機能を相補できる他のウイルス蛋白質などをウイルス産生細胞において発現させることもできる。
【００３７】
例えば、センダイウイルスの製造は、以下の公知の方法を利用して実施することができる（WO97/16539; WO97/16538; WO00/70055; WO00/70070; WO01/18223; WO03/025570； WO2005/071092; WO2006/137517; WO2007/083644; WO2008/007581; Hasan, M. K. et al., J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997、Kato, A. et al., 1997, EMBO J. 16: 578-587 及び Yu, D. et al., 1997, Genes Cells 2: 457-466; Durbin, A. P. et al., 1997, Virology 235: 323-332; Whelan, S. P. et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8388-8392; Schnell. M. J. et al., 1994, EMBO J. 13: 4195-4203; Radecke, F. et al., 1995, EMBO J. 14: 5773-5784; Lawson, N. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4477-4481; Garcin, D. et al., 1995, EMBO J. 14: 6087-6094; Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579; Baron, M. D. and Barrett, T., 1997, J. Virol. 71: 1265-1271; Bridgen, A. and Elliott, R. M., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 15400-15404; Tokusumi, T. et al. Virus Res. 2002: 86; 33-38、Li, H.-O. et al., J. Virol. 2000: 74; 6564-6569）。またウイルスの増殖方法および組み換えウイルスの製造方法については、ウイルス学実験学 各論、改訂二版（国立予防衛生研究所学友会編、丸善、1982）も参照のこと。
【００３８】
上記のセンダイウイルスには、KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子が、この順番、あるいはOCT遺伝子、SOX遺伝子、およびKLF遺伝子の順番でセンダイウイルスに組み込まれる。これらの外来遺伝子は、一般に、いずれかのウイルス遺伝子（NP, P, M, F, HN, または L）の直前（ゲノムの3'側）または直後（ゲノムの5'側）に挿入することができる。好ましくはKLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子は、この順番、あるいはOCT遺伝子、SOX遺伝子、およびKLF遺伝子の順番でセンダイウイルスのP遺伝子の直後、すなわちP遺伝子のすぐ下流（マイナス鎖RNAゲノムのすぐ5'側）に組み込まれる。例えば前者の順番の場合、P遺伝子とKLF遺伝子の間（後者に場合はP遺伝子とOCT遺伝子の間）には、転写開始シグナル（S配列）、転写終結シグナル（E配列）、およびスペーサー配列（介在配列 (I配列) など）は含まれうるものの、他の転写単位（例えば蛋白質をコードする遺伝子をコードする転写単位）は含まれない。センダイウイルスはマイナス鎖RNAをゲノムに持つことから、通常とは逆で、ゲノムの3'側が上流にあたり、5'側が下流にあたる。センダイウイルスのゲノム上でKLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子がこの順番で並ぶとき、KLF遺伝子が3つの遺伝子の中では最も3'側に配置され、SOX遺伝子が最も5'側に配置される。なおマイナス鎖RNAは遺伝子をアンチセンスにコードすることから、ゲノム上のKLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子は、蛋白質のコード鎖（センス鎖）ではなくアンチセンス鎖としてコードされている。センダイウイルスゲノムは、細胞に入るとこのゲノムを鋳型にしてアンチゲノムRNAが生成する。アンチゲノムはプラス鎖であって、KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子は、蛋白質をコードする鎖（センス鎖）が搭載されている。アンチゲノムRNAにおいては、KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子の配置は、KLF遺伝子が3つの遺伝子の中では最も5'側に配置され、SOX遺伝子が最も3'側に配置されている。
【００３９】
3つの遺伝子は、好ましくは互いに隣接している（すなわち３つの遺伝子の間に他の遺伝子が入ることはない）。それぞれの遺伝子は、適宜センダイウイルスS（Start）配列とE（End）配列で挟まれていてよい。S配列は転写を開始させるシグナル配列であり、E配列で転写が終結する。S配列とE配列で挟まれた領域は、１つの転写単位となる。ある遺伝子のE配列と次の遺伝子のS配列の間は、適宜スペーサーとなる配列（介在配列；intervening sequence）を挿入することができる。例えば S - KLF遺伝子 -E-I-S- OCT遺伝子 -E-I-S- SOX遺伝子 -E（S, I, およびE はそれぞれS配列、I (intervening) 配列、およびE配列を表す）の構成をもつ核酸をゲノムに含むセンダイウイルスベクターを好適に用いることができる。センダイウイルスゲノム上のP遺伝子とKLF遺伝子は、P遺伝子 -E-I-S- KLF遺伝子 - ... のように結合される。
OCT遺伝子、SOX遺伝子、およびKLF遺伝子の順番で配置される場合は、例えば S - OCT遺伝子 -E-I-S- SOX遺伝子 -E-I-S- KLF遺伝子 -E（S, I, およびE はそれぞれS配列、I (intervening) 配列、およびE配列を表す）の構成をもつ核酸をゲノムに含むセンダイウイルスベクターを好適に用いることができる。センダイウイルスゲノム上のP遺伝子とSOX遺伝子は、P遺伝子 -E-I-S- SOX遺伝子 - ... のように結合される。
【００４０】
S配列としては、センダイウイルスの所望のS配列を用いることができるが、例えば 3'-UCCCWVUUWC-5'（W= AまたはU; V= A, C, またはG）（配列番号：1）の配列を好適に用いることができる。特に 3'-UCCCAGUUUC-5'（配列番号：2）、3'-UCCCACUUAC-5'（配列番号：3）、および 3'-UCCCACUUUC-5'（配列番号：4）が好ましい。これらの配列は、プラス鎖をコードするDNA配列で表すとそれぞれ 5'-AGGGTCAAAG-3'（配列番号：5）、5'-AGGGTGAATG-3'（配列番号：6）、および 5'-AGGGTGAAAG-3'（配列番号：7）である。センダイウイルスベクターのE配列としては、例えば 3'-AUUCUUUUU-5'（配列番号：8）（プラス鎖をコードするDNAでは 5'-TAAGAAAAA-3'（配列番号：9））が好ましい。I配列は、例えば任意の3塩基であってよく、具体的には 3'-GAA-5'（プラス鎖DNAでは 5'-CTT-3'）を用いればよい。
【００４１】
野生型センダイウイルスのゲノムは、3'の短いリーダー領域に続き、ヌクレオキャプシド（NP）遺伝子、ホスホ（P）遺伝子、マトリックス（M）遺伝子、フュージョン（F）遺伝子、ヘマグルチニン-ノイラミニダーゼ（HN）遺伝子、およびラージ（L）遺伝子、及び短い5'トレイラー領域をこの順序で含んでいる。センダイウイルスベクターにおいても、この順番でウイルス遺伝子を配置することができる。野生型ウイルスに相当する組み換えベクターや、様々な変異型ベクターの作製が既に知られている。さらには、そのエンベロープを除いたRNPのみでも遺伝子導入が可能であることが示されている（WO00/70055）。よって、センダイウイルスRNPをウイルスベクターとして用いてリプログラミングを行うことができる。
【００４２】
センダイウイルスはNP遺伝子、P遺伝子、およびL遺伝子があればベクターとして十分機能でき、細胞中でゲノムを複製し、搭載されている外来遺伝子（KLF、OCT、およびSOX）を発現させることができる。ウイルス遺伝子としてNP遺伝子、P遺伝子、およびL遺伝子の３遺伝子を含むセンダイウイルスであれば、KLF、OCT、およびSOX遺伝子のセットは、例えばP遺伝子とL遺伝子の間に挿入される。M遺伝子を含むベクターであれば、KLF、OCT、およびSOX遺伝子のセットは、例えばP遺伝子とM遺伝子の間に挿入される（WO97/16539）。M遺伝子欠失型のセンダイウイルスベクターでF遺伝子を含む場合は、KLF、OCT、およびSOX遺伝子のセットはP遺伝子とF遺伝子の間に挿入される（WO00/70070）。MおよびF遺伝子欠失型であればP遺伝子とHN遺伝子の間に、F、M、HN遺伝子欠失型であればP遺伝子とL遺伝子の間に挿入される（WO2003/025570、WO2006/137517）。ウイルス遺伝子を欠失するベクターは安全性が高いので好ましい。本発明においては、少なくともF遺伝子を欠失したベクターを好適に用いることができる。
【００４３】
KLF、OCTおよびSOX遺伝子を含む上記センダイウイルスはそれだけを用いて適宜リプログラミングにおける遺伝子導入に使用することができるが、MYC遺伝子またはGlis1遺伝子をさらに導入するリプログラミングにおいて使用することがより好ましい。MYC遺伝子またはGlis1遺伝子は上記のKLF、OCTおよびSOX遺伝子を含むセンダイウイルスベクターの中に挿入することもできるが、別のベクターに挿入して使用してもよい。MYC遺伝子またはGlis1遺伝子を別のベクターに挿入する場合、ベクターはプラスミド、ウイルスベクター、非ウイルスベクター（例えばリポソーム）など所望のベクターを使用することができる。ウイルスベクターとしてはアデノウイルスベクターやレトロウイルスベクターなどが挙げられるがそれらに限定されない。より好ましくは、MYC遺伝子またはGlis1遺伝子は、センダイウイルスベクターに挿入される。本発明においては、KLF、OCTおよびSOX遺伝子を含む上記センダイウイルスは、MYC遺伝子またはGlis1遺伝子が挿入された別のセンダイウイルスベクターと組み合わせて用いることがより好ましい。MYC遺伝子またはGlis1遺伝子を挿入する元となるセンダイウイルスベクターは、上記に記載したセンダイウイルスベクターを使用することができる。
【００４４】
MYC遺伝子またはGlis1遺伝子をセンダイウイルスゲノムに挿入する場合、遺伝子のベクター中の挿入位置は所望の部位を選択することができる。例えばMYC遺伝子またはGlis1遺伝子は、マイナス鎖RNAゲノムの後方（5'側）、例えばマイナス鎖RNAウイルスのゲノムの中央よりも5'端側（順番が真中の遺伝子よりも5'端側）、すなわちゲノム上に配置される複数の蛋白質コード配列において、3'側から数えるよりも5'側から数えた方が早い位置に配置することが好ましい（実施例参照）。MYC遺伝子またはGlis1遺伝子は、例えば最も5'側（すなわち5'側から1番目）、あるいは5'側から2または3番目に配置することができる。MYC遺伝子またはGlis1遺伝子は、例えばゲノムの5'側から2番目、具体的には、ゲノムの最も5'側にL遺伝子があり、その次にHN遺伝子がある場合に、HN遺伝子とL遺伝子の間（HN-L間）に配置してもよい。特にMYC遺伝子またはGlis1遺伝子をセンダイウイルスゲノム上のL遺伝子のすぐ上流（3'側、例えばHN遺伝子とL遺伝子の間）、またはすぐ下流（5'側、例えばL遺伝子と5'トレイラー配列の間）に挿入することが好ましい。センダイウイルスベクターとしては、例えばM蛋白質にG69E, T116A, 及びA183Sの変異を、HN蛋白質にA262T, G264R, 及びK461Gの変異を、P蛋白質にL511F変異を、そしてL蛋白質にN1197S及びK1795E変異を持つF遺伝子欠失型センダイウイルスベクター（例えばZ strain）であってよく、このベクターにさらにTS 7、TS 12、TS 13、TS 14、またはTS 15の変異を導入したベクターはより好ましい。具体的には、SeV(HNL)c-rMYC/TSΔF、SeV(L)c-rMYC/TSΔF、SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF（WO2010/008054; Fusaki et al., Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. Vol. 85, p348-362(2009)）などが挙げられ、特に好ましくはSeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔFが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
MYC遺伝子は、野生型c-MYCのみならず、T58A変異体や、N-MYC、L-MYCでも多能性幹細胞を誘導できる（WO2007/69666; Blelloch R. et al., Cell Stem Cell, 1: 245-247, 2007）。このように、ファミリーの遺伝子を様々に選択して使用することが可能であるので、MYCファミリー遺伝子を適宜選択して、リプログラミングを誘導することができる。またMYC遺伝子は、コードされるアミノ酸配列を変えないように適宜サイレント変異を導入し、連続したAまたはTの塩基配列を置換することができる。
【００４６】
例えば野生型c-MYCはセンダイウイルスベクターなどのRNAウイルスベクターからの発現量が少ないことが判明した。しかし野生型c-MYCに、a378g、t1122c、t1125c、a1191g、および a1194g から選択される１つ以上、好ましくは２以上、３以上、４以上、または５つ全ての変異を導入することにより、ベクターから遺伝子を安定して高発現させることが可能となる。本発明においては、例えばWO2010/008054の配列番号：45に示された改変型c-MYC遺伝子を好適に用いることができる。
【００４７】
上記のKLF、OCTおよびSOX遺伝子を含むセンダイウイルスベクターおよび/またはMYC遺伝子を含むセンダイウイルスベクターには、適宜、細胞のリプログラミングのための遺伝子などをさらに搭載させることができる。また、それらの遺伝子を搭載した他のベクターを、上記センダイウイルスベクターと組み合わせてもよい。搭載する遺伝子は、分化した細胞からの多能性幹細胞などの種々の幹細胞の誘導等に関与する所望の遺伝子であってよい。例えばリプログラミングの効率を上昇させる遺伝子を搭載させることができる。
