(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Cross-braceモチーフを有する１個のドメインを含みユビキチンリガーゼ（Ｅ３）ではないものである亜鉛結合タンパク質（Ａ）の，該Cross-braceモチーフを構成する部分のアミノ酸配列であって，該Cross-braceモチーフの構成に与る第１番目のアミノ酸から第８番目のアミノ酸までの部分のアミノ酸からなるものであるアミノ酸配列の，該Cross-braceモチーフの構成に与る第６番目のアミノ酸と第７番目のアミノ酸との間を繋ぐアミノ酸配列（Ａ’）又は該アミノ酸配列（Ａ’）の一端若しくは両端のアミノ酸各１個を除いた残り部分を，ＲＩＮＧ型Ｅ３のCross-braceモチーフを構成する部分のアミノ酸配列における該Cross-braceモチーフの構成に与る第６番目のアミノ酸と第７番目のアミノ酸との間を繋ぐアミノ酸配列（Ｂ’）で，又は該アミノ酸配列（Ｂ’）の一端若しくは両端の各１個のアミノ酸を除いた残り部分で，置換して得られるアミノ酸配列を含んでなる，キメラタンパク質であって，該亜鉛結合タンパク質（Ａ）の該ドメインが，ヒトのタンパク質WSTFのＰＨＤドメインである，キメラタンパク質。
【請求項２】
該キメラタンパク質が，該亜鉛結合タンパク質（Ａ）由来の該Cross-braceモチーフを構成する第１番目のアミノ酸に及び／又は第８番目のアミノ酸にそれぞれ付加されたものである追加のアミノ酸を含むことができ，該追加のアミノ酸の個数が，該第１番目の及び／又は第８番目のアミノ酸のそれぞれの側において，１０を超えないものである，請求項１のキメラタンパク質。
【請求項３】
該キメラタンパク質が，該亜鉛結合タンパク質（Ａ）由来の該Cross-braceモチーフを構成する第１番目のアミノ酸に及び／又は第８番目のアミノ酸にそれぞれ付加されたものである追加のアミノ酸を含むことができ，該追加のアミノ酸よりなるアミノ酸配列が，該亜鉛結合タンパク質（Ａ）における該Cross-braceモチーフを構成する第１番目のアミノ酸に及び／又は第８番目のアミノ酸にそれぞれ隣接した部分のアミノ酸配列に一致するものであり，但し，該追加のアミノ酸よりなる配列が該亜鉛結合タンパク質（Ａ）に存在する他のドメインを含むまでには延びていないものである，請求項１のキメラタンパク質。
【請求項４】
該追加のアミノ酸の個数が，該Cross-braceモチーフを構成する第１番目のアミノ酸に及び／又は第８番目のアミノ酸のそれぞれの側において，１０を超えないものである，請求項３のキメラタンパク質。
【請求項５】
該ＲＩＮＧ型Ｅ３のアミノ酸配列（Ｂ’）が，配列番号２又は配列番号５〜１４より選ばれるものである，請求項１ないし４の何れかのキメラタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はキメラタンパク質に関し，特に，酵素であるユビキチンリガーゼ（Ｅ３）のうちＲＩＮＧ型Ｅ３が有するＲＩＮＧドメイン中のヘリックス領域で，Cross-braceモチーフを有する他のタンパク質に由来する当該モチーフを構成するタンパク質断片において該ヘリックス領域に対応する部分を置換した形の，キメラタンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
ユビキチン修飾系は，タンパク質の翻訳後修飾系であり，標的タンパク質のリジン残基にユビキチンを結合させる働きをする。この系は，Ｅ１（ユビキチン活性化酵素），Ｅ２（ユビキチン結合酵素）及びＥ３（ユビキチンリガーゼ）という３種の酵素より構成されており，Ｅ１は，ＡＴＰ依存性にユビキチンとの間で高エネルギーチオエステル結合を形成することによりこれを活性化し，次いでＥ２にこれを転移する。活性化されたユビキチンをチオエステル結合で受け取ったＥ２は，Ｅ３と複合体を形成する。Ｅ３は，標的タンパク質に対する特異的結合部位を有しており，それにより当該タンパク質と結合し，その状態で，ユビキチンを，当該タンパク質のリジン残基のε−アミノ酸に結合させることにより，Ｅ２から当該タンパク質に移す。
【０００３】
Ｅ３は，標的タンパク質に結合したユビキチンのリジン残基のε−アミノ基に，追加のユビキチンを結合させることができ，こうして複数のユビキチンが直鎖状にタンパク質に結合する（ポリユビキチン化）。標的タンパク質に結合したポリユビキチン鎖は，プロテアソーム内の特定の受容体により認識され，当該標的タンパク質のみがプロテアソーム系により分解され，結合していたユビキチンは，ユビキチン修飾系において再利用される。
【０００４】
