(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルギニン３〜１３残基が連続したアミノ酸配列からなるペプチドを薬物に付加したペプチド誘導体に、１−ピレン酪酸を組み合わせることを特徴とする皮膚導入システム。
【請求項３】
アルギニンの残基数が９〜１３である請求項１記載の皮膚導入システム。
【請求項４】
前記薬物が、タンパク質、ペプチド、低分子化合物から選択される請求項１または３記載の皮膚導入システム。
【請求項５】
前記タンパク質がＥＧＦＰである請求項４記載の皮膚導入システム。
【請求項６】
前記低分子化合物がハイドロキノンである請求項４記載の皮膚導入システム。
【請求項７】
ハイドロキノンにアルギニン３〜１３残基が連続したアミノ酸配列からなるペプチドを付加したハイドロキノンのペプチド誘導体を含む美白剤であって、１−ピレン酪酸との組み合わせを特徴とする美白剤。
【請求項９】
医薬品、医薬部外品または化粧料に添加して用いられる請求項７記載の美白剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品、医薬部外品または化粧料等に応用可能な皮膚導入システムに関する。本発明はまた、該システムを利用した美白剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的に薬物を経皮的に吸収させる方法としては、標的薬剤に脂溶性官能基を付加し、エステルまたは界面活性剤、酵素などの試薬を同時に使用する化学的吸収促進法（特許文献１）や、非イオン系界面活性剤、グリセリン単中鎖脂肪族エステル、アミド化合物などの吸収促進剤と超音波を併用する方法（特許文献２）およびマイクロニードルによる小孔形成により角質層へ吸収させる方法といった物理的吸収促進法（特許文献３）などが挙げられる。【０００３】
しかしながら、化学的吸収促進法では、現在のところ充分な効果は得られておらず、また、物理的吸収促進法では、導入に関して装置を必要とし、さらに表皮を傷つける可能性が指摘されている。【０００４】
一方、アルギニンが複数個連続したアミノ酸配列を有するペプチドが生体膜通過シグナル配列として機能し、細胞膜透過性を有することが報告されている（特許文献４）。しかしながら、皮膚に対して適用した場合、どの程度皮膚組織の各細胞内に導入されるかなどについては、これまで全く報告されていない。【０００５】
特に、分子量５００Ｄａ以上の化合物や非脂溶性薬物などの皮膚導入については、これまでに有効な導入システムは報告されていない。【０００６】
また、メラニン産生およびメラニン輸送のメカニズムは、その基礎研究・応用研究に従事する者のみならず、広く一般の人々の間においても絶えず関心の尽きない話題である。過度の日焼けなどの紫外線の強い刺激によりチロシナーゼが異常に活性化し、メラニン合成機能が非常に高くなり、代謝しきれない量のメラニンが皮膚基底層から表皮にいたるまで残存する。これを長年繰り返すことにより、現れてくるのがシミである。【０００７】
ハイドロキノン（以下、ＨＱとも略称する）は美白成分としてアメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）が認めている唯一の成分であるが、肌への刺激性が非常に強いため４％を超えるものに関しては医師の処方が必要とされる。したがって、一般に市販されている化粧品などでは配合されているハイドロキノン濃度は有効濃度よりかなり低く、その効果が期待できるものではない。【０００８】
また、美白効果のある濃度でハイドロキノンを使用した場合、「白抜き」と呼ばれる一部分が非常に白く色素が脱色されまだらになるような副作用を呈することも報告されている。これは、特に肌に敏感な女性への使用を考慮した場合、致命的な問題点となる。【０００９】
したがって、非脂溶性低分子化合物や、タンパク質などの高分子化合物など様々な有効成分をより効果的に皮膚に導入できる新たなシステムが切望されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２００７／１１９４６７号
【特許文献２】特開平１１−３３５２７１号公報
【特許文献３】特開２００４−５０１７２５号公報
