(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイコバクテリアの増強された増殖の方法であって、マイコバクテリアを含有する試料を、５ｇ／Ｌ〜５０ｇ／Ｌの最終濃度で培地に供給されるα‐ケトグルタラートを含む有効量の添加剤を含有する培地に添加するステップと、該培地を前記マイコバクテリアの増殖に適した条件にさらすステップとを含み、前記添加剤は前記マイコバクテリアの増殖を増強させ、α‐ケトグルタラートを含まない培地に比べて、マイコバクテリアの増殖の検出時間を少なくとも２日低減させる、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記増強された増殖は、マイコバクテリア増殖の誘導期を少なくとも１日低減させる、方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の方法であって、前記培地のｐＨは、５．５〜７．５である、方法。    
【請求項４】
請求項１〜３の何れか一項に記載の方法であって、前記培地はさらに抗菌サプリメントを含み、該抗菌サプリメントは、１つまたは複数の抗菌物質を、前記培地において細菌、イースト菌またはカビ汚染を阻害するのに十分な量で含み、
前記１つまたは複数の抗菌物質は、１つまたは複数の抗生物質を含み、該１つまたは複数の抗生物質は、ポリミキシンＢ、バンコマイシン、アズロシリン、アムホテリシンＢ、ナリジクス酸、トリメトプリムおよびホスホマイシンからなる群より選択する、方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、前記抗菌サプリメントは、ポリミキシンＢ、アムホテリシンＢ、ナリジクス酸、トリメトプリムおよびホスホマイシンを含む、方法。
【請求項６】
マイコバクテリウム種による感染の有無を試験する方法であって、（ａ）培地を用意するステップと、（ｂ）栄養サプリメントを前記培地に添加するステップであって、前記栄養サプリメント添加物は５ｇ／Ｌ〜５０ｇ／Ｌの最終濃度で培地に供給されるα‐ケトグルタラートを含むステップと、（ｃ）前記マイコバクテリウム種の有無について決定する試料を添加するステップと、（ｄ）前記マイコバクテリウム種の存在について前記培地を分析するステップと、を含み、前記マイコバクテリウム種の存在の発見により、前記感染有りと判定する方法であって、前記α‐ケトグルタラートの添加は、α‐ケトグルタラートを含まない培地に比べて、マイコバクテリアの増殖の検出時間を少なくとも２日低減させる、方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、前記培地および栄養サプリメントは、マイコバクテリア増殖の誘導期を少なくとも１日低減させる、方法。
【請求項８】
請求項６又は７に記載の方法であって、前記培地はさらに抗菌サプリメントを含み、該抗菌サプリメントは前記試料をステップ（ｃ）で添加する前に添加する、方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、前記抗菌サプリメントは前記栄養サプリメントを使って懸濁し、前記栄養サプリメントで懸濁した抗菌サプリメントをステップ（ｂ）で前記培地に添加し、
前記抗菌サプリメントは、ポリミキシンＢ、バンコマイシン、アズロシリン、アムホテリシンＢ、ナリジクス酸、トリメトプリムおよびホスホマイシンからなる群より選択した１種または複数種の抗生物質を含む、方法。
【請求項１０】
培地内のマイコバクテリアの増殖を検出するキットであって、該キットは、（１）基本培地を含有する培養瓶と、（２）α‐ケトグルタラートを含む栄養サプリメントと、（３）前記培地内で汚染呼吸器内細菌叢の増殖を抑制する１つまたは複数の抗菌剤を含む抗菌サプリメントとを含む、前記栄養サプリメント中の前記α‐ケトグルタラートは、前記栄養サプリメントと前記抗菌サプリメントとを前記培養瓶に含有される前記基本培地と混合した後に最終濃度で５ｇ／Ｌ〜５０ｇ／Ｌとなる濃度であり、かつ、前記α‐ケトグルタラートの添加は、α‐ケトグルタラートを含まない培地に比べて、マイコバクテリアの増殖の検出時間を少なくとも２日低減させる、キット。
【請求項１１】
請求項１０に記載のキットであって、前記増強された増殖は、マイコバクテリア増殖の誘導期を少なくとも１日低減させることを含む、キット。
【請求項１２】
請求項１０又は１１に記載のキットであって、前記基本培地はＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ７Ｈ９である、キット。
【請求項１３】
請求項１０〜１２の何れか一項に記載のキットであって、前記基本培地は熱不安定性成分を含有せず、前記培養瓶および前記基本培地はオートクレーブによって滅菌済みである、キット。
【請求項１４】
請求項１０〜１３の何れか一項に記載のキットであって、前記抗菌サプリメントは、ホスホマイシンを含み、ポリミキシンＢ、バンコマイシン、アムホテリシンＢ、ナリジクス酸およびトリメトプリムをさらに含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００９年７月１日に出願された「マイコバクテリウムの増強された検出のための方法および培地（Method and Culture Medium for Enhanced Detection of Mycobacterium）」と題される米国仮特許出願第６１／２６９，９５２号の恩恵を主張するものであり、これを本明細書に援用する。
【０００２】
本発明は一般に、マイコバクテリウムの増強された検出のための培地および方法に関するものである。より具体的には、本発明は培地におけるマイコバクテリウムの増殖の検出時間（ＴＴＤ：time to detection）を向上すなわち低減させる培地および方法に対する種々の改善に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
マイコバクテリアは抗酸性、非運動性、グラム陽性桿菌と特徴付けられる細菌属である。この属には、マイコバクテリウム・アフリカヌム、マイコバクテリウム・アビウム、ウシ型結核菌、ウシ型結核菌−ＢＣＧ、マイコバクテリウム・ケロネー、マイコバクテリウム・フォーチュイタム、マイコバクテリウム・ゴルドナエ、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、カンサシ菌、ライ菌、ネズミ型結核菌、マイコバクテリウム・スクロフラセウム、ヨーネ菌およびヒト型結核菌を含む多くの種がある。マイコバクテリアの中には、人間にも動物にも病原性を持つものがあり、特にヒト型結核菌、ライ菌およびウシ型結核菌はそうである。その他のマイコバクテリア種は通常病原性はないが、たとえばＡＩＤＳ患者などの免疫低下状態の個体に日和見感染を引き起こす。例えば、カンサシ菌、マイコバクテリウム・アビウムおよびマイコバクテリウム・イントラセルラーレによる感染は、免疫系が抑制された、または免疫系が不全の患者に何らかの肺病を引き起こすことがある。実際、１９５３年以降マイコバクテリア感染の報告症例はアメリカ合衆国内において増加しており、これらの症例の多くはＡＩＤＳ感染症に関連するものである。
【０００４】
臨床種におけるマイコバクテリウム種の検出は、臨床診断ツールとして重要である。歴史的に、ヒト型結核菌はこの属において唯一の臨床的意義を持つ病原体であると考えられてきた。ヒト型結核菌の薬剤耐性菌株の発生率の上昇により、この種を検出する必要性がさらに強調された。結核は世界的な流行病のあらゆる主要特性を示す。現在結核は世界中で３５００万以上の人々を苦しめ、年間で４００万人以上が亡くなっている。よって結核は世界中が大きな関心を持つ問題である。結核は、マイコバクテリア科の抗酸性、グラム陽性の結核菌である、ヒト型結核菌、ウシ型結核菌、マイコバクテリウム・アフリカヌムおよびネズミ型結核菌によって引き起こされる。ヒト型結核菌のいくつかの局所的な病原体菌株は、インドのマドラスおよびその他の街の患者から分離されてきた。これは毒性菌株であるヒト型結核菌Ｈ３７Ｒｖとはいくつかの点で異なる。
【０００５】
しかしながらその他のマイコバクテリウム種も臨床的に重要である。これらは時折「ＭＯＴＴ:Mycobacterium other than tuberculosis:非結核性抗酸菌」と呼ばれ、一般にマイコバクテリウム・アビウム／イントラセルラーレ複合微生物（一般にＭＡＩＣと呼ばれる、マイコバクテリウム・アビウム、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、ヨーネ菌）、マイコバクテリウム・ゴルドナエ、マイコバクテリウム・フォーチュイタム、マイコバクテリウム・ケロネー、マイコバクテリウム・ムコゲニカムおよびマイコバクテリウム種の混合物が臨床検体に含まれる。例えば、マイコバクテリウム・アビウム複合体（ＭＡＣ:M. avium complex）細菌によって急増殖する日和見感染は、エイズおよびその他の免疫低下状態の個体に頻繁に発生することが証明されている。このような感染した個体では、少なくとも１０６ＭＡＣ細胞／ｍｌの唾液沈殿物が見つかっている。従って多くのマイコバクテリウム種を検出することのできる検出アッセイは臨床的に重要である。
【０００６】
試料内のマイコバクテリウム種の検出および同定の多くの臨床方法では、細菌の物理的特性（例えば細菌の抗酸染色および顕微鏡による検出）、生理学的特性（例えば合成培地での増殖）または生化学的特性（例えば膜脂質組成）の分析が必要とされる。これらの方法では、検出する試料内の細菌は比較的高い濃度でなければならず、これは臨床技師の経験や専門知識によるものであり、時間がかかるものである。というのもマイコバクテリウム種を体外で増殖させるのは大抵難しく、培地内で有用な密度に到達するには数週間かかり、これらの方法では患者の処置の遅れや、感染した個体の診断終了までの隔離に関連する費用が生じることもある。
【０００７】
マイコバクテリア一般と、特にヒト型結核菌およびウシ型結核菌とは、増殖の大変遅い偏好性微生物である。従来使用している培地でこれらの微生物を増殖させるには２〜３週間かかる。増殖を増強させて時間因子を低減させることのできる培地または物質を見つけるために、いくつかの試みが行われてきた。例えば、本明細書に参考として援用する米国特許第３，９３５，０７３号は、以下の栄養素を以下に示す量ずつ含有するマイコバクテリアを培養するための培養基を開示している。すなわち、かかる培養基は、７Ｈ９基礎培地０．４７％（メリーランド州コッキーズビレのＢＢＬマイクロバイオロジーシステムス社より入手、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、グルタミン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、ピリドキシン、クエン酸鉄アンモニウム、硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛、硫酸銅、ビオチンおよび塩化カルシウムを含有）、ウシ血清アルブミン０．５％、カゼイン加水分解物０．１％、カタラーゼ９６単位／バイアル、１４Ｃ標識基質２ｕＣｉ／バイアル、および培養基を２ｍｌとして、最終ｐＨ６．８±０．１に調整するための脱イオン水を含有する。
【０００８】
