(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中における標的微生物の存否を検出する方法であって、
所定の指示微生物の増殖を促進するように選択された成分及び前記指示微生物を検出するように選択された第２の指示薬を含む培地を含む培養デバイス、
上側及び下側の主表面を有する基材及び前記主表面のうちの少なくとも１つに配置された第１の指示薬を含むコーティングを備える検出物品であって、前記第１の指示薬が前記標的微生物を検出するように選択されている、検出物品、及び
前記試料、を提供すること、
前記培養デバイスに前記試料を植菌すること、
前記指示微生物のコロニーの形成を可能にするのに十分な時間、前記植菌された培養デバイスをインキュベートすること、
少なくとも１つの前記指示微生物のコロニーの存在の有無について、前記インキュベートされた培養デバイスを観察すること、
前記少なくとも１つの前記指示微生物のコロニーの存在が観察された場合に、前記インキュベートされた培養デバイスの前記培地を前記検出物品に接触させること、並びに
第１の状態から第２の状態への前記第１の指示薬の変換を検出するために、前記検出物品に接触している前記培地を含む前記培養デバイスを観察すること、を含み、
前記少なくとも１つの前記指示微生物のコロニーの存在の有無について、前記インキュベートされた培養デバイスを観察することが、第１の状態から第２の状態への前記第２の指示薬の変換を検出することを含む、方法。
【請求項２】
培地を提供することが、腸内細菌科の微生物の増殖を促進するように選択された培地を提供することを含み、検出物品を提供することが、サルモネラ属の微生物を検出するための検出物品を提供することを含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１０年１２月３０日に出願された米国特許仮出願第６１／４２８，７２２号の利益を主張し、その全体を参照として本明細書に組み込む。
【０００２】
［背景］
[0001]全ての食品、飲料、及び水の試料に病原性微生物に対する試験を行うことは、経費のため、及び病原性微生物が、例えば、適切に加工された食品中に、まれにしか見出されないため、現実的であり得ない。したがって、指示微生物の存在のための試験は、食品及び水を試験し、ヒト病原体の汚染の可能性を判定するために、通常利される。１つ以上の指示微生物の存在は、例えば、糞便汚染の指示であり得、病原性微生物の潜在的な存在を示し得る。
【０００３】
[0002]大腸菌型細菌（「大腸菌型」）は、指示微生物の一例を代表する。大腸菌型群は、温血動物の糞便中に数多く見出され、ラクトースを酸及びガス副生成物へ発酵するそれらの能力によって特徴付けられる桿菌様のグラム陰性細菌の多数の属（例えば、シトロバクター属、エンテロバクター属、エシェリキア属、ハフニア属、クレブシエラ属、及びセラチア属）を含む。多数の大腸菌型は、単にヒトへの日和見感染に関連するが、いくつかの大腸菌型細菌（例えば、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７又は他の志賀毒素産生大腸菌）は、羅感率及び死亡率のより高い発生率に関連する。
【０００４】
[0003]腸内細菌科に属する微生物は、指示微生物の別の例を代表する。大腸菌型細菌に加えて、本科はまた、多数の他の桿菌様のグラム陰性細菌を含む。大腸菌型細菌の様に、食品又は水の試料中の腸内細菌科の微生物の存在は、糞便汚染の存在、したがって、ヒト病原体（例えば、サルモネラ腸内腸炎菌、サルモネラ腸内ネズミチフス菌、赤痢菌種、及びクロノバクター種）の潜在的な存在を示し得る。
【０００５】
[0004]試料中の病原性微生物の存在を試験するための効率的な方法に対するニーズが存在する。
【０００６】
［概要］
[0005]一般に、本発明は、試料（例えば、食品又は水の試料、環境試料）の微生物学的な内容物を評価するための方法を目的とする。具体的には、本発明に関する方法は、標的微生物の存在を示し得る、指示生物を含むことが判明した試料中の標的微生物の存否を検出し得る。本発明に関する方法は、第１の指示薬系を有する培養デバイス中の試料を培養し、指示微生物の存在を判定すること、及び指示微生物が検出された場合、培養デバイスを第２の指示薬系を含む検出物品に接触させ、標的微生物の存否を判定することを含む。
【０００７】
[0006]一態様では、本開示は、標的微生物の存否を検出する方法を提供する。該方法は、所定の指示微生物の増殖を促進するように選択された成分を含む培地を含む培養デバイス、第１の指示薬系を含む検出物品、及び試料を提供することを含み得る。第１の指示薬系は、標的微生物を検出するように選択され得る。該方法は、培養デバイスに試料を植菌すること、指示微生物の増殖を可能にするのに十分な時間、植菌された培養デバイスをインキュベートすること、少なくとも１つの指示微生物の存在の指示について、培養デバイスを観察すること、インキュベートされた培養デバイスの培地を検出物品に接触させること、並びに第１の状態から第２の状態への第１の指示薬系の変換を検出するために、物品に接触させた培養デバイスを観察すること、を更に含み得る。いくつかの実施形態では、第１の状態から第２の状態への第１の指示薬系の変換が、存在する場合、少なくとも１つの標的微生物の存在を示し得る。いくつかの実施形態では、第１の状態から第２の状態への第１の指示薬系の変換が、存在しない場合、少なくとも１つの標的微生物の存在を示す。
【０００８】
[0007]いくつかの実施形態では、該方法は、第２の指示薬系を培地と流体連通状態に設置することを更に含み、少なくとも１つの指示微生物の存在について、培養デバイスを観察することが、第１の状態から第２の状態への第２の指示薬系の変換の存否を検出することを含む。上記実施形態のいずれかでは、培養デバイスを提供することは、第２の指示薬系を含む培養デバイスを提供することを更に含み得る。上記実施形態の方法のいずれかでは、培養デバイスを提供することは、ヒドロゲル又は乾燥した冷水可溶性ゲル化剤を含む培養デバイスを提供することを更に含み得る。
【０００９】
[0008]上記実施形態の方法のいずれかでは、培地を検出物品に接触させることが、少なくとも１つの指示微生物の存在の指示が観察されるときにのみ実行される。
【００１０】
[0009]上記実施形態のいずれかでは、培地を提供することは、腸内細菌科の微生物の増殖を促進するように選択された培地を提供することを含み得、検出物品を提供することが、サルモネラ属の微生物を検出するための検出物品を提供することを含み得る。いくつかの実施形態では、第１の指示薬系は、α−ガラクトシダーゼ又はカプリレートエステラーゼ酵素活性を検出するための試薬を含み得る。
【００１１】
[0010]上記実施形態のいずれかでは、培地を提供することは、腸内細菌科の微生物の増殖を促進するように選択された培地を提供することを含み得、検出物品を提供することが、赤痢菌属の微生物を検出するための検出物品を提供することを含み得る。いくつかの実施形態では、第１の指示薬系は、β−グルコシダーゼ、β−フコシダーゼ、Ｎ−アセチル−β−ガラクトサミニダーゼ、又は前述の酵素活性のうちの任意の２つ以上の組み合わせを検出するための試薬を含み得る。
【００１２】
[0011]上記実施形態のいずれかでは、培地を提供することは、腸内細菌科の微生物の増殖を促進するように選択された培地を提供することを含み得、検出物品を提供することが、クロノバクター属の微生物を検出するための検出物品を提供することを含み得る。いくつかの実施形態では、第１の指示薬系は、α−グルコシダーゼ及び／又はβ−セロビオシダーゼ酵素活性を検出するための試薬を含み得る。
【００１３】
[0012]上記実施形態のいずれかでは、培地を提供することは、腸内細菌科の微生物の増殖を促進するように選択された培地を提供することを含み得、検出物品を提供することが、大腸菌を検出するための検出物品を提供することを含み得る。上記実施形態のいずれかでは、培地を提供することは、大腸菌型微生物の増殖を促進するように選択された培地を提供することを含み、検出物品を提供することが、大腸菌を検出するための検出物品を提供することを含む。いくつかの実施形態では、第１の指示薬系は、β−グルクロニダーゼ酵素活性を検出するための試薬を含み得る。
【００１４】
[0013]いくつかの実施形態では、培地を提供することは、リステリア属の微生物の増殖を促進するように選択された培地を提供することを含み得、検出物品を提供することが、リステリア・モノサイトゲネスを検出するための検出物品を提供することを含み得る。いくつかの実施形態では、第１の指示薬系は、α−マンノピラノシダーゼ又はホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ酵素活性を検出するための試薬を含み得る。
【００１５】
[0014]上記実施形態のいずれかでは、培養デバイス又は物品に接触させた培養デバイスを観察することは、培養デバイスを視覚的に観察することを含み得る。上記実施形態のいずれかでは、培養デバイス又は物品に接触させた培養デバイスを観察することは、自動読取り装置を使用して、培養デバイスを観察することを含み得る。上記実施形態のいずれかでは、該方法は、指示微生物のコロニー形成単位の一部分を数えることを更に含み得る。上記実施形態のいずれかでは、該方法は、標的微生物のコロニー形成単位の一部分を数えることを更に含み得る。
【００１６】
[0015]上記実施形態のいずれかでは、培地を検出物品に接触させることは、所定の温度で培地を接触させることを更に含み得る。
【００１７】
[0016]別の態様では、本開示は、物品を提供する。該物品は、上側及び下側の主表面を有する基材、及び該主表面のうちの少なくとも１つに配置されるコーティングを備え得る。該コーティングは、第１の指示薬系を含み得る。該指示薬系は、α−ガラクトピラノシド又はカプリレートエステラーゼ酵素活性によって、第１の状態から第２の状態に変換され得る。物品のいくつかの実施形態では、第１の指示薬系は、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−カプリル酸、及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−カプリル酸からなる群から選択され得る。
【００１８】
[0017]更に別の態様では、本開示は物品を提供する。該物品は、上側及び下側の主表面を有する基材、及び該主表面のうちの少なくとも１つに配置されるコーティングを備え得る。該コーティングは、第１の指示薬系を含み得る。第１の指示薬系は、β−グルクロニダーゼ酵素活性によって、第１の状態から第２の状態に変換され得る。いくつかの実施形態では、第１の指示薬系は、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸、ｐ−ニトロフェニル−β−グルクロニド、ｐ−ニトロフェニル−２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−グルクロン酸メチルエステル、フェノールフタレイングルクロン酸、フェノールフタレインモノ−Ｐ−グルクロン酸、ナフチル−ＡＳ−ＢＩ−β−Ｄ−グルクロニド、及び４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−グルクロニド、８−ヒドロキシキノリン−ベータ−Ｄ−グルクロン酸、ナトリウム塩、２−ナフチル−ベータ−Ｄ−グルクロン酸、ナトリウム塩、４−ニトロフェニル−ベータ−Ｄ−グルクロン酸、ナトリウム塩、フェノールフタレイン−ベータ−Ｄ−グルクロン酸、ナトリウム塩一水和物、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−ベータ−Ｄ−グルクロン酸、シクロヘキシルアンモニウム塩、３−インドキシル−ベータ−Ｄ−グルクロン酸、シクロヘキシルアンモニウム塩、３−インドキシル−ベータ−Ｄ−グルクロン酸、ナトリウム塩、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドキシル−ベータ−Ｄ−グルクロン酸、シクロヘキシルアンモニウム塩、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−ベータ−Ｄ−グルクロン酸、ナトリウム塩無水物、及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−ベータ−Ｄ−グルクロン酸、ナトリウム塩三水和物からなる群から選択され得る。
【００１９】
[0018]更に別の態様では、本開示は物品を提供する。該物品は、上側及び下側の主表面を有する基材、及び該主表面のうちの少なくとも１つに配置されるコーティングを備え得る。該コーティングは、第１の指示薬系を含み得る。第１の指示薬系は、α−マンノピラノシダーゼ又はホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ酵素活性によって、第１の状態から第２の状態に変換され得る。いくつかの実施形態では、第１の指示薬系は、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−ミオ−イノシトール−１−ホスフェート、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドキシルミオ−イノシトール−１−ホスフェート、アンモニウム塩、４−メチルウンベリフェリルミオ−イノシトール−１−ホスフェート、Ｎ−メチル−モルホリン塩、３−インドキシル−α−Ｄ−マンノピラノシド、５−ブロモ−３−インドキシル−α−Ｄ−マンノピラノシド、４−クロロ−３−インドキシル−α−Ｄ−マンノピラノシド、５−ヨード−３−インドキシル−α−Ｄ−マンノピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−α−Ｄ−マンノピラノシド、クロロ−３−インドキシル−α−Ｄ−マンノピラノシド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドキシル−α−Ｄ−マンノピラノシド、６−ブロモ−３−インドキシル−α−Ｄ−マンノピラノシド、６−クロロ−３−インドキシル−α−Ｄ−マンノピラノシド、６−フルオロ−３−インドキシル−α−Ｄ−マンノピラノシド、４，６−ジクロロ−３−インドキシル−α−Ｄ−マンノピラノシド、６，７−ジクロロ−３−インドキシル−α−Ｄ−マンノピラノシド、４，６，７−トリクロロ−３−インドキシル−α−Ｄ−マンノピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−Ｎ−メチル−−α−Ｄ−マンノピラノシド、３−インドキシル−α−Ｄ−マンノピラノシド、及びＮ−メチル−３−インドキシル−α−Ｄ−マンノピラノシド、６−ブロモ−２−ナフチル−α−Ｄ−マンノピラノシド、４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−マンノピラノシド、及び４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マンノピラノシドからなる群から選択され得る。
