(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＦ−０２３４１０６６を用いた治療に対する無応答性のリスクが増加した、癌を有する被験体または癌を発現するリスクを有する被験体を同定するための組成物であって、サンプルを分析して１つ以上の突然変異ＡＬＫポリヌクレオチド分子の存在を検出するための核酸を含み、
前記１つ以上の突然変異ＡＬＫポリヌクレオチド分子は、１１５６位および／または１１９６位に変異を有する突然変異ＡＬＫポリペプチドをコードし、
前記１つ以上の突然変異ＡＬＫポリヌクレオチド分子の存在が、前記被験体がＰＦ−０２３４１０６６を用いた治療に対する無応答性の増加したリスクを有することを示唆する、組成物。
【請求項２】
ＰＦ−０２３４１０６６を用いた治療に対する無応答性のリスクが増加した、癌を有する被験体または癌を発現するリスクを有する被験体を同定するための組成物であって、サンプルを分析して、１１５６位および／または１１９６位に変異を有する１つ以上の突然変異ＡＬＫポリペプチドの発現量、構造、および／または活性を検出するためのタンパク質を含み、
前記１つ以上の突然変異ＡＬＫポリペプチドの存在が、前記被験体がＰＦ−０２３４１０６６を用いた治療に対する無応答性の増加したリスクを有することを示唆する、組成物。
【請求項３】
前記被験体が、ＡＬＫ阻害剤を用いた治療を以前に受けていないか、またはＡＬＫ阻害剤を用いた治療を以前に受けていて、前記ＡＬＫ阻害剤に対して少なくとも部分耐性を発現している、請求項１または２記載の組成物。
【請求項４】
前記癌が、未分化大細胞リンパ腫、神経芽細胞腫、乳癌、結腸直腸癌、炎症性筋線維芽細胞性腫瘍、および非小細胞肺癌からなる群より選択される、請求項１または２記載の組成物。
【請求項５】
前記サンプルが、痰、気管支肺胞洗浄、胸水、組織、全血、血清、血漿、頬腔擦取物、唾液、脳脊髄液、尿、排泄物、循環腫瘍細胞、循環核酸、および骨髄からなる群より選択される、請求項１または２記載の組成物。
【請求項６】
前記サンプルが組織であり、前記組織が腫瘍または癌の組織である、請求項５記載の組成物。
【請求項７】
前記サンプルが細胞を含む、請求項１または２記載の組成物。
【請求項８】
前記１つ以上のＡＬＫ突然変異体が核酸ハイブリダイゼーション分析によって評価される、請求項１記載の組成物。
【請求項９】
前記１つ以上のＡＬＫ突然変異体がポリメラーゼ連鎖反応によって評価される、請求項１記載の組成物。
【請求項１０】
前記１つ以上の突然変異ＡＬＫポリペプチドの発現量が、前記１つ以上の突然変異ＡＬＫポリペプチドに特異的に結合する試薬を使用して検出される、請求項２記載の組成物。
【請求項１１】
前記試薬が、抗体、抗体誘導体、および抗体フラグメントからなる群より選択される、請求項１０記載の組成物。
【請求項１２】
前記１つ以上の突然変異ＡＬＫポリペプチドの量、構造および／または活性が対照サンプルと比較される、請求項２記載の組成物。
【請求項１３】
前記１つ以上のＡＬＫ突然変異体が、第１の時点およびその後の少なくとも１つの時点において評価される、請求項１または２記載の組成物。
【請求項１４】
前記サンプルが、生殖細胞系または体細胞ゲノムＤＮＡを含む、請求項１または２記載の組成物。
【請求項１５】
ＡＬＫ阻害剤を用いた治療に対する癌患者の化学的感受性を請求項１〜１４いずれか１項記載の組成物を用いて判定するキットであって、
１つ以上の突然変異ＡＬＫポリヌクレオチド分子またはポリペプチドに特異的に結合する試薬、および使用説明書を含み、
前記１つ以上の突然変異ＡＬＫポリヌクレオチド分子またはポリペプチドは、１１５６位に変異を有する突然変異ＡＬＫポリペプチドをコードする突然変異ＡＬＫポリヌクレオチド、または１１５６位に変異を有するＡＬＫポリペプチドである、キット。
【請求項１６】
ＡＬＫ阻害剤をさらに含む、請求項１５記載のキット。
【請求項１７】
前記試薬が、１つ以上のポリヌクレオチドプローブを含み、該プローブのそれぞれが、１１５６位に変異を有する突然変異ＡＬＫポリペプチドをコードする突然変異ＡＬＫポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列を含む、請求項１５記載のキット。
【請求項１８】
前記プローブが、約５０〜１０７個のヌクレオチド長を有するポリヌクレオチドを含む、請求項１７記載のキット。
【請求項１９】
前記プローブが、オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、および核酸塩基を含む合成遺伝子プローブからなる群より選択される請求項１７記載のキット。
【請求項２０】
前記試薬が、１１５６位に変異を有する突然変異ＡＬＫポリペプチドに対する、抗体、および抗体誘導体、および抗体フラグメントを含むことを特徴とする請求項１５記載のキット。
【請求項２１】
試験化合物が１つ以上の突然変異ＡＬＫポリペプチドの活性を調節するか否かを判定する方法であって、
（ａ）１１５６位に変異を有する１つ以上の突然変異ＡＬＫポリペプチドをコードする構成体をトランスフェクトされた哺乳動物細胞を前記試験化合物と試験管内で接触させ、
（ｂ）前記１つ以上の突然変異ＡＬＫポリペプチドの活性について前記哺乳動物細胞を評価することを含み、
対照実験と比較して、前記試験化合物の存在下で活性が有意に変調された場合に、前記試験化合物が、前記１つ以上の突然変異ＡＬＫポリペプチドの調節剤として同定される、方法。
【請求項２２】
前記対照が、野生型ＡＬＫポリペプチドを発現する哺乳動物細胞を含む、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記１つ以上の突然変異ＡＬＫポリペプチドの活性が、ＡＴＰ結合、チロシンキナーゼ活性、癌細胞増殖、腫瘍成長、腫瘍数、アポトーシス、および腫瘍転移からなる群より選択される、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記対照実験が、前記試験化合物の不在下で、前記１つ以上の突然変異ＡＬＫポリペプチドを発現する哺乳動物細胞を含む、請求項２１記載の方法。
【請求項２５】
前記１つ以上の突然変異ＡＬＫポリペプチドの活性が、ＡＴＰ結合、チロシンキナーゼ活性、癌細胞増殖、腫瘍成長、腫瘍数、アポトーシス、および腫瘍転移からなる群より選択される、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記１つ以上の突然変異ＡＬＫポリヌクレオチド分子は、
Ｇ４３７４Ａ突然変異を有する突然変異ＡＬＫ ｃＤＮＡ；および
Ｃ４４９３Ａ突然変異を有する突然変異ＡＬＫ ｃＤＮＡからなる群より選択される、請求項１記載の組成物。
【請求項２７】
前記１つ以上の突然変異ＡＬＫポリペプチド分子は、
Ｃｙｓ１１５６Ｔｙｒ突然変異を有する突然変異ＡＬＫタンパク質；および
Ｌｅｕ１１９６Ｍｅｔ突然変異を有する突然変異ＡＬＫタンパク質からなる群より選択される、請求項２記載の組成物。
【請求項２８】
前記１つ以上の突然変異ＡＬＫポリヌクレオチドまたはポリペプチド分子は、
Ｇ４３７４Ａ突然変異を有する突然変異ＡＬＫ ｃＤＮＡ、または
Ｃｙｓ１１５６Ｔｙｒ突然変異を有する突然変異ＡＬＫタンパク質である、請求項１５記載のキット。
【請求項２９】
前記ＡＬＫ阻害剤はＰＦ−０２３４１０６６である、請求項１６記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本願は、２０１０年２月４日出願の米国仮特許出願第６１／３３７，４６５号の優先権の利益を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）変異の同定、さらには、ＡＬＫ阻害剤に対し耐性を与える新しいＡＬＫ変異の同定に基づいた、癌の同定、評価および治療法に関する。
【背景技術】
【０００３】
チロシンキナーゼは、アデノシン三リン酸の末端リン酸の転移による、タンパク質基質のチロシン残基のリン酸化を触媒する酵素の一種である。多くの場面において、チロシンキナーゼは、細胞増殖、発癌、および細胞分化を含む多くの細胞機能のシグナル伝達における重要な役割を担う。
【０００４】
ＥＭＬ４−ＡＬＫは、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の事例の５％以下に存在する融合型チロシンキナーゼであり、ヒトの２番染色体の短腕内に微小な逆位が生じた結果として発現する（非特許文献１、２）。ＥＭＬ４−ＡＬＫは、各モノマーのＥＭＬ４領域内のコイルドコイル領域の相互作用の結果として構造的な二量化を被り、それによって顕著な発癌活性を得る。特に肺上皮細胞においてＥＭＬ４−ＡＬＫを発現するトランスジェニックマウスは、生後速やかに両肺に数百個もの肺腺癌結節を発現するが、同マウスにＡＬＫチロシンキナーゼ活性の特異的阻害剤を経口投与すると、このような結節を肺から速やかに消失させる（非特許文献３）。これらの観察は、この融合キナーゼを抱えるＮＳＣＬＣの発癌におけるＥＭＬ４−ＡＬＫの重要な役割を明らかにし、さらには、この癌のためのＡＬＫ阻害剤を用いた分子標的治療の実現可能性を支持する。例えば、ＡＬＫおよびＭＥＴの両方のチロシンキナーゼ活性の阻害剤であるＰＦ−０２３４１０６６の臨床試験がＥＭＬ４−ＡＬＫ陽性ＮＳＣＬＣの治療の下で行われており、その中間結果は有望である（非特許文献４）。しかしながら、ＥＭＬ４−ＡＬＫ陽性腫瘍のサブセットは阻害剤には応答せず、したがって、未知の分子を基盤とした治療は不成功に終わる。
【０００５】
ＰＦ−０２３４１０６６に加えて、他のチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）も、癌患者に顕著な治療活性を有することが示されている。ＡＢＬ１およびＫＩＴ用のＴＫＩであるメシル酸イマチニブは、例えば、ＢＣＲ−ＡＢＬ１融合キナーゼ陽性の慢性骨髄性白血病または活性化ＫＩＴ陽性の消化管間質性腫瘍を有する個人の転帰を顕著に改善する（非特許文献５、６）。さらには、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）のＴＫＩであるゲフィチニブおよびエルロチニブは、ＥＧＦＲ活性化に関係するＮＳＣＬＣの治療に効果がある（非特許文献７、８）。残念ながら、標的腫瘍のサブセットは、治療の最初から、対応するＴＫＩに対して難治性であるか、あるいは、初期応答の後に耐性を持つようになる。ＡＴＰ結合ポケットの形状に直接的にまたはアロステリックに影響を及ぼし、ＴＫＩの結合を妨害する標的キナーゼにおける二次変異が、治療不成功の一部の事例において検出されている（非特許文献９〜１２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Soda , M. et al. (2007) Nature 448:561-566
【非特許文献２】Mano, H. (2008) Cancer Sci. 99:2349-2355
【非特許文献３】Soda, M. et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:19893-19897
【非特許文献４】Kwak, E.L. et al. (2009) J. Clin. Oncol. 27(suppl):15s (abstract 3509)
【非特許文献５】Druker, B.J. et al. (2001) N. Engl. J. Med. 344:1031-1037
【非特許文献６】Heinrich, M.C. et al. (2008) J. Clin. Oncol. 26:5360-5367
【非特許文献７】Mok, T.S. et al. (2009) J. Clin. Oncol. 27:5080-2087
【非特許文献８】Mok, T.S. et al. (2009) N. Engl. J. Med. 361:947-957
【非特許文献９】Deininger, M. et al. (2005) Blood 105:2640-2653
【非特許文献１０】Kobayashi, S. et al. (2005) N. Engl. J. Med. 352:786-792
【非特許文献１１】Pao, W. et al. (2005) PLoS Med. 2:e73
【非特許文献１２】Shah, N.P. et al. (2002) Cancer Cell 2:117-125
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、異常な発現および／または活性に関する疾患を同定、評価、予防及び治療する組成物、キット、および方法を良好に開発することを目的として、ＥＭＬ４−ＡＬＫなどのチロシンキナーゼに耐性を与える突然変異を同定することが緊急的に必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、既知のＡＬＫ阻害剤に対し耐性を与える新しい未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）変異の同定に基づいた癌の同定、評価および治療のための、少なくとも、組成物、方法およびキットを提供する。このようなＡＬＫ突然変異は、新しいＡＬＫ突然変異によって生じた異常なＡＴＰ結合ポケットに適合し、ＡＬＫ活性を阻害することができる医薬組成物の同定にとって臨床的に意義がある。
【０００９】
１つの態様では、本発明は、癌を有する、またはＡＬＫ阻害剤を用いた治療に対する無応答性のリスクが増加した、癌を発現するリスクを有する被験体を同定する方法であって、
前記患者からサンプルを採取し、前記サンプルを分析して、１つ以上の突然変異ＡＬＫポリヌクレオチド分子の存在を検出することを含み、
前記１つ以上の突然変異ＡＬＫポリヌクレオチド分子の存在が、前記被験体の前記ＡＬＫ阻害剤を用いた治療に対する無応答性のリスクが増加したことを示唆する
方法を提供する。
【００１０】
別の態様では、本発明は、癌を有するまたはＡＬＫ阻害剤を用いた治療に対する無応答性のリスクが増加した、癌を発現するリスクを有する被験体を同定する方法であって、
前記患者からサンプルを採取し、前記サンプルを分析して、１つ以上の突然変異ＡＬＫポリペプチドの発現量、構造、および／または活性を検出することを含み、
前記１つ以上の突然変異ＡＬＫポリペプチドの存在が、前記被験体の前記ＡＬＫ阻害剤を用いた治療に対する無応答性のリスクが増加したことを示唆する
方法を提供する。
【００１１】
本発明のいずれかの態様の一部の実施の形態では、被験体は、ＡＬＫ阻害剤を用いた治療を以前に受けていないか、あるいはＡＬＫ阻害剤を用いた治療を以前に受けており、前記ＡＬＫ阻害剤（例えば、ＰＦ−０２３４１０６６、ＰＤＤ、２−メチル−１１−（２−メチルプロピル）−４−オキソ−４，５，６，１１，１２，１３−ヘキサヒドロ−２Ｈ−インダゾロ［５，４−ａ］ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−８−イル［４−（ジメチルアミノ）ベンジル］カルバメート、（１Ｓ，２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）−３−（｛５−クロロ−２−［（１−エチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−６−メトキシ−２−オキソ−１Ｈ−１−ベンゾアゼピン−７−イル）アミノ］−４−ピリミジニル｝アミノ）ビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−２−カルボキサミド、およびＮＶＰ−ＴＡＥ６８４）に対して少なくとも部分耐性を発現している。他の実施の形態では、癌は、未分化大細胞リンパ腫、神経芽細胞腫、乳癌、結腸直腸癌、炎症性筋線維芽細胞性腫瘍、および非小細胞肺癌からなる群より選択される。さらに別の実施の形態では、サンプルは、痰、気管支肺胞洗浄、胸水、組織、全血、血清、血漿、頬腔擦取物、唾液、脳脊髄液、尿、排泄物、循環腫瘍細胞、循環核酸、および骨髄からなる群より選択される。さらに別の実施の形態では、サンプルは細胞または組織を含む。一部の実施の形態では、組織は腫瘍または癌組織である。他の実施の形態では、１つ以上の突然変異ＡＬＫポリヌクレオチド分子またはポリペプチドは、表１記載の、突然変異ＡＬＫポリヌクレオチド分子またはポリペプチドからなる群より選択される。さらに別の実施の形態では、１つ以上のＡＬＫ突然変異は、核酸ハイブリダイゼーション分析によって評価される。さらに別の実施の形態では、１つ以上のＡＬＫ突然変異はポリメラーゼ連鎖反応によって評価される。他の実施の形態では、前記１つ以上のＡＬＫポリペプチドの発現量は、１つ以上のＡＬＫポリペプチドに特異的に結合する試薬（例えば、抗体、抗体誘導体、および抗体フラグメント）を使用して検出される。さらに別の実施の形態では、前記１つ以上の突然変異ＡＬＫポリペプチドの量、構造および／または活性は、対照サンプルと比較される。さらに別の実施の形態では、１つ以上のＡＬＫ突然変異は、第１の時点およびその後の少なくとも１つの時点において評価される。他の実施の形態では、サンプルは生殖細胞系または体細胞ゲノムＤＮＡを含む。
【００１２】
さらに別の態様では、本発明は、癌を有する、または癌を発現するリスクのある患者を治療する方法であって、前記患者からサンプルを採取し、前記サンプルを分析して表１記載の１つ以上の突然変異ＡＬＫポリヌクレオチド分子の存在を検出し、ＡＬＫ阻害剤を治療に有効な量で前記患者に投与することを含む、方法を提供する。一部の実施の形態では、ＡＬＫ阻害剤は、ＰＦ−０２３４１０６６、ＰＤＤ、２−メチル−１１−（２−メチルプロピル）−４−オキソ−４，５，６，１１，１２，１３−ヘキサヒドロ−２Ｈ−インダゾロ［５，４−ａ］ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−８−イル［４−（ジメチルアミノ）ベンジル］カルバメート、（１Ｓ，２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）−３−（｛５−クロロ−２−［（１−エチル―２，３，４，５−テトラヒドロ−６−メトキシ−２−オキソ−１Ｈ−１−ベンゾアゼピン−７−イル）アミノ］−４−ピリミジニル｝アミノ）ビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−２−カルボキサミド、およびＮＶＰ−ＴＡＥ６８４からなる群より選択される。他の実施の形態では、被験体は、ＡＬＫ阻害剤を用いた治療を以前に受けていないか、あるいはＡＬＫ阻害剤を用いた治療を以前に受けており、前記ＡＬＫ阻害剤に対して少なくとも部分耐性を発現している。
【００１３】
さらに別の態様では、本発明は、ＡＬＫ阻害剤を用いた治療に対する癌患者の化学的感受性を判定するキットであって、１つ以上の突然変異ＡＬＫポリヌクレオチド分子またはポリペプチドに特異的に結合する試薬；および使用説明書を含むキットを提供する。一部の実施の形態では、前記キットは、ＡＬＫ阻害剤をさらに含む。他の実施の形態では、前記試薬は１つ以上のポリヌクレオチドプローブを含み、前記プローブのそれぞれは、表１に記載されるヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列、または表１に記載されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列（例えば、オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、および核酸塩基を含む合成遺伝子プローブ）を含む。さらに別の実施の形態では、前記プローブは、約５０〜１０7のヌクレオチド長のポリヌクレオチドを含む。さらに別の実施の形態では、前記試薬は、表１に記載される１つ以上のポリヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドに対する、抗体、および抗体誘導体、および抗体フラグメントを含む。
【００１４】
別の態様では、本発明は、試験化合物が１つ以上の突然変異ＡＬＫポリペプチドの活性を調節するか否かを判定する方法であって、前記１つ以上の突然変異ＡＬＫポリペプチドをコードする構成体をトランスフェクトされた哺乳動物細胞を前記試験化合物と接触させ、前記哺乳動物細胞を前記１つ以上の突然変異ＡＬＫポリペプチドの活性について評価することを含み、対照実験と比べて前記試験化合物の存在下において顕著に活性が調節される場合に、前記試験化合物を前記１つ以上の突然変異ＡＬＫポリペプチドのモジュレータとして同定することを特徴とする方法を提供する。一部の実施の形態では、１つ以上の突然変異ＡＬＫポリヌクレオチド分子またはポリペプチドは、表１記載の突然変異ＡＬＫポリヌクレオチド分子またはポリペプチドからなる群より選択される。他の実施の形態では、対照は、表１記載のポリペプチドからなる群より選択される野生型ＡＬＫポリペプチドを発現する哺乳動物細胞を含む。さらに別の実施の形態では、１つ以上の突然変異ＡＬＫポリペプチドの活性は、ＡＴＰ結合、チロシンキナーゼ活性、癌細胞増殖、腫瘍成長、腫瘍数、アポトーシス、および腫瘍転移からなる群より選択される。さらに別の実施の形態では、対照実験は、例えば、１つ以上の突然変異ＡＬＫポリペプチドの活性（例えば、ＡＴＰ結合、チロシンキナーゼ活性、癌細胞増殖、腫瘍成長、腫瘍数、アポトーシス、および腫瘍転移）によって決定される試験化合物の不存在下で１つ以上の突然変異ＡＬＫポリペプチドを発現する哺乳動物細胞を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、ＡＬＫチロシンキナーゼ阻害剤に対する耐性に関連した本発明の新しいＡＬＫ突然変異を表している。図１Ａは、ＥＭＬ４−ＡＬＫタンパク質の略図を示している。キナーゼドメインにおける２つのde novo変異の位置が示されており、キナーゼ領域または融合ｃＤＮＡの増幅用のＰＣＲプライマーが、上方に黒塗りおよび白抜きの矢印でそれぞれ示されている。図１Ｂは、ＡＬＫキナーゼ領域ｃＤＮＡの大規模シークエンシング（deep sequencing）の結果を示している。ＧＡＩＩシステムを用いて、ＮＳＣＬＣ細胞株Ｈ２２２８由来または標本番号Ｊ−＃１、Ｊ−＃１２、Ｊ−＃１１３、Ｊ−＃１２７またはＬＫ−＃３３由来の１０００塩基対以下のＰＣＲ産物の配列を決定した。全読み取り範囲（全体）および一致しない読み取り（不一致）の数が、キナーゼ領域ｃＤＮＡの各位置にそれぞれ青色および赤色のひし形で示されている。差し込み図は、Ｊ−＃１およびＪ−＃１１３用のｃＤＮＡの５’領域の拡大図を示している（緑色の四角で示す）。図１Ｃは、Ｇ４３７４とＣ４４９３の位置を取り囲むＡＬＫ ｃＤＮＡクローンの電気泳動図を示している。ＰＣＲは、治療前に入手した痰（初期）および再発後に入手した胸水（再発）から調製したｃＤＮＡを用いて行われた。置換Ａヌクレオチドが赤色で示されている。
【図２】図２は、ＡＬＫ ｃＤＮＡのＧ４３７４およびＣ４４９３に対応する位置を取り囲むゲノム配列を表している。Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（米国カリフォルニア州カールズバッド所在）製）および次のプライマー（５’−ＧＧＴＡＡＧＡＡＧＴＧＧＣＴＣＡＣＴＣＴＴＧＡＧ−３’および５’−ＣＡＣＡＡＣＡＡＣＴＧＣＡＧＣＡＡＡＧＡＣＴＧＧ−３’）を用い、患者の胸水の細胞から単離されたゲノムＤＮＡを９４℃で１５秒間、６０℃で３０秒間および６８℃で２分間を３５サイクル行うＰＣＲに供し、産生物をｐＴ７Ｂｌｕｅ−２プラスミド（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社製）に連結させた。次に、３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いてプラスミド挿入物の配列を決定し、Ｇ４３７４Ａ（左のパネル）またはＣ４４９３Ａ（右のパネル）の変更を含むＰＣＲクローンを同定した。置換Ａヌクレオチドが赤色で示されている。
【図３】図３は、ＰＦ−０２３４１０６６で治療したＢＡ／Ｆ３細胞の結果を表している。ＥＭＬ４−ＡＬＫ（野生型）、ＥＭＬ４−ＡＬＫ（Ｃ１１５６Ｙ）、ＥＭＬ４−ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）、または二重変異体であるＥＭＬ４−ＡＬＫ（Ｃ１１５６Ｙ／Ｌ１１９６Ｍ）を発現するＢＡ／Ｆ３細胞を表示された濃度のＰＦ−０２３４１０６６の存在下で４８時間インキュベートし、その後、位相差顕微鏡法によって細胞形態を調べた。スケールバーは２０μｍである。
【図４】図４は、ＡＬＫチロシンキナーゼ阻害剤に対する耐性に関連した本発明の新しいＡＬＫ突然変異の特性を表している。図４Ａは、表示濃度のＰＦ−０２３４１０６６を用いて、５×１０5細胞を４８時間インキュベートした後にカウントしたＥＭＬ４−ＡＬＫ（野生型）、ＥＭＬ４−ＡＬＫ（Ｃ１１５６Ｙ）、ＥＭＬ４−ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）、または二重変異体であるＥＭＬ４−ＡＬＫ（Ｃ１１５６Ｙ／Ｌ１１９６Ｍ）を発現するＢＡ／Ｆ３細胞の数を示している。野生型のＥＭＬ４−ＡＬＫを発現するＢＡ／Ｆ３細胞に対する生存細胞のパーセンテージが示されている。データは、３つの独立した実験から得られた平均±標準偏差である。図４Ｂは、野生型または突然変変異体のＥＭＬ４−ＡＬＫのチロシンリン酸化におけるＰＦ−０２３４１０６６の効果を示している。ＦＬＡＧタグ化した野生型のＥＭＬ４−ＡＬＫまたはその突然変異体を発現するＢＡ／Ｆ３細胞を、表示濃度のＰＦ−０２３４１０６６に１５時間曝露し、その後、ＥＭＬ４−ＡＬＫを細胞溶解物から免疫沈降させて、Ｔｙｒ1604−リン酸化ＡＬＫまたはＦＬＡＧエピトープに特異的な抗体を用いたイムノブロット解析に供した（ＡＬＫ）。ＥＭＬ４−ＡＬＫの不活性変異体を発現する細胞（ＫＭ）を陰性対照として検査した。図４Ｃは、ＢＡ／Ｆ３細胞から免疫沈降させた、ＦＬＡＧタグ化した野生型のＥＭＬ４−ＡＬＫまたはその突然変異体についてのインビトロキナーゼ分析を示している（ＡＬＫ阻害剤には曝露せず）。その免疫沈降物を、［γ−32Ｐ］ＡＴＰ、合成ペプチド、および表示濃度のＰＦ−０２３４１０６６とともにインキュベートした。ペプチド基板免疫沈降物をリン酸化反応させたものを、ＦＬＡＧに対する抗体を用いたイムノブロット解析に別々に供した（下のパネル）。
【図５】図５は、ＡＬＫのキナーゼドメインの三次元構造モデルを表している。ＡＬＫのアミノ酸の位置は、結合ＡＴＰ類似体（ワールドワイドウェブのpdbj.org／index.htmlで利用可能な日本蛋白質構造データバンク（PDBj：Protein Data Bank of Japan）におけるＩＤ「1ir3」）を有するインスリン受容体の結晶構造と重なっていた。右のパネルは、左のパネルのモデルの右側に観察されるタンパク構造を示している。αらせん構造とβシート構造がそれぞれ赤紫色とオレンジ色で示されている。らせんαＣ、Ｃｙｓ１１５６、およびＬｅｕ1196の位置も表示されている。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、少なくともある程度は、癌治療におけるＡＬＫ阻害剤の有効性の予測に関連した、例えば未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）変異を含めた、ゲノムの特定部位の同定に基づいている。特に、ＡＬＫ阻害剤を用いた治療に対して少なくともある程度耐性のポリペプチドにつながりうる、新規のＡＬＫ遺伝子変異（例えば、ＥＭＬ４−ＡＬＫポリペプチドをコードする変異）が本願において特定される。本発明はさらに、限定はしないが、オリゴヌクレオチド系のマイクロアレイを含めた当技術分野で既知の技術を利用して、このような特異的ゲノム領域を同定する方法（Brennan, et al. (2004) Cancer Res. 64(14):4744-8; Lucito, et al. (2003) Genome Res. 13:2291-2305; Bignell et al. (2004) Genome Res. 14:287-295; Zhao, et al (2004) Cancer Research, 64(9):3060-71）、および、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく方法および直接配列に基づく方法などの他の方法についても提供する。本発明は、さらに、これらの方法に使用するための診断キットについても提供する。
【００１７】
本発明のさまざまな態様は、次のサブセクションでさらに詳細に説明される。
【００１８】
Ｉ．定義
マーカーの「変化量」またはマーカーの「変化レベル」という用語は、対照サンプルにおけるマーカーの発現量またはコピー数と比較した、ＡＬＫ遺伝子変異および／または遺伝子産物（例えば、表１記載のマーカー）などのマーカーまたは染色体領域のコピー数の増減、および／または、癌サンプルにおける１つまたは複数の特定のマーカー遺伝子の発現量の増減のことをいう。マーカーの「変化量」という用語はまた、正常な対照サンプルにおけるマーカーのタンパク質レベルと比較した、例えば癌サンプルなどのサンプルにおけるマーカーのタンパク質レベルの増減も含む。
【００１９】
ＡＬＫ遺伝子変異および／または遺伝子産物（例えば、表１記載のマーカー）の「発現の変化レベル」という用語は、発現またはコピー数の評価に用いられたアッセイの標準誤差よりも大きいまたは小さい、癌を患う患者に由来するサンプルなどの試験サンプルにおけるマーカーの発現量またはコピー数のことをいい、対照サンプル（例えば、関連疾患を有しない健康な被験体から得たサンプル）におけるＡＬＫ遺伝子変異および／または遺伝子産物（例えば、表１記載のマーカー）の発現量またはコピー数、または幾つかの対照サンプルにおけるＡＬＫ遺伝子変異および／または遺伝子産物（例えば、表１記載のマーカー）の平均の発現量またはコピー数の、少なくとも２倍、少なくとも３の２倍、少なくとも４の２倍、少なくとも５の２倍、または少なくとも１０の２倍またはそれ以上でありうる。発現の変化レベルは、発現またはコピー数の評価に用いられたアッセイの標準誤差よりも大きいか、または小さく、対照サンプル（例えば、関連疾患を有しない健康な被験体から得たサンプル）におけるＡＬＫ遺伝子変異および／または遺伝子産物（例えば、表１記載のマーカー）の発現量またはコピー数、または、幾つかの対照サンプルにおけるＡＬＫ遺伝子変異および／または遺伝子産物（例えば、表１記載のマーカー）の平均の発現量またはコピー数の少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍またはそれ以上である。
【００２０】
マーカーの「活性変化」という用語は、正常な対照サンプルにおけるマーカーの活性と比較して、例えば癌サンプルなどにおける病状が増減した、マーカーの活性のことをいう。マーカーの活性変化は、例えば、マーカーの発現変化、マーカーのタンパク質レベル変化、マーカーの構造変化、または、例えば、マーカーと同一または異なる経路に関係した他のタンパク質との相互作用の変化の結果でありうる。 
マーカーの「構造変化」という用語は、正常なまたは野生型の遺伝子またはタンパク質と比較した場合に、変異、あるいは、例えばマーカーの発現または活性に影響を及ぼす変異などのマーカー遺伝子またはマーカータンパク質内の変異の存在のことをいう。例えば、変異としては、限定はしないが、染色体間および染色体内の再配置、置換、欠失、および挿入変異が挙げられる。変異は、マーカーのコード領域または非コード領域に存在しうる。
【００２１】
「未分化リンパ腫キナーゼ」および「ＡＬＫ」は、本明細書では相互に用いられ、任意の起源（例えば、齧歯動物、ヒト、および他の哺乳動物）に由来した、天然の未分化リンパ腫キナーゼ、およびそれらのある特定の変異体および変異体のことを指す。一部の実施の形態では、ＡＬＫタンパク質は、ＮＣＢＩ参照配列同定番号：ＮＰ＿００４２９５で表される。他に指定のない限り、これらの用語はヒトタンパク質を意味する。本明細書では、ＡＬＫをコードしている遺伝子も「ＡＬＫ」と称される場合がある。一部の実施の形態では、ＡＬＫヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩ参照配列同定番号：ＮＭ＿００４３０４．３およびＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：２９０２９６３１、その中の関連配列（例えば、コード、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、転写開始、翻訳開始、転写停止、翻訳終止などの配列）で表され、これらは、当業者には容易に確認できるであろう。
