(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２５−ヒドロキシエルゴステロールまたは２５−ヒドロキシ−７−デヒドロコレステロールを生成するための、コレステロールＣ２５−ヒドロキシラーゼの使用であって、
エルゴステロールを２５−ヒドロキシエルゴステロールにヒドロキシル化するステップまたは７−デヒドロコレステロールを２５−ヒドロキシ−７−デヒドロコレステロールにヒドロキシル化するステップを含み、
前記生成がＥＲＧ５およびＥＲＧ６が不活性化されている酵母細胞内で生じ、
前記酵母がステロールΔ２４−還元酵素もまた発現し、
前記コレステロールＣ２５−ヒドロキシラーゼが、前記酵母中で発現し、
前記コレステロールＣ２５−ヒドロキシラーゼが、ラット、ブタ、イヌ、ウマ、ヒト、チンパンジー、アガゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）、マウス、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）、ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）またはカモノハシ（Ｏｒｎｉｔｈｏｒｈｙｎｃｈｕｓ   ａｎａｔｉｎｕｓ）起源である、
使用。
【請求項２】
前記酵母細胞が、サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）種、クリヴェロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）種、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）種、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）からなる群から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
遺伝子改変酵母中で２５−ヒドロキシ−７−デヒドロコレステロールを生成する方法であって、
ａ）７−デヒドロコレステロールを前記酵母によって産生されるコレステロールＣ２５−ヒドロキシラーゼに接触させることで、２５−ヒドロキシ−７−デヒドロコレステロールを生成するステップであって、
前記酵母が活性Ｅｒｇ５ｐおよびＥｒｇ６ｐ酵素を有さず、
前記酵母がステロールΔ２４−還元酵素もまた発現し、
前記コレステロールＣ２５−ヒドロキシラーゼが、ラット、ブタ、イヌ、ウマ、ヒト、チンパンジー、アガゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）、マウス、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）、ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）またはカモノハシ（Ｏｒｎｉｔｈｏｒｈｙｎｃｈｕｓ   ａｎａｔｉｎｕｓ）起源である、
ステップを含む、方法。
【請求項４】
ステップａ）に先だって、コレスタ−５，７，２４−トリエノールを機能性ステロールΔ２４−還元酵素をコードする核酸を含む酵母に接触させることで、前記酵母がラノステロール、ジメチルチモステロール、メチルチモステロール、チモステロール、コレスタ−７，２４−ジエノール、またはコレスタ−５，７，２４−トリエノールをそれぞれ３β−ヒドロキシ−８−ラノスタ−８−エン、４，４−ジメチル−コレスタ−８−エノール、４α−メチル−コレスタ−８−エノール、コレスタ−８−エノール、ラソステロールまたは７−デヒドロコレステロールに変換するステップをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
遺伝子改変酵母中で２５−ヒドロキシエルゴステロール（２５−ヒドロキシプロビタミンＤ２）を生成する方法であって、
ａ）前記酵母によって産生されるエルゴステロールを前記酵母によって産生されるコレステロールＣ２５−ヒドロキシラーゼに接触させることで、２５−ヒドロキシエルゴステロールを生成し、前記コレステロールＣ２５−ヒドロキシラーゼが、ラット、ブタ、イヌ、ウマ、ヒト、チンパンジー、アガゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）、マウス、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）、ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）またはカモノハシ（Ｏｒｎｉｔｈｏｒｈｙｎｃｈｕｓ   ａｎａｔｉｎｕｓ）起源である、ステップを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］
本発明は、サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母中における、７−デヒドロコレステロール、２５−ヒドロキシ−７−デヒドロコレステロール、および２５−ヒドロキシエルゴステロールをはじめとする、ステロールの生成に関する。それはまた、チモステロール、コレスタ−７，２４−ジエノール、およびコレスタ−５，７，２４−トリエノールの２４位における二重結合の還元；またはエルゴステロール、７−デヒドロコレステロール、コレスタ−８−エノール、およびコレスタ−７−エノールの２５位におけるヒドロキシル化を触媒する、様々な酵素にも関する。それはまた、コレステロールＣ２５−ヒドロキシラーゼおよびステロールΔ２４−還元酵素をコードする様々な核酸に関し、７−デヒドロコレステロールまたはエルゴステロールを生成してヒドロキシル化するためのそれらの使用にも関する。それはまた、このようにして生成された酵母株に関し、形質転換酵母細胞を培養するステップと、得られたステロールを収集するステップを含んでなる、これらのステロールを生成する方法にも関する。
【０００２】
［背景技術］
酵母中のステロール経路には、多数の段階が関与する。酵母ステロール経路のダイアグラムを図１４に示し、それを参照して、下で先行技術を考察する。
【０００３】
米国特許第５，４６０，９４９号明細書（Ａｍｏｃｏ）は、酵母中でスクアレンとトリエノールの蓄積を増大させる方法、および組成物を教示する。この方法は、その中でＥＲＧ５およびＥＲＧ６遺伝子が不活性化されている株中における、ＨＭＧ１（経路を制御する最重要遺伝子）のトランケーションと過剰発現を含む。ＥＲＧ５およびＥＲＧ６は２つの酵素をコードし、その活性は、コレステロール生合成と、酵母および真菌の主要ステロールであるエルゴステロール生合成とをはっきり区別する。これらの株は、好適には、通常はコレステロール生合成の中間体であるコレスタ−５，７，２４−トリエノールを蓄積する。
【０００４】
国際公開第０３／０６４６５０号パンフレット（Ｌａｎｇら）（米国特許出願公開第２００６／０２４０５０８号明細書）は、酵母中において、７−デヒドロコレステロールおよび／または生合成中間体または引き続く生成物を生成する方法を開示する。明細書では、その中でＥＲＧ５およびＥＲＧ６が不活性化され、ＨＭＧ１遺伝子がトランケートされ過剰発現される酵母株中で、マウスおよびヒトからのＣ−８ステロールイソメラーゼ、Ｃ−５ステロールデサチュラーゼ、およびステロールΔ２４−還元酵素の遺伝子が発現される。これらの酵母は、７−デヒドロコレステロールを合成できる。
【０００５】
国際公開第０３／０６４６５２号パンフレット（Ｌａｎｇら）（米国特許出願公開第２００６／００８８９０３号明細書）は、ラノステロール−Ｃ１４−デメチラーゼ活性（ＥＲＧ１１）を増大させることにより、遺伝子導入酵母中で、チモステロールおよび／または生合成中間体および／またはその引き続く生成物を生成する方法を開示する。
【０００６】
国際公開第２００５／１２１３１５号パンフレット（Ａｖｅｎｔｉｓ）は、コレステロール産生酵母株、およびその使用を教示する。ＥＲＧ６、そして場合によってはＥＲＧ５が不活性化されている様々な酵母宿主株に、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）からのステロールΔ７還元酵素遺伝子、およびヒトステロールΔ２４還元酵素遺伝子が導入された。新しい株は、他の中間体との混和材料中で、コレステロールを生成できた。
【０００７】
米国特許第６，５６２，６０９号明細書（Ｒｕｓｓｅｌｌら）は、単離されたヒトおよびマウスコレステロールＣ２５−ヒドロキシラーゼ、および遺伝子を教示する。
【０００８】
先行技術は、遺伝子導入酵母を使用した、２５−ヒドロキシプロビタミンＤ３の生成についても２５−ヒドロキシプロビタミンＤ２の生成についても沈黙している。
【０００９】
［発明の詳細な説明］
本発明に従って、酵素コレステロールＣ２５−ヒドロキシラーゼ（その基質は常態ではコレステロールである）は、７−デヒドロコレステロールおよびエルゴステロールに作用して、それぞれ２５−ヒドロキシ−７−デヒドロコレステロールおよび２５−ヒドロキシエルゴステロールを生成し得ることが分かった。
【００１０】
したがって本発明の一態様は、それぞれ２５−ヒドロキシ−７−デヒドロコレステロール（２５−ヒドロキシプロビタミンＤ３とも称される）または２５−ヒドロキシエルゴステロール（２５−ヒドロキシプロビタミンＤ２とも称される）を生成するために、７−デヒドロコレステロールまたはエルゴステロールをヒドロキシル化する、脊椎動物コレステロールＣ２５−ヒドロキシラーゼの使用である。
【００１１】
コレステロールＣ２５−ヒドロキシラーゼは、酵母中に天然に存在する酵素ではない。実際、酵母は、酵母中に存在し得る７−デヒドロコレステロールの側鎖をヒドロキシル化する能力を常態では有さない。しかし本発明に従って、酵母にコレステロールＣ２５−ヒドロキシラーゼをコードする核酸を提供し、酵母が７−デヒドロコレステロールをヒドロキシル化する条件下で酵母を培養する工程により、遺伝子改変酵母が、コレスタ−５，７，２４−トリエノールを２５−ヒドロキシ−７−デヒドロコレステロール（２５−ヒドロキシプロビタミンＤ３）に変換するようにでき得て、それによって２５−ヒドロキシ−７−デヒドロコレステロール（２５−ヒドロキシプロビタミンＤ３）が生成される。
【００１２】
上の工程では、酵母の遺伝子ＥＲＧ５およびＥＲＧ６が不活性化されていること、そして酵母中での発現のために最適化された脊椎動物ステロールΔ２４−還元酵素をコードする核酸もまた、それに提供されていることが好ましい。
【００１３】
本発明に従って、酵母にコレステロールＣ２５−ヒドロキシラーゼをコードする核酸を提供し、酵母がエルゴステロールをヒドロキシル化する条件下で酵母を培養する工程により、遺伝子改変酵母が、エルゴステロールを２５−ヒドロキシエルゴステロール（２５−ヒドロキシプロビタミンＤ２とも称される）に変換するようにでき得て、それによって２５−ヒドロキシエルゴステロール（２５−ヒドロキシプロビタミンＤ２）が生成されることもまた発見された。
【００１４】
以下の図面では、次の略語を使用する。
ＴＤＨ３ｐは、ＴＤＨ３（Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素イソ酵素３）のプロモーター領域であり；
Ｏｒｉ−ｐＢＲは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｐＢＲ３２２からのＣｏｌＥ１複製起点であり；
ｂｌａは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でアンピシリン耐性を与えるβ−ラクタマーゼ遺伝子であり；
２μは、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の複製起点を保有する２μ多コピー型ベクターの大型断片であり；
ＰＧＫ１ｔは、ＰＧＫ１（Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からの３−ホスホグリセリン酸キナーゼ）のターミネーター領域であり；
ＵＲＡ３は、ウラシルに対するＳ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＵＲＡ３栄養要求性マーカーであり；
Ｂａｍ  ＨＩ、Ｅｃｏ  ＲＩ、Ｈｉｎ  ｄＩＩＩ、Ｂｇｌ  ＩＩ、Ａｇｅ  Ｉは、対応する制限酵素の制限部位を指し；
