(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成したＲＮＡ分子を含む組成物であって、該粒子は、
（ａ）２５℃で液相である油コア、および
（ｂ）カチオン性脂質
を含む、組成物であって、
ここで、該油コアは、スクアレン、スクアラン、またはこれらの組合せを含み、
ここで、該ＲＮＡ分子が抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子であり、該ＲＮＡ分子はウイルス様粒子内に被包されず、該ＲＮＡ分子は感染性ウイルス粒子の産生を誘導することができない、組成物。
【請求項２】
前記粒子が界面活性剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記界面活性剤が、ソルビタントリオレエート、もしくはポリソルベート８０、またはこれらの組合せである、請求項２から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、０．０１％〜２．５％（ｖ／ｖ）の非イオン性界面活性剤を含む、請求項３または４に記載の組成物。
【請求項６】
前記界面活性剤が、前記水中油型エマルジョンの水相中に存在する、請求項３から５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
０．２％〜９％（ｖ／ｖ）の油を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記カチオン性脂質が、１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣコレステロール）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）、１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、ジパルミトイル（Ｃ１６：０）トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＰＴＡＰ）、ジステアロイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジオレオイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＯＥＰＣ）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）からなる群より選択される、請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記カチオン性脂質がＤＯＴＡＰであり、前記カチオン性水中油型エマルジョンが、０．５ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰを含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記カチオン性脂質がＤＣコレステロールであり、前記組成物が、０．１ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌのＤＣコレステロールを含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
前記カチオン性脂質がＤＤＡであり、前記組成物が、０．１ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌのＤＤＡを含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１２】
前記カチオン性脂質がＤＯＴＭＡであり、前記組成物が、０．５ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＭＡを含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１３】
前記カチオン性脂質がＤＯＥＰＣであり、前記組成物が、０．５ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌのＤＯＥＰＣを含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１４】
前記カチオン性脂質がＤＯＤＡＣであり、前記組成物が、０．５ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌのＤＯＤＡＣを含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１５】
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、該水中油型エマルジョンの水相中にポリマーをさらに含む、請求項１から１４までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ポリマーがポロキサマーである、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、０．１％〜１０％（ｖ／ｖ）のポリマーを含む、請求項１５または１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記エマルジョンの粒子の平均直径が２００ｎｍ以下である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記エマルジョンのＮ／Ｐ比が４：１〜１４：１である、請求項１から１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記エマルジョンの粒子の平均直径が８０ｎｍ〜１８０ｎｍであり、前記エマルジョンのＮ／Ｐ比が少なくとも４：１である、請求項１から１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
請求項１から２０のいずれか一項に記載の組成物であって、該組成物が、緩衝化されており、かつ６．０〜８．０のｐＨを有する、組成物。
【請求項２２】
前記ｐＨが６．２〜６．８である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
請求項１から２２のいずれか一項に記載の組成物であって、該組成物が無機塩をさらに含み、無機塩の濃度が３０ｍＭ以下である、組成物。
【請求項２４】
請求項１から２３のいずれか一項に記載の組成物であって、該組成物が、非イオン性等張化剤をさらに含む、組成物。
【請求項２５】
前記非イオン性等張化剤が、糖もしくは糖アルコールまたはこれらの組み合わせである、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記非イオン性等張化剤が、２８０ｍＭ〜３００ｍＭの濃度で存在する、請求項２４または２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記組成物が、等張性である、請求項１から２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、該粒子は、
（ａ）油コア、
（ｂ）カチオン性脂質、および
（ｃ）リン脂質
を含む、組成物であって、
ここで、該油コアは、スクアレン、スクアラン、またはこれらの組合せを含み、
ここで、該負に荷電した分子が抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子であり、該ＲＮＡ分子はウイルス様粒子内に被包されず、該ＲＮＡ分子は感染性ウイルス粒子の産生を誘導することができない、組成物。
【請求項２９】
前記リン脂質が、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、卵ホスファチジルコリン（卵ＰＣ）、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰｙＰＥ）、またはこれらの組合せである、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物を調製する方法であって、該方法は、
（ａ）カチオン性水中油型エマルジョンであって、該エマルジョンの粒子は、
（ｉ）２５℃で液相である油コア、および
（ｉｉ）カチオン性脂質、ならびに必要に応じて
（ｉｉｉ）リン脂質
を含む、カチオン性水中油型エマルジョンと、
（ｂ）負に荷電した分子を含む水性溶液と
を提供するステップと、
該負に荷電した分子が該カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成するように、（ａ）と（ｂ）とを合わせるステップと
を含む、方法であって、
ここで、該油コアは、スクアレン、スクアラン、またはこれらの組合せを含み、
ここで、該負に荷電した分子が抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子であり、該ＲＮＡ分子はウイルス様粒子内に被包されず、該ＲＮＡ分子は感染性ウイルス粒子の産生を誘導することができない、方法。
【請求項３１】
前記カチオン性水中油型エマルジョンおよび前記水性溶液が、１：１（ｖ／ｖ）の比で合わされる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
免疫応答を生じさせるための薬剤の製造における、請求項１から２９のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項３３】
免疫応答を生じさせるために使用される、請求項１から２９のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１０年７月６日に出願された米国仮出願第６１／３６１，８９２号の利益を主張し、上記米国仮出願の全教示は参考として本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
背景
核酸治療剤は、遺伝性障害から後天性状態の範囲の疾患、例えば、がん、感染性障害（ＡＩＤＳ）、心疾患、関節炎、および神経変性障害（例えば、パーキンソン病およびアルツハイマー病）などの処置に関して有望である。遺伝的欠損を修復するか、または外来遺伝子産物の発現を誘導するために機能遺伝子を送達することができるだけでなく、内在性遺伝子発現を阻害することによって、治療効果をもたらすために核酸を送達することもできる。遺伝子発現の阻害は、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、二本鎖ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、またはリボザイムによって媒介され得る。
【０００３】
このような療法の重要なステップは、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞内に核酸分子を送達することである。しかし、核酸分子、特に、ＲＮＡ分子のｉｎ  ｖｉｖｏ送達は、いくつかの技術的なハードルに直面する。第１に、細胞性ヌクレアーゼおよび血清ヌクレアーゼのために、ｉｎ  ｖｉｖｏで注入されるＲＮＡの半減期は、わずか約７０秒である（例えば、非特許文献１を参照）。化学修飾を使用することによって、注入されるＲＮＡの安定性を増大させる努力が行われているが、化学的変化が細胞傷害作用を増大させるか、または機能を喪失もしくは低下させるいくつかの事例が存在する。一具体例では、細胞は、刻々とホスフェートがホスホロチオエートによって置換されるＲＮＡｉ二本鎖の投与に耐性ではない（非特許文献２）。したがって、治療応答を誘発するのに、ｉｎ  ｖｉｖｏで十分な量であるが、宿主に対して毒性ではない核酸分子（特に、ＲＮＡ分子）を送達することができる送達システムを開発する必要がある。
【０００４】
核酸ベースのワクチンは、ワクチン接種に対する魅力的な手法である。例えば、抗原をコードするプラスミドＤＮＡの筋肉内（ＩＭ）免疫化は、細胞性免疫応答および体液性免疫応答を誘導し、チャレンジから保護することができる。ＤＮＡワクチンは、タンパク質抗原を使用する従来のワクチン、または弱毒化病原体に勝るある特定の利点を提供する。例えば、タンパク質ワクチンと比較した場合、ＤＮＡワクチンは、そのネイティブコンホメーションにおいて適切に折り畳まれた抗原を産生させ、細胞性免疫応答を生じさせることにおいてより有効となり得る。ＤＮＡワクチンにはまた、死滅病原体または弱毒化病原体に付随するいくつかの安全性問題がない。例えば、死滅ウイルス調製物は、残留性の生存ウイルスを含有する場合があり、弱毒化ウイルスは、病原性表現型に変異または復帰する場合がある。
【０００５】
核酸ベースのワクチンの別の限界は、非ヒト霊長類およびヒトにおいて強力な免疫応答を得るために大用量の核酸が一般に必要とされることである。したがって、核酸ベースのワクチンの効力を増強させるための送達システムおよびアジュバントが必要とされる。細胞内に核酸分子を導入するための様々な方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン（ｐｏｌｙｐｒｅｎｅ）トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、およびリポフェクションなどが開発されている。
【０００６】
カチオン性脂質は、細胞内に遺伝子を送達するために、リポソームとして広く処方され
ている。しかし、血清はアニオン性物質を含有するので、少量の血清でさえ（約１０％）、リポソーム／ＤＮＡ複合体のトランスフェクション活性を劇的に低減させ得る。最近、細胞内にＤＮＡ分子を送達するためのカチオン性脂質エマルジョンが開発された。例えば、非特許文献３を参照。
【０００７】
特許文献１および特許文献２には、カチオン性微粒子を使用して脊椎動物被験体に核酸分子を送達する方法が記載されている。微粒子は、ポリマー、例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物などを含み、カチオン性界面活性剤を使用して形成される。核酸分子は、微粒子の表面に吸着される。
【０００８】
非特許文献４および非特許文献５は、ＤＮＡ分子のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏトランスフェクション効率を増強するのに使用される様々な水中油型エマルジョン処方物を記載している。
【０００９】
非特許文献６は、ＤＮＡの送達システム／アジュバントとしてカチオン性サブミクロンエマルジョンを伴う手法を記載している。サブミクロンエマルジョン手法は、大規模に製造され、商業的に認可された製品（Ｆｌｕａｄ（登録商標））で使用されている、強力な水中スクアレンアジュバントであるＭＦ５９に基づく。１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）が、プラスミドＤＮＡの細胞内送達を促進するのに使用された。
【００１０】
ＤＮＡベースのワクチンは、疾患の予防および処置に関して、かなり有望であるが、その安全性に関して一般的な懸念が提起されている。導入されるＤＮＡ分子は、潜在的に、宿主ゲノム中に組み込まれる場合があり、またはこれらが様々な組織に分布するために、抗原の望ましくない持続発現に至る場合がある。さらに、ある特定のＤＮＡウイルスは、ＤＮＡ分子を送達するためのビヒクルとしても使用されている。その感染特性のために、このようなウイルスは、非常に高いトランスフェクション率を達成する。使用されるウイルスは、機能的な感染性粒子がトランスフェクション細胞内でまったく形成されないような様式で遺伝的に改変されている。しかし、これらの予防策にもかかわらず、例えば、潜在的な組換え事象のために、導入される遺伝子およびウイルス遺伝子の制御されない伝播のリスクを無視することはできない。これはまた、ＤＮＡが、例えば、組換えによって宿主細胞のゲノムのインタクトな遺伝子内に挿入されるリスクも必然的に伴い、その結果、上記遺伝子は、変異し、したがって完全もしくは部分的に不活化される場合があり、または誤情報を生じさせる場合がある。言い換えれば、細胞にとって不可欠な遺伝子産物の合成が完全に抑制される場合があり、または代わりに、改変された、もしくは誤った遺伝子産物が発現される。さらに、臨床グレードのウイルスベクターの製造および精製をスケールアップすることは、一般に困難である。
【００１１】
細胞増殖の調節に関与する遺伝子内にＤＮＡが組み込まれる場合、１つの特定のリスクが発生する。この場合、宿主細胞は、変性した状態になり、がんまたは腫瘍形成に至る場合がある。さらに、細胞内に導入されるＤＮＡを発現させる場合、対応するＤＮＡビヒクルが、ウイルス性ＣＭＶプロモーターなどの強いプロモーターを含有することが必要である。処置細胞のゲノム内にこのようなプロモーターが組み込まれると、細胞内の遺伝子発現の調節の望まれない変化がもたらされる場合がある。免疫応答を誘導するための作用物質として（例えば、ワクチンとして）ＤＮＡを使用することの別のリスクは、異質なＤＮＡが導入された患者内での病原性抗ＤＮＡ抗体の誘導であり、したがって、望ましくない免疫応答をもたらすことである。
【００１２】
抗原またはその誘導体をコードするＲＮＡ分子も、ワクチンとして使用することができ
る。ＲＮＡワクチンは、ＤＮＡワクチンと比較した場合、ある特定の利点を提供する。第１に、ＲＮＡは、宿主ゲノム中に組み込まれず、したがって、悪性腫瘍のリスクをなくす。第２に、ＲＮＡは急速に分解されるために、異質な導入遺伝子の発現は長続きしないことが多く、抗原の制御されない長期間の発現を回避する。第３に、ＲＮＡ分子は、コードされる抗原を発現するのに細胞質に送達される必要があるだけであり、一方、ＤＮＡ分子は、核膜を透過しなければならない。
【００１３】
それにもかかわらず、ＤＮＡベースのワクチンと比較して、ＲＮＡベースのワクチンに寄せられる関心は相対的に軽微である。ＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドは、親水性の負に荷電した分子であり、これらは、治療剤またはワクチンとして投与される場合、ヌクレアーゼによる分解に非常に感受性である。さらに、ＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドは、細胞内に能動的に輸送されない。例えば、非特許文献７を参照。
【００１４】
非特許文献８は、β−ガラクトシダーゼをコードする裸のＲＮＡが送達される自己複製ＲＮＡワクチンを記載し、ＣＤ８＋細胞の誘導が報告された。
【００１５】
Ｍｏｎｔａｎａら（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  ２００７年、１８巻、３０２〜３０８頁）は、遺伝子移入のために、ＲＮＡキャリアとしてカチオン性固体脂質ナノ粒子を使用することを記載している。固体脂質ナノ粒子は、ＲＮＡ分子を分解から保護することが示され、ＲＮＡ−粒子複合体をウニの卵内にマイクロインジェクションした後、リポータータンパク質（フルオレセイン）の発現が検出された。
【００１６】
ＷＯ２０１０／００９２７７では、（ａ）両親媒性ペプチド、（ｂ）脂質、および（ｃ）少なくとも１つの免疫原性種を含むナノ脂質ペプチド粒子（Ｎａｎｏ  Ｌｉｐｉｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ（ＮＬＰＰ））が開示されている。ある特定の実施形態では、ＮＬＰＰは、カチオン性脂質などの正に荷電した「捕捉剤」も組み入れる。捕捉剤は、負に荷電した免疫原性種（例えば、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子）をつなぎ留めるのに使用される。ＮＬＰＰの調製には両親媒性ペプチドが必要であり、これは、脂質成分を可溶化し、ナノ粒子を形成するのに使用される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】米国特許第６，７５３，０１５号明細書
【特許文献２】米国特許第６，８５５，４９２号明細書
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Ｋｕｒｒｅｃｋ、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈ．  （２００３年）２７０巻：１６２８〜４４頁
【非特許文献２】Ｈａｒｂｏｒｔｈら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｖ．  （２００３年）１３巻（２号）：８３〜１０５頁
【非特許文献３】Ｋｉｍら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、（２００５年）２９５巻、３５〜４５頁
【非特許文献４】Ｋｉｍら（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００１年、１８巻、５４〜６０頁）
【非特許文献５】Ｃｈｕｎｇら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、２００１年、７１巻、３３９〜３５０頁）
【非特許文献６】Ｏｔｔら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、２００２年、７９巻、１〜５頁）
【非特許文献７】Ｖａｊｄｙ，  Ｍ．ら、Ｍｕｃｏｓａｌ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ａｎｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ−，  ＤＮＡ−  ａｎｄ  ＲＮＡ  −ｂａｓｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２００４年、８２巻（６号）：６１７〜２７頁
【非特許文献８】Ｙｉｎｇら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１９９９年、５巻、８２３〜８２７頁）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
したがって、核酸分子または他の負に荷電した分子の送達システムを提供する必要がある。送達システムは、核酸ベースのワクチン、特に、ＲＮＡベースのワクチンに有用である。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、一般に、ＲＮＡ分子などの負に荷電した分子を細胞に送達するのに使用することができるカチオン性水中油型エマルジョンに関する。エマルジョン粒子は、油コアおよびカチオン性脂質を含む。カチオン性脂質は、負に荷電した分子と相互作用し、それによって、分子をエマルジョン粒子につなぎ留めることができる。本明細書に記載されるカチオン性エマルジョンは、核酸分子（抗原をコードするＲＮＡ分子など）を細胞に送達すること、および核酸ベースのワクチンを処方することに特に適している。
【００２１】
一態様では、本発明は、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した（ｃｏｍｐｌｅｘ）ＲＮＡ分子を含む組成物であって、粒子が、（ａ）２５℃で液相である油コア、および（ｂ）カチオン性脂質を含む、組成物を提供する。カチオン性水中油型エマルジョン粒子は、ナノ脂質ペプチド粒子（ＮＬＰＰ）ではないことが好ましい。油コアは、４℃で液相であることが好ましい。任意選択により、エマルジョン粒子の平均直径は約８０ｎｍ〜約１８０ｎｍであり、エマルジョンのＮ／Ｐは、少なくとも４：１である。任意選択により、エマルジョンは、緩衝化されており（例えば、クエン酸バッファー、コハク酸バッファー、酢酸バッファーなどで）、約６．０〜約８．０、好ましくは、約６．２〜約６．８のｐＨを有し、３０ｍＭ以下の無機塩（例えば、ＮａＣｌ）を含有する。任意選択により、エマルジョンは、エマルジョンを等張性にするのに十分な量で、糖、糖アルコール、またはこれらの組合せなどの非イオン性等張化剤（ｔｏｎｉｃｉｆｙｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）をさらに含む。
【００２２】
ある特定の実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、非イオン性界面活性剤などの界面活性剤をさらに含む。例示的な非イオン性界面活性剤には、例えば、ＳＰＡＮ８５（ソルビタントリオレエート）、Ｔｗｅｅｎ８０（ポリソルベート８０；ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、またはこれらの組合せが含まれる。カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．０１％〜約２．５％（ｖ／ｖ）の界面活性剤を含むことができる。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．０８％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ８０、または代わりに、約０．５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ８０、および約０．５％（ｖ／ｖ）のＳＰＡＮ８５を含むことができる。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはＰＥＧ−脂質、例えば、ＰＥＧ２０００ＰＥ、ＰＥＧ５０００ＰＥ、ＰＥＧ１０００ＤＭＧ、ＰＥＧ２０００ＤＭＧ、ＰＥＧ３０００ＤＭＧ、またはこれらの組合せなども使用することができる。
【００２３】
カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成したＲＮＡ分子を含む組成物は、約０．００５％〜約１．２５％（ｖ／ｖ）の界面活性剤を含むことができる。例えば、ＲＮＡ−エマルジョン複合体を含む組成物は、約０．０４％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ８０（ポリソルベート８０；ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、または代わりに、約０．２５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ８０、および約０．２５％（ｖ／ｖ）のＳＰＡＮ８５（ソルビタントリオレエート）を含むことができる。
【００２４】
ある特定の実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、リン脂質をさらに含む。例示的なリン脂質には、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰｙＰＥ）、または卵ホスファチジルコリン（卵ＰＣ）が含まれる。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ（好ましくは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ）のＤＯＰＥ、または代わりに、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ（好ましくは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ）のＤＰｙＰＥ、または代わりに、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ（好ましくは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ）の卵ＰＣを含むことができる。
【００２５】
カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成したＲＮＡ分子を含む組成物は、約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ（好ましくは、約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ）のＤＯＰＥ、または代わりに、約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ（好ましくは、約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ）のＤＰｙＰＥ、または代わりに、約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ（好ましくは、約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ）の卵ＰＣを含むことができる。
【００２６】
ある特定の実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、エマルジョンの水相中でポリマーまたは界面活性剤をさらに含む。例示的なポリマーには、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７（エチレンオキシド／プロピレンオキシドブロックコポリマー：Ｈ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｘ（ＯＣＨ３ＣＨ（ＣＨ３））ｙ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｚＯＨ）などのポロキサマーが含まれる。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．０５％〜約２０％（ｗ／ｖ）のポリマー、または約０．１％〜約１０％（ｗ／ｖ）のポリマー、例えば、０．５％（ｗ／ｖ）または１％（ｗ／ｖ）のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７などを含むことができる。カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成したＲＮＡ分子を含む組成物は、約０．０２５％〜約１０％（ｖ／ｖ）のポリマー、または約０．５％〜約５％（ｖ／ｖ）のポリマー、例えば、０．２５％（ｗ／ｖ）、または０．５％（ｗ／ｖ）のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７などを含むことができる。
【００２７】
エマルジョンは、粒子形成を促し、負に荷電した分子とカチオン性粒子との間の複合体形成を改善し、負に荷電した分子（ＲＮＡ分子など）の適切な脱複合体形成（ｄｅｃｏｍｐｌｅｘａｔｉｏｎ）／放出を促進し、負に荷電した分子の安定性を増大させ（例えば、ＲＮＡ分子の分解を防止し）、またはエマルジョン粒子の凝集を防止することができる成分を含むことができる。
【００２８】
ある特定の実施形態では、油コアは、以下、すなわち、ヒマシ油、ヤシ油、トウモロコシ油、綿実油、月見草油、魚油、ホホバ油、ラード油、亜麻仁油、オリーブ油、ラッカセイ油、サフラワー油、ゴマ油、ダイズ油、スクアレン、ヒマワリ油、コムギ胚芽油、鉱油、またはこれらの組合せから選択される油を含むことができる。油は、ダイズ油、ヒマワリ油、オリーブ油、スクアレン、またはこれらの組合せであることが好ましい。カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．２％〜約２０％（ｖ／ｖ）の油、好ましくは、約０．０８％〜約５％の油、約０．０８％の油、約４％〜約５％の油、約４％の油、約４．３％の油、または約５％の油を含むことができる。カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成したＲＮＡ分子を含む組成物は、約０．１％〜約１０％（ｖ／ｖ）の油、好ましくは、約２％〜約２．５％（ｖ／ｖ）の油を含むことができる。
【００２９】
ある特定の実施形態では、カチオン性脂質は、以下のうちの１つから選択される：１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣ
コレステロール）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）、１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、ジパルミトイル（Ｃ１６：０）トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＰＴＡＰ）、ジステアロイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）、ＷＯ２０１１／０７６８０７（参照により本明細書に組み込まれている）の表６（１１２〜１３９頁）に開示されている脂質Ｅ０００１〜Ｅ０１１８もしくはＥ０１１９〜Ｅ０１８０、またはこれらの組合せ。特に好適なカチオン性脂質として、ＤＯＴＡＰ、ＤＣコレステロール、およびＤＤＡが挙げられる。
【００３０】
ある特定の実施形態では、カチオン性脂質は、以下のうちの１つから選択される：１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣコレステロール）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）、１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、ジパルミトイル（Ｃ１６：０）トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＰＴＡＰ）、ジステアロイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）、ＷＯ２０１１／０７６８０７（参照により本明細書に組み込まれている）の表６（１１２〜１３９頁）に開示されている脂質Ｅ０００１〜Ｅ０１１８もしくはＥ０１１９〜Ｅ０１８０、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジオレオイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＯＥＰＣ）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、またはこれらの組合せ。特に好適なカチオン性脂質として、ＤＯＴＡＰ、ＤＣコレステロール、ＤＤＡ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＥＰＣ、ＤＳＴＡＰ、ＤＯＤＡＣ、ＤＯＤＡＰ、およびＤＬｉｎＤＭＡが挙げられる。
【００３１】
ある特定の実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌ、好ましくは、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰを含む。
【００３２】
カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成したＲＮＡ分子を含む組成物は、約０．４ｍｇ／ｍｌ〜約１．５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは、約０．４ｍｇ／ｍｌ〜約０．８ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰを含むことができる。任意選択により、エマルジョン粒子の平均直径は、約８０ｎｍ〜約１８０ｎｍであり、エマルジョンのＮ／Ｐは、少なくとも４：１である。任意選択により、組成物は、緩衝化されており（例えば、クエン酸バッファー、コハク酸バッファー、酢酸バッファーなどで）、約６．０〜約８．０のｐＨを有し、３０ｍＭ以下の無機塩（例えば、ＮａＣｌ）を含有する。任意選択により、組成物は、組成物を等張性にするのに十分な量で、糖、糖アルコール、またはこれらの組合せなどの非イオン性等張化剤をさらに含む。
【００３３】
ある特定の実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．６２ｍｇ／ｍｌ〜約４．９２ｍｇ／ｍｌのＤＣコレステロールを含む。
【００３４】
カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成したＲＮＡ分子を含む組成物は、約０．３１ｍｇ／ｍｌ〜約２．４６ｍｇ／ｍｌのＤＣコレステロールを含むことができる。任意選択により、エマルジョン粒子の平均直径は、約８０ｎｍ〜約１８０ｎｍであり、エマルジョンのＮ／Ｐは、少なくとも４：１である。任意選択により、組成物は、緩衝化されており（例えば、クエン酸バッファー、コハク酸バッファー、酢酸バッファーなどで）、約６．０〜約８．０、好ましくは、約６．２〜約６．８のｐＨを有し、３０ｍＭ以下の無機塩（例えば、ＮａＣｌ）を含有する。任意選択により、組成物は、組成物を等張性にするのに十分な量で、糖、糖アルコール、またはこれらの組合せなどの非イオン性等
張化剤をさらに含む。
【００３５】
ある特定の実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．７３ｍｇ／ｍｌ〜約１．４５ｍｇ／ｍｌのＤＤＡを含む。
【００３６】
カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成したＲＮＡ分子を含む組成物は、約０．３６５ｍｇ／ｍｌ〜約０．７２５ｍｇ／ｍｌのＤＤＡを含むことができる。任意選択により、エマルジョン粒子の平均直径は、約８０ｎｍ〜約１８０ｎｍであり、エマルジョンのＮ／Ｐは、少なくとも４：１である。任意選択により、組成物は、緩衝化されており（例えば、クエン酸バッファー、コハク酸バッファー、酢酸バッファーなどで）、約６．０〜約８．０、好ましくは、約６．２〜約６．８のｐＨを有し、３０ｍＭ以下の無機塩（例えば、ＮａＣｌ）を含有する。任意選択により、組成物は、組成物を等張性にするのに十分な量で、糖、糖アルコール、またはこれらの組合せなどの非イオン性等張化剤をさらに含む。
【００３７】
ある特定の実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌ、好ましくは、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＭＡを含む。
【００３８】
カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成したＲＮＡ分子を含む組成物は、約０．４ｍｇ／ｍｌ〜約１．５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは、約０．４ｍｇ／ｍｌ〜約０．８ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＭＡを含むことができる。任意選択により、エマルジョン粒子の平均直径は、約８０ｎｍ〜約１８０ｎｍであり、エマルジョンのＮ／Ｐは、少なくとも４：１である。任意選択により、組成物は、緩衝化されており（例えば、クエン酸バッファー、コハク酸バッファー、酢酸バッファーなどで）、約６．０〜約８．０、好ましくは、約６．２〜約６．８のｐＨを有し、３０ｍＭ以下の無機塩（例えば、ＮａＣｌ）を含有する。任意選択により、組成物は、組成物を等張性にするのに十分な量で、糖、糖アルコール、またはこれらの組合せなどの非イオン性等張化剤をさらに含む。
【００３９】
ある特定の実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌ、好ましくは、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約１．８ｍｇ／ｍｌのＤＯＥＰＣを含む。
【００４０】
カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成したＲＮＡ分子を含む組成物は、約０．４ｍｇ／ｍｌ〜約１．５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは、約０．４ｍｇ／ｍｌ〜約０．９ｍｇ／ｍｌのＤＯＥＰＣを含むことができる。任意選択により、エマルジョン粒子の平均直径は、約８０ｎｍ〜約１８０ｎｍであり、エマルジョンのＮ／Ｐは、少なくとも４：１である。任意選択により、組成物は、緩衝化されており（例えば、クエン酸バッファー、コハク酸バッファー、酢酸バッファーなどで）、約６．０〜約８．０、好ましくは、約６．２〜約６．８のｐＨを有し、３０ｍＭ以下の無機塩（例えば、ＮａＣｌ）を含有する。任意選択により、組成物は、組成物を等張性にするのに十分な量で、糖、糖アルコール、またはこれらの組合せなどの非イオン性等張化剤をさらに含む。
【００４１】
ある特定の実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．７３ｍｇ／ｍｌ〜約１．４５ｍｇ／ｍｌのＤＯＤＡＣを含む。
【００４２】
カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成したＲＮＡ分子を含む組成物は、約０．３６５ｍｇ／ｍｌ〜約０．７２５ｍｇ／ｍｌのＤＯＤＡＣを含むことができる。任意選択により、エマルジョン粒子の平均直径は、約８０ｎｍ〜約１８０ｎｍであり、エマルジョンのＮ／Ｐは、少なくとも４：１である。任意選択により、組成物は、緩衝化さ
れており（例えば、クエン酸バッファー、コハク酸バッファー、酢酸バッファーなどで）、約６．０〜約８．０、好ましくは、約６．２〜約６．８のｐＨを有し、３０ｍＭ以下の無機塩（例えば、ＮａＣｌ）を含有する。任意選択により、組成物は、組成物を等張性にするのに十分な量で、糖、糖アルコール、またはこれらの組合せなどの非イオン性等張化剤をさらに含む。
【００４３】
一例では、本発明は、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、カチオン性水中油型エマルジョンが、（ａ）約０．５％（ｖ／ｖ）の油、および（ｂ）カチオン性脂質を含む、組成物を提供する。
【００４４】
一例では、本発明は、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、（ａ）約０．２５％（ｖ／ｖ）の油、および（ｂ）カチオン性脂質を含む、組成物を提供する。
【００４５】
別の例では、本発明は、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、粒子が、（ａ）油コア、（ｂ）カチオン性脂質、および（ｃ）リン脂質を含む、組成物を提供する。好適なリン脂質には、例えば、ＤＰｙＰＥ、ＤＯＰＥ、および卵ＰＣが含まれる。好ましくは、組成物（負に荷電した分子−エマルジョン複合体）は、約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ（より好ましくは、約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ）のＤＯＰＥ、または代わりに、約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ（より好ましくは、約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ）のＤＰｙＰＥ、または代わりに、約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ（より好ましくは、約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ）の卵ＰＣを含む。
【００４６】
別の例では、本発明は、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、粒子が、（ａ）油コア、および（ｂ）ＤＯＴＡＰを含み、水中油型エマルジョンが、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約３．０ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰ、好ましくは、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰを含む、組成物を提供する。いくつかの実施形態では、負に荷電した分子はＲＮＡであり、エマルジョン粒子の平均直径は、約８０ｎｍ〜約１８０ｎｍであり、エマルジョンのＮ／Ｐは、少なくとも４：１である。任意選択により、組成物は、緩衝化されており（例えば、クエン酸バッファー、コハク酸バッファー、酢酸バッファーなどで）、約６．０〜約８．０のｐＨを有し、３０ｍＭ以下の無機塩（例えば、ＮａＣｌ）を含有する。任意選択により、組成物は、組成物を等張性にするのに十分な量で、糖、糖アルコール、またはこれらの組合せなどの非イオン性等張化剤をさらに含む。
【００４７】
別の例では、本発明は、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、粒子が、（ａ）油コア、および（ｂ）ＤＯＴＡＰを含み、組成物が、約０．４ｍｇ／ｍｌ〜約１．５ｍｇ／ｍｌ、例えば、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．７ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌなどのＤＯＴＡＰを含む、組成物を提供する。いくつかの実施形態では、負に荷電した分子はＲＮＡであり、エマルジョン粒子の平均直径は、約８０ｎｍ〜約１８０ｎｍであり、エマルジョンのＮ／Ｐは、少なくとも４：１である。任意選択により、組成物は、緩衝化されており（例えば、クエン酸バッファー、コハク酸バッファー、酢酸バッファーなどで）、約６．０〜約８．０、好ましくは、約６．２〜約６．８のｐＨを有し、３０ｍＭ以下の無機塩（例えば、ＮａＣｌ）を含有する。任意選択により、組成物は、組成物を等張性にするのに十分な量で、糖、糖アルコール、またはこれらの組合せなどの非イオン性等張化剤をさらに含む。
【００４８】
別の例では、本発明は、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、粒子が、（ａ）油コア、および（ｂ）ＤＣコレス
テロールを含み、水中油型エマルジョンが、約２．４６ｍｇ／ｍｌ〜約４．９２ｍｇ／ｍｌのＤＣコレステロールを含む、組成物を提供する。いくつかの実施形態では、負に荷電した分子はＲＮＡであり、エマルジョン粒子の平均直径は、約８０ｎｍ〜約１８０ｎｍであり、エマルジョンのＮ／Ｐは、少なくとも４：１である。任意選択により、組成物は、緩衝化されており（例えば、クエン酸バッファー、コハク酸バッファー、酢酸バッファーなどで）、約６．０〜約８．０、好ましくは、約６．２〜約６．８のｐＨを有し、３０ｍＭ以下の無機塩（例えば、ＮａＣｌ）を含有する。任意選択により、組成物は、組成物を等張性にするのに十分な量で、糖、糖アルコール、またはこれらの組合せなどの非イオン性等張化剤をさらに含む。
【００４９】
別の例では、本発明は、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、粒子が、（ａ）油コア、および（ｂ）ＤＣコレステロールを含み、組成物が、約１．２３ｍｇ／ｍｌ〜約２．４６ｍｇ／ｍｌ、例えば、１．２３ｍｇ／ｍｌなどのＤＣコレステロールを含む、組成物を提供する。いくつかの実施形態では、負に荷電した分子はＲＮＡであり、エマルジョン粒子の平均直径は、約８０ｎｍ〜約１８０ｎｍであり、エマルジョンのＮ／Ｐは、少なくとも４：１である。任意選択により、組成物は、緩衝化されており（例えば、クエン酸バッファー、コハク酸バッファー、酢酸バッファーなどで）、約６．０〜約８．０、好ましくは、約６．２〜約６．８のｐＨを有し、３０ｍＭ以下の無機塩（例えば、ＮａＣｌ）を含有する。任意選択により、組成物は、組成物を等張性にするのに十分な量で、糖、糖アルコール、またはこれらの組合せなどの非イオン性等張化剤をさらに含む。
【００５０】
別の例では、本発明は、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、粒子が、（ａ）油コア、および（ｂ）ＤＤＡを含み、水中油型エマルジョンが、約０．７３ｍｇ／ｍｌ〜約１．４５ｍｇ／ｍｌのＤＤＡを含む、組成物を提供する。いくつかの実施形態では、負に荷電した分子はＲＮＡであり、エマルジョン粒子の平均直径は、約８０ｎｍ〜約１８０ｎｍであり、エマルジョンのＮ／Ｐは、少なくとも４：１である。任意選択により、組成物は、緩衝化されており（例えば、クエン酸バッファー、コハク酸バッファー、酢酸バッファーなどで）、約６．０〜約８．０、好ましくは、約６．２〜約６．８のｐＨを有し、３０ｍＭ以下の無機塩（例えば、ＮａＣｌ）を含有する。任意選択により、組成物は、組成物を等張性にするのに十分な量で、糖、糖アルコール、またはこれらの組合せなどの非イオン性等張化剤をさらに含む。
【００５１】
別の例では、本発明は、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、粒子が、（ａ）油コア、および（ｂ）ＤＤＡを含み、組成物が、約０．３６５ｍｇ／ｍｌ〜約０．７２５ｍｇ／ｍｌ、例えば、０．７２５ｍｇ／ｍＬなどのＤＤＡを含む、組成物を提供する。いくつかの実施形態では、負に荷電した分子はＲＮＡであり、エマルジョン粒子の平均直径は、約８０ｎｍ〜約１８０ｎｍであり、エマルジョンのＮ／Ｐは、少なくとも４：１である。任意選択により、組成物は、緩衝化されており（例えば、クエン酸バッファー、コハク酸バッファー、酢酸バッファーなどで）、約６．０〜約８．０、好ましくは、約６．２〜約６．８のｐＨを有し、３０ｍＭ以下の無機塩（例えば、ＮａＣｌ）を含有する。任意選択により、組成物は、組成物を等張性にするのに十分な量で、糖、糖アルコール、またはこれらの組合せなどの非イオン性等張化剤をさらに含む。
【００５２】
別の例では、本発明は、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、粒子が、（ａ）油コア、および（ｂ）ＤＯＴＭＡを含み、組成物が、約０．４ｍｇ／ｍｌ〜約１．５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは、約０．４ｍｇ／ｍｌ〜約０．８ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＭＡを含む、組成物を提供する。いくつかの実施形態では、負に荷電した分子はＲＮＡであり、エマルジョン粒子の平均直径は、約８０ｎ
ｍ〜約１８０ｎｍであり、エマルジョンのＮ／Ｐは、少なくとも４：１である。任意選択により、組成物は、緩衝化されており（例えば、クエン酸バッファー、コハク酸バッファー、酢酸バッファーなどで）、約６．０〜約８．０、好ましくは、約６．２〜約６．８のｐＨを有し、３０ｍＭ以下の無機塩（例えば、ＮａＣｌ）を含有する。任意選択により、組成物は、組成物を等張性にするのに十分な量で、糖、糖アルコール、またはこれらの組合せなどの非イオン性等張化剤をさらに含む。
