(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（１）および（２）を含む、保護アミノ酸または保護ペプチドの製造方法；（１）ハロゲン系溶媒またはエーテル系溶媒に可溶で、かつ極性溶媒に不溶な分子量が３００以上のアンカーに由来するアンカー基によりＣ末端のカルボキシ基が保護されたＮ−保護 Ｃ−保護アミノ酸またはＮ−保護 Ｃ−保護ペプチドを、前記アンカーとＮ−保護アミノ酸またはＮ−保護ペプチドとを反応させた反応液から単離することなく、Ｎ末端の保護基を除去して、Ｃ−保護アミノ酸またはＣ−保護ペプチドを得る工程、および
（２）工程（１）の後に、６０〜９５％含水アセトニトリルを含む溶媒でＣ−保護アミノ酸またはＣ−保護ペプチドを沈殿させて、固液分離により取得する工程。
【請求項２】
以下の工程（３）〜（５）を含む、ペプチドの製造方法；
（３）ハロゲン系溶媒またはエーテル系溶媒に可溶で、かつ極性溶媒に不溶な分子量が３００以上のアンカーに由来するアンカー基によりＣ末端のカルボキシ基が保護されたＣ−保護アミノ酸またはＣ−保護ペプチドのＮ末端アミノ基と、Ｎ−保護アミノ酸またはＮ−保護ペプチドのＣ末端カルボキシ基とを溶媒中で縮合させ、Ｎ−保護 Ｃ−保護ペプチドを得る工程、
（４）工程（３）で得られたＮ−保護 Ｃ−保護ペプチドを単離することなく、工程（３）の反応液中でＮ末端の保護基を除去して、Ｃ−保護ペプチドを得る工程、および
（５）工程（４）の後に、６０〜９５％含水アセトニトリルを含む溶媒でＣ−保護ペプチドを沈殿させて、固液分離により取得する工程。
【請求項３】
工程（５）の後に、Ｃ−保護ペプチドのＣ末端のアンカー基を除去する工程（６）をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ハロゲン系溶媒またはエーテル系溶媒に可溶で、かつ極性溶媒に不溶な分子量が３００以上のアンカーが、下記式（Ｉ）：
【化１】
0006011528.tif 000014
［式中、
Ｒ１は、水素原子であるか、あるいはＲｂが下記式（ａ）で表される基である場合には、Ｒ３と一緒になって単結合を示して、環Ａおよび環Ｂと共にフルオレン環を形成していてもよく；
ｐ個のＲ２は、独立してそれぞれ脂肪族炭化水素基を有する有機基を示し；
ｐは、１〜４の整数を示し；
環Ａは、ｐ個のＯＲ２に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよく；
Ｒａは、水素原子、またはハロゲン原子により置換されていてもよいフェニル基を示し；かつ
Ｒｂは、水素原子、または式（ａ）：
【化２】
0006011528.tif 000015
（式中、＊は結合位置を示し；
ｒは、０〜４の整数を示し；
ｒ個のＲ４は、独立してそれぞれ脂肪族炭化水素基を有する有機基を示し；
Ｒ３は、水素原子を示すか、またはＲ１と一緒になって単結合を示して、環Ａおよび環Ｂと共にフルオレン環を形成していてもよく；かつ
環Ｂは、ｒ個のＯＲ４に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。）で表される基を示し；かつ
Ｙは、ヒドロキシ基、ＮＨＲ（Ｒは水素原子、アルキル基またはアラルキル基を示す。）またはハロゲン原子を示す。］
で表される化合物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
式（Ｉ）中のＹがヒドロキシ基であり、Ｒ１が水素原子であり、Ｒ２および／またはＲ４が炭素数５〜６０の脂肪族炭化水素基であり、ｐが１〜３の整数であり、かつｒが０〜２の整数である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
式（Ｉ）中のＹがヒドロキシ基であり、Ｒａ、Ｒｂ、およびＲ１が共に水素原子であり、Ｒ２が炭素数５〜６０の脂肪族炭化水素基であり、かつｐが１〜３の整数である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
式（Ｉ）中のＹがヒドロキシ基であり、Ｒａ、Ｒｂ、およびＲ１が共に水素原子であり、Ｒ２が炭素数１０〜４０のアルキル基であり、かつｐが２または３である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
式（Ｉ）中のＹがヒドロキシ基であり、Ｒａ、Ｒｂ、およびＲ１が共に水素原子であり、Ｒ２が炭素数１２〜３０のアルキル基であり、かつｐが２または３である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
式（Ｉ）中のＹがヒドロキシ基であり、Ｒａ、Ｒｂ、およびＲ１が共に水素原子であり、Ｒ２が炭素数１２〜３０のアルコキシ基を１〜３個有するベンジル基であり、かつｐが１〜３の整数である、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
式（Ｉ）中のＹがヒドロキシ基であり、Ｒａ、Ｒｂ、およびＲ１が共に水素原子であり、Ｒ２が炭素数１２〜３０のアルコキシ基を１〜３個有するシクロヘキシルメチル基であり、かつｐが１〜３の整数である、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
式（Ｉ）で表される化合物が、
３，４，５−トリ（オクタデシルオキシ）ベンジルアルコール、
２，４−ジ（ドコシルオキシ）ベンジルアルコール、
４−メトキシ−２−［３’，４’，５’−トリ（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ］ベンジルアルコール、
４−メトキシ−２−［３’，４’，５’−トリ（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］ベンジルアルコール、
２−メトキシ−４−［３’，４’，５’−トリ（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］ベンジルアルコール、
４−［３’，４’，５’−トリ（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］ベンジルアルコール、
３，５−ジメトキシ−４−［３’，４’，５’−トリ（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］ベンジルアルコール、
２，４−ジ（ドデシルオキシ）ベンジルアルコール、
３，４，５−トリ（オクタデシルオキシ）ベンジルアミン、
ビス（４−ドコシルオキシフェニル）メタノール、および
ビス（４−ドコシルオキシフェニル）メチルアミンからなる群より選択される化合物である、請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
含水アセトニトリルのアセトニトリル含量が、７０ｖ／ｖ％〜９０ｖ／ｖ％である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
含水アセトニトリルのアセトニトリル含量が、７５ｖ／ｖ％〜８５ｖ／ｖ％である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
含水アセトニトリルのアセトニトリル含量が、８０ｖ／ｖ％である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
含水アセトニトリルを含む溶媒が、含水アセトニトリルと、メタノール、エタノール、ジメチルホルムアミド、プロピオニトリル、ジメチルスルホキシド、アセトン、ジクロロメタン、クロロホルム、テトラヒドロフラン、シクロペンチルメチルエーテルおよび酢酸エチルからなる群より選択される少なくとも１種の溶媒との混合溶媒である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
含水アセトニトリルを含む溶媒が、含水アセトニトリルである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
Ｎ−保護アミノ酸またはＮ−保護ペプチドにおけるアミノ基の保護基が、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基またはベンジルオキシカルボニル基である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
以下の工程（１）および（２）：
（１）分子量が３００以上のアンカーに由来するアンカー基によりＣ末端のカルボキシ基が保護されたＮ−保護 Ｃ−保護アミノ酸またはＮ−保護 Ｃ−保護ペプチドを、前記アンカーとＮ−保護アミノ酸またはＮ−保護ペプチドとを反応させた反応液から単離することなく、Ｎ末端の保護基を除去して、Ｃ−保護アミノ酸またはＣ−保護ペプチドを得る工程、および
（２）工程（１）の後に、６０〜９５％含水アセトニトリルを含む溶媒でＣ−保護アミノ酸またはＣ−保護ペプチドを沈殿させて、固液分離により取得する工程
を含み、
分子量が３００以上のアンカーが、下記式（Ｉ）：
【化３】
0006011528.tif 000016
［式中、
Ｒ１は、水素原子であるか、あるいはＲｂが下記式（ａ）で表される基である場合には、Ｒ３と一緒になって単結合を示して、環Ａおよび環Ｂと共にフルオレン環を形成していてもよく；
ｐ個のＲ２は、独立してそれぞれ脂肪族炭化水素基を有する有機基を示し；
ｐは、１〜４の整数を示し；
環Ａは、ｐ個のＯＲ２に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよく；
Ｒａは、水素原子、またはハロゲン原子により置換されていてもよいフェニル基を示し；かつ
Ｒｂは、水素原子、または式（ａ）：
【化４】
0006011528.tif 000017
（式中、＊は結合位置を示し；
ｒは、０〜４の整数を示し；
ｒ個のＲ４は、独立してそれぞれ脂肪族炭化水素基を有する有機基を示し；
Ｒ３は、水素原子を示すか、またはＲ１と一緒になって単結合を示して、環Ａおよび環Ｂと共にフルオレン環を形成していてもよく；かつ
環Ｂは、ｒ個のＯＲ４に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。）で表される基を示し；かつ
Ｙは、ヒドロキシ基、ＮＨＲ（Ｒは水素原子、アルキル基またはアラルキル基を示す。）またはハロゲン原子を示す。］
で表される化合物である、保護アミノ酸または保護ペプチドの製造方法。
【請求項１９】
以下の工程（３）〜（５）：
（３）分子量が３００以上のアンカーに由来するアンカー基によりＣ末端のカルボキシ基が保護されたＣ−保護アミノ酸またはＣ−保護ペプチドのＮ末端アミノ基と、Ｎ−保護アミノ酸またはＮ−保護ペプチドのＣ末端カルボキシ基とを溶媒中で縮合させ、Ｎ−保護 Ｃ−保護ペプチドを得る工程、
（４）工程（３）で得られたＮ−保護 Ｃ−保護ペプチドを単離することなく、工程（３）の反応液中でＮ末端の保護基を除去して、Ｃ−保護ペプチドを得る工程、および
（５）工程（４）の後に、６０〜９５％含水アセトニトリルを含む溶媒でＣ−保護ペプチドを沈殿させて、固液分離により取得する工程
