(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
間葉系幹細胞の処理方法であって、予め取得されかつ単離された間葉系幹細胞を、酸化剤を含む処理培地において培養することを包含し、上記処理培地において上記細胞を培養することは、
ａ）第１のサイクル：上記細胞を培養表面に散布して、上記細胞が付着しかつその特徴的な形態を獲得するための４〜８時間の条件づけ時間を待つ工程と、
ｂ）最終Ｈ２Ｏ２濃度が０．０１〜０．０５ｍＭになるまで、上記処理培地を加える工程と、
ｃ）３７℃、５％ＣＯ２の雰囲気のインキュベータ内で、４８〜７２時間維持する工程と、
ｄ）第２のサイクル：再度、最終Ｈ２Ｏ２濃度が０．０１〜０．０５ｍＭになるまで、上記処理培地をリフレッシュさせる工程と、
ｅ）これらの細胞を、５％のＣＯ２を用いて、３７℃で４８〜７２時間インキュベートする工程と、
ｆ）第３のサイクル：最終Ｈ２Ｏ２濃度がもう一度０．０１〜０．０５ｍＭになるまで、上記処理培地を再度加えることによって、上記処理培地をリフレッシュさせる工程と、
ｇ）これらの細胞を、５％のＣＯ２を用いて、３７℃で２４〜４８時間インキュベートする工程と、を含んでいることを特徴とする方法。
【請求項２】
上記工程ｂ）、ｄ）、およびｆ）において用いられる上記処理培地は、８５〜９５％の通常の培養細胞、０．５〜５％のウシ胎児血清、および０．０１〜０．０５ｍＭ過酸化水素を含んでいることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記間葉系幹細胞は、脂肪組織、骨髄、臍帯および／または胎盤から単離されたものであることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
上記間葉系幹細胞は、ヒト脂肪組織から単離されたものであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
上記酸化剤は、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、過酸化カルシウム（ＣａＯ２）、過酸化マグネシウム（ＭｇＯ２）、過酸化亜鉛（ＺｎＯ２）、過酸化マンガン（ＭｎＯ２）、過酸化鉛（ＰｂＯ２）、一酸化窒素（ＮＯ）、亜酸化窒素（Ｎ２Ｏ）、オゾン（Ｏ３）、過ホウ酸ナトリウム（ＮａＢＯ３）、二酸化セレン（ＳｅＯ２）、酸化銀（Ａｇ２Ｏ）、塩化第二鉄（ＦｅＣｌ３）などの塩化鉄、過炭酸ナトリウム（２Ｎａ２ＣＯ３）などの銅塩、過マンガン酸カリウム（Ｋ２Ｍｎ２Ｏ８）などの過マンガン酸塩、重クロム酸カリウム（Ｋ２Ｃｒ２Ｏ７）などの重クロム酸塩、次亜塩素酸（ＨＣｌＯ−）のリチウム塩、ナトリウム塩およびカルシウム塩、亜塩素酸ナトリウム（ＮａＣｌＯ２）、塩素酸（ＨＣｌＯ３）、塩素酸カリウム（ＫＣｌＯ３）、水酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）、炭酸マグネシウム（ＭｇＣＯ３）で沈殿させた水酸化アルミニウム、水酸化砒素（Ａｓ（ＯＨ）３）、亜ヒ酸過酸化ベンゾイル（（Ｃ６Ｈ５ＣＯ）２Ｏ２）、水酸化カルシウム（Ｃａ（ＯＨ）２）、クロルジアゼポキシド塩酸塩、酸化銅（ＣｕＯ）、酸化鉄、酸化マグネシウム（ＭｇＯ）、マグネシウム二酸化物（Ｍｇ（ＯＨ）２）、水酸化カリウム（ＫＯＨ）、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、酸化チタン（ＴｉＯ２）、ならびに／または酸化亜鉛（ＺｎＯ）からなる群より選択される請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ＰＣＲ法によって測定された場合に、ＳＯＤ１（スーパーオキシドジスムターゼ１）遺伝子発現が、未処理のＡＳＣ（ヒト脂肪組織由来の間葉系幹細胞）に対して少なくとも３０％増加していることを示すことを特徴とする間葉系幹細胞。
【請求項７】
ＰＣＲ法によって測定された場合に、ＳＯＤ２（スーパーオキシドジスムターゼ２）遺伝子発現が、未処理のＡＳＣに対して少なくとも２５％増加していることを示すことを特徴とする請求項６に記載の間葉系幹細胞。
【請求項８】
ＰＣＲ法によって測定された場合に、ＳＯＤ３（スーパーオキシドジスムターゼ３）遺伝子発現が、未処理のＡＳＣに対して少なくとも５０％増加していることを示すことを特徴とする請求項７に記載の間葉系幹細胞。
【請求項９】
ＰＣＲ法によって測定された場合に、Ｃａｔ（カタラーゼ）遺伝子発現が、未処理のＡＳＣに対して少なくとも５０％増加していることを示すことを特徴とする請求項８に記載の間葉系幹細胞。
【請求項１０】
ティーツェ酵素法によって測定された場合に、細胞内ＧＳＨ（還元型グルタチオン）が、未処理のＡＳＣに対して少なくとも８％増加していることを示すことを特徴とする請求項９に記載の間葉系幹細胞。
【請求項１１】
ＤＣＦＡ（２’，７’−ジクロロフルオレセインジアセタート）プローブを用いた蛍光定量法によって測定された場合に、細胞内ＭＲＯ（酸化ストレスを引き起こす生得的免疫反応の反応性酸素代謝物）が、未処理のＡＳＣに対して少なくとも１０％減少していることを示すことを特徴とする請求項１０に記載の間葉系幹細胞。
【請求項１２】
ＰＣＲ法によって測定された場合に、ベータアクチンが、未処理のＡＳＣに対して少なくとも４０％増加していることを示すことを特徴とする請求項１１に記載の間葉系幹細胞。
【請求項１３】
ＰＣＲ法によって測定された場合に、ＩＧＦ−１が、未処理のＡＳＣに対して少なくとも４０％増加していることを示すことを特徴とする請求項１２に記載の間葉系幹細胞。
【請求項１４】
酸化ストレスに関連するかまたは酸化ストレスによって引き起こされる病気、および／または、酸素反応性種媒介化合物による変性発生状態を治療するための薬剤を製造するための、請求項６〜１３に記載の細胞の、利用。
【請求項１５】
結節性動脈周囲炎、糖尿病、慢性肉芽腫症、動脈硬化症、脳卒中、肺線維症（慢性閉鎖性肺疾患、ＣＯＰＤ、特発性肺線維症）、虚血−再灌流症候群、アルツハイマー病、パーキンソン病、関節リュウマチ、全身性エリスマトーデス、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、成分呼吸速迫症候群、粥状動脈硬化、脊髄損傷、末梢神経損傷、緊縮性側索硬化症、ハンチントン病、フレデリックの運動失調、歯周炎、炎症成分によって起こる粘膜の疾病、病気、および損傷、急性かつ慢性の潰瘍および傷からなる群から選択される病気を治療するための、請求項１４に記載の利用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔発明の技術的側面〕
本発明は、間葉系幹細胞の処理方法、この方法によって直接得られる細胞、酸化ストレスに関するかまたは酸化ストレスによって引き起こされる病気のケアにおけるその使用に関する。
【０００２】
〔発明の背景〕
幹細胞の可能性は、規定された細胞型へ分化することと、対応する組織または器官へ統合することとの能力次第である。幹細胞の他の有利な特性は、サイトカイン、インターロイキン、栄養因子、および成長因子のパラクリン放出である。
【０００３】
現在の研究および臨床的試験は、いくつかの病理学における幹細胞の治療効果を探求するように設計されている。そして、幹細胞療法への要求が増している。
【０００４】
呼吸器系、循環器系、免疫系、内分泌系／機能、中枢および抹消神経系、脊髄損傷、虚血再灌流障害、および脱髄性疾患の特定の変性疾患は、酸化ストレスと命名される活性酸素種（ＲＯＳ）によって媒介された炎症成分を有する。
【０００５】
活性酸素種、主にはスーパーオキシドアニオンラディカル（Ｏ２−）、およびその不均化生成物Ｈ２ＩＯ２は、エネルギー分子（ＡＴＰ）の生成における機能のゆえに、細胞の生涯に不可欠な現象である呼吸鎖が起こる細胞のミトコンドリアにおける自然な廃棄副生成物である。
【０００６】
ミトコンドリアは、末端電子受容体として、Ｏ２への電子伝達の９０％以上を担う、哺乳類細胞において最も酸化還元活性のある区画である。支配的な電子伝達は、さまざまな代謝性基質（たとえば、ピルピン酸、脂肪酸）の酸化によって利用可能になるポテンシャルエネルギーを、ＡＴＰの生成に用いる中心酸化還元回路を通じて起こる。この過程の制御は、細胞機能にとって最も重要である。なぜなら細胞は、不可欠かつ間欠的な食物摂取の結果としての長期間のエネルギー供給を実現するために、非必須アミノ酸の供給に関する適当なホメオスタシスを維持したり、過剰なアミノ酸を除去したり、エネルギー前駆物質を相互変換したりするのと同時に、ＡＴＰを生成しなければならないからである。制御の一部は、ＲＯＳ発生の持続的な低率と、分子センサーとを通じて起こるようである。とはいえ、この制御のための髄伴性の酸化還元回路としては、特殊化された酸化還元的環境を必要とする、不十分に定義されたものが知られている。
【０００７】
過剰な酸化ストレスの下では、ミトコンドリアＡＴＰ生成能力および電子伝達鎖によるＲＯＳ生成の一過性増加の同時崩壊によって、結果として、ＲＯＳから細胞質へのミトコンドリア放出が起こりうる。これは、「ＲＯＳ誘導性のＲＯＳ放出」を、隣のミトコンドリアにおいて引き起こしうる。ＲＯＳ生成の低率がミトコンドリアにおける通常の過程であるとはいえ、過剰なＲＯＳの発生によって電子の流れが崩壊すると、結果として、老化、アポトーシス、および細胞死が起こる。Go and Jones, 2008. Redox compartmentalization in eukaryotic cells. Biochimica et Biophysica Acta 1780 (1273.1290); Zorov, Juhaszova and Sollott. 2006. Mitochondrial ROS-induced ROS release: an update and review. Biochim Biophys Acta 1757 (509.517)。
【０００８】
特に、これらの過程は、パーキンソン病、フレデリックの運動失調、ハンチントン病、糖尿病などのミトコンドリア酸化ストレス関連病に直接的に関連している。Go and Jones, 2008. Redox compartmentalization in eukaryotic cells. Biochimica et Biophysica Acta 1780 (1273.1290); Dringen, Gutterer and Hirrlinger, 2000. Glutathione metabolism in brain. Metabolic interaction between astrocytes and neurons in the defense against reactive oxygen species. Eur J Biochem 267 (4912-4916); Chinta and Andersen, 2008. Redox imbalance in Parkinson's disease. Biochimica et Biophysica Acta 1780 (1362.1367); Cohen, 2000. Oxidative stress, mitochondrial respiration, and Parkinson's disease. Ann N Y Acad Sci 899 (112.120); Lodi, Tonon, Calabrese and Schapira, 2006. Friedreich's ataxia: from disease mechanisms to therapeutic interventions. Antioxid Redox Signal 8 (438.443); McGill and Beal, 2006. PGC-1alpha, a new therapeutic target in Huntington's disease? Cell 127 (465.468); Donath, Ehses, Maedler, Schumann, Ellingsgaard, Eppler and Reinecke, 2005. Mechanisms of beta-cell death in type 2 diabetes. Diabetes 54 (Suppl 2) (S108.S113)。
【０００９】
過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を含む過酸化物は、酸化ストレスをもたらす最も主要な活性酸素種の一つである。Ｈ２Ｏ２は、いくつかの酵素（スーパーオキシドジスムターゼ、グルコースオキシダーゼ、およびモノアミンオキシダーゼを含む）によって、絶えず生成されており、そして、酸化ストレス損傷を防ぐために分解されなければならない。Ｈ２Ｏ２の細胞毒性効果は、鉄触媒型反応によって生成されるヒドロキシラジカルによって起こると考えられ、これに続くＤＮＡ、蛋白質、および膜脂質の損傷の原因となる。Ｈ２Ｏ２は、高濃度（＞１００μＭ）において「自殺基質」として作用し、カタラーゼの非可逆的不活性化をもたらす。Hyslop, Zhang, Pearson and Phebus, 1995. Measurement of striatal H2O2by microdyalysis following global forebrain ischemia and reperfusion in the rat: Correlation with the cytotoxic potential of H2O2 in vitro. Brain Res 671 (181-186). H2O2 causes intracellular glutathione depletion, a molecule that remove H2O2 from the cell, suggesting that H2O2 enters the cells and therefore may set in motion one or more toxic pathways in cells. Dringen, Pawlowski and Hirrlinger, 2005. Peroxide Detoxification by Brain Cells. J Neurosci Res 79(157-165); Halliwell and Whiteman, 2004. Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: how should you do it and what do the results mean? British Journal of Pharmacology 142 (231-255); Baud, Greene, Li, Wang, Volpe and Rosenberg, 2004. Glutathione Peroxidase-Catalase Cooperativity Is Required for Resistance to Hydrogen Peroxide by Mature Rat Oligodendrocytes. J Neurosci 24(1531-1540).