アルブミンはマイコバクテリアを増殖するための培地において、解毒剤として使用することができる。アルブミンはほぼ全ての動物組織および多くの野菜組織で見つかる単純タンパク質である。アルブミンは水溶性であり、熱で凝固する特徴がある。アルブミンは炭素、水素、窒素、酸素および硫黄を含有する。本発明の培養基のための好適なアルブミンは、ウシ血清アルブミンである。アルブミンは典型的に約０．１重量％〜約１０重量％のレベルで培養基に存在する。
【０００９】
しかしながら、遅い増殖速度や培地におけるマイコバクテリアの増殖のために富栄養培地が必要なことから、臨床試料（例えば、唾液、肺液、組織または糞便）からマイコバクテリアを検出することは依然として生物学の大きな課題である。この課題の１つの要因は、より急速に増殖する細菌が、対象とする増殖の遅いマイコバクテリア微生物を圧倒してしまい、そのためマイコバクテリアの検出を妨げる、または著しく妨害するという事実から生じる。数１０年にわたり、マイコバクテリア同定のために提出された診断用試料を除染する（すなわち、非マイコバクテリア微生物を死滅させる、または阻害する）ために、いくつかの技術が開発されてきた。これらの技術は、潜在的な汚染物質を死滅させるか、またはそれらの増殖が阻害されるかもしくは完全に妨害されるくらいにそれらを傷つけるものである。
【００１０】
従来マイコバクテリアの検査診断は、微生物の抗酸性染色および培養、その後の生化学分析に基づくものであった。マイコバクテリアの遅い増殖と長い世代時間の結果、従来の技術によるマイコバクテリアの正確な検査診断には６週間もかかることがある。ＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（登録商標）システム（バイオメリュー社）などの自動培養システムは、マイコバクテリアの同定にかかる時間を２週間まで低減させることができる。
【００１１】
本譲受人であるバイオメリュー社は、血液以外の臨床試料においてマイコバクテリアを検出するための培養ベースのシステムとして、ＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（登録商標）微生物検出システムに使用するプラスチック製のＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（登録商標）ＭＰ培養瓶を提供する。ＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（登録商標）微生物検出システムは、比色センサと反射光を利用して、培地に溶解した二酸化炭素（ＣＯ２）の存在と生成を監視するものである。試験試料にマイコバクテリアが存在する場合には、これらの微生物が培地の中で基質を代謝する際に二酸化炭素が生成される。マイコバクテリアの増殖によって二酸化炭素が生成されると、各培養瓶の底に設置されたガス透過性センサの色が青緑から黄色へと変化する。
【００１２】
ＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（登録商標）ＭＰ試薬システムは、ＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（登録商標）ＭＰ培養瓶、再構成液（ＲＦ）、ＭＢ／ＢａｃＴ抗菌サプリメント（ＭＡＳ）（以下従来の、または旧いＲＦ（すなわち従来の／旧いＲＦ）および従来の、または旧いＭＡＳ（すなわち従来の／旧いＭＡＳ）と呼ぶ）を含む。ＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（登録商標）ＭＰ培養瓶はプラスチック製の瓶であり、これはいくつかの培地の成分を含んでいる。再構成液（ＲＦ）はマイコバクテリアの増殖のための残りの栄養素を含み、ＭＡＳを再構成するために使用される。ＭＡＳは、唾液試料からの好ましくない呼吸器内細菌叢（respiratory flora）を抑制するために６つの抗菌剤で作られた、凍結乾燥粉末である。ＲＦおよびＭＡＳは、ＭＡＳキットとしてパッケージ化されている。それでもなおマイコバクテリアの正確な診断のために必要とされる時間をさらに削減するための必要性が、当技術分野には今なお存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】米国特許第３，９３５，０７３号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
従って本発明の主な目的は、臨床試料に存在するマイコバクテリウム種の増強された増殖および検出のための培地および方法を提供することである。本発明のさらなる目的は、マイコバクテリアの体外培養に適した、新規のマイコバクテリア培地を提供することである。本発明のまたさらなる目的は、前述の目的に従ってマイコバクテリア培地を提供することであり、この場合、汚染微生物の増殖は阻害される。
【００１５】
よって本明細書には、新規の培地処方と、新規の栄養サプリメント（ＮＳ：nutrient supplement）および新規のマイコバクテリア抗菌サプリメント（ＭＡＳ：MB BacT antibiotic supplement）と、マイコバクテリアの増殖および検出に思いがけない増強を示す製造工程の向上とを記載する。また本明細書にはマイコバクテリアの増強された増殖および検出の方法を記載する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は概してマイコバクテリウムの増殖および検出のための新規の培地に関するものである。さらに本発明は、臨床試料に存在するマイコバクテリウム種の広域スペクトルを検出する組成および診断方法を提供する。また本発明は、マイコバクテリアの増殖および検出の増強された検出時間（ＴＴＤ）を示す、新規の、そして向上されたＭＰシステムまたはキットにも関するものであり、このＭＰシステムまたはキットは、オートクレーブ可能なＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（商標登録）ＭＰ培養瓶と、栄養サプリメント（ＮＳ）と、新規のマイコバクテリア抗菌サプリメント（ＭＡＳ）とを備える。
【００１７】
一実施形態では、本発明はマイコバクテリアを培養する新規の培地に関し、培地は、（ａ）マイコバクテリアの増殖に適した基本培地と、（ｂ）１つまたは複数の栄養サプリメント添加剤と、（ｃ）向上された抗菌サプリメントとを含み、前記培地は前記マイコバクテリアの増殖を増強する。
【００１８】
別の実施形態では、本発明はマイコバクテリアの増強された増殖の方法に関し、本方法は、マイコバクテリアを含むと疑われる試料を有効量の１種または複数種の栄養添加剤を含有する培地に添加して、前記マイコバクテリアの増殖を増強するステップと、該培地を前記マイコバクテリアの増殖に適した条件にさらすステップとを含む。
【００１９】
本発明の別の実施形態はマイコバクテリウム種による感染の診断方法に関し、（ａ）培地を提供するステップと、（ｂ）該培地に栄養サプリメントを添加するステップであって、該栄養サプリメントは、前記マイコバクテリアの増殖を増強させるための１つまたは複数の栄養添加剤を含むステップと、（ｃ）前記マイコバクテリウム種の有無が決定される試料を添加するステップと、（ｄ）マイコバクテリウム種の存在について培地を分析するステップと、を含み、マイコバクテリウム種の存在の発見は前記感染の陽性診断を示す診断方法に関するものである。
【００２０】
さらに別の実施形態では、本発明は向上されたＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（登録商標）ＭＰ試薬システムまたはキットに関する。向上されたＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（登録商標）ＭＰ試薬システムまたはキットは、マイコバクテリアの増殖のための基本培地または水を含む、向上されたＭＰ培養瓶を含んでいる。随意に、新規のＭＰ培養瓶の培地または水は熱不安定性成分を含まず、よって新規のＭＰ培養瓶はオートクレーブ可能とすることができる。試薬システムまたはキットはさらに新規の栄養サプリメント（ＮＳ）および新規のマイコバクテリア抗菌サプリメント（ＭＡＳ）を含む。栄養サプリメント（ＮＳ）は、マイコバクテリアの増殖のための基本培地および／または１つまたは複数の炭素源、窒素源、糖類、塩類、栄養素、タンパク質類、アミノ酸類、脂肪酸類またはその他の栄養素を含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】脂肪酸の補給のある場合とない場合のヒト型結核菌の検出時間（ＴＴＤ）を示す箱髭図である。
【図１Ｂ】脂肪酸の補給のある場合とない場合のマイコバクテリウム・イントラセルラーレの検出時間（ＴＴＤ）を示す箱髭図である。
【図１Ｃ】脂肪酸の補給のある場合とない場合のマイコバクテリウム・アビウムの検出時間（ＴＴＤ）を示す箱髭図である。
【図２】α‐ケトグルタラートを使った場合と使わない場合のマイコバクテリア菌株の検出時間（ＴＴＤ）を示す箱髭図である。
【図３】アズロシリンを使った場合のマイコバクテリア菌株の検出時間（ＴＴＤ）を示す箱髭図である。
【図４】マイコバクテリア菌株の増殖に対するバンコマイシンの効果を示す箱髭図である。
【図５Ａ】種々のマイコバクテリア抗菌サプリメント（ＭＡＳ）処方を使った場合のヒト型結核菌１８２８３の検出時間（ＴＴＤ）を示す箱髭図である。
【図５Ｂ】種々のマイコバクテリア抗菌サプリメント（ＭＡＳ）処方を使った場合のヒト型結核菌２７２９４の検出時間（ＴＴＤ）を示す箱髭図である。
【図５Ｃ】種々のマイコバクテリア抗菌サプリメント（ＭＡＳ）処方を使った場合のマイコバクテリウム・アビウム５６９の検出時間（ＴＴＤ）を示す箱髭図である。
【図５Ｄ】種々のマイコバクテリア抗菌サプリメント（ＭＡＳ）処方を使った場合のマイコバクテリウム・イントラセルラーレ１３９５０の検出時間（ＴＴＤ）を示す箱髭図である。
【図５Ｅ】種々のマイコバクテリア抗菌サプリメント（ＭＡＳ）処方を使った場合のマイコバクテリウム・スクロフラセウム１９９８１の検出時間（ＴＴＤ）を示す箱髭図である。
【図５Ｆ】種々のマイコバクテリア抗菌サプリメント（ＭＡＳ）処方を使った場合のカンサシ菌１２４７８の検出時間（ＴＴＤ）を示す箱髭図である。
【図６】ヒト型結核菌複合体の増殖の検出時間（ＴＴＤ）に関して、以前のＭＡＳ処方と新規のマイコバクテリア抗菌サプリメント（ＭＡＳ）処方との比較を示す箱髭図である。
【図７】その他のマイコバクテリア菌株の増殖の検出時間（ＴＴＤ）に関して、以前のＭＡＳ処方と新規のマイコバクテリア抗菌サプリメント（ＭＡＳ）処方との比較を示す箱髭図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
適切な栄養条件および環境条件を提供することによる微生物の繁殖は周知である。適切な培養基または培養地は、培養する微生物が必要とする全ての栄養素を含んでいなくてはならない。例えば、典型的な微生物学的培地は、利用できる水源、炭素源、窒素源、ビタミン、カリウム、マグネシウム、カルシウム、鉄などの微量元素および硫黄、リンなどのミネラル類を含んでいなくてはならない。典型的にこれらの必要物は多くの源から供給される。適切な繁殖条件のその他の要因には、ｐＨ、温度、エアレーション、食塩濃度および培地の浸透圧がある。
【００２３】
