(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｍｇ２＋イオン、４種のｄＮＴＰ、ＲＮＡである鋳型核酸、逆転写酵素、ピロホスフェート及びピロホスファターゼを含む、標的ＲＮＡの非特異的逆転写防止のためのホットスタート逆転写反応用組成物。
【請求項２】
前記ピロホスフェートは、０．１ｍＭ〜５ｍＭの濃度で含まれていて、前記ピロホスファターゼは０．００５Ｕ〜０．２５Ｕの量で含まれることを特徴とする請求項１に記載のホットスタート逆転写反応用組成物。
【請求項３】
一つ以上の逆転写プライマーをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のホットスタート逆転写反応用組成物。
【請求項４】
前記組成物は、凍結された状態又は乾燥された状態であることを特徴とする請求項１に記載のホットスタート逆転写反応用組成物。
【請求項５】
前記組成物は、核酸に対して非反応性である染料物質をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のホットスタート逆転写反応用組成物。
【請求項６】
前記組成物は、多価アルコール、ゼラチン、牛血清アルブミン、Ｔｈｅｓｉｔ及びＰＥＧ−８０００で構成された群から選択される一つ以上の物質をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のホットスタート逆転写反応用組成物。
【請求項７】
前記鋳型核酸は、３’末端に核酸重合ターミネーターが結合されて、非特異核酸重合が防止されたことを特徴とする請求項１に記載のホットスタート逆転写反応用組成物。
【請求項８】
前記核酸重合ターミネーターは、核酸重合酵素に作用できるトリホスフェート形態で活性化して、３’末端に水酸基以外の他の残基を持つ核酸類似化合物であることを特徴とする請求項７に記載のホットスタート逆転写反応用組成物。
【請求項９】
前記核酸類似化合物は、２’，３’−ジデオキシヌクレオシド５’−トリホスフェート、３’−デオキシアデノシン５’−トリホスフェート、３’−アジド−３’デオキシチミジン５’−トリホスフェート、１−β−ｄ−アラビノシルヌクレオシド５’−トリホスフェート、アシクログアノシントリホスフェート、３’−アミノ−３’デオキシヌクレオシド５’−トリホスフェート、及び３’−フルオロ−３’デオキシヌクレオシド５’−トリホスフェートから選択される一つ以上であることを特徴とする請求項８に記載のホットスタート逆転写反応用組成物。
【請求項１０】
Ｍｇ２＋イオン、４種のｄＮＴＰ、ＲＮＡである鋳型核酸、逆転写酵素、ピロホスフェート及びピロホスファターゼを含み、ＤＮＡ重合酵素をさらに含む、標的ＲＮＡの非特異的逆転写防止のためのホットスタート逆転写ＰＣＲ用組成物。
【請求項１１】
前記ピロホスフェートは、最終反応液を基準に０．１ｍＭ〜５ｍＭの濃度で含まれていて、前記ピロホスファターゼは０．００５Ｕ〜０．２５Ｕの量で含まれることを特徴とする請求項１０に記載のホットスタート逆転写ＰＣＲ用組成物。
【請求項１２】
一つ以上の逆転写プライマーをさらに含むことを特徴とする請求項１０に記載のホットスタート逆転写ＰＣＲ用組成物。
【請求項１３】
前記組成物は、プローブをさらに含むことを特徴とする請求項１０に記載のホットスタート逆転写ＰＣＲ用組成物。
【請求項１４】
前記組成物は、凍結された状態又は乾燥された状態であることを特徴とする請求項１０に記載のホットスタート逆転写ＰＣＲ用組成物。
【請求項１５】
前記組成物は、ＤＮＡに結合する蛍光染料をさらに含むことを特徴とする請求項１０に記載のホットスタート逆転写ＰＣＲ用組成物。
【請求項１６】
前記ＤＮＡ重合酵素は、５’−＞３’エキソヌクレアーゼ活性を持つ重合酵素、３’−＞５’エキソヌクレアーゼ活性を持つ重合酵素、及び５’−＞３’エキソヌクレアーゼ活性と３’−＞５’エキソヌクレアーゼ活性がない重合酵素で構成された群から選択される一つ以上であることを特徴とする請求項１０に記載のホットスタート逆転写ＰＣＲ用組成物。
【請求項１７】
前記組成物は、核酸に対して非反応性である染料物質をさらに含むことを特徴とする請求項１０に記載のホットスタート逆転写ＰＣＲ用組成物。
【請求項１８】
前記鋳型核酸は、３’末端に核酸重合ターミネーターが結合されて、非特異核酸重合が防止されたことを特徴とする請求項１０に記載のホットスタート逆転写ＰＣＲ用組成物。
【請求項１９】
前記核酸重合ターミネーターは、核酸重合酵素に作用できるトリホスフェート形態で活性化して、３’末端に水酸基以外の他の残基を持つ核酸類似化合物であることを特徴とする請求項１８に記載のホットスタート逆転写ＰＣＲ用組成物。
【請求項２０】
前記核酸類似化合物は、２’，３’−ジデオキシヌクレオシド５’−トリホスフェート、３’−デオキシアデノシン５’−トリホスフェート、３’−アジド−３’デオキシチミジン５’−トリホスフェート、１−β−ｄ−アラビノシルヌクレオシド５’−トリホスフェート、アシクログアノシントリホスフェート、３’−アミノ−３’デオキシヌクレオシド５’−トリホスフェート、及び３’−フルオロ−３’デオキシヌクレオシド５’−トリホスフェートから選択される一つ以上であることを特徴とする請求項１９に記載のホットスタート逆転写ＰＣＲ用組成物。
【請求項２１】
前記組成物は、多価アルコール、ゼラチン、牛血清アルブミン、Ｔｈｅｓｉｔ及びＰＥＧ−８０００で構成された群から選択される一つ以上の物質をさらに含むことを特徴とする請求項１０に記載のホットスタート逆転写ＰＣＲ用組成物。
【請求項２２】
前記組成物は、ＤＮＡ重合酵素と結合するか、ＤＮＡ重合酵素の作用を調節して、ホットスタートＰＣＲ効果を持つ物質をさらに含むことを特徴とする請求項１０に記載のホットスタート逆転写ＰＣＲ用組成物。
【請求項２３】
前記ＤＮＡ重合酵素は、変形された形態で、ホットスタートＰＣＲ効果を持つことを特徴とする請求項１０に記載のホットスタート逆転写ＰＣＲ用組成物。
【請求項２４】
前記物質は、ＤＮＡ重合酵素に結合する抗体、アプタマー及びアフィボディで構成された群から選択されることを特徴とする請求項２３に記載のホットスタート逆転写ＰＣＲ用組成物。
【請求項２５】
前記組成物は、多重（マルチプレックス）逆転写ＰＣＲ反応、リアルタイム逆転写ＰＣＲ反応、リアルタイム定量的逆転写ＰＣＲ反応及びマルチプレックスリアルタイム逆転写ＰＣＲ反応中いずれか一つの逆転写ＰＣＲ反応に用いられることを特徴とする請求項１０に記載のホットスタート逆転写ＰＣＲ用組成物。
【請求項２６】
前記組成物は、癌診断のための組成物であることを特徴とする請求項１０〜２５のいずれか一項に記載のホットスタート逆転写ＰＣＲ用組成物。
【請求項２７】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のホットスタート逆転写反応用組成物を一つの反応チューブ内に提供する段階を含むホットスタート逆転写反応用組成物の製造方法。
【請求項２８】
請求項１０〜２５のいずれか一項に記載のホットスタート逆転写ＰＣＲ用組成物を一つの反応チューブ内に提供する段階を含むホットスタート逆転写ＰＣＲ用組成物の製造方法。
【請求項２９】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のホットスタート逆転写反応用組成物を含むホットスタート逆転写反応用キット。
【請求項３０】
請求項１０〜２５のいずれか一項に記載のホットスタート逆転写ＰＣＲ用組成物を含むホットスタート逆転写ＰＣＲ用キット。
【請求項３１】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のホットスタート逆転写反応用組成物に鋳型ＲＮＡを含有した試料を混合する段階と、
前記反応混合物が逆転写されるように反応を行う段階と、を含む鋳型ＲＮＡの逆転写方法。
【請求項３２】
請求項１０〜２５のいずれか一項に記載のホットスタート逆転写ＰＣＲ用組成物に鋳型ＲＮＡを含有した試料を混合する段階と、
前記反応混合物が増幅されるように反応を行う段階と、
前記増幅産物を分析する段階と、を含む核酸増幅方法。
【請求項３３】
前記ＰＣＲは、ＰＣＲ、多重ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、又はリアルタイム定量的ＰＣＲ反応で構成された群から選択されることを特徴とする請求項３２に記載の核酸増幅方法。
【請求項３４】
３’末端に核酸重合ターミネーターが結合されて、非特異核酸重合が防止された鋳型核酸、Ｍｇ２＋イオン、４種のｄＮＴＰ、逆転写酵素、核酸、ｃＤＮＡ合成用プライマー、ピロホスフェート、ピロホスファターゼ及び癌診断用バイオマーカー増幅用プライマーを含む癌診断用逆転写ＰＣＲ用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホットスタート（Hot Start）逆転写反応又はホットスタート逆転写重合酵素連鎖反応用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
逆転写反応は、ランダムプライマーを用いる方法と標的特異的なプライマーを用いる方法に分けられる。ＲＮＡウイルスなどを検出する診断キットなどといった特定標的を検出する逆転写反応では、標的特異的なプライマーを用いることがより高い敏感度を示しており、一般的に利用されている。このような逆転写反応において、特異度（specificity）及び敏感度（sensitivity）は、標的ＲＮＡ配列に選択的に結合するプライマーの高い選択性によって決定される。しかし、逆転写反応実行時に反応に必要な全ての成分は、室温で混合されるため、この条件で非特異的なプライミング（priming）により非特異逆転写反応が発生することになる。常温でも逆転写酵素の活性が高いため、非特異プライミングが発生して、これに伴う不特定多数のｃＤＮＡが生成されるため、非特異的な増幅反応を増加させる主な要因になる。このような非特異的逆転写反応によって、続くＰＣＲ反応に必要なプライマー及び制限された濃度の他の必要成分が消費されたため、結果的に競争的な阻害剤として作用することになる。非特異的逆転写反応は、低濃度のＲＮＡを検出する際に問題となって、特に、細胞や体液から抽出した塩基配列複雑度が高いＲＮＡを多量含んでいる溶液で相対的に極少量で存在する標的ＲＮＡの検出の妨げになる。これにより、低濃度で存在するウイルスや遺伝子を検出し難くする。また、種々のプライマーを同時に用いて多重逆転写反応を行うに当たっても、特異度を落として多重検出を難しくさせる原因になっている。このような非特異的な増幅は、標的核酸の絶対的な量よりも標的核酸と生体試料から由来した他の核酸との相対的な量に大きく影響される。それは、反応物内に所望の標的以外に多くのＲＮＡが存在するようになると、プライマーの非特異的な混成化が増えることになって、非特異的な反応が起きるためである。
【０００３】
このような望まない非特異的逆転写反応と増幅を減らすために、様々な試みが行われている。プライマーをより標的に強く混成化させて、特定標的の検出限界を高めようと試みた。例えば、プライマーの５’末端をＬＮＡに置き換えて、より強く標的に混成化されるようにすることによって、結果的に非特異増幅を減らせるようにする方法が報告された（Malgoyre A. et al., Biochem Biophys Res Commun. Mar 2, 2007; 354(1):246-52）。特殊なプライマー構造で問題を解決するための他の方法でプライマーダイマーを防ぐ方法も開発された。逆転写反応段階において、特に低い温度で逆転写反応を行う際にプライマーの間の部分的な混成化によって重合が進行されて、ダイマー形成が起きて、これは逆転写反応で敏感度を急激に落とす重要な原因中の一つになる。これを解決するために、プライマーが低温度で５’の塩基配列のうち五つの塩基がヘアピンを形成できるように相補的な塩基配列をもっと増やして形成させたプライマーを用いることが開発された（JiYoung Hong et al., Virol J. 2011; 8: 330. Published online 2011，韓国特許第１０−０９８７３５２号）。しかし、このようなロックプライマー方法は、５’に追加的に入った塩基配列によって高い混成化温度を持つことになるため、続くＰＣＲ反応で塩基配列が類似する非特異的標的に対して非特異的な混成化が誘導でき、混成化段階でも内部のヘアピン構造によって効率性が落ちる問題を有している。
【０００４】
このような問題を解決するために、プライマーに部分的に相補的であって、３’末端がブロッキングされたブロッキングプライマーを用いる方法が開発された。このブロッキングプライマーは、３’がブロッキングされており、核酸重合反応にプライマーとして作用しないだけでなく長さが短くて常温でだけプライマーに混成化されて、プライマーダイマーの形成を妨げて、続く反応で温度が上がると、直ちに落ちて作動しないので、インスタント逆転写ＰＣＲを行える長所がある（韓国特許出願１０−２０１１−００１７２２６号）。
【０００５】
