(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療上有効量のベクターを含む、ハンチントン病の処置において使用するための薬学的組成物であって、前記ベクターは、コレステロール−２４−ヒドロキシラーゼをコードする核酸の完全配列を含む、前記薬学的組成物。
【請求項２】
前記ベクターは配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、請求項１の薬学的組成物。
【請求項３】
前記ベクターは配列番号１の配列を含む、請求項２の薬学的組成物。
【請求項４】
前記ベクターは、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルスおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターからなる群より選択される、請求項１〜３のいずれかの薬学的組成物。
【請求項５】
前記ベクターはＡＡＶベクターである、請求項１〜４のいずれか記載の薬学的組成物。
【請求項６】
前記ベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０である、請求項５記載の薬学的組成物。
【請求項７】
前記ベクターはＡＡＶ１０ベクターである、請求項６記載の薬学的組成物。
【請求項８】
直接的に被験体の脳に投与される、請求項１〜７記載の薬学的組成物。
【請求項９】
赤核、扁桃体、嗅内皮質、および視床外側腹側部におけるニューロン、または視床の前核に、定位的なマイクロインジェクションによって投与される、請求項８記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
静脈内注射によって投与される、請求項１〜８記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
くも膜下腔内注射によって投与される、請求項１〜８記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
脳室に投与される、請求項１〜８記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、ハンチントン病の処置において使用するためのベクターに関し、前記ベクターは、コレステロール−２４−ヒドロキシラーゼをコードする核酸を含む。
【０００２】
発明の背景：
ハンチントン病（ＨＤ）は、グルタミンリピートの伸長によって引き起こされる最も頻繁に起こる神経変性疾病である。ＨＤの主な臨床徴候は舞踏病、認知障害および精神疾患である。ＨＤの遺伝は、完全浸透率を伴う常染色体優性である。ＨＤに関与する突然変異、すなわちＣＡＧリピート配列の不安定な伸長は、ハンチントン（ｈｔｔ）をコードするＩＴ１５遺伝子の５’末端部分に位置する。ＨＤの１つの重要な特徴は、他の脳領域における突然変異タンパク質の同じような発現にも関わらず、特定の脳領域である線条体の脆弱性である（Roze et al., 2008a）。さらに、全ての神経細胞における突然変異Ｈｔｔの早期発現（Ｅｘｐ−Ｈｔｔ）は生まれてすぐにも関わらず、最初の症状および神経病理学的な特徴は、成人期、すなわち約４０〜４５歳で現れる。疾病の発症年齢は、罹患した対立遺伝子におけるＣＡＧリピートの数に反比例する。一旦最初の症状が現れると、疾病は進行し、そして進行的に死に至る。１つの現在認められている仮説は、加齢の際の特定のシグナル伝達経路の変化が、特にまたは主に線条体ニューロンにおいて、Ｅｘｐ−Ｈｔｔにより誘導される分子変化を増加させるというものである。これまで、疾病の進行を減速させることを目的とした利用可能な療法は全くなく、結果として、ＨＤは無情にも死へと進行する。従って、ＨＤ療法のための戦略を発見することが重要である。
【０００３】
発明の要約：
本発明者らは、中枢神経系においてコレステロールの分解に関与する酵素であるＣＹＰ４６Ａ１が、ＨＤの細胞モデルにおいて神経保護的であることを観察した。さらに、本発明者らは、Ｒ６／２トランスジェニックＨＤマウスモデルの線条体（疾病におけるより脆弱な脳構造）におけるＣＹＰ４６Ａ１ｍＲＮＡの減少を観察した。
【０００４】
従って、本発明は、ハンチントン病の処置のためのベクターに関し、前記ベクターは、中枢神経系の細胞においてＣＹＰ４６Ａ１を発現する。
【０００５】
さらに、本発明は、本発明によるベクターを含む、ハンチントン病の処置において使用するための薬学的組成物に関する。
【０００６】
発明の詳細な説明：
定義：
本明細書全体を通して、いくつかの用語が使用され、そして以下の段落において定義されている。
【０００７】
ＣＹＰ４６Ａ１配列
本発明の第１の目的はハンチントン病の処置において使用するためのベクターに関し、前記ベクターは、コレステロール−２４−ヒドロキシラーゼをコードする核酸の完全配列を含む。
【０００８】
本明細書において使用する「遺伝子」という用語は、転写または翻訳された後に特定のポリペプチドまたはタンパク質をコードすることのできる、少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドを指す。
【０００９】
本明細書において使用する「コード配列」または「特定のタンパク質をコードする配列」という用語は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合にin vitroまたはin vivoにおいてポリペプチドへと転写（ＤＮＡの場合）および翻訳（ｍＲＮＡの場合）される核酸配列を示す。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端における開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端における翻訳終止コドンによって決定される。コード配列としては、原核生物または真核生物のｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡ、原核生物または真核生物のＤＮＡに由来するゲノムＤＮＡ配列、およびさらには合成ＤＮＡ配列を挙げることができるが、それらに限定されない。
【００１０】
ＣＹＰ４６Ａ１遺伝子は、コレステロール−２４−ヒドロキシラーゼをコードする。この酵素は、チトクロムＰ４５０スーパーファミリーのメンバーである。ＣＹＰ４６Ａ１についてのｃＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセスナンバーＡＦ０９４４８０．１（配列番号１）に開示されている。アミノ酸配列は配列番号２で示される。
【００１１】
好ましい態様において、本発明は、ハンチントン病の処置のための配列番号１の配列またはその変異体を含む核酸構築物を提供する。
【００１２】
前記変異体は、例えば、個体間の対立遺伝子変異に因る天然に存在する変異体（例えば多形）、選択的スプライシング形などを含む。変異体という用語は、また、他の起源または生物に由来するＣＹＰ４６Ａ１の遺伝子配列を含む。変異体は、好ましくは配列番号１に対して実質的に相同であり、すなわち、配列番号１に対して典型的には少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％のヌクレオチド配列同一性を示す。ＣＹＰ４６Ａ１遺伝子の変異体は、また、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、上で定義したような配列（またはその相補鎖）にハイブリダイゼーションする核酸配列を含む。典型的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、３０℃を上回る、好ましくは３５℃を上回る、より好ましくは４２℃を超える温度、および／または約５００mM未満、好ましくは２００mM未満の塩分を含む。ハイブリダイゼーション条件は、温度、塩分および／またはＳＤＳ、ＳＳＣなどの他の試薬の濃度を改変することによって当業者によって調整され得る。
【００１３】
非ウイルスベクター
好ましい態様において、本発明により使用するベクターは、非ウイルスベクターである。典型的には、非ウイルスベクターは、ＣＹＰ４６Ａ１をコードするプラスミドであり得る。
【００１４】
ウイルスベクター
