(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
転移性結腸直腸癌を予防、再発予防又は処置するための方法において使用するための、ヒトプロガストリンに特異的に結合する抗ｈＰＧモノクローナル抗体を含む組成物であって、該抗ｈＰＧモノクローナル抗体は、
ａ）ＣＤＲ１がＶＨＣＤＲ１．３（配列番号１）のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２がＶＨＣＤＲ２．３（配列番号２）のアミノ酸配列を含み、そしてＣＤＲ３がＶＨＣＤＲ３．３（配列番号３）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲ１がＶＬＣＤＲ１．３（配列番号４）のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２がＶＬＣＤＲ２．３（配列番号５）のアミノ酸配列を含み、そしてＣＤＲ３がＶＬＣＤＲ３．３（配列番号６）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とか、
ｂ）ＣＤＲ１がＶＨＣＤＲ１．８（配列番号３７）のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２がＶＨＣＤＲ２．８（配列番号４１）のアミノ酸配列を含み、そしてＣＤＲ３がＶＨＣＤＲ３．８（配列番号４５）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲ１がＶＬＣＤＲ１．８（配列番号４９）のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２がＶＬＣＤＲ２．８（配列番号５２）のアミノ酸配列を含み、そしてＣＤＲ３がＶＬＣＤＲ３．８（配列番号５５）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とか、
ｃ）ＣＤＲ１がＶＨＣＤＲ１．１３（配列番号３８）のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２がＶＨＣＤＲ２．１３（配列番号４２）のアミノ酸配列を含み、そしてＣＤＲ３がＶＨＣＤＲ３．１３（配列番号４６）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲ１がＶＬＣＤＲ１．１３（配列番号５０）のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２がＶＬＣＤＲ２．１３（配列番号５３）のアミノ酸配列を含み、そしてＣＤＲ３がＶＬＣＤＲ３．１３（配列番号５６）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とか、
ｄ）ＣＤＲ１がＶＨＣＤＲ１．１６（配列番号３９）のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２がＶＨＣＤＲ２．１６（配列番号４３）のアミノ酸配列を含み、そしてＣＤＲ３がＶＨＣＤＲ３．１６（配列番号４７）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲ１がＶＬＣＤＲ１．１６（配列番号５０）のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２がＶＬＣＤＲ２．１６（配列番号５３）のアミノ酸配列を含み、そしてＣＤＲ３がＶＬＣＤＲ３．１６（配列番号５７）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とかを含む、組成物。
【請求項２】
前記抗ｈＰＧモノクローナル抗体は、
（ａ）配列番号１２からなる重鎖可変領域と、配列番号１３からなる軽鎖可変領域とか、
（ｂ）配列番号６１からなる重鎖可変領域と、配列番号６５からなる軽鎖可変領域とか、
（ｃ）配列番号５９からなる重鎖可変領域と、配列番号６３からなる軽鎖可変領域とか、
（ｄ）配列番号６０からなる重鎖可変領域と、配列番号６４からなる軽鎖可変領域とかを含む、請求項１記載の使用のための組成物。
【請求項３】
前記抗ｈＰＧモノクローナル抗体はヒト化抗体である、請求項１又は２記載の使用のための組成物。
【請求項４】
転移性結腸直腸癌が、肝臓、肺、脳、又はリンパ節に位置する、請求項１〜３のいずれか１項記載の使用のための組成物。
【請求項５】
抗ｈＰＧモノクローナル抗体組成物の投与が、転移性結腸直腸腫瘍の外科的切除の前又は後に実行される、請求項１〜３のいずれか１項記載の使用のための組成物。
【請求項６】
抗ｈＰＧモノクローナル抗体組成物の投与が、放射線治療または化学療法の補助として投与される、請求項１〜３のいずれか１項記載の使用のための組成物。
【請求項７】
抗ｈＰＧモノクローナル抗体組成物の投与が、ＶＥＧＦまたはＥＧＦＲに特異的に結合する第２の治療用抗体の投与の前、同時又は後に実行される、請求項１〜３のいずれか１項記載の使用のための組成物。
【請求項８】
抗ｈＰＧモノクローナル抗体が、０．００１ｎＭ〜５０００ｎＭのヒトプロガストリン結合親和性を有する、請求項１〜３のいずれか１項記載の使用のための組成物。
【請求項９】
組成物が、ヒトプロガストリンの別のエピトープについての特異性を有する複数の抗体を含む、請求項１〜３のいずれか１項記載の使用のための組成物。
【請求項１０】
抗ｈＰＧモノクローナル抗体が０．００１ｍｇ／ｋｇ〜２５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１〜３のいずれか１項記載の使用のための組成物。
【請求項１１】
患者において転移性結腸直腸癌のための処置における請求項１〜１０記載の組成物の効力をモニターするためのデータを提供するための方法であって、以下の工程：（ｉ）転移性結腸直腸癌のための処置前に患者から得られた第１サンプルにおいてプロガストリンの濃度を決定すること、及び、（ｉｉ）該第１サンプル中のプロガストリンの濃度を、転移性結腸直腸癌のための処置後に同じ患者から得られた第２サンプル中のそれと比較することを含み、ここで、該第１サンプルと比較した、該第２サンプル中のプロガストリンの濃度における低下は、処置が効果的であったことを示す、方法。
【請求項１２】
サンプルにおいてプロガストリンの濃度を決定する工程が、プロガストリンに特異的に結合する抗体を用いたアッセイを使用して実行される、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
転移性結腸直腸癌幹細胞をその増殖を阻害するために効果的な量の抗ｈＰＧ抗体に暴露することを含む転移性結腸直腸癌幹細胞の増殖を阻害するための方法において使用するための、抗ｈＰＧモノクローナル抗体を含む組成物であって、該抗ｈＰＧモノクローナル抗体が、
ａ）ＣＤＲ１がＶＨＣＤＲ１．３（配列番号１）のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２がＶＨＣＤＲ２．３（配列番号２）のアミノ酸配列を含み、そしてＣＤＲ３がＶＨＣＤＲ３．３（配列番号３）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲ１がＶＬＣＤＲ１．３（配列番号４）のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２がＶＬＣＤＲ２．３（配列番号５）のアミノ酸配列を含み、そしてＣＤＲ３がＶＬＣＤＲ３．３（配列番号６）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とか、
ｂ）ＣＤＲ１がＶＨＣＤＲ１．８（配列番号３７）のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２がＶＨＣＤＲ２．８（配列番号４１）のアミノ酸配列を含み、そしてＣＤＲ３がＶＨＣＤＲ３．８（配列番号４５）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲ１がＶＬＣＤＲ１．８（配列番号４９）のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２がＶＬＣＤＲ２．８（配列番号５２）のアミノ酸配列を含み、そしてＣＤＲ３がＶＬＣＤＲ３．８（配列番号５５）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とか、
ｃ）ＣＤＲ１がＶＨＣＤＲ１．１３（配列番号３８）のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２がＶＨＣＤＲ２．１３（配列番号４２）のアミノ酸配列を含み、そしてＣＤＲ３がＶＨＣＤＲ３．１３（配列番号４６）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲ１がＶＬＣＤＲ１．１３（配列番号５０）のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２がＶＬＣＤＲ２．１３（配列番号５３）のアミノ酸配列を含み、そしてＣＤＲ３がＶＬＣＤＲ３．１３（配列番号５６）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とか、
ｄ）ＣＤＲ１がＶＨＣＤＲ１．１６（配列番号３９）のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２がＶＨＣＤＲ２．１６（配列番号４３）のアミノ酸配列を含み、そしてＣＤＲ３がＶＨＣＤＲ３．１６（配列番号４７）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲ１がＶＬＣＤＲ１．１６（配列番号５０）のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２がＶＬＣＤＲ２．１６（配列番号５３）のアミノ酸配列を含み、そしてＣＤＲ３がＶＬＣＤＲ３．１６（配列番号５７）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とかを含む、組成物。
【請求項１４】
Ｎ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体が、
（ａ）配列番号１２の重鎖可変領域配列および配列番号１３の軽鎖可変領域配列を含むモノクローナル抗体；
（ｂ）配列番号６１の重鎖可変領域配列および配列番号６５の軽鎖可変領域配列を含むモノクローナル抗体；
（ｃ）配列番号５９の重鎖可変領域配列および配列番号６３の軽鎖可変領域配列を含むモノクローナル抗体；および
（ｄ）配列番号６０の重鎖可変領域配列および配列番号６４の軽鎖可変領域配列を含むモノクローナル抗体
から選択される参照抗体とｈＰＧに対する結合について競合する、請求項１３記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．  関連出願の相互参照
本願は、仮出願第６１／２９３，６１２号（２０１０年１月８日出願）及び仮出願第６１／３６７，８５５号（２０１０年７月２６日出願）の３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．  §  １１９（ｅ）下の利益を主張し、全ての内容がその全体において参照により本明細書において組み入れられる。
【０００２】
２．  配列リスト、表、又はコンピュータプログラムの参照
配列リストを本明細書と同時に提出する。
【０００３】
３．  発明の属する技術分野
本開示は、とりわけ、プロガストリンについて特異的な抗体を含む組成物を投与することにより結腸直腸癌の転移及び再発を処置及び防止する方法に向けられる。
【０００４】
４．  背景
数十年の基礎及び臨床研究にもかかわらず、結腸直腸癌は人類の最も致命的な非伝染性疾患の１つのままである。世界保健機関の国際がん研究機関のＧＬＯＢＯＣＡＮプロジェクトによれば、２００８年に結腸直腸癌の発生は１２０万を上回っており、同年に６０万を超える人々がこの疾患により殺されたと推定された。多くのことが、近年、結腸直腸癌が分子レベルでどのように作用するかについて学ばれてきたが、臨床医は、依然として、一世代前の癌専門医が精通してきたであろう治療様式（例えば手術、放射線、及び化学療法など）に頼っている。早期診断が、画像テクノロジー及び分子診断における進歩（任意の処置の成功における大きな要因）により可能になった。全てのこれらの処置の効力が長年にわたり改善されてきたが、治癒率における改善及び寿命における増加は漸進的である。分子腫瘍学における革命に起因する新たな標的治療さえ、大半の部分について、適度にだけ転帰を改善してきた。
【０００５】
結腸直腸癌患者を管理する最も困難な局面の２つは、転移及び再発である。
【０００６】
転移は、結腸直腸癌が原発腫瘍から遠隔臓器に広がる場合に生じる。原発腫瘍を切除することはしばしば可能であるが、患者を頻繁に殺してしまうことになるのは転移である。なぜなら、それらは、外科的に処置するには多すぎる、又は、健常宿主組織と絡み合うためである。米国癌協会によれば、１９９８年〜２０００年の間にステージＩＩＩＣの結腸癌と診断された患者についての米国における５年生存率は２８%であり、ステージＩＶ（即ち、転移性結腸直腸癌）ではわずか６%にまで下落した。
【０００７】
再発は、それにより、結腸直腸癌が、処置に最初は応答し、見かけ上消失した後に戻る現象である。患者及びその家族に与えられた感情的負担とは別に、再発が問題になる。なぜなら、戻った癌が、最初の癌と闘うために効果的であった治療にあまり応答性がないことがあるからである。他の患者については、最初の癌のための前処置が、不可逆的な副作用（例えば心臓又は神経損傷など）を起こしたであろう。そのような患者においては、再発癌と闘うために同じ治療を使用するリスクが大きすぎることがある。これらの状況下では、患者は、同時により大きな死亡のリスクを伴うより少ない処置の選択肢を有しうる。
【０００８】
放射線処置、化学療法における改善及び標的治療の出現によって結腸直腸癌に罹った患者の寿命が増加してきたが、多くのそのような患者は診断から数ヶ月から数年以内に死亡し続けている。緊急の必要性が、従って、転移性結腸直腸癌及び結腸直腸癌の再発に対して効果的な新たな処置について存在する。
【０００９】
５．  要約
本開示は、プロガストリンに特異的に結合する抗体を含む組成物の治療的に効果的な量を投与することにより、転移性結腸直腸癌のための処置を必要とする患者を処置するために有用な方法を提供する。一部の実施態様において、処置される転移性結腸直腸癌は、肝臓、肺、脳、又はリンパ節に位置する。
【００１０】
一部の他の実施態様において、転移性結腸直腸癌の外科的切除の前に抗プロガストリン抗体組成物を投与することにより患者を処置することが有用である。他の実施態様において、そのような腫瘍の外科的切除後に抗体組成物を投与することにより、そのような患者を処置することが有用である。
【００１１】
一部の実施態様において、患者に放射線治療を与える前に抗プロガストリン抗体組成物を投与することにより患者を処置することが有用である。他の実施態様において、放射線治療後に抗体組成物を投与することにより、そのような患者を処置することが有用である。
【００１２】
一部の他の実施態様において、化学療法剤の前に、それと同時に、又はその後に抗プロガストリン抗体組成物を投与することにより患者を処置することが有用である。この目的のための有用な化学療法剤は、しかし、限定しないが、葉酸拮抗剤、プリン拮抗剤、ピリミジン拮抗剤、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡ架橋薬、抗生物質、白金錯体、プロテアソーム阻害剤、有糸分裂紡錘体毒、トポイソメラーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、及びその他を含む。
【００１３】
一部の実施態様において、転移性結腸直腸癌に対する効力を伴う異なる型の抗体の前に、それと同時に、又はその後に抗プロガストリン抗体組成物を投与することにより患者を処置することが有用である。そのような抗体は、しかし、限定しないが、ＥＧＦＲを標的とする抗体（例えばセツキシマブ又はパニツムマブなど）、及びＶＥＧＦを標的とする抗体（例えばベバシズマブなど）を含む。
【００１４】
転移性結腸直腸癌を処置する方法における使用のために、治療用抗体は、転移性結腸直腸癌細胞の増殖を低下させる又は分化もしくは細胞死の速度を増加させる、結腸直腸転移の平均数又はサイズを低下させる、あるいは処置された患者においてプロガストリンの血中濃度を低下させるために効果的でありうる。
【００１５】
開示の方法における使用のための抗体組成物は、様々な製剤（しかし、限定しないが、種々の経路による投与（しかし、限定しないが、非経口投与、髄腔内投与、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、注入投与、又はボーラス投与を含む）のための水性懸濁液を含む）として調製することができる。一部の実施態様において、組成物は、非経口投与のために、一部の特定の実施態様において、注入による静脈注射のために製剤化される。
【００１６】
一部の実施態様において、開示の抗プロガストリン抗体の効果的な用量は、０．００１mg/kg〜約２５０mg/kgの範囲であり、１投与において、又は複数の間隔を空けた投与にわたり与えてもよい。
【００１７】
開示は、また、患者への抗プロガストリン抗体組成物の投与を促進するための、臨床医及びその他による使用のための医薬キットを提供する。一部の実施態様において、キットは、凍結乾燥形態中の又は水溶液としての開示の抗プロガストリン抗体、希釈剤（例えば医薬グレード水又は緩衝液など）、及び抗プロガストリン抗体を投与するためのデバイス（例えばシリンジ及びニードルなど）を含む。他の実施態様において、キットは、加えて、第２の治療用薬剤（例えば、しかし、限定しないが、開示の化学療法剤など）、開示の第２の抗プロガストリン抗体、又はその他を含みうる。
【００１８】
方法を、また、転移性結腸直腸癌の防止を必要とする患者に、転移性結腸直腸癌を防止するために効果的な量で、プロガストリンに特異的に結合する抗体を含む組成物を投与することにより転移性結腸直腸癌を防止するために提供する。多数の実施態様において、組成物の抗体は、転移性結腸直腸癌細胞の増殖を低下させる又は分化もしくは細胞死の速度を増加させる、あるいは処置された患者においてプロガストリンの血中濃度を低下させるために効果的である。
【００１９】
一部の実施態様において、組成物は、原発性結腸直腸癌のための手術又は放射線治療の前又は後に、あるいは、転移性結腸直腸癌を防止するために効果的な化学療法剤の投与と同時に又はその後に投与することができる。組成物は、また、プロガストリン以外についての特異性を有する、転移性結腸直腸癌を防止するために効果的な第２の治療用抗体と同時に又はその後に投与することができる。
【００２０】
方法を、また、結腸直腸癌の再発の防止を必要とする患者に、結腸直腸癌の再発を防止するために効果的な量で、プロガストリンに特異的に結合する抗体を含む組成物を投与することにより結腸直腸癌の再発を防止するために提供する。これらの方法の一部において、患者は結腸直腸癌のための処置（例えば手術、放射線治療、生物学的治療、免疫療法、及び化学療法など）を以前に受けており、その後、結腸直腸癌は見かけ上消失した。
【００２１】
多数の実施態様において、組成物の抗体は、転移性結腸直腸癌細胞の増殖を低下させる又は分化もしくは細胞死の速度を増加させる、あるいは処置された患者においてプロガストリンの血中濃度を低下させるために効果的である。他の実施態様において、組成物は、例えば、プロガストリン以外についての特異性を有する抗体を含む、転移性結腸直腸癌を防止するために効果的な第２の治療用薬剤と同時に又はその後に投与することができる。
【００２２】
方法を、また、結腸直腸癌幹細胞の成長の阻害を必要とする患者に、前記結腸直腸癌幹細胞を阻害するために効果的な量で、プロガストリンに特異的に結合する抗体を含む組成物を投与することにより、患者において結腸直腸癌幹細胞の成長を阻害するために提供する。
【００２３】
多数の実施態様において、組成物の抗体は、結腸直腸癌幹細胞の増殖を低下させる又は分化もしくは細胞死の速度を増加させる、あるいは処置された患者においてプロガストリンの血中濃度を低下させるために効果的である。他の実施態様において、組成物は、結腸直腸癌幹細胞の成長を阻害するために効果的な第２の治療用薬剤、例えば、プロガストリン以外についての特異性を有する抗体と同時に又はその後に投与することができる。
【００２４】
方法を、また、転移性結腸直腸癌のための処置前に患者から得られた第１サンプル（例えば体液又は転移性結腸直腸癌の生検など）においてプロガストリンの濃度を決定することにより、及び、次に、第１サンプル中のプロガストリンの濃度を、処置後に同じ患者から得られた第２サンプル中のそれと比較することにより、患者において転移性結腸直腸癌のための処置（例えば化学療法、生物学的治療、免疫療法、又は抗体治療など）の効力をモニターするために提供し、そこで、前記第１サンプルと比較した、前記第２サンプル中のプロガストリンの濃度における低下は、処置が効果的であったことを示す。
【００２５】
この方法の一部の実施態様において、プロガストリンについて特異的な抗体を用いたアッセイ（例えばＲＩＡ又はＥＬＩＳＡなど）を使用して、第１及び第２サンプル中のプロガストリンの濃度を決定する。
【００２６】
方法を、また、結腸直腸癌を有することが疑われる患者から得られたサンプル（例えば体液など）におけるプロガストリンの濃度を決定することにより、及び、次に、サンプル中のプロガストリンの濃度を所定値と比較することにより、患者における結腸直腸癌の存在を診断するために提供し、そこで、所定値と比較した、サンプル中のプロガストリンの上昇レベルは、患者における結腸直腸癌の存在を示す。一部の実施態様において、所定値は、患者に結腸直腸癌が無いことが公知であった場合に得られたサンプル値の平均に基づき、他において、所定値は母集団の平均に基づく。
【００２７】
この方法の一部の実施態様において、患者は結腸直腸癌のために以前に処置されたが、サンプルが得られた時点で寛解になっている。他の実施態様において、この方法は、結腸直腸癌の存在を確認するための患者での第２の診断テスト（例えば、血液テスト、医学的画像テスト、又は遺伝子テストを含む）を実施する追加の工程を含む。一部の実施態様において、血液テストは癌胎児性抗原を検出するためであり、他の実施態様において、遺伝子テストは大腸腺腫様ポリポーシス（ＡＰＣ）遺伝子における変異を検出することである。さらに他の実施態様において、プロガストリンについて特異的な抗体を用いたアッセイ（例えばＲＩＡ又はＥＬＩＳＡなど）を使用して、サンプル中のプロガストリンの濃度を決定する。
【００２８】
プロガストリンに特異的に結合する多くの異なる型の抗体が、転移性結腸直腸癌を処置するために効果的でありうる。これは、しかし、限定しないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ヒト化されうる）、ならびにキメラ抗体、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、及びＩｇＭのアイソタイプを有する抗体、及び一本鎖抗体を含む。一部の他の実施態様において、開示の方法のために有用な抗体は、それらの機能又は特徴を有用に変える（例えば、しかし、限定しないが、血清半減期を増加させる）成分に結合された抗体を含む。さらに他の実施態様において、アミノ酸の変化を、同様の目的、又は他の目的のためにもたらすことができる。
【００２９】
一部の実施態様において、抗体は、プロガストリンの１つのエピトープだけを認識する。他の実施態様において、プロガストリンの異なるエピトープについて特異的な抗体の混合物を使用することができる。
【００３０】
転移性結腸直腸癌を処置する方法における使用のための抗体は、プロガストリンについての広範な結合親和性、例えば、約５０００nM、又はさらにより高く、例えば、少なくとも約４０００nM、３０００nM、２０００nM、１０００nM、９００nM、８００nM、７００nM、６００nM、５００nM、４００nM、３００nM、２００nM、１００nM、９０nM、８０nM、７０nM、６０nM、５０nM、４０nM、３０nM、２５nM、２０nM、１５nM、１０nM、７nM、６nM、５nM、４nM、３nM、２nM、１nM、０．１nM、０．０１nM、又は０．００１nMを有しうる。
【００３１】
開示する方法の特定の実施態様において、本明細書に開示するモノクローナル抗体を使用してもよい（例えば、ＭＡｂ１、ＭＡｂ２、ＭＡｂ３、ＭＡｂ４、ＭＡｂ５、ＭＡｂ６、ＭＡｂ７、ＭＡｂ８、ＭＡｂ９、ＭＡｂ１０、ＭＡｂ１１、ＭＡｂ１２、ＭＡｂ１３、ＭＡｂ１４、ＭＡｂ１５、ＭＡｂ１６、ＭＡｂ１７、ＭＡｂ１８、ＭＡｂ１９、ＭＡｂ２０、ＭＡｂ２１、ＭＡｂ２２、ＭＡｂ２３、又はその他を含む）。
【００３２】
開示する方法の他の実施態様において、本明細書に開示するモノクローナル抗体を使用してもよい（例えば、重鎖可変領域（ＶＨ）を有するモノクローナル抗体を含み、それにおいて、第１ＣＤＲは、ＶＨ  ＣＤＲ１．３、ＶＨ  ＣＤＲ１．４、ＶＨ  ＣＤＲ１．８、ＶＨ  ＣＤＲ１．１３、ＶＨ  ＣＤＲ１．１６、ＶＨ  ＣＤＲ１．１９より選択され、第２ＣＤＲは、ＶＨ  ＣＤＲ２．３、ＶＨ  ＣＤＲ２．４、ＶＨ  ＣＤＲ２．８、ＶＨ  ＣＤＲ２．１３、ＶＨ  ＣＤＲ２．１６、ＶＨ  ＣＤＲ２．１９より選択され、及び、第３ＣＤＲは、ＶＨ  ＣＤＲ３．３、ＶＨ  ＣＤＲ３．４、ＶＨ  ＣＤＲ３．８、ＶＨ  ＣＤＲ３．１３、ＶＨ  ＣＤＲ３．１６、ＶＨ  ＣＤＲ３．１９より選択される）。これらのＣＤＲの特定の配列を以下に記載する。他の有用な抗体は軽鎖領域（ＶＬ）を有し、それにおいて、第１ＣＤＲは、ＶＬ  ＣＤＲ１．３、ＶＬ  ＣＤＲ１．４、ＶＬ  ＣＤＲ１．８、ＶＬ  ＣＤＲ１．１３、ＶＬ  ＣＤＲ１．１６、ＶＬ  ＣＤＲ１．１９より選択され、第２ＣＤＲは、ＶＬ  ＣＤＲ２．３、ＶＬ  ＣＤＲ２．４、ＶＬ  ＣＤＲ２．８、ＶＬ  ＣＤＲ２．１３、ＶＬ  ＣＤＲ２．１６、ＶＬ  ＣＤＲ２．１９より選択され、及び、第３ＣＤＲは、ＶＬ  ＣＤＲ３．３、ＶＬ  ＣＤＲ３．４、ＶＬ  ＣＤＲ３．８、ＶＬ  ＣＤＲ３．１３、ＶＬ  ＣＤＲ３．１６、ＶＬ  ＣＤＲ３．１９より選択される。これらのＣＤＲの特定の配列も以下に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、異なるヒト原発性及び転移性結腸直腸癌細胞株の間でガストリン遺伝子発現レベルを比較するグラフを提供する。
【図２】図２は、１１の異なる患者の各々からの転移性結腸直腸腫瘍における相対的ガストリン遺伝子発現レベルを比較するグラフを提供する。各患者からの転移性結腸直腸腫瘍における発現レベルを、同じ患者からの対応する原発性結腸直腸腫瘍における発現レベルに対して標準化した。
【図３】図３は、３つの異なる転移性結腸直腸癌細胞株により成長培地中に分泌されたプロガストリンの量を比較するグラフを提供する。
【図４】図４は、健常コントロールと比較した、原発性結腸直腸癌、転移性結腸直腸癌、及び原発腫瘍が切除された転移性結腸直腸癌を伴う患者における血漿又は血清中プロガストリン濃度を示すグラフを提供する。
【図５】図５は、培養中のＳＷ６２０転移性結腸直腸癌細胞の成長に対するコントロール及び抗ｈＰＧポリクローナル抗体の効果を比較するグラフを提供する。
【図６Ａ】図６Ａは、培養中のＳＷ６２０転移性結腸直腸癌細胞の成長に対するコントロール及び４つの異なる抗ｈＰＧモノクローナル抗体（ＭＡｂ１−ＭＡｂ４）の効果を比較するグラフを提供する。
【図６Ｂ】図６Ｂは、コントロール抗体と比較した、培養中のＳＷ６２０転移性結腸直腸癌細胞の成長に対する１９の異なる抗ｈＰＧモノクローナル抗体（ＭＡｂ５−ＭＡｂ２３）を用いた処理の効果を比較するグラフを提供する。
【図７】図７は、培養中のＴ８４転移性結腸直腸癌細胞の成長に対するコントロール及び抗ｈＰＧモノクローナル抗体の効果を比較するグラフを提供する。
【図８Ａ】図８Ａは、目に見える転移が存在しない、抗ｈＰＧポリクローナル抗体を用いて処置したヌードマウスから除去した肝臓の写真を提供する。ＳＷ６２０細胞をヌードマウスの脾臓中に注射し、次に、抗ｈＰＧポリクローナル抗体、コントロールポリクローナル抗体、又はリン酸緩衝生理食塩水を用いて６週間にわたり処置した。
【図８Ｂ】図８Ｂは、コントロールポリクローナル抗体を用いて処置したヌードマウスから除去した、目に見える転移を伴う肝臓の写真を提供する。ＳＷ６２０細胞をヌードマウスの脾臓中に注射し、次に、抗ｈＰＧポリクローナル抗体、コントロールポリクローナル抗体、又はリン酸緩衝生理食塩水を用いて６週間にわたり処置した。
【図９】図９は、ＳＷ６２０細胞をヌードマウスの脾臓中に注射し、次に、抗ｈＰＧポリクローナル抗体、コントロールポリクローナル抗体、又はリン酸緩衝生理食塩水を用いて６週間にわたり処置した後に形成された、目に見える肝臓転移の数を比較するグラフを提供する。
【図１０】図１０は、ＳＷ６２０細胞をコントロールヌードマウスの脾臓中に注射し、次に、コントロールポリクローナル抗体又はリン酸緩衝生理食塩水を用いて６週間にわたり処置した後に形成された、例示的な肝臓微小転移の顕微鏡写真を提供する。
【図１１】図１１は、ＳＷ６２０細胞をヌードマウスの脾臓中に注射し、次に、抗ｈＰＧポリクローナル抗体対コントロール抗体を用いて６週間にわたり処置した後に形成された、目に見える肝臓転移の数を比較するグラフを提供する。
【図１２】図１２は、原発性及び転移性結腸直腸癌細胞株、ならびに原発性ヒト結腸直腸癌の生検サンプルから得られた細胞による幹細胞マーカーＬＧＲ５の発現に対する低付着培養条件下での成長の効果を実証するグラフを提供する。
【図１３】図１３は、原発性及び転移性結腸直腸癌細胞株、ならびに原発性ヒト結腸直腸癌の生検サンプルから得られた細胞により発現されたガストリンｍＲＮＡの量に対する低付着培養条件下での成長の効果を実証するグラフを提供する。
【図１４】図１４は、低付着培養条件下で成長させた、原発性及び転移性結腸直腸癌細胞株、ならびに原発性ヒト結腸直腸癌の生検サンプルから得られた細胞により培地中に分泌されたプロガストリンの量を実証するグラフを提供する。
【図１５】図１５は、低付着培養条件下で成長させたＨＴ−２９原発性結腸直腸癌細胞によるスフェロイドの形成に対する抗プロガストリンポリクローナル抗体の効果を実証するグラフを提供する。
【図１６】図１６は、低付着培養条件下で成長させたＨＣＴ１１６原発性結腸直腸癌細胞によるスフェロイドの形成に対する抗プロガストリンポリクローナル抗体の効果を実証するグラフを提供する。
【図１７】図１７は、低付着培養条件下で成長させた原発性ヒト結腸直腸癌の生検サンプルから得られた細胞によるスフェロイドの形成に対する抗プロガストリンポリクローナル抗体の効果を実証するグラフを提供する。
【図１８Ａ】図１８Ａは、低付着培養条件において１４日間にわたりインキュベートしたＬＧＲ５陽性ＨＴ２９原発性結腸直腸癌細胞によるスフェロイドの形成に対する２つの抗プロガストリンモノクローナル抗体の効果を実証するグラフを提供する。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、低付着培養中のＬＧＲ５陽性ＨＴ２９原発性結腸直腸癌細胞による球形成に対する抗プロガストリンモノクローナル抗体を用いた処理の阻害効果が、抗体が除去された後、少なくとも１７日間にわたり継続することを実証するグラフを提供する。
【図１９Ａ】図１９Ａは、低付着培養条件において１４日間にわたりインキュベートしたＬＧＲ５陽性ＨＣＴ１１６原発性結腸直腸癌細胞によるスフェロイドの形成に対する２つの抗プロガストリンモノクローナル抗体の効果を実証するグラフを提供する。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、低付着培養中のＬＧＲ５陽性ＨＣＴ１１６原発性結腸直腸癌細胞による球形成に対する抗プロガストリンモノクローナル抗体を用いた処理の阻害効果が、抗体が除去された後、少なくとも１７日間にわたり継続することを実証するグラフを提供する。
【図２０】図２０は、低付着培養条件下で成長させたＣＲＣ１原発性結腸直腸癌細胞によるスフェロイドの形成に対する４つの異なる抗プロガストリンモノクローナル抗体を用いた処理の効果を実証するグラフを提供する。
【図２１】図２１は、低付着培養条件下で成長させたＴ８４転移性結腸直腸癌細胞によるスフェロイドの形成に対する抗プロガストリンモノクローナル抗体の効果を実証するグラフを提供する。
【図２２】図２２は、従来の組織培養条件下で成長させたＡＬＤＨ１陽性原発性結腸直腸癌細胞の成長に対する４つの異なる抗プロガストリンモノクローナル抗体を用いた処理の効果を実証するグラフを提供する。
【図２３】図２３は、低付着培養条件下で成長させた場合のスフェロイドとしての原発性結腸直腸癌細胞の成長に対する４つの異なる抗プロガストリンモノクローナル抗体を用いた前処理の効果を実証するグラフを提供する。
【図２４】図２４は、Ｔ８４転移性結腸直腸癌細胞における癌幹細胞マーカーＡＬＤＨ１の発現に対する抗プロガストリンモノクローナル抗体を用いた前処理の効果を実証するグラフを提供する。
【図２５】図２５は、ＳＷ６２０転移性結腸直腸癌細胞における癌幹細胞マーカーＡＬＤＨ１の発現に対する抗プロガストリンモノクローナル抗体を用いた前処理の効果を実証するグラフを提供する。
