(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
前駆タンパク質転換酵素スブチリシン/ケキシンタイプ9(PCSK9)の少なくとも２つの断片を含むワクチンであって、該少なくとも２つの断片の少なくとも１の断片が、配列番号：9のPCSK9のアミノ酸残基150〜170の少なくとも8連続アミノ酸残基を含み、該少なくとも２つの断片の少なくとも１の断片が配列番号：9のPCSK9のアミノ酸残基205〜225の少なくとも8連続アミノ酸残基を含むワクチン。
【請求項２】
該少なくとも２つの断片が、アミノ酸配列 SIPWNLERITPPR(配列番号：2)、PEEDGTRFHRQASK(配列番号：3)、PEEDGTRFHRQA(配列番号：4)、EEDGTRFHRQASK(配列番号：5)、EEDGTRFHRQAS(配列番号：6)、SIPWNLERITP(配列番号：7)、およびSIPWNLERIT(配列番号：8)を有するペプチドからなる群から選ばれる請求項１記載のワクチン。
【請求項３】
PCSK9の少なくとも１の断片が、SIPWNLERITPPR(配列番号：2)、SIPWNLERITP(配列番号：7)およびSIPWNLERIT(配列番号：8)からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有し、PCSK9の少なくとも１の断片が、PEEDGTRFHRQASK(配列番号：3)、PEEDGTRFHRQA(配列番号：4)、EEDGTRFHRQASK(配列番号：5)、およびEEDGTRFHRQAS(配列番号：6)からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有する請求項１または２記載のワクチン。
【請求項４】
SIPWNLERITPPR(配列番号：2)およびPEEDGTRFHRQASK(配列番号：3)、SIPWNLERITPPR(配列番号：2)およびPEEDGTRFHRQA(配列番号：4)、SIPWNLERITPPR(配列番号：2)およびEEDGTRFHRQASK(配列番号：5)、SIPWNLERITPPR(配列番号：2)およびEEDGTRFHRQAS(配列番号：6)、PEEDGTRFHRQASK(配列番号：3)およびSIPWNLERITP(配列番号：7)、PEEDGTRFHRQASK(配列番号：3)およびSIPWNLERIT(配列番号：8)、PEEDGTRFHRQA(配列番号：4)およびSIPWNLERITP(配列番号：7)、PEEDGTRFHRQA(配列番号：4)およびSIPWNLERIT(配列番号：8)、EEDGTRFHRQASK(配列番号：5)およびSIPWNLERITP(配列番号：7)、EEDGTRFHRQASK(配列番号：5)およびSIPWNLERIT(配列番号：8)、EEDGTRFHRQAS(配列番号：6)およびSIPWNLERITP(配列番号：7)、またはEEDGTRFHRQAS(配列番号：6)およびSIPWNLERIT(配列番号：8)を含む、請求項1〜3のいずれかに記載のワクチン。
【請求項５】
PCSK9の該少なくとも２つの断片がCおよび/またはN末端にシステイン残基を含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のワクチン。
【請求項６】
PCSK9の該少なくとも２つの断片が、医薬的に許容される担体、好ましくはKLH(キーホールリンペットヘモシアニン)と結合していることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のワクチン。
【請求項７】
PCSK9の該少なくとも２つの断片が、皮内、皮下、または筋肉内投与用に製剤化されることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のワクチン。
【請求項８】
少なくとも１のアジュバント、好ましくは水酸化アルミニウムを含む請求項１〜７のいずれかに記載のワクチン。
【請求項９】
高脂血症、高コレステロール血症、および/またはアテローム性動脈硬化症、好ましくは心血管疾患、卒中、または末梢血管疾患の治療および/または予防に用いるための請求項１〜８のいずれかに記載のワクチン。
【請求項１０】
PCSK9の該少なくとも２つの断片を、0.1ng〜10mg、好ましくは1μg〜500μg/用量の量で個体に投与することを特徴とする請求項９記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫原性担体と結合した２つの異なるPCSK9エピトープを組み合わせたPCSK9に対する新規混合免疫原性ペプチドワクチンの開発に関する。該ワクチンは、高脂血症、高コレステロール血症、およびアテローム性動脈硬化症によって生じる健康障害の予防および/または治療のためにもたらされる。
