(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
過分極［13Ｃ，2Ｈ］乳酸塩アイソトポマーを含んでなるＭＲイメージング媒体。
【請求項２】
［13Ｃ，2Ｈ］乳酸塩アイソトポマーが、［１−13Ｃ，２−2Ｈ］乳酸塩、［２−13Ｃ，２−2Ｈ］乳酸塩、［３−13Ｃ，２−2Ｈ］乳酸塩、［１−13Ｃ，２，３−2Ｈ］乳酸塩、［２−13Ｃ，２，３−2Ｈ］乳酸塩及び［３−13Ｃ，２，３−2Ｈ］乳酸塩からなる群から選択される、請求項１記載のＭＲイメージング媒体。
【請求項３】
［13Ｃ，2Ｈ］乳酸塩アイソトポマーのＣ１、Ｃ２及びＣ３位置の２以上が13Ｃ標識され、かつＣ２位置又はＣ２及びＣ３位置が重水素標識されている、請求項１記載のＭＲイメージング媒体。
【請求項４】
さらにトリチルラジカル及び任意には常磁性金属イオンを含む、請求項１乃至請求項３のいずれかに記載のＭＲイメージング媒体。
【請求項５】
前記常磁性金属イオンが存在し、Ｇｄ3+を含む常磁性キレートである、請求項４記載のＭＲイメージング媒体。
【請求項６】
乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性を決定するための請求項１乃至請求項５のいずれかに記載のＭＲイメージング媒体。
【請求項７】
ＬＤＨ活性が、［13Ｃ，2Ｈ］乳酸塩と内因性非標識乳酸塩との間における重水素標識のＬＤＨで触媒される交換を測定することを含む13Ｃ−ＭＲ検出によって決定される、請求項６記載のＭＲイメージング媒体。
【請求項８】
ヒト又はヒト以外の動物におけるＬＤＨ活性のインビボ決定のための、請求項６又は請求項７記載のＭＲイメージング媒体。
【請求項９】
ヒト又はヒト以外の動物から導かれる細胞培養物、身体試料、エクスビボ組織或いは単離器官におけるＬＤＨ活性のインビトロ決定のための、請求項６又は請求項７記載のＭＲイメージング媒体。
【請求項１０】
ＬＤＨ活性マップの作成のための、請求項６乃至請求項９のいずれかに記載のＭＲイメージング媒体。
【請求項１１】
［13Ｃ，2Ｈ］乳酸塩と内因性非標識乳酸塩との間における重水素標識のＬＤＨで触媒される交換が、異核13Ｃ／1Ｈスピンエコーイメージングを用いてモニターされる、請求項７記載のＭＲイメージング媒体。
【請求項１２】
［13Ｃ，2Ｈ］乳酸塩と内因性非標識乳酸塩との間における重水素標識のＬＤＨで触媒される交換が、異核二重エコーイメージングを用いてモニターされる、請求項７記載のＭＲイメージング媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な過分極イメージング剤及び乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性を決定するために使用できる13Ｃ−ＭＲ検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
以前の研究によれば、過分極［１−13Ｃ］ピルビン酸塩の代謝は13Ｃ磁気共鳴分光イメージング（13Ｃ−ＭＲイメージング）を用いてインビボでイメージングし得ることが実証されている。例えば、国際公開第２００６／０１１８０９号は、13Ｃ−ピルビン酸塩を含む組成物及び13Ｃ−ＭＲイメージングにおけるその使用方法を開示している。
【０００３】
腫瘍においては、ピルビン酸塩と乳酸塩との間における過分極13Ｃ標識の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）で触媒されるフラックスの測定結果は腫瘍グレード及び治療への応答と相関していた。例えば、Ａｌｂｅｒｓ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｈｙｐｅｒｐｏｌａｒｉｚｅｄ 13Ｃ ｌａｃｔａｔｅ，ｐｙｒｕｖａｔｅ，ａｎｄ ａｌａｎｉｎｅ：ｎｏｎｉｎｖａｓｉｃｅ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｒａｄｉｎｇ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６８，８６０７−８６１５（２００８）を参照されたい。インビボでの磁化移動測定及びインビトロの腫瘍細胞懸濁液での研究は、正味の化学的フラックスに反し、ピルビン酸塩と乳酸塩との間の同位体交換が、ピルビン酸塩と乳酸塩との間における過分極13Ｃ標識の観測フラックスに大きく寄与することを明確に実証した。これは、ＬＤＨが細胞内で平衡付近にある反応を触媒し、また該酵素の機構が定序三重複合体機構（即ち、ピルビン酸塩及び乳酸塩の前にそれぞれ補酵素ＮＡＤ＋及びＮＡＤＨが結合する機構）であるという長年にわたる観測結果と合致している。したがって、下記スキーム１に示されるように、ＬＤＨははピルビン酸塩及び乳酸塩の容易に可逆的な相互転化を触媒すると同時に、ＮＡＤＨ及びＮＡＤ＋の相互転化を触媒する。
【０００４】
【化１】
0005879333.tif 000002
ピルビン酸塩は、ＬＤＨで触媒されるフラックスを測定するための優れた過分極基質である。これは、それが無毒性であり、容易に高いレベルに分極し、分極が比較的長い寿命を有し、細胞中への輸送が速いからである。しかし、ピルビン酸塩はいくつかの重要な制約を有している。それはインビボで過分極13Ｃイメージング実験のために使用される比較的高い濃度で毒性の兆候を示さない内因性分子であるが、それでもＬＤＨで触媒されるフラックスを測定するためには乳酸塩を使用することが好ましいであろう。これは、乳酸塩が天然にピルビン酸塩よりずっと高い濃度で存在し、また細胞中に極めて迅速に輸送されるからである。標識ピルビン酸塩を用いてＬＤＨ活性を測定することのさらなる欠点は、この酵素が過分極13Ｃイメージング実験のために使用される高いピルビン酸塩濃度によって阻害されることである。しかし、乳酸塩を使用しようという試みは、ピルビン酸塩中の標識がほんの僅かしか検出されないためにあまり成功しなかった。これは恐らく、組織中の定常状態ピルビン酸塩濃度が非常に低く、したがって乳酸塩に交換される過分極13Ｃ標識に関しては小さなプールしか存在しないからである。
【０００５】
Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．，Ｂｒｉｎｄｌｅ，Ｋ．Ｍ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｆ．Ｆ．，Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｉ．Ｄ．＆ Ｆｏｘａｌｌ，Ｄ．Ｌ．Ａ ｐｍｒ ｉｓｏｔｏｐｅ−ｅｘｃｈａｎｇｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｔｈｅ ｋｉｎｅｔｉｃ−ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ ｉｎ ｉｎｔａｃｔ−ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ２０２，５７３−５７９（１９８２）、及びＳｉｍｐｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．，Ｂｒｉｎｄｌｅ，Ｋ．Ｍ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｆ．Ｆ．，Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｉ．Ｄ．＆ Ｆｏｘａｌｌ，Ｄ．Ｌ．Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｌａｃｔａｔｅ−ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｓｔａｔｅ ａｎｄ ｉｎ ｉｎｔａｃｔ ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ２０２，５８１−５８７（１９８２）の両論文には、ピルビン酸塩と乳酸塩との間における同位体標識のＬＤＨで触媒される交換が記載されている。これらの実験では、1Ｈ ＭＲＳを使用することで、ヒト赤血球懸濁液中におけるメチル重水素化ピルビン酸塩（［３−2Ｈ3］ピルビン酸塩）とプロトン化乳酸塩との交換が測定された。メチル重水素化ピルビン酸塩及びプロトン化乳酸塩を赤血球懸濁液に添加した後、２種の分子間で重水素標識が交換されたので、ピルビン酸塩からのメチルプロトン信号の増加及び対応する乳酸塩からのメチルプロトン信号の減少が存在した。
