(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ細胞ワクチンを調製する方法であって、該方法は：
（ａ）患者から単離したＴ細胞を含むサンプルを提供する工程；
（ｂ）該サンプルの複数の部分に、各々が異なるペプチドを含むペプチド混合物を添加する工程であって、ここで、ペプチド混合物中の異なるペプチドの各々が８〜２０個のアミノ酸であり、該ペプチド混合物中の別の異なるペプチドに対して４〜１９個のアミノ酸の重複する配列を含み、ここで、該ペプチド混合物中の該異なるペプチドの重複する配列は、ペプチド抗原の配列の一部に広がる、工程；
（ｃ）活性化した自己反応性Ｔ細胞を含む該サンプルの一部を同定する工程であって、ここで、工程（ｃ）で同定された、対照と比較して１．３を超えた刺激指数を有する自己反応性細胞を活性化するペプチド混合物は、患者特異的ペプチド混合物であり、ここで、該対照は、該ポリペプチド抗原またはその一部の非存在下でインキュベートされたＴ細胞を含む、工程；
（ｄ）該患者から単離したＴ細胞を含むサンプルをさらに提供する工程；
（ｅ）工程（ａ）〜（ｃ）において同定された該患者特異的ペプチド混合物と該Ｔ細胞とを接触させ、それによって自己反応性Ｔ細胞が活性化される工程；
（ｆ）活性化された自己反応性Ｔ細胞を増殖させる工程；および
（ｇ）該自己反応性Ｔ細胞を弱毒化する工程；
を含み、ここで、該Ｔ細胞ワクチンは、患者において自己免疫疾患を治療するために使用されることを特徴とする、方法。
【請求項２】
Ｔ細胞ワクチンを調製する方法であって、該方法は：
（ａ）患者からのＴ細胞を含むサンプルを提供する工程；
（ｂ）患者特異的ペプチド混合物と該Ｔ細胞とを接触させ、それによって自己反応性Ｔ細胞が活性化される工程；
（ｃ）活性化された自己反応性Ｔ細胞を増殖させる工程；および
（ｄ）該自己反応性Ｔ細胞を弱毒化する工程；
を含む方法であって、
ここで、該患者特異的ペプチド混合物の各ペプチドは、ポリペプチド抗原の一部のアミノ酸配列からなり、
ここで、ペプチド混合物中の異なるペプチドの各々が８〜２０個のアミノ酸であり、該ペプチド混合物中の別のペプチドに対して４〜１９個のアミノ酸の重複する配列を含み、
ここで、該患者特異的ペプチド混合物は、対照と比較して１．３を超えた刺激指数を有する自己反応性Ｔ細胞を刺激することが可能であるペプチド混合物を含み、ここで、該対照は、該ポリペプチド抗原またはその一部の非存在下でインキュベートされたＴ細胞を含み、ここで、該Ｔ細胞ワクチンは、患者において自己免疫疾患を治療するために使用されることを特徴とする、方法。
【請求項３】
前記ポリペプチド抗原がＭＢＰ、ＰＬＰ、ＭＯＧまたはその組み合わせである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記異なるペプチドが１２〜１６個のアミノ酸であり、そして、８〜１２個のアミノ酸の重複する配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ペプチドの重複する配列が、前記ポリペプチド抗原の完全な配列に広がる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｔ細胞が、照射または化学的不活性化によって弱毒化される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記異なるペプチドが、配列番号３〜８、１１〜２０、２３〜３４、３７〜４６、５１〜５２、５５〜５６、６５〜７０、７７〜８２、８７〜８８、９１〜１００、１０７〜１２５、１３２〜１３５、１３８〜１４３、１４８〜１５９、および、１６２〜１６３から選択される配列を有するペプチドからなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｔ細胞ワクチンおよびこれらワクチンの調製方法に関する。Ｔ細胞ワクチンは、例えば多発性硬化症などの自己免疫疾患の処置に使用し得る。
【背景技術】
【０００２】
多発性硬化症（ＭＳ：Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）は、中枢神経系（ＣＮＳ：Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ）のミエリンの破壊を特徴とする炎症性疾患である。この疾患の病因は、例えばミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ：Ｍｙｅｌｉｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ミエリン乏突起神経膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ：Ｍｙｅｌｉｎ  Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ  Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）およびミエリンプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ：Ｐｒｏｔｅｏｌｉｐｉｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）など、ミエリン抗原に応答する自己免疫Ｔ細胞に関係するという証拠が増えている（非特許文献１）。ミエリン反応性Ｔ細胞の活性化とクローン増殖のあと、これらは血液脳関門を通ってＣＮＳへ侵入し、ミエリン膜を損傷する結果となる。ＭＢＰ−反応性Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏの活性化を起こし、ＭＳ患者の血液および脳脊髄液中に高頻度で前駆物質を生じることが判った（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。この疾患と戦うための最近の方略は、Ｔ細胞ワクチン接種と称される手段によって活性化ミエリン−反応性Ｔ細胞の数を減少させることに焦点を合わせた。化学的処置または放射線照射によって不活性化したＭＢＰ−反応性Ｔ細胞による繰り返し接種は、ＭＳの動物モデルで、実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ：Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）を予防または治療すると証明された（非特許文献５）。
【０００３】
Ｔ細胞ワクチン接種は、ＭＳ患者における臨床試験に進んでいる。予備的臨床試験において、放射線照射したＭＢＰ−反応性Ｔ細胞による３回の皮下接種は、多くの被験体に検出不能なレベルまで循環ＭＢＰ−反応性Ｔ細胞数を減らすＴ細胞応答を誘発した（非特許文献６、非特許文献７）。その結果として、ワクチンを投与された患者では、再発率およびＭＲＩ病変活性の減少からもわかるように臨床改善が見られた。この予備的臨床試験では、安全プロフィールおよび技術的な実現可能性が優れていた。患者は、主観的な身体的および心理学的パラメータならびに患者の身体障害の客観的な尺度であるＫｕｒｔｚｋｅ総合障害度評価尺度（ＥＤＳＳ：Ｅｘｐａｎｄｅｄ  Ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ  Ｓｔａｔｕｓ  Ｓｃａｌｅ）において改善が見られた。
【０００４】
初期のＴ細胞ワクチン接種方略は、自己反応性エピトープを同定するために全長ＭＢＰを使用した。この方法を用いて産生した不活性化した自己反応性Ｔ細胞によるワクチン接種は、当初、ＭＳの処置に十分であると信じられていた。しかしながら、その後の研究で、ワクチン接種をしてからある期間を経過すると、ミエリン抗原−反応性Ｔ細胞が再出現したことが明らかにされた。（Ｚｈａｎｇら）。これらのミエリン抗原−反応性Ｔ細胞は頻繁に、エピトープシフトと称される過程で、最初に同定されたものとは異なる反応特性を提示した。再出現したＴ細胞によって認識されたエピトープはしばしば、全長ポリペプチドの免疫系に接近できない隠れたエピトープであり、および免疫優性での変異を意味するものであった。
【０００５】
その後のＴ細胞ワクチン接種方略では、任意のＭＳ患者の自己反応性Ｔ細胞を同定するために、免疫優性ミエリン抗原エピトープを使用し続けている。Ｔ細胞応答を促すＴ細胞受容体（ＴＣＲ：Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）−主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ：Ｍａｊｏｒ  Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｃｏｍｐｌｅｘ）クラスＩＩおよび／またはクラスＩ−ペプチド相互作用の構造上の特色は、顕著なエピトープに対応するものとした。免疫優性のための分子基盤がＭＨＣに対するペプチド親和性に関係する一方で、Ｔ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ：Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  Ｃｅｌｌｓ）であるＭＨＣと会合した抗原断片複合体を認識する。特定の抗原に対し活性化閾（例えば、刺激指数）に達して応答する抗原特異的Ｔ細胞の相対数（または頻度）が高い方を免疫優性とする。個体間または個体内免疫優性のどちらであるかを決定する要因は、未だ十分解明されていないが、免疫優性は、テストされた被験体間で一番高頻度に検出可能である応答、または一個人内で最も強い応答のいずれかを記述する際に可変的に用いられる。
【０００６】
免疫優性は、抗原に対するＴ細胞応答の中心的な特色である。抗原複合体の中には多くのペプチドが存在するが、ペプチドに対する応答を、Ｔ細胞と応答する数および／または活性に基づいて、比較的安定した序列に順序づけることができる。免疫優性は、免疫応答の解明およびワクチン創薬に対して重要であるにもかかわらず、その機序レベルでは十分解明されていない。免疫優性は、以下の各パラメータがこの現象に寄与するとはいえ、抗原提示細胞（ＡＰＣｓ：Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  Ｃｅｌｌｓ）によって発生するペプチド複合体の数、クラスＩまたはクラスＩＩ分子に対するペプチドの親和性、ペプチドクラスＩまたはクラスＩＩ複合体に対するＴ細胞受容体の親和性で容易に説明されるものではない。
