(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターロイキン−２がヒト対象にて３.５ＭＩＵ／日未満の用量で投与されるように用いられることを特徴とする、インターロイキン−２を含有する、Ｉ型糖尿病の治療用組成物。
【請求項２】
インターロイキン−２が３ＭＩＵ／日の用量で投与される、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
インターロイキン−２が２ＭＩＵ／日未満の用量で投与される、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
繰り返し投与のための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
インターロイキン−２を少なくとも３日連続して一日に一回投与する第一治療単位を少なくとも１回含む治療において用いるための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
インターロイキン−２を３〜７日間一日に一回投与する第一治療単位を少なくとも１回含む治療において用いるための、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
第一治療単位の後、続いて１〜４週間後に維持用量を投与することを含む治療において用いるための、請求項５または６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
治療が治癒的治療である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
治療が予防的治療である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
治療がＩ型糖尿病の発症または進行を予防している、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
対象がＩ型糖尿病を発症する危険があり、治療が該対象における糖尿病の罹患を予防する、請求項１０記載の組成物。
【請求項１２】
治療される対象がＩＬ−２の生産力低下およびインスリンの残産生を示す、請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】
注射用、経口用、経鼻用または局所投与用である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
皮下投与用である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
さらに医薬的に許容される担体または賦形剤を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒト疾患の新規なＩＬ−２療法に関する。さらに具体的には、本発明はヒト対象における炎症を含む、自己免疫疾患、免疫関連性疾患または炎症性疾患の低用量でのＩＬ−２療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インターロイキン−２（ＩＬ−２）はおよそ３０年前に同定されており［１］、最初は、それがインビトロにてＴリンパ球刺激能を有するためＴ細胞成長因子と称された。それは分子量が約１３ｋｄａ〜１７ｋｄａと報告されており［２］、等電点が約６〜８.７の蛋白である。
【０００３】
ＩＬ−２は癌および感染症におけるエフェクターの免疫応答を強化するために診療にて使用されてきた［３、４］。現在では、癌の治療にてヒトへの使用が認可されている。
【０００４】
その公認されている適応症の一で、腎細胞癌（ＲＣＣ）の補助治療にて、１０％に満たない患者が治療に応答する。ＩＬ−２のこの限定された効能は、現在では、ＩＬ−２がまた、抗腫瘍エフェクター応答を抑制することが知られている、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の末梢での生存および抑制機能にて主たる役割を果たすとの最近の知見によってある程度は説明される［５、６］。
【０００５】
実際、ＩＬ−２／ＩＬ−２受容体（ＩＬ−２Ｒ）のシグナル伝達は、エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）とＴｒｅｇの両方での免疫応答において重要である。広範囲に及ぶＩＬ−２Ｒのシグナル伝達は、一方で、機能的活動の強化を示す最終的に分化した短寿命のＴｅｆｆ細胞を成長させるために、および適切なＴ細胞記憶を発揮するために不可欠である［７］。他方、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒのシグナル伝達は、ＩＬ−２ノックアウトマウスがＴｒｅｇを欠くことから分かるように、Ｔｒｅｇの成長および恒常性のために不可欠である。注目に値するのは、ＩＬ−２またはＩＬ−２Ｒ欠損マウスが、重度のＴ−細胞介在性自己免疫疾患（ＡＩＤ）の発症により特に裏付けられるように、エフェクター免疫応答を亢進させうることである。
【０００６】
ＩＬ−２のシグナル伝達が異常であるこれらの異なる結果は、今では、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒのシグナル伝達における定量的かつ定性的な違いがＴｒｅｇおよびＴｅｆｆを制御することにより説明される。ＴｒｅｇはＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒのシグナル伝達の閾値が低いことを必要とし、その成長および末梢での恒常性を支持するようである［６］。ＩＬ−２の投与がマウスおよびヒトにてＴｒｅｇの著しい増殖および活性化をもたらすことが明らかにされた［３、４、８］。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
今日、ＩＬ−２は癌免疫療法における独占的使用に寄与しており、ヒト自己免疫疾患では、より一般的には、望ましくない免疫応答により惹起されるヒト疾患では研究されていない。これはかかる治療に付随する危険性が認識かつ予想されるからである。実際、ＩＬ−２の有するＴｅｆｆ刺激能は、該疾患を媒介する強力なエフェクターＴ細胞を活性化し、したがって該疾患を一層悪化させる危険性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の目的はヒト対象において望ましくない免疫応答を軽減または予防する方法であって、制御性Ｔリンパ球（Ｔｒｅｇ）を刺激するのに効果的で、実質的にエフェクターＴリンパ球（Ｔｅｆｆ）を誘発しない量のインターロイキン−２（ＩＬ−２）を該対象に投与することを特徴とする方法に関する。
【０００９】
発明のさらなる目的はヒト対象において望ましくない免疫応答を軽減または予防する方法であって、制御性Ｔリンパ球（Ｔｒｅｇ）を刺激するのに効果的で、実質的にＩＬ−２関連の副作用を誘発しない量のインターロイキン−２（ＩＬ−２）を該対象に投与することを特徴とする方法に関する。
【００１０】
発明のさらなる目的はヒト対象において望ましくない免疫応答を軽減または予防する方法であって、制御性Ｔリンパ球（Ｔｒｅｇ）を刺激するのに効果的で、実質的にエフェクターＴリンパ球（Ｔｅｆｆ）およびＩＬ−２関連の副作用を誘発しない量のインターロイキン−２（ＩＬ−２）を該対象に投与することを特徴とする方法に関する。
【００１１】
発明のさらなる目的はヒト対象において望ましくない免疫応答を軽減または予防する方法であって、制御性Ｔリンパ球（Ｔｒｅｇ）とエフェクターＴリンパ球（Ｔｅｆｆ）の間のバランス（または割合）（Ｔｒｅｇ／Ｔｅｆｆバランス）を、該対象にてＴｒｅｇの方にシフトさせるのに効果的な量のインターロイキン−２（ＩＬ−２）を該対象に投与することを特徴とする方法に関する。
【００１２】
発明のさらなる目的はヒト対象において望ましくない免疫応答を軽減または予防する方法であって、該対象における制御性Ｔリンパ球（Ｔｒｅｇ）とエフェクターＴリンパ球（Ｔｅｆｆ）の間のバランス（または割合）を増加させるのに効果的な量のインターロイキン−２（ＩＬ−２）を該対象に投与することを特徴とする方法に関する。
【００１３】
本発明は新規なＩＬ−２に基づいた療法を提案する。該発明はＩＬ−２が特異的なＴｒｅｇの増殖／活性化によって作用する新規な一連の免疫制御性および抗炎症性薬として使用され得ることを初めて示すものである。
【００１４】
発明のさらなる目的はヒト対象における自己免疫性、免疫関連性または炎症性障害を治療する方法であって、制御性Ｔリンパ球（Ｔｒｅｇ）とエフェクターＴリンパ球（Ｔｅｆｆ）の間のバランス（Ｔｒｅｇ／Ｔｅｆｆバランス）を、該対象にてＴｒｅｇの方にシフトさせるのに効果的な量のインターロイキン−２（ＩＬ−２）を該対象に投与することを特徴とする方法に関する。
【００１５】
発明のさらなる目的はヒト対象における自己免疫性、免疫関連性または炎症性障害を治療する方法であって、実質的にエフェクターＴリンパ球（Ｔｅｆｆ）を誘発することなく、制御性Ｔリンパ球（Ｔｒｅｇ）を刺激し、および／または炎症を鎮めるのに効果的な量のインターロイキン−２（ＩＬ−２）を該対象に投与することを特徴とする方法に関する。
【００１６】
発明はかかる障害の治癒的または予防的治療に使用されてもよい。さらに詳細には、本発明の方法は対象における自己免疫性、免疫関連性または炎症性障害の発症または進行を防止する。
【００１７】
ＩＬ−２は、典型的には、繰り返して投与される。
【００１８】
請求項１に記載の自己免疫性、免疫関連性または炎症性障害の治療における使用のためのインターロイキン−２は、約０.０５〜約２百万国際単位（ＭＩＵ）／ｍ２／日、好ましくは約０.１または０.２〜約１ＭＩＵ／ｍ２／日の用量で、あるいは約３.５ＭＩＵ／日未満の用量で投与される。
【００１９】
好ましい態様において、ＩＬ−２は、約３ＭＩＵ／日の用量で、あるいは約２ＭＩＵ／日未満の用量で、好ましくは約０.１ＭＩＵ〜約２ＭＩＵ／日の、好ましくは約０.３ＭＩＵ〜約１ＭＩＵ／日の用量で投与される。
【００２０】
治療は、好ましくは、インターロイキン−２が、少なくとも３日連続して、好ましくは３〜７日、さらに好ましくは４〜５日連続して、一日に一回投与される、第一治療単位を含んでもよい。好ましくは、続いて２〜４週間後に維持量で投与される。維持量は週に一回あるいは月に一回または二回投与され得る。
【００２１】
好ましい態様において、治療は、約０.２ＭＩＵ／ｍ２の用量のインターロイキン−２が、少なくとも３日連続して、好ましくは３〜７日、さらに好ましくは４〜５日連続して一日に一回投与され、続いて１〜３週間後に約０.２ＭＩＵ／ｍ２の維持量で投与され、その維持投与が１〜３週間毎に繰り返され得る、第一治療単位を少なくとも１回含む。
好ましい態様において、対象は、０.２ＭＩＵ／ｍ２の日用量として、約０.３ＭＩＵで投与される成人である。
【００２２】
もう一つ別の好ましい実施態様において、治療は、約０.６ＭＩＵ／ｍ２の用量のインターロイキン−２が、少なくとも３日連続して、好ましくは３〜７日、さらに好ましくは４〜５日連続して一日に一回投与され、続いて２〜４週間後に約０.６ＭＩＵ／ｍ２の維持量で投与され、その維持量が２〜４週間毎に繰り返され得る、第一治療単位を少なくとも１回含む。好ましい態様にて、対象は、０.６ＭＩＵ／ｍ２の日用量として、約１ＭＩＵで投与される成人である。
【００２３】
さらにもう一つ別の好ましい実施態様において、
