(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬学的に許容される賦形剤、担体または添加剤中に
(a)免疫刺激ポリペプチド、および
(b)ナノ粒子
を含む医薬組成物であって、前記免疫刺激ポリペプチドが、CD40を活性化する能力がある抗体、またはその抗原結合性フラグメントであり、前記ナノ粒子が、ポリグルタミン酸(PGA)を含むか、またはPGAからなり、前記免疫刺激ポリペプチドおよびナノ粒子が、混合物として提供される、医薬組成物。
【請求項２】
免疫刺激ポリペプチドが、ナノ粒子に非共有結合で結合されている、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
相乗的免疫刺激効果を提示する能力がある、請求項1または2に記載の組成物。
【請求項４】
抗がん組成物、ワクチン組成物および抗ウイルス組成物からなる群から選択される、請求項1から3のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
ポリペプチドが、樹状細胞(DC)などのプロフェッショナル抗原提示細胞(APC)を活性化する能力がある、請求項1から4のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
ポリペプチドが、CD40を活性化する能力がある、請求項5に記載の組成物。
【請求項７】
ポリペプチドが、リンパ球を刺激する能力がある、請求項1から6のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
ポリペプチドが、インタクトな抗体である、請求項1から7のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
ポリペプチドが、抗体の抗原結合性フラグメントである、請求項1から7のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
抗原結合性フラグメントが、Fvフラグメント(例えば、単鎖Fv、ジスルフィド結合Fv、およびドメイン抗体)およびFab様フラグメント(例えば、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、およびF(ab)2フラグメント)からなる群から選択される、請求項9に記載の組成物。
【請求項１１】
抗体が組換え抗体である、請求項1から10のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
抗体がモノクロナール抗体である、請求項1から11のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
抗体が、ヒト抗体またはヒト化抗体である、請求項1から12のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
抗体が、CD40に特異的に結合する能力がある、請求項1から13のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
抗体が、CD40のドメイン1のモジュールB2、またはそれを含むエピトープに特異的に結合する能力がある、請求項14に記載の組成物。
【請求項１６】
ポリペプチドが、CD40を介してT細胞を活性化する能力があり、かつ/またはCD40発現腫瘍細胞に対して直接的なアポトーシス効果を及ぼす能力がある、請求項1から15のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
PGAが、γ-PGA、α-PGA、PGAの水溶性塩、およびPGAの金属塩からなる群から選択される、請求項1から16のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
ナノ粒子が、γ-PGAを含むか、またはγ-PGAからなる、請求項1から17のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
ナノ粒子が、疎水性アミノ酸またはそのエステルをさらに含む、請求項17または18に記載の組成物。
【請求項２０】
疎水性アミノ酸がフェニルアラニンである、請求項19に記載の組成物。
【請求項２１】
ナノ粒子が、γ-PGA鎖上にコンジュゲートされたフェニルアラニンエチルエステルを含むか、または該エステルからなる、請求項1から20のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
ナノ粒子が生分解性である、請求項1から21のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
ナノ粒子が、50nm〜500nm、例えば、100nm〜300nmの平均粒子直径を有する、請求項1から22のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
ナノ粒子が、200nmの平均粒子直径を有する、請求項23に記載の組成物。
【請求項２５】
ナノ粒子が、負の表面電荷を有する、請求項1から24のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
負の表面電荷が、-10mV〜-35mVである、請求項25に記載の組成物。
【請求項２７】
ナノ粒子が、toll様受容体(TLR)に結合する能力がある、請求項1から26のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
toll様受容体が、TLR-2およびTLR-4からなる群から選択される、請求項27に記載の組成物。
【請求項２９】
(a)抗CD40抗体またはその抗原結合性フラグメント、および
(b)γ-PGAにコンジュゲートされたフェニルアラニンエチルエステルを含むか、または該エステルからなるナノ粒子
を含む、請求項1から28のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３０】
ナノ粒子が、200±50nmの平均粒子直径を有する、請求項29に記載の組成物。
【請求項３１】
抗原をさらに含む、請求項1から30のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３２】
抗原が、がん細胞抗原である、請求項31に記載の組成物。
【請求項３３】
非経口的に、例えば、腫瘍内または腫瘍近傍への局部(腫瘍内、腫瘍周囲内、腫瘍周囲、結節内など)、静脈内、筋内、皮下、髄腔内、脳内および/または脳室内に投与するための、請求項1から32のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３４】
薬剤中で使用するための請求項1から33のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３５】
患者の免疫系を刺激するのに使用するための、請求項1から34のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３６】
がんの治療で使用するための、請求項1から35のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３７】
がんが、リンパ腫、黒色腫、肝癌、骨肉腫、腎細胞癌、膀胱癌、乳がん、結腸直腸癌、肺がん、消化器がん、膵がん、前立腺がん、卵巣がん、腎臓がん、および白血病からなる群から選択される、請求項36に記載の組成物。
【請求項３８】
化学療法、放射線療法および/または手術などの1種または複数の通常の抗がん療法と組み合わせて使用するための、請求項36または37に記載の組成物。
【請求項３９】
ウイルス感染症の治療で使用するための、請求項1から35のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４０】
ウイルス感染症がHIVである、請求項39に記載の組成物。
【請求項４１】
自己免疫疾患の治療で使用するための、請求項1から35のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４２】
患者の免疫系を刺激するための医薬の調製における、請求項1から33のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項４３】
がんの治療で使用するための医薬の調製における、請求項1から33のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項４４】
がんが、リンパ腫、黒色腫、肝癌、骨肉腫、腎細胞癌、膀胱癌、乳がん、結腸直腸癌、肺がん、消化器がん、膵がん、前立腺がん、卵巣がん、腎臓がん、および白血病からなる群から選択される、請求項43に記載の使用。
【請求項４５】
医薬が、化学療法、放射線療法および/または手術などの1種または複数の通常の抗がん療法と組み合わせて使用するためのものである、請求項43または44に記載の使用。
【請求項４６】
ウイルス感染症の治療で使用するための医薬の調製における、請求項1から33のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項４７】
ウイルス感染症がHIVである、請求項46に記載の使用。
【請求項４８】
自己免疫疾患の治療で使用するための医薬の調製における、請求項1から33のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項４９】
(a)免疫刺激ポリペプチド、および
(b)ポリグルタミン酸(PGA)を含むか、またはPGAからなるナノ粒子
を含むキットであって、前記免疫刺激ポリペプチドが、CD40を活性化する能力がある抗体、またはその抗原結合性フラグメントである、キット。
【請求項５０】
成分(a)および(b)が、薬学的に許容される添加剤、賦形剤または担体中で別個に製剤化される、請求項49に記載のキット。
【請求項５１】
成分(a)および(b)が、それぞれ、他方と併用投与するのに適した形態で提供される、請求項49または50に記載のキット。
【請求項５２】
成分(a)および/または(b)が凍結乾燥されている、請求項49から51のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５３】