さらに、特定の増殖要因が必要であることが知られている。増殖要因は有機化合物であり、これは増殖するために微生物が含んでいなければならないものであるが、合成することのできないものである。多くの微生物は、上述の栄養素が与えられると、彼らの原形質の全ての有機成分を合成することができ、これらの有機成分には、アミノ酸類、ビタミン類、プリン・ピリミジン類、脂肪酸類ならびにその他の化合物がある。これらの必須化合物の各々は酵素反応の個々のシーケンスによって合成され、各々の酵素は特異遺伝子の支配下で生成される。しかしながら、微生物の中には１つまたは複数のこれらの増殖要因を合成することができず、よって環境からその化合物を得なければならないものがある。必要とされる増殖要因としては、以下のものに限定しないが、アミノ酸類、ビタミン類、プリン・ピリミジン類、脂肪酸類、および増殖に必要なその他の化合物がある。
【００２４】
上述のように、本譲受人であるバイオメリュー社は、マイコバクテリウムの増殖および検出のための培養瓶（ＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（登録商標）ＭＰ処理瓶）の製造と販売を行っている。ＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（登録商標）ＭＰ処理瓶は、無菌体の検体および消化、除染された臨床検体からマイコバクテリアを回収して検出するためのＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（登録商標）またはＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（登録商標）３Ｄシステムで使用するためのものである。ＭＰ処理瓶は、ＭＢ／ＢａｃＴ（登録商標）抗菌サプリメント（ＭＡＳ）および／またはＭＢ／ＢａｃＴ（登録商標）再構成液（ＲＦ）（本明細書では従来の、または旧いＭＡＳおよび従来の、または旧いＲＦと呼ぶ）と共に使用することができる。
【００２５】
ＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（登録商標）ＭＰ使い捨て培養瓶は脱着可能な蓋を有し、およそ１０ｍｌの培地および微生物増殖の指標としての二酸化炭素を検出する内部センサを含む。培地処方は、精製水中のＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ９  Ｂｒｏｔｈ（０．４７％  ｗ／ｖ）、カゼインの膵臓消化物（０．１％  ｗ／ｖ）、ウシ血清アルブミン（０．５％  ｗ／ｖ）およびカタラーゼ（４８ｕ／ｍｌ）から構成される（本明細書では、従来の、または旧い培地と呼ぶ）。
【００２６】
従来の、または旧いＭＢ／／ＢａｃＴ（登録商標）抗菌サプリメント（従来の／旧いＭＡＳ）は、アムホテリシンＢ（０．０１８０％  ｗ／ｖ）、アズロシリン （０．００３４％  ｗ／ｖ）、ナリジクス酸（０．０４００％  ｗ／ｖ）、ポリミキシンＢ（１００００単位）、トリメトプリム（０．００１０５％  ｗ／ｖ）およびバンコマイシン（０．０００５％  ｗ／ｖ）を含有するように処方された凍結乾燥サプリメントである。
【００２７】
従来の／旧いＭＢ／ＢａｃＴ（登録商標）再構成液（従来の／旧いＲＦ）は、精製水中にオレイン酸（０．０５％  ｗ／ｖ）、グリセリン（５％  ｗ／ｖ）、アマランス（０．００４％）およびウシ血清アルブミン（１％  ｗ／ｖ）を含有する。再構成液（ＲＦ）およびＭＢ／ＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（登録商標）抗菌サプリメント（ＭＡＳ）は、ＭＰ瓶に添加することのできるサプリメントキットを含む。
【００２８】
本発明は、マイコバクテリウムの増殖を増強するための新規かつ改善された培地および方法に関するものである。本発明の培地および方法は、任意の、既知のマイコバクテリアの培養に使用することができ、マイコバクテリアとしては、以下のものに限定しないが、ヒト型結核菌、ウシ型結核菌、ネズミ型結核菌、マイコバクテリウム・アフリカヌム、マイコバクテリウム・カネッティ、マイコバクテリウム・アビウム、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、マイコバクテリウム・スクロフラセウム、カンサシ菌、マイコバクテリウム・マルモエンセ、マイコバクテリウム・ゼノピ、マイコバクテリウム・マリヌム、マイコバクテリウム・シミアエ、マイコバクテリウム・テラエ、マイコバクテリウム・ウルセランス、マイコバクテリウム・アブセサス、マイコバクテリウム・フォーチュイタム、マイコバクテリウム・ケローネおよびマイコバクテリウム・ゴルドネがある。本発明者は今回マイコバクテリアの増殖および検出に予測を超えた増強を示す新規の培地処方、新規の栄養サプリメント（本明細書では新ＮＳと呼ぶ）、新規の抗菌サプリメント（本明細書では新ＭＡＳと呼ぶ）処方、および製造工程の改善を発見した。
【００２９】
本発明によるＭＰシステムの新規の特徴には、（１）熱不安定性成分をＭＰ培地から栄養サプリメントへ移すことによって可能となるＭＰ瓶の最終滅菌、（２）新規の炭素源を使用することによる二酸化炭素生成の最適化、（３）栄養サプリメントの最適化、および／または（４）ＭＡＳ抗菌剤の最適化および／または抗菌剤の濃縮がある。これらの改善はマイコバクテリアの増殖と検出にいくつかの予測を超えた改善をもたらし、これらの改善には、（１）マイコバクテリアの増殖の検出時間（ＴＴＤ）に関するＭＰ瓶の性能の向上、（２）臨床的に意義のあるマイコバクテリアの回収の向上、（３）汚染呼吸器内細菌叢（ＣＲＦ）の飛躍的なの低減、および／または（４）偽陽性の最小化がある。付加的な向上には、ＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（登録商標）ＭＰ瓶を室温で保管および出荷することができるという製造工程の簡素化がある。
【００３０】
培地
一実施形態では、本発明の新規の培地はマイコバクテリアの増強された増殖を提供する。本明細書で使用する場合、「増強された増殖」とは、マイコバクテリアの増殖を本発明の培地および／またはサプリメントを使って、例えば培養瓶の中で、従来の培地を用いるよりも少なくとも約半日、少なくとも約１日、少なくとも約２日、少なくとも約３日、少なくとも約５日または少なくとも約７日早期に検出可能なことを意味する。つまり、マイコバクテリアの増殖を増強することによって、従来の培地におけるマイコバクテリアの増殖と比較して、増殖の検出時間（ＴＴＤ）を向上すなわち低減させることができる。本発明によれば、本発明の培地を使うと、従来の培地と比較してＴＴＤを少なくとも約半日、少なくとも約１日、少なくとも約２日、少なくとも約３日、少なくとも約５日または少なくとも約７日向上すなわち低減させることができる。一実施形態では、従来の培地は、上述のＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（登録商標）ＭＰ処理瓶（バイオメリュー社）の従来の／旧いＲＦおよび従来の／旧いＭＡＳを補給した従来の培地とすることができる。
【００３１】
別の実施形態では、本発明の新規の培地は、マイコバクテリアの増殖における誘導時間の減少を提供する。本明細書で使用する場合、「減少された誘導時間」とは、マイコバクテリウムが対数期増殖に入る前のインキュベーション、すなわち潜伏時間の減少を意味する。本発明によれば、本培地および／またはサプリメントは、従来の／旧い培地内のマイコバクテリウムの誘導期と比較すると、少なくとも約半日、少なくとも約１日、少なくとも約２日または少なくとも約３日の誘導時間の減少または低減をもたらす。一実施形態では、従来の／旧い培地は、上述のＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（登録商標）ＭＰ処理瓶（バイオメリュー社）の従来の／旧いＲＦおよび従来の／旧いＭＡＳを補給した従来の培地とすることができる。
【００３２】
本発明の培地は、液体栄養素培地すなわち栄養素ブロスを含む。本発明の培地すなわち栄養素ブロスは、典型的には１つまたは複数の既知の栄養素を含む。例えば培地は１つまたは複数の炭素源（例えばグリセリン）、窒素源（例えばアンモニア塩）、糖類、塩（例えばＫ＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｚｎ２＋）、栄養素および／または水を含有することができる。一実施形態では、本発明の培地は、Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ９を含む。上述のように、Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ９は、カリウム塩、ナトリウム塩、グルタミン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、ピリドキシン、クエン酸第二アンモニウム、硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛、硫酸銅、ビオチンおよび塩化カルシウムを含む。
【００３３】
本発明の培地は、マイコバクテリアの増殖の増強された検出を可能にする付加的な栄養素および／または成分をさらに含むことができる。本発明の培地に添加することのできる付加的な栄養素および／または成分としては、以下のものに限定しないが、タンパク質、アミノ酸、脂肪酸、細胞または植物抽出物および／またはその他の栄養素がある。例えば、本発明の培地は、カゼイン（例えば、カゼインの膵液消化物）、アルブミン（例えばウシ血清アルブミン）、カタラーゼおよび／またはアマランスをさらに含むことができる。一実施形態では、本明細書でさらに述べるように、これらの付加的な栄養素および／または成分は、マイコバクテリウムの有無の決定が所望される試料を培地に接種する前に基本培地に添加することのできる、別個の栄養サプリメントを含むことができる。
【００３４】
本発明によれば、培地瓶内でウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と結合する高レベルの短鎖脂肪酸および中鎖脂肪酸（例えば８以下の炭素原子を有する脂肪酸）は、偽陽性の表示(reading)をもたらすことがあることを発見した。よって、短鎖脂肪酸または中鎖脂肪酸の使用を避けることが好適である。例えば、本実施形態によれば、８以下の炭素原子を有する脂肪酸（例えばカプリル酸）の使用は避けるべきである。
【００３５】
しかしながら本発明者は、偽陽性を引き起こすこれらの試薬は、脂肪酸を含まないＢＳＡを使用し、そして培地処方に長鎖脂肪酸を補給することによって排除することができる、または著しく低減させることができることも発見した。従って、培地は脂肪酸を含まないＢＳＡ（ＦＡフリーＢＳＡ）および１つまたは複数の飽和または不飽和の長鎖脂肪酸またはその塩をさらに含むことができる。一実施形態では、１０以上の炭素原子を有する１つまたは複数の長鎖脂肪酸を使用するのが好適である。一般には任意の既知の長鎖脂肪酸を使用することができ、この長鎖脂肪酸としては、以下のものに限定しないが、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸およびそれらの塩がある。別の実施形態では、本明細書にさらに述べるように、脂肪酸は、瓶の培地から、試験試料を接種する前に培地に別途添加することのできる栄養サプリメントに移すことができることを発見した。本明細書に示すように（例えば実施例１および図１Ａ〜図１Ｃ参照）、脂肪酸を含まないＢＳＡの使用および長鎖脂肪酸の培地への補給は、ヒト型結核菌（図１Ａ参照）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（図１Ｂ参照）およびマイコバクテリウム・アビウム（図１Ｃ参照）の増殖および検出時間（ＴＴＤ）を２〜２．５日向上させることとなった。
