(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
線形二本鎖ＤＮＡを提供する工程と、前記ＤＮＡを、エキソヌクレアーゼ活性を持つポリメラーゼ及び、前記ポリメラーゼと同じか異なるものでありエキソヌクレアーゼ活性が全部失われたポリメラーゼにより処理する工程と、を含み、
前記二本鎖ＤＮＡの末端は、平滑（ｂｌｕｎｔ）、５オーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）または３’オーバーハングであることを特徴とする、競争的抑制方式によるＤＮＡオーバーハング長さ調節方法。
【請求項２】
前記エキソヌクレアーゼ活性は、５’または３’方向の活性を持つことを特徴とする、請求項１に記載の競争的抑制方式によるＤＮＡオーバーハング長さ調節方法。
【請求項３】
前記エキソヌクレアーゼは、校正機能があるＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする、請求項１に記載の競争的抑制方式によるＤＮＡオーバーハング長さ調節方法。
【請求項４】
前記エキソヌクレアーゼ活性を持つポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ−類似ポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ＧＢ−Ｄ由来のＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ、またはＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ  ＫＯＤ１由来のＤＮＡポリメラーゼを含むことを特徴とする、請求項１に記載の競争的抑制方式によるＤＮＡオーバーハング長さ調節方法。
【請求項５】
前記エキソヌクレアーゼ活性を持つポリメラーゼは、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、イリドウイルス、バキュロウイルスを含むウイルス由来またはサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を含む真菌類由来であることを特徴とする、請求項１に記載の競争的抑制方式によるＤＮＡオーバーハング長さ調節方法。
【請求項６】
前記エキソヌクレアーゼ活性を持つポリメラーゼ及びエキソヌクレアーゼ活性が全部失われたポリメラーゼは、前記ＤＮＡの末端に５乃至１００ｎｔ長さのオーバーハングが形成されることができる比で混合されることを特徴とする、請求項１に記載の競争的抑制方式によるＤＮＡオーバーハング長さ調節方法。
【請求項７】
前記エキソヌクレアーゼ活性を持つポリメラーゼ及びエキソヌクレアーゼ活性が全部失われたポリメラーゼは、１〜１００：１〜１００のモル比で用いられることを特徴とする、請求項１に記載の競争的抑制方式によるＤＮＡオーバーハング長さ調節方法。
【請求項８】
前記方法は、４℃〜７２℃で１乃至６０分間実行されることを特徴とする、請求項１乃至７のうちいずれか一つに記載の競争的抑制方式によるＤＮＡオーバーハング長さ調節方法。
【請求項９】
請求項１乃至７のうちいずれか一つに記載の方法に用いられるエキソヌクレアーゼ活性を持つポリメラーゼ及びエキソヌクレアーゼ活性が全部失われたポリメラーゼを含むことを特徴とする、リガーゼ非依存性ＤＮＡ連結用キット。
【請求項１０】
前記エキソヌクレアーゼ活性を持つポリメラーゼ及びエキソヌクレアーゼ活性が全部失われたポリメラーゼは、別々にまたは混合された状態で含まれることを特徴とする、請求項９に記載のリガーゼ非依存性ＤＮＡ連結用キット。
【請求項１１】
前記エキソヌクレアーゼ活性を持つポリメラーゼ及びエキソヌクレアーゼ活性が全部失われたポリメラーゼは、１〜１００：１〜１００のモル比で混合されることを特徴とする、請求項１０に記載のリガーゼ非依存性ＤＮＡ連結用キット。
【請求項１２】
二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）連結方法において、
前記方法は、相補的末端を持つ二つ以上の線形ｄｓＤＮＡを提供する工程と、
前記線形ｄｓＤＮＡを、エキソヌクレアーゼ活性を持つポリメラーゼ及び、前記ポリメラーゼと同じか異なるものでありエキソヌクレアーゼ活性が全部失われたポリメラーゼの混合物と反応する工程と、
前記二つ以上の線形ｄｓＤＮＡは前記混合物での処理によってその末端に５−１００ｎｔのオーバーハングが生成されて、前記オーバーハング間の相補的結合によって前記二つ以上の線形ｄｓＤＮＡが互いに結合する工程と、