治療は、約１.８ＭＩＵ／ｍ２の用量のインターロイキン−２が、少なくとも３日連続して、好ましくは３〜７日、さらに好ましくは４〜５日連続して一日に一回投与され、続いて約１〜２ヶ月後に約１.８ＭＩＵ／ｍ２の維持量で投与され、その維持量が１〜２ヶ月毎に繰り返され得る、第一治療単位を少なくとも１回含む。好ましい態様にて、対象は、１.８ＭＩＵ／ｍ２の日用量として、約３ＭＩＵで投与される成人である。
【００２４】
概して、ＩＬ−２は、Ｄ／１０〜２０ｘＤの、好ましくはＤ／５〜１０ｘＤの用量で投与され、ここでＤは、Ｔｒｅｇの増殖を誘発することなく、ＴｒｅｇでのＣＤ２５の発現のアップレギュレーションを開始させる最小量である。ＣＤ２５の発現のアップレギュレーションは少なくとも３３％、好ましくは少なくとも５０％であることが好ましい。
【００２５】
本発明は、ヒト対象にて、エフェクターＴリンパ球（Ｔｅｆｆ）を実質的に誘発することなく、制御性Ｔリンパ球（Ｔｒｅｇ）を刺激する。本発明の方法は、対象におけるＴｒｅｇ／Ｔｅｆｆのバランスを増加させることを、あるいは抑制性Ｔ細胞集団の強度を増加させることを可能とする。
【００２６】
ＩＬ−２はヒト対象における炎症を軽減または予防するためにさらに投与される。
【００２７】
本発明は望ましくない免疫応答に関与するか、該応答により惹起される症状を治療または予防するために使用されてもよい。本発明は、限定されないが、ＨＣＶ関連性血管炎、ブドウ膜炎、筋炎、Ｉ型糖尿病、全身性エリトマトーゼス、全身性血管炎、乾癬、アレルギー、喘息、クローン病、多発性硬化症、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、自己免疫甲状腺疾患、神経変性疾患、アルツハイマー病、対宿主移植片疾患、自然流産および同種移植片拒絶反応を含む、炎症性、免疫関連性または自己免疫性疾患の治療に特に適している。
【００２８】
本発明のもう一つ別の対象は、Ｔｒｅｇの量および／またはＴｒｅｇでのＣＤ２５の発現レベルをモニター観察することを特徴とする、ＩＬ−２の治療計画または投与量が、ＩＬ−２を用いて治療される自己免疫性、免疫関連性または炎症性障害の患者にて修飾されるべきかどうかを決定する方法であって、対照値と比べて下回るＴｒｅｇの量および／またはＴｒｅｇにおけるＣＤ２５の発現レベルはＩＬ−２の投与量を増やすべきことを意味する、方法である。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】低用量のＩＬ−２のＨＣＶ関連性自己免疫血管炎の生物学的マーカーに対する効果を示す。  ＨＣＶウイルス量（パネルＡ）、クリオグロブリン（パネルＢ）および補体Ｃ４の血清中レベル（パネルＣ）の経時的変化を示す。データは平均値±標準誤差で表される（ｎ＝１０、＊：ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【００３０】
【図２】低用量のＩＬ−２のリンパ球部分母集団に対する効果を示す。  ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＣＤ１２７−ＦｏｘＰ３＋のＣＤ４＋Ｔ細胞中の、およびＣＤ８＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋のＣＤ８＋Ｔ細胞中の百分率（パネルＡ）、Ｔｒｅｇ／Ｔｅｆｆの全体割合（パネルＢ）、ＣＤ１９＋全体的Ｂ細胞および辺縁帯Ｂ細胞の絶対数（パネルＣ）ならびにＮＫ細胞およびＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔＮＫ細胞の絶対数（パネルＤ）の経時的変化を示す。データは平均値±標準誤差で表される（ｎ＝１０、＊：ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【００３１】
【図３】フローサイトメトリーによるＣＤ４＋Ｔｒｅｇの表現型の特徴を示す。  ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の部分的集団を同定するための代表的なリンパ球のゲートを示す。ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞内で、ＴｒｅｇはＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ１２７−ＦｏｘＰ３＋細胞として同定された。
【００３２】
【図４】ＩＬ−２治療下にあるＨＣＶ関連の自己免疫血液炎の患者におけるＴｒｅｇ細胞の抑制活性を示す。  ＦＡＣＳ精製したＴｒｅｇを、同種異系刺激の下、種々の割合（１／１〜１／８）で自己エフェクターＴ細胞を抑制するその能力についてアッセイした。結果をｃｐｍで表す。図示される実験結果は４つの代表値である。
【００３３】
【図５】フローサイトメトリーによるＣＤ８＋Ｔｒｅｇの表現型の特徴を示す。  ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔｒｅｇを同定するための代表的なリンパ球のゲートを示す。ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞内で、ＴｒｅｇはＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋細胞として同定された。
【００３４】
【図６】フローサイトメトリーによるＣＤ１９＋Ｂ細胞の部分的集団の特徴を示す。  Ｂ細胞部分的集団をナイーブ（ＩｇＤ＋ＣＤ２７−）、記憶（ＩｇＤ−ＣＤ２７＋）、辺縁帯（ＩｇＤ＋ＣＤ２７＋）として定義した。
【００３５】
【図７】低用量のＩＬ−２は炎症の減少を広範囲に誘発し、そのことはＰＢＭＣのトランスクリプトーム解析により明らかにされる。  ＩＬ−２処理の前後の階層的クラスタ分析（パネルＡ）は、主にＢ細胞関連性遺伝子および前炎症性遺伝子に影響を及ぼす遺伝子のダウンレギュレーションを反転表示する。データマイニングは前炎症性応答の低下にて中心的役割を果たすＮＦＫＢ経路を同定した（パネルＢ）。ＩＬ−２治療された患者にてダウンレギュレートされた遺伝子をレッドボックスで特徴付ける。転写シグナチャーに存在する遺伝子（パネルＡ）をフィルド丸型ボックスで概略的に示す。２個の遺伝子産物の間の（例えば、リン酸化、切断等による）転写後活性化は、シャープ矢印で表され、フィルド矢印は直接転写活性化を表す。ドット矢印は間接的シグナル伝達を示す。
【００３６】
表（パネルＣ）はこれらのデータのＩＣＡの結果を示す。炎症、免疫応答、および自己免疫（Ｉ型糖尿病、全身性エリテマトーデス、自己免疫甲状腺疾患）、移植（対宿主移植片疾患および同種移植拒絶反応）または炎症性感染関連性病理（シャーガス病、リシューマニア症、ヘリコバクター・ピロリ・感染、マラリア、アメーバ症、細菌性赤痢、高度の炎症により特徴付けられる全ての疾患）に関連付けられるＧＯ語彙およびＫＥＧＧ経路について有意に富むＩＬ−２処理群にてアップレギュレートまたはダウンレギュレートされているシグナチャーの数を示す。対照として、同数の無作為にピックアップしたＧＯ語彙を、細胞周期関連のＧＯ語彙および対照となる病理と一緒に試験した。ＧＯ語彙またはＫＥＧＧ経路の各々で、Ｋｈｉ２試験のｐ値は、アップ−（２５２７）またはダウン−（３４２９）レギュレートされた全体のシグナチャーと比べて、アップ−またはダウン−レギュレートされたシグナチャーについてバイアスに富む可能性のあることを示す。
【００３７】
【図８】低用量のＩＬ−２がＩ型糖尿病患者にてＴｒｅｇを誘発することを示す。  図８は０.３３、１または３ＭＩＵ／日のＩＬ−２（プロロイキン（登録商標））を５日間投与した患者におけるＴｒｅｇ／ＴＣＤ４の割合を示す。ピークＴｒｅｇ増加は異なる用量で相対的に似ているが、その作用時間は用量依存的であり、維持療法の治療計画を定めるための情報を提供する（すなわち、用量が低いほど、維持注射間の遅れは短くなる）。
【００３８】
【図９】低用量のＩＬ−２はＣ−ペプチド産生を減少させなかったことを示す。  図９ＡはＩＬ−２（プロロイキン（登録商標））を５日間投与した患者におけるＴｒｅｇ／ＴＣＤ４の割合を示す。図９Ｂは、同じ患者で、ＩＬ−２を投与した前後での血清中Ｃ−ペプチドの濃度を示す。処理する間はＴｒｅｇの増加があり、それはＣペプチドの産生の増加と２ヶ月で相関関係にある。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本発明は、予期せぬことに、ヒト自己免疫患者にて、低用量のＩＬ−２免疫療法を介して、Ｔｅｆｆを増殖することも、有害事象を生じさせることもなく、極めて有効な抑制性Ｔｒｅｇのインビボでの増殖を初めて示すものである。
【００４０】
ＩＬ−２は癌免疫療法に独占的に使用され、ヒトにおけるヒト自己免疫疾患にて単独では研究されていない。実際、ＩＬ−２のＴｅｆｆを刺激する能力は、自己免疫を媒介する極めて強力なエフェクターＴ細胞を活性化する危険がある。ここで、本発明者らは、免疫活性化関連の有害事象が観察されないことを示す臨床的証拠と一致する、ＩＬ−２がＴｅｆｆを誘発することなくＴｒｅｇを誘発する条件下で使用され得るとの生物学的証拠を示す。本発明によれば、ＩＬ−２療法の間に炎症の程度が大きく減少することでも支持されるように、ＩＬ−２がＴｒｅｇ／ＴｅｆｆのバランスをＴｒｅｇが大きくなるように傾けることは明らかである。
【００４１】
ＨＣＶ関連の患者での第一実験にて、本発明者らは、低用量のＩＬ−２が良好な耐容性を示し、Ｔｒｅｇ細胞の劇的かつ選択的な増加を誘発し、患者の８０％にて臨床的改善に至ることを明らかにした。
【００４２】
１.５ＭＩＵ／日での５日の治療単位で、Ｔｒｅｇの有意な増加（２倍増）が、副作用なしで、すべての患者にて観察された。付加的な３ＭＩＵ／日の５日の治療単位の後で、Ｔｒｅｇのさらなる増加が指摘された。
【００４３】
本発明者らの結果は、該治療が顆粒球、赤血球または肝酵素にて有意な変化がなく、良好な耐容性を示したことを明らかにした。さらには、１.５ＭＩＵ／日の用量で、無力症、注射部位での一過性局所反応、インフルエンザ様症候群、筋肉痛または高血圧症などの副作用は指摘されなかった。
【００４４】
重要なことは、治療全体および経過観察の間に、病原Ｔ細胞の活性化を示す生物学的または臨床的徴候が認められなかった。
【００４５】
５日間の１.５ＭＩＵ／日の治療単位が、今までのところ、ヒトにてＴｒｅｇの誘発を目的として証明された効能および安全性を有する最も低いＩＬ−２用量である。
【００４６】
加えて、本発明は、初めて、ＩＬ−２の著しい抗炎症活性を明らかにした。本発明者らによって管理されていないトランスクリプトーム解析は、多くの自己免疫性および炎症性疾患、ならびに対宿主移植片疾患および同種移植片拒絶反応などの免疫関連性疾患に付随するシグナチャー／経路の明らかなダウンレギュレーションを示した。ヒトにてＴｅｆｆを刺激することなく、Ｔｒｅｇを刺激するのにＩＬ−２を用いることが可能であることを示すこの実験で、本発明者らは低用量のＩＬ−２治療がこれらすべての疾患のための予防的および治療的パラダイムを大いに変化させるであろうことを提案する。
【００４７】
本発明者らはさらに、もう一つ別の自己免疫疾患、すなわちＩ型糖尿病にて低用量のＩＬ−２で試験することを進め、それにより自己免疫性、免疫関連性または炎症性障害の治療における低用量のＩＬ−２の利益を確認した。
【００４８】