また、より標的ＲＮＡに特異的な混成化のために、高温で逆転写反応を実施する方法が開発された。高温で混成化されるプライマーを用いて高温でも作動する逆転写重合酵素を利用して７０℃のような高温でｃＤＮＡを合成すると、より特異的に増幅できると発表された（Fuchs B, et al., Mol Biotechnol, 1999 Oct; 12(3):237-40）。
【０００６】
多重逆転写ＰＣＲでは特異度がより重要である。いくつかのプライマーが反応に用いられるため、逆転写反応段階での非特異的な反応によって、続くＰＣＲ反応でも非特異的な反応が起きうるからである。このような非特異反応を避けるために、多重逆転写ＰＣＲでは、一般的に逆転写反応とＰＣＲ反応を分離して、まず逆転写反応を行った後、ＰＣＲを行えばより特異的に反応させることができる。しかし、この場合、反応チューブを再び開けて、溶液を加えなければならないため、煩わしいだけでなく反応チューブを開けて操作する過程で汚染の可能性もさらに高く、一般的に一つのチューブ内で逆転写反応とＰＣＲをひきつづき実施することが好まれる。これのために、あるチューブでチューブを開けずに逆転写ＰＣＲを行いながらも物理的にそれぞれの反応を分離する方法として、逆転写反応物は、チューブの底にあって、ＰＣＲ反応物は、蓋にぶら下げて反応させる方法も開発された。チューブで逆転写反応をさせる間に、ＰＣＲ反応物は、蓋にぶら下がって反応せずにいて、逆転写反応が終わってから、反応チューブを遠心分離機で遠心分離して、反応チューブの蓋にぶら下がっているＰＣＲ溶液を逆転写反応物と混ぜた後、ＰＣＲを行う方法である（Rodney Mark Ratcliff, et al., 2002 November; 40(11):40914099. doi: 10.1128/JCM.40.11.4091-4099.2002）。
【０００７】
一般的な逆転写反応で現れるこのような問題を解決するための努力の結果として、「ホットスタート逆転写反応」が開発された。ホットスタート逆転写反応は、極少量の標的ＲＮＡを検出するための方法であって、プライマーが正確に相補的な塩基配列のＲＮＡに対してだけプライミングがおこりうる高温度条件で逆転写反応が開始できるようにして、室温で発生する非特異的プライミング及びそれによる非特異的なプライマーのオリゴマー化を防ぐことによって逆転写反応の特異性を増加させる効果的な方法である。これを実現するために、耐熱性重合酵素とアプタマーを用いる方法が開発されて常用化されている。ロッシュ社のＬｉｇｈＣｙｃｌｅｒ−ＲＮＡ  ｍａｓｔｅｒ  Ｋｉｔｓは、Ｔｔｈ  ＤＮＡ重合酵素とアプタマーを用いる方法である。Ｔｔｈ  ＤＮＡ重合酵素は、ＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを重合する機能とＤＮＡを鋳型としてＤＮＡを重合する機能を兼ね備えた酵素である。ここに用いられたアプタマーは、Ｔｔｈ  ＤＮＡ重合酵素の反応部位に付着していて、常温では活性を持たない。反応溶液の温度を高温に上げると、アプタマーの３次構造が変形されて、Ｔｔｈ  ＤＮＡ重合酵素から離脱することによって活性を持つようになり、高温で特異的に標的ＲＮＡにプライミングされたものを対象に逆転写反応を行い、引き続きＰＣＲを行うことができる。その他にも、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＡｃｃｕＲＴ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＲＮＡ  ＰＣＲ  ｋｉｔ（オプライドバイオシステム社）は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｐｅｃｉｅ  Ｚ０５から由来した耐熱性重合酵素であって、前記Ｔｔｈ  ＤＮＡ重合酵素のように逆転写反応とＰＣＲを一つの酵素を利用して行うことができる。そして、ここに特異的なアプタマーを利用して反応を行う。このような製品は、アプタマーを利用して常温で酵素活性を阻害することによって非特異的な逆転写反応を減少させて、逆転写ＰＣＲの非特異的な増幅を減らすことができる。しかし、アプタマーは、高温になると３次構造が変形されるが、再び温度を下げると、本来の構造に戻ってＤＮＡ重合酵素を阻害する。すなわち、可逆的な阻害を行う問題点を有している。前記ＧｅｎｅＡｍｐ  ＡｃｃｕＲＴ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＲＮＡ  ＰＣＲ  ｋｉｔの場合、５５℃でも依然としてアプタマーがＤＮＡ重合酵素に付着しており、６５℃になって完全に離れると説明されている。このため、一般的に多く用いられるプライマーのアニール温度が５５℃以下である反応では、ＤＮＡ重合酵素の活性が阻害されてＰＣＲ効率を低下させる問題点がある。そこで、ここではＴｔｈ  ＤＮＡ重合酵素のような逆転写機能を有した耐熱性ＤＮＡ重合酵素を用いる。このような耐熱性ＤＮＡ重合酵素は、酵素活性が維持される後続ＰＣＲ過程の間、逆転写反応機能を有していて、持続的な非特異的逆転写反応を起こして、非特異的増幅を起こす問題点がある。
【０００８】
抗体を利用したホットスタートＰＣＲ反応法は、Ｔａｑ  ＤＮＡ重合酵素にだけ適用可能な方法で（Enneth, G. et al., 1994, Biotechnology, 12; 506-509）、他の種類の逆転写重合酵素を利用してホットスタート逆転写反応をおこなうためには、高温で耐える耐熱性逆転写酵素がなければならなく、逆転写ＰＣＲの場合に低温で離れる逆転写酵素特異抗体と、高温で離れるＤＮＡ重合酵素に対する抗体がそれぞれ必要なため、それぞれの耐熱性重合酵素に対する特異的な抗体を開発しなければならないので、現実的に難しい技術的限界がある。
【０００９】
本発明者等は、ホットスタートＰＣＲのために、ピロホスフェート（pyrophosphate、ＰＰｉ）及び耐熱性ピロホスファターゼ（pyrophosphatase、ＰＰａｓｅ）を利用したホットスタートＰＣＲ方法を開発した（韓国特許登録第１０−０２９２８８３号）。この方法は、ＤＮＡ重合に必須のマグネシウムイオンと強く結合するＰＰｉを添加して、常温で重合酵素反応を抑制した後、高温でＰＰａｓｅを反応させてＰＰｉを除去することによって反応を開始させるのが原理である。逆転写酵素は、低い活性温度によって、抗体によるホットスタート方法を適用することはできない。従来抗体によるホットスタートＰＣＲ方法は、低温では酵素と抗体の結合によって酵素の活性を抑制する方法で、高温に到達時に抗体の安定性低下によって、酵素との結合を失うことでＰＣＲ反応が実行されるものである。逆転写酵素は、ＤＮＡ重合酵素とは異なって、高温での熱安定性を持たない。抗体の結合を失わせるために高温に到達すると、逆転写酵素の活性を抑制する要因になる。このような問題を解決するために、ＰＰｉ及びＰＰａｓｅを利用したホットスタート逆転写反応方法は、ＤＮＡ重合酵素の種類と関係なく一般的に適用できて、ＰＣＲ時ｄＮＴＰから発生するＰＰｉを持続的に除去することによって、持続的に反応性を維持させることができる長所がある。しかし、この方法を利用して、ホットスタートＰＣＲマスターミックス（mastermix）溶液を作っておけば、低温でもＰＰａｓｅがＭｇ２＋イオンから徐々にＰＰｉを分解して、ＤＮＡ重合酵素の活性が現れるようになり、望むホットスタートＰＣＲ反応効果を失う結果が発生する。また、ＰＰａｓｅは、非常に不安定であるため、逆転写反応マスターミックス溶液を作っておけば、常温又は、４℃でＰＰａｓｅの活性が長くは続かない問題がある。そこで、安全性を高めるために乾燥された形態の混合物を開発した（韓国特許登録第１０−１０９８７６４号）。したがって、前記のようなホットスタート逆転写反応の問題点を解決するために、より高感度のホットスタート逆転写及び逆転写ＰＣＲに対する技術が必要であるのが現状である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、ピロホスフェート（ＰＰｉ）及びピロホスファターゼ（ＰＰａｓｅ）を用いたホットスタート逆転写反応又はホットスタート逆転写ＰＣＲ用組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記目的を達成するために、本発明はＭｇ２＋イオン、４種のｄＮＴＰ、逆転写酵素、ＰＰｉ及びＰＰａｓｅを含むホットスタート逆転写反応用組成物を提供する。
【００１２】
さらに本発明は、Ｍｇ２＋イオン、４種のｄＮＴＰ、逆転写酵素、ピロホスフェート及びピロホスファターゼを含み、ＤＮＡ重合酵素をさらに含むホットスタート逆転写ＰＣＲ用組成物を提供する。
【００１３】
さらに本発明は、前記ホットスタート逆転写反応用組成物を一つの反応チューブ内に提供する段階を含むホットスタート逆転写反応用組成物の製造方法を提供する。
【００１４】
さらに本発明は、前記ホットスタート逆転写反応用組成物を含むホットスタート逆転写反応用キットを提供する。
【００１５】
さらに本発明は、前記ホットスタート逆転写ＰＣＲ用組成物に鋳型ＲＮＡを含有した試料を混合する段階と、前記反応混合物が増幅されるように反応を行う段階と、前記増幅産物を分析する段階と、を含む核酸増幅方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＰＰｉによる逆転写反応抑制効果を示す図面。レーン１、２、３及び４：それぞれ逆転写反応実行時にＲＮＡ濃度を１００ｎｇ、１０ｎｇ、１ｎｇ及び１００ｐｇを用いたもの；Ａ：陽性対照群で、ＰＰｉが添加されず逆転写反応後ＰＣＲ反応を行ったもの；Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦ：ＰＰｉを各濃度毎に添加して逆転写反応後、ＰＣＲ反応を異なったもの；及びレーンＭ：ＰＣＲ産物の大きさを確認できる１００ｂｐ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ（バイオニア社製、韓国）。
【図２】ＰＰｉを二つのポスフェートで加水分解するＰＰａｓｅを添加することによって逆転写反応が再活性化する効果を示す図面。レーン１、２、３及び４：それぞれ逆転写反応実行時ＲＮＡ濃度を１００ｎｇ、１０ｎｇ、１ｎｇ及び１００ｐｇを用いたもの；Ａ：陽性対照群で、ＰＰｉが添加されず逆転写反応後ＰＣＲを行ったもの；Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦ：ＰＰｉを各濃度毎に添加したもの；及びＢ−１、Ｃ−１、Ｄ−１、Ｅ−１及びＦ−１：ＰＰａｓｅを添加して逆転写反応後、ＰＣＲ反応を行ったもの；レーンＭ：１ｋｂ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｄｅｒ。
【図３】ＰＰｉ及びＰＰａｓｅの添加がリアルタイム逆転写ＰＣＲに及ぼす影響を示す図面。レーン１、２、３及び４：それぞれ１００ｎｇ、１０ｎｇ、１ｎｇ及び１００ｐｇのヒト総ＲＮＡを用いてリアルタイム逆転写ＰＣＲを行ったもの。
【図４】ホットスタート逆転写反応を介して、Ｃ型肝炎ウイルスＲＮＡを検出した結果を示す図面。
【図５】図５Ａは、リアルタイム逆転写ＰＣＲでＰＰｉ及びＰＰａｓｅによる非特異的反応が抑制される効果を示す図面。Ａ：ホットスタート逆転写機能がない反応物を用いたもの；Ｂ：Ａの反応物に１μｇのヒト細胞総ＲＮＡを添加したもの；Ｃ：ＰＰｉ及びＰＰａｓｅを用いたホットスタート逆転写機能が含まれた反応物；及びＤ：Ｃの反応物に１μｇのヒト細胞総ＲＮＡを添加したもの。図５Ｂは、リアルタイム逆転写ＰＣＲを介して得られた産物を２％のアガロースゲルに電気泳動した結果を示す図面。レーン１、２、３、４、５及び６：１０６、１０５、１０４、１０３、１０２及び１０コピー数の鋳型Ｃ型感染ウイルスＲＮＡを用いて得られた産物；Ａ：ホットスタート逆転写機能がない反応物を用いたもの；Ｂ：Ａの反応物に１μｇのヒト細胞総ＲＮＡを添加したもの；Ｃ：ＰＰｉ及びＰＰａｓｅを用いたホットスタート逆転写機能が含まれた反応物；及びＤ：Ｃの反応物に１μｇのヒト細胞総ＲＮＡを添加したもの。
【図６】図６Ａは、リアルタイム逆転写ＰＣＲでホットスタート逆転写反応を用いたものとＴａｑ抗体を利用したものとの非特異的反応抑制効果を比較して示す図面。Ａ：Ｔａｑ抗体を用いたホットスタートＰＣＲ反応物にホットスタート逆転写機能がない反応物を用いたもの；Ｂ：Ａの反応物に１μｇのヒト細胞総ＲＮＡを添加したもの；Ｃ：ＰＰｉ及びＰＰａｓｅを用いてホットスタートＰＣＲ反応にホットスタート逆転写機能が含まれた反応物；及びＤ：Ｃの反応物に１μｇのヒト細胞総ＲＮＡを添加したもの。図６Ｂは、リアルタイム逆転写ＰＣＲを介して得られた産物を２％のアガロースゲルに電気泳動した結果を示す図面。レーン１、２、３、４、５及び６：１０６、１０５、１０４、１０３、１０２及び１０コピー数の鋳型Ｃ型感染ウイルスＲＮＡを用いて得られた産物；Ａ：Ｔａｑ抗体を用いたホットスタートＰＣＲ反応物にホットスタート逆転写機能がない反応物を用いたもの；Ｂ：Ａの反応物に１μｇのヒト細胞総ＲＮＡを添加したもの；Ｃ：ＰＰｉ及びＰＰａｓｅを用いてホットスタートＰＣＲ反応にホットスタート逆転写機能が含まれた反応物；及びＤ：Ｃの反応物に１μｇのヒト細胞総ＲＮＡを添加したもの。