成分(a)および(b)が、それぞれ、密封された滅菌容器中に提供される、請求項49から52のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５４】
成分(a)が、請求項5から16のいずれか一項中で定義されたものである、請求項49から53のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５５】
成分(b)が、請求項17から30のいずれか一項中で定義されたものである、請求項49から54のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５６】
免疫刺激ポリペプチドおよびナノ粒子を、薬学的に許容される賦形剤、担体または添加剤と一緒に混合するステップを含む、請求項1から33のいずれか一項に記載の医薬組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、がんもしくはウイルス感染症の治療で、またはワクチン接種の際に、対象の免疫系を刺激するのに使用するための組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
がん免疫療法
がんは、先進諸国における第2の主要死亡原因である。いくつかの腫瘍の治療は、この数十年で相当に進歩した。しかし、手術、放射線療法および化学療法などの通常のがん療法は、とりわけ播種性のがん形態の場合、代替の取組みで補完される必要がある。1つの有望な取組みが、がん細胞を制御および破壊することができる効果的で特異的な免疫応答を誘導することを目指した、がん免疫療法である。
【０００３】
がん細胞が特異的な免疫応答をしばしば誘起しても、応答は、悪性細胞を排除するには十分でないのが通常である。これは、抗腫瘍免疫応答を遮断する腫瘍介在性免疫抑制機構のためである1。しかし、これらの免疫抑制機構を、1)樹状細胞(DC)などのプロフェッショナル抗原提示細胞(APC)を例えばCD40またはtoll様受容体(TLR)を介して活性化すること、2)IL-2、IL-12およびIFN-αなどのサイトカインを使用してリンパ球を刺激すること、または3)T細胞の活性化を抑制するシグナルを、例えば、細胞障害性T-リンパ球抗原4(CTLA-4)または抑制性受容体プログラム細胞死1(PD-1)を標的とすることによって遮断することを目指した免疫療法戦略によって、逆転させることができる。
【０００４】
免疫療法は、例えば、膀胱癌および悪性黒色腫の治療にすでに使用されている。膀胱がんにおけるサイトカイン環境は、免疫抑制的プロファイルを有することが立証されており、該プロファイルにより、該環境は免疫療法的介入のための妥当な標的となる2。実際、生存弱毒化カルメット・ゲラン桿菌(BCG)を用いる膀胱内治療は、膀胱がんの免疫療法のために日常的に使用されている2。いくつかの免疫療法が、悪性黒色腫の治療についても試みられてきた。腫瘍浸潤Tリンパ球注入を高用量のIL-2と組み合わせて使用する免疫療法的取組みは、かなりの客観的応答をもたらすことが示された。しかし、これらの適応症のためのより有効な免疫療法戦略に対する大きな必要性が存在する。
【０００５】
CD40は、免疫系において中心的な役割を演じ、その役割により、CD40は免疫療法のための非常に興味ある標的となる。CD40は、腫瘍壊死因子受容体(TNFR)ファミリーのメンバーであり、B細胞、単球および樹状細胞など、免疫系の種々の細胞上で発現され、一方、CD40リガンド(CD40L)は、主として活性化T細胞において発現される3。CD40L介在性シグナル伝達は、活性化、増殖、アポトーシスからの救済、ならびにサイトカインおよびケモカインの産生を含む、いくつかの生物学的事象を誘発する3。動物モデルおよび臨床試験を含む免疫療法の状況において、抗CD40抗体が、CD40の直接的刺激のために3〜6、自己免疫障害の治療に関してCD40-CD40L相互作用を遮断するために、または腫瘍細胞の直接標的化によって7、8使用されてきた。抗CD40抗体は、作動性である、すなわちCD40を介して細胞を活性化することができるか、または拮抗性、すなわちCD40のCD40L誘導性活性化を遮断することができると記載されてきた。免疫応答の活性化または耐性破壊を目指した免疫療法的応用の場合、強い作動性の抗体が求められる。このような抗体の刺激/活性化の有効性を向上させることのできる方法は、きわめて好都合である。
【０００６】
CD40は、免疫系で中心的役割を演じるI型膜タンパク質である。CD40は、腫瘍壊死因子受容体(TNFR)ファミリーのメンバーであり、種々の細胞、例えば、B細胞および樹状細胞(DC)に、ならびにいくつかの部類の癌において発現される1、2。CD40リガンド(CD40L)は、活性化されたT細胞において主として発現される1〜7。CD40L介在性シグナル伝達は、免疫、細胞活性化、増殖、ならびにサイトカインおよびケモカインの産生を含むいくつかの生物学的事象を誘発する(1、2によって概説されている)。さらに、このシグナル伝達はまた、いくつかのがん細胞においてアポトーシスを誘導する(8〜10で概説されている)。
【０００７】
CD40を介してシグナルを誘導するための最低要件は受容体二量体の形成であること11、および受容体介在性シグナルの強度は、細胞外で適用されるリガンドの原子価増大と相互に関連していること12、が示されている。CD40を介する細胞内シグナル伝達は、種々の細胞内認識モチーフと相互作用するアダプター分子(最も顕著にはTNFR関連因子(TRAF)ファミリー)に依存する13〜15。CD40の細胞外架橋は、これらの細胞内アダプター分子の安定化につながり、安定化は、次いで、シグナル伝達カスケードを開始させる。
【０００８】
CD40アゴニストの効果には、2つの面、すなわち、i)腫瘍に特異的なT細胞の応答をもたらす免疫活性化、およびii)CD40を発現している腫瘍に対する直接的アポトーシス効果(腫瘍型による)がある。多くの研究において、機構を区別することは困難であったが、CD40アゴニストは、CD40陰性腫瘍に対しても抗腫瘍効果を有することが立証された16。CD40の刺激はまた、がんワクチン中のアジュバントとして使用できる潜在能力を有する。
【０００９】
前臨床研究は、いくつかのがん型の作動性抗CD40抗体治療についての概念の証拠を立証した16〜21。この抗体治療は、リンパ腫、黒色腫、肝癌、骨肉腫、腎細胞癌、乳がんなどに対して抗腫瘍効果を有することが立証された。強力な抗腫瘍効果に加えて、全身性抗CD40治療はまた、副作用(ショック症候群、サイトカイン放出症候群(CRS))をもたらすことが示された。しかし、これらの副作用は、抗CD40抗体を腫瘍中に直接に注入した場合には認められず、さらにそれは全身性抗腫瘍効果をもたらした16。片側腹部において腫瘍内で処置されたマウスは、反対側の側腹部の腫瘍を消去することができた16。この抗腫瘍効果は、DC活性化およびそれに続くCTL応答の活性化に依存し21、また、腫瘍再チャレンジに対して防御免疫をもたらした。これらの結果は、Jackamanらによって検証された22。Jackamanらは、悪性中皮腫モデル(C57BL/6J)において、抗CD40抗体の単独での、またはIL-2と組み合わせた腫瘍内注入を研究した。
【００１０】
いくつかのヒト化またはヒト抗CD40抗体が、前臨床モデルで評価された23〜31。これらの抗体は、SCIDマウス中に異種移植されたヒト腫瘍をベースにしたモデルにおいてインビボで評価された。CD40陰性腫瘍に対する効果が、1つの研究で、ヒト単球由来樹状細胞(単球由来樹状細胞)および未処理T細胞で再配置されたSCIDを使用して立証された(Gladue、2008、ASCO)。
【００１１】
したがって、がん療法においてCD40アゴニストを使用する圧倒的多数の前臨床研究は、きわめて強力な抗腫瘍効果を立証した。局部的な腫瘍内CD40刺激は、全身性CD40刺激に付随する副作用なしに、全身性抗腫瘍効果および転移消去効果を引き起こすことが立証された。
【００１２】
抗CD40治療は、フェーズI臨床試験において有望な結果をもたらし、これまで試験されたあらゆる抗CD40タンパク質薬について、客観的な臨床的応答が報告された10。がん療法に関する臨床試験に供されたCD40アゴニスト(最近、Vonderheideによって概説されている10；32)としては、1つの強作動性抗CD40抗体であるCD40L(Avrend)33、(PfizerからのCP-870,893)34、および1つの弱アゴニスト(SGN-40、ダセツズマブ、Seattle Genetics/Genentech)が挙げられる。
【００１３】
ナノ粒子
ナノ粒子、すなわち、典型的にはほぼ100〜300nmの直径を有する粒子は、免疫療法の分野で大きな潜在能力を有する新規なツールである。ナノ粒子は、該粒子の表面に結合された、または該粒子内に封入されたDNA、RNAまたはタンパク質などの生体分子の効率的な輸送体として使用することができる。種々のナノ粒子変形体が、担持された生体分子の徐放出、および細胞障害性Tリンパ球(CTL)応答の誘導のための抗原提示細胞の活性化の双方に関して大きな潜在能力を示した10。現在、ポリスチレン粒子、ポリ(乳酸-co-グリコール酸)(PLGA)粒子、およびポリ(γ-グルタミン酸)(γ-PGA)粒子などのいくつかの種々の粒子型が、ナノ医療での応用に関して評価されている。ポリスチレン粒子は、DCの成熟を引き起こすのに有効であることが示されたが11、それらの粒子は、生分解性でなく、それゆえ治療的応用にあまり適していない。一方、PLGA粒子は、完全に生分解性であるが、水溶性タンパク質の低い封入効率、およびナノ粒子の製剤化、貯蔵および凍結乾燥中に現れる不安定性など、この方法に付随する諸問題が存在する。最近、完全に生分解性である自己会合性両親媒性ポリマー型γ-PGAナノ粒子をベースにした新規なタンパク質送達システムが発表された36。これらの粒子は、タンパク質送達に関して効率的であり、ワクチンモデル系において特異的なT細胞応答を誘導するのに使用できることが立証された10。
【００１４】
がん治療で使用するための、デキストランをベースにした粒子中に封入された抗CD40抗体を含む徐放性組成物も報告されている45。使用されるデキストラン粒子は、マイクロスケールの範囲で存在し、該粒子内に抗体を封入するように構築された。局部投与の取組みにおけるこのような徐放性製剤の目標は、抗体の全身性放出に付随する毒性および他の有害作用を低減するために、治療すべき局部領域からの抗体の漏出を最小化することを含めていくつか存在する。加えて、徐放出は、投与頻度の低減を達成できる可能性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】米国特許第4816567号
