(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＤＡＲｓ（アデノシンデアミナーゼ、ＲＮＡ特異的）活性を決定するためのin vitro法であって、
ａ）編集酵素ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂ、およびＡＤＡＲ２、ならびにホスホジエステラーゼサブタイプ８Ａ（ＰＤＥ８Ａ）を発現する哺乳類細胞を含有する生体サンプルから得られた細胞抽出物において、前記細胞抽出物から得られた細胞ＲＮＡ抽出物において測定されたＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体の編集プロフィールを決定する工程；
ｂ）工程ａ）で得られた特性を前記哺乳類細胞と、ＡＤＡＲｓ活性が既知である対照細胞で得られたＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体編集プロフィールとで比較する工程
を含んでなる、方法。
【請求項２】
患者がＡＤＡＲｓにより触媒されるｍＲＮＡ前駆体編集機構の変更に関連する病状を呈するかどうか、または前記病状を発症するリスクがあるかどうかの診断を促進または同定するためのin vitro法であって、
ａ）編集酵素ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂ、およびＡＤＡＲ２、ならびにホスホジエステラーゼサブタイプ８Ａ（ＰＤＥ８Ａ）を発現する哺乳類細胞を含有する生体サンプルから得られた前記細胞を含有する生体サンプルから得られた細胞ＲＮＡ抽出物において測定されたＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体の編集プロフィールを決定する工程；
ｂ）前記患者がこのような病状を呈するかどうか、またはこのような病状を発症するリスクがあるかどうかを、工程ａ）において得られたＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体の編集プロフィールと、正常な患者および／またはこのｍＲＮＡ編集機構の変更に関連する病状を示す患者に関して得られたＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体の対照編集プロフィールとを比較することによって同定する工程
を含んでなる、方法。
【請求項３】
ＡＤＡＲｓにより触媒されるｍＲＮＡ前駆体（またはｍＲＮＡ）編集機構の変更に関連する病状を有するか、または前記病状を呈するリスクがある患者において治療的処置の有効性をモニタリングするためのin vitro法であって、
ａ）編集酵素ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂ、およびＡＤＡＲ２、ならびにホスホジエステラーゼサブタイプ８Ａ（ＰＤＥ８Ａ）を発現する哺乳類細胞を含有する生体サンプルから得られた前記生体サンプルからの細胞抽出物において、前記細胞抽出物から得られた細胞ＲＮＡ抽出物において測定されたＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体の編集プロフィールを決定する工程；
ｂ）工程ａ）で得られた結果を、処置前と処置中の前記期間の後に前記患者から得られた前記生体サンプル細胞抽出物間で比較する工程
を含んでなる、方法。
【請求項４】
前記処置中の前記期間の後に測定された前記ＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体編集プロフィールの改変が有意でなければ、前記治療的処置の有効性がないことを示す、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記期間後に測定されたＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体編集プロフィールが、ＡＤＡＲｓにより触媒されるｍＲＮＡ前駆体編集機構の変更に関連する病状を呈しないか、または前記病状を呈するリスクのない被験体からの生体サンプル対照に関して得られたものと有意に同じ特性を有することが、前記処置の有効性を示す、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
患者における投与後の試験化合物の潜在毒性または副作用を決定するためのin vitro法であって、前記化合物がＡＤＡＲｓにより触媒されるｍＲＮＡ前駆体（またはｍＲＮＡ）編集機構の変更に関連する病状を予防または治療するその能力に関して試験され、
ａ）編集酵素ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂ、およびＡＤＡＲ２、ならびにホスホジエステラーゼサブタイプ８Ａ（ＰＤＥ８Ａ）を発現する哺乳類細胞を含有する生体サンプルから得られた哺乳類細胞を被験化合物と接触させる工程；
ｂ）細胞抽出物において、前記細胞抽出物から得られた細胞ＲＮＡ抽出物において測定されたＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体の編集プロフィールを決定する工程；
ｃ）工程ｂ）で得られた結果を、工程ａ）で得られた前記被験化合物で処置された細胞と非処置対照細胞とで比較する工程
を含んでなる、方法。
【請求項７】
ＡＤＡＲｓにより触媒されるｍＲＮＡ前駆体（またはｍＲＮＡ）編集機構（ＡＤＡＲ依存性のＡからＩへのｍＲＮＡ前駆体編集機構）の変更に関連する病状の処置に有用な治療化合物を選択するためのin vitro法であって、
ａ）編集酵素ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂ、およびＡＤＡＲ２、ならびにホスホジエステラーゼサブタイプ８Ａ（ＰＤＥ８Ａ）を発現する哺乳類細胞を含有する生体サンプルから得られた前記哺乳類細胞と被験化合物を接触させる工程；
ｂ）細胞抽出物において、前記細胞抽出物から得られた細胞ＲＮＡ抽出物において測定されたＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体の編集プロフィールを決定する工程；
ｃ）工程ｂ）で得られた結果を、前記被験化合物で処置された細胞と非処置対照細胞とで比較する工程
を含んでなる、方法。
【請求項８】
前記編集プロフィールが、前記ＰＤＥ８ＡｍＲＮＡ前駆体の同定された各アイソフォームの平均比率を表す、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜５の工程ｂ）および請求項６〜７の工程ｃ）が、前記細胞の細胞抽出物における前記編集酵素ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２の量的発現を決定することをさらに含んでなり；かつ
請求項１〜５の工程ｃ）および請求項６〜７の工程ｄ）が、工程ｃ）で得られた結果を、ＡＤＡＲ発現に関して処置細胞と非処置対照細胞とで比較することをさらに含んでなる、
請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜５の工程ｂ）および請求項６〜７の工程ｃ）において、細胞ＲＮＡ抽出物において測定されたＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体の編集プロフィールと前記編集酵素ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２の量的発現が同じ細胞抽出物において決定される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記編集酵素ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２の量的発現が、前記編集酵素のｍＲＮＡ発現の測定によるか、または細胞抽出物において発現された前記編集酵素タンパク質の測定によって決定される、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記編集酵素ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２の量的発現が前記編集酵素のｍＲＮＡ発現の測定によって決定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
工程ａ）において、ＡＤＡＲＳアイソタイプＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２ならびにＰＤＥ８Ａを発現し得る前記哺乳類細胞が進化した霊長類に由来する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記哺乳類細胞がヒト細胞またはヒト由来細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
工程ａ）において、ＡＤＡＲＳアイソタイプＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２ならびにＰＤＥ８Ａを発現し得る前記哺乳類細胞が、白血球を含有する血液サンプル、大脳皮質からなる生体サンプルの群から選択される、被験体または患者の生体サンプルに由来する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
工程ａ）において、ＡＤＡＲＳアイソタイプＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２ならびにＰＤＥ８Ａを発現し得る前記哺乳類細胞が、細胞系統に由来する細胞を含有する生体サンプルに由来する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
工程ａ）において、ＡＤＡＲＳアイソタイプＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２ならびにＰＤＥ８Ａを発現し得る前記哺乳類細胞が、進化した霊長類の腫瘍細胞系統である細胞系統に由来する細胞を含有する生体サンプルに由来する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記進化した霊長類の腫瘍細胞系統が、神経芽腫細胞系統、膠芽腫細胞系統および星状細胞腫細胞系統から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
工程ａ）において、前記哺乳類細胞が、ヒト神経芽腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞系に由来する細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
工程ａ）において、ＡＤＡＲＳアイソタイプＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２ならびにＰＤＥ８Ａを発現し得る前記哺乳類細胞が、組換え細胞系統に由来する細胞を含有する生体サンプルに由来する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＡＤＡＲｓにより触媒されるｍＲＮＡ前駆体編集機構の変更に関連する病状が、
ＡＤＡＲｓにより触媒される５−ＨＴ２ｃ受容体（５−ＨＴ２ＣＲ）ｍＲＮＡ編集機構；
ＡＤＡＲｓにより触媒されるＧｌｕＲ−Ｂ受容体ｍＲＮＡ編集機構；
ＡＤＡＲｓにより触媒されるＫ（Ｖ）１−１カリウムチャネルｍＲＮＡ編集機構；
ＡＤＡＲｓにより触媒されるＦｌｎＡまたはＢｌｃａｐ  ｍＲＮＡ編集機構；
ＡＤＡＲｓにより触媒される感染後ウイルスＲＮＡ  ｍＲＮＡ編集機構
の変更に関連する病状から選択される病状である、請求項２〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＡＤＡＲｓにより触媒されるｍＲＮＡ前駆体（またはｍＲＮＡ）編集機構の変更に関連する病状が、ＰＤＥ８ＡイントロンのＡからＩへのｍＲＮＡ前駆体編集の変更に関連する精神症候群、神経症候群、免疫症候群および変性症候群からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記病状がＡＤＡＲｓにより触媒される５−ＨＴ２Ｃ受容体ｍＲＮＡ編集機構に関連する場合、精神障害、統合失調症、鬱病、双極性疾患、自殺または異常摂食行動（食欲不振症、肥満）、軽度認知障害（ＭＣＩ）、癲癇、アルツハイマーまたは慢性疼痛症候群からなる群から選択される、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記病状がＡＤＡＲｓにより触媒されるＧｌｕＲ−Ｂ受容体ｍＲＮＡ編集機構に関連する場合、ＭＣＩ、癲癇、アルツハイマーおよび筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）からなる群から選択される、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記哺乳類細胞が５−ＨＴ２Ｃ受容体をさらに発現し、
請求項１〜５の工程ｂ）および請求項６〜７の工程ｃ）が、５−ＨＴ２Ｃ受容体ｍＲＮＡの編集プロフィールを決定することをさらに含んでなり；かつ
請求項１〜５の工程ｃ）および請求項６〜７の工程ｄ）が、５−ＨＴ２Ｃ受容体ｍＲＮＡの編集プロフィールに関して得られた結果を比較することをさらに含んでなる、
請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞抽出物から得られた細胞ＲＮＡ抽出物において測定されたＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体の編集プロフィールが、アイソフォームＩ、Ｊ、Ｋ、Ｌ、ＭもしくはＮ、または編集された編集部位Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ、ＭもしくはＮを少なくとも含んでなるＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体アイソフォームのうち少なくとも１つの決定および／または定量を少なくとも含んでなる、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞抽出物から得られた細胞ＲＮＡ抽出物において測定されたＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体の編集プロフィールが、ＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体アイソフォームＡＢ、ＡＢＣ、ＡＢＥ、ＡＢＥＦ、ＡＢＥＦＧ、ＡＢＧ、Ｂ、ＢＣ、ＢＤ、ＢＥ、ＢＥＧ、ＢＦ、ＢＦＧ、ＢＧ、Ｍまたは非編集アイソフォーム（ｎｅｄ）の決定および／または定量を少なくとも含んでなる、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記の測定されたＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体の編集プロフィールが、アイソフォームＮ、または編集された編集部位Ｎを少なくとも含んでなるＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体アイソフォームのうち少なくとも１つの決定および／または定量を少なくとも含んでなる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記の測定されたＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体の編集プロフィールが、非編集アイソフォーム（ｎｅｄ）の決定および／または定量を少なくとも含んでなる、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記の測定されたＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体の編集プロフィールが、アイソフォームｎｅｄおよびＢ、好ましくは、少なくとも非編集ＢおよびＡＢアイソフォーム、より好ましくは、少なくとも非編集Ｂ、ＡＢおよびＢＣアイソフォームの決定および／または定量を少なくとも含んでなる、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項３１】
