(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）組換えプラスミノーゲン封入体を産生させるのに十分な発現条件下で組換え発現系を使用して組換えプラスミノーゲンを発現させること；
（ｂ）可溶化された組換えプラスミノーゲン封入体を得るのに十分な可溶化条件下で、組換えプラスミノーゲン封入体を可溶化緩衝液と接触させること；
（ｃ）可溶化された組換えプラスミノーゲン封入体を再折りたたみ条件下で再折りたたみ溶液と接触させて組換えプラスミノーゲンを含んでなる組成物を得ること、ここで、沈殿条件下で再折りたたみ溶液にＰＥＧ若しくは硫酸アンモニウムが添加され、前記再折りたたみ溶液はプラスミノーゲンおよび凝集されたポリペプチドを含んでなり、プラスミノーゲンは再度折りたたまれたプラスミノーゲンであり、沈殿条件は凝集されたタンパク質の全部若しくは実質的な部分を沈殿させるのに十分である；
（ｄ）工程（ｃ）後に組成物をダイアフィルトレーションすること；
（ｅ）陽イオン交換媒体が組換えプラスミノーゲンを結合するのに十分であるイオン交換条件下で、該組成物を陽イオン交換媒体と接触させること；
（ｆ）陽イオン交換媒体により捕捉された組換えプラスミノーゲンを溶出して、組換えプラスミノーゲンを含んでなる陽イオン交換媒体溶出液を得ること；
（ｇ）第一のアフィニティー媒体が組換えプラスミノーゲンを結合するのに十分である第一のアフィニティー条件下で、陽イオン交換媒体溶出液を第一のアフィニティー媒体と接触させること；および
（ｈ）第一のアフィニティー媒体により結合された組換えプラスミノーゲンを溶出して、組換えプラスミノーゲンを含んでなるプラスミノーゲン溶液を得ること、
を含んでなる、組換えプラスミノーゲンの製造方法。
【請求項２】
陽イオン交換媒体が支持体に結合されているリガンドを含んでなり、該リガンドがスルホプロピルであり、該支持体がアガロースである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第一のアフィニティー媒体が支持体に結合されているリガンドを含んでなり、該リガンドがプラスミノーゲンに対する親和性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
リガンドがリシンであり、支持体がアガロースである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
（ａ）請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法に従って、組み換えプラスミノーゲンを製造すること；
（ｂ）陽イオン交換媒体が組換えプラスミノーゲンを結合するのに十分である陽イオン交換条件下で、前記組換えプラスミノーゲンを陽イオン交換媒体と接触させること；
（ｃ）組換えプラスミノーゲンをプラスミンに転化するのに十分な活性化条件下で、組換えプラスミノーゲンを活性化溶液中でプラスミノーゲンアクチベーターと接触させること；および
（ｄ）陰イオン交換媒体が、プラスミンよりもプラスミノーゲンアクチベーターを優先的に結合するような陰イオン交換条件下で陰イオン交換媒体とプラスミンを接触させること
を含んでなる、プラスミンの製造方法。
【請求項６】
プラスミンを結合するのに十分な第二のアフィニティー条件下で陰イオン交換媒体素通り画分を第二のアフィニティー媒体と接触させること；又は
疎水性相互作用クロマトグラフィー媒体が、プラスミンよりもプラスミノーゲンアクチベーターを優先的に結合するような十分な疎水性相互作用条件下で、プラスミンを含んでなる第二のアフィニティー媒体溶出液を疎水性相互作用クロマトグラフィー媒体と接触させることをさらに含んでなる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
組換えプラスミノーゲンを含む再折りたたみ混合物から、凝集された組換えプラスミノーゲンを選択的に沈殿させるための、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）若しくは硫酸アンモニウムの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プラスミノーゲンの製造方法およびプラスミノーゲン、とりわけ組換えプラスミノーゲンからのプラスミンの製造方法の双方に関する。本発明は、組換えプラスミノーゲンおよび／若しくはそれから製造されるプラスミンを含んでなる組成物およびキットにもまた関する。
【背景技術】
【０００２】
大量の比較的純粋なポリペプチドおよびタンパク質の製造は多くの製薬学的製剤の製造に重要である。多くのタンパク質の製造のため、組換えＤＮＡ技術が部分的に使用されている。大量の外因性タンパク質を宿主細胞中で発現し得るためである。
【０００３】
哺乳動物における主要線維素溶解酵素プラスミンは、血漿中を循環する不活性チモーゲン前駆体プラスミノーゲン由来であるトリプシン様特異性をもつセリンプロテアーゼである。プラスミノーゲンそれ自身はＮ末端グルタミン酸残基を有する７９０アミノ酸のポリペプチドである。ストレプトキナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）若しくはウロキナーゼのようなプラスミノーゲンアクチベーターは、Ａｒｇ５６０−Ｖａｌ５６１ペプチド結合で一本鎖プラスミノーゲン分子を切断して活性プラスミンを生じることができる。プラスミンの生じる２本のポリペプチド鎖は２個の鎖間ジスルフィド架橋によりまとめられている。２５ｋＤａの軽鎖は触媒中心を保有し、そしてトリプシンおよび他のセリンプロテアーゼと相同である。重鎖（６０ｋＤａ）は高度に類似のアミノ酸配列をもつ５個の三重ループクリングル構造よりなる。これらのクリングルのいくつかは、フィブリン、α２−アンチプラスミン若しくは他のタンパク質とのプラスミノーゲンおよびプラスミンの相互作用の原因であるいわゆるリシン結合部位を含有する。
【０００４】
潜在的血栓溶解剤としてのプラスミンは多数の技術的困難を有する。これらの困難は、その不活性前駆体プラスミノーゲンからプラスミンを生成するのに使用される機能的痕跡量のプラスミノーゲンアクチベーターを相対的に含まない純粋なプラスミンを製造するという困難を包含する。プラスミンの製剤は、典型的に、プラスミノーゲンアクチベーター、ストレプトキナーゼ若しくはウロキナーゼにより広範囲に汚染されており、従って、血栓溶解活性は、プラスミンそれ自身によりはむしろ汚染するプラスミノーゲンアクチベーターに帰される。汚染するプラスミノーゲンアクチベーターは血栓症の標的化部位以外の全身性出血もまた誘発し得る。プラスミンの臨床使用を制限する別の重要な技術的要因は、広範な特異性をもつセリンプロテアーゼとしてのプラスミンが高度に自己分解および活性喪失しやすいことである。この環境は、高品質プラスミンの生産、使用前の長期貯蔵期間のこの活性プロテアーゼの安定な製剤、および閉塞性血栓に苦しめられるヒト患者へのプラスミンの安全かつ効果的な投与に難しい課題を提供する。
【０００５】
製薬学的純度および十分な収量をもたらす組換えプラスミノーゲン若しくは組換えプラスミノーゲンから製造されるプラスミンの調製的単離は当該技術を回避している。従って、組換えプラスミノーゲン、およびプラスミノーゲンアクチベーターにより活性化された組換えプラスミノーゲンから製造されるプラスミンの製造のための組成物および方法に対する必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００６】
［発明の要約］
今や、プラスミノーゲンを製造するため；およびそれからプラスミンを製造するための組成物および方法が提供される。
【０００７】
一局面において、本発明はプラスミノーゲンの製造方法を提供する。該方法は、陽イオン交換媒体がプラスミノーゲンを結合するのに十分である陽イオン交換条件下で、プラスミノーゲンを含んでなる組成物を陽イオン交換媒体と接触させることを含んでなる。
【０００８】
別の局面において、本発明はプラスミノーゲンの製造方法を提供し、該方法は：
（ａ）組換えプラスミノーゲン封入体を産生させるのに十分な発現条件下で組換え発現系を使用して組換えプラスミノーゲンを発現させること；
（ｂ）可溶化された組換えプラスミノーゲン封入体を得るのに十分な可溶化条件下で組換えプラスミノーゲン封入体を可溶化緩衝液と接触させること；
（ｃ）可溶化された組換えプラスミノーゲン封入体を再折りたたみ条件下で再折りたたみ溶液と接触させて組換えプラスミノーゲンを含んでなる組成物を得ること；
（ｄ）工程（ｃ）の後に該組成物をダイアフィルトレーションすること；
（ｅ）陽イオン交換媒体が組換えプラスミノーゲンを結合するのに十分であるイオン交換条件下で該組成物を陽イオン交換媒体と接触させること；
（ｆ）陽イオン交換媒体により捕捉された組換えプラスミノーゲンを溶出して組換えプラスミノーゲンを含んでなる陽イオン交換媒体溶出液を得ること；
（ｇ）第一のアフィニティー媒体が組換えプラスミノーゲンを結合するのに十分である第一のアフィニティー条件下で陽イオン交換媒体溶出液を第一のアフィニティー媒体と接触させること；および
（ｈ）第一のアフィニティー媒体により結合された組換えプラスミノーゲンを溶出して、組換えプラスミノーゲンを含んでなるプラスミノーゲン溶液を得ること
を含んでなる。
【０００９】
他の局面において、本発明はプラスミンの製造方法を提供し、該方法は：
（ａ）陽イオン交換媒体がプラスミノーゲンを結合するのに十分である陽イオン交換条件下で、プラスミノーゲンを含んでなる組成物を陽イオン交換媒体と接触させること；
（ｂ）プラスミノーゲンをプラスミンに転化するのに十分な活性化条件下で、プラスミノーゲンを活性化溶液中でプラスミノーゲンアクチベーターと接触させること；および
（ｃ）陰イオン交換媒体がプラスミンに関してプラスミノーゲンアクチベーターを優先的に結合するような陰イオン交換条件下で陰イオン交換媒体とプラスミンを接触させることを含んでなる。
【００１０】
一局面において、本発明はプラスミンの製造方法を提供する。該方法は、プラスミンを含んでなる組成物を陰イオン交換体と接触させて、それにより、組成物中に存在する場合に、プラスミンのものより低い等電点を有するタンパク質性物質をプラスミンから分離することを含んでなる。
【００１１】
本発明の方法に従って製造されるプラスミノーゲンおよび／若しくはプラスミンもまた提供される。
【００１２】
本発明の組成物の１種若しくはそれ以上を含んでなるキットもまた提供される。
【００１３】
［発明の詳細な記述］
Ｉ．プラスミノーゲン
一局面において、本発明はプラスミノーゲンの製造方法を提供し、該方法は：
陽イオン交換媒体がプラスミノーゲンを結合するのに十分である陽イオン交換条件下で、プラスミノーゲンを含んでなる組成物を陽イオン交換媒体と接触させること
を含んでなる。
【００１４】
プラスミノーゲンのアミノ酸配列は、天然の配列若しくは遺伝子改変の形態の、および天然であろうと、合成であろうと、若しくは組換えで製造されようと、いかなる供給源からの、限定されるものでないがヒト、マウス、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマおよびトリを挙げることができるいずれの種にも対応し得るか、若しくはそれらに基づくことができる。
一態様において、プラスミノーゲンはヒトプラスミノーゲンに対応するか、若しくはそれに基づく。
【００１５】
一態様において、プラスミノーゲンは組換えプラスミノーゲンである。
【００１６】
Ａ．陽イオン交換クロマトグラフィー
陽イオン交換媒体は組成物中に存在するプラスミノーゲンを結合する固相であり得る。
陽イオン交換クロマトグラフィー媒体は、陽イオン交換媒体、好ましくは強陽イオン交換媒体として一般に記述される媒体の群のいずれからも選択し得る。該媒体は、組成物からのプラスミノーゲンの選択的若しくは優先的捕捉を見込むことができる、それに結合されている化学的構造（ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）すなわちリガンドを保有し得る。有用なクロマトグラフィー媒体は、支持体、およびプラスミノーゲンに対する選択的若しくは優先的結合能力を提供する、それに結合されている１種若しくはそれ以上のリガンドを含んでなる。有用な支持体は、具体的に説明する例として、アガロースおよびセルロースのような多糖、ポリアクリルアミド、メチルメタクリレートおよびポリスチレン−ジビニルベンゼンコポリマーのような有機ポリマーを包含する。有機支持体のみが媒体の支持体の使用に適することを意味することを本明細書で意図していないことが認識されるべきである。シリカおよびガラスのような無機支持体素材もまた使用し得るためである。
【００１７】
いくつかの態様において、陽イオン交換媒体は全般として球状であり得るビーズの形態にあるか、また、あるいは、陽イオン交換媒体は、他の規則的形状若しくは不規則形状を有する微粒子若しくは分割された形態で有用に提供され得る。あるいは媒体は膜の形式にあり得る。陽イオン交換媒体は多孔質若しくは非多孔質の特徴のものであることができ、そして、該媒体は圧縮可能若しくは圧縮不可能であり得る。好ましい陽イオン交換媒体は、ポンプで送ることおよびクロスフロー濾過、ならびに使用される多様な組成物の温度、ｐＨおよび他の局面を包含するプラスミノーゲン精製方法で使用される条件に対し物理的および化学的に回復力があることができる。多様な陽イオン交換媒体、例えば、結合されているリガンドがスルホプロピル若しくはメチルサルフェートであるものが当該技術分野で既知である。
【００１８】
一態様において、陽イオン交換媒体は支持体に結合されているリガンドを含んでなり、該リガンドはスルホプロピル（ＳＰ）であり、該支持体はアガロースである。例えば、陽イオン交換クロマトグラフィーはＳＰ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭカラム形式で実施し得る。ＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭはビーズの形態のアガロースゲルの登録商標である。
【００１９】
好ましくは、陽イオン交換条件は、該陽イオン交換媒体が組成物中に存在するプラスミノーゲンを該組成物中にまた存在しうる１種若しくはそれ以上の汚染分子に関して選択的若しくは優先的に結合するのに十分である。汚染分子は、所望のプラスミノーゲン分子と異なりかつ望ましくは最終プラスミノーゲン製品から排除される、組成物中に存在する物質であり得る。汚染物質は、限定されるものでないが、核酸、限定されるものでないが折り畳まれていないおよび誤って折り畳まれたプラスミノーゲンを挙げることができるポリペプチド、細胞破片、内毒素などを挙げることができる。
【００２０】
例えば、該組成物を適する緩衝液で平衡化されたＳＰカラムを通すことができる。適する緩衝液のｐＨは最低約３．０、具体的に説明すれば最低約ｐＨ３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０および９．０であり得る。いくつかの態様において、適する緩衝液は酸性のｐＨ、好ましくは最低約ｐＨ４．０を有する。別の態様において、適する緩衝液はアルカリ性のｐＨ、好ましくは最低約ｐＨ８．０のトリスに基づく緩衝液を有する。負荷工程の後にカラムを平衡化緩衝液、若しくは実質的な量の組換えプラスミノーゲンが媒体に結合されたままである限りは異なる緩衝液で洗浄し得る。
【００２１】
別の態様において、該方法は、陽イオン交換媒体により結合されている組換えプラスミノーゲンを溶出して組換えプラスミノーゲンを含んでなる陽イオン交換媒体溶出液を得ることをさらに含んでなる。例えば、媒体に結合された組換えプラスミノーゲンを、適する塩濃度を含んでなる溶出緩衝液で陽イオン交換媒体から溶出し得る。一態様において、最低約２００ｍＭのＮａＣｌを含んでなるトリスに基づく緩衝液を使用して、ＳＰカラムから組換えプラスミノーゲンを溶出する。
【００２２】
Ｂ．アフィニティークロマトグラフィー
組換えプラスミノーゲンを含んでなる陽イオン交換溶出液を、アフィニティークロマトグラフィーのため適するアフィニティー媒体に直接負荷し得る。あるいは、溶出液をアフィニティークロマトグラフィーの前にさらなる調製工程にかけることができる。いくつかの態様において、プラスミノーゲンの製造方法は、アフィニティー媒体がプラスミノーゲンを結合するのに十分である第一のアフィニティー条件下で陽イオン交換媒体溶出液を第一のアフィニティー媒体と接触させることをさらに含んでなる。
【００２３】
一態様において、該第一のアフィニティー媒体は支持体に結合されているリガンドを含んでなり、該リガンドはプラスミノーゲンに対する親和性を有する。
【００２４】
該第一のアフィニティー媒体は組成物中に存在するプラスミノーゲンを結合する固相であり得る。該媒体は、親和性相互作用によって該組成物からのプラスミノーゲンの選択的若しくは優先的捕捉を可能にし得る、それに結合されている化学的構造すなわちリガンドを保有し得る。有用なアフィニティークロマトグラフィー媒体は、支持体、およびプラスミノーゲンに対する選択的若しくは優先的結合能力を提供するそれに結合されている１種若しくはそれ以上のリガンドを含んでなる。有用な支持体は、具体的に説明する例として、アガロースおよびセルロースのような多糖、ポリアクリルアミド、メチルメタクリレートおよびポリスチレン−ジビニルベンゼンコポリマーのような有機ポリマーを包含する。
有機支持体のみが媒体の支持体の使用に適することを意味することを本明細書で意図していないことが認識されるべきであり、シリカおよびガラスのような無機支持体素材もまた使用し得るためである。
【００２５】
いくつかの態様において、アフィニティー媒体は全般として球状であり得るビーズの形態にあるか、または、あるいは、アフィニティー媒体は、他の規則的形状若しくは不規則形状を有する微粒子若しくは分割された形態で有用に提供され得る。アフィニティー媒体は多孔質若しくは非多孔質の特徴のものであることができ、また、該媒体は圧縮可能若しくは圧縮不可能であり得る。好ましいアフィニティー媒体は、プラスミノーゲン精製方法で使用される条件に対し物理的および化学的に回復力があることができる。多様なアフィニティー媒体、例えば結合されているリガンドがリシン、抗体若しくは金属イオンであるものが当該技術分野で既知である。
【００２６】
一態様において、アフィニティー媒体は支持体に結合されているリガンドを含んでなる。別の態様において、リガンドはリシンであり、該支持体はアガロースである。例えば、第一のアフィニティー媒体はＥＣＨ  Ｌｙｓｉｎｅ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭカラム形式で実施し得る。
【００２７】
Ｃ．組換えプラスミノーゲン
いくつかの態様において、プラスミノーゲンは組換えプラスミノーゲンである。例えば、本発明のプラスミノーゲンをコードする核酸分子をいくつかの供給源から、例えば既知ＤＮＡ配列を使用する化学合成により、若しくは当業者に既知の標準的クローニング技術の使用により製造し得る。プラスミノーゲンのコーディング配列を保有するｃＤＮＡクローンは、プラスミノーゲンの既知配列に基づき特異的に設計されたオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブの使用により同定し得る。
【００２８】
一態様において、本発明の組換えプラスミノーゲン若しくはそのバリアントは、チモーゲンのクリングルドメインとセリンプロテアーゼドメインの間に位置するＡｒｇ−Ｖａｌペプチド結合のタンパク質分解性切断を少なくとも必要とする活性化事象の後に機能的プラスミン酵素に活性化されたようになることが可能である組換えチモーゲンである。
【００２９】
組換えプラスミノーゲンまたはそのバリアント、フラグメント、誘導体若しくはアナログは、完全長の天然のヒトプラスミノーゲンのフィブリンおよびアンチプラスミン結合ならびに活性化特性を有し得る。多様な態様において、組換えプラスミノーゲンおよび／若しくはそれ由来のプラスミンは、以下、すなわち