本発明の実施において有用である遺伝子送達ウイルスベクターは、分子生物学の分野において周知の方法を使用して構築され得る。典型的には、導入遺伝子を有するウイルスベクターは、導入遺伝子をコードするポリヌクレオチド、適切な調節エレメント、および細胞の形質導入を媒介するウイルスタンパク質の産生に必要とされるエレメントから構築される。
【００１５】
「遺伝子導入」または「遺伝子送達」という用語は、外来ＤＮＡを宿主細胞に確実に挿入するための方法またはシステムを指す。このような方法により、組み込まれていない導入されたＤＮＡの一過性発現、導入されたレプリコン（例えばエピソーム）の染色体外における複製および発現、または宿主細胞のゲノムＤＮＡへ導入された遺伝子材料の組込みがもたらされ得る。
【００１６】
ウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが挙げられる。
【００１７】
このような組換えウイルスは、パッケージング細胞のトランスフェクションによって、またはヘルパープラスミドもしくはウイルスを用いての一過性トランスフェクションによってなどの、当技術分野において公知の技術によって産生され得る。ウイルスパッケージング細胞の典型的な例としては、ＰＡ３１７細胞、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞、ＧＰｅｎｖ＋細胞、２９３細胞などが挙げられる。このような複製欠損の組換えウイルスを産生するための詳細なプロトコールは、例えば、ＷＯ９５／１４７８５、ＷＯ９６／２２３７８、ＵＳ５，８８２，８７７、ＵＳ６，０１３，５１６、ＵＳ４，８６１，７１９、ＵＳ５，２７８，０５６およびＷＯ９４／１９４７８に見出され得る。
【００１８】
好ましい態様において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが使用される。
【００１９】
別の好ましい態様において、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、またはヒト、サルもしくは他の種に感染することのできる任意の他の血清型のＡＡＶである。
【００２０】
より好ましい態様において、ＡＡＶベクターはＡＡＶ１０である。
【００２１】
「ＡＡＶベクター」によって、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６などを含むがこれらに限定されない、アデノ随伴ウイルス血清型から誘導されたベクターを意味する。ＡＡＶベクターは、好ましくはｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子を完全にまたは部分的に欠失しているが、機能的なフランキングＩＴＲ配列は保持している、１つ以上のＡＡＶ野生型遺伝子を有し得る。機能的ＩＴＲ配列は、ＡＡＶビリオンの救出、複製およびパッケージングに必要である。従って、ＡＡＶベクターは、本明細書において、ウイルスの複製およびパッケージングのためにシスにおいて必要とされる少なくともそうした配列（例えば機能的ＩＴＲ）を含むと定義される。ＩＴＲは野生型ヌクレオチド配列である必要はなく、そして、配列が機能的救出、複製およびパッケージングを提供する限り、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって改変されていてもよい。ＡＡＶ発現ベクターは、作動可能に連結された成分として、転写の方向に、調節エレメント（転写開始領域を含む）、対象のＤＮＡ（すなわちＣＹＰ４６Ａ１遺伝子）および転写終結領域を少なくとも提供するように、公知の技術を使用して構築される。
【００２２】
調節エレメントは、哺乳動物細胞において機能的であるように選択される。作動可能に連結された成分を含む得られた構築物は、機能的なＡＡＶ ＩＴＲ配列と結合している（５’およびＹ）。「アデノ随伴ウイルス逆位末端反復（adeno-associated virus inverted terminal repeats）」すなわち「ＡＡＶＩＴＲｓ」は、ＤＮＡ複製起点としておよびウイルスのパッケージングシグナルとしてシスにおいて一緒に機能する、ＡＡＶゲノムの各末端に見出される当技術分野において認識されている領域を意味する。ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ ｒｅｐコード領域と一緒に、２つのフランキングするＩＴＲの間に挿入されたヌクレオチド配列の効率的な切断および救出、および２つのフランキングするＩＴＲの間に挿入されたヌクレオチド配列の、哺乳動物細胞ゲノムへの組込みを提供する。ＡＡＶ ＩＴＲ領域のヌクレオチド配列は公知である。例えば、ＡＡＶ−２配列についてはKotin,1994 ; Berns, KI "Parvoviridae and their Replication" in Fundamental Virology, 2nd Edition, (B. N. Fields and D. M. Knipe, eds. )を参照。本明細書において使用する「ＡＡＶ ＩＴＲ」は、野生型ヌクレオチド配列を必ずしも含まず、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって改変されていてもよい。さらに、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ６などを含むがそれらに限定されない、いくつかのＡＡＶ血清型のいずれかに由来し得る。さらに、ＡＡＶベクターにおける選択されたヌクレオチド配列にフランキングする５’および３’ＩＴＲは、それらが意図するように、すなわち、宿主細胞ゲノムまたはベクターからの対象の配列の切断および救出を可能とするように、および、ＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子産物が細胞に存在する場合にレシピエント細胞ゲノムへの異種配列の組込みを可能とするように、機能する限り、必ずしも同一であったり、または同じＡＡＶ血清型または単離株に由来する必要はない。さらに、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６などを含むがそれらに限定されない、いくつかのＡＡＶ血清型のいずれかに由来し得る。さらに、ＡＡＶ発現ベクターにおける選択されたヌクレオチド配列にフランキングする５’および３’ＩＴＲは、それらが意図するように、すなわち、宿主細胞ゲノムまたはベクターからの対象の配列の切断および救出を可能とするように、および、ＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子産物が細胞に存在する場合にレシピエント細胞ゲノムへのＤＮＡ分子の組込みを可能とするように、機能する限り、必ずしも同一であったり、または同じＡＡＶ血清型または単離株に由来する必要はない。
【００２３】
特に好ましいのは、哺乳動物ＣＮＳの細胞、特にニューロンに対する指向性および哺乳動物ＣＮＳの細胞、特にニューロンにおける高い形質導入効率を有する、ＡＡＶ血清型に由来するベクターである。種々の血清型の形質導入効率の総説および比較は、Cearley CN et al., 2008に提供されている。１つの好ましい例において、ＡＡＶ２をベースとしたベクターは、ＣＮＳにおいて、好ましくは形質導入ニューロンにおいて導入遺伝子の長期発現を指令することが示されている。他の非制限的な例において、好ましいベクターとしては、ＣＮＳの細胞を形質導入することも示された、ＡＡＶ１０およびＡＡＶ１１血清型に由来するベクターが挙げられる（Davidson et al、上記）。
【００２４】
選択されたヌクレオチド配列は、in vivoにおいて被験体におけるその転写または発現を指令する調節エレメントに作動可能に連結されている。このような調節エレメントは、選択された遺伝子に正常に関連した調節配列を含み得る。
【００２５】