したがって、本発明は、ＩＬ−２を用いる、自己免疫性、免疫関連性または炎症性障害の新規な治療方法を提供する。本発明は、ＩＬ−２が、低用量で、自己免疫性、免疫関連性または炎症性障害の対象にて制御性Ｔｒｅｇ細胞の母集団を効果的に活性化または増殖させうることを開示する。
【００４９】
該対象は、年齢または性別を問わず、いずれかのヒト患者である。個々の実施態様において、患者は子供または青年であってもよい。
【００５０】
インターロイキン−２（ＩＬ−２）
本発明の脈路の中で、「ＩＬ−２」なる語は、例えばヒト、マウス、ラット、霊長類およびブタなどの哺乳動物の供給源を含め、いずれの供給源のＩＬ−２も示し、それは天然物であってもよく、あるいは微生物宿主により産生される組換えＩＬ−２ポリペプチドを含む、組換え技法または合成方法により得られるものであってもよい。ＩＬ−２は天然ポリペプチド配列であっても、含んでいてもよく、あるいは天然ＩＬ−２ポリペプチドの活性変異体とすることができる。好ましくは、ＩＬ−２ポリペプチドまたは活性変異体は、ヒト供給源より由来し、組換えヒトＩＬ−２、特に微生物宿主により産生される組換えヒトＩＬ−２を包含する。
【００５１】
ＩＬ−２の活性変異体は文献に開示されている。天然ＩＬ−２の変異体はそのフラグメント、アナログおよび誘導体であり得る。「フラグメント」とは、無傷のポリペプチド配列の一部のみを含むポリペプチドを意図とする。「アナログ」は一または複数のアミノ酸が置換、添加または欠失されている、天然ポリペプチド配列を含むポリペプチドを示す。変異蛋白および疑似ペプチドはアナログの具体例である。「誘導体」は、グリコシル化、リン酸化、もう一つ別のポリペプチドまたは分子に融合した、高分子化等などの修飾された天然ＩＬ−２ポリペプチドまたはそのフラグメントもしくはアナログを、あるいは化学的または酵素的修飾または付加を介してＩＬ−２の特性（例えば、安定性、特異性等）を改善するように修飾された天然ＩＬ−２ポリペプチドまたはそのフラグメントもしくはアナログを包含する。標準となるＩＬ−２ポリペプチドの活性変異体は、一般に、標準となるＩＬ−２ポリペプチドのアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸配列の同一性を有する。
【００５２】
ＩＬ−２ポリペプチド変異体が活性であるかどうかを決定する方法は当該分野で利用可能であり、本明細書にて具体的に記載されている。活性変異体は、最も好ましくは、Ｔｒｅｇを活性化する変異体である。
【００５３】
ＩＬ−２変異体の例が、例えば、ＥＰ１０９７４８、ＥＰ１３６４８９、ＵＳ４，７５２，５８５；ＥＰ２００２８０またはＥＰ１１８，６１７にて開示されている。
【００５４】
好ましくは、本発明者らは、組換えＩＬ−２、すなわち、組換えＤＮＡ技法［９］により調製されるＩＬ−２を用いる。ＩＬ−２をコードする組換えＤＮＡを発現するのに使用される宿主有機体は原核生物（イー・コリなどの微生物）または真核生物（例えば、酵母、真菌、植物または哺乳動物細胞）であってもよい。ＩＬ−２を産生する方法は、例えば、出典明示により本明細書の一部とされる、ＵＳ４，６５６，１３２；ＵＳ４，７４８，２３４；ＵＳ４，５３０，７８７；またはＵＳ４，７４８，２３４に記載されている。
【００５５】
好ましい実施態様において、本発明はヒト起源のＩＬ−２、またはその活性変異体を、より好ましくは組換え技法により産生された変異体を使用する。ヒトＩＬ−２のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、例えば、各々、ジンバンク・レフ番号３５５８またはＰ６０５６８にて開示される。本発明は好ましくはヒトＩＬ−２を用いる。
【００５６】
本発明で用いるＩＬ−２は、本質的に、純粋な形態、例えば、純度が９５％以上、さらに好ましくは９６、９７、９８または９９％純粋な形態であろう。
【００５７】
本発明で用いるには、ＩＬ−２は、典型的には、Ｔｅｆｆ抑制剤と組み合わせ、または共投与されない。しかし、好ましくは、または必要ではないが、薬物の併用は考慮されてもよい。
【００５８】
ＩＬ−２は単量体または多量体の形態にて使用されてもよい。
【００５９】
ＩＬ−２は医薬的使用を含め市販品として入手可能であり、ヒト患者で用いることが認可されている。適当な市販形態は、例えば、
−プロロイキン（登録商標）、組換えヒトＩＬ−２組成物；
−アルデスロイキン（登録商標）、イー・コリにて産生される、非グリコシル化デス−アラニル−１、セリン−１２５ヒトインターロイキン−２；
−ロンコロイキン（登録商標）、酵母で産生される組換えヒトＩＬ−２
を包含する。
【００６０】
インターロイキン−２は単独で、またはいずれか他の治療的に活性な薬剤と組み合わせて使用されてもよい。好ましい実施態様において、Ｉ型糖尿病の予防または治療に使用される場合、ＩＬ−２はラパマイシンと併用して投与されない。
【００６１】
制御性Ｔ細胞
制御性Ｔ細胞は免疫抑制活性を有するＴリンパ球である。天然ＴｒｅｇはＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋として特徴付けられる。Ｔｒｅｇにて遺伝的欠損を示すヒトおよびマウスは複数のＴ−細胞介在性器官特異的自己免疫疾患を発症する。Ｔｒｅｇの定性的または定量的な欠陥が、全身性エリトマトーゼス（ＳＬＥ）、１型糖尿病、多発性硬化症、ブドウ膜炎および筋炎を含む、多くの自己免疫疾患にて説明されている。反対に、Ｔｒｅｇの増加／復元はこれら疾患の大部分の動物実験にて臨床的改善を誘発する。
【００６２】
Ｔｒｅｇはまた炎症性疾患の調節にて主たる役割を果たすが、かかる疾患におけるその作用機序は十分には認識されていない。事実、大部分の炎症性疾患にて、Ｔｒｅｇの枯渇は疾患を悪化させるのに対して、Ｔｒｅｇの増加は該疾患を軽減させる。このことは、例えば、アテローム性動脈硬化症との関連で明らかにされている。この疾患はそもそも炎症性疾患ではないが、その発症は炎症性成分／ループに関与する。自然発生的にアテローム性動脈硬化症を発症するアポリポ蛋白Ｅ（ＡｐｏＥ）欠損マウスにて、Ｔｒｅｇの枯渇はプラーク形成を有意に悪化させるが、ポリクローナルＴｒｅｇの注入は該疾患を有意に改善した。
【００６３】
大部分のＴｒｅｇはＣＤ４＋細胞であるが、抑制活性を有するＣＤ８＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔリンパ球の希少集団も存在する。
【００６４】
エフェクターＴ細胞
本明細書の脈路の中で、「エフェクターＴ細胞」（または「Ｔｅｆｆ」）は、一または複数のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現し、エフェクター機能（例えば、細胞毒性活性、サイトカイン分泌、抗自己認識等）を発揮する、Ｔｒｅｇ以外の通常のＴリンパ球（時に、文献にてＴｃｏｎｖとも称される）を示す。本発明のヒトＴｅｆｆの主たる集団は、ＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球（例えば、Ｔｈ０、Ｔｈ１、Ｔｈ１７）およびＣＤ４＋またはＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球を包含し、それらは自己または非自己抗原に対して特異的であり得る。
【００６５】
自己免疫疾患の個々の状況において、Ｔｅｆｆ細胞は該疾患の原因であるか、または該疾患に関与するＴ細胞集団を包含する。例えば、Ｔ細胞のかかる集団は、甲状腺抗原、関節抗原、β−ランゲルハンス島抗原等などの自己抗原を認識するＴリンパ球を包含する。ＧＶＨＤ疾患にて、Ｔｅｆｆ細胞は移植片からのＴリンパ球を包含する。
【００６６】
Ｔｒｅｇの選択的増殖
本明細書の脈路の中で、Ｔｒｅｇの刺激（あるいは誘発または活性化または増殖）は、抑制アッセイにより、あるいは患者におけるＣＤ２５、ＩＬ−２受容体のアルファ鎖などのＴｒｅｇの活性を反映する分子の発現により試験されるような、数または活性にて、Ｔｒｅｇ細胞のＴｅｆｆに対する割合の増加を示す。その割合の増加は、好ましくは、治療前のレベルと比べて少なくとも２０％の、より好ましくは少なくとも４０％の、さらにより好ましくは少なくとも６０％の増加である。特に好ましい実施態様において、刺激はＴｒｅｇ／ＴｅｆｆのバランスのＴｒｅｇの方へのシフトまたはＴｒｅｇ／Ｔｅｆｆの割合の増加を示す。
【００６７】
本発明の本質的態様は、実際は、自己免疫性、免疫関連性または炎症性障害のヒト患者にて、実質的にＴｅｆｆを誘発することなく、Ｔｒｅｇを刺激するその能力にある。
【００６８】
Ｔｒｅｇの誘発（あるいは活性化または増殖）は、実施例に開示されるように、例えば、治療される対象から由来のサンプル中の（例えば、ＣＤ２５、ＦｏｘＰ３・・・の発現に基づく）Ｔｒｅｇの数および／またはＴｒｅｇの活性を測定することにより査定され得る。Ｔｅｆｆの実質的な誘発（あるいは活性化または増殖）のないことはまた、実施例に開示されるように、例えば、治療される対象から由来のサンプル中のＴｅｆｆの数および／またはＴｅｆｆの活性を測定することにより査定され得る。好ましくは、実質的な誘発のないことは、全トランスクリプトーム解析によって評価されるように、標的とするＴｅｆｆ細胞集団がＣＤ２５、ＣＤ６９および／またはＨＬＡ−ＤＲなどの活性化のマーカーを獲得しないことを示す。ＴｒｅｇおよびＴｅｆｆ細胞を検出、測定および定量する詳細な方法は当該分野で自体周知であり、そのいくつかが実施例に開示されている。
【００６９】
Ｔｒｅｇの刺激は、患者におけるＴｒｅｇの数を、典型的には少なくとも１０％増やすことにより、あるいはＣＤ２５発現の強度などのマーカーの活性化を亢進することにより測定されてもよい。Ｔｅｆｆ誘発のないことは、典型的には、Ｔｅｆｆ細胞集団が治療の結果として該対象にて１０％を越えて増加しないことを示す。
【００７０】
Ｔｒｅｇが刺激され、かつＴｅｆｆが実質的に誘発されないことは、好ましくは、治療された対象におけるＴｒｅｇ／Ｔｅｆｆの割合またはバランスを測定することにより評価される。このバランスは、例えば、対象から由来のサンプル中のＴｒｅｇの数またはＴｅｆｆの数に基づいて計算される。実施例に示されるように、かかるバランスは、典型的には、治療患者にて少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、４０％または６０％増加する。
【００７１】
ヒト対象におけるＴｒｅｇの基線％、すなわち、Ｔｒｅｇ／ＣＤ４＋Ｔｅｆｆの割合は約４.６±０.６％である（自己免疫疾患の患者の基線％は実施例１に示されるように極めて低くてもよく、ＨＣＶ誘発の自己免疫血管炎の患者では、たった３.６％±０.２３の基線％レベルしかないが、これらの数値は、測定の技術態様に基づいて、個々の研究室で相互に変化してもよい）。
【００７２】
本願にて示される結果は、１.５ＭＩＵ／日の治療を１治療単位行った後、Ｔｒｅｇの基線％にて２倍（１００％）の増加が得られ、それは付加的な治療でさらに増幅されてもよい。プロトコルに応じて、３００％を越える増加が得られた。どのような用量が使用されても（０.３３；１および３ＭＩＵ／日）、５日治療単位を一回行った後、Ｔ１Ｄの患者で同様に２倍増が観察された。
【００７３】
好ましい実施態様において、該方法は、患者にて２０％、３０％、４０％、５０％、７５％、１００％またはそれ以上のＴｒｅｇ／Ｔｅｆｆの割合を可能とする。
【００７４】
さらには、本発明はＣＤ４＋  Ｔｒｅｇの増加だけでなく、ＣＤ８＋であるＴｒｅｇの希少集団の増加も示す。
【００７５】