【００３６】
本発明の一態様では、本発明の培地には１つまたは複数の既知の代謝経路基質すなわち中間体を補給することができる。本発明者は驚くことに、代謝経路基質（例えばα‐ケトグルタラート）を培地に含有させることによって、マイコバクテリアの増殖および検出を、代謝経路基質（例えばα‐ケトグルタラート）を含有しない培地と比較して増強させることができることを発見した。理論に縛られることを望むものではないが、代謝経路基質（例えばα‐ケトグルタラート）を培地内で使用すると、培地に存在するマイコバクテリアによる二酸化炭素の生成が増強されると考えられる。本実施形態によれば、クエン酸回路、解糖またはグリオキシル酸経路基質すなわち中間体を使用することができる。一実施形態では、二酸化炭素を生成する酵素の基質、共同因子またはそれらの中間体、前駆体もしくは誘導体を本発明で使用することができる。例えば、ピルビン酸、クエン酸、シス-アコニット酸、イソクエン酸、オキサロスクシナート、α‐ケトグルタラート、スクリニル‐ＣｏＡ、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、オキサロ酢酸などのクエン酸回路中間体が有用である。別の実施形態では、α‐ケトグルタラート、α‐ケトグルタラート前駆体および／またはα‐ケトグルタラート誘導体のうちの１つまたは複数を本発明の培地に含ませることができる。α‐ケトグルタラート前駆体または誘導体としては、以下のものに限定しないが、グルタミン酸、イソクエン酸、オキサロスクシナートまたはそれらの混合物がある。α‐ケトグルタラート、α‐ケトグルタラート前駆体および／またはα‐ケトグルタラート誘導体は、最終濃度約０．１ｇ／Ｌ〜約５０ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌまたは約１ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌで培地内に存在させることができる。一実施形態では、本明細書でさらに述べるように、α‐ケトグルタラート、α‐ケトグルタラート前駆体および／またはα‐ケトグルタラート誘導体は、培地に別途添加することのできる栄養サプリメント内に含ませることができる。
【００３７】
本発明のさらに別の態様では、本発明の培地はさらに１つまたは複数の抗菌剤または抗菌物質を含むことができる。抗菌薬は微生物の増殖を死滅、抑制、または阻害する薬剤または物質である。一般に、微生物の増殖を死滅、抑制または減速する薬物、化学薬品またはその他の物質などのような任意の既知の抗菌剤を使用することができる。有用な抗菌剤としては、以下のものに限定しないが、抗生物質、静菌剤、殺菌剤、抗菌薬、抗ウィルス剤、抗真菌剤、抗原虫剤および抗寄生虫剤がある。一般に抗菌剤は培地内に存在する汚染細菌の増殖を死滅、抑制または阻害するのに十分な量で使用する。例えば、当業者であれば理解できるように、培地における汚染呼吸器内細菌叢（ＣＲＦ）の増殖を阻害することは好適であろう。ＣＲＦはマイコバクテリアの増殖を妨げ、マイコバクテリアの増殖に必要な栄養素を枯渇させ、および／または偽陽性をもたらす。汚染呼吸器内細菌叢（ＣＲＦ）としては、以下のものに限定しないが、緑膿菌、黄色ブドウ球菌、カンジダ・アルビカンス、フェカリス菌、肺炎桿菌、人口呼吸器肺炎菌、カンジダ・トロピカリス、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（すなわちＭＲＳＡ）、バンコマイシン耐性腸球菌（すなわちＶＲＥ）がある。
【００３８】
抗菌薬は１つまたは複数の抗生物質または合成薬物とすることができ、これらは以下のものに限定しないが、ポリミキシンＢ、バンコマイシン、アズロシリン、アムホテリシンＢ、ナリジクス酸、トリメトプリムおよびホスホマイシンがある。好適な実施形態では、有用な抗生物質は、マイコバクテリアの増殖を抑制または阻害せずに汚染呼吸器内細菌叢（ＣＲＦ）を阻害する。
【００３９】
いくつかの実施形態では、抗菌サプリメントは１つまたは複数の抗真菌性抗生物質、グラム陰性抗生物質、グラム陽性抗生物質、１つの抗真菌性抗生物質および広域スペクトル抗生物質を含む。例えば、本発明の抗菌サプリメントは、抗真菌剤（例えばアムホテリシンＢ）、細胞膜透過性を変化させるグラム陰性抗生物質（例えばポリミキシンＢ）、ＤＮＡジャイレースを阻害する広域スペクトル抗生物質（例えばナリジクス酸）、化学療法剤（例えば、ジビロド葉酸還元酵素を阻害する薬剤（例えばトリメトプリム））およびエノールピルビン酸塩トランスフェラーゼを阻害する広域スペクトル抗生物質（例えばホスホマイシン）を含むことができる。一般に、任意の既知の抗真菌剤、グラム陰性抗生物質、広域スペクトル抗生物質、ＤＮＡジャイレースの抗生物質阻害剤または化学療法剤を本発明の実行で使用することができる。一実施形態では、抗菌サプリメントは、アムホテリシンＢ、ポリミキシンＢ、ナリジクス酸、トリメトプリムおよびホスホマイシンを含むことができる。
【００４０】
本明細書に示すように（例えば実施例３、４および図３、４を参照のこと）、バンコマイシンおよび／またはアズロシリンの使用によっていくつかのマイコバクテリア種の増殖を抑制、阻害または減速させることができる。よっていくつかの実施形態では、バンコマイシンおよび／またはアズロシリンの使用を避けることが好適である。本発明者は、アズロシリンおよびバンコマイシンの代わりにホスホマイシンを使うと、ＭＢ／ＢａｃＴ（登録商標）抗菌サプリメントと比較して、培地内でマイコバクテリアの増進と検出を増強させるために使用することのできる抗菌サプリメント（ＭＡＳ）を生成することができることを発見した。例えば、アズロシリンおよびバンコマイシンをホスホマイシンに代えることによって、新規のマイコバクテリア抗菌サプリメント（ＭＡＳ）は従来の／旧いＭＡＳ（例えば実施例５と図５Ａ〜５Ｆ参照）と比較して、マイコバクテリア増殖の検出時間（ＴＴＤ）を２〜９日間向上すなわち低減させることを発見した。従って、いくつかの実施形態では、ポリミキシンＢ、アムホテリシンＢ、ナリジクス酸、トリメトプリムおよびホスホマイシンの使用は好適である。これらの抗生物質は、培地に存在する汚染細菌の増殖を阻害するのに十分な量で使用することができる。例えば、培地はポリミキシンＢ約４００単位／ｍｌ〜約２０００単位／ｍｌ、アムホテリシンＢ約５０μｇ／ｍｌ〜約４００μｇ／ｍｌ、ナリジクス酸約１００μｇ／ｍｌ〜約１０００μｇ／ｍｌ、トリメトプリム約１０μｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌおよびホスホマイシン約１００μｇ／ｍｌ〜約１０００μｇ／ｍｌを最終濃度で含有することができる。一実施形態では、本明細書でさらに述べるように、これらの抗菌剤は、マイコバクテリウムの有無を決定することが所望される試料を培地に接種する前に基本培地に添加することのできる、別個のサプリメントを含むことができる。
【００４１】
本発明によれば、一実施形態では、本発明の培地は、Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ９、ウシ血清アルブミン、α‐ケトグルタラート、カゼイン、カタラーゼおよび／または水のうちの１つまたは複数を含むことができる。培地は、当業者にはマイコバクテリアの培養に恩恵のあるものとして知られる、１つまたは複数の付加的な栄養素および／または成分をさらに含むことができる。例えば、本発明の培地は、１つまたは複数の糖類または炭素源、窒素源、ミネラル類、塩類、アミノ酸類、ビタミン類、プリン・ピリミジン類、脂肪酸類、およびその他の化合物を付加的に含むことができる。別の実施形態では、本発明の培地は、Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ９、グリセリン、ステアリン酸（例えばステアリン酸ナトリウム）、ミリスチン酸（またはその塩）、パルミチン酸（例えばパルミチン酸ナトリウム）、オレイン酸（例えばオレイン酸ナトリウム）、ウシ血清アルブミン、カゼイン（例えばカゼインの膵液消化物）、カタラーゼ、ピルビン酸ナトリウム、α‐ケトグルタラート、アマランスおよび水を含む。
【００４２】
さらに別の実施形態では、培地はさらに１つまたは複数の抗菌剤（例えばホスホマイシン）を含む。例えば、培地は、ポリミキシンＢ、アズロシリン、バンコマイシン、アムホテリシンＢ、ナリジクス酸、トリメトプリムおよび／またはホスホマイシンのうちの１つまたは複数から選択した抗菌剤の混合物をさらに含むことができる。培地はポリミキシンＢ、アムホテリシンＢ、ナリジクス酸、トリメトプリムおよびホスホマイシンを含む抗生物質の混合物をさらに含むことができる。
【００４３】
さらにまた別の実施形態では、培地は約５．５〜約７．５ｐＨ、約６．０〜約７．０ｐＨ、または約６．５〜約７．０ｐＨに調整することができる。本発明によれば、本培地は従来の／旧いマイコバクテリア培地と比較すると、マイコバクテリア増殖の検出時間（ＴＴＤ）を少なくとも約０．５日、少なくとも約１日、少なくとも約２日、少なくとも約３日、少なくとも約５日または少なくとも約７日向上すなわち低減させる。
【００４４】
マイコバクテリアの増強された検出の方法
一般に、本発明は生体試料内に存在する１つまたは複数のマイコバクテリウムの増殖を検出する方法に関するものである。試験する試料には、マイコバクテリウムの存在が疑われる臨床試料と非臨床試料の両方が含まれる。試験する臨床試料には、典型的には臨床実験室で試験される任意のタイプの試料が含まれ、これらの試料としては、以下のものに限定しないが、血液、唾液、吸引液、スワッブおよびスワッブすすぎ液(swab rinsates)および体液などがある。一実施形態では、試料は無菌体の検体または消化、除染された臨床検体とすることができる。試験する非臨床試料は高度に可変性のある物質を含むことができ、この物質としては、以下のものに限定しないが、食品、飲料、医薬品、化粧品、水、空気、土、植物、血液製剤（血小板を含む）、ドナー臓器または組織試料などがある。
【００４５】
一態様では、本発明はマイコバクテリアの増強された増殖および／または検出の方法に関するものであり、本方法は、マイコバクテリアを含有すると疑われる試料を、該マイコバクテリアの増殖を増強するために、α‐ケトグルタラート、α‐ケトグルタラート前駆体および／またはα‐ケトグルタラート誘導体を含む有効量の添加剤を含有する培地に添加するステップと、この培地を前記マイコバクテリアの増殖に適した条件にさらすステップとを含む。私達は、α‐ケトグルタラート、α‐ケトグルタラート前駆体および／またはα‐ケトグルタラート誘導体を培地内で使用することにより、本発明の方法において、マイコバクテリアの増殖を、従来の（以前の）培地（すなわち、α‐ケトグルタラート、α‐ケトグルタラート前駆体または誘導体を含まない培地）を使用するよりも、少なくとも約半日、少なくとも約１日、少なくとも約２日、少なくとも約３日、少なくとも約５日または少なくとも約７日早く検出できることを思いがけなく発見した。実施例２と図２に示すように、α‐ケトグルタラートを含有する培地内のマイコバクテリア菌株の検出時間（ＴＴＤ）は、α‐ケトグルタラートを含有しない培地のＴＴＤと比較しておよそ２日間向上、すなわち低減された。
【００４６】