を含むことを特徴とする、二本鎖ＤＮＡ連結方法。
【請求項１３】
前記二つの中一つのｄｓＤＮＡは、クローニングベクターであり、前記方法は、前記ｄｓＤＮＡ結合工程後に、前記結合物をバクテリアに形質転換する工程を含むことを特徴とする、請求項１２に記載の二本鎖ＤＮＡ連結方法。
【請求項１４】
前記エキソヌクレアーゼは、校正機能があるＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする、請求項１２に記載の二本鎖ＤＮＡ連結方法。
【請求項１５】
前記エキソヌクレアーゼ活性を持つポリメラーゼ及びエキソヌクレアーゼ活性が全部失われたポリメラーゼは、１〜１００：１〜１００のモル比で用いられることを特徴とする、請求項１２に記載の二本鎖ＤＮＡ連結方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、核酸物質の末端一本鎖の長さ調節に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子組換え技術の具現またはＤＮＡ断片のクローニング等において、核酸を連結するライゲーションが必須である。ライゲーションは、ＤＮＡの末端の形態によって効率が変わりうる。線形二本鎖ＤＮＡは、末端の最後の塩基まで二本鎖である平滑末端（ｂｌｕｎｔ  ｅｎｄｓ）、または、末端にいくつかの塩基が３’末端または５’末端で一本鎖として存在するオーバーハング末端（ｏｖｅｒｈａｎｇ  ｅｎｄｓ）の形態で存在する。平滑末端の場合、またはオーバーハングの長さが短い場合、ライゲーションの効率が低い傾向がある。
【０００３】
クローニング等に用いられるこのような連結法は、大きくリガーゼという酵素を用いる方法と、リガーゼ非依存的方法（Ｌｉｇａｓｅ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）に分けることができ、ＰＣＲによる遺伝子操作及びクローニングの普遍化に伴って、より迅速かつ高効率の後者の方法が多く用いられている。前者の場合、ライゲーションを用いない場合に比べて効率が低くて、効率を高めるための方法が開発された。
【０００４】
特許文献１は、ライゲーション効率の向上方法に関し、リガーゼ以外に分子量１０００Ｄａ以下の直鎖または分枝鎖のジオールまたはポリオールを用いられたライゲーションの向上方法を開示する。
【０００５】
リガーゼ非依存的方法の例としては、イン・ビボ組換えを基にしたクローニング（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｂａｓｅｄ  ｃｌｏｎｉｎｇ）と、エキソヌクレアーゼに基づくクローニング方法が好まれている。後者の例として、特許文献２はＤＮＡ連結方法に関するもので、エキソヌクレアーゼを利用したライゲーション方法を開示する。
【０００６】
エキソヌクレアーゼを用いる場合、ライゲーションの効率が末端オーバーハングの長さに非常に依存的であり、これに対する調節方法の開発が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国公開特許  第２０１２−０２８３１４４号公報
【特許文献２】米国特許  第７，５７５，８６０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本願は、ＤＮＡ末端のオーバーハングを調節できる方法を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一様態において本願は、線形二本鎖ＤＮＡを提供する工程と、前記ＤＮＡを、エキソヌクレアーゼ活性を持つポリメラーゼ及び、前記ポリメラーゼと同じか異なるものでありエキソヌクレアーゼ活性が一部または全部失われたポリメラーゼにより処理する工程とを含み、前記二本鎖ＤＮＡの末端は、平滑、５’オーバーハングまたは３’オーバーハングである、競争的抑制方式によるＤＮＡオーバーハング長さの調節方法に関する。本願による一具現例において前記エキソヌクレアーゼ活性は３’→５’または５’→３’の活性を持って、一具現例では３’→５’活性を持つ。他の具現例において本願の方法に用いられるエキソヌクレアーゼは校正機能があるＤＮＡポリメラーゼで、例えばＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ−類似ポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ＧＢ−Ｄ由来のＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ、またはＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ  ＫＯＤ１由来のＤＮＡポリメラーゼを含むが、これらに制限されない。