【特許文献４】特開２００３−２５２８９８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、広範な薬物を効率的に皮膚の各組織の個々の細胞内へ導入することを可能とする皮膚導入システムを提供することである。また、このシステムを利用した、高い美白効果を奏する美白剤を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者が検討したところ、これまで知られているポリアルギニンやＴＡＴのタンパク質導入ドメインなどの細胞透過性シグナル配列を使用するだけでは、薬物を皮膚の各層のバリアを通過させて皮膚内へと導入することは可能でも、薬物が細胞と細胞の間の細胞間隙に存在してしまい皮膚の個々の細胞内への導入は困難であった。それにもかかわらず、驚くべきことに、アルギニン３〜１３残基が連続したアミノ酸配列からなるペプチドを薬物に付加し、１−ピレン酪酸などの皮膚導入促進剤を併用した場合には、該薬物の優れた、皮膚組織、とりわけ表皮および真皮から皮下組織、筋層までのそれぞれの細胞への導入・拡散が可能となることを見出し、本発明が完成された。【００１３】
すなわち、本発明は、アルギニン３〜１３残基が連続したアミノ酸配列からなるペプチドを薬物に付加したペプチド誘導体を、皮膚導入促進剤と組み合わせることを特徴とする皮膚導入システムに関する。本発明において、アルギニンは９〜１３残基がより好ましく、１１残基が最も好ましい。【００１４】
また、本発明に使用する皮膚導入促進剤としては、１−ピレン酪酸が好ましい。【００１５】
さらに、本発明の皮膚導入システムは、医薬品、医薬部外品または化粧料などの有効成分のように経皮吸収が望まれる広範な薬物に応用することができる。【００１６】
また、本発明は、ハイドロキノンにアルギニン３〜１３残基が連続したアミノ酸配列からなるペプチドを付加したペプチド誘導体を皮膚導入促進剤との組み合わせることを特徴とする新規美白剤に関する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、皮膚組織、とりわけ表皮および真皮から皮下組織までの細胞に広範な薬物を導入・拡散することが可能となる。また、本発明の皮膚導入システムは、経皮的な直接作用により効果的に薬物を導入できるため、薬剤を塗布したところにだけ局所的に強力な薬物作用を誘導することができる。【００１８】
本発明の美白剤は、ハイドロキノンの濃度を低く、たとえばハイドロキノン単独での有効濃度の約１００分の１程度に抑えることができ、それによりハイドロキノンの副作用である皮膚刺激や白抜きなどを抑えることができる。本発明の美白剤は、経皮的な直接作用が可能であるため、薬剤を塗布したところだけ局所的に強力な美白効果を誘導することができる。【００１９】
さらには、本発明の美白効果は、陰性対照であるコントロールおよび陽性対照であるハイドロキノンのみならず、ランダムなペプチドを使用した群とも比較検討して裏付けられたものであり、従来の他剤にはない、根拠に基づいた医療（ＥＢＭ）に即した美白剤として用いることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の美白剤の合成スキーム例である。
【図２】モルモットの皮膚に対する美白効果を評価する写真データである。（ａ）が治療前、（ｂ）が治療後の写真である。
【図３】ヘマトキシリン・エオジン染色を施した組織の顕微鏡像である。
【図４】フォンタナ・マッソン染色を施した組織の光学顕微鏡像である。
【図５】図４の組織におけるメラニン陽性細胞数を示すグラフである。
【図６】ＨＱおよびＨＱ−１１Ｒ投与による、Ｂ１６マウス悪性黒色腫瘍細胞におけるメラニン量の測定結果を示すグラフである。
【図７】Ｂ１６マウス悪性黒色腫瘍細胞におけるＥＧＦＰ導入を評価する蛍光顕微鏡像である。
【図８】モルモットの皮膚におけるＥＧＦＰ導入を評価する蛍光顕微鏡像である。
【図９Ａ】免疫組織染色による１−ピレン酪酸併用群および１−ピレン酪酸非併用群のＥＧＦＰ−１１Ｒの組織内分布を示す蛍光顕微鏡像である。
【図９Ｂ】図８Ａの蛍光顕微鏡像の青色に染色された核染色部分のスケッチである。
【図９Ｃ】図８Ａの蛍光顕微鏡像の緑色に蛍光を発しているＥＧＦＰ部分のスケッチである。
【図１０】１−ピレン酪酸併用ＥＧＦＰ−１１Ｒ群の経皮導入効果を示す皮膚組織の蛍光顕微鏡像である。
