(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療を必要とするヒトの対象におけるクローン病および潰瘍性大腸炎から選択される炎症性腸疾患の治療のための、オボアルブミンに対する少なくとも１つのヒトＴｒ１細胞集団からなる薬剤であって、１０４個／ｋｇ〜１０５個／ｋｇのＴｒ１細胞が治療を必要とする対象に投与されることを特徴とする、薬剤。
【請求項２】
治療を必要とするヒトの対象におけるクローン病および潰瘍性大腸炎から選択される炎症性腸疾患の治療のための、１つ以上の薬学的に許容可能なキャリアと組み合わされた、オボアルブミンに対する少なくとも１つのヒトＴｒ１細胞集団からなる薬学的組成物であって、１０４個／ｋｇ〜１０５個／ｋｇのＴｒ１細胞が治療を必要とする対象に投与されることを特徴とする、薬学的組成物。
【請求項３】
前記ヒトＴｒ１細胞集団はヒトＴｒ１クローン集団である、請求項１または２に記載の薬剤または薬学的組成物。
【請求項４】
治療を必要としている対象者に投与される前記薬剤または薬学的組成物は、前記対象者の細胞に対して自家であるヒトＴｒ１細胞を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の薬剤または薬学的組成物。
【請求項５】
有効量の本発明の薬剤または薬学的組成物の前記対象者への前記投与は、腸の炎症性疾患の治療に用いられる１つ以上の治療薬と組み合わせて行われる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の薬剤または薬学的組成物。
【請求項６】
前記対象者は、抗ＴＮＦ、ナタリズマブ、抗ＩＬ１、抗ＩＬ−６、抗ＩＬ−１２、抗ＩＬ−１７および抗ＩＬ−２３、ＩＬ−１受容体拮抗薬類縁体、５アミノサリチル酸および類縁体、コルチコイド、プロバイオティクス、メトトレキサート、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、サリドマイド、およびレフルノミドの群中の１つ以上の治療薬に対し、適切に反応しないかまたは適切に反応しない可能性がある請求項１〜５のいずれか１項に記載の薬剤または薬学的組成物。
【請求項７】
治療を必要としている対象者におけるクローン病および潰瘍性大腸炎から選択される炎症性腸疾患を治療するプロセスに使用するための薬剤または薬学的組成物であって、前記プロセスは、
オボアルブミンに対するＴｒ１細胞を得るステップであって、前記Ｔｒ１細胞は、前記対象者の血液サンプルから入手される、ステップと、
オボアルブミンに対する前記Ｔｒ１細胞をクローン化するステップと、
前記先行ステップにおいて得られたＴｒ１クローンをさらに拡大するステップと、
このようにして前記対象者において得られたＴｒ１クローンを１０４個／ｋｇ〜１０５個／ｋｇで再注入するステップと、
を含む、プロセスであり、ここで前記Ｔｒ１細胞は、前記Ｔｒ１細胞が向けられた抗原と共に同時投与されない、薬剤または薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腸の炎症性疾患の治療の分野に関する。本発明は特に、一般的なヒトの食餌からの食物抗原に対するヒトＴｒ１細胞を含む薬剤を用いた、食物不耐性またはアレルギーに関連する炎症性腸疾患および腸炎を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書中用いられる腸の炎症性疾患とは、食物不耐性またはアレルギーに関連する炎症性腸疾患および炎症を指す。
【０００３】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）とは、クローン病および潰瘍性大腸炎双方を含む疾患群を指す。これら２つの疾患は、病因および臨床症状が類似しているため、同じグループとして扱われることが多い。これら２つの疾患は、侵襲的画像化検査無しでは見分けることが不可能であり、そのため、多数の刊行物および研究において単一の疾患としてみなされることが多い。いずれかの疾患であるかを確定診断するためには、画像研究（例えば、内視鏡検査（例えば、Ｓ状結腸鏡検査または大腸内視鏡検査のいずれか）、二重造影バリウム注腸、およびコンピュータ断層撮影（ＣＴ）と、臨床検査（例えば、白血球レベル、赤血球沈降速度および血清アルブミン濃度の上昇を検出するための全血球計算）とを併せて行う必要がある。
【０００４】
どちらの疾患も、慢性的な再発寛解型の消化管炎症疾患である。消化管領域のうち、クローン病による影響が最も大きいのは小腸および大腸（結腸とも呼ばれ、直腸を含む）であるが、クローン病は、口腔から肛門までの消化管全体に影響を与え得る。単一または複数の炎症パッチがあり得る。潰瘍性大腸炎の場合、影響が出るのは大腸のみである。潰瘍性大腸炎における炎症および潰瘍は、大腸の４つの層のうち２つの最内層である粘膜および粘膜下層に限定される。クローン病において、炎症および潰瘍は、小腸および大腸双方における腸壁の全ての層を通じて広がり得る。これらの疾患の一般的症状を挙げると、下痢、腹痛、直腸出血および体重減少がある。クローン病の合併症を挙げると、腸管膿瘍、瘻孔、腸の一部から別の場所への異常通過に起因する液体または分泌物の通過、および腸閉塞がある。典型的には、どちらの疾患の進行も間欠性であり、疾患増悪の後に寛解期間が続く。しかし、潰瘍性大腸炎は単発である場合もあれば、症状が間断無く続く場合もある。
【０００５】
ＩＢＤにおける治療的介入の選択肢は多数あるものの、その多くは望ましくない副作用を伴うため、慢性疾患の治療において理想的といえない。軽度の潰瘍性大腸炎の場合、経口的にまたは局所的に（すなわち、かん腸により）送達されるアミノサリチル酸が第１選択の治療として用いられることが多い。アミノサリチル酸クラスは、５−アミノサリチル酸（５−ＡＳＡ）を含む薬剤からなり、これは、ＩＢＤにおいて最も早くから用いられている抗炎症化合物である。５−ＡＳＡを高投与量で用いた場合、急性発作における寛解を誘導することができる。５−ＡＳＡは維持療法において一般的に用いられているものの、寛解の維持における有効性については実証されていない。一般的に用いられている５−ＡＳＡ製剤を挙げると、スルファサラジン、経口および局所メサラミン、オルサラジンおよびバルサラジドがある。対象部位（例えば、小腸または大腸）に対して利用可能な作用性薬剤を提供するために、多様な製剤が改変されている。しかし、５−ＡＳＡの場合、副作用が発生しがちである。
【０００６】
コルチコステロイドは、ＩＢＤ発作における寛解を誘導するために最も有効な薬剤であり、５−ＡＳＡによる治療が不成功に終わった場合の第２の治療法として選択されることが多い。これらの化合物は、経口的にまたは経直腸的に送達され、その際、５−ＡＳＡの同時投与が行われる場合もあるし、行われない場合もある。経口送達が不成功であった場合、これらの化合物は静脈内投与される。理想的には、コルチコステロイドの使用は治療の一時期のみに限定し、疾患の寛解時から徐々に低減するとよい。ＩＢＤの治療において一般的に用いられるコルチコステロイドを挙げると、プレドニゾン、ブデソニドおよびヒドロコルチゾンがある。コルチコステロイドの使用は、その使用に関連する重篤かつ顕著な副作用の数により、限定される。短期使用における一般的な副作用として、不眠症、寝汗、気分変調およびグルコース代謝の変化がある。長期の維持療法は、概して重度かつ難治性の症例においてしか継続することができない。治療が長引くと、副腎萎縮を起こし得る一方で、突然中止した場合、副腎不全、低血圧およびさらには死亡を招き得る。他の副作用としては、座瘡、異常脂肪沈着、多毛症および骨粗しょう症がある。クローン病においてコルチコステロイドは、瘻孔の治癒を阻害し得、疾患状態を悪化させ得る。
【０００７】
経口または直腸コルチコステロイドに反応する個体は、維持投与量の５−ＡＳＡを受けることが多い。しかし、医師によっては、寛解期に薬理学的介入を提供しない。
【０００８】
静脈内のコルチコステロイドでの治療を必要とする個体は典型的には、免疫抑制剤（例えば、６−メルカプトプリンおよび／またはアザチオプリン）および５−ＡＳＡの組み合わせを受け続ける。非経口的栄養は典型的には、このような重度の疾患の場合に検討される。患者が上記治療に対して反応しない場合、罹患した腸部分を除去するための外科手術を回避するために、免疫抑制剤シクロスポリンが投与され得る。免疫抑制剤の介入は、望ましくない副作用を伴わないわけではない。６−メルカプトプリンおよびアザチオプリンは、白血球減少、膵炎、重度の感染および骨髄抑制を含む重篤な副作用を伴う発熱、発疹、嘔吐および頭痛の原因となり得る。シクロスポリンでは、知覚異常（灼熱感または刺痛などの異常感覚）、多毛症、高血圧、振戦、腎不全、頭痛および日和見感染を含むより重篤な副作用が発生し得る。
【０００９】
抗生物質（典型的には、シプロフロキサシンまたはメトロニダゾール）は、特に瘻孔または結腸疾患の患者において、５−ＡＳＡまたはコルチコステロイドに対するアドオン治療として用いられる。その他の治療全てと同様に、抗生物質を用いた長期治療では、副作用が発生する。
【００１０】
