(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２〜配列番号４のいずれか１つで示される塩基配列からなり、且つ、３’末端側が伸長阻害処理されたオリゴヌクレオチドと、標的とするＥＧＦＲエクソン１９遺伝子の多型部位を含む核酸配列にハイブリダイズ可能であり、且つ、蛍光色素で標識化されたプローブと、を含み、
前記プローブが、配列番号３５に示される塩基配列からなり、且つ、蛍光色素で標識化されたプローブであるＥＧＦＲ多型検出試験用試薬キット。
【請求項２】
前記３’末端側の伸長阻害処理がリン酸基の付加である請求項１記載のＥＧＦＲ多型検出試験用試薬キット。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチドが、蛍光色素により標識された塩基を含む請求項１又は請求項２記載のＥＧＦＲ多型検出試験用試薬キット。
【請求項４】
前記プローブが、標的配列にハイブリダイズしていないときに蛍光を発し、該標的配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少するプローブである請求項１〜請求項３のいずれか一項記載のＥＧＦＲ多型検出試験用試薬キット。
【請求項５】
更に、前記標的とするＥＣＧＲエクソン１９遺伝子の多型部位を含む核酸配列を増幅可能なプライマーセットを含む請求項１〜請求項４のいずれか一項記載のＥＧＦＲ多型検出試験用試薬キット。
【請求項６】
請求項１〜請求項５のいずれか一項記載のＥＧＦＲ多型検出試験用試薬キットを用いてＥＧＦＲエクソン１９遺伝子の多型を検出すること
を含むＥＧＦＲエクソン１９遺伝子の多型を検出する多型検出方法。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドと、核酸試料中の配列番号１で示される塩基配列を有する一本鎖核酸とを接触させて、前記オリゴヌクレオチド及び前記一本鎖核酸を含み且つ前記一本鎖核酸の核酸増幅が抑制されるハイブリッドを得ること、及び、
前記オリゴヌクレオチドと前記一本鎖核酸との接触時又は接触後の前記核酸試料に対して、前記プローブの存在下で核酸増幅を行うこと、
を含む請求項６記載の多型検出方法。
【請求項８】
請求項６又は請求項７記載の多型検出方法によりＥＧＦＲエクソン１９遺伝子における多型を検出すること、及び、
前記検出の結果に基づいてＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に対する耐性又はＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の薬効を判定すること、
を含むＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の薬効判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＥＧＦＲエクソン１９多型検出試験用試薬キット及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）は、肺癌において重要な役割を果たすと考えられており、ＥＧＦＲの機能抑制を目的とする薬剤が、肺癌治療の分野で用いられている。このような薬剤としては、非小細胞肺癌患者の治療に用いられているゲフィチニブ又はエルロチニブ等のＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤が知られており、これらの薬剤については、肺癌の他に腺癌への適用が試みられている。しかしながら、ある範囲の患者では、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の効果が充分に得られないことがある。また別の範囲の患者では、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に対して初期には反応があるものの、次第に薬剤の効果が期待された以上に上がらなくなることがある。
このため、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤を使用するに際して、その効果を予測するために予測因子の探索が試みられ、ＥＧＦＲ遺伝子変異が重要な因子であることが見出されてきた（非特許文献１、２）。
【０００３】
薬剤の感受性に関連する変異としては、例えば、ＥＧＦＲの７９０番目および８５８番目における置換変異、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９における欠失変異等が知られている（非特許文献１、２）。特に、前記ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９における欠失変異は、前記エクソン１９において、連続した数塩基〜十数塩基が欠失した複数の変異型が知られている。
【０００４】
一方、近年、遺伝子多型を検出する検出試験として、融解曲線分析（Ｔｍ分析）を利用した検出が行われている。この方法では、変異を含む領域をＰＣＲ法で増幅した後、蛍光色素で標識された核酸プローブを用いて融解曲線分析を行い、融解曲線分析の結果に基づいて塩基配列の変異を解析する（例えば、特許文献１参照）。
また、簡便に且つ、感度と信頼性に優れた多型検出方法としては、変異型プライマーと野生型（正常型）プライマーとを同一の反応系で用いて、変異型塩基を有する核酸配列を優先的に増幅させることを含む多型検出方法が知られている（特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００２−１１９２９１号公報
【特許文献２】国際公開第２０１０／００１９６９号パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ＰＬｏＳ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２００５年、Ｖｏｌ．２、Ｎｏ．３、ｐ．２２５−２３５
【非特許文献２】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２００５年、Ｖｏｌ．２３、Ｎｏ．１１、ｐ．２５１３−２５２０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、ＥＧＦＲエクソン１９の変異には、上述の通り種々の変異が存在している。このため、それぞれの変異に対するプライマーを使用する検出試験では、変異型特異的なプライマーを反応液中に多数含める必要がある。多数のプライマーを作製することは、設計が複雑化する可能性があり、また、複数のプライマーを同時に使用することはＰＣＲ反応そのもの進行しなくなる可能性がある。また、複数の変異が存在する場合には、充分な比率で変異が含まれていないと検出できない場合がある。
従って本発明は、ＥＧＦＲエクソン１９遺伝子の多型を検出する検出試験において当該多型を簡便で感度よく検出するために有用なＥＧＦＲ多型検出試験用試薬キット及びその用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は以下のとおりである。
［１］  配列番号２〜配列番号４のいずれか１つで示される塩基配列からなり、且つ、３’末端側が伸長阻害処理されたオリゴヌクレオチドと、標的とするＥＧＦＲエクソン１９遺伝子の多型部位を含む核酸配列にハイブリダイズ可能であり、且つ、蛍光色素で標識化されたプローブと、を含み、前記プローブが、配列番号３５に示される塩基配列からなり、且つ、蛍光色素で標識化されたプローブであるＥＧＦＲ多型検出試験用試薬キット。
［２］  前記３’末端側の伸長阻害処理がリン酸基の付加である［１］に記載のＥＧＦＲ多型検出試験用試薬キット。
［３］  前記オリゴヌクレオチドが、蛍光色素により標識された塩基を含む［１］又は［２］に記載のＥＧＦＲ多型検出試験用試薬キット。
［４］  前記プローブが、標的配列にハイブリダイズしていないときに蛍光を発し、該標的配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少するプローブである［１］〜［３］のいずれかに記載のＥＧＦＲ多型検出試験用試薬キット。
［５］  更に、前記標的とするＥＣＧＲエクソン１９遺伝子の多型部位を含む核酸配列を増幅可能なプライマーセットを含む［１］〜［４］のいずれかに記載のＥＧＦＲ多型検出試験用試薬キット。
［６］  ［１］〜［５］のいずれかに記載のＥＧＦＲ多型検出試験用試薬キットを用いてＥＧＦＲエクソン１９遺伝子の多型を検出することを含むＥＧＦＲエクソン１９遺伝子の多型を検出する多型検出方法。
［７］  前記オリゴヌクレオチドと、核酸試料中の配列番号１で示される塩基配列を有する一本鎖核酸とを接触させて、前記オリゴヌクレオチド及び前記一本鎖核酸を含み且つ前記一本鎖核酸の核酸増幅が抑制されるハイブリッドを得ること、及び、前記オリゴヌクレオチドと前記一本核酸との接触時又は接触後の前記核酸試料に対して、前記プローブの存在下で核酸増幅を行うこと、を含む［６］に記載の多型検出方法。
［８］  ［６］又は［７］に記載の多型検出方法によりＥＧＦＲエクソン１９遺伝子における多型を検出すること、及び、前記検出の結果に基づいてＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に対する耐性又はＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の薬効を判定すること、を含むＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の薬効判定方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、ＥＧＦＲエクソン１９遺伝子の多型を検出する検出試験において当該多型を簡便で感度よく検出するために有用なＥＧＦＲ多型検出試験用試薬キット及びその用途を提供すること提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】（Ａ）は、核酸混合物の融解曲線の一例であり、（Ｂ）は微分融解曲線の一例である。
【図２】（Ａ）〜（Ｄ）は、本発明の実施例１にかかる試料の融解曲線である。
【図３】（Ａ）〜（Ｄ）は、本発明の実施例２にかかる試料の融解曲線である。
【図４】（Ａ）〜（Ｄ）は、本発明の実施例３にかかる試料の融解曲線である。
【図５】（Ａ）〜（Ｄ）は、本発明の比較例１にかかる試料の融解曲線である。
【図６】（Ａ）及び（Ｂ）は、本発明の比較例２にかかる試料の融解曲線である。
【図７】（Ａ）〜（Ｄ）は、本発明の比較例３にかかる試料の融解曲線である。
【図８】（Ａ）及び（Ｂ）は、本発明の比較例４にかかる試料の融解曲線である。
