(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト多能性幹（ｈＰＳ）細胞を、肝細胞様細胞または成熟肝細胞に分化するインビトロの方法であって：
ｉ）ｈＰＳ細胞を胚体内胚葉（ＤＥ）細胞（ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ）へ二次元の表面で播種および分化する工程、
ｉｉ）工程ｉ）の前記ＤＥ細胞を、三次元（３Ｄ）スキャホールドに移すとともに、該三次元（３Ｄ）スキャホールド上に播種された前記ＤＥ細胞を肝細胞様細胞または成熟肝細胞へさらに分化する工程を含み、
前記３Ｄスキャホールドが以下：
ｉ）多孔性アルギン酸塩スポンジ
ｉｉ）生物分解性ポリ（ウレタン尿素）（ＰＵＵＲ）ポリマー
ｉｉｉ）エマルジョンテンプレート型ポリスチレン
ｉｖ）合成ナノ繊維性複合材
ｖ）ポリ（Ｌ‐乳酸）（ＰＬＬＡ）から作られた多孔性スポンジ
の１つから選択されるインビトロの方法。
【請求項２】
前記細胞が二次元と比べ、より高い密度で三次元に播種される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が二次元と比べ、３倍、５倍または１０倍高い密度で三次元に播種される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が、細胞生存因子の存在下で播種される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞生存因子は、一つのＲＯＣＫ  Ｒｈｏキナーゼの阻害剤である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
工程ｉ）またはｉｉ）の少なくとも１つが、フィーダーフリー（ｆｅｅｄｅｒ‐ｆｒｅｅ）条件下で行われる、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
工程ｉ）またはｉｉ）の少なくとも１つが、ゼノフリー（ｘｅｎｏ‐ｆｒｅｅ）条件下で行われる、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記ｈＰＳ細胞が、ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記ｈＰＳ細胞が、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記３Ｄスキャホールドがコーティングされていない、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記３Ｄスキャホールドが、１つ以上の細胞外マトリックス成分で予めコーティングされる、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記１つ以上の細胞外マトリックス成分が、ゼラチン、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲン、ポリリシン、ビトロネクチン、ヒアルロン酸、ヒアルロナンヒドロゲル、絹フィブロイン、キトサンまたは前述のいずれかの複合材を含むリストから選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＤＥ細胞が、前記３Ｄスキャホールドで、肝星細胞、肝免疫（クッパー（Ｋｕｐｐｆｅｒ））細胞、肝内皮細胞、胆管上皮細胞または線維芽細胞から選ばれる少なくとも１つの他の細胞型と共培養される、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｈＰＳ（ヒト多能性幹細胞）の生育および分化向上のための、合成または動物由来の三次元（３Ｄ）バイオスキャホールドの基質としての使用に関し、これらのスキャホールドは、既存の研究実験用プラスチック製器具と併せた使用に適用される。より具体的に、本発明は、前記ｈＰＳ細胞の肝細胞または肝細胞様の細胞型への分化向上のために、これらスキャホールドを単独、またはさまざまな生体マトリックスコーティングと併せてｈＰＳ細胞と播種することに関する。また、本発明は、部分的に分化した肝細胞前駆体（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ）を、より成熟した肝細胞型へさらに分化させるためにスキャホールドに播種することに関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類細胞培養
哺乳類細胞培養の方法は、長年にわたって改良され標準化されてきており、細胞の生育、増殖および分化を可能にするのに必要な条件が確立されている。通常、細胞はポリスチレンなどの無菌のプラスチック表面上で、多く場合、細胞が正常に生育すると思われる生体内環境を、より厳密に再現するように作られたマトリックスコーティングとともに培養することができる。胚性幹細胞の場合、マウス胎仔線維芽細胞などのフィーダー細胞の層が、細胞の増殖を助長、補助する、より良好な基質を提供するのに必要とされることが多い。典型的には、哺乳類細胞は、通常ウシ胎児血清などの添加物を含有する支持培地中で培養されることになる。その培地は、さまざまなホルモンおよび成長因子を細胞に与えることにくわえて、この場合もやはり細胞生育のための理想的な微環境を再現するのに役立つ多くの細胞マトリックス成分を含有する。
【０００３】
現在のところ、哺乳類細胞培養は、基礎研究における使用、薬物アッセイおよび毒物学アッセイにおける使用、ならびに正しく折り畳まれた組み換え哺乳類タンパク質を作る際の使用など。多岐にわたって下流で適用される。最近になって、哺乳類細胞培養はさらに発展し再生医療の領域で使用され、それにより皮膚真皮層などの組織は、外傷後の損傷の修復または病変内部臓器の修復などの臨床外科における使用用に、より大量の組織を作り出すために採取されて一定の期間増殖される。初代供給源から生成される細胞は、さらなる増殖能が非常に限られており、培養を成功するのに複雑な配合の生育培地および生育条件を必要とする。また、それら細胞は、免疫拒絶の問題のために再生医療における使用が限定される。
【０００４】
近年、胚性幹細胞研究の分野において、これらの障壁を超えることを意図した開発が多くある。そのような多能性幹細胞は、ほぼ無制限に増殖できるだけでなく、完全に発達した生命体を含むあらゆる細胞および組織型に分化する能力も有する。したがって、多能性幹細胞は、新しい薬物アッセイの開発において重要なツールであることができ、その供給は事実上制限がないので、より安価で、よりばらつきの少ない供給源を提供する。
【０００５】
３Ｄバイオスキャホールド
多能性幹細胞を分化させるにあたって直面する主な課題の１つは、部分的に分化した、未成熟な前駆細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌｓ）、またはさまざまな細胞型の高度に不均一な混合物よりむしろ、成熟した、完全に機能的な細胞型を常に一貫して作り出すように分化を制御することである。多能性幹細胞を分化させる最も単純な方法は、２Ｄプラスチック基質上であるが、残念ながらこの方法は、成熟した細胞型の特徴的な表現型を欠いている分化細胞を作り出すことが多い。これは、一部には、当然三次元で起こるという点で２Ｄ培養と異なるプロセスである正常な胚発生時に幹細胞が経る状態を再現できないからである。研究者がこのことに対処するよう試みてきた方法の１つは、胚発生の間に細胞が経る状態の幾つかをより忠実に再現し、細胞がより自然な形で分化できることを意図する新規の３Ｄ培養系を開発することである。特に、そのような３Ｄ系により、細胞がより大きい度合いで相互に作用することができ、２Ｄ細胞培養の使用で見られるいずれと比べても、機能する臓器により類似する複雑な多細胞の凝集体を開発することができる。
【０００６】
３Ｄ系は、細胞がその上に播種され、細胞が付着することができる生物活性スキャホールドの存在に依存する。そのようなスキャホールドは、細胞の成長および増殖を所望の３Ｄ形態に向かわせる助けとなるはずであり、また細胞が所望の構造を形成するのを助ける、ある種特定の分子シグナルを提供するのに必要とされうる。バイオスキャホールドの別の重要な要件は、それらが拡張可能であることであり、よれによって組織成長および細胞分化を、より大量で、より経済的な規模で実施できる。スキャホールドは、さまざまな材料から構成されることがあり、的確なスキャホールドの選択は、それに播種された任意の細胞の成長および増殖ならびに分化に向かわせることにおいて極めて重要でありうる。例えば、スキャホールドは、通常多孔性スポンジの形に整えられたポリマー性材料から構成される。このスキャホールドに播種された細胞は付着して、スキャホールド内の相互接続するトンネルおよび溝の網状組織を通してスキャホールドの細孔構造内で成長し、細孔径は適切なスキャホールドを選択する際に考慮すべき重要なことである。また、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分などの生物活性剤も使用されることがあり、スキャホールド表面上に置かれたときスキャホールド機能を増強し、より大きな細胞付着を可能にする。最終結果は、それらがより現実的に、それらの通常の生体内の生育場所により厳密に似た形で相互作用することができるインビトロ環境を細胞に提供する。
【０００７】
幾つかの培養系では、細胞外マトリックスの添加が細胞極性および組織形成を誘導する。例えば、コラーゲンの平らなシート上で培養された初代肝細胞の単層が、さらにコラーゲンの第二層で覆われる、いわゆるサンドイッチ培養の場合、細胞は、従来の２Ｄ培養における肝細胞と比較して形態および機能性の向上を示す（Ｄｕｎｎ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１）。その重層は、２Ｄ対照培養でみられるストレスファイバーの異常な形成と対照的に、生体内の状態に類似したアクチンフィラメントの維持を細胞にもたらす（Ｂｅｒｔｈｉａｕｍｅ，  Ｆ．  ｅｔ  ａｔ，  １９９６）。サンドイッチ培養の有益な効果は、細胞外マトリックスへの細胞の接触よりもむしろ細胞間の接触の向上から主に生じると後に議論になったとはいえ、より生理的に関連する細胞骨格の形成ならびにそれに続く細胞極性および形状は肝臓の機能性の向上に関与するかもしれない。（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）。また、コラーゲンスキャホールドは、胚性幹細胞の肝細胞への分化にも用いられている。Ｂａｈａｒｖａｎｄと同僚は、肝細胞用細胞のコラーゲンスキャホールド内での分化は、従来の２Ｄで分化した細胞と比較して、形態学的特徴、遺伝子発現パターンおよび代謝活性を向上することを見出した（Ｂａｈａｒｖａｎｄ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）。