標的タンパク質のポリユビキチン化は，フォールディングが正常になされなかったタンパク質（ミスフォールドタンパク質）や不要になったタンパク質を細胞から除去する為に重要な役割であり，このシステムにより細胞内のタンパク質の品質管理が行われている。
【０００５】
Ｅ３には，活性中心にＲＩＮＧドメインを持つものがあり，それらはＲＩＮＧ型Ｅ３と呼ばれている。ＲＩＮＧ型Ｅ３は，癌，パーキンソン病，関節リウマチなど多くの重篤な疾患に関わっている。例えば，パーキンソン病に関わるＲＩＮＧ型Ｅ３はParkinと，また乳癌に関わるＲＩＮＧ型Ｅ３はBRCA1と呼ばれ，これらの疾患に特有のものである。このように，各疾患ごとに特有のＲＩＮＧ型Ｅ３が存在し，それらのＲＩＮＧ型Ｅ３は，特定の疾患に特異的なタンパク質を標的として認識し，これをポリユビキチン化して除去する働きをしていると考えられている。また，全てのＲＩＮＧ型Ｅ３の各々は，対応する幾つかのＥ２と選択的に結合し，ＲＩＮＧドメインがその特異性を決定している。
【０００６】
ＲＩＮＧドメインは，一群の亜鉛結合タンパク質が有する特徴的なドメインの一つである。このドメインは，配位子として働く８個のアミノ酸で２個の亜鉛と配位結合することにより形成される，Cross-braceモチーフと呼ばれる構造的特徴部を有している。同モチーフの構成に与るそのそれら８個のアミノ酸のうち，先頭から（すなわち，タンパク質のアミノ末端側から見て）６番目と７番目のアミノ酸（システイン又はヒスチジン）の間が，螺旋状の構造を与えるヘリックス領域と呼ばれる部分である。Ｅ２との選択的な結合に与るのは，このヘリックス領域である。
【０００７】
ＲＩＮＧドメインと同様にCross braceモチーフ及びＥ２との特異的な結合に与るヘリックス領域を有するが，２個の亜鉛との配位結合のうちどちらか一方が水素結合に置き換えられた形のタンパク質ドメインと，２個の亜鉛との配位結合が双方共に水素結合に置き換えられた形のタンパク質ドメインとが知られており，それぞれ，Ｍｉｚドメイン及びＵｂｏｘドメインと呼ばれている。Ｍｉｚドメイン及びＵｂｏxドメインにおいて，亜鉛との配位結合の代わりに水素結合によってCross-braceモチーフの構成に与っているアミノ酸の代表的なものは，Ｃｙｓ，Ｈｉｓ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｇｌｕ，及びＡｓｐである。亜鉛との配位結合の代わりに水素結合よって構成されていても，そのことによるCross-braceモチーフの構造的違いは特になく，また，亜鉛の有無による機能的差異もない。従って，ＲＩＮＧドメイン，Ｍｉｚドメイン及びＵｂｏｘドメインは，活性化されたユビキチンを担持したＥ２及び標的タンパク質と結合して，標的タンパク質をポリユビキチン化するという機能において，等価である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Deshaies RJ, and Joazeiro CA., "RING Domain E3 Ubiquitin Ligases ", Annu Rev Biochem, 78, 339-434 (2009).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ＲＩＮＧ型Ｅ３，Ｍｉｚ型Ｅ３又はＵｂｏx型Ｅ３が関わる何れかの疾患（例えば，乳癌等の癌等）に患者が罹患している場合，当該疾患に特異的なタンパク質に対するユビキチン修飾系の障害が背景に存在し，これには，同疾患に特異的なタンパク質を標的とするＥ３に結合する筈のＥ２に，何らかの障害が生じ，その結果，Ｅ３への結合性の低下や喪失が起こっているものと考えられる。Ｅ２とＥ３との結合は，Ｅ２上のユビキチンを標的タンパク質に転移させるために必要なステップであることから，例えば，患者の組織サンプルに特定疾患との関連が知られているＥ３と標的タンパク質とを試薬として添加し，標的タンパク質にユビキチンが結合するか否かをin vitroで調べることにより，Ｅ２とＥ３との結合の有無及び強さを調べてＥ２の異常の有無をチェックでき，これを通じて患者が特定の疾患に罹患しているか否かを診断することが可能な筈である。
【００１０】
