(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
巨大分子を含有する試料中の巨大分子単量体の多量体の存在を測定する方法であって、
試料中の巨大分子の総濃度を決定するステップと、
バイオセンサーに基づく検出方法を行うことができるバイオセンサーシステムのセンサー表面に試料を接触させることによって試料中の巨大分子の活性濃度を決定するステップであって、巨大分子単量体の物理的特性を用いて活性濃度を決定するステップと、
試料に対して決定された巨大分子の総濃度に対応する巨大分子の総濃度を有する単量体標準対照試料の活性濃度に関する対照値を得るステップと、
決定された試料中の巨大分子の活性濃度を、単量体標準対照試料の対照値と比較するステップと
を含んでおり、
単量体標準対照試料の活性濃度の対照値と比較したときの試料中の巨大分子の活性濃度の低下が試料中の多量体の存在及び量の指標となる、方法。
【請求項２】
前記バイオセンサーに基づく検出方法が質量検知を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記物理的特性が分子量及び拡散係数を含む、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項４】
活性濃度の決定が、少なくとも部分的な質量輸送制限の条件下で様々な流量で試料をセンサー表面と接触させることを含む、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
校正標準を使用せずに決定を行う、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記方法がエバネッセント波検知に基づく、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記方法が表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）に基づく、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の方法の使用。
【請求項８】
前記巨大分子がタンパク質、ポリペプチド及び核酸から選択される、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の巨大分子の二量体又は三量体のような多量体の存在を決定する方法に関する。本発明はまた、巨大分子の精製における本発明方法の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質、核酸及び多糖のような生体巨大分子は、多くの場合、部分的に二量体、三量体若しくはそれ以上のオリゴマーのような多量体、又は集合体の形態で存在し得る。例えば、目的とするポリペプチド又はタンパク質が宿主生物中で生産され、その天然の環境とは全く異なる条件及び濃度で細胞抽出物から単離される組換えＤＮＡ技術において、その条件は分子間ジスルフィド結合若しくはその他の共有結合により、又は非共有相互作用によってかかる多量体を形成する傾向があり得る。
【０００３】
標的巨大分子のかかる多量体の存在は多くの場合望ましくない。例えば、巨大分子の治療用途を意図する場合、巨大分子の多量体形態はその生物学的活性がより低いか又は失われる可能性があり、又は望ましくない副作用を生じる可能性さえある。
【０００４】
試料中のタンパク質又はペプチドの多量体を分析するための従来技術方法には、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー及びイムノアッセイがある。サイズ排除クロマトグラフィーは実施するのが比較的遅くて複雑であるのに対して、イムノアッセイは標的タンパク質又はペプチドに対して特異的なモノクローナル抗体を使用する必要がある。
【０００５】
従って、例えば、タンパク質又はペプチドの精製において、又はタンパク質精製のための条件を最適化する際に、生体巨大分子の多量体の存在を便利に迅速に分析することができる方法に対するニーズがある。
【０００６】
タンパク質又はペプチドのような生体分子の溶液で、全ての生体分子が期待される活性、すなわちある特定のリガンドと特異的に相互作用する能力を有するわけではないことがある。例えば、遺伝子工学により調製されたタンパク質は誤って折り畳まれた分子を有する可能性があり、またタンパク質分子は精製中に損傷しているかもしれない。従って、生物学的な意味合いでは、単に単位体積当たりの生体分子の量を示すタンパク質の総濃度ではなく、生物学的に活性な濃度が関連する。
【０００７】
例えばタンパク質の総濃度は通例ＵＶ又はＮＩＲ吸収分光分析（活性な分子と不活性な分子とを区別しない）によって測定されるが、生体分子の活性濃度はバイオセンサー技術によって便利に測定され得る。後者の場合、生体分子を含有する試料をセンサー表面に固定化された特異的なリガンドと接触させ、その表面の会合／解離過程をモニターする。
【０００８】
