(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリグリセライド、グリセロリン脂質およびグリセロ糖脂質の分解活性を有し、トリグリセライド分解活性よりもグリセロ糖脂質分解活性の方が高い酵素を水分が０．１重量％以下である低水分油脂に添加して、水分が０．１重量％以下の低い水分下で油脂を改質することを特徴とする、低水分油脂の改質方法。
【請求項２】
水を添加せずに油脂を改質する、請求項１に記載の低水分油脂の改質方法。
【請求項３】
前記酵素をトリグリセライド分解活性として、油脂１ｋｇに対して０．５ユニット以上添加する、請求項１または２に記載の低水分油脂の改質方法。
【請求項４】
前記酵素をグリセロ糖脂質分解活性として、油脂１ｋｇに対して０．５ユニット以上添加する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の低水分油脂の改質方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は低水分条件下で用いることができる油脂改質剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素を用いて油脂を改質する方法は古くから知られており、該酵素としてはリパーゼが挙げられる。リパーゼを用いた油脂の改質方法としては大きく分けて２通りあり、１つは加水分解反応を利用して油脂すなわちトリグリセライドを分解し、ジグリセライドあるいはモノグリセライドを製造するものである。もう１つはエステル交換反応を利用するものであり、低水分条件下で作用させることにより、油脂の脂肪酸種を変換することができる。特に近年エステル交換反応を利用した油脂の改質が盛んになり、リパーゼは産業上有用な酵素であるとの認識が高まってきた。
【０００３】
リパーゼは蛋白であるから、立体構造の維持および触媒機能の発現のためには水の存在が欠かせないものとされている。しかしながら油脂に含有される水分は微量であり、油脂の品質改良を行うためには水の添加が必要であると認識されていた。すなわち、水溶性のリパーゼと油脂とが界面で作用すると考えられている。
【０００４】
油脂の改質の一つである加水分解反応を触媒する際には水の使用は問題ないが、反応を起こさせるために多くの水を添加すると、油脂と水とを均一に混合することが困難になり反応にムラが生じる、あるいは所期の反応後油脂から水を除去する工程が煩雑になるなど、産業上望ましくないことが生じることが容易に推測される。すなわち、可能な限り少ない水分量で反応が進行することが望ましい。
【０００５】
一方エステル交換反応は、低水分条件下での反応であり、リパーゼを働かせようとするあまり水を添加しすぎると、エステル交換反応ではなく加水分解反応が進行してしまうことになる。すなわち、リパーゼ/油脂複合体が初期に形成され、その後、水が反応するのかもう１分子の油脂に含有されている脂肪酸が反応するのかにより、加水分解反応が進行するのか、エステル交換反応が進行するかが選択される。したがって、水は可能な限り少ない条件で反応させることが望ましい。
【０００６】
このような認識のもと、エステル交換反応に関しては検討がなされており、リパーゼの固定化（特許文献１）や超音波によるリパーゼの分散（特許文献２）、リパーゼ粉末製剤（特許文献３）などが考案されてきた。
【０００７】
特許文献１には、基材に固定化されたリパーゼが記載されているが、油脂の中では基材は異物であり、バッチ式で用いる場合にはこれを除去する工程が必要になる。またカラムで用いる場合には、使用後の保管状態如何では微生物汚染の心配があり、産業上必ずしも良い方法とはいえない。さらには、基材に固定化することで、本来のリパーゼの機能が基材の立体障害のために阻害される可能性がある。
【０００８】
また、特許文献２には、エステル共存下にリパーゼを分散する方法が記載されているが、リパーゼ粉末を均一に分散するために超音波を用いることから特別な装置を必要とする。
【０００９】
特許文献３には、リパーゼ粉末製剤を用いる方法が記載されているが、凍結乾燥してはいるものの製剤中に水分、蛋白および油脂が含まれており、微生物の好適培地になりえる要素を含んでおり、常に汚染を監視する必要がある。また、凍結乾燥は高価であり、近年
