(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アセチルＣｏＡを基質として有機酸ＣｏＡを生物化学的に合成し、ＣｏＡ転移酵素を用いて前記有機酸ＣｏＡのＣｏＡ脱離反応を酢酸の存在下で行う有機酸の製造方法であって、
アセチルＣｏＡを基質として有機酸ＣｏＡを与える酵素遺伝子群とＣｏＡ転移酵素遺伝子とを有する形質転換された微生物に酢酸を人為的に添加して培養し、前記有機酸を得ることを特徴とする有機酸の製造方法。
【請求項２】
ＣｏＡ転移酵素が、プロピオン酸ＣｏＡ転移酵素、またはそのホモログである請求項１に記載の有機酸の製造方法。
【請求項３】
有機酸が、炭素数３〜６のカルボン酸である請求項１または２に記載の有機酸の製造方法。
【請求項４】
有機酸が、炭素数３〜６のヒドロキシカルボン酸である請求項３に記載の有機酸の製造方法。
【請求項５】
有機酸が、３−ヒドロキシプロピオン酸、３−ヒドロキシブタン酸、３−ヒドロキシ吉草酸、または３−ヒドロキシヘキサン酸である請求項４に記載の有機酸の製造方法。
【請求項６】
アセチルＣｏＡを基質として３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを与える酵素遺伝子群とＣｏＡ転移酵素遺伝子とを有する形質転換された微生物を酢酸を人為的に添加して培養して３−ヒドロキシブタン酸を得る請求項１に記載の有機酸の製造方法。
【請求項７】
アセチルＣｏＡを基質として３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを与える酵素遺伝子群が、β−ケトチオラーゼ遺伝子またはそのホモログ、及びアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ遺伝子またはそのホモログであり、ＣｏＡ転移酵素遺伝子が、プロピオン酸ＣｏＡ転移酵素（ＰＣＴ）遺伝子またはそのホモログである請求項６に記載の有機酸の製造方法。
【請求項８】
微生物が、大腸菌、酵母、コリネバクテリウム、またはクロストリジウムである請求項１〜７のいずれかに記載の有機酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＣｏＡ転移酵素を用いる、生物化学的な有機酸類の製造方法に関する。さらに詳しく言えば、有機酸ＣｏＡのＣｏＡ脱離反応を触媒するＣｏＡ転移酵素を産生する形質転換された微生物を用いた、炭素収率及びエネルギー効率に優れた生物化学的な有機酸類の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
昨今、化石資源の枯渇や地球温暖化対策の観点から、再生可能資源による化学品製造プロセス、いわゆるバイオリファイナリーへの転換が求められている。特に、バイオマスから生物化学的に効率よく得られる種々の有機酸類について、次世代のケミカルブロックとしての応用が広く検討されている。例えば、ヒドロキシカルボン酸類は、精密有機化学品の合成原料の他、微生物により蓄積生産されることが知られるバイオポリエステル、ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）のモノマー単位としても知られる有用な化合物である。特に、代表的な微生物由来ＰＨＡであるポリ−３−ヒドロキシブタン酸については、その生分解性ポリマーとしての性質が注目を集めた１９８０〜１９９０年代を中心に、精力的にその生合成経路の解明や生産性向上が試みられた。近年、その構成単位である３−ヒドロキシブタン酸のケミカルブロックとしての将来性が再び注目され、様々な３−ヒドロキシブタン酸モノマーの生物化学的製法が提案されている。【０００３】
具体的には、微生物菌体内に蓄積されるポリ−３−ヒドロキシブタン酸を抽出し、その分解活性を持つ酵素あるいは微生物を作用させることにより加水分解し、モノマー単位である（Ｒ）−３−ヒドロキシブタン酸を得る方法（非特許文献１）、ポリ−３−ヒドロキシブタン酸生産菌の生体内で、ポリ−３−ヒドロキシブタン酸デポリメラーゼを高発現させることにより、生成する３−ヒドロキシブタン酸オリゴマーを逐次分解し、培養中に（Ｒ）−３−ヒドロキシブタン酸を得る方法（非特許文献２）、生体内の３−ヒドロキシブタン酸前駆体である３−ヒドロキシブチリルＣｏＡに、共発現させたホスホトランスブチリラーゼ（ｐｔｂ）、ブチレートキナーゼ（ｂｕｋ）を逐次作用させることにより、リン酸化反応との共役によってＣｏＡを脱離し、培養中に（Ｒ）−３−ヒドロキシブタン酸を得る方法（非特許文献３）、同じく３−ヒドロキシブチリルＣｏＡに、共発現させたチオラーゼを作用させＣｏＡを脱離し、培養中に３−ヒドロキシブタン酸を得る方法（非特許文献４）等が知られている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Calabia, B.P., Tokiwa, Y., 2004. Microbial degradation of poly(d-3-hydroxybutyrate) by a new thermophilic Streptomyces isolate. Biotechnol. Lett. 26, 15-19.
