(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的タンパク質と、配列番号１に定義されるＣ末端エピトープタグとを含む、天然に存在しない融合タンパク質であって、標的タンパク質とＣ末端エピトープタグは、異種原に由来する、融合タンパク質。
【請求項２】
前記Ｃ末端エピトープタグが、前記標的タンパク質のＣ末端に直接的に又はリンカーを介して結合している、請求項１記載の天然に存在しない融合タンパク質。
【請求項３】
請求項１または２記載の融合タンパク質をコードする単離された核酸。
【請求項４】
請求項３記載の核酸を含むベクター。
【請求項５】
請求項４記載のベクターまたは請求項３記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項６】
（ｉ）配列番号１に定義されるＣ末端エピトープタグに特異的に結合する抗体又は抗体フラグメントであるアフィニティリガンドと、
（ｉｉ）請求項１または２記載の天然に存在しない融合タンパク質と
の複合体。
【請求項７】
（ｉｉｉ）天然に存在しない前記融合タンパク質に含まれる標的タンパク質に結合するリガンドをさらに含む、請求項６記載の複合体。
【請求項８】
アフィニティリガンドが、ナノボディである、請求項６または７記載の複合体。
【請求項９】
前記複合体が結晶性である、請求項６から８の何れか１項に記載の複合体。
【請求項１０】
請求項１または２記載の天然に存在しない融合タンパク質のＣ末端エピトープタグに特異的に結合する抗体又は抗体フラグメントであるアフィニティリガンドを含む、固体表面。
【請求項１１】
アフィニティリガンドが、ナノボディである、請求項１０記載の固体表面。
【請求項１２】
アフィニティクロマトグラフィー、アフィニティ精製、免疫沈降、インビボイメージング、縦列アフィニティ精製、タンパク質検出、免疫化学、表面提示、ＦＲＥＴ型用途、共結晶化からなる群から選択されるアフィニティに基づく用途のための、請求項１または２記載の天然に存在しない融合タンパク質のＣ末端エピトープタグに特異的に結合する抗体または抗体フラグメントであるアフィニティリガンド、請求項６から９の何れか１項に記載の複合体、または請求項１０または１１記載の固体表面の使用であって、但し、融合タンパク質はα-シヌクレイン又はα-シヌクレインの断片を含まない、使用。
【請求項１３】
アフィニティリガンドが、ナノボディである、請求項１２記載の使用。
【請求項１４】
前記タンパク質検出をＥＬＩＳＡ検出アッセイまたはウエスタンブロット分析において行う、請求項１２または１３記載の使用。
【請求項１５】
前記アフィニティ精製をカラム上またはビーズ上で行う、請求項１２または１３記載の使用。
【請求項１６】
天然に存在しない融合タンパク質を精製するための方法であって、
ａ）請求項１または２記載の天然に存在しない融合タンパク質を含有する溶液を、配列番号１に定義されるＣ末端エピトープに特異的に結合する抗体または抗体フラグメントである固定化アフィニティリガンドを有する固体支持体に適用する段階、
ｂ）前記固定化アフィニティリガンドと前記融合タンパク質との間で複合体を形成させる段階、
ｃ）弱く結合したまたは未結合の分子を除去する段階、および
ｄ）結合分子を溶出する段階
を含む、前記方法。
【請求項１７】
アフィニティリガンドが、ナノボディである、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
天然に存在しない融合タンパク質を固体支持体上に固定化し、および／または捕捉するための方法であって、
ａ）請求項１または２記載の天然に存在しない融合タンパク質を含有する溶液を、配列番号１に定義されるＣ末端エピトープに特異的に結合する抗体または抗体フラグメントである固定化アフィニティリガンドを有する固体支持体に適用する段階、
ｂ）前記固定化アフィニティリガンドと前記融合タンパク質との間で複合体を形成させる段階、および
ｃ）弱く結合したまたは未結合の分子を除去する段階
を含む、前記方法。
【請求項１９】
アフィニティリガンドが、ナノボディである、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
配列番号１に定義されるＣ末端エピトープに特異的に結合する抗体または抗体フラグメントであるアフィニティリガンドを使用することにより、サンプルまたは組成物中の請求項１または２記載の天然に存在しない融合タンパク質を検出するための方法。
【請求項２１】
アフィニティリガンドが、ナノボディである請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
請求項１または２記載の天然に存在しない融合タンパク質、および／または請求項３記載の核酸、および／または請求項４記載のベクター、および／または不溶性マトリックスまたは固体支持体に予め固定化されている、配列番号１に定義されるＣ末端エピトープに特異的に結合する抗体または抗体フラグメントであるアフィニティリガンド、および／または請求項６から９の何れか１項に記載の複合体を含むキット。
【請求項２３】
アフィニティリガンドが、ナノボディである請求項２２記載のキット。
【請求項２４】
アフィニティクロマトグラフィー、アフィニティ精製、免疫沈降、インビボイメージング、縦列アフィニティ精製、タンパク質検出、免疫化学、表面提示、ＦＲＥＴ型用途、共結晶化からなる群から選択されるアフィニティに基づく用途に使用するための、請求項２２または２３記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アフィニティに基づく用途において有用なエピトープタグに関する。本発明は更に、融合タンパク質、融合タンパク質の製造方法、これらの融合タンパク質をコードする核酸分子およびこれらの核酸分子を含有する組換え宿主細胞を含む。本発明はまた、前記エピトープタグを特異的に認識するナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）および他のアフィニティリガンド、ならびにアフィニティに基づく用途におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
エピトープタグ化（ｅｐｉｔｏｐｅ  ｔａｇｇｉｎｇ、エピトープタギング）は、既知エピトープタグ（典型的に６〜３０アミノ酸）を組換えタンパク質に融合させる技術であり、これは、前記エピトープをコードする配列を前記タンパク質の同一オープンリーディングフレーム内で遺伝子操作により置換することにより行われる。前記技術は、対応抗体が利用可能であるエピトープタグを選択することにより、対応抗体が利用可能でないタグ化タンパク質を検出することを可能にする。適当なエピトープタグと抗体とのペアの選択により、ウエスタンブロット分析、免疫沈降、免疫化学、アフィニティ精製などのような所望の実験用途に適した特性を有する組合せを見出すことが可能である。
【０００３】
最初の商業的に入手可能なタグは、本来タンパク質精製を意図したものであった。これらの初期の市販製品には、ＦＬＡＧ、６×Ｈｉｓおよびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）系が含まれる。ＦＬＡＧタグ化系は、その最初の形態においては、カルシウム依存的結合を示す抗ＦＬＡＧ  Ｍ１モノクローナル抗体を含んでいた。ＦＬＡＧタグ化タンパク質はＥＤＴＡで前記Ｍ１抗体から溶出されうる（Ｈｏｐｐら，１９８８）。同様に、６×Ｈｉｓタグは金属キレートクロマトグラフィーによる組換えタンパク質の精製に使用される（Ｈｏｃｈｕｌｉら，１９８８）。同様に、ＧＳＴタグ化タンパク質は、グルタチオンアガロースを使用して精製されうる（Ｓｍｉｔｈら，１９８８）。前記市販タグに加えて、ＨＡ（Ｆｉｅｌｄら，１９８８）およびｃ−ｍｙｃ（Ｅｖａｎら，１９８５）のような他のタグの開発も報告されている。研究が進展し、組換えＤＮＡ技術が進歩するにつれて、タンパク質相互作用の研究におけるエピトープタグの有用性が認識されるようになった。例えば、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２モノクローナル抗体が、６×Ｈｉｓタグに対するモノクローナル抗体（Ｋａｕｆｍａｎｎら，２００２）、ＨＡタグおよびｃ−ｍｙｃタグと同様に、商業的に入手可能となった（Ｂｒｉｚｚａｒｄら，１９９４）。現在では、多様な用途に適した種々の特徴を有する多数のタイプのタグが存在する（ＪａｒｖｉｋおよびＴｅｌｍｅｒ  １９９８）。
【０００４】
伝統的な抗体とエピトープとの組合せに加えて、他のタイプのエピトープタグが見出されている。初期の一例はプロテインＡタグであり、これはＩｇＧに結合する（Ｕｈｌｅｎら，１９８３）。他の例には、ストレプトアビジン（ＳｃｈｍｉｄｔおよびＳｋｅｒｒａ  ２００７）とビオチン（ＴｕｃｋｅｒおよびＧｒｉｓｓｈａｍｍｅｒ  １９９６）との相互作用に基づくもの、マルトース結合性ペプチド（ＭＢＰタグ）とマルトースとの相互作用に基づくもの（ｄｉ  Ｇｕａｎら，１９８８）、キチン結合性ドメイン（ＣＢＤ）とキチンとの相互作用に基づくもの（Ｃｈｏｎｇら，１９９７）、およびカルモジュリンに結合するカルモジュリン結合性タンパク質に基づくもの（Ｒｉｇａｕｔら，１９９９）が含まれる。もう１つのタイプのタグは、膵ＲＮアーゼＡに由来するＳ−タンパク質に結合するＳ−ペプチドタグである（Ｈａｃｋｂａｒｔｈら，２００４）。
【０００５】
この分野における更なる進歩は、シグナル強度およびシグナル対ノイズ比を増強するための複数のエピトープタグの使用、例えば、複数コピーのＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、ｃ−ｍｙｃおよびＨＡタグの使用、または縦列コピーの異なるタグの使用である。例えば、タンパク質ネットワークの研究に使用される縦列アフィニティ精製（ＴＡＰ）においては、介在するタバコ腐食ウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位を伴うカルモジュリン結合性ペプチドおよびＩｇＧ結合性ドメインが使用される（Ｒｉｇａｕｔら，１９９９）。最近、より短いＴＡＰタグ、すなわち、ＳＦ−ＴＡＰタグが記載されており（Ｇｌｏｅｃｋｎｅｒら，２００７）、この場合、２つの縦列コピーのＳｔｒｅｐ−タグＩＩがＦＬＡＧタグと組合された。
【０００６】
エピトープタグ化の利用は、新たに発見されたタンパク質の研究および特徴づけを促進するが、前記技術は幾つかの欠点を有する。エピトープタグの挿入は、特に大きなタグが使用される場合（例えば、ＧＳＴおよびＭＢＰタグ）、タンパク質の機能を変化させうる。注目すべきことに、比較的短いエピトープタグ、例えばＦＬＡＧは、関心のある異種タンパク質の特性にめったに影響を及さず、それらのそれぞれの一次抗体に対して非常に特異的である。しかし、抗体アフィニティクロマトグラフィーは、しばしば、融合タンパク質の特性に不可逆的に影響を及ぼしうる低または高ｐＨ溶出を伴う。また、それは、再利用性が限られている樹脂を使用する。組換えポリペプチドのＮまたはＣ末端に付加された、典型的にはヘキサ−Ｈｉｓタグの形態であるポリ−ヒスチジンは、固定化金属イオンクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を使用して組換えタンパク質を精製するために広く使用されている。しかし、（Ｈｉｓ）６タグを使用した場合、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）抽出物からは中等度の純度で回収されるに過ぎず、そして酵母、ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）およびＨｅＬａ抽出物からは比較的劣悪な精製が得られるに過ぎない（Ｌｉｃｈｔｙら，２００５）。また、異種発現（Ｈｉｓ）６タグ化タンパク質のＩＭＡＣ調製物においては混入タンパク質（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳｌｙＤ、プロリルイソメラーゼ）の非特異的結合がしばしば観察され、これは、これらのタンパク質上の内因性金属結合部位またはヒスチジンクラスターによるものである。更に、文献に記載されているタグのうちでハイスループットの状況で試験されたものはほとんどない。ＦＬＡＧ−タグ、カルモジュリン結合性ペプチド、Ｓｔｒｅｐ−タグまたはＳｔｒｅｐｔａｇＩＩおよびビオチン受容ペプチドのようなペプチドエピトープは全て、それらの対応結合相手に対して高度の特異性を示す。しかし、それらが相互作用する樹脂（固定化タンパク質）は高価な傾向にあり、簡単に詰まり、比較的低い結合能を有し、したがって、ハイスループット用途に理想的であるとは言えない。エピトープタグ化の幾つかの他の利点および欠点はＪａｒｖｉｋおよびＴｅｌｍｅｒ（１９９８）、ＫｉｍｐｌｅおよびＳｏｎｄｅｋ（２００４）、Ｗａｕｇｈ（２００５）、Ｂｒｉｚｚａｒｄ（２００８）に挙げられている。
【０００７】
エピトープタグ化が機能的ゲノミクスおよびプロテオミクスの新たな分野に大きな貢献をする可能性を有することを考慮すると、代替的エピトープタグが依然として必要とされている。実際、これらの分野における将来の用途は、組合せて使用されうる複数のエピトープタグを要する個々のタンパク質の別々のタグ化に益々依存するであろう。
【発明の概要】
【０００８】
発明の概括
タンパク質は、それらの多様な物理化学的特性のため、本来はハイスループット分析に適さない。したがって、エピトープタグは、構造的および機能的プロテオミクスの先導のための不可欠な手段となっている。ハイスループットなタンパク質製造および分析は、ほぼ自明のこととして、汎用的な精製方法を含む必要がある。これは明らかに、エピトープタグが鍵的役割を果たすものである。
【０００９】
本発明の小さな４アミノ酸のタグは、組換えタンパク質内に組込み操作されうるＨｉｓタグおよび他のペプチドタグに代わる良好な代替手段となる。特に、Ｃ末端ＥＰＥＡ−タグ（配列番号１）は短く、タグ化タンパク質の精製において使用される有効なアフィニティ樹脂を与えるように固定化されうる小さな単一ドメイン抗体フラグメントにより特異的に認識される。更に例示されるとおり、ＥＰＥＡ−タグ（配列番号１）は、タグ化タンパク質の可視化／特定（ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット）、タンパク質複合体の同時精製（Ｔａｐ−タグの適用）、（インビボ）イメージング、細胞内のタンパク質の局在化、他のタンパク質との相互作用の特定／サブユニット構造の決定、タンパク質の機能およびそれが細胞条件の変化にどのように応答するのかの決定、細胞の寿命中にタンパク質に生じることの決定、クローン化遺伝子に由来する新規タンパク質の特徴づけ、および他の多数の用途に使用されうる。
【００１０】
第１の態様においては、本発明のエピトープタグは４アミノ酸の配列からなり、前記配列はＥＰＥＡ（配列番号）により定められ、または配列番号１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列により、または前記アミノ酸の少なくとも５０％もしくは７５％が同類アミノ酸により置換されているアミノ酸配列により定められる。
【００１１】
１つの実施形態においては、本発明は、本発明のエピトープタグと標的タンパク質とを含む、天然に存在しない融合タンパク質に関する。この場合、前記エピトープタグは前記標的タンパク質のＣ末端に直接的に又はリンカーを介して結合している。
【００１２】
もう１つの実施形態においては、本発明は、前記エピトープタグまたは融合タンパク質をコードする単離された核酸配列に関する。前記核酸配列を含むベクターおよび前記ベクターまたは前記核酸配列を含む宿主細胞も本発明の一部を構成する。
【００１３】
もう１つの態様においては、本発明は、前記エピトープタグに特異的に結合するアフィニティリガンドに関する。特に、アフィニティリガンドは抗体または抗体フラグメントまたはナノボディでありうる。特定の実施形態においては、本発明はまた、本明細書に記載のアフィニティリガンドをコードする単離された核酸配列、ならびに前記核酸配列を含むベクターおよび前記ベクターまたは前記核酸配列を含む宿主細胞に関する。
【００１４】
もう１つの態様においては、本発明は、（ｉ）本明細書に記載のアフィニティリガンドと、（ｉｉ）本明細書に記載の天然に存在しない融合タンパク質と、（ｉｉｉ）場合によっては、天然に存在しない前記融合タンパク質に含まれる標的タンパク質に結合するリガンドとの複合体に関する。前記複合体は結晶性でありうる。
【００１５】
もう１つの態様においては、本発明は、アフィニティに基づく用途、例えばアフィニティクロマトグラフィー、アフィニティ精製、免疫沈降、インビボイメージング、縦列アフィニティ精製、タンパク質検出、免疫化学、表面提示、ＦＲＥＴ型用途、共結晶化のための、前記エピトープタグおよび／またはアフィニティリガンドおよび／または前記複合体の使用に関する。前記タンパク質検出はＥＬＩＳＡ検出アッセイまたはウエスタンブロット分析において行われうる。前記アフィニティ精製はカラム上またはビーズ上で行われうる。
【００１６】
また、本発明の一部は、
ａ）本明細書に記載の天然に存在しない融合タンパク質を含有する溶液を、本明細書に記載の固定化アフィニティリガンドを有する固体支持体に適用する段階、および
ｂ）前記固定化アフィニティリガンドと前記融合タンパク質との間で複合体を形成させる段階、および
ｃ）弱く結合した又は未結合の分子を除去する段階、および
ｄ）結合分子を溶出する段階
を含む、天然に存在しない融合タンパク質を精製するための方法である。
【００１７】
更に、本発明はまた、
ａ）天然に存在しない融合タンパク質を含有する溶液を、本明細書に記載の固定化アフィニティリガンドを有する固体支持体に適用する段階、および
ｂ）前記固定化アフィニティリガンドと前記融合タンパク質との間で複合体を形成させる段階、および
ｃ）弱く結合した又は未結合の分子を除去する段階
を含む、天然に存在しない融合タンパク質を固体支持体上に固定化し、および／または捕捉するための方法に関する。
【００１８】
また、本発明の一部は、本発明のアフィニティリガンドを使用することにより、サンプル中の天然に存在しない融合タンパク質を検出するための方法である。
【００１９】
更にもう１つの態様においては、本発明は、本明細書に記載のエピトープタグ、および／または本明細書に記載の天然に存在しない融合タンパク質、および／または本明細書に記載の核酸配列、および／または本明細書に記載のベクター、および／または本明細書に記載のアフィニティリガンド、および／または本明細書に記載の複合体を含むキットを提供する。前記キットは、アフィニティに基づく用途、例えばアフィニティクロマトグラフィー、アフィニティ精製、免疫沈降、インビボイメージング、縦列アフィニティ精製、タンパク質検出、免疫化学、表面提示、ＦＲＥＴ型用途、共結晶化に使用されうる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】α−シヌクレイン（ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）に特異的に結合する種々のナノボディのアミノ酸配列。