しかしながら，試薬としてＥ３を製造するには，様々な困難が予想される。すなわち，種々の疾患に対応するＲＩＮＧ型Ｅ３の塩基配列及びアミノ酸配列が知られていることから，例えば，それらのデータを用いて遺伝子工学の手法により発現ベクターを構築し，それにより例えば大腸菌等のような宿主細胞を形質転換して，ＲＩＮＧ型Ｅ３を発現させ，単離，精製する，という方法を検討することはできる。しかしながら，一般に，この方法でタンパク質を発現させ，精製して単体で得るのは，技術的に容易でない。すなわち，目的のタンパク質の取得に必要な工程が多く，また試行錯誤を要するため，高いコストを要する。また，必ずしも首尾よく目的のＥ３を発現させられる保証はない。また，目的のタンパク質を発現させることができたとしても，宿主細胞と培地に由来する非常に多くの夾雑タンパク質から，目的のＥ３を高純度で精製するには，高度の技術と何段階にも及ぶ工程を要し，収率も低い。また発現したタンパク質が生理的条件で水に可溶性でない場合，精製は困難である。しかも，精製してＥ３が高純度で得られた場合でも，それが正しいフォールディングをしたものとなる保障もない。特にタンパク質のサイズが大きく構造が複雑である程，正しいフォールディングができない可能性は高まる。また，宿主細胞内での発現から最終生成段階までの過程における，タンパク質の変性の可能性という問題がある。これらに加え，遺伝子工学の手法では，目的タンパク質は水溶液の状態で得られるが，そのままでは不安定であり，長期保存には適さない。長期保存のためにこれを凍結乾燥に付すことは可能であるが，その場合，酵素タンパク質は，用いる添加物や凍結乾燥条件について，最適なものを探さないと，凍結乾燥に際して往々にして不安定化し活性が低下する。また，特定の疾患に関連した活性のある特定のＥ３が首尾よく製造できたとしても，コストの非常に高いものとなり，従って試薬のコストも非常に高くなってしまう。
【００１１】
遺伝子工学の手法の代わりに，Ｅ３を化学合成できれば，これらの問題の幾つかは解消できる筈であるが，Ｅ３は，分子量が大き過ぎ，現在の技術では，到底，化学合成の対象たり得ない。
【００１２】
また，たとえＥ３を遺伝子工学的に合成できたとしても，更に問題がある。すなわち，上記の方法でＥ３活性を確認するには，ユビキチンの受け手となる標的タンパク質も準備しなければならないが，それには，Ｅ３について上に述べたのと同様の問題があることである。
【００１３】
この背景の下で本発明者は，Ｅ２との選択的結合活性を有し，しかもＥ２と結合したときに，標的タンパク質を必要とせずに標的タンパク質以外のタンパク質に対しユビキチン化活性を示すタンパク質を得ることを目的に検討を重ねた。
【００１４】
特定の疾患関連タンパク質を標的タンパク質とするＥ３は，標的タンパク質への特異的結合性を有する部位を有すると共に，ＲＩＮＧドメイン（又は，ＭｉｚドメインやＵｂｏｘドメイン）中に，特定のＥ２に結合する部位（ヘリックス領域）を含んでいる。このため，Ｅ３の全長の代わりに，それらドメインのみを診断に用いるという可能性に，発明者は先ず着目した。しかしながらそのようなアプローチは，依然として問題が残る。それは，ＲＩＮＧドメイン（又は，ＭｉｚドメインやＵｂｏｘドメイン）は，標的タンパク質が反応系に存在しなければＥ２上のユビキチンを何処にも転移できない，という問題である。すなわち，反応系に標的タンパク質を添加しておかなければ，それらドメインに結合したＥ２上には，ユビキチンが結合した状態のまま留まり，それ以上の反応は起こらないため，タンパク質のユビキチン化が起こるか否かを確認できない。従って，ＲＩＮＧ型Ｅ３の全体ではなく，その一部分であるＲＩＮＧドメインを疾患の診断に用いることができたとしても，標的タンパク質も準備する必要性は無くならず，その製造に伴う困難性とコストの問題は解決されない。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記の問題点の解決に向けた検討において，本発明者は，他のタンパク質のCross-braceモチーフを有する種々のドメインに着目した。そして，それら種々のドメイン（例えば，ＰＨＤドメイン，ＦＹＶＥドメイン，ＺＺドメイン，ＭＹＮＤドメイン，Ｂｂｏｘドメインその他）を断片として取り出し，それらのアミノ酸配列において，２個の亜鉛に配位結合することによりCross-braceモチーフを構成している８個のアミノ酸（配位子）のうちの６番目と７番目との間にあるアミノ酸配列の全部又は大半を，ＲＩＮＧドメイン（又は，ＭｉｚドメインやＵｂｏｘドメイン）を構成するアミノ酸配列中のへリックス領域のアミノ酸配列（の全部又は大半）で置き換えた形のキメラタンパク質を作成することを着想した。これに従い，本発明者は，そのような小型のキメラタンパク質を化学合成して，その性質を調べた。その結果，キメラタンパク質は，Ｅ２との選択的結合性を維持していると同時に，Ｅ２と結合した状態で，自身のリジン残基のε−アミノ基にユビキチンを転移させることができることを見出した。本発明は，この発見に基づき，更に検討を加えて完成させたものである。
【００１６】
すなわち，本発明は，以下を提供する。