【図７】図７Ａ及び図７Ｃは、リアルタイム逆転写ＰＣＲにおいて逆転写反応及び逆転写ＰＣＲ用組成物が溶液状態と乾燥状態で同等な性能を維持することをリアルタイム逆転写ＰＣＲのグラフとして示した図面（図７Ａ：溶液状態、図７Ｃ：乾燥状態）。図７Ｂ及び図７Ｄは、リアルタイム逆転写ＰＣＲにおいて逆転写反応及び逆転写ＰＣＲ用組成物が溶液状態と乾燥状態で同等な性能を維持することをリアルタイム逆転写ＰＣＲグラフの標準曲線で示す図面（図７Ｂ：溶液状態、図７Ｄ：乾燥状態）。
【図８】図８Ａは、乾燥状態の逆転写反応及び逆転写ＰＣＲ用組成物の保管期間に応じた安定性試験のために、液体状態の混合物である対照群を用いてリアルタイム逆転写ＰＣＲを行ったグラフを示す図面。図８Ｂは、乾燥状態の混合物の保管安定性試験のために乾燥した混合物を５０℃に保管した後、一日間隔で計５日間の保管期間に対してリアルタイム逆転写ＰＣＲを行ったグラフを示す図面。１日から５日：５０℃で総保管された日数。
【図９】図９Ａは、５’側６個の塩基配列が不一致のプライマーを用いたリアルタイム逆転写重合酵素反応を行ったもの。図９Ｂは、中間６個の塩基配列が不一致のプライマーを用いたリアルタイム逆転写重合酵素反応を行ったもの。ホットスタート逆転写ＰＣＲ反応物でテンプレートと非特異的なプライマーの結合を抑制することに対しリアルタイム逆転写ＰＣＲを行ったグラフを示す図面。
【図１０】図１０Ａ及び図１０Ｂは、ホットスタート逆転写ＰＣＲ反応を介してＲＮＡ一塩基多型分析に対してリアルタイム逆転写ＰＣＲを行ったグラフを示す図面。Ａは、正確に一致する塩基配列を持つプライマーを用いたものであり、Ｂは、単一塩基配列が不一致なプライマーを用いたものである。
【図１１】ホットスタート逆転写反応がＲＮＡ−ＲＮＡセルフプライミングによる非特異的反応を抑制することに対してリアルタイム逆転写ＰＣＲを行ったグラフを示す図面。図１１で、Ａは、逆転写反応なしにＲＮＡだけを添加してリアルタイム重合酵素反応を行ったものであり、Ｂは、逆転写反応時プライマーを添加して逆転写反応後リアルタイム重合酵素反応を行ったグラフを示す図面である。Ｂ−Ａは、ホットスタート逆転写反応物で行ったものであり、Ｂ−Ｂは、ホットスタート逆転写機能がない反応物行ったグラフを示した図面である。Ｃは、ホットスタート逆転写機能がない反応液にＲＮＡだけ入れて逆転写反応後、リアルタイム重合酵素反応を行ったグラフを示した図面である。Ｄは、ホットスタート逆転写反応物にＲＮＡだけ入れて逆転写反応後、リアルタイム重合酵素反応を行ったグラフを示した図面である。
【図１２】ＲＮＡターミネーションによって逆転写反応でＲＮＡ−ＲＮＡセルフプライミング反応を抑制することに対してリアルタイム逆転写ＰＣＲを行ったグラフを示した図面。ＡとＢは、ターミネーションさせなかったＲＮＡを用いたもので、ＣとＤは、ターミネーション反応をしたＲＮＡを用いたものである。ＡとＣは、一般的な逆転写反応を行って、ＢとＤはホットスタート逆転写反応を行ったグラフを示した図面である。
【図１３】図１３Ａは、ヒーラ細胞で抽出したＲＮＡを利用して癌マーカーであるケラチン８を検出したものであり、定量分析をするために抽出したＲＮＡを順次１０倍ずつ希釈してスタンダードカーブを作るためのリアルタイム逆転写ＰＣＲ反応を行ったグラフを示す図面。図１３Ｂ、図１３Ｃ、図１３Ｄ、及び図１３Ｅは、ＲＮＡターミネーションとホットスタート逆転写ＰＣＲ反応を介して癌マーカーに対する検出限界を向上させたことに対してリアルタイム逆転写ＰＣＲを行ったグラフを示した図面。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
一観点において、本発明は、Ｍｇ２＋イオン、４種のｄＮＴＰ、逆転写酵素、ＰＰｉ及びＰＰａｓｅを含むホットスタート逆転写反応用組成物に関する。
【００１８】
前記逆転写酵素は、公示された任意の逆転写酵素を特に制限なく用いられ、商業的に市販されているＡＭＶ又はＭＭＬＶなどが通常用いられる。
【００１９】
前記ＰＰａｓｅは、市販される通常のＰＰａｓｅが制限なく用いられ、Ｂ３５（Thermus thermophilus B35）由来の無機ピロホスファターゼ遺伝子をクローン化した大腸菌から由来したティーティーイ（Ｔｔｅ）−無機ピロホスファターゼ（Ｓｉｂｚｙｍｅ社）、又はフィクロピルストリダス（Picrophilus torridus、バイオニア社）由来の無機ピロホスファターゼ遺伝子をクローン化した大腸菌から由来したプト（Ｐｔｏ）−無機ピロホスファターゼを用いることが好ましい。前記プト（Ｐｔｏ）−無機ピロホスファターゼ酵素の１Ｕは１分間ピロホスフェートからポスフェート４０ｎｍｏｌｅを生成するのに必要な酵素の量で定義されて、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．０ｍＭ  ＰＰｉを用いて、反応体積を０．５にして、７０℃で１０分間の反応で確認する。
【００２０】
前記組成物に含まれるＰＰｉは、最終反応液を基準に０．１ｍＭ〜５．０ｍＭの濃度に加えられ、好ましくは０．２〜３．０ｍＭである。ＰＰｉ濃度が５．０ｍＭより高い場合には、比例してＰＰａｓｅの濃度も高く適用しなければならず、この場合逆転写反応産物の量が減少しうる。また、ＰＰｉ濃度が０．１ｍＭより低い場合には、逆転写反応組成物のうちのＭｇ２＋イオンを捕集する能力が落ちて、非特異的プライミング（mispriming）による非特異的産物の生成を抑制する効果が得られない。また、ＰＰａｓｅは、逆転写反応混合物にＰＰｉが０．１ｍＭ〜５ｍＭである時、０．００５Ｕ〜０．２５Ｕを含ませて用いることがより好ましい。ＰＰａｓｅ使用濃度は、ＰＰｉ０．１ｍＭ当たり０．００５Ｕを用い、それを超える場合には高いコピー数の鋳型の適用時では、低いコピー数の鋳型の適用時より高い濃度でその結果が確認されて、逆転写反応性が減少して反応産物が顕著に減少され、ＰＰａｓｅ処理濃度がＰＰｉ０．１ｍＭ当たり０．００５Ｕ未満の場合には逆転写反応を阻害する問題点がある。
【００２１】
前記反応用緩衝溶液は、１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、４０ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ９．０を用いることが好ましく、前記４種のｄＮＴＰは、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰを示す。前記組成物は、必要に応じてプライマー、鋳型核酸など逆転写反応に必要な物質をさらに含んでもよい。前記プライマーは、ランダムプライマー又は鋳型核酸に特異的なプライマーであってもよく、前記鋳型核酸は、逆転写反応を必要とするＲＮＡであることが好ましい。追加的に、前記組成物は、蛍光染料を包含してもよく、前記蛍光染料は、ＳｙＢｒ  Ｇｒｅｅｎ、ＥｔＢｒ及びＨＲｄｙｅで構成された群から選択されてもよい。
【００２２】
本発明の逆転写反応用組成物は、逆転写プライマーをさらに包含してもよく、逆転写プライマーは、鋳型ＲＮＡにアニールして逆転写が行えるプライマーであれば、制限なく用いられ、ポリＡプライマーや、鋳型ＲＮＡに特異的なプライマーなどを全部用いることができる。
【００２３】
一方、本発明の逆転写反応用組成物は、実験上の便宜、逆転写反応産物による汚染防止、逆転写反応酵素とｄＮＴＰの安定化及び反応性の向上のために核酸に対して非反応性である染料物質及び／又は、多価アルコール類を含んでもよい。
【００２４】
前記「非反応性染料物質」とは、逆転写反応に影響を及ぼさない物質から選択されるべきで、逆転写反応産物を利用したＰＣＲ反応分析や識別のために用いられることを目的とする。このような条件を満たす物質としては、ローダミン、ＴＡＭＲＡ、ラックス（lax）、ブロモフェノールブルー（bromophenol blue）、キシレンシアノール（xylene cyanole）、ブロモクレゾールレッド（bromocresol red）、クレゾールレッド（cresol red）等の水溶性染料が挙げられ、この中でもキシレンシアノールを用いることが好ましい。前記非反応性染料物質は、全組成物に対して０．０００１〜０．０１重量％の含有量で含まれるし、０．００１〜０．００５重量％の含有量で含まれることが好ましく、０．００１〜０．００３重量％の含有量で含まれることがより好ましい。仮に、前記非反応性染料物質が、０．０００１重量％未満の含有量で添加される場合には、逆転写反応後の分析のためのアガロースゲル電気泳動時染料の濃度が低く、試料の移動を目視で観測しにくい問題点があって、非反応性染料物質が０．０１重量％超の含有量で添加される場合には、逆転写反応時に高濃度の水溶性染料が反応阻害剤として作用する問題点がある。また、アガロースゲルへの沈降された後、電気泳動時試料の移動を邪魔する問題点がある。
【００２５】
また、前記多価アルコール類は、本発明の組成物をより安定化させるための追加安定化物質として用いられ、グルコース、グリセロール、マンニトール、カラクシトール、クルシトール、ソルビトールの中の一つ以上の物質を用いることが好ましい。前記多価アルコール類は、１０〜５００ｍＭの含有量で含まれ、５０〜３００ｍＭの含有量で含まれることが好ましい。仮に、多価アルコール類が、５００ｍＭを超えることになれば、水溶性重合体自らの溶解度によって水溶液で溶解しにくく、高粘度によって十分混合され難く、体積が必要以上大きくなって、逆転写反応のために遺伝子溶液と滅菌された蒸溜水で溶解時に溶解し難い。また、逆転写反応時に高濃度の水溶性重合体が反応阻害剤として作用しうる問題点がある。そして、１０ｍＭ未満なら、対象酵素と表面水分子を十分コーティングして保護できないので、効率的な酵素の安定化効果を期待するのが難しく、また、溶液の粘度が低すぎてチューブ底面全体に広く拡がるため、理想的な形態で乾燥できない問題点と酵素が十分保護できない問題点がある。本発明では、多価アルコール類の他にも安定化物質として、ゼラチン、牛血清アルブミン、Ｔｈｅｓｉｔ、ＰＥＧ−８０００を用いることが可能である。
【００２６】
前記組成物は、安定性、保管の簡便性及び長期保管性を増加させるために、凍結したり乾燥された状態であることが好ましい。前記乾燥は一般的な常温乾燥、加温乾燥、例えば４０℃〜６０℃での加温乾燥、又は、凍結乾燥、減圧乾燥のような公示の乾燥方法によって実行され、組成物の成分が失われない限り、任意の乾燥方法はいずれも使用可能である。前記のような乾燥方法は、用いられる酵素の種類及び量によって異なるように適用され、本発明では、好ましくは凍結乾燥又は、真空遠心分離を利用した減圧乾燥方法が用いられる。
【００２７】
前記ホットスタート逆転写ＰＣＲ用組成物は、前記反応混合物を一つの反応チューブ内に混合させた後、すぐに凍結したり乾燥させることによって安定化された状態で製造することができる。
【００２８】
前記反応混合物は、必要に応じてプライマー、プローブ、鋳型核酸、蛍光染料、非反応性の染料物質及び／又は多価アルコール類などをさらに含んでもよい。
【００２９】
前記ＤＮＡ重合酵素は、公示された任意のＤＮＡ重合酵素を特に制限なく用いられ、この中でも５’−＞３’エキソヌクレアーゼ活性を持つ重合酵素、３’−＞５’エキソヌクレアーゼ活性を持つ重合酵素、及び５’−＞３’エキソヌクレアーゼ活性と３’−＞５’エキソヌクレアーゼ活性がない重合酵素を単独で用いるか、又は、前記ＤＮＡ重合酵素を組み合わせて用いることができる。前記５’−＞３’エキソヌクレアーゼ活性を持つ重合酵素の例は、Ｔａｑ  ＤＮＡ重合酵素、３’−＞５’エキソヌクレアーゼ活性を持つ重合酵素の例は、Ｐｆｕ  ＤＮＡ重合酵素又はＴＬＡ  ＤＮＡ重合酵素（バイオニア社）、５’−＞３’エキソヌクレアーゼ活性と３’−＞５’エキソヌクレアーゼ活性がない重合酵素の例は、Ｔｏｐ  ＤＮＡ重合酵素（バイオニア社）を含んでもよい。ＤＮＡ重合酵素は、逆転写ＰＣＲ用組成物に０．１〜１０Ｕ（unit）、好ましくは０．５〜２Ｕ、最も好ましくは１Ｕの濃度で含ませて用いる。前記Ｔａｑ、Ｐｆｕ、Ｔｏｐ及びＴＬＡ  ＤＮＡ重合酵素は下記表１のような特性を持つ。
【００３０】
【表１】
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【００３１】
また、前記逆転写ＰＣＲ用組成物は通常の逆転写ＰＣＲ反応以外にも多重逆転写ＰＣＲ反応、リアルタイム逆転写ＰＣＲ反応、リアルタイム定量的逆転写ＰＣＲ反応、又は多重リアルタイム逆転写ＰＣＲ反応といった任意の核酸増幅方法が制限されず用いられる。
【００３２】
本発明において、前記逆転写ＰＣＲ用組成物は、ＤＮＡ重合酵素と結合するか、ＤＮＡ重合酵素の作用を調節して、ホットスタートＰＣＲ効果を持つ物質をさらに含むことを特徴とし、前記物質は、ＤＮＡ重合酵素に結合する抗体、アプタマー及びアフィボディ（Affibody）で構成された群から選択されることを特徴とする。
【００３３】
本発明において、前記ＤＮＡ重合酵素は、変形された形態で、このような重合酵素自体を用いることで、ホットスタートＰＣＲ効果を持つことができるようにすることを特徴とし、このような酵素の例は、Ｔｔｈ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅがあり、これに対して限定されるものではない。
【００３４】
