(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料を載せるステージと、
前記試料の像を形成する光学系と、
該光学系及び前記ステージの少なくとも一方を駆動することにより、前記試料と前記光学系とを相対的に移動させる駆動手段と、
前記試料の所定視野範囲の画像である基準視野画像を撮像すると共に、前記駆動手段により前記試料の位置を前記光学系に対して相対的に移動させて、前記所定視野範囲内の所定領域を含み前記所定視野範囲と互いに異なる周辺視野範囲の画像である周辺視野画像を複数撮像する撮像手段と、
前記基準視野画像と前記周辺視野画像とに基づいて、前記基準視野画像の各画素の補正ゲインを算出する補正ゲイン算出手段と、
該補正ゲイン算出手段により算出した補正ゲインに基づいて前記基準視野画像をシェーディング補正する補正手段と、
を備える顕微鏡システム。
【請求項２】
前記撮像手段が、前記所定視野範囲の中心の所定領域を含み前記所定視野範囲と互いに異なる周辺視野範囲の画像である周辺視野画像を複数撮像する請求項１に記載の顕微鏡システム。
【請求項３】
前記補正ゲイン算出手段が、前記周辺視野画像のうち前記基準視野画像との重複領域の輝度に対する前記所定視野範囲の中心の所定領域の輝度の比と、前記基準視野画像のうち前記周辺視野画像との重複領域の輝度に対する前記周辺視野範囲の中心の所定領域の輝度の比とに基づいて前記基準視野画像の各画素の補正ゲインを算出する請求項２に記載の顕微鏡システム。
【請求項４】
前記駆動手段が、前記試料の位置を前記光学系に対して前記基準視野画像の高さ方向及び幅方向にそれぞれ１／Ｎ（Ｎは３以上の奇数）ずつ移動可能であり、
前記撮像手段が、前記所定視野範囲の中心の所定領域を含み、前記所定視野範囲と高さ方向及び幅方向の少なくとも一方に１／Ｎずつずれた互いに異なる周辺視野範囲の画像である周辺視野画像を複数撮像する請求項２又は請求項３に記載の顕微鏡システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡システムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
顕微鏡によりスライドガラス上の標本の一部を高解像度に撮影した部分画像データを複数連結して標本全体の画像データを取得し、この画像データをＰＣのディスプレイ等に表示させて顕微鏡像として観察することができるバーチャルスライドが知られている。
顕微鏡において画像を撮影する場合、光源のムラや、光学系の不均一性、撮像素子等に起因して生じる明るさのムラであるシェーディングが発生する。シェーディングは光軸から遠ざかるにつれて暗くなるので、バーチャルスライドのように複数の部分画像データを連結する場合には、各部分画像データの境界部分において不自然な境界が生じたり、シェーディング自体が標本の模様のように見えたりする等の不具合がある。
【０００３】
このため、シェーディングの形状を較正画像として予め取得し、較正画像に基づいて補正を行う方法が知られている。このような補正を行う顕微鏡システムとして、特許文献１には、透過照明による観察時に標本を退避させて較正用画像データを取得し、落射照明による観察時には光を反射させて較正用画像データを取得することで、照明光の切り替えによって照明ムラが変化し、これに伴ってシェーディングが変化してもシェーディングを抑制することが記載されている。また、特許文献２には、蛍光観察時には均一な蛍光試料を較正試料として撮像する蛍光画像取得装置が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００６−１７１２１３号公報
【特許文献２】特開２００８−５１７７３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特許文献１に記載の顕微鏡システムでは、較正用画像データを取得するために、観察中の標本を一旦外す必要があるため煩雑となる。また、特許文献２のように較正試料を用いる場合は、較正試料の損壊や粉塵の付着がないことが必要であり、較正試料の管理が煩雑となる。そして、そもそも較正試料に適するような均一な蛍光試料を作成することが困難であり、好ましい補正を行うことができない場合がある。