特定の実施態様において、本発明は循環性ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＣＤ１２７−Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇを増加させる。
【００７６】
もう一つ別の特定の実施態様において、本発明は循環性ＣＤ８＋ＣＤ２５ｈｉＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇを増加させる。
【００７７】
もう一つ別の重要な態様は、増殖したＴｒｅｇ細胞集団が極めて抑制的であることである。実際、提示される結果は、本発明の治療を行うと、ＴｒｅｇはＴｅｆｆ細胞に対して強力な抑制活性があるように活性化されることを示す。本発明者らの実験では、実質的な抑制活性（＞７５％）が、非処理の正常な個体から由来のＴｒｅｇが１／２〜１／４の割合で抑制を付与する、典型的な抑制アッセイにて１／８のＴｒｅｇ／Ｔｅｆｆの割合で検出され得た。
【００７８】
したがって、本発明は、自己免疫疾患のヒト患者にて、エフェクターＴリンパ球の実質的な改変または活性化なしで、Ｔｒｅｇの実質的な増加を可能とする。好ましい実施態様において、本発明の方法は、対象にてＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇを少なくとも３０％増加させ、該対象にて標的Ｔｅｆｆの５％未満の増加を引き起こす方法である。
【００７９】
また、本発明は、予期せぬことに、好ましい投与量で、本発明のＩＬ−２に基づいた療法が本質的に動脈性高血圧症；頭痛、吐き気、関節痛、筋肉痛またはインフルエンザ様症候群を、あるいはIL-2 Summary of Product Characteristics of the FDAに記載されるようなＩＬ−２の既知の他の多数の副作用を誘発しないことを明らかにする。従って、免疫関連性障害のヒト対象にて、ＩＬ−２療法を用いて、Ｔｅｆｆ細胞を実質的に活性化することなく、ＩＬ−２が関連する副作用を実質的に誘発することなく、その一方でＴｒｅｇおよび抗炎症性作用を極めて実質的に誘発することが可能である。
【００８０】
ＩＬ−２の投与量
本発明で用いるのに、ＩＬ−２は、Ｔｅｆｆを実質的に活性化することなく、Ｔｒｅｇを効果的に活性化する投与量で投与される。結果として、対象にてＴｒｅｇ／Ｔｅｆｆのバランスが劇的に増加する。
【００８１】
効果的な投与量は、本願に含まれる情報に基づき、当業者が調節できる。特に、本発明が分かった上で、自己免疫性疾患の患者にて、ＩＬ−２はＴｒｅｇを活性化し、本質的にＴｅｆｆを活性化しない条件下で投与されてもよく、当業者は患者および症状の各々に対して投与量を調節しうる。
【００８２】
典型的には、ＩＬ−２は約０.０５〜約２ＭＩＵ／ｍ２／日、好ましくは０.２〜約１ＭＩＵ／ｍ２／日の用量で投与される。
【００８３】
かくして、ＩＬ−２の投与量は、好ましくは、対象の体表面積に依存する。体表面積（ＢＳＡ）は人体の測定または計算された表面積である。
【００８４】
直接測定することなく、ＢＳＡに到達する種々の計算法が公表されている：
デュボイス＆デュボイスの式［１８］：
【数１】
0006054889.tif 000002
は一般に成人に使用される
【００８５】
もう一つ別の一般に使用される式が、Pharmacy and Therapeutics Committee of the Cross Cancer Institute, Edmonton, Alberta, Canadaでの使用に適用される、モステラーの式［１９］：
【数２】
0006054889.tif 000003
である。
【００８６】
より詳細には、子供に使用される。
【００８７】
平均ＢＳＡは、成人の場合、一般に１.７３ｍ２で取り扱われる。
【００８８】
【表１】
0006054889.tif 000004
【００８９】
典型的には、本発明に従う投与量は３.５百万ＩＵ以下／日／患者、より好ましくは３.０百万ＩＵ以下／日／患者、さらにより好ましくは２.５百万ＩＵ以下／日／患者、さらに好ましくは２.０百万ＩＵ以下／日／患者である。
【００９０】
治療は、典型的には、繰り返され、すなわち上記した低用量のＩＬ−２を対象に数回投与し、斬新的に最も実用的な利益を得る。投与量および計画は、治療目的が予防であるかまたは治療であるか、ならびに治療／予防を予定する疾患で変化する。治療の効果はＴｒｅｇを測定することでモニター観察され、したがって用量および投与計画は調節され得る。
【００９１】
投与量は、例えば、０.１〜３ＭＩＵ、好ましくは０.１〜１.５ＭＩＵ、より好ましくは０.２５〜１ＭＩＵである。好ましい投与量は：
【表２】
0006054889.tif 000005
【００９２】
これらの投与量は対象および疾患の進行に応じて組み合わされてもよい。
【００９３】
治療は、数日に及ぶ治療単位で、例えば１−７日、好ましくは３〜５日間毎日投与するものとして提供されてもよい。かかる治療単位は、治療を行わない期間を挟んで、異なる期間で引き継がれてもよい。予防の場合には、ＩＬ−２は上記した投与量を種々の間隔にて一回の投与で、例えば長期間にわたって一週間に一度の投与でなされてもよい。患者および疾患に応じて異なるプロトコルが調節されてもよい。
【００９４】
維持用量は最初の周期が完了した２ないし８週後に投与され得る。好ましくは、維持用量は最初の用量と同量である。
【００９５】
投与量の決定：
概して、ＩＬ−２はＤ／１０〜２０ｘＤ、好ましくはＤ／５〜１０ｘＤの用量で投与されてもよく、ここでＤはＴｒｅｇの増殖を誘発することなく、ＴｒｅｇにおけるＣＤ２５の発現の誘発を開始する最終容量である。
【００９６】
皮下経路と異なる投与経路が考えられる場合に、適切な低用量のＩＬ−２を決定する方法が特に有用である。
【００９７】
特に、かかる投与量は経口、経鼻または直腸デリバリーにて有用である。
【００９８】
ＣＤ２５レベルの決定はフローサイロメトリーにて抗ＣＤ２５抗体を用いて達成され得る。
【００９９】
この点で、リンパ球含有サンプルは適当な固定剤（例えば、パラホルムアルデヒドであり、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中１％で使用されてもよい）で固定され、（例えば、リンパ球含有サンプルを収集および培養する場所からフローサイトメトリーの実験室まで移動の後で）都合のよいように、（例えば、フローサイトメトリーの使用による）その後の細胞表面マーカーの定量または定性的測定に供されてもよい。Ａｌｅｘａ４８８（Molecular Probes, Oregon, USA）およびＦＩＴＣ（Sigma）などの種々の蛍光色素で標識された市販の抗ＣＤ２５モノクローナル抗体（ｍＡｂ）が利用可能である。
【０１００】
用量および投与計画の例が以下に示される。
【０１０１】
１型糖尿病の治療
１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）は膵臓におけるインスリン産生細胞の自己免疫破壊に起因する。多くの患者で、ＩＬ−２／ＩＬ−２受容体活性化経路の異常が見受けられる。さらには、ＩＬ−２はＴ１Ｄのマウス実験（ＮＯＤマウス）にて１型糖尿病の発生を予防し、糖尿病の発症直後にＩＬ−２を投与すると糖尿病は反転されうる。
【０１０２】
しかしながら、低用量のＩＬ−２を用いて癌を治療する患者で、新たにＴ１Ｄが発症することが記載されている。したがって、ヒトＴ１Ｄ患者をＩＬ−２を用いて治療することは容易ではなく、そのようにＩＬ−２単独で治療することは未だ誰も行ったことがない。実施例２は低用量のＩＬ−２（０.３３、１または３ＭＩＵ／日）を５日間投与したＴ１Ｄ患者における二重盲検試験の結果を初めて示すものである。
【０１０３】
かくして、この度、本発明者らは、低用量のＩＬ−２を用いてＴ１Ｄを、特に発症したばかりのＴ１Ｄを１）予防および２）治療する方法を開示する。
【０１０４】
インターロイキン−２はＩ型糖尿病を発症する危険のある対象にて特に推奨される。その場合、ＩＬ−２を用いる治療は該対象での糖尿病の発症の予防である。予防の場合、Ｔ１Ｄの危険のある患者（家族でＴ１Ｄの病歴のある患者、または高頻度のＴ１Ｄと関連付けられる遺伝的多型のＩＬ−２／ＩＬ−２受容体の活性化経路のある患者、および／またはインスリン、ＧＡＤ、インスリノーマと関連した蛋白２（ＩＡ２）およびチロシンホスファターゼまたは亜鉛トランスポーター８（ＺｎＴ８）などの抗原に対する自己抗体（またはＴ１Ｄに付随する抗体）が検出される患者）は低用量のＩＬ−２で治療され、それによりＴ１Ｄを発症するであろうエフェクターＴ細胞の活性化を予防する。
【０１０５】
この場合、治療では、３ＭＩＵ／日以下の、あるいは好ましい実施態様において１または０.５ＭＩＵ／日より少ない用量を使用し、２週間に一度、好ましくは３週間に一度、または好ましくは１ヶ月に一度の割合で治療剤が投与される。Ｔｒｅｇの割合および機能に基づいて治療（用量および計画）は調整され得る。
【０１０６】
もう一つ別の特定の実施態様において、治療の候補は、好ましくは、ＩＬ−２の生産力低下およびインスリン残産生を示すものである。
【０１０７】
実際、該治療的療法にて、本発明の好ましい使用は、膵臓にまだ多くのインスリン産生細胞が残っていることが分かっているＴ１Ｄと正に診断された患者に関するものである。特定の実施態様において、この場合にはインターロイキン２を３百万単位／日の用量で３〜７日間投与することができ、付加的なＩＬ−２治療単位が上記したように少なくとも一ヶ月に１回付与され得る。Ｔｒｅｇの割合および機能に基づいて治療（用量および計画）は調整され得る。
【０１０８】
好ましい実施態様において、治療は約０.２ＭＩＵ／ｍ２の用量のインターロイキン−２を少なくとも３日連続して、好ましくは３〜７日間、さらに好ましくは４〜５日連続して一日に一回投与する、第一治療単位を少なくとも１回含み、続いて１〜３週間後に約０.２ＭＩＵ／ｍ２の維持用量を投与し、その維持用量の投与が１〜３週間毎に繰り返されうることを含む。好ましい態様にて、対象は０.２ＭＩＵ／ｍ２の日用量として約０.３ＭＩＵで投与される成人である。
【０１０９】
もう一つ別の好ましい実施態様において、治療は約０.６ＭＩＵ／ｍ２の用量のインターロイキン−２を少なくとも３日連続して、好ましくは３〜７日間、さらに好ましくは４〜５日連続して一日に一回投与する、第一治療単位を少なくとも１回含み、続いて約２〜４週間後に約０.６ＭＩＵ／ｍ２の維持用量を投与し、その維持用量の投与が２〜４週間毎に繰り返されうることを含む。好ましい態様にて、対象は０.６ＭＩＵ／ｍ２の日用量として約１ＭＩＵで投与される成人である。
【０１１０】
さらなるもう一つ別の実施態様において、治療は約１.８ＭＩＵ／ｍ２の用量のインターロイキン−２を少なくとも３日連続して、好ましくは３〜７日間、さらに好ましくは４〜５日連続して一日に一回投与する、第一治療単位を少なくとも１回含み、続いて約１または２ヶ月後に約１.８ＭＩＵ／ｍ２の維持用量を投与し、その維持用量の投与が１または２ヶ月毎に繰り返されうることを含む。好ましい態様にて、対象は１.８ＭＩＵ／ｍ２の日用量として約３ＭＩＵで投与される成人である。
【０１１１】
皮下経路が好ましい。
【０１１２】
多発性硬化症の再発の治療および予防
多発性硬化症（ＭＳ）の患者はその再発を予防または治療するのにＩＬ−２を用いて治療され得る。多発性硬化症の患者は再発しやすい。
【０１１３】