【図２６】図２６は、低付着培養条件下で成長させたＴ８４転移性結腸直腸癌細胞によるスフェロイドの形成に対する抗プロガストリンモノクローナル抗体を用いた前処理の効果を実証するグラフを提供する。
【図２７】図２７は、低付着培養条件下で成長させたＳＷ６２０転移性結腸直腸癌細胞によるスフェロイドの形成に対する抗プロガストリンモノクローナル抗体を用いた前処理の効果を実証するグラフを提供する。
【図２８】図２８は、異種移植片から単離された転移性結腸直腸癌細胞が低付着培養条件下でスフェロイドとして成長する能力に対する、抗プロガストリンモノクローナル抗体を用いてヒト転移性結腸直腸癌異種移植片を保持するマウスを処置することの効果を実証するグラフを提供する。
【図２９】図２９は、異種移植片から単離された転移性結腸直腸癌細胞が、他のマウス中に移植された場合に新たな腫瘍成長を開始する能力に対する、抗プロガストリンモノクローナル抗体を用いてヒト転移性結腸直腸癌異種移植片を保持するマウスを処置することの効果を実証するグラフを提供する。
【図３０】図３０は、ヒトプレプロガストリン（配列番号１００）（そこでシグナルペプチド配列に下線が付いている）、成熟ヒトプロガストリン（配列番号１０１）、及びプロガストリンプロセシングの特定産物（Ｇ３４（配列番号１０２）、Ｇ３４−Ｇｌｙ（配列番号１０３）、Ｇ１７（配列番号１０４）、Ｇ１７−Ｇｌｙ（配列番号１０５）、及びＣＴＦＰ（配列番号１０６）を含む）のアミノ酸配列を提供する。
【図３１Ａ】図３１は、特定の例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体の可変軽鎖及び可変重鎖のポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３１Ａは、マウス抗ｈＰＧ  ＭＡｂ３のＶＨ鎖のポリペプチド配列（配列番号１２）及びそれをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号１６）を提供する；
【図３１Ｂ】図３１は、特定の例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体の可変軽鎖及び可変重鎖のポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３１Ｂは、マウス抗ｈＰＧ  ＭＡｂ３のＶＬ鎖のポリペプチド配列（配列番号１３）及びそれをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号１７）を提供する；
【図３１Ｃ】図３１は、特定の例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体の可変軽鎖及び可変重鎖のポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３１Ｃは、マウス抗ｈＰＧ  ＭＡｂ４のＶＨ鎖のポリペプチド配列（配列番号１４）及びそれをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号１８）を提供する；
【図３１Ｄ】図３１は、特定の例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体の可変軽鎖及び可変重鎖のポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３１Ｄは、マウス抗ｈＰＧ  ＭＡｂ４のＶＬ鎖のポリペプチド配列（配列番号１５）及びそれをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号１９）を提供する；
【図３１Ｅ】図３１は、特定の例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体の可変軽鎖及び可変重鎖のポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３１Ｅは、マウス抗ｈＰＧ  ＭＡｂ８のＶＨ鎖のポリペプチド配列（配列番号５９）及びそれをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号６７）を提供する；
【図３１Ｆ】図３１は、特定の例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体の可変軽鎖及び可変重鎖のポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３１Ｆは、マウス抗ｈＰＧ  ＭＡｂ８のＶＬ鎖のポリペプチド配列（配列番号６３）及びそれをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号７１）を提供する；
【図３１Ｇ】図３１は、特定の例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体の可変軽鎖及び可変重鎖のポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３１Ｇは、マウス抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１３のＶＨ鎖のポリペプチド配列（配列番号６０）及びそれをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号６８）を提供する；
【図３１Ｈ】図３１は、特定の例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体の可変軽鎖及び可変重鎖のポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３１Ｈは、マウス抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１３のＶＬ鎖のポリペプチド配列（配列番号６４）及びそれをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号７２）を提供する；
【図３１Ｉ】図３１は、特定の例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体の可変軽鎖及び可変重鎖のポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３１Ｉは、マウス抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１６のＶＨ鎖のポリペプチド配列（配列番号６１）及びそれをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号６９）を提供する；
【図３１Ｊ】図３１は、特定の例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体の可変軽鎖及び可変重鎖のポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３１Ｊは、マウス抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１６のＶＬ鎖のポリペプチド配列（配列番号６５）及びそれをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号７３）を提供する；
【図３１Ｋ】図３１は、特定の例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体の可変軽鎖及び可変重鎖のポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３１Ｋは、マウス抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１９のＶＨ鎖のポリペプチド配列（配列番号６２）及びそれをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号７０）を提供する；及び
【図３１Ｌ】図３１は、特定の例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体の可変軽鎖及び可変重鎖のポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３１Ｌは、マウス抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１９のＶＬ鎖のポリペプチド配列（配列番号６６）及びそれをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号７４）を提供する。
【図３２Ａ】図３２は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３２Ａは、ヒト化ＭＡｂ３のＶＨ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号２１）；
【図３２Ｂ】図３２は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３２Ｂは、ヒト化ＭＡｂ３のＶＬ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号２２）；
【図３２Ｃ】図３２は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３２Ｃは、ヒト化ＭＡｂ４のＶＨ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号２３）；
【図３２Ｄ】図３２は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３２Ｄは、ヒト化ＭＡｂ４のＶＬ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号２４）；
【図３２Ｅ】図３２は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３２Ｅは、ヒト化ＭＡｂ８（ａ）のＶＨ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号７５）；
【図３２Ｆ】図３２は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３２Ｆは、ヒト化ＭＡｂ８（ａ）のＶＬ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号７６）；
【図３２Ｇ】図３２は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３２Ｇは、ヒト化ＭＡｂ８（ｂ）のＶＨ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号７７）；
【図３２Ｈ】図３２は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３２Ｈは、ヒト化ＭＡｂ８（ｂ）のＶＬ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号７８）；
【図３２Ｉ】図３２は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３２Ｉは、ヒト化ＭＡｂ８（ｃ）のＶＨ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号７９）；
【図３２Ｊ】図３２は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３２Ｊは、ヒト化ＭＡｂ８（ｃ）のＶＬ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号７６）；
【図３２Ｋ】図３２は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３２Ｋは、ヒト化ＭＡｂ１３（ａ）のＶＨ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号８０）；
【図３２Ｌ】図３２は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３２Ｌは、ヒト化ＭＡｂ１３（ａ）のＶＬ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号８１）；
【図３２Ｍ】図３２は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３２Ｍは、ヒト化ＭＡｂ１３（ｂ）のＶＨ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号８２）；
【図３２Ｎ】図３２は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３２Ｎは、ヒト化ＭＡｂ１３（ｂ）のＶＬ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号８３）；
【図３２Ｏ】図３２は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３２Ｏは、ヒト化ＭＡｂ１６（ａ）のＶＨ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号８４）；
【図３２Ｐ】図３２は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３２Ｐは、ヒト化ＭＡｂ１６（ａ）のＶＬ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号８５）；
【図３２Ｑ】図３２は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３２Ｑは、ヒト化ＭＡｂ１６（ｂ）のＶＨ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号８６）；
【図３２Ｒ】図３２は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３２Ｒは、ヒト化ＭＡｂ１６（ｂ）のＶＬ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号８７）；
【図３２Ｓ】図３２は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３２Ｓは、ヒト化ＭＡｂ１６（ｃ）のＶＨ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号８８）；
【図３２Ｔ】図３２は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３２Ｔは、ヒト化ＭＡｂ１６（ｃ）のＶＬ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号８９）；
【図３２Ｕ】図３２は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３２Ｕは、ヒト化ＭＡｂ１９（ａ）のＶＨ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号９０）；
【図３２Ｖ】図３２は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３２Ｖは、ヒト化ＭＡｂ１９（ａ）のＶＬ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号９１）；
【図３２Ｗ】図３２は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３２Ｗは、ヒト化ＭＡｂ１９（ｂ）のＶＨ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号９２）；
【図３２Ｘ】図３２は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３２Ｘは、ヒト化ＭＡｂ１９（ｂ）のＶＬ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号９３）；
【図３２Ｙ】図３２は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３２Ｙは、ヒト化ＭＡｂ１９（ｃ）のＶＨ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号９４）；及び
【図３２Ｚ】図３２は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３２Ｚは、ヒト化ＭＡｂ１９（ｃ）のＶＬ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号９５）。
【００３４】
７．  詳細な説明
７．１．  結腸直腸癌転移
転移は、癌が広がるプロセスを指す。簡単には、腫瘍細胞は、原発腫瘍を離れ、血液循環又はリンパ系を介して新たな組織部位へ移動し、二次腫瘍を形成する。新たな組織部位の腫瘍は転移性腫瘍として言及され、典型的には、原発腫瘍の供給源を同定する。例えば、他の組織に広がっている結腸直腸癌は、二次性の転移性腫瘍の組織部位にもかかわらず、「転移性結腸直腸癌」として言及される。結腸直腸癌が転移する最も共通の臓器は肝臓及び肺であるが、しかし、結腸直腸癌は他の臓器にも広がりうる。
【００３５】
癌細胞は原発腫瘍の近くのリンパ節に頻繁に広がり、それはリンパ節転移又は局所疾患と呼ばれる。
【００３６】
操作の任意の特定の理論により拘束されることを望まないが、転移は、多数の別々のステップ（浸潤及び遊走、脈管内への侵入、循環、血管外遊出及びコロニー形成、増殖及び血管新生を含む）を通じて進行すると考えられる。浸潤及び遊走の間に、個々の細胞はそれ自体が原発腫瘍から剥離し、隣接する健常組織に浸潤する。これを達成するために、癌細胞は、上皮から間葉への移行と呼ばれる表現型の形質転換を受けると仮定される。Kalluri, R., et al., J. Clin. Invest., 119(6) (2009), 1420-28.そのような細胞は、細胞外マトリックスを分解することが可能な酵素を産生し、それにより、原発腫瘍外への及び周囲の健常組織中への遊走を促進しうる。遊走する癌細胞が血管又はリンパ管に遭遇する場合、それは、血管を覆う内皮細胞の間にそれ自体を挿入し、血流又はリンパ系中に侵入する。異常細胞は、次に、循環器系又はリンパ系を介して新たな臓器に移動する。癌細胞は、次に、新たな臓器の毛細血管又はリンパ管に留まり、次に、組織空間中へ内皮に侵入することにより血管外遊出しうる。最後に、コロニー形成、増殖、及び血管新生の間に、転移性癌細胞はその新たな宿主組織中に居を定めて、成長を始める。新たな転移性腫瘍が十分なサイズに達する場合、それは、成長因子（例えばＶＥＧＦなど）を分泌し、腫瘍中への新たな血管の成長を刺激し、急速に成長する腫瘍により要求される酸素及び栄養を供給しうる。
【００３７】
７．２．  結腸直腸癌の再発
結腸直腸癌の再発は、結腸直腸癌を見かけ上消失させた処置の後での結腸直腸癌の戻りとして定義される。戻りの結腸直腸癌が最初の癌と同じ場所にある、又はそれに非常に近接している場合、それは局所再発として公知である。戻りの結腸直腸癌が、最初の癌の場所の近くのリンパ節又は組織において成長する場合、それは局所再発として公知であり、戻りの結腸直腸癌が、最初の癌の場所から遠い臓器又は組織に転移した場合、それは遠隔再発として公知である。
【００３８】
７．３．  癌幹細胞及び直腸結腸癌
固形腫瘍は必ずしも均質な組織ではない。むしろ、一部の腫瘍は、別々の表現型特性及び機能特性を有する複数の異常な細胞型を含む。この点において、そのような腫瘍は異常な臓器に類似する。固形腫瘍を含む細胞の間での１つの重要な違いは、同じ宿主中の新たな部位に、又は同じもしくは異なる種の新たな宿主に移植した場合に新たな腫瘍の形成を開始することが可能である範囲である。この特性を有する細胞は、腫瘍又は癌を開始する細胞、又は、あるいは、腫瘍又は癌幹細胞として公知である。対照的に、腫瘍を構成する他の細胞は、より多くの細胞が使用される場合でさせ、移植後の新たな腫瘍を開始するずっと低下した潜在力を有する。１つの非限定的な例において、ヒト腫瘍に由来する数百の結腸癌幹細胞が、マウス中への移植後に新たな腫瘍を開始するのに十分であったのに対し、腫瘍からの１０，０００個の非幹細胞はそのようにするには不十分であった。Dalerba, P., et al., 2007, "Phenotypic characterization of human colorectal cancer stem cells," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104: 10158-10163.
【００３９】
多くの腫瘍において、癌幹細胞は、腫瘍内に存在する全ての生存可能な細胞の比較的小さな割合を構成する。対照的に、腫瘍の塊を構成する腫瘍細胞の大多数が、移植した場合に新たな腫瘍を開始することはできない。一部の腫瘍において、しかし、癌幹細胞が、腫瘍を構成する大多数、又はさらには全ての細胞を構成しうる。本明細書において使用する通り、塊の腫瘍細胞は、そのような細胞の多数が使用されない場合、移植時に新たな腫瘍を開始することができない腫瘍細胞を指す。癌幹細胞は、また、塊の腫瘍細胞とは異なる表現型の特徴を有する（比較的少数の癌幹細胞の移植時に新たな腫瘍を自己再生及び形成する能力、及び蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）又は他のアッセイにより検出可能な異なるマーカーの発現を含む）。癌幹細胞と塊の腫瘍細胞の間での他の区別も可能である。
【００４０】
操作の任意の特定の理論により拘束されることを望まないが、癌幹細胞は、癌幹細胞の状況において、腫瘍を生じるそれらの能力に寄与する、正常幹細胞と特定の特性を共有すると考えられる。特に、癌幹細胞は非対称細胞分裂を受けて、２つの型の娘細胞を産生する。最初のものは未分化のままであり、それ自体を無限に再生することができる、その親の幹細胞の特徴を保持する。他の娘は、前駆細胞と呼ばれ、異常にではあるが、分裂及び分化することが可能であり、多くの固形腫瘍において見出される多くの分化細胞のスペクトラムを生じる。前駆細胞は幹細胞よりも高い速度で増殖し、このように、腫瘍の物理的成長に寄与するのに対し、幹細胞は、新たな前駆体を生成することにより、無限に成長する腫瘍の能力に関与している。
【００４１】
これらの特性によって、癌幹細胞は、最終的に、成長する腫瘍を構成する多数の細胞を生じることが許される。このように、新たな動物中に移植した場合、癌幹細胞は、複数の連続移植後でさえ、それらが由来した腫瘍の型を再構成しうる。癌幹細胞は、しかし、正常な幹細胞とは異なり、変化した増殖パターン及び／又は低速度のアポトーシスをもたらしうる遺伝子変異及び／又はエピジェネティック変化を持ち、ならびに、腫瘍の塊を構成しうる異常細胞の蓄積を起こす異常分化をもたらす。
【００４２】
癌幹細胞は、それらを塊の腫瘍細胞から区別する多数の表現型の特徴に従って同定することができる。最初に、上に記述した通り、癌幹細胞は、新たな宿主中に移植された場合、新たな腫瘍を開始する能力を有する。対照的に、塊の腫瘍細胞は、新たな腫瘍を開始すること、又は、新たな腫瘍の開始を達成するために癌幹細胞よりも多くの細胞を要求することはできない。癌幹細胞は、また、特定のマーカーのそれらでの発現又は非発現により同定可能であるのに対し、同じ腫瘍からの塊の腫瘍細胞は、マーカー発現の異なるパターンを有する。癌幹細胞は、また、塊の腫瘍細胞と比較して、無血清の低付着培養条件下で成長し、いわゆるスフェロイドを形成する優先的な能力を有する。塊の腫瘍細胞から癌幹細胞を区別することが可能な他の表現型の違いが可能である。
【００４３】
上に記述した通り、癌幹細胞は、また、単独で又は他との組み合わせで、特定のマーカーの発現パターンに従って同定されうる。異なる腫瘍からの癌幹細胞は、しかし、異なるマーカー表現型を示しうる。そのようなマーカーは、細胞内で、又は細胞表面上で発現されるタンパク質を含み、種々の技術（しかし、限定しないが、免疫組織化学、免疫蛍光、及びＦＡＣＳ分析を含む）を使用して検出することができる。マーカーを検出するための他の技術が、また、当業者の知識に従って可能である。マーカーは、また、その活性を癌幹細胞において機能的にアッセイすることができるタンパク質を含む。マーカーの型の非限定的な例は、トランスポータータンパク質（例えば、細胞から物質を輸送する又は細胞中に物質を取り込むものなど）、酵素（例えば解毒酵素など）を含む。
【００４４】
結腸直腸癌幹細胞を同定するために使用されうる例示的なマーカーは、しかし、限定しないが、以下：ＣＤ１３３、ＣＤ４４、ＣＤ１６６、ＥｐＣＡＭ、及びＬＧＲ５を含む。結腸直腸癌幹細胞を同定するための有用な他のマーカーも可能である。一部の実施態様において、マーカーの発現の非存在は、癌幹細胞の表現型を示している。また、アルデヒドデヒドロゲナーゼ１（ＡＬＤＨ１）は解毒酵素であり、癌細胞は、増加したＡＬＤＨ１活性（癌幹細胞についての別のマーカー）についてアッセイすることができる。
【００４５】
本開示の一部の実施態様において、結腸直腸癌幹細胞は、ＦＡＣＳ、又は当業者が精通している他の技術を使用して、以下：ＥｐＣＡＭ（ｈｉ）ＣＤ４４（＋）、ＥｐＣＡＭ（ｈｉ）ＣＤ４４（＋）ＣＤ１６６（＋）、ＣＤ１３３（＋）、ＡＬＤＨ１（＋）、ＣＤ１３３（  ）／ＡＬＤＨ１（＋）、ＣＤ４４（＋）／ＣＤ２４（＋）又はＬＧＲ５（＋）のマーカー表現型により同定されうる。他のマーカーの発現、ならびにそれらの組み合わせ及びパターンは、また、これらの癌、ならびに他の型の癌における癌幹細胞を同定するために使用されうる。
【００４６】
本開示の他の実施態様において、癌幹細胞は、ＦＡＣＳ分析を使用し、特定の色素を除外するそれらの優先的能力に従って、いわゆる副集団に選別されたそれらの細胞として同定されうる。そのような色素の１つの非限定的な例は、Ｈｏｅｃｈｓｔ色素３３３４２である。
【００４７】
上に記述する通り、癌幹細胞は、また、新たな宿主中への移植後に新たな腫瘍成長を開始するそれらの増加した能力により、塊の腫瘍細胞から区別することができる。このように、癌幹細胞であることが疑われる細胞集団の同一性を確認するための１つの方法は、塊の腫瘍細胞と比較して、非ヒトレシピエント動物中へのそのような細胞の相対的な小集団の移植後に、腫瘍成長を開始するそれらの能力をテストすることである。
【００４８】
腫瘍又は細胞株が癌幹細胞を含むか否かを評価するために有用な移植の方法は、当業者が精通している。非限定的な例として、癌幹細胞を含むことが疑われる腫瘍、又はその一部を、例えば外科的切除などにより単離する。その後、腫瘍組織を刻み、酵素で処理するか、又は腫瘍を脱凝集し、その構成細胞を放出するために効果的な任意の他の処理を用いて処理する。あるいは、細胞株が分析下にある場合、酵素的又は化学的処理を用いて細胞を解離することだけが必要でありうる。
【００４９】
細胞懸濁液を調製した後、細胞を遠心により回収し、癌幹細胞に対応することが公知である亜集団を、当技術分野において公知の方法に従って単離する。上に考察する通り、１つの非限定的な例において、そのような細胞は、特定の抗体及び蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して検出可能である、癌幹細胞を示しているマーカーの特定のパターンを発現する。他の実施態様において、癌幹細胞を含むことが疑われる亜集団は、他の表現型の特徴（例えば、特定の色素を除外するそれらの能力など）に従って単離することができる。
【００５０】
関連する細胞亜集団を単離した後、所定の数のそのような細胞を、次に、レシピエント動物における１つ又は複数の標的組織又は臓器中に移植する。一部の実施態様において、レシピエント動物は、免疫不全マウス（しかし、限定しないが、ヌードマウス、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）を伴うマウス、及び非肥満−糖尿病ＳＣＩＤ（ＮＯＤ−ＳＣＩＤ）マウスを含む）である。他の種を、また、当業者の知識に従って使用することができる。
【００５１】
細胞を、脂肪パッド（例えば、マウスの乳房脂肪パッドなど）中に、脳、盲腸、膵臓、もしくは肝臓中に、又は腎臓中（例えば腎被膜中など）に皮下移植することができる。細胞を他の組織及び臓器中にも移植することができる。一部の実施態様において、標的組織又は臓器を選び、分析下の腫瘍が由来する組織又は臓器を複製する。しかし、他の実施態様において、別々の組織又は臓器を選び、それにおいて移植細胞の宿主とする。非限定的な例として、結腸癌幹細胞をＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの腎被膜中に移植し、新たな腫瘍を開始するそれらの能力を評価することができる。
【００５２】
移植（当業者が精通する技術を使用して遂げられる）後、細胞を乱さないように放置し、新たな腫瘍が移植部位で成長するか否かを決定する。皮下移植された細胞については、腫瘍成長は、移植部位の目視検査及び触診により評価することができる。腫瘍が成長する場合、そのサイズを、ノギスを使用して、時間を通して測定することができる。内部臓器中に移植した細胞については、動物を移植後の所定の時間に屠殺してもよく、腫瘍が存在するか否か、及び、存在する場合、そのサイズを決定する。あるいは、当業者の知識に従って、非浸潤性の技術を使用して、腫瘍成長を評価することができる。
【００５３】
癌幹細胞の表現型は、また、無血清の低付着培養条件下でスフェロイドとして成長する癌幹細胞の優先的な能力により特徴付けられるのに対し、塊の腫瘍細胞は同じ条件下でスフェロイドとして成長することができる可能性は低くなる。スフェロイドは、特定の細胞が脱凝集した懸濁液として播種された後に培養中で成長する際に形成する圧縮した細胞球である。そのようなスフェロイドの形成は、細胞を、一般的には、特定の成長因子（しかし、限定しないが、上皮成長因子（ＥＧＦ）及び塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含む）の存在において、及び、哺乳動物細胞が不十分に付着する表面を有する組織培養皿において、無血清培地中で成長させる場合に促進される。正常組織からの幹細胞と同様に、癌幹細胞が適切な培養条件下でスフェロイドとして優先的に成長することが発見されている。例えば、Rappa, G., et al., Exp. Cell Res., 314: 2110 (2008)；Singh, S.K., et al., Cancer Res., 63: 5821 (2003)；Fang, D., et al., Cancer Res., 65: 9328 (2005)を参照のこと。対照的に、塊の腫瘍細胞は、より高度に分化する傾向があり、同一の培養条件下でスフェロイドを形成する可能性が低くなる。塊の腫瘍細胞がスフェロイドを形成することができる場合、それらは、同様の数の癌幹細胞により形成されるものと比較して、小さく及び／又は数が少ない傾向にある。
【００５４】
７．４．  癌幹細胞及び結腸直腸癌再発
癌幹細胞の特性を伴う腫瘍細胞が同定されており、放射線及び／又は化学療法剤に対して増強した抵抗性を示す。異なる分子機構が、放射線又は化学療法剤に対する癌幹細胞の抵抗性を説明するために提案されている。例えば、特定の癌幹細胞が遺伝毒性傷害後にそれらのＤＮＡをより容易に修復することができうるのに対し、他の癌幹細胞は、高レベルの抗アポトーシスタンパク質又はそのような細胞に入る化学療法剤を除去するために効果的な分子ポンプを発現すると報告されている。Eyler, C.E., and J.N. Rich, J. Clin.Oncol., 26: 2839-2845 (2008).癌幹細胞が前駆細胞よりも遅く増殖することも、また、塊の腫瘍細胞を殺しうる放射線及び毒性化学療法剤への暴露で生き残る幹細胞の比較上の能力を説明しうる。
【００５５】
操作の任意の特定の理論により拘束されることを望まないが、癌幹細胞が放射線及び化学療法に抵抗性であるという観察は、そのような治療を用いて処置された癌患者における再発の現象を説明しうる。Eyler（上記を参照）そのような患者において、処置は最初は効果的であり、診断スキャンにおいて腫瘍の見かけ上の消失を起こすが、しかし、腫瘍は、処置を止めていくらかの時間後に再出現する。
【００５６】
再発の機構における癌幹細胞の役割に関して、大半の又はさらには全ての塊の腫瘍細胞が治療により殺されるが、放射線又は化学療法の効果に抵抗するそれらの増強した能力のため、多数の生存する生存可能な癌幹細胞が残ると仮定される。治療が終わった後、これらの生存細胞は成長し続け、最初の腫瘍の再形成又は新たな腫瘍の形成を可能にする。この理論と一致し、化学療法剤を用いたマウスの処置は、ヒト結腸直腸癌細胞から開始した腫瘍の収縮を起こすが、腫瘍内の癌幹細胞の割合を増加させることが報告された。Dylla, S.J., et al., 2008, "Colorectal Cancer Stem Cells Are Enriched in Xenogeneic Tumors Following Chemotherapy," PLoS ONE, 3 (6): e2428.