【図１１】ＭＢＴＨ法によるチロシナーゼ活性の測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の皮膚導入システムは、アルギニン３〜１３残基が連続したアミノ酸配列からなるペプチドを薬物に付加したペプチド誘導体に皮膚導入促進剤を組み合わせることを特徴とする。
【００２２】
連続するアルギニンの残基数としては９〜１３が好ましく、１１が最も好ましい。アルギニン残基が２以下または１４以上であると、薬物の皮膚からの導入効率が悪くなる傾向がある。アルギニン３〜１３残基が連続したアミノ酸配列からなるペプチドは、細胞増殖に影響を及ぼすことなく、また細胞障害性も示さないため、安全な薬剤である。
【００２３】
本明細書において、「付加した」との記載は、薬物がペプチドやタンパク質である場合には、アミノ酸同士のアミド結合を一般的には意味するが、そのアミド結合に限定されるものではない。そして薬物がペプチドやタンパク質である場合、このペプチド誘導体は、通常の人工合成法のみならず、遺伝子工学的手法を用いて製造することもできる。たとえば、数個のアルギニンが連続する配列および薬物のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを挿入した組換えベクターを作製し、適当な宿主細胞に組換えベクターを導入後、その宿主細胞を培養する。ついで、培養物を回収することにより、ペプチド誘導体を得ることができる。製造後、得られたペプチド誘導体は公知の方法で精製することもできる。これらのペプチド誘導体の製造法および精製法は、本分野において一般的な手法であり、当業者により容易に実施されるものである。また、薬物がアミノ酸、ペプチドおよびタンパク質以外の有機化合物である場合、薬物とアルギニン３〜１３残基が連続したアミノ酸配列からなるペプチドとの結合は、同等の活性を有する限り、たとえばシステインなどの他のアミノ酸や他の化学結合を介して行なうことができ、アルギニン３〜１３残基が連続したアミノ酸配列からなるペプチドと薬物との間には、たとえば１〜２０個、または１〜１０個、または１〜３個のアミノ酸残基が挿入されていてもよい。システインを利用する場合には、たとえば反応性のニトロピリジンスルフェニル（ＮＰＹＳ）基などを用いて様々な薬物と容易にＳ−Ｓ結合により連結することができる。
【００２４】
本発明の皮膚導入システムは、低分子化合物、ペプチド、タンパク質など広範な薬物に適用でき、特に限定されるものではない。たとえば表皮、真皮、皮下組織から筋層にかけて導入されることが望まれるようなタンパク質や生理活性ペプチド、低分子化合物などが挙げられる。最も好ましい薬物としては、ハイドロキノンやその類似化合物、ＥＧＦＰなどの分子量３０ｋＤａ程度の非常に大きなタンパク質などが挙げられる。美白剤に使用する場合など、ＨＱ以外のチロシナーゼ抑制効果を有する低分子製剤にも適用することができる。
【００２５】
また、本発明の薬物のペプチド誘導体には、有効成分である薬物以外に、皮膚研究のモデルに使用する場合など、細胞内に導入されたことを確認するためのマーカーを含有しても良い。マーカーは、特に限定されるものではなく、たとえば、フルオレセインイソチオシアネート（以下、ＦＩＴＣと略称する）、ローダミンなどの蛍光色素、およびＧＦＰなどの蛍光タンパク質を使用することができる。
【００２６】
もちろん現在使用されている、経皮用薬物にアルギニン３〜１３残基が連続したアミノ酸配列からなるペプチドを付加し、皮膚導入促進剤と組み合わせることにより、飛躍的にその導入効果を増大することができる。
【００２７】
本発明において使用される「皮膚導入促進剤」としては、高い疎水性を有する負に帯電したカウンターアニオンを使用することができ、具体的には１−ピレン酪酸が挙げられるが、これに限定されるものではない。皮膚導入促進剤を、薬物のペプチド誘導体と組み合わせる方法としては、特に限定されるものではないが、薬物のペプチド誘導体の塗布前、好ましくは直前〜６０分前、より好ましくは１〜３０分前、最も好ましくは２〜１０分前に皮膚導入促進剤により前処理することができる。
【００２８】
本発明の用途は、医薬品類はもとより、医薬部外品類、化粧品類等、経皮吸収を目的とするものであれば、どのような薬物にも適用可能である。
