(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸性多糖を調製する方法であって、
調製される前記酸性多糖は、
ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、およびケラタン硫酸から選択される酸性多糖であって、
繰返し単位中に存在する、カルボキシル基ならびに硫酸基の全てが、酸の形、または、アルカリ金属との塩の形状で存在しており、
酪酸およびギ酸でエステル化された各アルコール基の併存を特徴とし、
ポリマーのヒドロキシル基における、酪酸によるエステル化による置換度が０．０１〜０．２０＊Ｎの間（Ｎは、繰返し単位中に存在する遊離アルコール基の数である）であり、
ポリマーのヒドロキシル基における、ギ酸によるエステル化度が０．０１〜０．２０の間である
但し、酪酸によるエステル化による置換度とギ酸によるエステル化による置換度の合計は、１＊Ｎ以下であり、
前記酪酸によるエステル化による置換度は、前記ギ酸によるエステル化による置換度を下回ることはなく、
前記酸性多糖を調製する方法は、
ａ）ナトリウムまたは他のアルカリ金属との塩を形成した、酸性多糖を加熱によってホルムアミドに溶解させるステップと、
ａ１）ナトリウムまたは他のアルカリ金属との塩の形状の酸性多糖の溶液を、室温まで冷却するステップと、
ａ２）ナトリウムまたは他のアルカリ金属との塩の形状の酸性多糖の溶液に、有機塩基を加えるステップと、
ｂ）得られた溶液に、有機塩基の存在下、室温で酪酸無水物を加えるステップと、
ｃ）均質な粘性の反応混合物をＮａＣｌ水溶液で希釈し、希釈された反応混合物のｐＨをｐＨ６〜７．５に調整するステップと、
ｄ）希釈した反応混合物を透析または接触濾過によって精製するステップと、
ｅ）精製した多糖溶液を凍結させ、凍結乾燥または噴霧乾燥によって生成物を回収するステップと
を含み、
順次、ａ）、ａ１）、ａ２）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）のステップを実施し、
前記有機塩基が、ジメチルアミノピリジンである
ことを特徴とする、酸性多糖の調製方法。
【請求項２】
調製される前記酸性多糖は、
カルボキシル基が酸の形で存在するか、またはナトリウム塩の形とされている
ことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
調製される前記酸性多糖は、
分子量が１０3ダルトン〜１０7ダルトンの範囲から選択される
ことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
調製される前記酸性多糖は、
多糖が、１０4ダルトン〜１０6ダルトンの間の分子量を有するヒアルロン酸である
ことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
多糖のホルムアミドへの可溶化温度が６０℃〜１２０℃の間である
ことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
多糖のホルムアミドへの可溶化温度が、９５℃である
ことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
上記ホルムアミドに溶解された溶液中、ステップｂ）において、
ギ酸エステルが、酪酸無水物および前記有機塩基の存在下でのホルムアミドの分解から生じる
ことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸性多糖の酪酸−ギ酸混合エステル、ギ酸エステルが酪酸無水物および塩基の存在下でホルムアミドから生じる方法によるその調製、透析および凍結乾燥によるその精製および回収、ならびに化粧用および皮膚保護用の弾性強化および保湿物質としてのその使用を開示する。
【背景技術】
【０００２】
現況技術