【０００６】
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、より簡便、かつ、確実にシェーディング補正を行うことを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、試料を載せるステージと、前記試料の像を形成する光学系と、該光学系及び前記ステージの少なくとも一方を駆動することにより、前記試料と前記光学系とを相対的に移動させる駆動手段と、前記試料の所定視野範囲の画像である基準視野画像を撮像すると共に、前記駆動手段により前記試料の位置を前記光学系に対して相対的に移動させて、前記所定視野範囲内の所定領域を含み前記所定視野範囲と互いに異なる周辺視野範囲の画像である周辺視野画像を複数撮像する撮像手段と、前記基準視野画像と前記周辺視野画像とに基づいて、前記基準視野画像の各画素の補正ゲインを算出する補正ゲイン算出手段と、該補正ゲイン算出手段により算出した補正ゲインに基づいて前記基準視野画像をシェーディング補正する補正手段と、を備える顕微鏡システムを提供する。
【０００８】
本発明によれば、撮像手段により試料の所定視野範囲の画像である基準視野画像を撮像すると共に、光学系及びステージの何れか一方或いは両方を駆動手段により駆動して試料の位置を光学系に対して相対的に移動させながら、複数の周辺視野画像を撮像する。ここで、撮像手段により取得した画像の中心は、光軸と略一致するため画像のうち最も明るい領域であり、シェーディングが問題とならない領域である。一方、画像の外側領域は、光軸から離れた暗い領域となるため、シェーディングが問題となる領域である。
【０００９】
そこで、周辺視野画像として、所定視野範囲内の所定領域を含み所定視野範囲と互いに異なる周辺視野範囲の画像を複数撮像する。そして、前記基準視野画像と前記周辺視野画像とに基づいて、前記基準視野画像の各画素の補正ゲインを算出し、この補正ゲインに基づいて基準視野画像をシェーディング補正することで、簡便、かつ、確実にシェーディング補正を行うことができる。
【００１０】
上記した発明において、前記撮像手段が、前記所定視野範囲の中心の所定領域を含み前記所定視野範囲と互いに異なる周辺視野範囲の画像である周辺視野画像を複数撮像することが好ましい。
上述のように、画像の中心は、光軸と略一致するため画像のうち最も明るい領域であり、シェーディングが問題とならない領域であるので、複数の周辺視野画像に所定視野範囲の中心の所定領域を含ませることで、効率的にシェーディング補正を行うことができる。
【００１１】
上記した発明において、前記補正ゲイン算出手段が、前記周辺視野画像のうち前記基準視野画像との重複領域の輝度に対する前記所定視野範囲の中心の所定領域の輝度の比と、前記基準視野画像のうち前記周辺視野画像との重複領域の輝度に対する前記周辺視野範囲の中心の所定領域の輝度の比とに基づいて前記基準視野画像の各画素の補正ゲインを算出することが好ましい。
【００１２】
このようにすることで、基準視野画像と１つの周辺視野画像とから、互いの中心の所定領域に相当する領域の補正ゲインを算出することができ、少ない演算量で簡便にシェーディング補正を行うことができる。
【００１３】
上記した発明において、前記駆動手段が、前記試料の位置を前記光学系に対して前記基準視野画像の高さ方向及び幅方向にそれぞれ１／Ｎ（Ｎは３以上の奇数）ずつ移動可能であり、前記撮像手段が、前記所定視野範囲の中心の所定領域を含み、前記所定視野範囲と高さ方向及び幅方向の少なくとも一方に１／Ｎずつずれた互いに異なる周辺視野範囲の画像である周辺視野画像を複数枚撮像することが好ましい。
【００１４】