【特許文献２】欧州特許出願公開第1932538号
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Baal JWら、「An improved protocol for generation of immuno-potent dendritic cells through direct electroporation of CD14+ monocytes」、J Immuno Methods 2007;321(1-2)、94〜106頁
【非特許文献２】Pound JDら、「Minimal cross-linking and epitope requirements for CD40-dependent suppression of apoptosis contrast with those for promotion of the cell cycle and homotypic adhesions in human B cells」、Int Immunol 1999、11(1)、11〜20頁
【非特許文献３】Orlandiら、1989、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:3833〜3837頁
【非特許文献４】Winterら、1991、Nature 349:293〜299頁
【非特許文献５】Kohlerら、1975、Nature 256:495〜497頁
【非特許文献６】Kozborら、1985、J. Immunol. Methods 81:31〜42頁
【非特許文献７】Coteら、1983、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026〜2026-2030頁
【非特許文献８】Coleら、1984、Mol. Cell. Biol. 62:109〜120頁
【非特許文献９】「Monoclonal Antibodies:A manual of techniques」、H Zola(CRC Press,1988)
【非特許文献１０】「Monoclonal Hybridoma Antibodies:Techniques and Applications」、JGR Hurrell(CRC Press、1982)
【非特許文献１１】Harlow& Lane、1988、「Antibodies:A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory、ニューヨーク
【非特許文献１２】Jonesら、1986、Nature 321:522〜525頁
【非特許文献１３】Riechmannら、1988、Nature 332:323〜329頁
【非特許文献１４】Presta、1992、Curr. Op. Struct. Biol. 2:593〜596頁
【非特許文献１５】Verhoeyenら、1988、Science 239:1534〜1536頁
【非特許文献１６】CarlssonおよびSoderlind、2001、Expert Rev Mol Diagn.1(1):102〜8頁
【非特許文献１７】HoogenboomおよびWinter、1991、J. Mol. Biol. 227:381頁
【非特許文献１８】Marksら、1991、J. Mol. Biol. 222:581頁
【非特許文献１９】Coleら、1985、Monoclonal antibodies and Cancer Therapy、Alan R. Liss、77頁
【非特許文献２０】Boernerら、1991、J. Immunol. 147:86〜95頁
【非特許文献２１】Naismithら、「Modularity in the TNF-receptor family」、Trends in Biochem. Sci 1998、23:74〜79頁
【非特許文献２２】Ellmarkら、「Modulation of the CD40-CD40 ligand interaction etc」2002、Immunology 106:456〜463
【非特許文献２３】Pound JD、Int Immunol 1999;11(1):11〜20頁
【非特許文献２４】Ledbetterら、Critical Reviews in Immunology 1997
【非特許文献２５】Remington:The Science and Practice of Pharmacy、第19版、1995年、Alfonso Gennaro編、Mack Publishing Company、ペンシルヴェニア州、米国
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
免疫療法およびナノ粒子の使用の分野における上記の発展にもかかわらず、免疫系を刺激するための新たな療法に対する必要性が、とりわけがん治療において依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明の第1態様は、医薬として許容される賦形剤、担体または添加剤中に、
(a)免疫刺激ポリペプチド、および
(b)ナノ粒子
を含み、前記ナノ粒子が、ポリグルタミン酸(PGA)を含むか、またはPGAからなる、医薬組成物を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本明細書中で使用する場合、「医薬組成物」は、本発明による治療上有効な製剤を意味する。
【００２０】
「治療有効量」、「有効量」、または「治療上有効な」は、本明細書中で使用する場合、所定の状態および投与レジメンに関して治療効果(例えば、免疫系の刺激)を提供する量を指す。これは、必要とされる添加物および賦形剤、すなわち担体または投与媒質と共同して所望の治療効果をもたらすように計算された活性材料のあらかじめ決められた分量である。さらに、それは、宿主の活動、機能および応答の臨床的に意味のある不足を縮小、最も好ましくは予防するのに十分な量を意味すると解釈される。あるいは、治療有効量とは、宿主における臨床的に意味のある状態の改善を引き起こすために十分な量である。当業者によって認識されるように、化合物の量は、その具体的な活性に応じて変えることができる。適切な投与量は、必要とされる賦形剤と共同して所望の治療効果をもたらすように計算されたあらかじめ決められた量の活性組成物を含むことができる。本発明の組成物の製造のための方法および使用では、治療有効量の活性成分が提供される。治療有効量は、当技術分野で周知のように、年齢、体重、性別、状態、合併症、他の疾患などの患者の特徴をベースにして、医学および獣医学に関わる当業者が決定することができる。
【００２１】
当業者は、このような有効量の本発明の組成物を、単回のボーラス投与(すなわち、急性投与)として、またはより好ましくは、長期にわたる一連の投与(すなわち、慢性投与)として送達することができることを認識するであろう。また、有効量の組成物は、局部または全身投与によって送達することができる。
【００２２】
一実施形態において、免疫刺激ポリペプチドおよびナノ粒子は、混合物(すなわち、成分は、互いに共有結合で連結されず、または互いの内部に封入され、例えば、免疫刺激ポリペプチドはナノ粒子内に封入される)として提供される。このような混合物は、好都合には、2種の成分の任意選択で洗浄ステップを伴う単純な混合によって製造することができ、そのため、免疫刺激ポリペプチド成分の完全性を傷害する可能性のある溶媒の必要性を回避する、迅速かつロバストなプロトコールを可能にする(後記実施例を参照されたい)。
【００２３】
当業者は、混合される成分が、組成物中で最初は別個に製剤化されても、それにもかかわらず非共有結合により互いに対して会合または吸着し得ることを認識するであろう。したがって、一実施形態において、免疫刺激ポリペプチド分子の一部または全部は、ナノ粒子上に非共有結合により固定化される、例えば、ナノ粒子の表面上に吸着される可能性がある。このような吸着は、きわめて穏やかで、ナノ粒子表面への抗体の共有結合性カップリングまたは固定化などの化学的修飾を使用するプロトコールと比較して、免疫刺激ポリペプチド(例えば、抗体)の機能活性の喪失を引き起こすことがより少ない36。
【００２４】
好ましい一実施形態において、組成物は、インビトロおよび/またはインビボで相乗的免疫刺激効果を提示する能力がある。「相乗的」とは、この関連において、成分(a)および(b)の双方を含む組成物が、免疫系(またはその構成要素)を、それらの単独で投与された成分(a)および(b)の相加的免疫刺激効果に比べて、より大きな程度まで活性化することを意味する。
【００２５】
当業者は、本発明の組成物が、いくつかの異なる目的に関して対象の免疫系を刺激するのに適していることを認識するであろう。したがって、本発明は、抗がん組成物、ワクチン組成物、および抗ウイルス組成物を包含する。
【００２６】
本発明の組成物の第1の必須成分は、免疫刺激ポリペプチドである。
【００２７】
一実施形態において、ポリペプチドは、樹状細胞(DC)などのプロフェッショナル抗原提示細胞(APC)を活性化する能力がある。このようなポリペプチドを同定することは、例えば、Baal JWら、「An improved protocol for generation of immuno-potent dendritic cells through direct electroporation of CD14+ monocytes」、J Immuno Methods 2007;321(1-2)、94〜106頁中に記載のような当技術で周知の方法を使用して完遂することができる。
【００２８】
ポリペプチドがCD40を活性化する能力がある、請求項6に記載の組成物。
【００２９】
代替としてまたは付加的に、ポリペプチドは、リンパ球を刺激する能力があってもよい。さらに、このような特性を提示するポリペプチドは、例えば、Pound JDら、「Minimal cross-linking and epitope requirements for CD40-dependent suppression of apoptosis contrast with those for promotion of the cell cycle and homotypic adhesions in human B cells」、Int Immunol 1999、11(1)：11〜20頁中に記載のような当技術分野で周知の方法を使用して同定することができる。