ベクター上の部位の位置は、ユニークなＢａｍ  ＨＩ部位の１位から始まる括弧によって示される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】プラスミドＶ５１ＴＤＨ−Ｓ２４Ｒ１の制限酵素地図である。Ｓ２４Ｒ−１は、ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）からの推定上のステロールΔ２４−還元酵素をコードする合成遺伝子Ｓ２４Ｒ１である。
【図２】プラスミドＶ５１ＴＤＨ−Ｓ２４Ｒ２の制限酵素地図である。Ｓ２４Ｒ−２は、ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）からの推定上のステロールΔ２４−還元酵素をコードする合成遺伝子Ｓ２４Ｒ２を表す。
【図３】プラスミドｐＦＬＡｄｅ−Ｓ２４Ｒ１の制限酵素地図である。Ｓ２４Ｒ１は、ドブネズミ（Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）からの推定上のステロールΔ２４−還元酵素をコードする合成遺伝子Ｓ２４Ｒ１であり；ＡＲＳ−ＣＥＮは、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の動原体自律的複製起点であり；ＡＤＥ２は、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＤＥ２遺伝子を表す。
【図４】プラスミドＶ５１−Ｃ２５Ｈ１の制限酵素地図である。ＧＡＬｐは、ＧＡＬ１０−ＣＹＣ１（Ｇｕａｒｅｎｔｅら、１９８２年）ガラクトース誘導性プロモーター領域を表し；Ｃ２５Ｈ−１は、イノシシ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）からの推定上のコレステロールＣ２５−ヒドロキシラーゼをコードする合成遺伝子Ｃ２５Ｈ１を表す。
【図５】プラスミドＶ５１−Ｃ２５Ｈ３の制限酵素地図である。ＧＡＬｐは、ＧＡＬ１０−ＣＹＣ１（Ｇｕａｒｅｎｔｅら、１９８２年）ガラクトース誘導性プロモーター領域を表し；Ｃ２５Ｈ−３は、イヌ（Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）からの推定上のコレステロールＣ２５−ヒドロキシラーゼをコードする合成遺伝子Ｃ２５Ｈ３を表す。ＵＶ２８２ｎｍで記録された全てのＨＰＬＣプロフィールは、実施例８に記載されるようにして作成したステロール抽出物を用いて、実施例９に記載されるようにして実施した。略語：Ｃ５，７，２２，２４＝コレスタ５，７，２２，２４−テトラエノール；Ｃ５，７，２４＝コレスタ５，７，２４−トリエノール；Ｃ５，７，２２＝コレスタ５，７，２２−トリエノール；Ｃ５，７＝コレスタ５，７−ジエノールまたは７−デヒドロコレステロール；２５ＯＨ−Ｃ５，７−Ａｃ＝２５−ヒドロキシ７−デヒドロコレステロールアセテート；２５ＯＨ−Ｅ５，７，２２−Ａｃ、２５−ヒドロキシエルゴステロールアセテート；Ｅ５、７，２２，２４、エルゴスタ５，７，２２，２４−テトラエノール；Ｅ５，７，２２、エルゴスタ５，７，２２−トリエノール（エルゴステロール）。
【図６】推定上のステロールＣ−２４ステロール還元酵素を発現する株からのステロール抽出物のＨＰＬＣ溶出プロフィールである。以下の株を使用した：Ａ：ＥＲＴ／Ｖ５１ＴＤＨ対照；Ｂ：ＥＲＴ／Ｖ５１ＴＤＨ−Ｓ２４Ｒ１；Ｃ：ＥＲＴ／Ｖ５１ＴＤＨ−Ｓ２４Ｒ２；Ｄ：ＥＲＴ／ｐＦＬＡｄｅ−Ｓ２４Ｒ１。
【図７】推定上のコレステロールＣ２５−ヒドロキシラーゼを発現するｅｒｇ６変異体からのステロール抽出物のＨＰＬＣ溶出プロフィールである。以下の株を使用した：Ｃ：ＥＲＴ／ｐＦＬＡｄｅ−Ｓ２４Ｒ１／Ｖ５１；Ｄ：ＥＲＴ／ｐＦＬＡｄｅ−Ｓ２４Ｒ１／Ｖ５１−Ｃ２５Ｈ１；Ｅ：ＥＲＴ／ｐＦＬＡｄｅ−Ｓ２４Ｒ１／Ｖ５１−Ｃ２５Ｈ３。標準物質は次のとおりであった：Ａ、コレスタ５，７−ジエノール（７−デヒドロコレステロール、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ  ６３１０３，ＵＳＡから購入）；Ｂ、２５−ヒドロキシ７−デヒドロコレステロールアセテート（実施例９に記載されるようにして調製）。
【図８】推定上のコレステロールＣ２５−ヒドロキシラーゼを発現するｅｒｇ６変異株からの単一ピークのＵＶスペクトルである。ＵＶスペクトルは、実施例９に記載されるようにして、ＨＰＬＣ中にＰＤＡ検出器によって、２０５〜３００ｎｍの間で以下のピークについてオンライン測定した：Ａ：１１．８分における７−デヒドロコレステロール標準ピーク（図７、プロフィールＡ）；Ｂ：８．５分における２５−ヒドロキシ７−デヒドロコレステロールアセテート標準ピーク（図７プロフィールＢ）；Ｃ：８．５分におけるＥＲＴ／ｐＦＬＡｄｅ−Ｓ２４Ｒ１／Ｖ５１−Ｃ２５Ｈ１ピーク（図７、プロフィールＤ）。
【図９】推定上のコレステロールＣ２５−ヒドロキシラーゼを発現するｅｒｇ６変異株からの単一ピークの質量分析プロフィールである。ｍ／ｚ＝３５０〜４５０の質量断片化プロフィールは、実施例９に記載されるようにして、ＨＰＬＣ中にＭｉｃｒｏ質量ＺＱ検出器によって、以下のピークについてオンライン測定した：Ａ：１１．８分における７−デヒドロコレステロール標準ピーク（図７、プロフィールＡ）；Ｂ：８．５分における２５−ヒドロキシ７−デヒドロコレステロールアセテート標準ピーク（図７、プロフィールＢ）；Ｃ：８．５分におけるＥＲＴ／ｐＦＬＡｄｅ−Ｓ２４Ｒ１／Ｖ５１−Ｃ２５Ｈ１ピーク（図７、プロフィールＤ）。
【図１０】推定上のコレステロールＣ２５−ヒドロキシラーゼを発現するＥＲＧ６野性型株からのステロール抽出物のＨＰＬＣ溶出プロフィールである。以下の株を使用した：Ｂ：Ｗ３０３／Ｖ５１；Ｃ：Ｗ３０３／Ｖ５１−Ｃ２５Ｈ１；Ｄ：Ｗ３０３／Ｖ５１−Ｃ２５Ｈ３。  標準物質は次のとおりであった：Ａ、エルゴステロール（エルゴスタ５，７，２２−トリエノール）Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ  ６３１０３，ＵＳＡから購入。
【図１１】推定上のコレステロールＣ２５−ヒドロキシラーゼを発現するＥＲＧ６野性型株からの単一ピークのＵＶスペクトルである。ＵＶスペクトルは、実施例９に記載されるようにして、ＨＰＬＣ中にＰＤＡ検出器によって、２０５〜３００ｎｍの間で以下のピークについてオンライン測定した：Ａ：１１．９分におけるエルゴステロール標準ピーク（図１０、プロフィールＡ）；Ｂ：１０．０分におけるＷ３０３／Ｖ５１−Ｃ２５Ｈ１ピーク（図１０、プロフィールＣ）；Ｃ：８．７分におけるＷ３０３／Ｖ５１−Ｃ２５Ｈ１ピーク（図１０、プロフィールＣ）。
【図１２】推定上のコレステロールＣ２５−ヒドロキシラーゼを発現するｅｒｇ６野生型株からの単一ピークの質量分析プロフィールである。ｍ／ｚ＝３５０〜４５０の質量断片化プロフィールは、実施例９に記載されるようにして、ＨＰＬＣ中にＭｉｃｒｏ質量ＺＱ検出器によって、以下のピークについてオンライン測定した：Ａ：１１．９分におけるエルゴステロール標準ピーク（図１０、プロフィールＡ）；Ｂ：１０．０分におけるＷ３０３／Ｖ５１−Ｃ２５Ｈ１ピーク（図１０、プロフィールＣ）；Ｃ：８．７分におけるＷ３０３／Ｖ５１−Ｃ２５Ｈ１ピーク（図１０、プロフィールＣ）。
【図１３】ＥＲＧ６が不活性化されている酵母（コレスタ−タイプステロール）と比較した、野生型酵母（エルゴスタ−タイプステロール）のステロール生合成経路の後半部分である。酵素は斜体で強調される。黒塗り矢印は、野生型酵母に見つかった酵素反応を表す。破線矢印は、異種活性（推定上のステロールΔ２４−還元酵素、推定上のコレステロールＣ２５−ヒドロキシラーゼ）によって触媒されるステップに対応し、対応する酵素には下線を引いた。
【図１４】酵母ステロール経路のダイアグラムである。
【図１５】１０種の異なる２５−ヒドロキシラーゼ遺伝子による、７−デヒドロコレステロールから２５−ヒドロキシ−７−デヒドロコレステロール（ＨｙＤＨＣ）への変換の比較である。以下のＳ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株を実施例２０に記載されるようにして培養した。Ｅｃａｂ  ＨＹ株（配列番号２６の遺伝子を有する組み込みコンストラクト）、Ｅｃａｂ  ｏｐｔ  ２．０株（配列番号２５の遺伝子を有する組み込みコンストラクト）、Ｐｔｒｏ  ｏｐｔ  ２．０株（配列番号１９の遺伝子を有する組み込みコンストラクト）、Ｐｔｒｏ  ＨＹ（配列番号２０の遺伝子を有する組み込みコンストラクト）、ＣｏｎＨｙＤ  ＨＹ株（配列番号３１の遺伝子を有する組み込みコンストラクト）、ＣｏｎＨｙＤ  ｏｐｔ  ２．０株（配列番号３０の遺伝子を有する組み込みコンストラクト遺伝子）、Ｒｎｏｒ  ＨＹ株（配列番号２３の遺伝子を有する組み込みコンストラクト）、Ｒｎｏｒ  ｏｐｔ  ２．０株（配列番号２２の遺伝子を有する組み込みコンストラクト）、Ｓｓｃｒ  ＨＹ株（配列番号２８の遺伝子を有する組み込みコンストラクト）、Ｓｓｃｒ  ｏｐｔ  ２．０株（配列番号２７の遺伝子を有する組み込みコンストラクト）、および実施例２に記載されるようにして最適化されたブタからの２５−ヒドロキシラーゼを含有するＳｃｒ  Ｐｏｍｐｏｎ株。細胞ペレットからステロールを単離し、ＨｙＤＨＣ含量、総ステロールのＨｙＤＨＣ比率、および７−ＤＨＣからＨｙＤＨＣへの変換を、２５−ヒドロキシラーゼＣ２５Ｈ１の組み込みによって得られる値と比較した。全ての新しいヒドロキシラーゼ遺伝子が発現され、その遺伝子産物は７−ＤＨＣをＨｙＤＨＣにヒドロキシル化（ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）できた。
【００１６】
［定義］
本明細書および請求の範囲の全体を通じて、以下の定義が適用される。
【００１７】
「酵母」は、サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ならびに分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）種、クリヴェロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）（Ｋｌｙｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）種、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）種、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）などの工業規模生産に適したその他の酵母を指す。
【００１８】
ハイブリダイゼーションの「標準条件」とは、本発明の文脈で、特定のハイブリダイゼーションシグナルを検出するために当業者によって一般に使用され、例えば参照によって本明細書に援用する、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９年，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載される条件を意味する。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」の一例は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含んでなる溶液中における、４２℃で一晩（例えば１５時間）のインキュベーションの後、０．１×ＳＳＣ中で約６５℃のハイブリダイゼーション担体の洗浄である。
【００１９】
「％同一性」という用語は、当該技術分野で知られているように、場合に応じて、配列のストリング間の一致により判定される、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の関連性の程度を意味する。「同一性」は、例えばプログラムＢＥＳＴＦＩＴ（ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ，  ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．２，Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．，９６８５  Ｓｃｒａｎｔｏｎ  Ｒｏａｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ  ９２１２１−３７５２，ＵＳＡ）によって、既知の方法によって、以下のパラメーターを使用して容易に判定し得る：ｇａｐ  ｃｒｅａｔｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ  ８、ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ  ２（デフォルトパラメーター）。