【００５３】
別の例では、本発明は、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、粒子が、（ａ）油コア、および（ｂ）ＤＯＥＰＣを含み、組成物が、約０．４ｍｇ／ｍｌ〜約１．５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは、約０．４ｍｇ／ｍｌ〜約０．９ｍｇ／ｍｌのＤＯＥＰＣを含む、組成物を提供する。いくつかの実施形態では、負に荷電した分子はＲＮＡであり、エマルジョン粒子の平均直径は、約８０ｎｍ〜約１８０ｎｍであり、エマルジョンのＮ／Ｐは、少なくとも４：１である。任意選択により、組成物は、緩衝化されており（例えば、クエン酸バッファー、コハク酸バッファー、酢酸バッファーなどで）、約６．０〜約８．０、好ましくは、約６．２〜約６．８のｐＨを有し、３０ｍＭ以下の無機塩（例えば、ＮａＣｌ）を含有する。任意選択により、組成物は、組成物を等張性にするのに十分な量で、糖、糖アルコール、またはこれらの組合せなどの非イオン性等張化剤をさらに含む。
【００５４】
別の例では、本発明は、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、粒子が、（ａ）油コア、および（ｂ）ＤＯＤＡＣを含み、組成物が、約０．３６５ｍｇ／ｍｌ〜約０．７２５ｍｇ／ｍｌのＤＯＤＡＣを含む、組成物を提供する。いくつかの実施形態では、負に荷電した分子はＲＮＡであり、エマルジョン粒子の平均直径は、約８０ｎｍ〜約１８０ｎｍであり、エマルジョンのＮ／Ｐは、少なくとも４：１である。任意選択により、組成物は、緩衝化されており（例えば、クエン酸バッファー、コハク酸バッファー、酢酸バッファーなどで）、約６．０〜約８．０、好ましくは、約６．２〜約６．８のｐＨを有し、３０ｍＭ以下の無機塩（例えば、ＮａＣｌ）を含有する。任意選択により、組成物は、組成物を等張性にするのに十分な量で、糖、糖アルコール、またはこれらの組合せなどの非イオン性等張化剤をさらに含む。
【００５５】
負に荷電した分子の例には、負に荷電したペプチドを含有する抗原、１つまたは複数のペプチド含有抗原をコードする核酸分子（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）、負に荷電した小分子、および負に荷電した免疫学的アジュバントが含まれる。負に荷電した免疫学的アジュバントには、例えば、免疫賦活性オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）、一本鎖ＲＮＡ、小分子免疫増強因子（ＳＭＩＰ）などが含まれる。負に荷電した小分子には、例えば、ホスホネート、フルオロホスホネートなどが含まれる。
【００５６】
ある特定の実施形態では、負に荷電した分子は、抗原をコードする、ＲＮＡ分子などの核酸分子である。ある特定の実施形態では、ＲＮＡ分子は、アルファウイルス由来ＲＮＡレプリコンなどの自己複製ＲＮＡ分子である。
【００５７】
別の態様では、本発明は、油コア（好ましくは、２５℃で液相である）およびカチオン性脂質を含有するエマルジョン粒子、ならびにエマルジョン粒子と複合体を形成する核酸分子を含み、エマルジョン粒子の平均直径は、約８０ｎｍ〜約１８０ｎｍであり、エマルジョンのＮ／Ｐは、少なくとも４：１である、免疫原性カチオン性水中油型エマルジョンを提供する。ある特定の実施形態では、核酸分子は、自己複製ＲＮＡなどのＲＮＡである。好ましくは、免疫原性カチオン性水中油型エマルジョンは、緩衝化されており（例えば、クエン酸バッファー、コハク酸バッファー、酢酸バッファーなどで）、約６．０〜約８．０、好ましくは、約６．２〜約６．８のｐＨを有し、３０ｍＭ以下の無機塩（例えば、ＮａＣｌ）を含有する。好ましくは、免疫原性カチオン性水中油型エマルジョンは、エマ
ルジョンを等張性にするのに十分な量で、糖、糖アルコール、またはこれらの組合せなどの非イオン性等張化剤をさらに含む。
【００５８】
別の態様では、本発明は、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物を調製する方法であって、（Ａ）カチオン性水中油型エマルジョンを調製するステップであって、エマルジョンは、（１）約０．２％〜約２０％（ｖ／ｖ）の油、（２）約０．０１％〜約２．５％（ｖ／ｖ）の界面活性剤、ならびに（３）（ｉ）約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰ、（ｉｉ）約２．４６ｍｇ／ｍｌ〜約４．９２ｍｇ／ｍｌのＤＣコレステロール、および（ｉｉｉ）約０．７３ｍｇ／ｍｌ〜約１．４５ｍｇ／ｍｌのＤＤＡからなる群より選択されるカチオン性脂質を含む、ステップと、（Ｂ）負に荷電した分子がエマルジョンの粒子と複合体を形成するように、負に荷電した分子をカチオン性水中油型エマルジョンに添加するステップとを含む、方法を提供する。
【００５９】
別の態様では、本発明は、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物を調製する方法であって、（Ａ）カチオン性水中油型エマルジョンを調製するステップであって、エマルジョンは、（１）約０．２％〜約２０％（ｖ／ｖ）の油、（２）約０．０１％〜約２．５％（ｖ／ｖ）の界面活性剤、ならびに（３）（ｉ）約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰ、（ｉｉ）約２．４６ｍｇ／ｍｌ〜約４．９２ｍｇ／ｍｌのＤＣコレステロール、（ｉｉｉ）約０．７３ｍｇ／ｍｌ〜約１．４５ｍｇ／ｍｌのＤＤＡ、（ｉｖ）約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＭＡ、（ｖ）約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約１．８ｍｇ／ｍｌのＤＯＥＰＣ、および（ｖｉ）約０．７３ｍｇ／ｍｌ〜約１．４５ｍｇ／ｍｌのＤＯＤＡＣからなる群より選択されるカチオン性脂質を含む、ステップと、（Ｂ）負に荷電した分子がエマルジョンの粒子と複合体を形成するように、負に荷電した分子をカチオン性水中油型エマルジョンに添加するステップとを含む、方法を提供する。
【００６０】
ある特定の実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、（１）油およびカチオン性脂質を合わせることによって、エマルジョンの油相を形成するステップと、（２）エマルジョンの水相（すなわち、連続相）を提供するステップと、（３）均質化によって水相中に油相を分散させるステップとを含むプロセスによって調製される。カチオン性脂質は、油中に直接溶解させることができる。あるいは、カチオン性脂質は、任意の適当な溶媒、例えば、クロロホルム（ＣＨＣｌ３）またはジクロロメタン（ＤＣＭ）などの中に溶解させることができる。イソプロピルアルコールも使用することができる。溶媒は、油相が水相に添加される前、または油相が水相に添加された後であるが、均質化の前に蒸発させることができる。あるいは、脂質の溶解度が問題となり得る事例では、依然として油相において溶媒（例えば、ＤＣＭ）を用いて一次エマルジョンを作製することができる。この場合では、溶媒は、第２の均質化の前にエマルジョンから直接蒸発させられる。
【００６１】
粒子形成を促し、負に荷電した分子とカチオン性粒子との間の複合体形成を改善し、負に荷電した分子の安定性を増大させ（例えば、ＲＮＡ分子の分解を防止し）、負に荷電した分子（ＲＮＡ分子など）の適切な脱複合体形成／放出を促進し、またはエマルジョン粒子の凝集を防止するための追加の任意選択のステップを含めることができる。例えば、ポリマー（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７）または界面活性剤を、エマルジョンの水相に添加することができる。例示的な一実施形態では、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７は、エマルジョン粒子との複合体形成の前に、ＲＮＡ分子に添加される。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７を添加すると、ＲＮＡ分子の安定性を増大させ、ＲＮＡ分解をさらに低減することができる。ポロキサマーポリマーも、ＲＮＡ分子の放出を促し、エマルジョン粒子の凝集を防止することができる。最後に、ポロキサマーポリマーは、免疫調節効果も有する。例えば、Ｗｅｓｔｅｒｉｎｋら、Ｖａｃｃｉｎｅ、２０
０１年１２月１２日；２０巻（５〜６号）：７１１〜２３頁を参照。
【００６２】
好ましくは、ＲＮＡ−カチオン性粒子複合体のＲＮＡ分子は、複合体を形成していないＲＮＡ分子と比較した場合、ＲＮａｓｅ分解に対してより耐性である。
【００６３】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載されるカチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含み、１つまたは複数の薬学的に許容されるキャリア、希釈剤、または賦形剤をさらに含むことができる医薬組成物を提供する。好適な実施形態では、医薬組成物はワクチンである。
【００６４】
別の態様では、本発明は、被験体において免疫応答を生じさせる方法であって、それを必要とする被験体に、本明細書に記載される組成物を投与するステップを含む、方法を提供する。
【００６５】
本発明はまた、療法において使用するための本明細書に記載される医薬組成物、および免疫応答を強化するか、または生じさせるための薬剤を製造するための、本明細書に記載される医薬組成物の使用に関する。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成したＲＮＡ分子を含む組成物であって、該粒子は、
（ａ）２５℃で液相である油コア、および
（ｂ）カチオン性脂質
を含む、組成物。
（項目２）
前記油コアが４℃で液相である、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記粒子が界面活性剤をさらに含む、項目１または２に記載の組成物。
（項目４）
前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤である、項目３に記載の組成物。
（項目５）
前記界面活性剤が、ＳＰＡＮ８５（ソルビタントリオレエート）、Ｔｗｅｅｎ８０（ポリソルベート８０）、またはこれらの組合せである、項目３または４に記載の組成物。
（項目６）
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約０．０１％〜約２．５％（ｖ／ｖ）の界面活性剤を含む、項目３から５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目７）
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約０．０８％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ８０を含む、項目３から６のいずれか一項に記載の組成物。
（項目８）
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約０．５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ８０、および約０．５％（ｖ／ｖ）のＳＰＡＮ８５を含む、項目３から６のいずれか一項に記載の組成物。
（項目９）
約０．００５％〜約１．２５％（ｖ／ｖ）の界面活性剤を含む、項目３から５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１０）
約０．０４％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ８０を含む、項目３から５および９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１１）
約０．２５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ８０、および約０．２５％（ｖ／ｖ）のＳＰＡＮ８５を含む、項目３から５および９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１２）
前記界面活性剤がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質である、項目３または４に記載の組成物。
（項目１３）
前記界面活性剤が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）２０００ＰＥ、ＰＥＧ５０００ＰＥ、ＰＥＧ１０００ＤＭＧ、ＰＥＧ２０００ＤＭＧ、ＰＥＧ３０００ＤＭＧ、またはこれらの組合せである、項目１２に記載の組成物。
（項目１４）
前記油コアが、ヒマシ油、ヤシ油、トウモロコシ油、綿実油、月見草油、魚油、ホホバ油、ラード油、亜麻仁油、オリーブ油、ラッカセイ油、サフラワー油、ゴマ油、ダイズ油、スクアレン、ヒマワリ油、コムギ胚芽油、および鉱油からなる群より選択される油を含む、項目３から１３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１５）
前記油コアが、ダイズ油、ヒマワリ油、オリーブ油、スクアレン、スクアラン、またはこれらの組合せを含む、項目３から１４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１６）
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約０．２％〜約２０％（ｖ／ｖ）の油を含む、項目３から１５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１７）
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約４％〜約５％（ｖ／ｖ）の油を含む、項目３から１６のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１８）
約０．１％〜約１０％（ｖ／ｖ）の油を含む、項目３から１５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１９）
約２％〜約２．５％（ｖ／ｖ）の油を含む、項目３から１６のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２０）
前記粒子がリン脂質をさらに含む、項目１または２に記載の組成物。
（項目２１）
前記リン脂質が、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、卵ホスファチジルコリン（卵ＰＣ）、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰｙＰＥ）、またはこれらの組合せである、項目２０に記載の組成物。
（項目２２）
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌのＤＯＰＥを含む、項目２０または２１に記載の組成物。
（項目２３）
約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌのＤＯＰＥを含む、項目２０または２１に記載の組成物。
（項目２４）
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌの卵ＰＣを含む、項目２０または２１に記載の組成物。
（項目２５）
約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの卵ＰＣを含む、項目２０または２１に記載の組成物。
（項目２６）
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌのＤＰｙＰＥを含む、項目２０または２１に記載の組成物。
（項目２７）
約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌのＤＰｙＰＥを含む、項目２０または２１に記載の組成物。
（項目２８）
前記油コアが、ヒマシ油、ヤシ油、トウモロコシ油、綿実油、月見草油、魚油、ホホバ油、ラード油、亜麻仁油、オリーブ油、ラッカセイ油、サフラワー油、ゴマ油、ダイズ油、スクアレン、ヒマワリ油、コムギ胚芽油、および鉱油からなる群より選択される油を含む、項目２０から２７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２９）
前記油コアが、ダイズ油、ヒマワリ油、オリーブ油、スクアレン、スクアラン、またはこれらの組合せを含む、項目２０から２８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３０）
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約０．２％〜約２０％（ｖ／ｖ）の油を含む、項目２０から２９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３１）
約０．１％〜約１０％（ｖ／ｖ）の油を含む、項目２０から２９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３２）
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、該エマルジョンの水相中にポリマーまたは界面活性剤をさらに含む、項目１または２に記載の組成物。
（項目３３）
前記ポリマーがポロキサマーである、項目３２に記載の組成物。
（項目３４）
前記ポリマーがＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７である、項目３２または３３に記載の組成物。
（項目３５）
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約０．１％〜約１０％（ｖ／ｖ）のポリマーを含む、項目３２から３４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３６）
ポリマーまたは界面活性剤をさらに含む、項目１または２に記載の組成物。
（項目３７）
前記ポリマーがポロキサマーである、項目３６に記載の組成物。
（項目３８）
前記ポリマーがＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７である、項目３６または３７に記載の組成物。
（項目３９）
約０．１％〜約１０％（ｗ／ｖ）ポリマーを含む、項目３６から３８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４０）
前記油コアが、ヒマシ油、ヤシ油、トウモロコシ油、綿実油、月見草油、魚油、ホホバ油、ラード油、亜麻仁油、オリーブ油、ラッカセイ油、サフラワー油、ゴマ油、ダイズ油、スクアレン、ヒマワリ油、コムギ胚芽油、および鉱油からなる群より選択される油を含む、項目３２から３９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４１）
前記油コアが、ダイズ油、ヒマワリ油、オリーブ油、スクアレン、スクアラン、またはこれらの組合せを含む、項目３２から４０のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４２）
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約０．２％〜約２０％（ｖ／ｖ）の油を含む、項目３２から４１のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４３）
約０．１％〜約１０％（ｖ／ｖ）の油を含む、項目３２から４１のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４４）
前記カチオン性脂質が、１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣコレステロール）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）、１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、ジパルミトイル（Ｃ１６：０）トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＰＴＡＰ）、ジステアロイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）、および米国仮特許出願第６１／２８４，７８７号に開示された脂質Ｅ０００１〜Ｅ０１１８からなる群より選択される、項目１から４３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４５）
前記カチオン性脂質が、１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣコレステロール）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）、１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、ジパルミトイル（Ｃ１６：０）トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＰＴＡＰ）、ジステアロイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジオレオイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＯＥＰＣ）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、および米国仮特許出願第６１／２８４，７８７号に開示された脂質Ｅ０００１〜Ｅ０１１８からなる群より選択される、項目１から４３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４６）
前記カチオン性脂質がＤＯＴＡＰである、項目１から４５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４７）
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約３．０ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰを含む、項目４６に記載の組成物。
（項目４８）
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰを含む、項目４６または４７に記載の組成物。
（項目４９）
約０．４ｍｇ／ｍｌ〜約１．５ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰを含む、項目４６に記載の組成物。
（項目５０）
約０．４ｍｇ／ｍｌ〜約０．８ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰを含む、項目４３または４４に記載の組成物。
（項目５１）
前記カチオン性脂質がＤＣコレステロールである、項目１から４５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５２）
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約０．６２ｍｇ／ｍｌ〜約４．９２ｍｇ／ｍｌのＤＣコレステロールを含む、項目５１に記載の組成物。
（項目５３）
約０．３１ｍｇ／ｍｌ〜約２．４６ｍｇ／ｍｌのＤＣコレステロールを含む、項目５１に記載の組成物。
（項目５４）
前記カチオン性脂質がＤＤＡである、項目１から４５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５５）
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約０．７３ｍｇ／ｍｌ〜約１．４５ｍｇ／ｍｌのＤＤＡを含む、項目５４に記載の組成物。
（項目５６）
約０．３６５ｍｇ／ｍｌ〜約１．７２５ｍｇ／ｍｌのＤＤＡを含む、項目５４に記載の組成物。
（項目５７）
前記カチオン性脂質がＤＯＴＭＡである、項目１から４５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５８）
約０．４ｍｇ／ｍｌ〜約０．８ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＭＡを含む、項目５７に記載の組成物。
（項目５９）
前記カチオン性脂質がＤＯＥＰＣである、項目１から４５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６０）
約０．４ｍｇ／ｍｌ〜約０．９ｍｇ／ｍｌのＤＯＥＰＣを含む、項目５９に記載の組成物。
（項目６１）
前記カチオン性脂質がＤＯＤＡＣである、項目１から４５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６２）
約０．３６５ｍｇ／ｍｌ〜約０．７２５ｍｇ／ｍｌのＤＯＤＡＣを含む、項目６１に記載の組成物。
（項目６３）
約２８０ｍＭ〜約３００ｍＭのスクロース、マンニトール、トレハロース、スクロース、ソルビトール、またはデキストロースを含む、項目１から６２のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６４）
約２８０ｍＭのスクロース、約１０ｍＭのＮａＣｌ、約１ｍＭのクエン酸塩、および約０．５％（ｗ／ｖ）のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７を含む、項目１から６３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６５）
前記ＲＮＡ分子が、抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子である、項目１から６４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６６）
前記自己複製ＲＮＡがアルファウイルス由来ＲＮＡレプリコンである、項目６５に記載の組成物。
（項目６７）
カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、該カチオン性水中油型エマルジョンは、
（ａ）約０．５％（ｖ／ｖ）の油、および
（ｂ）カチオン性脂質
を含む、組成物。
（項目６８）
カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、
（ａ）約０．２５％（ｖ／ｖ）の油、および
（ｂ）カチオン性脂質
を含む、組成物。
（項目６９）
前記負に荷電した分子が、抗原をコードする核酸分子である、項目６７または６８に記載の組成物。
（項目７０）
前記核酸分子がＲＮＡ分子である、項目６９に記載の組成物。
（項目７１）
前記ＲＮＡ分子が自己複製ＲＮＡ分子である、項目７０に記載の組成物。
（項目７２）
前記自己複製ＲＮＡがアルファウイルス由来ＲＮＡレプリコンである、項目７１に記載の組成物。
（項目７３）
前記粒子が界面活性剤をさらに含む、項目６７から７２のいずれか一項に記載の組成物。
（項目７４）
前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤である、項目７３に記載の組成物。
（項目７５）
前記界面活性剤が、ＳＰＡＮ８５（ソルビタントリオレエート）、Ｔｗｅｅｎ８０（ポリソルベート８０）、またはこれらの組合せである、項目７３または７４に記載の組成物。
（項目７６）
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約０．０１％〜約２．５％（ｖ／ｖ）の界面活性剤を含む、項目７３から７５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目７７）
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約０．０８％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ８０を含む、項目７３から７６のいずれか一項に記載の組成物。
（項目７８）
約０．００５％〜約１．２５％（ｖ／ｖ）の界面活性剤を含む、項目７３から７５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目７９）
約０．０４％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ８０を含む、項目７３から７５および７８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目８０）
前記カチオン性脂質が、１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣコレステロール）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）、１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、ジパルミトイル（Ｃ１６：０）トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＰＴＡＰ）、ジステアロイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）、および米国仮特許出願第６１／２８４，７８７号に開示された脂質Ｅ０００１〜Ｅ０１１８からなる群より選択される、項目６７から７９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目８１）
前記カチオン性脂質が、１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣコレステロール）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）、１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、ジパルミトイル（Ｃ１６：０）トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＰＴＡＰ）、ジステアロイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジオレオイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＯＥＰＣ）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、および米国仮特許出願第６１／２８４，７８７号に開示された脂質Ｅ０００１〜Ｅ０１１８からなる群より選択される、項目６７から７９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目８２）
前記カチオン性脂質がＤＯＴＡＰである、項目６７から８１のいずれか一項に記載の組成物。
（項目８３）
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約３．０ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰを含む、項目８２に記載の組成物。
（項目８４）
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰを含む、項目８２または８３に記載の組成物。
（項目８５）
約０．４ｍｇ／ｍｌ〜約１．５ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰを含む、項目８２に記載の組成物。
（項目８６）
約０．４ｍｇ／ｍｌ〜約０．８ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰを含む、項目８２または８５に記載の組成物。
（項目８７）
前記カチオン性脂質がＤＣコレステロールである、項目６７から８１のいずれか一項に記載の組成物。
（項目８８）
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約０．６２ｍｇ／ｍｌ〜約４．９２ｍｇ／ｍｌのＤＣコレステロールを含む、項目８７に記載の組成物。
（項目８９）
約０．３１ｍｇ／ｍｌ〜約２．４６ｍｇ／ｍｌのＤＣコレステロールを含む、項目８７に記載の組成物。
（項目９０）
前記カチオン性脂質がＤＤＡである、項目６７から８１のいずれか一項に記載の組成物。
（項目９１）
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約０．７３ｍｇ／ｍｌ〜約１．４５ｍｇ／ｍｌのＤＤＡを含む、項目９０に記載の組成物。
（項目９２）
約０．３６５ｍｇ／ｍｌ〜約１．７２５ｍｇ／ｍｌのＤＤＡを含む、項目９０に記載の組成物。
（項目９３）
前記カチオン性脂質がＤＯＴＭＡである、項目６７から８１のいずれか一項に記載の組成物。
（項目９４）
約０．４ｍｇ／ｍｌ〜約０．８ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＭＡを含む、項目９３に記載の組成物。
（項目９５）
前記カチオン性脂質がＤＯＥＰＣである、項目６７から８１のいずれか一項に記載の組成物。
（項目９６）
約０．４ｍｇ／ｍｌ〜約０．９ｍｇ／ｍｌのＤＯＥＰＣを含む、項目９５に記載の組成物。
（項目９７）
前記カチオン性脂質がＤＯＤＡＣである、項目６７から８１のいずれか一項に記載の組成物。
（項目９８）
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約０．３６５ｍｇ／ｍｌ〜約０．７２５ｍｇ／ｍｌのＤＯＤＡＣを含む、項目９７に記載の組成物。
（項目９９）
前記油コアが２５℃で液相である、項目６７から９８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１００）
前記油コアが４℃で液相である、項目６７から９９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１０１）
前記油が、ヒマシ油、ヤシ油、トウモロコシ油、綿実油、月見草油、魚油、ホホバ油、ラード油、亜麻仁油、オリーブ油、ラッカセイ油、サフラワー油、ゴマ油、ダイズ油、スクアレン、ヒマワリ油、コムギ胚芽油、鉱油、またはこれらの組合せである、項目６７から１００のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１０２）
前記油が、ダイズ油、ヒマワリ油、オリーブ油、スクアレン、またはこれらの組合せである、項目６７から１０１のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１０３）
約２８０ｍＭ〜約３００ｍＭのスクロース、マンニトール、トレハロース、スクロース、ソルビトール、またはデキストロースを含む、項目６７から１０２のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１０４）
約２８０ｍＭのスクロース、約１０ｍＭのＮａＣｌ、約１ｍＭのクエン酸塩、および約０．５％（ｗ／ｖ）のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７を含む、項目６７から１０３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１０５）
カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、該粒子は、
（ａ）油コア、
（ｂ）カチオン性脂質、および
（ｃ）リン脂質
を含む、組成物。
（項目１０６）
前記リン脂質が１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰｙＰＥ）である、項目１０５に記載の組成物。
（項目１０７）
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌのＤＰｙＰＥを含む、項目１０６に記載の組成物。
（項目１０８）
約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌのＤＰｙＰＥを含む、項目１０６に記載の組成物。
（項目１０９）
前記リン脂質が卵ＰＣである、項目１０５に記載の組成物。
（項目１１０）
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌの卵ＰＣを含む、項目１０９に記載の組成物。
（項目１１１）
約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの卵ＰＣを含む、項目１０９に記載の組成物。
（項目１１２）
前記リン脂質がＤＯＰＥである、項目１０５に記載の組成物。
（項目１１３）
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌのＤＯＰＥを含む、項目１１２に記載の組成物。
（項目１１４）
約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌのＤＯＰＥを含む、項目１１２に記載の組成物。
（項目１１５）
前記負に荷電した分子が、抗原をコードする核酸分子である、項目１０５から１１４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１１６）
前記核酸分子がＲＮＡ分子である、項目１１５に記載の組成物。
（項目１１７）
前記ＲＮＡ分子が自己複製ＲＮＡ分子である、項目１１６に記載の組成物。
（項目１１８）
前記自己複製ＲＮＡがアルファウイルス由来ＲＮＡレプリコンである、項目１１７に記載の組成物。
（項目１１９）
前記油コアが、ヒマシ油、ヤシ油、トウモロコシ油、綿実油、月見草油、魚油、ホホバ油、ラード油、亜麻仁油、オリーブ油、ラッカセイ油、サフラワー油、ゴマ油、ダイズ油、スクアレン、ヒマワリ油、コムギ胚芽油、および鉱油からなる群より選択される油を含む、項目１０５から１１８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１２０）
前記油コアが、ダイズ油、ヒマワリ油、オリーブ油、またはスクアレンを含む、項目１０５から１１９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１２１）
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約０．２％〜約２０％（ｖ／ｖ）の油を含む、項目１０５から１２０のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１２２）
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約４％〜約５％（ｖ／ｖ）の油を含む、項目１０５から１２１のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１２３）
約０．１％〜約１０％（ｖ／ｖ）の油を含む、項目１０５から１２０のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１２４）
約２％〜約２．５％（ｖ／ｖ）の油を含む、項目１０５から１２０および１２３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１２５）
カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、該粒子は、
（ａ）油コア、および
（ｂ）ＤＯＴＡＰ
を含み、該水中油型エマルジョンは、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約３．０ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰを含む、組成物。
（項目１２６）
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約０．８ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰを含む、項目１２５に記載の組成物。
（項目１２７）
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約１．２ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰを含む、項目１２５に記載の組成物。
（項目１２８）
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約１．４ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰを含む、項目１２５に記載の組成物。
（項目１２９）
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約１．６ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰを含む、項目１２５に記載の組成物。
（項目１３０）
カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、該粒子は、
（ａ）油コア、および
（ｂ）ＤＯＴＡＰ
を含み、該組成物は、約０．４ｍｇ／ｍｌ〜約１．５ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰを含む、組成物。
（項目１３１）
約０．４ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰを含む、項目１３０に記載の組成物。
（項目１３２）
約０．６ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰを含む、項目１３０に記載の組成物。
（項目１３３）
約０．７ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰを含む、項目１３０に記載の組成物。
（項目１３４）
約０．８ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰを含む、項目１３０に記載の組成物。
（項目１３５）
カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、該粒子は、
（ａ）油コア、および
（ｂ）ＤＣコレステロール
を含み、該水中油型エマルジョンは、約２．４６ｍｇ／ｍｌ〜約４．９２ｍｇ／ｍｌのＤＣコレステロールを含む、組成物。
（項目１３６）
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約２．４６ｍｇ／ｍｌのＤＣコレステロールを含む、項目１３５に記載の組成物。
（項目１３７）
カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、該粒子は、
（ａ）油コア、および
（ｂ）ＤＣコレステロール
を含み、該組成物は、約１．２３ｍｇ／ｍｌ〜約２．４６ｍｇ／ｍｌのＤＣコレステロールを含む、組成物。
（項目１３８）
約１．２３ｍｇ／ｍｌのＤＣコレステロールを含む、項目１３５に記載の組成物。
（項目１３９）
カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、該粒子は、
（ａ）油コア、および
（ｂ）ＤＤＡ
を含み、該水中油型エマルジョンは、約０．７３ｍｇ／ｍｌ〜約１．４５ｍｇ／ｍｌのＤＤＡを含む、組成物。
（項目１４０）
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約１．４５ｍｇ／ｍｌのＤＤＡを含む、項目１３９に記載の組成物。
（項目１４１）
カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、該粒子は、
（ａ）油コア、および
（ｂ）ＤＤＡ
を含み、該組成物は、約０．３６５ｍｇ／ｍｌ〜約０．７２５ｍｇ／ｍｌのＤＤＡを含む、組成物。
（項目１４２）
約０．７２５ｍｇ／ｍｌのＤＤＡを含む、項目１３９に記載の組成物。
（項目１４３）
カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、該粒子は、
（ａ）油コア、および
（ｂ）ＤＯＴＭＡ
を含み、該組成物は、約０．４ｍｇ／ｍｌ〜約０．８ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＭＡを含む、組成物。
（項目１４４）
約０．６７５ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＭＡを含む、項目１４３に記載の組成物。
（項目１４５）
カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、該粒子は、
（ａ）油コア、および
（ｂ）ＤＯＥＰＣ
を含み、該組成物は、約０．４ｍｇ／ｍｌ〜約０．９ｍｇ／ｍｌのＤＯＥＰＣを含む、組成物。
（項目１４６）
約０．８５ｍｇ／ｍｌのＤＯＥＰＣを含む、項目１４５に記載の組成物。
（項目１４７）
カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、該粒子は、
（ａ）油コア、および
（ｂ）ＤＯＤＡＣ
を含み、該組成物は、約０．３６５ｍｇ／ｍｌ〜約０．７２５ｍｇ／ｍｌのＤＯＤＡＣを含む、組成物。
（項目１４８）
約０．５８５ｍｇ／ｍｌのＤＯＤＡＣを含む、項目１０６に記載の組成物。
（項目１４９）
カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物を調製する方法であって、
Ａ．カチオン性水中油型エマルジョンを調製するステップであって、該エマルジョンは、
（１）約０．２％〜約２０％（ｖ／ｖ）の油、
（２）約０．０１％〜約２．５％（ｖ／ｖ）の界面活性剤、ならびに
（３）カチオン性脂質であって、
ｉ．約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰ、
ｉｉ．約２．４６ｍｇ／ｍｌ〜約４．９２ｍｇ／ｍｌのＤＣコレステロール、
ｉｉｉ．約０．７３ｍｇ／ｍｌ〜約１．４５ｍｇ／ｍｌのＤＤＡ、
ｉｖ．約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＭＡ、
ｖ．約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約１．８ｍｇ／ｍｌのＤＯＥＰＣ、および
ｖｉ．約０．７３ｍｇ／ｍｌ〜約１．４５ｍｇ／ｍｌのＤＯＤＡＣ
からなる群より選択される、カチオン性脂質
を含む、ステップと、
Ｂ．該負に荷電した分子が該エマルジョンの該粒子と複合体を形成するように、該負に荷電した分子を該カチオン性水中油型エマルジョンに添加するステップと
を含む、方法。
（項目１５０）
前記負に荷電した分子が、抗原をコードする核酸分子である、項目１４９に記載の方法。
（項目１５１）
前記核酸分子がＲＮＡ分子である、項目１５０に記載の方法。
（項目１５２）
前記ＲＮＡ分子が自己複製ＲＮＡ分子である、項目１５１に記載の方法。
（項目１５３）
ＲＮＡ−カチオン性粒子複合体のＲＮＡ分子が、複合体を形成していないＲＮＡ分子と比較した場合に、ＲＮａｓｅ分解に対してより耐性である、項目１５１または１５２に記載の方法。
（項目１５４）
ステップＢが、
（１）前記ＲＮＡ分子およびＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７を含む溶液を調製することと、
（２）該ＲＮＡ／Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７溶液を前記水中油型エマルジョンに添加することと
を含む、項目１５１から１５３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５５）
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、
（１）前記油および前記カチオン性脂質を合わせることによって、該エマルジョンの油相を形成するステップと、
（２）該エマルジョンの水相を提供するステップと、
（３）均質化によって該水相中に該油相を分散させるステップと
を含むプロセスによって調製される、項目１４９から１５４に記載の方法。
（項目１５６）
前記油相および前記水相が合わされる前に、該油相にジクロロメタン（ＤＣＭ）を添加するステップをさらに含む、項目１５５に記載の方法。
（項目１５７）
ＤＣＭ中に前記カチオン性脂質を溶解させるステップをさらに含む、項目１５５または１５６に記載の方法。
（項目１５８）
均質化の前にＤＣＭを蒸発させるステップをさらに含む、項目１５６または１５７に記載の方法。
（項目１５９）
均質化の後にＤＣＭを蒸発させるステップをさらに含む、項目１５６または１５７に記載の方法。
（項目１６０）
ステップＡが、
（１）前記カチオン性脂質を適当な溶媒と混合することによって、リポソーム懸濁物を形成することと、
（２）該リポソーム懸濁物を、前記油、前記界面活性剤、および水性溶液と混合することによって、水中油型エマルジョンを形成することと
を含む、項目１４９から１５５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６１）
ステップＢが、
（ｉ）ＲＮＡ分子を含む水性溶液を提供することと、
（ｉｉ）前記カチオン性水中油型エマルジョンおよび該ＲＮＡ溶液を合わせて、前記組成物を調製することと
を含む、項目１４９から１６０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６２）
前記カチオン性水中油型エマルジョンおよび前記ＲＮＡ溶液が、約１：１（ｖ／ｖ）の比で合わされる、項目１６１に記載の方法。
（項目１６３）
前記ＲＮＡ分子を含む前記水性溶液が塩を含む、項目１６１または１６２に記載の方法。
（項目１６４）
前記塩がＮａＣｌである、項目１６３に記載の方法。
（項目１６５）
前記水性溶液が約２０ｍＭのＮａＣｌを含む、項目１６４に記載の方法。
（項目１６６）
前記ＲＮＡ分子を含む前記水性溶液がバッファーである、項目１６１から１６５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６７）