本発明は、本発明のセンダイウイルスベクターの、細胞のリプログラミングにおいて遺伝子を導入するための使用、そして、細胞においてリプログラミング因子を発現させ、該細胞のリプログラミングを誘導するための使用を提供する。また本発明は、本発明のセンダイウイルスベクターを含む、細胞のリプログラミングにおいて遺伝子を導入するための剤（導入剤、遺伝子導入剤）、細胞においてリプログラミング因子を発現させるための剤を提供する。また本発明は、本発明のセンダイウイルスベクターを含む、細胞においてリプログラミング因子を発現させ、該細胞のリプログラミングを誘導するための剤に関する。また本発明のベクターは、細胞の核初期化を行う際に、所望の遺伝子を該細胞においてさらに発現させるためにも有用である。本発明のセンダイウイルスベクターは、本発明に従い、細胞のリプログラミングのために利用することができる。リプログラミングの誘導とは、具体的には多能性幹細胞の誘導であってよい。本発明は、医学的用途および非医学的用途のために用いることができ、メディカルおよびノンメディカルの態様において有用である。例えば本発明は、治療、手術、および/または診断、あるいは非治療、非手術、および/または非診断の目的に用いることができる。
【００４８】
本発明において核初期化因子（a nuclear reprogramming factor）とは、単独で、または複数の因子と共同して、ある細胞の分化状態をより未分化な状態に誘導するために用いられる遺伝子またはその産物を言い、例えば分化した細胞の脱分化を誘導するために用いられる遺伝子またはその産物が含まれる。本発明において核初期化因子（a nuclear reprogramming factor）には、核の初期化（reprogramming）に必須の因子、および核初期化の効率を上昇させる補助的な因子（補助因子）が含まれる。本発明においては、核初期化（nuclear reprogramming）に用いるための所望の遺伝子をベクターに搭載してよい。例えば多能性幹細胞の製造に用いるための遺伝子をさらに搭載することができる。多能性幹細胞を誘導するための核初期化因子（nuclear reprogramming factors）としては、具体的には、例えばＥＳ細胞や初期胚などで発現するが、分化した多くの体細胞では発現しないか、発現が低下する遺伝子（ＥＳ細胞特異的遺伝子など）を用いることができる。このような遺伝子は、好ましくは転写因子や核蛋白質等をコードする遺伝子である。核初期化遺伝子（nuclear reprogramming factors）を同定する方法は既に知られており（WO2005/80598）、実際、この方法を用いて同定された遺伝子は、多能性幹細胞へのreprogrammingに有用であることが示されている（WO2007/69666）。
【００４９】
そのような遺伝子の例を挙げれば、DPPA5 (developmental pluripotency associated 5, ES cell specific gene 1 (ESG1); accession numbers NM_001025290, NM_025274, XM_236761）、F-box protein 15 (Fbx15, NM_152676, NM_015798)、Nanog（NM_024865, AB093574）、ECAT1（ES cell associated transcript 1； AB211062, AB211060）、ERAS（ES cell expressed Ras; NM_181532, NM_181548)、DNMT3L（DNA (cytosine-5-)-methyltransferase 3-like; NM_013369, NM_019448)、ECAT8 （AB211063, AB211061）、GDF3（growth differentiation factor 3; NM_020634, NM_008108）、SOX15（SRY (sex determining region Y)-box 15; NM_006942, NM_009235）、DPPA4（developmental pluripotency associated 4; NM_018189, NM_028610）、DPPA2（NM_138815, NM_028615）、FTHL17（ferritin, heavy polypeptide-like 17; NM_031894, NM_031261）、SALL4（sal-like 4; NM_020436, NM_175303）、OCT3/4（POU5F1とも呼ばれる; NM_002701, NM_203289, NM_013633, NM_001009178）、SOX2（NM_003106, NM_011443, XM_574919）、Rex-1（ZFP42 (zinc finger protein 42 homolog); NM_174900, NM_009556）、Utf1（undifferentiated embryonic cell transcription factor 1; NM_003577, NM_009482）、TCL1A（T-cell leukemia/lymphoma 1A; NM_021966, NM_009337）、DPPA3（Stellaとも呼ばれる, NM_199286, NM_139218, XM_216263)、KLF4（Kruppel-like factor 4; NM_004235, NM_010637）、cateninβ1（cadherin-associated protein beta 1; NM_001904, NM_007614; S33Y変異体を含む）、c-MYC（NM_002467, NM_010849; T58A変異体を含む）、STAT3（signal transducer and activator of transcription 3; NM_139276, NM_213659）、GRB2（growth factor receptor-bound protein 2; NM_002086, NM_008163）、Glis1遺伝子（Maekawa et al., Nature, 474: 225-229, 2011; NM_147193, NM_147221）ならびにこれらの遺伝子が属するファミリーの他のメンバーの遺伝子などが挙げられる。これらの遺伝子は、細胞に導入することにより多能性幹細胞を誘導する（WO2007/69666）。従って、KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をこの順番で、あるいはOCT遺伝子、SOX遺伝子、およびKLF遺伝子の順番で含む本発明のセンダイウイルスベクターに、上記の遺伝子のうち、まだベクターに搭載されていない遺伝子をさらに搭載させたり、あるいはそれらの遺伝子を搭載する他のベクターを、KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をこの順番で、あるいはOCT遺伝子、SOX遺伝子、およびKLF遺伝子の順番で含む上記本発明のセンダイウイルスベクターと組み合わせて用いることができる。これらの遺伝子は、１つずつ別のベクターに組み込んでもよいし、複数の遺伝子をまとめて１つのベクターに組み込むこともできる。また、それぞれの遺伝子を一種類のベクターに組み込んでもよく、あるいは異なる種類のベクター（染色体組み込み型ウイルスベクターおよび／または非ウイルスベクターを含む）を、KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をこの順に、あるいはOCT遺伝子、SOX遺伝子、およびKLF遺伝子の順に含む上記本発明のセンダイウイルスベクターと組み合わせて用いてもよい。また個々のウイルスベクターは、別々にパッケージされており使用時に組み合わせて用いることができる。あるいは搭載する遺伝子が異なる複数のウイルスベクターを、予めまとめてキットとしたり、混合して組成物としてもよい。また、これらの遺伝子の任意の組み合わせ（または全て）を含む、１つまたはそれ以上の非組み込み型ウイルスベクター、および該ベクターをさらに含むキットまたは組成物も、細胞のリプログラミング、特に多能性幹細胞の製造において好適に用いることができる。組成物の場合は、ベクターは適宜、薬学的に許容される担体および/または��体と組み合わせてよく、例えば、滅菌水、ｐＨ緩衝液、生理的食塩水、培養液等の中に混合されていてよい。尚、これらの系は、核初期化遺伝子の一部または大部分をその発現産物であるタンパク質に置き換えることもできる。すなわち本発明の組成物およびキットは、少なくともKLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をこの順番で、あるいはOCT遺伝子、SOX遺伝子、およびKLF遺伝子の順番で含む上記センダイウイルスベクターを含む限り、リプログラム因子を発現する他のベクター（染色体組込み型ウイルスベクターおよび／または非ウイルスベクター）および／またはリプログラムを誘導する化合物、蛋白質等を含んでもよい。リプログラミングに必要な因子は、その全てをセンダイウイルスベクターから発現させてもよく、あるいは一部のみをセンダイウイルスベクターから発現させ、その他を他のベクターおよび／または化合物（例えば蛋白質や低分子化合物）により供給してもよい。また、本発明のリプログラムされた細胞の製造方法は、全ての遺伝子導入をセンダイウイルスベクターを用いて行う方法に限定されない。すなわち本発明の方法は、少なくともKLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をこの順番で、あるいはOCT遺伝子、SOX遺伝子、およびKLF遺伝子の順番で含む上記センダイウイルスベクターを用いればよく、リプログラム因子を発現する他のベクター（染色体組込み型ウイルスベクターおよび／または非ウイルスベクター）および／またはリプログラムを誘導する化合物等を併用することが含まれる。好ましくは、MYC遺伝子またはGlis1遺伝子を含む上記センダイウイルスベクターと組み合わせて用いられる。
また、OCT遺伝子、SOX遺伝子、およびKLF遺伝子の順番で含むセンダイウイルスベクターを用いる場合は、KLF遺伝子を含む別のセンダイウイルスベクターを組み合わせることが有用である。
【００５０】
本発明は、KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をこの順番で、あるいはOCT遺伝子、SOX遺伝子、およびKLF遺伝子の順番で含む上記センダイウイルスベクターを発現ベクターとして含む、細胞のリプログラミングに用いるための組成物に関する。また本発明は、該センダイウイルスベクターの、分化した細胞のリプログラミングに用いるための使用に関する。例えば本発明は、該センダイウイルスベクターの使用であって、細胞のリプログラミングにおいてその必要がある細胞にリプログラミング因子遺伝子（KLF、OCT、およびSOX）を導入するための使用を提供する。また本発明は、細胞のリプログラミングにおいて該遺伝子を導入するための方法であって、該ウイルスベクターを用いて、その必要がある細胞に該遺伝子を導入する方法に関する。また本発明は、該ウイルスベクターを含む、細胞のリプログラミングにおける該遺伝子の導入に用いるための組成物、細胞のリプログラミングにおける該遺伝子の導入に用いるための剤（細胞のリプログラミングにおける該遺伝子の導入に用いるための導入剤、細胞のリプログラミングにおける該遺伝子の導入剤）にも関する。また本発明は、該ウイルスベクターの使用であって、細胞のリプログラミングにおいてその必要がある細胞に該遺伝子を導入するための薬剤の製造における使用にも関する。また本発明は、該ウイルスベクターを含む、細胞のリプログラミングに用いるための該遺伝子の導入剤（該遺伝子発現剤、または発現ベクター）を提供する。また本発明は、該ウイルスベクターを含む、該リプログラミング遺伝子の導入剤（該遺伝子発現剤、または発現ベクター）を提供する。また本発明は、該ウイルスベクターを含む、核初期化因子（nuclear reprogramming factors）であるKLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子、あるいは順にOCT遺伝子、SOX遺伝子、およびKLF遺伝子、の発現剤（該核初期化遺伝子 (nuclear reprogramming genes) 導入剤、該核初期化遺伝子 (nuclear reprogramming genes) 発現ベクター）を提供する。また本発明は、該核初期化因子（nuclear reprogramming factors）をコードする該ウイルスベクターを含む、多能性幹細胞誘導剤および多能性幹細胞誘導補助剤を提供する。また本発明は、該ウイルスベクターの、分化した細胞のリプログラミングのための使用を提供する。また本発明は、該ウイルスベクターの、分化した細胞のリプログラミングのための薬剤、試薬および／または医薬の製造における使用を提供する。また本発明は、該ウイルスベクターの、分化した細胞への該核初期化因子（nuclear reprogramming factors）（KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子）導入剤の製造における使用にも関する。
【００５１】
ここでリプログラミングは、例えば分化した細胞からの多能性幹細胞の誘導であってよい。ベクターは、リプログラミングのための因子をコードする遺伝子（KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子）を組み込んで使用される。リプログラミング因子をコードする遺伝子としては、例えば上記、あるいは以下に例示した因子のいずれかをコードする遺伝子が挙げられる。
【００５２】
なお、導入する因子（KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子など）は、リプログラムしたい細胞の由来に合わせて適宜選択すればよく、ヒト由来であっても、その他の哺乳動物由来、例えばマウス、ラット、ウサギ、ブタ、サル等の霊長類由来であってもよい。また、遺伝子および蛋白質の配列は必ずしも野生型の配列でなくてもよく、リプログラミングを誘導できる限り、変異を有していてもよい。変異型遺伝子を用いて多能性幹細胞を作製した例は既に知られている（WO2007/69666）。例えば、１または少数（例えば数個、３個以内、５個以内、１０個以内、１５個以内、２０個以内、２５個以内）のアミノ酸が付加、欠失、置換、および／または挿入されたアミノ酸配列をコードする遺伝子であって、リプログラミングを誘導できる遺伝子は、本発明において使用することができる。また生物学的活性（リプログラミングの誘導能）を維持している限り、例えばＮ末端および／またはＣ末端の１〜数残基（例えば２、３、４、５、６、１０、１５または２０残基）のアミノ酸が欠失または付加されたポリペプチド、及び１〜数残基（例えば２、３、４、５、６、１０、１５または２０残基）のアミノ酸が置換されたポリペプチドなども使用できる。使用し得るバリアントとしては、例えば天然の蛋白質の断片、アナログ、派生体、及び他のポリペプチドとの融合蛋白質（例えば異種シグナルペプチドまたは抗体断片を付加したもの等）が含まれる。具体的には、野生型のアミノ酸配列の１またはそれ以上のアミノ酸を置換、欠失、および／または付加した配列を含み、野生型蛋白質と同等の生物学的活性（例えばリプログラミングを誘導する活性）を有するポリペプチドが含まれる。野生型蛋白質の断片を用いる場合は、通常、野生型ポリペプチド（分泌蛋白質の場合は成熟型の形態）の70％以上、好ましくは80%以上、85%以上、より好ましくは90％以上、95％以上または98％以上の連続領域を含む。
【００５３】
