(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
心不全に罹患しているか、または心不全を発症する危険性があると対象を決定するための方法であって、
ａ）該対象から得られた体液における少なくとも１個の遺伝子マーカーのレベルを決定する工程、ここで、該少なくとも１個の遺伝子マーカーがｍｉＲ−４２３−５ｐである；
ｂ）工程ａ）において決定された該少なくとも１個の遺伝子マーカーのレベルに基づいて、対象が心不全に罹患しているか、または心不全を発症する危険性があるか否かを決定する工程
を含み、
ｍｉＲ−４２３−５ｐの発現、量および／または活性が、心不全に罹患していないか、または心不全を発症する危険性がないコントロール対象と比較して上方調節されているとき、該対象が心不全に罹患しているか、または心不全を発症する危険性があると決定する、方法。
【請求項２】
体液が血液である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
心不全に罹患しているか、または心不全を発症する危険性があると対象を決定するためのパーツのキットであって、
−ｍｉＲ−４２３−５ｐに特異的に結合することができる少なくとも１個の化合物；および
−請求項１または２に記載の方法にしたがって、心不全に罹患しているか、または心不全を発症する危険性があると対象を決定するための該化合物の使用のための指示書
を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、生物学および医薬の分野に関する。より特に、本発明は、心不全の診断および治療における使用のためのｍｉＲＮＡに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ＭｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、植物および動物のゲノムにおいてコードされたＲＮＡ小分子である。それらは、多数のｍｉＲＮＡをコードするポリシストロン性転写産物および個々のｍｉＲＮＡ遺伝子においてタンパク質をコードする遺伝子のイントロン内に存在する。約２１−２３ヌクレオチド長を有するこれらの高度に保存されているＲＮＡは、通常、特定のｍＲＮＡの３’−非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）に結合することにより、遺伝子発現を調節する。数百のｍｉＲＮＡ遺伝子が高等真核生物において存在すると予測されており、ｍｉＲＮＡにより提供される可能な調節回路は莫大であるため、それぞれのｍｉＲＮＡは、多数の遺伝子を調節すると考えられる。いくつかの研究グループは、ｍｉＲＮＡが早期発生、細胞増殖および細胞死、アポトーシスおよび脂肪代謝、および細胞分化の多種多様なプロセッシングの重要なレギュレーターとして作用するという証拠を提供している。高等真核生物において、遺伝子発現の調節におけるｍｉＲＮＡの役割は転写因子の役割と同じくらい重要であるという推測がある。今日までに、５４０を越えるヒトｍｉＲＮＡが確認されている；しかしながら、コンピューターモデルは数千であり得ると示唆されている。最大３０％のヒト遺伝子がｍｉＲＮＡにより調節されると考えられている。
【０００３】
ｍｉＲＮＡをコードする遺伝子は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによりＤＮＡから転写されるが、タンパク質に翻訳されない。一般的に数キロベースの長さを有する一次転写産物は、プリ−ｍｉＲＮＡと呼ばれる。プリ−ｍｉＲＮＡは、細胞核において、プレ−ｍｉＲＮＡとして知られるより短い７０−１００ヌクレオチドのステムループ構造にプロセッシングされる。このプロセッシングは、動物においてＲＮａｓｅＩＩＩエンドヌクレアーゼＤｒｏｓｈａにより行われる。次に、プレ−ｍｉＲＮＡは細胞質に輸送され、そこで第２のＲＮａｓｅＩＩＩエンドヌクレアーゼＤＩＣＥＲにより２１−２３ヌクレオチド長を有する二本鎖ｍｉＲＮＡにプロセッシングされる。次に、ｍｉＲＮＡ二本鎖の一本鎖は、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれる。ＲＩＳＣの一部として、標的遺伝子の遺伝子発現は、翻訳を阻害することにより、および／またはｍＲＮＡを開裂することにより中和される。成熟ｍｉＲＮＡは、１つ以上のｍＲＮＡ分子と部分的に相補的である。ｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡが同じ細胞において発現されると、それらは配列特異的様式においてハイブリダイズし、それによりｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を防止し、したがって重要なことに特定のタンパク質レベルを調節することができる。
【０００４】
可能な臨床プレイヤー(player)としてのｍｉＲＮＡの興味および信頼レベルは、種々のｍｉＲＮＡベースのバイオテクノロジー会社が最近開始したという事実により証明することができる。
【０００５】
いくつかのｍｉＲＮＡは、癌および心臓疾患と関連している。発現分析試験は、正常組織と比較して腫瘍において不安定なｍｉＲＮＡ発現を示す。ＭｉｃｒｏＲＮＡは、乳房、肺および大腸癌において脱調節されており、Ｂｕｒｋｉｔｔおよび他のヒトＢ細胞リンパ腫において上方調節されている。結果として、ヒトｍｉＲＮＡは、とりわけ将来の癌診断のための、バイオマーカーとして高度に有用である可能性があり、疾患介入のための魅力のある標的として迅速に現れる。癌とのそれらの関連に加えて、ｍｉｃｒｏＲＮＡは、筋細胞増殖、心室壁の整合性、収縮性、遺伝子発現、および心調律の維持を含む心機能および機能障害の異なった局面のコントロールにおいて重要な役割を果たす。ｍｉＲＮＡの誤発現は、多数の形態の心臓疾患に必要および十分であることが示されている。
【０００６】
最近、ｍｉＲＮＡは、また、血液において存在すると述べられた。いくつかのｍｉＲＮＡは、血清、血漿、血小板、赤血球ならびに有核血球において比較的高レベルで検出することができる。ｍｉＲＮＡの異常発現プロフィールは、鎌状細胞貧血を有する対象の血液または前立腺癌において述べられている。
【０００７】
遺伝因子が心不全を発症する素因と関連することは確実であるが、このような遺伝因子の同定は、障害の複雑性を考慮すると困難である。
【０００８】
心不全を含む急性冠症候群を診断するための方法は、とりわけＷＯ／２００２／０８３９１３、ＷＯ２００２／０８９６５７およびＷＯ２００６／１２０１５２に記載されている。これら全ての方法は、例えば、血液または尿における急性冠症候群に対するマーカーとして脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）のレベルを使用する。しかしながら、このポリペプチドは心筋細胞の過度の伸展に応答して心室により分泌され、したがって心臓状態を反映する生理学的マーカーである。心不全を発症する対象の遺伝的素因をさらに正確に反映する遺伝子マーカーの必要性がある。このようなマーカーは、また、さらに早期に診断を可能にする。
【０００９】
したがって、心不全の発症を予測する遺伝子マーカーの有用性は、非常に望ましいことである。現在、このようなマーカーは存在しない。
【発明の概要】
【００１０】
発明の概要
今回、ｍｉＲＮＡ血液プロフィールが心臓疾患において変化することを見出した。あらゆる理論にとらわれずに、心筋細胞をふくむ細胞が、エキソソームを介して血液にこれらのｍｉＲＮＡを分泌し、排出パターンが疾患において変化すると考えられる。
【００１１】
したがって、本発明者らは、血液におけるｍｉＲＮＡプロフィールが心不全における診断またはバイオマーカーアプローチのための新規ツールとして使用することができることを見出した。
【００１２】
本発明の目的は、心不全（の危険性）を処置、予防または決定するための手段および方法を提供することである。
【００１３】
したがって、本発明は、第１の局面において、対象における心不全を処置または予防するための方法であって：
−該対象内で少なくとも１個のｍｉＲＮＡの発現、量および／または活性を減少させるか；または
−該対象内で少なくとも１個のｍｉＲＮＡとそのｍＲＮＡ標的の相互作用を減少させるか；または
−該対象内で少なくとも１個のｍｉＲＮＡのｍＲＮＡ標的の発現、量および／または活性を増加させる、
工程を含み、該少なくとも１個のｍｉＲＮＡがｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−１９１＊、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１２２８＊、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８ａ＊、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−２９９−３ｐ、ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｍｉＲ−６５２、ｍｉＲ−６７５、ｍｉＲ−１２９−５ｐ、ｍｉＲ１８ｂ＊、ｍｉＲ−１２５４、ｍｉＲ−６２２、ＨＳ＿２０２．１、ｍｉＲ−３０２ｄおよびｓｏｌｅｘａ−３９２７−２２１からなる群から選択される方法を提供する。
【００１４】
別の局面において、本発明は、対象における心不全を処置または予防するための方法であって：
−該対象内で少なくとも１個のｍｉＲＮＡの発現、量および／または活性を増加させるか；または
−該対象内で少なくとも１個のｍｉＲＮＡとそのｍＲＮＡ標的の相互作用を増加させるか；または
−該対象内で少なくとも１個のｍｉＲＮＡのｍＲＮＡ標的の発現、量および／または活性を減少させる、
工程を含み、該少なくとも１個のｍｉＲＮＡがｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−７４４、ｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｓｏｌｅｘａ−２９５２−３０６からなる群から選択される方法を提供する。
【００１５】
上記局面の好ましい態様において、該ｍｉＲＮＡの発現、量および／または活性または相互作用を増加させる該工程は、機能性ｍｉＲＮＡ、前駆体ｍｉｃｒｏＲＮＡ（プレ−ｍｉＲＮＡ）、またはｍｉｃｒｏＲＮＡ一次転写産物（プリ−ｍｉＲＮＡ）として該ｍｉＲＮＡを該対象に投与することを含む。
【００１６】
別の局面において、本発明は、医薬としての使用のための、好ましくは心不全の処置または予防における使用のための、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−７４４、ｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｓｏｌｅｘａ−２９５２−３０６、またはそれらの前駆体ｍｉｃｒｏＲＮＡ（プレ−ｍｉＲＮＡ）またはｍｉｃｒｏＲＮＡ一次転写産物からなる群から選択されるｍｉＲＮＡを提供する。
【００１７】
さらに別の局面において、本発明は、医薬としての使用のための、好ましくは心不全の処置または予防における使用のための、ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−１９１＊、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１２２８＊、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８ａ＊、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−２９９−３ｐ、ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｍｉＲ−６５２、ｍｉＲ−６７５、ｍｉＲ−１２９−５ｐ、ｍｉＲ−１８ｂ＊、ｍｉＲ−１２５４、ｍｉＲ−６２２、ＨＳ＿２０２．１、ｍｉＲ−３０２ｄおよびｓｏｌｅｘａ−３９２７−２２１、ならびにそれらの前駆体ｍｉｃｒｏＲＮＡ（プレ−ｍｉＲＮＡ）またはｍｉｃｒｏＲＮＡ一次転写産物からなる群から選択される少なくとも１個のｍｉＲＮＡに特異的に結合することができ、それによりそれらの活性および／または機能を阻害する化合物、好ましくは核酸を提供する。本明細書における「機能」なる用語は、特に、標的ｍＲＮＡの翻訳を阻害する該ｍｉＲＮＡの能力を示す。したがって、核酸は、好ましくは、ｍｉＲＮＡとそのｍＲＮＡ標的間の配列特異的手段においてハイブリダイゼーションを阻害することができる。本明細書において定義されている核酸の文脈における「特異的に結合する」なる用語は、特に、ストリンジェント条件下で該ｍｉＲＮＡにハイブリダイズすることができる核酸を示す。好ましい態様において、該核酸は、図３において提供されるｍｉＲＮＡの配列の相補体である配列を有する。
【００１８】
別の局面において、本発明は、医薬としての使用のための、好ましくは心不全の処置または予防における使用のための、該核酸または（プレまたはプリ）ｍｉＲＮＡを発現することができる、ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−１９１＊、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１２２８＊、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８ａ＊、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−２９９−３ｐ、ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｍｉＲ−６５２、ｍｉＲ−６７５、ｍｉＲ−１２９−５ｐ、ｍｉＲ−１８ｂ＊、ｍｉＲ−１２５４、ｍｉＲ−６２２、ＨＳ＿２０２．１、ｍｉＲ−３０２ｄおよびｓｏｌｅｘａ−３９２７−２２１、ならびにそれらの前駆体ｍｉｃｒｏＲＮＡ（プレ−ｍｉＲＮＡ）またはｍｉｃｒｏＲＮＡ一次転写産物からなる群から選択される少なくとも１個のｍｉＲＮＡ、または、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−７４４、ｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｓｏｌｅｘａ−２９５２−３０６、ならびにそれらの前駆体ｍｉｃｒｏＲＮＡ（プレ−ｍｉＲＮＡ）およびｍｉｃｒｏＲＮＡ一次転写産物からなる群から選択されるｍｉＲＮＡに特異的に結合することができ、それによりそれらの活性および／または機能を阻害する核酸をコードする核酸配列を含むベクターを提供する。
【００１９】
さらに別の局面において、本発明は、医薬としての使用のための、好ましくは心不全の処置または予防における使用のための、上記本発明のベクターを含む細胞を提供する。
【００２０】
さらに別の局面において、本発明は、対象における心不全を処置または予防するための医薬組成物であって、
−上記本発明の遺伝子またはその発現産物、上記本発明の（プレ−もしくはプリ−）ｍｉＲＮＡ、上記本発明のベクター、または上記本発明の細胞、および
−薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤
を含む医薬組成物を提供する。
【００２１】
さらにさらなる局面において、本発明は、心不全に罹患しているか、または心不全を発症する危険性があると対象を診断するための方法であって、
ａ）該対象から得られたサンプルにおける遺伝子マーカーのレベルを決定する工程、ここで、該遺伝子マーカーがｍｉＲ−１９１＊、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１２２８＊、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ  １８ａ＊、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−２９９−３ｐ、ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｍｉＲ−６５２、ｍｉＲ−６７５、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−３０２ｄ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−７４４、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｓｏｌｅｘａ−２９５２−３０６、およびｓｏｌｅｘａ−３９２７−２２１、ならびにそれらの前駆体ｍｉｃｒｏＲＮＡ（プレ−ｍｉＲＮＡ）またはｍｉｃｒｏＲＮＡ一次転写産物からなる群から選択されるｍｉＲＮＡである；