インフリキシマブおよびアダリムマブは、現在、炎症性腸疾患の薬剤療法における最後の手段となっている。インフリキシマブはキメラ化モノクローナル抗体であり、７５％のヒトタンパク質および２５％のマウスタンパク質で構成される。一方、アダリムマブは完全ヒト化抗体である。インフリキシマブおよびアダリムマブは、強い炎症性サイトカインである腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）の阻害剤である。この薬剤は、可溶性および膜結合型ＴＮＦ−α双方を結合させることにより、シンクとして機能する。炎症カスケードにおいて活性化因子を高く阻害することにより、多数の炎症経路を阻害することができる。この薬剤は、治療時において、先ず静脈内投与した後、維持薬剤として製品ラベルに記載の通りに８週毎に投与する。しかし、この薬剤は生物製剤であるため、免疫反応に起因して、当該薬剤の有効性が限定され得る。
【００１１】
そのため、免疫抑制剤は典型的には、インフリキシマブ維持療法と共に与えられることが多い。炎症性腸疾患における他の全ての治療と同様に、インフリキシマブにおいても実質的な副作用がある。ＴＮＦ−αは、新生細胞の根絶において重要な役割を持つため、ＴＮＦ−αが抑制された場合、特に長期戦略において、日和見感染、悪性腫瘍および他の合併症に繋がり得る。
【００１２】
外科的介入は、炎症性腸疾患の治療方法の一つであって、治癒させることではない。ＩＢＤは慢性的でありまた発症年齢も比較的低いため、薬理学的介入に反応しない患者の場合、患者の生存期間全体にわたって複数回の外科手術が必要となり得る。腸の短尺部位の除去であれば、実質的な副作用を伴わずに行うことが可能である。しかし、より大型の腸部位または複数の腸部位を除去した場合、短腸症候群が発生し得、栄養が吸収できなくなる場合がある。大腸の複数部位を除去した場合、人工肛門造設術または他のさらなる外科手術が必要となり得る。そのため、外科手術は、炎症性腸疾患の好適な治療方法ではない。炎症性腸疾患の治療のために外科的介入を行うと、さらなる疾患の原因となり得る。結腸を完全に除去した場合、外科医は、小腸から回腸嚢を造設して、恒久的オストミーを必要とするのではなく、肛門経由での排便を可能とし得る。回腸嚢炎は、回腸嚢の非特異的炎症であり、再建後２年以内に発生することが多い。その症状を挙げると、排便回数の着実な増加に加えて、失禁、出血、発熱および／または切迫感がある。潰瘍性大腸炎の罹患者のうちおよそ２０〜３０パーセントが、症状発現を少なくとも一度は経験している。回腸嚢炎を治療するには抗生物質で十分であり得るが、その場合、ＩＢＤに用いられるのと同様に他のより攻撃的な治療が必要となる。
【００１３】
炎症性腸疾患治療のための最近の新規治療アプローチのうち、ＷＯ２００７／０２７１３２において、前記疾患の治療方法が開示されている。この方法は、患者のセンチネル節から収集してインビトロで拡大（ｅｘｐａｎｄ）した制御性ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の投与を含む。別の種類の腸の炎症性疾患は、食物不耐性またはアレルギーに起因する。ヒトは、食餌タンパク質の摂取後、程度の差こそあれ、重篤なアレルギー反応または不耐性反応に苦しむ場合が多い。食物アレルギーまたは不耐性の罹患率は、成人のおよそ１〜２％および子供の６〜８％である。食物アレルギーまたは不耐性は、限られた範囲の食物（主にピーナッツ、木の実、鶏卵、牛乳、コムギ（グルテン）、ダイズ、魚および貝類）と主に関連する。
【００１４】
現在まで、食物アレルギーまたは不耐性の有効な治療は利用可能となっていない。ほとんどのアレルギーまたは不耐性の個体は、自身の置かれている状況に適合し、アレルギーまたは不耐性のある食べ物を摂取しないようにしている。抗ヒスタミン剤、充血除去剤またはステロイドなどの薬剤を用いた治療が利用可能であるものの、このような治療は、不耐性反応またはアレルギー性反応の症状に対してしか有効ではない。これらは、将来におけるアレルゲンまたは食餌タンパク質への暴露に起因して新規アレルギー反応または新規不耐性が発生する場合を回避することはできない。
【００１５】
よって、本発明において、出願人は、制御性ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞と異なるＴｒ１細胞の使用に基づいた腸の炎症性疾患の治療法を提供することを意図する。
【００１６】
Ｇｒｏｕｘら（Ｎａｔｕｒｅ１９９７、３８９：７３７〜７４２）は、抗原（オボアルブミン）特異的Ｔｒ１細胞の移入により、マウスにおいて病原性ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈＴ細胞によって誘引される腸疾患が回避されるのは、（この場合、前記マウスにオボアルブミンを給餌することにより）前記抗原によって前記Ｔｒ１細胞にインビボ刺激を与えた場合のみである点について、言及した。加えて、Ｆｏｕｓｓａｔら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００３、１７１：５０１８〜５０２６）は、抗原（オボアルブミン）特異的Ｔｒ１細胞および前記抗原（飲料水中のオボアルブミン）を同時投与した場合、マウスにおいて炎症性腸疾患の進行が治癒する点について、言及している。このように、前記Ｔｒ１細胞を有効化させるためには、前記抗原の同時投与が必要であった。
【００１７】
本発明によれば、本発明者らは、治療を必要としている対象者における腸の炎症性疾患の治療を提供することを意図し、前記治療は、ヒトの一般的食餌からの食物抗原に対するＴｒ１細胞の唯一の投与に基づく。詳細には、本発明者らは、驚くべきことに、ヒトの一般的食餌からの食物抗原に対する前記Ｔｒ１細胞は、併用することで前記Ｔｒ１細胞が有効となる前記抗原と共に同時投与する必要が無い。
【発明の概要】
【００１８】
本発明は、ヒトの一般的食餌からの食物抗原に対する少なくとも１つのヒトＴｒ１細胞集団を含む組成物に関する。
【００１９】
前記ヒトの一般的食餌からの食物抗原は好適には、ウシ抗原、Ｃａ結合ＳｌＯＯ、α−ラクトアルブミン、ラクトグロブリン（例えば、β−ラクトグロブリン、ウシ血清アルブミン、カゼイン）、大西洋サケ抗原、ニワトリ抗原、オボアルブミン、Ａｇ２２、コンアルブミン、リゾチームまたはニワトリ血清アルブミン、エビ抗原、コムギ抗原、セロリ抗原、ニンジン抗原、リンゴ抗原、リンゴ脂質伝達タンパク質、リンゴプロフィリン、ナシ抗原、イソフラボンレダクターゼ、アボカド抗原、アンズ抗原、モモ抗原、ダイズ抗原、ピーナッツ、オボアルブミン、ならびにそれらの断片、変異体および混合物を含む群から選択される。好適には、前記食物抗原は、オボアルブミン、カゼイン、β−ラクトグロブリン、ダイズタンパク質、グリアジン、ピーナッツ、ならびにそれらの断片、変異体および混合物である。
【００２０】
本発明の別の目的は、本発明の組成物を含む薬剤または薬学的組成物を提供することである。
【００２１】
本発明はまた、治療を必要としている対象者において腸の炎症性疾患を治療する方法にも関する。前記方法は、本発明の薬剤または薬学的組成物の有効量を前記対象者に投与するステップを含む。
【００２２】
本発明の好適な実施形態において、前記方法は、炎症性腸疾患の治療のためのものである。本発明の一実施形態において、前記炎症性腸疾患はクローン病である。本発明の別の実施形態において、前記炎症性腸疾患は潰瘍性大腸炎である。
【００２３】
本発明の別の好適な実施形態において、前記方法は、食物アレルギーまたは不耐性に関連する腸炎を治療するためのものである。一実施形態において、前記食物不耐性はセリアック病である。別の実施形態において、前記食物アレルギーは乳タンパク質アレルギーである。別の実施形態において、前記食物アレルギーはピーナッツアレルギーである。別の実施形態において、前記食物アレルギーはオボアルブミンアレルギーである。
【００２４】
好適な実施形態において、治療を必要としている対象者に投与されるべき前記薬剤または前記薬学的組成物は、前記対象者の細胞に対して自家であるＴｒ１細胞を含む。
【００２５】
本発明の別の実施形態において、前記治療を必要としている対象者において腸の炎症性疾患を治療する方法は、本発明の薬剤または薬学的組成物の有効量を腸の炎症性疾患の治療に用いられる別の治療薬と共に前記対象者に投与するステップを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】マウス抗魚タンパク質Ｔｒ１およびマウス抗ダイズタンパク質Ｔｒ１リンパ球のサイトカイン発現プロファイル。（Ａ）マウス抗魚タンパク質Ｔｒ１細胞による、ＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−γ産生。（Ｂ）マウス抗ダイズタンパク質Ｔｒ１細胞による、ＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−γ産生。
【図２】マウス抗魚タンパク質およびマウス抗ダイズタンパク質Ｔｒ１細胞は、マウスにおいて炎症性大腸炎を抑制する。（ＡおよびＢ）体重減少の分析。（Ｃ）マウス抗ダイズタンパク質Ｔｒ１細胞による、ＩＦＮ−γの産生。
【図３】健康なドナーからのオボアルブミン特異的Ｔｒ１クローンのサイトカインプロファイルおよび拡大プロファイル。２つの異なるクローンの例。（Ａ）人工的なショウジョウバエ由来のフィーダー細胞による刺激を毎週行い、週１回の細胞計数によってオボアルブミンＴｒ１クローンの増殖量を評価した。（Ｂ）抗原提示細胞の存在下で２日間特異的活性化を行った後、Ｔｒ１クローンをオボアルブミンの特異性について評価した。品質管理試験の例として与えられた３つのクローンについて、ＩＬ−１０のオボアルブミン特異的産生を上清中でＥＬＩＳＡによって測定した。結果を、オボアルブミンが有る場合と無い場合の刺激状態の間のＩＬ−１０産生のデルタとして表す。（Ｃ）抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８活性化Ｔｒ１クローンにおいて、Ｔｒ１特異的サイトカイン産生プロファイルを上清中でＥＬＩＳＡによって評価した。
