(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの２つの塩基間に組み込まれた少なくとも１つの修飾を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、修飾がアンチセンスオリゴヌクレオチドの結合親和性及びヌクレアーゼ耐性を高め、そして修飾が構造：
【化１】
0006053684.tif 000025
（式中、オリゴヌクレオチドに修飾を配置する連結基Ｌ1及びＬ2は、独立してアルケニルであり；Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ5は、独立して水素、又はアルキルであり；Ｒ6、Ｒ7、Ｒ9〜Ｒ12は、独立して水素、アルキル、又は電子吸引基であり；Ｒ8は、水素、アルキル、又は電子吸引基であり；そしてＸは窒素であり、ここで、Ｒ6〜Ｒ12のうちの一つは電子吸引基である）
を有する、上記アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
修飾が末端ヌクレオチドの３塩基内にある、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
修飾がアンチセンスオリゴヌクレオチドの３'又は５'末端のいずれかの末端塩基と最後から２番目の塩基との間に位置する、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
修飾がアンチセンスオリゴヌクレオチドの３'及び５'末端の両方で末端塩基と最後から２番目の塩基との間にある、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
Ｒ8がＮＯ2である、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
修飾が構造：
【化２】
0006053684.tif 000026
を有する、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの２'−Ｏ−メチルＲＮＡをさらに含む、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
アンチセンスオリゴヌクレオチドが、１つ又はそれ以上のホスホロチオエート結合をさらに含む、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ホスホジエステル結合を通して結合された塩基領域を含み、ここで、その領域は、一方又は両方の末端でホスホロチオエート結合を含む領域が側面に位置している、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
構造：
５'−Ｘ1−Ｚ−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｚ−Ｘ5−３'
（式中、Ｘ1及びＸ5は、独立して１−３個のヌクレオチドであり、ここで、ヌクレオチド間結合は、場合によりホスホロチオエートであり；Ｚは、請求項１で定義された構造を有するナフチレン−アゾ化合物であり；Ｘ2及びＸ4は、独立して１〜５個のヌクレオチドであり、ここで、ヌクレオチド間結合は、場合によりホスホロチオエートであり；そしてＸ3は、１０〜２５個のヌクレオチドである）を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対するクロス・リファレンス
本明細書は、２０１０年９月７日に出願の米国仮出願第６１／３８０,５８６号から優先権の利益を請求し、その開示は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。連邦支援の研究又は開発に関する供述
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所（National Institutes of Health）（ＮＩＨ）の国立一般医科学研究所（National Institute of General Medical Sciences）からの中小企業技術革新研究制度（Small Business Innovation Research）（ＳＢＩＲ）認可第５Ｒ４４ＧＭ０８５８６３−０２号及び同第５Ｒ４４ＧＭ０８５８６３−０３号によって一部支援された。政府は、本発明にある種の権利を有することができる。
【０００３】
本発明は、安定性を改善するため、そしてヌクレアーゼ分解から保護するために修飾が用いられる、アンチセンスオリゴヌクレオチドの修飾に関する。
【背景技術】
【０００４】
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、相補的標的に結合してその標的の機能を抑制する合成核酸である。典型的に、ＡＳＯは、ＲＮＡ標的、特にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）又はミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）種の発現を低下させる又は変えるために用いられる。一般的な原則として、ＡＳＯは、１）ＡＳＯが標的核酸にしっかりと結合してその種を不活性化し、細胞生物学におけるその関与を妨げる立体障害（steric blocking）によるか、又は２）ＡＳＯが標的に結合し、そして標的核酸種を分解する細胞ヌクレアーゼを活性化する分解の誘発によることを含む、２つの異なる作用機序により遺伝子発現を抑制することができる。ある種の「標的分解」ＡＳＯは、「ＲＮａｓｅ Ｈ活性」であり、標的ＲＮＡとＤＮＡ含有「ＲＮａｓｅ Ｈ活性」ＡＳＯとのハイブリダイゼーションによるヘテロ二本鎖核酸の形成は、酵素ＲＮａｓｅ Ｈの基質を形成する。ＲＮａｓｅ Ｈは、ヘテロ二本鎖分子のＲＮＡ部分を分解し、それによってその種の発現を低下させる。標的ＲＮＡの分解はＡＳＯを放出し、それは分解されず、次いで自由に再利用され、そして同じ配列の別のＲＮＡ標的を結合することができる。アンチセンス戦略、オリゴヌクレオチドデザイン、及び化学修飾の概要については、非特許文献１を参照のこと。
【０００５】
未修飾ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ヒト血清中にインキュベートされたときに数分の半減期を有する。従って、未修飾ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ＡＳＯとしての有用性が制限されている。血清中に存在する一次ヌクレアーゼ（primary nuclease）は、３'−エキソヌクレアーゼ活性を有する（非特許文献２）。ＡＳＯは、細胞内区画に接近したら、エンドヌクレアーゼ分解を受けやすくなる。歴史的に、広範囲にわたる使用を獲得した最初の機能性ＡＳＯは、ホスホロチオエート（phosphorothioate）基（ＰＳ）で修飾されたＤＮＡを含む。ヌクレオチド間結合のＰＳ修飾は、ヌクレアーゼ耐性をもたらし、血清中及び細胞中でＡＳＯをより安定にする。追加の利益として、ＰＳ修飾は、アルブミンのような血清タンパク質へのＡＳＯの結合も高め、静脈注射後の腎排泄速度が低下し、それにより薬物動態が改善され、そして機能的性能が改善される（非特許文献３）。しかし、ＰＳ修飾されたＡＳＯは、組織中の半減期が１〜３日に制限されており、そしてＰＳ修飾は、標的ＲＮＡに対するＡＳＯの結合親和性を低下させ、それは効力を低下させることがある（非特許文献４）。
【０００６】
ＰＳ修飾は、ヌクレアーゼ安定性をもたらすが、それでもなおＲＮａｓｅ Ｈ作用の基質であるＲＮＡとのヘテロ二本鎖の形成が可能である点で独特である。メチルホスホナート又はホスホルアミダートのようなヌクレアーゼ耐性をもたらす他のほとんどの修飾は、標的ｍＲＮＡにハイブリッド形成したときに、ＲＮａｓｅ Ｈ基質であるヘテロ二本鎖を形成しない修飾である。ヌクレアーゼ耐性であり、そして標的ＲＮＡに対してより高い親和性を示すが、ＲＮａｓｅ Ｈが介在する分解経路をなお活性化する能力を保持している化合物を用いて改善された効力を得ることができた。
【０００７】
ヌクレアーゼ耐性をなお維持しながら、標的ＲＮＡに対する親和性を高めるためにさらなるデザイン改善を行った（ホスホジエステル結合による未修飾残基を含む領域の３'−修飾を含むデザインについては、特許文献１を参照のこと；また、中央の２'−デオキシ間隙領域に隣接する３'及び５'末端に２'−修飾された『ウィング（wings）』を提供する２'−メトキシエチルリボース（ＭＯＥ'ｓ）を有する「ギャップマー（Gapmer）」化合物については、特許文献２を参照のこと）。新たな戦略は、明確な機能的ドメインを有するキメラ分子を考慮に入れている。例えば、単一のＡＳＯは、高められたヌクレアーゼ安定性及び高められた結合親和性の両方をもたらすが、それ自体はＲＮａｓｅ Ｈ活性基質を形成しないドメインを含むことができ；同じＡＳＯ中の第２のドメインは、ＲＮａｓｅ Ｈ活性化することができる。単一分子中に両方の機能ドメインを有することでアンチセンス用途における性能及び機能効力が改善される。１つの成功した戦略は、ＲＮａｓｅ Ｈ活性化のために用意された異なる修飾を含む中央のドメインに隣接する、高められた結合親和性及び高められたヌクレアーゼ耐性をもたらすためのドメインを各末端に有する異なる化学基からＡＳＯを構築することである。このいわゆる「末端ブロック（end blocked）」又は「ギャップマー」デザインは、改善された機能「第二世代」ＡＳＯの基礎となる。このデザインの化合物は、通常、「第一世代」ＰＳ−ＤＮＡ ＡＳＯよりも遺伝子ノックダウン剤としてかなり強力である。典型的に、立体障害の作用機序を用いて機能するＡＳＯは、結合親和性を最大にしたときにより高い効力を示す。これは、結合親和性を高める化学修飾、例えば本明細書に議論された２'−リボース修飾の多く、小溝結合剤、又は本発明の内部非塩基性修飾剤を用いて実施することができる。別法として、高められた結合親和性は、より長い配列を用いて達成できる。しかし、ｍｉＲＮＡのようないくつかの標的は短く、典型的に２０〜２４塩基の長さしかない。この場合、ＡＳＯをより長くして結合親和性を高めることは、不可能である。さらに、短い合成オリゴヌクレオチドは、長いオリゴヌクレオチドより有効に細胞に接近するため、結合親和性を高める修飾を有する短配列の使用は、望ましいものとなっている（例えば、非特許文献５を参照のこと）。本発明の化学修飾及び方法は、改善された機能的性能を示す、高められた結合親和性を有する比較的短いＡＳＯの合成を可能にする。
【０００８】
結合親和性及びヌクレアーゼ耐性の両方を改善するＡＳＯ修飾は、典型的に、製造に費用がかかる修飾ヌクレオシドである。修飾ヌクレオシドの例としては、メチル架橋が２'−酸素及び４'−炭素をつないで、リボースをＡ型コンフォメーションに固定しているロックド核酸（locked nucleic acids）（ＬＮＡ）が含まれ、また、ＬＮＡの変種、例えばさらなるメチル基を含むエチレン架橋された核酸（ＥＮＡ）、アミノ−ＬＮＡ及びチオＬＮＡも入手可能である。さらに、他の２'−修飾、例えば２'−Ｏ−メトキシエチル（ＭＯＥ）又は２'−フルオロ（２'−Ｆ）も、ＡＳＯに組み込むことができる。いくつかの修飾は安定性を低下させ、そしていくつかは毒性のような悪影響もたらすことがある（非特許文献６を参照のこと）。
【０００９】
本発明は、ＡＳＯ中の塩基間に挿入してヌクレアーゼ耐性及び結合親和性を改善し、それにより効力を高めることができる非ヌクレオチド修飾基を提供する。本発明の新規な修飾は、以前に記載された化学修飾（例えばＰＳヌクレオチド間結合、ＬＮＡ塩基、ＭＯＥ塩基、など）と共に、そして安価で非毒性であるＤＮＡ又は２'−Ｏ−メチルＲＮＡ（２'ＯＭｅ）のような天然に存在する核酸構成単位と共に用いることができる。本発明のこれらの及び他の利点、並びにさらなる本発明の特徴は、本明細書に提供された発明の説明から明らかである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】Walder et al.，米国特許第６,１９７,９４４号
【特許文献２】欧州特許第０６１８９２５号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Kurreck, 2003, Eur. J. Biochem., 270(8): 1628-44
【非特許文献２】Eder et al., 1991, Antisense Res. Dev. 1(2): 141-51
【非特許文献３】Geary et al., 2001, Curr. Opin. Investig. Drugs, 2(4): 562-73
【非特許文献４】Stein et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16(8): 3209-21
【非特許文献５】Straarup et al., 2010, Nucleic Acids Res. 38(20): 7100-11
【非特許文献６】Swayze et al., 2007, Nucleic Acids Res. 35(2): 687-700
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、結合親和性を高め、そしてヌクレアーゼ分解から保護するために修飾が用いられる、アンチセンスオリゴヌクレオチドのための非ヌクレオチド修飾を提供する。
【００１３】
