(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：３９の重鎖配列及び配列番号：４０の軽鎖配列において、ＶＨにおけるＮ１００Ａ、ＶＬにおけるＭ３２Ｌ及びＦｃ領域におけるＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含む、ヒトＣＤ２０に結合するヒト化抗体又はその抗原結合断片であって、Ｆｃ領域におけるアミノ酸番号付けはＥＵ番号付けに従っており、可変ドメインにおけるアミノ酸番号付けはＫａｂａｔの番号付けに従っている、ヒト化抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２】
配列番号：３９の重鎖配列及び配列番号：４０の軽鎖配列において、ＶＨにおけるＤ５６Ａ／Ｎ１００Ａ及びＶＬにおけるＳ９２Ａのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含む、ヒトＣＤ２０に結合するヒト化抗体又はその抗原結合断片であって、可変ドメインにおけるアミノ酸番号付けはＫａｂａｔの番号付けに従っている、ヒト化抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３】
配列番号：３９の重鎖配列及び配列番号：４０の軽鎖配列において、ＶＨにおけるＤ５６Ａ／Ｎ１００Ａ、ＶＬにおけるＭ３２Ｌ／Ｓ９２Ａ及びＦｃ領域におけるＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含む、ヒトＣＤ２０に結合するヒト化抗体又はその抗原結合断片であって、Ｆｃ領域におけるアミノ酸番号付けはＥＵ番号付けに従っており、可変ドメインにおけるアミノ酸番号付けはＫａｂａｔの番号付けに従っている、ヒト化抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４】
配列番号：３９の重鎖配列及び配列番号：４０の軽鎖配列において、ＶＨにおけるＤ５６Ａ／Ｎ１００Ａ、ＶＬにおけるＭ３２Ｌ／Ｓ９２Ａ及びＦｃ領域におけるＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ／Ｅ３５６Ｄ／Ｍ３５８Ｌのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含む、ヒトＣＤ２０に結合するヒト化抗体又はその抗原結合断片であって、Ｆｃ領域におけるアミノ酸番号付けはＥＵ番号付けに従っており、可変ドメインにおけるアミノ酸番号付けはＫａｂａｔの番号付けに従っている、ヒト化抗体又はその抗原結合断片。
【請求項５】
配列番号：３９の重鎖配列及び配列番号：４０の軽鎖配列において、ＶＨにおけるＤ５６Ａ／Ｎ１００Ａ、ＶＬにおけるＭ３２Ｌ／Ｓ９２Ａ及びＦｃ領域におけるＳ２９８Ａ／Ｋ３３４Ａ／Ｋ３２２Ａのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含む、ヒトＣＤ２０に結合するヒト化抗体又はその抗原結合断片であって、Ｆｃ領域におけるアミノ酸番号付けはＥＵ番号付けに従っており、可変ドメインにおけるアミノ酸番号付けはＫａｂａｔの番号付けに従っている、ヒト化抗体又はその抗原結合断片。
【請求項６】
細胞障害性剤に結合している、請求項１−５の何れか一項に記載のヒト化抗体又はその抗原結合断片。
【請求項７】
細胞障害性剤が放射性同位体または毒素である、請求項６に記載のヒト化抗体又はその抗原結合断片。
【請求項８】
請求項１−７の何れか一項に記載のヒト化抗体又はその抗原結合断片と、薬剤的許容性のある担体とを含んでなる組成物。
【請求項９】
請求項１−５のいずれか一項に記載のヒト化抗体又はその抗原結合断片をコードする単離した核酸。
【請求項１０】
請求項９に記載の核酸を含んでなる発現ベクター。
【請求項１１】
請求項９に記載の核酸を含んでなる宿主細胞。
【請求項１２】
ＣＨＯ細胞である、請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
ヒト化抗体又はその抗原結合断片の製造方法であって、請求項１−５の何れか一項に記載のヒト化抗体又はその抗原結合断片を産生する宿主細胞を培養し、細胞からヒト化抗体又はその抗原結合断片を回収することを含む方法。
【請求項１４】
請求項１−７の何れか一項に記載のヒト化抗体又はその抗原結合断片を含む、インビボでＢ細胞のアポトーシスを誘導するための医薬。
【請求項１５】
請求項１−７の何れか一項に記載のヒト化抗体又はその抗原結合断片の治療的有効量を含む、癌患者のＣＤ２０陽性癌を治療するための医薬。
【請求項１６】
ＣＤ２０陽性癌がＢ細胞リンパ腫または白血病である、請求項１５に記載の医薬。
【請求項１７】
ＣＤ２０陽性癌が非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）または白血球優性ホジキン病（ＬＰＨＤ）である、請求項１６に記載の医薬。
【請求項１８】
ＣＤ２０陽性癌が慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）または小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）である、請求項１５に記載の医薬。
【請求項１９】
２５０ｍｇ／ｍ２から５００ｍｇ／ｍ２の用量範囲で投与される、請求項１６に記載の医薬。
【請求項２０】
２７５ｍｇ／ｍ２から３７５ｍｇ／ｍ２の用量範囲で投与される、請求項１６に記載の医薬。
【請求項２１】
患者が、１用量当たり３７５ｍｇ／ｍ２の抗体の少なくとも２用量を投与される、請求項１６に記載の医薬。
【請求項２２】
２用量が２週間の間隔で投与される、請求項２１に記載の医薬。
【請求項２３】
患者が、少なくとも１つの化学療法剤をさらに投与される、請求項１６に記載の医薬。
【請求項２４】
癌が非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）であり、化学療法剤がドキソルビシン、シクロフォスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾロン及びＣＨＯＰからなる群から選択される、請求項２３に記載の医薬。
【請求項２５】
請求項１−７の何れか一項に記載のヒト化抗体又はその抗原結合断片の治療的有効量を含む、自己免疫疾患の患者の自己免疫疾患を治療するための医薬。
【請求項２６】
自己免疫疾患が、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、潰瘍性大腸炎、ウェゲナー肉芽種症、炎症性腸疾患、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、自己免疫性血小板減少症、多発性硬化症、乾癬、ＩｇＡ腎症、ＩｇＭ多発神経障害、筋無力症、血管炎、ＡＮＣＡ血管炎、固形臓器移植拒絶反応、移植片対宿主病、糖尿病、レイノー症候群、シェーグレン症候群、および糸球体腎炎よりなる群から選択される、請求項２５に記載の医薬。
【請求項２７】
自己免疫疾患が関節リウマチである、請求項２６に記載の医薬。
【請求項２８】
患者が、中程度ないし重症の関節リウマチを患っており、病気を調整する少なくとも１つの抗リウマチ薬での治療に失敗したことがある、請求項２７に記載の医薬。
【請求項２９】
患者が第二治療薬を投与される、請求項２７又は２８に記載の医薬。
【請求項３０】
第二治療薬が免疫抑制剤である、請求項２９に記載の医薬。
【請求項３１】
免疫抑制剤がメトトレキセートである、請求項３０に記載の医薬。
【請求項３２】
抗体が、２×１０ｍｇ、２×５０ｍｇ、２×２００ｍｇ及び２×５００ｍｇからなる群から選択される用量で投与される、請求項３１に記載の医薬。
【請求項３３】
抗体が静脈注射により投与される、請求項２５−３２の何れか一項に記載の医薬。
【請求項３４】
抗体が腹腔投与により投与される、請求項２５−３２の何れか一項に記載の医薬。
【請求項３５】
自己免疫疾患が多発性硬化症である、請求項２６に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、抗ＣＤ２０抗体、およびＢ細胞関連疾患の治療におけるその使用に関する。
（発明の背景）
リンパ球は外来の抗原を特異的に認識して、反応する、様々な白血球細胞の一つの集団である。リンパ球の３つの主な分類は、Ｂリンパ球（Ｂ細胞）、Ｔリンパ球（Ｔ細胞）、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。Ｂリンパ球は抗体産生を担い、体液性免疫を供給する細胞である。Ｂ細胞は骨髄内で成熟して、その細胞表面上に抗原結合抗体を発現する。Ｂ細胞がその膜結合性抗体に特異的な抗原と初めて遭遇すると、細胞は速やかに分離し、その子孫はメモリーＢ細胞と「プラズマ細胞」と呼ばれるエフェクター細胞に分化する。メモリーＢ細胞は長い寿命を持ち、本来の親細胞と同じ特異性を有する膜結合性抗体を発現し続ける。プラズマ細胞は、膜結合性抗体を発現する代わりに、分泌型抗体を産生する。分泌された抗体は、体液性免疫の主要なエフェクター分子である。
ＣＤ２０抗原（ヒトＢリンパ球制限分化抗原、Ｂｐ３５とも呼ばれる）はプレＢ及び成熟Ｂリンパ球上に位置するおよそ３５ｋＤの分子量の疎水性膜貫通型タンパク質である（Valentineら, J. Biol. Chem. 264(19):11282-11287 (1989)；及びEinfeldら, EMBO J. 7(3):711-717 (1988)）。該抗原はまたＢ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の９０％以上に発現されるが（Andersonら, Blood 63(6):1424-1433 (1984)）、造血幹細胞、プロＢ細胞、正常なプラズマ細胞又は他の正常な組織上には見出されない（Tedderら, J. Immunol. 135(2):973-979 (1985)）。ＣＤ２０は分化及び細胞周期の開始の活性化過程における初期段階を調節し（上掲のTedderら）、おそらくはカルシウムイオンチャネルとして機能する（Tedderら, J. Cell. Biochem. 14D:195 (1990)）。
【０００２】
Ｂ細胞リンパ腫ではＣＤ２０が発現されるため、この抗原はこのようなリンパ腫治療の有用な治療標的であった。合衆国ではＢ細胞ＮＨＬの人々は３００，０００人以上おり、毎年５６，０００人以上の人々が新しく診断されている。例えば、ヒトＣＤ２０抗原に対する遺伝子的操作を施したキメラマウス／ヒトモノクローナル抗体であるリツキシマブ(rituximab)（リツキサン(RITUXAN)(登録商標)）（Genentech, Inc., サウスサンフランシスコ,カリフォルニア, 合衆国より販売）は、再発性または低抵抗性の（refractory low-grade）または濾胞性の（follicular）、ＣＤ２０陽性、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫患者の治療に有用である。リツキシマブは１９９８年４月７日に発行された米国特許第５７３６１３７号（Andersonら）および米国特許第５７７６４５６号において「Ｃ２Ｂ８」と呼ばれている抗体である。インビトロの作用機序の研究は、リツキサン(登録商標)がヒト補体に結合し補体依存性細胞障害性（ＣＤＣ）を通してリンパＢ細胞系を溶解することを実証している（Reffら, Blood 83(2):435-445 (1994)）。加えて、その抗体は抗体依存細胞性細胞障害性（ＡＤＣＣ）のアッセイにおいて有意な活性を有している。インビボ前臨床研究では、リツキサン(登録商標)が、おそらく補体および細胞媒介性の過程によって末梢血、リンパ節、およびカニクイザルの骨髄からのＢ細胞を消耗させることを示した(Reffら. Blood 83(2):435-445 (1994))。ＮＨＬ治療に必要とされる他の抗ＣＤ２０抗体には、放射性同位体を結合させたマウス抗体ＺｅｖａｌｉｎＴＭ、Ｙｔｔｒｉｕｍ-９０(IDEC Pharmaceuticals、サンフランシスコ、カリフォルニア州), Ｉ-１３１を結合させたもう一つの完全なマウス抗体であるＢｅｘｘａｒＴＭ (Corixa、ワシントン州)を含む。
【０００３】
ヒトの治療にマウス抗体を用いる際の主な限界は、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）反応である（例として、Miller, R.A.ら. “Monoclonal antibody therapeutic trials in seven patients with T-cell lymphoma” Blood, 62:988-995, 1983;およびSchroff, R.W.,ら. “Human anti-murine immunoglobulin response in patients receiving monoclonal antibody therapy” Cancer Res. , 45:879-885, 1985参照）。齧歯類の抗体の可変（Ｖ）領域をヒトの定常（Ｃ）領域に結合させたキメラ分子でさえ、著しい免疫応答を引き起こしうる (HACA、ヒト抗キメラ抗体) (Neubergerら. Nature (Lond.), 314:268-270, 1985)。モノクローナル抗体を臨床に利用する際のこれらの限界を克服するための有力なアプローチは、マウス抗体または非ヒト種の抗体の「ヒト化」である (Jonesら. Nature (Lond), 321:522-525, 1986；Riechmanら, Nature (Lond), 332:323-327, 1988)。
それゆえ、患者、特に慢性治療のために投与するときに最小限または抗原性をなくしたＣＤ２０抗原に対する治療的抗体を生成することが有用である。本発明は、このおよび他のニーズを満たすものである。本発明は、現在の医薬組成物の限界を克服する抗ＣＤ２０抗体を提供するだけでなく、以下の詳細な説明に明らかなような付加的利点を提案する。
【０００４】
（発明の要約）
本発明は、ＣＤ２０結合性抗体またはその機能的フラグメント、およびＢ細胞関連疾患の治療への利用を提供する。この抗体はモノクローナル抗体である。特定の実施態様では、ＣＤ２０に結合する抗体はヒト化またはキメラである。ヒト化２Ｈ７変異体は、ＦＲにアミノ酸置換を持つもの、および移植したＣＤＲに変化を有する類似の成熟変異体を含む。ＣＤＲまたはＦＲの置換したアミノ酸は供与側の抗体または受容側の抗体にあるものに限らない。他の実施態様では、本発明の抗ＣＤ２０抗体はさらにＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣの亢進機能およびＢ細胞殺傷（ここではＢ細胞欠乏も参照）を含めて作動機能の改善を引き起こすＦｃ領域内のアミノ酸残基の変化を含む。他の本発明の抗ＣＤ２０抗体は安定性を改良する特異的な変化を含む。特定の実施態様では、安定性が増したヒト化２Ｆ７変異型は後述の実施例６に示す。インビボで亢進したＡＤＣＣ機能を有するフコースを欠損した変異型も提供する。一実施態様では、キメラ抗ＣＤ２０抗体はマウスＶ領域およびヒトＣ領域を有する。あるそのような特異的なキメラ抗ＣＤ２０抗体としてリツキサン（登録商標）（リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）（登録商標）；Genentech, Inc.）がある。
すべての抗体組成物およびこの発明の使用方法の好ましい実施態様では、ヒト化ＣＤ２０結合抗体は、図６および図７に示すようにそれぞれ配列番号２１および２２の軽鎖および重鎖アミノ酸配列を有する２Ｈ７．ｖ１６である。図６、７、および８のポリペプチド配列を参照したとき、分泌シグナル配列を形成する初めの１９ほどのアミノ酸は成熟ポリペプチドに存在しないことがわかるであろう。１６型を元とした他のすべての変異型のＶ領域は開示されているアミノ酸置換基の位置を除いてｖ１６のアミノ酸配列を有するであろう。特に示さない限り、２Ｈ７変異型はｖ１６と同じＬ鎖を持つ。
【０００５】
本発明は、ヒトＣＤ２０に結合するヒト化抗体、またはその抗原結合フラグメントを提供するものであり、抗体はインビボで霊長類のＢ細胞を枯渇させる効果があり、Ｈ鎖の可変領域（ＶＨ）に少なくとも一つの抗ヒトＣＤ２０抗体の配列番号１２のＣＤＲ３配列および実質的なヒト重鎖サブグループＩＩＩ（ＶＨＩＩＩ）のヒトコンセンサスフレームワーク（ＦＲ）残基を含んでなる抗体である。一実施態様では、霊長類のＢ細胞がヒトおよびカニクイザルのものである。一実施態様では、抗体はさらに配列番号１０のＨ鎖ＣＤＲ１配列および配列番号１１のＣＤＲ２配列を含む。他の実施態様では、前記抗体はさらに配列番号４のＬ鎖ＣＤＲ１配列、配列番号５のＣＤＲ２配列、配列番号６のＣＤＲ３配列、および実質的にヒトコンセンサスフレームワーク（ＦＲ）残基であるヒト軽鎖κサブグループＩ（ＶκＩ）を含む。好ましい実施態様では、ＶＬのＦＲ領域は４６番目に供与側の抗体残基を有する；特定の実施態様では、ＶＬのＦＲ２はｌｅｕＬ４６ｐｒｏのアミノ酸置換基を有する（ｍ２Ｈ７の一致する位置に存在するプロリンに変化されたヒトκＩコンセンサス配列のロイシン）。ＶＨ領域はさらにフレームワーク内の少なくとも４９、７１、および７３番目に供与側の抗体アミノ酸残基を含む。一実施態様では、ＶＨ内のヒト重鎖サブグループＩＩＩの以下に示すＦＲの位置に置換がある：ＦＲ２内のＡｌａＨ４９Ｇｌｙ；  ＦＲ３内のＡｒｇＨ７１ＶａｌおよびＡｓｎＨ７３Ｌｙｓ。他の実施態様では、ヒト化抗体のＣＤＲ領域はさらに供与側および受取側のいずれの抗体にもアミノ酸置換基を含まない。
【０００６】
前記実施態様の抗体は、図１Ｂに示すｖ１６の配列番号８のＶＨ配列を含む。更なる前記実施態様では、抗体は図１Ａに示すｖ１６の配列番号２のＶＬ配列をさらに含む。
一実施態様では、ヒト化抗体は、それぞれ図６および図８に示す配列番号２および２３の軽鎖および重鎖アミノ酸配列を有する２Ｈ７．ｖ３１；図８に示す配列番号２３の重鎖アミノ酸配列を有する２Ｈ７．ｖ３１；ｖ１６のＨ鎖にＤ５６ＡとＮ１００ＡおよびＬ鎖にＳ９２Ａのアミノ酸置換基を有する２Ｈ７．ｖ９６である。
別の実施態様では、前記実施態様のいずれかの抗体はさらに、多くの場合ではｖ．１６、他の場合ではリツキサン由来であり比較される元の抗体または親抗体よりＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性を向上するようにＦｃ領域に少なくとも一つのアミノ酸置換基を含む。向上した活性を有するある抗体は、Ｆｃ領域にＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａの３種類のアラニン置換を含む。Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ置換を有するある抗体は、配列番号２３の重鎖アミノ酸配列を有する２Ｈ７．ｖ３１である。抗体２Ｈ７．ｖ１１４および２Ｈ７．ｖ１１５は、リツキサンと比較して少なくとも１０倍のＡＤＣＣ活性向上を示す。
他の実施態様では、抗体はさらに、多くの場合でｖ１６由来となる親抗体と比較してＣＤＣ活性を減弱するようにＦｃ領域に少なくとも一つのアミノ酸置換基を含む。ｖ１６と比較してＣＤＣ活性が減弱している抗体は少なくともＨ鎖に置換Ｋ３２２Ａを含む。ＡＤＣＣおよびＣＤＣ活性の比較は実施例に示すようなアッセイを行う。
【０００７】
好ましい実施態様では、本発明の抗体はＶＨ領域がヒトＩｇＧ重鎖定常領域に結合している全長の抗体である。好ましい実施態様では、ＩｇＧはヒトのＩｇＧ１またはＩｇＧ３である。
一実施態様では、ＣＤ２０結合抗体は細胞障害性剤に結合している。好ましい実施態様では、細胞障害性剤が放射性同位体または毒素である。
一実施態様では、治療または診断の目的に用いるための本発明の抗体は、ＣＨＯ細胞で生成される。
また、前記いずれか一つの実施態様に示す抗体、および担体を含んでなる組成物を提供する。一実施態様では、担体は薬剤的許容性のある担体である。この組成物は製造品またはキットとして提供されうる。
本発明はまた、２０ｍｇ／ｍＬのヒト化２Ｈ７抗体、ｐＨ５．８の１０ｍＭヒスチジン硫酸塩、６０ｍｇ／ｍｌのショ糖（６％）、０．２ｍｇ／ｍｌのポリソルベート２０（０．０２％）を含む液状物を提供する。
本発明はまた、ここで開示するいずれかの抗体をコードし、抗体を発現するための発現ベクターを含む単離した核酸を提供する。
本発明の他の側面は、前記核酸を含む宿主細胞で、抗体を生成する宿主細胞である。後者の好ましい実施態様では、宿主細胞はＣＨＯ細胞である。これらの抗体を生成する方法であり、抗体を生成する宿主細胞を培養し、その細胞培地から抗体を回収することを含む方法を提供する。
【０００８】
さらに本発明の他の側面は、容器およびそれに内包される前記実施態様のいずれかの抗体を含む組成物を含んでなる製造品である。ＮＨＬ治療に使用するためには、製造品はさらに組成物が非ホジキンリンパ腫の治療に用いることが可能であることを示す梱包挿入物を含む。
本発明の更なる側面は、インビボでＢ細胞にアポトーシスを引き起こす方法において、前記いずれかに記載の抗体をＢ細胞に作用させ、それによってＢ細胞を殺すことを含むものである。
本発明はまた、ＣＤ２０結合抗体またはその機能的フラグメントを疾患に罹患したヒト患者などの哺乳動物に投与することによるここに示す疾患の治療方法を提供するものである。自己免疫性疾患またはＣＤ２０陽性癌のいずれの治療方法においても、一実施態様では、抗体は図６および図７に示すようにそれぞれ配列番号２１および２２の軽鎖および重鎖アミノ酸配列を有する２Ｈ７．ｖ１６である。故に、一実施態様はＣＤ２０陽性癌の治療方法において、本発明のヒト化ＣＤ２０結合抗体の治療的有効量を癌患者に投与することを含むものである。好ましい実施態様では、ＣＤ２０陽性癌は、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）または白血球優性ホジキン病（ＬＰＨＤ）を含むＢ細胞リンパ腫または白血病、慢性白血球性白血病またはＳＬＬであり、抗体は２７５−３７５ｍｇ／ｍ２の用量範囲で投与する。付加的実施態様では、治療方法はさらに少なくとも一つの化学療法剤を患者に投与することを含むものであり、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の場合は、化学療法剤がドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、およびプレドニゾロンよりなる群から選択したものである。
【０００９】
また、提供されるのは自己免疫性疾患の治療方法において、前記いずれか一つのヒト化ＣＤ２０結合抗体の治療的有効量を自己免疫性疾患患者に投与することを含むものである。自己免疫性疾患が、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ウェゲナー肉芽種症、炎症性腸疾患、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、自己免疫性血小板減少症、多発性硬化症、乾癬、ＩｇＡ腎症、ＩｇＭ多発神経障害、筋無力症、血管炎、糖尿病、レイノー症候群、シェーグレン症候群、および糸球体腎炎よりなる群から選択したものである。ここで自己免疫性疾患は関節リウマチであるとき、抗体は第二治療薬、好ましくはメトトレキセートと組み合わせて投与することができる。
これらの治療方法では、ＣＤ２０結合抗体は単独または第二抗体等の第二治療薬、もしくは化学療法剤や免疫抑制剤と組み合わせて投与されうる。第二抗体は、ＣＤ２０または異なるＢ細胞抗原、またはＮＫやＴ細胞抗原に結合するものである。一実施態様では、第二抗体は放射性標識した抗ＣＤ２０抗体である。他の実施態様では、ＣＤ２０結合抗体は毒素または放射性同位体を含む細胞障害性剤に結合している。
【００１０】
他の側面では、本発明は、皮膚筋炎、ウェゲナー肉芽腫症、ＡＮＣＡ（血管炎下を含む）再生不良性貧血、自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）、第ＶＩＩＩ因子欠損症、血友病Ａ、自己免疫性好中球減少症、カストルマン症候群、グッドパスチャー症候群、固形臓器移植拒絶反応、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、ＩｇＭ媒介、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、橋本甲状腺炎、自己免疫性肝炎、リンパ性間質性肺炎（ＨＩＶ）、閉塞性細気管支炎（非移植性）対ＮＳＩＰ、ギラン-バレー症候群、大血管血管炎、巨細胞（高安）動脈炎、中血管血管炎、川崎病、および結節性多発性動脈炎よりなる群から選択した自己免疫性疾患を治療する方法であって、治療的有効量のＣＤ２０結合抗体を罹患患者に投与することを含む方法を提供する。この方法の一実施態様では、ＣＤ２０結合抗体はリツキサン（登録商標）である。
本発明はまた、カニクイザルのＣＤ２０の配列番号： のヌクレオチド配列（図１９に示す）またはこの配列の変性変異型を含む単離した核酸を提供する。一実施態様では、保存的なアミノ酸置換基を有する配列番号： （図２０に示す）または配列番号： （図２０）のアミノ酸配列を持つポリペプチドをコードする配列を含んでなる単離した核酸である。他の実施態様では、前記核酸を含むベクターであり、宿主細胞内で発現するための発現ベクターを含んでなる。同様にベクターを含む宿主細胞である。また、カニクイザルのＣＤ２０のアミノ酸配列［配列番号 ；図２０］を含む単離したポリペプチドを提供する。
【００１１】
（好ましい実施態様の詳細な説明）
「ＣＤ２０」抗原は、末梢血又はリンパ系器官の９０％以上のＢ細胞の表面で見出されるおよそ３５ｋＤａの非グルコシル化膜結合型リンタンパク質である。ＣＤ２０は初期のプレＢ細胞発育中に発現し、プラズマ細胞分化まで残る；ヒトの幹細胞、リンパ球前駆細胞または正常プラズマ細胞にはみられない。ＣＤ２０は正常なＢ細胞及び悪性のＢ細胞の双方に存在する。文献でのＣＤ２０の他の名称には「Ｂリンパ球分化制限抗原」及び「Ｂｐ３５」がある。ＣＤ２０抗原は、例えば、ClarkおよびLedbetter, Adv. Can. Res. 52:81-149 (1989)、およびValentineら, J. Biol. Chem. 264(19):11282-11287 (1989)に記載されている。
「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、特にモノクローナル抗体(全長のモノクローナル抗体を含む)、多重特異的抗体(例えば、二重特異的抗体)、及びそれらが所望の生物活性または機能を示す限りは抗体断片を包含している。
【００１２】
本願のＣＤ２０結合抗体およびヒト化ＣＤ２０結合抗体の生物活性は、ヒトＣＤ２０への抗体結合、より好ましいことにはヒトおよび他の霊長類のＣＤ２０（カニクイザル、アカゲザル、チンパンジーを含む）への結合を少なくとも含むであろう。抗体は、１×１０−８より低いＫｄ値、好ましくは１×１０−９より低いＫｄ値でＣＤ２０に結合し、このような抗体処理をしていない適当なネガティブ対照と比較して少なくとも２０％のＢ細胞をインビボで死滅または枯渇するであろう。Ｂ細胞の枯渇はＡＤＣＣ、ＣＤＣ、アポトーシス、または他のメカニズムの一または複数の結果である。ここで言う疾患治療のある実施態様では、特定の効果的機能またはメカニズムが期待され、ヒト化２Ｈ７のある変異がＡＤＣＣなどの生物学的機能を選択的にもたらす。
【００１３】
「抗体断片」には、全長の抗体の一部、一般的にその抗体の抗原結合又は可変領域が含まれる。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２及びＦｖ断片；ダイアボディー(diabodies)；直鎖状抗体；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および結合部位を含む最小限抗体断片である。この断片は、一重鎖と一軽鎖可変領域ドメインが密接に非共有結合した二量体よりなる。この２つのドメインのフォールディングから６つの高頻度可変性ループ（Ｈ鎖およびＬ鎖のそれぞれから３ループずつ）が生じ、それにより抗原結合にアミノ酸残基を寄与して抗体に抗原結合特異性をもたらす。しかしながら、単鎖可変ドメイン（または抗原特異的なＣＤＲを３つしか含まないＦｖの半分）でさえ、結合部位全体より親和性は低いが、抗原を認識して結合する能力を持つ。
【００１４】
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する。すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在しうる自然に生じる可能な突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。更に、異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的には含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に対するものである。「モノクローナル」との修飾語句は、実質的に均一な抗体の集団から得たものとしての抗体の性質を表すものであり、抗体が何か特定の方法による生成を必要として構築したものであることを意味するものではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は、最初にKohler等, Nature, 256:495 (1975)に記載されたハイブリドーマ法によって作ることができ、あるいは組換えＤＮＡ法によって作ることができる（例えば米国特許第４８１６５６７号を参照のこと）。また「モノクローナル抗体」は、例えば、Clackson等, Nature, 352：624-628 (1991)およびMarks等, J. Mol. biol. 222: 581-597 (1991)に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから作成することもできる。
【００１５】
本発明のＣＤ２０結合抗体の「機能的断片」は、それ自体が由来する原型の全長分子と同じ十分な親和性でＣＤ２０への結合を維持する断片であり、ここで開示するようなインビトロまたはインビボアッセイにより測定されるＢ細胞を枯渇することを含む生物学的活性を示す。
「可変」という用語は、可変ドメインのある部分が、抗体間で配列が広く異なることを意味する。Ｖドメインは抗原結合を仲介し、その特異的抗原に対する特異的抗体の特異性を規定するものである。しかし、可変性は可変ドメインの１１０アミノ酸長を通して均一に分布しているわけではない。それどころか、Ｖ領域は、９−１２アミノ酸長の「高頻度可変領域」と呼ばれる高度可変性短領域により区分される１５−３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる相対的不可変伸展からなる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々４つのＦＲ領域を含み、これは主にβ-シート配置をとり、３つの高頻度可変領域に結合してループ状結合を形成するが、β-シート構造の一部を形成する場合もある。各鎖の高頻度可変領域は、ＦＲ領域の直近に保持され、他の鎖からの高頻度可変領域と共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)を参照のこと）。定常ドメインは抗体の抗原への結合には直接関与しないが、抗体依存的細胞障害（ＡＤＣＣ）における抗体の関与のような様々なエフェクター機能を示す。
【００１６】
ここで使用されるところの「高頻度可変領域」なる用語は、抗原結合に寄与する抗体のアミノ酸残基を意味する。高頻度可変領域は一般には「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（例えば、ＶＬの残基２４−３４(Ｌ１)、５０−５６(Ｌ２)及び８９−９７(Ｌ３)及びＶＨの３１−３５Ｂ(Ｈ１)、５０−６５(Ｈ２)及び９５−１０２(Ｈ３)；Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest,５版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991)）及び／又は「高頻度可変ループ」からの残基(例えば、ＶＬの残基２６−３２(Ｌ１)、５０−５２(Ｌ２)及び９１−９６(Ｌ３)及びＶＨの残基２６−３２(Ｈ１)、５２Ａ−５５(Ｈ２)及び９６−１０１(Ｈ３)；Chothia及びLesk J.Mol.Biol. 196:901-917 (1987)）を含む。
【００１７】
ここで示すように、「コンセンサス配列」または定常Ｖドメイン配列は、公知のヒト免疫グロブリン可変領域配列の比較したアミノ酸配列由来の人工の配列である。この比較に基づいて、ヒトκおよびヒトＨ鎖サブグループＩＩＩＶドメイン由来のコンセンサス配列であるＶドメインアミノ酸をコードする組み換え核酸配列を調製した。コンセンサスＶ配列はいずれの抗体結合特異性も親和性も持たない。