本発明はまたマイコバクテリウム種によって引き起こされる感染の診断方法にも関するものであり、本方法は、（ａ）培地を提供するステップと、（ｂ）該培地に栄養サプリメントを添加するステップであって、該栄養サプリメント添加剤は代謝経路基質（例えば、α‐ケトグルタラート、α‐ケトグルタラート前駆体および／またはα‐ケトグルタラート誘導体）を含むステップと、（ｃ）前記マイコバクテリウム種の有無が決定される試料を添加するステップと、（ｄ）前記マイコバクテリウム種の存在について前記培地を分析するステップと、を含み、前記マイコバクテリウム種の存在の発見は前記感染の陽性診断を示す。上述のように、α‐ケトグルタラート、α‐ケトグルタラート前駆体またはα‐ケトグルタラート誘導体の培地での使用により、本発明の方法において、ＴＴＤを少なくとも約半日、少なくとも約１日、少なくとも約２日、少なくとも約３日、少なくとも約５日または少なくとも約７日低減させることができる。本方法によれば、栄養サプリメント（ＮＳ）には随意に脂肪酸を含まないＢＳＡを使用してもよく、ＮＳは１つまたは複数の長鎖脂肪酸（例えば、１０以上の炭素元素を有する脂肪酸）をさらに含むことができる。私達は、脂肪酸を含まないＢＳＡと１つまたは複数の長鎖脂肪酸をＮＳで使用すると、偽陽性の表示（readings）の著しい低減がもたらされることを発見した。さらに本明細書に示すように（実施例１および図１Ａ〜１Ｃ参照）、脂肪酸を含まないＢＳＡの使用および長鎖脂肪酸の培地への補給は、ヒト型結核菌（図１Ａ参照）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（図１Ｂ参照）およびマイコバクテリウム・アビウム（図１Ｃ参照）の増殖および検出の検出時間（ＴＴＤ）を２〜２．５日向上させることとなった。
【００４７】
別の実施形態では、本発明はマイコバクテリア培地内の細菌汚染を阻害する方法に関するものであり、本方法は、マイコバクテリアの増殖に適した条件において、汚染細菌の増殖を阻害するのに十分な量のホスホマイシンを含む培地内でマイコバクテリアを含有すると疑われる試料を培養するステップを含む。本方法によれば、１つまたは複数の抗菌剤または抗菌物質を、試験される生体試料を接種する前または接種と同時に培地に添加することができる。続いて、培地および試料を十分な時間、十分な温度で培養して、試験試料内に存在するマイコバクテリアの増殖および検出を可能にする。別の実施形態では、１つまたは複数の抗菌薬をマイコバクテリア抗菌サプリメント（ＭＡＳ）に含めることができ、このサプリメントは、培地へ試験される試料を接種する前または接種と同時に基本培地に添加することができる。上述のように、ＭＡＳはポリミキシンＢ、アムホテリシンＢ、ナリジクス酸、トリメトプリムおよびホスホマイシンのうちの１つまたは複数を含むことができる。
【００４８】
さらにまた別の実施形態では、本発明は、向上されたＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（登録商標）ＭＰ試薬システムまたはキットを生体試料内に存在するマイコバクテリアの増殖および／または検出に使用する方法に関するものである。本実施形態によれば、本明細書にさらに詳しく説明するように、向上されたＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（登録商標）ＭＰ試薬システムは、マイコバクテリア増殖のための基本培地を含む向上されたＭＰ培養瓶、新規の栄養サプリメント（ＮＳ）および新規のマイコバクテリア抗菌サプリメント（ＭＡＳ）を含む。栄養サプリメント（ＮＳ）および／またはマイコバクテリア抗菌サプリメント（ＭＡＳ）は、マイコバクテリアの存在について試験される生体試料を培地に接種する前または接種と同時に基本培地に添加することができる。接種された瓶は十分な時間、十分な温度で培養し、生体試料内に存在するマイコバクテリアの増殖および／または検出を可能にする。一実施形態では、新規のＭＰ培養瓶の培地は熱不安定性成分を含まないので、新規のＭＰ培養瓶をオートクレーブ可能にすることができる。
【００４９】
ＭＰ試薬キット
一態様では、本発明はマイコバクテリアの増強された増殖および検出のためのＭＰ試薬キットに関するものである。ＭＰ試薬キットは基本マイコバクテリウム培地を有する培養瓶、栄養サプリメント（ＮＳ）および／またはマイコバクテリア抗菌サプリメント（ＭＡＳ）を含む。
【００５０】
培養瓶
一実施形態では、本発明は新規かつ改善されたマイコバクテリウム培地を含む瓶または容器（すなわち培養瓶）に関する。一般に、培養瓶は当技術分野において周知である任意の設計またはサイズとすることができ、マイコバクテリアの増殖および／または検出に恩恵のある任意の既知の培地を含むことができる。一実施形態では、培養瓶はＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ９ブロスおよび／または水を基本培地として含む。従来の（以前の）ＭＰ瓶は、マイコバクテリウムの増殖および検出のために、約６．８ｐＨの液体培地を使用する。同様に、新規かつ改善されたＭＰ培養瓶は液体すなわちブロス基本培地を有し、基本培地には、新規の栄養サプリメントおよび／または新規のマイコバクテリア抗菌サプリメント（ＭＡＳ）を添加することができる。培地は約５．５〜約７．５ｐＨ、約６．０〜約７．０ｐＨまたは約６．５〜約７．０ｐＨに調整することができる。別の実施形態では、ＭＰ培養瓶の培地のｐＨは約６．８である。
【００５１】
本発明者は驚くことに、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシ肝臓カタラーゼおよび／またはカゼインを含む特定の増殖栄養素を培地瓶から取り除くことにより、その瓶を最終滅菌することができることを発見した。例えば、熱不安定性成分を取り除くことにより、瓶をオートクレーブすることができる。瓶の最終滅菌に関する向上には、向上された保管と出荷がある。例えば、最終滅菌された瓶（例えばオートクレーブされた瓶）は室温で保存と出荷を行うことができ、著しいコスト削減をもたらす。この最終滅菌された瓶はさらに貯蔵寿命の向上および／または滅菌レベル（ＳＡＬ）の増大をもたらす。
【００５２】
栄養サプリメント（ＮＳ）
本発明はまた、マイコバクテリアの増殖および検出を増強させるために本発明の培養瓶に添加することのできる、向上された栄養サプリメント（ＮＳ）に関するものである。一般に栄養サプリメント（ＮＳ）は、マイコバクテリアを増殖させるための基本培地を含有する培養瓶に、該瓶および培地にマイコバクテリウムの存在の検出が所望される試料を接種する前に添加する。
【００５３】
本発明の向上された栄養サプリメント（ＮＳ）は、マイコバクテリアの増殖に恩恵のある任意の、既知の栄養素またはサプリメントを含むことができる。例えば栄養サプリメントは１つまたは複数の炭素源、窒素源、糖類、塩類、栄養素、タンパク質類、アミノ酸類、脂肪酸類および／または当業者に周知のその他の栄養素を含むことができる。
【００５４】
本発明によれば、一実施形態では、栄養サプリメントはさらに、α‐ケトグルタラート、α‐ケトグルタラート前駆体および／またはα‐ケトグルタラート誘導体を含む。一般に、任意の既知のα‐ケトグルタラート前駆体または誘導体を使用することができ、これらには、以下のものに限定しないが、グルタミン酸、イソクエン酸、オキサロスクシナートまたはそれらの混合物がある。α‐ケトグルタラート、α‐ケトグルタラート前駆体および／またはα‐ケトグルタラート誘導体は、培養瓶の培地に添加した後に、α‐ケトグルタラート、α‐ケトグルタラート前駆体および／またはα‐ケトグルタラート誘導体の最終濃度が約０．１ｇ／Ｌ〜約５０ｇ／Ｌとなるように、十分な量で栄養サプリメントに存在することができる。
【００５５】
本発明の別の実施形態によれば、栄養サプリメントは１つまたは複数の飽和または不飽和長鎖脂肪酸またはその塩をさらに含むことができる。一実施形態では、１０以上の炭素原子を有する１つまたは複数の長鎖脂肪酸を利用することが好適である。一般に、任意の、既知の長鎖脂肪酸を使用することができ、これらには、以下のものに限定しないが、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸およびそれらの塩がある。別の実施形態では、短鎖または中鎖の脂肪酸を使用することは避けることが好適である。例えば、本実施形態によれば、８以下の炭素原子を有する脂肪酸（例えばカプリル酸）の使用は避けるべきである。
【００５６】
別の態様では、上述のように、本発明の栄養サプリメントでは、脂肪酸を含まないウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用することが好適である。先にも述べたように、脂肪酸を含まないＢＳＡの使用は、試薬に基づく偽陽性を大幅に低減または削減させることができる。
【００５７】
一実施形態では、栄養サプリメント（ＮＳ）はグリコール、１つまたは複数の長鎖脂肪酸、脂肪酸を含まないウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼインの膵液消化物、ピルビン酸ナトリウム、アマランスおよびα‐ケトグルタラートを含む。栄養サプリメントは基本培地と共に培養瓶に添加することができる、または、試験試料の接種のすぐ前に培養瓶に添加することができる。あるいは、栄養サプリメントはマイコバクテリア抗菌サプリメント（ＭＡＳ）を再懸濁するために使用することができ、その後に培地瓶に添加する。
【００５８】
マイコバクテリア抗菌サプリメント（ＭＡＳ）
本発明は、マイコバクテリアの増殖と検出を増強するために本発明の培養瓶に添加することのできる、向上されたマイコバクテリア抗菌サプリメント（ＭＡＳ）にも関するものである。本発明者は、培地においてマイコバクテリアの増殖を増強させる、向上されたマイコバクテリア抗菌サプリメント（ＭＡＳ）を開発した。向上されたＭＡＳは、マイコバクテリアの増殖を抑制または阻害せずに、汚染呼吸器内細菌叢（ＣＲＦ）の増殖を抑制または阻害するのに効果的である。汚染呼吸器内細菌叢（ＣＲＦ）としては、以下のものに限定しないが、緑膿菌、黄色ブドウ球菌、カンジダ・アルビカンス、フェカリス菌、肺炎桿菌、人口呼吸器肺炎菌、カンジダ・トロピカリス、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）がある。一実施形態では、マイコバクテリア抗菌サプリメント（ＭＡＳ）は、マイコバクテリアの基本培地を含む培養瓶に、該瓶と培地にマイコバクテリウムの存在の検出が所望される試料を接種する前に、直接添加することができる。別の実施形態では、栄養サプリメント（ＮＳ）は、培地瓶に添加する前に、抗菌サプリメント（ＭＡＳ）を再懸濁するために使用することができる。
【００５９】
一般に、任意の既知の抗菌剤または抗菌物質を使用することができ、これには、以下のものに限定しないが、抗生物質、静菌剤、殺菌剤、抗菌薬、抗ウィルス剤、抗真菌剤、抗原虫剤および／または抗寄生虫剤がある。しかしながら好適な抗菌剤には、マイコバクテリアの増殖を抑制または阻害せずに汚染呼吸器内細菌叢（ＣＲＦ）の増殖を抑制または阻害する任意の抗菌剤がある。一実施形態では、ＭＡＳは１つまたは複数の抗菌薬を前記培地の細菌汚染を阻害するのに十分な量で含む。
【００６０】