の特徴として水分の減少にはスプレードライが多用されていることを考えると、産業上凍結乾燥は採用しにくい方法である。乾燥方法をスプレードライに変える場合には、該製剤に含まれる蛋白は卵白由来であり、スプレードライ条件下で安定に存在するとは考えにくい。
【００１０】
このように現在までに様々に工夫はされているものの、油脂の改質において、加水分解反応のための方法は十分ではなく、またエステル交換反応において、特別な装置を必要とせず、微生物による汚染を心配する必要が無い産業上有用な方法は、十分なものではなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開昭５９−１７９０９１号公報
【特許文献２】特開平７−７９７８９号公報
【特許文献３】特開２０１０−６８７５０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、低水分でも油脂を改質することができる油脂改質剤を提供することを課題とする。すなわち、油脂に多くの水を添加する必要がなく、また、特別な装置も必要なく、微生物汚染の可能性もなく、添加するだけで油脂を改質することができる油脂改質剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記課題を解決するため鋭意検討した結果、単純脂質および複合脂質のエステル結合を分解する酵素を含有する油脂改質剤を用いることにより、上記課題を解決できることがわかり、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、単純脂質および複合脂質のエステル結合を分解する酵素を含有する低水分油脂改質剤、該油脂改質剤を用いて製造された低水分油脂、該油脂改質剤を含有する低水分油脂組成物および該油脂改質剤を水分が０．１重量％以下である低水分油脂に添加する低水分油脂の改質方法に存する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の低水分油脂改質剤は、低水分下において、油脂に多くの水を添加せずとも、油脂を改質することができる。水の添加が不要であるため、反応ムラが少なく、反応後、油脂から水を除去する工程も必須ではない。また、特別な装置も必要なく、微生物汚染の可能性なく、添加するだけで油脂を改質することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下に記載する構成要件の説明は、本発明の実施態様の一例（代表例）であり、これらの内容に特定はされない。
【００１６】
本発明は、単純脂質および複合脂質のエステル結合を分解する酵素を含有する低水分油脂改質剤に関する。ここで、単純脂質とは、脂肪酸およびグリセリンのみがエステル結合してできている脂質であり、例えば、トリグリセライド、ジグリセライド、モノグリセライドなどが挙げられる。また、複合脂質とは、分子中にエステル結合した脂肪酸およびグリセリン以外に、リン酸やリン酸エステルあるいは糖や糖鎖などを含む脂質であり、例えば、グリセロリン脂質、グリセロ糖脂質などが挙げられる。
【００１７】
本発明においては、単純脂質としてトリグリセライドのエステル結合を分解し、複合脂質としてグリセロリン脂質及び／またはグリセロ糖脂質のエステル結合を分解する、基質
選択性が低い酵素を用いることが好ましい。特に、トリグリセライド、グリセロリン脂質及びグリセロ糖脂質のエステル結合を分解する酵素を用いることが好ましい。
【００１８】
尚、本発明において、単純脂質のエステル結合を分解する酵素とは、トリグリセライド分解活性を有する酵素であり、複合脂質のエステル結合を分解する酵素とは、複合脂質分解活性を実質的に有する酵素である。
【００１９】
（トリグリセライド分解活性）
トリグリセライド分解活性は、以下の方法により測定することができる。
オリーブ油（ナカライテスク社製）１００ｍｇとアラビアガム（和光純薬社製）５０ｍｇ、水１０ｍｌを加え、ブレンダー（日本精機社製）で１０,０００r.p.m.、１分間乳化する。この溶液（５００μl）、４００ｍＭ  ＭＯＰＳ（ナカライテスク社製）  ｐＨ  ６緩衝液（２５０μＬ）および１００ｍＭ 塩化カルシウム溶液（５０μｌ）の混合液を３７℃で５分間保温したのち、酵素水溶液（１００μl）を加え均一に分散させたのち、３７℃で１０分間保温する。この液に１Ｎ塩酸（１００μＬ）を加え酵素反応を停止させたのち、４重量％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｊａｐａｎ社製）水溶液（１ｍＬ）を加えて酵素反応の結果生じた遊離脂肪酸を溶解させ、２０μＬをデタミナーＮＥＦＡ７５５（協和メディックス社製）で測定する。