細胞はまた、抗酸化分子を合成しかつそれを再利用するメカニズムをも有する。グルタチオン（ＧＳＨ）は、その酸化型ＧＳＳＧおよび関連する酵素群すなわちグルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）、グルタチオンレダクターゼ（ＧＲ）、グルタレドキシン、およびＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋と共に、Ｈ２Ｏ２を消し去る抗酸化機構に関与する主要な蛋白質の一つである。細胞培養モデルを使った各種の研究によって、ミトコンドリアにおけるＧＳＨによる決定的な役割が、アポトーシス細胞死における保護作用であることが支持されている。アポトーシスでは、プログラム細胞死、ミトコンドリアＧＳＨ／ＧＳＳＧの酸化によってＧＳＨ欠乏が誘発され、その結果、ＲＯＳが増加する。このことは、ミトコンドリアＲＯＳ生成の制御におけるＧＳＨの役割を示唆している。Dringen, Pawlowski and Hirrlinger, 2005. Peroxide Detoxification by Brain Cells. J Neurosci Res 79(157-165); Dringen, Gutterer and Hirrlinger, 2000. Glutathione metabolism in brain. Metabolic interaction between astrocytes and neurons in the defense against reactive oxygen species. Eur J Biochem 267 (4912-4916)。
【００１０】
抗酸化機構において過酸化水素を除去するもう一つの酵素は、カタラーゼである。カタラーゼは、高濃度Ｈ２Ｏ２の除去が必要なときに特に重要な細胞質酵素である。Baud, Greene, Li, Wang, Volpe y Rosenberg, 2004. Glutathione Peroxidase-Catalase Cooperativity Is Required for Resistance to Hydrogen Peroxide by Mature Rat Oligodendrocytes. J Neurosci 24(1531-1540)。
【００１１】
ｈＭＳＣが、反応性種を解毒しかつプロテオームおよびゲノムの酸化的損傷を修復する主酵素機構および非酵素機構を有することもまた探索されている。Valle-Prieto and Conget, 2010. Human Mesenchymal Stem Cells efficiently manage oxidative stress. Stem Cell Dev 19 (1885-1893)。このポテンシャルがインビボで維持されるなら、ｈＭＳＣは、ＲＯＳ誘発組織損傷を制限する組織再生にも貢献し得る。
【００１２】
ＲＯＳ生成に関わる酵素の合成を改変するいくつかの首尾よく行った試みによって、アスコルビン酸の存在下での骨髄間質細胞が、高レベルのスーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、およびグルタチオンを発現することが示されている（Stolzing and Scutt, 2006. Effect of reduced culture temperature on antioxidant defenses of mesenchymal stem cells. Free Radic Biol Med 41(326-338)）。さらには、Ebert, Ulmer, Zeck, Meissner-Weigl, Schneider, Stopper, Schupp, Kassem and Jacob, 2006. Selenium supplementation restores the antioxidative capacity and prevents cell damage in bone marrow stromal cells in vitro. Stem Cells 24(1226-1235)という記事において、著者らは、セレン補給または温度低減と共に細胞培養条件を改変することによって、ＢＭＭＳＣの基本的抗酸化力の上方制御を記述している。StolzingおよびScuttは、２００６年に、これらのＢＭＭＳＣにおける温度低減は、その生存率には影響しないがその分化には影響することを公表している。一方、本発明の方法を通じて直接的に得られた幹細胞、ＨＣ０１６と命名された細胞は、分化の兆候を何ら示さず、未分化表現型を維持し、そしてまた生存率をも維持する。
【００１３】
さらには、Ebertらは２００６年に、１００ｎＭの亜セレン酸ナトリウムが入ったＢＭＭＳＣ培地にセレンを添加すると、グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）およびチオレドキシン還元酵素（ＴｒｘＲ）などの細胞内セレン依存性酵素の活性が顕著に増加することを示している。一方、ＨＣ０１６細胞は、その生存率、増殖能力、および未分化表現型を維持し、かつまたＲＯＳ解毒のために鍵となる、ＲＯＳ解毒に必要なスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）およびカタラーゼ（Ｃａｔ）などのセリウム依存性酵素をコードする遺伝子を活性化する。
【００１４】
結論すると、本発明に記述された処理方法によって直接得られたＨＣ０１６細胞は、当業界において利用される幹細胞に関する一連の利点を示す。これにより、酸化ストレス条件において働くことに特に適したＨＣ０１６が得られる。これらの利点は、主に、１）解毒分子ＧＳＨのより優位な細胞内貯蔵の生成、２）活性酸素種除去に関与する酵素をコードする遺伝子の優位かつ多大な発現、３）新たな細胞骨格構造と、その結果としての、損傷領域へのより高い遊走能力、および４）組織再生過程に関与する成長因子のより高い発現である。
【００１５】
ＨＣ０１６細胞によって得られるこれらの効果によって、その生存率および分化状態をなんら改変することなく、ＲＯＳに対するその細胞内および細胞外防御を向上させることができる。
【００１６】
国際公開公報第２０１０／１５００９４号には、間葉系幹細胞をインビボで脂肪細胞に分化させる方法および細胞治療としてのその利用が記述されている。記述されたこの方法では、これらの細胞を低酸素条件において培養する。
【００１７】
国際公開公報２００７／０３０８７０によって、幹細胞分化方法、より正確には、血清は無いがプロスタグラジンまたはｐ３８ＭＡＰキナーゼ抑制分子を追加で含む培地においてｈＥＳ細胞を培養することによって、ヒト胚由来の細胞（ｈＥＳ細胞）を、心筋細胞および神経前駆細胞に分化する方法が提供される。
【００１８】
結果として、当業界では、ＲＯＳに焦点を当てた酵素的機構または非酵素的機能を有する、間葉系幹細胞を得るための方法を開発することと、その結果として、酸化ストレス関連病への細胞治療により効果的に用いられうる細胞を生成することへの重要な要望がある。
【００１９】
〔発明の目的〕
本発明は、間葉系幹細胞の処理方法に関し、また、酸化ストレスによって引き起こされるまたは酸化ストレスに関連する病気を治療する際の、これらの処理された細胞の利用にも関する。
【００２０】
本発明の幹細胞は、異なる供給源から、中でも、脂肪組織、骨髄、臍帯および／または胎盤から取得することができる。しかし好ましくは、本発明は、ヒト脂肪組織由来の間葉系幹細胞、ＡＳＣから生成される。
【００２１】
本発明の一つ局面では、酸化ストレスに関連しかつ酸化ストレスによって引き起こされると考えられる病気、または、活性酸素種によって媒介される分子による退行性ストレス状況は、結節性動脈周囲炎、糖尿病、慢性肉芽腫症、動脈硬化症、脳卒中、肺線維症（慢性閉鎖性肺疾患、ＣＯＰＤ、特発性肺線維症）、虚血／再灌流症候群、アルツハイマー病、パーキンソン病、関節リュウマチ、全身性エリスマトーデス、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、成分呼吸速迫症候群、粥状動脈硬化、脊髄損傷、末梢神経損傷、緊縮性側索硬化症、ハンチントン病、フレデリックの運動失調、歯周炎、粘膜の疾病、炎症成分と共存する病気および損傷、急性かつ慢性の潰瘍および傷からなる群から選択される。
【００２２】
これらの病態に存在する酸化的環境は、損傷領域において、維持、および、炎症過程の強化さえも誘発する。この現象は、組織再生を弱める一つの要因であり、生成された大量のＲＯＳのために回復することができない。本発明の方法によって処理される間葉系幹細胞は、上掲した一群の病態において生成される酸化的環境を生き延びるより高い能力を獲得する。この事実によって、生体細胞から得ることができかつ損傷組織の回復を促進させる水溶性因子が増加する。
【００２３】
したがって、本発明の一局面は、ヒトドナーから間葉系幹細胞を取得しかつ単離し、かつ、規定された処理培地においてこれらの細胞を培養する、間葉系幹細胞の処理方法である。
【００２４】
本発明の好ましい局面は、脂肪組織から得られる間葉系幹細胞のために、前述した方法を適用することである。
【００２５】
間葉系幹細胞における、活性酸素種の解毒に関与する分子の生成能力を向上させかつその生存を促進する機能的改変もまた、本発明の局面である。
【００２６】
本発明の他の局面は、本発明の方法によって得られる間葉系幹細胞であって、本発明の前条件づけ方法によって処理していない間葉系幹細胞に比べて、活性酸素種の解毒に関与する遺伝子のより優れかつより増加した発現、および／または、ＧＳＨのより優れた細胞内濃度、および／または、細胞骨格立体構造変化、および／または、その細胞移動能力の増加、を有する間葉系幹細胞に関する。
【００２７】
本発明の他の局面は、ＧＳＨの細胞内濃度がより優れており、より好ましくは、ＳＯＤ１細胞質内スーパーオキシドジスムターゼ、ＳＯＤ２ミトコンドリアスーパーオキシドジスムターゼ、ＳＯＤ３細胞外スーパーオキシドジスムターゼ３、Ｃａｔカタラーゼ、ＧＰｘグルタチオンペルオキシダーゼおよびＧＲグルタチオンレダクターゼ、より好ましくは、β−アクチンコード遺伝子の異なる細胞骨格立体構造およびより優れた発現、およびまた、酸化ストレスによって引き起こされるかまたは酸化ストレスに関係する病気の治療のために細胞治療における治療製剤または試薬としての成長因子ＩＧＦ−１からなる群から選択される、活性酸素種の除去に関与する遺伝子の発現がより優れるかまたはより増加する、本発明に従い処理される間葉系幹細胞の利用に関する。
【００２８】
本発明はまた、損傷組織の隣接するおよび／または病変の中心点における領域に投与される本発明の間葉系幹細胞の利用にも関する。
【００２９】
〔図面の説明〕