あるいは、異種調節配列を使用することができる。有用な異種調節配列は、一般に、哺乳動物またはウイルスの遺伝子をコードする配列に由来するものを含む。例としては、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＫＧ）プロモーター、ＣＡＧ、神経細胞プロモーター、ドーパミン−１レセプターおよびドーパミン−２レセプターのプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えばＣＭＶ最初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、合成プロモーター、ハイブリッドプロモーターなどが挙げられるがそれらに限定されない。さらに、マウスメタロチオネイン遺伝子などの非ウイルス遺伝子に由来する配列もまた本明細書において用途を見出す。このようなプロモーター配列は、例えばStratagene (San Diego, CA)から市販されている。本発明の目的のために、異種プロモーターおよび他の調節エレメント（例えばＣＮＳに特異的で誘導性のプロモーター、エンハンサーなど）の両方が特に有用である。
【００２６】
異種プロモーターの例としてはＣＭＶプロモーターが挙げられる。ＣＮＳ特異的プロモーターの例としては、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）およびニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）に由来する遺伝子から単離されたものが挙げられる。
【００２７】
誘導性プロモーターの例としては、エクジソン、テトラサイクリン、低酸素症およびオーキシンのためのＤＮＡ応答エレメントが挙げられる。
【００２８】
ＡＡＶ ＩＴＲに結合した対象のＤＮＡ分子を有するＡＡＶ発現ベクターは、ＡＡＶゲノムから主要なＡＡＶオープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）を切り出しておいたＡＡＶゲノムに、選択された配列（群）を直接挿入することによって構築され得る。ＩＴＲの十分な部分が留まり、これにより複製およびパッケージング機能が可能である限り、ＡＡＶゲノムの他の部分もまた欠失されていてもよい。このような構築物は、当技術分野において周知の技術を使用して設計され得る。例えば、米国特許第5,173, 414号および第5,139, 941号;国際公開公報第WO 92/01070号（１９９２年１月２３日公開)および第WO 93/03769号(１９９３年３月４日公開); Lebkowski et al., 1988 ; Vincent et al., 1990; Carter, 1992 ; Muzyczka, 1992 ; Kotin,1994; ShellingおよびSmith, 1994 ;並びにZhou et al., 1994を参照。あるいは、ＡＡＶ ＩＴＲを、それを含むウイルスゲノムからまたはＡＡＶベクターから切り出し、そして、標準的なライゲーション技術を使用して別のベクターに存在する選択された核酸構築物の５’および３’に融合させることができる。ＩＴＲを含むＡＡＶベクターは、例えば米国特許第5,139, 941号に記載されている。特に、いくつかのＡＡＶベクターがそこに記載されており、これはアクセッションナンバー５３２２２、５３２２３、５３２２４、５３２２５および５３２２６の下でアメリカンタイプカルチャーコレクション（「ＡＴＣＣ」）から入手可能である。さらに、キメラ遺伝子を合成的に産生して、１つ以上の選択された核酸配列の５’および３’に配置されたＡＡＶ ＩＴＲ配列を含めることができる。哺乳動物ＣＮＳ細胞におけるキメラ遺伝子配列の発現のために好ましいコドンを使用することができる。完全なキメラ配列は、標準的な方法によって調製された重複オリゴヌクレオチドから構築される。例えば、Edge, 1981 ; Nambair et al., 1984 ; Jay et al., 1984を参照。ＡＡＶビリオンを産生するために、ＡＡＶ発現ベクターを、トランスフェクションなどの公知の技術を使用して適切な宿主細胞に導入する。多くのトランスフェクション技術が一般に当技術分野において公知である。例えば、Graham et al., 1973;, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New  York, Davisetal. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, ElsevierおよびChu et al., 1981を参照。特に適切なトランスフェクション法としては、リン酸カルシウム共沈降法（Graham et al., 1973）、培養細胞への直接的なマイクロインジェクション（Capecchi, 1980）、電気穿孔法（Shigekawa et al., 1988）、リポソームにより媒介される遺伝子導入（Mannino et al., 1988）、脂質により媒介される形質導入（Felgner et al., 1987）、および高速度の微粒子銃を使用した核酸の送達（Klein et al., 1987）が挙げられる。
【００２９】
例えば、好ましいウイルスベクター、例えばＡＡＶ１０は、コレステロール−２４−ヒドロキシラーゼをコードする核酸配列に加えて、ＡＡＶ−２に由来するＩＴＲを含むＡＡＶベクターの骨格、プロモーター、例えばマウスＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）遺伝子、またはサイトメガロウイルス／β−アクチンハイブリッドプロモーター（ＣＡＧ）（サイトメガロウイルス即時型遺伝子に由来するエンハンサー、ニワトリβ−アクチン遺伝子に由来するプロモーター、スプライスドナーおよびイントロン、ウサギβ−グロビンに由来するスプライスアクセプターからなる）、または任意の神経細胞プロモーター、例えば野生型または突然変異形のウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＷＰＲＥ）を含むまたは含まないドーパミン−１レセプターまたはドーパミン−２レセプターのプロモーターを含む。
【００３０】
ベクターの送達
本明細書において、被験体におけるハンチントン病を処置するための方法が提供され、前記方法は、
（ａ）コレステロール−２４−ヒドロキシラーゼをコードする核酸を含む、前記に定義したようなベクターを提供する工程；および
（ｂ）被験体の中枢神経系（ＣＮＳ）にベクターを送達して、それにより、前記ベクターがＣＮＳにおける細胞に形質導入され、これによりコレステロール−２４−ヒドロキシラーゼが、治療有効レベルで、形質導入された細胞によって発現される工程
を含む。
【００３１】
ニューロンおよび／またはアストロサイトへのベクターの送達法は、一般に、ニューロンおよび／またはアストロサイトへのベクターの送達に適した任意の方法を含み、これにより、選択されたシナプスで接続された細胞個体群の細胞の少なくとも一部が形質導入される。ベクターは、中枢神経系のいずれかの細胞、または両方に送達され得る。一般に、ベクターは、例えば、脊髄、脳幹（髄質、脳橋および中脳）、小脳、間脳（視床、視床下部）、終脳（線条体、大脳皮質、または、皮質内の、後頭葉、側頭葉、頭頂葉もしくは前頭葉）の細胞またはその組合せ、または好ましくは任意の適切なその亜個体群を含む、中枢神経系の細胞に送達される。送達のためにさらに好ましい部位としては、赤核、扁桃体、嗅内皮質および視床外側腹側部におけるニューロン、または視床の前核が挙げられる。
【００３２】
ベクターを、ＣＮＳの細胞の特定の領域におよび特定の個体群に特異的に送達するために、ベクターを定位的マイクロインジェクションによって投与し得る。例えば、患者は、定位フレームベース（frame base）を適所に固定される（頭蓋へねじで取り付けられる）。定位フレームベース（基準の印を有しＭＲＩ適合性）を有する脳が、高分解能ＭＲＩを使用して画像化される。その後、ＭＲＩ画像は、定位ソフトウェアを実行するコンピューターに転送される。一連の冠状面、矢状面および横断面の画像が、標的（ＡＡＶベクター注射部位）および軌道を決定するために使用される。ソフトウェアは、その軌道を定位フレームに適した３次元座標へと直接翻訳する。進入部位の上に頭蓋穿孔が開けられ、そして所定の深さで移植された針により定位装置が位置づけられる。その後、ＡＡＶベクターを標的部位に注射する。ＡＡＶベクターは、ウイルス粒子を産生するのではなく、標的細胞へと組み込まれるため、その後のベクターの広がりは少なく、そして主に、組み込み前の、注射部位からの受動拡散およびもちろん所望の経シナプス輸送の関数である。拡散の程度は、ベクターと流動性キャリアとの比率を調整することによって制御され得る。