好ましい実施態様において、治療は約０.２ＭＩＵ／ｍ２の用量のインターロイキン−２を少なくとも３日連続して、好ましくは３〜７日間、さらに好ましくは４〜５日連続して一日に一回投与する、第一治療単位を少なくとも１回含み、続いて１〜３週間後に約０.２ＭＩＵ／ｍ２の維持用量を投与し、その維持用量の投与が１〜３週間毎に繰り返されうることを含む。好ましい態様にて、対象は０.２ＭＩＵ／ｍ２の日用量として約０.３ＭＩＵで投与される成人である。
【０１１４】
もう一つ別の好ましい実施態様において、治療は約０.６ＭＩＵ／ｍ２の用量のインターロイキン−２を少なくとも３日連続して、好ましくは３〜７日間、さらに好ましくは４〜５日連続して一日に一回投与する、第一治療単位を少なくとも１回含み、続いて約２〜４週間後に約０.６ＭＩＵ／ｍ２の維持用量を投与し、その維持用量の投与が２〜４週間毎に繰り返されうることを含む。好ましい態様にて、対象は０.６ＭＩＵ／ｍ２の日用量として約１ＭＩＵで投与される成人である。
【０１１５】
さらなるもう一つ別の実施態様において、治療は約１.８ＭＩＵ／ｍ２の用量のインターロイキン−２を少なくとも３日連続して、好ましくは３〜７日間、さらに好ましくは４〜５日連続して一日に一回投与する、第一治療単位を少なくとも１回含み、続いて約１または２ヶ月後に約１.８ＭＩＵ／ｍ２の維持用量を投与し、その維持用量の投与が１または２ヶ月毎に繰り返されうることを含む。好ましい態様にて、対象は１.８ＭＩＵ／ｍ２の日用量として約３ＭＩＵで投与される成人である。
【０１１６】
本発明に係る予防の場合には、ＭＳ患者は低用量のＩＬ−２で治療して再発を予防する。この場合、治療では、３ＭＩＵ／日以下の、あるいは好ましい実施態様において１.５ＭＩＵ／日より少ない用量を使用し、２週間に一度、好ましくは３週間に一度、または好ましくは１ヶ月に一度の治療で投与される。Ｔｒｅｇの割合および機能に基づいて治療（用量および計画）は調整され得る。
【０１１７】
治療の場合には、再発を経験しているＭＳ患者はＩＬ−２を３百万単位／日の用量で５〜７日間付与され得、ついで上記したように付加的なＩＬ−２治療単位を月に一度付与され得る。Ｔｒｅｇの割合および機能に基づいて治療（用量および計画）は調整され得る。
【０１１８】
アテローム性動脈硬化症の予防および治療
（限定されるものではないが）一例が、１）中程度のアテローム性動脈硬化症、すなわち非症候性動脈狭窄症であって、その症状の悪化を妨げるのに低用量のＩＬ−２を毎月注射され得る患者；２）動脈瘤の患者で、動脈瘤の大きさの漸進的増大および症状の悪化を妨げるのに低用量のＩＬ−２を毎月注射されうる患者；３）冠動脈または末梢血管狭窄の患者であって、ステント移植とともに／なしで血管形成し、炎症および再狭窄の危険を減らし、ＩＬ−２を３百万単位／日で５〜７日間受け、一ヶ月に１回ＩＬ−２治療単位を付加的に受けて治療される患者；４）炎症および再狭窄の危険性を減少させるのに動脈性バイパス術を受けた後、ＩＬ−２を３百万単位／日で５〜７日間受け、ついで一ヶ月に１回ＩＬ−２治療単位を付加的に受けて治療される患者について用いることである。
【０１１９】
好ましい実施態様において、治療は約０.２ＭＩＵ／ｍ２の用量のインターロイキン−２を少なくとも３日連続して、好ましくは３〜７日間、さらに好ましくは４〜５日連続して一日に一回投与する、第一治療単位を少なくとも１回含み、続いて１〜３週間後に約０.２ＭＩＵ／ｍ２の維持用量を投与し、その維持用量の投与が１〜３週間毎に繰り返されうることを含む。好ましい態様にて、対象は０.２ＭＩＵ／ｍ２の日用量として約０.３ＭＩＵで投与される成人である。
【０１２０】
もう一つ別の好ましい実施態様において、治療は約０.６ＭＩＵ／ｍ２の用量のインターロイキン−２を少なくとも３日連続して、好ましくは３〜７日間、さらに好ましくは４〜５日連続して一日に一回投与する、第一治療単位を少なくとも１回含み、続いて約２〜４週間後に約０.６ＭＩＵ／ｍ２の維持用量を投与し、その維持用量の投与が２〜４週間毎に繰り返されうることを含む。好ましい態様にて、対象は０.６ＭＩＵ／ｍ２の日用量として約１ＭＩＵで投与される成人である。
【０１２１】
さらなるもう一つ別の実施態様において、治療は約１.８ＭＩＵ／ｍ２の用量のインターロイキン−２を少なくとも３日連続して、好ましくは３〜７日間、さらに好ましくは４〜５日連続して一日に一回投与する、第一治療単位を少なくとも１回含み、つづいて約１または２ヶ月後に約１.８ＭＩＵ／ｍ２の維持用量を投与し、その維持用量の投与が１または２ヶ月毎に繰り返されうる。好ましい態様にて、対象は１.８ＭＩＵ／ｍ２の日用量として約３ＭＩＵで投与される成人である。
【０１２２】
度重なる自然流産の予防
ある夫婦は、免疫学的原因であると考えられる、反復性自然流産で出産の難しさを感じている。
【０１２３】
反復性流産のマウス実験にて、本発明者らは、交尾の前にＩＬ−２を投与することで正常な妊娠の成果が得られることを示した。
【０１２４】
反復性自然流産の女性患者にて、プログラムされた受胎またはインビトロ受精により得られる胚の着床の前に、ＩＬ−２を付与し、胎児の着床を有利にすることができる。一例として、計画された交尾または着床の１ヶ月ないし１週間前に３ＭＩＵ／日の５日間にわたるＩＬ−２治療単位が付与され得る。
【０１２５】
細胞または器官拒絶反応の予防
免疫原性の可能性のある同種異系細胞または組織あるいはトランス遺伝子で遺伝的に修飾された細胞を移植した後に、本発明に従うＩＬ−２の投与は拒絶反応の割合を軽減するのに使用され得る。
【０１２６】
炎症を制御するための治療計画の付加的な例：
−０.１〜３.５または３ＭＩＵ／日で５〜７日間、２４時間の持続注入；
−０.１〜３.５または３ＭＩＵ／日の一日投与量で５〜３０日間、一日一回の繰り返し投与；
−０.１〜３.５または３ＭＩＵ／日の一日投与量で１５〜３０日間、二日毎に一回の繰り返し投与；
−０.１〜３.５または３ＭＩＵ／日の一日投与量で２〜４週間連続して、週に３日連続して一日一回の繰り返し投与
が挙げられる。
【０１２７】
維持および／または予防のための投与計画の例：
−０.１〜３.５または３ＭＩＵ／日の一日投与量で２〜６週間毎に一週間に１〜７日間、毎日の繰り返し投与；
−０.１〜３.５または３ＭＩＵ／日の一日投与量で３〜６ヶ月毎に５〜３０日間、一日一回の繰り返し投与；
−０.１〜３.５または３ＭＩＵ／日の一日投与量で一年に一回５〜３０日間、一日一回の繰り返し投与；
−０.１〜３.５または３ＭＩＵ／日の一日投与量で１〜３ヶ月毎に１〜３日間、一日一回の繰り返し投与；
−週毎に一日、０.０１〜１ＭＩＵ／日の維持用量の投与
が挙げられる。
【０１２８】
一定量のＩＬ−２投与処方を複数のサイクルで、または複数レベルのＩＬ−２投与処方を複数のサイクルで投与することの必要性は管理医師の裁量であり、本発明の方法の治療を受けている対象にてＴｒｅｇ細胞をモニター観察することにより評価され得る。
【０１２９】
好ましい実施態様において、自己免疫疾患の患者で、Ｔｒｅｇの％レベルをＴ細胞全体の５−１０％に達する、および／または維持するのが最良である。
【０１３０】
予防の場合には、Ｔｒｅｇの％レベルをＴ細胞全体の４.５−７％に達する、および／または維持するのが望ましい。
【０１３１】
ＩＬ−２用量は、患者の応答、すなわちＴｒｅｇの％およびその活性化状態（ＣＤ２５）についての効果に基づいて適合されてもよい。
【０１３２】
かくして、Ｔｒｅｇの量および／またはＴｒｅｇでのＣＤ２５の発現レベルをモニター観察することを含む方法であって、ＩＬ−２の治療計画または投与量が、ＩＬ−２を用いて治療される自己免疫性、免疫関連性または炎症性障害の患者にて修飾されるべきかどうかを決定する方法が記載される。
【０１３３】
対照値と比べて下回るＴｒｅｇの量および／またはＴｒｅｇにおけるＣＤ２５の発現レベルはＩＬ−２の投与量を増やすべきことを意味する。対照値は、一般に、治療する前の患者での基線となるＴｒｅｇの量および／またはＣＤ２５発現レベルである。
【０１３４】
特定の実施態様にて、かかる定量化は、治療が開始された場合に（例えば、第一投与のの３〜５日後に）行われうる。Ｔｒｅｇ％またはＣＤ２５発現レベルが、基線と比べて２０％増より低い場合、ＩＬ−２の用量を増やし（例えば、ｘ２）、適切なＴｒｅｇ応答を誘発する用量（３．５ＭＩＵ／日未満）が認められるまで、該工程を繰り返すことができる。
【０１３５】
好ましくは、この方法はまた、ＩＬ−２を投与した後、２〜６ヶ月毎に、好ましくは１〜５日の間に、Ｔｒｅｇの数および／またはＴｒｅｇ中のＣＤ２５の発現レベルを定量することを含め、維持期間の間実施される。Ｔｒｅｇの％またはＣＤ２５発現レベルが基線と比べて２０％増より小さいならば、ＩＬ−２の量は増加（例えば、ｘ２）させうる。
【０１３６】
投与形および経路
ＩＬ−２は当該分野にて自体公知の許容される方法を用いて投与されてもよい。かくして、例えば、ＩＬ−２またはＩＬ−２含有の医薬組成物は、静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）あるいは経皮または皮下（ＳＣ）注射を含む、いずれかの形態の注射により、あるいは経口または経鼻経路により、ならびに局所投与（クリーム、デポー等）により投与され得る。本発明の特定の実施態様において、ＩＬ−２は持続放出性製剤、または持続放出装置を用いて投与される製剤として使用される。かかる装置は当該分野にて周知であり、例えば、経皮パッチ、および薬物送達を持続的で安定した状態にて種々の用量にて経時的に提供し、持続放出効果を得ることのできる小型埋め込みポンプを包含する。舌下用または点眼用製剤も考慮されてもよい。
【０１３７】
ＩＬ−２は、医薬的に許容されるベヒクル、担体または賦形剤と共同して（例えば、溶液、懸濁液または混合液にて）局所的に投与される。適当な賦形剤は、等張溶液、生理食塩水溶液、緩衝液、遅延放出製剤等を包含する。ＩＬ−２またはその類似体を含む液体、凍結乾燥または噴霧乾燥組成物は当該分野にて公知であり、水性または非水性溶液または懸濁液として調製されてもよい。
【０１３８】
医薬組成物は適切な安定化剤、緩衝剤、増量剤またはその組み合わせを含み、製造および貯蔵の間の蛋白安定性および生物活性の喪失に付随する問題を最小にすることが好ましい。
【０１３９】
緩衝剤を用い、液体組成物のｐＨをＩＬ−２の安定のために許容される範囲内に維持する。緩衝剤は、例えばコハク酸、クエン酸、リン酸およびグルタミン酸などの酸であってもよい。
【０１４０】
適当な増量剤の例として、例えばグリシン、マンニトールまたはバリン、あるいはその組み合わせが挙げられる。
【０１４１】
安定化剤として使用され得る不活性担体の例として、糖（例えば、シュークロース、グルコース、デキストロース）および糖アルコール、ならびにアミノ酸が挙げられる。
【０１４２】
医薬組成物は、付加的に、メチオニンなどの他の安定化剤、ポリソルベート８０などの非イオン性界面活性剤等が配合されてもよい。
【０１４３】
ＩＬ−２製剤の特定の例が［１０］および米国特許第４，６０４，３７７号に記載されている。
【０１４４】
ＩＬ−２がモノマー形態である場合、貯蔵の間のＩＬ−２の凝集を減らすのに十分なアミノ酸基剤を該組成物に加えることが好ましい。アミノ酸基剤はアミノ酸またはアミノ酸の組み合わせとすることができ、所定のいずれのアミノ酸もその遊離塩基の形態またはその塩の形態にて存在する。かかるアミノ酸の例として、アルギニン、リジンおよびアスパラギン酸が挙げられる。
【０１４５】
特定の実施態様において、組成物は、例えば凍結乾燥された多量体ＩＬ−２を含む。
【０１４６】
かかる組成物の具体例がプロロイキン（登録商標）ＩＬ−２である。凍結乾燥製剤は、嵩をなすマンニトール、およびＩＬ−２を水溶解性とするＳＤＳなどの水可溶性担体と混合して選択的に酸化されている組換えＩＬ−２を含む。この組成物は非経口注射用水溶液中に復元するのに適する。