【図４】オボアルブミン特異的Ｔｒ１クローンの抑制活性。２つの異なるクローンの例。（Ａ）共培養中の自家ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖における、段階的濃度のオボアルブミン特異的Ｔｒ１クローンの抑制活性。（Ｂ）自家ＣＤ４＋Ｔ細胞における、活性化オボアルブミンＴｒ１クローンの希釈培養上清の抑制活性。（Ｃ）ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βモノクローナル抗体による、Ｔｒ１上清媒介Ｔ細胞増殖の阻害。
【図５】オボアルブミン特異的Ｔｒ１クローンの表現型。（Ａ）活性化オボアルブミン特異的Ｔｒ１クローンにおけるフローサイトメトリーにより、表面ＣＤ２５、ＧＩＴＲおよび細胞内Ｆｏｘｐ３およびＣＴＬＡ−４の発現を評価した。（Ｂ）活性化（０日）後と、刺激不在下での１４日間の培養とにおいて、マーカ発現の動態を評価した。
【図６】オボアルブミン特異的Ｔｒ１クローンの核型試験。このクローンは、ショウジョウバエ由来のフィーダー細胞と共にインビトロで拡大し、３０回よりも多く倍加されている。
【図７】クローン病患者からのオボアルブミン特異的Ｔｒ１クローンのサイトカインプロファイルおよび拡大プロファイル。（Ａ）抗原提示細胞の存在下で２日間抗原特異的活性化を行った後、Ｔｒ１クローンをそのオボアルブミンに対する特異性について評価した。品質管理試験の例として与えられた３つのクローンについて、ＩＬ−１０のオボアルブミン特異的産生を上清中でＥＬＩＳＡによって測定した。結果を、オボアルブミンが有る場合と無い場合の刺激状態の間のＩＬ−１０産生のデルタとして表す。（Ｂ）抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８活性化Ｔｒ１クローンの上清について、Ｔｒ１特異的サイトカイン産生プロファイルをＥＬＩＳＡによって評価した。（Ｃ）人工的なショウジョウバエ由来のフィーダー細胞による刺激を毎週行い、２つのＴｒ１クローンのオボアルブミンの増殖量を週１回の細胞計数によって評価した。
【図８】患者における寛解の分析。（Ａ）ＣＤＡＩの分析、（Ｂ）腹痛の分析、（Ｃ）液状便または軟便の週一度の分析、および（Ｄ）生活満足度スコアの分析。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
定義
本明細書中に用いられる「Ｔｒ１細胞」という用語は、静止状態のＣＤ４＋ＣＤ２５−ＦｏｘＰ３−において以下の表現型を有し、かつ活性化時に高レベルのＩＬ−１０および低レベルから中レベルのＴＧＦ−βを分泌することができる細胞を指す。Ｔｒ１細胞は、そのユニークなサイトカインプロファイルによって部分的に特徴付けられる。すなわち、Ｔｒ１細胞は、高レベルのＩＬ−１０、顕著なレベルのＴＧＦ−βおよび中程度のレベルのＩＦＮ−γを産生するが、ＩＬ−４またはＩＬ−２はほとんど又は全く産生しない。このサイトカイン産生は典型的には、Ｔリンパ球の多クローン性活性剤（例えば、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８抗体またはインターロイキン−２、ＰＭＡ＋イオノマイシン）による活性化の後、細胞の培養液において評価される。あるいは、前記サイトカイン産生は、抗原提示細胞によって提示される特異的Ｔ細胞抗原による活性化後、細胞の培養液において評価される。高レベルのＩＬ−１０は、少なくとも約５００ｐｇ／ｍｌ、典型的には、約１、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、または２０、０００ｐｇ／ｍｌ以上、に相当する。顕著なレベルのＴＧＦ−βは、少なくとも約１００ｐｇ／ｍｌ、典型的には、約２００、３００、４００、６００、８００、または１０００ｐｇ／ｍｌ以上、に相当する。中程度のレベルのＩＦＮ−γは、０ｐｇ／ｍｌから少なくとも４００ｐｇ／ｍｌの間の濃度、典型的には、約６００、８００、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、または２０００ｐｇ／ｍｌ以上の濃度、に相当する。ＩＬ−４またはＩＬ−２がほとんど無いまたは全く無いとは、約５００ｐｇ／ｍｌ未満、好適には、約２５０、１００、７５、または５０ｐｇ／ｍｌ未満に相当する。
【００２８】
本明細書中に用いられる「抗原」という用語は、本発明の細胞が調節するために用いられる、または本発明のいずれかの方法において用いられる、タンパク質またはペプチドを指す。１つの実施形態において、「抗原」という用語は、合成的に誘導された分子または天然由来の分子を指し得、前記分子は、対象抗原との配列相同性または対象抗原との構造的相同性またはその組み合わせを共有する。１つの実施形態において、前記抗原はミメトープであり得る。抗原の「断片」とは、より短いペプチドとしての抗原の任意のサブセットを指す。抗原の「変異体」とは、抗原全体またはその断片のいずれかに実質的に類似する分子を指す。変異体抗原は、当該分野において周知の方法を用いて、変異体ペプチドの直接的化学合成により、簡便に調製可能である。
【００２９】
本明細書中用いられる「対象者」という用語は、ヒトを指す。
【００３０】
本明細書中に用いられる「有効量」という用語は、有益なまたは所望の臨床結果（例えば、臨床状態の向上）を発生させるのに十分な量を指す。
【００３１】
本明細書中に用いられる「クローン」または「クローン集団」という用語は、ユニークな分化した細胞から派生した分化細胞の集団を指す。
【００３２】
本明細書中に用いられる「治療」または「治療する」という用語は一般的には、治療をされている個体の自然経過を変えようとする臨床的介入を指し、臨床病理のコースにおいて行われ得る。望ましい効果を非限定的に挙げると、症状の軽減、疾患のあらゆる直接的または間接的な病理学的帰結の抑制、低減又は阻害、疾患進行速度の低下、疾患状態の改善または緩和、寛解または予後の改善がある。
本発明
【００３３】
本発明は、治療を必要としている対象者において腸の炎症性疾患を治療する方法に関する。前記方法は、ヒトの一般的食餌からの食物抗原に対するヒトＴｒ１細胞を含む組成物を前記対象者に投与するステップを含む。
【００３４】
本発明によれば、本発明者らは、治療を必要としている対象者における腸の炎症性疾患の治療を提供することを意図する。前記治療は、ヒトの一般的食餌からの食物抗原に対するＴｒ１細胞の唯一の投与に基づく。詳細には、本発明者らは、驚くべきことに、ヒトの一般的食餌からの食物抗原に対する前記Ｔｒ１細胞は、併用することで前記Ｔｒ１細胞が有効となる前記抗原と同時投与する必要が無いことを発見した。
【００３５】
そのため、本発明は、薬事規制面において複雑化する同時投与または同時治療が不要である、という利点を提供する。
【００３６】
「ヒトの一般的食餌からの食物抗原」という用語は、免疫原性ペプチドを指し、ヒトにとって一般的な食物由来のものであり、例えば以下の非限定的リストの食物抗原：ウシ抗原（例えば、リポカリン、Ｃａ結合ＳｌＯＯ、αラクトアルブミン、ラクトグロブリン（例えば、βラクトグロブリン）、ウシ血清アルブミン、カゼイン）を指す。食物抗原はまた、大西洋サケ抗原（例えば、パルブアルブミン）、ニワトリ抗原（例えば、オボムコイド、オボアルブミン、Ａｇ２２、コンアルブミン、リゾチームまたはニワトリ血清アルブミン）、ピーナッツ、エビ抗原（例えば、トロポミオシン）、コムギ抗原（例えば、凝集素またはグリアジン）、セロリ抗原（例えば、セロリプロフィリン）、ニンジン抗原（例えば、ニンジンプロフィリン）、リンゴ抗原（例えば、タウマチン、リンゴ脂質伝達タンパク質、リンゴプロフィリン）、ナシ抗原（例えば、ナシプロフィリン、イソフラボンレダクターゼ）、アボカド抗原（例えば、エンドキチナーゼ）、アンズ抗原（例えば、アンズ脂質伝達タンパク質）、モモ抗原（例えば、モモ脂質伝達タンパク質またはモモプロフィリン）、ダイズ抗原（例えば、ＨＰＳ、ダイズプロフィリンまたは（ＳＡＭ２２）ＰＲ−１０タンパク質）であってもよい。
【００３７】
理論に縛られることを望むことなく、出願人は、ヒトの一般的食餌からの食物抗原に対するＴｒ１細胞集団が注入されると、前記Ｔｒ１細胞集団は、一般的食物摂取後に腸組織内に存在する食物抗原によってインビボ活性化され、その後、腸の炎症性疾患（例えば、食物アレルギーまたは不耐性と関連する炎症性腸疾患および炎症）を制御することができる、と推測する。
【００３８】
本発明は、ヒトの一般的食餌からの食物抗原に対する少なくとも１つのヒトＴｒ１細胞集団を含む組成物に関する。
【００３９】
本発明の１つの実施形態において、Ｔｒ１細胞は、以下のステップにより、入手され得る。
ａ）対象者から前駆細胞集団を単離するステップと、
ｂ）ＩＬ−１０の存在下で前記前駆細胞集団を培養することにより、樹状細胞の集団を得るステップと、
ｃ）食物抗原の存在下でステップｂ）の細胞を前記対象者から単離されたＣＤ４＋Ｔリンパ球集団と接触させて、前記抗原に対する前記ＣＤ４＋Ｔ細胞をＴｒ１細胞集団に分化させるステップと、
