(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ  Ｐ１（ＧＳＴＰ１）を含有する心筋症または虚血性心疾患の予防薬または治療薬。
【請求項２】
心筋症または虚血性心疾患の防止または処置のための医薬剤の製造のためのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ  Ｐ１（ＧＳＴＰ１）の使用。
【請求項３】
前記心筋症が、拡張型心筋症、うっ血性心筋症；閉塞性肥大性心筋症、肥大性大動脈弁下狭窄症；その他の肥大性心筋症、非閉塞性肥大性心筋症；虚血型心筋症；心内膜心筋（好酸性）疾患、心内膜心筋（熱帯性）繊維症またはレフラー心内膜炎；心内膜繊維弾性症、先天性心筋症；その他の拘束型心筋症、狭窄性心筋症ＮＯＳ；アルコール性心筋症、薬剤およびその他の外的作因による心筋症、非特異的心筋症、原発性、続発性心筋症ＮＯＳ；感染性および寄生性疾患における心筋症、ジフテリアにおける心筋症；代謝性疾患における心筋症、心臓アミロイドーシス；栄養性疾患における心筋症、栄養性心筋症ＮＯＳ；心臓の痛風結節または甲状腺中毒性心疾患であることを特徴とする請求項２記載の使用。
【請求項４】
前記虚血性心疾患が、心筋梗塞により、高血圧により、または心筋炎により引き起こされることを特徴とする請求項２記載の使用。
【請求項５】
前記心筋炎が、急性心筋炎、感染性心筋炎、敗血症性心筋炎；孤立性心筋炎、細菌疾患における心筋炎、ジフテリア性、淋菌性、髄膜炎菌性、梅毒性または結核性心筋炎；ウイルス疾患における心筋炎、インフルエンザ性心筋炎または流行性耳下腺炎性心筋炎；シャーガス病における急性または慢性心筋炎、トキソプラズマ症における心筋炎、リウマチ性心筋炎または類肉腫性心筋炎であることを特徴とする請求項４記載の使用。
【請求項６】
前記医薬剤が非経口投与されることを特徴とする請求項２〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
前記医薬剤が腹腔内または静脈内に投与されることを特徴とする請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記医薬剤が０．００１〜１００ｍｇ  ＧＳＴＰ１／ｋｇの投与量で、ヒト個体に投与されることを特徴とする請求項２〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
前記医薬剤が０．０１〜１０ｍｇ  ＧＳＴＰ１／ｋｇの投与量で、ヒト個体に投与されることを特徴とする請求項２〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
前記医薬剤が０．１〜１ｍｇ  ＧＳＴＰ１／ｋｇの投与量で、ヒト個体に投与されることを特徴とする請求項２〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
前記医薬剤が０．１〜１００００Ｕ  ＧＳＴＰ１／ｋｇの投与量で、ヒト個体に投与されることを特徴とする請求項２〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
前記医薬剤が１〜１０００Ｕ  ＧＳＴＰ１／ｋｇの投与量で、ヒト個体に投与されることを特徴とする請求項２〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３】
前記医薬剤が１０〜１００Ｕ  ＧＳＴＰ１／ｋｇの投与量で、ヒト個体に投与されることを特徴とする請求項２〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１４】
心筋症または虚血性心疾患の防止または処置のための、ＧＳＴＰ１、および製薬上許容可能な担体を含む薬学的組成物。
【請求項１５】
前記ＧＳＴＰ１がヒト組換えＧＳＴＰ１またはヒト胎盤ＧＳＴＰ１であることを特徴とする請求項１４に記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
１〜１０００００Ｕ  ＧＳＴＰ１を含有することを特徴とする請求項１４または１５に記載の組成物。
【請求項１７】
１０〜１００００Ｕ  ＧＳＴＰ１を含有することを特徴とする請求項１６記載の組成物。
【請求項１８】
１０〜１０００Ｕ  ＧＳＴＰ１を含有することを特徴とする請求項１７記載の組成物。
【請求項１９】
緩衝液を含有することを特徴とする請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
リン酸塩緩衝液、トリス−ＨＣｌ緩衝液またはＨＥＰＥＳ緩衝液を含有することを特徴とする請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
５．５〜９．０のｐＨを有する緩衝液を含有することを特徴とする請求項１９に記載の組成物。
【請求項２２】
６．０〜８．５のｐＨを有する緩衝液を含有することを特徴とする請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
６．５〜８．０のｐＨを有する緩衝液を含有することを特徴とする請求項２２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ  Ｐ１の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）は、基質分子の求電子性基に及ぼすグルタチオン（ＧＳＨ）のイオウ原子の求核性攻撃を触媒する多重遺伝子族のアイソザイムである。ＧＳＴは、毒性物質をＧＳＨと共役させてより水溶性の物質（これは肝臓中で代謝されて、最後には身体から排出される）にする解毒酵素として知られている。アミノ酸配列に基づいて、哺乳動物ＧＳＴは６つのクラスに分けられる：すなわち、アルファ、ミュー、オメガ、パイ、シータおよびゼータである。これらのアイソザイムの中で、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼＰ１（ＧＳＴＰ１；ＧＳＴ−パイ、ＧＳＴＰ１−１）は、哺乳動物細胞において最も一般的である。ＧＳＴＰ１は、それらが種々の異なるヒト悪性腫瘍、例えば肺癌、結腸癌、胃癌、食道癌、口腔癌、腎臓癌、卵巣癌および精巣癌中で過剰発現されるため、新生物マーカーとしても関心を示されてきた。ほとんどの前立腺癌型は、ＧＳＴＰ１プロモーターが過メチル化してＧＳＴＰ１の転写低減を引き起こすため（ＵＳ  ２００９／０１８６３６０  Ａ１）、正常前立腺組織に比して低減レベルのＧＳＴＰ１ポリペプチドを含有する。ＧＳＴＰ１は、酸化ストレスに対する細胞性応答における決定因子であり、種々の細胞傷害性作因、例えばＨ２Ｏ２、ＵＶ、シスプラチン、アドリアマイシン、エトポシド、チオテパ、クロラムブシル、エタクリン酸および三酸化ヒ素により引き出されるアポトーシスから腫瘍細胞を保護する。したがって、ＧＳＴＰ１は、薬剤作用の標的として、そして腫瘍マーカーとしても、腫瘍医療における有望な標的とみなされる。
【０００３】
ＧＳＴＰ１は、ストレスシグナル伝達の調節にも関与し、その非触媒およびリガンド結合活性に関連した機序により、アポトーシスに対して細胞を防御する。例えば、ＧＳＴＰ１は前炎症因子のＬＰＳ誘導性過剰産生を阻止し、ＬＰＳに対する応答において抗炎症的役割を果たす。ＧＳＴＰ１発現は、転写および翻訳の両レベルで、ＬＰＳ刺激により上方調節される。ＧＳＴＰ１は、Ｃ末端との相互作用により、ＪＮＫ（ｃ−Ｊｕｎ  ＮＨ２−末端キナーゼ）の内因性抑制因子としても機能する。外因性（組換え）ＧＳＴＰ１タンパク質はマクロファージに送達されて、細胞中でのｉＮＯＳおよびＣＯＸ−２発現を抑圧する、ということも実証されている。さらに、マウスへの腹腔内投与ＧＳＴＰ１タンパク質は、内毒素ショックの死亡率を有意に低減し、急性肺損傷および腹膜炎を抑制した（Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４６  （２００９），  ８４８−８５７）。
【０００４】
ＥＰ  １  ５００  ７０９  Ａ１は、２２の炎症マーカーのうちの１つとしてのＧＳＴＰ１を示唆している。
【０００５】
ＧＳＴＰ１の種々のアイソフォームは、呼吸器系における交通（および喫煙）からの空気汚染とのＧＳＴＰ１の相互作用、ならびに妊娠における高血圧との関連のため、喘息および小児アレルギー疾患と関連することも見出されている（Ｏｈｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｍ．  Ｔｈｒ．  Ｈｅｍ．  ２９  （２００３），  ６５３−６５９）。
【０００６】
心筋症（ＣＭＰ）は、拡張型（ＤＣＭ）（心筋症の中で最も高頻度に存在）および虚血型（ＩＣＭ）を含めた、混成群の疾患である。薬物療法および外科的介入はＣＭＰにおける生存利益を伴って改善されてきたが、しかし原因療法は依然として漠然とした目標である。したがって、ＣＭＰに介在する未知の機序の確認は、有益であり得る。この１０年の研究の結果は、炎症、ならびに前炎症サイトカイン、特に腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−αの放出増強がＣＭＰの病因においてある役割を果たし得る、という証拠を明確に提供している。しかしながら、臨床試験は、ＴＮＦ−αがＣＭＰに関する実用的な治療標的であるか否かという疑問を投げかけたＣＭＰにおけるＴＮＦ−αに関するより複雑な役割を逆説的に示している。ＩＨＤの病態は、ＣＭＰの発症に直接的に関連付けられ、患者は一般に、患者の症候を改善するため、そしてＩＨＤによる（虚血型）ＣＭＰの発症を防止するかまたは遅らせるためという目的で、ベータ遮断薬またはアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）遮断薬のような医薬剤を摂取する。したがって、ＩＨＤのためにもＣＭＰに関する療法を用いることは共通である。重要なことは、ＩＨＤを基礎にしたＣＭＰ、特に末期ＣＭＰを発症する患者は、一般に、限定された治療選択肢しかないということである（例えば、心臓移植または補助人工心臓の使用、これは、順次、限定数の患者にのみ提供され得る）。
【０００７】
ＣＭＰおよびＩＨＤ、ならびにその主要原因のうちの１つ、すなわち、虚血性心疾患（心筋梗塞を生じ得る冠動脈心疾患とも呼ばれる）、特に血圧上昇誘導性ＣＭＰおよび容積誘導性ＣＭＰを効率的に防止し、処置するためのさらなる薬剤標的および処置レジメンに対する必要性は依然として満たされていない。
【０００８】
心筋症は、再発性増悪を生じて、入院または死に至る。したがって、さらにまた、これらの患者における最適な目的に合わせた心筋症処置を達成するためには、厳密な査察および徹底的臨床試験が必要とされ、厖大なヘルスケア経費が掛かる。心筋症の進化を同定し、処置のモニタリングおよび結果を最適化するのに役立ち得るバイオマーカーが、したがって、非常に望ましい。理想的には、このような試験は、高感度で、特異的で、非侵襲性で、迅速且つ安価であるべきである。多数の神経液性因子および炎症性サイトカインは、心筋症のバイオマーカーとして報告されているが、しかし脳型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）およびその不活性Ｎ末端断片（プロＢＮＰ）は、慢性ＣＭＰが疑われるかまたは確立された患者の臨床診断およびモニタリングにおいて最も広範に受け入れられてきた。しかしながら、循環ＢＮＰおよびプロＢＮＰレベルは、腎機能により劇的に影響を及ぼされ、そして年齢および性別依存性である。さらに、プロＢＮＰが、駆出率（ＥＦ）が低下したＣＭＰとは対照的に保持されたＣＭＰという診断に有益であり得るか否かは依然として不明である。
【０００９】
したがって、心筋症および虚血性心疾患のための診断手段を提供することも、本発明の一目的である。
【００１０】
したがって、本発明は、心筋症（ＣＭＰ）の防止または処置のための、ならびに虚血性心疾患の防止または処置のための、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼＰ１（ＧＳＴＰ１）を提供する。本発明に関して、ＧＳＴＰ１は、ＣＭＰ処置において、ならびに虚血性心疾患（ＩＨＤ）の処置において、有益であるということが意外にも示され得た。ＧＳＴＰ１は、癌医療における（例えばＵＳ  ５，４２７，９１７  Ａ、ＵＳ  ５，５５２，２７７  ＡおよびＷＯ  ９８／２１３５９  Ａ１）、ならびにアレルギー疾患、例えば喘息における、特に交通関連大気汚染と結びついた（例えば、Ｍｅｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｎｖ．  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｅｒｓｐ．  １１６  （２００８），  １０７７−１０８４）、関連タンパク質として記載されている。ＧＳＴＰ１は、内毒素ショックの死亡率を低減し、ならびに急性肺損傷および腹膜炎を抑制することも示唆されてきた（例えば、Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４６  （２００９），  ８４８−８７５）。ＧＳＴＰ１は、キナーゼシグナル伝達を調整するに際してＧＳＴＰ１の新規のリガンド結合機能としてＴＲＡＦ２（腫瘍壊死因子受容体関連因子２）と相互作用することが報告された（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２５  （２００６），  ５７８７−５８００）。これは、サイトカイン、ＵＶまたはＨ２Ｏ２のような異なる損傷刺激に対して細胞を防御するためにＧＳＴＰ１により利用される機序を分析するための新規の識見を提供し、そしてこの教示は、腫瘍細胞においてＧＳＴＰ１−ＴＲＡＦ２複合体を形成することにより一般的生存因子としてのＧＳＴＰ１機能を考え得るとみなされたが、しかしこの複合体の抑制は抗腫瘍療法に限定されるものとみなされた。
【００１１】
本発明によれば、ＧＳＴＰ１は、具体的には、対照と比較して、ＣＭＰおよびＩＨＤ患者において上方調節される、ということが意外にも見出された。組換えＧＳＴＰ１は、ＧＳＴＰ１−ＴＲＡＦ２会合を媒介し、その用量およびＣＭＰの基本形態によって決まる前炎症ＪＮＫ１およびｐ３８活性化ならびにＴＲＡＦ２発現を低減する、ということがさらに見出された。これは、ＧＳＴＰ１の投与によるＣＭＰおよびＩＨＤに関する新規の治療戦略の提供を可能にした。ＧＳＴＰ１はＴＲＡＦ２との会合による前炎症ＪＮＫ１／ｐ３８のＴＮＦ−α媒介性活性化を改善するため、ＧＳＴＰ１は、ＣＭＰおよびＩＨＤ処置において有益であるだけでなく、特に危険な患者、例えば高血圧患者において、ＣＭＰおよびＩＨＤの防止にも有益である。
【００１２】