物理化学的特性および生物学的特性から見て、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）は、人体の特定の範囲で、一般にプロテオグリカンの形で存在して非常に重要な役割を果たしているので、この応用分野において非常に興味深い産物である。前記分子は、多糖鎖がタンパク質に共有結合または非共有結合している場合もある複雑な系である。この分子は、細胞外マトリックスにおけるイオン拡散モジュレーターとしての組織中の水分の調節から、細胞の運動性および他の機能の調節、生殖系への関与から単なる支持構造としての働きに至るまで、いくつもの生物学的機能を果たす。
【０００３】
最も研究が進んでおり、最も化学修飾がなされているＧＡＧは、ヒアルロン酸（ＨＡ）である。
【０００４】
一般に、ＨＡに対する修飾は、主に、生体材料、薬物制御放出、関節内補充療法製品、術後の癒着防止デバイスなどの生物医学の分野における新たな誘導体の使用に関するものである。化粧品では、ＨＡは、特定の分子量を特徴とする修飾されていない未変性の形で保湿剤として使用される。
【０００５】
文献によれば、最近では、ＨＡを架橋して、特定の生物学的特性（粘弾性）を有する新たな生体適合性分子を得る方法に最大の労力が向けられており、たとえば、EP341745は、関節内補充療法による関節内治療で使用するための、また術後の癒着防止デバイスとしての、ＨＡの自己架橋によって得られる生成物を記載している。
【０００６】
US4582865やUS4713488などの他の特許は、外因性分子を架橋剤として使用して、前記の性質を請求している。
【０００７】
生体材料および薬物制御放出の分野における修飾されたＨＡの使用については、カルボキシルとのエステル誘導体がEP216453に記載されている。
【０００８】
ＨＡの有機酸とのヒドロキシルエステルに関する特許ははるかに少ない。たとえば、US5679657は、低粘性および低分子量のＨＡを出発材料とする、薄膜形成剤（ｆｉｌｍｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）としての化粧品用の、置換の程度が０．６〜３．６の間であるＨＡアセチル化物を請求しており、US6017901は、多糖鎖にさらに負の電荷を導入するための、ＨＡのヘミコハク酸エステル誘導体の使用を請求している。
【０００９】
EP941253は、ヒドロキシル官能基のレベルでエステル化された生成物を得るための、塩基性環境で酪酸無水物を用いるＨＡ誘導体の合成を開示している。
【００１０】
皮膚科学／美容分野での使用に向けた他のＧＡＧの機能付与は、本発明者らが承知する限りでは知られていない。使用され請求されている本来の合成過程の結果として酪酸残基とギ酸残基が同時に存在することは、言及したどの事例にも記載されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】EP341745
【特許文献２】US4582865
【特許文献３】US4713488
【特許文献４】EP216453
【特許文献５】US5679657
【特許文献６】US6017901
【特許文献７】EP941253
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
発明の説明
本発明は、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）ファミリーに属する酸性多糖、特にヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、およびケラタン（ｃｈｅｒａｔａｎ）硫酸の遊離のヒドロキシル基が酪酸およびギ酸で部分的または完全にエステル化されている酸性多糖誘導体に関する。本発明はまた、その調製方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】酵素と共にインキュベートしたポリマー溶液から取り出したサンプルに関する０〜４時間の間の分子量Ｍｗの値を示す図である。