ｉ）特定の態様において、増大された比活性（タンパク質１ｍｇあたり）をもたらす天然の完全長プラスミン（プラスミノーゲン）分子に関してより小さい分子量；
ｉｉ）特定の態様において、比較的低分子量と組み合わせられた、天然のタンパク質中で見出される最低２個のグリコシル化部位の欠如が、比較的安価な発現系を使用するこのタンパク質の組換え産生を容易にし；
ｉｉｉ）特定の態様において、プラスミノーゲンアクチベーター、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、ｔＰＡおよび／若しくはスタフィロキナーゼにより活性化されるプラスミノーゲンの能力；
ｉｖ）特定の態様において、天然のヒトプラスミノーゲンのクリングルドメインに相同な単一のＮ末端クリングルドメインの存在であって、ここで、血栓溶解効力に重要であるプラスミンのフィブリン結合特性が保存されており；
ｖ）特定の態様において、プラスミンがプラスミンのこの生理学的阻害剤により迅速に阻害されることを可能にし得る（出血を予防し得る特徴）、天然のヒトプラスミノーゲンのクリングルドメインに相同な単一のＮ末端クリングルドメインのα２−アンチプラスミン結合部位の存在；
ｖｉ）特定の態様において、無傷の消化されていないフィブリン（フィブリノーゲン）の主結合部位を保持するクリングル５の非存在が、循環フィブリノーゲンの低下された枯渇を伴うプラスミンの使用を可能にし得；
ｖｉｉ）特定の態様において、天然のヒトプラスミノーゲンの１クリングルドメインに相同な単一のＮ末端クリングルドメインの存在（該クリングルドメイン内の最後の４アミノ酸残基がＶ、Ｐ、ＱおよびＣである）が、セリンプロテアーゼドメインへの天然様の結合を提供し（すなわち、ヒトプラスミノーゲンのクリングル５ドメインとセリンプロテアーゼドメインの間の天然に存在するドメイン接合部に類似の結合）；ならびに
ｖｉｉｉ）特定の態様において、組換えプラスミノーゲンの発現後にそのＮ末端が戻し切断されて（ｃｌｅａｖｅ  ｂａｃｋ）（例えば活性化の間に戻し切断されて）天然様のＮ末端を提供する、
の最低１つを特徴とし得る。
【００３０】
他の態様において、該組換えプラスミノーゲンは活性化部位およびセリンプロテアーゼドメインのＮ末端に単一クリングル領域を有する。いくつかの態様において、該単一クリングル領域含有分子は、活性化部位のＮ末端に付加的な配列（天然のプラスミノーゲンの天然のクリングル領域のもの由来の付加的なＮ末端配列）を含み得る。該Ｎ末端クリングルドメインは天然のプラスミン（プラスミノーゲン）およびそれらの機能的同等物のクリングル１および４のクリングル配列を包含し得る。さらに、組換えプラスミノーゲンおよびそれから製造されるプラスミンの特定の態様は、天然様構造によって低下された免疫原性を表し得る。例えば、いくつかの態様において、組換えプラスミノーゲンは、プラスミノーゲンアクチベーター（例えばストレプトキナーゼ）による活性化に際して天然様Ｎ末端を含んでなるプラスミンポリペプチドを生じる、天然に存在する形態のヒト血漿由来プラスミノーゲンの１種のものに同一のＮ末端を有する。加えて、他の態様において、組換えプラスミノーゲンは、天然に存在するヒトプラスミン中のクリングル５とＳＰドメインの間の接合部に類似である、クリングルとセリンプロテアーゼドメインの間の配列を有し得る。
【００３１】
別の態様において、本発明は組換えプラスミノーゲンの製造方法を提供し、該組換えプラスミノーゲンは配列番号１（図１）に示される配列を含んでなる。一態様において、該組換えプラスミノーゲンポリペプチドは、配列番号１に示される配列に最低９０％若しくは９５％若しくは９８％同一である。他の態様において、該組換えプラスミノーゲンは、天然のヒトプラスミノーゲンのクリングル１若しくはクリングル４ドメインに最低９０％若しくは９５％若しくは９８％同一である単一のクリングルドメインを含んでなり；また、Ｃ末端ドメインはヒトプラスミノーゲンの活性化部位およびセリンプロテアーゼドメインに最低９０％若しくは９５％若しくは９８％同一である。いくつかの態様において、組換えプラスミノーゲンポリペプチドは配列番号１に示されるところのアミノ酸配列およびその保存的置換を有する。他の態様において、該ポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置８５のものに類似の相対位置にアルギニン残基を有する。
【００３２】
他の態様において、該組換えプラスミノーゲンは活性化部位およびセリンプロテアーゼドメインのＮ末端に単一のクリングル領域を有し、ここで該プラスミノーゲンの該単一のＮ末端クリングルドメインのある位置の残基は天然のヒトプラスミノーゲンのクリングル１に関して保存されている。これらはジスルフィド架橋およびリシン結合と関連する位置の残基であり得、そしてそれぞれＣｙｓ８４、Ｃｙｓ１０５、Ｃｙｓ１３３、Ｃｙｓ１４５、Ｃｙｓ１５７およびＣｙｓ１６２、ならびにＰｒｏ１３６−Ｐｒｏ１４０、Ｐｒｏ１４３−Ｔｙｒ１４６およびＡｒｇ１５３−Ｔｙｒ１５６を包含する（位置は配列番号２（図２）に示されるとおり番号付けされる）。加えて、該組換えプラスミノーゲンの特定の態様は、類似のドメイン組成を有するミニプラスミン（プラスミノーゲン）に対照的に化学的に特徴付け得る（すなわちクリングル−セリンプロテアーゼ（Ｋ−ＳＰ）（Ｓｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ，Ｌ．ら、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ，Ｖｏｌ．３、（Ｊ．Ｆ．Ｄａｖｉｄｓｏｎら編）Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（１９７８）を参照されたい）が、しかし、とりわけ、配列番号１（図１）に示されるアミノ酸配列の位置８５のものに類似の相対位置の１個のアルギニン（Ａｒｇ）を欠く。いくつかの態様において、本発明の組換えプラスミノーゲンは、配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置８５のものに類似の相対位置に１個のＡｒｇ残基を含んでなる単一のＮ末端クリングルドメインを含んでなる。配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置８５のものに類似の相対位置の制限しない例は、配列番号２（図２）に示されるアミノ酸配列のＡｒｇ（１５３）、Ａｒｇ（２３４）、Ａｒｇ（３２４）およびＡｒｇ（４２６）位置を包含する。
【００３３】
他の態様において、言及される残基の特定の位置は、構造的および機能的に類似の位置で（すなわち、Ｎ末端ドメインのクリングル構造に関して；上で論考されるところのＣｈａｎｇ，Ｙ．らを参照されたい）該ポリペプチド中になお存在しつついくぶん変動し得る。いくつかの態様において、該プラスミン（プラスミノーゲン）ポリペプチドの単一のＮ末端クリングルドメインは、天然のヒトプラスミノーゲンのクリングル５とより最低１残基大きい、天然のヒトプラスミノーゲンのクリングル１若しくはクリングル４との同一性パーセントを有する。
【００３４】
さらに、特定の態様において、該組換えプラスミノーゲンはミニプラスミン（プラスミノーゲン）と対照的に機能的に特徴付け得る。一態様において、組換えプラスミノーゲンから製造されるプラスミンは、例えばミニプラスミンの阻害の速度より約１若しくは２桁と同じくらいより速い、α２−アンチプラスミンによる阻害の増大された速度を表す。
【００３５】
「Ｎ末端」としてのプラスミノーゲンの単一のＮ末端クリングルドメインの特徴付けは、該ドメインが活性化部位のＮ末端に存在することのみを意味しており、そして該ドメインそれ自身のＮ末端の付加的なアミノ酸残基が存在しないことを意味していない。さらに、該単一のＮ末端クリングルドメインの最もＣ末端のシステイン残基（すなわち図３に示される最もＣ末端のＣｙｓ残基）とプラスミノーゲンの活性化部位の間に挿入された残基の数および正体は、本発明の範囲から離れることなく変動され得る。当業者は、クリングル１の機能および構造に関する手引きについての本明細書の開示および本明細書で引用される参考文献に基づき、不要な実験を伴わずにこれらの変形（欠失変異体の大きさの実質的増大若しくは潜在的に問題の多いグリコシル化部位の導入を伴わないωアミノカルボン酸のクリングル１様結合）を決定することが可能であろう。
【００３６】
使用される基準に依存して、該組換えプラスミノーゲンのクリングル、活性化部位およびセリンプロテアーゼドメインの正確な「位置」若しくは配列が本発明の範囲内の特定の変形でわずかに異なり得ることが、さらに認識されるであろう。例えば、活性化部位に関するクリングルドメインの正確な位置はわずかに変動し得、かつ／若しくは該クリングルドメインのＮ末端の配列は長さが変動し得る。こうしたバリアントは、限定されるものでないが欠失、挿入、逆位、反復配列および置換を挙げることができる。どのアミノ酸変化が表現型上無変化であることがありそうであるかに関する手引きは、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら、“Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｅｓｓａｇｅ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ”、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）に見出し得る。
【００３７】
従って、配列番号１のポリペプチドのバリアント、フラグメント、誘導体若しくはアナログは、（ｉ）アミノ酸残基の１個若しくはそれ以上（例えば３、５、８、１０、１５若しくは２０残基）が保存された若しくは保存されないアミノ酸残基（好ましくは保存されたアミノ酸残基）で置換されているものであり得る。こうした置換されたアミノ酸残基は遺伝暗号によりコードされるものであっても若しくはなくてもよいか、あるいは、（ｉｉ）アミノ酸残基の１個若しくはそれ以上が１置換基を包含するもの（例えば３、５、８、１０、１５若しくは２０）、あるいは（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが該ポリペプチドの半減期を増大させるための化合物のような別の化合物（例えばポリエチレングリコール）に融合されているもの、あるいは（ｉｖ）ＩｇＧ  Ｆｃ融合領域ペプチドまたはリーダー若しくは分泌配列あるいは成熟ポリペプチド若しくはプロタンパク質配列の精製に使用される配列のような付加的なアミノ酸が成熟ポリペプチドに融合されているものであり得る。
こうしたフラグメント、誘導体およびアナログは本明細書の教示から当業者の範囲内にあると思われる。
【００３８】
示されるとおり、変化は、好ましくは、タンパク質のフォールディング若しくは活性に大きく影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換のような小規模の性質のものである。もちろん、当業者が行いうるアミノ酸置換の数は、上述されたものを包含する多くの因子に依存する。一般的に言って、いずれかの所定のプラスミノーゲンポリペプチドの置換の数は５０、４０、３０、２５、２０、１５、１０、５若しくは３を超えないことができる。
【００３９】
機能に不可欠である組換えプラスミノーゲン中のアミノ酸は、部位特異的突然変異誘発若しくはアラニンスキャニング突然変異誘発（ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍとＷｅｌｌｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５（１９８９））のような当該技術分野で既知の方法により同定し得る。後者の手順は分子中のすべての残基で単一アラニン突然変異を導入する。生じる変異体分子をその後、例えば本明細書に提供される実施例で示されるとおり生物学的活性について試験する。リガンド結合に決定的に重要である部位は、結晶化、核磁気共鳴若しくは光親和性標識（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４４：３９９−９０４（１９９２）およびｄｅ  Ｖｏｓら  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：３０６−３１２（１９９２））のような構造分析によってもまた決定し得る。タンパク質のＮ末端からの１個若しくはそれ以上のアミノ酸の欠失が該タンパク質の１種若しくはそれ以上の生物学的機能の改変若しくは喪失をもたらす場合であっても、他の生物学的活性はなお保持され得る。
【００４０】
組換えプラスミノーゲンが固相合成法により製造され得ることもまた企図している。Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：５１３１−５１３５（１９８５）；およびＨｏｕｇｈｔｅｎらへの米国特許第４，６３１，２１１号明細書（１９８６）を参照されたい。
【００４１】
配列番号１の参照アミノ酸配列に対する示された同一性パーセントのアミノ酸配列を有するポリペプチドは、ポリヌクレオチドに関して上で示されたコンピュータ支援方法を包含する方法を使用して決定し得る。ポリペプチドのアミノ酸配列は前述の論考のヌクレオチド配列がまさにそうであるように検査しかつ比較する。当業者は、ポリヌクレオチドについて論考された分子の終点のような概念が、ポリペプチド分析のためのこうした方法およびプログラムの対応する使用を考慮する場合に直接の類似物（ａｎａｌｏｇ）を有することができることを認識するであろう。例えば、ポリヌクレオチドに関して論考された人的修正は核酸の５’および３’終点を指すが、しかし同一の論考はポリペプチドのＮ末端およびＣ末端に適応可能と認識されるであろう。
【００４２】
本発明は、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）／保護（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）基による誘導体化、タンパク質分解性切断、抗体分子若しくは他の細胞リガンドへの結合などにより翻訳の間若しくは後に差別的に改変される組換えプラスミノーゲンポリペプチドもまた包含する。多数の化学修飾のいずれも、限定されるものでないが臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４による特異的化学的切断；アセチル化、脱アミド、ホルミル化、メチル化、酸化、還元；ツニカマイシンの存在下での代謝的合成；などを挙げることができる既知技術により実施し得る。
【００４３】
本発明により包含される付加的な翻訳後修飾は、例えば、例えばＮ−結合若しくはＯ−結合炭水化物鎖、Ｎ末端若しくはＣ末端のプロセシング、アミノ酸バックボーンへの化学的部分の付加、Ｎ−結合若しくはＯ−結合炭水化物鎖の化学修飾、ならびに組換えプラスミノーゲンポリペプチドの発現、例えば原核生物培養宿主細胞中での発現に適合されたベクターおよび構築物の結果としてのＮ末端メチオニン残基の付加を包含する。いくつかの態様において、該組換えプラスミノーゲンは、例えば親和性標識（例えばＨｉｓタグ、ＧＳＴタグ）、または酵素的、蛍光若しくは同位元素標識のような検出可能な標識でもまた修飾し得る。
【００４４】
Ｄ．ベクターおよび宿主細胞
他の局面において、本発明は、本発明の組換えプラスミノーゲン分子を包含するキットおよびベクター；該組換えベクターで遺伝子改変されている培養宿主細胞；ならびに組換え技術によるプラスミノーゲンポリペプチドの組換え発現にもまた関する。一態様において、プラスミノーゲン若しくはそれから製造されるプラスミンの製造方法は、組換え発現系を使用して組換えプラスミノーゲンを発現させることを含んでなる。
【００４５】
タンパク質発現のための宿主細胞の起源は限定されるものでなく、例えば宿主細胞は細菌（例えばエシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）に属するものおよびバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に属するもの）ならびに酵母（例えばサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびピキア属（Ｐｉｃｈｉａ））のような微生物により例示され得る。例えば、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）は、限定されるものでないが大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ））Ｋ１２ＤＨ１、Ｍ１０３、ＪＡ２２１、ＨＢ１０１、Ｘ６００、ＸＬ−１  ＢｌｕｅおよびＪＭ１０９を挙げることができる。例えば、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）は、限定されるものでないが枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４および２０７−２１を挙げることができる。例えば、酵母は、限定されるものでないが出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２、ＡＨ２２Ｒ．ｓｕｐ．−、ＮＡ８７−１１ＡおよびＤＫＤ−５Ｄならびにピキア  パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）を挙げることができる。米国特許第６，０６８，９９５号明細書は、所望のタンパク質を発現することが可能な宿主細胞によってタンパク質を産生するというその教示のために引用することにより本明細書に組み込まれる。
【００４６】
例えば、プラスミノーゲンのコーディング配列（例えば配列番号１）を有する分子を、宿主細胞中での発現に適切なクローニングベクターに挿入し得る。該クローニングベクターは、該コーディング配列の効率的な転写、翻訳およびプロセシングに必要とされる適切な制御機能を提供するように構築し得る。プラスミノーゲンをコードするＤＮＡを発現させるための適する宿主細胞は、原核生物、酵母若しくは高等真核生物細胞を包含する。適する原核生物は例えば古細菌および真正細菌のような細菌を包含する。好ましい細菌は、グラム陰性若しくはグラム陽性生物体のような真正細菌、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような腸内細菌科である。さらに、該ベクターは例えばプラスミド、ファージ、ウイルス若しくはレトロウイルスベクターであり得る。レトロウイルスベクターは複製能力があり得るか若しくは複製欠損であり得る。後者の場合、ウイルス増殖は一般に補完する培養宿主細胞中でのみ起こることができる。一態様において、組換え発現系は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に基づく発現系である。
【００４７】
原核生物に加え、糸状菌若しくは酵母のような真核生物微生物もまた、プラスミノーゲンをコードするベクターの適する発現宿主となり得る。例えば出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を使用し得る。別の態様において、組換え発現系はピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）に基づく発現系である。しかしながら、多数の他の属、種および株が商業的に入手可能でありかつ本明細書で有用である。
【００４８】
プラスミノーゲンをコードするＤＮＡの発現に適切な適する宿主細胞は多細胞生物体にもまた由来し得る。無脊椎動物細胞の例は植物（例えばアオウキクサ（Ｌｅｍｎａ）のようなウキクサ科から）および昆虫細胞を包含する。ワタ、トウモロコシ、バレイショ、ダイズ、ペチュニア、トマトおよびタバコの植物細胞培養物もまた宿主として利用し得る。