【背景技術】
【０００２】
高脂血症、高コレステロール血症、高血圧、アテローム性動脈硬化症は、世界中の死亡率の主要因と考えられる心血管障害である。肥満、糖尿病、喫煙、および身体活動の欠如などの要因とともに、心血管の変調の発現に対する主な要因に、常染色体優性高コレステロール血症(ADH)などの遺伝子疾患がある。ADHは、心血管障害の発現に対する重要な要因と考えられ、コレステロール代謝障害および低密度リポタンパク質コレステロール濃度の増加によって顕在化し、次いで早期冠動脈疾患(CAD)の形成をもたらす。
【０００３】
３つの主な遺伝子的変調がADHの発現をもたらしうることが知られている。古典形のADHは、低密度リポタンパク質レセプター(以後、LDLRという)の突然変異によって生じる。さらに、アポリポタンパク質B-100(apoB-100)、より具体的にはそのリガンド結合ドメインの突然変異は、ApoB-100のLDLRに対する結合を妨げ、次いでコレステロール代謝障害をもたらす。最終的に、遺伝子変化によりADHの発現に関与する可能性がある第3の最も最近発見された要素は、前駆タンパク質転換酵素スブチリシン/ケキシンタイプ9(以後、PCSK9という)である。
【０００４】
神経アポトーシス調節変換酵素１(NARC-1)としても知られるPCSK9は、分泌スブチラーゼファミリーの第９メンバーとして同定されたプロテアーゼK様スブチラーゼである。PCSK9タンパク質は、〜72kDa前駆タンパク質として合成され、自己触媒的にプロドメインと触媒ドメインの間が開裂し、次いで、成熟タンパク質の生成をもたらす。該プロドメイン(〜14kDa)は、成熟タンパク質63kDaと結合したままであり、この形で成熟タンパク質は分泌経路に向かう。
【０００５】
脂質ホメオスタシスにおけるPCSK9の役割はすでによく知られている。PCSK9の発現は、脂質ホメオスタシスに関与する他のステロール調節要素結合タンパク質（以後、SREBPという）反応性遺伝子と同様に、SREBPにより調節されるだけでなく、PCSK9はLDLRの内在化と分解を促進することにより低密度リポタンパク質コレステロール（以後LDLcという）クリアランスにも関与する。
【０００６】
in vitroおよびin vivo試験は、血液からの低密度リポタンパク質コレステロール取り込みにおけるPCSK9の本質的役割を強調した。一方で、PCSK9アデノウイルス過剰発現は、循環LDLc濃度を有意に増加させ、他方で、PCSK9-/-マウスは、野生型に比べてLDLRレベルの2.8倍の増加とLDLcの低下を示した。
【０００７】
該遺伝子は、ヒト染色体1p33-p34.3に局在し、肝臓、腎臓、小脳、および小腸などの組織に発現する。「機能突然変異の増加」がLDLRレベルの低下、次いで高コレステロール血症、およびアテローム性動脈硬化症になりやすい体質をもたらすことが、多くの研究で確認された。「機能突然変異の減少」は、LDLRレベルの増加、次いで低密度リポタンパク質コレステロール(LDLc)の低下をもたらす。
【０００８】
要するに、PCSK9は、転写後的にLDLRレベルを調節するので、アテローム性動脈硬化症の治療として魅力的な標的である。
【０００９】
ところで、PCDSK9の機能を阻害するための多くの種々の戦略およびアプローチが確立されている。
【００１０】
サル(Macaca fascicularis)におけるPCSK9に対するsiRNAの適用は、総コレステロールの顕著な低下をもたらした。マウスおよび非ヒト霊長類におけるPCDSK9に対するモノクローナルおよびポリクローナル抗体を用いた他の研究では、LDLRを上方調節すると同時に総コレステロールおよびLDLc濃度を低下させることができた。
【００１１】
モノクローナルまたはポリクローナル抗体によるPCDSK9レベルの低下または低分子阻害剤およびノックアウト技術を用いるPCDSK9の不活化は、種々の動物モデルでいかなる副作用も示さなかった。したがって、PCDSK9は全体としてアテローム性動脈硬化症を治療するための非常に魅力的な標的である。
【００１２】
WO 2011/027257は、PCDSK9介在疾患を治療、予防、および軽減するためのワクチンに用いることができるPCDSK9由来の免疫原性断片に関する。
【００１３】
WO 2009/100297は、ヒトPCDSK9のアンタゴニストを開示している。
