(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リグノセルロース原料と熱安定性キシラナーゼとを接触させることを含むリグノセルロースの糖化物製造方法であって、
前記熱安定性キシラナーゼが、対応する野生型キシラナーゼと比較して、反応の初速度が７０％以上であり、５０℃及び２４時間の熱処理後のキシラナーゼ活性が熱処理前のキシラナーゼ活性に比べて５０％以上であり、かつ置換アミノ酸残基を有する変異型キシラナーゼであり、
前記変異型キシラナーゼが、配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列において、２９番目のアスパラギン残基がロイシン残基に置換され、５８番目のリジン残基がアルギニン残基に置換され、２７番目のチロシン残基がチロシン残基とは異なる他のアミノ酸残基に置換され、且つ４４番目のアスパラギン残基がアスパラギン残基とは異なる他のアミノ酸残基に置換された置換アミノ酸残基を少なくとも有する変異型キシラナーゼである糖化物製造方法。
【請求項２】
前記変異型キシラナーゼの２７番目のチロシン残基と置換される、チロシン残基とは異なる他のアミノ酸残基がフェニルアラニン残基であり、且つ４４番目のアスパラギン残基と置換される、アスパラギン残基とは異なる他のアミノ酸残基がセリン残基である変異型キシラナーゼを糖化物製造に用いる請求項１に記載の糖化物製造方法。
【請求項３】
リグノセルロース原料と熱安定性キシラナーゼとを接触させることを含むリグノセルロースの糖化物製造方法であって、
前記熱安定性キシラナーゼが、対応する野生型キシラナーゼと比較して、反応の初速度が７０％以上であり、５０℃及び２４時間の熱処理後のキシラナーゼ活性が熱処理前のキシラナーゼ活性に比べて５０％以上であり、かつ置換アミノ酸残基を有する変異型キシラナーゼであり、
前記変異型キシラナーゼが、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列において、少なくとも１５４番目のアミノ酸残基が、他のアミノ酸残基に置換されている変異型キシラナーゼである糖化物製造方法。
【請求項４】
前記変異型キシラナーゼの、３３番目のアスパラギン残基がアスパラギン酸残基に置換された置換アミノ酸残基、３６番目のグリシン残基がアルギニン残基に置換された置換アミノ酸残基、９０番目のスレオニン残基がセリン残基に置換された置換アミノ酸残基、１３２番目のグルタミン残基がアルギニン残基に置換された置換アミノ酸残基、１５４番目のロイシン残基がメチオニン残基に置換された置換アミノ酸残基、１７４番目のセリン残基がスレオニン残基に置換された置換アミノ酸残基、１９５番目のプロリン残基がヒスチジン残基に置換された置換アミノ酸残基、１９７番目のセリン残基がアスパラギン残基に置換された置換アミノ酸残基、及び２１７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基に置換された置換アミノ酸残基を少なくとも含んでいる変異型キシラナーゼを糖化物製造に用いる請求項３に記載の糖化物製造方法。
【請求項５】
前記変異型キシラナーゼの、３０番目のイソロイシン残基がバリン残基に置換された置換アミノ酸残基、３３番目のアスパラギン残基がアスパラギン酸残基に置換された置換アミノ酸残基、３６番目のグリシン残基がアルギニン残基に置換された置換アミノ酸残基、及び１５４番目のロイシン残基がメチオニン残基に置換された置換アミノ酸残基を少なくとも含んでいる変異型キシラナーゼを糖化物製造に用いる請求項３に記載の糖化物製造方法。
【請求項６】
前記変異型キシラナーゼの、３０番目のイソロイシン残基がバリン残基に置換された置換アミノ酸残基、５９番目のセリン残基がスレオニン残基に置換された置換アミノ酸残基、１５４番目のロイシン残基がメチオニン残基に置換された置換アミノ酸残基、２３９番目のチロシン残基がヒスチジン残基に置換された置換アミノ酸残基、及び２４２番目のシステイン残基がセリン残基に置換された置換アミノ酸残基を少なくとも含んでいる変異型キシラナーゼを糖化物製造に用いる請求項３に記載の糖化物製造方法。
【請求項７】
前記リグノセルロース原料がパルプである、請求項１から請求項６のいずれか一項に記載の糖化物製造方法。
【請求項８】
請求項１から請求項７のいずれか一項に記載の糖化物製造方法により得られたリグノセルロースの糖化物を含む糖化反応液から、熱安定性キシラナーゼを回収することと、回収された熱安定性キシラナーゼと、リグノセルロース原料とを接触させて糖化物を製造することと、を含む糖化物製造方法。
【請求項９】
前記糖化反応液を遠心分離または精密濾過膜で固液分離し、分離した液体を限外濾過膜で限外濾過することにより、リグノセルロースの糖化物と前記熱安定性キシラナーゼとを分離、回収する、請求項８に記載の糖化物製造方法。
【請求項１０】
前記遠心分離または精密濾過膜で固液分離した固体および限外濾過膜で回収された熱安定性キシラナーゼと、リグノセルロース原料とを接触させて糖化物を製造する、請求項９に記載の糖化物製造方法。
【請求項１１】
配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列において、２９番目のアスパラギン残基がロイシン残基に置換され、５８番目のリジン残基がアルギニン残基に置換され、２７番目のチロシン残基がフェニルアラニン残基に置換され、且つ４４番目のアスパラギン残基がセリン残基に置換された置換アミノ酸残基を少なくとも有する変異型キシラナーゼ。
【請求項１２】
配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列において、少なくとも１５４番目のロイシン残基が、メチオニン残基に置換されている変異型キシラナーゼ。
【請求項１３】
配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列において、置換したアミノ酸残基の数が、１アミノ酸残基〜１０アミノ酸残基である請求項１２に記載の変異型キシラナーゼ。
【請求項１４】
配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列において、３３番目のアスパラギン残基がアスパラギン酸残基に置換された置換アミノ酸残基、３６番目のグリシン残基がアルギニン残基に置換された置換アミノ酸残基、９０番目のスレオニン残基がセリン残基に置換された置換アミノ酸残基、１３２番目のグルタミン残基がアルギニン残基に置換された置換アミノ酸残基、１５４番目のロイシン残基がメチオニン残基に置換された置換アミノ酸残基、１７４番目のセリン残基がスレオニン残基に置換された置換アミノ酸残基、１９５番目のプロリン残基がヒスチジン残基に置換された置換アミノ酸残基、１９７番目のセリン残基がアスパラギン残基に置換された置換アミノ酸残基、及び２１７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基に置換された置換アミノ酸残基を少なくとも含んでいる請求項１２又は請求項１３に記載の変異型キシラナーゼ。
【請求項１５】
配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列において、３０番目のイソロイシン残基がバリン残基に置換された置換アミノ酸残基、３３番目のアスパラギン残基がアスパラギン酸残基に置換された置換アミノ酸残基、３６番目のグリシン残基がアルギニン残基に置換された置換アミノ酸残基、及び１５４番目のロイシン残基がメチオニン残基に置換された置換アミノ酸残基を少なくとも含んでいる請求項１２又は請求項１３に記載の変異型キシラナーゼ。
【請求項１６】
配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列において、３０番目のイソロイシン残基がバリン残基に置換された置換アミノ酸残基、５９番目のセリン残基がスレオニン残基に置換された置換アミノ酸残基、１５４番目のロイシン残基がメチオニン残基に置換された置換アミノ酸残基、２３９番目のチロシン残基がヒスチジン残基に置換された置換アミノ酸残基、及び２４２番目のシステイン残基がセリン残基に置換された置換アミノ酸残基を少なくとも含んでいる請求項１２又は請求項１３に記載の変異型キシラナーゼ。
【請求項１７】
請求項１１から請求項１６のいずれか一項に記載の変異型キシラナーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列で示される核酸。
【請求項１８】
請求項１７に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１９】
請求項１８に記載の発現ベクターを含む形質転換体。
【請求項２０】
大腸菌、枯草菌、酵母、放線菌又は糸状菌由来の細胞を宿主細胞とする請求項１９に記載の形質転換体。
【請求項２１】
前記糸状菌が、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ属、Ｈｕｍｉｃｏｌａ属又はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属に属する請求項２０に記載の形質転換体。
【請求項２２】
前記糸状菌が、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ又はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒである請求項２０又は請求項２１に記載の形質転換体。
【請求項２３】
請求項１９から請求項２２のいずれか一項に記載の形質転換体を培養し、培養された形質転換体及び該形質転換体の培養物のうち少なくともいずれか一方から、請求項１１から請求項１６のいずれか一項に記載の変異型キシラナーゼを回収することを含む変異型キシラナーゼの製造方法。
【請求項２４】
請求項１１から請求項１６のいずれか一項に記載の変異型キシラナーゼを含有する組成物。
【請求項２５】
請求項１１から請求項１６のいずれか一項に記載の変異型キシラナーゼと、パルプとを接触させること
を含むパルプの漂白方法。
【請求項２６】
請求項１１から請求項１６のいずれか一項に記載の変異型キシラナーゼを含む洗剤。
【請求項２７】
請求項１１から請求項１６のいずれか一項に記載の変異型キシラナーゼを含む動物飼料。
【請求項２８】
請求項１１から請求項１６のいずれか一項に記載の変異型キシラナーゼを含む製パン改質剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、リグノセルロース原料からの効率的な糖化物製造方法に関する。また、本発明は、変異型キシラナーゼ、変異型キシラナーゼの製造方法及び変異型キシラナーゼの用途に関する。
【背景技術】
【０００２】  キシラナーゼは、植物細胞壁を構成するキシランのβ−１，４結合をランダムに加水分解する酵素である。該酵素は、ａ）リグノセルロース原料の糖化、ｂ）パルプ漂白、ｃ）動物飼料添加剤、ｄ）洗剤補助剤及びｅ）製パン改質剤といった幅広い用途への利用が期待されている。【０００３】  ａ）リグノセルロース原料の糖化：リグノセルロース原料から、酵素を用いて醗酵基質となる単糖を産生するリグノセルロース原料の糖化方法が知られている。しかしながら、該糖化方法に用いうるセルラーゼ、ヘミセルラーゼ（キシラナーゼ等）の酵素の価格が高いことが該糖化方法の実用化の障害となっている。そこで、該糖化方法のコストを低減させるための有効な手段として、該糖化方法において用いる酵素を再利用することが提案されている（例えば特開２００６−８７３１９号公報（特許文献１）、国際公開第２０１１−０６５４４９号パンフレット（特許文献１０）及び国際公開第２０１１−１２５０５６号パンフレット（特許文献１１）を参照）。【０００４】  キシラナーゼは、リグノセルロース原料の主成分の一つであるヘミセルロース（主成分β−１，４キシラン）を分断する酵素である。そのためリグノセルロース原料の糖化方法においては、重要な酵素の一つである。しかしながら、キシラナーゼは安定性が低いことが知られている。  一方、リグノセルロース原料の糖化には、酸性領域ｐＨ４．０〜ｐＨ６．０で、４０℃〜６０℃という高温下、数日間に及ぶ処理を必要とする。そのため、キシラナーゼの安定性の低さが、酵素再利用の妨げとなっている。【０００５】  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ（以下、「Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ」と略す。）由来耐熱性キシラナーゼ変異体（例えば国際公開第２００７／１１５３９１号パンフレット（特許文献２）及び国際公開第２００７／１１５４０７号パンフレット（特許文献３）を参照。）は、５０℃〜７０℃で３０分の熱処理後も８０％以上の残存活性を示している。  また、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属由来の耐熱性キシラナーゼ（例えば特開２００４−１２１２５７号公報（特許文献４）を参照。）も、７０℃、３０分間の熱処理後９０％以上の残存活性を示すことが知られている。【０００６】  ｂ）パルプ漂白：パルプの漂白工程にキシラナーゼを用いることにより、漂白薬剤の使用量を軽減することができることが知られている。  一般的に、製紙工業におけるパルプ漂白は、前段の酸素によるパルプからの脱リグニン（ｐＨ１０〜ｐＨ１２、８０℃）処理工程と、後段の漂白工程から成る。このように後段で漂白工程を行う理由としては、酸素による脱リグニン工程を経た後も数％程度のリグニンが着色成分としてパルプに残存するためである。脱リグニン処理工程と漂白工程とに加えて、キシラナーゼを作用させる工程を追加することで、リグニン及びセルロースに結合しているヘミセルロース鎖の切断が可能となる。これにより、リグニンを効果的に除去でき、漂白工程で用いる漂白薬剤の使用量を軽減できる効果が期待できる。【０００７】  前記キシラナーゼを作用させる工程を効率よく行うためには、７０℃〜８０℃、ｐＨ１０前後で数時間の処理に耐えうる特性を有するキシラナーゼを使用する必要がある。  Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ���来の耐熱性キシラナーゼ変異体（例えば、特許文献２、特許文献３、国際公開第２００１／９２４８７号パンフレット（特許文献５）及び国際公開第２００３／０４６１６９号パンフレット（特許文献６）を参照）は、至適反応温度が７０℃前後、至適反応ｐＨが７〜８であり、パルプ漂白工程での利用の可能性が示されている。【０００８】  ｃ）動物飼料添加剤：動物飼料は植物繊維が豊富であるため、キシラナーゼを添加することにより、動物飼料中の植物細胞壁を分解できるため、動物による植物栄養の吸収効率を向上させることができる。  キシラナーゼを用いて動物飼料をペレット化する場合には、約７０℃〜約９０℃で約１０分の処理に耐えうる安定性がキシラナーゼに求められる。また、動物の消化器官の中でキシラナーゼが作用するためには、４０℃前後、ｐＨ４．８程度の環境下において高い活性を示す必要がある。  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属やＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ属といった糸状菌由来のキシラナーゼの多くは、至適ｐＨがｐＨ３〜ｐＨ５であり、作用温度域は４０℃前後である。【０００９】  特許文献２、特許文献３、国際公開第２００１／２７２５２号パンフレット（特許文献７）及び国際公開第２００５／１０８５６５号パンフレット（特許文献８）に記載されている耐熱性キシラナーゼ変異体の中には、至適ｐＨがｐＨ５〜ｐＨ５．５付近の変異体が含まれている。【００１０】  ｄ）洗剤補助剤：洗剤補助剤としてキシラナーゼを使うことにより、衣類の毛羽立ちを除去することができる。  昨今のドラム式洗浄機は節水型となっているため、洗濯回数を重ねることにより微細な毛羽立ちが起きやすい。毛羽立ちが起きると、衣類の再汚染を生じやすい。  洗剤補助剤としてキシラナーゼを使用することにより、この毛羽立ちを取り去ることができる。そのため、再汚染を防ぐことも可能になる。また、衣服に付いた野菜や果物に由来する染みの主成分は、色素の結合した野菜や果物に由来する細胞壁である。そのため、洗濯の際にキシラナーゼを用いることにより、節水型のドラム式洗浄機を用いた場合でも効果的に洗浄できる。【００１１】  キシラナーゼを洗剤補助剤として使用する場合、アルカリ耐性や界面活性剤耐性を有するキシラナーゼを用いる必要がある。また、ランドリークリーニングでキシラナーゼを使用する場合は、５０℃〜７０℃の高温域で安定に作用するキシラナーゼを使用する必要がある。  Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ由来耐熱性耐アルカリ性キシラナーゼ変異体（例えば、特許文献２、特許文献３、特許文献５及び特許文献６を参照。）は、至適温度は６２℃〜７５℃、至適ｐＨはｐＨ７〜ｐＨ８といった性質を持つ。  特許文献８で示されているキシラナーゼ変異体は、至適ｐＨはｐＨ５と酸性側ではあるが、至適温度は７０℃であり、ｐＨ８〜ｐＨ９において６０℃、１０分間は１００％活性を維持している。  Ｂａｃｉｌｌｕｓ属由来の耐熱性耐アルカリ性キシラナーゼ（例えば、特許文献４及び特開２００７−５４０５０号公報（特許文献９）を参照。）は、いずれも５０℃〜７０℃に至適温度域があり、至適ｐＨはｐＨ７〜ｐＨ８という特性を持つ。４℃〜５℃において、１日間〜２日間、ｐＨ９で１００％活性が維持されている。【００１２】  ｅ）製パン改質剤���製パン改質剤としてキシラナーゼを用いることにより、製パンの質を改良することができる。  キシラナーゼは小麦粉のヘミセルロース部分を分解する性質を持つ。キシラナーゼによりヘミセルロース部分が分解されることにより、この部分に結合している水分がドウ中に放出され、ドウの性質に変化が生じる。その結果、製パンの粒子構造及びローフ体積が改善されることにより、製パンの良好な品質保持につながる。  ドウの作製時には、材料を攪拌し捏ねる工程で大きな物理的衝撃及び圧力負荷を伴うほか、発酵工程で３５℃〜４０℃で１時間〜２時間の時間を必要とする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】  しかしながら、（ａ）リグノセルロース原料の糖化で述べた糖化酵素の再利用は、糖生産コストやリグノセルロース資源の有効活用といった観点から、改良の余地がある。  特許文献１に記載の糖化酵素再利用では、酵素がリグノセルロース残渣に結合することによって、酵素の糖化活性が低下することが示されている。このため、酵素や基質の投入量に大きな制限を設けている。  特に、酵素量について、特許文献１の実施例においては、リグノセルロースを１２時間で９６％以上分解可能な量と記載されており、多量な酵素の投入が必要な点が挙げられている。従って、経済的観点において、長期間にわたる酵素の再利用が必要になる。  また、基質としてのリグノセルロース濃度が１％程度と低く、生産される糖濃度も低い。そのため、エタノール発酵工程などへの糖の利用を考慮すると、糖化槽の容積効率やエタノール発酵生産前の濃縮等に対応するための設備投資が必要となり、経済的な観点において工業的な方法とは言い難い。  よって、ヘミセルロースを含むリグノセルロースの糖化においては、高濃度のリグノセルロースを分解でき、かつ長期間での再利用に耐えうる酵素が必要になると考えられるため、前記のように、キシラナーゼの安定性の低さが問題になる。【００１４】  一方で、特許文献１０には、セルラーゼやヘミセルラーゼ等の酵素が、残渣に吸着した後も活性を維持することが記載されている。また、反応後にリグノセルロースへ糖化酵素を吸着して回収し、次の糖化反応で再利用する方法について記載されている。  