を含み、
分子量が３００以上のアンカーが、下記式（Ｉ）：
【化５】
0006011528.tif 000018
［式中、
Ｒ１は、水素原子であるか、あるいはＲｂが下記式（ａ）で表される基である場合には、Ｒ３と一緒になって単結合を示して、環Ａおよび環Ｂと共にフルオレン環を形成していてもよく；
ｐ個のＲ２は、独立してそれぞれ脂肪族炭化水素基を有する有機基を示し；
ｐは、１〜４の整数を示し；
環Ａは、ｐ個のＯＲ２に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよく；
Ｒａは、水素原子、またはハロゲン原子により置換されていてもよいフェニル基を示し；かつ
Ｒｂは、水素原子、または式（ａ）：
【化６】
0006011528.tif 000019
（式中、＊は結合位置を示し；
ｒは、０〜４の整数を示し；
ｒ個のＲ４は、独立してそれぞれ脂肪族炭化水素基を有する有機基を示し；
Ｒ３は、水素原子を示すか、またはＲ１と一緒になって単結合を示して、環Ａおよび環Ｂと共にフルオレン環を形成していてもよく；かつ
環Ｂは、ｒ個のＯＲ４に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。）で表される基を示し；かつ
Ｙは、ヒドロキシ基、ＮＨＲ（Ｒは水素原子、アルキル基またはアラルキル基を示す。）またはハロゲン原子を示す。］
で表される化合物である、ペプチドの製造方法。
【請求項２０】
式（Ｉ）中のＹがヒドロキシ基であり、Ｒ１が水素原子であり、Ｒ２および／またはＲ４が炭素数５〜６０の脂肪族炭化水素基であり、ｐが１〜３の整数であり、かつｒが０〜２の整数である、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
式（Ｉ）中のＹがヒドロキシ基であり、Ｒａ、Ｒｂ、およびＲ１が共に水素原子であり、Ｒ２が炭素数５〜６０の脂肪族炭化水素基であり、かつｐが１〜３の整数である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
式（Ｉ）中のＹがヒドロキシ基であり、Ｒａ、Ｒｂ、およびＲ１が共に水素原子であり、Ｒ２が炭素数１０〜４０のアルキル基であり、かつｐが２または３である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
式（Ｉ）中のＹがヒドロキシ基であり、Ｒａ、Ｒｂ、およびＲ１が共に水素原子であり、Ｒ２が炭素数１２〜３０のアルキル基であり、かつｐが２または３である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
式（Ｉ）中のＹがヒドロキシ基であり、Ｒａ、Ｒｂ、およびＲ１が共に水素原子であり、Ｒ２が炭素数１２〜３０のアルコキシ基を１〜３個有するベンジル基であり、かつｐが１〜３の整数である、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２５】
式（Ｉ）中のＹがヒドロキシ基であり、Ｒａ、Ｒｂ、およびＲ１が共に水素原子であり、Ｒ２が炭素数１２〜３０のアルコキシ基を１〜３個有するシクロヘキシルメチル基であり、かつｐが１〜３の整数である、請求項１８または１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、中間体の単離、精製操作を極力省略し、簡便な操作により高純度かつ高収率で目的とするペプチドを得ることが可能な工業的製造に適した方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ペプチドの製造方法には、固相法と液相法の他に、近年、反応を均一な液相で行い、反応後に溶媒組成を変化させ単離・精製を濾過および洗浄だけで行える保護基（以下、アンカー基ともいう。）を用いた製造方法（以下、アンカー法ともいう。）が提案されてきた。アンカー法は、ペプチド合成等においてアミノ酸またはペプチドのＣ末端および／または側鎖の官能基を保護するためのアンカー基を形成する化合物（アンカー）として、溶媒組成の変化に応じて溶解状態と不溶化（沈殿）状態とが可逆的に変化する特定の化合物を用いるペプチドの製造方法である。ここで、アンカー基とは、該基が反応基質に結合することにより非極性溶媒に可溶化し、液相中の反応が可能であると共に、極性溶媒の添加により沈殿し、固液分離が可能となる保護基を意味し、反応性と後処理の簡便性を兼ね備えたものである。アンカーとは、アンカー基を形成するための化合物を意味する。【０００３】
例えば、特許文献１および非特許文献１には、それぞれ３，４，５−トリ（ｎ−オクタデシルオキシ）ベンジルアルコールをカルボキシ基等のアンカーとする手法が開示されている。また、特許文献２〜４には、それぞれ３，５−ジ（ドコシルオキシ）ベンジルアルコール、２，４−ジ（ドコシルオキシ）ベンジルアルコール、トリチル型化合物等のアンカーが開示されている。【０００４】
本発明者もアンカー法に使用可能なアンカーとして既に特定のジフェニルメタン化合物（特許文献５）およびフルオレン化合物（特許文献６）を開発してきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０００−４４４９３号公報
【特許文献２】国際公開第２００６／１０４１６６号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００７／０３４８１２号パンフレット
【特許文献４】国際公開第２００７／１２２８４７号パンフレット
【特許文献５】国際公開第２０１０／１１３９３９号パンフレット
【特許文献６】国際公開第２０１０／１０４１６９号パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ  ７４，７３３−７３８（２００１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記アンカー法は、ペプチド合成等の有機合成方法において、後処理が簡便でスケールアップが可能である等、固相反応と液相反応の利点を兼備した有用な手法であり、工業的な観点からも注目されているが、ペプチド合成等の逐次的に多段階の合成反応を必要とする場合においては、次工程で望ましくない副反応、例えば、残留アミノ酸に起因するダブルヒット化合物の副生等、を起こさないために、各工程で濃縮、貧溶媒による沈殿、濾過、洗浄および乾燥という単離・精製操作を繰り返す必要があり、操作工程数が多いため、多大な時間とコストを要することが工業化への障壁となっている。ここで、ダブルヒット化合物とは、目的のペプチドにさらにアミノ酸残基が一つ余分に挿入されたペプチドを意味する。【０００８】
本発明は、以上のような従来のアンカー法によるペプチド合成特有の課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、中間体の単離・精製操作を極力省略し、ワンポットで連続して行うことができる工程を組み込んだ、簡便かつ工業的にも有用なペプチドの製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、Ｃ末端カルボキシ基の保護基としてアンカー基を有するアミノ酸またはペプチドと、Ｎ末端アミノ基が保護基（以下、一時保護基ともいう。）により一時的に保護されたアミノ酸またはペプチドとの縮合後に、濃縮、沈殿、濾過、洗浄および乾燥という一連の単離・精製操作を省略して、一時保護基の除去工程まで連続してワンポットで行えることを見出した。なお、本発明のペプチドの製造方法では、アンカー基ではなく、一時保護基を除去して、遊離Ｎ末端アミノ基を形成し、これに新たなアミノ酸またはペプチドのＣ末端カルボキシ基を反応させて、ペプチド鎖の伸長を行うものである。そのため、アンカー基と区別するために、Ｎ末端アミノ基を一時的に保護する保護基を、本明細書では「一時保護基」と呼ぶ。【００１０】
上記のようなワンポット工程を繰り返し効率良く行うためには、副反応の原因となる残留アミノ酸を完全に淘汰することが必要であるが、本発明者は、上記一時保護基の除去後に、含水アセトニトリルを含む溶媒の添加による沈殿化および固液分離を行うことにより、縮合生成物から残留アミノ酸を完全に除去できることを見出し、本発明を完成するに至った。本発明は以下の通りである。【００１１】
［１］  以下の工程（１）および（２）を含む、保護アミノ酸または保護ペプチドの製造方法；
（１）ハロゲン系溶媒またはエーテル系溶媒に可溶で、かつ極性溶媒に不溶な分子量が３００以上のアンカーに由来するアンカー基によりＣ末端のカルボキシ基が保護されたＮ−保護 Ｃ−保護アミノ酸またはＮ−保護 Ｃ−保護ペプチドを、前記アンカーとＮ−保護アミノ酸またはＮ−保護ペプチドとを反応させた反応液から単離することなく、Ｎ末端の保護基を除去して、Ｃ−保護アミノ酸またはＣ−保護ペプチドを得る工程、および
（２）工程（１）の後に、６０〜９５％含水アセトニトリルを含む溶媒でＣ−保護アミノ酸またはＣ−保護ペプチドを沈殿させて、固液分離により取得する工程。
［２］  以下の工程（３）〜（５）を含む、ペプチドの製造方法；
（３）ハロゲン系溶媒またはエーテル系溶媒に可溶で、かつ極性溶媒に不溶な分子量が３００以上のアンカーに由来するアンカー基によりＣ末端のカルボキシ基が保護されたＣ−保護アミノ酸またはＣ−保護ペプチドのＮ末端アミノ基と、Ｎ−保護アミノ酸またはＮ−保護ペプチドのＣ末端カルボキシ基とを溶媒中で縮合させ、Ｎ−保護 Ｃ−保護ペプチドを得る工程、
（４）工程（３）で得られたＮ−保護 Ｃ−保護ペプチドを単離することなく、工程（３）の反応液中でＮ末端の保護基を除去して、Ｃ−保護ペプチドを得る工程、および
（５）工程（４）の後に、６０〜９５％含水アセトニトリルを含む溶媒でＣ−保護ペプチドを沈殿させて、固液分離により取得する工程。
［３］  工程（５）の後に、Ｃ−保護ペプチドのＣ末端のアンカー基を除去する工程（６）をさらに含む、上記［２］に記載の方法。
［４］  ハロゲン系溶媒またはエーテル系溶媒に可溶で、かつ極性溶媒に不溶な分子量が３００以上のアンカーが、下記式（Ｉ）：【００１２】
【化１】
0006011528.tif 000002
【００１３】
［式中、
Ｒ１は、水素原子であるか、あるいはＲｂが下記式（ａ）で表される基である場合には、Ｒ３と一緒になって単結合を示して、環Ａおよび環Ｂと共にフルオレン環を形成していてもよく；
ｐ個のＲ２は、独立してそれぞれ脂肪族炭化水素基を有する有機基を示し；
ｐは、１〜４の整数を示し；
環Ａは、ｐ個のＯＲ２に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよく；
Ｒａは、水素原子、またはハロゲン原子により置換されていてもよいフェニル基を示し；かつ
Ｒｂは、水素原子、または式（ａ）：【００１４】
【化２】
0006011528.tif 000003
【００１５】
（式中、＊は結合位置を示し；
ｒは、０〜４の整数を示し；
ｒ個のＲ４は、独立してそれぞれ脂肪族炭化水素基を有する有機基を示し；