進化した霊長類細胞の細胞ＲＮＡ抽出物において評価される５個のＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体の編集プロフィールが、ＲＴとその後の、２回のＰＣＲを含んでなるネステッドＰＣＲにより測定され、
ａ）１回目のＰＣＲが下記のプライマーセット：
フォワード：
ＰＤＥ８Ａ−１ＦＷＤ（配列番号１３）
【化１】
0005879665.tif 000043
リバース：
ＰＤＥ８Ａ−１ＲＥＶ（配列番号１２）
【化２】
0005879665.tif 000044
により行われ、
ｂ）２回目のＰＣＲが下記のプライマーセット：
フォワード：
ＰＤＥ８Ａ−２ＦｏｗＦＡＭ（配列番号１０）
【化３】
0005879665.tif 000045
リバース：
ＰＤＥ８Ａ−２ＲｅｖＶＩＣ（配列番号１１）
【化４】
0005879665.tif 000046
により行われる、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
ＡＤＡＲｓ特異的アイソフォームが前記方法で決定される場合に、進化した霊長類ＡＤＡＲ  ｍＲＮＡ  ＰＣＲ増幅に特異的なプライマー対が、
ＡＤＡＲ１−１５０アイソフォームｍＲＮＡ増幅用の
フォワード：
【化５】
0005879665.tif 000047
（配列番号１４）
リバース：
【化６】
0005879665.tif 000048
（配列番号１５）
ＡＤＡＲ１−１１０アイソフォームｍＲＮＡ増幅用の
フォワード：
【化７】
0005879665.tif 000049
（配列番号１６）
リバース：
【化８】
0005879665.tif 000050
（配列番号１７）
ＡＤＡＲ２  ｍＲＮＡ増幅用の
フォワード：
【化９】
0005879665.tif 000051
（配列番号１８）
リバース：
【化１０】
0005879665.tif 000052
（配列番号１９）
からなる群から選択される、請求項８〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
各アイソフォームの分離および同定を含むＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体前駆体の編集プロフィールの定量が、キャピラリー電気泳動一本鎖構造多形（ＣＥ−ＳＳＣＰ）により行われる、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３４】
ａ）下記のプライマーセット：
（配列番号１３）
【化１１】
0005879665.tif 000053
（配列番号１２）
【化１２】
0005879665.tif 000054
および
ｂ）下記のプライマーセット：
（配列番号１０）
【化１３】
0005879665.tif 000055
（配列番号１１）
【化１４】
0005879665.tif 000056
を含んでなる、ＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体の編集プロフィールを決定するためのキット。
【請求項３５】
ａ）編集酵素ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２ならびにＰＤＥＡ８、場合により、セロトニン２Ｃ受容体（５ＨＴＲ２Ｃ）を発現する、進化した霊長類細胞系統由来の哺乳類細胞；および
ｂ）前記哺乳類細胞のＲＮＡ抽出物に存在し得るＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体の編集プロフィールを、２回のＰＣＲを含んでなるネステッドＰＣＲにより決定するための２つのプライマーセット
を含んでなるＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体の編集プロフィールを決定するためのキット。
【請求項３６】
前記哺乳類細胞が進化した霊長類の腫瘍細胞系統に由来する、請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】
前記進化した腫瘍細胞系統が、膠芽腫、星状細胞腫または神経芽腫細胞系統である、請求項３６に記載のキット。
【請求項３８】
前記哺乳類細胞が、ヒト神経芽腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞系統に由来する、請求項３７に記載のキット。
【請求項３９】
ｂ）の２つのプライマーセットが、
ａ）下記のプライマーセット：
（配列番号１３）
【化１５】
0005879665.tif 000057
（配列番号１２）
【化１６】
0005879665.tif 000058
および
ｂ）下記のプライマーセット：
（配列番号１０）
【化１７】
0005879665.tif 000059
（配列番号１１）
【化１８】
0005879665.tif 000060
である、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、進化した霊長類、特に、ヒト組織におけるＡＤＡＲｓ活性の特異的バイオマーカーとしてのＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体の編集プロフィール(edithing profile)の使用に関する。本発明はまた、ヒトにおいて、標的遺伝子のＡＤＡＲｓにより触媒されるｍＲＮＡ前駆体編集機構の変更を、血液サンプルなどの、前記ＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体を発現する細胞を含有する末梢組織サンプルにおけるＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体編集プロフィールを分析することによって予測するためのin vitro法にも関する。本発明はまた、潜在的治療化合物をスクリーニングするため、および治療効力および／もしくは有効性を予測および評価するため、または潜在的な、重篤な脳もしくは末梢薬物副作用を診断するための、特異的バイオマーカーとしての前記ＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体編集プロフィールを実装するin vitro法も対象とする。本発明はさらに、特に、ネステッドＰＣＲによる増幅の後のキャピラリー電気泳動一本鎖構造多形(capillary electrophoresis single-strand conformation polymorphism)（ＣＥ−ＳＳＣＰ）法により、ヒトにおいてＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体編集プロフィールを決定するための方法も対象とする。最後に、本発明は、前記ネステッドＰＣＲに実装される特定の核酸プライマーならびにこのようなプライマーセットとＰＤＥ８ＡおよびＡＤＡＲｓを発現し得るヒト細胞とを含んでなるキットに関する。あるいは、ヒトにおけるＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体編集の特性決定は、超ハイスループット・シーケンシング(high-throughput sequencing)（ＨＴＳ）技術によって行うことができる。一方でＡｂｂａｓおよび共同研究者ら、他方でＭｏｒａｂｉｔｏおよび共同研究者らが最近、ＨＴＳイルミナ技術に関する編集定量適用を開発した(Abbas et al, 2010, Nucl. Acid Res.; Morabito et al., 2010, Mol. Pharmacol.)（引用文献の材料および方法の節を参照）。これらのアプローチは、マウス脳における５−ＨＴ２ｃＲ  ｍＲＮＡ編集定量向けに設定されていた。前記著者らによって示された結果は、Ｐｏｙａｕおよび共同研究者らが彼らの主要文
献(Poyau, 2007)に記載しているものに極めて近い。ｃＤＮＡ増幅（２回目のネステッドＰＣＲ）に用いるプライマーのデザインと生成されるアンプリコンのサイズを若干改変すれば、イルミナ技術はＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体編集分析にも適用可能である。同様に、ＤＮＡ合成の直接的な電気的検出に基づくＨＴＳイオントレント半導体シーケンシング技術(HTS Ion Torrent semiconductor sequencing techno)(Life technologies)もＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体編集プロフィールの定量に使用することができる(Pourmand et al, 2006, Proc. Natl. Acad. Sci.; Anderson et al, 2008, Sens. Actuators B. Chem.)。使用する方法は何であれ、出発材料は、この特許の材料および方法に記載されている全ＲＮＡおよび最初のＰＣＲ産物からの構築されたｃＤＮＡライブラリーのままである。
【０００２】
アデノシン（Ａ）からイノシン（Ｉ）へのＲＮＡ編集は、機能的タンパク質の大きな集団の制御の基本的転写後機構として認知されている。このＲＮＡ編集は、特異的酵素（ＡＤＡＲｓ）の活性により、大きな標的セットを制御することができる（１）。これはｍＲＮＡ前駆体二本鎖構造の形成を意味し、その構造上に特異的編集部位が同定されている。これらのアデノシンは、コード配列（例えば、５−ＨＴ２ｃ受容体（５ＨＴ２ＣＲ）、グルタミン酸受容体）（２、３）またはイントロン配列（ホスホジエステラーゼサブタイプ８Ａ（ＰＤＥ８Ａ）（４、５）に属し得る。この後者の構造では、編集プロセスは、ＲＮＡスプライシングパターンおよび／またはｍｉＲＮＡの種々のアイソフォームの形成の双方に影響を及ぼし得る（６）。従って、観察されるこの編集による配列の改変は、編集プロセシング部位における種々のＡＤＡＲｓの相対濃度の改変および／または編集酵素自体の有効性の変更によるものであり得る。これまでの研究は、両タイプの機構が特定の病理学的または薬理学的変化の起源にあり得ることを明らかに示した（７、５）。
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、脳を含むヒト組織およびより容易に入手できる血液サンプルの全ＲＮＡ抽出物におけるＡＤＡＲｓ活性の有意な変更を予測するための極めて有効なツールとしてのＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体の編集プロフィールの迅速かつ定量的な着手を提供する。遺伝的所見は、このゲノムアプローチの早期の解決が、重篤な精神薬剤性副作用の一次または二次リスクを評価するための新たな可能性を拓くことを示している。
【０００４】
ＰＤＥ８Ａ遺伝子は染色体１５ｑ２５．３に位置する(Ensemble Genome browser)。再発性早期発症大鬱病性障害(major depressive disorder)（ＭＤＤ）を持った発端者を有する２９７家族を用いたゲノムスキャンによれば、染色体１５ｑ２５．３−ｑ２６．２との連鎖の有意な証拠が見られた（８）。著者らは、その最終報告書（９）で、この遺伝的連関を確定している。最も有意なスコアは、マーカーＤ１５Ｓ６５２とＧＡＴＡ１２８Ａ０２に関して見出された。再発性鬱病を有する４９７の同胞対の独立したゲノムスキャンによれば、大きくはないが、染色体１５ｑの同じ位置における連鎖のシグナルが見られ、最も有意なマーカー（Ｄ１５Ｓ１０４７）はＤ１５Ｓ６５２のおよそ１１Ｍｂ近くに位置していた（１０）。再発性早期発症鬱病および不安障害を有する家系を用いた別のゲノムスキャンによっても、１５ｑのこの同じ領域における連鎖を示唆する証拠が見出された（１１）。ＭＤＤにおける役割をＮＴＲＫ３遺伝子（Ｄ１５Ｓ６５２のおよそ５Ｍｂ近くに位置する）に帰することを試みるさらなる関連研究は、十分納得のいくものではなかった（１１、１２）。著者らは、この遺伝子がおそらく、鬱病の全体的リスクの主要な誘因ではないことを示唆している。
【０００５】
最近、Ｓｈｙｎおよび共同研究者ら(Shyn et al, 2011, Mol. Psychiatry)によって、３つのヨーロッパ家系ＭＤＤゲノムワイド関連研究データセットのメタ分析が行われた。これらのデータセットは３９５７症例および３４２８対照にのぼった。いくつかの候補のうち、著者らは、ＰＤＥ８Ａ遺伝子近傍のバンド１５ｑ２５．３に位置するＳＮＰ  ｒｓ１１６３４３１９（ｃｈｒ１５：８４，２２４，９１２）が大鬱の女性特有の表現型に関連していることを見出した（ｐ＜１０−５）。
【０００６】
他方、Ａｓｔｏｎおよび共同研究者らにより行われた以前の試験では、大鬱病性障害を有する１２名の患者と１４名の対応対照からの側頭皮質における遺伝子発現をＡｆｆｉｍｅｔｒｉｘマイクロアレイ(Aston et al, 2005, Mol. Psychiatry)を使用することによって比較された。神経発達、細胞の情報交換およびシグナル伝達に関与する遺伝子ファミリーにおいて有意な発現変化が同定された。このファミリーのうち、ＰＤＥ８Ａ遺伝子のｍＲＮＡの存在量は鬱病患者では２分の１であった（ｐ＜０．０００３）。ＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡは他の遺伝子のメッセンジャーとは違って総ての対照と患者で検出されたことから、この結果は極めて重要であった。これらの連鎖研究、関連研究およびマイクロアレイ遺伝子発現研究は総て、ＰＤＥ８Ａ遺伝子が大鬱病性障害に関連する可能性があることを示す傾向にある。
【０００７】