前記バッファーがクエン酸バッファーである、項目１６６に記載の方法。
（項目１６８）
前記バッファーが約２ｍＭのクエン酸塩を含む、項目１６７に記載の方法。
（項目１６９）
前記ＲＮＡ分子を含む前記水性溶液が重量オスモル濃度調整剤を含む、項目１６１から１６８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７０）
前記重量オスモル濃度調整剤が、スクロース、トレハロース、ソルビトール、またはデキストロースから選択される、項目１６９に記載の方法。
（項目１７１）
前記重量オスモル濃度調整剤がスクロースである、項目１７０に記載の方法。
（項目１７２）
前記水性溶液が約５６０ｍＭのスクロースを含む、項目１７１に記載の方法。
（項目１７３）
前記ＲＮＡ分子を含む前記水性溶液がポリマーを含む、項目１６１から１７２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７４）
前記ポリマーがＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７である、項目１７３に記載の方法。
（項目１７５）
前記水性溶液が、約０．０５％〜約２０％（ｗ／ｖ）のポリマーを含む、項目１７３または１７４に記載の方法。
（項目１７６）
前記水性溶液が、約１％（ｗ／ｖ）のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７を含む、項目１７３から１７５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７７）
項目１４９から１７６のいずれか一項に記載の方法によって調製される組成物。
（項目１７８）
前記カチオン性水中油型エマルジョンの前記粒子の平均直径が２００ｎｍ以下である、項目１から１４８および１７７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１７９）
前記エマルジョン粒子の平均直径が約８０ｎｍ〜約１８０ｎｍであり、前記エマルジョンのＮ／Ｐ比が少なくとも４：１である、項目１から１０４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１８０）
前記負に荷電した分子がＲＮＡ分子であり、前記エマルジョン粒子の平均直径が約８０ｎｍ〜約１８０ｎｍであり、前記エマルジョンのＮ／Ｐ比が少なくとも４：１である、項目１０５から１４８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１８１）
項目１７９または１８０に記載の組成物であって、該組成物が、緩衝化されており、かつ約６．０〜約８．０のｐＨを有する、組成物。
（項目１８２）
前記ｐＨが約６．２〜約６．８である、項目１８１に記載の組成物。
（項目１８３）
項目１７９から１８２のいずれか一項に記載の組成物であって、該組成物が無機塩をさらに含み、無機塩の濃度が３０ｍＭ以下である、組成物。
（項目１８４）
項目１７９から１８３のいずれか一項に記載の組成物であって、該組成物が、非イオン性等張化剤をさらに含み、かつ等張性である、組成物。
（項目１８５）
被験体において免疫応答を生じさせる方法であって、免疫応答を必要とする被験体に、項目１から１４８および１７７から１８４のいずれか一項に記載の組成物を投与するステップを含む、方法。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】図１は、ＲＮＡ分子がカチオン性ナノエマルジョン（ＣＮＥ）粒子と複合体を形成した後の、ＲＮａｓｅの存在下でのマウス胸腺ＲＮＡの安定性を示す。すべてのサンプルを、ＲＮａｓｅとともに３０分間インキュベートした。ＲＮａｓｅを、プロテイナーゼＫを用いて不活化した。ＣＮＥを用いて処方されたサンプルを、脱複合体化し、変性ゲル電気泳動によってＲＮＡ完全性について分析した。非標識レーンは、分子量マーカーを含有している。レーン１および２：ＲＮａｓｅ消化前（１）および消化後（２）のマウス胸腺ＲＮＡ；レーン３および４：ＲＮａｓｅ消化前（３）および消化後（４）の１０：１のＮ／Ｐ比でＣＮＥ０１と複合体を形成したマウス胸腺ＲＮＡ；レーン５および６：ＲＮａｓｅ消化前（５）および消化後（６）の４：１のＮ／Ｐ比でＣＮＥ０１と複合体を形成したマウス胸腺ＲＮＡ；レーン７および８：ＲＮａｓｅ消化前（７）および消化後（８）の１０：１のＮ／Ｐ比でＣＮＥ１７と複合体を形成したマウス胸腺ＲＮＡ；レーン９  ＲＮａｓｅ消化前（９）の４：１のＮ／Ｐ比でＣＮＥ１７と複合体を形成したマウス胸腺ＲＮＡ。
【図２】図２は、ＲＮＡ分子がＣＮＥ粒子と複合体を形成した後の、ＲＮａｓｅの存在下でのマウス胸腺ＲＮＡの安定性を示す。すべてのサンプルを、ＲＮａｓｅとともに３０分間インキュベートした。ＲＮａｓｅを、プロテイナーゼＫを用いて不活化した。ＣＮＥを用いて処方されたサンプルを、脱複合体化し、変性ゲル電気泳動によってＲＮＡ完全性について分析した。非標識レーンは、分子量マーカーを含有している。レーン１０：ＲＮａｓｅ消化後（１０）の４：１のＮ／Ｐ比でＣＮＥ１７と複合体を形成したマウス胸腺ＲＮＡ；レーン１１および１２：ＲＮａｓｅ消化前（１１）および消化後（１２）のマウス胸腺ＲＮＡ；レーン１３および１４：ＲＮａｓｅ消化前（１３）および消化後（１４）の１０：１のＮ／Ｐ比でＣＮＥ１２と複合体を形成したマウス胸腺ＲＮＡ；レーン１５および１６：ＲＮａｓｅ消化前（１５）および消化後（１６）の４：１のＮ／Ｐ比でＣＮＥ１２と複合体を形成したマウス胸腺ＲＮＡ；レーン１７および１８：ＲＮａｓｅ消化前（１７）および消化後（１８）の１０：１のＮ／Ｐ比でＣＮＥ１３と複合体を形成したマウス胸腺ＲＮＡ；レーン１９および２０：ＲＮａｓｅ消化前（１９）および消化後（２０）の４：１のＮ／Ｐ比でＣＮＥ１３と複合体を形成したマウス胸腺ＲＮＡ。
【図３】図３は、ＲＮＡ分子がＣＮＥ粒子と複合体を形成した後の、ＲＮａｓｅの存在下でのマウス胸腺ＲＮＡの安定性を示す。すべてのサンプルを、ＲＮａｓｅとともに３０分間インキュベートした。ＲＮａｓｅを、プロテイナーゼＫを用いて不活化した。ＣＮＥを用いて処方されたサンプルを、脱複合体化し、変性ゲル電気泳動によってＲＮＡ完全性について分析した。非標識レーンは、分子量マーカーを含有している。レーン１および２：ＲＮａｓｅ消化前（１）および消化後（２）のマウス胸腺ＲＮＡ；レーン３および４：ＲＮａｓｅ消化前（３）および消化後（４）の１０：１のＮ／Ｐ比でＣＮＥ０１と複合体を形成したマウス胸腺ＲＮＡ；レーン５および６：ＲＮａｓｅ消化前（５）および消化後（６）の４：１のＮ／Ｐ比でＣＮＥ０１と複合体を形成したマウス胸腺ＲＮＡ；レーン７および８：ＲＮａｓｅ消化前（７）および消化後（８）の１０：１のＮ／Ｐ比でＣＮＥ０２と複合体を形成したマウス胸腺ＲＮＡ；レーン９：ＲＮａｓｅ消化前（９）の４：１のＮ／Ｐ比でＣＮＥ０２と複合体を形成したマウス胸腺ＲＮＡ。
【図４】図４は、ＲＮＡ分子がＣＮＥ粒子と複合体を形成した後の、ＲＮａｓｅの存在下でのマウス胸腺ＲＮＡの安定性を示す。すべてのサンプルを、ＲＮａｓｅとともに３０分間インキュベートした。ＲＮａｓｅを、プロテイナーゼＫを用いて不活化し、処方されたサンプルを、脱複合体化し、変性ゲル電気泳動によってＲＮＡ完全性について分析した。非標識レーンは、分子量マーカーを含有している。レーン１５および１６：ＲＮａｓｅ消化前（１５）および消化後（１６）のマウス胸腺ＲＮＡ；レーン１７および１８：ＲＮａｓｅ消化前（１７）および消化後（１８）の１０：１のＮ／Ｐ比でＣＮＥ０４と複合体を形成したマウス胸腺ＲＮＡ；レーン１９および２０：ＲＮａｓｅ消化前（１９）および消化後（２０）の４：１のＮ／Ｐ比でＣＮＥ０４と複合体を形成したマウス胸腺ＲＮＡ；レーン２１および２２：ＲＮａｓｅ消化前（２１）および消化後（２２）の１０：１のＮ／Ｐ比でＣＮＥ０５と複合体を形成したマウス胸腺ＲＮＡ；レーン２３および２４：ＲＮａｓｅ消化前（２３）および消化後（２４）の４：１のＮ／Ｐ比でＣＮＥ０５と複合体を形成したマウス胸腺ＲＮＡ。
【図５】図５は、ＲＮＡ分子がＣＮＥ粒子と複合体を形成した後の、ＲＮａｓｅの存在下でのマウス胸腺ＲＮＡの安定性を示す。すべてのサンプルを、ＲＮａｓｅとともに３０分間インキュベートした。ＲＮａｓｅを、プロテイナーゼＫを用いて不活化し、処方されたサンプルを脱複合体化し、変性ゲル電気泳動によってＲＮＡ完全性について分析した。非標識レーンは、分子量マーカーを含有している。レーン１および２：ＲＮａｓｅ消化前（１）および消化後（２）のマウス胸腺ＲＮＡ；レーン３および４：ＲＮａｓｅ消化前（３）および消化後（４）の１０：１のＮ／Ｐ比でＣＮＥ１７と複合体を形成したマウス胸腺ＲＮＡ；レーン５および６：ＲＮａｓｅ消化前（５）および消化後（６）の４：１のＮ／Ｐ比でＣＮＥ１７と複合体を形成したマウス胸腺ＲＮＡ；レーン７および８：ＲＮａｓｅ消化前（７）および消化後（８）の１０：１のＮ／Ｐ比でのＣＮＥ２７とのもの；レーン９および１０：ＲＮａｓｅ消化前（９）および消化後（１０）の４：１のＮ／Ｐ比でＣＮＥ２７と複合体を形成したマウス胸腺ＲＮＡ；レーン１１および１２：ＲＮａｓｅ消化前（１１）および消化後（１２）のマウス胸腺ＲＮＡ；レーン１３および１４：ＲＮａｓｅ消化前（１３）および消化後（１４）の１０：１のＮ／Ｐ比でＣＮＥ３２と複合体を形成したマウス胸腺ＲＮＡ；レーン１５および１６：ＲＮａｓｅ消化前（１５）および消化後（１６）の４：１のＮ／Ｐ比でＣＮＥ３２と複合体を形成したマウス胸腺ＲＮＡ。
【図６】図６は、ＲＮＡ分子がＣＮＥ粒子と複合体を形成した後の、ＲＮａｓｅの存在下でのマウス胸腺ＲＮＡの安定性を示す。すべてのサンプルを、ＲＮａｓｅとともに３０分間インキュベートした。ＲＮａｓｅを、プロテイナーゼＫを用いて不活化し、処方されたサンプルを脱複合体化し、変性ゲル電気泳動によってＲＮＡ完全性について分析した。非標識レーンは、分子量マーカーを含有している。レーン１および２：ＲＮａｓｅ消化前（１）および消化後（２）のマウス胸腺ＲＮＡ；レーン３および４：ＲＮａｓｅ消化前（３）および消化後（４）の１０：１のＮ／Ｐ比でＣＮＥ３５と複合体を形成したマウス胸腺ＲＮＡ；レーン５および６：ＲＮａｓｅ消化前（５）および消化後（６）の４：１のＮ／Ｐ比でＣＮＥ３５と複合体を形成したマウス胸腺ＲＮＡ；レーン７：ＲＮａｓｅ消化前のマウス胸腺ＲＮＡ。
【図７−１】図７は、実施例において使用したベクターの配列を示す。図７Ａは、ＲＳＶ−Ｆ抗原をコードする、プラスミドＡ３１７の配列（配列番号１）を示す。図７Ｂは、分泌型ヒト胎盤アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）をコードする、プラスミドＡ３０６の配列（配列番号２）を示す。図７Ｃは、ＲＳＶ−Ｆ抗原をコードする、プラスミドＡ３７５の配列（配列番号３）を示す。
【図７−２】図７は、実施例において使用したベクターの配列を示す。図７Ａは、ＲＳＶ−Ｆ抗原をコードする、プラスミドＡ３１７の配列（配列番号１）を示す。図７Ｂは、分泌型ヒト胎盤アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）をコードする、プラスミドＡ３０６の配列（配列番号２）を示す。図７Ｃは、ＲＳＶ−Ｆ抗原をコードする、プラスミドＡ３７５の配列（配列番号３）を示す。
【図７−３】図７は、実施例において使用したベクターの配列を示す。図７Ａは、ＲＳＶ−Ｆ抗原をコードする、プラスミドＡ３１７の配列（配列番号１）を示す。図７Ｂは、分泌型ヒト胎盤アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）をコードする、プラスミドＡ３０６の配列（配列番号２）を示す。図７Ｃは、ＲＳＶ−Ｆ抗原をコードする、プラスミドＡ３７５の配列（配列番号３）を示す。
【図７−４】図７は、実施例において使用したベクターの配列を示す。図７Ａは、ＲＳＶ−Ｆ抗原をコードする、プラスミドＡ３１７の配列（配列番号１）を示す。図７Ｂは、分泌型ヒト胎盤アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）をコードする、プラスミドＡ３０６の配列（配列番号２）を示す。図７Ｃは、ＲＳＶ−Ｆ抗原をコードする、プラスミドＡ３７５の配列（配列番号３）を示す。
【図７−５】図７は、実施例において使用したベクターの配列を示す。図７Ａは、ＲＳＶ−Ｆ抗原をコードする、プラスミドＡ３１７の配列（配列番号１）を示す。図７Ｂは、分泌型ヒト胎盤アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）をコードする、プラスミドＡ３０６の配列（配列番号２）を示す。図７Ｃは、ＲＳＶ−Ｆ抗原をコードする、プラスミドＡ３７５の配列（配列番号３）を示す。
【図７−６】図７は、実施例において使用したベクターの配列を示す。図７Ａは、ＲＳＶ−Ｆ抗原をコードする、プラスミドＡ３１７の配列（配列番号１）を示す。図７Ｂは、分泌型ヒト胎盤アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）をコードする、プラスミドＡ３０６の配列（配列番号２）を示す。図７Ｃは、ＲＳＶ−Ｆ抗原をコードする、プラスミドＡ３７５の配列（配列番号３）を示す。
【図７−７】図７は、実施例において使用したベクターの配列を示す。図７Ａは、ＲＳＶ−Ｆ抗原をコードする、プラスミドＡ３１７の配列（配列番号１）を示す。図７Ｂは、分泌型ヒト胎盤アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）をコードする、プラスミドＡ３０６の配列（配列番号２）を示す。図７Ｃは、ＲＳＶ−Ｆ抗原をコードする、プラスミドＡ３７５の配列（配列番号３）を示す。
【図７−８】図７は、実施例において使用したベクターの配列を示す。図７Ａは、ＲＳＶ−Ｆ抗原をコードする、プラスミドＡ３１７の配列（配列番号１）を示す。図７Ｂは、分泌型ヒト胎盤アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）をコードする、プラスミドＡ３０６の配列（配列番号２）を示す。図７Ｃは、ＲＳＶ−Ｆ抗原をコードする、プラスミドＡ３７５の配列（配列番号３）を示す。
【図７−９】図７は、実施例において使用したベクターの配列を示す。図７Ａは、ＲＳＶ−Ｆ抗原をコードする、プラスミドＡ３１７の配列（配列番号１）を示す。図７Ｂは、分泌型ヒト胎盤アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）をコードする、プラスミドＡ３０６の配列（配列番号２）を示す。図７Ｃは、ＲＳＶ−Ｆ抗原をコードする、プラスミドＡ３７５の配列（配列番号３）を示す。
【図７−１０】図７は、実施例において使用したベクターの配列を示す。図７Ａは、ＲＳＶ−Ｆ抗原をコードする、プラスミドＡ３１７の配列（配列番号１）を示す。図７Ｂは、分泌型ヒト胎盤アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）をコードする、プラスミドＡ３０６の配列（配列番号２）を示す。図７Ｃは、ＲＳＶ−Ｆ抗原をコードする、プラスミドＡ３７５の配列（配列番号３）を示す。
【図７−１１】図７は、実施例において使用したベクターの配列を示す。図７Ａは、ＲＳＶ−Ｆ抗原をコードする、プラスミドＡ３１７の配列（配列番号１）を示す。図７Ｂは、分泌型ヒト胎盤アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）をコードする、プラスミドＡ３０６の配列（配列番号２）を示す。図７Ｃは、ＲＳＶ−Ｆ抗原をコードする、プラスミドＡ３７５の配列（配列番号３）を示す。
【図７−１２】図７は、実施例において使用したベクターの配列を示す。図７Ａは、ＲＳＶ−Ｆ抗原をコードする、プラスミドＡ３１７の配列（配列番号１）を示す。図７Ｂは、分泌型ヒト胎盤アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）をコードする、プラスミドＡ３０６の配列（配列番号２）を示す。図７Ｃは、ＲＳＶ−Ｆ抗原をコードする、プラスミドＡ３７５の配列（配列番号３）を示す。
【図７−１３】図７は、実施例において使用したベクターの配列を示す。図７Ａは、ＲＳＶ−Ｆ抗原をコードする、プラスミドＡ３１７の配列（配列番号１）を示す。図７Ｂは、分泌型ヒト胎盤アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）をコードする、プラスミドＡ３０６の配列（配列番号２）を示す。図７Ｃは、ＲＳＶ−Ｆ抗原をコードする、プラスミドＡ３７５の配列（配列番号３）を示す。
【図８Ａ】図８Ａは、１０：１のＮ／Ｐ比でＣＮＥ１７と複合体を形成した１μｇのＲＮＡレプリコンＡ３０６を使用した、ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＳＥＡＰアッセイの結果を示す。図８Ｂは、２ｗｐ１および２ｗｐ２の時点でのＢＡＬＢ／ｃマウスにおける全ＩｇＧ力価である（ＣＮＥ１７と複合体を形成したＲＮＡレプリコンＡ３１７を、ＢＡＬＢ／ｃに投与した）。
【図８Ｂ】図８Ａは、１０：１のＮ／Ｐ比でＣＮＥ１７と複合体を形成した１μｇのＲＮＡレプリコンＡ３０６を使用した、ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＳＥＡＰアッセイの結果を示す。図８Ｂは、２ｗｐ１および２ｗｐ２の時点でのＢＡＬＢ／ｃマウスにおける全ＩｇＧ力価である（ＣＮＥ１７と複合体を形成したＲＮＡレプリコンＡ３１７を、ＢＡＬＢ／ｃに投与した）。
【図９Ａ】図９Ａ〜９Ｃは、粒子サイズに対する種々のバッファー組成の影響を示す。図９Ａは、ＲＮＡ（１０：１のＮ／Ｐ比で複合体形成）を伴うＣＮＥ１７エマルジョンの粒子サイズに対する糖、塩およびポリマーＦ１２７の影響を示す。図９Ｂは、ＣＮＥ１７エマルジョンの粒子サイズに対するクエン酸バッファーの影響を示す。図９Ｃは、粒子サイズに対するポリマー（Ｆ６８、Ｆ１２７およびＰＥＧ３００）の影響を示す。
【図９Ｂ】図９Ａ〜９Ｃは、粒子サイズに対する種々のバッファー組成の影響を示す。図９Ａは、ＲＮＡ（１０：１のＮ／Ｐ比で複合体形成）を伴うＣＮＥ１７エマルジョンの粒子サイズに対する糖、塩およびポリマーＦ１２７の影響を示す。図９Ｂは、ＣＮＥ１７エマルジョンの粒子サイズに対するクエン酸バッファーの影響を示す。図９Ｃは、粒子サイズに対するポリマー（Ｆ６８、Ｆ１２７およびＰＥＧ３００）の影響を示す。
【図９Ｃ】図９Ａ〜９Ｃは、粒子サイズに対する種々のバッファー組成の影響を示す。図９Ａは、ＲＮＡ（１０：１のＮ／Ｐ比で複合体形成）を伴うＣＮＥ１７エマルジョンの粒子サイズに対する糖、塩およびポリマーＦ１２７の影響を示す。図９Ｂは、ＣＮＥ１７エマルジョンの粒子サイズに対するクエン酸バッファーの影響を示す。図９Ｃは、粒子サイズに対するポリマー（Ｆ６８、Ｆ１２７およびＰＥＧ３００）の影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６７】
１．概要
本発明は、一般に、ＲＮＡ分子などの負に荷電した分子を細胞に送達するのに使用することができるカチオン性水中油型エマルジョンに関する。エマルジョン粒子は、油コアおよびカチオン性脂質を含む。カチオン性脂質は、例えば、静電気力および疎水性／親水性相互作用を通じて、負に荷電した分子と相互作用し、それによって、分子をエマルジョン粒子につなぎ留めることができる。本明細書に記載されるカチオン性エマルジョンは、ＲＮＡ分子（例えば、タンパク質またはペプチドをコードするＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ、自己複製ＲＮＡなど）などの核酸分子を、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞に送達するのに特に適している。
【００６８】
本発明は、カチオン性水中油型エマルジョンを、負に荷電した分子を細胞に送達するの
に使用することができるという発見に基づく。エマルジョン粒子は、油コア、および負に荷電した分子と相互作用することができるカチオン性脂質を含む。好適な実施形態では、ＲＮＡ分子は、例えば、静電気力および疎水性／親水性相互作用を通じて、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成する。複合体を形成したＲＮＡ分子は、遊離ＲＮＡと比べて、安定化され、ＲＮａｓｅ媒介分解から保護され、細胞によってより効率的に取り込まれる。さらに、ＲＮＡが、ＲＮＡワクチンとの関連などで、コードされるタンパク質の発現を誘導するために送達される場合、コードされるタンパク質の免疫原性は、エマルジョンのアジュバント効果により増強され得る。したがって、負に荷電した分子（例えば、抗原をコードするＲＮＡ分子）のより効率的な送達に加えて、カチオン性エマルジョンは、アジュバント活性を通じて免疫応答を増強することもできる。
【００６９】
例えば、本明細書に記載および例示されるように、本発明者らは、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）免疫化のマウスモデルおよびコットンラットモデルを使用して、一連のカチオン性水中油型エマルジョンのｉｎ  ｖｉｖｏ効果を評価した。結果は、ＲＮＡ分子がカチオン性エマルジョンと複合体を形成した処方物が、遊離ＲＮＡ処方物と比較した場合、著しく高い免疫応答を生じることを実証する。いくつかの場合では、カチオン性水中油型エマルジョンと複合体を形成したＲＮＡ  １μｇを投与した後に得られた、ＲＮＡでコードされるタンパク質に対する平均抗体力価は、１０倍多い遊離ＲＮＡ（１０μｇの用量の遊離ＲＮＡ）を使用して得られる力価と同等であった。宿主におけるより高い免疫応答に加えて、本明細書に記載される処方物の別の利点は、遊離（未処方）ＲＮＡと比較した場合、異なる試験間および異なる宿主動物間で、宿主動物における免疫応答の変動がより少ないことである。
【００７０】
したがって、一態様では、本発明は、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成したＲＮＡ分子を含む組成物であって、粒子が、（ａ）２５℃で液相である油コア、および（ｂ）カチオン性脂質を含む、組成物を提供する。カチオン性水中油型エマルジョン粒子は、ナノ脂質ペプチド粒子（ＮＬＰＰ）ではないことが好ましい。油コアは、４℃で液相であることが好ましい。
【００７１】
カチオン性エマルジョン粒子は、界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０（ポリソルベート８０；ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、ＳＰＡＮ８５（ソルビタントリオレエート）、もしくはこれらの組合せ）、リン脂質、またはこれらの組合せをさらに含むことができる。エマルジョンは、エマルジョンの水相（連続相）中にポリマー（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７）を含むこともできる。
【００７２】
別の態様では、本発明は、負に荷電した分子を送達するのに使用することができるカチオン性水中油型エマルジョンのいくつかの特定の処方物も提供する。
【００７３】
別の態様では、本発明は、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物を調製する方法を提供する。本明細書に記載されるカチオン性エマルジョンを生成するための一例示的な手法は、均質化によって水相中に油相を分散させることによるものである。粒子形成を促し、負に荷電した分子とカチオン性粒子との間の複合体形成を改善し、負に荷電した分子の安定性を増大させ（例えば、ＲＮＡ分子の分解を防止し）、負に荷電した分子（ＲＮＡ分子など）の適切な脱複合体形成／放出を促進し、またはエマルジョン粒子の凝集を防止するための追加の任意選択のステップとして、例えば、油相中にジクロロメタン（ＤＣＭもしくは塩化メチレン）を添加し、均質化の前もしくは後にＤＣＭを蒸発させること；カチオン性脂質を適当な溶媒と混合することによって、リポソーム懸濁物を形成すること；またはエマルジョンの水相に、ポリマー（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７）もしくは界面活性剤を添加することが挙げられる。あるいは、カチオン性脂質を、油中に直接溶解させることができる。
【００７４】
本発明のカチオン性エマルジョンは、核酸（例えば、ＲＮＡ）などの負に荷電した分子を送達するのに使用することができる。組成物は、それを必要とする被験体に投与することによって、免疫応答を生じさせるか、または強化することができる。組成物は、誘導される免疫応答の有効性を増強するために、別の免疫原性分子、免疫原性組成物、またはワクチンとともに共送達（ｃｏ−ｄｅｌｉｖｅｒ）することもできる。
【００７５】
２．定義
本明細書において、単数形の「ａ」「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容が明らかに別段の指示をしていない限り、複数形への参照を含む。
【００７６】
用語「約」は、本明細書において使用される場合、値の＋／−１０％を指す。
【００７７】
用語「界面活性剤」は、専門用語であり、一般に、エネルギー的に水による溶媒和を選り好む親水性基（例えば、極性基）、および水によってあまり溶媒和にならない疎水性基の両方を有する任意の分子を指す。用語「非イオン性界面活性剤」は、当技術分野で公知の用語であり、一般に、親水性基（例えば、極性基）が静電気的に荷電していない界面活性剤分子を指す。
【００７８】
用語「ポリマー」は、一緒に結合されている個々の化学物質部分（同じであっても異なっていてもよい）からなる分子を指す。本明細書において、用語「ポリマー」は、末端間で結合されて直鎖状分子を形成している個々の化学物質部分、ならびに分岐（例えば、「マルチアーム」または「星形」）構造の形態で一緒に結合された個々の化学物質部分を指す。例示的なポリマーには、例えば、ポロキサマーが含まれる。ポロキサマーは、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２本の親水性鎖が隣接するポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中心の疎水性鎖を有する非イオン性トリブロックコポリマーである。
【００７９】
「バッファー」は、溶液のｐＨの変化に抵抗する水性溶液を指す。
【００８０】
本明細書において、「ヌクレオチド類似体」または「修飾ヌクレオチド」は、ヌクレオシドの窒素塩基（例えば、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）もしくはウラシル（Ｕ）、アデニン（Ａ）、またはグアニン（Ｇ））において、またはこの窒素塩基上に１つまたは複数の化学修飾（例えば、置換）を含有するヌクレオチドを指す。ヌクレオチド類似体は、ヌクレオシドの糖部分（例えば、リボース、デオキシリボース、修飾リボース、修飾デオキシリボース、６員糖類似体、もしくは開鎖糖類似体）において、もしくはこの糖部分上、またはホスフェートにおいて、もしくはホスフェート上にさらなる化学修飾を含有することができる。
【００８１】
本明細書において、「サッカリド」は、直鎖形態もしくは環形態での単糖、オリゴ糖、もしくは多糖、または糖鎖を形成するこれらの組合せを包含する。オリゴ糖は、２個以上の単糖残基を有するサッカリドである。サッカリドの例には、グルコース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、スクロース、およびトレハロースが含まれる。
【００８２】
用語「自己複製ＲＮＡ」、「ＲＮＡレプリコン」または「ＲＮＡベクター」は、専門用語であり、一般に、ｉｎ  ｖｉｖｏで、一般的に標的細胞内で、それ自体の増幅または自己複製を指示することができるＲＮＡ分子を指す。ＲＮＡレプリコンは、細胞内へのＤＮＡの導入、および転写が起こる核への輸送の必要性を伴うことなく、直接使用される。宿主細胞の細胞質内に直接送達するのにＲＮＡベクターを使用することによって、異種核酸配列の自律複製および翻訳が効率的に起こる。アルファウイルス由来自己複製ＲＮＡは、
連続した順序で以下のエレメントを含有することができる：複製のためにシスで必要とされる５’ウイルス配列（バックグラウンドでは５’ＣＳＥとも呼ばれる）、発現されると、生物学的に活性なアルファウイルス非構造タンパク質（例えば、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）をコードする配列、複製のためにシスで必要とされる３’ウイルス配列（バックグラウンドでは３’ＣＳＥとも呼ばれる）、およびポリアデニレートトラクト（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｅ  ｔｒａｃｔ）。アルファウイルス由来自己複製ＲＮＡは、ウイルスサブゲノムの「ジャンクション領域」プロモーター、１つまたは複数の構造タンパク質遺伝子に由来する配列またはこれらの部分、組換えアルファウイルス粒子の産生を可能にするのに十分なサイズの外来性核酸分子（複数可）、ならびに発現される異種配列（複数可）も含有することができる。
【００８３】
用語「アジュバント」は、それだけに限らないが、抗原に対する免疫応答を増大させ、かつ／または多様化させる免疫学的アジュバントを含めて、医薬品の作用を補助または改変する任意の物質を指す。したがって、免疫学的アジュバントは、抗原に対する免疫応答を強化することができる化合物を含む。免疫学的アジュバントは、体液性免疫および／または細胞性免疫を強化することができる。先天性免疫応答を刺激する物質は、本明細書の免疫学的アジュバントの定義内に含まれる。免疫学的アジュバントは、「免疫強化物質」と呼ばれる場合もある。
【００８４】
本明細書において、「抗原」または「免疫原」は、免疫応答を誘発する１つまたは複数のエピトープ（例えば、直鎖状、コンフォメーション、または両方）を含有する分子を指す。本明細書において、「エピトープ」は、その免疫学的特異性を決定する所与の種（例えば、抗原分子または抗原複合体）の一部である。エピトープは、抗原の本定義の範囲内である。用語「抗原」または「免疫原」は、本明細書において、サブユニット抗原、すなわち、抗原が自然において会合している生物体全体から分離され、別々になっている抗原を含む。抗イディオタイプ抗体などの抗体、またはこれらの断片、抗原もしくは抗原決定基を模倣することができる合成ペプチドミモトープも本明細書において、抗原の定義に取り込まれる。
【００８５】
「免疫応答（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）」または「免疫応答（ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）」は、抗原または免疫学的アジュバントに対する体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答の被験体における発生である。
【００８６】
免疫応答には、先天性免疫応答および適応免疫応答が含まれる。先天性免疫応答は、免疫系の防御の第一線をもたらす即効性の応答である。対照的に、適応免疫は、所与の病原体または障害（例えば、腫瘍）に由来する抗原を認識する体細胞性再構成受容体遺伝子（例えば、Ｔ細胞受容体およびＢ細胞受容体）を有する免疫細胞の選択およびクローン性増殖を使用し、それによって、特異性および免疫記憶がもたらされる。先天性免疫応答は、その多くの作用の中でも、炎症性サイトカインの急速なバースト、ならびにマクロファージおよび樹状細胞などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）の活性化をもたらす。病原体を自己成分と区別するために、先天性免疫系は、病原体関連分子パターン、またはＰＡＭＰとして公知の病原体からのシグネチャー（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）を検出する様々な相対的に不変の受容体を使用する。微生物成分を実験的なワクチンに添加すると、堅調で耐久性のある適応免疫応答が発生することが公知である。免疫応答のこの増強作用の背後の機構は、パターン認識受容体（ＰＲＲ）を伴うことが報告されており、ＰＲＲは、好中球、マクロファージ、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞を含めた様々な免疫細胞、ならびに上皮細胞および内皮細胞などのいくつかの非免疫細胞上で異なって発現される。ＰＲＲの関与（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）は、これらの細胞の一部の活性化、ならびにこれらのサイトカインおよびケモカインの分泌、ならびに他の細胞の成熟および遊走をもたらす。相前後して、これは、適応免疫応答を確立する炎症性環境を作り出す。ＰＲＲには、非食作用受容
体、例えば、トル様受容体（ＴＬＲ）、およびヌクレオチド結合オリゴマー形成ドメイン（ＮＯＤ）タンパク質など、ならびに食作用を誘導する受容体、例えば、スカベンジャー受容体、マンノース受容体、およびβ−グルカン受容体などが含まれる。報告されたＴＬＲ（本発明の様々な実施形態おいて免疫原性分子として使用することができる、いくつかの報告されたリガンドの例とともに）として、とりわけ、以下のものが挙げられる：ＴＬＲｌ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ由来の細菌リポタンパク質）、ＴＬＲ２（ザイモサン酵母粒子、ペプチドグリカン、リポタンパク質、リポペプチド、糖脂質、リポ多糖）、ＴＬＲ３（ウイルス二本鎖ＲＮＡ、ポリ：ＩＣ）、ＴＬＲ４（細菌リポ多糖、植物生成物タキソール）、ＴＬＲ５（細菌性フラジェリン）、ＴＬＲ６（酵母ザイモサン粒子、リポテイコ酸（ｌｉｐｏｔｅｃｈｏｉｃ  ａｃｉｄ）、マイコプラズマ由来のリポペプチド）、ＴＬＲ７（一本鎖ＲＮＡ、イミキモド、レシミキモド（ｒｅｓｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）、ならびにロキソリビンおよびブロピリミンなどの他の合成化合物）、ＴＬＲ８（一本鎖ＲＮＡ、レシミキモド）、およびＴＬＲ９（ＣｐＧオリゴヌクレオチド）。樹状細胞は、ナイーブＣＤ４＋ヘルパーＴ（ＴＨ）細胞のプライミングを開始し、ＣＤ８＋Ｔ細胞のキラー細胞への分化を誘導するための最も重要な細胞型の一部として認識される。ＴＬＲシグナル伝達は、例えば、観察される特定の型のＴＨ応答（例えば、ＴＨ１応答対ＴＨ２応答）を決定するＴＬＲシグナルの性質とともに、これらのヘルパーＴ細胞応答の質の決定において重要な役割を果たすことが報告されている。抗体（体液）および細胞性免疫の組合せが、ＴＨＩ型応答の一部として生成され、一方、ＴＨ２型応答は、大部分は抗体応答である。ＣｐＧ  ＤＮＡ（ＴＬＲ９）、およびイミダゾキノリン（ＴＬＲ７、ＴＬＲ８）などの様々なＴＬＲリガンドが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫細胞からのサイトカイン産生を刺激することが立証されている。イミダゾキノリンは、ＴＬＲアゴニストであることが示された最初の小さな薬物様化合物である。さらなる情報については、例えば、Ａ．  Ｐａｓｈｉｎｅ、Ｎ．  Ｍ．  Ｖａｌｉａｎｔｅ、およびＪ．  Ｂ．  Ｕｌｍｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １１巻、Ｓ６３〜Ｓ６８頁（２００５年）、Ｋ．  Ｓ．  ＲｏｓｅｎｔｈａｌおよびＤ．  Ｈ．  Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１３巻（８号）、８２１〜８２９頁（２００６年）、ならびにこれらに引用された参考文献を参照。
【００８７】
本発明の目的に関して、体液性免疫応答は、抗体分子によって媒介される免疫応答を指し、一方、細胞性免疫応答は、Ｔリンパ球および／または他の白血球によって媒介されるものである。細胞性免疫の重要な一様相は、細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）による抗原特異的応答を伴う。ＣＴＬは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）によってコードされ、細胞の表面上で発現されるタンパク質に会合して提示されるペプチド抗原に対して特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内微生物の細胞内破壊、またはこのような微生物に感染した細胞の溶解を誘導し、促すのを助ける。細胞性免疫の別の様相は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応答を伴う。ヘルパーＴ細胞は、その表面上でＭＨＣ分子と会合したペプチド抗原を提示する細胞に対する非特異的効果細胞の機能を刺激することを助けるように作用し、この細胞の活性に集中する。「細胞性免疫応答」は、活性化Ｔ細胞および／または他の白血球（ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞に由来するものを含む）によって産生されるサイトカイン、ケモカイン、および他のこのような分子の産生も指す。
【００８８】
したがって、細胞性免疫応答を誘発する免疫原性組成物などの組成物またはワクチンは、細胞表面のＭＨＣ分子との会合における抗原の提示によって、脊椎動物被験体を感作させるように機能することができる。細胞媒介免疫応答は、その表面で抗原を提示する細胞に、またはこの細胞付近に向けられる。さらに、抗原特異的Ｔリンパ球を生成することによって、免疫化された宿主の将来の保護を可能にすることができる。特定の抗原または組成物の細胞媒介免疫応答を刺激する能力は、当技術分野で公知のいくつかのアッセイによって、例えば、リンパ球増殖（リンパ球活性化）アッセイ、ＣＴＬ細胞傷害性細胞アッセイ、感作された被験体における抗原に特異的なＴリンパ球についてのアッセイ、または抗
原での再刺激に応答したＴ細胞によるサイトカイン産生の測定などによって判定することができる。このようなアッセイは、当技術分野で周知である。例えば、Ｅｒｉｃｋｓｏｎら（１９９３年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１５１巻：４１８９〜４１９９頁；Ｄｏｅら（１９９４年）Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２４巻：２３６９〜２３７６頁を参照。したがって、免疫応答は、本明細書において、ＣＴＬの産生および／またはヘルパーＴ細胞の産生もしくは活性化を刺激するものである場合がある。目的の抗原は、抗体媒介免疫応答も誘発することができる。したがって、免疫応答として、例えば、とりわけ、以下の作用のうちの１つまたは複数を挙げることができる：例えば、Ｂ細胞による抗体の産生、ならびに／または目的の組成物もしくはワクチン中に存在する１つまたは複数の抗原に特異的に向けられるサプレッサーＴ細胞および／もしくはγδＴ細胞の活性化。これらの応答は、例えば、感染力を中和するように、かつ／または抗体−補体もしくは抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を媒介して、免疫化された宿主に対して保護をもたらすように、機能することができる。このような応答は、当技術分野で周知の標準的なイムノアッセイおよび中和アッセイを使用して判定することができる。
【００８９】
本発明による組成物は、異なる組成物中の等価な量の抗原（例えば、抗原が可溶性タンパク質として投与される）に誘発される免疫応答より、免疫応答を誘発する能力が大きい場合、所与の抗原について「免疫原性の増強」を示す。したがって、例えば、組成物がより強い免疫応答を生じさせることによって、または抗原が投与される被験体において免疫応答を達成するのにより低い用量もしくはより少ない投与の抗原で済むことによって、組成物は、免疫原性の増強を示すことができる。このような免疫原性の増強は、例えば、動物に本発明の組成物および抗原対照を投与し、この２つのアッセイ結果を比較することによって判定することができる。
【００９０】
３．カチオン性水中油型エマルジョン
本明細書に開示されるカチオン性水中油型エマルジョンは、一般に、エマルジョンを調製するのに使用される成分の濃度によって、当技術分野で慣例的な様式で記述される。滅菌および他の下流プロセスを含めたエマルジョンを生成するプロセスの間に、少量の油（例えば、スクアレン）、カチオン性脂質（例えば、ＤＯＴＡＰ）、または他の成分が失われる場合があり、最終生成物（例えば、投与の準備ができているパッケージング、滅菌されたエマルジョン）中のこれらの成分の実際の濃度は、場合により、出発量よりわずかに低い場合があることが（最大約１０％または最大約２０％）、当技術分野において理解されている。
【００９１】
本発明は一般に、ＲＮＡ分子などの負に荷電した分子を送達するのに使用することができるカチオン性水中油型エマルジョンに関する。エマルジョン粒子は、油コアおよびカチオン性脂質を含む。カチオン性脂質は、例えば、静電気力、および疎水性／親水性相互作用を通じて負に荷電した分子と相互作用し、それによって、分子をエマルジョン粒子につなぎ留めることができる。本明細書に記載されるカチオン性エマルジョンは、負に荷電した分子、例えば、抗原をコードするＲＮＡ分子、または低分子干渉ＲＮＡなどを、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞に送達するのに特に適している。例えば、本明細書に記載されるカチオン性エマルジョンは、ワクチンとして、自己複製ＲＮＡを含めた抗原をコードするＲＮＡを送達することについて利点をもたらす。
【００９２】
水中油型エマルジョンの粒子は、油の中心コアを有するミセルに類似する。油コアは、カチオン性脂質でコーティングされており、カチオン性脂質は、ミセル様液滴として水性（連続）相中に油滴を分散させる。以下に記載される界面活性剤および／またはリン脂質などの１つまたは複数の任意選択の成分が、エマルジョン中に存在することができる。例えば、１つまたは複数の界面活性剤を、粒子形成を促し、かつ／またはエマルジョン粒子を安定化させるのに使用することができる。その場合、油コアは、カチオン性脂質ならび
に界面活性剤（複数可）でコーティングされることによって、ミセル様液滴を形成する。同様に、１つまたは複数の脂質（例えば、中性脂質、グリコール脂質、またはリン脂質）も、このような脂質が油滴を分散させるための乳化剤として使用される場合、エマルジョン粒子の表面上に存在することができる。
【００９３】
水中油型エマルジョンの粒子は、１マイクロメートル以下の平均直径（すなわち、数平均直径）を有する。カチオン性エマルジョンの平均粒子サイズ（すなわち、数平均直径）は、約９００ｎｍ以下、約８００ｎｍ以下、約７００ｎｍ以下、約６００ｎｍ以下、約５００ｎｍ以下、約４００ｎｍ以下、３００ｎｍ以下、または２００ｎｍ以下、例えば、約１ｎｍ〜約１μｍ、約１ｎｍ〜約９００ｎｍ、約１ｎｍ〜約８００ｎｍ、約１ｎｍ〜約７００ｎｍ、約１ｎｍ〜約６００ｎｍ、約１ｎｍ〜約５００ｎｍ、約１ｎｍ〜約４００ｎｍ、約１ｎｍ〜約３００ｎｍ、約１ｎｍ〜約２００ｎｍ、約１ｎｍ〜約１７５ｎｍ、約１ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約１ｎｍ〜約１２５ｎｍ、約１ｎｍ〜約１００ｎｍ、約１ｎｍ〜約７５ｎｍ、または約１ｎｍ〜約５０ｎｍであることが特に望ましい。
【００９４】
カチオン性エマルジョンの平均粒子直径は、約１８０ｎｍ以下、約１７０ｎｍ以下、約１６０ｎｍ以下、約１５０ｎｍ以下、約１４０ｎｍ以下、約１３０ｎｍ以下、約１２０ｎｍ以下、約１１０ｎｍ以下、または約１００ｎｍ以下、例えば、約８０ｎｍ〜１８０ｎｍ、約８０ｎｍ〜１７０ｎｍ、約８０ｎｍ〜１６０ｎｍ、約８０ｎｍ〜１５０ｎｍ、約８０ｎｍ〜１４０ｎｍ、約８０ｎｍ〜１３０ｎｍ、約８０ｎｍ〜１２０ｎｍ、約８０ｎｍ〜１１０ｎｍ、または約８０ｎｍ〜１００ｎｍであることが特に望ましい。特に好適な平均粒子直径は、約１００ｎｍである。
【００９５】
エマルジョン粒子のサイズは、油に対する界面活性剤の比（比を高くすると、液滴サイズが減少する）、均質化の運転圧（均質化の運転圧を上昇させると、一般的に、液滴サイズが低減する）、温度（温度を上昇させると、液滴サイズが減少する）を変化させることによって、油のタイプ、および以下に詳細に記載される他のプロセスパラメータを変化させることによって、変更することができる。水相中にある特定のタイプのバッファーを含めると、粒子サイズに影響する場合もある。
【００９６】
いくつかの場合では、ＲＮＡワクチンとの関連で、エマルジョン粒子のサイズが、ＲＮＡ−エマルジョン複合体の免疫原性に影響する場合がある。したがって、エマルジョンの平均粒子サイズの好適な範囲は、直径で、約８０ｎｍ〜約１８０ｎｍであるべきである。
【００９７】
本明細書に記載されるエマルジョン粒子は、負に荷電した分子と複合体を形成することができる。負に荷電した分子との複合体形成の前に、粒子の全正味電荷（一般的にゼータ電位として測定される）は、正（カチオン性）であるべきである。粒子の全正味電荷は、エマルジョン中のカチオン性脂質のタイプおよびカチオン性脂質の量、エマルジョン中の油の量（例えば、油の百分率が高いと、一般的に、粒子の表面上の電荷が減少する）に応じて変化する場合があり、エマルジョン中に存在する任意の追加の成分（例えば、界面活性剤（複数可）および／またはリン脂質（複数可））によっても影響され得る。例示的な実施形態では、複合体形成前の粒子のゼータ電位は、一般的に、１０ｍＶ超である。
【００９８】
複合体形成前の粒子のゼータ電位は、約５０ｍＶ以下、約４５ｍＶ以下、約４０ｍＶ以下、約３５ｍＶ以下、約３０ｍＶ以下、約２５ｍＶ以下、約２０ｍＶ以下；約５ｍＶ〜約５０ｍＶ、約１０ｍＶ〜約５０ｍＶ、約１０ｍＶ〜約４５ｍＶ、約１０ｍＶ〜約４０ｍＶ、約１０ｍＶ〜約３５ｍＶ、約１０ｍＶ〜約３０ｍＶ、約１０ｍＶ〜約２５ｍＶ、または約１０ｍＶ〜約２０ｍＶであることが好ましい。ゼータ電位は、（ｉ）エマルジョンのｐＨ、（ｉｉ）エマルジョンの伝導率（例えば、塩分）、および（ｉｉｉ）エマルジョンの様々な成分（ポリマー、非イオン性界面活性剤など）の濃度によって影響され得る。ＣＮ
Ｅのゼータ電位は、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｎａｎｏｓｅｒｉｅｓ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ）を使用して測定される。試料は、水中で１：１００に希釈され（粘度：０．８８７２ｃｐ、ＲＩ：１．３３０、誘電率：７８．５）、ポリスチレンラテックスキャピラリーセル（Ｍａｌｖｅｒｎ、Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ）に添加される。ゼータ電位は、２分の平衡時間とともに２５℃で測定され、Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉモデル（Ｆ（Ｋａ）値＝１．５）を使用して分析される。データは、ｍＶで報告される。
【００９９】
本発明の例示的なカチオン性エマルジョンは、ＣＮＥ１７である。ＣＮＥ１７の油コアは、スクアレン（４．３％  ｗ／ｖ）であり、カチオン性脂質は、ＤＯＴＡＰ（１．４ｍｇ／ｍＬ）である。ＣＮＥ１７は、界面活性剤のＳＰＡＮ８５（０．５％  ｖ／ｖの（ソルビタントリオレエート））およびＴｗｅｅｎ８０（０．５％  ｖ／ｖの（ポリソルベート８０；ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート））も含む。したがって、ＣＮＥ１７の粒子は、ＳＰＡＮ８５、Ｔｗｅｅｎ８０、およびＤＯＴＡＰでコーティングされたスクアレンのコアを含む。ＲＮＡ分子は、４：１のＮ／Ｐ比および１０：１のＮ／Ｐ比で効率的にＣＮＥ１７粒子と複合体を形成することが示された。他の例示的なカチオン性エマルジョンとして、例えば、ＣＮＥ０５（０．５％  ｗ／ｖのスクアレン、０．０８％のＴｗｅｅｎ８０、および１．２ｍｇ／ｍＬのＤＯＴＡＰ）、ＣＮＥ１２（４．３％のスクアレン、０．５％のＳＰＡＮ８５、０．５％のＴｗｅｅｎ８０、および２．４６ｍｇ／ｍＬのＤＣコレステロール）、ＣＮＥ１３（４．３％のスクアレン、０．５％のＳＰＡＮ８５、０．５％のＴｗｅｅｎ８０、および１．４５ｍｇ／ｍＬのＤＤＡ）、ならびに本明細書に記載される他のエマルジョンが挙げられる。
【０１００】
本発明の水中油型エマルジョンの個々の成分は、当技術分野で公知であるが、このような組成物が、本明細書に記載される様式で組み合わされたことはない。したがって、個々の成分は、好適な実施形態のために一般に、および少し詳しくの両方で以下に記載されているが、当技術分野で周知であり、本明細書で使用される用語、例えば、油コア、界面活性剤、リン脂質などは、さらなる説明なしで、十分に当業者に周知である。さらに、エマルジョンの個々の成分の量の好適な範囲が提供されているが、特定のエマルジョンの成分の実際の比は、所望のサイズおよび物理的特性のエマルジョン粒子が適切に形成され得るように調整される必要がある場合がある。例えば、特定の量の油が使用される場合（例えば、５％  ｖ／ｖの油）、界面活性剤の量は、安定なエマルジョンを形成するように水相中に油滴を分散させるのに十分なレベルであるべきである。水相中に油滴を分散させるのに必要とされる界面活性剤の実際の量は、エマルジョンに使用される界面活性剤のタイプおよび油コアのタイプに依存し、油の量も、液滴サイズによって変化する場合がある（これが、２つの相の間の表面積を変化させるので）。所望のエマルジョンの成分の実際の量および相対的な比率は、当業者によって容易に決定することができる。
【０１０１】
Ａ．油コア
カチオン性水中油型エマルジョンの粒子は、油コアを含む。好ましくは、油は、代謝可能な無毒性の油であり、より好ましくは、それだけに限らないが、アルカン、アルケン、アルキン、ならびにこれらの対応する酸およびアルコール、これらのエーテルおよびエステル、ならびにこれらの混合物を含めた、約６〜約３０炭素原子のうちの１つである。油は、エマルジョンが投与されることになる被験体の体によって代謝され得、被験体に毒性ではない任意の植物油、魚油、動物油、または合成的に調製された油とすることができる。被験体は、動物、一般的に、哺乳動物、好ましくは、ヒトとすることができる。
【０１０２】
ある特定の実施形態では、油コアは、２５℃で液相である。油コアは、２５℃で貯蔵されるとき、流体の特性を示す場合（固体および気体から区別され、明確な容積を有するが、明確な形状を有さない場合）、２５℃で液相である。しかし、エマルジョンは、任意の
適当な温度で貯蔵および使用することができる。油コアは、４℃で液相であることが好ましい。
【０１０３】