酵素反応の結果生じた遊離脂肪酸量での吸光度をＡａとする。また、同様にオレイン酸（標準物質）の１μｍｏｌの吸光度を測定し、これをＡｂとする。
次式より、該酵素のトリグリセライド分解活性を求める。
トリグリセライド分解活性＝
（Ａａ/Ａｂ）×（酵素の希釈倍率）/（反応時間）        ・・・・・式１
ここで、反応時間は１０分間とする。
尚、１分間に１μｍｏｌの遊離脂肪酸を生じさせる酵素量を１ユニットと定義する。
【００２０】
（複合脂質分解活性）
複合脂質分解活性としては、グリセロリン脂質分解活性やグリセロ糖脂質分解活性が挙げられる。本発明において、複合脂質分解活性を実質的に有する酵素とは、該酵素の上記トリグリセライド分解活性に対して、１０％以上の複合脂質分解活性を有する酵素である。
【００２１】
（グリセロリン脂質分解活性）
グリセロリン脂質分解活性は、下の方法により測定することができる。
予め３７℃に加温した４ｗｔ％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｊａｐａｎ社製）水溶液（１０ｍＬ）にレシチン（SLP-ホワイト 辻製油社製）（２００ｍｇ）を少しずつ加えて完全に溶解するまで攪拌する。この基質溶液（５００μＬ）および４００ｍＭ  ＭＯＰＳ（ナカライテスク社製）  ｐＨ６緩衝液（２５０μＬ）の混合液を３７℃で５分間保温したのち、１重量％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に溶解した酵素溶液（１５０μＬ）を加え均一に分散させたのち、３７℃で１０分間保温する。この反応液に１Ｎ塩酸（１００μＬ）を加え酵素反応を停止させたのち、２０μＬをデタミナーＮＥＦＡ７５５（協和メディックス社製）で測定する。
酵素反応の結果生じた遊離脂肪酸量での吸光度をＡｃとする。また、同様にオレイン酸の１μｍｏｌの吸光度を測定し、これをＡｄとする。
グリセロリン脂質分解活性＝
（Ａｃ/Ａｄ）×（酵素の希釈倍率）/（反応時間）        ・・・・・式２
ここで、反応時間は１０分間とする。
本発明においては、上記式１で得られた値を１００％としたときの、式２で得られる値の比率が１０％以上であれば、グリセロ糖脂質分解活性を有する酵素とする。
尚、１分間に１μｍｏｌの遊離脂肪酸を生じさせる酵素量を１ユニットと定義する。
【００２２】
（グリセロ糖脂質分解活性）
グリセロ糖脂質分解活性は、例えば、以下の方法により測定することができる。
すなわち、予め３７℃に加温した４ｗｔ％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｊａｐａｎ社製）水溶液（５０ｍＬ）にジガラクトシルジアシルグリセロール（ＤＧＤＧ）（１．０ｇ）を少しずつ加えて完全に溶解するまで攪拌する。この基質溶液（２１０μＬ）及び４００ｍＭ  ＭＯＰＳ（ナカライテスク社製）ｐＨ６．０緩衝液（３０μＬ）の混合液を３７℃で５分間保温した後、１重量％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に溶解した酵素溶液（３０μＬ）を加え、均一に分散させた後、３７℃で１０分間保温する。この反応液に１Ｎ塩酸（３０μＬ）を加え酵素反応を停止させたのち、２０μＬをデタミナーＮＥＦＡ７５５（協和メディックス社製）で測定する。
酵素反応の結果生じた遊離脂肪酸量での吸光度をＡｅとする。また、同様にオレイン酸の１μｍｏｌの吸光度を測定し、これをＡｆとする。
グリセロ糖脂質分解活性＝
（Ａｅ/Ａｆ）×（酵素の希釈倍率）/（反応時間）        ・・・・・式３
ここで、反応時間は１０分間とする。
本発明においては、上記式１で得られた値を１００％としたときの、式３で得られる値の比率が１０％以上であれば、グリセロ糖脂質分解活性を有する酵素とする。
尚、１分間に１μｍｏｌの遊離脂肪酸を生じさせる酵素量を１ユニットと定義する。
尚、上記方法に使用する装置等が存在しない場合は、同様の測定が可能なものを使用してもよい。また、測定条件は、同等に測定可能であれば、使用する酵素に応じて適宜変更してもよい。
【００２３】