植物細胞と適合性の制御およびシグナル配列が利用可能である。米国特許第６，８１５，１８４号明細書はウキクサでポリペプチドを発現するというその教示のために引用することにより本明細書に組み込まれる。
【００４９】
プラスミノーゲン発現ベクターを宿主細胞に導入し得、そして、プロモーターを誘導、形質転換体を選択、若しくは所望のプラスミノーゲン配列をコードする遺伝子を増幅するのに適切なように改変された慣習的栄養培地中で宿主細胞を培養し得る。多数のトランスフェクション方法、例えばリン酸カルシウムおよび電気穿孔法が当業者に既知である。使用される宿主細胞に依存して、こうした細胞に適切な標準的技術を使用して形質転換を実施する。例えば、原核生物細胞を使用してプラスミノーゲンを製造する場合、全般として例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク  １９８９）に記述されるようにプロモーターを構成的に若しくは人工的に誘導し得る適する培地中でそれらを培養し得る。従って、組換え構築物は、感染、形質導入、トランスフェクション、トランスベクション、電気穿孔法および形質転換のような公知の技術を使用して培養宿主細胞に導入し得る。
【００５０】
いくつかの態様において、組換えプラスミノーゲンをコードするポリヌクレオチドを、培養宿主中での増殖のための選択可能なマーカーを含有するベクターに結合し得る。プラスミノーゲンをコードするポリヌクレオチドに対するシス作用性調節領域を含んでなるベクターが好ましい。適切なトランス作用因子は、培養宿主により供給され得るか、補完するベクターにより供給され得るか、若しくは培養宿主への導入に際してベクターそれ自身により供給され得る。いくつかの態様において、該ベクターは、誘導可能かつ／若しくは細胞型特異的であり得る特異的発現を提供する。一態様において、温度および栄養素添加物のような操作するのが容易である環境因子により誘導可能なものがこうしたベクターの一部である。
【００５１】
本発明で有用な発現ベクターの制限しない例は、染色体、エピソームおよびウイルス由来ベクター、例えば細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体エレメント由来のベクター、バキュロウイルス、パポーバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスのようなウイルス、ならびにコスミドおよびファージミドのようなそれらの組合せ由来のベクターを包含する。
【００５２】
ＤＮＡ挿入物は、いくつかを挙げれば、ファージλ  ＰＬプロモーター、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌａｃ、ｔｒｐおよびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーターならびにレトロウイルスのＬＴＲのプロモーターのような適切なプロモーターに効果的に連結し得る。他の適するプロモーターは当業者に既知であろう。発現構築物は転写開始、終止の部位、および転写された領域中に翻訳のためのリボソーム結合部位をさらに含有することができる。該構築物により発現される成熟転写物のコーディング部分は、翻訳されるべきポリペプチドの最初の翻訳開始および終わりに適切に配置される終止コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡ若しくはＵＡＧ）を包含し得る。
【００５３】
示されるとおり、該発現ベクターは最低１個の選択可能なマーカーを包含し得る。こうしたマーカーは、真核生物細胞培養物のためのジヒドロ葉酸還元酵素若しくはネオマイシン耐性、ならびに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および他の細菌中で培養するためのテトラサイクリン若しくはアンピシリン耐性遺伝子を包含する。適切な培養宿主の制限しない例は、限定されるものでないが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）細胞のような細菌細胞；酵母細胞のような真菌細胞；ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２およびスポドプテラ属（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９細胞のような昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳおよびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞のような動物細胞；ならびに植物細胞を挙げることができる。上述された培養宿主細胞のための適切な培地および培養条件は当該技術分野で既知である。
【００５４】
例えば、他の態様において、該組換え発現系は哺乳動物に基づく発現系である。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な不死化細胞株を包含する発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株が当該技術分野で既知である。例示的哺乳動物宿主細胞は、限定されるものでないが形質転換細胞株を包含する霊長類細胞株およびげっ歯類細胞株を挙げることができる。好ましくは、双方とも慣習的方法によるベクターＤＮＡの安定な組込みおよび組込まれたベクターＤＮＡのその後の複製のために、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が選択すべき哺乳動物宿主細胞として使用される。他の適する細胞株は、限定されるものでないが、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ−１）、ヒト肝細胞癌細胞（例えばＨｅｐ  Ｇ２）、ヒトアデノウイルス形質転換２９３細胞、マウスＬ−９２９細胞、ＨａＫハムスター細胞株、Ｓｗｉｓｓ、Ｂａｌｂ−ｃ若しくはＮＩＨマウス由来マウス３Ｔ３細胞および多数の他の細胞株を挙げることができる。別の適する哺乳動物細胞株はＣＶ−１細胞株である。正常二倍体細胞、初代組織のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物由来の細胞株、ならびに初代体外移植組織もまた適する。候補細胞は、選択遺伝子が遺伝子型で欠損していても、若しくは優性に作用する選択遺伝子を含有していてもよい。
【００５５】
例えば、宿主細胞は例えば当該技術分野で既知の方法によりプラスミノーゲンＤＮＡを保有する１種若しくはそれ以上のベクターで形質転換し得、そしてその後所望の場合は一方若しくは双方の導入された遺伝子の増幅を伴い適する条件下で培養し得る。発現されたプラスミノーゲンをその後、当業者に既知の方法により回収し得かつ培地から（若しくは例えば細胞内で発現される場合は細胞から）精製し得る。
【００５６】
哺乳動物細胞中での複製に適するベクターは、ウイルスレプリコン、すなわちプラスミノーゲンをコードする配列の宿主ゲノムへの組込みを確保する配列を包含し得る。適するベクターは例えばサルウイルスＳＶ４０、レトロウイルス、ウシパピローマウイルス、ワクシニアウイルスおよびアデノウイルス由来のものを包含し得る。ベクターの成分、例えばレプリコン、選択遺伝子、エンハンサー、プロモーターなどは天然の供給源から得ても若しくは既知の手順により合成してもよい。
【００５７】
適するベクターは例えばワクシニアウイルス由来のものであり得る。この場合、異種ＤＮＡをワクシニアのゲノムに挿入する。ワクシニアウイルスゲノムへの外来ＤＮＡの挿入技術は当該技術分野で既知であり、そして例えば相同的組換えを利用する。異種ＤＮＡの挿入は、一般に、性質が必須でない遺伝子、例えば選択可能なマーカーもまた提供するチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子中である。
【００５８】
哺乳動物発現ベクターは、哺乳動物細胞中で発現が可能である１種若しくはそれ以上の真核生物転写単位を含み得る。例えば、転写単位は外来ＤＮＡ配列の転写を媒介するための最低１個プロモーター領域を含み得る。哺乳動物細胞のための適するプロモーターは当該技術分野で既知であり、そしてサルウイルス４０（ＳＶ４０）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、アデノウイルス（ＡＤＶ）およびウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）からのもののようなウイルスプロモーターを包含する。
【００５９】
転写単位は、プラスミノーゲン配列に作動可能に連結されている終止配列およびポリ（Ａ）付加配列もまた含み得る。転写単位はプラスミノーゲンの発現を増大させるためのエンハンサー配列もまた含み得る。
【００６０】
場合によっては、遺伝子の増幅を見込む配列もまた、選択可能なマーカーをコードする配列がそうされ得るように包含され得る。哺乳動物細胞のための選択可能なマーカーは当該技術分野で既知であり、そして例えばチミジンキナーゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ増幅因子としてのメトトレキサートと一緒になって）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、アスパラギン合成酵素、アデノシンデアミナーゼ、メタロチオニエン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｅｎ）、およびネオマイシンのような抗生物質耐性遺伝子を包含する。若しくは、例えば、該ベクターＤＮＡはウシパピローマウイルスゲノムの全部若しくは一部を含むことができ、そして安定なエピソームエレメントとしてＣ１２７マウス細胞のような細胞株に保有され得る。
【００６１】
一態様において、組換えプラスミノーゲンはＰＥＲ．Ｃ６（Ｒ）技術（Ｃｒｕｃｅｌｌ、ホラント、オランダ）を使用して製造し得る。組換えタンパク質の発現は、例えばヒト細胞株中の組換えタンパク質の製造のための方法および組成物のその教示のために引用することにより本明細書に組み込まれる米国特許第６，８５５，５４４号明細書により開示されている。
【００６２】
細菌での使用に好ましいベクターの一部は、例えば、Ｎｏｖａｇｅｎ、ウィスコンシン州マディソンから入手可能なｐＥＴ２４ｂ若しくはｐＥＴ２２ｂ（ｐＥＴ−２４ｂ（＋）およびｐＥＴ−２２ｂ（＋）＝それぞれｐＥＴ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２４ｂ（カタログ番号６９７５０）および２２ｂ（カタログ番号７０７６５）、ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｏｖａｇｅｎブランド、ウィスコンシン州マディソン；ベクターに関する詳細については、ｐＥＴ−２４ｂおよびｐＥＴ−２２ｂに関するｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｍｄｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍの製品情報の節を参照されたい）、Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州バレンシアから入手可能なｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０およびｐＱＥ−９；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホヤから入手可能なｐＢＳベクター、ＰＨＡＧＥＳＣＲＩＰＴベクター、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ；ならびにＰｈａｒｍａｃｉａ（現在Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク州ニューヨーク）から入手可能なｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５を包含する。好ましい真核生物ベクターの一部は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ；ならびにＰｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬである。他の適するベクターは当業者に容易に明らかであろう。
【００６３】
本発明での使用に適する細菌プロモーターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌａｃＩおよびｌａｃＺプロモーター、Ｔ３およびＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、λ  ＰＲおよびＰＬプロモーターならびにｔｒｐプロモーターを包含する。適する真核生物プロモーターは、ＣＭＶ前初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４０プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のもののようなレトロウイルスＬＴＲのプロモーター、ならびにマウスメタロチオネイン−Ｉプロモーターのようなメタロチオネインプロモーターを包含する。
【００６４】
いくつかの態様において、培養宿主細胞へのベクター構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、陽イオン性脂質媒介性トランスフェクション、電気穿孔法、形質導入、感染若しくは他の方法により遂げることができる。こうした方法は、Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版（１９９５）のような多くの標準的実験室手引き書に記述されている。
【００６５】
高等真核生物による本発明のプラスミノーゲンをコードするＤＮＡの転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することにより増大させ得る。エンハンサーは、所定の培養宿主細胞型でのプロモーターの転写活性を増大させるよう作用する通常約１０から３００ｂｐまでのＤＮＡのシスエレメントである。エンハンサーの例は、ｂｐ  １００ないし２７０の複製起点の後期側（ｌａｔｅ  ｓｉｄｅ）に配置されるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーを包含する。
【００６６】
小胞体の内腔、細胞膜周辺腔若しくは細胞外環境への翻訳されたタンパク質の分泌のため、発現されるポリペプチドに適切な分泌シグナルを組み込み得る。該シグナルは該ポリペプチドに内因性であり得るか、若しくはそれらは異種シグナルであり得る。
【００６７】
多様な態様において、プラスミノーゲンは融合タンパク質のような改変された形態で発現され得、そして分泌シグナルのみならずしかしまた付加的な異種機能領域も包含し得る。例えば、付加的なアミノ酸、とりわけ荷電したアミノ酸の一領域を、培養宿主細胞中、精製若しくはその後の取扱いおよび貯蔵の間の安定性および持続性を改良するためにＮ末端例えば該ポリペプチドに付加し得る。また、精製を容易にするためペプチド部分を該ポリペプチドに付加し得る。こうした領域は該ポリペプチドの最終製造前に除去し得る。とりわけ、分泌すなわち排出を生じさせるため、安定性を改良するためおよび精製を容易にするためのポリペプチドへのペプチド部分の付加は、当該技術分野で馴染みがありかつ慣例の技術である。好ましい融合タンパク質はタンパク質を可溶化するのに有用である免疫グロブリンからの異種領域を含んでなる。例えば、欧州特許第ＥＰ  ０  ４６４  ５３３  Ａ１号明細書（カナダの対蹠物第２，０４５，８６９号明細書）は、別のヒトタンパク質若しくはその部分と一緒になって免疫グロブリン分子の定常領域の多様な部分を含んでなる融合タンパク質を開示する。多くの場合、融合タンパク質中のＦｃ部分は治療および診断での使用に全面的に有利であり、そして従って例えば改良された薬物動態特性をもたらす。他方、いくつかの用途のため、融合タンパク質が記述される有利な様式で発現、検出および精製された後にＦｃ部分を除去することが可能であることが望ましいことができる。これは、Ｆｃ部分が治療および診断で使用するために妨害となることが判明している場合、例えば融合タンパク質を免疫化のための抗原として使用するはずである場合に真実である。例えば創薬において、ヒトタンパク質がハイスループットスクリーニングアッセイの目的上Ｆｃ部分と融合されている（ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定するためのｈＩＬ−５受容体のような）。Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｄ．ら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ、８：５２−５８（１９９５）およびＪｏｈａｎｓｏｎ，Ｋ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７０（１６）：９４５９−９４７１（１９９５）を参照されたい。
【００６８】
一態様において、不溶性プラスミノーゲンを原核生物宿主細胞から適する単離緩衝液中に単離する。例えば、宿主細胞を、ほとんどの宿主タンパク質を可溶化するために適するイオン強度のしかし凝集されたプラスミノーゲンが実質的に不溶性である緩衝液に曝露し得、そして封入体を放出しかつそれらを例えば遠心分離により回収に利用可能にするように細胞を破壊する。この技術は当業者に既知であり、そして、一変法が、例えば、組換え宿主細胞培養物中の不溶性の屈折性の形態で産生された異種タンパク質の可溶化方法のその教示のために本明細書に引用することにより組み込まれる米国特許第４，５１１，５０３号明細書に記述されている。一態様において、組換えプラスミノーゲンを発現する工程は、組換えプラスミノーゲン封入体を産生するのに十分な発現条件下で発現系を実施することを含んでなる。
【００６９】
特定の一理論に固執されずに、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での組換えタンパク質の発現は、封入体と呼ばれる不溶性凝集体中の組換えタンパク質の細胞内沈着を頻繁にもたらすと考えられている。封入体中の組換えタンパク質の沈着は、該封入体が高度に精製された組換えタンパク質を蓄積するため、および封入体中に隔離されるタンパク質が細菌プロテアーゼの作用から保護されるための双方で有利であり得る。
【００７０】
一般に、宿主細胞（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞）を適切な量の増殖後に収集し、そして例えば機械的方法（例えば音波発振器）のような技術を使用するまたは化学的若しくは酵素的方法による溶解による破壊前に適する緩衝液に懸濁する。化学的若しくは酵素的細胞破壊方法の例は、細菌壁を溶解するためのリゾチームの使用を含んでなるスフェロプラスト化、ならびにポリペプチドを放出させるための高浸透圧の溶液および低浸透圧の冷水洗浄での生存細胞の処理を必要とする浸透圧ショックを包含する。
【００７１】