【００２０】
[0019]上記実施形態のいずれかでは、コーティングは、上側及び下側の主表面上に配置され得る。上記実施形態のいずれかでは、物品は、接着層を更に備え得る。いくつかの実施形態では、第１の指示薬系の少なくとも一部分が、接着層上又は接着層内に配置され得る。上記実施形態のいずれかでは、第１の指示薬系は、両方の主表面上に配置され得る。上記実施形態のいずれかでは、基材は、ポリマーフィルム、紙、不織布、メンブレンフィルタ、及び前述の任意の派生物からなる群から選択され得る。上記実施形態のいずれかでは、コーティングは、結合剤を更に含み得る。
【００２１】
[0020]用語「好ましい」及び「好ましくは」は、特定の状況下で、特定の利点をもたらし得る本発明の実施形態を指す。しかしながら、同じ、又は他の状況下においては他の実施形態が好ましい場合もある。更に、１つ以上の好ましい実施形態の引用は、他の実施形態が有用ではないという意味を含むものではなく、他の実施形態を本発明の範囲から除外することを意図しない。
【００２２】
[0021]「含む」なる用語及びその変化形は、これらの用語が説明文及び「特許請求の範囲」において用いられている場合に限定的な意味を有するものではない。
【００２３】
[0022]本明細書で使用するところの「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、「少なくとも１つの」及び「１以上の」は、互換可能に使用される。したがって、例えば、微生物は、「１つ以上の」微生物を意味すると解釈され得る。
【００２４】
[0023]用語「及び／又は」は、列挙されている要素の１つ又は全て、あるいは、列挙されている要素の任意の２つ以上の組み合わせを意味する。
【００２５】
[0024]本明細書で使用するとき、「培養デバイス」は、微生物の増殖を促進する栄養培地を収容するように適合される物品を指す。所望により、培養デバイスは、インキュベーション及び／又は保管の間に、栄養培地の外部汚染への暴露を最小限に抑えるため、及び／又は培地からの水分の損失を低減するために、ふた又はカバーを備えてもよい。培養デバイスの非限定例としては、フラスコ、ビーカー、管、ペトリ皿、マルチウェルプレート、ＰＥＴＲＩＦＩＬＭプレート、ＣＯＭＰＡＣＴ  ＤＲＹ培地シート、ＳＡＮＩＴＡ−ＫＵＮシート等が挙げられる。
【００２６】
[0025]本明細書で使用するとき、「指示薬系」は、次の、発色酵素基質、蛍光発生酵素基質、レドックス指示薬（例えば、トリフェニルテトラゾリウム塩化物、メチレンブルー）、代謝可能な栄養分、及びｐＨ指示薬のうちの任意の１つ以上、及びそれらのうちの１つ以上の任意の組み合わせを指す。「代謝可能な栄養分」は、所定の指示生物及び／又は所定の標的微生物によって使用され、バイオマス及び／又はエネルギーを生成し得る任意の分子を指す。微生物による代謝可能な栄養分の使用は、微生物と流体接触状態の水溶性培地のｐＨ又は他の検出可能なイオン変化を直接的に、又は間接的にもたらす。「鑑別」指示薬系は、指示薬系（複数可）の構成成分（複数可）とのそれらのそれぞれの反応性に基づいて、２つの同一でない微生物を区別するために使用され得る指示薬系である。
【００２７】
[0026]本明細書で使用するとき、「指示微生物」は、標的微生物もまた見出される環境（例えば、液体又は固体マトリクス）中に見出されることが周知である微生物の群に属する微生物を指す。本開示によれば、指示微生物及びそれらの対応する標的微生物は、同一の培地で培養され得る。加えて、標的微生物は、対応する指示微生物を検出する同一の指示薬系と反応してもよい。指示微生物は、比較的大きく、多種多様な微生物の群（例えば、好気性細菌、酵母、糸状菌）、比較的大きく、比較的より多種多様でない微生物の群（例えば、腸内細菌科等の系統学的に関連する微生物の群、又は例えば、大腸菌型細菌等の生理学的に関連する微生物の群）、並びに更により小さな群及び／又は比較的より多種多様でない微生物の群（例えば、リステリア等の属、大腸菌などの種）を含み得る。
【００２８】
[0027]本明細書で使用するとき、「標的微生物」は、指示微生物が見出される同一の環境のうちの１つ以上に見出され得る所定の微生物を指す。標的微生物は、鑑別指示薬系とのその反応性、又はそれらの欠乏に基づいて指示微生物の群のうちの１つ以上から区別され得る。いくつかの実施形態では、標的微生物は、指示微生物の群に属し得る（例えば、代表的な標的微生物である大腸菌は、腸内細菌科に属するものであり、それは、当該技術分野において周知の指示微生物の群である）。ある特定の実施形態では、「標的微生物」は、特定の種の１つ以上の菌株、特定の属の１つ以上の種、あるいは非分類学的な（例えば、生理学的に関連する）群の２つ以上の属の各々に由来する複数の種又は１つ以上の菌株若しくは種を指してもよい。
【００２９】
[0028]また、本明細書における端点による数の範囲の記載には、その範囲に含まれるすべての数が含まれる（例えば、１〜５には、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５、などが含まれる）。
【００３０】
[0029]上記の本発明の概要は、開示される本発明の実施形態のそれぞれ又は全ての実施の態様を説明することを目的としたものではない。以下の説明は、実例となる実施形態をより詳細に例示するものである。本明細書にわたっていくつかの箇所で、実施例の一覧を通してガイダンスを提供するが、実施例は様々な組み合わせにおいて使用できる。それぞれの場合において記載される一覧はあくまで代表的な群として与えられるものであって、排他的な羅列として解釈されるべきものではない。
【００３１】
[0030]これら及び他の実施形態の追加の詳細を添付図及び以下の説明にて提示する。他の特徴、目的及び利点は、説明及び図面から、並びに請求項から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】[0031]本開示による標的微生物を検出するための方法の一実施形態のブロック図。
【図２】[0032]培養デバイス中に配置される指示微生物のコロニーを有する培養デバイスの一実施形態の平面図。
【図３】[0033]本開示による検出物品の一実施形態の斜視図。
【図４】[0034]培養デバイスに検出物品を設置後の図３の培養デバイスの平面図。
【００３３】
［詳細な説明］
[0035]本発明は、試料の微生物学的な内容物を評価するための方法を目的とする。具体的には、方法は、単一の培養デバイスに有利に実施される逐次検出プロセスを含む。検出プロセスは、はっきりと異なるが、第１の検出プロセスは、指示微生物の群を識別し、第２の検出プロセスは、群内の標的微生物を識別するという意味で関連する。有利に、第１の識別プロセスの結果は、第２の検出プロセスの使用を必要とするどうか決定するために使用され得る。それ故に、いくつかの実施形態では、指示微生物が第１の識別プロセスで検出されないときに、操作者は、第２の識別プロセスの時間、材料、労力、及び経費を省くことが可能である。
【００３４】
[0036]図１は、本開示による標的微生物を検出する方法の一実施形態を示すブロック図である。本開示の方法は、試料に標的微生物の存否の試験を行うことを目的とする。該方法は、試験される試料、検出物品、及び培地を含む培養デバイスを提供することである工程１５２を含む。所望により、第２の指示薬系が提供され得る。該方法は、第２の指示薬系が、存在する場合、培地と流体連通状態に配置されることである工程１５４を更に含む。該方法は、試料を用いて培養デバイスを植菌することである工程１５６、植菌された培養デバイスをインキュベートすることである、工程１５８、及び指示微生物の指示について培養デバイスを観察することである工程１６０を更に含む。指示微生物が工程１６０で観察された場合、該方法は、培地を検出物品に接触させることである任意の工程１６２、及び第１の指示薬系を観察することである工程１６４を更に含む。該方法の工程の各々は、以下で更に詳細が記載される。該方法の利点は、指示微生物の指示が検出される場合にのみ、検出物品が培地に適用される必要があり得ることである。したがって、指示微生物の指示が検出されない試料では、標的微生物が存在しないと推測されてもよく、検出物品が使用される必要はない。
【００３５】
[0037]試験される試料を提供することは、標的微生物を含んでいると疑われる試料を提供することを含んでもよい。試料は、本明細書に定義される標的微生物を含み得る任意の試料であり得る。好適な試料の非限定例としては、環境試料（例えば、表面の拭取り検体／スポンジ、土壌、堆積物、媒介物）、食品（例えば、原材料、仕掛り試料、及び最終製品試料）、飲料、臨床／獣医学的試料（例えば、血液、血清、血漿、尿、痰、組織、粘液、糞便、傷からの滲出物、膿、脳脊髄液）、及び水（例えば、地表水、飲用水、プロセス水）が挙げられる。
【００３６】
[0038]いくつかの実施形態では、標的微生物の存否は、多様な食品、飲料、又は食品若しくは飲料加工環境要因に由来する試験試料において分析され得る。食品源の非限定例としては、未加工又は加工肉、未加工又は加工果物若しくは野菜、非液体乳製品（例えば、チーズ、バター、及びアイスクリーム）、木の実、香辛料、具、及びシロップが挙げられる。飲料源の非限定例としては、飲用水、果物又は野菜ジュース、牛乳、及び発酵飲料が挙げられる。低温殺菌食品又は飲料もまた、好適な供給源であり得る。食品若しくは飲料加工環境試料の非限定例としては、食品処理表面試料（例えば、コンベヤベルト、刃、切断表面、混合機表面、フィルタ、保管容器）、部屋の試料（例えば、壁、床、配水管、換気装置）、及び洗浄装置（例えば、ホース、掃除用具）が挙げられる。
【００３７】
[0039]いくつかの実施形態では、標的微生物の存否は、例えば、血液、唾液、眼球レンズ液、滑液、脳脊髄液、膿、汗、滲出物、尿、粘液、分泌乳汁等の生理的液体等の多様なヒト又は動物源に由来する試料において分析され得る。更に、試験試料は、例えば、創傷、皮膚、鼻孔、頭皮、爪等の体部位に由来し得る。
【００３８】
[0040]ヒト又は動物源に由来する特に対象となる試料としては、鼻からの試料（例えば、前鼻孔、鼻咽頭腔、鼻腔、前鼻孔前庭等に由来する）等の粘液含有試料、並びに外耳、中耳、口、直腸、膣、又は他の類似の組織に由来する試料が挙げられる。特定の粘膜組織の例には、頬、歯肉、鼻、眼球、気管、気管支、胃腸、直腸、尿道口、尿管、膣、頚部、及び子宮粘膜のような粘膜が挙げられる。
【００３９】
[0041]生理的液体以外に、他の試験試料は、他の液体並びに液体媒質に溶解した固体（１つ又は複数）を含んでよい。対象試料としては、プロセス流、水、土壌、植物又はその他の草木、空気、表面（例えば、汚染された表面）などを挙げることができる。試料は、培養細胞を含むこともできる。試料はまた、細胞、胞子、又は酵素（例えば、生物学的指示薬デバイス）を含むデバイス上又はデバイス内に試料を含み得る。
【００４０】
[0042]本開示の方法のための好適な試料は、特定の固体試料を含み得る。固体試料は、分解されてもよく（例えば、混合、超音波処理、均質化によって）、液体（例えば、水、緩衝液、ブイヨン）中で懸濁されてもよい。いくつかの実施形態では、試料材料を含む試料捕集デバイス（例えば、拭取り検体、スポンジ）が該方法において使用されてもよい。あるいは、試料材料は、該方法において試料材料を使用する前に、試料捕集デバイスから溶出（例えば、すすぐ、こする、搾り出す）されてもよい。いくつかの実施形態では、液体又は固体試料は、液体（例えば、水、緩衝液、ブイヨン）中で希釈されてもよい。
【００４１】
[0043]試料は、本明細書に記載のように、指示微生物を含んでもよい。指示微生物は、汚染（例えば、糞便汚染）、感染（例えば、病原性微生物の感染）、又は一般的な公衆衛生の指示（例えば、任意の好気性微生物）を示し得る。指示微生物は、更に、標的微生物であり得る。
【００４２】
[0044]指示生物又は標的微生物として対象となり得る、特に対象となる微生物は、原核又は真核生物、具体的にはグラム陽性細菌、グラム陰性細菌、真菌類、マイコプラズマ、及び酵母を含む。特に関連性のある生物としては、腸内細菌科若しくは球菌科、又はブドウ球菌属の種、連鎖球菌種、シュードモナス種、腸球菌種、サルモネラ菌種、レジオネラ菌種、赤痢菌種、エルシニアエルシニア菌種、エンテロバクター菌種、エシェリキア菌種、バチルス菌種、リステリア菌種、ビブリオ菌種、コリネバクテリア菌種並びにヘルペスウイルス、アスペルギルス菌種、フサリウム菌種、及びカンジダ菌種が挙げられる。特に強い病原性を持つ生物は、黄色ブドウ球菌（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）等の耐性菌株を含む）、表皮ブドウ球菌、肺炎球菌、ストレプトコッカス・アガラクチア、化膿連鎖球菌、エンテロコッカス・フィカリス、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＶＲＳＡ）、バンコマイシン中間体耐性黄色ブドウ球菌（ＶＩＳＡ）、炭疽菌、緑膿菌、大腸菌、黒色アスペルギルス、アスペルギルス・フミガツ、アスペルギルス・クラバタス、フザリウム・ソラニ、フザリウム・オキシスポラム、フザリウム・クラミドスポラム、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・イバノビイ、コレラ菌、腸炎ビブリオ、サルモネラ・コレラエスイス、チフス菌、ネズミチフス菌、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラータ、カンジダ・クルセイ、クロノバクター・サカザキ、大腸菌Ｏ１５７、及び複数の薬物耐性グラム陰性桿菌（ＭＤＲ）を含む。
【００４３】
[0045]グラム陽性及びグラム陰性細菌には、特に関心が持たれている。リステリア・モノサイトゲネス等のグラム陽性細菌が特に対象となる。また、ＭＲＳＡ、ＶＲＳＡ、ＶＩＳＡ、ＶＲＥ、及びＭＤＲ菌を含む抗生物質耐性菌も特に対象となる。
【００４４】
[0046]図１の工程１５２に戻って参照すると、試験される試料を提供することに加えて、該方法は、培養デバイス、第１の指示薬系、及び物品上にコーティングされる第２の指示薬系を有する物品を提供することを更に含む。培養デバイスは、広義で使用され、微生物の増殖を促進する栄養培地を収容するように適合される多様な物品を含む。該方法による、任意の特定の指示微生物の増殖を促進する特定の栄養培地の選択は、当業者が入手できる範囲内である。
【００４５】