【図２−１】ＮＭＲ分光法を用いる化学シフトマッピングによるα−シヌクレインと一連のα−シヌクレイン特異的ナノボディとの間の相互作用の分析。上パネルは、１当量のＮｂｓｙｎ２、Ｎｂ８５またはＮｂ８７の非存在下（赤）または存在下（青）で得られたＮ１５標識α−シヌクレインのＨＳＱＣスペクトルを表す。下パネルは種々のナノボディの結合の際の相対的強度変化を表す。相対的強度（Ｉ／Ｉ０）は遊離α−シヌクレイン（Ｉ０）およびナノボディ結合α−シヌクレイン（Ｉ）のプロトン−窒素交差ピークから各アミノ酸に関して計算され、残基番号に対してプロットされた。
【図２−２】ＮＭＲ分光法を用いる化学シフトマッピングによるα−シヌクレインと一連のα−シヌクレイン特異的ナノボディとの間の相互作用の分析。上パネルは、１当量のＮｂｓｙｎ２、Ｎｂ８５またはＮｂ８７の非存在下（赤）または存在下（青）で得られたＮ１５標識α−シヌクレインのＨＳＱＣスペクトルを表す。下パネルは種々のナノボディの結合の際の相対的強度変化を表す。相対的強度（Ｉ／Ｉ０）は遊離α−シヌクレイン（Ｉ０）およびナノボディ結合α−シヌクレイン（Ｉ）のプロトン−窒素交差ピークから各アミノ酸に関して計算され、残基番号に対してプロットされた。
【図２−３】ＮＭＲ分光法を用いる化学シフトマッピングによるα−シヌクレインと一連のα−シヌクレイン特異的ナノボディとの間の相互作用の分析。上パネルは、１当量のＮｂｓｙｎ２、Ｎｂ８５またはＮｂ８７の非存在下（赤）または存在下（青）で得られたＮ１５標識α−シヌクレインのＨＳＱＣスペクトルを表す。下パネルは種々のナノボディの結合の際の相対的強度変化を表す。相対的強度（Ｉ／Ｉ０）は遊離α−シヌクレイン（Ｉ０）およびナノボディ結合α−シヌクレイン（Ｉ）のプロトン−窒素交差ピークから各アミノ酸に関して計算され、残基番号に対してプロットされた。
【図３】ナノボディＮｂ８５、Ｎｂ８７、Ｎｂ８８またはＮｂＳｙｎ２と複合体化したＥＰＥＡタグ化ＧＦＰのＩＭＡＣ精製。精製複合体はＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により分析された。パネル（Ａ）レーン１〜４：ＣＡ１５０８、ＣＡ１５０９、ＣＡ１５１０またはＣＡ１５１１と複合体化したＮｂ８５；レーン５〜８：ＣＡ１５０８、ＣＡ１５０９、ＣＡ１５１０またはＣＡ１５１１と複合体化したＮｂ８７；レーン９：タンパク質マーカー。パネル（Ｂ）レーン１：タンパク質マーカー；レーン２〜５：ＣＡ１５０８、ＣＡ１５０９、ＣＡ１５１０またはＣＡ１５１１と複合体化したＮｂ８８；レーン６〜９：ＣＡ１５０８、ＣＡ１５０９、ＣＡ１５１０またはＣＡ１５１１と複合体化したＮｂＳｙｎ２。
【図４】樹脂に結合したＮｂＳｙｎ２を使用するタグ化ＧＦＰ（ＣＡ１５０８）のアフィニティ精製。アフィニティ精製タグ化ＧＦＰをＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により分析した。レーン１：タンパク質マーカー；レーン２：塩の非存在下の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ７．５）での洗浄；レーン３：１Ｍ  ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ７．５）での溶出；レーン４：１Ｍ  ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）での溶出；レーン５：０．５Ｍ  アジピン酸を含有する５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ７．５）での溶出。
【図５】樹脂に結合したＮｂＳｙｎ２を使用するタグ化ＧＦＰ（ＣＡ１５０８）のアフィニティ精製。アフィニティ精製タグ化ＧＦＰをＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により分析した。レーン１：タンパク質マーカー；レーン２：フロースルー；レーン３および４：５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）での洗浄；レーン５：７５０μＭ  ペプチドＧＹＱＤＹＥＰＥＡを含有する溶出；レーン６：２Ｍ  ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）での溶出；レーン７：タンパク質マーカー。
【図６】αシヌクレインのＣ末端ペプチド（ＧＹＱＤＹＥＰＥＡ−配列番号２）と複合体化した単一ドメインのラクダ科動物抗体フラグメントＮｂｓｙｎ２の構造。パネル（Ａ）は前記複合体の概要図を示す。前記骨格は灰色で表されており、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ループはそれぞれ緑色、赤色および黄色で表されている。前記ペプチドは紫色に着色されている。パネル（Ｂ）は前記ナノボディと前記ペプチドとの間の分子的相互作用を示す。
【図７】前記ペプチドの残基とＮｂＳｙｎ２との間の側鎖相互作用の詳細な図。前記ペプチドの残基は棒として表されており、ＮｂＳｙｎ２の残基は線として描かれている。原子は以下のとおりに色分けされている：Ｃ：緑色；Ｎ：桃色；Ｏ：黄色。１σの等高線がつけられた２Ｆｏ−Ｆｃ地図が淡青色の網目として表されている。各側鎖に関する相互作用が種々のパネル（左から右へ、上パネル：Ａｓｐ１３５、Ｔｙｒ１３６、Ｇｌｕ１３７；下パネル：Ｐｒｏ１３８、Ｇｌｕ１３９、Ａｌａ１４０）において表されている。Ｔｙｒ１３６の側鎖は対称性関連ＮｂＳｙｎ２分子の残基と相互作用することに注目されたい。
【図８】樹脂に結合したＮｂＳｙｎ２を使用するタグ化ナノボディ（Ｎｂ４５８）のアフィニティ精製。Ｎｂ４５８のアフィニティ精製タグ化形態をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により分析した。レーン１：Ｎｂ４５８−ＧＹＱＤＹＥＰＥＡ；レーン２：タンパク質マーカー；レーン３：フロースルー；レーン４：Ｎｂ４５８−ｇａａＥＰＥＡ；レーン５：Ｎｂ４５８−ｇａａＥＰＥＡ。
【図９】自製ＮｂＳｙｎ２アルカリホスファターゼコンジュゲートを使用するＥＬＩＳＡにおけるＥＰＥＡタグ化ナノボディの検出。Ｎｂ４５８−ＧＹＱＤＹＥＰＥＡ（ＣＡ２９４４）、Ｎｂ４５８−ｇａａＥＰＥＡ（ＣＡ２９４５）および２つのＨｉｓタグ化ナノボディ（Ｎｂ４５８−配列番号６６およびＮｂ１９６−配列番号６５）を、ＥＬＩＳＡプレートの、異なるウェル内でコートした。自製ＮｂＳｙｎ２アルカリホスファターゼコンジュゲートを加えた。ｐ−ニトロフェニルホスファートを基質として使用して、前記ＥＬＩＳＡを現像した。
【図１０】ウエスタンブロットにおけるＥＰＥＡタグ化タンパク質の検出。ＧＹＱＤＹＥＰＥＡタグ化ＧＦＰ（レーン１および４）、αシヌクレイン（レーン３）およびタンパク質マーカー（レーン２）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、ニトロセルロースシートに移した。Ｈｉｓタグ化ＮｂＳｙｎ２を一次抗体として使用して、前記ウエスタンブロットを現像した。Ｎｂ１９０は、無関係な抗原を認識するＨｉｓタグ化ナノボディである。
【図１１】ウエスタンブロットにおけるＥＰＥＡタグ化タンパク質の検出。Ｎｂ４５８−ｇａａＥＰＡＡ（レーン１）、Ｎｂ４５８−ＧＹＱＤＹＥＰＥＡタグ化（レーン２）およびタンパク質マーカー（レーン３）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、ニトロセルロースシートに移した。ＮＢＴ／ＢＣＩＰと共に結合された自製ＮｂＳｙｎ２アルカリホスファターゼを使用して、前記ウエスタンブロットを現像した。
【図１２】ＥＰＥＡタグを含有する一群のＶＨＨの、ＥＬＩＳＡを使用するハイスループットスクリーニング。抗原をＥＬＩＳＡプレートの＋で示された行のウェルにコートした。ファージ提示により選択された４８個のナノボディを、前記コート化ウェル、および抗原を含有しない対照ウェル（−で示されている）に加えた。本発明者らの自製ＮｂＳｙｎ２アルカリホスファターゼコンジュゲートおよび基質としてのｐ−ニトロフェニルホスファートを使用して、抗原特異的ナノボディを検出した。
【図１３】ＮｂＳｙｎ２−ＧＦＰ融合体またはＮｂＳｙｎ２−ｍＫＯ１でのＨｅＬａ細胞内のＥＰＥＡタグ化ＨＩＶ−Ｒｅｖタンパク質の可視化。上パネル：ＨｅＬａ細胞系をＮｂＳｙｎ２−ＧＦＰで、それぞれ、単独で、ならびにＨＩＶ−Ｒｅｖ−ＧＹＱＤＹＥＰＥＡおよびＨＩＶ−Ｒｅｖ−ＥＰＥＡと共に、トランスフェクトした。下パネル：ＨｅＬａ細胞系をＮｂＳｙｎ２−ｍＫＯ１で、それぞれ、単独で、ならびにＨＩＶ−Ｒｅｖ−ＧＹＱＤＹＥＰＥＡおよびＨＩＶ−Ｒｅｖ−ＥＰＥＡと共に、トランスフェクトした。
【図１４】ビＮｂＳｙｎ２アルカリホスファターゼコンジュゲートを使用するＥＬＩＳＡにおけるＥＰＥＡタグ化ナノボディの検出。Ｎｂ４５８−ｇａａＥＰＥＡ（ＣＡ２９４５）をＥＬＩＳＡプレートのウェル当たりの種々の濃度（０，１μｇまたは０，０１μｇ／ウェル）でコートした。ビＮｂＳｙｎ２アルカリホスファターゼコンジュゲートまたはＮｂＳｙｎ２アルカリホスファターゼコンジュゲートを以下の種々の希釈度で加えた：１／２５０、１／５００、１／１０００、１／２０００および１／４０００。ｐ−ニトロフェニルホスファートを基質として使用して、前記ＥＬＩＳＡを現像した。ＯＤ４０５値を、（Ａ）６０分間のインキュベーションの後、および（Ｂ）一晩のインキュベーションの後に測定した。
【図１５】ウエスタンブロットにおけるＥＰＥＡタグ化膜タンパク質ＣｓｇＧの検出。タンパク質マーカー（レーン２）、ＥＰＥＡタグ化ＣｓｇＧのクローン１〜４（レーン２〜５）および陽性対照（ＥＰＥＡタグ化ナノボディ）（レーン６）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロースシートに移した。自製ＮｂＳｙｎ２アルカリホスファターゼコンジュゲートを使用して、前記ウエスタンブロットを現像した。
【図１６】樹脂に結合したＮｂＳｙｎ２を使用するタグ化膜タンパク質（ＣｓｇＧ）のアフィニティ精製。アフィニティ精製物質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した：レーン１：精製前のサンプル、Ｎｂ４５８−ＧＹＱＤＹＥＰＥＡ；レーン２：フロースルー；レーン３：タンパク質マーカー；レーン４：洗浄；レーン５：ＣｓｇＧｇｇＥＰＥＡ。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
発明の詳細な説明
本発明を、特定の実施形態に関して、および或る図面を参照して、詳細に説明することとするが、本発明はそれらに限定されるものではなく、特許請求の範囲のみにより限定される。特許請求の範囲におけるいずれの参照記号も前記範囲を限定するとは解釈されないものとする。記載されている図面は概要図に過ぎず、限定的なものではない。前記図面においては、要素の幾つかのサイズは例示目的で誇張されている場合があり、原寸法で描かれていない場合がある。「含む」なる語が本明細書および特許請求の範囲において用いられている場合、それは他の要素または段階を除外するものではない。単数名詞を指す表現が用いられている場合、これは、特に示されていない限り、その名詞の複数形を含む。更に、本明細書および特許請求の範囲における第１、第２、第３などの語は、類似要素を区別するために用いられており、必ずしも、連続的順序または年代順を示すために用いられているのではない。そのように用いられている語は、適当な状況においては交換可能であり、本明細書に記載の本発明の実施形態は、本明細書に記載または例示されている以外の他の順序で実施可能であると理解されるべきである。
【００２２】
本明細書中に特に示されていない限り、本発明に関して用いられている科学技術用語および表現は、当業者により一般に理解されている意味を有するものとする。一般に、分子生物学、遺伝学ならびにタンパク質および核酸の化学およびハイブリダイゼーションに関して用いられている命名法ならびにそれらの技術は、当技術分野において良く知られており一般的に用いられているものである。特に示されていない限り、本発明の方法および技術は、一般に、当技術分野で良く知られている、ならびに本明細書の全体にわたって引用され記載されている種々の一般的およびより専門的な参考文献に記載されている通常の方法により行われる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２，および２００２に対する補遺）を参照されたい。
【００２３】
本発明の第１の態様においては、４アミノ酸の配列からなるエピトープタグが特定されており、この場合、前記配列はＥＰＥＡ（配列番号）により定められ、または配列番号１に対して少なくとも２５％、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列により、または前記アミノ酸の少なくとも２５％、少なくとも５０％もしくは少なくとも７５％が同類アミノ酸により置換されているアミノ酸配列により定められる。
【００２４】
本明細書中で用いる「エピトープタグ」または「アフィニティタグ」なる語は、タンパク質またはリガンドとの特異的相互作用を可能にする短いアミノ酸配列またはペプチドを意味する。
【００２５】
本明細書中で用いる同類置換（保存的置換）は、前記アミノ酸配列内の少なくとも１つの残基が除去され、異なる残基がその位置に挿入されることを意味する。そのような置換は一般に表１に従い行われる。表１は、タンパク質内のアミノ酸の代わりに使用可能であり同類置換であると典型的にみなされうるアミノ酸を示す。
【００２６】
【表１】
0006053672.tif 000002
【００２７】
本明細書中で用いる、２以上のポリペプチド配列の場合における「同一」または「同一性（％）」なる語は、２以上の配列または部分配列が同一であること、あるいは配列比較アルゴリズムを用いた又は手動アライメントおよび目視検査による測定において比較ウィンドウまたは指定領域にわたって最大一致が得られるように比較され整列（アライメント）された場合に、２以上の配列または部分配列が、特定された割合の同一アミノ酸残基を有する（例えば、特定された領域にわたって７５％の同一性）ことを意味する。特に、前記同一性は、４アミノ酸長である領域にわたって存在する。
【００２８】
第２の態様においては、前記エピトープタグは分子に連結または結合されており、前記組合せは本明細書中では「融合分子」または「融合構築物」と称される。したがって、本発明は、本明細書に記載のエピトープタグを含む融合分子に関する。好ましくは、前記アフィニティタグは、関心のあるタンパク質または「標的タンパク質」に連結されている。前記エピトープタグは前記分子に直接的または間接的に連結されうる。前記タグは前記分子のいずれかの部位に、例えば前記分子の末端付近に、１以上の内部部位に、側鎖に、またはアミノ末端アミノ酸（Ｎ末端）に、またはカルボキシ末端アミノ酸（Ｃ末端）に連結されうる。また、２以上のエピトープタグが前記分子に連結されうる。好ましい実施形態においては、前記エピトープタグは、当業者によく知られた技術である遺伝的操作により前記組換えタンパク質の同じオープンリーディングフレーム内に前記エピトープタグをコードするＤＮＡ配列を配置することにより、標的タンパク質のＣ末端に連結されうる。
【００２９】
本明細書中で用いる「融合分子」または「融合構築物」なる語は、一般に、天然に存在しない組成物、または天然に存在しない融合分子もしくは融合構築物を示す。
【００３０】
間接的連結の場合、適当なリンカー配列は所望の分子と前記エピトープタグとの間に挿入される。ついで、前記リンカー配列内に切断部位が存在する場合、前記エピトープタグは、当技術分野で公知の方法を用いて、化学的または酵素的に除去されうる。好ましいリンカーは１〜３０アミノ酸長のペプチドであり、ペプチドＥＥＧＥＰＫ（Ｋｊｅｌｄｓｅｎら，ＷＯ９８／２８４２９；配列番号１３）またはＥＥＡＥＰＫ（Ｋｊｅｌｄｓｅｎら，ＷＯ９７／２２７０６；配列番号１４）；ＧＧＧＧＳ（配列番号８１）イムノサイレント（免疫不活性）リンカー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８１）；プロテアーゼ切断部位、例えば、配列ＩＥＧＲ（配列番号１５）を有する因子Ｘａ切断部位、配列ＬＶＰＲ（配列番号１６）を有するトロンビン切断部位または配列ＤＤＤＤＫ（配列番号１７）を有するエンテロキナーゼ切断部位を含むが、これらに限定されるものではない。他の適当なリンカーとしては、炭水化物、ＰＥＧに基づくリンカー、および当技術分野で利用可能な他のリンカーが挙げられる。好ましくは、前記アミノ酸リンカー配列は短く、前記タンパク質の生物活性および抗体フラグメントとの特異的相互作用を妨げない。適当な短いリンカー配列の非限定的な例は実施例（例えば、ＧＡＡおよびＧＡＧＡ（配列番号１２））および表２に記載されている。
【００３１】
本明細書中で用いる「分子」なる語は、抗体および酵素を含むタンパク質、ペプチド、ヌクレオチド、脂質、炭水化物、薬物ならびに補因子またはそれらの組合せを意味する。前記分子の性質は本発明にとって重要ではない。前記分子は種々の長さ、サイズまたは分子量のものであることが可能であり、当業者に公知の及び／又は望まれるいずれかの活性を有しうる。
【００３２】
特定の実施形態においては、前記分子はタンパク質である。より詳しくは、本発明のエピトープタグはタンパク質またはその断片に結合され、前記組合せは融合タンパク質とも称される。実際、本明細書中で用いる「融合タンパク質」は、異種源に由来する２つのアミノ酸配列の融合体を含むポリペプチドを意味し、したがって「天然に存在しない融合タンパク質」と称されうる。前記タンパク質は、当業者に公知の及び／又は望まれるいずれかの活性、例えば免疫原性活性、酵素活性または結合活性を有しうる。前記タンパク質はまた、構造タンパク質でありうる。本発明のエピトープタグに連結されうる具体的なタンパク質（その断片を含む）には、例えば、ホルモン、酵素、サイトカイン、細胞内シグナリングペプチド、受容体、抗体、増殖因子、血液因子、ワクチン、レポータータンパク質、合成ペプチドが含まれる。具体的なタンパク質の非限定的な例は実施例に記載されており、例えば、とりわけ、蛍光タンパク質、抗体フラグメント、ウイルス調節タンパク質、膜タンパク質、細胞周期タンパク質である。特定の実施形態においては、前記タンパク質は細菌、酵母、ウイルス、哺乳動物、植物、昆虫などに由来する。
【００３３】
本明細書中で用いる「ポリペプチド」、「タンパク質」、「ペプチド」なる語は互換的に用いられ、コード化および非コード化アミノ酸、化学的または生化学的に修飾または誘導体化されたアミノ酸ならびに修飾ペプチドバックボーンを有するペプチドを含みうる任意の長さのアミノ酸の重合形態を意味する。
【００３４】
当業者に明らかなとおり、本明細書に記載のタンパク質の種々の断片は組合されうる。前記断片は種々の長さのものでありうるが、これらは少なくとも４アミノ酸長であり、タンパク質の全長までであることが一般に好ましい。
【００３５】
本発明の融合分子の製造は、当技術分野で公知の標準的な組換えＤＮＡ法を用いて行われうる。
【００３６】