【０００８】
アルギン酸塩は、多孔質非粘着性の３Ｄスキャホールドを提供し、肝細胞の凝集をサポートして強い細胞間相互作用を形成し、肝臓の機能の向上をもたらす（ＤｖｉｒＧｉｎｚｂｅｒｇ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）。また、アルギン酸マトリックス中の環境は、より成熟した機能表現型への、新生ラット肝細胞の分化（Ｄｖｉｒ−Ｇｉｎｚｂｅｒｇ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）、およびＨｅｐＧ２の成熟（Ｅｌｋａｙａｍ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）をサポートする。くわえて、Ｃ３Ａ肝細胞系は、アルギン酸塩中でスフェロイドとして培養したとき多くの異なるＣＹＰの酵素活性が増加したように、２Ｄ単層培養と比較して薬物代謝の向上を示した（Ｅｌｋａｙａｍ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｔ，  ２００６）。肝臓培養状態を向上することが見出されている３Ｄ編込み（ｉｎｔｅｒｗｅａｖｉｎｇ）ナノファイバースキャホールド（Ｗａｎｇ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）を含む、細胞培養をサポートする３Ｄスキャホールドを提供する幾つかの新製品が最近発売された。あるいは、多孔質ポリスチレンスキャホールドは、細胞が成長および分化し、複雑な３Ｄ細胞間相互作用を起こす層を形成することができる空間を提供する（Ｂｏｋｈａｒｉ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ，  ２００７ａ；  Ｂｏｋｈａｒｉ，  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，  ２００７ｂ）。こられのスキャホールドでは、ＨｅｐＧ２は、２Ｄで培養された場合と比較して、より一層生体内での組織の作用に類似した形で生化学的製剤に反応する（Ｂｏｋｈａｒｉ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７ａ）。くわえて、成長因子処理を多細胞性スフェロイド形成と組み合わせることによって大量分化培養法を開発することを意図して、肝細胞にまき散らしたポリウレタンフォームでマウスＥＳ細胞をスフェロイドとして分化するのに成功している。（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）。
【０００９】
肝細胞培養
肝不全および末期の肝疾患は、全世界における膨大な数の死亡の原因であり、医療制度に大きな負担となっている。肝移植は、依然として最も有効な治療である。しかし、この治療の有効性は限定的で、感染症または拒絶反応などの多くの合併症につながる。また、肝移植は、入手可能ドナー臓器の不足に悩まされており、治療を受けた患者は、非常に多くの場合、生涯続く免疫抑制治療に委ねられることになる。臓器の必要性を減らすことによって、細胞に基づいた治療は、社会と、これらの重い疾患を患う個人の両方にとって非常に重要であると思われる。
【００１０】
さら、肝臓は人体における代謝および解毒作用の中心であるため、インビトロ試験用の機能的な細胞型の信頼できる供給源を見つけ出すために多大な努力がなされてきた。残念なことには、肝臓の複雑さおよび機能は、今日利用可能な細胞のいずれによっても正確に映し出されていない。
【００１１】
ｈＰＳ細胞から、成熟肝細胞にさらに分化しうる肝細胞様細胞を作り出す方法は、多く場合、胚様体の形成および／または細胞毒性化合物の添加に基づく初期の選択を含む（Ｒａｍｂｈａｔｌａ，  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）。これらの選択工程、特に胚様体の形成は、多く場合、大きな細胞数損失を生じ、そして低い効率に終わる。それらの方法は複雑で、たいていは非常に製作時間が長く、数回の消費工程を含む。よって、未分化ｈＢＳ細胞から生成される肝細胞様細胞形成のための迅速で簡単な方法が必要である。これまでの肝細胞様細胞を得る試みは、例えば米国特許出願第２００３０００３５７３号に公表されているように、出発材料に対して低い収率に終っている。さらに、初代ヒト肝細胞の入手の可能性は非常に限られており、インビトロの適用に使用したとき細胞はまたその通常の表現型および機能的な性質を急速に失うことが知られている。初代細胞に代わってしばしば使用されるものは、同様に非常に低いレベルの（または完全に欠損した）代謝酵素を含有し、生体内の生来の肝細胞と実質的に異なる他の重要なタンパク質の分布を有する肝臓の細胞系である。よって、肝臓代謝は種特有であるので試験される種以外の種で肝臓代謝および毒性を予測するのには困難を生じることが知られているにもかかわらず、多くの試験はいまだ動物材料を使用して行われる。
【００１２】
医薬開発おいて、有害な肝反応が依然として最も顕著な副作用である。したがって、ヒト肝臓の毒性負荷（ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｌｉａｂｉｌｉｔｉｅｓ）を早期に予測することは、臨床試験に入る化合物を選択する際に最優先に重要なことである。この領域における能力を向上する取り組みは、入手の可能性の問題（ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ  ｑｕｅｓｔｉｏｎ）と、ヒトにおける有害な肝臓損傷の誘導と一致する複雑な生体内作用に対してより大きな適用範囲を提供するモデルの開発の両方に向けなければならない。
【００１３】
したがって、新しい薬物または化学物質の開発において、ヒト肝細胞を模倣し、候補分子の効果を予測することができるモデルシステムに対する喫緊の必要性がある。入手可能性と生理学的関連性の両方の点で、ｈＰＳ細胞は、機能的なヒト肝細胞の理想的な再生可能供給源として役割を果たしうる。
【発明の概要】
【００１４】
本発明の発明者は、ｈＰＳ細胞、肝細胞前駆体（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ）、肝細胞前駆体（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ）の３Ｄバイオスキャホールド上での播種が、再生可能かつ拡張可能に成熟した形態および機能をもつ肝細胞を生み出すことができる多くの強力なプロトコールを確立してきた。
【００１５】
本発明は、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳ）の肝細胞前駆体（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）または肝細胞型への分化を向上する方法を含み、それによってｈＰＳ細胞は、最初に二次元培養表面で培養され、その後、さらなる分化および成熟のために３Ｄバイオスキャホールドの定義されたセットの１つに移される。また、ｈＰＳ細胞は、最初に二次元の表面で肝細胞前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ）型に部分的に分化されてもよい。その後、肝細胞前駆体（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ）またはｈＰＳ細胞は、コーティング無しの（ｎａｋｅｄ）三次元スキャホールド、またはマトリックス化合物でコーティングされたスキャホールドのいずれかに播種され、さらに培養される。
【００１６】
本発明の重要な態様として、ｈＰＳ細胞を最初に２Ｄ環境で生育するか、または随意に最初に分化させた後に、その細胞を３Ｄ環境に移すことによって肝細胞関連遺伝子の発現および肝細胞関連酵素の産生が著しく増加することを発明者らは見出した。
【００１７】
定義
本明細書において使用する場合、「ヒト多能性幹細胞」（ｈＰＳ）は、任意の供給源に由来しうる、適切な条件下で３つの胚層（内胚葉、中胚葉、および外胚葉）のすべての誘導体である種々の細胞型のヒト後代産物を生成できる細胞を指す。ｈＰＳ細胞は、８〜１２週齢のＳＣＩＤマウスで奇形腫を形成する能力、および／または組織培養で全３胚層の同定可能な細胞を形成する能力を有しうる。ヒト多能性幹細胞には、ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞（例えば、Ｔｈｏｍｓｏｎ，  Ｊ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ  （１９９８），  Ｈｅｉｎｓ，  Ｎ．  ｅｔ．ａｌ．  （２００４）を参照されたい）および人工多能性幹細胞（例えば、Ｙｕ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ，  （２００７）；  Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．  ｅｔ  ａｌ  （２００７）を参照されたい）を含むさまざまな型の胚細胞が含まれる。本明細書において記載されるさまざまな方法および他の実施形態は、多岐にわたる供給源からのｈＰＳ細胞を必要とし利用しうる。例えば、使用に好適なｈＰＳ細胞は、発生中の胚から得られうる。くわえてまたはあるいは、好適なｈＰＳ細胞は、確立された細胞系および／またはヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳ）細胞から得られうる。
【００１８】
本明細書において使用する場合、「ｈｉＰＳ細胞」（同様に「ｉＰＳ」）は、ヒト人工多能性幹細胞を指す。
【００１９】
本明細書において使用する場合、「胚体内胚葉（ＤＥ）」および胚体内胚葉細胞（ＤＥ細胞）は、限定されないがタンパク質もしくは遺伝子発現、および／または胚体内胚葉の細胞に典型的な形状もしくは胚体内胚葉細胞に類似している相当数の細胞を含む組成物を呈する細胞を指す。