本発明に用いられるＰＰａｓｅは、好ましくは７０℃以上の高温でも熱に安定した熱安定性酵素であり、逆転写及びＰＣＲ過程の間、熱に安定して、特にＰＰａｓｅは、逆転写重合酵素及びＤＮＡ重合酵素が反応する温度条件と類似して酵素活性を示す。そのため、混合過程で逆転写反応及びＰＣＲを防止して、プライマーが特異的に混成化される温度以上で一定時間ＰＰａｓｅを反応させてＰＰｉを分解させることによって、逆転写酵素が活性化しながら逆転写反応がプライマーの混成化温度から始まって非特異的なｃＤＮＡ合成を取り除くことができるようにする。また、ＤＮＡ重合酵素が混成化されると、非特異的な核酸増幅を防止する。結果的に、既存の逆転写及び逆転写ＰＣＲに比べて選択性が大きく増加するだけでなく、極微量の標的核酸を成功的に検出することができる。ここで、ＰＰｉ及びＰＰａｓｅを含む本発明のホットスタート逆転写反応及び逆転写ＰＣＲ反応用組成物は、従来の逆転写反応が持っていた非特異的逆転写反応とその後に続く非特異的ＰＣＲ増幅の問題点を解決したため、煩わしいことなく望む標的産物だけを選択的に増幅させて、正確な増幅結果を得ることができる安定した組成物である。
【００３５】
すなわち、本発明のホットスタート逆転写反応用組成物は、従来に報告されて常用化された種々の逆転写反応組成物と比較して下記のような利点がある：
１）本発明のホットスタート逆転写ＰＣＲ反応用組成物は、標的ＲＮＡが反応液の全ＲＮＡ中に極微量含まれている場合でも、選択的に標的ＲＮＡを逆転写反応させて、標的核酸に特異的にＰＣＲ増幅を行うことによって、極微量のＲＮＡウイルス検出や癌関連ＲＮＡ遺伝子分析を可能にする；
２）非特異的プライミングによる増幅産物の生成を防止するので、多様な標的に対する逆転写ＰＣＲ反応を同時に行う多重逆転写ＰＣＲ反応を行うことにおいて多様な標的を同時に検出することができる。
３）本発明に用いられる全ての逆転写ＰＣＲ反応の反応混合物構成成分は、一つの混合物で製造して用いることによって、逆転写ＰＣＲの間に別途の混合過程が必要ないので、反応中混合による誤りを防止することができる。非特異的ＰＣＲ産物の発生除去、実験上の便宜、逆転写ＰＣＲ反応産物による汚染防止、逆転写重合酵素、ＤＮＡ重合酵素及びｄＮＴＰの安定化及び反応性を向上させることができる。
４）核酸に安定化剤を一緒に混ぜて用いる場合、使用性及び安定性がより一層増加して保存し易い。
【００３６】
本発明の好ましい実現例において、本発明者等は、従来に非特異的に起きる逆転写反応の問題点を改善して、ホットスタート逆転写反応を標的特異的に行おうと、望むＲＮＡだけをｃＤＮＡで合成して、このように合成されたｃＤＮＡに対して特異的なＰＣＲ反応を行うことによって望むＲＮＡを高感度で増幅するために、ＰＰｉ及びＰＰａｓｅを逆転写反応に用いた。具体的に、逆転写重合酵素を含む逆転写反応混合物に０．５ｍＭ〜２．０ｍＭ濃度、好ましくは２．０ｍＭ濃度のＰＰｉ、及び０．００５Ｕ〜０．２５Ｕ濃度、好ましくは０．１Ｕ濃度のＰＰａｓｅを添加した後、４２℃で６０分間逆転写反応を実施した。その結果、ＰＰａｓｅを添加しなかった場合には、ＰＰｉによって逆転写反応が抑制された（図１参照）、一方ＰＰｉ及びＰＰａｓｅを添加した場合、逆転写及びＰＣＲ反応が活性化して、反応産物の量が増加したことが分かった（図２及び図３参照）。また、ＰＰｉ及びＰＰａｓｅを用いてＣ型肝炎ウイルスの遺伝子を増幅した結果、鋳型ＲＮＡは、１０１０〜１０のコピー数まで全検出が可能であって（図４参照）、前記Ｃ型肝炎ウイルスの鋳型ＲＮＡ以外のヒト細胞から抽出した総ＲＮＡを混合した結果、前記ヒト由来ＲＮＡによる非特異的反応が抑制されることを確認し、標的以外のＲＮＡによって反応効率減少、敏感度及び検出能力に変化がないことを確認した。一方、ＰＰｉ及びＰＰａｓｅがない場合には、添加したヒト由来ＲＮＡによって非特異的な反応が起きた（図５Ａ及び５Ｂ参照）。また、本発明のホットスタート逆転写ＰＣＲ方法は、既存のＴａｑ抗体を用いたホットスタートＰＣＲ方法と比較して、非特異的な反応が顕著に減少することによって、１０コピー数まで高感度で標的ＲＮＡだけを検出することを確認した（図６Ａ及び６Ｂ参照）。それと共に、本発明のホットスタート逆転写ＰＣＲ用組成物の安定性及び保管貯蔵性を高めるために、前記組成物を乾燥させて、乾燥された組成物は、乾燥しなかった組成物と比較して類似の反応性及び増幅結果を安定的に得られることが確認された（図７〜８参照）。
【００３７】
したがって、前記ホットスタート逆転写反応用組成物及びこれを利用した逆転写ＰＣＲ用組成物を用いてＲＮＡを対象に高感度の逆転写及び逆転写ＰＣＲを行うことが可能であるため、各種ウイルス検査及び癌遺伝子発現検査などＲＮＡ増幅を対象にする遺伝子増幅技術に有用に用いられる。
【００３８】
本発明では、ターゲット核酸を検出するためのＰＣＲ反応又はリアルタイム定量ＰＣＲ反応など核酸増幅検査で、鋳型核酸自体が非特異的にセルフプライミングされて、主に増幅されることによって問題が発生するのを防止するために、鋳型核酸に重合反応を終結させる物質と核酸重合酵素を添加して、ターミネーション反応させることによって鋳型核酸がプライマーとして作用できなくして、ターゲット核酸だけを増幅して高感度で検出できる方法をさらに用いてもよい。
【００３９】
したがって、本発明はさらに、３’末端に核酸重合ターミネーターが結合されて、非特異核酸重合が防止された鋳型核酸を含むことを特徴とし、前記核酸重合ターミネーターは、核酸重合酵素に作用できるトリホスフェート形態で活性化して、３’に水酸基以外の他の残基を持つ核酸類似化合物であることを特徴とする。
【００４０】
本発明で用いられる核酸重合ターミネーターが結合されて、非特異核酸重合が防止された鋳型核酸は、次の核酸準備方法を経て製造される：１）核酸重合酵素、酵素反応緩衝溶液、及び核酸重合ターミネーターを含む反応混合物を利用して、鋳型核酸の３’末端をターミネーション（termination）させる段階；及び２）前記反応混合物から核酸重合ターミネーターを不活化又は除去させる段階。
【００４１】
前記核酸準備方法は、より詳細には、１）核酸を含む生物学的試料から核酸を分離精製する段階；２）核酸重合酵素、酵素反応緩衝溶液、及び核酸重合ターミネーターを含む反応混合物を利用して、前記１）段階の分離精製された鋳型核酸の３’末端をターミネーションさせる段階；及び３）前記３’末端がターミネーションされた核酸を含む反応混合物から核酸重合ターミネーターを不活化又は除去させる段階；を含む方法を介して準備することができる。
【００４２】
本発明に記載された核酸準備方法は、通常の公示された自動核酸抽出装置が用いられ、例えば、韓国登録特許１０−０１４８２３９号、米国特許第５７０２５９０号、米国特許第５６４７９９４号、欧州特許第０６９１５４１号、米国特許第５３３６７６０号、米国特許第５８９７７８３号、米国特許第６１８７２７０号、韓国特許出願１０−２００８−００３２９０４号に記載された装置が用いられる。またバイオニア社のＥｘｉＰｒｅｐ（商標）  １６−ｆｕｌｌｙ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ＤＮＡ／ＲＮＡ／Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍが本発明の自動核酸抽出装置として好ましく用いられる。
【００４３】
本発明において、試料は、ポリヌクレオチドである核酸を含む任意植物、動物、細菌又は、ウイルスから由来するサンプルで構成される。
【００４４】
本発明において、前記核酸は、ＲＮＡ又はＤＮＡで、前記核酸重合酵素は、ＤＮＡ又はＲＮＡの３’末端にそれ以上重合が進めららないようにターミネーターを付けることができるいずれの核酸重合酵素を含む。
【００４５】
より詳細には、本発明の核酸重合酵素は、３’→５’エキソヌクレアーゼ（exonuclease）活性を有していないので、ターミネーターを再び加水分解しないことが好ましく、より好ましくは９０℃以上の高温で酵素力価を失った方が良い。前記核酸重合酵素は、ＲＮＡ−依存性ＲＮＡ−重合酵素、ＲＮＡ−依存性ＤＮＡ−重合酵素、ＤＮＡ−重合酵素、及びＲＮＡ−重合酵素から選択される一つ以上を含んでもよい。
【００４６】
本発明で「核酸重合ターミネーター」とは、核酸がそれ以上増えないようにいずれの鋳型核酸切片の重合反応を終結させる物質のことをいい、鋳型核酸切片の末端に結合されてさらに多くの核酸鎖伸長（chain elongation）が起きることができなくする物質をいう。
【００４７】
本発明で「ターミネーション」とは「前記核酸重合ターミネーター」を核酸の３’末端に共有結合させ、それ以上核酸重合反応を行うことができないようにするを意味し、ここで用いられる物質をターミネーター（terminator）と定義する。
【００４８】
より詳細には、本発明で言及される「ターミネーション」とは、核酸の３’位置にヒドロキシ（hydroxy）基がないか、重合酵素による重合反応を進むことができない化学基を持つ物質を核酸の３’末端に共有結合されて、それ以上核酸重合反応を進められないようにすることを意味し、ここで用いられる物質をターミネーターと定義する。
【００４９】
本発明において、前記核酸重合ターミネーターは、核酸重合酵素に作用できるトリホスフェート形態で活性化した核酸類似化合物であり、核酸が連結される３’水酸基が欠如したか他のものに置き換えられた多種のヌクレオチドトリホスフェートが用いられ、それぞれの核酸重合酵素と反応性が良い核酸重合ターミネーターを選択して用いることができる。
【００５０】
本発明において、前記核酸類似化合物は、２’，３’−ジデオキシヌクレオシド５’−トリホスフェート（2’, 3’-dideoxynucleoside 5’-triphosphate）、３’−デオキシアデノシン５’−トリホスフェート（3’-deoxyadenosine 5’-triphosphate）、３’−アジド−３’デオキシチミジン５’−トリホスフェート（3’-azido-3’-deoxythymidine5’-triphosphate）、１−β−ｄ−アラビノシルヌクレオシド５’−トリホスフェート（1-β-d-Arabinofuranosylnucleoside 5’-Triphosphate）、アシクログアノシントリホスフェート（acyclo-guanosine triphosphate）、３’−アミノ−３’デオキシヌクレオシド５’−トリホスフェート（3’-amino-2’-deoxynucleoside 5’-triphosphate）、及び３’−フルオロ−３’デオキシヌクレオシド５’−トリホスフェート（3’-fluoro-3’-deoxynucleoside 5’-triphosphate）から選択される一つ以上を用いることができる。
【００５１】
より詳細には、大腸菌や耐熱性細菌から由来したＤＮＡ−重合酵素は、サンガーによって開発されたｄｉｄｅｏｘｙ塩基配列決定法で多く用いられてきたジデオキシヌクレオチドトリホスフェート（2’, 3’-dideoxynuclreotide triphosphate、ｄｄＮＴＰ）を用いることができる。
【００５２】
本発明において、前記ジデオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄｄＮＴＰ）は、ジデオキシグアノシントリホスフェート（ｄｄＧＴＰ）、ジデオキシアデノシントリホスフェート（ｄｄＡＴＰ）、ジデオキシチミジントリホスフェート（ｄｄＴＴＰ）及びジデオキシシチジントリホスフェート（ｄｄＣＴＰ）から選択される一つ以上を含んでも良い。
【００５３】
前記デオキシヌクレオシドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）は、グアノシン、アデノシン、チミジン、ウリジン及びシチジンから選択される一つ以上を含んでも良い。
【００５４】
それの例示として、ＤＮＡ−重合酵素を利用してターミネーション反応させるためには、多様な核酸重合ターミネーターが用いられる。哺乳動物由来のＤＮＡ−重合酵素を用いる場合、この酵素に反応性が高い５’−Ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ  １−β−ｄ−Ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅや５’−Ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ９−β−ｄ−Ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｙｌａｄｅｎｉｎｅが用いられる（Inhibition of Mammalian DNA Polymerase by the 5’-Triphosphate of 1-β-d-Arabinofuranosylcytosine and the 5’-Triphosphate of 9-β-d-Arabinofuranosyladenine, J. J. Furth, and Seymour S. Cohen, Cancer Res October 1968 28; 2061）。
【００５５】