アミノ酸配列のバリアントは、例えば天然のポリペプチドをコードするDNAに変異を導入することにより調製することができる（Walker and Gaastra, eds. Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York, 1983); Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492, 1985 ; Kunkel et al., Methods Enzymol. 154:367-382, 1987; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.), 1989; U.S. Pat. No. 4,873,192）。生物学的活性に影響を与えないようにアミノ酸を置換するためのガイダンスとしては、例えばDayhoffら（Dayhoff et al., in Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), 1978）が挙げられる。
【００５４】
改変されるアミノ酸数に特に制限はないが、例えば天然の成熟型ポリペプチドの全アミノ酸の30％以内、好ましくは25％以内、より好ましくは20％以内、より好ましくは15％以内、より好ましくは10％以内、5％以内、または3％以内であり、例えば15アミノ酸以内、好ましくは10アミノ酸以内、より好ましくは8アミノ酸以内、より好ましくは5アミノ酸以内、より好ましくは3アミノ酸以内である。アミノ酸を置換する場合は、側鎖の性質が似たアミノ酸に置換することにより蛋白質の活性を維持することが期待できる。このような置換は、本発明において保存的置換という。保存的置換は、例えば塩基性アミノ酸（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸 (例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性アミノ酸 (例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性アミノ酸 (例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐アミノ酸 (例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族アミノ酸 (例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）などの各グループ内のアミノ酸間の置換などが挙げられる。また、例えば、BLOSUM62置換マトリックス（S. Henikoff and J.G. Henikoff, Proc. Acad. Natl. Sci. USA 89: 10915-10919, 1992）において、正の値の関係にあるアミノ酸間の置換が挙げられる。
【００５５】
改変された蛋白質は、野生型蛋白質のアミノ酸配列と高いホモロジーを示す。高いホモロジーとは、例えば70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、93%以上、95%以上、または96%以上の同一性を有するアミノ酸配列である。アミノ酸配列の同一性は、例えばBLASTPプログラム（Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990）を用いて決定することができる。例えばNCBI（National Center for Biothchnology Information）のBLASTのウェブページにおいて、デフォルトのパラメータを用いて検索を行うことができる（Altschul S.F. et al., Nature Genet. 3:266-272, 1993; Madden, T.L. et al., Meth. Enzymol. 266:131-141, 1996; Altschul S.F. et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Zhang J. & Madden T.L., Genome Res. 7:649-656, 1997）。例えば２つの配列の比較を行うblast2sequencesプログラム（Tatiana A et al., FEMS Microbiol Lett. 174:247-250, 1999）により、２配列のアライメントを作成し、配列の同一性を決定することができる。ギャップはミスマッチと同様に扱い、例えば天然型サイトカイン（分泌後の成熟型の形態）のアミノ酸配列全体に対する同一性の値を計算する。具体的には、野生型蛋白質 (分泌蛋白質の場合は成熟型) の全アミノ酸数における一致するアミノ酸数の割合を計算する。
【００５６】
また遺伝子は、コードされるアミノ酸配列を変えないようにサイレント変異を導入することができる。特にAT richな遺伝子においては、5個以上の連続したAまたはTの塩基について、コードされるアミノ酸配列を変えないようにGまたはCに置換することにより、安定して遺伝子の高発現を得ることができる。
【００５７】
また改変蛋白質あるいはリプログラミングに用いるタンパク質は、野生型蛋白質をコードする遺伝子のコード領域の一部または全部とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸がコードする蛋白質であって、野生型蛋白質と同等の活性（リプログラミングを誘導する活性）を有する蛋白質が挙げられる。ハイブリダイゼーションにおいては、例えば野生型蛋白質遺伝子のコード領域の配列またはその相補配列を含む核酸、またはハイブリダイズの対象とする核酸のどちらかからプローブを調製し、それが他方の核酸にハイブリダイズするかを検出することにより同定することができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件は、例えば 5xSSC、7%(W/V) SDS、100μg/ml 変性サケ精子DNA、5xデンハルト液（１xデンハルト溶液は0.2%ポリビニールピロリドン、0.2%牛血清アルブミン、及び0.2%フィコールを含む）を含む溶液中、60℃、好ましくは65℃、より好ましくは68℃でハイブリダイゼーションを行い、その後ハイブリダイゼーションと同じ温度で2xSSC中、好ましくは1xSSC中、より好ましくは0.5xSSC中、より好ましくは0.1xSSC中で、振蘯しながら２時間洗浄する条件である。
【００５８】
細胞のリプログラミングを誘導するために特に好ましい遺伝子を一般的に例示すれば、F-box protein 15 (Fbx15, NM_152676, NM_015798)、Nanog（NM_024865, AB093574）、ERAS（ES cell expressed Ras; NM_181532, NM_181548)、DPPA2（NM_138815, NM_028615）、OCT3/4（POU5F1とも呼ばれる; NM_002701, NM_203289, NM_013633, NM_001009178）、SOX2（NM_003106, NM_011443, XM_574919）、TCL1A（T-cell leukemia/lymphoma 1A; NM_021966, NM_009337）、KLF4（Kruppel-like factor 4; NM_004235, NM_010637）、cateninβ1（cadherin-associated protein beta 1; NM_001904, NM_007614; S33Y変異体を含む）、c-MYC（NM_002467, NM_010849; T58A変異体を含む）、およびGlis1遺伝子（Maekawa et al., Nature, 474: 225-229, 2011; NM_147193, NM_147221）、ならびにこれらの遺伝子が属するファミリーの他のメンバーの遺伝子などが挙げられる。これらの遺伝子を導入した場合、多能性幹細胞の形態を示したコロニーの割合は、４種類の遺伝子（OCT3/4、SOX2、KLF4、およびc-MYC）の導入の場合よりも高いことが報告されている（WO2007/69666）。従って、KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子に加えて、上記のいずれかまたはそれらの組み合わせをさらに搭載するセンダイウイルスベクター、あるいはKLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子を搭載する本発明のセンダイウイルスベクターと、上記のいずれかまたはそれらの組み合わせを搭載するセンダイウイルスベクターやそれらのベクターの組み合わせは、本発明において細胞のリプログラミングの誘導に用いるために有用であり、特に、多能性幹細胞の誘導に好適に用いることができる。個々のウイルスベクターは、使用時に組み合わせて用いることができる。また予めまとめてキットとしたり、混合して組成物としてもよい。また、KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子に加えて、上記のいずれかの遺伝子の任意の組み合わせ（または全て）を含む、１つまたはそれ以上のセンダイウイルスベクター、および該ベクターを含むキットまたは組成物も本発明に含まれる。
【００５９】
KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子を発現する本発明のベクターは、特にMYC遺伝子および/またはGlis1遺伝子を発現するベクターと組み合わせることが好ましい（Takahashi, K. and Yamanaka S., Cell 126, 663-676, 2006; Lowry WE et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 105(8):2883-8, 2008; Masaki, H. et al., Stem Cell Res. 1:105-115, 2008; Maekawa et al., Nature, 474: 225-229, 2011; WO2007/69666）。ここでSOX蛋白質、KLF蛋白質、MYC蛋白質、およびOCT蛋白質、ならびにそれらの遺伝子とは、それぞれSOXファミリー、KLFファミリー、MYCファミリー、およびOCTファミリーに属するメンバーの蛋白質および遺伝子を言う。これらの４つのファミリーのメンバーをそれぞれ１つ以上発現するように調整することで、分化した様々な細胞から多能性幹細胞を誘導できることが報告されている。例えばSOXファミリーの遺伝子については、SOX1、SOX2、SOX3、SOX15、SOX17 のいずれの遺伝子を用いても、多能性幹細胞を誘導できることが報告されている（WO2007/69666）。またKLFファミリーについても、KLF4でもKLF2でも多能性幹細胞を誘導できた（WO2007/69666）。MYCファミリーについても、野生型c-MYCのみならず、T58A変異体や、N-MYC、L-MYCでも多能性幹細胞を誘導できた（WO2007/69666; Blelloch R. et al., Cell Stem Cell, 1: 245-247, 2007）。このように、ファミリーの遺伝子を様々に選択して使用することが可能であるので、上記の４種のファミリー遺伝子を適宜選択して、リプログラミングを誘導することができる。
【００６０】
具体的には、KLFファミリーとしては、KLF1（NM_006563, NM_010635）、KLF2（NM_016270, NM_008452）、KLF4（NM_004235, NM_010637）、KLF5（NM_001730, NM_009769）が含まれ、MYCファミリーとしては、c-MYC（NM_002467, NM_010849, T58A変異体を含む）、N-MYC（NM_005378, NM_008709）、L-MYC（NM_005376, NM_005806）が含まれ、OCTファミリーとしては、OCT1A（NM_002697, NM_198934）、OCT3/4（NM_002701, NM_203289, NM_013633, NM_001009178）、OCT6（NM_002699, NM_011141）が含まれ、SOXファミリーとしては、SOX1（NM_005986, NM_009233）、SOX2（NM_003106, NM_011443, XM_574919）、SOX3（NM_005634, NM_009237）、SOX7（NM_031439, NM_011446）、SOX15（NM_006942, NM_009235）、SOX17（NM_022454, NM_011441）、SOX18（NM_018419, NM_009236）が含まれる。これらの遺伝子のいずれかを本発明の順番に従って搭載するセンダイウイルスベクターは、本発明において細胞の脱分化の誘導に用いるために有用であり、特に多能性幹細胞の誘導に好適に用いることができる。
【００６１】
なお、MYCファミリーの遺伝子は多能性幹細胞の誘導に必須ではなく、MYCファミリー遺伝子を除く３つのファミリーの遺伝子だけでも多能性幹細胞は誘導できる（Nakagawa M. et al., Nat Biotechnol. 26(1):101-6, 2008; Wering M. et al., Cell Stem Cell 2(1):10-2, 2008）。MYC遺伝子を発現させない場合、例えばp53 siRNAおよびUTF1により多能性幹細胞の誘導効率を有意に上昇させることができる（Y. Zhao et al., Cell Stem Cell, 3 (5): 475-479, 2008; N. Maherali, and K. Hochedlinger, Cell Stem Cell, 3 (6): 595-605, 2008）。また、KLFファミリーの遺伝子を除く３つのファミリーの遺伝子だけでも多能性幹細胞を誘導できることが報告されている（Park IH et al., Nature, 451(7175):141-6, 2008）。また、G9aヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（BIX-01294; Kubicek, S. et al., Mol. Cell 25, 473-481, 2007）を併用することにより、胎児由来のNPCからKLF遺伝子、SOX遺伝子、およびMYC遺伝子の３つの遺伝子のみで多能性幹細胞を誘導できることが報告されている（Shi Y et al., Cell Stem Cell, 2(6):525-8, 2008）。それぞれの遺伝子をコードするウイルスベクターは別々に単体として準備されてもよい。それらは、使用時に組み合わせて用いることができる。また任意の組み合わせまたは全てをまとめてキットとしたり、混合して組成物としてもよい。また本発明は、KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子を搭載する本発明のセンダイウイルスベクターに加えて、該３遺伝子以外の遺伝子や化合物の任意の組み合わせ（または全て）を含む、１つまたはそれ以上の染色体非組み込み型ウイルスベクター、および該ベクターをさらに含むリプログラミングのためのキットまたは組成物にも関する。更には、このキットに含まれる一部の組換えベクターは、相当の機能を有するタンパク質、合成化合物などに置き換えることも可能である。
【００６２】