[0047]いくつかの実施形態では、栄養培地は、１つ以上の選択性の阻害物質を含み得る。本明細書で使用するとき、「選択性の阻害物質」は、特定の感受性の微生物又は微生物群の増殖を部分的に又は完全に阻害するために、栄養培地に添加される化合物を指し、それによって他の微生物又は微生物群の増殖を選択的に支持する。選択性の阻害物質は、当該技術分野において周知であり、例えば、胆汁塩、無機塩（例えば、ＮａＣｌ、ＬｉＣｌ、ＭｇＣｌ２）、及び抗生物質（フルオロキノロン、β−ラクタム抗生物質、アミノグリコシド）を含む。本開示の特定の好ましい実施形態では、栄養培地は、最小限に選択性の濃度で（すなわち、選択性の成長培地に使用される通例の濃度を下回る濃度で）選択性の阻害物質を含み得る。有利なことに、最小限に選択性の栄養培地の使用は、本開示の方法を使用して、より多くの標的微生物の回復及び検出を可能にし得る。理論に束縛されるものではないが、これは、より低濃度の選択性の阻害物質は、選択性の培地中の損傷した、ストレスを与えられた、及び／又は比較的感受性の強い標的微生物の増殖を可能にするために可能であり得、それによって第２の指示薬系を用いてそれらを検出することができる。
【００４６】
[0048]第１の指示薬系は、標的微生物の存否を示すために使用される。任意の第２の指示薬系は、指示微生物の存否を示すために使用される。第１の及び／又は第２の指示薬系は、発色酵素基質、蛍光発生酵素基質、レドックス指示薬、代謝可能な栄養分、ｐＨ指示薬、又は前述のもののうちの２つ以上の任意の組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、ｐＨ指示薬、及び特定の代謝可能な栄養分の組み合わせは、構成成分のうちの１つを培養デバイスの培地に提供することによって、並びに他の構成成分を検出物品に提供することによって、該方法に提供されてもよい。
【００４７】
[0049]第１の指示薬系の選択は、標的微生物及び／又は培養デバイスに使用される培地に応じてもよく、そのような選択は、当業者に認識されるように、本開示によって導かれる。該方法のいくつかの実施形態では、高度に示差的な第１の指示薬系（すなわち、標的微生物を含む比較的少数の微生物と反応する指示薬系）は、最小限に選択性の培地と共に使用され得る。これらの実施形態では、最小限に選択性の培地は、損傷した及び／又はストレスを与えられた標的微生物の回復及び増殖を可能にし得、それによって比較的高選択性の培地によって阻害され得るそのような標的生物の検出を可能にする。
【００４８】
[0050]該方法のいくつかの実施形態では、比較的低度に示差的な第１の指示薬系（すなわち、標的微生物を含む、比較的多くの微生物と反応する指示薬系）は、比較的高選択性の培地と共に使用され得る。このアプローチは、高度複合試料（例えば、多数の非常に多種多様な微生物的内容物を有する傾向のある床排水からの試料、又は比較的非選択性の事前増菌ブイヨン培養にからの試料等の非常に選択的性の強い条件を必要とする試料）に利用され得る。このアプローチの１つの例は、Ｄｅｍｉ−Ｆｒａｓｅｒ／ＵＶＭ、リステリア微生物のＭｏｄｉｆｉｅｄ  Ｏｘｆｏｒｄ寒天検出を伴うＦｒａｓｅｒブイヨン増菌システムの使用である。
【００４９】
[0051]いずれかの実施形態では、第１の又は第２の指示薬系は、生物学的な酸化還元反応に好適な酸化還元指示薬（レドックス指示薬とも称される）を含み得る。酸化還元指示薬染料は、ｐＨ依存性又はｐＨ非依存性であってもよい。酸化還元指示薬染料の非限定例としては、２，２’−ビピリジン（Ｒｕ錯体）、ニトロフェナントロリン（Ｆｅ錯体）、Ｎ−フェニルアントラニル酸、１，１０−フェナントロリン（Ｆｅ錯体）、Ｎ−エトキシクリソイジン、２，２’−ビピリジン（Ｆｅ錯体）、５，６−ジメチルフェナントロリン（Ｆｅ錯体）、ｏ−ジアニシジン、ジフェニルアミンスルホン酸ナトリウム、ジフェニルベンジジン、ジフェニルアミン、ビオロゲン、２，６−ジブロモフェノール−インドフェノールナトリウム、２，６−ジクロロフェノール−インドフェノールナトリウム、ｏ−クレゾールインドフェノールナトリウム、チオニン（別名、ラウツバイオレット）、メチレンブルー、インジゴテトラスルホン酸、インジゴトリスルホン酸、インジゴジスルホン酸、インジゴモノスルホン酸、フェノサフラニン、サフラニンＴ、及びニュートラルレッドが挙げられる。
【００５０】
[0052]いずれかの実施形態では、第１の及び／又は第２の指示薬系は、発色酵素基質を含み得る。好適な発色酵素基質は、例えば、ブロモ−クロロ−インドリル誘導体、ニトロフェニル誘導体、及びフェノールフタレイン誘導体を含む。
【００５１】
[0053]有用な５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル誘導体は、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル酢酸塩、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル酢酸塩、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−１，３二酢酸塩、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−フコピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルコピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート、及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル硫酸塩を含む。
【００５２】
[0054]有用なニトロフェニル誘導体は、ｐ−ニトロフェノール及びｏ−ニトロフェノール誘導体を含む。具体的には有用なｐ−ニトロフェノールは、ジエチル−ｐ−ニトロフェニルホスフェート、ジ−ｐ−ニトロフェニルホスフェート、ｐ−ニトロフェニル−２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−β−ガラクトピラノシル−β−グルコピラノシド、ｐ−ニトロフェニル−２−アセトアミド−２−デオキシ−β−グルコピラノシド、ｐ−ニトロフェニル酢酸塩、ｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオシド、ｐ−ニトロフェニル−α−グルコピラノシド、ｐ−ニトロフェニル−α−マルトシド、ｐ−ニトロフェニル−β−マルトシド、ｐ−ニトロフェニル−α−マンノピラノシド、ｐ−ニトロフェニル−β−マンノピラノシド、ｐ−ニトロフェニルミリスチン酸塩、ｐ−ニトロフェニルパルミチン酸塩、ｐ−ニトロフェニルホスフェート、ビス（ｐ−ニトロフェニル）ホスフェート、トリス（ｐ−ニトロフェニル）ホスフェート、ｐ−ニトロフェニル−β−グルコピラノシド、ｐ−ニトロフェニル−β−グルクロニド、α−ｐ−ニトロフェニルグリセリン、ｐ−ニトロフェニル−α−ラムノピラノシド、ｐ−ニトロフェニルステアリン酸塩、ｐ−ニトロフェニル硫酸塩、ｐ−ニトロフェニル−２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−グルクロン酸メチルエステル、及びｐ−ニトロフェニル吉草酸塩を含む。
【００５３】
[0055]具体的に有用なｏ−ニトロフェノールは、ｏ−ニトロフェニル酢酸塩、ｏ−ニトロフェニル−β−グルコシド、及びｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを含む。他の具体的に有用なニトロフェニル誘導体は、ニトロフェニル−β−フコピラノシド、ニトロフェニル−α−ガラクトピラノシド、ニトロフェニル酪酸塩、ニトロフェニルカプリン酸塩、ニトロフェニルカプロン酸塩、ニトロフェニルカプリル酸塩、ニトロフェニルラウリン酸塩、及びニトロフェニルプロピオン酸塩を含む。
【００５４】
[0056]有用なインドキシル誘導体は、インドキシル−酢酸塩、インドキシルβ−Ｄ−グルコシド、３−インドキシル硫酸塩、３−インドキシルホスフェートを含む。
【００５５】
[0057]有用なフェノールフタレイン誘導体は、フェノールフタレイン二酪酸、フェノールフタレイン二リン酸塩、フェノールフタレイン二硫酸塩、フェノールフタレイングルクロン酸、フェノールフタレインモノ−Ｐ−グルコシドウロン酸、フェノールフタレインモノ−Ｐ−グルクロン酸、及びフェノールフタレイン一リン酸塩を含む。
【００５６】
[0058]全ての上述の発色基質は、適切な酵素と直接的に反応して、発色団を生成する。
【００５７】
[0059]誘導体酵素修飾生成物が、ジアゾ化染料、例えば、１−ジアゾ−４−ベンゾイルアミノ−２，５，ジエトキシベンセン、（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌから「Ｆａｓｔ  Ｂｌｕｅ  ＢＢ  Ｓａｌｔ」として市販）、１−ジアゾ−４−ベンゾイルアミノ−２，５−ジエトキシベンセン、ｐ−ジアゾ−２，５−ジエトキシ−Ｎ−ベンゾイルアラニン、クロロ−２−メチルベンゼンジアゾニウム塩化物、及びｏ−アミノアゾトルエンジアゾニウム塩等の発色試薬と更に反応する場合、Ｉ−ナフチル、２−ナフチル及びナフチル−ＡＳ−ＢＩ誘導体を含有する追加の酵素基質が有用に使用され、発色団を生成する。
【００５８】
[0060]具体的に有用な１−ナフチル誘導体は、１−ナフチル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドを含む。
【００５９】
[0061]具体的に有用な２−ナフチル誘導体は、２−ナフチル−ホスフェート、２−ナフチル−酪酸塩、２−ナフチル−カプリル酸塩、２−ナフチル−ミリスチン酸塩、Ｌ−ロイシル−２−ナフチルアミド、Ｌ−バリル−２−ナフチルアミド、Ｌ−シスチル−２−ナフチルアミド、Ｎ−ベンゾイル−ＤＬ−アルギニン−２−ナフチルアミド、Ｎ−グルタリル−フェニルアラニン２−ナフチルアミン、２−ナフチル−ホスフェート、６−Ｂｒ−２−ナフチル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド、２−ナフチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、２−ナフチル−２−Ｄ−グルコピラノシド、６−ブロモ−２−ナフトール−β−Ｄ−グルコピラノシド、６−ブロモ−２−ナフチル−２−Ｄ−マンノピラノシド、及び２−ナフチル−α−Ｌ−フコピラノシドを含む。
【００６０】
[0062]具体的に有用なナフチル−ＡＳ−ＢＩ誘導体は、ナフチル−ＡＳ−ＢＩ−ホスフェート及びナフチル−ＡＳ−ＢＩ−β−Ｄ−グルクロニドを含む。
【００６１】
[0063]その活性が検出される酵素がアルファ−Ｄ−グルコシダーゼである場合、好適な発色酵素基質は、例えば、ｐ−ニトロフェニル−α−グルコピラノシドである。検出される酵素活性がアルファ−Ｌ−アラビノフラノシダーゼである場合、好適な発色酵素基質は、例えば、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−アラビノフラノシドである。検出される酵素活性がベータ−Ｄ−グルコシダーゼの場合、好適な発色酵素基質は、例えば、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドである。
【００６２】
[0064]いずれかの実施形態では、第１の及び／又は第２の指示薬系は、蛍光発生酵素基質を含み得る。好適な蛍光発生酵素基質は、例えば、４−メチルウンベリフェロン７−アミド−４−メチルクマリン、フルオレセイン、ローダミン、及びフルオレスカミンの誘導体を含む。
【００６３】
[0065]好適な４−メチルウンベリフェリル誘導体は、例えば、４−メチルウンベリフェリル−２−アセトアミド−４、６−Ｏ−ベンジリデン−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド、４−メチルウンベリフェリル酢酸塩、４−メチルウンベリフェリル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトサミニド、４−メチルウンベリフェリル−Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニド、４−メチルウンベリフェリル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド、２’−（４−メチルウンベリフェリル）−α−Ｄ−Ｎ−アセチルノイラミン酸、４−メチルウンベリフェリルα−Ｌ−アラビノフラノシド、４−メチルウンベリフェリルα−Ｌ−アラビノシド、４−メチルウンベリフェリル酪酸塩、４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−セロビオシド、メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−Ｎ，Ｎ’ジアセチルキトビオシド、４−メチルウンベリフェリルエライジン酸塩、４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−フコシド、４−メチルウンベリフェリルα−Ｌ−フコシド、４−メチルウンベリフェリルβ−Ｌ−フコシド、４−メチルウンベリフェリルα−Ｄ−ガラクトシド、４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトシド、４−メチルウンベリフェリルａ−Ｄ−グルコシド、４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−グルコシド、４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−グルクロニド、４−メチルウンベリフェリルｐ−グアニジノ安息香酸、４−メチルウンベリフェリルヘプタノエート、４−メチルウンベリフェリルα−Ｄ−マンノピラノシド、４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−マンノピラノシド、４−メチルウンベリフェリルオレイン酸塩、４−メチルウンベリフェリルパルミチン酸塩、４−メチルウンベリフェリルホスフェート、４−メチルウンベリフェリルプロピオン酸塩、４−メチルウンベリフェリルステアリン酸塩、４−メチルウンベリフェリル硫酸塩、４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−トリアセチルキトトリオース、４−メチルウンベリフェリル２，３，５−トリ−ｏ−ベンゾイル−α−Ｌ−アラビノフラノシド、４−メチルウンベリフェリル−ｐ−トリメチルアンモニウムシンナメート塩化物、及び４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−キシロシドを含む。
【００６４】
[0066]好適な７−アミド−４−メチルクマリン誘導体は、例えば、Ｌ−アラニン−７−アミド−４−メチルクマリン、Ｌ−プロリン７−アミド−４−メチルクマリン、Ｌ−チロシン−７−アミド−４−メチルクマリン、Ｌ−ロイシン−７−アミド−４−メチルクマリン、Ｌ−フェニルアラニン−７−アミド−４−メチルクマリン、及び７−グルタリルフェニルアラニン−７−アミド−４−メチルクマリンを含む。
【００６５】