Ｍｏｒｓｅおよび共同研究者らは、ＲＮアーゼＴ１により処理されたグルオキシル化ポリ（Ａ）＋ＲＮＡに基づく独自の方法を用い、ヒト脳における編集酵素ＡＤＡＲｓの新たな標的を同定した（４）。彼らは、ｍＲＮＡ前駆体の非コード領域（イントロン、３’ＵＴＲ）がＡＤＡＲｓの主要な標的であると思われることを示した。ｃ−ＡＭＰ特異的ホスホジエステラーゼをコードしているＰＤＥ８Ａ遺伝子（１３）（コンティグＮＴ＿０１０２７４に埋め込まれているＰＤＥ８Ａ遺伝子）のイントロン９は、これらの標的の１つである。最近、全身性自己免疫性紅斑性狼瘡障害の領域およびＴリンパ球において、Ｏｒｌｏｗｓｋｉおよび共同研究者らは、ＰＤＥ８Ａ遺伝子転写物におけるＡからＩへの編集の２つのホットスポットを見出した（５）。１つは、部位１と呼ばれ、イントロン９の５５０５番および５５０６番の２つのアデノシン残基に関するものであった。本発明者らは、これらをそれぞれ編集部位ＡおよびＢと呼んだ。もう１つのホットスポット、すなわち、部位２は、イントロン９の５５３６番、５５３８番および５５３９番の他の３つのアデノシンに関するものであった。これらの編集部位は、それぞれＣ、ＤおよびＥと呼んだ。また、遺伝子ＰＤＥ８Ａのイントロン９の５４６８番、５５４８番および５６１７番の塩基に低頻度編集も見られた（それぞれ編集部位Ｈ、ＦおよびＧ）。配列内に埋め込まれたこれらの編集部位を総て、図１に示す。
【０００８】
遺伝子ＰＤＥ８Ａのイントロン９の５３６７番〜５７３６番塩基に相当するＲＮＡ配列の二次元構造を図２および３に示す。編集部位Ａ、Ｂ、Ｆ、ＧおよびＨのみがステム構造に埋め込まれ、Ｃ、ＤおよびＥはループにある。
【０００９】
ＡＤＡＲｓの活性を迅速に決定することができるin vitro試験とともに、特に、分析の容易な、ヒト組織におけるこれらのＡＤＡＲｓ活性の特異的バイオマーカーを提供する必要がある。このような試験は、ＡＤＡＲｓにより触媒されるｍＲＮＡ前駆体編集機構の変更の証明を可能とする。
【００１０】
編集は鬱病患者または自殺をした患者において変更されていることがすでに分かっていることから、例えば、前臨床段階において、このＡＤＡＲｓにより触媒されるｍＲＮＡ前駆体編集機構に関連する編集調節に対する新たな治療分子の潜在的効果を評価するために、このような特異的ＡＤＡＲｓバイオマーカー活性を実装するプラットフォームが提案され得る。さらに、このような特異的ＡＤＡＲｓバイオマーカー活性は、患者においてこの編集機構の変更に関連する病状を診断することができる、または試験化合物の有効性の潜在毒性を、もしくは特に上市前に、ヒトにおける薬物の潜在的副作用特性を決定することができる、迅速で有効な方法にためにも提案され得る。また、このような方法の実装形態としてのツールおよびキットの必要もある。
【００１１】
これが本発明の目的である。
【００１２】
本発明者らは、ＳＨ−ＳＹ５Ｙヒト細胞に適用されるＩＦＮα濃度を増加させることによりもたらされる編集変更がＰＤＥ８Ａタンパク質アイソフォームの定常状態に影響を及ぼし得ることを実証した。従って、本発明者らは、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞におけるＰＤＥ８Ａタンパク質濃度のウエスタンブロット解析後に、前記タンパク質のＰＤＥ８Ａ４アイソフォームの濃度が有意なものであり（Ｒ２＝０．８２）、負の線形相関があり（傾き＝−３．６）、２４時間中のＩＦＮα適用により誘導されたＡＤＡＲ１ａ−ｐ１５０のＧＡＰＤＨに対するＲＱの変動が＋Δであることを見出した。ＩＦＮαの濃度に対する効果の最適な当てはめにより、ＥＣ５０％評価値３．３±４．４（ＳＤ）ＩＵ／ｍｌが得られ、当てはめのＲ２＝０．７、相当する最大効果は、対照で見られた定常状態濃度の−４７％であった。
【００１３】
この例は、編集プロセスがスプライシング機構に対するその可能性のある影響によるか、または専用のｍｉＲＮＡの配列の制御によって、ＰＤＥ８Ａタンパク質の発現を正確に制御するであろうことを実証する。
【００１４】
さらに、この特異的編集標的に関して主として注目される点は、５−ＨＴ２ＣＲの場合とは異なり、脳と同様に、特にヒト血液中に存在するということである。従って、ＰＤＥ８Ａの編集プロフィールは、血液を含むヒト組織における編集酵素機構の活性を評価するための特異的ツールと考えることができる。
【００１５】
ヒトを含む進化した霊長類におけるＰＤＥ８Ａの完全な編集プロフィールの分析とともに、本発明者らは、補足的アプローチとしてのＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体の編集プロフィールの発現の評価が、編集機構の調節不全の全般的編集状況の評価にも特に十分適合していることを実証した。それはＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体の編集プロフィールの定量的および定性的分析（特に、ＣＥ−ＳＳＣＰ法併用、定量的ネステッドＲＴ−ＰＣＲによる）を含む。
【００１６】
以下の例は、種々の前臨床および臨床試験における革新的ツールとしてこの特異的標的の編集プロセスを評価するという着目点を強く裏付ける。
【００１７】
よって、本発明は、ＡＤＡＲｓ（アデノシンデアミナーゼ、ＲＮＡ特異的）活性を決定するためのin vitro法であって、
ａ）編集酵素ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２ならびにホスホジエステラーゼサブタイプ８Ａ（ＰＤＥ８Ａ）を発現する哺乳類細胞を含有する生体サンプルを得る工程；
ｂ）細胞抽出物において、前記細胞抽出物から得られた細胞ＲＮＡ抽出物において評価されるＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体の編集プロフィール、好ましくは、前記ＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体の同定された各アイソフォームの平均比率を表す前記編集プロフィールを決定する工程；
ｃ）工程ｂ）で得られた特性を前記哺乳類細胞と、ＡＤＡＲｓ活性が既知である対照細胞で得られたＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体編集プロフィールとで比較する工程
を含んでなる方法を対象とする。
【００１８】
別の態様において、本発明は、患者がＡＤＡＲｓにより触媒されるｍＲＮＡ前駆体編集機構の変更に関連する病状を呈するかどうか、または前記病状を発症するリスクがあるかどうかをin vitroで同定するため、または診断するためのin vitro法であって、
ａ）被験患者から編集酵素ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２ならびにＰＤＥ８Ａを発現する細胞を含有する生体サンプル、好ましくは、ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）を含有する生体サンプルを得る工程；
ｂ）前記細胞を含有する生体サンプルから得られた細胞ＲＮＡ抽出物において測定されたＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体の編集プロフィール、好ましくは、前記ＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体の同定された各アイソフォームの平均比率を表す前記編集プロフィールを決定する工程；
ｃ）前記患者がこのような病状を呈するかどうか、またはこのような病状を発症するリスクがあるかどうかを、工程ｂ）において得られたＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体の編集プロフィールと、正常な患者および／またはこのｍＲＮＡ編集機構の変更に関連する病状を示す患者に関して得られたＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体の対照編集プロフィールとを比較することによって同定する工程
を含んでなる方法を対象とする。
【００１９】
好ましい実施形態では、対照サンプルと被験患者サンプルで測定されたＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体の編集プロフィール間の有意差が、このような病状またはこのような病状のリスクの指標となる。
【００２０】
有意差とは、被験患者細胞と対照細胞の間で少なくとも１つの同じアイソフォーム（編集または非編集アイソフォーム）に関して少なくとも２％、好ましくは、少なくとも３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％および１０％の差を示すことが意図され、より好ましくは、この少なくとも１つの同じアイソフォームはＡＢ、ＡＢＣ、ＡＢＥ、ＡＢＥＦ、ＡＢＥＦＧ、ＡＢＧ、Ｂ、ＢＣ、ＢＤ、ＢＥ、ＢＥＧ、ＢＦ、ＢＦＧ、ＢＧ、Ｍまたは非編集アイソフォーム（ｎｅｄまたはｎｅまたはＮｅ）の群からから選択され、最も好ましくは、Ｂ、ＡＢ、ＢＣ、ＡＢＣおよびｎｅｄアイソフォームである。
【００２１】
より好ましい実施形態では、有意差とは、被験患者細胞と対照細胞の間で少なくとも１対の同じアイソフォーム（編集または非編集アイソフォーム）に関して少なくとも２％、好ましくは、少なくとも３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％および１０％の差を示すことが意図され、より好ましくは、この少なくとも１対の同じアイソフォームはＡＢ、ＡＢＣ、ＡＢＥ、ＡＢＥＦ、ＡＢＥＦＧ、ＡＢＧ、Ｂ、ＢＣ、ＢＤ、ＢＥ、ＢＥＧ、ＢＦ、ＢＦＧ、ＢＧ、Ｍ編集アイソフォームおよび非編集アイソフォーム（ｎｅｄ）の群から選択され、最も好ましくは、同対はＢ、ＡＢ、ＢＣ、ＡＢＣおよびｎｅｄアイソフォームからなる群から選択され、Ｂおよびｎｅｄアイソフォームが最も好ましいアイソフォーム対である。
【００２２】
別の態様において、本発明は、ＡＤＡＲｓにより触媒されるｍＲＮＡ前駆体（またはｍＲＮＡ）編集機構の変更に関連する病状を有するか、または前記病状を呈するリスクがある患者において治療的処置の有効性をモニタリングするためのin vitro法であって、
ａ）前記処置の前と前記処置中の少なくとも１期間の後に前記患者から、編集酵素ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２ならびにＰＤＥ８Ａを発現する細胞を含有する生体サンプルを得る工程；
ｂ）前記生体サンプルからの細胞抽出物において、前記細胞抽出物から得られた細胞ＲＮＡ抽出物において測定されたＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体の編集プロフィール、好ましくは、前記ＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体の同定された各アイソフォームの平均比率を表す前記編集プロフィールを決定する工程；
ｃ）工程ｂ）で得られた結果を、処置前と処置中の前記期間の後に前記患者から得られた前記生体サンプル細胞抽出物間で比較する工程
を含んでなる方法を対象とする。
【００２３】
好ましい実施形態では、前記処置中の前記期間の後に測定された前記ＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体編集プロフィールの改変が有意でなければ、前記治療的処置の有効性がないことを示す。
【００２４】
また好ましい実施形態では、前記期間後に測定されたＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体編集プロフィールが、ＡＤＡＲｓにより触媒されるｍＲＮＡ前駆体（またはｍＲＮＡ）編集機構の変更に関連する病状を呈しないか、または前記病状を呈するリスクのない被験体からの生体サンプル対照に関して得られたものと有意に同じ特性を有することが、前記処置の有効性を示す。
【００２５】
別の態様において、本発明は、患者における投与後の試験化合物の潜在毒性または副作用を決定するためのin vitro法であって、前記化合物がＡＤＡＲｓにより触媒されるｍＲＮＡ前駆体（またはｍＲＮＡ）編集機構の変更に直接的または間接的に関連する病状を予防または治療するその能力に関して試験され、
ａ）編集酵素ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２ならびにホスホジエステラーゼサブタイプ８Ａ（ＰＤＥ８Ａ）を発現する哺乳類細胞を含有する生体サンプルを得る工程；
ｂ）前記哺乳類細胞を被験化合物と接触させる工程；
ｃ）細胞抽出物において、前記細胞抽出物から得られた細胞ＲＮＡ抽出物において測定されたＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体の編集プロフィール、好ましくは、前記ＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体の同定された各アイソフォームの平均比率を表す前記編集プロフィールを決定する工程；
ｄ）工程ｃ）で得られた結果を、工程ｂ）で得られた前記被験化合物で処置された細胞と非処置対照細胞とで比較する工程
を含んでなる方法を含んでなる。
【００２６】
本発明に関して、「毒性」とは、細胞または組織の代謝に対する化合物の任意の有害作用および／または副作用、より一般には、患者において化合物の有害作用をもたらし得る代謝の任意の変更、特に、本発明に関しては、薬剤性の気分障害および自殺の潜在的リスクを意味する。
【００２７】
「試験化合物」とは、一般に、試験被験体が曝される化合物を意味する。典型的な試験化合物は、小有機分子、一般に、薬物および／または将来的な医薬リード化合物を意味するが、タンパク質、ペプチド、ポリヌクレオチド、異種遺伝子（発現系における）、プラスミド、ポリヌクレオチド類似体、ペプチド類似体、脂質、炭水化物、ウイルス、ファージ、寄生体なども含み得る。
【００２８】
「対照化合物」とは、試験化合物といずれかの生物活性を共有することが知られてない化合物を意味し、本発明の実施において群表示および薬物表示を行う際に「活性」（試験）化合物と「不活性」（対照）化合物を対比させるために使用される。典型的な対照化合物としては、限定されるものではないが、試験化合物の適用とは異なる障害を治療するための薬物、ビヒクル、試験薬剤の不活性型および既知の不活性化合物などが含まれる。
【００２９】
別の態様において、本発明は、ＡＤＡＲｓにより触媒されるｍＲＮＡ前駆体（またはｍＲＮＡ）編集機構（ＡＤＡＲ依存性のＡからＩへのｍＲＮＡ前駆体編集機構）の変更に関連する病状の治療に有用な治療化合物を選択するためのin vitro法であって、
ａ）編集酵素ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２ならびにＰＤＥ８Ａを発現する哺乳類細胞を含有する生体サンプルを得る工程；
ｂ）前記哺乳類細胞と被験化合物を接触させる工程；
ｃ）細胞抽出物において、前記細胞抽出物から得られた細胞ＲＮＡ抽出物において測定されたＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体の編集プロフィール、好ましくは、前記ＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体の同定された各アイソフォームの平均比率を表す前記編集プロフィールを決定する工程；
ｄ）工程ｃ）で得られた結果を、前記被験化合物で処置された細胞と非処置対照細胞とで比較する工程