図１  ＭＴＴ法によって測定され、かつ、酸化的環境（１００μＭ）にさらされた、ＡＳＣ、ＨＣ０１６（Ａ）、ＨＯＧ、および本発明の方法によって処理されたＨＯＧ（Ｂ）の増殖能力。ＨＣ０１６が酸化的環境にさらされると、その寿命が著しく増加することが観察されうる。この効果は、ＨＯＧ細胞に類似する他の哺乳動物細胞種に同じ処理を施しても起こらない。アスタリスクは、ｔ−スチューデント試験においてｐ＜０．０５であることを示す（実施例３）。
【００３０】
図２  ＡＳＣ、ＨＣ０１６、ＨＯＧ、および本発明の方法によって処理されたＨＯＧにおける、ＲＯＳの細胞内レベルの動態解析。この解析は、高濃度の酸化ストレスにさらされたときに大体の場合、ＨＣ０１６のみが細胞内ＲＯＳレベルを著しく減少させることを示す。アスタリスクは、二方向ＡＮＯＶＡ試験に基づく統計的に有意な相違を示す（＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１）（実施例４）。
【００３１】
図３  ＡＳＣ細胞およびＨＣ０１６細胞における総グルタチオンの細胞内レベル（ＧＳＨ総）（実施例５）。コントロール条件では、非ストレス、処理によって、ＨＣ０１６基底ＧＳＨにおいて、ＡＳＣに対して１０％の増加を示した。
【００３２】
図４Ａ  ＡＳＣ細胞およびＨＣ０１６細胞における、活性酸素種解毒に関与する遺伝子の発現レベル（実施例６）。
【００３３】
図４Ｂ  ＡＳＣ細胞およびＨＣ０１６細胞における、活性酸素種（ＳＯＤ１、ＳＯＤ２、ＳＯＤ３、Ｃａｔ、ＧＲ、ＧＰＸ）解毒に関与する遺伝子の発現の定量化。値は、ＨＣ０１６／ＡＳＣ比として表示されている（実施例６）。
【００３４】
図５Ａ  ＡＳＣ細胞およびＨＣ０１６細胞における、細胞骨格成分（β−アクチン）に関与する遺伝子の発現（実施例７）。
【００３５】
図５Ｂ  ＡＳＣ細胞およびＨＣ０１６細胞における、細胞骨格成分（β−アクチン）に関与する遺伝子の発現の定量化（実施例７）。値は、ＨＣ０１６／ＡＳＣ比として表示されている（実施例７）。
【００３６】
図５Ｃ  ＡＳＣ細胞およびＨＣ０１６細胞における、成長因子ＩＧＦ−１をコードする遺伝子の発現（実施例７）。
【００３７】
図５Ｄ  ＡＳＣ細胞およびＨＣ０１６細胞における、成長因子ＩＧＦ−１をコードする遺伝子の発現の定量化（実施例７）。値は、ＨＣ０１６／ＡＳＣ比として表示されている（実施例７）。
【００３８】
図６  Ｆ−アクチン免疫染色の蛍光顕微鏡画像。ＨＣ０１６におけるＦ−アクチン存在のＡＳＣに対する増加、および、そのストレスファイバーにおける分布が見られ、これは、ＨＣ０１６の優れた遊走および走化性能力に関するＨＣ０１６の細胞骨格立体形状変化を意味する（実施例８）。
【００３９】
図７  酸化ストレス侵襲後の神経分化ＨＯＧ細胞成長率、および、この成長率に対するＡＳＣおよびＨＣ０１６の影響。酸化的環境のストレスを受けたＨＯＧ細胞をＡＳＣおよびＨＣ０１６ と共培養すると、ＨＯＧ細胞生存が増加する。にもかかわらず、ＨＯＧ細胞を酸化的環境にさらした後では、ＨＣ０１６との共培養のみが、この保護的効果を４８時間維持する。アスタリスクは、ｔ−スチューデント試験に基づく統計的に有意な相違を示す（Ｐ＜０．０５）（実施例９）。
【００４０】
図８  ＡＳＣ細胞に対する、酸化ストレス侵襲を受けている細胞に向かうＨＣ０１６細胞の重要性優位遊走能力を示す代表画像および定量的棒グラフ（実施例１０）。
【００４１】
図９  未処理ラット、ＡＳＣ処理ラット、およびＨＣ０１６処理ラットからなる脊髄損傷ラットの三つの実験群のＢＢＢスコア（Basso-Beattie-Bresnahan）の発展の表（実施例１２）。
【００４２】
〔発明の詳細な説明〕
本発明は、一局面では、好ましくは脂肪組織からの、すなわち、成人脂肪組織から得られるおよび／または単離される、より正確には、動物器官、好ましくはヒトからの間葉系幹細胞の処理方法に関する。この手順は、主に、二つの規定された工程、第１に、間葉系幹細胞の取得および単離と、第２に、酸化剤を含む規定の処理培地における細胞の成長および特定処理の期間とを必要とする。
【００４３】
ＡＳＣ細胞の取得：
この工程に関し、上記手順は、第１に、間葉系幹細胞の取得および単離を含む。
【００４４】
間葉系幹細胞の由来は、脂肪組織、骨髄、臍帯および／または胎盤によって構成される群から選択することができ、好ましくは、本発明は、ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞から生成される。
【００４５】
したがって、本発明では、優先的に、脂肪組織由来間葉系幹細胞の画分が、麻酔下の健康なヒト患者からの吸引脂肪組織から抽出される。吸引脂肪組織は、対応するインフォームド・コンセントの後に、患者によって提供される。吸引脂肪組織を１×ＰＢＳで洗浄し、コラゲナーゼＩ型によって３７℃で３０分消化し、それから細胞ペレットを得るために遠心分離する。このペレットを楕円赤血球溶解バッファーで再度懸濁し、精製細胞懸濁を１００μｍナイロンメッシュを通じて濾過し、かつ、再び遠心分離する。細胞の再懸濁後、細胞コロニーを拡大するために、これらを培養フラスコに入れる。
【００４６】
本発明において用いられる細胞コロニー拡大または継代培養過程は、培養容器から細胞を取り出し、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液でのインキュベーションによって、収集した細胞懸濁を遠心分離し、細胞密度および生存率を決定し、これらの細胞を新しい細胞培養容器に播種することを含む。
【００４７】
本発明における細胞収集の次に、次の出版物に示すような当業界に記述される方法論が適用される。Yoshimura, Shigeura, Matsumoto, Sato, Takaki, Aiba-Kojima, Sato, Inoue, Nagase, Koshima y Gonda, 2006. Characterization of Freshly Isolated and Cultured Cells Derived From the Fatty and Fluid Portions of Liposuction Aspirates. J Cell Physiol 208(64-76); Almeida, Campa, Alonso-Vale, Lima, Daud y Stocchero, 2008. Fraccion vascular estromal de tejido adiposo. Cir.plast. iberolatinoam. 34 (71-79); Wagner, Wein, Seckinger, Frankhauser, Wirkner, Krause, Blake, Schwager, Eckstein, Ansorge y  Ho, 2005. Comparative characteristics of mesenchymal stem cells from human bone marrow, adipose tissue, and umbilical cord blood. Experimental Hematology 33 (1402-1416)。
【００４８】
いったん最適な数（３００，０００〜２，０００，０００の間）の細胞を得たら、それらを、特定の処置期間の前の規定の濃度の酸化剤に細胞を接することを必要とする処置で処理する。
【００４９】
酸化剤は、たとえば、酸化物および／または過酸化物、とりわけ、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、過酸化カルシウム（ＣａＯ２）、過酸化マグネシウム（ＭｇＯ２）、過酸化亜鉛（ＺｎＯ２）、過酸化マンガン（ＭｎＯ２）、過酸化鉛（ＰｂＯ２）、および一酸化窒素（ＮＯ）、亜酸化窒素（Ｎ２Ｏ）、オゾン（Ｏ３）、過ホウ酸ナトリウム（ＮａＢＯ３）、二酸化セレン（ＳｅＯ２）、酸化銀（Ａｇ２Ｏ）、塩化第二鉄（ＦｅＣｌ３）などの塩化鉄、過炭酸ナトリウム（２Ｎａ２ＣＯ３）などの銅塩、過マンガン酸カリウム（Ｋ２Ｍｎ２Ｏ８）などの過マンガン酸塩、重クロム酸カリウム（Ｋ２Ｃｒ２Ｏ７）などの重クロム酸塩、次亜塩素酸（ＨＣｌＯ−）のリチウム、ナトリウム、およびカルシウム塩、亜塩素酸ナトリウム（ＮａＣｌＯ２）、塩素酸（ＨＣｌＯ３）、塩素酸カリウム（ＫＣｌＯ３）、水酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）、炭酸マグネシウム（ＭｇＣＯ３）共沈殿水酸化アルミニウム、水酸化砒素（Ａｓ（ＯＨ）３）、亜ヒ酸過酸化ベンゾイル（（Ｃ６Ｈ５ＣＯ）２Ｏ２）水酸化カルシウム（Ｃａ（ＯＨ）２）、クロルジアゼポキシド塩酸塩、酸化銅（ＣｕＯ）、酸化鉄、酸化マグネシウム（ＭｇＯ）、マグネシウム二酸化物（Ｍｇ（ＯＨ）２）、水酸化カリウム（ＫＯＨ）、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、酸化チタン（ＴｉＯ２）、および／または酸化亜鉛（ＺｎＯ）、および他の酸化剤、好ましくは、活性酸素種（ＲＯＳ）の群に属する、ミトコンドリア呼吸鎖の老廃物でありかつ炎症性過程におけるシグナル伝達分子である過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）であると考えられる。一定の耐性値を超えてＨ２Ｏ２が増加すると、細胞死が引き起こされる。それにもかかわらず、本処理方法は、細胞をＨ２Ｏ２で制御して培養することを含む。このことは、期間および方法論の制御、および、この処理によって直接得られる間葉系幹細胞における新たな機能および特性を引き起こす規定の濃度、を意味する。
【００５０】
より正確には、本発明において開発された処理方法は、処理期間を規定した、適度な酸化的環境において細胞を培養することを含む。
【００５１】
通常の期間では、処理方法は、４８〜７２時間の期間以内の２つの連続したサイクルと、それに続く、実験容器内における２４〜４８時間の第３の処理サイクルを含む。
【００５２】
詳細には、処理期間は、以下の工程を含む：
ａ）第１のサイクル：細胞を培養容器に植えつけて、細胞が付着しかつその特徴的な形態を獲得するための４〜８時間の細胞適合期間を待つ工程。
【００５３】
ｂ）最終濃度が０．０１〜０．０５ｍＭの範囲になるまで、１０％ＦＢＳが加えられたＤＭＥＭと、Ｈ２Ｏ２溶液とによって構成される処理培地を加える工程。
【００５４】
ｃ）上記インキュベータ内で、３７℃、５％ＣＯ２の雰囲気で、４８〜７２時間維持する工程。
【００５５】
ｄ）第２のサイクル：最終濃度が０．０１〜０．０５ｍＭの範囲になるまで、上記処理培地を、１０％ＦＢＳが加えられたＤＭＥＭと、Ｈ２Ｏ２溶液とに置き換えることによって新しくする工程。
【００５６】
ｅ）これらの細胞を、３７℃で４８〜７２時間、５％のＣＯ２と共にインキュベートする工程。