【図９】（Ａ）〜（Ｅ）は、本発明の実施例４にかかる試料Ａ〜Ｅの融解曲線である。
【図１０】（Ａ）〜（Ｅ）は、本発明の実施例４にかかる試料Ｆ〜Ｊの融解曲線である。
【図１１】（Ａ）〜（Ｅ）は、本発明の実施例５及び比較例５にかかる試料５−１〜５−５の融解曲線である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明にかかるＥＧＦＲエクソン１９遺伝子多型検出試験用オリゴヌクレオチド（以下、単に「多型検出試験用オリゴヌクレオチド」ということがある）は、３’末端側が伸長阻害処理され、配列番号１で示される塩基配列の少なくとも１１５番目〜１２３番目の塩基を含む塩基長９〜８０の塩基配列と同一塩基長であり且つ相同的な配列であるオリゴヌクレオチド、即ち、下記（Ｐ１）及び（Ｐ’）からなる群より選択された少なくとも１種であるＥＧＦＲエクソン１９遺伝子多型検出試験用オリゴヌクレオチドである。
（Ｐ１）３’末端側が伸長阻害処理され、配列番号１で示される塩基配列の少なくとも１１５番目〜１２３番目の塩基を含む塩基長９〜８０の塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有するオリゴヌクレオチド；
（Ｐ１’）３’末端側が伸長阻害処理され、配列番号１で示される塩基配列の少なくとも１１５番目〜１２３番目の塩基を含む塩基長９〜８０の塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
本発明にかかる多型検出試験用試薬セットは、前記ＥＧＦＲエクソン１９遺伝子多型検出試験用オリゴヌクレオチドを含むものである。
【００１２】
本発明にかかるＥＧＦＲ遺伝子多型検出方法は、前記ＥＧＦＲエクソン１９遺伝子多型検出試験用オリゴヌクレオチドを少なくとも１種用いてＥＧＦＲエクソン１９の遺伝子多型を検出することを含む方法である。
本発明にかかるＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の薬効判定方法は、前記ＥＧＦＲエクソン１９遺伝子多型検出方法によりＥＧＦＲ遺伝子における多型を検出すること、及び前記検出結果に基づいてＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に対する耐性又はＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の薬効を判定することを含む方法である。
【００１３】
本発明によれば、配列番号１で示されるＥＧＦＲ遺伝子の特定の一部と同一の塩基長であり、且つ相同的な塩基配列、即ち、少なくとも８０％以上の同一性を有する及び／又は当該特定の一部の塩基配列の相補鎖に対してストリンジェンな条件でハイブリダイズ可能な配列を有し、３’末端側が伸長阻害処理されたオリゴヌクレオチドが、多型を含み得る野生型ＥＧＦＲエクソン１９の塩基配列の当該一部分に高い親和性を有するので、変異型ＥＧＦＲエクソン１９の核酸よりも野生型ＥＧＦＲエクソン１９の核酸に優先的に且つ強固にハイブリダイズする。また、前記多型検出試験用オリゴヌクレオチドは、３’末端側が伸長阻害処理されているので、野生型ＥＧＦＲ遺伝子の核酸にハイブリダイズした後で、ＤＮＡポリメラーゼを適用しても伸長しない。
【００１４】
前記多型検出試験用オリゴヌクレオチドは、ＥＧＦＲエクソン１９遺伝子多型検出試験に好ましく用いられるオリゴヌクレオチドである。前記多型検出用試験用オリゴヌクレオチドをＥＧＦＲ遺伝子多型検出試験に用いた場合、前記多型検出試験用オリゴヌクレオチドは、その類似性の高さから野生型ＥＧＦＲ遺伝子核酸にハイブリダイズする。ハイブリダイズした野生型ＥＧＦＲ遺伝子核酸と、当該ハイブリダイズした領域に対応する領域内に欠損や一塩基多型を含む変異型（多型）ＥＧＦＲ遺伝子核酸とが混在する環境下で、核酸増幅等の処理を行った場合に、野生型遺伝子の核酸配列の増幅は、多型検出試験用オリゴヌクレオチドの存在によって抑制される。一方、変異型ＥＧＦＲ遺伝子の核酸配列には、多型検出用試験用オリゴヌクレオチドがハイブリダイズしていないため、変異型ＥＧＦＲ遺伝子の核酸増幅が抑制されず、変異型ＥＧＦＲ遺伝子の核酸配列が優位に増幅する。この結果、試料中に、変異型ＥＧＦＲ遺伝子の核酸配列が野生型ＥＧＦＲ遺伝子の核酸配列よりも多く存在することになり、ＥＧＦＲエクソン１９遺伝子多型を感度よく検出することができる。なお、前記多型検出試験用オリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な野生型ＥＧＦＲ遺伝子核酸は、配列番号１で示される塩基配列の相補的な配列を有する核酸である。
【００１５】
また、本発明によれば、このようにＥＧＦＲエクソン１９遺伝子多型を簡便に且つ感度よく検出することができるので、ＥＧＦＲエクソン１９遺伝子多型に基づくＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に対する耐性又はＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の薬効を簡便かつ感度よく判定することができる。
【００１６】
本発明における「ＥＧＦＲ遺伝子」とは、具体的にはＥＧＦＲエクソン１９を意味する。本発明におけるＥＧＦＲエクソン１９は、既に公知であり、その塩基配列は、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＮＴ＿０３３９６８（バージョン：ＮＴ＿０３３９６８．６）の４８３１７１７〜４８３２００３の配列を意味する。配列番号１の塩基配列は、ＥＧＦＲエクソン１９遺伝子の核酸の塩基配列の一部に相当する。
本明細書では、前記多型検出試験用オリゴヌクレオチドがハイブリダイズし得る野生型ＥＧＦＲ遺伝子の塩基配列の領域を、特に「増幅抑制標的領域」という。
【００１７】
本明細書において、検出対象となるＥＧＦＲ遺伝子の多型には、野生型ＥＧＦＲ遺伝子の対応する配列において、複数の連続した塩基で構成される領域が欠損する多型を含み、検出可能である限り、塩基が１つ欠損する多型、塩基が１つ又は２つ以上連続して他の塩基に置換する多型も包含してもよい。なお、本発明における検出対象となるＥＧＦＲ遺伝子の多型は、増幅抑制標的領域をその一部に含む限り、同時に２つ以上の多型を含むものであってもよい。
【００１８】
本発明において、「多型検出試験」とは、特定の遺伝子多型を検出するために用いられる試験を意味し、試験、アッセイ、検出方法、評価方法、判定方法などの表現に拘わらず、核酸試料中の核酸に、多型を有する変異型が含まれているか否かを判定することを含むあらゆる行為を意味する。
【００１９】
本発明において、検出対象となる試料中の試料核酸、多型検出試験用オリゴヌクレオチド、プライマー又はプローブの個々の配列に関して、これら互いの相補的な関係に基づいて記述された事項は、特に断らない限り、それぞれの配列と、各配列に対して相補的な配列とについても適用される。各配列に対して相補的な当該配列について本発明の事項を適用する際には、当該相補的な配列が認識する配列は、当業者にとっての技術常識の範囲内で、対応する本明細書に記載された配列に相補的な配列に、明細書全体を読み替えるものとする。
本明細書において「鋳型核酸配列」とは、核酸増幅を行う際にプライマーが鋳型として認識してアニーリングする塩基配列を意味する。
【００２０】
本発明において、「Ｔｍ値」とは、二本鎖核酸が解離する温度（解離温度：Ｔｍ）であって、一般に、２６０ｎｍにおける吸光度が、吸光度全上昇分の５０％に達した時の温度と定義される。即ち、二本鎖核酸、例えば、二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。Ｔｍ値は、この現象に基づき設定される。本発明におけるＴｍ値は、特に断らない限り、吸光度が、吸光度全上昇分の５０％に達した時の温度をいう。
本発明において、オリゴヌクレオチドの配列に関して「３’末端から数えて１〜３番目」という場合は、オリゴヌクレオチド鎖の３’末端を１番目として数える。同様に「５’末端から数えて１〜３番目」という場合は、オリゴヌクレオチド鎖の５’末端を１番目として数える。
【００２１】
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても本工程の所期の作用が達成されれば、本用語に含まれる。
また、本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
また、本発明において、組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
以下、本発明について説明する。
【００２２】
＜多型検出試験用オリゴヌクレオチド＞
前記多型検出試験用オリゴヌクレオチドは、下記（Ｐ１）及び（Ｐ’）からなる群より選択された少なくとも１種であるＥＧＦＲ遺伝子多型検出試験用オリゴヌクレオチド：
（Ｐ１）３’末端側が伸長阻害処理され、配列番号１で示される塩基配列の少なくとも１１５番目〜１２３番目の塩基を含む塩基長９〜８０の塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有するオリゴヌクレオチド；
（Ｐ１’）３’末端側が伸長阻害処理され、配列番号１で示される塩基配列の少なくとも１１５番目〜１２３番目の塩基を含む塩基長９〜８０の塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
【００２３】
前記多型検出試験用オリゴヌクレオチドは、配列番号１で示される塩基配列の少なくとも１１５〜１２３番目の塩基を含む所定領域の塩基配列と少なくとも８０％以上の同一性を有する、又は当該所定領域の塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列であることを要する。１１５番目〜１２３番目の塩基を含むことにより、例えば、配列番号１で示される塩基配列の１１５番目以降に１又は複数の塩基の欠失を有する多型を感度よく検出可能にすることができる。なお配列番号１で示される１１５番目の塩基は、ＥＧＦＲエクソン１９の７４４番目のコドンの３’側の塩基に該当する。
【００２４】
前記Ｐ１オリゴヌクレオチドの前記所定領域の塩基配列に対する同一性は、少なくとも８０％以上であることを要する。また、検出感度の観点より、８５％以上とすることができ、９０％以上とすることができ、９５％以上とすることができ、また９６％以上とすることができ、９７％以上とすることができ、９８％以上とすることができ、９９％以上とすることができる。
【００２５】
前記Ｐ１’オリゴヌクレオチドは、前記配列番号１で示される塩基配列のうち前記所定領域の塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列である。
ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ３ｒｄ（Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．  Ｐｒｅｓｓ，  ２００１）  に記載の方法等に従って行うことができる。この文献は、参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【００２６】
ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。典型的なストリンジェントな条件とは、例えば、カリウム濃度は約２５ｍＭ〜約５０ｍＭ、及びマグネシウム濃度は約１．０ｍＭ〜約５．０ｍＭ中において、ハイブリダイゼーションを行う条件があげられる。本発明の条件の１例としてＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、２５ｍＭのＫＣｌ、及び１．５ｍＭのＭｇＣｌ２中においてハイブリダイゼーションを行う条件が、挙げられるが、これに限定されるものではない。その他、ストリンジェントな条件としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ ３ｒｄ（Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．  Ｐｒｅｓｓ，  ２００１）に記載されている。この文献は、参照により本明細書に組み入れられるものとする。当業者は、ハイブリダイゼーション反応や、ハイブリダイゼーション反応液の塩濃度等を変化させることによって、このような条件を容易に選択することができる。
【００２７】
更に、本発明における前記Ｐ１又は前記Ｐ１’のオリゴヌクレオチドには、前記Ｐ１又は前記Ｐ１’のオリゴヌクレオチドに１個又は２個以上の塩基が挿入、欠失又は置換したオリゴヌクレオチドも包含される。
当該塩基が挿入、欠失又は置換した多型検出試験用オリゴヌクレオチドは、前記Ｐ１又は前記Ｐ１’オリゴヌクレオチドと同等程度の作用を示せばよく、１個又は２個以上の塩基が挿入、欠失又は置換されている場合、その挿入、欠失又は置換の位置は、特に限定されない。挿入、欠失又は置換した塩基の数としては１塩基又は２塩基以上が挙げられ、蛍光標識オリゴヌクレオチド全体の長さによって異なるが、例えば１塩基〜１０塩基、１塩基〜５塩基、又は１塩基〜３塩基とすることができる。
【００２８】
前記多型検出試験用オリゴヌクレオチドが有する塩基配列の第１番目の塩基の位置は、配列番号１の１１５番目の位置に限定されず、例えば、配列番号１で示される塩基配列の６０番目〜１１５番目のいずれかの塩基としてもよく、１００番目〜１１０番目のいずれかの塩基としてもよく、１０２番目〜１０６番目のいずれかの塩基としてもよい。
【００２９】
前記多型検出試験用オリゴヌクレオチドの塩基長は、前記配列番号１で示される塩基配列の少なくとも１１５番目〜１２３番目の塩基を含む塩基長９ｍｅｒ〜８０ｍｅｒの塩基配列と同一となる９ｍｅｒ〜８０ｍｅｒであることを要する。前記多型検出試験用オリゴヌクレオチドの塩基長が８ｍｅｒ以下又は８１ｍｅｒ以上では、目的とする検出の感度が期待できない。多型検出試験用オリゴヌクレオチドの塩基長は、２０ｍｅｒ〜８０ｍｅｒとしてもよく、１０ｍｅｒ〜７０ｍｅｒとしてもよく、２５ｍｅｒ〜５０ｍｅｒとしてもよく、２６ｍｅｒ〜４２ｍｅｒとしてもよい。より短い塩基長の多型検出試験用オリゴヌクレオチドは、例えば、より確実に野生型核酸の核酸増幅を抑制し、検出感度が向上する傾向がある。
【００３０】
このような多型検出試験用オリゴヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１で示される塩基配列の第６０〜１１５番目のいずれかの塩基を第１番目の塩基とする１０ｍｅｒ〜８０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドとすることができ、第１００〜１１０番目のいずれかの塩基を第１番目の塩基とする２５ｍｅｒ〜５０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドとしてもよく、第１０２〜１０６番目のいずれかの塩基を第１番目の塩基とする２６ｍｅｒ〜４２ｍｅｒのオリゴヌクレオチドとしてもよい。このようなオリゴヌクレオチドは、例えば、より確実に野生型核酸の核酸増幅を抑制し、検出感度が向上する傾向がある。
【００３１】
このような多型検出試験用オリゴヌクレオチドとしては、例えば、下記の（Ｐ２）及び（Ｐ２’）からなる群より選択された少なくとも１種を挙げることができる。
（Ｐ２）３’末端側が伸長阻害処理され、配列番号１で示す塩基配列の少なくとも第１０４〜１２３番目の塩基を含む塩基長２０〜８０の塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有するオリゴヌクレオチド；
（Ｐ２’）３’末端側が伸長阻害処理され、配列番号１で示す塩基配列の少なくとも、１０４番目〜１２３番目の塩基を含む塩基長２０〜８０の塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
【００３２】
前記Ｐ２又はＰ２’オリゴヌクレオチドでは、配列番号１で示される塩基配列の第１０４番目〜第１２３番目の塩基を含む塩基長２０ｍｅｒ〜８０ｍｅｒの塩基配列であれば、Ｐ２又はＰ２’オリゴヌクレオチドの第１番目の塩基が配列番号１で示される塩基配列のいずれの塩基に対応する塩基であってもよい。例えば、Ｐ２又はＰ２’オリゴヌクレオチドは、前記１０４番目の塩基を、Ｐ２又はＰ２’オリゴヌクレオチドの５’末端から数えて１〜３番目の位置に有するものであってもよく、５’末端側、即ちＰ２又はＰ２’オリゴヌクレオチドの第１番目の塩基としてもよい。前記１０４番目の塩基を３’末端から１〜３番目、特に３’末端側に有するオリゴヌクレオチドは、例えば、野生型核酸に核酸増幅をより確実に抑制できる傾向がある。
【００３３】
前記Ｐ２’オリゴヌクレオチドにおけるストリンジェントな条件については、前記Ｐ１’オリゴヌクレオチドについて記述した事項をそのまま適用する。
【００３４】
更に、本発明における前記Ｐ２又は前記Ｐ２’のオリゴヌクレオチドには、前記Ｐ２又は前記Ｐ２’のオリゴヌクレオチドに１個又は数個塩基が挿入、欠失又は置換したオリゴヌクレオチドも包含される。
前記Ｐ２又は前記Ｐ２’のオリゴヌクレオチドの塩基配列に対して、挿入、欠失又は置換される１個又は２個以上の塩基については、前記Ｐ１及びＰ１’オリゴヌクレオチドの塩基配列に対して挿入、欠失又は置換される１個又は２個以上の塩基として記述した事項をそのまま適用する。
【００３５】
前記多型検出試験用オリゴヌクレオチドは、また、多型検出試験用オリゴヌクレオチド又はその相補鎖を検出するためなどを目的として、標識化されていてもよい。
多型検出試験用オリゴヌクレオチドに付される標識化物質としては、一般に蛍光色素及び蛍光団等を挙げることができる。標識化物質は、一般に、オリゴヌクレオチドの塩基に付されるが、これに限定されない。前記標識化物質が付された塩基は、多型検出試験用オリゴヌクレオチドのいずれかの塩基であればよく、いずれの位置であってよい。多型検出試験用オリゴヌクレオチドのいずれかの位置の塩基が蛍光色素により標識化された塩基とすることにより、多型検出試験用オリゴヌクレオチドがハイブリダイズした核酸の有無を有意に検出可能とするなどの利点を有する。
【００３６】
前記多型検出試験用オリゴヌクレオチドの３’末端側は、伸長阻害処理されていることを要する。ここで、「伸長」とは、ＤＮＡポリメラーゼ又はＲＮＡポリメラーゼ等の酵素を用いた核酸増幅処理によるヌクレオチド鎖の伸長を意味する。伸長阻害処理は、オリゴヌクレオチド鎖の５’末端から３’末端への伸長が阻害される処理であれば特に制限はなく、例えば、オリゴヌクレオチド鎖の３’末端側の核酸に対する置換基又は化合物の付加を挙げることができる。
【００３７】
このような伸長阻害を目的として付加される置換基の例としては、リン酸基、ｄｄＮＴＰ基等を挙げることができ、伸長阻害を目的として付加される化合物の例としては、蛍光色素、２’，３’ｄｄＡ、２’，３’ｄｄＣ、２’，３’ｄｄＧ、２’，３’ｄｄＴ等を挙げることができる。オリゴヌクレオチド鎖の伸長阻害処理としては、例えば、確実な伸長阻害などの観点から、３’末端側の核酸に対するリン酸基の付加としてもよい。なお、前記置換基又は化合物が付加される核酸の位置は、核酸の伸長に用いられる手段によって異なるが、ＤＮＡポリメラーゼ又はＲＮＡポリメラーゼを用いる場合には、（デオキシ）リボースの３位とすればよいが、これに限定されない。
【００３８】
また前記多型検出試験用オリゴヌクレオチドは、塩基配列上の塩基として、蛍光色素により標識された塩基を含んでもよい。
前記蛍光色素としては、特に制限されないが、例えば、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等が挙げられ、市販の蛍光色素としては、例えば、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ、ＦＡＭ、Ｃｙ３およびＣｙ５、ＴＡＭＲＡ等が挙げられる。
【００３９】
本発明にかかる多型検出試験用オリゴヌクレオチドの一例は、以下のとおりである。表中の「（Ｐ）」はリン酸基を表す。なお、配列番号１で示される塩基配列において、それぞれ、Ｃｍｐ−１は第１０４番目の塩基から４０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド、Ｃｍｐ−２は第１０４番目の塩基から２９ｍｅｒのオリゴヌクレオチド、Ｃｍｐ−３は第１１５番目の塩基から２８ｍｅｒのオリゴヌクレオチド、Ｃｍｐ−４は第８９番目の塩基から４９ｍｅｒのオリゴヌクレオチド、Ｃｍｐ−５は第７９番目の塩基から４７ｍｅｒのオリゴヌクレオチド、Ｃｍｐ−６は第１０７番目の塩基から３６ｍｅｒのオリゴヌクレオチド、Ｃｍｐ−７は第１０４番目の塩基から２０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド、Ｃｍｐ−８は第１０４番目の塩基から８０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド、Ｃｍｐ−９は第６３番目の塩基から８０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド、Ｃｍｐ−１０は第１０５番目の塩基から３９ｍｅｒのオリゴヌクレオチド、Ｃｍｐ−１１は第１０６番目の塩基から３８ｍｅｒ長のオリゴヌクレオチド、Ｃｍｐ−１２は第１１１番目の塩基から３３ｍｅｒのオリゴヌクレオチド、Ｃｍｐ−１３は第１１５番目の塩基から２９ｍｅｒのオリゴヌクレオチド、Ｃｍｐ−１４は第１１５番目の塩基から１０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド、Ｃｍｐ−１５は第１０６番目の塩基から７８ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである。