また、本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの２つの塩基の間に組み込まれた少なくとも１つの修飾を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、修飾がアンチセンスオリゴヌクレオチドの結合親和性及びヌクレアーゼ耐性を高める、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。一実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、末端ヌクレオチドの３つの塩基内にある少なくとも１つの修飾を含む。別の実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの３'−又は５'−末端のいずれかの末端塩基と最後から２番目の塩基との間にある少なくとも１つの修飾を含む。さらなる実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの３'−及び５'−末端の両方の末端の塩基と最後から２番目の塩基との間に修飾を含む。
【００１４】
さらに、本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの２つの塩基の間に組み込まれた少なくとも１つの修飾を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、修飾がアンチセンスオリゴヌクレオチドの結合親和性及びヌクレアーゼ耐性を高め、そして修飾がナフチレン−アゾ化合物である、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【００１５】
さらに、本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの２つの塩基の間に組み込まれた少なくとも１つの修飾を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、修飾がアンチセンスオリゴヌクレオチドの結合親和性及びヌクレアーゼ耐性を高め、そして修飾が構造：
【化１】
0006053684.tif 000002
（式中、オリゴヌクレオチドの内部位置に修飾を配置する連結基Ｌ1及びＬ2は、独立してアルキル、アルキニル、アルケニル、ヘテロアルキル、置換されたアルキル、アリール、ヘテロアリール、置換されたアリール、シクロアルキル、アルキルアリール、又はアルコキシ基であり；Ｒ1〜Ｒ5は、独立して水素、アルキル、アルキニル、アルケニル、ヘテロアルキル、置換されたアルキル、アリール、ヘテロアリール、置換されたアリール、シクロアルキル、アルキルアリール、アルコキシ、電子吸引基、電子供与基、又はリガンドの結合点であり；そしてＸは窒素又は炭素原子であり、ここで、Ｘが炭素原子である場合、炭素原子に結合された第４の置換基は水素又はＣ1−Ｃ8アルキル基であることができる）を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【００１６】
さらに、本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの２つの塩基の間に組み込まれた少なくとも１つの修飾を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、修飾がアンチセンスオリゴヌクレオチドの結合親和性及びヌクレアーゼ耐性を高め、そして修飾が構造：
【化２】
0006053684.tif 000003
（式中、オリゴヌクレオチドの内部位置に修飾を配置する連結基Ｌ1及びＬ2は、独立してアルキル、アルキニル、アルケニル、ヘテロアルキル、置換されたアルキル、アリール、ヘテロアリール、置換されたアリール、シクロアルキル、アルキルアリール、又はアルコキシ基であり；Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ5は、独立して水素、アルキル、アルキニル、アルケニル、ヘテロアルキル、置換されたアルキル、アリール、ヘテロアリール、置換されたアリール、シクロアルキル、アルキルアリール、アルコキシ、電子吸引基、又は電子供与基であり；Ｒ6、Ｒ7、Ｒ9〜Ｒ12は、独立して水素、アルキル、アルキニル、アルケニル、ヘテロアルキル、置換されたアルキル、アリール、ヘテロアリール、置換されたアリール、シクロアルキル、アルキルアリール、アルコキシ、電子吸引基、又は電子供与基であり；Ｒ8は、水素、アルキル、アルキニル、アルケニル、ヘテロアルキル、置換されたアルキル、アリール、ヘテロアリール、置換されたアリール、シクロアルキル、アルキルアリール、アルコキシ、又は電子吸引基であり；そしてＸは窒素又は炭素原子であり、ここで、Ｘが炭素原子である場合、炭素原子に結合された第４の置換基は水素又はＣ1−Ｃ8アルキル基であることができる）を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。一実施態様において、Ｒ8はＮＯ2である。
【００１７】
さらに、本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの２つの塩基の間に組み込まれた少なくとも１つの修飾を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、修飾がアンチセンスオリゴヌクレオチドの結合親和性及びヌクレアーゼ耐性を高め、そして修飾が構造：
【化３】
0006053684.tif 000004
を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【００１８】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、当分野で知られた天然、非天然、又は修飾された塩基を含むことができる。また、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、通常、オリゴヌクレオチドの３'又は５'末端において小溝結合剤、スペーサー、標識、又は他の非塩基単位のようなさらなる修飾を含むことができるが、必ずしも含まなくてもよい。一実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、２'−Ｏ−メチルＲＮＡをさらに含み、そして場合により少なくとも１つのナフチレン−アゾ化合物を含む。別の実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合をさらに含む。さらなる実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル結合を通して結合された塩基領域を含み、ここで、領域は、一方又は両方の末端でホスホロチオエート結合を含む領域に隣接している。
【００１９】
さらに、本発明は、構造：
５'−Ｘ1−Ｚ−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｚ−Ｘ5−３'      式４
（式中、Ｘ1及びＸ5は、独立して１〜３個のヌクレオチドであり、ここで、ヌクレオチド間結合は、場合によりホスホロチオエートであり；Ｚは、ナフチレン−アゾ化合物であり；Ｘ2及びＸ4は、独立して１〜５個のヌクレオチドであり、ここで、ヌクレオチド間結合は、場合によりホスホロチオエートであり；そしてＸ3は、１０〜２５個のヌクレオチドである）を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【００２０】
一実施態様において、第３の修飾は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの中央周辺に挿入することができる。より長いヌクレオチド（２５塩基より大きい）については、間隔をおいてさらなる修飾を用いてより大きい安定性をもたらすことができる。
【００２１】
本発明の修飾では、修飾基が隣接する塩基間に挿入され、それによって低下した毒性並びに改善された親和性及び安定性を有するＡＳＯが生じる。塩基は、ＤＮＡ、２'ＯＭｅ ＲＮＡ、又は他の修飾された塩基であることができる。しかしながら、修飾された塩基を用いる必要はない。修飾は塩基間に挿入されるため、標準ホスホラミダイト合成化学を用いてホスホラミダイト化合物として加えることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ウシ胎児血清中の合成ＤＮＡオリゴマーの分解レベルを示すゲル写真である。一連の１０−ｍｅｒ一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドをその５'末端で３２Ｐにより微量標識化し、そして血清中３７℃で、指示された時間（０〜２４０分）、インキュベートした。反応生成物をポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で分離し、そしてホスファーイメージング（phosphor imaging）によって視覚化した。サンプルは、表４に同定された。
【図２】ルシフェラーゼレポーターアッセイを用いたさまざまなａｎｔｉ−ｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＡＭＯ）による相対的ｍｉＲ−２１抑制を示す。レニラ（Renilla）ルシフェラーゼ及びホタルルシフェラーゼを発現するレポータープラスミドをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。細胞抽出物を両酵素の相対的活性について調べ、そしてレニラルシフェラーゼ活性をホタルルシフェラーゼ活性に対して標準化した。レニラルシフェラーゼ遺伝子は、ｍｉＲ−２１結合部位を含み、そしてｍｉＲ−２１はＨｅＬａ細胞中で高度に発現される。異なるａｎｔｉ−ｍｉＲ−２１オリゴヌクレオチド（Ｘ軸）を細胞にトランスフェクトしたところ、ｍｉＲ−２１活性を抑制する異なるデザインの相対的能力は、レニラルシフェラーゼ活性の増大（Ｙ軸）と直接関係があった。
【図３】パーフェクトマッチ及び１つ、２つ、又は３つのミスマッチを有する化合物（ミスマッチパターン１）を比較するルシフェラーゼレポーターアッセイを用いたさまざまなＡＭＯによる相対的ｍｉＲ−２１抑制を示す。レニラルシフェラーゼ及びホタルルシフェラーゼを発現するレポータープラスミドをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。細胞抽出物を両酵素の相対的活性について調べ、そしてレニラルシフェラーゼ活性をホタルルシフェラーゼ活性に対して標準化した。レニラルシフェラーゼ遺伝子は、ｍｉＲ−２１結合部位を含み、そしてｍｉＲ−２１はＨｅＬａ細胞中で高度に発現された。異なるａｎｔｉ−ｍｉＲ−２１オリゴヌクレオチド（Ｘ軸）を細胞にトランスフェクトしたところ、ｍｉＲ−２１活性を抑制する異なるデザインの相対的能力は、レニラルシフェラーゼ活性の増大（Ｙ軸）と直接関係があった。
【図４】パーフェクトマッチ及び１つ、２つ、又は３つのミスマッチを有する化合物（ミスマッチパターン２）を比較するルシフェラーゼレポーターアッセイを用いたさまざまなＡＭＯによる相対的ｍｉＲ−２１抑制を示す。レニラルシフェラーゼ及びホタルルシフェラーゼを発現するレポータープラスミドをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。細胞抽出物を両酵素の相対的活性について調べ、そしてレニラルシフェラーゼ活性をホタルルシフェラーゼ活性に対して標準化した。レニラルシフェラーゼ遺伝子は、ｍｉＲ−２１結合部位を含み、そしてｍｉＲ−２１はＨｅＬａ細胞中で高度に発現された。異なるａｎｔｉ−ｍｉＲ−２１オリゴヌクレオチド（Ｘ軸）を細胞にトランスフェクトしたところ、ｍｉＲ−２１活性を抑制する異なるデザインの相対的能力は、レニラルシフェラーゼ活性の増大（Ｙ軸）と直接関係があった。
【図５】ＰＳ結合又はｉＦＱ修飾を有する又は有しないＤＮＡ ＡＳＯによるＨＰＲＴ発現のノックダウンを示す。ＡＳＯをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトし、そしてトランスフェクション２４時間後、ＲＮＡを調製した。相対的なＨＰＲＴレベルをＲＴ−ｑＰＣＲによって評価し、そしてＹ軸に報告した。
【図６】ＰＳ結合を有する又は有しない及びｉＦＱ修飾を有する又は有しない、キメラ「ギャップマー」ＡＳＯによるＨＰＲＴ発現のノックダウンを示す。ＡＳＯをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトし、そしてトランスフェクション２４時間後、ＲＮＡを調製した。相対的なＨＰＲＴレベルをＲＴ−ｑＰＣＲによって評価し、そしてＹ軸に報告した。
【図７】０．０１ｎＭ〜１．０ｎＭの範囲の用量でＤｓｉＲＮＡを用いたＨＰＲＴのノックダウンを示す。グラフの下に略図で示したような二本鎖内の位置でＤｓｉＲＮＡをｉＦＱ基により修飾した。ＤｓｉＲＮＡをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトし、そしてトランスフェクション２４時間後、ＲＮＡを調製した。相対的なＨＰＲＴレベルをＲＴ−ｑＰＣＲによって評価し、そしてＹ軸に報告した。
【図８】ＨｅＬａ細胞中、５０ｎＭ又は１００ｎＭで２４時間トランスフェクトしたときの、さまざまなＡＭＯ化学の毒性はプロファイルを示す。陰性対照又は「ＮＣ１」配列が、任意の知られたヒトｍｉＲＮＡ又はｍＲＮＡを標的にすることは予測されないため、毒性効果は、オリゴヌクレオチドの化学組成に特異的であるはずである。さまざまな化学修飾オリゴヌクレオチド（Ｘ軸）で処理した後の細胞生存率を、MultiTox-Glo Multiplex Cytotoxicity Assayを用いて測定し、そして細胞生存率を生存／死滅細胞の比率として算出し、細胞数に影響されないデータに標準化した（Ｙ軸）。生存／死滅細胞値の減少は、細胞生存率の低下と相関関係があった。