[0067]７−アミド−４−メチルクマリンの好適なペプチド誘導体は、例えば、Ｎ−ｔ−ＢＯＣ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ  ７−アミド−４−メチルクマリン、Ｎ−ｔ−ＢＯＣ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ  ７−アミド−４−メチルクマリン、Ｎ−ＣＢＺ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ  ７−アミド−４−メチル−クマリン、Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ  ７−アミド−４−メチルクマリン、Ｎ−ｔ−ＢＯＣ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ  ７−アミド−４−メチルクマリン、及びＮ−グルタリル−Ｇｌｙ−Ａｒｇ  ７−アミド−４−メチルクマリンを含む。
【００６６】
[0068]好適なジアセチルフルオレセイン誘導体は、例えば、フルオレセイン二酢酸塩、フルオレセインジ−（β−Ｄ−ガラクトピラノシド）、及びフルオレセインジラウリン酸塩を含む。
【００６７】
[0069]検出される生物活性が、アルファ−Ｄ−グルコシダーゼ、キモトリプシンの場合、好適な蛍光発生酵素基質は、それぞれ、４−メチルウンベリフェリル−アルファ−Ｄ−グルコシド、７−グルタリルフェニルアラニン−７−アミド−４−メチルクマリン、又は４−メチルウンベリフェリルヘプタノエートである。検出される生物活性がアルファ−Ｌ−アラビノフラノシダーゼの場合、好適な蛍光発生酵素基質は４−メチルウンベリフェリル−アルファ−Ｌ−アラビノフラノシドである。検出される生物活性がベータ−Ｄ−グルコシダーゼの場合、好適な蛍光発生酵素基質は４−メチルウンベリフェリル−ベータ−Ｄ−グルコシドである。
【００６８】
[0070]該方法のいずれかの実施形態では、第１の及び／又は第２の指示薬系は、代謝可能な栄養分と共に使用されるｐＨ指示薬染料を含み得る。ｐＨ指示薬染料は、例えば、ｐＨ領域、指示薬及び／又は標的微生物との適合性、及び溶解度等の当該技術分野において周知の評価基準にしたがって選択され得る。いくつかの実施形態では、例えば、水性混合物中のｐＨ指示薬の溶解度を増加させるために、塩形態のｐＨ指示薬が使用されてもよい。好適なｐＨ指示薬染料の非限定例としては、例えば、チモールブルー、トロペオリンＯＯ、メチルイエロー、メチルオレンジ、ブロモフェノールブルー、ブロモクレゾールグリーン、メチルレッド、ブロモチモールブルー、フェノールレッド、ニュートラルレッド、フェノールフタレイン、チモールフタレイン、アリザリンイエロー、トロペオリンＯ、ニトラミン、トリニトロ安息香酸、チモールブルー、ブロモフェノールブルー、テトラブロモフェノールブルー、ブロモクレゾールグリーン、ブロモクレゾールパープル、メチルレッド、ブロモチモールブルー、フェノールレッド、コンゴーレッド、及びクレゾールレッドが挙げられる。
【００６９】
[0071]代謝可能な栄養分は、少なくとも１つの微生物（指示微生物か、及び／又は標的微生物かのいずれか）と反応するために、及び微生物と流体接触状態である水溶性培地において、ｐＨ変化（例えば、局部的なｐＨ変化）をもたらすために、当該技術分野において周知の任意の代謝可能な栄養分であり得る。栄養分は、当該技術分野において周知の多様な栄養分の種類から選択され得る。栄養分の種類の非限定例としては、炭水化物（例えば、糖、多糖類、それらの誘導体）、脂質（例えば、脂肪酸、脂肪酸エステル、及びそれらの誘導体）、アミン（例えば、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、ポリアミン、及びそれらの誘導体）、ポリリン酸塩、プリン、ピリミジン、ヌクレオシド、及びヌクレオチドが挙げられる。
【００７０】
[0072]いくつかの実施形態では、任意の第２の指示薬系は、培養デバイス中（例えば、ペトリ皿中の寒天培地中、例えば、Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ培養デバイス等のデバイス中の乾燥培地中）に提供され得る。寒天の培地の構成成分等のヒドロゲルの構成成分として提供されるときに、任意の第２の指示薬系は、培地と流体連通状態で提供される。Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍプレート等の再水和可能な培養デバイスの一部として、乾燥構成成分として提供されるときに、任意の第２の指示薬系は、図１の工程１５４に示されるように、培地と流体連通にされる。これは、例えば、デバイス中の乾燥培地を液体（例えば、水、緩衝液、希釈剤）で再水和することによって達成され得る。いくつかの実施形態では、再水和可能な培地は、例えば、寒天、アガロース、グアーガム、キサンタンガム、ローカストビーンガム、ポリビニルアルコール、及び／又はポリビニルピロリドン等の冷水可溶性ゲル化剤を含む。所望により、該液体は、試料材料を含有してもよく、それによって操作者による工程１５４と植菌工程１５６との同時実行を可能にする。
【００７１】
[0073]培養デバイスを植菌する工程は、当該技術分野において周知の多様な方法によって行われ得る。好適な植菌方法の非限定例としては、混釈平板技術、表面植菌技術、画線平板法技術、拭取り検体プレーティング技術、及び表面接触プレーティング技術（例えば、ロダックプレーティング方法）が挙げられる。フィルタメンブレンプレーティング技術は、メンブレンフィルタが、実質的に微生物と指示薬系との間の反応を妨害しないか、又は指示薬系の観察を妨害しないならば、本方法において使用されてもよい。
【００７２】
[0074]本開示の方法は、ある時間、植菌された培養デバイスをインキュベートする工程を含む。当業者は、検出される微生物に応じてインキュベーション温度を選択できることを認識するであろう。例えば、酵母又はカビが検出される場合、第１のインキュベーション温度は、典型的に、約室温（約２３℃）〜約３２℃であってもよい。例えば、細菌が検出される場合、第１のインキュベーション温度は、典型的に約室温〜約４５℃であってもよい。
【００７３】
[0075]本開示によれば、インキュベーション時間は、約１時間と短くてもよい。いくつかの実施形態では、第１の培養は、約４時間未満（例えば、約２時間未満、約３時間未満、又は約４時間未満）である。いくつかの実施形態では、インキュベーション時間は、約８時間未満（例えば、約５時間未満、約６時間未満、約７時間未満、又は約８時間未満）である。いくつかの実施形態では、インキュベーションは、約１２時間未満（例えば、約９時間、約１０時間、約１１時間、又は約１２時間）である。いくつかの実施形態では、インキュベーション時間は、約１５時間以下（例えば、約１３時間未満、約１４時間未満、又は約１５時間未満）である。いくつかの実施形態では、インキュベーション時間は、最大４８時間（例えば、約２４時間未満、約３６時間未満、又は約４８時間未満）である。
【００７４】
[0076]インキュベーション時間の後、培養デバイスは、指示微生物の存在の指示について観察される。いくつかの実施形態では、培養デバイスは、視覚的に観察される。いくつかの実施形態では、培養デバイスを観察することは、撮像デバイスを使用して、培養デバイスを観察することを含み得る。スキャンニング及び所望により、培養デバイスを分析するための撮像デバイスは、当該技術分野において周知であり、例えば、３Ｍ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）から入手可能なＰＥＴＲＩＦＩＬＭ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（ＰＰＲ）、Ｓｐｉｒａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｎｏｒｗｏｏｄ，ＭＡ）から入手可能なＰＥＴＲＩＳＣＡＮ  Ｃｏｌｏｎｙ  Ｃｏｕｎｔｅｒ、及びＳｙｎｂｉｏｓｉｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｕ．Ｋ．）から入手可能なＰＲＯＴＯＣＯＬ及びＡＣＯＬＹＴＥプレートスキャナを含む。
【００７５】
[0077]任意の第２の指示薬系を使用する実施形態では、指示微生物の存在の指示は、第１の状態から第２の状態への第２の指示薬系の変換を検出することによって観察され得る。例えば、いくつかの実施形態では、第２の指示薬系は、無色の第１の状態が、有色の第２の状態に変換されるまで（例えば、指示微生物によって）、無色の第１の状態に存在する発色試薬（例えば、トリフェニルテトラゾリウム塩化物又は５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルコピラノシド）を含んでもよい。他の実施形態では、第２の指示薬系は、無色の第１の状態が、蛍光の第２の状態に変換されるまで（例えば、指示微生物によって）、無色の第１の状態に存在する蛍光発生試薬（例えば、４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトシド又はフルオレセイン二酢酸塩）を含んでもよい。また他の実施形態では、第２の指示薬系は、微生物活動の生成物（例えば、炭水化物の酸最終産物への発酵）によって、第１の有色の又は蛍光の状態から第２の有色の又は蛍光の状態に変換され得る試薬（例えば、ｐＨ指示薬）を含んでもよい。
【００７６】
[0078]いくつかの実施形態では、第１の状態から第２の状態への第２の指示薬系の変換を検出することは、微生物コロニーを観察し、変換を検出することを含み得る。いくつかの実施形態では、第１の状態から第２の状態への第２の指示薬系の変換を検出することは、培地を観察し、変換を検出することを含み得る。
【００７７】
[0079]図２は、本開示による指示微生物を検出するいくつかの態様を例示する。図２は、第２の指示薬系と反応する指示微生物を含む植菌された培養デバイスの一実施形態の平面図を示す。培養デバイスは、第１の状態（第１の状態は、図２に濃い灰色で図示され、クロロフェノールレッドは、約６．８又はそれより高いｐＨを有する培地において、スミレ色の第１の状態で存在する）において、発酵性炭水化物（例えば、グルコース）及び試薬（例えば、クロロフェノールレッド）を含む第２の指示薬系を含む培地２８２を有する。グルコースを拡散性の酸最終産物に発酵する指示微生物コロニー２８４もまた、図２に示され、それは、試薬と反応して、それを第２の状態（第２の状態は、図２のコロニー２８４を囲む薄い灰色の嵩２８６として図示され、クロロフェノールレッドは、約５．２未満のｐＨを有する培地では、黄色の第２の状態に変換する）に変換する。いくつかの実施形態では、コロニーは試薬によって染色されてもよく、それらのすぐ近くを囲む培地と同一の（又は類似の）色のように見えてもよい。他の実施形態では（示されていないが）、第２の指示薬系は、第１の状態から第２の状態に変化する酵素基質又はレドックス剤を単に含んでもよく、それによって、コロニーを囲む培地よりもむしろ、コロニー自体の色又は蛍光特性を直接的に変化させる。
【００７８】
[0080]任意の第２の指示薬系（例えば、示されていないが、選択性の寒天培地を含む培養デバイス）を使用しない実施形態では、指示微生物の存在の指示は、培地上又は培地内の、細菌コロニーの存在を観察することによって（例えば、当該技術分野において周知の、その典型的なサイズ、形状、色、及び／又は形態によって）検出され得る。
【００７９】
[0081]表１は、腸内細菌科の微生物、サルモネラ標的微生物の存在を示す指示微生物の代表的な群の増殖を支持するために使用され得る選択性の培地のいくつかの非限定例を示す。腸内細菌科の微生物を検出するために使用され得る例示の指示薬系（すなわち、本開示による第２の指示薬系）もまた、表１に示される。サルモネラ標的微生物の存在を示すために使用され得る、例示の第１の指示薬系は、カプリル酸エステラーゼ酵素基質（ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ２００７０２３１８５号に開示され、その全文は参照することにより本明細書に組み込まれる）；２−デオキシ−Ｄ−リボースプラスニュートラルレッド（米国特許第７，１５０，９７７号に開示され、その全文は参照することにより本明細書に組み込まれる）；５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（米国特許第６，３６８，８１７号に開示され、その全文は参照することにより本明細書に組み込まれる）；プロパンジオールプラスニュートラルレッド（米国特許第５，１９４，３７４号に開示され、その全文は参照することにより本明細書に組み込まれる）；並びにメリビオース、マンニトール、ソルビトール、及びニュートラルレッドの組み合わせ（米国特許第５，７８６，１６７号に開示され、その全文は参照することにより本明細書に組み込まれる）を含む。
【００８０】
【表１】
0005911511.tif 000002
【００８１】
[0082]本開示によるサルモネラ標的微生物を検出する方法の例示的実施形態は、表２に列挙される構成成分を含む培地を伴う培養デバイス（例えば、寒天ペトリ皿又はＰＥＴＲＩＦＩＬＭ培養デバイス）の使用を含む。寒天培地を調製するときに、ノボビオシンナトリウム及びセフスロジンを除く全ての構成成分を任意の順序で一緒に混合し、その後煮沸し、冷却し、基本培地を形成する。平板培地の完成の直前に、冷却され、煮沸された基本培地にノボビオシンナトリウム及びセフスロジンを添加する。培地に加えて、実施例１に記載される通り、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−α−Ｄ−ガラクトピラノシドを含む第１の指示薬系を有する検出物品を調製する。培地に試料を植菌し、ある時間（例えば、約１８〜４８時間）インキュベートする。インキュベーションの後、少なくとも１つの指示微生物の存在の指示（例えば、ニュートラルレッドｐＨ指示薬を無色から赤色に変化させる酸最終産物への２−デオキシ−Ｄ−リボースの発酵を示す、概して円形の赤いコロニー及び／又はゾーン）について、培養デバイスを観察する。そのゾーンは、その中心部に又はその近くに目視できるコロニーを有してもよい。指示微生物が検出された場合、検出物品を培地と接触させ、物品に接触させた培地をある時間（例えば、約１〜５時間）インキュベートし、標的微生物の存在の指示（すなわち、微生物の第１の指示薬系との反応から形成された、一般に赤いゾーンの中心部の青色のコロニー）について観察し得る。所望により、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド）と異なる色を生成する発色β−ガラクトピラノシド基質を含む追加の第２の指示薬系を、培地又は検出物品に追加し得る。追加の第２の指示薬系は、大腸菌の特定の菌株及びシトロバクター・フロインデイ等の非標的指示微生物を更に識別するために使用され得る。ニュートラルレッドに代わるものとして、当該技術分野において周知の他のｐＨ指示薬が、第２の指示薬系に使用され、２−デオキシ−Ｄ−リボースの発酵に由来する酸最終産物を検出し得る。他の好適なｐＨ指示薬の例が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、他の第２の指示薬系（例えば、トリフェニルテトラゾリウム塩化物）が、２−デオキシ−Ｄ−リボース／ニュートラルレッド指示薬系の代わりに、又はそれに加えて使用され、指示微生物の存在を示し得る。いくつかの実施形態では、他の第２の指示薬が、培地の代わりに検出物品中に組み込まれ得る。検出物品に含まれ得る代替的な第１の指示薬系は、α−ガラクトシダーゼに対する他の発色又は蛍光発生酵素基質、カプリレートエステラーゼに対する発色又は蛍光発生酵素基質、あるいはフェニルアラニンデアミナーゼ又はプロパンジオール発酵を検出する指示薬系を含んでもよい。