ミエリン抗原に応答するＴ細胞がエピトープ認識の際、各個人間でばらつきがあるものの、例えばＭＢＰの８３〜９９および１５１〜１７０残基などのミエリン抗原の特定領域が、一部のＭＳ患者において優先的に認められているとの認識（非特許文献８）に基づき、Ｔ細胞ワクチンの産生において免疫優性エピトープが使用された患者には、免疫優性ペプチドに反応する自己Ｔ細胞を患者から単離し、それを増やして不活性化したものを注射した。この方略は疾患進行率の減少につながったが、患者の疾病経過は進行し続けている。故に、改善されたＴ細胞ワクチンが必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｓｔｉｎｉｓｓｅｎら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７；１７：３３〜７５
【非特許文献２】Ｚｈａｎｇら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９４；１７９：９７３〜９８４
【非特許文献３】Ｃｈｏｕら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９２；３８：１０５〜１１４
【非特許文献４】Ａｌｌｅｇｒｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９０；２４７：７１８〜７２１
【非特許文献５】Ｂｅｎ−Ｎｕｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９８１；１１：１９５〜２０４
【非特許文献６】Ｚｈａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９３；２６１：１４５１−１４５４
【非特許文献７】Ｍｅｄｅａｒら、Ｌａｎｃｅｔ  １９９５；３４６：８０７−８０８
【非特許文献８】Ｏｔａら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９０；３４６：１８３〜１８７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
自己反応性Ｔ細胞のためのポリペプチド抗原中のエピトープを同定する方法を提供する。宿主から単離したＴ細胞を含むサンプルも提供され得る。一個以上の異なるペプチドは、複数のサンプルの一部に加えられ得る。ペプチドの配列は、ポリペプチド抗原の配列の一部に集合的に含まれ得る。活性化した自己反応性Ｔ細胞を含む一部のサンプルは同定され得る。自己反応性Ｔ細胞を活性化するペプチドは、エピトープを含み得る。
【０００９】
ペプチドの配列は、ポリペプチド抗原の完全な配列に集合的に含まれ得る。ポリペプチド抗原は、ＭＢＰ、ＰＬＰ、ＭＯＧまたはその組合せであり得る。異なるペプチドは、重複する８〜１２個または４〜１９個のアミノ酸の配列を含み得る。異なるペプチドは、約１２〜１６個または８〜２０個のアミノ酸を含み得る。刺激された自己反応性Ｔ細胞の数は、対照と比較して少なくともおよそ２〜４の因数によって増量され得る。
【００１０】
Ｔ細胞ワクチンを調製する方法も提供する。患者から単離したＴ細胞を含むサンプルが提供され得る。Ｔ細胞は、自己反応性Ｔ細胞を活性化させ得るある一個以上の異なるペプチドと接触する可能性があり得る。活性化された自己反応性Ｔ細胞は増大し得る。自己反応性Ｔ細胞は、それから弱毒化し得る。異なるペプチドは、所定値を超す刺激指数で自己反応性Ｔ細胞を刺激することができる抗原性ポリペプチドのすべてのエピトープを含み得る。抗原性ポリペプチドは、ＭＢＰ、ＰＬＰ、ＭＯＧまたはその組み合わせであり得る。
【００１１】
Ｔ細胞媒介疾患のエピトープシフトを見つける方法をまた提供し、先に述べたように、自己反応性抗原のエピトープは同定され得る。エピトープは、対照と比較され得る。エピトープが異なるならば、エピトープシフトが生じ得る。エピトープシフトを見つけることは、被験体のエピトープシフトを診断するのに用いられ得る。エピトープシフトを見つけることはまた、前回のエピトープをエピトープと比較することによって被験体のエピトープの変異を観察するために使用され得る。
Ｔ細胞ワクチンも、提供する。本ワクチンは、抗原性ポリペプチドに対して特異的であるＴ細胞を含み得る。本ワクチンは、所定値を超す刺激指数で産生することが可能な抗原性ポリペプチドのエピトープそれぞれを認識できるＴ細胞を含み得る。抗原性ポリペプチドは、ＭＢＰ、ＰＬＰ、ＭＯＧまたはその組み合わせであり得る。ワクチンは、所定値未満の刺激指数で産生することが可能な抗原性ポリペプチドのエピトープを認識する５０％未満のＴ細胞を含み得る。Ｔ細胞は、これに限定されるものではないが、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＴＣＲαβ、ＴＣＲγδ、ＨＳＰ６０（熱ショックタンパク６０）またはその組合せを包含する細胞マーカーを含み得る。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
自己反応性Ｔ細胞に対するポリペプチド抗原中のエピトープを同定する方法であって：
（ａ）宿主から単離したＴ細胞を含むサンプルを提供する工程；
（ｂ）該サンプルの複数の部分に一種以上の異なるペプチドを添加する工程であって、該ペプチドの配列が、該ポリペプチド抗原の配列の一部を集合的に含む、工程；および
（ｃ）活性化した自己反応性Ｔ細胞を含む該サンプルの一部を同定する工程、
を含み、（ｃ）によって同定された自己反応性Ｔ細胞を活性化するペプチドが該エピトープを含む、方法。
（項目２）
前記ペプチドの配列が、前記ポリペプチド抗原の完全な配列を集合的に含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ポリペプチド抗原がＭＢＰ、ＰＬＰ、ＭＯＧまたはその組み合わせである、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記異なるペプチドが重複する８〜１２個または４〜１９個のアミノ酸の配列を含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記異なるペプチドが約１２〜１６個または８〜２０個のアミノ酸を含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
活性化した自己反応性Ｔ細胞を含む前記サンプルの刺激指数が所定値を超えている、項目１に記載の方法。
（項目７）
Ｔ細胞ワクチンを調製する方法であって、該方法は：
（ａ）患者から単離したＴ細胞を含むサンプルを提供する工程；
（ｂ）一種以上の異なるペプチドと該Ｔ細胞とを接触させ、それによって自己反応性Ｔ細胞が活性化される工程；
（ｃ）活性化された自己反応性Ｔ細胞を増殖させる工程；および
（ｄ）該自己反応性Ｔ細胞を弱毒化する工程；
を含み、該一種以上の異なるペプチドは、所定値を超えた刺激指数で自己反応性Ｔ細胞を刺激することができる抗原性ポリペプチドのエピトープすべてを含む、方法。
（項目８）
前記抗原性ポリペプチドが、ＭＢＰ、ＰＬＰ、ＭＯＧまたはその組み合わせである、項目７に記載の方法。
（項目９）
Ｔ細胞ワクチンを調製する方法であって、該方法は：
（ａ）患者から単離したＴ細胞を含むサンプルを提供する工程；
（ｂ）項目１に記載の方法で同定したエピトープを含む一種以上の異なるペプチドと該Ｔ細胞とを接触させ、それによって自己反応性Ｔ細胞が活性化される工程；
（ｃ）活性化された自己反応性Ｔ細胞を増殖させる工程；および
（ｄ）該自己反応性Ｔ細胞を弱毒化する工程；
を含み、該一種以上の異なるペプチドは、所定値を超えた刺激指数で自己反応性Ｔ細胞を刺激することができる抗原性ポリペプチドのエピトープすべてを含む、方法。
（項目１０）
Ｔ細胞介在疾患においてエピトープシフトを検出する方法であって、該方法は：
（ａ）項目１に記載の方法にしたがって自己反応性抗原のエピトープを同定する工程；および
（ｂ）対照におけるエピトープと（ａ）のエピトープとを比較する工程
を含み、該エピトープが異なるならば、エピトープシフトが生じている、方法。
（項目１１）
エピトープシフトを診断する方法であって、該方法は：
（ａ）項目１０に記載の方法にしたがってエピトープシフトを検出する工程、
を含み、エピトープシフトの検出がエピトープシフトの生じていることを示す、方法。
（項目１２）
エピトープシフトをモニタリングする方法であって、該方法は：
（ａ）項目１０に記載の方法にしたがってエピトープシフトを検出する工程；および
（ｂ）以前の時間と該エピトープとを比較する工程、
を含み、該エピトープが異なるならば、エピトープシフトが生じている、方法。
（項目１３）
抗原性ポリペプチドに対して特異的であるＴ細胞を含むＴ細胞ワクチンであって、所定値を超す刺激指数を生成することができる該抗原性ポリペプチドのエピトープそれぞれが、該ワクチンに存在する自己反応性Ｔ細胞によって認識される、Ｔ細胞ワクチン。
（項目１４）
前記抗原性ポリペプチドが、ＭＢＰ、ＰＬＰ、ＭＯＧまたはその組み合わせである、項目１３に記載のＴ細胞ワクチン。
（項目１５）
前記ワクチンに存在する前記自己反応性Ｔ細胞が、所定値未満の刺激指数を生成することのできる前記抗原性ポリペプチドの前記エピトープを認識するＴ細胞を５０％未満含む、項目１３に記載のＴ細胞ワクチン。
（項目１６）
前記ワクチンに存在する前記自己反応性Ｔ細胞が、以下：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＴＣＲαβ、ＴＣＲγδ、ＨＳＰ６０またはその組み合わせのうちの１つから選択した細胞マーカーに対し陽性である、項目１３に記載のＴ細胞ワクチン。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＭＯＧペプチド混合物に対する一人の患者のＴ細胞反応のＥＡＡ分析を示す。
【図２】被験体４８人由来のＴ細胞のうちでＭＢＰペプチド混合物に対する反応の頻度を示す。
【図３】被験体４８人由来のＴ細胞のうちでＰＬＰペプチド混合物に対する反応の頻度を示す。
【図４】被験体４８人由来のＴ細胞のうちでＭＯＧペプチド混合物に対する反応の頻度を示す。
【図５】患者の３種のＨＬＡ対立遺伝子のためのＭＯＧタンパク質内部のＰｒｏＰｒｅｄ結合予測を示す。黄色い残基がグルーブ内部でフィットするその他の残基を表す時、赤いアミノ酸残基は、ＨＬＡグルーブ内部で結合するための予測されたアンカー残基を表す。
【図６】ＭＢＰペプチド混合物に対する一人の患者のＴ細胞反応のＥＡＡ分析を示す。
【図７】ベースライン時および一人の患者のＴ細胞を使用してＭＢＰｍ１０ペプチドでの刺激の１８日後のＴＣＲ  Ｖベータ鎖発現の割合を示す。
【図８】ミエリンペプチド混合物に対する一人の患者のＴ細胞反応のＥＡＡ分析を示す。
【図９】図８に示されるように、ＥＡＡ分析によって２つのミエリンペプチドに対して強い反応を提示されたＴ細胞の成長を示す。