１．Cross-braceモチーフを有する１個のドメインを含みユビキチンリガーゼ（Ｅ３）ではないものであるタンパク質（Ａ）の，該Cross-braceモチーフを構成する部分のアミノ酸配列であって，該Cross-braceモチーフの構成に与る第１番目のアミノ酸から第８番目のアミノ酸までの部分のアミノ酸からなるものであるアミノ酸配列の，該Cross-braceモチーフの構成に与る第６番目のアミノ酸と第７番目のアミノ酸との間を繋ぐアミノ酸配列（Ａ’）又は該アミノ酸配列（Ａ’）の一端若しくは両端のアミノ酸各１個を除いた残り部分を，ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）のCross-braceモチーフを構成する部分のアミノ酸配列における該Cross-braceモチーフの構成に与る第６番目のアミノ酸と第７番目のアミノ酸との間を繋ぐアミノ酸配列（Ｂ’）で，又は該アミノ酸配列（Ｂ’）の一端若しくは両端の各１個のアミノ酸を除いた残り部分で，置換して得られるアミノ酸配列を含んでなる，キメラタンパク質。
２．該ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）が，ＲＩＮＧ型Ｅ３，Ｍｉｚ型Ｅ３又はＵｂｏx型Ｅ３である，上記１のキメラタンパク質。
３．該キメラタンパク質が，該タンパク質（Ａ）由来の該Cross-braceモチーフを構成する第１番目のアミノ酸に及び／又は第８番目のアミノ酸にそれぞれ付加されたものである追加のアミノ酸を含むことができ，該追加のアミノ酸の個数が，該第１番目の及び／又は第８番目のアミノ酸のそれぞれの側において，１０を超えないものである，上記１又は２のキメラタンパク質。
４．該キメラタンパク質が，該タンパク質（Ａ）由来の該Cross-braceモチーフを構成する第１番目のアミノ酸に及び／又は第８番目のアミノ酸にそれぞれ付加されたものである追加のアミノ酸を含むことができ，該追加のアミノ酸よりなるアミノ酸配列が，該タンパク質（Ａ）における該Cross-braceモチーフを構成する第１番目のアミノ酸に及び／又は第８番目のアミノ酸にそれぞれ隣接した部分のアミノ酸配列に一致するものであり，但し，該追加のアミノ酸よりなる配列が該タンパク質（Ａ）に存在する他のドメインを含むまでには延びていないものである，上記１又は２のキメラタンパク質。
５．該追加のアミノ酸の個数が，該Cross-braceモチーフを構成する第１番目のアミノ酸に及び／又は第８番目のアミノ酸のそれぞれの側において，１０を超えないものである，上記４又は２のキメラタンパク質。
６．該タンパク質（Ａ）が亜鉛結合タンパク質である，上記１ないし５の何れかのキメラタンパク質。
７．該タンパク質（Ａ）の該ドメインが，ＰＨＤドメイン，ＺＺドメイン，Ｂｂｏｘドメイン，ＦＹＶＥドメイン，ＭＹＮＤドメインよりなる群より選ばれるものである，上記１ないし５の何れかのキメラタンパク質。
８．該ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）のアミノ酸配列（Ｂ’）が，配列番号２又は配列番号５〜１４より選ばれるものである，上記１ないし７の何れかのキメラタンパク質。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば，特定の標的タンパク質を必要とすることなく，当該タンパク質に特異的なＲＩＮＧ型Ｅ３，Ｍｉｚ型Ｅ３又はＵｂｏx型Ｅ３のそれらＲＩＮＧドメイン，Ｍｉｚドメイン又はＵｂｏｘドメイン中のヘリックス領域と，これが選択的に結合する筈の生体サンプル中のＥ２との選択的結合の有無や強さ，及びユビキチン化活性の有無を，測定することができる。種々の疾患関連タンパク質その他の特定のタンパク質を標的タンパク質とするそれらのＥ３のヘリックス領域のアミノ酸配列は，別の特定のタンパク質を標的タンパク質とするＥ３のヘリックス領域のアミノ酸配列とは必ず相違する。従って，本発明のキメラタンパク質は，それ自身特定の標的タンパク質，例えば特定の疾患関連タンパク質に関連付けられており，患者サンプル中のＥ２における機能的異常の有無を特定の疾患との関連において検出できる。こうして，本発明のキメラタンパク質は，患者の組織サンプルを用いて当該疾患の有無を検出するための診断薬として使用することができる。更には，ユビキチン修飾系は，生物（ヒト等の動物並びに植物を含む真核生物）における広範なタンパク質の品質管理を担っており，既知の疾患関連タンパク質に止まらず，その他の種々のタンパク質の品質管理を通じて生体の生理的機能の調整を行っていると考えられることから，本発明のキメラタンパク質は，例えば，各種の生物における生理学的機能の研究や，医薬，農薬等の薬物の研究・開発におけるツールとしても，使用することができる。