宿主細胞破壊後に懸濁液を典型的には遠心分離して封入体をペレットにする。生じるペレットは不溶性ポリペプチド画分の実質的に全部を含有するが、しかし細胞破壊過程が完全でない場合、それは無傷の細胞若しくは破壊された細胞断片もまた含有しうる。細胞破壊の完全性は、ペレットを少量の同一緩衝溶液に再懸濁すること、および位相差顕微鏡で該懸濁液を検査することによりアッセイし得る。破壊された細胞断片若しくは全細胞の存在は、該断片若しくは細胞および関連する非屈折性ポリペプチドを除去するために付加的破壊が必要であることを示す。こうしたさらなる破壊後に、必要とされる場合は、該懸濁液を再度遠心分離し得かつペレットを回収し得、再懸濁し得かつ分析し得る。該方法は、視覚的検査がペレットにされた物質中の破壊された細胞断片の非存在を明らかにするまで、若しくはさらなる処理が生じるペレットの大きさを低下させることに失敗するまで反復し得る。可溶化された封入体から若しくは後の精製工程で一旦得られれば、プラスミノーゲンを本発明に従って適して再度折りたたみ得る。いかなるアンフォールディングの程度も、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を包含するクロマトグラフィーにより決定し得る。
【００７２】
プラスミノーゲンが再度折りたたまれるべきである前にそれがすでに可溶性の形態にない場合は、プラスミノーゲンを実質的に可溶化するために必要な量のカオトロピック剤（例えば尿素、グアニジン）および還元剤（例えばグルタチオン、ＤＴＴ、システイン）を含んでなる可溶化緩衝液中でのインキュベーションによりそれを可溶化しうる。このインキュベーションは、プラスミノーゲンの可溶化を起こさせることができるプラスミノーゲン濃度、インキュベーション時間およびインキュベーション温度の条件下で起こる。緩衝液中のプラスミノーゲンの可溶化の程度の測定は、濁度測定、遠心分離後の上清とペレットの間のプラスミノーゲンの分画を還元ＳＤＳゲル上で分析すること、タンパク質アッセイ（例えばＢｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイキット）若しくは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により実施し得る。一態様において、組換えプラスミノーゲンの製造方法は、可溶化された組換えプラスミノーゲン封入体を得るのに十分な可溶化条件下で、組換えプラスミノーゲン封入体を可溶化緩衝液と接触させることをさらに含んでなる。
【００７３】
可溶化緩衝液のｐＨはアルカリ性、好ましくは最低約ｐＨ７．５であり得、好ましい範囲は約ｐＨ７．５ないし約ｐＨ１１である。可溶化のための緩衝溶液中のプラスミノーゲンの濃度は、プラスミノーゲンが実質的に可溶化されかつ部分的に若しくは完全に還元かつ変性されることができるようでなければならない。あるいは、プラスミノーゲンは当初不溶性であってもよい。使用するための正確な量は、例えば緩衝溶液中の他成分の濃度および型、具体的には還元剤の型および量、カオトロピック剤の型および量ならびに緩衝液のｐＨに依存することができる。例えば、プラスミノーゲンの濃度は、還元剤例えばグルタチオンの濃度が同時に増大される場合に増大させ得る。
【００７４】
他の態様において、プラスミノーゲンの製造方法は、可溶化された組換えプラスミノーゲン封入体を再折りたたみ条件下で再折りたたみ溶液と接触させて組換えプラスミノーゲンを含んでなる組成物を得ることをさらに含んでなる。いくつかの態様において、より濃縮された可溶化されたタンパク質の溶液を希釈再折りたたみ前に製造することが望ましい。例えば、一態様において、プラスミノーゲンを再折りたたみ緩衝液で好ましくは最低５倍、より好ましくは最低約１０ないし約２０倍希釈する。他の態様において、プラスミノーゲンを再折りたたみ緩衝液に対し透析する。
【００７５】
再折りたたみ緩衝液中のプラスミノーゲンの濃度は、ＨＰＬＣ、ＲＩＡ若しくはバイオアッセイにより測定されるところの回収される誤って折り畳まれたコンフォーマーに対する正しく折り畳まれたコンフォーマーの比が最大化されることができるようであり得る。
再折りたたみインキュベーションは、ＲＩＡ若しくはＨＰＬＣにより測定されるところの、正しく折り畳まれたプラスミノーゲンコンフォーマーの収量および回収される誤って折り畳まれたプラスミノーゲンコンフォーマーに対する正しく折り畳まれたプラスミノーゲンコンフォーマーの比が最大になるように、ならびに例えば物質収支により決定されるところの多量体の会合したプラスミノーゲンの収量を最小化するように実施する。
【００７６】
他の態様において、再折りたたみは高圧再折りたたみ技術を使用して実施する。従って、いくつかの態様において、本発明はプラスミノーゲンの製造方法を提供し、該方法は、（ａ）混合物中の総タンパク質濃度を最低約０．０１ｍｇ／ｍｌの第一の濃度に調節することであって、該混合物はプラスミノーゲンを含んでなり；
（ｂ）該混合物を、第一の時間および第一の温度について約０．２５ｋｂａｒないし約１２ｋｂａｒの第一の圧にさらすこと；
（ｃ）該混合物を、第二の時間、約０．２５ｋｂａｒないし約３．３ｋｂａｒの第二の圧にさらすこと；および
（ｄ）該混合物を第三の圧にさらして、それにより混合物中のプラスミノーゲンを脱凝集しかつ再び折りたたむこと
を含んでなる再折りたたみを含んでなる。
【００７７】
高圧再折りたたみは、例えば、タンパク質凝集体および封入体の再折りたたみ方法のその教示のために本明細書に引用することにより組み込まれる米国特許第７，０６４，１９２号明細書に開示される。
【００７８】
一態様において、第一の濃度は５００ｍｇ／ｍｌを超えない。別の態様において、再折りたたみは８Ｍを超えない第二の濃度のカオトロピック剤と該混合物を接触させることを含んでなる。いくつかの態様において、第二の時間は約０．１時間ないし約１２時間である。他の態様において、第三の圧はほぼ大気圧である。特定の態様において、該混合物を第一の圧にさらすことはプラスミノーゲンを脱凝集するのに十分である。多様な他の態様において、該混合物は、組換え製造されたプラスミノーゲンに対応する可溶化された封入体を含んでなる。
【００７９】
例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での組換えプラスミノーゲンの過剰発現は、凝集されたプラスミノーゲンタンパク質の相対的に高密度の不溶性粒子に対応する封入体を形成し得る。一態様において、一旦単離されれば、封入体は、多様な技術、若しくは圧およびカオトロピック剤（ならびに場合によってはまた還元剤）の組合せにより可溶化され得る。
生物学的に適正なプラスミノーゲンのコンホメーションへの再生は、高圧の条件下、ならびに、場合によっては（例えば周囲大気圧での）非変性濃度のカオトロピック剤ならびに／若しくは酸化還元試薬（例えばジチオスレイトールおよび酸化型グルタチオン）の存在下で進行し得る。
【００８０】
例えば、圧は、１０倍水圧増加装置（Ｈｉｇｈ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ペンシルバニア州エリー）に接続された高圧窒素（例えば４００ｂａｒ）を使用して生成し得る。所望の圧に達するための時間は約１０分であり得る。窒素入力を１０倍水圧増加機に接続し得、これを約３０，０００ｐｓｉ（２ｋｂａｒ）に定格されている２リットルクローバー型リアクターに接続し得る。より高圧のためには、装置をより高い定格に改変し得る。サンプルを例えばＳＡＭＣＯＴＭプラスチック製トランスファーピペット（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ペンシルバニア州ピッツバーグ）のヒートシールバルブ中で調製し得、そして２，０００ｂａｒに定格されている２リットルクローバー型リアクターに入れかつ水で満たし得る。サンプルを最終的な所望の圧までゆっくり加圧し得る（１０分にわたり）。減圧速度は１分あたり約１０ｂａｒであり得る。
【００８１】
本発明の別の態様は変性されたプラスミノーゲンの圧で助長される再折りたたみを使用する。本態様において、溶液中の変性されたプラスミノーゲンを変性量のカオトロピック剤の存在下で提供する。溶液中のプラスミノーゲン濃度は、約０．００１ｍｇ／ｍｌないし約５００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．１ｍｇ／ｍｌないし約２５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約１ｍｇ／ｍｌないし約１０ｍｇ／ｍｌであり得る。カオトロピック剤濃度は約２Ｍないし約８Ｍであり得る。変性されたプラスミノーゲンの溶液を、再生を助長するのに効果的な圧範囲（いくつかの態様において約０．２５ｋｂａｒないし約３．３ｋｂａｒ、好ましくは約２ｋｂａｒから約３．３ｋｂａｒまでであり得る）の高圧でインキュベートし得る。加圧下の間に、カオトロピック剤の濃度をいずれかの適する手段により、例えば希釈若しくは透析により低下させ得る。インキュベーションはプラスミノーゲンの再折りたたみを可能にするのに十分な時間起こり得る。圧インキュベーション時間の終了時に圧をほぼ大気圧に低下させ得る。他の態様において、酸化還元剤、安定剤、界面活性剤などを該溶液に添加し得る。
【００８２】
一態様において、再折りたたみ組成物を、再折りたたみの工程後しかしさらなる下流の処理前に１若しくはそれ以上の濾過若しくはダイアフィルトレーション工程にかけて、凝集された形態の組換えプラスミノーゲンを再折りたたみ工程後に排除若しくは実質的に低減させ得る。例えば、再折りたたみ混合物にデプスフィルターを通過させ得、その後ダイアフィルトレーションし得、次いでいずれかの下流のクロマトグラフィーの前にその後濾過し得る。いくつかの態様において、１若しくはそれ以上の連続的な濾過および／若しくはダイアフィルトレーションによるプラスミノーゲン活性の回収は最低約７０％、好ましくは最低約８０％、９０％若しくはそれ以上である。一態様において、プラスミノーゲンの製造方法は、再折りたたみの工程後かつ陽イオン交換媒体と接触させる工程の前に組成物をダイアフィルトレーションすることをさらに含んでなる。
【００８３】
他の態様において、凝集された組換えプラスミノーゲンは、適切な濃度のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）若しくは硫酸塩を再折りたたみ混合物に添加することにより選択的に沈殿される。適切な条件下で、凝集されたタンパク質は添加されたＰＥＧ若しくは塩により不溶性にされ得、そして正しく再度折りたたまれた組換えタンパク質のほとんどが溶液中に維持され得る。遠心分離若しくは濾過のいずれかによる沈殿されたタンパク質凝集体の除去後に、生じる上清／濾液をさらに処理し得る。例えば、一態様において、再折りたたみ工程の完了時に、固体ＰＥＧ若しくは塩（例えば硫酸アンモニウムまたはナトリウム若しくはカリウムのような硫酸の不揮発性塩）を適切な濃度まで添加し得、そして該混合物を混合して該ＰＥＧ若しくは塩を溶解し得かつ凝集されたタンパク質の結果として生じる沈殿を進行させ得る。沈殿時間後に該沈殿物を１種若しくはそれ以上の澄明化法（例えば深層濾過、遠心分離、精密濾過法などおよびそれらの組合せ）、好ましくは深層濾過により除去し得る。生じる濾液をその後、組換えプラスミノーゲンを製造するためのさらなる処理にかけることができる。
【００８４】
ＰＥＧの例は、限定されるものでないが、ＰＥＧ  ２００、ＰＥＧ  ３００、ＰＥＧ  ４００、ＰＥＧ  ６００、ＰＥＧ  １０００、ＰＥＧ  ２０００、ＰＥＧ  ３３５０、ＰＥＧ  ４０００、ＰＥＧ  ４６００、ＰＥＧ  ５０００、ＰＥＧ  ６０００およびＰＥＧ  ８０００を挙げることができる。一態様において、ＰＥＧは沈殿条件下で再折りたたみ溶液に添加し、該再折りたたみ溶液はプラスミノーゲンおよび凝集されたポリペプチドを含んでなり、該プラスミノーゲンは再度折りたたまれたプラスミノーゲンであり、該沈殿条件は凝集されたタンパク質の全部若しくは実質的部分を沈殿させるのに十分である。他の態様において、ＰＥＧは最低約１％（ｗ／ｖ）、具体的に説明すれば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および２０％（ｗ／ｖ）のＰＥＧの最終濃度を達成するように添加する。いくつかの態様において、最初のＰＥＧ沈殿および最低１回のさらなるＰＥＧ沈殿を実施する。
【００８５】
他の態様において、硫酸アンモニウム（例えば固体硫酸アンモニウム）を、最低約１％飽和、具体的に説明すれば最低約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０および７０％に対応する硫酸アンモニウムの最終濃度を達成するよう再折りたたみ溶液に添加する。
【００８６】
一態様において、生じる濾液（ＰＥＧ若しくは塩沈殿後）を、疎水性相互作用クロマトグラフィー媒体がプラスミノーゲンを優先的に捕捉するような十分な適する疎水性相互作用条件下で、適する疎水性相互作用クロマトグラフィー媒体と接触させ得る。疎水性相互作用媒体はプラスミノーゲンを結合する固相であり得る。疎水性相互作用クロマトグラフィー媒体は、疎水性相互作用媒体として一般に記述されるクロマトグラフィー媒体の群のいずれからも選択し得る。該媒体はプラスミノーゲンの選択的若しくは優先的捕捉を見込むことができる、それに結合されている化学的構造すなわちリガンドを保有し得る。有用なクロマトグラフィー媒体は、支持体、およびプラスミノーゲンに対する選択的若しくは優先的結合能力を提供するそれに結合されている１種若しくはそれ以上のリガンドを含んでなる。有用な支持体は、具体的に説明する例として、アガロースおよびセルロースのような多糖、ポリアクリルアミド、メチルメタクリレートおよびポリスチレン−ジビニルベンゼンコポリマーのような有機ポリマーを包含する。有機支持体のみが媒体の支持体の使用に適することを意味することを本明細書で意図していないことが認識されるべきである。シリカおよびガラスのような無機支持体素材もまた使用し得るためである。
【００８７】
いくつかの態様において、疎水性相互作用媒体は、全般として球状であり得るビーズの形態にあるか、または、あるいは、第二のアフィニティー媒体は、他の規則的形状若しくは不規則形状を有する微粒子若しくは分割された形態で有用に提供され得る。一態様において、該媒体は膜の形態にある。該疎水性相互作用媒体は多孔質若しくは非多孔質の特徴のものであることができ、また、該媒体は圧縮可能若しくは圧縮不可能であり得る。好ましい疎水性相互作用媒体は精製方法で使用される条件に対し物理的および化学的に回復力があることができる。多様な疎水性相互作用媒体、例えば結合されているリガンドがフェニル、オクチル若しくはブチル部分であるものが当該技術分野で既知である。
【００８８】
一態様において、疎水性相互作用媒体は支持体に結合されているリガンドを含んでなり、該リガンドはフェニル部分であり、該支持体はアガロースである。例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィーはフェニル−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭカラム形式で実施し得る。
【００８９】
いくつかの態様において、沈殿されたプラスミノーゲン凝集体の遠心分離若しくは濾過いずれかによる除去後に、正しく再度折りたたまれた組換えプラスミノーゲンを含んでなる生じる上清／濾液を、場合によっては疎水性相互作用クロマトグラフィーにより直接捕捉かつ精製する。
【００９０】
所望の場合は、選択的沈殿および／若しくは疎水性相互作用クロマトグラフィーの使用は、再折りたたみ混合物の１若しくはそれ以上の濾過／ダイアフィルトレーション工程を置き換えてそれにより該組換えタンパク質の精製への代替の一アプローチを提供し得るが、しかしその必要はない。
【００９１】
いくつかの態様において、１若しくはそれ以上の濾過／ダイアフィルトレーション工程および／若しくは選択的沈殿工程および／若しくは疎水性相互作用クロマトグラフィーに再折りたたみ混合物をかける工程（１若しくは複数）後に、組換えプラスミノーゲンを含んでなる生じる溶液を陽イオン交換媒体（例えばＳＰ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭ）および／若しくは第一のアフィニティー媒体（例えばＥＣＨ−Ｌｙｓｉｎｅカラム）と接触させることにより、該生じる溶液をさらに精製し得る。
【００９２】
本発明の１若しくはそれ以上の製造工程後に、かように製造されたプラスミノーゲンを活性化してプラスミンを得ることができるか、若しくはプラスミノーゲンの活性化前に適する温度（例えば−２０℃、−８０℃）で保存し得る。
【００９３】
従って、特定の態様において本発明はプラスミノーゲンの製造方法を提供し、該方法は（ａ）ある発現条件下で組換え発現系を使用して組換えプラスミノーゲンを発現させること；
（ｂ）可溶化された組換えプラスミノーゲンを得るのに十分な可溶化条件下で該組換えプラスミノーゲンを可溶化緩衝液と接触させること；
（ｃ）可溶化された組換えプラスミノーゲンを再折りたたみ条件下で再折りたたみ溶液と接触させて、組換えプラスミノーゲンを含んでなる組成物を得ること；
（ｄ）工程（ｃ）の後に該組成物をダイアフィルトレーションすること；
（ｅ）陽イオン交換媒体が組換えプラスミノーゲンを結合するのに十分であるイオン交換条件下で該組成物を陽イオン交換媒体と接触させること；
（ｆ）陽イオン交換媒体により捕捉された組換えプラスミノーゲンを溶出して組換えプラスミノーゲンを含んでなる陽イオン交換媒体溶出液を得ること；
（ｇ）第一のアフィニティー媒体が組換えプラスミノーゲンを結合するのに十分である第一のアフィニティー条件下で陽イオン交換媒体溶出液を第一のアフィニティー媒体と接触させること；および
（ｈ）第一のアフィニティー媒体により結合された組換えプラスミノーゲンを溶出して、組換えプラスミノーゲンを含んでなるプラスミノーゲン溶液を得ること
を含んでなる。
【００９４】
一態様において、発現条件は組換えプラスミノーゲン封入体を提供するのに十分である。いくつかの態様において、組換えプラスミノーゲン封入体を、可溶化された組換えプラスミノーゲン封入体を得るのに十分な可溶化条件下で可溶化緩衝液と接触させ得る。他の態様において、可溶化された組換えプラスミノーゲン封入体を、再折りたたみ条件下で再折りたたみ溶液と接触させて、組換えプラスミノーゲンを含んでなる組成物を得ることができる。
【００９５】
ＩＩ．プラスミン
他の局面において、本発明はプラスミンの製造方法を提供する。一態様において、該方法はアフィニティー媒体（例えばベンズアミジン−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭ）とプラスミン組成物を接触させることを含んでなり、該プラスミン組成物はプラスミノーゲンアクチベーターでプラスミノーゲンを活性化することにより製造されるプラスミンを含んでなる。いくつかの態様において、プラスミノーゲンは本発明に従って製造される。一態様において、プラスミノーゲンは本発明に従って製造される組換えプラスミノーゲンである。
【００９６】
Ａ．プラスミノーゲンのプラスミンへの転化
いくつかの態様において、該プラスミンの製造方法は、プラスミノーゲンをプラスミンに転化するのに十分な活性化条件下で、プラスミノーゲンを活性化溶液中でプラスミノーゲンアクチベーターと接触させることを含んでなる。
【００９７】
一般に、プラスミノーゲンは、可溶性であり得かつ／若しくは固定されていることができる触媒濃度のプラスミノーゲンアクチベーター（例えばストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、ｔＰＡ、トリプシン）を使用して活性化され（すなわち切断されてプラスミンを提供し）得る。いくつかの態様において、プラスミノーゲンの活性化は約４℃若しくはそれ以上、例えば約４、１０、２０、２５、３７若しくはそれ以上の摂氏度で起こることができ、そして、典型的には最低数分若しくはそれ以上、好ましくは最低約１、２、４時間若しくはそれ以上かかることができる。プラスミノーゲンは、ω−アミノ酸、塩、ショ糖、アルコール（例えばエタノール、メタノール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、グリセロール、エチレングリコール）およびそれらの組合せのような安定剤および／若しくは賦形剤を包含する１種若しくはそれ以上の試薬の存在下で切断され得る。ω−アミノ酸はリシン、ε−アミノカプロン酸（ε−ＡＣＡ）、トラネキサム酸、ポリリシン、アルギニン、およびそれらの組合せ若しくはアナログを包含し得る。安定剤は例えば米国特許公開第２００３００１２７７８号明細書（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）により記述されている。