【００２０】
「機能性」酵素とは、典型的な酵母培養条件下で、酵素が酵母内で所望の活性を発揮することを意味する。例えば「機能性コレステロールＣ２５−ヒドロキシラーゼ」は、酵母細胞生体内で、コレステロールＣ２５−ヒドロキシラーゼが、７−デヒドロコレステロールを２５−ヒドロキシ−７−デヒドロコレステロールに変換することを意味する。
【００２１】
「機能性」核酸配列とは、核酸配列が（ポリペプチドをコードするものの他に）、酵母が機能する濃度でポリペプチドを発現するのに必要な配列を含むことを意味する。このような配列は、プロモーター、終止配列、エンハンサーなどを包含し得る。
【００２２】
［コレステロール２５−ヒドロキシラーゼ］
したがって本発明の一態様は、７−デヒドロコレステロールまたはエルゴステロールをコレステロールＣ２５−ヒドロキシラーゼに接触させるステップと、２５−ヒドロキシ−７−デヒドロコレステロールまたは２５−ヒドロキシエルゴステロールを得るステップを含んでなる、酵母細胞中で２５−ヒドロキシ−７−デヒドロコレステロールまたは２５−ヒドロキシエルゴステロールを生成する方法である。好適には、コレステロールＣ２５−ヒドロキシラーゼは脊椎動物起源であり、より好適にはラット、ブタ、イヌ、ウマ、ヒト、チンパンジー、アガゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔａ）、マウス、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）、ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）またはカモノハシ（Ｏｒｎｉｔｈｏｒｈｙｎｃｈｕｓ  ａｎａｔｉｎｕｓ）（Ｏｒｎｉｔｈｏｒｙｎｃｈｕｓ  ａｎａｔｉｎｕｓ）からの酵素である。さらに機能する能力を保持しさえすれば、これらの天然酵素の誘導体、すなわちアミノ酸配列が天然酵素ともはや同一でないものを使用してもよい。例えば、本発明は、天然脊椎動物Ｃ２５−ヒドロキシラーゼと、少なくとも９０％の同一性、好適には少なくとも９５％の同一性、より好適には少なくとも９９％の同一性を有する酵素の使用を包含するが、ただし誘導体酵素はその機能性を保持する。
【００２３】
同様に、本発明で使用し得る核酸は、上記ペプチド配列をコードするもの、および上記ペプチド配列をコードするものとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするものである。好適にはそれらは単離されている。さらに、いくつかの実施形態では、Ｃ２５−ヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸は、酵母環境により良く適するようにコドン最適化されている。好ましい実施形態では、核酸は、ブタ、ラット、イヌ、チンパンジー、またはウマ起源であり、酵母のためにコドン最適化されている。特に好まれる核酸は、参照核酸配列「配列番号５のＳｓｃｒ  Ｐｏｍｐｏｎ」と少なくとも同程度に酵母宿主中で発現されるようにコドン最適化されているものであり、より好適には、核酸配列は、Ｓｓｃｒ  Ｐｏｍｐｏｎ」よりもさらに良く発現される。
【００２４】
核酸は、好適にはＤＮＡである。
【００２５】
特に好まれる核酸は、次のように称されるものである：
Ｃ２５Ｈ１（ブタヒドロキシラーゼをベースとする；配列番号．５）、
Ｃ２５Ｈ３（イヌヒドロキシラーゼをベースとする：配列番号８）
Ｅｃａｂ＿ＨＹまたはＥｃａｂ２５ＯＨ＿ｏｐｔ２．０（ウマヒドロキシラーゼをベースとする：配列番号２５および２６）
ＣｏｎＨＹＤ  ｏｐｔ  ２０（配列番号３０）
Ｒｎｏｒ  ＨＹ（ラットヒドロキシラーゼをベースとする：配列番号２３）
Ｓｓｃｒ  ＨＹ（配列番号２８）
Ｓｓｃｒ  ｏｐｔ  ２０（配列番号２７）
Ｓｓｃｒ  Ｐｏｍｐｏｎ（配列番号５）
【００２６】
本発明の別の態様は、機能性コレステロールＣ２５−ヒドロキシラーゼを含んでなる酵母細胞である。本発明のさらなる態様は、７−デヒドロコレステロールまたはエルゴステロールを、それぞれ２５−ヒドロキシ７−デヒドロコレステロールまたは２５−ヒドロキシエルゴステロールに変換できる酵母である。
【００２７】
本発明のさらなる態様は、ヒドロキシル化反応を生じさせる培養条件下において、７−デヒドロコレステロールの存在下で、脊椎動物コレステロールＣ２５−ヒドロキシラーゼを発現させ、２５−ヒドロキシ７−デヒドロコレステロールの生成をもたらすステップを含んでなる、酵母中で２５−ヒドロキシ７−デヒドロコレステロールを生成する方法である。本発明の追加的態様は、ヒドロキシル化反応を生じさせる培養条件下において、エルゴステロールの存在下で、脊椎動物コレステロールＣ２５−ヒドロキシラーゼを発現させ、２５−ヒドロキシエルゴステロールの生成をもたらすステップを含んでなる、酵母中で２５−ヒドロキシエルゴステロールを生成する方法である。
【００２８】
遺伝子の複数コピーが、発現ベクター中に存在することが好ましい。好ましい実施形態では、２〜５個のコピーが使用される。
【００２９】
前述の遺伝子の何れかを酵母宿主にクローニングするためのベクターは、クローニングに有用なことが知られているあらゆるタイプ、特にＣ２５−ヒドロキシラーゼ遺伝子と、当該技術分野で通常使用されるプロモーターおよびエンハンサーをはじめとする、随伴する発現および／または組み込み配列とを保有する、プラスミドおよび動原体プラスミド；および本発明の別の態様を構成するベクターであってもよい。
【００３０】
米国特許出願公開第２００６／０２４２５０８号明細書で記載されるものなどの７−デヒドロコレステロールを産生できる酵母中では、遺伝子ＥＲＧ５およびＥＲＧ６が不活性化され、下でさらに詳しく述べられるような脊椎動物起源のステロールΔ２４−還元酵素が発現されることが好ましい。さらに状況によっては、このような酵母中でＨＭＧ１の切断型を過剰に発現することが有利である。不活性化ＥＲＧ５およびＥＲＧ６とトランケート型ＨＭＧ１遺伝子とを有するこのような株については、当該技術分野記載されている。
【００３１】
次に既知のＵＶ光照射処置を使用して、２５−ヒドロキシプロビタミンＤ３または２５−ヒドロキシプロビタミンＤ２を、それぞれビタミンＤ３またはＤ２の第１の代謝産物であり循環形態である、２５−ヒドロキシビタミンＤ３に変換し得る。２５−ヒドロキシビタミンＤ３は骨組織形成において重要な役割を果たし、商業的に家禽および他の動物飼料中でビタミン栄養補給剤として使用される。それは商標ＲＯＶＩＭＩＸ  ＨＹ−Ｄ（登録商標）の下に、ＤＳＭ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓから市販される。２５−ヒドロキシビタミンＤ２は体内で２５−ヒドロキシビタミンＤ３に匹敵する効果を示し、２５−ヒドロキシビタミンＤ３の用法と同様の様式で使用し得る。
【００３２】
［ステロールΔ２４−還元酵素］
本発明の別の態様は、ステロールΔ２４−還元酵素をコードする新規核酸であり、それは酵母によって発現され得て、ラノステロール、ジメチルチモステロール、メチルチモステロール、チモステロール、コレスタ−７，２４−ジエノールまたはコレスタ−５，７，２４−トリエノールからなる群から選択される基質を３β−ヒドロキシ−８−ラノスタ−８−エン、４，４−ジメチル−コレスタ−８−エノール、４α−メチル−コレスタ−８−エノール、コレスタ−８−エノール、ラソステロールおよび７−デヒドロコレステロールからなる群から選択される生成物に変換し得るが、ただし核酸配列はヒト核酸配列でもマウス核酸配列でもない。
【００３３】
好適には、酵母細胞は、その中でＥＲＧ６およびＥＲＧ５が不活性化されているものである。好適には、これらの核酸は、宿主細胞のためにコドン最適化されている脊椎動物起源の修飾ＤＮＡであるが、ただしそれはマウスでもヒトでもない。好適には、ステロールΔ２４−還元酵素は、ブタ、イヌ、チンパンジー、アガゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔａ）、マウス、ラット、ウマ、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）、ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）またはカモノハシ（Ｏｒｎｉｔｈｏｒｈｙｎｃｈｕｓ  ａｎａｔｉｎｕｓ）（Ｏｒｎｉｔｈｏｒｙｎｃｈｕｓ  ａｎａｔｉｎｕｓ）起源である。
【００３４】
特に好ましい実施形態では、これらは、ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）またはゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）ＤＮＡであり、およびより好ましい実施形態では、それらはサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）内での発現のためにコドン最適化されている。特に好まれる核酸は、Ｓ２４Ｒ１（修飾ラット遺伝子、配列番号１のヌクレオチド１０〜１５６３）およびＳ２４Ｒ２（修飾ゼブラフィッシュ遺伝子、配列番号３のヌクレオチド１０〜１５６３）と称される。
【００３５】
本発明の別の態様は、脊椎動物核酸配列、好適にはＤＮＡであり、それは酵母宿主中での発現のためにコドン最適化されており、それは酵母宿主細胞内で、酵素が、
ラノステロールを３β−ヒドロキシ−８−ラノスタ−８−エンに、またはジメチルチモステロールを４，４−ジメチル−コレスタ−８−エノールに；
メチルチモステロールを４α−メチル−コレスタ−８−エノールに；
チモステロールをコレスタ−８−エノールに；
コレスタ−７，２４−ジエノールをラソステロールに；または
コレスタ−５，７，２４−トリエノールを７−デヒドロコレステロール）に変換し得るように、機能性ステロールΔ２４−還元酵素をコードし；
酵素をコードする核酸は、ストリンジェントな条件下でＳ２４Ｒ１またはＳ２４Ｒ２とハイブリダイズし得るが、ただし脊椎動物核酸配列はヒトから単離された拡散配列でもマウスから単離された核酸配列でもない。
【００３６】
本発明の別の態様は、前述の核酸配列によってコードされる酵素である。本発明の好ましい酵素は、配列番号２および４で記載されるもの、
および配列番号２または４と少なくとも９０％、および好適には９５％の同一性を示すもの、および酵母細胞環境内で、
ラノステロールを３β−ヒドロキシ−８−ラノスタ−８−エンに、
ジメチルチモステロールを４，４−ジメチル−コレスタ−８−エノールに、
メチルチモステロールを４α−メチル−コレスタ−８−エノールに、
チモステロールをコレスタ−８−エノールに、
コレスタ−７，２４−ジエノールをラソステロール、または
コレスタ−５，７，２４−トリエノールを７−デヒドロコレステロールに
変換できるものである。
【００３７】
本発明の別の態様は、上述のような機能性核酸配列（ｎｕｃｌｅｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含有する酵母宿主、特にＳ２４Ｒ１、Ｓ２４Ｒ２を含んでなる、またはストリンジェントな条件下でＳ２４Ｒ１またはＳ２４Ｒ２とハイブリダイズする核酸配列を含んでなる、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母宿主であるが、ただし核酸はヒト配列でもマウス配列でもない。好ましい実施形態では、酵母宿主はＥＲＧ５およびＥＲＧ６が不活性化されており、特に好ましい実施形態では、酵母宿主はまたＨＭＧ１遺伝子の切断型を過剰発現する。
【００３８】
さらに本発明の別の態様は、ラノステロール、ジメチルチモステロール、メチルチモステロール、チモステロール、コレスタ−７，２４−ジエノールまたはコレスタ−５，７，２４−トリエノールと、酵母宿主中での発現についてコドン最適化されており、機能性ステロールΔ２４−還元酵素をコードする核酸配列を含んでなる酵母とを接触させるステップを含んでなる、酵母細胞内で３β−ヒドロキシ−８−ラノスタ−８−エン、４，４−ジメチル−コレスタ−８−エノール、４α−メチル−コレスタ−８−エノール、コレスタ−８−エノール、ラソステロールまたは７−デヒドロコレステロールを生成する方法であるが、ただし核酸配列はヒト核酸配列でもマウス核酸配列でもなく、酵母は、