【００１８】
また，本発明のキメラタンパク質は，ＲＩＮＧ型Ｅ３（又はＭｉｚ型やＵｂｏｘ型）それ自体のような大きなサイズのタンパク質でなく，Cross-braceモチーフを含んだ１個のドメインを有する他のタンパク質の該ドメイン部分の配列と，その一部に置き換わるＲＩＮＧドメイン等のヘリックス領域の配列とからなるか，あるいはこれに限られた個数のアミノ酸からなる追加の配列が一端又は両端に付加されたキメラタンパク質であり，サイズが小さい。そのため，本発明のキメラタンパク質においては，フォールディングのミスが生じる懸念が殆どない。またそのような小さなサイズのものであることから，化学合成は，自動化されている市販のペプチド合成装置を用いて簡単に行うことができ，夾雑タンパク質を実質的に含まず，ほとんど純粋な粉体として得ることができる。また生成物は粉体として得られるため，その状態で長期保存が可能である
更には，本発明のキメラタンパク質は，複数のドメインを含まないことから，Ｅ２への選択的結合以外に予想外の特異的な結合相手が存在して検査を妨害する，といった懸念がない。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は，Oryza sativaのユビキチンリガーゼのＲＩＮＧドメインの，Cross-braceモチーフを構成するタンパク質領域のアミノ酸配列を示す。二重下線は，亜鉛に対し配位子として機能するアミノ酸残基を示し，一重下線を付した配列は，ＰＨＤドメインのアミノ酸配列を置換するのに用いた部分を示す。
【図２】図２は，Homo sapiensのタンパク質WSTFのＰＨＤドメインの，Cross-braceモチーフを構成するタンパク質領域を含んだアミノ酸配列を示す。二重下線は，亜鉛に対し配位子として機能するアミノ酸残基を示し，下線を付した配列は，ＲＩＮＧドメイン中のヘリックス領域由来のアミノ酸配列によって置換される部分を示す。
【図３】図３は，得られたキメラタンパク質のアミノ酸配列を示す。二重下線は，亜鉛に対し配位子として機能するアミノ酸残基を示し，一重下線を付したアミノ酸配列は，置換により導入された配列を示す。
【図４】図４は，得られたキメラタンパク質の，種々のＥ２の存在下でのＥ３活性の有無及び強さを示すウエスタンブロッティングの図面代用写真。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明のキメラタンパク質は，ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）であるＲＩＮＧ型（又はＭｉｚ型，Ｕｂｏｘ型）Ｅ３のＲＩＮＧドメイン（又は，Ｍｉｚドメイン，Ｕｂｏｘドメイン）のCross-braceモチーフを構成するアミノ酸（すなわち，亜鉛に配位し又は水素結合を提供するアミノ酸）のうち先頭から第６及び第７番目のアミノ酸の間を繋ぐ部分であるヘリックス領域のアミノ酸配列を用い，これによりCross-braceモチーフを有する他の適宜のタンパク質の，当該モチーフを有するドメイン部分のアミノ酸配列の所定領域（Cross-braceモチーフを構成するアミノ酸のうち先頭から第６及び第７番目のアミノ酸の間を繋いでいる領域）を置き換えることことにより得られる。
【００２１】
異なる標的タンパク質，例えば異なる疾患関連タンパク質に対応するＥ３のヘリックス領域のアミノ酸配列は，相互に異なっており，このため，異なったアミノ酸配列のヘリックス領域に結合する各Ｅ２もまた，そのようなヘリックス領域がこれに選択的に結合することを通じて，ヘリックス領域の起源であるＥ３が対応しているのと同一の標的タンパク質に関連付けられている。
【００２２】
このことから，種々の疾患に関連するＲＩＮＧ型（又はＭｉｚ型やＵｂｏｘ型）Ｅ３の各ドメイン中にあるヘリックス領域（多数のもののアミノ酸配列が当業者に周知である）のアミノ酸配列（その全長であっても，一端又は両端に位置する各アミノ酸を除いたものであってもよい）によって，他のタンパク質のCross-braceモチーフ例えば，Cross-braceモチーフを有する亜鉛結合タンパク質や，それらの亜鉛に配位するアミノ酸残基が水素結合を提供するアミノ酸残基に置き換わったものの，当該モチーフを有する領域のアミノ酸配列のうち，当該モチーフの構成に（配位子として又は水素結合を提供する残基として）与る８個のアミノ酸のうち先頭から第６番目のアミノ酸と第７番目のアミノ酸とを繋ぐアミノ酸配列（その全長でもよく，一端又は両端に位置する各アミノ酸を除いた部分であってもよい）を置換した形のアミノ酸配列を有するタンパク質を種々設計することができる。
【００２３】