Ｒ３は、水素原子を示すか、またはＲ１と一緒になって単結合を示して、環Ａおよび環Ｂと共にフルオレン環を形成していてもよく；かつ
環Ｂは、ｒ個のＯＲ４に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。）で表される基を示し；かつ
Ｙは、ヒドロキシ基、ＮＨＲ（Ｒは水素原子、アルキル基またはアラルキル基を示す。）またはハロゲン原子を示す。］
で表される化合物である、上記［２］または［３］に記載の方法。
［５］  式（Ｉ）中のＹがヒドロキシ基であり、Ｒ１が水素原子であり、Ｒ２および／またはＲ４が炭素数５〜６０の脂肪族炭化水素基であり、ｐが１〜３の整数であり、かつｒが０〜２の整数である、上記［４］に記載の方法。
［６］  式（Ｉ）中のＹがヒドロキシ基であり、Ｒａ、Ｒｂ、およびＲ１が共に水素原子であり、Ｒ２が炭素数５〜６０の脂肪族炭化水素基であり、かつｐが１〜３の整数である、上記［４］に記載の方法。
［７］  式（Ｉ）中のＹがヒドロキシ基であり、Ｒａ、Ｒｂ、およびＲ１が共に水素原子であり、Ｒ２が炭素数１０〜４０のアルキル基であり、かつｐが２または３である、上記［４］に記載の方法。
［８］  式（Ｉ）中のＹがヒドロキシ基であり、Ｒａ、Ｒｂ、およびＲ１が共に水素原子であり、Ｒ２が炭素数１２〜３０のアルキル基であり、かつｐが２または３である、上記［４］に記載の方法。
［９］  式（Ｉ）で表される化合物が、
３，４，５−トリ（オクタデシルオキシ）ベンジルアルコール、
２，４−ジ（ドコシルオキシ）ベンジルアルコール、
４−メトキシ−２−［３’，４’，５’−トリ（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ］ベンジルアルコール、
４−メトキシ−２−［３’，４’，５’−トリ（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］ベンジルアルコール、
２−メトキシ−４−［３’，４’，５’−トリ（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］ベンジルアルコール、
４−［３’，４’，５’−トリ（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］ベンジルアルコール、
３，５−ジメトキシ−４−［３’，４’，５’−トリ（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］ベンジルアルコール、
２，４−ジ（ドデシルオキシ）ベンジルアルコール、
３，４，５−トリ（オクタデシルオキシ）ベンジルアミン、
ビス（４−ドコシルオキシフェニル）メタノール、および
ビス（４−ドコシルオキシフェニル）メチルアミンからなる群より選択される化合物である、上記［４］に記載の方法。
［１０］  含水アセトニトリルのアセトニトリル含量が、７０ｖ／ｖ％〜９０ｖ／ｖ％である、上記［２］〜［９］のいずれか一つに記載の方法。
［１１］  含水アセトニトリルのアセトニトリル含量が、７５ｖ／ｖ％〜８５ｖ／ｖ％である、上記［２］〜［９］のいずれか一つに記載の方法。
［１２］  含水アセトニトリルのアセトニトリル含量が、８０ｖ／ｖ％である、上記［２］〜［９］のいずれか一つに記載の方法。
［１３］  含水アセトニトリルを含む溶媒が、含水アセトニトリルと、メタノール、エタノール、ジメチルホルムアミド、プロピオニトリル、ジメチルスルホキシド、アセトン、ジクロロメタン、クロロホルム、テトラヒドロフラン、シクロペンチルメチルエーテルおよび酢酸エチルからなる群より選択される少なくとも１種の溶媒との混合溶媒である、上記［２］〜［１２］のいずれか一つに記載の方法。
［１４］  含水アセトニトリルを含む溶媒が、含水アセトニトリルである、上記［２］〜［１２］のいずれか一つに記載の方法。
［１５］  Ｎ−保護アミノ酸またはＮ−保護ペプチドにおけるアミノ基の保護基が、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基またはベンジルオキシカルボニル基である、上記［２］〜［１４］のいずれか一つに記載の方法。
［１６］  脱保護工程後に、アセトニトリルおよび水を含有する極性溶媒中での沈殿化工程を有することを特徴とする、連続的改良Ｃ末端固定化保護Ｎ末端伸長法によるペプチドの製造方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のペプチドの製造方法によれば、縮合工程に使用するアミン成分（Ｃ末端カルボキシ基の保護基としてアンカーを有するアミノ酸またはペプチド）のＮ末端アミノ基の一時保護基の除去後に含水アセトニトリルを含む溶媒による沈殿化、および固液分離操作を行うだけで、残留アミノ酸等を効果的に淘汰することができる。これにより、当該アミン成分とＮ末端アミノ基が、例えば、一時保護基により保護されたアミノ酸またはペプチドとの縮合工程、および続く一時保護基の除去工程を、中間体の単離・精製操作を経ることなく、連続してワンポットで高収率かつ高純度で行うことができる。そのため、工業的製造に適した簡便かつ効率的なペプチドの製造方法を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
文中で特に断らない限り、本明細書で用いるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味をもつ。本明細書に記載されたものと同様または同等の任意の方法および材料は、本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及したすべての刊行物および特許は、例えば、記載された発明に関連して使用されうる刊行物に記載されている、構築物および方法論を記載および開示する目的で、参照として本明細書に組み入れられる。
【００１８】
本発明の方法により製造されるペプチドの構成単位となるアミノ酸は、同一分子内にアミノ基とカルボキシ基を有する化合物であって、天然アミノ酸でも、非天然アミノ酸でもよく、またＬ体でも、Ｄ体でも、あるいはラセミ体でもよい。また、ペプチドは、そのアミノ酸配列に応じて、アミノ酸成分のアミノ基と、別のアミノ酸成分のカルボキシ基との脱水縮合工程（縮合工程）を繰り返すことにより合成される。以下、このペプチド結合の形成に関与する２つのアミノ酸成分の内、アミノ基を提供するものをアミン成分、カルボキシ基を提供するものを酸成分と称することがある。
【００１９】
本発明における縮合工程に使用される酸成分のＮ末端アミノ基の一時保護基は、例えば、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（以下、Ｆｍｏｃ基ともいう。）、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基（以下、Ｂｏｃ基ともいう。）またはベンジルオキシカルボニル基（以下、Ｃｂｚ基ともいう。）であり、好ましくはＦｍｏｃ基またはＢｏｃ基である。
【００２０】
本明細書において、「Ｎ−保護アミノ酸」または「Ｎ−保護ペプチド」とは、そのＮ末端アミノ基が一時保護基で保護されており、カルボキシ基が保護されていないアミノ酸またはペプチドを意味する。
【００２１】
本明細書において、「Ｃ−保護アミノ酸」または「Ｃ−保護ペプチド」とは、そのＣ末端カルボキシ基が、ハロゲン系溶媒またはエーテル系溶媒に可溶で、かつ極性溶媒に不溶な分子量が３００以上のアンカー（例えば、ベンジル化合物、ジフェニルメタン化合物、またはフルオレン化合物）と縮合して、アンカー基を形成することで保護されており、Ｎ末端アミノ基が保護されていないアミノ酸またはペプチドを意味する。
【００２２】
本明細書において、「Ｎ−保護 Ｃ−保護アミノ酸」または「Ｎ−保護 Ｃ−保護ペプチド」とは、上記「Ｃ−保護アミノ酸」または「Ｃ−保護ペプチド」のＮ末端アミノ基が一時保護基で保護されたものを意味する。
【００２３】
本発明におけるハロゲン系溶媒としては、例えば、クロロホルム、ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン、クロロベンゼン等のハロゲン化炭化水素が挙げられる。ハロゲン系溶媒は、２種以上の混合溶媒でもよい。ハロゲン系溶媒の中では、クロロホルムおよびジクロロメタンが特に好ましい。
【００２４】
本発明におけるエーテル系溶媒としては、例えば、１，４−ジオキサン、シクロペンチルメチルエーテル（以下、ＣＰＭＥと称することもある。）、テトラヒドロフラン（以下、ＴＨＦと称することもある。）等が挙げられる。エーテル系溶媒は、２種以上の混合溶媒でもよい。エーテル系溶媒の中でもＣＰＭＥおよびＴＨＦが特に好ましい。
【００２５】
本発明における極性溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトニトリル、プロピオニトリル、ジメチルホルムアミド（以下、ＤＭＦと称することもある。）、ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、水等、ならびにこれら２種以上の混合溶媒が挙げられる。
【００２６】
「含水アセトニトリルを含む溶媒」における「含水アセトニトリル」とは、アセトニトリルと水の混合溶媒を意味する。含水アセトニトリル中のアセトニトリルの含量の下限は、６０ｖ／ｖ％が好ましく、７０ｖ／ｖ％がより好ましく、７５ｖ／ｖ％が更に好ましい。一方、含水アセトニトリル中のアセトニトリルの含量の上限は、９５ｖ／ｖ％が好ましく、９０ｖ／ｖ％がより好ましく、８５ｖ／ｖ％が更に好ましい。特に好ましい含水アセトニトリル中のアセトニトリルの含量は、８０ｖ／ｖ％である。本明細書においては、例えば、アセトニトリルの含量が８０ｖ／ｖ％である含水アセトニトリルを「８０％含水アセトニトリル」と表記することがある。
【００２７】
「含水アセトニトリルを含む溶媒」は、上記「含水アセトニトリル」のみでもよく、また他の有機溶媒との混合溶媒であってもよい。他の有機溶媒としては、含水アセトニトリルと混合して残留アミノ酸等を淘汰できるものであれば特に限定されないが、メタノール、エタノール等のアルコール系溶媒、ＤＭＦ等のアミド系溶媒、プロピオニトリル等のニトリル系溶媒（アセトニトリルを除く）、ハロゲン系溶媒、エーテル系溶媒、ジメチルスルホキシド、アセトン、酢酸エチル等が挙げられる。
【００２８】
本発明におけるハロゲン系溶媒またはエーテル系溶媒に可溶で、かつ極性溶媒に不溶な分子量が３００以上のアンカーの一実施態様は、下記式（Ｉ）で表される化合物である。これらの中でも、分子量４００以上のものが好ましい。
【００２９】
式（Ｉ）：
【００３０】
【化３】
0006011528.tif 000004
【００３１】
［式中、
Ｒ１は、水素原子であるか、あるいはＲｂが下記式（ａ）で表される基である場合には、Ｒ３と一緒になって単結合を示して、環Ａおよび環Ｂと共にフルオレン環を形成していてもよく； 
ｐ個のＲ２は、独立してそれぞれ脂肪族炭化水素基を有する有機基を示し；
ｐは、１〜４の整数を示し；
環Ａは、ｐ個のＯＲ２に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよく；