を含んでなる方法を包含する。
【００３０】
本発明の方法の好ましい実施形態では、工程ｂ）において、前記哺乳類細胞は、前記哺乳類細胞の培養に好適または便宜な培地中、被験化合物の存在下で培養される。
【００３１】
好ましくは、工程ｂ）において、前記哺乳類細胞は、ＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体の編集されたアイソフォームの発現および／または発現されたＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２酵素が、それらがこのような化合物によって変化を受けるかどうか、少なくとも変化するのに必要な時間、被験化合物の存在下で培養される。
【００３２】
好ましくは、工程ｂ）において、前記哺乳類細胞は、同じ細胞抽出物において、前記ＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体の同定された各アイソフォームの編集プロフィールおよび／または前記編集酵素ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２の量的発現を決定する工程ｃ）の前に、少なくとも１時間、より好ましくは、少なくとも５、１０、２４または４８時間、被験化合物の存在下で培養される。
【００３３】
本発明の方法の好ましい実施形態では、被験化合物はさらにin vivoにおいて、同化合物を試験するのに好適な進化した霊長類の動物モデルに投与され、この動物モデルにおいてその投与後のこの試験化合物の潜在毒性または副作用を、特に、全血、特にＰＢＭＣ、または脳で発現されたＰＤＥ８Ａおよび／またはＡＤＡＲアイソフォームのｍＲＮＡ前駆体編集の変更を評価することによって評価することができる。
【００３４】
好ましい実施形態では、本発明による方法の工程ｂ）またはｃ）において、細胞ＲＮＡ抽出物で測定されたＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体の編集プロフィールの決定に加え、これらの工程は、前記細胞の細胞抽出物における前記編集酵素ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２の量的発現の決定をさらに含んでなる。
【００３５】
工程ｃ）またはｄ）で得られた結果を比較する工程は、ＡＤＡＲ発現に関して得られた結果を処置細胞と非処置対照細胞とで比較することをさらに含んでなる。
【００３６】
好ましい実施形態では、細胞ＲＮＡ抽出物において測定されたＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体の編集プロフィールと前記編集酵素ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２の量的発現とは、同じ細胞抽出物において決定される。
【００３７】
また、好ましい実施形態では、前記編集酵素ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２の量的発現は、前記編集酵素のｍＲＮＡ発現の測定によるか、または細胞抽出物において発現された前記編集酵素タンパク質の測定によって決定される。
【００３８】
別の好ましい実施形態では、前記編集酵素ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２の量的発現は、前記編集酵素のｍＲＮＡ発現の測定によって決定され、好ましくは、ＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体の編集プロフィールの決定に用いたものと同じ全ＲＮＡ細胞抽出物において決定される。
【００３９】
別の好ましい実施形態では、ＡＤＡＲｓアイソタイプＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２ならびにＰＤＥ８Ａを発現し得る前記哺乳類細胞は、進化した霊長類、例えば、チンパンジー、アカゲザルまたはヒトに由来する。
【００４０】
別の好ましい実施形態では、前記哺乳類細胞はヒト細胞またはヒト由来細胞、例えば、ヒト細胞系統に由来する細胞またはヒト細胞系統に起源する組換え細胞である。
【００４１】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法では、工程ａ）において、ＡＤＡＲＳアイソタイプＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２ならびにＰＤＥ８Ａを発現し得る前記哺乳類細胞は、血液サンプル（ＰＢＭＣ）または体液（ＬＣＲ）または術前および死後組織（脳、肝臓、前立腺）または生検サンプル（皮膚、腫瘍）からなる生体サンプルの群から選択される、被験体または患者の生体サンプルに由来する。
【００４２】
別の好ましい実施形態では、ＡＤＡＲｓアイソタイプＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２ならびにＰＤＥ８Ａを発現し得る前記哺乳類細胞は、細胞系統由来の細胞を含有する生体サンプルに由来する。
【００４３】
別の好ましい実施形態では、ＡＤＡＲＳアイソタイプＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２ならびにＰＤＥ８Ａを発現し得る前記哺乳類細胞は、進化した霊長類の神経芽腫、膠芽腫、星状細胞腫およびその他の組織または腫瘍特異的細胞系統からなる群から選択される細胞系統、好ましくは、ヒト神経芽腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞系統に由来する細胞を含有する生体サンプルに由来する。
【００４４】
別の好ましい実施形態では、ＡＤＡＲｓアイソタイプＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２ならびにＰＤＥ８Ａを発現し得る前記哺乳類細胞は、ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２アイソタイプから選択される進化した霊長類のＡＤＡＲアイソタイプ、または進化した霊長類のＰＤＥ８Ａのうち少なくとも１つをコードする核酸を担持するベクターによって場合により形質転換されていてもよい組換え細胞系統に由来する細胞を含有する生体サンプルに由来する。
【００４５】
好ましい実施形態では、前記ＡＤＡＲｓにより触媒されるｍＲＮＡ前駆体編集機構の変更に関連する病状は、
ＡＤＡＲｓにより触媒される５−ＨＴ２ｃ受容体（５−ＨＴ２ＣＲ）ｍＲＮＡ編集機構；
ＡＤＡＲｓにより触媒されるＧｌｕＲ−Ｂ受容体ｍＲＮＡ前駆体編集機構；
ＡＤＡＲｓにより触媒されるＫ（Ｖ）１−１カリウムチャネルｍＲＮＡ編集機構；
ＡＤＡＲｓにより触媒されるＦｌｎＡまたはＢｌｃａｐ(Riedmann et al; RNA 2008. 14: 1110-1118 Li et al; Science 2009 324,1210)ｍＲＮＡ編集機構；
ＡＤＡＲにより触媒される感染後ウイルスＲＮＡ  ｍＲＮＡ編集機構
の変更に関連する病状から選択される病状である。
【００４６】
より好ましい実施形態では、前記ＡＤＡＲにより触媒されるｍＲＮＡ前駆体（またはｍＲＮＡ）編集機構の変更に関連する病状は、ＰＤＥ８ＡイントロンのＡからＩへのｍＲＮＡ前駆体編集の変更に関連する精神症候群、神経症候群、免疫症候群および変性症候群からなる群から選択される。
【００４７】
前記病状は、ＡＤＡＲｓにより触媒される５−ＨＴ２Ｃ受容体ｍＲＮＡ編集機構に関連する精神障害、統合失調症、鬱病、双極性疾患、自殺または異常摂食行動（肥満、食欲不振症）、さらにまた、軽度認知障害（ＭＣＩ）、癲癇、アルツハイマーまたは慢性疼痛症候群からなる群から選択される。
【００４８】
前記病状は、ＡＤＡＲｓにより触媒されるＧｌｕＲ−Ｂ受容体ｍＲＮＡ編集機構に関連する場合、ＭＣＩ、癲癇、アルツハイマー、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）からなる群から選択される(Hideyama et al, 2010, J Pharmacol. Sci.113, 9-13)。
【００４９】
さらに、ＡＤＡＲ１遺伝子変更に関しては、遺伝性対側性色素異常症がある(Suzuki et al, 2007, J invest. Dermatol. 309-311)。
【００５０】
別の態様において、本発明の方法において実装される前記哺乳類細胞は、５−ＨＴ２ＣＲをさらに発現し、本発明による方法の工程ｂ）またはｃ）において細胞ＲＮＡ抽出物において測定されたＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体の編集プロフィールに加えて（場合により、前記細胞の細胞抽出物における編集酵素ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２の量的発現の決定を含んでもよい）、この工程は、好ましくは、２００８年６月１３日に出願された特許文献ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０５７５１９および２００９年１２月１７日に出願された特許文献ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０６７４６４において、ヒトサンプルにおける５−ＨＴ２ＣＲ  ｍＲＮＡの編集プロフィールの決定に関してすでに記載されているＣＥ−ＳＳＣＰ法による５−ＨＴ２ＣＲ  ｍＲＮＡの編集プロフィールの決定をさらに含んでなる。
【００５１】
５−ＨＴ２ＣＲ  ｍＲＮＡの編集プロフィールも決定される場合、工程ｃ）またはｄ）で得られた結果を比較する工程は、５−ＨＴ２ＣＲ  ｍＲＮＡの編集プロフィールに関して得られた結果を処置細胞と非処置対照細胞とで比較することをさらに含んでなる。
【００５２】
好ましい実施形態では、前記細胞抽出物から得られた細胞ＲＮＡ抽出物において測定されたＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体の編集プロフィール、好ましくは、前記ＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体の同定された各アイソフォームの平均比率を表す前記編集プロフィールは、編集部位：Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、または、編集部位Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎのうち少なくとも１つを含んでなるＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体アイソフォームのうち少なくとも１つ、加えて非編集アイソフォーム（ｎｅｄ）の少なくとも決定および／または定量を含んでなる。
【００５３】
より好ましい実施形態では、前記細胞抽出物から得られた細胞ＲＮＡ抽出物において測定されたＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体の編集プロフィール、好ましくは、前記ＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体の同定された各アイソフォームの平均比率を表す前記編集プロフィールは、ＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体アイソフォームＡＢ、ＡＢＣ、ＡＢＥ、ＡＢＥＦ、ＡＢＥＦＧ、ＡＢＧ、Ｂ、ＢＣ、ＢＤ、ＢＥ、ＢＥＧ、ＢＦ、ＢＦＧ、ＢＧ、Ｍまたは非編集アイソフォーム（ｎｅｄ）の少なくとも決定および／または定量を含んでなる。
【００５４】
また、さらに好ましい実施形態では、測定されたＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体の編集プロフィールは、アイソフォームＢ、または編集された編集部位Ｂを少なくとも含んでなるＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体アイソフォームのうち少なくとも１つの少なくとも決定および／または定量を含んでなる。
【００５５】
また、さらに好ましい実施形態では、測定されたＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体の編集プロフィールは、アイソフォーム（ｎｅｄ）の少なくとも決定および／または定量を含んでなる。
【００５６】
また、さらに好ましい実施形態では、測定されたＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体の編集プロフィールは、アイソフォームｎｅｄおよびＢ、好ましくは、少なくとも（ｎｅｄ）、ＢおよびＡＢ、より好ましくは、少なくとも（ｎｅｄ）、Ｂ、ＡＢおよびＢＣの少なくとも決定および／または定量を含んでなる。
【００５７】
本発明による方法の好ましい実施形態では、前記ＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体の編集型および非編集型それぞれの編集速度は、
Ａ）前記哺乳類細胞の全ＲＮＡを抽出した後、適当であれば、ｍＲＮＡ前駆体の精製を行う工程；
Ｂ）工程Ａ）において抽出されたＲＮＡを逆転写させる工程；および
Ｃ）工程Ｂ）において得られたｃＤＮＡを、編集の可能性がある編集部位を含有するＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体断片に特異的な少なくとも１対のプライマーを用いてＰＣＲににより増幅する工程（このプライマー対はＲＮＡ抽出物中に存在する可能性のある編集型および非編集型を総て増幅することができるように選択される）
を含んでなる方法によって決定される。
【００５８】
本発明による方法の好ましい実施形態では、前記ＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体の編集型および非編集型それぞれの編集速度は、
Ａ）前記哺乳類細胞の全ＲＮＡを抽出した後に、適当であれば、ｍＲＮＡ前駆体の精製を行う工程；
Ｂ）工程Ａ）において抽出されたＲＮＡを逆転写させる工程；および
Ｃ）工程Ｂ）において得られたｃＤＮＡを、編集の可能性がある編集部位を含有するＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体断片に特異的な少なくとも１対のプライマーを用いてＰＣＲににより増幅する工程（このプライマー対はＲＮＡ抽出物中に存在する可能性のある編集型および非編集型を総て増幅することができるように選択される）
を含んでなり、逆転写の工程Ｂ）がＰＤＥ８Ａ遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて行われる方法によって決定される。
【００５９】
本発明による方法の好ましい実施形態では、工程Ｃ）において、ＰＣＲ増幅工程（ネステッドＰＣＲである場合には２回目に）に使用されるプライマーは標識され、好ましくは蛍光団で標識される。
【００６０】