本発明に用いられる単純脂質および複合脂質のエステル結合を分解する酵素は、上記の通り、基質選択性が低いリパーゼであることが好ましい。通常のリパーゼは基質選択性が高く、油脂（トリグリセライド）をよく分解するものの、グリセロリン脂質やグリセロ糖脂質は実質上分解しない。本発明では、選択するリパーゼを抜本的に見直すことにより、低水分下において、油脂に水を添加せずとも、油脂を改質することができることを見出した。
【００２４】
尚、本発明において、低水分とは、水分計(例えば、島津製作所社製  ＭＯＣ−１２０Ｈ）で測定したとき、油脂に対して０．１重量％以下の水分含量であることを言う。
本発明による低水分での油脂の改質が起こる理由は定かではないが、以下の通り推測される。
【００２５】
リパーゼが加水分解反応を触媒するとはすなわち、加水分解反応の中間体であるヘミアセタール構造を安定化させることに起因することが知られている。通常不安定な状態を安定化させることにより、基底状態から中間体へ至るエネルギーレベルを低下させることにより、緩和な条件下加水分解反応が生じるとされている。
【００２６】
リパーゼにおいて中間体構造を安定化させる機能に関わるアミノ酸の部位（触媒残基近傍）は、いくつかの種類に分類されているものの、リパーゼ反応の根幹であるため基質選択性への関与は希薄なものと推定される。基質の認識はそれ以外のアミノ酸の部位でなされており、基質認識能が高いということは、酵素の立体構造が他の基質に対して閉鎖的な状態にあると考えられる。すなわち、触媒残基近傍が他のアミノ酸部位に埋没しており、ある基質にのみ都合がいい立体構造をなしていることが想定される。酵素反応はリパーゼ/基質複合体が形成されるところから開始される。当該複合体が形成される際に酵素の立体構造は変化し、触媒残基近傍は混み合った状態になり、水が立体的、電子的に入り込みにくいために、少量の水では酵素反応は進行しにくいと推定される。反応させるためには、ある程度の量の水を添加し、酵素の立体構造を若干変化させるとともに、反応部位への水の到達確率を上げてやることが必要となると推測している。したがって、水よりも更に立体的に混み合っている状態が想定されるエステル交換反応でも反応しにくいことが推測される。
【００２７】
一方、基質認識能が低いということは、触媒残基近傍およびその周囲の立体構造が比較的緩和であり、他のアミノ酸部位が立体的、電子的に邪魔になりにくいため、多少の基質の構造変化に対して柔軟に対応できると考えられる。触媒残基近傍およびその周囲の立体構造が比較的緩和であると、リパーゼ/基質複合体が形成された際にも、水が反応場近傍に存在する障壁が低いために、少量の水でも反応が進行するものと推測している。したがって、水よりも更に立体的に混み合っている状態が想定されるエステル交換反応でも、反応しやすいことが推測される。このような反応は、油脂の加水分解反応は言うに及ばず、エステル交換反応でも適用できるものと考えられる。
【００２８】
本発明に用いられる酵素は、上記のとおり、トリグリセライド、グリセロリン脂質および/またはグリセロ糖脂質の分解活性を有する酵素であることが好ましい。
すなわち、トリグリセライド分解活性を１００としたときのグリセロリン脂質分解活性が、トリグリセライド分解活性：グリセロリン脂質分解活性で、通常、１００：１０〜１００：１０，０００、好ましくは１００：５０〜１００：５，０００、より好ましくは１００：７０〜１００：１，３００である。
また、トリグリセライド分解活性を１００としたときのグリセロ糖脂質分解活性が、トリグリセライド分解活性：グリセロ糖脂質分解活性で、通常、１００：５〜１００：１０，０００、好ましくは１００：１０〜１００：１０，０００、より好ましくは１００：５０〜１００：５，０００、さらに好ましくは１００：１００〜１００：１，０００である。
さらにまた、グリセロリン脂質およびグリセロ糖脂質の両方の分解活性を有する場合、グリセロ糖脂質分解活性を１００としたときのグリセロリン脂質分解活性が、グリセロ糖脂質分解活性：グリセロリン脂質分解活性で、１００：１〜１００：５００、好ましくは１００：３〜１００：３００、より好ましくは１００：５〜１００：２５０である。
【００２９】
また、油脂の改質能力をより高めるため、トリグリセライド分解活性よりも、グリセロリン脂質分解活性の方が高い酵素、または、トリグリセライド分解活性よりも、グリセロ糖脂質分解活性の方が高い酵素であることが好ましい。
【００３０】