ｄ）ステップｃ）からの前記Ｔｒ１細胞集団を回復させるステップ。
【００４０】
ステップｂ）において、ＩＬ−１０は、５０〜２５０Ｕ／ｍｌで（好適には、培地中に１００Ｕ／ｍｌ）で存在する。このＴｒ１細胞を得る方法については、Ｗａｋｋａｃｈら（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２００３年５月、１８（５）：６０５‐１７）において記載がある。
【００４１】
前記方法は、ステップｂ）のＤＣの代わりにデキサメタゾンおよびビタミンＤ３または免疫寛容原性（ｔｏｌｅｒｏｇｅｎｉｓｅｄ）のまたは未成熟のＤＣを用いて実施することもできる。
【００４２】
本発明の別の実施形態において、ヒトＴｒ１細胞は、以下のステップにより入手され得る。
ａ）対象者から単離された食物抗原に対するＣＤ４＋Ｔ細胞集団を適切な量のＩＦＮ−αを含む培地中で培養するステップと、
ｂ）前記Ｔｒ１細胞集団を回復させるステップ。
【００４３】
ＩＦＮ−αは好適には、培地中に５ｎｇ／ｍｌで存在する。ステップａ）において、培地は、適切な量のＩＬ−１０（好適には１００Ｕ／ｍｌ）をさらに含み得る。
【００４４】
ステップｂ）において、Ｔｒ１細胞集団をＩＬ−１５を含む培地中で培養して増殖させ、ＩＬ−１５は好適には培地中で５ｎｇ／ｍｌである。前記Ｔｒ１細胞を得る方法については、特許ＵＳ６７４６６７０中に記載がある。
【００４５】
本発明のさらに別の実施形態において、ヒトＴｒ１細胞は、以下のステップにより入手され得る。
ａ）人工抗原提示細胞によって提示された食物抗原の存在下でＣＤ４＋Ｔ細胞集団をインビトロ活性化させるステップ、および
ｂ）少なくとも１０％のＴｒ１細胞を含む活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞を回復させるステップ。
【００４６】
好適には、前記人工抗原提示細胞は、ＨＬＡＩＩ系分子およびヒトＬＦＡ−３分子を発現し、副刺激分子Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−Ｈ１、ＣＤ４０、ＣＤ２３およびＩＣＡＭ−１を発現しない。
【００４７】
前記Ｔｒ１細胞を得るプロセスについては、特許出願ＷＯ０２／０９２７９３中に記載がある。
【００４８】
本発明のさらに別の実施形態において、ヒトＴｒ１細胞は、以下のステップにより入手され得る。
ａ）食物抗原および適切な量のＩＬ−１０の存在下でＣＤ４＋Ｔ細胞集団をインビトロ活性化させるステップ、および
ｂ）前記Ｔｒ１細胞集団を回復させるステップ。
【００４９】
好適には、ＩＬ−１０は、培地中に１００Ｕ／ｍｌで存在する。前記方法については、Ｇｒｏｕｘら（Ｎａｔｕｒｅ  １９９７、３８９（６６５２）：７３７−４２）において記載がある。
【００５０】
本発明のさらに別の実施形態において、ヒトＴｒ１細胞は、以下のステップにより入手され得る。
ａ）白血球集団または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）集団を食物抗原で刺激するステップ、
ｂ）前記刺激を受けた集団から、抗原特異的Ｔｒ１細胞集団を回復させるステップ、および
ｃ）前記抗原特異的Ｔｒ１細胞集団を必要に応じて拡大させるステップ。
【００５１】
白血球は、いくつかの種類の細胞を包含し、これらの細胞は、その重要性、その分布、その数、その寿命およびその可能性により、特徴付けられる。これらの種類は、以下のものである：多核または顆粒白血球（そのうち、好酸性白血球、好中性白血球および好塩基性白血球、および単核細胞または末梢血単核球（ＰＢＭＣ）（これらは、大型の白血球細胞であり、免疫系の細胞種類（リンパ球および単球）にある）がある）。白血球またはＰＢＭＣは、当業者に公知の任意の方法により、末梢血から分離することができる。有利には、ＰＢＭＣの分離のために、遠心分離法（好適には密度勾配遠心分離法、好適には不連続密度勾配遠心分離法）が用いられ得る。別の方法として、特異的モノクローナル抗体の使用がある。特定の実施形態において、ＰＢＭＣは典型的には、標準的な手順を用いたフィコールハイパックにより、血液製剤全体から単離される。他の実施形態において、ＰＢＭＣは、白血球除去輸血により回復される。
【００５２】
前記方法について、特許出願ＷＯ２００７／０１０４０６中に記載がある。
【００５３】
さらに別の実施形態において、ヒトＴｒ１細胞は、以下のステップにより入手され得る。
ａ）白血球集団または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）集団を食物抗原の存在下で間葉系幹細胞と共に培養するステップ、および
ｂ）前記Ｔｒ１細胞集団を回復させるステップ。
【００５４】
前記方法は、ＰＢＭＣまたは白血球の代わりにナイーブＴ細胞または記憶Ｔ細胞と共に行ってもよい。
【００５５】
このようにして得られたＴｒ１細胞集団は、サイトカイン（例えば、インターロイキン−２およびインターロイキン−４）の存在下で、培養により拡大され得る。あるいは、インターロイキン−１５およびインターロイキン−１３をＴｒ１細胞拡大培養において用いてもよい。
【００５６】
上記した方法において、ヒトＴｒ１細胞は、ＷＯ２００５／０００３４４中に記載の特定方法により、特徴付けることができる。前記Ｔｒ１細胞の特定方法は、ＣＤ４分子をコードする遺伝子の発現産物と、ＣＤ１８および／またはＣＤ１１ａおよびＣＤ４９ｂを含む群からの分子とが同時に存在することを検出することに基づく。Ｔｒ１細胞は、Ｅｌｉｓａ、フローサイトメトリーまたは前記マーカに対する抗体を用いた免疫アフィニティー法により、特定および／または精製することができる。
【００５７】
Ｔｒ１細胞は、フローサイトメトリーまたは磁気ビーズを用いた正の選択または負の選択により、高濃度化することもできる。このような方法については、ＷＯ２００５／０００３４４中にも記載がある。
【００５８】
本発明の別の実施形態において、前記ヒトの一般的な食餌抗原からの食物抗原に対するＴｒ１細胞は、ＷＯ２００６／１０８８８２に記載のインビトロ方法により、拡大され得る。前記方法は、以下のステップを含む。
ａ）３５℃よりも低い温度Ｔ１において培地Ｍｆ中で、フィーダー細胞（例えば、昆虫フィーダー細胞）を培養するステップであって、前記温度Ｔ１によりフィーダー細胞の増殖が可能となり、前記フィーダー細胞は、以下の細胞表面タンパク質と相互作用する因子を発現する、ステップ、
−ＣＤ３／ＴＣＲ複合体、
−ＣＤ２８タンパク質、
−ＩＬ−２受容体、
−ＣＤ２タンパク質、
−ＩＬ−４受容体、
ｂ）ステップａ）において得られた前記フィーダー細胞であって、その培地Ｍｆが除去されているかまたは除去されていない前記フィーダー細胞を前記培地Ｍｐ内に含まれる前記Ｔｒ１細胞集団と接触させるステップであって、前記培地Ｍｐは初めはステップａ）に記載の前記因子を含まず、これにより、前記Ｔｒ１細胞集団、前記フィーダー細胞および前記培地Ｍｐを含む混合物を入手する、ステップ、
ｃ）ステップｂ）において得られた前記混合物を温度Ｔ２において培養するステップであって、前記温度Ｔ２は少なくとも３５℃であり、前記温度は、前記Ｔｒ１細胞集団は増殖しかつ前記フィーダー細胞は増殖しないように、選択される、ステップ、および
ｄ）このように拡大された前記Ｔｒ１細胞集団を回復させるステップ。
【００５９】
上記した細胞表面タンパク質と相互作用する因子の例を以下に挙げる。
−修飾抗ＣＤ３抗体であって、ＣＤ３重鎖の抗ＣＤ３細胞質内ドメインが膜貫通ドメインと置換された、修飾抗ＣＤ３抗体、
−前記ＣＤ８０またはＣＤ８６タンパク質、
−前記フィーダー細胞により分泌されたＩＬ−２、
−前記ＣＤ５８タンパク質、
−ＩＬ−４およびＩＬ−１３からなる群から選択されたインターロイキン。
【００６０】
本発明の好適な実施形態において、ヒトの一般的食餌からの食物抗原に対する前記Ｔｒ１細胞は、Ｔ細胞をクローン化するための従来の方法を用いることにより、クローン化され得る。
【００６１】
本発明の好適な実施形態において、ヒトの一般的食餌からの食物抗原に対する少なくとも１つのヒトＴｒ１細胞集団を含む前記組成物またはヒトの一般的食餌からの食物抗原に対するヒトＴｒ１細胞の少なくとも１つのクローンは、凍結保存され得る。
【００６２】
本発明の好適な実施形態において、前記ヒトの一般的食餌からの食物抗原は、ウシ抗原、Ｃａ結合ＳｌＯＯ、α−ラクトアルブミン、ラクトグロブリン（例えば、β−ラクトグロブリン、ウシ血清アルブミン、カゼイン）、大西洋サケ抗原、ニワトリ抗原、オボアルブミン、Ａｇ２２、コンアルブミン、リゾチームまたはニワトリ血清アルブミン、エビ抗原、コムギ抗原（例えば、グルテンタンパク質）、グリアジン、セロリ抗原、ニンジン抗原、リンゴ抗原、リンゴ脂質伝達タンパク質、リンゴプロフィリン、ナシ抗原、イソフラボンレダクターゼ、アボカド抗原、アンズ抗原、モモ抗原、ダイズ抗原、ピーナッツ、ならびにそれらの断片、変異体および混合物を含む群から選択される。好適には、前記食物抗原は、組み換えまたは合成抗原である。
【００６３】
好適には、前記ヒトの一般的食餌からの食物抗原は、グリアジンではない。
【００６４】
好適には、前記ヒトの一般的食餌からの食物抗原は、オボアルブミン、カゼイン、β−ラクトグロブリン、ダイズタンパク質、グリアジン、ピーナッツ、ならびにそれらの断片、変異体および混合物である。
【００６５】
より好適には、前記ヒトの一般的食餌からの食物抗原は、オボアルブミンならびにその断片および変異体である。