このようにすることで、各周辺視野画像において、基準視野範囲と当該周辺視野範囲との重複領域及びその境界が明確となり補正ゲインを算出する際の演算が容易となる。また、基準視野画像と当該周辺視野画像との位置合わせの誤差や、各中心の所定領域の輝度の相違により各重複領域間で補正ゲインが不連続に変化する場合にも、重複領域及びその境界に対する補正を容易に行うことができる。なお、基準視野画像と１つの周辺視野画像とから、互いの中心の所定領域に相当する領域の補正ゲインを算出する場合には、周辺視野画像を（Ｎ２−１）／２＋１枚撮像すれば基準視野画像の全画素の補正ゲインを算出することができる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、より簡便、かつ、確実にシェーディング補正を行うことができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の第１の実施形態に係る顕微鏡システムを示す全体構成図である。
【図２】本発明の第１の実施形態に係る顕微鏡システムのステージの正面図である。
【図３】基準視野画像及び周辺視野画像の例を示す説明図である。
【図４】本発明の第１の実施形態に係る顕微鏡システムによるシェーディング補正についてのフローチャートである。
【図５】基準視野画像及び周辺視野画像の例を示す説明図である。
【図６】基準視野画像及び周辺視野画像の例を示す説明図である。
【図７】基準視野画像及び周辺視野画像の例を示す説明図である。
【図８】基準視野画像及び周辺視野画像の例を示す説明図である。
【図９】基準視野画像及び周辺視野画像の例を示す説明図である。
【図１０】本発明の第２の実施形態に係る顕微鏡システムを示す全体構成図である。
【図１１】輝度のヒストグラムを積算した累積ヒストグラムを示す図である。
【図１２】本発明の第３の実施形態に係る顕微鏡システムを示す全体構成図である。
【図１３】本発明の第３の実施形態に係る顕微鏡システムによるシェーディング補正についてのフローチャートである。
【図１４】基準視野画像及び周辺視野画像の例を示す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（第１の実施形態）
本発明の第１の実施形態に係る顕微鏡システムについて、図面を参照して以下に説明する。
図１に示すように、顕微鏡システムは、標本（試料）Ａを観察する顕微鏡装置１と、顕微鏡装置１による標本Ａの観察像を撮像する撮像装置２と、顕微鏡装置１及び撮像装置２を制御する制御部８と、撮像装置２により取得した画像に対して所定の処理を施す画像処理部９とを備えている。
【００１８】
顕微鏡装置１の光源７から出射した照明光はコンデンサユニット６を経由してステージ４に設置された標本Ａを照明し、対物レンズ５及び図示しない結像レンズ（光学系）を介して撮像装置２の撮像面において標本Ａの像を結像する。
【００１９】
顕微鏡装置１のステージ４は後述する駆動機構制御部１２により駆動され、標本Ａを対物レンズ５及び結像レンズからなる光学系に対して相対的に移動させる。図２に、ステージ４を対物レンズ５側から俯瞰した正面図を示した。図２に示すように、ステージ４は、ホルダ９０２に固定され、ホルダ９０２には図示しないボールネジによりステッピングモータが接続されている。
【００２０】
ステージ４は、駆動機構制御部１２でステッピングモータを駆動させることにより図２中のＸＹ方向（対物レンズ５の光軸に対して直交する方向）に駆動され、この結果、標本Ａと光学系、延いては撮像装置２とを相対的に移動させることができる。標本Ａと撮像装置２とを相対的に移動させることで、照明口９０１を通過する光源７からの光を照明する位置及び撮像装置２の撮像素子に結像させる像が移動する。
【００２１】
なお、ステージ４を駆動する手段（アクチュエータ）としてはボールネジとステッピングモータに限られるものではなく、例えば超音波モータなどを使用してもよい。
また、駆動機構制御部１２は撮像装置２で取得した画像からテンプレートマッチング等による画像マッチングにより駆動座標を操作者に指示することで駆動位置を制御する。ただし、駆動座標の取得は画像マッチングに限定するものではなく、例えばステージ４に搭載したスケールの値を使用しても良い。
【００２２】
撮像装置２はＣＣＤ、ＣＭＯＳ等の撮像素子を備えたデジタルカメラであり、結像した像を撮像し、デジタル画像として制御部８に出力する。撮像装置２は、後述する撮像装置制御部１１により制御され、標本Ａの所定視野範囲の画像である基準視野画像（図３（Ａ）参照）を撮像すると共に、駆動機構制御部１２によりステージ４を駆動させて標本Ａの位置を光学系に対して相対的に移動させながら、所定視野範囲の中心の所定領域を含み所定視野範囲と互いに異なる周辺視野範囲の画像である周辺視野画像（図３（Ｂ）〜図３（Ｅ）参照）を複数撮像する。