ｂ）工程ａ）において決定された遺伝子マーカーのレベルに基づいて、対象が心不全に罹患しているか、または心不全を発症する危険性があるか否かを診断する工程
を含む方法を提供する。
【００２２】
さらなる態様において、本発明は、心不全に罹患しているか、または心不全を発症する危険性があると対象を診断するための方法であって、ａ）該対象から得られたサンプルにおける少なくとも１個の遺伝子マーカーのレベルを決定する工程、ここで、該少なくとも１個の遺伝子マーカーがｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−１９１＊、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１２２８＊、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８ａ＊、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−２９９−３ｐ、ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｍｉＲ−６５２、ｍｉＲ−６７５、ｍｉＲ−１２９−５ｐ、ｍｉＲ−１８ｂ＊、ｍｉＲ−１２５４、ｍｉＲ−６２２、ＨＳ＿２０２．１、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−３０２ｄ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−７４４、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｓｏｌｅｘａ−２９５２−３０６、およびｓｏｌｅｘａ−３９２７−２２１、ならびにそれらの前駆体ｍｉｃｒｏＲＮＡ（プレ−ｍｉＲＮＡ）またはｍｉｃｒｏＲＮＡ一次転写産物からなる群から選択されるｍｉＲＮＡである；ｂ）工程ａ）において決定された該少なくとも１個の遺伝子マーカーのレベルに基づいて、対象が心不全に罹患しているか、または心不全を発症する危険性があるか否かを診断する工程を含む方法を提供する。好ましい態様において、該少なくとも１個の遺伝子マーカーは、ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−１９１＊、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１２２８＊、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８ａ＊、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−２９９−３ｐ、ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｍｉＲ−６５２、ｍｉＲ−６７５、ｍｉＲ−１２９−５ｐ、ｍｉＲ−１８ｂ＊、ｍｉＲ−１２５４、ｍｉＲ−６２２、ＨＳ＿２０２．１、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−３０２ｄ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−７４４、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｓｏｌｅｘａ−２９５２−３０６、およびｓｏｌｅｘａ−３９２７−２２１、ならびにそれらの前駆体ｍｉｃｒｏＲＮＡ（プレ−ｍｉＲＮＡ）またはｍｉｃｒｏＲＮＡ一次転写産物からなる群から選択されるｍｉＲＮＡから選択される少なくとも２個のｍｉＲＮＡ、より好ましくは少なくとも３個のｍｉＲＮＡを含む。さらに好ましい態様において、少なくとも２個のｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−４２３−５ｐおよびｍｉＲ−１９１＊、ｍｉＲ−４２３−５ｐおよびｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−４２３−５ｐおよびｍｉＲ−１２２８＊、ｍｉＲ−４２３−５ｐおよびｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−４２３−５ｐおよびｍｉＲ−１８ａ＊、ｍｉＲ−４２３−５ｐおよびｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−４２３−５ｐおよびｍｉＲ−２９９−３ｐ、ｍｉＲ−４２３−５ｐおよびｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｍｉＲ−４２３−５ｐおよびｍｉＲ−６５２、ｍｉＲ−４２３−５ｐおよびｍｉＲ−６７５、ｍｉＲ−４２３−５ｐおよびｍｉＲ−１２９−５ｐ、ｍｉＲ−４２３−５ｐおよびｍｉＲ−１８ｂ＊、ｍｉＲ−４２３−５ｐおよびｍｉＲ−１２５４、ｍｉＲ−４２３−５ｐおよびｍｉＲ−６２２、ｍｉＲ−４２３−５ｐおよびＨＳ＿２０２．１、ｍｉＲ−４２３−５ｐおよびｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−４２３−５ｐおよびｍｉＲ−３０２ｄ、ｍｉＲ−４２３−５ｐおよびｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−４２３−５ｐおよびｍｉＲ−７４４、ｍｉＲ−４２３−５ｐおよびｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−４２３−５ｐおよびｓｏｌｅｘａ−２９５２−３０６、またはｍｉＲ−４２３−５ｐおよびｓｏｌｅｘａ−３９２７−２２１からなる群から選択される。
【００２３】
さらにさらなる局面において、本発明は、心不全に罹患しているか、または心不全を発症する危険性があると対象を診断するための方法であって、
ａ）該対象から得られたサンプルにおける遺伝子マーカーのレベルを決定する工程、ここで、該遺伝子マーカーがｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−１９１＊、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１２２８＊、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ  １８ａ＊、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−２９９−３ｐ、ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｍｉＲ−６５２、ｍｉＲ−６７５、ｍｉＲ−１２９−５ｐ、ｍｉＲ−１８ｂ＊、ｍｉＲ−１２５４、ｍｉＲ−６２２、ＨＳ＿２０２．１、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−３０２ｄ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−７４４、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｓｏｌｅｘａ−２９５２−３０６、およびｓｏｌｅｘａ−３９２７−２２１、ならびにそれらの前駆体ｍｉｃｒｏＲＮＡ（プレ−ｍｉＲＮＡ）またはｍｉｃｒｏＲＮＡ一次転写産物からなる群から選択されるｍｉＲＮＡである；
ｂ）工程ａ）において決定された遺伝子マーカーのレベルに基づいて、対象が心不全に罹患しているか、または心不全を発症する危険性があるか否かを診断する工程を含む方法を提供する。
【００２４】
該方法の好ましい態様において、該工程ｂ）は、
−ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−１９１＊、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１２２８＊、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８ａ＊、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−２９９−３ｐ、ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｍｉＲ−６５２、ｍｉＲ−６７５、ｍｉＲ−１２９−５ｐ、ｍｉＲ−１８ｂ＊、ｍｉＲ−１２５４、ｍｉＲ−６２２、ＨＳ＿２０２．１、ｍｉＲ−３０２ｄおよび／またはｓｏｌｅｘａ−３９２７−２２１、またはそれらの前駆体ｍｉｃｒｏＲＮＡ（プレ−ｍｉＲＮＡ）またはｍｉｃｒｏＲＮＡ一次転写産物の発現、量および／または活性が、心不全に罹患していないか、または心不全を発症する危険性がないコントロール対象と比較して上方調節されている；および／または
−ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−７４４、ｍｉＲ−１４２−３ｐおよび／またはｓｏｌｅｘａ−２９５２−３０６、またはそれらの前駆体ｍｉｃｒｏＲＮＡ（プレ−ｍｉＲＮＡ）またはｍｉｃｒｏＲＮＡ一次転写産物の発現、量および／または活性が、心不全に罹患していないか、または心不全を発症する危険性がないコントロール対象と比較して下方調節されている
とき、該対象が心不全に罹患しているか、または心不全を発症する危険性があると考慮される。
【００２５】
本発明は、さらに、本発明の少なくとも１個の遺伝子マーカーのレベルに基づいて、対象が心不全に罹患しているか、または心不全を発症する危険性があるか否かを診断し；該対象が心不全に罹患しているか、または心不全を発症する危険性があるとき、該対象を処置することを含む対象における心不全を処置または予防するための方法を提供する。
【００２６】
別の局面において、本発明は、心不全に罹患しているか、または心不全を発症する危険性があると対象を診断するためのパーツのキットであって：
−ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−１９１＊、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ  １２２８＊、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８ａ＊、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−２９９−３ｐ、ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｍｉＲ  ６５２、ｍｉＲ−６７５、ｍｉＲ−１２９−５ｐ、ｍｉＲ−１８ｂ＊、ｍｉＲ−１２５４、ｍｉＲ−６２２、ＨＳ＿２０２．１、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−３０２ｄ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−７４４、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｓｏｌｅｘａ−２９５２−３０６、およびｓｏｌｅｘａ−３９２７−２２１、ならびにそれらの前駆体ｍｉｃｒｏＲＮＡ（プレ−ｍｉＲＮＡ）またはｍｉｃｒｏＲＮＡ一次転写産物からなる群から選択される少なくとも１個のｍｉＲＮＡに特異的に結合することができる少なくとも１個の化合物；および
−本発明の方法にしたがって、心不全に罹患しているか、または心不全を発症する危険性があると対象を診断するための該化合物の使用のための指示書
を含むキットを提供する。
【００２７】
別の局面において、本発明は、候補化合物がヒト対象における心不全を処置または予防することができるか否かを決定するための方法であって：
−該候補化合物とヒト組織細胞、好ましくは心臓組織細胞を接触させ、
−該候補化合物が該組織細胞におけるｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−１９１＊、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１２２８＊、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８ａ＊、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−２９９−３ｐ、ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｍｉＲ−６５２、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−３０２ｄ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−７４４、ｍｉＲ−６７５、ｍｉＲ−１２９−５ｐ、ｍｉＲ−１８ｂ＊、ｍｉＲ−１２５４、ｍｉＲ−６２２、ＨＳ＿２０２．１、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｓｏｌｅｘａ−２９５２−３０６、およびｓｏｌｅｘａ−３９２７−２２１のいずれかの発現、量および／または活性を調節することができるか否かを決定することを含む方法を提供する。好ましくは、該化合物は、もはや心不全（の危険性）と関連しない方向に、すべてのｍｉＲＮＡの発現に影響する。
【００２８】
候補化合物がヒト対象における心不全を処置または予防することができるか否かを決定するための好ましい方法において、該方法は：
−該候補化合物と組織細胞、好ましくはヒト組織細胞、より好ましくは心臓組織細胞を接触させ、
−該候補化合物が該組織細胞におけるｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−１９１＊、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１２２８＊、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８ａ＊、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−２９９−３ｐ、ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｍｉＲ  ６５２、ｍｉＲ−６７５、ｍｉＲ−１２９−５ｐ、ｍｉＲ−１８ｂ＊、ｍｉＲ−１２５４、ｍｉＲ−６２２、ＨＳ＿２０２．１、ｍｉＲ−３０２ｄ  ｓｏｌｅｘａ−３９２７−２２１の発現、量および／または活性を減少させるか、および／またはｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−７４４、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、またはｓｏｌｅｘａ−２９５２−３０６の発現を増加させることができるか否かを決定することを含む。
【００２９】
すべての局面および態様において、また本発明の一部は、健常コントロールの血漿と比較したときＨＦ患者の血漿において特異的に発現されることが見出された、ｍｉＲＮＡ  ｍｉＲ−６５４−３ｐ、ｍｉＲ−３４６、ｍｉＲ−１３０１、ｍｉＲ−２４−２およびＨＳ＿２３９である。
【００３０】
候補治療化合物のスクリーニングに適当である本発明の局面は、また、本明細書において示されている心不全（の危険性の増加）と関連する特定のｍｉＲＮＡ発現パターンを示すモデル系、例えば、動物モデルにおいて実施され得る。したがって、本発明のさらなる局面は、本明細書において示されている心不全（の危険性の増加）と関連するｍｉＲＮＡ発現プロフィールを示す（ヒトを含む動物）モデル系である。このようなモデル系は、該モデル系（の細胞）を候補化合物に暴露または投与し、該候補化合物が、もはや心不全（の危険性の増加）と関連しない該ｍｉＲＮＡ発現プロフィールにおける変化を誘導することができるか否か、特に該モデル系（の細胞）におけるｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−７４４、ｍｉＲ−１４２−３ｐまたはｓｏｌｅｘａ−２９５２−３０６の発現、量および／または活性を増加させることができるか否か、および／または該モデル系（の細胞）におけるｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−１９１＊、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１２２８＊、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８ａ＊、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−２９９−３ｐ、ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｍｉＲ  ６５２、ｍｉＲ−６７５、ｍｉＲ−１２９−５ｐ、ｍｉＲ−１８ｂ＊、ｍｉＲ−１２５４、ｍｉＲ−６２２、ＨＳ＿２０２．１、ｍｉＲ−３０２ｄまたはｓｏｌｅｘａ−３９２７−２２１の発現、量および／または活性を低下させることができるか否かを決定する工程を含む、候補治療剤に関してスクリーニングするための方法において使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、心不全（ＨＦ）患者の血漿において豊富なｍｉＲＮＡを示す。血漿サンプル。１）健常者１；２）健常者２；４）ＨＦ患者１；５）ＨＦ患者２；６）ＨＦ患者３。