【図９】ＨｅＬａ細胞中、５０ｎＭ又は１００ｎＭで２４時間トランスフェクトしたときに、さまざまなＡＭＯ化学によって生じたアポトーシス誘導プロファイルを示す。陰性対照又は「ＮＣ１」配列が、任意の知られたヒトｍｉＲＮＡ又はｍＲＮＡを標的にすることは予測されないため、アポトーシスの誘導は、細胞中のオリゴヌクレオチドの化学組成の生物学的効果に特異的であるはずである。カスパーゼ−Ｇｌｏ ３／７アッセイ（Caspase-Glo 3/7 Assay）を使用し、ルシフェラーゼアッセイを用いてアポトーシスの既知のエフェクターであるカスパーゼ−３及びカスパーゼ−７のレベルを測定した。さまざまな化学修飾オリゴヌクレオチドで処理した後のアポトーシス誘導（Ｘ軸）は、ルミネセンスレベル（Ｙ軸）の上昇に比例した。
【００２３】
発明の詳述
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド間に配置された修飾を有し、ここで、修飾は相補的標的に対する親和性を高め、そしてヌクレアーゼ耐性をもたらす。本発明の一実施態様において、化合物は、米国出願第１３／０７３８６６号に記載されたものと同じであり、その開示は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【００２４】
本発明の別の実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、構造：
【化４】
0006053684.tif 000005
（式中、オリゴヌクレオチドの内部位置に修飾を配置する連結基Ｌ1及びＬ2は、独立してアルキル、アルキニル、アルケニル、ヘテロアルキル、置換されたアルキル、アリール、ヘテロアリール、置換されたアリール、シクロアルキル、アルキルアリール、又はアルコキシ基であり；Ｒ1〜Ｒ5は、独立して水素、アルキル、アルキニル、アルケニル、ヘテロアルキル、置換されたアルキル、アリール、ヘテロアリール、置換されたアリール、シクロアルキル、アルキルアリール、アルコキシ、電子吸引基、電子供与基、又はリガンドの結合点であり；そしてＸは窒素又は炭素原子であり、ここで、Ｘが炭素原子である場合、炭素原子に結合された第４の置換基は水素又はＣ1−Ｃ8アルキル基であることができる）を有する少なくとも１つの修飾を含む。本発明のさらなる実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、構造：
【化５】
0006053684.tif 000006
（式中、オリゴヌクレオチドの内部位置に修飾を配置する連結基Ｌ1及びＬ2は、独立してアルキル、アルキニル、アルケニル、ヘテロアルキル、置換されたアルキル、アリール、ヘテロアリール、置換されたアリール、シクロアルキル、アルキルアリール、又はアルコキシ基であり；Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ5は、独立して水素、アルキル、アルキニル、アルケニ
ル、ヘテロアルキル、置換されたアルキル、アリール、ヘテロアリール、置換されたアリール、シクロアルキル、アルキルアリール、アルコキシ、電子吸引基、又は電子供与基であり；Ｒ6、Ｒ7、Ｒ9〜Ｒ12は、独立して水素、アルキル、アルキニル、アルケニル、ヘテロアルキル、置換されたアルキル、アリール、ヘテロアリール、置換されたアリール、シクロアルキル、アルキルアリール、アルコキシ、電子吸引基、又は電子供与基であり；Ｒ8は、水素、アルキル、アルキニル、アルケニル、ヘテロアルキル、置換されたアルキル、アリール、ヘテロアリール、置換されたアリール、シクロアルキル、アルキルアリール、アルコキシ、又は電子吸引基であり；そしてＸは窒素又は炭素原子であり、ここで、Ｘが炭素原子である場合、炭素原子に結合された第４の置換基は水素又はＣ1−Ｃ8アルキル基であることができる）を有する少なくとも１つの修飾を含む。
【００２５】
本発明の組成物及び方法は、相補的配列に対してハイブリッド形成するその配列の能力を保持ながら、塩基間に挿入物として非塩基修飾基を配置することによるオリゴヌクレオチドの修飾を含む。通常、塩基間の非塩基修飾基の挿入は、その補体に対する修飾配列の親和性を著しく損失することになる。本発明の独特な組成物は、その補体に対する修飾配列の親和性を高め、安定性を高め、そしてＴｍを高める。塩基間のこのような非塩基修飾基の配置は、修飾された結合でヌクレアーゼが分解を開始するのを阻止する。オリゴヌクレオチドの両末端で第１塩基と第２塩基との間に配置された場合、配列は、５'−エキソヌクレアーゼ及び３'−エキソヌクレアーゼの両方による攻撃から保護される。配列内の中央の位置に配置すると、エンドヌクレアーゼにいくらかの耐性をさらに与えることができる。特に、上の式２の種類の化合物は、修飾された結合に隣接するいくつかの隣接ヌクレオチド間リン酸結合に対するヌクレアーゼ攻撃を妨げ、未修飾結合がヌクレアーゼ切断をより受けにくい保護された「領域」を作り出す。また、修飾は、ヌクレアーゼが末端塩基を切断するのを阻止する。従って、本発明の組成物及び方法は、修飾を用いないが、その代わりに残基間に挿入された非塩基修飾基を用いて高められたＴｍ及び高められたヌクレアーゼ耐性を有するＡＳＯの合成が可能である。
【００２６】
二本鎖核酸の結合親和性（Ｔｍ）を高める本発明の修飾基の能力は、実施例１に示されており、ここでは、一連の未修飾及び修飾された１０−ｍｅｒ二本鎖ＤＮＡオリゴマーについて融解試験を行った。本発明の組成物及び方法を用いると、２つの修飾基（オリゴマーの各末端における２つの末端塩基間）しか用いなくても＋１１℃の上昇が達成された。プロパンジオール基の挿入により作成された類似の二本鎖は、有意な不安定化を示し、非塩基挿入で予想された結果と一致した。
【００２７】
ヌクレアーゼ安定性を改善する本発明の修飾基の能力は、実施例２に示されており、ここでは、一本鎖ＤＮＡオリゴマーを血清中にインキュベートし（血清ヌクレアーゼにより分解を受ける）、次いでポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって完全性について試験した。未修飾ＤＮＡオリゴマーは、血清中で急速に分解されるのに対して、各末端において末端塩基間にナフチレン−アゾ修飾因子が挿入された１０−ｍｅｒＤＮＡオリゴヌクレオチドでは、４時間インキュベーション後に分解しない化合物が得られた。他の修飾基、例えばプロパンジオールスペーサーは、わずかに分解速度を遅らせただけだった。Ｔｍを高めるヌクレアーゼブロッキング修飾（nuclease blocking modifications）（例えばナフチレン−アゾ基）を一本鎖オリゴマーに挿入して性質を改善できる。このタイプの安定化されて結合親和性が高められたオリゴマーは、当業者によく知られたさまざまな用途を有することができる。例として（制限するものではない）、このようなオリゴマーをＡＳＯとして用い、細胞又は動物中でｍＲＮＡ又はｍｉＲＮＡレベルの低下を促進できる。このような例を、下の実施例３及び４に示す。
【００２８】
本発明のさらなる実施態様では、合成ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡのような二本鎖核酸にも修飾を組み込むことができた。修飾基の注意深い配置は、ヌクレアーゼ安定性を改善するはずであり、そしてＲＮＡ二本鎖中で非対称的に用いた場合、ＲＩＳＣへの鎖装填（strand loading ）に影響することがよく知られている局所的熱安定性を変えることができ（Peek and Behlke, 2007, Curr. Opin. Mol. Ther. 9(2): 110-18）、そのためＲＮＡｉの合成トリガーとして化合物の相対的な生物学的効力に影響を与える。
【００２９】
ｍｉＲＮＡに対する配向におけるオリゴヌクレオチドアンチセンスは、ｍｉＲＮＡを結合し、そしてその種がミクロＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（microRNA-Induced Silencing Complex）（ｍｉＲＩＳＣ）に関与するのを機能的に排除する（Krutzfeldt et al., 2007, Nucleic Acids Res. 35(9): 2885-92）。このようなａｎｔｉ−ｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＡＭＯ）は、立体的結合機構により機能すると考えられ、そして高い安定性及び高い親和性を有する化合物は、一般に低親和性化合物と比較して改善された機能的性能を示す（Lennox and Behlke, 2010, Pharm. Res. 27(9): 1788-99）。本発明のＡＳＯは、ａｎｔｉ−ｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチドとして機能できる。
【００３０】
本発明の修飾では、修飾基が隣接する塩基間に挿入され、それにより低下した毒性並びに改善された結合親和性及びヌクレアーゼ安定性を有するＡＳＯを生じる。塩基は、ＤＮＡ、２'ＯＭｅ ＲＮＡ、ＬＮＡ、又は他の修飾された塩基であることができる。しかし、修飾された塩基を用いる必要はない。修飾が塩基間に挿入されるため、標準ホスホラミダイト合成化学を用いてホスホラミダイト化合物としてそれを加えることができる。
【００３１】
ＡＳＯが遺伝子発現を変える又は改良するために用いられるさらに別の適用において、ＡＳＯは、イントロン／エクソンスプライス接合部位で又はその近くでｐｒｅ−ｍＲＮＡ種に対して相補的であるように設計されている。スプライス部位又はその近くでのＡＳＯの結合は、核スプライシング機構によりこのイントロン／エクソン接合部での処理を変更し、それによって最終的な成熟ｍＲＮＡ中に存在するスプライスパターンを変更することができる（すなわち、最終的に処理されたｍＲＮＡ中に含まれる又は排除されるエクソンを変更するために用いることができる）。ｍＲＮＡ成熟後、変更されたｍＲＮＡは、このＡＳＯ処理の結果として変更されたタンパク質種の合成を導く。スプライスブロッキングオリゴヌクレオチド（splice-blocking oligonucleotides）（ＳＢＯ）を設計する方法は、当業者によく知られている（例えば、Aartsma-Rus et al., 2009, Mol. Ther. 17(3): 548-53; and Mitrpant et al., 2009, Mol. Ther. 17(8): 1418-26を参照のこと）。ＳＢＯはｍＲＮＡの形態を変えるが、そのｍＲＮＡを破壊するものではないため、この種類のオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ分解を誘発する化学作用又はデザインでなく、立体障害アンチセンス作用機序に適合しうる化学作用を用いて作られる。ＳＢＯ使用の一例として、デュシェンヌ筋ジストロフィ（Duchene's Muscular Dystrophy）を生じるこの遺伝子の突然変異体形態を有する個体においてジストロフィン遺伝子のエクソン−スキッピングを誘導する（Muntoni and Wood, 2011, Nat. Rev. Drug Discov. 10(8): 621-37; and Goemans et al., 2011, N. Engl. J. Med. 364(16): 1513-22を参照のこと）。本発明のデザイン及び化学を用いた合成オリゴヌクレオチドは、ＳＢＯとして用いることができる。
【００３２】
一実施態様において、合成オリゴヌクレオチドは、配列の一方若しくは両方の末端で又はその近くに配置された本発明の非ヌクレオチド修飾因子を含む。別の実施態様において、合成オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの３'末端又は５'末端のいずれかの末端塩基と最後から２番目の塩基との間に配置された本発明の非ヌクレオチド修飾因子を含む。さらなる実施態様において、オリゴヌクレオチドは、３'末端及び５'末端の両方の末端塩基と最後から２番目の塩基との間に修飾を含む。
【００３３】
本発明の一実施態様において、修飾は、ナフチレン−アゾ化合物である。オリゴヌクレオチドは、ＳＢＯと標的ｐｒｅ−ｍＲＮＡとの複合体がＲＮａｓｅ Ｈの基質を形成しないような修飾塩基を用いて、例えば、２'−Ｏ−メチルＲＮＡ、２'−メチオキシエチルＲＮＡ（２'−ＭＯＥ）、２'−Ｆ ＲＮＡ、ＬＮＡ、及び同様のものを含む、当業者によく知られた化学修飾残基を用いて作られる。本発明の非ヌクレオチド修飾因子を用いて作られたＳＢＯは、同種の未修飾種と比較して高められた結合親和性を有する。これにより、細胞中への改善された取り込み及び改善された生物活性を示すことができるより短い配列の使用が可能となる。
【００３４】
本発明の別の実施態様において、修飾は、構造：
【化６】
0006053684.tif 000007
を有する。
【００３５】
本発明のさらなる実施態様において、修飾は、構造：
【化７】
0006053684.tif 000008
を有する。
【００３６】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞又は生物へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの送達を補助することができる他のリガンドに結合してもよい。本発明の一実施態様において、リガンドは、５'コレステロールモノエチレングリコール（／５ＣｈｏｌＭＥＧ／）：
【化８】
0006053684.tif 000009
である。本発明の別の実施態様において、リガンドは、５'コレステロールトリエチレングリコール（／５Ｃｈｏｌ−ＴＥＧ／）：
【化９】
0006053684.tif 000010
である。本発明のさらなる実施態様において、リガンドは、３'コレステロールモノエチレングリコール（／３ＣｈｏｌＭＥＧ／）：
【化１０】
0006053684.tif 000011
である。本発明の別の実施態様において、リガンドは、３'コレステロールトリエチレングリコール（／３ＣｈｏｌＴＥＧ／）：
【化１１】
0006053684.tif 000012