【００８２】
【表２】
0005911511.tif 000003
【００８３】
[0083]腸内細菌科及び／又は大腸菌型微生物、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７標的微生物の存在を示す指示微生物の代表的な群の増殖を支持するために使用され得る選択性の培地の非限定例としては、バイオレットレッド胆汁ブドウ糖培地、バイオレットレッド胆汁乳糖培地、ＰＥＴＲＩＦＩＬＭ大腸菌Ｃｏｕｎｔ  Ｐｌａｔｅｓ、ＰＥＴＲＩＦＩＬＭ大腸菌型Ｃｏｕｎｔ  ｐｌａｔｅｓ、ＰＥＴＲＩＦＩＬＭ腸内細菌科Ｃｏｕｎｔ  ｐｌａｔｅｓ、及びＰＥＴＲＩＦＩＬＭ  Ｒａｐｉｄ大腸菌型Ｃｏｕｎｔ  ｐｌａｔｅｓが挙げられる。大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７標的微生物の存在を示すために使用され得る例示の第１の指示薬系は、サリシン、アドニトール、イノシトール、及びフェノールレッドを伴うソルビトールとの組み合わせを含む（米国特許第６，６１７，１４９に開示され、その全文は参照することにより本明細書に組み込まれる）。
【００８４】
[0084]リステリア微生物、リステリア・モノサイトゲネス標的微生物の存在を示す指示微生物の代表的な群の増殖を支持するために使用され得る選択性の培地の非限定例としては、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｏｘｆｏｒｄｓ  Ｍｅｄｉｕｍ及びＲ＆Ｆ培地が挙げられる。リステリア・モノサイトゲネス標的微生物の存在を示すために使用され得る例示の第１の指示薬系は、ホスファチジルイノシトールホスホリパーゼＣ酵素基質（米国特許出願公開第２００７０２５９３９３号に開示され、その全文は参照することにより本明細書に組み込まれる）及びアルファマンノシダーゼ酵素基質（米国特許第７，３５１，５４８号に開示され、その全文は参照することにより本明細書に組み込まれる）を含む。リステリア・モノサイトゲネス標的微生物を検出するために使用され得る第１の指示薬系の非限定例としては、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−ミオ−イノシトール−１−ホスフェート、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドキシルミオ−イノシトール−１−ホスフェート、アンモニウム塩、４−メチルウンベリフェリルミオ−イノシトール−１−ホスフェート、Ｎ−メチル−モルホリン塩、３−インドキシル−α−Ｄ−マンノピラノシド、５−ブロモ−３−インドキシル−α−Ｄ−マンノピラノシド、４−クロロ−３−インドキシル−α−Ｄ−マンノピラノシド、５−ヨード−３−インドキシル−α−Ｄ−マンノピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−α−Ｄ−マンノピラノシド、クロロ−３−インドキシル−α−Ｄ−マンノピラノシド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドキシル−α−Ｄ−マンノピラノシド、６−ブロモ−３−インドキシル−α−Ｄ−マンノピラノシド、６−クロロ−３−インドキシル−α−Ｄ−マンノピラノシド、６−フルオロ−３−インドキシル−α−Ｄ−マンノピラノシド、４，６−ジクロロ−３−インドキシル−α−Ｄ−マンノピラノシド、６，７−ジクロロ−３−インドキシル−α−Ｄ−マンノピラノシド、４，６，７−トリクロロ−３−インドキシル−α−Ｄ−マンノピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−Ｎ−メチル−−α−Ｄ−マンノピラノシド、３−インドキシル−α−Ｄ−マンノピラノシド、及びＮ−メチル−３−インドキシル−α−Ｄ−マンノピラノシド、６−ブロモ−２−ナフチル−α−Ｄ−マンノピラノシド、４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−マンノピラノシド、及び４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マンノピラノシドが挙げられる。
【００８５】
[0085]好ましい実施形態では、リステリア微生物の存在を検出するための薄膜培養デバイスは、プロテオースペプトン、トリプトン、カザミノ酸、Ｌａｂ  Ｌｅｍｃｏ  Ｐｏｗｄｅｒ／牛肉エキス、グルコース、酵母抽出物、リン酸水素二カリウム、塩化リチウム、ウシ血清アルブミン、グアーガム、ナリジクス酸（ナトリウム塩）、ｂ−グルコシダーゼ酵素活性（例えば、サーモン−β−Ｄ−グルコシド及び／又はマゼンタ−β−Ｄグルコシド）を検出するための発色酵素基質、及びセフタジジム五水和物を含む乾燥ブイヨン培地を含み得る。液体試料が培地を植菌するために使用され、リステリア微生物が、存在する場合、増殖し、β−グルコシダーゼ発色酵素基質の加水分解のために赤色のコロニーを形成する。リステリア微生物が培養デバイス中に検出される場合、培養デバイスの植菌された培地は、所望により、ホスファチジルイノシトールホスホリパーゼＣ酵素活性を検出するための発色指示薬（例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−ミオ−イノシトール−１−ホスフェート）、グアーガム、及びホスフェート緩衝液を含む乾燥コーティングを備える検出物品と接触され得る。コロニーのうちの１つ以上がリステリア・モノサイトゲネス微生物を含む場合、それは、ホスファチジルイノシトールホスホリパーゼＣ酵素基質を加水分解してコロニーを青色にするだろう。有利なことに、リステリア微生物が、コロニーに関連するβ−グルコシダーゼ酵素活性の兆候をまず観察することによって検出された場合にのみ、検出物品の使用を必要とする。
【００８６】
[0086]腸内細菌科の微生物、クロノバクター・サカザキ標的微生物の存在を示す代表的な指示微生物の増殖を支持するために使用され得る選択性の培地の非限定例としては、バイオレットレッド胆汁ブドウ糖培地及びＰＥＴＲＩＦＩＬＭ腸内細菌科Ｃｏｕｎｔ  ｐｌａｔｅｓが挙げられる。クロノバクター・サカザキ標的微生物の存在を示すために使用され得る例示の第１の指示薬系は、発色アルファグルコシダーゼ及びベータセロビオシダーゼ酵素基質（米国特許出願公開第２００６／０２５７９６７号に開示され、その全文は参照することにより本明細書に組み込まれる）を含む。
【００８７】
[0087]いくつかの実施形態では、標的微生物と類似の環境（例えば、糞便材料）で見出されることが周知の指示微生物群は、標的微生物を実際に含まない場合もある。この条件の一例は、大腸菌型指示微生物及びサルモネラ標的微生物の関係によって例示される。大腸菌型細菌は、糞便材料に見出され、ラクトースを酸最終産物に発酵する能力によって特徴付けられる。特定のサルモネラ標的微生物（例えば、サルモネラ腸内ネズミチフス菌）は、糞便材料に見出され、ラクトースを酸最終産物に発酵しない。したがって、本開示による方法は、サルモネラ標的微生物を検出するために、第１の指示薬系（例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド）を、及び大腸菌型指示微生物を検出するために、第２の指示薬系（例えば、ラクトース及びニュートラルレッド）を提供する工程を含んでもよい。この実施形態では、第１の指示薬系と反応するコロニーは、第２の指示薬系と反応しないだろう。
【００８８】
[0088]指示生物の存在の指示の観察は、試料中の標的微生物（例えば、潜在的病原体）が存在する可能性を暗示する。したがって、指示微生物の存在の指示が観察されるときに、検出物品が、試料中の標的微生物の存否を確認するために使用され得るという該方法の特徴である。逆に言えば、指示微生物の存在の指示が、培養デバイス中に観察されないいくつかの実施形態では、該方法における検出物品の使用が、試料中の指示微生物の不在が、試料中の標的微生物の不在を暗示するため、避けられ得る。
【００８９】
[0089]本開示の方法は、第１の指示薬系を含む検出物品を提供することを含む。図３は、本開示による検出物品３００の一実施形態の斜視図を示す。検出物品３００は、上側及び下側主表面、並びにその上に配置されるコーティング３２０を有する固体支持物３１０を備える。コーティング３２０は、本明細書に記載のように、第１の指示薬系を含む。第１の指示薬系は、特定の標的微生物を検出するために選択され得る。所望により、接着層（示されていないが）は、固体支持物３１０とコーティング３２０との間で、且つ固体支持物３１０上に配置され得る。任意の接着層は、実質的に、第１の指示薬系の標的微生物との反応を妨害せず、及び／又は第２の指示薬系の観察を妨害しない、接着剤を備えるべきである。好適な接着剤の非限定例としては、米国特許第４，５６５，７８３号に開示される、イソオクチルアクリレート／アクリルアミド（９４：６）の感圧接着剤が挙げられ、その全文は参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００９０】
[0090]いくつかの実施形態では、コーティング３２０は、実質的に水を含まない（すなわち、一旦周囲環境と均衡化されると、それは、乾燥コーティングのおおよその含水量を超えない含水量を有する）。いくつかの実施形態では、コーティング３２０は、粉末等の乾燥コーティングとして基材３１０又は任意の接着層に塗布され得るか、又はコーティングは液体として基質に塗布され、その後に基材上で乾燥され得、双方のプロセスは、例えば、米国特許第４，５６５，７８３号に記載される通りである。いくつかの実施形態では、物品３００は、米国特許第６，０２２，６８２号に複合物の製造に関して記載されるように構成、コーティング、及び乾燥され得、その全文は参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００９１】
[0091]いくつかの実施形態では、コーティング３２０は、結合剤を含む。検出物品３００に使用されるのに好適な多くの結合剤がある。好適な結合剤の非限定例としては、アガロース、グアーガム、キサンタンガム、ローカストビーンガム、及び他の天然ガムが挙げられる。好ましい結合剤は、グアーガムである。
【００９２】
[0092]コーティング３２０はまた、好ましくは、例えば、第１の指示薬系と標的微生物との間の反応が促進される地点でｐＨを制御するための好適な緩衝剤等の他の構成物質を含んでもよい。特定の緩衝剤（例えば、ホスフェート緩衝液）及びｐＨ（例えば、７．２）の選択は、当業者に認識されるように、第１の指示薬系及び／又は標的微生物に応じてもよい。
【００９３】
[0093]固体支持物３１０は、コーティングされ得、且つ第１の指示薬系及び所望により、第２の指示薬系の反応物又は生成物の観察を実質的に不明瞭にしない物質から選択されるべきである。固体支持物３１０は、ポリエステルフィルム等のポリマーフィルムであり得る。固体支持物３１０は、シート材料（例えば、ポリマーフィルム、紙、不織布）に由来し、コーティング又は乾燥の後に、検出物品３００を所望のサイズ又は形状に切断、又は穴あけすることを可能にしてもよい。いくつかの実施形態では、固体支持物３１０は、透明又は半透明であってもよく、又はそれは、ヒドロゲルと接触して設置されるときに、透明又は半透明になってもよい。固体支持物３１０に使用される材料は、検出物品３００に対して任意の度合いの剛性又は柔軟性を付与するように選択されてもよい。加えて、検出物品３００は、特定の用途に所望されるものに応じて、任意の形状（例えば、円形、卵形、正方形、方形等）又は厚さにおいて調製され得る。
【００９４】
[0094]固体支持物３１０は、好ましくは、透明か、又は少なくとも半透明であり、物品が培養デバイスと流体接触して設置されるときに呈する色変化を見ることを可能にする。固体支持物３１０はまた、物品に安定性を提供し、損傷からそれを保護する。
【００９５】
[0095]固体支持物３１０は、それがコーティング３２０から剥離可能であるように選択され、固体支持物３１０なしに試験で使用可能なようにコーティングを残してもよい（例えば、培地と流体接触して）。例えば、ポリエステルフィルムが固体支持物として使用されるところでは、固体支持物３１０は、コーティング３２０が培養デバイスと接触した後で水和するときに、コーティング３２０から剥離可能であってもよい。
【００９６】
[0096]使用時、検出物品は、培養デバイスの培地と流体接触されてもよい。好ましくは、検出物品及び培地は、培養デバイス中で接触される（例えば、培養デバイスの培地と接触して検出物品を設置することによって）。特定の好ましい実施形態では、検出物品は、物品が培養デバイスの培地の全面積と接触するように、実質的に同一の形状及び表面積を有するように寸法が取られる。いくつかの実施形態では、検出物品は、事前に水和されてもよいが（例えば、滅菌水又は緩衝液で）、培地の水分は検出物品を水和するのに十分であることが企図され、それによって、第１の指示薬系が、培養デバイス中に存在する微生物に流体接触することを可能にする。
【００９７】
[0097]理論に束縛されるものではないが、第１の指示薬系の構成成分が、代謝産物、標的微生物、又は標的微生物の構成成分と反応し、第１の状態から第２の状態へ変換され得るように、培地と検出物品との間の流体接触は、第１の指示薬系、微生物によって生成される代謝産物、及び／又は微生物（又は例えば酵素等のそれらの構成成分）の拡散を可能にすると考えられる。したがって、いくつかの実施形態では、第１の状態から第２の状態への第１の指示薬系の変換が、存在する場合、少なくとも１つの標的微生物の存在を示す。
【００９８】
[0098]いくつかの実施形態では、第１の状態から第２の状態への第１の指示薬系の変換が、存在しない場合、少なくとも１つの標的微生物の存在を示す。該方法のこれら実施形態では、指示微生物が、第１の指示薬系を第１の状態から第２の状態へ変化する（例えば、コロニー及び／又はコロニーのすぐ近くを囲む培地が、有色又は蛍光になる）ときに、指示微生物は標的微生物でない。逆に言えば、これらの実施形態では、指示微生物が、第１の指示薬系を第１の状態から第２の状態へ変化させない場合、それは、指示微生物が標的微生物であるという指示である。特定の非限定例は、この点を例示し得る。赤痢菌属の特定の微生物は、ヒトに対して病原性であり、したがって、赤痢菌は標的微生物の一例である。赤痢菌は、腸内細菌科の一属である。腸内細菌科の微生物（赤痢菌種を含む）は糞便材料中に見出され得るため、腸内細菌科の微生物は赤痢菌の指示微生物の一例である。本開示の方法の実施形態では、材料の試料は、腸内細菌科（例えば、バイオレットレッド胆汁寒天培地又はＰＥＴＲＩＦＩＬＭ腸内細菌科Ｃｏｕｎｔ  Ｐｌａｔｅｓ）のための選択性の培地上に植菌され得る。指示微生物が培地上に検出される場合、例えば、β−グルコシダーゼ、β−フコシダーゼ、及び／又はＮ−アセチル−β−ガラクトサミニダーゼを検出するための発色酵素基質を含む検出物品が、培地と接触され得る。無色の状態から有色の状態へのこれらの酵素基質のうちの任意の１つの変換は、赤痢菌標的微生物が、これらの酵素基質に対する任意の対応する酵素活性を含まないため、コロニーが標的微生物でないという指示である。