【図２】図２は、心不全患者の血漿において下方調節されているｍｉＲＮＡを示す。血漿サンプル：１）健常者１；２）健常者２；４）ＨＦ患者１；５）ＨＦ患者２；６）ＨＦ患者３。
【図３】図３は、本明細書に記載されているｍｉＲＮＡの配列（５’−３’）を示す。
【図４】図４は、ｍｉＲＮＡあたり２４個の測定を示すＤＮＡチップアレイ上で測定された本明細書に記載されているｍｉＲＮＡの発現を示す。最初の１２個は患者サンプルからの測定であり、次の１２個（番号１３−２４）はコントロールである。ＦＣ＝倍数変化；ｐ＝ｐ値；およびｐ調節されたは複数の試験に対して補正されたｐ値である。結果はＱＰＣＲにより確認された。
【図５】図５は、ＨＦ患者およびコントロール対象の血漿中の１６個の候補ｍｉＲＮＡの発現プロフィールを示す。それぞれのパネルの左の２個の棒は、１２個の健常コントロールおよび１２個のＨＦ患者においてｍｉＲＮＡアレイにより測定されたｍｉＲＮＡレベルを示す。右の２個の棒は、別々の対象においてリアルタイムＰＣＲにより今回確認された同じｍｉＲＮＡのレベルを示す（３０個のＨＦ症例および３９個の健常コントロール）。データは平均±ＳＥＭとして示される。健常コントロールと比較して＊Ｐ＜０．０５。
【図６】図６は、ｍｉＲＮＡの診断精度を示す。Ａ、Ｄ、およびＧは、健常コントロール、非ＨＦ症例、およびＨＦ症例におけるｍｉＲＮＡレベルを示す。データは平均±ＳＥＭとして示される。健常コントロールと比較して＊Ｐ＜０．０５；＄：非ＨＦ症例と比較してＰ＜０．０５。Ｂ、Ｅ、およびＨは、ＨＦを非ＨＦ症例と区別するために診断力に関してＲＯＣ曲線およびＡＵＣを示す。Ｃ、Ｆ、およびＩは、ｍｉＲ−４２３−５ｐ（Ｐ＝０．００２）に対して有意であり、ｍｉＲ−１８ｂ＊（Ｐ＝０．０４９）に対してぎりぎり有意であるｐｒｏＢＮＰとｍｉＲＮＡ間のＳｐｅａｒｍａｎ相互関係を示す。単一の異常値の省略は、ｍｉＲ４２３−５ｐの相互関係に影響しないが、ｍｉＲ−１８ｂ＊を減少させた。
【図７】図７は、非心臓性原因（コントロール）によって死んだ対象と比較して、拡張型心筋症（ＤＣＭ）によって死んだ対象由来の死後心筋組織におけるｍｉＲＮＡ発現を示す。ｍｉＲ−４２３−５ｐに対するリアルタイムＰＣＲをＵ６の発現に対して標準化した。＊は、コントロールと比較してｐ＜０．０５を示す。
【図８】図８は、心不全のアテローム性動脈硬化  対  非アテローム性動脈硬化形態を有する対象における循環ｍｉＲＮＡレベルを示す。心不全の根本にある原因にしたがって循環ｍｉＲＮＡレベルを比較するために、我々は、ＨＦのアテローム性動脈硬化形態とＨＦの非アテローム性動脈硬化形態を区別した。この試験において、我々は、活性虚血がＨＦの原因として除かれるように、心筋虚血の実際の徴候を示す患者を除いたことを強調することが重要である。３０人のうち１２人の患者は、ＨＦに至る慢性の高度の冠状アテローム性動脈硬化疾患の病歴を有した。アテローム性動脈硬化疾患を有するこれらの対象は、非アテローム性動脈硬化ＨＦを有する患者（ｎ＝１８）と比較して、ｍｉＲ−１８ｂ＊ではなく、ｍｉＲ−４２３−５ｐおよびｍｉＲ−６７５の有意に高い循環レベルを示した。＊：非アテローム性動脈硬化形態と比較してｐ＜０．０５。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
好ましい態様の記載
「心不全(heart failure)」または「心不全(cardiac failure)」なる用語は、心臓が、心機能の異常（検出可能または不可能）を介して、代謝組織の必要性と比例した速度で血液を供給できない、および／または異常に上昇した拡張期充満圧のみから供給する病態生理学状態を示す。心不全は、心筋障害により引き起こされ得るが、また、高需要の条件下でほぼ正常な心機能の存在で起こり得る。心不全は、いつも循環障害を引き起こすが、種々の心臓以外の状態（例えば、血液量減少性ショック、敗血症性ショック）が、正常な、ある程度の異常な、または通常でない心機能の存在において循環障害を生じることができるため、逆は必ずしも引き起こさない。したがって、「心不全」なる用語は、心不全の原因にかかわりなく、ならびに心不全および／または心不全の原因と関連する遺伝的要素があるか否かにかかわりなく、収縮期および拡張期心不全、急性心不全および慢性心不全を含む。
【００３３】
本明細書において使用される「核酸」は、一本鎖または二本鎖形態のいずれかにおけるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーへの言及を含み、他に記載のない限り、天然ヌクレオチド（例えば、ペプチド核酸）と同様の様式において一本鎖核酸にハイブリダイズするような天然ヌクレオチドの重要な性質を有する既知の類似体を含む。
【００３４】
「単離された細胞」における「単離された」なる用語は、天然環境において見出されるとき、通常、付随するか、または相互作用する成分と実質的または本質的に遊離している物質、例えば、細胞を示す。単離された細胞は、通常、存在する組織から分離され、由来の生物体の組織においてもはや統合されない細胞を培養することにより得られる細胞培養物であり得る。
【００３５】
「ヌクレオチド」は、一般的に受け入れられている１文字表記による以下のＩＵＰＡＣ命名法で示す：Ａ（アデニン）、Ｃ（シトシン）、Ｔ（チミン）、Ｇ（グアニン）、Ｕ（ウラシル）、Ｗ（ＡまたはＴ）、Ｒ（ＡまたはＧ）、Ｋ（ＧまたはＴ）、Ｙ（ＣまたはＴ）、Ｓ（ＣまたはＧ）、Ｍ（ＡまたはＣ）、Ｂ（Ｃ、ＧまたはＴ）、Ｈ（Ａ、ＣまたはＴ）、Ｄ（Ａ、ＧまたはＴ）、Ｖ（Ａ、ＣまたはＧ）、Ｎ（Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ）。
【００３６】
「コードする(coding)」または「コードする(encoding)」配列は、タンパク質のアミノ酸配列、または機能性ＲＮＡ、例えば、ｔＲＮＡまたはｒＲＮＡをコードする遺伝子の一部である。
【００３７】
本明細書において使用される「遺伝子」なる用語は、ポリペプチド鎖に翻訳することができるｍＲＮＡに転写されるか、ｒＲＮＡまたはｔＲＮＡに転写されるか、またはＤＮＡ複製、転写および調節と関連する酵素および他のタンパク質に対する認識部位として働き得るＤＮＡ配列を含むが、これらに限定されないＤＮＡ配列を示す。該用語は、いくつかの作動可能に連結したＤＮＡフラグメントを含むあらゆるＤＮＡ配列、例えば、プロモーター領域、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、コード領域（タンパク質をコードしていてもよく、コードしていなくてもよい）、およびポリアデニル化部位を含む非翻訳３’領域（３’ＵＴＲ）を示す。一般的に、５’ＵＴＲ、コード領域および３’ＵＴＲは、ＲＮＡに転写され、遺伝子をコードするタンパク質の場合、コード領域はタンパク質に翻訳される。遺伝子は、通常、イントロンおよびエキソンを含む。遺伝子は、さらなるＤＮＡフラグメント、例えば、イントロンを含み得る。
【００３８】
「サンプル」は、核酸を含む広い意味において使用される。サンプルは、体液、例えば、血液または尿；細胞調製物の可溶性画分、または細胞が増殖した培地のアリコート；細胞から単離または抽出された染色体、細胞小器官または膜；溶液中の、または基質に結合したゲノムＤＮＡ、ＲＮＡまたはｃＤＮＡ；細胞；組織；組織跡；指紋、口腔細胞、皮膚または髪などを含み得る。
【００３９】
本発明のｍｉＲＮＡの検出のための好ましいサンプルは、血液および尿から選択される体液である。もっとも好ましいサンプルは血液サンプルである。血液サンプルは、全血サンプル、または遠心分離および／または濾過により得られるサンプル、例えば、血漿、血清、血小板、赤血球、白血球を含んでよく、当業者に知られているとおりである。血液サンプルは、静脈穿刺、動脈穿刺および／または毛細血管穿刺、例えば、指穿刺により得ることができる。サンプル、好ましくは血液サンプルは、抗凝固剤を含むチューブ、例えば、ヘパリンチューブまたはＥＤＴＡチューブに回収され得、当業者に知られているとおりである。
【００４０】
本発明は、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８ａ＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５２、ｈｓａ−ｍｉＲ−６７５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８ｂ＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５４、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２、ＨＳ＿２０２．１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７４４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｓｏｌｅｘａ−２９５２−３０６、ｓｏｌｅｘａ−３９２７−２２１として本明細書において示されているｍｉＲＮＡの診断、予知および治療的使用に関する。これらのｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列は、図３に提供されている。
【００４１】
ＭｉＲＮＡは、タンパク性遺伝子産物をコードする遺伝子によってコードされるｍＲＮＡをアニールすることにより、特定の遺伝子産物の発現を中和する。したがって、ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡを翻訳的に抑制し、それにより標的ｍＲＮＡを機能的に調節する能力を有する。
【００４２】
したがって、細胞におけるこれらのｍＲＮＡによってコードされる遺伝子産物の発現は、該細胞内でｈｓａ−ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８ａ＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５２、ｈｓａ−ｍｉＲ−６７５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８ｂ＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５４、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２、ＨＳ＿２０２．１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７４４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｓｏｌｅｘａ−２９５２−３０６、ｓｏｌｅｘａ−３９２７−２２１、またはそれらの機能性部分もしくは誘導体からなる群から選択される少なくとも１個のｍｉＲＮＡの発現、量および／または活性に影響することにより、および／または標的ｍＲＮＡと該細胞内でｈｓａ−ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８ａ＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５２、ｈｓａ−ｍｉＲ−６７５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８ｂ＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５４、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２、ＨＳ＿２０２．１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７４４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｓｏｌｅｘａ−２９５２−３０６、ｓｏｌｅｘａ−３９２７−２２１、またはそれらの機能性部分もしくは誘導体からなる群から選択される少なくとも１個のｍｉＲＮＡの相互作用に影響することにより影響される。したがって、該細胞におけるｍｉＲＮＡの標的ｍＲＮＡによってコードされる特定の遺伝子産物の発現に影響するための、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８ａ＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５２、ｈｓａ−ｍｉＲ−６７５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８ｂ＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５４、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２、ＨＳ＿２０２．１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７４４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｓｏｌｅｘａ−２９５２−３０６、ｓｏｌｅｘａ−３９２７−２２１またはそれらの機能性部分または誘導体からなる群から選択される少なくとも１個のｍｉＲＮＡの使用、または細胞におけるｈｓａ−ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８ａ＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５２、ｈｓａ−ｍｉＲ−６７５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８ｂ＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５４、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２、ＨＳ＿２０２．１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７４４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｓｏｌｅｘａ−２９５２−３０６、ｓｏｌｅｘａ−３９２７−２２１からなる群から選択される少なくとも１個のｍｉＲＮＡの発現、量および／または活性に影響することができる化合物の使用、または標的ｍＲＮＡとｈｓａ−ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８ａ＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５２、ｈｓａ−ｍｉＲ−６７５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８ｂ＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５４、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２、ＨＳ＿２０２．１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７４４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｓｏｌｅｘａ−２９５２−３０６、ｓｏｌｅｘａ−３９２７−２２１からなる群から選択される少なくとも１個のｍｉＲＮＡの相互作用に影響することができる化合物の使用も提供する。１つの態様において、特定の遺伝子産物の発現は、インビトロにて、例えば、細胞培養において影響される。
【００４３】