【００３３】
追加の投与経路は、また、直接的可視化の下でのベクターの局所適用（例えば表在皮質適用）またはその他の非定位的適用を含み得る。ベクターは、くも膜下腔内、脳室内にまたは静脈内注射によって送達され得る。
【００３４】
本発明のベクターの標的細胞は、ハンチントン病を患う被験体の中枢神経系の細胞である。好ましくは、被験体はヒト、一般的には成人である。
【００３５】
しかしながら、本発明は、ベクターを、疾病の生物学的モデルに送達することを包含する。その場合、生物学的モデルは、送達の時点で任意の発達段階、例えば胚、胎仔、乳仔、幼若期または成体である任意の哺乳動物であり得、好ましくはそれは成体である。さらに、標的ＣＮＳ細胞は本質的に、任意の起源、特に非ヒト霊長類およびげっ歯目（マウス、ラット、ウサギ、ハムスター）、食肉目（ネコ、イヌ）およびウシ目（ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ）の哺乳動物、並びに任意の他の非ヒト系（例えばゼブラフィッシュモデル系）に由来し得る。
【００３６】
好ましくは、本発明の方法は、定位注射を通しての脳内投与を含む。しかしながら、他の公知の送達法もまた本発明に従って適応させ得る。例えば、ＣＮＳを横切ってのベクターのより広範な分布のために、それは、例えば腰椎穿刺によって脳脊髄液に注射され得る。ベクターを末梢神経系に指向させるために、それを脊髄にまたは末梢神経節に、または対象の身体部分の肉体（皮下または筋肉内）に注射し得る。特定の状況において、ベクターを、血管内アプローチを介して投与することができる。例えば、ベクターを、血液脳関門が障害されている場合または障害されていない場合の状況において動脈内（頸動脈）に投与することができる。さらに、より全体的な送達のために、ベクターを、マンニトールを含む高張液の点滴によって達成される血液脳関門の「開口」中に投与することができる。
【００３７】
本明細書において使用されるベクターは、送達のための任意の適切なビヒクルで製剤化され得る。例えば、それらは薬学的に許容される懸濁液、溶液またはエマルション中に配置され得る。適切な媒体としては食塩水およびリポソーム調製物が挙げられる。より具体的には、薬学的に許容される担体としては、無菌の水性または非水性溶液、懸濁液およびエマルションが挙げられ得る。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油、および注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体としては、水、アルコール性／水性溶液、エマルションまたは懸濁液（食塩水および緩衝化媒体を含む）が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、液体および栄養補充液（nutrient replenishers）、電解質補給液（electrolyte replenishers）（リンゲルデキストロースに基づくものなど）などが挙げられる。
【００３８】
保存剤および他の添加剤、例えば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどが存在していてもよい。
【００３９】
コロイド分散系もまた標的化遺伝子送達のために使用し得る。コロイド分散系としては、巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフィア、ビーズ、および脂質をベースとした系（水中油滴型エマルション、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含む）が挙げられる。
【００４０】
好ましい投与量および投与計画は医師によって決定され得、そして被験体の年齢、性別、体重および疾病の段階に依存する。一例として、ウイルス発現ベクターを使用したコレステロール−２４−ヒドロキシラーゼの送達のために、コレステロール−２４−ヒドロキシラーゼ発現ベクターの各単位投与量は、例えば１mlあたり１０１１〜１０１６個のウイルスゲノムの濃度範囲で薬学的に許容される液体中にウイルス発現ベクターを含む２．５〜１００μlの組成物を含み得る。
【００４１】
薬学的組成物
本発明の第２の目的は、治療有効量の本発明のベクターを含むハンチントン病の処置において使用するための薬学的組成物に関する。
【００４２】
「治療有効量」によって、任意の医学的処置に適用可能な妥当なベネフィット／リスク比でハンチントン病を処置するに十分な量の本発明のベクターを意味する。
【００４３】
本発明の化合物および組成物の全１日量は、妥当な医学的判断の範囲内で担当の医師によって決定されることが理解されるだろう。任意の特定の患者に対する具体的な治療有効投与量レベルは、処置する疾患および疾患の重度；使用する具体的な化合物の活性；使用する具体的な組成物；患者の年齢、体重、全般的な健康状態、性別および食事；使用する具体的な化合物の投与時刻、投与経路および排泄速度；処置の期間：使用する具体的なポリペプチドと組み合わせてまたは同時に使用される薬物；および医学分野において周知の同様な要因を含む、多種多様な要因に依存する。例えば、所望の治療効果を達成するのに必要とされるものよりも低いレベルで化合物の用量を開始し、そして、所望の効果が達成されるまで用量を次第に増加させることは十分に当業者の技能範囲内である。しかしながら、製品の１日量は、成人あたり１日あたり広い範囲におよび変動してもよい。投与されるべき本発明によるベクターの治療有効量、並びに、本発明のウイルスまたは非ウイルス粒子の数および／または薬学的組成物を用いての病的状態の処置のための投与量は、患者の年齢および状態、障害または疾患の重度、投与の方法および頻度、および使用しようとする特定のペプチドを含む、数多くの要因に依存する。
【００４４】
本発明によるベクターを含む薬学的組成物の提示は、脳内、くも膜下腔内、脳室内または静脈内投与のために適している任意の形態であり得る。
【００４５】
筋肉内、静脈内、脳内、くも膜下腔内または脳室内投与のための本発明の薬学的組成物において、活性成分を単独でまたは別の活性成分と組み合わせて、単位投与形で、従来の薬学的支持体との混合物として、動物またはヒトに投与することができる。
【００４６】
好ましくは、薬学的組成物は、注射されることのできる製剤に対して薬学的に許容されるビヒクルを含む。これらは、特に、等張で無菌の食塩水溶液（リン酸一ナトリウムまたは二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムまたは塩化マグネシウムなどまたはこのような塩の混合物）、または、場合に応じて、無菌水もしくは生理食塩水を添加すると、注射可能な溶液の構成を可能とする乾燥させた、特に凍結乾燥させた組成物であり得る。
【００４７】
注射用途に適した剤形としては、無菌水性液剤または分散剤；ゴマ油、ピーナッツ油または水性プロピレングリコールを含む製剤；および無菌注射液剤または分散剤の即時調製のための無菌粉末が挙げられる。全ての場合において、剤形は無菌でなければならず、そしてシリンジが容易に扱える程度まで流動性でなければならない。それは製造および保存の条件下において安定でなければならず、そして細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されていなければならない。
【００４８】
遊離塩基または薬理学的に許容される塩として本発明の化合物を含む液剤は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で調製され得る。分散剤は、また、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびその混合物並びに油中で調製され得る。通常の保存および使用の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐための保存剤を含む。
【００４９】
本発明によるベクターは、中性または塩の形態の組成物へと製剤化され得る。薬学的に許容される塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基を用いて形成される）を含み、これは、例えば塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのこのような有機酸を用いて形成される。遊離カルボキシル基を用いて形成される塩は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどのこのような有機塩基から誘導され得る。
