(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１０７６であるアルギン酸資化菌。
【請求項２】
アルギン酸を分解して次式（化４）、次式（化５）および次式（化６）からなる群から選択される１または２以上の物質を製造することができる分解酵素を産生する請求項１に記載のアルギン酸資化菌；
【化４】
0006025018.tif 000019
［化５］ＨＯＯＣ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨＯＨ−ＣＨＯＨ−ＣＨＯ、
［化６］ＨＯＯＣ−ＣＯＨ＝ＣＨ−ＣＨＯＨ−ＣＨＯＨ−ＣＨＯ。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載のアルギン酸資化菌の菌抽出液であって、アルギン酸を分解して次式（化７）、次式（化８）および次式（化９）からなる群から選択される１または２以上の物質を製造することができる分解酵素を含む前記菌抽出液；
【化７】
0006025018.tif 000020
［化８］ＨＯＯＣ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨＯＨ−ＣＨＯＨ−ＣＨＯ、
［化９］ＨＯＯＣ−ＣＯＨ＝ＣＨ−ＣＨＯＨ−ＣＨＯＨ−ＣＨＯ。
【請求項４】
分解酵素として、エンド型アルギン酸リアーゼおよび二糖分解酵素を含む、請求項３に記載の菌抽出液。
【請求項５】
アルギン酸を分解してオリゴ糖、ならびに次式（化１０）、次式（化１１）および次式（化１２）からなる群から選択される１または２以上の物質を製造する方法であって、請求項１または請求項２に記載のアルギン酸資化菌が産生する分解酵素をアルギン酸に作用させる工程を有する前記方法；
【化１０】
0006025018.tif 000021
［化１１］ＨＯＯＣ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨＯＨ−ＣＨＯＨ−ＣＨＯ、
［化１２］ＨＯＯＣ−ＣＯＨ＝ＣＨ−ＣＨＯＨ−ＣＨＯＨ−ＣＨＯ。
【請求項６】
アルギン酸を分解して次式（化１３）、次式（化１４）および次式（化１５）からなる群から選択される１または２以上の物質を製造するための、請求項１または請求項２に記載のアルギン酸資化菌の使用；
【化１３】
0006025018.tif 000022
［化１４］ＨＯＯＣ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨＯＨ−ＣＨＯＨ−ＣＨＯ、
［化１５］ＨＯＯＣ−ＣＯＨ＝ＣＨ−ＣＨＯＨ−ＣＨＯＨ−ＣＨＯ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規のＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌、その細菌が産生するアルギン酸を分解する酵素、それらを用いてオリゴ糖、不飽和単糖、ないしα−ケト酸を製造する方法、新規のエンド型アルギン酸リアーゼおよびそれをコードする遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルギン酸は、Ｄ−マンヌロン酸およびＬ−グルロン酸が直鎖結合してなる多糖であり、昆布やワカメなどの褐藻類に乾物換算で２０〜５０％（ｗ／ｗ）と多量に含まれる。アルギン酸は、増粘剤やゲル化剤、安定剤、歯科材料、手術糸、創傷被覆材、止血剤などとして用いられるほか、食物繊維としての機能があり、特にアルギン酸のカリウム塩はＫ−Ｎａ交換能を有し、体内のＮａを排泄する作用があると言われている有用な物質である。
【０００３】
しかしながら、アルギン酸は高分子量でかつ粘性の高い多糖であるため、食品に高濃度で添加できないなど、さまざまな作業上および品質管理上の取り扱いに困難性がある。そこで、アルギン酸を分解して粘性を低下させることができる、アルギン酸リアーゼなどの分解酵素の研究開発がなされている。
【０００４】
また、アルギン酸の分解物についても、アルギン酸と同様あるいはアルギン酸とは異なる、様々な機能が期待されている。
【０００５】
これまでに、アルギン酸リアーゼを産生する生物としては、褐藻類や貝類のほか、シュードモナス属やビブリオ属、クレブシェラ属、フラボバクテリウム属などの細菌が知られており、特許文献１にはアルギン酸リアーゼを産生するフラボバクテリウム・スピリチボラム、アルカリゲネス・デニトリフィカンスおよびバチルス・ラテロスポラスが、特許文献２にはアルギン酸リアーゼを産生するフラボバクテリウム・スピーシーズＯＴＣ−６株がそれぞれ開示されている。また、特許文献３にはアガリボランス・エスピー・ＪＡＭ−Ａ１ｍが産生するアルカリアルギン酸リアーゼが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第２９２６２４９号公報
【特許文献２】特開２００１−１６１３５８号公報
【特許文献３】特開２００９−１９５２２２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、アルギン酸を単糖まで分解して、不飽和単糖やα−ケト酸を製造することができるアルギン酸リアーゼを産生する菌株はほとんど知られておらず、アルギン酸を分解して不飽和単糖やα−ケト酸を製造する方法もほとんど知られていなかった。なお、特許文献１に記載のフラボバクテリウム・スピリチボラム、アルカリゲネス・デニトリフィカンスおよびバチルス・ラテロスポラス、ならびに特許文献２に記載のフラボバクテリウム・スピーシーズＯＴＣ−６株が産生するアルギン酸リアーゼは、「アルギン酸を分解して最終的に４−デオキシ−５−ケトウロン酸に分解する」と記述されているものの、実際に、アルギン酸を分解して、不飽和単糖やα−ケト酸などの単糖が得られていることは開示されていない。
【０００８】
また、特許文献１に記載されたアルギン酸リアーゼは、分子量５２ｋＤａのアルギン酸リアーゼと分子量８０ｋＤａのアルギン酸リアーゼとの混合物であること、特許文献２に記載されたアルギン酸リアーゼは、細菌由来アルギン酸に対し活性が高く海藻由来アルギン酸に対し活性が低いものであること、特許文献３に記載されたアルカリアルギン酸リアーゼは、ＭＧブロックおよびＧブロックに作用するがＭブロックにはわずかにしか作用しないものであることから、いずれも、本発明に係るエンド型アルギン酸リアーゼとは異なっている。
【０００９】
本発明は、新規のＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌、その細菌が産生するアルギン酸を分解する酵素およびそれらを用いてオリゴ糖、不飽和単糖、ないしα−ケト酸を製造する方法、分子量が約３０ｋＤａであってＭブロック、Ｇブロック、ＭＧブロックおよび交互ポリマーのいずれも同様に分解することができるなどの特徴を有する新規のエンド型アルギン酸リアーゼおよびそれをコードする遺伝子を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、鋭意研究の結果、腐敗したスギモク（Ｃｏｃｃｏｐｈｏｒａ ｌａｎｇｓｄｏｒｆｉｉ、褐藻類の一種）からアルギン酸を資化する新規のＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌を単離し、この新規Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌が、アルギン酸を分解してオリゴ糖や不飽和単糖、α−ケト酸を製造することができる分解酵素を産生すること、当該分解酵素には分子量が約３０ｋＤａである新規のエンド型アルギン酸リアーゼが含まれること、ならびに少なくとも当該分解酵素に含まれる新規のエンド型アルギン酸リアーゼがＭブロック、Ｇブロック、ＭＧブロックおよび交互ポリマーのいずれも分解することができることを見出し、下記の各発明を完成した。
【００１１】
（１）アルギン酸を分解して次式（化１）の不飽和単糖、次式（化２）のα−ケト酸および次式（化３）のウロン酸からなる群から選択される１または２以上の物質を製造することができる分解酵素を産生するＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌であって、配列番号１に記載の塩基配列と９８％以上の相同性を示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ ｒＤＮＡ）を有する前記Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌；
【化１】
0006025018.tif 000002
［化２］ＨＯＯＣ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨＯＨ−ＣＨＯＨ−ＣＨＯ、
［化３］ＨＯＯＣ−ＣＯＨ＝ＣＨ−ＣＨＯＨ−ＣＨＯＨ−ＣＨＯ。
【００１２】
（２）以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の少なくともいずれかの特性を有する（１）に記載のＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌；（ａ）グルコースから酸を産生しない、（ｂ）デンプンを加水分解できる、（ｃ）硝酸塩を還元しない。
【００１３】
（３）受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１０７６である、アルギン酸を分解して次式（化４）の不飽和単糖、次式（化５）のα−ケト酸および次式（化６）のウロン酸からなる群から選択される１または２以上の物質を製造することができる分解酵素を産生するＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌；
【化４】
0006025018.tif 000003
［化５］ＨＯＯＣ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨＯＨ−ＣＨＯＨ−ＣＨＯ、
［化６］ＨＯＯＣ−ＣＯＨ＝ＣＨ−ＣＨＯＨ−ＣＨＯＨ−ＣＨＯ。
【００１４】
（４）（１）から（３）のいずれかに記載のＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌が産生する、アルギン酸を分解して次式（化７）の不飽和単糖、次式（化８）のα−ケト酸および次式（化９）のウロン酸からなる群から選択される１または２以上の物質を製造することができる分解酵素；
【化７】
0006025018.tif 000004
［化８］ＨＯＯＣ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨＯＨ−ＣＨＯＨ−ＣＨＯ、
［化９］ＨＯＯＣ−ＣＯＨ＝ＣＨ−ＣＨＯＨ−ＣＨＯＨ−ＣＨＯ。
【００１５】
（５）下記（ｄ）および（ｅ）の少なくともいずれかである、（４）に記載の分解酵素；（ｄ）エキソ型アルギン酸リアーゼ、（ｅ）エンド型アルギン酸リアーゼおよび二糖分解酵素。
【００１６】
（６）エンド型アルギン酸リアーゼが以下の（ｆ）〜（ｌ）の少なくともいずれかの特性を有するエンド型アルギン酸リアーゼである、（５）に記載の分解酵素；（ｆ）分子量が約３０ｋＤａである、（ｇ）アルギン酸分解反応における至適ｐＨが約８である、（ｈ）最も安定なｐＨが７＜ｐＨ＜８である、（ｉ）アルギン酸分解反応における至適温度が約５４℃である、（ｊ）６０℃で３０分間アルギン酸分解反応を行った後にアルギン酸分解酵素活性が消失する、（ｋ）アルギン酸分解反応における至適ＮａＣｌ濃度Ｃが０．０５＜Ｃ＜０．３（ｍｏｌ／Ｌ）である、（ｌ）アルギン酸の構造中、Ｄ−マンヌロン酸のホモポリマーである部分（Ｍブロック）、Ｌ−グルロン酸のホモポリマーである部分（Ｇブロック）、ＭブロックとＧブロックとが交互に結合した部分（ＭＧブロック）およびＤ−マンヌロン酸とＬ−グルロン酸とが交互に結合した部分（交互ポリマー）のいずれも分解することができる。
【００１７】
（７）エンド型アルギン酸リアーゼが以下の（ｍ）または（ｎ）のアミノ酸配列を有するエンド型アルギン酸リアーゼである、（５）または（６）に記載の分解酵素；（ｍ）配列番号２、配列番号１２または配列番号１３のアミノ酸配列、（ｎ）配列番号２、配列番号１２または配列番号１３のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列。
【００１８】
（８）アルギン酸を分解してオリゴ糖、ならびに次式（化１０）の不飽和単糖、次式（化１１）のα−ケト酸および次式（化１２）のウロン酸からなる群から選択される１または２以上の物質を製造する方法であって、（１）から（３）のいずれかに記載のＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌およびＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｉｃｏｌａ Ｆ３１株の少なくともいずれかが産生する分解酵素をアルギン酸に作用させる工程を有する前記方法；
【化１０】
0006025018.tif 000005
［化１１］ＨＯＯＣ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨＯＨ−ＣＨＯＨ−ＣＨＯ、
［化１２］ＨＯＯＣ−ＣＯＨ＝ＣＨ−ＣＨＯＨ−ＣＨＯＨ−ＣＨＯ。
【００１９】
（９）アルギン酸を分解して次式（化１３）の不飽和単糖、次式（化１４）のα−ケト酸および次式（化１５）のウロン酸からなる群から選択される１または２以上の物質を製造するための、（１）から（３）のいずれかに記載のＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌およびＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｉｃｏｌａ Ｆ３１株の少なくともいずれかの使用；
【化１３】
0006025018.tif 000006
［化１４］ＨＯＯＣ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨＯＨ−ＣＨＯＨ−ＣＨＯ、
［化１５］ＨＯＯＣ−ＣＯＨ＝ＣＨ−ＣＨＯＨ−ＣＨＯＨ−ＣＨＯ。
【００２０】
（１０）以下の（ｉ）〜（ｖｉｉ）の特性を有するエンド型アルギン酸リアーゼ；（ｉ）分子量が約３０ｋＤａである、（ｉｉ）アルギン酸分解反応における至適ｐＨが約８である、（ｉｉｉ）最も安定なｐＨが７＜ｐＨ＜８である、（ｉｖ）アルギン酸分解反応における至適温度が約５４℃である、（ｖ）６０℃で３０分間アルギン酸分解反応を行った後にアルギン酸分解酵素活性が消失する、（ｖｉ）アルギン酸分解反応における至適ＮａＣｌ濃度Ｃが０．０５＜Ｃ＜０．３（ｍｏｌ／Ｌ）である、（ｖｉｉ）アルギン酸の構造中、Ｄ−マンヌロン酸のホモポリマーである部分（Ｍブロック）、Ｌ−グルロン酸のホモポリマーである部分（Ｇブロック）、ＭブロックとＧブロックとが交互に結合した部分（ＭＧブロック）およびＤ−マンヌロン酸とＬ−グルロン酸とが交互に結合した部分（交互ポリマー）のいずれも分解することができる。
【００２１】
（１１）以下の（ｖｉｉｉ）または（ｉｘ）のアミノ酸配列を有する、（１０）に記載のエンド型アルギン酸リアーゼ；（ｖｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列、（ｉｘ）配列番号２のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列。
【００２２】
（１２）以下の（ｘ）または（ｘｉ）のアミノ酸配列を有するエンド型アルギン酸リアーゼ；（ｘ）配列番号１２または配列番号１３のアミノ酸配列、（ｘｉ）配列番号１２または配列番号１３のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列。
【００２３】
（１３）以下の（ｘｉｉ）または（ｘｉｉｉ）のタンパク質をコードするエンド型アルギン酸リアーゼ遺伝子；（ｘｉｉ）配列番号１２または配列番号１３のアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｘｉｉｉ）配列番号１２または配列番号１３のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつエンド型アルギン酸リアーゼ活性を有するタンパク質。
【発明の効果】
【００２４】