ｍｉＲＮＡは、当業者に知られている標準命名法系に従う。大文字で始められていない「ｍｉｒ−」はプレ−ｍｉＲＮＡを示し、大文字で始められた「ｍｉＲ−」は成熟形態を示す。ほぼ同一の配列を有するＭｉＲＮＡは、さらなる小文字で注釈される。例えば、ｍｉＲ−１２３ａはｍｉＲ−１２３ｂと密接に関連している。１００％同一であるが、ゲノムにおいて異なる場所でコードされるＭｉＲＮＡは、さらなるダッシュ−数字接尾辞で示される：ｍｉＲ−１２３−１およびｍｉＲ−１２３−２は同一であるが、異なるプレ−ｍｉＲＮＡから生産される。起源の種は３文字接頭辞で示され、例えば、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２３はヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）由来であり、ｏａｒ−ｍｉＲ−１２３はヒツジ（Ｏｖｉｓ  ａｒｉｅｓ）ｍｉＲＮＡである。相対的発現レベルが知られているとき、名前に続くアステリスクは、ヘアピンの反対のアームにおけるｍｉＲＮＡと比較して低レベルで発現されるｍｉＲＮＡを示す。例えば、ｍｉＲ−１２３およびｍｉＲ−１２３＊はプレ−ｍｉＲＮＡヘアピンを共有するが、比較的よりｍｉＲ−１２３は細胞において見出される。接尾辞５ｐおよび３ｐは、ｍｉＲＮＡがプレ−ｍｉＲＮＡの５’アームまたは３’アームのそれぞれに由来するとき示す。これらの接尾辞は、ｍｉＲＮＡの両方が等レベルで発現するとき使用される。例えば、ｍｉＲ４２３−５ｐおよびｍｉＲ４２３−３ｐはプレ−ｍｉＲＮＡヘアピンを共有する。本発明において、本明細書に記載されているｍｉＲＮＡは特定の遺伝子産物の発現を中和することができる。本明細書において使用される「ｍｉＲＮＡ」なる用語は、該ｍｉＲＮＡのあらゆるアイソフォームを含み、該ｍｉＲＮＡファミリーの全てのメンバーは、特定の遺伝子産物の発現を中和することができる。したがって、「ｍｉＲＮＡ」なる用語は、前駆体、例えば、プリ−ｍｉＲＮＡおよびプレ−ｍｉＲＮＡ、スター(star)配列、例えば、ｍｉＲ−１２３およびｍｉＲ−１２３＊、ファミリーメンバー、例えば、ｍｉＲ−１７およびｍｉＲ−１８；およびクラスター(cluster)メンバー、例えば、ｍｉＲ−９２ａ、ｍｉＲ−９２ａ−２＊およびｍｉＲ−３６３を含む。
【００４４】
したがって、ｍｉＲ−４２３−５ｐなる用語は、アイソフォームｐｒｅ−ｍｉｒ４２３およびｍｉＲ４２３−３ｐを含み；ｍｉＲ−１２９−５ｐなる用語は、アイソフォームｐｒｅ−ｍｉｒ１２９−１、ｐｒｅ−ｍｉｒ１２９−２、ｍｉＲ−１２９＊およびｍｉＲ−１２９−３ｐを含み；ｍｉＲ−１８ｂ＊なる用語は、アイソフォームｐｒｅ−ｍｉｒ１８ｂ、ｍｉＲ−１８ｂ、ｐｒｅ−ｍｉｒ１７、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−１７＊、ｐｒｅ−ｍｉｒ１８ａ、ｍｉＲ−１８ａ、ｍｉＲ−１８ａ＊、ｐｒｅ−ｍｉｒ２０ａ、ｍｉＲ−２０ａ、ｐｒｅ−ｍｉｒ２０ｂ、ｍｉＲ−２０ｂ、ｍｉＲ−２０ｂ＊、ｐｒｅ−ｍｉｒ９３、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−９３＊、ｐｒｅ−ｍｉｒ１０６ａ、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１０６ａ＊、ｐｒｅ−ｍｉｒ１０６ｂ、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−１０６ｂ＊、ｐｒｅ−ｍｉｒ１９ｂ−２、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−１９ｂ−２＊、ｐｒｅ−ｍｉｒ９２ａ−２、ｍｉＲ−９２ａ、ｍｉＲ−９２ａ−２＊、ｐｒｅ−ｍｉｒ３６３、ｍｉＲ−３６３およびｍｉＲ−３６３＊を含み；ｍｉＲ−１２５４なる用語は、アイソフォームｐｒｅ−ｍｉｒ１２５４を含み；ｍｉＲ−６２２なる用語は、アイソフォームｐｒｅ−ｍｉｒ６２２を含み；ＨＳ＿２０２．１なる用語は、アイソフォームｐｒｅ−ｍｉｒ２２１、ｍｉＲ−２２１およびｍｉＲ−２２１＊を含む。
【００４５】
したがって、本明細書において使用される「ｍｉＲＮＡ」なる用語は、あらゆるｍｉＲＮＡメンバーを含む。ｈｓａ−ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１＊、ｈａｓ  ｍｉＲ−１５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８ａ＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５２、ｈｓａ−ｍｉＲ−６７５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８ｂ＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５４、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２、ＨＳ＿２０２．１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１、ｈａｓ  ｍｉＲ  ３０２ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７４４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｓｏｌｅｘａ−２９５２−３０６、およびｓｏｌｅｘａ  ３９２７  ２２１は当分野で知られているが、心不全とのそれらの関連および心不全におけるそれらの効果は、本発明の前に知られていなかった。
【００４６】
本発明は、上記ｍｉＲＮＡが心不全と関連する見識を提供するため、心不全を診断、予防および処置することが可能になった。本明細書に記載されているｍｉＲＮＡと心不全の関連は、発現がｍｉＲＮＡにより予防または調節される特定の遺伝子産物を介する。これらの特定の遺伝子産物の発現の中和は、より少ない量のこれらの特定の遺伝子産物をもたらし、同様に、心不全の発症、進行および／または影響を減少させる。これは、発現が心不全中に上方調節されるｍｉＲＮＡにより調節される遺伝子産物に特に当てはまる。加えて、例えば、ｍｉＲＮＡの発現を防止することによる、これらの特定の遺伝子産物の発現の刺激は、より高い量の他のこれらの特定の遺伝子産物をもたらし、また、心不全の発症、進行および／または影響を減少させ得る。これは、発現が心不全中に下方調節されるｍｉＲＮＡにより調節される遺伝子産物に特に当てはまる。したがって、これらの特定の遺伝子産物は、未だ未知のメカニズムによる心不全の重要なメディエーターとして示される。本発明にしたがって、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８ａ＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５２、ｈｓａ−ｍｉＲ−６７５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８ｂ＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５４、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２、ＨＳ＿２０２．１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７４４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｓｏｌｅｘａ−２９５２−３０６、ｓｏｌｅｘａ−３９２７−２２１から選択されるいくつかのｍｉＲＮＡは、特定の遺伝子産物の発現を中和することにより心不全を中和することができる。
【００４７】
したがって、１つの態様は、対象における心不全を中和、処置、減少、遅延および／または予防するための方法であって：
−該対象内でｈｓａ−ｍｉＲ−１９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７４４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｓｏｌｅｘａ−２９５２−３０６またはそれらの機能性部分または誘導体からなる群から選択されるｍｉＲＮＡの発現、量および／または活性を減少させる、および／または
−特定の標的ｍＲＮＡと該対象内でｈｓａ−ｍｉＲ−１９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７４４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｓｏｌｅｘａ−２９５２−３０６、またはそれらの機能性部分または誘導体からなる群から選択されるｍｉＲＮＡの相互作用を増加させることを含む方法を提供する。本明細書に上記されているとおり、該ｍｉＲＮＡは、該ｍｉＲＮＡファミリーのあらゆるメンバーを含み、および／または
−該対象内で、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８ａ＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５２、ｈａｓ−ｍｉｒ−６７５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８ｂ＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５４、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２、ＨＳ＿２０２．１、ｍｉＲ−３０２ｄおよび／またはｓｏｌｅｘａ−３９２７−２２１またはそれらの機能性部分または誘導体からなる群から選択されるｍｉＲＮＡの発現、量および／または活性を減少させ、および／または
−該対象内で、特定の標的ｍＲＮＡとｈｓａ−ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８ａ＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５２、ｈｓａ−ｍｉＲ−６７５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８ｂ＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５４、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２、ＨＳ＿２０２．１および／またはｓｏｌｅｘａ−３９２７−２２１、またはそれらの機能性部分または誘導体からなる群から選択されるｍｉＲＮＡの相互作用を減少させる。本明細書に上記されているとおり、該ｍｉＲＮＡは、該ｍｉＲＮＡファミリーのあらゆるメンバーを含む。
【００４８】
１つの態様において、該対象は、心不全と診断されている。別の態様において、しかしながら、例えば、該対象がすでに損傷または疾患に罹患しているため、該対象は心不全の高い危険性を有する。別の態様において、本発明の方法は、一般的に非罹患対象において心不全を予防するために実施される。
【００４９】
心不全を診断するための方法は、当分野で知られている。対象は、例えば、機械的剛性が増加しているか否か、正常機能、例えば、心臓の電気的特性が減少しているか否か、ＥＣＭタンパク質が過剰に蓄積しているか否か、および／または特定の遺伝子産物のレベルがある域値レベルを越えているか否かを決定することにより、心不全と診断される。しばしば、対象が損傷または障害に罹患しているとき、心不全の危険性は増加する。
【００５０】
本発明の方法は、心不全に対する診断および治療的使用のために適当である。１つの好ましい態様において、本発明の方法は、心不全を中和、処置、減少、遅延および／または予防するために使用される。したがって、対象における心不全を処置および／または予防するための方法であって、
−このような処置および／または予防の必要な対象内で、本明細書において特定されているとおり心不全において下方調節されているｍｉＲＮＡの発現、量および／または活性を増加させ、および／または本明細書において特定されているとおり心不全において上方調節されているｍｉＲＮＡの発現、量および／または活性を減少させることを含む方法をさらに提供する。これは、例えば、下方調節された、および上方調節されたｍｉＲＮＡそれぞれに対して、これらのｍｉＲＮＡの標的ｍＲＮＡ間の相互作用を増加させることにより、および／またはこれらのｍｉＲＮＡの標的ｍＲＮＡ間の相互作用を減少させることにより達成され得る。
【００５１】
１つの好ましい態様において、該対象は、心不全を有する、または心不全の危険性を有すると診断されている。別の態様において、該方法は、一般的に非罹患対象において心不全を予防するために実施される。
【００５２】
例えば、ｍｉＲＮＡの発現および／または活性を増加させることができる活性化化合物を投与することにより、直接的に本明細書において示されている心不全において下方調節されるｍｉＲＮＡの発現、量および／または活性を増加させることができる。また、例えば、ｍｉＲＮＡのインヒビターの発現、量および／または活性を減少させることにより、間接的にｍｉＲＮＡの発現、量および／または活性を増加させることができる。本明細書において示されている心不全において上方調節されるｍｉＲＮＡの発現、量および／または活性を減少させるという逆もある。
【００５３】
好ましい態様において、ｍｉＲＮＡの量は、プリ−ｍｉＲＮＡおよび／またはプレ−ｍｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡ、またはそれらの機能性部分もしくは誘導体を該対象に投与することにより増加する。これらのいずれかの化合物、またはこれらの化合物の任意の組み合わせの投与は、標的ｍＲＮＡの（増加された）中和、したがって、心不全の中和および／または予防をもたらす。プリ−ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによるゲノムｍｉＲＮＡ配列の転写後に得られる数キロベース長を有するｍｉＲＮＡの一次転写産物である。プレ−ｍｉＲＮＡは、リボヌクレアーゼＤｒｏｓｈａによるプリ−ｍｉＲＮＡのプロセッシング後に得られるより短い７０−１００ヌクレオチドのステムループ構造である。本明細書において示されているｍｉＲＮＡの配列は、図３に記載されている。
【００５４】
プリ−ｍｉＲＮＡまたはプレ−ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの機能性部分は、プリ−ｍｉＲＮＡまたはプレ−ｍｉＲＮＡまたは（成熟）ｍｉＲＮＡのそれぞれよりも短く、標的ｍＲＮＡ遺伝子（ｍｉＲＮＡが結合するｍＲＮＡをコードする遺伝子）および／または標的ｍＲＮＡに結合し、標的ｍＲＮＡ由来のタンパク質または該遺伝子の発現を中和することができる少なくとも７ヌクレオチド長を有する核酸配列として本明細書において定義される。該機能性部分は、好ましくはｍｉＲＮＡにより結合されることができる標的ｍＲＮＡの同じ３’ＵＴＲ領域に結合することができる。該機能性部分は、好ましくはｍｉＲＮＡのシード領域の配列を含む。ｍｉＲＮＡのシード領域は、天然ｍｉＲＮＡの５’領域に存在する。該シード領域は標的認識に特に関与する。ｍｉＲＮＡのシード領域の配列は、ｍｉＲＮＡとｍＲＮＡ間の結合試験を実施することにより困難性または発明力なしに当業者により見出すことができる。したがって、プリ−ｍｉＲＮＡまたはプレ−ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの機能性部分は、好ましくはシード領域配列を含む少なくとも７ヌクレオチド長を有する核酸配列である。しかしながら、標的ｍＲＮＡ遺伝子または標的ｍＲＮＡに結合する能力が維持されている限り、該シード領域のわずかな修飾が可能である。したがって、プリ−ｍｉＲＮＡまたはプレ−ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの機能性部分は、また、本明細書において示されているｍｉＲＮＡのシード領域の配列と少なくとも７２％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８６％、さらに好ましくは少なくとも９０％配列同一性を有する配列を含む、少なくとも７ヌクレオチド長を有する核酸配列を含む。
【００５５】