【００２２】
加えて、「未分化リンパ腫キナーゼ」および「ＡＬＫ」という用語は、本明細書では、ＡＬＫ融合キナーゼおよび当業者に周知のそれらの変異体も含めて用いられる。これらのＡＬＫ融合キナーゼおよびそれらの変異体はＡＬＫキナーゼ活性を有し、かつ、本明細書に記載の変異を含み、ＡＬＫキナーゼ活性をＡＬＫ阻害剤に対して耐性に変化させうる。代表的な例としては、ＥＭＬ４−ＡＬＫ Ｖａｒｉａｎｔ１（ＡＢ２７４７２２．１；ＢＡＦ７３６１１．１）、ＥＭＬ４−ＡＬＫ Ｖａｒｉａｎｔ２（ＡＢ２７５８８９．１；ＢＡＦ７３６１２．１）、ＥＭＬ４−ＡＬＫ Ｖａｒｉａｎｔ３ａ（ＡＢ３７４３６１．１；ＢＡＧ５５００３．１）、ＥＭＬ４−ＡＬＫ Ｖａｒｉａｎｔ３ｂ（ＡＢ３７４３６２．１；ＢＡＧ５５００４．１）、ＥＭＬ４−ＡＬＫ Ｖａｒｉａｎｔ４（ＡＢ３７４３６３．１；ＢＡＧ７５１４７．１）、ＥＭＬ４−ＡＬＫ Ｖａｒｉａｎｔ５ａ（ＡＢ３７４３６４．１；ＢＡＧ７５１４８．１）、ＥＭＬ４−ＡＬＫ Ｖａｒｉａｎｔ５ｂ（ＡＢ３７４３６５．１；ＢＡＧ７５１４９．１）、ＥＭＬ４−ＡＬＫ Ｖａｒｉａｎｔ６（ＡＢ４６２４１１．１；ＢＡＨ５７３３５．１）、ＥＭＬ４−ＡＬＫ Ｖａｒｉａｎｔ７（ＡＢ４６２４１２．１；ＢＡＨ５７３３６．１）、ＫＩＦ５Ｂ−ＡＬＫ（ＡＢ４６２４１３．１；ＢＡＨ５７３３７．１）、ＮＰＭ−ＡＬＫ、ＴＰＭ３−ＡＬＫ、ＴＦＧＸＬ−ＡＬＫ、ＴＦＧＬ−ＡＬＫ、ＴＦＧＳ−ＡＬＫ、ＡＴＩＣ−ＡＬＫ、ＣＬＴＣ−ＡＬＫ、ＭＳＮ−ＡＬＫ、ＴＰＭ４−ＡＬＫ、ＭＹＨ９−ＡＬＫ、ＲＡＮＢＰ２−ＡＬＫ、ＡＬＯ１７−ＡＬＫ、およびＣＡＲＳ−ＡＬＫが挙げられる（例えば、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれるPulford et al., (2004) J. Cell. Physiol. 199:330-358を参照）。加えて、当業者は、ＡＬＫキナーゼの変異体が、ＡＬＫキナーゼおよびその融合パートナーとの特定の融合事象に応じて発現しうることを理解するであろう（例えば、ＥＭＬ４は、例えば参照することによってその全体が本明細書に組み込まれるHorn and Pao, (2009) J. Clin. Oncol. 27:4247-4253に記載されるように、少なくともエクソン２、６ａ、６ｂ、１３、１４、および／または１５を融合することができる）。例えば、代表的なＡＬＫ配列は、本明細書において、次のように提供される：
【表１−１】
0005937017.tif 000002
【表１−２】
0005937017.tif 000003
【表１−３】
0005937017.tif 000004
【表１−４】
0005937017.tif 000005
【表１−５】
0005937017.tif 000006
【表１−６】
0005937017.tif 000007
【表１−７】
0005937017.tif 000008
【表１−８】
0005937017.tif 000009
【表１−９】
0005937017.tif 000010
【表１−１０】
0005937017.tif 000011
【表１−１１】
0005937017.tif 000012
【表１−１２】
0005937017.tif 000013
【表１−１３】
0005937017.tif 000014
【表１−１４】
0005937017.tif 000015
【表１−１５】
0005937017.tif 000016
【表１−１６】
0005937017.tif 000017
【表１−１７】
0005937017.tif 000018
【表１−１８】
0005937017.tif 000019
【表１−１９】
0005937017.tif 000020
【表１−２０】
0005937017.tif 000021
【表１−２１】
0005937017.tif 000022
【表１−２２】
0005937017.tif 000023
【表１−２３】
0005937017.tif 000024
【表１−２４】
0005937017.tif 000025
【表１−２５】
0005937017.tif 000026
【表１−２６】
0005937017.tif 000027
【表１−２７】
0005937017.tif 000028
【表１−２８】
0005937017.tif 000029
【表１−２９】
0005937017.tif 000030
【表１−３０】
0005937017.tif 000031
【表１−３１】
0005937017.tif 000032
【表１−３２】
0005937017.tif 000033
【表１−３３】
0005937017.tif 000034
【表１−３４】
0005937017.tif 000035
【表１−３５】
0005937017.tif 000036
【表１−３６】
0005937017.tif 000037
【表１−３７】
0005937017.tif 000038
【表１−３８】
0005937017.tif 000039
【表１−３９】
0005937017.tif 000040
【表１−４０】
0005937017.tif 000041
【表１−４１】
0005937017.tif 000042
【表１−４２】
0005937017.tif 000043
【表１−４３】
0005937017.tif 000044
【表１−４４】
0005937017.tif 000045
【表１−４５】
0005937017.tif 000046
【表１−４６】
0005937017.tif 000047
【表１−４７】
0005937017.tif 000048
【表１−４８】
0005937017.tif 000049
【００２３】
「ＡＬＫ突然変異」とは、一般に、参照未分化リンパ腫キナーゼ配列と比較した核酸および／またはアミノ酸配列における変化のことをいう。しかしながら、一部の実施の形態では、「ＡＬＫ突然変異」とは、ＡＬＫ阻害剤（例えば、ＰＦ−０２３４１０６６および／またはＰＤＤ）を用いた治療に対する反応が予測される特定の未分化リンパ腫キナーゼ変異のことを表す場合がある。例えば、野生型のＡＬＫタンパク質（ＮＰ＿００４２９５）の１１５６部位のシステインアミノ酸（Ｃ１１５６）および／または１１９６部位のロイシンアミノ酸（Ｌ１１９６）の異なるアミノ酸への変異は、本明細書では、ＡＬＫ阻害剤に対する耐性を与えるように説明されている。１つの実施の形態では、Ｃ１１５６部位はチロシンアミノ酸を含み、および／または、Ｌ１１９６部位はメチオニンアミノ酸を含む。当業者はまた、野生型のＡＬＫタンパク質の「Ｃ１１５６」および「Ｌ１１９６」変異に対応するアミノ酸位置が、ＡＬＫ阻害剤（例えば、ＰＦ−０２３４１０６６および／またはＰＤＤ）を用いた治療に対する反応の予測値に影響を及ぼすことなく、異なる参照配列（例えば、ＡＬＫ相同体、ＡＬＫ融合タンパク質など）と比較して異なる番号を有することを認識するであろう。当業者はさらに、遺伝子コード（以下に示す）によって定義されるように、特定のタンパク質のアミノ酸配列とそのタンパク質をコードできるヌクレオチド配列との間には既知の明確な対応が存在することを認識するであろう。同様に、遺伝子コードによって定義されるように、特定の核酸のヌクレオチド配列と、その核酸によってコードされるアミノ酸配列との間には、既知の明確な対応が存在する。
【００２４】
遺伝子コード
アラニン（Ala, A）               GCA, GCC, GCG, GCT
アルギニン（Arg, R）             AGA, ACG, CGA, CGC, CGG, CGT
アスパラギン（Asn, N）           AAC, AAT
アスパラギン酸（Asp, D）         GAC, GAT
システイン（Cys, C）             TGC, TGT
グルタミン酸（Glu, E）           GAA, GAG
グルタミン（Gln, Q）             CAA, CAG
グリシン（Gly, G）               GGA, GGC, GGG, GGT
ヒスチジン（His, H）             CAC, CAT
イソロイシン（Ile, I）           ATA, ATC, ATT
ロイシン（Leu, L）               CTA, CTC, CTG, CTT, TTA, TTG
リジン（Lys, K）                 AAA, AAG
メチオニン（Met, M）             ATG
フェニルアラニン（Phe, F）       TTC, TTT
プロリン（Pro, P）               CCA, CCC, CCG, CCT
セリン（Ser, S）                 AGC, AGT, TCA, TCC, TCG, TCT
トレオニン（Thr, T）             ACA, ACC, ACG, ACT
トリプトファン（Trp, W）         TGG
チロシン（Tyr, Y）               TAC, TAT
バリン（Val, V）                 GTA, GTC, GTG, GTT
終結シグナル（end）              TAA, TAG, TGA
【００２５】
遺伝子コードの重要な周知の特性はその冗長性であり、したがって、タンパク質の生成に用いられるアミノ酸の多くでは、１つ以上のコードヌクレオチドトリプレットが用いられうる（例えば、上記参照）。したがって、複数の異なるヌクレオチド配列が、所定のアミノ酸配列をコードしうる。これらのヌクレオチド配列は、すべての有機体において同一のアミノ酸配列を生成することから、これらは機能的に同等であるとみなされる（ある特定の有機体は、幾つかの配列を、他の配列を翻訳するよりも効率的に翻訳する場合があるが）。さらには、時折、所定のヌクレオチド配列に、プリンまたはピリミジンのメチル化変異体が見られることがある。このようなメチル化は、トリヌクレオチドコドンと対応するアミノ酸との間のコード関係に影響を及ぼさない。加えて、当業者は、関連するコドンチャートに基づいてコード化されたアミノ酸を特異的に変化させることを目的とした、特定のコドンのヌクレオチドを突然変異させる方法を理解するであろう。例えば、Ｃｙｓ−１１５６のコドンは「ＴＧＣ」であり、Ｔｙｒのコドンは「ＴＡＴ」または「ＴＡＣ」でありうる。よって、コドンの位置２における単一のヌクレオチドＧのＡへの置換は、システインではなくチロシンをコードすることになる。当業者は、同様の操作を行って、他の変異も設計することができる。
【００２６】
「結合化合物」とは、小分子、抗体、ペプチド、ペプチドリガンドまたは非ペプチドリガンド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸などのオリゴヌクレオチド類似体、レクチン、または、標的タンパク質または分子に特異的に結合する、またはタンパク質複合体などの対象とする検体との安定な複合体を形成する他の分子的実体など、結合組成物のことを称する。
【００２７】
「結合部分」とは、検体に特異的に結合することが可能な、分子標識が直接的または間接的に付着できる分子を意味する。結合部分としては、限定はしないが、最大で約１０００の分子量を有し、水素、炭素、酸素、窒素、硫黄およびリンからなる群より選択される原子を含む、抗体、抗体結合組成物、ペプチド、タンパク質、核酸および有機分子が挙げられる。
【００２８】
「生体指標」または「マーカー」とは、変化しうる遺伝子、ｍＲＮＡ、またはタンパク質のことであり、ここで、前記変化は癌に関係する。この変化は、正常または健康な組織または細胞（例えば、対照）におけるその量、構造、および／または活性と比較した、癌組織または癌細胞における量、構造、および／または活性における変化であって差し支えなく、癌などの病状に関係する。例えば、癌に関係するまたは抗癌治療法に対する反応性を予測する本発明のマーカーは、癌組織または癌細胞において、正常で健康な組織または細胞と比較して変化したヌクレオチド配列、アミノ酸配列、染色体転座配列、染色体内の逆位、コピー数、発現量、タンパク質レベル、タンパク質活性、またはメチル化状態を有しうる。さらには、「マーカー」は、例えば癌などの病状に関係する組織または細胞中に存在する場合に、例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸レベルにおける野生型の配列とは異なる（例えば置換、欠失、または挿入によって）、その構造が変化した分子、例えば突然変異した分子（突然変異を含む）を含む。
【００２９】
「癌」または「腫瘍」という用語は、制御されない増殖、不死、転移能、急速な成長および増殖速度、およびある特定の特有の形態学的特徴など、癌を引き起こす細胞に典型的な特徴を有する細胞の存在のことをいう。癌細胞は、しばしば腫瘍の形態で存在するが、これらの細胞は動物の細胞内で単独で存在する場合があり、あるいは、白血病細胞などの非腫瘍形成性の癌細胞の場合もある。本明細書では「癌」という用語は、前癌状態ならびに悪性の癌を含む。癌としては、限定はしないが、Ｂ細胞癌が挙げられ、例えば、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、例えばα鎖病、γ鎖病、μ鎖病などの重鎖病、良性単クローン性免疫グロブリン血症、免疫球性アミロイドーシス、黒色腫、乳癌、肺癌（非小細胞肺癌すなわちＮＳＣＬＣなど）、気管支癌、結腸直腸癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、卵巣癌、膀胱癌、脳腫瘍または中枢神経系の癌、末梢神経系の癌、食道癌、子宮頸癌、子宮癌または子宮内膜癌、口腔または咽頭の癌、肝臓癌、腎臓癌、精巣癌、胆道癌、小腸癌または虫垂癌、唾液腺癌、甲状腺癌、副腎癌、骨肉腫、軟骨肉腫、血液学的組織の癌、腺癌、炎症性筋線維芽細胞性腫瘍、消化管間質性腫瘍（ＧＩＳＴ）、結腸癌、多発性骨髄腫（ＭＭ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄増殖性疾患（ＭＰＤ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、真性赤血球増加症、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、軟部組織の肉腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮細胞肉腫、滑液腫瘍、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌（stadenocarcinoma）、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、ヘパトーマ、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、骨芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、肝細胞癌、甲状腺癌、胃癌、頭頚部癌、小細胞癌、本態性血小板血症、原発性骨髄線維症、好酸球増加症候群、全身性肥満細胞症、家族性過好酸球増加症（familiar hypereosinophilia）、慢性好酸球性白血病、神経内分泌癌およびカルチノイド腫瘍などが挙げられる。
【００３０】
「化学療法剤」とは、例えば癌などの病気の治療に用いられる細胞毒性剤または細胞増殖抑制剤などの化学物質を意味する。
【００３１】
「相補的」とは、２つの核酸鎖の領域間または同一の核酸鎖の領域間の配列相補性についての幅広い概念のことをいう。第１の核酸領域のアデニン残基は、第２の核酸領域の残基がチミンまたはウラシルの場合に、第１の領域に対して逆平行の前記第２の核酸領域の残基と特異的水素結合（「塩基対合」）を形成できることが知られている。同様に、第１の核酸鎖のシトシン残基は、第２の核酸鎖の残基がグアニンの場合に、第１の鎖に対して逆平行の前記第２の核酸鎖の残基と塩基対合できることが知られている。２つの領域が逆平行に配置されたときに、第１の領域の少なくとも１つのヌクレオチド残基が第２の領域の残基と塩基対合できる場合、核酸の第１の領域は、同一核酸または異なる核酸の第２の領域と相補的である。ある特定の実施の形態では、第１の領域は第１の部分を含み、第２の領域は第２の部分を含み、したがって、前記第１および第２の部分が逆平行に配置される場合、第１の部分のヌクレオチド残基の少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％が、第２の部分のヌクレオチド残基と塩基対合することができる。他の実施の形態では、第１の部分のすべてのヌクレオチド残基は、第２の部分のヌクレオチド残基と塩基対合することができる。
【００３２】
「遺伝子のコピー数」または「マーカーのコピー数」とは、特定の遺伝子産物をコードする細胞におけるＤＮＡ配列の数のことをいう。一般に、所定の遺伝子では、哺乳動物は、各遺伝子のコピーを２つ有している。しかしながら、コピー数は、遺伝子の増幅または複製によって増加させることができ、あるいは、遺伝子の削除によって減少させることもできる。
【００３３】
マーカーが共有的または非共有的に基質に結合している場合には、マーカーの実質画分を基質から解離させることなく基質を流体（例えば、標準食塩クエン酸緩衝液、ｐＨ７．４）ですすぐことができるように、マーカーは基質に「固定」される。
【００３４】
本明細書では「ハザード比」とは、相対的リスクについての評価を生み出すのに用いられる統計的手法のことをいう。「ハザード比」とは、１つの群の予測ハザードの別の群に対する予測ハザードの比である。例えば、ＡＬＫ阻害剤で治療した患者集団を、ＡＬＫ阻害剤を用いていない場合と比べて、ＡＬＫ阻害剤が、特にＡＬＫの突然変異状態に関して、疾患の再発までの期間の増大に有効か否かについて、評価することができる。例えば、本明細書に記載されるように、癌性組織にＡＬＫ突然変異を包含する被験体の治療は、癌性組織にＡＬＫ突然変異を有しない被験体と比較して、ＡＬＫ阻害剤がもたらす治療的有用性の増大を生じさせる。
【００３５】
「ＡＬＫ阻害薬」または「ＡＬＫ阻害剤」とは、本明細書では、ＡＬＫの生物活性を阻害することができる化合物のことをいう。生物活性には、本明細書に記載の患者反応も含まれうる。典型的なＡＬＫ阻害剤としては、限定はしないが、ＰＦ−０２３４１０６６、ＰＤＤ、２−メチル−１１−（２−メチルプロピル）−４−オキソ−４，５，６，１１，１２，１３−ヘキサヒドロ−２Ｈ−インダゾロ［５，４−ａ］ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−８−イル［４−（ジメチルアミノ）ベンジル］カルバメート、（１Ｓ，２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）−３−（｛５−クロロ−２−［（１−エチル―２，３，４，５−テトラヒドロ−６−メトキシ−２−オキソ−１Ｈ−１−ベンゾアゼピン−７−イル）アミノ］−４−ピリミジニル｝アミノ）ビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−２−カルボキサミド、およびＮＶＰ−ＴＡＥ６８４が挙げられる（例えば、参照することによって本明細書に組み込まれる、PNAS 104:270-275, 2007; Choi, Y.L. et al. (2008) Cancer Res. 68:4971-2976；およびBiochemistry 48:3600-3609, 2009を参照）。
【００３６】
本明細書において相互に用いられる「相同性」または「同一性／アイデンティティ」という用語は、２つのポリヌクレオチド配列間または２つのポリペプチド配列間の配列類似性のことをいい、同一性は、より厳密な比較である。「パーセント同一性または相同性」および「％同一性または相同性」という表現は、２つ以上のポリヌクレオチド配列または２つ以上のポリペプチド配列の比較においてみられる配列類似性の割合のことをいう。「配列類似性」とは、２つ以上のポリヌクレオチド配列（適切な方法によって決定される）間の塩基対配列におけるパーセント類似のことを指す。２つ以上の配列は、０〜１００％の類似性の間のいずれか、またはそれらの間の整数値のいずれかでありうる。同一性または類似性は、比較の目的でアラインメントされうる各配列における位置の比較によって決定することができる。比較配列における位置に同一のヌクレオチド塩基またはアミノ酸が存在している場合、その分子はその位置において同一である。ポリヌクレオチド配列間の類似性または同一性の程度は、共通のポリヌクレオチド配列を有している位置における同一または整合するヌクレオチド数の関数である。ポリペプチド配列の同一性の程度は、共通のポリペプチド配列を有している位置における同一のアミノ酸の数の関数である。ポリペプチド配列の相同性または類似性の程度は、共通のポリペプチド配列を有している位置におけるアミノ酸の数の関数である。本明細書では「実質的相同性」という用語は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、小なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％またはそれ以上の相同性のことをいう。
【００３７】
癌は、その少なくとも１つの症状が軽減、停止、遅滞、または予防された場合に「阻害」される。本明細書では、癌はまた、癌の再発または転移が低減、遅滞、遅延、または予防された場合にも「阻害」される。
【００３８】
「マーカー核酸」または「生体指標核酸」とは、本発明のマーカーによってコードされた核酸、または本発明のマーカーに対応する核酸（例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ）である。例えば、これらのマーカー核酸分子は、表１記載の核酸配列のいずれかの全体または部分配列、またはこれらの配列の相補体またはハイブリッド断片を含むＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡ）を含む。マーカー核酸分子はまた、すべてのチミジン残基がウリジン残基で置換された、表１記載の核酸配列のいずれかの全体または部分配列、またはこれらの配列の相補体を含むＲＮＡを含む。「マーカータンパク質」とは、本発明のマーカーによってコードされたタンパク質、または本発明のマーカーに対応するタンパク質である。マーカータンパク質は、表１記載の配列のいずれかによってコードされたタンパク質の全体または部分配列、またはそれらの断片を含む。本明細書では「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、相互に用いられる。
【００３９】
マーカーの「正常」なコピー数またはマーカーの「正常」な発現レベルとは、例えば癌を患っていないヒトなどの被験体から採取した、例えば、痰、気管支肺胞洗浄、胸水、組織、全血、血清、血漿、頬腔擦取物、唾液、脳脊髄液、尿、排泄物、および骨髄を含めたサンプルなどの生体サンプル中のマーカーの発現レベル、コピー数である。
【００４０】
ＡＬＫ遺伝子変異および／または遺伝子産物（例えば、表１記載のマーカー）の「過剰発現」または「有意に高い発現レベル、コピー数、および／または活性」とは、発現またはコピー数の評価に用いられたアッセイの標準誤差よりも大きい、試験サンプルにおける発現量、コピー数、および／または活性のことをいい、対照サンプル（例えば、癌を患っていない健康な被験体から得たサンプル）のＡＬＫ遺伝子変異および／または遺伝子産物（例えば、表１記載のマーカー）の発現量またはコピー数または、幾つかの対照サンプルのＡＬＫ遺伝子変異および／または遺伝子産物（例えば、表１記載のマーカー）の発現量またはコピー数の平均値の、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍またはそれ以上でありうる。
【００４１】
「プローブ」という用語は、例えば本発明のマーカーなどの明確に意図された標的分子に選択的に結合することができるいずれかの分子のことをいう。プローブは、当業者によって合成されるか、または適切な生物学的調製物に由来しうる。標的分子を検出する目的で、プローブは、本明細書に記載される通りに標識化されるよう、特別に設計されうる。プローブとして使用できる分子の例としては、限定はしないが、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、抗体、および有機モノマーが挙げられる。
【００４２】
「ＲＥＣＩＳＴ」は「固形癌治療効果判定基準（Response Evaluation Criteria in Solid Tumours）」を表す頭字語を意味し、治療の間に癌患者が好転（「奏功」）、現状を維持（「安定」）または悪化（「進行」）する場合について定義する一連の規則書である。ＲＥＣＩＳＴの基準によって定義される応答は、例えばJournal of the National Cancer Institute, Vol. 92, No. 3, Feb. 2, 2000に公開されており、ＲＥＣＩＳＴの基準は、他の同様に公開されている定義および規則書を含みうる。当業者は、本明細書における「ＰＲ」、「ＣＲ」、「ＳＤ」および「ＰＤ」などのＲＥＣＩＳＴ基準に伴う定義を理解するであろう。
【００４３】
治療に「反応する」ことである「反応性」、およびこの動詞の他の形態は、本明細書では、ＡＬＫ阻害剤を用いた治療に対する被験体の反応のことを指す。例えば、被験体における腫瘍の増殖が約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％またはそれ以上停滞した場合、被験体はＡＬＫ阻害剤を用いた治療に反応している。別の例では、例えば、質量％または体積％などの適切な測定法で判定して、被験体における腫瘍が約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％またはそれ以上縮小した場合、被験体はＡＬＫ阻害剤を用いた治療に反応している。別の例では、被験体が、治療が施されなかった場合に予測される平均余命と比べて約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％またはそれ以上延長された平均余命を体験する場合、被験体はＡＬＫ阻害剤を用いた治療に反応している。別の例では、被験体が無病生存率の増大、全生存率の増大または無増悪期間の増大を被る場合、被験体はＡＬＫ阻害剤を用いた治療に反応している。上記のようなＲＥＣＩＳＴ基準を含め、患者が治療に反応するか否かを判定するために、幾つかの方法が用いられうる。
【００４４】
「サンプル」、「組織サンプル」、「患者サンプル」、「患者の細胞または組織サンプル」または「試料」とは、それぞれ、被験体または患者の組織から入手した類似細胞の一群のことをいう。組織サンプルの入手源は、新鮮な、凍結された、および／または貯蔵された、臓器、組織 サンプル、生検、または吸引物；血液または血液成分；脳脊髄液、羊水、腹水または間質液などの体液；または被験体の妊娠または成長時期に得た細胞に由来する固形組織でありうる。組織サンプルは、保存料、抗凝血剤、緩衝剤、固定剤、栄養物、抗生物質など、もともとの組織には自然には混ざらない化合物を含んでいてもよい。
【００４５】
被験体における、例えば、マーカーの量が、その量を評価するために用いたアッセイの標準誤差を超えた量、または少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍またはそれ以上、正常なレベルよりも高いまたは低い場合、ＡＬＫ遺伝子変異および／または遺伝子産物（例えば、表１記載のマーカー）の発現またはコピー数などのマーカー量は、正常なマーカー量よりも「有意に」高いまたは低い。あるいは、被験体におけるマーカー量が、正常なマーカー量よりも少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、または少なくとも約５倍、高いまたは低い場合、被験体におけるマーカー量は、正常な量よりも「有意に」高いまたは低い。
【００４６】
本明細書では、「有意事象」とは、当業者によって決定される重要な患者の疾患における事象のことをいう。例えば、有意事象の例としては、限定はしないが、一次診断、死亡、再発、患者の疾患が転移性であるという判定、患者の疾患の再発、または上記ステージの１つから別のステージへの患者の疾患の進行が挙げられる。有意事象とは、ＯＳ、ＴＴＰの評価に用いられる、および／または、ＲＥＣＩＳＴまたは当業者によって決定される他の応答基準を使用する、重要な事象でありうる。
【００４７】
本明細書では、「被験体」および「患者」という用語は相互に用いられる。本明細書では、「被験体」という用語は、動物、例えば、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ロバ、ヤギ、ラクダ、ネコ、イヌ、モルモット、ラット、マウス、ヒツジ）および霊長類（例えば、マカクザル、ゴリラ、チンパンジーなどのサルおよびヒト）を含めた哺乳動物のことを指す。
【００４８】
本明細書では「経時変化」とは、初期事象と後発事象との間の時間量のことをいう。例えば、患者の癌に関連して、経時変化は、患者の疾患に関連していてもよく、疾患の経過における有意事象を測定することによって測定されうる。例えば、第１の事象は診断であり、後発事象は転移でありうる。
【００４９】
「無増悪期間」または「ＴＴＰ」とは、癌の治療開始から進行まで、またはセンサリング（打ち切り）までを測定した時間。センサリングは、試験の終了または治療の変更に起因しうる。無増悪期間はまた、例えば、Ｋａｐｌｅｉｎ−Ｍｅｉｅｒプロットにおけるような可能性も表すことができ、ここで、無増悪期間は、治療の開始と、進行またはセンサリングとの間の時間である特定の時間の間、進行しない可能性を表している。
【００５０】
「転写ポリヌクレオチド」とは、本発明のマーカーの転写および、存在する場合には、転写産物の正常な転写後過程（例えば、スプライシング）、および転写産物の逆転写によって生成された、成熟ＲＮＡの全部または一部に対して相補的、またはそれらに対して相同性のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、または、ＲＮＡまたはｃＤＮＡのうちの１つの類似体）である。
【００５１】
「治療する」、「治療」、およびこの言葉の他の形態は、癌の増殖を遅らせる、癌を重量または体積的に縮小させる、被験体の予測生存期間、および／または腫瘍などの無増悪期間を延長するために、ＡＬＫ阻害剤を投与することをいう。
【００５２】
ＡＬＫ遺伝子変異および／または遺伝子産物（例えば、表１記載のマーカー）の「低発現」または「有意に低いレベルの発現、コピー数、および／または活性」とは、対照サンプル（例えば、癌を患っていない健康な被験体から得たサンプル）におけるＡＬＫ遺伝子変異および／または遺伝子産物（例えば、表１記載のマーカー）の発現量、コピー数、および／または活性、または幾つかの対照サンプルにおけるＡＬＫ遺伝子変異および／または遺伝子産物（例えば、表１記載のマーカー）の平均的な発現量、コピー数、および／または活性よりも、例えば、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍またはそれ以上少ない、試験サンプルにおける発現量またはコピー数であって、発現またはコピー数の評価に用いられたアッセイの標準誤差の範囲を超えるもののことをいう。
【００５３】
ＩＩ．典型的な本発明の方法
本発明は、少なくとも一部には、癌の治療における、ＡＬＫ阻害剤の有効性の予測に関連した、例えば、ＡＬＫ突然変異を含めたゲノムの特定部位の同定に基づいている。ＡＬＫ遺伝子発現配列の分析は、ポリペプチドを少なくともある程度ＡＬＫ阻害剤を用いた治療に対して耐性に変えうる、ＡＬＫポリペプチド（例えば、ＥＭＬ４−ＡＬＫポリペプチドを含めた表１記載の生体指標）に対する新しい変異の同定をもたらした。したがって、本明細書に記載されるさまざまな方法における、これら生体指標の１つ以上の存在および／または不存在は、本発明の範囲内にある。
【００５４】
