(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
脊椎動物の椎間板髄核から採取された髄核細胞集団中の、表面マーカーのTie2が陽性である細胞（以下「Tie2陽性細胞」と称する。）の割合を測定することを含む、椎間板の状態に関する指標を得る方法であって、
椎間板の変性の程度に関する基準値ないし年齢層ごとの平均値および標準偏差をあらかじめ決定しておき、あるサンプルについて測定された前記椎間板髄核幹細胞の割合と前記基準値ないし平均値および標準偏差との対比により、椎間板の変性の程度ないしその年齢層の椎間板の状態として正常な範囲かどうかを把握することを含み、
前記椎間板の変性の程度に関する基準値は、椎間板の変性が進行するほど前記Tie2陽性細胞の割合が減少する傾向を示すものであり、
前記年齢層ごとの平均値は、年齢層が高いほど前記Tie2陽性細胞の割合が減少する傾向を示し、特に二十代において著しい減少を示すものであることを特徴とする、椎間板の状態に関する指標を得る方法。
【請求項２】
さらに、前記髄核細胞集団中の、下記（i）〜（v）の表面マーカーの発現パターンを示す少なくとも１種の細胞の割合を測定することを含み、下記（i）〜（v）の表面マーカーの発現パターンは、（i）から（v）に進むにつれて、細胞が分化または老化していることを表すものである、請求項１に記載の椎間板の状態に関する指標を得る方法。
（i）Tie2陽性／GD2陰性／CD24陰性
（ii）Tie2陽性／GD2陽性／CD24陰性
（iii）Tie2陰性／GD2陽性／CD24陰性
（iv）Tie2陰性／GD2陽性／CD24陽性
（v）Tie2陰性／GD2陰性／CD24陽性
【請求項３】
脊椎動物（ヒトを除く）について、請求項１または２に記載の方法によって椎間板の状態に関する指標を得る工程、および
当該工程によって得られた指標に基づいて、細胞集団またはそれを含有する細胞組成物を前記脊椎動物（ヒトを除く）の椎間板に移植する工程を含む、椎間板障害の治療または予防方法であって、
前記細胞集団は、脊椎動物の椎間板髄核から採取された髄核細胞集団または培養された髄核細胞集団に由来する、表面マーカーのTie2およびGD2の少なくとも一方が陽性である椎間板髄核細胞を含む細胞集団であることを特徴とする、椎間板障害の治療または予防方法。
【請求項４】
さらに、椎間板にある椎間板髄核幹細胞に対してAng-1を投与する工程を含む、請求項３に記載の椎間板障害の治療または予防方法。
【請求項５】
前記細胞集団が、表面マーカーのTie2が陽性である椎間板髄核細胞を９０％以上の純度で含むものである、請求項３または４に記載の椎間板障害の治療または予防方法。
【請求項６】
前記細胞集団が、下記（i）〜（iv）の表面マーカーの発現パターンを示す少なくとも１種の椎間板髄核細胞を含むものである、請求項３または４に記載の椎間板障害の治療または予防方法。
（i）Tie2陽性／GD2陰性／CD24陰性
（ii）Tie2陽性／GD2陽性／CD24陰性
（iii）Tie2陰性／GD2陽性／CD24陰性
（iv）Tie2陰性／GD2陽性／CD24陽性
【請求項７】
脊椎動物の椎間板髄核から採取された髄核細胞集団または培養された髄核細胞集団あるいはそれらから調製される髄核細胞集団に含まれる細胞について、表面マーカーの発現パターンを、Tie2が陽性であるか陰性であるか、GD2が陽性であるか陰性であるか、およびCD24が陽性であるか陰性であるかによって８通りに分類したとき、それぞれに分類される細胞の割合を求めることを含む、髄核細胞集団のポテンシャルまたは品質の評価方法であって、
前記髄核細胞集団中の、下記（i）〜（v）の表面マーカーの発現パターンを示す少なくとも１種の細胞の割合を測定することを含み、下記（i）〜（v）の表面マーカーの発現パターンは、（i）から（v）に進むにつれて、細胞が分化または老化していることを表すものである、髄核細胞集団のポテンシャルまたは品質の評価方法。
（i）Tie2陽性／GD2陰性／CD24陰性
（ii）Tie2陽性／GD2陽性／CD24陰性
（iii）Tie2陰性／GD2陽性／CD24陰性
（iv）Tie2陰性／GD2陽性／CD24陽性
（v）Tie2陰性／GD2陰性／CD24陽性
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、椎間板の髄核に含まれる幹細胞および前駆細胞に関し、より詳細には、それらの細胞を特定するためのマーカーに関する。また、本発明はそのような幹細胞および前駆細胞の培養方法および用途にも関する。
【背景技術】
【０００２】
腰痛は有訴者率で2位に入るありふれた疾患であり1、成人人口の2/3が一度は経験し、労働障害や医療経済における社会問題である。腰痛の原因の20％とも言われる3椎間板障害は可動部位(motion segment)におけるインバランスを来たし、椎間板ヘルニア、変形性脊椎症、脊柱管狭窄症、すべり症などを誘引しうる重大な問題である。椎間板障害、病理学的には椎間板変性と呼ばれる病態は不可逆的変化であり、現在のところ臨床的に有効な治療法は存在しないため、国内外の多数の研究施設で新たな治療法の開発が研究されている。今後、新規治療法を科学的根拠に基つき開発する為には椎間板の細胞・分子レベルでの理解が必須であるが、椎間板は未だその発生、構成細胞の分化、恒常性維持、そして変性機序に至るまで骨や関節軟骨に比し未知である4, 5。【０００３】
椎間板はドーナツ型をした軟骨性の臓器であり、中心部の髄核(Nucleus Pulposus;NP)と周りを何周にも取り巻く線維性軟骨である線維輪(Annulus Fibrosus;AF)、そして隣接椎骨とを上下で連結する終板軟骨(Cartilaginous Endplate;EP)とで形成されている。ゼラチン状のNPは無血管臓器で大型のプロテオグリカンとコラーゲンで構成される細胞外基質(Extracellular Matrix;ECM)を多く含有する。NPは発生学的に脊索に由来するが周囲の臓器は間葉から発生することが判明している。今日まで髄核細胞は特異的細胞マーカーなどが不明であった為に他の細胞と区別される際には形態学的特徴でのみに頼るしかなく、詳細な解析は不可能であった。ヒトを含む脊椎動物の一部において脊索由来髄核細胞が一生の早い時期に消失することが報告されている。脊索由来髄核細胞が消失したのち、その起源は未だ確定していないが形態学的には軟骨細胞に類似した軟骨様細胞が髄核を形成する。この細胞形質の転換はECM組成に影響を与え、含水量低下、線維化などその後の椎間板の加齢や変性、のちには腰痛や腰椎変性疾患に大きく関わると考えられている。一方、脊索由来髄核細胞を終生保持するマウス、ラットやブタなどの多くの動物種では椎間板変性は殆ど認められないことを考えると脊索由来髄核細胞や他の髄核細胞の制御機構の解明は椎間板障害の予防や椎間板の再生に有用な情報を提供するものと考える6, 7。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Deyo, R.A. & Weinstein, J.N. Low Back Pain. N Engl J Med. 344, 363-70 (2001).
【非特許文献２】Carragee, E. Surgical treatment of lumbar disk disorders. JAMA. 296, 2485-7 (2006).
【非特許文献３】Antoniou, J. et al. The human lumbar intervertebral disc: evidence for changes in the biosynthesis and denaturation of the extracellular matrix with growth, maturation, ageing, and degeneration. J Clin Invest. 98, 996-1003 (1996).
【非特許文献４】Seki, S. et al. A functional SNP in CILP, encoding cartilage intermediate layer protein, is associated with susceptibility to lumbar disc disease. Nat Genet. 37, 607-12 (2005).
【非特許文献５】Annunen, S. et al. An allele of COL9A2 associated with intervertebral disc disease. Science. 285, 409-12 (1999).
【非特許文献６】Guehring, T. et al. Notochordal intervertebral disc cells: sensitivity to nutrient deprivation. Arthritis Rheum. 60, 1026-34 (2009).
【非特許文献７】Yang, F., Leung, V.Y., Luk. K.D., Chan, D. & Cheung, K.M. Injury-induced sequential transformation of notochordal nucleus pulposus to chondrogenic and fibrocartilaginous phenotype in the mouse. J Pathol. 218, 113-21 (2009).
【非特許文献８】Risbud, M.V. et al. Evidence for skeletal progenitor cells in the degenerate human intervertebral disc. Spine. 32, 2537-44 (2007).
【非特許文献９】Henriksson, H. et al. Identification of cell proliferation zones, progenitor cells and a potential stem cell niche in the intervertebral disc region: a study in four species. Spine. 34, 2278-87 (2009).
【非特許文献１０】Schmittwolf, C. et al. In vivo haematopoietic activity is induced in neurosphere cells by chromatin-modifying agents. EMBO J. 24, 554-66 (2005).