【非特許文献２】Lee, S.Y., Lee, Y., 2003. Metabolic engineering of Escherichia coli for production of enantiomerically pure (R)-(-)-hydroxycarboxylic acids. Appl. Environ. Microbiol. 69, 3421-3426.
【非特許文献３】Gao, H.J., Wu, Q., Chen, G.Q., 2002. Enhanced production of d-(-)-3-hydroxybutyric acid by recombinant Escherichia coli. FEMS microbiol. Lett. 213, 59-65.
【非特許文献４】Tseng et al., "Metabolic Engineering of E. coli for Enhanced Production of (R)- and (S)-3-Hydroxybutyrate", 2009, Appl. Environ. Microbiol., 75, 3137-3145.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、これら提案されている製法の経済性は十分とは言えず、さらなる生産性の向上が求められている。例えば、非特許文献１の方法では醗酵、抽出、分解という煩雑な工程が必要である。非特許文献２の方法では、嫌気醗酵によりポリ−３−ヒドロキシブタン酸を生産させてから加水分解するため生産速度が遅い。非特許文献３及び４の方法では、炭素収率が低く、３−ヒドロキシブタン酸の生産性が十分でない。
従って、本発明の課題は、生成速度、炭素収率及びエネルギー効率に優れた有機酸類、特に３−ヒドロキシブタン酸モノマーの生物化学的な製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、前記非特許文献１〜４に記載されている知見を精査し、ＣｏＡとの共役による有機酸生合成経路における本質的な反応効率の向上を目指して、鋭意研究を行った。その結果、反応系内に添加した酢酸の存在下で、少なくともアセチルＣｏＡを基質として有機酸ＣｏＡを生物化学的に合成し、ＣｏＡ転移酵素により前記有機酸ＣｏＡのＣｏＡ脱離反応を行うことにより、有機酸類の生産性を効果的に向上できることを見出し、本発明を完成した。【０００７】
すなわち本発明は、以下の［１］〜［９］に示す有機酸の製造方法に関する。
［１］アセチルＣｏＡを基質として有機酸ＣｏＡを生物化学的に合成し、ＣｏＡ転移酵素を用いて前記有機酸ＣｏＡのＣｏＡ脱離反応を酢酸の存在下で行うことを特徴とする有機酸の製造方法。
［２］ＣｏＡ転移酵素が、プロピオン酸ＣｏＡ転移酵素、またはそのホモログである前項１に記載の有機酸の製造方法。
［３］有機酸が、炭素数３〜６のカルボン酸である前項１または２に記載の有機酸の製造方法。
［４］有機酸が、炭素数３〜６のヒドロキシカルボン酸である前項３に記載の有機酸の製造方法。
［５］有機酸が、３−ヒドロキシプロピオン酸、３−ヒドロキシブタン酸、３−ヒドロキシ吉草酸、または３−ヒドロキシヘキサン酸である前項４に記載の有機酸の製造方法。
［６］アセチルＣｏＡを基質として有機酸ＣｏＡを与える酵素遺伝子群とＣｏＡ転移酵素遺伝子とを有する形質転換された微生物を酢酸の存在下で培養して有機酸を得る前項１〜５のいずれかに記載の有機酸の製造方法。
［７］アセチルＣｏＡを基質として３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを与える酵素遺伝子群とＣｏＡ転移酵素遺伝子とを有する形質転換された微生物を酢酸の存在下で培養して３−ヒドロキシブタン酸を得る前項６に記載の有機酸の製造方法。
［８］アセチルＣｏＡを基質として３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを与える酵素遺伝子群が、β−ケトチオラーゼ遺伝子またはそのホモログ、及びアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ遺伝子またはそのホモログであり、ＣｏＡ転移酵素遺伝子が、プロピオン酸ＣｏＡ転移酵素（ＰＣＴ）遺伝子またはそのホモログである前項７に記載の有機酸の製造方法。