本発明に係る新規Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌が産生する分解酵素は、市販のアルギン酸リアーゼと比較して、アルギン酸を分解する活性が高く、また、アルギン酸の部分構造のうち、Ｍブロック、ＭＧブロック、Ｇブロックおよび交互ポリマーのいずれも分解することができる。また、本発明に係る分解酵素によれば、市販のアルギン酸リアーゼによっては得ることのできない、アルギン酸由来の単糖（不飽和単糖やα−ケト酸、ウロン酸）を得ることができる。また、本発明に係るアルギン酸を分解してオリゴ糖や不飽和単糖、α−ケト酸を製造する方法によれば、アルギン酸由来のオリゴ糖や不飽和単糖、α−ケト酸を、高純度で、安価に、かつ大量に製造することができる。また、本発明に係る新規のエンド型アルギン酸リアーゼによれば、アルギン酸の部分構造のうち、Ｍブロック、ＭＧブロック、Ｇブロックおよび交互ポリマーのいずれも同様に分解することができることから、基質とするアルギン酸の種類や由来は問わずに、効率的に分解してオリゴ糖を得ることができる。また、本発明に係る新規のエンド型アルギン酸リアーゼによれば、本発明に係るＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌に産生させて容易に精製することができることから、高純度のエンド型アルギン酸リアーゼを簡便に得ることができる。さらに、本発明に係る新規のエンド型アルギン酸リアーゼをコードする遺伝子によれば、翻訳領域の全長アミノ酸配列が明らかであることから、種々の遺伝子工学的手法を用いたエンド型アルギン酸リアーゼの利用が可能であり、例えば、発現効率の高いプロモーター配列と結合して任意の微生物に導入して培養することなどにより、大量のエンド型アルギン酸リアーゼを容易に得ることができる。一方、本発明によって製造されたオリゴ糖は、アルギン酸と比較して粘性が低下しているため操作性がよく、種々の用途に用いることができる。また、アルギン酸由来の不飽和単糖やα−ケト酸、ウロン酸は、例えば、活性酸素抑制剤や臓器保存剤、制癌剤や血糖降下剤、抗高脂血症剤、抗肥満剤などとしての医薬品原料、プレバイオティクス剤や整腸剤などとしての機能性食品添加剤、化粧品素材、紫外線吸収剤、調味剤、新規α−アミノ酸素材、各種複合有機酸素材、バイオプラスティック素材などとしての機能性ポリマー素材として期待でき、本発明によれば、これらについての研究開発を促進することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】アルギン酸ナトリウム、デンプン、カルボキシメチルセルロースおよびローカストビーンガムを加えたＭＳ培地、ならびに多糖類を加えないＬＢ培地にてアルギン酸資化菌を培養し、経時的に６００ｎｍにおける吸光度を測定した結果を示す図である。
【図２】データベース（アポロンＤＢ−ＢＡ ６．０）に対する相同性検索の結果に基づき、アルギン酸資化菌の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列（配列番号１）と相同率が高い上位３２位の塩基配列について作成した分子系統樹である。
【図３】０．５％（ｗ／ｖ）のアルギン酸ナトリウムを含み、かつ培養中にｐＨを調整しない培地（Ａ）、１％（ｗ／ｖ）のアルギン酸ナトリウムを含み、かつ培養中にｐＨを調整しない培地（Ｂ）、１％（ｗ／ｖ）のアルギン酸ナトリウムを含み、かつ培養中のｐＨを７．５に維持した培地（Ｃ）、および２％（ｗ／ｖ）のアルギン酸ナトリウムを含み、かつ培養中のｐＨを７．５に維持した培地（Ｄ）にてアルギン酸資化菌を培養し、経時的に６００ｎｍにおける吸光度を測定した結果、Ｂにおける４、２２、４０、６２および８９時間時点のｐＨの測定結果、ならびにＤにおいて２３．５（ｄ１）、３２（ｄ２）、４２（ｄ３）、５０（ｄ４）、６２（ｄ５）、７４（ｄ６）および９０（ｄ７）時間培養したＵＭＩ−０１が有するアルギン酸分解酵素活性の算出結果を示す図である。
【図４】アルギン酸ナトリウム濃度が１％（ｗ／ｖ）の培地で培養したＵＭＩ−０１から１回目の抽出操作により得た菌抽出液（ＡおよびＢ）、アルギン酸ナトリウム濃度が１％（ｗ／ｖ）の培地で培養したＵＭＩ−０１から２回目および３回目の抽出操作により得た菌抽出液（Ａ２およびＡ３）、アルギン酸ナトリウム濃度が２％（ｗ／ｖ）の培地で培養したＵＭＩ−０１から１回目の抽出操作により得た菌抽出液（Ｃ）について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果を示す図（上図）、ならびに、精製菌抽出液Ｃ６０−９０および精製菌抽出液Ｃ６０−９０をイオン交換クロマトグラフィーに供して得た溶出液（イオン交換クロマトグラフィー画分）について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果を示す図（下図）である。
【図５】アルギン酸ナトリウムを含む反応液に精製菌抽出液Ｃ６０−９０およびＣ６０−９０を加えて（反応液ｐおよび反応液ｑ）インキュベートし、インキュベートの間、経時的に分取した反応液について薄層クロマトグラフィーを行った結果を示す図である。図中、横軸のｍは分を示し、ｈは時間を示す。
【図６】Ｍブロック、ＭＧブロック、Ｇブロックおよび交互ポリマーなどがランダムに含まれるアルギン酸（Ａ）、主としてＭブロックからなるアルギン酸（Ｂ）、主としてＭＧブロックからなるアルギン酸（Ｃ）、ならびに主としてＧブロックからなるアルギン酸（Ｄ）を含む反応液に精製菌抽出液を加えてインキュベートし、インキュベートの間、経時的に２３５ｎｍにおける吸光度を測定した結果、およびアルギン酸分解酵素活性を算出した結果を示す図である。
【図７】主としてＭブロックからなるアルギン酸（Ｂ）、および主としてＧブロックからなるアルギン酸（Ｄ）をそれぞれ含む反応液に精製菌抽出液を加えてインキュベートし、インキュベートの間、経時的に分取した反応液について薄層クロマトグラフィーを行った結果を示す図である。
【図８】アルギン酸ナトリウムを含む反応液に、精製菌抽出液および市販のＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ由来アルギン酸リアーゼを加えて（反応液ｐおよび反応液ｑ）インキュベートし、インキュベートの間、経時的に分取した反応液について薄層クロマトグラフィーを行った結果を示す図である。
【図９】Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＤＥＡＥ−６５０Ｍカラムクロマトグラフィーにおける溶出画分の吸光度およびアルギン酸分解酵素活性を示す図である。
【図１０】ピークａ〜ｃに相当する溶出画分および精製菌抽出液について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび活性染色法を行った結果を示す図である。
【図１１】Ｍｏｎｏ Ｑ ５／５０ ＧＬカラムクロマトグラフィーにおける溶出画分の吸光度およびアルギン酸分解酵素活性を示す図である。
【図１２】ピークｄおよびｅに相当する溶出画分および第一酵素液について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび活性染色法を行った結果を示す図である。
【図１３】Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １０／３００ ＧＬカラムクロマトグラフィーにおける吸光度およびアルギン酸分解酵素活性を示す図である。
【図１４】ピークｆ〜ｈに相当する溶出画分および第二酵素液について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび活性染色法を行った結果を示す図である。
【図１５】アルギン酸分解反応の進行に伴う相対粘度の変化および２３５ｎｍにおける吸光度の変化を示す図である。
【図１６】ＦｌＡｌｙ−１の、種々のｐＨでのアルギン酸分解酵素活性（左図）、および種々のｐＨでアルギン酸分解反応を行った後のアルギン酸分解酵素活性（右図）を相対的活性値で示す図である。
【図１７】ＦｌＡｌｙ−１の、種々の温度でのアルギン酸分解酵素活性（左図）、および種々の温度でアルギン酸分解反応を行った後のアルギン酸分解酵素活性（右図）を相対的活性値で示す図である。
【図１８】ＦｌＡｌｙ−１の、種々のＮａＣｌ濃度でのアルギン酸分解酵素活性を相対的活性値で示す図である。
【図１９】アルギン酸ナトリウム、Ｍ−ｒｉｃｈ、ＭＧ−ｒｉｃｈまたはＧ−ｒｉｃｈを基質としてＦｌＡｌｙ−１によりアルギン酸分解反応を行った場合の、２３５ｎｍでの吸光度を示す図である。
【図２０】ＦｌＡｌｙ−１によるアルギン酸分解反応の分解産物を、薄層クロマトグラフィー、硫酸発色法およびチオバルビツール酸発色法により検出した結果を示す図である。
【図２１】ＦｌＡｌｙ−１遺伝子の塩基配列およびＦｌＡｌｙ−１のアミノ酸配列を示す図である。
【図２２】ＦｌＡｌｙ−１のアミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴ検索を行った結果を示す図である。
【図２３】アルギン酸分解産物をゲル濾過クロマトグラフィーに供し、得られた溶出液について、２３５ｎｍにおける吸光度を測定した結果および薄層クロマトグラフィーを行った結果を示す図である。
【図２４】アルギン酸分解産物をイオン交換クロマトグラフィーに供し、得られた溶出液について、２３５ｎｍにおける吸光度を測定した結果および薄層クロマトグラフィーを行った結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、本発明に係る新規のＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌、その細菌が産生するアルギン酸を分解する酵素、それらを用いてオリゴ糖、不飽和単糖、ないしα−ケト酸を製造する方法、新規のエンド型アルギン酸リアーゼおよびそれをコードする遺伝子について詳細に説明する。
【００２７】
本発明に係るＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌は、アルギン酸を分解して次式（化１６）の不飽和単糖、次式（化１７）のα−ケト酸および次式（化１８）のウロン酸からなる群から選択される１または２以上の物質を製造することができる分解酵素を産生するＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌であって、配列番号１に記載の塩基配列と９８％以上の相同性を示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ ｒＤＮＡ）を有する；
【化１６】
0006025018.tif 000007
［化１７］ＨＯＯＣ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨＯＨ−ＣＨＯＨ−ＣＨＯ、
［化１８］ＨＯＯＣ−ＣＯＨ＝ＣＨ−ＣＨＯＨ−ＣＨＯＨ−ＣＨＯ。
【００２８】
本発明におけるＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌は、配列番号１に記載の塩基配列と９８％以上の相同性を示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ ｒＤＮＡ）を有しているが、配列番号１に記載の塩基配列との相同性は、好ましくは９７．９％以上、９８．０％以上、９８．１％以上、９８．２％以上、９８．３％以上、９８．４％以上、９８．５％以上であり、より好ましくは９８．６％以上、９８．７％以上、９８．８％以上、９８．９％以上、９９．０％以上であり、さらに好ましくは９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上であり、よりさらに好ましくは９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、９９．９％以上である。
【００２９】
なお、本発明に係るＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌の単離源としては、例えば、後述のアルギン酸を有する生物のほか、海水、河川、氷河、土壌、池、湖沼、下水道、水田などを挙げることができる。
【００３０】
アルギン酸は、Ｄ−マンヌロン酸とＬ−グルロン酸とが直鎖状に１−４結合してなる多糖である。アルギン酸の構造中、Ｄ−マンヌロン酸のホモポリマーである部分をＭブロック、Ｌ−グルロン酸のホモポリマーである部分をＧブロック、ＭブロックとＧブロックとが交互に結合した部分をＭＧブロック、Ｄ−マンヌロン酸とＬ−グルロン酸とが交互に結合した部分を交互ポリマーという。
【００３１】
Ｄ−マンヌロン酸とＬ−グルロン酸との量比（Ｍ／Ｇ比）や、Ｍブロック、Ｇブロック、ＭＧブロックおよび交互ポリマーの各部分構造の量比は、アルギン酸の柔軟性やゲル強度、溶解性などの性質に影響を及ぼす。このＭ／Ｇ比や各部分構造の量比は、アルギン酸を抽出した生物種や、抽出した生物の部位や生育環境によって異なる。
【００３２】
本発明におけるアルギン酸は、生物から抽出したものでもよく、人工的に合成したものでもよい。アルギン酸を有する生物としては、例えば、コンブやワカメ、ヒジキ、モズク、ホンダワラ、スギモクなどの褐藻類、サンゴモなどの紅藻類、シュードモナス・アエルギノーザ（エルギノーザ）、アゾトバクターなどの細菌を挙げることができる。
【００３３】
また、本発明におけるアルギン酸は、純粋のアルギン酸のほか、アルギン酸の塩やエステルであってもよい。アルギン酸の塩としては、例えば、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム、アルギン酸カルシウム、アルギン酸アンモニウムなどを、アルギン酸のエステルとしては、例えば、アルギン酸プロピレングリコールエステルなどを挙げることができる。
【００３４】
本発明におけるアルギン酸のＭ／Ｇ比や各部分構造の量比は特に限定されず、例えば、主としてＭブロックを含むもの、主としてＧブロックを含むもの、主としてＭＧブロックを含むもの、主として交互ポリマーを含むもの、Ｍブロック、Ｇブロック、ＭＧブロックおよび交互ポリマーをランダムに含むものなどのうちのいずれであってもよい。
【００３５】
本発明における次式（化１９）の不飽和単糖、次式（化２０）のα−ケト酸および次式（化２０）のウロン酸；
【化１９】
0006025018.tif 000008
［化２０］ＨＯＯＣ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨＯＨ−ＣＨＯＨ−ＣＨＯ、
［化２１］ＨＯＯＣ−ＣＯＨ＝ＣＨ−ＣＨＯＨ−ＣＨＯＨ−ＣＨＯ
について、本明細書では、上記式（化１９）の不飽和単糖、式（化２０）のα−ケト酸および式（化２１）のウロン酸をまとめて「単糖」という場合があり、式（化２０）のα−ケト酸および式（化２１）のウロン酸をまとめて「α−ケト酸」という場合がある。さらに、本発明における上記式（化１９）、式（化２０）および式（化２１）の物質の−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＣＨＯは、それぞれ、−ＣＯＯＲ１、−ＯＲ２、−ＯＲ３Ｈ（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、それぞれ、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、置換基を有していてもよいアリール基または置換基を有していてもよい複素環のいずれかである）であってもよく、すなわち、−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＣＨＯとなり得るものであればよい。
【００３６】
本発明において、「オリゴ糖」は、アルギン酸を分解して生成する物質のうち、２以上の単糖が結合した構造を有するものをいい、そのような物質としては、例えば、２糖、３糖、４糖、５糖などを挙げることができる。また、本発明において不飽和単糖は、アルギン酸を単糖まで分解して生成する物質であって、上記式（化１９）の構造を有するものをいう。また、本発明においてα−ケト酸は、アルギン酸を単糖まで分解して生成する物質であって、上記式（化２０）または上記式（化２１）の構造を有するものをいう。
【００３７】
また、本発明に係るＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌は、以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の少なくともいずれかの特性を有することが好ましい；
（ａ）グルコースから酸を産生しない、
（ｂ）デンプンを加水分解できる、
（ｃ）硝酸塩を還元しない。
【００３８】
本発明に係る異なる態様のＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌は、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１０７６である、アルギン酸を分解して次式（化２２）、次式（化２３）および次式（化２４）からなる群から選択される１または２以上の物質を製造することができる分解酵素を産生するＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌である；
【化２２】
0006025018.tif 000009
［化２３］ＨＯＯＣ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨＯＨ−ＣＨＯＨ−ＣＨＯ、