また、ウイルス由来のＤＮＡ−重合酵素を阻害する抗ウイルス剤としてい多く用いられてきた非環式核酸（acyclonucleoside）のトリポスフェートも核酸重合ターミネーターとして用いられる（Inhibition of herpes simplex virus-induced DNA polymerase activity and viral DNA replication by 9-(2-hydroxyethoxymethyl)guanine and its triphosphate. P A Furman, M H St Clair, J A Fyfe, J L Rideout, P M Keller and G B Elion, J. Virol. October 1979 vol. 32 no. 1 72-77）。
【００５６】
さらに他の例示として、ＲＮＡ重合酵素であるＰｏｌｙ  Ａ重合酵素は、ＲＮＡの３’末端にアデノシンを付ける酵素として、本発明の核酸重合ターミネーション反応によく合う酵素である。前記酵素を用いる場合には、ｐｏｌｙ  Ａ重合酵素の阻害剤として知られている３’−デオキシアデノシントリホスフェート（３’−ｄＡＴＰ、ｃｏｒｄｙｃｅｐｉｎ）が用いられる。
【００５７】
本発明において、前記２）の段階は、１）の段階後、未反応核酸重合ターミネーターを不活化又は除去する過程であり、前記核酸重合ターミネーターの不活化は、重合に用いられる各種核酸重合ターミネーターのトリホスフェート結合を加水分解できる多様な酵素をいずれも用いることができる。
【００５８】
より詳細には、核酸重合ターミネーターの不活化は、前記核酸重合ターミネーターを加水分解して不活化させた後、酵素の機能がなくなるべきであるため、熱によって簡単に活性を失った方が良い。これは、引き続く逆転写反応やＰＣＲ反応のヌクレオチドトリホスフェートを分解しないためである。
【００５９】
例えば、前記ポスホ結合加水分解酵素は、トリホスフェートを分解する気質特性を有しているアルカリラインホスファターゼとして、ＢＡＰ（Bacterial Alkaline Phosphatase）とＣＩＰ（calf intestinal phosphatase）等が用いられ、より好ましくは熱によって簡単に不活化されるＣＩＰを用いることが好ましい。
【００６０】
また、ピロホスフェートとＡＴＰなどを加水分解する多様な生物体、すなわち、大腸菌由来、牛の小腸由来、海老由来のアルカリ性ホスファターゼ、Ａｕｔｏｔａｘｉｎ（Clair T, Lee HY, Liotta LA, Stracke ML (1997). “Autotaxin is an exoenzyme possessing 5’-nucleotide phosphodiesterase/ATP pyrophosphatase and ATPase activities”. J. Biol. Chem. 272(2): 996-1001. doi:10.1074/jbc.272.2.996. PMID 8995394.）も用いられる。ヌクレオシドトリホスフェートを非特異的に分解する黄色葡萄状球菌アデノシン合成酵素（Staphylococcus aureus adenosine synthase；ＡｄｓＡ）が用いられる。
【００６１】
本発明に係る核酸準備方法は、核酸分離精製過程を行って、連続して核酸重合酵素と核酸重合ターミネーターを抽出された核酸に加えることによって相補核酸の重合反応を終結させて、鋳型核酸による非特異プライミングを除去することができる。前記反応後、未反応核酸重合ターミネーターは、引き続く重合連鎖反応やＰＣＲ反応の阻害剤として作用するので、未反応核酸重合ターミネーターの除去段階が必要である。
【００６２】
前記核酸重合ターミネーターの除去は、ｇｅｌ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、又はｃａｏｔｒｏｐｉｃ  ａｇｅｎｔ及びシルリカビーズを利用することができ、これに限定されるものではない。
【００６３】
本発明に係る核酸準備方法は、公示の自動核酸抽出装置及び遺伝子増幅装置を統合的に管理する公示の核酸分析統合装置が用いられ、好ましくは前記Ｅｘｉｐｒｅｐ  １６  ＤＸ（（株）バイオニア）製品が用いられるが、これに限定されるものではない。
【００６４】
より詳細には、核酸分離精製過程を行って、連続して核酸重合酵素と核酸重合ターミネーターを抽出された核酸に加えて核酸重合ターミネーション反応をさせて、いずれの核酸のプライミングの機能を不活化させることができる。反応後残っているターミネーターは、引き続く逆転写反応やＰＣＲ反応の阻害剤として作用するので、これを除去するためには二つの方法を用いることができる。
【００６５】
前記二つの方法は、前記Ｅｘｉｐｒｅｐ  １６  ＤＸ（（株）バイオニア）装備を用いて再びＲＮＡ精製を行う方法と、核酸重合ターミネーターを分解させてそれ以上反応ができないようにする方法である。
【００６６】
前記装備を用いて精製を行う方法は、カオトロピック試薬（caotropic agent）存在下にシリカ磁性粒子に付けて再び洗浄と溶出する方法であり、複数の段階を経るので時間がかかり、この過程で精製されたＲＮＡの損失が発生する問題点がある。それに対して、活性化した核酸重合ターミネーターであるヌクレオチドトリホスフェートを加水分解酵素でジ又はモノトリヌクレオチドに分解して、不活化させる方法は、簡単かつ速く、収率を落とさないために長所が多い。
【００６７】
前記酵素を用いた不活化方法をより詳しく記述すると、Ｅｘｉｐｒｅｐ  １６  ＤＸの磁性粒子を捕集している溶出段階に用いられるウェルは、温度が調節可能なウェルであり、溶出バッファーで溶出させた後、ここにトリホスフェート加水分解酵素であるアルカリ性ホスファターゼ、オートタキシン、黄色葡萄状球菌アデノシン合成酵素（Staphylococcus aureus adenosine synthase；ＡｄｓＡ）を加えて３７℃で反応させることによって簡単にターミネーター除去反応をさせることができる長所を有している。
【００６８】
他の観点において、本発明は、ホットスタート逆転写反応用組成物又はホットスタート逆転写ＰＣＲ用組成物の製造方法に関する。
【００６９】
前記製造方法は具体的に、一つの反応チューブ内に反応用緩衝溶液、ＭｇＣｌ２、４種のｄＮＴＰ、逆転写重合酵素、ＰＰｉ及びＰＰａｓｅからなる反応混合物を提供する段階を含み、特にホットスタート逆転写ＰＣＲ用組成物の製造においては前記反応混合物にＤＮＡ重合酵素をさらに含む。
【００７０】
前記ＤＮＡ重合酵素は、５’−＞３’エキソヌクレアーゼ活性を持つ重合酵素、３’−＞５’エキソヌクレアーゼ活性を持つ重合酵素及び５’−＞３’エキソヌクレアーゼ活性と３’−＞５’エキソヌクレアーゼ活性がない重合酵素で構成された群から選択される一つ又はそれ以上であってもよい。
【００７１】
前記方法において、前記反応混合物の安定性及び長期保管性を増加させるために、凍結、又は乾燥させることによって、乾燥した状態の組成物を形成させる段階をさらに含むことが好ましいが、これに限定されない。
【００７２】
前記ＰＰｉは、最終反応液を基準に０．１ｍＭ〜５ｍＭの濃度、好ましくは０．５ｍＭ〜２．０ｍＭの濃度で含まれることがより好ましく、前記ピロホスファターゼはＰＰｉ０．１ｍＭ当たり０．００５Ｕ〜０．２５Ｕの量で含まれることがさらに好ましいがこれに限定されない。
【００７３】
加えて、前記反応混合物には一つ以上のプライマー又はプローブ、ＤＮＡに結合する蛍光染料、鋳型核酸、核酸に対して非反応性である染料物質、又は、多価アルコール、ゼラチン、牛血清アルブミン、Ｔｈｅｓｉｔ及びＰＥＧ−８０００で構成された群から選択される一つ以上の物質を含んでもよい。この時、前記蛍光染料は、ＳｙＢｒ  Ｇｒｅｅｎ、ＥｔＢｒ及びＨＲｄｙｅからなる群で選択されて、前記染料物質は、ローダミン、ＴＡＭＲＡ、ラックス、ブロモフェノールブルー、キシレンシアノール、ブロモクレゾールレッド、クレゾールレッドで構成された群から選択される一つ以上の物質であってもよい。
【００７４】
また、本発明は、前記ホットスタート逆転写反応用組成物を含むホットスタート逆転写反応用キットに関する。
【００７５】
また、本発明は、前記ホットスタート逆転写ＰＣＲ用組成物を含むホットスタート逆転写ＰＣＲ用キットに関する。
【００７６】
前記キットは、通常の逆転写反応用キット又は逆転写ＰＣＲ用キットの製造方法により製造することができる。
【００７７】
また他の観点において、本発明は、前記ホットスタート逆転写反応用組成物に鋳型ＲＮＡを含有した試料を混合する段階と、前記反応混合物が逆転写されるように反応を行う段階と、を含む鋳型ＲＮＡの逆転写方法に関する。
【００７８】
また、本発明は、前記ホットスタート逆転写ＰＣＲ用組成物に鋳型ＲＮＡを含有した試料を混合する段階と、前記反応混合物が増幅されるように反応を行う段階と、前記増幅産物を分析する段階と、を含む核酸増幅方法に関する。
【００７９】
この時、前記逆転写ＰＣＲ反応は、多重逆転写ＰＣＲ、リアルタイム逆転写ＰＣＲ及びリアルタイム定量的逆転写ＰＣＲ共に可能である。
【００８０】
本発明の好ましい実現例において、前記鋳型核酸は、逆転写及びＰＣＲを介して核酸増幅が起きうるＲＮＡであることが好ましい。
【００８１】
本発明のホットスタート逆転写反応用組成物及びこれを利用した逆転写ＰＣＲ用組成物は、反応用緩衝溶液、ＭｇＣｌ２、４種のｄＮＴＰ及び逆転写重合酵素を含む逆転写反応混合物にＰＰｉ及びＰＰａｓｅを追加することによって、常温の混合過程で逆転写反応を防止して、プライマーが特異的に混成化される温度以上で一定時間ＰＰａｓｅを反応させてＰＰｉを分解させて、逆転写酵素を活性化させるので、逆転写反応がプライマーの混成化温度から始まって非特異的なｃＤＮＡ合成を除去することができる。したがって、既存の逆転写反応に比べて選択性が顕著に増加するだけでなく、極微量の標的ＲＮＡも検出することができる効果がある。その上、前記組成物を凍結するか、安定化剤を添加して乾燥することによって、従来組成物に比べて安定的でかつ手軽に用いることできるため、より安定化されたホットスタート逆転写反応用組成物として有用に用いることができる。
【００８２】
本発明の一様態では、鋳型ＲＮＡと正確に一致した逆方向プライマーと鋳型ＲＮＡと不一致な塩基配列を持つプライマーを利用したＰＰｉ及びＰＰａｓｅを添加したホットスタート逆転写反応を行い、その結果、鋳型ＲＮＡと正確に一致した逆方向プライマーでは増幅産物が検出されたが、不一致な塩基配列を持つ逆方向プライマーでは検出されなかった。それに対して、ＰＰｉ及びＰＰａｓｅがないホットスタート逆転写反応は、不一致な塩基配列を持つ逆方向プライマーでも検出されることが確認された。
【００８３】
本発明の他の様態では、本発明のホットスタート逆転写ＰＣＲ反応を利用して、ターゲットＲＮＡに対する一塩基多型を分析して、ＰＰｉ及びＰＰａｓｅを添加したホットスタート逆転写反応の場合、鋳型ＲＮＡと正確に一致するプライマーを用いた結果と単一塩基が不一致な逆方向プライマーを用いた結果でＰＣＲ効率差が現れた。それに対して、ＰＰｉ及びＰＰａｓｅがないホットスタート逆転写反応は、正確に一致する逆方向プライマーと単一塩基配列が異なる逆方向プライマーとの間にＰＣＲ効率差なしに同じサイクルで検出された。これは、リアルタイムＰＣＲ方法を利用した一塩基多型分析において、本発明に係るホットスタート逆転写反応は、一塩基多型分析が可能であるが、ホットスタート逆転写反応がない反応物では一塩基多型分析が難しいことが言える。
【００８４】
本発明のさらに他の様態では、本発明に係るホットスタート逆転写ＰＣＲ反応を利用した抽出された核酸に含まれている単一螺旋核酸によるセルフプライミングによって現れる非特異的な反応を抑制する効果を確認した結果、ホットスタート逆転写反応は、ホットスタート機能がない反応液（ＰＰｉ及びＰＰａｓｅが除外された）よりセルフプライミングによる非特異的反応に対して抑制になることが確認された。
【００８５】
本発明のさらに他の様態では、ＲＮＡターミネーションを介したＲＮＡセルフプライミングによる非特異逆転写重合連鎖反応抑制効果を確認した。ｐｏｌｙ（Ａ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅと３’−デオキシアデノシン５’−トリホスフェート（３’−ｄＡＴＰ）を用いて抽出されたＲＮＡの３’末端をターミネーションさせて鋳型として用いた場合、ターミネーションさせなかったＲＮＡでは、あるプライマーを入れなくてもｃＤＮＡが作られることが確認された。これは、セルフプライミングによってｃＤＮＡが合成されたので、ＰＣＲで増幅されたのである。尚、ホットスタート逆転写重合連鎖反応でも非特異的なｃＤＮＡ合成と引き続くＰＣＲ増幅を防ごうとしても、完ぺきに阻害できなくて部分的にだけＲＮＡセルフプライミングによる逆転写重合連鎖反応を阻害させることができて、Ｃｔ値が約５程度遅らせて１／３０程度で反応を阻害させることができた。
【００８６】
しかし、ＲＮＡの３’末端をターミネーションした試料でいずれの逆転写重合酵素連鎖反応で４５ｃｙｃｌｅまで増幅されないことによって全くｃＤＮＡが合成されないことが確認された。前記結果は、逆転写重合酵素連鎖反応物混合時に多くの非特異逆転写重合酵素連鎖反応が起きて、これによって多くの非特異ｃＤＮＡが作られることが分かる。尚、前記結果から望まない反応は、ホットスタート逆転写重合酵素連鎖反応だけで抑制できないことが確認できて、結果的にこのようなＲＮＡセルフプライミングによる非特異逆転写重合酵素連鎖反応は、本発明のターミネーション反応を利用して遮断することによって完ぺきに抑制させる可能性があることを確認することができた。