【００２０】
本明細書において使用する場合、「肝前駆体（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ）」、「肝前駆体（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ）」または「肝前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ）」は、タンパク質もしくは遺伝子発現、および／または胚体内胚葉の細胞に典型的な形状もしくは肝前駆体（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ）もしくは肝前駆体（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ）の細胞に類似している相当数の細胞を含む細胞の組成物などのマーカーを呈する細胞を指す。
【００２１】
本明細書において使用する場合、「肝細胞」または「肝細胞様細胞（ＨＣＬＣ）」は、アルブミン、ＣＹＰ３Ａ４、ＵＧＴ２Ｂ７、ＯＡＴＰ‐２、ＡＤＨ１Ａ、ＵＧＴ１Ａ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９およびＣＹＰ２Ｄ６などの、少なくとも幾つかの成熟肝臓マーカーを発現している細胞型を意味することを意図する。
【００２２】
本明細書において使用する場合、「ｈＥＳＣ‐ＨＥＰ」は、アルブミン、ＣＹＰ３Ａ４、ＵＧＴ２Ｂ７、ＯＡＴＰ−２、ＡＤＨ１Ａ、ＵＧＴ１Ａ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９およびＣＹＰ２Ｄ６などの成熟肝臓マーカーを発現しているヒト胚性幹細胞に由来する細胞型を意味することを意図する。
【００２３】
本明細書において使用する場合、「ｈｉＰＳ‐ＨＥＰ」は、アルブミン、ＣＹＰ３Ａ４、ＵＧＴ２Ｂ７、ＯＡＴＰ−２、ＡＤＨ１Ａ、ＵＧＴ１Ａ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９およびＣＹＰ２Ｄ６などの成熟肝臓マーカーを発現しているヒト胚性幹細胞に由来する細胞型を意味することを意図する。
【００２４】
本明細書において使用する場合、「ゼノフリー（Ｘｅｎｏ‐ｆｒｅｅ）」は、細胞、組織および／もしくは体液またはその派生物などの、直接的または間接的に非ヒト動物由来の材料に一度も曝されたことがない細胞系または細胞材料を指す。
【００２５】
本明細書において使用する場合、「Ｗｎｔシグナル伝達（ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）」とは、例えばＮｅｊａｋ‐ＢｏｗｅｎおよびＭｏｎｇａ（２００８年）に概説されているようにＷｎｔシグナル伝達に含まれる経路を指す。
【００２６】
本明細書において使用する場合、ＨＤＡＣ阻害剤とは、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を指す。
【００２７】
本明細書において使用する場合、本明細書で使用される場合、「ＧＳＫ阻害剤」とは、ＧＳＫ（特にＧＳＫ３アルファまたはＧＳＫ３ベータを含むＧＳＫ３）を阻害する化合物を指す。本発明での使用に好ましいＧＳＫ阻害剤としては、例えば、以下のものの１つ以上が挙げられる：
ＢＩＯ  （２’Ｚ，３’Ｅ）‐６‐ブロモインジルビン‐３’‐オキシム（ＧＳＫ３阻害剤ＩＸ）；
ＢＩＯ‐アセトキシム  （２’Ｚ，３’Ｅ）‐６‐ブロモインジルビン‐３’‐アセトキシム（ＧＳＫ３阻害剤Ｘ）；
（５‐メチル‐［Ｈ‐ピラゾール‐３‐イル｝（２‐フェニルキナゾリン‐４‐イル）アミン（ＧＳＫ３阻害剤ＸＩＩＩ）；
ピリドカルバゾール‐シクロペナジエニル（ｃｙｃｌｏｐｅｎａｄｉｅｎｙｌ）ルテニウム複合体（ＧＳＫ３阻害剤ＸＶ）；
ＴＤＺＤ‐８  ４‐ベンジル‐２‐メチル‐１，２，４‐チアジアゾリジン‐３，５‐ジオン（ＧＳＫ３ベータ阻害剤Ｉ）；
２‐チオ（３‐ヨードベンジル）‐５‐（Ｉ‐ピリジル）‐［１，３，４］‐オキサジアゾール（ＧＳＫ３ベータ阻害剤ＩＩ）；
ＯＴＤＺＴ  ２，４‐ジベンジル‐５‐オキソチアジアゾリジン‐３‐チオン（ＧＳＫ３ベータ阻害剤ＩＩＩ）；
アルファ‐４‐ジブロモアセトフェノン（ＧＳＫ３ベータ阻害剤ＶＩＩ）；
ＡＲ‐ＡＯ１４４１８  Ｎ‐（４‐メトキシベンジル）‐Ｎ’‐（５‐ニトロ‐１，３‐チアゾール‐２‐イル）尿素（ＧＳＫ‐３ベータ阻害剤ＶＩＩＩ）；
３‐（１‐（３‐ヒドロキシプロピル｝１Ｈ‐ピロロ［２，３‐ｂ］ピリジン‐３‐イル］‐４‐ピラジン‐２‐イル‐ピロール‐２，５‐ジオン（ＧＳＫ３ベータ阻害剤ＸＩ）；
ＴＷＳＩ１９  ピロロピリミジン化合物（ＧＳＫ３ベータ阻害剤ＸＩＩ）；
Ｌ８０３  Ｈ‐ＫＥＡＰＰＡＰＰＱＳｐＰ‐ＮＨ２またはそのミリストイル化された形態（ＧＳＫ３ベータ阻害剤ＸＩＩＩ）；および
２‐クロロ４‐（４，５‐ジブロモ‐チオフェン‐２‐イル｝エタノン（ＧＳＫ３ベータ阻害剤ＶＩ）；およびアミノピリミジンＣＨＩＲ９９０２１。くわえて、多数のｗｉｎｇｌｅｓｓタンパク質またはＷｎｔタンパク質が、ＧＳＫ阻害剤、特に本発明に記載のＧＳＫ阻害剤と同様に機能する。したがって、それらはＧＳＫ阻害剤という用語に包含される。本発明において使用されうる例示的なＷｎｔタンパク質としては、Ｗｎｔタンパク質のなかでも特に、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ１０、Ｗｎｔ１４、Ｗｎｔｌ４ｂ、Ｗｎｔ１５、およびＷｎｔ１６の１つ以上が挙げられる。Ｗｎｔ３ａの使用が好ましい。
【００２８】
さらに、低分子が、Ｗｎｔシグナル伝達（ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）を方向付けるのに使用できる。なお、Ｗｎｔシグナル伝達誘導に対するＧＳＫ３β遮断薬または阻害剤を、Ｗｎｔシグナル伝達の調節に使用し、分化および成熟への方向付けを達成することができる。Ｗｎｔシグナル伝達経路は、開始後遅い段階または誘導が起こる前に誘導できる。
【００２９】
本明細書において使用する場合、「ＣＹＰ」は、シトクロムＰ、およびより具体的に、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＣＹＰ２Ａ６／２Ａ７／２Ａ１３、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ３Ａ７およびＣＹＰ７Ａ１などの多くの異なるアイソザイムから構成される肝臓の主要な第１相代謝酵素であるシトクロムＰ４５０を意味することを意図する。
【００３０】
本明細書において使用する場合、「ＧＳＴ」という用語は、グルタチオントランスフェラーゼを意味することを意図し、そのサブタイプには、例えばＧＳＴ  Ａ１‐１、ＧＳＴ  Ｍ１‐１、およびＧＳＴ  Ｐ１‐１がある。
【００３１】
本明細書において使用する場合、「ＵＧＴ」という用語は、グルクロン酸化作用を触媒する肝臓の酵素群であるウリジンジホスホグルクロノシルトランスフェラーゼを意味することを意図する。
【００３２】
本明細書において使用する場合、「シトクロムＰ４５０還元酵素」（ＣＰＲとしても知られる）という用語は、その生理学的機能が、電子の移動によるシトクロムＰ４５０酵素の還元であり、そのためシトクロムＰ４５０酵素介在反応に必要であるタンパク質を意味することを意図する。
【００３３】
「機能的な薬物代謝酵素」という用語によって、生物異物および薬物の化学的な改変、いわゆる薬物または生物異物代謝を行う第１相および第２相酵素に属する機能的な酵素を意味することを意図する。
【００３４】
本明細書において使用する場合、「機能活性」という用語は、通常初代ヒト肝細胞で検出される、薬物トランスポーターに関する測定可能な薬物の輸送、およびシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）に関する測定可能な酵素の代謝などの、効果的、測定可能な肝臓の細胞機能を意味する。
【００３５】
本明細書において使用する場合、「胚体外内胚葉（ｅｘｔｒａ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ）（ＥｘＥ）」という用語は、外部の卵黄嚢などの、胚体内胚葉の反対側に、ヒト発生における胚のコンパートメントを構成すると考えられる分化した内胚葉細胞を意味することを意図する。
【００３６】
本明細書において使用する場合、「ＡＡＴ」という用語は、肝臓マーカーであるアルファ−抗トリプシンを意味することを意図する。
【００３７】
本明細書において使用する場合、本明細書で使用される場合、「アルコールデヒドロゲナーゼ１」という用語は、ＮＡＤ＋のＮＡＤＨの還元を伴うアルコールとアルデヒドまたはケトンの間の相互変換を促進するデヒドロゲナーゼ酵素の種類を意味することを意図する。アルコールデヒドロゲナーゼ１は、分解しなければ有毒でありうるアルコールを分解する役目を果たす。
【００３８】
本明細書において使用する場合、「ＡＦＰ」という用語は、肝臓マーカーであるアルファフェトプロテインを意味することを意図する。本明細書において使用する場合、「ＢＳＥＰ」という用語は、胆汁トランスポーターである胆汁酸塩排出ポンプを意味することを意図する。
【００３９】
本明細書において使用する場合、「ＣＫ」という用語は、サイトケラチン１８（ＣＫ１８／ＫＲＴ１８）、サイトケラチン１９（ＣＫ１９／ＫＲＴ１９）、サイトケラチン８（ＣＫ８）およびサイトケラチン７（ＣＫ７）などの異なるサブタイプ肝臓マーカーであるサイトケラチン（相互交換可能に使用される）意味する。
【００４０】
本明細書において使用する場合、「ＦＧＦ」という用語は、好ましくはヒトおよび／または組み換え由来の線維芽細胞成長因子を意味し、それに属するサブタイプには、例えば「ｂＦＧＦ」（塩基性線維芽細胞成長因子を意味し、時としてＦＧＦ２とも称される）およびＦＧＦ４がある。「ａＦＧＦ」とは、酸性線維芽細胞成長因子（時としてＦＧＦ１とも呼ばれる）を意味する。
【００４１】
本明細書において使用する場合、「ＢＭＰ」という用語は、好ましくはヒトおよび／または組み換え由来の骨形成タンパク質を意味し、それに属するサブタイプは、例えばＢＭＰ４およびＢＭＰ２である。
【００４２】
本明細書において使用する場合、「ＨＧＦ」という用語は、好ましくはヒトおよび／または組み換え由来の肝細胞増殖因子を意味する。