【００５７】
７．５．  結腸直腸癌におけるプロガストリンの役割の理解における進歩
驚くべきことに、プロガストリン感受性の転移性結腸直腸癌細胞及び結腸直腸癌幹細胞が存在することが発見されており、プロガストリン（「ＰＧ」）に特異的に結合し、インビトロ又はインビボでそのような細胞の成長を阻害する特定の抗体の能力により実証される通りである。
【００５８】
ＰＧ感受性の結腸直腸癌細胞は、その生存及び／又は成長のために、直接的又は間接的に、プロガストリンに少なくとも部分的に依存するものである。操作の任意の特定の理論により拘束されることを望まないが、特定の抗ＰＧ抗体は、ＰＧに結合し、ＰＧ依存性のシグナル伝達を遮断することにより、そのような細胞の生存及び／又は成長を阻害するために効果的であることが仮定される。プロガストリンは、従って、その生存及び／又は成長促進効果を媒介することが防止される。抗ＰＧ抗体が結腸直腸癌細胞の生存及び／又は成長を阻害する他の機構が存在しうる。特定の作用機構は、本開示の範囲を限定することを意図しない。
【００５９】
実施例においてさらに詳細に記載する通り、出願人らは、驚くべきことに、ガストリン遺伝子（ＧＡＳＴ）が、６つの異なるヒト原発性結腸直腸癌細胞株ＨＴ２９、ＨＣＴ１１６、ＲＫＯ、ＳＷ４８０、ＤＬＤ１、及びＣＲＣ１細胞において、２つの異なるヒト転移性結腸直腸癌細胞株ＳＷ６２０及びＴ８４細胞において発現していることを発見している。インビトロ実験からのデータに関連して、出願人らは、また、驚くべきことに、ガストリン遺伝子が１１人の異なる患者の各々から得られた原発性結腸直腸腫瘍及び対応する結腸直腸転移において発現していることを発見したが、原発腫瘍におけるレベルと比べて、対応する転移における発現レベルは異なる患者の間で変動した。なぜなら、プロガストリンはガストリン遺伝子の産物（同じ遺伝子産物から翻訳後にプロセシングされた他のペプチドと共に）であるため、このデータは、原発性及び転移性結腸直腸腫瘍がプロガストリンを分泌することを示唆する。追加実験では、以下に説明する通り、これが確認された。
【００６０】
最初に、出願人らは、検出可能な量のＰＧタンパク質がＳＷ６２０及びＴ８４細胞により成長培地中に分泌される（Ｃｏｌｏ−２０５細胞により分泌されない）ことを確認した。加えて、出願人らは、原発性結腸直腸癌だけ、原発性及び転移性結腸直腸癌を同時に、及び原発腫瘍の切除後に転移性結腸直腸癌を有する患者は、全てが、健常コントロールの血液中よりも統計的に有意に高い、それらの血液中のＰＧレベルを有することを実証した。これらの結果は、原発性及び転移性結腸直腸腫瘍がＰＧを分泌し、それが直接的又は間接的に血流に入ることを示す。このように、上昇した血液ＰＧレベルは、原発性ならびに転移性結腸直腸癌の存在を示している。したがって、本開示の方法は、異なる患者集団における原発性及び転移性結腸直腸癌の両方の存在を検出又は診断する方法を提供する。
【００６１】
出願人らは、また、驚くべきことに、特定の抗ＰＧ抗体、即ち、中和性抗体が、培養中の転移性結腸直腸癌細胞の成長を阻害することが可能であることを発見している。具体的には、出願人らは、抗ＰＧポリクローナル抗体及び４つの異なる抗ＰＧモノクローナル抗体が、培養中で成長しているＳＷ６２０細胞の成長を阻害することができることを実験的に実証した。同様に、Ｔ８４細胞の成長は、抗ＰＧモノクローナル抗体を用いたインキュベーションにより阻害された。これらのデータは、中和性抗ＰＧ抗体が転移性結腸直腸癌細胞の成長を防止することが可能であること及びそのような細胞が、従って、ＰＧ感受性であることを実証する。これらのデータは、さらに、そのような抗体の治療的に効果的な量が、転移性結腸直腸癌の処置を必要とする被験者に投与される場合、そのような転移を処置するために効果的であることを示す。
【００６２】
ヌードマウスにおいて行ったさらなる実験は拡大し、出願人らのインビトロ実験を確認する。このように、出願人らは、ヌードマウスの脾臓中に転移性ＳＷ６２０細胞を注射した。その後、直ちに、脾臓を切除し、マウスに抗ＰＧモノクローナル抗体を時間経過にわたり投与した。コントロール動物を同様に処理したが、しかし、コントロール抗体を用いて注射した。６週間の処置後、マウスを屠殺し、肝臓において形成した転移の数及び重量をカウントした。驚くべきことに、出願人らは、転移の平均数が、処置動物対コントロール動物において、統計的に有意な４１%だけ下落することを見出した。この説得力のあるデータは、中和性抗ＰＧ抗体がインビボで転移性結腸直腸癌の成長を阻害することが可能であることを確認し、そのような抗体の治療的に効果的な量は、転移性結腸直腸癌のための処置を必要とする被験者に投与される場合、そのような転移を処置するために効果的であることを実証する。
【００６３】
出願人らによりインビトロ及びインビボで行われた追加実験では、驚くべきことに、原発性及び転移性結腸直腸癌が、ＰＧ感受性である結腸直腸癌幹細胞を含むこと、及び、中和性抗ｈＰＧ抗体がそのような細胞の成長を阻害することが可能であることが実証されている。
【００６４】
１つの実験において、出願人らは、低付着培養条件下での原発性（ＨＴ２９、ＨＣＴ１１６、ＣＲＣ１）及び転移性（ＳＷ６２０及びＴ８４）結腸直腸癌細胞株の成長が、ＬＧＲ５（結腸直腸癌幹細胞の表現型マーカー）を発現する細胞の割合を増加させることを実証した。そのような培養条件によって、非幹細胞亜集団と比較して、癌幹細胞の成長について優先的に選択され、ＬＧＲ５の増加発現によって、原発性及び転移性の両方の結腸直腸癌が癌幹細胞を含むことが確認される。
【００６５】
出願人らは、次に、低付着条件が、従来の条件下での細胞の成長と比較して、同じ細胞におけるガストリン遺伝子発現のレベルを増加させることを発見した。このデータは、ガストリン遺伝子発現が、同じ集団における非幹細胞と比較して、原発性及び転移性の両方の結腸直腸癌からの結腸直腸癌幹細胞においてより高いことを示唆し、分泌されたプロガストリンのレベルも高くなりうることをさらに示唆する。出願人らは、低付着条件下で成長させた場合、ＣＲＣ１、ＨＴ２９、ＳＷ６２０、及びＴ８４細胞においてプロガストリン発現を様々なレベルで確認したが、これらの細胞株がＰＧ感受性の結腸直腸癌幹細胞を含むことを示唆する。
【００６６】
出願人らは、低付着条件下で成長させた原発性及び転移性結腸直腸癌細胞を、抗ｈＰＧ抗体を用いて処理することによりこれを確認し、驚くべきことに、形成されたいわゆる細胞スフェロイドの数が、コントロール抗体を用いた処置と比較して低下することを見出した。なぜなら、低付着条件下でのスフェロイドの形成は、結腸直腸癌幹細胞（しかし、非幹細胞亜集団ではない）の特性であるため、この結果は、抗ｈＰＧ抗体が原発性及び転移性の両方の結腸直腸癌における結腸直腸癌幹細胞の成長を阻害するために効果的であることを意味すると解釈される。
【００６７】
例えば、抗ｈＰＧポリクローナル抗体を用いたＨＴ２９、ＨＣＴ１１６、及びＣＲＣ１細胞（それらの全てが原発性結腸直腸癌細胞である）の処理は、低下した球形成をもたらした。ＨＣＴ１１６及びＨＴ２９細胞でのさらなるテストでは、２つの異なる抗ｈＰＧモノクローナル抗体を使用して、ＬＧＲ５陽性癌幹細胞の亜集団による球成長に対する同様の効果が見出された。興味深いことに、洗浄による抗体の除去、それに続く、加えられた抗体の非存在における１７日間にわたる継続的なインキュベーションは、増加した球数をもたらさなかったが、結腸直腸癌幹細胞に対する抗ｈＰＧ抗体の阻害効果が永続的であり、それらの継続的な存在に依存しなかったことを示唆する。４つの異なる抗ｈＰＧモノクローナル抗体を用いたＣＲＣ１細胞の処理も、球形成を低下させるために効果的であった。加えて、抗ｈＰＧモノクローナル抗体の同じセットを用いた従来の条件下で成長しているＣＲＣ１細胞の前処理は、ＡＬＤＨ１陽性細胞の数、ならびに、前処理した細胞を低付着培養条件に移した後に形成されるスフェロイドの数を低下させた。抗体の３つがＣ末端部分ＰＧを認識したのに対し、１つがＮ末端部分を認識した。
【００６８】
同様の結果が、転移性結腸直腸癌細胞株をテストした場合に得られた。このように、ＡＬＤＨ１（結腸直腸癌幹細胞の別のマーカー）について陽性であるＴ８４細胞の亜集団の単離後、そのような細胞により形成されるスフェロイドの数は、コントロール抗体と比較して、抗ｈＰＧモノクローナル抗体を用いた処理により、用量反応的な様式で低下した。同様に、同じ抗ｈＰＧモノクローナル抗体を用いた従来の条件下で成長しているＴ８４及びＳＷ６２０細胞の前処理は、ＡＬＤＨ１陽性細胞の数、ならびに、前処理した細胞を低付着培養条件に移した後に形成されるスフェロイドの数を低下させた。実際には、成長阻害効果は、５−フルオロウラシル（化学療法薬）のそれより大きかった。このデータは、転移性結腸直腸癌細胞がプロガストリン感受性の幹細胞を含むという驚くべき結論を確認しており、その成長は、特定の抗ｈＰＧモノクローナル抗体を用いた処理により阻害することができる。
【００６９】
先に考察した通り、癌幹細胞の特徴的な特性の１つは、移植後に新たな腫瘍を開始するそれらの能力である。結腸直腸癌幹細胞を阻害する抗ｈＰＧ抗体の能力を確認するために、出願人らは、結腸直腸癌肝臓転移からの細胞が培養中でスフェロイドとして成長し、移植後に新たな腫瘍を開始する能力に対する特定の抗ｈＰＧモノクローナル抗体の効果をテストした。実施例においてさらに説明する通り、出願人らは、ヌードマウスの脾臓中に転移性ＳＷ６２０細胞を注射した。その後、直ちに、脾臓を切除し、マウスに抗ＰＧモノクローナル抗体を時間経過にわたり投与した。コントロール動物を同様に処理したが、しかし、コントロール抗体を用いて注射した。
【００７０】
６週間の処置後、マウスを屠殺し、肝臓において形成している結腸直腸転移を解剖し、次に、生存可能な転移性結腸直腸癌細胞を放出するために処理した。細胞を、次に、低付着培養中でスフェロイドを形成し、新たなマウス中に移植した後に新たな腫瘍を形成するそれらの能力についてテストした。これらの特性の両方が結腸直腸癌幹細胞の特徴である。
【００７１】
結果によって、結腸直腸癌幹細胞の成長に対する抗ｈＰＧ抗体の阻害効果が確認された。最初に、出願人らは、コントロールと比較して、より少数のスフェロイドが、特定の抗体を用いて処置された動物の肝臓から単離された転移性結腸直腸癌細胞からの低付着培養において形成されることを見出した。さらに、出願人らは、また、スフェロイドからの細胞を２匹の新たなテスト動物の大腿に皮下注射した場合、特定の抗体を用いてインビボで処理した細胞から成長している腫瘍のサイズが、コントロール抗体を用いてインビボで処理した細胞から成長しているものよりも平均してかなり小さいことを見出した。これらの説得力のある結果は、ｈＰＧについて特異的な抗体を用いたインビボでの転移性結腸直腸癌細胞の処置が、転移性腫瘍における結腸直腸癌幹細胞の数を低下させることを実証する。
【００７２】
上に記載する驚くべき、説得力のある結果に基づき、抗ｈＰＧ抗体を用いて患者を処置することは、原発性又は転移性結腸直腸癌の再発を防止するために効果的であることが期待される。さらに、そのような幹細胞の成長に対する抗体の阻害効果は、抗ｈＰＧ抗体の継続的な存在を要求しないことがある。
【００７３】
７．６．  抗体
本明細書に開示する方法及びキットにおいて有用な抗体は、ガストリン遺伝子の他の産物を上回りヒトプロガストリンに特異的に結合するものである。図３０に例証する通り、ガストリン遺伝子は、１０１アミノ酸ポリペプチド（プレプロガストリンと呼ばれる）に翻訳され、それは、切断されて、プロガストリン（８０アミノ酸ポリペプチド）を生じるシグナル配列（下線）を含む。プロガストリンは、順に、切断されて、３４アミノ酸産物（配列において、プロガストリンの残基３８−７１に対応する）を生成し、それは、次に、グリシン残基を用いてそのカルボキシ末端で伸長されて、グリシン伸長Ｇ３４（「Ｇ３４−Ｇｌｙ」）を生成する。この切断の副産物は、６アミノ酸ペプチド（Ｃ末端隣接ペプチド、又はＣＴＦＰと呼ばれる）であり、それは、配列において、プロガストリンの残基７５−８０に対応する。Ｇ３４−Ｇｌｙは、次に、さらに切断されて、配列において、プロガストリンの残基５５−７１に対応し、Ｇ１７−Ｇｌｙとして言及される１７残基ポリペプチドを生成する。Ｇ３４−Ｇｌｙ及びＧ１７−ＧｌｙのＣ末端グリシンの除去、それに続くＣ末端アミド化は、それぞれＧ３４及びＧ１７をもたらし、それらの両方がＣ末端アミド化されている。
【００７４】
本明細書において使用する通り、抗体は、それが全長プロガストリンに結合するが、しかし、ＣＴＦＰ、アミド化ガストリン、又はグリシン伸長ガストリンには全く結合しない場合、ｈＰＧ「について高度に特異的」又はｈＰＧに「高度に特異的に結合する」、及び、それがＣＴＦＰ及びガストリン遺伝子の他の産物よりも少なくとも約５倍大きなｈＰＧの結合を示す場合（標準的な結合アッセイにおいて測定した通り）、ｈＰＧ「について特異的」又はｈＰＧに「特異的に結合する」。特定の抗ｈＰＧ抗体の特異性を評価するために使用することができる特定のＥＬＩＳＡアッセイが、実施例２１に提供される。
【００７５】
そのような高度に特異的及び／又は特異的な抗ｈＰＧ抗体（本明細書において「抗ｈＰＧ抗体」として言及される）は、ポリクローナル（「抗ｈＰＧ  ＰＡｂ」）又はモノクローナル（「抗ｈＰＧ  ＭＡｂ」）であるが、治療的使用、一部の例において、診断又は他のインビトロでの使用のために、モノクローナル抗体が好ましい。
【００７６】
抗ｈＰＧ抗体により結合されるエピトープは決定的ではない。有用な抗ｈＰＧ抗体は、ｈＰＧのＮ末端領域、ｈＰＧのＣ末端領域、又はｈＰＧの異なる領域に結合しうる。近年、少なくともモノクローナル抗ｈＰＧ抗体について、抗ｈＰＧ抗体を産生するために使用される抗原の選択が重要でありうることが発見されている（国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／００６３２９号（２０１０年１０月１５日出願）及び米国出願第１２／９０６，０４１号（２０１０年１０月１５日出願）、その開示及び具体的に開示される抗ｈＰＧ抗体が参照により本明細書において組み入れられる；以下、‘３２９及び‘０４１出願としてそれぞれ言及される）。‘３２９及び‘０４１出願において開示される通り、ｈＰＧに由来する全ての抗原が、生理学的条件下でｈＰＧに特異的に結合するモノクローナル抗体の産生を刺激するわけではない。実際に、ポリクローナル抗ｈＰＧ抗体を成功裏に産生するために使用されてきた特定の抗原（例えば全長組換えｈＰＧ（例、ＷＯ０８／０７６４５４  Ｓｉｎｇｈを参照のこと）及びｈＰＧのＣ末端の最後の１０アミノ酸に対応するペプチド（ＷＯ０７／１３５５４２  Hollande et al.を参照のこと）など）は、モノクローナル抗体の生成に失敗した。‘３２９及び‘０４１出願において記述される通り、ｈＰＧ配列内の抗原性Ｎ末端及びＣ末端配列が同定されており、ｈＰＧに特異的に結合するモノクローナル抗体を生成するために使用することができる。興味深いことに、抗原性配列は、それに固有であるｈＰＧ配列の領域に限定する必要はない。ガストリン遺伝子の他の産物と共通の配列の領域を有するペプチド抗原（例えば、Ｇ１７、Ｇ３４、及びＣＴＦＰ）は、ｈＰＧに結合するだけでなく、しかし、それに特異的に結合するモノクローナル抗体をもたらす。
【００７７】
ｈＰＧのＮ末端領域に対応する配列を有するペプチド抗原を使用して入手可能であり及び／又はｈＰＧのＮ末端領域に結合する抗ｈＰＧ抗体を、本明細書において「Ｎ末端抗ｈＰＧ抗体」として言及する。ｈＰＧについて特異的なポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の両方を得るために適した免疫原を構築するために使用することができるｈＰＧの特定の例示的な抗原性領域は、ｈＰＧの残基１〜１４：ＳＷＫＰＲＳＱＱＰＤＡＰＬＧ（配列番号２５）に対応する。Ｎ末端抗ｈＰＧ抗体を得るために有用な例示的な免疫原、ならびに、これらの例示的な免疫原を用いて得られたＮ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体のＣＤＲならびにＶＨ及びＶＬ配列を以下の表１Ａ及び実施例のセクションに提供する：
【００７８】
【表１】
0005930972.tif 000002
0005930972.tif 000003
【００７９】
ｈＰＧのＣ末端領域に対応する配列を有するペプチド抗原を使用して入手可能であり及び／又はｈＰＧのＣ末端領域に結合する抗ｈＰＧ抗体を、本明細書において「Ｃ末端抗ｈＰＧ抗体」として言及する。ｈＰＧについて特異的なポリクローナル及びモノクローナル（末端抗ｈＰＧ）抗体の両方を得るために有用な免疫原を構築するために使用することができる特定の例示的な抗原性領域は、ｈＰＧの残基５５〜８０：ＱＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹＧＷＭＤＦＧＲＲＳＡＥＤＥＮ（配列番号２７）に対応する。Ｃ末端抗ｈＰＧ抗体を得るために有用なこの抗原を含む例示的な免疫原、ならびに、これらの例示的な免疫原を用いて得られたＣ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体のＣＤＲならびにＶＨ及びＶＬ配列を以下の表１Ｂ及び実施例のセクションに提供する。
【００８０】
【表２】
0005930972.tif 000004
0005930972.tif 000005
【００８１】
表１Ａ及び１Ｂに提供する例示的な抗ｈＰＧモノクローナル抗体ＭＡｂ１−ＭＡｂ２３により結合される特定のエピトープは、ＳＰＯＴ技術及びアラニンスキャンを使用してマッピングされた（Laune et al., 2002, J. Immunol. Methods 267: 53-70及びLaune, 1997, J. Biol. Chem. 272: 30937-30944にそれぞれ記載される通り）（‘３２９出願の実施例６も参照のこと）。
【００８２】
ＳＰＯＴ技術において、推定エピトープに及ぶ１５のアミノ酸ペプチド配列を生成し、ニトロセルロース膜上にスポットし、それを、次に、テスト抗体を用いてプローブし、抗体により認識される最小エピトープ配列を決定する。アラニンスキャンを使用して、抗体結合のために決定的であるエピトープ内の残基を決定する。推定エピトープ内の各残基が、１つずつ、アラニンに変異しており、アラニン含有ペプチドを、次に、テスト抗体を用いてプローブする。
【００８３】
Ｎ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体ＭＡｂ１−４及び１５−２０について、エピトープは少なくとも以下：ＤＡＰＬＧ（配列番号２８）、ＰＤＡＰＬＧ（配列番号２９）、ＰＲＳＱＱＰＤ（配列番号３０）、ＷＫＰＲＳＱＱＰＤ（配列番号３１）、又はＷＫＰＲＳＱＱＰＤＡＰＬＧ（配列番号３２）（以下の表２Ａに示す通り）の配列を含む。
【００８４】
【表３】
0005930972.tif 000006
【００８５】
Ｃ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体ＭＡｂ５−７、９−１２、１４、及び２１−２３について、エピトープは少なくとも以下：ＦＧＲＲ（配列番号３３）、ＭＤＦＧＲ（配列番号３４）、ＡＥＤＥＮ（配列番号３５）、及びＧＷＭＤＦＧＲＲ（配列番号３６）（以下の表２Ｂに示す通り）の配列を含む。
【００８６】
【表４】
0005930972.tif 000007
【００８７】
エピトープマッピング実験では、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ２及びＭＡｂ４が同じエピトープに結合することが明らかになる；抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１及びＭＡｂ３はほぼ同じエピトープに結合する；ＭＡｂ１７、ＭＡｂ１８、ＭＡｂ１９、及びＭＡｂ２０はほぼ同じエピトープに結合する；ＭＡｂ１５及びＭＡｂ１６はほぼ同じエピトープに結合する；抗ｈＰＧ  ＭＡｂ５、ＭＡｂ６、ＭＡｂ７、ＭＡｂ９、及びＭＡｂ１２は同じエピトープに結合し、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１０とほぼ同じエピトープに結合する；ならびに抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１１及びＭＡｂ１４はほぼ同じエピトープに結合する。
【００８８】
本明細書に記載する方法及びキットにおいて有用なＮ末端抗ＰＧ抗体の特定の実施態様は、ｈＰＧの残基１０〜１４（配列番号２８）、ｈＰＧの残基９〜１４（配列番号２９）、ｈＰＧの残基４〜１０（配列番号３０）、ｈＰＧの残基２〜１０（配列番号３１）、又はｈＰＧの残基２〜１４（配列番号３２）を含むエピトープに結合する抗体を含む。
【００８９】
本明細書に記載する方法及びキットにおいて有用なＣ末端抗ＰＧ抗体の特定の実施態様は、ｈＰＧの残基７１〜７４（配列番号３３）、ｈＰＧの残基６９〜７３（配列番号３４）、ｈＰＧの残基７６〜８０（配列番号３５）、又はｈＰＧの残基６７〜７４（配列番号３６）を含むエピトープに結合する抗体を含む。
【００９０】
本明細書に開示する方法及びキットにおいて有用なＮ末端及びＣ末端抗ｈＰＧ抗体は、表１Ａ＆１Ｂに提供するものに加えて、例示的なＭＡｂ１−２３を用いたあるいはＮ又はＣ末端エピトープに結合する他の参照抗体を用いた競合結合アッセイにおいて同定することができる（後のセクションにおいてより詳細に記載する通り）。
【００９１】
実施例において実証する通り、全ての抗ｈＰＧ抗体（ｈＰＧについて高い程度の特異性及び親和性を示すものでさえ）が、ｈＰＧの生物学的活性を中和するわけではない。例えば、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１４は約６pMのＫＤでｈＰＧに結合するが、それは少なくともテストした濃度では、インビトロアッセイにおいて結腸直腸癌細胞の成長を阻害しなかったのに対し、他の抗ｈＰＧモノクローナル抗体（例えば、ＭＡｂ１−ＭＡｂ１３及びＭＡｂ１５−ＭＡｂ２３）は様々な程度まで阻害活性を示した。ｈＰＧに特異的に結合する非中和及び中和性抗体の両方が本開示の診断方法のために有用であるが、治療方法のために有用な抗ｈＰＧ抗体は中和活性を示すはずである。
【００９２】
本明細書において使用する通り、「中和性抗ｈＰＧ抗体」は、非特異的抗体を用いて処理したコントロールサンプルと比較して、抗ｈＰＧ抗体を用いて処理したテストサンプル中の生きた結腸直腸癌細胞の数における統計的に有意な低下をもたらす抗ｈＰＧ抗体である。任意の特定の抗ｈＰＧ抗体が中和性である能力を評価するための特定のアッセイが、実施例２２に記載される。このアッセイにおいて生きた結腸直腸癌細胞の数における少なくとも約５０%低下を示すそれらの抗ｈＰＧ抗体は、結腸直腸癌を処置する際に特に有用であると考えられるが、このアッセイにおける生きた結腸直腸細胞の数におけるより低いレベルの中和活性、例えば、４０%、３０%、２０%、１５%、又は１０%の統計的に有意な低下を示す抗ｈＰＧ抗体が治療的利益を提供することが期待される。これらのアッセイにおける使用のための例示的な細胞は、しかし、限定しないが、本明細書に記載する原発性及び転移性結腸直腸癌細胞株を含む。
【００９３】
したがって、一部の実施態様、例えば、治療的な実施態様において、有用な抗ｈＰＧ抗体は中和性である。本明細書において、ならびに‘３２９及び‘０４１出願において開示される通り、抗ｈＰＧモノクローナル抗体が中和性である能力は、エピトープ依存的ではない。なぜなら、Ｎ末端及びＣ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体の両方が、結腸直腸癌細胞を用いたアッセイにおいて中和活性を示したからである。このように、一部の特定の実施態様において、中和性抗ｈＰＧ抗体はＮ末端中和性抗ｈＰＧ抗体である。他の実施態様において、中和性抗ｈＰＧ抗体はＣ末端中和性抗ｈＰＧ抗体である。
【００９４】
任意の特定の抗ｈＰＧ抗体の親和性は決定的ではない。しかし、一部の使用のために、少なくとも約１μＭの親和性を示す抗体が好まれうる。治療的使用のために、少なくとも約９０nM、８０nM、７０nM、６０nM、５０nM、４０nM、３０nM、２０nM、１５nM、１０nM、７nM、６nM、５nM、４nM、３nM、２nM、１nM、０．１nM、０．０１nM、０．００１nM又はさらに大きい親和性が望まれうる。表１Ａ＆１Ｂにおいて同定された抗ｈＰＧモノクローナル抗体の測定された親和性は、１０−６〜１０−１２Mの範囲である（以下の表３に記述する通り）：
【００９５】
【表５】
0005930972.tif 000008
【００９６】
特定の所望の適用のために特に適する親和性を有する抗ＰＧモノクローナル抗体を、これらの間より容易に選択する、あるいは、本明細書に記載する抗ｈＰＧ抗体の種々の免疫原、相補性決定領域（ＣＤＲ）配列、可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）配列を使用して生成又は設計することができる。任意の特定の抗ＰＧモノクローナル抗体の親和性は、当技術分野において周知の又は本明細書に記載する技術（例えばＥＬＩＳＡ、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）、ＢＩＡｃｏｒｅ、又は蛍光偏光アッセイなど）を使用して決定することができる。特定のアッセイを実施例２３に提供する。
【００９７】
表１Ａ＆１Ｂに記述する通り、いくつかのＮ末端及びＣ末端モノクローナル抗ｈＰＧ抗体が同定されている。これらの抗体の全てがｈＰＧについて特異的であり、列挙される全てのもの（ＭＡｂ１４を除く）が中和活性を示す。抗体を得るための有用なハイブリドーマのいくつかが、２０１０年１０月６日に、ブダペスト条約に従って、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes（ＣＮＣＭ）に寄託された。抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１−２３を産生するハイブリドーマの指定名称及び寄託されたそれらのハイブリドーマの寄託登録番号を表１Ａ＆１Ｂに提供する。また、抗体のいくつかについて、それらの可変重鎖（ＶＨ）、可変軽鎖（ＶＬ）、ＶＬ相補性決定領域（ＣＤＲ）、及びＶＨ  ＣＤＲのアミノ酸配列が決定されている。これらのアミノ酸配列、及び開示を通じてそれらを参照するために使用される省略命名法も表１Ａ＆１Ｂに提供する。簡単には、マウス重鎖及び軽鎖可変ドメインは、本明細書においてｍＶＨ及びｍＶＬとして言及され、対応するモノクローナル抗体の番号が続く（例えば、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ３の可変軽鎖及び可変重鎖についてそれぞれｍＶＨ．３及びｍＶＬ．３）。同様に、ヒト重鎖及び軽鎖可変ドメインは、本明細書においてｈＶＨ及びｈＶＬとして言及され、対応するモノクローナル抗体の番号が続く。３つの可変重鎖ＣＤＲ及び３つの可変軽鎖ＣＤＲは、それぞれＶＨ  ＣＤＲ１、２、又は３及びＶＬ  ＣＤＲ１、２、又は３として言及され、特定の抗ｈＰＧモノクローナル抗体の番号が続く。例えば、ＭＡｂ３のＶＨ  ＣＤＲ１はＶＨ  ＣＤＲ１．３と表示され、及び、ＭＡｂ３のＶＬ  ＣＤＲ  １はＶＬ  ＣＤＲ１．３と表示される。ＭＡｂ３のＶＨ  ＣＤＲ２はＶＨ  ＣＤＲ２．３と表示され、及び、ＭＡｂ３のＶＬ  ＣＤＲ２はＶＬ  ＣＤＲ２．３と表示される。