【００６６】
より好適には、前記ヒトの一般的食餌からの食物抗原は、グリアジンならびにその断片および変異体である。
【００６７】
より好適には、前記ヒトの一般的食餌からの食物抗原は、カゼインならびにその断片および変異体である。
【００６８】
より好適には、前記ヒトの一般的食餌からの食物抗原は、β−ラクトグロブリン、ならびにその断片および変異体である。
【００６９】
より好適には、前記ヒトの一般的食餌からの食物抗原は、ピーナッツならびにその断片および変異体である。
【００７０】
本明細書中、ヒトの一般的食餌からの食物抗原の「変異体」は、天然抗原とほとんど同一の抗原でありかつ同一の生物活性を共有する抗原である。天然抗原とその変異体との間のごくわずかな違いは、例えばアミノ酸置換、欠失、および／または付加にあり得る。このような変異体は、例えばアミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基と置換された保存アミノ酸置換を含み得る。塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、電荷を持たない極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む、類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが当該分野において規定されている。
【００７１】
本発明の別の目的は、上述したような組成物を含む薬剤を提供することである。
【００７２】
本発明はまた、上述したような組成物を含む薬学的組成物を、１つ以上の薬学的に許容可能なキャリアと組み合わせて提供することも意図する。
【００７３】
本明細書において有用な薬学的に許容可能なキャリアは、従来のものである。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｅｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ｏｓｏｌ、Ａ．Ｅｄ（１９８０）において、本発明の組成物の薬剤送達に適した組成物および製剤についての記載がある。一般的に、キャリアの性質は、用いられている投与モードに依存する。例えば、非経口製剤は通常、薬学的かつ生理的に受容可能な流体（例えば、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、ごま油、グリセロール、エタノール、その組み合わせなど）を送達媒体として含む注射用流体を含む。前記キャリアおよび組成物は無菌にすることができ、前記製剤は前記投与モードに適している。生物学的な中性キャリアに加えて、投与される薬学的組成物は、少量の無毒性補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、防腐剤、およびｐＨ緩衝剤など（例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンラウリン酸モノエステル）を含み得る。前記組成物は、液体溶液、懸濁液、エマルジョンであり得る。
【００７４】
本発明の一実施形態において、上述したような薬剤または薬学的組成物は、本質的に、ヒトの一般的食餌からの食物抗原に対する少なくとも１つのＴｒ１細胞集団からなる。
【００７５】
本発明の別の実施形態において、上述したような薬剤または薬学的組成物は、本質的に、ヒトの一般的食餌からの食物抗原に対するＴｒ１細胞集団の少なくとも１つのクローンからなる。
【００７６】
本明細書中に用いられる「本質的に〜からなる」とは、薬剤または薬学的組成物中に存在する細胞のうち少なくとも７０％（好適には７５％、８０％、８５％または９０％）がヒトの一般的食餌からの食物抗原に対するＴｒ１細胞である薬剤または薬学的組成物を指す。
【００７７】
本発明の一実施形態において、上述したような薬剤または薬学的組成物は、グリアジンを除く、ヒトの一般的食餌からの食物抗原に対するＴｒ１細胞集団を含む。
【００７８】
本発明の別の実施形態において、上述したような薬剤または薬学的組成物は、ヒトの一般的食餌からの食物抗原に対する少なくとも１つのＴｒ１細胞集団、または、ヒトの一般的食餌からの食物抗原に対するＴｒ１細胞集団の少なくとも１つのクローンからなる。
【００７９】
本発明の別の実施形態において、上述したような薬剤または薬学的組成物は、ヒトの一般的食餌からの食物抗原に対する少なくとも１つのＴｒ１細胞集団、または、グリアジンを除く、ヒトの一般的食餌からの食物抗原に対するＴｒ１細胞集団の少なくとも１つのクローンからなる。
【００８０】
本発明は、腸の炎症性疾患の治療のための薬剤または薬学的組成物の調製のための、上述したような組成物の使用に関する。
【００８１】
本発明によれば、上述したような薬学的組成物または薬剤は、腸の炎症性疾患の治療のためのものである。
【００８２】
本発明によれば、上述したような薬学的組成物または薬剤は、腸の炎症性疾患の治療において用いられる。
【００８３】
本発明によれば、前記薬学的組成物または薬剤は、ヒトの一般的食餌からの可溶性食物抗原と組み合わせて使用されない。
【００８４】
本発明によれば、前記薬学的組成物または薬剤は、ヒトの一般的食餌からの可溶性食物抗原と共にまたはヒトの一般的食餌からの可溶性食物抗原と組み合わせて前記対象者に投与されない。
【００８５】
本発明によれば、前記Ｔｒ１細胞に対するヒトの一般的食餌からの可溶性食物抗原との同時治療は不要である。
【００８６】
一実施形態において、本発明は、炎症性腸疾患の治療のための薬剤または薬学的組成物の調製のための、上述したような組成物の使用に関する。
【００８７】
好適な実施形態において、本発明は、クローン病の治療のための薬剤または薬学的組成物の調製のための、上述したような組成物の使用に関する。
【００８８】
別の好適な実施形態において、本発明は、潰瘍性大腸炎の治療のための薬剤または薬学的組成物の調製のための、上述したような組成物の使用に関する。
【００８９】
別の実施形態において、本発明は、食物アレルギーまたは不耐性に関連する腸炎の治療のための薬剤または薬学的組成物の調製のための、上述したような組成物の使用に関する。
【００９０】
好適な実施形態において、本発明は、乳タンパク質アレルギーに関連する腸炎の治療のための薬剤または薬学的組成物の調製のための、上述したような組成物の使用に関する。好適には、乳タンパク質アレルギーに関連する腸炎の治療のための前記薬剤または薬学的組成物は、カゼインまたはβ−ラクトグロブリンならびにその断片および変異体に対するヒトＴｒ１細胞を含む。
【００９１】
別の好適な実施形態において、本発明は、セリアック病に関連する腸炎の治療のための薬剤または薬学的組成物の調製のための、上述したような組成物の使用に関する。好適には、セリアック病に関連する腸炎の治療のための前記薬剤または薬学的組成物は、グリアジンならびにその断片および変異体に対するヒトＴｒ１細胞を含む。
【００９２】
別の好適な実施形態において、本発明は、鶏卵アレルギーに関連する腸炎の治療のための薬剤または薬学的組成物の調製のための、上述したような組成物の使用に関する。好適には、鶏卵アレルギーに関連する腸炎の治療のための前記薬剤または薬学的組成物は、オボアルブミンに対するヒトＴｒ１細胞、ならびにその断片および変異体を含む。
【００９３】
別の好適な実施形態において、本発明は、ピーナッツアレルギーに関連する腸炎の治療のための薬剤または薬学的組成物の調製のための、上述したような組成物の使用に関する。好適には、ピーナッツアレルギーに関連する腸炎の治療のための前記薬剤または薬学的組成物は、ピーナッツに対するヒトＴｒ１細胞、ならびにその断片および変異体を含む。
【００９４】
本発明の目的は、治療を必要としている対象者における炎症性腸疾患（好適には、クローン病または潰瘍性大腸炎）を治療する方法でもある。前記方法は、ここで上述したような薬剤またはここで上述したような薬学的組成物の有効量を前記対象者に投与するステップを含む。
【００９５】
本発明の別の目的は、治療を必要としている対象者において、食物アレルギーまたは不耐性に関連する腸炎（好適には、乳タンパク質アレルギー、セリアック病、鶏卵アレルギーまたはピーナッツアレルギー）、を治療する方法である。前記方法は、ここで上述したような薬剤またはここで上述したような薬学的組成物の有効量を前記対象者に投与するステップを含む。
【００９６】
前記組成物は、非経口、筋肉内、静脈内、腹腔内、注入、鼻腔内吸入、肺吸入、皮内、関節内、髄腔内または消化管経由に合わせて製剤化され得る。別の実施形態において、前記組成物は、前記組成物を結腸または小腸内に直接送達させるために、内視鏡ルートを介した組織内または粘膜内投与に合わせて製剤化され得る。
【００９７】
好適には、本発明の前記薬剤または薬学的組成物の投与は、筋肉内、腹腔内または静脈内注入によって行われるか、あるいは、好適には静脈内注入による患者のリンパ節内への直接注入によって行われ得る。
【００９８】
腸の炎症性疾患（例えば、炎症性腸疾患および食物アレルギーまたは不耐性に関連する腸炎）の治療において有効なヒトの一般的食餌からの食物抗原に対するＴｒ１細胞の量は、当該炎症の性質によって異なり、標準的な臨床技術によって決定することができる。製剤において用いられるべき正確な投与量も、投与経路および当該疾患または疾患の深刻度によって異なるため、施術者および個々の状況に従って決定すべである。有効な投与量は、インビトロまたは動物モデル試験システムから得られた投与量−反応曲線から推定することができる。