もう１つの実施形態においては、本発明は、本明細書に記載のエピトープタグをコードする単離された核酸断片、前記核酸断片を含む単離された核酸、本発明の融合分子をコードする単離された核酸、およびそのような核酸分子を含む組成物に関する。本明細書中で用いる「核酸」、「ポリヌクレオチド」、「ポリ核酸」なる語は互換的に用いられ、任意の長さのヌクレオチド、すなわち、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれか、またはそれらの組合せおよび／または類似体の重合形態を意味する。前記分子および前記エピトープタグをコードする核酸セグメントは、前記コードセグメントの転写および／または翻訳産物において前記セグメントが並置されるように、連続的でありうる。幾つかの実施形態においては、本発明のタグのコード配列と分子のコード配列とは、リンカーをコードする核酸配列により、または１以上の非コード配列により隔てられていることが可能である。したがって、本発明は、ＤＮＡ分子からＲＮＡ分子へと転写され次いで前記ＲＮＡ分子からタンパク質への翻訳の前に除去（例えば、スプライシング）されうる１以上の介在配列（例えば、イントロン）を含有する核酸分子を含む。本発明の核酸分子はインビトロで、インビボで、または無細胞転写の作用により合成されうる。好ましくは、まず、前記エピトープタグをコードするヌクレオチド配列が合成され、ついで、所望の分子またはタンパク質をコードするヌクレオチド配列に連結される。このようにして得られたハイブリッド遺伝子は、標準的な方法を用いて発現またはクローニングベクター内に組込まれうる。本発明のこの態様のベクターは二本鎖または一本鎖であることが可能であり、直鎖状、環状、コイル状、スーパーコイル状、ねじれ状、ニック状など（これらに限定されるものではない）を含むいずれかのコンホメーションのＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド分子でありうる。本発明のこれらのベクターには、プラスミドベクターおよびウイルスベクター、例えばバクテリオファージ、バキュロウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、セムリキ森林ウイルスおよびアデノ随伴ウイルスベクター（これらに限定されるものではない）が含まれ、これらの全ては良く知られており、商業的供給源から購入可能である。本発明の方法において使用される融合分子を構築するためには、任意のベクターが使用されうる。特に、当技術分野で公知のベクターおよび商業的に入手可能なベクター（およびそれらの変異体または誘導体）は、本発明に従い、本発明の方法で使用される１以上の組換え部位を含むように操作されうる。特に関心が持たれるベクターの一般的クラスには、原核性および／または真核性クローニングベクター、発現ベクター、融合ベクター、ツーハイブリッドまたは逆ツーハイブリッドベクター、ファージおよびリボソーム提示ベクター、ＴＡＰベクター、シャトルベクター（種々の宿主において使用されるもの）、突然変異誘発ベクター、転写ベクター、大きなインサートを受け入れるためのベクターなどが含まれる。関心のある他のベクターには、ウイルス由来ベクター（Ｍ１３ベクター、細菌ファージ８ベクター、アデノウイルスベクターおよびレトロウイルスベクター）ならびに高い、低い、および調節可能なコピー数のベクターが含まれる。必要な方法のほとんどはＡｕｓｕｂｅｌら，２００７に見出されうる。
【００３７】
原核性または真核性宿主内への導入のために調製されるベクター構築物は、典型的に、本発明の融合分子をコードする意図されるＤＮＡ断片を含む前記宿主により認識される複製系を含み、好ましくは、前記分子をコードするセグメントに機能的に連結された転写および翻訳開始調節配列をも含む。発現系は、例えば、複製起点または自律複製配列（ＡＲＳ）および発現制御配列、プロモーター、エンハンサーおよび必要なプロセシング情報部位、例えばリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、転写終結配列およびｍＲＮＡ安定化配列を含みうる。適当な場合には、前記タンパク質が細胞膜を越え及び／又は細胞膜内に留まること、あるいは前記細胞から分泌されることを可能にする、同一または関連種の分泌ポリペプチドからのシグナルペプチドも含まれうる。
【００３８】
適当なプロモーターおよび他の必要なベクター配列は、前記宿主において機能するように選択される。細胞系と発現ベクターとの機能可能な組合せの例はＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）（２００７）およびＭｅｔｚｇｅｒら（１９８８）に記載されている。細菌、酵母、真菌、哺乳類、昆虫、植物または他の細胞における発現のための多数の有用なベクターが当技術分野で良く知られている。また、前記構築物を増幅可能遺伝子（例えば、ＤＨＦＲ）に連結して、前記遺伝子の複数のコピーが生じうるようにすることが可能である。適当なエンハンサーおよび他の発現制御配列に関しては、Ｅｎｈａｎｃｅｒｓ  ａｎｄ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  （１９８３）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．をも参照されたい。そのような発現ベクターは自律複製可能であり、また、それよりは好ましくはないが、それらは、宿主細胞のゲノム内に挿入されることにより複製可能である。
【００３９】
発現およびクローニングベクターは、選択可能なマーカー、すなわち、前記ベクターで形質転換された宿主細胞の生存または成長に必要なタンパク質をコードする遺伝子を含有しうる。そのようなマーカー遺伝子は、宿主細胞内に共導入された別のポリヌクレオチド配列上に含有されうるが、それは最も頻繁には前記クローニングベクター上に含有される。前記マーカー遺伝子が導入された宿主細胞のみが選択条件下で生存および／成長する。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質、例えばカナマイシン、テトラサイクリンなど、または他の毒性物質に対する耐性を付与するタンパク質、（ｂ）栄養要求性欠損を相補するタンパク質、あるいは（ｃ）複合培地からは利用可能でない決定的に重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。適切な選択可能なマーカーの選択は宿主細胞に左右され、種々の宿主に対する適当なマーカーは当技術分野において公知である。
【００４０】
この場合における組換え宿主細胞は、本発明の単離されたＤＮＡ分子を含有するように遺伝的に修飾されているものである。前記ＤＮＡは、個々の細胞型に適した、当技術分野で公知のいずれかの手段により、例えば形質転換、リポフェクション、エレクトロポレーションまたはウイルス媒介性形質導入（これらに限定されるものではない）により導入されうる。本発明の融合分子の発現を可能にしうるＤＮＡ構築物は、当技術分野で公知の技術、例えばクローニング、ハイブリダイゼーションスクリーニングおよびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により容易に調製されうる。クローニング、ＤＮＡ単離、増幅および精製、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼなどが関わる酵素反応ならびに種々の分離技術のための標準的な技術は、当業者に公知であり一般に用いられているものである。多数の標準的な技術がＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）、Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２）、Ｗｕ（編）（１９９３）およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９２）に記載されている。
【００４１】
本明細書中で用いる「単離されたポリペプチド」または「単離されたポリヌクレオチド」は、それぞれ、天然に存在しない又はそれが元々存在していた天然環境中にはもはや存在しないアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列を意味する。
【００４２】
もう１つの実施形態においては、本発明は、本発明の１以上の核酸分子（例えば、本発明の１以上の融合分子をコードする核酸分子）を含む宿主細胞を含む。本発明で使用されうる代表的な宿主細胞には、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞および動物細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明での使用に適した細菌宿主細胞には、エシェリキア属種（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．）細胞、バシラス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）細胞、ストレプトマイセス属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）細胞、エルウィニア属種（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｓｐｐ．）細胞、クレブシエラ属種（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．）細胞、セラチア属種（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐｐ．）細胞、シュードモナス属種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．）細胞およびサルモネラ属種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．）細胞が含まれる。本発明での使用に適した動物宿主細胞には、昆虫細胞（最も格別なものは、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）細胞、スポドプテラ・フルジペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）Ｓｆ９およびＳｆＺｌ細胞ならびにトリコプルサ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓａ）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｖｅ細胞）、線虫細胞（特に、シー・エレガント（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｔ）細胞）、鳥類細胞、両生類細胞（特に、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）細胞）、爬虫類細胞および哺乳類細胞（最も格別なものは、チャイニーズハムスター由来のもの（例えば、ＣＨＯ）、サル由来のもの（例えば、ＣＯＳおよびＶｅｒｏ細胞）、乳児ハムスター腎（ＢＨＫ）由来のもの、ブタ腎由来のもの（ＰＫＩ５）、ウサギ腎１３細胞（ＰＫＩ３）、ヒト骨肉腫細胞系１４３Ｂ、ヒト細胞系ＨｅＬａおよびヒト肝癌細胞系、例えばＨｅｐ  Ｇ２）が含まれる。本発明での使用に適した酵母宿主細胞には、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クライベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）（例えば、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ））、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）（例えば、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ））、ヤロウィア（Ｙａｒｏｗｉａ）、シュワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｉｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ザイゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）などが含まれる。サッカロミセス・セレビシエ（ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、エス・カールスバーゲンシス（Ｓ．ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）およびケイ・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）は最も一般的に使用される酵母宿主であり、簡便な真菌宿主である。前記宿主細胞は懸濁またはフラスコ培養物、組織培養物、器官培養物などとして提供されうる。あるいは、前記宿主細胞はまた、トランスジェニック動物でありうる。
【００４３】
本発明の核酸分子および／またはベクターの１以上を含む宿主細胞を製造するために本発明の核酸分子および／またはベクターを本明細書に記載の宿主細胞内に導入するための方法は当業者に良く知られている。例えば、本発明の核酸分子および／またはベクターは、感染、形質導入、トランスフェクションおよび形質転換良く知られた技術を用いて宿主細胞内に導入されうる。本発明の核酸分子および／またはベクターは、単独で、あるいは他の核酸分子および／またはベクターと共に導入されうる。あるいは、本発明の核酸分子および／またはベクターは、沈殿物、例えばリン酸カルシウム沈殿物として、または脂質との複合体として、宿主細胞内に導入されうる。
【００４４】
本発明の核酸分子および／またはベクターを宿主内に導入するためには、エレクトロポレーションも用いられうる。同様に、そのような分子は、化学的にコンピテントな細胞、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内に導入されうる。前記ベクターがウイルスである場合、それはインビトロでパッケージ化（パッケージング）され、またはパッケージング細胞内に導入されることが可能であり、そのパッケージ化ウイルスは細胞内に形質導入されうる。したがって、本発明のこの態様に従い本発明の核酸分子および／またはベクターを細胞内に導入するのに適した多種多様な技術は良く知られており、当業者にとって常套的なものである。そのような技術は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）、Ｗａｔｓｏｎら（１９９２）およびＷｉｎｎａｃｋｅｒ（１９８７）に詳細に概説されており、これらは、これらの技術を詳述する多数の実験的マニュアルの一例であり、それらの全体をそれらの関連開示に関して参照により本明細書に組み入れることとする。
【００４５】
もう１つの態様においては、本発明は、前記エピトープタグに特異的に結合するアフィニティリガンドに関する。本明細書中で用いる「アフィニティタグ」は本発明のタグに非共有結合し、任意の分子であることが可能であり、より詳細には、金属アフィニティリガンド、抗体、抗体フラグメント、ナノボディ、小分子または合成アフィニティリガンドでありうる。好ましい実施形態においては、前記アフィニティリガンドは、前記エピトープタグに特異的に結合するナノボディである。前記エピトープタグが標的分子に直接的または間接的に結合する場合、前記エピトープタグへの前記アフィニティリガンドの特異的結合が本発明において特に想定されることが明らかなはずである。
【００４６】
本明細書中で用いる「特異的に結合する」および「特異的結合」なる語は、抗体、抗体フラグメントまたはナノボディが、種々の抗原の不均一混合物中に存在する特定の抗原に優先的に結合しうることを意味する。ある実施形態においては、特異的結合相互作用は、サンプル中の望ましい抗原と望ましくない抗原とを、幾つかの実施形態では約１０〜１００倍以上（例えば、約１０００倍または１０，０００倍以上）で識別する。「特異性」は、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンフラグメント、例えばナノボディが、１つの抗原標的に、異なる抗原標的と比べて優先的に結合しうることを意味し、必ずしも高いアフィニティを示唆するとは限らない。
【００４７】
本明細書に記載のタグに特異的に結合する抗体も本発明の一部である。抗体はポリクローナルおよび／またはモノクローナルでありうる。本明細書中で用いる「抗体」（Ａｂ）は、一本鎖全抗体を含む全抗体および抗原結合性フラグメントを含むと意図される。幾つかの実施形態においては、抗原結合性フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、およびＶＬまたはＶＨドメインのいずれかを含むフラグメント、ならびにナノボディ（これらに限定されるものではない）を含む哺乳類抗原結合性抗体フラグメントでありうる（更に本明細書を参照されたい）。本発明のエピトープタグおよび／または融合分子の１以上は、当技術分野で良く知られている技術（Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ，１９８８）を用いて、エピトープタグおよび／または融合分子に結合しうるポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体を製造するための免疫原として使用されうる。簡潔に説明すると、抗体は、本発明のエピトープタグおよび／または融合分子の全部または一部で適当な対象（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギなど）を免疫化することにより製造される。前記エピトープタグおよび／または融合分子あるいはそれらの断片が十分に免疫原性である場合、それは、前記対象を免疫化するために使用されうる。免疫原性を増強するために必要または望ましい場合には、前記エピトープタグおよび／または融合分子あるいは断片は適当な担体分子（例えば、ＢＳＡ、ＫＬＨなど）に結合されうる。
【００４８】
したがって、特定の実施形態においては、本発明はまた、
（ｉ）本発明のエピトープタグ、および／または本発明のエピトープタグを含む（融合）タンパク質で動物を免疫化し、
（ｉｉ）前記エピトープタグに特異的に結合する抗体に関してスクリーニングする
段階を含む、前記エピトープタグに特異的に結合する抗体を製造するための方法を含む。
【００４９】
モノクローナル抗体は、例えばＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）に記載されているような通常の方法を用いて、本発明の１以上のエピトープタグおよび／または融合分子の全部または一部で免疫化された動物（例えば、マウス、ラットなど）の免疫細胞から製造されうる。したがって、本発明は、本発明のエピトープタグおよび／または融合分子に特異的なモノクローナル抗体、ならびにそのようなモノクローナル抗体を産生する細胞系を提供する。本発明の抗体は、鳥類および哺乳類を含むいずれかの動物から製造されうる。
【００５０】
ナノボディ（Ｎｂ）は、天然に存在する一本鎖抗体の最小機能性断片または単一可変ドメイン（ＶＨＨ）であり、当業者に公知である。それらは、ラクダ科動物において見られる、重鎖のみの抗体に由来する（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら，１９９３；Ｄｅｓｍｙｔｅｒら，１９９６）。「ラクダ」科動物においては、軽ポリペプチド鎖を欠く免疫グロブリンが存在する。「ラクダ（科動物）」は旧世界ラクダ科動物（カメルス・バクトリアヌス（Ｃａｍｅｌｕｓ  ｂａｃｔｒｉａｎｕｓ）およびカメルス・ドロメダリウス（Ｃａｍｅｌｕｓ  ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ））および新世界ラクダ科動物（例えば、ラマ・パッコス（Ｌａｍａ  ｐａｃｃｏｓ）、ラマ・グラマ（Ｌａｍａ  ｇｌａｍａ）、ラマ・グアニコエ（Ｌａｍａ  ｇｕａｎｉｃｏｅ）およびラマ・ビクグナ（Ｌａｍａ  ｖｉｃｕｇｎａ））を含む。前記単一可変ドメイン重鎖抗体は本明細書においてはナノボディまたはＶＨＨ抗体と称される。ナノボディ（Ｎａｎｏｂｏｄｙ）（商標）、ナノボディズ（Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ）（商標）およびナノクローン（Ｎａｎｏｃｌｏｎｅ）（商標）はＡｂｌｙｎｘ  ＮＶ（Ｂｅｌｇｉｕｍ）の商標である。