バイオセンサー技術を用いて活性濃度を決定する際には、校正標準と関係なく検体濃度を決定することができる。この方法は、校正不要濃度分析（Calibration-Free Concentration Analysis（ＣＦＣＡ））といわれ、様々な流量で、センサー表面に固定化された標的に結合する検体を、観察される結合速度が検体分子のセンサー表面への輸送により一部若しくは完全に制限され、すなわち拡散により一部若しくは完全に制御される条件下で測定することに基づいている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１０／０８７０１１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、かかる活性濃度決定のためのセンサーに基づく方法を用いて巨大分子多量体を分析する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明によると、質量検知型のセンサーによる活性濃度測定を使用して、巨大分子、通例タンパク質又はポリペプチドのような生体高分子の多量体の存在を検出し、その組成を分析し得る。このアプローチは、巨大分子が質量検知バイオセンサーのセンサー表面に結合する場合、検知される質量変化は巨大分子の単量体とオリゴマー性形態の両方が表面に結合するならば両方の形態を区別しないこと、従って巨大分子の多量体が存在するならばセンサー表面の質量は変化しないという事実に基づいている。しかしながら、巨大分子の分子量、拡散係数及びモル濃度は変わり、活性濃度を計算するときに巨大分子単量体のこれらの物理的特性を使用するならば、例えば二量体又は三量体形態の巨大分子を含有する試料に対して決定される活性濃度は、単量体形態のみを含有する試料に対するものより低くなる。言い換えると、活性濃度は過小評価されるということができ、過小評価の程度は試料の組成と相関し得る。
【００１２】
１つの態様では、本発明は、巨大分子を含有する試料中の巨大分子の多量体の存在を決定する方法を提供する。この方法は、（ｉ）試料中の巨大分子の総濃度を決定し、（ｉｉ）バイオセンサーに基づく検出方法、殊に質量検知により、巨大分子単量体の物理的分子特性を使用して、試料中の巨大分子の活性濃度を決定し、（ｉｉｉ）前記試料に対する決定された活性巨大分子濃度と総巨大分子濃度の関係を、少なくとも実質的に多量体を含まない巨大分子を含有する試料に対する対応する関係と比較し、（ｉｖ）得られる差から、試料中の多量体の存在を決定する工程を含む。
【００１３】
巨大分子の物理的分子特性には、通例分子量（Ｍｗ）及び拡散係数（Ｄ）がある。活性な巨大分子と巨大分子の総濃度との関係は、通例、活性濃度の総濃度に対する比として定義される活性な巨大分子に関する試料の「活性」である。
【００１４】
多量体を含まない試料に対するこの関係は、かかる試料に対する総濃度と活性濃度の対応する決定を同様に実施する、すなわち、少なくとも実質的に多量体を含まない巨大分子単量体を含有する試料を準備し、その総巨大分子濃度を決定し、質量検知に基づく検出方法を用いて試料中の巨大分子単量体の活性濃度を決定することによって得るのが好ましい。
【００１５】
活性濃度の決定は、様々な流量で、少なくとも部分的な質量輸送制限の条件下で、殊に校正標準を使用せずに、すなわち校正不要様式で、試料をセンサー表面に接触させることを含むのが好ましい。
【００１６】
巨大分子は、生体巨大分子、特にタンパク質（例えば抗体を含む）、ポリペプチド及び核酸から選択されるものが好ましい。
【００１７】
別の態様では、本発明は、巨大分子の精製における本発明方法の使用を提供する。
【００１８】
本発明のさらに好ましい実施形態は従属請求項に記載されている。
【００１９】
本発明のより完全な理解、並びに別の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び添付の図面を参照することによって得られる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、センサー表面に結合する巨大分子の単量体、二量体及び三量体の概略図である。
【図２】図２は、様々な数の巨大分子サブユニットの組成に対する、活性濃度の単量体濃度と比較したパーセント「過小評価」対パーセント単量体の図である。計算は、多量体の分子形状が単量体の分子と比べて変化せず、結合が質量輸送制限条件下で起こると仮定して行った。
【図３】図３は、本発明による方法の一実施形態における活性濃度の決定で得られたセンサーグラム（sensorgram）のオーバーレイプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
特に定義しない限り、本明細書で使用する技術用語及び科学用語は全て本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解しているのと同じを有する。また、単数形態は特に断らない限り複数の場合も含んで意味する。
【００２２】