Ｒａは、水素原子、またはハロゲン原子により置換されていてもよいフェニル基を示し；かつ
Ｒｂは、水素原子、または式（ａ）：
【００３２】
【化４】
0006011528.tif 000005
【００３３】
（式中、＊は結合位置を示し；
ｒは、０〜４の整数を示し；
ｒ個のＲ４は、独立してそれぞれ脂肪族炭化水素基を有する有機基を示し；
Ｒ３は、水素原子を示すか、またはＲ１と一緒になって単結合を示して、環Ａおよび環Ｂと共にフルオレン環を形成していてもよく；かつ
環Ｂは、ｒ個のＯＲ４に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。）で表される基を示し；かつ
Ｙは、ヒドロキシ基、ＮＨＲ（Ｒは水素原子、アルキル基またはアラルキル基を示す。）またはハロゲン原子を示す。］
【００３４】
上記式（Ｉ）で表されるアンカーは、保護化を意図する化合物と結合する。すなわち、Ｙがヒドロキシ基、−ＮＨＲ基、またはハロゲン原子であるアンカーは、アミノ酸またはペプチドのＣ末端等のカルボキシ基と縮合することにより、化合物を保護化する。
【００３５】
本明細書中、Ｒで示される「アルキル基」としては、直鎖または分岐鎖のＣ１−３０アルキル基が挙げられ、好ましくはＣ１−１０アルキル基、より好ましくはＣ１−６アルキル基である。好適な具体例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル等が挙げられ、特にメチル、エチルが好ましい。
【００３６】
本明細書中、Ｒで示される「アラルキル基」としては、Ｃ７−３０アラルキル基が挙げられ、好ましくはＣ７−２０アラルキル基、より好ましくはＣ７−１６アラルキル基（Ｃ６−１０アリール−Ｃ１−６アルキル基）である。好適な具体例としては、ベンジル、１−フェニルエチル、２−フェニルエチル、１−フェニルプロピル、ナフチルメチル、１−ナフチルエチル、１−ナフチルプロピル等が挙げられ、特にベンジルが好ましい。
【００３７】
Ｒとしては、水素原子、Ｃ１−６アルキル基またはＣ７−１６アラルキル基が好ましく、水素原子、メチル、エチルまたはベンジルがより好ましく、水素原子が特に好ましい。
【００３８】
本明細書中、「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子である。本明細書中、Ｙで示される「ハロゲン原子」としては、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が好ましく、臭素原子がより好ましい。
【００３９】
本明細書中、Ｒ２またはＲ４として示される「脂肪族炭化水素基を有する有機基」とは、その分子構造中に脂肪族炭化水素基を有する１価の有機基である。
【００４０】
「脂肪族炭化水素基を有する有機基」における「脂肪族炭化水素基」とは、直鎖または分岐状の飽和または不飽和の脂肪族炭化水素基であり、炭素数５以上の脂肪族炭化水素基が好ましく、炭素数５〜６０の脂肪族炭化水素基がより好ましく、炭素数５〜３０の脂肪族炭化水素基がさらに好ましく、炭素数１０〜３０の脂肪族炭化水素基が特に好ましい。
「脂肪族炭化水素基を有する有機基」における「脂肪族炭化水素基」の部位は、特に限定されず、末端に存在しても（１価基）、それ以外の部位に存在してもよい（例えば２価基）。
【００４１】
「脂肪族炭化水素基」としては、アルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基、シクロアルケニル基、アルキニル基等の１価基およびそれらから誘導される２価基が挙げられ、好ましくは、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、デシル基、ドデシル基、ラウリル基、トリデシル基、ミリスチル基、セチル基、ステアリル基、アラキル基、ベヘニル基、オレイル基、イソステアリル基等の１価基およびそれらから誘導される２価基が挙げられる。
【００４２】
「脂肪族炭化水素基を有する有機基」中の「脂肪族炭化水素基」以外の部位は任意に設定することができる。例えば、リンカーとして−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯＮＨ−、および−ＣＯＮＨ−、並びに、炭化水素基（１価基または２価基）等の部位を有していてもよい。「炭化水素基」としては、例えば、脂肪族炭化水素基、芳香脂肪族炭化水素基、単環式飽和炭化水素基および芳香族炭化水素基等が挙げられ、具体的には、例えば、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基等の１価基およびそれらから誘導される２価基が用いられる。「アルキル基」としては、例えば、Ｃ１−６アルキル基等が好ましく、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル等が挙げられる。「アルケニル基」としては、例えば、Ｃ２−６アルケニル基等が好ましく、例えば、ビニル、１−プロペニル、アリル、イソプロペニル、ブテニル、イソブテニル等が挙げられる。「アルキニル基」としては、例えば、Ｃ２−６アルキニル基等が好ましく、例えば、エチニル、プロパルギル、１−プロピニル等が挙げられる。「シクロアルキル基」としては、例えば、Ｃ３−６シクロアルキル基等が好ましく、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル等が挙げられる。「アリール基」は、例えば、Ｃ６−１４アリール基等が好ましく、例えば、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、ビフェニリル、２−アンスリル等が挙げられる。中でもＣ６−１０アリール基がより好ましく、フェニルが特に好ましい。「アラルキル基」としては、例えば、Ｃ７−２０アラルキル基が好ましく、例えば、ベンジル、１−フェニルエチル、２−フェニルエチル、１−フェニルプロピル、ナフチルメチル、１−ナフチルエチル、１−ナフチルプロピル等が挙げられる。中でも、Ｃ７−１６アラルキル基（Ｃ６−１０アリール−Ｃ１−６アルキル基）がより好ましく、ベンジルが特に好ましい。当該「炭化水素基」は、ハロゲン原子（塩素原子、臭素原子、フッ素原子、ヨウ素原子）、１個以上のハロゲン原子により置換されていてもよい炭素数１〜６のアルキル基、オキソ基等から選択される置換基で置換されていてもよい。
【００４３】
上記式（Ｉ）中のＯＲ２基またはＯＲ４基を構成する「脂肪族炭化水素基を有する有機基」は、分岐等によって複数の「脂肪族炭化水素基」が存在してもよい。「脂肪族炭化水素基を有する有機基」中に「脂肪族炭化水素基」が複数存在する場合には、その各々は同一のものであっても異なるものであってもよい。
【００４４】
上記式（Ｉ）中のＲ２またはＲ４として示される「脂肪族炭化水素基を有する有機基」における、炭素数合計の下限は５が好ましく、１０がより好ましく、１２が更に好ましく、１４が更に一層好ましく、１６が殊更好ましく、２０が特に好ましい。一方、Ｒ２またはＲ４として示される「脂肪族炭化水素基を有する有機基」における、炭素数合計の上限は、２００が好ましく、１５０がより好ましく、１２０が更に好ましく、１００が更に一層好ましく、８０が殊更好ましく、６０が特に好ましく、４０が特に一層好ましく、３０が最も好ましい。当該炭素数が大きいほど、ペプチド鎖が長鎖となった場合でも、式（Ｉ）で表される化合物の極性溶媒における結晶性が良好となる。
【００４５】
「ＯＲ２」基または「ＯＲ４」基の好適な具体例として、ドデシルオキシ、セチルオキシ、オクタデシルオキシ、ドコシルオキシ、ドコシルオキシ−ドデシルオキシ、トリアコンチルオキシ等が挙げられる。「ＯＲ２」基または「ＯＲ４」基は合計でｐまたはｒ個存在し（ｐは１〜４の整数であり、ｒは０〜４の整数である。）、ｐは好ましくは２または３であり、ｒは好ましくは０〜２の整数である。
【００４６】
上記式（Ｉ）中の環Ａまたは環Ｂ中に有していてもよい置換基の好適な具体例としては、Ｃ１−６アルコキシ基（例、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ等のＣ１−４アルコキシ基）、１個以上のハロゲンで置換されていてもよいＣ１−６アルキル基（例、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル等のＣ１−６アルキル基、トリフルオロメチル、トリクロロメチル等のハロゲン置換されたＣ１−６アルキル基）、またはハロゲン原子が挙げられ、中でもＣ１−６アルコキシ基が好ましい。
【００４７】
上記式（Ｉ）で表されるアンカーの好ましい態様としては、式（Ｉ）中、
Ｙがヒドロキシ基であり；
Ｒ１が水素原子であり；
Ｒ２および／またはＲ４が炭素数５〜６０の脂肪族炭化水素基であり；
ｐが１〜３の整数であり；かつ
ｒが０〜２の整数である化合物である。
【００４８】
上記式（Ｉ）で表されるアンカーの別の好ましい態様としては、式（Ｉ）中、
Ｙがヒドロキシ基であり；
Ｒａ、Ｒｂ、およびＲ１が共に水素原子であり；
Ｒ２が炭素数５〜６０の脂肪族炭化水素基であり；かつ
ｐが１〜３の整数である化合物である。
【００４９】
上記式（Ｉ）で表されるアンカーの別の好ましい態様としては、式（Ｉ）中、
Ｙがヒドロキシ基であり；
Ｒａ、Ｒｂ、およびＲ１が共に水素原子であり；
Ｒ２が炭素数１０〜４０のアルキル基であり；かつ
ｐが２または３である化合物である。
【００５０】
上記式（Ｉ）で表されるアンカーの別の好ましい態様としては、式（Ｉ）中、
Ｙがヒドロキシ基であり；
Ｒａ、Ｒｂ、およびＲ１が共に水素原子であり；
Ｒ２が炭素数１２〜３０のアルキル基であり；かつ
ｐが２または３である化合物である。
【００５１】
上記式（Ｉ）で表されるアンカーの別の好ましい態様としては、式（Ｉ）中、
Ｙがヒドロキシ基であり；
Ｒａ、Ｒｂ、およびＲ１が共に水素原子であり；
Ｒ２が炭素数１２〜３０のアルコキシ基を１〜３個有するベンジル基であり；
ｐが１〜３の整数である化合物である。
【００５２】
上記式（Ｉ）で表されるアンカーの別の好ましい態様としては、式（Ｉ）中、
Ｙがヒドロキシ基であり；
Ｒａ、Ｒｂ、およびＲ１が共に水素原子であり；
Ｒ２が炭素数１２〜３０のアルコキシ基を１〜３個有するシクロヘキシルメチル基であり；
ｐが１〜３の整数である化合物である。
【００５３】
本発明におけるハロゲン系溶媒またはエーテル系溶媒に可溶で、かつ極性溶媒に不溶な分子量が３００以上のアンカーの好ましい例としては、以下のアンカーが挙げられる。
３，４，５−トリ（オクタデシルオキシ）ベンジルアルコール、
２，４−ジ（ドコシルオキシ）ベンジルアルコール、
４−メトキシ−２−［３’，４’，５’−トリ（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ］ベンジルアルコール、
４−メトキシ−２−［３’，４’，５’−トリ（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］ベンジルアルコール、