油は、任意の長鎖のアルカン、アルケン、もしくはアルキン、または遊離酸、その塩もしくはエステルとしてのこれらの酸誘導体もしくはアルコール誘導体、例えば、トリグリセリド、および１，２−プロパンジオールまたは同様のポリヒドロキシアルコールのエステルなどのモノエステル、またはジエステル、またはトリエステルなどとすることができる。アルコールは、一官能性酸または多官能性酸、例えば、酢酸、プロパン酸、クエン酸などを使用してアシル化することができる。油であり、本明細書に示される他の基準を満たす長鎖アルコールに由来するエーテルも使用することができる。
【０１０４】
個々のアルカン、アルケン、またはアルキンの部分、およびその酸誘導体またはアルコール誘導体は、一般に、約６〜約３０炭素原子を有することになる。この部分は、直鎖または分岐鎖の構造を有することができる。これは、完全に飽和していても、１つまたは複数の二重結合または三重結合を有していてもよい。モノエステルもしくはポリエステル、またはモノエーテルもしくはポリエーテルに基づく油が使用される場合、約６〜約３０炭素の制限は、個々の脂肪酸または脂肪アルコール部分に適用し、合計炭素数に適用しない。
【０１０５】
油は、エマルジョンが投与される宿主によって代謝され得ることが特に望ましい。
【０１０６】
動物、魚、または植物の供給源からの任意の適当な油を使用することができる。植物油の供給源には、堅果、種子、および穀類が含まれ、適当な油には、ラッカセイ油、ダイズ油、ヤシ油、およびオリーブ油などが含まれる。他の適当な種子油として、サフラワー油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ種子油などが挙げられる。穀類の群では、トウモロコシ油、および他の穀物、例えば、コムギ、カラスムギ、ライムギ、イネ、テフ、ライコムギなどの油も使用することができる。植物油を得るための技術は、十分に開発されており、周知である。これらの油および他の同様の油の組成は、例えば、メルクインデックス、および食品原料、栄養食品技術（ｓｏｕｒｃｅ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｏｎ  ｆｏｏｄｓ、ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｏｏｄ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に見出すことができる。
【０１０７】
グリセロールと１，２−プロパンジオールの約６〜約１０炭素の脂肪酸エステルは、種子油中に天然に存在しないが、堅果油および種子油から出発して、適切な材料の加水分解、分離、およびエステル化によって調製することができる。これらの製品は、ＰＶＯ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ．、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、４１６  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  Ｓｔｒｅｅｔ、Ｂｏｏｎｇｏｎ、Ｎ．Ｊ．からＮＥＯＢＥＥＳの名称で、およびその他で市販されている。
【０１０８】
動物油および動物性脂肪は、トリグリセリドとして存在し、魚または植物に由来する油より高い程度の飽和度を有するという事実のために、生理的温度で固相であることが多い。しかし、脂肪酸は、部分的または完全にトリグリセリドをけん化することによって動物性脂肪から得られ、このけん化は、遊離脂肪酸をもたらす。哺乳動物乳に由来する脂肪および油は、代謝可能であり、したがって、本発明の実施において使用することができる。動物供給源から純粋な油を得るのに必要な分離、精製、けん化、および他の手段の手順は、当技術分野で周知である。
【０１０９】
ほとんどの魚は、容易に収集することができる代謝可能な油を含有する。例えば、タラ肝油、サメ肝油、および鯨ろうなどの鯨油は、本明細書で使用することができる魚油のいくつかを例示する。いくつかの分岐鎖油は、５炭素イソプレン単位で生化学的に合成され
、一般に、テルペノイドと呼ばれる。スクアレン（２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエン）は、分岐、不飽和のテルペノイドであり、本明細書で特に好適である。スクアレンの主要な供給源はサメ肝油であるが、アマランサス種子、米糠、コムギ胚芽、およびオリーブ油を含めた植物性油（ｐｌａｎｔ  ｏｉｌ）（主に植物油（ｖｅｇｅｔａｂｌｅ  ｏｉｌ））も適当な供給源である。スクアレンの飽和類似体であるスクアランも好適である。スクアレンおよびスクアランを含めた魚油は、商業的供給源から容易に入手可能であり、または当技術分野で公知の方法によって得ることができる。
【０１１０】
ある特定の実施形態では、油コアは、ヒマシ油、ヤシ油、トウモロコシ油、綿実油、月見草油、魚油、ホホバ油、ラード油、亜麻仁油、オリーブ油、ラッカセイ油、サフラワー油、ゴマ油、ダイズ油、スクアレン、ヒマワリ油、コムギ胚芽油、および鉱油からなる群より選択される油を含む。例示的な実施形態では、油コアは、ダイズ油、ヒマワリ油、オリーブ油、スクアレン、またはこれらの組合せを含む。スクアランも、油として使用することができる。例示的な実施形態では、油コアは、スクアレン、スクアラン、またはこれらの組合せを含む。
【０１１１】
エマルジョンの油成分は、約０．２％〜約２０％（ｖ／ｖ）の量で存在することができる。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．２％〜約２０％（ｖ／ｖ）の油、約０．２％〜約１５％（ｖ／ｖ）の油、約０．２％〜約１０％（ｖ／ｖ）の油、約０．２％〜約９％（ｖ／ｖ）の油、約０．２％〜約８％（ｖ／ｖ）の油、約０．２％〜約７％（ｖ／ｖ）の油、約０．２％〜約６％（ｖ／ｖ）の油、約０．２％〜約５％（ｖ／ｖ）の油、約０．２％〜約４．３％（ｖ／ｖ）の油、約０．３％〜約２０％（ｖ／ｖ）の油、約０．４％〜約２０％（ｖ／ｖ）の油、約０．５％〜約２０％（ｖ／ｖ）の油、約１％〜約２０％（ｖ／ｖ）の油、約２％〜約２０％（ｖ／ｖ）の油、約３％〜約２０％（ｖ／ｖ）の油、約４％〜約２０％（ｖ／ｖ）の油、約４．３％〜約２０％（ｖ／ｖ）の油、約５％〜約２０％（ｖ／ｖ）の油、約０．５％（ｖ／ｖ）の油、約１％（ｖ／ｖ）の油、約１．５％（ｖ／ｖ）の油、約２％（ｖ／ｖ）の油、約２．５％（ｖ／ｖ）の油、約３％（ｖ／ｖ）の油、約３．５％（ｖ／ｖ）の油、約４％（ｖ／ｖ）の油、約４．３％（ｖ／ｖ）の油、約５％（ｖ／ｖ）の油、または約１０％（ｖ／ｖ）の油を含むことができる。
【０１１２】
あるいは、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．２％〜約１０％（ｗ／ｖ）の油、約０．２％〜約９％（ｗ／ｖ）の油、約０．２％〜約８％（ｗ／ｖ）の油、約０．２％〜約７％（ｗ／ｖ）の油、約０．２％〜約６％（ｗ／ｖ）の油、約０．２％〜約５％（ｗ／ｖ）の油、約０．２％〜約４．３％（ｗ／ｖ）の油、または約４．３％（ｗ／ｖ）の油を含むことができる。
【０１１３】
例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．５％（ｖ／ｖ）の油を含む。別の例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約４．３％（ｖ／ｖ）の油を含む。別の例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約５％（ｖ／ｖ）油を含む。別の例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約４．３％（ｗ／ｖ）のスクアレンを含む。
【０１１４】
上記に言及したように、上述した油の百分率は、エマルジョンを調製するのに使用される油の最初の量に基づいて決定される。最終生成物（例えば、投与の準備ができているパッケージング、滅菌されたエマルジョン）中の油の実際の濃度は、場合により、わずかに低い場合があることが（最大約１０％または最大約２０％）、当技術分野において理解されている。
【０１１５】
Ｂ．カチオン性脂質
本明細書に記載されるエマルジョン粒子は、カチオン性脂質を含み、これは、負に荷電した分子と相互作用し、それによって、分子をエマルジョン粒子につなぎ留めることができる。
【０１１６】
任意の適当なカチオン性脂質を使用することができる。一般に、カチオン性脂質は、生理的条件下で正に荷電した窒素原子を含有する。適当なカチオン性脂質として、塩化ベンザルコニウム（ＢＡＫ）、塩化ベンゼトニウム、セトリマイド（これは、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ならびに場合により少量のドデシルトリメチルアンモニウムブロミドおよびヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドを含有する）、塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）、セチルトリメチルアンモニウムクロリド（ＣＴＡＣ）、１級アミン、２級アミン、それだけに限らないが、Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ポリオキシエチレン（１０）−Ｎ−タロウ−１，３−ジアミノプロパンを含めた３級アミン、他の４級アミン塩、例えば、それだけに限らないが、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルトリメチル−アンモニウムブロミド、混合アルキル−トリメチル−アンモニウムブロミド、ベンジルジメチルドデシルアンモニウムクロリド、ベンジルジメチルヘキサデシル−アンモニウムクロリド、ベンジルトリメチルアンモニウムメトキシド、セチルジメチルエチルアンモニウムブロミド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、メチルベンゼトニウムクロリド、塩化デカメトニウム、メチル混合トリアルキルアンモニウムクロリド、メチルトリオクチルアンモニウムクロリド、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［２（２−メチル−４−（１，１，３，３テトラメチルブチル）−フェノキシ］−エトキシ）エチル］−ベンゼンメタ−ナミニウム（ｂｅｎｚｅｎｅｍｅｔｈａ−ｎａｍｉｎｉｕｍ）クロリド（ＤＥＢＤＡ）、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、［１−（２，３−ジオレイルオキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ，トリメチルアンモニウムクロリド、１，２−ジアシル−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（アシル基＝ジミリストイル、ジパルミトイル、ジステアロイル、ジオレオイル）、１，２−ジアシル−３（ジメチルアンモニオ）プロパン（アシル基＝ジミリストイル、ジパルミトイル、ジステアロイル、ジオレオイル）、１，２−ジオレオイル−３−（４’−トリメチル−アンモニオ）ブタノイル−ｓｎ−グリセロール、１，２−ジオレオイル３−スクシニル−ｓｎ−グリセロールコリンエステル、コレステリル（４’−トリメチルアンモニオ）ブタノエート、Ｎ−アルキルピリジニウム塩（例えば、臭化セチルピリジニウムおよび塩化セチルピリジニウム）、Ｎ−アルキルピペリジニウム塩、ジカチオン性ボラフォーム（ｂｏｌａｆｏｒｍ）電解質（Ｃ１２Ｍｅ６；Ｃ１２Ｂｕ６）、ジアルキルグリセチルホスホリルコリン、リゾレシチン、Ｌ−αジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、コレステロールヘミコハク酸コリンエステル、リポポリアミン、例えば、それだけに限らないが、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノール−アミドスペルミン（ＤＰＰＥＳ）、リポポリ−Ｌ（またはＤ）−リシン（ＬＰＬＬ、ＬＰＤＬ）、Ｎ−グルタリルホスファチジルエタノールアミンにコンジュゲートされたポリＬ（またはＤ）−リシン、ペンダントアミノ基を有するグルタミン酸ジドデシルエステル（Ｃ１２ＧｌｕＰｈＣｎＮ���）、ペンダントアミノ基を有するグルタミン酸ジテトラデシルエステル（Ｃ１４ＧｌｕＣｎＮ＋）、コレステロールのカチオン性誘導体、例えば、それだけに限らないが、コレステリル−３β−オキシスクシンアミドエチレントリメチルアンモニウム塩、コレステリル−３β−オキシスクシンアミドエチレンジメチルアミン、コレステリル−３β−カルボキシアミドエチレントリメチルアンモニウム塩、コレステリル−３β−カルボキシアミドエチレンジメチルアミン、および３γ−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ−ジメチルアミノエタンカルボモイル］コレステロール）（ＤＣ−コレステロール）、１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）、１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、ジパルミトイル（Ｃ１６：０）トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＰＴＡＰ）、ジステアロイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）、ならびにこれらの組合せが挙げられる。
【０１１７】
本発明で使用するのに適した他のカチオン性脂質には、例えば、米国特許公開第２００８／００８５８７０号（２００８年４月１０日公開）および同第２００８／００５７０８０号（２００８年３月６日公開）に記載されたカチオン性脂質が含まれる。
【０１１８】
本発明で使用するのに適した他のカチオン性脂質には、例えば、ＷＯ２０１１／０７６８０７の表６（１１２〜１３９頁）に開示された脂質Ｅ０００１〜Ｅ０１１８またはＥ０１１９〜Ｅ０１８０が含まれる（ＷＯ２０１１／０７６８０７は、これらのカチオン性脂質を作製する方法、および使用する方法も開示している）。追加の適当なカチオン性脂質には、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジオレオイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＯＥＰＣ）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）が含まれる。
【０１１９】
エマルジョンは、本明細書に記載されるカチオン性脂質の２つ以上の任意の組合せを含むことができる。
【０１２０】
好適な実施形態では、カチオン性脂質は、１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣコレステロール）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）、１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、ジパルミトイル（Ｃ１６：０）トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＰＴＡＰ）、ジステアロイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）、ＷＯ２０１１／０７６８０７の表６（１１２〜１３９頁）に開示されている脂質Ｅ０００１〜Ｅ０１１８もしくはＥ０１１９〜Ｅ０１８０、およびこれらの組合せからなる群より選択される。
【０１２１】
他の好適な実施形態では、カチオン性脂質は、１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣコレステロール）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）、１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、ジパルミトイル（Ｃ１６：０）トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＰＴＡＰ）、ジステアロイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジオレオイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＯＥＰＣ）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、ＷＯ２０１１／０７６８０７の表６（１１２〜１３９頁）に開示されている脂質Ｅ０００１〜Ｅ０１１８もしくはＥ０１１９〜Ｅ０１８０、およびこれらの組合せからなる群より選択される。
【０１２２】
ある特定の実施形態では、カチオン性脂質はＤＯＴＡＰである。カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰを含むことができる。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．１ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍ
ｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．３ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．４ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．６ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．７ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２４ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２２ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１８ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１２ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．９ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．８ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．７ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約３．０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ、約１．１ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ、約１．３ｍｇ／ｍｌ、約１．４ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ、約１．６ｍｇ／ｍｌ、約１２ｍｇ／ｍｌ、約１８ｍｇ／ｍｌ、約２０ｍｇ／ｍｌ、約２１．８ｍｇ／ｍｌ、約２４ｍｇ／ｍｌなどでＤＯＴＡＰを含むことができる。
【０１２３】
例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、例えば、０．８ｍｇ／ｍｌ、１．２ｍｇ／ｍｌ、１．４ｍｇ／ｍｌ、または１．６ｍｇ／ｍｌなどのＤＯＴＡＰを含む。
【０１２４】
ある特定の実施形態では、カチオン性脂質はＤＣコレステロールである。カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌのＤＣコレステロールでＤＣコレステロールを含むことができる。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．４ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．６２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約２．４６ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約３．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約４ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約４．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約４．９２ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約４．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約４ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約３．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２．４６ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約０．６２ｍｇ／ｍｌ、約０．１５ｍｇ／ｍｌ、約０．３ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ、約０．６２ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ、約２．４６ｍｇ／ｍｌ、約４．９２ｍｇ／ｍｌなどのＤＣコレステロールを含むことができる。
【０１２５】
例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．６２ｍｇ／ｍｌ〜約４．９２ｍｇ／ｍｌ、例えば、２．４６ｍｇ／ｍｌなどのＤＣコレステロールを含む。
【０１２６】
ある特定の実施形態では、カチオン性脂質はＤＤＡである。カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌのＤＤＡを含むことができる。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約４．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約４ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約３．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１．４５ｍｇ／ｍｌ、約０．２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．４ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ
／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．７３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１．４５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約２．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約３．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約４ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約４．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ、約１．４５ｍｇ／ｍｌなどでＤＤＡを含むことができる。あるいは、カチオン性水中油型エマルジョンは、約２０ｍｇ／ｍｌ、約２１ｍｇ／ｍｌ、約２１．５ｍｇ／ｍｌ、約２１．６ｍｇ／ｍｌ、約２５ｍｇ／ｍｌでＤＤＡを含むことができる。
【０１２７】
例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．７３ｍｇ／ｍｌ〜約１．４５ｍｇ／ｍｌ、例えば、１．４５ｍｇ／ｍｌなどのＤＤＡを含む。
【０１２８】
ある特定の実施形態では、カチオン性脂質はＤＯＴＭＡである。カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＭＡを含むことができる。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．１ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．３ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．４ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．６ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．７ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２４ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２２ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１８ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１２ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．９ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．８ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．７ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約３．０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ、約１．１ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ、約１．３ｍｇ／ｍｌ、約１．３５ｍｇ／ｍｌ、約１．４ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ、約１．６ｍｇ／ｍｌ、約１２ｍｇ／ｍｌ、約１８ｍｇ／ｍｌ、約２０ｍｇ／ｍｌ、約２２．５ｍｇ／ｍｌ、約２５ｍｇ／ｍｌなどでＤＯＴＭＡを含むことができる。
【０１２９】
例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、例えば、０．８ｍｇ／ｍｌ、１．２ｍｇ／ｍｌ、１．４ｍｇ／ｍｌ、または１．６ｍｇ／ｍｌなどのＤＯＴＭＡを含む。
【０１３０】
ある特定の実施形態では、カチオン性脂質はＤＯＥＰＣである。カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌのＤＯＥＰＣを含むことができる。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．１ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．３ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．４ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．６ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．７ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約
２４ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２２ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１８ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１２ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約４ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．９ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．８ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．７ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ〜約１．７ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ〜約１．７ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約１．７ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約３．０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ、約１．１ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ、約１．３ｍｇ／ｍｌ、約１．４ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ、約１．６ｍｇ／ｍｌ、約１．７ｍｇ／ｍｌ、約１．８ｍｇ／ｍｌ、約１．９ｍｇ／ｍｌ、約２．０ｍｇ／ｍｌ、約１２ｍｇ／ｍｌ、約１８ｍｇ／ｍｌ、約２０ｍｇ／ｍｌ、約２２．５ｍｇ／ｍｌ、約２５ｍｇ／ｍｌなどでＤＯＥＰＣを含むことができる。
【０１３１】
例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約１．８ｍｇ／ｍｌ、例えば、０．８ｍｇ／ｍｌ、１．２ｍｇ／ｍｌ、１．４ｍｇ／ｍｌ、１．６ｍｇ／ｍｌ、１．７ｍｇ／ｍｌ、または１．８ｍｇ／ｍｌなどのＤＯＥＰＣを含む。
【０１３２】
ある特定の実施形態では、カチオン性脂質はＤＳＴＡＰである。カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌのＤＳＴＡＰを含むことができる。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．１ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．３ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．４ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．６ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．７ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２４ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２２ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１８ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１２ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約４ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．９ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．８ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．７ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ〜約１．７ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ〜約１．７ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約１．７ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約３．０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ、約１．１ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ、約１．３ｍｇ／ｍｌ、約１．４ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ、約１．６ｍｇ／ｍｌ、約１．７ｍｇ／ｍｌ、約１．８ｍｇ／ｍｌ、約１．９ｍｇ／ｍｌ、約２．０ｍｇ／ｍｌ、約１２ｍｇ／ｍｌ、約１８ｍｇ／ｍｌ、約２０ｍｇ／ｍｌ、約２２．５ｍｇ／ｍｌ、約２５ｍｇ／ｍｌなどでＤＳＴＡＰを含むことができる。
【０１３３】
例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、例えば、０．８ｍｇ／ｍｌ、１．２ｍｇ／ｍｌ、１．４ｍｇ／ｍｌ、または１．６ｍｇ／ｍｌなどのＤＳＴＡＰを含む。
【０１３４】
ある特定の実施形態では、カチオン性脂質はＤＯＤＡＣである。カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌのＤＯＤＡＣを含むことができる。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．１ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．３ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．４ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．６ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．７ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２４ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２２ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１８ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１２ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約４ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．９ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．８ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．７ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ〜約１．７ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ〜約１．７ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約１．７ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約３．０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ、約１．１ｍｇ／ｍｌ、約１．１５ｍｇ／ｍｌ、約１．１６ｍｇ／ｍｌ、約１．１７ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ、約１．３ｍｇ／ｍｌ、約１．４ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ、約１．６ｍｇ／ｍｌ、約１．７ｍｇ／ｍｌ、約１．８ｍｇ／ｍｌ、約１．９ｍｇ／ｍｌ、約２．０ｍｇ／ｍｌ、約１２ｍｇ／ｍｌ、約１８ｍｇ／ｍｌ、約２０ｍｇ／ｍｌ、約２２．５ｍｇ／ｍｌ、約２５ｍｇ／ｍｌなどでＤＯＤＡＣを含むことができる。
【０１３５】
例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、０．７３ｍｇ／ｍｌ〜約１．４５ｍｇ／ｍｌ、例えば、１．４５ｍｇ／ｍｌなどのＤＯＤＡＣを含む。
【０１３６】
ある特定の実施形態では、カチオン性脂質はＤＯＤＡＰである。カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌのＤＯＤＡＰを含むことができる。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．１ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．３ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．４ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．６ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．７ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２４ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２２ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１８ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１２ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約４ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．９ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．８ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．７ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ〜約１．７ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ〜約１．７ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約１．７ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約３．０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ、約１．１ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ、約１．３ｍｇ／ｍｌ、約１．４ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ、約１．６ｍｇ／ｍｌ、約１．７ｍｇ
／ｍｌ、約１．８ｍｇ／ｍｌ、約１．９ｍｇ／ｍｌ、約２．０ｍｇ／ｍｌ、約１２ｍｇ／ｍｌ、約１８ｍｇ／ｍｌ、約２０ｍｇ／ｍｌ、約２２．５ｍｇ／ｍｌ、約２５ｍｇ／ｍｌなどでＤＯＤＡＰを含むことができる。
【０１３７】
例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、例えば、０．８ｍｇ／ｍｌ、１．２ｍｇ／ｍｌ、１．４ｍｇ／ｍｌ、または１．６ｍｇ／ｍｌなどのＤＯＤＡＰを含む。
【０１３８】
いくつかの場合では、油コアにおいて可溶性であるカチオン性脂質を使用することが望ましい場合がある。例えば、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＥＰＣ、ＤＯＤＡＣ、およびＤＯＴＭＡは、スクアレンまたはスクアラン中に可溶性である。他の場合では、油コアにおいて可溶性ではないカチオン性脂質を使用することが望ましい場合がある。例えば、ＤＤＡおよびＤＳＴＡＰは、スクアレン中に可溶性ではない。特定の脂質が油において可溶性であるか不溶性であるかを判定し、それに応じて適切な油と脂質の組合せを選ぶことは、当技術分野の知識の範囲内である。例えば、溶解度は、脂質および油の構造に基づいて予想することができる（例えば、脂質の溶解度は、そのテールの構造によって決定され得る）。例えば、１つまたは２つの不飽和脂肪酸鎖（例えば、オレオイルテール）を有する脂質、例えば、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＥＰＣ、ＤＯＤＡＣ、ＤＯＴＭＡなどは、スクアレンまたはスクアランにおいて可溶性であり、一方、飽和脂肪酸鎖（例えば、ステアロイルテール）を有する脂質は、スクアレンにおいて可溶性ではない。あるいは、溶解度は、所与の量の油中に溶解して飽和溶液を形成する脂質の量によって求めることができる。
【０１３９】
上記に言及したように、上述した脂質の濃度は、エマルジョンを調製するのに使用される脂質の最初の量に基づいて求められる。最終生成物（例えば、投与の準備ができているパッケージング、滅菌されたエマルジョン）中の油の実際の濃度は、場合により、わずかに低い場合があることが（最大約２０％）、当技術分野において理解されている。
【０１４０】
Ｃ．追加の成分
本明細書に記載されるカチオン性水中油型エマルジョンは、追加の成分をさらに含むことができる。例えば、エマルジョンは、粒子形成を促し、負に荷電した分子とカチオン性粒子との間の複合体形成を改善し、または負に荷電した分子の安定性を増大させる（例えば、ＲＮＡ分子の分解を防止する）ことができる成分を含むことができる。
【０１４１】
界面活性剤
ある特定の実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子は、界面活性剤をさらに含む。
【０１４２】
相当な数の界面活性剤が医薬品科学において使用されている。これらには、天然に由来する材料、例えば、樹木からのゴム、植物タンパク質、アルギネートおよびセルロースなどの糖ベースのポリマーなどが含まれる。炭素主鎖上にヒドロキシドまたは他の親水性置換基を有するある特定のオキシポリマーまたはポリマー、例えば、ポビドン、ポリビニルアルコール、およびグリコールエーテルベースの一官能性化合物および多官能性化合物は、界面活性剤活性を有する。長鎖脂肪酸由来化合物は、本発明で使用することができる乳化剤および懸濁剤の第３の実質的な群を形成する。
【０１４３】
適当な界面活性剤の具体例として、以下のものが挙げられる：
１．高級脂肪酸（Ｃ１０〜Ｃ２２）のナトリウム、カリウム、アンモニウム、およびアルカノール−アンモニウムの塩などの水溶性石けん、特に、ナトリウムタロウおよびカリウムタロウならびにココナツ石けん。
【０１４４】
２．その分子構造内に約８〜２２個の炭素原子を含有するアルキルラジカル、ならびにスルホン酸ラジカルおよび硫酸エステルラジカルからなる群より選択されるラジカルを有する有機硫酸反応生成物の水溶性塩によって代表され得るアニオン性合成非石けん界面活性剤。これらの例は、タロウまたはヤシ油に由来するナトリウムまたはカリウムアルキルスルフェート；ナトリウムまたはカリウムアルキルベンゼンスルホネート；ナトリウムアルキルグリセリルエーテルスルホネート；ナトリウムヤシ油脂肪酸モノグリセリドスルホネートおよびスルフェート；高級脂肪アルコール１モルとエチレンオキシド約１〜６モルとの反応生成物の硫酸エステルのナトリウムまたはカリウム塩；１分子当たり１〜１０単位のエチレンオキシドを有し、アルキルラジカルが８〜１２個の炭素原子を含有するナトリウムまたはカリウムアルキルフェノールエチレンオキシドエーテルスルホネート；イセチオン酸でエステル化され、水酸化ナトリウムで中和された脂肪酸の反応生成物；メチルタウリド（ｍｅｔｈｙｌ  ｔａｕｒｉｄｅ）の脂肪酸アミドのナトリウムまたはカリウム塩；ならびにＳＯ３−スルホン化されたＣ１０〜Ｃ２４α−オレフィンのナトリウムまたはカリウム塩である。
【０１４５】
３．アルキレンオキシド基を有機疎水性化合物と縮合することによって作製される非イオン性合成界面活性剤。一般的な疎水性基には、プロピレンオキシドのプロピレングリコールとの縮合生成物、アルキルフェノール、プロピレンオキシドとエチレンジアミンの縮合生成物、８〜２２個の炭素原子を有する脂肪族アルコール、および脂肪酸のアミドが含まれる。
【０１４６】
４．半極性特性を有する非イオン性界面活性剤、例えば、アミンオキシド、ホスフィンオキシド、およびスルホキシドなど。長鎖３級アミンオキシドの具体例には、ジメチルドデシルアミンオキシド、およびビス−（２−ヒドロキシエチル）ドデシルアミンが含まれる。ホスフィンオキシドの具体例は、１９６７年２月１４日に発行された米国特許第３，３０４，２６３号に見出され、これらには、ジメチルドデシルホスフィンオキシドおよびジメチル−（２ヒドロキシドデシル）ホスフィンオキシドが含まれる。
【０１４７】
５．式Ｒ１−ＳＯ−Ｒ２（式中、Ｒ１およびＲ２は、置換または非置換のアルキル基であり、前者は、約１０〜約２８個の炭素原子を含有し、一方、Ｒ２は、１〜３個の炭素原子を含有する）に対応するものを含めた長鎖スルホキシド。これらのスルホキシドの具体例には、ドデシルメチルスルホキシド、および３−ヒドロキシトリデシルメチルスルホキシドが含まれる。
【０１４８】
６．ナトリウム３−ドデシルアミノプロピオネート、およびナトリウム３−ドデシルアミノプロパンスルホネートなどの両性合成界面活性剤。
【０１４９】
７．３−（Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヘキサデシルアンモニオ）プロパン−１−スルホネート、および３−（Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヘキサデシルアンモニオ）−２−ヒドロキシプロパン−１−スルホネートなどの双性イオン性合成界面活性剤。
【０１５０】
さらに、以下のタイプの界面活性剤のすべてを、本発明の組成物中に使用することができる：（ａ）脂肪酸、ロジン酸、およびトールオイルの石けん（すなわち、アルカリ塩）；（ｂ）アルキルアレーンスルホネート；（ｃ）分岐鎖および直鎖疎水性基の両方、ならびに１級および２級スルフェート基を有する界面活性剤を含めたアルキルスルフェート；（ｄ）疎水性基と親水性基との間に中間連結を含有するスルフェートおよびスルホネート、例えば、脂肪アシル化メチルタウリドおよび硫酸化脂肪モノグリセリドなど；（ｅ）ポリエチレングリコールの長鎖の酸エステル、特にトールオイルエステル；（ｆ）アルキルフェノールのポリエチレングリコールエーテル；（ｇ）長鎖アルコールとメルカプタンのポリエチレングリコールエーテル；ならびに（ｈ）脂肪アシルジエタノールアミド。界面
活性剤は、１つを超える様式で分類することができるので、この段落で示した界面活性剤のいくつかのクラスは、以前に記載した界面活性剤のクラスと重複する。
【０１５１】
生物学的状況のために具体的に設計され、その状況において一般に使用されるいくつかの界面活性剤が存在する。このような界面活性剤は、４つの基本タイプ、すなわち、アニオン性、カチオン性、双性イオン性（両性）、および非イオン性に分けられる。例示的なアニオン性界面活性剤として、例えば、ペルフルオロオクタノエート（ＰＦＯＡもしくはＰＦＯ）、ペルフルオロオクタンスルホネート（ＰＦＯＳ）、アルキル硫酸塩、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、または硫酸ラウリルアンモニウム、硫酸ラウレスナトリウム（ナトリウムラウリルエーテルスルフェート、ＳＬＥＳとしても公知）、アルキルベンゼンスルホネート、および脂肪酸塩が含まれる。例示的なカチオン性界面活性剤には、例えば、アルキルトリメチルアンモニウム塩、例えば、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ、またはヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド）、塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）、ポリエトキシ化タロウアミン（ＰＯＥＡ）、塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ）、塩化ベンゼトニウム（ＢＺＴ）が含まれる。例示的な双性イオン性（両性）界面活性剤には、例えば、ドデシルベタイン、コカミドプロピルベタイン、およびココアンホ（ｃｏｃｏ  ａｍｐｈｏ）グリシネートが含まれる。例示的な非イオン性界面活性剤として、例えば、アルキルポリ（エチレンオキシド）、アルキルフェノールポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレンオキシド）とポリ（プロピレンオキシド）のコポリマー（ポロキサマーまたはポロキサミンと商業的に呼ばれる）、アルキル（ａａｙｌ）ポリグルコシド（例えば、オクチルグルコシドまたはデシルマルトシド）、脂肪アルコール（例えば、セチルアルコールまたはオレイルアルコール）、コカミドＭＥＡ、コカミドＤＥＡ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ−６８（ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）、およびポリソルベート、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０（ポリソルベート２０）、Ｔｗｅｅｎ８０（ポリソルベート８０；ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、ドデシルジメチルアミンオキシド、およびビタミンＥトコフェロールプロピレングリコールコハク酸（ビタミンＥ  ＴＰＧＳ）が挙げられる。
【０１５２】