【００８７】
本発明のさらに他の様態では、本発明のホットスタートＰＣＲを利用する場合、癌マーカー検出限界が向上することが確認された。
【００８８】
癌マーカーとしては、ホモサピエンスケラチン８（ＫＲＴ８）で、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ、米国）を通じて塩基配列情報を確認し、ヒト細胞腫であるヒーラＣ細胞でＲＮＡを抽出して、ＲＮＡターミネーション反応を行った。その結果、ＲＮＡターミネーション反応を行ったサンプルでは、ホットスタート逆転写反応はヒト血清１ｍＬに１０個のヒーラ細胞を添加したサンプルにまで検出された。ホットスタート逆転写反応機能がない反応液では、ヒーラ細胞１００個を添加したサンプルでだけ検出された。ＲＮＡターミネーションさせなかったサンプルでは、ホットスタート逆転写反応液は、ヒーラ細胞１００個を添加したサンプルにまで検出された。ホットスタート逆転写機能がない反応液では、ヒーラ細胞１，０００個を添加したサンプルにまで検出された。
【００８９】
したがって、ホットスタート逆転写反応だけでも検出限界が向上したが、ＲＮＡターミネーションと共に行った時より良い効果を確認することができた。
以下、本発明を実施例によってより一層詳細に説明する。
但し、下記の実施例は、本発明を例示するだけのものであって、本発明の内容が下記の実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００９０】
＜実施例１＞ＰＰｉによる逆転写反応抑制効果確認
ＰＰｉによって逆転写反応が抑制される条件を確認するために、マグネシウムイオンを１．５ｍＭに固定して、ＰＰｉを種々の濃度で添加して逆転写反応した後、その産物を利用してＰＣＲを行った。これのために、Ａｃｃｕｐｏｗｅｒ  ＲＴ  Ｐｒｅｍｉｘ（（株）バイオニア、韓国）にＰＰｉを０．５ｍＭ〜２ｍＭの濃度で添加して、逆転写反応及びＰＣＲを行った。逆転写反応はヒト細胞腫の中の一つであるヒーラ（Hela）細胞から抽出したＲＮＡをそれぞれ１００ｎｇ、１０ｎｇ、１ｎｇ又は、１００ｐｇを添加し、ＰＰｉ濃度を０、０．５、１、１．５、２又は２．５ｍＭになるべくそれぞれ添加して、逆転写反応を行った。逆転写反応はＡｃｃｕｐｏｗｅｒ  ＲＴ  Ｐｒｅｍｉｘ（（株）バイオニア、韓国）の最適温度である４２℃で６０分間１回行って、逆転写酵素の不活性のために９５℃で５分間１回行った。逆転写反応を介して得られた産物２０μＬ中５μＬをＡｃｃｕｐｏｗｅｒ  ＰＣＲ  Ｐｒｅｍｉｘ（（株）バイオニア、韓国）に添加して、ヒトＧＡＰＤＨプライマー塩基配列を標的にして、ＧＡＰＤＨ正方向プライマー５’−ＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣ−３’（配列番号１）及びＧＡＰＤＨ逆方向プライマー５’−ＧＣＣＡＡＡＴＴＣＧＴＴＧＴＣＡＴＡＣＣ−３’（配列番号２）を設計及び合成して、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は９５℃で５分間予備変成した後、９５℃で２０秒、５５℃で４０秒、７２℃で６０秒の過程を１回にして、計３０回を行って、最終伸長を７２℃で５分間行った。ＰＣＲ反応から収得された生成物をアガロースゲルにＤＮＡ分子量マーカーと共に電気泳動した後、エチジウムブロミド（ethidium bromide）で染色し、ポラロイドカメラでＰＣＲ反応によって増幅されたＤＮＡバンドを撮影した。陽性対照群としてＰＰｉが添加されなかったＲＴ  ＰｒｅＭｉｘ（（株）バイオニア、韓国）を利用して生成された産物を利用してＰＣＲ反応を行った。
その結果、ＰＰｉが添加された対照群では０，５ｍＭから逆転写反応が抑制されることが確認でき、２ｍＭまでＰＰｉを添加することによってよりはっきりと逆転写反応を抑制することが確認された（図１）。
【００９１】
＜実施例２＞ＰＰｉを二つのポスフェートに加水分解するＰＰａｓｅによる逆転写反応の確認
前記＜実施例１＞に示された結果と同様に、ＰＰｉを添加することによって逆転写反応がなされないことが確認されたので、このように抑制された逆転写反応に対してＰＰｉを二つのポスフェートに分解するピロリン酸加水分解酵素であるＰＰａｓｅを添加して逆転写反応の活性化を確認しようと試みた。具体的に、前記＜実施例１＞と同様にＰＰｉが添加された条件で、０．１ＵのＰＰａｓｅを添加して４２℃で６０分間ＰＰｉ酵素反応と逆転写反応を同時に行った後、逆転写酵素の不活性のために、９５℃で５分間放置した後、引き続きＰＣＲを行った。
その結果、ＰＰａｓｅを添加した場合、ＰＣＲ活性化されてＰＣＲ産物の量が最も多いことが確認された（図２）。
【００９２】
＜実施例３＞ＰＰｉ及びＰＰａｓｅの添加によるリアルタイム逆転写ＰＣＲの確認
リアルタイム逆転写ＰＣＲでＰＰｉ及びＰＰａｓｅが添加された組成物による反応を確認するために、２Ｘ  ＰＣＲ  ＰｒｅＭｉｘ溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ９．０、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、それぞれ２５０ｕＭの４種類のｄＮＴＰ、１Ｕ  ｔａｑ  ＤＮＡ重合酵素、２００Ｕ逆転写重合酵素、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０及び安定化剤を含む）に２ｍＭのＰＰｉ及び０．１ＵのＰＰａｓｅを添加して一つの反応に２５μＬ体積で実施した。ヒトＧＡＰＤＨを標的遺伝子にして、正方向プライマー５’−ＣＧＴＧＧＡＡＧＧＡＣＴＣＡＴＧＡＣＣＡＣＡ−３’（配列番号３）、逆方向プライマーＧＣＣＴＴＧＧＣＡＧＣＧＣＣＡＧＴＡＧＡ−３’（配列番号４）及びＧＡＰＤＨプローブ５’−ＣＴＧＴＧＧＡＴＧＧＣＣＣＣＴＣＣＧＧＧＡＡＡ−３’（配列番号５）をそれぞれ合成し、各１０ｎＭになるべく添加した。鋳型ＲＮＡとしては、ヒーラ細胞から抽出した総ＲＮＡを各１００ｎｇ、１０ｎｇ、１ｎｇ又は１００ｐｇの濃度で用いた。その次に、最終体積５０μＬになるべく蒸溜水を添加した。リアルタイム逆転写ＰＣＲは、Ｅｘｉｃｙｃｌｅｒ  ９６  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｂｌｏｃｋ（（株）バイオニア、韓国）を利用して行って、反応条件は５０℃で１５分間逆転写反応した後、９５℃で５分間予備変成段階を経て、９５℃で５秒間の変成段階、６０℃で５秒間のアニール段階及び７２℃で６秒間の伸長段階、蛍光を検出するスキャン段階の同時反応を１サイクルにして計４５サイクルを行った。
その結果、ＰＰｉ及びＰＰａｓｅによってリアルタイム逆転写ＰＣＲに影響を与えないことが確認され、標準グラフを作成した時、傾きは−３．１、直線性Ｒ２値は０．９９９４であった（図３）。
【００９３】
＜実施例４＞ホットスタート逆転写反応を介したｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ＲＮＡ検出
リアルタイム逆転写ＰＣＲを実施するために、先に鋳型ＲＮＡを製造した。
具体的に、Ｃ型肝炎ウイルス（Hepatitis C virus）部分を遺伝子合成法（Biochem. Biophys, Res. Commun 1998, 248, 200-203）で合成して、そのうちの一部をｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｃａｔ．Ａ１３６０、Ｐｒｏｍｅｇａ社製品、米国）にクローニングした。具体的に、２Ｘ  Ｒａｐｉｄ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐｒｏｍｅｇａ社製、米国）５μＬ、Ｔ−ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ（ｐｒｏｍｅｇａ社製、米国）１μＬ、Ｔ４  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ（ｐｒｏｍｅｇａ社製、米国）１μＬ、合成された遺伝子３μＬ（８ｎｇ）を同じチューブに入れて混合した後、３７℃で１時間定温配置した。その後、Ｅ．Ｃｏｌｉ万能細胞（Competent cell）５０μＬに前記定温配置した反応液５μＬを添加して、氷上に４０分間置いた後、４２℃で４０秒間培養して再び氷上に２分間置いた。アンピシリン（ampicillin）、イソプロピル１−チオ−β−Ｄ−カルクトシド（isopropyl1-thio-β-Dgalactoside；ＩＰＴＧ）及びＸ−ｇａｌが含まれたＬＢプレートに前記反応液を接種した後３７℃で１６時間培養した。培養後、白色コロニーを取ってＬＢ液体培地で１６時間培養した後、遠心分離して、上澄液は捨てて、ＡｃｃｕＰｒｅｐ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｐｒｅｐ  ｋｉｔ（（株）バイオニア、韓国）を用いてペレットからプラスミドＤＮＡを抽出した。プラスミドＤＮＡは、ＵＶ分光計（Ｓｈｉｍａｚｕ社製、日本）で濃度と純度を測定した後、純度が１．８〜２．０間であることを確認して、ＭＡＸＩｓｃｒｉｐｔ  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社製、米国）を用いてプラスミドＤＮＡをＲＮＡに転写させた。転写後、ＵＶ分光計で濃度と純度を測定して、純度が１．８〜２．０の間にあれば以後のリアルタイム逆転写ＰＣＲから鋳型ＲＮＡとして用いた。ＲＮＡコピー数（copy number）は、下記式（１）によって計算した。
【００９４】
数１
６．０２×１０２３×濃度（ＵＶ分光計で測定された濃度ｇ／ｍＬ）／（３０１５＋１５０）×３４０          （１）
ここで、前記３０１５はＴ−ｖｅｃｔｏｒの大きさ（３０１５ｂｐ）、１５０はＣ型肝炎ウイルス鋳型ＲＮＡの大きさ（１５０ｂｐ）を示す。鋳型ＲＮＡのコピー数を計算した後、１×ＴＥ  ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）で１０倍希釈して使用時まで−７０℃で保管した。作製されたＲＮＡを鋳型にして、Ｃ型肝炎ウイルス正方向プライマー５’−ＡＣＣＧＧＧＴＣＣＴＴＴＣＴＴＧＧＡＴ−３’（配列番号６）、逆方向プライマー５’−ＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＡＣＣＡＣＡ−３’（配列番号７）及びプローブ［５’ＦＡＭ］−ＣＧＴＧＣＣＣＣＣＧＣＲＡＧＡＣＴＧＣＴ−［３’ＢＨＱ１］（配列番号８）を３０ｎＭになるべく添加して、リアルタイム逆転写ＰＣＲを行った。リアルタイム逆転写ＰＣＲに用いた反応物は、前記＜実施例３＞と同様の条件とし、鋳型ＲＮＡは作製されたＲＮＡにそれぞれ１０１０、１０９、１０８、１０７、１０６、１０５、１０４、１０３、１０２又は１０コピー数で添加した。プライマー、プローブ及び鋳型ＲＮＡを除いては、前記＜実施例３＞と同様に反応した。
【００９５】
その結果、鋳型ＲＮＡは、コピー数１０１０〜１０まで全部検出が可能であって、二回繰り返し行って標準鋳型リアルタイム逆転写ＰＣＲの標準グラフを作成した結果、傾きは−３．２１〜−３．７３、直線性Ｒ２値は、０．９９５〜０．９９８を示した（図４）。ここで、Ｒ２はリアルタイムＰＣＲの標準グラフを描いた時、グラフの直線性を示す相関係数として１に近いほど（直線に近いほど）、ＰＣＲが正しく進行されたことを意味する。
【００９６】
＜実施例５＞リアルタイム逆転写ＰＣＲでＰＰｉ及びＰＰａｓｅによる非特異的反応抑制効果確認
前記＜実施例４＞と同様のプライマー、プローブ及びリアルタイム逆転写ＰＣＲ反応液に実際の臨床試料で精製されたＲＮＡによる非特異的反応の影響を確認するために、標的鋳型ＲＮＡの他にヒーラ細胞から抽出した総ＲＮＡを１μｇ添加した。
対照群としては、ホットスタート逆転写反応機能がない反応液（ＰＰｉ及びＰＰａｓｅが除外された）を用いた。非特異的反応抑制効果を確認するために、ホットスタート逆転写反応液とホットスタート逆転写機能がない反応液にヒト細胞から抽出した総ＲＮＡを１μｇ添加して反応させて比較した。抽出したＲＮＡを添加する以外には前記＜実施例４＞と同様に行った。
その結果、ＰＰｉ及びＰＰａｓｅを添加することによって、ホットスタート逆転写反応を行った時、標的以外のＲＮＡによる非特異的反応が抑制されることが確認され、標的以外のＲＮＡによって反応効率減少及び敏感度、検出能力に変化がないことが確認された。それに対して、ＰＰｉ及びＰＰａｓｅがないホットスタート逆転写反応は、添加したヒト細胞ＲＮＡによって非特異的な反応が起きることが確認されて、反応効率減少及び検出能力、敏感度が顕著に落ちることが確認された（図５Ａ）。リアルタイム逆転写ＰＣＲを介して得られた産物を２％のアガロースゲルで電気泳動下で確認した結果、ホットスタート逆転写反応されなかった産物でヒト細胞総ＲＮＡによって非特異的反応がより一層活発に起きたことが確認された（図５Ｂ）。したがって、逆転写ＰＣＲ反応で非特異的な反応による反応効率減少などの問題点をＰＰｉ及びＰＰａｓｅを添加したホットスタート逆転写反応で解決する可能性があることが確認された。
【００９７】
