(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示すアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ、下記の（ｏ）〜（ｕ）；
（ｏ）Ｌｅｕ−４２と立体構造上同等な位置のアミノ酸残基を、側鎖の表面積が１００〜２００（Å２）であるアミノ酸に置換、
（ｐ）Ｍｅｔ−４６と立体構造上同等な位置のアミノ酸残基を、側鎖の表面積が１００〜１５０（Å２）である中性アミノ酸、または、側鎖の表面積が１００〜１５０（Å２）である酸性アミノ酸に置換、
（ｑ）Ａｓｎ−９６と立体構造上同等な位置のアミノ酸残基を、塩基性アミノ酸に置換、
（ｒ）Ｔｙｒ−１７２と立体構造上同等な位置のアミノ酸残基を、側鎖の表面積がＴｙｒよりも小さいアミノ酸に置換、
（ｓ）Ｔｈｒ−１９６と立体構造上同等な位置のアミノ酸残基を、塩基性アミノ酸に置換、
（ｔ）Ａｌａ−３１２と立体構造上同等な位置のアミノ酸残基を、側鎖の表面積がＡｌａよりも大きいアミノ酸に置換、
（ｕ）Ｐｈｅ−３７１と立体構造上同等な位置のアミノ酸残基を、脂肪族アミノ酸、酸性アミノ酸、または、側鎖にヒドロキシル基を有するアミノ酸に置換、
から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなるＮＡＤＨオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
下記の（ｖ）〜（ｂｂ）；
（ｖ）Ｌｅｕ−４２と立体構造上同等な位置のアミノ酸残基を、Ｍｅｔに置換、
（ｗ）Ｍｅｔ−４６と立体構造上同等な位置のアミノ酸残基を、Ｉｌｅに置換、
（ｘ）Ａｓｎ−９６と立体構造上同等な位置のアミノ酸残基を、Ａｒｇ、または、Ｈｉｓに置換、
（ｙ）Ｔｙｒ−１７２と立体構造上同等な位置のアミノ酸残基を、Ａｌａ、または、Ｓｅｒに置換、
（ｚ）Ｔｈｒ−１９６と立体構造上同等な位置のアミノ酸残基を、Ｈｉｓに置換、
（ａａ）Ａｌａ−３１２と立体構造上同等な位置のアミノ酸残基を、Ｉｌｅに置換、
（ｂｂ）Ｐｈｅ−３７１と立体構造上同等な位置のアミノ酸残基を、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、または、Ｔｙｒに置換、
から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなる請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
配列番号１に示すアミノ酸配列において、下記の（ａ）〜（ｇ）；
（ａ）Ｌｅｕ−４２を、側鎖の表面積が１００〜２００（Å２）であるアミノ酸に置換、
（ｂ）Ｍｅｔ−４６を、側鎖の表面積が１００〜１５０（Å２）である中性アミノ酸、または、側鎖の表面積が１００〜１５０（Å２）である酸性アミノ酸に置換、
（ｃ）Ａｓｎ−９６を、塩基性アミノ酸に置換、
（ｄ）Ｔｙｒ−１７２を、側鎖の表面積がＴｙｒよりも小さいアミノ酸に置換、
（ｅ）Ｔｈｒ−１９６を、塩基性アミノ酸に置換、
（ｆ）Ａｌａ−３１２を、側鎖の表面積がＡｌａよりも大きいアミノ酸に置換、
（ｇ）Ｐｈｅ−３７１を、脂肪族アミノ酸、酸性アミノ酸、または、側鎖にヒドロキシル基を有するアミノ酸に置換、
から選択される少なくとも１つ以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなるＮＡＤＨオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項４】
下記の（ｈ）〜（ｎ）；
（ｈ）Ｌｅｕ−４２を、Ｍｅｔに置換、
（ｉ）Ｍｅｔ−４６を、Ｉｌｅに置換、
（ｊ）Ａｓｎ−９６を、Ａｒｇ、または、Ｈｉｓに置換、
（ｋ）Ｔｙｒ−１７２を、Ａｌａ、または、Ｓｅｒに置換、
（ｌ）Ｔｈｒ−１９６を、Ｈｉｓに置換、
（ｍ）Ａｌａ−３１２を、Ｉｌｅに置換、
（ｎ）Ｐｈｅ−３７１を、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、または、Ｔｙｒに置換、
から選択される少なくとも１つ以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなる請求項３に記載のタンパク質。
【請求項５】
配列番号２および４〜１９のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる、請求項４に記載のタンパク質。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項７】
請求項６に記載のＤＮＡを有するベクター。
【請求項８】
請求項７に記載のベクターにより形質転換された形質転換体。
【請求項９】
請求項８に記載の形質転換体の培養物。
【請求項１０】
請求項９に記載の培養物を処理して得た請求項１または３に記載のタンパク質を含む酵素変異体含有物。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれかに記載のタンパク質を用いて、ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨ（還元型）をＮＡＤ＋／ＮＡＤＰ＋（酸化型）に変換する方法。
【請求項１２】
ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨ（還元型）が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを補酵素とする酸化還元酵素を用いた反応により生成されたものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項８に記載の形質転換体、請求項９に記載の形質転換体の培養物、または請求項１０に記載の酵素変異体含有物を利用する、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを補酵素とする酸化還元酵素を用いた反応が、一方のエナンチオマーを優先的に酸化する反応である、請求項１２または１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼの変異体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを補酵素とする酸化還元酵素が関与する反応によって目的化合物を合成する反応は、工業的プロセスに幅広く利用されている。目的化合物の多くは光学活性化合物であり、それらは、主に医薬・農薬の前駆体として生産されている（非特許文献１、２）。該酸化還元酵素が関与する酸化還元反応では、ＮＡＤ（Ｐ）＋（酸化型補酵素）がＮＡＤ（Ｐ）Ｈ（還元型補酵素）に変換される反応、または逆に、ＮＡＤ（Ｐ）ＨがＮＡＤ（Ｐ）＋に変換される反応の、いずれか一方の反応を伴う。したがって、該酸化還元反応では、化学量論量のＮＡＤ（Ｐ）＋、または、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈが必要となる。工業的プロセスにおいては、高価な補酵素を化学量論量使用することは避けた方が好ましい。そこで、該酸化還元反応に伴って生じた補酵素を、反応に再利用可能な型（酸化型、あるいは、還元型）に変換する反応を共役させることにより、高価な補酵素の使用量を減らす工夫が、工業的に利用されている（非特許文献２、３）。【０００３】
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼは、ＮＡＤ（Ｐ）ＨをＮＡＤ（Ｐ）＋に変換する反応に用いることができる酸化還元酵素の一種である。ニコチンアミド補酵素依存性の酸化還元酵素が関与するアルコールやアミノ酸などの酸化反応においては、ＮＡＤ（Ｐ）＋が反応に利用され、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈが生成される。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼは、ＮＡＤ（Ｐ）ＨをＮＡＤ（Ｐ）＋に変換する反応を触媒するので、ＮＡＤ（Ｐ）＋の再生系の役割を担う酵素として、上述のアルコールやアミノ酸などの酸化反応に（第２酵素系として）組み込むことが可能である（特許文献１〜３、非特許文献３、４）。【０００４】