従って，本発明において，ヘリックス領域のアミノ酸としては，例えば，特定の疾患に対応づけられている周知のＲＩＮＧ型（又はＭｉｚ型やＵｂｏｘ型）Ｅ３の当該領域のアミノ酸配列を，それぞれ選択して用いることができる。それにより，種々の疾患に対応したキメラタンパク質を得ることができる。
【００２４】
本発明において使用できる，ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）以外のタンパク質のCross-braceモチーフを有するドメインとしては，特に制限はなく，そのようなモチーフを有する適宜のタンパク質のものであってよい。本発明において，Cross-braceモチーフは，ヘリックス領域のためにキメラタンパク質全体の構造的安定性を確保できればよいからである。Cross-braceモチーフを有するドメインの例としては，ＰＨＤドメイン，ＦＹＶＥドメイン，ＺＺドメイン，ＭＹＮＤドメイン，及びＢｂｏｘドメインがあげられる。これらは全て，ＲＩＮＧドメインと同様，２個の亜鉛と結合する配位子として機能する８個のアミノ酸を有し，それらのうち先頭から第６番目と第７番目のアミノ酸を繋ぐアミノ酸配列の全部又は大半を，ＲＩＮＧ（又はＭｉｚ，Ｕｂｏｘ）ドメインのヘリックス領域のアミノ酸配列の全部又は大半で置換して，本発明のキメラタンパク質を作成することができる。
【００２５】
本発明のキメラタンパク質は，Cross-braceモチーフを構成するアミノ酸配列〔配位子として機能するアミノ酸の１番目のものと８番目のもの〕のそれぞれ前及び／又は後に，付加された追加のアミノ酸配列を含んでいてもよい。少ない数のアミノ酸が付加されていてもCross-braceモチーフに保持されたキメラタンパク質の全体構造には，影響を及ぼさないからである。そのような追加のアミノ酸配列は，任意のアミノ酸を任意に並べることで構成してもよく，また，当該Cross-braceモチーフが起源とした元のタンパク質において同モチーフに隣接して存在しているアミノ酸配列と同一のものとしてもよい。
【００２６】
追加のアミノ酸配列を任意のアミノ酸から構成する場合，追加するアミノ酸の個数に明確な上限はないが，本発明のキメラタンパク質とＥ２との選択的結合性に影響を与えるおそれを生じないことが好ましい。そのためには，通常，Cross-braceモチーフを構成するアミノ酸配列の前及び／又は後に付加される追加のアミノ酸配列中のアミノ酸の個数が，それぞれ１０を超えないようにすればよい。従ってまた，それぞれ８を超えないように，或いはそれぞれ６を超えないように等，適宜設定してキメラタンパク質を設計することができる。
【００２７】
追加のアミノ酸配列として，ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）以外のタンパク質のCross-braceモチーフが起源とした元のタンパク質において同モチーフに隣接して存在しているアミノ酸配列と同一のものを選択する場合にも，追加されるアミノ酸の個数には明確な上限はない。従って，追加のアミノ酸配列は適宜の長さまで延びていてよいが，元のタンパク質に存在する他のドメインを含む程には延びていないようにすればよい。そうすることにより，本発明のキメラタンパク質が別の新たな選択的結合性を帯びることとなる可能性を排除できるからである。必須ではないが，より簡便には，Cross-braceモチーフを構成するアミノ酸配列の前及び／又は後に含まれる追加のアミノ酸配列中のアミノ酸の個数を，それぞれ１０を超えないようにすればよい。そのような個数では別のドメインが本発明のキメラタンパク質に取り込まれるおそれがないからである。勿論，追加のアミノ酸の個数につき８を超えないよう又は６を超えないように設計してもよい。
【００２８】
ヒトの各種疾患に対応づけられたユビキチンリガーゼ（Ｅ３）のヘリックス領域のアミノ酸配列の代表的な例としては，次の表１に示したものが挙げられる。これら，及び特定の疾患に対応づけられている限りその他のヘリックス領域のアミノ酸の何れも，本発明のキメラタンパク質を製造するために使用してよい。
【００２９】
【表１】
0005971788.tif 000002
【００３０】
表１において，配列番号５〜１３のアミノ酸配列はＲＩＮＧ型Ｅ３からのものであり，配列番号１４のそれはＵｂｏｘ型Ｅ３からのものである。
【００３１】
本発明のキメラタンパク質は，アミノ酸残基数の少ないタンパク質であるため，化学合成により容易に製造することができる。タンパク質の化学合成の方法は，当業者に周知であり，合成装置も種々市販されており，それらのマニュアルに従って装置に必要情報を入力することによって自動合成を簡単に行うことができる。
【実施例】