【００４３】
本明細書において使用する場合、相互に交換可能に使用される「ＨＮＦ３ベータ」または「ＨＮＦ３ｂ」は、内胚葉由来組織、例えば膵島および含脂肪細胞における遺伝子発現を調節する転写因子である、肝細胞核因子３を意味することを意図する。ＨＮＦ３ベータは、時としてＨＮＦ３ｂまたはＦｏｘ２Ａとも呼ばれることがあり、後者の名称はフォークヘッドボックス転写因子ファイミリ―のメンバーである転写因子に由来する。
【００４４】
本明細書において使用する場合、「ＯＣＴ‐１」という用語は、有機カチオントランスポーター１を意味することを意図する。ＯＣＴ‐１は、血液から化合物が代謝されるかまたは胆汁に分泌されうる肝臓への多くの有機カチオンの取り込みを媒介する主要な肝臓のトランスポーターである。
【００４５】
本明細書において使用する場合、「ＭＤＲ」という用語は、多剤耐性トランスポーターを意味することを意図する。ＭＤＲ１および３は、トランスポーターのＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）ファミリーのメンバーであり、ともに薬物排出トランスポーターである。ＭＤＲ１は、薬物、ペプチドおよび生体異物の体への出入りの調整すること、ならびに生体異物障害および薬物毒性に対する体の保護に重要であり、一方でＭＤＲ３は胆汁へのリン脂質分泌に必須である。
【００４６】
本明細書において使用する場合、「アクチビン」という用語は、「アクチビンＡ」または「アクチビンＢ」などの細胞増殖および分化の調節を含む広い範囲の生物活性を呈するＴＧＦベータファミリーメンバーを意味することを意図する。アクチビンは、リガンドの共通のＴＧＦベータスーパーファミリーに属する。
【００４７】
本明細書において使用する場合、「ＲＯＣＫ阻害剤」という用語は、Ｙ‐２７６３２またはファスジルなどのＲＯＣＫ  Ｒｈｏキナーゼの低分子阻害剤を意味することを意図する。
【００４８】
本明細書において使用する場合、「ゼノフリー（ｘｅｎｏ‐ｆｒｅｅ）」という用語は、非ヒト動物成分への直接的または間接的な曝露を完全に回避することを意味することを意図する。
【００４９】
本明細書において使用する場合、「肝細胞性毒性」という用語は、壊死性の毒性、アポトーシス、ミトコンドリア毒性、リン脂質代謝異常、脂肪変性および胆汁酸輸送などの細胞応答を指し示す。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
本発明の１つの態様は、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳ）または肝細胞前駆細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌｓ）を、成熟肝細胞または肝細胞様細胞に分化する方法であって：
ｉ）ｈＰＳまたは肝細胞前駆細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌｓ）を二次元の表面に播種して分化を開始する工程、
ｉｉ）さらなる分化および成熟化のために、工程ｉ）の初期分化した細胞を三次元の（３Ｄ）スキャホールドに移す工程を含む方法に関する。
【００５１】
細胞は、２Ｄ培養と比べて３倍高い、５倍高いまたは１０倍高いなど、より高い密度で３Ｄスキャホールドに播種されうる。さらに、Ｒｈｏキナーゼ（ｒｏｃｋ）阻害剤が加えられることがあり、および／または該方法は、フィーダーフリー（ｆｅｅｄｅｒ‐ｆｒｅｅ）またはゼノフリー条件下で行われることができる。
【００５２】
本発明に記載の方法に使用される細胞は、ゼノフリーｈＰＳ細胞系もしくはゼノフリーｈＰＳ細胞系由来の細胞などのゼノフリー細胞であってよく、または該細胞は、ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞もしくは人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）細胞であってよい。本発明に記載の肝細胞前駆細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌｓ）は、胚体内胚葉（ＤＥ）細胞であってもなくともよく、胎児内胚葉または肝内胚葉の特徴を有してよい。
【００５３】
工程ｉ）からｉｉ）の移行、すなわち、工程ｉ）で得られた細胞の移行が３Ｄスキャホールドに移される（工程ｉｉ）は、４〜１５日などの２〜２５日後に実施されうる。
【００５４】
三次元スキャホールドは以下のタイプから選択されうる：ｉ）多孔性アルギン酸塩スポンジ、ｉｉ）生物分解性ポリ（ウレタン尿素）（ＰＵＵＲ）ポリマー、ｉｉｉ）エマルジョンテンプレート型ポリスチレン、ｉｖ）合成ナノ繊維性複合材ｖ）少なくとも１つの非垂直側壁（ｎｏｎ‐ｖｅｒｔｉｃａｌ  ｓｉｄｅ‐ｗａｌｌ）をもつマイクロウェル装置、ｖｉ）ポリ（Ｌ‐乳酸）（ＰＬＬＡ）から作られた多孔性スポンジ、または三次元スキャホールドは別の好適なタイプでありうる。
【００５５】
多孔性アルギン酸塩スポンジは、５０〜２００μＭの細孔径を有しうる一方で、エマルジョンテンプレート型ポリスチレンスキャホールドの細孔径は、１５〜４５μＭなどの０．１〜１０００μＭの範囲にある。
【００５６】
さらに、本発明は、上記のように３Ｄスキャホールドがコーティングされてない方法に関する。別の態様では、３Ｄスキャホールドは、例えば１つ以上の細胞外マトリックス成分で予め被覆される。細胞外マトリックス成分の例は、ゼラチン、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲン、ポリリシン、ビトロネクチン、ヒアルロン酸、ヒアルロナンヒドロゲル、絹フィブロイン、キトサン、または前述にいずれかの複合材を含む。
【００５７】
本発明の３Ｄスキャホールドは、限定されないが、６ウェルプレート、１２ウェルプレート、２４ウェルプレート、４８ウェルプレート、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、１５３６ウェルプレートを含むマルチウェルプレートなどの好適な培養容器、または他の好適な細胞培養容器内に入れられうる。
【００５８】
したがって、本明細書において詳しく述べられる発明は、より肝臓の表現型を有する細胞または部分的もしくは完全に成熟した肝臓の表現型を最終的に有する細胞へのｈＰＳ細胞の分化を向上するのに使用される方法を含み、この方法は、細胞が最初に二次元培養表面で培養された後に６つの可能性のある三次元のスキャホールドの１つに移されることを必要とする。この肝臓表現型の向上は、いかなる特定の培養培地組成に依存しない（用いた細胞培養プロトコールについては図９を参照されたい）。
【００５９】
遺伝子発現および代謝研究に基づいて、本発明の発明者らは、従来の２Ｄ基質基と比較して、３ＤスキャホールドがｈＰＳ由来肝細胞または肝細胞前駆体（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ）の成熟およびさらなる分化に、より良好な環境を提供することを見出した。さらに、該発明者らは、細胞を３Ｄ環境に播種する前に２Ｄ表面で細胞を培養した際に、さらなる効果を見出した。
【００６０】
このことは、細胞系、マトリックスコーティング、培養日数または選択されたスキャホールドにかかわらず、そのすべてが２Ｄ表面より３Ｄスキャホールドで培養された細胞においてより高度に発現されるＣｙｐ２Ｃ９、アルブミン、Ｃｙｐ３Ａ４、およびＵＧＴ２Ｂ７などの幾つかの肝臓マーカー遺伝子の発現を比較することによって見られることができる。具体的には、３Ｄで培養されたとき、多くの肝臓トランスポーター（ＢＳＥＰ、ＦＡＢＰ１、ＭＲＰ２、ＮＴＣＰ、ＯＡＴＰ２、ＯＣＴ１）がより一層高いレベルで発現され、より成熟した、機能的な肝細胞を示している。これは、Ｕｌｔｒａｗｅｂ（図３）およびＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（図５）などの局所的なスキャホールド、ＡｌｇｉＭａｔｒｉｘ（図２）およびポリ‐Ｌ‐リジン（図６）などの多孔性スポンジタイプを含むさまざまな異なるスキャホールドタイプ、ならびにＡｒｔｅｌｏｎ（図１）およびＡｌｖａｔｅｘ（図４）などの合成ポリマーに基づくスキャホールドで見られることができる。
【００６１】
３Ｄスキャホールドは、肝細胞が通常遭遇する生体内微環境に、より類似するようにマトリックス成分で予め被覆されうる。具体的には、マトリックス成分であるゼラチンおよびマトリゲルがスキャホールドと併せて使用されたとき、幾つかの肝臓マーカーの発現レベルを向上することが示されている。数個のマーカー（ＴＡＴ、ＣＹＰ２Ｃ９、ＯＡＴＰ２）の発現は、マトリゲルでコーティングしたＡｒｔｅｌｏｎ（Ａｒｔｉｍｐｌａｎｔ）では、コーティングしてないものと比較してより高い（図１Ｃ＆Ｅ；図１Ａ＆Ｄ）。多くのマーカー（ＴＡＴおよびＵＧＴ２Ｂ７）が、マトリゲルでコーティングされたＡｌｖａｔｅｘで、コーティングしてないものと比較して著しく高度に発現されており（図４Ｆ＆Ｇ、１８日目に分析）、またこのことは、他の幾つかのマーカー（ＴＡＴ、ＵＧＴ２Ｂ７などの）にも当てはまり、それらはゼラチンでコーティングされたＡｌｖａｔｅｘでコーティングしてないものと比較してより高い程度に発現されている（図４Ｅ＆Ｇ）。本発明のこの特定の実施形態は、どのマーカーが高い程度に発現されるが見られるのが望ましいかに応じて随意に適用されることができる。特定のセットのマーカーの発現は、肝臓系統のある特定の表現型または段階を示唆すると思われるので、本発明のこの態様の適用により、生成された肝細胞の機能性のより細かい制御が可能になりうる。この態様の拡張は、３Ｄスキャホールドに播種されたｈＰＳ細胞またはｈＰＳ由来肝臓前駆体（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ）への１つ以上の異なる細胞型の追加でありえ、３Ｄスキャホールドでの細胞系の共培養を可能にする。
【００６２】