【０００６】
続いて、［３−2Ｈ3］ピルビン酸塩及びプロトン化乳酸塩を用いたこれらの１Ｈ ＭＲＳ実験におけるＬＤＨのピルビン酸塩阻害に取り組んだ。即ち、ピルビン酸塩と乳酸塩との間における標識交換を測定する代わりに、メチル標識（1Ｈ又は2Ｈ）によって識別される２種の同位体標識乳酸塩化学種のＣ２位置間における重水素標識の交換を測定した（Ｂｒｉｎｄｌｅ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ａ 1Ｈ ＮＭＲ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｂｙ ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５８，２９９−３０５（１９８６））。この実験では、τ＝１／２Ｊ（式中、Ｊは乳酸塩メチルプロトンとＣ２プロトンとの間の1Ｈ−1Ｈカップリング定数（７．４Ｈｚ）であり、τは９０°パルスと１８０°パルスとの間の遅延（６８ミリ秒）である。）でスピンエコーパルスシーケンスを使用した。これらの条件下では、乳酸塩メチル共鳴は得られるスペクトル中で完全に反転している。乳酸塩Ｃ２プロトンを重水素（Ｄ）と交換すれば、プロトンカップリング及びメチル共鳴の位相変調が除去され、後者は今では正の位相を示す。かくして、乳酸塩Ｃ２炭素のプロトン化状態は、等核1Ｈスピンエコー実験においてスピン結合メチルプロトンの位相変調により検出できる。例えば、過重水素化乳酸塩とプロトン化乳酸塩との等モル混合物を、乳酸デヒドロゲナーゼ及びＮＡＤ＋を含む溶液に添加すれば、1Ｈスペクトルは初めにプロトン化乳酸塩由来の反転したメチル共鳴を示すであろう。プロトン化及び重水素化乳酸塩化学種間におけるＣ２位置の重水素標識のＬＤＨで触媒される交換後には、同位体平衡状態において、以下の乳酸塩化学種、即ち［３−2Ｈ3，２−2Ｈ1］乳酸塩、［３−2Ｈ3，２−1Ｈ1］乳酸塩、［３−1Ｈ3，２−2Ｈ1］乳酸塩及び［３−1Ｈ3，２−1Ｈ1］乳酸塩の混合物が存在するであろう。メチルプロトン化化学種のみが観測され、これらの内で半分はＣ２位置にプロトンを有し、したがってメチル共鳴は反転しており、半分はＣ２位置に重水素を有し、したがってメチル共鳴は正の位相を有する。これらのメチルプロトン共鳴は加算されて信号を与えない（僅かな重水素シフトが存在し、したがって信号は完全には相殺されない）。［３−1Ｈ3，２−2Ｈ1］乳酸塩及び［３−2Ｈ3，２−1Ｈ1］乳酸塩から出発して同じ実験を実施することができる。この場合には、観測される乳酸塩メチル共鳴は初めにＣ２重水素に原因する正の位相を有し、Ｃ２位置での標識交換後にこれがゼロまで減衰する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
米国特許第５，４３９，８０３号明細書
【発明の概要】
【０００８】
このたび意外にも、過分極［１−13Ｃ］乳酸塩を用いる実験であって、組織中における過分極［１−13Ｃ，２−2Ｈ1］乳酸塩と内因性非標識乳酸塩との間の2Ｈ標識交換をモニターする実験を実施できることが見出された。本発明において我々は、［１−13Ｃ，２−2Ｈ1］乳酸塩又は他の二重標識アイソトポマーを用いてＬＤＨ活性を測定することを提唱する。この場合、異核13Ｃ／1Ｈスピンエコー実験において、乳酸塩Ｃ２炭素のプロトン化状態がＣ１又は他の乳酸塩炭素にあるスピン結合された過分極13Ｃ標識の位相変調によって検出される。
【０００９】
様々なタイプの癌のように、ＬＤＨの上昇によって示される疾患が存在している。
【００１０】
したがって、ＬＤＨ活性を決定するため、特にインビボでＬＤＨ活性を決定するための新しい改良方法に対するニーズが存在している。
【００１１】
本明細書中に我々は、ＬＤＨ活性をイメージングするための造影剤及び方法であって、［１−13Ｃ，２−2Ｈ］乳酸塩と内因性非標識乳酸塩との間における重水素標識のＬＤＨで触媒される交換を測定することによってピルビン酸塩の使用を回避する造影剤及び方法を記載する。したがって、13Ｃ−ＭＲ検出を用いることでインビボ及びインビトロでＬＤＨ活性を決定するための薬剤として過分極［13Ｃ，2Ｈ］乳酸塩を使用できることが見出された。スキーム２は、Ｃ２位置に重水素標識を有する乳酸塩が代謝されてプロトン化（非標識）乳酸塩になる過程を示している。Ｃ１位置は13Ｃ濃縮することができ、これは次いで過分極される位置である。13Ｃ標識はまた、Ｃ２又はＣ３位置に配置することもでき、それもＣ２プロトンとスピン−スピンカップリングを示すであろう。乳酸塩のメチル（Ｃ３）プロトンも重水素と交換できる結果、Ｃ２プロトンとＣ１、Ｃ２又はＣ３位置の13Ｃとの間におけるスピン−スピンカップリングのみが存在する。
【００１２】
【化２】
0005879333.tif 000003
過分極［13Ｃ，2Ｈ］乳酸塩（即ち、13Ｃ−重水素標識乳酸塩）から過分極［13Ｃ，1Ｈ］乳酸塩（即ち、13Ｃ−プロトン化乳酸塩）への代謝転化を使用すれば、ＭＲを用いてヒト及びヒト以外の動物の体内における代謝過程を調べることができると判明した。過分極13Ｃ−重水素標識乳酸塩から過分極13Ｃ−プロトン化乳酸塩への転化は、重水素化13Ｃ−乳酸塩母体化合物及びそのプロトン化生成物からの信号検出を可能にするのに十分な程度に速いことが判明した。13Ｃ−重水素標識乳酸塩と内因性非標識乳酸塩との間における重水素標識のＬＤＨで触媒される交換の測定値は、検査すべき組織の代謝状態に依存するはずである。過分極13Ｃ−乳酸塩のＭＲ信号強度は、該化学種の濃度及び検出時の残留分極度に関係する。したがって、過分極13Ｃ−重水素標識乳酸塩から過分極13Ｃ−プロトン化乳酸塩への転化をモニターすることにより、非侵襲的ＭＲイメージング又はＭＲ分光法を用いてヒト又はヒト以外の動物の体内のＬＤＨ活性をインビボで調べることが可能である。
【００１３】
かくして、第１の態様では、本発明は過分極［13Ｃ，2Ｈ］乳酸塩を含んでなるイメージング媒体を提供する。一般的に［13Ｃ，2Ｈ］乳酸塩と呼ばれるこのような同位体標識分子は、［１−13Ｃ，２−2Ｈ］乳酸塩、［２−13Ｃ，２−2Ｈ］乳酸塩、［３−13Ｃ，２−2Ｈ］乳酸塩、［１−13Ｃ，２，３−2Ｈ］乳酸塩、［２−13Ｃ，２，３−2Ｈ］乳酸塩及び［３−13Ｃ，２，３−2Ｈ］乳酸塩からなる群から選択されるか、或いはＣ１、Ｃ２及びＣ３位置の２以上が13Ｃ標識されかつＣ２位置又はＣ２及びＣ３位置が重水素標識されている分子からなる群から選択される。［１−13Ｃ，２−2Ｈ］乳酸塩、特に［１−13Ｃ，２−2Ｈ］乳酸塩を含むイメージング媒体が好ましい。
【００１４】