WO 2010/057242は、ヒトPCDSK9の断片由来のペプチドを含むワクチンに関する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、PCDSK9を阻害し、PCDSK9およびLDLRの相互作用を無効化/減少させることができるPCDSK9に対するペプチドベースのワクチンを提供することである。これは、肝細胞におけるLDLRレベルの増加、次いで総コレステロールおよびLDLcの低下をもたらす。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
この目的は、前駆タンパク質転換酵素スブチリシン/ケキシン タイプ 9(PCSK9)の複数（２以上、少なくとも２）の断片を含むワクチンにより達成され、ここで、該少なくとも２つの断片の第1断片はPCSK9(配列番号：9)のアミノ酸残基150〜170の少なくとも8連続アミノ酸残基を含み、該少なくとも２つの断片の第２断片はPCSK9のアミノ酸残基205〜225の少なくとも8連続アミノ酸残基を含む。
【００１６】
驚くべきことに、上記PCDSK9の少なくとも２の異なるペプチド断片を含むワクチンは、PCDSK9の１断片のみを含むワクチンに比べてLDLレセプターの量をはるかに効率的に増加させることができることがわかった。本発明のワクチンの投与は、例えばin vivoで肝細胞の低密度リポタンパク質レセプターレベルを増加させる。その結果として、ワクチン投与による血漿中のLDLcおよび総コレステロールの平均値は顕著に低下する。したがって、本発明のワクチンの投与は、高脂血症、高コレステロール血症、および/またはアテローム性動脈硬化症により生じる疾患を１ペプチドの投与に比べてはるかに高い効率と精度で治療または予防することができる。本発明の好ましい態様において、本発明のワクチンのすべてのPCDSK9断片は、配列番号：9のアミノ酸残基150〜170および205〜225からなるPCDSK9断片由来である。
【００１７】
本発明のワクチンに用いるペプチド断片は、PCSK9(配列番号：9)のアミノ酸残基150〜170、好ましくはアミノ酸残基153〜165、および205〜225、好ましくはアミノ酸残基209〜222の、少なくとも8、好ましくは少なくとも9、より好ましくは少なくとも10連続アミノ酸残基を含む。
【００１８】
配列番号：9(PCSK9 アミノ酸配列):
MGTVSSRRSW WPLPLLLLLL LLLGPAGARA QEDEDGDYEE LVLALRSEED GLAEAPEHGT TATFHRCAKD PWRLPGTYVV VLKEETHLSQ SERTARRLQA QAARRGYLTK ILHVFHGLLP GFLVKMSGDL LELALKLPHV DYIEEDSSVF AQSIPWNLER ITPPRYRADE YQPPDGGSLV EVYLLDTSIQ SDHREIEGRV MVTDFENVPE EDGTRFHRQA SKCDSHGTHL AGVVSGRDAG VAKGASMRSL RVLNCQGKGT VSGTLIGLEF IRKSQLVQPV GPLVVLLPLA GGYSRVLNAA CQRLARAGVV LVTAAGNFRD DACLYSPASA PEVITVGATN AQDQPVTLGT LGTNFGRCVD LFAPGEDIIG ASSDCSTCFV SQSGTSQAAA HVAGIAAMML SAEPELTLAE LRQRLIHFSA KDVINEAWFP EDQRVLTPNL VAALPPSTHG AGWQLFCRTV WSAHSGPTRM ATAVARCAPD EELLSCSSFS RSGKRRGERM EAQGGKLVCR AHNAFGGEGV YAIARCCLLP QANCSVHTAP PAEASMGTRV HCHQQGHVLT GCSSHWEVED LGTHKPPVLR PRGQPNQCVG HREASIHASC CHAPGLECKV KEHGIPAPQE QVTVACEEGW TLTGCSALPG TSHVLGAYAV DNTCVVRSRD VSTTGSTSEG AVTAVAICCR SRHLAQASQE LQ
【００１９】
PCSK9由来の断片は、好ましくは8〜20、より好ましくは10〜15アミノ酸残基からなるか、またはそれらを含む。本発明の特に好ましい態様によれば、PCDSK9のアミノ酸残基150〜170由来のペプチドは、8〜15、好ましくは10〜13アミノ酸残基を含む。PCDSK9のアミノ酸残基205〜225由来のペプチドは、8〜16、好ましくは10〜14アミノ酸残基を含む。
【００２０】