【非特許文献１１】Shiota, M. et al. Isolation and characterization of bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells with myogenic and neuronal properties. Exp Cell Res. 313, 1008-23 (2007).
【非特許文献１２】Makinodan, E. et al. A novel role for Fyn: change in sphere formation ability in murine embryonic stem cells. Neuroscience. 147, 1-4 (2007).
【非特許文献１３】Fujita, N. et al. CD24 is expressed specifically in the nucleus pulposus of intervertebral discs. Biochem Biophys Res Commun. 338, 1890-6 (2005).
【非特許文献１４】Nagoshi, N. et al. Ontogeny and multipotency of neural crest-derived stem cells in mouse bone marrow, dorsal root ganglia, and whisker pad. Cell Stem Cell. 2, 392-403 (2008).
【非特許文献１５】Lee, M.J. at al. In early development of the rat mRNA for the major myelin protein P(0) is expressed in nonsensory areas of the embryonic inner ear, notochord, enteric nervous system, and olfactory ensheathing cells. Dev Dyn. 222, 40-51 (2001).
【非特許文献１６】Thompson, J.P. et al. Preliminary evaluation of a scheme for grading the gross morphology of the human intervertebral disc. Spine 15, 411-5 (1990).
【非特許文献１７】Chan, C.K. et al. Endochondral ossification is required for haematopoietic stem-cell niche formation. Nature. 457, 490-4 (2009).
【非特許文献１８】Arai, F. et al. Tie2/angiopoietin-1 signaling regulates hematopoietic stem cell quiescence in the bone marrow niche. Cell. 118, 149-61 (2004).
【非特許文献１９】Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S. & Blau, H.M. Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells. Nature. 456, 502-6 (2008).
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【非特許文献２５】Androutsellis-Theotokis, A. et al. Targeting neural precursors in the adult brain rescues injured dopamine neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 13570-5 (2009).
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【非特許文献２７】Aguiar, D.J., Johnson, S.L. & Oegema, T.R. Notochordal cells interact with nucleus pulposus cells: regulation of proteoglycan synthesis. Exp Cell Res. 246, 129-37 (1999).
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【非特許文献３５】Gruber, H.E. et al. Autologous intervertebral disc cell implantation: a model using Psammomys obesus, the sand rat. Spine 27, 1626-33 (2002).
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【非特許文献３７】Sakai, D., Nakai, T., Mochida, J., Alini, M. & Grad, S. Differential phenotype of intervertebral disc cells: microarray and immunohistochemical analysis of canine nucleus pulposus and anulus fibrosus. Spine. 34, 1448-56 (2009).
【非特許文献３８】Muguruma, Y. et al. In vivo and in vitro differentiation of myocytes from human bone marrow-derived multipotent progenitor cells. Exp Hematol. 31,1323-1330 (2003).
【非特許文献３９】Nagoshi, N. et al. Ontogeny and multipotency of neural crest-derived stem cells in mouse bone marrow, dorsal root ganglia, and whisker pad. Cell Stem Cell. 2, 392-403 (2008).
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【非特許文献４２】Kawada, H. et al. Rapid ex vivo expansion of human umbilical cord hematopoietic progenitors using a novel culture system. Exp. Hematol. 27, 904-915 (1999).
【非特許文献４３】Nakamura, Y. et al. Ex vivo generation of CD34(+) cells from CD34(-) hematopoietic cells. Blood. 94, 4053-4059 (1999).
【非特許文献４４】Wang, J. et al. SCID-repopulating cell activity of human cord blood-derived CD34- cells assured by intra-bone marrow injection. Blood. 101, 2924-2931 (2003).
【非特許文献４５】Sakai, D., Nakai, T., Mochida, J., Alini, M. & Grad, S. Differential phenotype of intervertebral disc cells: microarray and immunohistochemical analysis of canine nucleus pulposus and anulus fibrosus. Spine. 34, 1448-56 (2009).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
近年、多くの臓器でその恒常性維持に内在性幹細胞・前駆細胞の役割が注目されている。また幹細胞の可塑性維持やメンテナンスに周囲の微小環境、いわゆるニッチが重要であることも多数報告される8, 9。椎間板組織における内在性幹細胞の詳細な同定、ニッチの局在の報告は現在までに無く、造血系幹細胞が骨芽細胞と相互作用を持つように、間葉系幹細胞でもその局在周囲に各種の細胞間接着や関連パスウェイの関与が予想される。【０００６】
本発明の目的は、椎間板NP内における幹細胞性質を持つ細胞集団を特定するための表面マーカーを探索すること、そしてNP組織中の幹細胞ニッチを同定しヒトにおける椎間板の加齢変化におけるNP内在性幹細胞の意義を見出すことなどを通じて、単離された椎間板NP幹細胞ないし前駆細胞、ならびにその培養方法、用途などの周辺技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、後記実施例に示すような実験結果に基づき、上記課題を解決しうる本発明を完成させるに至った。【０００８】