工業的に利用されるＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼとして、ＮＡＤ（Ｐ）ＨをＮＡＤ（Ｐ）＋に変換する酸化反応に伴って、酸素分子の還元反応が起こり、副生成物として、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、または、水（Ｈ２Ｏ）を生成するタイプがよく知られている（非特許文献３、４）。水生成型ＮＡＤ（Ｐ）ＨオキシダーゼによるＮＡＤ（Ｐ）ＨからのＮＡＤ（Ｐ）＋生成反応は非可逆的であるため、ＮＡＤ（Ｐ）＋再生系として適している。Ｈ２Ｏ２を生成するタイプのＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼは、生成したＨ２Ｏ２が酵素障害性を有するため、酵素を利用した化学反応プロセスには利用が難しい。したがって、反応産物として、ＮＡＤ（Ｐ）＋以外に水のみが生成するタイプの方が、工業的利用には好ましいと言える。【０００５】
水生成型ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼとしては、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）由来のＮＡＤＨオキシダーゼ、ラクトバチルス・サンフランシセンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）由来のＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨ（両方を基質とする）オキシダーゼ、ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来のＮＡＤＨオキシダーゼ、ボレリア・バーグドルフェリー（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）由来のＮＡＤＨオキシダーゼなどが公知である（非特許文献４〜６）。水生成型ＮＡＤ（Ｐ）ＨオキシダーゼをＮＡＤ（Ｐ）＋再生系に利用した、光学活性化合物の合成方法例（光学分割法）も報告されている（特許文献１、非特許文献５〜８）。【０００６】
ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属微生物由来、特にストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）由来の、水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼも公知である（特許文献２、非特許文献９〜１１）。ニコチンアミド補酵素依存性の酸化還元酵素が関与する、アルコールやアミノ酸などの酸化反応において、該酵素を、ＮＡＤ（Ｐ）＋再生系を担う第２酵素系として、反応に利用できることが既に実証されている（特許文献３、４）。該酵素の特徴としては、還元剤などの酵素安定化剤を添加せずとも、ＮＡＤ＋の再生反応が効率良く進むことが明らかになっている（特許文献２）。この特徴は、添加剤としてＤＴＴ（ジチオスレイトール）などの添加が必要とされているラクトバチルス・ブレビス由来のＮＡＤＨオキシダーゼ（非特許文献５）など、他のＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼと比較して、工業的利用の観点から優れた特徴と言える。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００３−１１６５８５号公報
【特許文献２】特開平８−１９６２８１号公報
【特許文献３】国際公開第ＷＯ０６／０１３８０２号公報
【特許文献４】国際公開第ＷＯ０６／０３３３３３号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｌｉｅｓｅ  Ａ．他著、「Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ」、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ出版
【非特許文献２】Ｗａｎｄｒｅｙ  Ｃ．他著、「Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」、２０００年、４巻、２８６−２９０
【非特許文献３】Ｃｈｅｎａｕｌｔ  Ｈ．Ｋ．他著、「Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＣｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」１９８７年、１４巻、１４７−１９７
【非特許文献４】Ｋｒｏｕｔｉｌ  Ｗ．他著、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、２００４年、８巻、１２０−１２６
【非特許文献５】Ｇｅｕｅｋｅ  Ｂ．他著、「Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  ＭｉｃｒｏＢｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、２００３年、３２巻、２０５−２１１
【非特許文献６】Ｒｉｅｂｅｌ  Ｂ．Ｒ．他著、「Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ＆  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ」、２００３年、３４５巻、７０７−７１２
【非特許文献７】Ｈｕｍｍｅｌ  Ｗ．他著、「Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ」、２００３年、５巻、３６４９−３６５０
【非特許文献８】Ｆｉｎｄｒｉｋ  Ｚ．他著、「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｊｏｕｒｎａｌ」、２００８年、３９巻、３１９−３２７
【非特許文献９】Ｈｉｇｕｃｈｉ  Ｍ．他著、「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」、１９９３年、１３９巻、２３４３−２３５１
【非特許文献１０】Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  Ｊ．他著、「Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、１９９６年、６０１巻、３９−４３
【非特許文献１１】Ｈｉｇｕｃｈｉ  Ｍ．他著、「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、１９９９年、１８１巻、５９４０−５９４７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ストレプトコッカス・ミュータンス由来の水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼは、工業的生産に実用する上で、安定性の面において更なる改良の余地がある。具体的には、ＮＡＤ＋再生反応において、経時的に酵素活性が顕著に低下するという問題点が確認された。本発明の目的は、酸化還元酵素による立体選択的酸化反応時のＮＡＤ＋再生系に有用な水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼを、蛋白質工学的な手法による機能改変によってＮＡＤ＋再生反応時に活性が低下することなく長時間の使用に耐え得る酵素、すなわちより安定性に優れた酵素を提供すること、および、効率的な光学活性アルコール・アミノ酸などの有用物質を製造する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、ストレプトコッカス・ミュータンス由来の水生成型ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼの安定性を向上させ得る酵素機能改変方法を新たに開発した。結果として、本手段は配列同一性の高いＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼの安定性を向上させ得る酵素機能改変方法として応用可能である。【００１１】
すなわち、本発明は、