［化２４］ＨＯＯＣ−ＣＯＨ＝ＣＨ−ＣＨＯＨ−ＣＨＯＨ−ＣＨＯ。
【００３９】
なお、本態様におけるＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌において、上述した本発明に係るＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌の構成と同等または相当する構成については再度の説明を省略する。
【００４０】
次に、本発明は、本発明に係るＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌が産生する、アルギン酸を分解して次式（化２５）、次式（化２６）および次式（化２７）からなる群から選択される１または２以上の物質を製造することができる分解酵素を提供する；
【化２５】
0006025018.tif 000010
［化２６］ＨＯＯＣ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨＯＨ−ＣＨＯＨ−ＣＨＯ、
［化２７］ＨＯＯＣ−ＣＯＨ＝ＣＨ−ＣＨＯＨ−ＣＨＯＨ−ＣＨＯ。
【００４１】
本発明における分解酵素としては、例えば、エキソ型アルギン酸リアーゼや、エンド型アルギン酸リアーゼおよび二糖分解酵素などを挙げることができ、１種類からなるものであってもよく、２以上の種類からなるものであってもよい。また、本発明において、「分解酵素」は、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌が産生して菌体内に保持するもの（菌体内酵素）でもよく、菌体外に分泌するもの（菌体外酵素）でもよい。
【００４２】
また、本発明における分解酵素は、定法に従って製造することができるが、そのような方法としては、例えば、アルギン酸を含む培地で、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌を培養した後、遠心分離を行い、上清（菌体外酵素である場合）または沈殿物（菌体内酵素である場合）を回収する方法を挙げることができる。また、菌体外酵素の場合は、回収した上清をそのまま、または精製した後、分解酵素として用いることができ、菌体内酵素の場合は、回収した沈殿物を緩衝液に懸濁した後に破砕し、再度遠心分離を行って上清を得て、これをそのまま、または精製した後、分解酵素として用いることができる。なお、精製方法としては、例えば、硫安分画や透析、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、吸着カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィーなどを挙げることができ、破砕方法としては、例えば、ガラスビーズによる物理的破砕方法、凍結融解法、超音波処理法、フレンチプレスによる破砕方法、液体窒素で凍結した試料を乳鉢と乳棒で破砕する方法などを挙げることができる。
【００４３】
本発明において、分解酵素がアルギン酸を分解する活性（アルギン酸分解酵素活性）の測定は定法に従って行うことができ、例えば、アルギン酸を含む緩衝液に分解酵素を添加してインキュベートし、２３５ｎｍにおける吸光度を測定することにより行うことができる。これは、アルギン酸が分解されて生成する、Ｃ−Ｃ間に２重結合を有する糖（不飽和糖）やα−ケト酸が、２３５ｎｍの光を特異的に吸収することに基づき、２３５ｎｍにおける吸光度を、不飽和糖やα−ケト酸の生成量の指標、すなわちアルギン酸分解酵素活性の指標とする方法である。
【００４４】
本発明の分解酵素における「エンド型アルギン酸リアーゼ」としては、例えば、以下の（ｆ）〜（ｌ）の少なくともいずれかの特性を有するエンド型アルギン酸リアーゼを挙げることができる；
（ｆ）分子量が約３０ｋＤａである、
（ｇ）アルギン酸分解反応における至適ｐＨが約８である、
（ｈ）最も安定なｐＨが７＜ｐＨ＜８である、
（ｉ）アルギン酸分解反応における至適温度が約５４℃である、
（ｊ）６０℃で３０分間アルギン酸分解反応を行った後にアルギン酸分解酵素活性が消失する、
（ｋ）アルギン酸分解反応における至適ＮａＣｌ濃度Ｃが０．０５＜Ｃ＜０．３（ｍｏｌ／Ｌ）である、
（ｌ）アルギン酸の構造中、Ｄ−マンヌロン酸のホモポリマーである部分（Ｍブロック）、Ｌ−グルロン酸のホモポリマーである部分（Ｇブロック）、ＭブロックとＧブロックとが交互に結合した部分（ＭＧブロック）およびＤ−マンヌロン酸とＬ−グルロン酸とが交互に結合した部分（交互ポリマー）のいずれも分解することができる。
【００４５】
ここで、本発明において、エンド型アルギン酸リアーゼのおよその分子量は、定法に従って確認することができ、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行うことにより確認することができる。エンド型アルギン酸リアーゼのアルギン酸分解反応における「至適ｐＨ」、「至適温度」および「至適ＮａＣｌ濃度」もまた、定法に従い確認することができ、例えば、上述したアルギン酸分解酵素活性の測定方法において、分解酵素をエンド型アルギン酸リアーゼに代えて、種々のｐＨ、温度およびＮａＣｌ濃度の条件下で測定を行い、アルギン酸分解酵素活性が最も大であるｐＨ、温度およびＮａＣｌ濃度をそれぞれ決定することにより行うことができる。
【００４６】
また、本発明において、エンド型アルギン酸リアーゼの「最も安定なｐＨ」とは、そのｐＨに長時間おいた場合あるいはそのｐＨで長時間アルギン酸分解反応を行った場合に、アルギン酸分解酵素活性の低下が最も小さいｐＨを意味する。本発明において、「最も安定なｐＨ」は、例えば、種々のｐＨでエンド型アルギン酸リアーゼを用いてアルギン酸分解反応を長時間行った後に、これを酵素液として添加して、上述したアルギン酸分解酵素活性の測定方法を行い、アルギン酸分解酵素活性が最も大であるｐＨを決定することにより、確認することができる。
【００４７】
また、本発明において、エンド型アルギン酸リアーゼの基質特異性は、主としてＭブロックを含むアルギン酸のナトリウム塩（Ｍ−ｒｉｃｈ）、主としてＭＧブロックを含むアルギン酸のナトリウム塩（ＭＧ−ｒｉｃｈ）、主としてＧブロックを含むアルギン酸のナトリウム塩（Ｇ−ｒｉｃｈ）ならびにＭブロック、ＭＧブロック、Ｇブロックおよび交互ポリマーがランダムに含まれるアルギン酸のナトリウム塩をそれぞれ基質とし、分解酵素をエンド型アルギン酸リアーゼに代えて、上述したアルギン酸分解酵素活性の測定方法を行い、活性の大小を比較することにより確認することができる。この方法において、いずれを基質とした場合も同程度の活性が確認された場合は、エンド型アルギン酸リアーゼは、Ｍブロック、Ｇブロック、ＭＧブロックおよび交互ポリマーのいずれも同様に分解すると判断することができる。
【００４８】
また、本発明の分解酵素における「エンド型アルギン酸リアーゼ」は、以下の（ｍ）または（ｎ）のアミノ酸配列を有するエンド型アルギン酸リアーゼであってもよい；
（ｍ）配列番号２、配列番号１２または配列番号１３のアミノ酸配列、
（ｎ）配列番号２、配列番号１２または配列番号１３のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列。なお、配列番号２は本発明に係る新規のＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌の一態様であるＵＭＩ−０１が産生する、新規のエンド型アルギン酸リアーゼの一態様であるＦｌＡｌｙ−１の成熟型におけるＮ末端４０残基と同一のアミノ酸配列である。また、配列番号１２はＦｌＡｌｙ−１の翻訳型の全アミノ酸配列２８８残基と、配列番号１３はＦｌＡｌｙ−１の成熟型の全アミノ酸配列２６０残基とそれぞれ同一のアミノ酸配列である。
【００４９】
ここで、本発明において、「１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列」というときの、欠失、置換、挿入および／または付加されるアミノ酸の個数は、当該配列を有するあるいは当該配列からなるタンパク質がエンド型アルギン酸リアーゼ活性を有する限り、特に限定されないが、例えば、配列番号２のアミノ酸配列については１〜５個、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個の任意の個数を挙げることができる。また、配列番号１２または配列番号１３のアミノ酸配列については１〜２５個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１５個、さらに好ましくは１〜１０個、よりさらに好ましくは１〜５個の任意の個数を挙げることができる。なお、同一あるいは性質の似たアミノ酸配列に相当するのであれば、さらに多くのアミノ酸が置換、挿入、および／または付加されてもよい。
【００５０】
すなわち、配列番号２において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列については、本発明に係る分泌型のエンド型アルギン酸リアーゼのアミノ酸配列のＮ末端側１〜４０番目と高い同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつそれを有するタンパク質がエンド型アルギン酸リアーゼ活性を有するアミノ酸配列が含まれる。また、配列番号１２において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列については、本発明に係る翻訳型のエンド型アルギン酸リアーゼの全長アミノ酸配列１〜２８９番目と、配列番号１３において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列については、本発明に係る分泌型のエンド型アルギン酸リアーゼの全長アミノ酸配列１〜２６１番目と、それぞれ高い同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつエンド型アルギン酸リアーゼ活性を有するアミノ酸配列が含まれる。また、これらにいう「高い同一性」とは、少なくとも５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列の同一性を指す。
【００５１】
本発明に係る配列番号２において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列には、当該配列を有するタンパク質がエンド型アルギン酸リアーゼ活性を有する限り、これらアミノ酸配列の１または複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列が包含され、また、本発明に係る配列番号１２または配列番号１３において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列には、エンド型アルギン酸リアーゼ活性を有する限り、これらアミノ酸配列の１または複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列が包含される。
【００５２】
本発明において、保存的アミノ酸置換とは、生じる分子の生理学的活性を変化させることなく一般的になされ得る範囲、すなわち保存的置換の範囲で認められるもの（Ｗａｔｓｏｎら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｇｅｎｅなど）であり、例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸の酸性アミノ酸；リシン、アルギニンおよびヒスチジンの塩基性アミノ酸；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンおよびトリプトファンの非極性アミノ酸；グリシン、アスパラギン、システイン、グルタミン、セリン、トレオニンおよびチロシンの極性無電荷側鎖アミノ酸；フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンの芳香族アミノ酸といった側鎖に類似性のあるアミノ酸同士（アミノ酸のファミリー内部）で起こる置換を挙げることができる。同様に、アスパラギン酸およびグルタミン酸の酸性アミノ酸；リシン、アルギニンおよびヒスチジンの塩基性アミノ酸、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリンおよびトレオニンの脂肪族アミノ酸（セリンおよびトレオニンの脂肪族−ヒドロキシアミノ酸と分類することもできる）；フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンの芳香族アミノ酸；アスパラギンおよびグルタミンのアミド）；システインおよびメチオニンの含硫アミノ酸といった分類をすることができる。
【００５３】
次に、本発明は、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌およびＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｉｃｏｌａ Ｆ３１株の少なくともいずれかの使用や、本発明に係る新規のＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌や分解酵素を用いて、オリゴ糖、不飽和単糖、ないしα−ケト酸を製造する方法を提供する。本発明に係るＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌およびＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｉｃｏｌａ Ｆ３１株の少なくともいずれかの使用は、次式（化２８）、次式（化２９）および次式（化３０）からなる群から選択される１または２以上の物質を製造するためであり、また、オリゴ糖、単糖、ないしα−ケト酸を製造する方法は、アルギン酸を分解してオリゴ糖、ならびに次式（化２８）、次式（化２９）および次式（化３０）からなる群から選択される１または２以上の物質を製造する方法であって、本発明に係るＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌およびＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｉｃｏｌａ Ｆ３１株の少なくともいずれかが産生する分解酵素をアルギン酸に作用させる工程を有する；
【化２８】
0006025018.tif 000011
［化２９］ＨＯＯＣ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨＯＨ−ＣＨＯＨ−ＣＨＯ、
［化３０］ＨＯＯＣ−ＣＯＨ＝ＣＨ−ＣＨＯＨ−ＣＨＯＨ−ＣＨＯ。なお、本発明に係るオリゴ糖、不飽和単糖、ないしα−ケト酸を製造する方法において、上述した本発明に係るＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌または分解酵素の構成と同等または相当する構成については再度の説明を省略する。
【００５４】
本発明に係るオリゴ糖や単糖、α−ケト酸を製造する方法において、本発明に係るＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌およびＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｉｃｏｌａ Ｆ３１株の少なくともいずれかが産生する分解酵素をアルギン酸に作用させる方法としては、例えば、アルギン酸を含む緩衝液に分解酵素を添加してインキュベートする方法を挙げることができる。この場合、生成して緩衝液中に含まれるオリゴ糖や不飽和単糖、α−ケト酸は適宜、精製、濃縮して用いることができ、例えば、透析やゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーによる精製を行うことにより、高純度のオリゴ糖や不飽和単糖、α−ケト酸を得ることができる。
【００５５】
本発明に係るオリゴ糖、不飽和単糖、ないしα−ケト酸を製造する方法において、オリゴ糖や不飽和単糖、α−ケト酸が製造されたか否かやそれらの生成量は、定法に従って確認することができる。そのような方法としては、例えば、上述の２３５ｎｍにおける吸光度を測定する方法や、薄層クロマトグラフィー法を挙げることができる。薄層クロマトグラフィー法の場合は、例えば、シリカゲルプレートにおいて、１−ブタノール：酢酸：水＝２：１：１で混合した展開溶液を用いて展開した後、チオバルビツール酸発色法を行うことにより、本発明に係るオリゴ糖、または本発明に係る不飽和単糖やα−ケト酸を、それぞれ別個のバンドとして検出することができる。なお、チオバルビツール酸発色法は、Ｃ−Ｃ間に２重結合を有する化合物（不飽和糖など）やケト基を有する化合物（α−ケト酸など）に過ヨウ素酸を作用させて過酸化誘導体（ペルオキシド）とし、これにチオバルビツール酸を作用させて発色させるという原理に基づく方法である。