「キメラ」抗体（免疫グロブリン）は特定の種由来または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体が持つ配列に一致するまたは類似する重鎖および／または軽鎖の一部を含むものであり、残りの鎖は、所望の生物学的活性を表す限り、抗体断片のように他の種由来または他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体が持つ配列に一致するまたは類似するものである（米国特許第4,816,567号；およびMorrisonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984))。ここで用いるヒト化抗体はキメラ抗体のサブセットである。
【００１８】
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト霊長類のような非ヒト種からの高頻度可変領域の残基（ドナー抗体）によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエントまたはアクセプター抗体)である。例として、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、もしくはドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性を更に洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、たとえＦＲ領域が結合特性を改善するような一又はそれ以上のアミノ酸置換を含んでも、全てあるいは実質的に全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ＦＲのアミノ酸置換数は一般的にＨ鎖では６個、Ｌ鎖では３個にすぎない。ヒト化抗体は、場合によっては免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、一般的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含む。更なる詳細については、Jones等, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann等, Nature 332:323-329 (1988);及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照のこと。
【００１９】
「抗体依存性細胞障害活性」または「ＡＤＣＣ」は、ある細胞障害性細胞(例えば、ナチュラルキラー(ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）上にあるＦｃレセプター(ＦｃＲ）に結合したＩｇによりその細胞障害性エフェクター細胞が抗原負荷標的細胞に特異的に結合し、続いて細胞毒により標的細胞を死滅するという細胞障害性の形態である。抗体は細胞障害性細胞を武装させ（arm）、完全に死滅することが必要とされる。ＡＤＣＣを媒介する一次細胞であるＮＫ細胞は、ＦＣγＲIIIのみを発現する一方、単球はＦＣγＲI、ＦＣγＲII及びＦＣγＲIIIを発現する。造血性細胞でのＦｃＲの発現は、Ravetch及びKinet, Annu.Rev.Immunol., 9:457-92(1991)の４６４頁の表３に要約されている。対象分子のＡＤＣＣ活性を評価するためには、米国特許第５５００３６２号又は第５８２１３３７号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイが実施されうる。そのようなアッセイのための有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー細胞(ＮＫ）細胞を含む。あるいは、又は付加的に、対象分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynes等 .PNAS(USA), 95:652-656(1998)に開示されたような動物モデルにおいて、インビボで評価されてもよい。
【００２０】
「Ｆｃレセプター」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを表す。好適なＦｃＲは、天然配列ヒトＦｃＲである。さらに好適なＦｃＲは、ＩｇＧ抗体(γレセプター)に結合し、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲII及びＦｃγＲIIIサブクラスのレセプターを含むものであり、これらのレセプターの対立遺伝子変異体及び選択的スプライシング型を含む。ＦｃγＲIIレセプターは、ＦｃγＲIIＡ(「活性化レセプター」）及びＦｃγＲIIＢ(「阻害レセプター」）を含み、それらは、主としてその細胞質ドメインにおいて異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化ＦｃγＲIIＡは、その細胞質ドメインに、免疫レセプターチロシン−ベース活性化モチーフ(ＩＴＡＭ）を有する。阻害レセプターＦｃγＲIIＢは、その細胞質ドメインに、免疫レセプターチロシン−ベース活性化モチーフ(ＩＴＡＭ）を有する(Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234(1997)に概説されている）。ＦｃＲはRavetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capelら, Immunomethods 4:25-34 (1994);及びde Hasら, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)において概説されている。将来同定されるものも含む他のＦｃＲが、ここにおける「ＦｃＲ」なる用語によって包含される。この用語は胎児への母性ＩｇＧの移動の原因である新生児レセプター、ＦｃＲｎもまた含む(Guyerら, J. Immumol. 117:587 (1976)及びKimら, J. Immunol. 24:249 (1994))。
【００２１】
WO00/42072 (Presta) にＦｃＲへの結合を向上または減弱させた抗体変異型が述べられている。この特許公開の内容はここには文献として具体的に組み込まれる。Shields ら J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)も参照のこと。
「ヒトエフェクター細胞」は、一又は複数のＦｃＲを発現し、エフェクター機能を果たす白血球である。好ましくは、細胞は少なくともＦＣγＲIIIを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を果たす。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー(ＮＫ）細胞、単球、細胞障害性T細胞及び好中球が含まれる；ＰＢＭＣ類及びＮＫ細胞が好まれる。エフェクター細胞は、その天然源、例えば血液から単離することができる。
「補体依存性細胞傷害性」または「ＣＤＣ」は、補体存在下における標的細胞の溶解に関する。古典的補体経路活性化は、同系の抗原に結合される（適当なサブクラスの）抗体に補体系(Ｃ１ｑ）の最初の構成物が結合することによって開始される。補体の活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを、例えばGazzano-Santoroら, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されているように実施することができる。
【００２２】
Ｆｃ領域のアミノ酸配列を変更させるような、およびＣ１ｑ結合能を増強または減弱させるポリペプチドの変異は米国特許第６１９４５５１号およびＷＯ９９／５１６４２に記載されている。これらの特許文献の内容はここに文献として具体的に組み込まれる。Idusogieら. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)も参照。
ＩｇＧのＮグリコシル化部位はＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７である。本発明もＣＤ２０結合性、Ｆｃ領域を有するヒト化抗体の組成物を提供するものであり、組成物中の抗体の約８０−１００％（好ましくは約９０−９９％）はフコースを欠損し、糖タンパク質のＦｃ領域に結合した成熟コア炭水化物構造を含む。このような組成物はヒトＩｇＧと相互作用する際にＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｖ１５８）ほど効果的ではないが、ＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｆ１５８）への結合を驚くほど改善を示すことがここに証明された。故に、ここでの組成物は特にＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｆ１５８）を発現するヒト患者の治療を目的として前述の抗ＣＤ２０抗体組成物より優れていることが予想される。ＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｆ１５８）は正常で健康なアメリカ黒人および白人にＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｖ１５８）より共通している。Lehrnbecherら. Blood 94:4220 (1999)参照。本願はさらに、糖タンパク質のＦｃ領域においてここで言うグリコシル化変異とアミノ酸配列修飾を兼ね備えることによるＦｃγＲＩＩＩ結合および／またはＡＤＣＣ機能における相乗的増加をも証明する。
【００２３】
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものを意味する。その自然環境の汚染成分は、抗体の診断又は治療への使用を妨害しうる物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様においては、抗体は、(１)ローリー(Lowry)法により定量して、９５重量％の抗体より多くなるほど、最も好ましくは９９重量％より多くなるまで、(２)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、Ｎ末端あるいは内部アミノ酸配列の少なくとも１５の残基を得るのに充分な程度まで、あるいは、(３)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性が得られるように充分な程度まで精製される。抗体の自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないため、単離された抗体には、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも１つの精製工程により調製される。
【００２４】
「単離された」核酸分子は、同定され、抗体核酸の天然供給源に通常付随している少なくとも１つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。単離された核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。故に、単離された核酸分子は、天然の細胞中に存在する核酸分子とは区別される。しかし、単離された核酸分子は、例えば、核酸分子が天然の細胞のものとは異なった染色体位置にある抗体を通常発現する細胞に含まれる核酸分子を含む。
「コントロール配列」という表現は、特定の宿主生物において作用可能に結合されたコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
【００２５】
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合され」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に寄与するプレタンパク質として発現されているならそのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合されている；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならばコード配列に作用可能に結合されている；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるならコード配列と作用可能に結合されている。一般的に、「作用可能に結合される」とは、結合されたＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読み取り枠内にある。しかし、エンハンサーは必ずしも近接しているわけではない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、通常の手法にしたがって、合成されたオリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
「ベクター」はシャトルおよび発現ベクターを含む。一般的に、プラスミドコンストラクトも複製起源（例として、ＣｏｌＥ１複製起源）および選択マーカー（例として、アンピシリンまたはテトラサイクリン耐性）をそれぞれ細菌内のプラスミドの複製および選択を目的として含むであろう。「発現ベクター」は必要なコントロール配列または本発明の抗体断片を含む抗体の発現の調節因子を細菌または真核細胞内で含むベクターを表す。好適なベクターは以下に示す。
【００２６】
本願のヒト化ＣＤ２０結合抗体を生成する細胞は抗体をコードする核酸を導入してある細菌および真核生物宿主細胞を含むであろう。好適な宿主細胞を以下に示す。
ここで使用される「標識」なる語句は、抗体に直接的に又は間接的に抱合した検出可能な化合物又は組成物を意味する。標識はそれ自体が検出可能(例えば、放射性標識又は蛍光標識)であり得、あるいは酵素標識の場合には、検出可能な基質化合物又は組成物の化学変化を触媒しうる。
ここでの「自己免疫疾患」は、個体自体（自身）の抗原および／または組織から生じるおよびそれらに対する非悪性疾病または疾患である。
ここで用いる「Ｂ細胞枯渇」は、処置前のＢ細胞レベルと比較して薬剤または抗体処置後に動物またはヒトにおいてＢ細胞レベルが減少することを表す。Ｂ細胞レベルは実験的実施例に示したもののような公知なアッセイを用いて測定する。Ｂ細胞枯渇は完全または部分的なものであり得る。一実施態様では、Ｂ細胞を発現するＣＤ２０の枯渇は少なくとも２５％である。一のメカニズムに限定するものではなく、Ｂ細胞を枯渇しうるメカニズムは、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、アポトーシス、カルシウム流動の調節または前記二もしくはそれ以上の組み合わせを含む。
【００２７】
ここで使用する「細胞障害性剤」なる用語は、細胞の機能阻害または阻止およびまたは細胞破壊をもたらす物質を表す。この用語は、放射性同位体（例として、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、およびＲｅ１８６）、化学療法剤、および真菌、植物、または動物起源の酵素活性毒素などの毒素、またはそれらの断片を含むことを意図する。
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロホスファミド(CYTOXAN(登録商標))のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類、；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；クロランブシル、クロロナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロスレアス(nitrosureas)；アクラシノマイシン(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン(cactinomycin)、カリケアマイシン(calicheamicin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン(carminomycin)、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorubicin)、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、エソルビシン(esorubicin)、イダルビシン、マルセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシン、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)などの抗生物質；メトトレキセート及び５−フルオロウラシル(５−ＦＵ）のような抗-代謝産物；デノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)のような葉酸類似体；フルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似物；ピリミジン類似体、例えばアンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、及びフロキシウリジン(floxuridine)、５−ＦＵ；カルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)のようなアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎剤；フロリン酸(frolinic acid)のような葉酸リプレニッシャー(replenisher)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチ��(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；オキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidamine)：ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidamol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＫＳ(登録商標)；ラゾキサン(razoxane)；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２&quot;-トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカーバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；シトシンアラビノシド（「Ara-C」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル（タキソール(登録商標)、Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ）、及びドキセタキセル（タキソテア(登録商標)、Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）；クロランブシル；ゲンシタビン(gemcitabine)；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチン、カルボプラチンのようなプラチナ類似体；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド(ＶＰ−１６）；イフォスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン(navelbine)；ノバントロン(novantron)；テニポシド；ダウノマイシン；カルミノマイシン；アミノプテリン；キセローダ(xeloda)；イバンドロナート(ibandronate)；ＣＴＰ-１１；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸；エスペラマイシン；カペシタビン(capecitabine)；並びに上述したものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。また、この定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように働くホルモン剤、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン(raloxifene)、４(５)-イミダゾール類を阻害するアロマターゼ、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン(onapristone)、トレミフェン(Fareston)；及び抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)及びニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド(bicalutamide)、リュープリン(leuprolide)、及びゴセレリン；プレドニゾロンなどの他の化学療法剤が含まれる。上記のものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。
【００２８】
「治療すること」または「処置」または「緩和」は、治療的処置および予防薬または予防対策の両方を表し、この目的は標的とした病態または疾患を予防または衰退（減少）することである。本発明の方法に従って本発明のＣＤ２０結合抗体の治療的有効量を取り込んだ後、患者がＣＤ２０陽性癌または自己免疫性疾患がうまく「治療」されれば、患者は特定の疾患の一またはそれ以上の兆候および症状が明らかにおよび／または測定可能な程度に減少または消失する。例えば、癌では、癌細胞数の減少または癌細胞の消失；腫瘍の大きさの減少；腫瘍転移の阻害（すなわち、ある程度の遅延および好ましくは停止）；ある程度の腫瘍成長の阻害；緩解期の延長、および／または特定の癌が関与する一またはそれ以上の症状のある程度の除去；罹患率および死亡率の減少、および生活の質の改善がある。疾患の兆候または症状の減弱は患者が感じ得るものである。癌のすべての兆候の消失を定義するならば、腫瘍の大きさが好ましくは５０％以上、より好ましくは７５％以上減少すると、処置が完全な反応または部分的な反応を達成し得たことになる。患者が疾患の安定を体験するならば、患者も治療されたと考える。好ましい実施態様では、癌患者に１年、好ましくは１５か月後に癌の進行がないことである。疾患の改善および治療の成功を評価するこれらのパラメーターは医師などの適切な当業者に知られたお決まりの手法によって簡単に測定可能である。
【００２９】
「治療的有効量」という用語は、対象物の疾患又は疾病を「治療」するのに効果的な抗体または薬剤の量を指す。癌の場合は、治療的有効量の薬剤は、癌細胞の数を減少させ；腫瘍の大きさを小さくし；癌細胞の周辺器官への浸潤を阻害(すなわち、ある程度に遅く、好ましくは止める）し；腫瘍の転移を阻害(すなわち、ある程度に遅く、好ましくは止める）し；腫瘍の成長をある程度阻害し；及び／又は癌に関連する一つ或いはそれ以上の症状をある程度和らげることが可能である。「治療する」の定義を参照。
「慢性」投与は、長期間初期治療効果（活性）を維持するために、急性の状態とは反対に連続的状態での薬剤投与を表す。「間欠的」投与は中断せずに継続して行わずむしろ自然的周期で行う治療である。
【００３０】
（発明の組成物と方法）
本発明は、ヒトＣＤ２０、好ましくは他の霊長類のＣＤ２０に同様に結合するヒト化抗体であり、非ヒト種抗ヒトＣＤ２０抗体（ドナー抗体）の少なくとも一の、好ましくは二またはすべてのＨ鎖ＣＤＲを有するＨ鎖、およびレシピエント抗体としてヒトコンセンサス抗体の実質的にすべてのフレームワーク残基を含むヒト化抗体を提供する。ドナー抗体はマウス、ラット、モルモット、ヤギ、ウサギ、ウマ、霊長類を含む様々な非ヒト種由来であるが、最も頻度が高いのはマウス抗体であろう。ここで「実質的にすべて」とは、ヒト化抗体のレシピエントＦＲ領域にはヒトコンセンサスＦＲ配列に元々存在しない一またはそれ以上のアミノ酸置換基を含みうることを意味する。これらのＦＲ変異はレシピエントまたはドナー抗体にはみられない残基を含みうる。
一実施態様では、ドナー抗体はマウス２Ｈ７抗体であり、そのＶ領域は図１Ａおよび図１Ｂに示すＨ鎖およびＬ鎖それぞれのＣＤＲおよびＦＲ配列を含む。特定の実施態様では、ヒトＶκサブグループＩおよびＶＨサブグループＩＩＩのコンセンサス配列と一致したヒトＦａｂフレームワークの残基であるコンセンサス配列を図１Ａおよび図１Ｂにそれぞれ示す。本発明のヒト化２Ｈ７抗体はマウスドナー抗体のＨ鎖内に少なくとも一のＣＤＲを有するであろう。一実施態様では、ヒトＣＤ２０に結合するヒト化２Ｈ７抗体はドナー抗体のＨ鎖およびＬ鎖の両方のＣＤＲを含む。
【００３１】
完全長抗体では、本発明のヒト化ＣＤ２０結合抗体はヒト免疫グロブリンのＣドメインに結合したヒト化Ｖドメインを含むであろう。好ましい実施態様では、Ｈ鎖Ｃ領域はヒトＩｇＧ、好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ３由来である。Ｌ鎖Ｃドメインは好ましくはヒトκ鎖由来である。
特に示さない限り、ここでのヒト化２Ｈ７抗体型は、アミノ酸置換基または以下の実験的実施例に示す変異を除く２Ｈ７．ｖ１６Ｌ鎖（図６、配列番号２１）およびＨ鎖（図７、配列番号２２）のＶおよびＣドメインを有するであろう。
ヒト化ＣＤ２０結合抗体は少なくともヒトＣＤ２０および好ましくは他の霊長類ＣＤ２０、例としてカニクイザルおよびアカゲザルおよびチンパンジーを含むサルのＣＤ２０に結合する。カニクイザルのＣＤ２０の配列を実施例１５および図１９に示す。
本発明のＣＤ２０結合抗体およびヒト化ＣＤ２０結合抗体の生物学的活性は、少なくともヒトＣＤ２０へ、より好ましくはヒトおよび霊長類（カニクイザルおよびアカゲザルおよびチンパンジーを含む）ＣＤ２０へ、１×１０−８より小さいＫｄ値、好ましくは１×１０−９より小さいＫｄ値、より好ましくは１×１０−１０より小さいＫｄ値で抗体が結合し、インビトロまたはインビボで基準値または抗体処理を施していない適当なネガティブ対照と比較して好ましくは少なくとも２０％Ｂ細胞を死滅または枯渇することができることである。
【００３２】
所望のＢ細胞枯渇レベルは疾患に依存する。ＣＤ２０陽性癌の治療を目的として、本発明の抗ＣＤ２０抗体の標的であるＢ細胞を最大限枯渇することを望むであろう。故に、ＣＤ２０陽性Ｂ細胞腫瘍の治療を目的として、腫瘍の成長（大きさ）、腫瘍細胞型の増殖、転移、特定の癌の他の兆候や症状を観察するなどによって当業の医師により評価可能な少なくとも疾患の進行予防に十分なＢ細胞枯渇であることが望まれる。好ましくは、少なくとも２か月、より好ましくは３か月、さらに好ましくは４か月、より好ましくは５か月、さらに好ましくは６か月またはそれ以上の間疾患の進行を予防するためにＢ細胞枯渇が十分であることである。さらにより好ましい実施態様では、少なくとも６か月、より好ましくは９か月、より好ましくは１年、より好ましくは２年、より好ましくは３年、さらに好ましくは５年以上の間緩解期間を増やすためにＢ細胞枯渇が十分であることである。最も好ましい実施態様では、疾患を治癒するためにＢ細胞枯渇が十分であることである。好ましい実施態様では、癌患者におけるＢ細胞枯渇は治療前の基準値の少なくとも７５％およびより好ましくは８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、および１００％であることである。
【００３３】
自己免疫疾患の治療のために、ＣＤ２０結合抗体の用量を調節することにより個々の患者の疾患および／または重症度に応じてＢ細胞枯渇の程度を調節することが望まれる。故に、Ｂ細胞枯渇は完全である必要はない。もしくは、全Ｂ細胞枯渇は続く治療を除いて初期治療の際に望まれ、用量が部分枯渇のみを達するように調節されるであろう。一実施態様では、Ｂ細胞枯渇は少なくとも２０％、すなわち、８０％またはそれ以下のＣＤ２０陽性Ｂ細胞が治療前の基準値と比較して残っているのである。他の実施態様では、Ｂ細胞枯渇は２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％またはそれ以上である。好ましくは、疾患の進行休止、より好ましくは治療下にある特定の疾患の兆候や症状の緩和、さらに好ましくは疾患治癒に十分なＢ細胞枯渇であることである。
本発明はまた、抗体がの一つのアームに本発明のヒト化ＣＤ２０結合抗体のヒト化Ｈ鎖およびＬ鎖を有し、他のアームに第二抗原特異的に結合するＶ領域を有する二重特異性ＣＤ２０結合抗体を提供する。特定の実施態様では、第二抗原は、ＣＤ３、ＣＤ６４、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、または他のＮＫ活性化リガンドからなる群から選択したものである。
リツキサン（リツキシマブ）と比較して、ｖ１６はリツキサンより約２から５倍のＡＤＣＣ作用強度、３−４倍以下のＣＤＣ減弱を表す。
【００３４】
（抗体生成）
モノクローナル抗体 
モノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製でき、又は組換えＤＮＡ法(米国特許第４，８１６，５６７号)によって作製することができる。 
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスターを上記のように免疫し、免疫化に用いられたタンパク質と特異的に結合する抗体を産生する、又は産生することのできるリンパ球を導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。次に、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。 
【００３５】
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞（融合パートナーとも表す）の増殖または生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培地に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠失するならば、ハイブリドーマのための選択培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ−欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含有するであろう(ＨＡＴ培地)。
【００３６】
好ましい融合パートナー骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの発現を支援し、融合していない親細胞を選択する選択培地に対して感受性である細胞である。これらの中でも、好ましい骨髄腫細胞株は、マウス骨髄腫株、例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター、サンディエゴ、カリフォルニア、ＵＳＡより入手し得るＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍、及び、ＳＰ−２および類縁体、例としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックヴィル、メリーランド、ＵＳＡより入手し得るＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞由来のものである。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために開示されている（Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,51-63頁、(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)）。 
【００３７】
ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫吸着検定(ＥＬＩＳＡ)によって測定する。 
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Munsonら, Anal. Biochem., 107:220 (1980)に記載されているスカッチャード分析により決定できる。
所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が確定された後、該クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。この目的に対して好適な培地は、例えば、Ｄ−ＭＥＭ又はＲＰＭＩ−１６４０培地を包含する。また、そのハイブリドーマ細胞は、例えばマウス内の細胞に腹腔内注入するなどして、動物において腹水症腫瘍としてインビボで増殖させることができる。 
【００３８】
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばアフィニティークロマトグラフィー（例としてプロテインＡまたはプロテインＧセファロースを用いることによる）、またはイオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析などのような常套的な抗体精製法により、培地、腹水、又は血清から好適に分離される。 