さらに他の具現例において前記エキソヌクレアーゼ活性を持つポリメラーゼは、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、イリドウイルス、バキュロウイルスを含むウイルス由来またはサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を含む真菌類由来であってもよい。
【００１０】
本願の方法において、前記エキソヌクレアーゼ活性を持つポリメラーゼ及びエキソヌクレアーゼ活性が一部または全部失われたポリメラーゼは、前記ＤＮＡの末端に５乃至１００ｎｔ長さのオーバーハングが形成されることができる比で、例えば約１〜１００：約１〜１００のモル比で用いられるか、用いられる具体的なポリメラーゼの種類及び活性の失われる程度により変わる。
【００１１】
他の側面で本願は、本方法に用いられるエキソヌクレアーゼ活性を持つポリメラーゼ及びエキソヌクレアーゼ活性が一部または全部失われたポリメラーゼを含む、リガーゼ非依存性ＤＮＡ連結用キットを提供する。本キットに含まれる前記エキソヌクレアーゼ活性を持つポリメラーゼ及びエキソヌクレアーゼ活性が一部または全部失われたポリメラーゼは、別々にまたは混合された状態で含まれてもよく、混合比は、例えば約１〜１００：１〜１００のモル比であってもよい。
【００１２】
他の様態で本願は、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の連結方法であって、相補的末端を持つ二つ以上の線形ｄｓＤＮＡを提供する工程と、前記線形ｄｓＤＮＡを、エキソヌクレアーゼ活性を持つポリメラーゼ及び、前記ポリメラーゼと同じか異なるものでありエキソヌクレアーゼ活性が一部または全部失われたポリメラーゼの混合物と反応する工程と、前記二つ以上の線形ｄｓＤＮＡは前記混合物での処理によってその末端に約５ｎｔ〜１００ｎｔのオーバーハングが生成されて、前記オーバーハング間の相補的結合によって前記二つ以上の線形ｄｓＤＮＡが互いに結合する工程とを含む、二本鎖ＤＮＡ連結方法を提供する。
【００１３】
本願に係る具現例において、前記二つの中一つのｄｓＤＮＡは、クローニングベクターで、前記方法は、前記ｄｓＤＮＡ結合工程後に、前記結合物をバクテリアに形質転換する工程を含む。
【発明の効果】
【００１４】
本願に係る方法及び組成物を利用したライゲーションの場合、オーバーハングの調節の容易性と正確性によって、エキソヌクレアーゼを利用したライゲーション効率が向上して、ＤＮＡ断片、ＰＣＲ産物のクローニングを含む多様な遺伝子組換え実験及びクローニングに有用に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】エキソヌクレアーゼを利用した一般的ＤＮＡライゲーション方法の模式図である。
【図２Ａ】エキソヌクレアーゼ活性を持つポリメラーゼの量によって異なるように生成されるＤＮＡ断片の種類を示す。
【図２Ｂ】エキソヌクレアーゼ活性を持つポリメラーゼの処理時間（５分〜１２０分）によって異なるように生成されるＤＮＡ断片の種類を示す。
【００１６】
図２Ａ及び２Ｂにおいて、エキソヌクレアーゼ機能を持つ代表的なＤＮＡポリメラーゼのうち一つであるＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて３’エキソヌクレアーゼ活性を測定した結果、ポリメラーゼの量及び時間が増加するほど切断されるｄｓＤＮＡ量及び切断される長さが増加した。実験に用いられた基質は図面上側に示し、予測される産物の構造は右側に表示した。
【図３】本願の一具現例に係る突然変異エキソヌクレアーゼとの競争的抑制方式によるエキソヌクレアーゼの活性調節結果を示す。（Ａ）は、野生型ＫＯＤの量を固定して突然変異ＫＯＤの量を１：０〜１：４割合で徐々に増加させながら反応した結果で、１４ｎｔ長さを基準にそれより大きい産物（ｕｐｐｅｒ）及びそれより小さい（ｌｏｗｅｒ）産物で区分して定量した。（Ｂ）は、Ａ実験で定量した値をグラフで示した結果である。