［９］微生物が、大腸菌、酵母、コリネバクテリウム、またはクロストリジウムである前項６〜８のいずれかに記載の有機酸の製造方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明は、少なくともアセチルＣｏＡを基質として生物化学的に合成した有機酸ＣｏＡのＣｏＡの脱離を伴う様々な有機酸の製造方法において、反応系内に添加した酢酸の存在下で有機酸のＣｏＡ脱離反応と共役する酢酸のＣｏＡ転移反応を用いる有機酸の製造方法を提供するものである。【０００９】
本発明によれば、ＣｏＡとの共役による有機酸生合成経路において、活性な中間体である有機酸ＣｏＡの自由エネルギーが、系内に存在させる酢酸との共役によるＣｏＡ転移反応で、アセチルＣｏＡとして回収される。生じるアセチルＣｏＡは、有機酸生合成の原料アセチルＣｏＡと等価であり、再び有機酸生合成経路に取り込まれ、その自由エネルギーは炭素骨格伸長反応に再利用される。また、この過程で供給された酢酸自体も、有機酸生合成経路の炭素骨格源として利用され、物質的なロスを生じることがなく、生成速度、エネルギー効率及び炭素収率のいずれにおいても優れた有機酸の生物化学的合成が達成される。【００１０】
本発明の方法では、反応系内に添加した酢酸の存在下で反応を行うことが必須である。なお、多くの微生物において、その糖質等を利用した増殖過程で副生物として酢酸を排出することが通常に知られている。本発明においても、このように副生する酢酸が目的とする有機酸合成におけるＣｏＡ転移のドナーとして利用され、さらに転移反応で生じるアセチルＣｏＡは有機酸合成の炭素骨格として利用され、培地炭素源の目的反応への有効活用にも寄与する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１で構築したプラスミドｐＴＶ１１８ＮｐｃｔＡＢの遺伝子地図である。
【図２】比較例３で構築したプラスミドｐＴＶ１１８ＮＡＢの遺伝子地図である。
【図３】実施例８のＧＣ／ＭＳクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の方法で合成の対象となる有機酸は、少なくともアセチルＣｏＡを基質とした反応によりその前駆体となる有機酸ＣｏＡを得ることができ、当該有機酸ＣｏＡが酢酸共役的ＣｏＡ脱離に用いる転移酵素の基質となるものであれば、特に限定されない。通常知られるＣｏＡ転移酵素の基質特異性の観点から、炭素数３〜６のカルボン酸が好ましく、炭素数３〜６のヒドロキシカルボン酸がさらに好ましい。具体的には、３−ヒドロキシプロピオン酸、３−ヒドロキシブタン酸、３−ヒドロキシ吉草酸、３−ヒドロキシヘキサン酸等が挙げられる。
【００１３】
アセチルＣｏＡを基質とし、かつ酢酸共役的ＣｏＡ脱離に至る前駆体である有機酸ＣｏＡを供給する、反応経路及び酵素群は目的とする有機酸に応じて任意に選択することができる。例えば、３−ヒドロキシブタン酸を目的とする反応工程において、その酢酸共役的ＣｏＡ脱離の前駆体である３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを得る反応は、２分子のアセチルＣｏＡより、１分子のＣｏＡ脱離を伴いアセトアセチルＣｏＡを与える、β−ケトチオラーゼ（ＥＣ：２．３．１．９）またはそのホモログ、さらに生じたアセトアセチルＣｏＡを還元し３-ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを与える、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼまたはそのホモログの二段階の酵素反応の組み合わせにより達成される。なお、本願明細書及び請求の範囲においては、特に記載の無い限り、当該アセトアセチルＣｏＡレダクターゼには、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼという名称の酵素（ＥＣ：１．１．１．３６；（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ生成）の他に、同等の反応を触媒することが知られる３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ：１．１．１．３５；（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ生成）、３−ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ：１．１．１．１５７；（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ生成）等も含まれる。