【００３０】
特定の一実施形態において、本発明の組成物のポリペプチド成分は、抗体、またはその抗原結合性フラグメントである。
【００３１】
「抗体」としては、実質的にインタクトな抗体分子、およびキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、単鎖抗体、二重特異性抗体(例えば、CD40、およびCD137などの別の免疫刺激受容体に対して親和性を有する)、抗体の重鎖、抗体の軽鎖、抗体の重鎖および/または軽鎖のホモ二量体およびヘテロ二量体、ならびにこれらの抗原結合性フラグメントおよび誘導体が挙げられる。
【００３２】
「抗原結合性フラグメント」とは、インタクトな「親」抗体と同様の抗原に結合する能力がある、抗体の機能性フラグメントを意味する。
【００３３】
例えば、抗原結合性フラグメントは、Fvフラグメント(例えば、単鎖Fvおよびジスルフィド結合Fv)、Fab様フラグメント(例えば、Fabフラグメント、Fab'フラグメントおよびF(ab)2フラグメント)、単鎖可変領域(例えば、VHおよびVL領域)、ならびにドメイン抗体(単一および二重フォーマット(すなわち、dAb-リンカー-dAb)を含むdAb]からなる群から選択できる。
【００３４】
抗体フラグメントを使用することの考え得る利点は、全抗体に比べてむしろ数倍になる。フラグメントの大きさが小さいほど、固形組織のより良好な浸透性などの改善された薬理学的特性につながる可能性がある。さらに、Fab、Fv、ScFvおよびdAb抗体フラグメントなどの抗原結合性フラグメントを、大腸菌(E.coli)中で発現させ、それから分泌させることができ、そのため、前記フラグメントの容易な大量製造を可能にする。
【００３５】
また、本発明の範囲には、例えば、ポリエチレングリコールまたは他の適切なポリマーの共有結合によって修飾された抗体およびその抗原結合性フラグメントの修飾バージョンが包含される。
【００３６】
抗体および抗体フラグメントを作出する方法は、当技術分野で周知である。例えば、抗体は、抗体分子のインビボ産生の誘導、免疫グロブリンライブラリーのスクリーニング(Orlandiら、1989、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:3833〜3837頁;Winterら、1991、Nature 349:293〜299頁)、または培養中での細胞株によるモノクロナール抗体分子の作出を採用するいくつかの方法のいずれか1つを介して作出することができる。これらの方法としては、限定はされないが、ハイブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術、およびエプスタイン-バーウイルス(EBV)-ハイブリドーマ技術(Kohlerら、1975、Nature 256:495〜497頁;Kozborら、1985、J. Immunol. Methods 81:31〜42頁;Coteら、1983、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026〜2030頁;Coleら、1984、Mol. Cell. Biol. 62:109〜120頁)が挙げられる。
【００３７】
選択された抗原に対して適切なモノクロナール抗体は、公知技術、例えば、「Monoclonal Antibodies:A manual of techniques」、H Zola(CRC Press,1988)および「Monoclonal Hybridoma Antibodies:Techniques and Applications」、JGR Hurrell(CRC Press、1982)に開示の技術によって調製することができる。
【００３８】
抗体フラグメントは、当技術分野で周知の方法を使用して得ることができる(例えば、HarlowおよびLane、1988、「Antibodies:A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory、ニューヨークを参照されたい)。例えば、本発明による抗体フラグメントは、抗体のタンパク質分解性加水分解によって、または該フラグメントをコードするDNAの大腸菌(E.coli)もしくは哺乳動物細胞(例えば、チャイニーズハムスター卵巣培養物または他のタンパク質発現系)中での発現によって調製することができる。代替として、抗体フラグメントは、従来法による全抗体のペプシンまたはパパイン消化によって得ることができる。
【００３９】
当業者は、ヒトの治療または診断のために、ヒト抗体またはヒト化抗体が好ましくは使用されることを認識するであろう。非ヒト(例えば、ネズミ)抗体のヒト化された形態は、非ヒト抗体に由来する好ましくは最小限の部分を有する、遺伝子操作されたキメラ抗体または抗体フラグメントである。ヒト化抗体としては、ヒト抗体(レシピエント抗体)の相補性決定領域が、所望の機能性を有するマウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種(ドナー抗体)の相補性決定領域からの残基によって置き換えられている抗体が挙げられる。一部の例では、ヒト抗体のFvフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基で置き換えられる。ヒト化抗体は、レシピエント抗体中または導入された相補性決定領域またはフレームワーク配列中のどちらにも見出されない残基を含むこともある。一般に、ヒト化抗体は、相補性決定領域のすべてまたは実質的にすべてが、非ヒト抗体のそれに対応し、フレームワーク領域のすべてまたは実質的にすべてが、関連するヒトコンセンサス配列のそれに対応する、少なくとも1つの、典型的には2つの可変領域の実質的にすべてを含む。ヒト化抗体は、最適には、また、ヒト抗体から典型的には由来するFc領域などの、抗体の定常領域の少なくとも一部を含む(例えば、Jonesら、1986、Nature 321:522〜525頁;Riechmannら、1988、Nature 332:323〜329頁;Presta、1992、Curr. Op. Struct. Biol. 2:593〜596頁を参照されたい)。
【００４０】
非ヒト抗体をヒト化する方法は、当技術分野で周知である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からその中に移入された1つまたは複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、移入残基と呼ばれ、典型的には、移入される可変領域から採取される。ヒト化は、ヒト相補性決定領域をげっ歯類の対応する相補性決定領域で置換することによって、本質的には記載のように実施することができる(例えば、Jonesら、1986、Nature 321:522〜525頁;Reichmannら、1988、Nature 332:323〜327頁;Verhoeyenら、1988、Science 239:1534〜1536頁;米国特許第4816567号を参照されたい)。したがって、このようなヒト化抗体は、キメラ抗体であり、ここで、インタクトなヒト可変領域よりも実質的により少ない領域が、非ヒト種からの対応する配列で置き換えられていた。実際、ヒト化抗体は、典型的には、一部の相補性決定領域の残基および場合によっては一部のフレームワーク残基が、げっ歯類の抗体中の類似部位からの残基で置き換えられているヒト抗体であってよい。
【００４１】
ヒト抗体はまた、ファージディスプレライブラリーを含め、当技術分野で公知の種々の技術を使用して同定することができる(例えば、CarlssonおよびSoderlind、2001、Expert Rev Mol Diagn. 1(1):102〜8頁; HoogenboomおよびWinter、1991、J. Mol. Biol. 227:381頁; Marksら、1991、J. Mol. Biol. 222:581頁; Coleら、1985、Monoclonal antibodies and Cancer Therapy、Alan R. Liss、77頁; Boernerら、1991、J. Immunol. 147:86〜95頁を参照されたい)。
【００４２】
適切な抗体が得られたら、それらを、例えばELISAを用いて活性について試験することができる。
【００４３】
したがって、一実施形態において、ポリペプチドは、インタクトな抗体(IgG分子など)であってよい。
【００４４】
代替として、ポリペプチドは、このような抗体の抗原結合性フラグメントであってよい。
【００４５】
一実施形態において、抗体は、組換え抗体である。
【００４６】
さらなる実施形態において、抗体は、モノクロナール抗体である。
【００４７】
抗体またはその抗原結合性フラグメントは、免疫系において調節の役割を有することが知られている任意の抗原を標的とすることができる。しかし、好ましくは、ここで、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、CD40、CD137、OX-40およびこれらの受容体からなる群から選択される抗原に特異的に結合する能力がある。
【００４８】
好ましい一実施形態において、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、CD40(ヒトCD40など、例えば、NCBI参照配列:NP_001241.1を参照されたい)に特異的に結合する能力がある。
【００４９】
CD40は、4つの細胞外ドメイン(D1、D2、D3およびD4と呼ばれる)を含み、そのそれぞれは、A-モジュールおよびB-モジュールに再分される(Naismithら、「Modularity in the TNF-receptor family」、Trends in Biochem. Sci 1998、23:74〜79頁を参照されたい)。一実施形態において、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、CD40のドメイン1のモジュールB2(またはそれを含むエピトープ)に特異的に結合する能力がある。
【００５０】