すなわち本発明は、脊椎動物の椎間板髄核から単離された、表面マーカーのTie2および
GD2の少なくとも一方が陽性であることを特徴とする、椎間板髄核細胞（ないし当該細胞を含む細胞集団）を提供する。【０００９】
上記椎間板髄核細胞の一つの態様は、表面マーカーが少なくともTie2陽性であり、自己複製能ならびに脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞および神経細胞に分化可能な多分化能を有する幹細胞（本発明において「椎間板髄核幹細胞」とよぶ。）である。このような幹細胞のうち、表面マーカーがGD2陰性であるものは休眠状態にあり、GD2陽性であるものは活性化された状態にある。【００１０】
また、上記椎間板髄核細胞のもう一つの態様は、表面マーカーがTie2陰性かつGD2陽性であり、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞または神経細胞のいずれかに分化可能な前駆細胞（本発明において「椎間板髄核前駆細胞」とよぶ。）である。【００１１】
上記椎間板髄核幹細胞は、さらに表面マーカーがCD24陰性、CD44陽性／陰性（幹細胞の場合）もしくは陽性（前駆細胞の場合）、CD271陽性かつFlt1陽性でもある。また、上記椎間板髄核前駆細胞は、さらに表面マーカーがCD24陰性もしくは陽性、CD44陽性、CD271陽性／陰性もしくは陰性かつFlt1陽性／陰性もしくは陰性である。【００１２】
上記脊椎動物は、好ましくは哺乳動物であり、たとえば、実施例に示すようにヒトまたはマウスである。【００１３】
本発明は一つの側面において、脊椎動物の椎間板髄核から採取された髄核細胞集団またはそれを培養して得られた細胞集団から、表面マーカーのTie2およびGD2の少なくとも一方が陽性である細胞を単離することを含むことを特徴とする、椎間板髄核細胞（ないし当該細胞を含む細胞集団）の培養方法を提供する。【００１４】
上記椎間板髄核細胞の培養方法の一つの態様は、単離される細胞が、表面マーカーが少なくともTie2陽性のものである、椎間板髄核幹細胞用の培養方法であり、もう一つの態様は、単離される細胞が、表面マーカーがTie2陰性かつGD2陽性のものである、椎間板髄核前駆細胞用の培養方法である。上記椎間板髄核幹細胞の培養方法は、アンジオポエチンＩ（Angiopoietin-1, Ang-1）の存在下にそれらの細胞を培養することを含むものであってもよい。なお、Tie2はアンジオポエチンＩの受容体である。【００１５】
さらに本発明は、上記椎間板髄核細胞（幹細胞および／または前駆細胞）を分化誘導条件下で培養するステップを含む、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞または神経細胞の培養方法も提供する。【００１６】
本発明は一つの側面において、上記椎間板髄核細胞（幹細胞および／または前駆細胞）を含有することを特徴とする細胞組成物を提供する。このような細胞組成物としては、たとえば、椎間板障害の治療用または予防用のものが好適である。【００１７】
本発明は一つの側面において、上記椎間板髄核細胞（幹細胞および／または前駆細胞）あるいは上記細胞組成物を椎間板に移植することを含む、脊椎動物（ヒトを除く）の椎間板障害の治療または予防方法を提供する。【００１８】
また本発明は、生体中の椎間板にある椎間板髄核幹細胞に対してAng-1を投与することを含む、脊椎動物（ヒトを除く）の椎間板障害の治療または予防方法を提供する。【００１９】
なお、これらの椎間板障害の治療または予防方法は、ヒトに対して同様に適用することが可能である。【００２０】
本発明は一つの側面において、脊椎動物の椎間板髄核から採取された髄核細胞集団中の、椎間板髄核幹細胞の割合を測定することを含むことを特徴とする、椎間板の状態に関する指標を得る方法を提供する。【００２１】
なお、本明細書において、椎間板髄核幹細胞および／または前駆細胞を「椎間板髄核幹／前駆細胞」と表記することがある。また、当該技術分野で慣用されているように、表面マーカーの陽性を「+」、陰性を「-」の記号で表すことがある（たとえば、「Tie2+GD2+」は「Tie2陽性かつGD2陽性」を意味する）。
【発明の効果】
【００２２】
本発明により、椎間板髄核幹／前駆細胞の単離、培養、増殖、ならびに椎間板障害の治療や予防が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】コロニー形成能によるマウス髄核細胞分画の同定。(a) マウス初代髄核細胞における髄核コロニー形成細胞（CFU-NP）および繊維芽細胞コロニー形成細胞(CFU-F)由来の各コロニー。スケールバーは100μm。(b) 培養髄核細胞からの表面マーカーGD2およびTie2を用いたCFU-NP細胞の純化。先の表面マーカーにて純化されたGD2+CD24+ またはGD2-CD24+細胞は、液体培地またはメチルセルロース培地にて１０日間の培養を行った。(c) 純化されたTie2+GD2-細胞からのGD2+細胞の誘導。Tie2+GD2-細胞は、培養後の髄核細胞から純化され、さらに１０日間の培養を行った。結果は、平均値±標準偏差（SD）にて表す。
【図２】P0-Cre およびWnt1-Cre/Floxed遺伝子改変マウス髄核細胞解析。(a) 16週令の同マウス椎間板の抗-緑色蛍光タンパク（GFP）質の免疫染色結果では、増強GFP陽性（EGFP）の陽性髄核細胞はP0-Cre/Floxedマウス椎間板において確認されるが、Wnt-Cre/Floxedマウスの椎間板には確認されない。上部写真パネルは、それぞれのマウスの尾椎椎間板水平セクション、下部写真パネルは矢状面セクションを示す。4'-6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)によって核は青色に染色されている。(b) P0-Cre/Floxedマウス（６週令）の初代髄核細胞は、メチルセルロース培地にて１０日間の培養を行った。上部写真は形成されたCFU-NPの位相差顕微鏡像、中央は、蛍光顕微鏡像を示す。緑色蛍光を発するCFU-NPコロニーが観察された（下部写真パネル）。スケールバーは100μm。(c) フローサイトメトリー法によるP0-Cre/Floxedマウス（６週令）初代髄核細胞の解析結果。
【図３】ヒト髄核細胞およびそのニッチの解析。ヒト椎間板由来組織は、(a)ファーストグリーンおよびサフラニンＯ、(b)ヘマトキシリン−エオジン染色にて染色した。点在する核または密集した核がＮＰ細胞の存在を示す。(c) 免疫染色によって髄核組織の中央部にTie2+陽性細胞が散在して存在することが分かる。(d) Tie2+陽性細胞とは対照的に、髄核組織にクラスターを形成してGD2+細胞が存在することが分かる。Tie2またはGD2とアンジオポエチン１(Ａｎｇ−１)との２重染色法によって、(e) Tie2+Ang-1+ 細胞ないしは(f) GD2+Ang-1+ 細胞の存在が確認された。4'-6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)染色によって核は青色に染色されている。スケールバーは50μm。(g) 分離した髄核細胞分画におけるリアルタイムPCR法による定量的Ang-1遺伝子の測定。それぞれの細胞における発現量は、Tie2-GD2-細胞における18Sのレベルと比較した絶対数にて表した（※p<0.05の時は、分画したそれぞれの細胞間にて比較して有意差を示すもの）。†p<0.05の時は、Tie2-GD2-細胞と比較して有意差を示すものを表す。(h) 水溶性Ang-1(sAng-1)のCFU-NPに対する支持作用。初代ヒト髄核細胞は、牛胎児血清（FBS）非添加α-MEM培地にて、500ng/ml ヒトsAng-1の存在下、10μg/mlのヤギ由来抗ヒトTie2中和抗体(BpAb)またはコントロールヤギ免疫グロブリン(CIg)を添加して７日間の培養を行った。培養終了後、髄核細胞はコロニー形成試験を行った。(i,j) 抗ヒトTie2中和抗体(BpAb)による髄核細胞のアポトーシスの誘導。初代ヒト髄核細胞は、牛胎児血清（FBS）非添加α-MEM培地にて10μg/mlのヤギ由来抗ヒトTie2中和抗体(BpAb)またはコントロールヤギ免疫グロブリン(CIg)を添加して２日間の培養を行った。アポトーシスを起こしている細胞は、アネキシンＶ陽性、ＰＩ陰性細胞集団と規定した。結果は、平均値±標準偏差（SD）にて表す。
【図４】ヒト髄核細胞のクローン解析。(a) １つのTie2+GD2+ 細胞由来のコロニー形成能。Tie2+GD2+ 細胞は培養髄核細胞から純化した。さらに純化された同細胞は、位相差顕微鏡下、手動細胞マニピュレーター（ナリシゲ）を用いて96穴培養皿に１つずつ分注した。１つずつ分注されたTie2+GD2+ 細胞は、100μLのメチルセルロース培地中において１０日間の培養後、1つのCFU-NPコロニーを形成した。(b) 純化Tie2+GD2+ 細胞の初代および２代目コロニー形成能。初代Tie2+GD2+ 細胞から形成されたCFU-NPコロニー由来の１つの細胞は、メチルセルロース培地中にて１０日間の培養後再びCFU-NPコロニーおよびCFU-Fコロニーを形成した。(c) Tie2+GD2+ 細胞により形成されたCFU-NPコロニーおよびCFU-Fコロニーの免疫染色結果。これらのコロニーのサイトスピン標本の免疫染色では、CFU-NPコロニーにおいてコラーゲンタイプIIおよびプロテオグリカンの産生が確認された。またCFU-Fコロニーにおいては、これらコラーゲンタイプIIおよびプロテオグリカンの産生は、陰性または僅かなものであった。(d) これらコラーゲンタイプIIを発現しているCFU-NPコロニーは、２重免疫染色にてネスチンを発現していることが確認された。ネスチンの発現は、コラーゲンタイプII産生細胞と共発現、または両者のモザイク発現として認められた。DAPI染色によって核は青色に染色されている。スケールバーは50μm。結果は、平均値±標準偏差（SD）にて表す。