である。リガンドは、さらなるＳ１８（ヘキサエチレングリコール）スペーサーを用いて又はなしでアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合してもよい。好ましい実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ａｎｔｉ−ｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＡＭＯ）である。別の好ましい実施態様において、非ヌクレオチド修飾は、ＦＱナフチレン−アゾ化合物（本開示ではｉＦＱ又はＺＥＮとも称する）である。
【００３７】
以下の実施例は、本発明をさらに説明するが、当然のことながら、なんらその範囲を制限するものと解釈すべきではない。
【００３８】
実施例１
本実施例は、他の化合物と比較して内部ナフチレン−アゾ含有オリゴマーの改善された熱安定性を示す。
【００３９】
オリゴヌクレオチド合成及び調製。固相ホスホラミダイト化学を用いてＤＮＡオリゴヌクレオチドを合成し、常用技術（Caruthers et al., 1992, Methods Enzymol. 211: 3-20）に従って脱保護し、そしてＮＡＰ−５カラム（Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）上で脱塩した。逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を用いてオリゴマーを精製した。Beckman P/ACE MDQシステム（Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA）で実施したキャピラリー電気泳動（ＣＥ）により各オリゴマーの純度を決定した。すべての一本鎖オリゴマーは、少なくとも９０％純粋であった。ThermoFinnigan TSQ7000、Xcaliburデータシステム、ProMassデータ処理ソフトウェア、及びParadigm MS4 HPLC（Michrom BioResources, Auburn, CA）からなるOligo HTCSシステム（Novatia, Princeton, NJ）を用い、オリゴヌクレオチドのエレクトロスプレー−イオン化液体クロマトグラフィー質量分析（ＥＳＩ−ＬＣＭＳ）を実施した。製造者により推奨されるプロトコールに従った。すべて一本鎖オリゴマーの実験的モル質量は、予想されるモル質量１．５ｇ／ｍｏｌ以内にあった。これらの結果からオリゴマーの同一性が確認された。
【００４０】
ＤＮＡサンプルの調製。融解実験を、３．８７ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、６．１３ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、１ｍＭ Ｎａ2ＥＤＴＡ、及び１０００ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液中で行った。１Ｍ ＮａＯＨを用いて各溶液をｐＨ７．０に滴定した。全ナトリウム濃度は、１０２０ｍＭであると推定された。２８ウェルマイクロダイアリシスシステム（Life Technologies, Carlsbad, CA）において、製造者の推奨プロトコールに従ってＤＮＡサンプルを融解緩衝液に対して十分に透析した。吸光係数を算出するための最近接モデル（nearest neighbor model）（Warshaw et al., 1966, J. Mol. Biol. 20(1): 29-38を参照のこと）を用いて推定された各オリゴヌクレオチドの吸光係数を用いて、分光光度計（Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA）における２６０ｎｍのサンプルのＵＶ吸光度からＤＮＡオリゴマーの濃度を推定した。
【００４１】
内部修飾の研究。合成時にホスホラミダイト試薬を用いて、ＦＱナフチレン−アゾ化合物（式３，Integrated DNA Technologies, Inc.，本開示では、しばしば「ｉＦＱ」又は「ＺＥＮ」と称する）を、オリゴヌクレオチドに導入した。
【化１２】
0006053684.tif 000013
【００４２】
第１系列の二本鎖では、１０塩基トップ鎖が１０塩基ボトム鎖にアニール化されるようにｉＦＱ基は二本鎖の塩基間の挿入物として配置され、そしてｉＦＱ基は塩基に整列されなかった。さらに、Ｃ３スペーサー挿入物を有する１０−ｍｅｒオリゴヌクレオチドを合成し、そして研究した。Ｃ３スペーサーは、リン酸基＋プロパンジオールの線状挿入物が塩基間に配置された対照を表し、それは、存在するナフチレン−アゾ環構造を有することなくｉＦＱ挿入物と類似している。２６０ｎｍのｉＦＱの吸光係数は、１３３４０であると推定され；Ｃ３スペーサーがＵＶ吸光度に寄与することはない。
【００４３】
第２系列の二本鎖では、９塩基トップ鎖が１０塩基ボトム鎖にアニール化されるように、ｉＦＱ基は二本鎖中の塩基の置換として配置され、そしてｉＦＱ基は塩基に整列された。さらに、Ｃ３スペーサー置換を有する１０−ｍａｒオリゴヌクレオチドを合成して研究した。
【００４４】
融解曲線の測定。オリゴマー濃度を、各サンプルについて少なくとも２回測定した。任意のサンプルについて評価された濃度が４％を超えて異なる場合、結果を廃棄して新たな吸光度測定を実施した。オリゴヌクレオチド二本鎖を調製するため、相補的ＤＮＡオリゴマーを１：１のモル比率で混合し、３６７Ｋ（すなわち、９４℃）に加熱し、そして周囲温度にゆっくり冷却した。二本鎖ＤＮＡの各溶液を融解緩衝液で２μＭの全ＤＮＡ濃度（ＣＴ）に希釈した。
【００４５】
融解実験は、Micro Tm Analysisアクセサリー、Beckman High Performance Peltier Controller（温度調節のため）、及び１ｃｍ経路長キュベットを備えた単一ビームBeckman DU 650分光光度計（Beckman-Coulter）において実施した。分光光度計に接続されたＰＣを用いて融解データを記録した。２６８ｎｍ波長のＵＶ吸光度値を３８３〜３６８Ｋ（すなわち、１０〜９５℃）の温度範囲において０．１度の増分で測定した。加熱（すなわち、「変性」）及び冷却（すなわち、「復元」）の両遷移曲線を、制御された温度変化速度（２４．９±１時間当たり０．３℃）で各サンプルにおいて記録した。ペルティエホルダー内にある内部プローブからサンプル温度を集め、そして各サンプルのＵＶ吸光度データと共に記録した。緩衝液単独（オリゴヌクレオチドなし）のサンプルについても融解プロファイルを記録し、そしてこれらの「ブランク」プロファイルをＤＮＡサンプルの融解曲線からデジタル的に減算した。系統的誤差を最小限にするため、各サンプルについて異なるキュベットで及びペルティエホルダー内の異なる位置で少なくとも２つの融解曲線を集めた。
【００４６】
融解温度の測定。各サンプルの融解温度を決定するため、以前に記載された方法（Doktycz et al., 1992, Biopolymers 32(7): 849-64; Owczarzy et al., 1997, Biopolymers 44(3): 217-39; and Owczarzy, 2005, Biophys. Chem. 117(3): 207-15.を参照のこと）を用いて融解プロファイルを分析した。簡潔には、デジタルフィルターを用いて各サンプルの実験データをなめらかにし、サンプルのＵＶ吸光度のプロットをその温度関数として得た。そのプロットから一本鎖のオリゴヌクレオチド分子の画分、θを算出した。サンプルの「融解温度」、すなわち「Ｔm」をθ＝０．５である温度として定義した。試験したオリゴヌクレオチドの融解温度を表１に記載する。
【００４７】
【表１】
0006053684.tif 000014
【００４８】
ｉＦＱ（ＺＥＮ）修飾因子が１０−ｍｅｒオリゴヌクレオチド内の中央（塩基３／４、４／５、又は５／６の間）に挿入された場合、Ｔmは平均３．７℃上昇した。末端残基の間（塩基１／２、又は９／１０の間）に配置された場合、Ｔmは平均７．２℃上昇した。これに対して、小さなプロパンジオール基（Ｃ３スペーサー）の挿入は、二本鎖のＴmにおいてかなりの悪影響があった（平均ΔＴm−８．７℃）。
【００４９】
ここで、９塩基のトップ鎖を塩基置換修飾で１０塩基のボトム鎖にアニール化し、そして反対側の鎖上において塩基と整列するように塩基置換として内部修飾を用いて、これらの配列のサブセットを研究した。結果を表２に示す。この場合、塩基置換によりかなり不安定になったのに対して、挿入物（表１）により安定化（ＺＥＮ）されたか、又は少なくともあまり不安定に（Ｃ３）ならなかったことは、明らかである。
【００５０】
【表２】
0006053684.tif 000015
【００５１】
この系列の内部修飾について、ｉＦＱ（ＺＥＮ）挿入の平均ΔＴmは＋３．７℃であったのに対して、ｉＦＱ（ＺＥＮ）置換の平均ΔＴmは−６℃であった。ｉＣ３スペーサー挿入の平均ΔＴmは−８．７℃であったのに対して、ｉＣ３スペーサー置換の平均ΔＴmは−２０℃より大きかった（Ｔmが室温より下であったため、正確な測定ができなかった）。従って、挿入配置は、置換配置より好ましい。
【００５２】
隣接しているか又は数個の塩基によって隔てられた２若しくは３カ所の部位で同じ１０−ｍｅｒオリゴマー配列にナフチレンアゾ修飾因子を導入した。二本鎖を形成し、そしてＴｍ値を測定した。結果を表３に示す。修飾パターン間に比較の明瞭性を改善するため、表１の単独で修飾された二本鎖のいくつかは表３にも含まれている。
【００５３】
【表３】
0006053684.tif 000016
【００５４】
２つの隣接するナフチレン−アゾ修飾因子を挿入すると不安定になり、Ｔmは配列状況に応じて−４〜−８．９℃変化することがわかった。３塩基隔てた同じ配列中に２つのナフチレン−アゾ修飾基を配置すると、わずかに安定化されたが（Ｔm＋２．９℃）、これは単一修飾因子単独の使用（Ｔm＋４．７℃）よりも少ない安定化であった。基間が２塩基隔てられた３つの修飾因子基を使用すると不安定になった。しかし、２つのナフタレン−アゾ修飾因子基を末端（塩基１／２及び９／１０の両方の間）に配置した場合、Ｔmは１１℃上昇した。従って、基を十分な数の塩基で隔てている限り、多数の修飾基挿入物を配列中に配置することによって相加効果が得られる。末端効果は、特に強力である。
【００５５】
従って、ＤＮＡ二本鎖内のナフチレンアゾ基の内部取り込みは、塩基間に挿入物として配置された場合、二本鎖を安定化する。ある種のアントラキノン基は、末端に配置された場合、二本鎖を安定化することができるが（Patra et al., 2009, J. Am. Chem. Soc. 131(35): 12671-81）、しかし、この効果は、内部配置については記載されていなかった。従って、ナフチレン−アゾ種の化合物の使用は、二本鎖安定性を高める内部修飾基として好ましい。
【００５６】
実施例２
本実施例は、他の化合物と比較して、内部ナフチレン−アゾ含有オリゴマーの改善されたヌクレアーゼ安定性を示す。
【００５７】
オリゴヌクレオチド合成及び精製。固相ホスホラミダイト化学を用いてＤＮＡオリゴヌクレオチドを合成し、常用技術（Caru thers et al., 1992）に従って脱保護し、そしてＮＡＰ−５カラム（Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）上で脱塩した。逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を用いてオリゴマーを精製した。Beckman P/ACE MDQシステム（Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA）で実施したキャピラリー電気泳動（ＣＥ）により各オリゴマーの純度を決定した。すべての一本鎖オリゴマーは、少なくとも９０％純粋であった。ThermoFinnigan TSQ7000、Xcaliburデータシステム、ProMassデータ処理ソフトウェア、及びParadigm MS4 HPLC（Michrom BioResources, Auburn, CA）からなるOligo HTCSシステム（Novatia, Princeton, NJ）を用い、オリゴヌクレオチドのエレクトロスプレー−イオン化液体クロマトグラフィー質量分析（ＥＳＩ−ＬＣＭＳ）を実施した。製造者により推奨されるプロトコールに従った。すべて一本鎖オリゴマーの実験的モル質量は、予想されるモル質量１．５ｇ／ｍｏｌ以内にあった。これらの結果からオリゴマーの同一性が確認された。合成したオリゴヌクレオチドを、表４に記載する。
【００５８】
【表４】
0006053684.tif 000017
【００５９】
オリゴマーの放射性標識化。ポリヌクレオチドキナーゼを用いて一本鎖オリゴマーを５'末端で放射性標識化した。簡潔には、各オリゴヌクレオチド５ピコモルを、OptiKinase（USB, Cleveland, OH）１０単位及びアルファ３２Ｐγ−ＡＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）(Perkin Elmer, Waltham, MA）１０ピコモルと共に３７℃で３０分間、続いて６５℃で１０分間インキュベートした。MicroSpin G-25カラム（GE Healthcare、Buckinghamshire、英国）を通る２本の連続的流路を用いてゲル濾過により過剰の放射性ヌクレオチドを除去した。Perkin Elmer TriCarb 2800 TRシンチレーションカウンター（Perkin Elmer, Waltham, MA）において同位体取り込みを測定した。
【００６０】