【００２９】
また、本発明の美白剤は、ハイドロキノンにアルギニン３〜１３残基が連続したアミノ酸配列からなるペプチドを付加したペプチド誘導体を皮膚導入促進剤と組み合わせることを特徴とするものである。臨床の現場では、４〜１０％程度のハイドロキノン濃度が、美白効果を得るために必要であると報告されているため、今回使用した０．２％ハイドロキノン量のＨＱ−１１Ｒは、ハイドロキノン単体と比較した場合、約２０〜１００倍程度の強いチロシナーゼ抑制効果を示し、日焼け後の美白および日焼けの予防のいずれの用途にも使用することができる。つまり、ハイドロキノンの実質的な使用量を約２０分の１〜約１００分の１程度に抑えることができる。
【００３０】
さらに、本発明の美白剤において、有効成分であるハイドロキノンのペプチド誘導体は、メラニン沈着抑制研究のモデルに使用する場合など、細胞内に導入されたことを確認するためのマーカーを含有しても良い。マーカーは、特に限定されるものではなく、たとえば、フルオレセインイソチオシアネート（以下、ＦＩＴＣと略称する）、ローダミンなどの蛍光色素、およびＧＦＰなどの蛍光タンパク質を使用することができる。
【００３１】
本発明において、有効成分である薬物のペプチド誘導体は、通常の人工合成法によって、または一般に市販されている人工合成機によってペプチド部分を製造し、通常の人工合成法などの一般的な方法により薬物を付加することにより製造することができる。製造後、得られたペプチド誘導体は、公知の方法で精製することもできる。これらのペプチド誘導体の製造法および精製法は、本分野において一般的な手法であり、当業者により容易に実施されるものである。
【００３２】
たとえば、薬物がハイドロキノンの場合、ペプチドの固相合成によりアルギニンを１残基ずつカルボキシル末端側から結合させ、所望の残基数結合した後、ニトロピリジンスルフェニル（ＮＰＹＳ）基などの反応性の側鎖を有するシステイン残基を１つ導入する。その後定法にて脱保護および精製したのち、メルカプトハイドロキノンと反応させ、システイン残基にハイドロキノンを結合させ、精製して本発明のハイドロキノンのペプチド誘導体を得ることができる（図１）。
【００３３】
本発明の皮膚導入システムの有効成分である薬物のペプチド誘導体や皮膚導入促進剤の剤形は、投与方法によって適宜設定することができる。具体的には、水溶液や乳液などの液剤、および軟膏などを例示することができる。
【００３４】
本発明の皮膚導入システムは、有効成分である薬物のペプチド誘導体と皮膚導入促進剤とを組み合わせた皮膚導入製剤として用いることができる。また、本発明の皮膚導入システムは、その投与方法に合わせて、有効成分である薬物のペプチド誘導体と皮膚導入促進剤とを含有するキットの態様にすることもできる。
【００３５】
本発明の皮膚導入システムの有効成分である薬物のペプチド誘導体の濃度は、使用する薬物、剤形、使用する基材などにあわせて適宜設定することができる。たとえば、薬物としてハイドロキノンを用い、親水性軟膏とする場合、薬物のペプチド誘導体の濃度は０．２〜２０ｍｇ／ｇであることが好ましい。
【００３６】
本発明の皮膚導入システムは、有効成分である薬物のペプチド誘導体の他に、適当な薬学的に許容され得る賦形剤、担体、溶媒、ゲル形成剤、酸化防止剤、希釈剤、等張化剤、ｐＨ安定化剤など、本技術分野において通常用いられている成分を添加してもよい。これらの添加剤は、通常当業者により適宜選択される。
【００３７】
本発明の薬物のペプチド誘導体を添加する医薬品、医薬部外品または化粧料としては、どのようなものでも使用することができ、特に限定されるものではないが、皮膚導入促進剤と組み合わせることによりその効果を発揮することができる。
【００３８】
以下、実施例によって、本発明の皮膚導入システムをさらに詳細に説明するが、本発明はその趣旨と適用範囲から逸脱しない限りこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００３９】
製造例１
（Ａ）保護ペプチド樹脂の構築
ペプチド自動合成機（４３３Ａ、アプライドバイオシステム（Applied Biosystems）社製）を用いて添付のソフトにしたがい、固相合成法により１個ずつアミノ酸をカルボキシル末端側から結合させＢｏｃ−Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）−［Ａｒｇ（Ｐｂｆ）］11−樹脂の合成を定法にて行なった。【００４０】