本発明の方法の好ましい実施形態では、工程ｃ）において、前記ＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体の同定された各アイソフォームの平均比率を表す編集プロフィールは、前記ｍＲＮＡ前駆体の編集および非編集の個々の各形態の編集プロフィールを表し得るＳＳＣＰ法によって決定され、このＳＳＣＰ法は、工程Ａ）、Ｂ）およびＣ）の後に、
Ｄ）適当であれば、工程Ｃ）において得られたＰＣＲ産物を精製する工程；
Ｅ）適当であれば、工程Ｄ）において得られたＰＣＲ産物を定量する工程；
Ｆ）特に、加熱した後に急冷することによって、二本鎖ｃＤＮＡを解離して一本鎖ｃＤＮＡとする工程；
Ｇ）前記一本鎖ｃＤＮＡをキャピラリー電気泳動により分離する工程；および
Ｈ）蛍光の読み取りと適当であれば、蛍光リーダーと連結した開発システムの手段による特性データの取得によって編集プロフィールを得る工程
を含んでなることを特徴とする。
【００６１】
特定の好ましい実施形態では、編集プロフィール、好ましくは、進化した霊長類細胞、好ましくはヒトの細胞ＲＮＡ抽出物において測定されたＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体の同定された各アイソフォームの平均比率を表す編集プロフィールは、ＲＴとその後の、２回のＰＣＲを含んでなるネステッドＰＣＲにより測定され、
ａ）１回目のＰＣＲが下記のプライマーセット：
フォワード：
ＰＤＥ８Ａ−１ＦＷＤ（配列番号１３）
【化１】
0005879665.tif 000002
リバース：
ＰＤＥ８Ａ−１ＲＥＶ（配列番号１２）
【化２】
0005879665.tif 000003
により行われ、
ｂ）２回目のＰＣＲが下記のプライマーセット：
フォワード：
ＰＤＥ８Ａ−２ＦｏｗＦＡＭ（配列番号１０）
【化３】
0005879665.tif 000004
リバース：
ＰＤＥ８Ａ−２ＲｅｖＶＩＣ（配列番号１１）
【化４】
0005879665.tif 000005
により行われる。
【００６２】
ＡＤＡＲｓ特異的アイソフォームを前記方法で決定しなければならない場合に、進化した霊長類、好ましくはヒト、ＡＤＡＲ  ｍＲＮＡ  ＰＣＲ増幅に特異的なプライマー対は、
ＡＤＡＲ１−１５０アイソフォームｍＲＮＡ増幅用の
フォワード：
【化５】
0005879665.tif 000006
（配列番号１４）
リバース：
【化６】
0005879665.tif 000007
（配列番号１５）
ＡＤＡＲ１−１１０アイソフォームｍＲＮＡ増幅用の
フォワード：
【化７】
0005879665.tif 000008
（配列番号１６）
リバース：
【化８】
0005879665.tif 000009
（配列番号１７）
ＡＤＡＲ２  ｍＲＮＡ増幅用の
フォワード：
【化９】
0005879665.tif 000010
（配列番号１８）
リバース：
【化１０】
0005879665.tif 000011
（配列番号１９）
からなる群から選択される。
【００６３】
本発明による方法のより好ましい実施形態では、各アイソフォームの分離および同定を含むＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体の編集プロフィールの定量は、キャピラリー電気泳動一本鎖構造多形（ＣＥ−ＳＳＣＰ）によって行われる。
【００６４】
特定の好ましい実施形態では、本発明の方法は、前記哺乳類細胞において発現されたＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡの量をＱ−ＰＣＲによって決定する工程、または前記哺乳類細胞において発現されたＰＤＥ８Ａポリペプチドの量を決定する工程をさらに含んでなる。
【００６５】
本発明の方法の好ましい実施形態では、工程ｂ）またはｃ）において、５−ＨＴ２ＣＲ  ｍＲＮＡに編集プロフィール（好ましくは、細胞ＲＮＡ抽出物において測定された５−ＨＴ２ＣＲ  ｍＲＮＡの同定された各アイソフォームの平均比率を表す）が決定される場合、前記決定は２回のＰＣＲを含んでなるネステッドＰＣＲにより行われ、
１回目のＰＣＲは下記のプライマーセット：
フォワード：
【化１１】
0005879665.tif 000012
（配列番号２０）、
リバース：
【化１２】
0005879665.tif 000013
（配列番号２１）
により行われ、
２回目のＰＣＲは下記のプライマーセット：
フォワード：
【化１３】
0005879665.tif 000014
（配列番号２２）、
リバース：
【化１４】
0005879665.tif 000015
（配列番号２３）
により行われる。
【００６６】
別の態様において、本発明は、
ａ）下記のプライマーセット：
（配列番号１３）
【化１５】
0005879665.tif 000016
（配列番号１２）
【化１６】
0005879665.tif 000017
および
ｂ）下記のプライマーセット（好ましくは標識される）：
（配列番号１０）
【化１７】
0005879665.tif 000018
（配列番号１１）
【化１８】
0005879665.tif 000019
を含んでなる、ＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体の編集プロフィールを決定するためのキットを対象とする。
【００６７】
本発明はまた、
ａ）編集酵素ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２ならびにＰＤＥＡ８、場合により、セロトニン２Ｃ受容体（５ＨＴＲ２Ｃ）を発現する、進化した霊長類細胞系統、好ましくはヒト細胞系統由来の哺乳類細胞；および
ｂ）前記哺乳類細胞のＲＮＡ抽出物に存在し得るＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体の編集プロフィールを、２回のＰＣＲを含んでなるネステッドＰＣＲを含むＲＴ／ＰＣＲにより決定するための２セットのプライマー；および／または
ｃ）場合により、編集酵素ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２の量的発現を定量的Ｑ−ＰＣＲにより測定するための１セットのプライマー（ＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡの発現レベルは下記のプライマーセット（Applied Biosystems References）：
ＰＤＥ８Ａ１  Ｈｓ  ０１０７９６２８＿ｍｌ
ＰＤＥ８Ａ  Ｈｓ  ００４００１７４＿ｍｌ
の使用による）
を含んでなるＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体の編集プロフィールを決定するためのキットにも関する。
【００６８】
好ましい実施形態では、前記哺乳類細胞は、神経芽腫、膠芽腫または星状細胞腫細胞系統などの進化した霊長類腫瘍細胞系統に由来し、好ましくは、ヒト神経芽腫細胞系統、より好ましくは、ヒト神経芽腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞系統に由来する。
【００６９】
より好ましい実施形態では、本発明のキットにおけるｂ）の２セットのプライマーは、
ａ）下記のプライマーセット：
（配列番号１３）
【化１９】
0005879665.tif 000020
（配列番号１２）
【化２０】
0005879665.tif 000021
および
ｂ）下記のプライマーセット（好ましくは標識される）：
（配列番号１０）
【化２１】
0005879665.tif 000022
（配列番号１１）
【化２２】
0005879665.tif 000023
である。
【００７０】
最後に、特定の態様において、本発明は、患者において、特に、ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）に感染した患者に関して、その投与後のインターフェロンα（ＩＦＮα）処置の潜在毒性または副作用を決定または予測するためのin vitro法であって、
ａ）前記処置患者から哺乳類白血球、好ましくはＰＢＭＣ細胞を含有する生体サンプルを得る工程；
ｂ）哺乳類白血球を含有する前記生体サンプルの細胞抽出物において、細胞ＲＮＡ抽出物において測定されたＰＤＥＡ８  ｍＲＮＡ前駆体、および場合により編集酵素ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２の編集プロフィールの量的発現を決定する工程；
ｄ）工程ｂ）で得られた結果を、ＩＦＮα処置患者からの前記細胞と非処置対照細胞またはＩＦＮα処置の開始時または処置中において同じ患者から得られたＩＦＮα処置前細胞とで比較する工程
を含んでなる方法を対象とする。
【００７１】
下記の例、また、以下の図面および凡例は、本発明を実施および使用することができるよう完全な説明を当業者に提供するように選択されたものである。これらの例は発明者が発明であると考えるものの範囲を限定するものではなく、以下に示す実験のみが行われたことを示すものでもない。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】ＰＤＥ８Ａ遺伝子のイントロン９の部分配列および編集されたアデノシン残基の座標。イントロン９の内部配列（４３２ｂｐ）（塩基番号５３０５〜５７３６）が示される。Ｏｒｌｏｗｓｋｉおよび共同研究者ら（５）により従前に記載されている編集部位を太字で示し、それらの名称をその配列の上に黒い大文字で示す（ＰＤＥ８Ａ遺伝子のイントロン９の座標：Ｈ＝５４６８；Ａ＝５５０５；Ｂ＝５５０６；Ｃ＝５５３６；Ｄ＝５５３８；Ｅ＝５５３９；Ｆ＝５５４８；Ｇ＝５６１７）。
【図２】ヒト遺伝子ＰＤＥ８Ａのイントロン９のＲＮＡ配列（塩基５３６７〜５７３６）の予測ステムおよびループ構造の全体像。二次元ＲＮＡ構造はＫｉｎｅＦｏｌｄプログラム(http://kinefold.curie.fr/)により計算される。Ｏｒｌｏｗｓｋｉおよび共同研究者らにより記載されている編集部位を赤で示す（５）。
【図３Ａ】編集部位Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ（３Ａ）およびＧ（３Ｂ）の拡大。二次元ＲＮＡ構造はＫｉｎｅＦｏｌｄプログラム(http://kinefold.curie.fr/)により計算される。公開されている編集部位は、部位Ｈ以外、示されている二次元構造の外側の黒い文字である（５）。
【図３Ｂ】編集部位Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ（３Ａ）およびＧ（３Ｂ）の拡大。二次元ＲＮＡ構造はＫｉｎｅＦｏｌｄプログラム(http://kinefold.curie.fr/)により計算される。公開されている編集部位は、部位Ｈ以外、示されている二次元構造の外側の黒い文字である（５）。
【図４】編集されたアデノシンはヒトとチンパンジーの間で保存されている。チンパンジー構築２．１ゲノムデータベースに対して図１に示すヒトイントロン配列（塩基番号５３０５〜５７３６）のＢＬＡＳＴ検索を行った。ヒト配列（上の列、クエリー）とチンパンジー(Pan troglodytes)参照配列（ｒｅｆ｜ＮＷ＿００１２２５２５２．１｜Ｐｔｒ１５＿ＷＧＡ１６８１６＿２）（下の列、対象対象）のアライメントを示す。保存されているアデノシンを赤で示す。それらの名称をアラインされた配列の上に黒い文字で示す。
【図５】編集されたアデノシンおよびイントロン配列は一部がヒトとアカゲザルの間で保存されている。アカゲザル構築１．１ゲノムデータベースに対して図１に示すヒトイントロン配列（塩基番号５３０５〜５７３６）のＢＬＡＳＴ検索を行った。ヒト配列（上の列、クエリー）とアカゲザル(Macaca mulatta参照)参照配列ｒｅｆ｜ＮＷ＿００１１２１１８９．１｜Ｍｍｕ７＿ＷＧＡ１１３５３＿１（下の列、対象）のアライメントを示す。保存されているアデノシンを赤で示す。それらの名称をアラインされた配列の上に黒い文字で示す。
【図６】太字の下線の文字は、１回目のＰＣＲ（アンプリコン＝４９５ｂｐ）に使用されるフォワード（ＦＷＤ）およびリバース（ＲＥＶ）非標識プライマーの配列を示す。２回目のネステッドＰＣＲ（アンプリコン＝１７５ｂｐ）のＦＡＭ標識ＦＷＤおよびＶＩＣ標識ＲＥＶプライマーに相当する２つの配列は下線だけが施されている。ＲＴプライマーに相当する配列を斜体の太字で示す。編集部位を配列の上のそれらの名称で示す。新たな編集部位を大文字で示す。このプライマーセットを用いた場合、ＨおよびＩ編集部位はＣＥ−ＳＳＣＰによって分析できないことに注意しなければならない（図１２参照）。
【図７】編集されたアイソフォーム（ここでは、アイソフォームＢ）の一貫した評価を得るために必要な全ＲＮＡ初期量の限界の例。編集プロフィールは、試験された最少量（６２．５ｎｇ）まで最初のＲＴに使用した全ＲＮＡ量の希釈度に拘わらずにあるアイソフォームＢの比率を示すことに留意されたい。
【図８Ａ】種々のヒト組織の全ＲＮＡ抽出物からＣＥにより決定された編集プロフィールの例。左にＦＡＭ標識鎖およびＶＩＣ標識鎖を含む典型的な分析シグナルを示す（材料および方法参照）。表は、各アイソフォームの個々の比率を発現された編集材料の合計に対する％として示す。
【図８Ｂ】種々のヒト組織の全ＲＮＡ抽出物からＣＥにより決定された編集プロフィールの例。左にＦＡＭ標識鎖およびＶＩＣ標識鎖を含む典型的な分析シグナルを示す（材料および方法参照）。表は、各アイソフォームの個々の比率を発現された編集材料の合計に対する％として示す。
【図８Ｃ】種々のヒト組織の全ＲＮＡ抽出物からＣＥにより決定された編集プロフィールの例。左にＦＡＭ標識鎖およびＶＩＣ標識鎖を含む典型的な分析シグナルを示す（材料および方法参照）。表は、各アイソフォームの個々の比率を発現された編集材料の合計に対する％として示す。
【図９Ａ】ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の全ＲＮＡから得られた編集プロフィールの例。Ａにおいて、正のシグナルは、対照条件において得られた平均ＣＥシグナル（ｎ＝６の抽出物）に相当する。負のシグナルは、標準アイソフォームに相当する（材料および方法を参照）。Ｂでは、全シグナルの１．５４％に当たるピークの同定（ここではＦＡＭ蛍光による）の一例を示すために、時間単位６００〜７００点の間のシグナルが拡大されている。
【図９Ｂ】ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の全ＲＮＡから得られた編集プロフィールの例。Ａにおいて、正のシグナルは、対照条件において得られた平均ＣＥシグナル（ｎ＝６の抽出物）に相当する。負のシグナルは、標準アイソフォームに相当する（材料および方法を参照）。Ｂでは、全シグナルの１．５４％に当たるピークの同定（ここではＦＡＭ蛍光による）の一例を示すために、時間単位６００〜７００点の間のシグナルが拡大されている。
【図１０】ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞における、適用されたＩＦＮα濃度とＢアイソフォームおよび非編集（ＮＥ）アイソフォームの平均変動Δとの関係。各点は、０、１、１０、１００、１０００および１００００ＩＵのＩＦＮαのインキュベート培地において投与４８時間後に測定された個々の値の平均±ＳＥＭ（ｎ＝８）を示す。