【００２３】
制御部８は、撮像装置２を制御する撮像装置制御部１１とステージ４を制御する駆動機構制御部１２とを備え、撮像装置制御部１１により撮像装置２を、駆動機構制御部１２によりステージ４を夫々制御して所定の位置、所定枚数の画像、より具体的には、所定視野範囲の画像である基準視野画像、及び、所定視野範囲の中心の所定領域を含み所定視野範囲と互いに異なる周辺視野範囲の画像である周辺視野画像を複数取得し、取得したこれらの画像を画像処理部９に出力する。
【００２４】
画像処理部９は、補正ゲイン算出部１３及びシェーディング補正部１４を備えている。補正ゲイン算出部１３は、制御部８から入力された基準視野画像と周辺視野画像とに基づいて基準視野画像の各画素の補正ゲインを算出する。シェーディング補正部１４は、補正ゲイン算出部１３による補正ゲインに従って、基準視野画像にシェーディング補正を施し、シェーディングが補正された画像を取得する。
なお、ここで、シェーディングとは、光源のムラや光学系の不均一性、撮像装置の撮像素子等が原因となる明るさのムラをいい、シェーディング補正とは、これらのムラを補正することをいう。
【００２５】
以下、本発明の顕微鏡システムによるシェーディング補正の流れについて、図４のフローチャートに従って説明する。本実施形態においては、ステージ４は、標本Ａの位置を光学系、すなわち、撮像装置２に対して基準視野画像の高さ方向（Ｙ方向）及び幅方向（Ｘ方向）にそれぞれ１／３ずつ移動可能とされている。そして、撮像装置２が、所定視野範囲の中心の所定領域を含み、前記所定視野範囲と高さ方向及び幅方向の少なくとも一方に１／３ずつずれた互いに異なる周辺視野範囲の画像である周辺視野画像を４枚撮像することとして説明する。
【００２６】
ステップ２０１において所定視野範囲の基準視野画像を撮像し、ステップ２０２においてステージ４を駆動して標本Ａと撮像装置２とを相対的に移動させて視野範囲を異ならせ、再度ステップ２０１に戻って周辺視野画像を撮像し、再度ステップ２０２においてステージを移動させて先に撮像した周辺視野画像と視野範囲を異ならせ、再びステップ２０１に戻って周辺視野画像を撮像する。これを繰り返すことにより、１枚の基準視野画像と４枚の周辺視野画像とを撮像する。
【００２７】
具体的には、図３（Ａ）〜図３（Ｅ）中、基準視野画像（所定視野範囲）３０１、周辺視野画像（周辺視野範囲）３０２，３０３，３０４，３０５とする。また図３（Ｂ）〜図３（Ｅ）において各周辺視野画像３０２，３０３，３０４，３０５に対して、基準視野画像３０１を破線で示した。
【００２８】
すなわち、基準視野画像３０１が撮像された後（図３（Ａ））、ステージ４を基準視野画像の画像幅の３分の１右に駆動して周辺視野画像３０２を撮像し（図３（Ｂ））、ステージ４を基準視野画像の画像高さの３分の１下かつ画像幅の３分の１左に駆動して周辺視野画像３０３を撮像し（図３（Ｃ））、ステージ４を基準視野画像の画像高さの３分の１下に駆動して周辺視野画像３０４を撮像し（図３（Ｄ））、最後にステージ４を基準視野画像の画像幅の３分の１右かつ画像高さの３分の１下に駆動して周辺視野画像３０５を撮像して（図３（Ｅ））、ステップ２０３で撮像完了となり次のステップ２０４へ進む。
なお、各周辺視野画像の撮像の順番は任意であり、基準視野画像３０１と周辺視野画像３０２〜３０５の相対的位置関係は逆でもよい。
【００２９】
ステップ２０４〜ステップ２０７では、全ての周辺視野画像に対して、１枚ずつ基準視野画像と位置合わせ、輝度画像変換、ローパスフィルタ処理、補正ゲイン算出を行う。
【００３０】
ここで、図５に示すように、説明の便宜上、各画像の高さ及び幅を夫々３分の１ずつ分割すると、夫々の画像は、高さ及び幅が夫々３分の１となる中心領域及び中心領域を囲む８個の周辺領域とから構成される。例えば、図５（Ａ）に示した領域４０１は基準視野画像３０１の中心領域であると共に周辺視野画像３０３の周辺領域に相当し、領域４０２は基準視野画像３０１の周辺領域であると共に周辺視野画像３０３の中心領域に相当する。
【００３１】