【００４０】
【表１】
0005930825.tif 000002
【００４１】
上述した多型検出試験用オリゴヌクレオチドを用いることにより検出可能なＥＧＦＲ遺伝子の変異（多型）は、配列番号１で示される塩基配列の１１５番〜１２３番目の塩基の領域に１つ又は複数の塩基が欠失している多型が挙げられる。このような変異型ＥＧＦＲ遺伝子としては、例えば、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない。なお、表２に中、「−」は欠損部、小文字は変異部、「ＷＴ」は野生型ＥＧＦＲエクソン１９（配列番号１の第１０４番目〜１５１番目）、野生型遺伝子の太字下線付きの「Ｇ」は、置換部をそれぞれ意味する。
【００４２】
【表２】
0005930825.tif 000003
【００４３】
＜ＥＧＦＲ多型検出プローブ＞
後述するＥＧＦＲ遺伝子多型検出方法では、検出対象となるＥＧＦＲ遺伝子多型を検出するためのＥＧＦＲ遺伝子多型検出プローブ（以下、単に多型検出プローブという）が用いられる。
前記多型検出プローブとしては、前記多型検出試験用オリゴヌクレオチドの増幅抑制標的部位に対応する位置に変異を有する多型を検出可能な多型検出プローブであればよく、また、当該増幅抑制標的部位に対応する位置に欠失を有する多型を検出可能な多型検出プローブであればよい。
【００４４】
このような多型検出プローブは、具体的には、配列番号１で示される塩基配列の第１１５番目〜第１２３番目の塩基を含む塩基配列に相補的な核酸に対してハイブリダイズ可能な配列であればよい。なお、配列番号１で示される塩基配列の第１１５番目〜第１２３番目の塩基を含む塩基配列に相補的な塩基配列であって、多型検出プローブがハイブリダイズ可能な配列を「標的配列」と称する場合がある。
プローブの長さとしては、特に制限はないが、５ｍｅｒ〜５０ｍｅｒとしてもよく、１０ｍｅｒ〜３０ｍｅｒとしてもよい。プローブの長さがこのような範囲であれば、例えば検出感度を高めることができる。
【００４５】
前記多型検出プローブは、前記多型検出試験用オリゴヌクレオチドの塩基配列に対して４５％以上の同一性を有する塩基配列を有していてもよい。このように前記多型検出プローブを、前記多型検出試験用オリゴヌクレオチドの塩基配列に対して４５％以上の同一性を有するプローブとすることにより、例えば、変異型のＥＧＦＲ遺伝子を含む試料核酸に対する感度を向上させることができる。前記多型検出プローブの前記多型検出用試験用オリゴヌクレオチドに対する同一性は、５５％以上としてもよく、６５％以上としてもよく、８０％以上としてもよい。
【００４６】
また、多型検出プローブの配列には、検出対象となる変異（例えば、欠失）部位の５’末端側の塩基に対応する塩基が含まれていれば特に制限はない。多型検出プローブの塩基配列は、検出対象となる変異（欠失）部位に対応する塩基が、プローブの５’末端から数えて５番目以降に位置してもよく、１０番目以降に位置してもよい。多型検出プローブにおける変異部位に対する塩基の位置がこのような位置であれば、例えば、検出感度を高めることができる。
【００４７】
また、多型検出プローブの配列としては、野生型の配列に対応した塩基配列としてもよく、更に変異を含むものであってもよい。多型検出プローブとしては、配列番号１で示される塩基配列又はその相補的な配列に対して、７０％〜１００％の同一性を有するオリゴヌクレオチドであってもよく、８０％〜１００％の同一性を有するオリゴヌクレオチドであってもよい。多型検出プローブの配列を野生型の対応した塩基とすることによって、例えば、検出感度を高めることができる。
また、多型検出プローブとしては、配列番号１で示される塩基配列又はその相補的な配列に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであってもよく、１個又は２個以上の塩基が挿入、欠失又は置換したオリゴヌクレオチドであってもよい。
なお、ストリンジェントな条件については、多型検出用試験用オリゴヌクレオチドの項に記載した条件と同様の条件を適用することができる。また、同一性や、挿入、欠失又は置換の範囲についても、多型検出用試験用オリゴヌクレオチドの項に記載したものと同様の範囲を適用することができる。
【００４８】
また、多型検出プローブを増幅工程でプライマーと共に存在させて使用する場合には、ＤＮＡポリメラーゼの反応対象となってプローブ自体の伸長を予防するために、多型検出プローブは、３’末端側に後述する蛍光標識が付加されていてもよく、プローブの３’末端に更にリン酸基が付加されていてもよい。
【００４９】
多型検出プローブには、検出の効率性の観点から、標識が付されている標識化プローブとしてもよい。
標識化プローブにおける標識物質の具体例としては、例えば、蛍光色素および蛍光団が挙げられる。
【００５０】
前記多型検出プローブは、標的配列にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、標的配列にハイブリダイズしているときの蛍光強度が減少（消光）するかまたは増加する蛍光標識プローブとすることができる。その中でも標的配列にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、標的配列にハイブリダイズしているときの蛍光強度が減少する蛍光標識プローブとすることができる。
【００５１】
このような蛍光消光現象（Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ）を利用したプローブは、一般的に、グアニン消光プローブと呼ばれており、いわゆるＱ  Ｐｒｏｂｅ（登録商標）として知られている。中でも、３’末端もしくは５’末端がシトシン（Ｃ）となるように設計され、その末端のＣがグアニン（Ｇ）に近づくと発光が弱くなるように蛍光色素で標識化されたオリゴヌクレオチドであることが挙げられる。
このようなプローブを使用すれば、シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。
【００５２】
なお、Ｑ Ｐｒｏｂｅを用いた検出方法以外にも、公知の検出様式を適用してもよい。このような検出様式としては、Ｔａｑ−ｍａｎ Ｐｒｏｂｅ法、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅ法、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ  Ｂｅａｃｏｎ法又はＭＧＢ  Ｐｒｏｂｅ法などを挙げることができる。
【００５３】
前記蛍光色素としては、特に制限されないが、例えば、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等が挙げられる。これらおｎ蛍光色素の市販品としては、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ、ＦＡＭ、Ｃｙ３およびＣｙ５、ＴＡＭＲＡ等が挙げられる。
蛍光標識オリゴヌクレオチドの検出条件は特に制限されず、使用する蛍光色素により適宜決定できる。例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅは、検出波長４４５ｎｍ〜４８０ｎｍ、ＴＡＭＲＡは、検出波長５８５ｎｍ〜７００ｎｍ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬは、検出波長５２０ｎｍ〜５５５ｎｍで検出できる。このような蛍光色素を有するプローブを使用すれば、それぞれの蛍光シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。蛍光色素のオリゴヌクレオチドへの結合は、通常の方法、例えば特開２００２−１１９２９１号公報等に記載の方法に従って行うことができる。
【００５４】
また、前記プローブが、蛍光色素等の標識化物質で標識化された標識化プローブである場合、例えば、検出する蛍光強度等のシグナル強度を調節するために、前記標識化プローブと同じ配列である未標識プローブを併用してもよい。この未標識プローブは、例えば、その３’末端にリン酸が付加されてもよい。
【００５５】
＜プライマー＞
後述するＥＧＦＲ遺伝子多型検出方法では、検出対象となるＥＧＦＲ遺伝子多型を含む配列を増幅する場合には、プライマーが用いられる。
核酸増幅に適用するプライマーは、目的とする検出対象となるＥＧＦＲ遺伝子多型の部位（例えば、欠失した塩基の領域に対応する配列番号１で示される配列）を含む核酸を増幅可能であれば特に制限されない。
このようなプライマーの設計については、配列番号１で示される塩基配列から、当業者であれば適宜設計することができる。
【００５６】
プライマーの長さ及びＴｍ値は、１２ｍｅｒ〜４０ｍｅｒ及び４０℃〜７０℃、又は１６ｍｅｒ〜３０ｍｅｒ及び５５℃〜６０℃にすることができる。
また、プライマーセットの各プライマーの長さは同一でなくてもよい。一方、両プライマーのＴｍ値はほぼ同一（又は、Ｔｍ値の両プライマーでの差が５℃以内）であってもよい。
【００５７】
＜ＥＧＦＲ遺伝子多型検出方法＞
本発明にかかるＥＧＦＲ遺伝子多型検出方法は、前記多型検出試験用オリゴヌクレオチドを少なくとも１種用いてＥＧＦＲ遺伝子の多型を検出することを含むＥＧＦＲ遺伝子多型検出方法である。
本検出方法によれば、前記多型検出試験用オリゴヌクレオチドを少なくとも１種が野生型のＥＧＦＲ遺伝子に優先的にハイブリダイズするので、野生型のＥＧＦＲ遺伝子と、変異型のＥＧＦＲ遺伝子とを簡便に区別し、感度よく変異型のＥＧＦＲ遺伝子を検出可能にする。
【００５８】
前記ＥＧＦＲ遺伝子多型検出方法は、前記多型検出試験用オリゴヌクレオチドが野生型ＥＧＦＲ遺伝子核酸に対して変異型ＥＧＦＲ遺伝子核酸よりも優先的にハイブリダイズすることを利用する方法であれば特に制限されない。
このような方法としては、例えば、核酸増幅を利用する方法が挙げられる。核酸増幅を利用した方法であれば、前記多型検出プローブの塩基配列が野生型ＥＧＦＲ遺伝子核酸に優先的にハイブリダイズした結果、野生型ＥＧＦＲ遺伝子核酸の増幅が抑制され、変異型ＥＧＦＲ遺伝子核酸を優先的に増幅させることができる。
【００５９】