【図１０】ペプチド混合物ＰＬＰｍ２７で刺激している間、９日目から１６日目に成長した培養物として一人の患者のＴ細胞株に生じたＴＣＲ  Ｖベータ増殖巣を示す。
【図１１】３種のミエリン−反応性Ｔ細胞ワクチンシリーズの最初の再処置を受けた患者由来のミエリン−反応性Ｔ細胞発生頻度データの一部を示す。
【図１２】全長ＭＢＰを範囲とするペプチドに対する患者の２４週目のＴ細胞反応を示す。棒グラフの周りの囲みは、Ｔ細胞頻度分析（ＴＣＦＡ）で過去に使用された２種の免疫優性ＭＢＰ配列を含有するペプチドを指す。
【図１３】全長のＰＬＰを範囲とするペプチドに対する患者の２４週目のＴ細胞反応を示す。棒グラフの周りの囲みは、ＴＣＦＡで過去に使用された２種の免疫優性ＰＬＰ配列を含有するペプチドを指す。
【図１４】全長のＭＯＧを範囲とするペプチドに対する患者の２４週目のＴ細胞反応を示す。棒グラフの周りの囲みは、ＴＣＦＡで過去に使用された２種の免疫優性ＭＯＧ配列を含有するペプチドを指す。
【図１５】８人の患者のＭＢＰペプチド反応パターンを示す。水平な赤い線は、３のＳＩカットオフを示す。棒グラフの周りの囲みは、過去に使用された免疫優性ペプチドを指す。
【図１６】８人の患者のＰＬＰペプチド反応パターンを示す。水平な赤い線は、３のＳＩカットオフを示す。棒グラフの周りの囲みは、過去に使用された免疫優性ペプチドを指す。
【図１７】８人の患者のＭＯＧペプチド反応パターンを示す。水平な赤い線は、３のＳＩカットオフを示す。棒グラフの周りの囲みは、過去に使用された免疫優性ペプチドを指す。
【図１８】ＥＡＡを用いてテストした合計１５人のＭＳ患者由来のサンプルに対しＭＢＰに反した平均的ＳＩｓを示す。棒グラフの周りの囲みは、免疫優性ペプチドを指す。
【図１９】ＥＡＡを用いてテストした合計１５人のＭＳ患者由来のサンプルに対しＰＬＰに反した平均ＳＩｓを示す。棒グラフの周りの囲みは、免疫優性ペプチドを指す。
【図２０】ＥＡＡを用いてテストした合計１５人のＭＳ患者由来のサンプルに対しＭＯＧに反した平均ＳＩｓを示す。棒グラフの周りの囲みは、免疫優性ペプチドを指す。
【図２１】被験体５４人のうちでＭＢＰペプチドに対する反応の頻度を示す。被験体は、健常人（「Ｎｏｒｍ」）、採血のみ（「ＭＤ」）、繰り返しワクチン接種研究に登録された（「Ｅｘｔ」）、または用量漸増試験に登録された（「ＤＥＳ」）方である。棒グラフの周りの囲みは、実施例１のワクチン産生に使用された免疫優性ペプチドの位置を指す。
【図２２】被験体５４人のうちでＰＬＰペプチドに対する反応の頻度を示す。被験体は、健常人（「Ｎｏｒｍ」）、採血のみ（「ＭＤ」）、繰り返しワクチン接種研究に登録された（「Ｅｘｔ」）、または用量漸増試験に登録された（「ＤＥＳ」）方である。棒グラフの周りの囲みは、実施例１のワクチン産生に使用された免疫優性ペプチドの位置を指す。
【図２３】被験体５４人のうちでＭＢＰペプチドに対する反応の頻度を示す。被験体は、健常人（「Ｎｏｒｍ」）、採血のみ（「ＭＤ」）、繰り返しワクチン接種研究に登録された（「Ｅｘｔ」）、または用量漸増試験に登録された（「ＤＥＳ」）方である。棒グラフの周りの囲みは、実施例１のワクチン産生に使用された免疫優性ペプチドの位置を指す。
【図２４】２．０未満の刺激指数を提示した５種のミエリン−反応性Ｔ細胞の増殖曲線を示す。Ｔ細胞は、二人の患者から単離した。
【図２５Ａ】４２９アッセイ（横列が独特なアッセイおよび縦列がペプチド）のマップを示す。患者それぞれのためのアッセイは、実行された日付順にリストされている。陽性ペプチド混合物は、薄灰色で示される。
【図２５Ｂ】４２９アッセイ（横列が独特なアッセイおよび縦列がペプチド）のマップを示す。患者それぞれのためのアッセイは、実行された日付順にリストされている。陽性ペプチド混合物は、薄灰色で示される。
【図２５Ｃ】４２９アッセイ（横列が独特なアッセイおよび縦列がペプチド）のマップを示す。患者それぞれのためのアッセイは、実行された日付順にリストされている。陽性ペプチド混合物は、薄灰色で示される。
【図２５Ｄ】４２９アッセイ（横列が独特なアッセイおよび縦列がペプチド）のマップを示す。患者それぞれのためのアッセイは、実行された日付順にリストされている。陽性ペプチド混合物は、薄灰色で示される。
【図２５Ｅ】４２９アッセイ（横列が独特なアッセイおよび縦列がペプチド）のマップを示す。患者それぞれのためのアッセイは、実行された日付順にリストされている。陽性ペプチド混合物は、薄灰色で示される。
【図２５Ｆ】４２９アッセイ（横列が独特なアッセイおよび縦列がペプチド）のマップを示す。患者それぞれのためのアッセイは、実行された日付順にリストされている。陽性ペプチド混合物は、薄灰色で示される。
【図２５Ｇ】４２９アッセイ（横列が独特なアッセイおよび縦列がペプチド）のマップを示す。患者それぞれのためのアッセイは、実行された日付順にリストされている。陽性ペプチド混合物は、薄灰色で示される。
【図２５Ｈ】４２９アッセイ（横列が独特なアッセイおよび縦列がペプチド）のマップを示す。患者それぞれのためのアッセイは、実行された日付順にリストされている。陽性ペプチド混合物は、薄灰色で示される。
【図２６】６５アッセイ（横列が独特なアッセイおよび縦列がペプチド）のマップを示す。患者それぞれのためのアッセイは、実行された日付順にリストされている。陽性ペプチド混合物は、薄灰色で示される。
【図２７】４人の被験体における経時的なエピトープシフトを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
抗原性ポリペプチドのエピトープに対して特異的なＴ細胞を含むＴ細胞ワクチンを提供する。また、このようなエピトープを特定する方法およびこのようなワクチンを調製する方法を提供する。このワクチンは、個別のワクチンであり得る。その他の態様は、以下の記載によって当業者に明らかになるであろう。
【００１４】
１．定義
本願明細書において用いられる専門用語は、特定の実施形態を記載することだけを目的とし、限定的なものではない。本願明細書および添付の請求の範囲で使用される単数形、「一つの」および「前記」は、文脈にその他の明瞭な指図がない限り複数形を包含する。
【００１５】
「ペプチド」または「ポリペプチド」は、アミノ酸の連鎖配列を意味し得、天然もしくは合成または天然および合成アミノ酸の組み換えもしくは組み合わせであってよい。
【００１６】
疾患由来の動物保護に言及する時、「処置」または「処置する」は、疾患を予防すること、鎮静することまたは完全に除去することを意味する。疾患を予防することは、疾患の兆候が見える前に動物へ本発明の組成物を投与することを伴う。疾患を鎮静することは、疾患を発症した後、臨床所見がつく前に動物へ本発明の組成物を投与することを伴う。疾患を抑制することは、疾患の臨床所見がついた後に動物へ本発明の組成物を投与することを伴う。
【００１７】
ａ．実質的に同一
本願明細書において用いられる「実質的に同一」は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００個またはそれ以上のアミノ酸の領域にわたって、第１および第２配列が、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であることを意味し得る。
【００１８】
２．Ｔ細胞免疫応答
ミエリン−反応性Ｔ細胞（ＭＲＴＣ：Ｍｙｅｌｉｎ−Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｔ−Ｃｅｌｌ）に対する特異的免疫応答を引き起こすために、免疫系は、病因に伴う自己反応性Ｔ細胞を同定し、宿主防衛の取り組みに励む特定のタンパク質産物を単離できなければならない。このようなモデルの拮抗作用の裏側には、抗原−提示細胞の表面での免疫原性ペプチドエピトープおよびその提示のプロセシングがある。これらの作用の結果、免疫応答に関わるその他の分子を寄り集めて拘束するＴ細胞応答が誘発される。この免疫系の中核を成すのは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）である。ヒト染色体６上にあるＭＨＣは、自己／非自己識別および抗原プロセシングおよび提示に不可欠である分子をコードする高度に多型性のある一連の遺伝子である。この多重遺伝子複合体の能力はその多型性にあり、異なる対立遺伝子クラスＩおよびクラスＩＩ産物が無限に近い一連のペプチドと結合することが可能となる。ＭＨＣの性質からは、自己−ＭＨＣ拘束の現在の基本概念が示唆される。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、クラスＩＩＭＨＣ対立遺伝子を共有する抗原提示細胞によってのみ活性化する；すなわち、ＣＤ４＋ヘルパーＴ（Ｔｈ：ｈｅｌｐｅｒ  Ｔ）細胞による抗原認識は、クラスＩＩＭＨＣ拘束性である。一方、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ（Ｔｃ：ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ）細胞による抗原認識は、クラスＩＭＨＣ拘束性である。
【００１９】
Ｔ細胞免疫応答のセントラルドグマは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ：Ｈｕｍａｎ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ、またＭＨＣとして周知の）によるペプチドの提示である。ＨＬＡ分子は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に存在する。これらＨＬＡ分子（この内に何百もの異なる対立遺伝子が存在する）は、患者のＨＬＡ表現型を作る。Ｔ細胞へ提示されるペプチドは、具体的には、ＨＬＡ分子によって作られたＭＨＣＩまたはＩＩグルーブ内部で結合しなければならない。
【００２０】
既に記載のように全長抗原性タンパク質を使用して産生したＴ細胞ワクチンは、失敗であった。全長抗原の場合、ＨＬＡによって正確なペプチドが提示されるには、ＡＰＣによるプロセシング次第となる。不完全なプロセシングは、疾患に関連のあるエピトープを提示するＨＬＡの能力を減少する。
【００２１】
全長抗原のプロセシング問題を解決する最初の試みは、ペプチドを使用したワクチンを代わりに産生することであった。どのペプチドが適当な刺激性抗原であったかを判定するために、ＭＳ患者のスクリーンを免疫優性エピトープの同定のために実行した。これら免疫優性エピトープは、実際には、ＭＳ罹患者に見られる全反応のうちささいな部分しかカバーしていない。各個人に見られる非常に個別的な特異的免疫反応性（疾患に関連する）ペプチドを検出する方法を、本願明細書において提供する。この方法は、これらのイディオタイプ細胞をトレース記録するのに用いることもできる。この方法は、新しい病原性イディオタイプが発生した時にそれらを検出し、他の抑制が持続しているのかについて観察するのに用いられ得る。