ステップ２０４では、何れか１枚の周辺視野画像に対して基準視野画像と位置合わせを行う。すなわち、上述したステージ４の駆動方法、撮像方法によれば、基準視野画像３０１と周辺視野画像３０３とは、理論的には図５（Ａ）に示す位置で撮像されるが、ステージ４の位置決め精度や分解能などによってずれが生じる場合があるため、ステージ４のスケール値、ステッピングモータのパルス数、画像によるマッチングやそれらの組み合わせにより位置の調整を行い、基準視野画像と周辺視野画像の画素の対応をつけることで位置合わせを行う。
【００３２】
続いて、次のステップ２０５では、基準視野画像及び周辺視野画像がカラー画像である場合に、輝度画像変換を行う。ここでの輝度変換はＲＧＢ値を加重加算してもよく、ＲＧＢのうち任意の値を選択してもよい。ステップ２０６では、輝度変換後の画像に対してローパスフィルタによる処理を行う。これにより、位置合わせのエラーや収差による位置ずれの影響を補正することができる。
【００３３】
つまり、位置合わせで厳密な位置合わせができていない場合もしくは歪曲収差やコマ収差等の影響で位置合わせをできない場合が存在するためそのままゲインを算出するとゲインに構造が表れてしまう問題を解決するものであり、一般的にシェーディングは低周波領域に存在するためローパスフィルタをかけて構造成分の発生を抑えることを目的とする。ローパスフィルタの適用は、例えば、画像処理によるガウシアンフィルタの畳み込み演算や、平均フィルタを適用してもよく、画像をフーリエ変換した周波数領域におけるバンドパスフィルタを適用しても良い。
【００３４】
次のステップ２０７において、図５（Ｂ）及び図６を参照しつつ補正ゲインを算出する。図６（Ｆ）は、便宜上、基準視野画像乃至は周辺視野画像と同大きさ同形状の画像５０７を３分の１ずつに分割した領域を例示している。補正ゲイン算出は、画像５０７における中心領域Ｅを除くＡ〜Ｉの周辺領域の補正ゲインを算出する。
【００３５】
補正ゲイン算出の流れを周辺視野画像３０３を例に説明する。上述したように、領域４０１は基準視野画像３０１の中心領域であると共に周辺視野画像３０３の周辺領域に相当し、領域４０２は基準視野画像３０１の周辺領域であると共に周辺視野画像３０３の中心領域に相当する。
従って、周辺視野画像３０３の領域４０１は分割画像５０７の領域Ｃの補正ゲインを算出するのに用いられ、また周辺視野画像３０３の領域４０２は分割画像５０７の領域Ｇの補正ゲインを算出するのに用いられる。
【００３６】
補正ゲインは、基準視野画像の高さをＨ、幅をＷ，画像左上を原点とし、右側をＸ、下側をＹ座標としたとき、領域Ｃの補正ゲインを算出する場合、基準視野画像３０１の座標（ｘ’，ｙ’）の輝度値をｆ（ｘ’，ｙ’）、周辺視野画像３０３の（ｘ’，ｙ’）に対応する座標（ｘ，ｙ）の輝度値をｇ（ｘ，ｙ）としたとき、基準視野画像３０１の座標（ｘ’，ｙ’）＝（ｘ−Ｗ／３，ｙ＋Ｈ／３）であり、領域ＣのゲインＧａｉｎＣ（ｘ，ｙ）は次の（１）式で求めることができる。
ＧａｉｎＣ（ｘ，ｙ）＝ｆ（ｘ’，ｙ’）／ｇ（ｘ，ｙ）  ・・・（１）
【００３７】
また、領域Ｇの補正ゲインを算出する場合、基準視野画像３０１の座標（ｘ’，ｙ’）の輝度値をｆ（ｘ’，ｙ’）、周辺視野画像３０３の（ｘ’，ｙ’）に対応する座標（ｘ，ｙ）の輝度値をｇ（ｘ，ｙ）としたとき、基準視野画像３０１の座標（ｘ’，ｙ’）＝（ｘ＋Ｗ／３，ｙ−Ｈ／３）であり、領域ＧのゲインＧａｉｎＧ（ｘ，ｙ）は次の（２）式で求めることができる。
ＧａｉｎＧ（ｘ，ｙ）＝ｆ（ｘ’，ｙ’）／ｇ（ｘ，ｙ）  ・・・（２）
【００３８】
このようにすることで、１枚の周辺視野画像３０３のうち基準視野画像３０１と重複する周辺領域４０１の輝度に対する基準視野画像の中心領域４０１の輝度の比と、基準視野画像３０１のうち１枚の周辺視野画像３０３と重複する周辺領域４０２の輝度に対する周辺視野画像３０３の中心領域４０２の輝度の比とに基づいて基準視野画像における領域４０１，４０２すなわち、分割領域Ｃ及び分割領域Ｇの各画素の補正ゲインを算出することができる。
【００３９】