【００５０】
担体は、また、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、その適切な混合物および植物油を含む、溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散剤の場合には必要とされる粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の防御は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば糖または塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射可能な組成物の延長された吸収は、組成物において、吸収を遅延する薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを使用することによってもたらされ得る。
【００５１】
無菌注射溶液は、必要量の活性ポリペプチドを、適切な溶媒中に、必要であれば前記に列挙した他の成分のいくつかと共に取り込み、その後、滅菌ろ過を行なうことによって調製される。一般的には、分散液は、種々の滅菌された活性成分を、基本的な分散媒体および前記に列挙した成分からの必要とされる他の成分を含む無菌ビヒクルに取り込むことによって調製される。無菌注射溶液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製法は、真空乾燥および凍結乾燥技術であり、これにより、先に滅菌ろ過したその溶液から活性成分と任意の追加の所望の成分の粉末が得られる。
【００５２】
製剤化されると、液剤は、投与製剤と適合性の様式で、そして治療的に有効な量で投与される。製剤は、前記した注射可能な溶液のタイプなどの多種多様な剤形で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなども使用してもよい。
【００５３】
また、複数回の投与量を投与してもよい。
【００５４】
本発明は、以下の図面および実施例によってさらに説明される。しかしながら、これらの実施例および図面はいずれにしても本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】Ｒ６／２およびＷＴマウスにおけるＣＹＰ４６Ａ１ｍＲＮＡ発現の定量。皮質、海馬および線条体ｍＲＮＡからのＲＴ−ｑＰＣＲを、ＣＹＰ４６Ａ１ｃＤＮＡのための特異的なプライマーを使用して実現した。全てのＲＴ−ｑＰＣＲデータを、内部標準としてＨＰＲＴｍＲＮＡを使用して正規化した。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）として表現される（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５、ｎｓ：有意ではない）
【図２】同時トランスフェクションアッセイの図示。Ｅｘｐ−Ｈｔｔ発現はＧＦＰ標識により検出され（緑色）、ＣＹＰ４６Ａ１またはｍｕｔ−ＣＹＰ４６Ａ１発現はＨａ免疫標識により検出された（赤色）。線条体ニューロンの生存度は、ヘキスト染色に基づいて評価された（青色）。ＣＹＰ４６Ａ１の存在下におけるＥｘｐ−Ｈｔｔの拡散された発現、一方、ｍｕｔ−ＣＹＰ４６Ａ１を同時発現するニューロンにおいてはＥｘｐ−Ｈｔｔの凝集体が形成されたことを注記する。
【図３】ＥｘｐＨｔｔにより媒介される凝集体の形成に対するＣＹＰ４６Ａ１の過剰発現の効果。一次線条体ニューロンをＥｘｐ−Ｈｔｔを用いてトランスフェクションするか、またはＥｘｐＨｔｔおよびｍｕｔ−ＣＹＰ４６Ａ１またはＣＹＰ４６Ａ１を用いて同時トランスフェクションした。ＥｘｐＨｔｔの凝集体を有するトランスフェクションされたニューロンを定量した。データは、少なくとも３回の独立した実験から分析し（１つの条件および１つの実験あたり１００個のトランスフェクションされたニューロン）、そして平均±ＳＥＭとして表現した（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。
【図４】ＥｘｐＨｔｔにより媒介される線条体のニューロン死滅に対するＣＹＰ４６Ａ１発現の効果。一次線条体ニューロンを、Ｈｔｔ、Ｅｘｐ−Ｈｔｔを用いてトランスフェクションするか、またはＥｘｐ−Ｈｔｔおよびｍｕｔ−ＣＹＰ４６Ａ１（Ｅｘｐ−Ｈｔｔ＋ｍｕｔ−ＣＹＰ４６Ａ１）もしくはＣＹＰ４６Ａ１（Ｅｘｐ−Ｈｔｔ＋ＣＹＰ４６Ａ１）を用いて同時トランスフェクションした。生存しているトランスフェクションされたニューロンの比率を、ヘキスト標識に基づいて定量した。データは少なくとも３回の独立した実験から分析し（１つの条件および１つの実験あたり１００個のトランスフェクションされたニューロン）、そして平均±ＳＥＭとして表現した（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ：有意ではない）。
【図５】ＷＴマウスの線条体への定位的注射後のＡＡＶｒｈ．１０ベクターの形質導入。脳の矢状切断（３０μm）を、線条体内へのＡＡＶｒｈ．１０−ＧＦＰの送達から３週間後にマウスで実施した。（Ａ）マウス脳矢状切片、側面２．２８mm。（Ｂ）マウス脳矢状切片、側面１．９２mm。ＧＦＰ染色（灰色）は、尾状核−被殻（ＣＰｕ）並びに２つのシナプスで接続された脳構造（皮質（Ｃｔｘ）および淡蒼球（ＧＰ））内におけるＡＡＶｒｈ．１０の広がった形質導入を示したことを注記する。
【図６】ＡＡＶｒｈ．１０−ＧＦＰによって形質導入された線条体の３次元描写。ＷＴマウスの線条体内へのＡＡＶｒｈ．１０−ＧＦＰの送達から３週間後に、脳の冠状切断（３０μm）を実施し、その後、線条体から放出された緑色蛍光の断層撮影画像の再構築を行なった。（Ａ）矢状断面図および（Ｂ）形質導入された線条体の中央断面図（灰色の標識）。（ＣＰｕ：尾状核−被殻、ＡＣ：前交連、ＮＡｃｃ：側坐核）。全ての背側線条体がＡＡＶｒｈ．１０によって形質導入されたことを注記する（灰色の標識）。
【図７】ＷＴマウスの線条体への定位的注射後のＡＡＶｒｈ．１０−ＣＹＰ４６Ａ１−Ｈａの形質導入および指向性。脳の矢状切片（３０μm）を、線条体内へのＡＡＶｒｈ．１０−ＣＹＰ４６Ａ１−Ｈａの送達から３週間後に免疫蛍光によって研究した。（Ａ）ＡＡＶｒｈ．１０−ＣＹＰ４６Ａ１−Ｈａの組換えＤＮＡの表示。側面２．０４mm。（Ｂ）ＣＹＰ４６Ａ１−Ｈａの発現は、Ｈａ免疫組織学的染色によって評価された（明るい灰色）。（Ｃ〜Ｅ）ニューロン特異的マーカー染色（Ｄ、ＮｅｕＮ、白色の核標識）と合わせられたより高い拡大率のＨａ染色（Ｃ、白色の細胞質内標識）。Ｅ）融合された画像：線条体におけるＡＡＶｒｈ．１０−ＣＹＰ４６Ａ１−Ｈａの形質導入効率およびＡＡＶｒｈ．１０の神経指向性を注記する。ＣＰｕ：尾状核−被殻、ＧＰ：淡蒼球。
【図８】ＷＴマウスの線条体へのＡＡＶｒｈ１０．ＣＹＰ４６Ａ１−Ｈａの定位的注射後のグリア細胞におけるＣＹＰ４６Ａ１−Ｈａ発現の不在。脳の冠状切片（３０μm）を、線条体内へのＡＡＶｒｈ．１０−ＣＹＰ４６Ａ１−Ｈａの送達から３週間後に免疫蛍光によって研究した。（Ａ）ＧＦＡＰ免疫標識（白色の標識）を使用した特定のアストロサイト染色に関連したＨａの免疫学的染色（白色の細胞質の標識）。（Ｂ）特定のミクログリア細胞の標識（白色）に関連したＨａの免疫学的染色（白色の細胞質の標識）、および（Ｃ）特定のオリゴデンドロサイトの免疫学的染色（Ｏｌｉｇ２、赤白色、矢印を参照）に関連したＨａの免疫学的染色（白色）。グリア細胞におけるＣＹＰ４６Ａ１−Ｈａ発現の不在を注記する。ＣＰｕ：尾状核−被殻、Ｃｃ：脳梁、Ｃｔｘ：皮質。
【図９】食塩水またはＡＡＶｒｈ．１０−ＣＹＰ４６Ａ１−Ｈａを用いて注射されたＷＴおよびＲ６／２マウスのロータロッドパフォーマンス。ロータロッド上での運動パフォーマンスを、６週令から１１週令のマウスの線条体内へのＡＡＶｒｈ．１０−ＣＹＰ４６Ａ１−Ｈａの送達から２週間後に実施した。データは平均＋／−ＳＥＭとして表現する（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。統計学的分析は、８週令からのＲ６／２マウスロータロッドパフォーマンスに対してＡＡＶｒｈ．１０−ＣＹＰ４６Ａ１−Ｈａの有意な効果を明らかとした。ＷＴ食塩水（ｎ＝６）、ＷＴ ＡＡＶｒｈ．１０−ＣＹＰ４６Ａ１−Ｈａ（ｎ＝８）、Ｒ６／２食塩水（ｎ＝１３）、Ｒ６／２ ＡＡＶｒｈ．１０（ｎ＝１２）。