本発明は、ＣＭＰおよび虚血性心疾患の防止または処置のための医薬剤の製造のためのＧＳＴＰ１の使用を提供する。本発明によるＣＭＰおよびＩＨＤの処置は、このような処置を必要とする個体、例えばヒトＣＭＰおよびＩＨＤ患者への有効量のＧＳＴＰ１の投与を包含する。これらの理由のため、ならびにＩＨＤの病態がＣＭＰの発症に直接的に関連づけられるという事実に基づいて、患者は一般に、患者の症候を改善するため、そしてＩＨＤによる（虚血型）ＣＭＰの発症を防止するかまたは遅らせるためという目的で、ベータ遮断薬またはアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）遮断薬のような医薬剤を摂取する。ＩＨＤ患者における、特にＩＨＤによる心筋梗塞を発症している患者における心筋のリモデリング（これは、順次、心室のリモデリングと、その後の心臓のポンプ機能減損をもたらし、特に心筋梗塞患者において、ＣＭＰおよびＩＨＤに共通である病理学的状態である）に基づいているＩＨＤの病態とＣＭＰとの密接な関係は、ＩＨＤおよびＣＭＰの防止または処置に関する本発明の有効性を示す。したがって、本発明は、ＩＨＤの防止または処置にも適している、ということは明白である。重要なことは、ＩＨＤを基礎にしたＣＭＰ、特に末期ＣＭＰを発症する患者は、一般に、限定された治療選択肢しかない（例えば、心臓移植または補助人工心臓の使用であって、これは、順次、限定数の患者にのみ提供され得る）ことであり、この事実は、一方ではＣＭＰの発症を防止することを目指し、他方で、ＩＨＤ患者における臨床症状を改善するかまたは安定化することを目指した、ＩＨＤに罹患している患者を防止しまたは処置するための本発明の好ましい使用を構成している。
【００１３】
本発明を用いて、ＣＭＰおよびＩＨＤのすべての型および段階、その急性および慢性型、は、ＣＭＰまたはＩＨＤの起源とは関係なく、処置され得る。もちろん、「処置」という用語は、優先的に、疾患の改善、ならびに疾患の進行の防止または緩慢化を包含する。例えば、ＣＭＰは、心筋梗塞により引き起こされ、特発性拡張型であり得るし、あるいは高血圧により引き起こされ得る。これらの型はすべて、本発明に従ってＧＳＴＰ１で処置され得る。具体的には、例えば心筋梗塞により引き起こされる虚血型ＣＭＰは、ＧＳＴＰ１で処置され得るが、しかしながら、非虚血型（例えば、特発性拡張型ＣＭＰ、あるいは高血圧または容積誘導性ＣＭＰ）も処置され得る。これらのＣＭＰのすべてにおいて、炎症経路が包含されるため、これは、本発明によるＧＳＴＰ１での処置に関してそれらを適格にする（このような炎症経路が包含される場合には、実にまれな型のＣＭＰ）。
【００１４】
したがって、本発明による好ましいＣＭＰは、拡張型心筋症、特にうっ血性心筋症；閉塞性肥大性心筋症、特に肥大性大動脈弁下狭窄症；その他の肥大性心筋症、特に、非閉塞性肥大性心筋症；心内膜心筋（好酸性）疾患、特に、心内膜心筋（熱帯性）繊維症またはレフラー心内膜炎；心内膜繊維弾性症、特に先天性心筋症；その他の拘束型心筋症、特に狭窄性心筋症ＮＯＳ（別記されない（ＩＣＤ−１０による））；アルコール性心筋症、薬剤およびその他の外的作因による心筋症、非特異的心筋症、特に原発性、続発性心筋症ＮＯＳ；感染性および寄生性疾患における心筋症、特にジフテリアにおける心筋症；代謝性疾患における心筋症、特に心臓アミロイドーシス；栄養性疾患における心筋症、特に栄養性心筋症ＮＯＳ；心臓の痛風結節または甲状腺中毒性心疾患である。
【００１５】
本発明により処置される（または防止される）べきＣＭＰまたはＩＨＤの具体的に選択される形態は、虚血により、特に心筋梗塞により、高血圧により、または心筋炎により引き起こされるＣＭＰである。したがって、本発明によるＧＳＴＰ１処置は、好ましくは、急性心筋炎、好ましくは感染性心筋炎、特に敗血症性心筋炎；孤立性心筋炎、細菌疾患における心筋炎、特にジフテリア性、淋菌性、髄膜炎菌性、梅毒性または結核性心筋炎；ウイルス疾患における心筋炎、特にインフルエンザ性心筋炎または流行性耳下腺炎性心筋炎；シャーガス病における急性または慢性心筋炎、トキソプラズマ症における心筋炎、リウマチ性心筋炎または類肉腫性心筋炎を有する患者に適用される。
【００１６】
本発明による好ましい適応症は、したがって、ＩＣＤ−１０の第ＩＸ章（Ｉ１１〜Ｉ１５、特にＩ２１、Ｉ２２およびＩ２３；Ｉ２０〜Ｉ２５、特にＩ２１およびＩ２２；Ｉ４０〜Ｉ４３、特にＩ４２；Ｉ５０〜Ｉ５７、特にＩ５０およびＩ５７）で列挙されている。
【００１７】
本発明の主眼点は、ヒト患者の処置である；しかしながら、本発明の知見に基づいて、炎症を伴う動物（哺乳動物）ＣＭＰおよびＩＨＤも、本発明に従ってＧＳＴＰ１により首尾よく処置され得る、ということが明らかである。これは、農場または動物園動物（特に繁殖農場動物、例えば（前者）競走馬）、あるいはペット、例えばイヌ、ネコおよびウマに関して重要であり得る。
【００１８】
本発明はＣＭＰおよびＩＨＤの防止のためにも使用可能であるが、しかし、本発明の主眼は、ＣＭＰまたはＩＨＤと既に診断されているか、あるいはＣＭＰまたはＩＨＤを発祥する危険を有するヒトＣＭＰおよびＩＨＤ患者、例えば高血圧を有する患者（例えば、収縮期血圧１６０ｍｍＨｇ以上、および／または拡張期血圧１００ｍｍＨｇ以上を有する段階２の患者）の処置にある、ということは明らかである。本発明の防止態様の別の好ましい実施形態は、狭心症患者に関するものであり、それにより、この組の患者においては心筋梗塞が起こっていることも起きていないこともある；新機能不全または心不全（Ｍｃ  Ｍｕｒｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｎｃｅｔ  ３６５  （２００５），  １８７７−１８８９）が存在することもある。ここでは、連続静脈内投与または心筋への連続投与さえ、示されている。
【００１９】
本発明によるＧＳＴＰ１含有医薬剤の投与の好ましい経路は、非経口経路、好ましくは腹腔内または静脈内投与であり、静脈内投与が特に好ましい。静脈内投与は、例えば、ボーラス注射により、または長期間（例えば、３０分〜６時間、特に１〜３時間）に亘る連続静脈内送達により、実施され得る。心臓手術の過程においては、心臓への直接的な投与（心筋内注射）も選択される。この経路を用いて、ＧＳＴＰ１活性は、直接的に且つ高濃度で、必要とされる領域に、例えば梗塞領域に送達され得る。別の好ましい投与経路は、冠静脈洞への投与（例えば、冠静脈洞中に挿入されるカテーテルによる）である。経口または粘膜経路（原則としてＧＳＴＰ１に関して記載されてはいるが；例えばＵＳ  ５，９７６，５２８  Ａ参照）は余り選択されないが、それは、ＧＳＴＰ１がタンパク質であり、この経路に関しては、本草薬物製造に関して有意の最適化とともに、特定の防御手段（腸溶コーティング、カプセル封入等）が必要であるためである。
【００２０】
投与の好ましい投与量は、０．００１〜１００ｍｇ  ＧＳＴＰ１／ｋｇ、好ましくは０．０１〜１０ｍｇ  ＧＳＴＰ１／ｋｇ、特に０．１〜１ｍｇ  ＧＳＴＰ１／ｋｇの投与量であって、好ましくは静脈内投与により、ヒト個体に投与される；あるいは、０．１〜１００００Ｕ  ＧＳＴＰ１／ｋｇ、好ましくは１〜１０００Ｕ  ＧＳＴＰ１／ｋｇ、特に１０〜１００Ｕ  ＧＳＴＰ１／ｋｇの投与量であって、好ましくは静脈内投与により、ヒト個体に投与される。これらは、静脈内適用のための好ましい１日投与量である（「ｋｇ」は、処置されるべきヒトの体重１ｋｇを意味する）。外科手術中、これらの投与量は、全投与量として、または１以上の投与量として；あるいは投与量の一部のみとしても適用され得る（ＧＳＴＰ１は、必要とされる領域で、外科手術中に、直接的に適用され得ると考える）。「直ぐに使える」１日剤形（例えば、８０ｋｇおよび／または６０ｋｇのヒト個体に関して）は、予備製造され、そして凍結乾燥または凍結（ならびに例えば−２０℃に保持）により、貯蔵安定性にされ得る。次に、投与量は、全部または一部のみ、消費され得る（他と、処置されるべきヒトの体重を基礎にして）。
【００２１】
本発明によるＧＳＴＰ１は、「ＧＳＴＰ１−１」、「ＧＳＴクラス−パイ」、「ＤＦＮ７」、「ＧＳＴ３」、「ＧＳＴπ」等とも呼ばれ、そして還元型グルタチオンを広範な数の外因性および内因性疎水性求電子性物質と共役させる（ＥＣ  ２．５．１．１８；触媒活性：ＲＸ＋グルタチオン＝ＨＸ＋Ｒ−Ｓ−グルタチオン）。ヒト配列（配列番号１）は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース（ＨＧＮＣ：４６３８、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ：  ２９５０）で「ＧＳＴＰ１＿ＨＵＭＡＮ、  Ｐ０９２１１」として列挙される。
配列番号１：
【表１】
0005863660.tif 000002
【００２２】
いくつかの変異体はこのヒトタンパク質に関して存在し（同型接合性ならびに異型接合性）、最も重要な変異体は、位置１０５でのＩｌｅ−Ｖａｌ交換、および位置１１４でのＡｌａ−Ｖａｌ交換である（Ｍｅｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，    ２００８）。他の変異体としては、位置７８でのＧｌｙ−Ｇｌｕ交換、位置１１０でのＴｈｒ−Ｓｅｒ交換、位置１３９でのＧｌｙ−Ｇｌｕ交換、位置１４７でのＡｓｐ−Ｔｙｒ交換、ならびに位置１５８でのＡｓｐ−Ｈｉｓ交換である。いくつかの他のＳＮＰが既知であるが、アミノ酸配列に影響を及ぼさない。
【００２３】
本発明によるＧＳＴＰ１で処置されるべきＣＭＰまたはＩＨＤ患者が、配列番号と比較して、（異型接合または同型接合性）アミノ酸交換を生じるような対立遺伝子を有する場合、このような患者に対立遺伝子型のこのタンパク質を投与することが推奨され得る。これは具体的には、この対立遺伝子に関して同型接合性である患者、例えば同型接合性１０５Ｖａｌまたは１１４Ｖａｌ対立遺伝子を有する患者（この患者は次に、それぞれ、１０５Ｖａｌまたは１１４Ｖａｌ  ＧＳＴＰ１変異体を受容する）に関して選択される。このような場合、悪性反応、特に悪性免疫反応（これは常に、タンパク質様医薬剤に関して局所的である）を発症する危険は、低く保持される。とにかく、患者における免疫反応を引き出すかまたは追加免疫する本発明によるＧＳＴＰ１を含有する薬学的調製物中の任意の成分は、可能な場合、最小限に保持されるべきである。
【００２４】
哺乳動物からのオルソログは、例えばチンパンジー（Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ；ＮＣＢＩ寄託番号：７４５９５４、  ＸＭ＿００１１５２５１６．１、ＸＰ＿００１１５２５１６．１）およびマウス（ハツカネズミ；ＮＣＢＩ寄託番号：１４８７０１、  ＮＭ＿０１３５４１．１１、ＮＰ＿０３８５６９．１１、ＡＫ０７９１４４５、ＢＣ００２０４８５）から既知であるが、しかし非哺乳動物、例えばミノカサゴ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）および蠕虫（線虫Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）からも既知である。
【００２５】
本発明は、心筋症または虚血性心疾患の防止または処置のための、ＧＳＴＰ１、好ましくはヒト組換えＧＳＴＰ１またはヒト胎盤ＧＳＴＰ１、ならびに製薬上許容可能な担体を含む薬学的組成物にも関する。
【００２６】
好ましい実施形態によれば、本発明の組成物は、１〜１０００００ＵのＧＳＴＰ１、好ましくは１０〜１００００ＵのＧＳＴＰ１、特に１０〜１０００ＵのＧＳＴＰ１を含有する。１単位のＧＳＴＰ１活性は、１．０マイクロモルの１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼンを還元グルタチオン／分と、ｐＨ６．５で２５℃で共役させる。
【００２７】
本発明による好ましい組成物は、緩衝剤も含有する。典型的緩衝系は、炭酸／ＨＣＯ３系（ｐＨ６．２〜８．６；中性）、炭酸／ケイ酸塩緩衝液（ｐＨ５．０〜６．２；弱酸性）、酢酸／酢酸塩緩衝液（ｐＨ３．７〜５．７）、リン酸塩緩衝液（ＮａＨ２ＰＯ４＋Ｎａ２ＨＰＯ４；ｐＨ５．４〜７．８）、アンモニア緩衝液（ＮＨ３＋Ｈ２Ｏ＋ＮＨ４Ｃｌ；ｐＨ８．２〜１０．２）、トリス／ＨＣｌ（トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン；ｐＨ７．２〜９．０）、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸；ｐＨ６．８〜８．２）、ＨＥＰＰＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン−１−プロパンスルホン酸；ｐＨ７．３〜８．７）、またはＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸；ｐＨ５．２〜６．７）である。本発明による好ましい緩衝剤は、リン酸塩緩衝液、トリス−ＨＣｌ緩衝液またはＨＥＰＥＳ緩衝液であり、ｐＨは５．５〜９．０、好ましくは６．０〜８．５、特に６．５〜８．０である。緩衝液濃度は、好ましくは１ｍＭ〜１Ｍ、特に１０ｍＭ〜０．５Ｍに調整され得る。その他の好ましい付加的成分としては、安定化剤、キレート化剤、塩等、例えばグリセロール、グルコース、サッカロース、マルトース、ＥＤＴＡまたは類似の物質、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＮＨ４Ｃｌ、ならびに薬学的調製物で使用可能な類似の塩が挙げられる。もちろん、薬学的調製物中のすべての成分は、薬学的等級品質のものでなければならない。
【００２８】
選択的に用いられる製薬上許容可能な担体は、生理学的食塩水、植物油、鉱油、水性カルボキシメチルセルロースナトリウムまたは水性ポリビニルピロリドンであるが、しかしながら、滅菌水も用いられ得る。
【００２９】
本発明に従って用いられるべきＧＳＴＰ１は、種々の方法により提供される。上記のように、ヒト胎盤からのＧＳＴＰ１は、ＧＳＴＰ１の好ましい天然供給源のうちの１つである。他の好ましい供給源は、ＧＳＴＰ１（過剰）発現細胞の培養である。ＧＳＴＰ１調製物は、市販もされている。しかしながら、本発明による好ましい工業的生産経路は、ＧＳＴＰ１の組換え生産である。ＧＳＴＰ１の組換え生産は、このような供給源からのその精製と同様に、十分に確立されている（例えば、Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６；ＷＯ  ９８／２１３５９  Ａ１；ＵＳ  ５，９７６，５２８等）。ＧＳＴＰ１コード配列を含有する発現ベクター（例えば、ＷＯ  ９８／２１３５９  Ａ１、パートＤ（４０〜５１頁））は、適切な宿主細胞（例えば、ＣＯＳ、ＨＥＫ  ２９３、ＨｅＬａ、ＶＥＲＯ、Ｗ１３８、ＢＨＫまたはＭＤＣＫ細胞、さらにまた酵母、植物、昆虫および細菌細胞（出芽酵母、大腸菌等））中に移される。次いで、ＧＳＴＰ１は、標準方法に従って発現され、精製される。組換えＧＳＴＰ１性腺は、金属キレートペプチド、プロテインＡドメイン、アフィニティー精製タグ等のような精製を助長する付加的配列を有するＧＳＴＰ１の変異体型も用い得る（例えばＵＳ５，９７６，５２８  Ａ、カラム１６）。このような変異体は、（精製後に、または精製の途中に）、例えば切断可能リンカー配列（プロテアーゼ、エンテロキナーゼ等）により除去され得る。ＧＳＴＰ１の精製済みバッチ調製物は、例えば１〜２００ＵのＧＳＴＰ１活性／総タンパク質１ｍｇを含有し得る。好ましい薬学的ＧＳＴＰ１組成物は、５〜２００Ｕ／タンパク質１ｍｇ、特に１０〜１５０Ｕ／タンパク質１ｍｇを含有する。本発明による薬学的調製物は、常に、滅菌性であり、本発明に従ってヒト患者への投与に使用可能である適切に標識された生成物として提供される。
【００３０】