ラノステロールを３β−ヒドロキシ−８−ラノスタ−８−エンに、
ジメチルチモステロールを４，４−ジメチル−コレスタ−８−エノールに、
メチルチモステロールを４α−メチル−コレスタ−８−エノールに、
チモステロールをコレスタ−８−エノールに、
コレスタ−７，２４−ジエノールをラソステロールに、または
コレスタ−５，７，２４−トリエノールを７−デヒドロコレステロールに変換する。この方法では、核酸は、好適にはＳ２４Ｒ１、Ｓ２４Ｒ２であり、またはストリンジェントな条件下でＳ２４Ｒ１またはＳ２４Ｒ２とハイブリダイズし得る核酸であるが、ただし脊椎動物核酸配列はヒト核酸配列でもマウス核酸配列でもない。
【００３９】
本発明の別の態様は、酵母宿主中での発現についてコドン最適化されており、機能性ステロールΔ２４−還元酵素をコードする機能性核酸配列を含んでなるプラスミドをはじめとするベクターを含むが、ただし核酸配列はヒト核酸配列でもマウス核酸配列でもない。好適には、ベクターは核酸Ｓ２４Ｒ１、Ｓ２４Ｒ２、またはストリンジェントな条件下でＳ２４Ｒ１またはＳ２４Ｒ２とハイブリダイズする核酸を含んでなるが、ただし脊椎動物核酸配列はヒト核酸配列でもマウス核酸配列でもない。ベクターは、転写、翻訳、および／または酵母染色体への組み込みを制御するプラスミドまたは他のベクター中に一般に見出される、通常の配列を含有してもよい。
【００４０】
［遺伝子コンストラクト］
Ｃ２５−ヒドロキシラーゼまたはステロールΔ２４還元酵素をコードする本発明の遺伝子コンストラクトは全て、典型的には、関心のある遺伝子を制御する、ＡＤＨ１プロモーター、ＴＥＦ１プロモーター、酵母ＧＰＤ（ＴＤＨ３）プロモーター、酵母ＨＸＴ７プロモーター、酵母ＧＡＬｌ／１０プロモーターまたは酵母ＰＧＫ１プロモーターなどの標準法を使用して制御し得る、既知のプロモーター制御下にある外来遺伝子を一般的に有する、発現カセットの一部である。さらに発現カセットは、上述の遺伝子の少なくとも１つのコード配列と作動可能なように結合している、ターミネーター配列および／または他の調節要素などの上流および下流配列を含んでなってもよい。本発明の遺伝子コンストラクトを保有するベクターは、従来の方法を用いて酵母に導入される。
【００４１】
以下の実施例は例証のみを意図するものであり、本発明をどのようにも制限するものではない。本出願全体を通じて引用される全ての参考文献、特許出願、特許、および公開特許公報の内容は、参照によって本明細書に援用する。
【実施例】
【００４２】
［参考文献］
参考文献の完全な一覧は実施例の終わりに記載した。全ての参考文献は、参照によって本明細書に援用する。
【００４３】
［培地］
【００４４】
【表１】
0005889200.tif 000002
【００４５】
培地の利用に先だって、それを１２０℃で２０分間の高圧蒸気滅菌によって滅菌した。必要ならば無菌トリプトファン、ウラシルまたはアデニン（ｂ）を２０ｍｇ／Ｌの最終濃度に添加した。
【００４６】
【表２】
0005889200.tif 000003
【００４７】
使用前に、培地を０．２μｍの濾過ユニットに通過させ、濾過して滅菌した。必要ならば、無菌のトリプトファン、ウラシルまたはアデニンを最終濃度０．２ｍｇ／ｍｌに添加した。
【００４８】
［実施例１］
［異なる生物からのΔ２４（２５）−ステロール還元酵素の選択および合成遺伝子設計］
ステロールΔ２４−還元酵素は、コレステロール生合成の最終段階の１つを触媒する。それはかなり非特異的酵素であり、基質として少なくともチモステロールおよびデスモステロールを受け入れる。２００４年には、対応する遺伝子がヒトで同定された（Ｗａｔｅｒｍａｎ  ＨＲら，２００１年）。ヒトおよびマウスからの遺伝子産物についてのみ、ステロールΔ２４−還元酵素活性が正式に（ｆｏｒｍａｌｌｙ）立証されている（Ｃｒａｍｅｒｉ  Ａら、２００６年；国際公開第０３／０６４６５０号パンフレット）。ラットからの相同遺伝子の匹敵する機能についてもまた記載されるが（Ｗｕ  Ｃ．ら  ２００４年：  Ｎａｔｕｒｅ  ４３２  （７０１７）：６４０−５）、遺伝子産物の酵素活性は確認されていない。
【００４９】
国際公開第０３／０６４６５０号パンフレットでは、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）変異体（ｅｒｇ５  ｅｒｇ６）中における、マウスからのΔ２４−還元酵素遺伝子の発現が示されており、宿主株中では生じない２つの新しいステロール（ラソステロールおよび７−デヒドロコレステロール）の形成がもたらされる。ヒトΔ２４（２５）−ステロール還元酵素と相同的な酵素についての、ＧＥＮＢＡＮＫまたはＥＭＢＬなどの公共データベースの検索は、標準条件下で、公的に利用可能なプログラムＢＬＡＳＴｐを用いて実施した。見つかった配列間で、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）アミノ酸配列と９７％のアミノ酸同一性を示すドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）の配列（表１）、およびヒト配列と７９％のアミノ酸同一性を示すゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）の配列（表１）をさらなる調査のために選択した。
【００５０】
【表３】
0005889200.tif 000004
【００５１】
各ｃＤＮＡについて、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中における発現のための合成遺伝子を設計した。一般に、この目的のために、元のｃＤＮＡ配列を使用することが可能である。場合によっては、かずさＤＮＡ研究所（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ／ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ）の異なる種のコドン使用頻度表を使用して、元のｃＤＮＡのコドン使用頻度プロフィールを新しい宿主のコドン使用頻度に適合させる試みが有利である。これは手動で、またはコンピュータプログラムの助けを借りて実施し得る。本例では、コンピュータプログラムが使用され、その計算アルゴリズムは配列作成ルーチンを伴い、ユーザー定義のコドンバイアス調節があるＤＮＡ配列を作成できるようにする。アルゴリズム中にはまたいくつかの制約を導入して、特定の制限部位の存在を回避し、または代案としては随意に制限部位の存在を支持し得る。配列作成の一部は乱数発生ルーチンによって進められ、通常、試行毎に異なるＤＮＡ配列がもたらされる。プログラムのユーザーが使用された乱数種を回復することは可能でなく、したがって結果を再現することは可能でなかった。したがって再コードされた配列は予測され得ず、ユニークな元のシグネチャーを保有すると見なし得る。
【００５２】
代案として作成されたＤＮＡ配列バージョン間の選択は、最終的にユーザー依存であった（外観検査）。選択されたＤＮＡ配列バージョンは、サービス提供者（例えばＧｅｎｅＣｕｓｔ  Ｅｕｒｏｐｅ，  ３０ｂ  ｒｕｅ  Ｄｏｍｉｎｉｑｕｅ  Ｌａｎｇ，３５０５  Ｄｕｄｅｌａｎｇｅ，Ｌｕｘｅｍｂｏｕｒｇ）によって、遺伝子合成のために使用された。翻訳開始および終結を最適化するために、３個の追加的アデニン残基をＡＴＧ開始コドン上流に付加し、第２の停止（ＳＴＯＰ）コドンを読み取り枠下流に付加した。合成遺伝子の酵母発現ベクターへの都合よいクローニングのために、Ｂａｍ  ＨＩおよびＥｃｏ  ＲＩ制限酵素部位をそれぞれ配列の上流および下流に付加した。上で説明したように、ラットステロールΔ２４−還元酵素遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＹ９２２２０（ｃＤＮＡ配列）およびＡＡＸ２９９６８（アミノ酸配列）を上述の方法によって再コードした。新しい合成遺伝子は、Ｓ２４Ｒ１と命名された。その配列を下に示す。
配列番号１
【化１】
0005889200.tif 000005
【００５３】
対応するアミノ酸配列は次のとおり：
配列番号２
【化２】
0005889200.tif 000006
【００５４】
ゼブラフィッシュ（Ｄ．ｒｅｒｉｏ）ステロールΔ２４−還元酵素遺伝子（ＤＮＡ配列はＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＭ＿００１００８６４５およびアミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋ  ｎｕｍｂｅｒ  ＮＰ＿００１００８６４５でアクセス可能）を上述の方法によって再コードした。新しい合成遺伝子をＳ２４Ｒ２と命名した。その配列を下に示す。
配列番号３
【化３】
0005889200.tif 000007
【００５５】
対応するアミノ酸配列は次のとおり：
配列番号４
【化４】
0005889200.tif 000008
【００５６】
［実施例２］
［ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）からのコレステロールＣ２５−ヒドロキシラーゼアミノ酸配列に相同的なアミノ酸配列の選択、およびＳ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中での発現について最適化された代案のＤＮＡ配列の計算］
ヒト（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）およびハツカネズミ（Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ）遺伝子産物について、コレステロールＣ２５−ヒドロキシラーゼ活性が示されている（Ｌｕｎｄら，１９９８年；米国特許第６５６２６０９号明細書）。ヒトコレステロールＣ２５−ヒドロキシラーゼと相同的な酵素についてのＧＥＮＢＡＮＫまたはＥＭＢＬなどの公共データベースの検索は、標準条件下で、公的に入手可能なプログラムＢＬＡＳＴｐを用いて実施した。見つかった配列間で、ヒト（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）アミノ酸配列と８２％のアミノ酸同一性、ハツカネズミ（Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ）配列と７９％のアミノ酸同一性を示すイノシシ（Ｓ．ｓｃｒｏｆａ）配列（表２）、およびヒトおよびマウス配列と７０％のアミノ酸同一性を示すイヌ（Ｃ．ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）配列（表４）をさらなる調査のために選択した。
【００５７】
【表４】
0005889200.tif 000009
【００５８】
酵母サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）によって滅多に使用されないコドンに相当する２５個のコドンを、酵母中で頻繁に使用されるコドンで置き換えることにより、ブタコレステロールＣ２５−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＤＮＡ配列はＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＹ９７４０８８で、アミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋ番号Ｑ４Ｇ１Ｇ８でアクセスできる）を再コードした（Ｚｈａｎｇら，１９９１年）。新しい合成遺伝子をＣ２５Ｈ１と称した。その配列を下に示す。
配列番号５
【化５】
0005889200.tif 000010
【００５９】
対応するアミノ酸配列は、次のとおり。
配列番号６
【化６】
0005889200.tif 000011
【００６０】
使用された配列と４つの違いを示す、データベースＧＥＮＢＡＮＫからの推定上のブタステロールＣ２５−ヒドロキシラーゼの代案のアミノ酸配列もまた利用できるが、実験でさらに使用することはなかった。
配列番号７
【化７】
0005889200.tif 000012
【００６１】
イヌ（Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）からの遺伝子（ヌクレオチド配列はＧｅｎＢａｎｋ番号ＸＭ＿５４６５９６．２で、アミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋ番号ＸＰ＿５４３５９６．１でアクセスできる）を実施例１に記載されるようにして、適合法によって再コードした。新しい合成遺伝子をＣ２５Ｈ３と命名し、そのＤＮＡ配列を下に示す。