プリ−ｍｉＲＮＡまたはプレ−ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの機能性誘導体は、本明細書において、プリ−ｍｉＲＮＡまたはプレ−ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡと７０％以上１００％未満の配列同一性を有する配列を含み、定量的考察にかかわりなく共通して少なくとも１個の同じ特性を有する分子と定義される。該機能性同等物は、プリ−ｍｉＲＮＡまたはプレ−ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡと必ずしも同程度ではないが、標的ｍＲＮＡ遺伝子および／または標的ｍＲＮＡに結合し、該遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を中和することができる。このような機能性同等物は、例えば：
−１つ以上のヌクレオチドがプリ−ｍｉＲＮＡまたはプレ−ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの天然配列に付加されたポリヌクレオチド；
−シード領域配列が図３において示されているｍｉＲＮＡ配列と少なくとも７２％配列同一性を維持している限り、１−４０％間のヌクレオチドが１つ以上の他のヌクレオチドにより置換されているプリ−ｍｉＲＮＡまたはプレ−ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ分子；および／または
−得られる産物が非天然ヌクレオチドを有するように、少なくとも１個のヌクレオチドが修飾されているプリ−ｍｉＲＮＡまたはプレ−ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ誘導体を含む。好ましくは、プリ−ｍｉＲＮＡまたはプレ−ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの機能性同等物は、プリ−ｍｉＲＮＡまたはプレ−ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡと少なくとも約７５％配列同一性、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、さらに好ましくは少なくとも約９５％を有するヌクレオチド配列を有する。配列同一性が高いほど、該機能性同等物はプリ−ｍｉＲＮＡまたはプレ−ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡとより密接に似る。
【００５６】
プリ−ｍｉＲＮＡまたはプレ−ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの機能性同等物の好ましい例は、少なくともｍｉＲＮＡのシード領域を含むベクター、またはシード領域配列と少なくとも７２％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８６％、さらに好ましくは少なくとも９０％配列同一性を有する配列を含むベクターである。
【００５７】
「％配列同一性」なる用語は、本明細書において、配列をアラインし、所望により、必要なとき、最大％配列同一性を成し遂げるためにギャップを導入した後に、興味ある核酸配列におけるヌクレオチドと同一である核酸配列におけるヌクレオチドのパーセントとして定義される。アラインメントのための方法およびコンピュータープログラムは当分野でよく知られている。本明細書において使用される「核酸配列」および「ヌクレオチド」なる用語は、また、核酸配列に基づく、および／または該配列に由来の非天然分子、例えば、人工的に修飾された核酸配列、ペプチド核酸、ならびに少なくとも１個の修飾されたヌクレオチドおよび／または非天然ヌクレオチド、例えば、イノシンを含む核酸配列を含む。
【００５８】
ポリヌクレオチドを細胞に導入するための方法は当分野で知られている。核酸を導入するための方法は、例えばリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーションまたはリポソーム介在トランスフェクションを含む。あるいは、ポリヌクレオチドの直接注射を使用する。しかしながら、好ましくは、核酸配列はベクター、好ましくはウイルスベクターにより細胞に導入される。該ベクターは、好ましくはレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、またはレンチウイルスベクターを含む。１つの態様において、ＡＡＶ９ベクターを使用する。
【００５９】
ベクターにより核酸の細胞への導入を示す種々の用語が当分野で知られている。このような用語の例は、「形質導入」、「トランスフェクション」および「形質転換」である。核酸配列を有するベクターを作製するため、および該ベクターを細胞に導入するための技術は当分野で知られている。
【００６０】
好ましくは、インビボにて哺乳動物細胞に導入することができるプリ−ｍｉＲＮＡまたはプレ−ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ、またはそれらの機能性部分または誘導体を使用する。本発明の方法の非限定的な例は、該核酸配列の細胞透過性ペプチド、マイクロキャリアまたはナノキャリアへの結合、または該核酸配列を含むリポソームの使用である。好ましくは、該インヒビターは、例えば、該インヒビターへ結合した人工ＨＤＬ様粒子を使用して、心筋への送達を増強することにより、心筋細胞に標的化される。
【００６１】
本発明において、心不全は、該対象において下方調節されているか、または下方発現されているプリ−ｍｉＲＮＡまたはプレ−ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ、またはそれらの機能性部分もしくは誘導体を、心不全に罹患しているか、または罹患している危険性がある対象に投与することにより、特に中和および／または予防される。心不全は、また、該対象において下方調節されているか、または下方発現されているｍｉＲＮＡの発現、量および／または活性を増加または回復することができる化合物を投与することにより、または該対象において標的ｍＲＮＡと下方調節されているか、または下方発現されているｍｉＲＮＡの相互作用を増加することができる化合物を投与することにより、中和および／または予防される。したがって、本発明は、心不全の中和、処置、減少、遅延および／または予防における使用のための、該対象において下方調節されているか、または下方発現されているプリ−ｍｉＲＮＡおよび／またはプレ−ｍｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡ、またはそれらの機能性部分もしくは誘導体、または、細胞において本明細書において示されている心不全において下方調節されているか、または下方発現されているｍｉＲＮＡの発現、量および／または活性を増加または回復することができる化合物、または、標的ｍＲＮＡと本明細書において示されている心不全において下方調節されているか、または下方発現されているｍｉＲＮＡの相互作用を増加することができる化合物をさらに提供する。本明細書において示されている心不全において上方調節されているまたは上方発現されているｍｉＲＮＡについての逆は真である。
【００６２】
したがって、上記化合物またはそれらの任意の組合せは、心不全に対する薬剤または予防剤の調製に対して特に適当である。したがって、本明細書において示されているプリ−ｍｉＲＮＡおよび／またはプレ−ｍｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡ、またはそれらの機能性部分もしくは誘導体の使用、または細胞におけるｍｉＲＮＡの発現、量および／または活性を増加または回復することができる化合物の使用、または心不全に対する薬剤または予防剤の調製のための標的ｍＲＮＡと該ｍｉＲＮＡの相互作用を増加することができる化合物の使用をさらに提供する。該予防剤は、心不全の危険性が高い対象、ならびに心不全にすでに罹患している対象に対して特に適当である。しかしながら、該予防剤は、また、一般的に非罹患対象における心不全の予防に対して適当である。
【００６３】
上記は、また、本明細書において特定されているｍｉＲＮＡの標的ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質産物の量または活性を増加または減少させることにより成し遂げることができる。上記化合物のいずれか、またはそれらの任意の組合せの対象への投与は、該対象における心不全の中和および／または予防に対して特に適当である。１つの態様において、上記化合物のいずれか、またはそれらの任意の組合せが、心不全と診断された対象に投与される。別の態様において、上記化合物のいずれかまたはそれらの任意の組合せは、心不全の危険性が高い対象、例えば、損傷または疾患にすでに罹患している対象に投与される。しかしながら、該化合物またはそれらの任意の組合せは、また、一般的に非罹患対象における心不全の予防に対して適当である。
【００６４】
すでに記載されているとおり、心不全の存在または危険性を確立するための方法は、心臓機能の試験を含む。今回、本明細書において特定されている（プリ／プレ）ｍｉＲＮＡレベルまたは標的ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質のレベルの蓄積の測定を含む方法を提供することができることを見出した。しかしながら、今回、本発明は、ｍｉＲＮＡのグループと心不全間の関連の存在を記載し、さらなる方法が利用できるようになった。本発明において、心不全の存在または危険性は、対象のサンプルにおける本明細書において特定されている心不全と関連するプリ−ｍｉＲＮＡおよび／またはプレ−ｍｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡの量が特定の参照値より高いか低いかを決定することにより確立される。１つの態様において、該参照値は、健常対象または健常集団におけるｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−７４４、ｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｓｏｌｅｘａ−２９５２−３０６からなる群から選択されるプリ−ｍｉＲＮＡおよび／またはプレ−ｍｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡの量を示す。対象のサンプルにおける該プリ−ｍｉＲＮＡおよび／またはプレ−ｍｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡの量が参照値よりも有意に低いとき、標的ｍＲＮＡ発現は有意に中和されない。結果として、標的ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現は非常に高く、対象は心不全に罹患している、または罹患している危険性がある。このような場合において、本発明の治療が推奨される。
【００６５】
他方では、対象のサンプルにおけるｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−１９１＊、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１２２８＊、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８ａ＊、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−２９９−３ｐ、ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｍｉＲ−６５２、ｍｉＲ−６７５、ｍｉＲ−１２９−５ｐ、ｍｉＲ−１８ｂ＊、ｍｉＲ−１２５４、ｍｉＲ−６２２、ＨＳ＿２０２．１、ｍｉＲ−３０２ｄおよび／またはｓｏｌｅｘａ−３９２７−２２１からなる群から選択されるｍｉＲＮＡのプリ−ｍｉＲＮＡおよび／またはプレ−ｍｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡの量が参照値よりも有意に高いとき、標的ｍＲＮＡ発現（またはタンパク質への標的ｍＲＮＡの翻訳）は大幅に中和される。この場合、対象は、また、心不全に罹患している、または罹患している危険性があると診断される。
【００６６】
心不全と関連するプリ−ｍｉＲＮＡおよび／またはプレ−ｍｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡの量は、サンプル、好ましくは血液サンプルまたは尿サンプルからのＲＮＡの単離後に決定され得る。ＲＮＡの単離は、好ましくは、存在するときＲＮａｓｅを不活性化するために、強い変性剤、例えば、ＧＩＴＣ、ＬｉＣｌ、ＳＤＳおよび／またはフェノールの存在下で実施される。ＲＮＡを単離するための方法は、市販のＲＮＡ単離キット、例えば、例えば、mirVana PARIS kit (Ambion) en Trizol LS (Invitrogen)の使用を含む当分野で知られている。しかしながら、サンプルは、ＲＮＡの単離なしに、例えば、サンプルから小胞、例えば、微小胞を単離することにより、ｍｉＲＮＡ配列の検出のために処理することができる。
【００６７】
サンプルにおけるｍｉＲＮＡの検出のための方法は、当業者に知られており、ノーザンブロット法、マイクロおよびマクロアレイの使用、インサイチュハイブリダイゼーション、液体相の単一の分子検出、超並列配列決定および定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）を含む。サンプルにおけるＲＮＡは、好ましくはｍｉＲＮＡ配列の検出の前に増幅される。ＲＮＡ配列の増幅のための方法は、当分野で知られており、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）および核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）を含む。好ましい増幅方法は、例えば、ＳＹＢＲ  ＧＲＥＥＮ（Roche, Basel, Switzerland）または蛍光標識されたＴａｑｍａｎ  プローブ（Applied Biosystems, Foster City, USA）の使用によるＲＮＡ配列の定量的増幅を含む。
【００６８】
逆転写酵素介在ｃＤＮＡ合成のためのプライマーは、ライゲーションにより、またはターミナルトランスフェラーゼの作用を介して、全てのｍｉＲＮＡ配列に対する共有の配列、例えば、ポリ（Ａ）−テイルの提供、次にアダプター−オリゴ（ｄＴ）プライマーのアニーリングにより提供され得る。さらなる方法は、ステムループプライマーの使用、および／またはｍｉＲＮＡ−特異的プライマーの使用を含む。好ましくはリアルタイムＰＣＲによる、ＲＮＡ配列の定量的増幅は、好ましくは、ユニバーサルプライマーおよびｍｉＲＮＡ−特異的プライマーを含む。
【００６９】
検出、ｃＤＮＡ合成および／または増幅のために使用されるプライマーは、好ましくはＲＮＡヌクレオチド、ＤＮＡヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチド、例えば、Ｌｏｃｋｅｄ  核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）ヌクレオチド、および／または２’−Ｏ−アルキル修飾、２’−フルオロ修飾、４’−チオ修飾、ホスホロチオエート結合、モルホリノ結合、ホスホノカルボキシ結合を含む。好ましい態様において、プライマー、好ましくはｍｉＲＮＡ−特異的プライマーの長さは、特定のｍｉＲＮＡの長さと同一である。さらに好ましい態様において、ｍｉＲＮＡ特異的プライマーの長さは、特定のｍｉＲＮＡの長さに依存してｍｉＲＮＡの長さよりも短く、例えば、１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、または２３ヌクレオチドである。プライマー、好ましくはｍｉＲＮＡ−特異的プライマーの配列は、好ましくは、ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡに加えられるアダプター配列の配列と比較して１または２個のミスマッチを含み、より好ましくはｍｉＲＮＡの配列と同一である。
【００７０】
サンプルにおける１つ以上のｍｉＲＮＡの検出のための方法および手段は、好ましくはキットとして提供される。該キットは、好ましくは、プライマーのセット、好ましくは少なくとも１個の特異的なプライマーのセット、酵素、例えば、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよび／またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ならびに反応行うための少なくとも１個のバッファーを含む。該キットは、例えば凍結乾燥後の、乾燥させた物質、または液体として提供され得る。