【０１４７】
パッケージング
ＩＬ−２の現行のパッケージングは１８ＭＩＵのＩＬ−２を含有するバイアルである。少量にて使用されて投与される場合、０.０１ＭＩＵ、０.０２ＭＩＵ、０.５ＭＩＵ、０.１ＭＩＵ、 ０.２ＭＩＵ、０.５ＭＩＵ、１ＭＩＵおよび３または３.５ＭＩＵの用量のパッケージングを製造するのが好ましい。
【０１４８】
従って、本発明の具体的な目的はまた、ＩＬ−２を３ＭＩＵまたはそれ以下の単位用量で含む医薬組成物にある。該組成物はバイアル、カプセル、シリンジ等の形態であってもよい。
【０１４９】
自己免疫疾患および炎症疾患の治療
本発明は、望ましくない免疫応答に付随するまたはそれにより惹起される、および／またはＴｒｅｇの定量的または定性的な異常が示される、症状の治療に使用されてもよい。かかる疾患の例として、自己免疫疾患、炎症疾患（炎症プロセスが重要な役割を果たすヒト疾患を含む）ならびに免疫関連性疾患が挙げられる。
【０１５０】
該治療は治癒的または予防的であってもよい。特定の実施態様において、該治療は治癒的であり、すなわち、かなり初期の段階であっても、疾患が特定されている対象に関する。かかる患者では、治療は疾患の進行を遅らせまたは停止させること、および／または疾患の症候または原因を抑制することを目的とする。治療は、実施例で説明されるように、患者にて疾患の完全な消失をもたらすものであってもよい。
【０１５１】
治療は、疾患が特定されていない患者では、あるいは多発性硬化症のように、疾患を緩和して再発を防止する患者では予防的であってもよい。かかる患者では、治療はＴｒｅｇを高レベルに維持すること、および／または望ましくない免疫反応により惹起される疾患の発症を回避するのに炎症を緩和することを目的とする。
【０１５２】
治療により、患者の症状にて、疼痛の軽減、組織障害の減少等などのなんらかの改善が示される。
【０１５３】
Ｔｒｅｇの異常は、種々の自己免疫ヒト疾患にて報告されており、本発明は、限定されないが、そのすべてが、術後局所炎症などの療法に影響を及ぼす炎症性要素と関与する、高度の炎症または症状により特徴付けられる、ＨＣＶ関連性血管炎、ブドウ膜炎、筋炎、Ｉ型糖尿病、全身性エリトマトーゼス、全身性血管炎、乾癬、アレルギー、喘息、クローン病、多発性硬化症、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、自己免疫甲状腺疾患、自己炎症疾患、神経変性疾患、アルツハイマー疾患、対宿主移植片疾患、自然流産および同種移植拒絶反応を含む、炎症または自己免疫疾患の治療に特に適する。本発明は、シャーガス病、リシューマニア症、ヘリコバクター・ピロリ感染症、慢性バイアル肝炎（Ｂ、Ｃ、Ｄ型）、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ、マラリア、アメーバー症または細菌性赤痢などの炎症性感染関連性病状の補助治療剤として使用されてもよい。
【０１５４】
慢性ＨＣＶ感染は、その発症機序が大いに免疫学的に活性化されると思われる、多数の肝外合併症と独自に関連付けられる。これらの合併症のうち、クリオグリブリン血症およびその臨床的続発症は最も強い関連性を保持する。クリオグリブリン血症はＨＣＶ感染の患者の４０−６０％にて容易に検出可能であり［１１、２０、２１、２２］、それに対して顕性クリオグリブリン血症血管炎（混合型クリオグリブリン血症：ＭＣ）はそのような患者の５−１０％が発症するに過ぎない［１１］。最大頻度の標的器官は皮膚、関節、神経および腎臓である。病気発現は緩やかな臨床症状（紫斑病、関節痛）から致命的な劇症合併症（糸球体腎炎、広汎性血管炎）の範囲まで可変しうる。Ｔ細胞の血管浸潤での観察、自己抗体の存在およびあるＨＬＡ基がＨＣＶ感染患者にてＭＣに感受性を付与するとの観察は、このウイルス関連の病状の自己免疫特性を支持するものである［１２、１３］。ＭＣ病態生理はＨＣＶとリンパ球の間の相互作用より由来するようであり、それはＢ−およびＴ−細胞機能を直接制御し、ポリクローナル抗体の活性化およびリウマチ因子（ＲＦ）の活動でＩｇＭを産生するＢ細胞の増殖をもたらす［２３］。本発明者らはこれまでにＴｒｅｇがＨＣＶ−ＭＣ患者にて顕著に減少していると報告した［１２、１４、１５］。その上、ＨＣＶについて治療するのに成功したＭＣ患者にて、ウイルスのクリアランスは血管炎の治癒およびＴｒｅｇの回復と関連付けられた。
【０１５５】
実験セクションは、自己免疫性疾患に伴うＨＣＶ感染の患者にて、低用量のＩＬ−２を繰り返し投与する療法の安全性、免疫効果および臨床的効能を評価するように設計されたフェーズＩ／ＩＩａ実験の結果を報告する。本発明者らは低用量のＩＬ−２が十分に耐性であり、Ｔｒｅｇ細胞の劇的かつ選択的な増加を誘発し、治療したすべての患者で臨床的改善に至ることを明らかにする。このことは、ヒト自己免疫疾患にてＩＬ−２の免疫療法に付した後、インビボでのＴｒｅｇの誘発および回収を示す第一の実証結果である。
【０１５６】
実施例にて示されるように、治療は十分に耐性であり、エフェクターＴ細胞の活性化、血管炎のフレアおよびＨＣＶウイルス血症の悪化を誘発しなかった。低用量のＩＬ−２はすべての患者にて強い抑制活性のあるＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＣＤ２７−Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇの割合を劇的に増加させ、付随して辺縁帯Ｂ細胞の割合を減少させた。末梢血単核細胞のトランスクリプトーム実験は、ＩＬ−２が炎症／酸化ストレス媒介物質の広範囲に及ぶ減衰を誘発することを示した。クリオグリブリン血症の軽減および／または血管炎の臨床的改善が、各々、９０％（９／１０）および８０％（８／１０）の患者で観察された。
【０１５７】
このことは、ヒト免疫疾患にて、十分に耐性である低用量のＩＬ−２免疫療法に付した後、Ｔｒｅｇ細胞の回収および臨床的改善を示す第一の実証結果である。それは炎症および自己免疫疾患の治療用のＩＬ−２の幅広い使用のための道を開くものである。
【０１５８】
他の疾患は：
−  全身性炎症応答症候群（ＳＩＲＳ）（choc）（アジュバント）；
−  肝移植片拒絶反応−炎症性肝線維症を予防するためのネオアジュバントおよびアジュバント療法、−臓器提供者および／または移植片の制御を改善するのに受容者を治療する
−  肝硬変−炎症性肝線維症および関連する合併症を予防するため
−  自己炎症性全身性疾患−臨床的／生物学的フレアとの炎症反応の軽減または予防
−  急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）（アジュバント）
−  急性膵炎−炎症性反応および続発性壊死の軽減
−  ステントの血管手術−ステントの挿入に対する炎症反応を妨げることによるステント閉塞の予防
−  心筋梗塞後の心臓リモデリングの改善
−  整形外科−ＯＳ後の炎症反応の軽減
−  歯学−歯周炎の治療
−  スティル病
−  精神科：鬱病
を包含する。
【０１５９】
次に実施例を用いて本発明を説明するが、何ら本発明を制限するものではない。
【０１６０】
実施例
実施例１：ＨＣＶ関連性血管炎における低用量のＩＬ−２
ここで、本発明者らは、ＩＬ−２が自己免疫力のある患者にてＴｅｆｆを誘発することなく、Ｔｒｅｇを誘発する条件下で使用され得るとの第一の生物学的証拠をヒト対象にて提供する。本発明者らは、ここで、ヒト自己免疫疾患にて、ＩＬ−２免疫療法を介して、臨床的改善に至る極めて強力な制御性Ｔｒｅｇのインビボにおける増殖を示す第一の実証結果を報告する。ＩＬ−２療法の終わりにＴｒｅｇを増加させるとする実験の主要評価項目、およびその臨床応答を含むすべての副次的評価項目はすべて適合した。本発明者らは低用量のＩＬ−２が十分に耐性であり、Ｔｒｅｇ細胞の劇的かつ選択的増加を誘発し、患者の８０％にて臨床的改善に至ることを示す。これは、ヒト自己免疫疾患にて、ＩＬ−２免疫療法の後でインビボにてＴｒｅｇの誘発および回収を示す第一の実証結果である。さらには、本発明者らは、低用量のＩＬ−２のヒトでの著しい抗炎症作用を初めて示す。
【０１６１】
方法
患者
該実験の選考基準は次のとおりであった：１）陽性ＨＣＶ  ＲＮＡにより規定される慢性活性ＨＣＶに感染していること；（ｉ）少なくとも２回測定して血清クリオグロブリン＞０．０５ｇ／ｌの存在、および（ｉｉ）三つ組の紫斑病−関節痛−無力症の存在、または（ｉｉｉ）紫斑がなく血管炎と証明された生検（腎臓、神経線維または皮膚）により規定されるＭＣ血管炎の病歴のあること［１６、１７］；３）臨床的に活性な血管炎を含める際に、通常の療法、すなわち抗ウイルス療法（ペグインターフェロン−αおよびリバビリン）および／またはリツキシマブに対して抵抗力があるか、不耐であること；５）リツキシマブまたは抗ウイルス療法を止めた、各々、６ヶ月または２ヶ月後に最小となること。
【０１６２】
除外基準は、Ｂ型肝炎ウイルスまたはＨＩＶとの共同感染、肝硬変、癌またはリンパ腫、少なくとも６ヶ月の免疫抑制剤の使用、薬物中毒、アルコール依存症または妊娠を包含した。
【０１６３】
実験計画
本発明者らは、モノセンター・オープン・プロスペクティブ・フェーズＩ／ＩＩトライアルを行った。４サイクルの５日皮下ＩＬ−２療法が施行された。第一の治癒は一週間の入院の間に１.５百万ＩＵ／日の用量で実施され、耐性を評価した。満足のいく耐性を基礎として、残りの３つの治癒は３百万ＩＵ／日ｍｐ用量で外来で行われた。第二の治癒は１０日の洗い出しの後に開始され、つづいて１７日の洗い出しの後で２つの治癒が開始された。該実験は制度倫理委員会が承認しており、すべての患者よりインフォームド・コンセントを得た。
【０１６４】
各治癒の１日目および５日目で、該治癒の第一および最後のＩＬ−２を投与する前に患者を評価した。彼らはまた最後にＩＬ−２投与した４８〜９０日後にも評価された。
【０１６５】
治療に対する応答は、臨床的、免疫学的およびウイルス学的パラメータを、初期評価で、ＩＬ−２の各治療単位の最後で（１、３、６および９週間で）、および追跡期間の最後で比較することにより分析された。臨床的応答は、次の主要な臨床的サイン：皮膚への浸潤（紫斑病および／または下腿潰瘍の不在）、末梢神経障害（２回連続した試験での臨床的および電気生理学的改善）、腎臓への浸潤（血清中クレアチニン濃度の正常化および蛋白尿および／または血尿の消失）および関節痛の不在の経過を分析することにより定められた。
【０１６６】
主要評価項目は、ＩＬ−２療法の最後に（すなわち、Ｗ９で）ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の割合の４％の絶対的増加であった。副次的評価項目は、安全性、Ｗ９での細胞性および体液性免疫の評価、治療から一定期間離れた時点（Ｗ１９）でのＴｒｅｇのレベルの持続的増加、および血管炎の臨床的応答の評価を包含した。
【０１６７】
フローサイトメトリー分析
免疫モニターリングは、Pitie-Salpetriere Biotherapyにて使用される慣用的な公開方法に従って行われた。
【０１６８】