具体的には、前記ＥＧＦＲ遺伝子多型検出方法は、配列番号１で示される塩基配列を有する一本鎖核酸を含み得る核酸試料を用意すること（核酸試料準備工程）、前記多型検出試験用オリゴヌクレオチドと前記一本鎖核酸とを接触させて、該多型検出試験用オリゴヌクレオチド及び該一本鎖核酸を含み且つ該一本鎖核酸の核酸増幅が抑制されるハイブリッドを得ること（第一のハイブリダイゼーション工程）、該多型検出試験用オリゴヌクレオチドと該一本鎖核酸の接触時又は接触後の前記核酸試料に対して核酸増幅を行うこと（核酸増幅工程）を含む多型検出方法とすることができる。このような多型検出方法とすることにより、例えば、簡便に且つ感度よく、ＥＧＦＲ遺伝子多型を検出することができるなどの利点を有する。
【００６０】
前記核酸試料準備工程で用意される核酸試料は、特に制限されないが、例えば、生体試料由来の核酸を含む試料が挙げられる。前記生体試料としては、例えば、大腸や肺等の組織、白血球細胞等の血球、全血、血漿、喀痰、口腔粘膜等の口腔内細胞、爪および毛髪等の体細胞、生殖細胞、乳、腹水液、パラフィン包埋組織、胃液、胃洗浄液、尿、腹膜液、羊水、細胞培養などの任意の生物学的起源に由来する又は由来しうるものを挙げられる。なお、試料の採取方法、核酸を含む試料の調製方法等は、制限されず、いずれも従来公知の方法が採用できる。また、鋳型となる核酸は、該起源から得られたままで直接的に、あるいは該サンプルの特性を改変するために前処理した後で使用することができる。また、生体試料由来の核酸を鋳型として核酸増幅法を行った反応液を、本発明における核酸試料とし、前記反応液に含まれる増幅産物を鋳型核酸配列としてもよい。
例えば、全血を試料とする場合、全血からのゲノムＤＮＡの単離は、従来公知の方法によって行うことができる。例えば、市販のゲノムＤＮＡ単離キット（商品名ＧＦＸ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ；ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）等が使用できる。
【００６１】
なお、前記試料は、例えば、目的の塩基部位が変異型および正常型のいずれを示すか不明である核酸を含む試料、変異型を有する核酸と正常型を有する核酸とを含む試料、これらを含む可能性のある試料等のいずれであってもよい。試料中の核酸、例えば、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸の由来は、制限されず、例えば、各種癌細胞等の細胞、ウィルス、ミトコンドリア等が挙げられる。特に、変異型を示す核酸と正常型を示す核酸とを有する試料への適用が好ましく、例えば、肺癌等の各種癌細胞等の生体試料、具体例としては、血液中に遊離する細胞等に適用することが好ましい。血液中に含まれる癌化した細胞には、変異型が発生した核酸を有する細胞と、正常型を示す核酸を有する細胞とが含まれるため、このような細胞由来の核酸試料に対して、本多型検出方法を適用することは、要求される感度を実現できる点で、好ましい。なお、本発明において、試料の採取方法、核酸の調製方法等は、特に制限されず、従来公知の方法が採用できる。
【００６２】
試料中の核酸は、一本鎖でもよいし、二本鎖でもよい。試料中の核酸配列としては、例えば、ＤＮＡ、および、トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡ等が挙げられる。また、前記核酸配列は、例えば、生体試料等の試料に含まれる核酸が挙げられる。
試料中の核酸は、例えば、生体試料中に元来含まれている核酸でもよいが、例えば、多型検出の精度を向上できることから、前記生体試料中の核酸を鋳型として核酸増幅法により増幅させた増幅産物等が挙げられる。具体例としては、例えば、前記生体試料に元来含まれているＤＮＡを鋳型として、核酸増幅法により増幅させた増幅産物や、前記生体試料に元来含まれているＲＮＡから逆転写−ＰＣＲ反応（ＲＴ−ＰＣＲ：Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ＰＣＲ）により生成させたｃＤＮＡを鋳型として、核酸増幅法により増幅させた増幅産物が挙げられる。これらの増幅産物を、本発明における鋳型核酸配列としてもよい。前記増幅産物の長さは、特に制限されないが、例えば、５０〜１０００塩基であり、好ましくは８０〜２００塩基である。
【００６３】
第一のハイブリダイゼーション工程は、前記多型検出試験用オリゴヌクレオチドと前記一本鎖核酸とを接触させて、該多型検出試験用オリゴヌクレオチド及び該一本鎖核酸を含み且つ該一本鎖核酸の核酸増幅が抑制されるハイブリッドを得る。前記ハイブリッドは、前記多型検出試験用オリゴヌクレオチドと一本鎖核酸とのハイブリダイズ可能な条件でハイブリダイゼーションを行うことにより得られる。
第一のハイブリダイゼーション工程におけるハイブリダイズ可能な条件とは、一本鎖核酸同士をハイブリダイズするために通常適用される条件をそのまま適用すればよく、後述するプライマーと一本鎖核酸とのハイブリダイズする際に適用される条件をそのまま採用すればよい。これにより、多型検出試験用オリゴヌクレオチドと配列番号１で示される塩基配列を有する一本鎖核酸とにより、ハイブリッドが得られる。このハイブリッドは、試料中の一本鎖核酸が多型検出試験用オリゴヌクレオチドにより二本鎖核酸となっているため、ハイブリッドを構成する核酸配列に対する核酸増幅が抑制される。
【００６４】
前記多型検出試験用オリゴヌクレオチドは、核酸試料、例えば単離したゲノムＤＮＡを含む液体試料に添加してもよいし、適当な溶媒中でゲノムＤＮＡと混合してもよい。前記溶媒としては、特に制限されず、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、グリセロール等を含む溶媒、ＰＣＲ反応液等、従来公知のものが挙げられる。
また、前記多型検出試験用オリゴヌクレオチドと試料中の検査対象となる一本鎖核酸との接触には、特に制限はなく、所定の量比となるように、例えば、所定量の核酸を含む試料中に多型検出試験用オリゴヌクレオチドを添加すればよい。
【００６５】
第一のハイブリダイゼーション工程において、検査対象となる試料は、好ましくは、前記多型検出試験用オリゴヌクレオチドと共に前記多型検出プローブを含む。これにより、簡便かつ感度よくＥＧＦＲ遺伝子多型を検出することができるなどの利点を有する。
【００６６】
本発明において、試料中の核酸における前記多型検出プローブの添加割合（モル比）は、検出対象核酸（検出対象配列を含む増幅産物）に対して１０倍以下としてもよく、５倍以下としてもよく、３倍以下としてよい。また、その下限は特に制限されないが、例えば、０．０００１倍以上としてもよく０．００１倍以上としてもよく、０．０１倍以上としてもよい。
ここで、試料中の核酸とは、例えば、検出目的の多型が発生している検出対象核酸と前記多型が発生していない非検出対象核酸との合計でもよいし、検出目的の多型が発生している検出対象配列を含む増幅産物と前記多型が発生していない非検出対象配列を含む増幅産物との合計でもよい。
なお、前記核酸に対する前記多型検出プローブの添加割合は、例えば、二本鎖核酸に対するモル比でもよいし、一本鎖核酸に対するモル比でもよい。
【００６７】
反応系における多型検出プローブの添加割合は、特に制限されないが、例えば、前記プローブを１０ｎｍｏｌ／Ｌ〜４００ｎｍｏｌ／Ｌとしてもよく、２０ｎｍｏｌ／Ｌ〜２００ｎｍｏｌ／Ｌとしてもよい。
【００６８】
核酸増幅工程における核酸増幅は、多型検出試験用オリゴヌクレオチドとの接触時又は接触後の核酸試料に対して行われる。なお、核酸増幅処理は、試料中に前記ハイブリッドが形成された後であれば、第一のハイブリダイゼーション工程の後であっても、ほぼ同時であってもよい。これにより、第一のハイブリダイゼーション工程によるハイブリッドを構成しなかった核酸試料中の一本鎖核酸について核酸増幅が行われる。
【００６９】
増幅工程では、核酸試料とプライマー対とを接触させて、核酸試料中の核酸配列を鋳型核酸配列とした核酸の増幅を行う。このとき、各プライマーは、同一の試料（同一の反応液）中で、それぞれ鋳型核酸配列にアニールし、核酸の増幅が開始される。なお、本発明における鋳型核酸配列には、前記増幅抑制標的部位を含む野生型の鋳型核酸配列が含まれる。
【００７０】
増幅工程において、増幅反応の反応系（例えば、反応液）における前記核酸試料の添加割合は、特に制限されない。具体例として、前記核酸試料が生体試料（例えば、全血試料）の場合、前記反応系における添加割合の下限が、例えば、０．０１体積％以上としてもよく、０．０５体積％以上としてもよく、０．１体積％以上としてもよい。また、前記添加割合の上限も、特に制限されないが、例えば、２体積％以下としてもよく、１体積％以下としてもよく、０．５体積％以下としてもよい。
【００７１】
また、後述する変異の検出において、例えば、標識化プローブを用いた光学的検出を行う場合、前記反応系における全血試料等の生体試料の添加割合は、例えば、０．１〜０．５体積％としてもよい。この範囲であれば、例えば、変性による沈殿物等の発生による影響を十分に防止でき、光学的手法による測定精度を向上できる。また、全血試料中の夾雑物による核酸増幅ＰＣＲの阻害も十分に抑制されるため、増幅効率をより一層向上できることも期待される。
【００７２】
また増幅反応の開始前に、反応系にさらにアルブミンを添加することが好ましい。このようなアルブミンの添加によって、例えば、沈殿物または濁りの発生による影響を、より一層低減でき、且つ、増幅効率もさらに向上することができる。
前記反応系におけるアルブミンの添加割合は、例えば、０．０１質量％〜２質量％としてよく、０．１質量％〜１質量％としてよく、０．２質量％〜０．８質量％としてもよい。前記アルブミンとしては、特に制限されず、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン、ラット血清アルブミン、ウマ血清アルブミン等が挙げられ、これらはいずれか１種類でもよいし２種類以上を併用してもよい。
【００７３】
増幅工程における核酸増幅法としては、例えばポリメラーゼを用いる方法等が挙げられる。その例としては、例えば、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法、ＩＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic acid sequence based amplification）法、ＴＭＡ（Transcription-mediated amplification）法、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）法等が挙げられる。なお、核酸増幅法の条件は、特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。
増幅工程における増幅について、ＰＣＲ法を例に挙げて説明するが、本発明は、これに限定されない。ＰＣＲの条件は、特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。
【００７４】