以上に記載した遺伝子の組み合わせに、さらに別の遺伝子を組み合わせて、リプログラミングの誘導効率を上昇させることもできる。このような遺伝子としては、TERT（NM_198253, NM_009354）および／またはSV40 large T antigen（NC_001669.1, Fiers,W. (05-11-1978) Nature 273:(5658)113-120）が挙げられる（Park IH. et al., Nature, 451(7175):141-6, 2008）。また、HPV16 E6、HPV16 E7、Bmil（NM_005180, NM_007552）からなる群より選択される１つ以上の遺伝子をさらに組み合わせてもよい。また、Fbx15（Mol Cell Biol. 23(8):2699-708, 2003）、Nanog（Cell 113: 631-642, 2003）、ERas（Nature 423, 541-545, 2003）、DPPA2（Development 130: 1673-1680, 2003）、TCL1A（Development 130: 1673-1680, 2003）、β-Catenin（Nat Med 10(1): 55-63, 2004）からなる群より選択される１つまたは任意の組み合わせを発現させてもよい。さらに、ECAT1（AB211062, AB211060）、DPPA5 (NM_001025290, NM_025274, XM_236761）、DNMT3L（NM_013369, NM_019448)、ECAT8 （AB211063, AB211061）、GDF3（NM_020634, NM_008108）、SOX15（NM_006942, NM_009235）、DPPA4（NM_018189, NM_028610）、FTHL17（NM_031894, NM_031261）、SALL4（NM_020436, NM_175303）、Rex-1（NM_174900, NM_009556）、Utf1（NM_003577, NM_009482）、DPPA3（NM_199286, NM_139218, XM_216263)、STAT3（NM_139276, NM_213659）、および GRB2（NM_002086, NM_008163）からなる群より選択される１つ以上の遺伝子を組み合わせてもよい。また、KLF遺伝子、OCT遺伝子、SOX遺伝子に加えて、NANOG遺伝子（NM_024865, AB093574）、および LIN28遺伝子 (NM_024674) の各遺伝子を含む組み合わせも、多能性幹細胞の誘導に有用である（Yu J. et al., Science, 318(5858):1917-20, 2007）。また、これらにMYC遺伝子をさらに組み合わせたものも好適である（Liao J et al., Cell Res. 18(5):600-3, 2008）。これらの遺伝子を付加的に発現させることで、多能性幹細胞の誘導を促進し得る（WO2007/69666）。成熟Ｂ細胞を対象とする場合は、例えば骨髄球系転写因子C/EBPα（CCAAT/enhancer-binding-protein α）（NM_004364）を異所発現させるか、あるいはＢ細胞系転写因子Pax5（paired box 5; NM_016734）の発現を抑制してリプログラミングを促進することができる（Hanna J, Cell. 133(2):250-64, 2008）。これらの因子も、本発明におけるセンダイウイルスベクターを用いて発現させることができる。更には、このキットに含まれる一部の組換えベクターは、相当の機能を有するタンパク質、合成化合物などに置き換えることも可能である。
【００６３】
また、上記の因子を発現させる以外にも、例えば化合物の添加を組み合わせることでリプログラミングの効率を向上させることができる。例えば、bFGF（basic fibroblast growth factor）および／またはSCF（stem cell factor）は多能性幹細胞の誘導を促進し、さらに多能性幹細胞の誘導におけるc-MYCの機能を代替することができる（WO2007/69666）。またMAPキナーゼ阻害剤（PD98056）も、よりＥＳ細胞に近い多能性幹細胞の樹立等に有用である（WO2007/69666）。また、DNAメチル化酵素（Dnmt）阻害剤および／またはヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）阻害剤により、多能性幹細胞の誘導効率が改善することが報告されている（Huangfu D et al., Nat Biotechnol. (Published online: 22 June 2008, doi:10.1038/nbt1418); Nat. Biotechnol. 26, 795-797 (2008)）。例えばHDAC（VPA）を併用することにより、OCT4とSOX2の2遺伝子のみの導入により多能性幹細胞を誘導することができる（Huangfu, D. et al., Nat Biotechnol. 2008 26(11):1269-75）。本発明のベクターは、これらの化合物の投与と組み合わせて用いるための剤として有用である。Dnmt阻害剤としては、例えば5-アザシチジン等、HDAC阻害剤としては、例えばスベロイラニリド・ハイドロザミック酸（SAHA）、トリコスタチンA（TSA）、バルプロ酸（VPA）等が有用である。また5-アザシチジンを用いる場合、グルココルチコイド（デキサメタゾン）を併用することにより効率を上昇させることができる。
【００６４】
細胞をリプログラミングさせるには、例えば（１）KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子を発現する本発明のベクター、（２）（１）のベクターとMYC遺伝子またはGlis1遺伝子を発現するセンダイウイルスベクターとの組み合わせ、（３）（２）にさらにNANOG遺伝子を発現するセンダイウイルスベクター、およびLIN28を発現するセンダイウイルスベクターを加えた組み合わせ、（４）（２）の組み合わせにさらにKLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をそれぞれ単独で発現するセンダイウイルスベクターを１種類または２種類加えた組み合わせ（例えばOCT3/4-SOX2-KLF4遺伝子搭載SeVベクターとMYC遺伝子搭載ベクターとKLF遺伝子搭載ベクターの組み合わせ等）、または（５）（１）のベクターと上記の他の所望のリプログラミング因子を搭載するベクターおよび/またはリプログラミングを誘導する所望の化合物との組み合わせ等を、細胞に導入することができる。（１）のベクターには、KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をこの順番で、あるいはOCT遺伝子、SOX遺伝子、およびKLF遺伝子の順番で含む本発明のセンダイウイルスベクターが含まれる。複数のベクターおよび／または化合物を組み合わせて導入する場合、導入は同時に行うことが好ましく、具体的には、最初のベクターまたは化合物等を添加してから４８時間以内、好ましくは３６時間以内、より好ましくは２４時間以内、１８時間以内、１２時間以内、１０時間以内、８時間以内、６時間以内、３時間以内、２時間以内、または１時間以内にリプログラミング因子をコードする全てのベクターおよび／または化合物の添加を完了することが好ましい。ベクターの用量は適宜調製することができるが、例えばMOIは0.1以上、好ましくは0.3以上、0.5以上、1以上、2以上、または3以上、また、100以下、好ましくは90以下、80以下、70以下、60以下、50以下、40以下、30以下、20以下、10以下、または5以下である。好ましくは、例えばMOI 0.3〜100、より好ましくはMOI 0.5〜50、より好ましくはMOI 1〜40、より好ましくはMOI 1〜30、より好ましくはMOI 2〜30、例えばMOI 3〜30 で感染させる。誘導された多能性幹細胞は、ＥＳ細胞とよく似た扁平なコロニーを形成し、アルカリホスファターゼを発現する。また誘導された多能性幹細胞は、未分化細胞マーカーであるNanog、OCT4、および／またはSOX2等を発現してよい。また誘導された多能性幹細胞は、好ましくはTERTを発現および/またはテロメラーゼ活性を示す。本発明は、アルカリホスファターゼを発現し、好ましくは未分化細胞マーカーであるNanogおよび/またはTERTをさらに発現する細胞の製造方法、および該細胞の製造および該細胞を誘導する薬剤の製造におけるセンダイウイルスベクターの使用にも関する。
【００６５】
本発明によれば、成人皮膚細胞および新生児包皮細胞を含む所望の細胞から多能性幹細胞のコロニーを、少なくともある細胞に関して、例えば0.03×10-5 以上、0.1×10-5 以上、0.3×10-5 以上、0.5×10-5 以上、0.8×10-5 以上、または1×10-5 以上（例えば1×10-5 〜 1×10-3）の出現率で、好ましくは1.5×10-5 以上、1.7×10-5 以上、2.0×10-5 以上、2.5×10-5 以上、3×10-5 以上、4×10-5 以上、5×10-5 以上、8×10-5 以上、1×10-4 以上、2×10-4 以上、3×10-4 以上、5×10-4 以上、8×10-4 以上、1×10-3 以上、1.5×10-3 以上、2×10-3 以上、5×10-3、1×10-2 以上、1.5×10-2 以上、2×10-2 以上、2.5×10-2 以上、3×10-2 以上、4×10-2 以上、または 5×10-2 以上の出現率で誘導することができる。また本発明のベクターによる多能性幹細胞のコロニーの出現効率は、少なくともある細胞に関して、KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をそれぞれ別のセンダイウイルスベクターに搭載した対照に比べて、例えば1.5倍以上、好ましくは2倍以上、2.5倍以上、3倍以上、3.5倍以上、4倍以上、4.5倍以上、または5倍以上である。またKLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をこの順番で含む本発明のベクターによる多能性幹細胞のコロニーの出現効率は、KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子を他の順番、例えばOCT遺伝子、SOX遺伝子、およびKLF遺伝子の順番で１つのセンダイウイルスベクターに搭載した対照に比べて、少なくともある細胞に関して例えば1.5倍以上、好ましくは2倍以上、2.5倍以上、3倍以上、3.5倍以上、4倍以上、4.5倍以上、または5倍以上である。尚、順にOCT遺伝子、SOX遺伝子、およびKLF遺伝子が挿入された本発明のベクターを用いた場合は、iPS細胞の成長が早い（コロニーの成長が早い）点が優れている特徴がある。
【００６６】
リプログラミングを誘導する対象となる分化した細胞は、特に限定はなく、所望の体細胞等を用いることができる。体細胞からの多能性幹細胞の生成は、マウス胎児由来の細胞からのみならず、成体マウスの尾部から採取した分化した細胞や、肝細胞および胃粘膜細胞からでも可能であることが示されており、細胞型や分化状態によらないことが示唆される（WO2007/069666; Aoi T. et al., Science [Published Online February 14, 2008]; Science. 2008; 321(5889):699-702）。またヒトにおいても、成人の顔皮膚由来線維芽細胞、成人滑膜細胞、新生児包皮由来線維芽細胞、成人間葉系幹細胞、成人の手のひらの皮膚細胞、胎児細胞等の多様な細胞から、多能性幹細胞が誘導できることが確認されている（Takahashi K et al. (2007) Cell 131: 861-872; Park IH et al., Nature, 451(7175):141-6, 2008）。また、膵臓β細胞やBリンパ球のような最終分化した細胞からも、同様に多能性幹細胞が誘導できることが報告されている（Stadtfeld M et al., Curr Biol. 2008 May 21. [PubMed, PMID: 18501604]; Curr Biol. 2008;18(12):890-4; Hanna J. et al., Cell. 133(2):250-64, 2008）。これらの知見は、多能性幹細胞の誘導が、元になる細胞によらないことを示唆している。これらの所望の体細胞からの多能性幹細胞の誘導において、本発明の方法を適用することができる。具体的には、リプログラミングの対象となる分化した細胞としては、線維芽細胞、滑膜細胞、口腔または胃などの粘膜細胞、肝細胞、骨髄細胞、歯胚細胞、血液細胞（例えばリンパ球、白血球）、その他の所望の細胞が含まれる。また細胞は、例えば胚、胎児、新生児、子供、成人または老人の細胞に由来してよい。また、動物の由来は特に制限はなく、ヒトおよび非ヒト霊長類（サルなど）、マウス、ラットなどのげっ歯類、およびウシ、ブタ、ヤギなどの非げっ歯類を含む哺乳動物等が含まれる。
【００６７】
リプログラミングが完了した細胞のコロニーからは、ベクターが除去された細胞を適宜選択することができる。例えばベクターが自然除去された細胞を選択すればよい。このために、例えばウイルスベクターに特異的な抗体（例えば抗HN抗体）でネガティブ選択を行うことができる。また、温度感受性ベクターを用いた場合は、高温（例えば37.5〜39℃、好ましくは38〜39℃、または38.5〜39℃）で培養することによりベクターを簡便に除去することができる。また、SeV(PM)/TSΔFや、これにさらにTS 7、TS 12、TS 13、TS 14、またはTS 15などの変異を導入したベクターを用いた場合は、継代により自然にベクターを脱落させることができる。好ましいベクターとしては、例えばSeV(PM)KOS/TS12ΔFが挙げられるが、これに限定されない。またこのとき、SeV(HNL)c-rMYC/TS12ΔF、SeV(HNL)c-rMYC/TS13ΔF、またはSeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF等を用いてMYC遺伝子を導入することができる。また、KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子を搭載するセンダイウイルスベクターにMYC遺伝子を搭載させないことで、癌化に関連するMYC遺伝子を用いずにリプログラミングを行うことができる利点がある他、KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子に加え、4つ目の因子としてc-MYC、L-MYC、またはGlis1などを自由に選択して用いること可能となる点でも優れている。
【００６８】
本発明の方法により製造された細胞は、様々な組織や細胞に分化させるために有用であり、所望の試験、研究、診断、検査、治療等において用いることができる。例えば誘導した幹細胞は、幹細胞療法において利用されることが期待される。例えば患者から採取した体細胞を用いて初期化（reprogramming）を誘導し、その後、分化誘導して得られる体性幹細胞やその他の体細胞を患者に移植することができる。細胞の分化誘導の方法は特に限定されず、例えばレチノイン酸処理や、様々な増殖因子・サイトカイン処理、ホルモンによる処理により分化を誘導することができる。また得られた細胞は、所望の薬剤や化合物の効果を検出するために使用することができ、これを通して薬剤や化合物のスクリーニングを実施することが可能である。
【実施例】