【図５】ヒト髄核細胞の免疫不全マウスへの移植。(a) Tie2+GD2-, Tie2+GD2+, Tie2-GD2+ そしてTie2-GD2-細胞への純化は、７日から１０日間培養された若いドナー（18才から25才）由来の髄核細胞から行った。(b) 移殖８週間後のNOD/SCIDマウス皮下における Tie2+GD2+細胞の生着（左）。生着後形成されたシストは、摘出後凍結切片を作製、ファーストグリーンおよびサフラニンＯ（中央）にて染色を行った。同切片における免疫染色およびDAPIによるによるGD2陽性細胞の同定(右)。DAPI染色によって核は青色に染色されている。黒色スケールバーは500μm。白色スケールバーは50μm。(c) Tie2-GD2-CD24+ 細胞の純化は、同じ提供者の髄核で20日から25日間の液体培養後のものを利用した。また、Tie2+GD2+ 細胞の純化は図5(a)に示すように行った。(d) 増強緑色蛍光蛋白質標識Tie2+GD2+ そしてTie2-GD2-CD24+ ヒト髄核細胞は、傷害を起こしたNOD/SCIDマウスの尾椎間板へ移植した。移殖後１２週間後に生物発光法にて同マウス尾椎を測定した。その結果、Tie2+GD2+ 細胞を移植した群では、移植細胞の存在が確認されたが、Tie2-GD2-CD24+ 細胞移殖群では消失していることが確認された。これら移殖細胞の生着が確認されたマウス尾椎間板髄核領域では、免疫染色の結果、EGFP陽性、コラーゲンタイプII陽性の細胞の存在が認められた。典型的な生着所見が認められる切片を示す。スケールバーは50μm。
【図６】ヒト髄核Tie2+GD2+細胞の多分化能。(a) ヒト髄核Tie2+GD2+細胞の脂肪細胞、骨細胞および軟骨細胞への分化。髄核細胞は、脂肪細胞、骨細胞および軟骨細胞へと分化誘導させる培地により、20日間の分化培養を行った。培養終了後、オイルレッドＯおよびフォンコッサ染色、3,3'-ジアミノベンチジン (DAB)を利用した免疫染色によりプロテオグリカン、コラーゲンタイプIIの存在を確認した。スケールバーは100μm。(b) 半定量的RT-PCR法による純化ヒト髄核細胞および骨髄ストローマ細胞の解析。Nanog, Oct3/4, Nestin, Musashi-1など胎性幹細胞(ES)に発現しているmRNAがNP細胞において検出された。さらにNP細胞特異的なSKT, Sox9, AGC, およびcollagen type IIなどのmRNAの発現もNP細胞で検出された。(c) 免疫染色による、Oct4, Nanog, cMyc, klf4 そしてSox2タンパク質のTie2+GD2+ そして Tie2-GD2-髄核細胞における発現。それぞれの細胞は、8x102 /cm2の密度にてスライドグラスに接着後、４％パラフォルムアルデヒドにて固定した。その後、それぞれの細胞は、純化の時に使用された２種類の蛍光の影響を防止するため、アレクサフルオロ350標識二次抗体を利用して、ESマーカーを検出した。目的タンパク質は緑色にて、細胞質アクチンは赤色にて示す。スケールバーは20μm。(d) ヒトTie2+GD2+ 培養髄核細胞は、神経およびグリア細胞マーカーが陽性である。β-Tubulin, tau, GFAP, GSTpi そして大腸腺腫性ポリポーシス腫瘍抑制遺伝子、adenomatous polyposis coli tumor suppresser gene (APC)陽性のそれぞれ神経細胞、グリア細胞の表現特徴を持つ細胞の存在が確認された。２重免疫蛍光染色の結果を示す。DAPI染色によって核は青色に染色されている。黒色および白色スケールバーは50μm。
【図７】髄核Tie2+細胞およびCFU-NPは、加齢によって減少する。(a) さまざまな異なる年齢の患者髄核細胞におけるTie2およびDG2の発現。(b) 初代髄核組織中のTie2+GD2- 細胞の割合と年齢の関係。(c) 初代髄核組織中のCFU-NP数と割年齢の関係。(d) これまでの結果を基にした髄核細胞の階層性分化モデル。
【図８】液体培養後におけるマウス髄核細胞におけるTie2, GD2そしてCD24分子の変化。マウス髄核細胞の液体培養においてTie2+GD2+ またはGD2+CD24+ 細胞の出現は認められたが、Tie2+CD24+ 細胞の出現は認められなかった。また、Tie2-GD2-CD24+ 細胞は培養後30日を経過して認められた。３例の実験結果中の典型例を示す。
【図９】液体培養後におけるヒト髄核細胞におけるTie2, GD2そしてCD24分子の発現。ヒト髄核細胞では、液体培養後においてTie2+GD2+ 細胞そしてTie2-GD2+ 細胞は増加が認められたが、Tie2+GD2-細胞は増加することはなかった。一方、初代髄核細胞の70%以上はTie2-GD2-CD24+細胞で占められていたが、それらは培養後６日で消失した。しかしながら、培養後28日目において細胞の35%が再びTie2-GD2-CD24+細胞となった。
【図１０】GD2+ 細胞は、Tie2+細胞から誘導されたが、Tie2+細胞はGD2+ 細胞から誘導されなかった。ヒト初代髄核細胞からTie2+ GD2- 細胞およびTie2-GD2+ 細胞を純化した。それぞれの細胞分画は、液体培養を行い、Tie2およびGD2分子の発現変化を観察した。１４日間の培養後では、Tie2+ GD2- 細胞からはTie2+GD2+ 細胞および Tie2-GD2+ 細胞の誘導が認められたが、Tie2-GD2+ 細胞からはTie2+GD2+ 細胞の誘導は確認されなかった。５例の実験結果中の典型例を示す。
【図１１】CD24+ 細胞はGD2+ 細胞から誘導される。Tie2-GD2+ CD24- 細胞を液体培養後７日目のヒト髄核細胞から純化した。引き続き１４日間の培養を行ったところ、Tie2-GD2+CD24-細胞は、Tie2-GD2+CD24+ およびTie2-GD2-CD24+ 細胞分画を誘導した。５例の実験結果中の典型例を示す。
【図１２】ヒト髄核細胞におけるその他の表面分子の発現。ヒト髄核細胞を用いて骨髄ストローマ細胞関連表面分子の発現を調べた。７日間の液体培養の終了した髄核細胞は、Tie2およびGD2、そしてその他の表面分子の発現を調べた。また、これらその他の表面分子は、A (Tie2-GD2-), B (Tie2+GD2+) 及び C (Tie2-GD2+)の３つの分画別に調べた。その結果、CD271はＢ分画に有意に発現しており、C分画では一部に、そしてA分画では、その発現が認められなかった。VEGF-AレセプターであるFlt1は、ＢおよびC分画の一部に発現していたが、A分画では認められなかった。また、A.B.C分画の80％以上においてCD44, CD49f, CD56, CD73, CD90 そして CD105の発現が認められ、さらにそれぞれの50％以上においてCD166の発現が認められた。５例の実験結果中の典型例を示す。
【図１３】ヒトAng-1を産生するマウスストローマ細胞、AHESS-5細胞とヒト髄核細胞の混合培養。(a) ７日間の混合培養の結果、AHESS-5細胞は、有意にCFU-NP数の増加をもたらした。しかしながら、CFU-F数の増加はもたらさなかった。このAHESS-5細胞の効果は、抗Tie2の中和抗体の添加によって阻害された。(b) また、AHESS-5細胞は、Ti2+GD2- 細胞およびTie2+GD2+ 細胞の増加をもたらした。これらの効果は、先の結果と同様に抗Tie2の中和抗体の添加によって阻害された。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
・椎間板髄核幹／前駆細胞
本発明の対象となる椎間板髄核細胞は、脊椎動物の椎間板髄核から単離された、表面マーカーのTie2およびGD2の少なくとも一方が陽性のものであり、幹細胞および前駆細胞が包含される。なお、Tie2およびGD2がともに陰性であるものは、分化を終えた、成熟した椎間板髄核細胞である。
【００２５】
椎間板髄核幹細胞は、表面マーカーが少なくともTie2陽性であり、自己複製能ならびに少なくとも脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞および神経細胞に分化可能な（他の細胞への分化可能性を否定するものではない）多分化能を有する幹細胞である。休眠状態にある上記幹細胞はGD2陰性であるが、活性化された上記幹細胞はGD2陽性である。休眠状態の幹細胞を活性化するには様々な刺激が考えられるが、たとえば、休眠状態の細胞を組織から分離し、系代培養することが一つの手法として挙げられる。一方、椎間板髄核前駆細胞は、表面マーカーがTie2陰性かつGD2陽性であり、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞または神経細胞のいずれかに分化可能な前駆細胞である。なお、このような椎間板髄核幹／前駆細胞を含む椎間板髄核細胞は脊索由来の細胞である。
【００２６】