【００１４】
本発明で用いられる、酢酸共役的ＣｏＡ脱離のための転移酵素も目的とする有機酸に応じて任意に選択することができる。例えば、３−ヒドロキシブタン酸を目的とする反応工程においては、プロピオン酸ＣｏＡ転移酵素（ＥＣ：２．８．３．１）またはそのホモログを用いることができる。
【００１５】
本発明により得られる有機酸の光学選択性は、前述のようにして得られる有機酸ＣｏＡの光学選択性、あるいは当該有機酸ＣｏＡの生合成経路において任意に選択される酵素反応の光学選択性に依存し、本発明のＣｏＡ転移酵素反応の適用は有機酸の光学選択性に影響を及ぼさない。すなわち、本発明は、前駆体である有機酸ＣｏＡを得る反応経路のキラリティを適切に選択することにより、任意の所望の光学活性体の製造に適用することができる。例えば、３−ヒドロキシブタン酸を目的とする反応工程において、一例として選択されるプロピオン酸ＣｏＡ転移酵素（ＰＣＴ）は、（Ｓ）体、（Ｒ）体いずれの３−ヒドロキシブチリルＣｏＡに対しても、酢酸をアクセプターとしたＣｏＡ転移を行うことができる。キラルな３−ヒドロキシブタン酸を得るには、その前駆体である３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ、あるいはその生成経路に適用される酵素の光学選択性を適切に選択すればよい。例えば、アセトアセチルＣｏＡより、ラルストニア（Ralstonia）属微生物に由来するアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＰｈａＢ）によれば（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡが、また例えばクロストリジウム（Clostridium）属微生物に由来するアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ｈｂｄ）によれば（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡが得られることが知られている。これらの工程と、本発明の酢酸共役的ＣｏＡ転移酵素とを組み合わせることにより、それぞれ（Ｒ）−３−ヒドロキシブタン酸、（Ｓ）−３−ヒドロキシブタン酸が得られる。
【００１６】
本発明を実施する好適な一つの形態では、前記のように、求める有機酸に応じて選ばれる一連の酵素群を、遺伝子組み換えにより形質転換された微生物体内で共発現させる。例えば、３−ヒドロキシブタン酸の生産にあたっては、前述の各酵素、すなわちβ−ケトチオラーゼ（ＥＣ：２．３．１．９）またはそのホモログ、及びアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ：１．１．１．３５、ＥＣ：１．１．１．３６、ＥＣ：１．１．１．１５７）またはそのホモログ、プロピオン酸ＣｏＡ転移酵素（ＥＣ：２．８．３．１）またはそのホモログをそれぞれコードする遺伝子を個別に、または一連のクラスターとして任意のベクターに挿入し宿主微生物を形質転換する。このような形質転換体を、適当な炭素源、例えばグルコースを炭素源とする培地により培養し、各遺伝子を発現させる。例えば、当該宿主で構成発現しうる遺伝子の場合にはそのまま、各遺伝子をベクター上に配されたレギュレーターの制御下に構成した場合には誘導基質の添加、誘導的環境への移行等により、それぞれのコードする遺伝子を発現させる。さらに、酢酸共役的ＣｏＡ転移の基質となる酢酸を共存させることにより、宿主の解糖系により供給されるアセチルＣｏＡを反応原料とした一連の反応が進行し、本発明の目的の一つである３−ヒドロキシブタン酸の合成が高効率で達成される。
【００１７】
本発明に用いられる、各酵素をコードする遺伝子の例としては、ラルストニア（Ralstonia）属微生物に由来するβ−ケトチオラーゼ（ＰｈａＡ）遺伝子、ラルストニア（Ralstonia）属微生物に由来するアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＰｈａＢ）遺伝子、及びメガスフェラ（Megasphaera）属またはクロストリジウム（Clostridium）微生物に由来するプロピオン酸ＣｏＡ転移酵素（ＰＣＴ）遺伝子が挙げられる。また、本発明に用いられる形質転換宿主微生物としては、遺伝子組み換え技術が適用できる限りにおいては特に限定されない。