＜実施例６＞リアルタイム逆転写ＰＣＲでホットスタート逆転写反応を用いたものとホットスタートＰＣＲとの非特異的反応抑制効果の比較
リアルタイム逆転写ＰＣＲでホットスタート逆転写反応とホットスタートＰＣＲ中どちらががさらに反応特異性とそれによる敏感度に効果的であるか調べてみるための実験を実施した。前記＜実施例５＞と同様のプライマー、プローブ及びリアルタイム逆転写ＰＣＲ反応液に標的鋳型ＲＮＡとヒト細胞から抽出した総ＲＮＡ１μｇが添加されたものを用いた。Ｔａｑ抗体を利用したホットスタートＰＣＲ反応物にホットスタート逆転写反応機能がない反応液（ＰＰｉ及びＰＰａｓｅが除外される）を用いて、ホットスタート逆転写反応に対する非特異的反応抑制効果を確認するために、Ｔａｑ抗体によるホットスタートＰＣＲ反応物にＰＰｉ及びＰＰａｓｅを添加して、ホットスタート逆転写反応とホットスタートＰＣＲを同時に行った。
その結果、逆転写及びＰＣＲにおいて、ホットスタートＰＣＲ反応だけでは、非特異的反応を抑制できないことが確認され、ＰＰｉ及びＰＰａｓｅを添加してホットスタート逆転写反応を行った時、多量のＲＮＡに対しても非特異的反応を抑制することができた。また、Ｔａｑ抗体を利用したホットスタートＰＣＲ反応は、低温でＰＣＲ反応を抑制するだけであって、逆転写反応での非特異的反応は抑制できないことが確認されて、したがって、逆転写反応及びＰＣＲで非特異的な反応を除去するためには、ホットスタート逆転写反応が必要であることが確認された。逆転写反応とＰＣＲ反応共にホットスタート機能がない（図５ＢのＢ）のに対して、Ｔａｑ抗体を利用してホットスタートＰＣＲ反応を行った（図６ＢのＢ）もので非特異的な反応産物が減ったものの、依然として非特異的な反応が起きてヒト細胞から由来したヒトＲＮＡが多量混ざっている試料では、１００コピー数以下の標的Ｃ型肝炎ウイルスＲＮＡといった疾病ウイルスを検出し難かった（図６ＡのＢ）。それに対して、ＰＰｉ及びＰＰａｓｅを含んだ反応では、ヒト細胞から由来したＲＮＡによる非特異的反応が起きないので（図６ＢのＤ）、１０コピーまで高感度で標的Ｃ型肝炎ウイルスＲＮＡを検出することができた（図６ＡのＤ）。
【００９８】
＜実施例７＞乾燥タイプ逆転写及びＰＣＲ組成物を用いた標準鋳型リアルタイム逆転写ＰＣＲの確認
逆転写及びＰＣＲ混合液乾燥物に対する熱安定性性能を調べるために、前記＜実施例４＞と同様にＰＰｉ及びＰＰａｓｅが添加されたＰＣＲ混合液を製造して乾燥した後、これを用いてＥｘｉｃｙｃｌｅｒ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｂｌｏｃｋ（（株）バイオニア、韓国）でリアルタイム逆転写ＰＣＲを実施した。
具体的に、１０×ｂｕｆｆｅｒ  ５μＬ、Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ３Ｕ、ｄＮＴＰ  ２０ｍＭ  ５μＬ、ＰＰｉ、ＰＰａｓｅ、安定化剤などを一つのチューブに入れて、蒸溜水を入れて総容量が２５μＬになるべく混合した後、Ｅｘｉｃｙｃｌｅｒ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｂｌｏｃｋ（（株）バイオニア、韓国）に用いられるチューブに分株して、ＳｕｐｅｒＣｅｎｔｒａ（（株）バイオニア、韓国）を利用して５０〜６０分間乾燥した。以後、前記＜実施例４＞で用いられたプライマー及びプローブを計５μＬになるべく混合した後、１次乾燥物に追加分株して３０分間乾燥した。乾燥した混合物に前記＜実施例６＞で用いた鋳型ＲＮＡを添加して、蒸溜水を添加して総容量が５０μＬになるべく分株して、乾燥物が解けやすいように完全混合した。Ｅｘｉｃｙｃｌｅｒ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｂｌｏｃｋ（（株）バイオニア、韓国）を利用して、陰性対照群（鋳型ＲＮＡがない球試料）を共に反応させた点及び鋳型ＲＮＡの使用コピー数を１０６、１０５、１０４、１０３、１０２又は１０でそれぞれ用いた点以外は、前記＜実施例４＞と同様の条件及び成分でリアルタイム逆転写ＰＣＲを実施した。
その結果、前記＜実施例４＞の方法のように、鋳型ＲＮＡは最低１０コピー数まで検出が可能であって、標準鋳型リアルタイム逆転写ＰＣＲの標準グラフを作成した時、傾き−０．２９３２、Ｒ２値は０．９９９１であった。前記結果によって、乾燥された状態の混合物を用いたことは、リアルタイム逆転写ＰＣＲを行うことにおいて、溶液状態の混合物を用いたのと同等な性能が維持されることが分かった（図７）。
【００９９】
＜実施例８＞乾燥タイプの逆転写及びＰＣＲ反応組成物の保管期間に応じた安定性試験
前記＜実施例７＞と同様の組成と方法を利用して、ＰＰｉ及びＰＰａｓｅが添加されたＰＣＲ混合液を製造した後、５０℃で１日間隔で８日間定温配置した。その次に、各保管期間毎乾燥タイプＰＣＲ組成物をＥｘｉｃｙｃｌｅｒ９６  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｂｌｏｃｋを利用して、鋳型ＲＮＡの使用コピー数を１０６、１０５、１０４又は１０３にし、前記＜実施例７＞と同様の条件でリアルタイム逆転写ＰＣＲを実施した。これは、実際の保管推奨温度である−２０℃で乾燥した組成物の性能維持期間を加速化実験を介して短期間に予測できる方法で、４０℃で１日保管した場合−２０℃で約１２８日保管したものと見なす。具体的に、乾燥タイプ組成物を同じ配置で６回テスト分量を一度に製造した後、乾燥直後の混合物の一部を前記＜実施例７＞と同様の条件で５回テスト分量を一度に製造した後、乾燥直後の混合物の一部を鋳型ＲＮＡの使用コピー数１０６、１０５、１０４又は１０３でそれぞれ用いた点以外には前記＜実施例４＞と同様の条件及び成分でリアルタイム逆転写ＰＣＲに用いて対照群結果を得た。その他の乾燥タイプ組成物をいずれも５０℃の恒温器に同時に置いて、反応に必要な数量だけ一日間隔で取り出してそれぞれリアルタイム逆転写ＰＣＲを実施した。この時、最高１０６から最低１０３コピー数まで４種類の濃度を用いて反応を行った。Ｅｘｉｃｙｃｌｅｒ９６  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｂｌｏｃｋ（バイオニア社製、韓国）を利用して得た各保管日数毎乾燥混合物のリアルタイム逆転写重合酵素連鎖反応結果のうち傾き値とＲ２値を対照群の結果と比較して、製造直後の乾燥混合物と５０℃で保管した日数に応じた乾燥混合物の性能を比較した。
その結果、５０℃で１日間隔で５日間定温配置した、液体状態の混合物である対照群で傾き−０．３４５、Ｒ２値は０．９９２２であり、５０℃で保管した乾燥された組成物は傾き−０．３１〜−０．３４、Ｒ２値は０．９９５〜０．９９８と確認された。これは、５０℃で定温配置５日後にも乾燥直後の結果と同等水準の結果値を得たことになり、−２０℃での保管日数で換算すると、約６４０日間乾燥した直後とほぼ類似の結果を安定的に得ることができたことが示された（図８Ａ及び８Ｂ）。
【０１００】
＜実施例９＞ホットスタート逆転写ＰＣＲ反応を介したプライマーの非特異的結合抑制
プライマーの非特異的結合を誘導するために、前記＜実施例４＞に用いられたプライマーとプローブ中逆方向プライマーの塩基配列を下記の表２のように合成した。
逆方向プライマー５’−ＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＡＣＣＡＣＡ−３’（配列番号７）
【０１０１】
【表２】
0006054431.tif 000003
【０１０２】
非特異的プライマーの反応による影響を確認するために、標的鋳型ＲＮＡと正確に一致する逆方向プライマーと５’側に６個の塩基配列が不一致な逆方向プライマー（配列番号９）、総逆方向プライマー塩基配列のうち６個の塩基配列が不一致なプライマー（配列番号１０）を各々使用した。対照群としては。ホットスタート逆転写反応機能がない反応液（ＰＰｉ及びＰＰａｓｅが除外された）を用いた。非特異的プライマーによる偽陽性の有無を確認するために、ホットスタート逆転写反応液とホットスタート逆転写機能がない反応液を用いて、各逆方向プライマーに対する非特異的反応の有無を確認した。不一致逆方向プライマーを用いたことと、鋳型ＲＮＡを１０４コピー濃度だけを用いことを除いては、前記＜実施例４＞と同様の方法で行った。
【０１０３】
５’側６個の塩基配列が不一致なプライマーを用いてリアルタイム逆転写重合酵素反応を行った結果を図９Ａに、中間６個の塩基配列が不一致なプライマーを用いた結果を図９Ｂに示した。図９において、Ａはホットスタート逆転写機能がない反応物で反応を行った結果であり、Ｂはホットスタート逆転写ＰＣＲ反応物で行った結果である。
【０１０４】
その結果、ＰＰｉ及びＰＰａｓｅを添加したホットスタート逆転写反応の場合、鋳型ＲＮＡと正確に一致した逆方向プライマーでは、増幅産物が検出されたが、不一致な塩基配列を持つ逆方向プライマーでは検出されなかった。それに対して、ＰＰｉ及びＰＰａｓｅがないホットスタート逆転写反応は、不一致な塩基配列を持つ逆方向プライマーでも検出されることが確認された。これは、反応温度以下の低温で逆方向プライマーの非特異的な反応により逆転写酵素反応が起きることが確認された（図９Ａ及び図９Ｂ）。したがって、逆転写ＰＣＲ反応で非特異的な反応による偽陽性などの問題点をＰＰｉ及びＰＰａｓｅを添加したホットスタート逆転写反応で解決する可能性があることが確認された。
【０１０５】
＜実施例１０＞ホットスタート逆転写ＰＣＲ反応を介したＲＮＡ一塩基多型分析
本発明のホットスタート逆転写ＰＣＲ反応を利用して、ターゲットＲＮＡに対する一塩基多型を分析するために、逆方向プライマーにポイント突然変異塩基配列が含まれるようにデザインした。前記＜実施例４＞に用いたプライマーとプローブ中逆方向プライマーの塩基配列を下記の表３のように合成した。
【０１０６】
【表３】
0006054431.tif 000004
【０１０７】
一塩基多型分析のために、鋳型ＲＮＡと正確に一致する逆方向プライマーと単一塩基が不一致な逆方向プライマーを用いた。対照群としては、ホットスタート逆転写反応機能がない反応液（ＰＰｉ及びＰＰａｓｅが除外された）を用いた。一塩基多型分析可能の有無を確認するために、ホットスタート逆転写反応液とホットスタート逆転写機能がない反応液を用いて、各逆方向プライマーに対する反応有無を確認した。単一塩基が不一致な逆方向プライマーを用いたことと、鋳型ＲＮＡを１０４コピー濃度だけを用いたことを除いては、前記＜実施例４＞と同様の方法で行った。ホットスタート逆転写ＰＣＲ反応物を行った結果を図１０Ａに、ホットスタート機能がない反応物で行った結果を図１０Ｂに示した。Ａは、正確に一致する塩基配列を持つプライマーを用いたものであり、Ｂは単一塩基配列が不一致なプライマーを用いたものである。
【０１０８】
その結果、ＰＰｉ及びＰＰａｓｅを添加したホットスタート逆転写反応の場合、鋳型ＲＮＡと正確に一致するプライマーを用いた結果と、単一塩基が不一致な逆方向プライマーを用いた結果とでＰＣＲ効率差が示された。それに対して、ＰＰｉ及びＰＰａｓｅがないホットスタート逆転写反応は、正確に一致する逆方向プライマーと、単一塩基配列が異なる逆方向プライマーとの間にＰＣＲ効率差がなく同じサイクルで検出された。これは、リアルタイムＰＣＲ方法を利用した一塩基多型分析において、ホットスタート逆転写反応は、一塩基多型分析が可能であるが、ホットスタート逆転写反応がない反応物では、一塩基多型分析が難しいことが言える（図１０Ａ及び図１０Ｂ）。したがって、ホットスタート逆転写ＰＣＲ反応は、鋳型ＲＮＡに対する単一塩基分析だけでなく多様な分野に応用する可能性があることが確認された。
【０１０９】
＜実施例１１＞ホットスタート逆転写反応を介したＲＮＡ−ＲＮＡセルフプライミング抑制
本発明に係るホットスタート逆転写ＰＣＲ反応を利用した抽出された核酸に含まれている単一螺旋核酸によるセルフプライミングによって現れる非特異的な反応を抑制する効果を確認した。
Ｈｅｌａ細胞１０６個からＴｏｔａｌ  ＲＮＡ抽出は、ＡｃｃｕＺｏｌｅ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（（株）バイオニア、韓国）を利用して、ＤＥＰＣ−Ｄ．Ｗを用いて最終体積が５０μＬになるべく精製した。
抽出したＲＮＡは、ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）装備を利用してＲＮＡ定量して２μｇを用いた。逆転写反応は、対照群としてホットスタート逆転写反応機能がない反応液（ＰＰｉ及びＰＰａｓｅが除外された）にした。リアルタイム重合連鎖反応は、ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ  Ｄｕａｌｓｔａｒ  ｑＰＣＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  ｋｉｔを用いて行った。＜実施例３＞で用いた正方向、逆方向プライマー、プローブを用いてリアルタイム重合連鎖反応を行った。逆転写反応には５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（塩基配列１２）逆転写反応用プライマーを用いて行った。