配列番号８
【化８】
0005889200.tif 000013
【００６２】
対応するアミノ酸配列は次のとおり。
配列番号９
【化９】
0005889200.tif 000014
【００６３】
［実施例３］
［発現プラスミドＶ５１ＴＤＨ−Ｓ２４Ｒ１の構築］
発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）によって記載されるような古典的分子生物学技術を使用して構築され、ＤＮＡ制限酵素および修飾酵素は、供給元（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ  ０１９３８−２７２３，ＵＳＡ）が推奨するようにして（ａｓ  ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｒ）使用された。
【００６４】
基礎的な多コピー構成的発現ベクターＶ５１ＴＤＨは、ガラクトース誘導性ＧＡＬ１０−ＣＹＣ１プロモーターを構成的に発現するＴＤＨ３遺伝子（サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）ゲノムデータベース中の系統的遺伝子注釈からのＹＧＲ１９２Ｃ遺伝子、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素イソ酵素３をコードする）からのプロモーターで置換して、Ｖ５１ベクターから誘導された。Ｖ５１は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）中における維持のためのＣｏｌＥ１複製起点およびｂｌａ遺伝子（アンピシリン耐性）、酵母中における維持のための２μ起点およびＵＲＡ３遺伝子、多重クローニング部位（ＭＣＳ）（ｐＹｅＤＰ１／８−２、ＣｕｌｌｉｎおよびＰｏｍｐｏｎ，１９８８年）によって隔てられるＧＡＬ１０−ＣＹＣ１ハイブリッドプロモーターおよびＰＧＫ１ターミネーター領域を保有する。ＴＤＨ３プロモーター領域は、Ｗ３０３−１Ｂ酵母株（ＴｈｏｍａｓおよびＲｏｔｈｓｔｅｉｎ，１９８９年）からのゲノムＤＮＡ上でＰＣＲによって増幅され、ＨｏｆｆｍａｎおよびＷｉｎｓｔｏｎ（１９８７年）に従って、以下のプライマーを使用して調製された。
【化１０】
0005889200.tif 000015
【００６５】
ＰＣＲ増幅産物をＡｇｅ  ＩおよびＢａｍ  ＨＩによって消化し、ＧＡＬ１０−ＣＹＣ１プロモーターを保有するＶ５１からの６１７ｂｐ長さのＡｇｅ  Ｉ−Ｂａｍ  ＨＩ断片を置換するのに使用した。得られたＶ５１ＴＤＨベクターは、ＴＤＨ３プロモーター（ＴＤＨ３ｐ）とＰＧＫ１ターミネーター（ＰＧＫ１ｔ）領域の間に局在するＭＣＳに挿入することで、酵母中において関心のある遺伝子を構成的発現させるのに有用な、多コピー大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）／Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）シャトルベクターである。
【００６６】
Ｓ２４Ｒ１合成遺伝子（実施例１参照）の構成的発現のためのＶ５１ＴＤＨ−Ｓ２４Ｒ１ベクターは、Ｂａｍ  ＨＩおよびＥｃｏ  ＲＩで制限酵素消化されたＶ５１ＴＤＨベクターに、Ｓ２４Ｒ１合成遺伝子からの１５６４ｂｐのＢａｍ  ＨＩ−Ｅｃｏ  ＲＩ制限酵素産物を挿入して構築された。
【００６７】
Ｖ５１ＴＤＨ−Ｓ２４Ｒ１構成的発現ベクターの制限酵素地図を図１に示す。
【００６８】
［実施例４］
［発現プラスミドＶ５１ＴＤＨ−Ｓ２４Ｒ２の構築］
Ｓ２４Ｒ２の構成的発現のためのＶ５１ＴＤＨ−Ｓ２４Ｒ２ベクター（実施例１参照）は、基本的に、実施例３で既に述べたようにして構築された。Ｂａｍ  ＨＩおよびＥｃｏ  ＲＩで制限酵素消化されたＶ５１ＴＤＨベクターに、合成遺伝子Ｓ２４Ｒ２の１５６４ｂｐ長さのＢａｍ  ＨＩ−Ｅｃｏ  ＲＩ制限酵素産物をライゲートした。Ｖ５１ＴＤＨ−Ｓ２４Ｒ２の制限酵素地図を図２に示す。
【００６９】
［実施例５］
［動原体発現プラスミドｐＦＬＡｄｅ−Ｓ２４Ｒ１の構築］
酵母動原体および自律複製配列（ＡＲＳＣＥＮ）およびＡＤＥ２選択マーカーを保有する空のｐＦＬＡｄｅ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）／Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）シャトルベクターに、Ｖ５１ＴＤＨ−Ｓ２４Ｒ１（実施例３に記載）からのＴＤＨ３ｐ−Ｓ２４Ｒ１−ＰＧＫ１ｔ発現カセットを挿入することにより、遺伝子Ｓ２４Ｒ１の構成的発現のための動原体ｐＦＬＡｄｅ−Ｓ２４Ｒ１ベクター（実施例１参照）を構築した。ｐＦＬＡｄｅベクターは、以下のプライマーを使用して、ＵＲＡ３遺伝子をコードするｐＦＬ３８の１．１ｋｂのＢｇｌ  ＩＩ断片（Ｂｏｎｎｅａｕｄら，１９９１年）を、酵母ゲノムＤＮＡ上でのＰＣＲ増幅によって得られるＡＤＥ２遺伝子をコードする２．７ｋｂのＢａｍ  ＨＩ断片で置換して構築された。
【化１１】
0005889200.tif 000016
【００７０】
ＴＤＨ３ｐ−Ｓ２４Ｒ１−ＰＧＫ１ｔ発現カセットは、標準条件下で、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（日本国滋賀県大津市のタカラバイオ株式会社）および以下のプライマーを使用して、ＰＣＲによって増幅された。
【化１２】
0005889200.tif 000017
【００７１】
増幅産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ  ９２００８，ＵＳＡ）にクローンした。Ｓａｃ  Ｉ−Ｐｓｔ  Ｉ制限酵素消化と、同一制限酵素によって切断されたｐＦＬＡｄｅベクターへのライゲーションによって、ＴＤＨ３ｐ−Ｓ２４Ｒ１−ＰＧＫ１ｔカセットを後者のベクター（ｌａｔｅｒ  ｖｅｃｔｏｒ）から単離した。結果として得られたｐＦＬＡｄｅ−Ｓ２４Ｒ１動原体発現ベクターの制限酵素地図を図３に示す。
【００７２】
［実施例６］
［発現ベクターＶ５１−Ｃ２５Ｈ１の構築］
Ｃ２５Ｈ１からの８２６ｂｐのＢａｍ  ＨＩ−Ｅｃｏ  ＲＩ断片をＶ５１に挿入し、Ｂａｍ  ＨＩおよびＥｃｏ  ＲＩで消化して、Ｃ２５Ｈ１（実施例２参照）のガラクトース誘導性発現のためのＶ５１−Ｃ２５Ｈ１プラスミドを構築した。得られたＶ５１−Ｃ２５Ｈ１発現プラスミドは、ガラクトース誘導性ＧＡＬ１０−ＣＹＣ１ハイブリッドプロモーター（Ｇｕａｒｅｎｔｅら，１９８２年）およびＰＧＫ１ターミネーターの制御下にある合成遺伝子Ｃ２５Ｈ１をコードする。Ｖ５１−Ｃ２５Ｈ１の制限酵素地図を図４に示す。
【００７３】
［実施例７］
［発現ベクターＶ５１−Ｃ２５Ｈ３の構築］
合成遺伝子Ｃ２５Ｈ３（実施例２参照）のガラクトース誘導性発現のためのＶ５１−Ｃ２５Ｈ３ベクターは、実施例６に既に記載したようにして、Ｂａｍ  ＨＩおよびＥｃｏ  ＲＩで消化されたＶ５１に、合成遺伝子Ｃ２５Ｈ３の８２６ｂｐのＢａｍ  ＨＩ−Ｅｃｏ  ＲＩ断片を挿入して構築した。得られた発現プラスミドＶ５１−Ｃ２５Ｈ３は、ガラクトース誘導性ＧＡＬ１０−ＣＹＣ１ハイブリッドプロモーターおよびＰＧＫ１ターミネーターの制御下にある、Ｃ２５Ｈ３をコードする。Ｖ５１−Ｃ２５Ｈ３の制限酵素地図を図５に示す。
【００７４】
［実施例８］
［酵母株形質転換およびステロール抽出］
上述の異なる発現プラスミドによって、Ｗ３０３−１Ｂ株（ＭＡＴａｌｐｈａ；ｕｒａ３−５２；ｔｒｐ１−１；ｌｅｕ２−３，１１２；ｈｉｓ３−１１；ａｄｅ２−１；ｃａｎ１−１００；ＴｈｏｍａｓおよびＲｏｔｈｓｔｅｉｎ，１９８９年）、およびそのｅｒｇ６変異体ＥＲＴ（ＭＡＴａｌｐｈａ；ｅｒｇ６：：ＴＲＰ１；ｕｒａ３−５２；ｔｒｐ１−１；ｌｅｕ２−３，１１２；ｈｉｓ３−１１；ａｄｅ２−１；ｃａｎ１−１００）を形質転換した。ＥＲＴ株のＥＲＧ６の不活性化は、ＥＲＧ６に機能性ＴＲＰ１遺伝子を挿入して得られた。ｐＦＬ４５からのＴＲＰ１遺伝子（Ｂｏｎｎｅａｕｄら，１９９１年）は、ＥＲＧ６配列が隣接するＴＲＰ１プライマーを使用して、ＰＣＲによって増幅した。プライマーの配列は以下のとおりである。
ＥＲＧＴＲＰ−１：
【化１３】
0005889200.tif 000018
【００７５】
Ｇｉｅｔｚら（１９９５年）によって記載されるリチウム−ＰＥＧ技術を使用して、得られたＰＣＲ産物を使用し、Ｗ３０３−１Ｂ株を形質転換した。トリプトファンを含まない規定培地上で形質転換体を選択し、それらのステロール組成物をＨＰＬＣによって確認し（Ｌｅｃａｉｎら，１９９６年）、ＥＲＧ６不活性化の既知の効果と一致する、エルゴステロールの不在および独特なステロールの存在を確認した。１つのｅｒｇ６：：ＴＲＰ１形質転換体をさらなる研究のために保存し、ＥＲＴと命名した。
【００７６】
ＥＲＴに加えて、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）野性型ＢＹ４７４２株（遺伝子型ＭＡＴａｌｐｈａ；ｈｉｓ３Δ１；ｌｅｕ２Δ０；ｌｙｓ２Δ０；ｕｒａ３Δ０；Ｂｒａｃｈｍａｎｎら，１９９８年）もまた、構築されたプラスミドのための宿主として使用した。
【００７７】
ＢＹ４７４２、Ｗ３０３−１Ｂ、およびＥＲＴの形質転換は、Ｇｉｅｔｚら（１９９５年）によって記載されるリチウム−ＰＥＧ法によって実施した。形質転換体は、ベクター上に存在する選択マーカーに応じて、ウラシルまたはアデニンを含まない定義された最少培地（表１）上で選択した。各形質転換の少なくとも２つの独立した形質転換体を分析した。ステロール分析のためには、形質転換体を合成培地（表２に記載）中で、定常期になるまで培養した。
【００７８】
酵母細胞を培養媒体から遠心分離して回収し、等容積の脱イオン水で洗浄した。細胞を２ｍｌエッペンドルフ管中の１００μＬの水に再懸濁して、０．１ｇガラスビーズ（０．５ｍｍ）の存在下、強力なボルテックス（５分間）によって破砕した。２ｍｌの１，２−ジクロロエタンを再懸濁細胞に添加して、混合物を５分間激しくボルテックスした。１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、溶媒相をガラス管に移した。抽出を２回実施した。プールされた有機相を窒素下で蒸発させた。最終段階として、ＨＰＬＣ分析のために乾燥抽出物を１００μＬのアセトニトリルに再懸濁した。
【００７９】
［実施例９］
［ＵＶおよび質量分析検出を用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるステロール分析］
通常３０μＬである、実施例８に記載されるようにして調製されたステロール抽出物のアリコートを、ＵＶおよび質量分析検出によってモニターされる逆相ＨＰＬＣによって分析した。「Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ＨＴ  ２７９０」ＨＰＬＣは、「Ｗａｔｅｒｓ  ＰＤＡ  ９９６」タイプからの光ダイオードアレーＵＶ検出器に、そして質量検出器「Ｗａｔｅｒｓ  ＭｉｃｒｏＭａｓｓ  ＺＱ」（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ０１７５７，ＵＳＡ）に接続されていた。分離は、ＸＴｅｒｒａ  ＲＰ１８  ３．５μｍ  ４．６×１００ｍｍカラム（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ０１７５７，ＵＳＡ）上で、水／アセトニトリル勾配を含有する直線的０．０３％（ｖ／ｖ）ギ酸を用いて、６０℃で実施した。８０％の緩衝液Ａ（０．０３％ギ酸添加水）と２０％の緩衝液Ｂ（０．０３％のギ酸添加アセトニトリル）とを含有する緩衝液で、カラムを安定化させた後に、サンプルを注入した。最初の５分間、緩衝液組成を８０％の緩衝液Ａおよび２０％の緩衝液Ｂから、２５％の緩衝液Ａおよび７５％の緩衝液Ｂに徐々に変化させた。次の１５分間、緩衝液組成を２５％の緩衝液Ａおよび７５％の緩衝液Ｂから、１２．５％の緩衝液Ａおよび８７．５％の緩衝液Ｂに徐々に変化させた。最後の数分で、分離プロトコル１００％の緩衝液Ｂに達した。この値を２分間保って、カラムを再生させた。
【００８０】
光ダイオードアレー検出器によって２０５〜３００ｎｍの間で、クロマトグラフィーをモニターした。質量検出器は、ｍ／ｚが３５０〜４５０の範囲の陽性エレクトロスプレーによって、１ｍ／ｚ単位の感度での検出が可能であった。