前記反応液における他の組成成分は、特に制限されず、従来公知の成分が挙げられ、その割合も特に制限されない。前記組成成分としては、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）等のヌクレオチドおよび溶媒等が挙げられる。前記反応液において、各組成成分の添加順序は何ら制限されない。
【００７５】
ＰＣＲ法に用いるＤＮＡポリメラーゼとしては、通常用いられるＤＮＡポリメラーゼを特に制限なく用いることができる。例えば、ＧｅｎｅＴａｑ（ニッポンジーン社製）、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）、Ｔａｑ  ポリメラーゼ等を挙げることができる。
【００７６】
ポリメラーゼの使用量としては、当業界で通常用いられている濃度であれば特に制限はない。例えば、Ｔａｑポリメラーゼを用いる場合、例えば、反応溶液量１０μＬに対して０．０１Ｕ〜１０Ｕの濃度とすることができ、反応溶液量１０μＬに対して０．０５Ｕ〜１Ｕとすることができる。これにより、前記多型検出試験用オリゴヌクレオチドの野生型核酸親和性を高めることができるなどの傾向がある。
【００７７】
ＰＣＲの方法は、一般的な工程を用い、温度やサイクル数等の条件は特に制限されない。各ステップの温度変化は、例えば、サーマルサイクラー等を用いて自動的に制御すればよい。
【００７８】
本発明の多型検出方法は、更に多型評価工程を含んでもよく、多型評価工程は、以下の（Ｉ）〜(IV)の各工程を含むことができ、また下記工程（Ｖ）を含んでいてもよい。
（Ｉ）前記多型検出プローブ及び試料中の一本鎖核酸を接触させて、前記多型検出プローブと前記一本鎖核酸とをハイブリダイズさせたハイブリッドを得ること（第二のハイブリダイゼーション工程という）。
（II）前記ハイブリッドを含む試料の温度を変化させるにより、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づく蛍光シグナルの変動を測定すること（測定工程という）。
（III）前記蛍光シグナルの変動に基づいてハイブリッドの解離温度であるＴｍ値を測定すること（Ｔｍ値測定工程）。
（IV）前記Ｔｍ値に基づいて、前記試料中の一本鎖核酸における、ＥＧＦＲ遺伝子における多型の存在を検出すること（多型検出工程）。
（Ｖ）前記多型の存在に基づいて、前記試料中の一本鎖核酸における、多型を有する一本鎖核酸の存在比を検出すること（多型存在比検出工程）。
このような多型検出方法とすることにより、ＥＧＦＲ遺伝子多型を簡便に且つ感度よく検出し、評価することができる。
【００７９】
第二のハイブリダイゼーション工程において適用されるハイブリダイゼーションの手法及び条件としては、特に制限はなく、二本鎖核酸配列を変性して一本鎖核酸配列にすること、一本鎖核酸配列同士をハイブリダイズすることを目的として当業界で既知の条件をそのまま適用すればよい。
例えば、解離における加熱温度は、前記増幅産物が解離できる温度であれば特に制限されないが、例えば、８５℃〜９５℃である。加熱時間も特に制限されないが、通常、１秒〜１０分であり、１秒〜５分としてもよい。また、解離した一本鎖核酸配列と多型検出プローブとのハイブリダイズは、例えば、解離後、解離における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件としては、例えば、４０℃〜５０℃である。
なお、本明細書において、増幅産物における「一本鎖核酸配列」の用語には、試験対象となっている当初の核酸試料における一本鎖核酸配列も包含する。
【００８０】
測定工程では、ハイブリッドを含む試料の温度を変化させて、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づくシグナルの変動を測定する。
前記増幅一本鎖核酸と多型検出プローブとのハイブリッドの融解状態を示すシグナル値の測定は、２６０ｎｍの吸光度測定でもよいが、前記多型検出用プローブに付加した標識のシグナルに基づくシグナルであって、一本鎖ＤＮＡと前記多型検出用プローブとのハイブリッド形成の状態に応じて変動するシグナルの測定であってもよい。標識物質のシグナル測定とすることによって、例えば検出感度を高めることができる。
【００８１】
標識化ブローブとしては、例えば、標的配列（相補配列）にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、標的配列にハイブリダイズしているときの蛍光強度が減少（消光）する蛍光標識オリゴヌクレオチド、または標的配列にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、標的配列にハイブリダイズしているときの蛍光強度が増加する蛍光標識オリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００８２】
前者のようなプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（例えば、二本鎖ＤＮＡ）を形成している際にはシグナルを示さないか、シグナルが弱いが、加熱によりプローブが解離するとシグナルを示すようになるか、シグナルが増加する。
また、後者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（例えば、二本鎖ＤＮＡ）を形成することによって蛍光シグナルを示し、加熱によりプローブが解離するとシグナルが減少（消失）する。したがって、この標識に基づくシグナルの変化をシグナル特有の条件（吸収波長等）で検出することによって、前記２６０ｎｍの吸光度測定と同様に、融解の進行ならびにＴｍ値の決定等を行うことができる。
【００８３】
ハイブリッドの解離に基づくシグナルの変動は、反応液の温度を変化させて行う。例えば、前記反応液を加熱し、すなわち、前記一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリッドを徐々に加熱し、温度上昇に伴うシグナルの変動を測定する。例えば、Ｑ Ｐｒｏｂｅを使用した場合、一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズした状態では、解離した状態に比べて蛍光強度が減少（または消光）する。したがって、例えば、蛍光が減少（または消光）しているハイブリッドを徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。なお、前記標識化プローブを使用する場合、前記シグナル値は、例えば、前記標識化プローブの標識物質に応じた条件で測定することができる。
【００８４】
蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されないが、例えば、開始温度が室温〜８５℃としてもよく、または２５℃〜７０℃としてもよい。終了温度は、例えば、４０〜１０５℃としうる。また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば、０．１℃〜２０℃／秒、又は０．３〜５℃／秒としうる。
【００８５】
Ｔｍ値測定工程では、前記測定工程で得られたシグナルの変動を解析してＴｍ値を決定する。具体的には、得られた蛍光強度から各温度における微分値（−ｄ蛍光強度／ｄｔ）を算出し、最も低い値を示す温度をＴｍ値として決定できる。あるいは、例えば、各温度における単位時間当たりの蛍光強度変化量を算出し、その変化量を（−ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ）とする場合は、例えば、最も低い値を示す温度をＴｍ値として決定できる。また、変化量を（ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ）とする場合は、例えば、最も高い点をＴｍ値として決定することもできる。なお、標識化プローブとして、消光プローブではなく、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示すプローブを使用した場合には、反対に、蛍光強度の減少量を測定すればよい。
【００８６】
Ｔｍ値は、例えば、従来公知のＭＥＬＴＣＡＬＣソフトウエア（http:/www.meltcalc.com/）等により算出でき、また、隣接法（Nearest Neighbor Method）によって決定することもできる。
【００８７】
多型検出工程では、決定されたＴｍ値に基づいて、ＥＧＦＲエクソン１９の多型の存在を検出する。また、任意の多型存在比検出工程では、決定されたＴｍ値に基づいて、ＥＧＦＲエクソン１９の多型を有する一本鎖核酸の存在比を検出する。
なお、ハイブリッドの解離温度を評価することだけでなく、ハイブリットの融解時に温度に応じて変動する蛍光シグナルの微分値の大きさを評価することを含む。微分値の大きさにより、多型を有する塩基配列（ＤＮＡ）の存在比を評価することができる。
【００８８】
本発明においては、前述のように、ハイブリッドを加熱して、温度上昇に伴うシグナル変動（好ましくは蛍光強度の増加）を測定するが、この方法に代えて、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナル変動の測定を行ってもよい。すなわち、前記プローブを含む反応液の温度を降下させてハイブリッドを形成する際の前記温度降下に伴うシグナル変動を測定してもよい。
【００８９】
具体例として、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ（例えば、Ｑ  Ｐｒｏｂｅ）を使用した場合、一本鎖核酸配列と標識化プローブとが解離している状態では蛍光を発しているが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、前記蛍光が減少（または消光）する。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。他方、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブを使用した場合、一本鎖核酸配列と標識化プローブとが解離している状態では蛍光を発していないが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光を発するようになる。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【００９０】
ＥＧＦＲエクソン１９における変異型及び野生型の核酸配列に存在比を定量的に測定するには、予め、変異型及び野生型それぞれの核酸配列を作製して得られた検量線を作成し、それに基づいてそれぞれの存在比を検出することが好ましい。
検量線の作成の一例について以下に説明する。