【００６９】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。また、本明細書中に引用された文献およびその他の参照は、すべて本明細書の一部として組み込まれる。【００７０】
[実施例１]
pSeV(PM)/TSΔFの構築
本発明で用いた外来遺伝子を保持するセンダイウイルスベクターの作製方法を以下に示す。特に断らない限り、すべての実施例で外来遺伝子の導入にはこのベクターを用いた。尚、本発明において「(PM)」とは、P遺伝子とM遺伝子の間にリプログラミング遺伝子を挿入することを表し、「(HNL)」とは、HN遺伝子とL遺伝子の間にリプログラミング遺伝子を挿入することを表す。また本発明において「TS」とは、M蛋白質にG69E,T116A,及びA183Sの変異を、HN蛋白質にA262T,G264R,及びK461Gの変異を、P蛋白質にL511F変異を、そしてL蛋白質にN1197S及びK1795E変異を持つことを表し、「ΔF」とは、F遺伝子を欠失していることを表す。また下記SeV(PM)/TSΔFとは、M蛋白質にG69E,T116A,及びA183Sの変異を、HN蛋白質にA262T,G264R,及びK461Gの変異を、P蛋白質にL511F変異を、そしてL蛋白質にN1197S及びK1795E変異を持つF遺伝子欠失型センダイウイルスベクター（Z strain）である。このベクターは、P遺伝子の直下（immediate downstream）（P遺伝子とM遺伝子の間）に導入遺伝子挿入部位(NotI部位)を有する。但しこれらは例示であって、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００７１】
pSeV(PM)/TSΔFの構築は以下の通りに行った。Litmus SalINheIfrg PmutMtsHNts ΔF-GFP delGFP(国際公開番号: WO2010/008054)を鋳型にしてPMNOTI-F（5’- GAAATTTCACCTAAGCGGCCGCAATGGCAGATATCTATAG -3’）(配列番号:10) およびPMNOTI-R（5’- CTATAGATATCTGCCATTGCGGCCGCTTAGGTGAAATTTC -3’） (配列番号:11) を用いてPCR反応(94℃-3分→98℃-10秒、55℃-15秒、72℃-12分を25サイクル→72℃-7分)を行った。得られた約11kbのPCR産物をDpn I処理後、この反応液20μlを大腸菌DH5α(ToYoBo Code No. DNA-903)を用いてトランスフォーメーションを行った。6個の大腸菌のコロニーをピックアップし、ミニプレップを行い、NotI消化によりNotI配列の導入されたプラスミドを選択し、次にシークエンスにより配列の正しいクローンを選択しLitmus SalINheIfrg PmutMtsHNts (PM)-dFを得た。次にこのLitmus SalINheIfrg PmutMtsHNts (PM)-dFをSal IおよびNheIで消化して回収したフラグメント（約8kbp）とL遺伝子に二カ所の変異を有するプラスミドpSeV/ΔSalINheIfrg Lmut(国際公開番号:WO2003/025570)をSalI/NheIで消化して回収したフラグメント（約8kbp）をライゲーションして、pSeV(PM)/TSΔFを得た。このベクターは、P遺伝子およびM遺伝子の間に導入遺伝子挿入部位(NotI部位)を有する。【００７２】
[実施例２]
KLF4-OCT3/4-SOX2遺伝子搭載SeVベクター作製用のプラスミドの作製
KLF4遺伝子は、PrimeStar HS DNA polymerase (タカラバイオ株式会社 カタログ番号R010A)を用いて、pSeV18+KLF4/TSΔF（WO2010/008054）を鋳型として、NotI-KIF-4F（5’-ATTGCGGCCGCGACATGGCTGTCAGCGACGCGCTG-3’） (配列番号:12)及びKOS-KO-R（5’-TCCGAAGCCAGGTGTCCCGCCATGGCGGCTGTTAGGTGGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTTAAAAATGCCTC-3’） (配列番号:13)のプライマーによりPCR(95℃-3分→98℃-10秒、55℃-15秒、72℃-2分を30サイクル→72℃-7分)を行い増幅した。PCR産物はQiaquick PCR Purification kit (キアゲンCat. No. 28106)を用いて精製し、キットに付属の溶出液100μlに溶出した。【００７３】
OCT3/4遺伝子は、PrimeStar HS DNA polymerase (タカラバイオ株式会社 カタログ番号R010A)を用いて、pSeV18+OCT3/4/TSΔF（WO2010/008054）を鋳型として、KOS-KO-F（5’- GAGGCATTTTTAACCGTAGTAAGAAAAACTTAGGGTGAAAGTTCATCCACCTAACAGCCGCCATGGCGGGACACCTGGCTTCGGA-3’） (配列番号:14)及びKOS-OS-R（5’- CCGTCTCCATCATGTTGTACATGGCGGCGTGTTAGGTGAAATCTTTCACCCTAAGTTTTTCTTATTCTACGGTCAGTTTGAATGCATGGG-3’） (配列番号:15)のプライマーによりPCR(95℃-3分→98℃-10秒、55℃-15秒、72℃-2分を30サイクル→72℃-7分)を行い増幅した。PCR産物はQiaquick PCR Purification kit (キアゲンCat. No. 28106)を用いて精製し、キットに付属の溶出液100μlに溶出した。【００７４】
SOX2遺伝子は、PrimeStar HS DNA polymerase (タカラバイオ株式会社 カタログ番号R010A)を用いて、pSeV18+SOX2/TSΔF（WO2010/008054）を鋳型として、KOS-OS-F（5’- CCCATGCATTCAAACTGACCGTAGAATAAGAAAAACTTAGGGTGAAAGATTTCACCTAACACGCCGCCATGTACAACATGATGGAGACGG-3’） (配列番号:16)及びNot I SOX-2R（5’- ATTGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTCACATGTGTGAGAGGGGCAGTGTGCCGTTAATGGCCGTG-3’） (配列番号:17)のプライマーによりPCR(95℃-3分→98℃-10秒、55℃-15秒、72℃-2分を30サイクル→72℃-7分)を行い増幅した。PCR産物はQiaquick PCR Purification kit (キアゲンCat. No. 28106)を用いて精製し、キットに付属の溶出液100μlに溶出した。【００７５】
精製したこれらのPCR産物を用いて2回目のPCRを行った。PrimeStar HS DNA polymerase (タカラバイオ株式会社 カタログ番号R010A)を用いて上記、精製したKLF4遺伝子PCR産物、OCT3/4遺伝子PCR産物、SOX2遺伝子PCR産物を1μlずつ添加し、NotI-KIF-4F（5’-ATTGCGGCCGCGACATGGCTGTCAGCGACGCGCTG-3’） (配列番号:12)、Not I SOX-2R（5’- ATTGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTCACATGTGTGAGAGGGGCAGTGTGCCGTTAATGGCCGTG-3’） (配列番号:17)のプライマーによりPCR(95℃-3分→98℃-10秒、55℃-15秒、72℃-2分を30サイクル→72℃-7分)を行い増幅した。【００７６】
また、もう一つの条件として、上記精製したKLF4遺伝子PCR産物、OCT3/4遺伝子PCR産物、SOX2遺伝子PCR産物をそれぞれH2Oで10倍希釈した溶液を1μlずつ添加し、NotI-KIF-4F（5’-ATTGCGGCCGCGACATGGCTGTCAGCGACGCGCTG-3’） (配列番号:12)、Not I SOX-2R（5’- ATTGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTCACATGTGTGAGAGGGGCAGTGTGCCGTTAATGGCCGTG-3’） (配列番号:17)のプライマーによりPCR(95℃-3分→98℃-10秒、55℃-15秒、72℃-2分を30サイクル→72℃-7分)を行い増幅した。【００７７】
PCR産物はQiaquick PCR Purification kit (キアゲンCat. No. 28106)を用いて精製し、キットに付属の溶出液50μlに溶出した。この精製産物をNot Iで消化し、1%アガロースゲル電気泳動により分離し、約3.6kbpのバンドを切り出し、Qiaquick Gel Extraction Kit (キアゲン、カタログ番号28706) で精製した。キットに付属の溶出液100μlに溶出した。このKLF4遺伝子、OCT3/4遺伝子、SOX2遺伝子を含むNot I断片をpSeV(PM)/TSΔFベクターのNot Iサイトにクローニングし、シークエンスにより配列の正しいクローンを選択し、pSeV(PM)KOS/TSΔFを得た。【００７８】
[実施例３]
ヒトKLF4-OCT3/4-SOX2遺伝子搭載SeVベクター作製
トランスフェクションの前日に6ウェルプレートに1ウェル当たり106細胞の293T/17細胞を播種し、37℃のCO2インキュベーター(5%CO2条件下)で培養した。その293T/17細胞にpCAGGS-NP, pCAGGS-P4C(-), pCAGGS-L(TDK), pCAGGS-T7, pCAGGS-F5R (WO2005/071085) および上記で示したセンダイウイルスベクタープラスミドpSeV(PM)KOS/TSΔFをそれぞれ0.5μg, 0.5μg, 2μg, 0.5μg, 0.5μg および5.0μgを混合し、TransIT-LT1 (Mirus)を15μl使用してトランスフェクションを行った。37℃のCO2インキュベーターで2日間培養した。その後、センダイウイルスの融合タンパク質(Fタンパク質)を発現する細胞LLC-MK2/F/A (Li, H.-O. et al., J. Virology 74. 6564-6569 (2000), WO00/70070) を1ウェル当たり106細胞の割合でトランスフェクションを行った293T/17細胞に重層し、37℃のCO2インキュベーターで1日間培養した。翌日、細胞の培養液を除き、ペニシリンストレプトマイシンを添加したMEM培地(以下PS/MEM)1mlで細胞を1度洗浄し、2.5 μg/mlのトリプシンを含むPS/MEM培地(以下Try/PS/MEMとする)を1ウェル当たり1ml添加し、32℃のCO2インキュベーターで2日間培養した。3〜4日毎に培地交換を行いながら、場合によっては、LLC-MK2/F/A細胞で継代を行いながら培養を継続した。培養上清の一部を赤血球凝集分析によりベクター回収の有無を確認し、十分な赤血球凝集反応が得られた後に培養上清を回収した。回収した培養上清よりQIAamp Viral RNA Mini Kit (キアゲン カタログ番号52906)を用いてRNAを回収し、搭載したKLF4-OCT3/4-SOX2遺伝子領域を標的にRT-PCRを行った。得られたRT-PCR産物はシークエンスにより正しい塩基配列であることを確認し、SeV(PM)KOS/TSΔFベクターを得た。
【００７９】
[実施例４]
OCT3/4-SOX2-KLF4遺伝子搭載SeVベクター作製用のプラスミドの作製
OCT3/4遺伝子は、PrimeStar HS DNA polymerase (タカラバイオ株式会社 カタログ番号R010A)を用いて、pSeV18+OCT3/4/TSΔF（WO2010/008054）を鋳型として、F6（5’- ACAAGAGAAAAAACATGTATGG-3’） (配列番号:18)及びOSK-OS-R（5’- GGCGGCGTGTTAGGTGGATGACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTCAGTTTGAATGC -3’） (配列番号:19)のプライマーによりPCR(95℃-3分→98℃-10秒、55℃-15秒、72℃-2分を30サイクル→72℃-7分)を行い増幅した。PCR産物はQiaquick PCR Purification kit (キアゲンCat. No. 28106)を用いて精製し、キットに付属の溶出液100μlに溶出した。【００８０】
SOX2遺伝子は、PrimeStar HS DNA polymerase (タカラバイオ株式会社 カタログ番号R010A)を用いて、pSeV18+SOX2/TSΔF（WO2010/008054）を鋳型として、OSK-OS-F（5’- TAGTAAGAAAAACTTAGGGTGAAAGTCATCCACCTAACACGCCGCCATGTACAACATGATGGAG -3’） (配列番号:20)及びOSK-SK-R （5’- TGTTAGGTGGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTCACATGTGTGAGAGGG -3’） (配列番号:21)のプライマーによりPCR(95℃-3分→98℃-10秒、55℃-15秒、72℃-2分を30サイクル→72℃-7分)を行い増幅した。PCR産物はQiaquick PCR Purification kit (キアゲンCat. No. 28106)を用いて精製し、キットに付属の溶出液100μlに溶出した。【００８１】
KLF4遺伝子は、PrimeStar HS DNA polymerase (タカラバイオ株式会社 カタログ番号R010A)を用いて、pSeV18+KLF4/TSΔF（WO2010/008054）を鋳型として、OSK-SK-F （5’- TAGTAAGAAAAACTTAGGGTGAAAGTTCATCCACCTAACACGCCGCCATGGCTGTCAGCGACGC -3’） (配列番号:22)及びR199 （5’- GATAACAGCACCTCCTCCCGACT -3’） (配列番号:23)のプライマーによりPCR(95℃-3分→98℃-10秒、55℃-15秒、72℃-2分を30サイクル→72℃-7分)を行い増幅した。PCR産物はQiaquick PCR Purification kit (キアゲンCat. No. 28106)を用いて精製し、キットに付属の溶出液100μlに溶出した。【００８２】
精製したこれらのPCR産物を用いて2回目のPCRを行った。PrimeStar HS DNA polymerase (タカラバイオ株式会社 カタログ番号R010A)を用いて上記、精製したOCT3/4遺伝子PCR産物、SOX2遺伝子PCR産物、KLF4遺伝子PCR産物を1μlずつ添加し、F6（5’- ACAAGAGAAAAAACATGTATGG-3’） (配列番号:18)、SOX2-R470 （5’- ATGCGCTGGTTCACGCCCGCGCCCAGG -3’） (配列番号:24)のプライマー、または、SOX2-F294（5’-AGCGCTGCACATGAAGGAGCACC-3’）(配列番号:25)、KLF4-R405（5’-CGCGCTGGCAGGGCCGCTGCTCGAC-3’）(配列番号:26)のプライマーによりPCR(95℃-3分→98℃-10秒、55℃-30秒、72℃-4分を30サイクル→72℃-7分)を行い増幅した。【００８３】