（Ｂ）脱保護と樹脂からの切り出し
精製後、脱保護を行い、樹脂から切り出し、Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）−［Ａｒｇ］11−ＮＨ2を得た。【００４１】
（Ｃ）ハイドロキノンへの付加
（Ｂ）で得られた、Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）−［Ａｒｇ］11−ＮＨ2（６０ｍｇ）を純水（１．２ｍｌ）に溶解し、２−メルカプトハイドロキノン（３．６ｍｇ、０．８当量）をアルゴン気流中で室温にて攪拌しながら添加した。一昼夜反応後、反応溶液を直接分取精製に供した。【００４２】
得られた粗精製物をＨＰＬＣ分取装置（ＬＣ−８Ａ−１、島津製作所製、カラム：ＯＤＳ３０×２５０ｍｍ）を用いて０．１％トリフルオロ酢酸を含む水−アセトニトリルの系で分取精製し、目的のペプチド誘導体の分画を得、アセトニトリルを留去した後、凍結乾燥粉末とし、目的物であるハイドロキノンのペプチド誘導体（ＨＱ−１１Ｒと略称する）２５ｍｇを得た。
ハイドロキノンに配列番号１記載のアミノ酸配列を有するペプチドを結合させたもの（ＨＱ−ＧＬＨＦＰＨＩＹＶＲＤ）も同様に製造した。【００４３】
製造例２
構築したpet21a ＥＧＦＰ−１１Ｒプラスミドを大腸菌ＢＬ２１株に形質転換した、その後、単一のコロニーをピックアップし、１００ｍＬのＬＢ−Ａｍｐ培地にて３７℃で一晩培養した。これを１ＬのＬＢ−Ａｍｐ培地に加えて、ＯＤ６００が０．６になるまで３７℃で培養した。その後、ＩＰＴＧを終濃度０．１ｍＭになるように加え、ｐＥＴ２１ａ−ＥＧＦＰ−１１Ｒについては２５℃で一晩培養した。培養後、発現誘導した培養液を集菌した（８，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）。続いて、８Ｍ 尿素、２０ｍＭ ＭＥＰＥＳ、１００ ｍＭ ＮａＣｌを含む溶菌バッファーを３０ｍＬ加えて懸濁させた後、超音波菌体破砕を行った（クボタ、Ｉｓｏｎａｔｅｒ２０１Ｍ）。破砕後、溶液を１２，０００ｒｐｍ、１５分、４℃で遠心し、上清を回収した。回収した上清を溶菌バッファーで平衡化したリジンビーズ（インビトロジェン、ＰｒｏＢｏｎｄ Ｒｅｓｉｎ）と反応させた。その後、８Ｍ 尿素、２０ｍＭ ＭＥＰＥＳ、１００ ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ イミダゾールを含む洗浄バッファーで３回洗浄した。洗浄後、８Ｍ 尿素、２０ｍＭ ＭＥＰＥＳ、１００ ｍＭ ＮａＣｌ、２００ｍＭ イミダゾールを含む溶出バッファーで溶出し、回収した。【００４４】
回収したタンパク質溶液中のイミダゾールを除去するために、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（登録商標）Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｃａｓｓｅｔｔｅ（Ｅｘｔｒａ Ｓｔｒｅｎｇｔｈ）（テルモ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）により透析を行った。透析用のバッファーとして、１０００倍量のＰＢＳを使用した。透析は６時間を２回行なった。最終的に、目的の濃度になるように限外濾過法にてタンパク濃縮を行った。【００４５】
実施例１：褐色モルモットを用いた美白効果の検討
実験には、褐色モルモット（Weiser-Maples、８週齢、雌、各群ｎ＝５）を使用した。褐色モルモットは、表皮基底層に色素細胞を有しており、ヒトの皮膚と似ている。紫外線照射により、ヒトと同様の皮膚反応を示し、メラニン色素の沈着を形成する。そのため、美白効果のアッセイに用いることができる。【００４６】