抽出されたＴｏｔａｌ  ＲＮＡにＧｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡが含まれているのか否かは、対照群としてホットスタート機能がない反応液（ＰＰｉ及びＰＰａｓｅが除外された）を用いて逆転写反応後実行して、抽出されたｔｏｔａｌ  ＲＮＡを逆転写反応なしに鋳型にしてＡｃｃｕＰｏｗｅｒ  Ｄｕａｌｓｔａｒ  ｑＰＣＲ  Ｐｒｅｍｉｘ（（株）バイオニア、韓国）を用いて実施した。
図１１において、Ａは逆転写反応なしにＲＮＡだけを添加してリアルタイム重合酵素反応を行ったものであり、Ｂは逆転写反応時プライマーを添加して逆転写反応後、リアルタイム重合酵素反応を行ったものである。Ｂ−Ａはホットスタート逆転写反応物を行ったものであり、Ｂ−Ｂはホットスタート逆転写機能がない反応物で行ったものである。
Ｃはホットスタート逆転写機能がない反応液にＲＮＡだけ入れて、逆転写反応後、リアルタイム重合酵素反応を行った結果である。
Ｄは、ホットスタート逆転写反応物にＲＮＡだけ入れて、逆転写反応後、リアルタイム重合酵素反応を行った結果である。
その結果、逆転写反応なしでは検出されないため、抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡにＧｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡが含まれていないことが確認された。
対照群としてホットスタート機能がない反応液（ＰＰｉ及びＰＰａｓｅが除外された）を用いて、プライマー添加なしにＴｏｔａｌ  ＲＮＡだけを添加して逆転写反応を行った。逆転写反応は、５０℃で１時間、９５℃で５分間行った。逆転写反応後生成された産物５μＬをテンプレートにして、リアルタイム重合連鎖反応を行った。
その結果、ホットスタート機能がない反応液（ＰＰｉ及びＰＰａｓｅが除外された）では、３７Ｃ（ｔ）でセルフプライミングによって検出されることが確認され、ホットスタート逆転写反応では４１Ｃ（ｔ）で検出されることが確認された（図１１）。したがって、ホットスタート逆転写反応は、ホットスタート機能がない反応液（ＰＰｉ及びＰＰａｓｅが除外された）よりセルフプライミングによる非特異的反応に対して抑制されることが確認された。
【０１１０】
＜実施例１２＞ＲＮＡターミネーションを介したＲＮＡセルフプライミングによる非特異逆転写重合連鎖反応（ＰＣＲ）抑制効果
（１）ｐｏｌｙ（Ａ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅと３’−デオキシアデノシン５’−トリホスフェート（３’−ｄＡＴＰ）によるＲＮＡ断片のターミネーション反応
前記＜実施例１１＞と同様にＲＮＡ抽出キットを利用して、ヒト細胞ＨｅＬａ  Ｃ細胞からＲＮＡを抽出した。ｐｏｌｙ（Ａ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅと３’−デオキシアデノシン５’−トリホスフェート（３’−ｄＡＴＰ）を用いて抽出されたＲＮＡの３’末端をターミネーションさせた（Ｃ、Ｄ）。
残留３’−デオキシアデノシン５’−トリホスフェート（３’−ｄＡＴＰ）を除去するために、ターミネーションされたＲＮＡをＡｃｃｕＰｒｅｐ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（（株）バイオニア、韓国）を利用して精製した。ＲＮＡの３’をターミネーションさせなかったＲＮＡ（Ａ及びＢ）も同じ条件で比較するために前記と同じ方法で精製した。ホットスタート逆転写重合酵素連鎖反応の影響を比較するために、ホットスタート機能がある逆転写重合酵素連鎖反応（Ｂ及びＤ）とホットスタート機能がない逆転写重合酵素連鎖反応（Ａ及びＣ）で行った。
各々のＲＮＡ  ５μｇを各々用いて、一般重合連鎖反応は、ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ  ＲｏｃｋｅｔＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｐｒｅｍｉｘ（（株）バイオニア、韓国）を用いて、ホットスタート逆転写重合連鎖反応は、ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ  ＲｏｃｋｅｔＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｐｒｅｍｉｘ（（株）バイオニア、韓国）にピロホスフェートとホスファターゼを添加して、最終ボリュームが２０μＬになるべく蒸溜水を添加して、ホットスタート逆転写重合酵素連鎖反応を行った。ＲＮＡセルフプライミングの効果を確認するために、逆転写重合酵素連鎖反応に必要ないかなる種類のプライマーも添加しなかった。
【０１１１】
逆転写重合酵素連鎖反応は、Ｍｙｇｅｎｉｅ  ９６  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｂｌｏｃｋ（（株）バイオニア、韓国）を利用して行って、反応混合過程上のＲＮＡセルフプライミング効果をみるために、２５℃で２０分間インキュベーションを行った。
以後、ＲＮＡセルフプライミングによる逆転写重合酵素連鎖反応の進行の有無を確認するために、それぞれの逆転写重合酵素連鎖反応物を鋳型テンプレートとして用いて、ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ  Ｄｕａｌｓｔａｒ  ｑＰＣＲ  Ｐｒｅｍｉｘ（（株）バイオニア、韓国）を利用して、＜実施例３＞で用いたヒトＧＡＰＤＨを標的遺伝子のプライマー及びプローブを用いて、リアルタイム重合連鎖反応を行った。
【０１１２】
リアルタイムＰＣＲは、Ｅｘｉｃｙｃｌｅｒ  ９６  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｂｌｏｃｋ（（株）バイオニア、韓国）を利用して行って、反応条件は９５℃、５分の間事前変成段階を経て、９５℃で５秒間の変成段階、６０℃で５秒間のアニール段階及び伸長段階、蛍光を検出するスキャン段階の同時反応を１回反応周期にして計４５回反応周期を進めた。
【０１１３】
その結果は、図１２に示した。ターミネーションさせなかったＲＮＡ（Ａ及びＢ）では、あるプライマーを入れなくても、ｃＤＮＡが作られることをヒトＧＡＰＤＨ遺伝子が検出されることで確認することができた。前記結果は、セルフプライミングによってｃＤＮＡが合成されたので、ＰＣＲで増幅されたのである。
尚、ホットスタート逆転写重合酵素連鎖反応でも非特異的なｃＤＮＡ合成と引き続くＰＣＲ増幅を防ごうとしても、完ぺきに阻害できなくて、部分的にだけＲＮＡセルフプライミングによる逆転写重合酵素連鎖反応を阻害させることができて、Ｃｔ値が約５程度遅らせて１／３０程度で反応を阻害させることができた。
しかしＲＮＡの３’末端をターミネーションした試料（Ｃ及びＤ）でいずれの逆転写重合酵素連鎖反応で４５ｃｙｃｌｅまで増幅されないことによって、全くｃＤＮＡが合成されないことが確認された。
前記結果は、逆転写重合酵素連鎖反応物混合時に多くの非特異逆転写重合酵素連鎖反応が起きて、これによって多くの非特異ｃＤＮＡが作られることが分かる。そして、前記結果から、望まない反応はホットスタート逆転写重合酵素連鎖反応だけで抑制できないが確認できて、結果的にこのようなＲＮＡセルフプライミングによる非特異逆転写重合連鎖反応は、本発明のターミネーション反応を利用して遮断することによって完ぺきに抑制させる可能性があることを確認することができた。
図１２において、ＡとＢはターミネーションさせなかったＲＮＡを用いたもので、ＣとＤはターミネーション反応を行ったＲＮＡを用いたものである。ＡとＣは、一般的な逆転写反応を行い、ＢとＤはホットスタート逆転写反応を行った。
【０１１４】
＜実施例１３＞ＲＮＡターミネーションとホットスタート逆転写ＰＣＲを介した癌マーカー検出限界向上
癌マーカーとしては、ホモサピオンスケラチン８（ＫＲＴ８）であり、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ、米国）を介して塩基配列情報を確認して、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号はＮＭ_００１２５６９３である。前記＜実施例１１＞と同様のＲＮＡ抽出キットを利用して、ヒト細胞腫であるヒーラＣ細胞からＲＮＡを抽出した。抽出されたＲＮＡを８５０ｎｇ、８５ｎｇ、８．５ｎｇ、０．８５ｎｇ、０．０８５ｎｇを各鋳型にして、ホットスタート逆転写ＰＣＲ反応を用いて、定量分析するためのスタンダードカーブを確認しようと、正方向プライマー５’−ＧＧＡＧＣＡＧＡＴＣＡＡＧＡＣＣＣＴＣＡ−３’（配列番号１３）、逆方向プライマー５’−ＴＴＧＴＣＣＡＴＧＴＴＧＣＴＴＣＧＡＧＣ−３’（配列番号１４）及びプローブ［５’ＦＡＭ］−ＴＧＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＡＣＣＧＴＡＣＣＴＴＧＴ−［３’ＢＨＱ１］（配列番号１５）を３０ｎＭになるべく添加して、リアルタイム逆転写ＰＣＲを行った。
【０１１５】
その結果、下記の図１３Ａのような結果を確認した。
検出限界に対して確認しようとヒト血清１ｍＬにヒーラ細胞を各１０，０００、１，０００、１００、１０個を添加して、＜実施例１１＞と同様にＲＮＡ抽出及び定量を行った。
その結果、各ＲＮＡ濃度が、５７．５ｎｇ／μＬ、５３．８ｎｇ／μＬ、５２．５ｎｇ／μＬ、５２．１ｎｇ／μＬと確認された。抽出された各ＲＮＡ５００ｎｇを用いて、＜実施例１２＞と同様の方法でＲＮＡターミネーションを実行後、ＲＮＡ定量を行った。ＲＮＡターミネーションによる検出限界を確認しようと対照群としてＲＮＡターミネーションをしなかったＲＮＡを用いた。各ＲＮＡ１００ｎｇを用いてホットスタート逆転写反応機能がない反応液（ＰＰｉ及びＰＰａｓｅが除外された）とホットスタート逆転写ＰＣＲ反応液を用いて、リアルタイム逆転写重合酵素連鎖反応を行った。リアルタイム逆転写ＰＣＲは、Ｅｘｉｃｙｃｌｅｒ  ９６  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｂｌｏｃｋ（（株）バイオニア、韓国）を利用して行って、反応条件は５０℃で１５分間逆転写反応した後、９５℃で５分間予備変成段階を経て、９５℃で５秒間の変成段階、６０℃で５秒間のアニール段階及び７２℃で６秒間の伸長段階、蛍光を検出するスキャン段階の同時反応を１サイクルにして計４５サイクルを進めた。
【０１１６】
その結果、ＲＮＡターミネーション反応したサンプルではホットスタート逆転写反応はヒト血清１ｍＬに１０個のヒーラ細胞を添加したサンプルにまで検出された。（図１３Ｂ参照）。ホットスタート逆転写反応機能がない反応液ではヒーラ細胞１００個を添加したサンプルでだけ検出された（図１３Ｃ）。ＲＮＡターミネーションさせなかったサンプルでは、ホットスタート逆転写反応液は、ヒーラ細胞１００個を添加したサンプルにまで検出された（図１３Ｄ）。ホットスタート逆転写機能がない反応液では、ヒーラ細胞１，０００個を添加したサンプルにまで検出された（図１３Ｅ）。
したがって、ホットスタート逆転写反応だけでも検出限界が向上したが、ＲＮＡターミネーションと共に行った時より良い効果を確認することができた。
【産業上の利用可能性】
【０１１７】
本発明のホットスタート逆転写反応用組成物及びホットスタート逆転写ＰＣＲ用組成物は、ＰＰｉ及びＰＰａｓｅを利用して逆転写反応を行うことによって、既存のホットスタート逆転写反応の様々な問題を解決して、標的核酸であるＲＮＡを高感度でかつ特異的に検出することができるので、ホットスタート逆転写反応及びこれを含むホットスタート逆転写ＰＣＲ技術に関連した安定化されたキットを提供して、高感度でＲＮＡを検出する高感度ＲＮＡ診断キットとして効果的に利用されることができる。
【０１１８】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとっては、このような具体的な記術は単に望ましい実施様態であるだけであり、これによって本発明の範囲が制限されないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は添付された請求範囲及びその等価物によって定義される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
0006054431.tif 000011
【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
0006054431.tif 000013
【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
0006054431.tif 000016
【図８Ａ】
0006054431.tif 000017
【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
0006054431.tif 000019
【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【配列表】
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