［１］配列番号１に示すアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有し、かつ、下記の（ｏ）〜（ｕ）；
（ｏ）Ｌｅｕ−４２と立体構造上同等な位置のアミノ酸残基を、側鎖の表面積が１００〜２００（Å２）であるアミノ酸に置換、
（ｐ）Ｍｅｔ−４６と立体構造上同等な位置のアミノ酸残基を、側鎖の表面積が１００〜１５０（Å２）である中性アミノ酸、または、側鎖の表面積が１００〜１５０（Å２）である酸性アミノ酸に置換、
（ｑ）Ａｓｎ−９６と立体構造上同等な位置のアミノ酸残基を、塩基性アミノ酸に置換、
（ｒ）Ｔｙｒ−１７２と立体構造上同等な位置のアミノ酸残基を、側鎖の表面積がＴｙｒよりも小さいアミノ酸に置換、
（ｓ）Ｔｈｒ−１９６と立体構造上同等な位置のアミノ酸残基を、塩基性アミノ酸に置換、
（ｔ）Ａｌａ−３１２と立体構造上同等な位置のアミノ酸残基を、側鎖の表面積がＡｌａよりも大きいアミノ酸に置換、
（ｕ）Ｐｈｅ−３７１と立体構造上同等な位置のアミノ酸残基を、脂肪族アミノ酸、酸性アミノ酸、または、側鎖にヒドロキシル基を有するアミノ酸に置換、
から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、
［２］下記の（ｖ）〜（ｂｂ）；
（ｖ）Ｌｅｕ−４２と立体構造上同等な位置のアミノ酸残基を、Ｍｅｔに置換、
（ｗ）Ｍｅｔ−４６と立体構造上同等な位置のアミノ酸残基を、Ｉｌｅに置換、
（ｘ）Ａｓｎ−９６と立体構造上同等な位置のアミノ酸残基を、Ａｒｇ、または、Ｈｉｓに置換、
（ｙ）Ｔｙｒ−１７２と立体構造上同等な位置のアミノ酸残基を、Ａｌａ、または、Ｓｅｒに置換、
（ｚ）Ｔｈｒ−１９６と立体構造上同等な位置のアミノ酸残基を、Ｈｉｓに置換、
（ａａ）Ａｌａ−３１２と立体構造上同等な位置のアミノ酸残基を、Ｉｌｅに置換、
（ｂｂ）Ｐｈｅ−３７１と立体構造上同等な位置のアミノ酸残基を、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、または、Ｔｙｒに置換、
から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなる［１］のタンパク質、
［３］配列番号１に示すアミノ酸配列において、下記の（ａ）〜（ｇ）；
（ａ）Ｌｅｕ−４２を、側鎖の表面積が１００〜２００（Å２）であるアミノ酸に置換、
（ｂ）Ｍｅｔ−４６を、側鎖の表面積が１５０（Å２）以下である中性アミノ酸、または、側鎖の表面積が１５０（Å２）以下である酸性アミノ酸に置換、
（ｃ）Ａｓｎ−９６を、塩基性アミノ酸に置換、
（ｄ）Ｔｙｒ−１７２を、側鎖の表面積がＴｙｒよりも小さいアミノ酸に置換、
（ｅ）Ｔｈｒ−１９６を、塩基性アミノ酸に置換、
（ｆ）Ａｌａ−３１２を、側鎖の表面積がＡｌａよりも大きいアミノ酸に置換、
（ｇ）Ｐｈｅ−３７１を、脂肪族アミノ酸、酸性アミノ酸、または、側鎖にヒドロキシル基を有するアミノ酸に置換、
から選択される少なくとも１つ以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、
［４］下記の（ｈ）〜（ｎ）；
（ｈ）Ｌｅｕ−４２を、Ｍｅｔに置換、
（ｉ）Ｍｅｔ−４６を、Ｉｌｅに置換、
（ｊ）Ａｓｎ−９６を、Ａｒｇ、または、Ｈｉｓに置換、
（ｋ）Ｔｙｒ−１７２を、Ａｌａ、または、Ｓｅｒに置換、
（ｌ）Ｔｈｒ−１９６を、Ｈｉｓに置換、
（ｍ）Ａｌａ−３１２を、Ｉｌｅに置換、
（ｎ）Ｐｈｅ−３７１を、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、または、Ｔｙｒに置換、
から選択される少なくとも１つ以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなる［３］のタンパク質、
［５］配列番号２および４〜１９のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる、［４］に記載のタンパク質、
［６］［１］〜［５］のいずれかに記載のタンパク質をコードするＤＮＡ、
［７］［６］に記載のＤＮＡを有するベクター、
［８］［７］に記載のベクターにより形質転換された形質転換体、
［９］［８］に記載の形質転換体の培養物、
［１０］［９］に記載の培養物を処理して得た酵素変異体含有物、
［１１］［１］〜［５］のいずれかに記載のタンパク質を用いて、ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨ（還元型）をＮＡＤ＋／ＮＡＤＰ＋（酸化型）に変換する方法、
［１２］ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨ（還元型）が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを補酵素とする酸化還元酵素を用いた反応により生成されたものである、［１１］に記載の方法、
［１３］［８］に記載の形質転換体、［９］に記載の形質転換体の培養物、または［１０］に記載の酵素変異体含有物を利用する、［１１］または［１２］に記載の方法、
［１４］［１１］〜［１３］のいずれかに記載の方法によって製造された化合物、
［１５］ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを補酵素とする酸化還元酵素を用いた反応が、一方のエナンチオマーを優先的に酸化する反応である、［１２］または［１３］に記載の方法、
［１６］［１５］に記載の方法を用いて製造されたエナンチオマー過剰率の高い光学活性化合物、
に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明における安定性の向上したＮＡＤＨオキシダーゼまたはＮＡＤＰＨオキシダーゼは、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋再生反応時に活性が低下することなく長時間の使用に耐え得るので、該再生反応が効率良く進む。従って、補酵素再生系を酸化還元酵素による立体選択的酸化反応と共役させれば、エナンチオマー混合物から効率的にエナンチオマー過剰率の高い光学活性化合物を得る事が可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
配列番号１で示されるポリペプチドは、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）ＮＣＩＢ１１７２３由来の水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼであり、そのアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡの塩基配列はすでに報告されている（特許文献２）。
【００１４】
水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼとは、前述のように、還元型補酵素ＮＡＤＨを酸化型補酵素ＮＡＤ＋に酸化し分子状酸素を電子受容体として水を生成する酸化還元酵素である。また、水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼによるＮＡＤＨからのＮＡＤ＋生成反応は非可逆的であり、反応産物としてはＮＡＤ＋以外には水が生成するのみである。
【００１５】
配列番号１のアミノ酸配列に対して導入する変異の設計コンセプトは、（Ｉ）触媒反応部位のシステイン残基のチオール基への酸素分子の接触を適切に妨げる、（ＩＩ）ＮＡＤＨ結合部位の立体障害を排除する、（ＩＩＩ）自由エネルギー的に酵素の立体構造を安定化する方向に働かせる、の３種類に基づいており、取得された変異が、単独の、または、複数の効果を有していれば、基本的に本研究の発明の範囲に含まれる。以下に、変異の設計コンセプトについて詳述する。
【００１６】
（Ｉ）触媒反応部位のシステイン残基のチオール基への酸素分子の接触を適切に妨げる変異とは、ストレプトコッカス・ミュータンス由来の水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼで触媒反応部位（活性中心）と考えられるＣｙｓ−４４への酸素分子の接触を適切に防ぐことにより、チオール基の過剰な酸化を抑制し得る変異である。
【００１７】