界面活性剤の特に有用な群は、ソルビタンベースの非イオン性界面活性剤である。これらの界面活性剤は、ソルビトールを脱水して１，４−ソルビタンを得、次いでこれを、１つまたは複数の当量の脂肪酸と反応させることによって調製される。脂肪酸置換部分を、エチレンオキシドとさらに反応させることによって、第２の群の界面活性剤を得ることができる。
【０１５３】
脂肪酸置換ソルビタン界面活性剤は、１，４−ソルビタンを、脂肪酸、例えば、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、または同様の長鎖脂肪酸などと反応させて、１，４−ソルビタンモノエステル、１，４−ソルビタンセスキエステル、または１，４−ソルビタントリエステルを得ることによって作製される。これらの界面活性剤の一般名称には、例えば、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート（ｓｏｒｂｉｔａｎ  ｍｏｎｏｅｓｔｅａｒａｔｅ）、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンセスキオレエート、およびソルビタントリオレエートが含まれる。これらの界面活性剤は、通常、様々なモノエステル、ジエステル、およびトリエステル置換ソルビタンを区別する文字または数値が指定されて、ＳＰＡＮ（登録商標）、またはＡＲＬＡＣＥＬ（登録商標）の名称で市販されている。
【０１５４】
ＳＰＡＮ（登録商標）およびＡＲＬＡＣＥＬ（登録商標）界面活性剤は、親水性であり、一般に、油中に可溶性または分散性である。これらはまた、ほとんどの有機溶媒中に可溶性である。水中で、これらは、一般に不溶性であるが分散性である。一般に、これらの界面活性剤は、１．８〜８．６の親水性親油性バランス（ＨＬＢ）数を有することになる。このような界面活性剤は、当技術分野で公知の手段によって容易に作製することができ
、または市販されている。
【０１５５】
界面活性剤の関係した群は、ポリオキシエチレン（ｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ）ソルビタンモノエステル、およびポリオキシエチレンソルビタントリエステルを含む。これらの材料は、１，４−ソルビタンモノエステル（ｍｏｎｅｓｔｅｒ）またはトリエステルにエチレンオキシドを付加することによって調製される。ポリオキシエチレンを付加すると、親油性のソルビタンモノエステルまたはトリエステル界面活性剤が、一般に水中で可溶性または分散性であり、有機液体中で様々な程度に可溶性である親水性界面活性剤に変換される。
【０１５６】
これらの材料は、ＴＷＥＥＮ（登録商標）の商標で市販されており、水中油型エマルジョンおよび分散物の調製、または油の可溶化、および水溶性または洗浄可能な無水軟膏の作製に有用である。ＴＷＥＥＮ（登録商標）界面活性剤は、関係したソルビタンモノエステルまたはトリエステル界面活性剤と合わせることによって、エマルジョン安定性を促すことができる。ＴＷＥＥＮ（登録商標）界面活性剤は、一般に、９．６〜１６．７に入るＨＬＢ値を有する。ＴＷＥＥＮ（登録商標）界面活性剤は、市販されている。
【０１５７】
単独で、またはＳＰＡＮ、ＡＲＬＡＣＥＬ（登録商標）、およびＴＷＥＥＮ界面活性剤とともに使用することができる非イオン性界面活性剤の第３の群は、エチレンオキシドを長鎖脂肪酸と反応させることによって作製されるポリオキシエチレン脂肪酸である。このタイプの最も一般に入手可能な界面活性剤は、ＭＹＲＪの名称で販売されており、ステアリン酸のポリオキシエチレン誘導体である。ＭＹＲＪ（登録商標）界面活性剤は、ＴＷＥＥＮ（登録商標）界面活性剤のように、親水性であり、水中で可溶性または分散性である。ＭＹＲＪ（登録商標）界面活性剤は、エマルジョンを形成するのに使用するために、ＴＷＥＥＮ（登録商標）界面活性剤と、またはＴＷＥＥＮ（登録商標）／ＳＰＡＮ（登録商標）もしくはＡＲＬＡＣＥＬ（登録商標）界面活性剤の混合物とブレンドすることができる。ＭＹＲＪ（登録商標）界面活性剤は、当技術分野で公知の方法によって作製することができ、または市販されている。
【０１５８】
ポリオキシエチレンベースの非イオン性界面活性剤の第４の群は、ラウリルアルコール、アセチルアルコール、ステアリルアルコール、およびオレイルアルコールに由来するポリオキシエチレン脂肪酸エーテルである。これらの材料は、脂肪アルコールにエチレンオキシドを付加することによって、上記のように調製される。これらの界面活性剤の商業的な名称は、ＢＲＩＪ（登録商標）である。ＢＲＩＪ（登録商標）界面活性剤は、界面活性剤中のポリオキシエチレン部分のサイズに応じて、親水性または親油性となり得る。これらの化合物の調製物は、当技術分野から利用可能であるが、これらは、商業的供給源からも容易に入手可能である。
【０１５９】
潜在的に使用することができる他の非イオン性界面活性剤は、例えば、ポリオキシエチレン、ポリオール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシプロピレン脂肪エーテル、ポリオキシエチレンを含有する蜜ろう誘導体、ポリオキシエチレンラノリン誘導体、ポリオキシエチレン脂肪グリセリド、グリセロール脂肪酸エステル、または他の１２〜２２炭素原子の長鎖脂肪酸のポリオキシエチレンの酸アルコールもしくはエーテル誘導体である。
【０１６０】
多相系であることが意図された本発明のエマルジョンおよび処方物として、約７〜１６の範囲内のＨＬＢ値を有するエマルジョン形成非イオン性界面活性剤を選ぶことが好ましい。この値は、ＴＷＥＥＮ（登録商標）界面活性剤などの単一の非イオン性界面活性剤の使用を通じて得ることができ、あるいはソルビタンモノエステル、ジエステル、もしくはトリエステルベースの界面活性剤などとの界面活性剤のブレンド；ソルビタンエステルポ
リオキシエチレン脂肪酸；ポリオキシエチレンラノリン由来界面活性剤と組み合わせたソルビタンエステル；高ＨＬＢポリオキシエチレン脂肪エーテル界面活性剤と組み合わせたソルビタンエステル界面活性剤；またはポリエチレン脂肪エーテル界面活性剤、もしくはポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸を使用することによって達成することができる。
【０１６１】
ある特定の実施形態では、エマルジョンは、エマルジョン安定化非イオン性界面活性剤として、単一の非イオン性界面活性剤、最も特にＴＷＥＥＮ（登録商標）界面活性剤を含む。例示的な実施形態では、エマルジョンは、ポリソルベート８０またはポリオキシエチレン２０ソルビタンモノオレエートとして別に公知であるＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を含む。他の実施形態では、エマルジョンは、２つ以上の非イオン性界面活性剤、特に、ＴＷＥＥＮ（登録商標）界面活性剤、およびＳＰＡＮ（登録商標）界面活性剤を含む。例示的な実施形態では、エマルジョンは、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０およびＳＰＡＮ（登録商標）８５を含む。
【０１６２】
水中油型エマルジョンは、約０．０１％〜約２．５％の界面活性剤（ｖ／ｖもしくはｗ／ｖ）、約０．０１％〜約２％の界面活性剤、０．０１％〜約１．５％の界面活性剤、０．０１％〜約１％の界面活性剤、０．０１％〜約０．５％の界面活性剤、０．０５％〜約０．５％の界面活性剤、０．０８％〜約０．５％の界面活性剤、約０．０８％の界面活性剤、約０．１％の界面活性剤、約０．２％の界面活性剤、約０．３％の界面活性剤、約０．４％の界面活性剤、約０．５％の界面活性剤、約０．６％の界面活性剤、約０．７％の界面活性剤、約０．８％の界面活性剤、約０．９％の界面活性剤、または約１％の界面活性剤を含有することができる。
【０１６３】
代わりにまたはさらに、水中油型エマルジョンは、０．０５％〜約１％、０．０５％〜約０．９％、０．０５％〜約０．８％、０．０５％〜約０．７％、０．０５％〜約０．６％、０．０５％〜約０．５％、約０．０８％、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、または約１％のＴｗｅｅｎ８０（ポリソルベート８０；ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）を含有することができる。
【０１６４】
例示的な実施形態では、水中油型エマルジョンは、０．０８％のＴｗｅｅｎ８０を含有する。
【０１６５】
代わりにまたはさらに、水中油型エマルジョンは、０．０５％〜約１％、０．０５％〜約０．９％、０．０５％〜約０．８％、０．０５％〜約０．７％、０．０５％〜約０．６％、０．０５％〜約０．５％、約０．０８％、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、または約１％のＳＰＡＮ８５（ソルビタントリオレエート）を含有することができる。
【０１６６】
代わりにまたはさらに、水中油型エマルジョンは、本明細書に記載される界面活性剤の組合せを含有することができる。例えば、Ｔｗｅｅｎ８０（ポリソルベート８０；ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）とＳＰＡＮ８５（ソルビタントリオレエート）の組合せを使用することができる。エマルジョンは、等しい量のこれらの界面活性剤を含めて、様々な量のＴｗｅｅｎ８０およびＳＰＡＮ８５（例えば、上記に例示したもの）を含有することができる。例えば、水中油型エマルジョンは、約０．０５％のＴｗｅｅｎ８０と約０．０５％のＳＰＡＮ８５、約０．１％のＴｗｅｅｎ８０と約０．１％のＳＰＡＮ８５、約０．２％のＴｗｅｅｎ８０と約０．２％のＳＰＡＮ８５、約０．３％のＴｗｅｅｎ８０と約０．３％のＳＰＡＮ８５、約０．４％のＴｗｅｅｎ８０と約０．４％のＳＰＡＮ８５、約０．５％のＴｗｅｅｎ８０と約０．５％のＳＰＡＮ８５、約０．６％のＴｗｅｅｎ８０と約０．６％のＳＰＡＮ８５、約０．７％のＴｗｅｅｎ８０と約０．７％のＳＰ
ＡＮ８５、約０．８％のＴｗｅｅｎ８０と約０．８％のＳＰＡＮ８５、約０．９％のＴｗｅｅｎ８０と約０．９％のＳＰＡＮ８５、または約１％のＴｗｅｅｎ８０と約１．０％のＳＰＡＮ８５を含有することができる。
【０１６７】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質、例えば、ジアルキルオキシプロピルにカップリングしたＰＥＧ（ＰＥＧ−ＤＡＡ）、ジアシルグリセロールにカップリングしたＰＥＧ（ＰＥＧ−ＤＡＧ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）（ＰＥＧ−ＰＥ）もしくはいくつかの他のリン脂質（ＰＥＧ−リン脂質）とカップリングしたＰＥＧ、セラミドとコンジュゲートしたＰＥＧ（ＰＥＧ−Ｃｅｒ）、またはこれらの組合せなども、界面活性剤として使用することができる（例えば、米国特許第５，８８５，６１３号；米国特許出願公開第２００３／００７７８２９号、同第２００５／０１７５６８２号、および同第２００６／００２５３６６を参照）。他の適当なＰＥＧ−脂質には、例えば、ＰＥＧ−ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）脂質、またはＰＥＧ−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）脂質が含まれる。例示的なＰＥＧ−ＤＡＧ脂質として、例えば、ＰＥＧ−ジラウロイルグリセロール（Ｃ１２）脂質、ＰＥＧ−ジミリストイルグリセロール（Ｃ１４）脂質、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリセロール（Ｃ１６）脂質、またはＰＥＧ−ジステアロイルグリセロール（Ｃ１８）脂質が挙げられる。例示的なＰＥＧ−ＤＡＡ脂質として、例えば、ＰＥＧ−ジラウリルオキシプロピル（Ｃ１２）脂質、ＰＥＧ−ジミリスチルオキシプロピル（Ｃ１４）脂質、ＰＥＧ−ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ１６）脂質、またはＰＥＧ−ジステアリルオキシプロピル（Ｃ１８）脂質が挙げられる。
【０１６８】
ＰＥＧは、その分子量によって分類される。例えば、ＰＥＧ２０００は、約２，０００ダルトンの平均分子量を有し、ＰＥＧ５０００は、約５，０００ダルトンの平均分子量を有する。ＰＥＧは、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．ならびに他の会社から市販されており、これらには、例えば、以下のものが含まれる：モノメトキシポリエチレングリコール（ＭｅＰＥＧ−ＯＨ）、モノメトキシポリエチレングリコール−コハク酸（ＭｅＰＥＧ−Ｓ）、モノメトキシポリエチレングリコール−スクシンイミジルコハク酸（ＭｅＰＥＧ−Ｓ−ＮＨＳ）、モノメトキシポリエチレングリコール−アミン（ＭｅＰＥＧ−ＮＨ２）、モノメトキシポリエチレングリコール−トレシレート（ＭｅＰＥＧ−ＴＲＥＳ）、およびモノメトキシポリエチレングリコール−イミダゾリル−カルボニル（ＭｅＰＥＧ−ＩＭ）。さらに、モノメトキシポリエチレングリコール−酢酸（ＭｅＰＥＧ−ＣＨ２ＣＯＯＨ）は、例えば、ＰＥＧ−ＤＡＡコンジュゲートを含めた、ＰＥＧ−脂質コンジュゲートの調製に特に有用である。
【０１６９】
好ましくは、ＰＥＧは、約１０００〜約５０００ダルトンの平均分子量を有する（例えば、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ３０００、ＰＥＧ４０００、ＰＥＧ５０００）。ＰＥＧは、アルキル基、アルコキシ基、アシル基、またはアリール基によって任意選択により置換されている場合がある。ＰＥＧは、脂質に直接コンジュゲートすることができ、またはリンカー部分を介して脂質に連結することができる。例えば、非エステル含有リンカー部分およびエステル含有リンカー部分を含めた、ＰＥＧを脂質にカップリングさせるのに適した任意のリンカー部分を使用することができる。
【０１７０】
例示的な実施形態では、ＰＥＧ２０００ＰＥ、ＰＥＧ５０００ＰＥ、ＰＥＧ１０００ＤＭＧ、ＰＥＧ２０００ＤＭＧ、ＰＥＧ３０００ＤＭＧ、またはこれらの組合せが、界面活性剤として使用される。ある特定の例示的な実施形態では、水中油型エマルジョンは、約１ｍｇ／ｍｌ〜約８０ｍｇ／ｍｌのＰＥＧ２０００ＰＥ、ＰＥＧ５０００ＰＥ、ＰＥＧ１０００ＤＭＧ、ＰＥＧ２０００ＤＭＧ、またはＰＥＧ３０００ＤＭＧを含有する。
【０１７１】
リン脂質
ある特定の実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子は、リン脂質をさら
に含む。
【０１７２】
リン脂質は、分子のアルコール成分がホスフェート基を含有する脂肪酸のエステルである。リン脂質には、グリセロホスファチド（グリセロールを含有する）、およびスフィンゴミエリン（スフィンゴシンを含有する）が含まれる。例示的なリン脂質として、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、およびスフィンゴミエリン；ならびにジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジステアロイルホスファチジルセリン、およびジパルミトイルセリンを含む合成リン脂質が挙げられる。
【０１７３】
以下の例示的なリン脂質を使用することができる。
【０１７４】
【化１−１】
0006025721.tif 000002
【０１７５】
【化１−２】
0006025721.tif 000003
【０１７６】
【化１−３】
0006025721.tif 000004
ある特定の実施形態では、中性脂質を使用することが有利である場合がある。双性イオン性リン脂質、例えば、長さが約１２〜約２２炭素（例えば、約１２〜約１４、〜約１６、〜約１８、〜約２０、〜約２２炭素）の１つまたは複数のアルキルラジカルまたはアルケニルラジカルを含有し、このラジカルは、例えば、０〜１〜２〜３個の二重結合を含有していてもよいリン脂質を含めたリン脂質を使用することが有利である場合もある。双性イオン性リン脂質を使用することが有利である場合がある。
【０１７７】
好適なリン脂質として、例えば、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、卵ホスファチジルコリン（卵ＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ＤＰＰＣ、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、パルミトイルリノレイルホスファチジルコリン（ＰＬＰＣ）、ＤＰｙＰＥ、またはこれらの組合せが挙げられる。
【０１７８】
ある特定の実施形態では、リン脂質はＤＯＰＥである。カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌのＤＯＰＥを含むことができる。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、または約１．５ｍｇ／ｍｌ〜約７．５ｍｇ／ｍｌのＤＯＰＥでＤＯＰＥを含むことができる。
【０１７９】
例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約１．５ｍｇ／ｍｌのＤＯＰＥを含む。
【０１８０】
ある特定の実施形態では、リン脂質は卵ＰＣである。カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌの卵ＰＣを含むことができる。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、または約１．５ｍｇ／ｍｌ〜約３．５ｍｇ／ｍｌの卵ＰＣで卵ＰＣを含むことができる。
【０１８１】
例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約１．５５ｍｇ／ｍｌの卵ＰＣを含む。
【０１８２】
ある特定の実施形態では、リン脂質はＤＰｙＰＥである。カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌのＤＰｙＰＥを含むことができる。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、または約１．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌのＤＰｙＰＥでＤＰｙＰＥを含むことができる。
【０１８３】
例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約１．６ｍｇ／ｍｌのＤＰｙＰＥを含む。
【０１８４】
ある特定の実施形態では、エマルジョン粒子は、本明細書に記載される界面活性剤とリン脂質の組合せを含むことができる。
【０１８５】
Ｄ．水相（連続相）
水中油型エマルジョンの水相（連続相）は、緩衝化塩溶液（例えば、食塩水）または水である。緩衝化塩溶液は、塩（例えば、ＮａＣｌ）、バッファー（例えば、クエン酸バッファー）を含む水性溶液であり、重量オスモル濃度調整剤（ｏｓｍｏｌａｌｉｔｙ  ａｄｊｕｓｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）（例えば、サッカリド）、ポリマー、界面活性剤、またはこれらの組合せをさらに含むことができる。エマルジョンが非経口投与用に処方される場合、組成物の投与後の膨張または急速な吸収などの望まれない投与後の結果を防止するために、張性、すなわち、重量オスモル濃度が正常な生理学的な液と本質的に同じであるように、最終的な緩衝化溶液を作製することが好ましい。正常な生理的条件と適合性のｐＨを維持するために、水相を緩衝化することも好ましい。また、ある特定の事例では、エマルジョンのある特定の成分の安定性を保証するために、ｐＨを特定のレベルに維持することが望ましい場合がある。
【０１８６】
例えば、等張性（すなわち、体の正常細胞および血液と同じ浸透性溶質（例えば、塩）濃度）であり、等浸透圧であるエマルジョンを調製することが望ましい場合がある。張性を制御するために、エマルジョンは、ナトリウム塩などの生理的塩を含むことができる。例えば、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を約０．９％（ｗ／ｖ）（生理食塩水）で使用することができる。存在し得る他の塩には、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどが含まれる。非イオン性等張化剤も張性を制御するのに使用することができる。いくつかの非イオン性張性調整剤が、通常、当業者に公知である。これらは一般的に様々な分類の炭水化物である（例えば、ＶｏｅｔおよびＶｏｅｔ（１９９０年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照）。アルドースとして分類される単糖、例えば、グルコース、マンノース、アラビノース、およびリボースなど、ならびにケトースとして分類されるもの、例えば、フルクトース、ソルボース、およびキシルロースなどを、本発明における非イオン性等張化剤として使用することができる。二糖、例えば、スクロース、マルトース、トレハロース、およびラクトースなども使用することができる。さらに、アルジトール（非環式ポリヒドロキシアルコール、糖アルコールとも呼ばれる）、例えば、
グリセロール、マンニトール、キシリトール、およびソルビトールなどは、本発明において有用な非イオン性等張化剤である。非イオン性張性調整剤は、使用される作用物質に応じて、約０．１％〜約１０％または約１％〜約１０％の濃度で存在し得る。
【０１８７】
水相を、緩衝化することができる。任意の生理学的に許容されるバッファー、例えば、水、クエン酸バッファー、リン酸バッファー、酢酸バッファー、トリスバッファー、ビカルボネートバッファー、カルボネートバッファー、コハク酸バッファーなどを、本明細書で使用することができる。水性成分のｐＨは、好ましくは、６．０〜８．０、好ましくは、約６．２〜約６．８である。例示的な実施形態では、バッファーは、６．５のｐＨを有する１０ｍＭのクエン酸バッファーである。別の例示的な実施形態では、水相は、ＲＮａｓｅフリー水またはＤＥＰＣ処理水を使用して調製されるか、またはこうして調製されるバッファーである。いくつかの場合では、バッファー中の高濃度の塩は、負に荷電した分子のエマルジョン粒子への複合体形成に干渉する場合があり、したがって、回避される。他の場合では、バッファーにおいてある特定の量の塩を含めることができる。
【０１８８】
例示的な実施形態では、バッファーは、６．５のｐＨを有する１０ｍＭのクエン酸バッファーである。別の例示的な実施形態では、水相は、ＲＮａｓｅフリー水またはＤＥＰＣ処理水を使用して調製されるか、またはこうして調製されるバッファーである。
【０１８９】
水相は、追加の成分、例えば、水相の容量オスモル濃度を変化させる分子、または複合体形成後の負に荷電した分子を安定化させる分子なども含むことができる。水相の容量オスモル濃度は、非イオン性等張化剤、例えば、糖（例えば、トレハロース、スクロース、デキストロース、フルクトース、還元パラチノースなど）、糖アルコール（マンニトール、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、ラクチトール、マルチトール、グリセロールなど）、またはこれらの組合せなどを使用して調整していることが好ましい。必要に応じて、非イオン性ポリマー（例えば、ポリ（アルキルグリコール）、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、もしくはポリブチレングリコールなど）、または非イオン性界面活性剤を使用することができる。
【０１９０】
いくつかの場合では、エマルジョンが最初に調製される際、純水（ｕｎａｄｕｌｔｅｒａｔｅｄ  ｗａｔｅｒ）が、エマルジョンの水相として好適となり得る。例えば、塩濃度を上昇させると、望ましい粒子サイズ（例えば、約２００ｎｍ未満）を達成することがより困難になり得る。
【０１９１】
ある特定の実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンの水相は、ポリマーもしくは界面活性剤、またはこれらの組合せをさらに含むことができる。例示的な実施形態では、水中油型エマルジョンは、ポロキサマーを含有する。ポロキサマーは、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２本の親水性鎖が隣接するポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中心の疎水性鎖を有する非イオン性トリブロックコポリマーである。ポロキサマーは、商標名Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ポリマーによっても公知である。ポロキサマーポリマーは、ＲＮＡ複合体形成後のＲＮＡ分子の安定性をより大きくし、ＲＮａｓｅ耐性を増大させることができる。
【０１９２】
代わりにまたはさらに、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．１％〜約２０％（ｗ／ｖ）のポリマー、または約０．０５％〜約１０％（ｗ／ｖ）のポリマーを含むことができる。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．１％〜約２０％（ｗ／ｖ）、約０．１％〜約１０％（ｗ／ｖ）、約０．０５％〜約１０％（ｗ／ｖ）、または約０．０５％〜約５％（ｗ／ｖ）でポリマー（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７などのポロキサマー）を含むことができる。
【０１９３】
例示的な実施形態では、水中油型エマルジョンは、約４％（ｗ／ｖ）、または約８％（ｗ／ｖ）のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７を含む。
【０１９４】
これらの組成物中に使用される水性成分の量は、組成の値を１にするのに必要な量となる。すなわち、１００％にするのに十分な水性成分の量が、上記に列挙された他の成分と混合されることによって、その組成物の容積となる。
【０１９５】
４．負に荷電した分子
負に荷電した分子が送達される場合、これは、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成させることができる。負に荷電した分子は、例えば、負に荷電した分子と粒子の表面上のカチオン性脂質との間の相互作用、ならびに負に荷電した分子と粒子の表面との間の疎水性／親水性相互作用によって、エマルジョン粒子と複合体を形成する。いずれの特定の理論にも束縛されることを望まないが、負に荷電した分子は、非共有結合性イオン電荷相互作用（静電気力）を通じてカチオン性脂質と相互作用し、複合体の強度、ならびに粒子と複合体を形成することができる負に荷電した化合物の量は、粒子中のカチオン性脂質の量に関係すると考えられる。さらに、負に荷電した分子と粒子の表面との間の疎水性／親水性相互作用も、役割を果たす場合がある。
【０１９６】
負に荷電した分子の例には、負に荷電したペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質、核酸分子（例えば、一本鎖もしくは二本鎖ＲＮＡもしくはＤＮＡ）、小分子（例えば、小分子免疫増強因子（ＳＭＩＰ）、ホスホネート、フルオロホスホネートなど）などが含まれる。好適な態様では、負に荷電した分子は、自己複製ＲＮＡ分子、または低分子干渉ＲＮＡを含めた、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードするＲＮＡなどのＲＮＡ分子である。
【０１９７】
複合体は、当技術分野で公知の技法を使用して形成することができ、その例は、本明細書に記載されている。例えば、核酸−粒子複合体は、例えば、ボルテックスすることによって、カチオン性エマルジョンを核酸分子と混合することによって形成することができる。負に荷電した分子およびエマルジョン中のカチオン性脂質の量を調整または最適化することによって、所望の結合強度および結合能力をもたらすことができる。
【０１９８】
例えば、本明細書に記載され、例として示されているように、例示的なＲＮＡ−粒子複合体は、ＲＮＡ：カチオン性脂質の比（「Ｎ／Ｐ比」で測定した場合）を変更することによって生成された。用語Ｎ／Ｐ比は、ＲＮＡ上のホスフェートの量（モル）によって除された、カチオン性脂質中のプロトン化可能な（ｐｒｏｔｏｎａｔａｂｌｅ）窒素原子の量（モル）を指す。好適なＮ／Ｐ比は、約１：１〜約２０：１、約２：１〜約１８：１、約３：１〜１６：１、約４：１〜約１４：１、約６：１〜約１２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、約１０：１、約１１：１、約１２：１、約１３：１、約１４：１、約１５：１、または約１６：１である。あるいは、好適なＮ／Ｐ比は、少なくとも約３：１、少なくとも約４：１、少なくとも約５：１、少なくとも約６：１、少なくとも約７：１、少なくとも約８：１、少なくとも約９：１、少なくとも約１０：１、少なくとも約１１：１、少なくとも約１２：１、少なくとも約１３：１、少なくとも約１４：１、少なくとも約１５：１、または少なくとも約１６：１である。より好適なＮ／Ｐ比は、約４：１以上である。
【０１９９】
各エマルジョンは、所望の効果（例えば、複合体を形成したＲＮＡの所望のレベルの発現）を生じさせるために、それ自体の最適または好適なＮ／Ｐ比を有することができ、これは、実験的に（例えば、ＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現レベルの測定、またはヘパリンの存在下で複合体から放出されるＲＮＡ分子の百分率の測定など、本明細書に記載されるアッセイ、または他の当技術分野で公知の技法を使用して）求めることが
できる。一般に、Ｎ／Ｐ比は、ＲＮＡ−粒子複合体が細胞によって取り込まれる場合、ＲＮＡ分子の少なくとも約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％が、ＲＮＡ−粒子複合体から放出される値であるべきである。少なくとも４：１のＮ／Ｐ比が好適である。
【０２００】
本明細書に記載されるカチオン性水中油型エマルジョンは、核酸ベースのワクチン（例えば、ＤＮＡワクチン、ＲＮＡワクチン）を処方するのに特に適している。核酸−エマルジョン粒子複合体の形成は、核酸の宿主細胞への取り込みを促進し、核酸分子をヌクレアーゼ分解から保護する。次いで、トランスフェクション細胞は、核酸分子によってコードされる抗原を発現することができ、抗原への免疫応答を生じさせることができる。生ウイルスまたは弱毒化ウイルスのように、核酸ベースのワクチンは、ＭＨＣ−Ｉ経路およびＭＨＣ−ＩＩ経路の両方に有効に関与し、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答およびＣＤ４＋Ｔ細胞応答の誘導を可能にすることができ、一方、組換えタンパク質などの可溶性形態で存在する抗原は、一般に、抗体応答のみを誘導する。
【０２０１】
ＲＮＡ分子の配列は、ヒト細胞などの所望の宿主における発現について最適化または脱最適化された（ｄｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄ）コドンとすることができる。
【０２０２】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される負に荷電した分子は、ＲＮＡ分子である。ある特定の実施形態では、ＲＮＡ分子は、抗原（ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質）をコードし、カチオン性水中油型エマルジョンは、ＲＮＡベースのワクチンとして使用するのに適している。組成物は、抗原をコードする１つを超えるＲＮＡ分子、例えば、エマルジョン粒子と複合体を形成している２、３、５、または１０のＲＮＡ分子を含有することができる。すなわち、組成物は、それぞれが異なる抗原をコードする、１つまたは複数の異なる種のＲＮＡ分子を含有することができる。代わりにまたはさらに、１つのＲＮＡ分子、例えば、異なるかまたは同一の抗原をコードするバイシストロニックまたはトリシストロニックなＲＮＡ分子は、１つを超える抗原をコードすることもできる。したがって、カチオン性水中油型エマルジョンは、一価または多価であるＲＮＡベースのワクチンとして使用するのに適している。
【０２０３】
ＲＮＡ分子の配列は、例えば、ＲＮＡの発現もしくは複製の効率を増大させ、または分解に対する追加の安定性もしくは耐性をもたらすために、必要に応じて修飾することができる。例えば、ＲＮＡ配列は、例えば、ＲＮＡの翻訳効率および半減期を増大させるために、そのコドン使用頻度に関して修飾することができる。ポリＡテール（例えば、約３０アデノシン残基またはそれ以上の）は、ＲＮＡの３’テールに結合することによって、ＲＮＡの半減期を増大させることができる。ＲＮＡの５’テールを、構造ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ（キャップ０構造）を有する修飾されたリボヌクレオチドまたはその誘導体でキャッピングすることができ、これは、ＲＮＡ合成の間に組み込むことができ、またはＲＮＡ転写後に酵素的に操作することができる（例えば、Ｎ７−モノメチル化キャップ０構造の構築を触媒するｍＲＮＡトリホスファターゼ、グアニリル−トランスフェラーゼ、およびグアニン−７−メチルトランスフェラーゼからなるワクシニアウイルスキャッピング酵素（ＶＣＥ）を使用することによって）。キャップ０構造は、ＲＮＡ分子の安定性および翻訳効率の維持に重要な役割を果たす。ＲＮＡ分子の５’キャップを、２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼによってさらに修飾することができ、これは、キャップ１構造（ｍ７Ｇｐｐｐ［ｍ２’−Ｏ］Ｎ）の生成をもたらし、この構造は、翻訳効率をさらに増大させることができる。
【０２０４】
必要に応じて、ＲＮＡ分子は、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含むことができる。これは、任意の５’キャップ構造に加えてのものとすることができる。哺乳動物ＲＮＡ
に９６を超える天然に存在するヌクレオシド修飾が見つかっている。例えば、Ｌｉｍｂａｃｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２２巻（１２号）：２１８３〜２１９６頁（１９９４年）を参照。ヌクレオチドならびに修飾ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオシドの調製は、例えば、米国特許第４３７３０７１号、同第４４５８０６６号、同第４５００７０７号、同第４６６８７７７号、同第４９７３６７９号、同第５０４７５２４号、同第５１３２４１８号、同第５１５３３１９号、同第５２６２５３０号、同第５７００６４２号から当技術分野で周知であり、これらの特許のすべては、その全体が参照により本明細書に組み込まれており、多くの修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドが市販されている。
【０２０５】
修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチド中に組み込むことができ、ＲＮＡ分子中に存在し得る修飾核酸塩基として、ｍ５Ｃ（５−メチルシチジン）、ｍ５Ｕ（５−メチルウリジン）、ｍ６Ａ（Ｎ６−メチルアデノシン）、ｓ２Ｕ（２−チオウリジン）、Ｕｍ（２’−Ｏ−メチルウリジン）、ｍ１Ａ（ｌ−メチルアデノシン）；ｍ２Ａ（２−メチルアデノシン）；Ａｍ（２−１−Ｏ−メチルアデノシン）；ｍｓ２ｍ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−メチルアデノシン）；ｉ６Ａ（Ｎ６−イソペンテニルアデノシン）；ｍｓ２ｉ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６イソペンテニルアデノシン）；ｉｏ６Ａ（Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）；ｍｓ２ｉｏ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）；ｇ６Ａ（Ｎ６−グリシニルカルバモイルアデノシン）；ｔ６Ａ（Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン）；ｍｓ２ｔ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン）；ｍ６ｔ６Ａ（Ｎ６−メチル−Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン）；ｈｎ６Ａ（Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）；ｍｓ２ｈｎ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）；Ａｒ（ｐ）（２’−Ｏ−リボシルアデノシン（ホスフェート））；Ｉ（イノシン）；ｍ１Ｉ（１−メチルイノシン）；ｍ’Ｉｍ（１，２’−Ｏ−ジメチルイノシン）；ｍ３Ｃ（３−メチルシチジン）；Ｃｍ（２Ｔ−Ｏ−メチルシチジン）；ｓ２Ｃ（２−チオシチジン）；ａｃ４Ｃ（Ｎ４−アセチルシチジン）；ｆ５Ｃ（５−ホンニルシチジン）；ｍ５Ｃｍ（５，２−Ｏ−ジメチルシチジン）；ａｃ４Ｃｍ（Ｎ４アセチル２ＴＯメチルシチジン）；ｋ２Ｃ（リシジン）；ｍ１Ｇ（１−メチルグアノシン）；ｍ２Ｇ（Ｎ２−メチルグアノシン）；ｍ７Ｇ（７−メチルグアノシン）；Ｇｍ（２’−Ｏ−メチルグアノシン）；ｍ２２Ｇ（Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン）；ｍ２Ｇｍ（Ｎ２，２’−Ｏ−ジメチルグアノシン）；ｍ２２Ｇｍ（Ｎ２，Ｎ２，２’−Ｏ−トリメチルグアノシン）；Ｇｒ（ｐ）（２’−Ｏ−リボシルグアノシン（ホスフェート））；ｙＷ（ワイブトシン）；ｏ２ｙＷ（ペルオキシワイブトシン）；ＯＨｙＷ（ヒドロキシワイブトシン）；ＯＨｙＷ＊（修飾未満（ｕｎｄｅｒｍｏｄｉｆｉｅｄ）ヒドロキシワイブトシン）；ｉｍＧ（ワイオシン）；ｍｉｍＧ（メチルグアノシン）；Ｑ（クエウオシン）；ｏＱ（エポキシクエウオシン）；ｇａｌＱ（ガラクトシル−クエウオシン）；ｍａｎＱ（マンノシル−クエウオシン）；ｐｒｅＱｏ（７−シアノ−７−デアザグアノシン）；ｐｒｅＱｉ（７−アミノメチル−７−デアザグアノシン）；Ｇ＊（アルカエオシン）；Ｄ（ジヒドロウリジン）；ｍ５Ｕｍ（５，２’−Ｏ−ジメチルウリジン）；ｓ４Ｕ（４−チオウリジン）；ｍ５ｓ２Ｕ（５−メチル−２−チオウリジン）；ｓ２Ｕｍ（２−チオ−２’−Ｏ−メチルウリジン）；ａｃｐ３Ｕ（３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン）；ｈｏ５Ｕ（５−ヒドロキシウリジン）；ｍｏ５Ｕ（５−メトキシウリジン）；ｃｍｏ５Ｕ（ウリジン５−オキシ酢酸）；ｍｃｍｏ５Ｕ（ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル）；ｃｈｍ５Ｕ（５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン）；ｍｃｈｍ５Ｕ（５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチルエステル）；ｍｃｍ５Ｕ（５−メトキシカルボニルメチルウリジン）；ｍｃｍ５Ｕｍ（Ｓ−メトキシカルボニルメチル−２−Ｏ−メチルウリジン）；ｍｃｍ５ｓ２Ｕ（５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン）；ｎｍ５ｓ２Ｕ（５−アミノメチル−２−チオウリジン）；ｍｎｍ５Ｕ（５−メチルアミノメチルウリジン）；ｍｎｍ５ｓ２Ｕ（５−メチルアミノメチル−２−チオウリジン）；
ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ（５−メチルアミノメチル−２−セレノウリジン）；ｎｃｍ５Ｕ（５−カルバモイルメチルウリジン）；ｎｃｍ５Ｕｍ（５−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン）；ｃｍｎｍ５Ｕ（５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン）；ｃｎｍｍ５Ｕｍ（５−カルボキシメチルアミノメチル−２−Ｌ−Ｏメチルウリジン）；ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ（５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン）；ｍ６２Ａ（Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデノシン）；Ｔｍ（２’−Ｏ−メチルイノシン）；ｍ４Ｃ（Ｎ４−メチルシチジン）；ｍ４Ｃｍ（Ｎ４，２−Ｏ−ジメチルシチジン）；ｈｍ５Ｃ（５−ヒドロキシメチルシチジン）；ｍ３Ｕ（３−メチルウリジン）；ｃｍ５Ｕ（５−カルボキシメチルウリジン）；ｍ６Ａｍ（Ｎ６，Ｔ−Ｏ−ジメチルアデノシン）；ｒｎ６２Ａｍ（Ｎ６，Ｎ６，Ｏ−２−トリメチルアデノシン）；ｍ２’７Ｇ（Ｎ２，７−ジメチルグアノシン）；ｍ２’２’７Ｇ（Ｎ２，Ｎ２，７−トリメチルグアノシン）；ｍ３Ｕｍ（３，２Ｔ−Ｏ−ジメチルウリジン）；ｍ５Ｄ（５−メチルジヒドロウリジン）；ｆ５Ｃｍ（５−ホルミル−２’−Ｏ−メチルシチジン）；ｍ１Ｇｍ（１，２’−Ｏ−ジメチルグアノシン）；ｍ’Ａｍ（１，２−Ｏ−ジメチルアデノシン）イリノメチルウリジン；ｔｍ５ｓ２Ｕ（Ｓ−タウリノメチル−２−チオウリジン）；ｉｍＧ−１４（４−ジメチル（ｄｅｍｅｔｈｙｌ）グアノシン）；ｉｍＧ２（イソグアノシン）；ａｃ６Ａ（Ｎ６−アセチルアデノシン）、ヒポキサンチン、イノシン、８−オキソ−アデニン、その７−置換誘導体、ジヒドロウラシル、シュードウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−アミノウラシル、５−（Ｃ１〜Ｃ６）−アルキルウラシル、５−メチルウラシル、５−（Ｃ２〜Ｃ６）−アルケニルウラシル、５−（Ｃ２〜Ｃ６）−アルキニルウラシル、５−（ヒドロキシメチル）ウラシル、５−クロロウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシシトシン、５−（Ｃ１〜Ｃ６）−アルキルシトシン、５−メチルシトシン、５−（Ｃ２〜Ｃ６）−アルケニルシトシン、５−（Ｃ２〜Ｃ６）−アルキニルシトシン、５−クロロシトシン、５−フルオロシトシン、５−ブロモシトシン、Ｎ２−ジメチルグアニン、７−デアザグアニン、８−アザグアニン、７−デアザ−７−置換グアニン、７−デアザ−７−（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニルグアニン、７−デアザ−８−置換グアニン、８−ヒドロキシグアニン、６−チオグアニン、８−オキソグアニン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２，４−ジアミノプリン、２，６−ジアミノプリン、８−アザプリン、置換７−デアザプリン、７−デアザ−７−置換プリン、７−デアザ−８−置換プリン、水素（無塩基残基）、ｍ５Ｃ、ｍ５Ｕ、ｍ６Ａ、ｓ２Ｕ、Ｗ、または２’−Ｏ−メチル−Ｕが挙げられる。これらの修飾核酸塩基およびこれらの対応するリボヌクレオシドの多くは、商業的供給者から入手可能である。例えば、参照により本明細書に組み込まれているＷＯ２０１１／００５７９９を参照。
【０２０６】
本発明で使用されるＲＮＡは、ヌクレオシド同士間でホスホジエステル連結のみを含むことが理想的であるが、いくつかの実施形態では、これは、ホスホラミデート連結、ホスホロチオエート連結、および／またはメチルホスホネート連結を含有することができる。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子は、修飾ヌクレオチドを含まず、例えば、修飾核酸塩基を含まず、ＲＮＡ分子中のヌクレオチドのすべては、例えば、７−メチルグアノシンを含むことができる任意選択の５’キャップを例外として、従来の標準的なリボヌクレオチドＡ、Ｕ、Ｇ、およびＣである。他の実施形態では、ＲＮＡは、７’−メチルグアノシンを含む５’キャップを含むことができ、最初の１、２、または３つの５’リボヌクレオチドは、リボースの２’位でメチル化されている場合がある。
【０２０８】
Ａ．自己複製ＲＮＡ
いくつかの態様では、カチオン性水中油型エマルジョンは、自己複製ＲＮＡ分子を含有する。ある特定の実施形態では、自己複製ＲＮＡ分子は、アルファウイルスに由来し、またはこれに基づく。
【０２０９】
自己複製ＲＮＡ分子は、当技術分野で周知であり、例えば、アルファウイルスに由来する複製エレメントを使用し、ウイルスの構造タンパク質を、目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列と置換することによって生成することができる。自己複製ＲＮＡ分子は、一般的に、細胞に送達された後に直接翻訳され得る（＋）鎖分子であり、この翻訳は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをもたらし、次いでこれは、送達されたＲＮＡからのアンチセンス転写物およびセンス転写物の両方を生成する。したがって、送達されたＲＮＡにより、複数の娘ＲＮＡが産生される。これらの娘ＲＮＡ、ならびに共線的な（ｃｏｌｌｉｎｅａｒ）サブゲノムの転写物は、これら自体が翻訳されて、コードされる抗原のｉｎ  ｓｉｔｕ発現をもたらすことができ、または転写されて、送達されたＲＮＡと同じセンスを有するさらなる転写物をもたらすことができ、これらが翻訳されて、抗原のｉｎ  ｓｉｔｕ発現をもたらす。この一連の転写の全体的な結果は、導入されたレプリコンＲＮＡの数の大規模な増幅であり、コードされる抗原は、細胞の主なポリペプチド産物となる。自己複製ＲＮＡをトランスフェクトされた細胞は、アポトーシス死を起こす前に、短期間、抗原を産生する。この死は、要求される二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ中間体の結果である可能性があり、これらはまた樹状細胞を超活性化することが示されている。したがって、自己複製ＲＮＡの増強された免疫原性は、炎症促進性（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）ｄｓＲＮＡの生成の結果である場合があり、これは宿主細胞のＲＮＡ−ウイルス感染を模倣する。
【０２１０】
有利には、細胞の機構が自己複製ＲＮＡ分子により使用されることによって、タンパク質または抗原などのコードされる遺伝子産物の指数関数的増加が生じ、これらは、細胞内に蓄積することができ、または細胞から分泌され得る。自己複製ＲＮＡ分子によるタンパク質の過剰発現は、ＲＮＡの複製および増幅、ならびにトランスフェクション細胞のアポトーシスを誘導する翻訳の産物による、トル様受容体（ＴＬＲ）３、７、および８、ならびに非ＴＬＲ経路（例えば、ＲＩＧ−１、ＭＤ−５）の刺激を含めた免疫賦活性アジュバント効果を活用する。
【０２１１】
自己複製ＲＮＡは、一般に、ウイルスレプリカーゼ、ウイルスプロテアーゼ、ウイルスヘリカーゼ、および他の非構造ウイルスタンパク質からなる群より選択される少なくとも１つまたは複数の遺伝子を含有し、５’−末端および３’−末端のシス活性複製配列、ならびに必要に応じて、所望のアミノ酸配列（例えば、目的の抗原）をコードする異種配列も含む。異種配列の発現を指示するサブゲノムプロモーターを、自己複製ＲＮＡ中に含めることができる。必要に応じて、異種配列（例えば、目的の抗原）を、自己複製ＲＮＡ中の他のコード領域にインフレームで融合することができ、かつ／または内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）の制御下とすることができる。
【０２１２】
ある特定の実施形態では、自己複製ＲＮＡ分子は、ウイルス様粒子内に被包されない。本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、自己複製ＲＮＡ分子が感染性ウイルス粒子の産生を誘導することができないように設計することができる。これは、例えば、自己複製ＲＮＡ中でウイルス粒子を産生するのに必要な構造タンパク質をコードする１つまたは複数のウイルス遺伝子を除外することによって達成することができる。例えば、自己複製ＲＮＡ分子がアルファウイルス、例えば、シンドビス（Ｓｉｎｅｂｉｓ）ウイルス（ＳＩＮ）、セムリキ森林ウイルス、およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）などに基づく場合、ウイルス構造タンパク質、例えば、カプシドおよび／またはエンベロープ糖タンパク質などをコードする１つまたは複数の遺伝子を除外することができる。
【０２１３】
必要に応じて、本発明の自己複製ＲＮＡ分子を、弱毒化された、もしくは伝染性の強い感染性ウイルス粒子の産生を誘導するように、またはその後に１ラウンド感染させることができるウイルス粒子を生成するように、設計することもできる。
【０２１４】
本様式において、自己複製を達成するための１つの適当なシステムは、アルファウイルスベースのレプリコンを使用することである。アルファウイルスは、トガウイスル科の一連の遺伝的、構造的、および血清学的に関係した節足動物媒介性ウイルスを含む。シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、ロスリバーウイルス、およびベネズエラウマ脳炎ウイルスを含めた２６の公知のウイルスおよびウイルスサブタイプが、アルファウイルス属に分類されている。したがって、本発明の自己複製ＲＮＡは、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、東部ウマ脳炎ウイルス、またはアルファウイルス科に属する他のウイルスに由来するＲＮＡレプリカーゼを組み込むことができる。
【０２１５】