【００５６】
また、本発明に係るオリゴ糖や不飽和単糖、α−ケト酸の構造は、定法に従って確認することができ、その様な方法としては、例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳを用いた質量分析法や１，２−ｄｉａｍｉｎｏ−４，５−ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉｏｘｙｂｅｎｚｅｎｅ（ＤＭＢ）による蛍光誘導化法などを挙げることができる。
【００５７】
次に、本発明は、新規なエンド型アルギン酸リアーゼを提供する。本発明に係る新規のエンド型アルギン酸リアーゼは、以下の（ｉ）〜（ｖｉｉ）の特性を有する；
（ｉ）分子量が約３０ｋＤａである、
（ｉｉ）アルギン酸分解反応における至適ｐＨが約８である、
（ｉｉｉ）最も安定なｐＨが７＜ｐＨ＜８である、
（ｉｖ）アルギン酸分解反応における至適温度が約５４℃である、
（ｖ）６０℃で３０分間アルギン酸分解反応を行った後にアルギン酸分解酵素活性が消失する、
（ｖｉ）アルギン酸分解反応における至適ＮａＣｌ濃度Ｃが０．０５＜Ｃ＜０．３（ｍｏｌ／Ｌ）である、
（ｖｉｉ）アルギン酸の構造中、Ｄ−マンヌロン酸のホモポリマーである部分（Ｍブロック）、Ｌ−グルロン酸のホモポリマーである部分（Ｇブロック）、ＭブロックとＧブロックとが交互に結合した部分（ＭＧブロック）およびＤ−マンヌロン酸とＬ−グルロン酸とが交互に結合した部分（交互ポリマー）のいずれも分解することができる。
【００５８】
また、本発明に係る新規のエンド型アルギン酸リアーゼは、以下の（ｖｉｉｉ）または（ｉｘ）のアミノ酸配列を有していてもよい；
（ｖｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列、
（ｉｘ）配列番号２のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列。
【００５９】
本発明に係る新規のエンド型アルギン酸リアーゼは、定法に従って製造することができ、例えば、本発明に係るＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌に産生させて精製することにより、あるいは、本発明に係る分解酵素をさらに精製することにより（すなわち本発明に係るＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌から単離することにより）製造することができる。本発明に係る分解酵素をさらに精製する場合の精製方法としては、例えば、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＤＥＡＥ−６５０Ｍカラム、Ｍｏｎｏ Ｑ ５／５０ ＧＬカラム、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １０／３００ ＧＬカラムなどの各種のカラムを用いてクロマトグラフィーを連続して行う方法を挙げることができる。この場合、カラムクロマトグラフィーにおいて分取した溶出液について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより約３０ｋＤａの分子量のタンパク質の含有量を確認するとともに、上述したアルギン酸分解酵素活性の測定方法により、活性の有無や大小を確認することにより、エンド型アルギン酸リアーゼが高純度に含まれる溶出液を容易に選択して、精製を行うことができる。
【００６０】
次に、本発明に係る新規なエンド型アルギン酸リアーゼの異なる態様は、以下の（ｘ）または（ｘｉ）のアミノ酸配列を有するエンド型アルギン酸リアーゼである；
（ｘ）配列番号１２または配列番号１３のアミノ酸配列、
（ｘｉ）配列番号１２または配列番号１３のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列。
【００６１】
本発明に係る異なる態様の新規エンド型アルギン酸リアーゼは、定法に従って製造することができ、例えば、本発明に係るＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌に産生させて精製することにより、あるいは、本発明に係る分解酵素をさらに精製することにより（すなわち本発明に係るＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌から単離することにより）製造することができる。本発明に係る分解酵素をさらに精製する場合の精製方法としては、上述した本発明に係る新規エンド型アルギン酸リアーゼについての精製方法と同様の方法を挙げることができる。また、例えば、（ｘ）または（ｘｉ）のアミノ酸配列に相当する塩基配列を、遺伝子工学的手法を用いて、任意のベクターに組み込み、この組換えベクターを用いて宿主を形質転換し、得られた形質転換体を培養して、培養液からエンド型アルギン酸リアーゼを抽出、精製することにより製造することもできる。さらに、当該本発明に係る異なる態様の新規エンド型アルギン酸リアーゼは、従来あるいは将来において開発される、いかなる人工合成手法によっても製造することができる。
【００６２】
なお、本発明に係る新規エンド型アルギン酸リアーゼおよび本発明に係る異なる態様の新規エンド型アルギン酸リアーゼにおいて、上述した本発明に係るＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌、本発明に係るＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌が産生する分解酵素、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌およびＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｉｃｏｌａ Ｆ３１株の少なくともいずれかの使用、ならびに本発明に係るＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌や分解酵素を用いて、オリゴ糖、不飽和単糖、ないしα−ケト酸を製造する方法と同等もしくは相当する構成については、再度の説明を省略する。
【００６３】
最後に、本発明は、本発明に係るエンド型アルギン酸リアーゼをコードする遺伝子を提供する。本発明に係る遺伝子は、以下の（ｘｉｉ）または（ｘｉｉｉ）のタンパク質をコードする；
（ｘｉｉ）配列番号１２または配列番号１３のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｘｉｉｉ）配列番号１２または配列番号１３のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつエンド型アルギン酸リアーゼ活性を有するタンパク質。
【００６４】
本発明に係る遺伝子において、上述した本発明に係るＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌、本発明に係るＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌が産生する分解酵素、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌およびＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｉｃｏｌａ Ｆ３１株の少なくともいずれかの使用、本発明に係るＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌や分解酵素を用いて、オリゴ糖、不飽和単糖、ないしα−ケト酸を製造する方法ならびに本発明に係るエンド型アルギン酸リアーゼと同等もしくは相当する構成については、再度の説明を省略する。なお、本発明に係る遺伝子を含有する組換えベクターや当該組み換えベクターにより形質転換された微生物も、本発明に含まれる。
【００６５】
以下、本発明に係る新規のＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌、その細菌が産生するアルギン酸を分解する酵素、それらを用いてオリゴ糖や不飽和単糖、ないしα−ケト酸を製造する方法、新規のエンド型アルギン酸リアーゼおよびそれをコードする遺伝子について、実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。
【実施例】
【００６６】
＜実施例１＞菌の単離および多糖類に対する資化性の検討
（１）アルギン酸資化菌の単離
腐敗したスギモク（Ｃｏｃｃｏｐｈｏｒａ ｌａｎｇｓｄｏｒｆｉｉ、褐藻類の一種）を採取して集積培養法を行い、アルギン酸を資化する菌を単離し、これをアルギン酸資化菌とした。
【００６７】
（２）多糖類に対する資化性の比較
下記の試薬を下記の終濃度となるよう蒸留水に溶解し、これをＭＳ培地とした。
Ｎａ２ＨＰＯ４                  ３．６  ｇ／Ｌ
ＫＨ２ＰＯ４                    ０．７５ｇ／Ｌ
ＮＨ４Ｃｌ ０．５  ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ４                      ０．２  ｇ／Ｌ
【００６８】
続いて、下記に示す多糖類を、終濃度１％（ｗ／ｖ）となるよう加えたＭＳ培地および多糖類を加えないＬＢ培地（ｐＨ７．０）を用意し、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥとした。
【００６９】
Ａ；アルギン酸ナトリウム＋ＭＳ培地
Ｂ；デンプン＋ＭＳ培地
Ｃ；カルボキシメチルセルロース＋ＭＳ培地
Ｄ；ローカストビーンガム＋ＭＳ培地
Ｅ；多糖類を加えないＬＢ培地
【００７０】
本実施例（１）のアルギン酸資化菌を、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥに植菌して、ＢｉｏＦｌｏ−１１５型バイオリアクター（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ社）を用いて、通気大気量１Ｌ／分、撹拌回転数１５０ｒｐｍ、培養温度３０℃の条件下で７０時間培養した。培養中、下記に示す培養時間の時点で、１０ｍＬの培地を分取して６００ｎｍにおける吸光度を測定することにより培地中の菌数を確認した。その結果を図１に示す。
【００７１】
６００ｎｍにおける吸光度を測定した時点（時間）
Ａ        ；０、５、１０、１５、２０、３０、４０、６０、７０
Ｂ、Ｃ、Ｄ；０、５、１０、２０、３０、４０、６０、７０
Ｅ        ；０、５、１０、１５、２０、３０、４０、６０
【００７２】
図１に示すように、吸光度は、０−１０時間ではＡ≒Ｂ≒Ｅ＞Ｃ≒Ｄであり、１５−６０時間ではＡ＞Ｂ＞Ｅ＞Ｃ≒Ｄであり、７０時間ではＡ＞Ｂ＞Ｃ≒Ｄであった。
【００７３】
これらの結果から、アルギン酸資化菌は、デンプン、カルボキシメチルセルロースおよびローカストビーンガムを加えたＭＳ培地、ならびに多糖類を加えないＬＢ培地と比較して、アルギン酸ナトリウムを加えたＭＳ培地において増殖率が高いことが明らかになった。すなわち、アルギン酸資化菌は、多糖類のうち、アルギン酸に対して特に高い資化性を有することが明らかになった。
【００７４】
＜実施例２＞菌の同定
実施例１（１）のアルギン酸資化菌について、株式会社テクノスルガ・ラボにおいて１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列解析および菌学的性状試験を行った。
【００７５】
（１）１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列解析
１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列解析は、下記の試薬、装置およびプログラムを用いて、添付の仕様書に従って行った。
【００７６】
ＤＮＡ抽出；ＩｎｓｔａＧｅｎｅ Ｍａｔｒｉｘ（ＢＩＯ ＲＡＤ社）
ＰＣＲ；ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社）
サイクルシークエンス；ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）
使用プライマー（中川恭好ら、日本放線菌学会、  放線菌の分類と同定、第８８−１１７頁、２００１年）；ＰＣＲ増幅：９Ｆ、１５１０Ｒ、シークエンス：９Ｆ、７８５Ｆ、８０２Ｒ、１５１０Ｒ
シークエンス；ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１３０ ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚａｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）
配列決定；ＣｈｒｏｍａｓＰｒｏ １．４（Ｔｅｃｈｎｅｌｙｓｉｕｍ Ｐｔｙ  Ｌｔｄ．社）
相同性検索および簡易分子系統解析；ソフトウェア：アポロン２．０（テクノスルガ・ラボ社）、データベース：アポロンＤＢ−ＢＡ ６．０（テクノスルガ・ラボ社）、国際塩基配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ）
【００７７】
アポロンＤＢ−ＢＡ ６．０に対する相同性検索の結果、アルギン酸資化菌の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列（配列番号１）と相同率が高い上位３０位を表１に、ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬに対する相同性検索の結果、アルギン酸資化菌の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列（配列番号１）と相同率が高い上位３０位を表２にそれぞれ示す。また、アポロンＤＢ−ＢＡ ６．０に対する相同性検索の結果、アルギン酸資化菌の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列（配列番号１）と相同率が高い上位３２位の塩基配列を基に作成した分子系統樹を図２に示す。
【００７８】
【表１】
0006025018.tif 000012
【００７９】
【表２】
0006025018.tif 000013
【００８０】
表１に示すように、アポロンＤＢ−ＢＡ６．０に対する相同性検索の結果、アルギン酸資化菌の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列（配列番号１）は、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列に対し高い相同性を示し、Ｆ．ｏｍｎｉｖｏｒｕｍ ＡＳＩ．２７４７株（アクセッション番号ＡＦ４３３１７４）の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列に対し、相同率９７．０％の最も高い相同性を示した。また、表２に示すように、ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬに対する相同性検索の結果においても、アルギン酸資化菌の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列は、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列に対し高い相同性を示し、基準株では、Ｆ．ｏｍｎｉｖｏｒｕｍ ＡＳＩ．２７４７株（アクセッション番号ＮＲ＿０２５２０２）の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列に対し、相同率９７．０％の高い相同性を示した。なお、アクセッション番号ＡＦ４３３１７４の配列とアクセッション番号ＮＲ＿０２５２０２の配列とは、同一である。
【００８１】
また、図２に示すように、簡易分子系統解析の結果、アルギン酸資化菌は、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の種で形成されるクラスター内に含まれた。また、アルギン酸資化菌はＦ．ａｌｇｉｃｏｌａと最小のクラスターを形成したが、両者の間には距離が認められた。
【００８２】
以上の結果から、アルギン酸資化菌は、属レベルではＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に帰属することが示された。
【００８３】