脱毛した褐色モルモットの背中をバリカン（ＥＲ５０９、松下電工）および除毛クリーム（epilat, Kracie）により脱毛した。脱毛した褐色モルモットの背中に、照射面積を一区画６ｃｍ2で４区画設定し、紫外線ＵＶＢ強度測定装置（ＶＬＸ−３,Ｗ、アトー株式会社製）にてＵＶ強度を測定しつつ、ＵＶ照射機（ＭＯＤＥＬ  ＵＶＭ−５７、フナコシ）により、１日１回紫外線量０．０１５Ｊｌｓ／ｃｍ2を５日間照射し、２日間休んでさらに５日間照射した。日焼けモデルを作製後、プロピレングリコールにて調整した５００μＭの１−ピレン酪酸５０μＬを塗布し、５分後、プロピレングリコールにて調整した５００μＭのＨＱ−１１Ｒ、ＨＱ、ＨＱに配列番号１記載のアミノ酸配列を有するペプチドを結合させたもの（ＨＱ−ＧＬＨＦＰＨＩＹＶＲＤ）およびＰＢＳ（陰性対照）を１回につき５０μＬずつ塗布した。【００４７】
投与スケジュールは、５日間連続塗布（１日１回）−２日休薬−再度５日間塗布（１日１回）−２日休薬、とした。【００４８】
結果、外観にてＨＱ−１１Ｒを用いた群の塗布部分のみが効果的な美白作用を示した（図２）。【００４９】
さらに、美白効果を顕微鏡下で詳細に検討するために、ヘマトキシリン・エオジン染色とフォンタナ・マッソン染色後、光学顕微鏡（×４０）にて観察し、組織障害およびリンパ球の浸潤、メラニン含有細胞について後述する手順で評価を行なった（図２、図３、図４）。ＨＱ−１１Ｒ群の塗布部分の組織においては、他の群と同様、アレルギー反応やリンパ球浸潤などの細胞・組織障害性は認められず、４群間において有意な差は認められなかった（図３）。フォンタナ・マッソン染色においてメラニン含有細胞数を確認したところ、明らかにＨＱ−１１Ｒ群の塗布部で有意に陽性細胞、すなわちメラニン含有細胞４が減少していた（図４）。図４のメラニン含有細胞数を各群２０視野にて観測し、スチューデントＴ検定にて、他の群と統計学的に評価したところ、ＨＱ−１１Ｒ群が有意差（ｐ＜０．０１）をもって他群よりもメラニン含有細胞の減少を認めた（ｐ＜０．０１、図５）。【００５０】
（免疫染色）
新鮮凍結切片を、４％ＰＦＡにて１０分間固定した。ＰＢＳにて３回洗浄した。ブロッキング緩衝液（ＰＢＳで調整した５％ ＢＳＡおよび０．３％トリトン）にてブロッキングを行った。ＰＢＳにて１回洗浄した。濃度１ｕｇ／ｍｌとなるようＰＢＳ中１０％ＢＳＡにて調整した一次抗体を添加し、４℃、１６時間静置した。ＰＢＳにて３回洗浄した。濃度１μｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳ中１０％ＢＳＡにて調整した二次抗体を添加し、暗所、室温で２時間静置した。ＰＢＳにて３回洗浄した。ヘキストを添加し、暗所で１分間染色した。ＰＢＳにて３回洗浄し、共焦点レーザー顕微鏡にて観察した。【００５１】
（フォンタナ・マッソン染色）
パラフィン切片を作製し、キシレンに５分間、１００％エタノール、９５％エタノール、９０％エタノールおよび７０％エタノールを順に各１分間滴下した。水洗し、１０％フォンタナアンモニア銀染色液を滴下し、遮光して１６時間静置した。水洗し、０．２５％チオ硫酸ナトリウム水溶液を１分間滴下した。水洗し、ケルンエヒトロート液を５分間滴下した。水洗し、７０％エタノール、９０％エタノール、９５％エタノールおよび１００％エタノールを順に各１分間滴下した。キシレンを５分間滴下し、封入し観察した。【００５２】
（フォンタナ・マッソン染色によるメラニン陽性細胞数の計測）
フォンタナ・マッソン染色を行ったサンプルについて、各サンプルにつき顕微鏡にて基底層をランダムに１０箇所撮影し、各箇所でのメラニン陽性細胞の個数を計測した。【００５３】
実施例２：メラニン含有量に対するＨＱ−１１Ｒの阻害効果【００５４】
マウス悪性メラノーマ細胞Ｂ１６細胞（Mouse B16 melanoma 4A5、ECACC）を用いて細胞内のメラニン量に対する効果を評価した。Ｂ１６細胞は、マウスの皮膚に発生した悪性黒色腫瘍細胞であり、特異的なメラニン産生能を有している。そのため、メラニン合成に関わる機能調節やメラニン産生抑制物質検索のための研究材料として汎用されている。Ｂ１６細胞は１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ギブコ、カールスバッド、ＣＡ、米国）、１００単位／ｍｌペニシリン（ギブコ）、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ギブコ）、および０．