【００９８】
ほぼ同じエピトープに結合する抗ｈＰＧモノクローナル抗体の対応するＣＤＲ及び／又はＶＨ及びＶＬ鎖を交換して、本明細書に記載する方法及びキットにおいて有用な新たな抗ｈＰＧモノクローナル抗体をもたらしうることが期待される。例えば、上に記述する通り、例示的な抗ｈＰＧモノクローナル抗体ＭＡｂ５及びＭＡｂ６は同じエピトープに結合する。そのＶＬ鎖において、これらの２つの抗体のＶＬ  ＣＤＲの種々の組み合わせ、及び／又は、そのＶＨ鎖において、これらの２つの抗体のＶＨ  ＣＤＲの種々の組み合わせを含む抗ｈＰＧモノクローナル抗体を設計することができる。可能な種々の組み合わせを例証するための特定の非限定的な例として、そのような抗体は、そのＶＬ鎖において、ＭＡｂ５のＣＤＲ１及び２（それぞれＶＬ  ＣＤＲ  １．５及びＶＬ  ＣＤＲ  ２．５）ならびにＭＡｂ６のＣＤＲ３（ＶＬ  ＣＤＲ  ３．６）、及び、そのＶＨ鎖において、ＭＡｂ６のＣＤＲ１（ＶＨ  ＣＤＲ  １．６）ならびにＭＡｂ５のＣＤＲ２及び３（それぞれＶＨ  ＣＤＲ  ２．５及びＶＨ  ＣＤＲ  ３．５）を含みうる。
【００９９】
寄託されているハイブリドーマにより産生される抗体のＣＤＲのアミノ酸配列は、従来の手段を使用して得ることができる。例えば、ハイブリドーマ６Ｂ５Ｂ１１Ｃ１０及び２０Ｄ２Ｃ３Ｇ２により産生される抗体の関連配列を以下の通りに決定した。簡単には、全ＲＮＡを、製造者の指示に従って使用したＲＮＡＢｅｅ試薬（ＡＭＳＢｉｏカタログｎｏ．ＣＳ−１０４Ｂ）を使用して凍結細胞ペレットから単離した。Ｖ領域についてのｃＤＮＡを、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、それに続くｃＤＮＡ末端の５’迅速増幅（ＲＡＣＥ）を使用してｍＲＮＡから調製した。ｃＤＮＡ合成を、定常領域特異的プライマーを使用して行い、その後、第１鎖産物を精製し、末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼを使用して、ｃＤＮＡの３’末端にホモポリマーテールを加えた。「テール付き」ｃＤＮＡ配列を、次に、プライマーペア（ホモポリマーテール及びＶＨ又はＶＬ領域のいずれかについての各々１つのプライマー）をそれぞれ使用したＰＣＲにより増幅した。重鎖及び軽鎖可変領域のＰＣＲ産物を、次に、「ＴＡ」クローニングベクター（p-GEM-T easy, Promega cat. no A 1360）中にクローン化し、標準的手順を使用して配列決定した。図３１Ａ−Ｂ（ＭＡｂ  ３）、図３１Ｃ−Ｄ（ＭＡｂ  ４）を参照のこと。
【０１００】
同様に、ハイブリドーマ１Ｃ１０Ｄ３Ｂ９、２Ｃ６Ｃ３Ｃ７、１Ｂ３Ｂ４Ｆ１、及び１Ｅ９Ｄ９Ｂ６１により産生される抗体の関連配列を以下の通りに決定した。全ＲＮＡを、製造者の指示に従って使用したRNAqueous（登録商標）-4PCRキット（Ambion cat.No.AM1914）を使用して凍結細胞ペレットから単離した。重鎖Ｖ領域のｍＲＮＡを、６つの縮重プライマープールのセット（ＨＡ〜ＨＦ）を使用して増幅し、軽鎖Ｖ領域のｍＲＮＡを、８つの縮重プライマープールのセットを使用して増幅した（κクラスターについて７つ（ＫＡ〜ＫＧ）及びλクラスターについて１つ（ＬＡ））。可変領域についてのｃＤＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲを使用してｍＲＮＡから調製した。ｃＤＮＡ合成を、定常領域特異的プライマーを使用して行い、５’マウスシグナル配列についての縮重プライマーのプール及びＩｇＧＶＨ、ＩｇκＶＬ、及びＩｇλＶＬの各々についての３’定常領域に対するプライマーを使用したＰＣＲが続いた。（Jones et al., 1991, Rapid PCR cloning of full-length mouse immunoglobulin variable regions, Bio/Technology 9:88-89）．重鎖及び軽鎖可変領域のＰＣＲ産物を、次に、「ＴＡ」クローニングベクター（p-GEM-T easy, Promega cat. no A 1360）中にクローン化し、標準的手順を使用して配列決定した。図３１Ｅ−Ｆ（ＭＡｂ  ８）、３１Ｇ−Ｈ（ＭＡｂ  １３）、３１Ｉ−Ｊ（Ｍａｂ  １６）、及び３１Ｋ−Ｌ（Ｍａｂ  １９）を参照のこと。
【０１０１】
表１Ａを参照して、本明細書に記載する方法及びキットにおいて有用なＮ末端抗ｈＰＧ抗体の特定の実施態様は、しかし、限定しないが、以下：
（ａ）配列において、ＭＡｂ１、ＭＡｂ２、ＭＡｂ３、ＭＡｂ４、ＭＡｂ１５、ＭＡｂ１６、ＭＡｂ１７、ＭＡｂ１８、ＭＡｂ１９、又はＭＡｂ２０のＶＬ  ＣＤＲに対応するＶＬ  ＣＤＲ、及び、配列において、ＭＡｂ１、ＭＡｂ２、ＭＡｂ３、ＭＡｂ４、ＭＡｂ１５、ＭＡｂ１６、ＭＡｂ１７、ＭＡｂ１８、ＭＡｂ１９、又はＭＡｂ２０のＶＨ  ＣＤＲに対応するＶＨ  ＣＤＲを有する抗体；
（ｂ）配列において、ＭＡｂ１、ＭＡｂ２、ＭＡｂ３、ＭＡｂ４、ＭＡｂ１５、ＭＡｂ１６、ＭＡｂ１７、ＭＡｂ１８、ＭＡｂ１９、又はＭＡｂ２０のＶＬ及びＶＨ  ＣＤＲに対応するＶＬ  ＣＤＲ及びＶＨ  ＣＤＲを有する抗体；
（ｃ）抗体、それにおいて：
（ｉ）ＶＬ  ＣＤＲ  １はＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹ（「ＶＬ  ＣＤＲ  １．３」；配列番号４）、ＱＳＬＶＨＳＳＧＶＴＹ（「ＶＬ  ＣＤＲ  １．４」；配列番号１０）、ＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹ（「ＶＬ  ＣＤＲ  １．１６」；配列番号５０）、及びＳＱＨＲＴＹＴ（「ＶＬ  ＣＤＲ  １．１９」；配列番号５１）より選択される；
（ｉｉ）ＶＬ  ＣＤＲ２はＫＶＳ（「ＶＬ  ＣＤＲ  ２．３」及び「ＶＬ  ＣＤＲ  ２．４」；配列番号５）、ＬＶＳ（「ＶＬ  ＣＤＲ  ２．１６」；配列番号５３）、及びＶＫＫＤＧＳＨ（「ＶＬ  ＣＤＲ  ２．１９」；配列番号５４）；
（ｉｉｉ）ＶＬ  ＣＤＲ３はＦＱＧＳＨＶＰＦＴ（「ＶＬ  ＣＤＲ  ３．３」；  配列番号６）、ＳＱＳＴＨＶＰＰＴ（「ＶＬ  ＣＤＲ  ３．４」；配列番号１１）、ＷＱＧＴＨＳＰＹＴ（「ＶＬ  ＣＤＲ  ３．１６」；配列番号５７）、及びＧＶＧＤＡＩＫＧＱＳＶＦＶ（「ＶＬ  ＣＤＲ  ３．１９」；配列番号５８）より選択される；
（ｉｖ）ＶＨ  ＣＤＲ１はＧＹＩＦＴＳＹＷ（「ＶＨ  ＣＤＲ  １．３」；配列番号１）、ＧＹＴＦＳＳＳＷ（「ＶＨ  ＣＤＲ  １．４」；配列番号７）、ＧＹＴＦＴＳＹＹ（「ＶＨ  ＣＤＲ  １．１６」；配列番号３９）、及びＧＹＳＩＴＳＤＹＡ（「ＶＨ  ＣＤＲ  １．１９」；配列番号４０）より選択される；
（ｖ）ＶＨ  ＣＤＲ２はＦＹＰＧＮＳＤＳ（「ＶＨ  ＣＤＲ  ２．３」；配列番号２）、ＦＬＰＧＳＧＳＴ（「ＶＨ  ＣＤＲ  ２．４」；配列番号８）、ＩＮＰＳＮＧＧＴ（「ＶＨ  ＣＤＲ  ２．１６」；配列番号４３）、及びＩＳＦＳＧＹＴ（「ＶＨ  ＣＤＲ  ２．１９」；配列番号４４）より選択される；及び
（ｖｉ）ＶＨ  ＣＤＲ３はＴＲＲＤＳＰＱＹ（「ＶＨ  ＣＤＲ  ３．３」；配列番号３）、ＡＴＤＧＮＹＤＷＦＡＹ（「ＶＨ  ＣＤＲ  ３．４」；配列番号９）、ＴＲＧＧＹＹＰＦＤＹ（「ＶＨ  ＣＤＲ  ３．１６」；配列番号４７）、及びＡＲＥＶＮＹＧＤＳＹＨＦＤＹ（「ＶＨ  ＣＤＲ  ３．１９」；配列番号４８）より選択される；
（ｄ）配列において、ＭＡｂ１、ＭＡｂ２、ＭＡｂ３、ＭＡｂ４、ＭＡｂ１５、ＭＡｂ１６、ＭＡｂ１７、ＭＡｂ１８、ＭＡｂ１９、又はＭＡｂ２０のＶＬに対応するＶＬ、及び、配列において、ＭＡｂ１、ＭＡｂ２、ＭＡｂ３、ＭＡｂ４、ＭＡｂ１５、ＭＡｂ１６、ＭＡｂ１７、ＭＡｂ１８、ＭＡｂ１９、又はＭＡｂ２０のＶＨに対応するＶＨを有する抗体；及び
（ｅ）配列において、ＭＡｂ１、ＭＡｂ２、ＭＡｂ３、ＭＡｂ４、ＭＡｂ１５、ＭＡｂ１６、ＭＡｂ１７、ＭＡｂ１８、ＭＡｂ１９、又はＭＡｂ２０のＶＬ及びＶＨに対応するＶＬ及びＶＨを有する抗体
を含む。
【０１０２】
表１Ｂを参照して、本明細書に記載する方法及びキットにおいて有用なＣ末端抗ｈＰＧ抗体の特定の実施態様は、しかし、限定しないが、以下：
（ｆ）配列において、ＭＡｂ５、ＭＡｂ６、ＭＡｂ７、ＭＡｂ８、ＭＡｂ９、ＭＡｂ１０、ＭＡｂ１１、ＭＡｂ１２、ＭＡｂ１３、ＭＡｂ１４、ＭＡｂ２１、ＭＡｂ２２又はＭＡｂ２３のＶＬ  ＣＤＲに対応するＶＬ  ＣＤＲ、及び、配列において、ＭＡｂ５、ＭＡｂ６、ＭＡｂ７、ＭＡｂ８、ＭＡｂ９、ＭＡｂ１０、ＭＡｂ１１、ＭＡｂ１２、ＭＡｂ１３、ＭＡｂ１４、ＭＡｂ２１、ＭＡｂ２２、又はＭＡｂ２３のＶＨ  ＣＤＲに対応するＶＨ  ＣＤＲを有する抗体；
（ｇ）配列において、ＭＡｂ５、ＭＡｂ６、ＭＡｂ７、ＭＡｂ８、ＭＡｂ９、ＭＡｂ１０、ＭＡｂ１１、ＭＡｂ１２、ＭＡｂ１３、ＭＡｂ１４、ＭＡｂ２１、ＭＡｂ２２、又はＭＡｂ２３のＶＬ及びＶＨ  ＣＤＲに対応するＶＬ及びＶＨ  ＣＤＲを有する抗体；
（ｈ）抗体、それにおいて：
（ｖｉｉ）ＶＬ  ＣＤＲ１はＫＳＬＲＨＴＫＧＩＴＦ（「ＶＬ  ＣＤＲ  １．８」；配列番号４９）及び  ＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹ（「ＶＬ  ＣＤＲ  １．１３」；配列番号５０）より選択される；
（ｖｉｉｉ）ＶＬ  ＣＤＲ２はＱＭＳ（「ＶＬ  ＣＤＲ  ２．８」；配列番号５２）及び  ＬＶＳ（「ＶＬ  ＣＤＲ  ２．１３」；配列番号５３）より選択される；
（ｉｘ）ＶＬ  ＣＤＲ３はＡＱＮＬＥＬＰＬＴ（「ＶＬ  ＣＤＲ  ３．８」；配列番号５５）及び  ＷＱＧＴＨＦＰＱＴ（「ＶＬ  ＣＤＲ  ３．１３」；配列番号５６）より選択される；
（ｘ）ＶＨ  ＣＤＲ１はＧＦＴＦＴＴＹＡ（「ＶＨ  ＣＤＲ  １．８」；配列番号３７）及び  ＧＦＩＦＳＳＹＧ（「ＶＨ  ＣＤＲ  １．１３」；配列番号３８）より選択される；
（ｘｉ）ＶＨ  ＣＤＲ２はＩＳＳＧＧＴＹＴ（「ＶＨ  ＣＤＲ  ２．８」；配列番号４１）及び  ＩＮＴＦＧＤＲＴ（「ＶＨ  ＣＤＲ  ２．１３」；配列番号４２）より選択される；及び
（ｘｉｉ）ＶＨ  ＣＤＲ３はＡＴＱＧＮＹＳＬＤＦ（「ＶＨ  ＣＤＲ  ３．８」；配列番号４５）及び  ＡＲＧＴＧＴＹ（「ＶＨ  ＣＤＲ  ３．１３」；配列番号４６）より選択される；
（ｉ）配列において、ＭＡｂ５、ＭＡｂ６、ＭＡｂ７、ＭＡｂ８、ＭＡｂ９、ＭＡｂ１０、ＭＡｂ１１、ＭＡｂ１２、ＭＡｂ１３、ＭＡｂ１４、ＭＡｂ２１、ＭＡｂ２２、又はＭＡｂ２３のＶＬに対応するＶＬ、及び、配列において、ＭＡｂ５、ＭＡｂ６、ＭＡｂ７、ＭＡｂ８、ＭＡｂ９、ＭＡｂ１０、ＭＡｂ１１、ＭＡｂ１２、ＭＡｂ１３、ＭＡｂ１４、ＭＡｂ２１、ＭＡｂ２２、又はＭＡｂ２３のＶＨに対応するＶＨを有する抗体；及び
（ｊ）配列において、ＭＡｂ５、ＭＡｂ６、ＭＡｂ７、ＭＡｂ８、ＭＡｂ９、ＭＡｂ１０、ＭＡｂ１１、ＭＡｂ１２、ＭＡｂ１３、ＭＡｂ１４、ＭＡｂ２１、ＭＡｂ２２、又はＭＡｂ２３のＶＬ及びＶＨに対応するＶＬ及びＶＨを有する抗体
を含む。
【０１０３】
当業者により理解される通り、診断方法において有用な抗ｈＰＧ抗体は、任意の起源（例えば、哺乳動物（例、ヒト、霊長類、げっ歯類、ヤギ、又はウサギ）、非哺乳動物、又は自然におけるキメラ（１を上回る種に由来する）を含む）でありうる。動物（ヒトを含む）における治療的使用のために適した抗体は、好ましくは、処置されることが意図される同じ種に由来する、あるいは、改変又は設計され、非免疫原性である、又は処置されている動物において低下した免疫原性を有する。ヒトにおける治療的使用のために有用な抗ｈＰＧ抗体の特定のクラスは、ヒト化抗体のクラスであり、以下により詳細に考察する。本明細書に記載する方法及びキットにおいて有用な抗ｈＰＧ抗体は、また、任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＡ（例、ＩｇＡ１又はＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（例、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４）、又はＩｇＭを含む）でありうる、又はそれに由来しうる。治療的使用のために設計された抗ｈＰＧ抗体は、好ましくは、ＩｇＧアイソタイプである。
【０１０４】
一部の実施態様において、本明細書に記載する治療的方法のために有用な抗ｈＰＧ抗体はヒト化される。一般的には、ヒト化抗体は、少なくとも１つの、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、それにおいて、ＣＤＲ領域の全て又は実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、フレームワーク領域の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものであり、「ＣＤＲ移植」として言及することができる。ヒト化抗体は、また、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものを含むことができる。抗体をヒト化するための方法（ヒト化抗体を設計するための方法を含む）は、当技術分野において周知である。例えば、Lefranc et al., 2003, Dev. Comp. Immunol. 27: 55-77；Lefranc et al., 2009, Nucl. Acids Res. 37: D1006-1012；Lefranc, 2008, Mol. Biotechnol. 40: 101-111；Riechmann et al., 1988, Nature 332: 323-7；米国特許第５，５３０，１０１号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号、第５，６９３，７６２号、及び第６，１８０，３７０号、Queen et al.；ＥＰ２３９４００；ＰＣＴ公開ＷＯ  ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；ＥＰ５９２１０６；ＥＰ５１９５９６；Padlan, 1991, Mol. Immunol. 28: 489-498;Studnicka et al., 1994, Prot. Eng. 7: 805-814；Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 969-973；及び米国特許第５，５６５，３３２号（その開示は、その全体において参照により本明細書により組み入れられる）。
【０１０５】
非ヒト抗ｈＰＧ抗体のＣＤＲに対応するＣＤＲ配列を有する抗体のヒト化バージョン（例として、限定しないが、表１Ａに提供する種々のＮ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体及び表１Ｂに提供する種々のＣ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体を含む）を、これらの周知の方法を使用して得ることができる。選択された抗ｈＰＧ抗体のヒト化ＶＬ及びＶＨ鎖の予測配列を、表１Ａ及び１Ｂに提供する。ヒト化抗体の特定の例は、以下：
（ｋ）本明細書に開示される任意の３つのＶＬ  ＣＤＲ及び任意の３つのＶＨ  ＣＤＲ；
（ｌ）配列番号２１に対応するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号２２に対応するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（ｍ）配列番号２３に対応するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号２４に対応するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（ｎ）配列番号７５、７７、及び７９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ならびに配列番号７６及び７８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（ｏ）配列番号８０及び８２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ならびに配列番号８１及び８３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（ｐ）配列番号８４、８６、及び８８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ならびに配列番号８５、８７、及び８９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；及び
（ｑ）配列番号９０、９２、及び９４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ならびに配列番号９１、９３、及び９５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む抗体を含む。
【０１０６】
当業者により認識される通り、特定の結合特性（例えば、目的の特定のエピトープに結合する能力など）を有する抗ｈＰＧ抗体は、本明細書に記載する種々の抗原及び免疫原を使用し、目的の参照抗体とｈＰＧ結合について競合するそれらの能力を評価して容易に得ることができる。本明細書に記載する抗ｈＰＧ抗体のいずれかを、そのような競合アッセイにおける参照抗体として利用することができる。目的のビオチン化参照抗ｈＰＧ抗体を用いてｈＰＧ結合について競合する抗体の能力を評価するために有用な特定のアッセイを、実施例２４に提供する。
【０１０７】
参照抗ｈＰＧ抗体と任意のテスト抗体（種又はアイソタイプと無関係）の間での抗体競合試験を行う際、最初に、参照を、直接的（例えばラジオアイソトープ又はフルオロフォア）又は間接的（例えばビオチン（蛍光標識ストレプトアビジンとの結合を介して検出可能）又は酵素（酵素反応を介して検出可能）など）のいずれかで検出可能な標識を用いて標識し、その後の同定を可能にする。この場合において、標識参照抗ｈＰＧ抗体（固定又は増加濃度で）を、既知量のｈＰＧを用いてインキュベートし、ｈＰＧ：標識抗ｈＰＧ抗体複合体を形成する。非標識テスト抗体を、次に、複合体に加える。複合標識の強度を測定する。テスト抗体が、重複するエピトープに結合することにより、ｈＰＧについて標識参照抗ｈＰＧ抗体と競合する場合、複合標識の強度は、テスト抗体の非存在において行うコントロール実験と比べて減少する。
【０１０８】
結合競合アッセイを行うための多数の方法が公知であり、適応して、上に及び実施例２４に記載するアッセイと同等の結果をもたらすことができる。
【０１０９】
抗体は、それが、競合結合アッセイ、及び、具体的には、実施例２４の競合結合アッセイにおいて参照抗ｈＰＧ抗体のｈＰＧへの結合を、少なくとも５０%だけ（より高いレベルの低下、例えば６０%、７０%、８０%、９０%、又はさらには１００%が望まれうる）、テスト抗体濃度の範囲０．０１〜１００μg/ml（例、０．０１μg/ml、０．０８μg/ml、０．４μg/ml、２μg/ml、１０μg/ml、５０μg/ml、又は１００μg/ml、あるいは記述する範囲内の他の濃度）で低下させる場合、参照抗ｈＰＧ抗体とｈＰＧ結合について競合すると考えられ、このように、参照抗ｈＰＧ抗体とほぼ同じ又は重複するｈＰＧのエピトープに結合すると考えられる。
【０１１０】
本開示の抗体は、また、誘導体化し、共有結合的に修飾し、又は他の分子に結合させ、それらの特性を変え、もしくは、その機能を向上させることができる。例えば、しかし、限定しないが、誘導体化抗体は、修飾されている（例、グリコシル化、フコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、ホルミル化、公知の保護／遮断基による誘導体化、細胞リガンド又は他のタンパク質への連結などによる）抗体を含む。あるいは、可変又は定常領域中の特定のアミノ酸を改変し、機能を変化又は改善することができる。１つの非限定的な例において、抗体のＦｃ領域中のアミノ酸残基を改変し、ＦｃＲｎへのその結合を増加させることにより抗体の血清半減期を増加させてもよい。
【０１１１】
抗ｈＰＧモノクローナル抗体は、検出可能な成分を用いて標識された抗体を含む。そのような標識は、開示の抗ｈＰＧモノクローナル抗体に直接的又は間接的に結合させることができる。標識はそれ自体が検出可能であり（例、ラジオアイソトープ標識、アイソトープ標識、又は蛍光標識）、又は、酵素標識の場合において、検出可能である基質化合物又は組成物の化学変化を触媒することができる。検出可能物質の例は、種々の酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、放射性材料、種々の陽電子放射断層撮影を使用した陽電子放出金属、及び非放射性常磁性金属イオンを含む。
【０１１２】
本明細書に記載する方法及びキットにおいて有用な種々の抗ｈＰＧ抗体は、全長抗体を用いて例示されてきたが、当業者は、結合フラグメント、あるいは全長抗体又は結合フラグメントから設計される又はそれに由来するサロゲート抗体も使用してもよいことを理解するであろう。適したフラグメント、サロゲートなどは、しかし、限定しないが、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｖＩｇＧ、ｓｃＦｖフラグメント及びサロボディ、ｒＩｇＧ、ジスルフィド安定化Ｆｖ抗体（ｄｓＦｖ）、ダイアボディ、トリアボディ、及び単一ドメイン抗体（例えばラクダ化抗体又はナノボディなど）を含む。
【０１１３】
本開示の抗体は、当業者に公知の任意の方法に従って産生することができる。１つの非限定的な例において、抗体は天然の供給源（抗体、例えば、ヒト、サル、ニワトリ、ヤギ、ウサギ、及びげっ歯類（例、ラット、マウス、及びハムスター）に由来する抗体などを産生することが可能である任意の種を含む）から得ることができる。他の種も可能である。抗体は、また、遺伝子操作又は組換えＤＮＡテクノロジー（例えば、しかし、限定しないが、培養中の酵母細胞、細菌細胞、及び哺乳動物細胞（例えばＣＨＯ細胞など）における組換え抗体の発現など）を利用するシステムから生成及び単離されうる。抗体は、また、完全に又は部分的に合成的でありうる。
【０１１４】
本開示のモノクローナル抗体（ＭＡｂ）は、ハイブリドーマテクノロジーを通じて産生された抗体に限定されない。モノクローナル抗体は、当技術分野において利用可能な又は公知の任意の手段により、単一クローン（任意の真核生物、原核生物、又はファージのクローンを含む）に由来する。モノクローナル抗体は、当技術分野において公知の多様な技術（ハイブリドーマ、組換え、及びファージディスプレイテクノロジー、又はそれらの組み合わせの使用を含む）を使用して調製することができる。
【０１１５】
転移性結腸直腸癌のための従来の処置
転移性結腸直腸癌は、生物学的治療、標的治療、抗体治療、放射線治療、化学療法、手術、凍結手術、又はこれらの組み合わせを用いて処置されうる。転移性結腸直腸癌のための他の処置も可能である。
【０１１６】
生物学的治療は、癌と闘うための免疫システムの能力を強化又は回復する処置である。生物学的治療において使用される薬剤は、生物学的応答の修飾因子（例えばインターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子、モノクローナル抗体、ワクチン、遺伝子治療、及び非特異的免疫調節剤など）を含む。これらの薬剤の一部は、また、直接的な抗腫瘍効果を有しうる。標的癌治療は、腫瘍の成長及び進行に関与する特定の分子に干渉することにより癌の成長及び広がりを遮断する薬物又は他の物質である。
【０１１７】
抗体治療は、抗体（しかし、限定しないが、転移性結腸直腸癌細胞を直接的又は間接的に殺す、その成長を減速又は停止させるモノクローナル抗体を含む）の投与を含む。そのような抗体は、種々の別々の機構を通じて機能することができる。例えば、特定の抗体は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は他の機構を介した患者の免疫システムによる攻撃のために癌細胞をマークすることができる。他の抗体が結合し、癌細胞が生存又は成長のために要求する抗原の機能を変える又は阻害する。多数の抗体がこのように機能すると考えられる。例えば、ベバシズマブ（アバスチン（登録商標））（成長因子ＶＥＧＦに結合する）を含む。他の機構も可能である。特定の抗体は、１つ又は複数の作用機構を介して働くことができうる。さらに他の抗体を放射性又は化学毒性成分に結合させ、それらを、抗体により特異的に認識される抗原を優先的に発現する癌細胞に標的化することができる。ベバシズマブ、セツキシマブ、及びパニツムマブは、転移性結腸直腸癌を処置する際に有用な抗体の具体的な例である。
【０１１８】
放射線治療は、癌細胞を殺し、腫瘍を縮小するためのＸ線、ガンマ線、中性子、陽子、及び他の供給源からの高エネルギー放射線の使用である。放射線は身体外の機械から来ることがあり（外部ビーム放射線治療）、又は、それは、癌細胞の近くの身体において配置された放射性材料から来ることがある（内部放射線治療又は近接照射療法）。全身放射線治療では放射性物質（例えば放射標識モノクローナル抗体など）が使用されており、それは身体全体にわたる組織へ血液中を移動する。放射線治療は、また、照射及び放射線治療とも呼ばれることがある。他の放射線治療は、三次元原体放射線治療（３Ｄ−ＣＲＴ）及び強度変調放射線治療（ＩＭＲＴ）を含む。他の放射線治療も可能である。
【０１１９】
化学療法は、癌細胞を殺す（細胞傷害又は細胞破壊）又はその成長を防止する（細胞分裂停止）有機小分子薬の使用である。多くの化学療法剤が、種々の機構を通じてそれらの抗腫瘍効果を媒介し、転移性結腸直腸癌の処置のために利用可能である。