上述のように、本発明は、試料中の多量体形態の巨大分子の検出と分析に関する。簡単にいうと、この方法は、バイオセンサー検出技術、殊に質量検知を用いて巨大分子の活性濃度を決定し、活性濃度と総濃度の関係から多量体形態の巨大分子の存在、場合により組成を決定することに基づいている。
【００２３】
バイオセンサーは通例標識を使わない技術に基づき、固定化された層の質量、屈折率又は厚さのようなセンサー表面の性質の変化を検出する。本発明の目的から典型的なバイオセンサーはセンサー表面における質量検出に基づいており、殊に光学的方法及び圧電又は音波方法を含む。光学的検出方法に基づく代表的なセンサーとしては、質量表面濃度を検出するもの、例えば、反射光学的方法に基づくセンサー、例えばエバネッセント波に基づくセンサー、例えば表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）センサー、フラストレーション全反射（ＦＴＲ）センサー、及び導波管センサー、例えば反射干渉分光法（ＲＩｆＳ）センサーがある。圧電及び音波センサーには、表面音波（ＳＡＷ）及び水晶ミクロバランス（ＱＣＭ）センサーがある。
【００２４】
ＳＰＲ及びその他の検出技術に基づくバイオセンサーシステムは今日市販されている。代表的なかかるＳＰＲバイオセンサーには、フロースルーセルに基づくＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）及びＰｒｏｔｅＯｎ（商標）ＸＰＲシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）があり、試料中の分子と検知表面に固定化された分子構造との相互作用を検出するために表面プラスモン共鳴を使用する。試料がセンサー表面を通過する際、結合の進行は相互作用が起こる速度を直接反映する。試料の注入の後通常緩衝液流が続き、その間検出器の応答は表面上の複合体の解離速度を反映する。システムからの典型的な出力は、会合相部分と解離相部分を含む分子の相互作用の経時的進行を記述するグラフ又は曲線である。通常コンピュータースクリーン上に表示されるこの結合曲線は「センサーグラム」といわれることが多い。
【００２５】
従って、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムを用いて、標識化を使用せずに、また多くの場合関連する物質を精製することなく、試料中の特定の分子又は検体の存在と濃度ばかりでなく、分子の相互作用における会合（結合）と解離の動的速度定数及び表面相互作用に対する親和性を含めて追加の相互作用パラメーターも、リアルタイムで決定することが可能である。
【００２６】
以下では、限定ではなく例示のためのみに、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システム型のＳＰＲセンサーに関して本発明を詳細に説明する。
【００２７】
Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システム並びに類似のセンサーシステムは、検体の総濃度とは区別して活性検体濃度を測定する。用語「活性」について、測定される活性の種類を定めるのはセンサー表面上のリガンドの選択である。例えば校正曲線を用いる標準タンパク質濃度分析を使用してもよいが、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システム（及び類似のセンサーシステム）は、校正不要濃度分析（ＣＦＣＡ）といわれることが多い校正不要方法によるタンパク質（及びその他の巨大分子）濃度の評価を可能にする。
【００２８】
この方法は、一部又は全体的質量輸送の条件下様々な流量での表面に固定化された標的（リガンド）に対する検体の結合速度の変化に依拠しており、上述したように、目的の分子の分子質量が既知であれば既知濃度の標準を必要としない。かかる校正不要測定のより詳細な説明については、例えば、Ｓｉｇｍｕｎｄｓｓｏｎ，Ｋ．  ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６，８２６３−８２７６を参照し得る。
【００２９】
Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）機器、又は類似の機器で、試料は微小流システムに注入され、層流としてセンサー表面に輸送される。分子は拡散制御輸送過程によってバルク溶液からセンサー表面に到達する。輸送に影響を及ぼす要因として、検体分子の濃度に加えて、拡散係数、フローセル寸法及び流量がある。輸送速度と結合速度との間のバランスは、観察される結合が輸送制限されるか反応制限されるかを決定する。
【００３０】