【００９１】
まず、例えば、野生型の核酸Ｗｔと変異型の核酸Ｍｔとの２種類の核酸の存在比を各々異ならせた複数の核酸混合物を作製し、複数の核酸混合物の各々について、融解曲線解析装置を用いて融解曲線を得る。
図１Ａに、ある１つの核酸混合物の温度と吸光度または蛍光強度等の検出信号との関係で表された融解曲線、及び同図１Ｂに温度と検出信号の微分値との関係で表された融解曲線（微分融解曲線ともいう）を示す。この微分融解曲線からピークを検出することにより、核酸Ｗｔの融解温度ＴｍＷ及び核酸Ｍｔの融解温度ＴｍＭを検出して、ＴｍＷ及びＴｍＭを含む温度範囲の各々を設定する。
【００９２】
ＴｍＷを含む温度範囲ΔＴＷとしては、例えば、ＴｍＷとＴｍＭとの間で検出信号の微分値が最小となる温度を下限、検出信号のピークの裾野に対応する温度を上限とする温度範囲を設定することができる。また、ＴｍＭを含む温度範囲ΔＴＭとしては、例えば、ＴｍＷとＴｍＭとの間で検出信号の微分値が最小となる温度を上限、検出信号のピークの裾野に対応する温度を下限とする温度範囲を設定することができる。
なお、温度範囲ΔＴＷ及び温度範囲ΔＴＭは、同一の幅（例えば、１０℃）または異なる幅（例えば、温度範囲ΔＴＷが１０℃、温度範囲ΔＴＭが７℃）となるように設定してもよい。また、温度範囲ΔＴＷ及び温度範囲ΔＴＭは、それぞれの融解温度ＴｍからプラスＸ℃、マイナスＸ℃の幅（Ｘ℃は例えば１５℃以内、望ましくは１０℃以内）というように設定してもよい。
【００９３】
次に、温度範囲ΔＴＷ及び温度範囲ΔＴＭの各々について、微分融解曲線の温度範囲の下限に対応する点と上限に対応する点とを通る直線と微分融解曲線とで囲まれた面積（図１Ｂの斜線部分）を求める。面積の求め方の一例として、具体的に以下のように求めることができる。温度Ｔにおける検出信号の微分値をｆ（Ｔ）とし、温度Ｔにおけるベース値をＢ（Ｔ）として、下記（１）式により求める。
【００９４】
面積Ｓ＝｛ｆ（Ｔｓ＋１）−Ｂ（Ｔｓ＋１）｝＋｛ｆ（Ｔｓ＋２）−Ｂ（Ｔｓ＋２）｝
＋・・・＋｛ｆ（Ｔｅ−１）−Ｂ（Ｔｅ−１）｝      ・・・（１）
ただし、Ｔｓは各温度範囲における下限値、Ｔｅは上限値である。また、各温度Ｔにおけるベース値Ｂ（Ｔ）は、下記（２）式により求まる値であり、検出信号に含まれるバックグラウンドレベルを表すものである。このベース値を検出信号の微分値から減算することにより、検出信号に含まれるバックグラウンドの影響を除去する。
【００９５】
Ｂ（Ｔ）＝ａ×（Ｔ−Ｔｓ）＋ｆ（Ｔｓ）      ・・・（２）
ただし、ａ＝｛ｆ（Ｔｅ）−ｆ（Ｔｓ）｝／（Ｔｅ−Ｔｓ）  である。
【００９６】
上記（１）式及び（２）式に従って、各核酸混合物について、温度範囲ΔＴＷにおける面積ＳＷ及び温度範囲ΔＴＷにおける面積ＳＭを求め、面積比と各核酸混合物の存在比との関係を表す検量線を作成する。例えば、横軸に存在比（核酸混合物の総量に対する核酸Ｍｔの割合）をとり、縦軸に面積比（ＳＭ／ＳＷ）をとった検量線とすることができる。なお、面積比はＳＷ／ＳＭで定めてもよい。
実際の試料を用いて得られた融解曲線と微分融解曲線から面積比を算出し、上記のようにしてあらかじめ作成した検量線に基づいて、実際の試料中に含まれる多型を有する塩基配列の存在比を決定することができる。
【００９７】
また、野生型及び変異型の各ピークの存在に従って存在比を計算することができるが、単にピークの存在を確認することによって、ＥＧＦＲ遺伝子における多型の存在（有無）を検出してもよい。
【００９８】
＜ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の判定方法＞
本発明のＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の判定方法は、上述した多型検出方法によりＥＧＦＲ遺伝子における多型を検出すること（遺伝子多型検出工程）、及び、前記検出結果に基づいてＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に対する耐性又はＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の薬効を判定すること（薬効判定工程）、を含む。
上述した多型検出方法では、本発明における多型検出試験用オリゴヌクレオチドを用いて、感度よく且つ簡便にＥＧＦＲエクソン１９遺伝子多型を検出するので、ＥＧＦＲエクソン１９におけるこの多型に基づいてＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の判定を感度よく且つ簡便に行うことができる。
【００９９】
ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の判定方法における遺伝子多型検出工程については、上述したＥＧＦＲ遺伝子における多型検出方法において記述した内容をそのまま適用することができる。
ＥＧＦＲチロシンキナーゼは、ＥＧＦＲエクソン１９における多型によって反応性が異なることが知られている。具体的には、ＥＧＦＲ遺伝子が変異型である場合には、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤による腫瘍縮小効果が期待できると判定することができる。
本発明のＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の判定方法により、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の効果に対する予測を、信頼性高く且つ簡便に行うことができる。
【０１００】
薬効判定対象となりうるＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬としては、ＥＧＦＲチロシンキナーゼを特異的に阻害すればよく、例えば、ゲフィチニブ、エルロチニブ等を挙げることができる。
ＥＧＦＲエクソン１９遺伝子多型の薬効判定の具体的な方法としては、既に知られており、例えば、Journal of Thoracic Oncology: March 2006 - Volume 1 - Issue 3 - pp 260-267(EGFR Mutation of Tumor and Serum in Gefitinib-Treated Patients with Chemotherapy-Naive Non-small Cell Lung Cancer)
に記載されている。
【０１０１】
＜試薬キット＞
本発明のＥＧＦＲ遺伝子における多型を検出するためのＥＧＦＲ多型検出試験用試薬キットは、上述した多型検出試験用オリゴヌクレオチドを含む。
この試薬キットには、ＥＧＦＲエクソン１９における多型を簡便にかつ感度よく検出するために使用可能な上述した増幅抑制標的領域に対してハイブリダイズ可能な既述の多型検出試験用オリゴヌクレオチドが含まれるので、ＥＧＦＲ遺伝子における多型の検出をより簡便に行うことができる。
【０１０２】
また、本試薬キットには、標的とするＥＧＦＲ遺伝子の多型部位を含む領域にハイブリダイズ可能な前記プローブを更に含んでもよく、更に、前記標的とするＥＧＦＲ遺伝子多型部位を含む核酸を増幅可能な前記プライマーセットを含んでいてもよい。これにより、本発明における多型検出試験用試薬キットは、より簡便に且つ精度よくＥＧＦＲ遺伝子における多型の検出を行うことができる。なお、本試薬セットに含まれ得るプローブ及びプライマーについては、前述した事項をそのまま適用することができる。
【０１０３】
前記試薬キットに含まれる各試薬は、異なる容器に含まれていてもよく、同一の容器に含まれていてもよい。なお、本明細書における「異なる容器」とは、各試薬が非接触状態を維持できるように区分けされたものであればよく、必ずしも、独立して取扱い可能な個別の容器でなくてもよい。
【０１０４】
本試薬キットには、上記の他に、増幅に必要なポリメラーゼ等の試薬又は緩衝液、ハイブリダイズのために必要な試薬又は緩衝液、検体試料を希釈するための希釈剤等を含んでもよい。更に、本試薬キットには、前述した多型検出方法を記載した説明書、キットに含まれる若しくは追加的に含むことが可能な各種の試薬に関する使用説明書等を含むことが好ましい。
【実施例】
【０１０５】
以下、本発明を実施例にて詳細に説明する。しかしながら、本発明はそれらに何ら限定されるものではない。なお、特に断りのない限り、「部」又は「％」は質量基準である。
【０１０６】
［実施例１〜３］
サーマルサイクラー（商品名Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ｅｐ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｓ、ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製）と全自動ＳＮＰｓ検査装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ（商標）、アークレイ社製）と、下記表３〜５に記載した処方の検査用試薬を用いて、ＰＣＲおよびＴｍ解析を行った。なお、使用したポリラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼである。
ＰＣＲは、９５℃で６０秒処理した後、９５℃で１秒及び５４℃で１５秒を１サイクルとして、５０サイクル繰り返した。
またＴｍ解析は、ＰＣＲの後、９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理し、続けて温度の上昇速度１℃／３秒で、４０℃から７５℃まで温度を上昇させ、その間の経時的な蛍光強度の変化を測定した。励起波長を４２０ｎｍ〜４８５ｎｍとし、測定波長を５２０〜５５５ｎｍとして、蛍光標識プローブに由来する蛍光強度の変化をそれぞれ測定した。野生型の遺伝子の場合には６６℃付近、変異型の遺伝子の場合には、５１℃付近及び６６℃付近にそれぞれピークが認められることがわかっている。
【０１０７】
試料中の一本鎖核酸の核酸増幅を抑制するために使用した本発明にかかる多型検出試験用オリゴヌクレオチド（以下、ＷＩ核酸という）は、配列番号１の１０４番目〜１４３番目と同一の配列を有するＣｍｐ−１（配列番号２、実施例１）、配列番号１の１０４番目〜１３２番目と同一の配列を有するＣｍｐ−２（配列番号３、実施例２）又は配列番号１の１１５番目〜１４２番目と同一の配列を有するＣｍｐ−３（配列番号４、実施例３）とし、それぞれ０．２μＭ又は０．４μＭで使用した。
野生型のＥＧＦＲエクソン１９遺伝子の配列は配列番号１のとおりである。
変異型のＥＧＦＲエクソン１９遺伝子としてはＥ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌを使用した（表２、Ｎｏ．２）。
【０１０８】