【図４】本願の一具現例に係る競争的抑制方法によってクローニング効率を測定した結果である。（Ａ）は、各々１ｋｂと３ｋｂ長さのＤＮＡ断片を、ベクターをクローニングした結果であり、黒棒グラフは生成されたコロニーの数（左側軸）を示し、斜線棒グラフは前記生成されたコロニー中目的するＤＮＡが挿入されたベクターを含むか否かによって判断されたクローニング成功率（右側軸）を示す。（Ｂ）は、クローニング成功率を確認するためにコロニーＰＣＲを行った結果で、左側矢印はクローニング成功時に予想されるＰＣＲ産物の大きさを示す。
【図５】エキソヌクレアーゼによってＤＮＡオーバーハング生成時の長さによるライゲーション効率を比較した模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本願は、競争的抑制方式によってエキソヌクレアーゼ活性を調節し、これによって生成されるオーバーハングの長さを調節することができる発見に基づいたものである。
【００１８】
リガーゼを用いないＤＮＡ連結方法では、ＤＮＡの両末端が、例えば３’→５’エキソヌクレアーゼ活性によって除去されて、適切な長さの５’オーバーハングが形成されることが重要で、また、５’→３’エキソヌクレアーゼを用いる場合は、適切な長さの３’オーバーハングが生成されることが重要である。エキソヌクレアーゼ、例えば３’→５’エキソヌクレアーゼの活性が弱い場合には、短い長さ、例えば５ｎｔ以下の５’ｓｓＤＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ）末端領域が形成されて相補鎖間のアニーリングが起こらず、その結果ライゲーション処理が難しくなる（図５のＡ参照）。逆に、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が強い場合は、長い５’ｓｓＤＮＡ末端領域が形成されて、これによって一本鎖領域で二次構造が形成され、ライゲーション効率が非常に低くなる（図５のＣ参照）。従って、リガーゼ非依存的ＤＮＡ連結方法で二次構造を形成しない、かつ、二つの相同配列間の安定したアニーリングを誘導できる適切な長さのオーバーハングの長さの調節が効率的で、成功的なライゲーションに大変重要である（図５のＢ参照）。
【００１９】
本願で用いられたＤＮＡと関連して用いられた用語ライゲーション、連結は、二つ以上のＤＮＡ断片を連結して一つの断片に作るもので、相互交換的に用いられる。
【００２０】
本願で用いられた用語二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）は、全部または一部が相補的な二つの鎖のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドであって、合成されたものであるか、細胞または組織から抽出されたものであってもよく、３’オーバーハング、５’オーバーハングまたは平滑末端を持ってもよい。本願に係る一実施例において、ｄｓＤＮＡはＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）産物であるか、誘電体ＤＮＡまたはプラスミドまたはベクターの物理的または酵素を利用した切断産物であってもよい。
【００２１】
本願で用いられた用語オーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）は、ｄｓＤＮＡの両末端において一本鎖で存在する部分を指すものであって、一本鎖で存在する部位の方向性によって５’オーバーハングまたは３’オーバーハングに区分される。オーバーハングは、例えば制限酵素による切断、エキソヌクレアーゼ処理、適切なｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）の付加によって生成できて、その長さも多様であってもよい。
【００２２】
従って、一様態で本願は、線形二本鎖ＤＮＡを提供する工程と、前記ＤＮＡを、エキソヌクレアーゼ活性を持つポリメラーゼ及び前記ポリメラーゼと同じか異なるものでありエキソヌクレアーゼ活性が欠如したポリメラーゼにより処理する工程とを含み、前記二本鎖ＤＮＡの末端は、平滑、５’オーバーハングまたは３’オーバーハングである、競争的抑制方式によるＤＮＡオーバーハング長さの調節方法に関するものである。
【００２３】
本願の方法に用いられるエキソヌクレアーゼ活性を持つＤＮＡポリメラーゼは、内在的３’→５’または５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を持つものであって、相補的末端を持つ二つのＤＮＡ末端を連結できる機能を持つ。このような機能を持つ限り多様な由来のポリメラーゼが本願において用いることができる。
【００２４】