【００２２】
特定の患者についてさらに別の疾患関連性ペプチドがあるかもしれないが、このようなワクチンを患者に接種すると、抗イディオタイプおよび抗エルゴタイプの免疫反応が導かれるので、免疫優性エピトープの使用は十分であると見なされていた。抗イディオタイプ反応は、ワクチンにおける特定のＴ細胞集団に対するものと考えられており、一方、抗エルゴタイプ反応は、すべての活性化したＴ細胞集団に対するものであると考えられた。
【００２３】
すべての患者に同じペプチドセットを使用することは、個人のＨＬＡ表現型を一切考慮しないこととなるので、それらＡＰＣと結合するペプチドは最適化されない。Ｔ細胞はこのようなペプチドによって適切に刺激されず、免疫優性ペプチドだけの使用は、しばしば不十分な増殖培養結果となる。周知のＨＬＡ対立遺伝子の場合、一般に患者のＨＬＡと結合することが可能なペプチドを使用してＴ細胞ワクチンを産生すると、強力なワクチンが産生される。一方、未知のＨＬＡ対立遺伝子の場合、結合するペプチドの予測ができず、したがって強力な応答を産生するためのスキャン分析評価にかけなければならない。さらに、周知の対立遺伝子の場合でも、予測モデルは１００％正確ではない。したがって、本願明細書において記載のエピトープスクリーニング分析（ＥＡＡ：Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）によるアプローチはまた、ミエリンタンパク質上でのさらなるペプチドに対するエピトープの広がりの影響を制限し得る。本願明細書において提供されたＴ細胞ワクチンは、患者間の自己反応性Ｔ細胞受容体の可変性およびばらつきに基づいてどの患者に対しても個別化され得る。
【００２４】
３．エピトープスクリーニング分析（ＥＡＡ）
自己反応性ポリペプチドのエピトープを同定する方法を、提供する。宿主から単離されたＴ細胞を含むサンプルを、提供する。たとえば、末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ：Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｃｅｌｌｓ）または脳脊髄液由来の単核球（ＣＳＦＭＣｓ：Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ＣｅｒｅｂｒｏＳｐｉｎａｌ  Ｆｌｕｉｄ）は、宿主から採取され得る。サンプルはそれから複数の部分に分割し得、それぞれの部分を一種以上の異なるペプチドまたは対照の存在下でインキュベートし得る。ペプチドの配列は、ポリペプチド抗原の一部の配列を集合的に含み得、これは完全なポリペプチドとすればよい。最終的に、刺激された自己反応性Ｔ細胞を含む一部のサンプルを同定すればよい。刺激された自己反応性Ｔ細胞を含むサンプルの一部は、刺激指数（ＳＩ：Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｅｘ）を参照することによって同定され得る。
【００２５】
ＥＡＡは、ＣＤ４（ＭＨＣ  ＩＩ）およびＣＤ８（ＭＨＣ  Ｉ）に成長をもたらし得る。本来、Ｔｈ１  ＣＤ４クラスＩＩ細胞は、ＭＳの唯一の病因細胞であると考えられていた；しかしながら、ＣＴＬ  ＣＤ８クラスＩ細胞も、ＭＳと強く関係していることが明白となった。ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座が主要な遺伝子的つながりであると記載するものもあるし、ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座の背景では、ＭＳおよびＭＳの重症型に対して特定のＭＨＣ  Ｉと強い関係があると示すものもある。過去に予測した方法論は、ＭＨＣ  ＩＩおよびＩの両方のペプチドを同定するものではない。ＥＡＡは、ＭＨＣ  ＩＩおよびＩとの関係を知る必要はなく、これらペプチドを同定する。さらに、ＥＡＡは患者に合ったワクチンを作るために十分な長さのペプチドを使用し得る。ＡＰＣｓは、クラスＩＩ  ＭＨＣによって現れる、１０〜１１個のアミノ酸ペプチドを産出するためにペプチドを処理し得る。ペプチドは、クラスＩ  ＭＨＣと結合し得る配列を産出する部分的なタンパク質分解を起こし得、それはアミノ酸約９個の長さであり得る。その結果、本当にＭＨＣ  ＩおよびＭＨＣ  ＩＩが特定の患者においてＭＳと関係しているならば、ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞は、好適なペプチドを用いて増殖し得る。
【００２６】
ａ．ペプチド
任意の自己反応性ポリペプチドの一部を含むペプチドが、スクリーニング方法でも使用し得る。ペプチドは、例えばＭＢＰ（ＮＣＢＩアクセッション番号Ｐ０２６８６、またはそれと実質的に同一のポリペプチド）、ＭＯＧ（ＮＣＢＩアクセッション番号ＣＡＡ５２６１７、またはそれと実質的に同一のポリペプチド）、ＰＬＰ（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＡＡ６０３５０、またはそれと実質的に同一のポリペプチド）、またはその組み合わせなど、ＭＳに関連した自己反応性ポリペプチドの一部を含み得る。ペプチドの配列は、集合的にではあるがポリペプチド抗原の完全な配列を含み得る。異なるペプチドは、重複する約４〜約１９個のアミノ酸または約８個〜約１２個のアミノ酸の配列を含み得る。ペプチドはまた、約８〜約２０個のアミノ酸または約１２〜約１６個のアミノ酸を含み得る。
【００２７】
ｂ．刺激指数（ＳＩ）
ＳＩは、ＭＲＴＣポリペプチド標的の一部を含むペプチド存在下でのサンプルの〔３Ｈ〕チミジンの取り込みを媒体のみの対照と比較することによって計算され得る。簡潔に書くと、サンプルの各アリコートを播種し、反応性Ｔ細胞を刺激するためにポリペプチドの一部を含むペプチドのみの対照または媒体いずれかの存在下でインキュベートする。培養物は、インキュベーションの最後の６〜１８時間に〔３Ｈ〕チミジンをパルスラベルにする。ＳＩは、抗原アリコートの１分当たりの平均的カウント（ｃｐｍ：ｃｏｕｎｔｓ  ｐｅｒ  ｍｉｎｕｔｅ）／対照アリコートの商として計算される。自己反応性Ｔ細胞のＳＩは、対照と比較して少なくとも１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７．２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、または４．０の倍で増大し得る。
【００２８】
（１）所定値
ＳＩは、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７．２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、または４．０であり得る所定値を有し得る。
【００２９】
所定値はまた、以下のような分散評価方法を使用して計算され得る：
１．ＥＡＡは、任意の患者個体群に実施すればよい（１２０人の各被験体から最低１２０アッセイ）
２．「陰性個体群」は、すべてのＳＩ値の平均が＜２．５であるものとすればよい
３．標準偏差（ＳＤ：Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）は、ペプチドそれぞれについて計算すればよい
４．各ペプチドについて、以下のものを計算すればよい：
ａ．平均＋１ＳＤ
ｂ．平均＋２ＤＤ
ｃ．平均＋３ＳＤ
５．以下のＳＩは所定値を超すとみなせばよい：
ａ．ＳＩが、平均＋３ＳＤ＜以上
ｂ．任意のＳＩが、２．５＜以上
ＳＩはまた、３重に実行してウェルを平均する代わりにそれぞれのウェルをテストすることによって計算してもよい。この場合、上記基準値を触れる単一ウェルはいずれも、所定値を超えたアッセイであると見なされ得る。
【００３０】
所定値はまた、１分当たりのカウント（ＣＰＭ）の分散評価方法を使用して評価され得る。このアルゴリズムは、任意のアッセイ内のペプチドすべてに対し広範囲なカットオフをセットされ得る。以下のように計算され得る：
１．ＥＡＡを実施し、すべての対照（媒体のみ、抗原は無し）ウェルに対するＣＰＭを平均すればよい。
【００３１】
２．次に対照ウェルのＣＰＭに対するＳＤを計算すればよい。
【００３２】
３．以下は、制御された各ウェルについて、以下のものを計算すればよい：
ａ．平均＋１ＳＤ
ｂ．平均＋２ＳＤ
ｃ．平均＋３ＳＤ
４．対照ウェルの平均＋３ＳＤ以上の平均ＣＰＭをもつ各ペプチドが所定値を超えると見なせばよい。
【００３３】
各ウェルはまた、３重に実行してウェルを平均する代わりに評価してもよい。この場合、上記基準値を触れる単一ウェルはいずれも、所定値を超えたアッセイであると見なされ得る。
【００３４】
個々のウェルで分析されたペプチドまたは３重に実行されるウェルで平均をとったペプチドのうち、分散評価方法でＳＩ≧２．５、ＳＩ≧平均＋３ＳＤ、またはＣＰＭ評価方法でＳＩ≧平均＋３ＳＤとなったペプチドはいずれも、所定値を超えると見なされ得、ペプチドに対する反応が陽性であるＴ細胞群を指し得る。
【００３５】
４．Ｔ細胞ワクチンを作る方法
Ｔ細胞ワクチンを調製する方法が、提供される。患者から単離したＴ細胞を含むサンプルも、提供し得る。さらに、スクリーニング方法によって同定したエピトープを含むペプチドも追加される。さらに、自己反応性Ｔ細胞も単離され得る。さらに、Ｔ細胞をも弱毒化し得る。
【００３６】
ａ．刺激
スクリーニング方法によって同定されたエピトープを含むペプチドに対し所定値を超えるＳ．Ｉ．を有すると同定された自己Ｔ細胞は、例えば放射線照射した自己ＰＢＭＣなどのＡＰＣの存在下、対応するペプチドと任意ではあるがＩＬ−２とで刺激サイクルを繰り返しかければよい。照射は、３５００または２５００〜６０００ラドであり得る。刺激サイクルは、７〜１４日間実行され得る。刺激サイクルはまた、７〜１０日間実行され得る。総細胞数が治療的なレベルに達するまで、Ｔ細胞は刺激サイクルで増殖し得る。Ｔ−細胞株は、この時点で凍結保存され得る。
【００３７】
Ｔ細胞は、エルゴトップ（ｅｒｇｏｔｏｐｅｓ）の上方制御を誘発するために、非特異的である刺激によって活性化し得る。次に結果として生じる活性化したＴ細胞は、弱毒化し得る。Ｔ細胞は、Ｔ細胞を複製能力はないが生存能力はあるものとするいずれもの方法によって弱毒化し得る。例として、Ｔ細胞は例えばガンマ照射などの放射線照射によってまたは化学的不活性化によって弱毒化し得る。
【００３８】
ｂ．活性化