【０１２０】
例示的な化学療法剤は以下：葉酸拮抗剤（メトトレキサート及びペメトレキセドを含む）；プリン拮抗剤（クラドリビン、クロファラビン、フルダラビン、６メルカプトプリン、ネララビン、ペントスタチンを含む）；ピリミジン拮抗剤（カペシタビン、シタラビン、５フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレアを含む）；ブレオマイシン；ＤＮＡアルキル化剤（ニトロソウレア、カルムスチン、ロムスチンを含む）；ＤＮＡ架橋薬及びアルキル化剤（ベンダムスチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、イホスファミド、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、メルファラン、ダカルバジン、テモゾロミド、プロカルバジンを含む）；アスパラギナーゼ；抗生物質（マイトマイシンを含む）；白金錯体（カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチンを含む）；プロテアソーム阻害剤（ボルテゾミブを含む）；紡錘体毒、例えばタキサン（ドセタキセル、パクリタキセルを含む）及びビンカ（ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビンを含む）など；トポイソメラーゼ阻害剤、例えばアントラサイクリン（ダウノルビシン、ダウノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシンを含む）、カンプトテシン（イリノテカン及びトポテカンを含む）、ポドフィロトキシン（エトポシド、テニポシド、及びミトキサントロンを含む）などを含む。他の化学療法剤も可能である。
【０１２１】
転移性結腸直腸癌は、しばしば、化学療法剤を互いに及び／又は抗体と組み合わせて使用して処置される。そのような組み合わせの例は、ロイコボリン（フォリン酸又はＬＶ）と組み合わせた５フルオロウラシル（５ＦＵ）を含む。ウラシル（ＵＦＴ）及びロイコボリンと組み合わせたテガフール；５ＦＵと組み合わせた、又はさらにカペシタビンと組み合わせでのオキサリプラチン；カペシタビンと組み合わせたイリノテカン；５ＦＵ、イリノテカン、又はカペシタビンと組み合わせたマイトマイシンＣ  ；単独で、又はベバシズマブもしくはセツキシマブと組み合わせたＦＯＬＦＯＸ（ロイコボリン（フォリン酸）、５−ＦＵ、及びオキサリプラチン）；単独で、又はベバシズマブもしくはセツキシマブと組み合わせたＦＯＬＦＩＲＩ（ロイコボリン、５−ＦＵ、及びイリノテカン）；単独で、又はベバシズマブもしくはセツキシマブと組み合わせたＣａｐｅＯＸ（カペシタビン及びオキサリプラチン）；ベバシズマブと組み合わせた５−ＦＵ及びロイコボリン；ベバシズマブと組み合わせたカペシタビン；ＦＯＬＦＯＸＩＲＩ（ロイコボリン、５−ＦＵ、オキサリプラチン、及びイリノテカン）；セツキシマブと組み合わせたイリノテカン。他の組み合わせ計画は、５ＦＵ  Ｍａｙｏ、５ＦＵ  Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ、ＬＶＦＵ２、ＦＯＬＦＯＸ４、ＦＯＬＦＯＸ６、ｂＦＯＬ、ＦＵＦＯＸ、ＩＦＬ、ＸＥＬＯＸ、ＸＥＬＩＲＩ、及びＣＡＰＩＲＩを含み、それらはChau, I., and Cunningham, D., Br. J. Cancer 100 (2009) 1704-19；及びField, K. and Lipton, L., World J. Gastroenterol.13 (2007) 3806-15においてさらに詳細に記載され、それらは参照により組み入れられる。化学療法剤及び他の治療用薬剤の他の組み合わせも可能である。
【０１２２】
抗ＰＧ抗体を使用した治療方法
本開示は、転移性結腸直腸癌を処置及び防止し、結腸直腸癌の再発を防止し、及び結腸直腸癌幹細胞の成長を防止する目的のために、被験者に組成物中で抗ＰＧ抗体を投与することを含む治療方法を提供する。特定の実施態様において、抗体はヒトプロガストリン（「ｈＰＧ」）について特異的であり、他の実施態様において、そのような抗体はモノクローナル抗体である。
【０１２３】
これらの実施態様の一部によれば、本明細書に開示する抗ＰＧ抗体は、組成物中で、転移性結腸直腸癌のための処置を必要とする被験者へ、治療的に効果的な量で、単剤療法として又は組み合わせ治療として投与される。そのような被験者は、しかし、限定しないが、転移性結腸直腸癌と診断された者を含む。これらの方法の特定の実施態様において、抗体は抗ｈＰＧモノクローナル抗体である。
【０１２４】
他の実施態様によれば、本明細書に開示する抗ＰＧ抗体は、組成物中で、転移性結腸直腸癌の防止を必要とする被験者へ、治療的に効果的な量で、単剤療法として又は組み合わせ治療として投与される。そのような被験者は、しかし、限定しないが、原発性結腸直腸癌を有すると決定されているが、しかし、それらにおいて癌が遠隔組織又は臓器に広がっていることが知られていない者を含む。これらの方法の特定の実施態様において、抗体は抗ｈＰＧモノクローナル抗体である。
【０１２５】
さらに他の実施態様によれば、本明細書に開示する抗ＰＧ抗体は、組成物中で、転移性結腸直腸癌の再発についての防止を必要とする被験者へ、治療的に効果的な量で、単剤療法として又は組み合わせ治療として投与される。そのような被験者は、しかし、限定しないが、原発性又は転移性結腸直腸癌のために以前に処置されたが、その処置後、そのような癌が見かけ上消失した者を含む。これらの方法の特定の実施態様において、抗体は抗ｈＰＧモノクローナル抗体である。
【０１２６】
他の実施態様によれば、本明細書に開示する抗ＰＧ抗体は、組成物中で、結腸直腸癌幹細胞の成長の阻害を必要とする被験者に、治療的に効果的な量で、単剤療法として又は組み合わせ治療として投与される。そのような被験者は、しかし、限定しないが、結腸直腸癌（その成長又は転移はその内での癌幹細胞の存在に少なくとも部分的に起因している）を有する者を含む。他の実施態様は、そのような幹細胞を、そのような細胞の成長を防止又は阻害するために効果的な抗ＰＧ抗体組成物の量を用いて接触させることにより、結腸直腸癌幹細胞の成長を防止又は阻害する方法を提供する。そのような方法は、インビトロ又はインビボで行うことができる。これらの方法の特定の実施態様において、抗体は抗ｈＰＧモノクローナル抗体である。
【０１２７】
中和性抗ＰＧ抗体は、治療的抗体組成物中で主要な活性薬剤になりうるが、非中和性抗ＰＧ抗体が、それらの存在が中和性抗体の治療効力を実質的に阻害しない場合、存在しうる。
【０１２８】
抗ＰＧ抗体組成物を投与することができる被験者は、哺乳動物、例えば非霊長類（例、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）又は霊長類（例、サル、チンパンジー、類人猿、又はヒト）でありうる。被験者は、ヒト（例えば成人患者又は小児患者など）でありうる。
【０１２９】
転移性結腸直腸癌を処置又は防止する、あるいは、結腸直腸癌の再発を防止する目的のために、抗ＰＧ抗体組成物を、単剤療法として、あるいは転移性結腸直腸癌を処置又は防止する、あるいは、結腸直腸癌の再発を防止するために効果的な１つ又は複数の一次治療の補助として被験者に単独で投与することができる。
【０１３０】
このように、本開示の特定の実施態様において、抗ｈＰＧ抗体組成物は、化学療法の補助として、放射線治療の補助として、生物学的治療の補助として、外科的治療の補助として、あるいは転移性結腸直腸癌を処置又は防止するために効果的な他の型の抗体治療の補助として、転移性結腸直腸癌を処置又は防止することを必要とする被験者に投与することができる。さらに他の実施態様において、抗ｈＰＧ抗体組成物は、そのような再発を防止するために効果的な他の治療の補助として、結腸直腸癌の再発を防止することを必要とする被験者に投与することができる。
【０１３１】
補助治療として、抗ｈＰＧ抗体組成物を、一次治療と同時に、それに連続して、又はそれと別々に投与することができる。
【０１３２】
抗ｈＰＧ抗体組成物及び一次治療は、同じ時間に投与される場合、さらには、それぞれの投与が重複する場合、同時に投与されるが、しかし、異なる時間に開始又は終了する。同時投与の非限定的な例は、被験者が転移性結腸直腸癌のための化学療法を受けている又は原発性結腸直腸腫瘍の外科的切除を受けているのと同時での抗ｈＰＧ抗体組成物の投与である。
【０１３３】
抗ｈＰＧ抗体組成物及び一次治療は、同じ日に（例えば、同じ診察の間に）、しかし、同時ではなく被験者に投与される場合、連続的に投与される。連続投与は、１、２、３、４、５、６、７、８時間又はそれ以上離して生じうる。一次治療は最初に投与してもよく、抗ｈＰＧ抗体組成物の投与が続く。代替の実施態様において、抗ｈＰＧ抗体組成物は最初に投与してもよく、一次治療が続く。
【０１３４】
抗ｈＰＧ抗体組成物及び一次治療は、それらが異なる日に被験者に投与される場合、別々に投与される。特定の実施態様において、抗ｈＰＧ抗体組成物及び一次治療は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、又は１ヶ月又はそれ以上の間隔で投与することができる。連続投与と同様に、抗ｈＰＧ抗体組成物の投与は、一次治療の別々の投与に先行する又はそれに続くことができる。
【０１３５】
本開示の特定の他の実施態様において、抗ｈＰＧ抗体組成物及び一次治療を、連続で又は別々に投与するかを問わず、交互パターンで反復的に投与することができる。
【０１３６】
特定の実施態様において、一次治療の補助として抗ｈＰＧ抗体組成物を投与することは、相加よりも大きな、又は相乗な効果をもたらし、治療的利益を提供し、そこでは、いずれの治療も、単独では、陥る許容不可能な副作用を伴わず、治療的に効果的でありうる量で投与することはできない。これらの状況下で、抗ｈＰＧ抗体組成物及び／又は一次治療は、より低い量で投与することができ、それにより有害作用の可能性又は重症度を低下させる。しかし、相乗効果は、抗ｈＰＧ抗体組成物を用いた補助治療が治療的に効果的であるために要求されない。
【０１３７】
７．７．  転移性結腸直腸癌の処置の効力をモニターする方法
上に記述する通り、原発性及び／又は転移性結腸直腸癌を伴う患者は、上昇したＰＧの血漿及び／又は血清レベルを有するのに対し、健常個人におけるＰＧのベースラインレベルは無視できる。原発性及び／又は転移性結腸直腸癌を伴う被験者におけるＰＧ血漿及び／又は血清レベルを測定可能であり、約２５pM又はそれより大きい。この観察に基づき、ＰＧの血漿及び／又は血清レベルを使用して、とりわけ、原発性又は転移性結腸直腸癌の処置の有効性をモニターし、原発性又は転移性結腸直腸癌の存在を検出及び診断し、抗ＰＧ抗体を用いた処置から利益を得うる被験者を選択することができる。
【０１３８】
このように、本開示は、転移性結腸直腸癌のための前のラウンドの治療の有効性を決定するために、結腸直腸転移癌のために処置されている被験者をモニターする方法を提供する。これらの方法は、単独で、又は他（しかし、限定しないが、抗ｈＰＧ抗体組成物の投与、他の型の抗体を用いた治療、化学療法、放射線治療、生物学的治療、及びその他を含む）との組み合わせにおいて使用される転移性結腸直腸癌に対する任意の型の治療のために使用することができる。１ラウンドの治療が完了した後、被験者のケアについて責任がある処置チームは、それが、新たなラウンドの処置を投与するかしないかを決定し、他の臨床決定を行うために効果的であるか否かを確認する必要がある。
【０１３９】
モニタリング方法の一部の実施態様において、１つ又は複数の体液（例えば血液、血漿、血清、又はその他など）におけるＰＧの濃度は、転移性結腸直腸癌のための処置を開始する前に測定し、処置が完了した後に、ある時間に同じ型の体液中で測定されたＰＧレベルと比較することができる。他の実施態様において、目的の組織（例えば結腸直腸癌の生検など）におけるＰＧレベルを測定する。
【０１４０】
ＰＧ濃度における低下は効力を示している。典型的には、処置後のＰＣ処置における低下の範囲が大きいほど、治療はより有効であった。操作の任意の特定の理論により拘束されることを望まないが、患者における転移の数及び／又はサイズが、有効な処置の結果として低下するにつれて、転移により産生されたＰＧの総量も減退すると考えられる。対照的に、処置が完了した後でのＰＧレベルにおける低下又は上昇の欠如は、治療が効果的ではなかったことを示しうる。この情報に基づき、処置チームは、新たなラウンドの治療を開始するか否かを決めることができる。
【０１４１】
１ラウンドの治療が完了し、その時間の前にサンプルをモニタリングのために取る適した間隔が、当業者により容易に決定され、考慮下にある治療の型、被験者の性別及び年齢、ならびにその他といった変数に依存する。例示的な間隔は、１ラウンドの治療が完了した後、サンプルを本開示のモニタリング方法における使用のために取る前の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１週間及び３、４、５、又は６ヶ月を含む。他の間隔も可能である。他の実施態様において、治療の完了後の異なる時間間隔での複数の測定値を取り、次に、グラフ化し、傾向が存在するか否かを決定しうる。非限定的な例において、ＰＧレベルを、１ラウンドの治療が終わった後、最初の６ヶ月にわたり毎週又は毎月決定することができる。他の間隔も可能である。
【０１４２】
体液中のＰＧ濃度レベルは、当業者が精通する分析技術（例えば、しかし、限定しないが、ＲＩＡ及びＥＬＩＳＡなど）を使用して測定することができる。ｈＰＧについて特異的な抗体に頼るアッセイ方法（例えばこれらなど）は、当業者の知識に従って、非中和性又は中和性抗体（例えば本明細書に開示するものなど）を使用して行うことができる。
【０１４３】
特定の実施態様において、ＰＧレベルは、プロガストリンのＮ末端を標的化する１つの抗ＰＧ抗体及びプロガストリンのＣ末端を標的化する第２の抗ＰＧ抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法を使用して測定されうる。そのようなサンドイッチアッセイのために有用な例示的なＮ及びＣ末端抗ＰＧ抗体を、後のセクションに記載する。そのようなアッセイにおいて、表面（例えば９６ウェルプレート中のウェルなど）を調製し、それに、既知量の第１の「捕捉」Ｎ末端又はＣ末端抗ＰＧ抗体を結合させる。テストサンプルを次に表面に適用し、インキュベーション期間が続く。表面を次に洗浄し、非結合抗原を除去し、第２「検出」抗ＰＧ抗体を含む溶液を適用し、そこで検出抗体がＰＧの異なるエピトープに結合する（例えば、捕捉抗体がＣ末端抗ＰＧ抗体である場合、Ｎ末端抗ＰＧ抗体が検出抗体として使用され、及び逆もまた同様である）。ＰＧレベルを次に直接的（例えば、検出抗体が検出可能な標識に結合している場合）又は間接的（検出抗ＰＧ抗体に結合する標識二次抗体を通じて）のいずれかで測定する。血漿及び／又は血清ＰＧレベルを測定するための特定のサンドイッチアッセイを、実施例２０に提供する。
【０１４４】
本開示の方法の代替の実施態様において、目的の体液中のＰＧレベルを低下させる際での被験者への抗ｈＰＧ抗体組成物の投与の効力をモニターしてもよい。これらの方法において、サンプルを経時的に取り、ＰＧ濃度をグラフ化し、傾向を評価してもよい。残留抗ｈＰＧ抗体が存在する場合、データは、抗体によるＰＧの隔離に起因するＰＧレベルにおける低下を示すことがあり、この効果が軽減するにつれて上昇が続き、処置が転移性結腸直腸癌を処置するために効果的である場合にはその後の減退が続く。
【０１４５】
本開示の方法の他の実施態様によれば、約５０pM、４０pM、３０pM、２０pM、１０pM、５pM、２pM、１pM又はそれ以下の既定の閾値を下回る血液、血清、又は血漿ＰＧ濃度は、転移性結腸直腸癌を処置するための効力を示している。効力を示している他のＰＧ濃度の閾値も可能であり、当業者により容易に決定される。
【０１４６】
７．８．  結腸直腸癌の存在を決定する方法
本開示は、また、いずれの被験者がテストされうるのかに従って、特定の実施態様を提供し、原発性又は転移性結腸直腸癌の存在あるいは処置後の結腸直腸癌の再発を検出する目的のために、適切なベースラインと比較して、それらが体液（例えば血液、血漿、血清、又はその他など）において上昇したＰＧレベルを有するか否かを決定する。
【０１４７】
本開示の方法の特定の実施態様において、被験者は、結腸直腸癌（原発性又は転移性）が被験者において存在するか否かを決定することが望まれる者でありうる。そのような被験者において、上昇したＰＧレベル（ベースラインと比べて）は、結腸直腸癌が存在することを示す。操作の任意の特定の理論により拘束されることを望まないが、被験者における結腸直腸癌のサイズ及び／又は範囲が増加するにつれて、全身及び／又は局所ＰＧレベルも被験者において増加すると考えられる。
【０１４８】
他の実施態様において、被験者は、結腸直腸癌が遠隔組織又は臓器に転移したか否かを決定することが望まれる、原発性結腸直腸癌のために以前に処置された者でありうる。そのような被験者において、上昇したＰＧレベル（ベースラインと比べて）は、転移性結腸直腸癌が存在することを示す。そのような被験者についても、本開示の方法が、とりわけ、転移性結腸直腸癌を防止することが意図される処置が効果的であったか否かを決定するために有用である。操作の任意の特定の理論により拘束されることを望まないが、被験者における転移の数及び／又はサイズが増加するにつれて、全身及び／又は局所ＰＧレベルも被験者において増加すると考えられる。
【０１４９】
さらなる他の実施態様によれば、被験者は、癌が見かけ上消失し、結腸直腸癌が再発している又は戻っているか否かを決定することが望まれる、結腸直腸癌（原発性又は転移性）のために以前に処置された者でありうる。そのような被験者において、上昇したＰＧレベル（ベースラインと比べて）は、結腸直腸癌が再発したことを示す。操作の任意の特定の理論により拘束されることを望まないが、被験者における再発性結腸直腸癌のサイズ及び／又は範囲が増加するにつれて、全身及び／又は局所ＰＧレベルも被験者において増加すると考えられる。
【０１５０】
転移性結腸直腸癌がＰＧを分泌し、ＰＧ感受性であるとの、本明細書に記載する発見の観点から、本開示は、また、抗ＰＧ抗体を投与することにより、治療から利益を受けうる被験者を選択する方法を提供する。このように、被験者は、それらが上昇した血漿及び／又は血清ＰＧレベル（ベースラインと比べて）を有するか否かを検出するために、ケア提供者によりスクリーニングされうる。一旦、そのような被験者が同定されると、ケア提供者は、被験者における転移性結腸直腸癌の存在を確認するために追加のテストを注文することができる。転移性結腸直腸癌が確認された場合、次に、処置（抗ｈＰＧ抗体の投与を含む）を始めることができる。
【０１５１】
被験者を選択するための方法の特定の実施態様において、スクリーニングを、被験者のプライマリケア医師による定期的な健康診断の一部として、又は、被験者の大規模集団を対象とする公衆衛生への取り組みの一部として実施しうる。他の実施態様において、スクリーニングされる被験者は、転移性結腸直腸癌を発生するより高い、次に、平均的なリスクを伴う特定の亜集団のメンバーである。そのような群は、しかし、限定しないが、結腸直腸癌を有していた近親者（親、兄弟、姉妹、又は子供）、結腸直腸ポリープの病歴を有する被験者、肥満である被験者、喫煙する被験者、及び身体的に不活性である被験者を含む。他のそのような被験者は、潰瘍性大腸炎、クローン病、又は家族性腺腫性ポリポーシス（ＦＡＰ）と診断されたもの、あるいはＨＮＰＣＣ遺伝子における変異、ＡＰＣ遺伝子における変異、又は結腸直腸癌の増加リスクと関連する他の遺伝子を有するものである。さらに他の群は、結腸直腸癌について以前に診断され、成功裏に処置された被験者を含む。
【０１５２】
ＰＧ濃度を、当業者が精通した技術（例えば、しかし、限定しないが、ＲＩＡ及びＥＬＩＳＡなど）を使用して測定することができる。ｈＰＧについて特異的な抗体に頼るアッセイ方法（例えばこれらなど）は、当業者の知識に従って、非中和性又は中和性抗体（例えば本明細書に開示するものなど）を使用して行うことができる。
【０１５３】
本開示の方法を使用した上昇ＰＧレベルの検出に基づき、処置チームは、次に、結腸直腸癌の存在又は処置後の結腸直腸癌の再発を確認するための追加試験を試みる、あるいは被験者を処置することに直接進むか否かを決めることができる。
【０１５４】
異なるベースラインを使用してもよく、それに対して、被験者において測定されたＰＧレベルを比較する。本開示の方法の一部の実施態様において、ベースラインを、先の時間に同じ被験者からサンプリングした目的の体液中のＰＧレベルを測定することにより確立する。そのようなサンプルを所定の間隔で取り、ＰＧレベルを測定してもよい。非限定的な例において、ＰＧレベルを、処置の終了後、最初の６ヶ月にわたり毎週又は毎月、次に、処置の終了の２周年目まで３ヶ月毎に１回、次に、その後、６ヶ月又は１年毎に測定する。他の所定の間隔も可能である。
【０１５５】
本開示の方法の他の実施態様において、ベースラインは、結腸直腸癌の転移又は再発の検出のためのサンプリングを受けた被験者のものと同様の特徴を伴う個体の集団における平均ＰＧレベルから確立することができる。そのような特徴は、しかし、必ずしも限定しないが、性、年齢、原発性結腸直腸腫瘍のステージ、特定の処置へ先の曝露、これらの又は他の因子の組み合わせを含みうる。さらに他の実施態様において、被験者に特異的なベースライン、ならびに集団由来のベースラインの両方を、対象の状態を評価する際に使用することができる。
【０１５６】
当業者の知識によれば、特定の閾値を超える（ベースラインと比べて）被験者からのサンプル中でのＰＧレベルは、結腸直腸癌又は処置後に再発した結腸直腸癌を有するとして結論付けられる。処置チームは、次に、結腸直腸癌の存在を確認するための確認試験を試みてもよい。そのようなテストの非限定的な例は、結腸直腸癌を検出するための探索的手術、結腸直腸癌を検出するための医学的画像テスト、潜血を検出するための被験者の便のテスト、結腸内視鏡検査、増加リスクの結腸直腸癌を示している遺伝子変異（例えばＨＮＰＣＣ遺伝子又はＡＰＣ遺伝子など）の存在についての被験者から得られたサンプルのテスト、及び結腸直腸癌を示している生物学的因子（例えば癌胎児性抗原（ＣＥＡ）など）の存在についての被験者から得られたサンプルのテストを含む。
【０１５７】
なぜなら、摂食は、通常、ガストリン合成及び分泌を増加させることから、摂食は、結腸直腸癌転移又は再発性結腸直腸癌により産生されたＰＧの正確な測定に干渉しうる血中ＰＧレベルにおける一過性の増加をもたらしうる。この効果を回避するために、特に血漿及び／又は血清中のＰＧレベルを決定すべき場合、サンプルを、当業者により容易に決定することができる通り、十分な時間にわたる絶食後に被験者から取ることができる。
【０１５８】
７．９．  医薬的組成物
本発明の方法における使用のための抗ｈＰＧ抗体は、組成物として製剤化することができる。場合により、組成物は、１つ又は複数の追加の治療用薬剤（例えば、転移性結腸直腸癌又は結腸直腸癌の再発に対する治療的効力を伴う化学療法剤又は他の抗体など）を含むことができる。組成物は、医薬的に許容可能な担体を通例含む無菌の医薬的組成物の部分として通常供給される。この組成物は、患者にそれを投与する所望の方法に依存して、任意の適した形態でありうる。
【０１５９】
抗ＰＧ抗体は、種々の経路により、典型的には、非経口的に、例えば、皮下、静脈内、腹腔内、又は筋肉内注射を介して被験者に投与することができる。投与は、１つ又は複数のボーラス注射として、あるいは１つ又は複数の注入としてもたらすことができる。他の投与経路が、また、当業者の知識に従って可能である。任意の所与の場合における投与のための最も適した経路は、投与される特定の組成物及び被験者の特徴（例えば年齢又は性など）に依存しうる。
【０１６０】
医薬的組成物は、用量当たりに開示の抗ｈＰＧ抗体の所定量を含む単位用量形態で便利に提示することができる。そのような単位は、しかし、限定しないが、例えば、５mg〜５g、１０mg〜１g、又は２０〜５０mgを含みうる。開示における使用のための医薬的に許容可能な担体は、例えば、投与経路に依存して、多様な形態を取ることができる。
【０１６１】
開示の医薬的組成物は、所望の純度を有する抗体を、当技術分野において典型的に用いられる任意の医薬的に許容可能な担体、賦形剤、又は安定剤（それらは全て本明細書において「担体」として言及される）、即ち、緩衝化薬剤、安定化薬剤、保存剤、等張剤、非イオン性界面活性剤、酸化防止剤、及び他の種々の添加剤を混合することにより、凍結乾燥製剤又は水溶液としての保存のために調製することができる。Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition (Osol, ed.1980)を参照のこと。そのような添加剤は、用いられる投与量及び濃度でレシピエントに非毒性でなければならない。
【０１６２】
緩衝化薬剤は、生理的条件に近似する範囲内のｐＨを維持するために役立つ。それらは約２mM〜約５０mMの範囲の濃度で存在することができる。本開示を用いた使用のための適した緩衝化薬剤は、有機酸及び無機酸の両方ならびにその塩、例えばクエン酸緩衝剤（例、クエン酸一ナトリウム−クエン酸二ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸三ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸一ナトリウム混合物など）、コハク酸緩衝剤（例、コハク酸−コハク酸一ナトリウム混合物、コハク酸−水酸化ナトリウム混合物、コハク酸−コハク酸二ナトリウム混合物など）、酒石酸緩衝剤（例、酒石酸−酒石酸ナトリウム混合物、酒石酸−酒石酸カリウム混合物、酒石酸−水酸化ナトリウム混合物など）、フマル酸塩緩衝剤（例、フマル酸−フマル酸一ナトリウム混合物、フマル酸−フマル酸二ナトリウム混合物、フマル酸一ナトリウム−フマル酸二ナトリウム混合物など）、グルコン酸緩衝剤（例、グルコン酸−グルコン酸ナトリウム混合物、グルコン酸−水酸化ナトリウム混合物、グルコン酸−グルコン酸カリウム混合物など）、シュウ酸緩衝剤（例、シュウ酸−シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸−水酸化ナトリウム混合物、シュウ酸−シュウ酸カリウム混合物など）、乳酸緩衝剤（例、乳酸−乳酸ナトリウム混合物、乳酸−水酸化ナトリウム混合物、乳酸−乳酸カリウム混合物など）、及び酢酸緩衝剤（例、酢酸−酢酸ナトリウム混合物、酢酸−水酸化ナトリウム混合物など）などを含む。加えて、リン酸緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤、及びトリメチルアミン塩（例えばＴｒｉｓなど）を使用することができる。