本発明に用いられる酵素は、動植物由来、微生物由来、遺伝子非組み換え、遺伝子組み換え等のいずれの酵素であってもよく、特に限定されない。特に、糸状菌から単離されたものが好ましく、アスペルギルス属由来の物が更に好ましく、アスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）由来のものが更に好ましい。
【００３１】
また、本発明に用いられる酵素は完全に精製したものでも、部分的に精製したものでもよく、また全く精製していないものでもよく、特に精製度合いにより、限定されるものではないが、製品の製造に悪影響を及ぼす可能性が有る物質を排除する点で、精製されているものが好ましい。さらに、本発明の低水分油脂改質剤においては、１種の酵素を含有していても、２種以上の酵素を含有していてもよい。
【００３２】
本発明の低水分油脂改質剤として用いられる酵素量は、酵素活性に基づいて設定することができ、トリグリセライド分解活性としては、油脂１ｋｇに対して通常０．５ユニット以上、好ましくは１００ユニット以上、より好ましくは２５０ユニット以上、通常１００，０００ユニット以下、好ましくは５０，０００ユニット以下、より好ましくは２０，０００ユニット以下である。
【００３３】
特に、グリセロ糖脂質分解活性が、油脂１ｋｇに対して通常０．５ユニット以上、好ましくは１００ユニット以上、より好ましくは２５０ユニット以上、通常２００，０００ユニット以下、好ましくは５０,０００ユニット以下、より好ましくは１０，０００ユニット以下である。
【００３４】
少なすぎると油脂の改質に使用した際に、油脂中での分散が不十分になり、所望の効果が得られない場合があり、多すぎると酵素の触媒としての機能が失われ、酵素１分子あたりの水分子が少なくなり、かえって所望の効果が得られない場合がある。
【００３５】
本発明に用いられる酵素の具体例としては、例えば、ＬｉｐｏｐａｎＦ（登録商標、ノボザイムズ社製）、ＰＡＮＡＭＯＲＥ  ＧＯＬＤＥＮ（登録商標、ＤＳＭ社製）、ＰＡＮＡＭＯＲＥ  ＳＰＲＩＮＧ（登録商標、ＤＳＭ社製）、ＰＡＮＡＭＯＲＥ  ＬＩＰＡＳＥ（登録商標、ＤＳＭ社製）及びＢＡＫＥＺＹＭＥ ＰＨ８００（登録商標、ＤＳＭ社製）など、および特開２００８−２０６５１５号公報に記載の基質選択性が低いリパーゼが挙げられる。
【００３６】
本発明の低水分油脂改質剤には、上記酵素が含有されるが、低水分油脂改質剤としては、酵素の培養液をそのまま乾燥したもの、培養液を基材に吹き付け乾燥したもの、あるいは酵素を糖類などで賦形したものいずれでもよく、基質選択性が低い状態を維持できるものが好ましい。ただし、油脂への水の持込を行わないため、水溶液でないことが好ましい。
【００３７】
また、本発明の酵素を含む水溶液と、以下に詳述するさまざまな酵素あるいは配合剤を混合した上で、凍結乾燥あるいはスプレードライなどにより乾燥させてもよい。また、本発明の酵素の粉末状のものとその他の酵素あるいは物質を直接混合してもよい。
本発明の低水分油脂改質剤は、他の酵素を含んでいてもよい。上記酵素以外の酵素としては、アミラーゼ、ヘミセルラーゼ等の糖質分解酵素、タンパク質分解酵素、グルコースオキシダーゼ等の酸化酵素等を用いることができる。
【００３８】
さらに、本発明の低水分油脂改質剤は、糖類、タンパク質、乳化安定剤、色素、抗酸化剤、香料、塩等の配合剤等を本発明の効果を損なわない範囲で含有していてもよい。
ただし、本発明の低水分油脂改質剤は、単純脂質および複合脂質のエステル結合を分解する酵素のみからなることが好ましい。
【００３９】
本発明の低水分油脂改質剤は、ショートニングなどの製パン用油脂、パーム油などの乳化物作製用油脂などの油脂に含有させることで、油脂を改質することができる。油脂を例えば、乳化機能を向上させた油脂、親水性を向上させた油脂、フレーバーを向上させた油脂などとすることができる。
【００４０】
本発明の低水分油脂改質剤が適用できる油脂として、さらに具体的には、例えば、乳脂、魚鯨油などの動物性油脂、ヤシ油、パーム油、カカオ脂、ゴマ油、サフラワー油、大豆油、トウモロコシ油、菜種油、ひまわり油、綿実油、落花生油、オリーブ油などの植物性油脂、これらを含有する動植物性油脂、これら動植物性油脂の硬化、分別、エステル交換等を施した加工油脂などが挙げられる。
【００４１】
特に、本発明の低水分油脂改質剤は、低水分下で反応可能であることから、水分が低い油脂に用いることが好ましく、例えば、油脂中の水分含量は、通常０．１重量％以下、好ましくは０．０７重量％以下、より好ましくは０．０５重量％以下である。