一部の実施の形態では、本発明の方法は、被験体における癌の進行をモニタリングするために用いられて差し支えなく、ここで、例えば、癌の進行の間の第１の時点およびその後の時点において、被験体のサンプルに、本明細書において同定される１つ以上のＡＬＫ突然変異（例えば、ＥＭＬ４−ＡＬＫ突然変異）が見られる場合、癌はＡＬＫ阻害剤介在性の治療にはあまり反応しておらず、逆もまた同様である。さらに別の実施の形態では、第１の時点とその後の時点の間に、被験体は、例えば、化学療法、放射線治療、外科手術、または癌の阻害に有用な他の治療的アプローチなどの治療を受けたか、治療を完了したか、または寛解期にある。
【００５５】
本明細書にさらに記載されるように、本発明の１つ以上の生体指標（例えば、ＥＭＬ４−ＡＬＫ突然変異を含めたＡＬＫ突然変異）は、配列番号：１などの参照配列と比較した場合に、ゲノム（例えば、生殖細胞系および／または体細胞）配列に存在することによって明確に同定されうる。例えば、本明細書に記載の方法は、表１記載の変異を１つ以上含むＤＮＡの伸長の標的核酸増幅反応を行うことにより本発明の生体指標を検出し、増幅した標的核酸を１つ以上の変異の存在について分析することを含みうる。
【００５６】
核酸を増幅するさまざまな技術は当技術分野で知られており、例えば、米国特許第４，６８３，１９５号明細書（参照することにより組み込まれる）、米国特許第４，６８３，２０２号明細書（参照することにより組み込まれる）および米国特許第４，８００，１５９号明細書（参照することにより組み込まれる）に記載されるＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）および、特に欧州特許第０５６９２７２号明細書に開示されるような一段階方式における代替法ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）、例えば欧州特許出願公開第０２０１１８４号明細書に記載されるＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）、例えば国際出願公開第ＷＯ９０／０１０６９号パンフレット（参照することにより組み込まれる）に記載されるＲＣＲ（修復連鎖反応）、例えば国際出願公開第ＷＯ９０／０６９９５号パンフレット（参照することにより組み込まれる）に記載される３ＳＲ（自家持続配列複製法）、例えばテンプレートとして二重鎖ＤＮＡを使用する、欧州特許第０３９７２６９号明細書および米国特許第５，４６６，５８６号明細書（参照することにより組み込まれる）に記載されるＮＡＳＢＡ（核酸配列ベース増幅）、および、例えば米国特許第５，３９９，４９１号明細書（参照することにより組み込まれる）に記載されるＴＭＡ（転写介在増幅法）が挙げられる。
【００５７】
増幅産物における１つ以上の変異の存在の検出は、当技術分野で周知のさまざまな方法で行うことができ、例えば、サンガーシーケンス法および大規模シークエンシング（deep sequencing）などのＤＮＡ配列決定法；制限酵素の利用；アレル特異的増幅；ペプチド核酸（ＰＮＡ）介在ＰＣＲ；一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）および変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）分析など、立体配座の差異の検出；標識オリゴヌクレオチドプローブを用いる膜での検出ステップ（ドットブロット）を有するアッセイ、リバースハイブリダイゼーション、オリゴヌクレオチドライゲーション法（ＯＬＡ、ＭＬＰＡ）、第１ヌクレオチド変化（ＦＮＣ）テクノロジー、架橋テクノロジーなどのマイクロタイタープレートにおける検出ステップを有するアッセイ；迅速サイクルＰＣＲおよび同時蛍光分析（例えば ５'ヌクレアーゼ／Ｔａｑｍａｎ）；およびＰＣＲに続く、質量分析またはキャピラリー電気泳動を用いたミニ配列分析が挙げられる。
【００５８】
ＩＩＩ．典型的な単離核酸分子
本発明の１つの態様は、本発明のマーカーに対応するポリペプチドまたはこのようなポリペプチの一部をコードする核酸を含めた、本発明の生体指標に対応する単離核酸分子に関する。本発明の核酸分子は、本明細書において同定されたＡＬＫまたはＡＬＫ関連ゲノム（例えば、生殖細胞系および／または体細胞）領域に存在する核酸分子、および／または、ＡＬＫまたはＡＬＫ関連（例えば、ＥＭＬ４−ＡＬＫ）ポリペプチドをコードする、核酸分子を含む。一部の実施の形態では、本発明の核酸分子は、表１に提示される核酸配列（nucleic sequences）、またはそれらの断片を含む、それらから実質的になる、またはそれらからなる。本発明の単離核酸分子はまた、本発明のマーカーに対応するポリペプチドをコードする核酸分子およびこのような核酸分子の断片を含めた、本発明のマーカーに対応する核酸分子を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとしての使用に十分な核酸分子を含み、例えば、核酸分子を増幅または変異させるためのＰＣＲプライマーとしての使用に適したものなどが挙げられる。本明細書では「核酸分子」という用語には、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）および、ヌクレオチド類似体を使用して生成したＤＮＡまたはＲＮＡの類似体が含まれることが意図されている。核酸分子は一本鎖または二本鎖であって差し支えない；ある特定の実施の形態では、核酸分子は二本鎖ＤＮＡである。
【００５９】
「単離」核酸分子とは、核酸分子の天然源に存在する他の核酸分子から分離されたものである。ある特定の実施の形態では、「単離」核酸分子は、その核酸が由来する有機体のゲノムＤＮＡにおいて、核酸に天然に隣接する（すなわち５'および３'末端に位置する）配列（例えば、タンパク質をコードする配列など）を含まない。例えば、さまざまな実施の形態では、単離核酸分子は、その核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡにおいて、核酸分子に天然に隣接するヌクレオチド配列の約５ｋＢ未満、約４ｋＢ未満、約３ｋＢ未満、約２ｋＢ未満、約１ｋＢ未満、約０．５ｋＢまたは約０．１ｋＢ未満でありうる。さらには、ｃＤＮＡ分子などの「単離」核酸分子は、組み換え技術で産生された場合には、他の細胞物質または培地を実質的に含まない場合があり、あるいは、化学的に合成された場合には、前駆体化学物質または他の化学物質を実質的に含まなくてよい。
【００６０】
「他の細胞物質または培地を実質的に含まない」をいう表現は、分子が単離されたまたは組み換え技術で生産された細胞の細胞成分からその分子が分離された、核酸分子の調製物を含む。よって、細胞物質を実質的に含まない核酸分子は、他の細胞物質または培地を約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、または約５％未満で有する（乾燥重量で）、核酸分子の調製物を含む。
【００６１】
例えば表１記載のＡＬＫ遺伝子変異など、本発明の核酸分子は、標準的な分子生物学的技法および本明細書に記載されるデータベース記録にある配列情報を使用して単離されうる。標準的なハイブリダイゼーションおよびクローン技術を利用して、これらの核酸配列の全部または一部を用いて、本発明の核酸分子を単離することができる（例えば、Sambrook et al., ed., Molecular Cloning:  A Laboratory Manual, 2nd ed.,  Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記載）。
【００６２】
本発明の核酸分子は、テンプレートとしてｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡ（例えば、生殖細胞系および／または体細胞ゲノムＤＮＡ）を使用し、標準的なＰＣＲ増幅技術に従った適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、増幅させることができる。このように増幅された核酸分子は、適切なベクターに組み込まれ、ＤＮＡ配列分析によって特徴づけられうる。さらには、本発明の核酸分子の全部または一部に対応するオリゴヌクレオチドは、例えば、自動ＤＮＡ合成装置を使用する標準的な合成法によって調製することができる。
【００６３】
別の実施の形態では、本発明の単離核酸分子は、本発明のマーカーに対応する核酸のヌクレオチド配列、または本発明のマーカーに対応するタンパク質をコードする核酸のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子を含む。所定のヌクレオチド配列に対して相補的な核酸分子は、所定のヌクレオチド配列に対して十分に相補的なものであり、所定のヌクレオチド配列とハイブリッド形成させ、それによって安定な二本鎖を形成することができる。
【００６４】
さらには、本発明の核酸分子は核酸配列の一部分のみを含んでいてもよく、ここで、完全長の核酸配列は、本発明のマーカーまたは、本発明のマーカーに対応するポリペプチドをコードするものを含む。これらの核酸分子は、例えば、プローブまたはプライマーとして使用することができる。プローブ／プライマーは、典型的には、１つ以上の実質的に精製されたオリゴヌクレオチドとして用いられる。オリゴヌクレオチドは、典型的には、ストリンジェントな条件下で、本発明の核酸の少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、少なくとも約２１、少なくとも約２２、少なくとも約２３、少なくとも約２４、少なくとも約２５、少なくとも約２６、少なくとも約２７、少なくとも約２８、少なくとも約２９、少なくとも約３０、少なくとも約３１、少なくとも約３２、少なくとも約３３、少なくとも約３４、少なくとも約３５、少なくとも約３６、少なくとも約３７、少なくとも約３８、少なくとも約３９、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約５５ 少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５ｋｂ、少なくとも約９０、少なくとも約９５、少なくとも約１００またはそれ以上の連続したヌクレオチドとハイブリッド形成させた、ヌクレオチド配列の領域を含む。
【００６５】
本発明の核酸分子配列に基づくプローブは、本発明の１つ以上のマーカーに対応する転写産物またはゲノム配列の検出に使用することができる。プローブは、例えば、ラジオアイソトープ、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子など、プローブに結合する標識基を含む。これらのプローブは、例えば、ｍＲＮＡレベルの検出またはタンパク質をコードする遺伝子が変異または欠失したか否かの判定など、被験体から得た細胞サンプルにおいてタンパク質をコードする核酸分子のレベルを測定することなどによって、タンパク質を誤発現する細胞または組織を同定するための診断検査キットの一部として使用することができる。
【００６６】
本発明はさらに、ＡＬＫ遺伝子変異および／または遺伝子産物（例えば、表１記載のマーカー）と実質的に相同性の核酸分子も含み、それらは、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％またはそれ以上の相同性である。他の実施の形態では、本発明はさらに、ＡＬＫ遺伝子変異および／または遺伝子産物（例えば、表１記載のマーカー）と実質的に相同性の核酸分子も含み、それらは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、少なくとも３５、少なくとも３６、少なくとも３７、少なくとも３８、少なくとも３９、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも１００のヌクレオチド、またはこれらの間の範囲のいずれかだけ、異なる。
【００６７】
「単一ヌクレオチド多型」（ＳＮＰ）という用語は、アレル配列間の変化部位である、単一ヌクレオチドによって占められた多型部位を表す。この部位は、アレルの高度に保存された配列（例えば、母集団の１／１００または１／１０００未満で変化する配列）の前方および後方に存在する。ＳＮＰは、通常、多型部位において、１つのヌクレオチドが別のヌクレオチドに置換されることに起因して生じる。ＳＮＰは、参照アレルに関連するヌクレオチドの削除またはヌクレオチドの挿入からも生じうる。典型的には、多型部位は、参照塩基以外の塩基によって占有される。例えば、参照アレルが多型部位に塩基「Ｔ」（チミジン）を含む場合、変異アレルは、多型部位に「Ｃ」（シチジン）、「Ｇ」（グアニン）、または「Ａ」（アデニン）を含みうる。ＳＮＰは、タンパク質をコードする核酸配列に生じうるが、その場合、欠陥タンパク質またはその他の変異体タンパク質、もしくは遺伝的疾患を生じうる。このようなＳＮＰは、遺伝子コード配列を変化させて別のアミノ酸（「ミスセンス」ＳＮＰ）を指定するか、あるいは、ＳＮＰは、終止コドン（「ノンセンス」ＳＮＰ）を導入する場合もある。ＳＮＰがタンパク質のアミノ酸配列を変化させない場合には、ＳＮＰは「サイレント」と称される。ＳＮＰは、ヌクレオチド配列の非コード領域にも生じることがある。これは、例えば選択的スプライシングの結果として、欠陥タンパク質の発現を生じるか、あるいは、タンパク質の機能に影響を有しない場合もある。
【００６８】
別の実施の形態では、本発明の単離核酸分子は、少なくとも７、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、 少なくとも２００、小なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも５５０、少なくとも６５０、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも１２００、少なくとも１４００、少なくとも１６００、少なくとも１８００、少なくとも２０００、少なくとも２２００、少なくとも２４００、少なくとも２６００、少なくとも２８００、少なくとも３０００、少なくとも３５００、少なくとも４０００、少なくとも４５００、またはそれ以上のヌクレオチド長を有し、ストリンジェントな条件下で、本発明のマーカーに対応する核酸分子または本発明のマーカーに対応するタンパク質をコードする核酸分子とハイブリッド形成する。本明細書では、「ストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する」という用語は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を表現することが意図されており、この条件下では、典型的には、互いに、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも８５％が同一のヌクレオチド配列が、互いにハイブリッド形成したままである。このような厳しい条件は当業者に知られており、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989)のsections 6.3.1-6.3.6から入手できる。厳しいハイブリダイゼーション条件の別の非限定的な例は、約４５℃における６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）のハイブリダイゼーションの後、続いて５０〜６５℃における０．２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳでの１回以上の洗浄である。
【００６９】
本発明はまた、本発明の核酸分子に対して相補的な少なくとも１つの領域を有する分子指標核酸分子も含み、したがって、分子指標は、サンプル中の本発明の核酸分子の存在を定量するのに有用である。「分子指標」核酸は、一対の相補的領域を含み、かつ、フルオロフォアおよびそれに関連する蛍光クエンチャーを有する核酸分子である。フルオロフォアおよびクエンチャーは、相補的領域が互いにアニーリングされる場合に、クエンチャーによってフルオロフォアの蛍光がクエンチされる位置（orientation）における、核酸の異なる部分と関連している。核酸分子の相補的領域が互いにアニールされない場合、フルオロフォアの蛍光はそれほどではないがクエンチされる。分子指標核酸分子は、例えば、米国特許第５，８７６，９３０号明細書（参照することにより組み込まれる）に記載される。
【００７０】
ＩＶ．典型的な単離タンパク質および抗体
本発明の１つの態様は、本発明の個別のマーカーに対応する単離タンパク質、およびそれらの生物学的に活性な部分に関連する。１つの実施の形態では、マーカーに対応する天然のポリペプチドは、標準的なタンパク質精製法を使用した適切な精製スキームによって、細胞源または組織源から単離することができる。別の実施の形態では、本発明のマーカーに対応するポリペプチドは、遺伝子組み換え技術によって産生される。組み換え発現に替えて、本発明のマーカーに対応するポリペプチドは、標準的なペプチド合成法を使用して化学的に合成することもできる。
【００７１】
「単離」または「精製」したタンパク質、またはそれらの生物学的に活性な部分は、そのタンパク質が得られた細胞源または組織源に由来する細胞物質または他の夾雑タンパク質を実質的に含まない、または、化学的に合成された場合には、前駆体化学物質または他の化学物質を実質的に含まない。「細胞物質を実質的に含まない」という表現は、タンパク質が単離された細胞または組み換え技術によって産生された細胞の細胞成分からタンパク質を分離したタンパク質調製物を含む。よって、細胞物質を実質的に含まないタンパク質は、約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、または約５％未満（乾燥重量で）の異種タンパク質（本明細書では「夾雑タンパク質」とも称される）を有するタンパク質調製物を含む。タンパク質またはそれらの生物学的に活性な部分が組み換え技術によって産生された場合には、それらは培地を実質的に含まない場合があり、すなわち、培地は、タンパク質調製物の体積の約２０％未満、約１０％未満、または約５％未満を示す。タンパク質が化学合成によって生成される場合、そのタンパク質は、前駆体化学物質または他の化学物質を実質的に含まない場合があり、すなわち、そのタンパク質は、該タンパク質合成に関連する前駆体化学物質または他の化学物質から分離される。したがって、このようなタンパク質調製物は、対象ポリペプチド以外の前駆体化学物質または化合物を約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、約５％未満（乾燥重量で）有する。
【００７２】
本発明のマーカーに対応するポリペプチドの生物学的に活性な部分は、本発明のＡＬＫ遺伝子変異および／または遺伝子産物（例えば、表１記載のマーカー）に対応するタンパク質のアミノ酸配列と十分に同一であるか、そのアミノ酸配列に由来したアミノ酸配列を含むポリペプチドを含み、前記ポリペプチドは、完全長タンパク質よりも少数のアミノ酸を含み、かつ、対応する完全長タンパク質の少なくとも１つの活性を示す。典型的には、生物学的に活性な部分は、対応するタンパク質の少なくとも１つ活性を有するドメインまたはモチーフを含む。本発明のタンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００またはそれ以上のアミノ酸長を有するポリペプチドでありうる。さらには、タンパク質の他の領域が削除された、他の生物学的に活性な部分は、組み換え技術によって調製されて、本発明のポリペプチドの天然型の１つ以上の機能活性について評価されうる。
【００７３】
ある特定の実施の形態では、ポリペプチドは、表１に記載される核酸分子にコードされるタンパク質のアミノ酸配列を有する。他の有用なタンパク質は、これらの配列の１つと実質的に同一（例えば、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも８６、少なくとも８７、少なくとも８８、少なくとも８９、少なくとも９０、少なくとも９１、少なくとも９２、少なくとも９３、少なくとも９４、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７、少なくとも９８、少なくとも９９、少なくとも９９．５％またはそれ以上）であり、アミノ酸配列は異なっているが、対応する完全長タンパク質の機能活性（例えば、ＡＬＫ阻害剤に対する耐性または感受性を与える）を保持する。
【００７４】
２つのアミノ酸または２つの核酸の配列のパーセント同一性を決定するため、配列は、最適な比較の目的でアラインメントされる（例えば、第２のアミノ酸または核酸配列との最適アラインメントを目的として、第１のアミノ酸配列または核酸配列にギャップを導入することができる）。次に、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置において、アミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第１の配列における位置が第２の配列における対応する位置と同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められている場合、分子はその位置において同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、該配列によって共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一の位置の数／全体の位置の数（例えば、重複部分）×１００）。１つの実施の形態では、２つの配列の長さは、同一である。
【００７５】
２つの配列間のパーセント同一性の決定は、数学アルゴリズムを利用して達成することができる。２つの配列の比較に有用な数学アルゴリズムの別の非限定的な例は、Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268のアルゴリズムであり、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877などで修正されている。このようなアルゴリズムは、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれる。本発明の核酸分子と相同のヌクレオチド配列を得るために、score = 100、wordlength = 12のＮＢＬＡＳＴプログラムを用いて、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を行うことができる。また、本発明のタンパク質分子と相同のアミノ酸配列を得るために、score = 50、wordlength = 3のＸＢＬＡＳＴプログラムを用いて、ＢＬＡＳＴタンパク質検索を行うことができる。比較目的でギャップアラインメント（gapped alignments）を得るために、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記載されるようにギャップ化ＢＬＡＳＴを用いることができる。あるいは、分子間の距離関係を検出する反復検索（iterated search）を行うために、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを用いることができる。ＢＬＡＳＴ、ギャップ化ＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを使用する場合、各プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを用いることができる（ワールドワイドウェブのncbi.nlm.nih.govのＮＣＢＩのウェブサイトを参照）。配列の比較に有用な数学アルゴリズムの別の非限定的な例は、Myers and Miller, (1988) Comput Appl Biosci, 4:11-7のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（version 2.0）に組み込まれる。アミノ酸配列の比較にＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重量残基表（weight residue table）、ギャップ長ペナルティー１２、およびギャップペナルティー４を使用することができる。局所的配列類似性およびアラインメントの領域を同定するためのさらに別の有用なアルゴリズムは、Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-2448に記載されるＦＡＳＴＡアルゴリズムである。ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の比較にＦＡＳＴＡアルゴリズムを使用する場合、ｋ−タプル値２でＰＡＭ１２０重量残基表を使用することができる。
【００７６】
２つの配列間のパーセント同一性は、ギャップ化あり、またはギャップ化なしで、上述のものと類似した技術を利用して決定することができる。パーセント同一性の計算では、完全一致したもののみがカウントされる。
【００７７】
本発明のマーカーに対応する単離ポリペプチド、またはそれらの断片は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の調製の標準的な技法を用いて抗体を産生するための免疫原として使用することができる。完全長のポリペプチドまたはタンパク質を用いることもできるが、もう１つの方法として、本発明は、免疫原として使用するための抗原性ペプチド断片を提供する。本発明のタンパク質の抗原性ペプチドは、本発明のポリペプチドの１つのアミノ酸配列のアミノ酸残基を、少なくとも８つ（または少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも３０またはそれ以上）含み、また、タンパク質のエピトープも包含し、したがって、前記ペプチドに対する抗体が、前記タンパク質に対応する本発明のマーカーと特異的な免疫複合体を形成する。抗原性ペプチドに包含される典型的なエピトープは、例えば親水性の領域など、タンパク質表面に位置する領域である。疎水性配列分析、親水性配列分析、または同様の分析を使用して、親水性の領域を同定することができる。
【００７８】
免疫原は、典型的には、ウサギ、ヤギ、マウス、または他の哺乳動物または脊椎動物などの適切な（すなわち、免疫応答性の）被験体に免疫を付与することによる抗体の調製に用いられる。適切な免疫原性調製物は、例えば、組み換え発現させたまたは化学的に合成したポリペプチドでありうる。調製物はさらに、完全または不完全フロイントアジュバントなどのアジュバント、または同様の免疫刺激薬を含みうる。
【００７９】
したがって、本発明の別の態様は、本発明のポリペプチドに対する抗体に関する。本明細書において相互に用いられる「抗体」および「抗体物質」という用語は、免疫グロブリン分子および該免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分を表す、すなわち、分子は、本発明のポリペプチドなどの抗原を特異的に結合する抗原結合部位を含む。本発明の所定のポリペプチドに特異的に結合する分子は、ポリペプチドと結合するが、例えばポリペプチドを天然に含む生体サンプルなどのサンプル中の他の分子とは実質的に結合しない分子である。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の例としては、抗体をペプシンなどの酵素で処理することによって生成することができるＦ（ａｂ）およびＦ（ａｂ'）2断片が挙げられる。本発明は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を提供する。「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、本明細書では、特定のエピトートプと免疫反応することができる抗原結合部位を１つだけ含む抗体分子の集団のことを表す。
【００８０】
ポリクローナル抗体は、免疫原として本発明のポリペプチドを有する適切な被験体に免疫を付与することによって、上述のように調製することができる。免疫付与した被験体の抗体力価は、固定化したポリペプチドを使用する酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）などの標準的な技法を用いることによって、経時的にモニタリングすることができる。必要に応じて、抗体分子は、被験体（例えば、被験体の血液または血清）から採取または単離され、さらに、プロテインＡクロマトグラフィーなどの周知の技術によって精製され、それによってＩｇＧ画分が得られる。免疫付与後の適切な時期、例えば、特定の抗体力価が最も高いときなどに、抗体産生細胞を被験体から採取し、Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495-497に最初に記載されたハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor et al., 1983, Immunol. Today 4:72参照）、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Cole et al., pp. 77-96 In Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., 1985参照）またはトリオーマ技法などの標準的な技法を用いて、モノクローナル抗体の調製に使用することができる。ハイブリドーマの産生技術は周知である（一般にCurrent Protocols in Immunology, Coligan et al. ed., John Wiley & Sons, New York, 1994参照）。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、例えば、標準的なＥＬＩＳＡ法を使用して、対象ポリペプチドと結合する抗体についてハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることによって検出される。
【００８１】
モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマを調製する別の方法として、本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体は、対象ポリペプチドを用い、組換え組合せ免疫グロブリンライブラリ（例えば、抗体ファージディスプレイライブラリ）をスクリーニングすることによって、同定および単離することができる。ファージディスプレイライブラリを生成およびスクリーニングするためのキットは市販されている（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ組換ファージ抗体システム、カタログ番号：２７−９４００−０１；およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ ＳｕｒｆＺＡＰ ファージディスプレイキット、カタログ番号：２４０６１２）。加えて、抗体ディスプレイライブラリの生成およびスクリーニングにおける使用に特に利用可能な方法および試薬の例は、例えば、米国特許第５，２２３，４０９号明細書（参照することにより組み込まれる）；国際出願公開第ＷＯ９２／１８６１９号パンフレット（参照することにより組み込まれる）；国際出願公開第ＷＯ９１／１７２７１号パンフレット（参照することにより組み込まれる）；国際出願公開第ＷＯ９２／２０７９１号パンフレット（参照することにより組み込まれる）；国際出願公開第ＷＯ９２／１５６７９号パンフレット（参照することにより組み込まれる）；国際出願公開第ＷＯ９３／０１２８８号パンフレット（参照することにより組み込まれる）；国際出願公開第ＷＯ９２／０１０４７号パンフレット（参照することにより組み込まれる）；国際出願公開第ＷＯ９２／０９６９０号パンフレット（参照することにより組み込まれる）；国際出願公開第ＷＯ９０／０２８０９号パンフレット（参照することにより組み込まれる）；Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275- 1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12:725-734に記載されている。
【００８２】