しかしながら、特許文献１０においては、糖化原料となるリグノセルロースを予め、酸性条件下で加熱処理し、リグノセルロース中のヘミセルロースの分解を行っている。そのため、加熱コストや耐酸性を有する圧力容器等の設備を設置する必要も生じることから、経済的な観点において好ましくない。  そこで、キシラナーゼによるヘミセルロースの分解が望まれるものの、糖化反応は長時間にわたるため、前記のように、その安定性の低さが問題になる。【００１５】  特許文献１１においては、初発反応で使用する糖化酵素量を多くすることによって、酵素再利用時に失われた活性に相当する分の追加投入酵素量を軽減し、全体として酵素のコストを削減できることが記載されている。  しかしながら、実際には、初発投入酵素量の１／３もの酵素量を追加投入しているため、経済的観点において好ましい方法ではない。また、特許文献１１の実施例には、反応残渣を廃棄することが記載されている。残渣に吸着した酵素が失われていることが、追加投与する酵素量を軽減できない大きな要因である。  また、特許文献１１の実施例においては、リグノセルロースに含まれるセルロースの利用、つまりグルコースの利用についてのみ述べられている。特許文献１１の実施例で用いられている前処理済みの麦わらには、３５％以上のヘミセルロース等が含まれている。リグノセルロース資源の有効活用や経済的な観点から考えると、ヘミセルロース中のキシロースも単糖として利用することが必要である。しかしながら、この場合、糖化からエタノール発酵までを想定した長時間反応後の酵素再利用を想定すると、キシラナーゼの安定性の低さが問題になる。  これらの解決策として、既存のキシラナーゼを改良した熱安定化キシラナーゼや耐熱菌由来の耐熱性キシラナーゼの利用が挙げられるが、現時点において、このようなキシラナーゼを用いた長時間の酵素再利用の報告例は無い。【００１６】  （ａ）リグノセルロース原料の糖化で述べた特許文献２及び特許文献３に記載のＴ．ｒｅｅｓｅｉ由来耐熱性キシラナーゼ変異体は、リグノセルロース原料の糖化の際に要求される条件（酸性領域、高温下での長期間の使用）を満たすものであるか否かは定かではない。  同じく、（ａ）で述べた特許文献４に記載のＢａｃｉｌｌｕｓ属由来の耐熱性キシラナーゼについては、中性付近のｐＨ７．２における熱処理時の残存活性に関する結果が示されている。そのため、リグノセルロースの糖化を行うために酸性下で数日間該耐熱性キシラナーゼを利用すれば、該耐熱性キシラナーゼの活性は低下する可能性が高い。【００１７】  （ｂ）パルプ漂白で述べたＴ．ｒｅｅｓｅｉ由来の耐熱性キシラナーゼ変異体に関する特許文献２、特許文献３、特許文献５及び特許文献６には、ｐＨ５、６０℃〜８０℃で３０分間処理した後の該Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ由来の耐熱性キシラナーゼの残存活性についてのデータが示されている。しかしながら、パルプ漂白の際に要求される条件（ｐＨ１０、７０℃〜８０℃で数時間）を想定した該Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ由来の耐熱性キシラナーゼの安定性は示されていない。【００１８】  （ｃ）動物飼料添加剤で述べたＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属やＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ属といった糸状菌由来のキシラナーゼは、ペレット化に耐え得る熱安定性は持ち合わせていない。  同じく、（ｃ）で述べた特許文献２、特許文献３、特許文献７及び特許文献８に記載されている耐熱性キシラナーゼ変異体の中には、至適ｐＨがｐＨ５〜ｐＨ５．５付近の変異体が含まれている。しかし、いずれの変異体も６０℃以上の高温域では顕著な熱失活が生じるため、動物飼料添加剤として用いることはできない。【００１９】  （ｄ）洗剤補助剤で述べた特許文献２、特許文献３、特許文献５及び特許文献６に記載されているＴ．ｒｅｅｓｅｉ由来耐熱性耐アルカリ性キシラナーゼ変異体に関しては、一般的に洗浄に要する時間（１時間〜２時間）における塩基性領域での該耐アルカリ性キシラナーゼ変異体の安定性に関しての情報は皆無であり、洗剤補助剤として用いることができるか否かについては明らかではない。  同じく、（ｄ）で述べた特許文献８に記載のキシラナーゼ変異体や、特許文献４及び特許文献９に記載のＢａｃｉｌｌｕｓ属由来の耐熱性耐アルカリ性キシラナーゼが、ランドクリーニングでの洗剤補助剤としての使用に耐えるか否かについては明らかではない。【００２０】  （ｅ）製パン改質剤で述べた特許文献２、特許文献３、特許文献５及び特許文献６に記載のＴ．ｒｅｅｓｅｉ由来の耐熱性キシラナーゼ変異体が、製パン時に加えられる大きな物理的衝撃及び圧力負荷に耐えうるか否かについては明らかにされていない。  また、製パン工程には、３５℃〜４０℃で１時間〜２時間行われる発酵工程が含まれており、この工程にも対応しうることが要求される。【００２１】  以上に示したように、キシラナーゼを利用し得る用途の範囲は多岐に渡る。そのため、キシラ���ーゼに要求される条件も幅広い。例えば、ｐＨ４〜ｐＨ１０、温度４０℃〜８０℃、数日間におよぶ使用時間といった酵素が失活しやすい厳しい条件が挙げられる。  このような多様なニーズに対応すべく、多種の変異型キシラナーゼや新規のキシラナーゼが報告されているものの、酵素が失活しやすい厳しい条件下において、十分に安定して作用しうるキシラナーゼは未だ見出されていないといえる。【００２２】  また、耐熱性を向上させることを目的として得られた変異型キシラナーゼは、反応の初速度が大きく低下するという問題点がある。これは、耐熱性向上のために加えたアミノ酸配列上の変異等により、タンパク質全体の構造上のフレキシビリティが低下してしまうためであると推測される。【００２３】  このような状況において、酸性領域（ｐＨ４〜ｐＨ６）、塩基性領域（ｐＨ８〜ｐＨ１０）又は高温域（４０℃〜８０℃）といった、酵素が失活しやすい厳しい条件下において、一定時間安定した活性を示すとともに、対応する野生型キシラナーゼと比較して反応の初速度が大きく低下することのないキシラナーゼの開発が待ち望まれていた。【００２４】  本発明は、熱安定性キシラナーゼを用いた、リグノセルロースの安価で効率的な糖化方法を提供することを課題とする。また、酵素が失活しやすい厳しい条件下においても、安定した活性を示すとともに、対応する野生型キシラナーゼと比較して反応の初速度が大きく低下することのない置換アミノ酸残基を有する変異型キシラナーゼを提供することを課題とする。さらに、本発明は該変異型キシラナーゼを低コストで製造しうる製造方法を提供するとともに、該変異型キシラナーゼの様々な用途を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本発明は以下のとおりである。
［１］  リグノセルロース原料と熱安定性キシラナーゼとを接触させることを含むリグノセルロースの糖化物製造方法であって、
前記熱安定性キシラナーゼが、対応する野生型キシラナーゼと比較して、反応の初速度が７０％以上であり、５０℃及び２４時間の熱処理後のキシラナーゼ活性が熱処理前のキシラナーゼ活性に比べて５０％以上であり、かつ置換アミノ酸残基を有する変異型キシラナーゼであり、
前記変異型キシラナーゼが、配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列において、２９番目のアスパラギン残基がロイシン残基に置換され、５８番目のリジン残基がアルギニン残基に置換され、２７番目のチロシン残基がチロシン残基とは異なる他のアミノ酸残基に置換され、且つ４４番目のアスパラギン残基がアスパラギン残基とは異なる他のアミノ酸残基に置換された置換アミノ酸残基を少なくとも有する変異型キシラナーゼである糖化物製造方法。
［２］  前記変異型キシラナーゼの２７番目のチロシン残基と置換される、チロシン残基とは異なる他のアミノ酸残基がフェニルアラニン残基であり、且つ４４番目のアスパラギン残基と置換される、アスパラギン残基とは異なる他のアミノ酸残基がセリン残基である変異型キシラナーゼを糖化物製造に用いる［１］に記載の糖化物製造方法。
［３］  リグノセルロース原料と熱安定性キシラナーゼとを接触させることを含むリグノセルロースの糖化物製造方法であって、
前記熱安定性キシラナーゼが、対応する野生型キシラナーゼと比較して、反応の初速度が７０％以上であり、５０℃及び２４時間の熱処理後のキシラナーゼ活性が熱処理前のキシラナーゼ活性に比べて５０％以上であり、かつ置換アミノ酸残基を有する変異型キシラナーゼであり、
前記変異型キシラナーゼが、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列において、少なくとも１５４番目のアミノ酸残基が、他のアミノ酸残基に置換されている変異型キシラナーゼである糖化物製造方法。
［４］  前記変異型キシラナーゼの、３３番目のアスパラギン残基がアスパラギン酸残基に置換された置換アミノ酸残基、３６番目のグリシン残基がアルギニン残基に置換された置換アミノ酸残基、９０番目のスレオニン残基がセリン残基に置換された置換アミノ酸残基、１３２番目のグルタミン残基がアルギニン残基に置換された置換アミノ酸残基、１５４番目のロイシン残基がメチオニン残基に置換された置換アミノ酸残基、１７４番目のセリン残基がスレオニン残基に置換された置換アミノ酸残基、１９５番目のプロリン残基がヒスチジン残基に置換された置換アミノ酸残基、１９７番目のセリン残基がアスパラギン残基に置換された置換アミノ酸残基、及び２１７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基に置換された置換アミノ酸残基を少なくとも含んでいる変異型キシラナーゼを糖化物製造に用いる［３］に記載の糖化物製造方法。
［５］  前記変異型キシラナーゼの、３０番目のイソロイシン残基がバリン残基に置換された置換アミノ酸残基、３３番目のアスパラギン残基がアスパラギン酸残基に置換された置換アミノ酸残基、３６番目のグリシン残基がアルギニン残基に置換された置換アミノ酸残基、及び１５４番目のロイシン残基がメチオニン残基に置換された置換アミノ酸残基を少なくとも含んでいる変異型キシラナーゼを糖化物製造に用いる［３］に記載の糖化物製造方法。
［６］  前記変異型キシラナーゼの、３０番目のイソロイシン残基がバリン残基に置換された置換アミノ酸残基、５９番目のセリン残基がスレオニン残基に置換された置換アミノ酸残基、１５４番目のロイシン残基がメチオニン残基に置換された置換アミノ酸残基、２３９番目のチロシン残基がヒスチジン残基に置換された置換アミノ酸残基、及び２４２番目のシステイン残基がセリン残基に置換された置換アミノ酸残基を少なくとも含んでいる変異型キシラナーゼを糖化物製造に用いる［３］に記載の糖化物製造方法。
［７］  前記リグノセルロース原料がパルプである、［１］〜［６］のいずれか１つに記載の糖化物製造方法。
［８］  ［１］〜［７］のいずれか１つに記載の糖化物製造方法により得られたリグノセルロースの糖化物を含む糖化反応液から、熱安定性キシラナーゼを回収することと、回収された熱安定性キシラナーゼと、リグノセルロース原料とを接触させて糖化物を製造することと、を含む糖化物製造方法。
［９］  前記糖化反応液を遠心分離または精密濾過膜で固液分離し、分離した液体を限外濾過膜で限外濾過することにより、リグノセルロースの糖化物と前記熱安定性キシラナーゼを分離、回収する、［８］に記載の糖化物製造方法。
［１０］  前記遠心分離または精密濾過膜で固液分離した固体および限外濾過膜で回収された熱安定性キシラナーゼと、リグノセルロース原料とを接触させて糖化物を製造する、［９］に記載の糖化物製造方法。
［１１］  配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列において、２９番目のアスパラギン残基がロイシン残基に置換され、５８番目のリジン残基がアルギニン残基に置換され、２７番目のチロシン残基がフェニルアラニン残基に置換され、且つ４４番目のアスパラギン残基がセリン残基に置換された置換アミノ酸残基を少なくとも有する変異型キシラナーゼ。
［１２］  配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列において、少なくとも１５４番目のロイシン残基が、メチオニン残基に置換されている変異型キシラナーゼ。
［１３］  配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列において、置換したアミノ酸残基の数が、１アミノ酸残基〜１０アミノ酸残基である［１２］に記載の変異型キシラナーゼ。
［１４］  配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列において、３３番目のアスパラギン残基がアスパラギン酸残基に置換された置換アミノ酸残基、３６番目のグリシン残基がアルギニン残基に置換された置換アミノ酸残基、９０番目のスレオニン残基がセリン残基に置換された置換アミノ酸残基、１３２番目のグルタミン残基がアルギニン残基に置換された置換アミノ酸残基、１５４番目のロイシン残基がメチオニン残基に置換された置換アミノ酸残基、１７４番目のセリン残基がスレオニン残基に置換された置換アミノ酸残基、１９５番目のプロリン残基がヒスチジン残基に置換された置換アミノ酸残基、１９７番目のセリン残基がアスパラギン残基に置換された置換アミノ酸残基、及び２１７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基に置換された置換アミノ酸残基を少なくとも含んでいる［１２］又は［１３］に記載の変異型キシラナーゼ。
［１５］  配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列において、３０番目のイソロイシン残基がバリン残基に置換された置換アミノ酸残基、３３番目のアスパラギン残基がアスパラギン酸残基に置換された置換アミノ酸残基、３６番目のグリシン残基がアルギニン残基に置換された置換アミノ酸残基、及び１５４番目のロイシン残基がメチオニン残基に置換された置換アミノ酸残基を少なくとも含んでいる［１２］又は［１３］に記載の変異型キシラナーゼ。
［１６］  配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列において、３０番目のイソロイシン残基がバリン残基に置換された置換アミノ酸残基、５９番目のセリン残基がスレオニン残基に置換された置換アミノ酸残基、１５４番目のロイシン残基がメチオニン残基に置換された置換アミノ酸残基、２３９番目のチロシン残基がヒスチジン残基に置換された置換アミノ酸残基、及び２４２番目のシステイン残基がセリン残基に置換された置換アミノ酸残基を少なくとも含んでいる［１２］又は［１３］に記載の変異型キシラナーゼ。
［１７］  ［１１］〜［１６］のいずれか一つに記載の変異型キシラナーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列で示される核酸。
［１８］  ［１７］に記載の核酸を含む発現ベクター。
［１９］  ［１８］に記載の発現ベクターを含む形質転換体。
［２０］  大腸菌、枯草菌、酵母、放線菌又は糸状菌由来の細胞を宿主細胞とする［１９］に記載の形質転換体。
［２１］  前記糸状菌が、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ属、Ｈｕｍｉｃｏｌａ属又はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属に属する［２０］に記載の形質転換体。
［２２］  前記糸状菌が、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ又はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒである［２０］又は［２１］に記載の形質転換体。
［２３］  ［１９］から［２２］のいずれか一つに記載の形質転換体を培養し、培養された形質転換体及び該形質転換体の培養物のうち少なくともいずれか一方から、［１１］〜［１６］のいずれか一つに記載の変異型キシラナーゼを回収することを含む変異型キシラナーゼの製造方法。
［２４］  ［１１］〜［１６］のいずれか一つに記載の変異型キシラナーゼを含有する組成物。
［２５］  ［１１］〜［１６］のいずれか一つに記載の変異型キシラナーゼと、パルプとを接触させることを含むパルプの漂白方法。
［２６］  ［１１］〜［１６］のいずれか一つに記載の変異型キシラナーゼを含む洗剤。
［２７］  ［１１］〜［１６］のいずれか一つに記載の変異型キシラナーゼを含む動物飼料。
［２８］  ［１１］〜［１６］のいずれか一つに記載の変異型キシラナーゼを含む製パン改質剤。
【発明の効果】
【００２６】  本発明によれば、熱安定性キシラナーゼを用いた、リグノセルロースの安価で効率的な糖化方法を提供することができる。また、酵素が失活しやすい厳しい条件下においても、安定した活性を示すとともに、対応する野生型キシラナーゼと比較して反応の初速度が大きく低下することのない置換アミノ酸残基を有する変異型キシラナーゼを提供することができる。さらに、本発明によれば、該変異型キシラナーゼを低コストで製造しうる製造方法を提供するとともに、該変異型キシラナーゼの様々な用途を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２７】  本発明にかかる熱安定性キシラナーゼは、一定時間熱処理後のキシラナーゼ活性の程度が、熱処理前のキシラナーゼ活性と変わらないもの、もしくは熱処理後のキシラナーゼ活性の減少が、熱処理前のキシラナーゼ活性と比べて少ないものであればよい。  例として、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、アウレオバシデウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属、スエヒロタケ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｃｏｍｍｕｎｅ）属等の糸状菌、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属やクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属等の細菌類から得られるキシラナーゼが挙げられる。  前記の野生型キシラナーゼの中でも、５０℃及び２４時間の熱処理後のキシラナーゼ活性が熱処理前のキシラナーゼ活性に比べて５０％以上であることが好ましい。  また、本発明にかかる熱安定性キシラナーゼは、前記糸状菌、細菌類を含めた野生型のキシラナーゼに変異を導入し、必要に応じて熱安定性を向上させた変異型キシラナーゼでもよい。このような変異型キシラナーゼの場合、対応する野生型キシラナーゼと比較して、反応の初速度が７０％以上であり、５０℃及び２４時間の熱処理後のキシラナーゼ活性が熱処理前のキシラナーゼ活性に比べて５０％以上であり、かつ置換アミノ酸を有するものがさらに好ましい。  本発明にかかる核酸は、前記変異型キシラナーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列で示されるものである。  本発明にかかる発現ベクターは、前記変異型キシラナーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列で示される核酸を含むものである。  本発明にかかる宿主細胞は、前記変異型キシラナーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列で示される核酸を含む発現ベクターで形質転換されたものである。  本発明にかかる変異型キシラナーゼの製造方法は、前記宿主細胞を培養し、培養された宿主細胞及び該宿主細胞の培養物のうち少なくともいずれか一方から、前記変異型キシラナーゼを採取することを含むものである。なお、本発明にかかる変異型キシラナーゼには、前記変異型キシラナーゼの製造方法によって製造された変異型キシラナーゼも含む。  本発明にかかる組成物は、前記変異型キシラナーゼを含有するものである。  本発明にかかるリグノセルロースの糖化物の製造方法は、前記変異型キシラナーゼと、リグノセルロース原料とを接触させることを含むものである。  本発明にかかるパルプの漂白方法は、前記変異型キシラナーゼと、パルプとを接触させることを含むものである。  本発明にかかる洗剤、動物飼料又は製パン改質剤は、前記変異型キシラナーゼを含むものである。