【００９８】
一態様において、プラスミノーゲンアクチベーターは可溶性プラスミノーゲンアクチベーターである。別の態様において、該プラスミンの製造方法は、プラスミノーゲンをプラスミンに転化するのに十分な活性化条件下でプラスミノーゲンを活性化溶液中でプラスミノーゲンアクチベーターと接触させることを含んでなり、該プラスミノーゲンアクチベーターは固定されているプラスミノーゲンアクチベーターである。
【００９９】
例えば、プラスミノーゲンアクチベーターは適するマトリックス上に吸着され得る。例えば、ストレプトキナーゼは、ストレプトキナーゼがニトロセルロースに強固に結合されている場合にプラスミノーゲンをプラスミンに活性化することがなお可能であることが報告されている（Ｋｕｌｉｓｅｋら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７７：７８−８４（１９８９））。また、ストレプトキナーゼの適するイオン交換樹脂への吸着はそれを固定されかつプラスミノーゲンを活性化することがなお可能であるようにし得る。
【０１００】
固定されたストレプトキナーゼもまた、ｐ−アミノフェニルアラニンおよびロイシンのジアゾ化コポリマーを使用してＲｉｍｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ．Ａｃｔａ  ７３：３０１（１９６３）により論考されている。これらの著者らは、固定されたストレプトキナーゼを利用してプラスミノーゲンの活性化の機序を研究した。Ｓｕｇｉｔａｃｈｉら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．（Ｓｔｕｔｔｇ．）３９：４２６（１９７８）はナイロン上のプラスミノーゲンアクチベーターウロキナーゼの固定を論考している。固定されたプラスミノーゲンアクチベーターのその教示のために引用することにより本明細書に組み込まれる米国特許第４，３０５，９２６号明細書は、ナイロン、Ｄａｃｒｏｎ、コラーゲン、ポリビニルピロリジン若しくはコポリマー性ｐ−アミノフェニルアラニンおよびロイシンのような生物適合性ポリマー上へのストレプトキナーゼの固定を提案する。
【０１０１】
一態様において、ストレプトキナーゼは、ストレプトキナーゼを固定するというその教示のために引用することにより本明細書に組み込まれる米国特許第６，４０６，９２１号明細書に記述されるところのアフィニティータグを使用して表面上に固定される。該表面は有機若しくは無機、生物学的若しくは非生物学的、またはこれらの素材のいずれかの組合せのいずれでもあり得る。一態様において、該表面は透明若しくは半透明である。多数の素材が表面としての使用に適する。例えば、該表面は、ケイ素、シリカ、石英、ガラス、孔径制御ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）、カーボン、アルミナ、二酸化チタン、ゲルマニウム、窒化ケイ素、ゼオライトおよびガリウムヒ素よりなる群から選択される素材を含み得る。金、白金、アルミニウム、銅、チタンのような多くの金属およびそれらの合金もまた表面の選択肢である。加えて多くのセラミックおよびポリマーもまた使用し得る。表面として使用しうるポリマーは、限定されるものでないが以下すなわちポリスチレン；ポリ（テトラ）フルオルエチレン；（ポリ）ビニリデンジフルオリド；ポリカーボネート；ポリメチルメタクリレート；ポリビニルエチレン；ポリエチレンイミン；ポリ（エーテルエーテル）ケトン；ポリオキシメチレン（ＰＯＭ）；ポリビニルフェノール；ポリラクチド；ポリメタクリルイミド（ＰＭＩ）；ポリアルケンスルホン（ＰＡＳ）；ポリヒドロキシエチルメタクリレート；ポリジメチルシロキサン；ポリアクリルアミド；ポリイミド；コブロックコポリマーを挙げることができ；ならびにＥｕｐｅｒｇｉｔＴＭフォトレジスト；重合ラングミュア−ブロジェット膜、およびＬＩＧＡ構造もまた本発明の表面としてはたらくことができる。
【０１０２】
いくつかの態様において、活性化条件はプラスミノーゲンの全部若しくは実質的な量をプラスミンに転化してそれによりプラスミンを含んでなる組成物を提供するのに十分である。
【０１０３】
Ｂ．陰イオン交換クロマトグラフィー
他の局面において、本発明はプラスミンの製造方法を提供する。該方法は、プラスミンを含んでなる組成物を陰イオン交換体と接触させて、それにより、組成物中に存在する場合は、プラスミンのものより下の等電点を有するタンパク質性物質をプラスミンから分離することを含んでなる。
【０１０４】
いずれかの特定の理論に固執されずに、いずれか１種のタンパク質性物質について、負の電荷の総数が正の電荷の数と等しいｐＨが存在することができると考えられている。これが該タンパク質の等電点（すなわちｐＩ）、すなわち該タンパク質が正味の電荷を保有しないｐＨである。そのｐＩより上では、該タンパク質は正味の負の電荷を有しかつ陰イオン交換体に結合することができる。
【０１０５】
好ましい一態様において、組成物中に存在するプラスミンは、プラスミノーゲンアクチベーターにより活性化されたプラスミノーゲンの生成物である。例えば、組換えプラスミノーゲン若しくは血液由来プラスミノーゲンをプラスミノーゲンアクチベーター（例えばストレプトキナーゼ）と接触させてプラスミンを提供し得る。一態様において、プラスミンを含んでなる組成物は、必要な場合は陰イオン交換体と接触させる前にｐＨ調節されている活性化溶液である。
【０１０６】
別の態様において、プラスミンを含んでなる組成物はクロマトグラフィー工程（例えばベンズアミジンを使用するアフィニティークロマトグラフィー）の溶出液若しくは素通り溶液であり、該溶出液若しくは素通り溶液は、必要な場合は陰イオン交換体と接触させる前にｐＨ調製されている。
【０１０７】
プラスミンから分離されるべきタンパク質性物質はプラスミンのｐＩのものより低いｐＩを有する。いくつかの態様において、該タンパク質性物質はプラスミノーゲンアクチベーター（例えばストレプトキナーゼ）若しくはそのフラグメントであり、プラスミンを含んでなる組成物は、プラスミンを含んでなる陰イオン交換体素通り画分を得るのに十分な陰イオン交換条件下で陰イオン交換媒体と接触され、該陰イオン交換条件は、該陰イオン交換媒体がプラスミンに関してプラスミノーゲンアクチベーター若しくはそのフラグメントを選択的若しくは優先的に結合するようである。
【０１０８】
いずれかの特定の理論に固執されずに、プラスミノーゲンのその活性化の結果としてのストレプトキナーゼのタンパク質分解が、プラスミノーゲンとのストレプトキナーゼ接触後に起こると考えられている。プラスミンの形成に加え、変動する分子量のストレプトキナーゼフラグメントが、ストレプトキナーゼによりプラスミノーゲンの活性化に際して生じ得る。
【０１０９】
一態様において、該タンパク質性物質は、例えば変性条件下のゲル電気泳動により測定されるところの約４５ｋＤ未満の分子量を有するストレプトキナーゼフラグメントである。別の態様において、該フラグメントは約４０、２５、１５、１０ｋＤ若しくはそれ未満の分子量を有する。いくつかの態様において、該フラグメントは約１５ｋＤの分子量を有する。
【０１１０】
一態様において、プラスミンを含んでなる組成物の陰イオン交換体との接触の前に、該組成物のｐＨは、プラスミンのｐＩ未満しかしプラスミンから分離されるべきタンパク質性物質のｐＩより大きくなるように調節される。いくつかの態様において、該組成物のｐＨは、約５．０ないし約１０．０、具体的に説明すれば約１０、９．９、９．８、９．７、９．６、９．５、９．４、９．３、９．２、９．１、９、８．９、８．８、８．７、８．６、８．５、８．４、８．３、８．２、８．１、８、７．９、７．８、７．７、７．６、７．５、７．４、７．３、７．２、７．１、７、６．９、６．８、６．７、６．６、６．５、６．４、６．３、６．２、６．１、６、５．９、５．８、５．７、５．６、５．５、５．４、５．３、５．２，５．１および５となるように調節される。別の態様において、該組成物のｐＨは約６．５ないし約７となるように調節される。他の態様において、該組成物のｐＨは約７ないし約８となるように調節される。なおさらなる態様において、該組成物のｐＨは約６．５ないし約８となるように調節される。
【０１１１】
多様な態様において、タンパク質性物質はプラスミノーゲンアクチベーター若しくはそのフラグメントである。一態様において、プラスミンを含んでなる組成物は、プラスミノーゲンがプラスミノーゲンアクチベーターにより転化されてプラスミンを形成する活性化溶液である。いくつかの態様において、活性化溶液（その中に形成されたプラスミンを含んでなる）を陰イオン交換体と直接接触させ、該接触の前に該活性化溶液は必要な場合はｐＨ調節される。別の態様において、活性化溶液を交換体と接触させる前に、該活性化溶液は、限定されるものでないが濾過、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび／若しくは疎水性相互作用クロマトグラフィーを挙げることができる１若しくはそれ以上のプラスミン精製工程にかけられる。従って、いくつかの態様において、１若しくはそれ以上のプラスミン精製工程から得られる溶出液若しくは素通り組成物を、必要な場合は該溶出液若しくは素通り組成物の適切なｐＨ調節後に陰イオン交換体と接触させ得る。
【０１１２】
例えば、プラスミンが約９若しくはそれ以上のｐＩを含んでなり、分離されるべき物質が約５のｐＩを有するストレプトキナーゼフラグメント（例えば約１５ｋＤ若しくはそれ未満の分子量を有するフラグメント）である一態様において、該組成物のｐＨを、交換体への該フラグメント（すなわち該物質）（しかしプラスミンでない）の結合を遂げるように約６ないし約８となるように調節し得る。
【０１１３】
別の例として、プラスミンが約７ないし約８のｐＩを含んでなり、分離されるべき物質が約５のｐＩを有するストレプトキナーゼフラグメント（例えば約１５ｋＤ若しくはそれ未満の分子量を有するフラグメント）である他の態様において、該組成物のｐＨは、交換体への該フラグメント（すなわち該物質）（しかしプラスミンでない）の結合を遂げるように約６ないし約７となるように調節し得る。
【０１１４】
いくつかの態様において、該方法はバッチで若しくは連続過程として実施しうる。
【０１１５】
他の態様において、陰イオン交換体から得られる素通り溶液は、その中に含有されるプラスミンのさらなる精製および／若しくはプラスミンを汚染しているかもしれないいかなる病原体の低減も包含するさらなる処理にかけることができる。いくつかの態様において、さらなる精製は、付加的な濾過工程（例えばナノ濾過）ならびに／若しくは限定されるものでないがアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーを挙げることができるクロマトグラフィー工程により遂げられる。
【０１１６】
いくつかの態様において、プラスミンの製造方法は、陰イオン交換条件下で陰イオン交換媒体と活性化溶液を接触させてプラスミンを含んでなる陰イオン交換体の素通り画分を得ることを含んでなり、該陰イオン交換条件は、該イオン交換媒体がプラスミンに関してプラスミノーゲンアクチベーターを選択的若しくは優先的に結合するようである。
【０１１７】
陰イオン交換媒体は、活性化溶液中に存在するプラスミノーゲンアクチベーターを結合する固相であり得る。該陰イオン交換クロマトグラフィー媒体は、陰イオン交換媒体、好ましくは強陰イオン交換体として一般に記述されるクロマトグラフィー媒体の群のいずれからも選択し得る。該媒体は、活性化溶液からのプラスミノーゲンアクチベーターの選択的若しくは優先的捕捉を見込むことができる、それに結合されている化学的構造すなわちリガンドを保有し得る。有用なクロマトグラフィー媒体は、支持体、およびプラスミノーゲンアクチベーターに対する選択的若しくは優先的結合能力を提供する、それに結合されている１種若しくはそれ以上のリガンドを含んでなる。有用な支持体は、具体的に説明する例として、アガロースおよびセルロースのような多糖、ポリアクリルアミド、メチルメタクリレートおよびポリスチレン−ジビニルベンゼンコポリマーのような有機ポリマーを包含する。有機支持体のみが媒体の支持体の使用に適することを意味することを本明細書で意図していないことが認識されるべきである。シリカおよびガラスのような無機支持体素材もまた使用し得るためである。
【０１１８】
いくつかの態様において、陰イオン交換媒体は、全般として球状であり得るビーズの形態にあることができるか、または、あるいは、陰イオン交換媒体は、他の規則的形状若しくは不規則形状を有する微粒子若しくは分割された形態で有用に提供され得る。一態様において媒体は膜の形態にある。該陰イオン交換媒体は多孔質若しくは非多孔質の特徴のものであることができ、また、該媒体は圧縮可能若しくは圧縮不可能であり得る。好ましい陰イオン交換媒体は、ポンプで送ることおよびクロスフロー濾過、ならびに使用される多様な組成物の温度、ｐＨおよび他の局面を包含する精製方法で使用される条件に対し物理的および化学的に回復力があることができる。多様な陰イオン交換媒体、例えば、結合されているリガンドが四級アンモニウム（Ｑ）若しくは四級アミノエチル（ＱＡＥ）であるものが当該技術分野で既知である。
【０１１９】
一態様において、陰イオン交換媒体は支持体に結合されているリガンドを含んでなり、該リガンドは四級アンモニウムであり、該支持体は膜である。例えば、陰イオン交換クロマトグラフィーはＱメンブレン若しくはＱ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭカラム形式で実施し得る。一態様において、陰イオン交換体はＱメンブレンである。
【０１２０】
他の態様において、陰イオン交換媒体は支持体に結合されているリガンドを含んでなり、該リガンドは四級アミン若しくはアンモニウムであり、該支持体は膜である。例えば、陰イオン交換クロマトグラフィーはＱメンブレン若しくはＱ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭカラム形式で実施し得る。一態様において、陰イオン交換体はＱメンブレンである。商業的に入手可能な陰イオン交換膜吸着体は、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（Ｒ）  Ｑ（Ｓａｒｏｒｉｕｓ、ニューヨーク州ボヘミア）、Ｍｕｓｔａｎｇ（Ｒ）  Ｑ  Ｐｏｒｔ（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ニューヨーク州ワシントン）およびＣｈｒｏｍａＳｏｒｂＴＭ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州ビルリカ）を包含する。別の態様において、陰イオン交換体はＳａｒｔｏｂｉｎ（Ｒ）  ＭＡ  ５Ｑメンブレンである。
【０１２１】
他の態様において、陰イオン交換体から得られる素通り溶液は、該陰イオン交換体と接触する前に該組成物中に存在したものの量未満であるプラスミノーゲンアクチベーター若しくはそのフラグメントの量を含んでなる。一態様において、生じるプラスミン組成物はプラスミンのｐＩ未満のｐＩを有するタンパク質性物質を実質的に含まない。
【０１２２】
いくつかの態様において、陰イオン交換体の素通り溶液中に存在するプラスミンは、典型的に最低約５０％（重量）、具体的に説明すれば最低約５０％、６０％、７０％、８０％。９０％、９５％、９９％若しくはそれ以上の純度を有することができる。
【０１２３】
他の態様において、陰イオン交換体の素通り溶液はタンパク質性物質を実質的に含まず、該タンパク質性物質を実質的に含まないは、ウエスタンブロットによる検出の限界より下であるタンパク質性物質のレベルを特徴とする。
【０１２４】
別の態様において、ストレプトキナーゼフラグメントの最低約５０％、具体的に説明すれば最低約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％若しくはそれ以上が、陰イオン交換体に負荷されるプラスミン含有組成物から除去され、それにより該フラグメントを実質的に含まない生じるプラスミン組成物を提供する。いくつかの態様において、該ストレプトキナーゼフラグメントは約１５ｋＤ若しくはそれ未満という分子量（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定されるところの）を有する。
【０１２５】
一態様において、陰イオン交換体からの素通り画分は例えば酸性のｐＨ（例えば約３．４）にｐＨ調節し得る。いくつかの態様において、プラスミンを含んでなるこのｐＨ調節された素通り画分はその後限外濾過／ダイアフィルトレーションにより濃縮かつ／若しくはダイアフィルトレーションし得る。
【０１２６】
別の例として、陰イオン交換素通り画分は水で透析しかつ氷酢酸で酸性化し得る。いくつかの態様において、製薬学的に許容できる酸性化された担体を提供する（例えば低緩衝能力緩衝剤を有しかつ約２．５ないし約４．０の間のｐＨを有する）いかなる酸も使用し得る。例えば、約２．５ないし約４．０の製薬学的に許容できる担体中のｐＨを維持することができる、単独若しくはそれらのいずれかの組合せのいずれかの、限定されるものでないがギ酸、酢酸、クエン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、安息香酸、セリン、トレオニン、バリン、グリシン、グルタミン、イソロイシン、β−アラニンおよびそれらの誘導体を挙げることができる、限定されるものでないが無機酸、カルボン酸、脂肪族酸およびアミノ酸を挙げることができる他の酸およびアミノ酸の使用もまた本発明の範囲内で企図している。
【０１２７】
Ｃ．アフィニティークロマトグラフィー
プラスミンを含んでなるプラスミン組成物は、組成物中に含有されるプラスミンを結合するアフィニティー媒体を使用するアフィニティークロマトグラフィーにより精製し得る。例えば、いくつかの態様において、陰イオン交換体の素通り画分を、該素通り画分に含有されるプラスミンを結合するのに十分な第二のアフィニティー条件下で第二のアフィニティー媒体と接触させる。特定の態様において、該第二のアフィニティー条件は、該アフィニティー媒体が、存在しうるプラスミノーゲンアクチベーターに関してプラスミンを選択的若しくは優先的に結合するようである。
【０１２８】
該第二のアフィニティー媒体はプラスミンを結合する固相であり得る。該第二のアフィニティークロマトグラフィー媒体は、第二のアフィニティー媒体として一般に記述されるクロマトグラフィー媒体の群のいずれからも選択し得る。該媒体は、活性化溶液からのプラスミノーゲンアクチベーターの選択的若しくは優先的捕捉を見込むことができる、それに結合されている化学的構造すなわちリガンドを保有し得る。有用なクロマトグラフィー媒体は、支持体、および、プラスミノーゲンアクチベーターに対する選択的若しくは優先的結合能力を提供する、それに結合されている１種若しくはそれ以上のリガンドを含んでなる。有用な支持体は、具体的に説明する例として、アガロースおよびセルロースのような多糖、ポリアクリルアミド、メチルメタクリレートおよびポリスチレン−ジビニルベンゼンコポリマーのような有機ポリマーを包含する。有機支持体のみが媒体の支持体の使用に適していることを意味することを本明細書で意図していないことが認識されるべきである。シリカおよびガラスのような無機支持体素材もまた使用し得るためである。