オリゴマーの血清分解。標識化効率が変化したため（５'末端近くに修飾を有するオリゴマーでは、より低い特異的活性を得た）、等価数のｄｐｍｓの放射性標識オリゴマーを、５０％ウシ胎児血清の存在下で非標識オリゴマーにより８μＭの最終濃度まで混合した（熱不活性化しなかった；Invitrogen, Carlsbad, CA）。サンプルを３７℃で０、３０、６０、又は２４０分間インキュベートし；指示された時点でアリコートを取り出し、等体積の９０％ホルムアミドを加え、そしてサンプルをドライアイス上で瞬間凍結した。２０％ポリアクリルアミド、７Ｍ尿素変性ゲルを用いてＰＡＧＥにより分解産物を分離し、そしてサイクロンホスホイメージャー（Cyclone phosphorimager）（Perkin Elmer, Waltham, MA）において視覚化した。結果を図１に示す。
【００６１】
未修飾ＤＮＡオリゴマーは急速に分解され、そして無傷の完全長物質は、インキュベーション３０分後に存在しなかった。サンプルは、４時間で完全に分解された。類似の分解パターンは、５'末端近くに配置された単一内部Ｃ３スペーサーを有するオリゴマーでみられた。これに対して、５'末端近くに単一内部ＦＱ修飾因子を担持すオリゴマーでは、不完全な分解しか観察されなかった。観察された分解パターンは、オリゴマーが完全に分解される前に停止された連続的（processive）３'−エキソヌクレアーゼ切断とほとんど一致した。これは、ｉＦＱ修飾因子が、隣接するＤＮＡ残基をエキソヌクレアーゼ分解から保護し、５'末端周辺に小さな保護領域を提供する可能性を示唆している。
【００６２】
３'末端近くの単一内部Ｃ３スペーサーを有するオリゴマーでは、単一塩基であるとみられるものが迅速に除去され、次いでゆっくり分解されることがわかった。両末端近くに配置された内部Ｃ３スペーサーを有するオリゴマーでは、わずかにより強力な保護が見られた。これに対して、３'末端近くに単一内部ＦＱ修飾因子を有するオリゴマーの３'末端での単一塩基切断の証拠は見られず、そして両末端近くに配置された内部ＦＱ修飾因子を有するオリゴマーについて５０％血清中で４時間インキュベーション後に分解の証拠は観察されなかった。
【００６３】
従って、ＦＱ修飾因子は、ウシ胎児血清中に存在する酵素からのエキソヌクレアーゼ攻撃を阻止し、そしてその近くに保護された「領域」を作り出して隣接する未修飾塩基に対して相対的なヌクレアーゼ耐性をもたらすことができる。
【００６４】
実施例３
本実施例は、他の化合物と比較して低下されたミクロＲＮＡ活性で、内部ナフチレン−アゾ含有ＡＳＯの改善された機能的活性を示す。
【００６５】
オリゴヌクレオチド合成及び精製。固相ホスホラミダイト化学を用いてＤＮＡ、２'ＯＭｅ ＲＮＡ、及びＬＮＡ含有オリゴヌクレオチドを合成し、常用技術（Caruthers et al., 1992）に従って脱保護し、そしてＮＡＰ−５カラム（Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）上で脱塩した。逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を用いてオリゴマーを精製した。Beckman P/ACE MDQシステム（Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA）で実施したキャピラリー電気泳動（ＣＥ）により各オリゴマーの純度を決定した。すべての一本鎖オリゴマーは、少なくとも８５％純粋であった。ThermoFinnigan TSQ7000、Xcaliburデータシステム、ProMassデータ処理ソフトウェア、及びParadigm MS4 HPLC（Michrom BioResources, Auburn, CA）からなるOligo HTCSシステム（Novatia, Princeton, NJ）を用い、オリゴヌクレオチドのエレクトロスプレー−イオン化液体クロマトグラフィー質量分析（ＥＳＩ−ＬＣＭＳ）を実施した。製造者により推奨されるプロトコールに従った。すべて一本鎖オリゴマーの実験的モル質量は、予想されるモル質量１．５ｇ／ｍｏｌ以内にあった。これらの結果からオリゴマーの同一性が確認された。本実施例で用いた合成オリゴマーを表５に記載する。
【００６６】
【表５】
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【００６７】
プラスミド調製。ｐｓｉＣＨＥＣＫ−２ベクター（Promega, Madison, WI）は、Ｘｈｏ１及びＮｏｔ１（New England Biolabs, Ipswitch, MA）で順に消化され、そしてQiaquick PCR精製カラム（Qiagen, Valencia, CA）で精製されたた制限酵素である。２つの合成二本鎖オリゴヌクレオチド（Integrated DNA Technologies, Coralville, IA）をアニール化することによって完全な補体ｈｓａ−ｍｉＲ−２１結合部位を作製し、そしてレニラルシフェラーゼの３'ＵＴＲ中のＸｈｏ１／Ｎｏｔ１部位にクローニングした。このｍｉＲ−２１レポーター構築物を3130 Genetic Analyzer（AB, Foster City, CA）において配列確認した。Plasmid Midiprep Kit（Bio-Rad, Hercules, CA）を用いてプラスミドを精製し、そしてエンドトキシン除去のためMiraCLEAN Endotoxin Removal Kit（Mirus Corporation, Madison, WI）で２回処理した。０．２μのフィルターを通してプラスミドを濾過し、そしてＵＶ分光測光を用いて２６０ｎｍで吸光度測定により定量化した。完全マッチｍｉＲＮＡ結合部位を有するこのレポータープラスミドをｐｓｉＣＨＥＣＫ−２−ｍｉＲ２１と表す。
【００６８】
細胞培養、トランスフェクション、及びルシフェラーゼアッセイ。１００ｍｍシャーレにおいて１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中でＨｅＬａ細胞を培養し、その翌日、集密度９０％に達した。翌朝、ｐｓｉＣＨＥＣＫ−２−ｍｉＲ２１プラスミド５μｇをLipofectamine 2000（Invitrogen, Carlsbad, CA）と共にトランスフェクトした。６時間後、細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理し、計数し、そして４８ウェルプレートにおいて１０％ＦＢＳ入りのＤＭＥＭ中で再び培養し、その翌日、集密度約７０％に達した。翌朝、血清なしのＤＭＥＭ中でウェル当たりＴｒｉＦＥＣＴｉｎ(R)（Integrated DNA Technologies）１μｌと共に三つ組でさまざまな濃度でｍｉＲ−２１ ＡＭＯをトランスフェクトした。６時間後、トランスフェクション培地を取り出し、そして１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで補充した。翌朝、（プラスミドトランスフェクション４８時間後、ｍｉＲＮＡ ＡＭＯトランスフェクション２４時間後）Dual-Luciferase(R) Reporter Assay System (Promega, Madison, WI）を用いて製造者の説明書によりルシフェラーゼルミネセンスについて細胞を分析した。唯一の陰性対照−TriFECTin(R)試薬と比較した発現における増加倍率（fold increase）としてレニラルシフェラーゼを測定した。レニラルシフェラーゼルミネセンスの値を、同時に測定されたホタルルシフェラーゼのレベルに対して標準化し、これは、内部対照（ＲＬｕｃ／ＦＬｕｃ比率）として同じプラスミド上の別々の発現単位として存在する。
【００６９】
結果。さまざまなＡＭＯを用いて行ったトランスフェクションから得たＲＬｕｃ／ＦＬｕｃ比率を図２に示す。未処理状態で、ＨｅＬａ細胞は、ＲＬｕｃレポーターの発現を抑制する大量のｍｉＲＮＡ ２１を含む。ｍｉＲ−２１レベルを低下させる任意の処理によりＲＬｕｃ発現を増大させ、こうして相対的ＲＬｕｃ／ＦＬｕｃ比を高める（トランスフェクション効率の内部標準化対照として役立つＦＬｕｃを用いる）。
【００７０】
未修飾２'ＯＭｅ ＲＮＡ ＡＭＯは、おそらく、トランスフェクション中に又は細胞内環境においてこの保護されていないオリゴマーの急速なヌクレアーゼ分解により、本質的にｍｉＲ−２１活性の抑制を示さなかった。ＡＭＯの各末端に３ＰＳ結合を加えると、エキソヌクレアーゼ攻撃が阻止され、そして「２'ＯＭｅ−ＰＳｅｎｄｓ」ＡＭＯは、ｍｉＲ−２１の機能的ノックダウンについて良好な効力を示した。このＡＭＯを変えて完全にＰＳ修飾した場合（「２'ＯＭｅ−ＰＳ」）、効力は低下し、これは、おそらく広範なＰＳ修飾に伴う結合親和性の低下（より低いＴｍ）のためである。標準ホスホジエステル結合についてのＰＳ結合の各置換は、Ｔｍを低下させ、そして「２'ＯＭｅ ＰＳｅｎｄｓ」バージョン中には６ＰＳ結合のみであるのと比較してこのオリゴマー中には２１ＰＳ結合がある。
【００７１】
望ましい修飾化学又は修飾パターンは、ヌクレアーゼ安定性を高め、かつＴｍを高めるものである。内部のナフチレン−アゾ修飾因子は、これらの基準を満たす。各末端に末端塩基と隣接塩基との間に配置された内部ナフチレン修飾因子を有する２'ＯＭｅオリゴマー（２'ＯＭｅ ５'＋３'ｉＦＱ）は、著しく改善されたａｎｔｉ−ｍｉＲ２１活性を示し、そして試験したいずれのＰＳ修飾２'ＯＭｅ ＡＭＯよりも強力であった。このデザイン（２'ＯＭｅＰＳ ５'＋３'ｉＦＱ）にＰＳ修飾を加えると、おそらく１９ＰＳ結合の付加により生じた結合親和性の低下のため、効力が低下した。この化合物は、それにもかかわらず、２ｉＦＱ修飾なしの２'ＯＭｅ−ＰＳバージョンよりなおかなり強力であった。
【００７２】
ａｎｔｉ−ｍｉＲ−２１ＡＭＯの一方の末端だけを内部ナフチレニル−アゾ修飾因子で保護すると、未修飾２'ＯＭｅ ＡＭＯと比較したときに改善された効力を示した；しかし、二重に修飾されたバージョンと比較して性能は大きく低下した。興味深いことに、５'末端の結合の修飾は、３'末端の結合の修飾よりも効果が大きく、正反対の結果は、実施例２に示された相対的な血清安定性プロファイルから予想される。この結果は、Ｔｍの測定された効果によって説明される（表６を参照のこと）。
【００７３】
エンドブロックトバージョン（２'ＯＭｅ ５'＋Ｉ＋３'ｉＦＱ）への第３のｉＦＱ修飾の付加は、最初のエンドブロックトバージョン（２'ＯＭｅ５'＋３'ｉＦＱ）と比較して低下した効力を示し、それは、おそらく単一の短い２２−ｍａｒ配列におけるこの多くのｉＦＱ修飾基を配置することで見られるＴｍの低下のためである。「ＤＮＡ／ＬＮＡ−ＰＳ」ＡＭＯは、その好ましいａｎｔｉ−ｍｉＲＮＡ剤としてExiqonによって用いられたデザインであり、そして今日実施されているｍｉＲＮＡノックダウン研究の「金基準」として広く認められている。ＤＮＡ／ＬＮＡ化合物は、二重修飾された「２'ＯＭｅ ５'＋３'ｉＦＱ」ＡＭＯとして同じ効力を示した。「２'ＯＭｅ／ＬＮＡ−ＰＳ」ＡＭＯは、研究したセット内で最も高い効力を示した。ＬＮＡ修飾はヌクレアーゼ耐性をもたらし、そしてＴｍを大きく上昇させ、より高い効力を有するＡＭＯを生じたが、また、より低い結合親和性を有するＬＮＡ塩基なしのＡＭＯよりも低い特異性を有した。異なるＡＭＯの相対的な特異性を下の実施例４に示す。注目すべきことに、ＬＮＡ−ＰＳ修飾されたＡＭＯは、いくらか毒性を示し、そして最も高い用量（５０ｎＭ）でトランスフェクトされた細胞培養では、収穫時に異形の病的な外観を呈する細胞があった。「２'ＯＭｅ ５'＋３'ｉＦＱ」ＡＭＯは、試験した任意の用量で毒性の視覚証拠をなんら示さなかった。その後の実験において、細胞生存性、細胞毒性、及びアポトーシスの誘導を測定することによって毒性効果を高用量で評価した（実施例７を参照のこと）。「２'ＯＭｅ ５'＋３'ｉＦＱ」化学は、ＬＮＡ塩基、広範なＰＳ修飾（全２１個の結合）、又はＬＮＡ及びＰＳの両修飾（「金基準」ＡＭＯ）を含む一本鎖オリゴヌクレオチドのトランスフェクションにより生じた実質的な細胞毒性と比べて細胞毒性を示さなかった。従って、「２'ＯＭｅ ５'＋３'ｉＦＱ」は、高い効力を達成するが、低い毒性を維持する新たな種類のＡＭＯでありうる。
【００７４】
上記のＡＭＯの融解温度、Ｔmは、実施例１に記載された同じ方法を用いて測定した。合成ＡＭＯオリゴヌクレオチドを合成ＲＮＡ補体（成熟ｍｉＲ２１配列）にアニール化した。細胞内イオン濃度に近い１５０ｍＭ ＮａＣｌ中の２μＭ二本鎖濃度で測定を行った。
【００７５】
【表６】
0006053684.tif 000019
【００７６】
２２−ｍａｒの２'ＯＭｅ ｍｉＲ２１ ＡＭＯは、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中でＲＮＡ完全補体にハイブリッド形成したときに７２．１℃のＴｍを示した。本来のＰＯ結合に６個のＰＳ結合を置換すると、Ｔmが１．２℃（「２'ＯＭｅ ＰＳｅｎｄｓ」）低下し、そして完全ＰＳ修飾では、Ｔmが５．０℃低下し（「２'ＯＭｅＰＳ」）、修飾されたヌクレオチド間結合により−０．２０〜−０．２５℃変化した。これに対して、３'末端結合にｉＦＱ基を挿入すると（「２'ＯＭｅ ３'ｉＦＱ」）、Ｔmが＋０．３℃上昇し、そして５'末端結合（「２'ＯＭｅ ５'ｉＦＱ」）では、Ｔmが＋２．２℃上昇した。これらの２つのデザインを合わせて、２つのｉＦＱ修飾を付加すると（各末端の結合で１つ、「２'ＯＭｅ５'＋３'ｉＦＱ」）、Ｔmが７５．４℃に上昇し、それは、未修飾配列と比較して＋３．３℃又はＰＳ末端ブロックト配列と比較して＋４．５℃の変化であった（それは、最も適切な比較である）。この二重末端修飾パターンは、良好なヌクレアーゼ耐性を生じ（図１）、そして２'ＯＭｅ ＡＭＯ中に用いたときに、Ｔmの上昇を示し（表６）、そして非常に強力なａｎｔｉ−ｍｉＲ２１剤である（図２）。興味深いことに、中央に配置された第３のｉＦＱ基付加（「２'ＯＭｅ ５'＋Ｉ＋３'ｉＦＱ」）では、未修飾化合物と比較してＴmが０．８℃低下し、又は２末端挿入バージョン（「２'ＯＭｅ５'＋３'ｉＦＱ」）と比較して４．１℃低下した。従って、末端塩基間にｉＦＱ修飾因子を挿入すると、Ｔmが上昇するが、配列の中央に第３の修飾を加えると、これらの修飾が互いに十分に１０塩基離れていたとしても、Ｔmが低下する。このＴmの低下は、機能的効力の損失を生じる（図２）。従って、二重修飾された末端挿入パターンが好ましい。