加えて、標準的な遺伝子組み換え技術を使用して産生できる、ヒトおよび非ヒトの両方の部分を含む、キメラ化およびヒト化モノクローナル抗体などの組み換え抗体は、本発明の範囲内にある。これらのキメラ化およびヒト化モノクローナル抗体は、例えば、国際出願公開第ＷＯ８７／０２６７１号パンフレット（参照することにより組み込まれる）；欧州特許出願公開第１８４，１８７；欧州特許出願公開第１７１，４９６号明細書；欧州特許出願公開第１７３，４９４号明細書；国際出願公開第ＷＯ８６／０１５３３号パンフレット（参照することにより組み込まれる）；米国特許第４，８１６，５６７号明細書（参照することにより組み込まれる）；欧州特許出願公開第１２５，０２３号明細書；Better et al. (1988) Science 240:1041-1043; Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA  84:3439-3443; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura et al. (1987) Cancer Res. 47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449; and Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559; Morrison (1985) Science 229:1202-1207; Oi et al. (1986) Bio/Techniques 4:214；米国特許第５，２２５，５３９号明細書（参照することにより組み込まれる）；Jones et al. (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534；およびBeidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4053-4060などに記載される方法を用いて、当技術分野で既知の遺伝子組み換え技術によって産生することができる。
【００８３】
完全ヒト抗体は、ヒト被験体の治療的処置には特に望ましい。このような抗体は、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子を発現する内在性の免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を発現することができないトランスジェニックマウスを使用して産生させることができる。トランスジェニックマウスは、例えば、本発明のマーカーに対応するポリペプチドの全部または一部など、選択された抗原を用いて通常の方法で免疫付与される。抗原に対するモノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ技術を使用して得ることができる。トランスジェニックマウスに含まれるヒト免疫グロブリン・トランス遺伝子は、Ｂ細胞の分化の間に再配列され、その後、クラススイッチおよび体細胞変異を被る。よって、これらの技術を用いて、治療に有用なＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥ抗体を産生することができる。ヒト抗体の産生のためのこの技術の概観については、Lonberg and Huszar (1995) Int. Rev. Immunol. 13:65-93を参照。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体の産生のためのこの技術の詳細な論述およびこれら抗体の産生プロトコルについては、例えば、米国特許第５，６２５，１２６号明細書（参照することにより組み込まれる）；米国特許第５，６３３，４２５号明細書（参照することにより組み込まれる）；米国特許第５，５６９，８２５号明細書（参照することにより組み込まれる）；米国特許第５，６６１，０１６号明細書（参照することにより組み込まれる）；および米国特許第５，５４５，８０６号明細書（参照することにより組み込まれる）を参照。加えて、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（米国カリフォルニア州フリーモント所在）などの会社は、上述の技術と同様の技術を使用した、選択された抗原に対するヒト抗体の提供を請け負い可能である。
【００８４】
選択されたエピトープを認識する完全ヒト抗体は、「誘導選択」と称される技術を使用して産生することができる。このアプローチでは、同一のエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択を誘導することを目的として、例えばネズミ科の抗体などの選択された非ヒトモノクローナル抗体が用いられる（Jespers et al., 1994, Bio/technology 12:899-903）。
【００８５】
本発明のマーカーに対応するポリペプチドに対する抗体（例えばモノクローナル抗体）は、親和性クロマトグラフィーまたは免疫沈降などの標準的な技法によるポリペプチドの単離に使用することができる。さらには、このような抗体は、マーカー発現のレベルおよびパターンを評価することを目的とした、マーカー（例えば、細胞溶解物または細胞上清中）の検出に用いることができる。抗体はまた、例えば、所定の治療計画の有効性を決定するための、例えば臨床試験手順の一部として、組織または体液（例えば、腫瘍細胞含有体液）におけるタンパク質レベルをモニタリングするために、診断的にも使用することができる。検出可能な物質に抗体を結合することにより、検出を容易にすることができる。検出可能な物質の例としては、限定はしないが、さまざまな酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、および放射性物質が挙げられる。適切な酵素の例としては、限定はしないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる；適切な補欠分子族複合体の例としては、限定はしないが、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられる；適切な蛍光物質の例としては、限定はしないが、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンが挙げられる；発光物質の例としては、限定はしないが、ルミノールが挙げられ；生物発光物質の例としては、限定はしないが、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびイクオリンが挙げられる；適切な放射性物質の例としては、限定はしないが、125Ｉ、131Ｉ、35Ｓまたは3Ｈが挙げられる。
【００８６】
Ｖ．典型的な組み換え発現ベクターおよび宿主細胞
本発明のもう１つの態様は、本発明のマーカーに対応するポリペプチド（またはこのようなポリペプチドの一部）をコードする核酸を含む、発現ベクターなどのベクターに関する。本明細書では、「ベクター」という用語は、別の核酸に結合して輸送することができる核酸分子を表す。ベクターの１つの型は「プラスミド」であり、これは、追加のＤＮＡ断片が連結する環状二重鎖ＤＮＡループを表す。別のタイプのベクターは、追加のＤＮＡ断片がウイルスゲノムに連結されうる、ウイルスベクターである。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自己複製することができる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入の際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、宿主ゲノムとともに複製される。さらには、ある特定のベクター、すなわち発現ベクターは、動作可能に連結した遺伝子の発現を検出することができる。一般に、遺伝子組み換え技術に有用な発現ベクターは、しばしば、プラスミド（ベクター）の形態をしている。しかしながら、本発明は、同等の機能を果たす、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）など、発現ベクターの他の形態も含むことが意図されている。
【００８７】
本発明の組み換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適した本発明の核酸を含む。これは、組み換え発現ベクターが、発現する核酸配列に動作可能に連結した、発現に使用するために宿主細胞に基づいて選択された１つ以上の制御配列を含むことを意味する。組み換え発現ベクター内において、「動作可能に連結」とは、対象ヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現（例えば、インビトロ転写／翻訳系において、またはベクターが宿主細胞内に導入される際に宿主細胞において）が可能な方法で制御配列に連結されることを意味することが意図されている。「制御配列」という用語は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化信号）を含むことが意図されている。これらの制御配列は、例えば、Goeddel, Methods in Enzymology: Gene Expression Technology vol.185, Academic Press, San Diego, CA (1991)に記載されている。制御配列は、多くのタイプの宿主細胞におけるヌクレオチド配列の構成的発現を対象とするもの、および、ある特定の宿主細胞（例えば、組織特異的制御配列）におけるヌクレオチド配列の発現のみを対象とするものを含む。発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの因子に応じて決まりうることは当業者に認識されよう。本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入し、それによって、本明細書記載の核酸にコードされた、融合タンパク質またはペプチドを含めたタンパク質またはペプチドを産生することができる。
【００８８】
本発明の組み換え発現ベクターは、原核細胞（例えば、大腸菌（E. Coli））または真核細胞（例えば、昆虫細胞｛バキュロ・ウイルス発現ベクターを使用｝、酵母細胞または哺乳動物細胞）において、本発明のマーカーに対応するポリペプチドを発現するように設計することができる。適切な宿主細胞は、上記Goeddelの文献においてさらに論述されている。あるいは、組み換え発現ベクターは例えばＴ７プロモーター制御配列およびＴ７ポリメラーゼを利用して、インビトロにおいて転写および翻訳することができる。
【００８９】
原核生物におけるタンパク質の発現は、ほとんどの場合、融合または非融合タンパク質のいずれかの発現を目的とする構成的プロモーターまたは誘導プロモーターを含むベクターを用いて、大腸菌（E. Coli）において行われる。融合ベクターは、内部にコードされたタンパク質、通常は組み換えタンパク質のアミノ末端に、多くのアミノ酸を加える。このような融合ベクターは、典型的には次の３つの目的：１）組み換えタンパク質の発現の増大；２）組み換えタンパク質の溶解性の増大；および３）アフィニティー精製におけるリガンドとしての働きをすることによる、組み換えタンパク質の精製の補助、を果たす。多くの場合、融合発現ベクターにおいて、融合タンパク質の精製後に融合部分から組み換えタンパク質を分離できるようにするため、融合部分と組み換えタンパク質の接合部位にタンパク質分解性切断部位が導入される。これらの酵素およびそれらの同族認識配列として、第Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼが挙げられる。典型的な融合発現ベクターとしては、それぞれ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを標的組み換えタンパク質と融合させる、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ社製；Smith and Johnson, 1988, Gene 67:31-40）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製（米国マサチューセッツ州ベバリー所在））およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製（米国ニュージャージー州ピスカタウェイ所在））が挙げられる。
【００９０】
適切な誘導非融合大腸菌（E. Coli）発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Amann et al., 1988, Gene 69:301-315）およびｐＥＴ １１ｄ（Studier et al., p. 60-89, In Gene Expression Technology: Methods in Enzymology vol.185, Academic Press, San Diego, CA, 1991）が挙げられる。ｐＴｒｃベクターからの標的遺伝子発現は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写に依拠している。ｐＥＴ １１ｄベクターからの標的遺伝子発現は、共発現したウイルスＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ ｇｎ１）が介在するＴ７ ｇｎ１０−ｌａｃ融合プロモーターからの転写に依拠している。このウイルスポリメラーゼは、ｌａｃＵＶ５プロモーターの転写制御下、Ｔ７ ｇｎ１遺伝子を包含する内在性のプロファージによって、宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）により供給される。
【００９１】
大腸菌（E. Coli）における組み換えタンパク質の発現を最大にするための１つの戦略は、タンパク質分解によって組み換えタンパク質を切断する能力を損なった宿主細菌においてタンパク質を発現させることである（Gottesman, p. 119-128, In Gene Expression Technology: Methods in Enzymology vol. 185, Academic Press, San Diego, CA, 1990）。別の戦略は、各アミノ酸についての個々のコドンが大腸菌（E. Coli）においてとりわけ利用されうるように、発現ベクター内に挿入される核酸の核酸配列を変化させることである（Wada et al., 1992, Nucleic Acids Res. 20:2111-2118）。本発明の核酸配列のこのような変化は、標準的なＤＮＡ合成法によって行うことができる。
【００９２】
別の実施形態では、発現ベクターは酵母発現ベクターである。酵母サッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）における発現用ベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Baldari et al., 1987, EMBO J. 6:229-234）、ｐＭＦａ（Kurjan and Herskowitz, 1982, Cell 30:933-943）、ｐＪＲＹ８８（Schultz et al., 1987, Gene 54:113-123）、ｐＹＥＳ２（Invitrogen Corporation社製（米国カリフォルニア州サンディエゴ所在））、およびｐｉｃＺ（Invitrogen Corporation社製（米国カリフォルニア州サンディエゴ所在））、が挙げられる。
【００９３】
あるいは、発現ベクターはバキュロウイルス発現ベクターである。培養昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）におけるタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ（Smith et al., 1983, Mol. Cell Biol. 3:2156-2165）、およびｐＶＬシリーズ（Lucklow and Summers, 1989, Virology 170:31-39）が挙げられる。
【００９４】
さらに別の実施の形態では、核酸は哺乳動物発現ベクターを使用して哺乳動物細胞において発現される。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Seed, 1987, Nature 329:840）およびｐＭＴ２ＰＣ（Kaufman et al., 1987, EMBO J. 6:187-195）が挙げられる。哺乳動物細胞に用いられる場合には、発現ベクターの制御機能は、多くの場合にはウイルス調節要素によって提供される。例えば、一般的に使用されているプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、およびシミアンウイルス４０に由来する。原核細胞および真核細胞の両方のための他の適切な発現システムについては、Sambrook et al., ed., Molecular Cloning:  A Laboratory Manual, 2nd ed.,  Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989の第16章および17章を参照のこと。
【００９５】
別の実施の形態では、組み換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型における核酸の発現を導くことができる（例えば、組織特異的調節要素が核酸の発現に用いられる）。組織特異的調節要素は当技術分野で公知である。適切な組織特異的プロモーターの非限定的な例としては、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Pinkert et al., 1987, Genes Dev. 1:268-277）；Ｔ細胞受容体のプロモーター（Winoto and Baltimore, 1989, EMBO J. 8:729-733）および免疫グロブリンのプロモーター（Banerji et al., 1983, Cell 33:729-740; Queen and Baltimore, 1983, Cell 33:741-748）などのリンパ特異的プロモーター（Calame and Eaton, 1988, Adv. Immunol. 43:235-275）；ニューロン特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター；Byrne and Ruddle, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5473-5477）、膵臓特異的プロモーター（Edlund et al., 1985, Science 230:912-916）、および乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号明細書（参照することにより組み込まれる）および欧州特許出願公開第２６４，１６６号明細書）が挙げられる。発生過程で調節されるプロモーターもまた包含され、例えば、マウスｈｏｘプロモーター（Kessel and Gruss, 1990, Science 249:374-379）およびα−フェトプロテインプロモーター（Camper and Tilghman, 1989, Genes Dev. 3:537-546）が挙げられる。
【００９６】
本発明はさらに、アンチセンス配向で発現ベクターに組み込まれた本発明のＤＮＡ分子を含む組み換え発現ベクターを提供する。すなわち、ＤＮＡ分子は、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡに対してアンチセンスのＲＮＡ分子の発現（ＤＮＡ分子の転写による）を可能にする方法で制御配列に動作可能に連結される。アンチセンス配向で組み込まれた核酸に動作可能に連結された制御配列は、例えばウイルスプロモーターおよび／またはエンハンサーなど、さまざまな細胞型におけるアンチセンスＲＮＡ分子の連続発現を誘導するように選択することができ、あるいは、制御配列は、アンチセンスＲＮＡの構成的、組織特異的または細胞型特異的発現を誘導するように選択することができる。アンチセンス発現ベクターは、組み換えプラスミド、ファージミド、または弱毒化ウイルスの形態であって差し支えなく、ここで、アンチセンス核酸は、高効率調節領域の調節下で産生され、その活性は、ベクターが導入される細胞型によって決定されうる。アンチセンス遺伝子を使用する遺伝子発現の調節の論述については、Weintraub et al., 1986, Trends in Genetics, Vol. 1(1)を参照。
【００９７】
本発明のもう１つの態様は、本発明の組み換え発現ベクターが導入された宿主細胞に関する。「宿主細胞」および「組み換え宿主細胞」という用語は、本明細書では相互に用いられる。これらの用語は、特定の対象細胞のみならず、これらの細胞の子孫または可能性のある子孫（potential progeny）も意味することが理解されよう。変異または環境の影響のいずれかに起因して、ある特定の修飾が継代において生じ得ることから、その子孫は、実際には親細胞とは同一ではないかもしれないが、本明細書においては用語の範囲内に含まれる。
【００９８】
宿主細胞は、原核細胞（例えば、大腸菌（E. Coli））または真核細胞（例えば、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞）のいずれかでありうる。
【００９９】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換またはトランスフェクション法によって原核細胞または真核細胞に導入することができる。本明細書では、「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウムの共沈、ＤＥＡＥデキストラン介在性トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションを含めた、外来核酸を宿主細胞に導入するためのさまざまな当技術分野で認識されている技術を表すことが意図されている。宿主細胞の形質転換またはトランスフェクションに適した方法は、上述のSambrookらの参照文献、および他の実験マニュアルで確認することができる。
【０１００】
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションのためには、使用する発現ベクターおよびトランスフェクションの技法に応じて、細胞の小画分のみが、外来ＤＮＡをそれらのゲノムに組み込みうることが知られている。これらの成分を同定および選択するために、一般的には、選択可能なマーカー（例えば、抗生物質に対する耐性のため）をコードする遺伝子が、対象の遺伝子と一緒に宿主細胞に導入される。典型的な選択可能なマーカーは、Ｇ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキサートなど、薬物に対する耐性を与えるものを含む。導入核酸を安定にトランスフェクトされた細胞は、薬剤選択によって同定することができる（例えば、選択可能なマーカー遺伝子を導入されている細胞は、他の細胞が死滅するのに対し、生存するであろう）。
【０１０１】
培養した原核細胞または真核宿主細胞など、本発明の宿主細胞を用いて、本発明のマーカーに対応するポリペプチドを生成することができる。したがって、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を用いて、本発明のマーカーに対応するポリペプチドを生成する方法を提供する。１つの実施の形態では、本方法は、本発明の宿主細胞（本発明のポリペプチドをコードする組み換え発現ベクターを導入したもの）をマーカーが産生されるように適切な培地で培養することを含む。別の実施の形態では、本方法はさらに、マーカーポリペプチドを培地または宿主細胞から単離することも含む。
【０１０２】
本発明の宿主細胞はまた、非ヒト・トランスジェニック動物を産生するのに使用することもできる。例えば、１つの実施の形態では、本発明の宿主細胞は、本発明のマーカーに対応するポリペプチドをコードする配列が導入されている受精卵母細胞または胚幹細胞である。次に、これらの宿主細胞を用いて非ヒト・トランスジェニック動物を作出することができ、ここで、本発明のマーカータンパク質をコードする外因性配列がそれらのゲノムまたは相同の組み換え動物に導入されており、本発明のマーカーに対応するポリペプチド配列をコードする内在性の遺伝子は変化している。これらの動物は、ポリペプチド活性のモジュレータを同定および／または評価することを目的とした、本マーカーに対応するポリペプチドの機能および／または活性の研究、ならびに、マーカーの発見または評価、例えば、治療用マーカーおよび診断マーカーの発見または評価を目的とした、または薬物の有効性および特異性の代用として、治療用または診断用分子の前臨床試験に有用である。
【０１０３】
本明細書では、「トランスジェニック動物」は 非ヒト動物、例えば、哺乳動物であり、例えば、ラットまたはマウスなどの齧歯動物であり、ここで、動物の１つ以上の細胞は、トランス遺伝子を含む。トランスジェニック動物の他の例としては、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類などが挙げられる。トランス遺伝子は、トランスジェニック動物が発現し、成体動物のゲノムにとどまり、したがってトランスジェニック動物の１つ以上の細胞型または組織におけるコードされた遺伝子産物の発現を検出する、細胞のゲノムに組み込まれた外来性ＤＮＡである。本明細書では「相同組み換え動物」とは、哺乳動物、例えばマウスなどの非ヒト動物であり、ここで、内在性の遺伝子は、内在性の遺伝子と、例えば動物の成長前の動物胚細胞などの動物細胞に導入された外来性ＤＮＡ分子との間の相同組み換えによって変化している。トランスジェニック動物はまた、誘導トランスジェニック動物も含み、例えば、Chan I.T., et al. (2004) J Clin Invest. 113(4):528-38およびChin L. et al (1999) Nature 400(6743):468-72に記載されるものなどが挙げられる。
【０１０４】
本発明のトランスジェニック動物は、本発明のマーカーに対応するポリペプチドをコードした核酸を受精卵母細胞の雄性前核に、例えば、マイクロ・インジェクション、レトロウイルス感染により導入すること、および、偽妊娠の雌性里親動物（ pseudopregnant female foster animal）中で前記卵母細胞を発生させることによって作出できる。また、イントロン配列およびポリアデニル化信号を、トランス遺伝子に含めることにより、トランス遺伝子の発現効率を増加させることができる。組織特異的制御配列は、トランス遺伝子に動作可能に連結されることにより、特定の細胞に本発明のポリペプチドの発現を導くことができる。胚操作およびマイクロ・インジェクション介したトランスジェニック動物（特にマウスなどの動物）の産生方法は、当技術分野において従来技術となっており、例えば、米国特許第４，７３６，８６６号明細書（参照することにより組み込まれる）および４，８７０，００９号明細書（参照することにより組み込まれる）、米国特許第４，８７３，１９１号明細書（参照することにより組み込まれる）およびHogan, Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986に記載されている。
【０１０５】
同様の方法が他のトランスジェニック動物の作出にも使用される。初代トランスジェニック動物は、そのゲノムにおけるトランス遺伝子の存在および／または前記動物の組織または細胞におけるトランス遺伝子をコードするｍＲＮＡの発現に基づいて同定することができる。初代トランスジェニック動物を使用して、トランス遺伝子を保持するさらなる動物を繁殖させることができる。さらには、トランス遺伝子を保持しているトランスジェニック動物を、他のトランス遺伝子を保持している他のトランスジェニック動物と更に交雑させることができる。
【０１０６】
相同組み換え動物を作出することを目的として、欠失、付加、または置換が導入され、それによって遺伝子が変化（例えば、機能的に破壊）した、本発明のマーカーに対応するポリペプチドをコードする遺伝子の少なくとも一部を含む、ベクターが調製される。別の実施の形態では、ベクターは、相同組み換えの際に、内在性の遺伝子が機能的に破壊されるように設計される（すなわち、もはや機能的なタンパク質をコードしない；「ノックアウト」ベクターとも称される）。あるいは、ベクターは、相同組み換えの際に、内在性遺伝子が変異または別の方法で変化してもなお、機能性タンパク質をコードするように設計することができる（例えば、上流調節領域が変化することによって内在性タンパク質の発現を変化させることができる）。相同組み換えベクターでは、遺伝子の変化部分が、該遺伝子の追加の核酸によって５'および３'末端に隣接して配置され、ベクターが担持する外来遺伝子と胚幹細胞中の内在性遺伝子との間に相同組み換えを生じさせる。追加のフランキング核酸配列は、内在性の遺伝子との相同組み換えを成功させるのに十分な長さを有する。典型的には、数キロベースのフランキングＤＮＡ（５’および３’末端の両方）がベクターに含まれる（例えば、相同組み換えベクターについて記載されるThomas and Capecchi, 1987, Cell 51:503を参照）。ベクターは胚幹細胞株（例えば、エレクトロポレーションによって）に導入され、ここで、導入された遺伝子が内在性の遺伝子と相同組み換えを起こした細胞が選択される（例えば、Li et al., 1992, Cell 69:915を参照）。選択された細胞は、次に動物（例えば、マウス）の胚盤胞に注入され、凝集キメラを形成する（例えば、Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, Robertson, Ed., IRL, Oxford, 1987, pp. 113-152を参照）。次に、キメラ胚は、適切な偽妊娠雌性里親動物に移植され、前記胚が出産に至る。生殖細胞内に相同組み換えＤＮＡを保持する子孫を使用して、トランス遺伝子の生殖細胞系への伝達により、動物の全ての細胞が相同組み換えＤＮＡを含んでいる動物を繁殖させることができる。相同組み換えベクターおよび相同組み換え動物を構築する方法はさらに、Bradley (1991) Current Opinion in Bio/Technology 2:823-829および国際出願公開第ＷＯ９０／１１３５４号パンフレット（参照することにより組み込まれる）、同第ＷＯ９１／０１１４０号パンフレット（参照することにより組み込まれる）、同第ＷＯ９２／０９６８号パンフレット（参照することにより組み込まれる）、および同第ＷＯ９３／０４１６９号パンフレット（参照することにより組み込まれる）にも記載されている。
【０１０７】
別の実施の形態では、トランス遺伝子の調節発現を可能にする選択されたシステムを含む、トランスジェニック非ヒト動物を作出することができる。このようなシステムの１つの例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ システムである。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ システムの説明は、例えば、Lakso et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6232-6236を参照されたい。リコンビナーゼシステムの別の例は、サッカロミセス・セレビシエのＦＬＰリコンビナーゼシステムである（O'Gorman et al., 1991, Science 251:1351-1355）。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムを使用してトランス遺伝子の発現を調節する場合には、Ｃｒｅリコンビナーゼと選択されたタンパク質の両方をコードするトランス遺伝子を含む動物が必要である。このような動物は、例えば、一方は選択されたタンパク質をコードするトランス遺伝子を含み、他方はリコンビナーゼをコードするトランス遺伝子を含んだ、２種類のトランスジェニック動物を交配させることによる、「ダブル」トランスジェニック動物の構築により提供することができる。