【０１６３】
保存剤を加えて、微生物の成長を遅らせることができ、０．２%−１%（ｗ／ｖ）の範囲の量で加えることができる。本開示を用いた使用のための適した保存剤は、フェノール、ベンジルアルコール、メタクレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド、ベンザルコニウムハロゲン化物（例、塩化物、臭化物、及びヨウ化物）、塩化ヘキサメトニウム、及びアルキルパラベン（例えばメチル又はプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、及び３ペンタノールなど）を含む。等張剤（時折「安定剤」として公知である）を加えて、本開示の液体組成物の等張性を確実にし、多価糖アルコール、例えば、三価又はそれより高い糖アルコール（例えばグリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、及びマンニトールなど）を含む。安定剤は、機能において、増量剤から添加剤（治療用薬剤を安定化する、又は、変性もしくは容器壁への付着を防止することを助ける）に及びうる広範なカテゴリーの賦形剤を指す。典型的な安定剤は、多価糖アルコール（上に列挙）でありうる；アミノ酸（例えばアルギニン、リジン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、Ｌ−ロイシン、２フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニンなど）、有機糖又は糖アルコール（例えばラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイノシトール、ガラクチトール、グリセロールなど）、シクリトール（例えばイノシトールなど）を含む；ポリエチレングリコール；アミノ酸ポリマー；含硫の還元剤（例えば尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、αモノチオグリセロール、及びチオ硫酸ナトリウムなど；低分子量ポリペプチド（例、１０残基又はそれより少ないペプチド）；タンパク質（例えばヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなど）；親水性ポリマー（例えばポリビニルピロリドンなど）単糖類（例えばキシロース、マンノース、フルクトース、グルコースなど）；二糖類（例えば、ラクトース、マルトース、スクロース）、及び三糖類（例えばラフィノースなど）；及び多糖類（例えばデキストランなど）。安定剤は、０．１〜１０，０００重量部の活性タンパク質重量の範囲で存在することができる。
【０１６４】
非イオン性界面活性物質又は界面活性剤（「湿潤剤」としても公知である）を加えて、治療的薬剤を可溶化し、ならびに、撹拌誘導性の凝集に対して治療的タンパク質を保護するのを助けることができ、それは、また、タンパク質の変性を起こすことなく、製剤が剪断面に曝露されることを許す。適した非イオン性界面活性物質は、ポリソルベート（２０、８０など）、ポリオキサマー（１８４、１８８など）、プルロニックポリオール、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（TWEEN（登録商標）２０、TWEEN（登録商標）８０など）を含む。非イオン性界面活性物質は、約０．０５mg/ml〜約１．０mg/ml、例えば、約０．０７mg/ml〜約０．２mg/mlの範囲で存在しうる。界面活性物質は、しかし、抗体に結合する傾向を有し、それらの立体構造を損ないうる。従って、使用した場合、濃度の安定化は低く、実験的に識別しなければならない。
【０１６５】
追加の種々の賦形剤は、キレート剤（例、ＥＤＴＡ）、酸化防止剤（例、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ）、及び共溶媒を含むことができる。
【０１６６】
抗ｈＰＧ抗体は、単独であるいは１つ又は複数の抗ｈＰＧ抗体単独の混合物として、あるいは結腸直腸癌転移又は再発を防止するために有用な他の薬剤（しかし、限定しないが、化学療法剤、生物学的治療用薬剤、及び抗体治療用薬剤（例、ベバシズマブ）を含む）との混合物又は組み合わせで投与することができる。
【０１６７】
７．１０．  医薬的キット
特定の実施態様において、本発明は、臨床医又は他のユーザーによる使用のための医薬的キットを提供する。医薬的キットは、開示の抗ｈＰＧ抗体（例、凍結乾燥形態又は水溶液のいずれか）及び以下：本開示において他に記載する少なくとも第２の治療用薬剤；抗ｈＰＧ抗体を投与するためのデバイス（例、ニードル及び／又はシリンジ）；及び抗体が凍結乾燥又は濃縮形態である場合、抗体を再懸濁又は希釈するための医薬品グレードの水又は緩衝液の１つ又は複数を含むパッケージである。キットは、また、抗体組成物を調製する及び／又は組成物を患者に投与するための指示を含みうる。
【０１６８】
抗ｈＰＧ抗体組成物の各単位用量は別々にパッケージ化することができる。キットは１つ又は複数の単位用量（例、２単位用量、３単位用量、４単位用量、５単位用量、７単位用量、８単位用量、１０単位用量又はそれ以上）を含むことができる。一実施態様において、１つ又は複数の単位用量はシリンジ中に各々収容される。別の実施態様において、１つ又は複数の単位用量は、ＩＶラインに接続するために適したバッグ又は同様の容器中に各々含める。
【０１６９】
７．１１．  効果的な投与量
本発明の中和性抗ｈＰＧ抗体を含む組成物は、一般的に、少なくとも部分的に所望の結果を達成するために効果的な投与量で、結腸直腸癌転移を処置又は防止するあるいは結腸直腸癌の再発を防止することを必要とする被験者に投与される。
【０１７０】
結腸直腸癌転移の処置に関して、治療上の利益は、とりわけ、転移性結腸直腸癌の任意の寛解、結腸直腸癌転移の成長を停止又は減速すること、被験者内でのそのような転移の数及び／又はサイズを低下すること、結腸直腸癌転移への血流を低下させること、結腸直腸癌転移の代謝を低下させること、結腸直腸癌転移癌の重症度を低下させること、転移性結腸直腸癌細胞の増殖を阻害すること又はそのアポトーシスを増加させること、被験者における転移性結腸直腸癌に関連する症状又は徴候の増悪を停止又は遅延すること、結腸直腸癌の外科的切除を許すこと（そこで、そのような切除は処置前に可能ではなかったであろう）、転移性結腸直腸癌を有する被験者の寿命、快適さ、又は生活の質を向上させること、あるいは、そのような被験者において痛みを低下させることを意味する。転移性結腸直腸癌の完全な治癒は、望ましいが、治療上の利益が存在するために要求されない。
【０１７１】
治療上の利益は、また、無増悪生存期間（ＰＦＳ）に関して測定することができる。この状況において、ステージＩＩ、ＩＩＩ、又はＩＶ結腸直腸癌を最初に有する被験者が、疾患のより進行したステージに進むために要する時間を測定する。３、４、５、６、７、８、９、１０ヶ月又はそれ以上のＰＦＳにおける増加は、治療上の利益を提供すると考えられる。
【０１７２】
転移性結腸直腸癌の腫瘍サイズ、数、及び代謝を、種々のスキャン技術（しかし、限定しないが、ＣＴ、ＭＲＩ、機能的ＭＲＩ、ＳＰＥＣＴ、及びＰＥＴを含む）、ならびに当業者に公知の他の方法を使用して測定することができる。
【０１７３】
治療上の利益は、また、１つ又は複数のサロゲートエンドポイントと相関しうる。例として、限定しないが、転移性結腸直腸癌による特定のタンパク質又は他の因子（例えばプロガストリン又は癌胎児性抗原（ＣＥＡ）など）の産生は、被験者において経時的に測定することができ、因子のレベルにおける低下は治療上の利益を示している。
【０１７４】
結腸直腸癌転移の防止に関しては、効果的な投与量は、転移性結腸直腸癌を少なくとも部分的に防止するために効果的なものであり、とりわけ、結腸直腸癌転移の非存在、結腸直腸癌転移の成長を遅延、停止、又は減速すること、最終的に生じうる任意の結腸直腸癌転移の数及び／又はサイズを低下させること、ならびに、転移性結腸直腸癌細胞が原発腫瘍から広がることができる機構段階のいずれかの阻害又はその干渉により証明される。結腸直腸癌転移の完全な防止は、望ましいが、効力が存在するために要求されない。
【０１７５】
結腸直腸癌の再発の防止に関しては、効果的な投与量は、結腸直腸癌の再発を少なくとも部分的に防止するために効果的なものであり、とりわけ、結腸直腸癌の再発の非存在、結腸直腸癌の寛解を維持すること、あるいは、最初の結腸直腸癌が検出不可能になった又は見かけ上消失した処置後の被験者において、結腸直腸癌の再成長、又は新たな結腸直腸腫瘍の成長の再出現を遅延、停止、又は減速させることにより証明される。結腸直腸癌の再発を防止するための効力は、また、とりわけ、結腸直腸癌幹細胞の死滅、結腸直腸癌幹細胞の成長又は増殖を遅延、停止、阻害、又は減速させること、結腸直腸癌幹細胞のアポトーシスを増加させること、あるいは結腸直腸癌の形成又は成長に寄与することが可能ではない細胞への結腸直腸癌幹細胞の分化を起こすことにより証明される。本明細書において他に記載する通り、結腸直腸癌幹細胞は、そのような細胞に特徴的な１つ又は複数の表現型特質（しかし、限定しないが、特定の細胞マーカーの発現、低付着培養条件下でスフェロイドとして成長する能力、及び移植後に新たな腫瘍成長を開始する能力を含む）を有するとして同定可能である。結腸直腸癌の再発の完全な防止は、望ましいが、効力が存在するために要求されない。
【０１７６】
全てのプロガストリンを結合することは、治療的効力を達成するために必ずしも要求されない。むしろ、腫瘍内のプロガストリンの濃度を、全身的に、特に体液（例えば腹水、胸水、脳脊髄液、リンパ液、血液、血漿、血清、又は他の場所からの液体など）において低下させることも効果的でありうる。
【０１７７】
当業者の知識によれば、抗ｈＰＧ抗体組成物の用量を、患者において滴定し、投与後の所定の時間での目的の組織又は体液中での遊離ｈＰＧ濃度を低下させるようにすることができる（少なくとも約１０%、２０%、３０%、４０%、５０%、６０%、７０%、８０%、９０、又は１００%、あるいは約５%−１０%、約１０%−１５%、約１５%−２０%、約２０%−２５%、約２５%−３０%、約３０%−３５%、約３５%−４０%、約４０%−４５%、約４５%−５０%、約５０%−５５%、約５５%−６０%、約６０%−６５%、約６５%−７０%、約７０%−７５%、約７５%−８０%、約８０%−８５%、約８５%−９０%、又は約９０%−９５%又は先行する値のいずれかの間の範囲での遊離ｈＰＧ濃度におけるパーセンテージ低下）。
【０１７８】
投与される抗ｈＰＧ抗体の量は、処置される被験者のサイズ及び体重、投与の形態、経路、及び部位、治療計画（例、第２の治療用薬剤が使用されているか否か）、処置されている特定の被験者の年齢及び状態、処置前の前記被験者の血液中で検出されたＰＧのレベル、抗ＰＧ抗体を用いて処理されている被験者の感受性を含む様々な要因に依存しうる。適切な投与量は、当業者により容易に決定されることができる。最終的には、臨床医が、使用される適切な投与量を決定する。この投与量は、しばしば、適宜、反復することができる。副作用が発生した場合、投与量の量及び／又は頻度を、通常の臨床診療に従って、変える又は低下させることができる。適当な投与量及び治療計画は、本開示の方法又は当業者に公知の他の方法を使用して、治療の進行をモニターすることにより確立することができる。
【０１７９】
効果的な投与量を、最初にインビトロアッセイから推定することができる。例えば、動物における使用のための初回用量を製剤化し、インビトロで測定されたプロガストリンについての抗体の結合親和性である又はそれを上回る抗ｈＰＧ抗体の循環血液又は血清濃度を達成してもよい。特定の抗体のバイオアベイラビリティを考慮に入れた、そのような循環血液又は血清中濃度を達成するための投与量の算出は、十分に当業者の能力内である。ガイダンスについては、読者はパート１を参照のこと：General Principles in "Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics," 11th Ed., Hardman, J.G., et al., Eds., McGraw-Hill Professional、及びその中で引用される参考文献。初回投与量は、また、インビボのデータ（例えば動物モデルなど）から推定することができる。当業者は、そのような情報を定期的に適応して、ヒトへの投与のために適した投与量を決定することができる。
【０１８０】
特定の実施態様において、静脈内用量を、処置の数日から数週間前に数回個人の血清又は血漿ＰＧ濃度を測定し、飽和しうる抗ＰＧ抗体の量（即ち、ＰＧの全てに結合するために十分でありうる量）を算出することにより個々の被験者について決定してもよい。当業者により理解される通り、ＰＧの所与の血清又は血漿中濃度について飽和を達成するために必要な任意の特定の抗体の量は、特定の抗体の親和定数に部分的に依存する。目的の特定の抗ＰＧ抗体についての飽和量を算出するための方法は周知である。
【０１８１】
飽和を保証するために、算出された飽和量より大きい量を投与してもよく、例えば、算出された飽和量よりも少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、又はさらには１０倍大きい量を投与してもよい。静脈内以外の投与様式のために、量を、当技術分野において周知の通りに、薬物動態及びバイオアベイラビリティに基づいて適応することができる。
【０１８２】
抗ｈＰＧ抗体組成物の効果的な用量は、約０．００１mg/kg〜約２５０mg/kg／単回（例、ボーラス）投与、複数投与又は連続（例、注入）投与の範囲でありうる、あるいは、再発を防止することが求められる癌の型、投与経路、ならびに被験者の年齢、体重、及び状態に依存する本明細書における任意の効果的な範囲又は値でありうる。特定の実施態様において、各用量は約０．１mg/kg〜約０．５mg/kg；約０．２５mg/kg〜約０．７５mg/kg；約０．５mg/kg〜約１mg/kg；約２mg/kg；約１．５mg/kg〜約２．５mg/kg；約２mg/kg〜約３mg/kg；約２．５mg/kg〜約３．５mg/kg；約３mg/kg〜約４mg/kg；約３．５mg/kg〜約４．５mg/kg；約４mg/kg〜約５mg/kg；約５mg/kg〜約７mg/kg；約６mg/kg〜約８mg/kg；約７mg/kg〜約９mg/kg；約８mg/kg〜約１０mg/kg；約１０mg/kg〜約１５mg/kg；約１２．５mg/kg〜約１７．５mg/kg；約１５mg/kg〜約２０mg/kg；約１７．５mg/kg〜約２２．５mg/kg；約２０mg/kg〜約２５mg/kg；約２２．５mg/kg〜約２７．５mg/kg；約２５mg/kg〜約３０mg/kg；約３０mg/kg〜約４０mg/kg；約３５mg/kg〜約４５mg/kg；約４０mg/kg〜約５０mg/kg；約４５mg/kg〜約５５mg/kg；約５０mg/kg〜約６０mg/kg；約５５mg/kg〜約６５mg/kg；約６０mg/kg〜約７０mg/kg；約６５mg/kg〜約７５mg/kg；約７０mg/kg〜約８０mg/kg；約７５mg/kg〜約８５mg/kg；約８０mg/kg〜約９０mg/kg；約８５mg/kg〜約９５mg/kg；約９０mg/kg〜約１００mg/kg；約９５mg/kg〜約１０５mg/kg；約１００mg/kg〜約１５０mg/kg；約１２５mg/kg〜約１７５mg/kg；約１５０mg/kg〜約２００mg/kg；約１７５mg/kg〜約２２５mg/kg；約２００mg/kg〜約２５０mg/kg。他の投与量の範囲も可能である。
【０１８３】
投与の量、頻度、及び持続時間は、種々の要因（例えば患者の年齢、体重、及び疾患の状態など）に依存する。このように、非限定的な例において、投与のための治療計画は、１日又はそれ以上、２日又はそれ以上、３日又はそれ以上、４日又はそれ以上、５日又はそれ以上、６日又はそれ以上、１週間又はそれ以上、２週間から無制限にわたり、２週間〜６ヶ月間、３ヶ月間〜５年間、６ヶ月間〜１又は２年間、８ヶ月間〜１８ヶ月間などにわたり継続することができる。場合により、治療計画は、反復投与（例、１日１回、１日２回、２日、３日、５日、１週間、２週間、又は１ヶ月毎）に提供する。反復投与では、同じ用量で又は異なる用量でありうる。投与は、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回又はそれ以上反復することができる。抗ｈＰＧ抗体の治療的に効果的な量は、単回用量として又は治療計画の経過にわたり（例、１週間、２週間、３週間、１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、１年又はそれより長い経過にわたり）投与することができる。
【０１８４】
８．  実施例
実施例１：転移性結腸直腸癌細胞におけるガストリン遺伝子の発現
この例では、ヒト原発性結腸直腸癌細胞株ＨＴ２９、ＨＣＴ１１６、ＲＫＯ、ＳＷ４８０、及びＤＬＤ１、ならびに転移性結腸直腸癌細胞株ＳＷ６２０及びＴ８４におけるガストリン（ＧＡＳＴ）遺伝子の発現を記載する。ヒト原発性結腸直腸腫瘍からの生検サンプルから単離された細胞もテストした（ＣＲＣ１）。ＳＷ６２０細胞は、元々は、デュークスステージＣ結腸直腸腺癌と診断された患者のリンパ節転移に由来した。Ｔ８４細胞は、元々は、結腸直腸癌と診断された患者の肺転移に由来した。
【０１８５】
Ａ．  方法
標準的技術を使用して、ＧＡＳＴ  ｍＲＮＡの発現は、ＨＴ２９、ＨＣＴ１１６、ＲＫＯ、ＳＷ４８０、ＤＬＤ１、ＳＷ６２０、及びＴ８４細胞株のＲＮＡ調製物からの定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用して定量した。データを、ＲＫＯ原発性結腸直腸癌細胞株において見出されたガストリンｍＲＮＡ発現レベルとの比較で表現する。ＲＫＯ細胞は、通例、低レベルのプロガストリンを発現する。相対的なガストリンｍＲＮＡレベルは対数スケールで報告されていることに留意すること。
【０１８６】
Ｂ．  結果
定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定したガストリン遺伝子発現レベルを図１に示す。検証した全ての原発性及び転移性結腸直腸癌細胞が、ガストリン遺伝子を発現したが、しかし、変動レベルであった。翻訳後プロセシングを通じて、ガストリン遺伝子産物はプロガストリンに変換されうる。
【０１８７】
同様の実験を、転移性結腸直腸癌細胞株Ｃｏｌｏ−２０５を使用して実施したが、しかし、結果は再現可能ではなかった。
【０１８８】
実施例２：患者から外科的に切除した原発性及び転移性結腸直腸腫瘍におけるガストリン遺伝子の発現
この実施例では、患者から外科的に切除した対応する原発性及び転移性結腸直腸腫瘍におけるガストリン遺伝子の発現を記載する。
【０１８９】
Ａ．  方法
原発性及び転移性結腸直腸腫瘍を、適用可能な倫理ガイドラインに従って、患者から外科的に切除した。標準的技術を使用して、ＲＮＡを腫瘍組織サンプルから調製し、ガストリンｍＲＮＡを定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定した。転移性腫瘍におけるガストリンｍＲＮＡの発現を、同じ患者から取った、対応する原発腫瘍における発現のレベルと比べて標準化した。
【０１９０】
Ｂ．  結果
１１人の患者からの転移性結腸直腸腫瘍において発現されたガストリンｍＲＮＡのレベルを、同じ患者からの対応する原発腫瘍における発現と比べて、図２に示す。試験した全ての原発性及び転移性結腸直腸腫瘍が、ガストリン遺伝子を発現したが、転移性腫瘍における発現レベルは、対応する原発腫瘍と比べて、異なる患者の間で広範に変動した。
【０１９１】
実施例３：転移性癌細胞によるプロガストリンの分泌
この実施例では、３つの異なる転移性結腸直腸癌細胞によるプロガストリンの分泌の定量化を記載する。
【０１９２】
Ａ．  方法
細胞を６０%コンフルエンスまで通常のプラスチック７５cm2フラスコ中で成長させた。培地を次に除去し、細胞を、ＰＢＳを用いて１回リンスした。２０mlのＭ１１培地（フェノールレッドを伴わない）を次にフラスコに加えて、細胞を追加の４８時間にわたりインキュベートした。培地を次に回収し、１，０００gで５分間にわたり遠心し、細胞デブリを除去し、−８０℃で凍結した。細胞を次にトリプシン処理し、カウントした。
【０１９３】
分泌されたプロガストリンを測定するために、凍結した成長培地をゆっくりと氷上で解凍し、次に、タンパク質コンセントレータ（Icon, Pierce）を使用して、２，５００gで４５分間にわたる遠心により容積５００μlまで４０倍濃縮した。プロガストリン濃度を、次に、サンドイッチＥＬＩＳＡ技術を使用して測定した。
【０１９４】
Ｂ．  結果
図３は、３つの転移性結腸直腸癌細胞株により調整された培地中でのプロガストリンの濃度を示す。データを、プロガストリン濃度（pM）／１００万個の細胞／４８時間の成長として表現する。この実験において、Ｃｏｌｏ−２０５細胞は、使用されるアッセイの検出限界内でＰＧを産生しなかった。
【０１９５】
実施例４：原発性及び転移性結腸直腸癌と診断された患者における血漿及び血清プロガストリン濃度
この実施例では、原発性結腸直腸癌及び無転移を伴う患者、転移性結腸直腸癌を伴う患者、及び原発腫瘍を外科的に除去された転移性結腸直腸癌を伴う患者におけるプロガストリンの血漿及び血清レベルの定量化について記載する。
【０１９６】
Ｃ．  方法
血漿又は血清プロガストリン濃度を、コントロールとして健常個人において、及び結腸直腸癌を伴う患者において測定した。健常コントロールサンプル（Ｎ＝１０４）を血液バンクから得た。結腸直腸癌患者は３群を構成した。第１に、サンプリング時に原発癌と診断された転移を伴わない患者（Ｔ＋Ｍ−；ｎ＝１６）。第２に、サンプリング時に転移性疾患と診断された患者（Ｔ＋Ｍ＋；ｎ＝２４）。及び、第３に、サンプリング時に転移性疾患と診断された患者であって、しかし、それらから、原発腫瘍は外科的に切除されていなかった（Ｔ−Ｍ＋；ｎ＝４６）。転移性疾患を伴う患者の大多数（即ち、２４人のＴ＋Ｍ＋患者の１５人及び４６人のＴ−Ｍ＋患者の４１人）が、サンプリング時に化学療法を受けていた、又は、ちょうど受けた。
【０１９７】
血漿又は血清プロガストリンレベルの定量化は、以下に予言的に記載するものと同様のプロガストリン特異的サンドイッチＥＬＩＳＡ技術を使用して実施した。
【０１９８】
Nunc MaxiSORP ９６ウェルプレートのウェルを、以下の通りに第１プロガストリン特異的抗体を用いてコーティングする。プロガストリンのカルボキシ末端領域について特異的な抗プロガストリンポリクローナル抗体を、ＭｉｌｌｉＱ水中の５０mM，  ｐＨ  ９．６炭酸／重炭酸ナトリウム緩衝液の溶液中に、濃度３μg/mlまで希釈する。合計１００μlの抗体溶液を、次に、９６ウェルプレートの各ウェルに加えて、４℃で一晩インキュベートする。結合後、抗体溶液をウェルから除去し、それらを次に、１００μl洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ／０．１%  TWEEN−２０）を用いて３回洗浄する。合計１００μlのブロッキング緩衝液（１×ＰＢＳ／０．１%  TWEEN−２０／０．１%  ＢＳＡ）を次に各ウェルに加えて、２２℃で２時間にわたりインキュベートする。ブロッキング緩衝液を次に除去し、ウェルを、洗浄緩衝液を用いて３回洗浄する。患者から単離された血漿又は血清サンプルを、ウェルに、容積１００μl中の希釈系列（典型的には１：１、１：２、１：５、及び１：１０希釈）において加えて、次に、２２℃で２時間にわたりインキュベートする。血漿又は血清サンプルを２通りに分析する。
【０１９９】
アッセイは、また、２つの標準曲線を含む。第１の標準曲線を、組換えプロガストリンの希釈物を使用して、最終量１ng、０．５ng、０．２５ng、０．１ng、０．０５ng、０．０１ng、及び０ng／ウェルに調製する。第２の標準曲線は、陰性コントロールとしての役割を果たし、テストサンプルと同じ希釈で（即ち、１：１、１：２、及び１：１０）、ブロッキング緩衝液中に希釈したプロガストリン陰性ヒト血清から調製する。あるいは、血漿サンプルをアッセイしている場合、第２の標準曲線は、陰性コントロールとしての役割を果たし、テストサンプルと同じ希釈で（即ち、１：１、１：２、及び１：１０）、ブロッキング緩衝液中に希釈したプロガストリン陰性ヒト血漿から調製する。
【０２００】
血漿又は血清サンプルを用いたインキュベーションが完了した後、ウェル内容物を除去し、洗浄緩衝液（１００μl／ウェル）を用いて３回洗浄し、その後、第１抗体に結合したプロガストリンを、プロガストリンについて特異的な第２抗体を使用して、以下の通りに検出する。
【０２０１】
プロガストリンのアミノ末端領域について特異的なビオチン結合抗プロガストリンポリクローナル又はモノクローナル抗体を、ブロッキング緩衝液中で、濃度０．１〜１０μg/mlまで、抗体に依存して希釈する。合計１００μlの抗体溶液を次に各ウェルに加えて、２２℃で１時間にわたりインキュベートする。
【０２０２】
第２抗体結合が完了した後、プレートを、洗浄緩衝液（１００μl／ウェル）を用いて３回洗浄し、その後、１００μlのストレプトアビジン−ＨＲＰ溶液（ブロッキング緩衝液中２５ng/ml）を各ウェルに加えて、２２℃で１時間にわたりインキュベートする。ストレプトアビジン−ＨＲＰ溶液を用いたインキュベーションが完了した後、プレートを、洗浄緩衝液（１００μl/ウェル）を用いて３回洗浄する。その後、Pierce SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Chemiluminescent Substrateキットを使用して調製した１００μlの化学発光基質を１ウェル当たりに加え、暗所に室温で５分間にわたりインキュベートし、ルミノメーターで読み込む。
【０２０３】
ルミノメーターの読み取りに基づき、線形回帰分析を使用して、標準曲線データに対応する線の等式を導く。この等式を使用して、種々の患者サンプル中でのプロガストリンの濃度を次に算出する。
【０２０４】
Ｄ．  結果
図４のボックスプロットは、健常コントロールと比較した、アッセイされた結腸直腸癌患者の３群における血清プロガストリン濃度の２５パーセンタイル、中央値、及び７５パーセンタイル血漿を示す。ウィスカーは、血漿又は血清プロガストリン濃度の５及び９５パーセンタイルを示す。Ｔ＋又はＴ−は、それぞれ、原発腫瘍がまだその場所ある又は切除されていることを示す；Ｍ＋又はＭ−は、それぞれ、転移が患者において検出された又は検出されなかったことを示す。表４は、生データの統計分析の要約を含む。