【００８１】
ステロールは、標準と比較した、それらのクロマトグラフィーの挙動、それらのＵＶ吸収スペクトル、およびそれらの質量断片化プロフィールに基づいて同定された（表５）。ＳｅｃｅｎおよびＫａｌｐａｒ（１９９９年）に従って、ピリジン存在下で、無水酢酸によって、２５−ヒドロキシ７−デヒドロコレステロール標準（ＤＳＭによって提供される）を２５−ヒドロキシ−７−デヒドロコレステロールアセテート（２５ＯＨ−７ＤＨＣ−Ａｃ）にアセチル化した。０．５ｍｇの乾燥２５−ヒドロキシ７−デヒドロコレステロールを１ｍｌの無水酢酸／ピリジン溶液（５０／５０ｖ／ｖ）に再懸濁して、５５℃で３時間加熱した。反応混合物を４ｍｌの水で希釈した。ＨＰＬＣ分析前に、実施例８に記載されるようにして、０．５ｍｌの希釈反応混合物を１，２−ジクロロエタンで抽出した。
【００８２】
上述の条件下で分析すると、非アセチル化２５−ヒドロキシ−７−デヒドロコレステロール標準（ＲＴ６．９分）と比較して、２５ＯＨ−７ＤＨＣ−Ａｃ標準は、アセチル化化合物のより高い疎水性のために、滞留時間（ＲＴ８．５分）にシフトを示した。２５ＯＨ−７ＤＨＣ−Ａｃ標準の質量断片化プロフィールは、非アセチル化２５−ヒドロキシ７−デヒドロコレステロール標準のプロフィールと同様であった。アセチル化形態に対応するｍ／ｚシグナルは、恐らく質量検出器内での検出中に起きる脱アセチル化のために、検出されなかった。
【００８３】
【表５】
0005889200.tif 000019
【００８４】
［実施例１０］
［ＥＲＧ６−欠損Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＥＲＴ株中におけるプラスミドＶ５１ＴＤＨ−Ｓ２４Ｒ１からのＳ２４Ｒ１遺伝子の発現］
プラスミドＶ５１ＴＤＨ−Ｓ２４Ｒ１（実施例３参照）および対照として空ベクターＶ５１ＴＤＨをリチウム−ＰＥＧ技術（Ｇｉｅｔｚら，１９９５年）によって、ＥＲＴ株に形質転換した。形質転換体をウラシルを含まない定義された最少培地上で選択した。各形質転換からの４つの独立した形質転換体をプラスミドの存在について分析した。確認された形質転換体の１つを無作為に選択し、それぞれＥＲＴ／Ｖ５１ＴＤＨおよびＥＲＴ／Ｖ５１ＴＤＨ−Ｓ２４Ｒ１と命名して、さらなる分析のために使用した。
【００８５】
株が定常期になるまで、２％（ｗ／ｖ）グルコースＫａｐｅｌｌｉ培地（表２）中で培養し、実施例８に記載されるようにして全ステロールを抽出し、実施例９に記載されるようにして、ＵＶおよび質量分析検出を用いたＨＰＬＣによって分析した。それぞれの標準（表５）を用いて、主要ステロールをそれらの滞留時間、質量、およびスペクトル諸特性によって同定した。
【００８６】
ＨＰＬＣ溶出プロフィール（２８２ｎｍでのＵＶ検出）を図６に示す。コレスタ−５，７，２２，２４−テトラエノール（ＲＴ９．２分、ｍ／ｚ＝３６３、最大ＵＶ２３３ｎｍ）が、ＥＲＴ／Ｖ５１ＴＤＨ  ｅｒｇ６対照株中に見つかった主要ステロールであり、２８２ｎｍにおけるＵＶシグナルの７０％に相当した。２８２ｎｍで特定された総ステロールの７％は、コレスタ５，７，２４−トリエノール（ＲＴ１０．３分、ｍ／ｚ＝３６５、最大ＵＶ２８２ｎｍ；図６−Ａ）と同定された。
【００８７】
Ｓ２４Ｒ１遺伝子を発現するＥＲＴ／Ｖ５１ＴＤＨ−Ｓ２４Ｒ１株（図６−Ｂ）のステロールプロフィールからは、対照ＥＲＴ株／Ｖ５１ＴＤＨ中で検出されなかった２つのステロール、すなわち本株の主要ステロールである（２８２ｎｍにおけるＵＶシグナルの６０％）コレスタ５，７，２２−トリエノール（ＲＴ１０．８分、ｍ／ｚ＝３６５、最大ＵＶ２８２ｎｍ）、および７−デヒドロコレステロール（ＲＴ１１．８、ｍ／ｚ＝３６７、最大ＵＶ２８２ｎｍ）とも称されるコレスタ５，７−ジエノールの存在が明らかになった。コレスタ５，７，２４−トリエノールおよびコレスタ５，７，２２，２４−テトラエノールのΔ２４−２５結合の還元によって生じたコレスタ５，７，−ジエノールおよびコレスタ５，７，２２−トリエノールの存在は、遺伝子Ｓ２４Ｒ１のステロールΔ２４−還元酵素活性を裏付けた（図１３参照）。
【００８８】
［実施例１１］
［Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＥＲＴ株中におけるプラスミドＶ５１ＴＤＨ−Ｓ２４Ｒ２からの遺伝子Ｓ２４Ｒ２の発現］
リチウム−ＰＥＧプロトコル（Ｇｉｅｔｚら，１９９５年）を使用して、Ｓ２４Ｒ２を構成的に発現するプラスミドＶ５１ＴＤＨ−Ｓ２４Ｒ２（実施例３）をＥＲＴ株に形質転換する。形質転換体をウラシルを含まない最少培地上で選択した。４つの独立した形質転換体が分析され、同一諸特性を示した。それらの１つをＥＲＴ／Ｖ５１ＴＤＨ−Ｓ２４Ｒ２と命名し、さらなる分析のために使用した。
【００８９】
株が定常期に達するまで、２％グルコースＫａｐｅｌｌｉ培地（表２）中で培養し、実施例８、９、および１０に記載されるようにして、ステロールを抽出し分析した。この例でも、対照ＥＲＴ／Ｖ５１ＴＤＨ株中では、主要ステロールとしてコレスタ５，７，２２，２４−テトラエノール（ＲＴ９．２分、ｍ／ｚ＝３６３、最大ＵＶ２３３ｎｍ）およびコレスタ５，７，２４−トリエノール（ＲＴ１０．３分、ｍ／ｚ＝３６５、最大ＵＶ２８２ｎｍ）が見つかったのに対し（図６−Ａ）、Ｓ２４Ｒ２を発現するＥＲＴ／Ｖ５１ＴＤＨ−Ｓ２４Ｒ２株中で検出された主要ステロールは、２８２ｎｍにおけるＵＶシグナルの７０％であった、コレスタ５，７，２２−トリエノール（ＲＴ１０．８分、ｍ／ｚ＝３６５、最大ＵＶ２８２ｎｍ）であった（図６−Ｃ）。コレスタ５，７−ジエノール（７−デヒドロコレステロール；ＲＴ１１．８、ｍ／ｚ＝３６７、最大ＵＶ２８２ｎｍ）は、より低濃度（ＵＶシグナルの１３％）で見つかった。これらの結果は、Ｓ２４Ｒ２遺伝子のステロールΔ２４−還元酵素活性を裏付けた。
【００９０】
［実施例１２］
［Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＥＲＴ株中における動原体プラスミドｐＦＬＡｄｅ−Ｓ２４Ｒ１からの遺伝子Ｓ２４Ｒ１の発現］
リチウム−ＰＥＧ手順（Ｇｉｅｔｚら，１９９５年）を使用して、Ｓ２４Ｒ１遺伝子の構成的発現のための動原体プラスミドｐＦＬＡｄｅ−Ｓ２４Ｒ１（実施例５）をＥＲＴ株に形質転換した。形質転換体をアデニンを含まない規定培地上で選択した。４つの独立した形質転換体をプラスミドｐＦＬＡｄｅ−Ｓ２４Ｒ１の発生と、それらのステロールパターンについて分析した。それらの１つを無作為に選択してＥＲＴ／ｐＦＬＡｄｅ−Ｓ２４Ｒ１と命名し、結果のさらなる例証のために使用した。
【００９１】
ＥＲＴ／ｐＦＬＡｄｅ−Ｓ２４Ｒ１を２％（ｗ／ｖ）グルコースＫａｐｅｌｌｉ培地（表２）中で、定常期に達するまで培養した。実施例８および９に記載されるようにして、ステロールを抽出し分析した。対照中に存在しない、ＥＲＴ／ｐＦＬＡｄｅ−Ｓ２４Ｒ１中の主要な新しいステロールは、２８２ｎｍにおけるＵＶシグナルの６０％であった、コレスタ５，７，２２−トリエノール（ＲＴ１０．８分、ｍ／ｚ＝３６５、最大ＵＶ２８２ｎｍ）であった（図６−Ｄ）。より少量（ＵＶシグナルの７％）の７−デヒドロコレステロール（ＲＴ１１．８、ｍ／ｚ＝３６７、最大ＵＶ２８２ｎｍ）もまた検出された。これらの新しいステロールの他に、ＥＲＴ対照株（図６−Ａ）中にもまた存在する、コレスタ５，７，２２，２４−テトラエノール（ＲＴ９．２分、ｍ／ｚ＝３６３、最大ＵＶ２３３ｎｍ）およびコレスタ５，７，２４（ＲＴ１０．３分、ｍ／ｚ＝３６５、最大ＵＶ２８２ｎｍ）もまたＥＲＴ／ｐＦＬＡｄｅ−Ｓ２４Ｒ１に見つかった。これらの結果は、動原体プラスミドｐＦＬＡｄｅ−Ｓ２４Ｒ１から発現されたＳ２４Ｒ１遺伝子のステロールΔ２４−還元酵素活性を裏付ける。
【００９２】
［実施例１３］
［Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＥＲＴ株中における遺伝子Ｓ２４Ｒ１およびＣ２５Ｈ１の同時発現による２５−ヒドロキシ−７−デヒドロコレステロールアセテートの生成］
リチウム−ＰＥＧ法（Ｇｉｅｔｚら，１９９５）によって、遺伝子Ｃ２５Ｈ１のガラクトース誘導性発現のためのプラスミドＶ５１−Ｃ２５Ｈ１（実施例６）、および対照としてのプラスミドＶ５１を（実施例１２に記載されるようにして）ＥＲＴ株／ｐＦＬＡｄｅ−Ｓ２４Ｒ１に形質転換した。Ｖ５１−Ｃ２５Ｈ１およびｐＦＬＡｄｅ−Ｓ２４Ｒ１は、適合性プラスミドである。それらの異なる２μおよびＡＲＳ−ＣＥＮ起源は、酵母中でそれらが同時発生できるようにする。形質転換体をウラシルおよびアデニンを含まない最少培地上で選択した。各形質転換からの４つの独立した形質転換体が分析され、同一諸特性を示した。各形質転換から１つの形質転換体を無作為に選択し、それぞれＥＲＴ／ｐＦＬＡｄｅ−Ｓ２４Ｒ１／Ｖ５１−Ｃ２５Ｈ１およびＥＲＴ／ｐＦＬＡｄｅ−Ｓ２４Ｒ１／Ｖ５１と命名し、さらなる分析のために使用した。
【００９３】
株を２％ガラクトースＫａｐｅｌｌｉ培地（表２）中で、定常期に達するまで培養した。ステロールを抽出し、実施例８および９に記載されるようにして、実施例１０に記載される条件下で、ＵＶおよび質量分析検出を用いたＨＰＬＣによって分析した。対照ＥＲＴ／ｐＦＬＡｄｅ−Ｓ２４Ｒ１／Ｖ５１株（図７−Ｃ）で見出されたように、ＥＲＴ／ｐＦＬＡｄｅ−Ｓ２４Ｒ１／Ｖ５１−Ｃ２５Ｈ１（図７−Ｄ）中の主要ステロールは、最終ステロールコレスタ５，７，２２，２４−テトラエノールのステロールΔ２４−還元酵素による還元によって生じた、コレスタ５，７，２２−トリエノール（ＲＴ１０．８分、ｍ／ｚ＝３６５、最大ＵＶ２８２ｎｍ）であった。標準として注入された調製２５−ヒドロキシ７−デヒドロコレステロールアセテート（２５ＯＨ−７ＤＨＣ−Ａｃ）と同時に溶出される（ＲＴ８．５分、図７−Ｂ）、対照株中に存在しない新しい化合物が、ＥＲＴ／ｐＦＬＡｄｅ−Ｓ２４Ｒ１／Ｖ５１−Ｃ２５Ｈ１株（図７−Ｄ）中に観察された。この化合物もまた、調製２５−ヒドロキシ７−デヒドロコレステロールアセテート（図８−Ｂ）と同一のＵＶ吸収プロフィール（図８−Ｃ）を示し、７−デヒドロコレステロール標準（図８−Ａ）でも観察された、Δ５−Δ７共役二重結合（ｄｏｕｂｌｅ  ｂｏｕｎｄｓ）に特異的な２８２ｎｍ前後の二重ピークがあった。新しい化合物は、（実施例９に記載されるようにして実施した）オンライン質量分析による判定で、２５−ヒドロキシ７−デヒドロコレステロールアセテート（図９−Ｂ）と同一の質量断片化プロフィール（図９−Ｃ）もまた示した。
【００９４】
３β−ヒドロキシステロールの場合、エレクトロスプレー（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐａｙ）分析は、分子量から１７を差し引いた所で主要シグナルを生じた（プロトン付加（＋１）および位置Ｃ３（−１８）での脱水。７−デヒドロコレステロール（図９−Ａ）の主要シグナルは、ｍ／ｚ質量３６７にある（３８４（７−デヒドロコレステロールＭＷ）＋１（プロトン付加）−１８（３β−ヒドロキシステロール脱水））。２５−ヒドロキシ７−デヒドロコレステロールアセテートで観察されたｍ／ｚ質量３８３におけるシグナルは、位置Ｃ２５（３６７＋１６＝３８３）における追加的ヒドロキシル化に対応する。ｍ／ｚ質量３６５における主要シグナルは、質量検出器内での検出中に、分子のごく一部に生じる位置Ｃ２５での脱水（３８３−１８＝３６５）に対応する。これらの異なる結果（標準として使用される２５−ヒドロキシ７−デヒドロコレステロールアセテートと同一滞留時間、同一ＵＶプロフィール、および同一質量断片化）は、ＥＲＴ／ｐＦＬＡｄｅ−Ｓ２４Ｒ１／Ｖ５１−Ｃ２５Ｈ１株中で生成された新しい化合物が、２５−ヒドロキシ７−デヒドロコレステロールアセテートであったことを実証した。
【００９５】
［実施例１４］
［Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＥＲＴ株中におけるＳ２４Ｒ１およびＣ２５Ｈ３の同時発現による２５−ヒドロキシ−７−デヒドロコレステロールアセテートの生成］
リチウム−ＰＥＧ法（Ｇｉｅｔｚら，１９９５年）によって、遺伝子Ｃ２５Ｈ３のガラクトース誘導性発現のために構築されたＶ５１−Ｃ２５Ｈ３（実施例７）をＥＲＴ／ｐＦＬＡｄｅ−Ｓ２４Ｒ１株（実施例１３参照）に形質転換した。形質転換体をウラシルおよびアデニンを含まない最少培地上で選択した。双方のプラスミドの発生確認のために、４つの独立した形質転換体を分析した。それらの１つを無作為に選択してＥＲＴ／ｐＦＬＡｄｅ−Ｓ２４Ｒ１／Ｖ５１−Ｃ２５Ｈ３と命名し、さらなる研究のために使用した。