アルファウイルスベースの「レプリコン」発現ベクターを、本発明において使用することができる。レプリコンベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および組換えレプリコン粒子を含めたいくつかの形式で利用することができる。このようなレプリコンベクターは、例えば、シンドビスウイルス（Ｘｉｏｎｇら（１９８９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３巻：１１８８〜１１９１頁；Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、（１９９６年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７０巻：５０８〜５１９頁；Ｈａｒｉｈａｒａｎら（１９９８年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７２巻：９５０〜９５８頁；Ｐｏｌｏら（１９９９年）ＰＮＡＳ  ９６巻：４５９８〜４６０３頁）、セムリキ森林ウイルス（Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ（１９９１年）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９巻：１３５６〜１３６１頁；Ｂｅｒｇｌｕｎｄら（１９９８年）Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １６巻：５６２〜５６５頁）、およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（Ｐｕｓｈｋｏら（１９９７年）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３９巻：３８９〜４０１頁）を含むアルファウイルスから得られている。アルファウイルス由来レプリコンは一般的に、全体的な特性（例えば、構造、複製）がかなり類似しており、個々のアルファウイルスは、ユニークであるいくつかの特性（例えば、受容体結合、インターフェロン感受性、および疾患プロファイル）を示すことができる。したがって、多岐にわたるウイルス科から作製されるキメラアルファウイルスレプリコンも有用となり得る。
【０２１６】
アルファウイルスベースのＲＮＡレプリコンは、一般的に、細胞に送達された後に、レプリカーゼ（またはレプリカーゼ−転写酵素）の翻訳をもたらす（＋）鎖ＲＮＡである。レプリカーゼは、ポリタンパク質として翻訳され、これは、自己切断して（＋）鎖で送達されたＲＮＡのゲノム（−）鎖コピーを作り出す複製複合体をもたらす。これらの（−）鎖転写物は、それ自体が転写されることによって、（＋）鎖親ＲＮＡのさらなるコピーを与え、また、抗原をコードするサブゲノム転写物を与えることができる。したがって、サブゲノム転写物が翻訳されると、感染細胞によって抗原がｉｎ  ｓｉｔｕで発現される。適当なアルファウイルスレプリコンは、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルスなどに由来するレプリカーゼを使用することができる。
【０２１７】
ＲＮＡレプリコンは、１つまたは複数の構造タンパク質遺伝子を、目的の産物をコードする、選択された異種核酸配列と置換することによって修飾された、ピコルナウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、コロナウイルス、パラミクソウイルス、黄熱病ウイルス、またはアルファウイルス（例えば、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、もしくはロスリバーウイルス）に由来するＲＮＡゲノムを含むことが好ましい。
【０２１８】
好適なレプリコンは、（ｉ）レプリコンからＲＮＡを転写することができるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、および（ｉｉ）抗原をコードする。ポリメラーゼは、例えば、アルファウイルスタンパク質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、およびｎｓＰ４の１つまたは複数を含むアルファウイルスレプリカーゼとすることができる。天然のアルファウイルスゲノムは、非構造レプリカーゼポリタンパク質に加えて、構造ビリオンタンパク質をコー
ドするが、レプリコンは、アルファウイルス構造タンパク質をコードしないことが好適である。したがって、好適なレプリコンは、細胞内でそれ自体のゲノムＲＮＡコピーの産生をもたらすことができるが、ＲＮＡ含有ビリオンの産生をもたらすことはできない。これらのビリオンを生成することができないことは、野生型アルファウイルスとは異なり、好適なレプリコンは、感染性形態でそれ自体を永続させることができないことを意味する。野生型ウイルスの永続に必要なアルファウイルス構造タンパク質は、好適なレプリコンにはなく、その場所は、目的の抗原をコードする遺伝子（複数可）によって奪われており、その結果、サブゲノム転写物は、構造アルファウイルスビリオンタンパク質ではなく抗原をコードする。
【０２１９】
本発明で有用なレプリコンは、２つのオープンリーディングフレームを有することができる。第１の（５’）オープンリーディングフレームは、レプリカーゼをコードし、第２の（３’）オープンリーディングフレームは、抗原をコードする。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、例えば、追加の抗原をコードするか、またはアクセサリーポリペプチドをコードするための追加の（例えば、下流）オープンリーディングフレームを有することができる。
【０２２０】
好適なレプリコンは、５’キャップ（例えば、７−メチルグアノシン）を有し、これは、多くの場合、ＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏ翻訳を増強することができる。いくつかの実施形態では、レプリコンの５’配列は、コードされるレプリカーゼとの適合性を保証するように選択される必要がある場合がある。
【０２２１】
レプリコンは、３’ポリＡテールを有することができる。これは、その３’末端付近にポリＡポリメラーゼ認識配列（例えば、ＡＡＵＡＡＡ）も含むことができる。
【０２２２】
レプリコンは、様々な長さを有することができるが、これらは一般的に、５０００〜２５０００ヌクレオチドの長さ、例えば、８０００〜１５０００ヌクレオチド、または９０００〜１２０００ヌクレオチドである。
【０２２３】
レプリコンは、好都合なことには、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）によって調製することができる。ＩＶＴは、細菌内で、プラスミド形態で作り出され、増幅させられるか、または合成的に（例えば、遺伝子合成および／もしくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）操作法によって）作り出される（ｃＤＮＡ）鋳型を使用することができる。例えば、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（バクテリオファージＴ７、Ｔ３、またはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼなど）を、ＤＮＡ鋳型からレプリコンを転写するのに使用することができる。適切なキャッピングおよびポリＡ付加反応を、必要に応じて使用することができる（しかし、レプリコンのポリＡは、通常、ＤＮＡ鋳型内でコードされる）。これらのＲＮＡポリメラーゼは、転写される５’ヌクレオチド（複数可）についてストリンジェントな要求事項を有する場合があり、いくつかの実施形態では、これらの要求事項は、ＩＶＴ転写ＲＮＡが、自己コードレプリカーゼの基質として効率的に機能することができることを保証するために、コードされるレプリカーゼの要求事項と整合されなければならない。具体例には、例えば、米国特許第５，８１４，４８２号、および同第６，０１５，６８６号、ならびに国際公開第ＷＯ９７／３８０８７号、同第ＷＯ９９／１８２２６号、および同第ＷＯ０２／２６２０９号に記載された、ｐＳＩＮＣＰなどのシンドビスウイルスベースのプラスミド（ｐＳＩＮ）が含まれる。このようなレプリコンの構築物は、一般に、米国特許第５，８１４，４８２号、および同第６，０１５，６８６号に記載されている。
【０２２４】
他の態様では、自己複製ＲＮＡ分子は、アルファウイルス以外のウイルス、好ましくは、プラス鎖ＲＮＡウイルス、より好ましくは、ピコルナウイルス、フラビウイルス、ルビウイルス、ペスチウイルス、ヘパシウイルス、カリチウイルス、またはコロナウイルスか
ら、またはこれらに基づいて得られる。適当な野生型アルファウイルス配列は、周知であり、アメリカンタイプカルチャーコレクション、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄなどの配列受託機関から入手可能である。適当なアルファウイルスの代表的な例として、アウラ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３６８）、ベバルウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６００、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４０）、カバッソウ（Ｃａｂａｓｓｏｕ）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２２）、チクングニアウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６４、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４１）、東部ウマ脳脊髄炎ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６５、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４２）、フォートモーガン（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２４）、ゲタウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３６９、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４３）、キジラガハ（Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈ）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２７）、マヤロ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６６）、マヤロウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２７７）、ミドルバーグ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７０）、ムカンボウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−５８０、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４４）、ヌドゥム（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７１）、ピクスナウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７２、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４５）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７３、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４６）、セムリキ森林（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６７、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４７）、シンドビスウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６８、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４８）、トナテ（Ｔｏｎａｔｅ）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２５）、トリニチ（Ｔｒｉｎｉｔｉ）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−４６９）、ウナ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７４）、ベネズエラウマ脳脊髄炎（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６９、ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２３、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５０  ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４９、ＡＴＣＣ  ＶＲ−５３２）、西部ウマ脳脊髄炎（ＡＴＣＣ  ＶＲ−７０、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５１、ＡＴＣＣ  ＶＲ−６２２、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５２）、ワタロア（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２６）、およびＹ−６２−３３（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７５）が挙げられる。
【０２２５】
本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、修飾ヌクレオチドを使用して調製された他のタイプのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）より大きい。一般的に、本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、少なくとも約４ｋｂを含有する。例えば、自己複製ＲＮＡは、少なくとも約５ｋｂ、少なくとも約６ｋｂ、少なくとも約７ｋｂ、少なくとも約８ｋｂ、少なくとも約９ｋｂ、少なくとも約１０ｋｂ、少なくとも約１１ｋｂ、少なくとも約１２ｋｂ、または１２ｋｂ超を含有することができる。ある特定の例では、自己複製ＲＮＡは、約４ｋｂ〜約１２ｋｂ、約５ｋｂ〜約１２ｋｂ、約６ｋｂ〜約１２ｋｂ、約７ｋｂ〜約１２ｋｂ、約８ｋｂ〜約１２ｋｂ、約９ｋｂ〜約１２ｋｂ、約１０ｋｂ〜約１２ｋｂ、約１１ｋｂ〜約１２ｋｂ、約５ｋｂ〜約１１ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約５ｋｂ〜約９ｋｂ、約５ｋｂ〜約８ｋｂ、約５ｋｂ〜約７ｋｂ、約５ｋｂ〜約６ｋｂ、約６ｋｂ〜約１２ｋｂ、約６ｋｂ〜約１１ｋｂ、約６ｋｂ〜約１０ｋｂ、約６ｋｂ〜約９ｋｂ、約６ｋｂ〜約８ｋｂ、約６ｋｂ〜約７ｋｂ、約７ｋｂ〜約１１ｋｂ、約７ｋｂ〜約１０ｋｂ、約７ｋｂ〜約９ｋｂ、約７ｋｂ〜約８ｋｂ、約８ｋｂ〜約１１ｋｂ、約８ｋｂ〜約１０ｋｂ、約８ｋｂ〜約９ｋｂ、約９ｋｂ〜約１１ｋｂ、約９ｋｂ〜約１０ｋｂ、または約１０ｋｂ〜約１１ｋｂである。
【０２２６】
本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、１つまたは複数のタイプの修飾ヌクレオチド（例えば、シュードウリジン、Ｎ６−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、５−メチルウリジン）を含むことができる。
【０２２７】
自己複製ＲＮＡ分子は、単一の異種ポリペプチド抗原、または任意選択により、配列のそれぞれが、アミノ酸配列として発現される場合に、その同一性を保持するように一緒に連結された（例えば、連続して連結された）２つ以上の異種ポリペプチド抗原をコードすることができる。次いで、自己複製ＲＮＡから生成される異種ポリペプチドを、融合ポリペプチドとして生成し、または別個のポリペプチドまたはペプチド配列をもたらす様式で操作することができる。
【０２２８】
本発明の自己複製ＲＮＡは、様々なエピトープを含有する１つまたは複数のポリペプチ
ド抗原をコードすることができる。エピトープは、ヘルパーＴ細胞応答、もしくは細胞傷害性Ｔ細胞応答、またはその両方を誘発することができることが好ましい。
【０２２９】
本明細書に記載される自己複製ＲＮＡ分子を、２つ以上のオープンリーディングフレームから複数のヌクレオチド配列を発現するように操作することができ、それによって、免疫応答の生成を増強することができるサイトカインまたは他の免疫調節剤を伴った、２つ以上の抗原などのタンパク質の共発現を可能にする。このような自己複製ＲＮＡ分子は、例えば、二価ワクチンまたは多価ワクチンとして、例えば、様々な遺伝子産物（例えば、タンパク質）を同時に生成することにおいて特に有用となり得る。
【０２３０】
本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、任意の適当な方法を使用して調製することができる。修飾ヌクレオチドを含有するＲＮＡ分子を生成するためのいくつかの適当な方法が当技術分野で公知である。例えば、修飾ヌクレオチドを含有する自己複製ＲＮＡ分子は、適当なＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔ７ファージＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ファージＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ファージＲＮＡポリメラーゼなど、またはＲＮＡ分子中への修飾ヌクレオチドの効率的な組込みを可能にする、これらのポリメラーゼの変異体を使用して、自己複製ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡを転写（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写）することによって調製することができる。転写反応物は、ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチド、ならびに適当なバッファー、および適当な塩などの選択されたポリメラーゼの活性を支持する他の成分を含有することになる。自己複製ＲＮＡ中へのヌクレオチド類似体の組込みは、例えば、このようなＲＮＡ分子の安定性を変更し、ＲＮａｓｅに対する耐性を増大させ、適切な宿主細胞内に導入した後の複製（ＲＮＡの「感染力」）を確立し、かつ／または先天性免疫応答および適応免疫応答を誘導もしくは低減するように操作することができる。
【０２３１】
本発明の自己複製ＲＮＡ分子を生成するために、適当な合成法を単独で、または１つもしくは複数の他の方法（例えば、組換えＤＮＡ技術もしくは組換えＲＮＡ技術）と組み合わせて、使用することができる。ｄｅ  ｎｏｖｏ合成のための適当な方法は、当技術分野で周知であり、特定の用途に適応させることができる。例示的な方法には、例えば、ＣＥＭなどの適当な保護基を使用する化学合成（Ｍａｓｕｄａら（２００７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５１巻：３〜４頁）、β−シアノエチルホスホラミダイト法（Ｂｅａｕｃａｇｅ  Ｓ  Ｌら（１９８１年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２２巻：１８５９頁）；ヌクレオシドＨ−ホスホネート法（Ｇａｒｅｇｇ  Ｐら（１９８６年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２７巻：４０５１〜４頁；Ｆｒｏｅｈｌｅｒ  Ｂ  Ｃら（１９８６年）Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １４巻：５３９９〜４０７頁；Ｇａｒｅｇｇ  Ｐら（１９８６年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２７巻：４０５５〜８頁；Ｇａｆｆｎｅｙ  Ｂ  Ｌら（１９８８年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２９巻：２６１９〜２２頁）が含まれる。これらの化学法を、市販されている自動核酸シンセサイザーとともに実施するか、またはこれとともに使用するのに適応させることができる。追加の適当な合成法は、Ｕｈｌｍａｎｎら（１９９０年）Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ  ９０巻：５４４〜８４頁、およびＧｏｏｄｃｈｉｌｄ  Ｊ（１９９０年）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ  １巻：１６５頁に開示されている。核酸合成は、クローニング、プロセシング、ならびに／またはポリヌクレオチドおよびこのようなポリヌクレオチドによってコードされる遺伝子産物の発現を含めた、当技術分野で周知であり、慣例的である適当な組換え法を使用して実施することもできる。ランダム断片化ならびに遺伝子断片および合成ポリヌクレオチドのＰＣＲ再構築によるＤＮＡシャッフリングは、ポリヌクレオチド配列を設計および操作するのに使用することができる公知の技法の例である。核酸およびコードされるタンパク質を変更する、例えば、新しい制限部位を挿入し、グリコシル化パターンを変更し、コドン選択を変化させ、スプライスバリアントを生成し、変異を導入するためなどに、部位特異的変異誘発を使用することができる。核
酸配列の転写、翻訳、および発現のための適当な方法は、当技術分野で公知であり、慣例的である。（一般に、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ、２巻、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈ．  Ａｓｓｏｃ．  ＆  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、１３章、１９８８年；Ｇｌｏｖｅｒ、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、ＩＩ巻、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈ．、Ｄ．Ｃ．、３章、１９８６年；Ｂｉｔｔｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５３巻：５１６〜５４４頁（１９８７年）；Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔｒａｔｈｅｒｎら編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉ巻およびＩＩ巻、１９８２年；ならびにＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年を参照）。
【０２３２】
自己複製ＲＮＡ分子中の１つまたは複数の修飾ヌクレオチドの存在および／または量を、任意の適当な方法を使用して判定することができる。例えば、自己複製ＲＮＡを消化してモノホスフェートにし（例えば、ヌクレアーゼＰ１を使用して）、脱リン酸化することができ（例えば、ＣＩＡＰなどの適当なホスファターゼを使用して）、得られるヌクレオシドを、逆相ＨＰＬＣ（例えば、ＹＭＣ  Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−ＡＱカラム（５ミクロン、４．６×２５０ｍｍ）を使用して、勾配（３０％のＢ（０〜５分）から１００％のＢ（５〜１３分））および１００％のＢ（１３〜４０分）、流量（０．７ｍｌ／分）、ＵＶ検出（波長：２６０ｎｍ）、カラム温度（３０℃）、バッファーＡ（２０ｍＭの酢酸−酢酸アンモニウム  ｐＨ３．５）、バッファーＢ（２０ｍＭの酢酸−酢酸アンモニウム  ｐＨ３．５／メタノール［９０／１０］）を使用して溶出する）によって分析することができる。
【０２３３】
任意選択により、本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、自己複製ＲＮＡ分子が、修飾ヌクレオチドを含有しない対応する自己複製ＲＮＡ分子と比較して、宿主細胞（例えば、ヒト細胞）内に導入または進入した際により低い免疫調節活性を有することになるように、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含むことができる。
【０２３４】
必要に応じて、自己複製ＲＮＡ分子をスクリーニングまたは分析することによって、当業者に公知である様々なｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ試験法を使用して、その治療特性および予防特性を確認することができる。例えば、自己複製ＲＮＡ分子を含むワクチンを、目的の特定のリンパ球型、例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、Ｔ細胞株、およびＴ細胞クローンの増殖またはエフェクター機能の誘導に対する、ワクチンの効果について試験することができる。例えば、免疫化されたマウスに由来する脾臓細胞を単離することができる。細胞傷害性Ｔリンパ球の、ポリペプチド抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子を含有する自己標的細胞を溶解する能力。さらに、Ｔヘルパー細胞分化を、ＥＬＩＳＡにより、ＴＨ１（ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ）サイトカインならびに／もしくはＴＨ２（ＩＬ−４およびＩＬ−５）サイトカインの増殖もしくは産生を測定することによって、または細胞質サイトカイン染色およびフローサイトメトリーによってＣＤ４＋Ｔ細胞内で直接に分析することができる。
【０２３５】
ポリペプチド抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子は、例えば、目的の抗原に特異的な抗体のＢ細胞産生の誘導によって立証されるような、体液性免疫応答を誘導する能力についても試験することができる。これらのアッセイは、例えば、免疫化された個体に由来する末梢Ｂリンパ球を使用して行うことができる。このようなアッセイ法は、当業者に公知である。本発明の自己複製ＲＮＡ分子を特徴付けるのに使用することができる他のアッセイでは、標的細胞による、コードされる抗原の発現の検出を伴う場合がある。例えば、ＦＡＣＳを使用することによって、細胞表面上または細胞内で抗原発現を検出することがで
きる。ＦＡＣＳ選択の別の利点は、異なるレベルの発現について選別することができることである。場合により、より低い発現が望まれる場合がある。特定の抗原を発現する細胞を同定するための他の適当な方法は、プレート上のモノクローナル抗体を使用するパニング、またはモノクローナル抗体でコーティングされた磁気ビーズを使用する捕捉を伴う。
【０２３６】
Ｂ．抗原
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される負に荷電した分子は、抗原をコードする核酸分子（例えば、ＲＮＡ分子）である。適当な抗原には、それだけに限らないが、細菌性（ｂａｃｔｅｒｔｉａｌ）抗原、ウイルス抗原、真菌抗原、原生動物（ｐｒｏｔａｚｏａｎ）抗原、植物抗原、がん抗原、またはこれらの組合せが含まれる。
【０２３７】
適当な抗原には、病原体、例えば、ウイルス、細菌、真菌、原生動物、植物、または腫瘍に由来するタンパク質およびペプチドが含まれる。自己複製ＲＮＡ分子によってコードされ得るウイルス抗原ならびに免疫原として、それだけに限らないが、オルソミクソウイルス、例えば、インフルエンザＡ、Ｂ、およびＣなど；パラミクソウイルス科ウイルス、例えば、ニューモウイルス（ＲＳＶ）、パラミクソウイルス（ＰＩＶ）、メタニューモウイルス、および麻疹ウイルス（Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ）（例えば、麻疹（ｍｅａｓｌｅｓ））など；ニューモウイルス、例えば、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、ウシＲＳウイルス、マウスの肺炎ウイルス、およびシチメンチョウ鼻気管支炎ウイルスなど；パラミクソウイルス、例えば、パラインフルエンザウイルス１〜４型（ＰＩＶ）、ムンプスウイルス、センダイウイルス、シミアンウイルス５、ウシパラインフルエンザウイルス、ニパウイルス、ヘニパウイルス、およびニューカッスル病ウイルスなど；真正痘瘡（それだけに限らないが、大痘瘡および小痘瘡を含む）などのオルソポックスウイルスを含めたポックスウイルス科；メタニューモウイルス、例えば、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）およびトリメタニューモウイルス（ａＭＰＶ）など；麻疹（ｍｅａｓｌｅｓ）などの麻疹ウイルス（Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ）；ピコルナウイルス、例えば、エンテロウイルス、ライノウイルス、ヘパルナウイルス、パレコウイルス、カルジオウイルス、およびアフタウイルスなど；エンテロウイルス、例えば、ポリオウイルス１型、２型、または３型、コクサッキーＡウイルス１〜２２型および２４型、コクサッキーＢウイルス１〜６型、エコーウイルス（ＥＣＨＯ）ウイルス１〜９型、１１〜２７型、および２９〜３４型、ならびにエンテロウイルス６８〜７１など、カリフォルニア脳炎ウイルスなどのオルソブニヤウイルスを含めたブニヤウイルス；リフトバレー熱ウイルスなどのフレボウイルス；クリミアコンゴ出血熱ウイルスなどのナイロウイルス；Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）などのヘパルナウイルス；トガウイルス（風疹）、例えば、ルビウイルス、アルファウイルス、またはアルテリウイルスなど；フラビウイルス、例えば、ダニ媒介脳炎（ＴＢＥ）ウイルス、デング熱（１型、２型、３型、もしくは４型）ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、キャサヌール森林ウイルス、西ナイル脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ロシア春夏脳炎ウイルス、ポーワッサン脳炎ウイルスなど；ペスチウイルス、例えば、ウシウイルス性下痢症（ＢＶＤＶ）、古典的ブタ熱（ＣＳＦＶ）、またはボーダー病（ＢＤＶ）など；ヘパドナウイルス、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスなど；ラブドウイルス、例えば、リッサウイルス（狂犬病ウイルス）、およびベシクロウイルス（ＶＳＶ）など、カリシウイルス科、例えば、ノーウォークウイルスなど、ならびにノーウォーク様ウイルス、例えば、ハワイウイルスおよびスノーマウンテンウイルスなど；コロナウイルス、例えば、ＳＡＲＳ、ヒト呼吸器コロナウイルス、トリ感染性気管支炎（ＩＢＶ）、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、およびブタ伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）など；レトロウイルス、例えば、オンコウイルス、レンチウイルス、またはスプマウイルスなど；レオウイルス、例えば、オルトレオウイルス、ロタウイルス、オルビウイルス、またはコルチウイルスなど；パルボウイルスＢ１９などのパルボウイルス；デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）；Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）；Ｇ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）；ヒトヘルペスウイルス、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘−帯状疱疹ウイルス（Ｖ
ＺＶ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ６）、ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ７）、およびヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ８）など；パポバウイルス、例えば、パピローマウイルスおよびポリオーマウイルスなど、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｅｓｓ）、ならびにアレナウイルスに由来するタンパク質およびペプチドが挙げられる。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、抗原は、魚に感染するウイルス、例えば、伝染性サケ貧血ウイルス（ＩＳＡＶ）、サケ膵臓病ウイルス（ＳＰＤＶ）、伝染性膵臓壊死症ウイルス（ＩＰＮＶ）、アメリカナマズウイルス（ＣＣＶ）、魚のリンホシスチス病ウイルス（ＦＬＤＶ）、伝染性造血器壊死症ウイルス（ＩＨＮＶ）、コイヘルペスウイルス、サケピコルナ様ウイルス（大西洋サケのピコルナ様ウイルスとしても公知）、ヤマメウイルス（ＬＳＶ）、大西洋サケロタウイルス（ＡＳＲ）、マスイチゴ病ウイルス（ＴＳＤ）、銀サケ腫瘍ウイルス（ＣＳＴＶ）、またはウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）などに対する免疫応答を誘発する。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、抗原は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ属、例えば、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐ．ｖｉｖａｘ、Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ、またはＰ．ｏｖａｌｅなどに由来する寄生虫に対する免疫応答を誘発する。したがって、本発明は、マラリア対して免疫化するのに使用することができる。いくつかの実施形態では、抗原は、Ｃａｌｉｇｉｄａｅ科、特に、Ｌｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ属およびＣａｌｉｇｕｓ属に由来する寄生虫、例えば、Ｌｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ  ｓａｌｍｏｎｉｓまたはＣａｌｉｇｕｓ  ｒｏｇｅｒｃｒｅｓｓｅｙｉなどのフナムシに対する免疫応答を誘発する。
【０２４０】
自己複製ＲＮＡ分子によってコードされ得る細菌性抗原および免疫原として、それだけに限らないが、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．（例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ、およびＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ（破傷風）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍｓ（ボツリヌス中毒）、Ｃｏｒｎｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ（ジフテリア）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｉｉ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｐ．（例えば、Ｂ．ａｂｏｒｔｕｓ、Ｂ．ｃａｎｉｓ、Ｂ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、Ｂ．ｎｅｏｔｏｍａｅ、Ｂ．ｏｖｉｓ、Ｂ．ｓｕｉｓ、およびＢ．ｐｉｎｎｉｐｅｄｉａｅ）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｓｐ．（例えば、Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｆ．ｐｈｉｌｏｍｉｒａｇｉａ、およびＦ．ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｎｅｉｓｅｒｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ（梅毒）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ
ｄｕｃｒｅｙｉ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、Ｅ．ｃｏｌｉ（腸毒素産生性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＴＥＣ）、腸管凝集性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＡｇｇＥＣ）、分散接着性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＤＡＥＣ）、腸管病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＰＥＣ）、腸外病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥｘＰＥＣ；尿路疾患性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＵＰＥＣ）、および髄膜炎／敗血症関連Ｅ．ｃｏｌｉ（ＭＮＥＣ）など）、ならびに／または腸管出血性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＨＥＣ））、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ（炭疽）
、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ（ペスト）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ（腸チフス）、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅなどに由来するタンパク質およびペプチドが挙げられる。
【０２４１】
自己複製ＲＮＡ分子によってコードされ得る真菌抗原および免疫原として、それだけに限らないが、皮膚糸状菌（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈｙｔｒｅｓ）、例えば、
【０２４２】
【化２】
0006025721.tif 000005
【０２４３】
【化３】
0006025721.tif 000006
に由来するタンパク質およびペプチドが挙げられる。
【０２４４】
自己複製ＲＮＡ分子によってコードされ得る原生動物抗原および免疫原には、それだけに限らないが、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ  ｃａｙａｔａｎｅｎｓｉｓ、およびＴｏｘｏｐｌａｓｍａに由来するタンパク質およびペプチドが含まれる。
【０２４５】
自己複製ＲＮＡ分子によってコードされ得る植物抗原および免疫原には、それだけに限らないが、Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓに由来するタンパク質およびペプチドが含まれる。
【０２４６】
適当な抗原として、ウイルス、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、インフルエンザウイルス（インフルエンザ）、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、パルボウイルス（ｐａｒｖｏｖｏｒｕｓ）、ノロウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ライノウイルス、黄熱病ウイルス、狂犬病ウイルス、デング熱ウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、風疹ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、エンテロウイルス（例えば、エンテロウイルス７１）、エボラウイルス、およびウシ下痢症ウイルスなどに由来するタンパク質およびペプチドが挙げられる。抗原性物質は、ＨＳＶ糖タンパク質ｇＤ、ＨＩＶ糖タンパク質ｇｐ１２０、ＨＩＶ糖タンパク質ｇｐ４０、ＨＩＶ  ｐ５５  ｇａｇ、ならびにｐｏｌ領域およびｔａｔ領域に由来するポリペプチドからなる群より選択されることが好ましい。本発明の他の好適な実施形態では、抗原は、細菌、例えば、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ（コレラ）、Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ（ジフテリア）、Ｃ．ｔｅｔａｎｉ（破傷風）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓなどに由来するタンパク質またはペプチドである。
【０２４７】
本発明の自己複製ＲＮＡ分子によってコードされ得るＨＩＶ抗原は、１９９０年３月９日に出願された米国出願第４９０，８５８号、公開された欧州出願第１８１１５０号（１９８６年５月１４日）、ならびに米国出願第６０／１６８，４７１号；同第０９／４７５，５１５号；同第０９／４７５，５０４号；および同第０９／６１０，３１３号に記載されており、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０２４８】
本発明の自己複製ＲＮＡ分子によってコードされ得るサイトメガロウイルス抗原は、米国特許第４，６８９，２２５号、１９８９年６月１６日に出願された米国出願第３６７，３６３号、およびＰＣＴ公開第ＷＯ８９／０７１４３号に記載されており、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０２４９】
本発明の自己複製ＲＮＡ分子によってコードされ得るＣ型肝炎抗原は、ＰＣＴ／ＵＳ８８／０４１２５、公開された欧州出願第３１８２１６号（１９８９年５月３１日）、１９８８年１１月１８日に出願された、公開された日本国出願第１−５００５６５号、カナダ国出願第５８３，５６１号、およびＥＰＯ３８８，２３２に記載されており、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。異なるセットのＨＣＶ抗原は、１９９０年３月１６日に出願された欧州特許出願第９０／３０２８６６．０号、および１９８９年１２月２１日に出願された米国出願第４５６，６３７号、およびＰＣＴ／ＵＳ９０／０１３４８に記載されており、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０２５０】
いくつかの実施形態では、抗原は、アレルゲン、例えば、花粉アレルゲン（樹木、ハー
ブ、雑草、および草の花粉アレルゲン）；昆虫またはクモ形類のアレルゲン（吸入アレルゲン、唾液アレルゲン、および毒液アレルゲン、例えば、ダニアレルゲン、ゴキブリおよび小昆虫のアレルゲン、膜翅目（ｈｙｍｅｎｏｐｔｈｅｒａ）毒液アレルゲン）；動物の毛アレルゲンおよびフケアレルゲン（例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、マウスなどからの）；ならびに食物アレルゲン（例えば、グリアジン）から得られる。樹木、草、ならびにハーブに由来する重要な花粉アレルゲンは、それだけに限らないが、カバノキ（Ｂｅｔｕｌａ）、ハンノキ（Ａｌｎｕｓ）、ハシバミ（Ｃｏｒｙｌｕｓ）、シデ（Ｃａｒｐｉｎｕｓ）、およびオリーブ（Ｏｌｅａ）、シーダー（ＣｒｙｐｔｏｍｅｒｉａおよびＪｕｎｉｐｅｒｕｓ）、プラタナス（Ｐｌａｔａｎｕｓ）を含めたＦａｇａｌｅｓ、Ｏｌｅａｌｅｓ、Ｐｉｎａｌｅｓの分類学上の目およびスズカケノキ科、Ｌｏｌｉｕｍ属、Ｐｈｌｅｕｍ属、Ｐｏａ属、Ｃｙｎｏｄｏｎ属、Ｄａｃｔｙｌｉｓ属、Ｈｏｌｃｕｓ属、Ｐｈａｌａｒｉｓ属、Ｓｅｃａｌｅ属、およびＳｏｒｇｈｕｍ属の草を含むＰｏａｌｅｓ目、Ａｍｂｒｏｓｉａ属、Ａｒｔｅｍｉｓｉａ属、およびＰａｒｉｅｔａｒｉａ属のハーブを含むＡｓｔｅｒａｌｅｓ目およびＵｒｔｉｃａｌｅｓ目が起源であるものである。他の重要な吸入性アレルゲンは、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ属およびＥｕｒｏｇｌｙｐｈｕｓ属のイエダニ、貯蔵庫ダニ、例えば、Ｌｅｐｉｄｏｇｌｙｐｈｙｓ、Ｇｌｙｃｙｐｈａｇｕｓ、およびＴｙｒｏｐｈａｇｕｓに由来するもの、ゴキブリ、小昆虫、およびノミ、例えば、Ｂｌａｔｅｌｌａ、Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ、およびＣｔｅｎｏｃｅｐｐｈａｌｉｄｅｓに由来するもの、ならびに哺乳動物、例えば、ネコ、イヌ、およびウマなどに由来するもの、ミツバチ（Ａｐｉｄａｅ）、スズメバチ（Ｖｅｓｐｉｄｅａ）、およびアリ（Ｆｏｒｍｉｃｏｉｄａｅ）を含む膜翅目の分類学上の目からのものなどの刺咬昆虫（ｓｔｉｎｇｉｎｇ  ｏｒ  ｂｉｔｉｎｇ  ｉｎｓｅｃｔ）が起源であるものを含めた毒液アレルゲンである。
【０２５１】
ある特定の実施形態では、腫瘍免疫原もしくは抗原、またはがん免疫原もしくは抗原は、自己複製ＲＮＡ分子によってコードされ得る。ある特定の実施形態では、腫瘍免疫原および抗原は、ペプチド含有腫瘍抗原、例えば、ポリペプチド腫瘍抗原または糖タンパク質腫瘍抗原である。
【０２５２】
本明細書で使用するのに適した腫瘍免疫原および抗原は、（ａ）ポリペプチド（これは、例えば、長さが８〜２０アミノ酸の範囲とすることができるが、この範囲外の長さも一般的である）、リポポリペプチド、および糖タンパク質を含めたポリペプチド含有腫瘍抗原などの多種多様な分子を包含する。
【０２５３】
ある特定の実施形態では、腫瘍免疫原は、例えば、（ａ）がん細胞に関連する全長分子、（ｂ）欠失、付加および／または置換された部分を有する分子を含めた、この全長分子の相同体および修飾形態、ならびに（ｃ）この全長分子の断片である。腫瘍免疫原には、例えば、ＣＤ８＋リンパ球によって認識されるクラスＩ制限抗原、またはＣＤ４＋リンパ球によって認識されるクラスＩＩ制限抗原が含まれる。
【０２５４】
ある特定の実施形態では、腫瘍免疫原として、それだけに限らないが、（ａ）がん精巣抗原、例えば、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＳＳＸ２、ＳＣＰ１、ならびにＲＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、およびＭＡＧＥファミリーポリペプチド、例えば、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、およびＭＡＧＥ−１２など（これらは、例えば、黒色腫、肺、頭頸部、ＮＳＣＬＣ、乳房、胃腸、および膀胱の腫瘍に対処するために使用することができる）、（ｂ）変異抗原、例えば、ｐ５３（様々な固形腫瘍、例えば、結腸直腸、肺、頭頸部のがんに関連する）、ｐ２１／Ｒａｓ（例えば、黒色腫、膵がん、および結腸直腸がんに関連する）、ＣＤＫ４（例えば、黒色腫に関連する）、ＭＵＭ１（例えば、黒色腫に関連する）、カスパーゼ−８（例えば、頭頸部がんに関連する）、ＣＩＡ０２０５（例えば、膀胱がんに関
連する）、ＨＬＡ−Ａ２−Ｒ１７０１、βカテニン（例えば、黒色腫に関連する）、ＴＣＲ（例えば、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫に関連する）、ＢＣＲ−ａｂｌ（例えば、慢性骨髄性白血病に関連する）、トリオースリン酸イソメラーゼ、ＫＩＡ０２０５、ＣＤＣ−２７、およびＬＤＬＲ−ＦＵＴ、（ｃ）過剰発現抗原、例えば、ガレクチン４（例えば、結腸直腸がんに関連する）、ガレクチン９（例えば、ホジキン病に関連する）、プロテイナーゼ３（例えば、慢性骨髄性白血病に関連する）、ＷＴ１（例えば、様々な白血病に関連する）、炭酸脱水酵素（例えば、腎がんに関連する）、アルドラーゼＡ（例えば、肺がんに関連する）、ＰＲＡＭＥ（例えば、黒色腫に関連する）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（例えば、乳房、結腸、肺、および卵巣のがんに関連する）、アルファ−フェトプロテイン（例えば、肝細胞がんに関連する）、ＫＳＡ（例えば、結腸直腸がんに関連する）、ガストリン（例えば、膵がん、および胃がんに関連する）、テロメラーゼ触媒タンパク質、ＭＵＣ−１（例えば、乳がん、および卵巣がんに関連する）、Ｇ−２５０（例えば、腎細胞がんに関連する）、ｐ５３（例えば、乳がん、結腸がんに関連する）、およびがん胎児性抗原（例えば、乳がん、肺がん、および結腸直腸がんなどの胃腸管のがんに関連する）、（ｄ）共通抗原、例えば、黒色腫−メラノサイト分化抗原、例えば、ＭＡＲＴ−１／メランＡ、ｇｐ１００、ＭＣ１Ｒ、メラニン細胞刺激ホルモン受容体、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質−１／ＴＲＰ１、およびチロシナーゼ関連タンパク質−２／ＴＲＰ２など（例えば、黒色腫に関連する）、（ｅ）例えば、前立腺がんに関連する前立腺関連抗原、例えば、ＰＡＰ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＨ−Ｐ１、ＰＳＭ−Ｐ１、ＰＳＭ−Ｐ２など、（ｆ）免疫グロブリンイディオタイプ（例えば、骨髄腫およびＢ細胞リンパ腫に関連する）が挙げられる。
【０２５５】
ある特定の実施形態では、腫瘍免疫原として、それだけに限らないが、ｐ１５、Ｈｏｍ／Ｍｅｌ−４０、Ｈ−Ｒａｓ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ、エプスタインバーウイルス抗原、ＥＢＮＡ、Ｅ６およびＥ７を含めたヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原、Ｂ型肝炎ウイルス抗原およびＣ型肝炎ウイルス抗原、ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルス抗原、
【０２５６】
【化４】