【００９９】
[0099]検出物品を培地と流体接触させた後、物品に接触させた培地は、第１の状態から第２の状態への第１の指示薬系の変換（例えば、無色状態から有色状態へ、非蛍光状態から蛍光状態へ、第１の色から第２の色へ）を検出するために観察される。この変換は、例えば、第１の状態から第２の状態への第２の指示薬系の変換を検出するための、本明細書に記載の任意の検出手段によって観察され得る。所望により、いくつかの実施形態では、物品に接触させた培地は、所定の温度で、ある時間インキュベートされ、第１の状態から第２の状態への第１の指示薬系の変換を促進し得る。インキュベーション温度は、例えば、周囲温度（約２３℃）、最大約２８℃、最大約３０℃、最大約３５℃、最大約３７℃、最大約４２℃、又は最大約４５℃であり得る。いくつかの実施形態では、物品に接触させた培地は、指示微生物を増殖し、検出するために使用されるインキュベーション温度と同一の温度でインキュベートされ得る。いくつかの実施形態では、物品に接触させた培地は、指示微生物を増殖し、検出するために使用されるインキュベーション温度と異なる（例えば、より低い又はより高い）温度でインキュベートされ得る。
【０１００】
[00100]いくつかの実施形態では、物品に接触させた培地は、少なくとも約１５分間インキュベートされ得る。いくつかの実施形態では、物品に接触させた培地は、少なくとも約３０分間インキュベートされ得る。いくつかの実施形態では、物品に接触させた培地は、少なくとも約６０分間インキュベートされ得る。いくつかの実施形態では、物品に接触させた培地は、少なくとも約９０分間インキュベートされ得る。いくつかの実施形態では、物品に接触させた培地は、少なくとも約２時間インキュベートされ得る。いくつかの実施形態では、物品に接触させた培地は、少なくとも約４時間インキュベートされ得る。いくつかの実施形態では、物品に接触させた培地は、最大約６０分間インキュベートされ得る。いくつかの実施形態では、物品に接触させた培地は、最大約９０分間インキュベートされ得る。いくつかの実施形態では、物品に接触させた培地は、最大約２時間インキュベートされ得る。いくつかの実施形態では、物品に接触させた培地は、最大約３時間インキュベートされ得る。いくつかの実施形態では、物品に接触させた培地は、最大約４時間インキュベートされ得る。いくつかの実施形態では、物品に接触させた培地は、最大５時間インキュベートされ得る。いくつかの実施形態では、物品に接触させた培地は、最大８時間インキュベートされ得る。いくつかの実施形態では、物品に接触させた培地は、最大１２時間インキュベートされ得る。いくつかの実施形態では、物品に接触させた培地は、最大２４時間インキュベートされ得る。いくつかの実施形態では、物品に接触させた培地は、約１５分間〜約８時間以下でインキュベートされ得る。いくつかの実施形態では、物品に接触させた培地は、約３０分間〜約８時間以下でインキュベートされ得る。いくつかの実施形態では、物品に接触させた培地は、約３０分間〜約５時間以下でインキュベートされ得る。いくつかの実施形態では、物品に接触させた培地は、約１時間〜約５時間以下でインキュベートされ得る。いくつかの実施形態では、物品に接触させた培地は、約２時間〜約５時間以下でインキュベートされ得る。いくつかの実施形態では、物品に接触させた培地は、約２時間〜約４時間以下でインキュベートされ得る。
【０１０１】
[00101]図４は、デバイス中の培養（増殖）培地と接触して検出物品を設置した後の、図３の培養デバイスの平面図を示す。培養デバイスは、培地４８２を有し、培地４８２上に及び／又は培地４８２内にコロニーが増殖する。図２に示される通り、指示微生物コロニー４８４が存在し、それは、第１の状態（濃い灰色）から第２の状態（薄い灰色）へ、第１の指示薬系を変化させ、指示微生物コロニー４８４を中心として特有の嵩４８６を形成する。標的微生物コロニー４８５がまた、図４に示され、それは、指示微生物コロニー４８４よりも大きく見える。これは、例えば、第１の状態から第２の状態への第２の指示薬系の変換のためであり得る。いくつかの実施形態では、第２の指示薬系は、沈殿性の発色酵素基質（例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド）であってもよく、それは、標的微生物と反応するときに、コロニーを青くし得、コロニーをわずかに大きく見せてもよい。標的微生物コロニー４８５はまた、第１の指示薬系と反応し、それらを囲む嵩４８６を有する。
【０１０２】
[00102]本開示の方法は、所望により、微生物の種類を数える工程を更に含み得る。微生物の種類を数えることは、微生物の特定の種類の多数のコロニー（又はコロニー形成単位）を数えることを含む。数えられるコロニー形成単位の数は、元の試料中の１グラム当り（又は１ミリリットル当り）の微生物の数を試算するために使用され得る。数えられるコロニー形成単位の数は、規格と比較され、元の試料が、例えば、品質基準に適合するかどうか判定され得る。いくつかの実施形態では、特定の種類の全ての微生物（例えば、指示微生物、標的微生物）が数えられ得る。いくつかの実施形態では、特定の種類の微生物の一部分（例えば、最大、所定の閾値数まで）が数えられ得る。
【０１０３】
[00103]いくつかの実施形態では、微生物の種類を数えることは、指示微生物の数を数えることを含む。いくつかの実施形態では、微生物の種類を数えることは、標的微生物の数を数えることを含む。いくつかの実施形態では、微生物の種類を数えることは、指示微生物の数及び標的微生物の数を数えることを含む。いくつかの実施形態では、微生物の種類を数えることは、撮像デバイスを使用して、微生物を数えることを含み得る。
【０１０４】
［実施形態］
[00104]実施形態１は、標的微生物の存否を検出する方法であって、
所定の指示微生物の増殖を促進するように選択された成分を含む培地を含む培養デバイス、
第１の指示薬系を含む検出物品であって、第１の指示薬系が標的微生物を検出するように選択されている、検出物品及び
試料を提供すること、
試料を用いて培養デバイスを植菌すること、
指示微生物の増殖を可能にするのに十分である時間、植菌された培養デバイスをインキュベートすること、
少なくとも１つの指示微生物の存在の指示について、培養デバイスを観察すること、
インキュベートされた培養デバイスの培地を検出物品に接触させること、並びに
第１の状態から第２の状態への第１の指示薬系の変換を検出するために、物品に接触させた培養デバイスを観察すること、を含む方法である。
【０１０５】
[00105]実施形態２は、第１の状態から第２の状態への第１の指示薬系の変換が、存在する場合、少なくとも１つの標的微生物の存在を示す、実施形態１に記載の方法である。
【０１０６】
[00106]実施形態３は、第１の状態から第２の状態への第１の指示薬系の変換が、存在しない場合、少なくとも１つの標的微生物の存在を示す、実施形態１に記載の方法である。
【０１０７】
[00107]実施形態４は、第２の指示薬系を提供して、第２の指示薬系を培地と流体連通状態に設置することを更に含み、少なくとも１つの指示微生物の存在の指示について、培養デバイスを観察することが、第１の状態から第２の状態への第２の指示薬系の変換を検出することを含む、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の方法である。
【０１０８】
[00108]実施形態５は、培養デバイスを提供することが、ヒドロゲル又は乾燥した冷水可溶性ゲル化剤を含む培養デバイスを提供する工程を更に含む、実施形態１〜４のいずれか１つに記載の方法である。
【０１０９】
[00109]実施形態６は、培地を検出物品に接触させることが、少なくとも１つの指示微生物の存在の指示が観察されるときにのみ実行される、実施形態１〜５のいずれか１つに記載の方法である。
【０１１０】
[00110]実施形態７は、培養デバイスを提供することが、第２の指示薬系を含む培養デバイスを提供することを更に含む、実施形態１〜６のいずれか１つに記載の方法である。
【０１１１】
[00111]実施形態８は、培地を提供することが、腸内細菌科の微生物の増殖を促進するように選択された培地を提供することを含み、検出物品を提供することが、サルモネラ属の微生物を検出するための検出物品を提供することを含む、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の方法である。
【０１１２】
[00112]実施形態９は、第１の指示薬系が、α−ガラクトシダーゼ又はカプリレートエステラーゼ酵素活性を検出するための試薬を含む、実施形態８の方法である。
【０１１３】
[00113]実施形態１０は、培地を提供することが、腸内細菌科の微生物の増殖を促進するように選択された培地を提供することを含み、検出物品を提供することが、赤痢菌属の微生物を検出するための検出物品を提供することを含む、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の方法である。
【０１１４】
[00114]実施形態１１は、第１の指示薬系が、β−グルコシダーゼ、β−フコシダーゼ、Ｎ−アセチル−β−ガラクトサミニダーゼ、又は前述の酵素活性のうちの任意の２つ以上の組み合わせを検出するための試薬を含む、実施形態１０に記載の方法である。
【０１１５】
[00115]実施形態１２は、培地を提供することが、腸内細菌科の微生物の増殖を促進するように選択された培地を提供することを含み、検出物品を提供することが、クロノバクター属の微生物を検出するための検出物品を提供することを含む、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の方法である。
【０１１６】
[00116]実施形態１３は、第１の指示薬系が、α−グルコシダーゼ及び／又はβ−セロビオシダーゼ酵素活性を検出するための試薬を含む、実施形態１２の方法である。
【０１１７】
[00117]実施形態１４は、培地を提供することが、腸内細菌科の微生物の増殖を促進するように選択された培地を提供することを含み、検出物品を提供することが、大腸菌を検出するための検出物品を提供することを含む、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の方法である。
【０１１８】
[00118]実施形態１５は、第１の指示薬系が、β−グルクロニダーゼ酵素活性を検出する試薬を含む、実施形態１４に記載の方法である。
【０１１９】
[00119]実施形態１６は、培地を提供する工程が、大腸菌微生物の増殖を促進するように選択された培地を提供することを含み、検出物品を提供することが、大腸菌を検出するための検出物品を提供することを含む、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の方法である。
【０１２０】
[00120]実施形態１７は、第１の指示薬系が、β−グルクロニダーゼ酵素活性を検出するための試薬を含む、実施形態１６の方法である。
【０１２１】
[00121]実施形態１８は、培地を提供することが、リステリア属の微生物の増殖を促進するように選択された培地を提供することを含み、検出物品を提供することが、リステリア・モノサイトゲネスを検出するための検出物品を提供することを含む、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の方法である。
【０１２２】
[00122]実施形態１９は、第１の指示薬系が、α−マンノピラノシダーゼ及び／又はホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ酵素活性を検出するための試薬を含む、実施形態１８の方法。
【０１２３】
[00123]実施形態２０は、培養デバイス又は物品に接触させた培養デバイスを観察することが、培養デバイスを視覚的に観察することを含む、実施形態１〜１９のいずれか１つに記載の方法である。
【０１２４】
[00124]実施形態２１は、培養デバイス又は物品に接触させた培養デバイスを観察することが、撮像デバイスを使用して、培養デバイスを観察することを含む、実施形態１〜１９のいずれか１つに記載の方法である。
【０１２５】
[00125]実施形態２２は、培養デバイス内の指示微生物のコロニー形成単位を数えることを更に含む、実施形態１〜２１のいずれか１つに記載の方法である。
【０１２６】
[00126]実施形態２３は、培養デバイス内の標的微生物のコロニー形成単位を数えることを更に含む、実施形態１〜２２のいずれか１つに記載の方法である。
【０１２７】
[00127]実施形態２４は、培地を検出物品に接触させることが、所定の温度で、培地を検出物品に接触させることを更に含む、実施形態１〜２３のいずれか１つに記載の方法である。
【０１２８】
[00128]実施形態２５は、上側及び下側の主表面を有する基材及び主表面のうちの少なくとも１つに配置された第１の指示薬系を含むコーティングを備える検出物品であって、第１の指示薬系が、α−ガラクトピラノシド又はカプリレートエステラーゼ酵素活性によって第１の状態から第２の状態へ変換される、検出物品である。
【０１２９】
[00129]実施形態２６は、第１の指示薬系が、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−カプリル酸、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−カプリル酸、及び前述の指示薬のうちの任意の２つ以上の組み合わせからなる群から選択される指示薬を含む、実施形態２５に記載の物品である。
【０１３０】
[00130]実施形態２７は、上側及び下側の主表面を有する基材及び主表面のうちの少なくとも１つにコーティングされた第１の指示薬系を含む検出物品であって、第１の指示薬系が、β−グルクロニダーゼ酵素活性によって第１の状態から第２の状態へ変換される、検出物品である。
【０１３１】