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常法を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより)即座に単離され配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび分離されたならば、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、この状況以外では抗体タンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞中に形質移入し、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を獲得することができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌内組み換え発現に関する文献には、Skerraら, Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) および Pluckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992)がある。
【００３９】
更なる実施態様において、抗体又は抗体断片は、McCafferty等, Nature, 348:552-554 (1990)に記載された技術を使用して産生される抗体ファージライブラリから単離することができる。Clackson等, Nature, 352:624-628 (1991)及び Marks等, J.Mol.Biol., 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリを使用したマウス及びヒト抗体の単離をそれぞれ記述している。続く刊行物は鎖シャッフリングによる高親和性(ｎＭ範囲)のヒト抗体の生産(Marks等, Bio/Technology, 10:779-783(1992))、並びに非常に大きなファージライブラリを構築するための方策としてコンビナトリアル感染とインビボ組換え(Waterhouse等, Nuc.Acids.Res., 21:2265-2266 (1993))を記述している。従って、これらの技術はモノクローナル抗体の単離に対する伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法に対する実行可能な別法である。 
【００４０】
キメラまたは融合抗体ポリペプチドを生成するために抗体をコードするＤＮＡを修飾する、例えば、相同的マウス配列をヒト重鎖及び軽鎖定常部のコード化配列（ＣＨおよびＣＬ）に置換することにより(米国特許第４，８１６，５６７号；およびMorrison等, Proc.Nat.Acad.Sci. USA, 81:6851(1984))、又は免疫グロブリンコード化配列に非免疫グロブリンポリペプチド（非相同ポリペプチド）のコード化配列の全て又は一部を共有結合させることにより、修飾することができる。 このような非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常部を置換し、又は抗体の１個の抗原結合部位の可変部を置換して、抗原に対する特異性を有する１個の抗原結合部位、及び異なる抗原に対する特異性を有するもう一つの抗原結合部位を含むキメラ二価抗体を作り出す。 
【００４１】
ヒト化抗体 
非ヒト抗体のヒト化方法は、当分野で示されている。好ましくは、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入された一又は複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基はしばしば「移入」残基と呼ばれ、これは典型的には「移入」可変ドメインから取られている。ヒト化は、本質的にはウィンターと共同研究者の方法(Jones等, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988))に従って、ヒト抗体の対応配列を高頻度可変領域配列に置換することにより、実施することができる。従って、このような「ヒト化」抗体は、未処理のヒト可変ドメインより実質上小さい部分が非ヒト種由来の対応配列によって置換されているキメラ抗体である(米国特許第４，８１６，５６７号)。実際、ヒト化抗体は、典型的には、幾つかの高頻度可変領域残基及びことによると幾つかのＦＲ残基が、齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。 
【００４２】
ヒト化抗体の作成に使用される軽鎖と重鎖両方のヒト可変ドメインの選択は、ヒト治療の使用を目的とする場合に、抗原性およびＨＡＭＡ反応（ヒト抗マウス抗体）を低下させるために非常に重要である。いわゆる「ベストフィット」法によれば、齧歯類抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに対してスクリーニングする。齧歯類の配列に最も近いヒトＶドメイン配列を同定して、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク(ＦＲ)として受け入れる(Sims等, J.Immunol., 151:2296 (1993)；Chothiaら, J.Mol.Biol., 196:901 (1987))。もう一つの方法は、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列由来の特定のフレームワークを使用するものである。同じフレームワークを幾つかの異なるヒト化抗体に使用することができる(Carter等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 89:4285 (1992)；Presta等, J.Immunol., 151:2623 (1993))。 
【００４３】
更に、抗体は、抗原に対する高親和性及び他の望ましい生物学的性質を保持したままヒト化することが重要である。この目的を達成するため、好ましい方法によれば、親配列及び様々な概念的ヒト化生成物を、親およびヒト化配列の三次元モデルを用いて分析する工程によって、ヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般に利用でき、当業者には良く知られている。選ばれた候補免疫グロブリン配列の可能な三次元コンホメーション構造を例示し表示するコンピュータープログラムが利用できる。これらの表示を調べることにより、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能な役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原を結合させる能力に影響を及ぼす残基の分析が可能となる。このようにしてレシピエント及び移入配列からのＦＲ残基を選択し、結びつけることができ、所望の抗体の特性、例えば標的抗原に対する親和性の増加が達成される。一般に、高頻度可変領域残基は、直接的かつ最も実質的に抗原結合への影響に関与する。
ヒト化抗体は抗体断片、例としてＦａｂであり、免疫複合体を生成するために一またはそれ以上の細胞障害性剤と選択的にコンジュゲートしている。またはヒト化抗体は完全長抗体、例として完全長ＩｇＧ１抗体であり得る。
【００４４】
ヒト抗体およびファージディスプレイ方法論
ヒト化の別法として、ヒト抗体を生成することができる。例えば、内因性の免疫グロブリン産生がなくともヒト抗体の全レパートリーを免疫化することで産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが現在は可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子の同型接合欠損が内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖系列突然変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子列の転移は、抗原投与時にヒト抗体の産生をもたらす。Jakobovitsら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993)；Jakobovitsら, Nature 362:255-258 (1993); Bruggemannら, Year in Immuno., 7:33 (1993)；及び米国特許第５５４５８０６号、同５５６９８２５号、同５５９１６６９号（すべてのＧｅｎＰｈａｒｍ）、同５５４５８０７号、およびＷＯ９７／１７８５２を参照されたい。
【００４５】
別法として、ファージディスプレイ技術(McCaffertyら, Nature 348：552-553(1990))を、非免疫化ドナーからの免疫グロブリン可変(Ｖ)ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体及び抗体断片を産出させるために使用することができる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子は、繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３またはｆｄの主要又は少数コートタンパク質遺伝子のいずれかにおいてイン-フレームをクローンし、ファージ粒子の表面において機能的抗体断片として表示される。繊維状粒子がファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能特性に基づいた選択により、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択がなされる。よって、ファージはＢ細胞の特性のいくつかを模倣している。ファージディスプレイは多様な形式で行うことができる；例えばJohnson, Kevin S. 及びChiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)を参照のこと。Ｖ-遺伝子セグメントのいくつかの供給源がファージディスプレイのために使用可能である。Clacksonら, Nature, 352：624-628(1991)は、免疫化されたマウス脾臓から得られたＶ遺伝子の小ランダム組合せライブラリからの抗-オキサゾロン抗体の異なった配列を単離した。非免疫化ヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーを構築することができ、多様な列の抗原(自己抗原を含む)に対する抗体を、Marksら, J. Mol. Biol. 222：581-597(1991)、又はGriffithら, EMBO J. 12：725-734(1993)に記載の技術に本質的に従って単離することができる。また、米国特許第５５６５３３２号及び同５５７３９０５号を参照のこと。
先に述べたように、ヒト抗体はインビトロで活性化されたＢ細胞により生成される（米国特許第５５６７６１０号および同第５２２９２７５号）。
【００４６】
抗体断片
ある状況では抗体全体より抗体断片を用いることに有用性がある。断片がより小さければ早く通過できるので、固形腫瘍へより接近しやすいであろう。
抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、未処理の抗体のタンパク分解性消化を介して誘導されていた(例えば、Morimoto等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)；及びBrennan等, Science, 229:81(1985)を参照のこと)。しかし、これらの断片は現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。Ｆａｂ、ＦｖおよびＳｃＦｖ抗体断片はすべて大腸菌で発現して分泌されるので、大量の抗原断片を容易に生成することができる。抗体断片は上述した抗体ファージライブラリーから単離することができる。別法として、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合してＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他のアプローチ法では、Ｆ(ａｂ')２断片を組換え宿主細胞培養から直接単離することができる。エピトープ残基に結合するサルベージレセプターを含むインビボでの半減期が長いＦａｂおよびＦ(ａｂ')２断片は米国特許第５８６９０４６号に述べられている。抗体断片の生産のための他の方法は当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択抗体は単鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦＶ)である。国際公開第９３／１６１８５号；米国特許第５５７１８９４号；及び米国特許第５５８７４５８号を参照のこと。ＦｖおよびｓＦｖは定常領域を欠損している無処理の結合部位を有する種のみである；故に、インビボで用いる際に非特異性結合を減らすのに好適である。ｓＦｖ融合タンパク質はｓＦｖのアミノ末端またはカルボキシル末端のいずれかでエフェクタータンパク質の融合が起こって構築されるものである。上述のAntibody Engineering, ed. Borrebaeckを参照。また、抗体断片は、例えば米国特許第５６４１８７０号に記載されているような「線形抗体」であってもよい。このような線形抗体断片は単一特異性又は二重特異性であってよい。
【００４７】
二重特異性抗体 
二重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる抗原に対する結合特異性を有する。例示的な二重特異性抗体は二つの異なるＣＤ２０タンパク質エピトープに結合しうる。このような他の抗体はＣＤ２０結合部位と他のタンパク質の結合部位を併せ持つであろう。または、抗ＣＤ２０アームはリンパ球上のトリガー分子、例としてＴ細胞レセプター分子(例として、CD3)、ＩｇＧのＦｃレセプター分子 (FcgR)、例として FcgRI (CD64)、FcgRII (CD32) およびFcgRIII (CD16)、または NKG2D もしくは他のＮＫ細胞活性化リガンドに結合するアームを併せ持ち、ＣＤ２０発現細胞への細胞性防御機構を局在化する。二重特異性抗体はＣＤ２０を発現する細胞へ細胞障害性剤を局在化するために用いることができる。これらの抗体はＣＤ２０結合アームおよび細胞障害性剤（例として、サポリン、抗インターフェロンα、ビンカ・アルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセート、または放射性同位体ハプテン）結合アームを有する。二重特異性抗体は全長抗体又は抗体断片(例えばＦ(ａｂ')２二重特異性抗体)として調製することができる。
ＷＯ９６／１６６７３では二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体を詳述しており、米国特許第５８３７２３４では二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＦｃγＲＩ抗体について開示されている。二重特異性抗ＥｒｂＢ２／Ｆｃα抗体はＷＯ９８／０２４６３に示されている。米国特許第５８２１３３７号は二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＣＤ３抗体について教示している。
【００４８】
二重特異性抗の作製方法は当分野において既知である。全長二重特異性抗体の伝統的な組換え産生は二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき、ここで二つの該鎖は異なる特異性を持っている(Millstein等, Nature, 305:537-539 (1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法が国際公開第WO 93/08829号及びTraunecker等,EMBO J., 10:3655-3659 (1991)に開示されている。 
【００４９】
異なったアプローチ法によると、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗原−抗体結合部位）を、免疫グロブリン不変ドメイン配列と融合させる。該融合は好ましくは、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖定常部との融合である。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)を、融合の少なくとも一つに存在させることが望ましい。免疫グロブリン重鎖の融合、そして、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。これにより、作製に使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比率が最適な収率を提供する態様において、三つのポリペプチドフラグメントの相互の割合の調節に大きな融通性が与えられる。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又は、その比率が特に重要性を持たないときは、２または３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。 
【００５０】
このアプローチ法の好適な実施態様において、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームにハイブリッド免疫グロブリン重鎖、及び他方のアームにハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)を含む。二重特異性分子の半分しか免疫グロブリン軽鎖がないことで容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、ＷＯ９４／０４６９０に開示されている。二重特異性抗体を作製する更なる詳細については、例えばSureshら, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
米国特許第５７３１１６８号に記載された他のアプローチ法によれば、一対の抗体分子間の境界面を操作することにより組換え細胞培養から回収するヘテロ二量体のパーセントを最大にすることができる。好適な境界面は抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の境界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置換される。大きな側鎖と同じ又はより小さいサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(アラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモ二量体のような不要の他の最終産物に対してヘテロ二量体の収量を増大させるメカニズムが提供される。 
【００５１】
二重特異性抗体は、架橋した又は「ヘテロ複合体抗体」もまた含む。例えば、ヘテロ複合体の抗体の一方はアビジンに結合され、他方はビオチンに結合され得る。そのような抗体は、例えば、不要の細胞に対する免疫系細胞を標的とするため(米国特許第４，６７６，９８０号)、及びＨＩＶ感染の治療のため(ＷＯ９１／００３６０，ＷＯ９２／２０３７３，  及びＥＰ０３０８９)に提案された。ヘテロ複合体抗体は、任意の簡便な架橋法を用いて作製することができる。好適な架橋剤は当該分野において良く知られており、幾つかの架橋技術と共に米国特許第４６７６９８０号に開示されている。 
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennanら, Science, 229:81 (1985) は、無処理の抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤、亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に転換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つを、次にメルカプトエチルアミンによる還元でＦａｂ'-チオールに再転換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。生成した二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
【００５２】
二重特異性抗体を形成するために科学的に結合して大腸菌からＦａｂ'-ＳＨ断片を直接回収することが近年の進歩により容易になった。Shalabyら, J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)では、完全ヒト化二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')２分子の生成について述べている。それぞれのＦａｂ'断片は別々に大腸菌から分泌され、二重特異性抗体を形成するためにインビトロで科学的に直接結合されやすい。故に、ヒト胸部腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の溶解性活性トリガーと同様に、形成された二重特異性抗体はＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞および正常ヒトＴ細胞に結合することが可能であった。
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な方法もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを用いて生成されている。Kostelnyら, J.Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを、遺伝子融合によって二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法は、抗体ホモダイマーの生産にも用いることができる。Hollingerら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)に記載の「ダイアボディ」技術は、二重特異性抗体断片を作成するための別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の二つのドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーによって軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と結合している重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成し、それによって二つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーの使用によって、二重特異性抗体断片を製造する他の方策も報告されている。Gruberら, J.Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt等 J.Immunol. 147:60(1991)。
【００５３】
多価抗体 
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞により、二価抗体よりも早くインターナリゼーション(及び／又は異化)されうる。本発明の抗体は、３又はそれ以上の結合部位を有する多価抗体(ＩｇＭクラス以外のもの)であり得(例えば四価抗体)、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により素速く生成することができる。多価抗体は二量化ドメインと３又はそれ以上の抗原結合部位を有する。好ましい二量化ドメインはＦｃ領域又はヒンジ領域を有する(又はそれらからなる)。このシナリオにおいて、抗体はＦｃ領域と、Ｆｃ領域のアミノ末端に３又はそれ以上の抗原結合部位を有しているであろう。ここで、好ましい多価抗体は３ないし８、好ましくは４の抗原結合部位を有する(又はそれらからなる)。多価抗体は少なくとも１つのポリペプチド鎖(好ましくは２つのポリペプチド鎖)を有し、ポリペプチド鎖(類)は２又はそれ以上の可変ドメインを有する。例えば、ポリペプチド鎖(類)はＶＤ１-(Ｘ１)ｎ−ＶＤ２−(Ｘ２)ｎ−Ｆｃを有し、ここでＶＤ１は第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の可変ドメインであり、ＦｃはＦｃ領域のポリペプチド鎖の１つであり、Ｘ１及びＸ２はアミノ酸又はポリペプチドを表し、ｎは０又は１である。例えば、ポリペプチド鎖(類)は：ＶＨ-ＣＨ１-柔軟なリンカー-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖；又はＶＨ-ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖を有し得る。ここで多価抗体は、好ましくは少なくとも２つ(好ましくは４つ)の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに有する。ここで多価抗体は、例えば約２〜約８の軽鎖可変ドメインポリペプチドを有する。ここで考察される軽鎖可変ドメインポリペプチドは軽鎖可変ドメインを有し、あるいはＣＬドメインをさらに有する。
【００５４】
他のアミノ酸修飾
ここに記載するＣＤ２０結合抗体のアミノ酸配列の修飾を考える。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望まれうる。抗ＣＤ２０抗体のアミノ酸配列変異体は、抗ＣＤ２０抗体の核酸中に適当なヌクレオチド変化を導入することにより、又はペプチド合成により調製される。そのような修飾は、例えば、抗ＣＤ２０抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失及び／又は挿入及び／又は置換を含む。最終コンストラクトが所望の特徴を有するとするならば、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせは、その最終コンストラクトに達するまでなされる。また、アミノ酸変化は、グリコシル化部位の数又は位置の変化などの、抗ＣＤ２０抗体の翻訳後プロセスを変更しうる。
突然変異誘発の好ましい位置である抗ＣＤ２０抗体の所定の残基又は領域の特定のために有用な方法は、Cunningham及びWells, Science 244: 1081-1085 (1989)に記載されているように「アラニンスキャンニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここで、標的残基の残基又は基が同定され（例えば、arg, asp, his, lys,及びglu等の荷電残基）、中性又は負荷電アミノ酸（最も好ましくはアラニン又はポリアラニン）に置換され、アミノ酸とＣＤ２０抗原との相互作用に影響を及ぼす。ついで置換に対する機能的感受性を示すこれらのアミノ酸の位置は、置換部位において又はそれに対して更なる又は他の変異体を導入することにより精製される。しかして、アミノ酸配列変異を導入する部位は予め決定されるが、変異自体の性質は予め決める必要はない。例えば、与えられた部位における変異の性能を分析するために、ａｌａスキャンニング又はランダム突然変異誘発を標的コドン又は領域で実施し、発現された抗ＣＤ２０抗体を所望の活性についてスクリーニングする。
【００５５】
アミノ酸配列挿入は、１残基から１００以上の残基を含むポリペプチドの長さの範囲のアミノ-及び／又はカルボキシル末端融合物、並びに一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入物を含む。末端挿入物の例には、Ｎ末端メチオニル残基を持つ抗ＣＤ２０抗体又は細胞障害性ポリペプチドに融合した抗体が含まれる。抗ＣＤ２０抗体の他の挿入変異体は、抗体の血清半減期を向上させる酵素(例えばＡＤＥＰＴ)又はポリペプチドへの、抗ＣＤ２０抗体のＮ又はＣ末端への融合物を含む。
他の型の変異体はアミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、抗ＣＤ２０抗体分子において少なくとも一つのアミノ酸残基が異なる残基で置換されている。置換突然変異に対して最も興味深い部位は高頻度可変領域を含むが、ＦＲ変化も考えられる。保存的置換は、「好ましい置換」と題して表１に示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表１に「例示的置換」と名前を付け、又はアミノ酸の分類に関して以下に更に記載するような、より実質的な変化を導入し、生成物をスクリーニングしてもよい。
【００５６】
0005885457.tif 000002
【００５７】
抗体の生物学的性質における実質的な修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位の分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩を維持するそれらの効果において実質的に異なる置換を選択することにより達成される。天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいて群に分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、met、ala、val、leu、ile；
（２）中性の親水性：cys、ser、thr、
（３）酸性：asp、glu；
（４）塩基性：asn、gln、his、lys、arg；
（５）鎖配向に影響する残基：gly、pro； 及び
（６）芳香族：trp、tyr、phe。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。
抗ＣＤ２０抗体の適切な配置の維持に関与しない任意のシステイン残基は、一般にセリンで置換し、分子の酸化的安定性を向上させて異常な架橋を防止する。逆に、抗体にシステイン結合を付加して、その安定性を向上させてもよい（特にここでの抗体は抗体断片、例としてＦｖ断片である）。
【００５８】
特に好ましい型の置換変異体は、親抗体（例えば、ヒト化又はヒト抗体）の一又は複数の高頻度可変領域残基の置換を含む。一般的に、さらなる発展のために選択され、得られた変異体は、それらが作製された親抗体と比較して向上した生物学的特性を有している。そのような置換変異体を作製する簡便な方法は、ファージディスプレイを使用する親和性突然変異を含む。簡潔に言えば、幾つかの高頻度可変領域部位（例えば６−７部位）を突然変異させて各部位における全ての可能なアミノ酸置換を生成させる。このように生成された多価抗体は、繊維状ファージ粒子から、各粒子内に充填されたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合物としてディスプレイされる。ファージディスプレイ変異体は、ついで、ここに開示されるようなそれらの生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。修飾のための候補となる高頻度可変領域部位を同定するために、アラニンスキャンニング突然変異誘発を実施し、抗原結合に有意に寄与する高頻度可変領域残基を同定することができる。別法として、又はそれに加えて、抗原-抗体複合体の結晶構造を分析して抗体とヒトＣＤ２０の接点を特定するのが有利である場合もある。このような接触残基及び隣接残基は、ここに述べた技術に従う置換の候補である。そのような変異体が生成されると、変異体のパネルにここに記載するようなスクリーニングを施し、一又は複数の関連アッセイにおいて優れた特性を持つ抗体を更なる開発のために選択する。
抗体のアミノ酸変異の他の型は、抗体の元のグリコシル化パターンを変更する。変更とは、抗体に見い出される一又は複数の糖鎖部分の欠失、及び／又は抗体に存在しない一又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。
【００５９】
抗体のグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合又はＯ結合の何れかである。Ｎ結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を意味する。アスパラギン-Ｘ-セリン及びアスパラギン-Ｘ-スレオニン（ここでＸはプロリンを除く任意のアミノ酸）のトリペプチド配列は、アスパラギン側鎖への糖鎖部分の酵素的結合のための認識配列である。従って、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列の何れかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が作出される。Ｏ結合グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンに、糖類Ｎ-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの一つが結合することを意味するが、５-ヒドロキシプロリン又は５-ヒドロキシリジンもまた用いられる。