すなわち、酸素分子による過剰な酸化を抑制するためには、酸素分子が結合する触媒反応部位のポケット（酸素分子が触媒反応部位に近づけるような空間）を狭くして、酸素分子が進入する素過程の反応速度を低下させる変異を設計する。当該酵素のモデリング立体構造を利用することにより、触媒反応部位の周辺の３次元立体構造、特に、ポケット空間について、立体的な把握が可能である。よって、どの部位にどのようなアミノ酸変異を導入すれば、ポケット空間を適度に狭く出来るかを効率的に考案し、有用なアミノ酸変異を設計することができる。
【００１８】
（ＩＩ）ＮＡＤＨ結合部位の立体障害を排除する変異とは、ＮＡＤＨの酵素への結合・解離速度の変化が酵素の安定化に有利に働き得る変異である。
【００１９】
一方、ＦＡＤとＮＡＤ（Ｐ）Ｈを利用する酸化還元酵素（ｆｌａｖｏｐｒｏｔｅｉｎ）は、ニコチンアミド補酵素ＮＡＤ（Ｐ）Ｈが結合するポケット（ＦＡＤのイソアロキサジン環の傍）を芳香族アミノ酸がシールドする立体構造を取ることが、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈが結合していないアポ酵素の結晶構造解析から解っている（Ｃａｒｒｉｌｌｏ，Ｎ．＆Ｃｅｃｃａｒｅｌｌｉ，Ｅ．Ａ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０、１９００−１９１５（２００３））。このような芳香環によるＮＡＤ（Ｐ）Ｈ結合ポケットのシールド機構の機能については、一般的には、このシールドが外れること（つまり芳香環が大きく動くこと）が、他の二次的な反応（例えば、他の分子との結合）に影響が及ぶと推測されている。しかし、ストレプトコッカス・ミュータンス由来の水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼに関しては、そのような機能に関する詳細は解析されておらず、さらに、工業的な利用目的においては、他の二次的な反応について考慮する必要はない。
【００２０】
そこで、このようなシールドの役割を果たす芳香族アミノ酸残基を置換変異することで、ＮＡＤＨの酵素への結合・解離速度の変化が酵素の安定化に有利に働くと考えられる。当該酵素のモデリング立体構造を利用することにより、このようなシールドの役割を果たすと推測される芳香族アミノ酸残基はＴｙｒ−１７２であるため、側鎖を小さくする変異が有効と考えられる。
【００２１】
（ＩＩＩ）自由エネルギー的に酵素の立体構造を安定化する方向に働く変異とは、野生型と変異体での自由エネルギー差分値の比較を行うことで、酵素の安定性を高く設計し得る変異である。
【００２２】
すなわち、分子モデリング構造（主鎖のフレームワーク）を利用すれば、分子力場法を利用した分子シミュレーション計算（エネルギー極小化計算）によって、ｄｅｎａｔｕｒｅｄ状態からｎａｔｉｖｅ状態へ移行するときの自由エネルギー差分値を算出することができ、自由エネルギー差がよりｎａｔｉｖｅ状態に有利であれば、熱力学的な安定性も高くなる。具体的には、プログラムＳｈｒｉｋｅ（特開２００１−１８４３８１）を用いた計算機スクリーニングにより、野生型、および、各種変異体の自由エネルギー差分値を算出し、アミノ酸置換変異が自由エネルギー差分値に与える影響を指標に、アミノ酸変異候補を設計し得る。
【００２３】
本発明における「変異」の設計は、立体構造モデリング手法によって得られたストレプトコッカス・ミュータンス由来の水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼのモデリング立体構造を利用することにより達成し得る。なお、配列番号１で示される当該酵素に関して、Ｘ線結晶構造解析をはじめとする構造解析等の実験は行われておらず、その立体構造は未知である。
【００２４】
すなわち、まず、当該酵素のアミノ酸配列を基に、アミノ酸配列ホモロジーを有し、かつ立体構造がプロテインデータバンク（ＰＤＢ）に登録されている酵素との多重アミノ酸配列アラインメントを、プログラムＣｌｕｓｔａｌＸ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２２、４６７３−８０  （１９９４））により作成する。当該酵素とアミノ酸配列ホモロジーを有するタンパク質は、ＰＤＢに登録されたタンパク質のアミノ酸配列を対象に、プログラムＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５、３３８９−３４０２（１９９７））やＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（Ｓｈａｆｆｅｒ，Ａ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｉｎｆｏｍａｔｉｃｓ  １６４、８８−４８９（２０００））を用いたアミノ酸配列ホモロジーの検索を行うことで選択し得る。
【００２５】
次に、これら立体構造既知のタンパク質の三次元立体構造アラインメントを、Ｓｗｉｓｓ−ＰＤＢＶｉｅｗｅｒ（Ｇｕｅｘ，Ｎ．＆Ｐｅｉｔｓｃｈ，Ｍ．Ｃ．、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １８、２７１４−２７２３  （１９９７））などの三次元グラフィックスプログラムや、ＶＡＳＴ  Ｓｅａｒｃｈ（Ｇｉｂｒａｔ，Ｊ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ６、３７７（１９９６））などの立体構造比較・類似構造検索サーバにより行う。先にアミノ酸配列のみから得られた多重アラインメントを立体構造の類似性に基づいて修正し、得られた配列アラインメントに基づいて、立体構造の類似性が高いと推定されるタンパク質を分子モデリングの雛形タンパク質として選択する。
【００２６】
そして、補酵素が結合した複合体の立体構造（ＰＤＢコードが２ＮＰＸ）を、分子モデリングの雛形タンパク質として選択し、この雛形タンパク質をプログラムＳｗｉｓｓ  ＰＤＢ−Ｖｉｅｗｅｒで表示させ、配列アラインメントに従って、当該酵素のアミノ酸配列（配列番号１）に適合するようアミノ酸残基の置換を行う。挿入、欠失部位については、ＰＤＢから最適な類似部分構造を検索し、その部分構造に置換することにより立体構造モデルを構築し得る。
【００２７】
上記のコンセプトを基に、配列番号１のアミノ酸配列について、４２位、４６位、９６位、１７２位、１９６位、３１２位、および、３７１位の部位から選択される、少なくとも１つ以上のアミノ酸置換を伴う変異を設計した。
【００２８】
なお、置換されるアミノ酸は、基本的には、タンパク質を構成する２０種類のアミノ酸であるが、非タンパク質構成アミノ酸や非天然アミノ酸であっても、後述の各々のアミノ酸置換と同様の効果が期待できる場合は、これらも含む。また、挿入、欠失、または修飾による当該部位での変異も、後述の各々のアミノ酸置換変異の効果と同様の効果が期待できる場合は、これらも含む。例えば、４５位に欠失変異を導入し、４７位に挿入変異を導入した場合に、結果的に４６位においてＭｅｔをＡｌａに置換する変異が導入されたことになり、後述の４６位におけるアミノ酸置換変異と同様の効果が期待できる。
【００２９】
配列番号１のアミノ酸配列に対して導入する変異のアミノ酸置換は、具体的には以下（１）〜（７）に示す変異である。
（１）Ｌｅｕ−４２を、触媒反応部位のシステイン残基のチオール基への酸素分子の接触を適切に妨げるアミノ酸に置換する変異である。具体的には、側鎖の表面積が１００〜２００（Å２）であるアミノ酸に置換する変異であり、好ましくは、Ｖａｌ（１１７Å２）、Ｉｌｅ（１４０Å２）、Ｔｈｒ（１０２Å２）、Ｍｅｔ（１６０Å２）、Ａｓｎ（１１３Å２）、Ｇｌｎ（１４４Å２）、Ａｓｐ（１０６Å２）、または、Ｇｌｕ（１３８Å２）に置換する変異であり、自由エネルギー的にも安定化に有利に働くという理由で、より好ましくは、Ｍｅｔに置換する変異である。なお、括弧内の数値は各アミノ酸の側鎖の表面積を表す。
【００３０】
（２）Ｍｅｔ−４６を、触媒反応部位のシステイン残基のチオール基への酸素分子の接触を適切に妨げるアミノ酸に置換する変異である。具体的には、側鎖の表面積が１００〜１５０（Å２）である中性アミノ酸、または、側鎖の表面積が１００〜１５０（Å２）である酸性アミノ酸に置換する変異であり、好ましくは、Ｖａｌ（１１７Å２）、Ｌｅｕ（１３７Å２）、Ｉｌｅ（１４０Å２）、Ｔｈｒ（１０２Å２）、Ａｓｐ（１０６Å２）、または、Ｇｌｕ（１３８Å２）に置換する変異であり、自由エネルギー的にも安定化に有利に働くという理由で、より好ましくは、Ｉｌｅに置換する変異である。