[00131]実施形態２８は、第１の指示薬系が、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸、ｐ−ニトロフェニル−β−グルクロニド、ｐ−ニトロフェニル−２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−グルクロン酸メチルエステル、フェノールフタレイングルクロン酸、フェノールフタレインモノ−Ｐ−グルクロン酸、ナフチル−ＡＳ−ＢＩ−β−Ｄ−グルクロニド、４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−グルクロニド、８−ヒドロキシキノリン−ベータ−Ｄ−グルクロン酸、ナトリウム塩、２−ナフチル−ベータ−Ｄ−グルクロン酸、ナトリウム塩、４−ニトロフェニル−ベータ−Ｄ−グルクロン酸、ナトリウム塩、フェノールフタレイン−ベータ−Ｄ−グルクロン酸、ナトリウム塩一水和物、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−ベータ−Ｄ−グルクロン酸、シクロヘキシルアンモニウム塩、３−インドキシル−ベータ−Ｄ−グルクロン酸、シクロヘキシルアンモニウム塩、３−インドキシル−ベータ−Ｄ−グルクロン酸、ナトリウム塩、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドキシル−ベータ−Ｄ−グルクロン酸、シクロヘキシルアンモニウム塩、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−ベータ−Ｄ−グルクロン酸、ナトリウム塩無水物、及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−ベータ−Ｄ−グルクロン酸、ナトリウム塩三水和物、並びに前述の指示薬のうちの任意の２つ以上の組み合わせからなる群から選択される指示薬を含む、実施形態２７の物品である。
【０１３２】
[00132]実施形態２９は、上側及び下側の主表面を有する基材及び主表面のうちの少なくとも１つにコーティングされた第１の指示薬系を含む検出物品であって、第１の指示薬系が、α−マンノピラノシダーゼ又はホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ酵素活性によって第１の状態から第２の状態へ変換される、検出物品である。
【０１３３】
[00133]実施形態３０は、第１の指示薬系が、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−ミオ−イノシトール−１−ホスフェート、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドキシルミオ−イノシトール−１−ホスフェート、アンモニウム塩、４−メチルウンベリフェリルミオ−イノシトール−１−ホスフェート、Ｎ−メチル−モルホリン塩、３−インドキシル−α−Ｄ−マンノピラノシド、５−ブロモ−３−インドキシル−α−Ｄ−マンノピラノシド、４−クロロ−３−インドキシル−α−Ｄ−マンノピラノシド、５−ヨード−３−インドキシル−α−Ｄ−マンノピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−α−Ｄ−マンノピラノシド、クロロ−３−インドキシル−α−Ｄ−マンノピラノシド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドキシル−α−Ｄ−マンノピラノシド、６−ブロモ−３−インドキシル−α−Ｄ−マンノピラノシド、６−クロロ−３−インドキシル−α−Ｄ−マンノピラノシド、６−フルオロ−３−インドキシル−α−Ｄ−マンノピラノシド、４，６−ジクロロ−３−インドキシル−α−Ｄ−マンノピラノシド、６，７−ジクロロ−３−インドキシル−α−Ｄ−マンノピラノシド、４，６，７−トリクロロ−３−インドキシル−α−Ｄ−マンノピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−Ｎ−メチル−−α−Ｄ−マンノピラノシド、３−インドキシル−α−Ｄ−マンノピラノシド、及びＮ−メチル−３−インドキシル−α−Ｄ−マンノピラノシド、６−ブロモ−２−ナフチル−α−Ｄ−マンノピラノシド、４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−マンノピラノシド、４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マンノピラノシド、及び前述の指示薬のうちの任意の２つ以上の組み合わせからなる群から選択される指示薬を含む、実施形態２９の物品である。
【０１３４】
[00134]実施形態３１は、接着層を更に備える物品であって、第１の指示薬系の少なくとも一部分が、接着層上又は接着層内に配置される、実施形態２５〜３０のいずれか１つに記載の物品である。
【０１３５】
[00135]実施形態３２は、第１の指示薬系が、両方の主表面にコーティングされている、実施形態２５〜３１のいずれか１つに記載の物品である。
【０１３６】
[00136]実施形態３３は、基材が、ポリマーフィルム、紙、不織布、メンブレンフィルタ、及び前述の任意の派生物からなる群から選択される、実施形態２５〜３２のいずれか１つに記載の物品である。
【０１３７】
[00137]実施形態３４は、コーティングが結合剤を含む、実施形態２５〜３３のいずれか１つに記載の物品である。
【実施例】
【０１３８】
[00138]材料
一塩基性リン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）−Ｍａｌｌｉｎｋｒｏｄｔ  Ｂａｋｅｒ，Ｉｎｃ．；Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ
二塩基性リン酸カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）−ＡＭＲＥＳＣＯ、Ｓｏｌｏｎ，ＯＨ
グアーガム−Ｍ１５０グアーＭＥＹＰＲＯＧＡＴガム、Ｍｅｙｈａｌｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＡＧ
５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド−ＢＩＯＳＹＮＴＨ  ＡＧ，Ｒｉｅｔｌｉｓｔｒ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ
ポリエステルフィルム−２．９１ミル（０．０７４ｍｍ）透明ポリエステルフィルム
ＢＣＩＧ−５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ベータ−Ｄ−グルクロニド酸シクロヘキシルアンモニウム塩−ＢＩＯＳＹＮＴＨ  ＡＧ
メチルグルクロニド−１−Ｏ−メチル−ベータ−Ｄ−グルクロン酸、ナトリウム塩−ＢＩＯＳＹＮＴＨ  ＡＧ
【０１３９】
[00139]実施例１．サルモネラ標的微生物を検出するための検出物品の調製
[00140]４Ｌ容器内の１０００ｍＬの逆浸透処理水中に１３．６ｇの一塩基性リン酸カリウムを添加し、気流型混合機で約１．５分間混合し、続いて、３．４ｇの二塩基性リン酸カリウムを添加し、約２分混合することによって、コーティング組成物を調製した。次いで、１１ｇのグアーガムをゆっくりと添加し、５分間混合した。混合している間、混合物が８０℃に到達するまで、容器を覆って、電気こんろ上で加熱した。容器を電気こんろから外し、室温で約１５分間混合し、次いで、混合物が約４０℃になるまで冷やした。５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−α−Ｄ−ガラクトピラノシドを、１０ｍＬの逆浸透水に添加し、混合物をボルテックスして均一な懸濁液を形成することによって指示薬懸濁液を調製した。コーティング組成物を約４０℃まで冷却した後、指示薬懸濁液をコーティング組成物中に混合した。
【０１４０】
[00141]次いで、混合物を冷蔵庫から取り出し、約室温にした。混合物を１０インチ（２５．４ｃｍ）×５４インチ（１３７．２ｃｍ）のポリエステルフィルムのシート上で約８インチ（２０．３２ｃｍ）の幅に手動でナイフコーティングし、２４平方インチ（９．６９ｇ／ｍ２、「ディスク１Ａ」）当り約０．１５０グラムの乾燥コーティング重量を得た。コーティング手順を繰り返して、０．１８５ｇ／２４平方インチ（１１．９５ｇ／ｍ２、「ディスク１Ｂ」）、０．２４０ｇ／２４平方インチ（１５．５ｇ／ｍ２、「ディスク１Ｃ」）、及び０．３０ｇ／２４平方インチ（１９．３８ｇ／ｍ２、「ディスク１Ｄ」）の乾燥コーティング重量を有するコーティングされたフィルムを得た。コーティングされたシートを、オーブンで２３０Ｆ（１１０Ｃ）の設定で５〜１５分間、乾燥するまで乾燥した。コーティングされたシートをプラスチック袋中に保管した。シートを各々４インチ（１０．２ｃｍ）の正方形に切断し、試験するまで該正方形をプラスチック袋中に保持した。
【０１４１】
[00142]実施例２．検出物品でサルモネラ標的微生物を検出すること
[00143]寒天画線プレートから単離されたサルモネラ・エンテリカ・アゴナ（（ＦＳＤ  ＃１４０）のコロニーを、５ｍＬのトリプシン大豆ブイヨン中に植菌し、一晩、３５℃でインキュベートした。一晩培養物をＢｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄのＰｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｄｉｌｕｅｎｔ中に希釈し、１ミリリットル当り約１００コロニー形成単位（ＣＦＵ）を有する懸濁液を得た。４つの細菌培養デバイス（３Ｍ（商標）Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ（商標）腸内細菌科Ｃｏｕｎｔ  Ｐｌａｔｅｓ、３Ｍ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓｔ．Ｐａｕｌ  ＭＮ）を製造者の説明書にしたがって、１ｍＬの細菌懸濁液で各々植菌し、３５℃で２２〜２４時間インキュベートした。デバイスを検査し、赤いコロニー（直径約１ｍｍ）は、黄化した酸性ゾーン（直径約２４ｍｍ）で囲まれた。培養プレートの上部フィルムを底部フィルムから慎重に引き上げ、培養プレート中の培地を露出させた。２つの正方形ディスク（ディスク１Ａ）をプレート中に挿入した。第１のディスクを、そのコーティングされた表面とともに、底部フィルムに被着される培地に対して（すなわち、下向きに）設置した。第２のディスクを、第２のディスクのコーティングされた面が底部フィルムから見て外側を向くように第１のディスクの上部に（すなわち、上向きに）設置した。上部フィルムを慎重に降ろし（「転がす」動きを使用して）、上部フィルムに接着される培地を第２のディスクのコーティングされた面と接着させた。閉じたプレートの上部フィルムの外側表面に軽い指圧を適用し、培養デバイスの表面とディスクのコーティングされた表面との間の接触を確実にした。該手順をディスク１Ｂ、１Ｃ、及び１Ｄを用いて繰り返した。ディスクを伴うデバイスを３５℃でインキュベートし、５時間、毎時検査した。各検査の間にディジタル画像を撮影した。該画像は、コロニー中の微生物による、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−α−Ｄ−ガラクトピラノシドの加水分解のため、約３時間以内に、プレートの各々上の全てのコロニーが青〜青緑になったことを示した。
【０１４２】
[00144]実施例３．大腸菌標的微生物を検出するための検出物品の調製
[00145]コーティング組成物を実施例１の手順に従って調製した。ビーカー内の５０ｍＬの逆浸透処理水中に０．４ｇの１−Ｏ−メチル−β−Ｄ−グルクロン酸（ナトリウム塩）及び２．０グラムの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルクロン酸を溶解し、電磁攪拌棒を用いて、室温で一定に攪拌することによって、懸濁液を調製した。指示薬懸濁液を含むビーカーを冷蔵庫に設置した。
【０１４３】
[00146]約４０℃まで冷却したときに、コーティング組成物を冷蔵庫から取り出し、その後に、渦が形成されるまでエアモーターミキサで混合した。指示薬懸濁液をコーティング組成物に添加し、約２０分混合した。次いで、使用するまで生成した検出培地を覆い、冷やした。
【０１４４】
[00147]実施例１に記載の手順に従って、２４平方インチ（９．６９ｇ／ｍ２、「ディスク２Ａ」）当り０．１５０グラム、０．１８５ｇ／２４平方インチ（１１．９５ｇ／ｍ２、「ディスク２Ｂ」）、０．２４０ｇ／２４平方インチ（１５．５ｇ／ｍ２、「ディスク２Ｃ」）、並びに０．３０ｇ／２４平方インチ（１９．３８ｇ／ｍ２、「ディスク２Ｄ」）の乾燥コーティング重量を有するディスク２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、及び２Ｄを調製し、保管した。
【０１４５】
[00148]実施例４．検出物品を用いて大腸菌標的微生物を検出する工程
[00149]大腸菌株（ＡＴＣＣ  ＃５１８１３）の単離されたコロニーを、５ｍＬのトリプシン大豆ブイヨン中に植菌し、３５℃で２０時間インキュベートして、約２×１０９ｃｆｕ／ｍＬの細菌濃度を有する一晩培養物を得た。培地をボルテックスし、１０マイクロリットルの培地を９９ｍＬのＢｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄｓ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（希釈液１）に添加した。懸濁液を約２０秒間勢いよく振盪し、５マイクロリットルのこの希釈液を別の９９ｍＬのＢｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄｓ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒに添加した（希釈液２）。この懸濁液を約２０秒間勢いよく振盪した。１６個の細菌培養デバイス（３Ｍ（商標）Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ（商標）Ｈｉｇｈ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ大腸菌型Ｃｏｕｎｔ  Ｐｌａｔｅ、３Ｍ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓｔ．Ｐａｕｌ  ＭＮ）を、製造者の説明書にしたがって、５ｍＬの希釈液２に各々植菌した。４個の培養デバイスを、４つの温度（それぞれ、３２℃、３５℃、３７℃、並びに４４．５℃）の各々で、２２〜２４時間インキュベートした。培養デバイスをインキュベーターから取り出し、ディジタルカメラを用いて各プレートのディジタル画像を記録した。各コロニーは、Ｈｉｇｈ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ大腸菌型Ｃｏｕｎｔ  Ｐｌａｔｅ上に、大腸菌型コロニーの特徴的な外観（すなわち、直径約２〜３ｍｍの赤いゾーンによって囲まれた、直径約１ｍｍの赤いコロニー中心部）を有した。
【０１４６】