【図２】酵素と共にインキュベートしたポリマー溶液から取り出したサンプルに関する０〜４時間の間の分子量Ｍｗの値を示す図である。
【００１４】
本発明による生成物は、保湿、弾性強化、皮膚の調整、老化防止、および抗ニキビ活性を有する局所用（化粧用または医学的）調製物中に使用でき、また炎症、潰瘍、およびＵＶ、Ｘ線、γ線などの照射によって誘発される熱傷（ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ）病変などの皮膚病変の治療における補助剤として有用である。
【００１５】
各多糖モノマーのヒドロキシル基の置換度（ＤＳ）は、酪酸エステルの場合では、０．０１〜１＊Ｎの間、好ましくは０．０１〜０．２＊Ｎの間（Ｎは、繰返し単位中に存在する遊離アルコール基の数である）で様々でよく、ポリマーのヒドロキシル基におけるギ酸によるエステル化度は、０．０１〜０．２の間（すなわち１％〜２０％の間）である。
【００１６】
エステル化度は、調整および再現可能であるので様々にすることができ、出発多糖の特性、ならびに多糖基質、用いる触媒塩基の種類、および酪酸無水物の化学量論比など、使用する反応条件に応じて決まる。
【００１７】
エステル化されていないカルボキシル官能基はいずれも、酸の形で存在してもよいし、またはアルカリ金属、特にナトリウムで塩化されていてもよい。
【００１８】
酸性多糖の分子量は、１０3ダルトン〜１０7ダルトンの間であるのが普通であり、多糖がヒアルロン酸である場合、分子量は、１０4ダルトン〜１０6ダルトンの間であることが好ましい。
【００１９】
ヒアルロン酸の場合では、ポリマーのヒドロキシル基における酪酸によるエステル化度は、０．０１〜０．８の間であることが好ましく、ポリマーのヒドロキシル基におけるギ酸によるエステル化度は、０．０１〜０．２０の間である。
【００２０】
個々の構成要素のエステル化度を様々にすることにより、本発明による誘導体の物理化学的特性および流動学的特性は変化し、そうした誘導体は、保湿剤、弾性強化剤、皮膚調整剤、老化防止剤、もしくは抗ニキビ剤として、または炎症、潰瘍、創傷、皮膚炎、および照射によって引き起こされる皮膚熱傷などの皮膚病変の治療のための補助剤として、治療用の局所用組成物に使用することができる。
【００２１】
本発明はまた、前記誘導体の調製方法に関する。前記方法は、以下のステップを含む。
ａ）ナトリウムまたは他のアルカリ金属で塩化した酸性多糖を、６０℃〜１２０℃の間の温度、好ましくは９５℃で加熱することにより、ホルムアミドに溶解させるステップと、
ｂ）得られた溶液に、有機塩基の存在下、室温で酪酸無水物を加えるステップと、
ｃ）均質な粘性の反応混合物をＮａＣｌ水溶液で希釈し、それをｐＨ６〜７．５に中和するステップと、
ｄ）希釈した反応混合物を透析または接触濾過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）によって精製するステップと、
ｅ）精製した多糖溶液を凍結させ、凍結乾燥または噴霧乾燥によって生成物を回収するステップ。
【００２２】
有機塩基は、少なくとも１個の三置換窒素原子を含む芳香族または脂肪族の塩基、好ましくはジメチルアミノピリジンまたはトリエチルアミンである。
【００２３】
たとえば天然の（未修飾の）市販のヒアルロン酸と比べた、本発明による化合物の長所の１つは、修飾ポリマーの酪酸およびギ酸エステル置換基の存在によって、組織中に存在するヒアルロニダーゼによる酵素分解から保護されることである。本発明による化合物の前記の新規な性質を以下の実験によって説明する。
【００２４】
市販のＨＡナトリウム塩と、例２および４に記載するとおりに得たサンプルを実験で使用する。
【００２５】