【００５１】
Ｎｂｓの小さいサイズおよび特有の生物物理的特性は、一般的でない又は隠れたエピトープの認識に関して、およびタンパク質標的の腔または活性部位内への結合に関して、通常の抗体フラグメントを凌駕する。更に、Ｎｂｓは二重特異性および二価抗体として設計されることが可能であり、またはレポーター分子に結合されうる（Ｃｏｎｒａｔｈら，２００１）。Ｎｂは安定であり、胃腸系内で存在し続け、容易に製造されうる。したがって、Ｎｂｓは、薬物発見および治療を含む多数の用途で使用されうる（Ｓａｅｒｅｎｓら，２００８）。
【００５２】
本明細書中で用いる「エピトープ」はポリペプチドの抗原決定基を意味する。エピトープは、前記エピトープに特有な空間的コンホメーションにおいて３個のアミノ酸を含みうるであろう。一般に、エピトープは少なくとも４個、５個、６個、７個のそのようなアミノ酸からなり、より通常は、少なくとも８個、９個、１０個のそのようなアミノ酸からなる。アミノ酸の空間的コンホメーションを決定する方法は当技術分野で公知であり、例えばＸ線結晶解析および二次元核磁気共鳴を包含する。
【００５３】
本発明のナノボディは、一般に、４個の「フレームワーク配列」またはＦＲと３個の「相補性決定領域」またはＣＤＲとを含むと考えられうる単一アミノ酸鎖を含む。「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」なる語はナノボディにおける可変領域を意味し、抗原性標的に特異的に結合しうるアミノ酸配列を含有する。これらのＣＤＲ領域は個々の抗原決定基構造に対するナノボディの基本的特異性をもたらすと考えられる。そのような領域は「超可変領域」とも称される。ナノボディは３個のＣＤＲ領域を有し、それぞれはその他のもの（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と称される）に対して非連続性である。本発明の幾つかの好ましいナノボディおよびそれらのＣＤＲが本明細書に記載されている（表３および４を参照されたい）。前記ＣＤＲ配列の記載はＶドメインおよびＶ様ドメインに関するＩＭＧＴ固有付番系（ＩＭＧＴ  ｕｎｉｑｕｅ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）に基づいている（Ｌｅｆｒａｎｃら，２００３）。
【００５４】
特定の実施形態においては、本発明のナノボディは二価であり、化学的に又は組換えＤＮＡ技術により、重鎖の２つの一価単一ドメインを互いに結合させることにより形成される。もう１つの特定の実施形態においては、本発明のナノボディは二重特異性であり、それぞれが異なる特異性を有する２つの重鎖可変ドメインを互いに結合させることにより形成される。同様に、多価または多重特異性ナノボディを含むポリペプチドが、この場合に非限定的な例として含まれる。
【００５５】
前記ナノボディの例には、配列番号１８〜２６（図１；表３を参照されたい）により定められるナノボディが含まれるが、これらに限定されるものではない。二価ナノボディの非限定的な一例は配列番号６８により定められる。もう１つの実施形態においては、前記ナノボディは、配列番号２７〜４２（図１；表４を参照されたい）から選択されるアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも１つを含みうる。より詳しくは、前記ナノボディは、配列番号１８〜２６（図１；表３を参照されたい）からなる群から選択されうる。
【００５６】
本明細書中で広義で用いるナノボディなる語は、特定の生物起源または特定の製造方法に限定されないことに注目すべきである。例えば、本発明のナノボディは、一般に、（１）天然に存在する重鎖抗体のＶＨＨドメインを単離することにより、（２）天然に存在するＶＨＨドメインをコードするヌクレオチド配列の発現により、（３）天然に存在するＶＨＨドメインの「ヒト化」により、またはそのようなヒト化ＶＨＨドメインをコードする核酸の発現により、（４）いずれかの動物種からの、特に哺乳類種からの、例えばヒトからの天然に存在するＶＨドメインの「ラクダ化」により、またはそのようなラクダ化ＶＨドメインをコードする核酸の発現により、（５）当技術分野で記載されている「ドメイン抗体」もしくは「Ｄａｂ」の「ラクダ化」により、またはそのようなラクダ化ＶＨドメインをコードする核酸の発現により、（６）自体公知のタンパク質、ポリペプチドまたは他のアミノ酸配列を製造するための合成または半合成技術を用いることにより、（７）自体公知の核酸合成のための技術を用いて、ナノボディをコードする核酸を製造し、ついで、このようにして得られた核酸を発現させることにより、および／または（８）前記の１以上のいずれかの組合せにより得られうる。
【００５７】
本明細書に記載の本発明の抗体の天然または合成類似体、突然変異体、変異体、対立遺伝子、ホモログおよびオルソログ（本明細書中では「類似体」と総称される）を使用することも本発明の範囲内である。したがって、本発明の１つの実施形態においては、「本発明の抗体」なる語は、その最も広い意味においては、そのような類似体をも含む。一般に、そのような類似体においては、本明細書に記載の本発明の抗体と比較して、１以上のアミノ酸残基が置換、欠失および／または付加されていることが可能である。
【００５８】
非限定的な例を挙げると、置換は、例えば、同類置換（前記のもの；表１も参照されたい）であることが可能であり、および／またはアミノ酸残基は、同じ位置に天然で存在する別のアミノ酸残基により置換されうる。したがって、本発明の抗体の特性を改善する、あるいは少なくとも、本発明の抗体の所望の特性または所望の特性のバランスもしくは組合せを大きく（すなわち、前記抗体が、その意図される用途に、もはや適さない程度まで）損なわない、いずれかの１以上の置換、欠失もしくは挿入またはそれらのいずれかの組合せは、本発明の範囲内に含まれる。当業者は、一般に、本明細書の開示に基づいて、そして場合によっては限られた程度の通常の実験（これは、例えば、限られた数の可能な置換を導入し、このようにして得られた抗体の特性に対するそれらの影響を決定することを含みうる）の後、適当な置換、欠失もしくは挿入またはそれらの適当な組合せを決定し選択することが可能であろう。
【００５９】
更にもう１つの修飾は、標識抗体の、意図される用途に応じて、１以上の検出可能な標識または他のシグナル生成基もしくは部分の導入を含みうる。適当な標識、ならびにそれを結合させ、使用し、および検出するための技術は、当業者に明らかであり、例えば、蛍光標識（例えば、フルオレセイン、イソチオシアナート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒドおよびフルオレスカミン、ならびに蛍光金属、例えばＥｕまたはランタニド系列からのその他の金属）、りん光標識、化学発光標識または生物発光標識（例えば、ルミナール、イソルミノール、サーロマティック（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ））アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、シュウ酸エステル、ジオキセタンまたはＧＦＰおよびその類似体）、放射性同位体、金属、金属キレートもしくは金属カチオン、またはインビボ、インビトロまたはインシトゥイメージングに特に適した他の金属もしくは金属カチオン、ならびに発色団および酵素（例えば、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−Ｖ−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ビオチナビジンペルオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−ＶＩ−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼ）を含むが、これらに限定されるものではない。他の適当な標識は当業者に明らかであり、例えば、ＮＭＲまたはＥＳＲ分光法を用いて検出されうる部分を含む。本発明のそのような標識抗体は、具体的な標識の選択に応じて、例えばインビトロ、インビボまたはインシトゥアッセイ（自体公知のイムノアッセイ、例えばＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＩＡおよび他の「サンドイッチアッセイ」などを含む）ならびにインビボイメージング目的に使用されうる。当業者に明らかなとおり、別の修飾は、例えば、前記の金属または金属カチオンの１つをキレート化するためのキレート化基の導入を含みうる。適当なキレート化基には、例えば、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。更にもう１つの修飾は、特異的な結合ペア、例えばビオチン−（ストレプト）アビイン結合ペアの一部である官能基の導入を含みうる。そのような官能基は、本発明の抗体を、前記結合ペアの残り半分に結合した別のタンパク質、ポリペプチドまたは化合物に連結する（すなわち、結合ペアの形成により連結）ために利用されうる。例えば、本発明の抗体をビオチンに対してコンジュゲート化（結合）し、アビジンまたはストレプトアビジンに対してコンジュゲート化した別のタンパク質、ポリペプチド、化合物または担体に連結することが可能である。例えば、そのようなコンジュゲート化抗体は、例えば、検出可能なシグナル生成物質がアビジンまたはストレプトアビジンにコンジュゲート化されている系において、レポーターとして使用されうる。
【００６０】
更にもう１つの実施形態においては、本明細書に記載の抗体、抗体フラグメントおよび／またはナノボディのいずれかをコードする核酸配列（本明細書に定められているもの）も目的となる。更に、本明細書に記載の抗体、抗体フラグメントおよび／またはナノボディのいずれかをコードする核酸配列を含むベクター（本明細書に定められているもの）、ならびにそのようなベクターまたはそのような核酸を含む宿主細胞（本明細書に定められているもの）をも提供する。
【００６１】
本発明のもう１つの態様においては、（ｉ）前記のアフィニティリガンドと、（ｉｉ）前記の天然に存在しない融合タンパク質と、（ｉｉｉ）場合によっては、天然に存在しない前記融合タンパク質に含まれる標的タンパク質に特異的に結合するリガンドとの複合体をも提供する。特定の実施形態においては、前記複合体は結晶性である。本明細書中で用いる「リガンド」なる語は、標的タンパク質に特異的に結合する分子を意味する。リガンドは、例えば、ポリペプチド、脂質、小分子、抗体または抗体フラグメント（例えば、ナノボディ）でありうる。リガンドはまた、天然標的タンパク質に対する内因性天然リガンドであるリガンドである「天然リガンド」を含む。
【００６２】
本明細書中で用いる「複合体」なる語は２以上の会合分子の一群を意味する。好ましい実施形態においては、複合体はタンパク質複合体でありうる。本明細書中で用いる「タンパク質複合体」または「多タンパク質複合体」なる語は、２以上の会合ポリペプチド鎖の一群を意味する。タンパク質複合体におけるタンパク質は非共有結合性タンパク質−タンパク質により連結される。四次構造は前記タンパク質複合体における会合折り畳みタンパク質の構造形態である。
【００６３】
本発明のエピトープタグ、およびこれらのエピトープタグに特異的に結合するアフィニティリガンド、およびエピトープタグとアフィニティリガンドとの複合体、および／またはそれらのいずれかの組合せは、以下のものを含む（それらに限定されるものではない）いずれかの目的を果たしうる：
・アフィニティ精製法に適した融合分子を製造する、
・前記エピトープタグに特異的に結合するアフィニティリガンドでの共精製に適した融合分子を製造する、
・アフィニティ精製法に適した融合分子を含有する、タンパク質および／または核酸の複合体を製造する、
・共有結合性または非共有結合性固定化に適した融合分子を製造する、
・サンプルまたは組成物中に融合分子が存在するかどうかを確認することを可能にする、
・組織内の融合分子を局在化することを可能にする、
・細胞内に融合分子を局在化する、
・前記融合分子と他のタンパク質／タンパク質複合体との相互作用を特定する、
・融合タンパク質の機能およびそれが細胞状態の変化にどのように応答するのかを決定する、
・細胞の寿命の間に前記融合タンパク質に何が生じるのかを決定する、
・クローン化遺伝子から誘導された新規タンパク質を特徴づける、
・前記エピトープタグに特異的に結合するナノボディとの共結晶化に適した融合分子を製造する。
【００６４】
特に、本発明のエピトープタグ、およびこれらのエピトープタグに特異的に結合するアフィニティリガンド、およびエピトープタグとアフィニティリガンドとの複合体、および／またはそれらのいずれかの組合せは、アフィニティに基づく用途、例えばアフィニティクロマトグラフィー、アフィニティ精製、免疫沈降、インビボイメージング、縦列アフィニティ精製、タンパク質検出、免疫化学、表面提示、ＦＲＥＴ型用途、結晶学などに使用されうる。前記用途における本明細書に開示されている汎用エピトープタグの有用性は実施例において非限定的に更に例示されている。
【００６５】
特定の実施形態においては、本発明は、本発明の１以上のエピトープタグを含む融合分子の精製のための、前記エピトープタグおよび／またはアフィニティリガンドのいずれかの使用に関する。したがって、通常のクロマトグラフィーに関連した高度に特別設計された方法ではなく一般化されたプロトコールを用いて、分子を精製することが可能である。融合分子は、宿主細胞から、またはそれが分泌された宿主細胞培養から精製されうる。典型的には、宿主細胞からの精製の場合、前記宿主細胞を、標準的な技術（例えば、酵素消化、音波処理、フレンチプレスなど）を用いて細胞溶解して、前記融合分子を含むライセートを形成させる。ライセートまたは宿主細胞培地を適当なクロマトグラフィー媒体と、前記クロマトグラフィー媒体への前記融合分子の結合に適した条件下で接触させることにより、前記ライセートまたは宿主細胞培地から前記融合分子を精製することが可能である。バッチワイズ技術（例えば、クロマトグラフィー培地を前記ライセートまたは培地と混合することによるもの）またはカラム技術で、前記ライセートまたは培地をクロマトグラフィー媒体と接触させることが可能である。樹脂に結合した融合分子を１回以上洗浄して、いずれかの弱く結合した物質、すなわち、前記クロマトグラフィー媒体へ前記融合分子ほどは強固に結合しない物質を除去することが可能である。ついで、前記媒体を、当業者に公知の適当な溶出バッファーと接触させることにより、前記分子を前記媒体から溶出することが可能である。前記カラムからの前記分子の溶出は、一定ｐＨにおいて、または直線的な若しくは不連続的に減少もしくは増加するｐＨ勾配で行われうる。最適溶出条件は、存在する不純物の量およびタイプ、精製すべき物質の量、カラム寸法、使用するクロマトグラフィー樹脂などに左右され、場合に応じて通常の実験により容易に決定される。
【００６６】
特定の実施形態においては、本発明は、
ａ）本明細書に記載のエピトープタグに連結された分子を含有する溶液を、本明細書に記載の固定化アフィニティリガンドを有する固体支持体に適用する段階、および
ｂ）前記固定化アフィニティリガンドと前記分子との間で複合体を形成させる段階、および
ｃ）弱く結合した又は未結合の分子を除去する段階、および
ｄ）結合分子を溶出する段階
を含む、天然に存在しない融合タンパク質を精製するための方法に関する。
【００６７】
本明細書に記載されているとおり、融合分子は、例えば本発明のタグと対象分子との間に位置する、プロテアーゼに対する切断部位を含みうる。前記クロマトグラフィー媒体からの溶出の後または前記媒体に尚も結合している間に、本発明の融合分子を、前記切断部位において切断するプロテアーゼ酵素を含む溶液と接触させることが可能である。したがって、特定の実施形態においては、前記精製方法は更に、前記エピトープタグを除去する段階を含む。
【００６８】
前記精製方法は、当技術分野で公知の任意の方法でありうる。適当な精製方法は、アフィニティクロマトグラフィー（例えば、免疫アフィニティクロマトグラフィー、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ））、金属アフィニティ沈降、固定化金属イオンアフィニティ電気泳動および免疫沈降を含むが、これらに限定されるものではない。
【００６９】
アフィニティクロマトグラフィーの場合、前記アフィニティ媒体は、以下のアフィニティリガンドの１以上に結合した固体支持体（例えば、樹脂、磁性ビーズなど）を含有する：Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、ＺｎまたはＡｌ充填ＩＭＡＣリガンド、抗体、抗体フラグメント、ナノボディ、小分子または合成アフィニティリガンド（例えば、Ｖｅｒｓａｆｆｍ（商標）を使用して誘導されたリガンドまたはアプタマー）。
【００７０】
本明細書に示されているとおり、精製のための本発明のエピトープタグおよび／またはアフィニティリガンドの使用は、高度に精製されたタンパク質を良好な収率で与える。本明細書においてタンパク質に適用された場合の「純度」または「精製（された）」なる語は、所望のタンパク質が、好ましくは、全タンパク質成分の少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より一層好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％を含むことを示唆する。
【００７１】
前記溶出段階は、とりわけ、小さな化合物、ペプチドを使用して、または高いイオン強度の溶液を使用して、またはｐＨを変化させることにより行われうる。特定の実施形態においては、前記融合分子は、過剰量の前記エピトープタグまたは過剰量の前記アフィニティリガンドによりアフィニティクロマトグラフィー媒体から溶出されうる。
【００７２】
本発明は更に、
ａ）本明細書に記載のエピトープタグに連結された分子を含有する溶液を、固定化アフィニティリガンドを有する固体支持体に適用する段階、
ｂ）前記固定化アフィニティリガンドと前記分子との間で複合体を形成させる段階、および
ｃ）弱く結合した分子を除去する段階
を含む、天然に存在しない融合タンパク質を固体支持体上に固定化し、および／または捕捉するための方法を含む。
【００７３】
前記方法は、固定化要素を使用して行わることが可能であり、前記固定化は、種々の固体支持体（例えば、カラム、ビーズ、吸着剤、ニトロセルロース紙など）上で種々の固定化手段を用いて行われうる。前記固定化アッセイは、例えば、前記タグに連結された分子に対する抗体に関してサンプルまたは組成物をスクリーニングするために用いられることが可能であり、あるいは試験化合物（例えば、薬物、新規抗生物質など）の大きなライブラリーをスクリーニングするためのスクリーニングアッセイの一部でありうる。前記スクリーニングアッセイは、好ましくは、マイクロプレート形態で行われる。任意の検出手段または方法が用いられうる。例えば、前記検出手段はプレートリーダー、シンチレーションカウンター、質量分析計または蛍光光度計でありうるであろう。