【００２８】  本発明において、変異型キシラナーゼをコードするアミノ酸配列及び塩基配列、又はプライマーの個々の配列に関して、これら互いの相補的な関係に基づいて記述された事項は、特に断らない限り、それぞれの配列と、各配列に対して相補的な配列とについても適用される。各配列に対して相補的な当該配列について本発明の事項を適用する際には、当該相補的な配列が認識する配列について、当業者にとっての技術常識の範囲内で、対応する本明細書に記載された配列に相補的な配列として、明細書全体を読み替えるものとする。
【００２９】  本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても本工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。  本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。  本明細書において、組成物中の各成分の量は、組成物中の各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。  以下、本発明について説明する。
【００３０】（１）定義〔キシラナーゼ活性と反応の初速度の定義〕  本発明において「キシラナーゼ活性」とは、主に植物細胞壁を構成するキシランのβ−１，４結合をランダムに加水分解し、還元末端を有するオリゴ糖（以下、「還元糖」とも略す。）を生成することを示す。  本発明において「反応の初速度」とは、キシラナーゼ活性の反応の初速度を示す。  反応の初速度は、次のようにして確認することができる。まず、基質として、１００ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に１％（ｗ／ｗ）のバーチウッドキシラン（シグマ・アルドリッチ社製）を激しく混合し、５０００×ｇで１５分間遠心し、クエン酸ナトリウム緩衝液中に存在する残存キシランを除いた上澄み液を準備する。次に、前記上澄み液を基質液として、該基質液に対してキシラナーゼを０．１％（ｗ／ｗ）となるよう混合し、４５℃で３０分間攪拌しながら反応させ、得られた反応液中の還元糖の量をＤＮＳ法（Ｂａｉｌｅｙ等、１９９２）で測定することにより、キシラナーゼ活性の反応の初速度を確認できる。
【００３１】〔野生型と同等の活性の定義〕  本明細書において「野生型と同等の活性」とは、野生型キシラナーゼの反応の初速度を１としたとき、変異型キシラナーゼの反応の初速度が０．７（７０％）以上のことをいう。〔酵素が安定に作用する範囲の定義〕  本明細書において「酵素が安定に作用する範囲」は、温度が３０℃より大きく４０℃より小さく、かつｐＨが６より大きく８より小さい範囲をいう。  本明細書において「酵素が失活しやすい厳しい条件」とは、酸性領域（ｐＨ４〜ｐＨ６）、塩基性領域（ｐＨ８〜ｐＨ１０）及び高温域（４０℃〜８０℃）をいう。
【００３２】〔残存活性と安定性の定義〕  本明細書において、「残存活性」とは、酵素が安定に作用する範囲外に、一定時間、酵素を曝した後の反応の初速度を、曝す前の反応の初速度で除し、百分率表示したものを言う。具体的な測定方法は、５０℃かつｐＨ４．５で１６時間、２４時間、４８時間、７２時間加熱処理後、氷上で５分間静置し、反応の初速度を測定すると同時に、熱処理前の該酵素の初速度も測定し、除して百分率表示する。前記以外に、５０℃かつｐＨ８、ｐＨ９、ｐＨ１０で１時間加熱処理後、６０℃かつｐＨ８、ｐＨ９、ｐＨ１０で１時間加熱処理後、７０℃かつｐＨ５．５で５分間加熱処理後の反応の初速度についても同様に残存活性を測定する。  本明細書において、安定性は、前記酵素が失活しやすい厳しい条件下に酵素が曝されたときの残存活性の程度により判定する。
【００３３】（２）本発明の変異型キシラナーゼについて  本発明の変異型キシラナーゼは、対応する野生型キシラナーゼと比較して、反応の初速度が７０％以上であり、５０℃及び２４時間の熱処理後のキシラナーゼ活性が熱処理前のキシラナーゼ活性に比べて５０％以上であり、かつ置換アミノ酸残基を有するものである。  本発明の変異型キシラナーゼは、置換アミノ酸残基を有することにより、酵素が失活しやすい厳しい条件下においても、安定した活性を示すとともに、対応する野生型キシラナーゼと比較しても反応の初速度が大きく低下することがない。
【００３４】  本発明における変異型キシラナーゼとしては、対応する野生型キシラナーゼと比較して、反応の初速度が７０％以上であり、５０℃及び２４時間の熱処理後のキシラナーゼ活性が熱処理前のキシラナーゼ活性に比べて５０％以上であり、かつ置換アミノ酸残基を有するものであれば、特に制限されるものではない。
【００３５】  本発明における変異型キシラナーゼとしては、対応する野生型キシラナーゼと比較して、好ましくは反応の初速度が７０％以上であることが挙げられる。  反応の初速度が７０％以上であれば、変異型キシラナーゼの使用量が、変異型キシラナーゼに対応する野生型キシラナーゼの使用より多くなることがないため、産業利用上好ましい。
【００３６】  本発明における変異型キシラナーゼとしては、５０℃及び２４時間の熱処理後のキシラナーゼ活性が熱処理前のキシラナーゼ活性に比べて、好ましくは５０％以上であり、より好ましくは７０％以上である。  ５０℃及び２４時間の熱処理後のキシラナーゼ活性が熱処理前のキシラナーゼ活性に比べて５０％以上であれば、酵素が安定に作用する範囲内で使用することができるため好ましい。具体的には、リグノセルロースの糖化といった長時間の酵素反応や酵素再利用を要する場合に、反応開始当初の反応初速度を維持するために大量の酵素を追加する必要もなく、結果としてコストがかさむ等の心配もなく、経済的な観点からも好ましい。
【００３７】  本発明における変異型キシラナーゼとしては、その由来は特に制限されるものではない。例えば、枯草菌、クロストリジウム属菌、放線菌又は糸状菌、担子菌由来の変異型キシラナーゼが挙げられる。産業利用上の観点より、前記糸状菌の中でも、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ属、Ｈｕｍｉｃｏｌａ属又はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属由来の変異型キシラナーゼが好ましい。さらに、大量生産の観点より、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ又はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ由来の変異型キシラナーゼがより好ましい。
【００３８】  酵素が失活しやすい厳しい条件下においても、安定した活性を示すとともに、対応する野生型キシラナーゼと比較して反応の初速度が大きく低下することがないという観点より、以下の二種の変異型キシラナーゼが、さらに好ましい変異型キシラナーゼとして挙げられる。
【００３９】  まず、第１の好ましい変異型キシラナーゼとしては、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来の変異型キシラナーゼが挙げられる。
【００４０】  前記第１の好ましい変異型キシラナーゼは、さらに、対応する野生型キシラナーゼと比較して、反応の初速度が７０％以上であり、５０℃及び２４時間の熱処理後のキシラナーゼ活性が熱処理前のキシラナーゼ活性に比べて５０％以上であるという観点より、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅの変異型キシラナーゼであることが好ましい。
【００４１】  前記第１の好ましい変異型キシラナーゼは、さらに、対応する野生型キシラナーゼと比較して、反応の初速度が７０％以上であり、５０℃及び２４時間の熱処理後のキシラナーゼ活性が熱処理前のキシラナーゼ活性に比べて５０％以上を達成しやすくするという観点より、配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列において、２９番目のアスパラギン残基がロイシン残基に置換され、５８番目のリジン残基がアルギニン残基に置換され、２７番目のチロシン残基がチロシン残基とは異なる他のアミノ酸残基に置換され、且つ４４番目のアスパラギン残基がアスパラギン残基とは異なる他のアミノ酸残基に置換された置換アミノ酸残基を有する変異体キシラナーゼが挙げられる。
【００４２】  配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅのキシラナーゼＩＩをコードするアミノ酸配列である。
【００４３】  また、第２の好ましい変異型キシラナーゼとしては、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ属糸状菌由来の変異型キシラナーゼが挙げられる。
【００４４】  前記第２の好ましい変異型キシラナーゼは、さらに対応する野生型キシラナーゼと比較して、反応の初速度が７０％以上であり、５０℃及び２４時間の熱処理後のキシラナーゼ活性が熱処理前のキシラナーゼ活性に比べて５０％以上であるという観点より、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓの変異型キシラナーゼであることが好ましい。
【００４５】  配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列は、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓのキシラナーゼＩをコードするアミノ酸配列である。
【００４６】  前記第２の好ましい変異型キシラナーゼは、対応する野生型キシラナーゼと比較して、反応の初速度が７０％以上であり、５０℃及び２４時間の熱処理後のキシラナーゼ活性が熱処理前のキシラナーゼ活性に比べて５０％以上を達成しやすくするという観点より、少なくとも１５４番目のロイシン残基がメチオニン残基に置換された置換アミノ酸残基を含んでいることが好ましい。
【００４７】  本発明の変異型キシラナーゼの具体例としては、例えば以下表１で示すようにクローン番号１〜クローン番号１７で示される置換アミノ酸残基を有するものが挙げられるが、本発明の変異型キシラナーゼはこれらに限定されるものではない。
【００４８】
【表１】
0005889331.tif 000002
【００４９】  上記表１のうち、対応する野生型キシラナーゼと比較して、反応の初速度が７０％以上であり、５０℃及び２４時間の熱処理後のキシラナーゼ活性が熱処理前のキシラナーゼ活性に比べて５０％以上という観点より、変異型キシラナーゼＴＶＸ０１（クローン番号１）、変異型キシラナーゼＡＣＸ０１（クローン番号１５）、変異型キシラナーゼＡＣＸ０２（クローン番号１６）又は変異型キシラナーゼＡＣＸ０３（クローン番号１７）が好ましい。
【００５０】  前記変異型キシラナーゼＴＶＸ０１は、配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列において、２９番目のアスパラギン残基がロイシン残基に置換され、５８番目のリジン残基がアルギニン残基に置換され、２７番目のチロシン残基がフェニルアラニン残基に置換され、且つ４４番目のアスパラギン残基がセリン残基に置換された置換アミノ酸残基を含んでいる。変異型キシラナーゼＴＶＸ０１は、対応する野生型キシラナーゼと比較して、反応の初速度が７０％以上であり、５０℃及び２４時間の熱処理後のキシラナーゼ活性が熱処理前のキシラナーゼ活性に比べて５０％以上であるという観点より好ましい。
【００５１】  本発明にかかる変異型キシラナーゼＴＶＸ０１は、好ましくは３０℃〜９０℃の範囲で活性を有するものであり、より好ましくは、３０℃〜７０℃の範囲で活性を有するものである。また、好ましくはｐＨ３〜ｐＨ９の範囲で活性を有するものであり、より好ましくはｐＨ４〜ｐＨ７の範囲で活性を有するものである。
【００５２】  前記変異型キシラナーゼＡＣＸ０１は、３３番目のアスパラギン残基がアスパラギン酸残基に置換された置換アミノ酸残基、３６番目のグリシン残基がアルギニン残基に置換された置換アミノ酸残基、９０番目のスレオニン残基がセリン残基に置換された置換アミノ酸残基、１３２番目のグルタミン残基がアルギニン残基に置換された置換アミノ酸残基、１５４番目のロイシン残基がメチオニン残基に置換された置換アミノ酸残基、１７４番目のセリン残基がスレオニン残基に置換された置換アミノ酸残基、１９５番目のプロリン残基がヒスチジン残基に置換された置換アミノ酸残基、１９７番目のセリン残基がアスパラギン残基に置換された置換アミノ酸残基、及び２１７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基に置換された置換アミノ酸残基を含んでいる。変異型キシラナーゼＡＣＸ０１は、対応する野生型キシラナーゼと比較して、反応の初速度が７０％以上であり、５０℃及び２４時間の熱処理後のキシラナーゼ活性が熱処理前のキシラナーゼ活性に比べて５０％以上であるという観点より好ましい。
【００５３】  本発明にかかる変異型キシラナーゼＡＣＸ０１は、好ましくは３０℃〜８０℃の範囲で活性を有するものであり、より好ましくは、３０℃〜６５℃の範囲で活性を有するものである。また、好ましくはｐＨ２〜ｐＨ８の範囲で活性を有するものであり、より好ましくはｐＨ２〜ｐＨ５の範囲で活性を有するものである。
【００５４】  前記変異型キシラナーゼＡＣＸ０２は、３０番目のイソロイシン残基がバリン残基に置換された置換アミノ酸残基、３３番目のアスパラギン残基がアスパラギン酸残基に置換された置換アミノ酸残基、３６番目のグリシン残基がアルギニン残基に置換された置換アミノ酸残基、及び１５４番目のロイシン残基がメチオニン残基に置換された置換アミノ酸残基を含んでいる。変異型キシラナーゼＡＣＸ０２は、対応する野生型キシラナーゼと比較して、反応の初速度が７０％以上であり、５０℃及び２４時間の熱処理後のキシラナーゼ活性が熱処理前のキシラナーゼ活性に比べて５０％以上であるという観点より好ましい。
【００５５】  本発明にかかる変異型キシラナーゼＡＣＸ０２は、好ましくは３０℃〜８０℃の範囲で活性を有するものであり、より好ましくは、３０℃〜６５℃の範囲で反応活性を有するものである。また、好ましくはｐＨ２〜ｐＨ８の範囲で活性を有するものであり、より好ましくはｐＨ２〜ｐＨ５の範囲で活性を有するものである。
【００５６】  前記変異型キシラナーゼＡＣＸ０３は、３０番目のイソロイシン残基がバリン残基に置換された置換アミノ酸残基、５９番目のセリン残基がスレオニン残基に置換された置換アミノ酸残基、１５４番目のロイシン残基がメチオニン残基に置換された置換アミノ酸残基、２３９番目のチロシン残基がヒスチジン残基に置換された置換アミノ酸残基、及び２４２番目のシステイン残基がセリン残基に置換された置換アミノ酸残基を含んでいる。変異型キシラナーゼＡＣＸ０３は、対応する野生型キシラナーゼと比較して、反応の初速度が７０％以上であり、５０℃及び２４時間の熱処理後のキシラナーゼ活性が熱処理前のキシラナーゼ活性に比べて５０％以上であるという観点より好ましい。
【００５７】  本発明にかかる変異型キシラナーゼＡＣＸ０３は、好ましくは３０℃〜８０℃の範囲で活性を有するものであり、より好ましくは、３０℃〜６５℃の範囲で活性を有するものである。また、好ましくはｐＨ２〜ｐＨ８の範囲で活性を有するものであり、より好ましくはｐＨ２〜ｐＨ５の範囲で活性を有するものである。
【００５８】  本発明の変異型キシラナーゼとしては、例えば変異型キシラナーゼＴＶＸ０１と相同性が認められる各アミノ酸配列からなる変異型キシラナーゼも、本発明における変異型キシラナーゼに包含される。  相同性が認められるアミノ酸配列とは、例えば変異型キシラナーゼＴＶＸ０１と同等程度のキシラナーゼ活性を示すアミノ酸配列であればよい。好ましくは変異型キシラナーゼＴＶＸ０１のアミノ酸配列と８０％以上の相同性、より好ましくは９０％以上の相同性、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する変異型キシラナーゼが挙げられる。８０％以上の相同性を示すことにより、キシラナーゼの立体構造類似性が高くなると考えられるため、本発明で明らかになった変異点を導入して、本発明と同等程度の作用を示す変異型キシラナーゼを開発できる等の利点がある。  変異型キシラナーゼＴＶＸ０１の他、変異型キシラナーゼＡＣＸ０１、変異型キシラナーゼＡＣＸ０２及び変異型キシラナーゼＡＣＸ０３についても同様である。
【００５９】  また、本発明における変異型キシラナーゼＴＶＸ０１としては、変異型キシラナーゼＴＶＸ０１と同等程度の作用を示すものであれば、変異型キシラナーゼＴＶＸ０１をコードするアミノ酸配列にアミノ酸残基が挿入、欠失又は置換した変異型キシラナーゼも、本発明における変異型キシラナーゼＴＶＸ０１に包含される。
【００６０】  アミノ酸残基が挿入、欠失又は置換されている場合、その挿入、欠失又は置換の位置は、本発明で示された作用を損なわない限りにおいて、任意に決定できる。挿入、欠失又は置換したアミノ酸残基の数としては１アミノ酸残基又は２アミノ酸残基以上が挙げられ、例えば１アミノ酸残基〜１０アミノ酸残基、好ましくは１アミノ酸残基〜５アミノ酸残基が挙げられる。具体的には、４重変異点を有すると同時に、配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列において、４７番目のグリシン残基がシステイン残基に置換したもの、５２番目のグルタミン残基がリジン残基に置換したもの、５９番目のバリン残基がイソロイシン残基に置換したもの、６７番目のアスパラギン残基がアスパラギン酸残基に置換したもの、６９番目のアスパラギン残基がイソロイシン残基に置換したもの、８０番目のセリン残基がアラニン残基に置換したもの、９７番目のアスパラギン残基がアスパラギン酸残基に置換したもの、１０５番目のロイシン残基がメチオニン残基に置換したもの、１０９番目のスレオニン残基がアラニン残基に置換したもの、１２０番目のスレオニン残基がアルギニン残基に置換したもの、１４３番目のスレオニン残基がイソロイシン残基に置換したもの、１５１番目のアスパラギン残基がセリン残基に置換したもの、１６１番目のセリン残基がロイシン残基に置換したもの、１８６番目セリン残基がスレオニン残基に置換したものなどが挙げられる。
【００６１】  変異型キシラナーゼＴＶＸ０１の他、変異型キシラナーゼＡＣＸ０１、変異型キシラナーゼＡＣＸ０２及び変異型キシラナーゼＡＣＸ０３についても同様である。具体的には、ＡＣＸ０１が有する変異点以外に、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列において、１３３番目のセリン残基がアスパラギン残基に、１７６番目のグルタミン残基がアルギニン残基に置換したものなどが挙げられる。