乳酸塩は内因性化合物であり、ヒト血中におけるその濃度は比較的高く（１〜３ｍＭ）、局所濃度は１０ｍＭ以上である。そのため、乳酸塩は非常によく認容されるはずであり、したがって分極［13Ｃ，2Ｈ］乳酸塩ををイメージング剤として使用することは安全性の観点から有利である。
【００１５】
第２の態様では、本発明は、過分極［13Ｃ，2Ｈ］乳酸塩を含むイメージング媒体を用いる13Ｃ−ＭＲ検出によってＬＤＨ活性を決定する方法であって、［13Ｃ，2Ｈ］乳酸塩と内因性非標識乳酸塩との間における重水素標識のＬＤＨで触媒される交換を測定することを含んでなる方法を提供する。
【００１６】
さらに詳しくは、［１−13Ｃ，２−2Ｈ］乳酸塩又はＣ２位置で重水素標識された他の2Ｈ及び13Ｃ標識乳酸塩アイソトポマーと内因性非標識乳酸塩との間におけるＣ２位置の重水素標識のＬＤＨで触媒される交換が測定される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】図１Ａは、Ｌ−［１−13Ｃ］乳酸塩の13Ｃスペクトルである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、Ｃ２プロトンを重水素で置換した後における乳酸塩の13Ｃスペクトルである。
【図２】図２は、異核13Ｃ／1Ｈスピンエコーパルスシーケンスを示している。
【図３】図３は、Ｃ１の13Ｃ共鳴の位相反転をもたらすＣ２プロトン選択性プロトンパルスを示している。
【図４】図４は、異核13Ｃ／1Ｈ二重エコースペクトルである。
【図５】図５は、Ｌ−［１−13Ｃ］乳酸塩とＬ−［１−13Ｃ，２−2Ｈ１1］乳酸塩との混合物に関する異核13Ｃ／1Ｈ二重エコースペクトルである。
【図６】図６は、過分極Ｌ−［１−13Ｃ］乳酸塩とＬ−［１−13Ｃ，２−2Ｈ１1］乳酸塩との等モル混合物からの複数の異核13Ｃ／1Ｈ二重エコースペクトルである。
【図７】図７は、過分極Ｌ−［１−13Ｃ］乳酸塩の信号強度を時間に対してプロットしたグラフ（インビボ）である。
【図８】図８は、インビボでＴ2を推定するために使用したマルチエコー実験からの減衰曲線である。
【図９】図９は、インビボでの乳酸塩信号に対する様々なＴ2成分の寄与をエコー時間の関数として示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の方法によって細胞中及び組織中で測定されるＬＤＨ活性は、ＬＤＨ活性ばかりでなく細胞中への乳酸塩輸送速度及び内因性乳酸塩濃度にも依存するので、見かけ上の活性である。インビボでは、この速度は検査すべき組織への標識乳酸塩送達速度にも依存することがある。
【００１９】
「ＬＤＨ活性を決定する」という用語は、Ｃ２の重水素標識と、過分極［１−13Ｃ，２−2Ｈ］乳酸塩又はＣ２位置で重水素標識された他の2Ｈ及び13Ｃ標識乳酸塩アイソトポマー中のプロトンとの交換速度の測定を意味し、これは細胞中への乳酸塩輸送速度、内因性乳酸塩濃度及びＬＤＨ活性に依存する。インビボでは、この速度は検査すべき組織への標識乳酸塩送達速度にも依存することがある。
【００２０】
本発明の方法の好ましい実施形態では、異核13Ｃ／1Ｈスピンエコー実験において、乳酸塩Ｃ２炭素のプロトン化状態がＣ１又は他の乳酸塩炭素にあるスピン結合された過分極13Ｃ標識の位相変調によって検出される。
【００２１】
「13Ｃ−ＭＲ検出」という用語は、13Ｃ−ＭＲイメージング又は13Ｃ−ＭＲ分光法或いは13Ｃ−ＭＲイメージングと13Ｃ−ＭＲ分光法との組合せ（即ち、13Ｃ−ＭＲ分光イメージング）を意味する。この用語はさらに、様々な時点における13Ｃ−ＭＲ分光イメージングも意味する。
【００２２】
「イメージング媒体」という用語は、ＭＲ活性剤（即ち、イメージング剤）として、［１−13Ｃ，２−2Ｈ］乳酸塩又はＣ２位置で重水素標識された他の2Ｈ及び13Ｃ標識乳酸塩アイソトポマーのような過分極［13Ｃ，2Ｈ］乳酸塩を含む液体組成物を意味する。
【００２３】
本発明の方法で使用されるイメージング媒体は、インビボ13Ｃ−ＭＲ検出（即ち、ヒト又はヒト以外の動物の生体内での13Ｃ−ＭＲ検出）用のイメージング媒体として使用できる。さらに、本発明の方法で使用されるイメージング媒体は、例えば、いずれもヒト又はヒト以外の動物の身体から導かれる細胞培養物、身体試料（例えば血液又は脳脊髄液）、エクスビボ組織（例えば、生検で得られるエクスビボ組織）又は単離器官に関するインビトロ13Ｃ−ＭＲ検出用のイメージング媒体としても使用できる。
【００２４】
「乳酸塩」及び「乳酸」という用語は、好ましくはＬ−異性体（Ｌ−乳酸塩、Ｌ−乳酸）を意味する。これは、哺乳動物のＬＤＨアイソフォームによって特異的に使用される異性体だからである。Ｄ−異性体（Ｄ−乳酸塩、Ｄ−乳酸）は微生物の乳酸デヒドロゲナーゼによって使用され、したがって上記に記載した標識乳酸塩アイソトポマーのＤ異性体は哺乳動物組織における細菌感染の存在を検出するために使用できる。したがって、本発明に係るイメージング媒体は、意図が哺乳動物又は微生物のＬＤＨ活性のいずれを決定することにあるかに応じて、それぞれ過分極13Ｃ−Ｌ−乳酸塩又は過分極13Ｃ−Ｄ−乳酸塩を含み得る。
【００２５】
本発明の方法で使用する乳酸塩アイソトポマーの同位体13Ｃ濃縮度は、好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上であり、９０％を超える同位体濃縮度が最も好ましい。理想的には、濃縮度は１００％である。本発明の方法で使用する13Ｃ−乳酸塩は、Ｃ１位置（［１−13Ｃ］乳酸塩と表示する）、Ｃ２位置（［２−13Ｃ］乳酸塩と表示する）、Ｃ３位置（［３−13Ｃ］乳酸塩と表示する）、Ｃ１及びＣ２位置（［１，２−13Ｃ］乳酸塩と表示する）、Ｃ１及びＣ３位置（［１，３−13Ｃ］乳酸塩と表示する）、Ｃ２及びＣ３位置（［２，３−13Ｃ］乳酸塩と表示する）又はＣ１、Ｃ２及びＣ３位置（［１，２，３−13Ｃ］乳酸塩と表示する）において同位体濃縮することができる。［１−13Ｃ］乳酸塩は他のＣ位置で同位体濃縮された13Ｃ−乳酸塩に比べて３７℃のヒト血中で長いＴ1緩和を有するので、Ｃ１位置での同位体濃縮が最も好ましい。
【００２６】
本発明の方法で使用する乳酸塩の同位体2Ｈ濃縮度は、好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上であり、９０％を超える同位体濃縮度が最も好ましい。理想的には、濃縮度は１００％である。本発明の方法で使用する乳酸塩は、Ｃ２位置又はＣ２位置及びＣ３位置で同位体的に重水素濃縮されている。
【００２７】
好ましい実施形態では、本発明に係るイメージング媒体は過分極13Ｃ−乳酸ナトリウムを含み、さらに好ましくは［１−13Ｃ，２−2Ｈ］乳酸ナトリウム又はＣ２位置で重水素標識された他の2Ｈ及び13Ｃ標識乳酸塩アイソトポマーを含んでいる。
【００２８】
過分極［１−13Ｃ，２−2Ｈ］乳酸塩を含む本発明のイメージング媒体の製造に際しては、商業的に入手可能な化合物である［１−13Ｃ1］乳酸ナトリウムを出発原料として使用できる。
【００２９】