とりわけ、細胞は、異なる相対的な密度で３Ｄスキャホールドに播種されうる。相対的な密度は、標準×１密度（すなわち２Ｄ対照表面に播種された細胞と同じ密度）もしくは３倍高い初期密度（×３と表わす）もしくは１０倍高い密度またはその間の任意の密度でありうる。図１ＨおよびＩは、コーティングしてないＡｒｔｅｌｏｎ（Ａｒｔｉｍｐｌａｎｔ）を使用したとき、マーカーＯＡＴＰ２、ＯＣＴ１およびＴＡＴの発現が、×１より低い初期密度で播種された細胞においてより高いことを示す。また、ある特定のマーカー（例えばＣＹＰ７ＡＩ）の発現は、×１で播種された細胞と比較して、×３でコーティングしてないＡｌｖａｔｅｘに播種された細胞でより低い（図４ＮおよびＯ）が、他のマーカー（ＯＣＴ１など）は、×３でコーティングしてないＡｌｖａｔｅｘに播種された細胞においてより高い発現を有する（図４ＩおよびＫ）。したがって、この特定の実施形態の適用は、この場合もやはり使用者によって求められる肝細胞の所望の表現型に依存する。
【００６３】
分化の制御を可能にするには、細胞が３Ｄスキャホールドに播種される分化の段階が関連し、すなわち３Ｄスキャホールドに播種される前により長期間培養されるとより成熟した表現型になる。ｈＰＳ細胞は、分化の異なる数段階において、例えば、未分化細胞（０日目）として、もしくはアクチビンＡで処理して胚体内胚葉に誘導後（４〜７日目）、または３Ｄスキャホールドでの成熟のための肝臓の前駆体（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ）（９、１１、１３、１４および１５日目）としてスキャホールドに播種できる。そのような前駆細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌｓ）の特徴付けが実施され、両段階に特徴的な定義されたマーカーの発現に基づいて、それら細胞が、スキャホールド（図１１）に播種する前に胚体内胚葉系統、またはより進んだ肝細胞前駆体（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）（図１２）であることを決定することができる。違いはＡｒｔｅｌｏｎ（Ａｒｔｉｍｐｌａｎｔ）で培養された細胞で容易に観察され、例えば１４日目に播種した細胞におけるＯＣＴ１の発現レベルは、１１日目に播種したものと比較してほぼ２倍である（図１Ｆ＆Ｈ）。これとは対照的に、ＯＡＴＰ２のレベルは、１４日目に播種した細胞において、１１日目に播種したものと比較して減少している（図１Ｊ＆Ｍ）。また、この傾向は、Ａｌｖａｔｅｘで培養された細胞にも見ることができ、この場合もやはり、１４日目に播種した細胞は、１１日目の細胞より低い発現レベルのＯＡＴＰ２を有し、ＯＡＴＰ２が、より未成熟肝細胞表現型のマーカーである可能性を示している（図４Ｉ＆Ｊ）。同様の方法では、ＯＣＴ１のレベルもまた、より成熟した（１４日目）よりも、より若い（１１日目）ときに播種された細胞のほうが高い（図４Ｎ＆Ｐ）。よって、細胞培養および分化期間の長さは、生成される細胞の最終的な表現型を制御するという点で本発明の重要な因子であり、適宜に変えることができる。図９および下表に概説したように、培養の期間および培地組成は調整され、本明細書において開示される方法によって得られる細胞の成熟度および発達段階を最適化しうる。関連する態様は、細胞がスキャホールドに播種される前に供される分化管理体制（ｒｅｇｉｍｅ）、実施例２で詳しく述べられるように、特に細胞がＲｈｏキナーゼＲＯＣＫの阻害剤を含有する培地に曝されるか否かに関係し、そのような阻害剤は、２Ｄおよび３Ｄ段階の両方において継代および播種後に細胞の生存および再付着を向上するのに使用される。
【００６４】
従来の２Ｄ表面で培養されたものと比較して、３Ｄスキャホールドに播種された肝細胞では、機能および代謝活性における向上が観察されている。実施例６に従って３Ｄスキャホールドで成熟したｈＥＳＣ由来の肝細胞は、薬物フェナセチン（ＡＰＡＰ）、ミダゾラムまたはジクロフェナクに曝されたとき、２Ｄ対照培養と比較して、より大きいＣＹＰ活性の誘導を示し（図７および８、１０）、ＡｌｖａｔｅｘスキャホールドはＵｌｔｒａｗｅｂより大きい誘導を示した。Ａｌｖａｔｅｘ（Ｒｅｉｎｎｅｒｖａｔｅ）で培養された細胞のさらなる試験により、それらの細胞は、分化開始後２３日目および２９日目の両日においてＣＹＰ２Ｃ９活性によって測定した際、２Ｄ表面で培養された細胞と比較して、より一層大きな代謝活性を有することが示された。ＣＹＰ２Ｃ９活性は、３Ｄ表面で培養された細胞では既に高かったが、細胞がジクロフェナクで処理されたとき上昇することも観察された（図８）。このことは、３Ｄスキャホールドで分化された肝細胞がやはり、２Ｄ培養された細胞と比較して優れた代謝幹細胞機能を有することを示す。これらの結果は、重要な肝臓のマーカーＣＹＰ３Ａのレベルもまた、薬物ミダゾラムの代謝分解産物について細胞がアッセイされたとき２Ｄ対照と比較してマトリゲルでコーティングされたＡｌｖａｔｅｘ（Ｒｅｉｎｎｅｒｖａｔｅ）で培養された細胞ではより高く、Ｕｌｔｒａｗｅｂで培養された細胞ではわずかに高いという結果をよって裏付けられている（図８）。よって、本発明は、３Ｄスキャホールドで培養された細胞における肝臓の代謝活性の向上の幾つかの例を示している。
【００６５】
したがって、上記のように、本発明の態様は、ＣＹＰ２Ｃ９もしくはＣＹＰ３Ａなどの１つ以上のＣＹＰマーカーの発現の増加、および／またはＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ３Ａ７、ＣＹＰ７Ａ１、ＭＲＰ２、アルブミン、ＵＧＴ２Ｂ７、ＡＡＴ、ＴＡＴを含むリストから選択される肝細胞関連遺伝子マーカーレベルの上昇で示されるように、肝細胞または肝細胞前駆体（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ）が代謝活性の上昇を見せる方法に関する。
【００６６】
さらに、本発明の態様は、肝細胞または肝細胞前駆体（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ）が、ＢＳＥＰ、ＦＡＢＰ１、ＭＲＰ２、ＮＴＣＰ、ＯＡＴＰ２、ＯＣＴ１などの１つ以上のトランスポータータンパク質の発現の増加を見せる方法に関する。
【００６７】
本方法は、上記のように、非肝細胞と比較した肝細胞のまたは肝細胞前駆体（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ）の割合が、１０％などの、２０％などの、３０％などの、４０％などの、５０％などの、６０％などの、７０％などの、８０％などの、９０％などの、１００％などの、５％より大きいことを促しうる。
【００６８】
前記肝細胞または肝細胞前駆体（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ）が、前記３Ｄスキャホールドで、限定されないが肝星細胞、肝免疫（クッパー（Ｋｕｐｐｆｅｒ））細胞、肝内皮細胞、胆管上皮細胞または線維芽細胞から選ばれる少なくとも１つの他の細胞型と共培養される、前述の請求項のいずれかに記載の方法。
【００６９】
したがって、上記のように、本発明の態様は、本明細書において記載されている方法によって得ることが可能なｈＰＳ由来肝細胞もしくは肝細胞前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ）、またはｈＰＳ由来細胞もしくは肝細胞前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ）を含む組成物に関する。さらに、本発明の態様は、治療、再生医療における、薬物スクリーニング、毒性テストまたは薬物送達のための、本明細書において記載されている方法によって得らことが可能なｈＰＳ由来肝細胞もしくは肝細胞前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ）またはｈＰＳ由来細胞もしくは肝細胞前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ）を含む組成物の使用に関する。
【００７０】
さらに、組成物は、限定されないが、多孔性アルギン酸塩スポンジ、生物分解性ポリ（ウレタン尿素）（ＰＵＵＲ）ポリマー、エマルジョンテンプレート型ポリスチレンまたは合成ナノ繊維性複合材などの３Ｄスキャホールドを含みうる。
【実施例】
【００７１】
実施例１
ヒト多能性幹細胞由来の肝細胞の出発材料
ｈＰＳ細胞（上記で定義された）すべてを、本発明の出発材料として使用することができる。下の例では、肝細胞様細胞を、ｍＥＦ細胞上で培養した未分化ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）からインビトロで生成した（Ｈｅｉｎｓ，  Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．  ２００４，  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ）。この実験に使用する細胞系は、限定されないがｈＥＳ細胞系ＳＡ００２、ＳＡ１２１、ＳＡ１８１、ＳＡ４６１（Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ  ＡＢ、Ｇｏｔｅｂｏｒｇ、スウェーデン、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｅｌｌａｒｔｉｓ．ｃｏｍ）であり、Ｈｅｉｎｓ，Ｎらによる２００４年の記載のように増殖させることができる。これらの細胞系は、ＮＩＨ幹細胞レジストリー（ｔｈｅ  ＮＩＨ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｒｅｇｉｓｔｒｙ）、英国幹細胞バンク（ｔｈｅ  ＵＫ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ｂａｎｋ）および欧州ｈＥＳＣレジストリー（ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｈＥＳＣ  ｒｅｇｉｓｔｒｙ）に載っており、依頼に応じて入手可能である。ｈＥＳＣから得られるｈＰＳと並んで、ｈｉＰＳ（人工多能性幹細胞）から得られるｈＰＳを本発明の実施例のための肝細胞の誘導に使用している。この場合、「ｈｉＰＳ‐ＨＥＰ」とは、アルブミン、ＣＹＰ３Ａ４、ＵＧＴ２Ｂ７、ＯＡＴＰ‐２、ＡＤＨ１Ａ、ＵＧＴ１Ａ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９およびＣＹＰ２Ｄ６などの成熟した肝臓のマーカーを発現している人工多能性幹細胞に由来する細胞型を意味することを意図する（「定義」も参照されたい）。ゼノフリーｉＰＳ細胞またはＳＡ６１１（Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ  ＡＢ、Ｇｏｔｅｂｏｒｇ、スウェーデン、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｅｌｌａｒｔｉｓ．ｃｏｍ）などのゼノフリー由来ｈＥＳ細胞系を使用することにより、随意に発明全体をゼノフリー状態下で使用してゼノフリー細胞生成物を作製することが可能になりうる。