【０１０８】
本明細書に記載される非ヒト・トランスジェニック動物のクローンは、例えば、Wilmut et al. (1997) Nature 385:810-813および国際出願公開第ＷＯ９７／０７６６８号パンフレット（参照することにより組み込まれる）およびＷＯ９７／０７６６９号パンフレット（参照することにより組み込まれる）に記載の方法に従って作出することができる。
【０１０９】
Ｖ．典型的なキット
キットは、少なくとも１種類の試薬、例えば、本発明のマーカーを特異的に検出するためのプローブを含む、いずれかの製品（例えば、パッケージまたは容器）であり、前記製品は、本発明の方法を実施するためのユニットとして、宣伝、流通、または販売される。本発明の組成物、キット、および方法を用いて本発明の方法を実施する場合、本発明のＡＬＫ遺伝子変異および／または遺伝子産物（例えば、表１記載のマーカー）は、対応するステージ、悪性度、組織型、または良性／前癌性／悪性の性質を有する癌を患っている被験体の少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約６０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％または１００％に、陽性結果が得られるように選択されうる。ある特定の実施の形態では、本発明のマーカーまたはマーカー群は、母集団について約１０％を超えるＰＰＶ（陽性予測値）が得られるように選択されうる（例えば、９９．５％を超えるアッセイ特異性に加えて）。
【０１１０】
本発明の複数のＡＬＫ遺伝子変異および／または遺伝子産物（例えば、表１記載のマーカー）が本発明の組成物、キット、および方法に用いられる場合、各マーカーの量、構造、および／または活性、または発現またはコピー数のレベルは、単一反応混合物中（すなわち、各マーカーについて異なる蛍光プローブなどの試薬を使用）または、１つ以上のＡＬＫ遺伝子変異および／または遺伝子産物（例えば、表１記載のマーカー）に対応する個別の反応混合物中における、複数のマーカーのそれぞれの正常な量、構造、および／または活性、もしくは、同一タイプの非癌性サンプルにおける発現レベルまたはコピー数と比較することができる。複数のＡＬＫ遺伝子変異および／または遺伝子産物（例えば、表１記載のマーカー）が用いられる場合には、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の個別のマーカーが使用または同定されうる。
【０１１１】
本発明は、サンプル（例えば、アーカイブされた組織サンプルまたは被験体から採取したサンプル）における癌細胞をアッセイするための組成物、キット、および方法を含む。これらの組成物、キット、および方法は、必要に応じて、その組成物、キット、および方法をある特定のタイプのサンプルと一緒に使用するために適合させるほかは、上述のものと実質的に同一である。
【０１１２】
よって、本発明は、ＡＬＫ阻害剤に対する反応性が低減した、または低減する可能性のある、癌細胞の存在を評価するためのキットを含む（例えば、被験体サンプルなどのサンプル）。キットは、例えば、本発明のＡＬＫ遺伝子変異および／または遺伝子産物（例えば、表１記載のマーカー）に対応する核酸またはポリペプチドに特異的に結合するなど、本発明のＡＬＫ遺伝子変異および／または遺伝子産物（例えば、表１記載のマーカー）を同定することができる１つ以上の試薬を含みうる。本発明のマーカーに対応するポリペプチドとの結合に適した試薬としては、抗体、抗体誘導体、抗体フラグメントなどが挙げられる。核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、スプライシングされたｍＲＮＡ、ｃＤＮＡなど）との結合に適した試薬としては、相補的核酸が挙げられる。例えば、核酸試薬は、基質、基質と結合しない標識化オリゴヌクレオチド、ＰＣＲプライマー対、分子指標プローブなどに固定されたオリゴヌクレオチド（標識化または非標識化）を含みうる。一部の実施の形態では、キットは、表１記載の変異を少なくとも１つ含む、少なくとも１本（one stretch）の核酸を取り囲む複数本（stretches）の核酸を認識し、ハイブリッド形成する少なくとも一対のプライマーを含むなど、本明細書に記載の方法の実施に有用な試薬、および、前記変異の存在の有無に関して増幅標的核酸を検出する手段を含みうる。
【０１１３】
本発明のキットには、随意的に、本発明の方法の実施に有用な追加の要素を含めてもよい。例えば、キットは、相補的核酸のアニーリングに適した、または抗体とその抗体が特異的に結合するタンパク質との結合に適した流体（例えば、ＳＳＣ緩衝剤）、１つ以上の試料コンパートメント、本発明の方法の性能を説明する教材、正常細胞サンプル、癌細胞サンプルなどを含みうる。
【０１１４】
本発明のキットは、マーカーのタンパク質レベルまたはタンパク質活性を決定するのに有用な試薬を含みうる。別の実施の形態では、本発明のキットには、マーカーのメチル化状態を決定するための試薬を含めて差し支えなく、あるいは、マーカーの構造変化、例えば、変異の存在を判定するための試薬を含めてもよい。
【０１１５】
ＶＩ．予測医学
本発明はまた、個人を予防治療するために、診断分析、薬理ゲノム学、および臨床試験のモニタリングを予測目的で用いる、予測医学の分野も対象とする。したがって、本発明の１つの態様は、癌を有するまたは癌を発現するリスクのある個人がＡＬＫ阻害剤介在性の治療に反応を示す可能性の高さを判定することを目的とした、本発明の１つ以上のマーカーに対応するポリペプチドまたは核酸の量、構造、および／または活性を決定するためのアッセイに関する。
【０１１６】
したがって、１つの態様では、本発明は、癌を有する被験体が、ＡＬＫ阻害剤を用いた治療に反応を示す可能性の高さを判定する方法にも関連する。別の態様では、本発明は、疾患の経時変化を予測する方法に関連する。さらに別の態様では、本方法は、疾患の経時変化における有意事象の可能性を予測する方法にも関連する。ある特定の実施の形態では、本方法は、ＡＬＫ阻害剤を用いた治療に対する反応に関連する生体指標または生体指標の組合せ（例えば、ＡＬＫ突然変異）を検出し、被験体がＡＬＫ阻害剤を用いた治療に対し反応を示す可能性の高さを判定することを含む。
【０１１７】
一部の実施の形態では、本方法は、癌を有すると診断された、または癌を有する疑いがある（例えば、癌の症状を示す）患者から得られた生物学的組織サンプルの、ＡＬＫ突然変異（例えば、表１に記載のものなど）を検出することを目的とした細胞遺伝学的スクリーニングに関する。
【０１１８】
スクリーニング法の結果およびその解釈は、ＡＬＫ阻害剤（例えば、ＰＦ−０２３４１０６６および／またはＰＤＤ）を用いた治療に対する患者の反応の予測となる。本発明によれば、ＡＬＫ突然変異の存在は、ＡＬＫ阻害剤（例えば、ＰＦ−０２３４１０６６および／またはＰＤＤ）を用いた治療が、ＡＬＫ突然変異を有しない患者の治療と比較して、癌細胞に対する強化された治療的有用性をもたらすことを示している。
【０１１９】
１つの実施の形態では、本発明の方法は、ＤＮＡサンプル、例えば患者から単離された細胞から入手した染色体サンプルなどの、例えば生殖細胞系および／または体細胞ＤＮＡを含むサンプルを、染色体異常（例えば、本明細書に記載のＡＬＫ突然変異）に関連した染色体領域にあるゲノムＤＮＡに特異的であり、かつストリンジェントな条件下で前記ゲノムＤＮＡとハイブリッド形成するポリヌクレオチドプローブと接触させて、患者の細胞における１つ以上の異常部分（例えば、変異）の存在または不存在を判定することを含む。前記分析の結果は、治療薬、特にＡＬＫを阻害する薬物（例えば、ＰＦ−０２３４１０６６および／またはＰＤＤ）を用いた治療に対して患者に生じうる反応の予測となる。
【０１２０】
別の実施の形態では、経時変化は、患者の疾患の過程における有意事象同士の間の期間を決定することによって測定され、ここで、測定は、患者が長期の経時変化を有するか否かを予測する。別の実施の形態では、有意事象は、一次診断から死亡への進行である。別の実施の形態では、有意事象は、一次診断から転移性疾患への進行である。別の実施の形態では、有意事象は、一次診断から再発への進行である。別の実施の形態では、有意事象は、転移性疾患から死亡への進行である。別の実施の形態では、有意事象は、転移性疾患から再発への進行である。別の実施の形態では、有意事象は、再発から死亡への進行である。ある特定の実施の形態では、経時変化は、全生存率、無増悪期間および／またはＲＥＣＩＳＴまたは他の応答基準の使用に関して測定される。
【０１２１】
ある特定の実施の形態では、患者サンプルを少なくとも２つの患者サブグループに分けることによって、所定の比較基準（predetermined measure）が作られる。ある特定の実施の形態では、サブグループの数は２つであり、患者サンプルは、ＡＬＫ突然変異を有する患者のサブグループと、ＡＬＫ突然変異を有しないサブグループに分けられる。ある特定の実施の形態では、被験体におけるＡＬＫ突然変異状態は、ＡＬＫ突然変異を有する、または有しないサブグループのいずれかと比較される；患者がＡＬＫ突然変異を有している場合、患者はＡＬＫ阻害剤（例えば、ＰＦ−０２３４１０６６および／またはＰＤＤ）に反応する可能性が低い、および／または、患者は長期の経時変化を有する可能性が高い。ある特定の実施の形態では、サブグループの数は３以上であり、限定はしないが、特定のＡＬＫ突然変異と相関する、ＡＬＫ阻害剤の予測有効性の層別化に応じて、３つのサブグループ、４つのサブグループ、５つのサブグループおよび６つのサブグループが含まれる。ある特定の実施の形態では、反応の可能性は、全生存率、無増悪期間および／またはＲＥＣＩＳＴ基準の使用に関して測定される。ある特定の実施の形態では、ＡＬＫ阻害剤は、ＰＦ−０２３４１０６６および／またはＰＤＤである。
【０１２２】
別の態様では、本発明は、ＡＬＫ突然変異陽性癌を有する被験体が、ＡＬＫ阻害剤（例えば、ＰＦ−０２３４１０６６および／またはＰＤＤ）を用いた治療に反応を示す可能性が高いか否かおよび／または疾患の経時変化が長期にわたるか否かを判定する方法に関連する。別の態様では、本発明は、ＡＬＫ突然変異陽性癌を有する被験体における疾患の経時変化を予測する方法に関する。別の態様では、本発明は、ＡＬＫ突然変異陽性癌を有する被験体の有意事象の可能性を予測する方法に関する。
【０１２３】
１．ＡＬＫ突然変異の検出方法
ＡＬＫ遺伝子変異および／または遺伝子産物（例えば、表１記載のマーカー）を評価する方法は、ハイブリダイゼーションに基づいたアッセイを含めて当業者に周知である。例えば、サンプル中のコード化核酸のコピー数を評価する１つの方法は、サザンブロット法に関する。サザンブロット法では、ゲノムＤＮＡ（典型的には、断片化され、電気泳動ゲル上で分離される）は、標的領域に特異的なプローブとハイブリッド形成される。標的領域用のプローブに由来するハイブリダイゼーションシグナルの強度と、正常なゲノムＤＮＡ（例えば、同一または関連する細胞、組織、臓器などの非増幅部分）の分析から得た対照プローブ信号との比較は、標的核酸の存在／不存在および相対コピー数の推定値を提供する。あるいは、ノーザンブロット法は、サンプル中のコード化核酸のコピー数の推定に用いられうる。ノーザンブロット法では、ｍＲＮＡは、標的領域に特異的なプローブとハイブリッド形成される。標的領域用のプローブから得たハイブリダイゼーションシグナルの強度と、正常なｍＲＮＡ（例えば、同一または関連する細胞、組織、臓器などの非増幅部分）の分析から得られた対照プローブ信号との比較は、標的核酸の存在／不存在および相対コピー数の推定を提供する。
【０１２４】
コピー数を決定するための別の手段は、in situハイブリダイゼーションである（例えば、Angerer (1987) Meth. Enzymol 152: 649参照）。一般に、in situハイブリダイゼーションは、次のステップを含む：（１）分析を目的とした組織または生物学的構造の固定；（２）標的ＤＮＡのアクセス性を増大させ、非特異的結合を低減させることを目的とした生物学的構造のプレハイブリダイゼーション処理；（３）生物学的構造または組織中の核酸への核酸混合物のハイブリダイゼーション；（４）ハイブリダイゼーションにおける非結合核酸断片の除去を目的としたハイブリダイゼーション後の洗浄、および（５）ハイブリッド形成された核酸断片の検出。これらのステップのそれぞれで用いられた試薬および使用条件は、特定の用途に応じて変化する。
【０１２５】
典型的なハイブリダイゼーションに基づいたアッセイとしては、限定はしないが、サザンブロット法またはin situハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨ法およびＦＩＳＨ ｐｌｕｓ ＳＫＹ法）などの伝統的な「直接プローブ」法、および、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）、例えば、ｃＤＮＡに基づく、またはオリゴヌクレオチドに基づくＣＧＨなどの「比較プローブ」法が挙げられる。本方法は、幅広い構成に使用することができ、例えば、限定はしないが、基板（例えば、膜またはガラス）結合法またはアレイに基づいた手法が挙げられる。
【０１２６】
１つの態様では、ＦＩＳＨ分析法が用いられる。細胞サンプルは、当技術分野で既知の適切な細胞遺伝学的試験法、例えばＦＩＳＨ法によって試験するため、当技術分野で周知の方法に従って患者から入手される。１つの実施の形態では、ＦＩＳＨ法は、Ｖｙｓｉｓ（商標）システム（Abbott Molecular社製）に従って実施することができ、前記製造業者のプロトコルは、参照することによって本明細書に取り込まれる。
【０１２７】
プローブは、染色体の異なる部分に存在するＤＮＡ塩基配列に対して本質的に相補的なＤＮＡ断片を含むものが用いられる。本発明に従った有用なプローブ、およびプローブの標識化およびサンプルへのハイブリダイゼーションの例は、Vysis，Inc.社に付与された２つの米国特許：米国特許第５，４９１，２２４号明細書（参照することにより組み込まれる）およびBittnerらに付与された同第６，２７７，５６９号明細書（参照することにより組み込まれる）である。
【０１２８】
染色体プローブは、典型的には、約５０〜約１０5ヌクレオチド長である。長いプローブは、典型的には、約１００〜約５００ヌクレオチド長の小さい断片を含む。セントロメアＤＮＡおよび遺伝子座特異的ＤＮＡとハイブリッド形成するプローブは、例えば、Vysis，Inc.社（米国イリノイ州ダウナーズグローブ所在）、Molecular Probes、Inc.社（米国オレゴン州ユージーン所在）またはCytoCell社（英国オックスフォードシャー所在）から市販されている。あるいは、プローブは、標準的な技法を通じて、染色体またはゲノムＤＮＡから非商業的に調製することもできる。例えば、使用可能なＤＮＡ源としては、ゲノムＤＮＡ、クローン化ＤＮＡ配列、宿主の正常な染色体組とともに１つの染色体（例えば、ヒト染色体）またはその一部を含む体細胞ハイブリッド、およびフローサイトメトリーまたは顕微解剖によって生成された染色体が挙げられる。対象領域は、クローニングを通じて、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を通じた部位特異的増幅によって単離することができる。例えば、Nath and Johnson, Biotechnic Histochem., 1998, 73(1):6-22, Wheeless et al., Cytometry 1994, 17:319-326、および米国特許第５，４９１，２２４号明細書（参照することにより組み込まれる）を参照されたい。
【０１２９】
用いられるプローブは、染色体異常がこの領域に存在するか否かを判定するために、染色体の特定部位とハイブリッド形成される。染色体異常の１つの型は欠失である。欠失は、１つ以上の完全染色体でありうるが、通常は、欠失は、１つ以上の染色体の一部の欠損に関係する。プローブに含まれる染色体の領域全体が細胞から欠失する場合、前記プローブの細胞由来のＤＮＡへのハイブリダイゼーションは、通常は生じず、その染色体にはシグナルは存在しない。プローブ内に部分的に含まれる染色体領域が細胞から欠失される場合には、そのプローブの細胞由来のＤＮＡへのハイブリダイゼーションは依然として生じるが、存在するシグナルはそれほど大きくはないであろう。例えば、シグナルの消失は、プローブ検出が意図する遺伝子異常部分を含まない、対照細胞に由来するＤＮＡへのプローブハイブリダイゼーションと比較される。一部の実施の形態では、染色体異常の存在に関し、少なくとも１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、またはそれ以上の細胞が列挙される。
【０１３０】
検出する染色体異常としては、限定はしないが、非相互転座、染色体内の逆位、点変異s、欠失、遺伝子コピー数の変化、遺伝子発現量の変化、および生殖細胞系の変異が挙げられる。特に、染色体異常の型の１つは複製である。複製は、染色体全体であって差し支えないが、染色体全体より小さい領域であってもよい。プローブに含まれる染色体領域が細胞内で複製される場合には、そのプローブの細胞由来のＤＮＡへのハイブリダイゼーションは、プローブに含まれる染色体領域に異常部分を有しない対照細胞に存在するシグナルの数と比較して、通常、少なくとも１つ追加のシグナルを生じる。ヒト染色体２ｐ２３またはそれらのオルソログ、またはＡＬＫ遺伝子の２ｐ２３に転座を含む染色体領域またはそれらのオルソログを検出するプローブが用いられうるが、適切なプローブは当技術分野で周知である（例えば、Vysis，Inc.社（米国イリノイ州ダウナーズグローブ所在）から市販される）。
【０１３１】
染色体プローブは、ハイブリッドを形成する染色体領域が検出できるように標識化される。プローブは、典型的には、低波長／高エネルギーの光を吸収した後に蛍光を発する有機分子であるフルオロフォアを用いて、直接的に標識化される。フルオロフォアは、二次的な検出分子を使用せずにプローブを視覚化できるようにする。フルオロフォアをヌクレオチドに共有結合させた後、ニックトランスレーション、ランダムプライミング、およびＰＣＲラベリングなどの標準的な技術を用いて、ヌクレオチドをプローブに直接導入することができる。あるいは、プローブ内のデオキシシチジンヌクレオチドは、リンカーを用いてアミノ基を転移させることができる。次に、フルオロフォアを、アミノ基転移させたデオキシシチジンヌクレオチドと共有結合させる。米国特許第５，４９１，２２４号明細書（参照することにより組み込まれる）を参照のこと。
【０１３２】
米国特許第５，４９１，２２４号明細書は、プローブ標識を、共有結合した蛍光標識を有する多くのシトシン残基として説明している。蛍光的に標識化されたシトシン塩基の数は、個別のその標識化されたＤＮＡ断片が、検出すべき染色体または染色体領域に対する特異的な相補的結合（ハイブリダイジング）特性を実質的に保持すると同時に、検出可能な蛍光シグナルを作出するのに十分である。これらのプローブは、標識化されていないＤＮＡプローブ・セグメントを採取し、連結基を用いてセグメント内の多くのデオキシシチジンヌクレオチドをアミノ基転移させ、アミノ基転移したデオキシシチジン塩基の少なくとも一部に蛍光標識を共有結合させることによって作出される。
【０１３３】
プローブはまた、ニックトランスレーション、ランダムプライマー標識化またはＰＣＲラベリングによっても標識化することができる。標識化は、蛍光（直接）またはハプテン（間接）−標識化ヌクレオチドのいずれかを用いて行われる。代表的な標識の非限定的な例としては、次のものが挙げられる：ＡＭＣＡ−６−ｄＵＴＰ、ＣａｓｃａｄｅＢｌｕｅ−４−ｄＵＴＰ、フルオレセイン−１２−ｄＵＴＰ、ローダミン−６−ｄＵＴＰ、ＴｅｘａｓＲｅｄ−６−ｄＵＴＰ、Ｃｙ３−６−ｄＵＴＰ、Ｃｙ５−ｄＵＴＰ、ビオチン（ＢＩＯ）−１１−ｄＵＴＰ、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）−１１−ｄＵＴＰまたはジニトロフェニル（ＤＮＰ）−１１−ｄＵＴＰ。
【０１３４】
プローブは、ビオチンまたはジゴキシゲニンを用いて間接的に標識化することができ、あるいは、32ｐおよび3Ｈなどの放射性同位体を用いて標識化することもできるが、プローブの視覚化には二次的な検出分子またはその後の継続処理が必要とされる。例えば、ビオチンで標識化されたプローブは、検出可能なマーカーと共役したアビジンによって検出することができる。例えば、アビジンは、アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素マーカーと共役させることができる。酵素マーカーは、酵素用の基質および／または触媒を用いて、標準的な比色反応で検出することができる。アルカリホスファターゼ用の触媒としては、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルフォスフェートおよびニトロ・ブルー・テトラゾリウムが挙げられる。ジアミノ安息香酸は、西洋ワサビペルオキシダーゼの触媒として使用することができる。
【０１３５】
プローブはまた、蛍光または他の標識が、ハイブリダイゼーションの前または間にＤＮＡの一部とならず、ハイブリダイゼーション後に付加されて、染色体とハイブリッド形成したプローブを検出するように調製することができる。例えば、ＤＮＡに組み込まれた抗原性分子を有するプローブを用いることができる。ハイブリダイゼーションの後、これらの抗原性分子は、該抗原性分子と反応性の特異的な抗体を用いて検出される。これらの抗体は、それ自体が蛍光色素を取り込むことができ、あるいは、結合蛍光色素を有する第２の抗体を用いて検出することもできる。
【０１３６】
しかしながら、処理または修飾されたプローブＤＮＡは、一般に、ハイブリダイゼーションに使用する前に未反応の残余生成物（例えば、ＤＮＡに取り込まれていない蛍光色素分子）を除去するため、精製される。
【０１３７】
ハイブリダイゼーションの前に、染色体プローブは、当技術分野で周知の方法に従って変性される。一般に、ハイブリダイゼーションのステップは、標識化プローブ組成物に対するブロッキングＤＮＡを過剰に加え、ハイブリダイゼーション条件下、例えばＤＮＡを変性させたスライド上で、ブロック化プローブ組成物を検出すべき染色体領域と接触させ、ハイブリッド形成していないプローブを洗い流し、プローブ組成物と染色体または染色体領域との結合を検出することを含む。
【０１３８】
プローブは、ハイブリダイゼーション条件下で、染色体ＤＮＡとハイブリッド形成またはアニーリングされる。「ハイブリダイゼーション条件」とは、プローブと標的染色体ＤＮＡとの間のアニーリングを促進する条件である。異なるプローブのアニーリングは、プローブの長さ、塩基濃度などに応じて変化することから、アニーリングは、プローブ濃度、ハイブリダイゼーション温度、塩濃度および当技術分野で周知の他の因子を変化させることによって促進される。
【０１３９】
ハイブリダイゼーション条件は、濃度、塩基組成、複雑性、およびプローブの長さ、ならびに、塩濃度、温度、およびインキュベーションの長さを変化させることによって促進される。例えば、in situハイブリダイゼーションは、典型的には、１〜２×ＳＳＣ、５０〜６５％のホルムアミドおよび非特異的ハイブリダイゼーションを抑制するブロッキングＤＮＡを含むハイブリダイゼーション緩衝液中で行われる。一般に、上述のハイブリダイゼーション条件は、約２５℃〜約５５℃の温度、および約０．５時間〜約９６時間のインキュベーション時間を含む
標的領域外での染色体プローブとＤＮＡとの非特異的結合は、一連の洗浄によって除去することができる。各洗浄における塩の温度および濃度を変化させて、洗浄のストリンジェンシーを調節する。例えば、高ストリンジェンシー条件では、洗浄は、約６５℃〜約８０℃で、０．２倍〜約２倍のＳＳＣ、および約０．１％〜約１％のＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（ＮＰ４０）などの非イオン性洗剤を使用して行うことができる。ストリンジェンシーは、洗浄温度を低下させることによって、または洗浄中の塩濃度を増大させることによって下げることができる。一部の用途では、反復配列のハイブリダイゼーション容量をブロックすることが必要である。よって、一部の実施の形態では、非特異的ハイブリダイゼーションのブロックにｔＲＮＡ、ヒトゲノムＤＮＡ、またはＣｏｔ−Ｉ ＤＮＡが用いられる。
【０１４０】
洗浄後、スライドから液体が流され、風乾され、次いでスライドに媒体が載せられ、ＤＡＰＩなどの対比染色およびカバースリップがスライドに施用される。スライドはすぐに観察することができ、あるいは、検査前に−２０℃で保存することもできる。
【０１４１】
蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）法に用いられる蛍光プローブでは、蛍光は、各フルオロフォアに適したフィルタを装備した蛍光顕微鏡を用いて、または複数のフルオロフォアを観察するためにデュアルまたはトリプルバンドパスフィルタのセットを使用することによって、視覚化することができる。例えば、米国特許第５，７７６，６８８号明細書（参照することにより組み込まれる）を参照。あるいは、フローサイトメトリーなどの技法を用いて、染色体プローブのハイブリダイゼーションパターンを検査することもできる。ＦＩＳＨ法を用いて、染色体の領域の染色体のコピー数または再配列を検出することもできる。これらのプローブは蛍光タグで標識化されていることから、相補的ＤＮＡとハイブリッド形成または結合し、研究者による蛍光顕微鏡を使用したＤＮＡの配列の位置の視認を可能にする。細胞の活発な分裂が必要とされる他の多くの染色体の研究に用いられる技法とは異なり、ＦＩＳＨ法は、非分裂細胞上で行うこともでき、非常に多目的な手法である。したがって、ＦＩＳＨ法は、間期細胞または細胞分裂周期の中期の細胞を使用して行うことができる。ＦＩＳＨ分析法に関する多くの技法は、ＧｒａｙおよびＰｉｎｋｅｌによる米国特許第５，４４７，８４１号明細書（参照することにより組み込まれる）に記載されている。
【０１４２】
ＦＩＳＨ法の結果は、プローブが検出されるように設計された特異的な染色体異常を含まないことが知られている対照細胞を参照して解釈することができる。対照細胞由来のプローブ−ＤＮＡ間のＦＩＳＨハイブリダイゼーションパターンが、特異的な染色体異常について試験およびアッセイされる細胞に由来するＤＮＡへの同一プローブのハイブリダイゼーションパターンと比較される。プローブが染色体または染色体領域の欠失を検出するように設計されている場合、試験細胞由来のＤＮＡとのプローブのハイブリダイゼーションは、通常、対照細胞由来のものよりも少ない。通常、試験細胞にはプローブ信号は存在せず、プローブが通常ハイブリッド形成する染色体領域が、欠失していることを示す。プローブが染色体の複製または付加を検出するように設計されている場合、試験細胞由来のＤＮＡとのプローブのハイブリダイゼーションは、通常、対照細胞のものよりも多く存在する。通常、試験細胞には追加のプローブ信号が存在し、プローブが通常ハイブリッド形成する染色体領域の追加の存在を表している。
【０１４３】
ＣＧＨ法では、核酸の第１の採取物（例えば、腫瘍の可能性のあるサンプルなど、サンプルから入手）は第１の標識を用いて標識化され、一方、核酸の第２の採取物（例えば、健康な細胞／組織に由来するものなどの対照サンプルから入手）は、第２の標識を用いて標識化される。核酸のハイブリダイゼーションの比は、アレイ中の各ファイバーと結合する２つの（第１および第２）標識の比によって決定される。染色体の欠失または重複が存在する場合、２つの標識のシグナルの比の差異が検出され、その比はコピー数の測定尺度を提供する。アレイに基づくＣＧＨはまた、単色標識化を利用して行うこともできる（ハイブリダイゼーションの前に対照サンプルと腫瘍の可能性のあるサンプルを２つの異なる染料を用いて標識化し、それらを混合することとは対照的に、単色標識化では、アレイ上のプローブのハイブリダイゼーションの比較に起因して比率を得る）。単色ＣＧＨ法では、対照を標識化して１つのアレイとハイブリッド形成し、アブソリュート信号を読み取り、また、腫瘍の可能性のあるサンプルを標識化して第２のアレイとハイブリッド形成し（同一の内容を使用）、アブソリュート信号を読み取る。２つのアレイから得たアブソリュート信号に基づいてコピー数の違いを計算する。本発明の方法とともに使用するのに適したハイブリダイゼーション プロトコルは、例えば、Albertson (1984) EMBO J. 3: 1227-1234; Pinkel (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 9138-9142; EPO Pub. No. 430,402; Methods in Molecular Biology, Vol. 33: In situ Hybridization Protocols, Choo, ed., Humana Press, Totowa, N.J. (1994) などに記載されている。１つの実施の形態では、Pinkel, et al. (1998) Nature Genetics 20: 207-211、またはKallioniemi (1992) Proc. Natl Acad Sci USA 89:5321-5325 (1992)のハイブリダイゼーションプロトコルが用いられる。アレイに基づくＣＧＨは、米国特許第６，４５５，２５８号明細書に記載されており、これらの各内容は、参照することによって本明細書に組み込まれる。
【０１４４】
さらに別の実施の形態では、増幅に基づくアッセイを使用して、存在／不存在およびコピー数を測定することができる。これらの増幅に基づくアッセイでは、核酸配列は、増幅反応（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）におけるテンプレートとしての働きをする。定量的な増幅では、増幅産物の量は、元々のサンプルにおけるテンプレートの量に比例するであろう。例えば健康な組織などの適切な対照との比較は、コピー数の測定尺度を提供する。
【０１４５】
「定量的な」増幅方法は当業者に周知である。例えば、定量的ＰＣＲは、同一のプライマーを使用して、既知量の対照配列を同時に共増幅することを含む。これは、ＰＣＲ反応を較正するために用いられうる内部標準を提供する。定量的ＰＣＲの詳細なプロトコルは、Innis, et al. (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N.Y.に提供されている。定量的ＰＣＲ分析を用いたマイクロサテライト領域におけるＤＮＡのコピー数の測定は、Ginzonger, et al. (2000) Cancer Research 60:5405-5409に記載されている。遺伝子の既知の核酸配列は、当業者が遺伝子の任意の部分を増幅するためにプライマーを日常的に選択可能にするのに十分である。蛍光性の定量的ＰＣＲもまた、本発明の方法に使用することができる。蛍光性の定量的ＰＣＲでは、定量は、例えば、ＴａｑＭａｎおよびサイバーグリーン（sybr green）などの蛍光シグナルの量に基づく。
【０１４６】
他の適切な増幅法としては、限定はしないが、リガーゼ連鎖反応法（ＬＣＲ）（Wu and Wallace (1989) Genomics 4: 560, Landegren, et al. (1988) Science 241:1077、およびBarringer et al. (1990) Gene 89: 117参照）、転写増幅法（Kwoh, et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173）、自家持続配列複製法（Guatelli, et al. (1990) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87: 1874）、ドットＰＣＲ法、およびリンカー−アダプター ＰＣＲ法などが挙げられる。
【０１４７】
ヘテロ接合性喪失（ＬＯＨ）マッピング（Wang, Z.C., et al. (2004) Cancer Res 64(1):64-71; Seymour, A. B., et al. (1994) Cancer Res 54, 2761-4; Hahn, S. A., et al. (1995) Cancer Res 55, 4670-5; Kimura, M., et al. (1996) Genes Chromosomes Cancer 17, 88-93）もまた、増幅領域または欠失領域の同定に使用して差し支えない。