自己反応性Ｔ細胞は、希釈前の刺激の増殖サイクル間に活性化し得る。希釈前の増殖サイクル間、Ｔ細胞の活性化は休眠状態のＴ細胞ではないが、活性化された表面に発現したエルゴトップ（ｅｒｇｏｔｏｐｅｓ）の全体的な上方制御を誘発し得る（Ｉｒａｎ  Ｒ．Ｃｏｈｅｎ，Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  Ｊ．Ｑｕｉｎｔａｎａ  ａｎｄ  Ａｖｉｓｈａｉ  Ｍｉｍｒａｎ．Ｔｒｅｇｓ  ｉｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ：ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．ＪＣＩ  Ｖｏｌｕｍｅ１１４（９）１２２７〜１２３２，２００４）。故に、自己反応性Ｔ細胞は、抗エルゴタイプおよび抗イディオタイプＴ細胞反応の両方を希釈前に活性Ｔ細胞として成長させる時、以下のワクチン接種を見込めばよい。（Ｃｏｈｅｎら、ＪＣＩ  Ｖｏｌｕｍｅ１１４（９）：１２２７〜１２３２、２００４）。自己反応性Ｔ細胞は、マイトジェン（例えばフィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ：ＰｈｙｔｏＨｅｍＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）など）またはＰＨＡ存在下でのインターロイキン−２またはＴＣＲ／ＣＤ３複合体の連結反応を通しての曝露によって活性化され得る（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７０：８２７）。Ｔ細胞活性がＩＬ−２に対する反応性を与え得る主要な機序の一つに、これらサイトカインに対する受容体サブユニット（エルゴトップ（ｅｒｇｏｔｏｐｅｓ））の上方制御を介するものがある（Ｃｈｕａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：１２８、１９９４；Ｄｅｓａｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：３１２５、１９９２；Ｐｒｅｓｋｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：１４００２、１９９７；ａｎｄ  Ｗｕら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：１４７、１９９７）。
【００３９】
ｃ．ＡＰＣ
ＡＰＣは白血球であり得る。ＡＰＣの代表的な例には、単核白血球、樹状細胞およびＢ細胞が含まれる。
【００４０】
ｄ．Ｔ細胞
Ｔ細胞ワクチンは、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＴＣＲαβ、ＴＣＲγδ、ＨＳＰ６０（熱ショックタンパク６０）またはその組合せに対して細胞マーカーを含み得る。Ｔ細胞ワクチンはまた、Ｔ細胞膜またはその断片を含み得る。
【００４１】
ｅ．希釈
Ｔ細胞ワクチンは、弱毒化し得る。弱毒化は、Ｔ細胞を複製能力はないが生存能力はあるものとするいずれもの方法によって成し得る。例えば、Ｔ細胞は、ガンマ線照射などの放射線照射または化学的不活性化によって弱毒化し得る。ガンマ線照射は、１０，０００または７，０００〜１２，０００ラドであろう。
【００４２】
５．Ｔ細胞ワクチン
Ｔ細胞ワクチンがさらに、提供される。ワクチンは、上記記載のように産生され得る。ワクチンは、所定値を超える刺激指数を生成する能力がある抗原性ポリペプチドのエピトープ（任意に、すべてのエピトープ）がワクチンに存在する自己反応性Ｔ細胞によって認識されることを特徴とする、抗原性ポリペプチドに特異的であるＴ細胞を含み得る。ワクチンは、６０００万〜９０００万、３０００万〜４５００万、または６００万〜９００万のＴ細胞を含み得る。ワクチンはまた、所定値未満の刺激指数を生成する能力がある抗原性ポリペプチドのエピトープを認識する５０％未満のＴ細胞を含み得る。ワクチンはまた、所定値未満の刺激指数を生成する能力がある抗原性ポリペプチドのエピトープを認識する４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％または１％未満のＴ細胞を含み得る。
【００４３】
Ｔ細胞ワクチンは、複数の抗原性ポリペプチドに対して特異的であるＴ細胞を含み得る。例えば、ＭＳ患者へ投与されるためのＴ細胞ワクチンは、ＭＢＰ、ＰＬＰおよびＭＯＧに対して特異的であるＴ細胞を包含し得る。
【００４４】
６．エピトープシフトを検出する方法
Ｔ細胞媒介疾患のエピトープシフトを検出する方法が提供される。この方法は、スクリーニング方法を用いて自己反応性抗原のエピトープを同定することを含み、対照に対するこれらエピトープを含む。エピトープが異なっていても、エピトープシフトは検出された。エピトープシフトを検出するには、エピトープシフトの診断またはエピトープシフトの観察が用いられ得る。
【００４５】
ポリペプチド抗原の配列の一部を含むペプチドを提供する工程によって、本発明は、全長タンパク質に覆われた隠れたエピトープを同定する方法を提供する。
【００４６】
本発明は、多面的な側面を有し、以下の限定されない実施例で説明される。
【実施例】
【００４７】
（実施例１）
免疫優性型ワクチン
過去の臨床試験では、ワクチン細胞株は、ＭＢＰ由来の２種の免疫優性ペプチドで培養Ｔ細胞を刺激することによって産生された。最近の臨床試験では、ワクチン細胞株は、合計６種の免疫優性ペプチド（ＭＢＰ由来の２種、ＰＬＰ由来の２種およびＭＯＧ由来の２種）でＴ細胞を刺激することによって産生された。一部の患者においてこの限られたペプチドセットの使用は、ワクチンの産生に不十分な増殖培養を生じ、数週間を要した。ペプチドが患者全員のＨＬＡ表現型と完全に一致しなかったため、Ｔ細胞は適切に刺激されなかった。加えて、関与した大部分のエピトープは、予想した免疫優性エピトープのみの使用だけではまかないきれず、故に正確に個別化したワクチンは樹立できなかった。まかないきれなかったエピトープは、ｉｎ  ｖｉｖｏ中、クローンの拡大および発生を刺激するかも知れないし、阻止できないかも知れない。
【００４８】
（実施例２）
ミエリンエピトープ
適当な刺激を与えたペプチドの選択が改良可能かどうかを判定するため、ＭＢＰ、ＰＬＰおよびＭＯＧ内の付加ペプチドエピトープを調製し、そして多発性硬化症患者でテストした。分析のため、ＭＢＰ、ＰＬＰおよびＭＯＧの全長をカバーした合計１６３種の異なる重複ペプチド（１６個のアミノ酸（１６マー）から成るペプチドそれぞれの合成を、前の配列と重複する１２個のアミノ酸に４個のアミノ酸を補う）を合成した。合計４４種のＭＢＰ、６７種のＰＬＰおよび５２種のＭＯＧペプチド配列を合成した。配列一覧表、それらの識別番号とアミノ酸番号、およびＥＡＡ（混合物ＩＤ）に使用するためどのように組み合わせたかを表１〜３に示す。実施例１に使用した６個の免疫優性配列を太字で示す。
【００４９】
【表１】
0006000205.tif 000002
【００５０】
【表２−１】
0006000205.tif 000003
【００５１】
【表２−２】
0006000205.tif 000004
【００５２】
【表３−１】
0006000205.tif 000005
【００５３】
【表３−２】
0006000205.tif 000006
（実施例３）
ミエリン抗原レパートリーの発生
１２個のアミノ酸（ａａ：ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｅ）が重複するそれぞれ長さ１６個のａａのＭＢＰタンパク質を範囲とする重複するペプチドを発生させた。ＭＢＰペプチドすべては生産可能であるが、ＭＢＰペプチドのレパートリーは８種のペプチドを除外した。結果として３６種のペプチドは、タンパク質の９５．７％をカバーする。１〜８個のアミノ酸だけが、カバーされなかった。ＭＢＰペプチドの一覧表は、薄灰色で強調表示された不使用のペプチドと並んで表４中にある。
【００５４】
【表４】
0006000205.tif 000007
１２個のａａが重複するそれぞれ長さ１６個のａａのＰＬＰタンパク質を範囲とする重複するペプチドを発生させた。生産可能であったすべてのＰＬＰペプチドは、アミノ酸の６１番〜７２番目および２４５番〜２４８番目の配列を包含していない。加えて、ＰＬＰペプチドレパートリーは、２０種のペプチドを除外した。結果として３５種のペプチドが、タンパク質の８３．０％をカバーする。カバーできなかった領域は、アミノ酸の２１番〜２４番目、６１番〜８０番目、１１７番〜１２８番目、１６５番〜１６８番目および２３７番〜２４８番目のみである。ＰＬＰペプチドの一覧表は、薄灰色で強調表示された不使用のペプチドと並んで表５に示され、網掛けで影をつけられた箇所は生産不能であった。
【００５５】
【表５−１】
0006000205.tif 000008
【００５６】
【表５−２】
0006000205.tif 000009
１２個のａａが重複するそれぞれ長さ１６個のａａのＭＯＧタンパク質を範囲とする重複するペプチドを発生させた。生産可能であったすべてのＭＯＧペプチドは、アミノ酸の１４１番〜１４４番目の配列を包含していない。加えて、ＭＯＧペプチドレパートリーは、８種のペプチドを除外した。結果として４０種のペプチドが、タンパク質の９３．６％をカバーする。カバーできなかった領域は、アミノ酸の６９番〜８０番目および１４１番〜１４４番目のみである。ＭＯＧペプチドの一覧表は、薄灰色で強調表示された不使用のペプチドと並んで表６に示され、網掛けで影をつけられた箇所は生産不能であった。
【００５７】
【表６−１】
0006000205.tif 000010
【００５８】
【表６−２】
0006000205.tif 000011
ペプチドを、ほとんどの場合、９５％超の純度で完全長のＭＢＰ、ＰＬＰおよびＭＯＧに対して合成した。合成可能であるすべてのペプチドは、その後の実験において評価された。合計１６種のペプチドは、固相ペプチド合成法（ＳＰＰＳ：Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ
Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）によって合成不可能である。これら１６種のペプチドは、３種のタンパク質（全タンパク量の２．６％）について特異的である全長１８個のアミノ酸に及んだ。生産不可能なすべてのペプチドは、実際ｈｙｄｒｏｐｈｉｃであった。
【００５９】
（実施例４）
エピトープ分析アッセイ