【００７２】
実施例２
３Ｄスキャホールドを使用したヒト多能性幹細胞からの肝細胞の誘導
以下に詳しく述べるように、肝細胞をプロトコールａ〜ｅに従ってｈＥＳ細胞およびヒトｈｉＰＳ細胞の両方から生成した。分化の開始前に、培養物をＰＢＳで２回洗浄した。異なる培地（表１）を、０日目からそれ以降、プロトコール概説に従って新たに調製して加えた。培地を、初期分化（ＩＤ）段階の間は毎日または１日おきに交換し、それ以降は１日おきまたは２日おきに交換した。各実験に対して１つ細胞系のみを使用したが、細胞の共培養が可能な３Ｄスキャホールド上に第一の細胞系を播種する場合、随意に第二（またはより多くの）細胞系を追加することもできた。
【００７３】
２Ｄ培養をゼラチンをコーティングした培養容器に播種した実験１１４および１１６以外は、２Ｄ培養をマトリゲルでコーティングした培養容器に播種した。２Ｄ培養では、１５０，０００〜２００，０００細胞／ｃｍ２で播種した。
【００７４】
下表は、種々の実験の概要、どの細胞系を出発材料として使用したか、図９で概説される分化プロトコールの変形、細胞を３Ｄスキャホールドに播種した分化プロトコールの日（ｔｉｍｅ）、細胞を分析した分化の日（ｔｉｍｅ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）、およびスキャホールドに播種した時点で１０ｍＭのＲＯＣＫ阻害剤を培地に加えたか否か（用いたプロトコールの詳細な図解については図９も参照されたい）を示す。
【００７５】
【表１】
0006025715.tif 000002
【００７６】
実施例３  スキャホールド
試験に使用したスキャホールドおよびマトリックスコーティング
Ａｒｔｅｌｏｎ（Ａｒｔｉｍｐｌａｎｔ）；細孔径＜１５０ｐｍ、４８ウェルプレート用にフォーマット
Ａｒｔｅｌｏｎ（Ａｒｔｉｍｐｌａｎｔ）（Ｖａｓｔｒａ  Ｆｒｏｌｕｎｄａ、スウェーデン）の厚意により提供（国際公開第００３５５０７号、またＢｌｕｍｅｎｔｈａｌ，  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）を参照されたい。）
Ａｌｖａｔｅｘ；４８ウェル用サイズ、Ｓｔｅｆａｎ  Ｐｒｚｙｂｏｒｓｋｉ  Ｒｅｌｎｎｅｒｖａｔｅ（Ｄｕｒｈａｍ、英国）の厚意により提供（国際公開第０７１２５２８８号、国際公開第１００３８０１３号を参照されたい。）
ＡｌｇｉＭａｔｒｉｘ；Ｉｎｖｒｉｔｏｇｅｎ／ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）、カタログ番号１２６８４、ロット番号７３１９５０、９６ウェル（実験０８８＋０８９）（国際公開第０８１１２９０４号、またＳｈａｐｉｒｏ，  Ｌ  ＆  Ｃｏｈｅｎ，  Ｓ．  （１９９７）を参照されたい。）
ＵｌｔｒａＷｅｂ；コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、カタログ番号３８７３ｘｘ、ロット番号０９２０７０４３、９６ウェル（実験０８８＋０８９）（国際公開第０９０３２１１７号、国際公開第１００６００６６号、またＰｉｒｙａｅｉ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）を参照されたい。）
Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ；Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号２７８６５、およそ３００マイクロウェル（国際公開第２００８１０６７７１１号を参照されたい）。
ＨＡＣ／Ｐｏｒｏｃｅｌｌ；（ＨａｃＢｉｏｍｅｄ）；（Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．  １９９７  Ｓｅｐ−Ｏｃｔ；６（５）：４６３−８  幹細胞用三次元培養系としての高度に多孔質のポリマーマトックス（Ｈｉｇｈｌｙ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｍａｔｒｉｃｅｓ  ａｓ  ａ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．）  Ｋａｕｆｍａｎｎ  ＰＭ，  Ｈｅｉｍｒａｔｈ  Ｓ，  Ｋｉｍ  ＢＳ，  Ｍｏｏｎｅｙ  ＤＪ．）
【００７７】
３Ｄスキャホールドおよび２Ｄ培養皿の使用前調製：
Ａｒｔｅｌｏｎ（Ａｒｔｉｍｐｌａｎｔ）およびＡｌｖａｔｅｘスキャホールドを、７０％ＥｔＯＨに浸し、ＥｔＯＨを取り除き、スキャホールドをＤＰＢＳで２回洗浄した。
【００７８】
マトリゲル：ＢＤからの低増殖因子マトリゲル、ロット番号０９３４を、ＤＰＢＳ中で０．０１６ｍｇ／ｍＬに希釈し、スキャホールドおよび２Ｄ培養皿に加え、室温で少なくとも１時間インキュベーションした後、マトリゲルを使用直前に取り除いた。
ゼラチン：製造用ゼラチン（ｇｅｌａｔｉｎ  ｆｒｏｍ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）を、スキャホールドおよび／または２Ｄ培養皿にを加え、室温で少なくとも３０分間インキュベーションし、次にそのゼラチンを使用直前に取り除いた。
【００７９】
実施例４
ｈＥＳ細胞培養の継代および維持
培養細胞から培地を取り除き、培養物をＤＰＢＳ−／−（３７℃、０．５ｍＬ／ｃｍ２）で２回洗浄した。ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔを加え（室温、０．１ｍＬ／ｃｍ２）、３７℃にて（未分化細胞またはアクチビンＡ処理後の細胞については４〜５分間、前記細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）段階にある細胞については１０〜４５分間）インキュベーションした。次に、ｐ１０００で細胞を流して細胞を剥がした。ＶｉｔｒｏＨＥＳを加え（３７℃、０．１ｍＬ／ｃｍ２）、細胞懸濁液を遠心分離チューブに移し、３３０×ｇで５分間室温にて遠心分離した。細胞ペレットを、培養培地で懸濁して細胞を数え、適切な播種懸濁液に希釈した。幾つかの実験（実験１１３、１１４、１１６、１１８、１１９、１２０）では、播種する日に１０ｍＭのＲｏｃｋ阻害剤を培養培地に加えた。
【００８０】
実施例５
３Ｄスキャホールドで培養したｈＥＳＣ由来肝細胞の遺伝子発現分析
図の説明に示したように、ｍＥＦ層上でＤＥＦ培養系またはＳＡ００２培養から培養した細胞系ＳＡ００２、ＳＡ１２１、ＳＡ１８１、ＳＡ４６からｈＥＳＣ−ＨＥＰを生成した。
【００８１】
１８、２２、２４、２５および３０日目に、キアゲンのＲＮＡ単離キットを使用することによってｈＥＳ‐ＨＥＰ培養物から全ＲＮＡを回収し、単離した。Ｔａｑｍａｎプローブを使用することによって、定量逆転写酵素ＰＣＲ、ＱｒｔＰＣＲを以下の肝臓マーカー遺伝子について行った：第１相薬物代謝酵素：ＣＹＰ（シトクロムＰ４５０）１Ａ２、２Ｃ９、３Ａ４、７Ａ１、第２相薬物代謝酵素ＧＳＴＡ１（グルタチオン‐Ｓ‐トランスフェラーゼ（ｇｌｕｔａｔｉｏｎ−Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓ）Ａ１）、ＵＧＴ２Ｂ７（ＵＤＰグルクロノシルトランスフェラーゼ２Ｂ７）、第３相、トランスポーター、ＭＲＰ２（多剤耐性タンパク質（ｍｕｌｔｉ−ｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｄｅｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）２、ＡＢＣＣ２とも称される）、ＢＳＥＰ（胆汁酸塩排出ポンプ）、ＮＴＣＰ（溶質輸送体、ナトリウム／胆汁酸共トランスポーター）、ＯＣＴＩ（溶質輸送体、有機カチオントランスポーター）、ＯＡＴＰ２（溶質輸送体、有機アニオントランスポーター）、ＦＡＢＰ１（脂肪酸の取り込み、輸送、および代謝に関与する脂肪酸結合タンパク質）、および一般的な肝臓マーカー：ＡＡＴ（アルファ‐１抗トリプシン）、ＡＤＨＩＡ（アルコールデヒドロゲナーゼ１Ａ）ＡＬＢ（アルブミン）およびＴＡＴ（チロシンアミノトランスフェラーゼ）。他に指示がある場合を除いて、データすべてを、ハウスキーピング遺伝子であるＣＲＥＢＢＰに対して正規化した。他に指示がある場合を除いて、２Ｄ対照に対する倍率変化（ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ）としてデータを提示する。
【００８２】
データは図１〜４に示され、２Ｄと比較して３Ｄ培養したとき、ｈＥＳＣ‐ＨＥＰにおいて肝臓の遺伝子が、より高いレベルで発現されることを示している。３Ｄ培養における他の肝臓マーカーの発現レベルの上昇は、３Ｄ培養がｈＥＳＣの肝臓への分化に重要であるという発見を支持する。
【００８３】
実施例６
ＣＹＰアッセイ
１６、１８、２０、２１および２５日目に、基質であるフェナセチン、ジクロフェナクおよびミダゾラムを、それぞれ最終濃度、２６ｐＭ、９ｐＭおよび３ｐＭで、０．１％ペニシリン・ストレプトマイシン、２ｍＭ  Ｌ‐グルタミンおよび２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓを補充したフェノールレッドを含まないＷｉｌｌｉａｍｓ培地Ｅ中でインキュベーションすることによって、ｈＥＳＣ由来肝細胞培養をシトクロムＰ４５０１Ａ、２Ｃおよび３Ａ活性について分析した。ウェル表面１ｃｍ２当たり１００μＬの容積（例えば４８ウェルでは７５μＬ）の希釈した基質を加えた。基質とともに、ｈＥＳＣ由来肝細胞培養を一晩インキュベーションした。１６時間後、培地を回収し、それに続いて１００００ｇで４℃にて２０分間遠心分離した。シトクロムｐ４５０酵素ＣｙｐｌＡ２、１Ａ１（フェナセチン）Ｃｙｐ２Ｃ９、２Ｃ８（ジクロフェナク）およびＣｙｐ３Ａ４、３Ａ５（ミダゾラム）によって生物学的に変換された（ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）代謝産物であるパラセタモール、４‐ＯＨ‐ジクロフェナクおよび１‐ＯＨミダゾラムの存在について、液体クロマトグラフィー‐質量分析（ＬＣ‐ＭＳ）ＬＣＭＳにより試料を分析した。