【００６２】  また、変異型キシラナーゼＡＣＸ０２についても同様に、その変異点すべてを有する多くの変異体がＡＣＸ０２と同程度の性質を示し、具体的には、ＡＣＸ０２が有する変異点以外に、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列において、９０番目のスレオニン残基がセリン残基に、１３２番目のグルタミン残基がアルギニン残基に、１３３番目のセリンがアスパラギン残基に、１７４番目のセリン残基がスレオニン残基に、１９５番目のプロリン残基がヒスチジン残基に、１７６番目のグルタミン残基がアルギニン残基に、１９７番目のセリン残基がアスパラギン残基に、２１７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基に置換したものなどが挙げられる。
【００６３】  さらに、変異型キシラナーゼＡＣＸ０３の変異点すべてを有する多くの変異体がＡＣＸ０３と同程度の性質を示し、具体的には、ＡＣＸ０３が有する変異点以外に、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列において、１７６番目のグルタミン残基がアルギニン残基に置換したものなどが挙げられる。
【００６４】  本発明の変異型キシラナーゼは、公知の方法に従い合成することができる。遺伝子に変異を生じさせる方法としては、例えば、部位特異的変異法（Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ． ａｎｄ ｆｒｉｔａ，Ｈ．Ｊ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１５４，Ｐ．３５０（１９８７））、リコンビナントＰＣＲ法（ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、特定の部分のＤＮＡを化学合成する方法、遺伝子をヒドロキシアミン処理する方法、遺伝子を保有する菌株を紫外線照射処理、または、ニトロソグアニジンや亜硝酸などの化学薬剤で処理する方法などが挙げられる。なお、本発明の変異型キシラナーゼを得る方法のうち、好ましい方法としては、以下に述べる変異型キシラナーゼの製造方法が挙げられる。
【００６５】（３）変異型キシラナーゼの製造方法  本発明にかかる変異型キシラナーゼの製造方法（以下、単に「製造方法」とも言う。）は、形質転換体を培養し、培養された形質転換体及び該形質転換体の培養物のうち少なくともいずれか一方から、前記変異型キシラナーゼを回収するものである。  ここで形質転換体とは、前記変異型キシラナーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列で示される核酸を含む発現ベクターで形質転換されたものを示す。  本発明にかかる変異型キシラナーゼの製造方法は、前記変異型キシラナーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列で示される核酸を含む発現ベクターで形質転換された形質転換体を培養することにより変異型キシラナーゼを製造するものである。当該製造方法により、酵素が失活しやすい厳しい条件下においても、安定した活性を示すとともに、対応する野生型キシラナーゼと比較しても反応の初速度が大きく低下することのない変異型キシラナーゼを、低コストで製造することができる。
【００６６】  以下に、製造方法に含まれうる各工程を説明するが、本発明にかかる変異型キシラナーゼの製造方法は、前記変異型キシラナーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列で示される核酸を含む発現ベクターで形質転換された形質転換体を培養する工程（宿主細胞培養工程）、及び培養された形質転換体及び該形質転換体の培養物のうち少なくともいずれか一方から、前記変異型キシラナーゼを回収する工程（変異型キシラナーゼ回収工程）を含んでいればよく、必要に応じてさらに他の工程を含んでいてもよい。
【００６７】Ａ．形質転換体培養工程  形質転換体培養工程は、前記変異型キシラナーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列で示される核酸を含む発現ベクターで形質転換された形質転換体を培養する工程である。
【００６８】〔形質転換体〕  本発明にかかる製造方法において、形質転換体とは前記変異型キシラナーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列で示される核酸を含む発現ベクターで形質転換されたものであれば特に限定されない。  前記形質転換体は、例えば、大腸菌、枯草菌、酵母、放線菌、糸状菌等由来の細胞を宿主細胞とするものが挙げられ、この中でも、目的酵素を菌体外に分泌生産させることができる枯草菌、酵母、放線菌又は糸状菌由来の細胞を宿主細胞とするものが産業利用上好ましい。
【００６９】  酵母としては、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、またはピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属に属するものが挙げられ、好ましい酵母の一例は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。
【００７０】  また、糸状菌としては、例えば、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、またはアクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属に属するものが挙げられ、好ましい糸状菌の例は、フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）もしくはアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、またはトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）、またはアクレモニウム・セルロリティカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）である。さらに、産業利用上の観点より、トリコデルマ・ビリデ、アクレモニウム・セルロリティカス、フミコーラ・インソレンス又はアスペルギルス・ニガーがより好ましい。
【００７１】〔核酸〕  前記核酸は、前記変異型キシラナーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列で示される。  前記変異型キシラナーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列を合成する方法として、対応する野生型キシラナーゼをコードする塩基配列に変異点を導入する方法や、変異点を含む全塩基配列を化学的に合成する方法などが挙げられる。以下に、対応する野生型キシラナーゼをコードする塩基配列に変異点を導入する方法について、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓのキシラナーゼＩをコードする塩基配列及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅのキシラナーゼＩＩをコードする塩基配列を用いて説明するが、本発明にかかる核酸はこれらに限定されるものではない。
【００７２】〔野生型キシラナーゼをコードする塩基配列への変異点の導入〕  野生型キシラナーゼをコードする塩基配列の例としては、配列表の配列番号３に記載のＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓのキシラナーゼＩをコードする塩基配列、及び配列番号４に記載のＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅのキシラナーゼＩＩをコードする塩基配列が挙げられる。  これらの野生型キシラナーゼをコードする塩基配列を鋳型として、遺伝子に変異を生じさせる方法としては、例えば、部位特異的変異法（Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ． ａｎｄ ｆｒｉｔａ，Ｈ．Ｊ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１５４，Ｐ．３５０（１９８７））、リコンビナントＰＣＲ法（ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、特定の部分のＤＮＡを化学合成する方法、遺伝子をヒドロキシアミン処理する方法、遺伝子を保有する菌株を紫外線照射処理、または、ニトロソグアニジンや亜硝酸などの化学薬剤で処理する方法、市販の突然変異導入キットなどにより、前記塩基配列に変異を導入することができる。  変異を導入する位置や種類としては、特に限定されるものではない。具体例として前記クローン番号１〜前記クローン番号１７で示される各種クローンの変異点を以下表２に示すが、変異を導入する位置及び種類としてはこれに限定されるものではない。
【００７３】
【表２】
0005889331.tif 000003
【００７４】〔発現ベクター〕  前記発現ベクターは、前記変異型キシラナーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列で示される核酸を含むものであれば特に限定されるものではないが、形質転換効率や翻訳効率を向上させるなどの観点より、以下に示すような構成を示すプラスミドベクターやファージベクターであることがより好ましい。
【００７５】〔発現ベクターの基本構成〕  発現ベクターは、前記変異型キシラナーゼをコードする塩基配列を含み、前記宿主細胞を形質転換しうるものであれば特に限定されない。必要に応じて、該塩基配列の他に、他の領域を構成する塩基配列（以下、単に「他の領域」とも言う。）を含んでいてもよい。  他の領域としては、例えば、前記形質転換体が、前記変異型キシラナーゼを産生するために必要とする制御領域や、自律複製に必要な領域などが挙げられる。  また、前記形質転換体の選択を容易にするという観点より、選択マーカーとなりうる選択遺伝子をコードする塩基配列をさらに含んでいてもよい。  前記変異型キシラナーゼを産生するために必要となる制御領域としては、プロモーター配列（転写を制御するオペレーター配列を含む。）、リボゾーム結合配列（ＳＤ配列）、転写終結配列等を挙げることができる。
【００７６】〔酵母を宿主細胞とした場合の発現ベクター〕  酵母を宿主細胞とした場合、発現ベクターとしては、前記変異型キシラナーゼをコードする塩基配列の他に、前記変異型キシラナーゼの産生効率の観点より、プロモーター配列を含んでいることが好ましい。プロモーター配列としては、酵母を宿主細胞とする形質転換体中で前記変異型キシラナーゼを発現できるものであればいずれを用いてもよい。
【００７７】  例えばアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１）プロモーター、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ１）プロモーター、ペプチド鎖伸長因子（ＴＥＦ）プロモーター、グリセロール３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）プロモーター、ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）プロモーター、メタロチオネイン（ＣＵＰ１）プロモーター、抑制性酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ５）プロモーター、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーターなどのプロモーター配列が用いられる。  なお、上記プロモーター配列の由来は宿主細胞となる酵母に限定されない。  サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターなどのように、外来のプロモーターを用いてもよい。これらは用いる酵素の由来や種類によって適宜選択することができる。
【００７８】  また、前記発現ベクターは、分泌シグナルを有していてもよい。これにより、形質転換体が前記変異型キシラナーゼを産生した場合、細胞外に前記変異型キシラナーゼを分泌することが可能となる。  分泌シグナルとしては、宿主細胞となる酵母から前記変異型キシラナーゼを分泌できるものであれば、特に限定されない。分泌効率の観点より、αファクターシグナル配列、インベルターゼシグナル配列、酸ホスファターシグナル配列、グルコアミラーゼシグナル配列などを用いることが好ましい。
【００７９】  以上のようなプロモーター配列や分泌シグナルを有する発現ベクターとしては、具体的にはｐＲＳ４２３、ｐＲＳ４２４、ＹＥｐｌａｃ１９５等が挙げられる。
【００８０】〔糸状菌を宿主細胞とした場合の発現ベクター〕  糸状菌を宿主細胞とした場合、発現ベクターとしては、前記変異型キシラナーゼをコードする塩基配列の他に、前記変異型キシラナーゼの産生効率の観点より、プロモーター配列を含んでいることが好ましい。プロモーター配列としては、糸状菌を宿主細胞とする形質転換体中で前記変異型キシラナーゼを発現できるものであればいずれを用いてもよい。 
【００８１】  糸状菌に対して適切な発現ベクターは、ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｎｄｅｌ，Ｃ．Ａ．Ｍ．  Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｉｎ：Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｊ．Ｗ．ａｎｄ  Ｌａｓｕｒｅ，  Ｌ．Ｌ．（ｅｄｓ．）Ｍｏｒｅ  ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｆｕｎｇｉ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．３９６−４２８に記載されている。  また、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２，ｐＵＣ１００、ｐＳＬ１１８０（ファルマシア・インク社製）、ｐＦＢ６及びアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）ｐＲＡＸ、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）ｐＴＥＸ等のような一般的に用いられる他の発現ベクターを用いることもできる。
【００８２】〔原核生物を宿主細胞とした場合の発現ベクター〕  大腸菌、枯草菌、放線菌などの原核生物を宿主細胞とする場合、発現ベクターは、前記変異型キシラナーゼをコードする塩基配列の他に、前記変異型キシラナーゼの産生効率の観点より、プロモーター配列を含んでいることが好ましい。また、プロモーター配列の他にリボゾーム結合配列や転写終結配列等を含んでいてもよい。
【００８３】  プロモーター配列の例としては、大腸菌由来のトリプトファンオペロンのｔｒｐプロモーター、ラクトースオペロンのｌａｃプロモーター、ラムダファージ由来のＰＬプロモーター及びＰＲプロモーターや、枯草菌由来のグルコン酸合成酵素プロモーター（ｇｎｔ）、アルカリプロテアーゼプロモーター（ａｐｒ）、中性プロテアーゼプロモーター（ｎｐｒ）、α−アミラーゼプロモーター（ａｍｙ）等が挙げられる。  また、ｔａｃプロモーターのように独自に改変又は設計されたプロモーター配列も利用できる。
【００８４】  リボゾーム結合配列としては、大腸菌由来または枯草菌由来の配列が挙げられるが、大腸菌や枯草菌等の所望の宿主細胞内で機能する配列であれば特に限定されるものではない。  前記リボゾーム結合配列としては、例えば、１６ＳリボゾームＲＮＡの３’末端領域に相補的な配列のうち、４塩基以上連続したコンセンサス配列をＤＮＡ合成により作成した配列などが挙げられる。  転写終結配列は必ずしも必要ではないが、ρ因子非依存性のもの、例えばリポプロテインターミネーター、ｔｒｐオペロンターミネーター等が利用できる。  これら制御領域の発現ベクター上での配列順序は、特に制限されるものではないが、転写効率を考慮すると５’末端側上流からプロモーター配列、リボゾーム結合配列、目的蛋白質をコードする遺伝子、転写終結配列の順に並ぶことが望ましい。
【００８５】  ここでいう発現ベクターの具体例としては、大腸菌中での自律複製可能な領域を有しているｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）、ｐＫＫ２２３−３、ｐＳＣ１０１や、枯草菌中での自律複製可能な領域を有しているｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１、φ１０５等を発現ベクターとして利用することができる。  また、２種類以上の宿主内での自律複製が可能な発現ベクターの例として、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７及びｐＢＳ７等を発現ベクターとして利用することができる。
【００８６】〔形質転換体の作製方法〕  本発明にかかる形質転換体は、公知の方法により作製することができる。例えば、本発明にかかる変異型キシラナーゼをコードする塩基配列と、必要に応じて前記他の領域とを含む前記発現ベクターを構築し、該発現ベクターを所望の宿主細胞に形質転換する方法等が挙げられる。具体的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ｅｔ．ａｌ．，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，（２００１）等に記載されている分子生物学、生物工学及び遺伝子工学の分野において公知の一般的な方法を利用することができる。
【００８７】  本発明にかかる形質転換体は、前記宿主細胞に前記発現ベクターを組み込むだけではなく、必要に応じて前記宿主細胞での使用頻度の低いコドンを、使用頻度の高いコドンにするように、サイレント変異を導入すること等を併せて行い作製することもできる。  これにより、発現ベクターに組み込んだ前記変異型キシラナーゼ由来のタンパク質の生産量を増加させることができる可能性がある。
【００８８】  サイレント変異の導入方法の例として、以下表３を例に挙げるが、サイレント変異の導入方法は、宿主細胞でのコドン使用頻度に発現ベクター上にある該キシラナーゼ遺伝子および該キシラナーゼ遺伝子を細胞外に分泌させるためのシグナル配列のコドンを合わせる物であれば、その手法、変異点、変更する塩基の種類等は特に制限されない。  以下表３はＴ．ｖｉｒｉｄｅにおいて、前記変異型キシラナーゼＡＣＸ０２を、高い頻度で発現させるためにサイレント変異を加える塩基の位置及び変更する塩基の種類を示したものである。  表３中、配列名「ＡＣＸ０２」の「塩基の位置」は、配列番号４で示される塩基の位置を示す。配列名「Ａ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓシグナル配列」の「塩基の位置」は、配列番号７３で示される塩基の位置を示す。
【００８９】
【表３】
0005889331.tif 000004