本発明のワクチンは、PCSK9(配列番号：9)のアミノ酸残基150〜170および205〜225由来の少なくとも2、好ましくは少なくとも3、より好ましくは少なくとも4、さらにより好ましくは少なくとも5ペプチドの組み合わせである。この組み合わせは、異なるエピトープ起源の少なくとも２配列を含む。
【００２１】
本発明のペプチドは、当該分野でよく知られた方法により化学的に合成することができる。もちろん、組換え法を用いて本発明のペプチドを生成することもできる。該ペプチドは、微生物、例えば細菌、酵母、または真菌；真核細胞、例えば哺乳動物細胞または昆虫細胞；または組換えウイルスベクター、例えばアデノウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、Simliki forest（シムリキフォレスト）ウイルス、バキュロウイルス、バクテリオファージ、シンドビスウイルス、またはセンダイウイルスを用いて生成することができる。該ペプチドを生成するのに適した細菌には、E. coli、B. subtilis、またはそのようなペプチドを発現させることができるあらゆる他の細菌が含まれる。本発明のペプチドを発現させるのに適した酵母細胞には、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Candida、Pichia pastoris、またはペプチドを発現させることができるあらゆる他の酵母が含まれる。対応する手段および方法は当該分野でよく知られている。組換え的に生成したペプチドを単離および精製する方法も当該分野でよく知られており、例えばゲルろ過、アフィニティクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィなどが含まれる。
【００２２】
本発明のペプチドの単離を促進するために、融合ポリペプチドを作製することができ、該ペプチドは、アフィニティクロマトグラフィにより単離することができるヘテロローガスなポリペプチドと翻訳的に融合する（共有結合する）。典型的なヘテロローガスなポリペプチドは、His-Tag(例えばHis6; 6ヒスチジン残基)、GST-Tag(グルタチオン-S-トランスフェラーゼ)などである。該融合ペプチドは、該ペプチドの精製を促進するだけでなく、精製工程中の該ペプチドの分解を防ぐことができる。精製後に該ヘテロローガスなポリペプチドを除去するのが望ましい場合は、該融合ポリペプチドは、該ペプチドと該ヘテロローガスなポリペプチドの間の連結部に開裂部位を含むことができる。該開裂部位は、該部位のアミノ酸配列に特異的な酵素（例えばプロテアーゼ）で開裂するアミノ酸配列からなり得る。
【００２３】
本発明によれば、少なくとも１の断片は、PCSK9(配列番号：9)のアミノ酸残基150〜170由来であり、少なくとも１の断片がアミノ酸残基205〜225由来である。
【００２４】
本発明のワクチンは、PCSK9タンパク質の異なる部分のPCDSK9断片を含む。したがって、少なくとも１の断片が特定のPCDSK9断片由来であり、少なくとも１の断片が別の特定のPCDSK9断片由来であるものが特に好ましい。
【００２５】
本発明の別の好ましい態様において、PCSK9の該少なくとも２つの断片は、アミノ酸配列 SIPWNLERITPPR(配列番号：2)、PEEDGTRFHRQASK(配列番号：3)、PEEDGTRFHRQA(配列番号：4)、EEDGTRFHRQASK(配列番号：5)、EEDGTRFHRQAS(配列番号：6)、SIPWNLERITP(配列番号：7)およびSIPWNLERIT(配列番号：8)を有するペプチドからなる群から選ばれる。
【００２６】
PCDSK9の少なくとも２つの断片は、FAQSIPWNLERITPPRYRAD(配列番号：10)、FAQSIPWNLERITPPRYRA(配列番号：11)、FAQSIPWNLERITPPRYR(配列番号：12)、FAQSIPWNLERITPPRY(配列番号：13)、FAQSIPWNLERITPPR(配列番号：14)、FAQSIPWNLERITPP(配列番号：15)、AQSIPWNLERITPPRYRAD(配列番号：16)、QSIPWNLERITPPRYRAD(配列番号：17)、SIPWNLERITPPRYRAD(配列番号：18)、AQSIPWNLERITPPRYRA(配列番号：19)、QSIPWNLERITPPRYRA(配列番号：20)、SIPWNLERITPPRYRA(配列番号：21)、AQSIPWNLERITPPRYR(配列番号：22)、QSIPWNLERITPPRYR(配列番号：23)