このようにして、本発明の低水分油脂改質剤を用いて製造された油脂は、本発明の低水分油脂改質剤を除去することなく、そのまま小麦粉、飲料、調味料などの食品に用いるこ
とができる。また、その食品をも改質することができる。
【００４２】
本発明の低水分油脂改質剤を用いて油脂を改質する方法としては、上記本発明の低水分油脂改質剤を上記のような低水分油脂に対して添加した低水分油脂組成物とすればよい。
【００４３】
例えば、下記のような条件で改質することも好ましい。
すなわち、油脂は室温で液体のものが好ましいが、固体油脂を用いる場合には、本発明の酵素を均一に分散させるためには溶解させることが必要で、酵素の安定性を鑑み、通常７０℃以下、好ましくは６０℃以下、より好ましくは５０℃以下で溶解する油脂を用いることが望ましい。
【００４４】
さらに酵素を含有させた油脂の改質に要する時間は保存温度にも依るが、通常３０日間以下、好ましくは２０日間以下、より好ましくは１５日間以下である。
尚、上記油脂組成物は、低水分油脂や低水分油脂改質剤を含むものであるが、これ以外にもタンパク質、乳化安定剤、色素、抗酸化剤、香料、塩等の配合剤等を本発明の効果を損なわない範囲で含有していてもよい。
【実施例】
【００４５】
以下、本発明を実施例によって更に具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実施例の記載に限定されるものではない。
【００４６】
（製造例１）  基質選択性が低いリパーゼの調製
滅菌した下記組成の培地１００ｍｌが入っている５００ｍｌ容の三角フラスコにＳＡＮＫ１１２９８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７５３）を接種し、２６℃にて４日間、１７０ｒｐｍ振とう培養を行った。なお、ＳＡＮＫ１１２９８株は、平成１８年１２月２７日付けで、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７５３で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている（特開２００８−２０６５１５号公報）。
【００４７】
＜培地組成＞
グルコース                ２０    ｇ
イーストエクストラクト    １０    ｇ
カザミノ酸                １０    ｇ
すりゴマ                  ２０    ｇ
トゥイーン８０            １０    ｇ
リン酸水素２カリウム      ０．１  ｇ
硫酸マグネシウム          ０．０５ｇ
純水で１０００ｍｌとした。
【００４８】
培養終了後、４℃、１０，０００×Ｇにて１０分間の遠心分離を行った。得られた上清を凍結乾燥し、基質選択性が低いリパーゼとした。
【００４９】
（測定例１）
製造例１記載の基質選択性が低いリパーゼ、ＬｉｐｏｐａｎＦ（登録商標、ノボザイムズ社製）、ＰＡＮＡＭＯＲＥ  ＧＯＬＤＥＮ（登録商標、ＤＳＭ社製）、ＰＡＮＡＭＯＲＥ  ＳＰＲＩＮＧ（登録商標、ＤＳＭ社製）、ＰＡＮＡＭＯＲＥ  ＬＩＰＡＳＥ（登録商標、ＤＳＭ社製）、ＢＡＫＥＺＹＭＥ ＰＨ８００（登録商標、ＤＳＭ社製）、リパーゼＡＹ「アマノ」３０Ｇ（天野エンザイム社製）およびリパーゼＡ「アマノ」６（天野エンザイム社製）について、トリグリセライド分解活性、グリセロ糖脂質分解活性及びグリセロリン脂質分解活性を上記明細書中に説明した測定方法により測定し算出した。トリグリセライド分解活性を１００％としたときの相対活性で表した結果を表１に示す。尚、表１
において、ＴＧはトリグリセライド分解活性、ＬＴはグリセロリン脂質（レシチン）分解活性、ＤＧはグリセロ糖脂質（ＤＧＤＧ）分解活性を表す。
【００５０】
【表１】
0005863316.tif 000002
【００５１】
＜酵素の精製＞
製造例１記載の基質選択性が低いリパーゼおよびＬｉｐｏｐａｎ  Ｆ（登録商標、ノボザイムズ社製）、について精製をおこない、トリグリセライド分解活性、グリセロ糖脂質分解活性及びグリセロリン脂質分解活性を測定した。
【００５２】
（精製例１）