【００９０】〔形質転換体の培養方法〕  前記発現ベクターで形質転換して得られた形質転換体の培養の条件は、形質転換前の宿主細胞の培養条件と同様であり、公知の条件を用いることができる。  培地としては炭素源、窒素源、無機物及びその他の栄養素を適量含有する培地ならば合成培地または天然培地のいずれでも使用可能である。培地に使用する成分としては、公知のものを用いることができる。例えば、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、ＮＺアミン及びジャガイモ等の有機栄養源、グルコース、マルトース、しょ糖、デンプン及び有機酸等の炭素源、硫酸アンモニウム、尿素及び塩化アンモニウム等の窒素源、リン酸塩、マグネシウム、カリウム及び鉄等の無機栄養源、ビタミン類を適宜組み合わせて使用できる。  なお、前記選択マーカーを含む発現ベクターにより形質転換した形質転換体の培養においては、例えば、前記選択マーカーが薬剤耐性である場合には、それに対応する薬剤を含む培地を使用し、前記選択マーカーが栄養要求性である場合には、それに対応する栄養素を含まない培地を使用する。培地のｐＨは、ｐＨ４〜ｐＨ８の範囲で選べばよい。  培養は前記培地を含有する液体培地中で、前記形質転換体を振とう培養、通気攪拌培養、連続培養、流加培養などの通常の培養方法を用いて行なうことができる。  培養条件は、前記形質転換体、培地、培養方法の種類により適宜選択すればよく、形質転換体が生育し、本発明にかかる変異型キシラナーゼを産生できる条件であれば特に制限はない。  培養温度は２０℃〜４５℃、好ましくは２４℃〜３７℃で好気的に培養を行う。  培養期間は１日間〜７日間の範囲で目的の変異型キシラナーゼ活性を有する蛋白質の含量が最大になるまで培養すればよい。
【００９１】Ｂ．変異型キシラナーゼ回収工程  変異型キシラナーゼ回収工程は、培養された形質転換体及び該形質転換体の培養物のうち少なくともいずれか一方から、前記変異型キシラナーゼを回収する工程である。
【００９２】  形質転換した形質転換体を培養した後、本発明にかかる前記変異型キシラナーゼを回収する方法は、この分野で慣用されている方法を使用することができる。  本発明にかかる前記変異型キシラナーゼが形質転換した形質転換体外に分泌される場合は、該形質転換体の培養物を遠心分離、ろ過等を行うことで粗酵素液を容易に得ることができる。また、本発明にかかる前記変異型キシラナーゼが形質転換した形質転換体内に蓄積される場合は、培養した該形質転換体を遠心分離等の手段により回収し、回収した該形質転換体を緩衝液に懸濁し、リゾチーム処理、凍結融解、超音波破砕などの公知の方法に従い該形質転換体の細胞膜を破壊することにより、粗酵素液を回収すればよい。
【００９３】  前記粗酵素液を、限外ろ過法などにより濃縮し、防腐剤などを加えて濃縮酵素として利用することが可能である。また、濃縮した後、スプレードライ法などによって前記変異型キシラナーゼの粉末酵素を得ることもできる。  回収されたキシラナーゼ活性を有する粗酵素液について、分離精製を必要とする場合は、例えば、硫酸アンモニウムなどによる塩析、アルコールなどによる有機溶媒沈殿法、透析及び限外ろ過などによる膜分離法、あるいはイオン交換体クロマトグラフィー、逆相高速クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーなどの公知のクロマト分離法を適宜組み合わせて行うことができる。
【００９４】（４）変異型キシラナーゼの利用  本発明にかかる前記変異型キシラナーゼは、前述の通り酵素の失活しやすい条件下においても、長期間安定した活性を有する。そのため、本発明にかかる前記変異型キシラナーゼは、広範囲な用途に使用することが可能となる。  本発明の組成物は、前記変異型キシラナーゼを含有し、必要に応じて目的とする用途に適した任意の成分を含有することもできる。  本発明の組成物は、酵素の失活しやすい条件下においても、長期間安定して作用する前記変異型キシラナーゼを含有する。そのため本発明の組成物は、様々な用途に使用することができる。  前記変異型キシラナーゼの含有量は、その組成物の用途により適宜定めることができ、特に制限されない。
【００９５】  本発明にかかる前記変異型キシラナーゼは、様々な用途に使用することができるが、好ましくは以下のように利用することが挙げられる。
【００９６】〔リグノセルロース原料の糖化物の製造方法〕  本発明にかかるリグノセルロースの糖化物の製造方法は、前記変異型キシラナーゼと、リグノセルロース原料とを接触させることを含むものである。  本発明にかかるリグノセルロースの糖化物の製造方法は、酵素の失活しやすい条件下においても、長期間安定して作用することが可能な前記変異型キシラナーゼを使用するため、酵素の失活しやすい条件下で行うことができ、効率よくリグノセルロースの糖化を得られる。
【００９７】  リグノセルロース原料としては、リグニン含量の低いリグノセルロース原料であれば公知のものを使用することができる。  リグニン含量が低いとは、リグノセルロース原料の平均的なリグニン含量がリグノセルロース原料の全体量に対して約３０質量％であるため、リグニン含量が３０質量％より低いことを示す。好ましくはリグニン含量が２０質量％以下、より好ましくはリグニン含量が１０質量％以下のリグノセルロース原料が好適である。  このようなリグノセルロース原料としては、針葉樹、広葉樹、林地残材、建築廃材、剪定廃棄物、ソーダスト、ケナフ、稲藁、麦わらなどの農産破棄物等のリグノセルロース材料から、アルカリ抽出、アルカリ蒸解等の化学パルプ製造法、オルガノソルブなどの方法により、高度にリグニンを除去したセルロース、ヘミセルロースを主成分とするパルプ繊維などが挙げられる。好ましくは、広葉樹クラフトパルプ、針葉樹クラフトパルプ、機械パルプ、ケナフ等の草本由来パルプ、古紙パルプ、もしくはペーパースラッジ（紙パルプ工場から回収されるパルプ繊維分を含む）、またはこれらの混合物が挙げられる。特に、広葉樹クラフトパルプ、針葉樹クラフトパルプがより好ましい。  これらのリグノセルロース原料は、其々一般のパルプ製造企業から入手することができる。
【００９８】  前記変異型キシラナーゼと、リグノセルロース原料とを接触させる方法としては、前記変異型キシラナーゼをリグノセルロース原料に加え、攪拌しながら反応を進行させる方法、振とうしながら反応を進行させる方法、変異型キシラナーゼとリグノセルロースを充分に混和の後、静置して反応を進行させる方法などが挙げられる。好ましくは、反応効率の観点より、前記変異型キシラナーゼをリグノセルロース原料に加え、攪拌しながら反応を進行させる方法が挙げられる。  反応に使用可能な反応容器としては特に制限はない。好ましくは、装入したリグノセルロース原料及び前記変異型キシラナーゼが十分混和されるように攪拌できるとともに、前記変異型キシラナーゼの最適温度に保てるように温度調節機能を有する反応容器であることが好ましい。  反応温度は、前記変異型キシラナーゼの作用し得る温度であれば特に制限はされない。例えば４０℃から６０℃が挙げられ、好ましくは４０℃から５５℃が挙げられる。  糖化反応容器中の液のｐＨは、前記変異型キシラナーゼの作用しうるｐＨであれば特に制限されない。例えばｐＨ４からｐＨ７が挙げられ、好ましくはｐＨ４からｐＨ６が挙げられる。
【００９９】  本発明にかかるリグノセルロースの糖化物の製造方法においては、本発明にかかる前記変異型キシラナーゼの他に、必要に応じて他の酵素を前記変異型キシラナーゼと組み合わせて使用することもできる。  他の酵素としては、セルラーゼ、キシロシダーゼ、マンナナーゼ、ペクチナーゼ、ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ、アラビノフラノシダーゼ等の酵素を併用することができる。リグノセルロースの糖化物を効率よく製造するという観点から、セルラーゼを、前記変異型キシラナーゼに併用することが好ましい。
【０１００】  セルラーゼとしては、セルロースをグルコースに分解するものであれば制限されず、公知のものを使用することができる。セルラーゼとしては例えば、エンドグルカナーゼ、セロビオハイドロラーゼ及びβ−グルコシダーゼの各活性の少なくとも１つの活性を有するものを挙げることができる。また、酵素活性の観点からは、これらの各活性を有する酵素混合物であることが好ましい。
【０１０１】  前記セルラーゼの起源は限定されることはなく、糸状菌、担子菌、細菌類等のセルラーゼを用いることができる。例えば、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属等の糸状菌、Ｉｒｐｅｘ属等の担子菌、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｈｕｍｉｃｏｌａ属等の細菌などの各種の起源のものや、これらの起源のセルラーゼを鋳型として、遺伝子組み換えにより製造したものを単独若しくは二種以上を混合して用いることもできる。また、一般に市販されているセルラーゼ製剤や上記菌の培養物やその濾過液を直接使用することもできる。  なお、セルラーゼとしては、この中でも、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ（トリコデルマ）属由来のセルラーゼ又はＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ（アクレモニウム）属由来のセルラーゼなどが、強力なセルロース分解力を有するという観点より好ましい。
【０１０２】  市販のセルラーゼとしては、Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ１０００（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ社製）、Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ１５００（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ社製）、ＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅＸＣ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ社製）、ＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅＸＹ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ社製）、Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ  ＤＵＥＴ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ社製）、Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ  ＴＲＩＯ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ社製）、Ｃｅｌｌｕｃｌａｓｔ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社製）、Ｃｅｌｌｉｃ  ＣＴｅｃ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社製）、Ｃｅｌｌｉｃ  ＨＴｅｃ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社製）、Ｃｅｌｌｉｃ  ＣＴｅｃ２（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社製）、Ｃｅｌｌｉｃ  ＨＴｅｃ２（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社製）、アクレモニウムセルラーゼ（Ｍｅｉｊｉ  Ｓｅｉｋａ  ファルマ（株）製）、メイセラーゼ（Ｍｅｉｊｉ  Ｓｅｉｋａ  ファルマ（株）製）、セルラーゼアマノＡ（天野エンザイム（株）製）、セルラーゼアマノＴ（天野エンザイム（株）製）、セルラーゼ  ダイワ（大和化成（株）製）、セルライザー（ナガセ生化学工業（株）製）、ドリセラーゼ（協和発酵（株）製）、セルラーゼオノズカ（ヤクルト薬品工業（株）製）、セルロシン（阪急バイオインダストリー（株）製）等を用いることができる。
【０１０３】  前記変異型キシラナーゼのセルラーゼに対する混合比は、生産される還元糖の量が最大になるような混合比であればいずれの割合でもよく、好ましくは前記変異型キシラナーゼを、セルラーゼに対して２０％〜６０％の割合で混合することが挙げられる。
【０１０４】  反応容器に仕込む基質としての、リグノセルロース原料と、前記変異型キシラナーゼ及びその他の酵素を合算した酵素全体（以下、単に「酵素」とも言う。）との濃度は、特に限定されるものではない。  リグノセルロース原料の移液、装入等の操作には、８質量％〜３０質量％の固形分濃度であることが好ましい。  また使用する酵素は、その活性に応じて基質を効率よく分解するに十分な量を投入すればよい。酵素の量は、酵素の種類等によって適宜調整が可能である。  本発明のリグノセルロース原料の糖化物の製造方法及び糖化酵素再利用によるリグノセルロース原料の糖化物の製造方法によって製造される糖化物としては、リグノセルロース由来の糖化物であればよい。糖化物としては、具体的には、単糖、二糖以上のオリゴ糖などが挙げられる。前記単糖としては、グルコース、キシロース、アラビノース、フルクトース、マンノース、ガラクトース等が挙げられる。  また、前記糖化物は、化学薬品や燃料、プラスチック、及び他の産物又は中間体の生産のために用いてよく、また、微生物を用いてこれらの物質を生産するための発酵原料として用いてもよい。  化学薬品や燃料、プラスチック、及び他の産物としては、エタノールやイソプロパノール、アセトン、アセテート、１，３−プロパンジオール、ブタンジオール、グリセロール、エチレングリコール、アミノ酸、有機酸、フルフラール、ポリヒドロキシアルカン酸類（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅｓ）、動物飼料及びキシロース等が挙げられる。  特に、エタノール、イソプロパノール、乳酸等の発酵生産に好適に利用することができる。
【０１０５】〔再利用のための変異型キシラナーゼの製造方法〕  本発明の再利用のための変異型キシラナーゼの製造方法は、前記リグノセルロースの糖化物の製造方法により得られたリグノセルロースの糖化物を含む糖化反応液（以下、単に「糖化反応液」と称する場合がある。）から、本発明にかかる変異型キシラナーゼを回収すること（以下、「回収工程」と称する場合がある。）を含むものである。  これにより、本発明にかかる変異型キシラナーゼを低コストに製造することができる。
【０１０６】  前記回収工程では、回収方法として、公知の方法を使用すればよい。例えば、固液分離をして、その後、酵素を回収可能な膜装置や公知の装置を用いて酵素を回収する方法等が挙げられる。  固液分離の方法としては、前記糖化反応液を遠心分離または粗濾過する方法が挙げられる。  遠心分離又は粗濾過の条件は、当業界において通常用いられている方法をそのまま適用すればよく、例えば遠心分離の場合５００×ｇ〜１００００×ｇとすればよい。  粗濾過の場合には、目開きサイズが０．１μｍ〜２ｍｍの、ステンレス製フィルター、セラミック製フィルター又は樹脂製濾過膜を用いて濾過すればよい。  また、精密濾過膜による精密濾過を行ってもよい。この場合には、平均細孔径０．０１μｍ〜１０μｍの精密濾過膜の使用が好ましい。  精密濾過膜により精密濾過を行う方法としては、圧濾過、真空濾過、クロスフロー濾過、遠心濾過などがある。中でも、クロスフロー濾過を行うことにより、膜の目詰まりを低減することができる。
【０１０７】  固液分離した液体から酵素を回収する場合、例えば、樹脂カラムを使用する方法や、膜装置を使用する方法が挙げられる。  前記樹脂カラムを使用する方法としては、例えば、イオン交換体クロマトグラフィー、逆相高速クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等の公知のクロマト分離法を挙げることができる。  前記膜装置としては、例えば限外濾過膜、透析膜等を備える膜装置を用いて回収すればよい。中でも、平均細孔径０．００１μｍ〜０．０１μｍの限外濾過膜の使用がより好ましい。  限外濾過膜には平膜型、多段平膜型、中空糸型等のタイプがあるが、いずれの型式でもかまわない。平膜型では、適切な濾過速度を確保するためには槽内を加圧する。加圧するには窒素ガス、ヘリウムガス、空気等を用いることが好ましい。また、必要に応じて反応槽内にインペラーを設置することが好ましい。インペラーにより液の攪拌を行うことで、膜表面の目詰まりを防止し、よりよい濾過速度を維持することができる。一方、多段平膜型、中空糸型の場合はポンプを用いて基質供給槽から反応槽へ輸液することで、適切な濾過圧力と線速度を保持し、よりよい濾過速度を維持することができる。  濾過方式については、浸漬膜方式、限外濾過方式、精密濾過方式等が挙げられる。なお、圧濾過、真空濾過、クロスフロー濾過、遠心濾過等は、限外濾過方式及び精密濾過方式のどちらの方式でも用いることができる。前記濾過操作は、定圧濾過、定流濾過、非定圧非定流濾過に大別されるが、本発明において特に限定されない。  加えて、本発明に係る前記回収工程に用いられる膜の材質については、酢酸セルロース、芳香族ポリアミド、ポリビニルアルコール、ポリスルホン、ポリフッ化ビニリデン、ポリエチレン、ポリアクリロニトリル、セラミック、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン（テフロン（登録商標））などが例示できる。これらの中でも、セルラーゼの使用や酸性条件下での反応を鑑みて、非セルロース系かつ耐酸性の材質から成る、ポリアクリロニトリルやポリスルホン等の膜の使用がより好ましい。  なお、前記回収工程で用いられる糖化反応液は、前記固液分離等の前処理を行わずに、製造直後の糖化反応液を用いてもよい。  本発明の再利用のための変異型キシラナーゼの製造方法により製造された、再利用のための変異型キシラナーゼは、既述の本発明の変異型キシラナーゼと同様に、種々の用途に用いることができる。また、前記再利用のための変異型キシラナーゼは、以下の単糖製造方法に用いることができる。
【０１０８】〔単糖製造方法〕  本発明の単糖製造方法は、前記リグノセルロースの糖化物の製造方法により得られたリグノセルロースの糖化物を含む糖化反応液（以下、単に「糖化反応液」と称する場合がある。）から、本発明にかかる変異型キシラナーゼを回収すること（以下、「回収工程」と称する場合がある。）と、回収された変異型キシラナーゼと、リグノセルロース原料とを接触させて単糖を製造すること（以下、単に「再糖化工程」と称する場合がある。）と、を含むものである。  これにより、本発明にかかる変異型キシラナーゼを有効に活用することができる。
【０１０９】  前記回収工程としては、既述の回収工程を適用する。  前記再糖化工程では、回収された変異型キシラナーゼを含む酵素液に、既述のリグノセルロース原料及び水を追加し、ｐＨ、温度を制御し攪拌しながら再度糖化反応を行う。ｐＨや反応温度の条件については、リグノセルロース原料の糖化物の製造方法に記載の条件と同一の条件にすればよい。  また、前記再糖化工程では、追加投与するリグノセルロース原料及び水に加えて、さらに前記回収工程中、固液分離の際に得られる固形物を追加することが好ましい。これにより、膜装置や樹脂カラムで固液分離した固形物中に含まれる未反応のリグノセルロースや該リグノセルロース等に吸着した変異型キシラナーゼを有効に活用することができる。  本発明にかかる再糖化工程では、前記変異型キシラナーゼ又は前記固形分離した固形物を追加してもよいし、両方を追加してもよい。