一方、既報（ＳＴＡＣＫＥＢＲＡＮＤＴら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｔｏｄａｙ、第３３巻、第１５２−１５５頁、２００６年）によると、１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列解析では、その菌株と比較した菌株との相同率が９８．７％以上を示す場合、同種である可能性がある。これに対し、アルギン酸資化菌の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列についての相同性検索では、９８．７％以上の相同率を示す株は検出されず、簡易分子系統解析においてアルギン酸資化菌と最小クラスターを形成したＦ．ａｌｇｉｃｏｌａとの相同率も９６．５％と、９８．７％と比較して顕著に小さかった。これらのことから、アルギン酸資化菌は、新種（新規）であることが示唆された。
【００８４】
（２）菌学的性状試験
菌学的性状試験は、下記の試薬、機器および方法を用いて行った。
【００８５】
形態観察；光学顕微鏡ＢＸ５０Ｆ４（オリンパス社）
グラム染色；フェイバーＧ「ニッスイ」（日水製薬社）
カタラーゼ反応、グルコースからの酸／ガス産生、グルコースの酸化／発酵（Ｏ／Ｆ）；既報（ＢＡＲＲＯＷら、Ｃｏｗａｎ ａｎｄ Ｓｔｅｅｌ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂａｃｔｅｒｉａ．３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９３年）に記載の方法
生化学試験、資化性試験；ＡＰＩ２０ＮＥ Ｖｅｒ．７（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社）
酵素反応試験；ＡＰＩＺＹＭ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社）
生育試験、フレキシルビン色素の産生、カゼインおよびデンプンの加水分解；ＮＣＩＭＢ Ｌｔｄ．社（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｉｍｂ．ｃｏ．ｕｋ／）との技術提携事項および分類・同定の関連文献に従った方法
【００８６】
［２−１］形態的性状
培養温度３０℃での形態的性状についての結果を下記に示す。
１．細胞形態                            桿菌（０．７−０．８×１．０−１．５μｍ）
２．運動性                              なし
３．グラム染色                          陰性
４．胞子の有無                          なし
５．コロニー形態（ＬＢ寒天培地上、２４時間）
直径：１．０ｍｍ以下
色調：黄色
形：円形
隆起状態：レンズ状
周縁：全縁
表面の形状：スムーズ
透明度：不透明
粘調度：バター様
【００８７】
［２−２］生理学的性状
生理学的性状についての結果を下記に示す。＋は陽性を、−は陰性をそれぞれ示す。
１．グルコースからの酸／ガス産生（酸産生／ガス産生）      −／−
２．グルコースの酸化／発酵（酸化／発酵）                  −／−
３．グルコースの酸性化                                    −
４．フレキシルビン色素の産生                              −
５．インドール産生                                        −
６．硝酸塩の還元                                          −
７．ＭＢ２２１６寒天での生育                              ＋
８．生育温度
８−１．  ５℃                                            ＋（反応弱い）
８−２．１５℃                                            ＋
８−３．３７℃                                            ＋
８−４．４５℃                                            −
９．加水分解
９−１．カゼイン                                          −
９−２．デンプン                                          ＋
９−３．エスクリン                                        ＋
９−４．ゼラチン                                          −
１０．酵素反応
１０−１．カタラーゼ                                      ＋
１０−２．オキシダーゼ                                    ＋
１０−３．アルギニンジヒドロラーゼ                        −
１０−４．ウレアーゼ                                      −
１０−５．β−ガラクトシダーゼ                            ＋
１０−６．チトクロームオキシダーゼ                        ＋
１０−７．アルカリフォスファターゼ                        ＋
１０−８．エステラーゼ（Ｃ４）                            −
１０−９．エステラーゼ  リパーゼ（Ｃ８）                  −
１０−１０．リパーゼ（Ｃ１４）                            −
１０−１１．ロイシン  アリルアミダーゼ                    ＋
１０−１２．バリン  アリルアミダーゼ                      −
１０−１３．シスチン  アリルアミダーゼ                    −
１０−１４．トリプシン                                    −
１０−１５．キモトリプシン                                −
１０−１６．酸性ホスファターゼ                            ＋
１０−１７．ナフトール−ＡＳ−ＢＩ−ホスホハイドロラーゼ  −
１０−１８．α−ガラクトシダーゼ                          −
１０−１９．β−グルクロニダーゼ                          −
１０−２０．α−グルコシダーゼ                            −
１０−２１．β−グルコシダーゼ                            −
１０−２２．Ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ          −
１０−２３．α−マンノシダーゼ                            −
１０−２４．α−フコシダーゼ                              −
１１．資化性試験
１１−１．グルコース                                      −
１１−２．Ｌ−アラビノース                                −
１１−３．Ｄ−マンノース                                  ＋
１１−４．Ｄ−マンニトール                                ＋
１１−５．Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン                  −
１１−６．マルトース                                      −
１１−７．グルコン酸カリウム                              −
１１−８．ｎ−カプリン酸                                  −
１１−９．アジピン酸                                      −
１１−１０．ｄｌ−リンゴ酸                                −
１１−１１．クエン酸ナトリウム                            −
１１−１２．酢酸フェニル                                  −
【００８８】
以上の形態的性状および生理学的性状の結果に示すように、アルギン酸資化菌は、運動性を有さず、グラム陰性であり、ＬＢ寒天培地上でコロニーの色は黄色を呈し、グルコースを酸化せず、カタラーゼ反応およびオキシダーゼ反応が陰性を示す点で、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の一般的性状と一致した（ＫＲＩＥＧら、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、第１巻、第３５３−３６０頁、１９８４年）。
【００８９】
一方で、これら以外の全ての性状について、アルギン酸資化菌と一致する菌種は、既知種の中では見当たらなかった。また、アルギン酸資化菌の形態的性状および生理学的性状は、簡易分子系統解析においてアルギン酸資化菌と最小クラスターを形成したＦ．ａｌｇｉｃｏｌａと比較して、多数の相違点を有することが確認された（ＭＩＹＡＳＨＩＴＡら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｅｖｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、第６０巻、第３４４−３４８頁、２０１０年）。
【００９０】
以上の（１）および（２）の結果から、アルギン酸資化菌は、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の新種であることが明らかになった。そこで、アルギン酸資化菌をＵＭＩ−０１と命名し、平成２３年３月１０日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１０７６として寄託した。
【００９１】
＜実施例３＞培地における至適アルギン酸ナトリウム濃度およびアルギン酸分解酵素活性と培養時間との関係の検討
（１）培地における至適アルギン酸ナトリウム濃度の検討
［１−１］ＵＭＩ−０１の培養
実施例１（２）のＭＳ培地に０．５％（ｗ／ｖ）、１％（ｗ／ｖ）、１％（ｗ／ｖ）および２％（ｗ／ｖ）となるようアルギン酸ナトリウムを加え、ａ、ｂ、ｃおよびｄとした。ａ、ｂ、ｃおよびｄに、ＵＭＩ−０１を植菌して、６００ｎｍにおける吸光度が１．５となるまで、実施例１（２）に記載の条件下で前培養し、前培養菌液を得た。
【００９２】
次に、実施例１（２）のＭＳ培地８００ｍＬに０．５％（ｗ／ｖ）、１％（ｗ／ｖ）、１％（ｗ／ｖ）および２％（ｗ／ｖ）となるようアルギン酸ナトリウムを加え、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤとした。Ａ、Ｂ、ＣおよびＤに、前培養菌液ａ、ｂ、ｃおよびｄをそれぞれ５０ｍＬずつ加えた後、実施例１（２）に記載の条件下で９０時間本培養した。
【００９３】
［１−２］ｐＨおよび吸光度の測定
本実施例（１）［１−１］のＡ、Ｂ、ＣおよびＤについて、培養中、下記に示す培養時間の時点で、サンプラーを用いて１０ｍＬの培地を分取して、ｐＨおよび６００ｎｍにおける吸光度を測定した。ｐＨの測定結果に基づき、ＣおよびＤについては、シリンジを用いて５％（ｖ／ｖ）リン酸水溶液を滴下して、培地のｐＨを７．５に調整することにより、培養中の培地のｐＨを７．５に維持した。ＡおよびＢについては、ｐＨの調整は行わなかった。
【００９４】
ｐＨおよび６００ｎｍにおける吸光度を測定した時点（時間）
Ａ：０、１１、２０、２８．５、４０、４８．５、５８、７７．５、８９
Ｂ：０、４、２２、３０、４０、６２、６８、７４、８９
Ｃ：０、４、６、１４、２２、３０、４０、４７、５７、６６，７６、８３、９０
Ｄ：０、４、８．５、１４、２３．５、２８．５、３２、３５、４２、４８．５、５７、６８、７７、９０
【００９５】
吸光度の測定結果、ならびにＢにおける４、２２、４０、６２および８９時間時点のｐＨの測定結果を図３に示す。
【００９６】
図３に示すように、ＡおよびＢの吸光度を比較すると、０〜７４時間ではＡ＜Ｂであり、７４〜９０時間ではＡ＞Ｂであった。この結果から、培地のｐＨを調整せず、かつ培養時間が比較的短い場合は、アルギン酸ナトリウム濃度が０．５％（ｗ／ｖ）と比較して１％（ｗ／ｖ）の方が、ＵＭＩ−０１の増殖率が高いことが明らかになった。一方、培地のｐＨを調整せず、かつ培養時間が比較的長い場合は、アルギン酸ナトリウム濃度が１％（ｗ／ｖ）と比較して０．５％（ｗ／ｖ）の方が、ＵＭＩ−０１の増殖率が高いことが明らかになった。
【００９７】
また、ＣおよびＤの吸光度を比較すると、０〜３５時間ではＣ＞Ｄであり、４０〜９０時間ではＣ≒Ｄであった。この結果から、培地のｐＨを７．５に維持し、かつ培養時間が比較的短い場合は、アルギン酸ナトリウム濃度が２％（ｗ／ｖ）と比較して１％（ｗ／ｖ）の方が、ＵＭＩ−０１の増殖率が高いことが明らかになった。これに対し、培地のｐＨを７．５に維持し、かつ培養時間が比較的長い場合は、アルギン酸ナトリウム濃度が１％（ｗ／ｖ）と２％（ｗ／ｖ）とで増殖率が同等であることが明らかになった。
【００９８】
さらに、ＢおよびＣの吸光度を比較すると、０〜６８時間ではＢ＞Ｃであり、６８〜９０時間ではＢ＜Ｃであった。この結果から、培養時間が比較的短い場合は、ｐＨの調整の有無に関わらず、増殖率が低下しないのに対し、培養時間が比較的長い場合は、ｐＨの調整を行うことより増殖率の低下が防止できることが明らかになった。
【００９９】
（２）アルギン酸分解酵素活性と培養時間との関係の検討
［２−１］菌抽出液の調製
本実施例（１）［１−１］のＤについて、培養中、培養時間が２３．５、３２、４２、５０、６２、７４および９０時間の時点で、サンプラーを用いて１０ｍＬの培地を分取し、ｄ１、ｄ２、ｄ３、ｄ４、ｄ５、ｄ６およびｄ７とした。これを１０，０００×ｇ、４℃の条件下で１０分間遠心分離を行って、菌体ペレットを回収した。
【０１００】
続いて、菌体ペレットを０．５ｍＬの１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した後、凍結融解操作（−４０℃での凍結と氷上での融解）を１回行った。次に、超音波ホモジェナイザー（ＴＡＩＴＥＣ ＶＰ−０５０型、２５ｋＨｚ、２５Ｗ）を用いて１５秒間の超音波処理を１０回行うことにより菌体を破砕した後、１０，０００×ｇ、４℃の条件下で１０分間遠心分離を行い、上清を回収して、これを菌抽出液とした。
【０１０１】
［２−２］２３５ｎｍにおける吸光度の測定およびアルギン酸分解酵素活性の算出
１０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に、終濃度０．１５％（ｗ／ｖ）となるようアルギン酸ナトリウムを加え、１／２０容量の本実施例（２）［２−１］の菌抽出液を加えた後、３０℃にて１５分間インキュベートした。その間、記録計により２３５ｎｍにおける吸光度上昇を記録した。
【０１０２】
続いて、２３５ｎｍにおける吸光度を１分間に０．０１上昇させる活性を１Ｕと定義して、吸光度の測定結果から、アルギン酸分解酵素活性を算出した。その結果を図３に示す。
【０１０３】
図３に示すように、アルギン酸分解酵素活性の値は、ｄ１が８Ｕ／ｍＬ、ｄ２が５５Ｕ／ｍＬ、ｄ３が２１５Ｕ／ｍＬ、ｄ４が１２５Ｕ／ｍＬ、ｄ５が５４Ｕ／ｍＬ、ｄ６が１５Ｕ／ｍＬおよびｄ７が７Ｕ／ｍＬであった。
【０１０４】
これらの結果から、２％（ｗ／ｖ）のアルギン酸ナトリウムを含み、かつｐＨを７．５に維持した培地においては、４２時間培養したＵＭＩ−０１が、顕著に高いアルギン酸分解酵素活性を有することが明らかになった。
【０１０５】
＜実施例４＞菌体タンパク質の性状の検討
（１）ＵＭＩ−０１の培養
実施例１（２）のＭＳ培地に、１％（ｗ／ｖ）、１％（ｗ／ｖ）および２％（ｗ／ｖ）となるようアルギン酸ナトリウムを加えた培地を用意し、Ａ、ＢおよびＣとして、実施例３（１）［１−１］に記載の方法により、ＵＭＩ−０１を培養した。ただし、本培養は８００ｍＬに代えて１００ｍＬのスケールで行い、本培養の時間は９０時間に代えて、４８時間とした。
【０１０６】
（２）菌抽出液の調製
本実施例（１）のＡ、ＢおよびＣについて、実施例３（２）［２−１］に記載の方法により菌抽出液を得た。
【０１０７】
続いて、Ａの菌抽出液を回収した後の沈殿物について、実施例３（２）［２−１］に記載の抽出操作を行い、Ａ２を得た。すなわち、Ａの菌抽出液を回収した後の沈殿物に０．５ｍＬの１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を加えて懸濁した後、実施例３（２）［２−１］に記載の凍結融解操作、超音波処理および遠心分離を行って上清を回収し、Ａ２とした。
【０１０８】