２％Ｌ−グルタミン（ギブコ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ギブコ）を用いてプラスチックディッシュ（直径１０ｃｍ、コーニング、グレンデール、ＡＺ、米国）中で、３７℃、５％ＣＯ2下で培養した。６ウェルプレートにＢ１６細胞を１ウェルあたり１×１０5個播種し、前述の培地を用いて３７℃、５％ＣＯ2下で培養後、最終濃度が５０μＭとなるように、ＰＢＳにて希釈した１−ピレン酪酸を添加し、３７℃、５％ＣＯ2下で２分間培養した。その後、ＰＢＳにて希釈したＨＱ、ＨＱ−１１Ｒ、ＨＱに配列番号１記載のアミノ酸配列を有するペプチドを結合させたもの（ＨＱ−ＧＬＨＦＰＨＩＹＶＲＤ）を最終濃度が各１０、２０および３０μＭになるように添加し（対照群は、ＰＢＳのみ添加）、２４時間培養した後、１Ｎ ＮａＯＨを０．５ｍｌ加えて８０℃で１時間メラニン可溶化処理を行い、吸光光度計にて４１５ｎｍの波長で測定した。【００５５】
結果を対照との比として図６に示す。ＨＱ単独およびＨＱ−１１Ｒ投与された細胞ではメラニン量が顕著に減少していた。また、ＨＱ−ＧＬＨＦＰＨＩＹＶＲＤ投与群では、ＨＱと同等の効果は得られず、２０μＭまでほとんどメラニン量に変化はみられなかった。さらに１１Ｒのみ投与している群では、メラニンの減少は全く認められなかった。これにより、細胞レベルにおいては、ＨＱ−１１ＲはＨＱと同等またはそれ以上のメラニン減少効果が認められた。【００５６】
実施例３：アルギニン１１残基が連続したアミノ酸配列にＥＧＦＰ（高感度緑色蛍光タンパク質：enhanced green fluorescence protein）を付加した化合物（ＥＧＦＰ−１１Ｒ）についての検討【００５７】
（Ａ）細胞膜通過作用の評価
マウス悪性メラノーマ細胞Ｂ１６細胞（Mouse B16 melanoma 4A5、ECACC）を用いて、細胞膜通過作用に対する評価を行なった。Ｂ１６細胞は１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ギブコ、カールスバッド、ＣＡ、米国）、１００単位／ｍｌペニシリン（ギブコ）、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ギブコ）、および０．２％Ｌ−グルタミン（ギブコ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ギブコ）を用いてプラスチックディッシュ（直径１０ｃｍ、コーニング、グレンデール、ＡＺ、米国）中で、３７℃、５％ＣＯ2下で培養した。コンフルエント状態にまで培養した細胞を回収し、１０分の１量の細胞を３ｍｌの新しい培地を含む３５ｍｍガラスボトムディッシュ（松浪硝子工業株式会社）に播き培養を続け、翌日のＥＧＦＰ導入観察に用いた。【００５８】
Ｂ１６細胞を培養したガラスボトムディッシュをＰＢＳにて２回洗浄した。ついで、１−ピレン酪酸処理群にはＰＢＳにて希釈した６７ｍＭ １−ピレン酪酸を最終濃度が５０μＭとなるように添加し、３７℃、５％ＣＯ2下で２分間培養した後、最終濃度５μＭとなるように、ＰＢＳで希釈した製造例２で得られたＥＧＦＰ−１１Ｒを添加した。もう一群には、最終濃度５μＭとなるように、ＰＢＳにて希釈したＥＧＦＰ−１１Ｒを添加した。どちらも３７℃、５％ＣＯ2下で２分間培養した後、ＰＢＳにて２回洗い、培養培地に置き換え、０．５、２、４、８時間ごとに共焦点レーザー顕微鏡にて観察した。【００５９】
１１個のアルギニンである１１Ｒを融合したタンパク質ＥＧＦＰ−１１Ｒ５は、細胞膜を通過して、細胞内に局在し、１１Ｒを付加していないＥＧＦＰは、細胞内へと導入されなかった。また、６７μＭの１−ピレン酪酸で２分間処理を行い、ＥＧＦＰ−１１Ｒを同量加えた群は、細胞内に導入され、より細胞内での緑色蛍光物質の拡散の増強が認められた（図７）。【００６０】
（Ｂ）モルモット皮膚へのＥＧＦＰ−１１Ｒ導入