産業上の利用に好適なものとしては、大腸菌、酵母、コリネ型細菌、クロストリジウム属細菌等が挙げられる。酵母としてはサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロマイセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、クリベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、クリベロマイセス・マルキシアヌス(Kluyveromyces marxianus)等が挙げられる。コリネ型細菌としてはコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)、コリネバクテリウム・エフィシエンス(Corynebacterium efficiens)、ブレビバクテリウム・ディバリカタム(Brevibacterium divaricatum)、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム(Brevibacterium saccharolyticum)、ブレビバクテリウム・インマリオフィルム(Brevibacterium immariophilum)、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium lactofermentum)、ブレビバクテリウム・ロゼウム(Brevibacterium roseum)、ブレビバクテリウム・フラバム(Brevibacterium flavum)、ブレビバクテリウム・チオゲニタリス(Brevibacterium tiogenitalis)、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム(Corynebacterium acetoacidophilum)、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム(Corynebacterium acetoglutamicum)、コリネバクテリウム・カルナエ(Corynebacterium callunae)、コリネバクテリウム・リリウム(Corynebacterium lilium)、コリネバクテリウム・メラセコーラ(Corynebacterium melassecola)、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム(Microbacterium ammoniaphilum)等が挙げられる。クロストリジウム属細菌としては、クロストリジウム・クリベリ(Clostridium kluyveri)、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)、クロストリジウム・アミノブチリカム(Clostridium aminobutyricum)、クロストリジウム・ベイジェリンキー(Clostridium beijerinckii)、クロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)などが挙げられる。これらのうち、大腸菌、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces Cerevisiae)、シゾサッカロマイセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)は形質転換が容易なことから好適に用いられ、特に大腸菌は好適である。なお、アセチルＣｏＡ以降、目的とする生合成経路を構成する酵素遺伝子のすべてが外来遺伝子として形質転換により提供される必要はなく、その一部に宿主の元来保有する酵素遺伝子を利用する形で生合成経路を構成することもできる。さらに、アセチルＣｏＡの供給もまた、宿主由来の代謝経路をそのまま利用するだけでなく、遺伝子増幅や外来遺伝子の導入、分岐経路のノックアウトなど代謝工学的な既知の手法を用いて、その供給能力を向上させて用いることができる。
【００１８】