【０１１０】  本発明にかかる単糖製造方法において、前記回収工程及び再糖化工程は、繰り返し実施することができる。これにより、前記回収された変異型キシラナーゼの活性が維持される期間内において触媒コストを低減することが可能となる。  また、本発明にかかる単糖製造方法においては、前記回収工程及び再糖化工程を繰り返す場合には、新たに変異型キシラナーゼを前記再糖化工程の際に追加してもよい。追加する変異型キシラナーゼの量については特に限定されるものではないが、経済的な観点から、最初の糖化反応で使用した変異型キシラナーゼの量の５０質量％以下であることが好ましい。また、最初の糖化反応で使用した変異型キシラナーゼの量の２０質量％以下となることが、経済的な観点からより好ましく、最初の糖化反応で使用した変異型キシラナーゼの量の１０質量％以下となることが更に好ましい。  本発明の単糖製造方法により、製造される単糖としては、リグノセルロース由来の単糖であればよい。具体的には、グルコース、キシロース、アラビノース、フルクトース、マンノース、ガラクトース等が挙げられる。
【０１１１】〔パルプの漂白方法〕  本発明にかかるパルプの漂白方法は、前記変異型キシラナーゼと、パルプとを接触させることを含むものである。  本発明にかかるパルプの漂白方法は、酵素の失活しやすい条件下においても、長期間安定して作用する前記変異型キシラナーゼを使用するため、一般に酵素の失活しやすい条件下で行うことができ、効率よくパルプを漂白できる。
【０１１２】  前記変異型キシラナーゼとパルプとを接触させる工程に用いられるパルプとしては、木材パルプ及び非木材パルプが挙げられる。木材パルプとしては、例えば針葉樹や広葉樹などを原料としたものが挙げられる。また、非木材パルプとしては、例えばサトウキビの搾りかすであるバガスや、藁、麻、木綿などを原料としたものが挙げられる。加えて、新聞や雑誌などの古紙を原料とした古紙パルプも含まれる。  これらのパルプは、原料から物理的な力で繊維を取り出した機械パルプと、化学的に処理して繊維を取り出した化学パルプに大別される。機械パルプとしては、例えば、砕木パルプ、リファイナーグランドパルプ、サーモメカニカルパルプ、ケミサーモメカニカルパルプが挙げられる。また、化学パルプとしては、例えば、クラフトパルプ、アルカリパルプ、サルファイトパルプが挙げられる。
【０１１３】  前記変異型キシラナーゼとパルプとを接触させる工程においては、前記変異型キシラナーゼに加えて、他のヘミセルラーゼやリグニン分解酵素を併用してもよい。これにより、パルプの漂白性を増強することができる。  ヘミセルラーゼやリグニン分解酵素の起源は限定されることはなく、糸状菌、担子菌、細菌類等が挙げられる。
【０１１４】  本発明にかかるパルプ漂白方法は、前記変異型キシラナーゼとパルプとを接触させる工程の他に、さらに、脱リグニン処理工程と、漂白工程とを含むことが好ましい。  本明細書においては、脱リグニン処理工程は、リグニンをパルプから積極的に除去するためのものであれば、どのような方法でもよく、従来から実施されている方法を使用することができる。例えば、特開２００４−２６３３１０号公報に記載のような方法が挙げられる。
【０１１５】  本明細書において、漂白工程とは、前記パルプに対して漂白処理を行う工程であればよく、例えば、パルプに残留するリグニンの除去、パルプの白色度の向上等を目的とした工程全般を包含するものである。また、該漂白工程は、前記脱リグニン処理工程に続く工程であり、従来から実施されている方法を使用することができる。例えば、特開２０１０−１５９４号公報に記載のような方法が挙げられる。
【０１１６】  本発明にかかる前記変異型キシラナーゼとパルプとを接触させる工程に、前記脱リグニン処理工程及び前記漂白工程を組み合わせて行う場合には、前記変異型キシラナーゼとパルプとを接触させる工程は、前記脱リグニン処理工程から前記漂白工程に続く工程のうちのいずれかの時点で行えばよい。すなわち、前記変異型キシラナーゼとパルプとを接触させる工程は、前記脱リグニン処理工程の前後及び前記漂白工程の前後のいずれかで行えばよい。また、前記変異型キシラナーゼとパルプとを接触させる工程は、前記脱リグニン処理工程又は前記漂白工程と同時に行うこともできる。  本発明にかかる前記変異型キシラナーゼとパルプとを接触させる工程は、前記漂白工程の一部として使用することが好ましい。なかでも、本願発明の変異型キシラナーゼの性能を最大限に発揮するという観点より、前記漂白工程中のリグニン含量が少ない段階での使用がより好ましい。
【０１１７】  また、前記変異型キシラナーゼとパルプとを接触させる工程は、前記漂白工程のうち、例えば、塩素、二酸化塩素、二酸化窒素、次亜塩素酸塩、酸素、過酸化水素、オゾン等を用いる化学漂白の漂白工程の一部として使用することもできる。
【０１１８】〔洗剤〕  本発明の洗剤は、前記変異型キシラナーゼを含有し、必要に応じて他の成分を含有することもできる。  本発明の洗剤は、酵素が失活しやすい厳しい条件下においても、安定した活性を示す前記変異型キシラナーゼを含有することにより、洗剤の性能を向上させることができる。
【０１１９】  本発明の洗剤には、衣料用洗剤、自動食器洗浄機用洗剤等の様々な洗剤が包含される。また、家庭用及び工業用の洗剤として用いることができる。さらに、本発明の洗剤は、衣料用繊維製品の改質剤として使用することもできる。  本発明の洗剤を衣料用繊維製品の改質剤として使用する場合に、衣料用繊維としては、木綿繊維、麻繊維、レーヨンやテンセルといったセルロース含有繊維等の改質剤と使用することができる。
【０１２０】  本発明の洗剤は、用途に応じて前記変異型キシラナーゼ以外にも、他の酵素が配合されていてもよい。他の酵素としては、この分野において公知のものを用いることができる。例えば、プロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、リパーゼが挙げられる。これらの他の酵素の起源は限定されることはなく、糸状菌、担子菌、細菌類等が挙げられる。
【０１２１】  本発明の洗剤は前記他の酵素以外にも、例えば界面活性剤、洗浄助剤、漂白剤、蛍光剤等の通常洗剤に用いられる各成分が配合されていてもよい。  前記界面活性剤としては、例えば陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤等を挙げることができる。好ましくは陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤が挙げられる。  前記陰イオン性界面活性剤としては、例えば、脂肪酸ナトリウム（石鹸）、α−スルホン化脂肪酸エステルナトリウム、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＬＡＳ）、アルキル硫酸エステルナトリウム（ＡＳ）、アルキルエーテル硫酸エステルナトリウム（ＡＥＳ）、α−オレフィンスルホン酸ナトリウム（ＡＯＳ）、アルキルスルホン酸ナトリウムが挙げられる。  前記非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル（ＡＥ）、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（ＡＰＥ）、蔗糖脂肪酸塩エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、アルカノールアミドが挙げられる。
【０１２２】  前記洗浄助剤としては、アルカリ緩衝剤、二価金属イオン補足剤、再汚染防止剤等を挙げることができ、具体的には、トリポリリン酸塩、ピロリン酸塩などのポリリン酸塩、Ａ型ゼオライトなどのアルミノケイ酸塩、炭酸ナトリウム、セスキ炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムなどの炭酸塩、ポリエチレングリコール、カルボン酸系ポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリグリシジル酸塩等のポリマー、カルボキシメチルセルロース等のセルロース誘導体、およびポリアスパラギン酸等のアミノカルボン酸系のポリマーが挙げられる。
【０１２３】  前記漂白剤としては、例えば、次亜塩素酸ナトリウム、ジクロロイソシアヌル酸塩、亜塩素酸ナトリウム、過酸化水素、過炭酸ナトリウム、過ホウ酸ナトリウム、過酢酸、ハイドロサルファイト、二酸化チオ尿酸が挙げられる。  前記蛍光剤としては、ビス（トリアジニルアミノ）スチルベンジスルホン酸誘導体やビススチリルビフェニル誘導体などが挙げられる。
【０１２４】  本発明の洗剤は、前記界面活性剤、前記洗浄助剤、前記漂白剤、前記蛍光剤等と組み合わせて常法に従い製造することができる。  洗剤の形態は用途に応じて選択することができ、例えば液体、粉体、顆粒、ペースト、固形等にすることができる。
【０１２５】〔動物飼料〕  本発明の動物飼料は、前記変異型キシラナーゼを含有し、必要に応じて他の成分を含有することもできる。  本発明の動物飼料は、酵素が失活しやすい厳しい条件下においても、安定した活性を示す前記変異型キシラナーゼを含有する。これにより、本発明の動物飼料は、該動物飼料に含まれる豊富な植物繊維が分解されるため、該動物飼料を摂取した動物において植物栄養の吸収効率が向上するとともに、動物の胃内における消化能を改善できる。  本発明の動物飼料における前記変異型キシラナーゼの含有量は、動物飼料の動物の胃内における消化能を改善できる量であれば特に制限されない。
【０１２６】  前記動物飼料としては、例えば、キシランを含有する既成動物飼料、穀類などが挙げられる。なお、穀類の中でも特に、コムギ、トウモロコシ、ライムギ、オオムギ、オートムギ、トリチケール、イネおよびモロコシなどが好ましい。
【０１２７】  本発明の動物飼料における前記変異型キシラナーゼは、他の飼料添加剤や、他の酵素と組み合わせて用いることもできる。  前記他の飼料添加剤としては、例えば、ビタミン飼料添加剤、ミネラル飼料添加剤、アミノ酸飼料添加剤、浸透保護剤などが挙げられる。  前記他の酵素としては、例えば、セルラーゼやアミラーゼ、プロテアーゼなどが挙げられる。これらの酵素の起源は限定されることはなく、糸状菌、担子菌、細菌類等由来の酵素を用いることができる。
【０１２８】  本発明の動物飼料は、広範囲の動物に使用可能である。好ましくは、鶏、七面鳥、アヒル、ガチョウ等の家禽類、ウシ、ウマ、ヒツジ等の反芻動物、ブタ等のイノシシ類、ラビット等の齧歯類および魚類が挙げられる。
【０１２９】  本発明の動物飼料は、前記変異型キシラナーゼが添加されたものであれば、どのような方法で製造されたものでもよく、該動物飼料の製造方法は特に限定されない。前記変異型キシラナーゼの動物飼料への添加は、例えば、飼料製造前、飼料製造中又は製造の最終段階等いずれの段階で行ってもよい。また、前記変異型キシラナーゼは、ペレット又はマッシュ形状に成形された既成の動物飼料に直接添加することもできる。なお、前記変異型キシラナーゼは、直接飲料水中に添加することにより、動物飼料中に含有させることもできる。
【０１３０】〔製パン改質剤〕  本発明の製パン改質剤は、前記変異型キシラナーゼを含有し、必要に応じて他の成分を含有することもできる。  本発明の製パン改質剤は、酵素が失活しやすい厳しい条件下においても、安定した活性を示す前記変異型キシラナーゼを含有する。これにより、本発明にかかる製パン改質剤は、３５℃〜４０℃の条件下で、１時間から２時間という製パン時の発酵工程中も安定した活性を示すため、小麦粉のヘミセルロース部分を分解することができ、製パンの性質を改質することができる。
【０１３１】  本発明の製パン改質剤は、前記変異型キシラナーゼの他に、他の製パン改質剤を含むことができる。前記他の製パン改質剤としては、例えば、モノグリセリド、有機酸モノグリセリド、グリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、リン脂質類、アスコルビン酸類およびその誘導体、有機酸類、アミノ酸類、塩類などが挙げられる。
【０１３２】  本発明の製パン改質剤を添加する対象となるパンの種類としては、パンの材料を混合し、捏ねて、発酵し、焼成等を行って製造されたものであればよく、食パン等の他に、特殊パン、調理パン、菓子パン、蒸しパン、ホットケーキ、ドーナツなどが含まれる。  前記パンの材料としては、小麦粉、水や乳製品などの水分、イースト、糖類、食塩、油脂類（ショートニング、ラード、マーガリン、バター、液状油等）などが挙げられる。必要に応じて、卵、調味料（グルタミン酸類、核酸等）、膨張剤、香料等を添加することもできる。また、小麦粉が主原料であれば、ライ麦粉、米粉などを小麦粉に併用することも可能である。なお、本明細書においてドウとは、前記パンの材料を混合し、捏ねたものを意味する。
【０１３３】  パンの製造方法は発酵工程を含むものであれば通常用いられる方法であれば特に制限はなく、例えば、ストレート法、中種法、液種法などが使用できる。  発酵工程は、通常用いられる方法を使用することができるが、発酵温度を室温より高めに設定することにより発酵時間を短縮できるため、３５℃〜４０℃で１〜２時間行うことが好ましい。
【０１３４】  本発明の製パン改質剤は、例えば、小麦粉等の原材料に粉体で混合したり、あらかじめ水中に溶かして使用したり、また、工程の途中で粉状又は液状の形態で添加してもよい。  以上、本発明の実施形態について述べたが、これは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。
【実施例】
【０１３５】  以下の実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例によって何等限定されるものではない。また、実施例の組成物における含有成分量を示す「％」は、特に断らない限り質量基準である。【０１３６】〔実施例１〕キシラナーゼ活性の測定方法（スタンダードアッセイ）  加水分解したキシランの還元糖の量をＤＮＳ法（Ｂａｉｌｅｙ等、１９９２）により測定し、キシラナーゼ活性を測定した。  評価に用いた基質は、１００ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に１％（ｗ／ｗ）のバーチウッドキシラン（シグマ・アルドリッチ社製）を激しく混合し、５０００×ｇで１５分間遠心した後、上澄み液を用いた。  前記基質液に対してキシラナーゼを０．１％（ｗ／ｗ）となるよう混合し、４５℃で３０分間攪拌しながら反応させ、得られた反応液中の還元糖の量を測定し、キシラナーゼ活性を測定した。【０１３７】〔実施例２〕部位特異的突然変異誘発によるキシラナーゼ変異体の作製と評価（１）発現ベクターＹＥｐ−ＧＡＰＤＨｐ−ＧＡｓ−ＴＶＸ、ＹＥｐ−ＧＡＰＤＨｐ−ＧＡｓ−ＡＣＸの構築  （ａ）プロモーター配列の取得：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのゲノムＤＮＡ配列を鋳型とし、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（以下ＧＡＰＤＨと略す）のプロモーター配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ：Ａ３５３９７．１）をＰＣＲ法によって取得した。ＰＣＲに用いたプライマーは、下記表４の配列番号５５及び５６に記載した。【０１３８】  （ｂ）シグナル配列の取得：Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅのゲノムＤＮＡ配列を鋳型とし、グルコアミラーゼ遺伝子のシグナル配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ：Ｄ０００４９．１）をＰＣＲ法によって取得した。ＰＣＲに用いたプライマーは、下記表４の配列番号５７及び５８に記載した。【０１３９】  （ｃ）プロモーター配列とシグナル配列との連結：ＰＣＲ増幅された前記ＤＮＡ配列を、フェノール／クロロホルム溶液で精製し、エタノール沈殿して回収した。精製されたプロモーター配列とシグナル配列とを制限酵素ＢｇｌＩＩで消化した後、それぞれをアガロース電気泳動して目的ＤＮＡを含む断片を切り出し精製した。このようにして得られた断片を、ＤＮＡライゲース（宝酒造社製）を用いて連結した（以下、ＧＡＰＤＨｐ−ＧＡｓと略す）。【０１４０】  （ｄ）Ｔ．ｖｉｒｉｄｅ由来キシラナーゼＩＩ遺伝子の増幅：Ｔ．ｖｉｒｉｄｅのゲノムＤＮＡ配列を鋳型とし、Ｔ．ｖｉｒｉｄｅ由来キシラナーゼＩＩ遺伝子の全長（キシラナーゼ遺伝子をコードする塩基配列及び分泌シグナル配列）をＰＣＲ法によって取得した。ＰＣＲに用いたプライマーは、下記表４の配列番号５９及び６０に記載した。得られた配列は配列表の配列番号７４に記載した。【０１４１】  （ｅ）Ａ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ由来キシラナーゼ遺伝子の増幅：Ａ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓのゲノムＤＮＡ配列を鋳型とし、Ａ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ由来キシラナーゼ遺伝子の全長（キシラナーゼ遺伝子をコードする塩基配列及び分泌シグナル配列）をＰＣＲ法によって取得した。ＰＣＲに用いたプライマーは、下記���４の配列番号６１及び６２記載。得られた配列は配列表の配列番号７５に記載した。【０１４２】  （ｆ）プロモーター配列、シグナル配列、キシラナーゼ遺伝子の連結：（ｄ）で取得したＴ．ｖｉｒｉｄｅ由来キシラナーゼＩＩを鋳型に、シグナル配列を除くキシラナーゼ遺伝子をコードする塩基配列をＰＣＲ法によって取得した。ＰＣＲに用いたプライマーは、下記表４の配列番号６３及び６４に記載した。その後、得られた断片を精製し、制限酵素ＳａｃＩによって消化した後、前記ＧＡＰＤＨｐ−ＧＡｓ断片とライゲーションした（以下、ＧＡＰＤＨｐ−ＧＡｓ−ＴＶＸと略す）。  また、（ｅ）で取得したＡ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ由来キシラナーゼＩについても同様に、分泌タンパク質部分の遺伝子をＰＣＲによって取得し、精製後、制限酵素ＳａｃＩによって消化し、前記ＧＡＰＤＨｐ−ＧＡｓ断片とライゲーションした（以下、ＧＡＰＤＨｐ−ＧＡｓ−ＡＣＸと略す）。なお、ＰＣＲに用いたプライマーは、下記表４の配列番号６５及び６６に記載。  なお、ここで示すＤＮＡ断片の精製やライゲーションの手法は、（ｃ）と同様である。【０１４３】  （ｇ）発現ベクターへの導入：前記ＧＡＰＤＨｐ−ＧＡｓ−ＴＶＸ断片と出芽酵母用マルチコピーベクターＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ  ７７６９）を制限酵素ＸｍａＩとＢａｍＨＩで消化し（前者約１．３ｋｂｐ、後者約７．４ｋｂｐ）、精製後、ライゲーションし、Ｔ．  ｖｉｒｉｄｅ由来キシラナーゼＩＩ変異体作製用プラスミドを得た（以下ＹＥｐ−ＧＡＰＤＨｐ−ＧＡｓ−ＴＶＸと略す）。また、同様に、ＧＡＰＤＨｐ−ＧＡｓ−ＡＣＸとＹＥｐ２４を制限酵素ＸｍａＩとＢａｍＨＩ制限酵素で消化し（前者約１．５ｋｂｐ、後者約７．４ｋｂｐ）、精製後、ライゲーションし、Ａ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ由来キシラナーゼＩ変異体作成用発現ベクターを得た（以下ＹＥｐ−ＧＡＰＤＨｐ−ＧＡｓ−ＡＣＸと略す）。  なお、ここで示すＤＮＡ断片の精製やライゲーションの手法は（ｃ）と同様である。また、ＹＥｐ２４は細胞・微生物バンクであるアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。【０１４４】
【表４】