別の実施形態では、本発明の培地は１つまたは複数の抗生物質を含む。有用な抗生物質には例えば、ＣＲＦの増殖を抑制する抗生物質があり、これには、以下のものに限定しないが、ポリミキシンＢ（ＰＯＬＹ  Ｂ）、バンコマイシン（ＶＡＮ）、アズロシリン（ＡＺＬ）、アムホテリシンＢ（ＡＭＰ  Ｂ）、ナリジクス酸（ＮＡ）、トリメトプリム（ＴＭＰ）およびホスホマイシン（ＦＯＳ）がある。マイコバクテリア感染の治療に使用される抗生物質で、マイコバクテリアの増殖を死滅、抑制または阻害するものは、本発明の抗菌サプリメントでは有用でなく、これには、例えば、イソニアジド、リファンピン、ピラジナミド、ストレプトマイシンおよびエタンブトールがある。先にも述べたように、本譲受人は、ＭＢ／ＢａｃＴ（登録商標）抗菌サプリメントの市販および販売を行っており、このサプリメントはアムホテリシンＢ（０．０１８０％  ｗ／ｖ）、アズロシリン（０．００３４％  ｗ／ｖ）、ナリジクス酸（０．０４００％  ｗ／ｖ）、ポリミキシンＢ（１００００単位）、トリメトプリム（０．００１０５％  ｗ／ｖ）およびバンコマイシン（０．０００５％  ｗ／ｖ）を含有するように処方された凍結乾燥サプリメントである。しかしながら本発明者は、従来の（以前の）ＭＢ／ＢａｃＴ（登録商標）抗菌サプリメントと比較して、ホスホマイシンをアズロシリンとバンコマイシンの代わりに補給すると、培地においてマイコバクテリアの増強された増殖と検出のために使用することのできる抗菌サプリメント（ＭＡＳ）を生成することができることを思いがけずに発見した。
【００６１】
よって一実施形態では、向上されたマイコバクテリア抗菌サプリメント（ＭＡＳ）は、アムホテリシンＢ（ＡＭＰ  Ｂ）、ポリミキシンＢ（ＰＯＬＹ  Ｂ）、トリメトプリム（ＴＭＰ）、ナリジクス酸（ＮＡ）およびホスホマイシン（ＦＯＳ）を含有するように処方された凍結乾燥サプリメントを含む。マイコバクテリア抗菌サプリメント（ＭＡＳ）は、最終培地がポリミキシンＢ約４００単位／ｍｌ〜約２０００単位／ｍｌ、アムホテリシンＢ約５０μｇ／ｍｌ〜約４００μｇ／ｍｌ、ナリジクス酸約１００μｇ／ｍｌ〜約８００μｇ／ｍｌ、トリメトプリム約１０μｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌおよびホスホマイシン約１００μｇ／ｍｌ〜約１０００μｇ／ｍｌの最終濃度を含有するように処方することができる。
【００６２】
またさらに別の実施形態では、栄養サプリメント（ＮＳ）および抗菌サプリメント（ＭＡＳ）は、最終滅菌された培地瓶に添加することのできる、別個のキットを形成することができる。本実施形態では、ＮＳ／ＭＡＳキットは、ＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ  ＭＰ瓶の添加剤として、別途市販および販売を行うことができる。
【００６３】
下記の実施例は本発明のさらなる特徴を説明するものであるが、本発明の範囲を制限することを何ら意図するものではない。
【実施例】
【００６４】
実施例１：脂肪酸の補給のある場合とない場合の種々のマイコバクテリア菌株のＴＴＤ
長鎖脂肪酸（ＦＡ）のマイコバクテリアの増殖に対する効果を評価するために、脂肪酸を含まない（ＦＡＦ）ＢＳＡをＰｒｏｌｉａｎｔ社（アイオワ州エームズ）から選択した。５つの長鎖脂肪酸、すなわちミリスチン酸（Ｃ１４：０）、パルミチン酸（Ｃ１６：０）、ステアリン酸（Ｃ１８：０）、オレイン酸（Ｃ１８：１）およびリノール酸（Ｃ１８：２）を、ＦＡプロファイルおよび増殖能力に基づき、可能なＦＡサプリメントとして認定した。ＦＡＦ  ＢＳＡを補給したサプリメントの新規の処方を調製し（新規のサプリメント処方については表１を参照のこと）、５つのＦＡの補給のある場合とない場合とで試験を行った。ＦＡ補給の目標レベルは、過去の評価から得られたＦＡ含有量に基づく。使用したＦＡＦ  ＢＳＡの濃度は１０ｇ／Ｌだった。新規のサプリメントの濾過中のＦＡの損失は、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）の分析によって決定した。０．４５μｍフィルタで濾過した後のＦＡの回収率は８０％超と観察された。この処方の分析により、高レベルのＢＳＡはＦＡの溶解化とＢＳＡ-ＦＡ結合による安定性を増強させることが証明された（データは示さず）。また分析により、ＢＳＡの含有量が下がると、ＦＡの結合が弱くなり、濾過中のＦＡ損失が増えることが証明された。
【００６５】
新規のオートクレーブ可能な培養瓶は、従来の（以前の）瓶に存在する培地の熱不安定性成分を従来の（以前の）ＲＦに移すことによって考案した。新規のオートクレーブ可能な培養瓶はＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ９を含む。新規のＲＦサプリメントは、従来の、または旧いＲＦの組成を使って調製したが、以前のＭＰ瓶処方から移された熱不安定性成分に適合させるために変更を加えた。下記の表１は新規の、オートクレーブ可能なＭＰ瓶（上述のような）および新規のサプリメントの組成を示す。この新規のサプリメントで使用するＢＳＡは、従来の（以前の）ＲＦで使用した従来のＢＳＡではなく、脂肪酸を含まない（ＦＡＦ）ＢＳＡ（Ｐｒｏｌｉａｎｔ社、アイオワ州エームズ）だった。
【００６６】
【表１】
0005879261.tif 000002
新規のＭＰ瓶および新規のサプリメント処方
【００６７】
増殖能力については、５つの微生物（ヒト型結核菌、マイコバクテリウム・アビウムおよびマイコバクテリウム・イントラセルラーレ）を試験した。従来のＭＡＳ処方をこれらの実験に使用した。ＦＡ補給のある場合とない場合の新規のサプリメントおよび従来の（以前の）ＲＦを、従来の（以前の）ＭＢ／ＢａｃＴ抗菌サプリメント（従来の（以前の）ＭＡＳ）（バイオメリュー社）の凍結乾燥粉末の再水和に使用した。従来の（以前の）ＭＡＳは、ポリミキシンＢ（ＰＯＬＹ  Ｂ）１０００単位／ｍｌ、アムホテリシンＢ（ＡＭＰ  Ｂ）１８０μｇ／ｍｌ、ナリジクス酸（ＮＡ）４００μｇ／ｍｌ、トリメトプリム（ＴＭＰ）１０．５μｇ／ｍｌ、アズロシリン（ＡＺＬ）３４μｇ／ｍｌおよびバンコマイシン（ＶＡＮ）５μｇ／ｍｌを含有する。
【００６８】
新規のサプリメントに関しては、新規の、オートクレーブ可能なＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（登録商標）ＭＰ瓶（上述のような）を使用し、従来の（以前の）ＲＦに関しては、従来の（以前の）ＭＰ瓶を使用した。新規の、および従来の（以前の）ＭＰ培養瓶（バイオメリュー社）にマイコバクテリア培地を接種する前に、ＦＡの補給のある、またはない新規のサプリメント０．５ｍｌまたは従来の（以前の）ＲＦ０．５ｍｌを、ＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（登録商標）ＭＰ培養瓶の１つめのセットに添加した。（ＦＡの補給のある、またはない新規のサプリメントおよび従来の（以前の）ＲＦを使って）再水和した従来のＭＡＳをＭＰ培養瓶の２つめのセットに添加した。およそ０．５×１０３ＣＦＵ／ｍｌを接種した後、マイコバクテリウム・アビウム、マイコバクテリウム・イントラセルラーレおよびヒト型結核菌の培地に関して、これらの瓶内の増殖（増殖のＴＴＤ）を比較した。Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ１０寒天平板を使ってコロニー数の計数も行い、培地の接種量と純度を検証した。接種されたＭＰ瓶は、ＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（登録商標）３Ｄ（バイオメリュー社）ノンロッキングシステムに３５〜３７℃で３５日間装填した。ＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（登録商標）装置によって瓶が陽性であると示されると、検出時間（ＴＴＤ）データを収集した。結果を表２および図１Ａ〜図１Ｃに示す。
【００６９】
【表２】
0005879261.tif 000003
ヒト型結核菌、マイコバクテリウム・イントラセルラーレおよびマイコバクテリウム・アビウムのＴＴＤ結果
【００７０】
図１Ａは、長鎖脂肪酸の補給のある場合とない場合のＦＡを含まない（ＦＡＦ）ＢＳＡを含有する培地におけるヒト型結核菌のＴＴＤ結果を示す。図１Ａに示すように、ＦＡの補給のないＢＳＡを含有する試料と比較して、ＦＡを補給したＦＡを含まないＢＳＡを含有する試料にはＴＴＤの低減が見られた。
【００７１】
図１Ｂは、長鎖脂肪酸の補給のある場合とない場合のＦＡを含まない（ＦＡＦ）ＢＳＡを含有する培地におけるマイコバクテリウム・イントラセルラーレのＴＴＤ結果を示す。図１Ｂに示すように、ＦＡの補給のないＢＳＡを含有する試料と比較して、ＦＡを補給したＦＡを含まないＢＳＡを含有する試料にはＴＴＤの低減が見られた。
【００７２】
図１Ｃは、長鎖脂肪酸の補給のある場合とない場合のＦＡを含まない（ＦＡＦ）ＢＳＡを含有する培地におけるマイコバクテリウム・アビウムのＴＴＤ結果を示す。図１Ｃに示すように、ＦＡの補給のないＢＳＡを含有する試料と比較して、ＦＡを補給したＦＡを含まないＢＳＡを含有する試料にはＴＴＤの低減が見られた。
【００７３】
この結果によって、マイコバクテリア抗菌サプリメント（ＭＡＳ）と新規の栄養サプリメント（ＮＳ）の存在する場合には、ヒト型結核菌、マイコバクテリウム・イントラセルラーレおよびマイコバクテリウム・アビウムのＴＴＤに２〜２．５日の向上のあることが証明された。上述のように、新規のＮＳは、脂肪酸を含まないＢＳＡおよび補給された長鎖脂肪酸を含む。
【００７４】
実施例２：α‐ケトグルタラートを使った場合と使わない場合のマイコバクテリア菌株のＴＴＤ
マイコバクテリアのＴＴＤをさらに向上させるために、マイコバクテリア細胞経路内の二酸化炭素生成酵素の基質および／または補因子をさらなる研究のために選択した。これらの基質および／または補因子には、α‐ケトグルタラート、イソクエン酸、Ｌ‐リンゴ酸、オキサロ酢酸、乳酸およびＬ‐アルギニンがある。ＦＡを含む新規のサプリメントを上述のように調製し、フィルタ滅菌した。基質を新規のサプリメントに異なる濃度で添加した。
【００７５】
４種のマイコバクテリアを０．５×ｌ０３ＣＦＵ／ｍｌで試験した。α‐ケトグルタラートの異なる濃度の効果を、マイコバクテリウム・アビウム、マイコバクテリウム・イントラセルラーレおよびヒト型結核菌の培地の増殖（増殖のＴＴＤ）に関して調べた。新規の、オートクレーブ可能なＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（登録商標）ＭＰ培養瓶を使用した（上述に示す）。ＭＰ培養瓶にマイコバクテリア培地を接種する前に、様々な量のα‐ケトグルタラートを含む新規のサプリメント５ｍｌを新規のＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（登録商標）ＭＰ培養瓶に添加した。Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ１０寒天平板を使ってコロニー数の計数も行い、培地の接種量と純度を検証した。接種されたＭＰ瓶は、ＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（登録商標）３Ｄノンロッキングシステムに３５〜３７℃で３５日間装填した。ＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（登録商標）装置によって瓶が陽性であると示されると、検出時間（ＴＴＤ）データを収集した。
【００７６】