【００５７】
ｆ）第３のサイクル：最終濃度が０．０１〜０．０５ｍＭの範囲になるまで、上記処理培地を、１０％ＦＢＳが加えられたＤＭＥＭと、Ｈ２Ｏ２溶液とに置き換えることによって新しくする工程。
【００５８】
ｇ）これらの細胞を、３７℃で２４〜４８時間、５％のＣＯ２と共にインキュベートする工程。
【００５９】
この処理期間の後、細胞は、その機能的および形態的特徴を改変する。前述したこの点から、ＨＣ０１６という頭文字が、これらの細胞に適用される。
【００６０】
培養または成長培地は、当業界において通常の既知の成分を含む。これらは、したがって、全量の８５〜９５％の高濃度のグルコース（ＤＭＥＭ、Invitrogen）、全量の５〜１５％の濃度のウシ胎児血清（Biochrom）および全量の１％の濃度の抗菌溶液ＰＳＡ（Invitrogen）を含む培地である。
【００６１】
同様に、本発明の方法に用いられる前記した処理培地は、全量の85〜９５％の高濃度グルコース（ＤＭＥＭ、Invitrogen）、全量の５〜１５％の濃度のウシ胎児血清（Biochrom）、全量の１％の濃度の抗菌溶液ＰＳＡ（Invitrogen）、および全量の０．０１〜０．０５ｍＭの濃度の過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）（Panreac）を含む。
【００６２】
本発明の方法で未処理のＡＳＣと比べたＨＣ０１６細胞の特徴
発明の処理方法の結果として、本発明のＨＣ０１６細胞では、本発明の方法によって処理されないＡＳＣに比べて、ＲＯＳの除去に関与する遺伝子の発現をより優れかつより増強する能力を獲得しかつ示す。そのような遺伝子は、以下のタンパク質をコードしている：ＳＯＤ１細胞質スーパーオキシドジスムターゼ１、ＳＯＤ２ミトコンドリアスーパーオキシドジスムターゼ２、ＳＯＤ３細胞外スーパーオキシドジスムターゼ３、ＧＰｘ、グルタチオンペルオキシダーゼ、ＧＲグルタチオンレダクターゼ、およびＣａｔカタラーゼ。
【００６３】
ＳＯＤ１：酵素スーパーオキシドジスムターゼ１は、補因子として銅（Ｃｕ）および亜鉛（Ｚｎ）を含む二量体タンパク質である。ＳＯＤ１は、細胞質に存在し、スーパーオキシドの不均一、酸素および過酸化水素における呼吸鎖の産物および酵素キサンチンオキシダーゼ、を、次の反応を通じて触媒する。
・Ｃｕ−Ｚｎ（ｎ＋１）＋−ＳＯＤ＋Ｏ２−→Ｃｕ−Ｚｎｎ＋−ＳＯＤ＋Ｏ２
・Ｃｕ−Ｚｎｎ＋−ＳＯＤ＋Ｏ２−＋２Ｈ＋→Ｃｕ−Ｚｎ（ｎ＋１）＋−ＳＯＤ＋Ｈ２Ｏ２
ＳＯＤ２：酵素スーパーオキシドジスムターゼ２は、補因子としてマンガン（Ｍｎ）を含むホモ四量体タンパク質である。ＳＯＤ２は、細胞ミトコンドリアに局在しており、スーパーオキシドの不均化、酸素および過酸化水素における呼吸鎖の産物および酵素キサンチンオキシダーゼ、を、次の反応を通じて触媒する。
・Ｍｎ（ｎ＋１）＋−ＳＯＤ＋Ｏ２−→Ｍｎｎ＋−ＳＯＤ＋Ｏ２
・Ｍｎｎ＋−ＳＯＤ＋Ｏ２−＋２Ｈ＋→Ｍｎ（ｎ＋１）＋−ＳＯＤ＋Ｈ２Ｏ２
ＳＯＤ３：酵素スーパーオキシドジスムターゼ３は、補因子として銅（Ｃｕ）およびマンガン（Ｍｎ）を含むホモ四量体タンパク質である。ＳＯＤ３は、細胞外媒質に放出され、ヘパラン硫酸プロテオグリカンおよびＩ型コラーゲンを介して細胞外マトリックスに結合し、媒質に存在するスーパーオキシドの不均化を触媒し、以下の反応を通じて酸素および過酸化水素を生成する。
・Ｃｕ−Ｚｎ（ｎ＋１）＋−ＳＯＤ＋Ｏ２−→Ｃｕ−Ｚｎｎ＋−ＳＯＤ＋Ｏ２
・Ｃｕ−Ｚｎｎ＋−ＳＯＤ＋Ｏ２−＋２Ｈ＋→Ｃｕ−Ｚｎ（ｎ＋１）＋−ＳＯＤ＋Ｈ２Ｏ２
Ｃａｔ：酵素カタラーゼは、四つのペプチド鎖および四つのポルフィリンヘムグループ（鉄、Ｆｅ）を有し、酸化ストレス防御における主要酵素として、ほとんどすべての好気性細胞のペルオキシソームに存在する四量体タンパク質である。カタラーゼは、過酸化水素と反応して、それを水に変換する。そのメカニズムは完全には知られていないが、その活性は、次の反応として記述される。
・Ｈ２Ｏ２＋Ｆｅ（ＩＩＩ）−Ｅ→Ｈ２Ｏ＋Ｏ＝Ｆｅ（ＩＶ）−Ｅ（．＋）
・Ｈ２Ｏ２＋Ｏ＝Ｆｅ（ＩＶ）−Ｅ（．＋）→Ｈ２Ｏ＋Ｆｅ（ＩＩＩ）−Ｅ＋Ｏ２
Chelikani, Fita y Loewen, 2004. Diversity of structures and properties among catalases. Cell Mol Life Sci 61(192-208)。
【００６４】
ＧＰｘ：酵素グルタチオンペルオキシダーゼは、より優れた脊椎動物においてセレノシステインを含むことが知られている、数少ないタンパク質の一つである。ＧＰｘは、主に、細胞質に見出され、スーパーオキシドジスムターゼおよびモノアミンオキシダーゼによって作られる過酸化水素の解毒に、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）分子に対するＨ２Ｏ２の結合を触媒することによって関与する。
【００６５】
ＧＲ：酵素グルタチオンレダクターゼは、ホモ二量体フラボタンパク質である。ＧＲはファミリーピリジンヌクレオチド−二流化物オキシドレダクダーゼクラスＩに属する。この酵素は、抗酸化防御の基本的サイクルに関与する。その活性は、酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）を、抗酸化防御における主要分子であるスルフヒドリル型（ＧＳＨ）に還元することを含む。
【００６６】
【表１】
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【００６７】
ＲＯＳの解毒に関与する遺伝子の発現の増加は、未処理ＡＳＣ細胞に対して定量化されている。ＨＣ０１６細胞は、ＳＯＤ１遺伝子の発現において少なくとも３０％（好ましくは５３％）の増加を示し、ＳＯＤ２遺伝子の発現において少なくとも２５％（好ましくは３７％）の増加を示し、ＳＯＤ３遺伝子の発現において少なくとも５０％（好ましくは７７％）の増加を示し、および／または、カタラーゼ遺伝子の発現において少なくとも５０％（好ましくは７８％）の増加を示す。
【００６８】
ＡＳＣに対してＨＣ０１６遺伝子の優位な発現を定量化することに用いられる方法論は、次の通りである：各実験群における、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄメンブレンフィルター商業用キットに含まれかつ記載されるプロトコルに従う細胞溶解、ｍＲＮＡ抽出および精製。一定量のｍＲＮＡは、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）ＲＮＡマイクロキットに含まれる試薬およびプロトコルに従うレトロ転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によってｃＤＮＡを生成するための鋳型として機能する。各実験群における対応する量のｃＤＮＡは、スーパーオキシドジスムターゼ１、２、および３（ＳＯＤ１〜３）、カタラーゼ（Ｃａｔ）、グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）、およびグルタチオンレダクターゼ（ＧＲ）をコードする遺伝子に存在するＤＮＡ断片の位置を特定する特定のプライマーを含むポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって処理される。各実験群のＰＣＲ産物を電気泳動し、増幅断片の大きさを決定し、各バンドの強度を定量化する。結果として得た値を、規定の構成遺伝子、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＧＡＰＤＨで標準化する。
【００６９】
さらには、ＨＣ０１６が、ＡＳＣに対して少なくとも８％、好ましくは１０％の優位なレベルの細胞内ＧＳＨを有することが示されている。ＨＣ０１６細胞におけるＡＳＣに対するＧＳＨの優位なレベルを定量化する方法は、以下に記述するティーツェ酵素法である：実験群は、ＡＳＣおよびＨＣ０１６である二つの細胞の独立した処理単位である。処理後、細胞を収集し、溶解バッファーにおいて細胞をインキュベートすることによって抽出されるそのタンパク質、および上清に含まれる総タンパク質を、ＢｉｏＲａｄ  ＤＣ  タンパク質アッセイキットと共に供給されるプロトコルおよび試薬によって、定量化する。異なる一定量の上清タンパク質を調製し、上清を総ＧＳＨおよびＧＳＳＧ定量化のために移す。ＧＳＨおよびＧＳＳＧアッセイのためのサンプルを、三通り、９６ウェルプレートにおいて処理する。ＧＳＨ測定のために、サンプルをグルタチオンレダクターゼと共にインキュベートし、この後、４０５ｎｍにおける吸光度を、２、５分の間、１５秒ごとに測定する。ＧＳＳＧ測定のために、精製サンプルタンパク質を２−ビニルピリジンで前処理し、その後、グルタチオンレダクターゼで前処理し、最後に、４０５ｎｍにおいて吸光度を、３０分の間、１５秒ごとに測定する。
【００７０】
吸光度値を、細胞タンパク質サンプルの代わりに既知のＧＳＨ濃度を用いてこれらの前述した工程を繰り返すことによって生成される標準曲線に外挿する。値を、タンパク質のｎｍｏｌ／ｍｇとして表す。総グルタチオンを、ＧＳＨ総＝ＧＳＨ還元型＋２ＧＳＳＧ酸化型として算出する。
【００７１】
さらに、ＨＣ０１６細胞は、ＡＳＣに比べ、細胞内ＲＯＳのレベルが、少なくとも１０％、好ましくは１１％、より好ましくは１５％劣っていることによって特徴づけられる。
ＡＳＣに対するＨＣ０１６細胞内ＲＯＳレベルの優位性を定量化するために選択される方法は、ＤＦＣＡプローブ式蛍光定量化である。
【００７２】
実験群は、４つの独立した集団（一つ目はＡＳＣ、二つ目はＨＣ０１６、三つ目はインタクトＨＯＧ細胞、四つ目は同じ処理で培養しかつＡＳＣからＨＣ０１６を生成するＨＯＧ）からなる。細胞を１倍ＰＢＳで洗浄し、次に３０分加えた１０μＭの２’，７’−ジクロロフルオレセインジアセタート（ＤＣＦＡ）で洗浄する。その後、ＤＣＦＡを洗い流し、新たな培地を加える。それから、Ｈ２Ｏ２を、濃度勾配０ｍＭ、０．１ｍＭ、０．２５ｍＭ、０．５ｍＭおよび１ｍＭで培地に加えることによって、細胞を酸化的培地で培養し、この直後、細胞内ＲＯＳレベルを、蛍光測定器プレートリーダーで、全６０分に渡って５分ごとに測定する。グラフを、時間（分）に沿った任意の蛍光強度単位として表す。
【００７３】