２−メトキシ−４−［３’，４’，５’−トリ（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］ベンジルアルコール、
４−［３’，４’，５’−トリ（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］ベンジルアルコール、
３，５−ジメトキシ−４−［３’，４’，５’−トリ（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］ベンジルアルコール、
２，４−ジ（ドデシルオキシ）ベンジルアルコール、
３，４，５−トリ（オクタデシルオキシ）ベンジルアミン、
ビス（４−ドコシルオキシフェニル）メタノール、
ビス（４−ドコシルオキシフェニル）メチルアミン、および
２−（１２−ドコシルオキシ−ドデシルオキシ）−９−（３−フルオロフェニル）−９−ブロモフルオレン。
【００５４】
前記アンカーの製造方法としては、特に限定されないが、自体公知の方法（特許文献１〜６、非特許文献１参照）またはこれらに準ずる方法に従って原料化合物から製造することができる。なお、原料として使用する化合物、例えば、式（Ｉ）の基Ｒ２またはＲ４に対応するハロゲン化物等は、市販品として入手可能であるか、あるいは、自体公知の方法またはこれらに準ずる方法に従って製造することができる。
【００５５】
本発明に使用する酸成分およびアミン成分であるアミノ酸またはペプチドは、ペプチド結合の形成に関与するアミノ基またはカルボキシ基に加えて、アミノ基、カルボキシ基、ヒドロキシ基等の脱水縮合反応に供される官能基を有する場合が多い。これらの官能基を、主鎖のペプチド結合を形成するアミノ基およびカルボキシ基と区別して、側鎖官能基と称する。側鎖官能基は、本発明の本質を損なわない限り、必ずしも保護する必要はないが、脱水縮合反応によるペプチド結合の形成、ならびにＮ末端アミノ基の脱保護反応時に、望ましくない副反応を防ぐために、適切な保護基により保護するのが好ましい。
【００５６】
側鎖官能基の保護基は、前述のアミン成分におけるＣ末端カルボキシ基の保護基と同様に、Ｎ末端アミノ基の保護基との組み合わせにおいて、一定の制約を受ける。すなわち、側鎖官能基の保護基は、Ｎ末端アミノ基の一時保護基の除去条件においても除去されることなく、所望のアミノ酸配列が完成するまで保持される必要がある。尚、当該保護基は、脱水縮合反応によるペプチド結合の形成、並びに、Ｎ末端アミノ基の脱保護反応時に、側鎖官能基が望ましくない副反応を引き起こさなければ特に限定されない。
【００５７】
側鎖官能基の保護基としては、Ｎ末端アミノ基の一時保護基の脱保護条件において安定であれば、特に限定されず、例えば、ペプチド合成の基礎と実験、丸善株式会社出版（１９８５年）や、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス（ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ  ＧＲＯＵＰＳ  ＩＮ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ）、第３版、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（ＪＯＨＮ  ＷＩＬＬＹ＆ＳＯＮＳ）出版（１９９９年）等に記載されている保護基を挙げることができる。
【００５８】
側鎖官能基がカルボキシ基である場合は、エステル型保護基、アミド型保護基、ヒドラジド型保護基等を挙げることができる。
【００５９】
エステル型保護基としては、置換若しくは無置換のアルキルエステル、置換若しくは無置換のアラルキルエステルが好ましく用いられる。置換若しくは無置換のアルキルエステルとしては、メチルエステル、エチルエステル、ｔｅｒｔ−ブチルエステル、シクロヘキシルエステル、トリクロロエチルエステル、フェナシルエステル等が好ましく用いられる。置換若しくは無置換のアラルキルエステルとしては、ベンジルエステル、ｐ−ニトロベンジルエステル、ｐ−メトキシベンジルエステル、ジフェニルメチルエステル、９−フルオレニルメチル（Ｆｍ）エステル、４−ピコリル（Ｐｉｃ）エステル等が好ましく用いられる。
【００６０】
アミド型保護基としては、無置換のアミド、Ｎ−メチルアミド、Ｎ−エチルアミド、Ｎ−ベンジルアミド等の１級アミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミド、ピロリジニルアミド、ピペリジニルアミド等の２級アミド等が好ましく用いられる。
【００６１】
ヒドラジド型保護基としては、無置換のヒドラジド、Ｎ−フェニルヒドラジド、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルヒドラジド等が好ましく用いられる。
【００６２】
中でも、Ｎ−末端の一時保護基がＦｍｏｃ基の場合には、その脱保護条件下で安定なｔ−ブチルエステル、置換若しくは無置換のベンジルエステル等のエステル型保護基が好ましく用いられ、置換若しくは無置換のベンジルエステルが、比較的合成が容易であることから、特に好ましく用いられる。
【００６３】
側鎖官能基がアミノ基である場合は、ウレタン型保護基、アシル型保護基、スルホニル型保護基等を挙げることができる。
【００６４】
ウレタン型保護基としては、例えば、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）基等が用いられ、好ましくは、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、Ｂｏｃ基等である。中でもＮ−末端の一時保護基がＦｍｏｃ基の場合には、Ｂｏｃ基は、穏和な酸性条件下で選択的に脱保護ができることから、特に好ましく用いられる。また、Ｎ−末端の一時保護基がＢｏｃ基の場合には、Ｃｂｚ基、ブロモベンジルオキシカルボニル基が、特に好ましく用いられる。
【００６５】
アシル型保護基としては、例えば、ホルミル基、アセチル基、トリフルオロアセチル基等が好ましく用いられる。
【００６６】
スルホニル型保護基としては、例えば、ｐ−トルエンスルホニル（Ｔｓ）基、ｐ−トリルメタンスルホニル基、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル基等が好ましく用いられる。
【００６７】
上記以外の側鎖官能基についても、同様にＮ末端アミノ基の一時保護基の脱保護条件において安定な保護基を選んで用いることができる。
【００６８】
側鎖官能基は目的のペプチド結合を形成した後に、必要に応じて脱保護すればよい。
【００６９】
次に、本発明の製造方法について説明する。本発明の製造方法は、保護アミノ酸、保護ペプチドまたはペプチドの製造方法であって、Ｎ末端の一時保護基の除去後に含水アセトニトリルの添加による沈殿化工程および固液分離工程を含むことを特徴とする。
【００７０】
本発明の製造方法の第１の態様は、以下の工程（１）および（２）を含む保護アミノ酸または保護ペプチドの製造方法である：
（１）ハロゲン系溶媒またはエーテル系溶媒に可溶で、かつ極性溶媒に不溶な分子量が３００以上のアンカーに由来するアンカー基によりＣ末端のカルボキシ基が保護されたＮ−保護 Ｃ−保護アミノ酸またはＮ−保護 Ｃ−保護ペプチドを、前記アンカーとＮ−保護アミノ酸またはＮ−保護ペプチドとを反応させた反応液から単離することなく、Ｎ末端の保護基を除去して、Ｃ−保護アミノ酸またはＣ−保護ペプチドを得る工程（Ｎ末端の脱保護工程）、および
（２）工程（１）の後に、６０〜９５％含水アセトニトリルを含む溶媒でＣ−保護アミノ酸またはＣ−保護ペプチドを沈殿させて、固液分離により取得する工程（沈殿・固液分離工程）。
【００７１】
上記工程（１）にて使用するＮ−保護 Ｃ−保護アミノ酸またはＮ−保護 Ｃ−保護ペプチドは、以下の工程（ａ）によって製造することができる。以下では、工程（１）の説明の前に、まず工程（ａ）から説明する。
【００７２】
工程（ａ）（縮合工程）
本工程は、ハロゲン系溶媒またはエーテル系溶媒に可溶で、かつ極性溶媒に不溶な分子量が３００以上のアンカーを、溶媒中で、Ｎ−保護アミノ酸またはＮ−保護ペプチドのＣ末端カルボキシ基と縮合させて、Ｎ−保護 Ｃ−保護アミノ酸またはＮ−保護 Ｃ−保護ペプチドを得る工程である。
【００７３】
本工程で使用するＮ−保護ペプチドが、本工程で使用する溶媒に可溶である限り、Ｎ−保護ペプチドのアミノ酸残基数の上限に特に限定は無いが、Ｎ−保護ペプチドのアミノ酸残基数は、好ましくは１００以下、より好ましくは５０以下、さらに好ましくは３０以下、殊更好ましくは１０以下、特に好ましくは５以下である。
【００７４】
縮合反応は、アンカー、Ｎ−保護アミノ酸またはＮ−保護ペプチドおよび触媒量のジメチルアミノピリジンを溶媒に溶解させ、縮合剤を加えた後、攪拌して行うことが好ましい。
【００７５】
本工程は、反応に影響を及ぼさない溶媒中で行われる。当該溶媒における溶解度が高い程、優れた反応性が期待できるため、前記Ｎ−保護アミノ酸またはＮ−保護ペプチドの溶解度の高い溶媒を選択することが好ましい。具体的にはクロロホルム、ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン系溶媒；１，４−ジオキサン、シクロペンチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン等のエーテル系溶媒が挙げられる。これらの溶媒は２種以上を適宜の割合で混合して用いてもよい。また、上記ハロゲン系溶媒やエーテル系溶媒に、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類；プロピオニトリル等のニトリル類（アセトニトリルを除く）；アセトン、２−ブタノン等のケトン類；Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等のアミド類；ジメチルスルホキシド等のスルホキシド類を、本発明の製造方法で用いられる化合物が溶解し得る限り、適宜の割合で混合して用いてもよい。中でも、クロロホルム、ジクロロメタン、シクロペンチルメチルエーテルまたはテトラヒドロフランが好ましく、クロロホルムが特に好ましい。
【００７６】
本工程におけるＮ−保護アミノ酸またはＮ−保護ペプチドの溶液中の濃度は、溶解していれば特に限定されないが、好ましくは１〜３０ｗｔ％である。
【００７７】
本工程におけるＮ−保護アミノ酸またはＮ−保護ペプチドの使用量は、前記アンカー１モルに対し、１〜１０モル使用することができ、好ましくは１〜５モルである。
【００７８】
前記式（Ｉ）のＹがヒドロキシ基である場合、反応に影響を及ぼさない溶媒中、ジメチルアミノピリジン触媒下、縮合剤、および必要に応じて縮合促進剤を添加することによりエステル結合が形成される。
【００７９】
前記式（Ｉ）のＹが−ＮＨＲ基である場合、縮合促進剤存在下、縮合剤を添加してアミド結合が形成される。
【００８０】
前記式（Ｉ）のＹがハロゲン原子である場合、反応に影響を及ぼさない溶媒中、ジイソプロピルエチルアミンなどの塩基を添加することにより、エステル結合が形成される。