これらのPCR産物と上記KLF4遺伝子のPCR産物精製物を0.5μlずつ用いてF6（5’- ACAAGAGAAAAAACATGTATGG-3’） (配列番号:18)及びR150（5’- AATGTATCGAAGGTGCTCAA-3’）（配列番号：26）のプライマーでPrimeStar HS DNA polymerase (タカラバイオ株式会社 カタログ番号R010A)によりPCRを行った。増幅してきた約3.6kbpのバンドを切り出してQiaquick Gel Extraction Kit (キアゲン、カタログ番号28706) で精製した。キットに付属の溶出液100μlに溶出した。このOCT3/4遺伝子、SOX2遺伝子、KLF4遺伝子を含むPCR産物をNot Iで消化し、Qiaquick PCR Purification kit (キアゲンCat. No. 28106)を用いて精製し、このNot I断片をpSeV(PM)/TSΔFベクターのNot Iサイトにクローニングし、シークエンスにより配列の正しいクローンを選択し、pSeV(PM)OSK/TSΔFを得た。【００８４】
[実施例５]
ヒトOCT3/4-SOX2-KLF4遺伝子搭載SeVベクター作製
トランスフェクションの前日に6ウェルプレートに1ウェル当たり106細胞の293T/17細胞を播種し、37℃のCO2インキュベーター(5%CO2条件下)で培養した。その293T/17細胞にpCAGGS-NP, pCAGGS-P4C(-), pCAGGS-L(TDK), pCAGGS-T7, pCAGGS-F5R (WO2005/071085) および上記で示したセンダイウイルスベクタープラスミドpSeV(PM)OSK/TSΔFをそれぞれ0.5μg, 0.5μg, 2μg, 0.5μg, 0.5μg および5.0μgを混合し、TransIT-LT1 (Mirus)を15μl使用してトランスフェクションを行った。37℃のCO2インキュベーターで2日間培養した。その後、センダイウイルスの融合タンパク質(Fタンパク質)を発現する細胞LLC-MK2/F/A (Li, H.-O. et al., J. Virology 74. 6564-6569 (2000), WO00/70070) を1ウェル当たり106細胞の割合でトランスフェクションを行った293T/17細胞に重層し、37℃のCO2インキュベーターで1日間培養した。翌日、細胞の培養液を除き、ペニシリンストレプトマイシンを添加したMEM培地(以下PS/MEM)1mlで細胞を1度洗浄し、2.5 μg/mlのトリプシンを含むPS/MEM培地(以下Try/PS/MEMとする)を1ウェル当たり1ml添加し、32℃のCO2インキュベーターで2日間培養した。3〜4日毎に培地交換を行いながら、場合によっては、LLC-MK2/F/A細胞で継代を行いながら培養を継続した。培養上清の一部を赤血球凝集分析によりベクター回収の有無を確認し、十分な赤血球凝集反応が得られた後に培養上清を回収した。回収した培養上清よりQIAamp Viral RNA Mini Kit (キアゲン カタログ番号52906)を用いてRNAを回収し、搭載したOCT3/4-SOX2-KLF4遺伝子領域を標的にRT-PCRを行った。得られたRT-PCR産物はシークエンスにより正しい塩基配列であることを確認し、SeV(PM) OSK/TSΔFベクターを得た。
【００８５】
[実施例６]
外来遺伝子を保持するセンダイウイルスベクターによるES様細胞の作製
ヒト新生児包皮由来線維芽細胞(BJ)(ATCC(www.atcc.org), CRL-2522) 1.5x 105(個)を 10% FBS ( Cell Culture BioscienceCat. No. 171012) 及びペニシリン(100u/ml)ストレプトマイシン(100μg/ml)（ナカライテスク, Code 26253-84）を含むDMEM (GIBCO-BRL, 11995) (以下10%FBS/PS/DMEMとする) 中で37℃、5% CO2インキュベータにて終夜培養した。
培養後、MOI=3の濃度で下記のベクターを上記培養した細胞に投与した。
【００８６】
条件１
SeV(PM)KOS/TSΔFベクター
SeV18+ c-rMYC/TSΔFベクター(国際公開番号: WO2010/008054)
条件2
SeV(PM)KOS/TSΔFベクター
SeV(HNL)c-rMYC/TSΔFベクター(国際公開番号: WO2010/008054)
条件3
SeV(PM)KOS/TSΔFベクター
SeV(L)c-rMYC/TSΔFベクター(Fusaki et al., Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. Vol. 85, p348-362(2009))
条件４
SeV(PM)KOS/TSΔFベクター
SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔFベクター(国際公開番号: WO2010/008054)
条件5
SeV(PM)KOS/TSΔFベクター
条件6
SeV(PM)OSK/TSΔFベクター
SeV18+ c-rMYC/TSΔFベクター
条件７
SeV(PM)OSK/TSΔFベクター
SeV(HNL)c-rMYC/TSΔFベクター
条件8
SeV(PM)OSK/TSΔFベクター
SeV(L)c-rMYC/TSΔFベクター
条件9
SeV(PM)OSK/TSΔFベクター
SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔFベクター
条件10
SeV(PM)OSK/TSΔFベクター
条件11
SeV18+ OCT3/4/TSΔFベクター(国際公開番号: WO2010/008054)
SeV18+ SOX2/TSΔFベクター(国際公開番号: WO2010/008054)
SeV18+ KLF4/TSΔFベクター(国際公開番号: WO2010/008054)
SeV(HNL) c-MYC/TS15ΔFベクター
条件12
ベクターなし【００８７】
上記ベクターを投与後、10%FBS/PS/DMEMで毎日培地交換を行い、37℃、5% CO2インキュベータにて培養した。その後、ゼラチンコート6ウェルプレートに用意したマイトマイシン処理済みフィーダー細胞(例えばMEF) 1.25×105(個)に対し、0.25%トリプシンで剥がした上記導入細胞の1.0×105(個)を添加し、その上で培養した。翌日、10%FBS/PS/DMEMから霊長類ES用培地(ReproCell社, RCHEMD001)(4 ng/ml になるようbFGFを添加した)に培地交換し、5% CO2インキュベータで培養した。培地交換は毎日もしくは二日に一度行った。培地はフィーダー細胞のコンディションドメディウムでも構わない。
感染14日後、MEF上に継代して7日後に、従来の方法（条件11）と比較して3遺伝子搭載した条件下（条件2、条件3、条件4）で顕著に高い効率でヒトES細胞様のコロニーが出現した。図1に従来型と条件2の細胞の状態を示す。図1の写真を見ると、誘導前の線維芽細胞(BJ)と明らかに異なる、ヒトES細胞に見られるのと同様の扁平なコロニーが見られた(実験医学 Vol.26, No.5 (増刊): pp. 35-40, 2008)。
感染21日目に、ES細胞の未分化マーカーであるアルカリホスファターゼの活性をNBCT/BCIP(PIERCE, NBT/BCIP, 1-Step, # 34042)にて染色すると、従来の条件（上記条件11）やOSK（OCT-SOX-KLF）の遺伝子の並びと比較して、KOS（KLF-OCT-SOX）の遺伝子の並びのベクターを用いた条件2、条件3、条件4において非常にたくさんのアルカリホスファターゼ陽性の青色に染まったコロニーが観察された(図2、図3)。このように、アルカリホスファターゼ陽性iPS様細胞の誘導効率は、KOS（KLF-OCT-SOX）の遺伝子の並びのベクターにおいて特異的に高いことが判明した（図4）。【００８８】
[実施例７]
ヒト胎児由来線維芽細胞(MRC-5)(ATCC(www.atcc.org), CCL-171) 1.5x 105(個)を 10% FBS (Cell Culture BioscienceCat. No. 171012) 及びペニシリン(100u/ml)ストレプトマイシン(100μg/ml)（ナカライテスク, Code 26253-84）を含むDMEM (GIBCO-BRL, 11995) (以下10%FBS/PS/DMEMとする) 中で37℃、5% CO2インキュベータにて終夜培養した。
培養後、下記のベクター条件で上記培養した細胞に投与した。
【００８９】
条件１
SeV(PM)KOS/TSΔFベクター  Moi=3
SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔFベクター  Moi=3
条件2
SeV(PM)KOS/TSΔFベクター  Moi=3
SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔFベクター  Moi=9
条件3
SeV(PM)KOS/TSΔFベクター  Moi=3
SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔFベクター  Moi=30
条件４
SeV(PM)KOS/TSΔFベクター  Moi=3
SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔFベクター Moi=90
条件5
SeV(PM)OSK/TSΔFベクター  Moi=3
SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔFベクター  Moi=3
条件6
SeV(PM)OSK/TSΔFベクター  Moi=3
SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔFベクター  Moi=9
条件７
SeV(PM)OSK/TSΔFベクター  Moi=3
SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔFベクター  Moi=30
条件8
SeV(PM)OSK/TSΔFベクター  Moi=3
SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔFベクター  Moi=90
条件9
SeV18+ OCT3/4/TSΔFベクター Moi=3
SeV18+ SOX2/TS15ΔFベクター Moi=3
SeV18+ KLF4/TSΔFベクター Moi=3
SeV(HNL) c-rMYC/TS15ΔFベクター Moi=3
条件10
SeV18+ OCT3/4/TSΔFベクター Moi=3
SeV18+ SOX2/TSΔFベクター Moi=3
SeV18+ KLF4/TSΔFベクター Moi=3
SeV(HNL) c-rMYC/TS15ΔFベクター Moi=9
条件11
SeV18+ OCT3/4/TSΔFベクター Moi=3
SeV18+ SOX2/TSΔFベクター Moi=3
SeV18+ KLF4/TSΔFベクター Moi=3
SeV(HNL) c-rMYC/TS15ΔFベクター Moi=30
条件12
SeV18+ OCT3/4/TSΔFベクター Moi=3
SeV18+ SOX2/TSΔFベクター Moi=3
SeV18+ KLF4/TSΔFベクター Moi=3
SeV(HNL) c-rMYC/TS15ΔFベクター Moi=90
条件13
ベクターなし【００９０】
上記ベクターを投与後、10%FBS/PS/DMEMで毎日培地交換を行い、37℃、5% CO2インキュベータにて培養した。その後、ゼラチンコート6ウェルプレートに用意したマイトマイシン処理済みフィーダー細胞(例えばMEF) 1.25×105(個)に対し、0.25%トリプシンで剥がした上記導入細胞の1.0×105(個)を添加し、その上で培養した。翌日、10%FBS/PS/DMEMから霊長類ES用培地(ReproCell社, RCHEMD001)(4 ng/ml になるようbFGFを添加した)に培地交換し、5% CO2インキュベータで培養した。培地交換は毎日もしくは二日に一度行った。培地はフィーダー細胞のコンディションドメディウムでも構わない。
感染27日後、MEF上に継代して21日後に、従来の方法（条件9〜12）と比較して3遺伝子搭載した条件下（条件1〜8）でヒトES細胞様のコロニー出現率の有意な上昇が見られ、特にMIO 90未満（条件1〜3, 5〜7）において高い効率でコロニーが出現した。ES細胞の未分化マーカーであるアルカリホスファターゼの活性をNBCT/BCIP(PIERCE, NBT/BCIP, 1-Step, # 34042) にて染色すると、従来の条件（上記条件9〜12）と比較してKOS（KLF-OCT-SOX）の遺伝子、OSK（OCT-SOX-KLF）の遺伝子の並びのベクターを用いた条件1〜8、特に条件1〜3 および 5〜7 において効率的にアルカリホスファターゼ陽性の青色に染まったコロニーが観察された(図5)。アルカリホスファターゼ陽性iPS様細胞の誘導効率は、従来の条件よりも効率的であった（図6）。また、KOS（KLF-OCT-SOX）の並びのベクターを用いた場合の方が、OSK（OCT-SOX-KLF）の並びのベクターを用いた場合よりも誘導効率は有意に高かった。【００９１】
[実施例８]
pSeV(PM)/TS7ΔFの構築
pSeV(PM)/TSΔFをPml I及びXho I消化して、約12.7kbpのバンドを切り出し、QIAquick Gel Extraction kitにて精製した。pSeV18+Oct3/4/TS7ΔF（国際公開番号 WO2010/008054）をNot Iで消化し、アガロースゲル電気泳動で分離後、約16.4Kbpのバンドを切り出し、QIAquik Gel Extraction kitにて精製した。その後、セルフライゲーションを行い、Oct3/4遺伝子を含むNotI断片を含まないクローンを選択し、pSeV18+/TS7ΔFを得た。pSeV18+/TS7ΔFをPml I及びXho I消化して、約3.6kbpのバンドを切り出し、QIAquick Gel Extraction kitにて精製した。これら2つの精製物を用いてライゲーションを行い、シークエンスにより配列の正しいクローンを選択し、pSeV(PM)/TS7ΔFを得た。このベクターは、P遺伝子およびM遺伝子の間に導入遺伝子挿入部位(NotI部位)を有する。【００９２】
[実施例９]
KLF4-OCT3/4-SOX2遺伝子搭載SeV/ TS7ΔFベクター作製用のプラスミドの作製
pSeV(PM)/TS7ΔFをNot Iで消化後、QIAquick PCR purification kitで精製し、BAP処理を行った。その後、QIAquick PCR purification kitで精製した。pSeV(PM)KOS/TSΔFをNot Iで消化し、1%アガロースゲル電気泳動により分離し、約3.6kbpのバンドを切り出し、Qiaquick Gel Extraction Kit (キアゲン、カタログ番号28706) で精製した。キットに付属の溶出液100μlに溶出した。このKLF4遺伝子、OCT3/4遺伝子、SOX2遺伝子を含むNot I断片をpSeV(PM)/TS7ΔFベクターのNot Iサイトにクローニングし、シークエンスにより配列の正しいクローンを選択し、pSeV(PM)KOS/TS7ΔFを得た。【００９３】
[実施例１０]
KLF4-OCT3/4-SOX2遺伝子搭載SeV/ TS7ΔFベクターの作製