、SIPWNLERITPPRYR(配列番号：24)、QSIPWNLERITPPRY(配列番号：25)、SIPWNLERITPPRY(配列番号：26)、AQSIPWNLERITPPR(配列番号：27)、QSIPWNLERITPPR(配列番号：28)、SIPWNLERITPP(配列番号：29)、ENVPEEDGTRFHRQASKCDS(配列番号：30)、ENVPEEDGTRFHRQASKCD(配列番号：31)、ENVPEEDGTRFHRQASKC(配列番号：32)、ENVPEEDGTRFHRQASK(配列番号：33)、NVPEEDGTRFHRQASKCDS(配列番号：34)、VPEEDGTRFHRQASKCDS(配列番号：35)、PEEDGTRFHRQASKCDS(配列番号：36)、NVPEEDGTRFHRQASKCD(配列番号：37)、VPEEDGTRFHRQASKCD(配列番号：38)、PEEDGTRFHRQASKCD(配列番号：39)、NVPEEDGTRFHRQASKC(配列番号：40)、VPEEDGTRFHRQASKC(配列番号：41)、PEEDGTRFHRQASKC(配列番号：42)、NVPEEDGTRFHRQASK(配列番号：43)、VPEEDGTRFHRQASK(配列番号：44)、PEEDGTRFHRQAS(配列番号：45)からなる群から選ばれるアミノ酸配列からなるかまたはこれらを含むことができる。
【００２７】
PCDSK9の少なくとも１の断片は、好ましくは、SIPWNLERITPPR(配列番号：2)、SIPWNLERITP(配列番号：7)およびSIPWNLERIT(配列番号：8)からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有し、PCDSK9の少なくとも１の断片は、PEEDGTRFHRQASK(配列番号：3)、PEEDGTRFHRQA(配列番号：4)、EEDGTRFHRQASK(配列番号：5)およびEEDGTRFHRQAS(配列番号：6)からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有する。
【００２８】
本発明の好ましい態様によれば、本発明のワクチンは、SIPWNLERITPPR(配列番号：2)およびPEEDGTRFHRQASK(配列番号：3)、SIPWNLERITPPR(配列番号：2)およびPEEDGTRFHRQA(配列番号：4)、SIPWNLERITPPR(配列番号：2)およびEEDGTRFHRQASK(配列番号：5)、SIPWNLERITPPR(配列番号：2)およびEEDGTRFHRQAS(配列番号：6)、PEEDGTRFHRQASK(配列番号：3)およびSIPWNLERITP(配列番号：7)、PEEDGTRFHRQASK(配列番号：3)およびSIPWNLERIT(配列番号：8)、PEEDGTRFHRQA(配列番号：4)およびSIPWNLERITP(配列番号：7)、PEEDGTRFHRQA(配列番号：4)およびSIPWNLERIT(配列番号：8)、EEDGTRFHRQASK(配列番号：5)およびSIPWNLERITP(配列番号：7)、EEDGTRFHRQASK(配列番号：5)およびSIPWNLERIT(配列番号：8)、EEDGTRFHRQAS(配列番号：6)およびSIPWNLERITP(配列番号：7)、またはEEDGTRFHRQAS(配列番号：6)およびSIPWNLERIT(配列番号：8)を含み、PEEDGTRFHRQA(配列番号：4)およびSIPWNLERITP(配列番号：7)、EEDGTRFHRQASK(配列番号：5)およびSIPWNLERITP(配列番号：7)、EEDGTRFHRQASK(配列番号：5)およびSIPWNLERIT(配列番号：8)、またはEEDGTRFHRQAS(配列番号：6)およびSIPWNLERIT(配列番号：8)を含むワクチンが特に好ましい。
【００２９】
PCDSK9の少なくとも２つの断片は、好ましくはCおよび/またはN末端に（と結合した）システイン残基を含む。
【００３０】
ペプチドのNおよび/またはC末端にシステイン残基を与えると、例えば担体との結合を促進し、該ペプチドの免疫原性を増強しうる。
【００３１】
本発明の好ましい態様によれば、PCSK9の少なくとも２つの断片(すなわち、PCDSK9由来の少なくとも２のペプチド)は、医薬的に許容される担体、好ましくはKLH(キーホールリンペットヘモシアニン)と個々にまたは一緒に結合する。
【００３２】