さらに、Ａ２の菌抽出液を回収した後の沈殿物について、実施例３（２）［２−１］に記載の抽出操作を行い、Ａ３を得た。
【０１０９】
（３）菌抽出液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ
本実施例（２）のＡ、Ａ２、Ａ３、ＢおよびＣについて、既報（Ｐｏｒｚｉｏら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ. Ａｃｔａ．、第４９０巻、第２７−３４頁、１９７７年）に記載の方法によりＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。なお、ゲルは１０％ポリアクリルアミドスラブゲル（１ｍｍ厚、１０×１２ｃｍ）を用い、サンプルは１ウェル当たり１０μＬをアプライした。また、染色には、終濃度０．５％（ｗ／ｖ）のＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｒ−２５０（ＴｈｅｒｍｏＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）を溶解したメタノール／酢酸水溶液｛メタノール：酢酸：水＝５０：１０：４０（ｖ：ｖ：ｖ）｝を、脱色には、メタノール／酢酸水溶液｛メタノール：酢酸：水＝５：７：８８（ｖ：ｖ：ｖ）｝をそれぞれ用いた。その結果を図４上図に示す。
【０１１０】
図４上図に示すように、Ａ、Ａ２およびＡ３を比較すると、バンドパターンは同様であった。また、各バンドの発色強度はおおむねＡ＞Ａ２≒Ａ３であり、Ａにおける発色強度はＡ２およびＡ３における発色強度と比較して、約２倍大きかった。
【０１１１】
これらの結果から、実施例３（２）［２−１］に記載の抽出操作を繰り返し行うことにより回収される菌体タンパク質は、ほぼ同じ種類のものであることが明らかになった。また、抽出操作を１回行うことにより、菌体タンパク質の５０％程度を回収することができること、および抽出操作を繰り返し行うことにより、菌体タンパク質の回収量を増大させることができることが明らかになった。
【０１１２】
また、図４上図に示すように、ＢおよびＣを比較すると、６６．４ｋＤａ〜９７．２ｋＤａ付近のバンドパターンにおいてやや違いが見られた。また、Ｃにおける４２．７ｋＤａ付近および５５．６ｋＤａ付近のバンドの発色強度がＢと比較して大きいことが確認された。
【０１１３】
これらの結果から、培地のアルギン酸ナトリウム濃度を変化させることにより、ＵＭＩ−０１の菌体タンパク質の種類や生成量に違いが生じ得ることが明らかになった。
【０１１４】
（４）精製菌抽出液および精製菌抽出液のイオン交換クロマトグラフィー画分に含まれる菌体タンパク質の性状の検討
［４−１］精製菌抽出液の調製
本実施例（２）の菌抽出液Ｃについて、定法に従って硫安分画を行い、４０〜６０％飽和硫安画分および６０〜９０％飽和硫安画分を得た。これを１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した後、１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を外液として透析し、内液を回収して精製菌抽出液とした。４０〜６０％飽和硫安画分を透析したものをＣ４０−６０、６０〜９０％飽和硫安画分を透析したものをＣ６０−９０とした。
【０１１５】
［４−２］精製菌抽出液のイオン交換クロマトグラフィー
本実施例（４）［４−１］のＣ６０−９０について、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＣＭ−６５０ Ｍ（東ソー社）を用いて、添付の仕様書に従ってイオン交換クロマトグラフィーを行い、溶出液を得て、これを精製菌抽出液のイオン交換クロマトグラフィー画分とした。なお、溶出液として、０〜０．３ｍｏｌ／Ｌの範囲で直線的に濃度を変化させたＮａＣｌ水溶液を用いた。
【０１１６】
［４−３］精製菌抽出液および精製菌抽出液のイオン交換クロマトグラフィー画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ
本実施例（４）［４−１］のＣ６０−９０、および本実施例（４）［４−２］のイオン交換クロマトグラフィー画分について、本実施例（３）に記載の方法によりＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その結果を図４下図に示す。
【０１１７】
図４下図に示すように、精製菌抽出液Ｃ６０−９０では、２００ｋＤａ付近から６．５ｋＤａ付近の範囲において、さまざまな分子量を示すバンドが確認された。また、イオン交換クロマトグラフィー画分の溶出液番号７（塩濃度が０．０２７ｍｏｌ／Ｌ）、溶出番号９（塩濃度が０．０３５ｍｏｌ／Ｌ）、溶出番号１０（塩濃度が０．０３９ｍｏｌ／Ｌ）、溶出番号１１（塩濃度が０．０４４ｍｏｌ／Ｌ）、溶出番号１２（塩濃度が０．０４８ｍｏｌ／Ｌ）、溶出番号１３（塩濃度が０．０５２ｍｏｌ／Ｌ）、溶出番号１４（塩濃度が０．０５５ｍｏｌ／Ｌ）、溶出番号１５（塩濃度が０．０６ｍｏｌ／Ｌ）および溶出番号６３（塩濃度が０．２５ｍｏｌ／Ｌ）において、バンドが確認された。
【０１１８】
これらの結果から、精製菌抽出液には２００ｋＤａ付近から６．５ｋＤａ付近に至る、さまざまな分子量のタンパク質が含まれることが明らかになった。また、精製菌抽出液の菌体タンパク質には、イオン交換クロマトグラフィーにおいて、さまざまな塩濃度で溶出するタンパク質が含まれることが明らかになった。
【０１１９】
（５）精製菌抽出液のアルギン酸分解酵素活性および分解産物の検討
［５−１］アルギン酸分解酵素活性の算出
１０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に、ＮａＣｌおよびアルギン酸ナトリウムをそれぞれ、０．１ｍｏｌ／Ｌおよび０．５％（ｗ／ｖ）となるよう加えたものを２つ用意し、反応液ｐおよび反応液ｑとした。反応液ｐおよび反応液ｑに、１／２０容量の本実施例（４）［４−１］のＣ６０−９０およびＣ４０−６０をそれぞれ加えた後、３０℃にて６時間インキュベートした。その後、実施例３（２）［２−２］に記載の方法によりアルギン酸分解酵素活性を算出したところ、反応液ｐは２３９Ｕ／ｍＬであり、反応液ｑは２０１Ｕ／ｍＬであった。
【０１２０】
［５−２］薄層クロマトグラフィーによる分解産物の検討
本実施例（５）［５−１］の反応液ｐおよび反応液ｑについて、インキュベート開始から、１分間、５分間、１０分間、３０分間、１時間、２時間、４時間および６時間経過時に、２μＬの反応液を分取した。分取した反応液を１μＬずつ、２枚のＴＬＣ６０シリカゲルプレート（Ｍｅｒｃｋ社）にアプライし、１−ブタノール：酢酸：水＝２：１：１（ｖ：ｖ：ｖ）で混合した展開溶液を用いて展開した。その後、一方のプレートについてはチオバルビツール酸発色法を行うことにより、不飽和糖やα−ケト酸を検出し、もう一方のプレートについては硫酸発色法を行うことにより、全糖質を検出した。その結果を図５に示す。
【０１２１】
図５に示すように、反応液ｐでは、インキュベート時間が５分間より短い場合には２糖、３糖、４糖および５糖などを示すバンドが確認され、インキュベート時間が１０分間の場合には単糖（不飽和単糖やα−ケト酸）、２糖、３糖および４糖を示すバンドが主に確認され、インキュベート時間が３０分間より長い場合には単糖を示すバンドが主に確認された。
【０１２２】
また、反応液ｑでは、インキュベート時間が１０分間より短い場合には２糖、３糖、４糖、５糖および６糖などを示すバンドが確認され、インキュベート時間が３０分間の場合には単糖および２糖を示すバンドが確認され、反応時間が１時間より長い場合には単糖を示すバンドが主に確認された。
【０１２３】
また、反応液ｐおよび反応液ｑの間で、インキュベート時間が同じ場合における各バンドの発色強度を比較すると、単糖、２糖、３糖、４糖、５糖および６糖のいずれを示すバンドについても、おおむね反応液ｐにおける発色強度の方が大きかった。
【０１２４】
これらの結果から、反応液ｐおよび反応液ｑにおいて、精製菌抽出液によりアルギン酸が分解されてオリゴ糖や不飽和単糖、α−ケト酸が生成したことが明らかになった。また、菌抽出液の６０〜９０％飽和硫安画分からなる精製菌抽出液が、４０〜６０％飽和硫安画分からなる精製菌抽出液と比較して、より高いアルギン酸分解酵素活性を有することが明らかになった。
【０１２５】
すなわち、ＵＭＩ−０１はアルギン酸を分解してオリゴ糖、不飽和単糖およびα−ケト酸を製造することができる分解酵素を産生することが明らかになった。
【０１２６】
また、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ（４７００ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ａｎａｌｙｚｅｒ，ＡＢＩ社）を用いた質量分析法および１，２−ｄｉａｍｉｎｏ−４，５−ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉｏｘｙｂｅｎｚｅｎｅ（ＤＭＢ）による蛍光誘導化法により、不飽和単糖、α−ケト酸の構造を解析したところ、次式（化３１）の不飽和単糖、次式（化３２）のα−ケト酸または次式（化３３）のウロン酸であることが判明した；
【化３１】
0006025018.tif 000014
［化３２］ＨＯＯＣ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨＯＨ−ＣＨＯＨ−ＣＨＯ、
［化３３］ＨＯＯＣ−ＣＯＨ＝ＣＨ−ＣＨＯＨ−ＣＨＯＨ−ＣＨＯ。
【０１２７】
＜実施例５＞ＵＭＩ−０１が産生する分解酵素の性状の検討
（１）ＵＭＩ−０１の培養
実施例１（２）のＭＳ培地に、１％（ｗ／ｖ）となるようアルギン酸ナトリウムを加えた培地を用意し、実施例３（１）［１−１］に記載の方法により、ＵＭＩ−０１を培養した。ただし、本培養は８００ｍＬに代えて１０００ｍＬのスケールで行い、本培養の時間は９０時間に代えて４８時間とし、本培養の培養温度は３０℃に代えて２５℃とした。
【０１２８】
（２）精製菌抽出液の調製
本実施例（１）のＵＭＩ−０１について、実施例３（２）［２−１］に記載の方法により、約５ｇの菌体ペレットを得て、約５０ｍＬの菌抽出液を得た。ただし、遠心分離の時間は１０分間に代えて１５分間とした。
【０１２９】
続いて、菌抽出液について、実施例４（４）［４−１］に記載の方法により精製菌抽出液を調製し、約２０ｍＬの精製菌抽出液を得た。ただし、飽和硫安画分として、４０〜６０％飽和硫安画分および６０〜９０％飽和硫安画分に代えて、５０〜９０％飽和硫安画分を用いた。
【０１３０】
（３）アルギン酸分解酵素活性の算出
本実施例（２）の精製菌抽出液について実施例３（２）［２−２］に記載の方法により、アルギン酸分解酵素活性を算出したところ、５００Ｕ／ｍＬであった。すなわち、５００Ｕ／ｍＬ×２０ｍＬ＝計１０，０００Ｕの酵素を得ることができた。
【０１３１】
（４）基質特異性の検討
［４−１］吸光度測定
１０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に、下記のアルギン酸塩を終濃度０．１５％（ｗ／ｖ）となるよう加えたものを用意し、Ａ、Ｂ、
ＣおよびＤとした。
【０１３２】
Ａ：アルギン酸ナトリウム
Ｂ：主としてＭブロックを含むアルギン酸のナトリウム塩（Ｍ−ｒｉｃｈ）
Ｃ：主としてＭＧブロックを含むアルギン酸のナトリウム塩（ＭＧ−ｒｉｃｈ）
Ｄ：主としてＧブロックを含むアルギン酸のナトリウム塩（Ｇ−ｒｉｃｈ）
【０１３３】
なお、アルギン酸ナトリウムには、通常、Ｍブロック、ＭＧブロック、Ｇブロックおよび交互ポリマーがランダムに含まれる。
【０１３４】
続いて、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤに、１／２０容量の本実施例（２）の精製菌抽出液を加えた後、３０℃にて１８０分間インキュベートした。インキュベート開始から９分間の間、１分間経過毎に２３５ｎｍにおける吸光度を測定して、実施例３（２）［２−２］に記載の方法によりアルギン酸分解酵素活性を算出した。吸光度の測定結果およびアルギン酸分解酵素活性の算出結果を図６に示す。
【０１３５】
図６に示すように、吸光度はＡ、Ｂ、ＣおよびＤのいずれにおいても時間経過に比例して増大した。また、アルギン酸分解酵素活性の値は、Ａでは２６７Ｕ／ｍＬ、Ｂでは４２５Ｕ／ｍＬ、Ｃでは１６３Ｕ／ｍＬ、およびＤでは８０Ｕ／ｍＬであった。
【０１３６】
これらの結果から、精製菌抽出液により、主としてＭブロックを含むアルギン酸、Ｍブロック、ＭＧブロック、Ｇブロックおよび交互ポリマーをランダムに含むアルギン酸、主としてＭＧブロックを含むアルギン酸、および主としてＧブロックを含むアルギン酸のいずれも分解されることが明らかになった。
【０１３７】
すなわち、ＵＭＩ−０１が産生する分解酵素は、Ｍブロック、ＭＧブロックおよびＧブロックのいずれも分解することができることが明らかになった。また、ＵＭＩ−０１が産生する分解酵素の活性は、Ｍブロック＞ＭＧブロック＞Ｇブロックの順に高いことが明らかになった。
【０１３８】
［４−２］分解産物の検討
本実施例（２）［２−１］のＢおよびＤについて、インキュベート開始から、０分間、５分間、１０分間、３０分間、６０分間、１２０分間および１８０分間経過時に、２μＬの反応液を分取し、実施例４（５）［５−２］に記載の方法により薄層クロマトグラフィーおよびチオバルビツール酸発色法を行った。その結果を図７に示す。
【０１３９】
図７に示すように、Ｂでは、インキュベート時間が５分間、１０分間、３０分間、６０分間、１２０分間および１８０分間において、２糖および単糖を示すバンドが確認された。また、インキュベート時間が長いほど、単糖を示すバンドの発色強度は大きくなることが確認された。一方、Ｄでは、インキュベート時間が５分間、１０分間、３０分間、６０分間、１２０分間および１８０分間において、２糖を示すバンドが確認された。また、インキュベート時間が長いほど、単糖を示すバンドの発色強度は大きくなることが確認された。
【０１４０】
これらの結果から、ＢおよびＤにおいて、精製菌抽出液によりアルギン酸が分解されて２糖の他、（化３１）、（化３２）または（化３３）のような不飽和単糖やα−ケト酸、ウロン酸が生成したことが明らかになった。すなわち、ＵＭＩ−０１はＭブロックやＧブロックを分解して２糖や不飽和単糖、α−ケト酸、ウロン酸を製造することができる分解酵素を産生することが明らかになった。
【０１４１】
（３）市販のＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ由来アルギン酸リアーゼとの比較
１０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に、アルギン酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）となるよう加えたものを２つ用意し、反応液ｐおよび反応液ｑとした。反応液ｐには、本実施例（２）の精製菌抽出液を５０Ｕ／ｍＬ相当量加え、反応液ｑには、市販のＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ由来アルギン酸リアーゼ（Ｓｉｇｍａ社）を５０Ｕ／ｍＬ相当量加えた後、いずれも３０℃にて９０分間インキュベートした。
【０１４２】
インキュベート開始から、０分間、５分間、１０分間、２０分間、３０分間、６０分間および９０分間経過時に、２μＬを分取し、実施例４（５）［５−２］に記載の方法により薄層クロマトグラフィーおよびチオバルビツール酸発色法を行った。その結果を図８に示す。
【０１４３】
図８に示すように、反応液ｐでは、５分間、１０分間、２０分間、３０分間、６０分間および９０分間経過時に、主として２糖および単糖を示すバンドが確認された。また、単糖を示すバンドの発色強度がインキュベート時間の経過とともに大きくなった。一方、反応液ｑでは、５分間、１０分間、２０分間、３０分間、６０分間および９０分間経過時に、主として３糖、４糖および５糖を示すバンドが確認されたが、単糖を示すバンドは確認されなかった。また、３糖および４糖を示すバンドの発色強度がインキュベート時間の経過とともに大きくなった。また、反応液ｐと反応液ｑとを、同じインキュベート時間において比較すると、反応液ｐにおけるバンドの発色強度が、反応液ｑと比較して大きかった。
【０１４４】
これらの結果から、市販のＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ由来アルギン酸リアーゼは、アルギン酸を単糖まで分解することができないのに対し、ＵＭＩ−０１が産生する分解酵素はアルギン酸を単糖まで分解することができることが明らかになった。また、ＵＭＩ−０１が産生する分解酵素の活性が、市販のＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ由来アルギン酸リアーゼと比較して、高いことが明らかになった。
【０１４５】
＜実施例６＞エンド型アルギン酸リアーゼの単離