【図１０】線条体へのＡＡＶｒｈ１０．ＣＹＰ４６Ａ１−Ｈａまたは食塩水の定位的注射後のＷＴおよびＲ６／２マウスの握り締めスコア。６週令から１１週令のマウスの線条体内へのＡＡＶｒｈ１０．ＣＹＰ４６Ａ１−Ｈａの送達から２週間後に握り締めを実施した。（Ａ）尾によって吊るした１１週令のＷＴおよびＲ６／２マウスの代表的な写真。食塩水またはＡＡＶｒｈ１０．ＣＹＰ４６Ａ１−ｈａを用いて注射されたＷＴマウスは、肢のヘリコプター化（helicoptering）を示したが、食塩水を用いて注射されたＲ６／２マウスは、前肢および後肢の両方の握り締めを示した。Ｒ６／２マウスにおけるＡＡＶＲｈ．１０−ＣＹＰ４６Ａ１−Ｈａの注射は、前肢および後肢の姿勢に対して有益な効果を及ぼす。（Ｂ）表現型の重度に関連した４つのスコアを用いての握り締め試験の定量。ＷＴ食塩水（ｎ＝６）、ＷＴ ＡＡＶｒｈ．１０−ＣＹＰ４６Ａ１−Ｈａ（ｎ＝８）、Ｒ６／２食塩水（ｎ＝１３）、Ｒ６／２ＡＡＶｒｈ．１０（ｎ＝１２）。
【００５６】
実施例：
実施例１：in vitroにおけるＣＹＰ４６Ａ１の効果
材料および方法
マウスの畜産：
トランスジェニックＲ６／２マウスおよびＷＴ同腹仔を、明／暗サイクルの維持された温度の調節された部屋で飼育した。食物および水は自由に利用できるようにした。ヒトＩＴ１５遺伝子プロモーターの制御下で１１５〜１５０個のＣＡＧを含むヒト突然変異ＨＤ遺伝子のエキソン１を発現する、Ｒ６／２マウス［Ｂ６ＣＢＡ−ＴｇＮ（ＨＤエキソン１）６２］を、卵巣の移植されたヘミ接合性の雌をそのバックグラウンド株Ｂ６ＣＢＡＦ１／Ｊの雄と交雑することによって、Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)から得た。トランスジェニックマウスの遺伝子型同定は尾ＤＮＡにおいてＰＣＲによって実施された。マウスを、１２時間の明／暗サイクルで、そして食物および水は自由にとれるようにして集団で飼育した。実験は、標準的な倫理指針に従って実施された（１９８５年に改訂された米国国立衛生研究所の刊行物番号８５〜２３、および実験動物の管理と使用に関する欧州委員会指針の指令８６／６０９／ＥＥＣ）。
【００５７】
組織からのＲＮＡの抽出および定量逆転写ＰＣＲによる増幅：
線条体、皮質および海馬を、６週令のＷＴおよびＲ６／２マウスから解剖した。全ｍＲＮＡを、製造業者の説明書に従ってＲＮｅａｓｙミニキット（Qiagen）を使用して単離した。逆転写をSuperScript III (Invitrogen)を使用して実施した。粗の線条体、皮質および海馬から抽出された４００ngの全ｍＲＮＡを、逆転写（ＲＴ）キット（SuperScript III -Invitrogen）を用いての逆転写のための鋳型として使用した。
【００５８】
得られたｃＤＮＡを、ABsolute SYBR Green QPCRキット(ABgene)を使用したIcycler検出システム(Bio-Rad)で実施された定量ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）のための鋳型として使用した。ＣＹＰ４６Ａ１ｃＤＮＡ増幅のために特異的なプライマー（Eurogentec S.A.）を設計した：
【化１】
0005937088.tif 000002
【００５９】
絶対的なｍＲＮＡの量を、ハウスキーピング遺伝子として使用されるＨＰＲＴｍＲＮＡ（ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）を用いて正規化した。ＨＰＲＴｃＤＮＡを増幅するための以下のプライマーは以下のようであった：
【化２】
0005937088.tif 000003
【００６０】
示された結果は、Ｒ６／２またはＷＴマウスにおけるＣＹＰ４６Ａ１ｍＲＮＡ発現の３つの異なる標準化の平均である。
【００６１】
一次線条体培養：
一次線条体ニューロンを、妊娠スイスマウス（Janvier, Le Genest Saint Isle, France）からの１４日令の胚から解剖して取り出した。細胞の解離を１mLのトリプシンＥＤＴＡを用いて１５分間かけて実施し、そして３００μLのウシ胎児血清および３０μLのＤＮａｓｅＩに１mLのComplete Neurobasal (NBC)（Ｂ２７、抗生物質およびグルタミンの補充されたNeurobasal）を添加することによって停止させた。機械的解離および氷上での５分間のインキュベーションの後、上清を取り出し、そしてペレットを１mLのＮＢＣに再懸濁した。線条体細胞の溶液を５分間、４℃、９００rpmで遠心分離にかけ、そしてペレットをＮＢＣに懸濁した。
【００６２】
細胞数を、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター中のポリ−Ｌ−リジンでコーティングされた４つのウェル（１ウェルあたり１６００００個の細胞）上に蒔いた。
【００６３】
トランスフェクション：
７日間培養した後、４つのウェルプレート中で増殖させたニューロンを、リポフェクタミン（Invitrogen）を使用して、ＧＦＰとin frameにある２５個（Ｈｔｔ）または１０３個（ＥｘｐＨｔｔ）の連続的なＣＡＡまたはＣＡＧリピートのいずれかを含むヒトＨｔｔの第１エキソンをコードするｐｃＤＮＡ構築物（HDF Resource Bank, UCLAによって提供）を用いて一過性にトランスフェクションした。指示された場合には、線条体ニューロンを、ヘマグルチニンタグとin frameにある野生型ＣＹＰ４６Ａ１タンパク質（ＣＹＰ４６Ａ１−Ｈａ）または酵素活性を欠失したミスセンス突然変異（Ａ１３０９Ｃ）に対応するＨａタグ化突然変異バージョン（ＣＹＰ４６Ａ１−ｍｕｔ）（Pr Aubourgからの贈り物）をコードするｐｃＤＮＡ構築物を用いて同時トランスフェクションした。トランスフェクションから３時間半後に、培地を除去し、そしてＮＢＣと交換した。
【００６４】
免疫組織化学、凝集体形成およびニューロン死滅の分析：
線条体ニューロンを室温で４０分間かけてＰＢＳ中２％パラホルムアルデヒドで固定し、そして１５分間かけてリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中０．３％トリトンを用いて透過処理し、そして室温で５分間かけて１×ＰＢＳ、０．１％トリトンを用いて洗浄した。ＰＢＳを用いて洗浄した後、細胞を２０分間かけて遮断緩衝液（ＰＢＳ、０．１％トリトン、５％ＮＧＳ）と共にプレインキュベーションし、そして室温で５分間かけてＰＢＳ、０．１％トリトン、１％ＮＧＳを用いて洗浄した。一次抗体（Covance社のモノクローナルマウス抗Ｈａ抗体、希釈率１／１０００）を４℃で一晩かけてＰＢＳ、０．１％トリトン、１％ＮＧＳ中でインキュベーションした。５分間かけてＰＢＳ、０．１％トリトンを用いて３回洗浄した後、細胞を二次抗体（Alexa 568抗マウス抗体、ＰＢＳ、０．１％トリトン、１％ＮＧＳ中の希釈率１／１０００）と共にインキュベーションした。ＰＢＳ、０．１％トリトンを用いての３回の洗浄を、核の標識前に、ヘキスト染色（ＰＢＳ中１／２００００）を使用して５分間かけて実施し、その後、５分間かけてＰＢＳを用いて３回洗浄した。細胞を、カバーガラス下に、Vectashield medium (Vector Laboratories)を使用して積載し、そして、Leica DM4000B蛍光顕微鏡（４０倍率）を用いて分析した。凝集体の形成をＧＦＰによるＥｘｐ−Ｈｔｔの染色により評価し、そしてトランスフェクションから２４時間後に定量した。ニューロン死滅をトランスフェクションから４８時間後にヘキスト染色後に評価し、そして凝縮されたまたは断片化された核を含むニューロンを、死滅細胞としてスコアリングした。提示された結果は、３回の独立した実験の結果であり、そして１００を超えるトランスフェクションされたニューロンを、各実験において分析した。
【００６５】
統計学的分析：
全てのデータをスチューデントｔ検定を使用して統計学的に分析し、そして全ての統計学的分析について比較間の差異がＰ＜０．０５の場合に有意であると判断した。