【０２０５】
このデータは、原発性及び転移性の両方の結腸直腸癌を伴う患者が、健常個人と比較して、それらの血漿又は血清中のプロガストリンの上昇レベルを有していたことを実証する。また、プロガストリンレベルは、原発腫瘍が外科的に除去された転移性結腸直腸癌を伴う患者において上昇したままである。これは、結腸直腸転移がそのような患者においてプロガストリンを産生することを示唆する。
【０２０６】
【表６】
0005930972.tif 000009
【０２０７】
実施例５：培養中のＳＷ６２０転移性結腸直腸癌細胞の成長に対する抗プロガストリンポリクローナル抗体の効果
この実施例では、培養中のＳＷ６２０ヒト転移性結腸直腸癌細胞株の成長に対する抗ｈＰＧポリクローナル抗体の効果を記載する。
【０２０８】
Ａ．  方法
ＳＷ６２０細胞を６ウェルプレート中に播種し、一晩、血清飢餓させ、次に、１２時間毎にＰＢＳ、３マイクログラム/mlコントロール抗体（ポリクローナルウサギ抗ヒトＩｇＧ，  Affinity BioReagents, Ref #SA1-600）又は抗ＰＧポリクローナル抗体を用いて処理した。実験を２通りに行い、技術者は、処理溶液の内容物に関して盲検化された。処置の開始から７２時間後、各ウェル中の生存細胞の数を３回カウントした。
【０２０９】
Ｂ．  結果
図５に示す通り、抗ＰＧポリクローナル抗体を用いた処理によって、７２時間の期間にわたりＳＷ６２０細胞の成長における４３．５%減少を起こした（ｐ＝０．０２９４、マンホイットニー検定；ｎ＝２）。この実験の結果は、ＰＧに対するポリクローナル抗体が、インビトロでの転移性結腸直腸癌細胞の成長を低下させるために効果的であることを実証する。
【０２１０】
実施例６：培養中のＳＷ６２０転移性結腸直腸癌細胞の成長に対する抗プロガストリンモノクローナル抗体の効果
この実施例では、培養中のＳＷ６２０ヒト転移性結腸直腸癌細胞株の成長に対する抗ｈＰＧモノクローナル抗体の効果を記載する。
【０２１１】
Ａ．  方法
ＳＷ６２０細胞を６ウェルプレート中に播種し、一晩、血清飢餓させ、次に、１２時間毎にＰＢＳ、３マイクログラム/mlコントロール抗体（マウス抗ヒトＩｇＧ１，  Calbiochem, Ref #411451）又は４つの異なる抗ＰＧモノクローナル抗体ＭＡｂ３、ＭＡｂ４、ＭＡｂ２、及びＭＡｂ１を用いて処理した。実験を２通りに行い、技術者は、処理溶液の内容物に関して盲検化された。処置の開始から４８時間後、各ウェル中の生存細胞の数を６回カウントし、平均した。
【０２１２】
別々の実験において、ＳＷ６２０細胞を６ウェルプレート中に播種し（１００，０００個細胞／ウェル）、上と同様に、５μg/mlの抗ｈＰＧモノクローナル抗体５−２３（即ち、ＭＡｂ５−ＭＡｂ２３）又は５μg/mlのコントロール抗体を用いて処理した。４８時間後、生存可能な細胞の数をカウントし、そこから、実験の開始時の細胞の数（即ち、Ｔ０）を引いた。特定の抗体処理ウェル中の生存細胞の数を、次に、コントロールのパーセンテージとして表現した。
【０２１３】
Ｂ．  結果
ＳＷ６２０細胞を、ＭＡｂ１−ＭＡｂ４を用いて処理した結果（図６Ａに示す）を、実験の終了時での平均細胞数／ウェル−実験の開始時に播種した細胞数として算出した。生の数値及び統計値（マンホイットニー検定）を表５に示す。この実験の結果は、ＰＧに対する異なるモノクローナル抗体が、コントロール抗体と比較して、インビトロでＳＷ６２０転移性結腸直腸癌細胞の成長を低下させるために効果的であることを実証する。結果は、また、ＰＧに対する全てのモノクローナル抗体が、コントロール抗体と比較して、細胞の成長を低下させるために効果的であったが、２つの抗体ＭＡｂ３及びＭＡｂ４は、他よりも効果的であったことを示す。
【０２１４】
【表７】
0005930972.tif 000010
【０２１５】
ＳＷ６２０細胞を、ＭＡｂ５−ＭＡｂ２３（それらの各々がｈＰＧに特異的に結合することが可能である）を用いて処理した結果を、図６Ｂに示す。結果が実証する通り、非特異的コントロール抗体と比較して、テストされた抗ｈＰＧモノクローナル抗体は、培養中のＳＷ６２０転移性結腸直腸癌細胞株の成長を阻害するための有効性の範囲を示す。
【０２１６】
ＭＡｂ３を用いてＣｏｌｏ−２０５転移性結腸直腸癌細胞を処理することの成長に対する効果を決定するための関連実験を実施したが、しかし、結果は再現可能ではなかった。
【０２１７】
実施例７：培養中のＴ８４転移性結腸直腸癌細胞の成長に対する抗プロガストリンモノクローナル抗体の効果
この実施例では、培養中のＴ８４ヒト転移性結腸直腸癌細胞株の成長に対する抗ｈＰＧモノクローナル抗体の効果を記載する。
【０２１８】
Ａ．  方法
この実験のために用いられた方法は、使用された抗プロガストリン抗体が抗ｈＰＧ  ＭＡｂ３であったことを除き、ＳＷ６２０細胞に対する抗プロガストリンモノクローナル抗体の効果を測定するために使用されたものと同様であった。
【０２１９】
Ｂ．  結果
結果（図７に示す）を、実験の終了時での平均細胞数／ウェル−実験の開始時に播種した細胞数として算出した。統計分析の要約を表６に示す。この実験の結果は、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ３が、コントロール抗体と比較して、インビトロでのＴ８４転移性結腸直腸癌細胞の成長を低下させるために効果的であることを実証する。
【０２２０】
【表８】
0005930972.tif 000011
【０２２１】
ＭＡｂ３を用いてＣｏｌｏ−２０５転移性結腸直腸癌細胞を処置することの成長に対する効果を決定するための関連実験を実施したが、しかし、結果は再現可能ではなかった。
【０２２２】
実施例８：ＳＷ６２０細胞異種移植片によるヌードマウスにおける肝転移の形成に対する抗プロガストリンポリクローナル抗体の効果
この実施例では、ヌードマウス中への移植後に肝臓転移を形成するＳＷ６２０細胞の能力に対する抗ＰＧポリクローナル抗体の効果が記載される。
【０２２３】
Ａ．  方法
合計５×１０６個のＳＷ６２０細胞を、６週齢の３１匹のＢＡＬＢｃ／ヌードマウスの各々の脾臓中に注射した。細胞の注射から２分後、脾臓を外科的に除去した。４日間の回復後、マウスを無作為に３群に分け、その各々を３つの異なる処置の１つに供した。具体的には、１１匹のマウスに、ＰＢＳを用いて注射し、１０匹に、ＰＢＳ中に希釈したコントロール抗体を用いて注射し、１０匹のマウスに、抗ＰＧポリクローナル抗体（またＰＢＳ中に希釈した）を用いて注射した。抗体の用量は、容積１５０マイクロリットル中８mg/kgであった。注射を腹腔内に６週間にわたり２回／週行った。６週間後、注射のコースが終わった後、マウスを、二酸化炭素を用いて安楽死させ、肝臓を除去し、存在する目に見える転移の数をカウントした。肝臓及び転移もパラフィン包埋及び免疫組織化学分析のために調製した。
【０２２４】
Ｂ．  結果
抗ｈＰＧポリクローナル抗体を用いて処置したマウスから目に見える転移を伴わない肝臓の写真を図８Ａに示す。コントロールポリクローナル抗体を用いて処置したマウスからの目に見える転移を伴う肝臓の写真を図８Ｂに示す。表７は、抗ｈＰＧポリクローナル抗体を用いて処置したマウスからの各肝臓においてカウントされた転移の数を示す。表８は、コントロールポリクローナル抗体を用いて処置したマウスからの各肝臓においてカウントされた転移の数を示す。表９は、ＰＢＳを用いて処置したマウスからの各肝臓においてカウントされた転移の数を示す。図９は、転移の数対治療群のグラフィカルな表示である。
【０２２５】
【表９】
0005930972.tif 000012
【０２２６】
【表１０】
0005930972.tif 000013
【０２２７】
【表１１】
0005930972.tif 000014
【０２２８】
組織学的分析では、両方のコントロール群からの肝臓切片における微小転移の存在が明らかになったが、それらは、抗ｈＰＧ抗体を用いて処置した動物の肝臓から得られた切片中には存在しなかった。コントロール動物の肝臓内の血管において検出された微小転移の例を、図１０に描写する顕微鏡写真に示す。
【０２２９】
この実施例における結果は、ＳＷ６２０細胞（結腸直腸癌転移性細胞株）を用いて移植したヌードマウスの抗ｈＰＧ抗体を用いた処置が、コントロール抗体又は媒体単独を受けたマウスと比較して、目に見える肝臓転移の総数が低下したことを実証する。低下の程度は統計的有意性に達しなかったが、数値データにおける傾向、ならびに抗ｈＰＧ抗体処置マウスの肝臓における微小転移の非存在は、ＰＧ抗体が、このモデルシステムにおいて結腸直腸癌の転移の発生率を低下させるのに効果的であることを示唆する。
【０２３０】
実施例９：ＳＷ６２０細胞異種移植片によるヌードマウスにおける肝転移の形成に対する抗プロガストリンモノクローナル抗体の効果
この実施例では、ヌードマウス中への移植後に肝臓転移を形成するＳＷ６２０細胞の能力に対する抗ＰＧモノクローナル抗体の効果が記載される。
【０２３１】
Ａ．  方法
合計５×１０６個のＳＷ６２０細胞を、５週齢の２０匹のＢＡＬＢｃ／ヌードマウスの各々の脾臓中に注射した。細胞の注射から２分後、脾臓を外科的に除去した。回復後、マウスを無作為に２群に分け、その各々を２つの異なる処置の１つに供した。具体的には、１０匹のマウスに、ＰＢＳ中に希釈したコントロール抗体（抗ヒトＩｇＧ１Ｆｃ）を用いて注射し、１０匹のマウスに、抗ｈＰＧモノクローナル抗体ＭＡｂ３（またＰＢＳ中に希釈した）を用いて注射した。抗体の用量は、容積１５０マイクロリットル中８mg/kgであった。注射を腹腔内に６週間にわたり２回／週行った。１週間に１回、各マウスの体重を量った。６週間後、注射のコースが終わった後、マウスを、二酸化炭素を用いて安楽死させ、肝臓を除去し、存在する目に見える転移の数をカウントした。
【０２３２】
Ｂ．  結果
結果を図１１に示す。転移の平均数は、コントロール抗体を投与されたマウスにおいて７．３であり、抗ｈＰＧモノクローナル抗体ＭＡｂ３を用いて処置されたマウスにおいて４．３であった。これは４１%の減少に対応し、ｐ＝０．０３７２で統計的に有意である。統計分析を以下の表１０に示す。処置マウスにおける肝臓転移の平均重量は、また、コントロールマウスにおける１６７mgと比較して、９６mgに減少したが、この差は統計的な有意性に達するように算出されなかった。
【０２３３】
【表１２】
0005930972.tif 000015
【０２３４】
実施例１０：結腸直腸癌細胞におけるＬＧＲ５の発現は、低付着培養条件下での成長により増加する。
この実施例では、結腸直腸癌細胞株での結腸幹細胞表面マーカーＬＧＲ５の発現に対する低付着培養条件下での成長の効果を記載する。テストした細胞は、原発性結腸直腸癌及び転移性結腸直腸癌細胞株からの細胞、ヒト原発性結腸直腸癌から得られた生検サンプルからの細胞を含んだ。低付着培養条件は、スフェロイドとしての癌幹細胞の成長のために濃縮し、結腸直腸癌幹細胞のための有用なアッセイツールを提供することができる。
【０２３５】
Ａ．  方法
テストした細胞は、原発性結腸直腸癌細胞株ＨＴ２９及びＨＣＴ１１６、及び転移性結腸直腸癌細胞株ＳＷ６２０及びＴ８４からであった。
【０２３６】
ヒト原発性結腸直腸腫瘍からの生検サンプルから単離された細胞も、以下の通りにテストした（ＣＲＣ１）。生検サンプルを無菌ハンクス平衡塩類（ＨＢＳＳ）中で数回リンスし、次にＨＢＳＳ中の０．４%次亜塩素酸ナトリウム溶液中で、室温で３０分間にわたり置いた。ＨＢＳＳ中でのいくつかのさらなるリンス後、生検を、メスの刃を使用して１mm小片に切断し、リンスした。小片を、次に、２０分毎に１回の緩やかな撹拌を伴い、５０%Accumax溶液において、強い抗生物質及びグルコースを含むＭ１１培地（２０ng/ml  ＥＧＦ、１０ng/ml  ＦＧＦ、２０μg/mlインスリン、Ｎ２サプリメント、２μg/mlシプロフラキシン（ｃｙｐｒｏｆｌａｘｉｎ）、５μg/mlゲンタマイシン、及び３μg/mlグルコースを伴うＤＭＥＭ／Ｆ１２）中で、３７℃で１時間にわたりインキュベートした。これらの消化サンプルを含むAccumax溶液を、次に、１００マイクロメータのふるいで濾過した。生存率を、トリパンブルー技術を使用して、濾過溶液の小さな一定分量で決定した。この溶液を、次に、２００gで１０分間にわたり遠心し、ペレットを、Accumax反応を停止するために、１０%ＦＢＳを含む２mlのＭ１１培地中に再懸濁した。細胞を、次に、Corning超低付着フラスコ中で数日間にわたりインキュベートし、次に、さらなる増幅のためのＦＢＳを伴わないＭ１１培地中に移した。ＣＲＣ１サンプルからの細胞を数週間にわたり増幅させ、実験を実施する前に１回凍結／解凍した。
【０２３７】
細胞を、２つの異なる培養条件下で成長させた。第１に、細胞を、哺乳動物細胞の成長のための標準的プラスチックカルチャウェア（表面への細胞付着を促進する）において成長させた。具体的には、２００，０００個の細胞を、７５cm2フラスコ（Corning）中に、ＤＭＥＭ＋５%ウシ胎児血清（ＦＢＳ）＋１００U/mlペニシリン＋１００U/mlストレプトマイシン中に播種した。
【０２３８】
第２に、細胞を、低付着カルチャウェア（哺乳動物細胞は、典型的には、不十分に付着する又は全く付着しない）において成長させた。具体的には、３０，０００個の細胞を、超低付着性７５cm2フラスコ（Corning）において、Ｍ１１培地（２０ng/ml  ＥＧＦ、１０ng/ml  ＦＧＦ、２０μg/mlインスリン、Ｎ２サプリメント、２μg/mlシプロフラキシン（ｃｙｐｒｏｆｌａｘｉｎ）、５μg/mlゲンタマイシン、及び３μg/mlグルコースを伴うＤＭＥＭ／Ｆ１２）中で成長させた。成長の期間後、細胞を、ＦＡＣＳ解析前に、Accumax（Innovative Cell Technologies, Inc.）を使用して、３７℃で４５分間にわたり単一細胞懸濁液に再懸濁及び脱凝集した。標準的な技術を使用して、細胞を、その後、細胞表面マーカーＬＧＲ５（Abgent, Inc.）のＮ末端領域への抗体を用いて染色し、ＦＡＣＳにより選別し、マーカーを発現する細胞のパーセンテージを決定した。全ての実験を３回実施した。
【０２３９】
Ｂ．  結果
２つの培養条件下での細胞の成長に起因するＬＧＲ５発現結腸直腸癌細胞の相対的なパーセンテージを図１２に示す。テストした全ての細胞株について、ＬＧＲ５発現細胞のパーセンテージは、細胞が、従来の条件（灰色バー）下での成長と比較して、低付着培養条件（黒色バー）下でスフェロイドとして成長させた場合により大きかった。パターンは、原発性結腸直腸癌細胞株（ＨＴ２９及びＨＣＴ１１６）、ならびに転移性結腸直腸癌細胞株（ＳＷ６２０及びＴ８４）に由来する細胞について同様であった。
【０２４０】
ヒト原発性結腸直腸癌の生検から得られたＣＲＣ１細胞は、低付着培養条件下で成長させた場合、また、ＬＧＲ５を発現した。この特定の実験において、ＣＲＣ１細胞は従来の付着性条件下でうまく成長しなかったため、しかし、細胞を付着性対非付着性条件下で成長させた場合、ＬＧＲ５発現レベルを直接的に比較することは可能ではなかった。
【０２４１】
実施例１１：ガストリン遺伝子の発現は、低付着培養条件下での結腸直腸癌細胞の成長により増加する
この実施例では、原発性及び転移性結腸直腸癌細胞株、ならびに低付着培養条件下で成長させたヒト原発性結腸直腸癌から得られた生検サンプルからの細胞におけるガストリン遺伝子の発現に対する効果について記載する。そのような成長条件によって癌幹細胞が濃縮される。
【０２４２】
Ａ．  方法
テストした細胞は、原発性結腸直腸癌細胞株ＨＴ２９、ＨＣＴ１１６、ＲＫＯ、ＳＷ４８０、及びＤＬＤ１、ならびに転移性結腸直腸癌細胞株ＳＷ６２０及びＴ８４からであった。ヒト原発性結腸直腸腫瘍からの生検サンプルから単離された細胞もテストした（ＣＲＣ１）。細胞を、２つの異なる培養条件下で成長させた。第１に、細胞を、哺乳動物細胞の成長のための従来のカルチャウェア（プラスチック表面への細胞付着を促進する）において、上に記載する通りに成長させた。第２に、細胞を、また、低付着カルチャウェア（哺乳動物細胞は、典型的には、不十分に付着する）において成長させた。成長の期間後、細胞を再懸濁及び溶解し、ｍＲＮＡを、標準的技術を使用して単離した。ガストリン遺伝子の発現を、次に、標準技術に従って定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用して測定した。各実験を３回反復した。
【０２４３】
Ｂ．  結果
従来の低付着培養条件下でテストした異なる細胞において発現されるガストリンｍＲＮＡの相対的レベルを図１３に報告する。レベルを、ＲＫＯ原発性結腸直腸癌細胞株において発現されるガストリンｍＲＮＡの量と比べて標準化した。ＲＫＯ細胞は、通例、低レベルのプロガストリンを発現する。相対的なガストリンｍＲＮＡレベルは対数スケールで報告されていることに留意すること。テストした全ての細胞株（ＲＫＯ細胞を除く）について、ガストリン遺伝子発現は、細胞が、従来の条件（灰色バー）下での成長と比較して、低付着培養条件（黒色バー）下で成長させた場合により高かった（時折、何倍もより高かった）。パターンは、原発性結腸直腸癌細胞株、ならびに転移性結腸直腸癌細胞株に由来する細胞について同様であった。
【０２４４】
実施例１２：低付着培養条件において成長させた結腸直腸癌細胞は、プロガストリンタンパク質を発現する
この実施例では、原発性及び転移性結腸直腸癌細胞株、ならびに低付着培養条件下で成長させたヒト原発性結腸直腸癌から得られた生検サンプルからの細胞におけるプロガストリンタンパク質の発現について記載する。そのような成長条件によって癌幹細胞が濃縮される。
【０２４５】
Ａ．  方法
テストした細胞は、原発性結腸直腸癌細胞株ＨＴ２９、及び転移性結腸直腸癌細胞株ＳＷ６２０及びＴ８４からであった。ヒト原発性結腸直腸腫瘍からの生検サンプルから単離された細胞もテストした（ＣＲＣ１）。細胞を低付着カルチャウェアにおいてＭ１１培地（フェノールレッドを伴わない）中で成長させた。４８時間後、培地を回収し、１，０００ｇで５分間にわたり遠心し、細胞デブリを除去し、−８０℃で凍結した。細胞を、Accumaxを使用して脱凝集し、カウントした。分泌されたプロガストリンを測定するために、凍結した培地を氷上で解凍し、次に、タンパク質コンセントレータ（Icon, Pierce）を使用して、２，５００gで４５分間にわたる遠心により容積５００μlまで４０倍濃縮した。プロガストリン濃度を、次に、サンドイッチＥＬＩＳＡ技術を使用して測定した。各実験を２回反復した。
【０２４６】
Ｂ．  結果
低付着培養条件下での４８時間の成長後に結腸直腸癌細胞により成長培地中に分泌されたプロガストリンの濃度を図１４に示す。テストした全ての細胞（１つの原発性結腸直腸癌細胞株、２つの転移性結腸直腸癌細胞株、及びヒト原発性結腸直腸癌から得られた生検サンプルからの細胞を含む）は、低付着培養条件においてスフェロイドとして成長させた場合、プロガストリンを分泌した。しかし、ＳＷ６２０細胞は、試験下の他の細胞株よりも実質的に少ないプロガストリンを分泌した。データを、プロガストリン濃度（pM）／１００万個細胞／４８時間の成長として表現した。
【０２４７】
実施例１３：低付着培養条件下でのスフェロイドとしての原発性結腸直腸癌細胞の成長に対する抗プロガストリンポリクローナル抗体の効果
この実施例では、原発性結腸直腸癌細胞株、ならびに低付着培養条件下で成長させたヒト原発性結腸直腸癌から得られた生検サンプルからの細胞のスフェロイドとしての成長に対する抗プロガストリンポリクローナル抗体の効果について記載する。そのような成長条件によって癌幹細胞が濃縮される。
【０２４８】
Ａ．  方法
テストした細胞は、原発性結腸直腸癌細胞株ＨＴ２９及びＨＣＴ１１６、ならびにヒト原発性結腸直腸腫瘍（ＣＲＣ１）からの生検サンプルから単離された細胞からであった。細胞を、低付着９６ウェルプレート（Corning）のウェルにおいて、Ｍ１１培地（２０ng/ml  ＥＧＦ、１０ng/ml  ＦＧＦ、２０μg/mlインスリン、Ｎ２サプリメント、２μg/mlシプロフラキシン（ｃｙｐｒｏｆｌａｘｉｎ）、５μg/mlゲンタマイシン、及び３μg/mlグルコースを伴うＤＭＥＭ／Ｆ１２）中に播種した。ＨＴ２９及びＨＣＴ１１６細胞について、１００μl中の合計５００個の細胞を、３ウェル／処理条件の各々に加えたのに対し、ＣＲＣ１細胞について、１００μl中の合計５００個の細胞を、１０ウェル／処理条件の各々に加えた。２４時間毎に、細胞を、３μg/mlのポリクローナル抗プロガストリン抗体、又はコントロール抗体（ポリクローナルウサギ抗ヒトＩｇＧ、Affinity BioReagents, Ref #SA1-600）を用いて処理した。ＨＴ２９及びＨＣＴ１１６細胞について１０日間の処理、ならびにＣＲＣ１細胞について１４日間の処理後、各ウェル中の細胞スフェロイドの数をカウントし、１ウェル当たりの平均を算出した。実験を実施する技術者は、テストされている抗体溶液の内容物に関して盲検化された。各実験を２回反復した。
【０２４９】
Ｂ．  結果
図１５〜１７に示す通り、コントロール抗体と比較して、抗プロガストリンポリクローナル抗体は、低付着培養条件下で成長させた原発性結腸直腸癌細胞により形成された細胞スフェロイドの数を実質的に低下させた。
【０２５０】
実施例１４：低付着培養条件下でのスフェロイドとしての原発性結腸直腸癌細胞の成長に対する抗プロガストリンモノクローナル抗体の効果
この実施例では、そのような細胞を低付着培養条件下で成長させた場合での２つの原発性結腸直腸癌細胞株からのＬＧＲ５陽性細胞のスフェロイドとしての成長に対する抗プロガストリンモノクローナル抗体の効果を記載する。そのような成長条件によって癌幹細胞が濃縮される。
【０２５１】
Ａ．  方法
テストした細胞は原発性結腸直腸癌細胞株ＨＴ２９及びＨＣＴ１１６からであった。細胞を、最初に、ＦＡＣＳ（FACSaria, BD Biosciences）により選別し、癌幹細胞マーカーＬＧＲ５を発現する細胞を単離した。ＦＡＣＳのために、２×１０６個のＨＴ２９細胞を選別し、１×１０６個のＨＣＴ１１６細胞を選別した。細胞を、２mg／１×１０６個細胞のＬＧＲ５のＮ末端について特異的な抗体（Abgent, Inc., No.AP2745A）を用いて標識した。ＦＡＣＳ後、ＬＧＲ５陽性細胞を、低付着９６ウェルプレートの３０ウェルにおいて、密度１０個細胞／ウェルで、１００μlのＭ１１培地（２０ng/ml  ＥＧＦ、１０ng/ml  ＦＧＦ、２０μg/mlインスリン、Ｎ２サプリメント、２μg/mlシプロフラキシン（ｃｙｐｒｏｆｌａｘｉｎ）、５μg/mlゲンタマイシン、及び３μg/mlグルコースを伴うＤＭＥＭ／Ｆ１２）中に蒔いた。１４日間にわたり２４時間毎に、細胞を、０．３μg/mlの２つの異なる抗プロガストリンモノクローナル抗体（ＭＡｂ２及びＭＡｂ３）の１つ、又はコントロールモノクローナル抗体（モノクローナルマウス抗ヒトＩｇＧ１、Calbiochem, Ref #411451）を用いて処理した。処理の終了時、各抗体型の存在において形成された細胞スフェロイドの数をカウントした。細胞を、次に、追加の１７日間成長することを許し、その間に、培地を、さらなる抗体処理を伴わず、毎週新しくした。実験を実施する技術者は、テストされている抗体溶液の内容物に関して盲検化された。
【０２５２】
Ｂ．  結果
図１８Ａ及び図１９Ａにそれぞれ示す通り、２つの原発性結腸直腸癌細胞株（ＨＣＴ１１６及びＨＴ２９）からのＬＧＲ５陽性細胞がスフェロイドとして１４日間にわたり低付着培養において成長する能力は、コントロールモノクローナル抗体と比較して、プロガストリンに対する２つの別々のモノクローナル抗体を用いた処理により低下した。
【０２５３】
さらに、図１８Ｂ及び１９Ｂに示す通り、スフェロイドの数は、ＨＣＴ１１６及びＨＴ２９細胞の１７日間にわたる外因的に加えられた抗体の非存在における培養中でのさらなるインキュベーション後に増加しなかった。このデータは、抗ｈＰＧ抗体による球形成の抑制が、特定の抗体を除去した後でさえ継続していることを意味する。
【０２５４】
実施例１５：低付着培養条件下でのスフェロイドとしての原発性結腸直腸癌細胞の成長に対する抗プロガストリンモノクローナル抗体の効果
この実施例では、そのような細胞を低付着培養条件下で成長させた場合でのＣＲＣ１細胞のスフェロイドとしての成長に対する４つの異なる抗プロガストリンモノクローナル抗体の効果を記載する。そのような成長条件によって癌幹細胞が濃縮される。
【０２５５】
Ａ．  方法
ＣＲＣ１細胞は、標準的な手順に従って、ヒト結腸癌生検から得られた。Accumax（Sigma）中での３７℃で４５分間にわたり解離させた後、細胞を、低付着９６ウェルプレート（Corning）において、密度１００個細胞／ウェルで、Ｍ１１培地（２０ng/ml  ＥＧＦ、１０ng/ml  ＦＧＦ、２０μg/mlインスリン、Ｎ２サプリメント、２μg/mlシプロフラキシン（ｃｙｐｒｏｆｌａｘｉｎ）、５μg/mlゲンタマイシン、及び３μg/mlグルコースを伴うＤＭＥＭ／Ｆ１２）中に蒔いた。各処理群について、１０ウェルを使用した。
【０２５６】
第１日に開始し、細胞を、４つの異なる抗プロガストリンモノクローナル抗体ＭＡｂ５、ＭＡｂ８、ＭＡｂ１３、又はＭＡｂ１６（３μg/ml）の１つ又は同じ濃度のモノクローナル抗体Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８（ＡＴＣＣ，  Ｒｅｆ  ＴＩＢ−９）又はコントロールとして抗体を加えていない培地を用いて１日２回処理した。その後、処理を８日間にわたり１日１回実施した。球を、その後のカウントのために毎日写真撮影した。全ての実験を盲検化様式で行った。実験の終了時、各処理群からのスフェロイドの数をカウントした。
【０２５７】
Ｂ．  結果
結果を図２０に示す。テストした抗ｈＰＧモノクローナル抗体の各々が、低付着培養条件において原発性結腸直腸癌細胞により形成されたスフェロイドの数を低下させるために効果的であった。非特異的モノクローナル抗体及び培地単独と比較して、テストした全ての抗体についての阻害効果は、ボンフェローニの事後検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを使用し、ｐ＜０．０５で統計的に有意であった。ＭＡｂ５、ＭＡｂ８、及びＭＡｂ１３が全てｈＰＧのＣ末端エピトープを認識するのに対し、ＭＡｂ１６はｈＰＧのＮ末端エピトープに結合する。
【０２５８】
実施例１６：低付着培養条件下でのスフェロイドとしての転移性結腸直腸癌細胞の成長に対する抗プロガストリンモノクローナル抗体の効果