【０１２９】
いくつかの態様において、第二のアフィニティー媒体は、全般として球状であり得るビーズの形態にあることができるか、または、あるいは、該第二のアフィニティー媒体は、他の規則的形状若しくは不規則形状を有する微粒子若しくは分割された形態で有用に提供され得る。一態様において該媒体は膜の形態にある。該第二のアフィニティー媒体は多孔質若しくは非多孔質の特徴のものであることができ、また、該媒体は圧縮可能若しくは圧縮不可能であり得る。好ましい第二のアフィニティー媒体は、ポンプで送ることおよびクロスフロー濾過、ならびに使用される多様な組成物の温度、ｐＨおよび他の局面を包含する該精製方法で使用される条件に対し物理的および化学的に回復力があることができる。
多様な第二のアフィニティー媒体、例えば、結合されているリガンドがベンズアミジンであるものが当該技術分野で既知である。
【０１３０】
一態様において、該第二のアフィニティー媒体は支持体に結合されているリガンドを含んでなり、該リガンドはベンズアミジンであり、該支持体はアガロースである。例えば、本発明の第二のアフィニティークロマトグラフィーは、ベンズアミジン−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭカラム形式で実施し得る。形成されるプラスミンはセリンプロテアーゼであるため、他の態様において、ベンズアミジンと類似の特性を有する他のアフィニティー型媒体（例えばセリンプロテアーゼ吸着媒素材）もまた使用し得る。
【０１３１】
例えば、他の態様において、切断されたプラスミノーゲンから得られたプラスミンを、該溶液をベンズアミジン−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭカラムに適用する前に中性のｐＨで数日間の該溶液の安定性を見込む１種若しくはそれ以上の試薬（例えばアミノ酸、塩化ナトリウム、グリセロール）を含んでなる溶液に含有し得る。該素通り画分プールは、活性化されていないプラスミノーゲンおよびプラスミンの不活性自己分解生成物の双方を含有し得る。
【０１３２】
アフィニティー媒体により結合されているプラスミンは酸性緩衝液若しくは実質的に中性のｐＨ添加剤溶液（ｐＨ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で溶出し得る。例えば、ベンズアミジン−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ｒ）に結合されたプラスミンはグリシン緩衝液のような酸性緩衝液で溶出し得る。結合されたプラスミンを溶出するのに実質的に中性のｐＨ添加剤溶液を使用する場合、最終的な溶出されるプラスミン溶液は分解されたプラスミンを実質的に含まないことができる。典型的に、実質的に中性のｐＨ添加剤溶液は約６．５ないし約８．５の間の値のｐＨを有する。しかしながら、溶液のｐＨは約２．５から約９．０までの範囲にわたり得る。特定の態様において、ｐＨは約３．０から約７．５までであり得る。他の態様においてｐＨは約６．０であり得る。添加剤の例は、リシン、ε−アミノカプロン酸、トラネキサム酸、ポリリシン、アルギニンを包含するω−アミノ酸ならびにそれらのアナログおよび組合せ、塩化ナトリウムのような塩、ならびにベンズアミジンのような活性部位阻害剤を包含する。
【０１３３】
塩の適切な濃度は約５ｍＳ／ｃｍから約１００ｍＳ／ｃｍまでの伝導率により表し得る。一般に、塩濃度は酸性度に関していくぶん逆に変動し得、すなわちより低いｐＨの溶液はより低い塩とともに良好に機能し得、また、より高いｐＨ（上で論考された範囲内）を有する溶液はより高い塩濃度とともに良好に機能し得る。塩が塩化ナトリウムである場合、該濃度は約５０ｍＭから約１０００ｍＭまで、若しくは約１００ｍＭから約２００ｍＭまでであり得る。溶液が約ｐＨ６．０である場合に塩化ナトリウムの濃度は約１５０ｍＭであり得る。従って、いくつかの態様において、組換えプラスミノーゲンの活性化の完了に際して、プラスミン組成物を濾過し得、そしてベンズアミジン−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭクロマトグラフィーの前に、ω−アミノ酸および塩化ナトリウムのような添加剤の添加により中性のｐＨで数日間さらに安定化し得る。
【０１３４】
いくつかの態様において、溶出されたプラスミンを低ｐＨの低緩衝能力剤で緩衝し得る。低ｐＨの低緩衝能力剤は、典型的に、アミノ酸、最低１種のアミノ酸の誘導体、最低１種のアミノ酸を包含するオリゴペプチド若しくは上の組合せのいずれかの緩衝液を含んでなる。加えて、低ｐＨの低緩衝能力剤は、酢酸、クエン酸、塩酸、カルボン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、安息香酸、セリン、トレオニン、メチオニン、グルタミン、アラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、アラニン、アスパラギン酸、それらの誘導体若しくは組合せから選択される緩衝剤を含み得る。該緩衝剤は、酸性化されたプラスミンの容量の約４ないし５倍を超えない量で組成物に血清を添加することにより酸性化されたプラスミンのｐＨを中性のｐＨに上げることができるような濃度で存在し得る。
【０１３５】
他の態様において、緩衝溶液中のプラスミンの濃度は約０．０１ｍｇ／ｍｌから約５０ｍｇ／ｍｌ全溶液までの範囲にわたり得る。緩衝剤の濃度は約１ｎＭから約５０ｍＭまでの範囲にわたり得る。もちろん、これらの範囲は、選ばれた緩衝剤に、または添加物若しくは安定剤のような他の試薬の添加に依存して広め若しくは狭めてよい。添加される緩衝剤の量は、典型的に、酸性化されたプラスミン溶液に約２．５ないし約４の間のｐＨを有させることができるものである。
【０１３６】
酸性化されたプラスミン溶液は、多価アルコール、製薬学的に許容できる炭水化物、塩、グルコサミン、チアミン、ナイアシンアミド若しくはそれらの組合せのような安定剤の添加によりさらに安定化しうる。安定剤は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウムおよびそれらの組合せよりなる群から選択し得る。ブドウ糖、麦芽糖、マンニトール、ソルビトール、ショ糖、乳糖、トレハロースおよびそれらの組合せのような糖若しくは糖アルコールもまた添加しうる。
【０１３７】
酸性化されたプラスミン溶液を安定化するために添加される炭水化物の濃度は約０．２ｗ／ｖ％から約２０ｗ／ｖ％までの範囲を包含する。塩、グルコサミン、チアミン、ナイアシンアミドおよびそれらの組合せの範囲は約０．０１Ｍから約１Ｍまでの範囲にわたり得る。
【０１３８】
緩衝された酸性化された水中で本発明に従って処方されたプラスミンは極めて安定であることが見出されている。それは、活性の実質的喪失またはタンパク質分解性若しくは酸性の性質の分解生成物の出現を伴わずにこの形態で数か月間保つことができる。４℃でプラスミンは最低９か月間安定である。室温ででさえプラスミンは最低２か月間安定である。室温での長期安定性は、この製剤が血栓溶解性投与の長期投与計画と適合性であることを可能にし得る。例えば、組織プラスミノーゲンアクチベーター若しくはウロキナーゼのような血栓溶解剤の３６時間投与は末梢動脈閉塞の処置で一般的である。
【０１３９】
好ましい一態様において、酸性化されたプラスミン溶液に含有されるプラスミンは可逆的に不活性のプラスミンである。緩衝された酸性化されたプラスミンの生理学的ｐＨへの移行に際して完全に活性になる能力は、カゼイン分解アッセイおよびまたＩ１２５−フィブリン標識凝血塊溶解アッセイでのその活性により明示される。これらのアッセイの双方はｐＨ７．４で実施し得、また、ｐＨの変化および等電点（ｐＨ９．３および９．５）の通過の間の組換えプラスミン活性の完全な回収が存在し得る。これは、組換えプラスミンが低緩衝能力溶媒中で処方されており、また、緩衝溶液（例えばＰＢＳ、血漿）に添加される場合にそれが中性のｐＨを即座に受け入れることができかつ等電点の遅い通過と通常同時に起こる沈殿が起こらないからである。
【０１４０】
Ｄ．疎水性相互作用クロマトグラフィー
いくつかの態様において、プラスミンの製造方法は疎水性相互作用クロマトグラフィーをさらに含み得る。一態様において、疎水性クロマトグラフィーは任意である。他の態様において、該プラスミンの製造方法は、疎水性相互作用クロマトグラフィー媒体がプラスミンに関してプラスミノーゲンアクチベーターを優先的に結合するような十分な疎水性相互作用条件下で、プラスミンを含んでなる第二のアフィニティー媒体溶出液を疎水性相互作用クロマトグラフィー媒体と接触させることを含んでなる。特定の態様において、疎水性相互作用条件は、該疎水性相互作用媒体が、存在する場合はプラスミンに関してプラスミノーゲンアクチベーターを選択的若しくは優先的に結合するようである。
【０１４１】
疎水性相互作用媒体はプラスミンを結合する固相であり得る。該疎水性相互作用クロマトグラフィー媒体は、疎水性相互作用媒体として一般に記述されるクロマトグラフィー媒体の群のいずれからも選択し得る。該媒体は、プラスミノーゲンアクチベーターの選択的若しくは優先的捕捉を見込むことができる、それに結合されている化学的構造すなわちリガンドを保有し得る。有用なクロマトグラフィー媒体は、支持体、およびプラスミノーゲンアクチベーターに対する選択的若しくは優先的結合能力を提供する、それに結合されている１種若しくはそれ以上のリガンドを含んでなる。有用な支持体は、具体的に説明する例として、アガロースおよびセルロースのような多糖、ポリアクリルアミド、メチルメタクリレートおよびポリスチレン−ジビニルベンゼンコポリマーのような有機ポリマーを包含する。有機支持体のみが媒体の支持体の使用に適することを意味することを本明細書で意図していないことが認識されるべきである。シリカおよびガラスのような無機支持体素材もまた使用し得るためである。
【０１４２】
いくつかの態様において、疎水性相互作用媒体は、全般として球状であり得るビーズの形態にあることができるか、または、あるいは、第二のアフィニティー媒体は、他の規則的形状若しくは不規則形状を有する微粒子若しくは分割された形態で有用に提供され得る。一態様において該媒体は膜の形態にある。該疎水性相互作用媒体は多孔質若しくは非多孔質の特徴のものであることができ、また、該媒体は圧縮可能若しくは圧縮不可能であり得る。好ましい疎水性相互作用媒体は、精製方法で使用される条件に対し物理的および化学的に回復力があることができる。多様な疎水性相互作用媒体、例えば、結合されているリガンドがオクチル、フェニル若しくはブチル部分であるものが当該技術分野で既知である。
【０１４３】
一態様において、疎水性相互作用媒体は支持体に結合されているリガンドを含んでなり、該リガンドはオクチル部分であり、該支持体はアガロースである。例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィーはオクチル−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭカラム形式で実施し得る。
特定の態様において、プラスミンを含んでなる組成物を硫酸アンモニウム中で約０．１Ｍに調製し、そして例えばオクチル−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭのような樹脂を使用するカラム形式の疎水性相互作用クロマトグラフィーにかける。
【０１４４】
一態様において、プラスミンを含んでなるオクチル−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭの素通り画分をナノ濾過にかけることができる。例えば、該素通り画分を０．１ミクロンフィルターカプセルでの前濾過にかけることができ、そしてその後例えばＡＳＡＨＩ  ＮＦ（ノーマルフロー）１．０ｍ２  １５Ｎメンブレン（ＰＬＡＮＯＶＡフィルター、Ａｓａｈｉ  Ｋａｓｅｉ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．、イリノイ州バッファローグローブ）を使用するナノ濾過にかけることができる。オクチル疎水性相互作用クロマトグラフィー後の該方法のさらに下流でナノ濾過を実施することは、より純粋な供給流によりスループットおよび膜の流れ特性を改良し得る。いくつかの態様において、疎水性相互作用クロマトグラフィー後のナノ濾過の工程は任意である。
【０１４５】
ＩＩＩ．治療薬およびキット
他の局面において、プラスミノーゲンおよび／若しくはそれから製造されるプラスミンは、例えば、米国特許第６，９６４，７６４号明細書；およびＮｏｖｏｋｈａｔｎｙ，Ｖ．ら、Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．１（５）：１０３４−４１（２００３）（双方とも引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述される方法に従った治療的使用のため処方し得る。例えば、低ｐＨ（約２．５から約４まで）の低緩衝能力の緩衝剤を本発明に従って製造されるプラスミンの製剤に使用し得る。いくつかの態様において、プラスミノーゲンおよび／若しくはそれから製造されるプラスミンを使用して、例えば、米国特許第６，３５５，２４３号明細書および同第６，９６９，５１５号明細書（それぞれ、処置方法のその教示のために引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されるところの方法に従って、多様な血栓性疾患若しくは状態を処置し得る。加えて、プラスミン、ミニプラスミンおよび／若しくはマイクロプラスミンで実践されるところの当業者に既知の他の方法および製剤を使用して、本発明のプラスミノーゲンおよび／若しくはそれから製造されるプラスミンを治療的投与のため処方し得る。
【０１４６】
なおさらなる局面において、本発明は、本明細書に記述される組換えプラスミノーゲンおよび／若しくはそれから製造されるプラスミンを含んでなるキットを提供する。こうしたキットは一般に、１個若しくはそれ以上の別個の区画中にプラスミノーゲンおよび／若しくはそれから製造されるプラスミンの製薬学的に許容できる製剤を含み得る。該キットは他の製薬学的に許容できる製剤もまたさらに含み得る。該キットは単一容器を有し得るか、若しくはそれらは各所望の成分について個別の容器を有してもよい。組換えプラスミノーゲンおよび／若しくはそれに由来するプラスミンを製造するのに必要な試薬、例えば、限定されるものでないが発現ベクター、該発現ベクターを含んでなる組換え宿主細胞およびプラスミノーゲンアクチベーターを挙げることができる試薬を含んでなるキットもまた企図している。さらに、該キットの成分は１種若しくはそれ以上の液体溶液で提供され、該液体溶液は水性溶液であり、無菌水性溶液がとりわけ好ましい。しかしながら、該キットの成分は乾燥された粉末（１種若しくは複数）として提供してもよい。試薬若しくは成分が乾燥粉末として提供される場合、該粉末は適する溶媒の添加により再構成し得る。
該溶媒もまた提供されうることが予見される。
【０１４７】
以下の実施例は本方法を具体的に説明するためにのみ示され、かつ、本発明を制限するために示されない。当業者は、示される実施例は特許請求されるものを具体的に説明するのみであること、および本発明は付随する請求の範囲によってのみ範囲が制限されることを認識するであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１４８】
【図１】組換えプラスミノーゲンのアミノ酸配列の一態様（配列番号１）を示す。
【図２】−１９ないし−１と番号付けられた１９残基のリーダー配列、および残基１−７９１として示されるプラスミノーゲン配列を示す、ヒトプラスミノーゲンのアミノ酸配列（配列番号２）を示す。以下、すなわち組換えプラスミノーゲンのアミノ酸配列の一態様（影を付けられた領域は配列番号１に示されるところのアミノ酸配列に対応する）；クリングルドメイン１〜５（二重下線）；グリコシル化部位Ａｓｎ２８９およびＴｈｒ３４６（太字）；Ａｒｇ−Ｖａｌ活性化部位（太字のＲ５６１Ｖ５６２）；ならびにクリングル１中のリシン結合部位（下線および特定の位置番号付けを伴う）を包含する多数の特徴が示される。
【図３】天然のヒトプラスミン（プラスミノーゲン）の５個のクリングルドメイン（１〜５）間のポリペプチド配列比較（すなわちギャップアライメント）を示す。クリングル１中の同一の相対位置のものに同一であるアミノ酸残基を下線で示す。
【図４】精製中間体のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）ゲルを示す。サンプルを還元条件下で４〜１２％ポリアクリルアミドゲル上で泳動し、そしてクマシーブルーＲ−３５０色素で染色した。ゲルレーン２〜９はそれぞれ３．５μｇの総タンパク質量を負荷した。レーン１および１０、分子量マーカー；レーン２、可溶化された封入体；レーン３、再度折りたたまれた組換えプラスミノーゲン；レーン４、ＳＰ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭ溶出液；レーン５、ＥＣＨ−Ｌｙｓｉｎｅ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭ溶出液；レーン６、プラスミン；レーン７、Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭ負荷液（ｌｏａｄ）；レーン８、Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭ溶出液；レーン９、最終製剤プラスミン。ゲルの右への矢印はプラスミンの自己溶解産物を示す。
【図５】精製された組換えプラスミンのサイズ排除分析を示す。精製された組換えプラスミンの３調製物の溶出プロファイル（Ａ２８０）を該図に重ねる。単量体プラスミンは、各分析の間にカラムから溶出される吸光度の９８．３±０．１％を構成した。溶出される吸光度の残部（１．７±０．１％）は主ピークの前に溶出された。
【図６】初期可溶性総タンパク質（Ａ２８０）、ならびに固体ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の示される濃度までの添加および形成される沈殿物の遠心分離による除去後に溶液中に残存する組換えプラスミノーゲン活性のパーセンテージを示すグラフである。
【図７】初期可溶性総タンパク質（Ａ２８０）、ならびに固体硫酸アンモニウムの示される濃度までの添加および形成される沈殿物の遠心分離による除去後に溶液中に残存する組換えプラスミノーゲン活性のパーセンテージを示すグラフである。
【図８】硫酸アンモニウム沈殿した再折りたたみ物（ｒｅｆｏｌｄ）からの組換えプラスミノーゲン（ＴＡＬ６００３Ｚ）の直接捕捉を示す、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）樹脂スクリーニング実験のクロマトグラム（Ａ２８０吸光度の追跡）のオーバーレイである。各分析の溶出期の開始が黒矢印により示され、そして画分収集の開始と一致している。
【図９】ＳＤＳ−ＰＡＧＥである。
【０１４９】
実施例
【実施例１】
【０１５０】
組換えプラスミノーゲンの製造
配列番号１に示される組換えプラスミノーゲンポリペプチドをコードするＤＮＡ（図２に示される影を付けられたアミノ酸配列もまた参照されたい）を含んでなる発現ベクターを、ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホヤ）、ＢＬ２１（ＤＥ３）（遺伝子型：Ｆ−ｏｍｐＴ  ｈｓｄＳＢ（ｒＢ−ｍＢ−）ｇａｌ  ｄｃｍ（ＤＥ３））（ＥＭＢ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴ）およびＢＬＲ（ＤＥ３）（遺伝子型：Ｆ−ｏｍｐＴ  ｈｓｄＳＢ（ｒＢ−ｍＢ−）ｇａｌ  ｄｃｍ（ＤＥ３）Δ（ｓｒｌ−ｒｅｃＡ）３０６：：Ｔｎ１０（ＴｅｔＲ））を包含する多様な細胞に形質転換し、そして１ｍＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）による誘導後のタンパク質過剰発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。発現推定値は振とうフラスコ中細胞培養物１Ｌあたり最低約２５０ｍｇであった。