別の態様によれば、本発明は、ＣＭＰまたはＩＨＤに対する診断標的としてのＧＳＴＰ１に関する。本発明は、ＣＭＰまたはＩＨＤの診断のためのＧＳＴＰ１の使用を提供する。ＧＳＴＰ１は腫瘍診断における既知の且つ確立されたマーカーであるが、しかしＧＳＴＰ１が、感受性および特異性に関して一般的「ゴールド・スタンダード（最も信頼できる基準）」であるプロＢＮＰより優れてさえいる、ＣＭＰまたはＩＨＤに対するバイオマーカーである、ということは意外である。
【００３１】
ＧＳＴＰ１の療法的使用に関して上記で言及された心筋症または虚血性心疾患は、本発明に従って診断もされ得る。
【００３２】
したがって、本発明は、ＣＭＰまたはＩＨＤの診断方法、特に上記の同定方法であって、生物学的試料中のＧＳＴＰ１またはＧＳＴＰ１  ｍＲＮＡの量を確定すること、そしてこの量を、限定された且つ既知のＣＭＰ／ＩＨＤ状態を有する、特に健常ヒト個体または患者からの生物学的試料中のＧＳＴＰ１またはＧＳＴＰ１  ｍＲＮＡ量と比較することによる方法に関する。この比較は、実際的見地から実行され得る。すなわちその場合、実試料は、生物学的試料と同様に試験され（横並びで）、それは、実質上の比較であって、したがって、確定値が、健常または罹患試料の既知の値と比較される。
【００３３】
ＧＳＴＰ１の量を確定するための好ましい技法としては、抗体連結技法、例えばＥＬＩＳＡが挙げられ、これらは任意に、電気泳動技法またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）と組合わされる。電気泳動技法は、ＭＡＬＤＩ技法とも組合され得る。
【００３４】
代替的には、ＧＳＴＰ１  ｍＲＮＡは、例えば定量的実時間ＲＴ−ＰＣＲにより決定され得る。
【００３５】
好ましい診断標的は、ＣＭＰまたはＩＨＤを有することが疑われるヒト患者、ＣＭＰまたはＩＨＤを発祥する危険があるヒト患者、あるいはＣＭＰまたはＩＨＤを有する（当該疾患の進行に関してモニタリングされなければならない）ヒト患者である。
【００３６】
本発明による好ましい生物学的試料としては、ヒトの血液、血漿または血清試料、あるいはヒト心筋生検試料が挙げられる。これらの試料は、慣用的方法によっても試験され得る。
【００３７】
典型的には、血清中の高濃度のＧＳＴＰ１は、ＣＭＰまたはＩＨＤを示す。健常人では、ＧＳＴＰ１の血清濃度は、５０ｎｇ／ｍｇより低く、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌより低いことさえある。ＣＭＰまたはＩＨＤ罹患状態は、５０ｎｇ／ｍｌ以上、好ましくは１００ｎｇ／ｍｌ以上の血清レベルで診断され得る。重症型のＣＭＰまたはＩＨＤは、２００ｎｇ／ｍｌ以上で診断され得る。もちろん、これらの値は、常に、ＧＳＴＰ１タンパク質を検定するために用いられる技法によって決まる。代替的には、ＣＭＰまたはＩＨＤ罹患状態は、ＧＳＴＰ１の血清レベルが、健常状態、特に同一患者の健常状態と比較して、少なくとも係数２の差で、好ましくは少なくとも係数５の差で、上昇される場合に、診断され得る。血清ＧＳＴＰ１レベルが、健常状態、特に同一患者の健常状態と比較して、少なくとも係数１０、特に少なくとも係数２０の差で上昇される場合、重症型が診断され得た。
【００３８】
本発明に関しては、試料中のＧＳＴＰ１またはＧＳＴＰ１  ｍＲＮＡの量の確定は、標準試験方法、例えばＥＬＩＳＡまたはＰＣＲにより、非常に短時間内に実施され得る。配列番号２：
【表２】
0005863660.tif 000003
および配列番号１（ならびにＧＳＴＰ１遺伝子およびＧＳＴＰ１タンパク質に関して上記されたデータベース記載事項）によるＤＮＡおよびアミノ酸配列に基づいて、本発明は、例えば、黄色ブドウ球菌感染の同定のためのＰＣＲ検定、あるいはサンドイッチＥＬＩＳＡ検定も提供する。本発明による適切なＥＬＩＳＡにおいて、ＧＳＴＰ１は、ＧＳＴＰ１特異的抗体を有する生物学的試料から捕捉され、ＧＳＴＰ１の異なるエピトープまたは以前の結合事象に特異的である抗体に対して向けられる二次抗体で検出され、定量され得る。
【００３９】
ジス転写物（ｍ−ＲＮＡ）の検出は、標準定量核酸試験、例えば定量的ＲＴ−ＰＣＲにより可能である。したがって、本発明は、ＧＳＴＰ１をコードする少なくとも１つの核酸配列またはその一部を増幅するための少なくとも２つの合成核酸配列中のＧＳＴＰ１  ｍＲＮＡの量を決定するためのキットであって、キット中の合成核酸配列のうちの少なくとも１つが、以下のものからなる群から選択されるキットも提供する：（ａ）適切なプライマー対（上記プライマー対は、以下のうちの少なくとも１つの１０〜３０連続ヌクレオチドを含む核酸配列である：（ｉ）配列番号２によるＧＳＴＰ１  ｍＲＮＡまたはその相補配列；あるいは（ｉｉ）ＧＳＴＰ１遺伝子の５’または３’非コード領域から（例えば、５’−または３’−方向に５００ヌクレオチドまで、好ましくは２００ヌクレオチドまで、特に１００ヌクレオチドまで延びる領域またはその相補配列中；このような配列は上記の配列ライブラリー記載事項に存在する）；上記プライマーは、ＧＳＴＰ１遺伝子またはその５’−または３’−領域間に配置されるヌクレオチド配列を重合するために使用可能である）（上記重合可能ＧＳＴＰ１ヌクレオチド配列は、ＰＣＲ検出可能であり、好ましくは１０００ｂｐまで、さらに好ましくは５００ｂｐまで、さらに好ましくは３００ｂｐまでの長さである；他方で、プライマーは、全ＧＳＴＰ１  ｍ−ＲＮＡを（ＰＣＲで）重合するためにも選択され得る）；ならびに（ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のための適切な試薬。好ましくは、キットはさらに、以下の：（ｃ）使用説明書、ならびに（ｄ）任意に、ＧＳＴＰ１  ｍＲＮＡの確定および／または定量のための陽性および／または陰性対照、特に、ＧＳＴＰ１をコードする対照核酸またはその断片を含む。適切なＰＣＲ試薬の例としては、ＰＣＲ反応緩衝液、Ｍｇ２＋（例えば、ＭｇＣｌ２）、ｄＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、逆転写酵素および熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑ関連ＤＮＡポリメラーゼおよびｐｆｕ関連ＤＮＡポリメラーゼ））、ＲＮアーゼ、ＰＣＲ反応エンハンサーまたは阻害剤、ＰＣＲ反応モニタリング剤（例えば二本鎖ＤＮＡ染料（例えばＳＹＢＲＴＭグリーン））、ＴａｑＭａｎＴＭプローブ、分子標識およびＳｃｏｒｐｉｏｎ−ＳＴＭ、ならびにＰＣＲ等級水が挙げられる。
【００４０】
本明細書中に記載されるプライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）検定において特に有用である。ＰＣＲは、ＤＮＡベースの配列のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅のための実用的な系である。例えば、ＰＣＲ検定は、熱安定性ポリメラーゼ、ならびに２つの約１０〜３０塩基プライマー（一方は増幅されるべき配列の一端で（＋）鎖と相補性であり、他方は他の端と（−）鎖と相補性である）を用い得る。ＤＮＡ鎖を含むプライマー組を含む新規合成生物学的試料は、その後、同一プライマー配列のための付加的鋳型として役立ち得るため、解離は、所望の配列の迅速且つ高度特異的増幅を生じ得る。ＰＣＲは、ＧＳＴＰ１  ｍＲＮＡ含有試料中の限定配列の存在を検出するためにも用いられ得る。
【００４１】
例として、本発明による典型的ＰＣＲ検定は、任意に、ｍＲＮＡのＤＮＡへの逆転写後に、２つの合成オリゴヌクレオチドプライマー（それぞれ、増幅されるべきＧＳＴＰ１をコードする標的ＤＮＡまたはその相補鎖の２つの領域、あるいはその５’−または３’−領域（各鎖に関するもの）と特異的におよび相補的に結合している）を用いて開始し得る。これらは、過剰デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）および熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑポリメラーゼ）の存在下で、標的ＤＮＡ（純粋である必要はない）に付加され得る。一連（典型的には２０〜４０）の温度周期で、標的ＤＮＡは繰り返し変性され（約８０〜１００℃、例えば９０℃）、プライマーとアニーリングされ（典型的には４０〜６５℃で）、そして娘鎖がプライマーから伸長され得る（典型的には６５〜８０℃、例えば７２℃）。娘鎖それ自体は、その後の周期のための鋳型として作用するので、両プライマーと整合するＤＮＡ断片は、線状というよりむしろ幾何級数的に増幅される。標的ＤＮＡは、純粋である必要も、豊富である必要もない；したがって、ＰＣＲは、具体的には、本発明による臨床診断法に適している。
【００４２】
これらの試験は、好ましくは、定量のためにも適している標識、例えばビオチン、蛍光分子、放射性分子、色原性基質、化学発光マーカー等を用い得る。核酸をビオチニルかするための方法は、蛍光分子および放射性分子をオリゴヌクレオチドおよびヌクレオチド中に導入するための方法であって、当該技術分野で周知である。検出方法は、他の一般に用いられる標識と同様に、蛍光、放射性、化学発光、色原性標識に関して周知である。要するに、化学発光は、それらの発光の波長および強度によりほとんど直接的に、同定され、定量され得る。ビオチンが用いられる場合、それは、検出可能マーカー、例えば酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ）と共役されるアビジン、ストレプトアビジン等により検出される。ストレプトアビジンは、高親和性でビオチンと結合し、非結合ストレプトアビジンは洗い落とされ、次いで、過酸化物および適切な緩衝液の存在下で、冷光−発光基質を用いて、ホースラディッシュペルオキシダーゼ酵素の存在が検出される。
【００４３】
試料中のＧＳＴＰ１の量の確定は、好ましくは、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡおよびＦＡＣＳを包含する。抗ＧＳＴＰ１抗体を用いたＧＳＴＰ１の検出および定量は、当該技術分野で十分に確立されており（特に、腫瘍医療において）、本発明にしたがってＣＭＰまたはＩＨＤを診断する目的のために容易に適用され得る（例えば、ＷＯ  ９８／２１３５９  Ａ１（「Ｆ．  抗体」）；ＵＳ  ５，９７６，５２８  Ａ、ＵＳ  ５，４２７，９１７  Ａ）。ＧＳＴＰ１発現に関する正常または標準値は、正常哺乳動物被験体、好ましくはヒトから採取される体液または細胞抽出物を、複合体形成に適した条件下で、ＧＳＴＰ１に対する抗体と組合せることにより確立される。標準複合体形成の量は、種々の方法により、好ましくは測光学的手段により、定量され得る。被験体、試料、対照および疾患にいて、生検組織から発現されるＧＳＴＰ１の量は、標準値と比較される。標準および被験体値間の偏差は、疾患を診断するためのパラメーターを確立する。上で既に記述したように、最も好ましい試料は、ヒト心臓生検のもの、ならびにＣＭＰまたはＩＨＤを有する、ＣＭＰまたはＩＨＤを有することが疑われる、あるいはＣＭＰまたはＩＨＤを発症する危険がある個々のヒト患者のヒト血液から得られるものである。
【００４４】
本発明は、以下の実施例および図面によりさらに例証されるが、それらに限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】ＤＣＭおよびＩＣＭ患者におけるＧＳＴＰ１およびＴＲＡＦ２増大を示す。（Ａ）代表的遺伝子アレイ画像は、標識化ｃＤＮＡプローブのＧＳＴＰ１およびＴＲＡＦ２アレイ配列（矢印）とのハイブリダイゼーション増大を示す。（Ｂ）対照のＣｙ３（緑色）染色と比較した場合の、ＤＣＭおよびＩＣＭ患者における心臓ＧＳＴＰ１およびＴＲＡＦ２タンパク質に関するＣｙ５（赤色）染色増強を示す代表的タンパク質アレイ画像。（Ｃ）実時間ＲＴ−ＰＣＲによる心筋ＧＳＴＰ１およびＴＲＡＦ２  ｍＲＮＡ発現の定量。ＧＳＴＰ１（＊Ｐ＜０．０００１）およびＴＲＡＦ２（Ｐ＜０．０００１）ｍＲＮＡ発現は、対照と比較して、心不全患者において有意に上方調節される。（Ｄ）タンパク質負荷対照レベルに関して補正された心筋ＧＳＴＰ１およびＴＲＡＦ２タンパク質発現の代表的ウエスタンブロット画像および定量。心筋タンパク質発現レベルは、対照と比較して、ＧＳＴＰ１（Ｐ＜０．０００１、Ｐ＝０．００１９）およびＴＲＡＦ２（Ｐ＜０．０００１、Ｐ＝０．００５）に関してＤＣＭおよびＩＣＭで上昇した。ＤＣＭおよびＩＣＭを比較した場合、ＧＳＴＰ１  ｍＲＮＡおよびタンパク質発現に有意差は見出されなかった；しかし、ＴＲＡＦ２  ｍＲＮＡ（†Ｐ＝０．００１）およびタンパク質（†Ｐ≦０．０００１）発現レベルは、ＩＣＭと比較して、ＤＣＭでは有意に高かった。＊  対照に対して有意に異なる。
【図２】ＤＣＭおよびＩＣＭにおけるＧＳＴＰ１−ＴＲＡＦ２相互作用、ならびにＪＮＫおよびｐ３８の活性化を示す。（Ａ）ＤＣＭ、ＩＣＭおよび対照における心筋ＧＳＴＰ１−ＴＲＡＦ２複合体形成の代表的ウエスタンブロット画像および定量。ＬＶ心筋溶解物を免疫沈降（ＩＰ）させて、沈降物をウエスタンブロットで分析した。ＩＣＭおよび対照と比較して、有意に低いＧＳＴＰ１−ＴＲＡＦ２会合が、ＤＣＭにおいて見出された（＊Ｐ≦０．００８）。（Ｂ）ＤＣＭ、ＩＣＭおよび対照における心筋活性ＪＮＫ１およびｐ３８タンパク質発現の代表的ウエスタンブロット画像および定量。ＤＣＭおよびＩＣＭの両方において、活性ＪＮＫならびにｐ３８のＭ心臓タンパク質発現（Ｐ＜０．０００１）は、対照と比較して、有意に上方調節される。さらに、ＤＣＭ患者は、ＩＣＭと比較して、有意に高い心臓ＪＮＫおよびｐ３８タンパク質発現（†Ｐ＜０．０００１）を明示する。全タンパク質発現を、タンパク質負荷対照レベルに関して補正した。＊  対照に対して有意に異なる。