【００８４】
実施例７
Ｒｅｉｎｎｅｒｖａｔｅスキャホールドで培養した細胞におけるＣｙｐ２Ｃ９活性の向上およびＣＹＰ２Ｃ９活性の誘導の向上
実施例１および２、実験０８３の条件、次いで以下のスキームに従って、細胞系ＳＡ４６１（Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ  ＡＢ）を培養して分化させた。
【００８５】
【表２】
0006025715.tif 000003
【００８６】
上で適用した成長培地組成物。
【００８７】
【表３】
0006025715.tif 000004
【００８８】
分化は１５日目まで実施され、１５日目にスキャホールドを２４ウェルプレートに合うように小さい円に切った。Ａｌｖａｔｅｘ（Ｒｅｌｎｎｅｒｖａｔｅ）スキャホールドを、７０％ＥｔＯＨで洗浄し、ＥｔＯＨを取り除き、ウェルをＰＢＳ＋／＋で２回洗浄した。マトリゲル：ＧＦＲマトリゲル  ロット番号６７４１を、ＤＰＢＳで０．０１６ｍｇ／ｍＬに希釈し、１ウェル当たり、スキャホールド当たり５００ｕＬをスキャホールドに加えた。スキャホールドを、〜１時間室温にてマトリゲルとインキュベーションした。マトリゲルを使用の直前に取り除いた。
【００８９】
目的は、２Ｄウェルに１．５：１の分割比で播種することであった。Ａｌｖａｔｅｘ（Ｒｅｌｎｎｅｒｖａｔｅ）では、５倍多くの細胞を播種し、７．５：１の分割比であった。９．６ｃｍ２の２７ウェル、つまり２６０ｃｍ２で開始。
Ａｌｖａｔｅｘ（Ｒｅｌｎｎｅｒｖａｔｅ）スキャホールドでは、１ｃｍ２当たり１００ｕＬを播種するために、細胞を（２６０／７．５×０．１＝３４．６）３．４６ｍＬに懸濁した。
【００９０】
２７ウェルの細胞を、ＤＢＰＳ＋／＋で１回洗浄し、１ウェル当たり２ｍＬのＴｒｙｐｌｅ  Ｓｅｌｅｃｔを加え、２３分間３７℃でインキュベーションした。遠沈した培地を加え、細胞を流して剥離した。細胞を回収し、５分間４００×ｇで遠心した。３．４６ｍＬの播種培地に再懸濁した。Ａｌｖａｔｅｘ（Ｒｅｌｎｎｅｒｖａｔｅ）スキャホールド当たりこの懸濁液を２００μＬ播種した。６００μＬの懸濁液を５倍に希釈し、２Ｄウェル当たりこの２００μｌを播種した。次に、全ウェルに培地を加えて、１ウェルにつき総量８００μｌとした。
【００９１】
細胞カウント：２７．９×１０６細胞／ｍＬ（生存率８７％）、総量３．４６ｍＬ、合計９６ｘ１０６個の細胞
【００９２】
【表４】
0006025715.tif 000005
【００９３】
誘導：
細胞を、１ｍＭ  フェノバルビタール、１０μＭ  デキサメタゾンおよび５μＭ  β‐ナフトフラボンで誘導した。
これらの溶液を得るために、１００μＬの６４ｍＭ  デキサメタゾン溶液を、５４０μＬのＤＭＳＯに希釈し、１０ｍＭ  デキサメタゾン溶液を得た。
１１．４ｍｇのβ‐ナフトフラボンを８．４４６ｍＬのＤＭＳＯに溶かし、５ｍＭ溶液を得た。
１Ｍ  フェノバルビタールを、ＰＢＳで１：１で希釈した。
３５ｍＬ  Ｍ６（Ｄｅｘ含まず）に、３５μＬの１０ｍＭ  ｄｅｘ、３５μＬの５ｍＭ  β‐ナフトフラボンおよび７０μＬの０．５Ｍ  フェノバルビタール。
酵素活性をベースライン酵素活性と比較できるように、対照培地（非誘導培地）はＤＭＳＯを含有しなかった。
各ウェルに、誘導または対照培地のいずれか（２Ｄ培養では４００μＬ／ウェル、Ｒｅｌｎｎｅｖａｔｅスキャホールドでは２０００μＬ／ウェル）を加え、プレートを２４時間インキュベーションした。
【００９４】
活性アッセイ：
誘導の２４時間後、全ウェルをＤＰＢＳ＋／＋で２回洗浄し、活性アッセイ培地を加えた：２Ｄ対照では２００ｕＬ／ウェルおよびＲｅｌｎｎｅｒｖａｔｅスキャホールドでは１０００ｕＬ／ウェル。活性アッセイ培地：０．１％ＰＥＳＴ、２ｍＭ  Ｌ‐グルタミン、２５ｍｍ  ＨＥＰＥＳならびに２６ｕＭ  フェナセチン、３ｕＭ  ミダゾラムおよび９ｕＭ  ジクロフェナク含有ＷＥからなるフェノールレッドを含まない無タンパク質培地。
【００９５】
３７℃で１６時間インキュベーションした後、培地をエッペンドルフチューブに移し、２０分間４℃にて１００００ｇで遠心した。ジクロフェナクの代謝産物であるＯＨ‐ジクロフェナクの存在について、上澄みをＨＰＬＣによって分析した。
【００９６】
実施例８
スキャホールドに播種したときに、細胞が胚体内胚葉または肝臓前駆体（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ）に分化していることの検証
肝細胞への分化に使用したプロトコールを、「内胚葉誘導」工程後の胚体内胚葉細胞、プロトコールａ）に従って培養した細胞の形成について分析した（図１１）。分化プロトコール中の７日目に、細胞をＲＮＡ用に採取し、リアルタイムＰＣＲで分析し、実験の開始（０日目）からの未分化細胞と比較した。分化プロトコールにより、胚体内胚葉マーカー（ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７、ＨＨＥＸ、ＣＸＣＲ４、ＣＥＲ１）を発現する細胞が生成されることが示された。さらに、未分化細胞のマーカー（ＮａｎｏｇおよびＯＣＴ４）が、未分化出発材料に比べて下方制御されていることが確かめられた。くわえて、胚体外内胚葉マーカー（Ｓｏｘ７およびＣＤＸ２）は内胚葉誘導の間に増加しないので、細胞がこれらの遺伝子を発現していることを確認した。同様の方法を採用して、スキャホールド「肝前駆体（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ）」として播種された細胞が実際にこの表現型を保有することを検証した（図１２）。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】Ａｒｔｅｌｏｎ（Ａｒｔｉｍｐｌａｎｔ）で培養したｈＥＳＣ由来肝細胞。  ２Ｄ培養または３Ｄ  Ａｒｔｅｌｏｎ（Ａｒｔｉｍｐｌａｎｔ）スキャホールドで培養したｈＥＳＣ由来肝細胞の肝臓マーカーの相対的な発現レベル。Ａｒｔｅｌｏｎ（Ａｒｔｉｍｐｌａｎｔ）をコーティングしないか、またはマトリックス（マトリゲルもしくはゼラチン）でコーティングし、細胞を、×１密度または×３密度のいずれかで播種した。図は、示された実験番号、プロトコールａ）およびｃ）に従って０、５、１１、１２、１４または１５日間スキャホールドで培養した細胞と、３つの独立した細胞系（ＳＡ４６１、ＳＡ００２、ＳＡ１８１）を示す。
【図１−１】図１の分図である。
【図１−２】図１の分図である。
【図１−３】図１の分図である。
【図１−４】図１の分図である。
【図１−５】図１の分図である。
【図１−６】図１の分図である。
【図１−７】図１の分図である。
【図２ａ】ＡｌｇｉＭａｔｒｉｘ上のｈＥＳＣ由来肝細胞。  ２Ｄまたは３Ｄ  ＡｌｇｉＭａｔｒｉｘスキャホールドで培養したｈＥＳＧ由来肝細胞での肝臓マーカーの相対的な発現レベル。図は、スキャホールドでそれぞれプロトコールｄ）、１４または１３日間培養した細胞と、２つの独立した細胞系（ＳＡ００２およびＳＡ１２１）を示す。
【図２ｂ】ＡｌｇｉＭａｔｒｉｘ上のｉＰＳ由来肝細胞。  ２Ｄまたは３Ｄ  ＡｌｇｉＭａｔｒｉｘスキャホールドで培養したｉＰＳ由来肝細胞での肝臓マーカーの相対的な発現レベル。細胞を７日間分化させた後、スキャホールドに播種し、３２日培養した後に分析した；プロトコールｈ（実験１６９ａ）またはｆ（実験１６９ｂ）。
【図３】ＵｌｔｒａＷｅｂ上のｈＥＳＣ由来肝細胞。  ２Ｄまたは３Ｄ  ＵｌｔｒａＷｅｂスキャホールドで培養したｈＥＳＣ由来肝細胞での肝臓マーカーの相対的な発現レベル。Ｕｌｔｒａｗｅｂを、コーティングしないか、またはマトリックス（マトリゲルもしくはゼラチン）でコーティングする。図は、プロトコールａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、スキャホールドで４、５、７または１４日間培養した細胞と、４つの独立した細胞系（ＳＡ００２、ＳＡ４６１、ＳＡ１２１およびＳＡ１８１）を示す。
【図３−１】図３の分図である。
【図３−２】図３の分図である。
【図３−３】図３の分図である。
【図４ａ】Ａｌｖａｔｅｘ（Ｒｅｉｎｎｅｒｖａｔｅ）上のｈＥＳＣ由来肝細胞。  ２Ｄ培養または３Ｄ  Ａｌｖａｔｅｘ（Ｒｅｉｎｎｅｒｖａｔｅ）スキャホールドで培養されたｈＥＳＣ由来肝細胞の肝臓マーカーの相対的な発現レベル。Ａｌｖａｔｅｘを、コーティングしないか、またはマトリックス（マトリゲルもしくはゼラチン）でコーティングし、細胞を、×１密度または×３密度のいずれかで播種する。図は、示された実験番号、プロトコールａ）、ｃ）、ｄ）に従って０、４、９、１１．１３または１４日間スキャホールドで培養した細胞と、４つの独立した細胞系（ＳＡ４６１、ＳＡ００２、ＳＡ１８１およびＳＡ１２１）を示す。
【図４ａ−１】図４ａの分図である。
【図４ａ−２】図４ａの分図である。
【図４ａ−３】図４ａの分図である。
【図４ａ−４】図４ａの分図である。
【図４ａ−５】図４ａの分図である。
【図４ａ−６】図４ａの分図である。
【図４ａ−７】図４ａの分図である。
【図４ａ−８】図４ａの分図である。
【図４ａ−９】図４ａの分図である。
【図４ｂ】Ａｌｖａｔｅｘ（Ｒｅｉｎｎｅｒｖａｔｅ）上のｉＰＳ由来肝細胞。  ２Ｄ培養または３Ｄ  Ａｌｖａｔｅｘ（Ｒｅｉｎｎｅｒｖａｔｅ）スキャホールドで培養されたｉＰＳ由来肝細胞の肝臓マーカーの相対的な発現レベル。Ａｌｖａｔｅｘを、コーティングしないか、またはマトリックス（マトリゲルもしくはフィブロネクチン）でコーティングし、細胞を、７日の２Ｄ培養後に採取した２Ｄ培養の密度の６倍の密度で播種した。図は、培養プロトコールｆで、スキャホールドで分析前に最長２９日間培養した細胞と、１つの独立したｉＰＳ系（ＩＭＲ９０）を示す。
【図４ｂ−１】図４ｂの分図である。
【図５ａ】Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ上のｈＥＳＣ由来肝細胞。  ２Ｄ培養または３Ｄ  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌスキャホールドで培養されたｈＥＳＣ由来肝細胞の肝臓マーカーの相対的な発現レベル。Ａｇｇｒｅｗｅｌｌを、マトリックス（フィブロネクチン）で予めコーティングした後、プロトコールｆ）に従って２Ｄで１１日間培養した細胞と播種し、細胞をウェル当たり１００または２００の凝集体で播種した。図は、スキャホールドで分析前に最長２５日間培養した細胞と、１つの独立したｈＥＳＣ系（ＳＡ１８１）を示す。