【００３２】
以下，実施例を参照して本発明を更に具体的に説明するが，当該実施例は単なる例示であって，本発明がこれに限定されることは意図しない。
【００３３】
１．キメラタンパク質
（１）ドメインの選択
ＲＩＮＧ型Ｅ３の一例として，Oryza sativa（イネ）のユビキチンリガーゼ（タンパク質ＥＬ５）を選択した。そのＲＩＮＧドメインの，Cross-braceモチーフを含む部分のアミノ酸配列を配列番号１及び図１に示す。この配列において，アミノ酸１，４，２０，２２，２５，２８，３９及び４２（図１において二重下線で示す。）の８個のアミノ酸残基が配位子として機能するものであり，これらのうち６番目（Cys２８）と７番目（Cys３９）の間を繋ぐアミノ酸配列（すなわち，Val Asp Met Trp Leu Gly Ser His Ser Thr：配列番号２）がヘリックス領域に相当する。
【００３４】
ヘリックス領域からのアミノ酸配列の移植先となるドメインの一例として，Homo sapiens（ヒト）のタンパク質WSTFのＰＨＤドメインの，Cross-brace領域を含んだ配列番号３のアミノ酸配列（図２）を選択した。この配列においてアミノ酸３，６，１８，２１，２６，２９，４４及び４７（図２において二重下線で示す。）の８個のアミノ酸が配位子として機能するものであり，これらのうち６番目（Ｃｙｓ２９）と７番目（Ｃｙｓ４４）の間にある１４個のアミノ酸（すなわち，アミノ酸３０〜４３）よりなる配列（以下，「配列Ｘ」）は，機能不明のものである。なお配位子として機能する第１番目のアミノ酸残基の前（上流）にある２個のアミノ酸，及び配位子として機能する第８番目アミノ酸残の後ろ（下流）にある４個のアミノ酸は，何れも元のＰＨＤドメイン由来のものである。
【００３５】
（２）キメラタンパク質の設計
ヘリックス領域のアミノ酸配列（配列番号２）のうち，先頭の１残基を除いた残り（図１の一重下線を付した配列）を，上記ＰＨＤドメインの配列Ｘのうち先頭の１残基を除いた残り（図２の一重下線を付した配列）と置き換えたアミノ酸配列（配列番号４）よりなるキメラタンパク質を，下記のとおりにして化学合成した。
【００３６】
（３）キメラタンパク質の化学合成
(i) 材料
(a) ＰｙＢＯＰ： ヘキサフルオロリン酸  （ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウム
(b) ＨＯＢｔ： Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール
(c) ＮＭＭ： Ｎ−メチルモルホリン
(d) ペプチド合成装置： ＰＳＳＭ−８（島津製作所製）
(ii) 方法
Ｆｍｏc固相法により，室温下ペプチド合成装置にて，ＰｙＢＯＰ−ＨＯＢｔ−ＮＭＭ（１：１：１．５）を用い，１００μｍｏｌスケールで，配列番号４のアミノ酸配列よりなるキメラタンパク質を化学合成した。得られた反応物をメタノールで５回洗浄後，ｔ−ブチルメチルエーテルで２回洗浄し，デシケーターに入れ，真空ポンプで２４時間引きながら乾燥させた。
得られた乾燥物に，クリーベイジ試薬〔８２．５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ），５％蒸留水，５％チオアニソール，３％エチルメチルスルフィド，２．５％エタンジオール，２％チオフェノール〕を１ｍｌ加えて室温下で８時間反応させることにより，脱保護を行った。反応溶液に，無水ジエチルエーテルを１０ｍｌ加えて３４００ｒｐｍで１５分間遠心した後，上清を捨てた。この操作を５回繰り返した。遠心後に残ったペプチドのペレットに窒素をブローし，キメラタンパク質を得た。
【００３７】
合成されたキメラタンパク質のアミノ酸配列（配列４）において，アミノ酸３，６，１８，２１，２６，２９，４０及び４３（図３において二重下線で示す。）の８個のアミノ酸残基が配位子として機能するアミノ酸であり，これらのうち６番目（Ｃｙｓ２９）と７番目（Ｃｙｓ４０）の間を繋ぐ１０個のアミノ酸よりなる配列中，先頭の１個を除く９個のアミノ酸よりなる部分（図３において下線で示す。）が，ＲＩＮＧドメインのヘリックス領域由来配列である。
【００３８】
（４）キメラタンパク質の精製
分析のため，上記で得られたキメラタンパク質を，５ｍｌの１０ｍＭ塩酸溶液：アセトニトリル（４：１）に溶解させて，ＨＰＬＣにより以下の条件で精製した。
カラム：Shim-pack PREP-ODS  ５μｍ，４．６ｍｍｘ２５ｃｍ（島津製作所製）
流速：１２ｍｌ／分
移動相Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液