【００７７】
原則として、さまざまなｍｉＲ２１ ＡＭＯの相対的な効力は、増加した結合親和性（Ｔｍ）と相関関係があった。化合物間で観察された効力におけるすべての変動は、研究した異なる修飾パターン間の結合親和性及びヌクレアーゼ安定性における改善の相対的な寄与によって説明されるはずである。各末端近くに配置されたｉＦＱ修飾を伴う２'ＯＭｅ塩基を有するＡＭＯ（「２'ＯＭｅ ５'＋３'ｉＦＱ」）は、増加したＴｍに伴うヌクレアーゼ安定性の優れたバランスを提供し、そしてより高い効力を示す唯一のＡＭＯは、「２'ＯＭｅ／ＬＮＡ−ＰＳ」化合物であった。しかし、「２'ＯＭｅ／ＬＮＡ−ＰＳ」化合物は、結合親和性におけるその極端な上昇のため低下した特異性（実施例４参照）及び増加した細胞毒性（実施例７参照）を示した。従って、本発明の新規な「２'ＯＭｅ ５'＋３'ｉＦＱ」デザインは、優れている。
【００７８】
実施例４
本実施例は、結合親和性を高める修飾を含む他の化合物と比較して、ミクロＲＮＡ活性を低下させたときに内部ナフチレン−アゾ含有オリゴマーの改善された特異性を示す。
【００７９】
実施例３で実施した機能的研究からのより強力なＡＭＯデザインの３つを、より詳細に試験し、合成ａｎｔｉ−ｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチドとその標的との間のミスマッチを識別するその相対的な能力を評価した。一般に、高親和性オリゴヌクレオチドは、高い効力を示すが、相補性における１つ又はそれ以上のミスマッチの存在下でも高い親和性によりハイブリダイゼーションが可能となるため、通常、低下した特異性を示す。ｍｉＲ−２１標的配列に対して１、２、又は３個のミスマッチを有する変種としてデザイン「２'ＯＭｅ ５'＋３'ｉＦＱ」、「ＤＮＡ／ＬＮＡ−ＰＳ」、及び「２'ＯＭｅ／ＬＮＡ−ＰＳ」を合成した。配列を表７に示す。実施例３に記載した通り研究を実施した。
【００８０】
【表７】
0006053684.tif 000020
【００８１】
結果。さまざまなＡＭＯで行ったトランスフェクションから得たＲＬｕｃ／ＦＬｕｃ比率を図３に示す。ＨｅＬａ細胞は、未処理の状態で、ＲＬｕｃレポーターの発現を抑制する大量のｍｉＲＮＡ ２１を含む。ｍｉＲ−２１レベルを低下させる任意の処理はＲＬｕ
ｃ発現を高め、従って相対的ＲＬｕｃ／ＦＬｕｃ比を高める（トランスフェクション効率の内部標準化対照として作用するＦＬｕｃを用いる）。研究した化学的性質のそれぞれについて、親の野生型配列を１つ、２つ、又は３つの突然変異を有する変種によって追跡調査した。
【００８２】
すべての場合において、パーフェクトマッチＡＭＯは、ルシフェラーゼレベルの上昇から明らかなようにｍｉＲ−２１活性の有意な抑制を示した（ＦＬｕｃに対するＲＬｕｃの比率の増加は、ＲＬｕｃ ｍＲＮＡの脱抑制を示している）。実施例３（図３）のように、「２'ＯＭｅ／ＬＮＡ−ＰＳ」化合物は、低用量でのｍｉＲ−２１の抑制から明らかなように最も高い効力を示した（データポイント１ｎＭ及び５ｎＭ）。「２'ＯＭｅ ５'＋３'ｉＦＱ」及び「ＤＮＡ／ＬＮＡ−ＰＳ」ＡＭＯは、野生型（パーフェクトマッチ）及び突然変異体（ミスマッチ）バージョンにおいて比較的類似の性能を示した。両方の場合において、シングルミスマッチ（single mismatch）は、ａｎｔｉ−ｍｉＲ−２１活性の部分的な低下を示し、ダブルミスマッチ（double mismatch）は、ａｎｔｉ−ｍｉＲ−２１活性のほとんど完全除去を示し、そしてトリプルミスマッチ（triple mismatch）は、ａｎｔｉ−ｍｉＲ−２１活性を全く示さなかった。これに対して、より高い親和性「２'ＯＭｅ／ＬＮＡ−ＰＳ」化合物は、トリプル及びダブルミスマッチ化合物について有意なａｎｔｉ−ｍｉＲ−２１活性を示し、そしてさらにトリプルミスマッチ化合物については高用量（５０ｎＭ）でいくらかの活性を示した。従って、「２'ＯＭｅ／ＬＮＡ−ＰＳ」化合物は最も強力であるが、また、研究した試薬で最も低い特異性である。
【００８３】
注目すべきことに、上の実験は、ＬＮＡ修飾された位置にミスマッチが配置されたＡＭＯを用いて（ＬＮＡ含有ＡＭＯにおいて）実施された。このデザインは、高親和性ＬＮＡ：ＲＮＡ塩基対を破壊するため、ミスマッチが活性に作用する可能性に影響を及ぼすことがある。従って、これらの結果は、ＬＮＡ修飾されたＡＭＯの特異性について最良の場合のシナリオを表す。ミスマッチが全て非ＬＮＡ塩基に配置された新たな試薬セットを用いて実験を繰り返した。この新たな系列のＡＭＯ試薬を表８に示す。
【００８４】
【表８】
0006053684.tif 000021
【００８５】
結果。さまざまなＡＭＯで行ったトランスフェクションから得たＲＬｕｃ／ＦＬｕｃ比率を図４に示す。ＨｅＬａ細胞は、未処理の状態で、ＲＬｕｃレポーターの発現を抑制する大量のｍｉＲＮＡ ２１を含む。ｍｉＲ−２１レベルを低下させる任意の処理はＲＬｕ
ｃ発現を高め、従って相対的ＲＬｕｃ／ＦＬｕｃ比を高める（トランスフェクション効率の内部標準化対照として作用するＦＬｕｃを用いる）。研究した化学的性質のそれぞれについて、親の野生型配列を１つ、２つ、又は３つの突然変異を有する変種によって追跡調査した。
【００８６】
結果は、最初の突然変異ミスマッチ配置で得たものとほとんど同一であった（図３）。すべての場合において、パーフェクトマッチＡＭＯは、ルシフェラーゼレベルの上昇から明らかなようにｍｉＲ−２１活性の有意な抑制を示した（ＦＬｕｃに対するＲＬｕｃの比率の増加は、ＲＬｕｃ ｍＲＮＡの脱抑制を示している）。実施例３（図３）のように、「２'ＯＭｅ／ＬＮＡ−ＰＳ」化合物は、低用量でのｍｉＲ−２１の抑制から明らかなように最も高い効力を示した（データポイント１ｎＭ及び５ｎＭ）。「２'ＯＭｅ ５'＋３'ｉＦＱ」及び「ＤＮＡ／ＬＮＡ−ＰＳ」ＡＭＯは、野生型（パーフェクトマッチ）及び突然変異体（ミスマッチ）バージョンにおいて比較的類似の性能を示した。両方の場合において、シングルミスマッチは、ａｎｔｉ−ｍｉＲ−２１活性の部分的な低下を示し、ダブルミスマッチは、ａｎｔｉ−ｍｉＲ−２１活性のほとんど完全除去を示し、そしてトリプルミスマッチは、ａｎｔｉ−ｍｉＲ−２１活性を全く示さなかった。これに対して、より高い親和性「２'ＯＭｅ／ＬＮＡ−ＰＳ」化合物は、トリプル及びダブルミスマッチ化合物について有意なａｎｔｉ−ｍｉＲ−２１活性を示し、そしてさらにトリプルミスマッチ化合物については高用量（５０ｎＭ）でいくらかの活性を示した。従って、「２'ＯＭｅ／ＬＮＡ−ＰＳ」化合物は最も強力であるが、また、研究した試薬について最も低い特異性である。
【００８７】
実施例５
本実施例は、他の関連化合物と比較してＲＮａｓｅ Ｈ活性なＡＳＯ中に組み込まれたときに、低下した細胞ｍＲＮＡレベルで、内部ナフチレン−アゾ含有オリゴマーの改善された機能的活性を示す。
【００８８】
細胞メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に対して配向がアンチセンスのオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡとハイブリッド形成してＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二本鎖を形成し、それは細胞ＲＮａｓｅ Ｈの基質である。ＲＮａｓｅ Ｈによる分解は、ｍＲＮＡ中の切断部位、そしてその後、そのＲＮＡ種の全分解を導き、それによって標的となる転写物、そしてそれがコードしているタンパク質の有効な発現を機能的に低下させる。このタイプのＡＳＯは、ＲＮａｓｅ Ｈの基質であるＤＮＡの少なくとも４塩基を含むドメインを必要とし、そして８〜１０ＤＮＡ塩基が存在するまで最大活性は見られない。ＡＳＯは、血清及び細胞ヌクレアーゼによる分解に耐えるために化学修飾されなければならない。ヌクレオチド間結合のホスホロチオエート（ＰＳ）修飾は、ＲＮａｓｅ Ｈ活性化と適合しうるが、２'ＯＭｅ ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＭＯＥなどのような、すべての２'−修飾を含む、ほとんどの他のヌクレアーゼ耐性の修飾は、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を阻止する。ＰＳ修飾は、結合親和性（Ｔm）を低下させる。一般に、Ｔmを低下させる修飾は、効力を低下させるのに対して、Ｔmを上昇させる修飾は、効力を向上させる。ＡＳＯの効力を改善する１つの戦略は、ＰＳ修飾されたＤＮＡでできた低ＴmのＲＮａｓｅ Ｈ活性化ドメインが、高い結合親和性をもたらすけれどもＲＮａｓｅ Ｈ活性化しない２'修飾された糖質を含む末端ドメインに隣接するキメラデザインを用いることである（「ギャップマー」デザイン）。一般に用いられる１つの戦略は、５'末端で５個の２'修飾塩基、中央に１０個のＰＳ修飾ＤＮＡ塩基、そしてＡＳＯの３'末端で５個の２'修飾塩基を配置することである（いわゆる「５−１０−５」デザイン）。ヌクレアーゼ耐性をもたらし、結合親和性を高め、そしてＲＮａｓｅ Ｈを活性化する試薬の能力を損なわない修飾は、理想的である。本実施例は、ヌクレアーゼ安定性を改善し、そしてＡＳＯの結合親和性を高め、遺伝子ノックダウン試薬としてその機能を強化する内部ナフチレン−アゾ修飾因子の有用性を示す。
【００８９】
オリゴヌクレオチド合成及び精製。固相ホスホラミダイト化学を用いてＤＮＡ、２'ＯＭｅ ＲＮＡ、及びＬＮＡ含有オリゴヌクレオチドを合成し、常用技術（Caruthers et al., 1992）に従って脱保護し、そしてＮＡＰ−５カラム（Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）上で脱塩した。逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を用いてオリゴマーを精製した。Beckman P/ACE MDQシステム（Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA）で実施したキャピラリー電気泳動（ＣＥ）により各オリゴマーの純度を決定した。すべての一本鎖オリゴマーは、少なくとも８５％純粋であった。オリゴヌクレオチドのエレクトロスプレー−イオン化液体クロマトグラフィー質量分析（ＥＳＩ−ＬＣＭＳ）を実施した。ThermoFinnigan TSQ7000、Xcaliburデータシステム、ProMassデータ処理ソフトウェア、及びParadigm MS4 HPLC（Michrom BioResources, Auburn, CA）からなるOligo HTCSシステム（Novatia, Princeton, NJ）を用い、製造者により推奨されるプロトコールに従った。すべて一本鎖オリゴマーの実験的モル質量は、予想されるモル質量１．５ｇ／ｍｏｌ以内にあった。これらの結果からオリゴマーの同一性が確認された。
【００９０】
【表９】
0006053684.tif 000022
【００９１】
ＨｅＬａ細胞培養、トランスフェクション、及びＲＴ−ｑＰＣＲ法。ＨｅＬａ細胞を４８ウェルプレート中に分割し、その翌日、無血清ダルベッコ変法イーグル培地（Invitrogen, Carlsbad, CA）中、指示された濃度のＡＳＯと共にTriFECTin(R)（Integrated DNA Technologies, Coralville, IA）を濃度２％で（OptiMEM(R) I ５０μＬ当たり１μＬ ）（Invitrogen, Carlsbad, CA）用いて集密度約６０％でトランスフェクトした。すべての
トランスフェクションを三つ組で実施した。６時間後、培地を、１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ変法イーグル培地と交換した。トランスフェクション２４時間後、SV96 Total RNA Isolation Kit（Promega, Madison, WI）を用いてＲＮＡを調製した。ランダム六量体及びオリゴ−ｄＴプライミングの両方を用い、製造者の説明書に従ってSuperScriptTM-II Reverse Transcriptase（Invitrogen, Carlsbad, CA）と共に全ＲＮＡ１５０ｎｇを用いてｃＤＮＡを合成した。トランスフェクション実験は、すべて少なくとも３回実施した。
【００９２】
ImmolaseTM DNA Polymerase（Bioline, Randolph, MA）、２００ｎＭプライマー、及び２００ｎＭプローブと共に反応液１０μＬ当たりｃＤＮＡ １０ｎｇを用いて定量的リアルタイムＰＣＲを実施した。ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１）（GenBank Acc. No. ＮＭ＿０００１９４）特異的プライマーは、
ＨＰＲＴ−Ｆｏｒ  ５'ＧＡＣＴＴＴＧＣＴＴＴＣＣＴＴＧＧＴＣＡＧＧＣＡ（配列番号：７９）、
ＨＰＲＴ−Ｒｅｖ  ５'ＧＧＣＴＴＡＴＡＴＣＣＡＡＣＡＣＴＴＣＧＴＧＧＧ
（配列番号：８０）、及びプローブ
ＨＰＲＴ−Ｐ ５'ＭＡＸ−ＡＴＧＧＴＣＡＡＧＧＴＣＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＴＧＧＴＩｏｗａＢｌａｃｋＦＱ（ＩＢＦＱ）（配列番号：８１）
であり、そして内部対照遺伝子のレベルに対して標準化され、ヒト酸性リボソームリンタンパク質Ｐ０（ＲＰＬＰ０）（GenBank Acc. No. ＮＭ＿００１００２）は、プライマー：
ＲＰＬＰ０−Ｆｏｒ ５'ＧＧＣＧＡＣＣＴＧＧＡＡＧＴＣＣＡＡＣＴ（配列番号：８２）、
ＲＰＬＰ０−Ｒｅｖ ５'ＣＣＡＴＣＡＧＣＡＣＣＡＣＡＧＣＣＴＴＣ（配列番号：８３）、及びプローブ
ＲＰＬＰ０−Ｐ ５'ＦＡＭ−ＡＴＣＴＧＣＴＧＣＡＴＣＴＧＣＴＴＧＧＡＧＣＣＣＡ−ＩＢＦＱ（配列番号：８４）