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（Ｍａｃ−２結合タンパク質／サイクロフィリンＣ関連タンパク質）、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、ＴＰＳなどが挙げられる。
【０２５７】
Ｃ．負に荷電した分子についての水性溶液
負に荷電した分子（ＲＮＡなど）は、一般に、水性溶液の形態、または水性溶液中に容易に溶解することができる形態（例えば、凍結乾燥した）で提供される。水性溶液は、水、または塩（例えば、ＮａＣｌ）、バッファー（例えば、クエン酸バッファー）、重量オスモル濃度もしくは張性の調整剤（例えば、サッカリド）、ポリマー、界面活性剤、もしくはこれらの組合せを含む水性溶液とすることができる。処方物がｉｎ  ｖｉｖｏ投与のために意図されている場合、水性溶液は、正常な生理的条件と適合性であるｐＨを維持する生理学的に許容されるバッファーであることが好ましい。また、ある特定の場合では、処方物のある特定の成分の安定性を保証するために、ｐＨを特定のレベルに維持すること
が望ましい場合がある。
【０２５８】
例えば、等張性および／または等浸透圧である水性溶液を調製することが望ましい場合がある。高張性および低張性の溶液は、注入されたとき、組成物と生理学的な液との間でイオン濃度が異なるために、組成物の投与後の膨張または急速な吸収などの厄介な問題および望ましくない影響を場合により引き起こすことがある。張性を制御するために、エマルジョンは、ナトリウム塩などの生理的な塩を含むことができる。例えば、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を、約０．９％（ｗ／ｖ）（生理食塩水）で使用することができる。存在する場合がある他の塩には、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム無水物、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどが含まれる。例示的な実施形態では、水性溶液は、１０ｍＭのＮａＣｌ、および他の塩、または非イオン性等張化剤を含む。本明細書に記載されるように、非イオン性等張化剤も、張性を制御するのに使用することができる。
【０２５９】
水性溶液を、緩衝化させることができる。任意の生理学的に許容されるバッファー、例えば、クエン酸バッファー、リン酸バッファー、酢酸バッファー、コハク酸バッファー、トリスバッファー、ビカルボネートバッファー、カルボネートバッファーなどを本明細書で使用することができる。水性溶液のｐＨは、好ましくは、６．０〜８．０、好ましくは、約６．２〜約６．８となる。いくつかの場合では、ある特定の量の塩をバッファー中に含めることができる。他の場合では、バッファー中の塩は、負に荷電した分子のエマルジョン粒子への複合体形成に干渉し得、したがって、回避される。
【０２６０】
水性溶液は、追加の成分、例えば、水性溶液の容量オスモル濃度を変化させる分子、または複合体形成後の負に荷電した分子を安定化させる分子なども含むことができる。例えば、一般に炭水化物であるが、ポリマーとすることもできる非イオン性等張化剤を使用して、重量オスモル濃度を調整することができる。（例えば、ＶｏｅｔおよびＶｏｅｔ（１９９０年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照）。適当な非イオン性等張化剤の例には、糖（例えば、トレハロース、スクロース、デキストロース、フルクトース、還元パラチノースなど）、糖アルコール（マンニトール、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、ラクチトール、マルチトール、グリセロールなど）、およびこれらの組合せが含まれる。必要に応じて、非イオン性ポリマー（例えば、ポリ（アルキルグリコール）、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、もしくはポリブチレングリコールなど）、または非イオン性界面活性剤を使用することができる。これらのタイプの作用物質、特に、糖および糖アルコールは、凍結乾燥されたとき、ＲＮＡ、および他の負に荷電した分子を保護することができる凍結保護物質でもある。例示的な実施形態では、バッファーは、約５６０ｎＭ〜６００ｍＭのトレハロース、スクロース、ソルビトール、またはデキストロースを含む。
【０２６１】
いくつかの場合では、高張性溶液として、負に荷電した分子を含む水性溶液を調製し、純水または低張性バッファーを使用してカチオン性エマルジョンを調製することが好ましい場合がある。エマルジョンと負に荷電した分子が合わされると、混合物は、等張性となる。例えば、ＲＮＡを含む水性溶液を２×高張性溶液とすることができ、カチオン性エマルジョンを、１０ｍＭのクエン酸バッファーを使用して調製することができる。ＲＮＡ溶液とエマルジョンが１：１（ｖ／ｖ）の比で混合されると、組成物は等張性となる。エマルジョンと負に荷電した分子を含む水性溶液の所望の相対量（例えば、１：１（ｖ／ｖ）の混合、２：１（ｖ／ｖ）の混合、１：２（ｖ／ｖ）の混合など）に基づいて、等張性の混合物を達成するのに必要とされる水性溶液の張性を容易に決定することができる。
【０２６２】
同様に、生理的な重量オスモル濃度を有する組成物が、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与にとって望ましい場合がある。生理的な重量オスモル濃度は、水１ｋｇ当たり約２５５ｍＯｓｍ〜水
１ｋｇ当たり約３１５ｍＯｓｍである。場合により、高浸透圧性溶液として、負に荷電した分子を含む水性溶液を調製し、純水または低浸透圧性バッファーを使用してカチオン性エマルジョンを調製することが好ましい場合がある。エマルジョンと負に荷電した分子が合わされると、生理的な重量オスモル濃度が達成される。エマルジョンと負に荷電した分子を含む水性溶液の所望の相対量（例えば、１：１（ｖ／ｖ）の混合、２：１（ｖ／ｖ）の混合、１：２（ｖ／ｖ）の混合など）に基づいて、等浸透圧性の混合物を達成するのに必要とされる水性溶液の重量オスモル濃度を容易に決定することができる。
【０２６３】
ある特定の実施形態では、負に荷電した分子を含む水性溶液は、ポリマー、もしくは界面活性剤、またはこれらの組合せをさらに含むことができる。例示的な実施形態では、水中油型エマルジョンは、ポロキサマーを含有する。特に、本発明者らは、カチオン性エマルジョン粒子との複合体形成の前に、ＲＮＡ水性溶液にＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７を添加すると、ＲＮＡ分子の安定性がより大きくなり、ＲＮＡ分子のＲＮａｓｅ耐性が増大することを観察した。ＲＮＡ水性溶液にｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７を添加すると、ＲＮＡ／ＣＮＥ複合体の粒子サイズが小さくなることも見出された。ポロキサマーポリマーはまた、ＲＮＡ分子の適切な脱複合体形成／放出を促進し、エマルジョン粒子の凝集を防止し、免疫調節効果を有することができる。使用することができる他のポリマーには、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８、またはＰＥＧ３００が含まれる。
【０２６４】
代わりにまたはさらに、負に荷電した分子を含む水性溶液は、約０．０５％〜約２０％（ｗ／ｖ）のポリマーを含むことができる。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．０５％〜約１０％（ｗ／ｖ）、例えば、０．０５％、０．５％、１％、または５％などで、ポリマー（例えば、ポロキサマー、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８、またはＰＥＧ３００）を含むことができる。
【０２６５】
緩衝系は、２つ以上の上述した分子（塩、バッファー、サッカリド、ポリマーなど）の任意の組合せを含むことができる。好適な実施形態では、バッファーは、５６０ｍＭのスクロース、２０ｍＭのＮａＣｌ、および２ｍＭのクエン酸塩を含み、これを、本明細書に記載されるカチオン性水中油型エマルジョンと混合することによって、２８０ｍＭのスクロース、１０ｍＭのＮａＣｌ、および１ｍＭのクエン酸塩を含む最終的な水相を生成することができる。
【０２６６】
５．調製方法
別の態様では、本発明は、カチオン性水中油型エマルジョンを調製するステップであって、エマルジョンが、（１）約０．２％〜約２０％（ｖ／ｖ）の油、（２）約０．０１％〜約２．５％（ｖ／ｖ）の界面活性剤および（３）カチオン性脂質を含む、ステップと、負に荷電した分子がエマルジョンの粒子と複合体を形成するように、負に荷電した分子をカチオン性水中油型エマルジョンに添加するステップとを含む、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物を調製する方法を提供する。
【０２６７】
カチオン性水中油型エマルジョンを作製するための例示的な一アプローチは、（１）油およびカチオン性脂質を合わせて、エマルジョンの油相を形成するステップと、（２）水性溶液を提供して、エマルジョンの水相を形成するステップと、（３）例えば、均質化によって水相中に油相を分散させるステップとを含むプロセスによるものである。均質化は、任意の適した方法で、例えば、市販のホモジナイザー（例えば、ＩＫＡ  Ｔ２５ホモジナイザー、ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＰＡ）で入手可能）を使用して達成され得る。
【０２６８】
カチオン性脂質を、クロロホルム（ＣＨＣｌ３）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、エタノール、アセトン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、２，２，２トリフルオロエタノール、アセトニトリル、酢酸エチル、ヘキサン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などといった適した溶媒に溶解させ、エマルジョンの油成分に直接的に添加してもよい。あるいは、カチオン性脂質を、適した溶媒に添加してリポソーム懸濁物を形成し、次いで、リポソーム懸濁物をエマルジョンの油成分に添加してもよい。カチオン性脂質はまた、油中に直接的に溶解させてもよい。
【０２６９】
脂質の溶解を促進するために、油を約３０℃〜約６５℃の温度に加熱することが望ましい場合がある。
【０２７０】
カチオン性脂質（例えば、ＤＯＴＡＰ）の所望の量を測定し、本明細書において記載され、例示されるような所望の最終濃度に達するように、溶媒中、水中、または油中に直接的に溶解してもよい。
【０２７１】
クロロホルム（ＣＨＣｌ３）またはジクロロメタン（ＤＣＭ）などの溶媒は、水相および油相を合わせる前に、または均質化の前に、例えば、蒸発によって油相から除去してもよい。あるいは、脂質溶解度が問題であり得る場合には、一次エマルジョンを依然として油相において溶媒（例えば、ＤＣＭ）を用いて作製してもよい。このような場合には、溶媒は、第２の均質化の前に一次エマルジョンから除去することができる（例えば、蒸発させる）。
【０２７２】
エマルジョンが１種または複数の界面活性剤を含む場合には、界面活性剤（複数可）は、当技術分野における従来の慣例に従って油相に含まれる場合も、水相に含まれる場合もある。例えば、ＳＰＡＮ８５は、油相（例えば、スクアレン）に溶解させることができ、Ｔｗｅｅｎ  ８０は、水相（例えば、クエン酸バッファー）に溶解させてもよい。
【０２７３】
別の態様では、本発明は、（ｉ）本明細書に記載されるようなカチオン性水中油型エマルジョンを提供するステップと、（ｉｉ）負に荷電した分子（ＲＮＡなど）を含む水性溶液を提供するステップと、（ｉｉｉ）負に荷電した分子がエマルジョンの粒子と複合体を形成するように、（ｉ）の水中油型エマルジョンおよび（ｉｉｉ）の水性溶液を合わせるステップとを含む、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子（ＲＮＡなど）を含む組成物を調製する方法を提供する。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンを、負に荷電した分子を含む水性溶液（例えば、ＲＮＡ水性溶液）と、任意の所望の相対量、例えば、約１：１（ｖ／ｖ）、約１．５：１（ｖ／ｖ）、約２：１（ｖ／ｖ）、約２．５：１（ｖ／ｖ）、約３：１（ｖ／ｖ）、約３．５：１（ｖ／ｖ）、約４：１（ｖ／ｖ）、約５：１（ｖ／ｖ）、約１０：１（ｖ／ｖ）、約１：１．５（ｖ／ｖ）、約１：２（ｖ／ｖ）、約１：２．５（ｖ／ｖ）、約１：３（ｖ／ｖ）、約１：３．５（ｖ／ｖ）、約１：４（ｖ／ｖ）、約１：１．５（ｖ／ｖ）または約１：１．１０（ｖ／ｖ）などで合わせてもよい。
【０２７４】
複合体形成後組成物（例えば、ＲＮＡ−エマルジョン複合体）の各成分の濃度は、使用される、複合体形成前水中油型エマルジョンおよび負に荷電した分子を含む水性溶液（例えば、ＲＮＡ水性溶液）の相対量に従って、容易に決定できる。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンが、１：１（ｖ：ｖ）比で負に荷電した分子を含む水性溶液（例えば、ＲＮＡ水性溶液）と合わされる場合には、油およびカチオン性脂質の濃度は、複合体形成前エマルジョンのものの１／２となる。したがって、４．３％（ｗ／ｖ）スクアレン、１．４ｍｇ／ｍＬ  ＤＯＴＡＰ、０．５％  ｖ／ｖ  ＳＰＡＮ８５および０．５％  ｖ／ｖ
Ｔｗｅｅｎ  ８０を含むエマルジョン（本明細書において「ＣＮＥ１７」と呼ばれる）が、５６０ｍＭスクロース、２０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭクエン酸塩および１％（ｗ／ｖ
）Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７を含むＲＮＡ水性溶液と、１：１（ｖ：ｖ）で合わされる場合には、複合体形成後組成物は、２．１５％（ｗ／ｖ）スクアレン、０．７ｍｇ／ｍＬ
ＤＯＴＡＰ、０．２５％  ｖ／ｖ  ＳＰＡＮ８５、０．２５％  ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ  ８０、２８０ｍＭスクロース、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭクエン酸塩および０．５％（ｗ／ｖ）Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７を含む。
【０２７５】
粒子形成を促し、負に荷電した分子とカチオン性粒子との間の複合体形成を改善し、負に荷電した分子の安定性を増大し（例えば、ＲＮＡ分子の分解を防ぎ）、負に荷電した分子（ＲＮＡ分子など）の適当な脱複合体形成／放出を促進し、またはエマルジョン粒子の凝集を防ぐ、さらなる任意選択のステップが含まれてもよい。例えば、ポリマー（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７）または界面活性剤を、負に荷電した分子（ＲＮＡなど）を含む水性溶液に添加してもよい。例示的一実施形態では、エマルジョン粒子との複合体形成の前に、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７がＲＮＡ分子に添加される。
【０２７６】
エマルジョン粒子のサイズは、油に対する界面活性剤の比（比を増大すると、液滴のサイズが減少する）、運転圧力（運転圧力を増大すると、液滴のサイズが減少する）、温度（温度を高めると、液滴のサイズが減少する）およびその他の処理パラメータを変更することによって変えることができる。実際の粒子サイズは、使用される特定の界面活性剤、油およびカチオン性脂質によって、選択された特定の運転条件によっても変わる。エマルジョン粒子サイズは、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって製造された、市販のＳｕｂ−Ｍｉｃｒｏｎ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（モデルＮ４ＭＤ）などの分粒機器（ｓｉｚｉｎｇ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を使用することによって確認でき、粒子の平均直径が、１μｍ未満、０．９μｍ未満、０．８μｍ未満、０．７μｍ未満、０．６μｍ未満、０．５μｍ未満、０．４μｍ未満、０．３μｍ未満、０．２μｍ未満または０．１μｍ未満となるまで、パラメータを上記で記載されたガイドラインを使用して変更することができる。好ましくは、粒子は、約４００ｎｍ以下、約３００ｎｍ以下、約２００ｎｍ以下、約１８０ｎｍ以下、約１５０ｎｍ以下または約１４０ｎｍ以下、約５０ｎｍ〜１８０ｎｍ、約６０ｎｍ〜１８０ｎｍ、約７０ｎｍ〜１８０ｎｍまたは約８０ｎｍ〜１８０ｎｍ、約８０ｎｍ〜１７０ｎｍ、約８０ｎｍ〜１６０ｎｍ、約８０ｎｍ〜１５０ｎｍまたは約８０ｎｍ〜１４０ｎｍの平均直径を有する。いくつかの場合には、カチオン性エマルジョンの平均粒子サイズが、無菌濾過を可能にする２００ｎｍ以下であることが望ましい場合がある。その他の場合には、無菌濾過は、必要ではなく、カチオン性エマルジョンの平均粒子サイズは、２００ｎｍ超であってもよい。
【０２７７】
カチオン性水中油型エマルジョン（複合体形成前エマルジョン）または負に荷電した分子−エマルジョン複合体を調製するための任意選択のプロセスとして、例えば、滅菌、粒子サイズ選択（例えば、大きな粒子を除去すること）、充填、パッケージングおよび標識などが挙げられる。
【０２７８】
例えば、複合体形成前エマルジョンまたは負に荷電した分子−エマルジョン複合体が、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与のために処方される場合には、例えば、滅菌グレードフィルターを通した（例えば、０．２２ミクロンフィルターを通した）濾過によって滅菌され得る。その他の滅菌技術として、熱プロセスまたは放射線滅菌プロセスまたは滅菌組成物を製造するためにパルス光を使用することが挙げられる。
【０２７９】
本明細書に記載されたカチオン性水中油型エマルジョンを使用してワクチンを製造してもよい。ＭＦ５９について記載されたような同様の方法を使用して、滅菌および／または臨床グレードのカチオン性水中油型エマルジョンを調製できる。例えば、ＶＡＣＣＩＮＥ
ＡＤＪＵＶＡＮＴＳ（Ｏ’Ｈａｇａｎ編）、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ中の、Ｏｔｔら
、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２０００年、第４２巻、２１１〜２２８頁参照のこと。例えば、ＭＦ５９の製造プロセスと同様に、エマルジョンの油相および水相を合わせ、インラインホモジナイザーにおいて処理して、粗エマルジョンを得ることができる。次いで、粗エマルジョンをマイクロフルイダイザー中に送り、そこでさらに処理して、安定なサブミクロンエマルジョンを得ることができる。粗エマルジョンを、所望の粒子サイズが得られるまで、マイクロフルイダイザーの相互作用チャンバーに繰り返し通してもよい。次いで、バルクエマルジョンを濾過して（例えば、窒素下で０．２２μｍフィルターを通して）、大きな粒子を除去し、エマルジョンバルクを得、これを適した容器（例えば、ガラス瓶）中に充填してもよい。自己貯蔵（ｓｅｌｆ  ｓｔｏｒａｇｅ）について、水中油型エマルジョンの存在下での長期の安定性を実証したワクチン抗原については、抗原およびエマルジョンを合わせ、無菌濾過（例えば、０．２２μｍフィルターメンブランを通して）してもよい。合わせた単一バイアルワクチンを、単回用量容器中に充填してもよい。長期の安定性が実証されていないワクチン抗原については、エマルジョンを別個のバイアルとして供給することができる。このような場合には、エマルジョンバルクを濾過滅菌（例えば、０．２２μｍフィルターメンブランを通して）し、最終単回用量バイアルに充填し、パッケージングしてもよい。
【０２８０】
品質管理は、場合により、エマルジョンバルクまたは混合ワクチンの小サンプルで実施してもよく、サンプルが品質管理試験に合格する場合にのみ、バルクまたは混合ワクチンを用量にパッケージングする。
【０２８１】
６．医薬組成物および投与
別の態様では、本発明は、本明細書に記載される、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む医薬組成物を提供し、１種または複数の薬学的に許容されるキャリア、希釈剤または賦形剤をさらに含み得る。好ましい実施形態では、医薬組成物は、ワクチンとして使用することができる免疫原性組成物である。
【０２８２】
あるいは、本明細書において記載された組成物を使用して、負に荷電した分子を細胞に送達してもよい。例えば、種々の目的のために、例えば、遺伝子療法などのために、所望の遺伝子産物（例えば、タンパク質）の産生を誘導するために、遺伝子の発現を調節するために、核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を細胞に送達することができる。また、本明細書に記載された組成物を使用して、治療目的で、例えば、がんまたは増殖性障害、代謝疾患、心血管疾患、感染、アレルギーなどの疾患を処置するために、免疫応答を誘導するなどのために、核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を細胞に送達してもよい。例えば、標的遺伝子の発現を阻害するために、核酸分子を細胞に送達してもよい。このような核酸分子として、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡなどの二本鎖ＲＮＡなどが挙げられる。低分子干渉ＲＮＡなどの二本鎖ＲＮＡ分子は、対応する標的遺伝子を特異的にサイレンシングする（遺伝子ノックダウン）ＲＮＡ干渉を引き起こし得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、選択された配列に相補的であるＤＮＡまたはＲＮＡの一本鎖である。一般に、アンチセンスＲＮＡは、特定のメッセンジャーＲＮＡ鎖のタンパク質翻訳を、それと結合することによって妨げることができる。アンチセンスＤＮＡを使用して、特異的な、相補的な（コーディングまたは非コーディング）ＲＮＡを標的とすることができる。したがって、本明細書に記載されたカチオン性エマルジョンは、例えば、がんの処置のために（腫瘍学標的の産生を阻害することによる）、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは二本鎖ＲＮＡを送達するのに有用である。
【０２８３】
本明細書において提供された医薬組成物は、単独で投与しても、１種または複数のさらなる治療薬と組み合わせて投与してもよい。投与法として、それだけには限らないが、経口投与、直腸投与、非経口投与、皮下投与、静脈内投与、硝子体内投与、筋肉内投与、吸入、鼻腔内投与、局所投与、眼部投与または耳への投与が挙げられる。
【０２８４】
本明細書に記載された組成物の治療上有効な量は、とりわけ、示された疾患、疾患の重篤度、被験体の年齢および関連のある健康状態、投与される化合物の効力、投与様式および所望の処置に応じて変わる。
【０２８５】
その他の実施形態では、本明細書に記載された医薬組成物は、１種または複数のさらなる治療薬と組み合わせて投与してもよい。さらなる治療薬として、それだけには限らないが、抗生物質または抗菌薬、制吐薬、抗真菌薬、抗炎症薬、抗ウイルス薬、免疫調節薬、サイトカイン、抗うつ剤、ホルモン、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍性抗生物質、有糸分裂阻害薬、トポイソメラーゼ阻害剤、細胞増殖抑制剤、抗浸潤薬（ａｎｔｉ−ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｇｅｎｔ）、抗血管新生薬、ウイルス複製の増殖因子機能阻害剤の阻害剤、ウイルス酵素阻害剤、抗がん剤、α−インターフェロン、β−インターフェロン、リバビリン、ホルモンおよびその他のトル様受容体モジュレーター、免疫グロブリン（Ｉｇ）およびＩｇ機能を調節する抗体（抗ＩｇＥ（オマリズマブ）など）が挙げられる。
【０２８６】
特定の実施形態では、本明細書において提供された医薬組成物は、それだけには限らないが、性器疣贅、尋常性疣贅、足底疣贅、狂犬病、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、デングウイルス、黄熱病、単純ヘルペスウイルス（ほんの一例として、ＨＳＶ−Ｉ、ＨＳＶ−ＩＩ、ＣＭＶまたはＶＺＶ）、伝染性軟属腫、ワクシニア、痘瘡、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、肝炎ウイルス（Ｃ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、ライノウイルス、エンテロウイルス（例えば、ＥＶ７１）、アデノウイルス、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ）、インフルエンザ、パラインフルエンザ、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パポーバウイルス、ヘパドナウイルス、フラビウイルス、レトロウイルス、アレナウイルス（ほんの一例として、ＬＣＭ、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルスおよびラッサ熱）およびフィロウイルス（ほんの一例として、エボラウイルスまたはマールブルグウイルス）などのウイルス性疾患をはじめとする、本明細書に開示された病原体によって引き起こされる疾患をはじめとする感染性疾患の処置において使用される。
【０２８７】
特定の実施形態では、本明細書において提供された医薬組成物は、それだけには限らないが、マラリア、結核およびｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ、ハンセン病；ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｎｉｉ、クリプトスポリジウム症、ヒストプラスマ症、トキソプラズマ症、トリパノソーマ感染、リーシュマニア症、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｐｒｏｔｅｕｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属およびＣｈｌａｍｙｄｉａ属の細菌によって引き起こされる感染ならびにカンジダ症、アスペルギルス症、ヒストプラスマ症およびクリプトコッカス髄膜炎などの真菌感染症をはじめとする細菌感染症、真菌感染症および原生動物感染症の処置において使用される。
【０２８８】
特定の実施形態では、本明細書において提供された医薬組成物は、同種移植片拒絶、自己免疫およびアレルギー、がん、または瘢痕および皺などの損傷を受けた皮膚もしくは加齢皮膚をはじめとする、呼吸器疾患および／または障害、皮膚科障害、眼性疾患および／または障害、泌尿生殖器疾患および／または障害の処置において使用される。
【０２８９】
別の態様では、本発明は、有効量の本明細書に開示された組成物を投与するステップを含む、哺乳動物などのそれを必要とする被験体において、免疫応答を発生させるかまたは強化する方法を提供する。免疫応答は、好ましくは、保護的であり、好ましくは、抗体および／または細胞媒介性免疫を含む。本方法は、一次免疫応答を誘導するため、および／
または免疫応答をブースト（ｂｏｏｓｔ）するために使用してもよい。
【０２９０】
特定の実施形態では、本明細書に開示された組成物は、例えば、哺乳動物などのそれを必要とする被験体において免疫応答を引き起こすかまたは増強することにおいて使用するための、医薬として使用してもよい。
【０２９１】
特定の実施形態では、本明細書に開示された組成物は、哺乳動物などのそれを必要とする被験体において免疫応答を発生させるかまたは強化するための医薬の製造において使用してもよい。
【０２９２】
本発明はまた、本明細書に開示された組成物またはワクチンを予め充填された送達デバイスを提供する。
【０２９３】
哺乳動物は、好ましくは、ヒトであるが、本明細書の範囲内の病原体は、広範な種にわたって問題となり得るので、例えば、ウシ、ブタ、ニワトリ、ネコまたはイヌであってもよい。ワクチンが、予防的使用のためのものである場合には、ヒトは、好ましくは、小児（例えば、幼児または乳児）、十代の若者または成人であり；ワクチンが、治療的使用のためのものである場合には、ヒトは、好ましくは、十代の若者または成人である。小児を対象としたワクチンはまた、例えば、安全性、投与量、免疫原性などを評価するために成人に投与してもよい。
【０２９４】
治療的処置の有効性を調べる１つの方法は、本明細書に開示された組成物またはワクチンの投与後に病原体感染をモニタリングすることを含む。予防的処置の有効性を調べる１つの方法は、抗原に対する免疫応答を全身的にモニタリングすること（ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ産生のレベルをモニタリングすることなど）および／または粘膜的にモニタリングすること（ＩｇＡ産生のレベルをモニタリングすることなど）を含む。通常、抗原特異的粘膜抗体応答は、免疫化後およびチャレンジ後に決定されるのに対し、抗原特異的血清抗体応答は、免疫化後であるが、チャレンジ前に決定される。
【０２９５】
核酸分子（例えば、ＲＮＡ）がタンパク質抗原をコードする、本明細書に開示された組成物またはワクチンの免疫原性を評価する別の方法は、免疫ブロットおよび／またはマイクロアレイによって患者の血清または粘膜分泌物をスクリーニングするために組換えによってタンパク質抗原を発現させることである。タンパク質と患者サンプルとの間の陽性反応は、患者が、問題のタンパク質に対する免疫応答を開始したことを示す。この方法はまた、免疫優性抗原および／またはタンパク質抗原内のエピトープを同定するために使用してもよい。
【０２９６】
組成物の有効性はまた、目的の感染症の病原体の適当な動物モデルをチャレンジすることによってｉｎ  ｖｉｖｏで決定できる。
【０２９７】
投与量は、単回用量スケジュールまたは複数回用量スケジュールによるものであり得る。複数回用量は、一次免疫化スケジュールおよび／またはブースタースケジュールにおいて使用してよい。複数回用量スケジュールでは、種々の用量を、同一または異なる経路、例えば、非経口の一次免疫および粘膜のブースト、粘膜の一次免疫および非経口のブーストなどによって与えてもよい。複数回用量は、通常、少なくとも１週間（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間など）の間隔で投与する。
【０２９８】
１種もしくは複数の抗原を含むか、または１種もしくは複数の抗原と組み合わせて使用される本明細書に開示された組成物は、小児および成人の両方を処置するために使用でき
る。したがって、ヒト被験体は、１歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳または少なくとも５５歳であり得る。組成物を受け取るのに好ましい被験体は、高齢者（例えば、＞５０歳、＞６０歳、好ましくは、＞６５歳）、若年者（例えば、＜５歳）、入院患者、医療従事者、軍職員および軍人、妊婦、慢性疾患患者または免疫不全患者である。しかし、組成物は、これらの群にのみ適しているのではなく、集団においてより全般的に使用してもよい。
【０２９９】
１種もしくは複数の抗原を含むか、または１種もしくは複数の抗原と組み合わせて使用される本明細書に開示された組成物は、その他のワクチンと実質的に同時に（例えば、同一の医療相談または医療専門家もしくは予防接種センターへの訪問の際に）、例えば、麻疹ワクチン、ムンプスワクチン、風疹ワクチン、ＭＭＲワクチン、水痘ワクチン、ＭＭＲＶワクチン、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、ＤＴＰワクチン、結合型Ｈ．インフルエンザｂ型ワクチン、不活化ポリオウイルスワクチン、Ｂ型肝炎ウイルスワクチン、髄膜炎菌結合型ワクチン（四価Ａ  Ｃ  Ｗ１３５  Ｙワクチンなど）、ＲＳウイルスワクチンなどと実質的に同時に患者に投与してもよい。
【０３００】
特定の実施形態では、本明細書において提供された組成物は、１種もしくは複数のアジュバントなどの免疫調節剤を含むか、または場合により含んでもよい。例示的アジュバントとして、それだけには限らないが、以下でさらに論じるＴＨ１アジュバントおよび／またはＴＨ２アジュバントが挙げられる。特定の実施形態では、本明細書において提供された免疫原性組成物において使用されるアジュバントとして、それだけには限らないが、以下が挙げられる：
１．ミネラル含有組成物；
２．油エマルジョン；
３．サポニン処方物；
４．ビロソームおよびウイルス様粒子；
５．細菌または微生物誘導体；
６．生体接着剤（ｂｉｏａｄｈｅｓｉｖｅ）および粘膜付着剤（ｍｕｃｏａｄｈｅｓｉｖｅ）；
７．リポソーム；
８．ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル処方物；
９．ポリホスファゼン（ＰＣＰＰ）；
１０．ムラミルペプチド；
１１．イミダゾキノロン化合物；
１２．チオセミカルバゾン化合物；
１３．トリプタントリン化合物；
１４．ヒト免疫調節物質；
１５．リポペプチド；
１６．ベンゾナフチリジン；
１７．微粒子
１８．免疫賦活性ポリヌクレオチド（ＲＮＡまたはＤＮＡなど；例えば、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド）。
【実施例】
【０３０１】
ここで、一般的に記載されている本発明は、以下の実施例を参照することによってより容易に理解されよう。これらは、単に本発明の特定の態様および実施形態を例示する目的で含まれるのであって、本発明を制限しようとするものではない。
【０３０２】
（実施例１）
カチオン性水中油型エマルジョンの開発
自己複製ＲＮＡの送達のために、３種のカチオン性ナノエマルジョン（ＣＮＥ）を開発した。タイプ１エマルジョンは、「ＭＦ５９」様エマルジョンである。これらのエマルジョンは、カチオン性脂質が添加された点を除いてＭＦ５９と同一成分から作製した。タイプ２エマルジョンは、ＭＦ５９中のＳｐａｎ８５およびＴｗｅｅｎ８０をリン脂質で置き換えたエマルジョンである。タイプ３エマルジョンは、脂質またはその他の界面活性剤のいずれかによって安定化され、エマルジョンの水相中にさらなるポリマーまたは界面活性剤を有し得るハイブリッドエマルジョンである。
【０３０３】
タイプ１エマルジョンの調製では、３種の異なる脂質を使用した：１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（塩化物）（ＤＯＴＡＰ）、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール塩酸塩（ＤＣコレステロール）およびジメチルジオクタデシルアンモニウム（臭化物塩）（ＤＤＡ）。タイプ２およびタイプ３エマルジョンの調製では、ＤＯＴＡＰを使用した。
【０３０４】
用語Ｎ／Ｐ比とは、ＲＮＡ上のリン酸の量に対するカチオン性脂質中の窒素の量を指す。窒素は、試験されるカチオン性脂質内で電荷を有する元素である。リン酸はＲＮＡ骨格上に見られ得る。１０／１というＮ／Ｐ電荷比は、ＲＮＡ上の負に荷電したリン酸各々に対して、カチオン性脂質に由来する１０個の正に荷電した窒素があることを示す。
【０３０５】
タイプ１ＣＮＥ：
このクラスのエマルジョンについては、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｓｐａｎ８５、スクアレンおよびクエン酸バッファーの比は、変更しなかった。これらのエマルジョンは、ＭＦ５９と同一濃度で調製した。用量あたりの与えられるカチオン性脂質の全量は、脂質濃度にかかわらず、一定のままである。例えば、１０／１のＮ／Ｐ比で０．８ｍｇ／ｍｌ  ＤＯＴＡＰエマルジョンを用いてエマルジョンにおいて送達されるＲＮＡの１０μｇの用量は、２×希釈を必要とする。したがって、送達されるスクアレンの量は、ＭＦ５９を用いる免疫化の際に普通に投与されるものの１／２となる。あるいは、１０／１のＮ／Ｐ比で１．６ｍｇ／ｍｌ  ＤＯＴＡＰを用いたエマルジョンにおいて送達されるＲＮＡの１０μｇの用量は、４×希釈を必要とする。
【０３０６】
この実施例では、タイプ１エマルジョンの１７種の異なる処方物を調製した。エマルジョンを作製することができたカチオン性脂質の範囲を以下に列挙する：
【０３０７】
【表１】
0006025721.tif 000008
０．８ｍｇ／ｍｌから最大１．６ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰ濃度を有する処方物はすべて、安定なエマルジョンをもたらした。０．６２ｍｇ／ｍｌから最大２．４６ｍｇ／ｍｌのＤＣコレステロール濃度を有する処方物はすべて、安定なエマルジョンをもたらした。０．７３ｍｇ／ｍｌから最大１．６４ｍｇ／ｍｌのＤＤＡ濃度を有する処方物はすべて、安定なエマルジョンをもたらした。
【０３０８】
タイプ２ＣＮＥ：
スクアレンの百分率は、タイプ２ＣＮＥの場合には変動した。ＭＦ５９からのもう１つ
の相違は、これらのエマルジョンは、クエン酸バッファー中ではなく水中で作製したという点である。これらのエマルジョンは、脂質安定化剤として１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）およびホスファチジルコリン（卵ＰＣ）を用いて作製した。エマルジョンは、タイプ１エマルジョン研究から得られた最適濃度のＤＯＴＡＰ、ＤＣコレステロールまたはＤＤＡのいずれかとともにＤＯＰＥおよび卵ＰＣを使用して作製した。
【０３０９】
安定化剤としてＤＯＴＡＰのみを使用して別個のシリーズのエマルジョンを作製した。これらのエマルジョンは、種々の量のスクアレン（０．４３％  ｗ／ｗから最大４．３％
ｗ／ｗのＭＦ５９濃度）を含有していた。
【０３１０】
タイプ３ＣＮＥ：
ＤＯＴＡＰ／卵ＰＣエマルジョンとの複合体形成の前の、ＲＮＡへのＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７（ポロキサマー）の添加は、ポロキサマーが添加されなかったサンプルと比較して、より大きなＲＮａｓｅ安定性につながった。これは、油滴とのより良好なＲＮＡ複合体形成を可能にすることにおけるこのポリマーの役割を示す。
【０３１１】
ＤＯＴＡＰのみのエマルジョンの乳化ステップの間の少量のｔｗｅｅｎ８０（０．０８％  ｗ／ｗ）の添加は、より小さな液滴につながった。
【０３１２】
カチオン性エマルジョンを調製する方法：
スクアレン、ソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ  ８５）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ  ８０）は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から入手した。ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール塩酸塩（ＤＣ−コレステロールＨＣｌ）は、Ａｖａｎｔｉ  Ｌｉｐｉｄｓから購入した。Ｌ−α−リゾホスファチジルコリン（卵、ニワトリ）および１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）は、Ｌｉｐｏｉｄ（Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ  Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。
【０３１３】
カチオン性ナノエマルジョン（ＣＮＥ）は、電荷を有するＭＦ５９と同様に、先に記載されたとおりであるが、わずかに改変を加えて調製した（Ｏｔｔ、Ｓｉｎｇｈら２００２年）。手短には、油溶性成分（すなわち、スクアレン、ｓｐａｎ８５、カチオン性脂質、脂質界面活性剤）をビーカー中で合わせ、脂質成分をクロロホルム（ＣＨＣｌ３）またはジクロロメタン（ＤＣＭ）に溶解した。得られた脂質溶液を、油およびｓｐａｎ８５に直接添加した。エマルジョンのサブセット（ＣＮＥ０１、０２、１７）については、溶媒をドラフト中、室温で２時間蒸発させ、その後、水相を合わせ、サンプルをホモジナイズした。残りのエマルジョン（ＣＮＥ１２、１３、２７、３２、３５）については、油相を水相と合わせ、ＩＫＡ  Ｔ２５ホモジナイザーを２４Ｋ  ＲＰＭで使用して直ちに２分間ホモジナイズして、均一な原料を提供した。ＣＮＥ０５は、リポソームストック溶液を調製することによって調製した。リポソームは、５０℃の温度で、ロータリーエバポレーター（Ｂｕｃｈｉモデル番号Ｒ２００）を３００ｍｉｌｌｉＴｏｒｒの圧力で３０分使用して、１０ｍｇ／ｍｌ  ＤＯＴＡＰクロロホルム溶液を蒸発させることによって調製した。残りのクロロホルム蒸発は、サンプルを一晩Ｌａｂｃｏｎｃｏ凍結乾燥機中に入れることによって確実にした。脂質フィルムを、１．０ｍＬの濾過した脱イオン化蒸留水を添加することによって水和させ、分散させ、脂質の完全な懸濁を確実にするために５０℃で静置した。得られたリポソームをスクアレンに直接加え、ＩＫＡ  Ｔ２５ホモジナイザーを２４Ｋ  ＲＰＭで使用して直ちに２分間乳化した。次いで、エマルジョンを、ドラフト中で、第１の均質化後２〜３時間、撹拌プレート（ｓｔｉｒｐｌａｔｅ）上に室温で放置した。
一次エマルジョンを、およそ１５ｋ〜２０ｋ  ＰＳＩの均質化圧で、氷浴冷却コイルを備えたマイクロフルイダイザーＭ１１０Ｓホモジナイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）に３回から５回通した。ユニットから２０ｍｌのバッチサンプルを取り出し、４℃で保存した。表２には、エマルジョンの成分が記載されている。
【０３１４】
【表２】
0006025721.tif 000009
エマルジョンの油相中に脂質を添加する一方法は、油相中にジクロロメタン（ＤＣＭまたは塩化メチレン）を添加することであった。一旦添加されたＤＣＭは、完全に蒸発させることができた。蒸発させた後、次いで、エマルジョンをマイクロフルイダイザーに通した。あるいは、脂質溶解度が問題である場合には、一次エマルジョンを、依然として有機相においてＤＣＭとともに作製してもよい。その場合には、ＤＣＭは、第２の均質化の前にエマルジョンから直接的に蒸発させる。
【０３１５】
脂質を安定化剤として含有したエマルジョンのための代替法は、脂質がリポソームを形成するように、脂質フィルムを作製し、フィルムを再水和することであった。次いで、リポソームを油相に添加し、標準ＭＦ５９が処理されるように処理した。
【０３１６】
（実施例２）
ＲＮＡ−粒子複合体の調製
１．材料および方法
ＲＮＡ合成
アルファウイルスレプリコン（自己複製ＲＮＡ）をコードするプラスミドＤＮＡを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＲＮＡの合成のための鋳型として使用した。各レプリコンは、ＲＮＡ複製に必要な遺伝子エレメントを含有するが、粒子アッセンブリに必要な遺伝子産物をコードする配列を欠く。アルファウイルスゲノムの構造遺伝子を異種タンパク質（その発現が、アルファウイルスサブゲノムプロモーターによって駆動される）をコードする配列によって置換した。レプリコンが真核細胞へ送達されると、プラス鎖ＲＮＡが翻訳されて、４種の非構造タンパク質が生じ、これはゲノムＲＮＡを一緒に複製し、異種タンパク質をコードする大量のサブゲノムｍＲＮＡを転写する。アルファウイルス構造タンパク質の発現がないために、レプリコンは、感染粒子を生成できない。バクテリオファージＴ７プロモーターを、アルファウイルスｃＤＮＡの上流に配置して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでレプリコンＲＮＡの合成を促進し、ポリ（Ａ）テールのすぐ下流に位置するデルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）リボザイムが、その自己切断活性によって正しい３’末端を作製する。実施例において使用された４種のプラスミドの配列が図７Ａ〜７Ｂ中に示されている。
【０３１７】
適した制限エンドヌクレアーゼを用いて、ＨＤＶリボザイムの下流でプラスミドＤＮＡを線状化した後、Ｔ７またはＳＰ６バクテリオファージ由来ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏでランオフ転写物を合成した。転写は、製造業者（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）によって提供された使用説明書に従って、７．５ｍＭ（Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ）または５ｍＭ（ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ）最終濃度の各ヌクレオシド三リン酸（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰ）の存在下、３７℃で２時間実施した。転写後、鋳型ＤＮＡをＴＵＲＢＯ  ＤＮａｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を用いて消化した。レプリコンＲＮＡを、ＬｉＣｌを用いて沈殿させ、ヌクレアーゼフリー水中で再構成した。非キャッピングＲＮＡを、ユーザーマニュアルに概説されるように、ＳｃｒｉｐｔＣａｐ  ｍ７Ｇキャッピングシステム（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用してワクシニアキャップ形成酵素（Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ｃａｐｐｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅ）（ＶＣＥ）を用いて転写後にキャッピングした。転写後キャッピングＲＮＡをＬｉＣｌを用いて沈殿させ、ヌクレアーゼフリー水中で再構成した。あるいは、レプリコンを、６ｍＭ（Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼに対して）または４ｍＭ（ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼに対して）のｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、非可逆性キャップ構造類似体（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を転写反応物に補充すること、およびグアノシン三リン酸の濃度を１．５ｍＭ（Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼに対して）または１ｍＭ（ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼに対して）に低下させることによってキャッピングしてもよい。次いで、転写物をＴＵＲＢＯ  ＤＮａｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）消化と、それに続くＬｉＣＬ沈殿および７５％エタノールでの洗浄によって精製してもよい。
【０３１８】
ＲＮＡサンプルの濃度は、２６０ｎｍで光学濃度を測定することによって決定した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物の完全性は、全長構築物の存在について変性アガロースゲル電気泳動によって確認した。
【０３１９】
ＲＮＡ複合体形成
溶液中の窒素数を、カチオン性脂質濃度から算出した。例えば、ＤＯＴＡＰは、分子あたり１個のプロトン化され得る窒素を有する。ＲＮＡ濃度を使用し、ＲＮＡ１マイクログラムあたり３ｎｍｏｌのリン酸という推定値を使用して溶液中のリン酸量を算出した。ＲＮＡ：脂質の量を変えることによって、Ｎ／Ｐ比を改変することができる。ＲＮＡを様々な窒素／リン酸比（Ｎ／Ｐ）でＣＮＥと複合体形成させた。Ｎ／Ｐ比の算出は、１ミリリ
ットルあたりのエマルジョン中のプロトン化できる窒素のモル数を算出することによって行った。リン酸数を算出するために、ＲＮＡ１マイクログラムあたり３ｎｍｏｌのリン酸という定数を使用した。値を決定した後、ＲＮＡに適当な割合のエマルジョンを添加した。これらの値を使用して、ＲＮＡを適当な濃度に希釈し、軽くボルテックス処理しながら等容積のエマルジョン中に直接添加した。溶液をおよそ２時間室温に放置した。複合体形成後、得られた溶液を適当な濃度に希釈し、１時間以内に使用した。
【０３２０】
ゲル電気泳動
変性ゲル電気泳動を実施して、ＲＮＡのカチオン性処方物との結合およびＲＮａｓｅＡの存在下での安定性を評価した。ゲルは以下のとおりに成型した：２ｇのアガロース（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を１８０ｍｌの水に添加し、溶解するまで電子レンジ中で加熱し、次いで、６０℃に冷却した。次いで、アガロース溶液に２０ｍｌの１０×変性ゲルバッファー（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を添加した。ゲルを注ぎ、室温で少なくとも４５分間放置した。次いで、ゲルをゲルタンク中に入れ、１×ＭＯＰＳランニングバッファー（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を添加してゲルを数ミリメートル覆った。
【０３２１】
ＲＮａｓｅ保護アッセイ