さらに、本発明の方法によって処理したＨＣ０１６細胞は、より優れた移動能力を示す。この特性によって、ＨＣ０１６細胞が、より効率的に損傷組織領域にアクセスでき、そして、損傷細胞を防御かつ優雅胃管橋の制御に影響を与えるための栄養的活動を開始できることが分かる。ＡＳＣに対するこの顕著に高い移動能力は、ＨＣ０１６の細胞骨格に起こる構造的変化と、細胞拡張境界において組織される微小繊維（β−アクチン）によって決定される。これらの細胞膜突起は、移動中の細胞運動のための物理的基質である。この点では、β−アクチン遺伝子発現解析は、ＨＣ０１６がＡＳＣに対して５９％増加することを示す（図５Ａ〜図５Ｂ）。さらに、重合アクチンまたはＦ−アクチン免疫染色は、より高い運動能力に関する関連する形態的変化を、ストレスファイバーの形成、移動発生時の根本的要素として示す。図６は、細胞移動過程における重要な側面である、ストレスファイバーに配列されたＦ−アクチンを示す（Mitchisonら、１９９６年）。また、Boydenチャンバー法によって、もっぱら細胞移動能力を解析するために行われた実験は、ＨＣ０１６細胞が、ＡＳＣに対して３０倍高い移動能力を有することを示す。
【００７４】
さらに、ＨＣ０１６細胞では、インシュリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）遺伝子発現がＡＳＣに対して６４％増加する（図５Ｃ〜Ｄ）。これまでの研究によって、ＩＧＦ−１が、損傷後に起こる再生過程を関連して仲介することが示されている。ＩＧＦ−１は、神経組織に対する損傷後に非神経細胞によって生成される強力な神経栄養因子であり、組織再生を刺激する。ＩＧＦ−１は、神経生存、神経突起成長、神経細胞増殖、ミエリン化を促進し、かつ、アクソンシュワン細胞相互作用を改善する（Apelら、２０１０年）。さらに、他の実験モデルでは、ＩＧＦ−１の局所投与によって、損傷を受けた骨格筋の修復が、傷組織を形成することなくかつ損傷領域に幹細胞をより補充することなく行われることが証明されている（Spangenburgら、２０１０年）。これらの理由のため、ＨＣ０１６細胞におけるＩＧＦ−１発現の誘導によって、それが、細胞増殖能力、損傷組織細胞の機能的回復、および回復過程に対して貢献するための損傷領域に対する幹細胞の補充を増加するように、ＡＳＣ再生能力を促進することができる。
【００７５】
ＡＳＣに対する遺伝子発現を解析するために選択される方法は、次のものである。この比較解析は、ＡＳＣおよびＨＣ０１６細胞によって構成される２つの実験群を必要とする。処理方法がいったん完了したら、各細胞群を収集し、溶解し、そしてＲＮＡを抽出しかつ精製し、そしてｃＤＮＡを得るために処理する。β−アクチンおよびインシュリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）をコードする遺伝子に存在するＤＮＡ断片の位置を特定するプライマーを用いてＰＣＲ反応を行う。各実験群のＰＣＲ産物を、電気泳動で移動させ、増幅断片のサイズを決定し、各バンドの強度を定量化する。結果として得た値を、規定の構成遺伝子ＧＡＰＤＨの強度の値で標準化する。
【００７６】
一連のデータは、ＨＣ０１６を生成する処理方法が、Ｈ２Ｏ２の除去に必要な細胞内分子機構および細胞外分子機構の「プール」の合成と、有害を引き起こすことを示す。ＨＣ０１６細胞は、損傷組織領域に到達するためのより高い移動能力を有し、かつまた、損傷組織の細胞の再生過程に影響しかつその生存を維持するためのより多い量の栄養因子を生産する。
【００７７】
酸化ストレスに関するまたは酸化ストレスの結果として引き起こされる病気の治療におけるＨＣ０１６の利用。
【００７８】
上述したように、前セクションにおいて示したＨＣ０１６細胞の特性によって、ＨＣ０１６は、特に、酸化ストレスによって、または、活性酸素種によって媒介される成分に基づく放出の変性条件によって引き起こされる病気の治療に適している。
【００７９】
中枢神経系に影響し、酸化ストレスに含まれ、結果として、活性酸素種によって媒介される成分に基づく変性的変化を引き起こす病態の一つは、脊椎損傷である。
【００８０】
脊椎損傷は、病原体が含まれない神経組織に損傷を有し、外部因子または遺伝因子によっては引き起こされない。損傷の時点では、外傷の結果直ちに、衝撃部位において、組織圧迫、出血、浮腫、酸素欠乏、および栄養剤が起こる（Lu, Liang, Chen, Chen, Hsu, Liliang, Lin y Cho, 2004. Injury severity and cell death mechanisms: Effects of concomitant hypovolemic hypotension on spinal cord ischemia-reperfusion in rats. Exp Neurol 185: 120-132; Fehlings y Tator, 1995). The relationships among the severity of spinal cord injury, residual neurological function, axon counts and counts of retrogradely labeled neurons after experimental spinal cord injury. Exp Neurol 132: 220-228)。これらの生命現象は、２つの細胞性防御機構を引き起こす：組織虚血または炎症、言い換えると、第２の損傷を引き起こすものとして、非損傷領域に及びかつ損傷後に数週間または数か月さえも維持される(Lu, Liang, Chen, Chen, Hsu, Liliang, Lin y Cho, 2004. Injury severity and cell death mechanisms: Effects of concomitant hypovolemic hypotension on spinal cord ischemia-reperfusion in rats. Exp Neurol 185: 120-132）、プログラム細胞死およびアポトーシス(Yukawa, Lou, Fukui y Lenke, 2002. Optimal treatment timing to attenuate neuronal apoptosis via Bcl-2 gene transfer in vitro and in vivo. J Neurotrauma 19: 1091-1103)および生得的免疫反応(Carpentier y Palmer, 2009. Immune influence on adult neural stem cell regulation and function. Neuron 64: 79-92)である。
【００８１】
生理的結果に対する応答するために神経組織に利用可能な機構が不十分であるため、これらの２つのタイプの組織応答は、脊椎に沿って拡大し、かつ、まず健全な組織に影響を与える。
【００８２】
この拡大は主に、酸化ストレスを引き起こす生得的免疫反応の反応性酸素代謝物（ＭＲＯ）特性を通じて行われ、当該酸化ストレスの強度に基づきアポトーシスを誘導することができる。(Liu, Liu, y Wen, 1999. Elevation of hydrogen peroxide after spinal cord injury detected by using the Fenton reaction. Free Rad Biol & Medicine 27: 478-482; Yukawa et al., 2002)。これらのうち、最も豊富なＭＲＯは、神経細胞を取り囲みかつ第２の損傷形態として拡散する細胞外環境に溶け込む過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）である。Ｈ２Ｏ２は、細胞の膜、タンパク質、およびＤＮＡに反応しかつ分解し(Braughler y Hall, 1989. Central Nervous System trauma and stroke. I. Biochemical considerations for oxygen radical formation and lipid peroxidation. Free Radic Biol Med. 6: 289-301)、最終的には、それらをプログラム細胞死またはアポトーシスに導く。(Yukawa et al., 2002)。Ｈ２Ｏ２は正常細胞の廃棄産物でもあるので、正常細胞は、この分子に対して多少は防御することができる。 (Phillis, 1994. A “radical” view of cerebral ischemic injury. Prog Neurobiol 42: 441-448). However, the levels of H2O2 that are generated after injury are higher than those physiologically tolerable (Hyslop, Zhang, Pearson y Phebus, 1995. Measurement of striatal H2O2by microdialysis following global forebrain ischemia and reperfusion in the rat: Correlation with the cytotoxic potential of H2O2 in vitro. Brain Res 671: 181-186)。
神経細胞の中では、オリゴデンドロサイト、神経細胞の軸索を被覆するミエリンシートを生成する細胞が、ＭＲＯに対してより弱い。なぜなら、この細胞は、ＭＲＯに対するより弱い防御機構を有し、自身を第２の損傷の標的に変える分子を有するからである。(Dringen R, Pawlowski P y Hirrlinger J. 2005. Peroxide detoxification by brain cells. J Neurosci Res 79: 157-165)。したがって、損傷後の初期細胞死に加えて、それに続くＨ２Ｏ２に基づかせた酸化的損傷によって、神経繊維の恒久的な脱ミエリン化が引き起こされ、神経細胞を通じた神経信号伝達を弱める(Nashmi R y Fehlings MG. 2001. Changes in axonal physiology and morphology after chronic compressive injury of the rat thoracic spinal cord. Neuroscience 104: 235-251)。
【００８３】
他の病気は、結節性動脈周囲炎、糖尿病、慢性肉芽腫症、動脈硬化症、脳卒中、肺線維症（慢性閉鎖性肺疾患、ＣＯＰＤ、特発性肺線維症）、虚血−再灌流症候群、アルツハイマー病、パーキンソン病、関節リュウマチ、全身性エリスマトーデス、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、成分呼吸速迫症候群、粥状動脈硬化、脊髄損傷、末梢神経損傷、緊縮性側索硬化症、ハンチントン病、フレデリックの運動失調、歯周炎、炎症成分によって起こる粘膜の疾病、病気、および損傷、急性かつ慢性の潰瘍および傷からなる群から選択される。