多糖の母溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を、３７℃で１時間機械的に穏やかに撹拌した後、酵素を加える。前記溶液から出発して、０．１ｍｇ／ｍｌの酵素（ウシ睾丸ヒアルロニダーゼ１０６０Ｕ／ｍｇ）を含有する１０ｍｌの希釈溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を調製する。１０分の１の量の酵素で第２の希釈溶液を調製する。両方の溶液を３７℃でインキュベートする。０．６ｍｌのサンプルを一定の間隔で取り出し、１００℃の水浴に５分間浸し、濾過して酵素を除去し、次いで凍結させる。
【００２６】
ＨＰ−ＳＥＣ−ＴＤＡクロマトグラフィーによる加重平均分子量分布の決定
４種の検出器の組合せ（９０°および８°での光散乱、屈折率、および粘度計検出器）を使用しながら、サンプルをサイズ排斥クロマトグラフィーにかけた。クロマトグラムの処理によって、分子量Ｍｗ（重量分子量）分布の決定が可能になる。
【００２７】
クロマトグラフィー条件
計器装備：Ｖｉｓｃｏｔｅｋポンプ、モデルＶＥ１１２１；インライン２チャネル脱ガス装置、Ｇａｓｔｏｒｒ  １５０。
カラム：２×ＧＭＰＷＸＬ混合床カラム、内径７．８ｍｍＩＤ×３０ｃｍ、Ｖｉｓｃｏｔｅｋ；温度４０℃。
移動相：０．１Ｍ  ＮａＮＯ3。
流量：０．６ｍｌ／分。
検出器：  屈折率検出器、細管粘度計検出器、および９０°および８°で測定する光散乱検出器を備えたＶｉｓｃｏｔｅｋモデル３０２  ＴＤＡ、温度４０℃。
注入体積：１００μｌ。
【００２８】
図１および２は、酵素と共にインキュベートしたポリマー溶液から取り出したサンプルに関する０〜４時間の間の分子量Ｍｗの値を示す。未変性の無置換ヒアルロン酸を含有するサンプルは、本発明による酪酸／ギ酸で部分的にエステル化されたサンプルより速い破壊速度を示した。プラトーに達した解重合の程度も、未変性ポリマーの方が大きかった。どちらの影響も、酪酸／ギ酸エステルの置換度によってモジュレートされる。
【００２９】
ポリマー：酵素比１０：１（図１）では、エステル化度の高い例４に関する化合物は、実験終了の時点（４時間）で重合速度を未変性ポリマーの約１０倍に保っている。ポリマー：酵素比１００：１（図２）では、本発明による化合物は全く解重合しないが、未変性ＨＡの分子量は、約３分の２減少する。
【００３０】
健康なボランティアにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでの効力の評価
本発明による酸性多糖エステルは、健康なボランティアにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで行った実験で強力な弾性強化活性を示した。
【００３１】
本発明を例示する例を以下で述べる。
【００３２】
脱イオン水（９８．３５％）中に例２に記載するとおりに得たＨＡナトリウム塩の酪酸／ギ酸混合エステル０．１％を、賦形剤、すなわち増粘剤（０．５％）および保存剤（１．０５％）と共に含有するゲルを調製した。
【００３３】
市販のＨＡナトリウム塩を同じ濃度（０．１％）で同じ賦形剤と共に含有する同じ組成のゲルを対照（ｃｏｍｐａｒａｔｏｒ）として使用した。
【００３４】
実験の目的は、機器を用いた潤いおよび弾性の測定によって、本発明による化合物を含有するゲル製剤（処置群Ａ）の効力を、市販の未修飾ＨＡナトリウム塩（処置群Ｂ）と比較して評価することであった。
【００３５】
２４人のボランティア（平均年齢４９．８才）が、４週間にわたり各製品を顔面の半分に１日２回、毎日適用した。
【００３６】
試験期間の始め（Ｔｏ）および４週間の処置の終わり（Ｔｆ）に、適用部位で、特定範囲における皮膚の潤いおよび弾性を機器によって測定した。ボランティアらは、機器による記録の３時間前に水洗いによって製品を完全に落とした。
【００３７】