適切な抗体およびその抗原結合性フラグメントおよび変異体が、Ellmarkら、「Modulation of the CD40-CD40 ligand interaction etc」2002、Immunology 106:456〜463頁に記載されている。
【００５１】
本発明の組成物に関するさらなる好ましい実施形態において、免疫刺激ポリペプチドは、CD40アゴニストである(すなわち、該ポリペプチドはCD40受容体を少なくとも部分的に活性化する)。CD40アゴニストの特性を有するポリペプチドは、例えばPound JD、Int Immunol 1999;11(1):11〜20頁; Ledbetterら、Critical Reviews in Immunology 1997; Ellmarkら、2002 Immunologyに記載のような、当技術分野で周知の方法を使用して同定することができる。
【００５２】
適切なCD40アゴニストとしては、限定はされないが、CD40L[Avrend(Immunex Corp)など]、抗CD40抗体ならびにその抗原結合性フラグメントおよび変異体[CP-870-893(Pfizer)およびSGN-40(Seattle Genetics/Genentech)など]が挙げられる。
【００５３】
さらなる好ましい実施形態において、ポリペプチドは、CD40を介して直接的におよび/またはCD40を経由する樹状細胞の活性化を介して間接的にT細胞を活性化する能力があり、かつ/またはCD40発現腫瘍細胞に対して直接的なアポトーシス効果を及ぼす能力がある。
【００５４】
本発明の組成物の第2の必須成分は、PGAナノ粒子である。
【００５５】
一実施形態において、PGAは、γ-PGA、α-PGA、PGAの水溶性塩、およびPGAの金属塩からなる群から選択することができる。
【００５６】
したがって、一実施形態において、ナノ粒子は、γ-PGAを含むか、またはγ-PGAからなる。
【００５７】
生分解性γ-PGAナノ粒子は、ナノスケールの範囲の好都合な大きさ、吸着された抗体の好都合な放出プロファイル、および好都合な生体内分布(ナノ粒子の大きさから由来する)を含めて、いくつかの利点を提供すると考えられる44。γ-PGAナノ粒子は、ナノ粒子の性質およびそれらの表面に吸着される免疫刺激ポリペプチド(例えば、抗体)の特異性の型のため、がん治療において高められた効果を提供することのできる独特の放出プロファイルを有する。ナノスケールの粒子の生体内分布に影響を及ぼす可能性のあるもう1つの要因は、それらの粒子がウイルスと同様の大きさの範囲で存在することである。抗原提示細胞(APC、例えばB細胞、マクロファージおよび樹状細胞)は、この大きさの粒子を取込み、処理する上でとりわけ有効である46、47。このことは、適切な細胞に刺激シグナルを提供し、したがってナノ粒子の取込みおよび分解を促進することによって、APCを標的とする場合の利点を立証することができる。小さなサイズのナノ粒子はまた、マイクロスケールの粒子と比較して表面対質量の比率を増大させ、免疫刺激ポリペプチドの効果的な吸着を可能にする。
【００５８】
さらなる実施形態において、ナノ粒子は、疎水性アミノ酸またはそのエステルをさらに含む。例えば、疎水性アミノ酸は、フェニルアラニンであってよい。したがって、ナノ粒子は、γ-PGA鎖上でコンジュゲートされたフェニルアラニンエチルエステルを含むか、または該エステルからなっていてもよい。
【００５９】
好ましい一実施形態において、ナノ粒子は生分解性である。
【００６０】
当業者は、ナノ粒子が、均一、または様々な大きさであってもよいことを認識するであろう。
【００６１】
一実施形態において、ナノ粒子は、25nm〜500nm、例えば100nm〜300nmの平均粒子直径を有する。例えば、ナノ粒子は、200nmの平均粒子直径を有することができる。
【００６２】
さらなる実施形態において、ナノ粒子は、負の表面電荷を有する。例えば、負の表面電荷は、-10mV〜-35mV、例えば約-15mVであってよい。
【００６３】
よりさらなる実施形態において、ナノ粒子は、TLR-2および/またはTLR-4などのtoll様受容体(TLR)に結合する能力がある。
【００６４】
当業者は、本発明の2つの必須成分に関する前記実施形態を、任意の組合せで組み合わせることができることを認識するであろう。
【００６５】
したがって、一実施形態において、本発明の第1態様の組成物は、
(a)CD40アゴニスト、および
(b)γ-PGAナノ粒子
の混合物を含むことができる。
【００６６】
例えば、組成物は、
(a)抗CD40抗体またはその抗原結合性フラグメント、および
(b)γ-PGAにコンジュゲートされたフェニルアラニンエチルエステルを含むか、または該エステルからなるナノ粒子
を含むことができる。
【００６７】
1つのこのような好ましい組成物において、ナノ粒子は、200±50nmの平均粒子直径を有する。
【００６８】
当業者は、さらに、本発明の組成物がさらなる成分を含むことができることを認識するであろう。
【００６９】
したがって、一実施形態において、組成物は、第2の免疫刺激ポリペプチドを含むことができる。したがって、組成物は、このようなポリペプチドの組合せ、例えば、次の抗体:CD137抗体、CD40抗体、およびOX-40抗体の2種以上を含むことができる。
【００７０】
さらなる実施形態において、組成物は、抗原を含むことができる。したがって、組成物は、がん細胞抗原を含むことができる。
【００７１】
本発明の組成物は、局所、局部および全身を含む、任意の公知の経路で投与するのに適し得る。
【００７２】
本発明の組成物の活性成分は、使用されるポリペプチド/ナノ粒子の有効性/毒性、および使用されている適応症に応じて、種々の濃度で製剤化することができる。例えば、組成物は、ポリペプチド成分を、0.1μM〜1mM、より好ましくは1μM〜100μM、5μM〜50μM、10μM〜50μM、20μM〜40μM、最も好ましくは約30μMの濃度で含むことができる。
【００７３】
当業者は、活性成分が、意図した投与経路および標準的な薬学的実践に関して選択される適切な薬学的添加剤、賦形剤または担体との混合物の状態で、一般には投与されることを認識するであろう(例えば、Remington:The Science and Practice of Pharmacy、第19版、1995年、Alfonso Gennaro編、Mack Publishing Company、ペンシルヴェニア州、米国を参照されたい)。例えば、組成物は、非経口的、局所的、口腔内、吸入による、および座剤またはペッサリーの形態での投与に適するように製剤化することができる。
【００７４】
したがって、一実施形態において、組成物は、非経口的に、例えば、腫瘍内または腫瘍近傍への局部(腫瘍内、腫瘍周囲内、腫瘍周囲、結節内など)、静脈内、筋内、皮下、髄腔内、脳内および/または脳室内に投与するためのものであり、または、それらの組成物は、点滴技術によって投与することができる。このような組成物は、他の物質、例えば、溶液を血液と等張にするのに十分な塩またはグルコースを含んでいてもよい滅菌水性溶液の形態で使用するのが最良である。水性溶液は、必要なら、適切に緩衝化されるべきである(好ましくは3〜9のpHに)。滅菌条件下での適切な非経口製剤の調製は、当業者に周知の標準的な製薬技術によって容易に完遂される。
【００７５】
非経口投与に適した製剤としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を意図したレシピエントの血液と等張にする溶質を含んでいてもよい水性および非水性の滅菌注射溶液;ならびに懸濁剤および増粘剤を含んでいてもよい水性および非水性の滅菌懸濁液が挙げられる。製剤は、単位投与または多回投与用の容器、例えば密閉されたアンプルおよびバイアル瓶の状態で提供することができ、使用直前に滅菌液状担体、例えば、注射用水の添加のみを必要とするフリーズドライ(凍結乾燥)の状態で貯蔵することができる。即席注射溶液および懸濁液は、先に説明した部類の滅菌した粉末、顆粒、および錠剤から調製することができる。
【００７６】
本発明の組成物は、鼻腔内にまたは吸入によって投与することもでき、好都合には、乾燥粉末吸入器、または適切な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、ヒドロフルオロアルカン[1,1,1,2-テトラフルオロエタン(HFA134A3)または1,1,1,2,3,3,3-ヘプタフルオロプロパン(HFA227EA3)など]、二酸化炭素、または他の適切な気体を使用する、加圧容器、ポンプ、スプレーまたはネブライザーから提供されるエアロゾル噴霧の形態で送達される。加圧エアロゾルの場合、投与単位は、定量された量を送達するためのバルブを備えることによって定めることができる。加圧容器、ポンプ、スプレーまたはネブライザーは、滑沢剤、例えばトリオレイン酸ソルビタンを付加的に含んでいてもよい、溶媒としてのエタノールと噴射剤との混合物を例えば使用して、活性化合物の溶液または懸濁液を含むことができる。吸入器または吹込み器中で使用するためのカプセルおよびカートリッジ(例えば、ゼラチンから作製された)は、本発明の化合物と、乳糖またはデンプンなどの適切な粉末基剤との粉末状混合物を含むように製剤化することができる。
【００７７】
エアロゾルまたは乾燥粉末製剤は、それぞれ定量された用量または「パフ(puff)」が、少なくとも1mgの本発明の化合物を含んで患者に送達されるように好ましくは準備される。エアロゾルでの1日の全用量は、患者毎に異なり、単回投与で、またはより通例では1日にわたって分割投与で投与されてもよいことが認識されるであろう。
【００７８】
代替として、本発明の組成物は、座剤またはペッサリーの形態で投与することができ、または、それらの組成物は、ローション剤、溶液剤、クリーム剤、軟膏剤、または粉剤の形態で局所的に適用することができる。本発明の組成物はまた、例えば皮膚パッチを使用して経皮的に投与することができる。それらの組成物はまた、眼経路によって投与することができる。
【００７９】
眼で使用する場合、本発明の薬剤は、等張性でpHを調節した滅菌生理食塩水中のミクロ化懸濁液剤、または好ましくは、等張性でpHを調節した滅菌生理食塩水中の、場合によっては塩化ベンザルコニウムなどの保存剤と組み合わせた溶液剤として製剤化することができる。代替として、それらの組成物は、ワセリンなどの軟膏中で製剤化することができる。
【００８０】