なお、本発明で言うホモログは、オーソログ及びパラログを包含している。本明細書において、オーソログとは、共通祖先の遺伝子から種分化によって生じた種間で対応する遺伝子、及びその遺伝子より得られる酵素を言い、パラログとは、同種内において種分化でなく遺伝子重複によって生じた遺伝子、及びその遺伝子より得られる酵素の組を言い、ホモログとは、オーソログかパラログかに関係なく配列に同一性がある遺伝子、及びその遺伝子より得られる酵素を言うものとする。なお、こうしたホモログは、適当なデータベースに対するホモロジー検索プログラム（ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等）の適用、または上記同定遺伝子一部または全部からなるプローブを用いたハイブリダイゼーション、ＰＣＲ等、常法に基づいて、遺伝子として、もしくはその遺伝子による形質転換等によって得られる酵素として取得することができる。
【００１９】
本発明において、有機酸ＣｏＡ合成の基質となるアセチルＣｏＡは、好適には、上記のような組み換え体による生産においては、宿主の持つ解糖系により、培養に用いる任意の炭素源、例えばグルコース等の糖質を由来として供給される。アセチルＣｏＡはまた、有機酸合成経路の酢酸共役的ＣｏＡ転移の共役基質として添加される酢酸を由来とし、当該反応の進行で生じるアセチルＣｏＡとしても同時に供給される。すなわち、培養あるいは反応の主原料である糖質等の炭素源に加えて、本反応で追加される酢酸は、有機酸ＣｏＡのＣｏＡ転移反応の共役基質として消費されるだけでなく、反応の進行とともにアセチルＣｏＡに変換されることにより、目的とする有機酸の合成基質、及び有機酸合成の自由エネルギー源として回収されることとなり、高効率に寄与する。
【００２０】
酢酸を反応系内に供給する方法に特に制限はなく、微生物の耐性の範囲においてあらかじめ培地に添加しておく他、反応の進行に応じて連続的に添加してもよい。培養の至適ｐＨに合わせて、あらかじめアルカリと混合してｐＨを調整してから添加してもよいし、酢酸塩の形で添加してもよい。酢酸塩としては酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム等を好適に用いることができる。また人為的に培養あるいは反応過程に添加する酢酸のみでなく、微生物の代謝副産物として培養中に生成する酢酸も反応に利用され、反応系全体の物質収支の改善に寄与する。そのため、反応全体で供給する酢酸量は、有機酸合成において消費される主原料由来のアセチルＣｏＡ量、及びＣｏＡ転移の共役基質として要求され、アセチルＣｏＡとして回収される酢酸量、また培養過程で発酵副生する酢酸量等を量論的に勘案し、適切に調節することも好ましい。さらに、培養条件の調整や、宿主の代謝経路改変等により、酢酸の人為的な添加と合わせて、主原料である糖質から理論等量分の酢酸が生成し、酢酸共役的ＣｏＡ転移反応に必要な量供給されるよう調整することもできる。なお、本発明の要件である「供給した酢酸の存在下」とは、通常知られる酢酸の分析方法により酢酸が検知される状態で存在することのみを意味しない。すなわち、供給される酢酸が逐次、反応に消費される反応中間体として反応経路上に存在することをも含む。このような酢酸の存在の態様は、直接酢酸としての検知が困難であっても、酢酸が供給され、かつ反応経路に取り込まれている事実として、例えば、同位体ラベル化酢酸を共存させ、質量分析計により逐次反応物、生成物を追跡する、いわゆる代謝フラックス解析等の常法により確認することができる。
【実施例】
【００２１】
以下に実施例及び比較例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の記述により限定されるものではない。【００２２】
［３−ヒドロキシブタン酸の生産（１）］
実施例１：
組み換え微生物の作製：
メガスフェラ・エルスデニ（Megasphaera elsdenii）ＡＴＣＣ２５９４０株（American Type Culture Collection所蔵）培養菌体より、既知遺伝子配列情報より作成したプライマーを用いるＰＣＲ法により、約１．６ｋｂｐのプロピオン酸ＣｏＡ転移酵素（ＰＣＴ）遺伝子断片を調製した。同様にして、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）Ｈ１６株（ＡＴＣＣ１７６９９として同機関所蔵）培養菌体より、β−ケトチオラーゼ（ＰｈａＡ）、及び同株由来アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＰｈａＢ）の２つの酵素をコードする約２．３ｋｂｐの一連の遺伝子領域を、その上流の同株由来プロモーター様領域を含む断片として取得した。なおプライマーの設計及びクローニングに際しては、ＰＣＴについてタグチ（Taguchi）らの文献（PNAS，vol.105, No.45, p.17323(2008)）、ＰｈａＡ、ＰｈａＢについてはピープルズ（Peoples）らの文献（J. Biol. Chem. Vol.264, No.26, p.15293-(1989))を参照した。これらを、常法によりベクタープラスミドｐＴＶ１１８Ｎ（タカラバイオ社製）のマルチクローニングサイトに挿入し、大腸菌で発現可能なプラスミドｐＴＶ１１８ＮｐｃｔＡＢを構築した。当該プラスミドの遺伝子地図を図１に示す。