（Bieche et al., 2000, Clin. Cancer Res. 6(2): 452-59）を用いて多重化反応において測定された。使用した循環条件は、１０分間９５℃、続いて１５秒間９５℃及び１分間６０℃の２ステップＰＣＲ４０サイクルであった。ABI PrismTM 7900 Sequence Detector（Applied Biosystems Inc., Foster City, CA）を用いてＰＣＲ及び蛍光測定を行った。すべての反応を三つ組で実施した。発現データを標準化した。ＨＰＲＴ及びＲＰＬＰ０の両アッセイのために線形化クローニングされたアンプリコンを用いてコピー数標準を多重化した。絶対定量的測定を確立した標準に対して未知のものを推定した。
【００９３】
結果。ＡＳＯを、１ｎＭ、５ｎＭ、及び２０ｎＭ濃度でＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション２４時間後、ＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡに変換し、そしてｑＰＣＲを用いてＨＰＲＴ発現レベルを測定した。ＤＮＡ塩基から作成したａｎｔｉ−ＨＰＲＴ ＡＳＯセットについての結果を図５に示す。未修飾一本鎖ＤＮＡオリゴは、エキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼによって急速に分解された。おそらく未保護化合物の急速分解のため、このデザイン（ＨＰＲＴ ＤＮＡ）を用いてＨＰＲＴのノックダウンは観察されなかった。また、３'末端近くの単一ｉＦＱ修飾（ＨＰＲＴ ＤＮＡ ３'ｉＦＱ）、５'末端近くの単一ｉＦＱ修飾（ＨＰＲＴ ＤＮＡ ５'ｉＦＱ）、両末端近くに挿入された２つのｉＦＱ修飾（ＨＰＲＴ ＤＮＡ ５'＋３'ｉＦＱ）、並びに中央及び両末端近くに挿入された３つのｉＦＱ修飾（ＨＰＲＴ ＤＮＡ ５'＋Ｉ＋３'ｉＦＱ）を有するＡＳＯを試験し、そして同様に試験用量で、機能遺伝子ノックダウンを示さなかった。従って、３つまでのｉＦＱ修飾の付加は、特に、未修飾ＤＮＡオリゴがアンチセンス遺伝子−ノックダウン剤として機能できるのに十分なヌクレアーゼ安定化を提供しない。
【００９４】
配列を通してホスホロチオエート（ＰＳ）ヌクレオチド間結合を有する（リン酸がｉＦＱ修飾因子に結合する場合を除く）同じ系列のオリゴヌクレオチドを合成した。歴史的に、ＤＮＡ−ＰＳオリゴは、研究された最初に有効なアンチセンス化合物の中にあった。この修飾は、ヌクレアーゼ安定性を高めるが；しかし、それは、また結合親和性（Ｔｍ）を低下させ、結果として、このいわゆる「第１世代」アンチセンス化学は、通常、比較的低い効力を示す。「ＤＮＡ−ＰＳ」ＡＳＯは、２０ｎＭ濃度でＨＰＲＴレベルを５０％低下させるが；しかし、ＨＰＲＴレベルの低下は、より低い用量で観察されなかった。ｉＦＱ修飾の付加は、結合親和性を高め、そしてエキソヌクレアーゼ作用を遮断し、ＤＮＡ−ＰＳ ＡＳＯの機能を改善する。「ＤＮＡ−ＰＳ ５'＋Ｉ＋３'ｉＦＱ」化合物は、この系列内で最良の結果を示し、２０ｎＭで７０％、そして５ｎＭで４０％のＨＰＲＴノックダウンが観察された（図５）。
【００９５】
５塩基末端ドメインが２'ＯＭｅ ＲＮＡでできており、そして中央の１０塩基ＲＮａｓｅ Ｈ活性物質ドメインがＤＮＡでできているキメラ「５−１０−５ギャップマー」デザインを用いて第２セットのＡＳＯを合成した。オリゴヌクレオチドは、図５のＤＮＡ ＡＳＯと同じ位置に挿入された０、１つ、２つ、又は３つのｉＦＱ修飾因子を有した。これらのオリゴヌクレオチドを前のようにＨｅＬａ細胞にトランスフェクトし、そしてトランスフェクション２４時間後、ＨＰＲＴ ｍＲＮＡレベルを試験した。結果を図６に示す。リン酸ジエステルＤＮＡ中央ドメインを有する３つのギャップマーＡＳＯは、配列をｉＦＱ基で修飾したか又はそうでないかにかかわらず、ＨＰＲＴ ｍＲＮＡレベルの低下において活性を示さなかった（「５−１０−５」、５−１０−５ ２×ｉＦＱ」及び「５−１０−５ ３×ｉＦＱ」）。完全にＰＳ修飾された同じ配列（「５−１０−５ＰＳ」）は、２０ｎＭ濃度でＨＰＲＴの７５％ノックダウンという良好な効力を示した。このデザインの末端近くの２つのｉＦＱ基の付加（「５−１０−５−ＰＳ  ２×ｉＦＱ」）は、２０ｎＭでＨＰＲＴノックダウン＞９０％、そして５ｎＭ濃度でノックダウン＞７０％というこのセットの最良の効力を示した。
【００９６】
２'ＯＭｅ ＲＮＡは、エンドヌクレアーゼ攻撃に対していくらか耐性であるが、このデザインのギャップマーＡＳＯは、通常、十分なＰＳ修飾が行われており、エキソヌクレアーゼ分解を阻止する。このアイデアと一致して、ＰＳヌクレオチド間結合によって保護されたＤＮＡドメインを有するが、２'ＯＭｅフランキングドメイン中にホスホジエステル結合を有するＡＳＯは、遺伝子ノックダウン活性を示さなかった（「５−１０−５ ｇａｐＰＳ」）。しかし、末端ｉＦＱ修飾の使用は、エキソヌクレアーゼ攻撃から保護されるこの新たなデザインの使用を可能にする；また、この新たなデザインは、ＰＳ含量を減らすことによって結合親和性を高め、そして毒性を低下させるはずである。この戦略は、有効であり、そしてＡＳＯ（「５−１０−５ ｇａｐＰＳ ２×ｉＦＱ」）は、２０ｎＭで＞９０％、そして５ｎＭで＞７０％のＨＰＲＴレベルのノックダウンを示した。効力は、完全ＰＳ修飾ＡＳＯと非常に類似していた。このデザインは、毒性の低下が期待されるが；しかし、ＨｅＬａ細胞は、かなり高用量のＰＳ修飾オリゴヌクレオチドに対して耐性があるため、この系で毒性を試験するのは容易ではない。低下したＰＳ含量の利益は、生体内でより十分に認識されることになる。
【００９７】
第３の中央に配置されたｉＦＱ基（「５−１０−５ ｇａｐＰＳ−３×−ｉＦＱ」）の付加は、機能的効力を高めなかったが、このＲＮａｓｅ Ｈ活性アンチセンスデザインにおいて遺伝子ノックダウンと適合した。一般に、ＲＮａｓｅ Ｈ活性ＡＳＯの最大活性には、少なくとも８つの連続的なＤＮＡ残基を有するＤＮＡドメインを必要とすることが知られている。２×ｉＦＱデザイン（ここでは、１０塩基ＤＮＡドメインが連続的である）と比較して、３×ｉＦＱデザイン（ここでは、１０塩基ＤＮＡドメインが、中央のｉＦＱ基によって中断されている）が、効力を低下させることなく作用することは予想外であった。ｉＦＱ基の独特な性質は、おそらくこれらの化合物においてＴｍを上昇させると仮定される同じ塩基積重ね相互作用のため、その挿入によってＲＮａｓｅ Ｈ活性と適合性の
ままにできる可能性がある。
【００９８】
現在使用されている最も強力なアンチセンスデザインは、ＬＮＡ修飾されたギャップマーであり、ここでは、本実施例で用いた２'ＯＭｅ ＲＮＡ塩基の代わりにフランキングドメインにおいて非常に強いＴｍ強化ＬＮＡ修飾が用いられている。強力であるが、このデザインは高価であり、そして特定の状況ではかなりの毒性を示すことがある。同じａｎｔｉ−ＨＰＲＴ配列をＬＮＡ ５−１０−５ギャップマー（完全ＰＳ修飾）として作った。予想通り、この化合物は、試験したあらゆるＡＳＯで最も高い相対的効力を示した（「５−１０−５ ＬＮＡ ＰＳ」）しかし、観察された効力は、ｉＦＱ組成物（「５−１０−５−ＰＳ ２×ｉＦＱ」）の最高よりもわずかにより高いだけあった。非常に高い結合親和性ＬＮＡ試薬は、通常、特異性を低下させるため、本発明のｉＦＱデザインの使用は、効力を少し犠牲にして改善された特異性を示すことができる。
【００９９】
実施例６
本実施例は、ＲＮＡｉ作用機序を介して遺伝子発現の抑制における適用に伴うＲＮＡ二本鎖のｉＦＱ修飾の使用を示す。
【０１００】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介して遺伝子抑制を誘発する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の使用は、よく知られた技術である。天然細胞生成物を模倣する合成ｄｓＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ、又はｓｉＲＮＡ）は、通常、２−塩基３'−オーバーハングを有する中央の１９塩基二本鎖ドメインを有する２１塩基長である。別法として、細胞質ヌクレアーゼダイサーの基質であるわずかに大きい合成オリゴヌクレオチドを用いることができ、それはこれらの種を２１−ｍａｒのｓｉＲＮＡに処理する。典型的に、これらの試薬は、非対称であり、そして２５塩基トップ鎖（top strand）（センス鎖、「Ｓ」）及びＡＳ鎖に単一の２−塩基３'−オーバーハングを有する２７塩基ボトム鎖（bottom strand）（アンチセンス鎖、「ＡＳ」）を有する。これらのより長いｓｉＲＮＡを、ダイサー基質ｓｉＲＮＡ、又はＤｓｉＲＮＡと称する。ｄｓＲＮＡはヌクレアーゼ攻撃に対して一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ一本鎖ＲＮＡ）よりもはるかに安定であるが、特に生体内に用いる場合、合成ｓｉＲＮＡの分解は、化合物の効力を有意に制限することができる。化学修飾（例えば２'ＯＭｅ ＲＮＡ、２'Ｆ ＲＮＡ、又はＬＮＡ塩基）の組み込みは、ヌクレアーゼ安定性を改善し、そしてｓｉＲＮＡの機能を改善できる。また、ヌクレアーゼ耐性ホスホロチオエート結合（ＰＳ）の選択的配置は、特に末端３'ヌクレオチド間結合の近くに用いた場合、ｓｉＲＮＡの安定化を助けることができる。残念なことに、広範な化学修飾では、通常、ヌクレアーゼ安定化が達成されても、おそらく、ＲＮＡ二本鎖とダイサー又はＡｇｏ２のようなＲＮＡｉの鍵となるタンパク質メディエーターとの相互作用を破壊することで化合物の機能的効力が低下するため、修飾基の注意深い配置は、不可欠である。
【０１０１】
本実施例は、ｉＦＱ修飾因子をＤｓｉＲＮＡに導入できることを示す。他の化学修飾因子と同様に、ｉＦＱ挿入は、配置に応じて増加した効力、低下した効力、又は効力における無変化を導くことができる。
【０１０２】
オリゴヌクレオチド合成及び精製。固相ホスホラミダイト化学を用いてＲＮＡ及び修飾されたＲＮＡオリゴヌクレオチドを合成し、常用技術（Caruthers et al., 1992）に従って脱保護し、そして脱塩した。イオン交換高性能液体クロマトグラフィー（ＩＥ−ＨＰＬＣ）を用いてオリゴマーを精製し、そしてＲＮａｓｅなしの条件下で取り扱った。すべてのＲＮＡオリゴヌクレオチドを、ナトリウム塩として調製した。Beckman P/ACE MDQシステム（Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA）で実施したキャピラリー電気泳動（ＣＥ）により各オリゴマーの純度を決定した。すべての一本鎖オリゴマーは、少なくとも８５％純粋であった。ThermoFinnigan TSQ7000、Xcaliburデータシステム、ProMassデータ処理ソフトウェア、及びParadigm MS4 HPLC（Michrom BioResources, Auburn, CA）からなるOligo HTCSシステム（Novatia, Princeton, NJ）を用い、オリゴヌクレオチドのエレクトロスプレー−イオン化液体クロマトグラフィー質量分析（ＥＳＩ−ＬＣＭＳ）を実施した。製造者により推奨されるプロトコールに従った。すべて一本鎖オリゴマーの実験的モル質量は、予想されるモル質量１．５ｇ／ｍｏｌ以内にあった。これらの結果からオリゴマーの同一性が確認された。
【０１０３】
等モル量のトップ及びボトム鎖を３０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ酢酸カリウム中で混合し、９５℃で２分間加熱し、次いで室温に冷却することによって二本鎖を形成した。実施例６で合成された二本鎖を表１０に記載する。
【０１０４】
【表１０】
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【０１０５】
ＨｅＬａ細胞培養、トランスフェクション、及びＲＴ−ｑＰＣＲ方法。指示された濃度でＲＮＡ二本鎖と共にOptiMEMTM I（Invitrogen, Carlsbad, CA）５０μＬ当たり LipofectamineTM RNAiMAX １μＬを用いて、集密度約６０％で「リバースフォーマット（reverse format）」においてＨｅＬａ細胞をトランスフェクトした（Invitrogen, Carlsbad, CA）。すべてのトランスフェクションを三つ組で実施した。SV96 Total RNA Isolation Kit（Promega, Madison, WI）を用いてトランスフェクション２４時間後にＲＮＡを調製した
；ランダム六量体及びオリゴｄＴプライミングを用い、製造者の説明書に従って、SuperScriptTM-II Reverse Transcriptase（Invitrogen, Carlsbad, CA）と共に全ＲＮＡ１５０ｎｇを用いてｃＤＮＡを合成した。
【０１０６】
反応物１０μＬ当たりｃＤＮＡ１０ｎｇ、ImmolaseTM DNA Polymerase（Bioline, Randolph, MA）、５００ｎＭプライマー、及び２５０ｎＭプローブを用いて定量的リアルタイムＰＣＲ反応を行った。ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１）（GenBank Acc, No. NM_000194）特異的プライマーは、
ＨＰＲＴ−Ｆｏｒ  ５'ＧＡＣＴＴＴＧＣＴＴＴＣＣＴＴＧＧＴＣＡＧＧＣＡ（配列番号：７９）、
ＨＰＲＴ−Ｒｅｖ  ５'ＧＧＣＴＴＡＴＡＴＣＣＡＡＣＡＣＴＴＣＧＴＧＧＧ（配列番号：８０）、及びプローブ
ＨＰＲＴ−Ｐ ５'ＦＡＭ−ＡＴＧＧＴＣＡＡＧＧＴＣＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＴＧＧＴＩｏｗａＢｌａｃｋＦＱ（ＩＢＦＱ）（配列番号：８１）