実施例２のペプチドは、患者の血液中のミエリン反応性Ｔ細胞を同定するため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＰＢＭＣ刺激アッセイでテストした。末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）を、全血より分離、洗浄、カウントし、合計４枚の９６穴プレートに、１穴当たり細胞２５０，０００個を播種した。２種の重複する１６マーペプチドのミエリンペプチド混合物を、プレート毎に培地のみのコントロール穴の３穴とＰＢＭＣｓの３穴に加え、それからインキュベートした。インキュベーションの２日後に、インターロイキン２（ＩＬ−２：Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２）を２０Ｕ／ｍｌ加えた。５日目に、プレートを放射性同位元素（放射性チミジン）で標識し、６時間後に採取した。このアッセイにおいて、放射性チミジンを取り込んだ細胞は、Ｔ細胞受容体−ペプチド−ＭＨＣ複合体で急速に活性化し誘発されるＴ細胞の代表である。コントロールおよび実験細胞より比較的多くの放射性チミジンを取り込んでいるＴ細胞は、より高度に活性化されたＴ細胞であり、より迅速に増殖する。
【００６０】
刺激指数（ＳＩ）は、４枚のプレートすべてに比例配分した培地のみのコントロール穴中の１分間あたりの（ＣＰＭ）平均をペプチドで刺激した穴の平均ＣＰＭで放射性標識数で割ることによって、それぞれのペプチド混合物に対して決定された。少なくとも３枚のＳＩは、陽性であると見なされた。図１は一人のＭＳ患者由来のＥＡＡ例である。ＭＯＧｍ１５で刺激した穴は非常に高い反応性であるのに、ペプチド混合物のうち７種は、わずかな反応性であった。図２〜４は、患者４８人中のペプチド混合物に対する反応の頻度を示す。
【００６１】
（実施例５）
ＨＬＡ分析
実施例２で記述したように、ＥＡＡによって同定された活性ペプチドを、患者のＨＬＡ表現型と比較した。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｔｅｃｈ．ｒｅｓ．ｉｎ／ｒａｇｈａｖａ／ｐｒｏｐｒｅｄ／（Ｓｉｎｇｈ，Ｈ．およびＧ．Ｐ．Ｓ．Ｒａｇｈａｖａ，ＰｒｏＰｒｅｄ：ＨＬＡ−ＤＲ結合の予測サイト）で閲覧利用可能なクラスＩＩの結合領域を予測するためのアルゴリズムを、患者のＤＲＢ１＿０８０１、ＤＲＢ１＿１５０１およびＤＲＢ５＿０１０１のＨＬＡ−ＤＲハプロタイプに基づくＭＯＧの結合領域を予測するため用いた。
【００６２】
図５は、患者の３種のＨＬＡ対立遺伝子のためのＭＯＧタンパク質内部のＰｒｏＰｒｅｄ結合予測を示す。黄色い残基がグルーブ内部でフィットするその他残基を表す時、赤いアミノ酸残基は、ＨＬＡグルーブ内部で結合するための予測されたアンカー残基を表す。その結果、これら残基は、この患者由来のＴ細胞に対する刺激性エピトープの候補であると予測される。
【００６３】
明黄色の囲みは、１０のＳＩを与えるペプチド混合物ＭＯＧｍ１５に含められる配列を包囲する。ＨＬＡ対立遺伝子のうち３種すべてと結合すると予測されるこれらペプチド内部に配列がある。２種の対立遺伝子に対して、２種の予測された結合エピトープおよびこれら配列内に３番目の部分がある。これら配列の予測した結合が、特定の範囲をＥＡアッセイで得られた結果と相関させるが、予測されていない刺激性ペプチドがある。
【００６４】
これら結果は、ＥＡＡが患者特有の刺激性ペプチドを同定するため、優れた予測結果を提供する工程を示す。ＥＡＡの優越性は、ＨＬＡ発現変異体のために強化された。ＨＬＡ−ＡおよびＢ遺伝子のための血清学と分子タイピング間の比較検査は、血清学的試薬では検出されないがＤＮＡタイピング試薬で検出される対立遺伝子を発見した。これらＨＬＡ発現変異体は、細胞表面上に発現しないか、またはごく少量発現する。ＨＬＡ変異体を同定する必要がないので、ＥＡＡはソフトウェア画面より優れている。
【００６５】
（実施例６）
ワクチンの産生
ワクチンに使用するため、ＥＡＡによって同定された患者−特有のペプチドを、ミエリン−反応性Ｔ細胞の産生および増大に利用可能かどうか判定するためテストした。５００ｍｌの血液袋を、ワクチンの産生培養を始めるため患者から得た。バルク培養を、最適なペプチドとともにＡＩＭ  Ｖ培地で開始した。４８時間のインキュベーション後、ｒＩＬ−２を２０Ｕ／ｍｌ加えた。７日後、培養物をＰＢＭＣｓおよびペプチドで再度刺激した。培地を、Ｘ  Ｖｉｖｏ１５培養液中１００Ｕ／ｍｌのｒＩＬ２と２％のＡＢ血清へ変更した。培養物を養い、必要に応じて１〜４日おきに分割した。さらに７日後、培養物をＡＰＣｓおよびペプチドでもう一度刺激した。培養物を持続的に養い、必要に応じて１〜４日おきに分割した。さらに７〜１４日後、培養物は、少なくとも１００×１０６個の細胞数に増大した。その細胞を１０×１０６個の細胞数の一定分量に分割し、凍結した。
【００６６】
（実施例７）
ＴＣＲ  ＶＢ分析
実施例６で産生したワクチンを、選択的に増大させたＴ細胞がＴ細胞の特定亜群を持っていたかどうか判定するためテストした。Ｔ細胞亜群の富化を、可変のＴ細胞受容体ベータ鎖の使用法（Ｖβ：Ｖａｒｉａｂｌｅ  ｂｅｔａ  ｃｈａｉｎ  ｕｓａｇｅ）で分析することによって評価した。２４の異なる周知のベータ鎖可変（Ｖβ）領域群を、特有の蛍光で標識したモノクローナル抗体およびフローサイトメトリーを使って評価した。Ｔ細胞の特定亜群がペプチドの刺激によって選択的に増大するならば、亜群は増大し、増加はＶベータ群の１つを表す細胞の割合で検出されるはずである。
【００６７】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ：Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）Ｖベータ分析を、実施例６で記述されるように産生したワクチンの産生中の約１８日後に実行した。Ｔ細胞株を、この患者に対する元のＥＡＡ中４．６のＳＩを産生したペプチド混合物ＭＢＰｍ１０で患者のＰＢＭＣｓを刺激することによって産生した。図６は、ペプチド混合物ＭＢＰｍ１０が４．６のＳＩを産生したことを示す。この混合物を、培養中この患者由来のＰＢＭＣｓの刺激のために用いた。
【００６８】
図７は、ベースライン時の細胞で、ＰＢＭＣｓで、およびこの同一患者のためのＭＢＰｍ１０ペプチドでＴ細胞培養の１８日目に実行したＶベータ分析を示す。ベースラインには、ＰＢＭＣｓにおけるＴＣＲ  Ｖベータ鎖使用法の典型的に比較的均等な分布がある。しかしながら、ＭＢＰｍ１０で培養中に刺激した１８日後、培養中の細胞の現在４５％を占めるＶベータ５〜６陽性Ｔ細胞が、ＭＢＰｍ１０ペプチド混合物での刺激に焦点を合わせたことを示すか、またはこの患者のＰＢＭＣｓ中のＴ細胞亜群を選択的に増大できることを示している。
【００６９】
（実施例８）
成長分析
より迅速に拡大およびＴ細胞を刺激するため、ＥＡＡで選択されたペプチドの刺激能力をテストした。細胞増殖曲線を、異なる２つの刺激性ペプチド混合物で分析した。図８に示されるＥＡＡ  ＣＰＭデータは、４．７のＳＩで患者のＭＢＰｍ１９中、強い反応性混合物を示す。同じアッセイからの第２のプレートは、１７．９の高いＳＩでＰＬＰｍ３３中、その他の反応性混合物を示す。これら２種のペプチド混合物を、その後、Ｔ細胞株の産生のためにこの患者由来のＰＢＭＣｓの刺激に使用した。
【００７０】
ＥＡＡ−同定したペプチドの成長分析を図９に示す。ＰＬＰｍ３３刺激細胞を、ペプチド混合物で３回刺激することによって２０日間で１５００万個のＰＢＭＣｓから２億個のＴ細胞へ増大した。それらはまた、２１日目にペプチドで再度刺激を加えた後、１５００万個のＰＢＭＣｓから２億１７００万個のＴ細胞まで増大したが、ＭＢＰｍ１９刺激細胞は、迅速に増大するのにより時間がかかった。それらを培養開始日から２７日目に採取した。この過程は、ＭＢＰ、ＰＬＰおよびＭＯＧ由来の免疫優性ペプチドだけを使用する過去の産生方法より６倍短い過程を表す。
【００７１】
その他ＭＳ患者のため、合計８．２５×１０６個のＰＢＭＣｓを、刺激状態ごとに最初にシードした。培養中２１日目、ペプチド（ＰＨＡを使用していない）による合計３回の刺激の後、細胞株の１つは１４２×１０６個の細胞に増大し、一方、その他の細胞株は９５×１０６個のＴ細胞に増大した。図１０は、ペプチド混合物ＰＬＰｍ２７で刺激している間、９日目から１６日目に成長した培養物として生じたことに焦点をあわせるＴＣＲ  Ｖベータを示す。Ｖベータ鎖５−５を使用するＴ細胞亜群は、大部分のその他のＶベータＴ細胞亜群を犠牲にして増大する。
【００７２】
（実施例９）
ミエリンＭＲＴＣの観察
ＥＡＡを、Ｔ細胞ワクチン接種の後、ミエリン反応性Ｔ細胞（ＭＲＴＣ）特異性を評価するため用いた。拡散しているエピトープを検出し、当初生じた新規エピトープを含むミエリンタンパク質への免疫攻撃を重点とした広がりもテストした。図１１は、３種ワクチンシリーズの最初の再処置を受けた患者由来のＭＲＴＣ発生頻度データの一部を示す。最初のワクチンシリーズの後５２週目で、患者のＭＲＴＣｓは、１０００万個のＰＢＭＣｓにつき合計２９個のＭＲＴＣをリバウンドした。優先的Ｔ細胞頻度分析（ＴＣＦＡ：Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）は、２８週目で、１０００万個のＰＢＭＣｓ中４個のＭＲＴＣだけを示した。
【００７３】
新規ワクチンを、最初のワクチンシリーズと同一手順で調製し、処置を再開した。患者は４週目および８週目に追加接種を受け、そして、ＭＲＴＣｓ数が１０００万個のＰＢＭＣｓ中６個に減少した。１５週後、２４週目に、特にＭＢＰ反応性Ｔ細胞が再発し、患者のＭＲＴＣが開始された。
【００７４】
図１２は、全長ＭＢＰペプチドに対する患者の２４週目のＴ細胞反応を示す。ペプチド周辺の囲みは、ＴＣＦＡで過去に使用された２種の免疫優性ＭＢＰ配列を含有する。見られるように、ＭＢＰペプチド２種に対し未だ反応性があり、ＴＣＦＡでも見られるように、ＭＢＰに対する反応性の増加が原因かもしれない。
【００７５】
図１３および１４は、それぞれ、全長のＰＬＰおよびＭＯＧタンパク質のペプチドに対する患者の２４週目のＴ細胞反応を示す。ペプチド周辺の囲みは、ＴＣＦＡで過去に使用された２種の免疫優性ＰＬＰおよびＭＯＧ配列を含有する。示されるように、ＰＬＰの３つの領域およびＭＯＧの２つの領域は、ＥＡＡで強い反応を示す。この分析を、６種の新しく同定した反応性ペプチド混合物を使用している患者のための新規ワクチンの産生に用いた。
【００７６】
（実施例１０）
ＥＡＡ分析１の要約
図１５〜１７は、８人のＭＳ患者の、それぞれ、ＭＢＰ、ＰＬＰおよびＭＯＧペプチド反応パターンを示す。赤い線は、３のＳＩカットオフで陽性を示す。過去に使用されたＭＢＰ、ＰＬＰおよびＭＯＧの２つの免疫優性ペプチドを、囲みで同定した。図１５で示されるように、２つの免疫優性ＭＢＰペプチドを含まないＭＢＰｍ１９中にエピトープがある。ＰＬＰのため、図１６は、免疫優性ＰＬＰペプチドを内部に含まれていない３カ所の別の免疫反応領域があることを指す。最も高い免疫反応は、ＰＬＰタンパク質配列の末端で３領域のすべての中にあった。ＭＯＧのため、図１７は、タンパク質の膜貫通と隣接する細胞内部が過去に使用された免疫優性ＭＯＧペプチドよりはるかに免疫的活性が強いことを指す。