【００８４】
幹部にＨＣ０１６細胞を投与すると、炎症過程中の免疫細胞の活性化の結果として生じた酸化ストレスのレベルを低減することができる。
【００８５】
さらに、患部に対してＨＣ０１６細胞を投与すれば、内出血後のＭＲＯ産生の結果として上昇した酸化ストレスのレベルを低減し、パラクリンサイトカイン、インターロイキン、ケモカイン、栄養因子、および成長因子の分泌を改善し、他の哺乳類細胞の生存および増殖を増加し、投与したＨＣ０１６細胞の近くにある哺乳類細胞近傍の細胞外ＭＲＯのレベルを低減し、炎症促進性ＴＮＦ−α、ＩＬ−１βなどの信号伝達分子の細胞外レベルを低減する。
【００８６】
さらに、ＨＣ０１６細胞は、本発明の実施例１０に示すように、Ｈ２Ｏ２による損傷細胞に対する顕著に高い走化性能力を有する。
【００８７】
ＨＣ０１６細胞を用いることは、組織損傷の放射、損傷の程度、および機能的欠損を抑えるために、損傷の中心よりもむしろ損傷箇所に隣接する領域において事前に処理した間葉系幹細胞を投与することを含む。
【００８８】
損傷した組織は、神経細胞および血管系細胞の膜を破壊する過酷な圧縮力を受ける。また、損傷の結果、動脈および静脈破裂、小組織の破損、細胞質、小胞、および細胞膜が出血する可能があり、組織壊死に繋がりうる事実である。これらの出来事は、病変に固有である。後に、これらがアドレスされなければ、壊死性細胞から放たれた分子および免疫システム細胞から放たれた他の分子は、Ｈ２Ｏ２などの信号伝達分子を通じて隣接する細胞を損傷するように、損傷を拡大する。この間葉系幹細胞方式の治療は、組織損傷の拡大を低減するまたは最小化するように設計される。したがって、細胞治療は、好ましくは、損傷の中心の近傍領域になされる。
【００８９】
本発明の他の局面では、損傷領域における大規模な細胞死を防ぐために、当該領域における活性酸素種を代謝し、酸化ストレスを低減し、かつ炎症状態を制御するために、処理された細胞は、損傷領域における活性酸素種を投与のルートで与えられ、これにより、細胞が損傷の中心に直接達することができる。
【００９０】
投与のルートは、任意の非経口的ルート（動脈内、静脈内、リンパ内、くも膜下内、硬膜外、髄内など）、皮下、筋肉内、腹腔内、経皮的（延髄内）、関節内、気管内、肺胞内、くも膜下腔内、眼内、結膜式、心臓内、鼻腔内、腟式、尿道式、皮膚式、直腸式、舌下式、経口式、経口毛胃粘膜式であればよい。これらの適用を実行するために、本発明の方法によって得られた細胞を、ルートに基づき、当業者にすでに知られた、適切な薬理学的に容認できる媒体によって処方する。
【００９１】
とりわけ、処方は、細胞ＨＣ０１６に加えて、とりわけ、リンゲル乳酸、ヒトアルブミン（CSL-Behring）などを含む、ガラスバイアル、無菌、および非発熱性（Sword Scientific）において投与に廃棄する溶液を提供する。
【００９２】
同様に、ＨＣ０１６細胞は、損傷箇所に対する細胞のより優れた扱いおよび細胞の生存および機能性を増加することが適切にできる、ヒドロゲル、泡、重合体材料、複合体、リン酸カルシウム誘導体、および金属材料などの、細胞および組織エンジニアリング治療法を生み出すために、自然由来または合成の生体材料に導入することができる。
【００９３】
哺乳動物にＨＣ０１６細胞を投与した後、損傷箇所に対する間葉系幹細胞の移動は、組織において維持される。加えて、患者の組織に投与された間葉系幹細胞が存在しても、これらの投与された間葉系幹細胞に対する免疫応答は起こらない。
【００９４】
実施
実施例１．脂肪組織（ＡＳＣ）からの間葉系幹細胞の取得
脂肪組織由来の間葉系幹細胞を、Yoshimuraら（２００６年）、Almeidaら（２００８年）、Wagneretら（２００５年）によって記述された方法論に従い、ヒト組織から単離する。
【００９５】
脂肪組織由来の間葉系幹細胞の画分を、麻酔下の健康な患者の吸引脂肪組織から取得する。吸引脂肪組織を１×ＰＢＳで洗浄し、コラゲナーゼＩ型によって３７℃で３０分消化し、それから細胞ペレットを得るために遠心分離する。このペレットを赤血球溶解バッファーで再度懸濁し、精製細胞懸濁を１００μｍフィルターを通じて濾過し、かつ、再び遠心分離する。細胞の再懸濁後、細胞コロニーを拡大するために、これらを培地に散布する。
【００９６】
細胞を、初期培養として、５日間、３７℃かつ５％ＣＯ２でインキュベータにおいて、１０％ウシ胎児血清（Biochrom）、１％抗菌−抗真菌ＰＳＡ（Invitrogen）、およびＤＭＥＭ（Invitrogen）によって構成される成長培地において培養する。
【００９７】
これに続き、半停止させるとき、細胞を膨張させる。この過程では、０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を用いて、細胞を培養表面から剥離し、遠心分離し、新鮮な培地に再懸濁する。細胞の密度および生存率を、取得した細胞懸濁において決定し、新しい細胞培養表面に散布する。
【００９８】
実施例２．細胞ＡＳＣに対する本発明の処理の適用：細胞ＨＣ０１６の取得
継代培養した３５００００個のＡＳＣ細胞を、粘着するまで、次の組成：１０％ウシ胎児血清（Biochrom）を含むＤＭＥＭ（Invitrogen）および１％ＰＳＡ抗菌−抗真菌（Invitrogen）の５ｍＭの成長培地が入ったＴ２５培養フラスコに散布し、３７℃かつ５％ＣＯ２でインキュベートする。
【００９９】
第１のサイクル：次の組成：１０％ウシ胎児血清（Biochrom）を含むＤＭＥＭ（Invitrogen）、１％抗菌−抗真菌ＰＳＡ（Invitrogen）、および０．０１％Ｈ２Ｏ２（Panreac）を含む培地を加える。これらの細胞を、４８時間、この培地でインキュベートする。
【０１００】
第２のサイクル：４８時間後、細胞を取得し、再び、３５００００個の細胞を第２のＴ２５培養フラスコに散布し、３７℃かつ５％ＣＯ２でインキュベートする。続いて、処理培地を加え、細胞を4８時間インキュベートする。
【０１０１】
第３のサイクル：これらの４８時間後、細胞を取得し、再び、３５００００個の細胞を第２のＴ２５培養フラスコに散布し、３７℃かつ５％ＣＯ２でインキュベートする。続いて、処理培地を加え、細胞を4８時間インキュベートする。
【０１０２】
これらの４８時間後、ＡＳＣ処理細胞を、ＨＣ０１６と再命名する。
【０１０３】
実施例３．ＡＳＣに対するＨＣ０１６細胞の細胞増殖の比較解析。
【０１０４】
細胞増殖の解析は、次の四つの実験群：ＡＳＣ、ＨＣ０１６、無傷なＨＯＧ細胞、およびＨＣ０１６を生成する本発明の処理で培養したＨＯＧ細胞で行う。
【０１０５】
ＨＯＧ細胞は、神経系統の実験的棒突起膠細胞モデルとして考えられる棒突起神経膠腫由来のヒト細胞である。ＨＯＧ細胞を、増殖能力を有しかつ棒突起膠細胞遺伝子バックグラウンドを有する未分化の状態で、培養する。
【０１０６】
ＡＳＣを、この実験用の細胞集団を生成するために、上記方法論および実施例１に規定しかつ記述した成長培地において培養する。一回分の同数のＨＣ０１６細胞を、実施例２に基づき生成した。ＨＯＧ細胞集団を、実施例１および実施例２にそれぞれ基づくＡＳＣおよびＨＣ０１６のための方法によって、生成した。
【０１０７】
四つの細胞集団をいったん調製して、細胞を、ウェルに付着するまで、成長培地を含む９６ウェルプレートに散布する。それから、０．１ｍＭＨ２Ｏ２を曝露することによって、細胞を酸化的環境において成長させる。細胞増殖ＭＴＴ法のプロトコルおよび試薬に従い、増殖を、異なる時間：０時間、２４時間、４８時間、および７２時間において測定した。キット製造業者に基づき、この試験は、細胞増殖の比色分析推定を生み出す。したがって、このパラメーターは、四つの細胞型において、解析されかつ比較される。
【０１０８】
図は、時間に対する任意の単位の蛍光強度で表される。
【０１０９】
結果
ＨＣ０１６の増殖能力は、酸化的刺激の７２時間後において、ＡＳＣの対象集団よりも１．２３倍高い（２３％増加）（ｔ−スチューデント試験ｐ＜０．５；サンプルｎ＝３）（図１Ａ）。この効果は、他の細胞ヒト細胞、ＨＯＧオリゴデンドロサイトでは共有されない（図１Ｂ）。本発明の処理は、ＡＳＣでは効果的であるが、ＨＯＧオリゴデンドロサイトなどの他の細胞型では効果的ではありえない。
【０１１０】
実施例４．ＨＣ０１６細胞における細胞内活性酸素種レベル。
【０１１１】
活性酸素種の細胞内レベルの解析は、四つの実験群：ＡＳＣ、ＨＣ０１６、無傷なＨＯＧ細胞、およびＨＣ０１６を生成する本発明の処理で培養したＨＯＧ細胞で行う。
【０１１２】
四つの細胞集団をいったん調製して、細胞を、ウェルに付着するまで、成長培地を含むウェルプレートに散布する。それから、細胞を１×ＰＢＳで手短に洗浄して、次に、ＰＢＳを、１０μＭの２’，７’−ジクロロフルオレセインジアセタート（ＤＣＦＡ）を含む１００μｌの１×ＰＢＳで置き換え、細胞を３０分インキュベートする。ＤＣＦＡを次に除去し、新鮮な培地を加える。次に、細胞を、異なる濃度：０、０．１、０．２５、０．５、および１ｍＭのＨ２Ｏ２を含む培地で培養した。ＭＲＯレベルの時間的変化を、蛍光測定器プレートリーダーで、全６０分に渡って５分ごとに測定する。励起／発光の周波数範囲は、４８５／５３８ｎｍである。
【０１１３】
グラフを、時間（分）に沿った任意の蛍光強度単位として表す。
【０１１４】
結果
Ｈ２Ｏ２の勾配にさらした５５分後、ＨＣ０１６細胞は、ＡＳＣに対して、１ｍＭおよび０．５ｍＭのＨ２Ｏ２と共に、顕著に低いレベルの細胞内ＭＲＯを含む（１１％低い）、二方向ＡＮＯＶＡ試験Ｐ＜０．０３１および（１５％低い）、二方向ＡＮＯＶＡ試験（Ｐ＜０．０３９、それぞれ）（図２）。ＡＳＣからＨＣ０１６を生成する処理は、ＨＯＧオリゴデンドロサイト細胞の様な他の哺乳類細胞では同様の応答を含まない（図２）。加えて、ＨＣ０１６細胞においてＲＯＳの細胞内レベルがより低いことは、間接的に、この分子の細胞外レベルもまた低減することを示し、そのため、ＨＣ０１６細胞が、過酸化水素を環境から除去するより高い能力を有し、これにより、細胞治療などの適用箇所において、より高いＨ２Ｏ２解毒能力を細胞に付与することができる。
【０１１５】
実施例５：細胞内総グルタチオン（ＧＳＨ）レベル。
【０１１６】
実験群は、２つの別々の一回分のＡＳＣおよびＨＣ０１６によって構成される。ＡＳＣを、上述した方法論および培地によって培養する。ＡＳＣを、記述された方法によって抽出かつ単離し、この実験に必要な細胞集団が得られるまで、成長培地において継代培養する。また、一回分のＨＣ０１６細胞を、本発明の方法論によって、同数の細胞として生成した。
【０１１７】