移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡアセトニトリル溶液
勾配（移動相Ａ／移動相Ｂ）：７５／２５〜６０／４０（３０分）
検出波長：２２０ｎｍ
精製後，その溶液を−８０℃で２４時間凍結乾燥させた。
【００３９】
（５）透析
乾燥物を１ｍｌの６Ｍ塩酸グアニジンに溶かし，脱気した溶液Ａ（下記）に対して，室温にて２時間の透析を２回行った。次いで，これを溶液Ａに対して４℃にて終夜透析した。
溶液Ａ：２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．９），５０ｍＭ塩化ナトリウム，１ｍＭジチオトレイトール，５０ｍＭ塩化亜鉛
【００４０】
（６）Ｅ３活性の確認
上記で得られたキメラタンパク質について，種々のＥ２との関係でのＥ３活性の有無及び強さについて調べた。活性測定には，Ubiquitinylationキット（BIOMOL社）を使用し，表２に従って，反応液を準備した。
【００４１】
【表２】
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【００４２】
上記において，Ｅ２としては，次の１１種類を用いた：UbcH1(His6-tagged), UbcH2(His6-tagged), UbcH3(His6-tagged), UbcH5a(His6-tagged), UbcH5b(His6-tagged), UbcH5c(His6-tagged), UbcH6(His6-tagged), UbcH7(His6-tagged), UbcH8(His6-tagged), UbcH10(His6-tagged), Ubc13/Mms2(His6-tagged)。なおこれらは何れもヒト起源のＥ２であるが，イネもそれらに対応するＥ２を有しているため，種の相違は問題とならない。
【００４３】
表１の下記の組成に従って，すべての成分を混ぜ合わせ，３７℃で1時間インキュベートした後，Non-reducing Gel Loading Buffer（キット内容をそのまま使用）を加えて，反応を終了させた（全２２個）。この反応液につきＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った〔泳動緩衝液：２５ｍＭトリス，１９２ｍＭグリシン，０．１％ＳＤＳ），ゲル濃度１０〜２０％〕。
【００４４】
次いでウエスタンブロッティングを行った。ＰＶＤＦ膜に１時間，１５０ｍＡで転写した後，ブロッキング液（１％ＢＳＡを含むＴＢＳ−Ｔ*）でブロッキングを行った。
（注）ＴＢＳ−Ｔ：２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４），０．１５Ｍ塩化ナトリウム，０．１％Tween−２０
【００４５】
抗体溶液として，ストレプトアビジン検出系のVECTASTAIN Elite ABCキット（VECTOR LABORATORIES社）を使用した。このキットのＡおよびＢ液を２滴ずつ５ｍｌのＴＢＳに溶かして膜に添加した。
（注）ＴＢＳ：２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４），０．１５Ｍ塩化ナトリウム
ウエスタンブロッティング検出試薬として，ＥＣＬ試薬（ＧＥヘルスケア社）を使用した。ＥＣＬ試薬内のＡおよびＢ液を１ｍｌずつ混ぜて膜に添加し，発光検出装置LAS3000（FUJIFILＭ社）で検出を行った。
【００４６】
次いで，ウエスタンブロッティング検出試薬のＥＣＬ試薬（ＧＥヘルスケア社）を用いて発光させ，検出装置ＬＡＳ３０００（FUJIFILM社）で検出を行った。この結果を図４に示した。図より，UbcH2, UbcH5a, UbcH5b及びUbcH5cでは明らかにポリユビキチン化が起こっており，作成したキメラタンパク質が強いＥ３活性を有していることが分かる。UbcH1及びUbcH3では，弱いＥ３活性が認められる。UbcH6及びUbcH13/Mms2でも，Ｅ３活性を有しているが，モノユビキチン化が起こっている。
このように，本発明のキメラタンパク質は，Ｅ２との選択的結合性及びＥ３活性（タンパク質のユビキチン化活性）を併せ持つことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明のキメラタンパク質は，ヒトその他の動物における各種の疾患の診断のために，また医薬や農薬の研究・開発のツールとして，使用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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