【００７４】
本発明は更に、サンプルまたは組成物中に分子が存在するかどうかを確認するための方法に関する。例えば、本発明のエピトープタグは、レポーター分子（放射能標識、アルカリホスファターゼ、ＧＦＰ、ペルオキシダーゼなど；前記を参照されたい）に融合したアフィニティリガンドを使用する融合分子の検出において使用されうる。特定の実施形態においては、本発明は、前記エピトープタグに特異的に結合する抗体での本発明の融合タンパク質の検出に関する。この実施形態は、組織または細胞下局在化実験、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティングまたは他の免疫分析方法において有用でありうる。
【００７５】
特定の実施形態においては、抗体（抗体フラグメントまたはナノボディを含む）は、イムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイにおいて前記エピトープタグの検出に使用されることが可能であり、免疫細胞化学的方法において使用されうる。幾つかの実施形態においては、抗タグ抗体が溶液中に存在することが可能であり、認識されるべきタグが溶液中に存在することが可能であり（例えば、免疫沈降）、あるいは固体表面上に存在する又は固体表面に結合していることが可能である（例えば、ウエスタンブロット）。他の実施形態においては、前記抗体は固体表面に結合していることが可能であり、前記タグは溶液中に存在することが可能である（例えば、免疫アフィニティクロマトグラフィーまたはＥＬＩＳＡ）。
【００７６】
本発明のタグおよび／または融合分子に対する抗体（抗体フラグメントまたはナノボディを含む）は、サンプル中の１以上の分子の存在、非存在または量を決定するために使用されうる。特異的に結合したタグおよび／または融合分子の量は、レポーター分子（例えば、放射性、蛍光または酵素標識）が結合している抗体を使用して決定されうる。あるいは、特異的抗体とポリペプチドとのポリペプチド−抗体複合体を検出するために、標識された二次抗体（例えば、前記ポリペプチドに特異的な抗体を認識する抗体）が使用されうる。
【００７７】
本明細書に開示されているエピトープタグを使用する前記方法はハイスループットアプローチにも用いられうることが、当業者に明らかなはずである。更に、組合せタグ化も本発明の一部を構成する。
【００７８】
もう１つの特定の実施形態においては、本発明のエピトープタグは、短いタグが好ましい又はタグが存在しないことが好ましい、タンパク質の結晶学においても有用でありうる。通常、タンパク質において非構造性部分が存在することは結晶化に不都合であるため、タグは除去される。前記柔軟性部分を除去するためには、限定的なプロテアーゼが使用される。タンパク質が本発明のエピトープタグでタグ化されたら、アフィニティリガンド、特にナノボディが前記タグに結合して、前記複合体全体をより可溶性にし、結晶化し易くし、前記複合体の構造を解析するのを助ける。Ｎｂは、柔軟性ループを固定し又は結晶接触をもたらすことにより、結晶化を促すことが示されている（Ｌｏｒｉｓら，２００３，Ｋｏｒｏｔｋｏｖら，２００９）。
【００７９】
更にもう１つの特定の実施形態においては、本発明はまた、天然条件下でタンパク質複合体を精製するための縦列アフィニティ精製（Ｔａｎｄｅｍ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＴＡＰ）方法における、本発明のエピトープタグおよび／またはアフィニティリガンドの使用を提供する。ＴＡＰタグ化方法（Ｒｉｇａｕｔら，１９９９；Ｐｕｉｇら，２００１）は酵母プロテオームに非常に首尾よく適用されることが可能であり、種々の細胞および生物に適合化されている。しかし、前記方法は本質的に妥当なものであるが、それは幾つかの欠点を有する。特に、ＴＡＰタグのサイズは２１ｋＤａの範囲でありうる。タグが大きくなればなるほど、それが、単離されるべきポリペプチドの機能または構造を阻害する、あるいは前記ポリペプチド標的により切断または消化される可能性が大きくなる。ＴＡＰのための一般に使用されるタグの組合せは良く知られており、Ｌｉ（２０１０）に要約されている。本発明のエピトープタグは、アフィニティに基づく用途のためのＴＡＰタグの開発に組込まれうる。
【００８０】
もう１つの態様においては、本発明はまた、本明細書に記載のアフィニティに基づく用途のいずれかにおける使用のためのキットを提供する。そのようなキットは、限定的なものではないが、以下の要素の１以上を含みうる：
・場合によっては検出可能な様態で標識されている、および場合によっては不溶性マトリックスまたは固体支持体に結合している、本発明の１以上の（ポリ）ペプチド、
・場合によっては不溶性マトリックスまたは固体支持体に予め固定化されている、本発明の１以上のアフィニティリガンド、
・本発明の核酸、
・本発明のベクター構築物、
・当技術分野で公知の標識試薬、
・１組の説明、
・当技術分野で公知のバッファー、溶出成分、検出成分。
【００８１】
好ましい実施形態、特定の構造および構成ならびに物質（材料）が本発明の方法および手段に関して本明細書に記載されているが、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、形態および詳細における種々の変更または修飾が施されうる、と理解されるべきである。したがって、本発明は、本明細書に添付されている特許請求の範囲のみにより限定される。
【００８２】
【表２】
0006053672.tif 000003
【００８３】
【表３】
0006053672.tif 000004
【００８４】
【表４】
0006053672.tif 000005
【実施例】
【００８５】
実施例１．α−シヌクレインに対するナノボディの単離、発現および精製
ラクダ科動物ナノボディ、例えばＮｂＳｙｎ１ａ、ＮｂＳｙｎ１ｂ、ＮｂＳｙｎ１ｃおよびＮｂＳｙｎ２、Ｎｂ８５、Ｎｂ８６、Ｎｂ８７およびＮｂ８８を、α−シヌクレイン（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ３７８４０）で免疫化されたヒトコブラクダ、または２つのタンパク質、すなわち、α−シヌクレインＡｌａ５３Ｔｈｒ突然変異体およびβ−シヌクレイン（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号はＱ１６１４３である）で免疫化されたヒトコブラクダから単離した。α−シヌクレインとβ−シヌクレインとは前記タンパク質のＮ末端部分においては８５％の同一性を有するが、Ｃ末端部分においては両タンパク質はそれほど相同ではない（±４０％）。両タンパク質は同じＣ末端ＥＰＥＡ配列を共有する。実質的に公開プロトコール（Ｌａｕｗｅｒｅｙｓら，１９９８；Ｃｏｎｒａｔｈら，２００１）に従うことにより、または「材料および方法」に記載されているとおりに、ファージ提示により全てのナノボディを選択した。固定化α−シヌクレイン上のインビトロ選択は１つの結合物質ファミリー、すなわち、ＮｂＳｙｎ１ａ、ＮｂＳｙｎ１ｂおよびＮｂＳｙｎ１ｃを示したに過ぎなかった。１０μＭのＮｂＳｙｎ１ａの存在下、固定化α−シヌクレイン上で第２のインビトロ選択を行った。この選択から、３ラウンドのパンニングの後にＮｂＳｙｎ２を得た。２つのタンパク質（α−シヌクレインＡ５３Ｔ突然変異体およびβ−シヌクレイン）で免疫化されたヒトコブラクダから、１０７個の独立クローンの、１つの独立したファージディスプレイライブラリーを構築した。このライブラリーを、２つの別々のインビトロ選択において、β−シヌクレインおよびα−シヌクレインＡ５３Ｔ突然変異体に対して並行してパンニングした。前記ベータ−シヌクレインパンニングからＮｂ８５、Ｎｂ８６およびＮｂ８７が回収された。また、これらの結合物質の２つ（Ｎｂ８５、Ｎｂ８６）をＡｌａ５３Ｔｈｒ  α−シヌクレイン上で選択した。１つの添加結合物質Ｎｂ８８も前記Ａｌａ５３Ｔｈｒ  α−シヌクレインパンニングから回収された。したがって、Ｎｂ８５およびＮｂ８６はβ−シヌクレインだけでなくα−シヌクレインＡ５３Ｔにも結合するらしい。Ｎｂ８８は、フレームワーク１およびＣＤＲ１における少数の点突然変異においてＮｂ８５と異なるに過ぎず、一方、ＣＤＲ２とＣＤＲ３とは同一である（図１）。全てのナノボディを、Ｃ末端に６個のヒスチジンを有するようにｐＨＥＮ６内に再クローニングした。実質的に公開プロトコール（Ｃｏｎｒａｔｈら，２００１）に従い、固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）およびサイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製を行った。
【００８６】
実施例２．シヌクレインに対するナノボディのエピトープの特徴づけ
バックボーンアミド共鳴に対する摂動を観察することにより、α−シヌクレイン上のＮｂＳｙｎ２、Ｎｂ８５およびＮｂ８７のエピトープをマッピングするために、１５Ｎ−１Ｈ異種核単一光子相関分光法（ＨＳＱＣ）を用いた。未標識Ｎｂの、１５Ｎ標識α−シヌクレイン中への滴定は、後者のＨＳＱＣスペクトルにおける特異的共鳴の広がり及びシフトの両方を引き起こした。標識α−シヌクレインのＨＳＱＣスペクトルに対するＮｂＳｙｎ２、ＮｂＳｙｎ８５およびＮｂ８７の結合の効果を図２に示す。前記上パネルは、Ｎｂの添加に際して得られた生スペクトルを表し、ここで、赤色ピークは遊離体に対応し、青色ピークは、種々のナノボディと複合体化しているα−シヌクレインのシグナルに対応する。図２の下パネルは、滴定剤とほぼ等しい乃至等しいモル濃度のＮｂを使用した滴定実験を要約している。用いた濃度範囲では、標識α−シヌクレインの、影響を受けたＨＳＱＣ交差ピークのほとんどは完全に消失するか（中間的な交換）、または前記スペクトルの異なる領域に再出現した（遅い交換）。これは、結合の際の安定複合体の形成に非常に合致する。前記遊離および結合スペクトルにおける遊離シヌクレインのスペクトルのピークの相対強度を前記配列に沿って各アミノ酸に関してプロットした場合（図２の下パネル）、前記Ｃ末端領域は、前記ナノボディのそれぞれの結合に際して、化学シフトまたは強度に関して最大摂動に付される。これらのデータは、３つ全てのＮｂがα−シヌクレインのＣ末端領域に結合することを示した。
【００８７】
実施例３．α−シヌクレインと相互作用するナノボディのアフィニティ測定
α−シヌクレインへのＮｂＳｙｎ２の結合をモニターするために、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）を用いた。２０℃〜３７℃の温度で測定を行った。前記データは、各場合において、ＮｂＳｙｎ２とα−シヌクレインとの間の１：１の二分子会合に合致しており、それぞれ２０℃、２５℃、３０℃および３７℃において１０６±２１ｎＭ、１３０±２３ｎＭ、９９±１７ｎＭおよび２６０±６９ｎＭのＫｄ値を示した。
【００８８】
【表５】
0006053672.tif 000006
【００８９】
ＮｂＳｙｎ２、およびα−シヌクレイン配列のｐＤ１３５−Ａ１４０（ＮＨ２−ＤＹＥＰＥＡ−ＣＯＯＨ）を含むα−シヌクレインのペプチド断片を使用して、「材料および方法」に記載されているとおりに、同様のＩＴＣ測定を行った。同様の結合特性が観察された。このことは、このペプチドがα−シヌクレイン上にＮｂＳｙｎ２のエピトープを含有することを示している（実施例４を参照されたい）。本発明者らは、対応するアフィニティおよびΔＣｐ値が完全長α−シヌクレインとの相互作用の場合に非常に類似していることを見出した（表５）。この知見は、ΔＣｐ値が、α−シヌクレインのＣ末端ペプチド内に位置するこれらの残基へのＮｂＳｙｎ２の直接的結合から圧倒的に生じ、前記分子の残部内の有意なコンホメーション変化の結果として生じるのではないことを証明している。
【００９０】
実施例４．ＮｂＳｙｎ２−ペプチド複合体の結晶化
もう１つの実験において、本発明者らは、α−シヌクレインの残基１３２−１４０に対応するペプチドＮＨ２−ＧＹＱＤＹＥＰＥＡ−ＣＯＯＨと複合体化しているＮｂＳｙｎ２を結晶化した（図６）。前記複合体のＸ線構造において、本発明者らは、前記ペプチドの最後の６つのＣ末端残基に関してのみ、有意な電子密度を観察している。前記ペプチドの残りの残基は前記電子密度においては視認できず、このことは、それらが前記複合体において高度に柔軟性であり無秩序であることを示しており、それらがＮｂＳｙｎ２との特異的相互作用に関与しないことを示唆している。残基Ａｓｐ１３５のみが不明瞭な電子密度を示しており（図７：上の第１パネル）、Ｔｙｒ１３６に関しては明らかな密度が存在するが、この残基は対称性関連複合体との結晶充填接触に関与しており（図７：上の第２パネル）、このことは、Ｔｙｒ１３６の側鎖のコンホメーションが、溶液中で、より柔軟性でありうることを示している。原子レベルでの前記構造の分析は、前記ペプチドが、ＮｂＳｙｎ２のＣＤＲ３およびＣＤＲ２ループの残基により形成されるポケットにおいてＮｂＳｙｎ２に結合することを示している。ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ループの残基は、前記ペプチドの残基Ｔｙｒ１３６、Ｇｌｕ１３７、Ｐｒｏ１３８、Ｇｌｕ１３９およびＡｌａ１４０との接触をもたらす。前記結合は主に側鎖相互作用によりもたらされ、本質的に主に静電気的である。尤も、前記ペプチドのＰｒｏ１３８とＮｂＳｙｎ２のＴｙｒ１０５との間で重要な疎水性相互作用が生じ、この場合、Ｐｒｏ１３８の環状脂肪族環のＣγおよびＣδはＴｙｒ１０５の芳香環に対して垂直に積み重なる。Ａｌａ１４０のＣβは前記ナノボディのＣＤＲ３およびＣＤＲ２ループにより形成されるポケットにおいて深く潜っており（図６ｂ）、Ａｌａ１４０のＣ末端のカルボニル基はＮｂＳｙｎ２のＡｒｇ５０と塩橋を形成する（図７）。ＮｂＳｙｎ２の残基と直接的な水素結合をもたらす、Ａｌａ１４０のカルボニル基ならびにＰｒｏ１３８およびＧｌｕ１３７のカルボニル酸素とは別に、ペプチド主鎖原子は溶媒に露出され、または架橋水分子を介して前記ナノボディとの間接的接触をもたらす。α−シヌクレイン（ＰＤＢ−コード２×６Ｍ）の９個のＣ末端残基を含むペプチドに結合したＮｂＳｙｎ２の結晶構造の決定は、ＮｂＳｙｎ２がαシヌクレインの最後の４つのＣ末端残基に、より詳細には、Ｃ末端配列ＥＰＥＡ（配列番号１）に結合することを証明している（図６）。
【００９１】
実施例５．タグ化ＧＦＰのアフィニティ精製
ＮＭＲ実験（実施例２）およびＩＣＴデータ（実施例３）は、ナノボディＮｂＳｙｎ２、Ｎｂ８５およびＮｂ８７がα−シヌクレインのＣ末端に結合することを示している。Ｘ線構造（実施例４）は、ＮｂＳｙｎ２が主に最後の４つのアミノ酸と相互作用することを証明している。これらのナノボディがこのＣ末端直鎖状４アミノ酸エピトープに結合することを更に確認するために、本発明者らは、種々のＧＦＰ−ペプチドハイブリッドを構築することを決めた。標準的なＤＮＡクローニング技術により、Ｃ末端において種々のタグに融合したＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）の、４つの異なる構築物を作製した。
【００９２】
【表６】
0006053672.tif 000007
【００９３】
それらの４つの構築物を、「材料および方法」に記載されているとおりにｐＢＡＤｍｙｃＨｉｓベクター内にクローニングした。全てのＧＦＰハイブリッドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細胞質内で発現させた。構築物ＣＡ１５１０で形質転換された細胞においては緑色蛍光は観察され得なかった。このことは、この融合タンパク質が十分には発現されないことを示している。しかし、これらの構築物で形質転換された誘導細胞の緑色蛍光により示されるとおり、ＣＡ１５０８、ＣＡ１５０９およびＣＡ１５１１に関しては機能性ＧＦＰ発現を得ることが可能であった。ナノボディＮｂ８５、Ｎｂ８７、Ｎｂ８８およびＮｂＳｙｎ２を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のペリプラズムにおいて標準的な方法により発現させた。次に、前記ナノボディの１つを含有するペリプラズム画分を、４つのタグ化ＧＦＰタンパク質の１つを含有する細胞ライセートと混合し、１時間インキュベートした。ついで、それらの種々のＧＦＰ−融合体を、ＩＭＡＣにより、これらの混合物からＨｉｓタグ化ナノボディと共に同時精製した。この同時精製実験においては、非特異的結合を避けるために高塩（１Ｍ  ＮａＣｌ）を加えた。次に、同時精製されたＮｂ−ＧＦＰ複合体をイミダゾールによりカラムから溶出し、溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（図３）。Ｎｂ８５またはＮｂＳｙｎ２を使用して、ＣＡ１５０８およびＣＡ１５０９によりコードされるタグ化ＧＦＰを粗細胞ライセート混合物から同時精製することが可能であった。最後のアラニンが前記タグから欠失しているＧＦＰ構築物（ＣＡ１５１１）を回収することはできなかった。このことは、このＣ末端Ａｌａが、Ｎｂ８５またはＮｂＳｙｎ２によるこれらのＧＦＰ融合体の結合に決定的に重要であることを示している。第２段階において、ＮｂＳｙｎ２をセファロースマトリックス上に固定化することにより、アフィニティカラムを調製した。製造業者の説明に従い、ＮｂＳｙｎ２をＣＮＢｒ活性化セファロースに結合させた。別の実験において、ＧＹＱＤＹＥＰＥＡタグに融合したＧＦＰ（構築物ＣＡ１５０８）を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で発現させた。細胞を遠心分離により回収し、細胞溶解させた。ついで、前記タグ化ＧＦＰ（構築物ＣＡ１５０８）を含有するこの粗ライセートを、固定化ＮｂＳｙｎ２を含有するアガローススラリーと混合し、４℃で１時間インキュベートした。次に全てのビーズを小カラム内のフィルター上に回収し、非特異的結合を防ぐために１０カラム体積（ｃｖ）の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）で、そして１０ｃｖの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／１Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）で洗浄し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）で平衡化した。ＧＹＱＤＹＥＰＥＡタグ化ＧＦＰを種々のバッファー（その全ては５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌを含有する）で溶出することを試み、ｐＨ７．５：０．５Ｍ  クエン酸、０．５Ｍ  Ｎ−Ｌ−ａ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−１−メチルエステル（アスパルテーム）、０．５Ｍ  アスパラート（ａｓｐａｒｔａａｔ）／チロシン、０．５Ｍ  グルタミン酸／チロシン、０．５Ｍ  ギ酸または０．５Ｍ  アジピン酸に対して滴定した。前記溶出液の蛍光を測定することにより、前記ＧＦＰ融合体の溶出をモニターした。アジピン酸およびＮａＣｌは前記タグ化ＧＦＰを前記アフィニティマトリックスから溶出することが判明した。次に溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析し、この観察を証明した。前記ＧＦＰ融合体に対応する分子量を有する１つの特異的バンドをＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で特定することが可能であった（図４）。別の実験において、ＧＦＰ−ＧＹＱＤＹＥＰＥＡ融合体を粗ライセートからＮｂＳｙｎ２アフィニティカラム上に捕捉し、それを１０ｃｖのバッファーで洗浄し、前記タグ化ＧＦＰを７５０μＭの（合成）遊離ＮＨ２−ＧＹＱＤＹＥＰＥＡ−ＣＯＯＨペプチドで成功裏に溶出した（図５）。この場合、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で前記ＧＦＰ融合体に対応する分子量を有する１つのバンドをも特定した。第２の高塩洗浄（２Ｍ  ＮａＣｌ）では、残りのタンパク質は前記カラムからほとんど溶出され得なかった。このことは、前記ペプチドがＧＹＱＤＹＥＰＥＡタグ化タンパク質を前記合成ＧＹＱＤＹＥＰＥＡペプチドの存在下に定量的に溶出することを示している。結論としては、ＮｂＳｙｎ２アフィニティカラムを使用して、ＧＦＰ−ＧＹＱＤＹＥＰＥＡ融合体（ＣＡ１５０８）を細胞ライセートから捕捉し、それをモル濃度のＮａＣｌもしくはアジピン酸で又はミリモル濃度の合成ＮＨ２−ＧＹＱＤＹＥＰＥＡ−ＣＯＯＨペプチドで前記アフィニティカラムから溶出することが可能であった。