ＣＦＣＡがうまくいくためには、観察される結合速度が少なくとも部分的に輸送により制限されなければならない。濃度は、少なくとも２つの異なる流量で結合実験を行い、そのデータを、この過程を記述するモデル、例えば二区画モデルにフィットさせることによって得られる（Ｍｙｓｚｋａ，Ｄ．Ｇ．，ら（１９９８）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７５，５８３−５９４、並びにＳｃｈａｎｋ−Ｒｅｔｚｌａｆｆ，Ｍ．Ｌ．及びＳｌｉｇａｒ，Ｓ．Ｇ．（２０００）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７２，４２１２−４２２０）。Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムに関する曲線のフィッティングについてのより総合的な説明は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を参照し得る。
【００３１】
制御された流れ系における表面に結合したリガンドへの検体の結合は２つの過程、すなわち表面への検体の輸送及びリガンドとの分子の相互作用の和によって表される。分子の相互作用は速度定数ｋa及びｋdによって記述され、一方検体の表面への輸送及び表面からの輸送は質量輸送定数ｋm及びｋ-m（ｋt及びｋ-tともいわれる）によって記述される。輸送現象は本質的に拡散制限過程であるので対称的であり、従ってｋm＝ｋ-mである。
【００３２】
従って、例えばＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）（又は類似の）システムを用いてタンパク質の活性濃度を決定するには、相互作用の相手が固定化された表面上に少なくとも二回タンパク質溶液を注入する。かかる実験から得られたセンサーグラムの結合相を質量移動期間と共に二分子相互作用モデルにフィットさせる。ここで、活性濃度がフィッティングされるパラメーターである。当て嵌めは全体的であるのが好ましい。すなわち、相互作用モデルを複数の結合曲線（センサーグラム）に同時にフィットさせる。このモデルでは、質量輸送係数の値を定数として導入する。これは、上記したように、フローセルの寸法、タンパク質の拡散係数及び使用した流量から計算し得る。
【００３３】
簡単にした形態で、結合したタンパク質によって与えられるセンサー表面における応答上昇ｄＲ／ｄｔは質量輸送定数ｋtと活性濃度に比例する。すなわち、
ｄＲ／ｄｔ＝ｋt×（活性濃度）          （２）
ｋtは定数×Ｍｗ×Ｄ2/3と書き直すことができ、ここでＭｗはタンパク質の分子量であり、Ｄはその拡散係数である。従って、
ｄＲ／ｄｔ＝定数×Ｍｗ×Ｄ2/3×（活性濃度）  （３）
拡散係数Ｄは分子の大きさ及び形状並びに当該溶媒の粘度によって与えられる摩擦抵抗の関数である。球状の分子の場合、拡散係数は半径に反比例し、従って分子量の立方根に比例する。しかしながら、タンパク質のような非常に大きい溶質分子の場合、拡散係数は分子量に対して比較的鈍感である。
【００３４】
タンパク質分子が集合して二量体、三量体などを形成するとき、センサー表面上の質量は変化しないが、Ｍｗ、Ｄ、Ｍｗ×Ｄ2/3及びモル濃度は変わる。サブユニットの数に伴うモル濃度の低下はＭｗ×Ｄ2/3の増大より大きいので、これらの物理的パラメーターに基づいてタンパク質単量体に対して決定される活性濃度は減少する。すなわち、例えば二量体又は三量体形態のタンパク質を含有する試料に対して決定される活性濃度は単量体形態のみを含有する試料に対して決定されるよりも低い。従って、活性濃度は「過小評価される」といえる。かかる過小評価の程度は試料中の多量体の組成に関連し得る。
【００３５】
これを以下の表１に示す。ここでは、濃度決定、及びその結果としての活性濃度の「過小評価」に対する全体的な効果を、タンパク質（Ｍｗ１２５００）及び二量体、三量体等、８個のサブユニットまでの多量体について計算した。この計算は、多量体の分子形状が単量体の分子と比べて変化せず、多量体の結合が質量輸送制限条件下で起こると仮定して行った。
【００３６】
【表１】
0005889793.tif 000002
これをさらに図１に図示する。図１は、タンパク質が多量体を形成するとき表面上の質量が変化しないが（固定化された相互作用の相手すなわちリガンドは図では省略されている）、積ＭｗＤ2/3は増大し、濃度は低下することを示している。
【００３７】
本発明に従って、多量体が形成されるとき上記のように測定される活性濃度の低下は多量体の検出のために、また多量体を含有する試料の組成を見出すために使用し得る。
【００３８】
本方法は、多量体がセンサー表面上のリガンドに対する結合能力を保持し、質量輸送制限の条件が維持される場合に使用することができるものと理解される。しかしながら、リガンドと単量体、及びリガンドと多量体の相互作用の動力学及び親和性が同じである必要はない。さらに、少なくとも単量体標準が入手可能であるべきである。
【００３９】
濃度の過小評価は次の場合に増大する。
・多量体の分子形状（分数の比ｆ／ｆ０として表される）が増大するとき。
・多量体の結合が質量輸送制限なしでおこる（ずっと弱い結合）とき。
・多量体が結合しないとき。
【００４０】
本発明によるタンパク質のような巨大分子の多量体の存在の決定は次のように実施し得る。
１．単量体の総濃度及び未知の組成の試料（多量体を含有する）の総濃度をそれぞれ決定する。これは通例、例えば２８０ｎｍでのＵＶ吸収分光法により達成し得る。