【００９９】
本発明の一実施形態において、１０４個／ｋｇ〜１０９個／ｋｇの細胞が前記対象者に投与される。好適には、１０５個／ｋｇ〜１０７個／ｋｇの細胞およびより好適には約１０６個／ｋｇの細胞が、前記対象者に投与される。
【０１００】
本発明の一実施形態において、前記対象者の臨床状態の低下によって再発が起こった場合、または、例えば内視鏡検査によって炎症病変が視認できた場合、前記対象者に前記薬剤を投与する。
【０１０１】
本発明の一実施形態において、前記対象者に、本発明の薬剤または薬学的組成物を１回投与する。
【０１０２】
本発明の第２の実施形態において、前記対象者に、本発明の薬剤または薬学的組成物を月に１回投与する。
【０１０３】
本発明の第３の実施形態において、前記対象者に対し、本発明の薬剤または薬学的組成物を３ヶ月毎に投与する。
【０１０４】
本発明の第４の実施形態において、前記対象者に対し、本発明の薬剤または薬学的組成物を１年に１回から２回投与する。
【０１０５】
本発明の別の実施形態において、治療を必要としている対象者に投与されるべき薬剤または薬学的組成物は、前記対象者の細胞に対して自家であるＴｒ１細胞を含む。
【０１０６】
すなわち、Ｔｒ１細胞の入手元である対象者に当該Ｔｒ１細胞が投与されるか、または、対象者から得られたＴｒ１細胞の作製に用いられた前駆体が投与される。
【０１０７】
本発明は、治療を必要としている対象者において腸の炎症性疾患を治療するプロセスにも関する。前記プロセスは、
−前記対象者の血液サンプルを収集するステップ、
−ヒトの一般的食餌から選択された食物抗原に対するＴｒ１細胞を得るステップ、
−ヒトの一般的食餌から選択された食物抗原に対する前記Ｔｒ１細胞をクローン化するステップ、
−前記先行ステップにおいて得られたＴｒ１クローンをさらに拡大するステップ、
−このようにして前記対象者において得られたＴｒ１クローンを好適には静脈内経由で再注入するステップ、
を含む。
【０１０８】
好適には、ヒトの一般的食餌から選択された食物抗原に対するＴｒ１クローンのクローン化および拡大は、以下の方法によって行われる。
ａ）３５℃よりも低い温度Ｔ１において培地Ｍｆ中でフィーダー細胞（例えば、昆虫フィーダー細胞）を培養するステップであって、前記温度Ｔ１によりフィーダー細胞の増殖が可能となり、前記フィーダー細胞は、以下の細胞表面タンパク質と相互作用する因子を発現する、ステップ、
−ＣＤ３／ＴＣＲ複合体、
−ＣＤ２８タンパク質、
−ＩＬ−２受容体、
−ＣＤ２タンパク質、
−ＩＬ−４受容体、
ｂ）ステップａ）において得られた前記フィーダー細胞であって、その培地Ｍｆが除去されているかまたは除去されていない前記フィーダー細胞を前記培地Ｍｐ内に含まれる前記Ｔｒ１細胞集団と接触させるステップであって、前記培地Ｍｐは初めはステップａ）に記載の前記因子を含まず、これにより、前記Ｔｒ１細胞集団、前記フィーダー細胞および前記培地Ｍｐを含む、混合物を入手する、ステップ、
ｃ）ステップｂ）において得られた前記混合物を温度Ｔ２において培養するステップであって、前記温度Ｔ２は少なくとも３５℃であり、前記温度は、前記Ｔｒ１細胞集団は増殖しかつ前記フィーダー細胞は増殖しないように、選択される、ステップ、
ｄ）このように拡大された前記Ｔｒ１細胞集団を回復させるステップ。
【０１０９】
上記した細胞表面タンパク質と相互作用する因子の例を以下に挙げる。
−修飾抗ＣＤ３抗体であって、ＣＤ３重鎖の抗ＣＤ３細胞質内ドメインが膜貫通ドメインと置換された、修飾抗ＣＤ３抗体、
−前記ＣＤ８０またはＣＤ８６タンパク質、
−前記フィーダー細胞により分泌されたＩＬ−２、
−前記ＣＤ５８タンパク質、
−ＩＬ−４およびＩＬ−１３からなる群から選択されたインターロイキン。
【０１１０】
本発明の別の実施形態において、治療を必要としている対象者における腸の炎症性疾患（例えば、炎症性腸疾患、または、食物アレルギーまたは不耐性に関連する腸炎）の治療のための前記方法は、有効量の本発明の薬剤または薬学的組成物を腸の炎症性疾患の治療に用いられる１つ以上の治療薬と組み合わせて前記対象者に投与するステップを含む。
【０１１１】
本発明は、本発明の薬学的組成物または薬剤の使用に関し、有効量の本発明の薬剤または薬学的組成物の前記対象者への投与は、腸の炎症性疾患の治療に用いられる１つ以上の治療薬と組み合わせて行われる。
【０１１２】
腸の炎症性疾患の治療において一般的に用いられる治療薬の例を以下に挙げる。
−ヒトサイトカインまたは成長因子の抗体または拮抗薬、詳細には、抗ＴＮＦ（例えば、インフリキシマブ、アダリムマブ、エタネルセプト）、抗ＩＬｌ、抗ＩＬ−６、抗ＩＬ−１２、抗ＩＬ−１７および抗ＩＬ−２３、ＩＬ−１受容体拮抗薬類縁体（アナキンラ）、
−細胞表面分子に対する抗体（例えば、抗α４インテグリン（ナタリズマブ）、ＣＤ２、ＣＤ３（ビジリズマブ）、抗ＣＣＲ９、抗ＬＦＡｌおよび抗ＩＣＡＭｌ）、
−５アミノサリチル酸および類縁体（例えば、メサラジン、スルファサラジン（ｓｕｌｆａｚａｌｉｎｅ）、オルサラジン、バルサラジド）、
−コルチコイド（例えば、プレドニゾン、ブデソニド、ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ベタメタゾン、ベドメタゾン（ｂｅｄｏｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、チキソコルトール、
−プロバイオティクス（例えば、サッカロマイセスブラウディ）、
−メトトレキサート、サリドマイド、レフルノミドおよびプリン（例えば、アザチオプリンおよび６−メルカプトプリン）の類縁体。
【０１１３】
本発明の好適な実施形態において、前記治療を必要としている対象者において腸の炎症性疾患を治療する方法は、有効量の本発明の薬剤または薬学的組成物を１つ以上の治療薬と組み合わせて前記対象者に投与するステップを含む。前記１つ以上の治療薬は、抗ＴＮＦ、ナタリズマブ、抗ＩＬｌ、抗ＩＬ−６、抗ＩＬ−１２、抗ＩＬ−１７および抗ＩＬ−２３、ＩＬ−１受容体拮抗薬類縁体（アナキンラ）、５アミノサリチル酸および類縁体（例えば、メサラジン、スルファサラジン（ｓｕｌｆａｚａｌｉｎｅ）、オルサラジン、バルサラジド）、コルチコイド（例えば、プレドニゾン、ブデソニド、ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ベタメタゾン、ベドメタゾン（ｂｅｄｏｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、チキソコルトール）の群において、選択される。
【０１１４】
本発明は、治療を必要としている対象者における腸の炎症性疾患を治療するための、本発明の薬学的組成物または薬剤の使用に関する。前記使用において、有効量の本発明の薬剤または薬学的組成物の前記対象者への投与は、１つ以上の治療薬と組み合わせて、行われる。前記１つ以上の治療薬は、抗ＴＮＦ、ナタリズマブ、抗ＩＬｌ、抗ＩＬ−６、抗ＩＬ−１２、抗ＩＬ−１７および抗ＩＬ−２３、ＩＬ−１受容体拮抗薬類縁体（アナキンラ）、５アミノサリチル酸および類縁体（例えば、メサラジン、スルファサラジン（ｓｕｌｆａｚａｌｉｎｅ）、オルサラジン、バルサラジド）、コルチコイド（例えば、プレドニゾン、ブデソニド、ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ベタメタゾン、ベドメタゾン（ｂｅｄｏｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、チキソコルトール）の群において、選択される。
【０１１５】
別の実施形態において、本発明は、治療を必要としている対象者に本発明の薬剤または薬学的組成物を投与すべき腸の炎症性疾患の治療方法にも関する。前記方法において、前記対象者は、１つ以上の治療薬に対し、適切に反応しないかまたは適切に反応しない可能性がある。前記１つ以上の治療薬は、抗ＴＮＦ、ナタリズマブ、抗ＩＬｌ、抗ＩＬ−６、抗ＩＬ−１２、抗ＩＬ−１７および抗ＩＬ−２３、ＩＬ−１受容体拮抗薬類縁体（アナキンラ）、５アミノサリチル酸および類縁体（例えば、メサラジン、スルファサラジン（ｓｕｌｆａｚａｌｉｎｅ）、オルサラジン、バルサラジド）、コルチコイド（例えば、プレドニゾン、ブデソニド、ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ベタメタゾン、ベドメタゾン（ｂｅｄｏｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、チキソコルトール）、プロバイオティクス（例えば、サッカロマイセスブラウディ、メトトレキサート、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、サリドマイド、レフルノミド）の群中にある。
【０１１６】