[00150]各種類のディスク（すなわち、ディスク２Ａ、ディスク２Ｂ、ディスク２Ｃ、及びディスク２Ｄ）を、実施例２に記載の通り、各温度でインキュベートされた別個の培養デバイス中に設置した。次いで、ディスクを伴うデバイスをそれらの対応する温度で５時間インキュベートした。各培養デバイスのディジタル画像を、５時間のインキュベーション時間の１時間毎後に記録した。
【０１４７】
[00151]ディスクを含む培養デバイスをインキュベートした後、それらを観察した。培養デバイスをディスクに接触させ、５時間インキュベートした後、全てのプレート上の赤いコロニーの各々が青くなった。ディスクを伴う、より高い温度でインキュベートしたプレートは、より低い温度でインキュベートしたプレートよりもより早い時間で青いコロニーを有することが観察された。より高いコーティング重量を有する検出物品を収容したプレートもまた、より低いコーティング重量を有する検出物品を収容したプレートよりも、より早い時間で、青いコロニーを有することが観察された。
【０１４８】
[00152]実施例５．リステリア指示微生物を増殖させるための培養デバイスの調製の机上の実施例
[00153]培地組成物を表３の物質で調製する。プロテオースペプトン、トリプトン、カザミノ酸、及び酵母抽出物は、例えば、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）から入手可能である。Ｌａｂ  Ｌｅｍｃｏ  Ｐｏｗｄｅｒ／牛肉エキスは、例えば、Ｏｘｏｉｄ（Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ，ＵＫ）から入手可能である。ウシ血清アルブミンは、例えば、Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ）から入手可能である。ベータ−Ｄ−グルコシド指示薬は、例えば、ＢｉｏＳｙｎｔｈ  ＡＧから入手可能である。セフタザジムは、例えば、Ｇｌａｘｏ  Ｗｅｌｌｃｏｍｅから入手可能である。
【０１４９】
【表３】
0005911511.tif 000004
【０１５０】
[00154]構成成分１〜１０（表３に示される）を１０００ｍＬの逆浸透水に添加し、混合して均一な懸濁液を得て、８０℃に到達するまで混合物を過熱し、次いで室温まで冷却することによって、第１の混合物を調製する。第１の混合物を冷却している間に、構成成分１１〜１４（表１に示される）を１０ミリリットルの逆浸透水中に混合することによって第２の混合物を調製する。第２の混合物をボルテックスし、均一な混合物を得て、それを第１の混合物に添加し、次いで混合して、均一な培地を更に得た。次いで、培地を１８〜２４時間（２〜８℃）冷やした。
【０１５１】
[00155]冷やされた培地を室温まで温め、次いで２．６ミル（０．０７４ｍｍ）厚の透明ポリエステルフィルムのシート上にナイフコーティングし、約２００°Ｆ（９３℃）で５〜１０分間乾燥させた。ナイフギャップを調整し、約５１５〜５４０ｍｇ／２４ｉｎ２（３３．２７〜３４．８８ｇ／ｍ２）の乾燥コーティング重量を得る。独立気泡ポリスチレンフォームの１８ミル（０．４６ｍｍ）厚のシートを感圧接着剤転写テープにラミネートする。直径２インチ（５．１ｃｍ）の円形開口部を、フォームシートからダイパンチし、フォームシートをポリエステルフィルムの培地がコーティングされた面にラミネートして、米国特許第４，５６５，７８３号の図１に示される培養デバイスの底部に類似の構造体を形成する。３Ｍ（商標）Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ（商標）Ｓｔａｐｈ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｃｏｕｎｔ  Ｐｌａｔｅから上部フィルムを取り除き、両面コーティング接着テープを有するスタイロフォームシートにそれを付着させることによって培養デバイスの調製を完成し、それによって、米国特許第４，５６５，７８３号の図１に示される完成した培養デバイスに似ているデバイスを製造する。
【０１５２】
[00156]実施例６．リステリア・モノサイトゲネス標的微生物を検出するための検出物品の調製の机上の実施例
[00157]コーティング組成物を、実施例１で記載の通り、１０００ミリリットルの逆浸透水中にグアーガム、リン酸二ナトリウム、及びリン酸水素カリウム（表４に示される）を混合して、均一分散液を形成することによって作製した。
【０１５３】
【表４】
0005911511.tif 000005
【０１５４】
[00158]コーティング組成物を有する容器を覆い、８０℃の温度に加熱する間、分散液を連続的に混合する。次いで、それを加熱から外し、室温で連続的に混合する。５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−ミオ−イノシトール−１−ホスフェート（例えば、Ｂｉｏｓｙｎｔｈ  ＡＧから入手可能である）を１０ｍＬの逆浸透水に添加し、ボルテックスして均一な懸濁液を形成することによって、指示薬懸濁液を調製する。コーティング組成物が室温まで冷却した後、指示薬懸濁液をコーティング組成物中に混合する。混合物を覆い、１８〜２２時間冷やす。コーティング混合物を冷蔵庫から取り出し、およそ室温まで温めさせる。２．９ミル（０．０７４ｍｍ）のポリエステルフィルムを、実施例１に記載の手順に従って、混合物でナイフコーティングし、約８０〜９５ｍｇ／２４ｉｎ２（５．１７〜６．１４ｇ／ｍ２）の乾燥コーティング重量を有するフィルムを得る。ポリエステルフィルムをひっくり返し、同一の様式で反対側にナイフコーティングした。次いで、両面がコーティングされたフィルムを約２インチ（５．１ｃｍ）の直径を有する円形のディスクに打ち抜く。
【０１５５】
[00159]実施例７−リステリア・モノサイトゲネス標的微生物を検出する机上の実施例
[00160]標準的な試料捕集及びブイヨン増菌手順（例えば、ｔｈｅ  ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ、ｔｈｅ  Ｆｏｏｄ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、又はｔｈｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌによって特定されるように）を使用して、増菌培養物を食品及び環境試料から調製した。Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄの希釈剤中に培養物の８段階、１０倍希釈液を調製する。実施例５に記載される個々の培養デバイス中に１ミリリットルの各希釈液を植菌する。次いで、３５〜３７℃で、１８〜３０時間、デバイスをインキュベートする。リステリア（リステリア・モノサイトゲネスの存在を示す指示微生物群）を示す典型的なコロニー形態（例えば、直径約０．５〜１．５ｍｍの赤いコロニー）についてデバイスを検査する。インキュベーションの後、典型的に有色コロニーが培養デバイス中に見られる場合、使用者は検出物品を更に挿入して、鑑別可能なコロニー検出する。培養デバイスの上部フィルムをそっと引き戻し、２インチ（５．１ｃｍ）の実施例６に記載の検出物品を培地と接触させて設置する。上部フィルムを再び閉じ、それを検出物品と接触させる。上部フィルムを軽い指圧で押圧し、デバイスの増殖領域を検出物品と接触させ得る。デバイスを最大５時間、３５〜３７℃でインキュベートし、定期的に（例えば、１時間毎に）、コロニー中に青〜青緑色が存在するか検査する。青〜青緑色の有色コロニーは、リステリア・モノサイトゲネスの存在を示す。
【０１５６】
[00161]実施例８−リステリア・モノサイトゲネス標的微生物を検出する方法
[00162]薄膜培養デバイスの調製−ブイヨンコーティングされた基質：
[00163]グアーガムを除く表５に示される全ての成分を、ステンレススチールビーカー中の９７０ミリリットルの脱イオン水と混合した。混合しながら、グアーを添加し、完成した混合物を８０℃まで加熱した。加熱された完成した混合物を約１５分間攪拌し、覆い、冷蔵庫で一晩冷却した。コーティングする前に、２０ミリリットルのサプリメントＡ（ウシ血清アルブミン、３．２ｇ／２０ｍＬ）及び１０ミリリットルのサプリメントＢ（セフタジジム五水和物、４０ｍｇ／１０ｍＬ）をコーティング混合物に混合した。透明ポリエステルフィルム（２．９１ミル（０．０７ｍｍ）厚）上に、１５ミル（０．３８ｍｍ）ギャップを使用して、サプリメントを含むコーティング混合物をナイフコーティングした。コーティングされたポリエステルを約８分間、２１０℃設定のオーブン内で乾燥した。乾燥され、コーティングされた混合物の最終コーティング重量は０．３０８ｇ／２４ｉｎ２（０．３０８ｇ／１５４．８ｃｍ２）であった。米国特許第５，６０１，９９８号の実施例１に記載の通り、直径２インチ（５．０８ｃｍ）の開口部を有するスタイロフォームスペーサー（２０ミル（０．５１ｍｍ）厚）を、コーティングされ、乾燥されたフィルムに被着し、その全文は参照することにより本明細書に組み込まれる。基材を約４インチ（１０．２ｃｍ）×４インチ（１０．２ｃｍ）の切片に切断し、各切片は、乾燥され、コーティングされたブイヨン組成物の円形の領域にはめられる、５ｃｍの開口部を有するスペーサーを有する。
【０１５７】
[00164]
【表５】
0005911511.tif 000006
【０１５８】
[00165]薄膜培養デバイスの調製−粉末コーティングされた基質：
[00166]ポリエチレンコーティングされた紙（０．１３ｍｍ厚）をＳｃｈｏｅｌｌｅｒ  Ｐａｐｅｒ（Ｐｕｌａｓｋｉ，ＮＹ）から入手した。６−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド（Ｘ−ｇｌｕｃ、製品番号Ｂ５０２０）をＢｉｏｓｙｎｔｈ  ＡＧ（Ｓｔａａｄ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から入手した。Ｘ−ｇｌｕｃ（１３９．１ｍｇ）を２００グラムの接着剤（９６：４の重量比のイソオクチルアクリレート及びアクリルアミドのコポリマー）中に十分に混合した。次いで、接着剤混合物をポリエチレンコーティングされた紙上にナイフコーティングし、２１０℃のオーブン内で加熱し、０．２３７ｇ／２４ｉｎ２（０．２３７ｇ／１５４．８ｃｍ２）の乾燥コーティング重量を得た。エチレンオキシドを使用して、あらかじめ殺菌したグアーガムの層で接着剤コーティングされたフィルムをコーティングした。過剰なグアーガムを振り落とし、粉末コーティングされた基質を約４インチ（１０．２ｃｍ）×４インチ（１０．２ｃｍ）の切片に切断した。
【０１５９】
[00167]薄膜培養デバイスの組み立て：
[00168]１枚の両面接着テープ（３Ｍ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）を、各ブイヨンコーティングされた基質上のスタイロフォームスペーサーの一端に沿って貼り付けた。粉末コーティングされた基質を整列させて（粉末コーティングされた面がスペーサーに面する状態で）ブイヨンコーティングされた基質と重ね合わせ、粉末コーティングされた面を両面接着テープに被着し、組み立てられた培養デバイスを形成した。
【０１６０】
[00169]検出物品の調製：
[00170]次の構成成分、１３．０グラムのグアーガム及び２．０ｍＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解された、１４１．３ミリグラムの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−ミオ−イノシトール−１−ホスフェート（Ｘ−ＩＰ、製品番号Ｂ７４０４−Ｐ００、Ｂｉｏｓｙｎｔｈ  ＡＧより入手）の溶液を、１０００ミリリットルの脱イオン水中に混合することによってコーティング混合物を調製した。混合の間、混合物を覆われたビーカー中で８０℃まで加熱し、その温度で、更に１５分間混合し、次いで冷蔵庫内で冷却した。コーティングする前に、混合物を室温まで温めた。上述の透明ポリエステルフィルム上に混合物をナイフコーティング（２５ミル（０．６４ｍｍ）ギャップ）した。コーティングされたフィルムを２１０℃のオーブン内で乾燥し、０．０９２ｇ／２４ｉｎ２（０．０９２ｇ／１５４．８ｃｍ２）の乾燥コーティング重量を得た。コーティングされた基質を約４インチ（１０．２ｃｍ）×４インチ（１０．２ｃｍ）の切片に切断した。
【０１６１】
[00171]検出方法。
[00172]酵母抽出物（ＴＳＢＹＥ）を含むトリプシン大豆ブイヨンの別個の管中に、表６に示される細菌の各々の純粋なコロニーを植菌する。管を３５℃で１８〜２４時間インキュベートした。個々の培養デバイス（この実施例に記載される通り調製される）を開き、スタイロフォームスペーサーによって画定される乾燥ブイヨンの円形の領域中に１．５ｍＬのＢｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄの緩衝液をピペッティングすることによって水和した。粉末コーティングされた紙を緩衝液と接触させ、緩衝液をスペーサーによって画定される全円形の増殖領域中に広げながら培養デバイスを閉じる。水和されたプレートを室温で１時間放置させた。
【０１６２】
[00173]１０マイクロリットルの一晩リステリアを培養した各々の物を、画線平板法技術によって、個々の水和された培養デバイス中に植菌し、植菌された培養デバイスを３５℃で、ジッパーシールプラスチック袋内で２４時間インキュベートした。インキュベーション後、コロニーを観察し、コロニーの外見は表６に記載される。
【０１６３】
[00174]細菌コロニーを含む水和されたゲルをポリプロピレンコーティングされた紙基材に付着させたままにしながら、インキュベートされたプレートを開いた。検出物品のコーティングされた面がコロニーを含む水和されたゲルに面するように、検出物品（この実施例に記載の）を培養デバイスに設置した。次いで、検出物品のコーティングされた面を、細菌コロニーを含む水和されたゲルと接触させながら、培養デバイスを閉じた。次いで、培養デバイスを３５℃でインキュベートし、観察した。観察結果を表６に記す。結果は、リステリア・モノサイトゲネス微生物のみが、検出物品にからの酵素基質指示薬（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−ミオ−イノシトール−１−ホスフェート）と反応（すなわち、加水分解）したことを示す。
【０１６４】
[00175]
【表６】
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１−２４時間のインキュベーション後のコロニーの外見
２−検出物品を培養デバイスの増殖領域と接触させた後、１５〜６０分以内のコロニーの外見
【０１６５】
[00176]本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な修正を行ってもよい。これらの及び他の実施形態は、以下の特許請求の範囲に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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