【０１５１】
細胞型ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬを、Ａｒｇ、ＩｌｅおよびＬｅｕをコードする希な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｔＲＮＡを発現するよう工作する。さらに、ＢＬ２１（ＤＥ３）およびＢＬＲ（ＤＥ３）は、病原性およびコロニー形成因子の非存在に基づきヒトおよび動物に対し非病原性と分類されているＢ株大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。ＢＬＲ（ＤＥ３）細胞はＤＮＡ組換えのためのｒｅｃＡ遺伝子を欠いており、また、λファージの導入はこれらの細胞を用いて報告されていない。ＢＬＲ（ＤＥ３）細胞中の組換えプラスミノーゲン構築物の研究細胞バンクを製造し、そしてＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ペンシルバニア州マルバーン）でバクテリオファージの純度、同一性および誘導について試験した。該試験は該研究細胞バンクの同一性および純度を確認し、また、該細胞はファージ誘導試験に合格しファージは観察されなかった（データは示されない）。
【０１５２】
組換えプラスミノーゲン（すなわち配列番号１に基づく）の産生が、細胞を溶解しかつ可溶性タンパク質および精製された封入体の双方をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検査した、より大スケールの発現で確認された。
【０１５３】
以下の典型的プロトコルを組換えプラスミノーゲンの発現に使用した。すなわち、
組換えプラスミノーゲンベクターを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞（例えばＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬ、ＢＬ２１（ＤＥ３）若しくはＢＬＲ（ＤＥ３））の単一コロニーを使用して５ｍｌのＬＢ／カナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）に接種し、そして振とう機上３７℃で８時間インキュベートした。それの後に、新鮮培地中でのさらなる増殖のため５０μｌアリコートを培養細菌懸濁液から採取した。６ｍｌの細菌培養物および２５０ｍｌの培地を用いて該手順を１６時間後に反復した。培養物を約１．０のＯＤ６００ｎｍまで３７℃で振とうしながら増殖させ、そしてＩＰＴＧを１ｍＭ最終濃度まで添加した。培養物を追加の５時間増殖させた。細胞を５，０００×ｇの遠心分離により収集し、そして細胞ペレットを２０ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する２０ｍＭトリスｐＨ８．０に溶解しかつ−８０℃で凍結させた。
【０１５４】
組換えプラスミノーゲンを精製するため、細胞ペレットを融解しかつ溶液の容量が元の細胞培養物容量のもののおよそ１／２０になるまで緩衝液を添加した。その後、リゾチームを０．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで添加し、そして細胞を４℃で１０〜１５分間急速に攪拌した。その後、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を１％最終濃度まで添加し、そして攪拌を別の１０分間継続した。ＤＮＡアーゼＩ（０．０５ｍｇ／ｍｌ）およびＭｇＣｌ２（２．５ｍＭ）を添加し、そして４℃で３０分間若しくは溶液がもはや粘性でなくなるまで攪拌を継続した。最終溶液を４℃で１５，０００×ｇで３０分間遠心分離しかつ上清を廃棄した。細胞ペレットを洗浄溶液（１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００および０．５Ｍ尿素を含有する５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）で３回洗浄した。
【０１５５】
組換えプラスミノーゲンは図１に示されるアミノ酸配列を含んでなる。該組換えプラスミノーゲンの一次構造はＭｅｔ６９で開始し、そして位置１６０〜１６２（ヒトプラスミノーゲン番号付け体系）のＩＬＥの代わりにリンカー配列ＶＰＱを有し；後者の変化は、天然のクリングル５セリンプロテアーゼ配列のものに同一のセリンプロテアーゼドメインに該クリングルを結合するリンカー領域を作成するため組み込んだ。組換えプラスミノーゲンのＮ末端配列は、ＳＫによる活性化および活性化前ペプチドの切断後にＬｙｓ７８およびＶａｌ７９のＮ末端を生じる。１００Ｌの培養物から単離される封入体の平均収量は２．１７±０．６３ｋｇ（ｎ＝３）であり、これはおよそ２０重量％の組換えプラスミノーゲンタンパク質を含有した。
【実施例２】
【０１５６】
プラスミノーゲンの可溶化および再折りたたみ
破砕し凍結させた封入体（２６ｇ）を４８０ｍｌの冷可溶化緩衝液（７Ｍ尿素、１０ｍＭ還元型グルタチオン、１０ｍＭトリス、０．２５Ｍアルギニン、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）に添加し、そしてこの懸濁液を６℃で４時間活発に攪拌した。可溶化された封入体のこの溶液をその後冷再折りたたみ緩衝液（０．５Ｍ尿素、還元型および酸化型グルタチオンそれぞれ１．０ｍＭ、０．５Ｍアルギニン、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ、５．０ｍＭ  ε−ＡＣＡ、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０）で１：２０に希釈しかつ低温で１７時間攪拌した。この再折りたたみ環境中の組換えプラスミノーゲン濃度はおよそ０．５ｍｇ／ｍｌであった。
【０１５７】
可溶化された封入体を還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し；クマシーブルー染色ゲルの濃度測定分析に基づき総タンパク質量のおよそ７０％が組換えプラスミノーゲンであると推定された（図４、レーン２）。従って、封入体中の発現された組換えプラスミノーゲンの堆積物はこの方法の初めに比較的純粋な標的タンパク質を提供した。
【０１５８】
再折りたたみ手順を約０．５ｇ／Ｌのタンパク質濃度で実施した。封入体からの可溶化／還元された組換えプラスミノーゲンは、希釈再折りたたみにより、０．３４の比活性を有する触媒的に活性なタンパク質（化学量論的ＳＫの存在下で決定される）に酸化的に再度折りたたまれ；これは再折りたたみ工程について（総タンパク質量に関して）３４％の推定収率に対応する。封入体中に存在する組換えプラスミノーゲンタンパク質の含量にのみ基づいて再折りたたみ収率を正規化する場合、それはおよそ４８％に増大する。
【実施例３】
【０１５９】
濾過／ダイアフィルトレーション
実施例２の再折りたたみ混合物を、０．０５４ｍ２のＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ  Ｐｏｄ＋  Ａ１ＨＣデプスフィルターを通過させることにより澄明化した。この濾液を０．０１ｍ２のＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＳＨＣ  Ｏｐｔｉｃａｐ  ＸＬ  １５０フィルター（０．５／０．２μｍ）を通してさらに濾過した。この後者の濾液のダイアフィルトレーションは、２個の０．１１ｍ２の３０ｋＤａ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｋｖｉｃｋカセットを用いて実施した。ダイアフィルトレーション緩衝液は１０ｍＭトリス、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ、５．０ｍＭ  ε−ＡＣＡ、５０ｍＭ尿素、ｐＨ９．０であった。３７と４０Ｌの間の緩衝液交換が１〜２ｍＳ／ｃｍという標的伝導率に達するのに必要であった。
【０１６０】
再折りたたみ混合物を最初にデプスフィルターを通過させてタンパク質の微粒子凝集体を除去し、そしてその後ダイアフィルトレーションした。クロマトグラフィー前のその後の濾過は下流の陽イオン交換クロマトグラフィーの汚れに対し保護するために行った。これら３種の連続した濾過／ダイアフィルトレーション／濾過工程全体の組換えプラスミノーゲン活性の回収はおよそ８１％であった。
【実施例４】
【０１６１】
ポリエチレン（ＰＥＧ）沈殿
固体ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を、酸化的再折りたたみ後に存在しうる凝集されたタンパク質を沈殿させるため、組換えプラスミノーゲンの再折りたたみ組成物（０．５Ｍアルギニンおよび０．８５Ｍ尿素を含んでなる透析されていない再折りたたみ組成物）に添加した。
【０１６２】
５、１０、１５若しくは２０％（ｗ／ｖ）のＰＥＧの最終濃度を達成するように、固体ＰＥＧの量を再折りたたみ混合物の冷（５℃）５０ｍｌ部分に活発な攪拌を伴い添加した。攪拌を６０分間継続してＰＥＧの完全な可溶化を確保した。これらのサンプルならびにＰＥＧを添加していない元の再折りたたみ混合物のサンプルを１６，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して、生じたいかなる沈殿物もペレットにした。澄明な上清を収集し、そして総タンパク質含量（Ａ２８０の測定により）および活性組換えプラスミノーゲンの含量（ＳＫ活性化アッセイ、ＤｉａＰｈａｒｍａ、オハイオ州ウエストチェスターにより）について評価し、また、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）により分析した。結果を表１および図６に要約し、そして、ＰＥＧの添加が（ｉ．）活性組換えプラスミノーゲンでなかったタンパク質の比較的選択的な沈殿；（ｉｉ．）可溶性のままであった組換えプラスミノーゲンの比活性の結果として生じる増加；および（ｉｉｉ．）凝集されたタンパク質の排除をもたらしたことを示す。これらの結果は、透析されていない再折りたたみ混合物へのＰＥＧの添加が（活性組換えプラスミノーゲンでなかった）若干のタンパク質の沈殿を引き起こし、また、溶液中の活性のＳＫ活性組換えプラスミノーゲンのほとんどを保存したことを示す。さらに、ＳＥＣ−ＨＰＬＣは、透析されていない再折りたたみ混合物へのＰＥＧの添加が、凝集されたタンパク質の進行性の減少およびＰＥＧ上清中の単量体の組換えプラスミノーゲンの対応する増加をもたらしたことを示した。該結果は、ＰＥＧが、誤って再折りたたみ若しくは凝集された組換えプラスミノーゲンをいくぶん選択的に沈殿させ、そしてそれによりＰＥＧ上清中の正しく再度折りたたまれた組換えプラスミノーゲンを濃縮したことを示す。この透析されていない再折りたたみ混合物中のＳＫ活性組換えプラスミノーゲンの比活性は２０％ＰＥＧ上清中で０．３３から０．５３に増加した。該結果は、ＰＥＧ沈殿が、クロマトグラフィー若しくはＳＫ活性化工程前の再折りたたみ混合物中に存在するＳＫ不活性組換えプラスミノーゲンの少なくとも一部分の実現可能な選択的排除方法であることを示した。
【０１６３】
【表１】
0006045642.tif 000002
【実施例５】
【０１６４】
硫酸アンモニウム沈殿
固体硫酸アンモニウムを、酸化的再折りたたみ後に存在しうる凝集されたタンパク質を沈殿させるため、組換えプラスミノーゲンの再折りたたみ組成物（０．５Ｍアルギニンおよび０．８５Ｍ尿素を含んでなる透析されていない再折りたたみ組成物）に添加した。
【０１６５】
固体硫酸アンモニウムを、それぞれ１０、２０、３０若しくは４０％飽和に対応する硫酸アンモニウムの最終濃度を達成するように、再折りたたみ混合物の冷（５℃）５０ｍｌ部分に活発な攪拌を伴い添加した。攪拌を６０分間継続して硫酸アンモニウムの完全な可溶化を確保した。これらのサンプルならびに硫酸アンモニウムを添加していなかった元の再折りたたみ混合物のサンプルを１６，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して、生じたいかなる沈殿物もペレットにした。澄明な上清を収集し、そして総タンパク質含量（Ａ２８０の測定により）および活性組換えプラスミノーゲンの含量（ＳＫ活性化アッセイ、ＤｉａＰｈａｒｍａ、オハイオ州ウエストチェスターにより）について評価し、また、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）により分析した。該結果を表２および図７に要約し、そして、硫酸アンモニウムの添加が（ｉ．）活性組換えプラスミノーゲンでなかったタンパク質の比較的選択的な沈殿；（ｉｉ．）可溶性のままであった組換えプラスミノーゲンの比活性の結果として生じる増加；および（ｉｉｉ．）凝集されたタンパク質の排除をもたらしたことを示す。これらの結果は、透析されていない再折りたたみ混合物へのアンモニウムの添加が（活性組換えプラスミノーゲンでなかった）若干のタンパク質の沈殿を引き起こし、また、溶液中の活性のＳＫ活性組換えプラスミノーゲンのほとんどを保存したことを示す。さらに、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）は、透析されていない再折りたたみ混合物へのアンモニウムの添加が、凝集されたタンパク質の進行性の減少および硫酸アンモニウム上清中の単量体の組換えプラスミノーゲンの対応する増加をもたらしたことを示した。該結果は、硫酸アンモニウムが、誤って再折りたたみ若しくは凝集された組換えプラスミノーゲンをいくぶん選択的に沈殿させ、そしてそれにより硫酸アンモニウム上清中の正しく再度折りたたまれた組換えプラスミノーゲンを濃縮したことを示す。この透析されていない再折りたたみ混合物中のＳＫ活性組換えプラスミノーゲンの比活性は、３０％飽和硫酸アンモニウム上清中で０．３３から０．４８に増加し；より多量の硫酸アンモニウムの添加はＳＫ活性組換えプラスミノーゲンのかなりの沈殿を引き起こすという明らかな影響を有した。該結果は、硫酸アンモニウム沈殿が、クロマトグラフィー若しくはＳＫ活性化工程前の再折りたたみ混合物中に存在するＳＫ不活性組換えプラスミノーゲンの少なくとも一部分の実現可能な選択的排除方法であることを示した。
【０１６６】
【表２】
0006045642.tif 000003
【実施例６】
【０１６７】
硫酸アンモニウム沈殿後の疎水性相互作用クロマトグラフィー
固体（ＮＨ４）２ＳＯ４を、組換えプラスミノーゲンを含有する再折りたたみ組成物（ｐＨ８．０）に１Ｍまで添加した。形成された沈殿物を濾過（０．４５μｍ）により除去し、そして濾過後溶液を以下の疎水性相互作用クロマトグラフィー媒体、すなわち
分析１。ＨｉＴｒａｐＴＭフェニルセファロースＦＦ：負荷：２５ｍｌ（Ａ２８０；０．８３９）；素通り画分（ＦＴ）／洗浄液：４９．４ｇ（Ａ２８０：０．２６６）；溶出液：画分を含む９６ウェルプレート。
分析２。ＨｉＴｒａｐＴＭオクチルセファロースＦＦ：負荷：２５ｍｌ（Ａ２８０；０．８３９）；素通り画分（ＦＴ）／洗浄液：４９．６ｇ（Ａ２８０：０．４０７）；溶出液：画分を含む９６ウェルプレート。この分析はいかなる現実の溶出物ピークも示さなかった。
分析３。ＨｉＴｒａｐＴＭブチルセファロースＦＦ：負荷：２５ｍｌ（Ａ２８０；０．８３９）；素通り画分（ＦＴ）／洗浄液：４９．０５ｇ（Ａ２８０：０．２１５）；溶出液：画分を含む９６ウェルプレート。
分析４。ＨｉＴｒａｐＴＭフェニルセファロースＨＰ：負荷：２５ｍｌ（Ａ２８０；０．８３９）；素通り画分（ＦＴ）／洗浄液：４９．０１ｇ（Ａ２８０：０．１８３）；溶出液：画分を含む９６ウェルプレート。
と接触させた。
【０１６８】
クロマトグラフィー：緩衝液Ａ：２５ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、および１Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４；ならびに緩衝液Ｂ：２５ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０および１ｍＭ  ＥＤＴＡ（１ｍｌ／分で４０ＣＶで１００−０％逆勾配）。画分を１ｍｌスケールで収集した。
【０１６９】
分析からの以下の画分を１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ９．０および１ｍＭ  ＥＤＴＡに対し４℃で最低２日間の透析にかけた。すなわち、画分１−フェニルセファロースＦＦ（Ｂ１−Ｂ１１）；画分２−フェニルセファロースＦＦ（Ｂ１２−Ｄ５）；画分３−フェニルセファロースＦＦ（Ｄ６−Ｄ１１）；画分４−フェニルセファロースＦＦ素通り画分；画分５−オクチルセファロース素通り画分；画分６−カラム負荷液；画分７−ブチルセファロース（Ａ６−Ｂ１２）；画分８−ブチルセファロース（Ｃ１−Ｃ７）；画分９−ブチルセファロース（Ｃ８−Ｄ１２）；画分１０−ブチルセファロース素通り画分；画分１１−フェニルセファロースＨＰ（Ａ１２−Ｂ１２）；画分１２−フェニルセファロースＨＰ（Ｃ１−Ｄ１）；画分１３−フェニルセファロースＨＰ素通り画分；および画分１４−カラム負荷液。
【０１７０】
４種の疎水性相互作用クロマトグラフィー分析のＡ２８０吸光度追跡を図８に示す。選択された画分の効力分析は、フェニルセファロースＦＦ（Ｂ１２−Ｄ５）のプールされた画分２が０．９１の比活性を有する一方、素通りプール画分４が０．００３の比活性を有したことを示した。同様に、フェニルセファロースＨＰ（Ａ１２−Ｂ１２）のプールされた画分１１の比活性が１．０１であった一方、この分析の素通り画分１３の比活性は無視できた。画分７ブチルセファロース（Ａ６−Ｂ１２）は０．６１の比活性、画分８ブチルセファロース（Ｃ１−Ｃ７）は０．２１の比活性、および画分１０ブチルセファロース素通り画分は０．０５の比活性を有した。オクチルセファロース樹脂で捕捉ピークは達成されず、また、この分析からの素通り画分５は０．４２の比活性を有した。
【０１７１】
該結果は、硫酸アンモニウム沈殿工程からの上清／濾液が疎水性相互作用クロマトグラフィーへの直接適用に従うことを示す。フェニルセファロースＦＦ、フェニルセファロースＨＰおよびブチルセファロースＦＦは、再折りたたみ混合物から活性組換えプラスミノーゲン（ｒｅｃＰｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）タンパク質のほとんどを選択的に捕捉することが可能であり、溶出液画分中の高比活性および素通り画分プール中の低比活性により明らかである。従って、例えば、硫酸アンモニウム沈殿後に、該沈殿物を、いかなる沈殿物の全部若しくは実質的量も除去する１種若しくはそれ以上の方法（例えば深層濾過、遠心分離、精密濾過などおよび／若しくはそれらの組合せ）により澄明化し得、そして、プラスミノーゲンを含んでなる澄明化された濾液を疎水性相互作用クロマトグラフィーにかけてその中に含有される組換えプラスミノーゲンを捕捉し得る。
【実施例７】
【０１７２】
陽イオン交換クロマトグラフィー
再度折りたたまれたダイアフィルトレーションされた組換えプラスミノーゲンを室温でＳＰセファロースＦＦ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ペンシルバニア州ピッツバーグ）の２０６ｍｌのカラムで捕捉した。カラム平衡化緩衝液は２５ｍＭトリス、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０であった。該カラムを１０カラム容量の平衡化緩衝液で洗浄した後、組換えプラスミノーゲンを２５ｍＭトリス、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０で溶出した。