得られたプラスミドを用い、大腸菌ＪＭ１０９株を常法により形質転換し、上記３遺伝子により形質転換された大腸菌株を取得した。【００２３】
実施例２及び比較例１：
培養試験：
得られた形質転換体を、アンピシリン５０ｍｇ／Ｌを含むＬＢ寒天培地で３７℃、一昼夜培養したのち、同液体培地５ｍＬに１白金耳植菌し、１２時間培養した。
得られた培養液１００μＬを、アンピシリン５０ｍｇ／Ｌ、グルコース２０ｇ／Ｌ、さらに酢酸をグルコースに対し１モル等量（約６．７ｇ／Ｌ）含む５００ｍＬフラスコ中の１００ｍＬのＬＢ培地に移植し、３０℃、４８時間振盪培養した（実施例２）。
また、酢酸を含まない他は同一組成の培地に移植し、同様に３０℃、４８時間振盪培養した（比較例１）。
培養４８時間目のそれぞれの培養物の遠心上清を、０．４５μｍの除菌フィルターに通し、その原液１０μＬを、下記条件のＨＰＬＣに供した。
標品として、０．１質量％濃度の試薬３-ヒドロキシブタン酸（シグマアルドリッチ社製）水溶液を同様にＨＰＬＣに供試した。培養物サンプルより当該標品と同一保持時間に得られたピーク面積との相対値より、培養液中に生成した３−ヒドロキシブタン酸の濃度（ｇ／Ｌ）を測定した。
ＨＰＬＣ条件：
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ  ＳＨ−１０１１（昭和電工製）、
カラム温度：６０℃、
移動相：希硫酸（５ｍＭ）、
流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、
検出：示差屈折検出器。【００２４】
結果を表１に示す。酢酸添加により、生成物量の増大とともに、炭素源投入量あたりの収量にも改善が認められた。
【表１】
0006054872.tif 000002
【００２５】
［３−ヒドロキシブタン酸の生産（２）］
実施例３：
組み換え微生物の作製：
プラスミドｐＴＶ１１８ＮｐｃｔＡＢを用い、大腸菌ＢＷ２５１１３株を常法により形質転換し、ＰｈａＡ、ＰｈａＢ及びＰＣＴの３遺伝子により形質転換された大腸菌株を取得した。【００２６】
実施例４及び比較例２：
培養試験：
実施例３で作製した形質転換体を使用した他は実施例２、比較例１と同様にして、酢酸を含む培地（実施例４）及び酢酸を含まない培地（比較例２）で培養し、同条件のＨＰＬＣにより培養液中に生成した３−ヒドロキシブタン酸の濃度（ｇ／Ｌ）を測定した。【００２７】
結果を表２に示す。酢酸添加により、生成物量の増大とともに、炭素源投入量あたりの収量にも改善が認められた。
【表２】
0006054872.tif 000003
【００２８】
［３−ヒドロキシブタン酸の生産（３）］
比較例３：
組み換え微生物の作製：
実施例１のＰＣＴ遺伝子断片を除いた他は実施例１と同様にして、ＰｈａＡ及びＰｈａＢの２つの酵素をコードする約２．３ｋｂｐのＤＮＡ断片をベクタープラスミドｐＴＶ１１８Ｎのマルチクローニングサイトに挿入し、大腸菌で発現可能なプラスミドｐＴＶ１１８ＮＡＢを構築した。当該プラスミドの遺伝子地図を図２に示す。
得られたプラスミドを用い、大腸菌ＢＷ２５１１３株を常法により形質転換し、ＰｈａＡ及びＰｈａＢの２遺伝子により形質転換された大腸菌株を取得した。【００２９】
比較例４〜８及び実施例５〜７：
培養試験：
実施例３及び比較例３で得られた形質転換体を、グルコース１０ｇ／Ｌ、表３に示す各種濃度の酢酸、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌを含むＬＢ液体培地１．５ｍＬを入れた試験管中で、３０℃、２４時間振盪培養した（比較例５〜８及び実施例５〜７）。形質転換していない大腸菌ＢＷ２５１１３株も同様に培養した（比較例４）。酢酸は水酸化ナトリウムでｐＨ７．０になるように中和し、０．２μｍの除菌フィルターに通したものを培地に添加した。
培養２４時間目のそれぞれの培養物の遠心上清を、０．２μｍの除菌フィルターに通し、その原液１０μＬを、下記条件のＨＰＬＣに供した。