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【０１４５】（２）部位特異的突然変異誘発  本発明の実施例において用いた突然変異体は、（１）で構築した発現ベクターを鋳型に、宝酒造社製の「ＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ」によって変異を導入した。  プライマーは、合成したオリゴヌクレオチドを用いた。  発現ベクターＹＥｐ−ＧＡＰＤＨｐ−ＧＡｓ−ＴＶＸを鋳型として、以下表５の配列番号５及び配列番号６と、配列番号７及び配列番号８と、配列番号９及び配列番号１０と、配列番号１１及び配列番号１２とをプライマーとして用いてＰＣＲを実施し、変異型キシラナーゼ発現ベクターＹＥｐ−ＧＡＰＤＨｐ−ＧＡｓ−ＴＶＸ０１を得た。  発現ベクターＹＥｐ−ＧＡＰＤＨｐ−ＧＡｓ−ＡＣＸを鋳型として、以下表５の配列番号２１及び配列番号２２との配列をプライマーとして、配列表の配列番号２の１５４番目のロイシン残基がメチオニン残基に置換された置換アミノ酸残基を有するＹＥｐ−ＧＡＰＤＨｐ−ＧＡｓ−Ｌ１５４Ｍを得た。  発現ベクターＹＥｐ−ＧＡＰＤＨｐ−ＧＡｓ−ＡＣＸを鋳型として、以下表５の配列番号１３及び配列番号１４と、配列番号１５及び配列番号１６と、配列番号１７及び配列番号１８と、配列番号１９及び配列番号２０と、配列番号２１及び配列番号２２と、配列番号２３及び配列番号２４と、配列番号２５及び配列番号２６と、配列番号２７及び配列番号２８と、配列番号２９及び配列番号３０との配列をプライマーとして、同様にＹＥｐ−ＧＡＰＤＨｐ−ＧＡｓ−ＡＣＸ０１を得た。【０１４６】  発現ベクターＹＥｐ−ＧＡＰＤＨｐ−ＧＡｓ−ＡＣＸを鋳型として、以下表５の配列番号１５及び１６と、配列番号２１及び配列番号２２と、配列番号３１及び配列番号３２と、配列番号３３及び配列番号３４との配列をプライマーとして、同様にＹＥｐ−ＧＡＰＤＨｐ−ＧＡｓ−ＡＣＸ０２得た。【０１４７】  発現ベクターＹＥｐ−ＧＡＰＤＨｐ−ＧＡｓ−ＡＣＸを鋳型として、以下表５の配列番号２１及び配列番号２２と、配列番号３１及び配列番号３２と、配列番号３５及び配列番号３６、配列番号３７及び配列番号３８と、配列番号３９及び配列番号４０との配列をプライマーとして、同様にＹＥｐ−ＧＡＰＤＨｐ−ＧＡｓ−ＡＣＸ０３得た。  該変異型キシラナーゼを含むプラスミドを大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）に形質転換し、形質転換体を得た。  この菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてキシラナーゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、鋳型であるＹＥｐ−ＧＡＰＤＨｐ−ＧＡｓ−ＴＶＸ、ＹＥｐ−ＧＡＰＤＨｐ−ＧＡｓ−ＡＣＸのキシラナーゼ遺伝子をコードする部分に、アミノ酸置換が導入されていることを確認した。【０１４８】
【表５】
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【０１４９】（３）酵母への形質転換と変異型キシラナーゼの生産  （２）によって作製された変異型キシラナーゼを有する発現ベクターを、Ｆａｓｔ−Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｇ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＢＹ４７４１のコンピテントセルに形質転換し、ＳＤ−Ｕｒａ寒天培地（０．６７％  Ｙｅａｓｔ−ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（ディフコ社）、２％グルコース、０．５％カザミノ酸、０．０７７％−Ｕｒａ  ＤＯ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（クロンテック社）、２％寒天、脱イオン水）上にて３０℃、４８時間培養した。その結果取得した変異体を表６に示す。【０１５０】
【表６】
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【０１５１】（４）変異型キシラナーゼの安定性の評価  得られたコロニーをＳＤ−Ｕｒａ液体培地（４％グルコース、寒天なし、ＳＤ−Ｕｒａ液体培地以外は前記培地組成と同じ）に植え、３０℃で２４時間前培養した後、２％植菌して４８時間本培養し、該変異型キシラナーゼを含む上澄み液を遠心分離後、５０℃〜５５℃で加熱処理し、実施例１に示した測定法によって残存活性を評価した。【０１５２】＜ＴＶＸ０１＞  実施例２−（２）に記した手法により作製した変異型キシラナーゼを５０℃で０〜７２時間熱処理後、実施例１の測定方法により残存活性を測定した。その結果を表７に示す。ＷＴは野生型を、Ｆ、Ｌ、Ｓ、Ｒは、配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列において、２７番目のチロシン残基に相当するアミノ酸残基がフェニルアラニン、２９番目のアスパラギン残基に相当するアミノ酸残基がロイシン残基、４４番目のアスパラギン残基に相当するアミノ酸残基がセリン残基、５８番目のリジン残基に相当するアミノ酸残基がアルギニン残基への置換を表す。なお、２７番目のチロシン残基に相当するアミノ酸残基がフェニルアラニン残基に置換した変異型キシラナーゼ（表７（ｅ））の作製には、表８に記載の配列番号４１と配列番号４２とのプライマーを用いた。【０１５３】
【表７】
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【０１５４】
【表８】
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【０１５５】  国際公開第２００７／１１５３９１号パンフレット、国際公開第２００１／２７２５２号パンフレット、国際公開第２００５／１０８５６５号パンフレットで示されている熱安定化をもたらすと考えられている特定のアミノ酸残基の置換アミノ酸残基を有する変異型キシラナーゼは、表７の（ｄ）、（ｆ）及び（ｈ）で示されるとおり、２４時間後に完全に失活した。  また、表７の（ｅ）及び（ｇ）で示されるとおり、２７番目のチロシン残基がフェニルアラニン残基に置換された置換アミノ酸残基を有する変異型キシラナーゼ又は４４番目のアスパラギン残基がセリン残基に置換された置換アミノ酸残基を有する変異型キシラナーゼについても、２４時間後には完全に失活した。【０１５６】  しかしながら、２９番目のアスパラギン残基がロイシン残基および５８番目のリジン残基がアルギニン残基に置換された置換アミノ酸残基を有する変異型キシラナーゼ（表７（ｄ））は、２７番目のチロシン残基をフェニルアラニン残基に置換することによって残存活性が向上し、７２時間後も５０％以上の残存活性を示した（表７（ｃ））。  さらに前記変異型キシラナーゼの４４番目のアスパラギン残基をセリン残基に置換することによって、野生型（表７（ａ））並の活性を維持したまま、７２時間後も７０％の活性を残していた（表７（ｂ））。  なお、本発明の４重変異点を持つ多くの変異体がＴＶＸ０１と同程度の性質を有し、具体的には、４重変異点を有すると同時に、配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列において、４７番目のグリシン残基がシステイン残基に置換したもの、５２番目のグルタミン残基がリジン残基に置換したもの、５９番目のバリン残基がイソロイシン残基に置換したもの、６７番目のアスパラギン残基がアスパラギン酸残基に置換したもの、６９番目のアスパラギン残基がイソロイシン残基に置換したもの、８０番目のセリン残基がアラニン残基に置換したもの、９７番目のアスパラギン残基がアスパラギン酸残基に置換したもの、１０５番目のロイシン残基がメチオニン残基に置換したもの、１０９番目のスレオニン残基がアラニン残基に置換したもの、１２０番目のスレオニン残基がアルギニン残基に置換したもの、１４３番目のスレオニン残基がイソロイシン残基に置換したもの、１５１番目のアスパラギン残基がセリン残基に置換したもの、１６１番目のセリン残基がロイシン残基に置換したもの、１８６番目セリン残基がスレオニン残基に置換したものなどが挙げられる。【０１５７】＜Ｌ１５４Ｍ＞  実施例２−（２）に記した手法により作製した変異型キシラナーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列で示される核酸を含む発現ベクターにより、実施例２−（３）に記した手法により酵母を形質転換し、変異型キシラナーゼ産生酵母を液体培養し、その培養液の上澄みを５０℃で２４時間熱処理後、実施例１に示す測定方法により残存活性を測定した。  該変異型キシラナーゼの残存活性は５０％であった。また、熱処理前の反応初速度についても野生型１に対して該変異型キシラナーゼの方が１．１３と高かった。【０１５８】＜ＡＣＸ０１，ＡＣＸ０２，ＡＣＸ０３＞  実施例２−（２）に記した手法により作製した変異型キシラナーゼのアミノ酸配列をコード��る塩基配列で示される核酸を含む発現ベクターにより、実施例２−（３）に記した手法により酵母を形質転換し、変異型キシラナーゼ産生酵母を液体培養し、その培養液の上澄みを５０℃で０〜４８時間熱処理後、実施例１に示す測定方法により残存活性を測定した。その結果を表９に示す。表中、ＷＴは野生型を示す。  なお、ここで用いた液体培地は、４％のグルコースを含むＳＤ（Ｕｒａを含まない）培地である。【０１５９】
【表９】
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【０１６０】  野生型Ａ．  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ由来キシラナーゼは、１６時間の熱処理後、完全に失活した（表９（ｉ））。一方、変異型キシラナーゼの残存活性は向上しており、４８時間後も５０％以上の残存活性を示した（表９（ｊ）、（ｋ）又は（ｌ））。ＡＣＸ０２、ＡＣＸ０３（表９（ｋ）及び（ｌ））は、熱処理前の反応初速度についても野生型とほぼ同等であり、ＡＣＸ０１に至っては野生型の２倍近い活性を示した（表９（ｊ））。  なお、ＡＣＸ０１の変異点すべてを有する多くの変異体がＡＣＸ０１と同程度の性質を示し、具体的には、ＡＣＸ０１が有する変異点以外に、配列表の配列番号３記載のアミノ酸配列において、１３３番目のセリン残基がアスパラギン残基に、１７６番目のグルタミン残基がアルギニン残基に置換したものなどが挙げられる。  また、ＡＣＸ０２についても同様に、その変異点すべてを有する多くの変異体がＡＣＸ０２と同程度の性質を示し、具体的には、ＡＣＸ０２が有する変異点以外に、配列表の配列番号３記載のアミノ酸配列において、９０番目のスレオニン残基がセリン残基に、１３２番目のグルタミン残基がアルギニン残基に、１３３番目のセリンがアスパラギン残基に、１７４番目のセリン残基がスレオニン残基に、１９５番目のプロリン残基がヒスチジン残基に、１７６番目のグルタミン残基がアルギニン残基に、１９７番目のセリン残基がアスパラギン残基に、２１７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基に置換したものなどが挙げられる。  さらに、ＡＣＸ０３の変異点すべてを有する多くの変異体がＡＣＸ０３と同程度の性質を示し、具体的には、ＡＣＸ０３が有する変異点以外に、配列表の配列番号３記載のアミノ酸配列において、１７６番目のグルタミン残基がアルギニン残基に置換したものなどが挙げられる。【０１６１】〔比較例〕  変異導入によって酵素の耐熱性を向上させる場合、通常は反応の初速度が大幅に低下もしくは完全に失活してしまうことが知られている。本願においても、耐熱性は向上するものの、反応初速度が低下した変異体が得られることがほとんどだった。その一例を表１０に示す。ＷＴは野生型を、ＭＴは変異型を表す。  なお、これらの変異体は、実施例２−（２）に記載の手法により作製した。  ＭＴ１は、プラスミドＹＥｐ−ＧＡＰＤＨｐ−ＧＡｓ−ＴＶＸを鋳型に、以下表１１の配列番号４３及び配列番号４４と、配列番号４５及び配列番号４６と、配列番号４７及び配列番号４８との配列をプライマーとした。  ＭＴ２は、プラスミドＹＥｐ−ＧＡＰＤＨｐ−ＧＡｓ−ＴＶＸを鋳型として、以下表１１の配列番号７及び配列番号８と、配列番号４７及び配列番号４８と、配列番号４９及び配列番号５０との配列をプライマーとした。  ＭＴ３は、プラスミドＹＥｐ−ＧＡＰＤＨｐ−ＧＡｓ−ＡＣＸを鋳型として、以下表１１の配列番号５１及び配列番号５２と、配列番号５３及び配列番号５４との配列をプライマーとした。【０１６２】  表１０におけるＭＴ１の変異点とは、配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列において、１３番目のチロシン残基がフェニルアラニン残基（Ｔｙｒ１３Ｐｈｅ）、４７番目のグリシン残基がシステイン残基（Ｇｌｙ４７Ｃｙｓ）、１５１番目のアスパラギン残基がセリ��残基（Ａｓｎ１５１Ｓｅｒ）に置換されたことを示す。  また、ＭＴ２の変異点とは、配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列において、４６番目のバリン残基がイソロイシン残基（Ｖａｌ４６Ｉｌｅ）、５８番目のリジン残基がアルギニン残基（Ｌｙｓ５８Ａｒｇ）、１５１番目のアスパラギン残基がセリン残基（Ａｓｎ１５１Ｓｅｒ）に置換されたことを示す。【０１６３】  ＭＴ３の変異点とは、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列において、１００番目のセリン残基がシステイン残基（Ｓｅｒ１００Ｃｙｓ）、１４４番目のアスパラギン残基がシステイン残基（Ａｓｎ１４４Ｃｙｓ）に置換されたことを示す。【０１６４】
【表１０】
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【０１６５】
【表１１】
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【０１６６】〔実施例３〕Ｔ．ｖｉｒｉｄｅを宿主としたＴＶＸ０１及びＡＣＸ０２の大量生産（１）Ｔ．ｖｉｒｉｄｅを用いたＴＶＸ０１の大量生産（ａ）プラスミドＴＶＸ０１−ｐＣＢ１の構築  実施例２で得られた変異型キシラナーゼＴＶＸ０１をコードする塩基配列を鋳型とし、キシラナーゼ部分のＤＮＡ配列をＰＣＲ法によって取得した。  ＰＣＲに用いたプライマーは、下記表１２の配列番号６７及び配列番号６８に記載した。  実施例２−（１）（ｄ）で取得したＴ．ｖｉｒｉｄｅ由来キシラナーゼ遺伝子の全長を鋳型とし、シグナル部分のＤＮＡ配列をＰＣＲ法によって取得した。ＰＣＲに用いたプライマーは、下記表１２の配列番号６９及び配列番号７０に記載した。  前記シグナル配列部分のＤＮＡ配列ならびにキシラナーゼ部分のＤＮＡ配列をＰＣＲ法により連結し、前記シグナル配列部分の開始コドンの上流の配列にＳｔｕＩを、終始コドンの下流にＸｈｏＩを含む配列を取得した。  ＰＣＲに用いたプライマーは、下記表１２の配列番号７１及び配列番号７２に記載した。増幅された０．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（インビトロジェン社製）により、添付のプロトコールに従ってｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ発現ベクターに挿入し、プラスミドＴＯＰＯ−ＴＶＸ０１を得た。【０１６７】
【表１２】
0005889331.tif 000013
【０１６８】  プラスミド「ＴＯＰＯ−ＴＶＸ０１」をＳｔｕＩおよびＸｈｏＩで切断し、約０．７ｋｂｐの遺伝子断片「ＴＶＸ０１−Ｎ」を得た。一方、ｐＣＢ１−Ｅｇ３Ｘ−ｈｐｈｌｅｓｓ（国際公開第２０１１／０２１６１６号パンフレット）をＳｔｕＩおよびＸｈｏＩで切断し、約７ｋｂｐの断片を回収した。回収した断片に約０．７ｋｂｐの遺伝子断片「ＴＶＸ０１−Ｎ」をＤＮＡライゲース（宝酒造社製）で連結し、プラスミド「ＴＶＸ０１−ｐＣＢ１」を作製した。酵素などの反応条件についてはキットに添付の説明書の条件に従った。プラスミド「ＴＶＸ０１−ｐＣＢ１」は、宿主のＴ．ｖｉｒｉｄｅ内にて、自身の開始コドンを用いてＴＶＸ０１を発現するように構築した。【０１６９】（ｂ）プラスミド「ＴＶＸ０１−ｐＣＢ１」によるＴ．ｖｉｒｉｄｅの形質転換体の作製  実施例３−（１）−（ａ）で得られたプラスミド「ＴＶＸ０１−ｐＣＢ１」によるＴ．ｖｉｒｉｄｅの形質転換は、国際公開第２０１１／０２１６１６号パンフレットに記載の方法に従い、実施した。ウラシル生合成遺伝子（ｐｙｒ４）欠損株であるＴ．ｖｉｒｉｄｅ  ｓｔｒａｉｎ２株を宿主とし、選択マーカーとしてニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）のｐｙｒ４遺伝子を用いたコートランスフォーメーション法により形質転換を実施した。なお、Ｔ．ｖｉｒｉｄｅ  ｓｔｒａｉｎ２株は、日本特許第４６４４６０３号明細書の段落番号［０１０２］に記載の方法に従い取得することができる。すなわち、特許第４６４４６０３号明細書の段落番号[０１０２]に記載の通り、トリコデルマ・ビリデＭＣ３００−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６０４７）の１０９ＣＦＵ／ｍｌ程度の胞子懸濁液を、ＵＶ灯２灯を３０ｃｍの高さで点灯下、穏やかに混和しながら照射した。ＵＶ照射後の胞子懸濁液を選択培地に塗布し、２８℃で７日間培養した。生育した株を選抜し、トリコデルマ・ビリデのウラシル要求株であるＴ．ｖｉｒｉｄｅ  ｓｔｒａｉｎ２株を取得した。選択培地の組成は、最少培地［０．２％リン酸２水素１カリウム、０．４％硫酸アンモニウム、０．０３％尿素、０．０３％硫酸マグネシウム７水和物、０．０３％塩化カルシウム、０．５％グルコース、２．５％寒天、０．０１％トレースエレメント（５ｍｇ硫酸鉄７水和物、１．５６ｍｇ硫酸マンガン７水和物、１．４ｍｇ硫酸亜鉛７水和物、２ｍｇ塩化コバルトを１Ｌの水に溶解したもの）］に１０μｇ／ｍＬのウリジン及び１ｍｇ／ｍＬの５−フルオロオロチン酸を添加したものである。  Ｔ．ｖｉｒｉｄｅ  ｓｔｒａｉｎ２株をプロトプラスト化酵素溶液（１ｍｇ／ｍＬ  β−グルクロニダーゼ、０．３ｍｇ／ｍＬ  キチナーゼ、０．３ｍｇ／ｍＬ  ザイモリエース、０．５ｍｏｌ／Ｌ  シュークロース）に懸濁し、菌糸をプロトプラスト化させた。この懸濁液を濾過及び遠心した後、ＳＵＴＣ緩衝液（０．５ｍｏｌ／Ｌ  シュークロース、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化カルシウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス塩酸（ｐＨ７．５））で洗浄した。【０１７０】  上記プロトプラストを１００μＬのＳＵＴＣ緩衝液に懸濁し、そこに１０μｇ分のプラスミド「ＴＶＸ０１−ｐＣＢ１」が入ったＤＮＡ溶液１０μＬとｐｙｒ４遺伝子が入ったＤＮＡ溶液１０μＬとを加え、氷中に５分間静置した。次に４００μＬのＰＥＧ溶液（６０％  ＰＥＧ４０００、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化カルシウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス塩酸（ｐＨ７．５））を加え、氷中に２０分間静置した後、１０ｍＬのＳＵＴＣ緩衝液を加え、遠心分離した。集めたプロトプラストを１ｍＬのＳＵＴＣ緩衝液に懸濁し、２００μＬずつ０．５ｍｏｌ／Ｌ  シュークロースを含む最少培地に軟寒天とともに重層し、２８℃で５日間培養後、生育したコロニーを再度最少培地に移植し、ここで形成したコロニーを形質転換体とした。【０１７１】（ｃ）「ＴＶＸ０１−ｐＣＢ１」の形質転換体の培養および同定  プラスミド「ＴＶＸ０１−ｐＣＢ１」を導入し最少培地で生育した株を選抜し、国際公開第９８／１１２３９号パンフレットに記載の方法に従い培養した。得られた培養液を遠心し、菌体と培養上清に分離した後、該培養上清をフィルター（孔径：０．２μｍ）に通してろ過滅菌することにより培養上清液を調製した。この培養上清液を１２％  Ｇｅｌ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｍｉｎｉ（テフコ社製）を用いて電気泳動分離を行い、ＴＶＸ０１のバンドが良好に検出される培養上清を選抜した。選抜した培養上清液を、「大量調製したＴＶＸ０１」とした。【０１７２】（２）Ｔ．ｖｉｒｉｄｅを用いたＡＣＸ０２の大量生産（ａ）Ｔ．ｖｉｒｉｄｅでの発現に適したＡＣＸ０２遺伝子コドンの改変  ＡＣＸ０２遺伝子をＴ．ｖｉｒｉｄｅにおいて、活性あるタンパク質として高発現させるために、Ａ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓのシグナル配列とＡＣＸ０２遺伝子に計２４箇所の塩基の変更を伴うＤＮＡを作成した。表１３中、配列名「ＡＣＸ０２」の「塩基の位置」は、配列番号４で示される野生型Ａ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓキシラナーゼ遺伝子の塩基の位置と一致する。また、配列名「Ａ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓシグナル配列」の「塩基の位置」は、配列番号７３で示される塩基の位置を示す。【０１７３】