【００９６】
ＥＲＴ／ｐＦＬＡｄｅ−Ｓ２４Ｒ１／Ｖ５１−Ｃ２５Ｈ３を２％ガラクトースＫａｐｅｌｌｉ培地（表２）中で、定常期まで培養した。収集細胞からステロールを抽出し、実施例８および９に記載されるようにして、実施例１０に記載される条件下で、ＵＶおよび質量分析検出を用いたＨＰＬＣによって分析した。対照ＥＲＴ／ｐＦＬＡｄｅ−Ｓ２４Ｒ１／Ｖ５１株（図７−Ｃ）で見つかったように、ＥＲＴ／ｐＦＬＡｄｅ−Ｓ２４Ｒ１／Ｖ５１−Ｃ２５Ｈ３（図７−Ｅ）中の主要ステロールは、実施例１３に記載されるように、最終ステロールコレスタ５，７，２２，２４−テトラエノールのステロールΔ２４−還元酵素による還元産物である、コレスタ５，７，２２−トリエノール（ＲＴ１０．８分、ｍ／ｚ＝３６５、最大ＵＶ２８２ｎｍ）であった。
【００９７】
２５−ヒドロキシ７−デヒドロコレステロールアセテート（ＲＴ８．５分、図７−Ｂ）と同時に溶出される、親株中に存在しない化合物が、ＥＲＴ／ｐＦＬＡｄｅ−Ｓ２４Ｒ１／Ｖ５１−Ｃ２５Ｈ３（図７−Ｅ）中に見つかった。ＥＲＴ／ｐＦＬＡｄｅ−Ｓ２４Ｒ１／Ｖ５１−Ｃ２５Ｈ１（実施例１３に記載）の場合のように、この化合物は、２５−ヒドロキシ７−デヒドロコレステロールアセテートと同一のＵＶ吸収プロフィール（図８）、および同一の質量断片化プロフィール（図９）を示した。これらの結果（滞留時間、ＵＶプロフィール、および質量断片化が２５−ヒドロキシ７−デヒドロコレステロールアセテートに匹敵する）は、ＥＲＴ／ｐＦＬＡｄｅ−Ｓ２４Ｒ１／Ｖ５１−Ｃ２５Ｈ３中に生成された新しい化合物が、実施例１３と同様、２５−ヒドロキシ７−デヒドロコレステロールアセテートであることを実証する。
【００９８】
［実施例１５］
［Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｗ３０３−１Ｂ株およびＢＹ４７４２株中におけるＣ２５Ｈ１発現による２５−ヒドロキシ−エルゴステロールアセテートの生成］
リチウム−ＰＥＧ法（Ｇｉｅｔｚら，１９９５年）によって、遺伝子Ｃ２５Ｈ１のガラクトース誘導性発現のために構築されたプラスミドＶ５１−Ｃ２５Ｈ１（実施例６）、および対照としての空ベクターＶ５１をＷ３０３−１Ｂ株（実施例８に記載）に形質転換した。形質転換体をウラシルを含まない最少培地上で選択した。各形質転換からの４つの独立した形質転換体をプラスミドの発生について分析した。各形質転換から１つの陽性形質転換体を無作為に選択して、それぞれＷ３０３／Ｖ５１−Ｃ２５Ｈ１およびＷ３０３／Ｖ５１と命名し、さらなる研究のために使用した。
【００９９】
株を２％ガラクトースＫａｐｅｌｌｉ培地（表２）中で、定常期に達するまで培養した。収集細胞からステロールを抽出し、実施例８および９に記載されるようにして、実施例１０に記載される条件下で、ＵＶおよび質量分析検出を用いたＨＰＬＣによって分析した。ＨＰＬＣ溶出プロフィール（２８２ｎｍでのＵＶ検出）を図１０に示す。エルゴステロールの滞留時間（図１０−Ａ）、ｔｈｅＵＶスペクトル（図１１−Ａ）、および質量断片化プロフィール（図１２−Ａ）（ＲＴ１１．９分、ｍ／ｚ＝３７９、最大ＵＶ２８２ｎｍ）との比較によって実証されるように、Ｗ３０３／Ｖ５１−Ｃ２５Ｈ１（図１０−Ｃ）およびＷ３０３／Ｖ５１（図１０−Ｂ）の双方の株について観察された主要シグナルは、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）野生型株の主要ステロール（ｍａｙｏｒ  ｓｔｅｒｏｌ）であるエルゴステロール（エルゴスタ５，７，２２−トリエノール）に対応する。
【０１００】
Ｗ３０３／Ｖ５１−Ｃ２５Ｈ１株（図１０−Ｃ）の１０分における微量シグナルは、Ｗ３０３／Ｖ５１対照株（図１０−Ｂ）では痕跡シグナルとしてのみ観察された。オンラインＰＤＡ検出によって測定されたこのピークのＵＶプロフィール（図１１−Ｂ）は、２８２ｎｍ前後の二重ピークによって特徴付けられるΔ５およびΔ７の共役二重結合に加えて、Δ２２およびΔ２４の共役二重結合に特異的である２３３ｎｍにおける最大吸収を示した。恐らくこのシグナルは、Ｅｒｇ４ｐによるΔ２４の還元がないエルゴステロール生合成経路の最後の中間体の１つである、エルゴスタ５，７，２２，２４−テトラエノールに対応する（図１３参照）。オンライン質量分析法（図１２−Ｂ）によって検出されたｍ／ｚ質量３７７は、エルゴスタ−テトラエノール構造に一致する。
【０１０１】
Ｗ３０３／Ｖ５１−Ｃ２５Ｈ１株（図１０−Ｃ）のステロール抽出物中で、ＨＰＬＣによって観察された８．７分における第３のシグナルは、Ｗ３０３／Ｖ５１（図１０−Ｂ）では完全に欠如していた。このピーク（図１１−Ｃ）について測定されたＵＶプロフィールは、Δ５およびΔ７共役二重結合（ｄｏｕｂｌｅ  ｂｏｕｎｄｓ）に特異的な最大２８２ｎｍの典型的な二重ピークを示した。質量断片化（図１２−Ｃ）は、ｍ／ｚ＝３７７における主要シグナル、およびｍ／ｚ＝３９５における微量のシグナルを示し、水酸化型エルゴステロール（３７９＋１６＝３９５）およびその脱水形態（３９５−１８＝３７７）に一致する。断片化プロフィール（図１２−Ｃ）は、全ての質量が、７−デヒドロコレステロール（ｍｚ＝３６７）およびエルゴステロール（ｍ／ｚ＝３７９）間の質量差に相当する１２質量単位増大していたこと以外は、２５−ヒドロキシ７−デヒドロコレステロールアセテート（図９−Ｂ）の１つと同一であった。この新しい化合物（ＲＴ８．７分）とエルゴステロール（ＲＴ１１．９分）の間の３．２分の滞留時間の差は、２５−ヒドロキシ７−デヒドロコレステロールアセテート（ＲＴ８．５分）と７−デヒドロコレステロール、（ＲＴ１１．８）の滞留時間の差と同一であった。
【０１０２】
これらの諸特性（ＵＶプロフィール、質量断片化、滞留時間）は全て、Ｗ３０３／Ｖ５１−Ｃ２５Ｈ１中のＣ２５Ｈ１発現によって生成されるこの新しい化合物が、２５−ヒドロキシ−エルゴステロールアセテートであるという結論に矛盾しない。
【０１０３】
Ｖ５１−Ｃ２５Ｈ１および対照としての空ベクターＶ５１のＳ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＢＹ４７４２への形質転換は、Ｗ３０３／Ｖ５１−Ｃ２５Ｈ１株およびＷ３０３／Ｖ５１株で得られたものに匹敵する結果（図１０）をもたらした。この場合もＶ５１−Ｃ２５Ｈ１形質転換体について、ＨＰＬＣ（ＵＶ検出）によって８．７分における追加的シグナルが観察された。化合物は、Ｗ３０３／Ｃ２５Ｈ１中で検出された化合物と同一ＵＶプロフィール（図１１）および質量断片化プロフィール（図１２）を示し、この化合物もまた２５−ヒドロキシ−エルゴステロールアセテートであることを強く示唆する。
【０１０４】
［実施例１６］
［Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｗ３０３−１Ｂ株中における遺伝子Ｃ２５Ｈ３の発現による２５−ヒドロキシ−エルゴステロールアセテートの生成］
リチウム−ＰＥＧ法（Ｇｉｅｔｚら，１９９５年）を使用して、合成遺伝子Ｃ２５Ｈ３のガラクトース誘導性発現のために構築されたプラスミドＶ５１−Ｃ２５Ｈ３（実施例７）をＷ３０３−１Ｂ株（実施例８に記載）に形質転換した。形質転換体をウラシルを含まない最少培地上で選択した。４つの独立した形質転換体をＶ５１−Ｃ２５Ｈ３の発生について分析した。１つの陽性形質転換体をＷ３０３／Ｖ５１−Ｃ２５Ｈ３と命名し、生成されるステロールのさらなる研究のために使用した。
【０１０５】
株が定常期になるまで、２％（ｗ／ｖ）ガラクトースＫａｐｅｌｌｉ培地（表２）中で培養した。収集細胞からステロールを抽出し、実施例８および９に記載されるようにして、実施例１０に記載される条件下で、ＵＶおよび質量分析検出を用いたＨＰＬＣによって分析した。
【０１０６】
図１０−Ｄに示すＨＰＬＣ（２８２ｎｍでのＵＶ検出）によるステロール抽出物分析は、Ｗ３０３／Ｖ５１−Ｃ２５Ｈ３のステロールパターンが、Ｗ３０３／Ｖ５１−Ｃ２５Ｈ１株（実施例１５）のステロールパターンと非常に良く似ていることを示し、エルゴステロール（ＲＴ１１．９分）およびエルゴスタ５，７，２２，２４−テトラエノール（ＲＴ１０．０分）に加えて、新しい化合物（ＲＴ８．７分）が生成されていた。オンラインＵＶ  ＰＤＡ検出（図１１）および質量分析法（図１２）は、例えばΔ５−Δ７の特異的共役二重結合ＵＶプロフィール、ｍ／ｚ＝３７７における主要シグナルおよびｍ／ｚ＝３９５における微量シグナルがある質量断片化、および２５−ヒドロキシル化ステロールと一致するＨＰＬＣ滞留時間遅延など、この新しい化合物が、Ｗ３０３／Ｖ５１−Ｃ２５Ｈ１によって生成される化合物と同一諸特性を有することを示した。これらの特徴（ＵＶプロフィール、質量断片化、滞留時間）は全て、この新しい化合物がＣ２５Ｈ３の発現に起因する２５−ヒドロキシ−エルゴステロールアセテートであることを強力に示唆する。
【０１０７】
［実施例１７］
［主にコレスタ−５，７，２４−トリエノールを産生する酵母株へのＣ２５Ｈ１およびＣ２５Ｈ３の導入］
リチウム−ＰＥＧ法（Ｇｉｅｔｚら，１９９５年）を用いて、遺伝子Ｃ２５Ｈ１およびＣ２５Ｈ３のガラクトース誘導性発現のためのプラスミドＶ５１−Ｃ２５Ｈ１（実施例６）およびプラスミドＶ５１−ＣＨ２５Ｈ３（実施例７）、および対照としてのプラスミドＶ５１をＥＲＴ  ｅｒｇ５  ｅｒｇ６株（実施例１２に記載；ＥＲＧ５は遺伝子ＵＲＡ３の組み込みによって不活性化されていた）に形質転換した。形質転換体をウラシルおよびアデニンを含まない最少培地上で選択した。各形質転換からの４つの独立した形質転換体が分析され、同一諸特性を示した。各形質転換からの１形質転換体を無作為に選択して、それぞれＥＲＴ  ｅｒｇ５  ｅｒｇ６／Ｖ５１−Ｃ２５Ｈ１、ＥＲＴ  ｅｒｇ５  ｅｒｇ６／Ｖ５１−Ｃ２５Ｈ３、およびＥＲＴ  ｅｒｇ５  ｅｒｇ６／Ｖ５１と命名し、さらなる分析のために使用した。
【０１０８】
株を２％ガラクトースＫａｐｅｌｌｉ培地（表２）中で、定常期に達するまで培養した。ステロールを抽出し、実施例８および９に記載されるようにして、実施例１０に記載される条件下で、ＵＶおよび質量分析検出を用いたＨＰＬＣによって分析した。３株間でステロールパターンの違いは検出されず、２種のヒドロキシラーゼがコレスタ−５，７，２４−トリエノールに対して活性でないことを裏付けた。
【０１０９】
［実施例１８］
［追加的コレステロール２５−ヒドロキシラーゼ遺伝子の選択］
イノシシ（Ｓ．ｓｃｒｏｆａ）およびイヌ（Ｃ．ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）（Ｃａｎｉｓ  ｌｕｐｕｓ）、からの選択された推定上のコレステロール２５−ヒドロキシラーゼ遺伝子に加えて、ドブネズミ（Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）（配列番号２１、Ｇｅｎｅｂａｎｋ登録番号ＮＰ＿００１０２０５８６、ＸＰ＿２２００６３）、チンパンジー（Ｐ．ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）（配列番号１８、遺伝子ｂａｎｋ登録番号ＸＰ＿５０７９０１）、およびウマ（Ｅ．ｃａｂａｌｌｕｓ）（配列番号２４、Ｇｅｎｅｂａｎｋ登録番号ＸＰ＿００１５０３０５７）からの相同遺伝子もまたより詳細に調べた。
【０１１０】
選択された各２５−ヒドロキシラーゼのＳ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中における発現のための２つの異なるコドン最適化遺伝子を計算した（配列番号１９、２０、２２、２３、２５、２６）。最後に接尾語「＿ｏｐｔ」が付いている遺伝子は全て、ＤＮＡ  ２．０社（ＭｅｎｌｏＰａｒｋ，ＣＡ，ＵＳＡ）によって、独自仕様のアルゴリズムを使用してコドン最適化された。接尾語「＿ＨＹ」がある全遺伝子は、常に、配列中に生じるアミノ酸の各位置に、各アミノ酸の最も一般的なコドンを配置させて作成した。酵母のための典型的なコドン使用頻度表は公的に入手可能であり、またプログラムパッケージＬａｓｅｒｇｅｎｅの一部でもある。
【０１１１】
イノシシ（Ｓ．ｓｃｒｏｆａ）からの２５−ヒドロキシラーゼの２つの新しい最適化された遺伝子（実施例２参照）もまた、上で述べたのと同一方法を使用して計算した（配列番号２７、２８）。
【０１１２】
インプットとして既知のアルゴリズムＣｌｕｓｔａｌＷを用いて計算されるアミノ酸配列アラインメントを使用して、各位置に最も豊富なアミノ酸を単に選択することで、共通アミノ酸配列を判定した。「最も豊富なアミノ酸」は、判定できない場合は、それぞれの位置のアミノ酸を恣意的に選択した。このＣｏｎＨｙＤアミノ酸配列（配列番号２９）もまた、上述のようにして、２つの異なるＤＮＡ配列（配列番号３０、３１）に逆翻訳した。