【００６６】
結果
Ａ．ハンチントン病のマウスモデルにおけるＣＹＰ４６Ａ１ｍＲＮＡの定量
ＨＤにおいてはコレステロール生合成の機能不全が記載されている（総説についてはValenza et al 2006）。Ｅｘｐ−Ｈｔｔは転写の調節不全（特にニューロンの生存および代謝に関与する遺伝子）を誘導することが知られているので、本発明者らは、ＣＹＰ４６Ａ１ｍＲＮＡ発現の欠損が、少なくとも部分的には、コレステロールの調節解除を、そして従ってＨＤにおけるニューロンの機能不全を説明し得ると考えた。Ｒ６／２マウスは、ＨＤのより一般的に使用され、そして最も特徴付けられたマウスモデルである。これらのトランスジェニックマウスは、１３週令から１６週令までに起こる、死亡するまで次第に発達する数々の挙動的および調節的変化を示す。本発明者らは、定量逆転写ＰＣＲを使用して、その野生型同腹仔と共に、６週令のＲ６／２マウスの脳組織におけるＣＹＰ４６Ａ１ｍＲＮＡ発現を測定した。各マウス株について、ＲＮＡを、大脳皮質、海馬および線条体から抽出した。ＣＹＰ４６Ａ１ｍＲＮＡ発現は、野生型マウスと比較した場合にＲ６／２マウスの大脳皮質において僅かではあるが有意にダウンレギュレーションされていた（図１）。海馬においては有意な変化は全く認められなかった。Ｒ６／２マウスの線条体において、本発明者らは、野生型マウスの線条体と比較した場合に、ＣＹＰ４６Ａ１ｍＲＮＡの発現の強力な減少を発見した（−５０％；図１）。
【００６７】
Ｂ．一次線条体ニューロンにおけるＥｘｐＨｔｔの毒性作用に対するＣＹＰ４６Ａ１の過剰発現の影響
Ｒ６／２マウスの線条体において観察されたＣＹＰ４６Ａ１ｍＲＮＡ発現の減少は、ＨＤの病変発生における可能性ある原因的な役割を示唆した。これに対処するために、本発明者らは、実験室（Garcia et al., 2004; Charvin et al., 2005, Deyts et al., 2009）でセットされた、Ｅｘｐ−Ｈｔｔによって誘導された線条体ニューロン機能不全の簡単なモデルシステムを使用した。このモデルシステムは、２５個のポリグルタミン（Ｈｔｔ）または１０３個のポリグルタミン（Ｅｘｐ−Ｈｔｔ）ストレッチを有するＨｔｔの第１エキソンをコードするｃＤＮＡ構築物を用いて一過性にトランスフェクションされた線条体ニューロンの一次培養液からなる。この細胞モデルにおいては、Ｅｘｐ−Ｈｔｔの過剰発現により、自発的な凝集体の形成および死滅が起こる。これらの２つのパラメーターをそれぞれ２４時間後および４８時間後に評価し得る。ＣＹＰ４６Ａ１の可能性ある防御的な役割を分析するために、その野生型の完全長タンパク質（ＣＹＰ４６Ａ１）または突然変異形（ｍｕｔ−ＣＹＰ４６Ａ１）をコードするｃＤＮＡを、Ｅｘｐ−Ｈｔｔと共に同時トランスフェクションした。ＨｔｔまたはＥｘｐ−Ｈｔｔ発現はＧＦＰ標識により検出され、一方ＣＹＰ４６Ａ１およびｍｕｔ−ＣＹＰ４６Ａ１はＨａ免疫標識後に検出された。同時トランスフェクションアッセイにおいて、全てのトランスフェクションされたニューロンがＧＦＰおよびＨａの同時発現を示した（図２）。
【００６８】
Ｂ−１）ＥｘｐＨｔｔにより媒介される凝集体の形成に対するＣＹＰ４６Ａ１の過剰発現の効果：
ＧＦＰ−ＥｘｐＨｔｔをコードするプラスミドを用いて線条体ニューロンをトランスフェクションしてから２４時間後、トランスフェクションされたニューロンの５８％がＥｘｐ−Ｈｔｔの凝集体を示した（図３）。ＧＦＰ−Ｈｔｔを発現するニューロンにおいては凝集体は全く観察されなかった（データは示さず）。ＣＹＰ４６Ａ１とＥｘｐＨｔｔの同時発現は、凝集体形成の強力かつ有意な減少を促進した（５８％ｖｓ２７．５％）（図３）。凝集体の僅かであるが有意な減少（５８％ｖｓ４７％）が、不活性なＣＹＰ４６Ａ１突然変異体で見られた。結論すると、ＣＹＰ４６Ａ１の過剰発現は、Ｅｘｐ−Ｈｔｔによる凝集体形成から線条体ニューロンを防御する。
【００６９】
Ｂ．２）．ＥｘｐＨｔｔにより媒介される線条体ニューロンの死滅に対するＣＹＰ４６Ａ１発現の効果
線条体ニューロンにおけるＥｘｐＨｔｔの発現は、Ｈｔｔ発現ニューロンと比較した場合、生存の有意な減少を誘導した（図４）。実際に、トランスフェクションから４８時間後、Ｈｔｔ発現ニューロンの８９％がトランスフェクション後に依然として生存していたが、一方、Ｅｘｐ−Ｈｔｔ発現ニューロンの僅か５５％しか生存していなかった。ｍｕｔ−ＣＹＰ４６Ａ１とＥｘｐ−Ｈｔｔの同時発現は、線条体の死滅に対して防御しなかった。これに対して、Ｅｘｐ−ＨｔｔおよびＣＹＰ４６Ａ１を同時発現した線条体ニューロンにおいてはニューロン保護が認められた（図４）。従って、Ｅｘｐ−Ｈｔｔ＋ＣＹＰ４６Ａ１でトランスフェクションされたニューロンにおいては生存ニューロンの比率は７６％まで上昇したが、これに対してＥｘｐ−Ｈｔｔ発現ニューロンのみでは５５％、またはＨｔｔ発現ニューロンにおいては８９％であった。従って、ＣＹＰ４６Ａ１は、ＥｘｐＨｔｔによって誘導されるニューロン死滅に対して強力な防御効果を有する。
【００７０】
実施例２：in vivoにおけるＣＹＰ４６Ａ１の効果：
材料および方法
マウスにおけるＡＡＶｒｈ．１０−ＧＦＰおよびＡＡＶｒｈ．１０−ＣＹＰ４６Ａ１−Ｈａの線条体への送達
使用した２つのＡＡＶｒｈ１０ベクターは、ＡＡＶ２の逆位末端配列によって囲まれたＣＭＶ／β−アクチンハイブリッドプロモーターによって駆動される、ｇｆｐｃＤＮＡ（ＡＡＶｒｈ．１０−ＧＦＰ、またはヘマグルチニンタグとin frameにあるヒトＣＹＰ４６Ａ１ｃＤＮＡ（ＡＡＶｒｈ．１０−ＣＹＰ４６Ａ１−Ｈａ）からなる発現カセットを含む。両方のＡＡＶｒｈ１０ベクターが、Pr Ronald G. Crystal laboratory (Department of Genetic Medicine, Weill Medical College of Cornell University, New York, New York, USA)において作製された。４週令の時にＷＴまたはＲ６／２マウスを、ケタミン／キシラジン溶液（ケタミン１００mg/kg、Merial、Lyon、Franceおよびキシラジン１０mg/kg、Bayer Health Care、Germany）の腹腔内注射によって麻酔し、そして慣用的なＰＣ２（物理的封じ込めレベル２）の実験室中の脳定位固定装置（Kopf）に配置した。マウスは、線条体の両側に（Ａ／Ｐ＋０．５mm、Ｍ／Ｌ＋／−２．１mm、Ｄ／Ｖ−３．３５mm）投与されたＡＡＶｒｈ．１０ＧＦＰ（１０３vg/ml）またはＡＡＶｒｈ．１０ＣＹＰ４６Ａ１−Ｈａ（１．６×１０１２vg/ml）または食塩水溶液（ＮａＣｌ０．００１％）を受け、注射容量は０．２μl/分の速度で２μlであった。手術後、マウスをＰＣ２動物施設で７２時間かけて回復させ、そしてＰＣ１動物施設を有する表現型プラットフォームに移した。
【００７１】
in vivoにおける送達後の脳におけるＡＡＶｒｈ．１０の形質導入および指向性の評価
ＷＴマウス線条体へのＡＡＶｒｈ．１０−ＧＦＰまたはＡＡＶｒｈ．１０−ＣＹＰ４６Ａ１−Ｈａの送達から３週間後、動物をペントバルビタールナトリウムの過剰投与２５０mg/kg（Sanofi, Paris, France）によって麻酔し、５分間かけて２５ml/分で蠕動ポンプを用いて送達された４％パラホルムアルデヒド溶液を用いて経心的に灌流した。その後、脳を同じ溶液中で一晩かけて後固定（postfix）し、そして４℃で保存した。冠状切片または矢状切片（３０μm）をビブラトーム（Leica Microsystems, Rueil-Malmaison, France）を用いて切断し、そして−２０℃で３０％エチレングリコール、３０％グリセロール、および０．１Ｍリン酸緩衝液を含む溶液中に維持し、その後、組織学的分析のための処理を行なった。
【００７２】
ＡＡＶｒｈ．１０の形質導入
脳のＡＡＶｒｈ．１０の形質導入を、ＷＴマウスへのＡＡＶｒｈ．１０−ＧＦＰベクターの送達から３週間後に決定した。ＴＢＳ中で３回濯いだ後、脳切片をカバーガラス下にVectashield (Vector Laboratories)を用いて積載し、そしてＧＦＰ染色を、ＰＣコンピューターに接続されたＣＣＤカメラの装備された落射蛍光電動顕微鏡（Zeiss）を使用して、脳の吻側尾側の方向にかけて冠状脳切片上で分析した。線条体から放出された緑色蛍光の断層画像再構成をモザイク写真（Mastronarde, D.N., 1997）から、その後、ＩＭＯＤソフトウェア（Kremer et al, 1996）のお陰で３次元表示によって実施した。