皮膚に局所的に適用する場合、本発明の組成物は、例えば、次の成分:ミネラルオイル、流動パラフィン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、乳化性ワックス、および水の1種以上との混合物中に懸濁または溶解された活性成分を含む適切な軟膏剤として製剤化することができる。代替として、それらの組成物は、例えば、次の成分:ミネラルオイル、モノステアリン酸ソルビタン、ポリエチレングリコール、流動パラフィン、ポリソルベート60、セチルエステルワックス、セテアリールアルコール、2-オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、および水の中の1種以上の混合物中に懸濁または溶解された適切なローション剤またはクリーム剤として製剤化することができる。
【００８１】
口内での局所投与に適した製剤としては、風味をつけた基剤、通例では蔗糖およびアラビアゴムもしくはトラガカントゴム中に活性成分を含むロゼンジ剤;ゼラチンとグリセリン、または蔗糖とアラビアゴムなどの不活性基剤中に活性成分を含むパステル剤;適切な液状担体中に活性成分を含む含嗽剤が挙げられる。
【００８２】
特定の一実施形態において、組成物は、徐放性薬物送達システムとして製剤化される。
【００８３】
代替として、本発明の組成物は、薬物を必要部位に直接的に放出する外科的に埋め込まれたデバイスによって投与することができる。
【００８４】
本発明の第2態様は、薬剤中で使用するための前述の組成物を提供する。
【００８５】
本発明の第3態様は、患者の免疫系を刺激するのに使用するための前述の組成物を提供する。
【００８６】
一実施形態において、組成物は、がんの治療で使用するためのものである。
【００８７】
例えば、がんは、リンパ腫、黒色腫、肝癌、骨肉腫、腎細胞癌、膀胱癌、乳がん、結腸直腸癌、肺がん、消化器がん、膵がん、前立腺がん、卵巣がん、腎臓がん、および白血病からなる群から選択することができる。
【００８８】
「治療」とは、患者の治療および予防処置の双方を包含する。用語「予防的」は、患者または対象におけるがんの可能性を予防または低減する、本明細書に記載のポリペプチドまたは製剤の使用を包含して使用される。
【００８９】
当業者は、組成物が、化学療法、放射線療法および/または手術などの1種または複数の通常の抗がん療法と組み合わせて使用するためのものであってもよいことを認識するであろう。
【００９０】
別の実施形態において、組成物は、ウイルス感染症(例えば、HIV/AIDS)の治療で使用するためのものである。
【００９１】
さらなる実施形態において、組成物は、自己免疫疾患の治療で使用するためのものである。
【００９２】
本発明の関連する第4態様は、患者の免疫系を刺激するための医薬の調製における、本発明の第1態様による組成物の使用を提供する。
【００９３】
一実施形態において、医薬は、がんの治療で使用するためのものである。
【００９４】
例えば、がんは、リンパ腫、黒色腫、肝癌、骨肉腫、腎細胞癌、膀胱癌、乳がん、結腸直腸癌、肺がん、消化器がん、膵がん、前立腺がん、卵巣がん、腎臓がん、および白血病からなる群から選択することができる。
【００９５】
当業者は、医薬が、化学療法、放射線療法および/または手術などの1種または複数の通常の抗がん療法と組み合わせて使用するためのものであってもよいことを認識するであろう。
【００９６】
別の実施形態において、医薬は、ウイルス感染症(例えば、HIV/AIDS)の治療で使用するためのものである。
【００９７】
さらなる実施形態において、医薬は、自己免疫疾患の治療で使用するためのものである。
【００９８】
本発明の第5態様は、対象に本発明の第1態様による組成物を投与するステップを含む、対象の免疫系を刺激する方法を提供する。
【００９９】
一実施形態において、方法は、対象のがんを治療するためのものである(前に考察した通り)。
【０１００】
別の実施形態において、方法は、対象のウイルス感染症を治療するためのものである(前に考察した通り)。
【０１０１】
さらなる実施形態において、方法は、対象の自己免疫疾患を治療するためのものである(前に考察した通り)。
【０１０２】
当業者は、組成物を、当技術分野で公知の経路のいずれかによって対象に投与できることを認識するであろう。したがって、該組成物は、対象に、非経口的、腫瘍もしくは腫瘍近傍中への局部(腫瘍内、腫瘍周囲内、腫瘍周囲、結節内など)、静脈内、筋内、皮下、髄腔内、脳内および/または脳室内に投与することができる。
【０１０３】
本発明の使用および方法に関する一実施形態において、組成物は、免疫刺激が患者にとって有益である部位またはその近傍での局部投与のためのものである。このような使用は、TH-1型サイトカインの放出を含め、免疫系の高められた局部刺激(例えば、腫瘍の中および周囲)を提供する。同時に、本発明の組成物は、全身性免疫刺激を低減し、例えば、身体中へのサイトカインの「広域的」放出に付随する有害作用(肝臓傷害など)を低減する可能性がある。
【０１０４】
本発明の第6態様は、
(a)免疫刺激ポリペプチド、および
(b)ナノ粒子
を含むキット(kit of parts)を提供する。
【０１０５】
一実施形態において、成分(a)および(b)は、薬学的に許容される添加剤、賦形剤または担体中で別個に製剤化される。
【０１０６】
成分(a)および(b)は、それぞれ、他方と併用投与するのに適した形態で提供することができる。
【０１０７】
用語「と併用投与すること」は、キット中の2つの成分(免疫刺激ポリペプチドおよびナノ粒子)を一緒に、または時間的に十分に近接して（場合によっては繰り返し）投与して、免疫刺激ポリペプチドを含む製剤またはナノ粒子を含む製剤のどちらかを他方の成分の非存在下に単独で同一の治療過程にわたって（場合によっては繰り返し）投与する場合に比べて、関連状態の治療過程にわたってより大きい、患者に対する有益な効果を可能にすることを包含する。ある組合せが、個々の状態の治療過程に関しておよび治療過程にわたってより大きい有益な効果を提供するかどうかの決定は、治療または予防すべき状態に依存するが、当業者によって定型的に行うことができる。
【０１０８】
別の実施形態において、成分(a)および/または(b)は凍結乾燥されている。
【０１０９】
さらなる実施形態において、成分(a)および(b)は、それぞれ、密封された滅菌容器中に提供される。
【０１１０】
当業者は、成分(a)が、本発明の第1態様に関して前に定義した通りであってよいことを認識するであろう。同様に、成分(b)は、本発明の第1態様に関して前に定義した通りであってよい。
【０１１１】
本発明のキットは、本発明の第5態様に記載の方法を実施するための説明書をさらに含んでいてもよい。
【０１１２】
本発明の第7態様は、ポリグルタミン酸(PGA)を含むか、またはPGAからなるナノ粒子と組み合わせて薬剤中で使用するための免疫刺激ポリペプチドを提供する。
【０１１３】
一実施形態において、免疫刺激ポリペプチドは、本発明の第1態様に関して前に定義した通りである。
【０１１４】
したがって、免疫刺激ポリペプチドは、抗CD40抗体またはその抗原結合性フラグメントなどのCD40アゴニストであってよい。
【０１１５】
別の実施形態において、免疫刺激ポリペプチドは、γ-PGAのナノ粒子と組み合わせて薬剤中で使用するためのものである。
【０１１６】
さらなる実施形態において、免疫刺激ポリペプチドは、がんの治療で使用するためのものである。
【０１１７】
免疫刺激ポリペプチドは、非経口的に、例えば、腫瘍内または腫瘍近傍への局部(腫瘍内、腫瘍周囲内、腫瘍周囲、結節内など)、静脈内、筋内、皮下、髄腔内、脳内および/または脳室内に投与するためのものであってもよい。
【０１１８】
本発明の第8態様は、ポリグルタミン酸(PGA)を含むか、またはPGAからなる、免疫刺激ポリペプチドと組み合わせて薬剤中で使用するためのナノ粒子を提供する。
【０１１９】
一実施形態において、ナノ粒子は、本発明の第1態様に関して前に定義した通りである。
【０１２０】
したがって、ナノ粒子は、γ-PGAを含むか、またはγ-PGAからなっていてもよい。例えば、ナノ粒子は、γ-PGAとコンジュゲートされたフェニルアラニンエチルエステルを含むか、または該エステルからなっていてもよい。
【０１２１】
別の実施形態において、ナノ粒子は、抗CD40抗体またはその抗原結合性フラグメントなどのCD40アゴニストと組み合わせて薬剤中で使用するためのものである。
【０１２２】
さらなる実施形態において、ナノ粒子は、がんの治療で使用するためのものである。
【０１２３】
ナノ粒子は、非経口的に、例えば、腫瘍内または腫瘍近傍への局部(腫瘍内、腫瘍周囲内、腫瘍周囲、結節内など)、静脈内、筋内、皮下、髄腔内、脳内および/または脳室内に投与するためのものであってもよい。
【０１２４】
本発明の第9態様は、免疫刺激ポリペプチドおよびナノ粒子を薬学的に許容される賦形剤、担体または添加剤と一緒に混合するステップを含む、本発明の第1態様による医薬組成物を製造するための方法を提供する。
【０１２５】
本発明の特定の態様を具体化する好ましい非限定的例を、これより、以下の図を参照しながら説明する:
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】図1は、γ-PGAナノ粒子と抗CD40抗体との混合物が、CD40誘導性のB細胞増殖に対して強力な相乗効果を有することを示す。血液由来のヒトCD19+B細胞を、100μg/mLのγ-PGAナノ粒子の非存在または存在下で、様々な濃度の抗CD40抗体と72時間培養した。未処理細胞またはγ-PGAナノ粒子単独で処理された細胞を対照として使用した。増殖を、[3H]チミジン取込みによってアッセイした。データは、CPM-値±SEMに基づく刺激指数(stimulation index)(SI)を表し、ここで、未処理対照は、SI=1に相当し、n=3ドナーである。
【図２】図2は、γ-PGAナノ粒子上に固定化された、またはγ-PGA粒子との混合物の状態の抗CD40抗体での刺激によって誘導されたB細胞増殖の比較を示す。ヒト血液CD19+B細胞を、単独の、γ-PGAに固定化された(imm)、またはγ-PGAナノ粒子との混合物の状態の様々な濃度の抗CD40抗体と72時間培養した。未処理細胞、および固定化された/混合されたCD40抗体での刺激の際に存在する対応する濃度のγ-PGAナノ粒子で刺激された細胞を対照として使用した。増殖を、[3H]チミジン取込みによってアッセイした。データは、CPM-値±SEMに基づく刺激指数(SI)を表し、ここで、未処理対照は、SI=1に相当し、n=3ドナーである。