293T/17細胞(Human embryonic kidney subclone 17, ATCC CRL-11286, Pear, W. S. et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8392-8396)にpCAGGS-NP, pCAGGS-P4C(-), pCAGGS-L(TDK), pCAGGS-T7, pCAGGS-F5Rおよび上記で示したセンダイウイルスベクタープラスミドpSeV(PM)KOS/TS7ΔFをそれぞれ0.5μg, 0.5μg, 2μg, 0.5μg, 0.5μgおよび5.0μgを混合し、TransIT-LT1 (Mirus) を15μl使用してトランスフェクションを行った。37℃のCO2インキュベーターで3日間培養した。その後、センダイウイルスの融合タンパク質（Fタンパク質）を発現する細胞LLC-MK2/F/Aを1ウェル当たり106細胞の割合でトランスフェクションを行った293T/17細胞に重層し、37℃のCO2インキュベーターで１日間培養した。翌日、細胞の培養液を除き、ペニシリンストレプトマイシンを添加したMEM培地（以下PS/MEM）1 mlで細胞を一度洗浄し、2.5μg/mlのトリプシンを含むPS/MEM培地（以下Try/PS/MEMとする）を１ウェル当たり1 ml添加し、32℃のCO2インキュベーターで２日間培養した。その後、適宜培地交換を行いながら、場合によっては、LLC-MK2/F/A細胞で継代を行いながら培養を継続した。培養上清の一部を赤血球凝集分析によりベクター回収の有無を確認し、十分な赤血球凝集反応が得られた後に培養上清を回収した。回収した培養上清よりQIAamp Viral RNA Mini Kit（キアゲン カタログ番号52906）を用いてRNAを回収し、搭載したKLF4-OCT3/4-SOX2遺伝子領域を標的にRT-PCRを行った。得られたRT-PCR産物はシークエンスにより正しい塩基配列であることを確認し、SeV(PM)KOS/TS7ΔFベクターを得た。
【００９４】
[実施例１１]
pSeV(PM)/TS12ΔFの構築
pSeV(PM)/TSΔFを鋳型にして、F3208 (5'-AGAGAACAAGACTAAGGCTACC-3' (配列番号：27))及びR3787(5'- ACCTTGACAATCCTGATGTGG-3' (配列番号：28))のプライマーを用いて、PrimeSterを使用し、94℃3分、（98℃10秒、55℃15秒、72℃1.5分）のサイクルを30サイクル、72℃5分、4℃∞の条件でPCRを行い、増幅された約600bpのバンドをQIAquick PCR purification kitにて精製した。pSeV18+Oct3/4/TS12ΔF(WO2010/008054)を鋳型にして、F2001 (5'- CCATCAACACTCCCCAAGGACC-3' (配列番号：29)) 及びR3390(5'- AGACGTGATGCGTTTGAGGCCC-3' (配列番号：30)) のプライマーを用いて、PrimeSterを使用し、94℃3分、（98℃10秒、55℃15秒、72℃1.5分） のサイクルを30サイクル、72℃5分、4℃∞の条件でPCRを行い、増幅された約1.4kbpのバンドをQIAquick PCR purification kitにて精製した。これらのPCR産物を混合し、F2001及びR3787のプライマーを用いて、PrimeSterを使用し、94℃3分、（98℃10秒、55℃15秒、72℃2分） のサイクルを30サイクル、72℃5分、4℃∞の条件でPCRを行った。そのPCR産物をQIAquick PCR purification kitにて精製し、SalI及びNot Iで消化後アガロースゲル電気泳動にて分離後、約1.6kbpのバンドを切り出し、QIAquick Gel Extraction kitにて精製した。pSeV(PM)/TSΔFをSalI及びNot Iで消化後アガロースゲル電気泳動にて分離後、約14.8kbpのバンドを切り出し、QIAquick Gel Extraction kitにて精製した。この2つのSalI及びNot I消化、精製産物を用いてライゲーションを行い、シークエンスにより配列を正しいクローンを選択し、pSeV(PM)/TS12ΔFを得た。このベクターは、P遺伝子およびM遺伝子の間に導入遺伝子挿入部位(NotI部位)を有する。【００９５】
[実施例１２]
KLF4-OCT3/4-SOX2遺伝子搭載SeV/ TS12ΔFベクター作製用のプラスミドの作製
pSeV(PM)/TSΔFをNot Iで消化後、QIAquick PCR purification kit(キアゲンカタログ番号28106)で精製し、BAP処理を行った。その後、QIAquick PCR purification kitで精製した。pSeV(PM)KOS/TSΔFをNot Iで消化し、1%アガロースゲル電気泳動により分離し、約3.6kbpのバンドを切り出し、Qiaquick Gel Extraction Kit (キアゲン、カタログ番号28706) で精製した。キットに付属の溶出液100μlに溶出した。このKLF4遺伝子、OCT3/4遺伝子、SOX2遺伝子を含むNot I断片をpSeV(PM)/TS12ΔFベクターのNot Iサイトにクローニングし、シークエンスにより配列の正しいクローンを選択し、pSeV(PM)KOS/TS12ΔFを得た。【００９６】
[実施例１３]
KLF4-OCT3/4-SOX2遺伝子搭載SeV/ TS12ΔFベクターの作製
293T/17細胞(Human embryonic kidney subclone 17, ATCC CRL-11286, Pear, W. S. et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8392-8396)にpCAGGS-NP, pCAGGS-P4C(-), pCAGGS-L(TDK), pCAGGS-T7, pCAGGS-F5Rおよび上記で示したセンダイウイルスベクタープラスミドpSeV(PM)KOS/TS12ΔFをそれぞれ0.5μg, 0.5μg, 2μg, 0.5μg, 0.5μgおよび5.0μgを混合し、TransIT-LT1 (Mirus) を15μl使用してトランスフェクションを行った。37℃のCO2インキュベーターで3日間培養した。その後、センダイウイルスの融合タンパク質（Fタンパク質）を発現する細胞LLC-MK2/F/Aを1ウェル当たり106細胞の割合でトランスフェクションを行った293T/17細胞に重層し、37℃のCO2インキュベーターで１日間培養した。翌日、細胞の培養液を除き、ペニシリンストレプトマイシンを添加したMEM培地（以下PS/MEM）1 mlで細胞を一度洗浄し、2.5μg/mlのトリプシンを含むPS/MEM培地（以下Try/PS/MEMとする）を１ウェル当たり1 ml添加し、32℃のCO2インキュベーターで２日間培養した。その後、適宜培地交換を行いながら、場合によっては、LLC-MK2/F/A細胞で継代を行いながら培養を継続した。培養上清の一部を赤血球凝集分析によりベクター回収の有無を確認し、十分な赤血球凝集反応が得られた後に培養上清を回収した。回収した培養上清よりQIAamp Viral RNA Mini Kit（キアゲン カタログ番号52906）を用いてRNAを回収し、搭載したKLF4-OCT3/4-SOX2遺伝子領域を標的にRT-PCRを行った。得られたRT-PCR産物はシークエンスにより正しい塩基配列であることを確認し、SeV(PM)KOS/TS12ΔFベクターを得た。
【００９７】
[実施例１４]
外来遺伝子を保持する温度感受性センダイウイルスベクターによるヒト新生児包皮由来繊維芽細胞（BJ）からのiPS細胞誘導
ヒト新生児包皮由来繊維芽細胞(BJ) (ATCC（www.atcc.org）, CRL-2522) を 10 % FBS (Cell Culture BioscienceCat. No. 171012) 及びペニシリン(100u/ml)ストレプトマイシン(100μg/ml)（ナカライテスク, Code 26253-84）を含むDMEM (GIBCO-BRL, 11995) (以下10%FBS/PS/DMEMとする)を用いて12ウェルプレートに 2.0x 105(個)で播き、37℃、5 % CO2インキュベータにて終夜培養した。
【００９８】
培養後、下記のベクター条件で上記培養した細胞に投与した。
条件１：従来型
SeV18+ OCT3/4/TSΔFベクター Moi=3
SeV18+ SOX2/TSΔFベクター Moi=3
SeV18+ KLF4/TSΔFベクター Moi=3
SeV(HNL) c-rMYC/TS15ΔFベクター Moi=3
条件2
SeV(PM) OSK/TSΔFベクター  Moi=3
SeV18+ KLF4/TSΔFベクター Moi=3
SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔFベクター  Moi=3
条件3
SeV(PM)KOS/TSΔFベクター  Moi=3
SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔFベクター  Moi=3
条件4
SeV(PM)KOS/TS7ΔFベクター  Moi=30
SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔFベクター Moi=30
条件5
SeV(PM)KOS/TS12ΔFベクター  Moi=30
SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔFベクター  Moi=30
条件6
ベクターなし【００９９】
上記ベクターを投与後、10%FBS/PS/DMEMで毎日培地交換を行い、36℃、37℃の各温度、5 % CO2インキュベータにて培養した。その後、ゼラチンコート6ウェルプレートに用意したマイトマイシン処理済みフィーダー細胞 (例えばMEF) 1.25×105(個)に対し、0.25 %トリプシンで剥がした上記導入細胞の1.0×105(個)を添加し、その上で培養した。翌日、10%FBS/PS/DMEMから霊長類ES用培地 (ReproCell社, RCHEMD001) (4 ng/ml になるようbFGFを添加した) に培地交換し、36℃、37℃の各温度で5% CO2インキュベータで培養した。培地交換は毎日もしくは二日に一度行った。培地はフィーダー細胞のコンディションドメディウムでも構わない。
感染28日目に、ES細胞の未分化マーカーであるアルカリホスファターゼの活性をNBCT/BCIP(PIERCE, NBT/BCIP, 1-Step, # 34042)にて染色すると、従来の条件（上記条件1）と比較して、KOS（KLF-OCT-SOX）を搭載したベクターを使用した条件では、アルカリホスファターゼ陽性の青色に染まったコロニーが観察された(図７)。温度感受性ベクターを用いた場合は、36℃がより効率的にアルカリホスファターゼ陽性iPS様細胞を誘導した。図８に各条件でのアルカリホスファターゼ陽性でiPS細胞様細胞の誘導効率を示す。アルカリホスファターゼ陽性iPS様細胞の誘導効率は、3初期化因子同時搭載させた温度感受性センダイウイルスベクターを用いても従来の条件よりも効率的であることを示している。ここで示した条件以外にも、SeV(PM)KOS/TS12ΔFベクターとSeV(HNL)c-rMYC/TS12ΔFベクター（WO2010/008054に記載したpSeV18+c-rMyc/TS12ΔFを用いて作製したHNとLの間にc-rMYCを搭載したTS12の変異を有するベクター）、SeV(PM)KOS/TS12ΔFベクターとSeV(HNL)c-rMYC/TS13ΔFベクター（WO2010/008054に記載したpSeV18+c-rMyc/TS13ΔFを用いて作製したHNとLの間にc-rMYCを搭載したTS13の変異を有するベクター）を用いても効率的にアルカリホスファターゼ陽性iPS様細胞の誘導に成功した。BJ細胞以外にもヒト成人皮膚由来繊維芽細胞HDF(Applications, Inc. 106-05A-1388; 36歳成人白人女性頬由来)やヒト胎児肺細胞由来繊維芽細胞（MRC5；ATCC, CCL-171）からのiPS細胞の誘導にも成功した。【０１００】
[実施例１５]
RT-PCRによるiPS細胞のＥＳマーカー発現
3初期化因子同時搭載センダイウイルスベクターにより誘導されたiPS細胞がESマーカー遺伝子を発現しているかを確かめるために、SeV(PM)KOS/TSΔFとSeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔFを用いて誘導、樹立したiPSクローンKOS-O1、KOS-O6、KOS-O7、KOS-O10（BJ細胞由来）、及びSeV(PM)OSK/TSΔF、SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔFおよびSeV18+KLF4/TSΔFを用いて誘導、樹立したiPSクローンOSKK1, OSKK2、OSKK4（BJ細胞由来）の株からトータルRNAを抽出し、ランダムプライマーを用いてRT反応を行い、各遺伝子検出用のプライマーを用いてPCRを行った。評価したＥＳ細胞マーカーは、NANOG、TERT, SALL4, ZFP42, TDGF1, DNMT3B, LIN28, GABRA3, CYP26A1, FOXD3, GDF3である。内部コントロールとしてβ-ACTINを用いた。また、センダイウイルスベクター検出のためのPCRも行った。図９に示したように、3初期化因子同時搭載センダイウイルスベクターにより誘導されたiPS細胞は、評価したすべてのESマーカー遺伝子を発現していることが確認された。また、センダイウイルスベクターRNAは検出されなかった。【０１０１】
同様にSeV(PM)KOS/TS12ΔFとSeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔFを用いて36℃で誘導、樹立したiPSクローン（BJ細胞、HDF細胞由来）においても評価したすべてのESマーカー遺伝子を発現していることが確認された（図１０）。
SeV(PM)KOS/TS12ΔFとSeV(HNL)c-rMYC/TS12ΔFを用いて37℃で誘導し、39℃で7日間培養を行い樹立したiPSクローン（BJ細胞、HDF細胞由来）においても評価したすべてのESマーカー遺伝子を発現していることが確認された（図１１）。また、センダイウイルスベクターRNAは検出されなかった。【０１０２】