【図３】ＧＳＴＰ１が心臓組織培養中の心臓ＴＲＡＦ２−ＪＮＫ１／ｐ３８系を調整する、ということを示す。（Ａ）５μｇ／ｍＬ組換えＧＳＴＰ１で処置した心臓組織培養中のＴＲＡＦ２、ＧＳＴＰ１、活性ＪＮＫおよび活性ｐ３８タンパク質発現の代表的ウエスタンブロット画像。（Ｂ）組換えＧＳＴＰ１（２．５、５、１０μｇ／ｍｌ）で２４時間処置したＤＣＭ、ＩＣＭおよび対照心臓組織培養中でのＴＲＡＦ２、活性ＪＮＫおよび活性ｐ３８タンパク質発現の定量。ＴＲＡＦ２のタンパク質発現は、用いた濃度によって、非処置のものと比較して有意に低減された（ＤＣＭ：２．５μｇ／ｍＬに関してはＰ＝０．０１１、５μｇ／ｍＬに関してはＰ＝０．０１４、１０μｇ／ｍＬに関してはＰ＝０．００３；ＩＣＭ：２．５μｇ／ｍＬに関してはＰ＝０．００６、５μｇ／ｍＬに関してはＰ＝０．００３、１０μｇ／ｍＬに関してはＰ＝０．０００１；対照：２．５μｇ／ｍＬに関してはＰ＝０．１９、５μｇ／ｍＬに関してはＰ＝０．０００３、１０μｇ／ｍＬに関してはＰ＝０．０３）。ＧＳＴＰ１処置後、活性ＪＮＫ発現は、用いた濃度によって、非処置群と比較して、ＤＣＭ、ＩＣＭおよび対照心臓組織において減少した（ＤＣＭ：２．５μｇ／ｍＬに関してはＰ＝０．０００９、５μｇ／ｍＬに関してはＰ＝０．０１、１０μｇ／ｍＬに関してはＰ＝０．０００３；ＩＣＭ：２．５μｇ／ｍＬに関してはＰ＝０．０００５、５μｇ／ｍＬに関してはＰ＝０．００７、１０μｇ／ｍＬに関してはＰ＝０．０００１；対照：２．５μｇ／ｍＬに関してはＰ＝０．００１、５μｇ／ｍＬに関してはＰ＝０．６９、１０μｇ／ｍＬに関してはＰ＝０．７１）。同様に、活性ｐ３８発現は、用いた濃度によって、非処置のものと比較して、ＤＣＭ、ＩＣＭおよび対照心臓組織においてＧＳＴＰ１処置に応答して低減した（ＤＣＭ：２．５μｇ／ｍＬに関してはＰ＝０．００４、５μｇ／ｍＬに関してはＰ＝０．０００１、１０μｇ／ｍＬに関してはＰ＝０．０００９；ＩＣＭ：２．５μｇ／ｍＬに関してはＰ＝０．０３、５μｇ／ｍＬに関してはＰ＝０．０００１、１０μｇ／ｍＬに関してはＰ＝０．００８；対照：２．５μｇ／ｍＬに関してはＰ＝０．００８、５μｇ／ｍＬおよび１０μｇ／ｍＬに関してはＰ＝０．０００４）。ＴＲＡＦ２、ＪＮＫおよびｐ３８低減に関する適用ＧＳＴＰ１濃度の比較は、ＤＣＭおよびＩＣＭにおいては、２．５μｇ／ｍＬおよび５μｇ／ｍＬ、ならびに１０μｇ／ｍＬの間の差が有意であるが、対照では有意でない、ということを示した。ＴＲＡＦ２：（ＤＣＭ：２．５対５μｇ／ｍＬおよび対１０μｇ／ｍＬに関してはＰ＝０．０１、５対１０μｇ／ｍＬに関してはＰ＝０．６２；ＩＣＭ：２．５μｇ／ｍＬ対５μｇ／ｍＬに関してはＰ＝０．０００７、２．５対１０μｇ／ｍＬに関してはＰ＝０．０００４、５対１０μｇ／ｍＬに関してはＰ＝０．３５；対照：２．５対５μｇ／ｍＬに関してはＰ＝０．０７、２．５対１０μｇ／ｍＬに関してはＰ＝０．０６、５対１０μｇ／ｍＬに関してはＰ＝０．１５）。ＪＮＫ：（ＤＣＭ：２．５対５μｇ／ｍＬに関してはＰ＝０．０００６、２．５対１０μｇ／ｍＬに関してはＰ＝０．００３、５対１０μｇ／ｍＬに関してはＰ＝０．４８；ＩＣＭ：２．５対５μｇ／ｍ���に関してはＰ＝０．００４、２．５対１０μｇ／ｍＬに関してはＰ＝０．０１、５対１０μｇ／ｍＬに関してはＰ＝０．８８；対照：２．５対５μｇ／ｍＬに関してはＰ＝０．０２、２．５対１０μｇ／ｍＬに関してはＰ＝０．０５、５対１０μｇ／ｍＬに関してはＰ＝０．９７）。ｐ３８（ＤＣＭ：２．５対５μｇ／ｍＬに関してはＰ＝０．０００２、２．５対１０μｇ／ｍＬに関してはＰ＝０．０４、５対１０μｇ／ｍＬに関してはＰ＝０．７６；ＩＣＭ：２．５対５μｇ／ｍＬに関してはＰ＝０．０００６、２．５対１０μｇ／ｍＬに関してはＰ＝０．０２、５対１０μｇ／ｍＬに関してはＰ＝０．４１；対照：２．５対５μｇ／ｍＬに関してはＰ＝０．０６、２．５対１０μｇ／ｍＬに関してはＰ＝０．０８、５対１０μｇ／ｍＬに関してはＰ＝０．２９）。（Ｃ）組換えＧＳＴＰ１（５μｇ／ｍｌ）で処置し、免疫沈降（ＩＰ）に付したＤＣＭ、ＩＣＭおよび対照心筋組織培養からの心筋ＧＳＴＰ１−ＴＲＡＦ２複合体の代表的ウエスタンブロット画像。ＧＳＴＰ１およびＴＲＡＦ２間のＧＳＴＰ１処置心臓組織培養会合は、用量および疾患非依存性で、非処置試料と比較した場合、有意に高かった（５μｇ／ｍＬ  ＧＳＴＰ１濃度に関してはＰ＝０．０２；２．５および１０μｇ／ｍＬ  ＧＳＴＰ１濃度に関する結果は示されていない）。＊  対照に対して有意に異なる。†  ＧＳＴＰ１  ２．５μｇ／ｍｌ処置組織培養に対して有意に異なる。≠  ＧＳＴＰ１  ５μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌ処置組織に対して有意に異なる。
【図４】ＴＮＦ−αが、ＤＣＭ心臓培養中でのＧＳＴＰ１に対するＴＲＡＦ２−ＪＮＫ１／ｐ３８カスケードの感受性を阻止する、ということを示す。（Ａ）ＴＮＦ−α（５０ｎｇ／ｍｌ）およびＧＳＴＰ１（５μｇ／ｍｌ）で処置したＤＣＭ、ＩＣＭおよび対照心臓組織培養の代表的ウエスタンブロット画像および定量（Ｂ）。ＴＮＦ−α活性化ＪＮＫ（Ｐ＝０．０８）およびｐ３８（Ｐ＝０．７５）カスケード、ならびにＴＲＡＦ２（Ｐ＝０．１８）タンパク質発現は、ＤＣＭ心臓組織培養中の組換えＧＳＴＰ１の影響を受けなかった。ＩＣＭおよび対照では、活性ＪＮＫ（Ｐ＜０．００１；Ｐ＜０．００２）、活性ｐ３８（Ｐ＜０．０００２；Ｐ＜０．０００１）およびＴＲＡＦ２（Ｐ＜０．００１；Ｐ＝０．００３）タンパク質発現は、ＧＳＴＰ１刺激に応答して顕著に低減された。ＧＳＴＰ処置ＩＣＭおよびＤＣＭ心臓組織培養の比較は、ＤＣＭの場合と比較して、ＩＣＭにおいて有意に低いＴＲＡＦ２、活性ＪＮＫおよびｐ３８（†Ｐ＜０．００１）タンパク質発現を示す。（Ｃ）ＴＮＦ−α（５０ｎｇ／ｍｌ）およびＧＳＴＰ１（５μｇ／ｍｌ）で処置した免疫沈降心臓組織溶解物の代表的ウエスタンブロット画像。ＩＣＭおよび対照心臓組織と対比して、ＤＣＭ心臓組織中では、ＴＮＦ−α刺激後に、ＧＳＴＰ１はＴＲＡＦ２と会合できなかった。
【図５】（Ａ）ＴＮＦ−α（５０ｎｇ／ｍｌ）およびＧＳＴＰ１（１０μｇ／ｍｌ）で処置したＤＣＭ、ＩＣＭおよび対照心臓組織培養の代表的ウエスタンブロット画像および定量（Ｂ）。（Ｂ）結果は、ＧＳＴＰ１（１０μｇ／ｍＬ）およびＴＮＦ−αで処置したＤＣＭ心臓組織培養が、ＴＮＦ−α処置対照と比較して、ＪＮＫおよびｐ３８活性化を顕著に低減し、ならびにＴＲＡＦ２タンパク質発現を低減した（＊Ｐ＜０．０００１）、ということを実証する。（Ｃ）ＤＣＭ心臓組織溶解物の免疫沈降物は、５ｍｇ／ｍｌのＧＳＴＰ１と比較して、１０μｇ／ｍｌのＧＳＴＰ１でのＧＳＴＰ１−ＴＲＡＦ２会合の有意の（Ｐ≦０．０３５）増大を示す。
【図６】血清および心臓ＧＳＴＰ１がＣＭＰと関連する、ということを示す。（Ａ）代表的血清タンパク質アレイ画像は、対照（ＥＦ≧６５％；ｎ＝４０）と比較して、末期心疾患（ＨＦ）（ＥＦ≦３５％；ｎ＝４０）患者における血清ＧＳＴＰ１タンパク質に関するＣｙ３（緑色）およびＣｙ５（赤色）染色増強を示す。（Ｂ）ＥＬＩＳＡ測定値は、（ＥＦ≧６５％；ｎ＝４０）を有する対照に対して、（ＥＦ≦３５％；ｎ＝４０）を有する末期ＨＦ患者における血清ＧＳＴＰ１濃度の有意の（＊Ｐ＜０．０００１）上昇を示す。（Ｃ）代表的心臓組織タンパク質アレイ画像は、対照（ＥＦ≧６５％；ｎ＝２０）と比較して、末期ＨＦ患者（ＥＦ≦３５％；ｎ＝４０）における心臓ＧＳＴＰ１タンパク質に関するＣｙ３（緑色）およびＣｙ５（赤色）染色増強を示す。（Ｄ）タンパク質負荷対照レベルに関して補正された心筋ＧＳＴＰ１タンパク質発現の代表的ウエスタンブロット画像および定量。ＧＳＴＰ１タンパク質発現レベルは、対照心臓移植片組織に比して、ＥＦ≦３５％を有する末期ＨＦ患者において有意に上昇した（†Ｐ≦０．００１）。
【図７】駆出率（ＥＦ）との血清ＧＳＴＰ１およびプロＢＮＰ関連、ならびにＧＳＴＰ１およびプロＢＮＰ間の相関を示す。（Ａ）ＥＦ≦２２％を示す心不全患者は、他のすべてのＥＦ群と比較して、有意に高い血清ＧＳＴＰ１濃度を有する。ＥＦ３３〜４２％、ＥＦ２３〜３２％およびＥＦ≦２２％を示す患者は、ＥＦ＞５２％およびＥＦ４３〜５２％を示すものと比較して、有意に高い血清ＧＳＴＰ１濃度を有する。（Ｂ）ＥＦ≦２２％を示す患者は、他のすべてのＥＦ群と比較して、有意に高い血清プロＢＮＰ濃度を有する。血清プロＢＮＰにおける有意差は、他のすべてのＥＦ群間には観察されなかった。（Ｃ）全試験被験体に関する血清ＧＳＴＰ１および血清プロＢＮＰ測定値の相関プロット。血清ＧＳＴＰ１およびプロＢＮＰ間に、有意の正の関係は認められなかった（ｒ＝０．４７；Ｐ＜０．０００１）。＊Ｐ＜０．００１  対  対照、†Ｐ＜０．０００１  対  ＥＦ＞５２％、≠Ｐ＜０．０００１  対  ＥＦ４３〜５２％、§Ｐ＜０．０００１  対  ＥＦ３３〜４２％、‖Ｐ＜０．００１  対  ＥＦ２３〜３２％。
【図８】心臓機能との血清ＧＳＴＰ１およびプロＢＮＰ相関を示す。（Ａ）試験被験者における血清ＧＳＴＰ１およびプロＢＮＰ濃度と心臓駆出率（ＥＦ）との相関。分析は、血清プロＢＮＰ濃度（ｒ＝−０．２７；Ｐ＝０．０００６）と比較した場合の、ＥＦと血清ＧＳＴＰ１（ｒ＝−０．７４；Ｐ＜０．０００１）とのより高い有意の負の相関を示す。（Ｂ）ＲＯＣ曲線分析は、血清ＧＳＴＰ１に関して、≧２２６ｎｇ／ｍｌの最適カットオフレベル（黒線；ＡＵＣ＝０．８９１、Ｐ＜０．０００１）で、８１％の感受性および８２％の特異性、そして≧５２７ｐｇ／ｍｌの最適カットオフレベル（赤線；ＡＵＣ＝０．６２４、Ｐ＝０．００３９）で、血清プロＢＮＰに関して９７％の感受性および２６％の特異性を示して、ＥＦ≦２２％を同定する。（Ｃ）ＲＯＣ曲線分析は、血清ＧＳＴＰ１に関して、≧７６ｎｇ／ｍｌの最適カットオフレベル（ＡＵＣ＝０．９７４、Ｐ＝０．０００８）で、９３％の感受性および１００％の特異性を示して、ＥＦ≦４２％を同定する。
【図９】ＧＳＴＰ１が、ラット急性ＭＩモデルにおける炎症性サイトカインを抑制することを示す。（Ａ）ウエスタンブロットによる免疫沈降は、ＧＳＴＰ１処置および対照動物間のＧＳＴＰ１−ＴＲＡＦ２複合体形成における差を明示しなかった；（Ｂ）ＧＳＴＰ１は、ウエスタンブロットにより分析した場合、活性化ＪＮＫ１タンパク質発現レベルを低減した；（Ｃ）ＧＳＴＰ１は、いくつかの炎症性サイトカインの心筋組織ｍＲＮＡ発現を抑制する。  ＊；Ｐ＜０．０１。
【図１０】ＧＳＴＰ１が、心不全ラットにおける炎症を改善することを示す。（Ａ）ＧＳＴＰ１処置動物は、免疫沈降およびウエスタンブロット分析により示されるように、ＧＳＴＰ１−ＴＲＡＦ２、ＧＳＴＰ１−ＪＮＫ１およびＧＳＴＰ１−ｐ３８間の複合体形成の有意に高いレベルを示した；（Ｂ）活性化ＪＮＫ１、ｐ３８およびＦＦ−κＢのタンパク質発現葉、ウエスタンブロット分析により示されるように、対照と比較して、ＧＳＴＰ１処置動物において有意に低かった；（Ｃ）ＧＳＴＰ１は、対照と比較した場合、心筋不全において、炎症性サイトカイン  ＴＧＦ−Ｂ、ＩＬ−１Ｂ、ＩＬ−２およびＩＬ−１７のｍＲＮＡ発現を抑制し；そして抗炎症性サイトカインＩＬ−１０のｍＲＮＡ発現を増大する。  ＊；Ｐ＜０．００１。
【図１１】ＧＳＴＰ１が、心不全のラット虚血誘導モデルにおける心筋リモデリングを弱めることを示す。（Ａ）ゴールドナー３色コラーゲン染色は、対照と比較して、ＧＳＴＰ１処置動物の心臓における有意に低い組織リモデリングを明示する；（Ｂ）左心室（梗塞）壁厚は、対照と比較して、ＧＳＴＰ１処置ラットにおいて有意に大きい；（Ｃ）ＧＳＴＰ１または対照ビヒクルで処置したラット心臓の代表的Ｔｕｎｅｌ検定画像。バー＝２５μｍ；（Ｄ）ＧＳＴＰ１処置ラットは、対照と比較して、有意に低いアポトーシス指数を有する。  ＊；Ｐ＜０．００１。
【図１２】ＧＳＴＰ１が、虚血誘導性心不全のラットモデルにおいて左心室機能を改善することを示す。（Ａ）ＧＳＴＰ１処置ラットは、心筋梗塞後２１日目に有意に高い左心室駆出率を有した；（Ｂ）左心室拡張終期容量は、ＧＳＴＰ１処置動物と比較して、対照において有意に大きい。  ＊；Ｐ＜０．０５。  実施例：  １．：  ＧＳＴＰ１は心筋症（ＣＭＰ）および虚血性心疾患（ＩＨＤ）における炎症を改善する  患者および組織標本採取
【００４６】
この試験は、ウィーン医科大学の倫理委員会により認可された。登録されるためにインフォームド・コンセントを示した７０名のＣＭＰ患者の心臓組織試料（特発性拡張型心筋症（ＤＣＭ）、ｎ＝３５；虚血型心筋症（ＩＣＭ）、ｎ＝３５）を、初期アレイ分析のために用いた。次いで、２００４年１月から２００８年７月までの間に、合計１００名のＣＭＰ患者（ＤＣＭ、ｎ＝５０；ＩＣＭ、ｎ＝５０）が含まれた。表１は、人口統計学的な、最も重要な臨床および血行動態的特性、ならびに患者の処置を要約する。全患者が、米国心臓協会判定基準に従って、最適化された心不全処置を有し、心臓移植を予定された。個々の心臓学者による心室機能、心筋生存度および標準血行動態パラメーターの評価のために、全患者が、心エコー検査、冠動脈血管造影、右心臓カテーテル処置、および磁気共鳴画像診断を受けた。病歴、臨床試験結果および処置を文書に記録し、暗号化して、心臓生検の研究者には伏せた。対照群は、その心臓が質的理由のために移植され得ない心臓疾患の病歴を有さない２０名の心臓ドナーで構成された。
表１：  試験患者の人口統計学的データ、血行動態パラメーターおよび医薬剤
【表３】
0005863660.tif 000004
ＡＣＥ、アンギオテンシン変換酵素；  ＢＭＩ、体格指数；  ＢＳＡ、体表面積；  ＤＣＭ、拡張型心筋症；  ＩＣＭ、虚血型心筋症；  ＬＶＥＦ、左心室駆出率；  ＰＡＰ、肺動脈圧；  ＰＣＷＰ、肺毛細管楔入圧；  ＰＶＲ、肺血管抵抗。
ｃＤＮＡアレイ
【００４７】
ポリ（Ａ＋）−ＲＮＡを、オリゴテックス−ｄＴキット（Ｑｉａｇｅｎ，  Ｖａｌｅｎｃｉａ，  ＣＡ）で単離して、第一鎖ｃＤＮＡ合成を、２μｇのポリ（Ａ＋）ＲＮＡ上で鳥骨髄芽細胞症ウイルス逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）を用いて実施した。ＤＮＡ−ＲＮＡ二重鎖内のＲＮＡ鎖を分解し、生成物をセファデックスＧ−５０スピンカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，  Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎ）で精製した。逆鎖プライミングのために、第一鎖ｃＤＮＡを用いて、記載されたように（Ｓｃｈａｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０８  （２００３），  １５８５‐１５９１）、ｃＤＮＡアレイ（ＧＥアレイＱ  ヒトアポトーシス遺伝子アレイ、ＳｕｐｅｒＡｒｒａｙ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，  ＭＤ）のための［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ標識第二鎖ｃＤＮＡを生成した。プールされたｃＤＮＡハイブリダイゼーションシグナルを、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，  Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，  ＣＡ）を用いて定量した。
心臓組織タンパク質アレイ
【００４８】
記載されたように（Ａｈａｒｉｎｅｊａｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １２０  （２００９ａ），  １１  Ｓｕｐｐｌ：  Ｓ１９８‐２０５）、抗体マイクロアレイ５００（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  ＣＡ；  ５０７  ｐｒｏｔｅｉｎ）で、タンパク質アレイを実施した。各試料中のタンパク質を２つの異なる蛍光染料で標識して、マイクロアレイ抗体被覆スライド上でインキュベートした。両スライドのタンパク質蛍光シグナルを、ＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ｂスキャナ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，  Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，  ＣＡ）により検出した。内部正規化比率（ＩＮＲ）を算定して、自動化マイクロアレイ分析ワークブック（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏ．ｃｌｏｎｔｅｃｈ．ｃｏｍ）を用いることにより対照試料中のものに比して、ＣＭＰ試料中の豊富な抗原を産生することにより、シグナルの定量を実施した。閾値間隔外のＩＮＲ値を有するタンパク質は、示差的に発現されるとみなされた。
ｍＲＮＡ単離および定量的実時間ＲＴ−ＰＣＲ
【００４９】
ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）を用いて、心筋生検から、全部のＲＮＡを単離した。ＭａｇＮＡライザー・グリーンビーズを用いて、ＭａｇＮＡライザー系（Ｒｏｃｈｅ，  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）で、６０００ｒｐｍで２０〜３０秒間、組織を均質化した。次いで、均質化試料を２００μＬのクロロホルムと混合し、室温で２〜３分間インキュベートして、４℃で１５分間、１２０００ｇで遠心分離した。ＲＮＡを収集し、２μｇの全ＲＮＡはおよびＭ−ＭｕＬＶ−ＲＴキット（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ，  Ｓｔ．  Ｌｅｏｎ−  Ｒｏｔ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてｃＤＮＡを合成した。記載されたとおりに（Ａｈａｒｉｎｅｊａｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．  ５  （２００５），  ２１８５−２１９２）、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ機器（Ｒｏｃｈｅ）で、実時間ＲＴ−ＰＣＲを実施した。プライマー配列は、センス／アンチセンス：
ＧＳＴＰ１：  ５’−ＧＧＣＡＡＣＴＧＡＡＧＣＣＴＴＴＴＧＡＧ−３’／５’−ＴＣＡＴＧＧＡＴＣＡＧＣＡＧＣＡＡＧＴＣ−３’；
ＴＲＡＦ２：  ５’−ＧＣＡＧＡＡＧＧＴＣＴＴＧＧＡＧＡＴＧＧ−３’／５’−ＧＧＴＧＧＡＧＣＡＧＣＡＴＴＡＡＧＧＴＣ−３’；
およびβ２−マイクログロブリン：  ５’−ＧＡＴＧＡＧＴＡＴＧＣＣＴＧＣＣＧＴＧＴＧ−３’／５’−ＣＡＡＴＣＣＡＡＡＴＧＣＧＧＣＡＴＣＴ−３’であった。正規化後に、以前の記載どおり（Ａｈａｒｉｎｅｊａｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９ａ  ａｎｄ  ２００５；Ｐｆａｆｆｌ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２９  （２００１）：  ｅ４５）にハウスキーピング遺伝子β２−マイクログロブリンの発現に対してｍＲＮＡ発現単位を確定し、対照に比してパーセンテージとしてＣＭＰ患者に関してプロットした。測定を３回実施した。各試料における３回のＰＣＲ測定値の平均を、データ分析のために用いた。
同時免疫沈降およびウエスタンブロット
【００５０】
２０ｍＭ  トリス（ｐＨ７．５）、１３５ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、２ｍＭ  ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、２５ｍＭ  β−グリセロホスフェート、２ｍＭ  ピロリン酸ナトリウム、１０％グリセロール、１％トリトンＸ−１００、１ｍＭ  オルトバナジン酸ナトリウム、１０ｍＭ  ＮａＦおよび１ｍＭ  フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）を含有し、完全プロテアーゼ阻害薬カクテル（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  ＩＮ，  ＵＳＡ）を補足した溶解緩衝液中に、記載どおり（Ａｈａｒｉｎｅｊａｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）に４℃で、ヒト心臓組織を溶解した。溶解物を、４℃で１５分間、遠心分離（１５０００ｇ）した。ＧＳＴＰ１−ＴＲＡＦ２複合体形成タンパク質（５００μｇ）を、ＴＲＡＦ２抗体（０．５μｇ、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）を用いて免疫沈降させた。予備清澄化プロテインＡ／Ｇ  ＰＬＵＳアガロース・ビーズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を、免疫複合体とともにさらに２時間インキュベートして、溶解緩衝液で４回洗浄した。免疫沈降物をさらにＳＤＳ−ＰＡＧＥに付して、抗ＧＳＴＰ１モノクローナル抗体（Ｂｅｔｈｙｌ，  Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，  ＴＸ）を用いてウエスタンブロット分析で統轄した。
【００５１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％）によりタンパク質溶解物（５０μｇ／レーン）を分離した後、ニトロセルロース膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）上で電気泳動移動させた（Ａｈａｒｉｎｅｊａｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）。ブロットを一次ヒトモノクローナル抗ＧＳＴＰ１抗体（Ｂｅｔｈｙｌ，  Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，  ＴＸ）、ヒトモノクローナル抗ＴＲＡＦ２（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）、ヒトポリクローナルホスホ−ｐ３８（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）、ヒトポリクローナルホスホル−ＪＮＫ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，  ＣＡ）、ヒトポリクローナル抗ＪＮＫ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，  ＣＡ）、ヒトポリクローナル抗−ｐ３８（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，  ＣＡ）とともにインキュベートした後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ共役化二次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）とともにインキュベートした。タンパク質負荷をポンソＳ染色により査定し、化学発光により免疫検出を実施した（Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ−Ｗｅｓｔ−Ｐｉｃｏ，  Ｐｉｅｒｃｅ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬ）。帯域をＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアにより定量し、特定タンパク質シグナルを負荷対照に対して正規化して、任意単位として表した。各試料における３回の測定の平均値を、データ分析のために用いた。
心臓組織培養実験
【００５２】
対照、ＤＣＭまたはＩＣＭ患者の新鮮な単離心筋（２〜３ｍｍ３）を、１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）、５０Ｕ／ｍｌペニシリンおよび２５０μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ（ｐＨ７．２）中で、３７℃で５％ＣＯ２を含有する完全加湿空気雰囲気中（Ｓｃｈａｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）でインキュベートした（１００片／６ウェルプレート）。６時間後、ウェルを組換えＧＳＴＰ１（２．５、５または１０μｇ／ｍｌ；Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎ，  Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，  ＭＣ）および／またはＴＮＦ−α（５０ｎｇ／ｍｌ；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）で処理した（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）。２４時間インキュベーション後、培地を取り替えて、心臓組織培養溶解物を分析した。実験は、三重反復実験で実施した。
統計学的分析
【００５３】
分散の規模によって（連続または無条件）、Ｘ２検定および分散の一方向分析（一方向ＡＮ−ＯＶＡ；テューキー検定）により、臨床パラメーター、患者特性、ＧＳＴＰ１およびＴＲＡＦ２のｍＲＮＡ発現レベル、ならびにＧＳＴＰ１、ＴＲＡＦ２、活性ｐ３８および活性ＪＮＫのタンパク質発現レベルを群間で比較した。統計学的分析はすべて、ウィンドウズ（登録商標）、バージョン９．１．３およびエンタープライズガイド、バージョン４．１に関するＳＡＳシステム（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  Ｉｎｃ．，  Ｃａｒｙ，  ＮＣ）を用いて実施した。統計学的有意をＰ＜０．０５に設定した。結果を、平均±標準偏差（ＳＤ）で表す。
結果
ＧＳＴＰ１およびＴＲＡＦ２は不全心筋中で過剰発現される
【００５４】
スクリーニング組織プロファイリングアレイは、対照個体と比較して、ＤＣＭおよびＩＣＭの両方を有する無作為選択患者において、より高い心臓ＧＳＴＰ１およびＴＲＡＦ２遺伝子ならびにタンパク質発現レベルを同定した（図１Ａ、１Ｂ）。スクリーニングアレイで得られた結果を立証するために、次に、試験群において、実時間ＲＴ−ＰＣＲおよびウエスタンブロットにより、ＧＳＴＰ１およびＴＲＡＦ２の心筋発現を予測的に実験した。これらの分析は、対照と比較した場合、ＧＳＴＰ１（Ｐ＜０．０００１）およびＴＲＡＦ２（Ｐ＜０．０００１）に関してＤＣＭおよびＩＣＭにおける心筋ｍＲＮＡ発現レベルの有意の上昇を示した（図１Ｃ）。同様に、心筋タンパク質発現レベルは、対照と比較した場合、ＧＳＴＰ１（Ｐ＜０．０００１、Ｐ＝０．００１９）およびＴＲＡＦ２（Ｐ＜０．０００１、Ｐ＝０．００５）に関して、ＤＣＭおよびＩＣＭで上昇した（図１Ｄ）。ＤＣＭおよびＩＣＭを比較した場合、ＧＳＴＰ１  ｍＲＮＡおよびタンパク質発現に有意差は認められなかった；しかし、ＴＲＡＦ２  ｍＲＮＡ（Ｐ＝０．００１）およびタンパク質（Ｐ≦０．０００１）発現レベルは、ＩＣＭと比較した場合、ＤＣＭにおいて有意に高かった（図１Ｃ、１Ｄ）。
ＪＮＫ／ｐ３８活性化におけるＧＳＴＰ１−ＴＲＡＦ２相互作用
【００５５】
ＧＳＴＰ１はＴＲＡＦ２と物理的に会合して、腫瘍細胞中で細胞内複合体を形成するため、この経路が不全心筋で活性であるか否かを確定した。心臓組織培養における本発明の分析は、ＧＳＴＰ１が、ＩＣＭおよび対照心臓においてはＴＲＡＦ２と会合するが、一方、この会合はＤＣＭにおいては有意に低い値（Ｐ＜０．０００１）で検出可能である、ということを示した（図２Ａ）。ＴＲＡＦ２は、２つの主要ＭＡＰキナーゼ（不全心筋における炎症を媒介することが知られているＪＮＫとｐ３８）を活性化すると報告されているので、試験患者における活性ｐ３８およびＪＮＫタンパク質の心筋発現を調べた。結果は、ＤＣＭおよびＩＣＭの両方において、活性ＪＮＫならびにｐ３８の心臓タンパク質発現（Ｐ＜０．０００１）は、対照と比較して、有意に上方調節される、ということを示す。さらに、ＤＣＭ患者は、ＩＣＭと比較して、有意に高い心臓ＪＮＫおよびｐ３８タンパク質発現（Ｐ＜０．０００１）を明示した（図２Ｂ）。これらの結果は、ＧＳＴＰ１−ＴＲＡＦ２会合がＤＣＭおよびＩＣＭにおいて示差的に調節されるということ、そしてこれがＭＡＰＫ活性化に影響を及ぼし得るということを示す。
ＧＳＴＰ１は心臓ＴＲＡＦ２媒介性ＪＮＫ／ｐ３８活性化を調整する
【００５６】
ＧＳＴＰ１がＴＲＡＦ２媒介性ＪＮＫおよびｐ３８活性化を調整することを確定するために、不全心臓および対照からの心臓組織培養を、３つの異なる濃度での組換えＧＳＴＰ１で処置した。結果は、ＤＣＭ、ＩＣＭおよび対照から得られたＧＳＴＰ１処置組織培養において、ＴＲＡＦ２のタンパク質発現が、非処置のものと比較して、有意に低減された、ということを示す。同様に、ＧＳＴＰ１処置後、活性ＪＮＫおよびｐ３８発現は、非処置群と比較して、ＤＣＭ、ＩＣＭおよび対照心臓組織において減少した。ＴＲＡＦ２、ＪＮＫおよびｐ３８低減に関する適用ＧＳＴＰ１濃度の比較は、ＤＣＭおよびＩＣＭにおいては、２．５μｇ／ｍＬおよび５μｇ／ｍＬならびに１０μｇ／ｍＬ間の差は有意であったが、しかし対照においては有意でなかった、ということを示す（図３Ａ、３Ｂ）。
【００５７】
外因的に補足されるＧＳＴＰ１がＧＳＴＰ１−ＴＲＡＦ２複合体形成に影響を及ぼすか否かを試験するために、ＧＳＴＰ１処置心臓組織溶解物をＴＲＡＦ２抗体とともに免疫沈降させて、免疫ペレットをウエスタンブロットに付した。結果は、ＧＳＴＰ１処置心臓組織培養では、ＧＳＴＰ１およびＴＲＡＦ２間の会合は用量および疾患非依存性であり、非処置試料と比較して有意に高かった（５μｇ／ｍＬ  ＧＳＴＰ１濃度に関してはＰ＝０．０７）、ということを示す（図３Ｃ）。
【００５８】
これらの結果は、心臓組織倍表中では、ＧＳＴＰ１はＴＲＡＦ２タンパク質発現に影響を及ぼし、そしてＧＳＴＰ１−ＴＲＡＦ２複合体形成を介してＪＮＫ１およびｐ３８活性化の負の調節因子として作用する、ということを示す。
ＴＮＦ−αはＤＣＭにおいてＧＳＴＰ１に対するＴＲＡＦ２／ＪＮＫ／ｐ３８カスケードの感受性を阻害する
【００５９】
ＧＳＴＰ１が、不全心筋における報告されたＴＮＦ−α誘導性ＪＮＫおよびｐ３８活性化と相互作用するか否かを確定するために、ＤＣＭ、ＩＣＭおよび対照から単離された心臓組織培養を、組換えＴＮＦ−αで、その後、ＧＳＴＰ１（５μｇ／ｍｌ）で処置した。これらの実験は、ＴＮＦ−α活性化ＪＮＫ（Ｐ＝０．０８）およびｐ３８（Ｐ＝０．７５）カスケードならびにＴＲＡＦ２（Ｐ＝０．１８）タンパク質発現が、ＤＣＭ心臓組織培養中の組換えＧＳＴＰ１により影響を及ぼされない、ということを実証する。しかしながら、ＩＣＭおよび対照から単離された培養中では、ＪＮＫ（Ｐ＜０．００１；Ｐ＜０．００２）、ｐ３８（Ｐ＜０．０００２；Ｐ＜０．０００１）およびＴＲＡＦ２（Ｐ＜０．００１；Ｐ＜０．００３）タンパク質発現は、ＧＳＴＰ１刺激に応答して顕著に低減される（図４Ａ）。ＤＣＭ対ＩＣＭ群に関して得られた相違する結果を理解するために、ＴＮＦ−αおよびＧＳＴＰ１で処置した心臓組織溶解物を免疫沈降指せて、免疫ペレットをウエスタンブロットに付した。これらの分析は、ＤＣＭ心臓組織中ではＴＮＦ−α刺激後にＧＳＴＰ１はＴＲＡＦ２と会合できない、ということを示す（図４Ｂ）。しかしながら、この作用は、ＩＣＭおよび対照心臓組織中では認められなかった（図４Ｃ）。これらのデータは、５μｇ／ｍｌ  ＧＳＴＰ１でのＤＣＭ心臓組織培養中では、ＴＮＦ−α媒介性ＴＲＡＦ２はＧＳＴＰ１と結合できない、ということを示す。
ＧＳＴＰ１は高濃度でのＴＮＦ−α処置後にＴＲＡＦ２媒介性ＪＮＫ１／ｐ３８下方調節を救出する
【００６０】
ＤＣＭにおけるＴＲＡＦ２心臓組織タンパク質発現はＩＣＭおよび対照と比較して約２倍高いということに留意し、そして上記の結果を考慮しながら、ＴＮＦ−α処置後のより高いＧＳＴＰ１濃度の作用を試験した。結果は、ＧＳＴＰ１（１０μｇ／ｍＬ）およびＴＮＦ−α（５０ｎｇ／ｍＬ）で処置したＤＣＭ心臓組織培養が、顕著に低減されたＪＮＫおよびｐ３８活性化を発現し、ならびに低減されたＴＲＡＦ２タンパク質を発現する、ということを実証する（Ｐ＜０．０００１：図５Ａ、５Ｂ）。重要なことは、ＤＣＭ心臓組織溶解物の免疫沈降物が、５ｍｇ／ｍｌ  ＧＳＴＰ１と比較して、１０μｇ／ｍｌでのＧＳＴＰ１−ＴＲＡＦ２会合の有意の（Ｐ≦０．０３５）増大を実証する、ということである。