【００９４】
実施例６．タグ化ナノボディのアフィニティ精製
もう１つの実施例として、ナノボディ（これは別のタンパク質に特異的である）をタグ化し、それを、ＮｂＳｙｎ２アフィニティ樹脂を使用して精製した。タグ化ナノボディを得るために、「材料および方法」に詳細に記載されている２つの新たなプラスミドｐＭＥＳｙ１およびｐＭＥＳｙ２を構築した。ｐＭＥＳｙ１においては、元のＨｉｓタグを、より長いＧＹＱＤＹＥＰＥＡにより置換した。ｐＭＥＳｙ２においては、４アミノ酸のＥＰＥＡタグを小さなＧＡＡリンカーの後方にクローニングした。１つのＶＨＨ、Ｎｂ４５８（無関係な抗原、すなわち、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）のＡｏｘ１を認識するもの；配列番号６６）を、ＰｓｔＩおよびＥｃｏ９１Ｉ部位を用いて、両方のベクターにおいてクローニングした。Ｎｂ４５８の両方のタグ化形態を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のペリプラズムにおいて発現させた。新鮮なペリプラズム画分を調製し、実施例４に記載されているとおりにセファロース−ビーズに架橋されたＮｂＳｙｎ２のスラリーと混合した。前記セファローススラリーを小カラムのフィルター上に集め、５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）で洗浄した。両方のタグ化ナノボディは、１ＭのＮａＣｌで、これらのカラムから成功裏に溶出されることが可能であった（図８）。結論としては、ＮｂＳｙｎ２アフィニティカラムを使用して、Ｎｂ４５８−ＧＹＱＤＹＥＰＥＡ融合体およびＮｂ４５８−ｇａａＥＰＥＡ融合体を細胞ライセートから捕捉し、それをモル濃度のＮａＣｌで前記アフィニティカラムから溶出することが可能であった。
【００９５】
実施例７：ＥＬＩＳＡにおけるＥＰＥＡ−タグの適用
まず、９６ウェルプレートの種々のウェルを、それぞれ、Ｃ末端においてＧＹＱＤＹＥＰＥＡでタグ化されたＮｂ４５８で、およびＧｇａａＥＰＥＡタグでタグ化されたＮｂ４５８でコートした。次に、前記プレートをＰＢＳ中の乳でブロッキングした。Ｈｉｓタグ化ＮｂＳｙｎ２（ＮｂＳｙｎ２のＣ末端にＨｉｓタグ）を使用し、ついで抗Ｈｉｓマウスモノクローナル抗体および抗マウスアルカリホスファターゼコンジュゲートを使用して、両方の固定化ＥＰＥＡタグ化Ｎｂ４５８が検出された。ＧＹＱＤＹＥＰＥＡでＣ末端においてタグ化されたＮｂ４５８で、またはｇａａＥＰＥＡでタグ化されたＮｂ４５８でコートされたウェルにおいてのみ、乳でブロッキングされただけのブランクウェルと比較して有意なアルカリホスファターゼ活性を検出することが可能であった。次に、ＥＬＩＳＡプレートの種々のウェルを（１）ヘキサヒスチジン−エピトープタグを有するＮｂ４５８、（２）ＧＹＱＤＹＥＰＥＡタグ、および（３）ｇａａＥＰＥＡタグを有するＮｂ４５８でコートした。全てのウェルを乳でブロッキングした。この実験においては、自製ＮｂＳｙｎ２アルカリホスファターゼコンジュゲートでＥＰＥＡタグ化ナノボディを検出することはできたが、Ｈｉｓタグ化ナノボディを検出することはできなかった。ＧＹＱＤＹＥＰＥＡおよびｇａａＥＰＥＡタグ化構築物に関してのみ、明らかなシグナルが得られた（図９）。したがって、組換え発現されたタンパク質をＥＬＩＳＡにおいて検出するために、短いＥＰＥＡタグをＮｂＳｙｎ２と共に使用することが可能のようである。
【００９６】
実施例８：ウエスタンブロットにおけるＥＰＥＡ−タグの適用
ウエスタンブロット分析においてＥＰＥＡ−タグＮｂＳｙｎ２の組合せを試験した。第１の実験において、ＧＹＱＤＹＥＰＥＡタグ化ＧＦＰ（ＣＡ１５０８）およびα−シヌクレインをＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で泳動させ、ニトロセルロースシートへ移した。一次抗体としてＨｉｓタグ化ＮｂＳｙｎ２を、二次抗体としてマウスモノクローナル抗Ｈｉｓ−タグ抗体を、そしてブロットを現像するためにＮＢＴおよびＢＣＩＰと共に抗マウスアルカリホスファターゼコンジュゲートを使用することにより、両方のブロット化タンパク質を可視化することが可能であった（図１０）。類似したウエスタンブロット実験において、本発明者らの自製ＮｂＳｙｎ２−アルカリホスファターゼコンジュゲート（ＮｂＳｙｎ２−ＡＰ）をＮＢＴおよびＢＣＩＰと共に使用する単一段階で、ブロット化ＧＹＱＤＹＥＰＥＡタグ化Ｎｂ４５８（ＣＡ２９４４）、そしてまた、Ｎｂ４５８−ｇａａＥＰＥＡ（ＣＡ２９４５）を可視化することが可能であった（図１１）。したがって、組換え発現されたタンパク質をウエスタンブロットにおいて検出するために、短いＥＰＥＡタグをＮｂＳｙｎ２と共に使用することが可能のようである。
【００９７】
実施例９．ＥＰＥＡタグでの大きなタンパク質ライブラリーのインビトロ検出および分析
Ｃ末端ＥＰＥＡタグ化タンパク質はＮｂＳｙｎ２−ＡＰでＥＬＩＳＡにおいて検出されうることが実施例７から明らかである。このタグがハイスループット用途においても機能することを確認するために、本発明者らは、ＥＰＥＡタグ化ＶＨＨの大きなファージ提示ライブラリーをスクリーニングするためにＮｂＳｙｎ２を使用した。この目的のために、ファージ提示ベクターｐＭＥＳｙ２において（免疫化ラマの）ＶＨＨ（ナノボディ）ライブラリーをクローニングした。２つの異なる抗原に対するナノボディのサブセットを選択するために、ファージ提示による２つの異なるインビトロ選択を行った。１つの抗原に特異的であるナノボディに関するクローンのこれらのサブセットのスクリーニングを以下のとおりにＥＬＩＳＡにより行った。抗原を９６ウェルプレート上にコートし、プレートをブロッキングし、ＥＰＥＡタグと融合した異なるＶＨＨ遺伝子を発現する別のクローンのペリプラズマ画分と共に各ウェルをインキュベートした。ＮｂＳｙｎ２  ＡＰコンジュゲートで検出を行った（図１２）。両方の実験において、種々の特異的結合物質を特定した。したがって、ファージ提示ライブラリーの及び他のゲノミクスまたはプロテオミクスアプローチにより作製された組換えタンパク質のライブラリーのハイスループット分析において、組換え発現されたタンパク質を検出するために、短いＥＰＥＡタグをＮｂＳｙｎ２と共に使用することが可能のようである。
【００９８】
実施例１０．ＮｂＳｙｎ２でのＥＰＥＡタグ化タンパク質のインビボ検出
もう１つの一連の実験において、（生きた）真核細胞内の組換えタンパク質の発現を検出／可視化するための、ＥＰＥＡタグの使用を検討した。この目的のために、２つの異なるタンパク質（ＨＩＶ−ＲｅｖおよびＧＦＰ）をＥＰＥＡタグ化（Ｒｅｖ−ＧＡＧＡＧＹＱＤＹＥＰＥＡ、Ｒｅｖ−ＧＡＧＡＥＰＥＡ、ＧＦＰ−ＧＹＱＤＹＥＰＥＡおよびＧＦＰ−ＧＡＡＥＰＥＡ）し、真核細胞内の一過性発現のためにｐｃＤＮＡトランスフェクションベクター内にクローニングした。ＥＰＥＡタグ化タンパク質の検出を可能にするために、ＮｂＳｙｎ２またはＮｂＳｙｎ１ａをｍＫＯ１またはＧＦＰに融合させ、ｐｃＤＮＡ内にクローニングしてＮｂＳｙｎ１ａ−ｍｋＯ１、ＮｂＳｙｎ１ａ−ＧＦＰおよびＮｂＳｙｎ２−ＧＦＰ融合体を得た。ＨｅＬａ細胞をこれらのベクターで又はこれらのベクターの組合せでトランスフェクトして、ＮｂＳｙｎ１ａまたはＮｂＳｙｎ２に融合したＧＦＰまたはｍＫＯ１を使用して前記発現を検出し前記ＥＰＥＡタグ化タンパク質の位置を特定することが可能かどうかを調べた。図１３は、ｍＫＯ１またはＧＦＰに融合したＮｂＳｙｎ２またはＮｂＳｙｎ１ａでトランスフェクトされた細胞が前記細胞において均一に着色していることを示している。Ｒｅｖ−ＧＡＧＡＧＹＱＤＹＥＰＥＡまたはＲｅｖ−ＧＡＧＡＥＰＥＡと、ｍＫＯ１またはＧＦＰに融合したＮｂＳｙｎ２またはＮｂＳｙｎ１ａとで二重トランスフェクトされた細胞は、核において、より濃い色を示す。野生型Ｒｅｖは細胞の核と細胞質との間を往来し、前記タンパク質の大部分は核内に局在することが公知である（Ｐｅｒｋｉｎｓら，１９８９）。したがって、前記蛍光ナノボディ融合体および前記ＥＰＥＡタグ化Ｒｅｖタンパク質は二重トランスフェクト化細胞の核内に共局在し、このことは、ＧＹＱＤＹＥＰＥＡおよびＥＰＥＡタグの両方が、たとえ細胞の核内であっても、ＮｂＳｙｎ２またはＮｂＳｙｎ１ａ融合体によりインビボで認識されることを証明している（図１３）。
【００９９】
実施例１１．二価ナノボディを使用するインビトロ検出の感度の改良
前記ＥＰＥＡタグがハイスループット用途において機能することは実施例９から明らかである。ＥＬＩＳＡの感度を改良するために、ｂｉＮｂＳｙｎ２（配列番号６８）と称される、ＮｂＳｙｎ２の二価形態を構築した。この目的のために、ＮｂＳｙｎ２遺伝子を増幅し、それを、両方のＮｂＳｙｎ２配列の間にＧＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号６９）リンカーを含有する二価構築物として、ファージ提示ベクターｐＭＥＳ４内にクローニングした。ｂｉＮｂＳｙｎ２の発現、精製およびアルカリホスファターゼに対するコンジュゲート化は、実施例の「材料および方法」に記載されているとおりに行った。一価ＮｂＳｙｎ２を二価「ｂｉＮｂＳｙｎ２」と比較するために、ＥＬＩＳＡを以下のとおりに行った。抗原Ｎｂ４５８−ｇａａＥＰＥＡを種々の濃度で９６ウェルプレート上にコートし、プレートをブロッキングした。前記ＮｂＳｙｎ２−ＡＰコンジュゲートまたは前記ｂｉＮｂＳｙｎ２−ＡＰコンジュゲートで検出を行った。この実験から、ｂｉＮｂＳｙｎ２を使用することにより、検出感度が増加することが明らかである（図１４Ａ、Ｂ）。
【０１００】
実施例１２．タグ化膜タンパク質の検出およびアフィニティ精製
もう１つの実施例として、タグ化膜タンパク質が検出されアフィニティ精製により精製されうるかどうかをも試験した。したがって、膜タンパク質ＣｓｇＧをタグ化し、その発現をウエスタンブロットにより調べ、ＮｂＳｙｎ２アフィニティ樹脂を使用してそれを部分精製した。ｐＴｒｃ９９ａ（ｐＭＣ２；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら，２００６）においてｔｒｃプロモーターの後に自身の天然ＲＢＳと共にクローニングされた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＵＴＩ８９  ＣｓｇＧを、Ｃ末端ＥＰＥＡアフィニティタグを含むように修飾した。ＳＬＩＭ（部位特異的連結非依存的突然変異誘発；Ｃｈｉｕら，２００４）法を用いて、「材料および方法」に詳細に記載されているとおりに、このＣ末端Ｈｉｓタグを、ＧＧＥＰＥＡをコードする配列（配列番号７０）で置換した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞の小規模培養を成長させ、ＩＰＴＧを加えてＥＰＥＡタグ化ＣｓｇＧ（配列番号７２）の産生を誘導した。前記ＣｓｇＧタンパク質の存在を証明するために、この構築物の、４つの個々のクローン上で、ウエスタンブロットを行った。適切な高さで泳動している明らかなバンドを検出することができた（図１５）。前記ＥＰＥＡタグ化ＣｓｇＧの、より大規模な製造のために、前記プラスミドをＢＬ２１細胞に形質転換した。「材料および方法」に記載されているとおりに、細胞膜を調製した。最後に、前記膜を１％  ｎ−ドデシル  β−Ｄ−マルトシド（ＤＤＭ）中、一晩にわたって可溶化し、前記可溶化物質を、実施例４に記載されているとおりセファロース−ビーズに架橋されたＮｂＳｙｎ２を含有する小さなカラム上で移動させた。前記ビーズを２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．０２％  ＤＤＭ、１％  Ｃ８Ｅ４、５ｍＭ  ＬＤＡＯで洗浄した。小さな合成ＮＨ２−ＳＥＰＥＡ−ＣＯＯＨペプチド（配列番号７１）での溶出の後、前記膜タンパク質の明らかな富化を認めることが可能であった。このことは、１％  界面活性剤溶液からのＥＰＥＡタグ化膜タンパク質の捕捉が可能であることを示している（図１６）。
【０１０１】
実施例に関する材料および方法
全ての制限酵素、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼはＦｅｒｍｅｎｔａｓから購入した。
【０１０２】
細菌株およびプラスミド
使用した大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株はＴＧ１：ｓｕｐＥ  ｔｈｉ−１Δ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）Δ（ｍｃｒＢ−ｈｓｄＳＭ）５（ｒｋ−ｍｋ−）［Ｆ’ｔｒａＤ３６  ｐｒｏＡＢ  ｌａｃｌｑＺＤＭ１５］、Ｔｏｐ１０［ｍｃｒＡ  D（ｍｒｒ−ｈｓｄＲＭＳ−ｍｃｒＢＣ）φ８０ｌａｃＺΔＭ１５  ΔｌａｃＸ７４  ｄｅｏＲ  ｒｅｃＡ１  ａｒａＤ１３９  Δ（ａｒａ−ｌｅｕ）７６９７  ｇａｌＵ  ｇａｌＫ  ｒｐｓＬ（＝ＳｔｒＲ）ｅｎｄＡ１  ｎｕｐＧ］（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＷＫ６［Δ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）、ｇａｌＥ、ｓｔｒＡ／Ｆ’ｌａｃＩｑ、ｌａｃＺΔＭ１５、ｐｒｏＡ＋Ｂ＋］（Ｚｅｌｌ  ＆  Ｆｒｉｔｚ，１９８７）およびＢＬ２１細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）であった。
【０１０３】
プラスミドｐＨＥＮ４（Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら，１９９７）、ｐＨＥＮ６（Ｌａｕｗｅｒｅｙｓら，１９９８）、ｐＭＥＳ４（ｇｅｎｂａｎｋ  ＧＱ９０７２４８）、ｐＢａｄＭｙｃＨｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡ３．１．（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびｐＭＣ２（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら，２００６）を使用した。
【０１０４】
α−シヌクレインに対するナノボディの免疫化、単離、発現および精製
ヒトコブラクダ（１）をα−シヌクレインで皮下に６週間で６回免疫化した。もう１頭のヒトコブラクダ（２）をα−シヌクレインＡｌａ５３Ｔｈｒおよびβ−シヌクレインで免疫化した。両方の動物から、ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ（１９８７）に記載されているとおりに、約１０７個のリンパ球から全ＲＮＡを単離した。ｄＮ６プライマーおよびｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＲＴを製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の説明に従い使用して、第１鎖ｃＤＮＡ合成を行った。ヒトコブラクダ１から、ＶＨＨ遺伝子をコードする遺伝子断片を、既に記載されているとおりに（Ｃｏｎｒａｄら，２００１）、特異的プライマーを使用するＰＣＲにより増幅した。ネスティッドＰＣＲのために、フレームワーク１においてアニールする１つのプライマー（５’−ＧＡＴＧＴＧＣＡＧＣＴＧ−ＣＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＲＧＧＡＧＧ−３’）（配列番号４３）、および重鎖ヒトコブラクダ免疫グロブリン（Ｃｏｎｒａｄら，２００３）の重鎖の種々のヒンジ領域においてアニールする３つの他のプライマー（５’−ＧＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＧＧＧＴＣＴＴＣＧＧＧＧＴＧＧＴ−ＧＣＧＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＴＧＧＧＴ−３’、５’−ＧＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＡＴＣＴＴＧＧＧＴＴＣＴＧＡＧＧＡＧＡ−ＣＧＧＴＧＡＣＣＴＧＧＧＴ−３’、５’−ＧＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＣＴＴＣＡＴＴＣＧＴＴＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡ−ＣＣＴＧＧＧＴ−３’）（配列番号４４、４５および４６）を使用した。ＶＨＨ遺伝子を、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ制限酵素を使用してｐＨＥＮ４ベクター（Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら，１９９７）内にクローニングし、標準的な方法によりＴＧ１細胞（ｇｅｎｅｐｕｌｓｅｒ，Ｂｉｏｒａｄ）内に形質転換した。ヒトコブラクダ２から、ＶＨＨ遺伝子をコードする遺伝子断片を増幅し、クローニングした（Ｃｏｎｒａｄら，（２００１）に記載されているとおりに行った）。Ｍ１３Ｋ０７での重感染の後、両方のライブラリーのＶＨＨレパトワを前記ファージ上で発現させた。第１ライブラリーからのインビトロ選択を、マキシソープ（ｍａｘｉｓｏｒｐ）マイクロタイターウェル（Ｎｕｎｃ）のウェルにおいてα−シヌクレイン（１０μｇ／ウェル）でコートされた固相上で、または第２ライブラリーに関してα−シヌクレインＡｌａ５３Ｔｈｒもしくはβ−シヌクレインでコートされた固相上で行った。結合ファージを１００ｍＭ  トリエチルアミン（ｐＨ１１）で溶出した。後続段階、選択された結合物質の再クローニング、発現および精製は、Ｃｏｎｒａｄら，（２００１）に記載されているとおりに行った。
【０１０５】
ＥＰＥＡタグを使用するライブラリー構築およびファージ提示