【００７１】
対象のサンプルにおけるプリ−ｍｉＲＮＡおよび／またはプレ−ｍｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡの量が参照値と本質的に同じであるとき、標的ｍＲＮＡ発現は十分に中和されている。この場合、対象は、心不全に罹患している、または罹患する危険性があると診断されない。
【００７２】
もちろん、健常対象のもの以外の他の種類の参照値を使用することができる。例えば、参照値は、心不全に罹患している対象または集団におけるプリ−ｍｉＲＮＡおよび／またはプレ−ｍｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡの量を示すものを使用することができる。この場合、該参照値と本質的に同じであるプリ−ｍｉＲＮＡおよび／またはプレ−ｍｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡの量を有するサンプルは、心不全（の危険性）を示す。該値が非常に少ない、または多いサンプルは健常を示す。
【００７３】
したがって、本発明は、対象が心不全に罹患しているか否かを、または対象が心不全を発症する危険性が高いか否かを決定するための方法であって、
−該対象由来のサンプルを得；
−該サンプルにおいて本明細書において心不全と関連すると示されているプリ−ｍｉＲＮＡおよび／またはプレ−ｍｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡの量を決定し；
−該量と参照量を比較し；
−対象が心不全に罹患しているか否か、または心不全を発症する危険性が高いか否かを該比較から決定する
ことを含む方法を提供する。
【００７４】
対象のサンプルにおけるプリ−ｍｉＲＮＡおよび／またはプレ−ｍｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡの量は、好ましくは結合化合物を使用して確立される。少なくとも一部のサンプルを、好ましくはこのような結合化合物と接触させ（所望によりサンプルの以前の処理後）、その後、非結合成分を好ましくは洗い流し、結合化合物を好ましくは可視化および定量化する。したがって、１つの態様は、対象が心不全に罹患しているか否かを、または対象が心不全を発症する危険性が高いか否かを決定するための本発明の方法であって、少なくとも１部の該サンプルとプリ−ｍｉＲＮＡおよび／またはプレ−ｍｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡに特異的に結合することができる少なくとも１個の化合物を接触させることをさらに含む方法を提供する。もちろん、該サンプルの一部のみが使用されるとき、適当な試験が実施されるようにｍｉｃｒｏＲＮＡを含む一部を使用される。
【００７５】
サンプルは、好ましくは血液または血漿または尿サンプルである。
本発明は、本発明の方法を実施するためのパーツのキットをさらに提供する。したがって、
−心不全と関連すると本明細書において示されているプリ−ｍｉＲＮＡおよび／またはプレ−ｍｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡに特異的に結合することができる少なくとも１個の化合物；および
−対象が心不全に罹患しているか否かを決定するための該化合物の使用のための指示書
を含むパーツのキットをさらに提供する。
【００７６】
本発明は、本発明の治療を実施するためのパーツのキットをさらに提供する。このようなパーツのキットで、標的ｍＲＮＡ発現は、一般的に、ｍｉＲＮＡを介して中和される。本発明のパーツのキットは、
−心不全において下方調節または下方発現されると本明細書において示されているプリ−ｍｉＲＮＡおよび／またはプレ−ｍｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡ、またはそれらの機能性部分もしくは誘導体、および／または
−細胞において心不全において下方調節または下方発現されると本明細書において示されているプリ−ｍｉＲＮＡおよび／またはプレ−ｍｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡの発現、量および／または活性を増加または回復することができる化合物、および／または
−標的ｍＲＮＡと心不全において下方調節または下方発現されると本明細書において示されているプリ−ｍｉＲＮＡおよび／またはプレ−ｍｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡの相互作用を増加することができる化合物、および
−必要とする対象における心不全を中和、処置、減少、遅延および／または予防するための該化合物の使用のための指示書を含む。心不全において下方調節または下方発現されると本明細書において示されている該プリ−ｍｉＲＮＡおよび／またはプレ−ｍｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡ、またはそれらの機能性部分もしくは誘導体は、好ましくはベクターに存在する。また、任意の上記化合物をコードする核酸配列を含むベクターを使用することができる。好ましくは、該ベクターは、ウイルスベクター、さらに好ましくはレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスまたはレンチウイルスベクターを含む。１つの態様において、ＡＡＶ９ベクターを使用する。
【００７７】
したがって：
−心不全において下方調節または下方発現されると本明細書において示されているプリ−ｍｉＲＮＡおよび／またはプレ−ｍｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡ、またはそれらの機能性部分もしくは誘導体、および／または
−細胞において心不全において下方調節または下方発現されると本明細書において示されているｍｉＲＮＡの発現、量および／または活性を増加または回復することができる化合物をコードする核酸配列、および／または
−心不全において下方調節または下方発現されると本明細書において示されている標的ｍＲＮＡとｍｉＲＮＡの相互作用を増加することができる化合物をコードする核酸配列
を含むベクターをさらに提供する。
【００７８】
１つの好ましい態様において、該ベクターは、
−１つ以上のｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−７４４、ｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｓｏｌｅｘａ−２９５２−３０６、またはそれらのプレ−またはプリ−ｍｉＲＮＡ、またはそれらの機能性部分もしくは誘導体、および／または
−細胞において１つ以上のｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−７４４、ｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｓｏｌｅｘａ−２９５２−３０６の発現、量および／または活性を増加または回復することができる化合物をコードする核酸配列、および／または
−１つ以上のｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−７４４、ｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｓｏｌｅｘａ−２９５２−３０６の標的ｍＲＮＡとｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−７４４、ｍｉＲ−１４２およびｓｏｌｅｘａ−２９５２−３０６の相互作用を増加することができる化合物をコードする核酸配列を含む。このようなベクターは、心不全を中和するために特に適当である。
【００７９】
本発明のベクターは、好ましくはレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスまたはレンチウイルスベクターを含む。１つの態様において、該ベクターは、ＡＡＶ９ベクターを含む。
【００８０】
任意の本発明のベクターの上記核酸配列は、好ましくは、該核酸の発現がトランスフェクション後に起こるようにプロモーターに作動可能に連結している。該プロモーターは、好ましくは哺乳動物細胞における発現のために適当である。特に好ましい態様において、本発明のベクターは、心不全（の危険性）が中和されるように、心臓細胞における発現のために適当である。この事実において、該ベクターは、好ましくは心臓細胞における発現に適当なプロモーターを含む。しかしながら、別の態様において、本発明のベクターは、ユビキタスプロモーターを含む。本発明のベクターの（少なくとも１個の）核酸の発現が任意に調節されるように、誘導プロモーターを使用する利点がある。誘導プロモーターの非限定的な例は、心筋細胞特異的プロモーターである心臓トロポニンおよびアルファミオシン重鎖である。１つの態様において、心臓繊維芽細胞特異的プロモーターを使用してもよい。
【００８１】
本発明のベクターは治療のために特に適当である。したがって、心不全を中和、処置、減少、遅延および／または予防するための薬剤および／または予防剤の調製のための上記定義のベクターの使用をさらに提供する。
【００８２】
また、対象における心不全を中和、処置、減少、遅延および／または予防するための方法であって、治療量の本発明のベクターを対象に投与することを含む方法も提供する。繰り返しになるが、該ベクターは、好ましくはレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスまたはレンチウイルスベクターを含む。１つの態様において、ＡＡＶ９ベクターを使用する。本発明のベクターを含む単離された細胞または組換え細胞を提供する。
【００８３】
インビトロにてプリ−ｍｉＲＮＡおよび／またはプレ−ｍｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡを有する細胞を提供することができる。このような細胞は研究目的のために特に適当である。さらに、このような細胞は治療のために適当である。例えば、１つ以上のｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−７４４、ｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｓｏｌｅｘａ−２９５２−３０６を過剰発現する細胞を、心不全の危険性を減少させるために対象に投与することができる。したがって、心不全を中和、処置、減少、遅延および／または予防するための薬剤および／または予防剤の調製のための、１つ以上のｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−７４４、ｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｓｏｌｅｘａ−２９５２−３０６、またはそれらの機能性部分もしくは誘導体を過剰発現することができる単離された細胞の使用をさらに提供する。あるいは、心不全に罹患している対象において過剰発現されていると本明細書において示されているｍｉＲＮＡの標的ｍＲＮＡによってコードされる１つ以上のタンパク質を過剰発現する、好ましくは分泌することができる単離された細胞の使用を予測する。
【００８４】
本明細書において示されている化合物の１種または組合せを、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と共に含む心不全の予防および／または処置を可能にする医薬組成物も、本明細書において提供される。
【００８５】
本発明の医薬組成物は、本明細書において示されている下方調節または下方発現が心不全と関連するｍｉＲＮＡのプリ−ｍｉＲＮＡおよび／またはプレ−ｍｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡ、またはそれらの機能性部分もしくは誘導体、および／または
−細胞における該ｍｉＲＮＡの発現、量および／または活性を増加または回復することができる化合物、および／または
−標的ｍＲＮＡと該ｍｉＲＮＡの相互作用を増加することができる化合物、および／または
−細胞における該ｍｉＲＮＡを発現することができる本発明のベクター、および／または
−該ｍｉＲＮＡ、またはそれらの機能性部分もしくは誘導体を過剰発現することができる細胞、および／または
−本明細書において示されている上方調節または過剰発現が心不全と関連するｍｉＲＮＡの標的ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質、または該タンパク質を発現することができるベクターまたは細胞
を薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と共に含み得る。
【００８６】
また、対象における心不全を中和、処置、減少、遅延および／または予防するための方法であって、治療量の本発明の医薬組成物を該対象に投与する方法も提供する。
【００８７】
−上方または下方調節が本明細書において示されている心不全と関連する１つ以上のプリ−ｍｉＲＮＡおよび／またはプレ−ｍｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡ、またはそれらの機能性部分もしくは誘導体を含む外因性核酸配列、および／または
−上方または下方調節が細胞において本明細書において示されている心不全、またはそれらの機能性部分もしくは誘導体と関連するｍｉＲＮＡの発現、量および／または活性を増加または阻害することができる化合物をコードする外因性核酸配列、および／または
−標的ｍＲＮＡと上方または下方調節が本明細書において示されている心不全と関連するｍｉＲＮＡの相互作用を増加することができる化合物をコードする外因性核酸配列
を含む非ヒト動物をさらに提供する。
【００８８】
該非ヒト動物は、好ましくは、哺乳動物を含む。１つの好ましい態様において、該非ヒト動物は、試験動物、例えば、齧歯動物、ウサギ、ヤギ、ウシ、ヒツジまたはサルを含む。本発明のベクター、単離された細胞、および／または医薬組成物で提供されている非ヒト動物も提供される。本発明の非ヒト動物は、とりわけ、本明細書において示されている心不全を脱調節するｍｉＲＮＡの発現、量および／または活性を阻害または減少することができる候補化合物のスクリーニング、検出および／または同定のために有用である。このような非ヒト試験動物は、また、とりわけ、標的ｍＲＮＡとその対応するｍｉＲＮＡの相互作用を減少させることができる候補化合物のスクリーニング、検出および／または同定のために有用である。したがって、本発明の非ヒト試験動物は、とりわけ、心不全を増加または増強することができる候補化合物のスクリーニング、検出および／または同定のために有用である。候補化合物がこの特性を有することが明白であるとき、ヒト対象への投与を回避することを推奨する。
【００８９】
本発明の処置方法において、対象は、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトであり、本明細書において示されているｍｉＲＮＡは、好ましい態様において、ホモサピエンス（ｈｓａ）ｍｉＲＮＡを言及する。
【００９０】
さらに別の態様において、方法は、心不全を中和、処置、減少、遅延および／または予防することができる候補化合物のスクリーニング、検出および／または同定のために提供される。この態様において、候補化合物を、一般的に、下方調節が心不全と関連するｍｉＲＮＡの発現、量および／または活性を増加する可能性のある能力、上方調節が心不全と関連するｍｉＲＮＡの発現、量および／または活性を減少する可能性のある能力、または本明細書において示されている異常ｍｉＲＮＡ発現と関連する異常タンパク質発現の効果を中和する能力に対してスクリーニングする。候補化合物がこの特性を有することが明白であるとき、心不全において中和または予防することができる。したがって、候補化合物が、心不全を中和、処置、減少、遅延および／または予防することができるか否かを決定するための方法であって、
−該候補化合物を細胞、好ましくは心臓細胞と接触させ、
−該候補化合物が、該細胞において本明細書において示されている異常ｍｉＲＮＡ発現と関連する異常タンパク質発現の効果を中和することができるか否かを決定する
ことを含む方法をさらに提供する。
【００９１】