【０１４８】
２．遺伝子発現の評価方法
マーカーの発現量についても分析することができる。本発明のマーカーの発現は、転写分子またはタンパク質の発現を検出するための幅広い周知の方法で評価されうる。これらの方法の非限定的な例としては、分泌された、細胞表面タンパク質、細胞質タンパク質、または核タンパク質の検出用の免疫学的方法、タンパク質精製法、タンパク質の機能または活性の分析法、核酸ハイブリダイゼーション法、核酸の逆転写法、および核酸増幅法が挙げられる。
【０１４９】
ある特定の実施の形態では、特定の遺伝子の活性は、ある程度の遺伝子転写産物（例えば、ｍＲＮＡ）、ある程度の翻訳されるタンパク質量、またはある程度の遺伝子産物活性によって特徴づけられる。マーカーの発現は、ｍＲＮＡレベル、タンパク質レベル、またはタンパク質活性の検出を含めたさまざまな方法でモニタリングすることができ、これらは、標準的な技法を用いて測定することができる。検出は、遺伝子発現（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質、または酵素活性）のレベルの定量化に関するものであって差し支えなく、あるいは、特に対照レベルとの比較においては、検出は遺伝子発現レベルの定性的評価であってもよい。
【０１５０】
核酸ハイブリダイゼーション法を用いて遺伝子転写産物（ｍＲＮＡまたはそれらから作出されたｃＤＮＡ）を検出および／または定量する方法は、当業者に周知である（上記Sambrook et al. の文献を参照）。例えば、ｃＤＮＡの存在、不存在、または定量を評価する方法の１つは、上述のサザン法に関する。簡潔に述べると、ｍＲＮＡを単離し（例えば、酸性グアニジン・フェノール・クロロホルム抽出法を使用、上記Sambrook et al. の文献を参照）、逆転写させて、ｃＤＮＡを産生する。次に、ｃＤＮＡを随意的に分解し、緩衝剤中でゲル電気泳動にかけ、膜へと移送させる。次に、標的ｃＤＮＡに特異的な核酸プローブを用いてハイブリダイゼーションが行われる。
【０１５１】
これら診断分析および予測分析の一般原理は、適切な条件下、マーカーとプローブが相互作用および結合するのに十分な時間、マーカーおよびプローブを含むサンプルまたは反応混合物を調製し、その後、取り出し可能なおよび／または反応混合物中で検出可能な複合体を形成することを含む。これらの分析はさまざまな方法で行うことができる。
【０１５２】
例えば、このような分析を行うための方法の１つは、マーカーまたはプローブを、基板とも称される固相担体上にアンカーし、反応終了時に固相上にアンカーされた標的マーカー／プローブ複合体を検出することを含む。このような方法の１つの実施の形態では、マーカーの存在および／または濃度についてアッセイされるべき被験体由来のサンプルは、キャリアまたは固相担体上にアンカーすることができる。別の実施の形態では、逆の状態も可能であり、その場合、プローブが固相にアンカーされ、被験体由来のサンプルは分析のアンカー成分として反応することができる。
【０１５３】
アッセイ成分を固相にアンカーするための多くの確立された方法が存在する。これらには、限定はしないが、ビオチンとストレプトアビジンの共役を通じて固定化されたマーカー分子またはプローブ分子が含まれる。このようなビオチン化アッセイ成分は、当技術分野で既知の技術（例えば、ビオチン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製（米国イリノイ州ロックフォード所在））を用いてビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）から調製することができ、ストレプトアビジンでコーティングした９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）のウェル内で固定化することができる。ある特定の実施の形態では、固定化アッセイ成分を有する表面があらかじめ準備され、保管されうる。
【０１５４】
これらの分析のための他の適切なキャリアまたは固相担体には、マーカーまたはプローブが属する分子の類を結合することができるいずれかの材料が含まれる。周知の担体またはキャリアとしては、限定はしないが、ガラス、ポリスチレン、ナイロン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、アミラーゼ、天然および改質セルロース、ポリアクリルアミド、斑糲岩、および磁鉄鉱が挙げられる。
【０１５５】
上記手法を用いてアッセイを行うために、非固定化成分が固相に加えられ、その際に第２の成分がアンカーされる。反応完了後、形成された複合体が固相上に固定化された状態で維持されるような条件下で、複合化していない成分が取り除かれうる（例えば、洗浄によって）。固相にアンカーされたマーカー／プローブ複合体の検出は、本明細書で説明した多くの方法で達成することができる。
【０１５６】
別の実施の形態では、プローブが、アンカーされたアッセイ成分の場合、該プローブは、アッセイの検出および読み出しの目的で、直接的または間接的に、本明細書で述べた当業者に周知の検出可能な標識を用いて標識化することができる。
【０１５７】
マーカー／プローブ複合体の形成は、いずれの成分も（マーカーまたはプローブ）さらなる操作または標識化することなく、例えば蛍光エネルギー移動によって（例えば、Lakowiczらの米国特許第５，６３１，１６９号明細書（参照することにより組み込まれる）；Stavrianopoulosらの米国特許第４，８６８，１０３号明細書（参照することにより組み込まれる）を参照）、直接的に検出することも可能である。第１の「ドナー」分子上のフルオロフォア標識は、適切な波長の入射光を用いた励起の際に、その放射蛍光エネルギーが第２の「アクセプター」分子上の蛍光標識によって吸収され、今度は蛍光標識が吸収エネルギーによって蛍光を発することができるようになるように選択される。あるいは、「ドナー」タンパク質分子は、単に、トリプトファン残基の自然の蛍光エネルギーを利用してもよい。標識は「アクセプター」分子標識が「ドナー」のものと識別されるように、異なる光波長を放出するものが選択される。標識間のエネルギーの伝達効率は分子間の距離に関係していることから、分子間の空間関係が評価されうる。分子間に結合が生じる状況において、アッセイにおける「アクセプター」分子標識の蛍光放射は最大であるべきである。ＦＥＴ結合事象は、当技術分野で周知の標準的な蛍光検出手段（例えば、蛍光光度計を使用）を通じて、便利に測定することができる。
【０１５８】
別の実施の形態では、プローブのマーカーを認識する能力判定は、いずれかのアッセイ成分（プローブまたはマーカー）を標識化することなく、リアルタイム生体分子相互作用分析（ＢＩＡ）などの技術を用いて達成することができる（例えば、Sjolander, S. and Urbaniczky, C., 1991, Anal. Chem. 63:2338-2345 and Szabo et al., 1995, Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705参照）。本明細書では「ＢＩＡ」または「表面プラズモン共鳴」とは、相互作用物質のいずれか（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ）を標識化することなく、生体特異的な相互作用をリアルタイムに研究するための技術である。結合表面における質量変化（結合事象を示す）は、表面近くでの光の屈折率の変化（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学現象）を生じ、生体分子間のリアルタイムの反応を表すものとして用いることができる検出可能なシグナルをもたらす。
【０１５９】
あるいは、別の実施の形態では、液相中の溶質としてマーカーおよびプローブを用いて、類似した診断分析および予測分析を行うことができる。このような分析では、複合体化したマーカーとプローブは、限定はしないが、分画遠心法、クロマトグラフィー、電気泳動法および免疫沈降などの多くの標準的な技法のいずれかによって、非複合体化成分から分離される。分画遠心法では、マーカー／プローブ複合体は、異なる大きさおよび密度に基づいた複合体の異なる沈降平衡に起因して、一連の遠心分離ステップを通じて非複合体化アッセイ成分から分離されうる（例えば、Rivas, G., and Minton, A.P., 1993, Trends Biochem Sci.  18(8):284-7参照）。標準的なクロマトグラフィー法も、複合体化した分子を非複合体化分子から分離するのに利用して差し支えない。例えば、ゲルろ過クロマトグラフィーは、大きさに基づいて、およびカラムフォーマットにおける適切なゲルろ過樹脂の利用を通じて、分子を分離し、例えば、比較的大きい複合体が比較的小さい非複合体化成分から分離されうる。同様に、非複合体化成分と比較して、マーカー／プローブ複合体の比較的異なる電荷特性は、例えばイオン交換クロマトグラフィー樹脂の利用を通じて、複合体を非複合体化成分と区別するのに利用されうる。これらの樹脂およびクロマトグラフィー法は当業者に周知である（例えば、Heegaard, N.H., 1998, J. Mol. Recognit. Winter 11(1-6):141-8; Hage, D.S., and Tweed, S.A.  J Chromatogr B Biomed Sci Appl 1997 Oct 10;699(1-2):499-525参照）。ゲル電気泳動法もまた、複合体化したアッセイ成分を非結合性分から分離するのに利用されうる（例えば、Ausubel et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1987-1999参照）。この方法では、タンパク質または核酸複合体は、例えば、大きさまたは電荷に基づいて分離される。電気泳動工程の間に結合相互作用を維持するためには、非変性のゲルマトリクス材料、および、還元剤不存在の条件が典型的である。特定の分析およびその成分にとって適切な条件は、当業者に周知であろう。
【０１６０】
特定の実施の形態では、マーカーに対応するｍＲＮＡレベルは、当技術分野で既知の方法を用いて、生体サンプルにおけるin situフォーマットおよびインビトロフォーマットの両方によって決定することができる。「生体サンプル」という用語は、被験体から単離された組織、細胞、生体液およびそれらの単離物、ならびに、被験体内に存在する組織、細胞および流体を含むことが意図されている。多くの発現検出方法は、単離ＲＮＡを使用する。インビトロの方法では、ｍＲＮＡの単離を選択しないＲＮＡ単離法は、細胞からのＲＮＡの精製のために利用することができる（例えば、Ausubel et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York 1987-1999参照）。加えて、例えば、ChomczynskiのシングルステップのＲＮＡ単離法（１９８９年、米国特許第４，８４３，１５５号明細書参照（参照することにより組み込まれる））などの当業者に周知の方法を用いて、多数の組織サンプルを容易に処理することができる。
【０１６１】
単離された核酸は、限定はしないが、サザン法またはノーザン分析法、ポリメラーゼ連鎖反応分析およびプローブアレイを含めた、ハイブリダイゼーション分析または増幅分析に使用することができる。ｍＲＮＡレベルを検出するための診断法の１つは、単離されたｍＲＮＡを、検出すべき遺伝子によってコードされたｍＲＮＡとハイブリッド形成することができる核酸分子（プローブ）に接触させることを含む。核酸プローブは、例えば、完全長ｃＤＮＡ、またはそれらの一部であって差し支えなく、例えば、少なくとも７、１５、３０、５０、１００、２５０または５００ヌクレオチド長であって、ストリンジェントな条件下で、本発明のマーカーをコードするｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡと特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドなどが挙げられる。本発明の診断分析に使用する他の適切なプローブは本明細書に記載されている。プローブを用いたｍＲＮＡのハイブリダイゼーションは、対象マーカーが発現されていることを示唆する。
【０１６２】
１つのフォーマットでは、ｍＲＮＡを固体表面に固定化し、プローブと接触させる；これは、例えば、単離ｍＲＮＡをアガロース・ゲル上で電気泳動を行い、ｍＲＮＡをゲルからニトロセルロースなどの膜に移送することなどによる。別のフォーマットでは、プローブが固体表面に固定化され、例えば、アフィメトリクス社のＤＮＡチップアレイにおいて、ｍＲＮＡがプローブと接触する。当業者は、本発明のマーカーによってコードされたｍＲＮＡのレベルの検出に使用するために、既知のｍＲＮＡの検出方法を容易に適合させることができる。
【０１６３】
プローブは、タンパク質をコードする核酸配列の完全長であっても、あるいは完全長未満であってもよい。短いプローブは、特異性について経験的に試験される。典型的な核酸プローブは２０塩基またはそれ以上の長さである（例えば、Sambrookらの核酸ハイブリダイゼーションに使用する核酸プローブ配列を選択する方法を参照）。ハイブリッド形成した部分の視覚化は、ｃＤＮＡの存在または不存在の定性的な決定を可能にする。
【０１６４】
サンプル中の本発明のマーカーに対応する転写産物レベルを決定する別の方法は、例えば、ｒｔＰＣＲ（Mullis，１９８７年，米国特許第４，６８３，２０２号明細書（参照することにより組み込まれる）に記載される実験的実施形態）、リガーゼ連鎖反応（Barany, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:189-193）、自家持続配列複製法（Guatelli et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878）、転写増幅システム（Kwoh et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177）、Ｑ−βレプリカーゼ（Lizardi et al., 1988, Bio/Technology 6:1197）、ローリング・サークル複製（Lizardiら，米国特許第５，８５４，０３３号明細書（参照することにより組み込まれる））または他の核酸増幅法のいずれかによる核酸増幅法を含み、当業者に周知の方法を使用して、増幅分子を検出する。蛍光性のｒｔＰＣＲもまた、本発明の方法に使用されうる。蛍光性ｒｔＰＣＲでは、定量は、例えば、ＴａｑＭａｎおよびサイバーグリーン（sybr green）などの蛍光シグナルの量に基づいている。これらの検出スキームは、核酸分子が非常に少数しか存在しない場合には、これらの分子の検出に特に有用である。本明細書では、増幅プライマーは、遺伝子の５’または３’領域をアニールすることができ、その間に短い領域を含んだ、一対の核酸分子（それぞれ、プラス鎖およびマイナス鎖であるか、またはその逆）であると定義される。一般に、増幅プライマーは、約１０〜３０ヌクレオチド長であり、約５０〜２００ヌクレオチド長の領域に隣接する。適切な条件下および適切な試薬を用いて、このようなプライマーは、該プライマーを側面に有するヌクレオチド配列を含む核酸分子の増幅を可能にする。
【０１６５】
in situの方法では、検出の前に細胞からｍＲＮＡを単離する必要がない。このような方法では、細胞または組織サンプルは、既知の組織学的な方法を用いて調製／処理される。つぎに、そのサンプルを担体（典型的にはスライドガラス）上に固定化し、次いで、マーカーをコードするｍＲＮＡとハイブリッド形成することができるプローブに接触させる。
【０１６６】
マーカーの絶対発現量に基づいた決定方法の代わりに、決定は、マーカーの正規化発現量に基づいてもよい。発現量の正規化は、マーカーの絶対発現量を、例えば、構成的に発現されるハウスキーピング遺伝子などのマーカーではない遺伝子の発現と比較することによって、補正することによりなされる。正規化に適した遺伝子としては、アクチン遺伝子、または上皮細胞特異的遺伝子などのハウスキーピング遺伝子が挙げられる。この正規化により、例えば被験体サンプルなどの１つのサンプルにおける発現量と例えば非癌性のサンプルなどの別のサンプルとの比較、または発生源の異なるサンプル間の比較が可能になる。
【０１６７】
あるいは、発現量は、相対発現量としてもたらされてもよい。マーカーの相対発現量を決定するため、対象サンプルの発現量の決定前に、癌細胞単離物との比較用の正常細胞の１０以上、または５０以上のサンプルについて、マーカーの発現レベルが決定される。多数のサンプルにおいてアッセイされた遺伝子の各々の平均発現量が決定され、これがマーカーのベースラインとなる発現量として用いられる。試験サンプルについて決定したマーカーの発現量（絶対的な発現レベル）を、次に、そのマーカーについて得られる平均発現値で割る。こうして相対発現量がもたらされる。
【０１６８】
ある特定の実施の形態では、ベースライン決定に用いられるサンプルは、同一の組織型の癌細胞または正常細胞に由来する。細胞源の選択は、相対発現量の使用に応じて決まる。平均発現スコアとして、正常組織に見られる発現を利用することは、アッセイするマーカーが、その細胞由来の組織に特異的であるか否か（正常細胞と比較して）を立証するのに役立つ。加えて、さらなるデータが蓄積されることから、平均発現値を修正することができ、蓄積データに基づく相対発現値の改善をもたらしうる。正常細胞から得た発現データは、癌の状態を重症度によって分類するための手段を提供する。
【０１６９】
別の実施の形態では、マーカーの発現は、被験体サンプル中の細胞からゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ（すなわち、転写ポリヌクレオチド）を調製することによって、および、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡ／ｃＤＮＡを、マーカーを含むポリヌクレオチド相補体およびそれらの断片である参照ポリヌクレオチドとハイブリダイゼーションすることによって、評価される。ｃＤＮＡは、参照ポリヌクレオチドを用いたハイブリダイゼーションの前に、さまざまなポリメラーゼ連鎖反応方法のいずれかを用いて随意的に増幅されうる。１つ以上のマーカーの発現は、同様に、マーカーの発現レベルを評価するため、定量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）を用いて検出されうる。あるいは、本発明のマーカーの変異または変異体（例えば、単一ヌクレオチド多型、欠失）の検出のための多くの既知の方法のいずれかが、被験体における突然変異マーカーの発生の検出に用いられうる。
【０１７０】
関連する実施の形態では、サンプルから得られた転写ポリヌクレオチドの混合物は、本発明のマーカーの少なくとも一部（例えば、少なくとも７、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも５００、またはそれ以上のヌクレオチド残基）に対して相補的な、またはそれらと相同の、ポリヌクレオチドが固定された基板と接触させられる。本発明のマーカーに対して相補的、またはそれらと相同であるポリヌクレオチドが、基板上で特異的に検出可能な（例えば、異なる発色団またはフルオロフォアを用いて検出可能な、または異なる選択部分に固定される）場合、複数のマーカーの発現レベルは、単一の基板（例えば、選択された位置に固定されたポリヌクレオチドの「ＤＮＡチップ」マイクロアレイ）を利用して、同時に評価することができる。マーカーの発現の評価方法が、１つの核酸を別の核酸にハイブリダイゼーションすることに関するものを使用する場合、そのハイブリダイゼーションは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で行われうる。
【０１７１】
別の実施の形態では、マーカーの発現を評価することを目的とした複数の方法の組合せが用いられる。
【０１７２】
本発明の組成物、キット、および方法は、本発明の１つ以上のマーカーの発現量またはコピー数における差異の検出に依拠していることから、ある特定の実施の形態では、マーカーの発現レベルまたはコピー数は、少なくとも１つの正常細胞および癌性細胞における発現またはコピー数の評価に用いられる方法の最小検出限界よりも有意に大きい。
【０１７３】
３．発現タンパク質の評価法
マーカータンパク質の活性またはレベルもまた、発現ポリペプチドの検出または定量によって検出および／または定量することができる。ポリペプチドは、当業者に周知の多くの手段のいずれかによって検出または定量することができる。これらには、電気泳動法、キャピラリー電気泳動、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、高拡散クロマトグラフィーなどの生化学的分析方法、または、流体またはゲル沈降素反応、免疫拡散法（一元または二元）、免疫電気泳動法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光分析、ウエスタンブロット法、免疫組織化学的方法などのさまざまな免疫学的方法が含まれうる。当業者は、細胞が本発明のマーカーを発現するか否かの判定に使用するため、既知のタンパク質／抗体検出方法を容易に適合させることができる。
【０１７４】
本発明のポリペプチドを検出するための別の薬剤は、例えば、検出可能な標識を有する抗体など、本発明のマーカーに対応するポリペプチドに結合することができる抗体である。抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体でありうる。インタクト抗体またはそれらの断片（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ'）2）を用いて差し支えない。プローブまたは抗体に関して「標識化」という用語は、検出可能な物質をプローブまたは抗体にカップリング（すなわち物理的に連結）することによるプローブまたは抗体の直接標識化、ならびに、直接標識化された別の試薬と反応させることによるプローブまたは抗体の間接標識化を含むことが意図されている。間接標識化の例としては、蛍光標識化された二次抗体を用いた一次抗体の検出および、蛍光標識化ストレプトアビジンを用いた検出ができるようにビオチンを使用したＤＮＡプローブの末端標識化が挙げられる。
【０１７５】
別の実施の形態では、抗体は、例えば、放射標識化抗体、発色団標識化抗体、フルオロフォア標識化抗体、または酵素標識化抗体など、標識化される。別の実施の形態では、抗体誘導体（例えば、基板と共役した抗体、または、タンパク質−リガンド対｛例えば、ビオチン−ストレプトアビジン｝のタンパク質またはリガンドと共役した抗体）、もしくは、マーカーに対応するオープンリーディングフレームによってコードされたタンパク質、または、その正常な翻訳後修飾の全部または一部を受けたタンパク質など、マーカーに対応するタンパク質と特異的に結合する抗体フラグメント（例えば、一本鎖抗体、単離抗体の超可変領域など）が用いられる。
【０１７６】
免疫組織化学またはＩＨＣとは、生物学的組織における抗原に特異的に結合する抗体の原理を利用した、組織切片の細胞における抗原（例えばタンパク質）の局所化のプロセスのことを表す。免疫組織化学的染色は、癌性腫瘍に見られるものなど、異常細胞の診断に幅広く用いられる。特異的な分子マーカーは、増殖または細胞死（アポトーシス）などの特定の細胞的事象の特徴である。ＩＨＣはまた、生物学的組織の異なる部分における生体指標および特異的に発現したタンパク質の分布および局在化を理解するための研究にも幅広く用いられる。抗体−抗原間の相互作用の視覚化は、多くの方法で達成されうる。最も一般的な例では、抗体は、発色反応（colour-producing reaction）を触媒することができるペルオキシダーゼなどの酵素に共役する。あるいは、抗体は、フルオレセイン、ローダミン、DyLight FluorまたはAlexa Fluorなどのフルオロフォアにタグ化されてもよい。
【０１７７】
細胞由来のタンパク質は、当業者に周知の技法を用いて単離することができる。用いられるタンパク質の単離方法は、例えば、HarlowおよびLaneによって報告されるものなどでありうる（Harlow and Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York）。
【０１７８】
１つのフォーマットでは、抗体または抗体フラグメントは、発現タンパク質を検出するために、ウエスタンブロットまたは免疫蛍光法などの方法に使用されうる。このような用途では、抗体またはタンパク質のいずれかを固体担体上に固定してもよい。適切な固相担体またはキャリアには、抗原または抗体を結合する能力のある担体が含まれる。周知の担体またはキャリアとしては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および改質セルロース、ポリアクリルアミド、斑糲岩、および磁鉄鉱などが挙げられる。
【０１７９】
当業者は、抗体または抗原を結合するための多くの他の既知の適切なキャリアを知っており、本発明とともに使用するためにこのような担体を適合させることができる。例えば、細胞から単離されたタンパク質は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけられ、ニトロセルロースなどの固相担体上に固定されうる。担体は、次に、適切な緩衝剤で洗浄され、その後、検出可能な標識化抗体を用いて処理されうる。次いで、固相担体は、非結合抗体を除去するために、第２の時間、緩衝剤を用いて洗浄されうる。次に、固体担体上の結合標識の量は、従来の手段によって検出されうる。電気泳動法を使用してタンパク質を検出する方法は、当業者に周知である（一般に、R. Scopes (1982) Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y.; Deutscher, (1990) Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc., N.Y.を参照）。
【０１８０】
別の実施の形態では、サンプル中のポリペプチドの存在を検出および定量するために、ウエスタンブロット（イムノブロット）法が用いられる。この技法は、一般に、サンプルタンパク質を、分子量に基づいてゲル電気泳動法によって分離し、分離タンパク質を適切な固体担体（ニトロセルロースフィルタ、ナイロンフィルタ、または誘導体化ナイロンフィルタ）に移送し、ポリペプチドを特異的に結合する抗体とともにサンプルをインキュベーションすることを含む。抗ポリペプチド抗体は、固体担体上のポリペプチドに特異的に結合する。これらの抗体は、直接的に標識化されて差し支えなく、あるいは、抗ポリペプチドに特異的に結合する標識化抗体（例えば、標識化ヒツジ抗ヒト抗体）を使用して、その後に検出されてもよい。
【０１８１】
別の実施の形態では、ポリペプチドは、免疫測定法を用いて検出される。本明細書では、免疫測定法は、検体に特異的に結合する抗体を使用するアッセイである。よって、検体を単離し、標的とし、定量するための他の物理的または化学的特性の使用とは対照的に、免疫測定法は、ポリペプチドの抗抗体への特異的な結合を検出することによって特徴づけられる。
【０１８２】
ポリペプチドは、多くのよく認識された免疫結合法（immunological binding assays）のいずれかを使用して検出および／または定量化される（例えば、米国特許第４，３６６，２４１号明細書（参照することにより組み込まれる）；同第４，３７６，１１０号明細書（参照することにより組み込まれる）；同第４，５１７，２８８号明細書（参照することにより組み込まれる）；および同第４，８３７，１６８号明細書（参照することにより組み込まれる）を参照）。一般的な免疫測定法の説明として、Asai (1993) Methods in Cell Biology Volume 37: Antibodies in Cell Biology, Academic Press, Inc. New York; Stites & Terr (1991) Basic and Clinical Immunology 7th Editionも参照されたい。
【０１８３】
免疫結合法（または免疫測定法）は、典型的には、検体（ポリペプチドまたはサブ配列）に特異的に結合し、多くの場合、前記検体を固定するため、「捕捉剤」を使用する。捕捉剤は、検体に特異的に結合する部分である。別の実施の形態では、捕捉剤は、ポリペプチドを特異的に結合する抗体である。抗体（抗ペプチド）は、当業者に周知の多くの手段のいずれかによって産生されうる。
【０１８４】
免疫測定法はまた、多くの場合、捕捉剤と検体によって形成される結合複合体に特異的に結合し、標識する、標識化剤も使用する。標識化剤は、それ自体が抗体／検体複合体を含む部分の１つでありうる。よって、標識化剤は、標識化ポリペプチドまたは標識化抗抗体でありうる。あるいは、標識化剤は、抗体／ポリペプチド複合体に特異的に結合する、別の抗体などの第３の部分でありうる。
【０１８５】
１つの実施の形態では、標識化剤は、標識を持つ第２のヒト抗体である。あるいは、前記第２の抗体は標識を欠いていてもよいが、同様に、第２の抗体が由来する種類の抗体に特異的な、標識化された第３の抗体によって結合されうる。第２の抗体は、酵素−標識化ストレプトアビジンなど、第３の標識化分子が特異的に結合することができる、例えばビオチンなどの検出可能な部分を有するように改質されうる。
【０１８６】
プロテインＡまたはプロテインＧなどの免疫グロブリン定常領域を特異的に結合することができる他のタンパク質もまた、標識化剤として使用して差し支えない。これらのタンパク質は、連鎖球菌の細胞壁の正常な構成物質である。それらは、さまざまな種に由来する免疫グロブリン定常領域との強い免疫原性の反応性を示す（一般に、Kronval, et al. (1973) J. Immunol., 111: 1401-1406, and Akerstrom (1985) J. Immunol., 135: 2589-2542を参照）。
【０１８７】
前述の通り、ポリペプチドの検出および／または定量化の免疫測定法は、当業者に周知の幅広いフォーマットを採用することができる。
【０１８８】
ポリペプチドを検出するための典型的な免疫測定法は、競合性または非競合性でありうる。非競合的免疫測定法は、捕捉された検体の量が直接的に測定されるアッセイである。１つの「サンドイッチ」アッセイでは、例えば、捕捉剤（抗ペプチド抗体）は、それらが固定化される固体基板に直接的に結合されうる。これらの固定化した抗体は、次に、試験サンプル中に存在するポリペプチドを捕捉する。固定化ポリペプチドは、次に、標識を持つ第２のヒト抗体などの標識化剤によって結合される。
【０１８９】
競合的アッセイでは、サンプル中に存在する検体（ポリペプチド）の量は、サンプル中に存在する検体によって捕捉剤（抗ペプチド抗体）から追い出された（または競合により排除された）添加（外来性）検体（ポリペプチド）の量を測定することによって、間接的に測定される。１つの競合的アッセイでは、既知量の（この場合には）ポリペプチドが、サンプルに加えられ、つぎに、そのサンプルは、捕捉剤と接触させられる。抗体に結合するポリペプチドの量は、サンプル中に存在するポリペプチドの濃度に逆比例する。
【０１９０】
別の実施の形態では、抗体は固体基板上に固定化される。抗体に結合したポリペプチドの量は、ポリペプチド／抗体複合体に存在するポリペプチドの量を測定することによって、あるいは、残留する非複合体化ポリペプチドの量を測定することによって、のいずれかで決定されうる。ポリペプチドの量は、標識化ポリペプチドを提供することによって検出されうる。
【０１９１】
本明細書に記載されるアッセイは、当業者に周知の標準的な方法に従って（ポリペプチドの陽性または陰性または定量化として）スコアリングされる。スコアリングの特定の方法は、標識のアッセイフォーマットおよび選択に応じて決まる。例えば、ウエスタンブロット法は、酵素標識によって産生された着色生成物を視覚化することによってスコアリングすることができる。正確な分子量において明確に視認できる着色帯または着色点は陽性結果としてスコアリングされ、明確に視認できる点または帯がない場合は陰性結果としてスコアリングされる。前記帯または点の強度は、ポリペプチドの定量的測定を提供できる。
【０１９２】