本発明の好ましい態様によれば、PCSK9の該少なくとも２つの断片は、医薬的に許容される担体、好ましくはKLH(キーホールリンペットヘモシアニン)、破傷風トキソイド、アルブミン結合タンパク質、B型肝炎コア抗原、ウシ血清アルブミン、デンドリマー(MAP)、ペプチドリンカー（または隣接領域)、およびSingh et al.、Nat. Biotech. 17(1999)、1075-1081に記載のアジュバント物質(特に、該文献の表１記載のもの)およびO'Hagan et al.、Nature Reviews、Drug Discovery 2(9)(2003)、727-735(特に、その中に記載の内因性免疫増強化合物および送達システム)、またはそれらの混合物と結合する。この文脈において共役化学（例えば、ヘテロ２機能性化合物、例えばGMBSを介するもの、もちろん「Bioconjugate Techniques」、Greg T. Hermansonに記載の他のものも）は、当業者に知られた反応から選択することができる。さらに、該ワクチン組成物は、アジュバント、好ましくは低溶解性アルブミン組成物、特に水酸化アルミニウムを用いて製剤化することができる。もちろん、アジュバント、例えばMF59リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム、サイトカイン(例えば、IL-2、IL-12、GM-CSF)、サポニン(例えばQS21)、MDP誘導体、CpGオリゴヌクレオチド、LPS、MPL、ポリホスファゼン、エマルジョン(例えばFreund's、SAF)、リポソーム、リポペプチド、ビロソーム、イスコム、コクレアート（cochleate）、PLG微粒子、ポロキサマー粒子、ウイルス様粒子、易熱性エンテロトキシン(LT)、コレラ毒素(CT)、変異体毒素(例えば、LTK63およびLTR72)、微粒子、および/または重合リポソームも用いることができる。
【００３３】
本発明のペプチドは、好ましくは、NHS-ポリ(エチレンオキシド)(PEO)(例えばNHS-PEO4-マレイミド)からなる群から選ばれるリンカーを介して担体またはアジュバントと結合する。
【００３４】
本発明のペプチドおよび医薬的に許容される担体を含むワクチンは、あらゆる適切な適用方法、例えば皮内(i.d.)、腹腔内(i.p.)、筋肉内(i.m.)、鼻内、経口、皮下(s.c.)など、およびあらゆる適切な送達用具(O'Hagan et al.、Nature Reviews、Drug Discovery 2(9)、(2003)、727-735)により投与することができる。本発明の化合物は、好ましくは、皮内、皮下、または筋肉内投与用に製剤化される。各製剤を得るための手段と方法は、当業者に知られている（例えば、「Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations」、Sarfaraz Niazi、CRC Press Inc、2004参照)。
【００３５】
すなわち、本発明のワクチンは、好ましくは皮内、皮下、または筋肉内投与用に製剤化される少なくとも２のペプチドを含む。
【００３６】
本発明のワクチンの少なくとも２のペプチド/断片は、好ましくはアジュバント、好ましくは水酸化アルミニウムを用いて製剤化される。
本発明の好ましい態様によれば、該ワクチンは、高脂血症、高コレステロール血症、および/またはアテローム性動脈硬化症、好ましくは心血管疾患、卒中、または末梢血管疾患によって生じる疾患の治療および/または予防に用いられる。
【００３７】
示したように、上記ペプチドおよびその組み合わせは、PCDSK9と特異的に結合することができる抗体の形成を誘導することができる。該抗体とPCDSK9の相互作用は、in vivoで肝細胞中の低密度リポタンパク質レセプターの増加、次いで血漿中総コレステロール濃度の低下をもたらす。
【００３８】
アテローム性動脈硬化症関連疾患は、好ましくは、末梢動脈閉塞性疾患、冠状動脈性心疾患、卒中性脳発作、および卒中からなる群から選ばれる。
【００３９】
用語「高脂血症、高コレステロール血症、および/またはアテローム性動脈硬化症関連疾患」、および「高脂血症、高コレステロール血症、および/またはアテローム性動脈硬化症によって生じる障害」は、高脂血症、高コレステロール血症、およびアテローム性動脈硬化症の結果である疾患を表す。これら疾患には、とりわけ、末梢動脈閉塞性疾患、冠状動脈性心疾患、および卒中性脳発作が含まれる（例えばSteinberg、D. J Lipid Res 46(2005):179-190およびSteinberg、D. J Lipid Res 47(2006):1339-1351参照)。
【００４０】