重水素標識、即ち［１−13Ｃ1，２−2Ｈ1］乳酸塩の製造のためには、［１−13Ｃ1］乳酸ナトリウムを2Ｈ2Ｏに溶解する。リン酸塩緩緩衝液のような適当な緩衝液を添加することでｐＨを調整する。他の適当な緩衝液は、ＡＣＥＳ、ＰＩＰＥＳ、イミダゾール／ＨＣｌ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＰＳ又はＴＲＩＣＩＮである。さらに、溶液からの金属イオンを封鎖するため、調製される組成物中にＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）又はＤＴＰＡのようなキレート化剤を含めることもできる。ＥＤＴＡが好ましい。かかる方法段階は、さらに実施例１に略述される。この実施例では、ブタ心臓からのリポアミドデヒドロゲナーゼが、ＮＡＤＨのニコチンアミド環中のＣ４位置のプロトンと溶媒の重水素との交換を触媒する。次いで、この重水素がＬＤＨによって触媒される反応でＬ−［１−13Ｃ1］乳酸塩中のＣ２プロトンと交換される。このようなカップルド酵素反応は、Ｌ−［１−13Ｃ1］乳酸塩のＣ２位置のプロトンが溶媒2Ｈ2Ｏ中のずっと大きい重陽子プールと交換することを保証する。
【００３０】
したがって一態様では、本発明は、過分極［１−13Ｃ，２−2Ｈ］乳酸塩の製造方法であって、
ｉ）［１−13Ｃ1］乳酸ナトリウムを重水素標識して［１−13Ｃ1，２−2Ｈ1］乳酸塩を生成する段階、及び
ii）［１−13Ｃ1，２−2Ｈ1］乳酸塩を過分極させる段階
を含んでなる方法を提供する。
【００３１】
「過分極」及び「分極」という用語は、以後は13Ｃ核の分極に関して互換的に使用され、０．１％を超え、さらに好ましくは１％を超え、最も好ましくは１０％を超える核分極レベルを意味する。
【００３２】
分極レベルは、例えば、固体過分極13Ｃ−乳酸塩（例えば、13Ｃ−乳酸塩の動的核分極（ＤＮＰ）によって得られる固体過分極13Ｃ−乳酸塩）の固体状態13Ｃ−ＮＭＲ測定によって決定できる。固体状態13Ｃ−ＮＭＲ測定は、好ましくは低フリップ角パルスを用いる単パルス取得ＮＭＲシーケンスからなる。ＮＭＲスペクトル中の過分極13Ｃ−乳酸塩の信号強度を、分極プロセス前に取得したＮＭＲスペクトル中の13Ｃ−乳酸塩の信号強度と比較する。次いで、ＤＮＰ前後における信号強度の比から分極レベルを計算する。
【００３３】
同様に、溶解した過分極13Ｃ−乳酸塩に関する分極レベルは、液体状態ＮＭＲ測定によって決定できる。この場合にも、溶解した過分極13Ｃ−乳酸塩の信号強度を分極前又は分極が減衰した後における溶解13Ｃ−乳酸塩の信号強度と比較する。次いで、分極前後における13Ｃ−乳酸塩の信号強度の比から分極レベルを計算する。
【００３４】
ＮＭＲ活性13Ｃ核の過分極は、例えば国際公開第９８／３０９１８号、同第９９／２４０８０号及び同第９９／３５５０８号（これらの開示内容はいずれも援用によって本明細書の内容の一部をなす）に記載されている様々な方法によって達成でき、また希ガスからの分極移動、「ブルートフォース（ｂｒｕｔｅ ｆｏｒｃｅ）」、スピン冷凍、パラ水素法及び動的核分極（ＤＮＰ）のような、当技術分野で公知の過分極方法によっても達成できる。ＤＮＰが好ましい。
【００３５】
過分極13Ｃ−乳酸塩を得るためには、13Ｃ−乳酸塩を直接に分極させることが好ましい。また、13Ｃ−乳酸を分極させることもできるが、分極13Ｃ−乳酸を（例えば、塩基での中和により）分極13Ｃ−乳酸塩に転化させることが必要である。13Ｃ−乳酸塩（例えば、13Ｃ−乳酸ナトリウム）は商業的に入手できる。13Ｃ−乳酸もまた、商業的に入手できる。それは、商業的に入手できる13Ｃ−乳酸塩（例えば、商業的に入手できる13Ｃ−乳酸ナトリウム）へのプロトン付加によっても得ることができる。
【００３６】
過分極13Ｃ−乳酸塩を得るための１つの方法は、国際公開第９８／３０９１８号に記載されている過分極希ガスからの分極移動である。非ゼロ核スピンを有する希ガスは、円偏光の使用によって過分極させることができる。過分極希ガス（好ましくはＨｅ又はＸｅ或いはかかるガスの混合物）を用いて13Ｃ核の過分極を達成することができる。過分極ガスは気相中にあってもよく、液体／溶媒中に溶解されてもよく、或いは過分極ガス自体を溶媒として使用してもよい。別法として、ガスを冷却固体表面上に凝縮させ、この形態で使用してもよいし、或いは昇華させてもよい。過分極ガスと13Ｃ−乳酸塩又は13Ｃ−乳酸とを緊密に混合することが好ましい。
【００３７】
過分極13Ｃ−乳酸塩を得るための別の方法は、非常に低い温度及び高い磁場での熱力学的平衡化によって13Ｃ核に分極を付与するものである。過分極は、ＮＭＲ分光計の動作磁場及び温度に比べ、非常に高い磁場及び非常に低い温度（「ブルートフォース」）の使用によって達成される。使用する磁場強度はできるだけ高くすべきであり、好適には１Ｔより高く、好ましくは５Ｔより高く、さらに好ましくは１５Ｔ以上であり、特に好ましくは２０Ｔ以上である。温度は非常に低くすべきであり、例えば４．２Ｋ以下、好ましくは１．５Ｋ以下、さらに好ましくは１．０Ｋ以下、特に好ましくは１００ｍＫ以下である。
【００３８】
過分極13Ｃ−乳酸塩を得るための別の方法は、スピン冷凍法である。この方法は、スピン冷凍分極による固体化合物又は系のスピン分極をカバーする。かかる系には、三次若しくはそれ以上の対称軸をもつ好適な結晶質常磁性物質（例えば、Ｎｉ2+、ランタニド又はアクチニドイオン）がドープされるか、或いは緊密に混合される。共鳴励起磁場を全く加えないので均一な磁場は必要とされず、その計装はＤＮＰのために必要なものより簡単である。このプロセスは、磁場の方向に直角な軸の周りで試料を物理的に回転させることによって実施される。この方法に関する前提条件は、常磁性種が高度に異方性のｇ因子をもつことである。試料回転の結果として、電子常磁性共鳴が核スピンと接触し、核スピン温度の低下をもたらす。試料回転は、核スピン分極が新たな平衡に達するまで実施される。
【００３９】
好ましい実施形態では、過分極13Ｃ−乳酸塩を得るためにＤＮＰ（動的核分極）が使用される。13Ｃ−乳酸ナトリウムは、冷却／凍結時に結晶化しないので、ＤＮＰのために直接使用できる商業的に入手可能な化合物である。これは試料中にガラス形成剤及び／又は多量の溶媒を使用する必要性を排除するので、高度に濃縮された試料を調製してＤＮＰプロセスで使用することができる。さらに、13Ｃ−乳酸ナトリウムはｐＨ中性であり、したがって各種のＤＮＰ剤が使用できる。ＤＮＰでは、分極させるべき化合物中のＭＲ活性核の分極は、不対電子を含む化合物である分極剤又はいわゆるＤＮＰ剤によって達成される。ＤＮＰプロセス中には、通常はマイクロ波放射の形態でエネルギーが供給され、これがまずＤＮＰ剤を励起する。基底状態への崩壊に際して、ＤＮＰ剤の不対電子から分極させるべき化合物のＮＭＲ活性核（例えば、13Ｃ−乳酸塩中の13Ｃ核）への分極の移動が起こる。一般に、ＤＮＰプロセスでは中程度の又は高い磁場及び非常に低い温度が使用されるのであって、例えばＤＮＰプロセスは液体ヘリウム及び約１Ｔ以上の磁場中で実施される。別法として、中程度の磁場及び十分な分極増強が達成される任意の温度を使用することもできる。ＤＮＰ技法は、例えば国際公開第９８／５８２７２号及び同第０１／９６８９５号に一層詳しく記載されており、これらの開示内容はいずれも援用によって本明細書の内容の一部をなしている。
【００４０】
ＤＮＰ法によって化学的実在物（即ち、化合物）を分極させるためには、分極させるべき化合物及びＤＮＰ剤を含む組成物を調製し、次いでこれを凍結して分極用のＤＮＰ分極装置内に挿入する。分極後、凍結した固体過分極組成物は、融解又は適当な溶解媒質中への溶解によって急速に液体状態に移行される。溶解が好ましく、凍結過分極組成物の溶解プロセス及びそのための好適な装置は国際公開第０２／３７１３２号に詳述されている。融解プロセス及び融解用の好適な装置は、例えば国際公開第０２／３６００５号に記載されている。
【００４１】