本明細書に記載のさまざまな免疫測定法に使用するための抗体は、本明細書に記載されるように産生することができる。
【０１９３】
別の実施の形態では、レベル（活性）は、遺伝子産物の酵素活性を測定することによってアッセイされる。酵素活性のアッセイ方法は、当業者に周知である。
【０１９４】
マーカータンパク質検出のためのインビボの方法は、タンパク質に対する標識化抗体を被験体に導入することを含む。例えば、抗体は、被験体におけるその存在および位置を標準的な画像技術によって検出することができる、放射性マーカーを用いて標識化することができる。
【０１９５】
本発明の方法によって同定されたある特定のマーカーは、分泌タンパク質でありうる。特定のマーカータンパク質が分泌タンパク質であるか否かを判定することは、当業者にとって簡単な事柄である。この判定をするために、マーカータンパク質は、例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞株などにおいて発現し、細胞外液が回収され、細胞外液におけるタンパク質の存在または不存在が（例えば、タンパク質と特異的に結合する標識化抗体を使用して）評価される。
【０１９６】
以下は、タンパク質の分泌の検出に使用されうる方法の例である。約８×１０5の２９３Ｔ細胞は、約６０〜７０％のコンフルエンスに達するまで、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ2、９５％の空気雰囲気下、成長培地（１０％のウシ胎児血清を補充したダルベッコ変法イーグル培地｛ＤＭＥＭ｝）を含むウェル内において、３７℃でインキュベーションされる。次に、細胞は、タンパク質をコードする発現ベクターを含む２マイクログラムのＤＮＡ、および１ウェルあたり１０マイクロリットルのＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（商標）（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬカタログ番号：１８３４２−０１２）を含む標準的なトランスフェクション混合物を使用してトランスフェクトされる。トランスフェクション混合物は約５時間維持され、次いで新鮮な成長培地に置換され、空気雰囲気中で維持される。各ウェルは、メチオニンまたはシステインを含まないＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ−ＭＣ；ＩＣＮカタログ番号：１６−４２４− ５４）を用いて、２回穏やかにすすがれる。約１ミリリットルのＤＭＥＭ−ＭＣおよび約５０マイクロキュリーのトランス−35Ｓ（商標）試薬（ＩＣＮカタログ番号：５１００６）が各ウェルに添加される。ウェルは、上述の５％のＣＯ2雰囲気下で維持され、選択された期間、３７℃でインキュベーションされるインキュベーション後、１５０マイクロリットルの馴化培地が除去され、遠心分離されて、浮遊細胞および残屑が除去される。上清におけるタンパク質の存在は、タンパク質が分泌されていることを示す。
【０１９７】
例えば、痰、気管支肺胞洗浄、胸水、組織、全血、血清、血漿、頬腔擦取物、唾液、脳脊髄液、尿、排泄物、および骨髄を含めたサンプルなど、被験体サンプルは、特に、細胞が癌性の場合、さらに具体的には、癌が転移している場合には、その中に細胞が含まれ、したがって、本発明の方法に用いられうることが認識されよう。細胞サンプルは、当然ながら、サンプル中のマーカーの発現レベルを評価する前に、さまざまな周知の採取後の調製および保存技術（例えば、核酸および／またはタンパク質の抽出、固定、保存、凍結、限外ろ過、濃度、蒸発、遠心分離など）に供されて差し支えない。よって、本発明の組成物、キット、および方法は、タンパク質を発現する細胞の表面に提示された少なくとも１つの部分を有するタンパク質に対応するマーカーの発現の検出に用いることができる。特定のマーカーに対応するタンパク質が細胞表面タンパク質を含むか否かを判定することは、当業者にとって簡単なことである。例えば、免疫学的方法は、細胞全体におけるこのようなタンパク質の検出に用いて差し支えなく、または周知のコンピューターに基づいた配列分析法（例えば、ＳＩＧＮＡＬＰプログラム；Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10:1-6）は、少なくとも１つの細胞外ドメイン（すなわち、分泌タンパク質と、少なくとも１つの細胞表面ドメインを有するタンパク質の両方を含む）の存在の予測に用いることができる。それを発現する細胞表面に提示された少なくとも１つの部分を有するタンパク質に対応するマーカーの発現は、必ずしも細胞を溶解させる必要なしに検出されうる（例えば、タンパク質の細胞表面ドメインと特異的に結合する標識化抗体を使用）。
【０１９８】
本発明はまた、生体サンプル、例えば、痰、気管支肺胞洗浄、胸水、組織、全血、血清、血漿、頬腔擦取物、唾液、脳脊髄液、尿、排泄物、および骨髄を含むサンプルにおいて、本発明のマーカーに対応するポリペプチドまたは核酸の存在を検出するためのキットを含む。このようなキットは、被験体が癌を患っているか否か、あるいは、被験体の癌発現のリスクが増加しているか否かを判定するのに用いることができる。例えば、キットは、生体サンプル中のポリペプチドまたは本発明のマーカーに対応するポリペプチドをコードするｍＲＮＡを検出することができる標識化した化合物または薬剤、およびサンプル中のポリペプチドまたはｍＲＮＡの量を決定するための手段（例えば、ポリペプチドを結合する抗体、またはポリペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡに結合するオリゴヌクレオチドプローブ）を備えうる。キットはまた、キットを使用して得られる結果を解釈するための使用説明書も含みうる。
【０１９９】
抗体に基づくキットでは、前記キットは、例えば：（１）本発明のマーカーに対応するポリペプチドに結合する（例えば、固体担体に接着した）第１の抗体；および、随意的に、（２）ポリペプチドまたは第１の抗体のいずれかと結合し、検出可能な標識と共役する、第２の異なる抗体とを含みうる。
【０２００】
オリゴヌクレオチドに基づくキットでは、前記キットは、例えば：（１）本発明のマーカーに対応するポリペプチドをコードする核酸配列とハイブリッド形成する、オリゴヌクレオチド、例えば、検出可能に標識化されたオリゴヌクレオチド、または（２）本発明のマーカーに対応する核酸分子を増幅するのに有用な一対のプライマーを含みうる。キットは、例えば、緩衝剤、保存剤、またはタンパク質安定剤も含みうる。キットは、検出可能な標識（例えば、酵素または基板）を検出するのに必要な成分をさらに含みうる。キットはまた、アッセイされ、試験サンプルと比較することができる、対照サンプルまたは一連の対照サンプルも含みうる。キットの各要素は個別の容器内に封入されて差し支えなく、さまざまな容器のすべては、キットを使用して行われるアッセイの結果を解釈するための使用説明書とともに、単一パッケージ内に存在しうる。
【０２０１】
４．構造的変化の評価方法
本発明はまた、変化、例えば変異などの構造的変化の存在を評価する方法も提供する。
【０２０２】
別の検出方法は、多型部位と重なり合い、多型領域の周りに約５、約１０、約２０、約２５、または約３０ヌクレオチドを有するプローブを用いた、アレル特異的ハイブリダイゼーションである。本発明の別の実施の形態では、変異に特異的にハイブリダイゼーション可能な幾つかのプローブが、例えば「チップ」などの固相担体に接着される。オリゴヌクレオチドは、リソグラフィーを含めたさまざまな方法によって固体担体に結合させることができる。例えば、チップは、２５０，０００オリゴヌクレオチドまで保有することができる（ＧｅｎｅＣｈｉｐ社製、アフィメトリクス（商標））。「ＤＮＡプローブアレイ」とも称されるオリゴヌクレオチドを含むこれらのチップを使用する変異検出分析は、例えば、Cronin et al. (1996) Human Mutation 7:244に記載されている。１つの実施の形態では、チップは、遺伝子の少なくとも１つの多型領域の変異のすべてを含む。次に、固相担体を試験核酸と接触させ、特異的なプローブへのハイブリダイゼーションを検出する。したがって、１つ以上の遺伝子の多数の変異のアイデンティティを、単一のハイブリダイゼーション実験で同定することができる。例えば、５'上流調節要素におけるヌクレオチド多型の変異のアイデンティティを、単一のハイブリダイゼーション実験において決定することができる。
【０２０３】
他の検出方法では、変異を同定する前に、マーカーの少なくとも一部を最初に増幅する必要がある。増幅は、当技術分野で既知の方法に従って、例えば、ＰＣＲおよび／またはＬＣＲによって行うことができる（Wu and Wallace (1989) Genomics 4:560参照）。１つの実施の形態では、細胞のゲノムＤＮＡは２つのＰＣＲプライマーに曝露され、所望の量の増幅ＤＮＡの作出に十分な多くの周期で増幅される。ある特定の実施の形態では、２つのプライマーは、１５０〜３５０塩基対の間に離れて位置している。
【０２０４】
別の増幅法としては、自家持続配列複製法（Guatelli, J.C. et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878）、転写増幅システム（Kwoh, D.Y. et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177）、Ｑ−βレプリカーゼ（Lizardi, P.M. et al., (1988) Bio/Technology 6:1197）、および自家持続配列複製法（Guatelli et al., (1989) Proc. Nat. Acad. Sci. 87:1874）、ならびに核酸に基づく配列増幅（ＮＡＢＳＡ）、または他のいずれかの核酸増幅法が挙げられ、続いて、当業者に周知の方法を用いて増幅分子が検出される。これらの検出スキームは、核酸分子が非常に少ない数しか存在しない場合には、これらの分子の検出に特に有用である。
【０２０５】
１つの実施の形態では、当技術分野で既知のさまざまなシークエンシング反応のいずれかを用いて、マーカーの少なくとも一部を直接的に配列し、サンプルの配列を対応する参照（対照）配列と比較することによって変異を検出する。典型的なシークエンシング反応としては、MaxamおよびGilbert（Proc. Natl Acad Sci USA (1977) 74:560）またはSanger（Sanger et al. (1977) Proc. Nat. Acad. Sci 74:5463）によって開発された方法に基づくものが挙げられる。被験体のアッセイを行う場合には（Biotechniques (1995) 19:448）、質量分析による配列決定を含めたさまざまな自動配列決定手法のいずれかが使用されうることもまた意図されている（例えば、H. Koesterによる「DNA Sequencing by Mass Spectrometry」という発明の名称の米国特許第５，５４７，８３５号明細書（参照することにより組み込まれる）および国際出願公開第ＷＯ９４／１６１０１号パンフレット（参照することにより組み込まれる）；H. Koesterによる「DNA Sequencing by Mass Spectrometry Via Exonuclease Degradation」という発明の名称の米国特許第５，５４７，８３５号明細書（参照することにより組み込まれる）および国際出願公開第ＷＯ９４／２１８２２号パンフレット（参照することにより組み込まれる））、およびH. Koesterによる「DNA Diagnostics Based on Mass Spectrometry」という発明の名称の米国特許第５，６０５，７９８号明細書（参照することにより組み込まれる）および国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９６／０３６５１号明細書（参照することにより組み込まれる）；Cohen et al. (1996) Adv Chromatogr 36:127-162; およびGriffin et al. (1993) Appl Biochem Biotechnol 38:147-159参照）。ある特定の実施の形態では、シークエンシング反応における決定には、わずかに１つ、２つまたは３つの核酸塩基の存在しか必要とされないことは、当業者にとって明白であろう。例えば１つのヌクレオチドのみが検出される、例えばＡトラックなどを、行うことができる。
【０２０６】
さらに他の配列方法は、例えば、「Method of DNA sequencing employing a mixed DNA−polymer chain probe」という発明の名称の米国特許第５，５８０，７３２号明細書（参照することにより組み込まれる）および「Method for mismatch−directed in vitro DNA sequencing」という発明の名称の米国特許第５，５７１，６７６号明細書（参照することにより組み込まれる）に開示されている。
【０２０７】
一部の事例では、被験体に由来するＤＮＡにおけるマーカーの特異的アレルの存在は、制限酵素分析によって示すことができる。例えば、特異的なヌクレオチド多型は、別の変異のヌクレオチド配列を含まない制限酵素認識部位を含むヌクレオチド配列を生じうる。
【０２０８】
さらなる実施の形態では、開裂剤（ヌクレアーゼ、ヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウムなど、およびピペリジンの使用）からの保護は、ＲＮＡ／ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＤＮＡ、またはＲＮＡ／ＤＮＡのヘテロ二本鎖におけるミスマッチ塩基の検出に用いることができる（Myers, et al. (1985) Science 230:1242）。一般に、「ミスマッチ切断」の方法は、組織サンプルから入手した、例えばＲＮＡまたはＤＮＡなどのサンプル核酸とともにマーカー変異のヌクレオチド配列を含む、例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡなどの、随意的に標識化された、対照核酸をハイブリダイゼーションすることによって形成されるヘテロ二本鎖を提供することによって開始する。二本鎖は、対照とサンプル鎖の間の塩基対のミスマッチに基づいて形成された二本鎖など、二本鎖の一本鎖領域を切断する薬剤で処理される。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖は、そのミスマッチ領域を酵素的に分解するために、ＲＮａｓｅで処理することができ、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドはＳ１ヌクレアーゼで処理されうる。他の実施の形態では、ミスマッチ領域を分解するため、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡのいずれかの二重鎖を、ヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウムで、およびピペリジンを用いて処理することができる。ミスマッチ領域の分解後、得られた材料をポリアクリルアミドゲルの変性の際に大きさで分離し、対照核酸およびサンプル核酸が同一のヌクレオチド配列を有するか、あるいは、ヌクレオチドが異なっているかを決定する。例えば、Cotton et al (1988) Proc. Natl Acad Sci USA 85:4397; Saleeba et al (1992) Methods Enzymol. 217:286-295参照。別の実施の形態では、対照核酸またはサンプル核酸は検出用に標識化される。
【０２０９】
別の実施の形態では、変異は、熱変性高速液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ）によって同定することができる（Oefner and Underhill, (1995) Am. J. Human Gen. 57:Suppl. A266）。ＤＨＰＬＣは、逆相イオンペアクロマトグラフィーを使用して、その断片内の特定のヌクレオチド位置にヘテロ接合を有する個体由来のＰＣＲ断片の増幅の間に作出されたヘテロ二本鎖を検定する（Oefner and Underhill, (1995) Am. J. Human Gen. 57:Suppl. A266）。一般に、ＰＣＲ産物は、対象ＤＮＡに隣接するＰＣＲプライマーを使用して産生される。ＤＨＰＬＣ分析が行われ、得られたクロマトグラムは、特異的なクロマトグラフ特性に基づいて、塩基対の変化または欠失を同定するため、分析される（O’Donovan et al. (1998) Genomics 52:44-49参照）。
【０２１０】
他の実施の形態では、マーカーの変異型を同定するために、電気泳動移動度における変化が用いられる。例えば、突然変異体の核酸と野生型の核酸の電気泳動移動度の差異を検出するために、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）が用いられる（Orita et al. (1989) Proc Natl. Acad. Sci USA 86:2766, およびCotton (1993) Mutat Res 285:125-144; and Hayashi (1992) Genet Anal Tech Appl 9:73-79を参照）。サンプル核酸および対照核酸の一本鎖ＤＮＡ断片を変性させ、復元させる。一本鎖核酸の二次的な構造は配列に従って変化し、電気泳動移動度で得られた変化は、１塩基の変化でさえも検出することができる。ＤＮＡ断片は、標識化されるか、または標識化プローブを用いて検出されうる。アッセイの感受性は、ＲＮＡを使用することによって（ＤＮＡよりも）促進され、ここで、二次的な構造は配列の変化に対しさらに感受性である。別の実施の形態では、目的の方法は、ヘテロ二本鎖分析を利用して、電気泳動移動度における変化に基づいて二重鎖ヘテロ二本鎖分子を分離する（Keen et al. (1991) Trends Genet 7:5）。
【０２１１】
さらに別の実施の形態では、多型領域の変異のアイデンティティは、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）を用いて、変性剤の勾配を含むポリアクリルアミドゲル内での多型領域を含む核酸の動きを分析することによって得られる（Myers et al. (1985) Nature 313:495）。分析方法としてＤＧＧＥが用いられる場合、完全に変性しないことを確保するため、ＤＮＡは、例えば、ＰＣＲによって高融合性のＧＣが豊富なＤＮＡの約４０塩基対のＧＣ ｃｌａｍｐを付加することによって、改質される。さらなる実施の形態では、変性剤勾配の代わりに温度勾配を用いて、対照ＤＮＡおよびサンプルＤＮＡの移動度の差異を同棲する（Rosenbaum and Reissner (1987) Biophys Chem 265:1275）。
【０２１２】
２つの核酸間の少なくとも１つヌクレオチドの差異を検出する方法の例としては、限定はしないが、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマー伸長が挙げられる。例えば、オリゴヌクレオチドプローブは、既知の多型ヌクレオチドが中枢に位置するように調製され（アレル特異的プローブ）、次いで、完全一致が見られる場合のみハイブリダイゼーションが許される条件下で、標的ＤＮＡとハイブリッド形成される（Saiki et al. (1986) Nature 324:163); Saiki et al (1989) Proc. Natl Acad. Sci USA 86:6230；およびWallace et al. (1979) Nucl. Acids Res. 6:3543）。このようなアレル特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション法は、マーカーの異なる多型領域における幾つかのヌクレオチド変化の同時検出に用いられうる。例えば、特異的な変異ヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション膜に付着され、次に、標識化したサンプル核酸を用いてこの膜をハイブリッド形成する。その後、ハイブリダイゼーションシグナルの分析により、サンプル核酸のヌクレオチドのアイデンティティが明らかになる。
【０２１３】
あるいは、選択的ＰＣＲ増幅に応じて決まるアレル特異的増幅技術を、本発明と併用してもよい。特異的な増幅用のプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドは、分子の中心に（したがって、増幅は、異なるハイブリダイゼーションに応じて決まる）（Gibbs et al (1989) Nucleic Acids Res. 17:2437-2448）、あるいは、適切な条件下、ミスマッチを防ぐことができる、またはポリメラーゼ伸長を低減する、１つのプライマーの３’末端に（Prossner (1993) Tibtech 11:238; Newton et al. (1989) Nucl. Acids Res. 17:2503）、目的の変異をもたらしうる。この技法は、プローブオリゴ塩基伸長のための「プローブ（PROBE）」とも称される。加えて、変異領域に新規の制限酵素認識部位を導入して、切断に基づいた検出を生じさせることが望ましいであろう（Gasparini et al (1992) Mol. Cell Probes 6:1）。
【０２１４】
別の実施の形態では、変異の同定は、例えば、米国特許第４，９９８，６１７号明細書およびLandegren, U. et al., (1988) Science 241:1077 1080に記載されるオリゴヌクレオチドライゲーション法（ＯＬＡ）を用いて行われる。ＯＬＡプロトコルは、標的の一本鎖の隣接する配列にハイブリダイゼーションできるように設計された、２つのオリゴヌクレオチドを利用する。前記オリゴヌクレオチドの１つは、分離マーカー、例えば、ビオチン化されたものに連結され、他のものは検出可能なように標識化される。標的分子に正確な相補的配列が見られる場合、オリゴヌクレオチドは、それらの終端が隣接してライゲーション基質を生み出すようにハイブリッド形成する。次に、ライゲーションは、標識化オリゴヌクレオチドが、アビジン、または別のビオチンリガンドを使用して再生できるようにする。Nickerson, D. A.らは、ＰＣＲとＯＬＡの特性を合わせた核酸検出法について報告している（Nickerson, D. A. et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 87:8923 8927）。この方法では、ＯＬＡを用いて検出される標的ＤＮＡの指数関数的増幅を達成するために、ＰＣＲが用いられる。
【０２１５】
本発明はさらに、マーカーにおける単一ヌクレオチド多型の検出方法を提供する。単一ヌクレオチド多型は変異体配列の領域が隣接する変異部位を構成することから、それらの分析には、その変異部位に存在する単一のヌクレオチドのアイデンティティの決定しか必要とせず、各被験体の完全な遺伝子配列の決定は必要ではない。このような単一ヌクレオチド多型の分析を促進するために、幾つかの方法が開発されている。
【０２１６】
１つの実施の形態では、一塩基多型は、例えば、Mundy, C. R.（米国特許第４，６５６，１２７号明細書（参照することにより組み込まれる））に開示されるような、特殊化されたエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドを用いることによって検出されうる。その方法によれば、多型部位に近接した３’側のアレル配列に相補的なプライマーを、特定の動物またはヒトから得られた標的分子とハイブリッド形成することができる。その標的分子上の多型部位が、存在する特定のエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド誘導体に相補的なヌクレオチドを含む場合、その誘導体は、ハイブリッド形成されたプライマーの末端上に組み込まれる。そのような組み込みは、そのプライマーをエキソヌクレアーゼに対して耐性にし、よってその検出を可能にする。そのサンプルのエキソヌクレアーゼ耐性誘導体のアイデンティティは既知であることから、そのプライマーがエキソヌクレアーゼに対して耐性を持つようになるという知見から、標的分子の多型部位に存在するヌクレオチドが、その反応に用いられるヌクレオチド誘導体のものと相補的だったことが明らかになる。この方法は、大量の無関係な配列データを決定する必要がないという利点を有する。
【０２１７】
本発明の別の実施形態では、多型部位のヌクレオチドのアイデンティティを決定するために、溶液系の方法が使用される（Cohen, D.ら（仏国特許第２，６５０，８４０号明細書；国際出願公開第ＷＯ９１／０２０８７号パンフレット（参照することにより組み込まれる））。米国特許第４，６５６，１２７号明細書（参照することにより組み込まれる）のMundyの方法に見られるように、プライマーは、多型部位に近接した３’側のアレル配列に相補的なものが使用される。この方法は、多型部位のヌクレオチドに相補的である場合にプライマーの末端上に組み込まれるようになる標識化ジデオキシヌクレオチド誘導体を用いて、その部位のヌクレオチドのアイデンティティを決定する。
【０２１８】
Genetic Bit AnalysisまたはGBAとして知られている別の方法が、Goelet, P.らによって報告されている（国際出願公開第９２／１５７１２（参照することにより組み込まれる））。Goelet, P.らの方法は、標識化ターミネーターと、多型部位に対して３’側の配列に相補的なプライマーとの混合物を使用する。したがって、組み込まれた標識化ターミネーターは、評価される標的分子の多型部位に存在するヌクレオチドによって決定され、そのヌクレオチドと相補的である。Cohenら（仏国特許第２，６５０，８４０号明細書；国際出願公開第ＷＯ９１／０２０８７号パンフレット（参照することにより組み込まれる））の方法とは対照的に、Goelet, P.らの方法は、プライマーまたは標的分子が固相に固定化された、不均一相アッセイである。
【０２１９】
ＤＮＡにおける多型部位をアッセイするための、幾つかのプライマー誘導ヌクレオチド組み込み法が報告されている（Komher, J. S. et al., (1989) Nucl. Acids. Res. 17:7779 7784; Sokolov, B. P., (1990) Nucl. Acids Res. 18:3671; Syvanen, A.  C., et al., (1990) Genomics 8:684 692; Kuppuswamy, M. N. et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:1143 1147; Prezant, T. R. et al., (1992) Hum. Mutat. 1:159 164; Ugozzoli, L. et al., (1992) GATA 9:107 112; Nyren, P. (1993) et al., Anal. Biochem. 208:171 175）。これらの方法のすべてが、多型部位における塩基を識別するために、標識化デオキシヌクレオチドの組み込みに依拠する点で、これらの方法は、ＧＢＡとは異なる。このようフォーマットでは、シグナルが、組み込まれるデオキシヌクレオチドの数に比例することから、一続きの同一ヌクレオチドに生じる多型は、その一続きの長さに比例するシグナルを生じうる（Syvanen, A.C., et al., (1993) Amer. J. Hum. Genet. 52:46 59）。
【０２２０】
マーカーのコード領域に位置する多型領域の変異の同一性を決定するため、上述の方法とは異なるさらに別の方法を用いることもできる。例えば、変異マーカーをコードする変異の同定は、例えば、免疫組織化学または免疫沈降において、突然変異タンパク質を特異的に認識する抗体を使用することによって行うことができる。野生型のマーカーまたは変異形態のマーカーに対する抗体は、当技術分野で既知の方法にしたがって調製することができる。
【０２２１】
あるいは、マーカーリガンドへの結合など、マーカーの活性を測定することもできる。結合分析は当技術分野で既知であり、例えば、被験体から細胞を入手し、標識化リガンドとの結合実験を行い、変異形態のタンパク質への結合が野生型のタンパク質への結合と異なるか否かを判定することを含む。
【０２２２】
ＶＩ．ＡＬＫ阻害に基づく典型的なスクリーニング法
本発明は、さらに、ＡＬＫポリペプチド（例えば、ＥＭＬ４−ＡＬＫポリペプチド）を阻害する物質を同定し、それによって癌細胞の増殖、成長、分化、アポトーシス、および／または転移を阻害するための方法も提供する。この方法は、試験化合物をＡＬＫポリペプチド（例えば、表１記載のポリペプチド）と接触させることを含む。一部の実施の形態では、ＡＬＫポリペプチドは、１つ以上のＡＬＫ阻害剤による阻害に対する部分反応性または非反応性のリスクを増大させる変異体（例えば、表１記載のポリペプチド）を含む。腫瘍転移の阻害剤である化合物は、ＡＬＫポリペプチド変異体の活性（例えば、ＡＴＰ結合などのリガンド結合および／またはチロシンキナーゼ活性を含む）における試験化合物の効果を決定することによって同定されうる。特定の例では、試験化合物の不存在下における活性と比較してチロシンキナーゼ活性を阻害する試験化合物は、腫瘍転移の阻害剤として同定される。その化合物がＡＬＫ変異体の活性を阻害する場合、該化合物は腫瘍成長または転移を阻害する能力についてさらに評価されうる。
【０２２３】
特に、表１記載の新しい本発明の生体指標（例えば、ＡＬＫ 突然変異体）を含めたチロシンキナーゼ突然変異体の活性化は、例えば、癌細胞増殖、成長、分化、アポトーシス、および／または転移を阻害または予防することによって新生物を治療、改善、または予防することを目的として使用することができる化合物の同定に有用である。調節（例えば、阻害、拮抗、または作動）する分子または模倣する分子の化学ライブラリのスクリーニングは、当技術分野で知られている。化学ライブラリは、例えば、ペプチドライブラリ、ペプチド模倣薬ライブラリ、化学合成ライブラリ、組み換えライブラリ（例えば、ファージディスプレイライブラリ）、およびインビトロ翻訳系ライブラリ、その他の非ペプチド合成有機ライブラリでありうる。
【０２２４】
表１に記載される本発明の新しい生体指標（例えば、ＡＬＫ突然変異体）の適切な高親和性阻害剤のスクリーニングまたは作出、同定および選択は、さまざまな方法によって達成することができる。大まかに言えば、これらには、限定はしないが、２つの一般的な手法が含まれる。手法の1つは、標的タンパク質についての構造的知識を使用して、正確に相互作用する候補分子を設計することである。例として、特に、本明細書に図６として開示される新しい構造−機能情報に基づいた、コンピューター支援型の分子設計が挙げられる。第２の手法は、分子の組合せライブラリまたは他のライブラリを使用し、それによって、分子の広範なライブラリを標的酵素に対する親和性または標的酵素の阻害活性能力についてスクリーニングすることである。さらなる例では、抗体群は、標的酵素を阻害する能力についてスクリーニングされうる。
【０２２５】