標品として、０．１質量％濃度の試薬３-ヒドロキシブタン酸、酢酸、グルコース（シグマアルドリッチ社製）水溶液を同様にＨＰＬＣに供試した。培養物サンプルより当該標品と同一保持時間に得られたピーク面積との相対値より、培養液中に生成した３−ヒドロキシブタン酸、酢酸、グルコースの濃度を測定した。得られた測定値から、グルコースの消費量及び３−ヒドロキシブタン酸の生成速度を算出した。
また、培養２４時間目の培養液のＯＤ６００及びｐＨを測定した。
ＨＰＬＣ条件：
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ  ＳＨ−１０１１（昭和電工製）、
カラム温度：６０℃、
移動相：希硫酸（５ｍＭ）、
流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、
検出：示差屈折検出器。【００３０】
結果を表３に示す。形質転換していない大腸菌では、十分に生育はしたものの、３−ヒドロキシブタン酸は生成しなかった（比較例４）。ＰＣＴ遺伝子を含まずＰｈａＡ及びＰｈａＢの２遺伝子で形質転換された大腸菌も十分に生育はしたものの、酢酸の添加の有無に関わらず３−ヒドロキシブタン酸は生成しなかった（比較例５〜７）。一方、ＰｈａＡ、ＰｈａＢ及びＰＣＴの３遺伝子により形質転換された大腸菌では、酢酸の添加の有無に関わらず３−ヒドロキシブタン酸を生成した（比較例８、実施例５〜７）。酢酸を添加していない培地で培養した時（比較例８）と比べて、酢酸を添加した培地で培養した時（実施例５〜７）に３−ヒドロキシブタン酸の生成量が顕著に増大した。また、実施例５〜７では、グルコースの消費量が増大するとともに、３−ヒドロキシブタン酸の生成速度が顕著に増加した。これは、培地中に添加した酢酸がＣｏＡ受容体として機能し、ＰＣＴのＣｏＡ転移反応により速やかにアセチルＣｏＡが生成し、それに共役して３−ヒドロキシブタン酸ＣｏＡから３−ヒドロキシブタン酸が速やかに生成すること、及びグルコースから生成する酢酸もＰＣＴによりアセチルＣｏＡに再生されること、さらにそのようにして生成したアセチルＣｏＡを基質として３−ヒドロキシブタン酸を生成するというＣｏＡをリサイクルして３−ヒドロキシブタン酸の生成を促進する代謝経路が成立したことにより、糖代謝と３−ヒドロキシブタン酸の生成が亢進したためと考えられる。
【表３】
0006054872.tif 000004
【００３１】
［炭素フラックス解析］
実施例８：
培地中に添加した酢酸が３−ヒドロキシブタン酸に変換されていることを証明するため、安定同位体13Ｃで標識した酢酸を培地中に添加して実施例５と同様に培養試験を行い、生成する３−ヒドロキシブタン酸に含まれる13Ｃを測定した。培養後の３−ヒドロキシブタン酸及び酢酸の濃度はそれぞれ４．１ｇ／Ｌ、２．３ｇ／Ｌとなり、非標識酢酸を用いた実施例５と同等であった。実施例５及び実施例８の培養液を遠心して得た培養上清を０．２μｍの除菌フィルターに通して除菌した後、真空乾燥し、アライらの方法（Arai Y, et al. Plant Cell Physiol. Vol.43, p.555(2002)）に従い、クロロホルム中でエタノール、塩酸と共に加熱し、３−ヒドロキシブタン酸エチルを得た。得られたエチルエステルをＧＣ／ＭＳスペクトロメーター（GCMS-QP2010Plus、島津製作所製）を用いて分析し、３−ヒドロキシブタン酸に含まれる13Ｃを測定した。結果のＧＣ／ＭＳクロマトグラムを図３に示す。
３−ヒドロキシブタン酸エチルはｍ／ｚ＝１１７のイオンフラグメントを生じる。図３から明らかなように、13Ｃで標識した酢酸の存在下で生成した３−ヒドロキシブタン酸に由来するエチルエステルは、ｍ／ｚ＝１１８及び１１９のイオンフラグメントを含んでいることが分かった。すなわち、培地中に添加した酢酸は３−ヒドロキシブタン酸に取り込まれており、培地に添加した酢酸が３−ヒドロキシブタン酸に変換されていることが証明された。
各クロマトグラムのピーク面積比から、３−ヒドロキシブタン酸中の酢酸由来炭素の比率は３４％と推定される。残りの６６％はグルコース由来と考えられる。表３に示した実施例５のグルコース消費量及び３−ヒドロキシブタン酸生成量のモル濃度はそれぞれ４２ｍＭ、４４ｍＭであり、グルコースから３−ヒドロキシブタン酸の炭素収率は約７０％となり、高い炭素収率でグルコースから３−ヒドロキシブタン酸が得られることが分かった。
【図１】
0006054872.tif 000005
【図２】
0006054872.tif 000006
【図３】
0006054872.tif 000007