であった。使用した循環条件は、１０分間９５℃、続いて１５秒間９５℃及び１分間６０℃の２ステップＰＣＲ４０サイクルであった。ABI PrismTM 7900 Sequence Detector（Applied Biosystems Inc., Foster City, CA）を用いてＰＣＲ及び蛍光測定を行った。すべてのデータポイントを三つ組で実施した。発現データを内部対照遺伝子、ヒトスプライシング因子、アルギニン／セリン−リッチ９（ＳＦＲＳ９）（GenBank Acc. No. ＮＭ＿００３７６９）のレベルに対して標準化し、それは、多重化反応においてプライマー：
ＳＦＲＳ９−Ｆｏｒ ５'ＴＧＴＧＣＡＧＡＡＧＧＡＴＧＧＡＧＴ（配列番号：１０３）、ＳＦＲＳ９−Ｒｅｖ ５'ＣＴＧＧＴＧＣＴＴＣＴＣＴＣＡＧＧＡＴＡ（配列番号：１０４）、及びプローブ
ＳＦＲＳ９−Ｐ ５'ＭＡＸ−ＴＧＧＡＡＴＡＴＧＣＣＣＴＧＣＧＴＡＡＡＣＴＧＧＡ−ＩＢＦＱ（配列番号：１０５）
を用いて、ベースラインをスクランブル陰性対照ＲＮＡ二本鎖（ＮＣ１）でトランスフェクトされた細胞に設定して測定した。ＨＰＲＴ及びＳＦＲＳ９の両アッセイの線形化クローニングされたアンプリコンを用いてコピー数標準を並列に実施した。絶対定量的測定を確立した標準に対して未知のものを推定した。
【０１０７】
結果。本研究に用いたａｎｔｉ−ＨＰＲＴ ＤｓｉＲＮＡは極めて強力であり、そして典型的に低ピコモルレベルで標的ｍＲＮＡの検出可能なノックダウンを示す。この予想と一致して、未修飾二本鎖は、ＨｅＬａ細胞中のトランスフェクション２４時間後、１０ｐＭ用量でＨＰＲＴレベルを約４０％低下させた。Ｓ鎖、ＡＳ鎖、又は両方のさまざまな位置に配置されたｉＦＱ基を含む修飾された二本鎖の系列を同様にＨｅＬａ細胞にトランスフェクトし、そしてトランスフェクション２４時間後にＨＰＲＴ ｍＲＮＡレベルを測定した。結果を図７に示す。
【０１０８】
ＡＳ鎖の３'末端近くにｉＦＱ基を配置することは、十分に許容され；３'末端から塩基１と２との間（一本鎖の３'−オーバーハングドメイン中）（二本鎖ＨＰＲＴ ｉＦＱ  ｖ１）又は３'末端から塩基３と４との間（二本鎖ドメインの出発点で）（二本鎖ＨＰＲＴ ｉＦＱ ｖ４）の挿入は、未修飾二本鎖と類似の効力を示した。Ｓ鎖の５'末端近くにｉＦＱ基を配置すること（二本鎖ＨＰＲＴ ｉＦＱ ｖ２）は、Ｓ鎖の両末端近くにｉＦＱ基を配置すること（二本鎖ＨＰＲＴ ｉＦＱ ｖ３）と同様に十分に許容された。これに対して、ＡＳ鎖の５'末端近くにｉＦＱ基を有する二本鎖（二本鎖ＨＰＲＴ ｉＦＱ ｖ５及びｖ７）は、低下した効力を示したため、この位置の修飾は、回避しなければならない。
【０１０９】
研究した系の誤差内で、ｉＦＱ修飾された二本鎖と未修飾二本鎖とは、類似の効力を示した（上記のように、ＡＳ鎖の５'末端で修飾されたそれらの二本鎖を除く）。ｉＦＱ基からの利益は、ヌクレアーゼ安定化が必要である設定では最も明らかであると考えられ、それは本in vitro系では認められないが、実施例１及び２の結果に基づいており、血清ヌクレアーゼに対する暴露がより不確定なin vivoで用いる場合、この修飾の使用からのより大きな利益が期待される。
【０１１０】
実施例７
本実施例は、他の化合物と比較して、脂質トランスフェクト内部ナフチレン−アゾ含有オリゴマーからの低下した細胞毒性を示す。
【０１１１】
合成オリゴマーの化学修飾からの毒性は、望ましくない副作用をもたらし、信頼できない結果を生じ、そしてオリゴマーの治療有用性を制限するため、問題がありうる。細胞死は、毒性の化学修飾から壊死又はアポトーシスを誘導することによって生じることがある。実施例３及び４で試験したＡＭＯに用いた化学修飾パターンを用いて、非標的の陰性対照（「ＮＣ１」）配列を含むオリゴマーで毒性を確認した（表１１参照）。一般化細胞毒性（Generalized cytotoxicity）（壊死及び／又はアポトーシスから）は、化学修飾オリゴマーで処理した後、生存及び死滅細胞の相対数を定量化することによって測定したのに対して、アポトーシス経路の誘導から生じた細胞毒性は、オリゴマー処理後、カスパーゼ−３、及び−７のレベルを測定することによって決定した。
【０１１２】
オリゴヌクレオチド合成及び調製。固相ホスホラミダイト化学を用いてＤＮＡオリゴヌクレオチドを合成し、常用技術（Caruthers et al., 1992）に従って脱保護し、そしてＮＡＰ−５カラム（Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）上で脱塩した。逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を用いてオリゴマーを精製した。Beckman P/ACE MDQシステム（Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA）で実施したキャピラリー電気泳動（ＣＥ）により各オリゴマーの純度を決定した。すべての一本鎖オリゴマーは、少なくとも９０％純粋であった。
ThermoFinnigan TSQ7000、Xcaliburデータシステム、ProMassデータ処理ソフトウェア、及びParadigm MS4 HPLC（Michrom BioResources, Auburn, CA）からなるOligo HTCSシステム（Novatia, Princeton, NJ）を用い、オリゴヌクレオチドのエレクトロスプレー−イオン化液体クロマトグラフィー質量分析（ＥＳＩ−ＬＣＭＳ）を実施した。製造者により推奨されるプロトコールに従った。すべて一本鎖オリゴマーの実験的モル質量は、予想されるモル質量１．５ｇ／ｍｏｌ以内にあった。これらの結果からオリゴマーの同一性が確認された。
【０１１３】
【表１１】
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【０１１４】
細胞培養、トランスフェクション、及びルシフェラーゼアッセイ。４８ウェルプレートにおいて１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中でＨｅＬａ細胞を培養し、その翌日、集密度９０％を達成した。翌朝、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中、ウェル当たりTriFECTin(R)（Integrated DNA Technologies）１μｌを用いて２セット（一方は一般的な細胞毒性を測定するため、もう一方はアポトーシス誘導を測定するため）で、三つ組みのウェルにおいて１００ｎＭ又は５０ｎＭ濃度でＮＣ１ ＡＭＯをトランスフェクトした。アポトーシス誘導剤、スタウロスポリン（ＤＭＳＯ中１ｍＭ）を、陽性対照として細胞上１μＭで２４時間インキュベートした。ＮＣ１ ＡＭＯ処理の２４時間後、「生存細胞」に特異的なプロテアーゼにより切断されると蛍光シグナルを生じるペプチド−基質ＧＦ−ＡＦＣ（グリシル−フェニルアラニルアミノフルオロクマリン）によるMultiTox-Glo Multiplex Cytotoxicity Assay（Promega, Madison, WI）を用いて、SpectraFluor Microplate Reader（Tecan Group Ltd, Mannedorf, Switzerland）中４０５ｎｍEx／５０５ｎｍEmで測定して、第１セットの細胞を生存率について分析した。MultiTox-Glo Multiplex Cytotoxicity Assayの使用を継続し、その後、製造者の推奨に従ってGloMax(R) 96 Microplate Luminometer（Promega）で測定されたルシフェラーゼベースのアッセイにおける「死滅細胞」プロテアーゼ活性を検出することによって同じ細胞を細胞毒性について分析した。アポトーシス経路の誘導により導かれた細胞毒性を評価するため、GloMax(R) 96 Microplate Luminometer（Promega）において製造者の推奨に従って、カスパーゼ−３及び−７のレベルを測定する第２セットの細胞を用いてCaspase-Glo(R) 3/7 Assay（Promega）を実施した。
【０１１５】
結果。図８にグラフで示した細胞毒性分析では、データを、上記の豊富な「生存細胞」及び「死滅細胞」プロテアーゼから算出された生存／死滅細胞の比率として示している。
生存／死滅細胞の比率は、細胞数に依存しないデータを提供する内部標準化対照として役立ち、そして生存／死滅細胞の低下は、細胞毒性と相関関係がある。「２'ＯＭｅ ５'＋３'ｉＦＱ」及び「２'ＯＭｅ ＰＳｅｎｄｓ」化合物は、最小毒性のオリゴマーであり、そして１００ｎＭの高用量でも最小限の毒性である。「ＤＮＡ／ＰＳ」オリゴマーは、全面的にＰＳ結合を含んでおり、ＰＳ修飾が細胞に対して毒性であることを示唆するいずれの用量でも実質的な細胞死を示す。「ＤＮＡ／ＬＮＡ ＰＯ」オリゴマー中のように、ＬＮＡ塩基がＮＣ１ ＡＭＯに組み込まれた場合、１００ｎＭの高用量で細胞死が見られ、ＬＮＡ修飾が細胞に対して毒性であることを示唆している。重要なことに、「ＤＮＡ／ＬＮＡ ＰＳ」オリゴマー中にこれらの２つの化学的性質を合わせた後、追加の細胞死が見られ、アッセイ実施時の視覚分析中に見られた異形の病的な細胞とも関係がある毒性を示している。「２'ＯＭｅ／ＬＮＡ ＰＯ」及び「２'ＯＭｅ／ＬＮＡ ＰＳ」ＮＣ１ ＡＭＯ中でＤＮＡを２'ＯＭｅ塩基で置換するとそれらのＤＮＡ対応物と比較して毒性が低下するが；細胞死は、１００ｎＭ用量でなお見られる。
【０１１６】
並行して、ルシフェラーゼベースのアッセイにおいてカスパーゼ−３及び−７のレベルを調べることによって、アポトーシス誘導についてＮＣ１ ＡＭＯで処理したＨｅＬａ細胞を評価した（図９）。ルミネセンスは、アポトーシスエフェクターの存在量に比例し、そしてＲＬＵの増加は、アポトーシスの増加と相関関係がある。図９のデータは、図８で評価したＮＣ１ ＡＭＯからの細胞毒性プロファイルを反映している。アポトーシスを誘発しないＮＣ１ ＡＭＯは、「２'ＯＭｅ ５'＋３'ｉＦＱ」及び「２'ＯＭｅ ＰＳｅｎｄ」化合物である。広範なＰＳ修飾（「ＤＮＡ／ＰＳ」）及びＬＮＡ塩基（「ＤＮＡ／ＬＮＡ ＰＯ」）の組み込みは、いずれもアポトーシスを誘導するが、これらの２つの化学的性質が合わさったとき（「ＤＮＡ／ＬＮＡ ＰＳ」）、相加効果が見られる。また、２'ＯＭｅ塩基についてのＤＮＡ塩基の置換（「２'ＯＭｅ／ＬＮＡ ＰＯ」及び「２'ＯＭｅ／ＬＮＡ ＰＳ」）は、アポトーシス誘導を低下させる。しかし、「２'ＯＭｅ／ＬＮＡ ＰＳ」は、１００ｎＭ用量でなおアポトーシス誘導を示す。
【０１１７】
この細胞毒性プロファイリング分析は、ある種の化学修飾戦略が細胞生存率に有害でありうることを明らかに例示している。「２'ＯＭｅ ５'＋３'ｉＦＱ」ＡＭＯ及び「ＤＮＡ／ＬＮＡ  ＰＳ」ＡＭＯは、実施例３と類似の高い効力を示したが、かなり異なる毒性プロファイルを有する。「２'ＯＭｅ ５'＋３'ｉＦＱ」オリゴマーは、この系において非毒性であり、そして「ＤＮＡ／ＬＮＡ ＰＳ」オリゴマーは、図８で実質的に細胞死を生じ、そして図９でアポトーシスを誘導することが示された。これらのデータから、匹敵する効力（実施例３）、増加した特異性（実施例４）、及び低下した毒性を有する他の標準ＡＭＯと比較したときに、「２'ＯＭｅ ５'＋３'ｉＦＱ」ＡＭＯの優位性が確認される。
【０１１８】
本明細書に引用された刊行物、特許出願、及び特許を含むすべての参考文献は、各参考文献が、個別にかつ詳しく示されて参照により組み込まれ、そして本明細書に全体として記載されているのと同程度まで参照により本明細書によって組み込まれている。
【０１１９】
本発明を記載する文脈における（特に特許請求の範囲に関して）、単数形及び「その」といった用語並びに類似の指示対象の使用は、本明細書において特に明記されない限り、又は文脈により特に明らかに否定されない限り、単数及び複数の両方を包含するものと解釈すべきである。「含む」、「有する」、「包含する」、及び「含有する」という用語は、特に明記しない限り、無制限の用語（すなわち、「包含するが、限定されるものではない」ことを意味する）と解釈すべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書において特に明記されない限り、単に範囲に入っているそれぞれ別々の値を個別に引用する簡単な方法として用いただけであって、そしてそれぞれ別々の値は、本明細書にそれぞれ列挙されたかのように明細書に組み込まれる。本明細書に記載されたすべての方法は、本明細書において特に明記されない限り、又は文脈によって特に明らかに否定されない限り、任意の適した順序で実施することができる。本明細書に提供された任意の及びすべての例、又は例となる言語（例えば、「のような」）の使用は、単に本発明をより明らかにすることを意図しており、特に請求しない限り、本発明の範囲を制限することはない。本明細書の用語は、任意の非請求要素を本発明の実施に不可欠なものとして示していると解釈すべきではない。
【０１２０】
本発明の好ましい実施態様は、本明細書に記載されており、本発明を実施するために本発明者らに知られている最良の様式を含む。それらの好ましい実施態様の変法は、前述の説明を読むことで当業者に明らかになる。本発明者らは、熟練技術者が、必要に応じてこのような変法を用いることを期待し、そして本発明者らは、本発明が本明細書に具体的に記載された以外で実施されることを意図している。従って、本発明は、適用法によって許可されるように、本明細書に添付された特許請求の範囲に詳述された内容のすべての改良及び同等物を包含する。さらに、そのすべての可能な変法における上記要素の任意の組み合わせは、本明細書において特に明記されない限り、又は文脈によって特に明らかに否定されない限り、本発明によって包含される。
【図１】
0006053684.tif 000027
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
0006053684.tif 000035
【配列表】
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