同様の手順で、１枚の周辺視野領域に対して、２つの領域の補正ゲインを算出することができる。そして、ステップ２０４の位置合わせ〜ステップ２０７の補正ゲインの算出を各周辺視野領域に対して行うことで、領域Ｅを除くＡ〜Ｉ領域に対する補正ゲインを算出することができる。なお、領域Ｅは中心領域なので補正ゲインは全て１とすることで、基準視野画像の全領域に対して各画素の補正ゲインが決定され、ステップ２０８により全領域完了の判断がなされ、次のステップ２０９へ進む。
【００４０】
ステップ２０９では、つなぎ目補正を行う。つなぎ目補正とは、上述した補正ゲインの演算に便宜的に用いた各領域Ａ〜Ｉの境界で不整合が起きると非常に目立ち、画質が低下するため、この境界部分を滑らかにするものである。つなぎ目補正としては、例えば、ガウシアンフィルタのようなローパスフィルタをかけることによってつなぎ目を滑らかに接続して補正する。
【００４１】
また、上述したステップ２０７では、補正ゲイン算出のために設定した領域の大きさを基準視野画像の高さ及び幅の３分の１としたが、図７のように変更することで重み合成を行っても良い。具体的には、図７では領域を３分の１に区切るのではなくそれより大きめに設定することで斜線部のように領域同士が重なって算出される。この重なった領域６０１を用いて補正を行う。
【００４２】
この他、図８（Ａ）に中心領域を駆動ピッチより大きく設定した場合の補正ゲインを示した。この場合、補正ゲインが境界付近６０２で重なって表れるため、図８（Ｂ）に示すグラフに従って、境界付近６０２の補正ゲインに位置による重みをかけて合成することで境界付近の不整合を補正することができる。また、中心領域を駆動ピッチより大きく設定せず、ローパスフィルタによってつなぎ目を滑らかにしてもよい。
【００４３】
以上述べた処理によって画像全体の補正ゲインを求めることができるため、ステップ２１０において、基準視野画像に補正ゲインを乗じることでシェーディングが補正された画像を得ることができる。また、補正ゲインを保持しておき、取得済み画像やライブ画像、画像連結用の画像へ適用してもよい。
【００４４】
このように、本実施形態にかかる顕微鏡システムによれば、基準視野画像と基準視野画像の中心の所定領域を含み互いに異なる視野範囲の周辺視野画像を複数撮像し、これらの画像に基づいて、基準視野画像の各画素の補正ゲインを算出し、この補正ゲインに基づいて基準視野画像をシェーディング補正するので、標本を画角から退避させたり、シェーディング補正のための専用の較正標本を準備したりすることなく、簡便、かつ、確実にシェーディング補正を行うことができる。
【００４５】
なお、光学系の調整ミス等によりシェーディングが発生しない領域が光軸近辺でない場合が生じる。この場合には、基準視野画像又は周辺視野画像の撮像に先立って、シェーディングが発生しない領域を指定する。領域の指定は、例えば、マウス、キーボード等のインターフェース機器を用いて使用者が画像処理部９に入力したり、画像処理部９に予め記憶された光学系の条件に従って自動的に設定したりすることとしてもよい。
【００４６】
シェーディングが発生しない領域を指定した場合、図９に示すように、指定した領域１６１の大きさで便宜的に基準視野画像を分割し、分割した画像１６０において、領域１６１がそれ以外の領域全てと重なるように周辺視野画像を取得する。領域分割数がＮだとすると相対位置関係が同じでも全て撮像する場合に最大でＮ枚、相対位置関係が同じ場合はどちらか一方のみ撮像する場合は最小で（Ｎ＋１）／２枚の周辺視野画像及び基準視野画像を取得することになる。なお、選択領域１６１は４角形に限定するものではなく、多角形や円などの図形でもよい。
【００４７】
なお、図１には透過照明観察にかかる構成を示したが、これに限定されるものではなく落射照明観察であってもよい。
【００４８】
また、ステージ４の駆動は、駆動機構制御部１２によるものに限られず、手動による駆動であってもよい。そして、ステージ４の駆動ピッチは、上述した基準視野画像の幅、高さの３分の１に限られず、Ｎ分の１（Ｎは３以上の奇数）でもよい。駆動ピッチを幅、高さのＮ分の１としたとき、例えば、図５（Ａ）の領域４０１、領域４０２のように画像をＮ×Ｎに分割した中心の領域がそれ以外の領域と重なるように駆動させながら撮像を繰り返せばよく、前述した３分の１ピッチと同様に基準視野画像と周辺視野画像の相対的位置が同じときに２度目の撮像をしないとすると（Ｎ×Ｎ＋１）/２枚の画像を取得すればよい。