本発明の好ましい態様によれば、PCSK9の該少なくとも２つの断片は、0.1ng〜10mg、好ましくは0.5〜500μg、より好ましくは1〜100μg/免疫の量で個体に投与される。好ましい態様において、これらの量は、該ワクチン中に存在するすべてのPCDSK9断片に言及する。別の好ましい態様において、これらの量は、各ワクチン中に存在する各一断片に言及する。もちろん、PCDSK9の特異的断片が種々の量または等量で存在するワクチンを提供することができる。あるいは、本発明のペプチドは、0.1ng〜10mg、好ましくは10ng〜1mg、特に100ng〜300μg/kg体重の量で個体に投与することができる。
【００４１】
単回用量を作製するために担体物質と混合することができるペプチドの量は、治療する宿主および特定の投与方法に応じて変化しうる。該ワクチンの用量は、個体の病状、年齢、性別、および体重、ならびに個体に目的とする反応を生じさせる抗体の能力に応じて変化しうる。投薬計画は、最適な治療反応をもたらすように調節することができる。例えば、種々の分割用量を毎日投与するか、または該用量を治療状況の緊急性が示すように比例的に減少させることができる。該ワクチンの用量は、状況に応じて最適予防用量反応をもたらすように変更することもできる。例えば、本発明のペプチドおよびワクチンは、常にPCDSK9に対する抗体レベルに応じて数日、１または２週間、または数カ月間、または数年の間隔で個体に投与することができる。
【００４２】
本発明の好ましい態様において、該ペプチド/ワクチンは、2〜10回、好ましくは2〜7回、さらにより好ましくは5回以下、最も好ましくは4回以下で適用される。この免疫回数は、基礎免疫をもたらすことができる。特に好ましい態様において、続くワクチネーション間の時間間隔は2週間〜5年間、好ましくは1カ月間〜3年間（以下）、より好ましくは2カ月間〜1.5年間の間で選ばれる。典型的なワクチネーションスケジュールは、6〜8週間および6カ月間以下の期間にわたる3〜4回の最初のワクチネーションを含みうる。次いで、該ワクチネーションを2〜10年間ごとに反復しうる。本発明のペプチド/ワクチンの反復投与は、治療的ワクチネーションの最終効果を最大にしうる。
【００４３】
本発明のワクチンは、ヒト体内のLDLおよび/またはHDL濃度の調節にも関与する他のタンパク質由来の抗原も含みうる。例えば、本発明のPCDSK9断片をヒトCETPタンパク質由来のエピトープと組み合わせうる。
【００４４】
典型的には、該ワクチンは、本発明のペプチドを、0.5〜500μg、好ましくは1〜100μg、あるいは0.1ng〜10mg、好ましくは10ng〜1mg、特に100ng〜100μg、あるいは例えば、100fmol〜10μmol、好ましくは10pmol〜1μmol、特に100pmol〜100nmolの量で含む。典型的には、該ワクチンは、補助物質、例えば緩衝剤、安定化剤なども含みうる。
【００４５】
好ましい態様によれば、本発明は、2またはそれ以上のペプチドの使用に関する。本発明は、アテローム性動脈硬化症およびアテローム性動脈硬化症関連疾患を予防および/または治療するためのワクチンの製造に関し、該アテローム性動脈硬化症関連疾患は、好ましくは末梢動脈閉塞性疾患、冠状動脈性心疾患、卒中性脳発作、および卒中からなる群から選ばれる。
【００４６】
本発明のさらに別の局面は、アテローム性動脈硬化症またはアテローム性動脈硬化症関連疾患に罹患しているか、または罹患するリスクがある個体を、本発明のペプチドまたはワクチンを該個体に投与する過程で治療する方法に関する。
【００４７】
本発明のワクチンに次いで、治療する個体には、ヒトおよび哺乳動物のLDLおよび/またはHDL濃度に影響を及ぼすことが知られている他の活性成分、例えば、スタチン、ヒブラート、ニコチン酸、コレステロール取り込み阻害剤（例えばエゼチミブ）、ApoA1 Milano、脱脂HDL、植物ステロールを投与することができる。個体に本発明のワクチンとスタチンを一緒（すなわち、同時、連続的など）に投与することが特に好ましい。
【００４８】
本発明を下記図および実施例でさらに説明するがこれらに制限されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】コントロール動物と比較した、配列番号1(無関係なペプチドコントロール)、4、5、6、7、および8、ならびに組み合わせA(配列番号：4および7)、B(配列番号：5および7)、C(配列番号：5および8)およびD(配列番号：6および8)のペプチドに関する肝臓溶解物中の低密度リポタンパク質レセプターの量を示す。