【００７７】
図１８〜２０は、ＥＡアッセイを使用してテストした合計１５人のＭＳ患者由来のサンプルに対し平均的ＳＩｓを示す。見られるように、ＭＢＰのＣ末端に対して、わずかに増加した反応が見られた。同じデータがＰＬＰタンパク質を分析するとき、このタンパク質のＣ末端で、再び、免疫優性部分が非常に明白である。ＭＯＧタンパク質に対する反応の分析は、タンパク質のＣ末端領域と同様、膜貫通領域において免疫優性部分を示す。これらをもとに、データは、より効率的な手法で、より効果的なワクチンを産生するため、Ｔ細胞ワクチンの使用に対してＭＳ患者由来のミエリン反応性Ｔ細胞を同定するのにミエリンタンパク質内部由来のその他ペプチドエピトープを含むことが重要であることを示している。
【００７８】
ＭＳにおいて、エピトープの拡散またはシフトのパターンの知識は、進行する組織破壊を防ぐペプチド−特有のＴ細胞ワクチン接種治療法を考案するために使用され得る。患者が分析される３つのミエリンタンパク質内部で「新しい」エピトープに対する反応を発現する時、および発現するならば、結果として起こるＥＡＡは、判定に使用され得る。新たに同定された反応ペプチドは、後続のワクチンのためＴ細胞株の産生に使用され得る。
【００７９】
（実施例１１）
ＥＡＡ分析２の要約
ＥＡＡを５４人の被験体に実行した。被験体は、健常人（Ｎ＝１２）、Ｔｏｖａｘｉｎの用量漸増臨床試験に登録されたＭＳ患者（Ｎ＝１６）、Ｔｏｖａｘｉｎの繰り返しワクチン接種臨床試験（拡張試験）に登録されたＭＳ患者（Ｎ＝１３）および採血のみの臨床試験（方法開発）に登録されたＭＳ患者（Ｎ＝１３）を含む。表４は、ミエリンペプチド混合物に対する被験体の反応を示す。それぞれ、表５〜７は、ＭＢＰ、ＰＬＰおよびＭＯＧペプチド混合物に対する被験体の反応を示す。図２１〜２３は、実施例１のワクチンの産生に使用された免疫優性ペプチドの場所を示す囲みとともにミエリンペプチド混合物に対する被験体の反応を示す。
【００８０】
【表７】
0006000205.tif 000012
１テストされた１３人すべての被験体は、ＭＳ治療の認証された免疫修復を受けていた。２調製されたＴｏｖａｘｉｎは、６人の患者にのみワクチン接種された。
３陰性であった２つのサンプルは、凍結保存細胞からセットアップされた。
４Ｔｏｖａｘｉｎ未接種；これらの患者は、過去にＭＢＰ由来のみのペプチドで調製されたワクチンのワクチン接種を受けたことがある。
【００８１】
【表８】
0006000205.tif 000013
【００８２】
【表９】
0006000205.tif 000014
【００８３】
【表１０】
0006000205.tif 000015
少なくとも１つのミエリンペプチド混合物の反応が、健常人被験体１２人のうち７人を含む、テストした５４人の被験体のうち４２人に見られた（７８％）。被験体が反応したペプチド混合物の数は、０〜１１の範囲であった。陽反応性は、３．０の最小ＳＩから２１．１の最大ＳＩの範囲であった。
【００８４】
反応パターンで示すように、テストされた被験体の過半数は、実施例１でワクチンの調製に使用した６種の免疫優性ペプチドの外側にある３種のミエリンタンパク質領域のペプチド配列に対する反応Ｔ細胞を有した。テストした被験体の４１パーセントは、ＭＢＰ（ＭＢＰ８３〜９９およびＭＢＰ１５１〜１７０）の免疫優性ペプチドに反応した。テストした３１％の被験体だけが、ＰＬＰ免疫優性ペプチド（ＰＬＰ３０〜４９およびＰＬＰ１８０〜１９９）に反応した。テストした１１％の被験体だけが、ＭＯＧ免疫優性ペプチド配列（ＭＯＧ１〜１７およびＭＯＧ１９〜３９）に反応した。
【００８５】
最初に現れる反応パターンは、ＰＬＰおよびＭＯＧペプチドよりさらに反応するペプチド配列ＭＢＰ８３〜９９を同定する過去の研究と一致する。しかしながら、一般に、ＭＢＰペプチドに対する反応は、ＰＬＰおよびＭＯＧペプチドに対して見られる反応より低く；テストされたすべての被験体の３０％は、ＰＬＰペプチドでの６５％およびＭＯＧペプチドでの６１％とは対照的に、１種以上のＭＢＰペプチドに対して反応した。下記の表１１は、被験体に対して反応したタンパク質ごとの平均ペプチド数を示す。
【００８６】
【表１１】
0006000205.tif 000016
ＭＤ＝被験体の採血方法開発
Ｈ．Ｓ．＝被験体の健常人
ＤＥＳ＝患者の用量漸増（ワクチンを接種したおよび未接種の両方）
ＥＸＴ＝患者の拡張試験。
【００８７】
ＭＯＧタンパク質の場合、過去の研究は、タンパク質の細胞外の一部に重点を置いた。ＭＯＧは、アミノ酸残基１〜１２２個を含む免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメイン、細胞膜部分およびアミノ酸残基１２３〜２１８個から成り立つ細胞内部分を含む。上記の結果は、アミノ酸１１３〜１３２個（ＭＯＧｍ１５）の細胞内膣おいて、細胞膜配列の範囲内または隣接の範囲を越えてタンパク質の一部に高水準の反応を示す。興味深いことに、実施例１のワクチンで、前にワクチン接種を受けている拡張試験患者のすべて（１００％）は、ＭＯＧの細胞内部分に免疫反応を示した。これはテストされたその他の被験体全員と対照的であり、４９％のみがＭＯＧペプチドに対する何らかの反応を示した。
【００８８】
低刺激指数によるミエリン反応Ｔ細胞株の成長
以下は、３．０未満のＳＩおよび特に２．０以下で増殖するミエリン−反応性Ｔ細胞の能力を実証する。上記のアルゴリズムを使用して、１．３に限りなく低い統計的に優位なＳＩｓを観察し、そしてそれ故、抗原に応答して増殖可能である。この能力を立証するため、２人の患者にまたがる５種の細胞株が、ＳＩ＜２．０で示された。結果を、ペプチド抗原刺激およびＴ細胞成長因子だけで細胞株の成長を指す、表１２および図２４に示す。
【００８９】
被験体１０４２のＰＢＭＣをＥＡＡで実行し、および１．８のＳＩによるＰＬＰｍ１８、２．５のＳＩによるＰＬＰｍ２６および２．５のＳＩによるＰＬＰｍ２８を包含する２種のペプチド混合物は、陽性だった。細胞は以下に示すように通常のプロトコルごとに抗原刺激を受け、そして１４、１９、２６、３３および３５日後に採取された。被験体１０１４のＰＢＭＣをＥＡＡで実行し、および１．７のＳＩのＭＢＰｍ１４、１．７のＳＩのＰＬＰｍ１７、２．２のＳＩのＰＬＰｍ２８および１．９のＳＩのＭＯＧｍ６を包含する４種の混合物は、陽性だった。被験体１０１４のための細胞は、以下に示すように抗原性刺激を受け、そして１４、１９、２６、３３および３５日後に採取された。
【００９０】
ＰＢＭＣｓを、ＡＣＤ−１抗凝固剤中の静脈穿刺を通して得られる末梢血から密度勾配遠心分離によって分離した。ＰＢＭＣｓを、２４穴プレートで１穴当たり２．５Ｅ＋０６個の細胞を播種した。ＥＡＡで同定された１６マーペプチド型の抗原を、最終濃度で２０ｕｇ／ｍｌになるように加えた。インターロイキン−２（ＩＬ−２：ＩｎｔｅｒＬｕｅｋｉｎ−２）を開始４８時間後に最終濃度で１００Ｕ／ｍｌになるように加え、そしてＩＬ−２をそれぞれの給餌またはウェルの分割によって同一濃度になるまで加えた。抗原提示細胞（３５００ラドで放射線照射したＡＰＣｓ−自家ＰＢＭＣｓ）の存在下でペプチドの再刺激を、７、１４および２１日目に行った。インターロイキン−１５（ＩＬ−１５：ＩｎｔｅｒＬｕｅｋｉｎ−１５）を、開始１４日後に最終濃度で５ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌ（特定ロット）になるまで加え、そして残りの培養期間続けた。細胞株を３５日目ですべて採取し、そして３．０〜８．２倍の増大を達成した。
【００９１】
【表１２】
0006000205.tif 000017
図２４は、抗原に応答して成長できた＜２．０のＳＩｓであるミエリンペプチド混合物に反応する被験体１０４２および１０１４由来の５種のＴ細胞株を示す。したがって、低いＳＩｓを提示するＴ細胞株は、ミエリン抗原に応答して大きくなることができる。
【００９２】
（実施例１２）
ミエリン反応ペプチドのＥＡＡ分析
実施例３のペプチドを、次の通り４２９ＥＡＡｓ臨床試験でテストした。分散評価法またはＣＰＭ分散法を用いて、４２９アッセイのうち合計１６２（３７．８％は、ＳＩｓ陽性を示した。ワクチン前のＥＥＡｓは、３６８アッセイのうち１５０陽性（４０．８％）を示す再発寛容型のＭＳ患者（ＲＲＭＳ：Ｒｅｌａｐｓｅ  Ｒｅｍｉｔｔｉｎｇ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、および１９アッセイのうち８陽性（４２．１％）を示す最初のエピソードからなる症候群（ＣＩＳ：Ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  Ｉｓｏｌａｔｅｄ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）とともに３８７アッセイのうち１５８陽性（４０．８％）を示す。
【００９３】
スクリーニング受診被験体のうち、合計３１２のうち１４４アッセイは、２４９人の被験体で陽性だった（それぞれ４６．２％および５７．８％）。これらのうち、ＰＲＭＳ患者は、２３８人の被験体において３０１アッセイのうち１３６陽性を示し（それぞれ４５．２％と５７．１％）およびＣＩＳ患者は、１１アッセイのうち８陽性を示した（７２．７％）。
【００９４】
達成の間、８９アッセイのうち１４（１５．７％）は陽性であり、そのうちＰＲＭＳ患者は８４アッセイのうち１４陽性（１６．７％）を示し、およびＣＩＳ患者は、５アッセイのうち０陽性（０％）を示した。ＥＡＡｓの投与開始時は、３１アッセイのうち６陽性（１９．４％）であり、ＰＲＭＳ患者は２８アッセイのうち６陽性（２１．４％）を示し、ＣＩＳ患者は３アッセイのうち０陽性（０％）を示した。
【００９５】
ワクチン後ＥＡＡｓは、４２アッセイのうち４陽性（９．５％）を示し、そのうちＰＲＭＳ患者は３７アッセイのうち３陽性（８．１％）を示し、およびＣＩＳ患者は５アッセイのうち１陽性（２０．０％）を示した。
【００９６】
４週目、ＥＥＡｓは２１アッセイのうち２陽性（９．５％）を示し、そのうちＰＲＭＳ患者は１９アッセイのうち１陽性（５．３％）を示し、ＣＩＳ患者は、２アッセイのうち１陽性（５０．０％）を示した。８週目、ＥＡＡｓは１６アッセイのうち２陽性（１２．５％）を示し、そのうちＰＲＭＳ患者は１４アッセイのうち２陽性（１４．３％）を示し、ＣＩＳ患者は２アッセイのうち０陽性（０％）を示した。１２週目、ＥＡＡｓは５アッセイのうち０陽性（０％）を示し、そのうちＰＲＭＳ患者は４アッセイのうち０陽性（０％）を示し、ＣＩＳは１アッセイのうち０陽性（０％）を示した。