分極させるべき化合物中に高い分極レベルを得るためには、ＤＮＰプロセス中に前記化合物とＤＮＰ剤とが緊密に接触している必要がある。凍結又は冷却時に組成物が結晶化するならば、それに当てはまらない。結晶化を避けるためには、組成物中にガラス形成剤を存在させる必要があり、或いは凍結時に結晶化せずにガラスを形成する化合物を分極用として選択する必要がある。13Ｃ−乳酸ナトリウムを含む組成物は凍結／冷却時に結晶化しないので、13Ｃ−乳酸ナトリウムは特に好ましい。
【００４２】
本発明の方法で使用する過分極13Ｃ，2Ｈ−乳酸塩がＤＮＰによって得られる場合、分極させるべき試料（即ち、13Ｃ−乳酸塩及びＤＮＰ剤）はさらに常磁性金属イオンを含み得る。ＤＮＰによって分極させるべき組成物中における常磁性金属イオンの存在は、国際公開第２００７／０６４２２６号（その開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす）に詳述されているように、13Ｃ−乳酸塩中の分極レベルを増大させ得ることが判明している。したがって、本発明の好ましい実施形態では、ＭＲイメージング媒体は、［13Ｃ，2Ｈ］乳酸塩（例えば、［１−13Ｃ，２−2Ｈ］乳酸塩）、トリチルラジカル）及び任意には常磁性金属イオンを含んでいる。前記常磁性金属イオンが存在する場合、これは好ましくはＧｄ3+を含む常磁性キレートの形態で存在する。かかるＭＲイメージング媒体は、好ましくは動的核分極によって得られる。
【００４３】
前述の通り、本発明に係るイメージング媒体は、インビボでの（即ち、ヒト又はヒト以外の動物の生体内での）13Ｃ−ＭＲ検出によるＬＤＨ活性決定のためのイメージング媒体として使用できる。この目的のためには、イメージング媒体はヒト又はヒト以外の動物の生体への投与に適した組成物として提供される。かかるイメージング媒体は、ＭＲ活性剤である［13Ｃ，2Ｈ］乳酸塩に加えて、水性キャリヤー、好ましくは生理学的に認容されかつ薬学的に許容される水性キャリヤー（例えば、水、緩衝液又は食塩水）を含むことが好ましい。かかるイメージング媒体はさらに、通常の薬学的又は獣医学的キャリヤー又は賦形剤（例えば、ヒト医学又は獣医学における診断用組成物に関して常用されている製剤化補助剤）を含むことができる。
【００４４】
さらに、本発明の方法に係るイメージング媒体は、インビトロでの（即ち、細胞培養物、血液試料のような身体試料、生検組織のようなエクスビボ組織又は単離器官中での）13Ｃ−ＭＲ検出によるＬＤＨ活性決定のためのイメージング媒体として使用できる。この目的のためには、イメージング媒体は、例えば、細胞培養物、血液試料、生検組織のようなエクスビボ組織又は単離器官に添加するのに適した組成物として提供される。かかるイメージング媒体は、ＭＲ活性剤である13Ｃ−乳酸塩に加えて、インビトロ細胞又は組織アッセイに適合しかつそのために使用される溶媒（例えば、ＤＭＳＯ又はメタノール或いは水性キャリヤー及び非水性溶媒を含む溶媒混合物（例えば、ＤＭＳＯと水又は緩衝液との混合物或いはメタノールと水又は緩衝液との混合物））を含むことが好ましい。当業者には自明の通り、かかるイメージング媒体中には薬学的に許容されるキャリヤー、賦形剤及び製剤化補助剤が存在し得るが、かかる目的のために必要なわけではない。
【００４５】
本発明の方法で使用するイメージング媒体をインビボでの（即ち、ヒト又はヒト以外の動物の生体内での）ＬＤＨ活性決定のために使用するならば、前記イメージング媒体は好ましくは前記生体に非経口的に（好ましくは静脈内に）投与される。一般に、検査すべき生体はＭＲ磁石内に配置される。専用の13Ｃ−ＭＲ及び1Ｈ−ＭＲ ＲＦコイル或いは二重同調13Ｃ／1Ｈ ＲＦコイルが、検査対象領域をカバーするように配置される。イメージング媒体の正確な用量及び濃度は、毒性及び投与経路のような一連の因子に依存する。投与後４００秒未満、好ましくは１２０秒未満、さらに好ましくは投与後６０秒未満において、ＭＲイメージングシーケンス、好ましくは検査対象体積をエンコードするＭＲイメージングシーケンスを複合した周波数及び空間選択的な方法で適用する。ＭＲシーケンスの正確な適用時間は、検査対象体積及び化学種に大きく依存する。
【００４６】
本発明の方法で使用するイメージング媒体をインビトロでのＬＤＨ活性決定のために使用するならば、前記イメージング媒体は13Ｃ−乳酸塩について１〜１００ｍＭ、さらに好ましくは２０〜９０ｍＭ、最も好ましくは13Ｃ−乳酸塩について４０〜８０ｍＭである。
【００４７】
本発明の方法の一実施形態では、［１−13Ｃ，２−2Ｈ］乳酸塩と内因性非標識乳酸塩との間における重水素標識のＬＤＨで触媒される交換が、異核13Ｃ／1Ｈスピンエコー実験を用いてモニターされる。１８０°パルスを1Ｈスピン及び13Ｃスピンに同時に印加し、13Ｃ共鳴をτ＝１／２Ｊ（式中、ＪはＣ２プロトンとＣ１炭素−１３との間の1Ｈ−13Ｃカップリング定数である。）で観測するこの実験では、13Ｃ共鳴は反転している。２種の乳酸塩化学種間における重水素標識のＬＤＨで触媒される交換後には、両者が等しい濃度で存在すると仮定すれば、同位体平衡状態において、［１−13Ｃ1，２−2Ｈ1］乳酸塩、［１−13Ｃ1，２−1Ｈ1］乳酸塩、［２−2Ｈ1］乳酸塩及び［２−1Ｈ1］乳酸塩の等モル混合物が存在するであろう。13Ｃ実験では、13Ｃ標識化学種のみが観測され、これらの内で［１−13Ｃ1，２−2Ｈ1］乳酸塩は正の位相を有する13Ｃ共鳴を与え、［１−13Ｃ1，２−1Ｈ1］乳酸塩は負の位相を有する13Ｃ共鳴を与え、両者は大部分が相殺される。もちろん、インビボでは濃度が等しいことはありそうにない。しかし、同位体交換時間経過中の任意の時点における［１−13Ｃ1，２−1Ｈ1］乳酸塩化学種の濃度は、１８０°1Ｈパルスの存在下及び不存在下で観測される異核スピンエコー差スペクトルを取得することで決定できる。したがって、本発明の一実施形態では、異核13Ｃ／1Ｈスピンエコーイメージング方法を使用することで、［１−13Ｃ，２−2Ｈ］乳酸塩と内因性非標識乳酸塩との間における重水素標識の交換がモニターされる。
【００４８】
［１−13Ｃ，２−2Ｈ］乳酸塩アイソトポマーを使用するならば、13Ｃ核とＣ３メチルプロトンとの間のスピン−スピンカップリングによる位相変調を回避するため、1Ｈパルスは周波数感受性でなければならない。メチルプロトンもまた重水素と交換された乳酸塩アイソトポマーを使用すれば、周波数選択性1Ｈパルスを使用する必要性は除去される。
【００４９】
本発明のさらに別の実施形態では、異核二重エコーイメージングパルスシーケンスを使用することで、［１−13Ｃ，２−2Ｈ］乳酸塩のＣ２プロトン化状態をインビボで検出できる。この場合には、標準的なエコー平面イメージングシーケンスにおけるリードアウト勾配及び位相エンコード勾配を用いてエコーが取得される。1Ｈパルスなしで取得された13Ｃ画像は13Ｃ標識Ｃ２重水素化乳酸塩プラス13Ｃ標識Ｃ２プロトン化乳酸塩からの信号を有し、1Ｈパルスを用いて取得された13Ｃ画像は13Ｃ標識Ｃ２重水素化乳酸塩マイナス13Ｃ標識Ｃ２プロトン化乳酸塩からの信号を有する。これらの画像を加算すれば総13Ｃ標識Ｃ２重水素化乳酸塩が得られ、減算すれば13Ｃ標識Ｃ２プロトン化乳酸塩が得られる。したがって、本発明の別の実施形態では、異核二重エコーイメージングを使用することで、［１−13Ｃ，２−2Ｈ］乳酸塩と内因性非標識乳酸塩との間における重水素標識の交換がモニターされる。
【００５０】