【００３１】
（３）Ａｓｎ−９６を、自由エネルギー的に酵素の立体構造を安定化する方向に働くアミノ酸に置換する変異である。具体的には、塩基性アミノ酸に置換する変異であり、好ましくは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、または、Ｈｉｓに置換する変異であり、算出されたエネルギー値が特に優れているという理由で、より好ましくは、Ａｒｇ、または、Ｈｉｓに置換する変異である。
【００３２】
（４）Ｔｙｒ−１７２を、ＮＡＤＨ結合部位の立体障害を排除するアミノ酸に置換する変異である。具体的には、側鎖の表面積がＴｙｒ（１８７Å２）よりも小さいアミノ酸に置換する変異であり、好ましくは、Ｇｌｙ（０Å２）、Ａｌａ（６７Å２）、Ｖａｌ（１１７Å２）、Ｌｅｕ（１３７Å２）、Ｉｌｅ（１４０Å２）、Ｓｅｒ（８０Å２）、Ｔｈｒ（１０２Å２）、Ａｓｎ（１１３Å２）、Ｇｌｎ（１４４Å２）、Ａｓｐ（１０６Å２）、Ｇｌｕ（１３８Å２）、Ｈｉｓ（１５１Å２）、Ｌｙｓ（１６７Å２）、または、Ｐｈｅ（１７５Å２）に置換する変異であり、自由エネルギー的にも安定化に働くという理由で、より好ましくは、Ａｌａ、または、Ｓｅｒに置換する変異である。
【００３３】
（５）Ｔｈｒ−１９６を、自由エネルギー的に酵素の立体構造を安定化する方向に働くアミノ酸に置換する変異である。具体的には、塩基性アミノ酸に置換する変異であり、好ましくは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、または、Ｈｉｓに置換する変異であり、算出されたエネルギー値が特に優れているという理由で、より好ましくは、Ｈｉｓに置換する変異である。
【００３４】
（６）Ａｌａ−３１２を、触媒反応部位のシステイン残基のチオール基への酸素分子の接触を適切に妨げるアミノ酸に置換する変異である。具体的には、側鎖の表面積がＡｌａ（６７Å２）よりも大きいアミノ酸に置換する変異であり、好ましくは、Ｖａｌ（１１７Å２）、Ｌｅｕ（１３７Å２）、Ｉｌｅ（１４０Å２）、Ｔｈｒ（１０２Å２）、Ａｓｎ（１１３Å２）、Ｇｌｎ（１４４Å２）、Ａｓｐ（１０６Å２）、Ｇｌｕ（１３８Å２）、Ｈｉｓ（１５１Å２）、Ｌｙｓ（１６７Å２）、Ａｒｇ（１９６Å２）、Ｍｅｔ（１６０Å２）、Ｐｈｅ（１７５Å２）、Ｔｙｒ（１８７Å２）、または、Ｔｒｐ（２１７Å２）に置換する変異であり、自由エネルギー的にも安定化に有利に働くという理由で、より好ましくは、Ｖａｌ、または、Ｉｌｅに置換する変異である。
【００３５】
（７）Ｐｈｅ−３７１を、自由エネルギー的に酵素の立体構造を安定化する方向に働くアミノ酸に置換する変異である。具体的には、脂肪族アミノ酸、酸性アミノ酸、または、側鎖にヒドロキシル基を有するアミノ酸に置換する変異であり、好ましくは、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、または、Ｔｙｒに置換する変異であり、算出されたエネルギー値が特に優れているという理由で、より好ましくは、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、または、Ｔｙｒに置換する変異である。
【００３６】
なお、酸性側鎖を有するものが酸性アミノ酸であり、塩基性側鎖を有するものが塩基性アミノ酸であり、それ以外を中性アミノ酸とする。等電点（ｐＩ）を基準値とした場合、ｐＩが４．０以下のアミノ酸を酸性アミノ酸、ｐＩが７．０以上のアミノ酸を塩基性アミノ酸とする。各々のアミノ酸の等電点（Ｂａｒｒｅｔｔ  Ｇ．Ｃ．著、「Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ」、Ｃｈａｍｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ社、１９８５年、９頁、Ｔａｂｌｅ  ２．２）を基にタンパク質構成アミノ酸について分類すると、酸性アミノ酸は、Ａｓｐ、Ｇｌｕであり、塩基性アミノ酸は、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇであり、それら以外が中性アミノ酸である。
【００３７】
また、脂肪族アミノ酸とは、側鎖が炭素鎖でつながった構造、かつ、環状構造を含まない構造をしているもので、タンパク質構成アミノ酸では、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅが含まれる。
【００３８】
本発明における変異の一部は、側鎖の大きさを変えることによる、タンパク質構造中の空隙を調節する効果を期待した変異であり、側鎖の表面積を規定パラメータとして用いる。「側鎖の表面積」とは、側鎖の大きさを的確に示す側鎖の表面積（接触可能表面積）であり、各種アミノ酸側鎖の表面積、および、その数値については、公知の情報（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｓ．著、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」、１９８７年、１９６号、６４１−６５６ページ、側鎖の表面積の数値についてはＴａｂｌｅ  ２の値など）を利用可能である。
【００３９】
本発明のタンパク質は、安定性や活性の面で特に高いポテンシャルを示すという理由で、配列番号２および４〜１９に示すアミノ酸配列からなるタンパク質であることが最も好ましい。
【００４０】
本発明における変異の設計に関しては、前述したように、立体構造モデリング手法によって得られたストレプトコッカス・ミュータンス由来の水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼのモデリング立体構造を利用することにより達成し得る。したがって、配列番号１に示すアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列に対して、本発明を適応することは容易であるため、該アミノ酸配列に対して本発明の変異を導入したタンパク質も本発明の範囲に含まれる。
【００４１】
本発明における「配列同一性」は、プログラムＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５、３３８９−３４０２（１９９７））を用いたアミノ酸配列相同性解析により決定することができる。なお、ＢＬＡＳＴ分析には、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）等を通じて入手可能なソフトウェアが利用できる。
【００４２】
本発明における「立体構造上同等な位置」とは、ＶＡＳＴ  Ｓｅａｒｃｈなどの立体構造比較・類似構造検索サーバを利用し、立体構造既知のアミノ酸配列（例えば、今回の発明に用いたＰＤＢコード：２ＮＰＸのアミノ酸配列）と、立体構造をベースにしたアミノ酸配列のアラインメントを行うことで容易かつ客観的に同定可能な位置のことである。なお、ＶＡＳＴ  ＳｅａｒｃｈもＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて入手可能である。
【００４３】
なお、配列番号１で示されるストレプトコッカス・ミュータンス由来の水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼと８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する酵素の中には、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ（または、ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨ両用型のオキシダーゼ）も含まれ得る。なぜなら、酵素において補酵素と結合する部位のわずかなアミノ酸配列の違いによって、補酵素の選択性が変わること（および、設計できること）は、すでに公知の情報であるため（Ｐｅｎｎｉｎｇ  Ｔ．Ｍ．＆  Ｊｅｚ  Ｊ．Ｍ．、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．、１０１、３０２７−３０４６（２００１））、ＮＡＤＨオキシダーゼではなく、ＮＡＤＰＨオキシダーゼであっても、本発明を適用して得られたタンパク質は、本発明の範囲に含まれる。