抗体へのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を、それが一又は複数の上述したトリペプチド配列(Ｎ結合グリコシル化部位のもの)を含むように変化させることによって簡便に達成される。該変化は、元の抗体の配列への一又は複数のセリン又はスレオニン残基の付加、又はこれによる置換によってもなされる(Ｏ-結合グリコシル化部位の場合)。
抗ＣＤ２０抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、この分野で知られた種々の方法によって調製される。これらの方法は、限定するものではないが、天然源からの単離（天然に生じるアミノ酸配列変異体の場合）又は初期に調製された変異体又は抗ＣＤ２０抗体の非変異体のオリゴヌクレオチド媒介（又は部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、及びカセット突然変異誘発による調製を含む。
【００６０】
エフェクター機能、例えば抗体の抗原依存性細胞媒介性細胞障害性(ＡＤＣＣ)及び／又は補体依存性細胞障害性(ＣＤＣ)を向上させるために、本発明の抗体を修飾することが望ましい。このことは、抗体のＦｃ領域に一又は複数のアミノ酸修飾を導入することで達成される。代わりにまたは加えて、Ｆｃ領域にシステイン残基を導入することによってこの領域での鎖間のジスルフィド結合形成が起こりうる。故に、生成されたホモ二量体抗体は内部移行能を向上および／または補体媒介性細胞障害および抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）を増強する。Caronら, J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) およびShopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992)を参照。抗腫瘍活性が亢進されたホモ二量体抗体もまた、Wolff ら Cancer Research 53:2560-2565 (1993)に記載されているような異種性二機能性交差結合を用いて調製されうる。または、抗体を二重のＦｃ領域を持つように操作して、それによって補体媒介性溶解およびＡＤＣＣ能を亢進した。StevensonらAnti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)を参照。
抗体の血清半減期を延長するために、例として米国特許第５７３９２７７号に記載されているように抗体（特に抗体断片）内にサルベージレセプター結合エピトープを組み込む方法がある。ここで用いる、「サルベージレセプター結合エピトープ」は、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期延長に関与するＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープを表す。
【００６１】
他の抗体修飾
抗体の他の修飾がここで考えられる。例えば、抗体は様々な非タンパク様ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマーの一つに結合されてもよい。抗体はまた例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル中に（例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル中に）、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）中に、又はマイクロエマルション中に捕捉されていてもよい。これらの技術は、Remington's Pharmaceutical Science 16版, Oslo, A編(1980)に開示されている。
【００６２】
所望の性質を有する抗体のスクリーニング
実験的実施例に示すようにある生物学的特徴を有する抗体を選択する。
本発明の抗ＣＤ２０抗体の成長阻害効果は当業者に知られた方法、例として、ＣＤ２０遺伝子を内因性または形質移入して発現する細胞を用いるなどの方法によって評価しうる。例えば、腫瘍細胞株およびＣＤ２０形質移入細胞を、様々な濃度の本発明の抗ＣＤ２０モノクローナル抗体で２、３（例として２−７）日間処理し、クリスタル・バイオレットまたはＭＴＴで染色、または他の比色アッセイ法によって分析した。増殖を測定する他の方法には、本発明の抗ＣＤ２０抗体存在または非存在下にて処理した細胞による３Ｈ-チミジン取り込みを比較することによる。抗体処理後、細胞を回収して、ＤＮＡ内に取り込まれた放射線量をシンチレーションカウンターで定量した。細胞株の成長を阻害することが知られている成長阻害抗体で選択した細胞株を処理して適当な陽性対照とする。
【００６３】
細胞死を誘導する抗体を選択するために、プロピジウムヨウ素化物（ＰＩ）、トリファンブルーまたは７ＡＡＤ取り込みなどにより表される膜の完全性の欠損を対照と相対的に評価した。補体および免疫エフェクター細胞非存在下でＰＩ取り込みアッセイを行う。ＣＤ２０発現腫瘍細胞を単独培地または例として約１０μｇ／ｍｌの適当なモノクローナル抗体を含む培地で培養する。それぞれの処理後、細胞を洗浄して、細胞塊を除去するために３５ｍｍ濾過器をかぶせた１２×７５チューブ（１チューブ当たり１ｍｌ、各処理群につき３チューブ）に分注する。その後、ＰＩ（１０μｇ／ｍｌ）をチューブに加える。試料をFACSCANＴＭフローサイトメーターおよびFACSCONVERTＴＭCellQuestソフトウェア(Becton Dickinson)により分析しうる。ＰＩ取り込みにより決定されるような統計学上有意なレベルの細胞死を引き起こす抗体を細胞死誘導抗体として選択しうる。
【００６４】
対象の抗体により結合されるＣＤ２０上のエピトープに結合する抗体を検索するために、例としてAntibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)に示されているように平凡なクロスブロッキングアッセイを行うことができる。このアッセイは、試験抗体が本発明の抗ＣＤ２０抗体として同じ部位に結合するかエピトープに結合するかを決定するのに用いられる。代わりにまたは加えて、エピトープマッピングはこの分野でよく知られた方法によって行うことができる。例えば、接触する残基を同定するためにアラニンスキャニングによるように抗体の配列に突然変異が誘発される。変異した抗体は確実にフォールディングされるように初めにポリクローナル抗体との結合を試験する。異なる方法では、ＣＤ２０の異なる領域に一致するペプチドを用いて、試験抗体の競合アッセイ、または試験抗体と特徴のあるまたは既知のエピトープを持つ抗体の競合アッセイを行うことができる。
【００６５】
（ベクター、宿主細胞及び組換え方法）
本発明はまたヒト化ＣＤ２０結合抗体をコードしている単離された核酸、該核酸を含むベクター及び宿主細胞、及び抗体の生産に対する組換え方法を提供する。
抗体の組換え生産のために、それをコードする核酸が単離され、さらなるクローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために、複製可能なベクター中に挿入される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは直ぐに単離され、通常の手法を用いて(例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドを使用することによって）配列決定される。多くのベクターが公的に入手可能である。ベクター成分には、一般に、これらに制限されるものではないが、次のものの一又は複数が含まれる：シグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列である。
【００６６】
（ｉ）シグナル配列成分
この発明のＣＤ２０結合抗体は直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産される。好ましく選択された異種シグナル配列は宿主細胞によって認識され加工される(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。天然ＣＤ２０結合抗体シグナル配列を認識せずプロセシングしない原核生物宿主細胞に対して、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定なエンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列により置換される。酵母での分泌に対して、天然シグナル配列は、例えば酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含む)、又は酸ホスフォターゼリーダー、白体(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー、又は国際公開第９０／１３６４６号に記載されているシグナルにより置換されうる。哺乳動物細胞での発現においては、哺乳動物のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルが利用できる。
このような前駆体領域のＤＮＡは、好ましくは、多価抗体をコードするＤＮＡに読み枠を一致させて結合される。
【００６７】
（ｉｉ）複製開始点
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。一般に、クローニングベクターにおいて、この配列は宿主染色体ＤＮＡとは独立にベクターが複製することを可能にするものであり、複製開始点又は自律的複製配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般には、哺乳動物の発現ベクターには複製開始点成分は不要である(ＳＶ４０開始点は典型的にはただ初期プロモーターを有しているために用いられる)。
【００６８】
（ｉｉｉ）選択遺伝子成分
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(ａ)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(ｂ)栄養要求性欠陥を補い、又は(ｃ)例えばバシリに対する遺伝子コードＤ-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
選択方法の一例では、宿主細胞の成長を抑止する薬物が用いられる。異種性遺伝子で首尾よく形質転換した細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を生産し、よって選択工程を生存する。このような優性選択の例は、薬剤ネオマイシン、ミコフェノール酸及びハイグロマイシンを使用する。
哺乳動物細胞に適切な選択可能なマーカーの他の例は、ＣＤ２０結合抗体核酸を捕捉することのできる細胞成分を同定することを可能にするもの、例えばＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネインＩ及びＩＩ、好ましくは、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等々である。
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子によって形質転換された細胞は、先ず、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトリキセート(Ｍｔｘ)を含む培地において形質転換物の全てを培養することで同定される。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性に欠陥のあるチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)株化細胞である（例として、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ-９０９６）。
【００６９】
あるいは、ＣＤ２０結合抗体をコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲタンパク質、及びアミノグリコシド３'-ホスホトランスフェラーゼ(ＡＰＨ)のような他の選択可能マーカーで形質転換あるいは同時形質転換した宿主細胞(特に、内在性ＤＨＦＲを含む野生型宿主)は、カナマイシン、ネオマイシンあるいはＧ４１８のようなアミノグリコシド抗生物質のような選択可能マーカーの選択剤を含む培地中での細胞増殖により選択することができる。米国特許第４９６５１９９号を参照のこと。
酵母中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である(Stinchcomb等, Nature, 282：39(1979)）。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ第４４０７６号あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファン内で成長する能力に欠ける酵母の突然変異株に対する選択マーカーを提供する。Jones, Genetics, 85:12 (1977)。酵母宿主細胞ゲノムにｔｒｐ１破壊が存在することは、ついでトリプトファンの不存在下における増殖による形質転換を検出するための有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２欠陥酵母株(ＡＴＣＣ２０６２２あるいは３８６２６)は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する既知のプラスミドによって補完される。
更に、１．６μｍの円形プラスミドｐＫＤ１由来のベクターは、クルイヴェロマイシス(Kluyveromyces)酵母の形質転換に用いることができる。あるいは、組換え仔ウシのキモシンの大規模生産のための発現系がＫ.ラクティス(lactis)に対して報告されている。Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990)。クルイヴェロマイシスの工業的な菌株による、組換え体成熟ヒト血清アルブミンの分泌のための安定した複数コピー発現ベクターもまた開示されている。Fleer 等, Bio/Technology,9:968-975 (1991)。
【００７０】
（ｉｖ）プロモーター成分
発現及びクローニングベクターは通常は宿主生物体によって認識されＣＤ２０結合抗体核酸に作用可能に結合しているプロモーターを含む。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターは、ｐｈｏＡプロモーター、βラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(ｔｒｐ)プロモーター系、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーターを含む。しかし、他の既知の細菌プロモーターも好適である。細菌系で使用するプロモータもまたＣＤ２０結合抗体をコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(Ｓ.Ｄ.)配列を有する。
真核生物に対してもプロモーター配列が知られている。実質的に全ての真核生物の遺伝子が、転写開始部位からおよそ２５ないし３０塩基上流に見出されるＡＴリッチ領域を有している。多数の遺伝子の転写開始位置から７０ないし８０塩基上流に見出される他の配列は、Ｎが任意のヌクレオチドであるＣＮＣＡＡＴ領域である。大部分の真核生物遺伝子の３'末端には、コード配列の３'末端へのポリＡ尾部の付加に対するシグナルであるＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列は全て真核生物の発現ベクターに適切に挿入される。
【００７１】
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ又は他の糖分解酵素、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターは、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域である。酵母の発現に好適に用いられるベクターとプロモータは欧州特許７３６５７に更に記載されている。また酵母エンハンサーも酵母プロモーターと共に好適に用いられる。
【００７２】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのＣＤ２０結合抗体の転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及び最も好ましくはサルウィルス４０(ＳＶ４０)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターにょって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り、調節される。
ＳＶ４０ウィルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点を更に含むＳＶ４０制限断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガロウィルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩＥ制限断片として簡便に得られる。ベクターとしてウシ乳頭腫ウィルスを用いて哺乳動物宿主中でＤＮＡを発現させる系が、米国特許第４４１９４４６号に開示されている。この系の変形例は米国特許第４６０１９７８号に開示されている。また、単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの調節下でのマウス細胞中でのヒトβインターフェロンｃＤＮＡの発現について、Reyes等, Nature, 297：598-601(1982)を参照のこと。あるいは、ラウス肉腫ウィルス長末端反復をプロモーターとして使用することができる。
【００７３】
（ｖ）エンハンサーエレメント成分
より高等の真核生物によるこの発明のＣＤ２０結合抗体をコードしているＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによってしばしば増強される。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。真核生物プロモーターの活性化のための増強要素については、Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)もまた参照のこと。エンハンサーは、ＣＤ２０結合抗体コード配列の５'又は３'位でベクター中にスプライシングされうるが、好ましくはプロモーターから５'位に位置している。
【００７４】
（ｖｉ）転写終結成分
真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、また転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの５'、時には３'の非翻訳領域から一般に取得できる。これらの領域は、ＣＤ２０結合抗体をコードしているｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。一つの有用な転写終結成分はウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第９４／１１０２６号とそこに開示された発現ベクターを参照のこと。
【００７５】
（ｖｉｉ）宿主細胞の選択及び形質転換
ここに記載のベクター中のＤＮＡをクローニングあるいは発現させるために適切な宿主細胞は、上述の原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。この目的にとって適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えばエシェリチアのような腸内菌科、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア(Erwinia)、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア属、例えばセラチア・マルセスキャンス及び赤痢菌属、並びに桿菌、例えば枯草菌及びバシリ・リチェフォルミス(licheniformis)(例えば、１９８９年４月１２日に公開された ＤＤ２６６７１０に開示されたバシリ・リチェニフォルミス４１Ｐ)、シュードモナス属、例えば緑膿菌及びストレプトマイセス属を含む。一つの好適な大腸菌クローニング宿主は大腸菌２９４(ＡＴＣＣ３１４４６)であるが、他の大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６(ＡＴＣＣ３１５３７)及び大腸菌Ｗ３１１０(ＡＴＣＣ２７３２５)のような株も好適である。これらの例は限定するものではなく例示的なものである。
【００７６】
完全長抗体、抗体断片、および抗体融合タンパク質は細菌内で生成することができ、特にグリコシル化およびＦｃエフェクター機能は必要でない、例として、治療的抗体が細胞障害性剤（例として、毒素）にコンジュゲートして、その免疫コンジュゲートが腫瘍細胞破壊に効果的である場合など。全長抗体は循環中で半減期が長い。大腸菌での生成がより早くよりコスト効率がよい。大腸菌における抗体断片およびポリペプチドの発現方法について、発現および分泌を最適化する転写開始領域（ＴＩＲ）およびシグナル配列を記載している米国特許第5,648,237号 (Carterら.)、同第5,789,199号(Jolyら)、および同第5,840,523号 (Simmonsら)を参照のこと。これらの特許文献はここ文献として組み込まれる。発現後、可溶性分画の大腸菌ペーストから抗体を単離し、例としてアイソタイプによるプロテインＡまたはＧカラムにより精製しうる。例としてＣＨＯ細胞での発現抗体精製工程と同様にして最終的精製を行う。
【００７７】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ＣＤ２０結合抗体をコードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシア、又は一般的なパン酵母は下等真核生物宿主微生物のなかで最も一般的に用いられる。しかしながら、多数の他の属、種及び菌株も、一般的に入手可能でここで使用できる、例えば、シゾサッカロマイセスポンベ；クルイベロマイセス宿主、例えばＫ.ラクティス、Ｋ．フラギリス(ＡＴＣＣ１２４２４)、Ｋ.ブルガリカス(ＡＴＣＣ１６０４５)、Ｋ．ウィッケラミイ(ＡＴＣＣ２４１７８)、Ｋ.ワルチイ(ＡＴＣＣ５６５００)、Ｋ．ドロソフィラルム(ＡＴＣＣ３６９０６)、Ｋ．サーモトレランス、及びＫ．マルキシアナス；ヤローウィア(ＥＰ４０２２２６)；ピチアパストリス(ＥＰ１８３０７０)；カンジダ；トリコデルマ・リーシア(ＥＰ２４４２３４)；アカパンカビ；シュワニオマイセス、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス；及び糸状真菌、例えばパンカビ属、アオカビ属、トリポクラジウム、及びコウジカビ属宿主、例えば偽巣性コウジ菌及びクロカビが使用できる。
【００７８】
グリコシル化ＣＤ２０結合抗体の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては植物及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウィルス株及び変異体及び対応する許容可能な昆虫宿主細胞、例えばスポドプテラ・フルギペルダ(毛虫)、アエデス・アエジプティ(蚊)、アエデス・アルボピクトゥス(蚊)、ドゥロソフィラ・メラノガスター(ショウジョウバエ)、及びボンビクス・モリが同定されている。トランスフェクションのための種々のウィルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカＮＰＶのＬ-１変異体とボンビクス・モリ ＮＰＶのＢｍ-５株が公に利用でき、そのようなウィルスは本発明においてここに記載したウィルスとして使用でき、特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞の形質転換に使用できる。
綿花、コーン、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、及びタバコのような植物細胞培養を宿主として利用することができる。
【００７９】
しかしながら、脊椎動物細胞におけるものが最も興味深く、培養(組織培養)中での脊椎動物細胞の増殖は常套的な手順になっている。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (ＣＯＳ-７, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１);ヒト胚腎臓株（２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977)）；ハムスター乳児腎細胞(ＢＨＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０)；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ, Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));マウスのセルトリ細胞（ＴＭ４, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)）;サルの腎細胞 (ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０); アフリカミドリザルの腎細胞(ＶＥＲＯ-７６, ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１５８７); ヒト子宮頸癌細胞 (ＨＥＬＡ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ２); イヌ腎細胞 (ＭＤＣＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４); バッファローラット肝細胞 (ＢＲＬ３Ａ, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２); ヒト肺細胞 (Ｗ１３８, ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５); ヒト肝細胞 (Ｈｅｐ Ｇ２, ＨＢ８０６５); マウス乳房腫瘍細胞 (ＭＭＴ０６０５６２, ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１);ＴＲＩ細胞（Mather等, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)）；ＭＲＣ５細胞;ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌株(ＨｅｐＧ２)である。
宿主細胞は、ＣＤ２０結合抗体生産のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適切に修飾された常套的栄養培地で培養される。
【００８０】
（ｖｉｉｉ）宿主細胞の培養
本発明の多価抗体を産生するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ｈａｍ)のＦ１０(シグマ)、最小必須培地((ＭＥＭ),(シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地((ＤＭＥＭ),シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980), 米国特許第４７６７７０４号；同４６５７８６６号；同４９２７７６２号；同４５６０６５５号；又は同５１２２４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；又は米国再発行特許第３０９８５号に記載された何れの培地も宿主細胞に対する培地として使用できる。これらの培地には何れもホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインシュリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオチド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮTM薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は等価なエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について過去に用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【００８１】
（ｉｘ）精製
組換え技術を用いる場合、抗体は細胞内、細胞膜周辺腔に生成され、又は培地内に直接分泌される。抗体が細胞内に生成された場合、第１の工程として、宿主細胞か溶解された断片の何れにしても、粒子状の細片が、例えば遠心分離又は限外濾過によって除去される。Carter等, Bio/Technology 10: 163-167 (1992)は、大腸菌の細胞膜周辺腔に分泌された抗体の単離方法を記載している。簡単に述べると、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、及びフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分間解凍する。細胞細片は遠心分離で除去できる。抗体が培地に分泌された場合は、そのような発現系からの上清を、一般的には先ず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎ又はＰｅｌｌｉｃｏｎの限外濾過装置を用いて濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めて、タンパク質分解を阻害してもよく、また抗生物質を含めて外来性の汚染物の成長を防止してもよい。
【００８２】
細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製でき、アフィニティクロマトグラフィーが好ましい精製技術である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する免疫グロブリンＦｃ領域の種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる（Lindmark等, J. immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)）。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨されている（Guss等, EMBO J. 5: 16571575 (1986)）。アフィニティーリガンドが結合されるマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他の材料も使用可能である。孔制御ガラスやポリ(スチレンジビニル)ベンゼン等の機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるものより早い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸＴＭ樹脂（J.T. Baker, Phillipsburg, NJ）が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンでのクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂上でのＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭクロマトグラフィー（ポリアスパラギン酸カラム）、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿法も、回収される多価抗体に応じて利用可能である。
予備的精製工程に続いて、目的の抗体および混入物を含む混合液をｐＨ約２．５−４．５、好ましくは低塩濃度（例として、約０−０．２５Ｍ塩）の溶出緩衝液を用いて低ｐＨ疎水性作用クロマトグラフィを行う。
【００８３】
（抗体コンジュゲート）
抗体は細胞障害性剤、例として毒素または放射性同位体とコンジュゲートしうる。ある実施態様では、毒素はカリケアマイシン、メイタンシノイド、ドラスタチン、アウリスタチンＥおよびその類似体または誘導体が好ましい。