（１）精製菌抽出液の調製
実施例１（２）のＭＳ培地に、１／１００００量のＴｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓ溶液 （０．１ＮのＨＣｌ １ＬにＦｅＣｌ３９．７ｇ、ＣａＣｌ２７．８ｇ、ＣｏＣｌ２６水和物０．２１８ｇ、ＣｕＳＯ４５水和物０．１５６ｇ、ＮｉＣｌ３６水和物０．１１８ｇおよびＣｒＣｌ３６水和物０．１０５ｇを溶解したもの）および１％（ｗ／ｖ）となるようアルギン酸ナトリウムを加えた培地（アルギン酸ナトリウム入りＭＳ最少培地）を用意し、実施例３（１）［１−１］に記載の方法により、ＵＭＩ−０１を培養した。ただし、前培養は１００ｍＬ、本培養は１０００ｍＬのスケールで行い、本培養の培地に加える前培養菌液は２０ｍＬとした。続いて、実施例３（２）［２−１］に記載の方法において、１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に代えて１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６；以下「トリス緩衝液」という。）を用いて抽出操作を行い、菌抽出液を得た。
【０１４６】
次に、菌抽出液について、実施例４（４）［４−１］に記載の方法において、０〜５０％飽和硫安画分および５０〜９０％飽和硫安画分を用いて硫安分画を行った。すなわち、菌抽出液の体積を測定して、粉末硫安を５０％飽和となるように添加して溶解した。その際、０．１ＮのＮＨ４ＯＨを用いてｐＨを７．６に維持した。続いて、１００００×ｇで２０分間遠心分離を行うことにより沈殿物と上清とをそれぞれ回収し、沈殿物をトリス緩衝液に溶解して、これを０〜５０％飽和硫安画分とした。一方、上清には、９０％飽和となるようにさらに粉末硫安を添加して溶解した。続いて、同様の条件下で遠心分離を行うことにより沈殿物を回収し、トリス緩衝液に溶解して、これを５０〜９０％飽和硫安画分とした。実施例３（２）［２−２］に記載の方法により、０〜５０％飽和硫安画分および５０〜９０％飽和硫安画分のアルギン酸分解酵素活性を算出して比較したところ、５０〜９０％飽和硫安画分の方がより高いアルギン酸分解酵素活性を示したことから、この５０〜９０％飽和硫安画分を精製菌抽出液として、下記の実験に用いた。
【０１４７】
（２）Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＤＥＡＥ−６５０Ｍカラムクロマトグラフィーによる精製
トリス緩衝液で平衡化したＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＤＥＡＥ−６５０Ｍカラム（直径２．５×長さ１７．５ｃｍ；東ソー社）に本実施例６（１）の精製菌抽出液を供した。その後、０〜０．３ｍｏｌ／Ｌの直線濃度勾配および０．５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含むトリス緩衝液（ＮａＣｌ／トリス緩衝液）を用いてカラムに吸着させたタンパク質の溶出を行い、溶出液を１０ｍＬずつ分取して、分取開始から順に、１〜１２０番の溶出画分とした。各溶出画分について、含有タンパク質量の指標として２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。また、各溶出画分について、実施例３（２）［２−２］に記載の方法によりアルギン酸分解酵素活性を測定した。その結果を図９に示す。図９に示すように、アルギン酸分解酵素活性は、５〜７番の溶出画分（トリス緩衝液による溶出液；図９においてピークａで示す）、および、３１〜４５番の溶出画分（０．０５〜０．１５ｍｏｌ／Ｌ付近のＮａＣｌ水溶液による溶出液；図９においてピークｂおよびｃで示す）にピークが確認された。
【０１４８】
そこで、ピークａ〜ｃに相当する溶出画分ならびに精製菌抽出液について、定法に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。また、ピークａ〜ｃに相当する溶出画分および精製菌抽出液について、実施例４（５）［５−１］および［５−２］に記載の方法により、アルギン酸ナトリウムを加えてインキュベートした後に薄層クロマトグラフィーを行い、チオバルビツール酸発色法により検出した（以下、「活性染色法」という。）。その結果を図１０に示す。図１０に示すように、活性染色法で、ピークｂに相当する溶出画分において顕著に高い発色が確認され、アルギン酸の分解産物が多く生成していることが確認された。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで、ピークｂに相当する溶出画分において、分子量約３０ｋＤａのタンパク質を示すバンドが確認された。これらの結果から、ピークｂに相当する溶出画分（３１〜３５番の溶出画分）を第一酵素液として、以下のさらなる精製に供することとした。
【０１４９】
（３）Ｍｏｎｏ Ｑ ５／５０ ＧＬカラムクロマトグラフィーによる精製
本実施例６（２）の第一酵素液を凍結乾燥した。続いて、これをトリス緩衝液に溶解し、トリス緩衝液を外液として透析して、内液を回収した。次に、遠心濾過フィルターＵｌｔｒａｆｒｅｅ ＭＣ／ＣＬ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて濾過し、濾液を回収した。濾液をＭｏｎｏ Ｑ ５／５０ ＧＬ陰イオン交換カラム（５×５０ｍｍ）を装着したＡＫＴＡ−ＦＰＬＣ （ＧＥヘルスケア社）に供した。その後、０〜０．３ｍｏｌ／Ｌの直線濃度勾配および０．５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ／トリス緩衝液を用いて、流速０．８ｍＬ／分でカラムに吸着させたタンパク質の溶出を行い、溶出液を１ｍＬずつ分取して、分取開始から順に、１〜３５番の溶出画分とした。各溶出画分について、２８０ｎｍにおける吸光度を測定し、また、実施例３（２）［２−２］に記載の方法によりアルギン酸分解酵素活性を測定した。その結果を図１１に示す。図１１に示すように、アルギン酸分解酵素活性は、２および３番の溶出画分（トリス緩衝液による溶出液；図１１においてピークｄで示す）にピークが確認された。また、吸光度は、２および３番の溶出画分（トリス緩衝液による溶出画分；図１１においてピークｄで示す）および１１〜１５番の溶出画分（０．１ｍｏｌ／Ｌ付近のＮａＣｌ／トリス緩衝液による溶出液；図１１においてピークｅで示す）にピークが確認された。
【０１５０】
そこで、ピークｄおよびｅに相当する溶出画分および第一酵素液について、定法に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥを、実施例４（５）［５−１］および［５−２］に記載の方法により、活性染色法を、それぞれ行った。その結果を図１２に示す。図１２に示すように、活性染色法で、ピークｄに相当する溶出画分において顕著に高い発色が確認され、アルギン酸の分解産物が多く生成していることが確認された。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで、ピークｄに相当する溶出液において、分子量約３０ｋＤａのタンパク質を示すバンドが明瞭に確認された。これらの結果から、ピークｄに相当する溶出画分（２および３番の溶出画分）を第二酵素液として、以下のさらなる精製に供することとした。
【０１５１】
（４）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １０／３００ ＧＬカラムクロマトグラフィーによる精製
本実施例６（３）の第二酵素液を０．３ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ／トリス緩衝液に溶解し、０．３ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ／トリス緩衝液を外液として透析して、内液を回収した。次に、遠心濾過フィルターＵｌｔｒａｆｒｅｅ ＭＣ／ＣＬ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて濾過し、濾液を回収した。濾液を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １０／３００ ＧＬカラム（０．１×３０ｃｍ）を装着したＡＫＴＡ−ＦＰＬＣゲル濾過カラムクロマトグラフィーに供した。その後、０．３ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ／トリス緩衝液を用いて流速１．０ｍＬ／分でカラムに吸着させたタンパク質の溶出を行い、溶出液を１ｍＬずつ分取して、分取開始から順に、１〜３５番の溶出画分とした。各溶出画分について、２８０ｎｍにおける吸光度を測定し、また、実施例３（２）［２−２］に記載の方法によりアルギン酸分解酵素活性を測定した。その結果を図１３に示す。図１３に示すように、アルギン酸分解酵素活性は、１０〜１２番の溶出画分；図１３においてピークｆ〜ｈで示す）にピークが確認された。
【０１５２】
そこで、ピークｆ〜ｈに相当する溶出画分および第二酵素液について、定法に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥを、実施例４（５）［５−１］および［５−２］に記載の方法により活性染色法を、それぞれ行った。その結果を図１４に示す。図１４に示すように、活性染色法で、ピークｆ〜ｈに相当する溶出画分のいずれにおいても、高い発色が確認され、アルギン酸ナトリウムの分解産物が多く生成していることが確認された。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで、ピークｆ〜ｈに相当する溶出画分のいずれにおいても、分子量約３０ｋＤａのタンパク質を示すバンドが確認され、特にピークｆおよびｇに相当する溶出画分で、そのバンドが明瞭に確認された。これらの結果から、ピークｆ〜ｈに相当する溶出画分中に存在する分子量約３０ｋＤａのタンパク質を、アルギン酸リアーゼＦｌＡｌｙ−１と称することとした。また、ピークｆ〜ｈに相当する溶出画分を精製ＦｌＡｌｙ−１液とした。
【０１５３】
また、本実施例６（１）の菌抽出液および精製菌抽出液、本実施例６（２）の第一酵素液、本実施例６（３）の第二酵素液および精製ＦｌＡｌｙ−１液について、Ｌｏｗｒｙ法によりタンパク質量を測定して、アルギン酸分解酵素活性の測定結果に基づき、比活性（Ｕ／ｍｇ）および総活性（Ｕ）を算出した。また、菌抽出液の総活性を１００％として、精製菌抽出液、第一酵素液、第二酵素液および精製ＦｌＡｌｙ−１液の総活性を百分率に換算し、これを酵素の活性収率（％）とした。また、菌抽出液の比活性を１として、比活性の相対比を算出し、これを精製度（ｆｏｌｄ）とした。その結果を表３に示す。表３に示すように、精製ＦｌＡｌｙ−１液の精製度は菌抽出液の３０１６．４倍であり、酵素の活性収率は１．４％であった。
【０１５４】
【表３】
0006025018.tif 000015
【０１５５】
＜実施例７＞ＦｌＡｌｙ−１の酵素特性の検討
（１）アルギン酸の分解様式の検討
１０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に、終濃度０．１５％（ｗ／ｖ）となるようアルギン酸ナトリウムを加えて解析用基質液とした。オストワルド粘度計を用いて解析用基質液の３０℃における粘度を測定した。続いて、解析用基質液に精製ＦｌＡｌｙ−１液０．１ｍＬ（６０Ｕ）を加えて反応液とし、３０℃にて３０分間インキュベートすることによりアルギン酸分解反応を行った。その間、２３５ｎｍにおける吸光度を測定するとともに、オストワルド粘度計を用いて粘度を測定した。反応液の粘度の測定値について、解析用基質液の測定値を１として、相対値（相対粘度）を算出した。その結果を図１５に示す。図１５に示すように、相対粘度はアルギン酸分解反応の初期に急激に低下した後、穏やかに低下を続け、３０分後には１．０８となった。一方、吸光度の増加速度、すなわちアルギン酸の分解産物である不飽和糖の生成速度は、反応時間を通じてほぼ一定であった。これらの結果から、ＦｌＡｌｙ−１は、アルギン酸の分子内部をランダムに分解する酵素であること、すなわち、エンド型のアルギン酸リアーゼであることが明らかになった。
【０１５６】
（２）至適ｐＨの検討
本実施例７（１）の解析用基質液を調製し、８．３Ｕの精製ＦｌＡｌｙ−１液を加えて反応液とした。ただし、１０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム緩衝液のｐＨを変化させることにより、種々のｐＨの反応液を調製した。反応液を３０℃にて１５分間インキュベートすることによりアルギン酸分解反応を行い、実施例３（２）［２−２］に記載の方法によりアルギン酸分解酵素活性を測定した。その後、測定されたアルギン酸分解酵素活性の最高値を１００％として、相対的活性値を算出した。その結果を図１６左図に示す。図１６左図に示すように、相対的活性値は、反応液のｐＨが約８の場合に１００％となった。この結果から、ＦｌＡｌｙ−１のアルギン酸分解反応における至適ｐＨは約８であることが明らかになった。
【０１５７】
（３）ｐＨ安定性の検討
本実施例７（２）に記載の方法において、反応時間を１５分間に代えて３時間としてアルギン酸分解反応を行い、これを当初反応液とした。当初反応液を急冷した後、本実施例７（１）の解析用基質液に加えて、３０℃で１０分間インキュベートすることにより二度目のアルギン酸分解反応を行った。その後、実施例３（２）［２−２］に記載の方法によりアルギン酸分解酵素活性を測定し、本実施例７（２）に記載の方法により相対的活性値を算出した。その結果を図１６右図に示す。図１６右図に示すように、相対的活性値は、当初反応液のｐＨが７．６の場合に１００％であり、ｐＨ７〜８の場合に８０％以上であった。この結果から、ｐＨ７〜８でアルギン酸分解反応を行った後に、アルギン酸分解酵素活性が最もよく残存すること、すなわち、ＦｌＡｌｙ−１はｐＨが７＜ｐＨ＜８において最も安定であることが明らかになった。
【０１５８】
（４）至適温度の検討
本実施例７（１）の解析用基質液に、１１．３Ｕの精製ＦｌＡｌｙ−１液を加えて反応液とし、種々の温度にて１５分間インキュベートすることによりアルギン酸分解反応を行った。その後、実施例３（２）［２−２］に記載の方法によりアルギン酸分解酵素活性を測定し、本実施例７（２）に記載の方法により相対的活性値を算出した。その結果を図１７左図に示す。図１７左図に示すように、相対的活性値は、反応液の温度が約５４℃の場合に１００％であった。この結果から、ＦｌＡｌｙ−１のアルギン酸分解反応における至適温度は約５４℃であることが明らかになった。
【０１５９】
（５）温度安定性の検討
本実施例７（５）に記載の方法において、反応時間を１５分間に代えて３０分間としてアルギン酸分解反応を行い、これを当初反応液とした。当初反応液について、本実施例７（３）に記載の方法により、相対的活性値を求めた。その結果を図１７右図に示す。図１７右図に示すように、相対的活性値は、当初反応液のアルギン酸分解反応時の温度が、２０℃〜４７℃の場合に５０％以上であり、６０℃の場合に０％であった。この結果から、ＦｌＡｌｙ−１は、４７℃で３０分間アルギン酸分解反応を行った後ではアルギン酸分解酵素活性が５０％以上残存しているのに対し、６０℃で３０分間アルギン酸分解反応を行った後ではアルギン酸分解酵素活性が消失することが明らかになった。
【０１６０】
（６）至適ＮａＣｌ濃度の検討
本実施例７（１）の解析用基質液に、８．８Ｕの精製ＦｌＡｌｙ−１液を加え、種々の終濃度になるようにＮａＣｌを添加して反応液とした。反応液を３０℃にて１０分間インキュベートすることによりアルギン酸分解反応を行った。その後、実施例３（２）［２−２］に記載の方法によりアルギン酸分解酵素活性を測定し、本実施例７（２）に記載の方法により相対的活性値を算出した。その結果を図１８に示す。図１８に示すように、相対的活性値は、反応液におけるＮａＣｌの終濃度が０．１および０．２ｍｏｌ／Ｌの場合に１００％であり、０．０５ｍｏｌ／Ｌおよび０．４ｍｏｌ／Ｌの場合に９０％以上であった。この結果から、ＦｌＡｌｙ−１のアルギン酸分解反応における至適ＮａＣｌ濃度Ｃは、０．０５＜Ｃ＜０．３（ｍｏｌ／Ｌ）であることが明らかとなった。
【０１６１】
（７）基質特異性の検討