本願の方法には、多様な好熱性、中温性のポリメラーゼを用いることができる。例えば、これに制限するのではないが、Ｔｈｅｒｍｕｓ属菌株由来のポリメラーゼであるＴａｑポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ、高精度融合ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、速度向上領域を含むＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ−類似ポリメラーゼ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、ＵＳＡ）、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ、ＵＳＡ）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ＧＢ−Ｄ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、ＭＡ）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、またはＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ  ＫＯＤ１由来のＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ、Ｔｏｙｏｂｏ、Ｊａｐａｎ）を含む。他の側面では、その由来を基準に、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、イリドウイルス、バキュロウイルスを含むウイルス由来ＤＮＡポリメラーゼ、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のような真菌類由来のＤＮＡポリメラーゼを用いることができる。
【００２５】
本願に係る一具現例では、特に校正機能がある、即ち３’→５’エキソヌクレアーゼ機能があるポリメラーゼ（ｐｒｏｏｆｒｅａｄｉｎｇ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）が用いられる。本願の目的を達成する限り、多様な校正機能を持つポリメラーゼが用いられ、このようなポリメラーゼは、一般に３’→５’エキソヌクレアーゼ活性により、ＤＮＡ合成中に誤って組み込まれたヌクレオチドを除去して相補性に合うヌクレオチドに入れ替える役割をするが、反応物のｄＮＴＰの存在の有無により活性が変わる。即ち、反応物にｄＮＴＰが存在する場合は、主にＤＮＡ合成に関与するが、反応物にｄＮＴＰが存在しない場合は、主に３’→５’エキソヌクレアーゼ機能が活性化してＤＮＡのヌクレオチドを除去する。
【００２６】
本願の方法に用いられる二本鎖ＤＮＡの末端は、平滑、５’オーバーハングまたは３’オーバーハングであってもよい。
【００２７】
一般に、ポリメラーゼの３’→５’エキソヌクレアーゼ活性は、結合したＤＮＡの３’末端を連続的に（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｅ）除去していくので、所望の適切な長さを持つ同じオーバーハングを多く生成するよりも、長いオーバーハングから短いオーバーハングまで多様な長さのオーバーハングが生成され、ポリメラーゼの量を増加させるほど長いオーバーハングがさらに多く生成されるように、クローニングの効率を減少させる（図２参照）。
【００２８】
本願に係る方法は、上述したエキソヌクレアーゼ機能を持つＤＮＡポリメラーゼと共に、上述したポリメラーゼと同じか異なるものでエキソヌクレアーゼ機能が全部または一部失われたＤＮＡポリメラーゼが共に用いられる場合、競争的抑制方法によってオーバーハングを調節することができる。
【００２９】
競争的抑制に用いられるポリメラーゼは、例えば野生型ポリメラーゼにエキソヌクレアーゼの機能が不活性化された突然変異（ｅｘｏ−）が発生したものを含み、公示された多様なものが用いられる。このようなポリメラーゼの例としては、ＫＯＤポリメラーゼの２１０番目残基がアスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）からアスパラギン酸に置換された突然変異が誘発されたものを含むが、これに制限されない。
【００３０】