【００４９】
また、取得画像枚数はこの方法に限定するものではなく、相対位置関係が同じ時でも撮像するものとして最大でＮ×Ｎ枚を撮像するようにしてもよい。この場合、取得時間は増えるが、駆動ピッチを小さくすれば補正のために使用する領域サイズも小さくできるため補正効果を高めることができ、取得画像枚数を増やすことで同じ領域で補正できるので標本によるばらつきを低減できる。
【００５０】
さらに、上記した実施形態においては、周辺視野画像を５枚取得する場合に付いて説明したが、例えば、基準視野画像と３分の１ずつずらした８枚の周辺視野画像の合計９枚の画像を取得してもよく、駆動ピッチがＮ（Ｎは奇数）の場合にはＮ×Ｎ枚の画像を取得してもよい。
【００５１】
（第２の実施形態）
以下、図１０を参照して本発明の第２の実施形態について説明する。
本実施形態に係る顕微鏡システムに適用される顕微鏡装置１は、図１０に示すように、励起光源７０１及び蛍光キューブ７０２を備え、励起光源７０１から照射された光が蛍光キューブ７０２、対物レンズ５を経由して蛍光試薬が塗布された標本Ａへ照射され、標本Ａから発せられた蛍光が対物レンズ５、蛍光キューブ７０２、不図示の結像レンズを介して撮像装置１の撮像面で結像する。
【００５２】
このような顕微鏡システムにおいては、以下のようにシェーディング補正を行う。すなわち、上述した図４のフローチャートを参照すると、基準視野画像と周辺視野画像と位置合わせ、輝度画像変換の後に、ローパスフィルタによる処理に先立って褪色補正を行う。  この褪色補正は、蛍光試薬の褪色による蛍光発光の低下を補正するものであり、図８に示す中心領域の重なり６０２を用いて６０２の輝度平均値の比を褪色補正ゲインとし、対象画像の全画素に適用することで補正する。これにより褪色による画像全体の明るさの変化を補正し、褪色のない画像を構築できる。ただし褪色の補正方法はこれに限定するものではなく、例えば、特開２０１１−９５０７３号公報に開示されているような累積ヒストグラムを利用した方法を適用してもよい。
【００５３】
図１１を参照して、累積ヒストグラムによる褪色補正の原理を説明する。前述したようにシェーディングの影響を受けないよう中心領域の重なり６０２に関して輝度のヒストグラムを積算した累積ヒストグラムを図１１に示す。グラフ１０２は先に取得した画像、グラフ１０１は後に取得した画像を示しており、グラフ１０１では褪色がおきて中心輝度付近で明るさの違いが顕著に現れているのに対して低輝度領域や高輝度領域ではほとんど変化がなく暗くなっていることがわかる。
【００５４】
このように輝度によって明るさの変化が異なるのは、変化が大きい中輝度では褪色による変化が発生しているが、低輝度は背景領域であるためほとんど変化せず、高輝度ではそこまでの光量で発光しているものがほとんどないことを示している。褪色補正はグラフ１０１をグラフ１０２に一致するよう補正することで達成される。そこで、基準画像の累積ヒストグラム１０２と補正対象画像の累積ヒストグラム１０１に基づいて、補正対象画像の累積ヒストグラム１０１を、基準画像の累積ヒストグラムに変換するルックアップテーブルを作成する。
【００５５】
つまり、そのルックアップテーブルを用いて階調補正された後の補正対象画像の累積ヒストグラム１０２が、基準画像の累積ヒストグラムと一致するようなルックアップテーブルを作成する。ルックアップテーブルは、ＲＧＢ別に作成する。具体的には、基準とする階調（輝度）をＩｏｕｔとし、基準画像の累積画素数をＳｏｕｔ（Ｉｏｕｔ）とし、補正対象画像の階調（輝度）をＩＩＮとし、補正対象画像をＳＩＮ（ＩＩＮ）とし、ルックアップテーブルが有する入出力関係をＬＵＴとするとき、ルックアップテーブルは以下の関係式（３）を満たす基準画像の階調Ｉｏｕｔと補正対象画像の階調ＩＩＮに対して、関係式（４）を満たす。
【００５６】
Ｓｏｕｔ（Ｉｏｕｔ）＝ＳＩＮ（ＩＩＮ）  ・・・（３）
Ｉｏｕｔ＝ＬＵＴ［ＩＩＮ］  ・・・（４）
【００５７】
以上のように作成したＬＵＴを用いて補正対象画像の階調を補正することで褪色を補正することができ、前述したように低輝度、高輝度部分のような変化の少ないところを強調することがないため、蛍光物質が存在しない領域や自家蛍光があるときにそれ以外の褪色が起きている領域のみを補正することができる。