前記のとおりに、ｃＤＮＡライブラリーを構築し、全てのＶＨＨ遺伝子を増幅した。ＶＨＨ遺伝子をｐＭＥＳｙ２内にクローニングするために、ベクターおよびＰＣＲ産物をＰｓｔＩおよびＥｃｏ９１Ｉ制限酵素で消化し、精製し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼで一晩連結した。プライマーＲＰおよびＧＩＩＩを使用するＰＣＲにより、インサートの分析を行った。ヘルパーファージでの重感染の後、前記ライブラリーのＶＨＨレパトワを前記ファージ上で発現させた。マキシソープ（ｍａｘｉｓｏｒｐ）マイクロタイターウェル（Ｎｕｎｃ）のウェルにおいてタンパク質（２×５μｇ／ウェル）でコートされた固相上のライブラリーから、特異的結合物質をインビトロで選択した。前記コート化ウェルを１００ｍＭ  トリエチルアミン（ｐＨ１０）と共に１０分間インキュベートすることにより、ファージを回収し、溶出物（ファージを含有するもの）を、ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ６．８）を加えることにより中和した。この溶出物を、新たに増殖させたＴＧ１細胞に加えた。ついで前記コート化ウェルをＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ６．８）で１回およびＰＢＳで数回洗浄し、新たに増殖させたＴＧ１細胞を前記ウェルに加えて、未溶出ファージを回収した。特異的結合物質に関するコロニースクリーニングを、前記のとおり、ＮｂＳｙｎ−ＡＰを使用するＥＬＩＳＡにより行った。
【０１０６】
ヘキサヒスチジンタグとＥＰＥＡタグとを併せ持つ新たなファージ提示ベクターを以下のとおりに構築した。ｐＭＥＳｙ４（ＣＡ３１９８と称される）を以下のとおりに調製した。プライマーＥＰ１７７：（５’−ＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴ−ＣＣＴＣＡＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＧＡＡＣＣＴＧＡＡＧＣＣＴＡＧＴＡＣＣＣ−３’）（配列番号４７）およびＥＰ１７８：（５’−ＧＴＡＣＧＧＧＴＡＣＴＡＧ−ＧＣＴＴＣＡＧＧＴＴＣＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＧＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧ−３’）（配列番号４８）を５０μＭの濃度で互いに混合した。両方のプライマーを水浴中で９５℃に加熱し、非常にゆっくりと室温に冷却した。ついで前記プライマーを１μＭの濃度に希釈した。ＢｓｌＷＩおよびＥｃｏ９１Ｉで切断された精製されたｐＭＥＳ４の１００ｎｇまたは０．０３４ｐｍｏｌを１．７ｐｍｏｌのプライマーと混合し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼで連結した。ＷＫ６大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を形質転換し、ＰＣＲのより分析し、配列決定した。
【０１０７】
ＮＭＲ測定
全てのＮＭＲ実験は、低温プローブを備えたＢｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ５００ＭＨｚまたは７００ＭＨｚ分光計を使用して行った。ついで全てのＮＭＲデータを、ＮＭＲｐｉｐｅ７２を使用して処理し、前記データの分析のためにプログラムＳＰＡＲＫＹ７３を使用した。
【０１０８】
１４Ｎ  ＮｂＳｙｎ２の存在下または非存在下の標識α−シヌクレインの結合形態の１５Ｎ−１Ｈ  ＨＳＱＣ測定および帰属
低温プローブを備えたＢｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ７００ＭＨｚ装置で、標準的な１５Ｎ−１Ｈ  ＨＳＱＣ実験を行った。ＮｂＳｙｎ２の小容量の濃縮ストック溶液の滴定により、種々のモル当量の未標識ＮｂＳｙｎ２（０．２５、０．５、０．７５、１．０、１．２５、１．５、１．７５、２．０、２．５、３．０、３．２５）において、１５Ｎ標識α−シヌクレインのスペクトルを記録した。全ての実験を１０ｍＭ  リン酸バッファー（ｐＨ７．４）中、１０℃で記録した。アミド共鳴ならびにＣβおよびＣα化学シフトは予め決定されており（Ｄｅｄｍｏｎら，２００５ａ；２００５ｂ）、それらを前記データの更なる解析に使用した。ＮｂＳｙｎ２と複合体化しているα−シヌクレイン共鳴の化学シフトを、一連の標準的な３Ｄ実験（ＣＢＣＡ（ＣＯ）ＮＨおよびＨＮＣＡＣＢ）を用いて帰属した。各３Ｄ実験の実験と実験との間およびそれらの後、１５Ｎ−１Ｈ  ＨＳＱＣスペクトルを記録することにより、サンプルの完全性の検査を行った。
【０１０９】
１４Ｎ  ＮｂＳｙｎ２の存在下または非存在下の１５Ｎ１３Ｃ標識α−シヌクレインの１３Ｃ−１５Ｎ  ＣＯＮ測定
１３Ｃ−１５Ｎ  ＣＯＮ実験は残基ｎの１３Ｃカルボニル化学シフトを残基ｎ＋１の１５Ｎ化学シフトと相関させるものであり、前記実験を、既に記載されている（Ｂｅｒｍｅｌら，２００６）とおりに行った。前記スペクトルにおける全ての交差ピークの帰属はＢｅｒｍｅｌら，２００６から得た。合わせて２つのＣＯＮスペクトルを、１５Ｎ  １３Ｃ標識α−シヌクレインの遊離体および１当量の１４Ｎ  ＮｂＳｙｎ２の添加後のものに関して記録した。前記スペクトルは、低温プローブを備えた５００ＭＨｚ  Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ分光計で記録した。サンプルバッファーは１０ｍＭ  リン酸バッファー（ｐＨ７．４）であり、温度は２８３Ｋに設定した。結合形態のα−シヌクレインのＣＯＮ交差ピークの帰属は、結合α−シヌクレインに関する帰属１５Ｎ−１Ｈ  ＨＳＱＣスペクトルにおける対応ピークに関する１５Ｎ化学シフトを比較することにより得た。
【０１１０】
完全長α−シヌクレインおよびα−シヌクレインのペプチド断片に結合した１５Ｎ  １３Ｃ標識ＮｂＳｙｎ２の１５Ｎ−１Ｈ  ＨＳＱＣ測定および帰属
本発明者らはＮｂＳｙｎ２のバックボーン共鳴の帰属を報告している（Ｖｕｃｈｅｌｅｎら，２００９）。α−シヌクレインに結合した２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）中の０．３ｍＭの１５Ｎ  １３Ｃ標識ＮｂＳｙｎ２のサンプルのバックボーン帰属を、低温プローブを備えたＢｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ７００ＭＨｚ分光計を使用するＨＮＣＡ実験により得た。完全長１４Ｎ  α−シヌクレインおよび１４Ｎ  １２−残基ペプチドＮ−ＳＥＥＧＹＱＤＹＥＰＥＡ−Ｃ（Ｇｅｎｅｍｅｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｃ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）の滴定を２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）中の０．３ｍＭの１５Ｎ標識ＮｂＳｙｎ２で２９８および２８３Ｋで行った。
【０１１１】
等温熱量測定
ＭＣＳ−ＩＴＣ熱量計（ＭｉｃｒｏＣａｌ，ＬＬＣ，Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して、熱量測定を記録した。７５μＭの濃度の２７３μｌのＮｂＳｙｎ２の溶液を１０μｌのアリコートにおいて、１．４ｍｌの５μＭ  α−シヌクレインを含有する熱量測定セル中に滴定した。測定前に、１０ｍＭ  リン酸塩、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム（ｐＨ７．４）を含有する全く同じバッファー中で両方のタンパク質を透析した。所望の温度で４分ごとに各注入を行った。バッファーのみを含有するサンプルセルにおけるＮｂＳｙｎ２の滴定を、解析前に実際の結合実験から差し引いた。Ｍｉｃｒｏｃａｌ解析ソフトウェア（Ｏｒｉｇｉｎ  ７．０）を１：１結合モデルで使用して、熱力学的解析を行った。ΔＨの温度依存性は、ΔＣｐ＝δΔＨ／δＴ関係により、ΔＣｐの計算を可能にした。ΔＨへのプロトン化の寄与を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬバッファー１００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）を使用して評価した。
【０１１２】
タグ化ＧＦＰのクローニング、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現および精製
Ｔａｋａｒａ  Ｅｘ  Ｔａｑポリメラーゼ（ＴＡＫＡＲＡ  ＢＩＯ  ＩＮＣ）を使用するＰＣＲにより、４つの異なるタグをｇｆｐ遺伝子に結合させた。同じ特異的プライマーＥＰ１２４（５’  ＴＡＡＴＣＡＴＧＡＧＣＡＡＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡＣＴＴＴＴＣＡＣ  ３’）（配列番号６７）を全ての構築物において使用した。それは前記遺伝子のＮ末端においてアニールする。Ｃ末端において種々のタグのコード配列を融合させるために、種々のプライマーを使用した。ＧＹＱＤＹＥＰＥＡには、プライマーＥＰ１２６（５’−ＴＴＣＧＡＡＴＴ−ＣＡＴＴＡＣＧＣＴＴＣＣＧＧＴＴＣＡＴＡＡＴＣＣＴＧＡＴＡＴＣＣＴＴＴＧＴＡＧＡＧＣＴＣＡＴＣＣＡＴＧＣ  ３’）（配列番号４９）を使用し、ＹＱＤＹＥＰＥＡには、プライマーＥＰ１２７（５’−ＴＴＣＧＡＡＴＴＣＡＴＴＡＣＧＣＴＴＣＣＧＧＴＴＣＡＴＡＡＴＣＣＴＧＡＴＡＴＴＴＧＴＡＧＡＧＣＴ−ＣＡＴＣＣＡＴＧＣＣ−３’）（配列番号５０）を使用し、ＱＤＹＥＰＥＡには、プライマーＥＰ１２８（５’−ＴＴＣＧＡＡＴＴＣＡＴＴＡＣＧＣＴＴＣＣＧＧＴＴＣＡＴＡＡＴ−ＣＣＴＧＴＴＴＧＴＡＧＡＧＣＴＣＡＴＣＣＡＴＧＣＣ−３’）（配列番号５１）を使用した。増幅条件は９４℃で４分、２８回（９４℃で４０秒、５０℃で４０秒、７２℃で１分）および７２℃で１０分であった。種々のエピトープタグを有するＧＦＰ融合分子をコードする増幅ｇｆｐ融合体をＢｓｐＨＩおよびＥｃｏＲＩで切断した。前記ＰＣＲ産物を、ＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩで開裂されたｐＢＡＤｍｙｃＨｉｓベクター内に連結した。最後に、前記連結産物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０内に形質転換した。ＧＹＱＤＹＥＰＥタグを有するＧＦＰを構築するために、１μｌの前記ＥＰ１２４−ＥＰ１２６増幅ＧＦＰ断片を、プライマーＥＰ１２４およびＥＰ１２９（５’ＴＴＣＧＡＡＴＴＣＡＴＴＡＴＴＣＣＧＧＴＴＣＡＴＡＡＴＣＣＴＧ  ３’）（配列番号５２）を使用する更なるＰＣＲのための鋳型として使用した。前記増幅ＰＣＲ産物を、前記のとおり、ｐＢＡＤｍｙｃＨｉｓベクターにクローニングした。様々にタグ化されたＧＦＰ融合体を発現させるために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞培養をＯＤ６００＝０．７の細胞密度で０．０２％  アラビノースの添加により誘導し、３７℃で更に一晩インキュベートした。３３０ｍｌのＬＢ培養からの細胞を遠心分離（１０分間、４０００ｒｐｍ、４℃）により回収し、ペレットを、１ｍＭ  ＰＭＳＴを含有する２０ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に再懸濁させた。Ｃ５  ＥｍｕｌｓｉＦｌｅｘ  Ｈｉｇｈ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｈｏｍｏｇｅｎｉｓｅｒ  ８６−００１（ＡＶＥＳＴＩＮ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により細胞を細胞溶解させた。不溶性物質を遠心分離（３０分間、４０００ｒｐｍ、４℃）によりペレット化し、上清（細胞質画分）を集めた。ヘキサヒスチジンタグ化（Ｈｉｓタグ化）ＮｂＳｙｎ２と複合体化しているタグ化ＧＦＰを精製するために、Ｈｉｓタグ化ＮｂＳｙｎ２のペリプラズム画分を各タグ化ＧＦＰの１つの細胞質画分と混合した。前記のとおりにＩＭＡＣを行った。ＮｂＳｙｎ２−ＧＦＰタグ化融合複合体を１Ｍ  イミダゾールで溶出した。
【０１１３】
ＶＨＨ−ＥＰＥＡタグ化融合体のクローニング、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現および精製
１ｎｇのｐＭＥＳ４ａ上で、ｐＭＥＳｙ１（ＣＡ２８５７）を構築するためにＥＰ１３８（５’−ＡＣＣＣＡＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＧＧＴＡＴＣＡＡＧＡＣＴＡＣＧＡＡＣＣＴＧＡＡＧＣＣＴＡＧＴＡＣＣＣＧＴＡＣＧＡＣＧＴ）（配列番号５３）およびＦＰ（５’−ＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ−３’）（配列番号５４）を使用して、そしてｐＭＥＳｙ２（ＣＡ２７４１）を構築するためにプライマーＥＰ１３９（５’−ＡＣＣＣＡＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＧＧＧＣＡＧＣＧＧＡＡＣＣＴＧＡＡＧＣＣＴＡＧＴＡＣＣＣＧＴＡＣＧＡＣＧＴＴＣ−３’）（配列番号５５）およびＦＰを使用して、Ｔａｋａｒａ  Ｅｘ  ＴａｑポリメラーゼでＰＣＲを行った。増幅条件は９４℃で４分、２８回（９４℃で４０秒、５５℃で４０秒、７２℃で１分）および７２℃で１０分であった。両方のＰＣＲ産物およびｐＭＥＳ４ベクターをＢａｍＨＩおよびＥｃｏ９１Ｉで切断し、精製した。５０ｎｇのＰＣＲ産物への１００ｎｇのベクターの、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼでの連結を、４℃で一晩行った。前記混合物をＷＫ６細胞内に形質転換し、３７℃で一晩増殖させた。プライマーＭＰ５７（５’−ＴＴＡＴＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＧ−３’）（配列番号５６）およびＧＩＩＩ（５’−ＣＣＡＣＡＧＡＣＡＧＣＣＣＴＣＡＴＡＧ−３’）（配列番号５７）を使用するＰＣＲならびにＳｐｅＩ消化により分析を行った。クローンを配列決定し、適切なものから、ＤＮＡを調製した（Ｑｉａｇｅｎ）。Ｎｂ４５８を、プライマーＲＰおよびプライマーＥＰ１０１（５’−ＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＴＧＧＧＴ−３’）（配列番号５８）を使用して、前記と同じ増幅条件で増幅し、ＰｓｔＩおよびＥｃｏ９Ｉ制限酵素を使用してｐＭＥＳｙ１（ＣＡ２８５７）またはｐＭＥＳｙ２（ＣＡ２７４１）ベクター内にクローニングした。インサートの分析を、プライマーＲＰおよびＧＩＩＩを使用するＰＣＲにより行った。Ｃｏｎｒａｄら，（２００１）に記載されているとおりに、発現を行った。ｐＭＥＳｙ１内のＮｂ４５８はＧＹＱＤＹＥＰＥＡタグの配列に融合され、ＣＡ２９４４と称される。一方、ｐＭＥＳｙ２においては、それはｇａａＥＰＥＡタグを有し、ＣＡ２９４５と称される。
【０１１４】
ＮｂＳｙｎ２アフィニティカラム精製
精製されたＨｉｓタグ化ＮｂＳｙｎ２をＣＮＢｒ活性化セファロース（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈ  ｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅ）に、前記製造業者の説明に従い結合させた。カラムを５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）で平衡化した。タグ化融合体（ＧＦＰまたはＶＨＨ）のライセートをビーズ上に１時間接触させた。前記カラムを１０カラム体積（ｃｖ）の５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）で洗浄し、全てｐＨ７．５の追加化合物（実施例を参照されたい）の存在下の１０ｃｖの５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌで溶出を行った。最後の実験においては、溶出バッファーは１Ｍまたは２Ｍ  ＮａＣｌの存在下の５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５Ｍ  アジピン酸の存在下の５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）、または７５０μＭのペプチド（ＧＹＱＤＹＥＰＥＡ）の存在下の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）であった。
【０１１５】
Ｈｉｓタグ化ＮｂＳｙｎ２を使用する固相ＥＬＩＳＡ
マキシソルブ（Ｍａｘｉｓｏｒｂ）９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）をＮｂ４５８−ｇａａＥＰＥＡまたはＮｂ４５８−ＧＹＱＤＹＥＰＥＡ調製物で、炭酸水素ナトリウムバッファー（ｐＨ８．２）中、２μｇ／ｍｌで４℃で一晩コートした。前記ウェル内の残留タンパク質結合部位をＰＢＳ中の２％  乳で室温で２時間ブロッキングした。ＮｂＳｙｎ２−Ｈｉｓ６タグを０．２％  乳と共にＰＢＳ中の２μｇ／ｍｌで加えた。マウス抗ヒスチジン−タグ（Ｓｅｒｏｔｅｃ）を使用して、ＮｂＳｙｎ２ナノボディの検出を行った。アルカリホスファターゼ抗マウスＩｇＧコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ）を使用して、前記マウス抗ｈｉｓ抗体の後続検出を行った。酵素基質ｐ−ニトロフェニルホスファートの添加の１５分後に４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【０１１６】
アルカリホスファターゼにコンジュゲート化されたＮｂＳｙｎ２を使用する固相ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット
ＰＢＳ中の０．５ｍｇのＨｉｓタグ化ＮｂＳｙｎ２を、Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ（１９８８）に記載されているとおり、０．５ｍｌの最終体積中の２．５ｍｇのアルカリホスファターゼにコンジュゲート化した。マキシソルブ（Ｍａｘｉｓｏｒｂ）９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）を、炭酸水素ナトリウムバッファー（ｐＨ８．２）中の２μｇ／ｍｌのタンパク質調製物で４℃で一晩コートした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットを標準的なプロトコールに従い行った。前記ウェル内または膜上の残留タンパク質結合部位をＰＢＳ中の２％  乳で室温で２時間ブロッキングした。前記タグの検出を１／１０００の希釈度のＮｂＳｙｎ２−ＡＰコンジュゲートで行った。ＥＬＩＳＡのために、酵素基質ｐ−ニトロフェニルホスファートの添加の１５〜分後に４０５ｎｍの吸光度を測定した。ウエスタンのために、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ基質（Ｒｏｃｈｅ）を、前記製造業者が記載しているとおりに使用した。