本発明の方法の好ましい実施形態では、一連の上述した画像を取得し、Ｃ２プロトン化及びＣ２重水素化乳酸塩濃度の画像中における信号強度の画素−画素当てはめを動力学モデルに当てはめることで、組織中におけるＬＤＨ活性のマップを得る。そこでは、見かけのＬＤＨ活性は、組織への標識乳酸塩の送達速度、細胞膜を横切っての乳酸塩輸送速度、及び内因性乳酸塩濃度に依存し得る。本発明の方法をインビボで（即ち、ヒト又はヒト以外の動物の生体内で）実施する場合、前記ＬＤＨ活性マップは全身から導くことができ、例えば全身インビボ13Ｃ−ＭＲ検出によって得ることができる。別法として、前記ＬＤＨ活性マップは検査対象領域又は体積（即ち、前記ヒト又はヒト以外の動物の身体の特定の組織、器官又は部分）から生成される。
【００５１】
本発明の方法の別の好ましい実施形態では、13Ｃ−乳酸塩の上述した信号を使用することで、ヒト又はヒト以外の動物から導かれる細胞培養物中の細胞、血液試料のような身体試料、生検組織のようなエクスビボ組織或いは単離器官のＬＤＨ活性が決定される。その場合、前記ＬＤＨ活性はインビトロ13Ｃ−ＭＲ検出によって生成される。
【００５２】
かくして好ましい実施形態では、本発明は、過分極［13Ｃ，2Ｈ］乳酸塩（例えば、［１−13Ｃ，２−2Ｈ］乳酸塩）を含むイメージング媒体を用いる13Ｃ−ＭＲ検出によってＬＤＨ活性を決定する方法であって、Ｃ２プロトン化状態を検出し、前記情報を用いてＬＤＨ活性のマップ又は点測定値を生成することを含んでなる方法を提供する。
【００５３】
本発明に係る方法の好ましい実施形態で生成されるＬＤＨ活性マップ又は測定値は、検査すべき身体、身体部分、細胞、組織、身体試料などのＬＤＨ活性を表しており、得られた前記情報は様々な目的のために以後の段階で使用できる。
【００５４】
これらの目的の１つは、ＬＤＨ活性を変化させる化合物、好ましくはＬＤＨ活性を上昇させる化合物の評価であり得る。これらは組織の生存能力を向上させる薬物であり得るが、この場合にはＬＤＨ活性の増加が見られると期待できよう。
【００５５】
一実施形態では、本発明の方法はインビトロで実施され、得られた情報はＬＤＨ活性を変化させる潜在的薬物の効力を（例えば、薬物発見及び／又はスクリーニングプロセスで）評価するために使用される。かかる実施形態では、本発明の方法は適当な細胞培養物又は組織において実施できる。細胞又は組織を潜在的薬物に接触させ、本発明の方法に従った13Ｃ−ＭＲ検出によってＬＤＨ活性を決定する。処理された細胞又は組織のＬＤＨ活性を非処理細胞又は組織のＬＤＨ活性と比較することで、潜在的薬物の効力に関する情報を得ることができる。別法として、処理の前後における細胞又は組織のＬＤＨ活性を決定することで、ＬＤＨ活性の変動を求めることができる。かかる薬物効力評価は、例えばマイクロプレート上で実施できる。これは様々な潜在的薬物及び／又は潜在的薬物の様々な用量の並行試験を可能にし、したがってそれを高スループットスクリーニングのために好適なものとするであろう。
【００５６】
別の実施形態では、本発明の方法はインビボで実施され、得られた情報はＬＤＨ活性を変化させる潜在的薬物の効力をインビボで評価するために使用される。かかる実施形態では、本発明の方法は例えば試験動物に対して実施でき、或いは臨床治験において志願者に対して実施できる。試験動物又は志願者に潜在的薬物を投与し、本発明の方法に従った13Ｃ−ＭＲ検出によってＬＤＨ活性を決定する。処置の前後に（例えば、処置を繰り返しながら一定の期間にわたり）ＬＤＨ活性の変動を決定することで、潜在的薬物の効力に関する情報を得ることができる。かかる薬物効力評価は、前臨床研究（試験動物）又は臨床治験において実施できる。
【００５７】
別の実施形態では、本発明の方法はインビボ又はインビトロで実施され、得られた情報は疾患に対する治療を受けている罹患患者において治療応答の評価及び／又は治療効果の判定を行うために使用される。
【００５８】
前述の通り、本発明の方法によって得られた情報は様々な目的のために以後の段階で使用できる。別の目的は、疾患状態を洞察すること、即ちリスクのある患者の同定、疾患の早期検出、並びに疾患の進行、重篤度及び疾患に関係する合併症の評価であり得る。
【００５９】
さらに別の実施形態では、本発明の方法はインビボ又はインビトロで実施され、得られた情報は疾患の進行をモニターするために使用される。これは、例えば治療に重大な副作用が伴うため、治療が適用又は推奨されるレベルにまで疾患が進行していない場合の疾患又は障害に関して有用であり得る。かかる状況下では、選択すべき処置は「経過観察」、即ち患者を綿密にモニターして疾患の進行及び悪化の早期検出を行うことである。この実施形態では、本発明の方法を用いることで、初期ＬＤＨ活性を決定し、続いて一定の期間にわたり一定の頻度でＬＤＨ活性の決定を行うことができる。ＬＤＨ活性の低下は疾患の進行及び悪化を表すと予想でき、医師は前記低下を用いて治療の開始を決断することができる。別法として、ＬＤＨ活性の増加は疾患の悪化を表すことがある。例えば癌、特に前立腺癌では、疾患の進行と共にＬＤＨ及び乳酸塩濃度が増加することがあり、これは本発明の方法によって測定される見かけのＬＤＨ活性を増加させるであろう。上述の目的のために本発明の方法をインビトロで実施するには、治療を受ける患者から適当な試料（例えば、組織試料又は血液試料のような身体試料）が得られることが必要である。
【００６０】
好ましい実施形態では、本発明に係る方法は、脳腫瘍。、乳房腫瘍、結腸腫瘍、肺腫瘍、腎腫瘍、頭頸部腫瘍、筋肉腫瘍、卵巣腫瘍、胃腫瘍、膵臓腫瘍、食道腫瘍及び前立腺腫瘍のインビボＭＲ腫瘍イメージング、腫瘍治療モニタリング及び／又は腫瘍ステージングのために使用される。さらに、本発明に係る方法は、インビボＭＲ前立腺腫瘍イメージング、即ち前立腺腫瘍診断及び／又は前立腺腫瘍ステージング及び／又は前立腺腫瘍治療モニタリングのため特に有用であることが判明した。
【００６１】
さらに別の実施形態では、本発明の方法はインビボ又はインビトロで実施され、得られた情報は疾患の重篤度を判定するために使用される。多くの場合、疾患はその発症から時間の経過と共に進行する。症状の種類及び／又は一定の臨床マーカーの所見に応じ、疾患は一定の段階（例えば、初期（軽症期）、中期（中等症期）及び後期（重症期））によって特徴づけられる。ある種の疾患に関しては、さらに細分された段階が常用される。疾患のステージングのためには、ある種の酵素又はタンパク質発現物のような特異的なものばかりでなく血液値や電解質レベルなどの一般的なものを含む各種の臨床マーカーが使用されることが知られている。このような点から見て、ＬＤＨ活性は、疾患の段階、したがって疾患の重篤度を判定するために（単独で或いは他のマーカー及び／又は症状と組み合わせて）使用できる上記のような臨床マーカーであり得る。したがって、本発明の方法を用いて患者におけるＬＤＨ活性を定量的に決定し、得られたＬＤＨ活性値から患者の疾患のステージングを行うことが可能であり得る。例えば初期、中期及び後期の疾患を有する患者におけるＬＤＨ活性を本発明の方法に従って決定し、一定の段階に特有のＬＤＨ活性範囲を画定することにより、一定の疾患段階に特有のＬＤＨ範囲を確定できる。
【００６２】
さらに別の実施形態では、本発明の方法はインビボ又はインビトロで実施され、得られた情報は疾患に関係する合併症を同定及び評価するために使用される。本発明の方法によれば、例えば心臓又は腎臓の上方に配置された表面コイルを用いて実施されるインビボ13Ｃ−ＭＲ検出により、ＬＤＨ活性を器官特異的に決定できる。インビボで実施する場合、本発明の方法には解剖学的情報及び／又は（好適であれば）灌流情報を含めることができる。解剖学的情報は、例えば、本発明の方法の前後に適当な造影剤を使用し又は使用せずにプロトン又は13Ｃ−ＭＲ画像を取得することで得ることができる。
【００６３】
さらに別の態様では、本発明は、13Ｃ−ＭＲ検出によるＬＤＨ活性の決定における過分極［13Ｃ，2Ｈ］乳酸塩を含むイメージング媒体の使用を提供する。