細胞条件づけ工程の後、細胞を、０．０５トリプシン／ＥＤＴＡでの消化によって集める。タンパク質を、細胞を溶解バッファー（バッファーリン酸ナトリウムに入ったプロテアーゼ阻害剤、ＥＤＴＡ、およびトリトンＸ−１００、ｐＨ７．５）でインキュベートすることによって、抽出し、上清における総タンパク質細胞を、ＢｉｏＲａｄ  ＤＣ  タンパク質アッセイキットによって供給されるプロトコルおよび試薬に従い、定量化する。
【０１１８】
上清の他の一定分量では、タンパク質を、５％スルホサリチル酸で沈殿させ、遠心分離し、上清に溶解した低分子量ペプチドを、総ＧＳＨおよびＧＳＳＧアッセイのために移す。
【０１１９】
総ＧＳＨおよびＧＳＳＧアッセイのためのサンプルを、９６ウェルプレートにおいて三通り処理する。ＧＳＨ測定では、サンプルは、５％精製タンパク質サンプル、４５％蒸留水、および５０％反応バッファー（０．１Ｍのリン酸ナトリウムバッファーに入った０．２ＭのＥＤＴＡ、ＤＴＮＢ１．２ｍｇ／μｌ、３．６ｍｇのＮＡＤＰＨ、および４．５単位のグルタチオンレダクターゼ、ｐＨ７．５）を含む。それから、４０５ｎｍにおける吸光度を、２．５分間、１５秒ごとに測定する。ＧＳＳＧ測定では、精製タンパク質サンプルを、９６．３％／３．７％の割合で２−ビニルピリジンで事前処理し、１時間、４℃でインキュベートする。それから、解析様のサンプルを、１０％の事前処理したサンプル、５０％の蒸留水、および５０％の反応溶液（０．１Ｍのリン酸ナトリウムバッファーに入った０．２ＭのＥＤＴＡ、ＤＴＮＢ１．２ｍｇ／μｌ、３．６ｍｇのＮＡＤＰＨ、および４．５単位のグルタチオンレダクターゼ、ｐＨ７．５）を含むものとして調製する。それから、４０５ｎｍにおける吸光度を、２．５分間、１５秒ごとに測定する。
【０１２０】
吸光度値を、細胞タンパク質サンプルの代わりに既知のＧＳＨ濃度を用いて同じ工程を繰り返すことによって生成される標準曲線に外挿する。値を、タンパク質のｎｍｏｌ／ｍｇとして表す。総グルタチオンを、ＧＳＨ＋２ＧＳＳＧとして算出する。
【０１２１】
結果
ＨＣ０１６細胞では、総ＧＳＨの基本含有量がＡＳＣに対してより高い（図３）（１０％高）。ＨＣ０１６細胞において細胞内総ＧＳＨのレベルが高いことは、毒性薬剤のこれらの細胞の解毒能力もまた高いことを確信させ、環境ストレスまたは細胞性代謝活性上昇に対するより高い耐性を授ける。
【０１２２】
実施例６．代謝物反応性種解毒に関与する遺伝子の発現レベル。
【０１２３】
この比較解析は、ＡＳＣおよびＨＣ０１６細胞によって構成される２つの実験群を必要とする。この実験に必要な細胞集団を取得するために、通常のＡＳＣを、上述した方法論および培地によって培養する。一回分の同様の細胞数のＨＣ０１６を、実施例２に記述した方法を適用することによって、生成する。
【０１２４】
条件づけ手順が完了すると、各細胞群を、トリプシン／ＥＤＴＡ消化によって、細胞培養容器から収集する。細胞を溶解し、細胞膜断片およびタンパク質を保持する商業的に利用可能なメンブレンフィルターシステムを用いて、各実験群の総ｍＲＮＡを別々に抽出かつ精製する。溶出ｍＲＮＡを、商業キット（Ｐｕｒｅ  Ｌｉｎｋ（登録商標）ＲＮＡマイクロキット；Invitrogen；参照９１１８１１）に含まれる確立されたプロトコルおよび試薬に従うレトロ転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって、ｃＤＮＡに転換する。対応する量の各実験群の取得ｃＤＮＡを、スーパーオキシドジスムターゼ１，２，および３、カタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、およびグルタチオンレダクターゼの遺伝子のエクソン領域に局在する特定のｃＤＮＡ断片に結合する特別に設計されたプライマー配列を含む、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うのに適した量および濃度に混合する。
【０１２５】
各実験群のＰＣＲ産物を、電気泳動技術（１×ＴＡＥバッファー中の４％アガロース）および一定量の規定の濃度の商業ＤＮＡ染色試薬（ＳＹＢＲ  Ｓａｆｅ  ＤＮゲル染色；Invitrogen；Ｓ３３１０２）によって、アガロースゲルに移す。ゲルをＵＶ光で透照し、各移動バンドの吸光度を測定するために、デジタル映像システムによる吸光度を測定する。各実験群および各選択遺伝子の各バンドの吸光度の値は、バックグラウンドを差し引き、規定の構成遺伝子発現の吸光度の値に対して標準化される。
【０１２６】
結果
ＨＣ０１６の酸化的代謝に関与する遺伝子の発現レベルは、ＡＳＣとは異なる（図４Ａ）。異なる遺伝子発現の定量化によって、ＨＣ０１６細胞では、ＳＯＤ１遺伝子が５３％、ＳＯＤ２遺伝子が３７％、Ｃａｔ遺伝子が７８％、ＧＲ遺伝子が１８％、ＧＰｘ遺伝子が６％、ＡＳＣに対して増加することが示される（図４Ｂ）。これらの結果によって、ＨＣ０１６細胞では、細胞内および細胞外抗酸化防御が、ＡＳＣよりも改善していることの結論が導かれる（図４Ａ）。
【０１２７】
実施例７．細胞骨格および成長因子分泌に関与する遺伝子およびタンパク質の発現レベル。
【０１２８】
この比較解析は、ＡＳＣおよびＨＣ０１６細胞によって構成される２つの実験群を必要とする。この実験に必要な細胞集団を取得するために、通常のＡＳＣを、上述した方法論および培地によって培養する。一回分の同様の細胞数のＨＣ０１６を、実施例２に記述した方法を適用することによって、生成する。実施例６にあるように、条件づけ手順が完了すると、各細胞群を、トリプシン／ＥＤＴＡ消化によって、細胞培養容器から収集し、細胞を溶解し、総ｍＲＮＡを別々に抽出かつ精製し、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに転換する。β−アクチンおよびＩＧＦ−１の遺伝子のエクソン領域に局在化する特定のｃＤＮＡ断片に結合する特別に設計されたプライマー配列を含むｃＤＮＡを用いて、ＰＣＲを行う。図６のように、各実験群のＰＣＲ産物を、電気泳動技術によって、アガロースゲルに移す。各移動バンドの吸光度を測定し、その値は、バックグラウンドを差し引き、規定の構成遺伝子発現、ＧＡＤＰＨの吸光度の値に対して標準化される。
【０１２９】
結果
ＡＳＣと比較したときの、ＨＣ０１６細胞における細胞質成分および成長因子に関する遺伝子の発現レベル（図５Ａおよび図５Ｃ）。異なる遺伝子の発現する定量化によって、ＨＣ０１６細胞において、β−アクチン遺伝子が５９％（図５Ｂ）、ＩＧＦ−１遺伝子が６４％（図５Ｄ）、ＡＳＣと比較して増加することが示される。
【０１３０】
実施例８．細胞質分子の組成および配置。
【０１３１】
この比較解析は、通常のＡＳＣによって再び構成される２つの実験群を必要とする。この実験に必要な細胞集団を取得するために、通常のＡＳＣを、上述した方法論および培地によって培養する。一回分の同様の細胞数のＨＣ０１６を、実施例２に記述した方法を適用することによって、生成する。
【０１３２】
各集団の細胞を、上述した成長培地および方法論を用いて２４ウェルプレートに散布する。いったん細胞が付着すると、培地を除去し、細胞を手短にＰＢＳ１×で洗浄する。それから、細胞を、ＰＢＳ１×に入った４％ホルムアルデヒドで１２分間固定し、ＰＢＳ１×に入ったトリトンＸ−１００によって４℃で１０分間透過処理し、再び、ＰＢＳ１×で洗浄し、ＰＢＳ×１に入った１００μｇ／ｍｌのファロイジン−ＦＩＴＣ（Sigma-Aldrich；参照Ｐ５２８２）によって室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳ１×によって室温（〜２３℃）で１時間再び洗浄する。それから、細胞を激しくＰＢＳ１×で洗浄し、核をＨｏｅｓｃｈｔ３３２５８（Invitrogen；参照Ｈ１３９８）で染色し、最終的に、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｎｔ−Ｇ（Southern Biotech；参照０１００−０１）の薄膜で被覆し、蛍光顕微鏡で可視化する。
【０１３３】
結果
細胞質ＨＣ０１６細胞は、より多くのＦ−アクチン繊維を有し、ＡＳＣ細胞よりも薄く、ストレスファイバーに組織される。顕微鏡下でＡＳＣおよびＨＣ０１６細胞を観察すると、ＨＣ０１６細胞は、より多くのＦ−アクチン繊維を有し、ＡＳＣよりも薄い（図６）、これにより細胞質がより強固になりかつ起こりうる構造的再構成により備えることができることが定量的に示される。実施例７には、Ｆ−アクチンおよびβ−アクチン単量体をコードする遺伝子の発現の定量化を示す（図５Ａ〜Ｂ）。双方の二つの結果は、Ｆ−アクチンの合成が増加したこと、そして、この後者の結果、細胞の細胞質への影響を示す。
【０１３４】
実施例９．ＨＣ０１６細胞による、神経系統の防御能力。
【０１３５】
実験群は、通常の培養手順において何ら改変の無い対照の棒突起膠細胞ＨＯＧ細胞、酸化的環境において培養されたＨＯＧ細胞、酸化的環境におけるＨＯＧ細胞とＡＳＣとの共培養、および酸化的環境におけるＨＯＧ細胞とＨＣ０１６細胞との共培養によって構成される。
【０１３６】
ＨＯＧ細胞は、神経系統の実験的棒突起膠細胞モデルとして考えられる棒突起神経膠腫由来のヒト細胞である。ＨＯＧ細胞を増殖能力および棒突起膠細胞遺伝子バックグラウンドを未分化させて、培養する。
【０１３７】
ＡＳＣおよびＨＣ０１６細胞の同様の細胞数の集団を、実施例１および実施例２に記述した方法によって生成する。実験の日に、２つの細胞集団間の物理的接触を防ぐ、２４ウェルプレートに挿入されたＢｏｙｄｅｎチャンバー（トランスウェルチャンバーの挿入）、に基づくインビトロ共培養システムに含めることに先だって０．０５トリプシン／ＥＤＴＡ消化によって細胞を収集する。
【０１３８】
実験の日に、オリゴデンドロサイトを２４ウェルプレートの底部に撒きかつ付着させ、０．５ｍｌの０．５ｍＭＨ２Ｏ２を培養培地に加えることによって、１時間、酸化的環境において培養する。毒性侵襲の後、培地を新鮮な培養培地に置き換え、１０％ウシ胎児血清および抗生物質を含むＤＭＥＭによって構成される培地において３７℃で培養する。
【０１３９】
次の工程では、共培養の状況において、ＡＳＣまたはＨＣ０１６細胞を、上に説明した実験群に対応するＢｏｙｄｅｎチャンバー（トランスウェルチャンバーの挿入）にインキュベートし散布する。２４および４８時間の期間まで、棒突起膠細胞の生存率を、トリバンブルー色素排除法によって定量化する。
【０１４０】
生細胞の成長率（ＧＲ）を、％生細胞−％死細胞として算出する。正常ＨＯＧに対する酸化的ＨＯＧの成長率を、ＧＲ酸化的ＨＯＧ／ＧＴ対照ＨＯＧとして算出する。
【０１４１】
結果値を酸化的ＨＯＧに対して標準化し、棒グラフにおいて対パーセンテージとして表す。
【０１４２】
結果