【００８１】
縮合促進剤としては、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１−ヒドロキシ−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−５−カルボン酸エチルエステル（ＨＯＣｔ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、Ｏ−（６−クロロベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）等が挙げられ、好ましくは、ＨＯＢｔである。
【００８２】
縮合促進剤の使用量は、前記アンカー１モルに対して、好ましくは０．０５〜１．５モルである。
【００８３】
縮合剤としては、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、Ｎ−エチル−Ｎ’−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミドおよびその塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ）、ヘキサフルオロリン酸（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウム（ＰｙＢｏｐ）、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム  テトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−５−クロロ−１Ｈ−ベンゾトリアゾリウム３−オキシド  ヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）、Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）等が挙げられる。
【００８４】
縮合剤の使用量は、前記アンカー１モルに対して、例えば１〜１０モルであり、好ましくは１〜５モルである。
【００８５】
反応温度は、反応が進行しさえすれば特に限定されないが、好ましくは−１０℃以上、より好ましくは０℃以上であり、好ましくは５０℃以下、より好ましくは３０℃以下である。反応時間は、例えば、１〜７０時間である。
【００８６】
工程（１）（Ｎ末端の脱保護工程）
本工程は、Ｎ−保護 Ｃ−保護アミノ酸またはＮ−保護 Ｃ−保護ペプチドを、アンカーとＮ−保護アミノ酸またはＮ−保護ペプチドとを反応させた反応液から単離することなく、そのＮ末端の一時保護基を除去する工程である。本工程は、除去工程後に中和工程を含んでいてもよい。
【００８７】
Ｎ−保護 Ｃ−保護アミノ酸またはＮ−保護 Ｃ−保護ペプチドのＮ末端の一時保護基の除去（脱保護）は、公知の方法に従い行うことができる。例えば、脱保護は、一時保護基がＦｍｏｃ基の場合には、有機塩基で処理することにより行われ、一時保護基がＢｏｃ基の場合には、酸で処理することにより行われ、一時保護基がＣｂｚ基の場合には接触還元等により行われる。脱保護は、その反応に影響を及ぼさない溶媒中で行われる。
【００８８】
Ｆｍｏｃ基の除去に使用し得る有機塩基としては特に限定されないが、ジエチルアミン、ピペリジン、モルホリン等の２級アミン類、ジイソプロピルエチルアミン、ジメチルアミノピリジン、１，８−ジアザビシクロ[５．４．０]−７−ウンデセン（ＤＢＵ）、１，４−ジアザビシクロ[２．２．２]オクタン（ＤＡＢＣＯ）、１，５−ジアザビシクロ[４．３．０]−５−ノネン（ＤＢＮ）等の３級アミン類が挙げられる。なかでも、ハロゲン系溶媒またはエーテル系溶媒中で脱保護を行う場合には、ＤＢＵ等が好ましい。有機塩基の使用量は、前記Ｎ−保護 Ｃ−保護アミノ酸またはＮ−保護 Ｃ−保護ペプチド１モルに対し、例えば１〜１００モル、好ましくは１〜１０モルである。
【００８９】
Ｂｏｃ基の除去に使用し得る酸としては特に限定されないが、塩化水素、硫酸、硝酸等の鉱酸類、ギ酸、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）等のカルボン酸類、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等のスルホン酸類等、またはこれらの混合物を用いることができる。混合物としては、例えば、臭化水素／酢酸、塩化水素／ジオキサン、塩化水素／酢酸等を挙げることができる。なかでも、水溶液ではない酸、例えば、非水系でギ酸またはメタンスルホン酸等を用いた場合には、例えば酸性条件下で加水分解を受けるカルボキシ基の保護基であるアンカー基を残しながら、選択的にＢｏｃ基を除去することも可能である。特に、メタンスルホン酸等の常温で液体であり、かつ水溶性のスルホン酸類は、非水系で用いた場合に、室温下で比較的少ない使用量で速やかに反応を進行させることができるため、好適である。酸の使用量は、前記Ｎ−保護 Ｃ−保護アミノ酸またはＮ−保護 Ｃ−保護ペプチド１モルに対し、例えば１〜１００モル、好ましくは１〜１０モルである。
【００９０】
Ｃｂｚ基の除去に使用し得る触媒としては特に限定されないが、例えばパラジウムなどが挙げられる。触媒の使用量は、前記Ｎ−保護 Ｃ−保護アミノ酸またはＮ−保護 Ｃ−保護ペプチド１００重量部に対し、例えば１重量部以上、好ましくは５重量部以上であり、例えば５０重量部以下、好ましくは３０重量部である。
【００９１】
反応に影響を及ぼさない溶媒としては、例えば、クロロホルム、ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン系溶媒；トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類；ジエチルエーテル、ＣＰＭＥ、ＴＨＦ、１，４−ジオキサン等のエーテル系溶媒；など、あるいはそれらの混合物が挙げられ、好ましくはクロロホルム、ジクロロメタンまたはＴＨＦである。
【００９２】
前記Ｎ末端の一時保護基がＦｍｏｃ基である場合には、脱保護に使用した過剰量の有機塩基が、場合により溶媒留去等の後処理中に反応生成物に対して悪影響を及ぼす可能性があるため、次の沈殿化、固液分離工程の前に酸の添加による中和工程を組み込んでもよい。
【００９３】
かかる中和工程に使用する酸としては、例えば、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸無水物、硫酸、塩化水素等が挙げられる。中でも、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、塩化水素が好ましい。
【００９４】
中和工程に使用する酸の使用量は、有機塩基１モルに対して、例えば０．５モル以上、好ましくは０．９モル以上であり、例えば１０モル以下、好ましくは５モル以下である。
【００９５】
工程（１）の反応の温度は、反応が進行しさえすれば特に限定されないが、好ましくは−１０℃以上、より好ましくは０℃以上であり、好ましくは５０℃以下、より好ましくは３０℃以下である。工程（１）の反応の時間は、例えば１〜７０時間である。
【００９６】
工程（２）（沈殿・固液分離工程）
当該工程は、上記工程（１）で得られたＣ−保護アミノ酸またはＣ−保護ペプチドを単離するために、Ｃ−保護アミノ酸またはＣ−保護ペプチドが溶解している溶媒を変化させ（例、溶媒組成の変更、溶媒の種類の変更）、沈殿させる工程である。すなわち、Ｃ−保護アミノ酸またはＣ−保護ペプチドが溶解するような条件下にて工程（１）の脱保護を行った後、溶媒置換することによってＣ−保護アミノ酸またはＣ−保護ペプチドを沈殿化させ、固液分離により不純物（遊離アミノ酸、遊離ペプチド等）を淘汰する。溶媒置換の前に、溶媒留去などを行ってもよい。
【００９７】
置換溶媒としては、メタノールやアセトニトリル等の極性溶媒を用いることができる。しかし、置換溶媒としてメタノールを用いると、残留アミノ酸は淘汰できるものの、溶媒の除去が不十分な場合には、単離操作時または次の縮合工程で、アンカー基とのエステル交換反応が起こる等の問題がある。そのため、メタノールを十分に除去するために乾燥工程を設ける必要があり、工業化には多大な時間を要してしまうという課題があった。また、後述するように置換溶媒としてアセトニトリルを用いると、残留アミノ酸を十分に淘汰することはできず、次の縮合工程に付した場合に、残留アミノ酸由来のダブルヒット化合物が副生することが分かった。また、置換溶媒として水を用いると、目的のペプチド化合物が不純物を含んだ状態で凝集してしまうため、残留するアミノ酸またはペプチドを効率よく除去することが困難であった。従って、Ｃ−保護アミノ酸またはＣ−保護ペプチドを反応混合物から純度よく単離するため、またはＣ−保護アミノ酸またはＣ−保護ペプチドを、引き続き縮合工程および脱保護工程からなるワンポット反応に付すのに十分な純度のＣ−保護アミノ酸またはＣ−保護ペプチドを得るためには、置換溶媒として、含水アセトニトリルを含む溶媒を使用することが必要である。
【００９８】
本工程において、含水アセトニトリル中のアセトニトリルの含量の下限は、６０ｖ／ｖ％が好ましく、７０ｖ／ｖ％がより好ましく、７５ｖ／ｖ％が更に好ましい。一方、含水アセトニトリル中のアセトニトリルの含量の上限は、９５ｖ／ｖ％が好ましく、９０ｖ／ｖ％がより好ましく、８５ｖ／ｖ％が更に好ましい。特に好ましい含水アセトニトリル中のアセトニトリルの含量は、８０ｖ／ｖ％である。
【００９９】
本工程において「含水アセトニトリルを含む溶媒」は、上記「含水アセトニトリル」のみでもよく、また上述したような他の有機溶媒との混合溶媒であってもよい。他の有機溶媒としては、メタノール、エタノール、ジメチルホルムアミド、プロピオニトリル、ジメチルスルホキシド、アセトン、ジクロロメタン、クロロホルム、テトラヒドロフラン、シクロペンチルメチルエーテルおよび酢酸エチルからなる群より選択される少なくとも１種の溶媒が好ましい。「含水アセトニトリルを含む溶媒」中の「含水アセトニトリル」の含量は、アミノ酸類を淘汰できる範囲であれば特に限定されないが、６０ｖ／ｖ％〜１００ｖ／ｖ％が好ましい。
【０１００】
本発明の製造方法の第２の態様は、以下の工程（３）〜（５）を含むペプチドの製造方法である：
（３）ハロゲン系溶媒またはエーテル系溶媒に可溶で、かつ極性溶媒に不溶な分子量が３００以上のアンカーに由来するアンカー基によりＣ末端のカルボキシ基が保護されたＣ−保護アミノ酸またはＣ−保護ペプチドのＮ末端アミノ基と、Ｎ−保護アミノ酸またはＮ−保護ペプチドのＣ末端カルボキシ基とを溶媒中で縮合させ、Ｎ−保護 Ｃ−保護ペプチドを得る工程、
（４）工程（３）で得られたＮ−保護 Ｃ−保護ペプチドを単離することなく、工程（３）の反応液中でＮ末端の保護基を除去して、Ｃ−保護ペプチドを得る工程（Ｎ末端の脱保護工程）、および
（５）工程（４）の後に、６０〜９５％含水アセトニトリルを含む溶媒でＣ−保護ペプチドを沈殿させて、固液分離により取得する工程（沈殿・固液分離工程）。
【０１０１】
工程（３）（縮合工程）