製造例１記載の基質選択性が低いリパーゼ１ｇに１Ｍ硫安（ナカライテスク社製）溶液２００ｍＬを加え可溶化した液を、予め１Ｍ硫安で平衡化したＴｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍ（登録商標  東ソー社製）カラム（直径２．２ｃｍ×長さ２０ｃｍ）に添加し、吸着させた。１Ｍ硫安で該カラムを十分洗浄した後、６００ｍｌ中に１乃至０Ｍ硫安の直線的濃度勾配を作製して該カラムに吸着した成分を溶出させた。オリーブオイル分解活性は硫安濃度が０Ｍ乃至０．５Ｍの画分（３００ｍｌ）に溶出された。
この画分を２Ｍ硫安溶液４Ｌに対して３回透析を行った溶液を、予め２Ｍ硫安で平衡化したＨｉＴｒａｐ  Ｂｕｔｙｌ  ＦＦ  ５ｍＬ（登録商標  ＧＥヘルスケア社製）カラムに添加し、吸着させた。２Ｍ硫安で該カラムを十分洗浄した後、２５０ｍｌ中に２乃至０Ｍ硫安の直線的濃度勾配を作製して該カラムに吸着した成分を溶出させた。オリーブオイル分解活性は硫安濃度が０．４Ｍ乃至０．８Ｍの画分（５０ｍｌ）に溶出された。この画分は、電気泳動的に単一バンドであり、水４Ｌに対して３回透析を行い、基質選択性が低いリパーゼ精製酵素とした。
【００５３】
（精製例２）
Ｌｉｐｏｐａｎ  Ｆ製剤１ｇに１Ｍ硫安（ナカライテスク社製）溶液２００ｍＬを加え可溶化した液を、予め１Ｍ硫安で平衡化したＴｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍ（登録商標  東ソー社製）カラム（直径２．２ｃｍ×長さ２０ｃｍ）に添加し、吸着させた。１Ｍ硫安で該カラムを十分洗浄した後、６００ｍｌ中に１乃至０Ｍ硫安の直線的濃度勾配を作製して該カラムに吸着した成分を溶出させた。オリーブオイル分解活性は硫安濃度が０Ｍ乃至０．２Ｍの画分（１２０ｍｌ）に溶出された。
この画分を２Ｍ硫安溶液４Ｌに対して３回透析を行った溶液を、予め２Ｍ硫安で平衡化したＨｉＴｒａｐ  Ｂｕｔｙｌ  ＦＦ  ５ｍＬ（登録商標  ＧＥヘルスケア社製）カラムに添加し、吸着させた。２Ｍ硫安で該カラムを十分洗浄した後、２５０ｍｌ中に２乃至０
Ｍ硫安の直線的濃度勾配を作製して該カラムに吸着した成分を溶出させた。オリーブオイル分解活性は硫安濃度が０Ｍ乃至０．４Ｍの画分（５０ｍｌ）に溶出された。この画分は、電気泳動的に単一バンドであり、水４Ｌに対して３回透析を行い、Ｌｉｐｏｐａｎ  Ｆ精製酵素とした。
【００５４】
（測定例２）
精製酵素の基質選択性を測定した。方法は測定例１と同様にしておこなった。結果を表２に示す。トリグリセライド分解活性を１００％としたときの相対活性で表した。
尚、表２において、ＴＧはトリグリセライド分解活性、ＬＴはグリセロリン脂質（レシチン）分解活性、ＤＧはグリセロ糖脂質（ＤＧＤＧ）分解活性を表す。
【００５５】
【表２】
0005863316.tif 000003
【００５６】
この結果から、測定例１に記載した未精製酵素の活性比は、トリグリセライド、グリセロリン脂質、グリセロ糖脂質それぞれを分解する酵素の集合体ではなく、単一の酵素が複数の基質を効率よく分解する性質を有する、基質選択性の低い酵素であることがわかった。
【００５７】
＜油脂中の水分含量の測定法＞
実施例に用いた油脂の水分は以下のようにして測定した。
油脂約２０ｇを水分計（島津製作所社製  ＭＯＣ−１２０Ｈ）にセットする。１１０℃に加温し、重量減少量を測定する。重量減少量を含有水分量とし、百分率にて水分量を算出する。
この手法にてショートニングの水分量を測定したところ、０．０４重量％、パーム油の水分量を測定したところ、０．０３重量％であった。
【００５８】
（実施例１）
油脂としてショートニング（花王社製、ニューエコナＶＥ(Ｍ)）を５０℃に加熱し、液状とした。これに、次に、油脂改質剤として、製造例１で記載した基質選択性が低いリパーゼをトリグリセライド分解活性として８．８ユニット／ｇとなるように加え油脂組成物とし、攪拌しながら氷冷し、２０℃で保存した後（２日、６日、１３日）の酸価を表３に示す。０日の酸価を１００としたときの相対値で表記した。
尚、保存日数０日とは、油脂組成物調製直後を示す。
酸価は酵素による油脂の加水分解反応により生じる遊離脂肪酸の指標となるため、酸価（基準油脂分析法２．３．１−１９９６）を測定することで、酵素による油脂の改質度を評価することができる。酸価の測定方法は以下の通りである。
【００５９】
＜酸価の測定方法＞