【図１１】ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞における、ＩＦＮαの濃度増によって誘導されたＡＤＡＲ１ａ−１５０の相対量（ＲＱ）とＰＤＥ８Ａ  ＲＮＡの編集プロフィールにおけるアイソフォームＢの比率の相対的増加との相関。アイソフォームＢは、編集部位Ｂが編集された形態下だけにあるアイソフォームと定義される。
【図１２】ＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体の編集された領域の概略図。編集された配列はＰＤＥ８Ａ遺伝子のイントロン９に位置する。ネステッドＰＣＲに用いた２つの標識プライマーの配列を示し、概略図にグレーの四角で示す。編集部位を垂直の棒でそれらの名称とともに示す。斜体の文字（ＨおよびＩ）は、このプライマーセットで分析できない部位に相当する。
【図１３Ａ】対照被験体の３つの皮質領域におけるＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体編集プロフィールの変動。Ａ−対照の背外前頭前皮質(Dorsoprefrontal Cortex)（ＤＰＦＣｘ）、前帯状皮質(Anterior Cingulate Cortex)（ＡＣＣｘ）および内側嗅領皮質(Entorhinal Cortex)（ＥＲＣｘ）におけるＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体編集アイソフォームの比率（各領域ｎ＝１０）。３つの脳領域のうち２つで３％より高い比率を有する編集アイソフォームだけを示す（Ｂ、ＡＢＣ、Ｎｅ、ＢＥ、ＡＢＥ、ＡＢ）。平均の標準誤差（ＳＥＭ）を示す（ｎ＝１０）。Ｂ−対照におけるＤＰＦＣｘ、ＡＣＣｘおよびＥＲＣｘ間の編集アイソフォームの比率。個々の値は、正規分布を有するデータとなるように対数正規（ＬＮ）変換を行った。考慮する各アイソフォームについて、脳領域の個々の対照間に存在し得る総ての違いを計算した（ｎ＝１００）。脳領域間の平均比率は、上述の違いの平均値の指数関数的上昇として得られた。変動がない場合には比率＝１。有意性に関して、＊はｐ≦０．０５、＊＊はｐ≦０．００５、＊＊＊はｐ≦０．０００５、および＊＊＊＊はｐ≦０．００００５を表す。
【図１３Ｂ】対照被験体の３つの皮質領域におけるＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体編集プロフィールの変動。Ａ−対照の背外前頭前皮質(Dorsoprefrontal Cortex)（ＤＰＦＣｘ）、前帯状皮質(Anterior Cingulate Cortex)（ＡＣＣｘ）および内側嗅領皮質(Entorhinal Cortex)（ＥＲＣｘ）におけるＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体編集アイソフォームの比率（各領域ｎ＝１０）。３つの脳領域のうち２つで３％より高い比率を有する編集アイソフォームだけを示す（Ｂ、ＡＢＣ、Ｎｅ、ＢＥ、ＡＢＥ、ＡＢ）。平均の標準誤差（ＳＥＭ）を示す（ｎ＝１０）。Ｂ−対照におけるＤＰＦＣｘ、ＡＣＣｘおよびＥＲＣｘ間の編集アイソフォームの比率。個々の値は、正規分布を有するデータとなるように対数正規（ＬＮ）変換を行った。考慮する各アイソフォームについて、脳領域の個々の対照間に存在し得る総ての違いを計算した（ｎ＝１００）。脳領域間の平均比率は、上述の違いの平均値の指数関数的上昇として得られた。変動がない場合には比率＝１。有意性に関して、＊はｐ≦０．０５、＊＊はｐ≦０．００５、＊＊＊はｐ≦０．０００５、および＊＊＊＊はｐ≦０．００００５を表す。
【図１４Ａ】ＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体編集プロフィールは、対照に対して、鬱性自殺のＡＣＣｘでは有意に変更される。Ａ−対照と鬱性自殺（ｎ＝１０）の前帯状皮質（ＡＣＣｘ）におけるＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体編集アイソフォームの比率。編集アイソフォームは図１３において検討されたものである（３％を越える比率を有するＢ、ＡＢＣ、Ｎｅ、ＢＥ、ＡＢＥ、ＡＢ）。平均の標準誤差（ＳＥＭ）を示す（ｎ＝１０）。Ｂ−鬱性自殺と対照の間のＡＣＣｘにおける編集アイソフォーム割合の比率。考慮する各アイソフォームについて、対照と対照と比較される自殺においてＬＮ（各アイソフォームの割合）間に存在し得る総ての違いを計算した（ｎ＝１００）。自殺と対照の間の比率は、上述の違いの平均値の指数関数的上昇により得られた。変動がない場合には比率＝１。有意性に関して、＊はｐ≦０．０５、＊＊はｐ≦０．００５、＊＊＊はｐ≦０．０００５、および＊＊＊＊はｐ≦０．００００５を表す。
【図１４Ｂ】ＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体編集プロフィールは、対照に対して、鬱性自殺のＡＣＣｘでは有意に変更される。Ａ−対照と鬱性自殺（ｎ＝１０）の前帯状皮質（ＡＣＣｘ）におけるＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体編集アイソフォームの比率。編集アイソフォームは図１３において検討されたものである（３％を越える比率を有するＢ、ＡＢＣ、Ｎｅ、ＢＥ、ＡＢＥ、ＡＢ）。平均の標準誤差（ＳＥＭ）を示す（ｎ＝１０）。Ｂ−鬱性自殺と対照の間のＡＣＣｘにおける編集アイソフォーム割合の比率。考慮する各アイソフォームについて、対照と対照と比較される自殺においてＬＮ（各アイソフォームの割合）間に存在し得る総ての違いを計算した（ｎ＝１００）。自殺と対照の間の比率は、上述の違いの平均値の指数関数的上昇により得られた。変動がない場合には比率＝１。有意性に関して、＊はｐ≦０．０５、＊＊はｐ≦０．００５、＊＊＊はｐ≦０．０００５、および＊＊＊＊はｐ≦０．００００５を表す。
【図１５】自殺企図者の血液サンプルでは、ＡＤＡＲｓおよびＰＤＥ８ＡのｍＲＮＡ発現が変更されている。自殺企図者を自殺企図のない鬱病患者と比較した（ｎ＝２５）。ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂ、ＡＤＡＲ２およびＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ発現を全血(ＰＡＸｇｅｎｅチューブ)から、それぞれ下記の特異的プライマー：ＨＳ０１０２０７８０＿ｍｌ；ＨＳ０１０１７５９６＿ｍｌ；ＨＳ００２１０７６２＿ｍｌおよびＨＳ００４００１７４＿ｍｌ(Applied Biosystems References)を用いたＱ−ＰＣＲ技術によって測定した。結果を、ヒト白血球全ＲＮＡの参照プールで見られた各値と比較することにより正規化した。［参照遺伝子：グリセルアルデヒド−３リン酸−デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）およびβ２ミクログロブリン（β２Μ）］。有意性に関して、＊＊＊＊はｐ≦０．００００５を表す。
【実施例】
【００７３】
実施例Ｉ：材料および方法
１−細胞培養、ＩＦＮα処置、細胞溶解およびＲＮＡ抽出
ＳＨ−ＳＹ５Ｙヒト神経芽腫細胞系統をＥＣＡＣＣ（参照９４０３０３０４、ロット番号０６Ｈ０２１）から購入した。細胞を、１０％透析済みＦＣＳ（ＰＡＡ、参照Ａ１５−５０７、ロット番号Ａ５０７０８−００５０）、２ｍＭグルタミン（Ｓｉｇｍａ、Ｇ７５１３）およびＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ  Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  １倍混合物（Ｓｉｇｍａ、参照Ａ５９５５）を添加した高グルコースＤ−ＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ、参照Ｄ６５４６）中、３７℃、５％ＣＯ２の加湿雰囲気下で培養した。ｈＩＦＮα処置の前日、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を８枚の異なる６ウェルプレートに７．１０５細胞／ウェルの密度で播種した。翌日、培養培地を除去し、細胞を適正な濃度のｈＩＦＮα（ＰＢＬ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、参照１１１００１−１、ロット番号３７３４）とともに４８時間インキュベートした。試験当日に、ｈＩＦＮα保存溶液（−８０℃で保存した無菌１倍Ｄ−ＰＢＳ中１０５Ｉ．Ｕ／ｍｌ）を氷上で解凍した後、ＦＣＳおよびＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃを添加したＤ−ＭＥＭで終濃度が１、１０、１００、１０００および１０００ＩＵ／ｍｌとなるように即希釈した。各ウェルにおいて、細胞を２ｍｌの検量線用溶液で処理した。保存溶液のアリコートを一度だけ用いた。対照（ビヒクル）としては、細胞を、添加を行った２ｍｌのＤ−ＭＥＭで処理した。インキュベーション４８時間後、培地を排出し、１試験条件８ウェルに相当する細胞を、供給者が記載しているように、６００μｌのＰＬＴ溶解バッファー（Ｑｉａｇｅｎ、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓミニキット、参照７４１３４）中でそのまま溶解させた。
【００７４】
ＲＮＡの単離および精製は、本質的に製造者（Ｑｉａｇｅｎ、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓミニキット、参照７４１３４）が記載しているように行った。ホモジナイゼーションのため、細胞溶解液をまず、２ｍｌ回収試験管内に置いたＱＩＡシュレッダースピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ、参照７９６５６）に通した。次に、残留するゲノムＤＮＡを除去するために、流出液をＲＮｅａｓｙ  ＰｌｕｓミニキットのｇＤＮＡ  Ｅｌｉｍｉｎａｔｏｒスピンカラムに移した。その後、ＲＮｅａｓｙスピンカラム上でＲＮＡを精製し、４０μｌのＲＮアーゼ不含水で溶出させた。溶出したＲＮＡはさらなる試験のために氷上で維持するか、−３０℃で保存した。
【００７５】
各精製から得られた全ＲＮＡの量を、Ｑｕｂｉｔ蛍光計（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、参照Ｑ３２８５７）およびＱｕａｎｔ−ＩＴ  ＲＮＡ  ＢＲアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、参照Ｑ１０２１１）を用いて測定した。ＲＮＡの品質は、１μｇの材料を非変性１．５％アガロースゲルにのせることによって確認した。２８Ｓおよび１８Ｓ  ｒＲＮＡに相当するバンドの強度を各サンプルに対して確認した。
【００７６】
２−ヒト全血からのＰＢＭＣの単離およびＲＮＡ抽出
血液サンプル（２×５ｍｌ）をヘパリン処理試験管に採取し、プールし、等容量のＣａ２＋およびＭｇ２＋不含１倍ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）無菌溶液で希釈した。予温した３ｍｌの分離媒体（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ、参照１７−１４４０−０２）を満たした２本のＬｅｕｃｏＳｅｐチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ、参照１６３  ２８９または１６３  ２９０）を室温にて１０００ｇで３０秒遠心分離した。希釈した血液量の半量を２本の分離媒体含有ＬｅｕｃｏＳｅｐチューブのそれぞれに注意深く注いだ。
【００７７】
１０００ｇ、室温で１０分の遠心分離の後、高密度細胞画分を回収し、プールした（リンパ球／ＰＢＭＣ＝白いリング）。次に、細胞を１０ｍｌのＣａ２＋およびＭｇ２＋不含１倍ＰＢＳ無菌溶液で洗浄した。２５０ｇで１０分の遠心分離後、乾燥ペレットを１ｍｌのＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で破砕した。下記の相分離およびＲＮＡ沈降工程を製造者（ＴＲｉｚｏｌ試薬、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の説明書に従って行った。ＲＮＡペレットを１ｍｌの７５％エタノールで２回洗浄し、乾燥させ、５０μｌのＲＮアーゼ不含水に再懸濁させた。ＲＮＡ濃度は、Ｑｕｂｉｔ蛍光計（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｑ３２８５７）およびＱｕａｎｔ−ＩＴ  ＲＮＡ  ＢＲアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、参照Ｑ１０２１１）を用いて測定した。
【００７８】
３−ＣＥ−ＳＳＣＰ用の標準編集アイソフォームの構築
ｃＤＮＡの合成前に、１μｇの全ＲＮＡ（ヒト末梢血白血球全ＲＮＡ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、参照６３６５８０［５３名の男／女白色人種、年齢：２０〜５０のプール］およびヒト大脳皮質全ＲＮＡ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、参照６３６５６１［１０名の男／女白色人種、年齢：２０〜６８のプール］）を３７℃で３０分、１単位のＲＱ１  ＲＮアーゼ不含ＤＮアーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ、参照Ｍ６１０Ａ）で処理した。１μｌの停止溶液（２０ｍＭ  ＥＧＴＡ、Ｐｒｏｍｅｇａ、参照パート番号Ｍ１９９Ａ）を加えることにより反応を停止させた後、酵素の変性とＲＮＡの線状化の双方のために６５℃で１０分加熱した。その後すぐにＲＮＡを含有する試験管を氷上に置き、維持した。次に、ＤＮアーゼで処理したＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  Ｐｌｕｓ  Ｔａｑ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、参照１１１４６−０３２）とヒトＰＤＥ８Ａ遺伝子のイントロン９内に置かれた遺伝子特異的プライマーＰＤＥ８Ａ−ＲＴ：
【化２３】
0005879665.tif 000024
（配列番号５）を用いて逆転写させた。２０２ｂｐの断片を生じるＰＣＲ反応（最終容量５０μｌ）を、２μｌの逆転写産物に対して、１単位のＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、参照１１７０８−０１３）とイントロン９特異的プライマー（フォワードプライマー：
【化２４】
0005879665.tif 000025
（配列番号６）およびリバースプライマー：
【化２５】
0005879665.tif 000026