このようなエキソヌクレアーゼ機能があるポリメラーゼと、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性だけが不活性化されたｅｘｏ−突然変異ポリメラーゼとを組合で用いる場合、ｅｘｏ−突然変異はＤＮＡに結合はできるが、エキソヌクレアーゼの機能をすることができなく、結果的に正常ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ機能を阻害して、一定の長さ以上を切断できないように調節できるのである。
【００３１】
本願に含まれるエキソヌクレアーゼ機能があるポリメラーゼと３’→５’エキソヌクレアーゼ活性だけが不活性化されたｅｘｏ−突然変異の混合比は、目的とするオーバーハングの長さにより変わり得る。本願の方法は、リガーゼ非依存性ＤＮＡ連結方法に有効に用いられ、この場合オーバーハングによって提供される一本鎖間の相補性による十分な結合力を提供することができ、二次構造が形成されない範囲の長さで形成されなければならない。このようなオーバーハングの長さは、例えば約５ｎｔ〜１００ｎｔ、約５ｎｔ〜約５０ｎｔ長さである。５ｎｔより小さい場合は、相補性による結合力が弱くて、アニーリングがよく起きないこともあり（図６のＡ参照）、１００ｎｔを越える場合、分子内二次構造形成によりアニーリングの効率が落ちる（図６のＣ参照）。
【００３２】
上述した条件を満たすためのオーバーハングを形成するための、エキソヌクレアーゼ機能があるポリメラーゼと３’→５’エキソヌクレアーゼ活性だけが不活性化されたｅｘｏ−突然変異の比は、従って具体的オーバーハングの長さにより変わり、また用いられる具体的なポリメラーゼ及び突然変異による３’→５’エキソヌクレアーゼ活性程度、その他反応条件により変わる。一具現例では、ＫＯＤ及び３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が全部失われたＫＯＤが用いられて、約１４ｎｔの長さのオーバーハングを生成するために、前記ポリメラーゼは、約１：４のモル比で用いられる。３’→５’エキソヌクレアーゼの活性で５’オーバーハングが生成されて、連結に参加する全ｄｓＤＮＡのオーバーハングの長さは同じでなくてもよく、また、オーバーハングの全配列にわたって相補的でなくてもよい。これにより、相補的オーバーハング間に結合が起きた後ギャップが存在する。このようなギャップは、バクテリアのような細胞で増幅時満たされることになる。
【００３３】
エキソヌクレアーゼ機能があるポリメラーゼの反応条件は公知のもので、当業者ならば本願の目的を考慮して適切な条件を選択することができることである。
【００３４】
例えば、エキソヌクレアーゼ機能のある多くのポリメラーゼは、機能のために２価の陽イオンを必要とする。このような陽イオンは、マグネシウムまたはマンガンを含むが、これに制限するのではない。このような陽イオンは、ＤＮＡ増幅が行われる程度の量で用いられるか、またはエキソヌクレアーゼ活性が生じ得る程度の量で用いられる。反応時間は、用いられる具体的なポリメラーゼ及び用いられる２価の陽イオンの種類、培養温度により変わる。適切な反応時間は、例えば約１分〜約１００分であるが、これに制限するのではない。
【００３５】
反応温度は、主に用いられるＤＮＡポリメラーゼの特性により決定される。温度の上限は、ポリメラーゼの安定性の有無により決定されて、温度の下限は、ポリメラーゼの活性により決定される。例えば、好熱性ＤＮＡポリメラーゼの場合、反応温度は、−２０℃〜１０５℃、特に４℃〜９５℃である。一具現例では１０℃〜５０℃である。
【００３６】
他の様態において、本願はさらに、前記方法に用いられるエキソヌクレアーゼ機能があるポリメラーゼと、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性だけが不活性化されたｅｘｏ−突然変異の組合せとを含む、リガーゼ非依存性ＤＮＡライゲーション組成物またはキットに関する。本願に係るキットまたは組成物に含まれる前記ポリメラーゼは、上述した通りである。キットに含まれるポリメラーゼの場合、各ポリメラーゼは混合された、または、個別的に含まれることができる。個別的に含まれる場合、使用前に適切な比で混合されて用いられる。キットは、用途に合う使用案内書をさらに含んでもよい。
【００３７】
他の様態において、本願はさらに、上述したオーバーハング調節方法を利用する二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）連結方法に関するものである。本願に係る方法は、相補的末端を持つ二つ以上の線形ｄｓＤＮＡ提供する工程と、前記線形ｄｓＤＮＡを、エキソヌクレアーゼ活性を持つポリメラーゼ及び前記ポリメラーゼと同じか異なるものを以てエキソヌクレアーゼ活性が一部または全部失われたポリメラーゼの混合物と反応する工程と、前記二つ以上の線形ｄｓＤＮＡは、前記混合物への処理によってその末端に約５ｎｔ〜１００ｎｔのオーバーハングが生成され、前記オーバーハング間の相補的結合によって前記二つ以上の線形ｄｓＤＮＡが互いに結合する工程とを含む。