好ましい薬剤／毒素には、ＤＮＡ阻害剤、微小管重合化または脱重合化阻害剤および代謝阻害剤を含む。細胞障害性剤の好ましいものには、例えば、酵素阻害剤、例としてジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤、およびチミジル酸合成酵素阻害剤、ＤＮＡ干渉物質、ＤＮＡ切断物質、トポイソメラーゼ阻害剤、アントラサイクリンファミリー剤、ビンカ剤、マイトマイシン、ブレオマイシン、細胞障害性ヌクレオシド、プテリジンファミリー剤、ジイネネス(diynenes)、ポドフィロトキシン、および分化誘導物質を含む。好ましい薬剤／毒素には、ＤＮＡ阻害剤、微小管重合化または脱重合化阻害剤および代謝阻害剤を含む。細胞障害性剤の好ましいものには、例えば、酵素阻害剤、例としてジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤、およびチミジル酸合成酵素阻害剤、ＤＮＡ干渉物質、ＤＮＡ切断物質、トポイソメラーゼ阻害剤、アントラサイクリンファミリー剤、ビンカ剤、マイトマイシン、ブレオマイシン、細胞障害性ヌクレオシド、プテリジンファミリー剤、ジイネネス(diynenes)、ポドフィロトキシン、および分化誘導物質を含む。特に有用なものの中には、例としてメトトレキサート、メトプテリン(methopterin)、ジクロロメトトレキセート(dichloromethotrexate)、5フルオロウラシルの、そして、6メルカプトプリンのシトシンアラビノシド、メルファラン、レウロシン(leurosine)、レウロシデイン(leurosideine)、アクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、N(5、5-ジアセトキシペンチル)ドキソルビシン、モルフォリノ-ドキソルビシン、1(2-クロエチル)-1、2-ジメタネスルホニル(dimethanesulfonyl)ヒドラジッド、N8-アセチルスペルミジン、アミノプテリンメトプテリン、エスペラマイシン、マイトマイシンC、マイトマイシンA、アクチノマイシン、ブレオマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、タリソマイシン、ポドフィロトキシンおよびポドフィロトキシン誘導体、例としてエトポシドまたはエトポシドリン酸塩、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソール、タキソテレ、レチノイン酸、酪酸、N8-アセチルスペルミジン、カンプトテシン、カリケアマイシン、ブリオスタチン、セファロスタチン、アンサマイトシン、アクトシン、メイタンシノイド、例としてＤＭ-１、メイタンシン、メイタンシノール、 N-デスメチル-4,5-デセポキシメイタンシノイド、C-19-デクロロメイタンシノイド、C-20-ヒドロキシメイタンシノール、 C-20-デメトキシメイタンシノール、C-9-SH メイタンシノール、C-14-アルコキシメチルメイタンシノール、C-14-ヒドロキシまたはアセチルオキシメチルメイタンシノール、C-15-ヒドロキシ／アセチルオキシメイタンシノール、C-15-メトキシメイタンシノール、 C-18-N-デメチルメイタンシノールおよび4,5-デオキシメイタンシノール、アウリスタチン、例としてアウリスタチンE、M、PHEおよびPE；ドロスタチン(dolostatin)、例としてドロスタチン A、ドロスタチン B、 ドロスタチン C、 ドロスタチン D、 ドロスタチン E (20-epi and 11-epi)、 ドロスタチン G、 ドロスタチン H、 ドロスタチン I、 ドロスタチン 1、 ドロスタチン 2、 ドロスタチン 3、 ドロスタチン 4、 ドロスタチン 5、 ドロスタチン 6、 ドロスタチン 7、 ドロスタチン 8、 ドロスタチン 9、 ドロスタチン 10、 deo-ドロスタチン 10、 ドロスタチン 11、 ドロスタチン 12、 ��ロスタチン 13、 ドロスタチン 14、 ドロスタチン 15、 ドロスタチン 16、 ドロスタチン 17、 and ドロスタチン 18；セファロスタチン(cephalostatin)、例として セファロスタチン 1、 セファロスタチン 2、 セファロスタチン 3、 セファロスタチン 4、 セファロスタチン 5、 セファロスタチン 6、 セファロスタチン 7、 25'-epi-セファロスタチン 7、 20-epi-セファロスタチン 7、 セファロスタチン 8、 セファロスタチン 9、 セファロスタチン 10、 セファロスタチン 11、セファロスタチン 12、セファロスタチン 13、セファロスタチン 14、 セファロスタチン 15、セファロスタチン 16、セファロスタチン 17、 セファロスタチン 18、およびセファロスタチン 19を含む。
【００８４】
メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害するように作用する分裂阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカシラブMaytenus serrataから単離されたものである(米国特許第３，８９６，１１１号)。その後、ある種の微生物がメイタンシノイド類、例えばメイタンシノール及びＣ-３メイタンシノールエステルを生成することが発見された(米国特許第４，１５１，０４２号)。合成メイタンシノール及びその誘導体及び類似体は、例えば米国特許第４，１３７，２３０号；同４，２４８，８７０号；同４，２５６，７４６号；同４，２６０，６０８号；同４，２６５，８１４号；同４，２９４，７５７号；同４，３０７，０１６号；同４，３０８，２６８号；同４，３０８，２６９号；同４，３０９，４２８号；同４，３１３，９４６号；同４，３１５，９２９号；同４，３１７，８２１号；同４，３２２，３４８号；同４，３３１，５９８号；同４，３６１，６５０号；同４，３６４，８６６号；同４，４２４，２１９号；同４，４５０，２５４号；同４，３６２，６６３号；及び同４，３７１，５３３号に開示されており、その開示は出典を明示してここに取り込まれる。
【００８５】
メイタンシン及びメイタンシノイドは、腫瘍細胞抗原に特異的に結合する抗体と結合している。メイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲート及びそれらの治療用途は、例えば米国特許第５，２０８，０２０号、同５，４１６，０６４号、欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号に開示されており、その開示は出典を明示してここに取り込まれる。Liuら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：8618-8623(1996)には、ヒト結腸直腸癌に対するモノクローナル抗体Ｃ２４２に結合するＤＭ１と命名されたメイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲートが記載されている。前記コンジュゲートは培養された結腸癌細胞に対して高い細胞毒性を有することが見出されており、インビボ腫瘍成長アッセイにおいて抗腫瘍活性を示す。Chariら, Cancer Research, 52：127-131(1992)には、メイタンシノイドが、ジスルフィド結合を介して、ヒト結腸癌株化細胞の抗原に結合するマウス抗体Ａ７、又はＨＥＲ-２／ｎｅｕオンコジーンに結合する他のマウスモノクローナル抗体ＴＡ.１に結合している免疫コンジュゲートが記載されている。
【００８６】
例えば、米国特許第５２０８０２０号又は欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号、及びChari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)に開示されているもの等を含む、抗体-メイタンシノイドコンジュゲートを作製するために、当該技術で公知の多くの結合基がある。結合基には、上述した特許に開示されているようなジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチターゼ不安定性基、又はエステラーゼ不安定性基が含まれるが、上記特許文献に開示されているように、ジスルフィド及びチオエーテル基が好ましい。
【００８７】
抗体とメイタンシノイドとのコンジュゲートは、種々の二官能価性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能価性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トルエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。特に好ましいカップリング剤には、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)(Carlsson等, Biochem. J. 173：723-737[1978])およびジスルフィド結合により提供されるＮ-スクシンイミジル-４-(２-ピリジルチオ)ペンタノアート(ＳＰＰ)が含まれる。
リンカーは結合の種類に応じて、種々の位置でメイタンシノイド分子に結合し得る。例えば、従来からのカップリング技術を使用してヒドロキシル基と反応させることによりエステル結合を形成することができる。反応はヒドロキシル基を有するＣ-３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ-１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ-１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ-２０位で生じる。好ましい実施態様において、結合はメイタンシノール又はメイタンシノールの類似体のＣ-３位で形成される。
【００８８】
カリケアマイシン
対象の他の免疫コンジュゲートには、１つ又は複数のカリケアマイシン分子と結合した抗ＴＡＳＫ抗体が含まれる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはサブ-ピコモルの濃度で二重鎖ＤＮＡ破壊を生じることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第５７１２３７４号、同５７１４５８６号、同５７３９１１６号、同５７６７２８５号、同５７７０７０１号、同５７７０７１０号、同５７７３００１号、同５８７７２９６号(全て、American Cyanamid Company)を参照のこと。使用可能なカリケアマイシンの構造類似体には、限定するものではないが、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ-アセチル-γ１Ｉ、ＰＳＡＧ及びθＩ１(Hinman等, Cancer Research, 53：3336-3342(1993)、Lode等 Cancer Research, 58：2925-2928(1998)及び上述したAmerican Cyanamidの米国特許)が含まれる。抗体が結合可能な他の抗腫瘍剤は、葉酸代謝拮抗薬であるＱＦＡである。カリケアマイシン及びＱＦＡは双方とも、細胞内に作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。よって抗体媒介性インターナリゼーションによるこれらの薬剤の細胞への取込により、細胞障害効果が大きく向上する。
【００８９】
放射性同位元素
腫瘍を選択的に破壊するため、抗体は高い放射性を有する原子を含有してよい。放射性コンジュゲートした抗ＴＡＳＫ抗体を生成するために、種々の放射性同位元素が利用される。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位元素が含まれる。コンジュゲートが診断用に使用される場合、それはシンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴(ＮＭＲ)映像(磁気共鳴映像、mriとしても公知)用のスピン標識、例えばヨウ素-１２３、ヨウ素-１３１、インジウム-１１１、フッ素-１９、炭素-１３、窒素-１５、酸素-１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含有し得る。
放射-又は他の標識が、公知の方法でコンジュゲートに導入される。例えば、ペプチドは生物合成されるか、又は水素の代わりにフッ素-１９を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する化学的なアミノ酸合成により合成される。標識、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８及びＩｎ１１１は、ペプチドのシステイン残基を介して結合可能である。イットリウム-９０はリジン残基を介して結合可能である。IODOGEN法(Fraker等(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80：49-57)は、ヨウ素-１２３の導入に使用することができる。他の方法の詳細は、「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal, CRC Press 1989)に記載されている。
【００９０】
抗体と細胞障害剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238:1098(1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素-１４標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレン-トリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)が抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。国際公開第９４／１１０２６号を参照されたい。リンカーは細胞中の細胞障害剤の放出を容易にするための「切断可能リンカー」であってよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカーが使用され得る(Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)；米国特許第５２０８０２０号)。
【００９１】
ＣＤ２０結合抗体の医薬使用
本発明のＣＤ２０結合抗体は、自己免疫疾患および関連症状、Ｂ細胞リンパ腫および白血病を含むＣＤ２０陽性癌を含む悪性および非悪性疾患の治療に有用である。骨髄中の幹細胞（Ｂ細胞前駆細胞）はＣＤ２０抗原を欠き、治療後健康なＢ細胞が生成され、数か月で正常レベルに戻る。
【００９２】
自己免疫疾患又は自己免疫関連症状には、関節炎(リウマチ様関節炎、若年性関節リウマチ、骨関節炎、乾癬性関節炎)、乾癬、アトピーを含む皮膚炎；慢性の自己免疫性蕁麻疹、多発筋炎/皮膚筋炎、毒性の表皮壊死症、全身性硬皮症、および硬化症、炎症性腸疾患(IBD)(クローン病、潰瘍性大腸炎)関連反応、呼吸窮迫症候群、成人呼吸窮迫症候群(ARDS)、髄膜炎、アレルギー性鼻炎、脳炎、ぶどう膜炎、大腸炎、腎炎、アレルギー症状、湿疹、喘息、Ｔ細胞および慢性炎症性応答の浸潤に伴う症状、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性心筋炎、白血球接着不全、全身性紅斑性狼瘡(SLE)、ループス(腎炎、非腎臓性、円形脱毛症)、若年型糖尿病、多発性硬化症、アレルギー性脳脊髄炎、サイトカインおよびＴリンパ球媒介性急性および遅延性過敏症に関連する免疫反応、結核、サルコイドーシス、ヴェグナー肉芽腫症を含む肉芽腫症、顆粒球減少症、脈管炎(ANCAを含む)、再生不良性貧血、クームス積極的な貧血、ダイアモンド-ブラックファン(Diamond Blackfan)貧血、自己免疫性溶血性貧血(AIHA)を含む免疫性溶血性貧血、悪性貧血、赤芽球癆(PRCA)、第VIII因子欠乏、血友病A、自己免疫性好中球減少症、汎血球減少、白血球減少症、白血球血管外遊出に伴う病気、CNS炎症性疾病、複数の器官傷害症候群、重症筋無力症、抗原-抗体複合体関連疾患、抗糸球体基底膜病、抗りん脂質抗体症候群、アレルギー性神経炎、ベーチェット病、カースルマン症候群、グッドパスチュア症候群、ランバート-イートン筋無力症症候群、レーノー症候群、シェーグレン症候群、スティーブンス-ジョンソン症候群、固形器官移植臓器拒絶反応（高パネルの反応抗体力価のための前処理、組織におけるIgA沈着症等を含む）、移植片対宿主病(GVHD)、類天疱瘡、天疱瘡(尋常性、落葉状をすべて含む)、自己免疫性多腺性内分泌障害、レイター病、スティフマン症候群、巨細胞動脈炎、免疫複合体性腎炎、IgA腎障害、IgM多発性神経炎又はIgM関連神経障害、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性睾丸炎と卵巣炎を含む精巣および卵巣の自己免疫疾患、原発性甲状腺機能低下症；自己免疫性甲状腺炎、慢性甲状腺炎(橋本甲状腺炎)を含む自己免疫性内分泌疾患、亜急性甲状腺炎、特発性甲状腺機能低下症、アジソン病、グレーブス病、自己免疫性多腺性症候群(または、多腺性内分泌疾患症候群)、インスリン依存性糖尿病(IDDM)とも言われるI型糖尿病およびシーハン症候群；自己免疫性肝炎、リンパ様間質性肺炎(HIV)、閉塞性細気管支炎(非移植性)対NSIP、ギラン・バレー症候群、大血管脈管炎(リウマチ性多発筋痛と巨細胞(高安)動脈炎を含む)、中血管血管炎(川崎病および結節性多発性動脈炎を含む)、強直性脊椎炎、バーガー病(IgA腎症)、急速進行性糸球体腎炎、原発性胆汁性肝硬変、複腔熱帯性下痢(グルテン性腸症)、クリオグロブリン血症、ALS、冠動脈疾患が含まれる。
【００９３】
ＣＤ２０陽性癌は細胞表面上にＣＤ２０を発現する細胞の異常増幅を含むものである。ＣＤ２０陽性Ｂ細胞腫瘍には、リンパ球優性ホジキン病(LPHD)を含むCD20陽性ホジキン病；非ホジキンリンパ腫(NHL)；濾胞性中心細胞リンパ腫(FCC)；急性リンパ性白血病(ALL)；慢性リンパ球性白血病(CLL)；ヘアリー細胞白血病が含まれる。非ホジキンリンパ腫には、低程度／濾胞性非ホジキンリンパ腫(NHL)、小リンパ球性リンパ腫(SLL)、中程度／濾胞性NHL、中程度びまん性NHL、高程度免疫芽細胞NHL、高程度リンパ芽球性NHL、高程度小正円形細胞(non-cleaved cell)NHL、厖大な病気のNHL、プラズマ細胞様リンパ球性リンパ腫、外套細胞リンパ腫、エイズ関連リンパ腫およびワルデンストロームマクログロブリン血症が含まれる。これらの癌の再発治療を含む。LPHDは頻回の放射線又は化学療法にもかかわらず再発する傾向にあるホジキン型の疾患であり、CD２０陽性悪性細胞の特徴がある。CLLはリンパ球といわれる成熟B細胞の４つの主要な白血病Ａ癌のうちの一つである。CLLは血液、骨髄およびリンパ球組織における細胞の進行性蓄積が顕在化する。
【００９４】
特定の実施態様では、ヒト化CD２０結合抗体およびその機能的断片は、非ホジキンリンパ腫(NHL)、リンパ球優性ホジキン病(LPHD)、小リンパ球性リンパ腫(SLL)、慢性リンパ球性白血病、リウマチ様関節炎、および若年性関節リウマチ、ループス腎炎を含む全身性紅斑性狼瘡(SLE)、ヴェゲナー病、炎症性腸疾患、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、抗血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)、自己免疫性血小板減少症、多発性硬化症、乾癬、IgA腎症、IgM多発性神経炎、重症筋無力症、脈管炎、糖尿病、レーノー症候群、シェーグレン症候群、および腎炎の治療に使用される。
【００９５】
ヒト化CD２０結合抗体またはその機能的断片は、例として再発または難治性低程度または濾胞性、CD20陽性、B細胞NHLのための単剤治療に有用であり、多剤療法の多剤と組み合わせて患者に投与可能である。
治癒の遅いリンパ腫は成長が遅い難病であり、患者は緩解と再発を繰返し６から１０年生存するものである。一実施態様では、ヒト化CD２０結合抗体またはその機能的断片は治癒の遅いNHLの治療に用いられる。
腫瘍治療の効率または効果を評価するパラメータが適当な疾患で医師に知られている。一般に、医師は特定の失陥の徴候および症状の減弱を求めるであろう。パラメータは疾患の進行の中央値時間、緩解、疾患の安定時間を含む。
【００９６】
以下に示す文献は、リンパ腫およびCLL、その診断、治療および治療効果を評価するための標準的な医療手順について記載している。Canellos GP, Lister, TA, Sklar JL: The Lymphomas.  W.B.Saunders Company, Philadelphia, 1998、van Besien KおよびCabanillas, F: Clinical Manifestations, Staging and Treatment of Non-Hodgkin's Lymphoma, Chap. 70, 1293-1338頁, in: Hematology , Basic Principles and Practice, 3rd ed. Hoffman et al. (editors). Churchill Livingstone, Philadelphia, 2000、およびRai, KおよびPatel, D:Chronic Lymphocytic Leukemia, Chap. 72, 1350-1362頁, in: Hematology , Basic Principles and Practice, 3rd ed. Hoffmanら(editors). Churchill Livingstone, Philadelphia, 2000。
自己免疫または自己免疫関連疾患の治療の効率および成功率を評価するためのパラメータは、適当な疾患で医師に知られている。一般に、医師は特定の失陥の徴候および症状の減弱を求めるであろう。以下は、実施例の方法による。
【００９７】
一実施態様では、本発明の抗体は、関節リウマチの治療に有用である。RAは多関節の炎症、軟骨の減少、骨侵食により関節の破壊および最終的に関節機能の減退をもたらす特徴がある。加えて、RAは全身性疾患であるため、他の組織、例として肺、眼および骨髄に影響しうる。１０年以上患っているRA患者の５０％弱は日常を基準として仕事を続けるまたは正常に機能し続けている。
初期RA（すなわち、メトトレキセート(MTX)未処理）患者の一次治療および単剤治療、または例としてMTXもしくはシクロフォスファミドとの組合せとして抗体が利用可能である。もしくは、DMARDおよび／またはMTX抵抗性患者の二次療法、および単剤療法および例としてMTXとの組合せとして治療に抗体が利用できる。ヒト化CD２０結合抗体は関節傷害の予防と調節、機能傷害の遅延、RAの炎症に伴う痛みの軽減に有用である。RA治療に用いる多剤での処置の前、後、または同時にRA患者をヒト化CD２０抗体で治療する（以下の混合治療参照）。一実施態様では、以前に病気を調整する抗リウマチ薬に失敗した患者および／またはメトトレキセート単独では効果が不十分な患者は本発明のヒト化ＣＤ２０結合抗体で治療する。この治療の一実施態様では、ヒト化CD２０結合抗体単独を１７日間の投与計画（第１および１５日目に１ｇを静脈注射）；ＣＤ２０結合抗体＋シクロフォスファミド（第３および１７日目に７５０ｍｇ静脈投与）、またはＣＤ２０結合抗体＋メトトレキセートで患者を治療する。
【００９８】
ＲＡの治療効果を評価するある方法は、American College of Rheumatology (ACR)診断基準に基づくものであり、圧痛および腫大した関節の改善の割合を測定するものである。ＲＡ患者は、無抗体治療（例として、治療前の基準）またはプラセボ治療と比較して例としてＡＣＲ２０（２０パーセントの改善）でスコア付けをする。抗体治療の効果を評価する他の方法は、Ｘ線画像、例として骨の侵食および関節腔の狭小化等の構造的傷害のスコア付けに用いられる鋭Ｘ線スコアを含む。また、患者は、治療期間中または治療後にHealth Assessment Questionnaire [HAQ]スコア、AIMSスコア、SF-36に基づいて能力障害の予防または改善の評価をすることができる。ＡＣＲ２０診断基準は、圧痛（痛み）関節数と腫大関節数の両方に２０％の改善があり、５つの追加測定のうち少なくとも３つに２０％の改善があることを含む。
１．視覚的類似尺度（ＶＡＳ）による患者の痛み評価
２．疾患活動性の患者の全体評価（ＶＡＳ）
３．疾患活動性の医師の全体評価（ＶＡＳ）
４．Health Assessment Questionnaireにより測定した能力障害の患者の自己評価、および
５．急性期反応、ＣＲＰまたはＥＳＲ
ＡＣＲ５０および７０も同様に定義する。好ましくは本発明のＣＤ２０結合抗体を少なくともＡＣＲ２０のスコア、好ましくは少なくともＡＣＲ３０、より好ましくは少なくともＡＣＲ５０、さらにより好ましくは少なくともＡＣＲ７０、最も好ましくは少なくともＡＣＲ７５より高いスコアに達する用量を患者に投与する。
【００９９】
乾癬性関節炎は特異的で明瞭なＸ線撮影像的特徴を有する。乾癬性関節炎の関節侵食および関節腔狭小化も同様にシャープ(sharp)スコアにより評価しうる。本発明のヒト化ＣＤ２０結合抗体は関節傷害の予防だけでなく疾患の兆候および疾病の症状の減弱に利用可能である。
さらに、本発明の他の側面では、本発明のヒト化ＣＤ２０結合抗体の治療的有効量をＳＬＥ患者に投与することによるループスまたはＳＬＥの治療方法である。ＳＬＥＤＡＩスコアでは疾患の活動性を数量で表す。ＳＬＥＤＡＩは疾患活動性に相関することが知られている２４の臨床および治験の荷重指数であり、０−１０３の数的範囲である。Bryan Gescuk & John Davis, “Novel therapeutic agent for systemic lupus erythematosus” in Current Opinion in Rheumatology 2002, 14:515-521を参照。二本鎖ＤＮＡに対する抗体は、血清クレアチニン、尿蛋白、または尿中の血液で顕著に生成され増加することで定義される腎性発赤および他のループスの症状を引き起こすと信じられている。代わりに、または加えて、抗核抗体および二本鎖ＤＮＡに対する抗体のレベルで患者をモニターする。ＳＬＥ治療は高用量の副腎皮質ステロイドおよび／またはシクロホスファミド(HDCC)を含む。
【０１００】
脊椎関節症は関節疾患のグループであり、硬直性脊椎炎、乾癬性関節炎、クローン病を含む。治療成果は、確認された患者および医師の全体的評価測定方法によって決定しうる。
様々な医薬が乾癬治療に用いられる；疾患重症度に関連して治療が異なる。より軽度な感染患者は一般的に局所治療、例として局所ステロイド、アンスラリン(anthralin)、カルシポトリエン(calcipotriene)、クロベタゾール(clobetasol)、およびタザロテン(tazarotene)が、全身的（メトトレキセート、レチノイド、シクロスポリン、ＰＵＶＡおよびＵＶＢ）治療を行うと思われる中度および重症乾癬患者では疾患の管理に有効である。タールも利用される。これらの治療は、安全性の考慮、時間のかかる投与計画、または不便な治療過程を複合して有する。さらに、いくつかは高価な設備および設置のための場所を必要とする。全身性医薬は、高血圧、高脂血症、骨髄抑制、肝疾患、腎疾患、および消化器系不調を含む様々な副作用を引き起こしうる。また、光線療法の使用は皮膚癌の発症を増加させうる。局所療法の使用に伴う不便および不快感に加え、光線療法および全身性治療は患者を処置および非処置の周期におき、その副作用のために生涯曝露をモニターする必要がある。
【０１０１】
乾癬の治療効果は、医師の包括的評価(PGA)変化、および乾癬領域および重症度指数(PASI)スコア、乾癬症状評価(PSA)を含む臨床兆候および疾患の症状の変化をモニターし、基礎となる症状と比較することによって評価する。特定の時点で経験した掻痒の程度を表すために用いられる視覚的類似尺度の処置を通して定期的に患者を測定する。
患者は治療的抗体の初期注入時に注入反応または注入関連症状を経験するかもしれない。これらの症状は重症度が様々であり、一般的に医療処置に可逆的なものである。これらの症状はここに限るものではないが、インフルエンザのような熱、寒気/硬直、吐き気、蕁麻疹、頭痛、気管支けいれん、血管性水腫が含まれる。本発明の疾患治療方法には注入反応を最小限にすることが望まれる。ゆえに、本発明の他の側面では、ヒト化ＣＤ２０結合抗体を投与することによるここに示された疾患の治療方法であり、ここでの抗体は補体依存性の細胞傷害性を減弱または全く持たず、リツキサン（登録商標）で処置したときと比較して侵食関連症状が減弱する結果となる治療方法である。一実施態様では、ヒト化ＣＤ２０結合抗体は２Ｈ７．ｖ１１６である。
【０１０２】
用量
当業の医師によく知られた治療効能および用量に関する因子次第で、毒素および副作用を最小限にする一方で治療効能を有効にする用量で本発明の抗体を投与するであろう。ＣＤ２０陽性癌または自己免疫疾患の治療のための治療的有効量は、約２５０ｍｇ／ｍ２〜約４００  ｍｇ／ｍ２  または５００  ｍｇ／ｍ２、好ましくは約２５０〜３７５ｍｇ／ｍ２の範囲とする。一実施態様では、用量範囲は、２７５−３７５ｍｇ／ｍ２である。ＣＤ２０陽性Ｂ細胞腫瘍の治療の一実施態様では、抗体は３００−３７５ｍｇ／ｍ２の範囲で投与する。Ｂ細胞リンパ腫、例として非ホジキンリンパ腫患者の治療のための特定の実施態様では、本発明の抗ＣＤ２０抗体およびヒト化抗ＣＤ２０抗体は１０ｍｇ／ｋｇまたは３７５ｍｇ／ｍ２の用量で患者に投与するであろう。ＮＨＬの治療のある用量投与計画では、治療の初めの１週間は10mg/kgの用量当たり抗体組成物一用量で投与し、２週間の間隔の後、同量の第二用量抗体を投与する。一般に、ＮＨＬ患者は１年に１度リンパ腫の再発によってこのような治療を受けるが、このような治療は繰り返される。他の用量投与計画では、低程度ＮＨＬ患者は４週間、ヒト化２Ｈ７の型、好ましくはｖ１６（週当たり３７５ｍｇ／ｍ２）を、続く５週目には抗体＋ＣＨＯＰ（シクロフォスファミド、ドキソルビシン(doxorubicin)、ビンクリスチンおよびプレドニゾン）またはＣＶＰ（シクロフォスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾン）化学療法を３追加投与過程、３週ごとに３周期で投与する。
【０１０３】
関節リウマチ治療の一実施態様では、ヒト化抗体の用量範囲は２回の用量で１２５ｍｇ／ｍ２（約２００ｍｇ／用量と当量）〜６００ｍｇ／ｍ２、例として第１日目に初期用量２００ｍｇ、その後第１５日目には２００ｍｇの第二用量を投与する。異なる実施態様では、用量は１用量当たり２５０ｍｇ、２７５ｍｇ、３００ｍｇ、３２５ｍｇ、３５０ｍｇ、３７５ｍｇ、４００ｍｇ、４２５ｍｇ、４５０ｍｇ、４７５ｍｇ、５００ｍｇ、５２５ｍｇ、５５０ｍｇ、  ５７５ｍｇ、６００ｍｇである。
疾患の治療において、本発明のＣＤ２０結合抗体は疾患において医師によって決定されるように慢性的または間欠的に患者に投与する。
静脈注入または皮下中により薬剤を投与している患者は有害事象、例として熱、寒気、灼熱感、無力症、および頭痛を経験する。このような有害事象を軽減または最大限小さくするために、治療的用量に続いて初期調整用量の抗体を患者に投与する。調整用量はより多くの用量に耐えるように治療用量より少ないであろう。
【０１０４】
投与経路
ＣＤ２０結合抗体は公知の方法でヒト患者に投与される。例としてボーラスまたは一定期間中の継続注入、皮下的、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、動脈血管内、滑膜内、クモ膜下腔内、または吸入、一般的には静脈内または皮下的投与により患者に投与する。
一実施態様では、ヒト化２Ｈ７抗体は注入溶媒として０．９％塩化ナトリウム溶液の静脈注入により投与する。
【０１０５】
混合療法
上述のＢ細胞腫瘍の治療に一またはそれ以上の治療薬、例として多剤投与での化学療法剤と組み合わせて本発明のＣＤ２０結合抗体で患者を治療する。ＣＤ２０結合抗体は連続的、同時、または化学療法剤と交代して、または他の治療に応答しないときに投与しうる。標準的なリンパ腫治療の化学療法は、シクロホスファミド、シタラビン(cytarabine)、メルファラン、ミトキサントロン(mitoxantrone)＋メルファランを含む。ＣＨＯＰは非ホジキンリンパ腫治療の最も一般的な化学療法投与の一つである。ＣＨＯＰ投与に用いられる薬剤は以下のとおりである：シクロホスファミド(ブランド名シトキサン(cytoxan)、ネオサル(neosar)); アドリアマイシン(ドキソルビシン/ヒドロキシドキソルビシン); ビンクリスチン(オンコビン); および、プレドニゾロン(時々デルタゾン(Deltasone)またはオラソン(Orasone)と呼ばれる)。特定の実施態様では、ＣＤ２０結合抗体は以下の化学療法剤、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、およびプレドニゾロンの一またはそれ以上を組み合わせて必要とする患者に投与する。特定の実施態様では、リンパ腫患者（例として非ホジキンリンパ腫）は本発明の抗ＣＤ２０抗体をＣＨＯＰ(シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾン)療法と組み合わせて治療する。他の実施態様では、癌患者は本発明のヒト化ＣＤ２０結合抗体をＣＶＰ(シクロホスファミド、ビンクリスチン、およびプレドニゾン)化学療法と組み合わせて治療する。特定の実施態様では、ＣＤ２０陽性ＮＨＬ患者は、ヒト化２Ｈ７．ｖ１６をＣＶＰと組み合わせて治療する。ＣＬＬ治療の特定の実施態様では、ＣＤ２０結合抗体はフルドラビンおよびシトキサンの一または両方での化学療法と組み合わせて投与する。