なお使用した各プライマーは以下の通りである。NANOGについては、NANOG-F(CCACCATGAGTGTGGATCCAGCTTGTCC (配列番号：31))およびNANOG-R（CTCACACGTCTTCAGGTTGCATGTTC (配列番号：32)）TERTについてはTERT F2847（TGCCCGGACCTCCATCAGAGCCAG (配列番号：33)）およびTERT R3399（TCAGTCCAGGATGGTCTTGAAGTCTG (配列番号：34)）、Sall4についてはSall4 F（AAACCCCAGCACATCAACTC (配列番号：35)）およびSall4 R（GTCATTCCCTGGGTGGTTC (配列番号：36)）、Zfp42についてはZfp42-F1（ATGAGCCAGCAACTGAAGAAACGGGCAAAG (配列番号：37)）およびZfp42-R933（CTACTTTCCCTCTTGTTCATTCTTGTTCG (配列番号：38)）、TDGF1についてはTDGF1-F1（ATGGACTGCAGGAAGATGGCCCGC (配列番号：39)）およびTDGF1-R567（TTAATAGTAGCTTTGTATAGAAAGGC (配列番号：40)）、Dmmt3bについてはDnmt3b F（GCAGCGACCAGTCCTCCGACT (配列番号：41)）およびDnmt3b R（AACGTGGGGAAGGCCTGTGC (配列番号：42)）、LIN28についてはLIN28-F（CCACCATGGGCTCCGTGTCCAACCAGC (配列番号：43)）およびLIN28-R（GTCAATTCTGTGCCTCCGGGAGC (配列番号：44)）、GABRB3についてはGABRB3 F（CTTGACAATCGAGTGGCTGA (配列番号：45)）およびGABRB3 R（TCATCCGTGGTGTAGCCATA (配列番号：46)）、CYP26A1についてはCYP26A1 F（AACCTGCACGACTCCTCGCACA (配列番号：47)）およびCYP26A1 R（AGGATGCGCATGGCGATTCG (配列番号：48)）、FOXD3についてはFoxD3-F418（GTGAAGCCGCCTTACTCGTAC (配列番号：49)）およびFoxD3-R770（CCGAAGCTCTGCATCATGAG (配列番号：50)）、GDF3についてはGDF3 F（GGCGTCCGCGGGAATGTACTTC (配列番号：51)）およびGDF3 R（TGGCTTAGGGGTGGTCTGGCC (配列番号：52)、β-ACTINについてはbeta-actin-F（CAACCGCGAGAAGATGAC (配列番号：53)）およびbeta-actin-R（AGGAAGGCTGGAAGAGTG (配列番号：54)、センダイウイルスベクターについてはF15204（GGATCACTAGGTGATATCGAGC (配列番号：55)）およびR15397e（ACCAGACAAGAGTTTAAGAGATATGTATC (配列番号：56)【０１０３】
[実施例１６]
免疫染色によるiPS細胞のＥＳマーカー発現
3初期化因子同時搭載センダイウイルスベクターにより誘導されたBJ由来のiPS細胞クローンであるKOS-O1、KOS-O6、KOS-O7、KOS-O10の培養細胞をマイルドホルム１０N（和光純薬工業株式会社、カタログ番号133-10311）で固定を行った。抗Nanog抗体（リプロセル、カタログ番号RCAB0003P）、抗Oct3/4抗体（Santa Cruz社,カタログ番号sc‐5279）、抗SSEA4（Cell signaling、カタログ番号  4755S）抗体を用いて免疫染色を行った。この際、核を染色するために、同時にDAPI染色も行い蛍光顕微鏡にて観察した。その結果、評価したすべての3初期化因子同時搭載センダイウイルスベクターにより誘導されたBJ由来のiPS細胞クローンにおいて、ESマーカータンパク質の発現が確認された（図１２）。
SeV(PM)KOS/TS12ΔFとSeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔFを用いて36℃で誘導、樹立したHDF細胞由来のiPSクローン（図１３）、SeV(PM)KOS/TS12ΔFとSeV(HNL)c-rMYC/TS12ΔFを用いて37℃で誘導し、39℃で7日間培養を行い樹立したHDF細胞由来のiPSクローン（図１４）を各種抗体で免疫染色を行った。同時にDAPI染色も行い蛍光顕微鏡にて観察した。抗Nanog抗体（CSTジャパン株式会社、カタログ番号#4893S）、抗Oct3/4抗体（Santa Cruz社,カタログ番号sc‐5279）、抗SSEA4（Cell signaling、カタログ番号  4755S）、抗Tra-1-60抗体（Stemgent, カタログ番号09-0068）、抗Tra-1-81抗体（Stemgent, カタログ番号09-0069）を使用した免疫染色によりESマーカータンパク質の発現が確認された。その結果、評価したすべての3初期化因子同時搭載温度感受性センダイウイルスベクターを用いて誘導されたヒト成人（HDF）由来のiPS細胞クローンにおいて、ESマーカータンパク質の発現が確認された。
【０１０４】
[実施例１７]
in vitro におけるiPS細胞の多分化能
3初期化因子同時搭載センダイウイルスベクターにより誘導されたiPS細胞の多分化能を確認するため、in vitroの胚様体形成実験を行った。SeV(PM)KOS/TSΔFとSeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔFを用いて誘導を行い樹立したiPSクローンKOS-O6（BJ由来）、SeV(PM)OSK/TSΔF、SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔFおよびSeV18+KLF4/TSΔFを用いて誘導を行い、樹立したiPSクローンOSKK4（BJ由来）コロニーをコラゲナーゼIV (Invitrogen, 17104-019)でシャーレから剥がし、細胞塊をMPCコートのウェル(Nunc, 145383)に移し、 10 % FBSを含んだD-MEM中にて８日間浮遊培養を行い、胚様体の形成を顕微鏡下で確認した。センダイウイルスベクター誘導iPSは分化能を持っており、いずれのiPSも胚様体を形成し、多数の嚢胞状を含む胚様体が認められた（図１５）。その後、ゼラチン処理したプレートに継代し、さらに8日間培養を行った。その後、抗α-フェトプロテイン（AFP）抗体（シグマアルドリッジ、カタログ番号A8452）、抗Brachyury抗体（シグマアルドリッジ、カタログ番号B8436）、抗ヒトグリア線維性酸性蛋白質（GFAP）抗体（コスモバイオ、カタログ番号ROI003）を用いて抗免疫染色を行い蛍光顕微鏡で観察を行った結果、3初期化因子同時搭載センダイウイルスベクターにより誘導されたiPS細胞は、三胚葉分化できることが確認された（図１５）。【０１０５】
[実施例１８]
in vivo におけるiPS細胞の多分化能
BJ細胞由来のiPSクローンKOS-O6およびOSKK4を用いてin vivoでの多分化能を評価するために、免疫不全マウスへのテラトーマ形成で確認を行った。KOS-O6およびOSKK4クローンはSCIDマウス皮下および筋肉内に接種し、105日後に検体を回収し、10 %ホルマリン固定後、株式会社組織化学研究所に依頼し、パラフィン包埋、組織切片の作製、ヘマトキシリン・エオジン染色、病理解析を行い、三胚葉分化を確認した(図１５、１７、１８)。【０１０６】
[実施例１９]
核型解析
BJ細胞由来のiPSクローンKOS-O6およびOSKK4の核型解析を日本遺伝子研究所に依頼して行った。その結果、ともに46本の染色体を有し、核型が正常であることが示された（図１９）。【０１０７】
[実施例２０]
iPS細胞のプロモーター解析
ES細胞で発現する遺伝子プロモーターOct3/4のiPS細胞における活性化状況について、以下のバイサルファイトシークエンス法によりメチル化解析を行った。その結果、対照の親株BJおよびHDFではOct3/4プロモーターのメチル化が多く認められた。つまり、遺伝子発現は抑制されていることを示している。一方で、3初期化因子同時搭載センダイウイルスベクターにより誘導されたiPS細胞の各クローンに於いては、多くの脱メチル化が認められ、SeV-iPS細胞はES細胞同様にOct3/4プロモーター領域が活性化されていることが明らかになった (図２０)。【０１０８】
（バイサルファイトシークエンス法）
iPS細胞よりDNAゾル試薬（インビトロジェン、カタログ番号：10503027）または、Wizard Genomic DNA Purification Kit（プロメガ、カタログ番号：A1120）を用いて、キットのプロトコールに従いゲノムDNAを抽出した。次に、抽出したゲノムDNAををMethylEasy Xceed Rapid DNA Bisulphite Modification Kit（タカラ、コード番号：GE004）を用いて、キットのプロトコールに従いバイサルファイト修飾を行った。バイサルファイト修飾ゲノムDNAを鋳型としてOct3/4遺伝子のプロモーター領域を標的として特異的プライマーを用いてPCRを行った。PCR産物をQIAquick PCR purification kit（キアゲン、カタログ番号：28106）にて精製した。精製したPCR産物は、pGEM-T Easy Vector System I（プロメガ、カタログ番号：A1360）を用いて、キットのプロトコールに従い、TA-クローニングを行った。次に、コロニーPCR用のプライマーを用いてコロニーPCRを行った。コロニーPCRは、GoTaq Green Master Mix  （プロメガ、カタログ番号M7123）を用いて行った。その産物はアガロースゲル電気泳動を行いバンドサイズの正しいクローンを10クローン以上選択した。そのクローンについて、コロニーPCR産物をQIAquick PCR purification kit（キアゲン、カタログ番号：28106）にて精製し、T7プライマー、SP6プライマーを用いてシークエンスを行った。バイサルファイト修飾後の標的配列との比較を行いプロモーター領域のメチル化状態を評価した。【０１０９】
Oct3/4遺伝子プロモーター領域増幅用およびコロニーPCR用プライマー（J. Biol. Chem., 2005, Vol. 280, 6257-6260）
mOct4-3F: 5'-ATTTGTTTTTTGGGTAGTTAAAGGT-3'（配列番号：57）
mOct4-3R: 5'-CCAACTATCTTCATCTTAATAACATCC-3'（配列番号：58）
コロニーPCR用プライマー
PGEMT-F: 5'- CACGACGTTGTAAAACGACGGCC-3'（配列番号：59）
PGEMT-R: 5'- CAGCTATGACCATGATTACGCC -3'（配列番号：60）
シークエンス用のプライマー
T7: 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'（配列番号：61）
SP6: 5'-CATACGATTTAGGTGACACTATAG-3'（配列番号：62）【０１１０】
[実施例２１]
ベクターの除去
3初期化因子同時搭載温度感受性センダイウイルスベクターにより誘導されたiPS細胞からのベクターの除去を評価するために、SeV(PM)KOS/TS12ΔFとSeV(HNL)c-rMYC/TS12ΔFを用いて誘導したiPS細胞を39℃で1，2，3，4，5，6，7日間培養後、継代を行いさらに7日間培養を行ったiPS細胞を抗センダイウイルス抗体により免疫染色を行いベクターが除去されているかどうかを評価した。その結果、図２１に示したように39℃での培養3日目から培養時間依存的にセンダイウイルスベクターの除去割合が増加し、6から7日の培養によりベクターがほぼ完全に除去できることが示された。【０１１１】
[実施例２２]
ベクターの自然脱落
従来型の方法を用いて誘導されたiPS細胞を一般的な方法で継代培養することにより、センダイウイルスベクターが自然に除去されることが明らかとなっている（Fusaki N et al. (2009) Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci 85(8):348-362）。3初期化因子同時搭載センダイウイルスベクター、3初期化因子同時搭載温度感受性センダイウイルスベクターを用いて誘導されたiPS細胞についても自然除去が観察された。特に、SeV(PM)KOS/TS12ΔFとSeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF を用いて36℃で誘導されたiPS細胞は、従来型の方法で誘導した場合に比べてベクターの自然脱落の効率が非常に高いことが明らかになった。【０１１２】
従来型の方法で誘導されたBJ-iPSとSeV(PM)KOS/TS12ΔFとSeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF を用いて36℃で誘導されたBJ-iPS細胞を各3クローンピックアップし、37℃で継代を行い3、5、7継代目に一部の細胞を抗センダイウイルス抗体による免疫染色を行い、センダイウイルスの除去について検討を行った。その結果、SeV(PM)KOS/TS12ΔFとSeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF を用いて36℃で誘導されたBJ-iPS細胞は3継代目で3クローンの全てにおいてセンダイウイルスベクターが陰性となっていた。従来型は、3クローン中1クローンでベクター陰性となっていたが、残りの2クローンは7継代目においても完全にはベクター陰性には至らなかった（図２２）。【０１１３】
また、BJ細胞以外の細胞、例えば、ヒト成人皮膚由来繊維芽細胞HDF(Applications, Inc. 106-05A-1388; 36歳成人白人女性頬由来)やヒト胎児肺細胞由来繊維芽細胞（MRC5；ATCC, CCL-171）からSeV(PM)KOS/TS12ΔFとSeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF を用いて36℃で誘導されたiPS細胞についても、3から5継代目でベクターが除去されたことを確認した。
従って、SeV(PM)KOS/TS12ΔFとSeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF を用いて36℃で誘導されたiPS細胞は、ベクターの除去効率の非常に優れたiPS誘導法である。
【産業上の利用可能性】
【０１１４】
本発明により、複数のリプログラミング因子を１つのベクターの搭載することで、必要なセンダイウイルスベクターの数を減らしつつ、リプログラミングの効率を飛躍的に上昇させることが可能となった。得られた多能性幹細胞は、外来遺伝子が染色体に組み込まれていないため、本細胞を利用した試験、研究に好都合であるばかりでなく、疾病の治療においても免疫拒絶の問題や倫理面の問題を回避でき、さらに遺伝毒性に基づく癌化の危険性を回避することが期待できる。
【図１】
0005908838.tif 000002
【図２】
0005908838.tif 000003
【図３】
0005908838.tif 000004
【図４】
0005908838.tif 000005
【図５】
0005908838.tif 000006
【図６】
0005908838.tif 000007
【図７】
0005908838.tif 000008
【図８】
0005908838.tif 000009
【図９】
0005908838.tif 000010
【図１０】
0005908838.tif 000011
【図１１】
0005908838.tif 000012
【図１２】
0005908838.tif 000013
【図１３】
0005908838.tif 000014
【図１４】
0005908838.tif 000015
【図１５】
0005908838.tif 000016
【図１６】
0005908838.tif 000017
【図１７】
0005908838.tif 000018
【図１８】
0005908838.tif 000019
【図１９】
0005908838.tif 000020
【図２０】
0005908838.tif 000021
【図２１】
0005908838.tif 000022
【図２２】
0005908838.tif 000023
【配列表】
0005908838000001.app