顔面の角質層の潤いレベルは、皮膚表面の潤いレベルを測定する機器であるコルネオメーターで測定し、一方皮膚弾性は、測定プローブに吸引された際の皮膚表面の変形を測定する機器であるキュトメーターを使用して、弾性吸引法（ｅｌａｓｔｏｍｅｔｒｉｃ  ｓｕｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）によって測定した。皮膚に接触したプローブの内部で３５０ミリバールの一定の陰圧を１秒間生じさせた。実験は、３回の吸引／解放サイクルからなるものであり、これによって皮膚の弾性特性である変形を測定し、パラメーターＲ２として示した。
【００３８】
そうして得た結果を以下の表に要約する。
【００３９】
生物学的弾性（パラメーターＲ２）の測定
【００４０】
【表１】
0006000511.tif 000002
【００４１】
表に示したデータから、本発明に従って得た調製物（Ａ群）では、パラメーターＲ２（生物学的弾性）の有意性の高い増加が見られたが、比較製品（Ｂ群）では、パラメーターＲ２に対する有意な効果が何ら示されなかったことが示唆される。
【００４２】
保湿パラメーターに関しては、どちらの処置群でも時間ＴｏとＴｆとに有意差はなく、この結果は、使用した実験プロトコールが、機器による測定の３時間前に調製物を洗い落とすことをスケジュールに組み込んだタイプであったことから説明がつく。
【００４３】
照射による熱ストレスに曝された皮膚に対する鎮静作用の評価
乳癌に罹患している平均年齢５２才の８人の患者が、γ粒子の線形加速器での放射線療法による治療を受けた。
【００４４】
治療サイクルは、１週間に５日２Ｇｙずつの照射を含む１５回の治療を含むものであり、合計照射線量は３０Ｇｙになった。
【００４５】
この調査の目的は、必要な全治療サイクルを実施できる見込み、製品の忍容性、および製品の保護効力を評価することであった。
【００４６】
例９に記載するとおりに得た軟膏を、各適用の間に８時間空けて１日３回毎日、常に放射線療法処置の２時間前に開始し、放射線療法が完了した後も５日間継続して、照射した範囲に適用した。放射線を浴びた皮膚範囲をその段階で評価した。
【００４７】
全員の患者が、計画した治療サイクル（３０Ｇｙ）に耐え、使用した調製物の優れた保護効果および忍容性が実証された。
【００４８】
処置の効力を、放射線を浴びた皮膚での有害反応に得点を付けることによっても評価した。詳細には、以下の得点を割り当てた。
０：反応なし
１：軽度の紅斑
２：中程度の紅斑
３：重度の紅斑
４：剥離
８人の患者のうち１人が剥離を示し、１人が中程度の紅斑を示し、１人が軽度の紅斑を示し、５人は反応がなかった。
【００４９】
結論として、本発明によるクリーム調製物を用いたこの予備的な試験により、十分な忍容性、および放射線療法による皮膚炎からの優れた局所保護効果が実証された。
【００５０】
これらの所見は、本発明による誘導体が、皮膚科学的に許容される不活性担体と混合された局所用組成物の活性成分として有利に使用できることを明らかに示唆している。
【００５１】
本発明による誘導体は、０．０５重量％〜５重量％の間の範囲のパーセンテージで存在してよいはずである。適切な組成物としては、クリーム、軟膏、ゲル、親水性液体、水性ローションまたは水−アルコールローション、油／水型または水／油型エマルジョンが挙げられる。
【００５２】
酸性多糖の酪酸／ギ酸混合エステルの調製について以下の例で報告する。
【００５３】
例１
ヒアルロン酸ナトリウム塩の酪酸およびギ酸エステル（ＢＵＴ０７００５）の合成
分子量約３００ｋＤａのヒアルロン酸ナトリウム５．００ｇを、窒素流中にて機械的に撹拌しながら９５℃で約１時間かけて１００ｍＬのホルムアミドに可溶化する。
【００５４】
得られた多糖溶液を室温で冷まし、４−ジメチルアミノピリジン５０３．３ｍｇを５ｍＬのホルムアミドに溶かした溶液を、１．６７ｍＬ／分の速度で滴下する。１５分後、７３４μｌの酪酸無水物を加え、４０分間反応させる。均質で粘性の高い反応混合物を１．２Ｌの０．９％ＮａＣｌ（ｗ／ｖ）に移す。