本発明は、本発明の薬学的組成物または薬剤の使用に関する。前記使用にいて、前記対象者は、１つ以上の治療薬に対し、適切に反応しないかまたは適切に反応しない可能性がある。前記１つ以上の治療薬は、抗ＴＮＦ、ナタリズマブ、抗ＩＬｌ、抗ＩＬ−６、抗ＩＬ−１２、抗ＩＬ−１７および抗ＩＬ−２３、ＩＬ−１受容体拮抗薬類縁体（アナキンラ）、５アミノサリチル酸および類縁体（例えば、メサラジン、スルファサラジン（ｓｕｌｆａｚａｌｉｎｅ）、オルサラジン、バルサラジド）、コルチコイド（例えば、プレドニゾン、ブデソニド、ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ベタメタゾン、ベドメタゾン（ｂｅｄｏｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、チキソコルトール）、プロバイオティクス（例えば、サッカロマイセスブラウディ、メトトレキサート、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、サリドマイド、レフルノミド）の群中にある。
【０１１７】
「不適切な反応」および「適切に応答しない」または「適切に応答しない可能性がある」とは、実際のまたは推定される対象者からの反応を指し、当該対象者に関する限り、当該治療が有効ではないか、毒性があるかまたは免疫寛容性が低いかあるいはそのような可能性があることを、示している。
【０１１８】
実施例
以下の記載において、詳細なプロトコルの無い全ての実験は、標準的なプロトコルに基づいて行われる。
【０１１９】
以下の実施例は、本発明の好適な実施形態を示すために包含される。当業者であれば、以下の実施例中に開示される技術は、本発明者によって発見された技術を本発明の実施において良好に機能するように示し、よって、好適な実施様式を構成するものとしてみなすことができることを理解するであろう。しかし、当業者であれば、本開示を鑑みれば、開示される特定の実施形態において多くの変更が可能であり、本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様のまたは類似の結果を得ることができることを理解するであろう。
実験１
実験手順
マウス
【０１２０】
Ｊａｎｖｉｅｒ（Ｌｅ  Ｇｅｎｅｓｔ−Ｓｔ−Ｉｓｌｅ、フランス）から、７週齢のメスのＢａｌｂ／ｃマウスを入手した。
ＴＲｌ細胞の分化
【０１２１】
先ず、Ｂａｌｂ／ｃ脾細胞を２．５１０６個の細胞／ｍｌにおいてＹｓｓｅｌ培地中で培養した。前記Ｙｓｓｅｌ培地には、一般的なマウス繁殖用食餌（ＳＡＦＥ）において見受けられるダイズまたは魚タンパク質の存在下において、ＩＬ−２（１００ＵＩ／ｍｌ）プラスＩＬ−４（２０ｎｇ／ｍｌ）を添加した。細胞を３７℃において５％のＣＯ２で培養し、同一培地において必要な場合、分割した。その後、２４−ウェルプレート内の４．１０５個の照射自家脾細胞の存在下、前記ダイズまたは魚タンパク質の存在下でマウスＴ細胞を週一回刺激した。２週間または５週間の間、週一回Ｔ細胞集団を再度刺激した。
サイトカインアッセイ
【０１２２】
照射自家脾細胞（４．１０５個）の存在下または不在下で前記特異的抗原（魚またはダイズタンパク質）で刺激したＴ細胞集団（５．１０５個の細胞）の４８時間後の上清に対し、サンドイッチＥＬＩＳＡを行った。ＥＬＩＳＡは、抗ＩＬ−４（１１Ｂ１１）、抗ＩＬ−１０（２Ａ５）、抗ＩＦＮ−γ（ＸＧＭ１．２）、ビオチン抗ＩＬ−４（２４Ｇ２）、抗ＩＬ−１０（ＳＸＣｌ）、抗ＩＦＮ−γ（Ｒ４−６Ａ２）（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて行った。
大腸炎の誘導
【０１２３】
大腸炎の誘導のため、０日目から５日目にかけて、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ、ＩＣＮ、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）をマウスの飲料水に添加した。
結果
【０１２４】
マウスにおける大腸炎の治療のための、食物抗原に対するマウスＴＲ１の使用
【０１２５】
これらの実験において、魚タンパク質およびダイズタンパク質に対するマウスＴｒ１細胞を用いた。なぜならば、魚粉およびダイズタンパク質からのタンパク質は、マウスの繁殖のための一般的食物抗原であるからである。
【０１２６】
図１は、魚タンパク質（図１Ａ）およびダイズタンパク質（図１Ｂ）に対して特異的なＴｒ１細胞のサイトカイン発現プロファイルを示す。
【０１２７】
マウスを水中の５％のＤＳＳで５日間処置して急性炎症性大腸炎を誘導し、前記マウスの体重を５日目、６日目および７日目に測定した。
【０１２８】
図２Ａにおいて、第１群のマウスには処置を行わず、第２群には１日目に１０６個のマウス抗魚Ｔｒ１細胞を注入した。
【０１２９】
図２Ｂにおいて、第１群のマウスには処置を行わず、第２群を１日目および３日目に４．１０５個のマウス抗ダイズＴｒ１細胞で処置し、６日目に３．１０５個のマウス抗ダイズＴｒ１細胞で処置した。
【０１３０】
図２Ｃは、８日目の結腸細胞によるＩＦＮ−γ産生も、マウス抗ダイズＴｒ１細胞の投与により阻害されていることを示す。
【０１３１】
これらの実験の結果から、一般的なマウスの食餌からの食物抗原に対するＴｒ１細胞を投与した結果、体重減少が阻害され、また、マウスにおいてＤＳＳによって誘導された炎症性大腸炎を制御することが可能となった。
実験２
実験手順
オボアルブミン特異的Ｔｒ１クローンの作製
【０１３２】
健康なドナーまたはクローン病患者の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から、オボアルブミン特異的Ｔｒ１クローンを作製した。Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心法（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）によるＰＢＭＣ単離後、３７℃、５％ＣＯ２において、Ｘ−Ｖｉｖｏ１５（Ｃａｍｂｒｅｘ、Ｅａｓｔ  Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ、ＮＪ）中の天然照射オボアルブミン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ−Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）およびサイトカイン富化ショウジョウバエフィーダー細胞上清の存在下、、細胞を培養した。培養を数日間行った後、３７℃、５％ＣＯ２で、Ｘ−Ｖｉｖｏ１５中のショウジョウバエフィーダー細胞の層において、限界希釈法により、細胞をクローン化する。その後、ショウジョウバエフィーダー細胞上で５０億個まで増殖させる前に、成長クローンを採取し、抗原特異性およびＴｒ１細胞同一性について試験を行う。
ショウジョウバエフィーダー細胞
【０１３３】
ショウジョウバエフィーダー細胞をＴｘＣｅｌｌによって操作して、Ｔｒ１細胞クローンの刺激および成長を改善する。膜貫通形のマウス抗ヒトＣＤ３抗体、ヒトＣＤ８０、ヒトＣＤ５８、ヒトＩＬ−２およびヒト１Ｌ−４により、シュナイダーショウジョウバエ細胞をトランスフェクトした。ＰＡＡ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐａｓｈｉｎｇ、オーストリア）からのＥｘｐｒｅｓｓ  ｆｉｖｅ培地中で、細胞を定期的に培養する。
サイトカインアッセイ
【０１３４】
抗原特異性の判定のため、抗原提示細胞（４．１０５個）の存在下および特異的抗原（オボアルブミン）の存在下または不在下で刺激したＴ細胞クローンの４８時間後の上清に対し、サンドイッチＥＬｌＳＡを行った。サイトカイン産生プロファイルの決定のため、オボアルブミン特異的Ｔｒ１細胞クローンを抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８モノクローナル抗体コーテッドビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で刺激し、４８時間後に上清を採取した。Ｄｉａｃｌｏｎｅ（Ｂｅｓａｎｃｏｎ、フランス）からの市販のキットを用いて、ＥＬＩＳＡを行った。
抑制アッセイ
【０１３５】
共培養における抑制を調べるため、自家ＣＤ４＋Ｔリンパ球と共に、段階的な量のオボアルブミン特異的Ｔｒ１クローンを共培養した。共培養を抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８モノクローナル抗体コーテッドビーズで刺激した。３日後、Ｒｏｃｈｅ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ．Ｓｃｉｅｎｃｅ、バーゼル、スイス）からのＷＳＴ−１増殖キットを用いて、全体の細胞増殖を評価した。抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８モノクローナル抗体コーテッドビーズにより活性化されたＴｒ１細胞の希釈上清を用いて、自家ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖の抑制も４８時間評価した。抗ＩＬ−１０および抗ＴＧＦβモノクローナル抗体は、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓから購入し、１０μｇ／ｍｌで用いた。
毒性調査
【０１３６】