【図３】図3は、γ-PGAナノ粒子中に封入された抗CD40抗体での刺激に応答したB細胞の増殖を示す。ヒト血液CD19+B細胞を、様々な濃度の遊離のまたは封入された(ecp)抗CD40抗体と共に72時間培養した。未処理細胞、および封入されたCD40‐抗体での刺激の際に存在する対応する濃度のγ-PGAナノ粒子で刺激された細胞を対照として使用した。増殖を、[3H]チミジン取込みによってアッセイした。データは、CPM-値±SEMに基づく刺激指数(SI)を表し、ここで、未処理対照は、SI=1に相当し、n=3ドナーである。
【図４】図4は、ネズミ脾臓CD19+B細胞を、100μg/mLのγ-PGAナノ粒子の非存在または存在下に様々な濃度の抗CD40抗体(FGK-45)と共に72時間培養した結果を示す。未処理細胞、またはγ-PGAナノ粒子単独で処理された細胞を対照として使用した。増殖を、[3H]チミジン取込みによってアッセイした。データは、CPM-値±SEMに基づく刺激指数(SI)を表し、ここで、未処理対照は、SI=1に相当し、n=2脾臓である。
【図５】図5は、単球由来樹状細胞におけるTLR2またはTLR4の遮断が、γ-PGAナノ粒子の刺激効果を低下させることを示す。未熟単球由来樹状細胞を、TLR2またはTLR4を無効にする20μg/mLの抗体と共に1時間インキュベートし、その後、100μg/mLのγ-PGAナノ粒子で48時間刺激した。HLA-DR、CD86およびCD80の発現レベルの変化をフローサイトメトリーで分析した。Cは、未処理対照を意味する。平均蛍光強度(MFI)±SEMを示す(n=5)。統計的有意性は、ペアードスチューデント両側t検定で判定した(*=p<0.05、**=p<0.01)。
【図６】図6は、CD40抗体を、γ-PGAナノ粒子の表面上に吸着させた結果を示す。γ-PGAナノ粒子(100μg/mL)と抗CD40抗体(B44、4.3μg/mL)との混合物を、4℃で15分間インキュベートし、続いて遠心により3回洗浄した。ヒトCD19+B細胞を、γ-PGAナノ粒子と抗CD40抗体との新鮮な混合物(洗浄0)、または1、2または3回の洗浄後に回収された抗CD40抗体/γ-PGAナノ粒子混合物で72時間刺激した。未処理細胞、またはγ-PGAナノ粒子または抗CD40抗体単独で処理された細胞を対照として使用した。増殖を、[3H]チミジン取込みによってアッセイした。データは、CPM-値±SDに基づく刺激指数(SI)を表し、ここで、未処理対照は、SI=0に相当し、n=2ドナーである。
【図７】図7は、様々なポリマーをベースにしたナノ粒子の比較を示す。ヒトCD19+B細胞を、抗CD40抗体(4.3μg/mL)を含めて、または含めずに、100μg/mLのγ-PGAまたはポリラクチドナノ粒子と共に72時間インキュベートした。増殖を、[3H]チミジン取込みによってアッセイした。データは、CPM-値±SDに基づく刺激指数(SI)を表し、ここで、未処理対照は、SI=0に相当し、n=4ドナーである。
【図８】図8は、本発明のナノ粒子組成物が、CD40アゴニストの全身性投与に典型的に付随するサイトカインの放出を妨げることを示す。C57BL/6マウス中の皮下MB49(膀胱がん)腫瘍において、抗CD40抗体、γ-PGAナノ粒子と混合された抗CD40抗体、またはγ-PGAナノ粒子と混合されたアイソタイプ対照抗体での処理に続いて、サイトカイン放出を研究した。血清サンプルを処理の4時間後に採取し、IL6、IL10およびTNF-αのレベルを分析した。スチューデントＴ検定は、IL6では22日目に(p<0.05)、IL10では15日目に(p<0.00004)、TNF-αでは8日目(p<0.02)、22日目(p<0.03)に、γ-PGAナノ粒子と混合されたFGK45に対するFGDK45の統計的有意性を示している。
【０１２７】
(実施例)
(実施例1):γ-PGAナノ粒子と抗CD40抗体との混合物によるCD40の相乗的活性化
序論
本発明は、その治療効果を有意に増強する、ナノ粒子およびタンパク質薬物から構成される薬物製剤を提供する。該製剤は、作用薬の特性を増強し、免疫調節分子を標的とするタンパク質薬物の架橋を増強し、該薬物の持続時間および組織停留を増強する潜在能力を有する。それらの製剤は、さらに、制御放出性媒質として機能し、投与頻度を低減し、それによって患者の利便性を高め、全身性漏出したがって全身性副作用のリスクを低下させる潜在能力を有する。本明細書中で、所望の相乗効果は、CD40に関して立証されるが、他の免疫調節性および他の細胞受容体、ならびに受容体の組合せにも及ぶ。したがって、本発明は、がんの治療(免疫療法)、ワクチン接種(がん、ウイルスなど)、ならびにHIV/AIDS療法に多大な利益を提供する。
【０１２８】
材料および方法
ヒトCD19-陽性B細胞を、ヒトCD19磁性マイクロビーズ(Miltenyi Biotech、Bergisch Gladbach、ドイツ)を使用して、末梢血(ルンド大学病院、Lund、スウェーデン)から単離した。細胞を、96ウェルプレート中(150,000細胞/ウェル)、2mM L-グルタミンおよび50μg/mL  ゲンタマイシン(Sigma-Aldrich、St. Louis、ミズーリ州、米国)および10%(v/v)熱不活化ウシ胎児血清(invitrogen)で補足されたRPMI 1640培地(Invitrogen、Carlsbad、カリフォルニア州、米国)中で培養した。3H-チミジン(0.0185MBq/ウェルまたは0.5μCi/ウェル)はPerkin Elmer(Waltham、マサチューセッツ州、米国)から購入した。サンプルを、5回の繰り返しで試験し、3H-チミジンの取込みは、ベータシンチレーションカウンター(Matrix96 Directベータカウンター、Packard、Meriden、コネティカット州)で測定した。
【０１２９】
使用される両親媒性γ-PGA粒子は、γ-PGA鎖上に疎水性アミノ酸(フェニルアラニン)をコンジュゲートさせることによって合成し、γ-PGAの疎水性誘導体(γ-hPGA)を創出した。L-Pheグラフト度が53%、直径がほぼ200nmの前もって作製したγ-hPGAナノ粒子(Akashi教授提供、欧州特許出願公開第1932538A号も参照されたい)を、混合および固定化実験に使用した(図1および2)。タンパク質薬物を封入したナノ粒子(図3)には、粗生成物(γ-hPGA)を使用した。
【０１３０】
(CD40抗体とナノ粒子の混合)
ナノ粒子を抗CD40抗体と混合した後に、この混合物を細胞培養物に添加した。
【０１３１】
(固定化)
γ-hPGAナノ粒子(緩衝液中10mg/mL、pH5.8)のカルボキシル基を、まず、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(WSC)(1mg/mL)で20分間活性化した。遠心(14,000×gで15分間)で得られたナノ粒子(5mg)を、次いで、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS、pH7.4)中のタンパク質(1.75mg/mL)の1mLと混合し、該混合物を4℃で24時間インキュベートした。反応が終結した後に、ナノ粒子を、遠心で単離し、PBSまたは水で2回洗浄し、PBS中に10mg/mLで再懸濁した。タンパク質を封入したナノ粒子を、同容積の4%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)に添加してナノ粒子を溶解し、次いで、タンパク質の含有量をLowry法で測定した。
【０１３２】
(封入)
タンパク質を封入したγ-hPGAナノ粒子を調製するために、0.25〜4mgのタンパク質(抗体)を1mLの生理食塩水に溶解し、そのタンパク質溶液に1mLのγ-hPGA(DMSO中10mg/mL)を添加した。抗体を封入したナノ粒子を含む生成溶液を、14,000×gで15分間遠心し、繰り返し洗浄した。タンパク質含有量をLowry法で測定した。タンパク質を封入したナノ粒子を、同容積の4%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)に添加してナノ粒子を溶解し、次いで、タンパク質含有量をLowry法で測定した。
【０１３３】
(B細胞の増殖アッセイ)
ヒトCD19+B細胞を、100μg/mLのγ-PGAナノ粒子を含めてまたは含めずに抗CD40抗体(0.07、0.27、1.08または4.33μg/mL)と共に、または100μg/mLのγ-PGAナノ粒子単独と共に培養した。封入または固定化された抗CD40抗体をB細胞に、同一濃度(抗体濃度を基準にして)で添加した。未処理細胞を対照として使用した。増殖を評価するため、インキュベーションの最後の16時間の間に3H-チミジンを添加した。刺激指数(SI)値を、式:[処理細胞のCPM(1分間当たり計数値)-未処理細胞のCMP]/未処理細胞のCMPにより計算した。データは、異なるドナーに関する3つの別個の実験から取得し、値は、計算された正規化計数により調整した。
【０１３４】
ネズミのCD19+B細胞を、100μg/mLのγ-PGAナノ粒子を含めてまたは含めずに抗CD40抗体(0.07、0.27、1.08または4.33μg/mL)と共に、または100μg/mLのγ-PGAナノ粒子単独と共に培養した。
【０１３５】
結果
図1に示すように、γ-PGAナノ粒子と抗CD40抗体との混合物は、B細胞の増殖によって立証されるように、CD40の活性化に対して強力な相乗効果を有することが見出された。これらの結果は、各抗体濃度において一貫していた。CD40抗体の単独およびナノ粒子の単独は、刺激シグナルが付加された場合でさえ、ナノ粒子と抗CD40抗体との混合物に比べて、はるかに低い活性化効率を有している。
【０１３６】
ナノ粒子を共有結合で固定化した場合(図2)、または抗CD40抗体をナノ粒子中に封入した場合(図3)、このような効果は観察されなかった。
【０１３７】
図5で観察できるように、γ-PGAナノ粒子は、それ自体で小さな免疫刺激効果を有する。TLR-2/4に結合し、それを遮断する抗体は、γ-PGAナノ粒子のmoDcに対するこの免疫刺激効果を有意に低下させる。したがって、ナノ粒子がTLR-2/4に結合できること、およびこの相互作用が、図1に示す相乗効果の(少なくとも一部は)基礎をなす可能性があることは明白であろう。
【０１３８】
考察