【００６１】
これらのデータは、より高いＧＳＴＰ１濃度が、ＧＳＴＰ１−ＴＲＡＦ２複合体形成によりＤＣＭにおけるＴＮＦ−α誘導性ＪＮＫおよびｐ３８活性化を抑制し、そしてＴＲＡＦ２発現にも影響を及ぼす、ということを示す。
【００６２】
本発明の実施例では、ＧＳＴＰ１およびＴＲＡＦ２は、ＣＭＰの新規の調節物質として同定された。ＧＳＴＰ１およびＴＲＡＦ２間の相互作用は、悪性腫瘍において以前に同定されている（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）が、しかしながら、ＣＭＰとの結びつきは以前には示唆されていない。興味深いことに、ＴＲＡＦ２と会合するＧＳＴＰ１の能力は、ＴＮＦ−α依存的に、ＤＣＭおよびＩＣＭ間で異なる。ＣＭＰにおけるＴＮＦ−αシグナル伝達の前炎症性役割の壊滅は十分に確立されているが、しかし臨床試験は、逆説的に、ＣＭＰにおけるＴＮＦ−αのより複雑な役割を示した。したがって、ＴＮＦ−αシグナル伝達に関連した特定経路の標的化は、ＣＭＰ処置におけるより選択的なアプローチを提供し得た。ＴＲＡＦ２は、ＭＡＰＫ活性化を媒介するＴＮＦ−αシグナル伝達の中心的調節物質である。同時に、ＧＳＴＰ１は、ＴＲＡＦ２との会合によりＭＡＰＫ活性化を阻止し、その結果、ＴＮＦ−αシグナル伝達を抑制し得る。本発明のデータは、ＩＣＭおよび対照と比較下場合の、ＤＣＭ心筋における活性ＪＮＫおよびｐ３８の有意の上昇を示す。
【００６３】
ＧＳＴＰ１の細胞内貯蔵に組換えＧＳＴＰ１タンパク質を補給すると、ＭＡＰＫシグナル伝達の抑制により全身性および局在性炎症応答を有効に抑圧することが実証された、ということは重要である。興味深いことに、この試験２置いてネイティブＤＣＭ心筋中に観察された知見と対比して、組換えＧＳＴＰ１は、ＪＮＫおよびｐ３８活性化の抑制、ならびに心臓組織培養中での総ＴＲＡＦ２タンパク質発現低減を誘導した。この作用は、すべてのＧＳＴＰ１処置心臓細胞培養におけるＧＳＴＰ１−ＴＲＡＦ２会合のかなりの増大を伴った。さらに、ＴＲＡＦ２−ＪＮＫ／ｐ３８系に及ぼすＧＳＴＰ１減衰の最大作用は、５μｇ／ｍｌで観察されたが、さらなる濃度増大による影響は受けなかった。これらの結果は、心臓組織に関して得られたものと矛盾する。しかしながら、ＧＳＴＰ１処置後、活性ＪＮＫ／ｐ３８およびＴＲＡＦ２の発現レベルは、ＤＣＭ患者からの培養中で最高であった。ＩＣＭおよび対照心臓組織培養と比較した場合の、ＧＳＴＰ１インキュベーション時のＧＳＴＰ１−ＴＲＡＦ２複合体形成における差はＤＣＭにおいては観察されなかったため、付加的因子は、ＣＭＰにおけるＧＳＴＰ１−ＴＲＡＦ２会合の細胞内調節には関与し得なかった。心筋試料の分析により得られたデータとｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験で得られたデータとの間の相違点は、ネイティブ心筋中には普通に存在するが、心臓組織培養中には存在しない可溶性の循環因子の存在により説明され得る。ＴＮＦ−αはＣＭＰ患者の血清中で非常に増大し、根元的病態と密接に関連づけられるため、心臓組織培養は予備インキュベートされた後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおけるＴＮＦ−αの作用を導入するために組換えＧＳＴＰ１を投与する。珍しいことに、ＴＮＦ−α刺激心臓組織培養を５μｇ／ｍｌのＧＳＴＰ１とともにインキュベートしても、ＩＣＭ心臓培養におけるＧＳＴＰ１−ＴＲＡＦ２会合に影響を及ぼさないが、一方、ＤＣＭ心臓培養中では、ＧＳＴＰ１−ＴＲＡＦ２複合体形成は完全に阻止された。さらに、活性ＪＮＫ／ｐ３８ならびにＴＲＡＦ２の高発現は、変化することなく、ＤＣＭ心臓組織培養中で専ら観察された。これらの結果は、心筋生検の分析により得られるものと一致し、そして、ＤＣＭ患者におけるＧＳＴＰ１−ＴＲＡＦ２相互作用損傷がＭＡＰＫの活性増大を引き起こす、ということを完全に支持する。
【００６４】
これらのデータは、ＧＳＴＰ１濃度のさらなる増大はＧＳＴＰ１−ＴＲＡＦ２会合を回復させて、ＴＮＦ−α刺激時のＤＣＭ心臓組織培養中でのＪＮＫ１およびｐ３８活性を抑制する、ということを示す。これらの結果は、ＤＣＭ病態と専ら関連するＧＳＴＰ１−ＴＲＡＦ２結合のＴＮＦ−α誘導性減衰が高濃度のＧＳＴＰ１により阻止され得る、ということを示す。さらに、ＩＣＭ心臓組織培養中では、ＪＮＫ１およびｐ３８活性の両方が、用量およびＴＮＦ−α非依存的に、組換えＧＳＴＰ１により抑制される、ということが実証された。これらの結果は、ＩＣＭにおけるＧＳＴＰ１作用がＴＲＡＦ２非依存的方法により生じ得る、ということを示す。
【００６５】
要するに、これらの結果は、ＴＮＦ−α／ＴＲＡＦ２を調整するに際してのＧＳＴＰ１の新規の機能がＤＣＭにおけるＪＮＫ１／ｐ３８活性化を引き出した、ということを示す。さらに、ＧＳＴＰ１−ＴＲＡＦ２会合は、ＧＳＴＰ１濃度依存的に、ＤＣＭ心筋におけるＴＮＦ−α刺激により保護されるが、しかしＩＣＭまたは対照においてはそうではない。これらの知見（公開後要約：Ａｈａｒｉｎｅｊａｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １２０  （Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２００９），  Ｓ９０５；  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ：Ｈａｂｅｒｚｅｔｔｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １２０  （Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２００９），  Ｓ７１８も参照）は、ＧＳＴＰ１の高炎症作用を標的にする信頼できる、進歩的治療戦略としての本発明の機能性を示す。
２．：血清ＧＳＴＰ１はＣＭＰの感受性マーカーである
患者および方法
患者
【００６６】
この試験は、ウィーン医科大学の倫理委員会により認可された。患者（ＥＦ≦３５％；ｎ＝４０）および健常志願者（ＥＦ≧６５％；ｎ＝４０）の血清試料を、初期アレイ分析のために用いた。次いで、登録されるためにインフォームド・コンセントを示した合計１６１名の患者が、予測的に含まれた。試験群は、心臓移植を予定された１４１名の末期ＣＭＰ患者、ならびに慣用的分離大動脈または僧帽弁手術を受けている保持的ＥＦを有する患者２０名で構成された。２名の個々の心臓学者による心室機能および標準血行動態パラメーターの評価のために、全患者が、心エコー検査、冠動脈血管造影、右心臓カテーテル処置を受けた。病歴、臨床試験結果および処置を文書に記録し、暗号化して、血清試料の研究者には伏せた。
【００６７】
試験患者を、以下のように、心エコーにより査定される左心室ＥＦに基づいた群に細分した：ＥＦ＞５２％；ＥＦ  ５２〜４３％；ＥＦ  ４２〜３３％、ＥＦ  ３２〜２３％およびＥＦ≦２２％（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１９  （２００９）  ３０７０‐３０７７）。対照群（ｎ＝２０）は、男性１０名および女性１０名（年齢３０〜６１歳）（５１．８±３．２歳）で構成された。
血清および心臓組織収集
【００６８】
末梢静脈血試料を、ＣＭＰ診断時あるいは移植直前に収集した（Ａｈａｒｉｎｅｊａｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．  ９  （２００９ｂ），  １４９−１５９）。血清試料を暗号化し、分析まで液体窒素中に保存した。移植患者（ＥＦ≦３５％；ｎ＝４０）の外植心臓の前左心室壁（ＬＶ）から、ならびに質的理由のために移植されえなかった２０のドナー心臓（ＥＦ≧６５％、平均年齢４５±１０、男性１２名、女性８名）から、多数の心筋生検を得て、暗号化し、液体窒素中に瞬間凍結した。
血清および心臓組織タンパク質アレイ
【００６９】
タンパク質アレイのために、移植直前に末期ＣＭＰ患者から、ならびに健常志願者から、無作為選択血清試料を得て、各群のためにプールした。心臓組織タンパク質アレイに関しては、移植患者（ｎ＝４０）における外植心臓およびドナー対照心臓（ｎ＝２０）のＬＶ心筋生検からの組織溶解物（Ａｂｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｒｃ．  Ｒｅｓ．  ８７  （２０００），  ６４４‐６４７）を用いた。メーカーのプロトコールに従って、抗体マイクロアレイ５００（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  ＣＡ；  ５０７  ｐｒｏｔｅｉｎ）で、タンパク質アレイを実施した。各試料中のタンパク質を２つの異なる蛍光染料（Ｃｙ３およびＣｙ５）で標識して、マイクロアレイ抗体被覆スライド上でインキュベートした。両スライドのタンパク質蛍光シグナルを、ＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ｂスキャナ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，  Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，  ＣＡ）により検出した。自動化マイクロアレイ分析ワークブック（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏ．ｃｌｏｎｔｅｃｈ．ｃｏｍ）を用いて、内部正規化比率（ＩＮＲ）を算定することにより、シグナルの定量を実施した。
ＧＳＴＰ１およびプロＢＮＰ検定
【００７０】
ＧＳＴＰ１に関する酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）（ＨＥＰＫＩＴ（商標）−Ｐｉ、Ｂｉｏｔｒｉｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｔｄ．，  Ｄｕｂｌｉｎ，  Ｉｒｅｌａｎｄ）を、メーカーのプロトコールに従って実施した。９６ウェル自動マイクロプレート読取器（Ａｎｔｈｏｓ，  Ｓａｌｚｂｕｒｇ，  Ａｕｓｔｒｉａ）を４５０ｎｍで用いて、分光測光的に基質反応を定量した。Ｒｏｃｈｅ  Ｅｌｅｃｓｙｓ  ２０１０分析器での化学発光非競合的ＥＬＩＳＡ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  ＩＮ）により、自動的に、非希釈血清中で、Ｎ末端プロＢＮＰを測定した。
ｍＲＮＡ単離および定量的実時間ＲＴ−ＰＣＲ
【００７１】
ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）を、ＭａｇＮＡライザー系（Ｒｏｃｈｅ，  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）とともに用いて、ＬＶ生検から総ＲＮＡを単離した。記載されたとおりに（Ａｈａｒｉｎｅｊａｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９ｂ，  Ａｂｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ機器（Ｒｏｃｈｅ）で、実時間ＲＴ−ＰＣＲを実施した。プライマー配列は、センス／アンチセンス：
ＧＳＴＰ１：  ５’−ＣＣＡＡＡＧＧＴＧＧＴＧＡＧＣＴＴＣＡＴ−３’／５’−ＴＣＴＡＣＣＣＡＧＣＡＴＧＧＡＧＧＡＡＣ−３’；
およびβ２−マイクログロブリン：  ５’−ＧＡＴＧＡＧＴＡＴＧＣＣＴＧＣＣＧＴＧＴＧ−３’／５’−ＣＡＡＴＣＣＡＡＡＴＧＣＧＧＣＡＴＣＴ−３’であった。ハウスキーピング遺伝子としてのβ２−マイクログロブリンシグナルに対してＧＳＴＰ１のｍＲＮＡ発現レベルを正規化した（Ａｈａｒｉｎｅｊａｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９ｂ；Ａｂｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）。各試料における３回のＰＣＲ測定値の平均を、データ分析のために用いた。
ウエスタンブロット分析
【００７２】
組織溶解物を調製し（Ａｈａｒｉｎｅｊａｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９ｂ）、一次ヒトモノクローナル抗ＧＳＴＰ１抗体を用いて、ウエスタンブロットによりＧＳＴＰ１発現を分析した（Ｂｅｔｈｙｌ，  Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，  ＴＸ）。タンパク質帯域をＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアにより定量し、特定タンパク質シグナルを負荷対照に対して正規化した。各試料における３回の測定の平均値を、データ分析のために用いた。
統計学的分析
【００７３】
分散の分析（一方向ＡＮ−ＯＶＡ；テューキー検定）により、患者群間で、ＧＳＴＰ１およびプロＢＮＰ血清濃度を比較した。ＧＳＴＰ１およびプロＢＮＰ間の関係、ならびにＧＳＴＰ１と、年齢、ＰＡＰ、ＰＣＷＰ、ＰＶＲ、心指数およびクレアチニンの関係を調べるために、スピアマンの順位相関係数（ｒＳ）を計算した。単変量ロジスティック回帰を用いて、ＥＦの予測子としてのＧＳＴＰ１およびプロＢＮＰの有用性を記述する。対応する受信者動作特性曲線（ＲＯＣ）分析を用いて、最適カットオフ値を見出した。ＧＳＴＰ１およびプロＢＮＰカットオフの感受性および特異性を、表分析により算定した。統計学的分析はすべて、ウィンドウズ（登録商標）、バージョン９．１．３およびエンタープライズガイド、バージョン４．１に関するＳＡＳシステム（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  Ｉｎｃ．，  Ｃａｒｙ，  ＮＣ）を用いて実施した。統計学的有意をＰ＜０．０５に設定した。結果を、平均±標準偏差（ＳＤ）で表す。
結果
ＧＳＴＰ１はＣＭＰと関連する
【００７４】
試験患者の人口統計学的データ、臨床特性および主なＣＭＰ関連医薬剤を、表２に示す。
表２：試験患者の人口統計学的データ、臨床特性および主なＣＭＰ関連医薬剤
【表４】
0005863660.tif 000005
ＤＣＭ＝拡張型心筋症；  ＥＦ＝左心室駆出率；  ＩＣＭ＝虚血型心筋症；  ＩＤＤＭ＝インスリン依存性真性糖尿病；  ＮＩＤＤＭ＝非インスリン依存性真性糖尿病；  ＮＹＨＡ＝ニューヨーク心臓協会；  ＰＡＰ＝肺動脈圧；  ＰＣＷＰ＝肺毛細管楔入圧；  ＰＶＲ＝肺血管抵抗。
【００７５】
選択ＣＭＰ患者におけるプール化血清試料の標的化タンパク質アレイスクリーンにおいて、ＧＳＴＰ１は、ＣＭＰと会合されるべき新規のタンパク質と同定された。図６Ａは、ＧＳＴＰ１のアレイ画像を示し、そして、その血清タンパク質レベルが、健常志願者と比較した場合、ＣＭＰ患者において増大される、ということを示す。これらのスクリーニング分析後、ＧＳＴＰ１特異的ＥＬＩＳＡによるスクリーニング分析のために選択された同一患者コホートにおいて、血清ＧＳＴＰ１濃度を確定した。これらの結果は、血清ＧＳＴＰ１濃度が、対照試料と比較した場合、末期ＨＦ患者において有意に上方調節された、ということを示す（図６Ｂ、Ｐ≦０．００１）。