【００５５】
溶液を減圧下にてガラス濾過器で濾過し、次いで０．９％ＮａＣｌ溶液（ｗ／ｖ）でさらに希釈して、最終体積を２．５Ｌとする。
【００５６】
生成物を、まず０．９％ＮａＣｌ（ｗ／ｖ）に対して、次いで超純水に対して徹底的に、空孔率１０ｋＤａの濾過膜を介した接触濾過によって精製する。
【００５７】
最後に、溶液を凍結させ、凍結乾燥によって生成物を回収し、４．０３ｇの白色の凍結乾燥物（ｌｙｏｐｈｉｌｉｓａｔｅ）を得る。
【００５８】
凍結乾燥物を1Ｈ  ＮＭＲによって分析する。
【００５９】
酪酸エステルの置換度（ＤＳｂｕｔ．）：０．１３、ギ酸エステルの置換度（ＤＳｆｏｒｍ．）：０．０７。
【００６０】
例２
ヒアルロン酸ナトリウム塩の酪酸およびギ酸エステル（ＢＵＴ０７００２）の合成
分子量約３００ｋＤａのヒアルロン酸ナトリウム５．００ｇを、窒素流中にて機械的に撹拌しながら９５℃で約１時間かけて１００ｍＬのホルムアミドに可溶化する。
【００６１】
得られた多糖溶液を室温で冷まし、０．７６ｇの４−ジメチルアミノピリジンを５ｍＬのホルムアミドに溶かした溶液を、１．６７ｍＬ／分の速度で滴下する。１５分後、１．０ｍｌの酪酸無水物を加え、４０分間反応させる。均質で非常に粘性のある反応混合物を１．２Ｌの０．９％ＮａＣｌ（ｗ／ｖ）に移す。
【００６２】
溶液を減圧下にてガラス濾過器で濾過し、次いで０．９％ＮａＣｌ溶液（ｗ／ｖ）でさらに希釈して、最終体積を２．５Ｌとする。
【００６３】
サンプルを、まず０．９％ＮａＣｌ（ｗ／ｖ）に対して、次いで超純水に対して徹底的に、空孔率１０ｋＤａの濾過膜を介した接触濾過によって精製する。
【００６４】
多糖溶液を最後に凍結させ、凍結乾燥によって生成物を回収し、４．９０ｇの白色の凍結乾燥物を得る。
【００６５】
凍結乾燥物を1Ｈ  ＮＭＲによって分析する。
【００６６】
酪酸エステルの置換度（ＤＳｂｕｔ．）：０．２３、ギ酸エステルの置換度（ＤＳｆｏｒｍ．）：０．０７。
【００６７】
例３
ヒアルロン酸ナトリウム塩の酪酸およびギ酸エステル（ＢＵＴ０７００４）の合成
分子量約３００ｋＤａのヒアルロン酸ナトリウム５．００ｇを、窒素流中にて機械的に撹拌しながら９５℃で約１時間かけて１００ｍＬのホルムアミドに可溶化する。
【００６８】
得られた多糖溶液を室温で冷まし、１．２６ｇの４−ジメチルアミノピリジンを８ｍＬのホルムアミドに溶かした溶液を、１．６７ｇｍＬ／分の速度で滴下する。１５分後、１．７ｍＬの酪酸無水物を加え、４０分間反応させる。均質で粘性の高い反応混合物を１．２Ｌの０．９％ＮａＣｌ（ｗ／ｖ）に移す。
【００６９】
溶液を減圧下にてガラス濾過器で濾過し、次いで０．９％ＮａＣｌ溶液（ｗ／ｖ）でさらに希釈して、最終体積を２．５Ｌとする。
【００７０】
サンプルを、まず０．９％ＮａＣｌ（ｗ／ｖ）に対して、次いで超純水に対して徹底的に、空孔率１０ｋＤａの濾過膜を介した接触濾過によって精製する。
【００７１】
多糖溶液を最後に凍結させ、凍結乾燥によって生成物を回収し、４．７９ｇの白色の凍結乾燥物を得る。
【００７２】
凍結乾燥物を1Ｈ  ＮＭＲによって分析する。
【００７３】
酪酸エステルの置換度（ＤＳｂｕｔ．）：０．５０、ギ酸エステルの置換度（ＤＳｆｏｒｍ．）：０．０６。
【００７４】
例４
ヒアルロン酸ナトリウム塩の酪酸およびギ酸エステル（ＢＵＴ０７００１）の合成
分子量約３００ｋＤａのヒアルロン酸ナトリウム５．００ｇを、窒素流中にて機械的に撹拌しながら９５℃で約１時間かけて１００ｍＬのホルムアミドに可溶化する。
【００７５】
得られた多糖溶液を室温で冷まし、１．６７ｇの４−ジメチルアミノピリジンを１０ｍＬのホルムアミドに溶かした溶液を、１．６７ｍＬ／分の速度で滴下する。１５分後、２．２５ｍｌの酪酸無水物を加え、４０分間反応させる。均質で粘性の高い反応混合物を１．２Ｌの０．９％ＮａＣｌ（ｗ／ｖ）に移す。
【００７６】