本発明の椎間板髄核細胞が由来する「脊椎動物」は、椎間板髄核を有するものであれば特に限定されるものではないが、好ましくは哺乳動物であり、ヒトおよびヒト以外の哺乳動物（たとえばマウス、ラット、ブタ）が包含される。
【００２７】
椎間板髄核幹細胞は、上記Tie2およびGD2にも、たとえば、CD24陰性、CD44陽性／陰性（幹細胞の場合）もしくは陽性（前駆細胞の場合）、CD271陽性かつFlt1陽性といった表面マーカーの特徴を有する。一方、椎間板髄核前駆細胞は、上記Tie2およびGD2にも、たとえば、CD24陰性もしくは陽性、CD44陽性、CD271陽性／陰性もしくは陰性かつFlt1陽性／陰性もしくは陰性であるといった表面マーカーの特徴を有する（図７ｄ参照）。
【００２８】
・培養方法
本発明の椎間板髄核幹／前駆細胞ないしそれらの細胞を含む細胞集団は、代表的には、脊椎動物の椎間板髄核から採取された髄核細胞集団またはそれを培養して得られた細胞集団から、表面マーカーのTie2およびGD2の少なくとも一方が陽性であるもの、すなわち、表面マーカーが少なくともTie2陽性である椎間板髄核幹細胞および／またはTie2陰性かつGD2陽性である椎間板髄核前駆細胞を単離することを含む培養方法により培養し、作製することができる。
【００２９】
椎間板髄核細胞は、脊椎動物から椎間板の髄核を採取した後、消化、分散、洗浄などの処理を施して当該組織から分離することができる。椎間板髄核細胞の培養方法は公知であり、適切な培地および条件下で培養すればよい。
【００３０】
Tie2、GD2、およびその他の表面マーカーが陽性であるか陰性であるかは、それらのマーカーとなるタンパク質に対応する蛍光標識抗体（好ましくはモノクローナル抗体、必要に応じて二次抗体を併用してもよい）を用いて細胞染色をするなど、公知の方法により判定することができる。フローサイトメーター、セルソーター（細胞分離装置）などの装置を用いることにより、そのように染色された細胞集団から、所定のマーカーのタイプを有する細胞集団を分画して、椎間板髄核幹／前駆細胞を純化することができる。
【００３１】
そのようにして純化された椎間板髄核幹／前駆細胞をさらに培養し増殖させれば、多数の椎間板髄核幹／前駆細胞を含む純度の高い細胞集団を作製することができる。
【００３２】
なお、本発明において「単離」された椎間板髄核幹／前駆細胞（集団）とは、脊椎動物の体内から取り出されて各種の用途に使用可能になった椎間板髄核幹／前駆細胞（集団）であって、特に表面マーカー（幹細胞：少なくともTie2陽性、前駆細胞：Tie2陰性かつGD2陽性）により他の髄核細胞（集団）と区別可能になったものを意味する。また、本発明の椎間板髄核幹／前駆細胞の細胞を含む細胞集団は、各種の用途（増殖のための培養、細胞組成物の調製等）に適した純度を有していればよく、それらの細胞集団が他の細胞（椎間板髄核幹／前駆細胞から分化して成熟した、Tie2陰性かつGD2陰性になった細胞など）を一つも含まないことまでは必ずしも要求されない。たとえば、椎間板髄核幹細胞、椎間板髄核前駆細胞、または椎間板髄核幹細胞および前駆細胞の合計のいずれかについて、生体中の通常の椎間板髄核細胞集団よりも高い純度、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上の純度を有するものであればよい。上記純度の上限は100％に近づけることが可能であるが、99％、98％または97％であってもよい。
【００３３】
本発明の椎間板髄核幹細胞の培養方法のもう一つの態様は、それらの細胞をアンジオポエチンＩの存在下に培養するステップを含むものである。このような培養方法は、椎間板髄核幹細胞を単離するために脊椎動物の椎間板髄核から採取された髄核細胞集団を培養する際に適用してもよいし、すでに単離、純化された椎間板髄核幹細胞を培養するために用いてもよい。
【００３４】
アンジオポエチンＩを細胞培養の環境中に存在させる方法は特に限定されるものではないが、アンジオポエチンＩ（好ましくは水に可溶化したもの）を培養液に添加するようにしてもよいし、アンジオポエチンＩを産生する細胞と共培養するようにしてもよい。
【００３５】
十分な濃度のアンジオポエチンＩの共存下で椎間板髄核幹細胞を培養すると、その細胞を維持し、増殖させることができる。逆にアンジオポエチンＩが培養系内に存在しないと、あるいは存在していてもさらにアンジオポエチンＩの活性を阻害する物質（ブロッキング抗体等）までもが存在していると、椎間板髄核幹細胞を維持することができず、それらの細胞はやがてアポトーシスに向かう。
【００３６】
本発明の脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞または神経細胞（ニューロン、グリア）の培養方法は、椎間板髄核幹／前駆細胞を分化誘導条件下で培養するステップを含むものである。      
【００３７】
脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞および神経細胞への分化誘導条件は公知であり(たとえば後記実施例、非特許文献 42, 43, 44参照)、椎間板髄核幹／前駆細胞からそれらの細胞へと分化させたい場合は、所定の分化誘導物質に曝露させるなど、それぞれ適切な分化誘導条件下で培養すればよい。このようにして作製された脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、神経細胞は移植に用いることができる。
【００３８】
・細胞組成物
本発明の細胞組成物は、前述したような椎間板髄核幹および／または前駆細胞を含有するものである。このような細胞組成物は、特に椎間板障害（腰痛、椎間板変性疾患等）の治療用または予防用のものとして好適である。
【００３９】
すなわち、損傷ないし変性した椎間板の髄核に上記細胞ないし細胞組成物を移植し、移植された椎間板髄核幹／前駆細胞ならびにそれから分化した細胞がＥＣＭ（２型コラーゲン、プロテオグリカン）を産生することにより、椎間板組織の修復や、再構築された組織の維持が可能となる。
【００４０】
上記細胞組成物は、用途に応じて、たとえば治療用の薬剤、細胞の培養、増殖、分化に適した成分、すでに分化した脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、神経細胞のような、椎間板髄核幹／前駆細胞以外の成分、あるいは細胞の足場となる人工的な基質をさらに含有していてもよい。また、細胞組成物に含まれる椎間板髄核幹／前駆細胞の数や純度は、用途に応じて適宜調整することができる。上記細胞組成物は、たとえば、椎間板に注射可能な形態に製剤化した医薬組成物として調製することが好適である。
【００４１】
・治療方法など
本発明による椎間板障害の治療または予防方法は、一つの態様において、前述したような椎間板髄核幹および／または前駆細胞、あるいは細胞組成物を、椎間板に移植することを含むものである。移植に用いる椎間板髄核幹／前駆細胞の数や純度、あるいは細胞組成物の成分やその割合は、治療または予防の態様に応じて適宜調整することができる。
【００４２】
本発明による椎間板障害の治療または予防方法は、もう一つの態様において、椎間板髄核にある椎間板髄核幹（上記のようにして移植されたものであっても、もともと生体内にあるものであってもよい）に対してアンジオポエチンＩを投与することを含むものである。このような方法は、いわゆるサイトカイン療法と呼ばれるものに相当する。アンジオポエチンＩは、前述したように椎間板髄核幹細胞の維持および増殖に必要なタンパク質（サイトカイン）であり、椎間板組織を構成するほとんど全ての細胞が発現しているが、それらの細胞の減少によりアンジオポエチンＩ発現量が低減すると、椎間板髄核幹細胞も減少し、やがて椎間板障害を招くおそれがある。したがって、椎間板髄核幹細胞に十分な量のアンジオポエチンＩを投与することにより、椎間板髄核幹細胞の減少を防止または減少速度を低減し、椎間板障害を治療または予防できる可能性がある。アンジオポエチンＩの投与量は、治療または予防の態様に応じて適宜調整することができる。
【００４３】
本発明による、椎間板の状態に関する指標を得る方法は、脊椎動物の椎間板髄核から採取された髄核細胞集団中の、椎間板髄核幹細胞の割合を測定することを含むものである。      
【００４４】
椎間板髄核幹細胞の割合は、椎間板変性の程度、ないし加齢の程度にともなって変化し、概してその程度が進むほど割合は低下する傾向がある。したがって、被験者の椎間板髄核から採取された髄核細胞集団中の、椎間板髄核前駆細胞集団（Tie2+）の割合を、たとえばフローサイトメトリーまたはＰＣＲ法を用いた表面マーカー解析を通じて測定し、基準となるデータを用いて統計学的な処理をすることにより、その被験者の椎間板の状態に関する指標を得ることができる。基準となるデータおよび統計学的手法は、分析の態様に応じて適切なものを用意または選択すればよい。たとえば、椎間板の変性の程度に関する基準値ないし年齢層ごとの平均値および標準偏差をあらかじめ決定しておき、あるサンプルについて測定された椎間板髄核幹細胞の割合とその基準値ないし平均値および標準偏差との対比により、椎間板の変性の程度ないしその年齢層の椎間板の状態として正常な範囲かどうかを把握することなどが考えられる。
【実施例】
【００４５】
材料および方法
［１］マウス