（配列番号７）；終濃度各０．３μΜ）を用いて行った。９５℃で５分の変性工程後、ＰＣＲは、３５サイクル（９５℃で３０秒、６２℃で３０秒、１０サイクル目以降、１サイクルごとに０．５℃減温、および６８℃で３０秒）、および６８℃で２分の最終伸長工程の後にその最終点に達した。増幅産物のアリコート（５μｌ）を用いて２％アガロース分析ゲル上でアンプリコンの量と品質を確認した。各ＰＣＲ反応の残りの４５μｌを分取２％アガロースゲルで泳動させた。長波長ＵＶ光下で、ＰＣＲ産物を含有するアガローススライスを切り取った後、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、参照２８７０４）を用いてＤＮＡを精製した。精製したＰＣＲ産物をｐＵＣ５７ベクター中へのクローニングおよび配列決定のためにＧｅｎｅＣｕｓｔに送った。両組織源（大脳皮質および白血球）から得られた１５０のクローンの配列決定を行った。配列分析はＢｉｏｃｏｒｔｅｃｈで行い、各編集アイソフォームの存在度を定量した。次に、種々の編集アイソフォームに相当するプラスミドを増幅し、ＣＥ−ＳＳＣＰ試験で標準として用いた。
【００７９】
４−逆転写およびネステッドＰＣＲ
ヒト全血ＲＮＡを、ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡキット５０（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ、参照７６２１７４）を製造者の説明書に従って用いて抽出した。全ＲＮＡをＲＱ１  ＲＮアーゼ不含ＤＮアーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ、参照Ｍ６１０Ａ）で３７℃にて３０分処理した。１μｌの停止溶液（２０ｍＭ  ＥＧＴＡ、Ｐｒｏｍｅｇａ、参照パート番号Ｍ１９９Ａ）を加えることにより反応を停止させた後、酵素の変性とＲＮＡの線状化の双方のために６５℃で１０分加熱した。その後すぐにＲＮＡを含有する試験管を氷上に置き、維持した。１μｇ、５００ｎｇ、２５０ｎｇ、１２５ｎｇまたは６２．５ｎｇのＤＮアーゼ処理済みＲＮＡを、Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  Ｐｌｕｓ  Ｔａｑ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、参照１１１４６−０３２）とヒトＰＤＥ８Ａ遺伝子のイントロン９内に置かれた遺伝子特異的プライマーＰＤＥ８Ａ−ＲＴ：
【化２６】
0005879665.tif 000027
（配列番号５）を用いて逆転写させた。４９５ｂｐの断片を生じる１回目のＰＣＲ反応（最終容量２５μｌ）を、１μｌの逆転写産物に対して、１単位のＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、参照１１１４６−０３２）とイントロン９特異的非標識プライマー（フォワードプライマー：
【化２７】
0005879665.tif 000028
（配列番号８）およびリバースプライマー：
【化２８】
0005879665.tif 000029
（配列番号９）；終濃度各０．３μΜ）を用いて行った。９５℃で３分の変性工程の後、ＰＣＲは、３５サイクル（９５℃で３０秒、５０℃で３０秒、および７２℃で３０秒）、および７２℃で２分の最終伸長工程の後にその最終点に達した。この１回目のＰＣＲの産物を２％アガロース分析ゲル上で確認した後、２回目のＰＣＲのために１：１００希釈した。１７５ｂｐの断片をもたらす、この２回目の反応（最終容量２５μｌ）を、１：１００希釈液１μｌに対して、１単位のＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、参照１１７０８−０１３）とイントロン９特異的標識プライマー（フォワードプライマー：
【化２９】
0005879665.tif 000030
（配列番号１０）およびリバースプライマー：
【化３０】
0005879665.tif 000031
（配列番号１１）；終濃度各０．３μΜ）を用いて行った。９４℃で４分の変性工程の後、ＰＣＲは、３５サイクル（９５℃で３０秒、５０℃で３０秒、および６８℃で３０秒）、および６８℃で２分の最終伸長工程の後にその最終点に達した。増幅産物のアリコート（５μｌ）を用いて２％アガロース分析ゲル上でアンプリコンの量と品質を確認した。
【００８０】
他のＲＮＡ源（Ｔヘルパー／インデューサーリンパ球（ＣＤ４陽性）からの全ＲＮＡ、Ｙｏｒｋｓｈｉｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、参照Ｎ１１２１；ヒト末梢血白血球全ＲＮＡ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、参照６３６５８０；ヒト大脳皮質全ＲＮＡ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、参照６３６５６１およびＰＢＭＣまたはＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞系統からの全ＲＮＡ）については、５００ｎｇの全ＲＮＡを逆転写させ、得られたｃＤＮＡを上記のようにネステッドＰＣＲにより増幅させた。
【００８１】
５−リアルタイムＰＣＲ分析によるＡＤＡＲ１ａ−ｐ１５０  ｍＲＮＡ発現の定量
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞におけるＡＤＡＲ１ａ  ｍＲＮＡの発現レベルを定量するために、第一鎖ｃＤＮＡを逆転写のより合成し（上記の通り）、ＴａｑＭａｎ定量的リアルタイムＰＣＲ分析（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を行った。定量的ＰＣＲに用いたプローブおよびプライマーはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手したものであった（Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ、Ａｓｓａｙ−Ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ）：
ＡＤＡＲ１ａ：参照Ｈｓ  ０１０２０７８０＿ｍｌ
ヒトＧＡＰＤＨ（製品番号４３２６３１７Ｅ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を各マルチプレックスＰＣＲにおいて内部対照として含めた。Ｑ−ＰＣＲとその後の分析を、９６ウェルブロックＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。総てのサンプルにおける標的遺伝子発現の定量を、式Ｃｔ（標的）−Ｃｔ（ＧＡＰＤＨ）＝ΔＣｔ（式中、Ｃｔは閾値サイクル数である）によってＧＡＰＤＨ発現に対して正規化した。非処理細胞からのサンプルの平均ΔＣｔ値を求め、ＩＦＮα処理細胞に相当するサンプルの参照点として用いた。個々の変動を含む、非処理細胞と処理細胞との差を、式ΔＣｔ（個々の処理サンプル）−ΔＣｔ（非処理サンプルの平均）＝ΔΔＣｔにより計算した。各サンプルにおける標的遺伝子発現の変化（ｎ倍）を、２ーΔΔＣｔにより計算し、それから平均および標準偏差（ＳＤ）を導いた。
【００８２】
６−キャピラリー電気泳動による一本鎖ｃＤＮＡ断片の分離（ＣＥ−ＳＳＣＰ）
ＦＡＭ標識およびＶＩＣ標識ｃＤＮＡ断片をそれらの独特な一本鎖構造多形（ＳＳＣＰ）の手段によって分析するために、蛍光ＰＣＲ産物（１：２０〜１：２００希釈液１μｌ）および脱イオン化ホルムアミド（１１μｌ）を、移動標準と編集アイソフォーム標準の混合物（０．５μｌ）に加えた。移動標準は、ＲＯＸ蛍光色素（Ｅｕｒｏｆｍｓ  ＭＷＧ  ｏｐｅｒｏｎｓ）で標識された種々のサイズのＰＣＲアンプリコンである。それらはキャピラリー内の電気泳動移動の較正のために用いられる。編集アイソフォーム標準（ＦＡＭ標識されたものとＶＩＣ標識されたものの双方）（構造は上記）は、種々のサンプル中に存在する種々の編集アイソフォームを明確に同定するために用いられる。添加前に、サンプルと標準の混合物を９０℃で２分間変性させ、その後すぐに氷上で冷やした。非変性電気泳動は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１００−Ａｖａｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて、グリセロールを含まない７％「ＰＯＰ（商標）Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｏｌｙｍｅｒ」（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、１倍Ｔｒｉｓ−ホウ酸−ＥＤＴＡを満たした８０ｃｍ長のキャピラリーにより行った。１５ｋＶで３分間予備泳動を行った後、サンプルを２ｋＶで１５秒間注入し、温度を厳密に２４℃に制御して１５ｋＶで１０５分間電気泳動を行った。これらの条件で、各編集アイソフォームに対して個々の保持時間を得た。ＲＮＡ編集のＣＥ−ＳＳＣＰ分析に用いた手順は、Ｐｏｙａｕおよび共同研究者ら（１６）により文献に詳細に記載されている。
【００８３】
７−複雑な混合物中の各ｃＤＮＡ形態の同定および相対的定量
ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１３０ｘｌｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒから得られた生データをＰｅａｋＦｉｔ（登録商標）（ｖ４．１１）ソフトウエアによるシグナルプロセシングのために抽出した。ベースラインの処理および各電気泳動特性（ＦＡＭ標識断片またはＶＩＣ標識断片）の正規化の後、種々の編集されたアイソフォームの相対存在量を、独自の時間単位でアイソフォームおよびサンプルシグナルのデコンボルーションを可能とする自家製ソフトウエアによって定量した。
【００８４】
８−タンパク質抽出およびウエスタンブロット分析
培養培地の排出後、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞をリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ、Ｇｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で２回洗浄し、破砕し、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１％デオキシコール酸ナトリウム、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］を含有し、プロテアーゼ阻害剤（１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニルおよびＣｏｍｐｌｅｔｅ（商標）ミニプロテアーゼ阻害剤カクテル［Ｒｏｃｈｅ］１錠）を添加した可溶化バッファー中、４℃で２時間可溶化させた。次に、この溶解液を４℃にて１３．０００ｘｇで１０分間遠心分離して細胞残渣をペレットとした。上清（透明溶解液）に存在するタンパク質をＱｕｂｉｔ蛍光計（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｑ３２８５７）およびＱｕａｎｔ−ＩＴタンパク質アッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、参照Ｑ３３２１１）を用いて定量した。
【００８５】
各試験条件に対応する透明溶解液７５μｇを４〜２０％  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  Ｐｒｅｃａｓｔ  Ｇｅｌｓ  参照３４５−００３３）上、１００Ｖにて３時間分離した。
【００８６】
次に、タンパク質（全細胞抽出物からの透明溶解液）をニトロセルロース膜（ニトロセルローストランスファーメンブランＰｒｏｔｒａｎ  ＢＡ  ８５、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ）に、Ｔｏｗｂｉｎバッファー(Towbin et al, 1979, PNAS, 76, 4350-4354)と半乾燥エレクトロトランスファーデバイス（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて転写した。転写後、膜をアジ化ナトリウム（０．１％）を添加したＴＢＳＴ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）中５％の脱脂乾燥ミルク中で２時間ブロッキングした。その後、この膜を同じバッファーで１：２００希釈した一次抗体（Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ、抗ＰＤＥ８Ａ（Ｃ−１５）参照ｓｃ−１７２３２）とともに室温で１６時間インキュベートした。ＴＢＳＴで数回洗浄した後、ブロットを１：１００００希釈したＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０抗ヤギ二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ２１０８８）とともにインキュベートした。その後、シグナルをＯｄｙｓｓｅｙ装置（ＬｉＣｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で読み取った。
【００８７】
９−特に５−ＨＴ２Ｃ受容体の編集プロフィールの決定のためのＣＥ−ＳＳＣＰ法
ＣＥ−ＳＳＣＰの決定に用いた方法は、すでにヒトサンプル（２００８年６月１３日に出願された特許ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０５７５１９、および２００９年１２月１７日に出願された特許ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０６７４６４）に記載されている。
【００８８】
実施例ＩＩ：ＰＤＥ８ＡのＡからＩへの編集はヒトを含むより進化した霊長類に特異的なものである
興味深いことに、図４に示されるように、ＰＤＥ８Ａヒト遺伝子（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧ）のイントロン９において編集されたことが表されている総てのアデノシンは、チンパンジーの対応するイントロン配列において保存されている。全体の同一性極めて高く＝４２８／４３２（９９％）、これらの２配列のアライメントにはギャップは存在しない＝０／４３２（０％）。これら２つのイントロン間のこの極めて高い配列の、およびおそらくは二次構造の類似性は、これらのアデノシン残基がヒト配列の場合と同様にチンパンジーでも編集される可能性があることを強く示唆する。
【００８９】