油脂組成物０．５〜１０ｇを三角フラスコに秤量し、５０℃温浴中で溶解させる。速やかにヘキサン／イソプロパノール（１：１）溶液１００ｍｌを加えて振り、完全に油脂組成物を溶解させる。ここに１％フェノールフタレイン溶液を１滴滴下し、０．１ｍｏｌ／Ｌの水酸化カリウム標準液で滴定し、溶液の変色が３０秒間続いたときの中和点を終点と
する。
酸価の計算には下記の式を用いた。
酸価＝５．６１１×Ａ×Ｆ／Ｂ
ただし、Ａ：０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化カリウム標準液使用量（ｍｌ）、
Ｆ：０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化カリウム標準液のファクター、
Ｂ：油脂組成物採取量（ｇ）
である。
【００６０】
（比較例１）
実施例１と同様にして、基質選択性の高いリパーゼであるリパーゼＡＹ「アマノ」３０Ｇをショートニングに、トリグリセライド分解活性として８．８ユニット／ｇとなるように加えた。２０℃で保存した後の酸価を表３に示す。０日の酸価を１００としたときの相対活値で表記した。
【００６１】
（比較例２）
実施例１と同様にして、基質選択性の高いリパーゼであるリパーゼＡ「アマノ」６をショートニングに、トリグリセライド分解活性として８．８ユニット／ｇとなるように加えた。２０℃で保存した後の酸価を表３に示す。０日の酸価を１００としたときの相対活値で表記した。
【００６２】
【表３】
0005863316.tif 000004
【００６３】
（実施例２）
実施例１と同様にして、油脂改質剤として、ＰＡＮＡＭＯＲＥ ＧＯＬＤＥＮをトリグリセライド分解活性として、８．８ユニット／ｇとなるようにショートニングに加えた。２０℃で保存した後（４日、１０日）の酸価を表４に示す。０日の酸価を１００としたときの相対値で表記した。
【００６４】
（実施例３）
実施例１と同様にして、油脂改質剤として、ＰＡＮＡＭＯＲＥ ＳＰＲＩＮＧをトリグリセライド分解活性として、８．８ユニット／ｇとなるようにショートニングに加えた。２０℃で保存した後の酸価を表４に示す。０日の酸価を１００としたときの相対活値で表記した。
【００６５】
（実施例４）
実施例１と同様にして、油脂改質剤として、ＰＡＮＡＭＯＲＥ ＬＩＰＡＳＥをトリグリセライド分解活性として、８．８ユニット／ｇとなるようにショートニングに加えた。２０℃で保存した後の酸価を表４に示す。０日の酸価を１００としたときの相対活値で表記した。
【００６６】
（実施例５）
実施例１と同様にして、油脂改質剤として、ＢＡＫＥＺＹＭＥ  ＰＨ８００をトリグリセライド分解活性として、８．８ユニット／ｇとなるようにショートニングに加えた。２０℃で保存した後の酸価を表４に示す。０日の酸価を１００としたときの相対活値で表記した。
【００６７】
【表４】
0005863316.tif 000005
【００６８】
（実施例６）
実施例１と同様にして、油脂改質剤として、ＬｉｐｏｐａｎＦをトリグリセライド分解活性として、１７．７ユニット／ｇとなるようにショートニングに加えた。冷蔵保存した後（２日、７日）の酸価を表５に示す。０日の酸価を１００としたときの相対活値で表記した。
【００６９】
【表５】
0005863316.tif 000006
【００７０】
（実施例７）
実施例１と同様にして、油脂改質剤として、製造例１で製造したリパーゼをトリグリセライド分解活性として、８．８ユニット／ｇとなるようにパーム油に加え、２０℃で保存した後（７日）の酸価を表６に示す。０日の酸価を１００としたときの相対活値で表記した。
【００７１】
（比較例３）
実施例７と同様にして、基質選択性の高いリパーゼであるリパーゼＡＹ「アマノ」３０Ｇをトリグリセライド分解活性として、８．８ユニット／ｇとなるようにパームに加えた。２０℃で保存した後の酸価を表６に示す。０日の酸価を１００としたときの相対活値で表記した。
【００７２】
（比較例４）
実施例７と同様にして、基質選択性の高いリパーゼであるリパーゼＡ「アマノ」６をトリグリセライド分解活性として、８．８ユニット／ｇとなるようにパーム油に加えた。２
０℃で保存した後の酸価を表６に示す。０日の酸価を１００としたときの相対活値で表記した。
【００７３】
【表６】
0005863316.tif 000007
【００７４】
以上のとおり、本発明の油脂改質剤は、低水分下でも、効率よく油脂を分解して、油脂の改質を行うことができることがわかった。また、室温下や冷蔵保存下でも油脂の改質を行うことができることがわかった。