２．単量体の活性濃度及び多量体を含有する試料の活性濃度をそれぞれ決定する。
３．単量体の活性＝活性濃度／総濃度を計算する。
４．多量体を含有する試料の活性＝活性濃度／総濃度を計算する。
５．単量体の決定された活性と未知の組成の試料の決定された活性とを比較する（上記表１中最後の２つの欄参照）。
試料の組成は、単量体標準に加えて多量体標準も入手可能であれば、より高い精度で決定することができる。
【００４１】
簡単化した方法では、活性濃度の代わりに、相対的な活性を与える初期の結合傾きの値を使用することができる。
【００４２】
上述のように、「過小評価」の程度又は活性の低下を図２に示すように試料の組成と関連付けることも可能である。図は未知の試料の組成を分析し得る方法の一例を示している。
【００４３】
例えば、図２を参照して、単量体濃度の「過小評価」が約１０％であるならば、可能な試料組成は、試料が２つの成分、すなわち単量体と１つの形態の多量体を含有すると仮定すると、次のように考えることができる。
Ａ＝２８％の六量体、１００〜２８％の単量体、
Ｂ＝３３％の五量体、１００〜３３％の単量体、
Ｃ＝３６％の四量体、１００〜３６％の単量体、
Ｄ＝４４％の三量体、１００〜４４％の単量体、
Ｅ＝６８％の二量体、１００〜６８％の単量体。
【００４４】
以下の実施例で、（多量体の存在に関して）未知の組成の試料中の多量体の決定を示す１つの実験を説明する。
【実施例】
【００４５】
Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）３０００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用した。この機器では、微小流体システムで試料と流動緩衝液を４つの個別に検出されるフローセル（１つずつ、又は連続して）に通す。センサーチップとして、共有結合したカルボキシメチル変性デキストランポリマーヒドロゲルを有する金を被覆した表面を有するＳｅｒｉｅｓ  ＳセンサーチップＣＭ５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用した。計算には、機器専用のＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用した。
【００４６】
機器制御ソフトウェアを介した機器からの出力は、時間の関数としての検出器応答（「共鳴単位」、ＲＵで測定）のプロットである「センサーグラム」である。１０００ＲＵの上昇がおよそ１ｎｇ／ｍｍ2のセンサー表面上の質量の増大に対応する。
【００４７】
２つの抗体試料（ｉ）単量体の抗体を含有する試料、及び（ｉｉ）抗体の多量体の存在について「未知の組成」の試料を用意した。
【００４８】
両方の試料の総濃度は２８０ｎｍにおけるＵＶ吸収分光法で決定した。
【００４９】
次に、試料を２００倍に希釈し、抗ヒトＩｇＧがセンサーチップ上に固定化されているＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）３０００機器を用いて校正不要活性濃度分析（ＣＦＣＡ）により各々の試料の活性濃度を決定した。
【００５０】
抗体溶液を２つの流量、５及び１００μｌ／ｍｉｎで注入し、１：１結合モデルを使用し、活性濃度決定のための質量輸送期間でセンサーグラムを評価した。得られた全てのセンサーグラムのオーバーレイプロットを図３に示す。ここで、ｙ軸は応答（ＲＵ）であり、ｘ−軸は時間（秒）である。
【００５１】
ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ・ソフトウェアによるＣＦＣＡ−計算において、次の定数を使用した。いずれも抗体の単量体形態に関する。
Ｄ（２５℃）（ｍ2／ｓ）：４．５８Ｅ−１１
ｋm流５μｌ／ｍｉｎ（ＲＵ／Ｍ×ｓ）：１．６２Ｅ＋０９
ｋm流１００μｌ／ｍｉｎ（ＲＵ／Ｍ×ｓ）４．４０Ｅ＋０９。
【００５２】
結果を以下の表２に示す。
【００５３】
【表２】
0005889793.tif 000003
比較として、２つの試料の組成をＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）によるサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）でも分析した。結果を以下の表３に示す。
【００５４】
【表３】
0005889793.tif 000004
これらの結果によると、活性濃度の予想される％「過小評価」は１４％であり、これはＣＦＣＡで得られる値（１２．５％）より１．５％大きい。この不一致は幾つかの要因に依存し得る。１つの可能な理由は、分子形状の変化を考慮しなかったことであるかもしれない。
【００５５】
本発明は上記の好ましい実施形態に限定されない。様々な代替、改変及び均等物を使用し得る。従って、上記実施形態は特許請求の範囲に定義される本発明の範囲を限定するものではない。
【図１】
0005889793.tif 000005
【図２】
0005889793.tif 000006
【図３】
0005889793.tif 000007