【実施例】
【００６４】
実施例１：Ｌ−［１−13Ｃ，２−2Ｈ］乳酸塩の製造
５０ｍｇのＥＤＴＡ（二ナトリウム塩、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社、ギリンガム、英国）、１０ｍｇのジチオトレイトール（Ｍｅｌｆｏｒｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、イプスウィッチ、英国）、２５ｍｇのＮＡＤ＋（遊離塩、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、ウェストサセックス、英国）、１ｍｇ（約９００単位）のウサギ筋肉乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社、ギリンガム、英国）及び５ｍｇ（約３０単位）のブタ心臓リポアミドデヒドロゲナーゼ（Ｃａｌｚｙｍｅ社、サンルイスオビスポ、米国カリフォルニア州からの凍結乾燥粉末）を含む、９９．８％2Ｈ2Ｏ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、アンドーバー、米国マサチューセッツ州）中の０．０２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ローボロー、英国）、ｐＨ*５．５（ｐＨ*は補正されないｐＨ計の読みである）２．５ｍｌに、Ｌ−［１−13Ｃ1］乳酸ナトリウム（２５０ｍｇ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、アンドーバー、米国マサチューセッツ州）を溶解した。得られた溶液を室温で約１週間インキュベートした。インキュベーションは、溶液を沸騰水浴中に１０分間配置することで終わった。沈殿したタンパク質を、０．２２μｍ孔径の膜で濾過することで除去した。溶液を濃塩酸で酸性化し、次いで塩基性炭酸亜鉛（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社、ギリンガム、英国）で中和することで亜鉛塩を得た。次いで、溶液を濾過し、凍結乾燥し、得られた乳酸亜鉛を水／エタノール混合物からの再結晶によって精製した。ナトリウム塩は、過剰のイオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ ５０Ｗｘ８、Ｎａ+形、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社、ギリンガム、英国）を用いて製造し、凍結乾燥によって単離した。乳酸塩は、ＮＡＤＨ結合アッセイにおいて分光光度法で分析すると共に、1Ｈ ＮＭＲ分光法によって分析した。
【００６５】
実施例２：乳酸塩Ｃ２プロトン化の検出のための異核13Ｃスピンエコー実験
Ｌ−［１−13Ｃ］乳酸塩の13Ｃスペクトルは、Ｃ２プロトン（Ｊ＝３．３Ｈｚ）とＣ３メチルプロトン（Ｊ＝４．１Ｈｚ）との間におけるスピン−スピンカップリングを示している。したがって、13Ｃ共鳴は二重の四重線である（図１Ａ）。Ｃ２プロトンを重水素で置換すると、メチルプロトンとのスピン−スピンカップリングのみが残る（図１Ｂ）。
【００６６】
異核13Ｃ／1Ｈスピンエコーパルスシーケンスを図２ａに示す。τ＝１／２Ｊで１８０°13Ｃパルスと同時に1Ｈ １８０°パルスを印加すると、観測される1Ｈ結合13Ｃ共鳴の位相変調が生じる。実験の終了時にｚ軸に沿って残留する分極の＋ｚ軸への戻りを保証することから、二重エコーシーケンス（図２ｂ）を使用した。
【００６７】
３００ミリ秒のエコー時間及びＣ２プロトン選択性プロトンパルスの印加を使用しながら異核13Ｃ二重エコースペクトル（図２ｂ）を取得すると、Ｃ１ 13Ｃ共鳴の位相反転が生じる（図３）。同様に、Ｃ３プロトン選択性プロトンパルスを印加すると、（２４０ミリ秒のエコー時間で）Ｃ１ 13Ｃ共鳴の位相反転が生じる。Ｌ−［１−13Ｃ1，２−2Ｈ1］乳酸塩においてＣ２プロトンを重水素で置換すると、Ｃ２プロトンカップリングに原因する位相反転が除去される（図３）。
【００６８】
図３に関しては、試料は１０ｍＭのＬ−［１−13Ｃ1，２−2Ｈ1］乳酸塩又はＬ−［１−13Ｃ1］乳酸塩（非分極）を含んでいた。重水素化乳酸塩のＴ1は（９．４Ｔで）５５．８±２．２秒（ｎ＝１）、Ｔ2は１．３３±０．１０秒（ｎ＝４）であり、Ｃ２プロトン化乳酸塩のＴ1は４６．９±４．０秒（ｎ＝１）、Ｔ2は１．４９±０．１３秒（ｎ＝２）であった。Ｃ２又はＣ３乳酸塩プロトン共鳴に中心を置いた１０マイクロ秒の９０°13Ｃパルス、５ミリ秒の断熱１８０°13Ｃパルス（帯域幅約２ｋＨｚ）及び１０ミリ秒の断熱1Ｈパルス（帯域幅約１ｋＨｚ）を用いて異核13Ｃ／1Ｈ二重エコースペクトルを取得した（図２ｂ）。ＴＲは２０秒であった。初期ダミースキャンは定常状態ｚ磁化を生み出す。スペクトル帯域幅は８ｋＨｚであり、データを２０４８の複合点に収集した。乳酸塩13Ｃ共鳴に関する位相及び振幅補正されたピーク積分値を測定した。エコー時間は２τと同等である。
【００６９】
実施例３：Ｇｄ3+を添加したＬ−［１−13Ｃ1］乳酸塩
Ｇｄ3+を添加しながら、Ｃｈｅｎ，Ａ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．Ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｕｓｉｎｇ ｈｙｐｅｒｐｏｌａｒｉｚｅｄ ［１−Ｃ−１３］ｌａｃｔａｔｅ ａｓ ａ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｖｏ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｃ−１３ ＭＲＳＩ ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｉｍａｇｉｎｇ ２６，７２１−７２６（２００８）に記載されたＤＭＳＯ製法を用いてＬ−［１−13Ｃ1］乳酸塩を過分極させた。簡単に述べれば、７０ｍｇの約５０％ｗ／ｗ Ｌ−［１−13Ｃ1］乳酸塩溶液（０．３１ｍｍｏｌ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社、ギリンガム、英国）を、２７ｍｇのＤＭＳＯ（０．３６ｍｍｏｌ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社、ギリンガム、英国）、２ｍｇのＯＸ６３ラジカル（１．４μｍｏｌ）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）及びＤｏｔａｒｅｍ Ｇｄ3+キレート（Ｇｕｅｒｂｅｔ社、ロワシー、フランス）の５０ｍｍｏｌ／Ｌ溶液２．７ｍｇに添加する。インビトロ実験のためには、得られた溶液の１／３を最適マイクロ波周波数で最大値まで分極させる。分極が最大値に達した後、１００ｍｇ／Ｌ ＥＤＴＡを添加した６ｍＬの４０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ系緩衝液（ｐＨ＝７．６ｍｍｏｌ）を用いて溶解を行う。その場合、過分極Ｌ−［１−13Ｃ1］乳酸塩の最終濃度は約１７ｍｍｏｌ／Ｌである。１８０°１Ｈパルスを使用し及び使用せずに異核13Ｃ／1Ｈ二重エコースペクトル（ＴＥ＝３００ミリ秒）を取得したところ、図４に示すスペクトルが得られた。
【００７０】