【００４４】
また、本発明によって得られた水生成型ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ変異体は、酵素としての活性（機能）は野生型と同様であり、安定性は野生型よりも向上しているという特徴を有する。
【００４５】
本発明における、配列番号１において、上記（１）〜（７）に示すアミノ酸置換変異を、少なくとも１つ以上有するアミノ酸配列からなるタンパク質は、本質的には、配列番号１のアミノ酸配列からなる野生型のＮＡＤＨオキシダーゼに対して、安定性が向上したことを特徴とするＮＡＤＨオキシダーゼ変異体である。
【００４６】
「安定性」とは、酵素（以後、酵素という表記では、酵素機能を保持した酵素「変異体」も含むものとする）を含む組成物を、ある一定の温度で一定時間処理した後、維持されている酵素の活性残存率（％）が、同一処理を施した比較対象の酵素に比べて、増大することを意味する。上記の処理には、単に一定温度で静置（インキュベート）する処理や、通気・攪拌などの処理が含有されるが、これらに限定されるものではない。本発明では、処理前の酵素活性（ＮＡＤＨ酸化活性）を１００％として、処理後の酵素活性残存率を求めている。
【００４７】
本発明におけるＮＡＤＨオキシダーゼ変異体の酵素活性残存率が、野生型のＮＡＤＨオキシダーゼの酵素活性残存率と比較して増大していた場合、安定性が向上したＮＡＤＨオキシダーゼ変異体が得られたと判断することができる。野生型ＮＡＤＨオキシダーゼの酵素活性が１０〜４０％となるような処理条件において、安定性が向上したＮＡＤＨオキシダーゼ変異体の酵素活性残存率は、野生型ＮＡＤＨオキシダーゼの酵素活性残存率に比べて、１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上増大する。なお、ＮＡＤＨ酸化活性に関しては、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨをＮＡＤ＋に酸化する酵素活性を１Ｕｎｉｔと定義（処理前と処理後の反応液組成や酵素濃度は同一条件とする）して算出するが、これに限定されるものではない。処理条件に関しては、ｐＨ４．０〜１０．０、好ましくは、ｐＨ５．０〜９．０の中性付近の溶液にて、４℃〜８０℃、好ましくは、１５℃〜５０℃の範囲の一定温度下で、一定時間の通気攪拌処理が好適であるが、これらに限定されるものではない。
【００４８】
以下のように、組換えＤＮＡ技術、ＰＣＲ法等を用いて、野生型ＮＡＤＨオキシダーゼＤＮＡへ部位特異的な変異を導入することにより、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを取得することができる。
【００４９】
すなわち、組換えＤＮＡ技術による変異の導入は、例えば、野生型水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼ遺伝子中の変異導入を希望する目的の部位の両側に適当な制限酵素認識配列が存在する場合に、そこを前記制限酵素で切断し、変異導入を希望する部位を含む領域を除去した後、化学合成等によって目的の部位のみに変異導入したＤＮＡ断片を挿入するカセット変異法によって行うことができる。
【００５０】
また、ＰＣＲによる部位特異的変異の導入は、野生型水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼ遺伝子中の変異導入を希望する目的の部位に目的の変異を導入した変異プライマーと前記遺伝子の一方の末端部位の配列を含む変異を有しない増幅用プライマーとで前記遺伝子の片側を増幅し、前記変異用プライマーに対して相補的な配列を有する変異用プライマーと前記遺伝子のもう一方の末端部位の配列を含む変異を有しない増幅用プライマーでもう片側を増幅し、得られた２つの増幅断片をアニーリング操作後、さらに前記２種類の増幅用プライマーでＰＣＲ操作することにより、行うことができる。
【００５１】
本発明のベクターは前述した水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼ変異体ＤＮＡを適当なベクターに連結（挿入）することにより得ることができる。
【００５２】
遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で自律複製可能なものであれば特に限定されず、プラスミドＤＮＡやファージＤＮＡをベクターとして用いることができる。例えば、大腸菌を宿主として用いる場合には、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ等のプラスミドＤＮＡ、ＥＭＢＬ３、Ｍ１３、λｇｔ１１等のファージＤＮＡ等を、酵母を宿主として用いる場合は、ＹＥｐ１３、ＹＣｐ５０等を、植物細胞を宿主として用いる場合には、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１等を、動物細胞を宿主として用いる場合は、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ等をベクターとして用いることができる。
【００５３】
本発明の形質転換体は、宿主となる細胞へ前記ベクターを導入することにより得ることができる。細菌への組換え体ＤＮＡの導入方法としては、例えばカルシウムイオンを用いる方法やエレクトロポレーション法等が挙げられる。酵母への組換え体ＤＮＡの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。植物細胞への組換え体ＤＮＡの導入方法としては、アグロバクテリウム感染法、パーティクルガン法、ポリエチレングリコール法等が挙げられる。動物細胞への組換え体ＤＮＡの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法等が挙げられる。
【００５４】
本発明の酵素変異体は、前記した形質転換体を培地で培養し、培養菌体または培養上清中に本発明の酵素変異体を生成蓄積させ、該培養物から前記酵素変異体を採取することにより製造することができる。したがって、本発明における「培養物」は、前記した形質転換体を培地で培養して得られる、菌体を含む培養液あるいは培養菌体を意味する。形質転換体を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。大腸菌等の細菌を宿主として得られた形質転換細胞を培養する培地としては、完全培地又は合成培地、例えばＬＢ培地、Ｍ９培地等が挙げられる。また、培養温度２０〜４０℃で好気的に培養することにより本発明の酵素変異体を菌体内に蓄積させ、回収する。
【００５５】
本発明の酵素変異体の精製は、前述した培養法により得られる培養物を遠心して回収し（細胞についてはソニケーター等にて破砕する）、アフィニティークロマトグラフィー、陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過等を単独でまたは適宜組み合わせることによって行うことができる。
【００５６】
得られた精製物質が目的の酵素であることの確認は、通常の方法、例えばＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、ウエスタンブロッティング等により行うことができる。したがって、本発明における前記の形質転換体の培養物の「精製処理」とは、酵素活性を失うことなく、目的の酵素以外の不純物を除くことである。
【００５７】
本発明の酵素含有物は、前記の形質転換体の培養物を精製処理したものである。酵素含有物として、例えば、細胞を破砕することで得られる無細胞抽出液や、精製して得られた酵素溶液、あるいは、酵素溶液の凍結乾燥物が挙げられる。
【００５８】
上記ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ変異体を用いて、ＮＡＤ（Ｐ）ＨからＮＡＤ（Ｐ）＋を製造する方法も本発明に含まれる。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ（還元型）が生成されるのは、基本的には、ＮＡＤ（Ｐ）系補酵素を認識する酸化還元酵素による化合物の酸化反応において、副反応としてＮＡＤ（Ｐ）＋が還元されることによるが、これらに限定されるものではない。例えば、酵素以外の酸化還元触媒によって、ＮＡＤ（Ｐ）＋が還元されてＮＡＤ（Ｐ）Ｈが生成される場合も、本発明に含まれる。