【図５ａ−１】図５ａの分図である。
【図５ｂ】Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ上のｉＰＳ由来肝細胞。  ２Ｄ培養または３Ｄ  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌスキャホールドで培養されたｉＰＳ由来肝細胞の肝臓マーカーの相対的な発現レベル。Ａｇｇｒｅｗｅｌｌを、マトリックス（フィブロネクチン）で予めコーティングした後、２Ｄで７日間培養された細胞と播種した。図は、培養プロトコールｉで、スキャホールドで分析前に最長２９日間培養した細胞と、１つの独立したｉＰＳ系（ＩＭＲ９０）を示す。
【図５ｂ−１】図５ｂの分図である。
【図６】ポリ‐Ｌ‐リジン３Ｄスキャホールドで培養したｈＥＳＣ由来肝細胞の肝臓マーカーの相対的な発現レベル。細胞を、２Ｄで７日間部分的に分化させた後、播種し、２４日目まで培養してマーカー発現について分析した；プロトコールｇ）。
【図７】３ＤスキャホールドにおけるｈＥＳＣ由来肝細胞のＣＹＰ活性。３Ｄスキャホールド  左＝Ａｌｖａｔｅｘ、３Ｄスキャホールド  右＝ＵｌｔｒａＷｅｂ。実験２４、ＳＡ００１  ＥＣＤ。  図は、ＡＰＡＰ、ミダゾラムまたはジクロフェナクのいずれかを用いて処理し、ＣＹＰ反応を誘導して肝臓の代謝活性を模倣した細胞と、Ａｌｖａｔｅｘ、Ｕｌｔｒａｗｅｂまたは２Ｄ対照のいずれかで培養したｈＥＳＣ由来肝細胞の相対的なＣＹＰ活性を示す。
【図８】従来の２Ｄ培養プレートまたはＡｌｖａｔｅｘスキャホールドで培養したｈＥＳＣ由来肝細胞におけるＣＹＰ誘導。  図は、Ａｌｖａｔｅｘ（Ｒｅｉｎｎｅｒｖａｔｅ）または２Ｄ対照で培養したｈＥＳＣ由来肝細胞、ジクロフェナクを用いて誘導し、肝臓の肝臓活性を模倣した細胞におけるＣＹＰ反応を示す。活性アッセイは、示されたように２３日目および２９日目に行った。
【図８−１】図８の分図である。
【図９】ｈＰＳ細胞の肝細胞への分化に使用した分化プロトコールの概略図。  プロトコールａ〜ｅおよび対応する実験番号と各実験の期間。  プロトコールａ：（実験１１３、１１４、１１８、１１９、１２０）。２日間  ＩＤ１、５日間  ＩＤ２、２日間  Ｐ１、２日間  ＶＨ１、５日間  ＶＨ２、８日間  Ｍ１。  プロトコールｂ：（実験１０４）。４日間  ＩＤ３、３日間  Ｐ１、２日間  ＶＨ１、３日間  ＶＨ２、２日間  ＶＨ２Ｂ、４日間または８日間  Ｍ２（それぞれ１８日目および２２日目に分析した培養細胞について）。  プロトコールｃ：（実験０９８）。５日間  ＩＤ３、３日間  Ｐ１、７日間  ＶＨ１、１０日間  Ｍ３。  プロトコールｄ：（実験０８８、０８９）。２日間  ＩＤ１、２日間  ＩＤ２、３日間  Ｐ１、７日間  ＶＨ１、１０日間のＭ４。  プロトコールｅ：（実験０８３）。１日  ＩＤ４、５日間  ＩＤ５、６日間  Ｐ１、８日間  Ｍ５、１５日間  Ｍ６。  プロトコールｆ：（実験１６９ｂ、１７２、１７５ＳＡ１８１）。１日  １Ｄ１、１日  ＩＤ６、５日間  ＩＤ２、７日間  ＶＨ１、その後実験の終りまでＭ１。  プロトコールｇ：（実験１３９、１４０、１４８、１７５ＳＡ１２１、１７７ＳＡ１２１、ＣＹＰ３Ａ誘導）。１日  ＩＤ７、１日  １Ｄ８、５日間  ＩＤ９、７日間  ＶＨ１、その後実験の終りまでＭ１。  プロトコールｈ：（実験ｌ６９ａ、１７７ＳＡ１８１、ＣＹＰ３Ａ誘導）。１日  ＩＤ７、１日  ＩＤ１、５日間  ＩＤ２、７日間  ＶＨ１、その後実験の終りまでＭ１。  プロトコールｉ：（実験１５３）。１日  ＩＤ１０、１日  ＩＤ１１、２日間  ＩＤ３、７日間  ＶＨ１、その後実験の終りまでＭ１。  プロトコールａ〜ｅに使用した成長培地組成の詳細。  初期分化（ＩＤ）。
【表５】
0006025715.tif 000006
肝前駆体（Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）培地。
【表６】
0006025715.tif 000007
成熟培地。
【表７】
0006025715.tif 000008
【図９−１】図９の分図である。
【図１０】３ＤスキャホールドにおけるＣＹＰ活性の誘導。  １ｍＭ  フェノバルビタールおよび１０μＭ  デキサメタゾンを用いてまたは用いずに誘導（誘導／非誘導）した２４時間後にミダゾラムの代謝産物である４‐ＯＨミダゾラムを測定することによるＣＹＰ３ＡおよびＣＹＰ２Ｃ９活性の誘導。２４時間の誘導の間、デキサメタゾン、ＤＭＳＯおよびＢｉｏを培地組成Ｍ１から除外した。誘導後、活性アッセイを他所で記載のように（実施例６を参照されたい）行った。
【図１０−１】図１０の分図である。
【図１１ａ】２Ｄで培養された後に３Ｄスキャホールドに播種したｈＥＳＣ細胞の胚体内胚葉の運命の検証。  ２Ｄフォーマットで７日間培養した後、３Ｄスキャホールドに播種したｈＥＳＣ細胞；プロトコールａ）に従ってマトリゲルでコーティングされた２Ｄ表面で培養した２つの独立した細胞系（ＳＡ１２１およびＳＡ１８１）における内胚葉マーカー（ＦｏｘＡ２、ＨＨｅｘ、ＣｘｃＲ４、ＣＥＲ１）の誘導、および分化万能性マーカー（Ｓｏｘ７、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４）の下方制御。また、細胞の明視野形状も示す。
【図１１ａ−１】図１１ａの分図である。
【図１１ｂ】２Ｄで培養された後に３Ｄスキャホールドに播種したｉＰＳ細胞の胚体内胚葉の運命の検証。  ２Ｄフォーマットで７日間培養した後、３Ｄスキャホールドに播種したｉＰＳ細胞；プロトコールｈ（実験１６９ａ）およびｆ（実験１６９ｂ）に従って培養した細胞系ＩＭＲ９０における内胚葉マーカー（ＦｏｘＡ２、ＨＨｅｘ、ＣｘｃＲ４、ＣＥＲ１）の誘導。
【図１２】２Ｄで培養された後に３Ｄスキャホールドに播種したｈＥＳＣ細胞の肝前駆体（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）の運命の検証。  ２Ｄフォーマットで１１日間培養した後、３Ｄスキャホールドに播種したｈＥＳＣ細胞；プロトコールｇ）に従って培養した細胞系ＳＡ１２１およびＳＡ１８１における肝前駆体（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）マーカー（ＡＦＰ、ＥｐＣＡＭ、ＦＯＸＡ２、ＨＮＦ４‐ａ、ＫＲＴ１９、ＫＲＴ８）の誘導。
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【図１】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図１−７】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４ａ】
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【図４ａ−１】
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【図４ａ−２】
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【図４ａ−３】
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【図４ａ−４】
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【図４ａ−５】
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【図４ａ−６】
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【図４ａ−７】
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【図４ａ−８】
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【図４ａ−９】
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【図４ｂ】
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【図４ｂ−１】
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【図５ａ】
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【図５ａ−１】
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【図５ｂ】
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【図５ｂ−１】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図８−１】
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【図９】
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【図９−１】
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【図１０】
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【図１０−１】
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【図１１ａ】
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【図１１ａ−１】
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【図１１ｂ】
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【図１２】
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