配列番号１８：チンパンジー（Ｐ．ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）からの推定上のコレステロール２５−ヒドロキシラーゼのアミノ酸配列。
【化１４】
0005889200.tif 000020
配列番号１９：ＤＮＡ配列チンパンジー（Ｐ．ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）ＣＨ２５ＯＨ＿ｏｐｔ  ２．０
【化１５】
0005889200.tif 000021
配列番号２０：チンパンジー（Ｐ．ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）ＣＨ２５ＯＨ＿ＨＹのＤＮＡ配列
【化１６】
0005889200.tif 000022
配列番号２１：ドブネズミ（Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）からの推定上のコレステロール２５−ヒドロキシラーゼのアミノ酸配列
【化１７】
0005889200.tif 000023
配列番号２２：ドブネズミ（Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）ＣＨ２５ＯＨ＿ｏｐｔ  ２．０のＤＮＡ配列
【化１８】
0005889200.tif 000024
配列番号２３：ドブネズミ（Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）ＣＨ２５ＯＨ＿ＨＹのＤＮＡ配列
【化１９】
0005889200.tif 000025
配列番号２４：ウマ（Ｅ．ｃａｂａｌｌｕｓ）からの推定上のコレステロール２５−ヒドロキシラーゼのアミノ酸配列
【化２０】
0005889200.tif 000026
配列番号２５：ウマ（Ｅ．ｃａｂａｌｌｕｓ）ＣＨ２５ＯＨ＿ｏｐｔ  ２．０のＤＮＡ配列
【化２１】
0005889200.tif 000027
配列番号２６：ウマ（Ｅ．ｃａｂａｌｌｕｓ）ＣＨ２５ＯＨ＿ＨＹのＤＮＡ配列
【化２２】
0005889200.tif 000028
配列番号２７：イノシシ（Ｓ．ｓｃｒｏｆａ）ＣＨ２５ＯＨ＿ｏｐｔ  ２．０のＤＮＡ配列
【化２３】
0005889200.tif 000029
配列番号２８：イノシシ（Ｓ．ｓｃｒｏｆａ）ＣＨ２５ＯＨ＿ＨＹのＤＮＡ配列
【化２４】
0005889200.tif 000030
配列番号２９：ＣｏｎＨｙＤのアミノ酸配列
【化２５】
0005889200.tif 000031
配列番号３０：ＣｏｎＨｙＤ＿ｏｐｔ  ２．０のＤＮＡ配列
【化２６】
0005889200.tif 000032
配列番号３１：ＣｏｎＨｙＤ＿ＨＹのＤＮＡ配列
【化２７】
0005889200.tif 000033
【０１１３】
［実施例１９］
［ＥＲＧ６に組み込まれた発現コンストラクトからの新しい２５−ヒドロキシラーゼ遺伝子の発現］
実施例１８に示す新しい遺伝子をＳ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＳＣ０５５４（ｅｒｇ５、ｅｒｇ６、ＴＲＰ１−ｐＡＲＣ３００Ｄ、ＵＲＡ３−ｐＡＲＣ３０４Ｓ、ＡＲＥ１：：ＴＤＨ３ｐ−Ｓ２４Ｒ２−ＰＧＫｔ−ＵＲＡ３；２つのプラスミドに関する説明は米国特許第５，４６０，９４９号明細書を参照されたい）のＥＲＧ６遺伝子座に組み込んだ。
【０１１４】
組み込みコンストラクトの配列を下に示す。関心のあるヒドロキシラーゼを組み込みコンストラクトのＢａｍ  ＨＩおよびＥｃｏ  ＲＩ部位の間にクローンした。ＥＲＧ６組み込みコンストラクトは、プラスミドＶ５１ＴＤＨに見出されるような、発現のためのＳ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＴＤＨ３プロモーターおよびＰＧＫターミネーター、および選択のためのＳ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＵＲＡ３を保有した。培養、形質転換、および選択は上述のように実施した。
【０１１５】
最終株は、次のように称された。
Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｅｃａｂ  ＨＹ（配列番号２６の遺伝子を有する組み込みコンストラクト）、
Ｅｃａｂ  ｏｐｔ  ２．０（配列番号２５の遺伝子を有する組み込みコンストラクト）、
Ｐｔｒｏ  ｏｐｔ  ２．０（配列番号１９の遺伝子を有する組み込みコンストラクト）、
Ｐｔｒｏ  ＨＹ（配列番号２０の遺伝子を有する組み込みコンストラクト）、
ＣｏｎＨｙＤ  ＨＹ（配列番号３１の遺伝子を有する組み込みコンストラクト）、
ＣｏｎＨｙＤ  ｏｐｔ  ２．０（配列番号３０の遺伝子を有する組み込みコンストラクト）、
Ｒｎｏｒ  ＨＹ（配列番号２３の遺伝子を有する組み込みコンストラクト）、
Ｒｎｏｒ  ｏｐｔ  ２．０（配列番号２２の遺伝子を有する組み込みコンストラクト）、
Ｓｓｃｒ  ＨＹ（配列番号２８の遺伝子を有する組み込みコンストラクト）、
Ｓｓｃｒ  ｏｐｔ  ２．０（配列番号２７の遺伝子を有する組み込みコンストラクト）、および
実施例２に記載されるようにして最適化されたブタからの２５−ヒドロキシラーゼを保有するＳｃｒ  Ｐｏｍｐｏｎ。
【０１１６】
配列番号３２：ＥＲＧ６組み込みコンストラクトのＤＮＡ配列
【化２８】
0005889200.tif 000034
【０１１７】
［実施例２０］
［新しいＨｙＤＨＣ株の振盪フラスコアッセイ］
実施例１９に記載されるようにして作成された株を震盪フラスコ内で培養し、新たに設計された推定上の２５−ヒドロキシラーゼ遺伝子の過剰発現効果を評価した。２０ｍｌのＫａｐｅｌｌｉ培地（実施例１）に接種するために、４ｍｌのＹＰＤ培地中の一晩培養物を使用した。２４および４８時間培養した後に１０ｇ／Ｌのグルコース、３２および５６時間後に２０ｇ／Ｌのグルコースを供給した。７２時間の培養時間後、細胞を遠沈して鹸化し、実施例９に記載されるようにしてステロール含量を測定した。図１５に示すように、全ての新しいヒドロキシラーゼ遺伝子は、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中で発現され、効率は様々であったが、遺伝子産物は全て７−ＤＨＣをＨｙＤＨＣにヒドロキシル化できた。
【０１１８】
文献、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる：
Ｂｒａｃｈｍａｎｎ  Ｃ．Ｂ．，  Ｄａｖｉｅｓ  Ａ．，  Ｃｏｓｔ  Ｇ．Ｊ．，  Ｃａｐｕｔｏ  Ｅ．，  Ｌｉ  Ｊ．，  Ｈｉｅｔｅｒ  Ｐ．，  Ｂｏｅｋｅ  Ｊ．Ｄ．  （１９９８年）．  Ｙｅａｓｔ  １４（２）：  １１５−１３２．
Ｃｒａｍｅｒｉ  Ａ．，  Ｂｉｏｎｄｉ  Ｅ．，  Ｋｕｅｈｎｌｅ  Ｋ．，  Ｌuｔｊｏｈａｎｎ  Ｄ．，  Ｔｈｅｌｅｎ  Ｋ．Ｍ．，  Ｐｅｒｇａ  Ｓ．，  Ｄｏｔｔｉ  Ｃ．Ｇ．，  Ｎｉｔｓｃｈ  Ｒ．Ｍ．，  Ｌｅｄｅｓｍａ  Ｍ．Ｄ．，  Ｍｏｈａｊｅｒｉ  Ｍ．Ｈ．  （２００６年）．  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ２５（２）：４３２−４３．
Ｃｕｌｌｉｎ  Ｃ．，  Ｐｏｍｐｏｎ  Ｄ．  （１９８８年）．  Ｇｅｎｅ  ６５：２０３−２１７．
Ｂｏｎｎｅａｕｄ  Ｎ．，  Ｏｚｉｅｒ−Ｋａｌｏｇｅｒｏｐｏｕｌｏｓ  Ｏ．，  Ｌｉ  Ｇ．Ｙ．，  Ｌａｂｏｕｅｓｓｅ  Ｍ．，  Ｍｉｎｖｉｅｌｌｅ−Ｓｅｂａｓｔｉａ  Ｌ．，  Ｌａｃｒｏｕｔｅ  Ｆ．  （１９９１年）．  Ｙｅａｓｔ  ７：６０９−６１５．
Ｇａｂｅｒ  Ｒ．Ｆ．，  Ｃｏｐｐｌｅ  Ｄ．Ｍ．，  Ｋｅｎｎｅｄｙ  Ｂ．Ｋ．，  Ｖｉｄａｌ  Ｍ，  Ｂａｒｄ  Ｍ．  （１９８９年）．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ９（８）：３４４７−３４５６．
Ｇｕａｒｅｎｔｅ  Ｌ．，  Ｙｏｃｕｍ  Ｒ．Ｒ．，  Ｇｉｆｆｏｒｄ  Ｐ．  （１９８２年）．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７９：７４１０−７４１４．
Ｈｏｆｆｍａｎ  Ｃ．Ｓ．  ａｎｄ  Ｗｉｎｓｔｏｎ  Ｆ．  （１９８７年）．  Ｇｅｎｅ  ５７：２６７−２７２
Ｇｉｅｔｚ  Ｒ．Ｄ．，  Ｓｃｈｉｅｓｔｌ  Ｒ．Ｈ．，  Ｗｉｌｌｅｍｓ  Ａ．Ｒ．，  Ｗｏｏｄｓ  Ｒ．Ａ．  （１９９５年）．  Ｙｅａｓｔ  １１：３５５−３６０．  
Ｌｅｃａｉｎ  Ｅ．，  Ｃｈｅｎｉｖｅｓｓｅ  Ｘ．，  Ｓｐａｇｎｏｌｉ  Ｒ．，  Ｐｏｍｐｏｎ  Ｄ．  （１９９６年）．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１（１８）：１０８６６−１０８７３．
Ｌｕｎｄ  Ｅ．Ｇ．，  Ｋｅｒｒ  Ｔ．Ａ．，  Ｓａｋａｉ  Ｊ．，  Ｌｉ  Ｗ．Ｐ．，  Ｒｕｓｓｅｌｌ  Ｄ．Ｗ．  （１９９８年）．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３（５１）：３４３１６−３４３２７．
Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．，    Ｆｒｉｔｓｃｈ  Ｅ．  Ｆ．，  Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．  （１９９８年）．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．  ２ｎｄ  ｅｄ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ：  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．
Ｓｅｃｅｎ  Ｈ．，  Ｋａｌｐａｒ  Ｈ．  （１９９９年）．  Ｔｕｒｋ  Ｊ  Ｃｈｅｍ  ２３：  ２７−３０．
Ｔｈｏｍａｓ  Ｂ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ  Ｒ．  （１９８９年）．  Ｃｅｌｌ  ５６（４）：６１９−６３０．
Ｗａｔｅｒｈａｍ  Ｈ．Ｒ．，  Ｋｏｓｔｅｒ  Ｊ．，  Ｒｏｍｅｉｊｎ  Ｇ．Ｊ．，  Ｈｅｎｎｅｋａｍ  Ｒ．Ｃ．Ｍ．，  Ｖｒｅｋｅｎ  Ｐ．，  Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ         Ｈ．Ｃ．，  ＦｉｔｚＰａｔｒｉｃｋ  Ｄ．Ｒ．，  Ｋｅｌｌｅｙ  Ｒ．Ｉ．，  Ｗａｎｄｅｒｓ  Ｒ．Ｊ．Ａ．  （２００１年）．  Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ６９：６８５−６９４．
Ｗｕ  Ｃ．，  Ｍｉｌｏｓｌａｖｓｋａｙａ  Ｉ．，  Ｄｅｍｏｎｔｉｓ  Ｓ．，  Ｍａｅｓｔｒｏ  Ｒ．，  Ｇａｌａｋｔｉｏｎｏｖ  Ｋ．  （２００４年）．  Ｎａｔｕｒｅ  ４３２  （７０１７）：６４０−５．
Ｚｈａｎｇ  Ｓ．Ｐ．，  Ｚｕｂａｙ  Ｇ．，  Ｇｏｌｄｍａｎ  Ｅ．  （１９９１年）．  Ｇｅｎｅ  １００５：６１−７２．
【図１】
0005889200.tif 000035
【図２】
0005889200.tif 000036
【図３】
0005889200.tif 000037
【図４】
0005889200.tif 000038
【図５】
0005889200.tif 000039
【図６】
0005889200.tif 000040
【図７】
0005889200.tif 000041
【図８】
0005889200.tif 000042
【図９】
0005889200.tif 000043
【図１０】
0005889200.tif 000044
【図１１】
0005889200.tif 000045
【図１２】
0005889200.tif 000046
【図１３】
0005889200.tif 000047
【図１４】
0005889200.tif 000048
【図１５】
0005889200.tif 000049
【配列表】
0005889200000001.app