簡単には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の部分集合（ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔリンパ球、ＣＤ１９＋Ｂリンパ球およびＣＤ３−ＣＤ５６＋ＮＫ細胞）の数（細胞／μｌ）は、メーカーの使用説明書（Beckman Coulter, Villepinte, France）に従って、内部標準としてフローカウント蛍光ビーズを用いるＣＹＴＯ−ＳＴＡＴテトラＣＨＲＯＭＥキット、およびＦＣ５００サイトメーターでのテトラＣＸＰソフトウェアを用い、新鮮血サンプルより決定された。これら細胞の部分集合を多色フローサイトメトリーおよび種々の蛍光マーカーと直接コンジュゲートしたｍＡｂを用いて分析した。細胞獲得およびフローサイトメトリーによる分析をＦＣサイトメーター（Beckman Coulter）を用いて行った。機器の設定パラメータ（利益、補償、および閾値）を、キャリブレーションビーズ（フローセットビーズ、Cytocompキット、およびＣＹＴＯ−ＴＲＯＬ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｃｅｌｌｓ）と合わせて機器ソフトウェア（ＣＸＰソフトウェア；Beckman Coulter）で設定した。機器の再現性は標準化されたビーズで確認された（フローチェック）。データをＣＸＰ分析用ソフトウェア（Beckman Coulter）を用いて分析した。
【０１６９】
これら細胞の部分集合は、多色フローサイトメトリーを用いて分析し、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、フィコエリトリン−テキサス・レッド（ＥＣＤ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）またはフィコエリトリン−シアニン（ＰＥ−Ｃｙａ７）のいずれかに直接コンジュゲートしたｍＡｂ：ＣＤ３−ＥＣＤまたは−ＰＣ７、ＣＤ４−ＥＣＤまたは−ＰＣ７、ＣＤ８−ＰＣ７、ＣＤ８−ＡＰＣ、ＣＤ１４−ＰＥ、ＣＤ１６−ＦＩＴＣ、ＣＤ１９−ＥＣＤ、ＣＤ２８−ＦＩＴＣ、ＣＤ４５ＲＡ−ＡＰＣ、ＣＤ４５ＲＯ−ＦＩＴＣ、ＣＤ５６−ＰＥ、ＣＤ６９−ＰＥ、ＣＤ１５２−ＰＥおよびＨＬＡ−ＤＲ−ＰＣ７を用いた。そのすべてはBeckman Coulter（Villepinte、France）より入手した。ＣＤ２５−ＰＥ、ＣＤ２５ＡＰＣ、ＣＤ２７−ＰＥ、ＣＤ６２Ｌ−ＦＩＴＣおよびＩｇＤ−ＦＩＴＣはBD Biosciences（Le Pont De Claix, France）より入手した。ＣＤ１２７はe-Biosciences（San Diego, CA, USA）より、グルココルチコイド誘発性腫瘍壊死因子関連の蛋白（ＧＩＴＲ）−ＰＥはMiltenyi Biothech（Paris, France）より入手した。潜伏関連ペプチド（ＬＡＰ）−ＰＥおよびＣＣＲ７−ＰＥ抗体はR&D Systems（Abingdon, UK）より入手した。細胞内ＣＤ１５２標識化は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１２７およびＣＤ２５の膜染色の後に、Invitrogen（Cergy Pontoise, France）から由来のＦｉｘおよびＰｅｒｍ試薬を用いて行われた。適合マウスのアイソタイプの対照抗体を用いた。細胞内ＦＯＸＰ３の標識化は、メーカーの使用説明書にしたがって、ＡＰＣ抗ヒトＦｏｘｐ３キット（ＰＣＨ１０１クローン、eBiosciences）を用いて、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１２７およびＣＤ２５の膜染色を行った後に実施される。ラットＩｇＧ２ａＡＰＣをアイソタイプの対照（eBiosciences）として用いた。
【０１７０】
フローサイトメトリーによる細胞獲得および分析はＦＣ５００サイトメーター（Beckman Coulter）を用いて実施された。機器の設定パラメータ（利益、補償、および閾値）を、キャリブレーションビーズ（フローセットビーズ、Cytocompキット、およびＣＹＴＯ−ＴＲＯＬ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｃｅｌｌｓ）と合わせて機器ソフトウェア（ＣＸＰソフトウェア；Beckman Coulter）で設定した。機器の再現性は標準化されたビーズで確認された（フローチェック）。データをＣＸＰ分析用ソフトウェアおよびＫａｌｕｚａソフトウェア（Beckman Coulter）で分析した。
【０１７１】
細胞内サイトカイン産生の検出には、ＰＢＭＣを、ゴルジ−ストップ（BD Biosciences）の存在下、５０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡおよび１ｍＭのイオノマイシンで４時間刺激し、ついでメーカーの使用説明書に従って、固定および透過化を行った後、抗−ＩＮＦ−ｇ−ＦＩＴＣ（eBioscience）または抗−ＩＬ−１７−Alexa Fluor ６４７（e−Bioscience）を用いて染色した。
【０１７２】
制御性Ｔ細胞アッセイ
細胞制御アッセイを従前通りに行った。簡単には、ＰＢＭＣを適当に組み合わせたｍＡｂで染色し、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ Ａｒｉａ、BD Biosciences）によりＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７低レベル／−細胞、すなわちＦＡＣＳ−分類化Ｔｒｅｇを精製した。その制御活性を試験するのに、Ｔｒｅｇを、２００μＬの完全培地中、刺激細胞として１０４個の照射された（１５グレイ）の同種異系ＰＢＭＣの存在下で、応答細胞として５ｘ１０４個の自己Ｆａｃｓ−分類化ＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞と、種々の細胞割合（１／１；１／２；１／４；１／８；１／１６）にて混合した丸底の９６−ウェル組織培養プレートにてアッセイした。各培養条件で３回重複して試験を行った。４日後に、１μＣｉ（０．０３７ＭＢｑ）の３Ｈ−チミジン（Amersham, Buckinghamshire, UK）を付加的に１６時間取り込むことにより細胞増殖を決定し、β−カウンター（counter-WALLAC）を用いて測定した。結果をカウント毎分（ｃｐｍ）で表し、増殖の抑制％をｔｒｅｇ不含のエフェクター細胞の増殖／ｔｒｅｇ含有のエフェクター細胞の増殖の割合により決定した。
【０１７３】
トランスクリプトーム実験
メーカーの使用説明書に従って、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（QIAGEN, requis, CA）を用いてＲＮＡを生成した。７−９．５のＲＮＡインテグリティ・ナンバー（ＲＩＮ）の性質を示すＡｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｒ（Agilent Technologies）を用いてＲＮＡインテグリティを評価した。ＲＮＡの収量をＮａｎｏＤｒｏｐ１０００分光光度計（NanoDrop Products、Thermo Fisher Scientific）を用いて評価した。
【０１７４】
全ＲＮＡを増幅し、メーカーのプロトコル（Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit；Ambion）に従ってビオチニル化ｃＲＮＡに変換した。
【０１７５】
標識化ｃＲＮＡを、４８０００個以上のプローブを含有する、Illumina Human HT-12 V3 BeadChipアレイ（Illumina）と一夜にわたってハイブリダイズさせた。次に、該アレイを洗浄し、遮断し、染色し、メーカーのプロトコルに従って、Illumina BeadStation上でスキャンした。Illumina BeadStudioソフトウェア（Illumina）を用い、該スキャンからシグナル強度の数値を得た。
【０１７６】
データを分位方法に従って正規化し、管理された階層的クラスタ分析を、６人の患者のうち少なくとも３人で治療後に有意に調整されている、４３５個の選択された転写産物に対して行った。調整閾値の割合は、ダウンレギュレートおよびアップレギュレートされた転写産物に対して、各々、０.６および１.５に設定された。他人と違い過ぎる調整特性を示す一の患者はクラスタ分析から除外した。遺伝子特性を分析し、プレディクト・サーチー（登録商標）ソフトウェア（Prediguard）を用いて機能的ネットワークを作製し、遺伝子とコンセプトの間の関連的相関性を同定するのにささげられるデータマイニング生物情報操作を用いて機能的ネットワークを作製した。このツールはＮＣＢＩ  Ｐｕｂｍｅｄ全データベースで毎日アップデートされ、共引用の要約内で、遺伝子−遺伝子または遺伝子−コンセプトの間の関連的相関性を追求する。
【０１７７】
相関性はＮＣＢＩ  ＧＥＯデータベースに蓄積されている転写特性（＞１８０００）を一切合切交互比較して検索され、ＤＢＦ−ＭＣＬアルゴリズムでトランスクリプトーム・ブローサー・ツールを用いて抽出される。さらには、プレディクト・サーチー（登録商標）はＫＥＧＧおよびＢｉｏｃａｒｔａ経路に、ならびにＧＯオントロジーに従って調節された遺伝子の注釈を可能とする。
【０１７８】
管理されていない分析では、管理されていない独立成分分析（ＩＣＡ）を用いて可能性のある分子特性を抽出した。それらの特性をジン・セット・エンリッチメント・アナリシス（ＧＳＥＡ）特性データベースに加え、ＧＳＥＡソフトウェアを用い、マイクロアレイデータにおけるその有意性について試験した。最新のＧＳＥＡの統計学的に有意な分子特性（ＦＤＲ  ｑ値＜０．０５）がそのＧＯ語彙およびＫＥＧＧ経路の豊富化のために注釈が付された。炎症、免疫応答および自己免疫の病状と関連付けられるＧＯ語彙を豊富化する特性が選択された。Ｋｈｉ２試験を用いて、これらの選択された特性が、ＩＬ−２治療のサンプルにて、アップまたはダウンレギュレートされた特性の分布全体と比較して、優先的にアップレギュレートまたはダウンレギュレートされるかどうかを決定した。
【０１７９】
統計的分析
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋の制御性Ｔ細胞の割合の実際の分布が正常であることを前提として、１０人の標体の大きさで、ウィルコクソンの符号付き両側検定を用い、平均対差が４％で、標準偏差の推定量が３％で、０．０５の有意水準（アルファ）の９４％の検出力が達成される。
【０１８０】
基線のＷ９またはポストＩＬ−２の測定値との比較をウィルコクソンの符号付き検定で行った。フリードマン検定のＦ近似を用いて、反復したすべての測定値を交差して比較した［２４］。必要に応じて、臨界領域のフリードマンの統計的近似および複数回の比較を行った［２５］。
【０１８１】
最大値に至るまでの時間（Ｔｍａｘ）を最大Ｔｒｅｇ割合の時間（Ｅｍａｘ）として実験データより直接決定した。
【０１８２】
結果
患者 
１０人の患者を用いた（表１）。男性／女性の割合が５０／５０％で、メディアン（Ｑ１−Ｑ３）の年齢が５８.５（４９.５−６６.２）歳であった。ＭＣ血管炎の臨床症状として、末梢神経障害（ｎ＝８）、紫斑病（ｎ＝８）、無力症（ｎ＝６）、関節痛（ｎ＝３）および腎臓への浸潤（ｎ＝１）［毎日の蛋白尿１.５ｇ、顕微鏡的血尿およびクレアチニン血症７４マイクロモル／Ｌ］が挙げられる。メディアン（Ｑ１−Ｑ３）のクリオグリブリンレベルがあらゆるケースで０.５３（０.２６−２.７７）ｇ／ＬのＩＩ型ＩｇＭカッパである。メディアン（Ｑ１−Ｑ３）のＣ４補体因子のレベルが０.０６５（０.０２−０.１６）ｍｇ／Ｌであり、関節リウマチ因子活性が９０％のケースで存在し、抗核抗体が一の患者にて陽性であった（１／６４０力価）。メディアンＨＣＶウイルス負荷は６.２５（５.５−６.８）の対数コピー数／ｍＬであった；患者は肝硬変ではなかった。