本工程は、工程（ａ）における前記式（Ｉ）のＹがＮＨＲである場合と同様の条件下、Ｃ−保護アミノ酸またはＣ−保護ペプチドのＮ末端アミノ基と、Ｎ−保護アミノ酸またはＮ−保護ペプチドのＣ末端カルボキシ基とを縮合させることにより行われる。
【０１０２】
本工程で使用するＣ−保護ペプチドが、本工程で使用する溶媒に可溶である限り、Ｃ−保護ペプチドのアミノ酸残基数の上限に特に限定は無いが、Ｃ−保護ペプチドのアミノ酸残基数は、好ましくは１００以下、より好ましくは５０以下、さらに好ましくは３０以下である。また、本工程で使用するＮ−保護ペプチドが、本工程で使用する溶媒に可溶である限り、Ｎ−保護ペプチドのアミノ酸残基数の上限に特に限定は無いが、Ｎ−保護ペプチドのアミノ酸残基数は、好ましくは１００以下、より好ましくは５０以下、さらに好ましくは３０以下、殊更好ましくは１０以下、特に好ましくは５以下である。
【０１０３】
工程（４）（Ｎ末端の脱保護工程）
本工程は、工程（１）におけるＮ末端の脱保護工程と同様にして行われる。
【０１０４】
工程（５）（沈殿・固液分離工程）
本工程は、工程（２）における沈殿・固液分離工程と同様にして行われる。
【０１０５】
上記工程（３）〜（５）を２回以上繰り返して、ペプチド鎖を伸長させたＣ−保護ペプチドを取得してもよい。ペプチド鎖を伸長させたＣ−保護ペプチドが、工程（３）で使用する溶媒に可溶である限り、ペプチド鎖を伸長させたＣ−保護ペプチドのアミノ酸残基数の上限に特に限定は無いが、このアミノ酸残基数は、好ましくは２００以下、より好ましくは１００以下、さらに好ましくは５０以下である。
【０１０６】
本発明のペプチドの製造方法は、工程（５）の沈殿工程の後に、Ｃ−保護ペプチドのＣ末端のアンカー基を除去する工程（６）をさらに含むことができる。
【０１０７】
Ｃ末端のアンカー基の除去（脱保護）により、ペプチドのＣ末端が−ＣＯＯＨ（例えば、前記式（Ｉ）のＹが、ヒドロキシ基、またはハロゲン原子である場合）、または−ＣＯＮＨＲ（例えば、前記式（Ｉ）のＹがＮＨＲ基である場合）である最終目的物であるペプチドが得られる。
【０１０８】
前記式（Ｉ）のＹが、ヒドロキシ基、またはハロゲン原子であるアンカー由来のアンカー基を選択的に除去する場合には、脱保護は好適には酸処理により行われる。脱保護に使用する酸としては、トリフルオロ酢酸（以下、ＴＦＡという。）、塩酸、硫酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等が挙げられ、中でも、ＴＦＡが好ましい。脱保護に使用する溶媒としては、例えば、クロロホルム、ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタンまたはこれらの混合溶媒等が挙げられる。脱保護に使用する酸の濃度は、例えば、０．１ｗ／ｖ％〜５ｗ／ｖ％である。
【０１０９】
前記式（Ｉ）のＹがヒドロキシ基、−ＮＨＲ基、またはハロゲン原子であるアンカー由来のアンカー基を、ペプチド中の他の側鎖の保護基と同時に除去することも可能である。その場合には、当該分野、特にペプチド合成、において行われている慣用の方法が用いられるが、酸などを加える方法が好適に採用される。酸としてＴＦＡ、塩酸、硫酸、メシル酸、トシル酸、トリフルオロエタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール等が使用される。中でもＴＦＡが特に好ましい。酸の使用量は、用いる酸の種類によって適宜設定され、アンカー基を除去するのに適当な量が用いられる。酸の使用量は、Ｃ−保護ペプチド１モルに対して、好ましくは３モル以上、より好ましくは５モル以上であり、好ましくは１００モル以下、より好ましくは５０モル以下である。これらの使用とともに、更なる強酸源として、トリフルオロメタンスルホン酸や、トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル、ＢＦ３・エーテラートなどを加えることもできる。
【０１１０】
反応温度は、反応が進行しさえすれば特に限定されないが、例えば０℃〜５０℃、好ましくは０℃〜３０℃である。反応時間は、例えば０．５〜２４時間である。
【０１１１】
上記工程（ａ）、（２）、（４）および（５）における反応の進行の確認は、いずれも一般的な液相有機合成反応と同様の方法を適用できる。すなわち、薄層シリカゲルクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等を用いて反応を追跡することができる。
【実施例】
【０１１２】
以下、参考例および実験例に沿って本発明をさらに詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。また、本発明において使用する試薬や装置、材料は特に言及されない限り、商業的に入手可能である。また、本明細書において、アミノ酸等を略号で表示する場合、各表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものである。【０１１３】
実験例で使用したアンカーは、自体公知の方法（前記特許文献１〜６、非特許文献１参照）またはこれらに準ずる方法、あるいは下記参考例１に準ずる方法に従って、公知（または市販品）の原料化合物から製造することができる。【０１１４】
参考例１：４−メトキシ−２−［３’，４’，５’−トリ（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ］ベンジルアルコール（アンカー（Ａ））の合成【０１１５】
【化５】
0006011528.tif 000006
【０１１６】
（ｉ）３，４，５−トリ（オクタデシルオキシ）ベンジルアルコール(８３．０ｇ，９０．８ｍｍｏｌ)をクロロホルム(８３０ｍｌ)に溶解し、０℃で塩化チオニル(２１．６ｇ，０．１８２ｍｏｌ)を加えて１．５時間室温で攪拌した。溶媒を留去し、残渣をアセトニトリル(８００ｍｌ)で晶析して３，４，５−トリ（オクタデシルオキシ）ベンジルクロリドを湿晶として９３．６ｇを得た。【０１１７】
（ｉｉ）３，４，５−トリ（オクタデシルオキシ）ベンジルクロリド(９３．６ｇ，ｗｅｔ，<９０．８ｍｍｏｌ)、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンズアルデヒド(１５．２ｇ，０．１０ｍｏｌ)、炭酸カリウム(３１．４ｇ，０．２３ｍｏｌ)をＤＭＦ(８３０ｍｌ)に懸濁し、８０℃で一晩攪拌した。反応液をクロロホルム(１６００ｍｌ)に溶解し、１Ｎ塩酸(８００ｍｌ)で３回、５ｗｔ％炭酸水素ナトリウム水溶液(８００ｍｌ)で１回、２０ｗｔ％食塩水(８００ｍｌ)で１回洗浄した。溶媒を留去し、残渣をメタノール(８００ｍｌ)で晶析し、アセトニトリル(８００ｍｌ)で洗浄して、４−メトキシ−２−［３’，４’，５’−トリ（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ］ベンズアルデヒド(９３．５ｇ,８９．２ｍｍｏｌ，収率９８％)を得た。【０１１８】
（ｉｉｉ）４−メトキシ−２−［３’，４’，５’−トリ（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ］ベンズアルデヒド(９３．５ｇ， ８９．２ｍｍｏｌ)をＴＨＦ−メタノール(１８７０ｍｌ＋９４ｍｌ)に溶解し、０℃で水素化ホウ素ナトリウム(４．０５ｇ，１０７ｍｍｏｌ)を加えた。室温で１．５時間攪拌した後、０℃で０．２Ｎ塩酸（１００ｍｌ）を加えて反応を停止した。溶媒を半分程度留去し、クロロホルム(２４００ｍｌ)に溶解して０．１Ｎ塩酸(１２００ｍｌ)で２回、５ｗｔ％炭酸水素ナトリウム水溶液(１２００ｍｌ)で１回、２０ｗｔ％食塩水(１２００ｍｌ)で１回洗浄した。溶媒を留去し、残渣をメタノール(９００ｍｌ)で晶析し、アセトニトリルで洗浄して、４−メトキシ−２−［３’，４’，５’−トリ（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ］ベンジルアルコール（アンカー（Ａ），９２．４ｇ，８８．０ｍｍｏｌ，収率９７％（vs ３，４，５−トリ（オクタデシルオキシ）ベンジルアルコール）)を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ０．８８（９Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，Ｃ１７Ｈ３４−Ｍｅ），１．１５−１．４０（８４Ｈ，ｂｒ，Ｃ３’，４’，５’−ＯＣ３Ｈ６−Ｃ１４Ｈ２８−ＣＨ３），１．４０−１．５５（６Ｈ，ｂｒ，Ｃ３’，４’，５’−ＯＣ２Ｈ４−ＣＨ２−Ｃ１５Ｈ３１），１．７０−１．８５（６Ｈ，ｍ，Ｃ３’，４’，５’−ＯＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ１６Ｈ３３），２．１８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，ＯＨ），３．７９（３Ｈ，ｓ，Ｃ４−ＯＭｅ），３．９０−４．０３（６Ｈ，ｍ，Ｃ３’，４’，５’−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ１７Ｈ３５），４．６５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，Ａｒ−ＣＨ２−ＯＨ），４．９７（２Ｈ，ｓ，Ａｒ−Ｏ−ＣＨ２−Ａｒ），６．４７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．１，８．１Ｈｚ，Ｃ５−Ｈ），６．５３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，Ｃ３−Ｈ），６．６０（２Ｈ，ｓ，Ｃ２’，６’−Ｈ），７．１９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，Ｃ６−Ｈ）【０１１９】
実験例１：沈殿化溶媒の違いによる不純物含量の比較
実験方法：
アンカー（Ａ）（５００ｍｇ）をクロロホルムに溶解させ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ（１．３当量）、ジメチルアミノピリジン（０．１５当量）、およびＥＤＣ・ＨＣｌ（１．４当量）を添加して反応させた。反応終了後の反応液に直接ジエチルアミン（１５当量）とＤＢＵ（２．５当量）を加えてＦｍｏｃ基を除去し、４Ｍ  ＨＣｌ／ＣＰＭＥ（２．５当量）で中和し、溶媒を減圧留去し、アセトニトリルのみまたは８０％含水アセトニトリルで沈殿させ、沈殿物をろ過してアセトニトリルでスラリー洗浄した。湿晶をクロロホルムに溶解させ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（１．１当量）と、ＥＤＣ・ＨＣｌ（１．２当量）およびＨＯＢｔ（０．１当量）を添加することにより縮合し、上記同様にＦｍｏｃ基を除去後、アセトニトリルのみ（または８０％含水アセトニトリル）で沈殿させた。さらに同じ操作を繰り返しＦｍｏｃ−Ｇｌｙと縮合後にＦｍｏｃ基を除去してトリペプチド保護体を得た。このようにして得られたトリペプチド保護体をＴＦＡでアンカー基および側鎖官能基の保護基を除去した。目的物であるＨ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−ＯＨ以外に生成した不純物（例えば、ダブルヒット化合物等）の含量をアセトニトリルのみで沈殿させた場合と８０％含水アセトニトリルで沈殿させた場合とで比較した。【０１２０】