【０１０６】
上述の自己免疫疾患または自己免疫関連症状の治療に、本発明のＣＤ２０結合抗体を第二治療剤、例として免疫抑制剤と組み合わせて、例として多剤投与計画で患者を処置する。ＣＤ２０結合抗体は連続的、同時、または化学療法剤と交代して、または他の治療に応答しないときに投与しうる。免疫抑制剤は分野常用と同じまたはより少ない用量で投与することが可能である。好適な免疫抑制剤は治療する疾患の型だけでなく患者の病歴を含めて多くの因子によるであろう。
【０１０７】
添加剤療法についてここで用いられる「免疫抑制剤」は、患者の免疫系を抑制又はマスクするために作用する物質を意味する。このような薬剤には、サイトカイン生成を抑制する、自己抗原発現を下方制御又は抑制する、あるいはＭＨＣ抗原をマスクする物質を含む。このような薬剤の例は、グルココルチコステロイド、例えばプレドニゾン、メチルプレドニソロン、及びデキサメタゾンなどのステロイド；２-アミノ-６-アリール-５-置換ピリミジン（米国特許第４６６５０７７号参照）；アザチオプリン（アザチオプリンに抵抗性の場合はシクロホスファミド）、ブロモクリプチン；グルタルアルデヒド（米国特許第４１２０６４９号に記載されているように、ＭＨＣ抗原をマスクする）；ＭＨＣ抗原及びＭＨＣ断片に対する抗イディオタイプ抗体；シクロスポリンＡ；抗インターフェロン-γ、-β又は-α抗体を含むサイトカイン又はサイトカインレセプターアンタゴニスト、抗腫瘍壊死因子-α抗体、抗腫瘍壊死因子-β抗体、抗インターロイキン-２抗体及び；抗ＩＬ-２レセプター抗体；抗Ｌ３Ｔ４抗体；異種性抗リンパ球グロブリン；全Ｔ抗体、好ましくは抗ＣＤ３又は抗ＣＤ４／ＣＤ４ａ抗体；ＬＦＡ-３結合ドメインを持つ可溶性ペプチド（１９９０年７月２６日に公開された国際公開９０／０８１８７）；ストレプトキナーゼ；ＴＧＦ-β；ストレプトドルナーゼ；宿主からのＲＮＡ又はＤＮＡ；ＦＫ５０６；ＲＳ-６１４４３；デオキシスペルグアリン(deoxyspergualin)；ラパマイシイン(rapamycin)；Ｔ細胞レセプター（米国特許第５１１４７２１号）；Ｔ細胞レセプター断片（Offner等, Science, 251: 430-432 (1991)；国際公開９０／１１２９４；及び国際公開９１／０１１３３）；及びＴ１０Ｂ９等のＴ細胞レセプター抗体（欧州特許第３４０１０９号）を含む。
【０１０８】
関節リウマチ治療に、本発明のＣＤ２０結合抗体を以下の薬剤のうちの一またはそれ以上と組み合わせて患者を治療する：ＤＭＡＲＤＳ（疾患変更姓抗リウマチ薬(例として、メトトレキセート)）、ＮＳＡＩまたはＮＳＡＩＤ（非ステロイド性抗炎症薬）、HUMIRAＴＭ（アダリムマブ(adalimumab)；Abbott Laboratories）、ARAVA(登録商標)（レフノミド(leflunomide)）、REMICADE(登録商標)（インフリキシマブ(infliximab)；Centocor Inc., of Malvern, Pa）、ENBREL（エターナルセプト(etanercept)；Immunex, WA）、COX-2阻害剤。一般にＲＡに用いられるＤＭＡＲＤは、ヒドロキシクロロクイン(hydroxycloroquine)、スルファサラジン、メトトレキサート、レフルノミド、エターナルセプト、インフリキシマブ、アザチオプリン、Ｄペニシラミン、ゴールド(Gold)（経口）、ゴールド（筋注）、ミノサイクリン、シクロスポリン、ブドウ球菌タンパク質A免疫吸着である。アダリムマブ(adalimumab)はＴＮＦαに結合するヒトモノクローナル抗体である。インフリキシマブはＴＮＦαに結合するキメラモノクローナル抗体である。エターナルセプトはヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に結合するヒト７５ｋＤ(p75)腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）の細胞外リガンド結合部位からなる「免疫吸着」融合タンパク質である。ＲＡの従来治療は、例として“Guidelines for the management of rheumatoid arthritis” Arthritis & Rheumatism 46(2): 328-346 (February, 2002)を参照。特定の実施態様では、ＲＡ患者を本発明のＣＤ２０抗体をメトトレキセート(MTX)と組み合わせて治療する。ＭＴＸの例示的用量は、約７．５−２５ｍｇ／ｋｇ／ｗｋである。ＭＴＸは経口および皮下的ににより投与される。
【０１０９】
硬直性脊椎炎、乾癬性関節炎およびクローン病の治療には、本発明のＣＤ２０結合抗体を、例としてRemicadeR (インフリキシマブ； Centocor Inc., of Malvern, Paより)、ENBREL (エターナルセプト；Immunex, WA)と組み合わせて患者を治療する。
ＳＬＥの治療には高用量副腎皮質ステロイドおよび／またはシクロスファミド(HDCC)を含む。
乾癬治療には、ＣＤ２０結合抗体を局所的治療、例として局所的ステロイド、アンスラリン、カルシポトリエン、およびタザロテン、またはメトトレキセート、レチノイド、シクロスポリン、ＰＵＶＡおよびＵＶＢ治療と組み合わせて患者を治療する。一実施態様では、乾癬患者はシクロスポリンに続いてまたは同時にＣＤ２０結合抗体で治療する。
【０１１０】
（治療的剤形）
本発明に使用されるＣＤ２０結合抗体の治療的剤形は、所望の純度を有する抗体を選択的に薬剤的許容可能な担体、賦形剤、安定剤と混合して凍結乾燥の剤形または液状溶液の形態の貯蔵に適するものである(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))。許容可能な担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度で受容者に非毒性であり、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；ベンズアルコニウムクロライド；ベンズエトニウムクロライド；フェノール；ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物ＥＤＴＡ等のキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ-タンパク質錯体）又はトゥイーン(TWEEN)（商品名）、プルロニクス(PLURONICS)（商品名）、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。
例示的抗ＣＤ２０抗体の剤形はWO98/56418に記載されており、参考としてここに組み込まれる。他の剤形は液状の多用量剤形であり、２−８度で２年間の最小限の貯蔵期間を持つように抗ＣＤ２０抗体40 mg/mL、25 mM 酢酸塩、150 mMロレハロース、0.9% ベンジルアルコール、pH 5.0の0.02% ポリソルベート20 を含むものである。目的の他の抗ＣＤ２０剤形は、10mg/mLの抗体、9.0 mg/mL塩化ナトリウム、7.35 mg/mL クエン酸ナトリウム二水和物、0.7mg/mLポリソルベート80、および注入用の滅菌水を含むpH 6.5のものである。さらに、他の液状医薬剤形は、約ｐＨ４．８〜約ｐＨ５．５、好ましくはｐＨ５．５の１０−３０ｍＭ酢酸ナトリウム、約０．０１−０．１％ｖ／ｖ量の界面活性剤としてのポリソルベート、約２−１０％ｗ／ｖ量のトレハロース、保存剤としてのベンジルアルコール（米国特許第６１７１５８６）を含む。凍結乾燥剤形はＷＯ９７／０４８０１に記載されるように、皮下的投与に適する。そのような凍結乾燥剤形は適当な希釈剤で高いタンパク質濃度に再編成されるかもしれない、また再編成された剤形はここで治療される哺乳動物に皮下注射されうる。
【０１１１】
ヒト化２Ｈ７変異体の一剤形は、ｐＨ５．８の１０ｍＭヒスチジン、６％ショ糖、０．０２％ポリソルベート２０中の抗体１２−１４ｍｇ／ｍＬである。
特定の実施態様では、２Ｈ７変異体および特に２Ｈ７．ｖ１６は、ｐＨ５．８の１０ｍＭヒスチジン硫酸塩、６０ｍｇ／ｍｌショ糖、０．２ｍｇ／ｍｌポリソルベート２０、および注入用の滅菌水中の抗体２０ｍｇ／ｍＬである。
また、ここでの剤形は治療を特異的に示すために必要な一以上の活性化合物、好ましくはお互い負に作用しない相補的活性を持つものを含みうる。例として、さらに細胞障害性剤、化学療法剤、サイトカインまたは免疫抑制剤（例として、シクロスポリンまたはＴ細胞結合抗体、例としてＬＦＡ-１に結合するもの等のＴ細胞作用性のもの）を提供することが望まれる。そのような多剤の有効量は剤形が存在する抗体量、疾患または疾病または治療の型、および上述した他の因子に依存する。これらは一般に同じ用量およびここに示した投与経路またはここで用いられる用量の１〜９９％量で用いられる。
【０１１２】
また、活性成分は、例としてコアセルべーション技術または界面重合化により調製したマイクロカプセル、例として、個々のコロイド状のドラッグデリバリーシステム（例として、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）またはマクロエマルジョン中のヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ(メチルメタサイクリン)マイクロカプセル中に包まれているかもしれない。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
持続性徐放剤が調製される。持続性徐放剤の好適な例は、アンタゴニストを含む固形疎水性ポリマーの準透過性基質を含むものであり、基質は、造形品、例としてフィルム、またはマイクロカプセルの形である。持続性徐放基質の例として、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(2ヒドロキシエチル-メタクリレート)、またはポリ(ビニルアルコール))、ポリ乳酸(米国特許3773919), L-グルタミン酸およびエチルＬグルタミン酸の共重合体、非分解性のエチレンビニール酢酸塩、分解性の乳酸グリコール酸共重合体、例としてLUPRON DEPOTＴＭ(乳酸-グリコール酸共重合体およびロイプロリド酢酸塩で構成された注入可能ミクロスフェア)、およびポリD-(-)-3ヒドロキシブチリン酸を含む。
インビボ投与に用いる剤形は無菌でなければならない。これは滅菌濾過膜を通す濾過によって容易く達成できる。
【０１１３】
（製造品およびキット）
本発明の他の実施態様は、自己免疫性疾患および関連症状およびＣＤ２０陽性癌、例として非ホジキンリンパ腫の治療に有用な材料を含む製造品である。製造品は、容器とラベルまたは容器上にあるまたは容器に付属するパッケージ挿入物を含む。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ等を含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成されうる。容器は、症状の治療に有効な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針による穴あきストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも一の活性剤は本発明のＣＤ２０結合抗体である。ラベルまたはパッケージ挿入物は、組成物が特定の症状の治療のために使用されることを示している。さらに、ラベルまたはパッケージ挿入物は抗体組成物の患者への投与についての説明を含むであろう。パッケージ挿入物は治療的製造品の商用パッケージに含まれる慣例的な説明書を示しており、効能、使用法、用量、投与法、禁忌および／または医薬製品に関する警告についての情報を含む。一実施態様では、パッケージ挿入物は、組成物が非ホジキンリンパ腫の治療に有用である。
【０１１４】
加えて、さらに製造品は、薬学的に許容可能な緩衝液、例として注射用静菌水(BWFI)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、およびブドウ糖溶液を含む第二容器を含みうる。さらに、商業的および消費者視点で望まれる他の材料、他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、針、およびシリンジを含みうる。
キットもまた様々な目的、例としてＢ細胞死滅分析に、アポトーシスアッセイのポジティブコントロールとして、細胞からのＣＤ２０の精製または免疫沈降に有用である。ＣＤ２０を単離および精製するために、キットにビーズ（例としてセファロースビーズ）に結合した抗ＣＤ２０抗体を含めることができる。インビトロでＣＤ２０を検出および定量する、例としてＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロット法のための抗体を含むキットが提供される。製造品として、キットは容器およびラベルまたは容器上または容器に付随したパッケージ挿入物を含む。容器は本発明の少なくとも一の抗ＣＤ２０抗体を含む組成物を有する。付加的容器には、例として希釈剤および緩衝液、対照抗体を包含しうる。ラベルまたはパッケージ挿入物は組成物の解説と同様にインビトロまたは診断的使用を意図した指示書も含みうる。
【０１１５】
（カニクイザルＣＤ２０）
本発明は、図１９に示すように、カニクイザルＣＤ２０の配列番号： のヌクレオチド配列を含んでなる単離した核酸も提供する。一実施態様では、核酸はｃＤＮＡである。一実施態様では、カニクイザルＣＤ２０をコードする核酸は宿主細胞内で発現するために発現ベクター内にある。発現ベクター内の配列番号：＿のヌクレオチド配列は発現コントロール配列、例としてプロモーターまたはプロモーターおよびエンハンサーに作用可能に結合している。発現コントロール配列は、正常にカニクイザルＣＤ２０遺伝子を構成している天然配列、または該遺伝子の異種性配列であり得る。また、カニクイザルＣＤ２０のアミノ酸配列［配列番号．＿；図１９および２０］を含む単離したポリペプチドと同様に、カニクイザルＣＤ２０核酸を含む宿主細胞をも提供する。一側面では、宿主細胞は真核細胞、例としてＣＨＯ細胞である。カニクイザルＣＤ２０アミノ酸配列またはその配列断片を含む融合タンパク質も考慮する。
【実施例】
【０１１６】
実施例１
２Ｈ７抗ＣＤ２０マウスモノクローナル抗体のヒト化
マウス抗ヒトＣＤ２０抗体の２Ｈ７（ここではマウスをｍとしてｍ２Ｈ７とも呼ぶ）のヒト化を一連の部位特異的突然変異誘発工程で実施した。マウス２Ｈ７抗体可変領域配列とマウスＶとヒトＣのキメラ２Ｈ７は開示されており、例えば米国特許第５８４６８１８号及び同第６２０４０２３号を参照のこと。２Ｈ７のＣＤＲ残基は、マウス２Ｈ７可変ドメインのアミノ酸配列（米国特許第５８４６８１８号に開示）を既知の抗体の配列と比較することにより同定された（Kabat等, Sequences of proteins of immunological interest, 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）。軽鎖と重鎖のＣＤＲ領域は配列高頻度可変性（上掲のKabat等）に基づいて定まり、図１Ａ及び図１Ｂにそれぞれ示す。合成オリゴヌクレオチド（表１）を用いて、部位特異的突然変異誘発（Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. 82:488-492 (1985)）を使用して、プラスミドｐＶＸ４に含まれるコンセンサス配列ＶｋＩ,ＶＨＩＩＩ（ＶＬカッパサブグループＩ，ＶＨサブグループＩＩＩ）に対応する完全ヒトＦａｂフレームワーク中に６つ全てのマウス２Ｈ７ＣＤＲ領域を導入した（図２）。
ファージミドｐＶＸ４（図２）を突然変異誘発並びに大腸菌中でのＦ(ａｂ)の発現に使用した。ｐＢ０４７５の誘導体（Cunningham等, Science 243: 1330-1336 (1989)）であるファージミドｐｂ０７２０に基づいて、ｐＶＸ４は、ヒト化コンセンサスκ-サブグループＩ軽鎖（ＶＬκＩ-ＣＬ）とヒト化コンセンサスＩＩＩ重鎖（ＶＨＩＩＩ-ＣＨ１）抗ＩＦＮ-α（インターフェロンα）抗体をコードするＤＮＡ断片を含む。ｐＶＸ４はまた共に別の過去に開示されたｐＵＣ１１９ベースのプラスミドｐＡＫ２（Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285 (1992)）から誘導されたアルカリホスファターゼプロモーター及びシャイン-ダルガーノ配列を有している。独特のＳｐｅｌ制限部位をＦ(ａｂ)軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡ間に導入した。抗ＩＦＮ-α重鎖及び軽鎖双方の最初の２３のアミノ酸はＳｔＩＩ分泌シグナル配列である（Chang等, Gene 55: 189-196 (1987)）。  
【０１１７】
２Ｈ７のＣＤＲスワップ型を構築するために、部位特異的突然変異誘発をｐＶＸ４のデオキシウリジン含有鋳型で実施した；抗ＩＦＮ-αの６つ全てのＣＤＲがマウス２Ｈ７ＣＤＲに変化した。得られた分子をヒト化２Ｈ７型２（２Ｈ７.ｖ２）又は２Ｈ７の「ＣＤＲスワップ型」と呼ぶ；これは図１Ａ及び１Ｂに示されるコンセンサスヒトＦＲ残基を有するｍ２Ｈ７ＣＤＲ残基を有する。ヒト化２Ｈ７.ｖ２は更なるヒト化に用いた。
表１はＨ及びＬ鎖においてマウス２Ｈ７（ｍ２Ｈ７）ＣＤＲのそれぞれを作製するために用いたオリゴヌクレオチド配列を示す。例えば、ＣＤＲ-Ｈ１オリゴヌクレオチドを使用してｍ２Ｈ７のＨ鎖を再作製した。ＣＤＲ-Ｈ１、ＣＤＲ-Ｈ２及びＣＤＲ-Ｈ３はＨ鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３をそれぞれ意味する；同様に、ＣＤＲ-Ｌ１、ＣＤＲ-Ｌ２及びＣＤＲ-Ｌ３はＬ鎖ＣＤＲのそれぞれを意味する。ＣＤＲ-Ｈ２における置換はＣＤＲ-Ｈ２ＡとＣＤＲ-Ｈ２Ｂの二つのオリゴヌクレオチドを用いる二工程で行った。
表１．ｐＶＸ４のヒトフレームワーク中へのマウス２Ｈ７ＣＤＲのＣＤＲスワップの構築に使用したオリゴヌクレオチド配列。
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【０１１８】
ヒト化コンストラクトとの比較のために、キメラ２Ｈ７Ｆａｂ（マウスＶＬ及びＶＨドメイン、及びヒトＣＬ及びＣＨ１ドメインを含む）を発現するプラスミドを、２Ｈ７.ｖ２中にマウスフレームワーク残基を導入するために合成オリゴヌクレオチドを使用して部位特異的突然変異誘発（上掲のKunkel）によって構築した。２Ｈ７.ｖ６.８として知られているキメラＦａｂを発現させるための得られたプラスミドコンストラクトの配列を図３に示す。Ｆａｂの各コード鎖は上にｐＶＸ４（図２）について記載された２３のアミノ酸のＳｔＩＩ分泌シグナル配列を有している。
ヒトＶｋＩ,ＶＨＩＩＩコンセンサスフレームワーク（図１Ａ及び１Ｂ）及び過去のヒト化抗体（Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-4289 (1992)）とのマウス２Ｈ７フレームワーク残基の配列比較に基づいて、幾つかのフレームワーク変異を部位特異的突然変異誘発によって２Ｈ７.ｖ２Ｆａｂコンストラクト中に導入した。これらの変異により、ＣＤＲコンフォメーション又は抗原接触に影響を及ぼすかも知れない部位において、あるヒトコンセンサスフレームワーク残基がマウス２Ｈ７フレームワークに見出されたものに変化した。型３はＶＨ（Ｒ７１Ｖ，Ｎ７３Ｋ）を、型４はＶＨ（Ｒ７１Ｖ）を、型５はＶＨ（Ｒ７１Ｖ，Ｎ７３Ｋ）及びＶＬ（Ｌ４６Ｐ）を、型６はＶＨ（Ｒ７１Ｖ，Ｎ７３Ｋ）及びＶＬ（Ｌ４６Ｐ，Ｌ４７Ｗ）を含んでいた。
【０１１９】
ｍ２Ｈ７抗体のヒト化及びキメラＦａｂ型を次のようにして大腸菌中で発現させ、精製した。二本鎖及び一本鎖ＤＮＡの調製のためにプラスミドを大腸菌株ＸＬ-１ブルー（Stratagene, San Diego, CA）中に形質転換した。各変異体に対して、軽鎖と重鎖の双方をジデオキシヌクレオチド法（Sequenase, U.S. Biochemical Corp.）を使用して完全に配列決定した。プラスミドを、ＭＭ２９４の誘導体である大腸菌株１６Ｃ９に形質転換し、５μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含むＬＢプレート上に蒔き、単一のコロニーをタンパク質発現のために選択した。その単一のコロニーを３７℃で５−８時間、５ｍｌのＬＢ-１００μｇ／ｍｌカルベニシリン中で成長させた。５ｍｌの培養物を５００ｍｌのＡＰ５-１００μｇ／ｍｌカルベニシリンに添加して、３７℃で４Ｌの邪魔板振盪フラスコ中で１６時間成長させた。ＡＰ５培地は１．５ｇのグルコース、１１．０のHycaseＳＦ、０．６ｇの酵母エキス（保証付き）、０．１９ｇの無水ＭｇＳＯ４、１．０７ｇのＮＨ４Ｃｌ、３．７３ｇのＫＣｌ、１．２ｇのＮａＣｌ、１２０ｍｌの１Ｍトリエタノールアミン、ｐＨ７．４からなり、１Ｌの水に加えた後、０．１μｍのSealkeenフィルターを通して滅菌濾過した。
細胞を、３０００ｘｇにて１Lの遠心分離瓶（Nalgene）で遠心分離によって収集し、上清を除去した。１時間の凍結後、ペレットを２５ｍｌの非放射性１０ｍＭ ＭＥＳ-１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ５．０（バッファーＡ）中に再懸濁させた。２５０μｌの０．１Ｍ ＰＭＳＦ（シグマ）を添加してタンパク質分解を阻止し、３．５ｍｌの原液１０ｍｇ／ｍｌのニワトリの卵の白色リゾチーム（シグマ）を添加して細菌細胞壁の溶解を補助した。氷上で１時間、穏やかに振盪した後、試料を４００００ｘｇで１５分、遠心分離した。上清をバッファーＡを用いて５０ｍｌにし、バッファーＡで平衡にした２ｍｌのＤＥＡＥカラムに充填した。ついで、バッファーＡで平衡にしたプロテインＧセファロースＣＬ-４Ｂ（ファルマシア）カラム（０．５ｍｌ床容積）に流通させた。カラムを１０ｍｌのバッファーＡで洗浄し、１．２５ｍｌの１Ｍトリス、ｐＨ８．０に入れた３ｍｌの０．３Ｍグリシン、ｐＨ３．０で溶出させた。ついで、Ｆ(ａｂ)をセントリコン-３０（アミコン）を使用してＰＢＳ中にバッファー交換し、０．５ｍｌの最終容積まで濃縮した。全てのＦ(ａｂ)のＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルを実施して純度を確保し、各変異体の分子量をエレクトロスプレー質量分析法によって証明した。
【０１２０】
細胞ベースのＥＬＩＳＡ結合アッセイ（以下に記載）においては、キメラ２Ｈ７Ｆａｂを含むＦａｂのＣＤ２０への結合は検出が難しかった。従って、２Ｈ７Ｆａｂ型をアッセイと更なる突然変異誘発のために完全長ＩｇＧ１抗体として再形態化した。
完全長ＩｇＧの発現のためのプラスミドは、キメラ２Ｈ７（ｖ６.８）ＦａｂのＶＬ及びＶＨドメイン並びにヒト化Ｆａｂ型２ないし６を、哺乳動物細胞の発現のための過去に記載されたｐＲＫベクター（Gorman等, DNA Prot. Eng. Tech. 2:3-10 (1990)）中にサブクローニングすることによって構築した。簡単に述べると、各ＦａｂコンストラクトをＥｃｏＲＶ及びＢｌｐＩを用いて消化させてＶＬ断片を切除し、これを、完全な軽鎖（ＶＬ-ＣＬドメイン）の発現のためにプラスミドｐＤＲ１（図４）のＥｃｏＲＶ／ＢｌｐＩ部位にクローニングした。また、各ＦａｂコンストラクトをＰｖｕＩＩ及びＡｐａＩで消化させてＶＨ断片を切除し、これを、完全な重鎖（ＶＨ-ＣＨ１-ヒンジ-ＣＨ２-ＣＨ３ドメイン）の発現のためにプラスミドｐＤＲ２（図５）のＰｖｕＩＩ／ＡｐａＩ部位中にクローニングした。各ＩｇＧ変異体に対して、軽鎖発現プラスミドと重鎖発現プラスミドをアデノウイルス形質転換ヒト胎児腎臓細胞株２９３（Graham等, J. Gen. Virol., 36:59-74, (1977)）中に同時形質移入することによって、一過性トランスフェクションを実施した。簡単に述べると、２９３細胞をトランスフェクションの前の日に分裂させ、血清含有培地に蒔いた。次の日に、リン酸カルシウム沈殿物として調製した二本鎖ＤＮＡと、続いてｐＡｄＶＡｎｔａｇｅＴＭＤＮＡ（Promega, Madison, WI）を添加し、細胞を３７℃で一晩インキュベートした。細胞を無血清培地で培養し４日後に収集した。抗体を、プロテインＡ-セファロースＣＬ-４Ｂを使用して培養上清から精製した後、バッファーを１０ｍＭコハク酸ナトリウム、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０に交換し、セントリコン-１０（アミコン）を使用して濃縮した。タンパク質濃度は定量アミノ酸分析法によって決定した。
【０１２１】
ＣＤ２０抗原に対する相対的結合親和性を測定するために、細胞ベースのＥＬＩＳＡアッセイ法を開発した。ヒトＢリンパ芽球腫ＷＩＬ２-Ｓ細胞（ATCC CRL 8885, American Type Culture Collection, Rockville, MD）を、加湿した５％ＣＯ２インキュベーターにおいて、２ｍＭのＬ-グルタミン、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２及び１０％の熱不活化仔ウシ血清を補填したＲＰＭＩ１６４０中で成長させた。細胞を、１％ＦＢＳ含有ＰＢＳ（アッセイバッファー）で洗浄し、９６ウェルの丸底プレート（Nunc, Roskilde, Denmark）中で２５０−３０００００細胞／ウェルにて播種した。アッセイバッファー中、２倍の連続希釈標準（１５．６−１０００ｎｇ／ｍｌの２Ｈ７ｖ６.８キメラＩｇＧ）と３倍の連続希釈試料（２．７−２０００ｎｇ／ｍｌ）をプレートに添加した。プレートを氷中に埋設し、４５分間、インキュベートした。未結合抗体を除くために、ウェルに０．１ｍＬのアッセイバッファーを添加した。プレートを遠心分離し、上清を除去した。細胞を０．２ｍＬのアッセイバッファーでもう２回洗浄した。プレートに結合した抗体を、ペルオキシダーゼ抱合ヤギ抗ヒトＦｃ抗体（Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA）をプレートに添加することによって検出した。４５分のインキュベーション後、細胞を前に記載したようにして洗浄した。ＴＭＢ基質（３,３',５,５'-テトラメチルベンジジン；Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD）をプレートに添加した。１Ｍのリン酸を加えて反応を停止させた。滴定曲線を４変数非線形回帰曲線フィッティングプログラム（KaleidaGraph, Synergy software, Reading, PA）を用いてフィッティングさせた。滴定曲線の中点の吸光度（中央-ＯＤ）とその対応する標準濃度を決定した。ついで、この中央-ＯＤでの各変異体の濃度を決定し、標準の濃度を各変異体の濃度で割った。よって、値は、標準に対する各変異体の結合比である。相対親和性の標準偏差（等価濃度）は一般に実験値の＋／−１０％であった。
【０１２２】
表２に示されるように、ＣＤＲ-スワップ変異体（ｖ.２）の結合はキメラ２Ｈ７（ｖ.６.８）と比較すると極めて低減していた。しかしながら、型３ないし６は改善された結合性を示した。キメラ２Ｈ７のものに対する結合親和性を回復させるのに必要とされるかも知れない変異の最小数を決定するために、更なる変異及び変異の組み合わせを部位特異的突然変異誘発によって構築して、表３に示される変異体７から１７を産生した。特に、これらはＶＨ変異Ａ４９Ｇ、Ｆ６７Ａ、Ｉ６９Ｌ、Ｎ７３Ｋ、及びＬ７８Ａ；及びＶＬ変異Ｍ４Ｌ、Ｍ３３Ｉ、及びＦ７１Ｙを含んでいた。型１６及び１７は、キメラ型の２倍内の、最良の相対的結合親和性を示し、２者間に有意差はなかった（標準偏差＝＋／−１０％）。よって、変異の数を最小にするために、マウスフレームワーク残基に対してヒトフレームワーク残基の４の変異のみを有する型１６を、更なる特徴付けのためのヒト化型として選択した。
【０１２３】
表２.細胞ベースＥＬＩＳＡを使用してキメラ２Ｈ７と比較したＣＤ２０に対するヒト化２Ｈ７ＩｇＧ変異体の相対的結合親和性。相対的結合性は、等価な結合に必要とされる変異体の濃度に対するキメラ２Ｈ７の濃度として表す；よって、比＜１は変異体に対する弱い親和性を示す。相対的親和性の決定値における標準偏差は平均して＋／−１０％であった。可変ドメインのフレームワーク置換はＫａｂａｔ（上掲のKabat等）の番号付けに従ったＣＤＲ-スワップ型に対するものである。
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表３  ヒト化２Ｈ７型１６（２Ｈ７.ｖ１６）における変異ＶＨ（Ａ４９Ｇ、Ｒ７１Ｖ、Ｎ７３Ｋ）及びＶＬ（Ｌ４６Ｐ）の構築に使用したオリゴヌクレオチド配列。下線のコドンは示されたアミノ酸置換をコードする。ＶＨ（Ｒ７１Ｖ、Ｎ７３Ｋ）及びＶＬ（Ｌ４６Ｐ）に対して、オリゴは、Ｆａｂ鋳型での突然変異誘発に使用されたので、センス鎖として示される一方、ＶＨ（Ａ４９Ｇ）に対して、オリゴは、ｐＲＫ（ＩｇＧ重鎖）鋳型と共に使用されたので、アンチセンス鎖として示される。型１６のタンパク質配列は図６及び図７に示す。
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【０１２４】
実施例２
２Ｈ７の抗原結合決定基（パラトープ）
ＣＤ２０への結合における抗体の個々の側鎖の寄与を試験するために２Ｈ７.ｖ１６又は２Ｈ７.ｖ１７においてアラニン置換（(Cunningham及びWells, Science 244: 1081-1085 (1989)）を行った。ＩｇＧ変異体をｐＤＲ１及びｐＤＲ２ベクターから２９３細胞中で発現させ、精製し、上述の相対的結合親和性についてアッセイした。幾つかのアラニン置換は、ＷＩＬ-２Ｓ細胞上のＣＤ２０への相対結合性を有意に減少させた（表４）。
【０１２５】
表４．細胞ベースＥＬＩＳＡ（ＷＩＬ-２Ｓ細胞）を使用して測定したヒト化２Ｈ７.ｖ１６のＣＤＲ領域におけるアラニン置換の効果。相対結合性は、等価な結合に必要とされる変異体の濃度に対する２Ｈ７.ｖ１６親の濃度として表す；よって、比＞１は変異体に対する高い親和性を示す。相対的親和性の決定値における標準偏差は平均して＋／−１０％であった。可変ドメインのフレームワーク置換はＫａｂａｔ（上掲のKabat等）の番号付けに従った２Ｈ７.ｖ１６に対するものである。ＮＢＤは検出可能な結合がないことを意味する。型４５の二つの数値は別の実験のものである。
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【０１２６】
実施例３
２Ｈ７ＣＤＲ領域内の更なる変異
Ａｌａスキャニングによって重要であると同定されたＣＤＲ位置での更なる残基の置換及び置換の組み合わせをまた試験した。幾つかの組み合わせた変異体、特にｖ.９６はｖ.１６よりもより強固に結合したようであった。
【０１２７】
表５．細胞ベースＥＬＩＳＡ（ＷＩＬ-２Ｓ細胞）を使用して測定したヒト化２Ｈ７.ｖ１６のＣＤＲ領域における変異と非アラニン置換の組み合わせの効果。ＣＤ２０に対する相対結合性は、等価な結合に必要とされる変異体の濃度に対する２Ｈ７.ｖ１６親の濃度として表す；よって、比＜１は変異体に対する弱い親和性を示す；比＞１は変異体に対する高い親和性を示す。相対的親和性の決定値における標準偏差は平均して＋／−１０％であった。可変ドメインのフレームワーク置換はＫａｂａｔ（上掲のKabat等）の番号付けに従った２Ｈ７.ｖ１６に対するものである。
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【０１２８】
実施例４
フレームワークヒト化置換の部位における変異
ヒト化の間に変化したフレームワーク位置の更なる残基の置換をまた２Ｈ７.ｖ１６バックグラウンドで試験した。特に、マウス２Ｈ７親にもヒトコンセンサスフレームワークの何れにも見出されなかった選択的フレームワーク置換をＶＬ（Ｐ４６）及びＶＨ（Ｇ４９、Ｖ７１、及びＫ７３）において行った。
これらの置換は一般的に相対的結合性の変化をあまりもたらさず（表６）、これらの位置のフレームワーク残基にある程度の自由度があることを示している。
【０１２９】
表６．フレームワーク置換の細胞ベース（ＷＩＬ-２Ｓ）アッセイにおける相対結合性。ＩｇＧ変異体は２Ｈ７.ｖ１６バックグラウンドに対する変異で示す。相対結合性は、等価な結合に必要とされる変異体の濃度に対する２Ｈ７.ｖ６.８キメラの濃度として表す；よって、比＜１は変異体に対する弱い親和性を示す；比＞１は変異体に対する高い親和性を示す。相対的親和性の決定値における標準偏差は平均して＋／−１０％であった。可変ドメインのフレームワーク置換はＫａｂａｔ（上掲のKabat等）の番号付けに従った２Ｈ７.ｖ１６に対するものである。（*）標準コンパレーターとして２Ｈ７.ｖ１６でアッセイされた変異体；相対値はキメラの値に対して正規化してある。
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（*）標準コンパレーターとして２Ｈ７.ｖ１６でアッセイされた変異体；相対値はキメラの値に対して正規化してある。
【０１３０】
実施例５
亢進したエフェクター機能を持つヒト化２Ｈ７変異体