１つの好ましい態様において、候補化合物を、ｍｉＲＮＡ発現または活性時の候補化合物の効果がさらに明白に認識できるように、ｍｉＲＮＡ（好ましくは、心不全において下方調節されている）の発現を減少させる本発明の細胞と接触させる。しかしながら、また、本発明のスクリーニング方法において現在当分野で知られているあらゆる細胞または非ヒト動物を使用することができる。１つの態様において、本発明において非ヒト動物を使用する。
【００９２】
別の態様において、候補化合物を、標的ｍＲＮＡと本明細書において示されているｍｉＲＮＡ、またはそれらの機能性部分または誘導体の相互作用を増加する能力に対してスクリーニングする。候補化合物が下方調節が心臓疾患と関連するｍｉＲＮＡに関してこの特性を有することが明白であるとき、心不全において中和または予防することができる。したがって、候補化合物が、心不全を中和、処置、減少、遅延および／または予防することができるか否かを決定するための方法であって、
−該候補化合物を細胞、好ましくは心臓細胞と接触させ、
−該候補化合物が、該細胞内で、ｍＲＮＡと１つ以上のｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−７４４、ｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｓｏｌｅｘａ−２９５２−３０６、またはそれらの機能性部分または誘導体の相互作用を増加することができるか否かを決定する
ことを含む方法をさらに提供する。
【００９３】
好ましい態様において、本発明の心不全に罹患しているか、または心不全を発症する危険性があると対象を診断するための方法は、（ａ）ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−１９１＊、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１２２８＊、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８ａ＊、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−２９９−３ｐ、ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｍｉＲ−６５２、ｍｉＲ−６７５、ｍｉＲ−１２９−５ｐ、ｍｉＲ−１８ｂ＊、ｍｉＲ−１２５４、ｍｉＲ−６２２、ＨＳ＿２０２．１、ｓｏｌｅｘａ−３９２７−２２１、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−３０２ｄ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−７４４、ｍｉＲ−１４２−３ｐおよび／またはｓｏｌｅｘａ−２９５２−３０６、またはそれらの前駆体ｍｉｃｒｏＲＮＡ（プレ−ｍｉＲＮＡ）またはｍｉｃｒｏＲＮＡ一次転写産物から選択される少なくとも１個のｍｉＲＮＡレベルを決定する工程、（ｂ）工程（ａ）において決定された該少なくとも１個の遺伝子マーカーのレベルに基づいて、対象が心不全に罹患しているか、または心不全を発症する危険性があるか否かを診断する工程を含む。好ましいｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−４２３−５ｐである。
【００９４】
さらに好ましい態様において、本発明の方法は、ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−１９１＊、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１２２８＊、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８ａ＊、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−２９９−３ｐ、ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｍｉＲ−６５２、ｍｉＲ−６７５、ｍｉＲ−１２９−５ｐ、ｍｉＲ−１８ｂ＊、ｍｉＲ−１２５４、ｍｉＲ−６２２、ＨＳ＿２０２．１、ｓｏｌｅｘａ−３９２７−２２１、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−３０２ｄ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−７４４、ｍｉＲ−１４２−３ｐおよび／またはｓｏｌｅｘａ−２９５２−３０６、またはそれらの前駆体ｍｉｃｒｏＲＮＡ（プレ−ｍｉＲＮＡ）またはｍｉｃｒｏＲＮＡ一次転写産物から選択される少なくとも２個のｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−１９１＊、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１２２８＊、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８ａ＊、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−２９９−３ｐ、ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｍｉＲ−６５２、ｍｉＲ−６７５、ｍｉＲ−１２９−５ｐ、ｍｉＲ−１８ｂ＊、ｍｉＲ−１２５４、ｍｉＲ−６２２、ＨＳ＿２０２．１、ｓｏｌｅｘａ−３９２７−２２１、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−３０２ｄ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−７４４、ｍｉＲ−１４２−３ｐおよび／またはｓｏｌｅｘａ−２９５２−３０６、またはそれらの前駆体ｍｉｃｒｏＲＮＡ（プレ−ｍｉＲＮＡ）またはｍｉｃｒｏＲＮＡ一次転写産物から選択される、例えば、２個のｍｉＲＮＡ、３個のｍｉＲＮＡ、４個のｍｉＲＮＡ、５個のｍｉＲＮＡ、６個のｍｉＲＮＡ、７個のｍｉＲＮＡ、８個のｍｉＲＮＡ、９個のｍｉＲＮＡ、１０個のｍｉＲＮＡ、１５個のｍｉＲＮＡ、２０個のｍｉＲＮＡ、全てのｍｉＲＮＡレベルを決定することを含む。
【００９５】
好ましい態様において、該少なくとも２個のｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−４２３−５ｐおよびｍｉＲ−１９１＊、ｍｉＲ−４２３−５ｐおよびｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−４２３−５ｐおよびｍｉＲ−１２２８＊、ｍｉＲ−４２３−５ｐおよびｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−４２３−５ｐおよびｍｉＲ−１８ａ＊、ｍｉＲ−４２３−５ｐおよびｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−４２３−５ｐおよびｍｉＲ−２９９−３ｐ、ｍｉＲ−４２３−５ｐおよびｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｍｉＲ−４２３−５ｐおよびｍｉＲ−６５２、ｍｉＲ−４２３−５ｐおよびｍｉＲ−６７５、ｍｉＲ−４２３−５ｐおよびｍｉＲ−１２９−５ｐ、ｍｉＲ−４２３−５ｐおよびｍｉＲ−１８ｂ＊、ｍｉＲ−４２３−５ｐおよびｍｉＲ−１２５４、ｍｉＲ−４２３−５ｐおよびｍｉＲ−６２２、ｍｉＲ−４２３−５ｐおよびＨＳ＿２０２．１、ｍｉＲ−４２３−５ｐおよびｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−４２３−５ｐおよびｍｉＲ−３０２ｄ、ｍｉＲ−４２３−５ｐおよびｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−４２３−５ｐおよびｍｉＲ−７４４、ｍｉＲ−４２３−５ｐおよびｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−４２３−５ｐおよびｓｏｌｅｘａ−２９５２−３０６、またはｍｉＲ−４２３−５ｐおよびｓｏｌｅｘａ−３９２７−２２１からなる群から選択される。
【００９６】
本発明の診断および／または予知するための好ましい方法は、心不全を診断および／または予知するために使用され得る１つ以上のバイオマーカーの検出をさらに含む。これらのバイオマーカーは、好ましくは、炎症マーカー、例えば、Ｃ−反応性タンパク質および炎症性サイトカイン、例えば、インターロイキン−６および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）；酸化ストレスの指標、例えば、低密度のリポタンパク質、マロンジアルデヒドおよびミエロペルオキシダーゼならびに血漿および尿中のイソプロスタンレベル；心室の細胞外マトリックスのリモデリングに対するマーカー、例えば、プロペプチドプロコラーゲンＩ型および／またはプロペプチドプロコラーゲンＩＩＩ型；神経ホルモン、例えば、ノルエピネフリンおよびエンドセリン−１の血漿レベル；筋細胞損傷に対するマーカー、例えば、心臓トロポニンＴおよびＩ；心臓リモデリングおよび線維症のマーカー、例えば、ガレクチン−３、および筋細胞ストレスに対するマーカー、例えば、ナトリウム利尿ペプチドＢＮＰおよびＮ−末端プロ−脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＮＴ−プロ−ＢＮＰ）、アドレノメデュリンおよびＳＴ２、インターロイキン−１受容体ファミリーメンバーを含む。加えて、本発明の診断および／または予知するためのさらなる好ましい方法は、慣用の方法、例えば、心電図検査法、心エコー検査、および／または心臓磁気共鳴画像法（ＣＭＲ）を含む。
【００９７】
さらに好ましい態様において、本発明の診断および／または予知するための方法の結果は、心不全に罹患しているか、または心不全を発症する危険性がある対象の処置の方法の少なくとも一部で決定される。可能な処置は、食事療法、例えば、ナトリウム摂取の低下、肥満対象における体重減少、および／または喫煙の阻止；薬物、例えば、アンジオテンシン変換酵素インヒビターおよび／またはベータ−アドレナリン受容体アンタゴニストの処方；および／または侵襲的方法、例えば、血行再建術、僧帽弁手術、心室回復および心臓移植を含む。処置の選択は、少なくとも１部分において、対象から得られたサンプルにおいて決定されるｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−１９１＊、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１２２８＊、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８ａ＊、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−２９９−３ｐ、ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｍｉＲ−６５２、ｍｉＲ−６７５、ｍｉＲ−１２９−５ｐ、ｍｉＲ−１８ｂ＊、ｍｉＲ−１２５４、ｍｉＲ−６２２、ＨＳ＿２０２．１、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−３０２ｄ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−７４４、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｓｏｌｅｘａ−２９５２−３０６、およびｓｏｌｅｘａ−３９２７−２２１、ならびにそれらの前駆体ｍｉｃｒｏＲＮＡ（プレ−ｍｉＲＮＡ）またはｍｉｃｒｏＲＮＡ一次転写産物からなる群から選択される少なくとも１個の遺伝子マーカーの同一性および／または発現レベルに依存し得る。
【００９８】
医薬組成物および治療的使用
医薬組成物は、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは小分子を含むことができ、まとめて本明細書において医薬化合物と呼ばれる。該医薬組成物は、治療有効量の本明細書に記載されているバイオマーカータンパク質、ポリヌクレオチドまたは小分子のいずれかを含み得る。
【００９９】
本明細書において使用される「治療有効量」なる用語は、所望の疾患または状態を処置、改善または予防するか、または検出可能な治療または予防効果を示す治療剤の量を示す。該効果は、例えば、化学マーカーまたは抗原レベルにより検出することができる。治療効果は、また、身体症状の減少を含む。対象に対する正確な有効量は、対象のサイズおよび健康、状態の性質および程度、ならびに投与のために選択される治療剤または治療剤の組合せに依存する。したがって、あらかじめ正確な有効量を明細書に記載することは有益でない。しかしながら、所定の状況に対する有効量は、日常の実験により決定することができ、臨床医の判断の範囲内である。
【０１００】
本発明の目的のために、有効用量は、投与される個体において約０．０１ｍｇ／ｋｇから５０ｍｇ／ｋｇまたは０．０５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇのポリヌクレオチドまたはポリペプチド組成物であり得る。
【０１０１】
医薬組成物は、また、薬学的に許容される担体を含むことができる。「薬学的に許容される担体」なる用語は、治療剤、例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび他の治療剤の投与のための担体を示す。該用語は、それ自体、組成物を受ける個体に有害な抗体の生産を誘導せず、過度の毒性なしに投与され得るあらゆる医薬担体を示す。適当な担体は、大型のゆっくり代謝される高分子、例えば、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマーおよび不活性ウイルス粒子であり得る。このような担体は当業者によく知られている。
【０１０２】
薬学的に許容される塩は、例えば、鉱酸塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩など；および有機酸の塩、例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などを使用することができる。薬学的に許容される賦形剤の徹底的な議論は、Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub. Co., N.J. 1991)において利用できる。
【０１０３】
治療組成物における薬学的に許容される担体は、液体、例えば、水、塩水、グリセロールおよびエタノールを含み得る。さらに、補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などがこのようなビヒクルに存在し得る。一般的に、治療組成物は、注射可能な液体溶液または懸濁液のいずれかとして製造される；注射前に液体ビヒクル中の溶液または懸濁液のために適当な固体形態も製造され得る。リポソームは、薬学的に許容される担体の定義内に含まれる。
【０１０４】
送達方法
製剤化された本発明の医薬組成物は、（１）対象に直接投与するか；（２）エキソビボにて対象由来の細胞に送達するか；または（３）インビトロにて組換えタンパク質の発現のために送達することができる。
【０１０５】
該組成物の直接送達は、一般的に、皮下、腹腔内、静脈内、または筋肉内のいずれかへの注射によりにより成し遂げられるか、または組織の間質腔に送達される。該組成物は、また、神経系に投与することができる。他の投与様式は、局所的、経口的、坐薬的、および経皮的適用、針、ならびにパーティクル・ガンまたは皮下噴射器を含む。投与処置は、単回投与スケジュールまたは複数回投与スケジュールであり得る。
【０１０６】
形質転換細胞の対象へのエキソビボでの送達および再移植のための方法は、当分野で知られており、例えば、国際公開番号ＷＯ９３／１４７７８に記載されている。エキソビボでの適用において有用な細胞の例は、例えば、幹細胞、特に造血、リンパ細胞、マクロファージ、樹状細胞、または腫瘍細胞を含む。
【０１０７】
一般的に、エキソビボおよびインビトロでの両方の適用のための核酸の送達は、例えば、デキストラン介在トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン介在トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソームにおけるポリヌクレオチドのカプセル化、およびＤＮＡの核への直接微量注入により成し遂げることができ、これらはすべて当分野でよく知られている。
【０１０８】