アカゲザル配列において、これらのアデノシンは一部が保存されている（図５参照）。実際に、編集部位Ａはアカゲザル配列には存在せず、全体の配列相同性はチンパンジーで見られるものよりも低い＝３９９／４３３（９２％）。さらに、１０ギャップ／４３３（２％）が検出され、これは二次元ＲＮＡ構造の保存性はより低いことを暗示する。マウスおよびラットゲノムに対する類似のＢＬＡＳＴ分析は、遺伝子ＰＤＥ８Ａのイントロン９の配列は、これらの他の２つの種では保存されていないことを示す。これらの結果は、遺伝子ＰＤＥ８Ａのイントロン配列（イントロン９）の潜在的編集が哺乳類では霊長類に限定されていることを示唆する。このように編集が保存されている機能的な理由は知られていないが、霊長類のより高度な脳の活動、および特に気分障害を含意しているかもしれない。最後に、ＰＤＥ８Ａ遺伝子のイントロン９における可能性のある編集部位は、ヒトおよびチンパンジーですでに同定されている保存されている８つの部位とともに、いくつかの霊長類種に特異的であると思われる。
【００９０】
実施例ＩＩＩ：このゲノム領域における編集部位の同定は、ヒト大脳皮質および白血球双方のＲＮＡ抽出物から得られた１５０のクローンに対して実現されたクローニングおよび配列決定技術によって完遂された（実施例１：材料および方法参照）
これらの新たな編集部位はＩ、Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎと呼ばれ、対応する、発現された編集アイソフォームを下表に示す。
【００９１】
表Ｉ：新たな編集部位および種々のヒト組織における対応する編集アイソフォーム
【００９２】
【表１】
0005879665.tif 000032
【００９３】
【表２】
0005879665.tif 000033
【００９４】
【表３】
0005879665.tif 000034
この発見のさらなる興味深い点は、脳および末梢ヒト組織ならびにヒト由来細胞系統において発現される各編集アイソフォームの標準の調製が可能となるということであった。これは方法の節に示されているように、ＲＴ−ＰＣＲ産物をｐＵＣ５７ベクターにサブクローニングすることによって実現された。
【００９５】
実施例ＩＶ：次に、ＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体の編集および非編集アイソフォームの分布の厳密な測定の条件をバリデートし、ここに一例として種々の組織または細胞において示した
このように、ヒト組織において、ＲＮＡ前駆体アイソフォームの２１４の理論的組合せに対してこれらの１４編集部位の同定を行うことができ、種々のヒト組織およびヒト細胞系統において編集プロフィールの複雑性の程度を確認することが重要であった。
【００９６】
典型的な例として、ヒト大脳皮質ＲＮＡ、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）全ＲＮＡ、全血ＲＮＡおよびＳＨ−ＳＹ５Ｙヒト細胞系統（神経芽腫由来）においてＰＤＥ８Ａの編集プロフィールを同定し、その定量をバリデートした（図参照）。これらの細胞において、インターフェロンα（２０〜５０％の処置患者において重篤な気分悪化作用を誘導することが知られている分子（１４、１５））の作用を評価し、編集酵素の活性の変更を追跡するための、編集プロフィールを決定するという着眼点を実証することを可能とした。全ＲＮＡ抽出物から出発し、初期全ＲＮＡ量を７０ｎｇ未満に制限することを可能とするため、かつ、キャピラリー電気泳動による発現されたアイソフォームの特異的分離を可能とする特異的に標識されたフォワードおよびリバース一本鎖の最良の組合せを得るために、７つの編集部位を含む遺伝子配列の増幅条件を試験した。最後に、最良の感受性（ＲＴのための最初のＲＮＡ材料６２ｎｇに対して十分な結果）および発現されたアイソフォームの十分な同定を得るために、以下の二段階ネステッドＰＣＲを下記プライマーを用いてバリデートした。
【００９７】
よって、定義されるプライマーは
１ｓｔ  ＰＣＲ／非標識プライマー：
ＰＤＥ８Ａ−１ＲＥＶ（配列番号１２）
【化３１】
0005879665.tif 000035
ＰＤＥ８Ａ−１ＦＷＤ（配列番号１３）
【化３２】
0005879665.tif 000036
２ｄ  ＰＣＲ／ＦＡＭ  ＦＷＤ標識およびＶＩＣ  ＲＥＶ標識プライマー：
ＰＤＥ８Ａ−２Ｒｅｖ  ＶＩＣ（配列番号１１）
【化３３】
0005879665.tif 000037
ＰＤＥ８Ａ−２ＦｏｗＦＡＭ（配列番号１０）
【化３４】
0005879665.tif 000038
である。
【００９８】
この選択は、最良の感受性（所定のサンプルにおける全ＲＮＡの初期濃度の使用限界）およびＰＣＲ産物の最良の信頼性および所定の組織において発現されたアイソフォームの大部分の良好な分離を可能とするのに最良な一本鎖の長さを決定するための、特異的スクリーニングからの結果であった（図７、８Ａ〜８Ｃおよび９Ａ〜９Ｂ参照）。
【００９９】
【表４】
0005879665.tif 000039
【０１００】
実施例Ｖ：編集酵素の活性の変更の信頼性のある指標としての編集アイソフォーム特性の同定
一例として、ＡＤＡＲ１ａ−１５０アイソエンザイムの発現の薬理学的変更によってもたらされる変更をＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞系統で試験した。結果を図１０にまとめる。
【０１０１】
このように、この細胞系統において、アイソフォームＢ発現の正の変動は明らかに濃度依存的であることが示される。ｎｅｄアイソフォームは、その変動がこの編集酵素の発現の変動と密接な相関があることから（図１１参照）、アイソフォームＢがもっぱらではなくとも主としてＡＤＡＲ１ａ−ｐ１５０によりもたらされることを示す対称的反比例で減少する。この試験から計算されたＥＣ５０％は、同じ細胞系統において同じ条件で５−ＨＴ２ｃＲの編集に関してすでに示されたＥＣ５０％と同程度の値であった。
【０１０２】
実施例ＶＩ：ＰＤＥ８Ａは脳において発現され、編集プロフィールが確認可能である
よって、それらの編集部位によって特徴付けられるＰＤＥ８Ａ  ＲＮＡ編集アイソフォームは、下記のように要約することができるプロセスに従って全脳ＲＮＡから同定することができる。
【０１０３】
材料および方法
脳は剖検時に採取し、輪切りにし、急速冷凍し、解剖まで−８０℃で保存した。脳外傷、中枢神経系病状、アルコール依存症または薬物使用障害は排除基準とした。脳サンプルは死因を知らない人によってアッセイおよび分析された。ｐＨは小脳で測定した。心理学的剖検を用いて、ＤＳＭ−ＩＶ第Ｉ軸および第ＩＩ軸診断を得た。
【０１０４】
対照被験体（ｎ＝１０）は自殺以外の原因で死亡し、生涯において第Ｉ軸の判定基準を満たさなかった。自殺（ｎ＝１０）は、自殺行動のコロンビア分類の判定基準を満たした。
【０１０５】
脳領域およびＲＮＡ抽出
背外前頭前皮質（ブロードマン野９、ＤＰＦＣｘ）、前帯状皮質（ブロードマン野２４、ＡＣＣｘ）および内側嗅領皮質（ブロードマン野２８／３４、ＥＲＣｘ）は鬱病および／または自殺において変更されていると一貫して関連づけられていたことから、これらを対象領域として選択した。組織の湿重（平均±ＳＥＭ）はＤＰＦＣｘで８０±４ｍｇ、ＡＣＣｘで８４±４ｍｇ、およびＥＲＣｘで８０±５ｍｇであった。
【０１０６】
全ＲＮＡをアフィニティーカラムからＲＮｅａｓｙ脂質組織ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離した。ゲノムＤＮＡの混入はオンカラムＤＮアーゼ消化によって除去した。全ＲＮＡの収量（２６０ｎｍでの吸光度）は１２〜５７μｇの範囲であった。各サンプルの逆転写に用いたＲＮＡの総量は、一様に１μｇであった。
【０１０７】
逆転写、ネステッドＰＣＲならびに各脳サンプルの同定および相対的定量
前記材料および方法の節に記載の通り。
【０１０８】
統計分析
個々の値は、正規分布を有するデータとなるように対数正規（ＬＮ）変換を行った。次に、発現された各アイソフォーム、検討される脳領域の各皮質、各被験体群を正確に指数化し、独立変数として用いた。対照個体の３領域（ＤＰＦＣｘ、ＡＣＣｘおよびＥＲＣｘ）において、または自殺と対照個体の１つの特定の領域（本実施例ではＡＣＣｘ）において測定されたアイソフォームをそれぞれＬＮ形質転換した比率間の、あり得る総ての差を判別ＡＮＯＶＡおよび適切な事後分析（Ｓｃｈｅｆｆｅ検定）により分析した。領域または被験体群の間に差がない場合にｐ値を示し、これらの差はｐ≦０．０５で有意とみなされる。
【０１０９】
結果
ＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体の編集プロフィールは３つの皮質領域で有意に異なり（図１３ＡおよびＢ）、鬱性自殺と対照とで変更されている（一例として図１４）
まず、本発明者らは、対照被験体の３つの脳領域［背外前頭前皮質（ＤＰＦＣｘ）、前帯状皮質（ＡＣＣｘ）および内側嗅領皮質（ＥＲＣｘ）］におけるＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体の編集プロフィールを確定した。３つの脳領域のうち少なくとも１つにおいて３％より高い比率を有する６つの編集アイソフォーム（Ｂ、ＡＢＣ、Ｎｅ、ＢＥ、ＡＢＥ、ＡＢ）を分析した（図１３Ａ参照）。これらの各アイソフォームについて、ＤＰＦＣｘ、ＡＣＣｘおよびＥＲＣｘにおけるそれらの割合の比率を図１３Ｂに示す。異なる領域間で、特に、３つの皮質領域において差次的に発現されるＡＢアイソフォームの場合に有意な変動が見られた（ＤＰＦＣｘとＥＲＣｘ、およびＡＣＣｘとＥＲＣｘを比較）。これらの結果は、対照被験体に脳における、代謝調節型レギュレーターとしてＰＤＥ８Ａを用いている細胞ネットワークの属性と機能的定常状態に応じたＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体編集の緻密な調節を明らかに示した。
【０１１０】
第二段階では、同じアイソフォームの割合を、３つの皮質領域において対照被験体と鬱性自殺とで比較した。一例として、鬱性自殺と対照のＡＣＣｘにおける６つのアイソフォームの割合を図１４Ａに示す。６つのアイソフォームのそれぞれについて、鬱性自殺と対照のそれらの割合の比率を図１４Ｂに示す。ＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体の編集プロフィールは鬱性自殺のＡＣＣｘにおいて有意に変更され、編集アイソフォームはおそらく種々の細胞コンパートメントでアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションを受けている。
【０１１１】
実施例ＶＩ：ＡＤＡＲｓおよびＰＤＥ８ＡのｍＲＮＡ発現は自殺企図者の血液サンプルにおいて変更されている
ＰＤＥ８Ａは、編集酵素と同様に全血中に存在する。
【０１１２】
従って、ＲＮＡ編集のこの標的が特定の自殺リスクの結果として変更されたのかどうかを調べるため、編集酵素およびＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡの発現のあり得る変更を検討することに着目した。編集酵素ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２と、それらの標的ＰＤＥ８Ａの発現のうち１つの双方の変更の例は、２つの患者集団においてこれらのマーカーを測定することによって実証された。１つは自殺企図直後に試験した鬱病被験体（特定の自殺リスク集団（ＳｕｉｃｉｄｅＡｔｔ）と考えられる）であり、対照として用いたもう１つのものは自殺企図のない鬱病（ＭＤ）として含められた。最初の結果を図１５にまとめる（全血中のこれらのバイオマーカーＲＮＡの濃度の定常状態を測定した後に得られた）。
【０１１３】
自殺企図者の血液における自殺傾向に関連するＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ発現の変更の例
自殺企図のない鬱病患者に比べて自殺企図者では編集酵素およびＰＤＥ８Ａの発現レベルの変更が見られた（ｎ＝２５）。ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂ、ＡＤＡＲ２およびＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡを全血（ＰＡＸｇｅｎｅ  ＲＮＡチューブ）から測定した。ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂ、ＡＤＡＲ２およびＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ定常状態濃度は、特異的プライマー（それぞれＨＳ０１０２０７８０＿ｍｌ；ＨＳ０１０１７５９６＿ｍｌ；ＨＳ００２１０７６２＿ｍｌおよびＨＳ００４００１７４＿ｍｌ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ参照）を使用して、５００ｎｇの全ＲＮＡサンプルからＱＰＣＲにより測定し、ヒト白血球全ＲＮＡの参照プールにおいて見られた個々の値と比較することにより正規化した。［参照遺伝子：グリセルアルデヒド−３リン酸−デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）およびβ２ミクログロブリン（β２Μ）］。本発明者らは、自殺企図者に見られる編集の極めて有意な変更に着目する。
【０１１４】
最後に、脳のＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ前駆体編集プロフィールは自殺者において変更されている。他方、編集酵素およびＰＤＥ８Ａの発現は、自殺企図者の血液において変更されている。ヒトおよびヒト以前の霊長類において独特なこの特定の調節能は、特に興味深い、血液検査により自殺リスクを評価する方法を提供する。
【０１１５】
本実施例は、自殺リスクに関連する編集プロセスの著しい変更を示す。編集酵素と同様にＰＤＥ８Ａが考えられ、この標的の非コード配列の編集がこの標的の調節に直接的または間接的に関与する可能性があることが示唆され得る。
【０１１６】
参照文献
0005879665.tif 000040
0005879665.tif 000041
0005879665.tif 000042
【図１】
0005879665.tif 000061
【図２】
0005879665.tif 000062
【図３Ａ】
0005879665.tif 000063
【図３Ｂ】
0005879665.tif 000064
【図４】
0005879665.tif 000065
【図５】
0005879665.tif 000066
【図６】
0005879665.tif 000067
【図７】
0005879665.tif 000068
【図８Ａ】
0005879665.tif 000069
【図８Ｂ】
0005879665.tif 000070
【図８Ｃ】
0005879665.tif 000071
【図９Ａ】
0005879665.tif 000072
【図９Ｂ】
0005879665.tif 000073
【図１０】
0005879665.tif 000074
【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
0005879665.tif 000078
【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【配列表】
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