Ｔｒ１クローンの核型を「ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ  Ｇｅｎａｚｕｒ」（ニース、フランス）において行った。Ｇ．Ｂｕｔｌｅｒ  ｂｒｏｗｎ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  ｍｙｏｌｏｇｙ、Ｉｎｓｅｒｍ  Ｕ７８７、パリ）のチームにより、テロメアの長さ測定が標準的手順（１３）に従って行われた。Ｔｒ１細胞をＸ−Ｖｉｖｏｌ５中で９６ウェルプレートに１細胞／ウェルで播種することにより、クローン形成能評価を行った。この評価の際、成長因子（ＩＬ−２、２００ＵＩ／ｍｌおよびＩＬ−４、２０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ＭＮから購入）と共に若しくは無しに、又は半固形寒天培地中の成長因子を有するか若しくは有さない４００００個の細胞／ｍｌを共に用いた。８週間続けて、１週間に一度クローンの成長の評価を行った。
結果
【０１３７】
先ず、抗オボアルブミン特異的Ｔｒ１細胞の製造プロセスを、健康なドナーからの末梢血細胞で展開させた。この第１のステップは、天然オボアルブミン、ＩＬ−２およびＩＬ−４と共に末梢血単核細胞を培養して、オボアルブミン特異的Ｔリンパ球を濃縮／拡大することを含む。このステップの終了時、限界希釈法により、細胞をクローン化する。膜貫通形の抗ＣＤ３モノクローナル抗体、ヒトＣＤ８０、ヒトＣＤ５８、ヒトＩＬ−２およびヒトＩＬ−４で安定的にトランスフェクトされたショウジョウバエ由来（シュナイダー細胞）からのフィーダー細胞の層上に前記オボアルブミン特異的Ｔ細胞濃縮ＰＢＭＣを播種することにより、Ｔ細胞のクローン化およびＴ細胞クローンのさらなる拡大を達成する。この戦略の結果、Ｔ細胞クローンの効率的増殖（図３ａ）が得られる。この方法により、１２〜１５週以内に５０億個よりも多くのモノクローナルＴｒ１細胞集団が産生され得る。前記拡大ステップにおいて、成長クローンの評価を、オボアルブミンに対する特異性およびＴｒ１特異的同一性について行う。照射自家ＰＢＭＣによって提示されるオボアルブミンの存在下で培養された細胞クローンの上清中のＥＬＩＳＡにより検出されたＩＬ−１０の産生により、オボアルブミンに対する特異性を観察する。Ｔｒ１細胞同一性についても、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８コーテッドビーズによる前記クローンのポリクローナル活性化後、ＥＬＩＳＡによって観察する。選択されたクローンの例を図３中のパネルＢおよびＣ中に示す。重要なことに、このプロセスにおいて、ショウジョウバエフィーダー細胞を用いることで、動物またはヒト血清が全く無くても、Ｔｒ１細胞の拡大が可能となる。５０人よりも多くの健康なドナーに対してこのプロセスを展開した結果、この方法により、ほとんど大多数の（９０％よりも多くの）個体において、オボアルブミン特異的Ｔｒ１細胞が単離可能であることが示される。これが示唆しているのは、オボアルブミン、そしてより広くは食物抗原、に対する免疫寛容は、Ｔｒ１細胞を含む抑制機構によって部分的に達成されるため、この抑制細胞の集団は経口免疫寛容の中央制御性エフェクターであることと関係する。
【０１３８】
前記選択されたＴｒ１細胞クローンをより深く特徴付けるために、前記Ｔｒ１細胞クローンについて、従来の抑制アッセイにおいて抑制機能をインビトロで分析した。この目的のため、同一ドナーから選択された段階的な量のＴｒ１クローンの存在下で、精製ＣＤ４＋Ｔリンパ球を抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８モノクローナル抗体コーテッドビーズを用いてインビトロで活性化させた。図４は、これらの実験において、Ｔｒ１細胞は、実に１６個の標的細胞のうち１個の割合で、自家ＣＤ４＋Ｔリンパ球の増殖を阻害することを示す（図４、パネルＡ）。同種の増殖アッセイにおいて、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８モノクローナル抗体コーテッドビーズによりインビトロで活性化されたＴｒ１クローンの培養上清も、接触を介した抑制よりもより不連続な様子が一貫して観察される抑制活性を示している（図４、パネルＢ）。これは、Ｔ細胞増殖におけるＴｒ１細胞の阻害作用は可溶性因子によって部分的に媒介されることを示唆している。驚くべきことではないが、これらの上清の抑制作用は、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βに対するブロッキング抗体により阻害される（図４、パネルＣ）。これらの異なる実験は、発明者らの手順に従って単離された細胞は、Ｔｒ１細胞について記載されているものと同様の抑制能を表すことを示す。実際、活性化Ｔｒ１クローンによって産生されたＩＬ−１０およびＴＧＦ−βは、Ｔ細胞増殖を阻害するように機能し、双方のサイトカインのブロッキングにより、Ｔｒ１細胞上清の抑制作用が完全にブロックされ、これにより、これらの可溶性因子は相乗的にＴ細胞増殖を抑制させることが示される。前記選択されたクローンのＴｒ１同一性を表現型ベースでさらに確認するために、制御性細胞マーカＣＤ２５、Ｆｏｘｐ３、ＧＩＴＲおよびＣＴＬＡ−４のその表面発現について評価した。これらの分子は全て、活性化Ｔｒ１細胞の大部分によって発現し、数日間刺激無しで前記細胞を培養中に放置した後、静止状態において下方制御される（図５）。
【０１３９】
この製造プロセスの開発は、患者へ注入される細胞を作製することを目的としているため、前記作製されたＴ細胞クローンにおける遺伝子異常の不在、または細胞生存／増殖特性の調節解除を実証するために、実験を行った。異なるドナーからの４個のクローンに対して核型分析を行ったところ、常に正常プロファイルを示す（図６）。また、ショウジョウバエフィーダー細胞による慢性刺激下でのＴｒ１クローンの生存能力についても分析した。この分析は、老化前に行われた最大倍加の評価と、液体および半固形培地中のクローンのクローン形成能の評価とにより、行った（表１）。最後に、３０倍加したクローン（１０９個の細胞に相当）と、１０倍加した細胞との間で、倍加時間およびテロメアの長さを比較した（表１）。これらの実験は全て、細胞治療のためのこれらの制御性Ｔｒ１リンパ球の使用と適合して拡大された前記Ｔｒ１細胞クローンにおける増殖および老化の正常な制御を示した。
【０１４０】
表１：倍加ポテンシャル、クローン形成能およびテロメアの長さの制御に関する、オボアルブミン特異的Ｔｒ１クローンのキャラクタリゼーション
【表１】
0005908670.tif 000002
【０１４１】
最後に、患者の血液細胞を用いた前記製造プロセスの実現可能性を実証するために、オボアルブミン特異的Ｔｒ１細胞クローンを成功裏に作製し、クローン病患者のＰＢＭＣから１０億個まで拡大した（図７）。
【０１４２】
結論として、重度の難治性クローン病患者の治療のためのオボアルブミン特異的Ｔｒ１細胞クローンを１０億個まで作製することが可能な製造プロセスを確立した。これらの細胞は当該炎症性腸に対して自家であり、その特異的抗原オボアルブミンとの遭遇後に前記炎症性サイトカインを放出する、という仮説を立てた。
【０１４３】
この仮説についての試験およびこの治療の忍容性についての評価のために、フェーズＩ／ＩＩａの臨床試験が、重度の難治性クローン病患者に対して２００８年３月から開始されている。
【０１４４】
従来の治療（例えば、非ステロイド抗炎症薬剤（ＮＳＡＩＤ（例えばＰｅｎｔａｓａ）、コルチコイド（ソルプレド、プレドニゾロン）、免疫抑制剤（アザチオプリン、メトトレキサート）および抗ＴＮＦベースの薬物療法（レミケード、ヒュミラ、シムジア））に対して難治性であるクローン病患者の数が増えている。消化管の持続性の炎症状況は生活の質及び生活の満足度の低下に直結するため、これらの患者を、慢性活動性クローン病患者（ＣＡＣＤ）の観点においてグループ分けすることができる。ＣＡＣＤ患者のクローン病活動係数（ＣＤＡＩ）の履歴は、少なくとも６か月間にわたって２２０以上である。
【０１４５】
このクローン病活動係数またはＣＤＡＩは、クローン病患者の症状を定量化する際に用いられる研究手段である。これは、クローン病治療に用いられる薬物療法に対して行われる研究調査において、重要な意味を持つ。より新規の薬物に関するほとんどの研究では、疾患の反応または寛解を規定する目的のためにＣＤＡＩを用いている。スコアが２２０を越えている場合、患者の病状が活性化していることを示し、ＣＤＡＩが１５０以下である場合、患者の疾患の寛解を示す。
ＣＤＡＩ計算表
0005908670.tif 000003
＊合併症：関節痛、ブドウ膜炎、結節性紅斑、アフタ性潰瘍、壊疽性膿皮症、裂肛、新規瘻孔、膿瘍（項目毎に１スコア）。
【０１４６】
難治性ＣＡＣＤ患者に対し、抗原オボアルブミンに対し特異的なＴｒ１細胞クローンを静脈内投与した。
【０１４７】
図８は、オボアルブミン特異的Ｔｒ１細胞による治療５週後のＣＡＣＤ患者におけるＣＤＡＩの低下による寛解の誘導を示す（パネルＡ）。腹痛（パネルＢ）、１週あたりの液状便または軟便の数（パネルＣ）、および一般的な生活の満足度のスコア（パネルＤ）の減少により、ＣＤＡＩの低下が部分的に達成されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
0005908670.tif 000008
【図６】
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【図７】
0005908670.tif 000010
【図８】
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