【００７６】
心筋ＧＳＴＰ１タンパク質レベルについて習得するために、血清アレイにより分析された同一末期ＨＦ患者のＬＶ心筋試料を用いて、組織タンパク質プロファイリングを開始して、対照として供与心臓のＬＶ心筋生検を用いた。組織プロファイリングの結果は、対照と比較した場合、末期ＨＦ患者の心筋２置いて、ＧＳＴＰ１発現レベルの上昇を示した（図６Ｃ）。これらの知見を実証するために、ウエスタンブロット分析を心臓組織に関して実施し、対照と比較して、末期ＨＦ患者において、ＧＳＴＰ１タンパク質発現レベルの有意の上方調節が見出された（Ｐ＜０．００１；図６Ｄ）。
ＧＳＴＰ１およびプロＢＮＰとＥＦとの関連
【００７７】
ＧＳＴＰ１とＣＭＰの関連を理解するために、その血清レベルを全試験患者で分析して、これらの結果を患者のＥＦに関してプロットした。駆出率保持および低減間の弁別を可能にするこの型の分析を選択することにより、他のすべてのＥＦ群と比較して、ＥＦ≦２２％を有する患者において、有意に高い血清ＧＳＴＰ１濃度が見出された（図７Ａ；Ｐ＜０．０００１）。さらに、２３〜３２％および３３〜４２％間のＥＦを示すＣＭＰ患者は、４３〜５２％または＞５２％のＥＦを示すものと比較して、有意に高いＧＳＴＰ１血清濃度を有した（図７Ａ；Ｐ＜０．０００１）。血清プロＢＮＰに関する同一型の分析は、本発明の患者コホートにおいて、ＥＦ≦２２％を示すものだけが、他のＥＦ群すべてと比較した場合、有意に高い血清プロＢＮＰ濃度（Ｐ＜０．０００１）を示す、ということを明示したが、但し、３３〜４２％のＥＦを示す患者は除く（図７Ｂ）。他のＥＦ群を比較した場合、循環プロＢＮＰに関しては有意差は観察されなかった。全集団において、ＧＳＴＰ１およびプロＢＮＰ間に有意の正の関係が認められた（ｒ＝０．４７、Ｐ＜０．０００１；図７Ｃ）。
ＣＭＰにおけるプロＢＮＰと比較した場合の血清ＧＳＴＰ１の診断値
【００７８】
血清ＧＳＴＰ１およびプロＢＮＰとＥＦとの相関を例証するために、すべての試験患者を含めたスケーター・プロット分析を実施した（図８Ａ）。これらの分析は、ＧＳＴＰ１およびＥＦ間の有意の負の相関（ｒ＝−０．７４；Ｐ＜０．０００１）を明示したが、これは、プロＢＮＰおよびＥＦ間の相関（ｒ＝−０．２７；Ｐ＝０．０００６）より高かった。ＥＦ≦２２％に関するＲＯＣ曲線分析において血清ＧＳＴＰ１測定値を入れる場合（これは、単変量ロジスティック回帰分析においてＧＳＴＰ１およびプロＢＮＰの両方に関して優位に異なると道程された）、≧２２６ｎｇ／ｍｌの最適カットオフレベルで、血清ＧＳＴＰ１は、ＥＦ≦２２％を同定するために８１％の感受性および８２％の特異性を有した（ＡＵＣ＝０．８９１、Ｐ＜０．０００１）。≧５２７ｐｇ／ｍｌのカットオフレベルでの同一型の分析は、ＥＦ≦２２％を示すＣＭＰ患者を診断するために９７％の感受性および２６％の特異性を明示した（ＡＵＣ＝０．６２４、Ｐ＝０．００３９）（図８Ｂ）。次いで、高ＥＦ患者群を診断するＧＳＴＰ１血清レベルの能力を、上記の単変量分析により示されたように、分析した（プロＢＮＰは、ＥＦ＞２２％を示す患者群間で有意に異ならなかった）。ＲＯＣ曲線分析は、≧７６ｎｇ／ｍｌの最適カットオフレベルでのＧＳＴＰ１が、９３％感受性および１００％特異性でＥＦ≦４２％を示すＣＭＰ患者を診断する（ＡＵＣ＝０．９７４、Ｐ＝０．０００８）、ということを示した（図８Ｃ）。
ＧＳＴＰ１およびプロＢＮＰと人口統計学的および臨床的パラメーターとの相関
【００７９】
ＧＳＴＰ１およびプロＢＮＰと試験患者の臨床的特性との間の関連を、表３に示す。
表３：ＧＳＴＰ１およびプロＢＮＰと試験患者の臨床的変数との間のスピアマン相関分析
【表５】
0005863660.tif 000006
ＥＦ＝駆出率；  ＰＡＰ＝肺動脈圧；  ＰＣＷＰ＝肺毛細管楔入圧；  ＰＶＲ＝肺血管抵抗。
【００８０】
血清ＧＳＴＰ１（ｒ＝−０．１３７；Ｐ＝０．０２４１）およびプロＢＮＰ（ｒ＝０．１７５；Ｐ＝０．２５９）の両方に関して、単にわずかに、しかし関連しない患者年齢との相関が、試験患者間に見出された。血清ＧＳＴＰ１濃度と、肺動脈圧、肺毛細管楔入圧、肺血管抵抗、血清クレアチニンレベルおよび心指数との間の有意の相関は、観察されなかった。同様に、性別および真性糖尿病との関連（Ｐ≧０．４０８）は、血清ＧＳＴＰ１およびプロＢＮＰに関しては観察されなかった。
【００８１】
証拠に基づいた管理の私用における有意の処置ギャップは、無作為臨床試験からの楽観的結果にもかかわらず、存続する。漸増的に有効な臨床ツールとしての心臓バイオマーカーの出現は、治療を首尾よく導き、疾患負荷を低減する可能性を示唆する。革新的試験は、ＣＭＰにおける診断的および予後的値の種々の新規の分子マーカーを同定してきた。プロＢＮＰは、ＣＭＰモニタリングにおける代理のパラメーターとして一般に許容されており、さらに、臨床的ルーチン作業はＣＭＰ患者における拡散的結果を示す。したがって、本発明の試験の目的は、低減されたおよび保持されたＥＦの両方を有するＣＭＰ患者のモニタリングを可能にする非侵襲性および迅速応答性ＣＭＰ血清マーカーを見出すことであった。本発明による標的化スクリーニングは、ＧＳＴＰ１が末期ＣＭＰと関連する、ということを示した。血清ＧＳＴＰ１濃度は、具体的には、われわれの患者コホートにおける人口統計学的および臨床的特性とは関係なく、ＥＦとの有意の関連を示すＣＭＰを診断した。注目すべきは、プロＢＮＰと比較して、顕著に高い相関係数が、血清ＧＳＴＰ１とＥＦとの関連に関して示されたことである。さらに、血清ＧＳＴＰ１は、プロＢＮＰと比較して、ＥＦ≦２２％を有するＣＭＰ患者においてより良好な診断力を示す。さらに重要なことは、ＧＳＴＰ１はＥＦ≦４２％を診断したが、一方、プロＢＮＰは出来なかったことである。
【００８２】
ＥＦがＣＭＰ患者における心臓危険性の決定因子である、ということは十分に確立されている。すべての原因死亡率に関する危険率は、４５％より低いＥＦにおける１０％毎の低減に関して３９％増大した。しかしながら、ＣＭＰ臨床特徴は、保持ＥＦを有するＣＭＰとして言及されるＥＦ＞４５％を示す患者において生じ得る。したがって、ＧＳＴＰ１がＥＦ≦４２％を有するＣＭＰ患者を区別し得る、という本発明の知見は、重要な診断的および予後的意義を有する。プロＢＮＰはＣＭＰ診断に関する確立されたツールであり、ＥＦと相関するが、しかしプロＢＮＰに関して報告された値は、全く拡散的であり、保持ＥＦおよび低減ＥＦを有するＣＭＰにおいて明らかに上昇して、その限定臨床的用途を生じる。他方、プロＢＮＰは、ＣＭＰに起因する症候を有する患者において正常ＥＦを示すＣＭＰの排除のために主に用いられることを推奨される。しかしながら、性別および高齢がより高いプロＢＮＰレベルと関連することを考えると（Ｃｏｓｔｅｌｌｏ−Ｂｏｅｒｒｉｇｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｏｌｌ．  Ｃａｒｄｉｏｌ．  ４７  （２００６），  ３４５‐３５３）、プロＢＮＰの提示された診断特性は、高齢患者における保持ＥＦを示すＣＭＰを識別するには非特異的過ぎるかもしれない。
【００８３】
報告によれば、プロＢＮＰは、ＥＦ＜４５％を有するＣＭＰ集団において、それぞれ９０％および７１％の感受性および特異性でＥＦ＜３０％を予測し得る。他の試験は、血漿プロＢＮＰが、ＥＦ＜５０％を示す患者コホートにおいて７７％感受性および６９％特異性でＥＦ＜２８％を検出することを報告し、そして、プロＢＮＰは、０．６９の曲線下面積でＥＦ＜４０％を予測し得る、ということが見出された。本発明の試験において、プロＢＮＰは９７％感受性を有したが、しかし特異性は２６％に過ぎず、０．６２の曲線下面積でＥＦ≦２２％を検出した。本発明の試験におけるプロＢＮＰのより低い特異性は、他の試験と比較した場合、より低いＥＦを同定するためにわれわれのカットオフレベルが選択された、という事実により説明され得る。この判定基準は、ＥＦ≦２２％を診断するためのＧＳＴＰ１の有用性を実証するために選択された。さらに、本発明の試験は、ＥＦに関する排除判定基準を有さず、そしてこれは、保持ＥＦを示すＣＭＰ患者において代わることが以前に示されたプロＢＮＰに関する試験特性に影響を及ぼしてきた。
【００８４】
ＣＭＰ患者における血清ＧＳＴＰ１増大の理由は、不明である。しかしながら、ＧＳＴＰ１がストレスシグナル伝達の調節に関与し、その非触媒性リガンド結合活性によるアポトーシスに対して細胞を保護するという証拠が蓄積されつつある。
【００８５】
本発明の試験の結果は、ＧＳＴＰ１が、ＣＭＰにおいて、プロＢＮＰより優れた感受性の、特異的な、安価な且つ迅速に測定可能な血清マーカーである、ということを示す。重要なことは、ＧＳＴＰ１が高感受性および特異性で保持および低減ＥＦ間を識別することであり、したがって、ＣＭＰ患者における臨床試験を進行させる新規のツールとして役立ち得る。
３．：ＧＳＴＰ１処置に関する動物ＩＨＤおよびＣＭＰモデル
【００８６】
ヒトにおけるＩＨＤおよびＣＭＰの両方を模倣するモデルを有するために、ラットにおける左冠動脈の前枝の結紮のモデルが、本発明の原理をさらに立証するために選択された。このモデルでは、ＩＨＤは上記冠動脈枝の結紮後に誘導され、そして時が経つと、動物はその後、ＣＭＰを発症する。したがって、当該モデルは、ＩＨＤおよびＣＭＰの両方の防止または処置のための示唆された本発明の効力を示すために最良に適合される。
【００８７】
Ａｈａｒｉｎｅｊａｄ等（Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．  Ｒｅｓ．  ７９  （２００８），  ３９５‐４０４）により発表されたプロトコールに従って、以下の実験を実施する。当該研究は、アメリカ国立衛生研究所発行の実験動物の管理と使用に関する指針（ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ８５‐２３，  ｒｅｖｉｓｅｄ  １９９６）に従っており、そしてウィーン医科大学の倫理委員会により確証される。Ｓｅｙｅｄｈｏｓｓｅｉｎ  Ａｈａｒｉｎｅｊａｄ教授（Ｄｒ．，  ＭＤ，  ＰｈＤ）は本試験の実施の設計および指示を指揮する。
【００８８】
雄Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｅｙラット（Ｈａｒｌａｎ，  Ｂｏｒｃｈｅｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を、実験のために暗号化する。心筋梗塞（ＭＩ）後の予測される血行動態的妥協、心室細動、心筋断裂および出血のため、生存動物の数は、約６０〜７０％と予測される。したがって、心筋梗塞を有する各群において、合計１８匹の動物が含まれる。ラットは、ケタゾル（１００ｍｇ／体重１ｋｇ）およびロムプン（１０ｍｇ／体重１ｋｇ）の腹腔内注射で麻酔され、１４ゲージカテーテルを用いて気管に挿管されて、５５サイクル／分で１．５％イソフルランを通気され（１回換気量：２．５ｍｌ）、その後、左側開胸手術を受けた。左冠動脈（ＬＣＡ）の前枝を、７−０ポリプロピレン係締（Ｅｔｈｉｃｏｎ，  Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，  ＮＪ）と結紮するか、または擬似手法で無傷のままにした。ＭＩ後７日（ｄ）目に、左心室（ＬＶ）機能を心エコーにより査定する。ついで、匹敵する基線心機能を有する動物を暗号化して、表４に示すように群１〜８に割り当てる。ＭＩ後に予測される疼痛を処置するために、ＭＩ誘導直後、ならびにＭＩ後１日目に、動物に０．６ｍｇ／体重１００ｇのピリトラミド（５％グルコース溶液中のジピドロール（登録商標））を皮下投与する。さらに、０．６ｍｇ／体重１００ｇで３日間、飲料水を介して（水２５０ｍｌ＋５％グルコース溶液２０ｍｌ）、そしてＭＩ後４〜７日目には０．３ｍｇ／体重１００ｇで、ピリトラミドを摂取させる。
【００８９】
７日目、ＭＩ誘導直後、群１〜４において、以下のように処置を開始する。群１は、毎日、リンガー溶液の腹腔内注射を２週間施され（対照）、一方、群２〜４は、毎日、１０、２０および４０ｍｇ／体重の用量で２週間、それぞれ組換えＧＳＴＰ１を注射される。２１日目に、群５〜８において、以下のように処置を開始する。群５は、毎日、リンガー溶液の腹腔内注射を２週間施され（対照）、一方、群６〜８は、毎日、１０、２０および４０ｍｇ／体重の用量で２週間、それぞれ組換えＧＳＴＰ１を注射される。群９は、１０匹の動物を含み、擬似手法を施される。５２日目および８６日目に、ＬＶ機能を再査定して、ＭＩ後８８日目に、動物を屠殺する。
表４：動物群およびその処置
【表６】
0005863660.tif 000007
ｂｗ：  体重
【表７】
0005863660.tif 000008
【００９０】
以下のパラメーターを評価する（１〜１１）：
１．  ＬＶ駆出率（ＥＦ）、ＬＶ収縮終期容積（ＥＳＶ）、ＬＶ拡張終期容積（ＥＤＶ）：心エコー使用
２．  心臓対体重比
３．  梗塞サイズ、梗塞壁厚および繊維症に関する組織学および免疫細胞化学知見、ならびに血管新生、炎症性タンパク質、例えばｐ３８、ｊｕｎキナーゼおよびインターロイキン（炎症性経路に関する例のみを記述）
４．  シグナル伝達経路
５．  プロモーター結合検定
６．  アポトーシス評価のためのＴＵＮＥＬ検定
７．  定量的ＲＴ−ＰＣＲならびにウエスタンブロット、そしてＧＳＴＰ１の評価のための、ならびにその経路、ＴＲＡＦ、ＴＮＦ−αおよびその受容体に関連した免疫沈降；ＭＭＰおよびそれらの阻害薬ＴＩＭＰ、ＶＥＧＦ−Ａおよびその受容体（ここでは単なる例を記述）
８．  血清ＧＳＴＰ１レベルおよび関連タンパク質のＥＬＩＳＡ。
【００９１】
データはすべて暗号化し、マイクロソフトＡＣＣＥＳＳを用いて保存した。変量の分析（ＡＮＯＶＡ；ｔ検定または非パラメーターＡＮＯＶＡ）およびカイ二乗検定を、分析されるべきパラメーター（数字式、文字数字式、正規分布またはノット）の依存度に基づいて用いて、群間のデータを比較する。スピアマンの相関検定およびロジスティック回帰分析を用いて、評価パラメーター間の相関を査定する。ＳＡＳバージョン９．１．３を、統計学的分析のために用いる。
４．：急性心筋梗塞および虚血誘導性心不全のラットモデルにおける炎症、心臓形態および機能に及ぼすＧＳＴＰ１処置の作用
【００９２】
以下の実験は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼＰ１−１（ＧＳＴＰ１）処置が、急性心筋梗塞後に活性化される炎症カスケードを相殺するに際して、そして、許容実験ラットモデルにおいてその結果生じる虚血誘導性心不全の過程において、有益であるか否かという原理を立証する。
材料および方法
動物および心筋梗塞モデル
【００９３】