【０１７３】
ＳＰセファロースカラム溶出液は、およそ８９％の組換えプラスミノーゲン活性の回収を伴い、０．９８という比活性を有するほぼ均質な組換えプラスミノーゲンを提供した。
このクロマトグラフィー工程は、表３に示されるとおり、宿主細胞タンパク質による組換えプラスミノーゲンの汚染の低減において高度に有効であった。
【０１７４】
【表３】
0006045642.tif 000004
【実施例８】
【０１７５】
アフィニティークロマトグラフィー
ＳＰセファロースカラムから溶出された組換えプラスミノーゲンをその後ＥＣＨ−Ｌｙｓｉｎｅセファロースカラムに結合しかつそれから溶出した。この後者のアフィニティークロマトグラフィー工程は、処理されたタンパク質の全部若しくは実質的に全部がクリングルドメイン上の正しく再度折りたたまれたリシン結合部位をさらに下流に含有することを確認するのにもまた役立った。
【０１７６】
ＳＰセファロースカラムからの溶出液を、５０ｍＭトリス、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０で平衡化したＥＣＨ−Ｌｙｓｉｎｅセファロース４  ＦＦ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ペンシルバニア州ピッツバーグ）の２９５ｍｌカラムに室温で負荷した。該カラムを４カラム容量の平衡化緩衝液およびその後３カラム容量の洗浄２緩衝液（５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０および１ｍＭ  ＥＤＴＡ）で洗浄した後に、プラスミノーゲンを５０ｍＭトリス、２０ｍＭ  ε−ＡＣＡ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０で溶出した。このカラム溶出液を、精製方法の次の工程を開始するまで−８０℃で凍結保存した。
【０１７７】
組換えプラスミノーゲンのほぼ定量的な回収が、単一の比活性を伴い、ＥＣＨ−Ｌｙｓｉｎｅセファロースクロマトグラフィー工程から達成された。このアフィニティーカラムは宿主細胞タンパク質の含量のさらなる低減においてもまた有効であった。
【実施例９】
【０１７８】
可溶性ストレプトキナーゼを使用するプラスミノーゲンのプラスミンへの活性化
融解した組換えプラスミノーゲンを、以下の溶液条件下すなわち２．５ｍｇのプラスミノーゲン／ｍｌ；１２．５％（ｖ／ｖ）１，２−プロパンジオール；２００ｍＭ  ε−ＡＣＡ；８７．５％（ｖ／ｖ）ＥＣＨ−Ｌｙｓｉｎｅセファロース溶出緩衝液；２５μｇのストレプトキナーゼ（ＳＫ）／ｍｌ；ｐＨ７．０で、室温で４時間ＳＫで活性化した。
【０１７９】
ＳＫを使用して、遊離溶液中で組換えプラスミノーゲンをプラスミンに活性化した。活性化の条件は、組換えプラスミノーゲンの活性化を最大化しかつ自己溶解を最小化するよう慎重に選択した。４時間の活性化時間の終了時のプラスミンの比活性は０．７７であり、この工程でのおよそ８０％収率を示した。
【実施例１０】
【０１８０】
固定された組換えポリヒスチジン標識ストレプトキナーゼを使用するプラスミノーゲンのプラスミンへの活性化
１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）および１００ｍＭ  ＮａＣｌ中の組換えポリヒスチジン標識ストレプトキナーゼ（１００μｇ）を、１００μｌの固定された金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）マトリックスに添加する。２２℃で５分間のインキュベーション後に、０．４５μｍセルロースアセテートフィルターを取り付けたＳｐｉｎ−Ｘ微小遠心スピンカラム（Ｃｏｓｔａｒ、マサチューセッツ州ケンブリッジ）に該スラリーを適用する。マトリックスを２，０００×ｇで３分間遠心分離によりペレットにし、そしてその後２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４で数回洗浄する。マトリックスをＳｐｉｎ−Ｘ装置から取り出し、微小遠心管に入れ、２００ｍｌの５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４に再懸濁する。
【０１８１】
等モル量の組換えプラスミノーゲンを、活性化溶液すなわち５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．４中の固定されたストレプトキナーゼに添加する。サンプルを２２℃でインキュベートし、そして回転プラットフォーム上に置いてマトリックスを懸濁状態に保つ。
活性化の完了に際して、活性化溶液をガラスフィルター上のストレプトキナーゼ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭから濾過し、そして直ちにＱメンブレン若しくはベンズアミジン−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭカラムに適用する。プラスミノーゲン活性化の進行をモニターするため、多様な間隔でサンプルを選択し、そして０．１容量の１０×停止緩衝液（１．０Ｍ  ＮａＨＣＯ３、１．０Ｍ  ε−アミノカプロン酸（ｐＨ９．４））の添加により反応を停止する。サンプルをＳｐｉｎ−Ｘ微小遠心管に移し、そして２，０００×ｇで３分間の遠心分離によりペレットにする。固定された反応体を２５μｌの１００ｍＭ  ＥＤＴＡの添加により溶出し、次いで５，０００×ｇで１０分間遠心分離する。還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを慣習的方法論により実施した。
【実施例１１】
【０１８２】
陰イオン交換クロマトグラフィー
実施例９のＳＫ活性化混合物を２００ｍＭ  ε−ＡＣＡ／１２．５％１，２−プロパンジオールで１：１希釈しそして９．０にｐＨ調節した。この溶液に室温でＳａｒｔｏｂｉｎｄ  ＳｉｎｇｌｅＳｅｐ  Ｑ  Ｎａｎｏ  １ｍｌメンブレン（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を通過させた。
【０１８３】
活性化溶液にＱメンブレンを通過させて、プラスミンの９１％回収を伴いＳＫを除去し；この分離は、組換えプラスミン（９．３および９．５）ならびにＳＫ（５．２）の完全に異なるｐＩにより可能にされる。負荷物質およびこのＱメンブレンからの素通り画分のウエスタンブロット分析に基づけば、ＳＫはこの工程により定量のレベルより下に減少された。
【実施例１２】
【０１８４】
アフィニティークロマトグラフィー
実施例１１のＱメンブレン素通り画分にＮａＣｌ（０．５Ｍまで）を補充し、そして室温で２５ｍＭトリス、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭ  ε−ＡＣＡ、ｐＨ７．０で平衡化されたベンズアミジンセファロース４  ＦＦ（ｈｉｇｈ  ｓｕｂ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ペンシルバニア州ピッツバーグ）の２００ｍｌカラムに負荷される前に７．０にｐＨ調節した。カラムを５カラム容量の平衡化緩衝液で洗浄した後、プラスミンを２００ｍＭクエン酸ナトリウム、２００ｍＭ  ε−ＡＣＡ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ３．０で溶出した。このカラム溶出液を、ピーク前端に存在するプラスミンのｐＨを（３．０に）迅速に低下させる目的上、１カラム容量の溶出緩衝液を含有する容器に収集した。
【０１８５】
Ｑメンブレン素通り画分を、活性プラスミンを結合しかつ反応されていない組換えプラスミノーゲンおよび自己溶解されたプラスミンを除去するため、ベンズアミジンセファロースカラムに負荷した。プラスミン活性はこの工程の間におよそ９５％の収率を伴い回収された。
【実施例１３】
【０１８６】
限外濾過／ダイアフィルトレーション
ベンズアミジンセファロースカラムからの溶出液中に存在するプラスミンをおよそ５倍（５ｍｇ／ｍｌまで）濃縮し、そして５ｋＤａ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ＸＬ（０．００５ｍ２）メンブレンを使用して５．０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．３）に対しダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーション後にこの酸性プラスミン溶液を−８０℃で保存した。
【実施例１４】
【０１８７】
プラスミンの濃度、活性および純度
全タンパク質を、２８０ｎｍでのその吸光度に基づいて較正したプラスミノーゲン標準を使用するピロガロールレッド法により、上流の精製中間体中で定量した。純粋な組換えプラスミンの吸光係数はアミノ酸組成に基づき１．６６ｍｇ−１／ｍｌであると計算され；２８０ｎｍでの吸光度を使用して下流の精製中間体中のプラスミンタンパク質を定量した。プラスミノーゲン活性はＣＯＡＭＡＴＩＣ（Ｒ）プラスミノーゲンキット（ＤｉａＰｈａｒｍａ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．）を使用してアッセイした。後者のキットは、しかしアッセイ混合物へのＳＫの添加を伴わずにプラスミン活性をアッセイするのにもまた使用し；触媒的に活性のチモーゲンの濃度を測定するためこれらのアッセイを較正しかつ検証した。慣習的ＳＤＳ−ＰＡＧＥを還元条件下で実施した。サイズ排除ＨＰＬＣを、１０ｍＭ酢酸、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ３．４を移動相として用いる７．８ｍｍ×３０ｃｍのＴＳＫ−ＧＥＬ  Ｇ２０００ＳＷＸＬカラム（トーソー・バイオサイエンス）を用いて実施した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１宿主細胞タンパク質をＣｙｇｎｕｓ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＥＬＩＳＡキットを用いてアッセイした。ＳＫは特注で調製されアフィニティー精製されたウサギ抗ＳＫ血清を使用する半定量的ウエスタンブロットで推定した。
【０１８８】
プラスミノーゲンおよびプラスミンの純度の第一の判断基準は調製物の比活性であり、１．０という比活性は１００％純粋なタンパク質を表す。表３および４に示されるとおり、プラスミノーゲン中間体およびプラスミン最終生成物の比活性は双方とも１．０に近かった。
【０１８９】
【表４】
0006045642.tif 000005
【０１９０】
プラスミノーゲンの進行的精製、ＳＫによる一本鎖プラスミノーゲンの二本鎖プラスミンへの転化、およびプラスミンの精製を具体的に説明する図４に提示されるＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果は、純度のこれらの推定を裏付けている。小さいパーセンテージの自己溶解産物が、精製過程の終了時に限外濾過／ダイアフィルトレーションされたプラスミンで観察された（図４、レーン９）。最終生成物の３サンプルのサイズ排除ＨＰＬＣ分析を図５に重ね；この分析はタンパク質の９８％が単量体プラスミンに対応するピーク中に溶出されたことを示した。宿主細胞タンパク質は精製されたプラスミン１ｍｇあたり０．８ｎｇ未満に減少された。ＳＫは定量のレベルより下（プラスミン１ｍｇあたり０．０２μｇ未満）に減少された。
【０１９１】
可溶化された封入体に存在する組換えプラスミノーゲンタンパク質はおよそ４８％の収率を伴い活性タンパク質に再度折りたたまれた。活性の再度折りたたまれたチモーゲンに基づくＥＣＨ−Ｌｙｓｉｎｅセファロースクロマトグラフィー後の活性の総回収は７０％であった。出発チモーゲン活性に基づくプラスミン活性の収率は６５％であった。従って、活性の再度折りたたまれたチモーゲンに基づくプラスミンの計算される総収率は、表３および４に提示される３回の精製運転について４６％であった。
【実施例１５】
【０１９２】
組換えプラスミノーゲンから製造されるプラスミンの陰イオン交換クロマトグラフィー
Ｑメンブレンクロマトグラフィーを、ＳＫを使用する組換えプラスミノーゲンのプラスミンへの活性化直後に実施した。ＳＫ活性化混合物を約７から約８までｐＨ調節し、ｐＨ８トリス緩衝液で平衡化したＱメンブレンに負荷し、そしてプラスミンを含有する素通り画分を収集した。ベンチスケール研究を実施し、そしてＳＫ結合およびプラスミン回収率に伝導性のメンブレン負荷条件を特定した。ベンチスケール実験からのサンプルをＳＫ含量についてアッセイし、そしてサンプル純度を確認した。
【実施例１６】
【０１９３】
血漿由来プラスミノーゲンから製造されるプラスミンの陰イオン交換クロマトグラフィー  血液由来プラスミノーゲンおよび／若しくはそれから製造されるプラスミンは、例えば、米国特許第６，３５５，２４３号明細書、同第６，９６４，７６４号明細書、同第６，９６９，５１５号明細書および同第７，５４４，５００号明細書；米国特許公開第２００２／０１９２７９４号明細書および同第２００３／００１２７７８号明細書；ならびにＤｅｕｔｓｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１７０：１０９５−６（１９７０）（それらのそれぞれはそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）により開示される。
従って、プラスミノーゲンは、プラスミンを含んでなる組成物を提供するために血液（例えば血漿、血清）から製造される。
【０１９４】
例えば、プラスミノーゲンは、Ｄｅｕｔｓｃｈら、上記により記述されるところのＬｙｓ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥでのアフィニティークロマトグラフィーによりＣｏｈｎ画分ＩＩ＋ＩＩＩペーストから製造される。例えば、２００ｇのＣｏｈｎ画分ＩＩ＋ＩＩＩペーストを２リットルの０．１５Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．８に再懸濁する。該懸濁液を３７℃で一夜インキュベートし、１４，０００ｒｐｍで遠心分離し、ガラス繊維で濾過し、そして５００ｍｌのＬｙｓ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）と混合する。プラスミノーゲンの結合を室温で２時間実施する。Ｌｙｓ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥをその後２リットルガラスフィルター上に移し、そして２８０ｎｍでの吸光度が０．０５より下に下落するまで、０．３Ｍ  ＮａＣｌを含有する０．１５Ｍクエン酸ナトリウムで数回洗浄する。結合されたプラスミノーゲンを０．２Ｍ  ε−アミノカプロン酸の３個の２００ｍｌ部分で溶出する。溶出されたプラスミノーゲンを、プラスミノーゲン溶液１ｍｌあたり０．４ｇの固体硫酸アンモニウムで沈殿させる。該粗（８０〜８５％純粋）プラスミノーゲンの沈殿物を４℃で保存し得る。
【０１９５】
粗プラスミノーゲンの硫酸アンモニウム沈殿物を１４，０００ｒｐｍで遠心分離し、そして、１０〜１５ｍｇ／ｍｌの最終タンパク質濃度を達成するためにｐＨ９．０の１０ｍＭリシン、８０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する４０ｍＭトリスを使用して最少容量に再懸濁する。該プラスミノーゲン溶液を同一緩衝液に対し一夜透析して硫酸アンモニウムを除去する。透析されたプラスミノーゲン溶液（１０〜２０ｍｌ）を等容量の１００％グリセロールで希釈し、そして適切な量のプラスミノーゲンアクチベーター、好ましくはストレプトキナーゼと合わせる。５０％グリセロールの使用は、該アクチベーターによる活性化の間に形成されるプラスミンの自己分解を低減し得る。
【０１９６】
アクチベーター（例えばストレプトキナーゼ）によるプラスミノーゲン活性化は室温で約２時間ないし約２４時間若しくはそれ以上である。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを還元条件下で実施してプラスミノーゲン活性化の進行をモニターする。活性化の完了に際して、プラスミンを含んでなる活性化溶液を所望の場合はガラスフィルターで濾過し、そしてベンズアミジン−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥのようなアフィニティー吸着媒に適用する。プラスミンはトリプシン様特異性をもつセリンプロテアーゼであるため、ベンズアミジン−セファロースは活性プラスミンの捕捉を可能にし得るアフィニティー吸着媒である。例えば、５０％グリセロール中の溶液を、０．５Ｍ  ＮａＣｌを含有する０．０５Ｍトリス、ｐＨ８．０で平衡化された５０ｍｌのベンズアミジン−セファロースカラムに３ｍｌ／分の流速で適用する。該カラムを３〜７℃で３ｍｌ／分で運転する。結合されないピークの前端部分は高分子量不純物を含有する。結合されないピークの残部は、残余の活性化されていないプラスミノーゲンおよびプラスミンの不活性自己分解生成物により表される。
【０１９７】
プラスミンを中性ｐＨ条件での不活性化から保護するため酸性溶出条件を選択する。ベンズアミジン−セファロースに結合されたプラスミンは例えば０．５Ｍ  ＮａＣｌを含有する０．２Ｍグリシン緩衝液ｐＨ３．０で溶出する。
【０１９８】
ベンズアミジンセファロースカラムから収集される溶出液をｐＨ約６．５ないし７．０に調節し、そして注射用水（ＷＦＩ）で４倍希釈した。Ｑメンブレン（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  ＭＡ  ５  Ｑメンブレン）を平衡化緩衝液（６２．５ｍＭ  ＥＣＡＣ、３７．５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５ないし７．０）で平衡化し、そして希釈されたベンズアミジン溶出液をＱメンブレンに負荷した。素通り画分およびすすぎ液を収集し、そしてｐＨを１Ｎ  ＨＣｌで直ちにｐＨ３．４に調節した。このｐＨを調節された素通り画分をその後ＵＦ／ＤＦにより濃縮しかつダイアフィルトレーションした。
【０１９９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、ごく少量（約１０％若しくはそれ未満）のプラスミンがＱメンブレンに結合され、残余が素通りおよびすすぎ画分に捕捉されたことを確認した（図９）。また、ウエスタンブロット分析は、Ｑ負荷液中に存在するＳＫフラグメントは素通り画分およびすすぎ液中に存在しなかったが、しかしＱメンブレンを６２．５ｍＭ  ＥＡＣＡ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５で処理した場合にストリップ画分に存在したことを確認した。該ウエスタンブロットを濃度測定で分析し、そして該結果を表５に示す。
【０２００】
【表５】
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【図１】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図２】
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【図４】
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【配列表】
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