P0-Cre/Floxed-EGFPマウスおよびWnt-Cre/Floxed-EGFPマウスの入手は、先の論文で述べた方法に従って入手した14．移植実験のレシピエントとして使用する糖尿病性重症免疫不全マウス(NOD/SCID)マウスは、クレアジャパンより購入した。これらのマウスは、東海大学医学部実験動物部門のアイソレーター内にて飼育され、実験に供された。また、こられのマウスを用いた動物実験は、東海大学動物実験委員会の承認を得て行った。【００４６】
［２］マウス髄核細胞の採取
マウスNP組織は、尾部椎間板から外科手術用顕微鏡下にて採取した。簡単には尾部表皮および柔部組織を除去した後、終末板頭部および椎間板の間に切り込みを入れ椎間板を採取した。その後、ゼラチン様のNP組織のみを精密なスプーン器具により採取した。【００４７】
［３］ヒト髄核組織
今回の研究を行う上で、ヒトサンプルの使用においては東海大学病院、医の倫理委員会の承認を得て行った。また、髄核組織の提供を受けるに当たり、十分な説明と同意を患者から得た上で実験に供した。症例の内訳は、椎骨の破裂骨折が１０例、腰椎間板ヘルニアが８例、脊椎分離症が２例の合計２０例である。患者の年齢は１８才から７０才まで、また、個々の症例における椎間板の変性度合いは、トンプソンらの判定法16に基づいて判定を行った。髄核組織は、外科手術における腰椎間板摘出後、繊維輪を注意深く避けて髄核組織の分離を行った。椎骨の破裂骨折の症例においては、椎骨の上部終末板頭部が骨折し、下部終末板頭部が健常な場合に、健常な終末板頭部側から椎間板は基本的に健常部位と想定し、NP組織を採取した。しかしながら、変性の強い椎間板の場合においては、NP組織と内部繊維輪との識別は困難であり、したがって髄核組織内部の領域のみを髄核組織として採取した。患者骨髄液の採取は、十分な説明と同意得た後、椎間板の手術中に行った。RT-PCR解析用の患者骨髄由来間葉系細胞の誘導は、採取された骨髄液から標準的な方法にて行った36。【００４８】
［４］細胞分離および培養
採取されたヒトないしはマウス髄核組織は、はさみなどを利用して小片へと細切した。ヒト髄核組織は、タンパク消化酵素であるトリプルエクスプレス（TrypLE Express）（ギブコ）による１時間の消化、および0.25mg/mlコラゲナーゼP（ロッシュ）による２時間の消化を行い、その後、α-MEM培地（ギブコ）により２回洗浄し、3000〜5000細胞/cm2の細胞密度にて播種した。マウス髄核細胞は、上記消化酵素による消化時間をそれぞれ３０分とした以外は、ヒト髄核組織と同様の処理を行った。消化、分散および洗浄を経て分離されたヒトおよびマウス髄核細胞はそれぞれ、１０％FBS（セルカルチャーバイオサインス）添加同培地にて３７℃５％CO2および５％O2条件下にて培養を開始した。さらに髄核細胞の骨、軟骨および脂肪細胞などへの生体外多分化能の実験法は、後記［１３］「髄核細胞の多分化能」の項を参照されたし。【００４９】
［５］混合培養
10%FBS添加αMEM培地にて４日間の単層状態で初代培養の終了した髄核細胞を混合培養へ利用した。培養は底部に0.4μmのポアサイズを持つポリエチレンテレフタレート膜がはられた６穴培養皿用セルカルチャーインサート（BD バイオサイエンス）および６穴培養皿を利用した。具体的には1.0x104のNP細胞を、単層飽和状態のAHESS-5細胞が膜の裏側に存在するセルカルチャーインサートの中に入れ、髄核細胞およびAHESS-5細胞との膜を隔てた細胞と細胞の接触培養を行った。AHESS-5細胞とは、造血幹細胞を支持する能力のあるマウス骨髄間葉系細胞を、遺伝子工学的手法によってヒトアンジオポエチンＩを産生するようにした細胞である42, 43, 44。また、可溶性アンジオポエチンＩ(500ng/ml)もAHESS-5の変わりに使用した。また、AHESS-5由来のアンジオポエチンＩの影響を検証する目的にて、10μg/mlの濃度にてヤギ由来の抗Tie2ポリクローナル中和抗体またはコントロールとしてヤギ由来の正常血清Ig（R&Dシステム）を利用した。７日間の混合培養の後、NP細胞はトリプルエクスプレスによって分散、コロニーアッセイおよびフローサイトメトリー法による解析に供した。【００５０】
［６］コロニー形成試験
一定個数のヒトないしはマウスの細胞をメソカルトH4230メチルセルロース培地（ステムテクノロジー、増殖因子無添加）に浮遊させた後、35mm直径の培養皿に入れ、３７℃５％CO2および５％O2条件下にて10日間の培養を行い、コロニーを形成させた。形成されたコロニーは、倒立位相差顕微を用いてその数を計測した。なおコロニーは１０以上の細胞から成るものをコロニーとした。【００５１】
［７］フローサイトメトリー解析および髄核細胞の純化
髄核細胞は、FACSキャリバーフローサイトメーター（BDバイオサインス）を用いて細胞表面抗原の解析、またFACSバンテージ細胞分離装置（BDバイオサインス）を用いて細胞分離を行った。【００５２】
ヒトNP細胞は、PE標識マウス由来抗ヒト特異的モノクローナル抗体であるVEGF-R1 (Flt1)（R&Dシステム, 49560）, CD271（ミルテニー, ME20.4-1.H4）, CD44（BDバイオサイエンス, 515）, CD49f（BDバイオサイエンス、GoH3）, CD56（ベックマンコールター, N901）, CD73（BDバイオサイエンス, AD2）, CD90（BDバイオサイエンス, 5E10）, CD105（ベックマンコールター, 1G2）, CD166（BDバイオサイエンス, 3A6）を使用して染色した。【００５３】
染色洗浄後、NP細胞はFACSキャリバーフローサイトメーター（BDバイオサイエンス）を使用して解析した。また、細胞の純化では、ヒト髄核細胞をマウス由来抗ヒト特異的ディシアロガングリオシドGD2抗体（GD2）モノクローナル抗体（BDファミンジェン、14.G2a)を30分間反応、引き続きヤギ由来FITC標識抗マウス二次抗体（BDバイオサイエンス）を４℃30分間反応させた。洗浄後アロピコエリシン（APC）標識抗ヒトTie2モノクローナル抗体（R&D システム、83715）およびPE標識抗ヒトCD24モノクローナル抗体（BDバイオサイエンス、ML5）を反応させた。マウスNP細胞では、ヒトと同様に抗GD2モノクローナル抗体、ヤギ由来ビオチン化抗マウスTie2ポリクローナル抗体およびPE標識抗マウスCD24モノクローナル抗体（BDバイオサイエンス、M1/69)を利用して染色した。洗浄後APCストレプトアビヂン（BDバイオサイエンス）など、それぞれに対応する二次抗体を用いて二次染色を行った。染色の終了したヒトないしマウス髄核細胞は、FACSバンテージ細胞分離装置（BDバイオサイエンス）を利用して細胞を純化した。【００５４】
［８］免疫組織染色
髄核組織などの免疫蛍光染色は、先の論文で記載された方法37にて行った。【００５５】
組織免疫染色として髄核組織は、以下に示す一次抗体を反応させた：抗ヒトTie2/TEK モノクローナル抗体（アップステート, Ab33）, ヤギ由来ビオチン化抗マウスTie2/TEKポリクローナル抗体（R&Dシステム）, anti-human disialoganglioside GD2 mAb,（BD Biosciences, 14.G2a）, 抗ヒトCD24 モノクローナル抗体（BDバイオサインス, M1/69）, 抗タイプIIコラーゲンモノクローナル抗体（生化学工業, II-4C11）, ウサギ由来抗アンジオポエチンＩポリクローナル抗体（アクラス）, 抗ヒト軟骨プロテオグリカンモノクローナル抗体（ケミコン, MAB2015）, 抗グリア細胞線維性酸性タンパク質 (GFAP) モノクローナル抗体（ケミコン, G-A-5）, 抗腺腫性多発結腸ポリープ遺伝子産物 (APC) モノクローナル抗体（ジェネテックス, CC-1）, 抗βチュブリンモノクローナル抗体（シグマアルドリッチ, 2G10）, ウサギ由来抗Tau ポリクローナル抗体（ダコ）, ラビット由来抗ネスチンポリクローナル抗体（Abカム）, ヤギ由来抗ナノグ ポリクローナル抗体（R&Dシステム）, ウサギ由来抗Oct4A モノクローナル抗体（セルシグナリングテクノロジー, C52G3）, ウサギ由来抗-c-Myc rabbit ポリクローナル抗体（サンタクルズ）, ウサギ由来抗-Sox2 rabbit ポリクローナル抗体（ケミコン）, ウサギ由来抗-klf4 ポリクローナル抗体 （サンタクルズ）。次に二次抗体としてヤギ由来アレクサフルオロ488標識抗マウスIgG, ヤギ由来アレクサフルオロ594標識抗マウスIgG, ヤギ由来アレクサフルオロ350標識抗ラビットIgG, ヤギ由来アレクサフルオロ488標識抗ラビットIgG、ヤギ由来アレクサフルオロ594標識抗ラビットIgG, ロバ由来アレクサフルオロ350標識抗ヤギIgGの各二次抗体（モレキュラープローブ）を使用した。標本は同時にDAPI（ベクターラボラトリー）による核染も行った。ウサギ由来アレクサフルオロ488標識抗緑色蛍光タンパク質 (EGFP) ポリクローナル抗体は、EGFP遺伝子標識された移殖細胞の蛍光増強に、またアレクサフルオロ594標識ファロイジン（各モレキュラープローブ）は、アクチン繊維の染色用に使用した。さらに馬由来ビオチン標識抗マウス抗体（ベクターラボラトリー）は、ABCコンプレックス（ストレプトアビジン/西洋わさびペルオキシダーゼ）染色法と共に、DAB染色はヘマトキシリンとの対比染色として使用した。各免疫染色の陰性コントロールとしてウサギまたはヤギIgGを使用した。さらに髄核細胞の骨分化、脂肪細胞分化は、フォンコッサ染色およびオイルレッドO染色により確認した。また、サフラニン O染色またはヘマトキシリン−エオジン染色は、明視野での構造観察用に使用した。【００５６】