本明細書で提供される一部の実施の形態は、所定の化合物について、表１に記載される本発明の新しい生体指標（例えば、ＡＬＫ突然変異体）を阻害する能力を判定することを含む。新生物の治療に有用であることが知られている化合物に対する試験化合物の活性を比較することによって、直接的にまたは間接的に、腫瘍性病変を治療する見込み能力について試験化合物を評価することができる。例えば、表１に記載される本発明の新しい生体指標（例えば、ＡＬＫ突然変異体）に対するＡＴＰ結合および／またはチロシンキナーゼ活性などのリガンド結合を阻害する試験化合物の能力を、ＰＦ−０２３４１０６６および／またはＰＤＤなどの既知のＡＬＫ阻害剤のものと比較することができる。１つの実施の形態では、これらの試験化合物は、同一のアッセイ条件下で、既知のＡＬＫ阻害剤と比較して、表１記載の本発明の新しい生体指標（例えば、ＡＬＫ 突然変異体）を、少なくとも１００％、少なくとも９９．９％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９％、少なくとも９８．５％、少なくとも９８％、少なくとも９７．５％、少なくとも９７％、少なくとも９６．５％、少なくとも９６％、少なくとも９５．５％、少なくとも９４％、少なくとも９３．５％、少なくとも９３％、少なくとも９２．５％、少なくとも９２％、少なくとも９１．５％、少なくとも９１％、少なくとも９０．５％、少なくとも９０％、少なくとも８９．５％、少なくとも８９％、少なくとも８８．５％、少なくとも８８％、少なくとも８７．５％、少なくとも８７％、少なくとも８６．５％、少なくとも８６％、少なくとも８５．５％、少なくとも８５％、少なくとも８４．５％、少なくとも８４％、少なくとも８３．５％、少なくとも８３％、少なくとも８２．５％、少なくとも８２％、少なくとも８１．５％、少なくとも８１％、少なくとも８０．５％、少なくとも８０％、少なくとも７９％、少なくとも７８％、少なくとも７７％、少なくとも７６％、少なくとも７５％、少なくとも７４％、少なくとも７３％、少なくとも７２％、少なくとも７１％、少なくとも７０％、少なくとも６９％、少なくとも６８％、少なくとも６７％、少なくとも６６％、少なくとも６５％、少なくとも６４％、少なくとも６３％、少なくとも６２％、少なくとも６１％、少なくとも６０％、少なくとも５９％、少なくとも５８％、少なくとも５７％、少なくとも５６％、少なくとも５５％、少なくとも５４％、少なくとも５３％、少なくとも５２％、少なくとも５１％、少なくとも５０％、またはその間のいずれかの範囲で阻害するであろう。ある特定の実施の形態では、細胞は、表１記載の本発明の新しい生体指標（例えば、ＡＬＫ突然変異体）をコードする構成体をトランスフェクトされ、検出可能なマーカーを用いてタグ化または標識化された試験化合物との接触に供され、試験化合物を結合する存在について分析されうる。ある特定の実施の形態では、表１に記載される本発明の新しい生体指標（例えば、ＡＬＫ突然変異体）がトランスフェクトされていない細胞と比較して��トランスフェクトされた細胞は、試験化合物との結合が観察され、これは、試験化合物がそれらの細胞によって発現された表１に記載される本発明の新しい生体指標（例えば、ＡＬＫ突然変異体）と結合していることを示している。化合物の結合は、典型的には、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、および／またはＢＩＡｃｏｒｅアッセイなどの当技術分野で既知の広範なアッセイのうちのいずれかによって決定される。
【０２２６】
酵素の発現組み換え体、または別の種から単離された相同体またはオルソログを使用して、表１に記載される本発明の新しい生体指標（例えば、ＡＬＫ突然変異体）の活性における阻害効果または他の効果について、化合物をスクリーニングすることができる。あるいは、試験化合物を用いて、これらの新しい生体指標ポリペプチドの１つを発現する細胞を処理することができ、例えば本明細書記載の技法の１つを使用して、特異的な標的のリン酸化反応における試験化合物の効果を決定することができる。一例を挙げれば、チロシンキナーゼ活性が決定される。活性（例えば、阻害）に影響を与えるチロシンキナーゼのリン酸化反応を決定する方法は、当業者に周知である。幾つか例を挙げれば、チロシンキナーゼ活性は、表１に記載される本発明の新しい生体指標（例えば、ＡＬＫ突然変異体）によってリン酸化可能な基板内への標識化リン酸（32Ｐ標識化リン酸など）の取り込みを評価することによって決定されうる（例えば、タンパク質またはペプチド断片、特に下流シグナル伝達成分のもの）。他の実施の形態では、チロシンキナーゼ活性は、ユニバーサルチロシンキナーゼ活性キット（例えば、Universalチロシンキナーゼアッセイキット（Takara Bio, Inc.社製（米国ウィスコンシン州マディソン所在））；チロシンキナーゼアッセイキット（Millipore社製（米国、マサチューセッツ州ビルリカ所在））を使用して測定することができる。
【０２２７】
別の実施の形態では、化合物が、例えば、表１に記載される本発明の新しい生体指標（例えば、ＡＬＫ突然変異体）などの活性化チロシンキナーゼ変異を発現することが知られている腫瘍細胞などの腫瘍細胞の成長を低減するか否かを判定することをさらに含むスクリーニング法が提供される。さまざまな細胞株を使用することが可能であり、これら細胞株は、当業者に周知の試験すべき組織（例えば、ＢＡ／Ｆ３細胞）に基づいて選択されうる。例えば、多くの細胞株は、例えば米国国立癌研究所（ＮＣＩ）の新しい抗癌剤についてのスクリーニングプログラムによって、よく特徴付けられ、用いられる。
【０２２８】
１００μＭ、９０μＭ、８０μＭ、７０μＭ、６０μＭ、５０μＭ、４０μＭ、３０μＭ、２０μＭ、１０μＭ、９μＭ、８μＭ、７μＭ、６μＭ、５μＭ、４．５μＭ、４μＭ、３．５μＭ、３μＭ、２．５μＭ、２μＭ、１．５μＭ、１μＭ、９００ｎＭ、８５０ｎＭ、８００ｎＭ、７５０ｎＭ、７００ｎＭ、６５０ｎＭ、６００ｎＭ、５５０ｎＭ、５００ｎＭ、４５０ｎＭ、４００ｎＭ、３５０ｎＭ、３００ｎＭ、２５０ｎＭ、２００ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、９５ｎＭ、９０ｎＭ、８５ｎＭ、８０ｎＭ、７５ｎＭ、７０ｎＭ、６５ｎＭ、６０ｎＭ、５５ｎＭ、５０ｎＭ、４５ｎＭ、４０ｎＭ、３５ｎＭ、３０ｎＭ、２５ｎＭ、２０ｎＭ、１５ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ またはそれ以下の用量において約５０％より高い割合で生じるような、大幅かつ統計的に有意な腫瘍細胞増殖阻害は、その化合物が腫瘍性病変の治療に有用であることをさらに示している。ＩＣ50値を決定し、比較目的で使用してもよい。この値は、対照と比較して腫瘍細胞増殖を５０％阻害するのに必要とされる薬物の濃度である。
【０２２９】
これらの値はさらに他の基準にも適用することができる。例えば、他の実施の形態では、本明細書において提供されるスクリーニング法はさらに、腫瘍細胞の培養において、試験化合物がアポトーシスを誘発するか否かを判定することを含む。２つの異なる型の細胞死は、形態学的および生化学的基準：壊死およびアポトーシスによって表される。壊死は、細胞膜の透過性の増大を伴い、それによって細胞が膨張し、数分以内に細胞膜が破裂することに付随して発生する。アポトーシスは、膜ブレブ形成、細胞質凝集、および内在性のエンドヌクレアーゼの活性化にを特徴とする。
【０２３０】
アポトーシスは、正常な組織のターンオーバーおよび臓器および四肢の胚発生の間に自然に発生する。アポトーシスはまた、イオン化放射線およびある特定の化学療法薬による、細胞毒性のＴリンパ球およびナチュラルキラー細胞を含めたさまざまな刺激によっても誘発することができる。アポトーシスの不適切な調節は、癌、ＡＩＤＳ、またはアルツハイマー病などを含めた多くの病状における重要な役割を果たすと考えられる。
【０２３１】
試験化合物は、上述の条件下で維持される腫瘍細胞の培養を用いて、アポトーシスの誘発についてスクリーニングすることができる。このようなスクリーニング法の例を幾つか挙げれば、試験化合物を用いた細胞の処理は、コンフルエント培養の前または後、および、さまざまな濃度の試験化合物を用いた１〜７日間の処理を含む。アポトーシスを起こした細胞は、培養物の接着部分および「浮遊」部分の両方において測定することができる。この接着部分と浮遊部分は、上清を除去し、接着細胞をトリプシン処理し、両方の調製物を合わせた後に遠心分離洗浄ステップ（１０分間、２０００ｒｐｍ）を行うことによって回収される。試験化合物を用いて処理した後、例えば蛍光顕微鏡によって、アポトーシスおよび壊死について培養物をアッセイすることができ、続いて、アクリジン・オレンジおよび臭化エチジウムを用いて培養物を標識化することができる。アポトーシスを起こした細胞を測定するための多くの方法は、当業者に知られている；例えば、アポトーシスを起こした細胞の数を測定する方法の１つは、DukeおよびCohenによって報告されている（Curr. Prot. Immuno., Coligan et al., eds., 3.17.1-3.17.1, 1992）。例えば、浮遊細胞および接着細胞は、トリプシン処理によって回収され、ＰＢＳで３回洗浄される。次に、等分した細胞を遠心分離する。沈殿物を培地に再懸濁し、アクリジン・オレンジおよび臭化エチジウムを含む染料混合物をＰＢＳ中で調製し、穏やかに混合する。次に、混合物を顕微鏡スライド上に置き、アポトーシスの形態学的特徴について検査する。アポトーシスはまた、試験化合物で処理した細胞におけるＤＮＡ断片化の増大を測定することによっても定量化することができる。細胞質ヒストン関連ＤＮＡ断片（モノヌクレオソームおよびオリゴヌクレオソーム）のインビトロにおける定量的決定のため、市販のフォトメトリック酵素免疫測定法（ＥＩＡ）を利用することができる（例えば、細胞死検出ＥＬＩＳＡ，Boehringer Mannheim社製）。
【０２３２】
追加の実施の形態では、本明細書において提供されるスクリーニング法は、試験化合物が、腫瘍転移、例えば動物モデルにおける転移を低減するか否かを判定することをさらに含む。腫瘍転移を評価する方法は、当業者に知られている（例えば、Khanna and Hunter, Carcinogenesis 26:513-523, 2005を参照）。転移モデルの１つは、ヒト癌細胞株または組織が免疫不全マウス（ＳＣＩＤマウスまたはヌードマウスなど）に移植される、ヒト−マウス間の異種移植に関する。同様の方法においては、表１に記載される本発明の新しい生体指標（例えば、ＡＬＫ突然変異体）を発現するように改変された細胞株が、免疫不全マウスに移植されうる。一例を挙げれば、腫瘍細胞または細胞株は、直接、体循環に注入される。注入部位は、これらの実験系における転移の発現部位を概ね定義する。実験的転移モデルに用いられる腫瘍細胞注入の最も一般的な部位は、マウスにおいては側尾静脈であり、この結果、最初に肺転移を生じる。対照的に、腫瘍細胞の脾内静脈または門脈内注入は、細胞の肝臓に転移が発現する最も一般的な部位であり、心腔内注射は骨を含めた幾つかの部位への転移を生じうる。腫瘍細胞または他の細胞株の循環系への注入に続いて、対象部位（肺など）における転移の発現が数日間または数週間にわたりモニタリングされる。
【０２３３】
腫瘍転移を評価する別の方法は同所移植を利用するものであり、ここで、癌細胞は腫瘍の由来する解剖学的位置または組織に移植される（例えば、腫瘍断片の直接注入または外科的移植による）。同所性腫瘍に起因する自然転移は、数日間または数週間にわたり評価することができる。腫瘍転移を低減または予防する試験化合物の能力は、試験化合物を動物に投与し、続いて、皮下、筋肉内、または循環系内に、もしくは同所移植によって、腫瘍細胞を注入することによって評価することができる。転移の発現の数、大きさ、または時間が評価されうる。腫瘍転移を阻害する化合物は、対照サンプルと比較して、転移の数を、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％低下しうる。腫瘍転移を阻害する化合物はまた、対照サンプルと比較して、転移の大きさも縮小させうる。同様に、腫瘍転移を阻害する化合物は、転移の発現の開始を、例えば、少なくとも１週間、２週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、または無期限に遅延しうる。
【０２３４】
ＶＩＩ．典型的なＡＬＫ阻害剤
本明細書に開示される方法は、表１に記載される本発明の新しい生体指標（例えば、ＡＬＫ突然変異体）の阻害剤を用いた治療候補として被験体を同定し、腫瘍の細胞死を誘発し、腫瘍成長を低減し、または腫瘍転移のリスクを低下させることを含む。ＡＬＫポリペプチドの阻害剤は当業者に既知である。例えば、ＰＦ−０２３４１０６６、ＰＤＤ、２−メチル−１１−（２−メチルプロピル）−４−オキソ−４，５，６，１１，１２，１３−ヘキサヒドロ−２Ｈ−インダゾロ［５，４−ａ］ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−８−イル［４−（ジメチルアミノ）ベンジル］カルバメート、（１Ｓ，２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）−３−（｛５−クロロ−２−［（１−エチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−６−メトキシ−２−オキソ−１Ｈ−１−ベンゾアゼピン−７−イル）アミノ］−４−ピリミジニル｝アミノ）ビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−２−カルボキサミド、およびＮＶＰ−ＴＡＥ６８４が挙げられる（例えば、PNAS 104:270-275, 2007; Choi, Y.L. et al. (2008) Cancer Res. 68:4971-2976；およびBiochemistry 48:3600-3609, 2009参照。これらは、参照することによって本明細書に組み込まれる）。
【０２３５】
参照による組み込み
本明細書に記載されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、参照することにより各個別の刊行物、特許、および特許出願が組み込まれることを明確かつ個別に示唆されている場合、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。矛盾する場合には、本明細書における定義を含めて、本願は制御される。
【０２３６】
ワールドワイドウェブのtigr.orgのゲノム研究所（ＴＩＧＲ）および／またはワールドワイドウェブのncbi.nlm.nih.govの全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）によって管理されるものなど、公開データベースの登録に関連付けられるアクセッション番号に言及するポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列は、参照することによりその全体が組み込まれる。
【実施例】
【０２３７】
本発明は、限定すると解釈されるべきではない次の実施例によって、さらに例証される。本明細書中で引用されたすべての参考文献、図面、配列表、特許および公開された特許出願の内容は、参照することによって本明細書に組み込まれる。
【０２３８】
実施例１−例えば２〜４の材料および方法
a．ＤＮＡの配列決定
ＥＺ１ ｓｙｓｔｅｍ（Qiagen社製（米国カリフォルニア州ヴァレンシア所在））を使用して抽出した試料ＲＮＡからオリゴ（ｄＴ）でプライミングしたｃＤＮＡを生成し、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＨＳ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ.社製（日本国滋賀県所在））および、プライマーであるＡＬＫ−ＴＫ−Ｆ（５’−ＴＡＣＡＡＣＣＣＣＡＡＣＴＡＣＴＧＣＴＴＴＧＣＴ−３’）およびＡＬＫ−ＴＫ−Ｒ１（５’−ＡＧＧＣＡＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＡＣ−３’）を用いた３０サイクル（９８℃で１０秒間および６８℃で１分間で構成される）のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供した。次に、ＡＬＫのキナーゼドメインに対応するＰＣＲ産物を断片化し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＩＩ（ＧＡＩＩ）を用いて、ｐａｉｒｅｄ−ｅｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製（米国カリフォルニア州サンディエゴ所在））を使用して両端から７６塩基について配列決定した。すべての塩基について、ＰＣＲプライマー配列の存在およびＱ値≧２０に基づいて、未処理の読み取りデータを質的にフィルタリングした。次に、Ｂｏｗｔｉｅアルゴリズムを用いて（ワールドワイドウェブのbowtie-bio.sourceforge.net/index.shtmlで利用可能）、フィルタを通過した読み取りをＡＬＫのｃＤＮＡ配列とアラインメントした。
【０２３９】
３１３０×ｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Applied Biosystems社製（米国カリフォルニア州フォスターシティ所在））を利用したキャピラリー配列決定では、同一のプライマーセットまたは、ＥＡ−Ｆ−ｇ−Ｓ（５’−ＣＣＡＣＡＣＣＴＧＧＧＡＡＡＧＧＡＣＣＴＡＡＡＧ−３’）プライマーとＡＬＫ−ＴＫ−Ｒ２（５’−ＣＣＴＣＣＡＡＡＴＡＣＴＧＡＣＡＧＣＣＡＣＡＧＧ−３’）プライマーの組合せを用いてｃＤＮＡからＰＣＲ産物を調製した。
【０２４０】
ｂ．突然変異体ＥＭＬ４−ＡＬＫ
ＦＬＡＧタグ化したＥＭＬ４−ＡＬＫとマウスＣＤ８を同時発現させるために、ＦＬＡＧエピトープタグ化ＥＭＬ４−ＡＬＫ Ｖａｒｉａｎｔ１をコードしたｃＤＮＡ（Soda , M. et al. (2007) Nature 448:561-566）をｐＭＸ-ｉｒｅｓＣＤ８レトロウイルスベクター（Yamashita Y. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:39012-39020）に挿入した。ＡＬＫのＣ１１５６ＹおよびＬ１１９６Ｍ変異に対応するヌクレオチド変化を、個別に、またはＥＭＬ４−ＡＬＫ（Ｃ１１５６Ｙ）、ＥＭＬ４−ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）、またはＥＭＬ４−ＡＬＫ（Ｃ１１５６Ｙ／Ｌ１１９６Ｍ）の発現と組み合わせて、プラスミドに導入した。パッケージング細胞株ＢＯＳＣ２３（Pear, W.S. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8392-8396）を利用して、これらのプラスミドに基づいた組み換えレトロウイルスを生成し、その組み換えレトロウイルスを使用してマウスのインターロイキン３依存性細胞株ＢＡ／Ｆ３（Palacious, R. et al. (1985) Cell 41:727-734）を感染させた。ｍｉｎｉＭＡＣＳ細胞分離カラムおよびＣＤ８に対する抗体と結合させた電磁ビーズ（双方ともMiltenyi Biotec社製（ドイツ国グラードバッハ所在））を使用して、得られたＣＤ８陽性細胞を精製した。Selleck社からＰＦ−０２３４１０６６を入手した。
【０２４１】
ＥＭＬ４−ＡＬＫのチロシンリン酸化の検査のため、融合タンパク質を発現するＢＡ／Ｆ３細胞を１５時間、ＡＬＫ阻害剤に曝露し、その後、ＦＬＡＧに対する抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（米国ミズーリ州セントルイス所在））を用いて細胞溶解物からＥＭＬ４−ＡＬＫを免疫沈降させ、Ｔｙｒ1604−リン酸化ＡＬＫに対する抗体（Cell Signaling Technology社製（米国マサチューセッツ州デンバー所在））を用いてイムノブロット解析に供した。合成ＹＦＦペプチド（Operon Biotechnologies社製（米国アラバマ州ハンツビル所在））を使用して、先に説明したとおり、室温で３０分間、インビトロキナーゼ分析を行った（Donella-Deana, A. et al. (2005) Biochemistry 44:8533-8542）。
【０２４２】
実施例２−ＡＬＫチロシンキナーゼ阻害剤に対する耐性に関連する新しいＡＬＫ突然変異
患者は、喫煙歴のない２８歳の男性であり、２００８年４月にＴ４Ｎ３Ｍ１の臨床病期にある肺腺癌と診断された。腫瘍はＥＧＦＲ変異を包含しなかったことを考えれば、患者は従来の化学療法によって治療され、疾患が進行し、脳および骨に多発性転移の形成を生じる結果となった。２００８年１１月には、痰の逆転写ＰＣＲ分析ならびに生検試料の蛍光in situハイブリダイゼーション分析によって、腫瘍にＥＭＬ４−ＡＬＫ Ｖａｒｉａｎｔ１のｍＲＮＡの存在が確認された。したがって、ＰＦ−０２３４１０６６のトライアルに患者を登録し、患者の一般状態に顕著な改善が見られた（レベル４から２への引き下げ）。患者は治療に対して「部分反応」を示したが、患者の胸水は完全には根絶されなかった。治療５ヶ月後、腫瘍は突然、再び増殖し始め、両肺に胸水および多発性の癌結節の形成が増大する結果となった。患者は２００９年５月にトライアルから除外され、その後、分子分析のために胸水を採取した。
【０２４３】
ＡＬＫ阻害剤を持続投与したにもかかわらず、腫瘍が増殖を再開したことを考慮して、腫瘍が、薬剤への耐性を付与する二次的な遺伝子変化を獲得したか否かを判定した。さらには、ＴＫＩへの耐性が標的キナーゼ内に獲得変異を生じることを考慮し、ＥＭＬ４−ＡＬＫ自体がアミノ酸変化を被る可能性について調べた。
【０２４４】
痰（ＩＤ Ｊ−＃１）および胸水（ＩＤ Ｊ−＃１１３）試料は、それぞれ、治療前および治療後の患者の腫瘍の分子分析に使用可能であった。２つの試料の腫瘍細胞の割合が異なっているであろうことを考慮して、次世代シーケンサーを用いて、これらの試料に由来するＥＭＬ４−ＡＬＫのｃＤＮＡの大規模シークエンシング（deep sequencing）を行った。両方の試料からＡＬＫのチロシンキナーゼドメインに対応するｃＤＮＡを増幅し（図１Ａ）、断片化し、ＧＡＩＩ ｓｙｓｔｅｍを使用してヌクレオチド配列決定に供した。比較のため、ＥＭＬ４−ＡＬＫ陽性ＮＳＣＬＣ細胞株Ｈ２２２８、および融合タンパク質陽性の他の３種類の臨床試料についても同様に分析した。４種類の試料に由来するｃＤＮＡにおいて、既知の単一ヌクレオチド多型ｒｓ３７９５８５０が検出された（図１Ｂ）。加えて、Ｊ−＃１のｃＤＮＡにおいて、ヒト野生型ＡＬＫのｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００４３０４）の４２３０部位のヌクレオチドに対応する位置に、Ｔ→Ｃの変化が低頻度（８．９％）で検出された。さらには、Ｊ−＃１１３のｃＤＮＡにおいて、野生型ＡＬＫのｃＤＮＡの４３７４部位および４４９３部位のヌクレオチドに対応する位置に、２つの新しい変化、すなわちＧ→ＡおよびＣ→Ａの変化が、それぞれ４１．８％および１４．０％の頻度で検出された。いずれかの試料に由来するキナーゼ領域のｃＤＮＡには、他に再発性の変化（読み取りデータ中、≧５％に存在）は存在しなかった。
【０２４５】
その後、サンガー法シーケンサーを使用して、これらのヌクレオチド変化について確認した。変異がＥＭＬ４−ＡＬＫではなく内在性の野生型ＡＬＫに生じたという可能性を排除するため、融合ｃＤＮＡのみが増幅されるように、ＥＭＬ４のｃＤＮＡを標的とする順方向プライマーを用いてＰＣＲを行った（図１Ａ）。Ｔ４２３０Ｃの変化は、Ｊ−＃１に由来する何百もの融合ｃＤＮＡには検出されず、このことは、初期ＰＣＲまたはＧＡＩＩシークエンシングの段階において生じるアーチファクトであることを示唆している。
【０２４６】
しかしながら、Ｇ４３７４ＡおよびＣ４４９３Ａの両変化は、サンガーシーケンス法によって容易に確認できた。Ｊ−＃１１３について配列決定した７３の融合ｃＤＮＡクローンのうち、３４のクローン（４６．６％）はＧ４３７４Ａ陽性であり、１１のクローン（１５．１％）はＣ４４９３Ａ陽性であり、残るクローン（３８．４％）は野生型であった（図１Ｃ）。ＰＣＲ分析は、同一の生成物における両ヌクレオチド部位についても及んでいたが、生成物はいずれも変異を両方一緒には含まず、このことは、各変異が独立して発生することを示唆している。Ｇ４３７４またはＣ４４９３の部位を含むゲノム断片についてもＰＣＲを用いて増幅し、ヌクレオチド配列決定に供し、腫瘍ゲノムにおける各変化について確認した（図２）。
【０２４７】
Ｇ４３７４ＡおよびＣ４４９３Ａの置換の結果、それぞれ野生型のヒトＡＬＫのアミノ酸の１１５６部位および１１９６部位に対応する位置にＣｙｓ→ＴｙｒおよびＬｅｕ→Ｍｅｔの変化を生じる。
【０２４８】
実施例３−新しいＡＬＫ突然変異はＡＬＫチロシンキナーゼ阻害剤に対する耐性を与える
これらのアミノ酸変化がＡＬＫ阻害剤に対するＥＭＬ４−ＡＬＫの感受性に影響を及ぼすか否かについて試験した。野生型 ＥＭＬ４−ＡＬＫ、単一の突然変異体であるＥＭＬ４−ＡＬＫ（Ｃ１１５６Ｙ）およびＥＭＬ４−ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）、および二重変異体ＥＭＬ４−ＡＬＫ（Ｃ１１５６Ｙ／Ｌ１１９６Ｍ）を、ＢＡ／Ｆ３細胞に個別に発現させ、次に、細胞をＡＬＫ阻害剤に曝露した。ＰＦ−０２３４１０６６は、濃度依存性で、野生型のＥＭＬ４−ＡＬＫを発現するＢＡ／Ｆ３細胞の増殖を阻害した（図４Ａ）。対照的に、Ｃ１１５６ＹまたはＬ１１９６Ｍの突然変異体を発現する細胞は、この薬剤に対する感受性を顕著に低下させることを明らかにし、繰り返し実験により、ＥＭＬ４−ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）を発現するＢＡ／Ｆ３細胞が、ＥＭＬ４−ＡＬＫ（Ｃ１１５６Ｙ）を発現するものよりもＰＦ−０２３４１０６６に対して耐性が大きいことが示された（図３）。両変異の存在は、ＰＦ−０２３４１０６６に対する細胞の耐性に相加効果を生じなかった。よって、これらのデータは、Ｃ１１５６ＹおよびＬ１１９６Ｍの変異が、それぞれ、この薬剤に対する耐性を与えることを示した。
【０２４９】
Ｔｙｒ１６０４におけるＡＬＫのリン酸化に特異的な抗体を使用したイムノブロット解析を用いて、ＥＭＬ４−ＡＬＫのチロシンリン酸化について試験した。ＢＡ／Ｆ３細胞のＰＦ−０２３４１０６６への曝露は、野生型のＥＭＬ４−ＡＬＫのチロシンリン酸化を顕著に阻害したが、ＥＭＬ４−ＡＬＫ（Ｃ１１５６Ｙ）またはＥＭＬ４−ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）のチロシンリン酸化には実質的効果を有しなかった（図４Ｂ）。これらの発見と一致して、インビトロキナーゼ分析から、ＥＭＬ４−ＡＬＫのＣ１１５６ＹおよびＬ１１９６Ｍ突然変異体が、野生型タンパク質よりも、ＰＦ−０２３４１０６６による酵素活性の阻害に対する感受性が低いことが明らかになった（図４Ｃ）。細胞増殖の阻害に関しては（図４Ａ）、Ｌ１１９６Ｍ突然変異体は、Ｃ１１５６Ｙ突然変異体と比較して、ＰＦ−０２３４１０６６によるキナーゼ活性の阻害に対してさらに難治性であった（図４Ｃ）。
【０２５０】
実施例４−新しいＡＬＫ突然変異とＡＬＫチロシンキナーゼ阻害剤に対する耐性との間の構造−機能の関係
図５は、関連キナーゼであるインスリン受容体の結晶構造に基づいた、ＡＬＫのキナーゼドメインの三次元構造モデルにおけるＣｙｓ１１５６およびＬｅｕ１１９６の部位を示している。前者の残基は、予測らせんαＣのアミノ末端に隣接し、かつ、ＡＴＰ結合ポケットの上蓋の近くに配置される。他のチロシンキナーゼのこの位置では活性化突然変異は報告されていない。ＡＬＫのＬｅｕ１１９６は、ＡＢＬ１のＴｈｒ３１５およびＥＧＦＲのＴｈｒ７９０に対応し、これらはそれぞれ、これらのキナーゼにおいてＴＫＩに対する耐性を与える、最も高頻度で獲得された変異の部位である（Deininger, M. et al. (2005) Blood 105:2640-2653; Linardou, H. et al. (2009) Nat. Rev. Clin. Oncol. 6:352-366）。この「ゲートキーパー」部位は、ＡＴＰ結合ポケットの底部表面に位置し（図５）、この位置における嵩ばった側鎖を有するアミノ酸の存在が、多くのＴＫＩの結合を妨げることが知られている（Shah, N.P. et al. (2002) Cancer Cell 2:117-125; Tsao, M.S. et al. (2005) N. Engl. J. Med. 353:133-144）。
【０２５１】
このように、多くのＡＬＫ阻害剤に対して耐性を与えるＥＭＬ４−ＡＬＫのキナーゼドメイン内の２つのde novo突然変異が同定された。ＥＭＬ４−ＡＬＫのｃＤＮＡには両方の変異を含んでいるものは観察されなかったことから、各変異は、腫瘍の明白なサブクローンにおいて、個別に発現したと考えられる。
【０２５２】
理論に縛られるわけではないが、治療前に患者の痰から調製されたｃＤＮＡが、Ｃ１１５６ＹまたはＬ１１９６Ｍの変異に対応するヌクレオチド変化を含まなかったことを考慮すると、おそらく、腫瘍サブクローンは、ＰＦ−０２３４１０６６を用いた治療の間にde novo変異を獲得したと考えられる。しかしながら、治療前の胸水については検査できなかったことから、Ｃ１１５６ＹまたはＬ１１９６Ｍの突然変異体を包含する腫瘍細胞は、患者の最初の入院時にすでに胸水中に存在していた可能性も完全には排除できない。しかし、もしそうであれば、腫瘍は、ＰＦ−０２３４１０６６を用いた５ヶ月間の治療の間に、その後の急速な増殖を可能にする他の未知の変異を獲得したであろう。Ｃ１１５６ＹまたはＬ１１９６Ｍの変異を有する腫瘍細胞のサブクローンは、初期治療に対しても難治性であってよかったはずであり、また、治療方針に沿って進める間に拡大してもおかしくなかったはずである。しかしながら、反対に、少なくとも５カ月間は、患者に腫瘍拡大の兆候はなかったことから、Ｃ１１５６ＹおよびＬ１１９６Ｍの変異は、ＰＦ−０２３４１０６６を用いた治療の間に発現したことを示唆している。この考えは、以前にＴＫＩを用いて治療した患者では、ゲフィチニブまたはエルロチニブに対する耐性を与えるＥＧＦＲのＴ７９０Ｍ変異が頻繁に検出されるのに対し、未治療の患者個人には稀にしか見られない（Pao, W. et al. (2005) PLoS Med. 2:e73）という事実によって支持される。
【０２５３】
幾つかのチロシンキナーゼのゲートキーパー位置におけるアミノ酸置換が、ＴＫＩで治療された腫瘍において検出されている（Kobayashi, S. et al. (2005) N. Engl. J. Med. 352:786-792; Pao, W. et al. (2005) PLoS Med. 2:e73; Shah, N.P. et al. (2002) Cancer Cell 2:117-125; Cools, J. et al. (2003) N. Engl. J. Med. 348:1201-1214; Tamborini, E. et al. (2004) Gastroenterology 127:294-299）。この部位における変異は、ＥＭＬ４−ＡＬＫまたはＡＬＫについては以前に報告されてはいないが、ＡＬＫの別の融合型オンコキナーゼであるＮＰＭ−ＡＬＫのゲートキーパー位置におけるさまざまな人工的なアミノ酸置換の影響が最近になって検査されている（Lu, L. et al. (2009) Biochemistry 48:3600-3609）。腫瘍細胞のインビボにおける現在の分析と一致して、この位置へのＭｅｔの導入は、ＮＰＭ−ＡＬＫを多くのＡＬＫ阻害剤に対して最も耐性にすることが判明した。
【０２５４】
ゲートキーパー置換とは対照的に、αＣらせんに対するアミノ末端の直近の位置にある活性化突然変異（ＡＬＫのＣｙｓ１１５６）は、他のチロシンキナーゼについては報告されていない。ＥＧＦＲの対応する部位におけるＴｈｒ→Ｉｌｅの変化はＮＳＣＬＣの１つの事例において説明されているが、薬物感受性との関連性は調査されていない（Tsao, M.S. et al. (2005) N. Engl. J. Med. 353:133-144）。酵素活性のアロステリック制御についてのらせんαＣの重要性は、セリン・トレオニンキナーゼに関して立証されている（Hindie, V. et al. (2009) Nat. Chem. Biol. 5:758-764）。したがって、ＡＬＫのＣｙｓ１１５６における変化は、ＴＫＩ結合をアロステリックに妨げている可能性があり、あるいは、Ｃｙｓ１１５６は、キナーゼドメインとＴＫＩとの物理的相互作用に直接的に関連している可能性がある。
【０２５５】
等価物
当業者は、本明細書に記載される発明の特定の実施の形態に対する多くの等価物を認識するか、または、単に日常的な実験のみを利用して解明することができるであろうであろう。このような等価物は添付の特許請求の範囲に包含されることが意図されている。
【図２】
0005937017.tif 000050
【図１】
0005937017.tif 000051
【図３】
0005937017.tif 000052
【図４】
0005937017.tif 000053
【図５】
0005937017.tif 000054
【配列表】
0005937017000001.app