実験はすべて、ウィーン医科大学の実験動物の管理および使用委員会により認可された。総数６０匹の雄Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｅｙラット（Ｈａｒｌａｎ，  Ｂｏｒｃｈｅｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を、実験のために暗号化した。心筋梗塞後の血行動態的妥協、心室細動、心筋断裂および出血のため、匹敵する基線心機能を有する生存動物の数は、４８であった。ラットを麻酔し、気管挿管して、酸素／イソフラウラン混合物を通気下後、左側開胸手術を施した。次に、左冠動脈の枝を、７−０ポリプロピレン係締（Ｅｔｈｉｃｏｎ，  Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，  ＮＪ，  ＵＳＡ）と結紮した。組換えＧＳＴＰ１（１ｍｇ／ｋｇ：１ｍｌのリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に溶解；ｎ＝２４）（Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎ，  Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，  ＭＩ）または１ｍｌ  ＰＢＳ（ｎ＝２４）の腹腔内単一回用量注射を、心筋梗塞の１時間後に適用した。左心室（ＬＶ）機能を、下記のように心筋梗塞誘導後１日（ｎ＝４８）および３週間（ｎ＝２４）に、心エコーにより査定した。次いで、各群における総数１２匹の動物を、処置１日後に屠殺し；各群の残りの１２匹を、心筋梗塞誘導後３週間で屠殺した（Ａｈａｒｉｎｅｊａｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）。
心エコー血行動態測定
【００９４】
麻酔ラットにおいて、最大ＬＶ長軸長（Ｌ）および心臓内領域追跡を、１５ＭＨｚ線状アレイスキャンヘッドを用いて測定して、ＬＶ拡張終期（ＬＶＥＤＶ）および収縮終期（ＬＶＥＳＶ）容積ならびに駆出率（ＬＶＥＦ＝得るＶＥＤＶ−ＬＶＥＳＶ／ＬＶＥＤＶ）を算定した。測定は、３連続心臓終期を利用した（Ａｈａｒｉｎｅｊａｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）。
組織学および免疫細胞化学知見
【００９５】
心室を、その長軸の中点で横断した後、それらを凍結するかまたはホルマリン中に浸漬固定した。パラフィン包埋検体を、Ｈ＆Ｅ、Ｔｕｎｎｅｌ検定ならびにゴールドナー３色コラーゲン染色のために用いた。メーカーのプロトコール（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  Ｂａｓｅｌ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に従って、三重反復実験で、ＴＵＮＥＬ検定（ｉｎ  ｓｉｔｕ細胞死検定キット）を実施した。スライドを４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｅｕｇｅｎｅ，  ＯＲ）で対比染色して、ＡＦ１  褪色防止剤（Ｃｉｔｉｆｌｕｏｒ，  Ｌｅｉｃｅｓｔｅｒ，  ＵＫ）中に包埋した。蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ，  Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，  ＮＹ）により、デジタル画像を得た。記載されたように（Ａｈａｒｉｎｅｊａｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）、外形測定を実行した。
ｍＲＮＡ単離および定量的実時間ＲＴ−ＰＣＲ
【００９６】
ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）およびＭａｇＮＡライザー系（Ｒｏｃｈｅ，  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、心筋組織から、総ＲＮＡを単離した（Ａｈａｒｉｎｅｊａｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）。三重反復実験での実時間ＲＴ−ＰＣＲ測定を、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ機器（Ｒｏｃｈｅ）で実施した（Ａｈａｒｉｎｅｊａｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）。プライマー配列は、センス／アンチセンス：
ＧＳＴＰ１：  ５’−ＧＧＣＡＡＣＴＧＡＡＧＣＣＴＴＴＴＧＡＧ−３’／５’−ＴＣＡＴＧＧＡＴＣＡＧＣＡＧＣＡＡＧＴＣ−３’；
主要壊死因子受容体関連因子２（ＴＲＡＦ２）：  ５’−ＧＣＡＧＡＡＧＧＴＣＴＴＧＧＡＧＡＴＧＧ−３’／５’−ＧＧＴＧＧＡＧＣＡＧＣＡＴＴＡＡＧＧＴＣ−３’；
およびβ２−マイクログロブリン：  ５’−ＧＡＴＧＡＧＴＡＴＧＣＣＴＧＣＣＧＴＧＴＧ−３’／５’−ＣＡＡＴＣＣＡＡＡＴＧＣＧＧＣＡＴＣＴ−３’であった。ｍＲＮＡ発現を算定し、対照に比してパーセンテージとして処置動物に関してプロットした。
同時免疫沈降およびウエスタンブロット
【００９７】
心臓組織溶解物を、記載どおりに調製した（Ｓｃｈａｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）。ＧＳＴＰ１−ＴＲＡＦ２、ＧＳＴＰ１−ＪＮＫ１およびＧＳＴＰ１−ｐ３８複合体検出のために、タンパク質（５００μｇ）を、ＴＲＡＦ２（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）、ＪＮＫ１およびｐ３８（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，  ＣＡ）に対する対応する抗体０．５μｇとともに免疫沈降させた。免疫複合体を、Ａ／Ｇ  ＰＬＵＳ−アガロースビーズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，  ＣＡ）とともにインキュベートして、ＧＳＴＰ１抗体（Ｂｅｔｈｙｌ，  Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，  ＴＸ）を用いて、ウエスタンブロットにより沈降させた（Ｓｃｈａｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）。ブロットを、一次ヒトモノクローナルＧＳＴＰ１（Ｂｅｔｈｙｌ）およびＴＲＡＦ２（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、またはポリクローナルホスホ−ｐ３８（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）、ホスホ−ＪＮＫ１、ＪＮＫ１およびｐ３８（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）抗体とともにインキュベートした後、二次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）とともにインキュベートした。実験はすべて、三重反復実験で実施し、発現レベルを対照負荷タンパク質に関して補正した。
統計学的分析
【００９８】
パラメーターはすべて、分散の規模によって（連続または無条件）、Ｘ２検定および分散の一方向分析（一方向ＡＮＯＶＡ；テューキー検定）により、群間で比較した。統計学的分析はすべて、ウィンドウズ（登録商標）、バージョン９．１．３およびエンタープライズガイド、バージョン４．１に関するＳＡＳシステム（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  Ｉｎｃ．，  Ｃａｒｙ，  ＮＣ）を用いて実施した。統計学的有意をＰ＜０．０５に設定した。結果を、平均±標準偏差（ＳＤ）で表す。
結果
ＧＳＴＰ１は急性ＭＩ後の炎症性サイトカインの心筋過剰発現を改善する
【００９９】
免疫沈降およびウエスタンブロット分析は、急性心筋梗塞モデルにおいて、ＧＳＴＰ１処置がＧＳＴＰ１−ＴＲＡＦ２複合体の形成を変えなかった、ということを明示した（図９Ａ）。ウエスタンブロットは、ＧＳＴＰ１が活性化ＪＮＫ１の心臓組織タンパク質レベルを低減し得る（Ｐ＜０．０１；図９Ｂ）が、しかし対照と比較して、活性化ｐ３８およびＮＦ−ｋＢのタンパク質発現レベルに差は認められない、ということを明示した。さらに、ＧＳＴＰ１は、対照と比較して、炎症性サイトカイン、例えばＴＧＦ−β、ＩＬ−１β、ＩＬ−２およびＩＬ−１７の心臓組織発現を抑制した（Ｐ＜０．１；図９Ｃ）；しかし、ＩＬ−１０発現レベルは、ＧＳＴＰ１処置後、有意に変化しなかった（図９Ｃ）。
ＧＳＴＰ１は不全心筋におけるＴＲＡＦ２調節ＮＦ−ｋＢシグナル伝達による前炎症性サイトカインの心筋発現を改善する
【０１００】
免疫沈降およびウエスタンブロット分析は、ＧＳＴＰ１処置ラットが、対照と比較して、ＭＩ後３週目に、それらの不全心臓組織において、ＧＳＴＰ１−ＴＲＡＦ２、ＧＳＴＰ１−ＪＮＫ１およびＧＳＴＰ１−ｐ３８複合体の形成の有意の増大を示す、ということを明示した（Ｐ＜０．００１；図１０Ａ）。さらに、ＧＳＴＰ１処置ラットは、対照と比較して、それらの不全心臓組織において、活性化ＪＮＫ１およびｐ３８のタンパク質発現の有意の低減を示した（Ｐ＜０．００１；図１０Ｂ）。さらに、ＧＳＴＰ１処置ラットは、対照と比較して、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１β、ＩＬ−２およびＩＬ−１７のより低い心臓組織ｍＲＮＡ発現を示した（Ｐ≦０．００１；図１０Ｃ）。これに対比して、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０の心臓組織ｍＲＮＡ発現は、対照と比較して、ＧＳＴＰ１処置動物において有意に増大された（Ｐ＜０．００１；図１０Ｃ）。これらの結果は、ＧＳＴＰ１処置が、ＴＲＡＦ２媒介性ＪＮＫ１、ｐ３８およびＮＦ−ｋＢ前炎症性シグナル伝達を抑制し、そして虚血誘導性心不全における心筋サイトカイン発現を改善する、ということを示す。
ＧＳＴＰ１はラット不全心筋におけるリモデリングを改善する
【０１０１】
外形測定分析は、対照ラット（１．３±０．５ｍｍ）と比較して、ＧＳＴＰ１処置（２．２±０．４ｍｍ）において、ＬＶ壁厚が有意に増大される、ということを明示した（図１１Ａおよび１１Ｂ）。梗塞および梗塞周辺領域における心筋組織の救済に及ぼすＧＳＴＰ１処置の作用を分析するために、ＴＵＮＥＬ検定を実施した。これらの検定の結果は、対照動物と比較した場合、ＧＳＴＰ１処置した梗塞および梗塞周辺領域におけるアポトーシス事象が有意に低減する、ということを示している（図１１Ｃおよび１１Ｄ）。これらのデータは、ＧＳＴＰ１処置が、ラット不全心臓における心筋リモデリングならびにＭＩ後心筋組織アポトーシスを有意に低減する、ということを示す。
ＧＳＴＰ１は心臓機能を改善する
【０１０２】
ＧＳＴＰ１は、虚血誘導性心不全および急性心筋梗塞のラットモデルにおける炎症および心筋リモデリングを相殺するのに有効であるということが示されたので、不全ラット心筋におけるＬＶ機能を立証した。結果は、ＭＩ後３週目の左心室駆出率（ＬＶＥＦ）が、非処置群と比較した場合、ＧＳＴＰ１処置ラットにおいて有意に高い、ということを示した（Ｐ＜０．０５、図１２Ａ）。さらに、ＬＶ拡張終期容積（ＬＶＥＤＶ）が、対照動物と比較して、ＭＩ後３週間でのＧＳＴＰ１処置群において有意に改善（低減）された（Ｐ＜０．０５、図１２Ｂ）。これらのデータは、ＧＳＴＰ１処置が、虚血誘導性心不全に関連したＬＶＥＦを有意に改善し、ＬＶ拡張を有意に減衰する、ということを示す。
【０１０３】
心不全の病態生理学における炎症伝達物質の役割については、この２０年間、関心が増大しつつある。ＬＶ機能に及ぼすＴＮＦ−αの負の変力作用を、種々の実験研究が記載してきた。さらに、ＴＮＦ−αがＬＶリモデリング、心臓肥大、ならびにアポトーシスによる進行性心筋細胞損失を促進する、ということが報告されている。心不全の設定における炎症伝達物質の病理学的役割に関する漸増的証拠は、心不全患者におけるＴＮＦ−αを標的にするよう意図された一連の多中心的臨床試験を実施させてきた。しかしながら、これらの試験の結果は、落胆させられるものであった。これらの結果の一解釈は、心臓組織のリモデリングおよび修復のためには、ＴＮＦ−αのせり理学的レベルが低いことが重要である、というものであった。この主張と同時に、実験的研究は、その２つの異なる受容体ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２による心臓組織リモデリングにおけるＴＮＦ−αの逆の役割を記載している。ＴＮＦＲ１はリモデリング、肥大およびアポトーシスを悪化させるが、ＴＮＦＲ２はこれらの事象を改善する、ということが示されてきた。しかしながら、心不全におけるＴＮＦＲ２媒介性作用の機序は、依然として不明である。近年、ＴＲＡＦ２は、ＭＡＰＫ活性化を媒介するＴＮＦ−αシグナル伝達の重要な調節因子である、ということが示された。さらに、ＴＮＦＲ２およびＴＲＡＦ２間の相互作用は、ＮＦ−κＢの活性化を生じる。さらに、ＧＳＴＰ１は、ＴＲＡＦ２との相互作用を形成することによるＴＮＦ−α誘導性シグナル伝達の重要な負の調節因子である、ということが報告されている。これと一致して、ＧＳＴＰ１は、ＴＲＡＦ２とのその相互作用により間接的に、あるいはジェイＮＫ１およびｐ３８とのその相互作用により直接的に、悪性細胞株におけるＭＡＰＫ活性化を抑制し得る。これらの結果は、ＧＳＴＰ１およびＴＲＡＦ２が心不全患者において上方調節されるという本発明の知見とともに、ＧＳＴＰ１−ＴＲＡＦ２複合体形成が心不全の病因と関連する、ということを示す。心不全患者における組織培養実験は、ＴＮＦ−αの付加はジストの抗炎症作用を抑制し得るが、しかしこの作用はＧＳＴＰ１用量を増大することにより存続され得る、ということを明示した。ＧＳＴＰ１の抗炎症特性は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの最新の結果により承認された。本明細書中で用いた実験モデルは、ＧＳＴＰ１が炎症反応を改善し、ＭＩの誘導後の心臓リモデリングを低減し得る、ということを明示した。興味深いことに、ＧＳＴＰ１は前炎症伝達物質、例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＪＮＫ１、ｐ３８およびＮＦ−κＢを抑圧し得るだけでなく、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０の発現を増大し得た。さらに、本発明による結果は、ＧＳＴＰ１が不全心臓におけるアポトーシスに対して心臓組織を防御する、ということを明示した。これと同時に、ＧＳＴＰ１はＴＲＡＦ２増強性アポトーシスシグナル調節性キナーゼ１（ＡＳＫ１）の自己リン酸化を減衰し、したがって、ＴＲＡＦ２およびＡＳＫ１の相互作用を抑圧することによりＴＲＡＦ２−ＡＳＫ１誘導性細胞アポトーシスを抑制する、ということが腫瘍学的状況で示されてきた。
【０１０４】
要するに、本発明は、心不全においてＪＮＫ１／ｐ３８活性化を引き出すＴＮＦ−α／ＴＲＡＦ２を調整する場合のＧＳＴＰ１の新規の機能を提供する。ＧＳＴＰ１によるＴＮＦ−α／ＴＲＡＦ２媒介性炎症シグナル伝達の選択的抑制は、心筋症または虚血性心疾患を有する患者のための、特に心筋梗塞および心不全を有する患者のための有益な処置であることが示された本発明の動物モデルによるものであった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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