【００９７】
（実施例１３）
ＥＡＡ臨床試験
６ヶ月にわたって、研究を臨床試験の基準値を満たしている１２０人の被験体に対して行った。被験体は、再発寛容型多発性硬化症（ＰＲ−ＭＳ；ｎ＝１１４）、または０〜５．５の総合障害度評価尺度（ＥＤＳＳ）による危険性の高い最初のエピソードからなる症候群（ＣＩＳ；ｎ＝６）、０〜１０年の疾患の診断、年齢１８〜５５歳、ＭＳおよび陽性ＥＡＡを連想させるＭＲＩ基準値を有した。
【００９８】
先に述べた被験体の個体群を、上記記載の分散評価方法およびＣＰＭ分散法を用いたＥＡＡによって評価し、そしてワクチン産生にふさわしいとみなした。ワクチンを生産する１２０回の試みのうち、輸送失敗（血液が定まった基準値の範囲内で授受できなかった）が２回、培養の汚染による失敗が１回および収穫量当たりの低い細胞量に達した５サンプルがあった。残り１１２被験体のうち、８９人の被験体にワクチンが無事発生し、２２人がいまだ産生中（適格なサンプルの９８．９％、完了されたサンプル９２．５％）である。このことから、陽性ＥＡＡを、本願明細書において開示された方法による治療用量のワクチン生産能力の前兆と見なした。
【００９９】
Ｔ細胞株が増殖するための従来の方法は以下を含む：
１．ＰＢＭＣｓの単離
２．２４穴プレートに２．５Ｅ＋０６個の細胞／穴でＰＢＭＣｓを播種すること
３．２ペプチド／穴に２０ｕｇ／ｍｌ／ペプチドで抗原を添加すること
４．４８時間後（および採取までを含んだ）に、ＩＬ−２（１０〜２００ＩＵ／ｍｌ）を添加すること
５．７、１４および２１日目に、３５００ラド（前に記載のように１．０Ｅ＋０６個）の放射線照射したＡＰＣｓおよび抗原（同一抗原／同一濃度）で再刺激すること
６．１４日目（および採取までを含んだ）に、ＩＬ−１５（１〜５０ｎｇ／ｍｌ）を添加すること
７．細胞が十分な個数に生育しなかったなら、３５日目に、成長を刺激するマイトジェン、スーパー抗原または抗体を添加する可能性。
【０１００】
この研究の間、免疫優性のいくつかのエピトープがＭＳ被験体の個体群中に発見された。これらのエピトープのいくつかは、新規である。我々の試験中、スクリーニングを受診した被験体の大多数が反応を示したペプチドがある。これら免疫優性領域のいくつかは、過去の文献に記述されていない。表１３〜１５に興味深いエピトープを羅列した。
【０１０１】
【表１３−１】
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【０１０２】
【表１３−２】
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【０１０３】
【表１４】
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【０１０４】
【表１５】
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図２５〜２７は、この臨床試験の結果を示す。図２５Ａ〜Ｈは４２９アッセイ（横列が独特なアッセイおよび縦列がペプチド）のマップを示す。アッセイは日付順に並ぶ。陽性ペプチド混合物を、薄灰色で示す。陽性と判明したペプチド混合物は、独特および予測不能であったことを示す。
【０１０５】
図２６は６５アッセイ（横列が独特なアッセイおよび縦列がペプチド）のマップを示す。アッセイは日付順に並ぶ。陽性ペプチド混合物を、薄灰色で示す。陽性と判明したペプチド混合物は、独特および予測不能であったことを示す。陽性混合物の数は、単一被験体において０〜１９まで変動した。
【０１０６】
図２７は、４人の被験体における経時的なエピトープシフトを指すＥＡＡ分析の結果を示す。被験体１は、最初、ＭＯＧｍ４、ＭＯＧｍ５とＭＯＧｍ６の周りでの反応、およびＭＯＧｍ２１、ＭＯＧｍ２２とＭＯＧｍ２３へ移動による反応で微変異を示した。これら２つが重複することに注目する。被験体２は、さらに０時間から新しいペプチドへの反応が増すが、時間の経過とともに反応する同一ペプチドを示した。被験体３は、ＰＬＰからＭＯＧへの反応の重要な変異を示し、および被験体４は、１つの部分（Ｃ−末端ＰＬＰ）からその他の部分（Ｎ−末端ＭＯＧ）への段階的な変異で、反応の多数の中心点を示した。また、同一患者において、最後の２つの時点での、ＭＯＧ中心部への長期かつ短期の反応、およびＭＢＰへの最終的な反応が観察された。
（配列表）
【数１】
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【数２】
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【数３】
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【数４】
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【数５】
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【数６】
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【数７】
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【数８】
0006000205.tif 000029
【数９】
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【数１０】
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【数１１】
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【数１２】
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【数１３】
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【数１４】
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【数１５】
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【数１６】
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【数１７】
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【数１８】
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【数１９】
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【数２０】
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【数２１】
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【数２２】
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【数２３】
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【数２４】
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【数２５】
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【数２６】
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【数２７】
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【数２８】
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【数２９】
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【数３０】
0006000205.tif 000051
【数３１】
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【数３２】
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【数３３】
0006000205.tif 000054
【数３４】
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【数３５】
0006000205.tif 000056
【数３６】
0006000205.tif 000057
【数３７】
0006000205.tif 000058
【数３８】
0006000205.tif 000059
【数３９】
0006000205.tif 000060
【図２】
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【図３】
0006000205.tif 000062
【図４】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１５】
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【図２４】
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【図１】
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【図５】
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【図６】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２５Ｅ】
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【図２５Ｆ】
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【図２５Ｇ】
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【図２５Ｈ】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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