２Ｈ７は補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）と抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の双方を通してＢ細胞の溶解を媒介できるので、我々は、改善されたＣＤＣ及びＡＤＣＣ活性を持つヒト化２Ｈ７.ｖ１６の変異体を産生しようとした。補体成分Ｃ１ｑへの向上した結合性を介してＣＤＣを改善するために、他の抗体のＦｃ領域内でのある種の残基の変異は記載されている（Idusogie等, J. Immunol. 166:2571-2575 (2001)）。活性化ＦｃγレセプターへのＩｇＧ結合性の向上と阻害性ＦｃγレセプターへのＩｇＧ結合性の向上によってＡＤＣＣを改善するための変異もまた記載されている（Shields等, J. Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001); Presta等, Biochem. Soc. Trans. 30:487-490 (2002)）。特に、記載されているようにして（上掲のIdusogie等 (2001)；上掲のShields等）３の変異がＣＤＣ及びＡＤＣＣ活性の改善のために同定されている：Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ（ここでは、三重Ａｌａ変異又は変異体とも呼ぶ；Ｆｃ領域の番号付けはＥＵ番号付け法による；上掲のKabat等）。
【０１３１】
２Ｈ７のＣＤＣ及びＡＤＣＣ活性を向上させるために、２Ｈ７Ｆｃの三重Ａｌａ変異体を構築した。抗ＨＥＲ２抗体４ｄ５のヒト化変異体は、変異Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａで産生されており、４Ｄ５Ｆｃ１１０として知られている（つまり、抗ｐ１８５ＨＥＲ２ＩｇＧ１（Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ）；上掲のShields等）。プラスミドである抗体４Ｄ５Ｆｃ１１０をコードするｐ４Ｄ５Ｆｃ１１０（上掲のShields等）をＡｐａＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化させ、Ｆｃ断片（変異Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａを含む）を２Ｈ７重鎖ベクターｐＤＲ２-ｖ１６のＡｐａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に結合させ、ｐＤＲ２-ｖ３１を産生した。型３１の完全Ｈ鎖のアミノ酸配列は図８に示す。Ｌ鎖はｖ１６のものと同じである。
ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域の定常ドメインは与えられた種内にかなり保存されているが、対立遺伝子変異が存在している（Lefranc及びLefranc, The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function, and regulation, pp. 43-78, F. Shakib編, Pergammon Press, Oxford (1990)に概説）。
【０１３２】
表７．ＣＤ２０結合性に対するＦｃ領域中の置換の効果。ＣＤ２０への相対結合性は、フレームワーク置換の細胞ベース（ＷＩＬ２-Ｓ）アッセイで測定した。Ｆｃ変異（*）はＥＵ番号付け法（上掲のKabat）により、２Ｈ７.ｖ１６親に対するものである。ｖ.３１のＦｃ領域の３つのＡｌａ変化の組み合わせは「Ｆｃ１１０」と記載される。ＩｇＧ変異体は２Ｈ７.ｖ１６バックグラウンドに対する変異で示される。相対結合性は等価な結合に必要とされる変異体の濃度に対する２Ｈ７.ｖ６.８キメラの濃度として表す；よって、比＜１は変異体に対する弱い親和性を示す。相対的親和性の決定値における標準偏差は平均して＋／−１０％であった。
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【０１３３】
実施例６
向上した安定性を持つヒト化２Ｈ７変異体
治療用タンパク質としての開発のためには、好適な製剤バッファー中で、酸化、脱アミド化、又は生成物の品質に影響を及ぼしうる他のプロセスに対して安定なままである変異体を選択することが望ましい。２Ｈ７.ｖ１６では、幾つかの残基が不安定性の可能な原因として同定された：ＶＬ（Ｍ３２）及びＶＨ（Ｍ３４、Ｎ１００）。従って、ｖ１６との比較でこれらの部位に変異を導入した。
【０１３４】
表８．細胞ベース（ＷＩＬ２-Ｓ）アッセイにおけるＣＤ２０に対する、安定性及び／又はエフェクター機能の向上のために設計された２Ｈ７変異体の相対結合性。ＩｇＧ変異体は２Ｈ７.ｖ１６バックグラウンドに対する変異で示される。相対結合性は等価な結合に必要とされる変異体の濃度に対する２Ｈ７.ｖ６.８キメラの濃度として表す；よって、比＜１は変異体に対する弱い親和性を示す。相対的親和性の決定値における標準偏差は平均して＋／−１０％であった。可変ドメインにおけるフレームワーク置換はＫａｂａｔの番号付けに従った２Ｈ７.ｖ１６に対するものであり、Ｆｃ変異（*）はＥＵ番号付けによって示される（上掲のKabat等）。（**）標準コンパレーターとして２Ｈ７.ｖ１６で測定された変異体；相対値はキメラの値に対して正規化してある。
更なるＦｃ変異が過去に報告された変異（Idusogie等 (2000); Idusogie等 (2001); Shields等 (2001)）に基づいてエフェクター機能を改変又は亢進するために安定性又は親和性亢進変異と組み合わせた。これらの変化には実施例５に記載したＳ２９８、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４ＡＣＤＣ活性の低減に対するＫ３２２Ａ；ＡＤＣＣ活性を減少させるＤ２６５Ａ；ＣＤＣ活性を亢進するＫ３２６Ａ又はＫ３２６Ｗ；及びＦｃ領域にアロタイプ変化の効果を試験するＥ３５６Ｄ／Ｍ３５８Ｌが含まれる。これらの変異の何れもＣＤ２０結合親和性に有意な差異を生じなかった。
0005885457.tif 000014
（**）標準コンパレーターとして２Ｈ７.ｖ１６で測定された変異体；
相対結合値はキメラの値に対して正規化してある。
タンパク質の分解速度に対する安定性変異の効果を試験するために、２Ｈ７.ｖ１６と２Ｈ７.ｖ７３を１０ｍＭのヒスチジン、６％のスクロース、０．０２％のポリソルベート２０、ｐＨ５．８中１２−１４ｍｇ／ｍＬで処方し、４０℃で１６日間インキュベートした。ついで、インキュベートした試料につき、イオン交換クロマトグラフィーによって荷電変異体における変化を、サイズ排除クロマトグラフィーによって凝集と断片化を、細胞ベース（ＷＩＬ２-Ｓ）アッセイでの試験によって相対結合性をアッセイした。
結果（図９）は、加速された安定性条件下でのイオン交換クロマトグラフィーによる主ピークのフラクションの喪失について、２Ｈ７.ｖ７３が２Ｈ７.ｖ１６と比較して大なる安定性を有していることを示している。凝集、断片化又は結合親和性については有意差は見られなかった。
【０１３５】
実施例７
ＷＩＬ２-Ｓ細胞上のＣＤ２０への抗体結合のスキャッチャード分析
平衡解離定数（Ｋｄ）を、放射標識２Ｈ７ＩｇＧを使用してＷＩＬ２-Ｓ細胞へ結合している２Ｈ７ＩｇＧ変異体について定量した。ＩｇＧ変異体はＣＨＯ細胞中で産生させた。リツキサン(登録商標)（全実験での入手源はジェネンテック、S. San Francisco, CA）とマウス２Ｈ７（BD PharMingen, San Diego, CA）をヒト化変異体との比較に使用した。マウス２Ｈ７抗体はまた例えばeBioscience及びCalbiochem（共にSan Diego, CA）、Accurate Chemical & Scientific Corp.(Westbury, NY)、Ancell (Bayport, MN)、及びVinci-Biochem (Vinci, Italy)から入手可能である。希釈は全て結合アッセイバッファー（１％ウシ血清アルブミン、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２、及び０．０１％のアジ化ナトリウムを含むＤＭＥＭ培地）で実施した。０．８ｎＭの濃度の１２５Ｉ-２Ｈ７.ｖ１６（ラクトペルオキシダーゼでヨウ素化）のアリコート（０．０２５ｍＬ）をＶ底の９６ウェルマイクロアッセイプレートのウェル中に分配し、非放射性抗体の連続希釈物（０．０５ｍＬ）を加えて混合した。ついで、ＷＩＬ２-Ｓ細胞（０．０２５ｍＬ中６００００細胞）を加えた。プレートをシールし、室温で２４時間インキュベートした後、３５００ＲＰＭで１５分間遠心分離した。ついで、上清を吸引し、細胞ペレットを洗浄し遠心分離した。上清を再び吸引し、ペレットを１ＮのＮａＯＨに溶解し、ガンマ計数のためチューブに移した。データを、プログラムLigand (McPherson, Comput. Programs Biomed. 17: 107-114 (1983))を使用するスキャッチャード分析 (Munson and Rodbard, Anal. Biochem. 107:220-239 (1980)) に使用した。表９に示す結果は、ヒト化２Ｈ７変異体がマウス２Ｈ７と比較して類似のＣＤ２０結合親和性を、リツキサン(登録商標)と類似の結合親和性を有していたことを示している。２Ｈ７.ｖ３１は上の表７に示した結合性に基づくとｖ.１６に非常に類似したＫｄを有していると予想される。
【０１３６】
表９．スキャッチャード分析による２Ｈ７変異体の均衡結合親和性
0005885457.tif 000015
【０１３７】
実施例８
補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイ
２Ｈ７ＩｇＧ変異体について、本質的に開示されている（Idusogie等, J. Immunol. 164:4178-4184 (2000); Idusogie等, J. Immunol. 166:2571-2575 (2001)）ＣＤ２０発現リンパ芽球腫Ｂ細胞株のＷＩＬ２-Ｓ細胞の補体依存性溶解を媒介するその能力をアッセイした。抗体を０．１ｍｇ／ｍＬ原液から１：３で連続希釈した。各希釈物の０．０５ｍＬのアリコートを、０．０５ｍＬの正常なヒト補体溶液（Quidel, San Diego, CA）を含んだ９６ウェル組織培養プレートに加えた。この混合物に、０．０５ｍＬ容積で５００００ＷＩＬ２-Ｓ細胞を加えた。３７℃で２時間のインキュベーション後、０．０５ｍＬのアラマーブルー溶液（Accumed International, Westlake, OH）を加え、３７℃で更に１８時間、インキュベーションを継続した。ついで、カバーをプレートから除去し、それを軌道振盪器で室温にて１５分振盪した。相対蛍光単位（ＲＦＵ）を５３０ｎｍ励起フィルター及び５９０ｎｍ発光フィルターを使用して読み取った。KaleidaGraphソフトウェアを使用して各抗体に対して濃度の関数としてＲＦＵをフィッティングさせることによってＥＣ５０を計算した。
結果（表１０）は、ヒト化２Ｈ７抗体によるＣＤＣの驚くべき改善を示しており、ｖ.７３に対してはリツキサン(登録商標)と同様の相対作用強度で、ｖ.７５に対してはリツキサン(登録商標)より３倍強く、ｖ.１６に対してはリツキサン(登録商標)より３倍弱い。
【０１３８】
表１０．リツキサンと比較した２Ｈ７抗体のＣＤＣ活性。＞１の数はリツキサン(登録商標)より弱いＣＤＣ活性を示しており、＜１の数はリツキサン(登録商標)より強い活性を示している。抗体は、（*）によって示したものが一過性に産生された以外は、安定なＣＨＯ株から産生された。
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【０１３９】
実施例９
抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイ
２Ｈ７ＩｇＧ変異体について、乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）読み取りを使用して、本質的に開示されている（Shields等, J.  Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001)）ＣＤ２０発現リンパ芽球腫Ｂ細胞株のＷＩＬ２-Ｓ細胞のナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）溶解を媒介するその能力をアッセイした。ＮＫ細胞を、ＣＤ１６としても知られている（Koene等, Blood 90:1109-1114 (1997)）ＦｃγＲＩＩＩに対してアイソタイプであった正常なヒトドナーから得られた１００ｍＬのＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で希釈した１００ｍＬのヘパリン処理血液から調製した。この実験では、ＮＫ細胞はＣＤ１６（Ｆ１５８／Ｖ１５８）に対してヘテロ接合性のヒトドナーからのものであった。希釈した血液を１５ｍＬのリンパ球分離培地（ICN Biochemical, Aurora, Ohio）上に層状にし２０００ＲＰＭで２０分間、遠心分離した。層間界面の白血球を４本の清浄な５０ｍＬチューブに分配し、それに１５％の仔ウシ血清を含むＲＰＭＩ培地を満たした。チューブを１４００ＲＰＭで５分間遠心分離し、上清を捨てた。ペレットをＭＡＣＳバッファー（０．５％ＢＳＡ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）中に再懸濁させ、ビーズ（ＮＫ細胞単離キット，１３０-０４６-５０２）を製造者のプロトコール（Miltenyi Biotech）に従って使用してＮＫ細胞を精製した。ＮＫ細胞をＭＡＣＳバッファーで２ｘ１０６細胞／ｍＬまで希釈した。
アッセイ培地（グリシンなしのＦ１２／ＤＭＥＭ５０：５０、１ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー、ｐＨ７．２、ペニシリン／ストレプトマイシン（１００単位／ｍＬ；Ｇｉｂｃｏ）、グルタミン、及び１％熱不活化仔ウシ血清）中の抗体の連続希釈物（０．０５ｍＬ）を、９６ウェルの丸底組織培養プレートに加えた。ＷＩＬ２-Ｓ細胞をアッセイバッファーで４ｘ１０５／ｍＬの濃度まで希釈した。ＷＩＬ２-Ｓ細胞（ウェル当たり０．０５ｍＬ）を９６ウェルプレート中で希釈抗体と混合し、室温で３０分間、インキュベートしてＣＤ２０への抗体の結合を可能にした（オプソニン作用）。
【０１４０】
各ウェルに０．１ｍＬのＮＫ細胞を添加してＡＤＣＣ反応を開始させた。コントロールウェルでは、２％のトリトンＸ-１００を添加した。ついで、プレートを３７℃で４時間インキュベートした。放出されたＬＤＨのレベルを、細胞傷害性（ＬＤＨ）検出キット（キット番号1644793, Roche Diagnostics, Indianapolis, Indiana）を製造者のプロトコールに従って使用して測定した。０．１ｍＬのＬＤＨ展開液を各ウェルに加えた後、１０秒間混合した。ついで、プレートをアルミフォイルで覆い、室温で１５分暗室でインキュベートした。ついで、４９０ｎｍでの光学密度を読み取り、コントロールウェル中で測定した全ＬＤＨで割ることによって溶解％を計算するために使用した。溶解を抗体濃度の関数としてプロットし、４変数曲線フィッティング（KaleidaGraph）を用いてＥＣ５０濃度を決定した。
結果は、ヒト化２Ｈ７抗体がＡＤＣＣに活性があり、ｖ.３１に対してはリツキサン(登録商標)の２０倍強い相対作用強度で、ｖ.１６に対してはリツキサン(登録商標)より５倍強く、ｖ.７３に対してはリツキサン(登録商標)よりほぼ４倍強い。
【０１４１】
表１１．ｎ回の実験に基づいて２Ｈ７.ｖ１６と比較したＷＩＬ２-Ｓ細胞に対する２Ｈ７抗体のＡＤＣＣ活性。（＞１の値は２Ｈ７.ｖ１６より低い作用強度を示し、＜１の値はより大なる強度を示す。）
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更なるＡＤＣＣアッセイを実施してリツキサン(登録商標)と２Ｈ７の組み合わせ変異体を比較した。これらのアッセイの結果は、２Ｈ７.ｖ１１４及び２Ｈ７.ｖ１１５がリツキサン(登録商標)と比較して＞１０倍の改善されたＡＤＣＣ作用強度を有することを示している（表１２）。
【０１４２】
表１２．ｎ回の実験に基づいてリツキサン(登録商標)と比較したＷＩＬ２-Ｓ細胞に対する２Ｈ７抗体のＡＤＣＣ活性（＞１の値はリツキサン(登録商標)より低い作用強度を示し、＜１の値はより大なる強度を示す）。
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【０１４３】
実施例１０
カニクイザルにおけるパイロット試験での２Ｈ７変異体のインビボ効果
ＣＨＯ細胞の一過性トランスフェクションによって産生下２Ｈ７変異体を、そのインビボ活性を評価するために正常な雄カニクイ(Macaca fascicularis)ザルにおいて試験した。Ｃ２Ｂ８（リツキサン(登録商標)）のような他の抗ＣＤ２０抗体は、正常な霊長類においてＢ細胞を枯渇させる能力が証明されている（Reff等, Blood 83: 435-445 (1994)）。
一試験では、ヒト化２Ｈ７変異体を比較した。平行した試験では、リツキサン(登録商標)もまたカニクイザルにおいて試験された。４匹のサルを５つの用量群のそれぞれに使用した：（１）ビヒクル、（２）０．０５ｍｇ／ｋｇのｈｕ２Ｈ７.ｖ１６、（３）１０ｍｇ／ｋｇのｈｕ２Ｈ７.ｖ１６、（４）０．０５ｍｇ／ｋｇのｈｕ２Ｈ７.ｖ３１、及び（５）１０ｍｇ／ｋｇのｈｕ２Ｈ７.ｖ３１。抗体は、試験の１日目に一用量と８日目にもう一用量の全二用量に対して、０、０．２、又は２０ｍｇ／ｍＬの濃度で静脈内投与した。投薬の最初の日を１日目とし、その前の日を−１日と標記する；回復の最初の日（各群２匹の動物に対して）は１１日と標記する。血液試料を−１９、−１２、１（投薬前）日、及び最初の投薬後６時間、２４時間、及び７２時間で収集した。更なる試料を８日目（投薬前）、１０日目（２動物／群の屠殺前）、及び３６日及び６７日目（回復動物に対して）に採取した。
末梢Ｂ細胞濃度を、ＣＤ３−／ＣＤ４０＋細胞を計数するＦＡＣＳ法によって定量した。サル試料中における全リンパ球のＣＤ３−ＣＤ４０＋細胞の割合（パーセント）を次のゲーティング方法によって得た。前方散乱／側方散乱散乱図上にリンパ球集団をマークして領域１（Ｒ１）を決めた。Ｒ１での事象を使用して、ＣＤ４０及びＣＤ３マーカーに対して蛍光強度ドットプロットを表示した。蛍光的に標識した同位元素コントロールを用いて、ＣＤ４０及びＣＤ３陽性の各カットオフ点を決定した。
【０１４４】
結果は、２Ｈ７.ｖ１６と２Ｈ７.ｖ３１の双方が１０ｍｇ／ｋｇ用量で完全な末梢Ｂ細胞枯渇を、また０．０５ｍｇ／ｋｇ用量で部分的な末梢Ｂ細胞枯渇を生じさせることができたことを示している（図１１）。投薬の最初の７２時間の間に測定されたＢ細胞枯渇の時間経過と程度は二つの抗体に対して同様であった。回復動物の続く分析は、２Ｈ７.ｖ３１で処置した動物が２Ｈ７.ｖ１６を投薬したものと比較してＢ細胞の長い枯渇を示したことを示している。特に、１０ｍｇ／ｋｇの２Ｈ７.ｖ１６で処置した回復動物は１０日目と３６日目の間のある時に実質的なＢ細胞回復を示した。しかしながら、１０ｍｇ／ｋｇの２Ｈ７.ｖ３１で処置した回復動物では、３６日目と６７日目の間のある時にならないとＢ細胞は回復を示さなかった（図１１）。これは、２Ｈ７.ｖ１６と比較して２ｈ７.Ｖ３１の場合に約一ヶ月完全な枯渇の期間が長くなることを示唆している。
低又は高用量でサルの試験では毒性は観察されず、全体的な症状は正常であった。他の試験では、ｖ１６はこれらのサルで２週間あけて２用量を静脈内投与した後（１００ｍｇ／ｋｇｘ２＝１２００ｍｇ／ｍ２ｘ２）の最も高い用量まで耐容性が良好であった。
２Ｈ７.ｖ１６対リツキサン(登録商標)のカニクイザルにおけるデータは、ＣＤＣ活性の５倍の減少が作用強度には悪影響を及ぼさないことを示唆している。強力なＡＤＣＣ活性を持つが減少したＣＤＣ活性の抗体は、大なるＣＤＣ活性を持つものよりも最初の注入反応に対して好ましい安全性状を有しうる。
【０１４５】
実施例１１
亢進したエフェクター機能を持つフコース欠損２Ｈ７変異体抗体
正常なＣＨＯ及びＨＥＫ２９３細胞はＩｇＧオリゴ糖に高度に（９７−９８％）フコースを添加する。血清からのＩｇＧがまた高度にフコシル化される。
フコシル化適格性であるジヒドロ葉酸レダクターゼマイナス（ＤＨＦＲ−）ＣＨＯ細胞株のＤＰ１２と、タンパク質フコシル化に欠損がある細胞株のＬｅｃ１３を用いてこの試験の抗体を産生した。ＣＨＯ細胞株Ｐｒｏ-Ｌｅｃ１３.６ａ（Ｌｅｃ１３）を、イェシーバ大学のアルバートアインシュタイン医科カレッジのパメラ・スタンレー教授から取得した。親株はＰｒｏ−（プロリン栄養要求株）及びＧａｔ−（グリシン、アデノシン、チミジン栄養要求株）である。ＣＨＯ-ＤＰ１２細胞株はＣＨＯ-Ｋ１細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ-６１）の誘導体であり、これはジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損であり、インスリンに対する要求は低い。細胞株は、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ法(Qiagen, Valencia, CA)を使用してｃＤＮＡを形質移入した。形質移入した抗体を発現するＬｅｃ１３細胞の選択は、１０％の不活化ＦＢＳ(GIBCO)、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、及び１Ｘのペニシリン／ストレプトマイシン(GIBCO)を補填したＬ-グルタミン、リボヌクレオシド及びデオキシリボヌクレオシド(GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD)を含むＭＥＭアルファ培地を含む成長培地中１０μｇ／ｍｌで、ピューロマイシン二塩酸塩(Calbiochem, San Diego, CA) を使用して実施した。ＣＨＯ細胞を同様に、５％のＦＢＳ(GIBCO)、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＬ-グルタミン、１ＸのＧＨＴ（グリシン、ヒポキサンチン、チミジン）、及び１Ｘのペニシリン／ストレプトマイシンを補填したＮａＨＣＯ３を伴いグリシンを伴わない低グルコースＤＭＥＭを含むＧＨＴなしのハムＦ１２を含む成長培地で選択された。
コロニーは２ないし３週間以内に形成され、増殖とタンパク質発現のためにプールした。細胞プールを、小バッチタンパク質発現のために３ｘ１０６細胞／１０ｃｍプレートで最初に播種した。細胞は、それらが９０−９５％の集密度まで成長したところで無血清培地に転換し、３−５日後に細胞の上清を収集し、ＦｃＩｇＧ-及び無傷ＩｇＧ-ＥＬＩＳＡで試験してタンパク質の発現レベルを推定した。１０ｍｇ／Ｌの組換えヒトインスリン及び１ｍｇ／Ｌの微量元素を補填したＰＳ２４生産培地への転換の一日前に約８ｘ１０６細胞／１５ｃｍプレートでＬｅｃ１３及びＣＨＯ細胞を播種した。
【０１４６】
Ｌｅｃ細胞及びＤＰ１２細胞は３−５日間、無血清生産培地に残したままとした。上清を収集し、１５０ｍｌのコニカルチューブで遠心分離によって透明にし、細胞及び細胞片を除去した。プロテアーゼ阻害剤のＰＭＳＦとアプロチニン（Sigma, St. Louis, MO）を添加し、上清を、プロテインＧクロマトグラフィー（Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）を使用する即座の精製の前にＭＷＣＯ３０フィルター（Amicon, Beverly, MA）を用いて撹拌細胞で５倍に濃縮した。全てのタンパク質を、Centripriep-30濃縮器（Amicon）を使用してリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にバッファー交換し、ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって分析した。タンパク質濃度はＡ２８０を使用して定量し、アミノ酸組成分析を使用して証明した。
ＣＨＯ細胞を、ヒト化２Ｈ７ｖ１６，２Ｈ７ｖ.３１を発現するベクターでトランスフェクトし、記載されたようにして選択した。２Ｈ７ｖ.１６抗体は野生型Ｆｃ領域を保持する一方、ｖ．３１（実施例５、上の表７を参照）は、３のアミノ酸変化がなされた（Ｓ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ）Ｆｃ領域を有しており、ＦｃγＲＩＩＩａレセプターに対して高い親和性を生じる（Ｓｈｉｅｌｄｓ等 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（９）：６５９１−６６０４（２００１））。トランスフェクションと選択に続いて、個々の細胞コロニーを単離し、タンパク質の発現レベルの評価をし、最も高い発現体をネトトレキセートでの選択にかけて、プラスミドコピー数を増大させ、高レベルの抗体を産生した細胞を選択した。細胞を成長させ、７日の期間、無血清培地に移した後、培地を収集し、プロテインＡカラムに充填し、標準的な方法を使用して抗体を溶出させた。抗体の最終濃度を、無傷の抗体を測定するＥｌｉｓａを使用して定量した。全てのタンパク質を、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｉｅｐ-３０濃縮器（Amicon）を用いてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にバッファー交換し、ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって分析した。
【０１４７】
アスパラギン結合オリゴ糖のマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法：  Ｎ結合オリゴ糖は、Papac et al., Glycobiology 8, 445-454 (1998)の方法を使用して組換え糖タンパク質から放出された。簡単に説明すると、９６ウェルＰＶＤＦ-裏打ちマイクロタイタープレート（Millipore, Bedford, MA）を、ミリポア・マルチスクリーン真空マニフォールドに真空を適用することによってＰＤＶＦ膜を通して吸引した１００μｌメタノールで条件化した。条件化ＰＶＤＦ膜を３Ｘ２５０μｌ水で洗浄した。全ての洗浄工程間に、ウェルを、マニフォールドに穏やかな真空をかけることによって完全に液抜きした。膜を、６Ｍ塩酸グアニジン、３６０ｍＭのトリス、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．６からなる還元及びカルボキシメチル化バッファー（ＲＣＭ）で洗浄した。糖タンパク質試料（５０μｇ）を個々のウェルに適用し、穏やかな真空をかけてＰＶＤＦ膜を通して再び吸引し、ウェルを２Ｘ５０μｌのＲＣＭバッファーで洗浄した。固定化した試料を、各ウェルに５０μｌの０．１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）溶液に添加し、３７℃で１時間マイクロタイタープレートをインキュベートすることにより還元した。ＤＴＴを真空で除去し、ウェルを４ｘ２５０μｌ水で洗浄した。システイン残基を、１ＭのＮａＯＨで新しく調製しＲＣＭバッファーで０．１Ｍまで希釈した５０μｌの０．１Ｍのヨード酢酸（ＩＡＡ）を添加してカルボキシメチル化した。カルボキシメチル化は雰囲気温度で暗室にて３０分間インキュベーションを行うことによって達成した。真空をプレートにかけてＩＡＡ溶液を除去し、ウェルを４ｘ２５０μｌの純水で洗浄した。ＰＶＤＦ膜を、１００μｌの１％ＰＶＰ３６０（ポリビニルピロリドン、分子量３６００００）（Sigma）溶液を添加し、雰囲気温度で１時間インキュベーションすることによりブロックした。ＰＶＰ-３６０溶液を穏やかな真空で除去し、ウェルを４ｘ２５０μｌの水で洗浄した。１０ｍＭトリスアセテート、ｐＨ８．４中２５μｌの２５単位／ｍｌ溶液のＰＮＧａｓｅＦ（New England Biolabs, Beverly, MA）消化液を各ウェルに加え、３７℃で３時間、消化を進めた。消化後、試料を５００μｌのエッペンドルフチューブに移し、各試料に２．５μｌＬの１．５Ｍ酢酸溶液を加えた。酸性化試料を雰囲気温度で３時間インキュベートし、オリゴ糖をグリコシルアミンからヒドロキシル形態に転換した。ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ質量スペクトル分析の前に、放出されたオリゴ糖を、コンパクトな反応チューブ（US Biochemical, Cleveland, OH）中に充填したスラリー化された陽イオン交換樹脂（水素形態のＡＧ５０Ｗ-Ｘ８樹脂）（Bio-Rad, Hercules, CA）の０．７ｍｌ床を使用して脱塩した。
【０１４８】
ポジティブモードでの試料のＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ質量スペクトル分析では、脱塩オリゴ糖（０．５μｌアリコート）を、１ｍｌのエタノール／１０ｍＭ塩化ナトリウム１：１（ｖ／ｖ）中で２ｍｇの２,５ジヒドロキシ安息香酸を０．１ｍｇの５-メトキシスリサイリック(methoxyslicyic)酸で溶解することによって調製した０．５μｌの２,５ジヒドロキシ安息香酸マトリックス（ｓＤＨＢ）と共に染色なしの標的に適用した。試料／マトリックス混合物を真空乾燥した。ネガティブモードでの分析のために、脱塩Ｎ結合オリゴ糖（０．５μｌアリコート）を、１：３（ｖ／ｖ）アセトニトリル／１３．３ｍＭクエン酸アンモニウムバッファー中で調製した０．５μｌの２',４',６'-トリヒドロキシアセトフェノンマトリックス（ＴＨＡＰ）と共に染色なしの標的に適用した。試料／マトリックス混合物を真空乾燥した後、分析前に大気水分を吸収させた。放出されたオリゴ糖をPerSeptive BioSystems Voyager-DE質量分析計でのＭＡＬＤＩ-ＴＯＦによって分析した。質量分析計を線形構成のポジティブ又はネガティブモードの何れかで遅延型抽出を使用して２０ｋＶで操作した。データは、信号雑音比を改善するためにデータ加算モード（２４０スキャン）で１３００のレーザー出力を用いて獲得した。機器を標準オリゴ糖の混合物を用いて較正し、質量をあてがう前に１９点のＳａｖｉｔｓｋｙ-Ｇｏｌａｙアルゴリズムを使用して平滑化した。質量スペクトルデータの積分をＣａｅｓａｒ７．０データ解析ソフトパッケージ（SciBridge Software）を使用して達成した。
【０１４９】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞抗体依存性細胞傷害アッセイ。
ＡＤＣＣアッセイは実施例９に記載されたようにして実施した。標識細胞（ＷＩＬ２-Ｓ）に対するＮＫ比は１対４であり、アッセイを４時間実施し、毒性をラクトースデヒドロゲナーゼアッセイを使用して前のようにして測定した。標的細胞を、ＮＫ細胞の添加の前に３０分間、示した抗体濃度でオプソニン化した。使用したリツキサン(登録商標)抗体はジェネンテック（S. San Francisco, CA）からのものであった。図１２は代表的なＡＤＣＣアッセイの結果を示す。
結果は、低フコシル化抗体が、フコースの完全な補体を持つ抗体よりもより効果的にＮＫ細胞標的細胞死滅を媒介することを示している。低フコシル化抗体２Ｈ７ｖ.３１が標的細胞死滅の媒介に最も効果的である。この抗体は低濃度で効果的であり、他の抗体より高い濃度で、より大なる割合の標的細胞の死滅を媒介することができる。抗体の活性は次の通りである：Ｌｅｃ１３誘導２Ｈ７ｖ３１＞Ｌｅｃ１３誘導２Ｈ７ｖ１６＞Ｄｐ１２誘導２Ｈ７ｖ３１＞Ｄｐ１２誘導２Ｈ７ｖ１６＞又は＝リツキサン。タンパク質及び糖鎖改変が相加的である。Ｌｅｃ１３産生及びＣＨＯ産生ＩｇＧから天然ＩｇＧに見出された糖鎖の比較では、ガラクトシル化の度合いに有意な差異を示しておらず、よってこの結果はフコースの存在／不存在のみに帰する可能性がある。
【０１５０】
実施例１２
インビボでの亢進したＡＤＣＣを示すフコース欠損２Ｈ７変異体抗体
この実施例は、ヒトＣＤ[ＦｃＲγＩＩＩ]とヒトＣＤ２０を発現するマウスにおける、ＤＰ１２中で産生された正常なフコシル化対応物と比較した場合のＬｅｃ１３中で産生されたｖ.１６及びｖ.３１を含むフコース欠損ヒト化２Ｈ７変異体のインビボでのＡＤＣＣ活性を記載する。
ｈｕＣＤ２０Ｔｇ＋ｈｕＣＤ１６Ｔｇ＋ｍＣＤ１６−／−マウスの産生
ヒトＣＤ２０トランスジェニックマウスをヒトＣＤ２０ＢＡＣ ＤＮＡ（Invitrogen, Carlsbad, CA）から産生した。ヒトＣＤ２０の発現のＦＡＣＳ分析に基づいてマウスをスクリーニングした。ついで、ＨｕＣＤ２０Ｔｇ＋マウスをｈｕＣＤ１６Ｔｇ＋ｍＣＤ１６−／−マウスと交雑させて、ｈｕＣＤ２０Ｔｇ＋ｈｕＣＤ１６Ｔｇ＋ｍＣＤ１６−／−マウスを産生した。
インビトロ処置
２Ｈ７変異体又はリツキサン(登録商標)のそれぞれを１０から１００ｍｇ、腹腔内注射によって、ｈｕＣＤ２０Ｔｇ＋ｈｕＣＤ１６Ｔｇ＋ｍＣＤ１６−／−マウスに投与する。等量のアイソタイプの一致した抗体を動物のネガティブコントロール群に同様に適用する。
【０１５１】
マウスリンパ球の調製