種々の方法が、治療組成物を体の特定の部位に直接投与するために使用される。アンチセンスポリヌクレオチド、サブゲノムポリヌクレオチド、または特定の組織に対する抗体を含む治療組成物の受容体介在で標的化された送達も使用される。受容体介在ＤＮＡ送達技術は、例えば、Findeis et al., Trends in Biotechnol. (1993) 11:202-205; Wu et al., J. Biol. Chem. (1994) 269:542-46に記載されている。
【０１０９】
ポリヌクレオチドを含む医薬組成物は、好ましくは、遺伝子治療プロトコールにおいて局所投与のために約１００ｎｇから約２００ｍｇの範囲のポリヌクレオチドにおいて投与される。約５００ｎｇから約５０ｍｇ、約１μｇから約２ｍｇ、約５μｇから約５００μｇ、および約２０μｇから約１００μｇの濃度範囲のポリヌクレオチドが、また、遺伝子治療プロトコールに使用することができる。因子、例えば、作用方法ならびに形質転換および発現の有効性は、ポリヌクレオチドの究極の有効性のために必要とされる用量に影響するであろうことが考慮される。より良い発現が望ましいとき、組織のより広い地域、より大きな量のポリヌクレオチド、または連続投与プロトコールの同じ量の再投与、または例えば、神経終末またはシナプスの組織部分の異なる隣接部分または接近した部分への複数回の投与が、陽性治療結果に影響を与えるために必要であり得る。全ての場合において、臨床試験における日常の実験によって、最適な治療効果のための特定の範囲を決定するであろう。遺伝子治療ベクター、とりわけレトロウイルスベクターのさらに完全な記載は、ＷＯ９８／００５４２に含まれており、これを本明細書に明白に包含させる。
【０１１０】
本発明は、今回、以下の非限定的な実施例の方法により説明される。
【実施例】
【０１１１】
実施例
実施例１．心不全の検出のための循環バイオマーカーとしてのｍｉＲＮＡの使用
血液を、２人の健常個体および３人の心不全患者から取った。１５５０×ｇで１５分間の遠心分離後、血漿を回収した。Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡを、製造業者のプロトコールにしたがって、ＲＮＡ単離のためのPARIS kit（Applied Biosystems）を使用して、単離した。ＭｉＲＮＡ発現プロフィールを、Illumina human miRNA Expression Profiling Panel（User card for bead chip cat#MI-501-1001, part#11297760 RevA）を使用して行った。これはパイロットアレイ(pilot-array)であった。Ｇｅｎｅｓｐｒｉｎｇソフトウェアを使用して、標準化を行った。
【０１１２】
全９個のｍｉＲＮＡは、心不全患者の血液において有意に上方調節されることが見出され、６個のｍｉＲＮＡは下方調節された（表１、ならびに図１および２参照）。
これらの特異的に調節されたｍｉＲＮＡは、心不全の検出のためのバイオマーカーとして使用され得る。
表１．心不全患者の血漿中で特異的に発現するｍｉＲＮＡ
ＨＦにおいて上方調節される
【表１−１】
0005871791.tif 000002
ＨＦにおいて下方調節される
【表１−２】
0005871791.tif 000003
【０１１３】
実施例２．心不全の検出のための循環バイオマーカーとしてのｍｉＲＮＡの使用。最終的なアレイ。
上記実施例を、この新規スクリーニングのために特異的に生産された新規アレイにおけるｍｉＲＮＡの重複セットに対して繰り返した。１２人の健常個体および１２人の心不全患者から血液を取った。１５５０×ｇで１５分間の遠心分離後、血漿を回収した。製造業者のプロトコールにしたがって、ＲＮＡ単離のためのmirVana PARIS kit（Applied Biosystems）を使用して、Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡを単離した。ＭｉＲＮＡ発現プロフィールを、Illumina human miRNA Expression Profiling Panelを使用して行った。Ｇｅｎｅｓｐｒｉｎｇソフトウェアを使用して、標準化を行った。
【０１１４】
図４に示されているアレイの結果は、ＱＰＣＲにより確認した。１個のｍｉＲＮＡ（solexa-3927-221）は、図１のパイロットアレイ試験において下方調節されたように見られたが、この試験において上方調節されることを見出した。ＱＰＣＲ結果は、ＭｉＲＮＡが、実際に、心不全患者において上方調節されることを確認した。残っているｍｉＲＮＡを確認した。
これらの特異的に調節されたｍｉＲＮＡは、心不全の検出のためのバイオマーカーとして使用され得る。
【０１１５】
実施例３：心不全の検出のための循環バイオマーカーとしてのｍｉＲＮＡの使用。独立臨床試験における確認。
方法
ヒト血漿サンプルを、ヒト材料の適当な二次使用に関して、Academic Medical Center施設内倫理委員会による一般的な権利放棄の下にインフォームドコンセントで得た。呼吸困難登録のために、血漿サンプルを、オランダにおける多施設努力(effort)関連の３個のセンターの一部として得た。記載されている試験を、Academic Medical Centerで得られたサンプルにおいて行った。
【０１１６】
それらが診断のためのＦｒａｍｉｎｇｈａｍ基準に合ったとき、および循環ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰが１０００ｎｇ／Ｌを越えたとき、対象をＨＦ症例として分類した。臨床診断がＨＦを排除し、循環ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰがJanuzzi et al. (Januzzi et al. 2006. Eur Heart J 27:330)により公開されている加齢関連カットオフポイント以下であったとき、対象を非ＨＦ症例として分類した。全体で、７７人の患者のうちの５０人を基準に満足した呼吸困難登録のためにスクリーニングした。
【０１１７】
３９人の健常コントロールおよび呼吸困難登録の５０人の対象を試験した。５０人の患者のうちの２０人の対象は、ＨＦを有さないと診断され、３０人の対象はＨＦを有すると診断された。症例とコントロール間のＭｉＲＮＡ発現レベルを、スチューデントｔ−検定またはＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ−Ｕ−検定を使用して比較した。分析を、ロジスティック回帰分析を使用して行った。受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線は、非ＨＦ症例または健常コントロールとＨＦ症例の区別におけるロジスティック回帰モデルの予期される確率の種々のカットオフレベルを越えた。ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を、ｍｉＲＮＡの診断精度を評価するために概算した。全ての分析はＳＰＳＳを使用して行われ、全ての統計試験は両側であった。全ての分析に関して、ｐ−値＜０．０５を統計的に有意と考えた。
【０１１８】
心筋組織
我々は、特発性ＤＣＭによって死んだ対象由来の死体心筋サンプルおよび非心臓症例によって死んだ対象由来の心筋サンプルを得た。全ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ（Invitrogen）を使用して抽出した。ＲＮＡの質は保証され、次に、ｍｉＲ−４２３−５ｐの発現レベルを評価するためにリアルタイムＰＣＲを使用した。これをＵ６の発現のために標準化し、ｍｉＲ−４２３−５ｐの相対心筋発現を評価した。
【０１１９】
血液処理
全ての対象の血液を、直接静脈穿刺を介して２．７ｍｌのクエン酸ナトリウムを含むチューブ（BD Biosciences 363048）に回収した。ｍｉＲＮＡアレイのために対象から１０．８ｍｌの血液を抜き取り、リアルタイムＰＣＲのために、我々は５．４ｍｌの血液を回収した。全ての血液を、回収の４時間以内に血漿の単離のために処理した。血液を、室温で１０分間１５５０×ｇでの回転により処理した。血漿を新鮮なＲＮＡｓｅ／ＤＮＡｓｅなしのチューブに注意深く移し、−８０℃で保存した。
【０１２０】
ＲＮＡ単離
ｍｉＲＮＡアレイのために、我々は４．４ｍｌの血漿のＲＮＡを単離し、リアルタイムＰＣＲのために、我々は５００μｌの血漿のＲＮＡを単離した。血漿を氷上で解凍し、ＲＮＡを液体サンプルに対して製造業者のプロトコールにしたがってmirVana PARIS kit (Ambion)を使用して単離した。サンプルを等量の酸フェノールクロロホルムで２回抽出し、カラムを最後の洗浄工程後かつ溶離前に３分間乾燥させるように、プロトコールを修正した。
【０１２１】
ｍｉＲＮＡアレイ
ｍｉＲＮＡアレイのための溶離サンプルから、５０μｌを１２μｌに濃縮し、それぞれのサンプルに対して、５μｌをアレイのために使用した。Illumina human v2 miRNA Expression Profilingをこれらのサンプルにおいて行った。Illumina miRNAビーズチップで、１１４６個のｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡであると予期される他のｓｍａｌｌ  ＲＮＡを探査した。１，２の生のデータを前処理し、要約し、対数変換し、変位値を統計ソフトウェアパッケージＲ（バージョン２．９．０）におけるビーズアレイパッケージ（バージョン１．１２．１）を使用して標準化した。差次的発現を、ｌｉｍｍａ  パッケージ（バージョン２．１８．３）を使用するモデレートｔ−検定を使用して評価した。Ｐ−値が０．０５未満であるとき、ＭｉｃｒｏＲＮＡは有意に特異的に発現すると考えた。
【０１２２】
リアルタイムＰＣＲ
血漿サンプルに対して８μｌの固定された容量のＲＮＡ単離からの溶離物、および心筋組織サンプルに対して１μｇのインプット(input)ＲＮＡを逆転写反応においてインプットとして使用した。インプットＲＮＡを、製造業者のプロトコールにしたがってｍｉＳｃｒｉｐｔ逆転写キット（Qiagen）を使用して逆転写した。リアルタイムＰＣＲを、High Resolution Melting Master（Roche）を使用して行った。ＭｇＣｌ２を２．５ｍｍｏｌ／Ｌの最終濃度で使用し、２μｌの８回希釈したｃＤＮＡを１０μｌの全容量で使用した。フォワードプライマーは、全てのＵをＴに変化されている成熟ｍｉＲＮＡ配列と同じ配列を有し、リバースプライマーの配列は、ｍｉＲＮＡのｃＤＮＡを作製するために使用されるＲＴプライマー（ｍｉＳｃｒｉｐｔ  逆転写キットの一部）のアダプター配列に相補的であるＧＡＡＴＣＧＡＧＣＡＣＣＡＧＴＴＡＣＧＣである。リアルタイムＰＣＲ反応は、以下のプログラムを使用してLightCycler480 system II（Roche）で行った：９５℃で１０分プレインキュベーションならびに９５℃で４５秒変性、  ５５℃で４５秒アニーリング、および７２℃で４５秒伸長の４０サイクル。データは、ＬｉｎＲｅｇＰＣＲ  定量的ＰＣＲデータ分析ソフトウェア、バージョン１１．３．３を使用して分析した。このソフトウェアにより概算されるｍｉＲＮＡの出発濃度をｍｉＲ−１２４９の概算出発濃度に対して補正し、内因性ｍｉＲＮＡは我々のｍｉＲＮＡアレイにおいて安定に発現した。
【０１２３】
結果
ＨＦ患者の血漿中のＭｉＲＮＡの発現プロフィール
ＭｉＲＮＡアレイ（Illumina beadchip, human v2 miRNA panel）を、１２人のＨＦ患者および１２人の健常コントロールの血漿由来のＲＮＡで行った。全１０８個のｍｉＲＮＡが、ＨＦ患者とコントロール間で有意に特異的に発現した。これらから、我々は、さらなる確認のために、これらの倍数変化および確率値に基づいて１６個のｍｉＲＮＡを選択した。
【０１２４】
独立集団における候補ｍｉＲＮＡの確認
我々は、対象の３つの新規グループにおいて１６個の候補ｍｉＲＮＡの発現を確認した。第１のグループは、ＨＦと診断された呼吸困難登録からの対象からなり（ＨＦ症例、ｎ＝３０）、対象の第２のグループは、臨床診断でＨＦを有さないと確立された呼吸困難登録から得られ（非ＨＦ症例、ｎ＝２０）、第３のグループは、健常コントロールからなった（ｎ＝３９）。ＨＦ症例において、３０人の対象のうち１９人は、４５％より低い駆出率（ＥＦ）を有するが、非ＨＦ症例において、２０人の対象のうち３人は４５％より低いものを有した。したがって、これらの後者の３人の対象は左室後機能障害を有するが、ＨＦを診断するための臨床およびＮＴｐｒｏＢＮＰ基準を欠いていた。ｍｉＲＮＡの発現レベルをリアルタイムＰＣＲにより評価し、アレイにおいて変化がないと見出されたｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−１２４９の発現レベルにより標準化した。ＨＦ症例  対  健常コントロールに対するｍｉＲＮＡレベルの倍数変化は図５に示されている。
【０１２５】
候補ｍｉＲＮＡの診断精度
１個のｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−４２３−５ｐは、年齢および性別を含む多変数ロジスティック回帰モデルにおいてＨＦ診断の有意な予測因子であることが見出された。図６は、ｍｉＲ−４２３−５ｐが健常コントロールおよび呼吸困難非ＨＦ症例の両方と比較して、ＨＦ症例において特異的に増加することを示す。ＭｉＲ−４２３−５ｐは、０．９１（９５％信頼間隔、０．８４から０．９８）の曲線下面積（ＡＵＣ）で健常コントロールとＨＦ症例を区別した。ｍｉＲ−４２３−５ｐの予測力は、また、ＨＦおよび非ＨＦ症例（ＡＵＣ、０．８３；９５％信頼間隔、０．７１から０．９４）と比較したとき、呼吸困難登録内で高かった。循環ｍｉＲ−４２３−５ｐは、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰおよびＥＦ（Ｓｐｅａｒｍａｎ相関係数：０．４３、確率値：０．００２；Ｓｐｅａｒｍａｎ相関係数：０．３４、確率値：０．０２３、各々）と相関していた。ｍｉＲ−４２３−５ｐの発現は、正常なヒト心臓と比較してヒト不全心筋において３倍に増加した（図７参照）。
【０１２６】
ｍｉＲ−４２３−５ｐに加えて、６つの他のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−１８ｂ＊、ｍｉＲ−１２９−５ｐ、ｍｉＲ−１２５４、ｍｉＲ−６７５、ＨＳ＿２０２．１およびｍｉＲ−６２２）はＨＦ症例において増加することを見出した。これらのうちのｍｉＲ−１８ｂ＊およびｍｉＲ−６７５は図６に示されている。しかしながら、呼吸困難集団内で、ｍｉＲ−１８ｂ＊は、また、非ＨＦ症例においてわずかに増加するが、ｍｉＲ−６７５は非ＨＦ症例においてＨＦ症例と同じレベルに上方調節される。これは、ＨＦ症例を健常コントロールと比較することにより最初に同定されるいくつかのｍｉＲＮＡは、また、実際に、呼吸困難がＨＦにより引き起こされないとき高いようであり、したがってＨＦにあまり特異的でないことを例示する。しかしながら、ｍｉＲ−１８ｂ＊のようなｍｉＲＮＡがさらにＨＦの重要なバイオマーカーであり得るように、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰも右心室過負荷に起因する肺疾患でわずかに増加し得ることが知られている。
【０１２７】
候補ｍｉＲＮＡが疾患重症度または病因に関するか否かを研究するために、我々は、これらのＥＦ、ＮＹＨＡクラスまたは基礎的病因にしたがってＨＦ患者を分類した。循環ｍｉＲ−４２３−５ｐおよびｍｉＲ−１８ｂ＊のレベルは、＞４５％のＥＦを有する対象と比較して、≦４５％のＥＦを有する対象においてより高いが、これは統計的有意性に到達しなかった。ｍｉＲ−４２３−５ｐおよびｍｉＲ−１８ｂ＊のような他のｍｉＲＮＡの循環レベルは、ＮＹＨＡクラスの増加で増加した。最後に、いくつかの候補ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−１８ｂ＊ではなくｍｉＲ−４２３−５ｐおよびｍｉＲ−６７５）は、ＨＦの非アテローム性動脈硬化形態と比較してＨＦのアテローム性動脈硬化形態においてより高かった（図８参照）。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図４−６】
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【図４−７】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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