【００５８】
以上のように、本実施の形態にかかる顕微鏡システムは、基準視野画像と基準視野画像の中心の所定領域を含み互いに異なる視野範囲の周辺視野画像を複数撮像し、これらの画像に基づいて、基準視野画像の各画素の補正ゲインを算出し、この補正ゲインに基づいて基準視野画像をシェーディング補正するので、標本を画角から退避させたり、シェーディング補正のための専用の較正標本を準備することなく、簡便、かつ、確実にシェーディング補正を行うことができる。
【００５９】
（第３の実施形態）
以下、図１２を参照して本発明の第３の実施形態について説明する。
本実施形態においては、制御部８が部分画像取得部１２１を備え、これに応じて画像処理部９が貼り合わせ部１２２を備えている。部分画像取得部１２１は、画像を貼り合わせて広視野な画像を構築するための画像取得を行う手段であり、撮像装置制御部１１を制御して取得した画像同士が画像端で重なるように駆動機構制御部１２を制御して駆動させながら部分画像を取得する。
【００６０】
このような顕微鏡システムにおいては、図１３のフローチャートに従って、以下のようにシェーディング補正を行う。具体的には、基準視野画像及び周辺視野画像を撮像からつなぎ目補正までは上述した第１の実施形態と同様に行われる（図４のステップ２０１〜ステップ２０９参照）ので、ステップ２０１〜ステップ２０９には同符号を付し、その説明を省略する。本実施形態においては、つなぎ目補正の後に、部分画像取得部１２１により部分画像を取得する。
【００６１】
図１４に示すように、ステップ１３１の部分画像１４１の取得は、ステージ４を駆動させて部分画像１と一部重なるように部分画像２を撮像し、同様にして９までを撮像する。ただし、撮像の順番及び枚数はこれに限定されるものではなくどのような順番で何枚撮像してもよい。
次のステップ１３２では、撮像した部分画像に既に算出されている補正ゲインを使って部分画像を補正する。これにより部分画像のシェーディングが補正され、部分画像の結合部での不自然さを除去できる。
【００６２】
このような部分画像取得とシェーディング補正を全ての部分画像に対して適用すると画像取得完了１３３となり次のステップ１３４へ進む。ステップ１３４では、部分画像貼り合わせを行う。すなわち、例えば、テンプレートマッチング等の画像マッチングを用いて部分画像の重なりの位置合わせを行った後合成を行う。ここで位置合わせは画像マッチングに限定されるものではなくステージ４の駆動量を用いてもよい。また、合成は、例えば図８（Ｂ）に示した重み付け合成などを行ってよい。
【００６３】
以上のように、本実施の形態にかかる画像貼り合わせ装置は、標本を退避させず、あるいは専用の較正標本を用いることなくシェーディング補正がなされた貼り合わせ画像を構築することができる。また、使用者は貼り合わせ画像取得の前に較正用画像を取得するといった手間をかけることなく自動的にシェーディング補正がなされた貼り合わせ画像を取得することができる。
【符号の説明】
【００６４】
１  顕微鏡装置
２  撮像装置
４  ステージ
５  対物レンズ
６  コンデンサユニット
７  光源
８  制御部
９  画像処理部
１１  撮像装置制御部
１２  駆動機構制御部
１３  補正ゲイン算出部
１４  シェーディング補正部
【図１】
0005940383.tif 000002
【図２】
0005940383.tif 000003
【図３】
0005940383.tif 000004
【図４】
0005940383.tif 000005
【図５】
0005940383.tif 000006
【図６】
0005940383.tif 000007
【図７】
0005940383.tif 000008
【図８】
0005940383.tif 000009
【図９】
0005940383.tif 000010
【図１０】
0005940383.tif 000011
【図１１】
0005940383.tif 000012
【図１２】
0005940383.tif 000013
【図１３】
0005940383.tif 000014
【図１４】
0005940383.tif 000015