免疫蛍光染色された標本は、LSM510共焦点レーザー顕微鏡（カールツャアイス）により、画像採取、画像解析を行った。また、画像処理には、アドビフォトショップ7.0ソフトウェアー（アドビシステム）を利用した。【００５７】
［９］レンチウイルスを利用した遺伝子標識
髄核細胞の遺伝子標識には、EGFPレポーター遺伝子をコードする高力価レンチウイルスを利用して行った。MOI 条件は10に設定、２４時間の感染培養後、髄核細胞をα-MEM培地にて２回洗浄し、さらに２４時間の培養を行い、実験に供した。【００５８】
［１０］髄核細胞移植
マウス皮下移植；PBS100μlに浮遊した純化ヒト髄核細胞浮遊液を、レシピエントNOD/SCIDマウスの腹部皮下に注射し移植を行った40。移殖８週間後、腹部皮下に形成された髄核細胞シストは、レシピエントマウスを麻酔にかけて摘出した。摘出されたシストは、４％パラフォルムアルデヒド（和光純薬）により固定後、各種組織学的検討に使用した。【００５９】
マウス尾椎への移殖；EGFP標識された純化ヒト髄核細胞（5.0 x 105)は、50μlのPBSに浮遊後、27ゲージ針付きインシュリン注射器に注入した。その後、同様の27ゲージ針にて髄核組織を吸引し障害を与えたNOD/SCIDマウス尾椎へ上記細胞浮遊約10μlずつ注入し、移殖を行った。これら尾椎への移殖は、全て外科手術用顕微鏡下にて行った。移植髄核細胞の生存ないし生着は、生物化学発光測定法（BLI法）により測定した。BLI測定は冷却されたIVISシステム（ゼノゲン）を利用して測定し、イメージ解析にはゼノゲン社製ソフトウェアー（ゼノゲン）を利用した。移殖後８〜１２週間後、移殖部位の椎間板は、レシピエントマウスを麻酔にかけて摘出し、解析を行った。具体的には、イソフルランを使用した麻酔下のレシピエントマウスは、遮光された箱の中に置かれ、移殖ヒト髄核から放出されるピーク時のEGFP蛍光を、CCDカメラにより検出し記録した。EGFP蛍光は、１秒間当たりの蛍光量として表した。【００６０】
［１１］アポトーシス測定
ヒト髄核細胞のアポトーシス測定は、ヤギ由来ポロクローナル抗ヒトTie2中和抗体の添加培養により行った。また、コントロールとしてヤギコントロールIgを利用した。抗体添加48時間後、細胞はPIおよびFITC標識抗アネキシンV抗体により染色後（ベックマンコールター）、FACSキャリバーを用いたフローサイトメトリーにより解析した。【００６１】
［１２］RT-PCT
目的髄核細胞は溶解緩衝液で溶解後、RNアクエアス-マイクロスケール RNA 分離キット（アンビオン社）を利用して、RNAを分離した。分離されたmRNAは、高効率 RNA to DNA キット（アプライドバイオサイエンス）を利用して、逆転写してcDNAを作製した。【００６２】
リアルタイムPCR法による９つの標的遺伝子増幅法は、先の論文にて報告した45。簡単には、逆転写されたcDNAは標的遺伝子用プライマーおよびタックマンプローブを含むタックマン遺伝子検出キット（アプライドバイオサインス）を利用して増幅した（表１）。アンジオポエチンＩmRNAの定量は、比較CT法（ABIプリズム、アプライドバイオサイエンス）により、18SリボソームRNAを内部コントロールとして測定した。遺伝子発現のレベルは、純化した髄核Tie2-GD2-細胞分画を基準として、Tie2+GD2-, Tie2+GD2+, Tie2-GD2+ そして Tie2-GD2-CD24+細胞それぞれの発現量を換算した。【００６３】
純化したNP細胞（Tie2+GD2+ または Tie2-GD2-細胞）および骨髄間葉系細胞(BMMSCs)からのRNA抽出は、先に述べた方法にて行った37。40サイクルの増幅後のPCR産物は、３％アガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド（シグマアルドリッチ）を用いて可視した。また、コントロールとして18SリボゾーマルRNAを内部標準として使用した。【００６４】
【表１】
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【００６５】
［１３］髄核細胞の多分化能
ヒト髄核細胞の体外での多分化能を調べる目的にて、先に論文に報告した方法によって、骨、脂肪細胞および軟骨細胞への分化誘導を行った1。また、神経方向への分化を調べる方法として、1.0 x 104/ml 濃度のTie2+GD2+ 髄核細胞をインシュリン(25 mg/ml), トランスフェリン(100 mg/ml), プロゲステロン (20 nM), 亜セレン酸ナトリウム(30 nM), プトレッシン-2HCL (60 nM) (全てシグマアルドリチより購入), 遺伝子組み換え型ヒトEGF(100ng/ml) (ペプロテック), ヒト塩基性FGF (100 ng/ml) (ペプロテック),そしてB27 (20 ng/ml) (ギブコ) 2を添加した DMEM/F12 (1:1) (ギブコ)無血清培地に浮遊し、37℃, 5% CO2 、5% O2条件下にて14日間の培養を行った。培養終了後、細胞はトリプシン分散し、1.0 x 103 の細胞をメチルセルロース培地であるメソカルトH4230倍地（ステムセルテクノロジー、増殖因子は含まず）に浮遊後、35mm培養皿に撒きさらに37℃, 5% CO2 、5% O2条件下にて７日間の培養を行った。【００６６】
［１４］統計処理
それぞれの結果は、平均値±標準偏差にて示す。また、統計学的有意差は、スチューデントのＴ検定を利用した。リアルタイムPCR法において、マンウィットニーのＵ試験を利用した。有意差は、ｐ値が0.05以下の時を有意とした。相関関係は、ピアソン相関係数を利用して算出した。【００６７】
結果
（１）球状コロニー形成髄核細胞のクローン形成能
クローン形成能と球状コロニー形成能は造血幹細胞、神経幹細胞、ES細胞の特徴である11, 12, 13。このような特徴を持つ細胞集団が椎間板髄核内に存在するか否かを検証するため、C57BL/6マウス尾椎椎間板より採取したNP細胞をメチルセルロース上で培養したところ複数の付着型と球状型コロニーの導出を認めた。10日間の培養で大多数のコロニーが付着型であり、付着型：球状型の比率は3.5：1であった（図１ａ）。我々はこの球状型コロニーをCFU-NPと命名した。球状型コロニーを構成する細胞集団を特定するために数多くの表面マーカーにつきフローサイトメトリーを用いて検討したところ、Disialoganglioside GD2とTie2と呼ばれるマーカーを発現する少数の細胞集団に細胞増殖能が高いことが判明した。これまでglycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor protein CD24が分化型NP細胞のマーカーとして報告されている13。GD2がCD24陽性細胞の一部に発現し、GD2+CD24+から球状型コロニーの導出を確認、GD2-CD24+細胞からの導出は認められなかった（図１ｂ）。さらに3-4％の少数のNP細胞がtyrosine kinase receptor Tie2陽性であり、のちにGD2+細胞へと分化した。フローサイトメトリーの結果をまとめるとTie2+GD2- 細胞が10.2±2.9% (n=3) のTie2+GD2+細胞を導出し、やがて Tie2-GD2-CD24+ cellsへと最終分化するという分化傾向にヒエラルキーが存在することが判明した（図１ｂ，ｃおよび図８）。【００６８】
（２）Tie2+細胞は脊索由来NP細胞から派生するTie2+NP細胞の起源を調べるべく、我々はいずれも神経堤由来細胞が遺伝的にマーキングされたダブルトランスジェニックマウスであるWnt1およびP0-Cre/Floxed-EGFPを用いて検索を行った。この2つのトランスジェニックマウスはWnt1またはP0遺伝子が発現した細胞においてEGFPが発現し免疫染色で検出できるモデルである。これまでの報告によるとP0-creにおいてのみ神経堤由来細胞だけでなく脊索にも発現しているとされている15。これら2系統のマウスの椎間板を免疫染色したところP0-creのNP細胞においてのみ陽性であったことから、EGFP陽性細胞は脊索由来であると示唆された（図２ａ）。さらに、メチルセルロース上で球状コロニーを導出させると（図２ｂ）、導出されたコロニーを構成したTie2+細胞のほとんどとTie2-細胞の半分がEGFP陽性であり（図２ｃ）、クローン形成能力に優れたTie2+細胞は脊索由来であると考えられた。【００６９】
（３）ヒトNPにおけるTie2+およびGD2+細胞、Tie2/Ang-1ニッチの同定