CD40を介してシグナルを誘導するための最低要件は、受容体二量体の形成であること11、および受容体介在性シグナルの強度は、細胞外で適用されるリガンドの結合価の増加と相互に関連していること12が示されている。CD40を介する細胞内シグナル伝達は、様々な細胞内認識モチーフと相互作用するアダプター分子(最も注目すべきは、TNFR関連因子(TRAF)ファミリー)に依存する14、15、35。CD40の細胞外架橋は、これらの細胞内アダプター分子の安定化につながり、次にはシグナル伝達カスケードを始動させる。より多くの受容体が架橋されるほど、より多くの/より大きなそしてより安定なシグナル伝達複合体が作り出される。したがって、CD40抗体の単独またはナノ粒子の単独の場合に比べて有意により高い図1で観察される相乗的シグナル伝達効果は、より大きなオーダーのCD40架橋のためであると仮説を立てることができる。タンパク質は、これらのナノ粒子にきわめて効果的に吸着され得ることが立証されている36。ナノ粒子に吸着されると、CD40抗体は、複数(2つ以上)のCD40に架橋する潜在能力を有する。
【０１３９】
予想外に、表面に固定化されたCD40抗体を有するナノ粒子は、同様の相乗効果を提供しない(図2)。それらはCD40の活性化を誘導したが、それは、CD40抗体の単独と比べてより高くはなかった。CD40抗体の封入化は、いっそうより低い活性化効力を立証した(図3)。
【０１４０】
この実施例に記載の製剤は、したがって、がん治療(膀胱、黒色腫、乳房、結腸直腸、胃、膵臓など)における有意な治療効果を暗示するが、(がん、ウイルス、寄生虫、細菌など)に対するいくつかの部類のワクチン接種製剤におけるアジュバント効果をも暗示する、独特の強力な相乗的CD40活性化効果を呈示する。加えて、このようなCD40活性化効果は、HIV/AIDS治療における治療効果を暗示する42。
【０１４１】
増大した抗CD40活性化効力に加えて、本発明の記載の組成物は、薬物の持続時間および組織停留の増加により有効性を向上させること、投与頻度を低減すること、それによって患者の利便性を高めること、および全身性漏出したがって全身性副作用のリスクを低減することによって、免疫調節分子を標的とするタンパク質薬物の機能を増大させることができる。
【０１４２】
(実施例2):抗CD40抗体は、γ-PGAナノ粒子の表面上に吸着される
材料および方法
自由に混合されたCD40抗体がγ-PGAナノ粒子の表面上に吸着される程度を調べるために、γ-PGAナノ粒子(100μg/mL)と抗CD40抗体(B44、4.3μg/mL)との混合物を4℃で15分間インキュベートした。次いで、混合物を13000rpmで10分間遠心し、上清液を除去した。残留ペレットを一定のナノ粒子濃度に再懸濁し、サンプルを抜き取った。
【０１４３】
この手順を、次いで、全部で3回の洗浄について2回繰り返した。
【０１４４】
増殖を、γ-PGAナノ粒子と抗CD40抗体(洗浄0回)との新鮮な混合物で、または1、2または3回の洗浄後に取り出した抗CD40抗体/γ-PGAナノ粒子混合物で72時間刺激されたヒトCD19+B細胞について評価した。データを、異なるドナーに関する2つの別個の実験から取得し、値を計算された正規化係数により調整した。
【０１４５】
結果
吸着アッセイ研究からの結果を図6に示す。
【０１４６】
データは、本発明の典型的なCD40抗体/γ-PGAナノ粒子組成物が、洗浄ステップを実施した後に、B細胞の刺激に関するその相乗効果を保持していることを立証している。γ-PGAナノ粒子組成物に対して実施された第3回目の洗浄後に、観察される相乗効果は、洗浄を含めずに観察された効果と比較して50%まで低下する。したがって、本発明の組成物におけるCD40抗体のγ-PGAナノ粒子上への吸着または会合が達成されている。
【０１４７】
(実施例3):種々のナノ粒子の比較
材料および方法
ヒトCD19+B細胞を、抗CD40抗体(4.3μg/mL)を含めてまたは含めずに100μg/mLのγ-PGAナノ粒子または純粋なポリラクチドナノ粒子(大きさ250nm、Corpuscular Inc.、Cold Spring、ニューヨーク州、米国)と共に培養した。未処理細胞を対照として使用し、72時間後に増殖をアッセイした。データは、異なるドナーに関する4つの別個の実験から収得し、値は、計算された正規化係数により調整した。
【０１４８】
結果
ナノ粒子の比較研究からの結果を表7に示す。
【０１４９】
本発明の典型的なγ-PGAナノ粒子組成物に関して実施例1で立証されたB細胞刺激に対する予想外の相乗効果は、抗CD40抗体と(前記実施例1に記載の混合プロトコールを使用して)混合された純粋なポリラクチドナノ粒子を含むナノ粒子組成物では観測されなかった。
【０１５０】
PLGAおよびPLAミクロ粒子[ポリ(ラクチド-co-グルコリド)およびポリ(ラクチド酸)]は、ナノ粒子製剤中で通常的に使用される他の部類の生分解性材料である。しかし、これらの材料をベースにしたナノ粒子製剤に関して、問題点が報告されている。例えば、疎水性タンパク質の低い封入効率、および製剤化、貯蔵および凍結乾燥中のタンパク質およびナノ粒子組成物の不安定性である36、44。加えて、PLGA材料を使用するナノ粒子の製造は、典型的には、組成物中のタンパク質成分の安定性、完全性および機能に影響を及ぼす可能性のある有機溶媒を必要とする。
【０１５１】
本発明のγ-PGAナノ粒子をベースにした組成物は、そのような制約の問題を有さない。
【０１５２】
(実施例4):γ-PGAナノ粒子の状態での抗CD40抗体の投与に続くインビボでのサイトカイン放出の低減
材料および方法
3×105個のMB9細胞(膀胱がん)を、0日目に雌性C57BL/6マウス(Taconic Denmark)に皮下(s.c.)で接種した。
【０１５３】
抗CD40抗体、FGK-45(BioXCell BE0016-2)、ラット-IgG2a、またはアイソタイプ対照2A3(BioXcell BE0089)、およびγ-PGAナノ粒子を、混合プロトコールにより混合、調製した。
【０１５４】
群1(10尾のマウス)には、8、15および22日目に、γ-PGAナノ粒子に吸着されたアイソタイプ対照を腫瘍周囲で投与した(菱形)。
【０１５５】
群2(10尾のマウス)には、8、15および22日目に、10μgのFGK-45を腫瘍周囲で投与した(四角)。
【０１５６】
群3(10尾のマウス)には、8、15および22日目に、γ-PGAナノ粒子に吸着された10μgのFGK-45を腫瘍周囲で投与した(三角)。
【０１５７】
各処置の4時間後に血清サンプルを採取し、サイトカインレベルを、サイトカインビーズアレイを使用して分析した(BD CBAマウス炎症キット説明マニュアル、カタログ番号552364、BD Biosciences)。理論検出限界は、IL-6が50pg/mL、IL-10が17.5pg/mL、TNFが7.3pg/mLである。
【０１５８】
結果
この研究からの結果を図8に示す。
【０１５９】
腫瘍を有し抗CD40抗体とγ-PGAナノ粒子との混合物で治療されたマウスは、血清中IL-6、IL-10およびTNFαに関して、腫瘍を有し抗CD40抗体で治療されたマウスと比較して、低下したサイトカイン濃度を有する。
【０１６０】
CD40アゴニストでの全身性治療は、サイトカイン放出症候群に関連し33、34、したがって、TNFαおよびIL-6などのサイトカインの放出によって特徴付けられる48。サイトカインレベルの上昇は、肝傷害、およびアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALAT)およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(ASAT)などのバイオマーカーの上昇と関連している33、34、49。本明細書中で提供される結果は、本発明の組成物および方法が、IL-6、IL-10、およびTNFαの血清中レベルの低下をもたらすことを立証し、CD40アゴニスト抗体の全身性放出に付随する毒性副作用(肝傷害など)を最小化する潜在能力を暗示している。
【０１６１】
さらに、血清中レベルはまた、本発明の組成物での治療に続いて、抗CD40抗体での治療と比較して、サイトカインIL-12、IFN-γおよびMCP-1に関しても低下した。
【０１６２】
結論
したがって、本明細書中で提供されるデータは、本発明のナノ粒子組成物が、抗CD40抗体によって投与部位(例えば、腫瘍内および周辺)で局部的に誘導される免疫刺激効果を相乗的に高める能力があるだけでなく、このような抗体に典型的に付随する有害な全身性免疫刺激(肝毒性につながることがある)を最小化するのに役立つことを立証している。
【０１６３】
(実施例5):がん療法のためのインビボ実験計画
2.5×105個の腫瘍細胞(例えば、Panc02細胞)または3×105個のMB49細胞を、0日目に、雌性C57BL/6マウスの右後肢に皮下(s.c.)で接種する。γ-PGAナノ粒子と混合および/またはγ-PGAナノ粒子上に吸着された100μLの抗CD40抗体(FGK-45)原液/用量を、3日間の間隔で、3回または6回、腫瘍内および/または腫瘍周囲で投与する。療法は、Panc02モデルでは腫瘍注入後の5日目に、MB49モデルでは8日目に開始する。
【０１６４】
実験の始めから終わりまで、腫瘍増殖および生存を監視する。腫瘍体積を、キャリパーで計測し、楕円体の体積公式、V=4/3＊π＊a(長さ)＊b(幅)＊c(深さ)によって計算する。免疫活性化に関する抗体、既知バイオマーカー(例えば、IL-6、TNF-α、IFN-γ)の、および肝毒性に関するマーカー(ASATおよびALAT)の薬物動態をマウス中で追跡することができる。
【０１６５】
マウスを70日目まで追跡した。
【０１６６】
[参考文献]
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【図５】
0005911471.tif 000008
【図８（Ａ）】
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【図８（Ｂ）】
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【図８（Ｃ）】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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