実験には褐色モルモット（Weiser-Maples、８週例、雌、ｎ＝５）を用いた。モルモットの背中をバリカン（ＥＲ５０９、松下電工）および除毛クリーム（epilat, Kracie）により脱毛した。プロピレングリコールに溶解した５００μＭの１−ピレン酪酸を５０μＬずつモルモット皮膚６ｃｍ2あたり塗布した。５分後、同じ部位にプロピレングリコールに溶解したＥＧＦＰ−１１Ｒ（５０μＭ）およびＥＧＦＰ（８０μＭ）を５０μＬずつ塗布した。塗布後０．５時間、２時間、４時間、８時間、２４時間ごとにデルマパンチ（３ｍｍ、マルホ株式会社）を用いて皮膚サンプルを採取した。新鮮凍結切片（厚さ１０μｍ）を作成後、ローダミン  ファロイジン、ＤＡＰＩにより染色を行った。そして、共焦点レーザー顕微鏡により観察した。ＥＧＦＰ６のみでは、皮膚への導入は見られなかった。ＥＧＦＰ−１１Ｒのみの塗布群では、ＥＧＦＰ−１１Ｒ５は皮膚組織へと導入されたが、皮膚の細胞内へは導入されずに皮膚構成細胞間隙に局在し組織全体（表皮・真皮・皮下組織）への拡散は認められなかった（図８）。１−ピレン酪酸とＥＧＦＰ−１１Ｒとの組み合わせ群では皮膚塗布後０．５時間より、表皮・真皮・皮下組織全体へ拡散し、４〜８時間でピークに達し、２４時間後でも皮膚内に残存していることを確認した（図９および図１０）。図１０中、白く光って観察される部分がＥＧＦＰ−１１Ｒが存在する部分である。【００６１】
参考例１：細胞生存能の評価
９６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ、ＡＧＣテクノグラス株式会社）５枚にＢ１６細胞を３７℃、５％ＣＯ2下で１ウェルあたり５００個培養した。１６時間後、ＰＢＳにて希釈したハイドロキノン（シグマ−アルドリッチ）およびＨＱ−１１Ｒを５００ｎＭ、５μＭ、５０μＭとなるように添加し、３７℃、５％ＣＯ2下で静置した。０、２４、４８、７２時間ごとにプレートを室温に平衡化し、調整したCell Titer-Glo試薬（Cell Titer-Glo Luminescent Cell Viability Assay、プロメガ）を、各ウェルに培地と等量添加した。シェーカーで２分間攪拌し、室温で１０分間静置している間に、各ウェルをホワイトプレート（マイクロプレート９６−ウェル  Pswhite、Porvair advanced materials）に移した。ルミノメーター（MicroLumat Plus LB 96V, Berthold technologies）にて発光シグナルを測定した。
従来のハイドロキノン投与群と比較し、毒性その他に関してはＨＱ−１１Ｒ投与群との間に有意な差は無く、１１Ｒを付加したことによる新たな有害事象は認めなかった。【００６２】
参考例２：ＭＢＴＨによるチロシナーゼ活性の測定
９６ウェルプレートにＢ１６細胞を１ウェルあたり５０００個播き、３７℃、５％ＣＯ2下で１２時間培養した。培養液を捨て、ＰＢＳにて希釈した１％トリトン  Ｘ−１００、０．１％  Ｌ−ＤＯＰＡ（３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン）および２０．７ｍＭ ＭＢＴＨ（３−メチル−２−ベンゾ−チアゾリノンヒドラゾン塩酸塩一水和物、和光純薬工業株式会社）をそれぞれ１ウェルあたり５０μＬ添加し、５．０μＭ、５００ｎＭまたは５０ｎＭのＨＱ−１１Ｒを１ウェルあたり５０μＬ添加した後、３７℃で２時間培養した。マイクロプレートリーダー（ＭＴＰ−３００、コロナ電気株式会社）を用いてＯＤ４９２ｎｍ吸光度を測定した（参考文献：Winder AJ., et al., Eur J Biochem. 1991 Jun 1; 198(2):317-326）。
結果を図１１に示す。ＨＱ−１１Ｒは濃度依存的にチロシナーゼ活性を阻害した。
【符号の説明】
【００６３】
１  角質層
２  表皮
３  真皮
４  メラニン含有細胞
５  ＥＧＦＰ−１１Ｒ
６  ＥＧＦＰ
【配列表フリーテキスト】
【００６４】
配列番号１：人工的なランダムなアミノ酸配列を有するペプチド
【図１】
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【図２】
0005940542.tif 000003
【図３】
0005940542.tif 000004
【図４】
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【図５】
0005940542.tif 000006
【図６】
0005940542.tif 000007
【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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