ＨＯＧに対する４８時間の酸化的刺激の後、ＨＣ０１６細胞と共培養した細胞では、酸化的ＨＯＧに対する標準化成長率が、ＡＳＣと共培養したＨＯＧ細胞よりも２１％高い（図７）。一方、２４時間では、両細胞型共に、酸化的ＨＯＧの生存率を同様に促進し、中間期間では、ＨＣ０１６細胞は、酸化的ＨＯＧに対してより長く続く効果を有する。この理由のため、ＨＣ０１６細胞は、ＡＳＣに関する、本書において参照した病気における組織損傷において起こるストレス条件下における他の細胞型に対して、時間に渡る効果を改善しかつ上昇させるので、これらの細胞をインビトロ細胞療法で投与すると、通常のＡＳＣ療法よりも多くの利点が生ずる。
【０１４３】
実施例１０．炎症／酸化ストレスシグナル伝達細胞に対するＨＣ０１６細胞の移動能力
実験群は、通常の培養手順において何ら改変の無い対照の棒突起膠細胞、酸化的環境において培養された棒突起膠細胞、酸化的環境におけるＨＯＧ細胞とＡＳＣとの共培養、および酸化的環境における棒突起膠細胞とＨＣ０１６細胞との共培養によって構成される。
【０１４４】
ＡＳＣおよびＨＣ０１６細胞の移動能力を解析するために、酸化ストレスモデルを、増殖および生存率が酸化ストレス条件に敏感な試験哺乳動物細胞（棒突起膠細胞）を用いて生成する。
酸化ストレスモデルは、２４ウェルプレートの底部に撒かれかつ付着し、かつ、０．５ｍｌの０．５ｍＭＨ２Ｏ２を加えることによって酸化的環境において１時間培養した棒突起膠ＨＯＧ細胞によって構成される。毒性侵襲の後、培地を新鮮な培養培地に置き換え、１０％ウシ胎児血清および抗生物質を含むＤＭＥＭによって構成される培地において３７℃で培養する。
【０１４５】
次の工程では、共培養の状況において、ＡＳＣまたはＨＣ０１６細胞を、上に説明した実験群に対応するＢｏｙｄｅｎチャンバー（トランスウェルチャンバーの挿入）にインキュベートし散布する。
【０１４６】
２４、４８、および７２時間の期間まで、トランスウェル挿入を、ＰＢＳ１×によって洗浄し、かつ、ＰＢＳ１×に入った４％ホルムアルデヒドで１２分間固定する。
トランスウェル膜の上部表面にある細胞を、Ｑ−チップの綿スワブによって取り除き、残った細胞を室温で１時間、０．１％クレシルバイオレット溶液によって染色する。それから、ＰＢＳ１×で完全に洗浄し、最後に、挿入からカットし、ＤＰＸマウント培地（Sigma-Aldrich；参照４４５８１）の薄膜で覆ったガラススライドに平らに乗せ、顕微鏡下で可視化する。顕微鏡下で膜を観察し、各状況の代表的な画像を、取得し、領域ごとの細胞数を、実験群ごとに直接算出する。
【０１４７】
定量化を、ｍｍ２ごとの細胞の移動数として表す。
【０１４８】
結果
我々は、それぞれ０．５７ｍｍ２の全部で１０領域（図８）、全部で５．７ｍｍ２を解析した。この領域では、４８および７２時間において、酸化ストレスによる損傷細胞に向かうＨＣ０１６細胞の移動能力は、ＡＳＣに比べて、３２．７５倍（３，２７５％）および２０．６１倍（２，０６１％）高い。結論として、ＨＣ０１６細胞で処理すると、ＡＳＣに比べて、細胞外Ｈ２Ｏ２によって損傷を受けたＨＯＧ細胞への走化性能力が、より強くかつより優れる。Ｈ２Ｏ２を与えた後にＨＯＧ細胞に及ぼす走化性効果は、酸化ストレスおよび活性酸素代謝物の放出後に起こる炎症成分の誘発などの現象に関連しているかもしれない。
【０１４９】
実施例１１．ＨＣ０１６細胞薬剤学成分生産。
【０１５０】
ＨＣ０１６細胞を、動物モデルおよびその有効性の決定に用いられる細胞療法薬用産物に至る製薬処方に基づき調製した。
【０１５１】
それゆえ、ＡＳＣからＨＣ０１６細胞を取得する処理をいったん行うと、実施例２に示すように、細胞を、非発熱性のガラスバイアルに配置する。
【０１５２】
この目的のため、０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を加えることによって、ＨＣ０１６細胞を、培養フラスコから剥離し、酵素活性を、ＦＢＳ（Boichrom）を加えることによって中和し、４００ｇでの遠心分離を、細胞懸濁液取得のために行う。上清を取り除き、細胞ペレットを生理食塩水（Grifols）に再懸濁し、前の溶液の痕跡を完全に取り除くために、新たな遠心分離を行う。上清を捨て、細胞を、注射用溶液（リンゲル乳酸９５％（Grifols）および５％ヒトアルブミン（CSL-Behring）で再懸濁する。我々は、血球計測器を用いて、細胞計測および生存率解析を行い、細胞溶液を２００，０００細胞／μｌの濃度に調製した。
【０１５３】
動物モデルにおける定位固定注入のための医薬製剤は、９５％リンゲル乳酸に入った２００，０００細胞／μｌの濃度の５０μｌのＨＣ０１６生細胞溶液およびヒトアルブミン（CSL-Behring）によって構成され、無菌かつ非発熱性のガラスバイアルに撒かれる。
【０１５４】
実施例１２．脊椎損傷の動物モデルにおけるＨＣ０１６細胞の適用に基づく細胞療法の防御および／または機能的モーターリハビリテーション能力
実験群は、２５０〜３００ｇの重量の１０匹の大人のスプラーグドーリーラットによって構成される。これらの動物を対象に、イソフルラン３〜４％を用いた全身麻酔下において、胸部において椎弓切除術を行い、そのため脊椎が露出する。背側脊椎において、既知の直径の金属プランジャーに負荷される距離および重量などの一組のパラメーターによってキャリプレートされかつ規定された挫傷によって、中程度の脊椎損傷を与える。１０匹の動物からなる第１の群では、損傷を与えるが何の治療もしない。１０匹の動物からなる第２の群では、損傷を与えると共に、ＡＳＣ細胞療法を施す。１０匹の動物からなる第２の群では、損傷を与えると共に、ＨＣ０１６細胞療法を施す。損傷の上部および下部の脊髄レベルの６点の定位固定注入によって、ＡＳＣおよびＨＣ０１６の細胞療法を４８時間適用する。各注入物は、２００，０００個の細胞を含む１ｍｌの生理食塩水によって構成され、動物ごとに１，２００，０００個の細胞が総投与量となる。ラットは、動物施設において常時管理され、食物および飲料を自由に与えられる。各群の防御および／または機能的モーターリハビリテーション能力は、１、２、３、４、６、および８週後に開放場における自発運動を探求する機能的試験によって決定する。この試験は、Basso-Beattie-Bresnahan（ＢＢＢスコア）として知られており、２１のスコアを達成しかつ短期、中期、および長期の回復の純定量的測定を与える信頼性および感受性のある方法である。(Basso, Beattie and Bresnahan, 1995. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. J Neurotrauma 12, 1-21)。
【０１５５】
定量化は、各探求時間における各実験群のＢＢＢスケール値の統計的平均値として表される。
【０１５６】
結果
脊椎損傷後にＨＣ０１６細胞療法を適用すると、ＢＢＢ試験において試験したモーター能力の回復が促進する。この試験のスケールによると、値は、損傷後の１、２、３、４、６、および８週後に試験したすべての時点において、この開腹が通常のＡＳＣ療法よりも少なくとも１点上回ることを示す（図９）。回復が上昇することは、ＨＣ０１６細胞療法が、ＨＣ０１６細胞では８週間後に獲得される、最良のスコアを獲得するための時間を短くすることを示す。
【図面の簡単な説明】
【０１５７】
【図１】ＭＴＴ法によって測定され、かつ、酸化的環境（１００μＭ）にさらされた、ＡＳＣ、ＨＣ０１６（Ａ）、ＨＯＧ、および本発明の方法によって処理されたＨＯＧ（Ｂ）の増殖能力。ＨＣ０１６が酸化的環境にさらされると、その寿命が著しく増加することが観察されうる。この効果は、ＨＯＧ細胞に類似する他の哺乳動物細胞種に同じ処理を施しても起こらない。アスタリスクは、ｔ−スチューデント試験においてｐ＜０．０５であることを示す（実施例３）。
【図２】ＡＳＣ、ＨＣ０１６、ＨＯＧ、および本発明の方法によって処理されたＨＯＧＯにおける、ＲＯＳの細胞内レベルの動態解析。この解析は、高濃度の酸化ストレスにさらされたときに大体の場合、ＨＣ０１６のみが細胞内ＲＯＳレベルを著しく減少させることを示す。アスタリスクは、二方向ＡＮＯＶＡ試験に基づく統計的に有意な相違を示す（＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１）（実施例４）。
【図３】ＡＳＣ細胞およびＨＣ０１６細胞における総グルタチオンの細胞内レベル（ＧＳＨ総）（実施例５）。コントロール条件では、非ストレス、処理によって、ＨＣ０１６基底ＧＳＨにおいて、ＡＳＣに対して１０％の増加を示した。
【図４】Ａ：ＡＳＣ細胞およびＨＣ０１６細胞における、活性酸素種解毒に関与する遺伝子の発現レベル（実施例６）。Ｂ：ＡＳＣ細胞およびＨＣ０１６細胞における、活性酸素種（ＳＯＤ１、ＳＯＤ２、ＳＯＤ３、Ｃａｔ、ＧＲ、ＧＰＸ）解毒に関与する遺伝子の発現の定量化。値は、ＨＣ０１６／ＡＳＣ比として表示されている（実施例６）。
【図５】Ａ：ＡＳＣ細胞およびＨＣ０１６細胞における、細胞骨格成分（β−アクチン）に関与する遺伝子の発現（実施例７）。Ｂ：ＡＳＣ細胞およびＨＣ０１６細胞における、細胞骨格成分（β−アクチン）に関与する遺伝子の発現の定量化（実施例７）。値は、ＨＣ０１６／ＡＳＣ比として表示されている（実施例７）。Ｃ：ＡＳＣ細胞およびＨＣ０１６細胞における、成長因子ＩＧＦ−１をコードする遺伝子の発現（実施例７）。Ｄ：ＡＳＣ細胞およびＨＣ０１６細胞における、成長因子ＩＧＦ−１をコードする遺伝子の発現の定量化（実施例７）。値は、ＨＣ０１６／ＡＳＣ比として表示されている（実施例７）。
【図６】Ｆ−アクチン免疫染色の蛍光顕微鏡画像。ＨＣ０１６におけるＦ−アクチン存在のＡＳＣに対する増加、および、そのストレスファイバーにおける分布が見られ、これは、ＨＣ０１６の優れた遊走および走化性能力に関するＨＣ０１６の細胞骨格立体形状変化を意味する（実施例８）。
【図７】酸化ストレス侵襲後の神経分化ＨＯＧ細胞成長率、および、この成長率に対するＡＳＣおよびＨＣ０１６の影響。酸化的環境のストレスを受けたＨＯＧ細胞をＡＳＣおよびＨＣ０１６ と共培養すると、ＨＯＧ細胞生存が増加する。にもかかわらず、ＨＯＧ細胞を酸化的環境にさらした後では、ＨＣ０１６との共培養のみが、この保護的効果を４８時間維持する。アスタリスクは、ｔ−スチューデント試験に基づく統計的に有意な相違を示す（Ｐ＜０．０５）（実施例９）。
【図８】ＡＳＣ細胞に対する、酸化ストレス侵襲を受けている細胞に向かうＨＣ０１６細胞の重要性優位遊走能力を示す代表画像および定量的棒グラフ（実施例１０）。
【図９】未処理ラット、ＡＳＣ処理ラット、およびＨＣ０１６処理ラットからなる脊髄損傷ラットの三つの実験群のＢＢＢスコア（Basso-Beattie-Bresnahan）の発展の表（実施例１２）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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