図４は、Ｃ２乳酸塩プロトン共鳴に中心を置いた１マイクロ秒の６°13Ｃパルス、５ミリ秒の断熱１８０°13Ｃパルス（帯域幅約２ｋＨｚ）及び１０ミリ秒の断熱１８０°1Ｈパルス（帯域幅約１ｋＨｚ）を用いて、過分極Ｌ−［１−13Ｃ1］乳酸塩から取得した２つの連続した13Ｃ／1Ｈ異核二重エコースペクトル（ＴＥ＝３００ミリ秒）を示している。スペクトルは１８０°1Ｈパルスを使用し及び使用せずに取得した。取得時間中にはプロトンデカップリングを適用した。ＴＲ＝１秒。
【００７１】
Ｌ−［１−13Ｃ1］乳酸塩とＬ−［１−13Ｃ1，２−2Ｈ1］乳酸塩との等モル混合物を調製し、約２６±０．５％（ｎ＝２）まで分極させた。ＮＭＲ管中の最終乳酸塩濃度は１０ｍＭであった。
【００７２】
図５は、Ｃ２乳酸塩プロトン共鳴に中心を置いた１マイクロ秒の６°13Ｃパルス、５ミリ秒の断熱１８０°13Ｃパルス（帯域幅約２ｋＨｚ）及び１０ミリ秒の断熱１８０°1Ｈパルス（帯域幅約１ｋＨｚ）を用いて、過分極Ｌ−［１−13Ｃ1］乳酸塩とＬ−［１−13Ｃ1，２−2Ｈ1］乳酸塩との等モル混合物から取得した13Ｃ／1Ｈ異核スピンエコースペクトル（ＴＥ＝３００ミリ秒）を示している。示されている場合には、取得時間中にプロトンデカップリングを適用した。ＴＲ＝１秒。
【００７３】
分極の寿命中にこれら一連のスペクトルを取得したところ、図６に示す結果が得られた。断熱13Ｃパルスの使用により、標本化されない13Ｃ分極がｚ軸に沿って残留することが保証された。しかし、これらのデータから推定したＴ1（2Ｈ−乳酸塩について２７秒及び1Ｈ−乳酸塩について２５秒）は、非分極物質について推定されたＴ1よりずっと短く（図３）、恐らくは双曲線セカントパルスの欠陥を反映している。これらはまた、複数の低フリップ角に関する補正の欠如を反映しているかもしれない。
【００７４】
図６の凡例に示されるように、過分極Ｌ−［１−13Ｃ1］乳酸塩とＬ−［１−13Ｃ1，２−2Ｈ1］乳酸塩との等モル混合物から複数の異核13Ｃ／1Ｈ二重エコースペクトルを取得した。上方のプロットは、1Ｈパルスの不存在下で取得された総13Ｃ信号、1Ｈパルスの存在下で取得された13Ｃ信号（13Ｃ＋1Ｈ）、並びにＣ２プロトン化及び重水素化乳酸塩化学種の計算濃度を示している。これらの値の対数を下方のプロットに示す。
【００７５】
実施例４：［１−13Ｃ1，２−2Ｈ1］乳酸塩を用いたインビボ実験
異核13Ｃ／1Ｈ二重エコー実験がインビボで［１−13Ｃ1，２−2Ｈ1］乳酸塩のＣ２プロトン化状態を検出するためには、13Ｃ共鳴は十分に長いＴ1及びＴ2を有していなければならない。
【００７６】
インビボでのＴ1測定
Ｃｈｅｎ，Ａ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．Ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｕｓｉｎｇ ｈｙｐｅｒｐｏｌａｒｉｚｅｄ ［１−Ｃ−１３］ｌａｃｔａｔｅ ａｓ ａ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｖｏ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｃ−１３ ＭＲＳＩ ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｉｍａｇｉｎｇ ２６，７２１−７２６（２００８）に記載されたようにしてＬ−［１−13Ｃ1］乳酸塩を分極させ、２００μｌを尾静脈を通してＥＬ４腫瘍担持マウスに注射した。腫瘍の上方に配置された２４ｍｍ直径の表面コイルを用いて非スライス選択的スペクトルを収集した。最初の３２のスペクトルに関しては５度の推定フリップ角及び１秒の反復時間（ＴＲ）を使用し、続く１６のスペクトルでは２秒のＴＲを使用し、次いで１０度のフリップ角及び２秒のＴＲを用いて１６のスペクトルを収集した。乳酸塩のピーク積分値を時間の関数としてプロットし（図７）、Ｔ1及びフリップ角の推定値を与えるモデルにデータを当てはめた。腫瘍中の乳酸塩Ｔ1は、３３秒（ｎ＝１）と推定された。
【００７７】
インビボでのＴ2測定
異核スピンエコー実験におけるエコー時間は３００ミリ秒（図３参照）であり、したがって13Ｃ共鳴は長いＴ2を有することが必須である。我々は以前に、ＥＬ４リンパ腫中の［１−13Ｃ］乳酸塩に関する横緩和時間を、インビボで［１−13Ｃ］ピルビン酸塩の注射後に９．４Ｔで測定した。Ｋｅｔｔｕｎｅｎ，Ｍ．Ｉ．，ｅｔ ａｌ．Ｍａｇｎｅｔｉｚａｔｉｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｈｙｐｅｒｐｏｌａｒｉｚｅｄ ［１−13Ｃ］ｐｙｒｕｖａｔｅ ａｎｄ ［１−13Ｃ］ｌａｃｔａｔｅ ｉｎ ａ ｍｕｒｉｎｅ ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｍａｇｎ Ｒｅｓｏｎ Ｍｅｄ ６３，８７２−８８０（２０１０）を参照されたい。乳酸塩及びピルビン酸塩共鳴の両方に関して多重指数関数的Ｔ２緩和を観測した（図８）。
【００７８】
乳酸塩（ｎ＝８）に関しては、３つの成分を指数関数的データに当てはめた（図９）。即ち、短いＴ2成分（０．１３±０．０９秒、３１±２１％）、中位のＴ2成分（０．７５±０．２０秒、５２±１６％）及び長いＴ2成分（２．２±０．７秒、２３±１５％）であった。同様な多重指数関数的挙動は３Ｔでも報告されている。Ｐｒｏｃ Ｉｎｔｌ Ｓｏｃ Ｍａｇ Ｒｅｓ Ｍｅｄ，Ｖｏｌ．１６ ８９０（Ｔｏｒｏｎｔｏ，２００８）中のＹｅｎ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｉｇｎａｌ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｉｎ Ｌｏｗ−Ｄｏｓｅ Ｈｙｐｅｒｐｏｌａｒｉｚｅｄ １３Ｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｕｓｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ−Ｓｌｉｃｅ ＦＳＥＰＳＩ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ．を参照されたい。
【００７９】
したがって、３００ミリ秒のエコー時間では、総［１−13Ｃ］乳酸塩信号のほぼ６０％が残留する。
【００８０】
［１−13Ｃ，２−2Ｈ］乳酸塩のＣ２プロトン化状態をインビボで検出するために使用できる異核二重エコーイメージングパルスシーケンスでは、標準的なＥＰＩシーケンスにおけるリードアウト勾配及び位相エンコード勾配を用いてエコーが取得される。断熱13Ｃパルスを使用することで、我々は標本化されない13Ｃ分極がｚ軸に沿って残留することを保証している。また、二重エコーシーケンスを使用することで、我々はこの分極がパルスシーケンスの終了時に＋ｚ軸に戻ることを保証している。1Ｈパルスは１回置きの取得時に共鳴からスイッチオフされ、これによって１回置きの取得時には13Ｃ信号の位相変調がターンオフされる（図３参照）。1Ｈパルスなしで取得された13Ｃ画像は13Ｃ標識Ｃ２重水素化乳酸塩プラス13Ｃ標識Ｃ２プロトン化乳酸塩からの信号を有し、1Ｈパルスを用いて取得された13Ｃ画像は13Ｃ標識Ｃ２重水素化乳酸塩マイナス13Ｃ標識Ｃ２プロトン化乳酸塩からの信号を有する。これらの画像を加算すれば総13Ｃ標識Ｃ２重水素化乳酸塩が得られ、減算すれば13Ｃ標識Ｃ２プロトン化乳酸塩が得られる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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