溶液を減圧下にてガラス濾過器で濾過し、次いで０．９％ＮａＣｌ溶液（ｗ／ｖ）でさらに希釈して、最終体積を２．５Ｌとする。
【００７７】
サンプルを、まず０．９％ＮａＣｌ（ｗ／ｖ）に対して、次いで脱イオン水に対して徹底的に、空孔率１０ｋＤａの濾過膜を介した接触濾過によって精製する。
【００７８】
多糖溶液を最後に凍結させ、凍結乾燥によって生成物を回収し、５．１５ｇの白色の凍結乾燥物を得る。
【００７９】
凍結乾燥物を1Ｈ  ＮＭＲによって分析する。
【００８０】
酪酸エステルの置換度（ＤＳｂｕｔ．）：０．６９、ギ酸エステルの置換度（ＤＳｆｏｒｍ．）：０．０４。
【００８１】
例５
ヒアルロン酸ナトリウム塩の酪酸およびギ酸エステル（ＢＵＴ０７００７）の合成
分子量約３００ｋＤａのヒアルロン酸ナトリウム２３．００ｇを、窒素流中にて機械的に撹拌しながら９５℃で約１時間かけて０．４６Ｌのホルムアミドに可溶化する。
【００８２】
得られた多糖溶液を室温で冷まし、５．４７ｇの４−ジメチルアミノピリジンを２０ｍＬのホルムアミドに溶かした溶液を、２．０ｍＬ／分の速度で滴下する。１５分後、７．３ｍｌの酪酸無水物を加え、４０分間反応させる。均質で粘性の高い反応混合物を２．５Ｌの０．９％ＮａＣｌ（ｗ／ｖ）に移す。
【００８３】
溶液を減圧下にてガラス濾過器で濾過し、次いで０．９％ＮａＣｌ溶液（ｗ／ｖ）でさらに希釈して、最終体積を８．０Ｌとする。
【００８４】
サンプルを、まず０．９％ＮａＣｌ（ｗ／ｖ）に対して、次いで超純水に対して徹底的に、空孔率１０ｋＤａの濾過膜を介した接触濾過によって精製する。
【００８５】
多糖溶液を最後に凍結させ、凍結乾燥によって生成物を回収し、２２．２６ｇの白色の凍結乾燥物を得る。
【００８６】
凍結乾燥物を1Ｈ  ＮＭＲによって分析する。
【００８７】
酪酸エステルの置換度（ＤＳｂｕｔ．）：０．４１、ギ酸エステルの置換度（ＤＳｆｏｒｍ．）：０．０７。
【００８８】
例６
ヒアルロン酸ナトリウム塩の酪酸およびギ酸エステル（ＢＵＴ０７００８）の合成
分子量約３００ｋＤａのヒアルロン酸ナトリウム２３．００ｇを、窒素流中にて機械的に撹拌しながら９５℃で約１時間かけて０．４６Ｌのホルムアミドに可溶化する。
【００８９】
得られた多糖溶液を室温で冷まし、７．７１ｇの４−ジメチルアミノピリジンを３５ｍＬのホルムアミドに溶かした溶液を、３．５ｍＬ／分の速度で滴下する。１５分後、１０．３ｍｌの酪酸無水物を加え、４０分間反応させる。均質で粘性の高い反応混合物を７．０Ｌの０．９％ＮａＣｌ（ｗ／ｖ）に移す。
【００９０】
溶液を減圧下にてガラス濾過器で濾過し、次いで０．９％ＮａＣｌ溶液（ｗ／ｖ）でさらに希釈して、最終体積を８．０Ｌとする。
【００９１】
サンプルを、まず０．９％ＮａＣｌ（ｗ／ｖ）に対して、次いで超純水に対して徹底的に、空孔率１０ｋＤａの濾過膜を介した接触濾過によって精製する。
【００９２】
多糖溶液を最後に凍結させ、凍結乾燥によって生成物を回収し、２３．５０ｇの白色の凍結乾燥物を得る。
【００９３】
凍結乾燥物を1Ｈ  ＮＭＲによって分析する。
【００９４】
酪酸エステルの置換度（ＤＳｂｕｔ．）：０．５４、ギ酸エステルの置換度（ＤＳｆｏｒｍ．）：０．１０。
【００９５】
例７
ヒアルロン酸の酪酸およびギ酸エステルのナトリウム塩（ＢＵＴ０７０１４）の合成
分子量約３００ｋＤａのヒアルロン酸ナトリウム１５０．００ｇを、窒素流中にて機械的に撹拌しながら９５℃で約１時間４５分かけて３Ｌのホルムアミドに可溶化する。
【００９６】
得られた多糖溶液を室温で冷まし、３２．００ｇの４−ジメチルアミノピリジンを２００ｍＬのホルムアミドに溶かした溶液を、２０．０ｍＬ／分の速度で滴下する。１５分後、４３．０ｍｌの酪酸無水物を加え、４５分間反応させる。均質で粘性の高い反応混合物を４．０Ｌの超純水に移す。
【００９７】
溶液を減圧下にてガラス濾過器で濾過し、次いで超純水でさらに希釈して、最終体積を３０．０Ｌとする。
【００９８】