【００７３】
ＡＡＶｒｈ．１０の指向性
脳におけるＡＡＶｒｈ．１０の指向性を、ＷＴマウスの線条体へのＡＡＶｒｈ．１０ＣＹＰ４６Ａ１Ｈａベクターの送達から３週間後に研究した。特異的なニューロンおよびグリアマーカーを免疫組織化学法によって評価した。自由に浮遊している切片をＴＢＳ中で濯ぎ、そして１５分間かけてＴＢＳ中０．２％トリトンＸ−１００と共にインキュベーションした。３回濯いだ後、浮遊している切片を、ＴＢＳ中１０％ＮＧＳを用いて室温で１時間かけて飽和させた。その後、切片をＴＢＳ中で３回濯ぎ、そしてＴＢＳ１Ｘ−ＮＧＳ５％中で４℃で一晩かけて一次抗体（Ha 1/500, Covance ; NeuN 1/200, AbCys Vector ; Olig2 1/1000, Millipore; GFAP 1/1000, Dako; Isolectine 1/1000, Chemicon）と共にインキュベーションした。その後、切片をAlexa Fluor二次抗体（1/1000, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）と共に室温で９０分間インキュベーションした。ＴＢＳ中で３回濯いだ後、組織切片をカバーガラス下にVectashield (Vector Laboratories)を用いて蛍光顕微鏡検査のために積載した。
【００７４】
ＨＤマウスモデルにおけるＡＡＶｒｈ１０−ＣＹＰ４６Ａ１Ｈａのin vivoにおける研究
握り締め試験およびロータロッドパフォーマンスを、ＷＴおよびＲ６／２マウスへのＡＡＶｒｈ．１０−ＣＹＰ４６Ａ１−Ｈａの送達または食塩水の注射から２週間後に試験した。握り締めスコアについては、マウスを６週令から１１週令まで１週間に１回試験した。マウスを尾によって３０秒間吊るし、そして以下の尺度に従って握り締め表現型を特定のレベルに等級づけた：０、握り締めは全くなし；１、前肢のみの握り締め；２、１回または２回の前肢および後肢の両方の握り締め；３、３回を超えるまたは５秒間を超える前肢および後肢の両方の握り締め。ロータロッドパフォーマンスについては、６週令から１１週令までのマウスを、毎週毎に３日間連続して試験した。トレーニングトライアルを５週令時に実施したが、データは最終結果に含めなかった。毎日のセッションは、４ＲＰＭでの５分間のトレーニングトライアルを含んだ。少なくとも１時間後、マウスは、３０分間のトライアル間の間隔で隔てられた加速速度（５分間で０から４０ＲＰＭ）での３回の５分間のトライアルで試験された。ロータロッドから落ちるまでの潜伏時間（latency）を記録した。５分間を超えてロータロッド上に留まるマウスを除去し、そしてその時間を３００秒間としてスコアリングした。
【００７５】
統計学的分析
２元配置分散分析、その後のボンフェローニ試験を、ロータロッドパフォーマンスの比較のために使用した（＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。全ての統計学的な分析のために、比較間の差異をＰ＜０．０５の場合に有意であると判断した。
【００７６】
結果
Ｃ．ＡＡＶｒｈ．１０ベクターを使用したin vivoにおけるＣＹＰ４６Ａ１の送達
Ｃ１．形質導入の効率
マウスの線条体においてＣＹＰ４６Ａ１を発現させるために、本発明者らはＡＡＶｒｈ．１０ベクターを使用することを決定した。第１の工程において、本発明者らは、ＧＦＰをコードするｃＤＮＡを発現するＡＡＶｒｈ．１０を使用した。ＡＡＶｒｈ．１０−ＧＦＰベクターを、in vivoにおいて線条体にマイクロインジェクションを使用して投与した（方法の章を参照）。ＧＦＰの発現を、注射から３週間後に矢状切片および冠状切片から分析した。本発明者らのパラメーターを使用して、ＧＦＰは、線条体にシナプス的に接続された２つの脳構造である淡蒼球および大脳皮質と共に、背側線条体の全ての伸長部分内において観察することができた（図５Ａおよび５Ｂ）。ＧＦＰを発現している冠状切片の３次元表示を実施し、線条体の６３％における、すなわち全ての背側線条体におけるＧＦＰの発現を示した（図６Ａおよび６Ｂ）。
【００７７】
Ｃ２．ニューロンの指向性
その後、本発明者らは、同じ実験条件に従ってＡＡＶｒｈ．１０−ＣＹＰ４６Ａ１−Ｈａベクター（図７Ａ）を使用した（１．６×１０１２vg/mlにおける２μl）。このベクターによって誘導されるＣＹＰ４６Ａ１の発現は、Ｈａ免疫細胞検出法を使用して明らかとなり、これは予期された通り、全ての背側線条体内（尾状核被殻−ＣｐＵ）に見られた（図７Ｂ）。細胞レベルにおいては、本発明者らは、ＣＹＰ４６Ａ１−Ｈａ産物の細胞質内局在を発見した（図７Ｃ）。二重免疫細胞化学検出法によって評価したところ、ＡＡＶｒｈ１０ベクターは強いニューロンへの指向性を有していた。なぜなら、Ｈａによる標識は完全に、ニューロンマーカーＮｅｕＮと重複していたからである（図７Ｃ〜Ｄ）。さらなる実験が、グリアマーカーを使用して、アストロサイト（ＧＦＡＰ）、アストログリア（イソレクチン）およびオリゴデンドロサイト（Ｏｌｉｇ２）について実施された。これらのどのマーカーもＨａと同時標識されなかった（図８Ａ〜Ｃ）。従って、合わせてこれらのデータは、ＡＡＶｒｈ１０−ＣＹＰ４６Ａ１−Ｈａベクターが厳密なニューロンへの指向性を有することを示す。
【００７８】
Ｄ．ＨＤのＲ６／２マウスモデルにおけるＡＡＶｒｈ．１０−Ｃｙｐ４６Ａ１−Ｈａの送達
Ｄ１．行動の防御
ＨＤのトランスジェニックマウスモデルである、１５０個のＣＡＧリピートを有するヒトＨＴＴ遺伝子の第１エキソンを過剰発現するＲ６／２マウス、およびその野生型同腹仔を、この試験部分に使用した。両方の株に、誕生から４週間後にＡＡＶｒｈ．１０−ＣＹＰ４６Ａ１−Ｈａベクターを、線条体内の両側に注射した（野生型マウスについてはｎ＝６、そしてＲ６／２マウスについてはｎ＝１２〜１３）。対照群に、同じ実験条件に従って食塩水溶液を注射した。
【００７９】
生後６週令から１１週令までの注射されたマウスの行動パフォーマンスを、ロータロッド（図９）および握り締め（図１０）試験を使用して評価した。線条体への注射が何であれ（すなわち食塩水またはＡＡＶｒｈ．１０−ＣＹＰ４６Ａ１−Ｈａ）、野生型マウスは、ロータロッド試験において同じ行動パフォーマンスを示し（図９）、誕生から９週令と１１週令との間に僅かな減少を示し、これはおそらく、この試験を実施する際のモチベーションの僅かな減少を反映していた。食塩水およびＡＡＶｒｈ．１０−ＣＹＰ４６Ａ１−Ｈａの注射されたＲ６／２マウスは、６週令から１１週令の野生型マウスよりも有意により低いパフォーマンスを示した（図９）。それにも関わらず、６週令から１１週令の食塩水の注射されたＲ６／２マウスは、この試験において進行的な減少を示したが、ＡＡＶｒｈ１０−ＣＹＰ４６Ａ１−Ｈａの注射されたＲ６／２マウスは同じパフォーマンスレベルに留まった（図９）。誕生から１１週間後（注射から７週間後）、ＡＡＶｒｈ．１０−ＣＹＰ４６Ａ１−Ｈａの注射されたＲ／６マウスは、食塩水の注射された野生型マウスと有意に異ならなかった。
【００８０】
食塩水の注射されたＲ６／２マウスは、尾から吊り下げられている間に後肢握り締め応答において進行的な変化を示した（図１０Ａ）。誕生から１１週間後にはこれらのマウスのほぼ１００％が、最大スコアに到達した（５秒間を超える前肢および後肢の両方の握り締め）。ＡＡＶｒｈ１０−ＣＹＰ４６Ａ−Ｈａの注射されたＲ６／２マウスは、その応答の遅延および１１週間後における有意により低いスコアを示し、すなわち、これらのマウスの僅か３０％がスコア３を示した（図１０Ｂ）。合わせるとこれらのデータは、ＡＡＶｒｈ．１０−ＣＹＰ４６Ａ１−Ｈａは、ＨＤにおける突然変異によって誘導される自発運動の悪化を軽減する。
【００８１】
参考文献：
本出願全体を通して、種々の参考文献が、本発明が属する技術分野の最新技術を記載する。これらの参考文献の開示は、本明細書において、本開示への参照によって組み入れられる。
【００８２】
【表１】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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