基質を、アルギン酸ナトリウムに代えてアルギン酸ナトリウムならびに実施例５（４）［４−１］のＭ−ｒｉｃｈ、ＭＧ−ｒｉｃｈおよびＧ−ｒｉｃｈとして、本実施例７（１）の解析用基質液を調製した。解析用基質液に２．１Ｕの精製ＦｌＡｌｙ−１液を加えて反応液とし、３０℃にて５分間インキュベートすることによりアルギン酸分解反応を行った。その間、２３５ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果を図１９に示す。図１９に示すように、アルギン酸ナトリウム、Ｍ−ｒｉｃｈ、ＭＧ−ｒｉｃｈおよびＧ−ｒｉｃｈのいずれが基質である場合も、同程度の吸光度が測定された。この結果から、ＦｌＡｌｙ−１は、Ｍブロック、ＭＧブロック、Ｇブロックおよび交互ポリマーをランダムに含むアルギン酸（アルギン酸ナトリウム）、主としてＭブロックを含むアルギン酸（Ｍ−ｒｉｃｈ）、主としてＭＧブロックを含むアルギン酸（ＭＧ−ｒｉｃｈ）、および主としてＧブロックを含むアルギン酸（Ｇ−ｒｉｃｈ）のいずれも同様に分解することができることが明らかになった。すなわち、ＦｌＡｌｙ−１は、アルギン酸の構造中、Ｄ−マンヌロン酸のホモポリマーである部分（Ｍブロック）、Ｌ−グルロン酸のホモポリマーである部分（Ｇブロック）、ＭブロックとＧブロックとが交互に結合した部分（ＭＧブロック）およびＤ−マンヌロン酸とＬ−グルロン酸とが交互に結合した部分（交互ポリマー）のいずれも同様に分解することができることが示された。
【０１６２】
（８）種々の塩および化学物質の影響の検討
ｐＨを７．０に代えて７．２とし、基質をアルギン酸ナトリウムに代えて二価金属イオンが共存した場合にゲル化し難いＭ−ｒｉｃｈとして、本実施例７（１）の解析用基質液を調製した。解析用基質液に表４の左欄に示す試薬を表４の中欄に示す終濃度となるよう添加し、８．６９Ｕの精製ＦｌＡｌｙ−１液を加えて反応液とした。反応液を、３０℃にて５分間インキュベートすることによりアルギン酸分解反応を行った。また、コントロールとして、試薬を添加せずに、同様にアルギン酸分解反応を行った。その後、実施例３（２）［２−２］に記載の方法によりアルギン酸分解酵素活性を測定し、コントロールのアルギン酸分解酵素活性の値を１００％として、相対的活性値を算出した。その結果を表４右欄に示す。表４右欄に示すように、アルギン酸分解酵素活性は、反応液中にＮａ＋やＮＨ４＋などが存在した場合に増大する一方で、Ｃｏ２＋やＣｄ２＋、Ｃｕ２＋などが存在した場合に低下する傾向であること、およびＤＴＴなどの還元剤が存在した場合には、ほとんど変化しないことが明らかになった。
【０１６３】
【表４】
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【０１６４】
（９）アルギン酸分解産物の検討
アルギン酸ナトリウムの終濃度を０．１５（ｗ／ｖ）に代えて０．７５％（ｗ／ｖ）として、本実施例７（１）の解析用基質液を調製した。解析用基質液に、５００Ｕの精製ＦｌＡｌｙ−１液を加えて反応液とし、３０℃にて０〜２４時間インキュベートすることによりアルギン酸分解反応を行った。その後、実施例４（５）［５−２］に記載の方法により、分解産物の検討を行った。その結果を図２０に示す。図２０に示すように、硫酸発色法およびチオバルビツール酸発色法のいずれにおいても、２〜４糖を示すバンドが主に確認された。その一方で、単糖（不飽和単糖やα−ケト酸）を示すバンドは確認されなかった。これらの結果から、ＦｌＡｌｙ−１はアルギン酸を分解して２〜４糖のオリゴ糖を生成させること、および、単糖は生成させないことが明らかになった。なお、ＵＭＩ−０１の菌抽出液や精製菌抽出液により単糖（不飽和単糖やα−ケト酸）が生成したのは、アルギン酸オリゴ糖を単糖（不飽和単糖やα−ケト酸）にまで分解する、ＦｌＡｌｙ−１とは別の二糖分解酵素をＵＭＩ−０１が有するためと考えられた。
【０１６５】
＜実施例８＞ＦｌＡｌｙ−１遺伝子の塩基配列解析
（１）ＦｌＡｌｙ−１のＮ末端アミノ酸配列
ＦｌＡｌｙ−１のＮ末端アミノ酸配列を、プロテインシーケンサー（４７３Ａ型；アプライドバイオシステムズ社）を用いて分析した。その結果、Ｎ末端４０残基のアミノ酸配列はＳＫＴＡＫＩＤＷＳＨＷＴＶＴＶＰＥＥＮＰＤＫＰＧＫＰＹＳＬＧＹＰＥＩＬＮＹＡＥＤ（配列番号２）であることが明らかになった。次に、配列番号２のアミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴ検索を行った。その結果を表５に示す。表５に示すように、配列番号２のアミノ酸配列と、１００％の相同性を示す既知のアミノ酸配列は検出されなかった。また、配列番号２のアミノ酸配列と４６〜５１％の相同性を示す既知のアミノ酸配列が検出された。これらは、多糖リアーゼファミリー７（ＰＬ−７）に属する微生物由来アルギン酸リアーゼおよび類似の配列を有するタンパク質であった。この結果から、ＦｌＡｌｙ−１は新規のアルギン酸リアーゼであることが明らかになった。
【０１６６】
【表５】
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【０１６７】
（２）ＵＭＩ−０１のゲノムＤＮＡの抽出
ＵＭＩ−０１を、実施例６（１）のアルギン酸ナトリウム入りＭＳ最少培地１０ｍＬで培養した後、８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離を行い、菌体ペレットを回収した。菌体ペレットをマイクロピペットの先で１μＬ程度取ってマイクロチューブに入れ、ＩＳＯＨＡＩＲ（ＮＩＰＰＯＮ ＧＥＮＥ社）を用いて、添付の使用書に従いゲノムＤＮＡを抽出して、抽出液を得た。抽出液に、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１／ｖ：ｖ：ｖ）２００μＬを加えて５分間穏やかに転倒混和することによりタンパク質を不溶化させ、１１０００×ｇで５分間遠心分離を行った後、ゲノムＤＮＡを含む水相を回収した。その後、エタノール沈殿を行ってゲノムＤＮＡを回収し、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した。ゲノムＤＮＡの濃度は、ナノドロップ（ＮａｎｏＤｒｏｐ １０００）を用いて測定した。
【０１６８】
（３）ＦｌＡｌｙ−１遺伝子のＰＣＲによる増幅
下記条件により一次ＰＣＲおよび二次ＰＣＲを行って、二次ＰＣＲ産物を得た。二次ＰＣＲ産物を、定法に従い、ｐＴａｑ１プラスミドベクターに挿入した後、大腸菌ＤＨ５αにトランスフォーメーションしてクローニングし、クローンプラスミドを得た。
【０１６９】
一次ＰＣＲの条件
ＤＮＡポリメラーゼ；Ｅｘ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ社）
プライマー；
配列番号２のアミノ酸配列に基づき設計した縮重プライマーとして１Ｆおよび２Ｆ
１Ｆ：ＧＧＮＡＡＲＡＣＮＧＣＮＡＡＲＡＴＨＧＡ（配列番号３）
２Ｆ：ＣＡＹＷＳＮＣＡＹＴＧＧＡＣＮＧＴＮＡＣ（配列番号４）
ＰＬ−７の高度保存領域のアミノ酸配列に基づき設計した縮重プライマーとして１Ｒおよび２Ｒ
１Ｒ：ＴＣＮＧＣＮＧＣＲＴＡＲＴＴＮＡＲＤＡＴ（配列番号５）
２Ｒ：ＴＡＮＡＲＮＣＣＮＧＣＮＧＣＹＴＴＲＡＡＲＴＡ（配列番号６）
［なお、プライマーの塩基配列中、ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴを、ＲはＡまたはＧを、ＨはＡ、ＴまたはＣを、ＹはＣまたはＴを、ＷはＡまたはＴを、ＳはＣまたはＧを、ＤはＡ、ＧまたはＴをそれぞれ示す。］
鋳型ＤＮＡ；本実施例８（２）のゲノムＤＮＡ
使用機器；ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＤｉｃｅＲ ｍｉｎｉ（ＴａＫａＲａ社）
反応条件；９６℃で２分間の後、９６℃で３０秒、４５℃で３０秒および７２℃で１分の反応を１サイクルとして、４０サイクル行い、最後に７２℃で７分間インキュベートすることにより、一次ＰＣＲ産物を得た。
【０１７０】
二次ＰＣＲの条件（下記以外は一次ＰＣＲと同条件）
鋳型ＤＮＡ；一次ＰＣＲ産物
プライマー；（ＴＡ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ；ダイナエクスプレス社）
Ｍ１３ ＢＤ−Ｆｗ Ｐｒｉｍｅｒ
Ｍ１３ ＢＤ−Ｒｅｖ Ｐｒｉｍｅｒ
反応条件；４０サイクルを３０サイクルとした他は一次ＰＣＲと同条件で行い、二次ＰＣＲ産物を得た。
【０１７１】
また、下記の条件によりインバース一次ＰＣＲを行って、インバース一次ＰＣＲ産物を得た。インバース一次ＰＣＲ産物を鋳型として、インバース一次ＰＣＲと同条件でインバース二次ＰＣＲを行い、インバース二次ＰＣＲ産物を得た。インバース二次ＰＣＲ産物を、定法に従いｐＴａｑ１プラスミドベクターに挿入してクローニングし、クローンプラスミドを得た。
【０１７２】
インバース一次ＰＣＲの条件（下記以外は一次ＰＣＲと同条件）
鋳型ＤＮＡ；本実施例８（２）のゲノムＤＮＡを各種の制限酵素により消化し、フェノール−クロロホルム処理およびエタノール沈殿を行って精製したものをＴ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（ＴａＫａＲａ社）により自己ライゲーションさせて得られた環状ＤＮＡ。
プライマー；
ｉｎｖ−１Ｆ：ＡＡＴＧＡＧＡＧＧＴＡＣＧＴＡＴＧＣＴＡＴＴＧＡＣＧＡ（配列番号７）
ｉｎｖ−２Ｆ：ＧＣＣＧＣＧＴＴＡＴＴＡＴＴＧＣＧＣＡＡＡＴＴＣＡＣＧＧ（配列番号８）
ｉｎｖ−１Ｒ：ＣＡＡＣＡＧＡＣＴＴＧＴＣＴＴＴＴＧＧＧＴＣＡＴＣＧＴＡ（配列番号９）
ｉｎｖ−２Ｒ：ＧＧＡＴＧＣＧＡＴＴＴＴＡＴＣＣＴＣＡＧＣＡＴＡＡＴＴＴ（配列番号１０）
反応条件；９６℃で２分間の後、９６℃で３０秒、６０℃で３０秒および７２℃で５分の反応を１サイクルとして、３０サイクル行い、最後に７２℃で７分間。
【０１７３】
（４）ＦｌＡｌｙ−１遺伝子の全塩基配列および演繹アミノ酸配列
本実施例８（３）のクローンプラスミドについて、定法に従い塩基配列のシークエンスを行って、ＦｌＡｌｙ−１遺伝子の翻訳領域の全塩基配列（配列番号１１）を決定した。また、配列番号１１の塩基配列から、ＦｌＡｌｙ−１の全アミノ酸配列（配列番号１２）を演繹した。その結果を図２１に示す。なお、図２１において、本実施例８（１）で決定したＮ末端アミノ酸配列（配列番号２）に相当する部分を下線で示す。図２１に示すように、ＦｌＡｌｙ−１遺伝子の翻訳領域の塩基配列（配列番号１１）は８６７ｂｐであり、ＦｌＡｌｙ−１のアミノ酸配列（配列番号１２）は２８８残基であった。ここで、本実施例８（１）で決定したＮ末端アミノ酸配列（配列番号２）よりＮ末端側の２８アミノ酸残基は、ＦｌＡｌｙ−１には存在していなかったことから、分泌シグナル配列と推定された。このことから、成熟型のＦｌＡｌｙ−１は、配列番号１２のアミノ酸配列（翻訳型のアミノ酸配列）のうち、配列番号２のアミノ酸配列をＮ末端として、そこからＣ末端までの全部で２６０アミノ酸残基（配列番号１３）から成り、その理論分子量は２９６６９．４Ｄａと算定された。この理論分子量は、実施例６で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥにより推定された分子量である約３０ｋＤａと一致しており、整合性のある結果が得られたことが明らかになった。
【０１７４】
続いて、成熟型のＦｌＡｌｙ−１のアミノ酸配列（配列番号１３）について、ＢＬＡＳＴ検索を行った。その結果を図２２に示す。図２２に示すように、成熟型のＦｌＡｌｙ−１のアミノ酸配列（配列番号１３と１００％の相同性を示す既知のアミノ酸配列は検出されなかった。なお、成熟型のＦｌＡｌｙ−１のアミノ酸配列（配列番号１３）と９８％の同一性を示すアルギン酸リアーゼａｌｇ２Ａ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号；ＡＥＢ６９７８３．１、ＵｎｉＰｒｏｔ ｅｎｔｒｙ；Ｇ９ＣＨＸ６）が検出されたが、ａｌｇ２Ａはゲノム解析によって見いだされた理論上の酵素であり、実際にタンパク質として発現しているかどうかは不明であり、酵素特性などについても知られていない。この結果から、ＦｌＡｌｙ−１は新規のアルギン酸リアーゼであることが明らかになった。
【０１７５】
＜実施例９＞オリゴ糖、不飽和単糖およびα−ケト酸、ウロン酸の製造
（１）ゲル濾過クロマトグラフィーによる精製
［１−１］アルギン酸の分解およびアルギン酸分解産物の回収
蒸留水５０ｍＬに、アルギン酸ナトリウム５００ｍｇを溶解した後、実施例５（２）の精製菌抽出液を６０Ｕ／ｍＬ相当量加えて、これを反応液とした。反応液を３０℃にて１２時間インキュベートした後、透析用セルロースチューブＵＣ３６−３２（三光純薬）を用いて、蒸留水４５０ｍＬを外液として透析して、外液を回収した。ロータリーエバポレーターを用いて回収した外液を濃縮乾固し、３７５ｍｇの濃縮乾固物を得て、これをアルギン酸分解産物とした。
【０１７６】
［１−２］ゲル濾過クロマトグラフィー
本実施例（１）［１−１］のアルギン酸分解産物３５０ｍｇを５ｍＬの５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、バイオゲルＰ２カラム（４．６×７０ｃｍ；分画分子量１００−１８００；ＢｉｏＲａｄ社）を用いて、添付の仕様書に従ってゲル濾過クロマトグラフィーを行い、溶出液を１０ｍＬずつ分取した。その後、各溶出液の２３５ｎｍにおける吸光度を測定した。また、各溶出液から２μＬをとり、実施例４（５）［５−２］に記載の方法により薄層クロマトグラフィーおよびチオバルビツール酸発色法を行った。その結果を図２３に示す。
【０１７７】
図２３に示すように、吸光度は、溶出液番号６６〜７３および溶出液番号７７〜９０において顕著に大きかった。また、薄層クロマトグラフィーでは、溶出液番号６８〜７１において２糖を示すバンドのみが、溶出液番号７８〜８２において単糖を示すバンドのみがそれぞれ確認された。
【０１７８】
これらの結果から、ＵＭＩ−０１の精製菌抽出液によりアルギン酸を分解して得たアルギン酸分解産物を透析により回収した後、ゲル濾過クロマトグラフィーに供することにより、高純度の２糖や不飽和単糖、α−ケト酸、ウロン酸を得ることができることが明らかになった。またこの場合において、アルギン酸５００ｍｇから２糖が５０ｍｇ程度、α−ケト酸ないしウロン酸が３２５ｍｇ程度得ることができることが明らかとなり、いわゆるα−ケト酸の収率はラボレベルでも実に６５％と高い値であることが明らかとなった。
【０１７９】
（２）イオン交換クロマトグラフィーによる精製
本実施例（１）［１−１］に記載の方法により、アルギン酸の分解およびアルギン酸分解産物の回収を行った。続いて、アルギン酸分解産物３５０ｍｇを５ｍＬの蒸留水に溶解し、第４級アンモニウム基をイオン交換基とするＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＳｕｐｅｒＱ−６５０ Ｍ（２×２０ｃｍ；東ソー社）を用いて、添付の仕様書に従ってイオン交換クロマトグラフィーを行い、溶出液を５ｍＬずつ分取した。なお、溶出液には直線濃度勾配０〜０．１５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ水溶液を用いた。その後、各溶出液の２３５ｎｍにおける吸光度を測定した。また、各溶出液から２μＬをとり、実施例４（５）［５−２］に記載の方法により薄層クロマトグラフィーおよびチオバルビツール酸発色法を行った。その結果を図２４に示す。
【０１８０】
図２４に示すように、吸光度は、溶出液番号５０〜６２（溶出液のＮａＣｌ濃度は０．０７５〜０．０８５ｍｏｌ／ｍＬ）および溶出液番号８１〜８９（溶出液のＮａＣｌ濃度は０．０９１〜０．０９３ｍｏｌ／ｍＬ）において大きく、溶出液番号７１〜８０（溶出液のＮａＣｌ濃度は０．０９５〜０．０９７ｍｏｌ／ｍＬ）において顕著に大きかった。また、薄層クロマトグラフィーでは、溶出液番号５８〜６１において単糖を示すバンドのみが、溶出液番号７３、７５、７７および７９において２糖を示すバンドのみが、溶出液番号８６〜８８において３糖を示すバンドのみがそれぞれ確認された。
【０１８１】
これらの結果から、ＵＭＩ−０１の精製菌抽出液によりアルギン酸を分解して得たアルギン酸分解産物を透析により回収した後、イオン交換クロマトグラフィーに供することにより、高純度の単糖、２糖、３糖を得ることができることが明らかになり、実施例４（５）［５−２］と同様の質量分析および蛍光誘導化法により単糖の構造を解析したところ、実施例４（５）［５−２］と同様、次式（化３４）の不飽和単糖、次式（化３５）のα−ケト酸または次式（化３６）のウロン酸であった；
【化３４】
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［化３５］ＨＯＯＣ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨＯＨ−ＣＨＯＨ−ＣＨＯ、
［化３６］ＨＯＯＣ−ＣＯＨ＝ＣＨ−ＣＨＯＨ−ＣＨＯＨ−ＣＨＯ。
【０１８２】
＜実施例１０＞Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｉｃｏｌａ Ｆ３１株による実験
上述の実施例６の実験を、ＵＭＩ−０１に代えてＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｉｃｏｌａ Ｆ３１株を用いて行ったところ、ＵＭＩ−０１を用いた場合と同様の結果が得られた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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