【表１３】
0005889331.tif 000014
【０１７４】  この改変ＡＣＸ０２遺伝子は、Ｔ．ｖｉｒｉｄｅにおけるコドンの使用頻度分布を考慮してデザインしたものである。この改変ＡＣＸ０２遺伝子を、株式会社ジーンデザインで、人工的に合成した。なお人工合成の際、開始コドンの上流の配列にＥｃｏＲＩとＳｔｕＩを、終始コドンの下流にＸｈｏＩとＨｉｎｄＩＩＩを含むように設計した。ｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ／  ＨｉｎｄＩＩＩに、コドン改変ＡＣＸ０２遺伝子が挿入されたプラスミド「ｐＡＣＸ０２」を得た。【０１７５】（ｂ）プラスミドＡＣＸ０２−ｐＣＢ１の構築プラスミド「ｐＡＣＸ０２」をＳｔｕＩおよびＸｈｏＩで切断し、約８５０ｂｐの遺伝子断片「ＡＣＸ０２−Ｎ」を得た。一方、ｐＣＢ１−Ｅｇ３Ｘ−ｈｐｈｌｅｓｓ（国際公開第２０１１／０２１６１６号パンフレット）をＳｔｕＩおよびＸｈｏＩで切断し、約７ｋｂｐの断片を回収した。回収した断片に約８５０ｂｐの遺伝子断片「ＡＣＸ０２−Ｎ」をＤＮＡライゲース（宝酒造社製）で連結し、プラスミド「ＡＣＸ０２−ｐＣＢ１」を作製した。酵素などの反応条件についてはキットに添付の説明書の条件に従った。プラスミド「ＡＣＸ０２−ｐＣＢ１」は、宿主のＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ内にて、自身の開始コドンを用いてＡＣＸ０２を発現するように構築した。【０１７６】（ｃ）プラスミド「ＡＣＸ０２−ｐＣＢ１」によるＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅの形質転換体の作製  実施例３−（２）−（ｂ）で得られたプラスミド「ＡＣＸ０２−ｐＣＢ１」によるＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅの形質転換は、国際公開第２０１１／０２１６１６号パンフレットに記載の方法に従い、実施した。ウラシル生合成遺伝子（ｐｙｒ４）欠損株であるトリコデルマ・ビリデ  ｓｔｒａｉｎ２株を宿主とし、選択マーカーとしてニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）のｐｙｒ４遺伝子を用いたコートランスフォーメーション法により形質転換を実施した。Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ  ｓｔｒａｉｎ２株をプロトプラスト化酵素溶液（１ｍｇ／ｍＬ  β−グルクロニダーゼ、０．３ｍｇ／ｍＬ  キチナーゼ、０．３ｍｇ／ｍＬ  ザイモリエース、０．５ｍｏｌ／Ｌ  シュークロース）に懸濁し、菌糸をプロトプラスト化させた。この懸濁液を濾過・遠心した後、ＳＵＴＣ緩衝液（０．５ｍｏｌ／Ｌ  シュークロース、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化カルシウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス塩酸（ｐＨ７．５））で洗浄した。  上記プロトプラストを１００μＬのＳＵＴＣ緩衝液に懸濁し、そこに１０μｇ分のプラスミド「ＡＣＸ０２−ｐＣＢ１」が入ったＤＮＡ溶液１０μＬとｐｙｒ４遺伝子が入ったＤＮＡ溶液１０μＬを加え、氷中に５分間静置した。次に４００μＬのＰＥＧ溶液（６０％  ＰＥＧ４０００、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化カルシウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス塩酸（ｐＨ７．５））を加え、氷中に２０分間静置した後、１０ｍＬのＳＵＴＣ緩衝液を加え、遠心分離した。集めたプロトプラストを１ｍＬのＳＵＴＣ緩衝液に懸濁し、２００μＬずつ０．５ｍｏｌ／Ｌ  シュークロースを含む最少培地に軟寒天とともに重層し、２８℃で５日間培養後、生育したコロニーを再度最少培地に移植し、ここで形成したコロニーを形��転換体とした。【０１７７】（ｄ）「ＡＣＸ０２−ｐＣＢ１」の形質転換体の培養および同定  プラスミド「ＡＣＸ０２−ｐＣＢ１」を導入し最少培地で生育した株を選抜し、国際公開第９８／１１２３９号パンフレットに準じて培養した。  得られた培養液を遠心し、菌体と培養上清に分離した後、該培養上清をフィルター（孔径：０．２μｍ）に通してろ過滅菌することにより培養上清液を調製した。この培養上清液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに処し、ＡＣＸ０２のバンドが良好に検出される培養上清を選抜した。選抜した培養上清液を、「大量調製したＡＣＸ０２」とした。【０１７８】〔実施例４〕温度とｐＨの変化に伴うＴＶＸ０１の安定性の推移  実施例３に示した方法によって大量調製したＴＶＸ０１を用いて、以下に記す実験を行った。２００ｍＭの各種緩衝液（後記）とキシラナーゼを１：１で混合し、各種温度で一定時間処理後、５分間アイスバスに静置した後、実施例１に示す方法にて残存活性を測定した。なお、ここで用いた緩衝液は、クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８〜ｐＨ９）、グリシンナトリウム緩衝液（ｐＨ１０）とした。  ＴＶＸ０１は、ｐＨ４．５、５０℃において、７２時間熱処理後も８６％の活性を有した。また、さらに高温である７０℃において、ｐＨ５．５（該変異体キシラナーゼ原液のｐＨ）、５分間の熱処理後も６８％の活性を有した。いずれの条件においても、野生型は完全に活性を失う条件であり、該変異体は、酸性かつ高温下において残存活性が向上していた。  また、ｐＨ８〜ｐＨ１０、５０℃において６０分間の熱処理後、野生型の残存活性は、ｐＨ８で２８％、ｐＨ９で８％であり、ｐＨ１０においては完全に失活するのに対し、該変異体は、ｐＨ８で８３％、ｐＨ９で６０％、ｐＨ１０においても５６％の活性を有した。加えて、野生型が完全に活性を失う６０℃、６０分間の熱処理後においても、該キシラナーゼは、ｐＨ８で３０％、ｐＨ９で１７％、ｐＨ１０においても１０％の活性を有しており、塩基性かつ高温下においても残存活性が向上していた。【０１７９】  以上のように、本発明のＴＶＸ０１は、ｐＨ４．５、ｐＨ８〜ｐＨ１０、かつ５０℃〜７０℃といった野生型酵素が顕著に失活する条件において、有意な残存活性の向上を示した。【０１８０】〔実施例５〕温度とｐＨの変化に伴うＡＣＸ０２の安定性の推移  実施例３に示した方法によって大量調製したＡＣＸ０２を用いて、実施例４と同様に実験を行った。  大量調製したＡＣＸ０２は、ｐＨ４．５、５０℃において、７２時間熱処理後も８４％の活性を有した。同様に処理した野生型のキシラナーゼは、４５％まで活性が低下しており、該変異型キシラナーゼは野生型と比して、酸性かつ高温下において残存活性が向上していた。  また、ｐＨ８〜ｐＨ１０、５０℃において６０分間の熱処理後、野生型は完全に活性を失ったのに対し、ＡＣＸ０２は、ｐＨ８で３４％、ｐＨ９で５％、ｐＨ１０においても２％の活性を有しており、塩基性かつ高温下においても残存活性が向上していた。  以上のように、本発明のＡＣＸ０２は、ｐＨ４．５、ｐＨ８〜ｐＨ１０、かつ５０℃といった野生型が顕著に失活する条件において、有意な残存活性の向上を示した。【０���８１】〔実施例６〕リグノセルロース原料の糖化反応（１）  三角フラスコに乾燥重量２ｇの広葉樹クラフトパルプ（ＬＢＫＰ）を入れた後、実施例３の方法によって大量調製したＡＣＸ０２、ＴＶＸ０１、実験対照としてＴ．ｖｉｒｉｄｅ由来の野生型キシラナーゼ及びＡ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ由来の野生型キシラナーゼを含むセルラーゼ水溶液をそれぞれ蛋白質重量で５２ｍｇ相当ずつ該三角フラスコに加え、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）を注入して２０ｇの反応液を調製し、シリコン栓で密閉した。その後、５０℃にて緩やかに撹拌して糖化反応を行った。その結果を表１４に示す。ＷＴは野生型キシラナーゼを表す。【０１８２】
【表１４】
0005889331.tif 000015
【０１８３】  ７２時間経過後、Ａ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ由来およびＴ．ｖｉｒｉｄｅ由来の野生型キシラナーゼの残存活性が３０％前後まで低下していたのに対し（表１４（ｍ），（ｏ））、大量調製したＡＣＸ０２及び大量調製したＴＶＸ０１は９０％以上の残存活性を示していた（表１４（ｎ），（ｐ））。【０１８４】〔実施例７〕リグノセルロース原料の糖化反応（２）（１）糖化反応  セパラブルフラスコに乾燥重量４０ｇの広葉樹クラフトパルプ（ＬＢＫＰ）を入れた後、実施例３の方法によって大量調製したＴＶＸ０１、ＡＣＸ０２を含むセルラーゼ水溶液をそれぞれ蛋白質重量で３４７ｍｇ相当ずつ該セパラブルフラスコに加え、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）を注入して４００ｇの反応液を調製した。その後、５０℃にて緩やかに撹拌して糖化反応を行い、７２時間反応後の生成単糖量をＨＰＬＣにて分析した。＜ＨＰＬＣ分析条件＞分析機器：  日本分光ＨＰＬＣカラム  ：  ＵＬＴＲＯＮ  ＰＳ−８０Ｈ（３００×８ｍｍ；信和化工株式会社製）分析温度：  ５０℃移動相  ：  過塩素酸水溶液  ｐＨ２．１【０１８５】（２）酵素の回収  この糖化反応液（７２時間反応液）を７０００×ｇで遠心した沈殿物を回収した。一方の遠心上清液を市販のＵＦ膜（商品名；マイクローザＵＦペンシル型モジュールＡＩＰ−００１３Ｄ、旭化成ケミカルズ株式会社製）にて処理し、濃縮画分を得た。【０１８６】（３）回収した酵素を用いた再糖化反応  セパラブルフラスコに、上記糖化反応液の７０００×ｇ遠心沈殿物と、ＵＦ膜処理にて得られた濃縮画分を装入し、広葉樹クラフトパルプ（ＬＢＫＰ）を終固形分として４０ｇとなる様に加え、５０℃にて緩やかに撹拌して糖化反応を行い、７２時間反応後の生成単糖量をＨＰＬＣにて分析した。【０１８７】（４）糖化反応結果  最初の反応（酵素再利用０回目）を始めて７２時間後、ＴＶＸ０１を含む糖化反応液中のグルコース及びキシロースの蓄積濃度は７９．１ｇ／Ｌであった。そのうち、グルコースの蓄積濃度は６５．１ｇ／Ｌであった。一方、野生型のＴ．ｖｉｒｉｄｅ由来キシラナーゼを含む糖化反応液中のグルコース及びキシロースの蓄積濃度は７８．０ｇ／Ｌ、グルコースの蓄積濃度は６４．７ｇ／Ｌであった。同様に、ＡＣＸ０２を含む糖化反応液中では、グルコース及びキシロースの蓄積濃度は６１．３ｇ／Ｌ、グルコースの蓄積濃度は４９．９ｇ／Ｌであった。これらの糖化反応液中の酵素を、前記の方法によって糖化反応に再利用した。【０１８８】  再利用１回目のグルコース及びキシロースの蓄積濃度は、ＴＶＸ０１を含む糖化反応液で７０．７ｇ／Ｌ、野生型のＴ．ｖｉｒｉｄｅ由来キシラナーゼを含む糖化反応液で５３．３ｇ／Ｌ、ＡＣＸ０２を含む糖化反応液中で５３．１ｇ／Ｌだった。  再利用１回目のグルコースの蓄積濃度は、ＴＶＸ０１を含む糖化反応液で５８．７ｇ／Ｌ、野生型のＴ．ｖｉｒｉｄｅ由来キシラナーゼを含む糖化反応液で４５．０ｇ／Ｌ、ＡＣＸ０２を含む糖化反応液中で４３．５ｇ／Ｌだった。【０１８９】  再利用２回目のグルコースとキシロースの蓄積濃度は、ＴＶＸ０１を含む糖化反応液で６３．６ｇ／Ｌ、野生型のＴ．ｖｉｒｉｄｅ由来キシラナーゼを含む糖化反応���で４２．３ｇ／Ｌ、ＡＣＸ０２を含む糖化反応液中で４２．６ｇ／Ｌだった。  再利用２回目のグルコースの蓄積濃度は、ＴＶＸ０１を含む糖化反応液で５３．０ｇ／Ｌ、野生型のＴ．ｖｉｒｉｄｅ由来キシラナーゼを含む糖化反応液で３５．８ｇ／Ｌ、ＡＣＸ０２を含む糖化反応液中で３４．６ｇ／Ｌだった。  得られた結果を再利用０回目の糖蓄積濃度を１００％としたときの相対値で表す。その結果を表１５及び表１６に示す。なお、ＷＴは野生型キシラナーゼを表す。【０１９０】
【表１５】
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【０１９１】
【表１６】
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【０１９２】  表１５に示すように、酵素を再利用した糖化反応において、本発明の変異型キシラナーゼＴＶＸ０１およびＡＣＸ０２が好適に利用できることが明らかとなった。  また、表１６に示すように、本発明の変異型キシラナーゼを用いることで、キシロースの生産性だけではなく、グルコースの生産性も向上できることが明らかになった。  加えて、針葉樹由来パルプ（ＮＢＫＰ）に本発明のＴＶＸ０１およびＡＣＸ０２を用いても、前記同様の効果が得られた。【０１９３】〔実施例８〕パルプの漂白方法（１）パルプのキシラナーゼ処理  パルプとして、市販の牛乳パックを用いる。牛乳パックの原料は、針葉樹の間伐材や製材されたときに出る端材等であり、着色成分であるリグニンを含むバージンパルプである。  よく洗った牛乳パックを５ｃｍ角程度に裁断し、２日〜５日程度の間、水に浸ける。その後、表面のポリエチレンフィルムをはがす。  前紙片を浸した水を５０℃に加熱し、本発明の変異型キシラナーゼＴＶＸ０１および変異型キシラナーゼＡＣＸ０２を添加する。また、比較対象として、それぞれの野生型のキシラナーゼでも同様に処理する。ここで使用するキシラナーゼは、いずれも糸状菌由来のものとする。キシラナーゼの添加量は、最適な配合比となるよう検討する。また、処理時間も最適となるよう検討する。加えてキシラナーゼ処理しないものも準備する。【０１９４】  その後、市販の塩素系漂白剤を加え、ｐＨ７〜ｐＨ１０において、前記の紙片を半日間静置する。よく水洗いした後、細かくちぎり、適量の水と同時に家庭用のミキサーで紙片が見えなくなるまで攪拌する。  市販の紙すき器を用いて前記繊維を紙状に加工し、水分を除いた後、乾燥させる。【０１９５】（２）白色度の測定  紫外可視分光白色度計で、前記で作成された紙の白色度（ＪＩＳ  Ｚ  ８７１５）を測定する。（３）本発明の変異型キシラナーゼＴＶＸ０１および変異型キシラナーゼＡＣＸ０２を添加した場合には、ｐＨ７〜ｐＨ１０の条件下においてもパルプを漂白できる。【０１９６】〔実施例９〕洗剤（１）毛羽立ち布の洗浄  洗濯の対象には、毛羽立たせた古い布地を用いる。また、洗剤としては、市販の洗剤に、本発明の変異型キシラナーゼＴＶＸ０１または変異型キシラナーゼＡＣＸ０２を添加したものを使用する。また、比較対象として、それぞれの野生型のキシラナーゼでも同様に処理する。ここで使用するキシラナーゼは、いずれも糸状菌由来のものとする。加えてキシラナーゼ処理しないものも準備する。キシラナーゼの添加量は、最適な配合比となるよう検討する。添加するタイミングは、洗剤を投入するのと同時になるようにする。【０１９７】  １Ｌのセパラブルフラスコ中に８００ｍｌの水を入れ、前記洗剤とキシラナーゼを添加し、６０ｒｐｍで回転させながら、ｐＨ７〜ｐＨ１０、５０℃で、１時間の洗浄を行う。その後、自然乾燥させる。【０１９８】（２）毛羽立ち除去度の測定  実体顕微鏡で毛羽立ちの除去具合を観察する。また、分光測色計を用いて洗浄後の布地の毛羽立ち除去度を測定する。（３）本発明の変異型キシラナーゼＴＶＸ０１および変異型キシラナーゼＡＣＸ０２を添加した場合には、ｐＨ７〜ｐＨ１０、温度５０℃の条件下において毛羽立ちを抑制す��。【０１９９】〔実施例１０〕動物飼料（１）動物飼料の製造  実験動物用粉末飼料に、本発明の変異型キシラナーゼＴＶＸ０１または変異型キシラナーゼＡＣＸ０２を添加する。また、比較対象として、それぞれの野生型のキシラナーゼでも同様に処理する。ここで使用するキシラナーゼは、いずれも糸状菌由来のものとする。加えてキシラナーゼ処理しないものも準備する。キシラナーゼの添加量は、最適な配合比となるよう検討し、混合物をペレット化する。【０２００】（２）成型後動物飼料中の細胞壁分解度の測定  成型した動物飼料を一晩静置した後、市販のカミソリの刃でスライスし、プレパラート上でグラム染色を行い、光学顕微鏡で細胞壁の染色度を観察する。また、一晩静置した動物飼料を、１００ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に激しく混合し、５０００×ｇで１５分間遠心した後、上澄み液を分取し、上澄み液に含まれる還元糖の量をＤＮＳ法（Ｂａｉｌｅｙ等、１９９２）によって測定する。【０２０１】〔実施例１１〕製パン改質剤（１）パンの製造  ストレート法により、パンの製造を行う。原料の配合は、以下の表１７に示すとおりである。すべて一般に市販されている家庭用の材料を用いる。【０２０２】
【表１７】
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【０２０３】  製パン改質剤として、本発明の変異型キシラナーゼＴＶＸ０１または変異型キシラナーゼＡＣＸ０２を添加する。また、比較対象として、それぞれの野生型のキシラナーゼでも同様に処理する。  添加するタイミングは、原料を混合するのと同時にする。キシラナーゼの添加量は、最適な配合比となるよう検討する。また、キシラナーゼ処理しないものも準備する。  出来上がったドウは、約３７℃でおよそ２倍の大きさになるまで約１時間〜２時間をかけて醗酵させた。その後、電子レンジで焼成する。【０２０４】（２）パンの粒子構造観察  焼成したパンを市販のカミソリの刃でスライスし、実体顕微鏡により粒子構造を観察する。（３）ローフ体積の測定  焼成したパンを一晩静置後、菜種置換法により、焼成したパンのローフ体積を測定する。（４）本発明の変異型キシラナーゼＴＶＸ０１および変異型キシラナーゼＡＣＸ０２を添加した場合には、発酵工程における３５℃〜４０℃で１時間から２時間の条件下において、安定して反応しうるものである。【０２０５】  ２０１１年１１月２５日に出願の日本国出願番号第２０１１−２５７３８９号及び２０１２年４月２４日に出願の日本国出願番号第２０１２−０９９０９６号の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。  本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。
【配列表】
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