５ｇおよび１５ｇ／Ｌの２つの濃度のα‐ケトグルタラートを含む主要なマイコバクテリア種のＴＴＤの結果を表３および図２に示す。表３および図２は、α‐ケトグルタラート（５ｇ／Ｌまたは１５ｇ／Ｌ）を培地に添加することにより、α‐ケトグルタラートを含有しない培地と比較して、マイコバクテリウム・アビウム、マイコバクテリウム・イントラセルラーレおよびヒト型結核菌の培地における増殖の検出時間（ＴＴＤ）がおよそ２日間低減されたことを示している。
【００７７】
異なる濃度のイソクエン酸、Ｌ‐リンゴ酸、オキサロ酢酸、乳酸およびＬ‐アルギニンを使って同様の実験を行った。しかしながら、α‐ケトグルタラートとは異なり、これらのその他の基質はＴＴＤの低減は示さなかった（データは示さず）。
【００７８】
【表３】
0005879261.tif 000004
α‐ケトグルタラートを使った場合と使わない場合のマイコバクテリア種のＴＴＤ
【００７９】
実施例３:従来のＭＡＳを使った場合のマイコバクテリア種のＴＴＤ
ポリミキシンＢ（ＰＯＬＹ  Ｂ）、アムホテリシンＢ（ＡＭＰ  Ｂ）、ナリジクス酸（ＮＡ）、トリメトプリム（ＴＭＰ）、アズロシリン（ＡＺＬ）およびバンコマイシン（ＶＡＮ）を含む６つの薬物の効果を研究することによって、マイコバクテリアの増殖に対する従来のＭＡＳの有効性を決定した。これらの研究はまた、マイコバクテリアの増殖に悪影響を及ぼす薬物とその濃度を同定するためにも行った。
【００８０】
増殖能力に関して、従来の（以前の）ＲＦを調製し、濃度の異なる６つの抗菌薬を添加した。濃度は従来のＭＡＳの濃度よりも２５〜５０％高いか、または低いレベルに選択した。従来のＭＡＳの濃度は、ポリミキシンＢ（ＰＯＬＹ  Ｂ）１０００単位／ｍｌ、アムホテリシンＢ（ＡＭＰ  Ｂ）１８０μｇ／ｍｌ、ナリジクス酸（ＮＡ）４００μｇ／ｍｌ、トリメトプリム（ＴＭＰ）１０．５μｇ／ｍｌ、アズロシリン（ＡＺＬ）３４μｇ／ｍｌ、バンコマイシン（ＶＡＮ）５μｇ／ｍｌである。
【００８１】
アズロシリンを使って、培地内におけるマイコバクテリウム・イントラセルラーレ、カンサシ菌、マイコバクテリウム・スクロフラセウムおよびヒト型結核菌の増殖（増殖のＴＴＤ）を決定した。唾液試料（汚染呼吸器内細菌叢すなわちＣＲＦと呼ばれる）に存在するグラム陽性菌、グラム陰性菌および酵母菌の抑制も同じ処方と並行して研究した（データは示さず）。
【００８２】
この評価には、従来の（以前の）ＭＰ処方（バイオメリュー社）を使用した。ＭＰ培養瓶にマイコバクテリアまたはその他の細菌／イースト菌培地を接種する前に、異なる薬物を使った従来の（以前の）ＲＦ０．５ｍｌを従来のＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（登録商標）ＭＰ培養瓶（バイオメリュー社）に添加した。Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ１０または羊血液またはトリプチックソイの寒天平板を使ってコロニー数の計数も行い、培地の接種量と純度を検証した。接種されたＭＰ瓶は、マイコバクテリア培地に関しては、ＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（登録商標）３Ｄ（バイオメリュー社）ノンロッキングシステムに３５〜３７℃で３５日間装填し、他の培地に関しては、最大１５日間装填した。ＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（登録商標）装置によって瓶が陽性であると示されると、検出時間（ＴＴＤ）データを収集した。結果を表４および表５ならびに図３および図４に示す。
【００８３】
表４と図３に示すように、培地におけるアズロシリンの使用は、抗菌剤を含有しない培地と比較すると、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、カンサシ菌、マイコバクテリウム・スクロフラセウム、およびヒト型結核菌の増殖（増殖のＴＴＤによって決定される）に悪影響を及ぼした。
【００８４】
培地内でバンコマイシンを使って、カンサシ菌、マイコバクテリウム・スクロフラセウム、およびヒト型結核菌に関する増殖（増殖のＴＴＤ）を決定した。
【００８５】
表５および図４に示すように、培地におけるバンコマイシンの使用は、抗菌剤を含有しない培地と比較すると、カンサシ菌、マイコバクテリウム・スクロフラセウムおよびヒト型結核菌の増殖（増殖のＴＴＤ）に悪影響を及ぼした。
【００８６】
培地におけるその他の薬物の使用は、より高い濃度で試験してもマイコバクテリアの増殖に悪影響を与えなかった（データは示さず）。薬物の濃度を上げると、グラム陰性菌のいくつかの例外を除き、ＣＲＦのほとんどを１０〜１５日間抑制することができた（データは示さず）。
【００８７】
【表４】
0005879261.tif 000005
アズロシリン（ＡＺＬ）の存在下でのマイコバクテリア種のＴＴＤ
【００８８】
【表５】
0005879261.tif 000006
バンコマイシン（ＶＡＮ）の存在下でのマイコバクテリア種のＴＴＤ
【００８９】
実施例４:種々のＭＡＳ処方を使った種々のマイコバクテリウム種のＴＴＤ
マイコバクテリアのＴＴＤを向上させるために、種々の薬物をスクリーニングして汚染呼吸器内細菌叢（ＣＲＦ）を抑制させる能力について調べた。これらの評価から、ホスホマイシンがＣＲＦの抑制には一番の選択であると考えられた。
【００９０】
新規のＭＡＳ混合物のための最良の処方を決定するために研究を行い、異なる濃度のＴＭＰ、ＮＡ、ＦＯＳおよびＰＯＬＹ  Ｂを含有させて種々の処方を試験した。下記の処方、すなわち（１）ＮＳ：新規の瓶＋栄養サプリメント（ＮＳ）、（２）ＲＦ：従来の（以前の）ＭＰ瓶＋従来の（以前の）再構成液、（３）処方１：ＮＳ＋ＴＭＰ（３０μｇ／ｍｌ）、ＮＡ（６００μｇ／ｍｌ）、ＰＯＬＹ  Ｂ（１２５０単位／ｍｌ）、ＦＯＳ（６００μｇ／ｍｌ）、Ａｍｐ  Ｂ（１８０μｇ／ｍｌ‐ＰＩまたはＩＦＵ）、（４）処方２：ＮＳ＋ＴＭＰ（３０μｇ／ｍｌ）、ＮＡ（４００μg／ｍｌ‐ＰＩまたはＩＦＵ）、ＰＯＬＹ  Ｂ（１２５０単位／ｍｌ）、ＦＯＳ（６００μｇ／ｍｌ）、Ａｍｐ  Ｂ（１８０μｇ／ｍｌ‐ＰＩまたはＩＦＵ）、（５）処方３：ＮＳ＋ＴＭＰ（３０μｇ／ｍｌ）、ＮＡ（４００μｇ／ｍｌ‐ＰＩまたはＩＦＵ）、ＰＯＬＹ  Ｂ（１５００単位／ｍｌ）、ＦＯＳ（６００μｇ／ｍｌ）、Ａｍｐ  Ｂ（１８０μｇ／ｍｌ‐ＰＩまたはＩＦＵ）、（６）処方４：ＮＳ＋ＴＭＰ（３０μｇ／ｍｌ）、ＮＡ（６００μｇ／ｍｌ）、ＰＯＬＹ  Ｂ（１２５０単位／ｍｌ）、ＦＯＳ（６００μｇ／ｍｌ）、Ａｍｐ  Ｂ（１８０μｇ／ｍｌ‐ＰＩまたはＩＦＵ）および（７）処方５：ＮＳ＋ＴＭＰ（５０μｇ／ｍｌ）、ＮＡ（４００μｇ／ｍｌ‐ＮＳ＋ＴＭＰ）、ＰＯＬＹ  Ｂ（１２５０単位／ｍｌ）、ＦＯＳ（６００μｇ／ｍｌ）、Ａｍｐ  Ｂ（１８０μｇ／ｍｌ‐ＰＩまたはＩＦＵ）を評価した。ここで、ＴＭＰはトリメトプリム、ＮＡはナリジクス酸、ＰＯＬＹ  ＢはポリミキシンＢ、ＦＯＳはホスホマイシン、Ａｍｐ  ＢはアムホテリシンＢである。
【００９１】
脂肪酸を含まない（ＦＡＦ）ＢＳＡ、５つの長鎖脂肪酸およびα‐ケトグルタラートを含有する栄養サプリメント（ＮＳ）と呼ばれる新規のサプリメントを先に説明したように調製し、フィルタ滅菌した。新規の、オートクレーブ可能なＭＰ培養瓶（上述に示す）をこの研究のために使用した。表６は新規のＭＰ培養瓶および栄養サプリメント（ＮＳ）を示す。
【００９２】
【表６】
0005879261.tif 000007
新規の培養瓶および新規の栄養サプリメント処方
【００９３】
新規のＮＳにはオートクレーブされた、または新規のＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（登録商標）ＭＰ瓶を使用し（上述に示す）、従来の（以前の）ＲＦには従来の（以前の）ＭＰ瓶（バイオメリュー社）を使用した。以前のまたは新規のＭＰ培養瓶にマイコバクテリアまたは他の細菌／イースト菌培地を接種する前に、栄養サプリメント（新規のＮＳ）０．５ｍｌまたは異なる薬物を使った従来の（以前の）ＲＦ０．５ｍｌをＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（登録商標）ＭＰ培養瓶の１つめのセットに添加した。従来のＭＡＳ（従来の（以前の）ＲＦを使用）および新規のＭＡＳ処方（ＮＳを使用）をＭＰ培養瓶の２つめのセットに添加した。マイコバクテリア種０．５×ｌ０３ＣＦＵ／ｍｌおよびＣＲＦ培地０．５×ｌ０５ＣＦＵ／ｍｌで実験を行った。Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ１０または羊血液またはトリプチックソイの寒天平板を使ってコロニー数の計数も行い、接種量と培地純度を検証した。接種されたＭＰ瓶は、ＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（登録商標）３Ｄ（バイオメリュー社）ノンロッキングシステムに３５〜３７℃でマイコバクテリア培地に関しては３５日間装填し、他の培地に関しては最大で１５日間装填した。ＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（登録商標）装置によって瓶が陽性であると示されると、検出時間（ＴＴＤ）データを収集した。結果を表７および図５Ａ〜図５Ｆに示す。
【００９４】
従来の（以前の）ＭＡＳと比較して、新規のＭＡＳ処方は全てグラム陰性菌のより優れた抑制を達成した。従来の（以前の）ＭＡＳと比較して、新規の処方では、スタヒロコッカス種とエンテロコッカス種に飛躍的な増殖があった。
【００９５】
表７および図５Ａは種々のＭＡＳ処方を使ったヒト型結核菌１８２８３のＴＴＤを示す。５つの新規の処方は全て、ＭＡＳの従来の（以前の）処方と比較すると、ＴＴＤの向上を示した。新規のＭＡＳ処方を使ったヒト型結核菌１８２８３のＴＴＤの向上はおよそ６〜８日であった。
【００９６】
表７および図５Ｂは、種々のＭＡＳ処方を使ったヒト型結核菌２７２９４のＴＴＤを示す。５つの新規の処方は全て、ＭＡＳの従来の（以前の）処方と比較すると、ＴＴＤの向上を示した。新規のＭＡＳ処方を使ったヒト型結核菌２７２９４のＴＴＤの向上はおよそ３〜４日であった。
【００９７】
表７および図５Ｃは、種々のＭＡＳ処方を使ったマイコバクテリウム・アビウム５６９のＴＴＤを示す。５つの新規の処方は全て、ＭＡＳの従来の（以前の）処方と比較すると、ＴＴＤの向上を示した。新規のＭＡＳ処方を使ったマイコバクテリウム・アビウム５６９のＴＴＤの向上はおよそ６〜７日であった。
【００９８】
表７およびと図５Ｄは、種々のＭＡＳ処方を使ったマイコバクテリウム・イントラセルラーレ１３９５０のＴＴＤを示す。５つの新規の処方は全て、ＭＡＳの従来の（以前の）処方と比較すると、ＴＴＤの向上を示した。新規のＭＡＳ処方を使ったマイコバクテリウム・イントラセルラーレ１３９５０のＴＴＤの向上はおよそ８〜９日であった。
【００９９】
表７および図５Ｅは、種々のＭＡＳ処方を使ったマイコバクテリウム・スクロフラセウム１９９８１のＴＴＤを示す。５つの新規の処方は全て、ＭＡＳの従来の（以前の）処方と比較すると、ＴＴＤの向上を示した。新規のＭＡＳ処方を使ったマイコバクテリウム・スクロフラセウム１９９８１におけるＴＴＤの向上はおよそ６〜７日であった。とりわけマイコバクテリウム・スクロフラセウム１９９８１について試験した５つの試料のうちの２つは、従来の（以前の）ＭＡＳ処方では増殖が見られなかった。
【０１００】