マウスNP細胞での傾向がヒト椎間板においても認められるか否かを手術時に採取されたヒト椎間板細胞を用いて検証した（図３ａ，ｂ）。ヒト椎間板組織は採取時にその変性変化を評価し、比較的変性変化が軽度なThompson grade IからIIIを用いた16。免疫組織染色による評価ではごく少数のTie2+がNP中心部とAFとの境界領域に認められたが、GD2+細胞は複数の細胞からなる細胞塊に認められることが多く、NP全体的に散って存在していた（図３ｃ，ｄ）。フローサイトメトリーによる解析の結果、表面マーカーで分離できる細胞の分化傾向はマウスのそれと同様のパターンであった（図９〜１２）。Tie2は神経、血管、造血などの未分化細胞に発現することが報告されている17。造血幹細胞ではTie2と結合するAngiopoietin-1(Ang-1)を分泌し、造血幹細胞を骨髄内ニッチにおいて分化停止状態で保存するといった役割を担っている18。このような制御機構がTie2+NP細胞にも存在するのか否かを検証するためにNP組織中のAng-1の発現を免疫組織化学的に評価した。Ang-1蛋白は椎間板組織を構成する殆どすべての細胞に濃密に発現しており、Tie2+細胞やGD2+細胞にも発現していた（図３ｅ，ｆ）。さらに無血清培地下にメチルセルロース上で培養したNP細胞に分泌型Ang-1を添加したところ導出される球状型コロニー数が増加し、逆にAng-1をブロックする抗体を添加したところ減少した（図３ｇ）。またヒトAng-1を強制発現させたAHESS5細胞と共培養したところ球状型コロニーは同様に増加した（図１３）。一方Ang-1ブロッキング抗体存在下ではTie2+NP細胞はアポトーシスに向かうことなども判明し（図３ｈ，ｉ）、Tie2+NP細胞を維持するためにはTie2/Ang-1シグナル伝達機構が必須であることが示唆され、AHESS5を用いた共培養系によりTie2+細胞を増幅できることが明らかとなった。【００７０】
（４）ヒトTie2+GD2+NP細胞における単細胞解析
単細胞からの自己複製能は幹細胞形質の重要な因子である。我々はヒトTie2+GD2+NP細胞の単細胞培養からでも球状型コロニーが導出され（図４ａ）、二次コロニーも導出できることを証明した（図４ｂ）。NP細胞の主要な役割は主に2型コラーゲンとプロテオグリカンで構成されるECMの産生である。Tie2+GD2+細胞から導出した球状型コロニーの免疫染色を行った結果、球状型コロニーは2型コラーゲンとプロテオグリカンに加えて（図４ｃ）神経幹細胞のマーカーであるnestin陽性であり（図４ｄ）、Tie2+GD2+NP細胞の未分化性を示唆した。【００７１】
（５）Tie2+GD2+NP細胞の組織維持、再構築能
Tie2+GD2+NP細胞が椎間板組織の維持及び再構築能力を有するか否かを調べる目的でまず免疫不全マウスの皮下に細胞を注入した（図５ａ）。すると8週間で皮下に軟骨基質で染色される組織構築をTie2+GD2+NP細胞を注入した群にのみ認めた（図５ｂ）。さらにEGFPにより遺伝的にマーキングしたTie2+GD2+細胞とTie2-GD2-CD24+細胞を椎間板に傷害を加えた免疫不全マウス尾椎椎間板に移植し（図５ｃ）、Bioluminescence imagingを用いて評価した19, 20。その結果、Tie2+GD2+細胞を移植した群においてのみ12週間経ても組織内に認め、移植細胞が2型コラーゲンを産生し、組織維持、再構築する能力の高さを証明した（図５ｄ）。【００７２】
（６）ヒトTie2+GD2+NP細胞の多分化能
In VitroにおいてTie2+GD2+NP細胞は脂肪、骨、軟骨への分化能力を示した（図６ａ）。RT-PCRの結果、Tie2+GD2+細胞は骨髄間質細胞に比べNanog, Oct3/4, Nestin, Musashi-1などの未分化マーカーを強く発現（図６ｂ）、蛋白レベルにおいてはOct3/4, Nanog, cMyc, Sox2, klf4などのES細胞マーカーも他の細胞集団に比べて高く発現していた（図６ｃ）。NestinとMusashi-1は神経幹細胞のマーカーと知られている為21、神経分化能力も検証した。その結果Tie2+GD2+NP細胞は特別な誘導をかけずにニューロン、グリア系のマーカーを複数発現し神経方向への分化能力も合わせ持っていることが判明（図６ｄ）、Tie2+GD2+細胞の多分化能力の高さを証明した。【００７３】
（７）ヒトTie2+NP細胞の臨床的意義
脊索由来NP細胞が成人になると殆ど消失するといわれる6ヒト椎間板手術検体においてTie2+細胞の割合をフローサイトメトリーで検証した。その結果20代を境に著明にTie2+細胞が減少し（図７ａ，ｂ）、ドナーの年齢と負の相関関係を示した（図７ｃ）。さらに球状型コロニーの導出数も年齢と負の相関関係を示しており、Tie2+NP細胞の椎間板変性における病態生理と診断における有用性を示した。【００７４】
考察
今回、in vitro並びにin vivo 研究において我々は初めて椎間板髄核内に球状型コロニーを形成し、自己複製能、多分化能などの幹細胞性質を有するTie2陽性集団をマウスおよびヒトで同定した。そしてこの細胞集団は脊索より派生していた。またAngiopoietin-1が抗アポトーシス、この細胞集団のメンテナンスに重要な役割を担っていることも判明、Angiopoietin-1によるニッチ環境の存在とAngiopoietin-1を用いた治療法開発の可能性を示した。そして最後にこの細胞集団がヒト椎間板において20代という比較的早期に減衰することを突き止め、椎間板における老化、変性と密接な相関関係にあることを示した。【００７５】
球状型コロニー形成は多分化能を持つ幹細胞集団を分離する手法として使用されてきた10-12, 22。過去には骨髄中の球状型コロニー形成細胞が神経幹細胞マーカーnestinを発現、ニューロン、骨格筋細胞、心筋細胞に分化しうることが報告されている11。本研究で同定した球状型コロニー形成細胞も椎間板髄核細胞の主要ECMである2型コラーゲンとプロテオグリカンだけでなくnestinを発現した。さらに球状型コロニー形成細胞集団を純化する為の細胞マーカーとしてTie2 およびGD2を多くの幹細胞関連表面マーカー中より同定した。GD2は間養系幹細胞を単一マーカーで分離できる数少ない表面マーカーである23。これまでに臍帯血内のGD2陽性間葉系幹細胞がGD2陰性間葉系幹細胞に比べてOct-4、Sox-2、Nanog、SSEA-4などのES細胞マーカーがより高く発現していたとの報告がある24。一方Tie2は造血幹細胞や神経幹細胞においてニッチ環境との接着を介した幹細胞制御についてより多くの報告がある18, 25。我々の結果は髄核細胞においてこれら表面マーカーの新たな役割を足す結果となった。In vitroにおけるいくつもの反復実験において髄核細胞の非可逆的分化傾向を証明（図１ｃおよび図９〜１１）、さらにヒト、マウスの髄核細胞において髄核細胞分化におけるヒエラルキーを示し、それを制御するニッチ因子の一つとしてAng-1を挙げた（図７ｄ）。【００７６】
最近、多分化能、自己複製能を持つ神経堤由来幹細胞がマウスの骨髄、後根神経節、ウィスカー・パッドに存在することがWnt1とP0-Cre/Floxed-EGFPトランスジェニックマウスを用いて報告された14。先の研究において椎間板は調べられておらず、我々は神経堤由来間葉系幹細胞が椎間板に存在し得ないかにつき調べた26。今回、球状型コロニーを形成するTie2GD2陽性髄核細胞が脊索由来であったことは、これまでヒト椎間板髄核では脊索由来細胞が20代までに消失し、椎間板の加齢、変性に深く関わることに相関する3-6。脊索由来髄核細胞がほかの髄核細胞に対し様々な刺激を与え、恒常性維持に役立っているという報告はこれまでに多数存在する27, 28。脊索由来髄核細胞の減少は髄核の含水量を低下させる。従い脊索由来髄核細胞を維持することは椎間板変性に対する予防・治療戦略を立てる上で究極のゴールである。【００７７】
Tie2/Ang-1シグナル伝達がTie2陽性髄核細胞のニッチ環境の一つとして細胞の運命を制御できる事実は治療戦略上有益である。サイトカイン療法によりTie2陽性細胞は増幅・維持することが可能となる。組織工学的手法による治療線楽からもニッチ環境を認知しておくことも重要である。Tie2/Ang-1ニッチは椎間板再生の上で必須な要素である。【００７８】
細胞移植療法が椎間板の変性抑制の治療法として動物モデルを経て臨床治験に入っている29-32。軟骨形質を示す様々な細胞、例えば椎間板の軟骨様細胞、関節軟骨細胞、脂肪または骨髄由来幹細胞などである30-34。動物モデルでは有効な手法であるが、実際のヒトでの臨床治験ではどの程度有効かは依然不明である。これまでに脊索由来髄核細胞やそれと同様の性質を持つ細胞を用いた研究は報告がない。我々の研究結果からはTie2+GD2+細胞のほうがTie2-GD2-細胞よりも傷害を与えられた椎間板でより修復能力が高く、細胞移植を考えた場合、これまで治験で試用されている細胞種よりも優れたドナー細胞となりうると考えられた。髄核細胞の栄養はほとんどすべて上下の終板軟骨経由の拡散に頼っているため、加齢に伴う周辺環境の悪化は脊索由来髄核細胞が減衰する一因と考えられる。その為、細胞移植療法は周囲環境が比較的保持された変性初期から中期にかけてのみ適応があると考えられている。脊索由来髄核細胞とそのニッチを含む微小環境をさらに解析することでこういった諸問題を克服できる可能性がある。【００７９】
最後に我々は本研究の様々な結果から推定される髄核細胞の分化カスケードを提示する。この情報は臨床現場における診断と治療に有用な情報となる。例えば、加齢に伴い変化するTie2陽性細胞集団の割合は椎間板変性、加齢の程度を示す指標として使用可能である。我々は手術後に生じる椎間板変性をターゲットとした細胞移植療法の臨床治験中であり29、このような確立された表面マーカーの存在は細胞のポテンシャルと品質を評価する上で大変有用である。本研究結果は椎間板の生物学における新知見を報告するとともに不可逆的に進行する椎間板障害の新規治療法に今後役立つものと考えられた。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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