全血、脾臓、リンパ節及び骨髄からのマウスリンパ球を、“Current Protocols in Immunology, edited by John Coligan, Ada Kruisbeek, David Margulies, Ethan Shevach and Warren Strober, 1994”に記載された標準的なプロトコールに従って調製する。
ＦＡＣＳ分析
５０万の細胞を洗浄し、５μｌの染色又はコントロール抗体を含む１％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水であるＦＡＣＳバッファー１００μｌに再懸濁させる。アイソタイプコントロールを含む全ての染色抗体は、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡから取得する。ヒトＣＤ２０の発現を、ＦＩＴＣ結合抗ヒトＩｇＧ１二次抗体と共にリツキサン(登録商標)で染色することによって評価する。ＦＡＣＳ分析を、ＦＡＣＳｃａｎ及びＣｅｌｌ Ｑｕｅｓｔ（Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA）を使用して実施する。全てのリンパ球は前方及び側方光散乱で定義される一方、全てのＢリンパ球は細胞表面上のＢ２２０の発現で定義される。
Ｂ細胞枯渇及び回復は、注入後の最初の週について毎日の基準でとその後の毎週基準で脾臓、リンパ節及び骨髄において末梢Ｂ細胞カウントを分析しｈＣＤ２０＋Ｂ細胞をＦＡＣＳによって分析することによって評価する。注入された２Ｈ７変異体抗体の血清レベルをモニターする。
インビボアッセイでのこの結果は、野生型（フコシル化に関して）グリコシル化対応物に対するフコース欠損２Ｈ７変異体の増加したＡＤＣＣ活性及びＢ細胞枯渇に対するインビトロでの知見を確認する。
【０１５２】
実施例１３
アポトーシス活性
リツキサン(登録商標)を含む抗ＣＤ２０抗体は二次抗体又は化学的手段によって架橋されると、インビトロでアポトーシスを誘導することが示されている(Shan等, Blood 9:1644-1652 (1998); Byrd等, Blood 99:1038-43 (2002); Pederson等, Blood 99:1314-19 (2002))。化学的に架橋すると、マウス２Ｈ７二量体はＤａｕｄｉ細胞のアポトーシスを誘導した(Ghetie等, Proc Natl Acad Sci USA 94:7509-14 (1997))。二次抗体での架橋はマウス２Ｈ７抗体でのアポトーシスを誘導した(Shan等, 1998)。これらの活性は、様々な作用機序がインビボでの細胞表面ＣＤ２０に結合した抗ＣＤ２０抗体の架橋を生じうるので、生理学的に関連していると考えられる。
ＲｈｕＭＡｂ２Ｈ７.ｖ１６［ヒト化２Ｈ７ｖ１６；ＲｈｕＭＡｂは組換えヒトモノクローナル抗体の略である］及びリツキサン(登録商標)を、二次架橋抗体を用いてインビトロでのアポトーシスアッセイで比較した。ＣＤ２０を発現するヒトＢリンパ球細胞株であるＲａｍｏｓ細胞（ＣＲＬ-１５９６，ＡＴＣＣ，Manassas,VA）を用いて、アネキシンＶ染色とプロピジウムヨウ素色素排除(Vybrant(登録商標)アポトーシスアッセイキット, Molecular Probes, Seattle, WA)によって測定したアポトーシスを誘導する、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体ｒｈｕＭＡｂ２Ｈ７.ｖ１６及びリツキシマブ対ネガティブコントロール抗体のトラスツズマブ(ハーセプチン（登録商標）、ジェネンテック, South San Francisco, CA）の能力を測定した。Ｒａｍｏｓ細胞を、１０％仔ウシ血清（Biosource International, Camarillo, CA）及び２ｍＭのＬ-グルタミン（Gibco）を含むＲＰＭＩ-１６４０培地（Gibco, Rockville, MD）で培養した。アッセイの前に、細胞を新鮮培地で２回洗浄した後、ｍＬ当たり２Ｘ１０６の細胞濃度に調節した。細胞（１５０ｍＬ）を、１５０ｍＬの予め定まった量のコントロールＩｇＧ１、ｒｈｕＭＡｂ２Ｈ７.ｖ１６、又はリツキシマブを、Ｆ(ａｂ)'２ヤギ抗ヒトＦｃ（Pierce Biotechnology, Rockford, IL）と共に含む９６ウェルアッセイプレート（Ｂecton Dickinson, Palo Alto, CA）に加えた。最終ＩｇＧ濃度は１００、１０、１．０、０．１、０．０１及び０．００１ｎＭであり、Ｆ(ａｂ)'２ヤギ抗ヒトＦｃ抗体濃度は各試料抗体濃度の２倍に設定した。各希釈物は３組用意した。３７℃で２４時間インキュベーションした後、細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、アネキシンＶ及びプロピジウムヨウ素で製造者の推奨に従って染色した。Ｒａｍｏｓ細胞の染色パターンをＦＡＣｓｃａｎフローサイトメーター（Becton Dickinson, San Jose, CA）を使用してフローサイトメトリーによって分析し、データを１０秒間収集した。データをCellquest Proソフトウェア（Becton Dickinson）を使用して減らした。（１）アネキシンＶ染色、（２）アネキシンＶ及びプロピジウムヨウ素二重染色に対して陽性であったＲａｍｏｓ細胞と、（３）未染色生存細胞の数をカウントし、KaleidaGraphソフトウェア（Synergy Software, Reading, PA)を使用してプロットした。
ｒｈｕＭＡｂ２Ｈ７.ｖ１６及びリツキシマブは、無関係なＩｇＧ１コントロール抗体と比較して、抗ヒトＦｃで架橋された場合に、Ｒａｍｏｓ細胞のアポトーシスを誘導した（図１３−１５）。（ｒｈｕＭＡｂ２Ｈ７）のアポトーシス活性はリツキシマブのものより僅かに低かった。１０ｎＭ濃度の架橋ｒｈｕＭＡｂ２Ｈ７、リツキシマブ、及びコントロールＩｇＧ１抗体の場合に、アネキシンＶ染色細胞の画分はそれぞれ１８．５、１６．５、２．５％であり、二重に標識された細胞の画分は２９、３８、及び１６％であり、１０秒当たりに計数した生存細胞数は５２００、３１００、及び８６００であった。
これらのインビトロのデータは、アポトーシスがインビボでのＢ細胞枯渇の一つの潜在的な機構であることを裏付けている。細胞表面ＣＤ２０に結合したｒｈｕＭＡｂ２Ｈ７又はリツキシマブのインビボでの架橋は免疫エフェクター細胞の表面上のＦｃγＲを通して生じうる。
【０１５３】
実施例１４
腫瘍成長のインビボでの抑制
ＲａｊｉヒトＢ細胞のリンパ腫細胞株（ＡＴＣＣ ＣＣＬ８６）の成長を阻害するｒｈｕＭＡｂ２Ｈ７.ｖ１６の能力をＢａｌｂ／ｃヌード（胸腺欠損）マウスで評価した。Ｒａｊｉ細胞はＣＤ２０を発現し、ヌードマウスに成長し、転移性疾患を生じると報告されている；腫瘍成長はリツキサン(登録商標)によって阻害される（Ｃｌｙｎｅｓ等， Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６，  ４４３−４４６  （２０００））。５６匹の８−１０週齢のＢａｌｂ／ｃヌードマウスを、各群が８匹のマウスからなる７群（Ａ−Ｇ）に分けた。０日目に、各マウスは側部に５ｘ１０６のＲａｊｉＢリンパ腫細胞の皮下注射を受けた。０日目に始まって、各マウスは１００ｕＬのネガティブコントロール液（ＰＢＳ；リン酸緩衝生理食塩水）、リツキサン(登録商標)又は２Ｈ７.ｖ１６の何れかを受けた。投薬量は体重に依存し、薬剤送達は尾静脈を経る静脈内であった。Ａ群のマウスはＰＢＳを受けた。Ｂ−Ｄ群はリツキサン(登録商標)を、それぞれ５．０ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、及び０．０５ｍｇ／ｋｇで受けた。Ｅ−Ｇ群のマウスは２Ｈ７ｖ.１６をそれぞれ５．０ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、及び０．０５ｍｇ／ｋｇで受けた。注射は６週間の間、毎週繰り返した。処置の間、毎週の間隔で、各マウスにつき、注射部位での明白な腫瘍の存在を検査し、存在した場合には腫瘍体積を測定し記録した。最終検査は８週目に行った（処置なしの２週の間隔後）。
この試験の結果は、ｒｈｕＭＡｂ２Ｈ７.ｖ１６とリツキサン(登録商標)の両方がヌードマウスにおいて皮下Ｒａｊｉ-細胞腫瘍成長の阻害に効果的であったことを示している（図１６−１８）。腫瘍成長は４週目に始まりＰＢＳコントロール群で観察された。しかしながら、８週の試験の間、５ｍｇ／ｋｇ又は０．５ｍｇ／ｋｇのリツキサン(登録商標)又は２Ｈ７.ｖ１６で処置した群には腫瘍は観察されなかった。０．０５ｍｇ／ｋｇの低用量処置群では、２Ｈ７群の一匹の動物に、リツキサン(登録商標)群の一匹の動物に腫瘍が観察された（図１８）。
【０１５４】
実施例１５
カニクイザルＣＤ２０のクローニングと抗体結合
カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）のＣＤ２０ＤＮＡ配列を、カニクイザル脾臓ｃＤＮＡライブラリーからＣＤ２０をコードするｃＤＮＡの単離の際に決定した。ｃＤＮＡ合成及びプラスミドクローニングのＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＭプラスミド系（カタログ番号１８２４８-０１３，Invitrogen, Carlsbad, CA）を僅かに変更して用いてライブラリーを構築した。ｃＤＮＡライブラリーを制限部位ＸｈｏＩ−及びＮｏｔＩを使用してｐＲＫ５Ｅベクター中にライゲーションさせた。ｍＲＮＡは脾臓組織（California Regional Research Primate Center, Davis, CA）から単離された。ＣＤ２０をコードするｃＤＮＡを増幅するプライマーはヒトＣＤ２０の非コード化配列に基づいて設計した。Ｎ末端領域プライマー５'-ＡＧＴＴＴＴＧＡＧＡＧＣＡＡＡＡＴＧ-３'及びＣ末端領域プライマー５'-ＡＡＧＣＴＡＴＧＡＡＣＡＣＴＡＡＴＧ-３'を用い、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってカニクイザルＣＤ２０をコードするｃＤＮＡをクローニングした。ＰＣＲ反応はＰｌａｔｉｎｕｍ・Ｔａｑ・ＤＮＡポリメラーゼ・高フィデリティを使用して製造者の推奨に従って（Gibco, Rockville, MD）実施した。ＰＣＲ産物をｐＣＲ(登録商標)２.１-ＴＯＰＯ(登録商標)ベクター（Invitrogen）にサブクローニングし、ＸＬ-１ブルー大腸菌（Stratagene. La Jolla, CA）中に形質転換した。結合したＰＣＲ産物を含むプラスミドＤＮＡを個々のクローンから単離し、配列決定した。
カニクイザルＣＤ２０のアミノ酸配列は図１９に示す。図２０はカニクイザル及びヒトＣＤ２０の比較を示す。カニクイザルＣＤ２０はヒトＣＤ２０と９７．３％類似で、８の差がある。細胞外ドメインはＶ１５７Ａに一つの変化を含む一方、残りの７残基は細胞質又は膜貫通領域に見出すことができる。
【０１５５】
ヒトＣＤ２０に対する抗体について、ＣＤ２０を発現するカニクイザル細胞に結合しＦＩＴＣ結合マウス２Ｈ７の結合を置換する能力をアッセイした。２０ミリリットルの血液を２匹のカニクイザル(California Regional Research Primate Center, Davis, CA)から抜き取ってヘパリンナトリウム中に入れジェネンテック・インクに直接送った。同じ日に、血液試料をプールし、４０ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を加えて１：１で希釈した。２０ｍｌの希釈した血液を５０ｍｌのコニカルチューブ (カタログ番号352098, Falcon, Franklin Lakes, NJ)中で４ｘ２０ｍｌのＦｉｃｏｌｌ-ＰａｑｕｅＴＭＰｌｕｓ(Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)上に層状に加え、Ｓｏｒｖａｌ７遠心分離器(Dupont, Newtown, CT)で３０分間室温にて１３００ｒｐｍで遠心分離した。ＰＢＭＣ層を単離し、ＰＢＳで洗浄した。赤血球を０．２％ＮａＣｌ溶液に溶解させ、等価容積の１．６％のＮａＣｌ溶液で等張に回復させ、１０００ＲＰＭで１０分間、遠心分離した。ＰＢＭＣペレットを、５％仔ウシ血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０(Gibco,  Rockville, MD)に再懸濁させ、３７℃で１時間、１０ｃｍの組織培養皿に分配した。非付着性Ｂ及びＴ細胞集団を吸引により取り除き、遠心分離し、計数した。全体で２．４ｘ１０７細胞が回収された。再懸濁させたＰＢＭＣを２０の１２ｘ７５ｍｍ培養チューブ(カタログ番号352053, Falcon)中に分配した。各チューブは０．２５ｍｌの容積中に１ｘ１０６細胞を含む。チューブを４組の５本のチューブに分けた。各組に、培地（ＲＰＭＩ１６４０、５％ＦＢＳ）、滴定量のコントロールヒトＩｇＧ１抗体、リツキサン(登録商標)、２Ｈ７.ｖ１６、又は２Ｈ７.ｖ３１の何れかを加えた。各抗体の最終濃度は３０、１０、３．３及び１．１ｎＭであった。また、各チューブには２０ｕｌのフルオレッセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合抗ヒトＣＤ２０(カタログ番号555622, BD Biosciences, San Diego, CA)を入れた。細胞を穏やかに混合し、氷上で１時間インキュベートした後、非標識ＰＢＳで２回洗浄した。細胞表面染色をEpic XL-MCL (Coulter, Miami, FL)で分析し、得られた幾何学的平均値を、抗体濃度に対してプロットした(KaleidaGraphTM, Synergy Software, Reading, PA)。
図２１のデータは、２Ｈ７ｖ.１６と２Ｈ７ｖ.３１がカニクイザル細胞へのＦＩＴＣ-マウス２Ｈ７の結合を競合的に排除したことを示している。更に、リツキサン(登録商標)もまたＦＩＴＣ-マウス２Ｈ７の結合を排除し、よって、２Ｈ７とリツキサン(登録商標)の双方がＣＤ２０上の重複するエピトープに結合することを裏付けている。また、データは、２Ｈ７ｖ.１６、２Ｈ７ｖ．３１及びリツキサンに対するＩＣ５０値が同様で、４−６ｎＭの範囲に入ることを示している。
【０１５６】
実施例１６
中程度から重症の関節リウマチにおけるｒｈｕＭＡｂ２Ｈ７（２Ｈ７.ｖ１６）のＩ／ＩＩ相治験
プロトコール概要
安定した用量の併用メトトレキセートを受ける中程度ないし重症の関節リウマチの患者におけるＰＲＯ７０７６９（ｒｈｕＭＡｂ２Ｈ７）の増大用量の安全性に関する無作為プラシーボ対照、多施設、盲式Ｉ／ＩＩ相治験。
目的
この試験の主要な目的は中程度ないし重症の関節リウマチの患者におけるＰＲＯ７０７６９（ｒｈｕＭＡｂ２Ｈ７）の増大静脈内（ＩＶ）用量の安全性と耐容性を評価することにある。
【０１５７】
研究計画
これは、中程度ないし重症のＲＡの患者におけるＭＴＸと組み合わせてのＰＲＯ７０７６９の増大用量の安全性に関する無作為プラシーボ対照、多施設、盲式Ｉ／ＩＩ期の研究者及び患者盲式治験である。治験は、用量増大相と多数の患者の登録を伴う第二相からなる。スポンサーは治療の指定には加わらなかった。
現在はＭＴＸでの治療には満足できない臨床応答を示す生物又は１ないし５の疾患改変抗リウマチ剤に失敗した中程度から重症のＲＡの患者が登録される。
患者は試験への参加の前に少なくとも１２週の間、毎週１０−２５ｍｇの範囲でＭＴＸを受け、試験薬（ＰＲＯ７０７６９又はプラシーボ）の最初の用量を受ける前に少なくとも４週の間、安定した投薬を受けていることが必要である。患者はまた安定用量の経口コルチコステロイド（毎日１０ｍｇまで又はプレドニゾン等価物）と安定用量の非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を受ける。患者は次の用量増大計画に従って（図２２を参照）１日目と１５日目に示された用量でＰＲＯ７０７６９又はプラシーボ等価物の２回の静脈内注入を受ける。
用量増大は、特定の基準に従って（用量増大規則を参照）、かつ内部の安全性データ審査委員会による安全性データの審査と各コホートで治療された最後の患者への第二の注入の７２時間後の急性毒性の評価の後になされる。用量レベルが用量増大相の間、耐容性があると証明された場合には、用量増大相後に、４０名の更なる患者（３２名は活性及び８名はプラシーボ）を、次の用量レベル：２ｘ５０ｍｇ、２ｘ２００ｍｇ、２ｘ５００ｍｇ、及び２ｘ１０００ｍｇのそれぞれに無作為化する。およそ２０５名の患者を試験に登録する。
Ｂ細胞のカウント数を得て、記録する（試験評価のため、セクション４．５及びアペンディックスＡ-１を参照）。６ヶ月の効果評価を越えて４８週の追跡試験期間にフローサイトメトリーを使用して、細胞カウント数を評価する。Ｂ細胞枯渇は用量制限毒性（ＤＬＣ）とは考えられず、むしろＰＲＯ７０７６９処置の期待される薬物動態学的結果である。
任意のサブ試験において、血清及びＲＮＡ分析のための血液並びに尿試料を様々な時点で患者から得た（セクション３．３．３を参照）。これらの試料を用いて、中程度から重症のＲＡの患者におけるＰＲＯ７０７６９治療への応答の予測となりうる生物マーカーを同定することができる。
【０１５８】
結果判定
この研究の主要な結果判定法は中程度から重症のＲＡの患者におけるＰＲＯ７０７６９の安全性と耐容性である。
【０１５９】
研究治療
患者のコホートは次の増大計画に従って１日目と１５日目に示した用量でＰＲＯ７０７６９又はプラシーボの２回の静脈点滴を受ける。
−  １０ｍｇのＰＲＯ７０７６９又はプラシーボ等価物：４患者活性薬、１コントロール
−  ５０ｍｇのＰＲＯ７０７６９又はプラシーボ等価物：８患者活性薬、２コントロール
−  ２００ｍｇのＰＲＯ７０７６９又はプラシーボ等価物：８患者活性薬、２コントロール
−  ５００ｍｇのＰＲＯ７０７６９又はプラシーボ等価物：８患者活性薬、２コントロール
−  １０００ｍｇのＰＲＯ７０７６９又はプラシーボ等価物：８患者活性薬、２コントロール
【０１６０】
効果
ＰＲＯ７０７６９の効果をＡＣＲ応答によって測定する。ＡＣＲ２０、ＡＣＲ５０及びＡＣＲ７０の応答を達成する患者の割合は治療群によって総括され、９５％の信頼区間が各群に対して生じる。これらの応答の成分とベースラインからのその変化は治療と往診によって総括される。
【０１６１】
結論
上のデータは、その生物学的性質を維持し、亢進さえするヒト化ＣＤ２０結合抗体、特にヒト化２Ｈ７抗体変異体を産生することに成功したことを証明している。本発明のヒト化２Ｈ７抗体はマウスドナー及びキメラ２Ｈ７抗体と同様の親和性でＣＤ２０に結合し、霊長類におけるＢ細胞死滅に効果的であり、Ｂ細胞枯渇を生じる。ある種の変異体は、ＮＨＬを治療するために現在使用されているキメラ抗ＣＤ２０抗体よりも亢進されたＡＤＣＣを示し、患者におけるより低用量の治療抗体の使用を支持する。また、マウスＦＲ残基を持つキメラ抗体はそれに対する抗体応答を取り除くには完全なＢ細胞枯渇を達成するのに効果的な用量で投与されることが必要である場合があるところ、本ヒト化抗体は、特定の疾患及び患者に望ましいように、部分的な又は完全なＢ細胞枯渇を達成する用量で、異なった時間の間、投与することができる。また、これらの抗体は溶液中で安定性を示した。ヒト化２Ｈ７抗体のこれらの性質は、ＣＤ２０陽性癌及び自己免疫疾患の治療における免疫療法剤としての使用にそれを理想的なものにする；これらの抗体は免疫原性であるとは予想されないし又はヒト患者において完全なマウス又はキメラ抗ＣＤ２０抗体よりも免疫原性が少なくとも少ないであろう。
【０１６２】
文献
特許、公開出願及び他の刊行物を含む本願において引用した文献は出典明示によりここに取り込む。
本発明の実施には、特に示さない限り、当業者の技量内にある分子生物学の一般的技法等を用いる。かかる技法は文献に十分に説明されている。例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (J. Sambrook等, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989); Current Protocols in Molecular Biology (F. Ausubel等編, 1987更新); Essential Molecular Biology (T. Brown編, IRL Press 1991); Gene Expression Technology (Goeddel編, Academic Press 1991); Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes (A. Bothwell等編, Bartlett Publ. 1990); Gene Transfer and Expression (M. Kriegler, Stockton Press 1990); Recombinant DNA Methodology II (R. Wu等編, Academic Press 1995); PCR:  A Practical Approach (M. McPherson et al., IRL Press at Oxford University Press 1991); Oligonucleotide Synthesis (M. Gait ed., 1984); Cell Culture for Biochemists (R. Adams等, Elsevier Science Publishers 1990); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. Miller及びM. Calos編, 1987); Mammalian Cell Biotechnology (M. Butler編, 1991); Animal Cell Culture (J. Pollard等編, Humana Press 1990); Culture of Animal Cells, 2版 (R. Freshney等編, Alan R. Liss 1987); Flow Cytometry and Sorting (M. Melamed等編, Wiley-Liss 1990); シリーズMethods in Enzymology (Academic Press, Inc.);Wirth M.及びHauser H. (1993); Immunochemistry in Practice, 3rd edition, A. Johnstone & R. Thorpe, Blackwell Science, Cambridge, MA, 1996; Techniques in Immunocytochemistry, (G. Bullock及びP. Petrusz編, Academic Press 1982, 1983, 1985, 1989); Handbook of Experimental Immunology, (D. Weir及びC. Blackwell編); Current Protocols in Immunology (J.  Coligan等編 1991); Immunoassay (E. P. Diamandis及びT.K. Christopoulos編, Academic Press, Inc., 1996); Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2版) Academic Press, New York; Ed Harlow及びDavid Lane, Antibodies A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1988; Antibody Engineering, 2版(C. Borrebaeck編, Oxford University Press, 1995);及びシリーズAnnual Review of Immunology; シリーズAdvances in Immunologyを参照のこと。
【図面の簡単な説明】
【０１６３】
【図１】図１Ａはマウス２Ｈ７（配列番号１）、ヒト化２Ｈ７．ｖ１６変異型（配列番号２）、およびヒトκ軽鎖サブグループＩ（配列番号３）それぞれの軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列を比較した配列。２Ｈ７およびｈｕ２Ｈ７．ｖ１６のＶＬのＣＤＲは以下の通りである：ＣＤＲ１（配列番号４）、ＣＤＲ２（配列番号５）、およびＣＤＲ３（配列番号６）。ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は示すように大括弧で囲っており、フレームワーク領域に隣接している。図１Ｂはマウス２Ｈ７のＶＨ配列（配列番号７）、ヒト化２Ｈ７．ｖ１６変異型（配列番号８）、および重鎖サブグループＩＩＩのヒトコンセンサス配列（配列番号９）を比較した配列。２Ｈ７のＶＨおよびｈｕ２Ｈ７．ｖ１６のＣＤＲは以下の通りである。ＣＤＲ１（配列番号１０）、ＣＤＲ２（配列番号１１）、およびＣＤＲ３（配列番号１２）。それぞれの鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は示すように大括弧で囲っており、フレームワーク領域に隣接している。２Ｈ７はマウス２Ｈ７抗体を示す。２配列間にあるアステリスクは２配列間で異なる箇所を示す。 Kabat ら, Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)に従って残基番号を示し、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、およびｅで挿入を示す。
【図２Ａ】２Ｈ７Ｆａｂプラスミド（実施例１参照）構築に用いたファージミドｐＶＸ４（配列番号１３）の配列、およびＣＤＲ移植抗ＩＦＮαヒト化抗体のＬ鎖（配列番号１４）およびＨ鎖（配列番号１５）のアミノ酸配列を示す。
【図２Ｂ】２Ｈ７Ｆａｂプラスミド（実施例１参照）構築に用いたファージミドｐＶＸ４（配列番号１３）の配列、およびＣＤＲ移植抗ＩＦＮαヒト化抗体のＬ鎖（配列番号１４）およびＨ鎖（配列番号１５）のアミノ酸配列を示す。
【図２Ｃ】２Ｈ７Ｆａｂプラスミド（実施例１参照）構築に用いたファージミドｐＶＸ４（配列番号１３）の配列、およびＣＤＲ移植抗ＩＦＮαヒト化抗体のＬ鎖（配列番号１４）およびＨ鎖（配列番号１５）のアミノ酸配列を示す。
【図２Ｄ】２Ｈ７Ｆａｂプラスミド（実施例１参照）構築に用いたファージミドｐＶＸ４（配列番号１３）の配列、およびＣＤＲ移植抗ＩＦＮαヒト化抗体のＬ鎖（配列番号１４）およびＨ鎖（配列番号１５）のアミノ酸配列を示す。
【図２Ｅ】２Ｈ７Ｆａｂプラスミド（実施例１参照）構築に用いたファージミドｐＶＸ４（配列番号１３）の配列、およびＣＤＲ移植抗ＩＦＮαヒト化抗体のＬ鎖（配列番号１４）およびＨ鎖（配列番号１５）のアミノ酸配列を示す。
【図３Ａ】キメラ２Ｈ７．ｖ６．８Ｆａｂをコードする発現プラスミドの配列（配列番号１６）を示す。Ｌ鎖（配列番号１７）およびＨ鎖（配列番号１８）のアミノ酸配列を示す。
【図３Ｂ】キメラ２Ｈ７．ｖ６．８Ｆａｂをコードする発現プラスミドの配列（配列番号１６）を示す。Ｌ鎖（配列番号１７）およびＨ鎖（配列番号１８）のアミノ酸配列を示す。
【図３Ｃ】キメラ２Ｈ７．ｖ６．８Ｆａｂをコードする発現プラスミドの配列（配列番号１６）を示す。Ｌ鎖（配列番号１７）およびＨ鎖（配列番号１８）のアミノ酸配列を示す。
【図３Ｄ】キメラ２Ｈ７．ｖ６．８Ｆａｂをコードする発現プラスミドの配列（配列番号１６）を示す。Ｌ鎖（配列番号１７）およびＨ鎖（配列番号１８）のアミノ酸配列を示す。
【図３Ｅ】キメラ２Ｈ７．ｖ６．８Ｆａｂをコードする発現プラスミドの配列（配列番号１６）を示す。Ｌ鎖（配列番号１７）およびＨ鎖（配列番号１８）のアミノ酸配列を示す。
【図４Ａ】実施例１に示すように免疫グロブリン軽鎖の発現のためのプラスミドｐＤＲ１（配列番号１９；５３９１ｂｐ）の配列を示す。ｐＤＲ１は無関係な抗体をコードする配列、ヒト化抗ＣＤ３抗体の軽鎖(Shalabyら, J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992))、太字および下線で開始コドンと終止コドンを示す。
【図４Ｂ】実施例１に示すように免疫グロブリン軽鎖の発現のためのプラスミドｐＤＲ１（配列番号１９；５３９１ｂｐ）の配列を示す。ｐＤＲ１は無関係な抗体をコードする配列、ヒト化抗ＣＤ３抗体の軽鎖(Shalabyら, J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992))、太字および下線で開始コドンと終止コドンを示す。
【図５Ａ】実施例１に記載した免疫グロブリン重鎖を発現するためのプラスミドｐＤＲ２（配列番号２０、６１３５ｂｐ）の配列を示す。ｐＤＲ２は無関係な抗体、ヒト化抗ＣＤ３抗体の重鎖(Shalabyら、上述)をコードする配列を含み、開始コドンおよび終止コドンを太字および下線で示す。
【図５Ｂ】実施例１に記載した免疫グロブリン重鎖を発現するためのプラスミドｐＤＲ２（配列番号２０、６１３５ｂｐ）の配列を示す。ｐＤＲ２は無関係な抗体、ヒト化抗ＣＤ３抗体の重鎖(Shalabyら、上述)をコードする配列を含み、開始コドンおよび終止コドンを太字および下線で示す。
【図６】２Ｈ７．ｖ１６完全Ｌ鎖（配列番号２１）のアミノ酸配列を示す。ＤＩＱ前の初めの１９アミノ酸は成熟ポリペプチド鎖に存在しない分泌シグナル配列である。
【図７】２Ｈ７．ｖ１６完全Ｈ鎖（配列番号２２）のアミノ酸配列を示す。ＥＶＱ前の初めの１９アミノ酸は成熟ポリペプチド鎖に存在しない分泌シグナル配列である。完全Ｈ鎖配列と図１Ｂ（配列番号８）のＶＨ配列比較であり、ヒトγ１定常領域は配列番号２２のアミノ酸１１４−４７１由来である。
【図８】２Ｈ７．ｖ３１完全Ｈ鎖（配列番号２３）のアミノ酸配列を示す。ＥＶＱ前の初めの１９アミノ酸は成熟ポリペプチド鎖に存在しない分泌シグナル配列である。Ｌ鎖は２Ｈ７．ｖ１６と同じである（図６参照）。
【図９】実施例６に示すように２Ｈ７．ｖ１６および２Ｈ７．ｖ７３ＩｇＧ変異体の相対的安定性を示す。アッセイにより、培養前の値に正常化し、培養後維持されることがわかった。
【図１０】マウス２Ｈ７からｖ７５までのヒト化型サブセットへのアミノ酸変異の概略のフローチャートである。
【図１１】実施例１０に示すように、全ての群における絶対的Ｂ細胞の平均値を表に表す[CD3-/CD40+]。（２Ｈ７研究およびリツキサン研究の組合せ）
【図１２】実施例１１に示すように、フコース欠損２Ｈ７変異体の代表的ＡＤＣＣアッセイの結果を示す。
【図１３】酵素濃度の機能をアネキシンＶ染色プロットで表した結果を示す。ラモス細胞を交差結合第二抗体存在下で無関係なＩｇＧ１対照抗体（ハーセプチン（登録商標）；円形）、リツキシマブ（四角）、またはｒｈｕＭＡｂ２Ｈ７．ｖ１６（三角）処理して、ＦＡＣＳにより分析した。図１３−１５は実施例１３に示す。
【図１４】アネキシンＶおよびプロピジウムヨウ素化物二重染色の結果をプロットして酵素濃度の機能として表した。ラモス細胞を交差結合第二抗体存在下で無関係なＩｇＧ１対照抗体（ハーセプチン（登録商標）；円形）、リツキシマブ（四角）、またはｒｈｕＭＡｂ２Ｈ７．ｖ１６（三角）処理して、ＦＡＣＳにより分析した。
【図１５】生細胞数（１０秒当たり）を示し、抗体濃度の機能を非染色細胞をプロットした。ラモス細胞を交差結合第二抗体存在下で無関係なＩｇＧ１対照抗体（ハーセプチン（登録商標）；円形）、リツキシマブ（四角）、またはｒｈｕＭＡｂ２Ｈ７．ｖ１６（三角）処理して、ＦＡＣＳにより分析した。
【図１６】実施例１４に示すように、ヌードマウスにおけるラジ細胞腫瘍成長の抑制を表す。動物に週毎に６週間（縦の矢印で表す；各群ｎ＝８マウス）、ＰＢＳ（対照）またはリツキサン（登録商標）または５ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂ２Ｈ７．ｖ１６で処置を施した。
【図１７】実施例１４に示すように、ヌードマウスにおけるラジ細胞腫瘍成長の抑制を表す。動物に週毎に６週間（縦の矢印で表す；各群ｎ＝８マウス）、ＰＢＳ（対照）またはリツキサン（登録商標）または０．５ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂ２Ｈ７．ｖ１６で処置を施した。
【図１８】実施例１４に示すように、ヌードマウスにおけるラジ細胞腫瘍成長の抑制を表す。動物に週毎に６週間（縦の矢印で表す；各群ｎ＝８マウス）、ＰＢＳ（対照）またはリツキサン（登録商標）または０．０５ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂ２Ｈ７．ｖ１６で処置を施した。
【図１９】実施例１５に示すように、カニクイザルのＣＤ２０のヌクレオチド配列（配列番号＿）およびアミノ酸配列（配列番号＿）を示す。
【図２０】カニクイザルのＣＤ２０のアミノ酸配列を示す。ヒトＣＤ２０と異なる残基に下線をし、ヒト残基をサル残基の下に直接示した。サルＣＤ２０の推定上の細胞外ドメインを太字で示す。
【図２１】実施例１５に示すように、ｈｕ２Ｈ７．ｖ１６、ｖ３１、およびリツキサンに結合するＣＤ２０を発現するカニクイザル細胞の結果を示す。抗体が持つカニクイザルＣＤ２０に結合するＦＩＴＣコンジュゲートマウス２Ｈ７に対する結合および置換能力を分析した。
【図２２】関節リウマチ第Ｉ／ＩＩ臨床試験の用量段階を図解する。
【図２３】ＣＨＯ細胞の２Ｈ７．ｖ１６の発現ベクターを示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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