プローブには、配列番号１の１０４〜１３６番目の配列を認識し、５’末端に標識を有する５ＦＰ−ＥＧＦＲ−ＥＸ１９−ＷＴ−ＦＷ−３（5'-(FL)-CCCGTCGCTATCAAGTAATTAAGAGAAGCAACA：配列番号３５）を用いた。Ｆプライマー（フォワードプライマー）としては、配列番号１の５４〜７３番目の配列に対応するＥＧＦＲ−ＥＸ１９−Ｆ２（TCTCTCTGTCATAGGGACTC：配列番号３３）を使用し、Ｒプライマー（リバースプライマー）としては、配列番号１の１５５〜１７５番目の塩基に対応するＥＧＦＲ−ＥＸ１９−Ｒ１（GAAACTCACATCGAGGATTTC：配列番号３４）を使用した。鋳型核酸配列としては、１×１０３ｃｏｐｙ／μＬの精製ヒトゲノム（Roche社製）及び、野生型の遺伝子配列（配列番号１）と変異型の遺伝子配列（配列番号３６、表２のＮｏ．２に相当）とを１０：９９０の割合（変異型混合比１％）で混合した１×１０３ｃｏｐｙ／μＬのプラスミド（Genescript社製）を用いた。
なお、各配列は表６に記載の通りである。
【０１０９】
Ｔｍ解析によって、プローブの蛍光値の変化量を示すグラフを得た。
結果を図２〜図４に示す。なお、図２（Ａ），図３（Ａ）及び図４（Ａ）、並びに図２（Ｃ）、３（Ｃ）及び図４（Ｃ）はゲノムＤＮＡのみを鋳型核酸配列として用いた場合（野生型１００％）を示し、図２（Ｂ），図３（Ｂ）及び図４（Ｂ）、並びに図２（Ｄ）、３（Ｄ）及び図４（Ｄ）は野生型の遺伝子配列と変異型の遺伝子配列を所定割合で混合したプラスミドＤＮＡを鋳型核酸配列として用いた場合を示す。また、各図において、図２（Ａ），図３（Ａ）及び図４（Ａ）、並びに図２（Ｂ），図３（Ｂ）及び図４（Ｂ）はＷＩ核酸濃度０．２μＭの場合を示し、図２（Ｃ）、３（Ｃ）及び図４（Ｃ）、並びに図２（Ｄ）、３（Ｄ）及び図４（Ｄ）は、ＷＩ核酸濃度０．４μＭの場合を示す。図中、横軸が温度(℃)、縦軸が蛍光値の変化量を示す。
【０１１０】
【表３】
0005930825.tif 000004
【０１１１】
【表４】
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【０１１２】
【表５】
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【０１１３】
【表６】
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【０１１４】
図２及び図３に示されるように、ゲノムＤＮＡのみの核酸試料（野生型１００％）では６６℃付近にしかピークが認められず、プラスミドＤＮＡを含む核酸試料（変異型１％）では５１℃付近のピークを明瞭に確認できた。この傾向は、ＷＩ核酸の濃度を変更しても同様であり、ＷＩ核酸の濃度を増やすことにより、変異型核酸配列をより感度よく検出できることがわかった。
【０１１５】
また、図４に示されるように、ＤＮＡポリメラーゼの濃度を、実施例１及び２に対して５割以下である０．１６Ｕとした実施例３では、変異型核酸のピークが実施例１及び実施例２の場合よりもより明瞭となることがわかった。
【０１１６】
以上の実施例から、使用したプローブとＷＩ核酸配列との重複塩基配列数がそれぞれ、３３ｍｅｒ（Ｃｍｐ−１、１００％）、２９ｍｅｒ（Ｃｍｐ−２、８７．９％）、２２ｍｅｒ（Ｃｍｐ−２、６６．７％）であった。この結果から、プローブとＷＩ核酸配列との重複する塩基数の割合が６６．７％（２２ｍｅｒ／３３ｍｅｒ）以上である場合には、変異型核酸を感度よく検出できることがわかった。
【０１１７】
［比較例１〜比較例４］
比較例１では、ＷＩ核酸配列として、配列番号１の１２３番目〜１５１番目と同一の配列を有するＣｍｐ−Ｃ１（配列番号３２、表６参照）を用いた以外は、実施例１と同様にして多型検出を行った。結果を図５に示す。
比較例２では、ＷＩ核酸配列及びプローブを含まない反応液を使用し、ＰＣＲ反応後にプローブを１μＭの終濃度となるように各試料に添加した以外は、実施例１と同様にして多型検出を行った。ＰＣＲ反応用試薬の各成分を表７に示す。結果を図６に示す。
【０１１８】
比較例３では、ＷＩ核酸配列として、配列番号１の１２３番目〜１５１番目と同一の配列を有するＣｍｐ−Ｃ１を使用し、ＤＮＡポリメラーゼを０．１６Ｕに変更した以外は実施例１と同様にして多型検出を行った。結果を図７に示す。
比較例４では、ＤＮＡポリメラーゼを０．１６Ｕで使用した以外は、比較例２と同様にして多型検出を行った。結果を図８に示す。
【０１１９】
図５〜図８において、図５（Ａ），図６（Ａ）、図７（Ａ）及び図８（Ａ）、並びに図５（Ｃ）、図６（Ｃ）、図７（Ｃ）及び図８（Ｃ）はゲノムＤＮＡのみを鋳型核酸配列として用いた場合（野生型１００％）を示し、図５（Ｂ），図６（Ｂ）、図７（Ｂ）及び図８（Ｂ）、並びに図５（Ｄ）、図６（Ｄ）、図７（Ｄ）及び図８（Ｄ）は野生型の遺伝子配列と変異型の遺伝子配列を所定割合で混合したプラスミドＤＮＡを鋳型核酸配列として用いた場合を示す。また、各図において、図５（Ａ），図６（Ａ）、図７（Ａ）及び図８（Ａ）、並びに図５（Ｂ），図６（Ｂ）、図７（Ｂ）及び図８（Ｂ）はＷＩ核酸濃度０．２μＭの場合を示し、図５（Ｃ）、図６（Ｃ）、図７（Ｃ）及び図８（Ｃ）、並びに図５（Ｄ）、図６（Ｄ）、図７（Ｄ）及び図８（Ｄ）は、ＷＩ核酸濃度０．４μＭの場合を示す。図中、横軸が温度(℃)、縦軸が蛍光値の変化量を示す。
【０１２０】
【表７】
0005930825.tif 000008
【０１２１】
図５に示されるように、配列番号１の第１１５番目〜第１２３番目の増幅抑制標的核酸に対応する配列を含まないＷＩ核酸配列を用いた場合には、鋳型核酸配列としてゲノムＤＮＡの場合とプラスミドＤＮＡの場合の双方で変異型を示す６１℃のピークが認められ、判定不可能であった。
【０１２２】
また、比較例１で用いられた比較用ＷＩ核酸配列Ｃｍｐ−Ｃ１と、多型検出プローブとの重複塩基配列数が１４ｍｅｒであり、多型検出プローブとＷＩ核酸配列との重複する塩基数の割合が４２．４％（１４ｍｅｒ／３３ｍｅｒ）であった。この結果から、ＷＩ核酸配列と多型検出プローブとの重複塩基配列数の割合が、４２．４％（１４ｍｅｒ／３３ｍｅｒ）である場合には、野生型を示すピークが認められないことがわかった。
【０１２３】
また、図６に示されるように、ＷＩ核酸を存在させないでＰＣＲ反応を行った場合には、変異型を示すピークが認められず、変異型の検出ができなかった。
このような傾向は、ＤＮＡポリメラーゼの量を減らした場合でも同様であった（図７及び図８参照）。
【０１２４】
［実施例４］
全自動ＳＮＰｓ検査装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ（商標）、アークレイ社製）を使用してＰＣＲ反応及びＴｍ解析を行うと共に、鋳型核酸配列の種類を表８に示すように変更した試料Ａ〜Ｊ（変異型プラスミドの配列は表８参照、野生型プラスミドの配列は配列番号１）を使用し、ＰＣＲ反応液の各成分を表９に示すように変更した以外は、実施例１と同様にして、多型検出を行った。なお、使用したポリラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼである。
なお、各試料中の鋳型核酸配列は、野生型の遺伝子配列（配列番号１）と表８に示す変異型の各遺伝子配列を、表８に示す混合比となるように混合した１×１０３ｃｏｐｙ／μＬのプラスミド（Genescript社製）を使用した。表８に記載の変異種類については、Ｎｏ．２及びＮｏ．３はＥ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌ、Ｎｏ．４はＬ７４７＿Ｅ７４９ｄｅｌ，Ａ７５０Ｐ、Ｎｏ．６はＬ７４７＿Ｓ７５２ｄｅｌ，Ｐ７５３Ｓを示す（表２参照）。
【０１２５】
野生型の遺伝子の場合には６６℃付近、変異型の遺伝子の場合には、変異型の種類に応じて５１℃付近及び６６℃付近にそれぞれピークが認められることがわかっている。
結果を図９及び図１０に示す。
【０１２６】
【表８】
0005930825.tif 000009
【０１２７】
【表９】
0005930825.tif 000010
【０１２８】
図９に示されるように、野生型のみを含む試料Ａについては６６℃付近のピークのみが認められ（図９（Ａ）参照）、一方、各変異型を含む試料Ｂ〜Ｅ（図９（Ｂ）〜図９（Ｅ））については、６６℃付近のピークに加えて各変異型を示す５１〜５４℃の明瞭なピークが認められ、変異型の種類に拘わらず、ＷＩ核酸配列を用いることにより変異型を検出できることが分かった。
また、図１０に示されるように、変異の混合比を０．１％、１％、５％、１０％及び５０％と変更しても、混合比に応じた大きさのピークとして、変異型を混合比依存的に検出できることがわかった（図１０（Ａ）〜図１０（Ｅ）参照）。
【０１２９】
［実施例５及び比較例５］
全自動ＳＮＰｓ検査装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ（商標）、アークレイ社製）を使用してＰＣＲ反応及びＴｍ解析を行うと共に、ＷＩ核酸の濃度を０．０３μＭ、０．０６μＭ、０．１２μＭ又は０．１８μＭに変更したＰＣＲ反応液（試料５−１〜５−４、実施例５）又は、ＷＩ核酸を含まないＰＣＲ反応液（試料５−５、比較例５）を使用し、ＰＣＲ反応後にプローブを試料あたり１μＭの終濃度となるように添加した以外は、実施例１と同様にして多型検出を行った。なお、試料核酸としては、変異型（Ｎｏ．２）と野生型を、１％の変異型混合率として含むプラスミドＤＮＡを用いた。各試料の処方は、表１０に示す。
結果を図１１に示す。図１１（Ａ）はＷＩ核酸の濃度が０．０３μＭの試料５−１、図１１（Ｂ）はＷＩ核酸の濃度が０．０６μＭの試料５−２、図１１（Ｃ）はＷＩ核酸の濃度が０．１２μＭの試料５−３、図１１（Ｄ）はＷＩ核酸の濃度が０．１８μＭの試料５−４、図１１（Ｅ）はＷＩ核酸の濃度が０の試料５−５の結果を示す。
【０１３０】
【表１０】
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【０１３１】
図１１（Ａ）〜（Ｄ）に示されるように、異なる濃度のＷＩ核酸を含む試料５−１〜５−４では、野生型の６６℃付近のピークと変異型の５１℃付近のピークの双方が認められる。変異型のピークは、ＷＩ核酸の濃度に応じて大きくなっていることがわかる。
これに対して、図１１（Ｅ）に示されるように、ＷＩ核酸を含まない試料５−５では、変異型を示す５１℃付近のピークは明瞭でなかった。
【０１３２】
このように本発明によれば、簡便に且つ高感度にＥＧＦＲエクソン１９における多型を簡便にかつ感度よく検出することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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