ＲＮａｓｅ消化は、ＲＮＡ１マイクログラムあたり６．４ｍＡＵのＲＮａｓｅＡ（Ａｍｂｉｏｎ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）とともに室温で３０分間インキュベートすることによって達成した。ＲＮａｓｅは、プロテイナーゼＫ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）とともにサンプルを５５℃で１０分間インキュベートすることによって不活化した。ＲＮａｓｅ不活性化後、サンプルと、２５：２４：１、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールとの１：１混合物を用いて、サンプルを脱複合体化した。サンプルを数回反転させて混合し、次いで、１２ｋ  ＲＰＭで遠心機に１５分間かけた。有機相から水相を収集し、ＲＮＡを分析するために使用した。ローディング（ウェルあたり４６０ｎｇ）の前に、すべてのサンプルをホルムアルデヒドローディング色素とともにインキュベートし、６５℃で１０分間変性させ、室温に冷却した。ＲＮＡ構築物の分子量を見積もるためにＡｍｂｉｏｎ  Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍマーカーを使用した。ゲルは、１３０Ｖで泳動した。ゲルを、水中で、０．１％  ＳＹＢＲゴールドを製造業者のガイドライン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に従って使用し、室温で１時間振盪することによって染色した。ゲル画像は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｃｈｅｍｉｄｏｃ  ＸＲＳイメージングシステム（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）で取得した。すべての研究は、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）製のマウス胸腺ＲＮＡを使用した。
【０３２２】
ヘパリン結合実験
ＲＮＡを上記のように複合体形成させた。ＲＮＡ／ＣＮＥ複合体を、種々の濃度のヘパリンスルフェート（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ、Ｗａｒｄ  Ｈｉｌｌ  ＭＡ）とともに室温で３０分間インキュベートした。得られた溶液を、１５〜２０分間遠心分離した。遠心管をツベルクリンシリンジで穿刺し、下層部（ｓｕｂｎａｔａｎｔ）を収集した。次いで、Ｑｕａｎｔ−ｉｔ  Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ  ＲＮＡアッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）を製造業者の指示に従って使用して、溶液をＲＮＡ濃度についてアッセイした。サンプルをＢｉｏｔｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  ４（Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）蛍光プレートリーダーで分析した。遊離ＲＮＡ値を標準曲線を使用して算出した。
【０３２３】
粒子サイズアッセイ
エマルジョンの粒子サイズは、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を製造業者の使用説明書に従って使用して測定した。粒子サイズは、多分散指数（ｐｄｉ）とともにＺ平均（
ＺＡｖｅ）として報告した。測定の前にすべてのサンプルを水で希釈した。さらに、エマルジョンの粒子サイズは、Ｈｏｒｉｂａ  ＬＡ−９３０粒子サイズ分析計（Ｈｏｒｉｂａ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を使用して測定した。測定の前にサンプルを水で希釈した。ゼータ電位は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳを使用し、希釈サンプルを使用して製造業者の使用説明書に従って測定した。
【０３２４】
分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）アッセイ
抗原産生の動態および量を評価するために、ＳＥＡＰをコードするＲＮＡレプリコンを、処方物とともにおよび処方物を伴わずにマウス筋肉内に投与した。８〜１０週齢の、約２０ｇの体重の３または５匹の雌性のＢａｌｂ／Ｃマウスの群を、示されたＮ／Ｐ比でＳＥＡＰをコードするレプリコンＲＮＡと複合体を形成したＣＮＥを用いて免疫化した。裸のＲＮＡを、ＲＮａｓｅフリー１×ＰＢＳ中で処方した。各マウスに、四頭筋中に１００μｌ用量を投与した（部位あたり５０μｌ）。注射の１、３および６日後に血液サンプルを採取した。採取後直ちに血清を血液から分離し、使用まで−３０℃で保存した。
【０３２５】
化学発光ＳＥＡＰアッセイＰｈｏｓｐｈａ−Ｌｉｇｈｔシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を使用して、血清を分析した。マウス血清を、１×Ｐｈｏｓｐｈａ−Ｌｉｇｈｔ希釈バッファーで１：４希釈した。サンプルを水浴中に入れ、アルミニウム密閉ホイルで密閉し、６５℃で３０分間熱不活化した。氷上で３分間冷却し、室温に平衡化した後、ウェルに５０μＬのＰｈｏｓｐｈａ−Ｌｉｇｈｔアッセイバッファーを添加し、サンプルを室温で５分間静置した。次いで、１：２０  ＣＳＰＤ（登録商標）（化学発光アルカリホスファターゼ（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｃｅｎｔ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）基質）基質を含有する５０μＬの反応バッファーを添加し、室温で２０分インキュベートした後、発光を測定した。発光は、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｃｅｎｔｒｏ  ＬＢ  ９６０ルミノメーター（Ｏａｋ  Ｒｉｄｇｅ、ＴＮ）で、ウェルあたり１秒の積算を用いて測定した。各サンプル中のＳＥＡＰの活性は、２連で測定し、これら２回の測定値の平均が示されている。
【０３２６】
エレクトロポレーション
エレクトロポレーションは、プラスミドＤＮＡワクチンの送達にとって極めて効果的な方法であり、この技術を使用して、自己複製ＲＮＡを送達した。イソフルオラン下でマウスを麻酔し、念入りに両後肢の毛を剃り、処理される肢上の領域を露出させた。ワクチンの３０μｌの用量を、１／２ｃｃインスリン用シリンジを使用して後肢の四頭筋に注射した。Ｅｌｇｅｎ（登録商標）ＤＮＡ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｏｖｉｏ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）を使用して筋肉にエレクトロポレーションした。機器パラメータは以下のとおりである：６０Ｖ、各６０ｍｓで２パルス。第２の肢に別の用量を同様に送達し、続いて、エレクトロポレーションを行った。
【０３２７】
ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）
本発明者らは、ＲＮＡワクチンを、リポーター遺伝子または抗原のｉｎ  ｖｉｖｏ発現を達成するための伝統的なＲＮＡベクターによるアプローチと比較するために、Ｐｅｒｒｉらによって記載された方法によってＢＨＫ細胞において産生されたウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）を利用した。この系では、抗原（またはリポーター遺伝子）レプリコンは、シンドビスウイルスの３’末端配列（３’ＵＴＲ）およびシンドビスウイルスパッケージングシグナル（ＰＳ）（Ｐｅｒｒｉ  Ｓ．ら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ第７７巻：１０３９４〜１０４０３頁（２００３年）の図２参照のこと）を含有するよう遺伝子操作されたベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）のゲノムに由来するアルファウイルスキメラレプリコン（ＶＣＲ）からなるものであった。これらのレプリコンを、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞中に、シンドビスウイルスカプシドおよび糖タンパク質遺伝子（Ｐｅｒｒｉらの図２参照のこと）をコードする欠損ヘルパーＲＮＡとともに共エレクトロポレーション
することによってＶＲＰにパッケージングした。次いで、標準方法によってＶＲＰを収集し、力価測定し、培養液またはその他の等張性バッファー中で動物に接種した。
【０３２８】
２．水中油型エマルジョンの粒子サイズ分析
作製後、エマルジョンを粒子サイズおよびゼータ電位について分析した。表３および４は、４：１および１０：１のＮ／Ｐ比での複合体形成前および複合体形成後に得られたデータ粒子サイズおよびゼータ電位データを要約している。エマルジョンの粒子サイズは、Ｎａｎｏ  ＺＳ粒子サイズ分析計で測定された場合に、試験された処方物のすべてについて１６０ｎｍ未満であった。複合体形成後、一部の粒子サイズは、特に、４：１  Ｎ／Ｐ比で大幅に増大した。これは、凝集および複数のエマルジョン液滴間のＲＮＡの架橋による可能性が高い。Ｈｏｒｒｉｂａデータは、全般的に、ｎａｎｏＺＳで分析され得ない大きな粒子集団があると思われる２、３の場合（ＣＮＥ０２およびＣＮＥ３２）を除いて、ＮａｎｏＺＳ測定値とよく一致していた。ＣＮＥ０２およびＣＮＥ３２を除くすべてのＣＮＥは、Ｈｏｒｉｂａ粒子サイズ分析計で測定した場合に１９０ｎｍ未満のサイズであった。サイズにおける変動性が小さいことから、添加されるカチオン性脂質の量またはタイプにかかわらない堅調な処理方法が示される。平均粒子サイズは、無菌濾過を可能にするよう２００ｎｍ未満のサイズであることが特に望ましい。試験したすべてのサンプルがこの基準を通過する。
【０３２９】
【表３】
0006025721.tif 000010
ゼータ電位は、粒子サイズデータよりもわずかに変動性であった（表４）。これは、本発明者らの予想と一致しているが、これは、これらの処方物におけるいくつかの相違が、カチオン性脂質濃度の変化であるからである。例えば、ＣＮＥ０１、ＣＮＥ０２およびＣＮＥ１７は、各々、０．８、１．６および１．２ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰをそれぞれ含有する。これらのロットのゼータ電位は、予想と一致しており、複合体形成前に１５．９ｍＶの最低ゼータ電位を有するＣＮＥ０１、続いて、３３．４ｍＶの複合体形成前ゼータ電位を有するＣＮＥ１７、最後に、４３ｍＶのゼータ電位を有するＣＮＥ０２であった。上
記複合体形成後ゼータ電位は、おそらくはエマルジョンにおける過剰の電荷のために、一般に、複合体形成前ゼータ電位から大きくは変化しない。
【０３３０】
【表４】
0006025721.tif 000011
３．ＲＮａｓｅ安定性アッセイ：
エマルジョンの、ＲＮａｓｅ分解から保護する能力を評価するために、処方物をスクリーニングするためのｉｎ−ｖｉｔｒｏアッセイを開発した。図１は、１０：１および４：１  Ｎ／Ｐ比のＣＮＥ０１およびＣＮＥ１７のＲＮａｓｅ保護アッセイの結果を示す。ＣＮＥ０１は、４：１比と比較して１０：１比でＲＮＡを良好に保護した。ＣＮＥ１７は、１０：１で良好な保護を示した。図２は、ＣＮＥ１７がまた、４：１のＮ／Ｐ比でＲＮＡを保護できることを示す。ＣＮＥ１２および１３もまた、両電荷比でＲＮＡを保護した（ＣＮＥ１７と同様に）（図２）。図３は、４：１  Ｎ／Ｐ比で、あまり良好には保護しないＣＮＥ０１を用いた図１と同様の結果を示す。ＣＮＥ０２は、試験した両Ｎ／Ｐ比でＲＮａｓｅを極めて良好に保護した（図３および４）。ＣＮＥ０４は、ＲＮＡをＲＮａｓｅ消化から保護しなかったが、ＣＮＥ０５は、試験した両電荷比でＲＮＡを保護できた（図５）。ＣＮＥ２７が、極めて少ないＲＮａｓｅ保護を示したのに対し、ＣＮＥ３２は、わずかにより多い保護を示したが、これまでに記載された処方物より全体的に少なかった。ＣＮＥ３５（図６）は、ＲＮＡをＲＮａｓｅからの分解からわずかに保護できた。５種の異なる処方物全部が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＲＮＡの分解を防ぐことができた。
【０３３１】
４．Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＳＥＡＰスクリーニング：
分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を発現するＡ３０６レプリコンを使用して、アルファウイルスベクターの投与後のｉｎ  ｖｉｖｏでのタンパク質発現レベルを決定した。ＢＡＬＢ／ｃマウス、群あたり５匹の動物に、ＳＥＡＰ（５×１０５ＩＵ）を発現するＶＲＰ、裸の自己複製ＲＮＡ（Ａ３０６、１μｇ）、エレクトロポレーションを使用して送達される自己複製ＲＮＡ（Ａ３０６＋ＥＰ、それぞれ、１および０．１μｇ）、ならびに先に記載したように作製された、１０：１のＮ／Ｐ比でＣＮＥ１７、ＣＮＥ０５およびＣＮＥ３５を用いて処方した自己複製ＲＮＡ（１μｇまたは０．１μｇ  Ａ３０６）
を用いて０日目に両側筋肉内ワクチン接種（下肢あたり５０μＬ）を行った。０日目の筋肉内ワクチン接種の１、３および６日後の血清ＳＥＡＰレベル（相対光単位（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｌｉｇｈｔ  ｕｎｉｔ）、ＲＬＵ）が表５に示されている。データは、群あたり５匹の個々のマウスの算術平均力価として表されている。
【０３３２】
【表５】
0006025721.tif 000012
表５は、同様の用量の裸のＲＮＡ対照に対して、ＲＮＡがＣＮＥ１７中に処方された場合に血清ＳＥＡＰレベルが増大したことを示す。ＳＥＡＰ発現は、ＶＲＰ対照に対して、ＲＮＡがＣＮＥ中に処方された場合に増大したが、発現の動態は極めて様々であった。エレクトロポレーションを用いる送達は、裸のＲＮＡ対照に対して、ＳＥＡＰ発現の増大をもたらしたが、これらのレベルは、ＲＮＡがＣＮＥ１７を用いて処方された場合のＳＥＡＰ発現レベルと比較して低かった。ＣＮＥ０５およびＣＮＥ３５は、タンパク質発現レベルを低下させた。
【０３３３】
５．ＳＥＡＰ発現に対するＮ／Ｐ比の影響（ＣＮＥ１７）
分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を発現するＡ３０６レプリコンを使用して、アルファウイルスベクターの投与後のｉｎ  ｖｉｖｏでのタンパク質発現レベルを決定した。ＢＡＬＢ／ｃマウス、群あたり５匹の動物に、裸の自己複製ＲＮＡ（Ａ３０６、１μｇ）、以下のＮ／Ｐ比６：１、７：１、８：１、１０：１、１２：１、１３：１、１４：１、１６：１において、記載したように作製されたＣＮＥ１７を用いて処方した自己複製ＲＮＡ（Ａ３０６、１μｇ）を用いて０日目に両側筋肉内ワクチン接種（下肢あたり５０μＬ）を行った。
【０３３４】
０日目の筋肉内ワクチン接種の１、３および６日後の血清ＳＥＡＰレベル（相対光単位、ＲＬＵ）が表６に示されている。データは、群あたり５匹の個々のマウスの算術平均力価として表されている。６日目ＳＥＡＰ発現と比較した、ヘパリンスルフェート結合の相関が、表７に概説されている。それぞれ、６×、８×および１０×ヘパリンスルフェートで複合体から放出されたＲＮＡの百分率が示されている。
【０３３５】
【表６】
0006025721.tif 000013
【０３３６】
【表７】
0006025721.tif 000014
表６および７は、同様の用量の裸のＲＮＡ対照に対して、１０：１のＮ／Ｐ比でＲＮＡが処方された場合に血清ＳＥＡＰレベルが増大したことを示す。試験したその他のＮ／Ｐ比は、１０：１  Ｎ／Ｐ比と比較して低い量のタンパク質発現を示したが、すべてが、裸のＲＮＡよりは高い応答を示した。裸のＲＮＡから得られた平均ＳＥＡＰ値は、相当に変動したということは強調されなくてはならず、これは、表５および６中に例示され、一実験では、およそ３５，０００で、別のものでは５，０００の発現である。６日目のタンパク質発現レベルは、ヘパリン放出と良好に相関していた。
【０３３７】
６．ＳＥＡＰ発現に対するＮ／Ｐ比の影響（ＣＮＥ１３）
分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を発現するＡ３０６レプリコンを使用して、アルファウイルスベクターの投与後のｉｎ  ｖｉｖｏでのタンパク質発現レベルを決定した。ＢＡＬＢ／ｃマウス、群あたり５匹の動物に、裸の自己複製ＲＮＡ（Ａ３０６、１μｇ）、以下のＮ／Ｐ比６：１、８：１、１０：１、１２：１、１４：１、１６：１、１８：１において、先に記載したように作製したＣＮＥ１３を用いて処方した自己複製ＲＮＡ（１μｇ  Ａ３０６）を用いて０日目に両側筋肉内ワクチン接種（下肢あたり５０μＬ）を行った。
【０３３８】
０日目の筋肉内ワクチン接種の１、３および６日後の血清ＳＥＡＰレベル（相対光単位、ＲＬＵ）が表８に示されている。データは、群あたり５匹の個々のマウスの算術平均力価として表されている。６日目ＳＥＡＰ発現と比較したヘパリンスルフェート結合の相関が、表９に概説されている。それぞれ、６×、８×および１０×ヘパリンスルフェートで複合体から放出されたＲＮＡの百分率が示されている。
【０３３９】
【表８】
0006025721.tif 000015
【０３４０】
【表９】
0006025721.tif 000016
表８および９は、同様の用量の裸のＲＮＡ対照に対して、ＲＮＡが試験されたすべてのＮ／Ｐで処方された場合に、血清ＳＥＡＰレベルが増大したことを示す。６日目でのタンパク質発現は、ヘパリン放出と良好に相関していた。
【０３４１】
７．ＳＥＡＰ発現に対するＮ／Ｐ比の影響（ＣＮＥ０１）
分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を発現するＡ３０６レプリコンを使用して、アルファウイルスベクターの投与後のｉｎ  ｖｉｖｏでのタンパク質発現レベルを決定した。ＢＡＬＢ／ｃマウス、群あたり５匹の動物に、裸の自己複製ＲＮＡ（Ａ３０６、１μｇ）、以下のＮ／Ｐ比４：１、１０：１、１２：１、１４：１、１６：１、１８：１において、先に記載したように作製したＣＮＥ０１を用いて処方した自己複製ＲＮＡ（１μｇ  Ａ３０６）を用いて０日目に両側筋肉内ワクチン接種（下肢あたり５０μＬ）を行った。
【０３４２】
０日目の筋肉内ワクチン接種の１、３および６日後の血清ＳＥＡＰレベル（相対光単位、ＲＬＵ）が表１０に示されている。データは、群あたり５匹の個々のマウスの算術平均相対光単位（ＲＬＵ）として表されている。６日目ＳＥＡＰ発現と比較した、ヘパリンスルフェート結合の相関が、表１１に概説されている。それぞれ、６×、８×および１０×ヘパリンスルフェートで複合体から放出されたＲＮＡの百分率が示されている。
【０３４３】
【表１０】
0006025721.tif 000017
【０３４４】
【表１１】
0006025721.tif 000018
表１０および１１は、同様の用量の裸のＲＮＡ対照に対して、ＲＮＡが処方された場合に（試験されたすべてのＮ／Ｐ比において）、血清ＳＥＡＰレベルが増大したことを示す。
【０３４５】
（実施例３）
種々の油を用いたタンパク質発現レベルの評価
種々の油を使用するが、ＣＮＥ１７の基本処方、すなわち、５％油、０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ８０、０．５％  ｓｐａｎ８５および１．４ｍｇ／ｍｌ  ＤＯＴＡＰにおいて、一連のエマルジョンを作製した。以下の表１２には、群の各々の油の変化が概説されている。油の分類も表１２に列挙されている。
【０３４６】
１０：１  Ｎ／Ｐ比でエマルジョンを試験し、先に記載したように複合体を形成した。ＢＡＬＢ／ｃマウス、群あたり５匹の動物に、ＳＥＡＰを発現するＶＲＰ（５×１０５ＩＵ）、裸の自己複製ＲＮＡ（Ａ３０６、１μｇ）、エレクトロポレーションを使用して送
達される自己複製ＲＮＡ（Ａ３０６＋ＥＰ、１および０．１μｇ）、ならびに先に記載したように作製したＣＮＥ３６、ＣＮＥ３７、ＣＮＥ３８およびＣＮＥ４１を用いて処方された自己複製ＲＮＡ（１μｇ  Ａ３０６）を用いて０日目に両側筋肉内ワクチン接種（下肢あたり５０μＬ）を行った。０日目の筋肉内ワクチン接種の１、３および６日後の血清ＳＥＡＰレベル（相対光単位、ＲＬＵ）が表１３に示されている。データは、群あたり５匹の個々のマウスの算術平均ＲＬＵとして表されている。
【０３４７】
【表１２】
0006025721.tif 000019
【０３４８】
【表１３】
0006025721.tif 000020
表１３に示されるように、ＣＮＥ１７は、研究を通じて最高レベルの発現を示す。その他のエマルジョンのすべてが、裸のＲＮＡの１μｇ用量よりも低かった。ＣＮＥ３６は、新規油の最高発現をもたらし、それに続いて、ＣＮＥ４１およびＣＮＥ３８であった。ＭＦ５９に直接添加した１μｇの用量のＲＮＡは、応答を弱めた。
【０３４９】
（実施例４）
マウスモデルにおける、ＲＳＶ−Ｆ抗原のＣＮＥ１７によって増強された免疫原性
１．方法
マウス免疫原性研究
この研究には、ＲＳＶの表面融合糖タンパク質（ＲＳＶ−Ｆ）を発現するＡ３１７レプリコンを使用した。８〜１０週齢で、体重約２０ｇのＢＡＬＢ／ｃマウス、群あたり１０匹の動物に、両側筋肉内ワクチン接種を行った。すべての動物に、ＲＳＶ−Ｆを発現するＶＲＰ（１×１０６ＩＵ）、裸の自己複製ＲＮＡ（Ａ３１７、１μｇ）、エレクトロポレーションを使用して送達される自己複製ＲＮＡ（１０μｇ  Ａ３１７＋ＥＰ）またはＣＮＥ１７中に処方された自己複製ＲＮＡ（０．１μｇまたは１μｇ  Ａ３１７）を用いて、０日目および２１日目に、２本の後肢中、四頭筋に注射し、各々等容積（下肢あたり５０μＬ）を投与した。１４日目（２ｗｐ１）、３５日目（２ｗｐ２）および４９日目（４ｗｐ２）に抗体分析のために血清を採取した。Ｔ細胞応答の測定が必要であった場合には、Ｔ細胞分析のために３５日目または４９日目に群あたり５匹のマウスから脾臓を摘出した。
【０３５０】
マウスＴ細胞機能アッセイ：細胞内サイトカイン免疫蛍光アッセイ
等しくワクチン接種されたＢＡＬＢ／ｃマウスから得た２から５個の脾臓を、プールし、培養のために単細胞懸濁物を調製した。各脾細胞プールについて、２つの抗原によって刺激された培養物および２つの非刺激培養物を確立した。抗原によって刺激された培養物は、１×１０６個の脾細胞、ＲＳＶ  Ｆペプチド８５〜９３（１×１０−６Ｍ）、ＲＳＶ
Ｆペプチド２４９〜２５８（１×１０−６Ｍ）、ＲＳＶ  Ｆペプチド５１〜６６（１×１０−６Ｍ）、抗ＣＤ２８ｍＡｂ（１ｍｃｇ／ｍＬ）およびブレフェルジンＡ（１：１０００）を含有していた。非刺激培養物は、ＲＳＶ  Ｆペプチドを含有しておらず、その他の点では、刺激された培養物と同一であった。３７℃で６時間培養した後、培養物を免疫蛍光のために処理した。細胞を洗浄し、次いで、蛍光標識された抗ＣＤ４および抗ＣＤ８モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を用いて染色した。細胞を再度洗浄し、次いで、Ｃｙｔｏｆｉｘ／ｃｙｔｏｐｅｒｍを用いて２０分間固定した。次いで、Ｐｅｒｍ洗浄バッファー
を用いて固定された細胞を洗浄し、次いで、ＩＦＮ−ｇ、ＴＮＦ−ａ、ＩＬ−２およびＩＬ−５に特異的な蛍光標識ｍＡｂを用いて染色した。染色された細胞を洗浄し、次いで、ＬＳＲ  ＩＩフローサイトメーターで分析した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して、取得したデータを分析した。ＣＤ４＋８−およびＣＤ８＋４−Ｔ細胞サブセットを、別個に分析した。所与のサンプル中の各サブセットについて、サイトカイン陽性細胞％を決定した。ＲＳＶ  Ｆ抗原特異的Ｔ細胞％を、抗原によって刺激された培養物中のサイトカイン陽性細胞％と非刺激培養物中のサイトカイン陽性細胞％との間の相違として算出した。抗原特異的細胞％の９５％信頼限界は、標準法（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、第７版、Ｇ．Ｗ．ＳｎｅｄｅｃｏｒおよびＷ．Ｇ．Ｃｏｃｈｒａｎ）を使用して決定した。
【０３５１】
マウスＴ細胞機能アッセイ：分泌型サイトカインアッセイ
分泌型サイトカインアッセイのための培養物は、ブレフェルジンＡが省かれた点を除いて細胞内サイトカイン免疫蛍光アッセイのものと同様であった。３７℃で一晩培養した後に培養上清を収集し、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ製のマウスＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインキットを使用して複数のサイトカインについて分析した。培養物あたりの各サイトカインの量を、製造業者によって供給された精製組換えサイトカインを使用して作成した標準曲線から決定した。
【０３５２】
２．マウスモデルにおける、ＲＳＶ−Ｆ抗原のＣＮＥ１７によって増強された免疫原性
１４、３５および４９日目のＦ特異的血清ＩｇＧ力価が、表１４、１５および１６に示されている。３５および４９日目のＲＳＶ血清中和力価が表１７に示されており、４９日目のＴ細胞応答が表１８および１９に示されている。
【０３５３】
【表１４】
0006025721.tif 000021
１４日目（２ｗｐ１）に抗体分析のために血清を収集した。データは、個々の動物および群あたり１０匹の個々のマウスの幾何平均力価として表されている。個々の動物が、＜２５の力価（検出限界）を有していた場合、５の力価を割り当てた。
【０３５４】
【表１５】
0006025721.tif 000022
３５日目（２ｗｐ２）に抗体分析のために血清を収集した。データは、個々の動物および群あたり１０匹の個々のマウスの幾何平均力価として表されている。個々の動物が、＜２５の力価（検出限界）を有していた場合、５の力価を割り当てた。
【０３５５】
【表１６】
0006025721.tif 000023
４９日目（４ｗｐ２）に抗体分析のために血清を収集した。データは、個々の動物および群あたり１０匹の個々のマウスの幾何平均力価として表されている。個々の動物が、＜
２５の力価（検出限界）を有していた場合、５の力価を割り当てた。
【０３５６】
【表１７】
0006025721.tif 000024
３５日目（２ｗｐ２）および４９日目（４ｗｐ２）に分析のために血清を収集した。データは、個々のマウスの６０％プラーク減少中和力価および群あたり１０匹の個々のマウスの幾何平均力価として表されている。個々の動物が、＜４０の力価（検出限界）を有していた場合、２０の力価を割り当てた。ＮＡ＝アッセイされていない。
【０３５７】
【表１８】
0006025721.tif 000025
正味の（抗原特異的）サイトカイン陽性頻度（％）±９５％半信頼区間（ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ  ｈａｌｆ−ｉｎｔｅｒｖａｌ）が示されている。太字で示される正味の頻度は、統計上有意に＞０である刺激応答を示す。
【０３５８】
【表１９】
0006025721.tif 000026
正味の（抗原特異的）サイトカイン陽性頻度（％）±９５％半信頼区間が示されている。太字で示される正味の頻度は、統計上有意に＞０である刺激応答を示す。
【０３５９】
表１４〜１９に示されるように、ＣＮＥ１７処方物は、裸のＲＮＡ対照に対して、Ｆ特異的ＩｇＧ力価の増大（５倍増大４ｗｐ２）によって決定される免疫原性、中和力価ならびにＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞応答を増強した。ＲＮＡのエレクトロポレーションは、裸のＲＮＡ対照に対して、免疫原性を増強したが、ＣＮＥ１７送達より低かった。重要なことに、ＣＮＥ１７群において誘発された免疫応答は、裸のＲＮＡのものと比較して変動が非常に少なかった。例えば、１μｇの裸の自己複製ＲＮＡ群から得た１４日目のサンプルは、５２９から５１１０の抗体力価をもたらしたが、ＣＮＥ１７を用いて処方されたＲＮＡサンプルは、１μｇの用量で、１９２７から５７３１の抗体力価をもたらした。さらに、ＣＮＥ１７群中のすべての動物は、堅調な応答で応答し、非常に良好にブーストされた。対照的に、裸のＲＮＡ群中の一部の動物は、顕著にはブーストされなかった。
【０３６０】
（実施例５）
ラットモデルにおけるＲＮＡ−粒子複合体の免疫原性
１．方法
ＲＳＶ−Ｆ三量体サブユニットワクチン
ＲＳＶ  Ｆ三量体は、融合ペプチド領域が欠失した（その他の三量体との会合を防ぐ）、ＲＳＶ  Ｆの外部ドメインを含む組換えタンパク質である。得られた構築物は、同種三量体を形成することがサイズ排除クロマトグラフィーによって観察され、融合後Ｆコンホメーションと一致する予測された表現型を有することが電子顕微鏡によって観察された。タンパク質は、昆虫細胞において発現され、構築物のＣ末端と融合したＨＩＳタグ、さらに、従来の技術を使用するサイズ排除クロマトグラフィーによって精製された。得られたタンパク質サンプルは、９５％超の純度を示す。Ｆ−サブユニットワクチンのｉｎ  ｖｉｖｏ評価のために、１００μｇ／ｍＬ三量体タンパク質を、１０ｍＭヒスチジンバッファー、ｐＨ６．３を使用して２ｍｇ／ｍＬアラム（ａｌｕｍ）上に吸着させ、塩化ナトリウムを用いて等張へ調整した（１５０ｍＭに）。Ｆ−サブユニットタンパク質を、２〜８℃で穏やかに撹拌しながらアラム上に一晩吸着させた。
【０３６１】
コットンラットのワクチン接種およびチャレンジ
雌性のコットンラット（Ｓｉｇｍｏｄｏｎ  ｈｉｓｐｉｄｉｓ）は、Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。すべての研究は、Ｎｏｖａｒｔｉｓの動物の管理および使用に関する委員会（Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓ
ｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認され、これに従って実施した。０日目および２１日目に、示されたワクチンを用いて、動物の群を、筋肉内で免疫化した（ｉ．ｍ．、１００μｌ）。第１の免疫化の３週間後および第２の免疫化の２週間後に血清サンプルを採取した。免疫化された動物またはワクチン接種されていない対照動物に、最終免疫化の４週間後に、１×１０５ＰＦＵ  ＲＳＶを用いて鼻腔内（ｉ．ｎ．）チャレンジを行った。精密気化器（ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ｖａｐｏｒｉｚｅｒ）を使用し、３％イソフルランを用いる採血および麻酔下でのＲＳＶチャレンジを実施した。
【０３６２】
ＲＳＶ  Ｆ特異的ＥＬＩＳＡ
個々の血清サンプルを、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）によってＲＳＶ  Ｆ特異的ＩｇＧの存在についてアッセイした。ＥＬＩＳＡプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ  ９６ウェル、Ｎｕｎｃ）を、ＰＢＳ中、１μｇ／ｍｌの精製ＲＳＶ  Ｆ（ｄｅｌｐ２３−ｆｕｒｄｅｌ−ｔｒｕｎｃ非切断型）を用いて４℃で一晩コーティングした。洗浄（０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）後、プレートを、ＰＢＳ中のＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋブロッキングバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、３７℃で少なくとも１．５時間ブロッキングした。次いで、プレートを洗浄し、実験または対照コットンラットから得た、アッセイ希釈剤（０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０および５％ヤギ血清を含むＰＢＳ）での血清の段階希釈物を添加し、プレートを３７℃で２時間インキュベートした。洗浄後、プレートを、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ニワトリ抗コットンラットＩｇＧ（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｎｓｕｌｔａｎｔｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｉｎｃ、アッセイ希釈剤で１：５，０００希釈）とともに３７℃で１時間インキュベートした。最後に、プレートを洗浄し、各ウェルに１００μｌのＴＭＢペルオキシダーゼ基質溶液（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ）を添加した。１００μｌの１Ｍ  Ｈ３ＰＯ４を添加することによって反応を停止させ、プレートリーダーを使用して４５０ｎｍで吸光度を読み取った。各血清サンプルについて、光学濃度（ＯＤ）  対  血清希釈の逆数の対数のプロットを、非線形回帰（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）によって作成した。力価は、およそ０．５のＯＤでの血清希釈の逆数として定義した（各プレートに含まれていた、１：２５００の定義された力価を有する、ＲＳＶ感染したコットンラットから得たプールされた標準の血清に正規化された）。
【０３６３】
マイクロ中和アッセイ
血清サンプルを、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）によって中和抗体の存在について試験した。ＨＩ−血清の２倍段階希釈物（５％  ＨＩ−ＦＢＳを含むＰＢＳ中）を、以前に力価測定された等容積のＲＳＶ  Ｌｏｎｇに添加した（およそ１１５ＰＦＵ／２５μｌを生じる）。血清／ウイルス混合物を３７℃および５％ＣＯ２で２時間インキュベートして、ウイルス中和が生じるのを可能にし、次いで、２５μｌのこの混合物（およそ１１５ＰＦＵを含有する）を９６ウェルプレート中のＨＥｐ−２細胞の２連のウェルに接種した。３７℃および５％ＣＯ２で２時間後、細胞を０．７５％メチルセルロース／ＥＭＥＭ５％ＨＩ−ＦＢＳで覆い、４２時間インキュベートした。免疫染色とそれに続く自動計数によるシンシチウム形成の検出によって感染性ウイルス粒子の数を決定した。中和力価は、対照（血清なし）に対して、ウェルあたりのシンシチウム（ｓｙｎｃｔｉａ）の数の少なくとも６０％の減少を生じる、血清希釈の逆数として定義される。
【０３６４】
ウイルス量
肺中のウイルス量は、プラークアッセイによって決定した。具体的には、ＲＳＶ感染の５日後に肺を摘出し、１つの右葉を、２．５ｍｌの２５％スクロースを含むダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に入れ、組織ホモジナイザーを用いて破壊した。これらのサンプルから得た細胞不含上清を、−８０℃で保存した。感染性ウイルスのアッセイのために、清澄化した肺ホモジネートの希釈物（５％熱不活化ウシ
胎仔血清を含むＰＢＳ、ＨＩ−ＦＢＳ中）を、２００μｌ／ウェル（１２ウェルプレート）の容積で集密なＨＥｐ−２細胞単層上に接種した。周期的に穏やかに振盪し（３７℃、５％  ＣＯ２）、２時間後、接種材料を除去し、細胞を、１．５ｍｌの、５％  ＨＩ−ＦＢＳ、グルタミンおよび抗生物質が補充されたイーグルの最小必須培地（ＥＭＥＭ、Ｌｏｎｚａ）中の１．２５％のＳｅａＰｌａｑｕｅアガロース（Ｌｏｎｚａ）で覆った。３〜４日間インキュベートした後、細胞を、１ｍｌの、０．１％ニュートラルレッド（Ｓｉｇｍａ）を含有するＥＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）中の１．２５％のアガロースで再度覆った。プラークは、１日後にライトボックスを用いて計数する。
【０３６５】
コットンラットの肺の病理
ＲＳＶチャレンジの５日後、肺を摘出し、各動物から得た４葉を集め、穏やかな気管内注入とそれに続く浸漬固定によって、１０％中性緩衝化ホルマリン（ＮＢＦ）を用いて固定化した。組織を慣例的に処理して、顕微鏡検査のためのヘマトキシリン＆エオシン染色切片を調製した。以下のパラメータ：細気管支周囲炎、肺胞炎、気管支炎、血管周囲細胞性浸潤および間質性肺炎についてのこれまでに公開された基準［Ｐｒｉｎｃｅ  ＧＡら、２００１年］の改変を使用して、所見を評価した。病変は４点の半定量的スケールで類別した。最小（＋）変化は、１つまたは２、３個の小さい病巣を含有していた；軽度（＋＋）変化は、小〜中程度のサイズの病巣からなっていた；中程度（＋＋＋）変化は、高頻度の、および／または中程度のサイズの病巣を含有していた；著しい（＋＋＋＋）変化は、組織のほとんど／すべてに影響を及ぼす広範な病巣から集密的な病巣を示した。
【０３６６】
２．コットンラットＲＳＶチャレンジ研究
この研究には、ＲＳＶの表面融合糖タンパク質（ＲＳＶ−Ｆ）を発現するＡ３１７レプリコンを使用した。コットンラット（Ｓｉｇｍｏｄｏｎ  ｈｉｓｐｉｄｕｓ）、群あたり８匹の動物に、裸の自己複製ＲＮＡ（Ａ３１７、１μｇまたは１０μｇ）、ＣＮＥ１７を用いて処方された自己複製ＲＮＡ（Ａ３１７、０．１μｇまたは１μｇ）、ＲＳＶ−Ｆを発現するＶＲＰ（５×１０６ＩＵ）、Ｆ三量体／アラムサブユニット（１０μｇ）またはホルマリン不活化ＲＳＶワクチン（５２００ＦＩ−ｐｆｕ）を用いて０日目および２１日目に両側筋肉内ワクチン接種（下肢あたり５０μＬ）を行った。１４日目（２ｗｐ１）および３５日目（２ｗｐ２）に抗体分析のために血清を採取した。すべての動物を、４９日目に１×１０５ｐｆｕのＲＳＶを用いて鼻腔内でチャレンジし、ウイルス量および肺の病理の決定のために５４日目（５ｄｐｃ）に肺を採取した。
【０３６７】
１４日目および３５日目のＦ特異的血清ＩｇＧ力価が、表２０に示されており；２ｗｐ２での選択された群に由来する８匹の動物の個々の抗体力価が、表２１に示されており；１４日目および３５日目のＲＳＶ血清中和力価が、表２２に示されており；ＲＳＶチャレンジの５日後の肺のウイルス力価が、表２３に示されており；ＲＳＶチャレンジの５日後の肺の肺胞炎スコアが、表２４に示されている。
【０３６８】
【表２０】
0006025721.tif 000027
群あたり８匹の動物、０日目および２１日目の筋肉内ワクチン接種後。１４日目（２ｗｐ１）および３５日目（２ｗｐ２）に抗体分析のために血清を採取し、すべての動物を、４９日目に１×１０５ｐｆｕのＲＳＶを用いて鼻腔内でチャレンジした。ウイルス量および肺の病理の決定のために５４日目（５ｄｐｃ）に肺を採取した。データは、群あたり８匹の個々のコットンラットの幾何平均力価として表されている。個々の動物が、＜２５の力価（検出限界）を有していた場合には、５の力価を割り当てた。
【０３６９】
【表２１】
0006025721.tif 000028
選択された群に由来する８匹の動物の個々の抗体力価（裸のＲＮＡおよびＣＮＥ処方されたＲＮＡ）。
【０３７０】
【表２２】
0006025721.tif 000029
群あたり８匹の動物、０日目および２１日目の筋肉内ワクチン接種後。１４日目（２ｗｐ１）および３５日目（２ｗｐ２）に分析のために血清を採取した。データは、６０％プラーク減少中和力価として表されている。群あたり４匹のコットンラットの２つのプールの幾何平均力価。個々の動物が、＜２５の力価（検出限界）を有していた場合には、５の力価を割り当てた。
【０３７１】
【表２３】
0006025721.tif 000030
群あたり８匹の動物、０日目および２１日目の筋肉内ワクチン接種後。１４日目（２ｗｐ１）および３５日目（２ｗｐ２）に分析のために血清を採取した。データは、６０％プラーク減少中和力価として表されている。群あたり４匹のコットンラットの２つのプールの幾何平均力価。個々の動物が、＜２５の力価（検出限界）を有していた場合には、５の力価を割り当てた。
【０３７２】
【表２４】
0006025721.tif 000031
群あたり８匹の動物、０日目および２１日目の筋肉内ワクチン接種後。すべての動物を、４９日目に１×１０５ｐｆｕのＲＳＶを用いて鼻腔内でチャレンジした。ウイルス量および肺の病理の決定のために５４日目（５ｄｐｃ）に肺を採取した。病変は、４点の半定量的スケールで類別した。最小（１）変化は、１つまたは２、３個の小さい病巣を含有していた；軽度（２）変化は、小〜中程度のサイズの病巣からなっていた；中程度（３）変化は、高頻度の、および／または中程度のサイズの病巣を含有していた；著しい（４）変化は、組織のほとんど／すべてに影響を及ぼす広範な病巣から集密的な病巣を示した。
【０３７３】
この研究は、コットンラットＲＳＶモデルにおけるレプリコンＲＮＡの免疫原性および保護能力を示す。処方されていないレプリコンＲＮＡは、１回のワクチン接種後、血清Ｆ特異的ＩｇＧおよびＲＳＶ中和抗体を誘導し、これらの応答は、２回目のワクチン接種によってブーストされた。ＣＮＥは、このモデルにおいて効果的であり、２回目のワクチン接種後に、１μｇのレプリコンＲＮＡへのＦ特異的ＩｇＧ力価をおよそ９倍に、中和力価を４倍にブーストした。さらに、ＣＮＥ１７は、用量（０．１または１μｇ）にかかわらず、裸のＲＮＡが使用された場合に観察された免疫応答の相当な変動を低減し、すべての動物は、ワクチン接種に応答した。すべてのレプリコンＲＮＡワクチンは、鼻へのＲＳＶチャレンジからの保護を提供し、ＲＳＶチャレンジの５日後の肺のウイルス量を３桁を越えて低減させた。ＣＮＥを用いて処方された１μｇのレプリコンＲＮＡによって生じた免疫応答の大きさおよび保護能力は、５×１０６ＶＲＰによって誘発される応答の２倍以内であった。
【０３７４】
（実施例６）
免疫原性に対する粒子サイズの影響
この実施例は、粒子サイズが、ＣＮＥ／ＲＮＡ処方物の免疫原性に影響を及ぼすことを示す。
【０３７５】
粒子サイズアッセイおよびｉｎ  ｖｉｖｏ  ＳＥＡＰアッセイのプロトコールは、実施例２に記載されている。マウス免疫原性研究のプロトコールは、実施例３に記載されている。図８Ａは、ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＳＥＡＰアッセイの結果（算術平均）を示す。図８Ｂは
、２ｗｐ１および２ｗｐ２の時点でのＢＡＬＢ／ｃマウスにおける個々の動物の全ＩｇＧ力価を示す。
【０３７６】
ＣＮＥ１７とＲＮＡの複合体形成は、約２２０ｎｍから約３００ｎｍへ粒子サイズを増大させた（示されていないデータ）。図８Ａおよび８Ｂに示されるように、粒子サイズが増大するにつれ、ＳＥＡＰの発現レベルは低下し、宿主免疫応答も減少した。
【０３７７】
（実施例７）
免疫原性に対する代替カチオン性脂質の影響の評価
１．材料および方法
ＣＮＥの調製
以下のカチオン性脂質：ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＥＰＣ、ＤＳＴＡＰ、ＤＯＤＡＣおよびＤＯＤＡＰを使用して一連のエマルジョンを作製した。表２５には、エマルジョンの成分が記載されている。
【０３７８】
ＣＮＥは、実施例１に記載したプロトコールに従って調製した。ＲＮＡ／ＣＮＥ複合体は、実施例２に記載したプロトコールに従って調製した。
【０３７９】
【表２５】
0006025721.tif 000032
マウス免疫原性研究
エマルジョンを１０：１  Ｎ／Ｐ、１２：１  Ｎ／Ｐまたは１８：１  Ｎ／Ｐ比で試験した（表２６参照のこと）。そこで、ＲＮＡレプリコンおよびエマルジョンを、実施例２に先に記載したように複合体形成させた。ＢＡＬＢ／ｃマウス、群あたり５〜１０匹の動物に、裸の自己複製ＲＮＡ（Ａ３１７、１μｇ）、ＲＶ０１（１５）（４０％  ＤｌｉｎＤＭＡ、１０％  ＤＳＰＣ、４８％  Ｃｈｏｌ、２％  ＰＥＧ  ＤＭＧ  ２０００を含有するリポソーム中に処方された１μｇのＡ３１７）、ＣＮＥ１３、ＣＮＥ１７、ＣＭＦ３７、ＣＭＦ３８またはＣＭＦ４２を用いて処方された自己複製ＲＮＡ（Ａ３１７、１μｇ）を用いて０日目に両側筋肉内ワクチン接種（下肢あたり５０μＬ）を行った。
【０３８０】
２．ＣＮＥ処方されたＲＮＡは、マウスモデルにおいてＲＳＶ−Ｆ抗原の免疫原性を増強した
１４日目および３５日目にＢＡＬＢ／ｃマウスの群から得た全血清ＩｇＧ力価（幾何平均力価）が表２６に示されている（群１〜８）。ＣＭＦ３７（ＤＯＴＭＡ）を用いて処方されたＲＮＡは、宿主免疫応答を良好に増強し、ＩｇＧ力価は、ＣＮＥ１７（ＤＯＴＡＰ）のものと同等であった。ＣＭＦ３８（ＤＯＥＰＣ）を用いて処方されたＲＮＡは、ＣＮ
Ｅ１７のものよりもわずかに高いＩｇＧ力価を誘発したが、増強は、統計上有意ではなかった。ＤＳＴＡＰを用いて処方されたＲＮＡは、宿主免疫応答を有意に増強せず、この低いＩｇＧ力価は、スクアレンにおけるＤＳＴＡＰの低い溶解度による可能性が高い。ＣＮＥ１３を用いて処方されたＲＮＡは、ＩｇＧ力価を、リポソーム（ＤＤＡ）を用いて処方されたＲＮＡのものよりも、約１．５倍高く増強した。ＣＭＦ４３（ＤＯＤＡＣ）を用いて処方されたＲＮＡによって誘導された全抗体力価は、ＣＮＥ１７のものよりも低かった（表２８、群７および８）。
【０３８１】
【表２６】
0006025721.tif 000033
群１〜８は、５匹の動物／群を有しており、群９〜１２は、１０匹の動物／群を有していた。
【０３８２】
（実施例８）
免疫原性に対するバッファー組成の影響の評価
この実施例では、ＣＮＥ１７をベースとするが、異なるバッファー成分を含む種々のエマルジョンを調製した。表２７は、バッファーが改変されたエマルジョンの組成を示す。
【０３８３】
【表２７】
0006025721.tif 000034
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイは、クエン酸バッファーの濃度の低減が、ＲＮＡをより緊密に結合させたことを示した（示されていないデータ）。
【０３８４】
マウス免疫原性研究から得られた結果は、ＣＮＥ１７に糖を添加することは、ＣＮＥ１７を用いて処方されたＲＮＡの免疫原性に大きく影響を与えなかったことを示した（表２６、群９〜１２）。ソルビトールおよびデキストロースの添加でＩｇＧ力価のわずかな増大が観察された。
【０３８５】
表２８には、ＣＮＥ１７を用いて処方されたＲＮＡが種々のバッファー系を使用して調製された場合の、マウス免疫原性研究の結果が要約されている。
【０３８６】
【表２８】
0006025721.tif 000035
＊ｖＡ３７５レプリコン、＊＊ｖＡ３１７レプリコン。レプリコンは、ＨＥＰＥＳバッファー中で転写されたＡｍｂｉｏｎであり、  （ｉ）ＬｉＣｌ沈殿され、（ｉｉ）トリスバッファー中でキャッピングされ、（ｉｉｉ）ＬｉＣｌ沈殿された。すべての群は、８匹の動物／群を有していた。
【０３８７】
種々のバッファー組成も粒子サイズに影響を及ぼした。図９に示されたように、糖（スクロース）の添加は、ＲＮＡ／ＣＮＥ複合体（図９Ａ）の粒子サイズを減少させ、低濃度の（１０ｍＭの）ＮａＣｌの添加もＲＮＡ／ＣＮＥ複合体の粒子サイズを減少させた（図９Ａ）。クエン酸バッファーは、ＲＮＡ／ＣＮＥ複合体の粒子サイズに影響を及ぼさなかった（図９Ｂ）。
【０３８８】
粒子サイズに対するポリマーの影響が、図９Ｃに示されている。特に、ＲＮＡバッファーへの０．５％  ｐｌｅｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７の添加は、ＲＮＡ／ＣＮＥ複合体の粒子サイズを複合体形成前のサイズ（ＲＮＡを含まないＣＮＥ粒子）に減少させた。
【０３８９】
好ましいバッファー系、２８０ｍＭスクロース、１０ｍＭ  ＮａＣｌおよび１ｍＭクエン酸塩；または２８０ｍＭスクロース、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭクエン酸塩および０．５％（ｗ／ｖ）Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７におけるＣＮＥ１７の全抗体力価および中和抗体力価が、表２８に示されている（群４および５）。
【０３９０】
（実施例９）
免疫原性に対するＰＥＧ脂質の影響の評価
この実施例では、ＰＥＧ脂質を使用して一連のエマルジョンを製造した。表２９には、これらのＰＥＧ脂質をベースとするエマルジョンの組成が示されている。
【０３９１】
【表２９】
0006025721.tif 000036
すべてのエマルジョンについて、ＤＣＭ中、１０ｍｇ／ｍＬ  ＤＯＴＡＰのストック溶液を使用し、第１の均質化の後に溶媒を蒸発させた。マウス免疫原性研究は、実施例７において上に記載されるように実施した。
【０３９２】
表３０は、２ｗｐ１および４ｗｐ２時点でプールされた抗体力価を示す。ＣＮＥ１３群について、個々の動物の力価の平均および幾何平均力価が示されている。表３０に示されるように、ＰＥＧ−脂質を用いて作製されたエマルジョンは、ＲＳＶ−Ｆ抗原に対する免疫応答の誘導において効果的であったが、全抗体力価は、ＣＮＥ１７を用いて処方されたＲＮＡと比較して低レベルであった。さらに、ＰＥＧ脂質の濃度の増大は、抗体力価の低減をもたらした。
【０３９３】
【表３０】
0006025721.tif 000037
＊  ｖＡ３１７レプリコン、群１〜１０は、５匹の動物／群を有し、群１１は、１０匹の動物／群を有していた。
【０３９４】
本明細書は、本明細書内に引用される参考文献の教示を踏まえると、最も完全に理解される。本明細書内の実施形態は、本発明の実施形態の例示を提供するものであって、本発明の範囲を制限すると解釈されてはならない。当業者ならば、多数のその他の実施形態が、本発明によって包含されることは容易に認識しよう。本開示内容中に引用されるすべての刊行物および特許は、参照によりその全文が組み込まれる。参照によって組み込まれる材料が、この明細書と相反するかまたは矛盾する範囲においては、本明細書が任意のこのような材料に優先する。本明細書における任意の参考文献の引用は、このような参考文献が本発明の先行技術であると認めることではない。
【０３９５】
当業者ならば、本明細書に記載された本発明の特定の実施形態の多数の等価物を認識するだろうし、慣例的な実験程度を使用して確認できる。このような等価物は、以下の実施形態によって包含されるものとする。
【図１】
0006025721.tif 000038
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
0006025721.tif 000042
【図６】
0006025721.tif 000043
【図７−１】
0006025721.tif 000044
【図７−２】
0006025721.tif 000045
【図７−３】
0006025721.tif 000046
【図７−４】
0006025721.tif 000047
【図７−５】
0006025721.tif 000048
【図７−６】
0006025721.tif 000049
【図７−７】
0006025721.tif 000050
【図７−８】
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【図７−９】
0006025721.tif 000052
【図７−１０】
0006025721.tif 000053
【図７−１１】
0006025721.tif 000054
【図７−１２】
0006025721.tif 000055
【図７−１３】
0006025721.tif 000056
【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
0006025721.tif 000059
【図９Ｂ】
0006025721.tif 000060
【図９Ｃ】
0006025721.tif 000061
【配列表】
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