この実施例では、そのような細胞を低付着培養条件下で成長させた場合での転移性結腸直腸癌細胞株からのＡＬＤＨ１陽性細胞のスフェロイドとしての成長に対する抗プロガストリンモノクローナル抗体の効果を記載する。
【０２５９】
Ａ．  方法
テストした細胞は、転移性結腸直腸癌細胞株Ｔ８４からであった。細胞を、最初に、ＦＡＣＳ（FACSaria, BD Biosciences）により選別し、ALDEFLUORキット（Stemcell Technologies）を使用して癌幹細胞マーカーＡＬＤＨ１を発現する細胞を単離した。ＦＡＣＳ後、ＡＬＤＨ１陽性細胞（即ち、検出可能なＡＬＤＨ１酵素活性を示す細胞）を、低付着９６ウェルプレートのウェルにおいて、密度１００個細胞／ウェルで、１００μlのＭ１１培地（２０ng/ml  ＥＧＦ、１０ng/ml  ＦＧＦ、２０μg/mlインスリン、Ｎ２サプリメント、２μg/mlシプロフラキシン（ｃｙｐｒｏｆｌａｘｉｎ）、５μg/mlゲンタマイシン、及び３μg/mlグルコースを伴うＤＭＥＭ／Ｆ１２）中に蒔いた。１１日間にわたり２４時間毎に、細胞を、３つの異なる濃度（０．０１μg/ml、０．１μg/ml、又は１μg/ml）の１つの抗プロガストリンモノクローナル抗体（ＭＡｂ３）、又は１μg/mlのコントロールモノクローナル抗体（モノクローナルマウス抗ヒトＩｇＧ１、Calbiochem, Ref #411451）を用いて処理した。処理の終了時、各抗体の存在において形成された細胞スフェロイドの数をカウントした。実験を実施する技術者は、テストされている抗体溶液の内容物に関して盲検化された。
【０２６０】
Ｂ．  結果
図２１に示す通り、Ｔ８４転移性結腸直腸癌細胞株からのＡＬＤＨ１陽性細胞が低付着培養においてスフェロイドとして成長する能力は、コントロールモノクローナル抗体と比較して、プロガストリンに対するモノクローナル抗体を用いた処理により用量依存的な様式で低下した。
【０２６１】
実施例１７：低付着培養条件下でのスフェロイドとしての原発性結腸直腸癌細胞の成長に対する抗プロガストリンモノクローナル抗体を用いた前処理の効果
この実施例では、細胞を低付着培養条件に移した場合、スフェロイドとしての従来の培養条件下でのＡＬＤＨ１陽性ＣＲＣ１細胞の成長に対する４つの異なる抗プロガストリンモノクローナル抗体を使用した前処理の効果を記載する。
【０２６２】
Ａ．  方法
ＣＲＣ１細胞は、標準的な手順に従って、ヒト結腸癌生検から得られた。３７℃で４５分間にわたりAccumax（Sigma）中で解離された後、ＣＲＣ１細胞（１００，０００個細胞／ウェル）を、抗ｈＰＧモノクローナル抗体ＭＡｂ５、ＭＡｂ８、ＭＡｂ１３、又はＭＡｂ１６の存在又は非存在における７２時間にわたる無血清ＤＭＥＭ培地中での従来の付着性培養条件下で成長させた。実験を盲検化様式で行った。
【０２６３】
処理期間の終わりに、２つの異なるアッセイを細胞で実施した。第１に、ＡＬＤＨ１（結腸直腸癌幹細胞のマーカー）を発現する細胞のパーセンテージをＦＡＣＳにより決定した。第２アッセイにおいて、各処理群について、２００個細胞／ウェルを、低付着２４ウェルプレートの６ウェルにおいて、ｂＦＧＦ及びＥＧＦを添加した５００μlの無血清Ｍ１１培地中に蒔き、さらなる処理を伴わず、７日間にわたり成長させた。この期間の終了時に、写真を撮り、ウェル当たりの球の数をカウントし、球の表面積を測定した。
【０２６４】
Ｂ．  結果
結果を図２２及び図２３に示す。テストした４つの抗ｈＰＧモノクローナル抗体の各々は、コントロールと比較して、ＡＬＤＨ１を発現するＣＲＣ１原発性結腸直腸癌細胞の数を低下させるために、従来の付着性培養において３日後に効果的であった。これらの抗体の各々は、また、抗体を除去し、細胞を追加の７日間にわたり成長させた後、低付着培養条件における原発性結腸直腸癌細胞により形成されるスフェロイドの数を低下させるために効果的であった。コントロールと比較して、ＭＡｂ５、ＭＡｂ８、及びＭＡｂ１６の阻害効果は、ボンフェローニの事後検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを使用し、ｐ＜０．０５で統計的に有意であった。ＭＡｂ１３は、また、コントロールと比較して、スフェロイドの数を低下させたが、効果は統計的有意性に達しなかった。
【０２６５】
実施例１８：低付着培養条件下でのスフェロイドとしての転移性結腸直腸癌細胞の成長に対する抗プロガストリンモノクローナル抗体を用いた前処理の効果
この実施例では、そのような細胞を低付着培養条件下で成長させた場合での２つの転移性結腸直腸癌細胞株からのＡＬＤＨ１陽性細胞のスフェロイドとしての成長に対する抗プロガストリンモノクローナル抗体を使用した前処理の効果を記載する。
【０２６６】
Ａ．  方法
テストした細胞は、転移性結腸直腸癌細胞株Ｔ８４及びＳＷ６２０からであった。細胞は、最初に、従来の付着性カルチャウェア中で、抗プロガストリンモノクローナル抗体ＭＡｂ３（１μg/ml）、コントロールモノクローナル抗体、化学療法剤５フルオロウラシル（５ＦＵ  １０μM）、又は溶剤ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の存在において７２時間にわたり成長させた。処理後、細胞を２つのアッセイに供した。第１において、癌幹細胞マーカーＡＬＤＨ１について陽性の細胞のパーセンテージを、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲキット（Stemcell Technologies）を使用して決定した。第２のアッセイにおいて、各処理群について、細胞を、低付着９６ウェルプレートの６ウェル中に、密度５００個細胞／ウェルで、ｂＦＧＦ及びＥＧＦを含む１００μlの無血清培地中に蒔き、さらなる処理を伴わずに１１日間にわたり成長させた。この期間の終了後、１ウェル当たりのスフェロイドの数をカウントした。
【０２６７】
Ｂ．  結果
図２４及び図２５にそれぞれ示す通り、ＡＬＤＨ１陽性Ｔ８４及びＳＷ６２０転移性結腸直腸癌細胞の数は、コントロールモノクローナル抗体を用いた処理と比較して、抗プロガストリンモノクローナル抗体ＭＡｂ３を用いた７２時間にわたる前処理の結果として低下した。
【０２６８】
図２６及び図２７にそれぞれ示す通り、Ｔ８４及びＳＷ６２０転移性結腸直腸癌細胞が低付着培養においてスフェロイドとして成長する能力は、コントロールモノクローナル抗体と比較して、プロガストリンに対するモノクローナル抗体を用いた７２時間にわたる前処理により低下した。
【０２６９】
実施例１９：抗プロガストリン抗体はインビボで新たな腫瘍の開始を低下させる
この実施例では、ヌードマウスにおいて成長するヒト転移性結腸直腸癌から単離された細胞が移植後に新たな腫瘍を形成する能力に対するヒトプロガストリンに特異的なモノクローナル抗体の効果を記載する。
【０２７０】
Ａ．  方法
標準的な技術を使用して、免疫不全／ＢＡＬＢｃヌードマウスに、ヒト転移性ＳＷ６２０結腸直腸癌細胞の脾臓内注射を与えた。マウスに、次に、抗ｈＰＧモノクローナル抗体ＭＡｂ３又はコントロールモノクローナル抗体を合計６週間にわたり週２回投与した。各抗体について、用量は８mg/kgであった。処置期間の終わりに、組織を、処置及びコントロールの両方のマウスからの転移から解剖した。腫瘍細胞を、Accumaxを用いた解剖組織の処理により脱凝集し、濾過し、カウントした。合計２３，８００個の生存可能な腫瘍細胞がＭＡｂ３を用いて処理したマウスからの転移組織から得られ、３６，４００個がコントロールマウスから得られた。
【０２７１】
単離した細胞を次にテストし、細胞が低付着培養条件下でスフェロイドとして成長することができるか否か、及び、それらが、新たな宿主中に移植された場合に新たな腫瘍を開始することができるか否かをテストすることにより、それらが癌幹細胞の表現型特徴を示すか否かを決定した。スフェロイドテストについては、処理及びコントロール細胞の各々について、２，０００個細胞／ウェルを、低付着カルチャウェアの５つのウェル中に、ｂＦＧＦ及びＥＧＦを添加したＭ１１培地中に播種した。細胞を７日間にわたり成長させ、次に、各ウェルにおいて形成されたスフェロイドの数をカウントした。移植テストについては、処理及びコントロール転移から単離した細胞から発生したスフェロイドをプールし、脱凝集し、カウントした。合計２０，０００個の細胞が処置された転移に由来するスフェロイドから得られ、１１０，０００個の細胞がコントロール転移に由来するスフェロイドから得られた。２匹の新たなＢＡＬＢｃ／ヌードマウスに、次に、等しい数の処理又はコントロール細胞を用いて移植した。具体的には、処置した転移に由来する６，５００個の腫瘍細胞をマウスの左大腿中に皮下注射したのに対し、同じ数のコントロール細胞を右大腿中に皮下注射した。この様式において、各マウスがそれ自体のコントロールとしての役割を果たした。腫瘍容積を、次に、時間を通して両方の動物において算出した。
【０２７２】
Ｂ．  結果
図２８に示す通り、インビボ転移から単離されたヒト転移性結腸直腸癌細胞の低付着培養におけるスフェロイドとしての成長は、同じ用量のコントロールモノクローナル抗体を用いた処置と比較して、抗プロガストリンモノクローナル抗体ＭＡｂ３を用いて動物を処置することにより低下した。
【０２７３】
図２９に示す通り、インビボ転移から単離された転移性結腸直腸癌細胞の移植後に新たな腫瘍成長を開始する能力も、同じ用量のコントロールモノクローナル抗体を用いた処理と比較して、抗プロガストリンモノクローナル抗体ＭＡｂ３を用いて細胞を処理することにより低下した。グラフにおいて、Ｙ軸は腫瘍容積（mm3）に対応する。黒四角は、コントロールモノクローナル抗体を用いて処置したマウスにおいて成長した転移に由来する転移性結腸直腸癌細胞を用いて皮下注射したヌードマウスの１匹についての腫瘍容積のデータポイントを表す。逆に、白四角は、ＭＡｂ３抗プロガストリンモノクローナル抗体を用いて処置したマウスにおいて成長した転移に由来する転移性結腸直腸癌細胞を用いて反対側の大腿に注射された同じマウスについてのデータポイントを表す。黒及び白ダイヤモンドは、実験に使用した第２ヌードマウスから収集した同様のデータに対応する。
【０２７４】
実施例２０：血漿又は血清ＰＧレベルの定量化
ＰＧの血漿及び／又は血清レベルは、以下のアッセイを使用して便利に決定することができる。９６ウェルマイクロタイタープレートを、０．５〜１０μg/mlのＣ末端抗ｈＰＧ抗体、例えば、ウサギＣ末端抗ｈＰＧポリクローナル抗体、又はＣ末端抗ｈＰＧ抗体（本明細書に記載する）を用いてコーティングし、次に、一晩インキュベートする。プレートを、次に、ＰＢＳ−TWEEN（０．０５%）中で３回洗浄し、ＰＢＳ−TWEEN（０．０５%）中の２%脱脂乾燥ミルク（ｗ／ｖ）を用いてブロックする。別々に、テストサンプル、コントロールサンプル（ブランク又はＰＧ陰性血漿又は血清サンプル）、及び約５ｐＭ（０．５×１０−１１M）〜約０．１nM（１×１０−１０M）のｈＰＧ参照基準（ＰＧ陰性血漿又は血清中で希釈した凍結乾燥ｈＰＧ）を適切な希釈剤（例、ＰＢＳ−TWEEN  ０．０５%）中で調製する。サンプルを、コーティングしたプレート上で２〜４時間にわたり３７℃で、又は、あるいは、１２〜１６時間２１℃でインキュベートする。インキュベーション後、プレートを、ＰＢＳ−TWEEN（０．０５%）を用いて３回洗浄し、０．００１〜０．１μg/mlのＮ末端抗ｈＰＧ抗体、例えば、ポリクローナルＮ末端抗ｈＰＧ抗体又はＮ末端モノクローナル抗ｈＰＧ抗体（本明細書に記載する）を用いてインキュベートし、２１℃で３０分間にわたり西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Nakane et al., 1974, J. Histochem. Cytochem. 22(12): 1084-1091を参照のこと）に結合させる。プレートを次にＰＢＳ−TWEEN（０．０５%）中で３回洗浄し、ＨＲＰ基質を２１℃で１５分間にわたり加える。反応を、１００μlの０．５Ｍ硫酸を加えることにより停止させ、光学密度測定値を４０５nMで取る。テストサンプルｈＰＧレベルを、ｈＰＧ参照基準に由来する測定値から構築された標準曲線との比較により決定する。
【０２７５】
実施例２１：抗ｈＰＧ抗体の特異性を評価するためのＥＬＩＳＡアッセイ
抗ｈＰＧ抗体の特異性を、以下の通りにＥＬＩＳＡアッセイを使用して便利に決定することができる。９６ウェルプレートを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の適切な濃度のテストポリペプチド（例、２５及び５０ngの組換えヒトＰＧ、ならびに５０及び２５０ngのＣＴＦＰ又は他のガストリン由来の遺伝子産物）を用いて４℃で一晩インキュベートした。その後、ウェルを、洗浄溶液（ＰＢＳ及び０．１%TWEEN−２０）を用いて３回洗浄し、次に１００μlのブロッキング溶液（ＰＢＳ、０．１%TWEEN−２０、０．１%ウシ血清アルブミン又はカゼイン加水分解物）を用いて２２℃で２時間にわたりインキュベートした。ブロッキング後、ウェルを３回洗浄し、アッセイする抗体（テスト抗体）を加える。１００μlのＰＢＳ中のテスト抗体（０．３〜１ng/ml）及び０．１%TWEEN−２０を各ウェルに加える。プレートを次に２２℃で２時間にわたりインキュベートし、その後、テスト抗体溶液を捨て、洗浄工程（３×１００μlの洗浄溶液、上に記述する通り）後、二次抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させたヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）抗体を含むブロッキング溶液を用いて置換する。二次抗体を用いた１時間のインキュベーション後、１００μlの基質溶液（例、Ｆａｓｔ  ＯＰＤ、又はＯ−フェニレンジアミン二塩酸塩、Sigma-Aldrich Co.から入手可能、製造者の指示に従って調製した）を各ウェルに加え、暗所で、２２℃で２０分間にわたりインキュベートした。反応は、５０μlの４Ｎ硫酸を加えることにより停止させ、触媒された基質の量を、４９２nmでの光学密度（ＯＤ）を測定することにより決定する。基質変換は、抗原に結合した一次（テスト）抗体の量に比例する。実験を２通りに実行し、ＯＤ測定値を抗原濃度の関数としてプロットする。テスト抗体は、測定されたＯＤがｈＰＧについて０．２〜１．５の間であり、ＣＴＦＰ又は他のガストリン遺伝子由来ペプチドのいずれかを用いて、バックグラウンドを上回る統計的に有意なシグナルはない場合、ＰＧについて特異的であるとスコア化される（ここで、バックグラウンドはＰＢＳだけを含むコントロールウェルからの平均シグナルである）。
【０２７６】
実施例２２：抗ｈＰＧ抗体の中和活性を評価するためのアッセイ
特異的な抗ｈＰＧ抗体が中和性であるか否かを評価するための特定のテストを、以下の通りに実行することができる。結腸直腸癌細胞を６ウェルプレート中に約５０，０００〜１００，０００個細胞／ウェルで播種する。細胞を、次に、テスト抗ｈＰＧ抗体又はコントロール抗体を用いて、約５μg/mlの抗体濃度で４８時間にわたり１２時間間隔で処理する。テスト抗体は、テスト抗体を用いて処理した細胞の数が、コントロールの非特異的抗体を用いて処理した細胞の数と比較して、生存細胞の数における少なくとも１０%の統計的に有意な低下を示す場合（両側マンホイットニー検定（差は、ｐ＜０．０５の場合に有意と考えられる）を使用する）、アッセイにおいて中和性であるとして定義される。全細胞数は、処理期間の開始時での細胞数について補正され、Ｔ０として言及される。このアッセイにおける使用のための例示的な結腸直腸癌細胞は、しかし、限定しないが、本明細書に開示する原発性及び転移性結腸直腸癌細胞株を含む。
【０２７７】
実施例２３：抗ｈＰＧ抗体の親和性を評価するためのアッセイ
抗ｈＰＧ抗体の親和性定数は、Proteon Technique（BioRad）を使用して、Nahshol et al., 2008, Analytical Biochemistry 383: 52-60（その全体において参照により本明細書により組み入れられる）に従って測定することができる。簡単には、マウス抗ＰＧ抗体について、抗マウスＩｇＧ抗体（５０μg/ml）を最初にセンサーチップ上にコーティングし、抗体の注射後にチップにより検出されたシグナルが１０，０００〜１１，５００応答単位（ＲＵ）の間に入ることを確認する。目的のマウス抗ｈＰＧ抗体（テスト抗体）を次に注射する（３０μg/mlの典型的な濃度で）。テスト抗体が十分に結合する場合、少なくとも５００ＲＵの追加シグナルが観察される。テスト抗体とｈＰＧの間での結合の時間経過を、次に、ｈＰＧの変動濃度、例えば、２００nM、１００nM、５０nM、２５nM、及び１２．５nMを注射し、結合のレベルを検出することにより得る。典型的には、いくつかのチャンネルが、単一の実験において並行して複数の抗体をテストするために利用可能であり、ｈＰＧの異なる濃度で並行して単一のテスト抗体の結合をアッセイすることを可能にする。１つのチャネルを、非特異的結合についてのコントロールとして、ｈＰＧに特異的ではないマウスモノクローナル抗体を用いて注射すべきである。別のチャネルを、バックグラウンドシグナルについてのベースラインとして、希釈緩衝液単独を用いて注射すべきである。一般的に、結合は、非特異的マウス抗体を用いて注射したチャネルにおいて検出可能ではない。この設定において高レベルの結合を示す抗体は、ｈＰＧによる捕捉モノクローナル抗体の飽和をもたらしうるが、より低いｈＰＧ濃度（５０nM、２５nM、１２．５nM、６．２５nM、及び３．１２５nM）に対してテストすることができ、より洗練された測定を許す。
【０２７８】
親和性定数（ＫＤ）を、解離定数（ｋｄ）と結合定数（ｋａ）の間の比率として算出する。実験値は、結合測定値に基づく実験曲線及び理論上のプロファイルの間での統計的に関連する類似性を分析することにより検証することができる。
【０２７９】
非マウス抗ｈＰＧ抗体の親和性定数は、抗ｈＰＧ試験抗体の起源の種について特異的なＩｇＧを使用して同様のフォーマットにおいて評価することができる。
【０２８０】
実施例２４：参照抗ｈＰＧ抗体を用いた競合的結合を評価するためのアッセイ
目的の抗体（テスト抗体）が、ｈＰＧ結合について、ビオチン化参照抗ｈＰＧ抗体と競合するか否かを評価するための特定のアッセイを、以下の通りに実施することができる。９６ウェルプレートを、捕捉抗ｈＰＧ抗体 （ビオチン化参照抗ｈＰＧ抗体により認識されるエピトープとは異なるｈＰＧのＮ又はＣ末端領域を認識するポリクローナル又はモノクローナル抗体）を用いて、１〜１０μg/mlの範囲内で選ばれる濃度で、４℃で一晩コーティングする（０．１〜１μg/ウェル）。２２℃で２時間にわたるブロッキングバッファー（ＰＢＳ中の０．１%  TWEEN−２０、０．１%ＢＳＡ）を用いたブロッキング後、組換えｈＰＧを、１０pM〜１nM（１０〜１０００pg/ウェル）の間の範囲の濃度で加え、２２℃で２時間にわたりインキュベートする。その後、ビオチン化参照抗ｈＰＧ抗体（又はビオチン化参照抗ｈＰＧ抗体を含む混合物）を、増加濃度の非標識テスト抗体濃度と共に加え、２２℃で１時間にわたりインキュベートする。非結合抗体を除去するための洗浄後、結合した標識参照抗ｈＰＧ抗体の検出を、混合物を、５０ng/mlのストレプトアビジン（ｓｔｅｐｔａｖｉｄｉｎ）−ＨＲＰを用いて２２℃で１時間にわたりインキュベートすることにより実施し、西洋ワサビペルオキシダーゼ用の蛍光基質とのインキュベーション、及び、次に、ルミノメーターにおける相対的な光単位（ＲＬＵ）の定量化が続く。アッセイを２通りに実施した。
【０２８１】
参照抗ｈＰＧ抗体と競合する抗体は、ｈＰＧへの参照抗体の結合を阻害する。実質的に同一のエピトープに、又は重複するエピトープと参照抗体として結合する抗体は、結合した参照抗ｈＰＧ抗体の量を有意に低下させる（例えば、少なくとも５０%）（観察されたＲＬＵにおける低下により証明される通り）。
【０２８２】
高いコントロール値が、標識した参照抗体を、テスト抗体を伴わず、組換えｈＰＧとインキュベートすることにより行われるコントロール実験から得られる。低いコントロール値は、過剰濃度の非標識参照抗体（非標識参照抗体は、このように、ｈＰＧへの結合について標識抗体と競合する）の存在において標識された参照抗体を、組換えｈＰＧを用いてインキュベートすることにより行われるコントロール実験から得られる。参照抗ｈＰＧ抗体と競合するテスト抗体の能力は、次に、標識した参照抗体を、増加濃度の非標識テスト抗体の存在において組換えｈＰＧとインキュベートすることにより決定される。
【０２８３】
テストアッセイにおいて、テスト抗体の存在における観察されたＲＬＵにおける有意な低下は、テスト抗体が、参照抗ｈＰＧ抗体と実質的に同じエピトープを認識することを示す。
【０２８４】
結合の阻害は阻害定数又はＫｉとして表現することができ、以下：
Ｋｉ＝ＩＣ５０／（１＋（［参照抗ｈＰＧ  Ａｂ濃度］／ＫＤ参照抗ｈＰＧ  Ａｂ））
の式に従って算出される。
式中、「ＩＣ５０」は、参照抗体の結合における５０%低下をもたらすテスト抗体の濃度であり、ＫＤ参照抗ｈＰＧ  Ａｂは参照抗ｈＰＧ抗体の解離定数（ｈＰＧについてのその親和性の測定値）である。参照抗ｈＰＧ抗体（例えば、本明細書に記載する抗ｈＰＧ抗体の１つ）と競合する有用なテスト抗体は、典型的には、本明細書に記載するアッセイ条件下で１０pM〜１００nMの範囲のＫｉｓを有する。
【０２８５】
本願において引用する全ての刊行物、特許、特許出願、及び他の文書が、各々の個々の刊行物、特許、特許出願、又は他の文書が全ての目的のために参照により組み入れられることが個々に示される場合と同じ程度まで、全ての目的のためにそれらの全体において参照により本明細書により組み入れられる。
【０２８６】
種々の特定の実施態様が例証及び記載されているが、種々の変化を、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく作ることができることが理解されるであろう。
【図８Ａ】
0005930972.tif 000016
【図８Ｂ】
0005930972.tif 000017
【図１０】
0005930972.tif 000018
【図３１Ａ】
0005930972.tif 000019
【図３１Ｂ】
0005930972.tif 000020
【図３１Ｃ】
0005930972.tif 000021
【図３１Ｄ】
0005930972.tif 000022
【図３１Ｅ】
0005930972.tif 000023
【図３１Ｆ】
0005930972.tif 000024
【図３１Ｇ】
0005930972.tif 000025
【図３１Ｈ】
0005930972.tif 000026
【図３１Ｉ】
0005930972.tif 000027
【図３１Ｊ】
0005930972.tif 000028
【図３１Ｋ】
0005930972.tif 000029
【図３１Ｌ】
0005930972.tif 000030
【図３２Ａ】
0005930972.tif 000031
【図３２Ｂ】
0005930972.tif 000032
【図３２Ｃ】
0005930972.tif 000033
【図３２Ｄ】
0005930972.tif 000034
【図３２Ｅ】
0005930972.tif 000035
【図３２Ｆ】
0005930972.tif 000036
【図３２Ｇ】
0005930972.tif 000037
【図３２Ｈ】
0005930972.tif 000038
【図３２Ｉ】
0005930972.tif 000039
【図３２Ｊ】
0005930972.tif 000040
【図３２Ｋ】
0005930972.tif 000041
【図３２Ｌ】
0005930972.tif 000042
【図３２Ｍ】
0005930972.tif 000043
【図３２Ｎ】
0005930972.tif 000044
【図３２Ｏ】
0005930972.tif 000045
【図３２Ｐ】
0005930972.tif 000046
【図３２Ｑ】
0005930972.tif 000047
【図３２Ｒ】
0005930972.tif 000048
【図３２Ｓ】
0005930972.tif 000049
【図３２Ｔ】
0005930972.tif 000050
【図３２Ｕ】
0005930972.tif 000051
【図３２Ｖ】
0005930972.tif 000052
【図３２Ｗ】
0005930972.tif 000053
【図３２Ｘ】
0005930972.tif 000054
【図３２Ｙ】
0005930972.tif 000055
【図３２Ｚ】
0005930972.tif 000056
【図１】
0005930972.tif 000057
【図２】
0005930972.tif 000058
【図３】
0005930972.tif 000059
【図４】
0005930972.tif 000060
【図５】
0005930972.tif 000061
【図６Ａ】
0005930972.tif 000062
【図６Ｂ】
0005930972.tif 000063
【図７】
0005930972.tif 000064
【図９】
0005930972.tif 000065
【図１１】
0005930972.tif 000066
【図１２】
0005930972.tif 000067
【図１３】
0005930972.tif 000068
【図１４】
0005930972.tif 000069
【図１５】
0005930972.tif 000070
【図１６】
0005930972.tif 000071
【図１７】
0005930972.tif 000072
【図１８Ａ】
0005930972.tif 000073
【図１８Ｂ】
0005930972.tif 000074
【図１９Ａ】
0005930972.tif 000075
【図１９Ｂ】
0005930972.tif 000076
【図２０】
0005930972.tif 000077
【図２１】
0005930972.tif 000078
【図２２】
0005930972.tif 000079
【図２３】
0005930972.tif 000080
【図２４】
0005930972.tif 000081
【図２５】
0005930972.tif 000082
【図２６】
0005930972.tif 000083
【図２７】
0005930972.tif 000084
【図２８】
0005930972.tif 000085
【図２９】
0005930972.tif 000086
【図３０】
0005930972.tif 000087
【配列表】
0005930972000001.app