【００５９】
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ変異体を用いて、ＮＡＤ（Ｐ）ＨからＮＡＤ（Ｐ）＋を製造する本発明の方法は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを補酵素とする酸化還元酵素（脱水素酵素）を用いた反応系に適用することができる。これらの反応系で生成したＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨ（還元型）を、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ変異体によってＮＡＤ＋／ＮＡＤＰ＋（酸化型）に変換して再生することができる。
【００６０】
すなわち、本発明は、ＮＡＤ（Ｐ）＋を補酵素とする酸化還元酵素と組み合わせて使用し得る、水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼ変異体を提供する。なお、「組み合わせて使用し得る」とは、「組み合わせて使用するため」を意味する。例えば、水生成型ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ変異体の使用の、前、中および／または後に、ＮＡＤ（Ｐ）＋を補酵素とする酸化還元酵素を使用し得る。好ましくは、ＮＡＤ（Ｐ）＋を補酵素とする酸化還元酵素および水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼ変異体を同時的に、基質と接触させる。
【００６１】
酸化還元酵素は、ＥＣ第１群に分類される酵素であり、ＥＣ．１．Ｘ．Ｘ．Ｘ（Ｘは任意）で表記される。本発明によって再生されたＮＡＤ＋／ＮＡＤＰ＋（酸化型）を補酵素として利用する酸化還元酵素は、ＥＣ．１．Ｘ．１．Ｘで表記される。したがって、例えば、ＥＣ．１．１．１．Ｘで表記される酸化還元酵素と、本発明のＮＡＤ（Ｐ）＋再生系を利用した、アルコール誘導体やヒドロキシ酸誘導体の製造方法は、本発明に包含される。
【００６２】
同様に、ＥＣ．１．４．１．Ｘで表記される酸化還元酵素変異体と本発明のＮＡＤ（Ｐ）＋再生系を利用した、アミノ酸誘導体や１級アミン誘導体の製造も本発明に包含される。なお、「誘導体」とは、ある化合物に小部分の構造上の変化があってできる化合物である。化合物中の水素原子あるいは特定の原子団が、他の原子あるいは原子団によって置換された化合物は、該化合物の誘導体であると理解される。
【００６３】
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを補酵素とする酸化還元酵素は、その他にも、炭化水素鎖、含窒素化合物、含硫化合物など、非常に幅広い化合物を基質として利用でき、本発明のＮＡＤ（Ｐ）＋再生系を組み合わせて利用する限り、本発明はこれらの酸化還元酵素の種類には限定されるものではない。
【００６４】
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ変異体は、上述の酸化還元酵素による立体選択的酸化による、エナンチオマー混合物からエナンチオマー過剰率の高い光学活性化合物を生成する反応（光学分割）にも、利用できる。なお、製造するエナンチオマー過剰率の高い光学活性化合物は特に限定されるものではなく、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ変異体はどのような光学活性化合物の製造にも適用できる。
【００６５】
「エナンチオマー混合物」としては、不斉炭素を有し、その不斉炭素に脱水素酵素で酸化され得る水酸基、アミノ基、ホルミル基の結合した化合物が挙げられる。具体的には、ジオール誘導体などを含めたアルコール誘導体、ヒドロキシ酸誘導体、アミノ酸誘導体などを利用でき、例えば、鎖状１，２−ジオール、β−ヒドロキシカルボン酸、２−アミノアルコール、非天然アミノ酸等が挙げられる。
【００６６】
「エナンチオマー過剰率の高い」とは、目的の対掌体が、もう一方の対掌体との混合物において７０％モル量以上、好ましくは約９０％モル量以上、更に好ましくは約９５％モル量以上の割合で存在するものを意味する。
【００６７】
本発明によって得られたＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ変異体を利用する際の反応条件は、用いる基質、組み合わせる酸化還元酵素などにより異なるが、通常、約４〜８０℃、好ましくは、約１０〜５０℃の温度で反応を行い、また、ｐＨは、約４．０〜１０．０、好ましくは、約５．０〜９．０で反応を行う。本発明をＮＡＤ（Ｐ）＋再生系として利用する場合の、ＮＡＤ（Ｐ）＋の濃度は、組み合わせる酸化還元酵素が酸化を触媒する基質に対して約０．００００１〜１モル％（ｗ／ｖ）、好ましくは、約０．００００１〜０．１モル％（ｗ／ｖ）であるが、これらに限定されるものではない。
【００６８】
また、本発明で得られたＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ変異体が反応を触媒するには、酸素が必要であるため、空気または比較的純粋な酸素存在下で行われる事が好ましい。また、酸素の反応液への溶解を促進するため、反応は、振盪あるいは攪拌条件下で行われる事が好ましい。さらに大気圧以上の加圧下で反応する事により、反応液への酸素の溶解度が向上し、反応がより効率に進む場合もある。
【００６９】
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ変異体は、単一にまたは部分的に精製された酵素変異体であってもよいし、これら酵素変異体を産生する微生物の培養物またはその処理物を使用することも可能である。ここで、「培養物」とは、菌体を含む培養液あるいは培養菌体を意味し、「処理物」とは、例えば、粗抽出液、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、あるいはそれらの磨砕物、これらの混合物などを意味する。更にそれらは、酵素自体または菌体のまま公知の手段（例えば、架橋法、物理的吸着法、包括法など）で固定化されて使用できる。
【００７０】
また、反応を行う際、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ変異体と、組み合わせる酸化還元酵素の両者を、同一宿主細胞内に導入した形質転換微生物の培養物、または、その処理物を用いれば、別々に両者を発現する微生物を培養する必要はない。
【００７１】
また、両酵素を同一細胞内に発現した形質転換微生物を用いれば、微生物細胞内のＮＡＤ（Ｐ）＋を使用し、反応が進行することも可能となり、従って、外部から別途ＮＡＤ（Ｐ）＋を添加する必要がなく、または添加するＮＡＤ（Ｐ）＋の量を大幅に減らす事が可能となる。このような形質転換体は、水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼ変異体をコードするＤＮＡおよび組み合わせて使用する酸化還元酵素をコードするＤＮＡを、同一のベクターに組込み、これを宿主に導入することにより製造できるし、また、これら２種類のＤＮＡを不和合性グループの異なる２種のベクターにそれぞれ組込み、それらを同一の宿主に導入することによっても製造できる。
【００７２】
以下に、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例になんら限定されるものではない。
【実施例】
【００７３】
（実施例１）ストレプトコッカス・ミュータンス由来ＮＡＤＨオキシダーゼの立体構造モデリング