【図２】配列番号1(無関係なペプチドコントロール)、4、5、6、7、および8、ならびに組み合わせA(配列番号：4および7)、B(配列番号：5および7)、C(配列番号：5および8)およびD(配列番号：6および8)のペプチドに関する血漿中総コレステロール濃度の低下率（n=5マウス/群）を示す。
【実施例】
【００５０】
材料および方法
ワクチン:
該ペプチドを、ヘテロ二機能性リンカーGMBS(4-マレイミド酪酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル)を介してKLH(キーホールリンペットヘモシアニン)と結合させた。
15μgのペプチドを水酸化アルミニウムに懸濁させた(水酸化アルミニウムの最終濃度は0.2％であった)。リン酸緩衝剤を用いた。
【００５１】
表１．ワクチン生産に用いた配列
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【００５２】
動物実験：
5匹のBalb/cマウスの皮下に免疫した。マウスを不断給餌給水とし、12時間の明/暗周期で維持した。実験開始時のマウスの年齢は、通常8〜10週齢であった。
マウスに、KLHに結合したペプチド純量15μgをアジュバントとしてAlumに吸着させたもの総量1mlをs.c.経路で2週間間隔で4回注射した。
血液を最終注射の約2週間後に採取した。
【００５３】
タンパク質ELISA:
該ワクチンの免疫原性を検討するため、96ウェルNunc-Maxisorbプレートを組換えヒトPCSK9タンパク質でコートした。非特異結合をブロッキング緩衝液(1％BSA、PBS中)を用いてインキュベーションすることによりブロックした。1:2倍に連続希釈した適切な血清希釈液をウェルに加え、37℃で約１時間インキュベーションした。ELISAプレート毎に、標準血清を内部コントロールとして含めた。結合した抗体をビオチン化ヤギ抗マウスIgG、次いでストレプトアビジン結合ホースラディッシュパーオキシダーゼとインキュベーションして検出した。基質としてABTSを加え、405nmの光学濃度（OD）をマイクロウェルプレートリーダーで測定した。陰性コントロールとして、無関係のペプチドを注射したコントロール群由来の血清を分析した。力価を、アッセイにおいてODmaxの50％に達する血清の希釈で定義した。
【００５４】
総コレステロールアッセイ
総コレステロールを、WAKO LabAssay（登録商標）コレステロールキット(Wako)を用いて測定した。
【００５５】
LDLRサンドウィッチELISA
マウス肝臓中の低密度リポタンパク質レセプター(LDLR)レベルを測定するため、最終ワクチネーションの2週間後にマウスを屠殺した。肝臓組織を単離し、タンパク質抽出を標準プロトコールに従って行った。
96ウェルNunc-MaxisorbプレートをマウスLDLRアフィニティ精製ヤギポリクローナル抗LDLR抗体(R&D Systems)を用いてコートした。非特異結合を1％BSA/PBSとインキュベーションしてブロックした。次に、肝臓溶解物を室温で3時間インキュベーションして、マウスLDLRを捕捉した。捕捉したLDLRの検出は、ニワトリポリクローナル抗LDLR抗体(Abcam)、次いで二次ビオチン化ヤギ抗ニワトリIgG(Southern Biotech)およびストレプトアビジン-HRPコンジュゲートとインキュベーションして行った。最後に、TMBをパーオキシダーゼ色素原基質として用いた。
低密度リポタンパク質レセプターの定量は、標準較正曲線との比較により行い、溶解物の総タンパク質濃度に対して正規化した。
コントロール群（無関係ペプチドのコントロールワクチネーション）を100％に設定し、抗PCDSK9ワクチン処置群のレベルをこのコントロール群と比較した。
実施例１
【００５６】
ヒトPCDSK9に対するタンパク質価中央値（n=5マウス/群)。
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実施例２
【００５７】
総コレステロールの平均値（mg/dL）および低下率(n=5マウス/群)。
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実施例３
【００５８】
コントロール群と比較したin vivoマウス肝臓中の低密度リポタンパク質レセプター量（n=5マウス/群）
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
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