ＨＰＬＣ測定条件
測定機器：島津製作所製  ＬＣ−２０Ａ
カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−Ａ  ４．６×１５０ｍｍ（５μｍ）
温度：４０℃
波長：２２０ｎｍ
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
溶離液：Ａ液  ０．０５ｖ／ｖ％ＴＦＡ−水
Ｂ液  ０．０５ｖ／ｖ％ＴＦＡ−ＭｅＣＮ
タイムプログラム：Ｂ液濃度  ０ｍｉｎ        １ｖ／ｖ％
２０ｍｉｎ    ５０ｖ／ｖ％
２５ｍｉｎ    ５０ｖ／ｖ％【０１２１】
実験結果：表１に示すように、アセトニトリルのみで沈殿化を繰り返した場合には、不純物が大量（４５面積％（ＨＰＬＣ分析データにおける目的のトリペプチドのピークに対する面積比））に副生してきたのに対し、８０％含水アセトニトリルによる沈殿化を繰り返した場合には、不純物の生成はほとんどみられなかった。【０１２２】
【表１】
0006011528.tif 000007
【０１２３】
実験例２：沈殿化溶媒によるアミノ酸淘汰性の比較
実験方法：
以下に示すアンカー（Ａ）、アンカー（Ｂ）またはアンカー（Ｃ）をクロロホルムに溶解させ、Ｆｍｏｃ−アミノ酸（以下、「Ｆｍｏｃ−Ｘａａ−ＯＨ」と表記することもある。）（１．２当量）、ジメチルアミノピリジン（０．１当量）、およびＥＤＣ・ＨＣｌ（１．３当量）を加えて脱水縮合させた。反応完結後、単離せずに反応液に直接ジエチルアミン（１５当量）とＤＢＵ（２当量）を加えて、Ｆｍｏｃ基を除去し、４Ｍ  ＨＣｌ／ＣＰＭＥ（２当量）の添加により中和し、溶媒を減圧留去させた。残渣に各種の置換溶媒を加えて攪拌し、沈殿物をろ過した。残渣に加えた置換溶媒と同じもので洗浄し、乾燥させ、Ｘａａ−Ｏ−アンカー基（アンカー（Ａ）由来）の粗結晶中の残留アミノ酸およびアミノ酸保護体（Ｈ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ）量を、アミノ酸分析およびＨＰＬＣにて測定した（表２）。【０１２４】
ＨＰＬＣの測定条件は実験例１と同じである。また、アミノ酸分析の測定条件を以下に記載する。
測定機器：ＡＡＡ（ＨＩＴＡＣＨＩ  Ｌ−８９００）
カラム：ＨＩＴＡＣＨＩ  ＃２６２２ＰＨ  ４．６ｍｍ×６０ｍｍ
ＨＩＴＡＣＨＩ  ＃２６５０Ｌ  ４．６ｍｍ×４０ｍｍ
溶媒：Ｌ−８５００ＰＨ  Ｋｉｔ
温度：５７℃【０１２５】
また、各種の置換溶媒を加えて得られた沈殿物をクロロホルムに溶解させ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕを加えて、ＥＤＣ・ＨＣｌ／ＨＯＢｔで縮合反応を行った。かかる反応液を少量採取し、ＴＦＡ中でアンカー基（下記アンカー（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）に由来）を除去して得られる粗Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−ＯＨ中のダブルヒット化合物（Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｘａａ−ＯＨ）含量を、実験例１と同じ測定条件でのＨＰＬＣによって測定した（表３）。【０１２６】
【表２】
0006011528.tif 000008
【０１２７】
【表３】
0006011528.tif 000009
【０１２８】
なお、実験例２で使用したアンカーは、参考例１に示したアンカー（Ａ）、式：【０１２９】
【化６】
0006011528.tif 000010
【０１３０】
で表されるアンカー（Ｂ）、および式：【０１３１】
【化７】
0006011528.tif 000011
【０１３２】
で表されるアンカー（Ｃ）である。【０１３３】
実験結果：
表２に示すように、アセトニトリルのみで沈殿化を行った場合に比べ、８０％含水アセトニトリルによる沈殿化を行うと、効率よく残留アミノ酸を淘汰できることが分かった。また、表３に示すように、本発明で規定する範囲内の含水アセトニトリル（特に、８０％含水アセトニトリル）で沈殿化を行うことにより、ペプチド合成の際に問題となるダブルヒット化合物の副生が顕著に抑えられることが分かった。【０１３４】
実験例３：各種Ｆｍｏｃ−アミノ酸共存下でのジペプチド合成時におけるアミノ酸淘汰性の比較
実験方法：
合成単離したＦｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｏ−アンカー基（上記アンカー（Ｂ）または（Ｃ）に由来）をクロロホルムに溶解させ、各種Ｆｍｏｃ−アミノ酸（０．２当量）を加えて溶液中に混在させた。この溶液にＤＢＵとジエチルアミンを加えてＦｍｏｃ基を除去し、各種の置換溶媒の添加による沈殿化にてＨ−Ｐｈｅ−Ｏ−アンカー基の粗生成物を取得し、Ｆｍｏｃ−ＬｅｕとＥＤＣ／ＨＯＢｔにて縮合させた。かかる縮合反応液を少量採取し、ＴＦＡ中でアンカー基を除去してＨＰＬＣ分析し、目的のジペプチドであるＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅに対する、混在させたアミノ酸のダブルヒット化合物（Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｐｈｅ）の量比を測定した。結果を表４および５に示す。【０１３５】
【表４】
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【０１３６】
【表５】
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【０１３７】
実験結果：
表４および５に示すように、アセトニトリルのみ、または２０％含水アセトニトリルにより沈殿化を行った場合に比べ、本発明で規定する範囲内の含水アセトニトリル（特に、８０％含水アセトニトリル）により沈殿化を行うと、ダブルヒット化合物の副生が顕著に抑えられることが分かった。また、８０％含水アセトニトリルは、アセトニトリル含量が８０ｖ／ｖ％である含水アセトン、含水ＤＭＦ、含水メタノールおよび含水エタノールに比べて、ダブルヒット化合物の副生が少ないことも確認した。
【産業上の利用可能性】
【０１３８】
本発明のペプチドの製造方法によれば、アンカー基でＣ末端を保護したアミノ酸またはペプチドのＮ末端アミノ基と、Ｎ−保護アミノ酸またはＮ−保護ペプチドのＣ末端カルボキシ基との脱水縮合、および続くＮ末端の一時保護基の除去工程後に、特定の含水アセトニトリルの添加により沈殿化および固液分離を行うだけで、縮合工程およびＮ末端の脱保護工程を連続してワンポットで収率良く行うことができる。本発明によれば、縮合工程後の溶媒留去、溶媒置換による沈殿化、濾過、洗浄、乾燥等の煩雑な単離・精製操作を省略することができ、またダブルヒット化合物等の副生もみられないことからスケールアップが可能で工業的製造に適した簡便かつ効率的なペプチドの製造方法を提供することができる。【０１３９】
本発明のペプチドの製造方法の特徴を表す、別の表現方法について以下に示す。
「固定化保護基」を「（脱保護工程）および（縮合工程）で影響を受けず、（最終脱保護工程）で脱保護される保護基」とし、通常の「保護基」を「（縮合工程）で影響を受けず、（脱保護工程）では脱保護される保護基」と定義する。
また、「Ｃ末端固定化保護Ｎ末端伸長法によるペプチドの製造方法」を「Ｃ末端固定化保護されたアミノ酸またはペプチドと、新規Ｎ末端保護アミノ酸またはペプチドと縮合させる工程（縮合工程）と、Ｃ末端固定化保護された伸長されたＮ末端保護ペプチドのＮ末端脱保護させる工程（脱保護工程）とを繰り返して、Ｎ末端方向にペプチド鎖を伸長させるペプチドの製造方法」と定義すると、Ｆｍｏｃ法やＢｏｃ法がこれに含まれ、Ｆｍｏｃ法が好ましい。【０１４０】
ここに、「連続的改良Ｃ末端固定化保護Ｎ末端伸長法」を「（縮合工程）と（脱保護工程）との間は、途中で抽出・沈殿化等により精製させることなく溶液中で連続的に行い、（脱保護工程）終了後に、（沈殿化工程）により精製させることを特徴とする、Ｃ末端固定化保護Ｎ末端伸長法」と定義すれば、本発明のペプチドの製造方法を以下のように表現することもできる。
〔１〕脱保護工程後に、アセトニトリルおよび水を含有する極性溶媒での沈殿化工程を有することを特徴とする、連続的改良Ｃ末端固定化保護Ｎ末端伸長法によるペプチドの製造方法。
〔２〕該極性溶媒が６０〜９５％含水アセトニトリルであることを特徴とする、〔１〕記載の連続的改良Ｃ末端固定化保護Ｎ末端伸長法によるペプチドの製造方法。
〔３〕保護基がＦｍｏｃ基であることを特徴とする、〔１〕または〔２〕に記載の連続的改良Ｃ末端固定化保護Ｎ末端伸長によるペプチドの製造方法。
〔４〕最終脱保護工程を有することを特徴とする、〔１〕〜〔３〕のいずれか一項記載の連続的改良Ｃ末端固定化保護Ｎ末端伸長法によるペプチドの製造方法。【０１４１】
本発明のペプチドの製造方法は、更に以下のように詳細に表現することもできる。
（第一工程：Ｃ末端固定化保護工程）
Ｎ末端保護アミノ酸またはペプチドのＣ末端に、固定化保護基を反応させ、Ｃ末端固定化保護されたＮ末端保護アミノ酸またはペプチドを製造する工程。
（第二工程：脱保護工程）
Ｃ末端固定化保護されたＮ末端保護アミノ酸またはペプチドのＮ末端保護基を脱保護して、Ｃ末端固定化保護されたアミノ酸またはペプチドを製造する工程。
（第三工程：縮合工程）
Ｃ末端固定化保護されたアミノ酸またはペプチドに対して、新規Ｎ末端保護アミノ酸またはペプチドと縮合させ、Ｃ末端固定化保護された伸長されたＮ末端保護ペプチドを製造する工程。
（第四工程：脱保護工程）
Ｃ末端固定化保護されたＮ末端保護アミノ酸またはペプチドのＮ末端保護基を脱保護して、Ｃ末端固定化保護されたアミノ酸またはペプチドを製造する工程。
（第五工程：沈殿化工程）
Ｃ末端固定化保護された伸長されたＮ末端保護ペプチドを、極性溶媒中で沈殿化させ、Ｃ末端固定化保護された伸長されたＮ末端保護ペプチドを精製させる工程。
（第六工程：最終脱保護工程）
Ｃ末端固定化保護された伸長されたＮ末端保護ペプチド、または、Ｃ末端固定化保護された伸長されたペプチドの、Ｃ末端固定化保護を脱保護して、伸長されたペプチドを製造する工程。【０１４２】
上記、第三工程、第四工程、第五工程を1セットとして繰り返し行われるので、本発明のペプチドの製造方法は、具体的には以下ケースが含まれる。
第一工程⇒第二工程⇒（第三工程⇒第四工程⇒第五工程）×ｍ回⇒第六工程
（ただし、ｍは、自然数を表し、「（・・・）×ｍ回」は、カッコ内の工程をｍ回繰り返すことを意味する。）【０１４３】
本願は、日本に出願された特願２０１１−１２２９４３号を基礎としており、その内容は本願明細書に全て包含される。