配列番号１のアミノ酸配列と相同性の高い配列を、プログラムＢＬＡＳＴで検索した。検索に用いたプログラムの種類はｂｌａｓｔｐで、検索したデータベースはｐｄｂ（ａａ＿ｄｂ、ただしｒｅｄｕｎｄａｎｔ配列を一切除いていないデータベース）である。配列番号１のアミノ酸配列について、検索によって見つかった相同性の高い各種アミノ酸配列との多重アミノ酸配列アラインメントを、プログラムＣｌｕｓｔａｌＸにより作成した。次に、これら立体構造既知のタンパク質の三次元立体構造アラインメントを、三次元グラフィックスプログラムＳｗｉｓｓ−ＰＤＢＶｉｅｗｅｒや、立体構造比較・類似構造検索サーバＶＡＳＴ  Ｓｅａｒｃｈを用いて、先にアミノ酸配列のみから得られた多重アラインメントを立体構造の類似性に基づいて修正した。得られた配列アラインメントに基づいて、類似性が高いと推定される立体構造（ＰＤＢコードが２ＮＰＸ）を、分子モデリングの雛形タンパク質として選択し、補酵素が結合した複合体のこの雛形タンパク質をプログラムＳｗｉｓｓ  ＰＤＢ−Ｖｉｅｗｅｒで表示させ、配列アラインメントに従って、当該酵素のアミノ酸配列（配列番号１）に適合するようアミノ酸残基の置換を行った。挿入、欠失部位については、ＰＤＢから最適な類似部分構造を検索し、その部分構造に置換することにより立体構造モデルを構築した。【００７４】
以上の手順により、触媒反応部位のシステイン残基のチオール基への酸素分子の接触を適切に妨げることが可能な変異部位としては、Ｈｉｓ−１１、Ｌｅｕ−４２、Ｇｌｙ−４３、Ｇｌｙ−４５、Ｍｅｔ−４６、Ｔｙｒ−６２、Ａｌａ−３１２であることを同定した。Ｈｉｓ−１１、Ｔｙｒ−６２は触媒残基でもあり、Ｇｌｙ−４３、Ｇｌｙ−４５への変異は主鎖構造が大きく変わる可能性があったので、それ以外の部位でアミノ酸置換変異を設計した。【００７５】
また、ＮＡＤＨ結合部位の立体障害を排除することが可能な変異部位としては、Ｔｙｒ−１７２であることを同定し、この部位でアミノ酸置換変異を設計した。【００７６】
さらに、自由エネルギー的に酵素の立体構造を安定化する方向に働く変異部位としては、Ａｓｎ−９６、Ｔｈｒ−１９６、Ｐｈｅ−３７１を同定した。プログラムＳｈｒｉｋｅ（特開２００１−１８４３８１）を用いた計算機スクリーニングにより、野生型、および、各種変異体の自由エネルギー差分値を算出し、アミノ酸置換変異が自由エネルギー差分値に与える影響を指標に、アミノ酸変異を設計した。【００７７】
これら変異を有するタンパク質、すなわち、ストレプトコッカス・ミュータンス由来水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼ変異体については、配列番号２および４〜１９に示した。配列番号２はＬ４２Ｍ、配列番号４はＭ４６Ｉ、配列番号５はＮ９６Ｈ、配列番号６はＮ９６Ｒ、配列番号７はＹ１７２Ａ、配列番号８はＹ１７２Ｓ、配列番号９はＴ１９６Ｈ、配列番号１０はＡ３１２Ｉ、配列番号１１はＦ３７１Ａ、配列番号１２はＦ３７１Ｅ、配列番号１３はＦ３７１Ｖ、配列番号１４はＦ３７１Ｉ、配列番号１５はＦ３７１Ｓ、配列番号１６はＦ３７１Ｔ、配列番号１７はＦ３７１Ｙ、配列番号１８はＮ９６Ｒ／Ｔ１９６Ｈ／Ｆ３７１Ａ、配列番号１９はＭ４６Ｉ／Ｎ９６Ｒ／Ｔ１９６Ｈ／Ｆ３７１Ａの各変異体のアミノ酸配列をそれぞれ表す。【００７８】
（実施例２）ＮＡＤＨオキシダーゼ遺伝子を含む組換えベクターの作製および組換え大腸菌の作製
大腸菌においてストレプトコッカス・ミュータンス由来水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼを発現させるために、形質転換に用いる組換えベクターを、特許文献３に記載の方法にて作成した。得られた組換えベクター（ｐＮＴＮＸ）を用いて大腸菌ＨＢ１０１（Ｔａｋａｒａ社製）を形質転換し、組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＮＸ）を得た。野生型ＮＡＤＨオキシダーゼをコードするＤＮＡ配列を、配列番号２０に示した。【００７９】
（実施例３）各種ＮＡＤＨオキシダーゼ変異体遺伝子を含む組換えベクターの作製および組換え大腸菌の作製
組換えプラスミドｐＮＴＮＸを鋳型として、ＮＡＤＨオキシダーゼをコードするＤＮＡ配列の意図した部位に変異を導入できるよう設計した２種の合成プライマーを用いるクイックチェンジ法にて、各種ＮＡＤＨオキシダーゼ変異体遺伝子を含む組み換えプラスミドを得た。クイックチェンジ法に関しては、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用い、添付のプロトコルに従って行った。用いた２種の合成プライマーおよび得られた変異体の対応について、例を示す。配列番号２で示すＬ４２Ｍの変異を導入したＮＡＤＨオキシダーゼ変異体（コードＤＮＡ配列は配列番号２１）は、配列番号２２〜２３の２種の合成プライマーを用いたクイックチェンジ法にて、ＮＡＤＨオキシダーゼＬ４２Ｍ変異体の組換えベクター（ｐＮＴＮＸ−Ｌ０４２Ｍ）を得た。同様の方法で、適切な２種の合成プライマーを設計・利用して、配列番号４〜１９に示す、ＮＡＤＨオキシダーゼ各種変異体の組換えベクターを調製した。なお、配列番号１８〜１９に示す多重変異体は、鋳型となる組換えプラスミドとして変異が導入されたｐＮＴＮＸに、さらにクイックチェンジ法にて別の変異を導入することによって調製した。それぞれのＮＡＤＨオキシダーゼ変異体遺伝子を含む組換えベクターは、実施例１と同様に、大腸菌ＨＢ１０１を形質転換し、組換え大腸菌を得た。【００８０】
（実施例４）組換え大腸菌によるＮＡＤＨオキシダーゼの発現
実施例２、３で得たそれぞれの組換え大腸菌ＨＢ１０１を、半合成培地（グリセリン  １．５％（ｗ／ｖ）、イーストエキス  ０．３％（ｗ／ｖ）、Ｎａ２ＨＰＯ４  ０．６％（ｗ／ｖ）、ＫＨ２ＨＰＯ４  ０．３％（ｗ／ｖ）、ＮａＣｌ  ０．２％（ｗ／ｖ）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．５％（ｗ／ｖ）、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、ｐＨ７．２）に植菌し、３７℃にて３８時間培養し、それぞれの培養液を集菌し培養上清を除いた後、培地と等量の緩衝液（５０ｍＭ  リン酸カリウム、ｐＨ７．０）に懸濁し、超音波破砕法により破砕し無細胞抽出液を得た。以下の測定条件により、各種酵素変異体含有無細胞抽出液が、ＮＡＤＨオキシダーゼ活性を有していることを確認した。【００８１】
［ＮＡＤＨオキシダーゼ活性の測定条件］
５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に、ＮＡＤＨ  ０．１７ｍＭ、ＥＤＴＡ  ０．２ｍＭ、ＦＡＤ  ０．０２ｍＭを含む反応液０．９５ｍＬに、酵素液０．０５ｍＬを添加し（必要に応じて上記緩衝液にて希釈）、一定温度（２５℃）での波長３４０ｎｍの吸光度の減少を測定することにより行った。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨをＮＡＤ＋に酸化する酵素活性を１Ｕｎｉｔと定義した。【００８２】
（実施例５）酸素存在下での水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼ変異体の安定性
実施例４で調製したそれぞれの野生型（対照群として）および変異体の水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼを含むＨＢ１０１無細胞抽出液を、１分間に３４０ｎｍの吸光度の減少が０．１〜０．４程度になるように上記リン酸カリウム緩衝液にて希釈し、温度を３０℃、または、４０℃に一定に保って、一定時間インキュベートした。インキュベート処理前、および、処理後の残存する酵素活性を測定して、各種酵素の酵素活性残存率（％）を算出した。本測定は、数回に分けて行っており、それぞれの測定において、野生型の水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼを対照として利用している。その結果を表１に示す。なお、本測定は、基本的には酸素供給条件下にて実施しており、最後の測定では、スターラーによる攪拌処理による影響も確認した。【００８３】
【表１】
0005908729.tif 000002
【００８４】
水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼ変異体は、野生型と比較して、３０℃で高い酵素活性残存率を維持しており、４０℃でも優れた酵素活性残存率を有している。また、同一の温度・時間のインキュベート処理でも、攪拌処理をすることで酵素活性残存率は下がるが、野生型よりも変異体の方が、酵素活性残存率が相対的に高いという関係は変わらなかった。
【配列表】
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