【０１８３】
低用量ＩＬ−２の安全性
治療に対するコンプライアンスは良好であり、全ての患者がＩＬ−２の４つの全ての治療単位を終了した。ＩＬ−２は臨床的かつ生物学的に十分に耐性であった（表１）。顆粒球、赤血球または肝酵素にて有意な変化は実験を通して観察されなかった。無力症（ｎ＝４）、注射部位での一過性局所反応（ｎ＝４）、インフルエンザ様症候群（ｎ＝４）、筋肉痛（ｎ＝１）および高血圧症（ｎ＝１）を含む、ささいな臨床的グレード１の副作用に気づいたに過ぎず、自然に解消した。とりわけ、これらの副作用のいずれも最も低い１.５百万ＩＵ／日のＩＬ−２投与量では生じなかった（表１）。治療およびその後の全体を通して、病原性Ｔ細胞の活性化を示す生物学的または臨床的徴候はなく：血管炎フレアは指摘されず；リンパ系器官の試験はリンパ球増殖活性障害の誘発の示唆を異常なまでに示さず；ＨＣＶウイルス負荷の増加は観察されなかった（表１および図１Ａ）。
【０１８４】
低用量のＩＬ−２のＨＣＶ−ＭＣに対する生物学的および臨床的効能
ＨＣＶウイルス負荷はＩＬ−２の治療期間の間に減少し続け、抗ウイルス治療なしで、Ｗ９で有意に低下した。クリオグリブリン血清中濃度も減少し続け（Ｐ＝０.０１４、Ｗ９）、１.５ＭＩＵの第一のＩＬ−２治療単位の後でＣ４が逆に増加しても（Ｐ＝０.０２７）、なおも減少した（Ｐ＝０.００３）（図１）ＩＬ−２療法で患者は抗核抗体を産生せず、患者＃１では抗核抗体は消滅した。
【０１８５】
ＨＣＶ−ＭＣ血管炎の生物パラメータの改善と一致して（図１）、１０人の患者のうち８人はＩＬ−２療法の後で、紫斑病および関節痛の消失（各々、８／８および３／３の患者）と共に、著しい臨床的改善を示した。患者＃１０にて腎パラメータは正規化された（毎日の蛋白尿＜０.３ｇおよび血尿はなし）。著しい臨床的応答のなかった患者だけがインクルージョンの際に神経障害だけを示す患者であった（ｎ＝２）。
【０１８６】
低用量のＩＬ−２はＣＤ４＋およびＣＤ８＋の制御性Ｔ細胞の劇的な増加を誘発する
ＩＬ−２は循環性ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＣＤ１２７−Ｆｏｘｐ３＋のＴｒｅｇの劇的な増加を誘発した（図２Ａおよび図３）。この群の患者におけるＴｒｅｇの基線％は３.６％±０.２３（平均＋／−標準偏差）であり、正常な値（４.６±０.６）よりも有意に低く、本発明者らが以前に報告した実験と一致するものであった。Ｗ９で、Ｔｒｅｇの割合は、主要な効能の基準となる評価項目に達する、１１.８％±１.９６（Ｐ＝０.００４）であった。特筆すべきは、Ｔｒｅｇの割合は、ＩＬ−２の１.５百万ＩＵの第一の５日の治療単位の後で約２倍に既に増加した（図２Ａ）。治療単位の間の洗い流し間にもＴｒｅｇの割合は増加し続け、その後の治療単位でさらにブーストされた（図２Ａ）。基線値と比較した場合、これらのＴｒｅｇの割合の増加は治療全体を通して統計学的に有意であった（Ｐ＝０.０１６、Ｗ１およびＰ＜０.００１、Ｗ３、６および９）。Ｔｒｅｇの割合のメディアン最大値（Ｅｍａｘ＝１４％）には第三のＩＬ−２治療単位の最後に到達し（メディアン  Ｔｅｍａｘ２.９）、それは基線と比べて１０.３％の増加（Ｅｍａｘ−基線）に相当し、あるいはＴｒｅｇの３５０％増（Ｅｍａｘ／基線）に相当する。治療から離れて（１２９〜１５０日）、Ｔｒｅｇの割合は、正常な血液ドナー値の範囲にある、基線値の２倍で（６.１％±０.５１、Ｐ＝０.００８）、有意に高度に維持された。最後に、本発明者らは、ＩＬ−２増殖性Ｔｒｅｇの機能性を評価し、それらが高度に抑制性であることを見出した（図４）。
【０１８７】
抑制性機能を有するレア−なＣＤ８＋ＣＤ２５ｈｉＦｏｘｐ３＋Ｔ細胞の集団が正常な個体にて検出され得る［２６］（図５）。本発明者らはこれらの細胞をＩＬ−２治療の間にモニター観察し、ＣＤ４＋  Ｔｒｅｇの増加に付随して、その著しい増加を観察した。第一の治療単位の後で、その割合が約５００％まで増加し、治療の間を通して高度を維持した（図２Ａ、表２）。要するに、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔｒｅｇの増加は、ＣＤ４／ＣＤ８の割合を修飾することなく、グローバルなＴｒｅｇ／Ｔｅｆｆの割合の著しい増加をもたらす（図２Ｂ、表２）。
【０１８８】
第一治療単位の直後、Ｂ細胞の全体数はＩＬ−２の治療の間に減少し、治療から一定期間経過後に回復した。この減少は、血管炎の病態生理学に関与するＩｇＤ＋ＣＤ２７＋辺縁帯Ｂ細胞に特に影響を及ぼした［２７］（図２Ｃ、図６）。反対に、ＮＫ細胞にて有意な増加があり、それは第一のＩＬ−２治療単位の後にすでに検出されており、経時的に持続的増加の明瞭な傾向を示し；この増加は、ＩＬ−２の中断の後、速やかに停止した。とりわけ、高レベルの免疫抑制性サイトカインを産生し、細胞傷害性の少ない、ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔＮＫ細胞の特異的な増加があった（図２Ｄ、表２）。
【０１８９】
低用量のＩＬ−２はＰＢＭＣのトランスクリプトーム解析により明らかにされる炎症の広範囲に及ぶ減少を誘発する
本発明者らは、ＩＬ−２の治療単位の前後で、ＰＢＭＣのトランスクリプトームを分析した（図３）。本発明者らは、まず、２セットのデータを直接比較し、２種の条件間でアップレギュレートまたはダウンレギュレートする遺伝子を探す、管理分析を行った。この実験は、ＴｒｅｇおよびＮＫ細胞の機能と関連付けられる遺伝子の発現の増加を示し、同時にＢ細胞機能に関連付けられる遺伝子の発現の減少を示す表現型観察（図示せず）をまず行った。階層的クラスタ分析およびデータマイニング技法は、炎症／酸化ストレスメディエータに関与する遺伝子の発現における顕著な減少を明らかにした（図７Ａ）。ＮＦＫＢ経路はこの制御と大きく関与しているようである（図７Ｂ）。本発明者らはこれらの結果を管理されていない（すなわち、仮定なしで進められる）分析で確認した。この方法で、すべてのＩＬ−２の前−および後−トランスクリプトームデータを一緒に混合し、独立した群のデータの分離を最大にする特性を独立成分分析（ＩＣＡ）に基づき追求した［２８］。次に遺伝子オントロジー（ＧＯ）の語彙および経路（ＧＯＴＰ）を治療前および後の群を区別する特性の中から検索した。アップ−対ダウン−レギュレートされたＧＯＴＰの割合は、炎症で０／２５１（ｐ＝１、３Ｅ−４０）、免疫応答で１６／６８４（ｐ＝３、４Ｅ−９４）およびリンパ球活性化で７７／５５５（ｐ＝７、０Ｅ−４９）であった（図３Ｃ）。反対に、本発明者らは細胞周期と関連付けられるＧＯＴＰに富む１７０１のアップ−および２０８のダウン−レギュレートされた特性を得た（ｐ＝１、５Ｅ−１３８）。無作為に選択された対照語彙を用いて同様を分析を行っても豊富化を示されなかった。
【０１９０】
ついで、同様の分析を、自己免疫、炎症および移植関連の病状、および感染疾患と関連付けられる経路および語彙でＫｙｏｔｏ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅｓ（ＫＥＧＧ）にて行った。これらの特性はＩＬ−２治療の後に優先的にダウンレギュレート（各々、ｐ＝７.６Ｅ−０９およびｐ＝７.６Ｅ−３６）されるのに対して、対照となる病状はダウンレギュレートされなかった。
【０１９１】
【表３】
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【０１９２】
【表４】
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【０１９３】
実施例２：１型糖尿病における低用量のＩＬ−２
本発明者らは、成人Ｔ１Ｄ患者にてＴｒｅｇを安全に誘発しうる最小の活性用量を定めることを目的とした、Ｔ１ＤでのＩＬ−２用量測定臨床試験を開始した。
【０１９４】
ＤＦ−ＩＬ２実験は、プラセボ、０.３、１および３ＭＩＵ／日の用量のプロロイキン（登録商標）（各々、１.５、５および１５ＭＩＵの累積用量）を比較する、二重盲検である。
【０１９５】
該実験の目的は、Ｔ１Ｄと診断されたばかりの患者にて残っている内因性インスリン分泌を保持することであろう。
【０１９６】
患者の主たる特徴：成人、男女、ＷＨＯ−ＡＤＡとしてのＴ１Ｄ診断、診断から最初にＩＬ−２を投与して１２週間に満たない罹患期間、および開始時にＣ−ペプチドが検出可能であることである。
【０１９７】
臨床的に有意義な効果についての現行の推奨事項は、活性な治療薬を用いて、少なくとも膵臓β−細胞塊の保存、すなわち基線と比べてＣ−ペプチドのＡＵＣ０−１２０の維持を標的とすることである。
【０１９８】
２４人すべての患者が含まれる。治験責任者は依然としてＩＬ−２の投与量について分かっていないが、これまでに得られた結果はＩＬ−２が安全であることを示す（いずれの患者においてもＳＡＥはない）。副次的な有害事象（軽い発熱、注射部位での中程度の痛み等）が数人の患者で観察され、以前の臨床実験４０からの安全性のデータに基づき、３ＭＩＵ／日の用量と関連付けられそうである。その治療を終えた最初の１６人の患者について動的なＴｒｅｇの中間分析は、（規制当局からの承諾に従って）その実験を治験責任者に対して盲検とすることなく、独立した統計学者によりなされた。この中間実験は（ｉ）ＩＬ−２がＴ１Ｄ患者にて実際にＴｒｅｇを誘発しうること、および（ｉｉ）１ＭＩＵ／日の用量が２週間以上にわたって持続する良好なＴｒｅｇ応答を誘発することを示す（図８を参照のこと）。
【０１９９】
重要なこととして、Ｃ−ペプチド産生の有意な減少が患者にて検出されなかった。ＭＭＴＴ（混合食耐性検定）の後のＣ−ペプチド測定は、図９Ｂの患者１について示されるように、患者に５日間のＩＬ−２治療を行った２ヶ月後にＣ−ペプチド産生を少なくとも保持し、あるいは時に増加させることを示す（本発明者らはこの患者に投与される投与量を知らないが、治療の間に観察されるＴｒｅｇの増加は該患者がプラセボではなく、ＩＬ−２を受領したことを示すことに留意している）。
【０２００】
成人Ｔ１Ｄ患者を用いるこの第一実験に従って、本発明者らは、＞７歳からの患者（ＤＦ−ＩＬ２−子供）を含めた、子供Ｔ１Ｄについての第二用量測定実験を思いついた。本発明者らは上記した実験の結果に基づいて用量測定実験を精緻化した。一連の用量の０.１２５〜１ＭＩＵ／ｍ２／日（ここで、超低用量と称される）を、耐性およびＴｒｅｇ誘発に関する効能を確認するのに、一年の治療期間にわたって検査した（１６回の注射）。これは、上記した実験よりも１００倍以上少ない、２〜１６ＭＩＵ／ｍ２の累積用量に相当する。
【０２０１】
本発明の臨床結果は、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒの活性化経路が変更されているＴ１Ｄ患者にてＩＬ−２がＴｒｅｇを誘発するのに効果的でないかもしれないとの懸念を払拭する。その結果はまた、使用される用量でＩＬ−２の優れた耐性を確認し、０.５ＭＩＵ／ｍ２／日が、Ｔ１Ｄ患者と診断されたばかりの子供および成人にてＩＬ−２の効能を評価する適切な用量であることを支持する。
【０２０２】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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