サンプルを、まず０．９％ＮａＣｌ（ｗ／ｖ）に対して、次いで超純水に対して徹底的に、空孔率１０ｋＤａの濾過膜を介した接触濾過によって精製する。
【００９９】
次いで、溶液を、圧力（２バール）をかけながら０．２２μｍの濾過膜に通して殺菌し、最後に凍結させる。
【０１００】
凍結乾燥によって生成物を回収して、１４０ｇの白色の凍結乾燥物を得る。
【０１０１】
凍結乾燥物を1Ｈ  ＮＭＲによって分析する。
【０１０２】
酪酸エステルの置換度（ＤＳｂｕｔ．）：０．３２、ギ酸エステルの置換度（ＤＳｆｏｒｍ．）：０．０７。
【０１０３】
例８
コンドロイチン硫酸ナトリウム塩の酪酸およびギ酸エステル（ＢＵＴ０７０１５）の合成
分子量約２０ｋＤａのコンドロイチン硫酸２０１．９ｍｇを、窒素流中にて機械的に撹拌しながら９５℃で約２０分かけて１ｍＬのホルムアミドに可溶化する。
【０１０４】
得られた多糖溶液を室温まで冷まし、４９．２ｍｇの４−ジメチルアミノピリジンを０．５ｍＬのホルムアミドに溶かした溶液を加える。１５分後、６５μｌの酪酸無水物を加え、４０分間反応させる。
【０１０５】
生成物を２０体積のアセトン中に沈殿させて回収し、アセトンで３回洗浄し、次いで低圧で乾燥させる。
【０１０６】
１８０．０ｍｇの白色固体が得られる。サンプルを1Ｈ  ＮＭＲによって分析する。
【０１０７】
酪酸エステルの置換度（ＤＳｂｕｔ．）：０．５０、ギ酸エステルの置換度（ＤＳｆｏｒｍ．）：０．０３。
【０１０８】
例９
Ｏ／Ｗ型弾性強化クリームの調製
本発明による酪酸／ギ酸エステルの１つを含有するクリーム製剤の調製を例示する本発明の非限定的な例を以下で述べる。
【０１０９】
Ｏ／Ｗ型クリーム製剤は、乳化剤、増粘剤、油、湿潤剤（ｍｏｉｓｔｕｒｉｓｅｒ）、ゲル化剤、保存剤などの、皮膚科学的化粧品中に使用される一般的な賦形剤と適切に混合された例２に記載の化合物を、弾性強化および保湿剤として０．１％の濃度で含有する。
【０１１０】
簡潔に述べると、方法は以下のとおりである。
【０１１１】
（製剤全体の約６０重量％に相当する）約６００ｍｌの脱イオン水をターボ乳化機に装入し、予め融解させた脂肪相を撹拌しながら約７０℃で加える。混合物を乳化し、３５〜４０℃の温度にゆっくりと冷却する。熱不安定性および揮発性の成分をその温度で加えた後、適切な量の水に溶解させた例２に記載のＨＡナトリウム塩の酪酸／ギ酸エステルを加える。温度が２５〜３０℃になるまで混合物をゆっくりと撹拌し、次いで完成した生成物を適切な容器に注入する。
【０１１２】
得られたのは以下の組成（％Ｗ／Ｗ）のクリームである。
ＨＡナトリウムの酪酸／ギ酸エステル（例２）                ０．１
油（パルミチン酸／カプリル酸グリセリド−トリグリセリド）    １２
非イオン性乳化剤                                              ６
セチルアルコール                                              ２
ジメチコン                                                    ４
ＭｇＡｌケイ酸塩                                              ２
グリセリン                                                    ３
キシリトール                                                  ２
パラベン                                                  ０．７
Ｈ2Ｏ  １００までの十分量
【図１】
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【図２】
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