【０１１７】
ＮｂＳｙｎ２−ペプチド複合体の結晶化
合成ペプチド（配列ＮＨ２−ＧＹＱＤＹＥＰＥＡ−ＣＯＯＨ）（ＢＩＯ−ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ，ＩＮＣ．，Ｔｅｘａｓ）と複合体化しているＮｂＳｙｎ２の結晶化を、結晶化ロボットＰｈｏｅｎｉｘ（Ａｒｔ  Ｒｏｂｂｉｎｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）およびシッティング・ドロップ（ｓｉｔｔｉｎｇ  ｄｒｏｐ）蒸気拡散アッセイを用いて行った。まず、１３３μｌの１０ｍｇ／ｍｌのＮｂＳｙｎ２を１５μｌのペプチド（２０ｍｇ／ｍｌ）と混合した後、ＪＢ  Ｃｌａｓｓｉｃ  １−４（Ｇ１０）スクリーン（Ｊｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に分散させた。１００ｎｌの滴を１００ｎｌの沈殿溶液と混合した。以下の条件下で結晶を得た：２５％  ｗ／ｖ  ＰＥＧ  ６０００、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）および１００ｍＭ  ＬｉＣｌ。ついで結晶を集め、凍結保護溶液（２５％  ｗ／ｖ  ＰＥＧ  ６０００、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）および１００ｍＭ  ＬｉＣｌおよび１０％  ＰＥＧ４００）に移し、データ収集のために液体窒素中で瞬間冷凍した。
【０１１８】
データ収集および構造解析
ＮｂＳｙｎ２−ペプチド複合体の凍結結晶の回折パターンを、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｓ  Ｅｌｅｋｔｒｏｎｅｎ  Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ（ＤＥＳＹ  Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＥＭＢＬ）において、ＭＡＲ５５５検出器を備えたＸ１１ビーム線で得た。Ｍｏｓｆｉｌｍ６５およびＰｏｉｎｔｌｅｓｓを使用してデータを処理し、Ｓｃａｌａを使用して空間群を決定し、データをそれぞれ基準化（ｓｃａｌｅ）し合体させた。プログラムＰｈａｓｅｒ６６、およびＮｂＳｙｎ２に関するモデル、すなわち、ｐｂｄエントリー１ＨＣＶ６７を使用する分子置換を用いて、構造因子に関連した相情報を得た。プログラムＡｒｐ／Ｗａｒｐ６８およびＲｅｆｍａｃ５６９を使用して、モデル構築および精密化を行った。電子密度地図を解釈するため、および前記モデルの精密化のために、グラフィックスプログラムＣｏｏｔ７０を使用した。ＮｂＳｙｎ２：α−シヌクレイン複合体の形成の際の溶媒接近可能表面積（ＡＳＡ）における変化を、ウェブベースサーバーＰＲＯＴＯＲＰ７１を使用して計算した。
【０１１９】
ＨｅＬａ細胞内での発現のための長いタグ（ＧＹＱＤＹＥＰＥＡ）および短いタグ（ＥＰＥＡ）のクローニング
Ｔａｋａｒａ  Ｅｘ  Ｔａｑポリメラーゼ（ＴＡＫＡＲＡ  ＢＩＯ  ＩＮＣ）を使用するＰＣＲにより、２つの異なるタグＧＹＱＤＹＥＰＥＡおよびＥＰＥＡをＣ末端においてＲｅｖに融合させた。ＧＹＱＤＹＥＰＥＡのＤＮＡ配列にＣ末端において融合されたｒｅｖ遺伝子を増幅するために、プライマーＴ７（５’−ＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ−３’）（配列番号５９）およびプライマーＥＰ１３６（５’−ＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＧＧＣＴＴＣＡＧＧＴＴＣＧＴＡＧＴＣＴＴＧＡＴＡＣＣＣＴＧＡＡＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＣＴＣ−３’）（配列番号６０）を使用して、Ｄｉｒｋ  Ｄａｅｌｅｍａｎｓにより快く贈呈されたｐｃＤＮＡＲｅｖ−ｍＫＯ１上でＰＣＲを行った。ＥＰＥＡタグをＲｅｖに融合させるために、プライマーＴ７およびＥＰ１７６（５’−ＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＧＧＣＴＴＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＣＴＣ−３’）（配列番号６１）を使用した。増幅条件は９４℃で２分、２５回（９４℃で３０秒、５２℃で３０秒、７２℃で１分）および７２℃で１０分であった。前記増幅ＤＮＡ断片をＫｐｎＩおよびＮｏｔＩで切断し、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター内に連結した。前記連結産物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０内にエレクトロポレーションした。ＰＣＲおよび配列分析によりクローンを分析した。また、同時に、前記のとおりに両方のタグをＧＦＰに融合させた。前記融合は、それをＧＹＱＤＹＥＰＥＡに融合させるためにプライマーＥＰ１８０（５’−ＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＴＣＡＴＧＡＧＣＡＡＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡＣ−３’）（配列番号６２）およびプライマーＥＰ１２６（５’−ＴＴＣＧＡＡＴＴＣＡＴＴＡＣＧＣＴ−ＴＣＣＧＧＴＴＣＡＴＡＡＴＣＣＴＧＡＴＡＴＣＣＴＴＴＧＴＡＧＡＧＣＴＣＡＴＣＣＡＴＧＣ−３’）（配列番号６３）を使用して、そしてＧＦＰをＥＰＥＡに融合させるためにプライマーＥＰ１８０およびプライマーＥＰ１８１（５’−ＴＴＣＧＡＡＴＴＣＡＴＴＡＣＧＣＴＴＣＣＧＧＴＴＣＴ−ＧＣＧＧＣＴＣＣＴＴＴＧＴＡＧＡ−ＧＣＴＣＡＴＣＣＡＴＧＣＣ−３’）（配列番号６４）を使用して行った。前記増幅ＤＮＡ断片をＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター内に連結した。ついで前記連結産物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０内にエレクトロポレーションし、クローンをＰＣＲおよび配列分析により分析した。
【０１２０】
ＨｅＬａ細胞のトランスフェクション
ＨｅＬａ（ヒト上皮細胞）を、標準的な方法を用いて、１０％  ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ培地内でコンフルエントになるまで維持した。ＨｅＬａにおけるプラスミドＤＮＡのトランスフェクションのために、細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ処理により集め、計数し、ガラス底マイクロウェルディッシュ（ＭａｔＴｅｋ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）上でプレーティングした。製造業者のマニュアルに従いトランスフェクションを行った。４×１０５個の細胞を３５ｍｍディッシュ内に播いた。１．２μｇのＤＮＡ、または２つの異なるプラスミドを２回コトランスフェクトする場合には１μｇのＤＮＡを、４．５μｌのＴｒａｎｓｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）と混合し、前記細胞上に滴下し、一晩インキュベートした。
【０１２１】
共焦点顕微鏡法
トランスフェクト化ＨｅＬａ細胞を、ＨＣＸ  ＰＬ  ＡＰＯ×６３（ＮＡ１．２）水中浸漬対物拡大を用いて、ＡＦ６０００顕微鏡およびＡＯＢＳを備えたレーザー走査ＳＰ５共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）でイメージングした。励起のために４８８ｎｍ線を使用して、ＡｒレーザーでＧＦＰをモニターし、４９２〜５７０ｎｍで発光を検出した。励起のためにＤＰＳＳ−５６１ｎｍレーザーを使用して、ｍＫｕｓａｂｉｒａオレンジ蛍光タンパク質（ｍＫＯ）をイメージングし、５７０〜６７５ｎｍで発光を検出した。
【０１２２】
二価ｂｉＮｂＳｙｎ２のクローニング、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内での発現および精製
２ｎｇのｐＨｅｎ６（ｃ）ＮｂＳｙｎ２ベクター（ＥＰ３５８）上で、ｋａｐａ  Ｔａｑポリメラーゼで２つの異なるＰＣＲを行った。前記ＰＣＲにおいては、ＮｂＳｙｎ２遺伝子を増幅するために、１回は、プライマーＳＭ１７（５’−ＣＧＣＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＴ−ＧＡＴＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧ−ＧＡＧＴＣＴＧＧ−３’）（配列番号７３）およびプライマーＶＨＨ１−リバース−５ＧＳ−ＢａｍＨＩ（５’−ＡＧＴＡＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＴＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＣＧＴＧＡＣＣＴＧＧＧＴ−３’）（配列番号７４）を使用し、１回は、プライマーＶＨＨ２−フォワード−４ＧＳ−ＢａｍＨＩ（５’−ＴＣＴＴＧＧＡＴＣＣＧＧＣＧＧＡＧＧＴＡＧＴＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧ−３’）（配列番号７５）およびプライマーＶＨＨ２−リバース−ＴＶＳＳ−ＢｓｔｅＩＩ（５’−ＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＴＧＧＧＴ−３’）（配列番号７６）を使用した。増幅条件は９４℃で２分、２８回（９４℃で４０秒、５５℃で４０秒、７２℃で１分）および７２℃で１０分であった。プライマーＳＭ１７およびＶＨＨ１−リバース−５ＧＳ−ＢａｍＨＩを使用することにより得られたＰＣＲ産物をＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで切断し、プライマーＶＨＨ２−フォワード−４ＧＳ−ＢａｍＨＩおよびＶＨＨ２−リバース−ＴＶＳＳ−ＢｓｔｅＩＩを使用することにより得られた第２のＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよびＥｃｏ９１Ｉで切断した。ｐＭＥＳ４ベクターをＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩおよびＥｃｏ９１Ｉで切断した。全ての消化物を精製し、ＤＮＡ濃度を測定した。３０ｎｇの両方のＰＣＲ産物への１００ｎｇのベクターの、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼでの３点連結を、１０μｌ中で室温で２時間行った。前記混合物を希釈し、ＸｂａＩで切断して、自己連結ベクターを除去した。前記消化物を精製し、ＷＫ６細胞内に形質転換し、３７℃で一晩増殖させた。プライマーＭＰ５７（５’−ＴＴＡＴＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＧ−３’）（配列番号５６）およびＧＩＩＩ（５’−ＣＣＡＣＡＧＡＣＡＧＣＣＣＴＣＡＴＡＧ−３’）（配列番号５７）を使用するＰＣＲならびにＢａｍＨＩ消化により、分析を行った。ＢａｍＨＩ部位を含有する適切なＰＣＲ断片サイズを有するクローンから前記ＰＣＲ断片を配列決定し、適切なものから、プラスミドＤＮＡを調製し（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＭＥＳ４ｂｉＮｂＳｙｎ２（ＣＡ４３９４）と命名した。Ｃｏｎｒａｄら，（２００１）に記載されているとおり、発現および精製を行った。ＩＭＡＣ精製後、前記サンプルを濃縮し、分取用スーパーデックス（ｓｕｐｅｒｄｅｘ）７５サイズ排除カラム上で移動させて、前記二価ｂｉＮｂＳｙｎ２を混入物または分解産物から分離した。
【０１２３】
アルカリホスファターゼにコンジュゲート化されたｂｉＮｂＳｙｎ２を使用する固相ＥＬＩＳＡ
ＰＢＳ中の０．６６ｍｇのＨｉｓタグ化ｂｉＮｂＳｙｎ２を１．７ｍｇのアルカリホスファターゼにコンジュゲート化し、並行実験において、０．３３ｍｇの一価ＮｂＳｙｎ２を１．７ｍｇのアルカリホスファターゼにコンジュゲート化した。どちらの場合も、最終体積は０．３３ｍｌであり、前記コンジュゲート化は、Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ（１９８８）に記載されているとおりに行った。マキシソルブ（Ｍａｘｉｓｏｒｂ）９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）を、炭酸水素ナトリウムバッファー（ｐＨ８．２）中、１μｇ／ｍｌまたは０．１μｇ／ｍｌの濃度の１００μｌのタンパク質調製物で４℃で一晩コートした。前記ウェル内の残留タンパク質結合部位をＰＢＳ中の２％  乳で室温で２時間ブロッキングした。前記タグの検出を、ＮｂＳｙｎ２−ＡＰコンジュゲートおよびｂｉＮｂＳｙｎ２−ＡＰの両方の１／２５０〜１／４０００の希釈度で行った。ＥＬＩＳＡのために、酵素基質ｐ−ニトロフェニルホスファートの添加の６０分後および一晩のインキュベーションの後、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【０１２４】
ＣｓｇＧ膜タンパク質のクローニング、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内での発現およびその検出／精製
ＣｓｇＧのＣ末端Ｈｉｓタグを、ＧＧＥＰＥＡをコードする配列で置換するために、以下のプライマー：５’−ＧＧＣＧＧＣＧＡＡＣＣＧＧＡＡＧＣＧＴＧＡＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＧＣＴ−３’（配列番号７７）、５’−ＴＧＡＣＴＧＣＡＧＧＣ−ＡＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＧＣＴ−３’（配列番号７８）、５’−ＣＧＣＴＴＣＣＧＧＴＴＣＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＴＴＣＣ−３’（配列番号７９）、５’−ＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＴＴＣＣ  ３’（配列番号８０）を使用して、ｐＭＣ２プラスミドをＳＬＩＭ法（Ｃｈｉｕら，２００４）において使用した。ＰＣＲおよび配列分析は適切な置換を証明した。ＣｓｇＧタンパク質の発現を確認するために、同じ構築物の、４つの異なるクローンを拾い、２５ｍｌの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養を成長させ、誘導した。細胞を集め、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロース膜に移した。前記ブロットを２％  乳でブロッキングし、２０ｍｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで５回洗浄した。ＮｂＳｙｎ２−ＡＰコンジュゲート（一価）をＰＢＳ中の０，２％  乳中で５００倍希釈し、１時間振とうした。前記ブロットを更に５回洗浄し、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ基質（Ｒｏｃｈｅ）で前記製造業者の説明のとおりに現像した。発現されたＥＰＥＡタグ化ＣｓｇＧを精製するために、１１０ｇの凍結細胞ペレットを３３０ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）に再懸濁させた。ペレット１ｇ当たり２０μｇのＤＮアーゼおよびバッファー１ｍｌ当たり０．１ｍｇのリゾチームを加えた。細胞をフレンチプレスにより細胞溶解し、細胞残渣を短い遠心分離段階（７，５００ｇ、４℃で１２分間）により除去した。ついで前記上清を高速で遠心分離（１０００００ｇ、４℃で５０分間）して、膜を取り出した。０．５％  サルコシンを含有する１００ｍｌの２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）中で膜をホモジナイズした。前記懸濁液を高速で遠心分離（１０００００ｇ、４℃で５０分間）し、ペレット（＝外膜）を集めた。ホモジナイザーを使用して、前記ペレットを、２ｍＭ  ＬＤＡＯを含有する１００ｍｌの２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）に再懸濁させた。遠心分離後、前記ペレット（膜）を、０．００２％  ＤＤＭを含有する５０ｍｌの２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）にそれを再懸濁させることにより、洗浄した。懸濁液を遠心分離（１０００００ｇ、４℃で５０分間）して、外膜を集めた。これらを１００ｍｌの２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴおよび１％  ＤＤＭに再懸濁させ、４℃で一晩振とうして前記膜を可溶化した。最後の１つの遠心分離段階（１０００００ｇ、４℃で５０分間）を行って、不溶性部分を除去した。実施例４に記載されているとおりにセファロース−ビーズに架橋された１ｍｌのＣＮＢｒ−ＮｂＳｙｎ２を含有する小さなカラム内で上清を移動させた。前記ビーズを５ｍｌの２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、１ｍＭ  Ｄ��Ｔ、０．０２％  ＤＤＭ、１％  Ｃ８Ｅ４、５ｍＭ  ＬＤＡＯで洗浄した。７５０μＭの小さな合成ＮＨ２−ＳＥＰＥＡ−ＣＯＯＨペプチドを含有する１ｍｌの２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．０２％  ＤＤＭで結合タンパク質の溶出を２回行った。
【０１２５】
【表７】
0006053672.tif 000008
0006053672.tif 000009
0006053672.tif 000010
0006053672.tif 000011
【図１】
0006053672.tif 000012
【図２−１】
0006053672.tif 000013
【図２−２】
0006053672.tif 000014
【図２−３】
0006053672.tif 000015
【図３】
0006053672.tif 000016
【図４】
0006053672.tif 000017
【図５】
0006053672.tif 000018
【図６】
0006053672.tif 000019
【図７】
0006053672.tif 000020
【図８】
0006053672.tif 000021
【図９】
0006053672.tif 000022
【図１０】
0006053672.tif 000023
【図１１】
0006053672.tif 000024
【図１２】
0006053672.tif 000025
【図１３】
0006053672.tif 000026
【図１４】
0006053672.tif 000027
【図１５】
0006053672.tif 000028
【図１６】
0006053672.tif 000029
【配列表】
0006053672000001.app