表７と図５Ｆは種々のＭＡＳ処方を使ったカンサシ菌１２４７８のＴＴＤを示す。５つの新規の処方は全て、ＭＡＳの従来の（以前の）処方と比較すると、ＴＴＤの向上を示した。従来の（以前の）ＭＡＳ処方を使って検出した増殖のない場合と比較すると、新規のＭＡＳを使った場合、カンサシ菌１２４７８のＴＴＤ検出はおよそ１３〜１４日であった。
【０１０１】
【表７】
0005879261.tif 000008
様々な種のＴＴＤ
【０１０２】
実施例５：ヒト型結核菌複合体の増殖に関する以前のＭＡＳ処方と新規のＭＡＳ処方との比較
さらなる試験のために、新規のＭＰ瓶の処方と栄養サプリメントおよび新規のＭＡＳの処方５を選択した。この研究はマイコバクテリウム・アフリカヌム、ウシ型結核菌、ネズミ型結核菌およびヒト型結核菌を含むヒト型結核菌複合体菌株によって行った。処方５の成分は、ＮＳ＋ＴＭＰ（５０μｇ／ｍｌ）、ＮＡ（４００μｇ／ｍｌ‐ＰＩまたはＩＦＵ）、ＰＯＬＹ  Ｂ（１２５０単位／ｍｌ）、ＦＯＳ（６００μｇ／ｍｌ）、Ａｍｐ  Ｂ（１８０μｇ／ｍｌ‐ＰＩまたはＩＦＵ）であった。
【０１０３】
新規のＭＡＳ処方とＮＳには、新規の、オートクレーブしたＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（登録商標）ＭＰ瓶（上述に示す）を使用し、従来の（以前の）ＲＦには、従来の（以前の）ＭＰ瓶（バイオメリュー社）を使用した。従来のまたは新規のＭＰ培養瓶にマイコバクテリア培地を接種する前に、栄養サプリメント（新規のＮＳ）０．５ｍｌまたは異なる薬物を使った従来の（以前の）ＲＦ０．５ｍｌをＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（登録商標）ＭＰ培養瓶の一つ目のセットに添加した。従来のＭＡＳ（従来の（以前の）ＲＦを使用）および新規のＭＡＳ処方（ＮＳを使用）をＭＰ培養瓶の２つめのセットに添加した。
【０１０４】
マイコバクテリアの接種量は０．５×ｌ０３ＣＦＵ／ｍｌであった。Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ１０または羊血液またはトリプチックソイの寒天平板を使ってコロニー数の計数も行い、培地の接種量および純度を検証した。マイコバクテリア培地に関しては、接種されたＭＰ瓶をＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（登録商標）３Ｄ（バイオメリュー社）ノンロッキングシステムに３５〜３７℃で３５日間装填した。ＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ装置によって瓶が陽性であると示されると、検出時間（ＴＴＤ）データを収集した。
【０１０５】
従来の（以前の）ＲＦおよびＭＡＳ（ＲＦ＋従来の（以前の）ＭＡＳ）と新規の栄養サプリメントおよび新規のＭＡＳ（ＮＳ＋新規のＭＡＳ）とを比較して、ヒト型結核菌複合体菌株の増殖（増殖のＴＴＤ）を決定した。ＴＴＤは、ＲＦ＋従来の（以前の）ＭＡＳ培地およびＮＳ＋新規のＭＡＳ培地内の５つのヒト型結核菌複合体菌株のうちの４つ、すなわちマイコバクテリウム・アフリカヌム、ウシ型結核菌、ネズミ型結核菌およびヒト型結核菌に関して決定した。結果を表８および図６に示す。
【０１０６】
表８および図６に示すように、ＮＳ＋新規のＭＡＳは、ＲＦ＋従来の（以前の）ＭＡＳと比較すると、ヒト型結核菌複合体菌株に関する増殖のＴＴＤにおよそ１〜１０日の向上を示した。
【０１０７】
【表８】
0005879261.tif 000009
ヒト型結核菌複合体のＴＴＤ
【０１０８】
実施例６:結核菌以外のマイコバクテリア（ＭＯＴＴ）の増殖のＴＴＤに関する以前のＭＡＳ処方と新規のＭＡＳ処方との比較
さらなる試験のために、新規のＭＰ瓶の処方と、栄養サプリメント（ＮＳ）および新規のＭＡＳの処方５とを選択した。この研究は、マイコバクテリウム・アビウム、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、カンサシ菌およびマイコバクテリウム・スクロフラセウムを含む、結核菌以外のマイコバクテリア（ＭＯＴＴ）の菌株によって行った。処方５の組成は、ＮＳ＋ＴＭＰ（５０μｇ／ｍｌ）、ＮＡ（４００μｇ／ｍｌ‐ＰＩまたはＩＦＵ）、ＰＯＬＹ  Ｂ（１２５０単位／ｍｌ）、ＦＯＳ（６００μｇ／ｍｌ）、Ａｍｐ  Ｂ（１８０μｇ／ｍｌ‐ＰＩまたはＩＦＵ）であった。
【０１０９】
新規の処方とＮＳには、オートクレーブした、または新規のＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（登録商標）ＭＰ瓶（上述に示す）を使用し、従来の（以前の）ＲＦには、従来の（以前の）ＲＭＰ瓶（バイオメリュー社）を使用した。従来のまたは新規のＭＰ培養瓶にマイコバクテリア培地を接種する前に、栄養サプリメント（新規のＮＳ）０．５ｍｌまたは異なる薬物を使った従来の（以前の）ＲＦ０．５ｍｌをＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（登録商標）ＭＰ培養瓶の１つめのセットに添加した。従来のＭＡＳ（従来の（以前の）ＲＦを使用）および新規のＭＡＳ処方（ＮＳを使用）をＭＰ培養瓶の２つめのセットに添加した。
【０１１０】
マイコバクテリアの接種量は０．５×ｌ０３ＣＦＵ／ｍｌであった。Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ１０または羊血液またはトリプチックソイの寒天平板を使ってコロニー数の計数も行い、培地の接種量と純度を検証した。マイコバクテリア培地に関して、接種されたＭＰ瓶はＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（登録商標）３Ｄ（バイオメリュー社）ノンロッキングシステムに３５〜３７℃で３５日間装填した。ＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（登録商標）装置によって瓶が陽性であると示されると、検出時間（ＴＴＤ）データを収集した。結果を表９および図７に示す。
【０１１１】
表９および図７に示すように、ＮＳ＋新規のＭＡＳは、ＲＦ＋従来の（以前の）ＭＡＳと比較すると、結核菌以外のマイコバクテリア（ＭＯＴＴ）のＴＴＤにおよそ１〜１２日の向上が示された。
【０１１２】
【表９】
0005879261.tif 000010
結核菌以外のマイコバクテリア（ＭＯＴＴ）のＴＴＤ
【０１１３】
実施例７：ヒト型結核菌の菌株におけるＴＴＤに関する以前のＭＡＳ処方と異なるＦＯＳ濃度を使った２つの新規のＭＡＳ処方との比較
ＦＯＳ濃度を６００μｇ／ｍｌから８００μｇ／ｍｌに増やして、ＣＲＦのより優れた抑制を達成するために、新規のＭＡＳの処方５をさらに精製した。次の研究は、０．５×ｌ０３ＣＦＵ／ｍｌで、１０のヒト型結核菌の菌株を使って行った。１０の結核菌の菌株は、４つのＣＤＣ分離株、５つの毒性ＡＴＣＣ菌株および１つのＱＣ参考菌株から構成される。
【０１１４】
新規の処方と新規のＮＳには、オートクレーブした、または新規のＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（登録商標）ＭＰ瓶（上述に示す）を使用し、従来の（以前の）ＲＦには、従来の（以前の）ＭＰ瓶（バイオメリュー社）を使用した。従来のまたは新規のＭＰ培養瓶にマイコバクテリア培地を接種する前に、栄養サプリメント（新規のＮＳ）０．５ｍｌまたは異なる薬物を使った従来の（以前の）ＲＦ０．５ｍｌをＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（登録商標）ＭＰ培養瓶の１つめのセットに添加した。従来のＭＡＳ（従来の（以前の）ＲＦを使用）および新規のＭＡＳ処方（ＮＳを使用）をＭＰ培養瓶の２つめのセットに添加した。
【０１１５】
マイコバクテリアの接種量は０．５×ｌ０３ＣＦＵ／ｍｌだった。Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ１０または羊血液またはトリプチックソイの寒天平板を使ってコロニー数の計数も行い、培地の接種量および純度を検証した。マイコバクテリア培地に関しては、接種されたＭＰ瓶はＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（登録商標）３Ｄ（バイオメリュー社.）ノンロッキングシステムに３５〜３７℃で３５日間装填した。ＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（登録商標）装置によって瓶が陽性であると示されると、検出時間（ＴＴＤ）データを収集した。結果を表１０に示す。
【０１１６】
表１０に示すように、新規のＭＡＳ処方はＲＦ＋従来の（以前の）ＭＡＳと比較して、ヒト型結核菌の菌株のＴＴＤにおよそ２〜８日の向上を示した。
【０１１７】
【表１０】
0005879261.tif 000011
６００μｇ／ｍｌ（ＭＡＳ  ５）および８００μｇ／ｍｌ（処方５＋ＦＯＳ２００μｇ／ｍｌ）を含有する新規のＭＡＳ処方を使った種々のヒト型結核菌の菌株のＴＴＤ
【０１１８】
実施例８:汚染呼吸器内細菌叢（ＣＲＦ）の抑制に関する、以前のＭＡＳ処方と異なるＦＯＳ濃度を有する２つの新規のＭＡＳ処方との比較
ＦＯＳ濃度を６００μｇ／ｍｌから８００μｇ／ｍｌに増やして、ＣＲＦのより優れた抑制を達成するために、新規のＭＡＳの処方５をさらに精製した。従来の（以前の）ＲＦおよびＭＡＳ（ＲＦ＋従来の（以前の）ＭＡＳ）と新規の栄養サプリメントおよび新規のＭＡＳ処方（ＮＳ＋新規のＭＡＳ）とを比較して、種々のグラム陽性またはグラム陰性の細菌およびイースト菌培地に関して、増殖があるかない（ＮＧ）かを決定した。新規のＭＡＳ処方は、処方５＋２００μｇ／ｍｌのＦＯＳ（合計で８００μｇ／ｍｌのＦＯＳ）を含有する。ＣＲＦは０．６×１０４ＣＦＵ／ｍｌで試験した。羊血液またはトリプチックソイの寒天平板を使ってコロニー数の計数も行い、培地の接種量と純度を検証した。全ての培地に関して、接種されたＭＰ瓶をＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（登録商標）３Ｄ（バイオメリュー社）ノンロッキングシステムに３５〜３７℃で１５日間装填した。ＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（登録商標）装置によって瓶が陽性であると示されると、検出時間（ＴＴＤ）データを収集した。
【０１１９】
表１１は、新規のＭＡＳの処方が従来の（以前の）ＭＡＳ処方と比較してＣＲＦの増殖を抑制するにはより優れた処方であることを示している。
【０１２０】
【表１１】
0005879261.tif 000012
汚染呼吸器内細菌叢（ＣＲＦ）の抑制を示す表
【図１Ａ】
0005879261.tif 000013
【図１Ｂ】
0005879261.tif 000014
【図１Ｃ】
0005879261.tif 000015
【図２】
0005879261.tif 000016
【図３】
0005879261.tif 000017
【図４】
0005879261.tif 000018
【図５Ａ】
0005879261.tif 000019
【図５Ｂ】
0005879261.tif 000020
【図５Ｃ】
0005879261.tif 000021
【図５Ｄ】
0005879261.tif 000022
【図５Ｅ】
0005879261.tif 000023
【図５Ｆ】
0005879261.tif 000024
【図６】
0005879261.tif 000025
【図７】
0005879261.tif 000026