【００３８】
一具現例で、前記連結方法はＤＮＡクローニング方法であって、この場合、前記二つの中一つのｄｓＤＮＡはクローニングベクターであり、前記方法は、前記ｄｓＤＮＡ結合工程後に、前記結合物をバクテリアに形質転換する工程を含む。本願で用いられた用語ベクターとは、組換えベクター、クローニングベクター、発現ベクターと相互交換的に用いられ、原核及び/または真核細胞で自己複製が可能なＤＮＡ分子のことを言い、一般に遺伝子またはＤＮＡ断片を細胞などに伝達するための中間伝達体として用いられる。ベクターは、通常、原核及び/または真核細胞で複製できる複製原点、抗生剤分解酵素のような特定条件／物質に抵抗性を付与できる選別マーカー遺伝子、真核または原核細胞における遺伝子の転写が可能なプロモーター、翻訳が可能な配列を含むが、これに制限するのではない。
【００３９】
リン酸カルシウム法（calcium phosphate transfection）、電気穿孔、ショットガン法などバクテリアに形質転換方法及びこれに用いられるバクテリアは公知のもので、当業者ならば具体的な実験目的により適切なものを選択することができる。
【００４０】
本願に係る具現例で、前記エキソヌクレアーゼは、校正機能があるＤＮＡポリメラーゼであり、これについては前述の通りである。
【００４１】
本願の方法において、クローニングに用いられるｄｓＤＮＡは、ＰＣＲ産物または化学的合成法で製作されたオリゴヌクレオチドのような合成ＤＮＡ、または細胞または組織由来のゲノムＤＮＡまたはベクターである。このようなｄｓＤＮＡは、線形でない場合、制限酵素処理などのような適切な公示方法によって線形化されてもよい。
【００４２】
二つ以上の本願の方法に用いられるｄｓＤＮＡは、結合のために各々その末端に互いに相補的な特定長さの配列を含む。相補的配列は、自然に存在するかまたは人工的に導入可能で、このような相補的配列は、制限酵素処理、特定配列を持つプライマーを利用したＰＣＲ、ｉｎｖｅｒｓｅＰＣＲなどで生成されてもよい。
【００４３】
このような相補的末端を持つ二つ以上のｄｓＤＮＡは、ｄＮＴＰ不在下で、エキソヌクレアーゼ活性を持つポリメラーゼ及び前記ポリメラーゼと同じか異なるものであり、エキソヌクレアーゼ活性が一部または全部が失われたポリメラーゼの混合物により処理する時オーバーハングが生成されて、末端の相補的結合によって連結される。結合後のオーバーハングの長さ、相補性がある部分の程度によりギャップが生成され、ギャップは、形質転換でバクテリアに導入時、複製過程においてギャップ部位に相応する相補的配列で埋められることになる。
【００４４】
本願の方法に用いられることができるエキソヌクレアーゼの種類及び混合比、反応条件は前述の通りである。
【００４５】
以下、本発明の理解を助けるために実施例を提示する。しかし下記の実施例は、本発明をより理解しやすくするために提供されるだけであって、本発明が下記の実施例に限定されるものではない。
（実施例）
[実施例１：競争的抑制方式による５’オーバーハング長さの調節]
競争的抑制によるオーバーハング長さ調節の有無を次の通り行った。野生型３’→５’エキソヌクレアーゼでＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ  ＫＯＤ１由来ＫＯＤ及び野生型と同じであるが３’→５’エキソヌクレアーゼ活性だけが特異的に不活性化されたｅｘｏ−ＫＯＤポリメラーゼ突然変異（Ｎ２１０Ｄ、２１０番目アミノ酸をアスパラギンがアスパラギン酸に置換）を次の文献に記載された通り製作して大腸菌で発現して用いた。（Nishioka M,et al.,2001.Long and accurate PCR with a mixture of KODDNA polymerase and its exonuclease deficient mutant enzyme.J Biotechnol.2001Jun 15;882:141-9.）
競争的抑制実験のために、まず野生型ＫＯＤポリメラーゼを１０ｆｍｏｌで固定した後、そこにｅｘｏ−突然変異ＫＯＤポリメラーゼを５ｆｍｏｌから４０ｆｍｏｌまで徐々に増加させながらＤＮＡ断片と３７で１５分間反応させた。用いられたＤＮＡ断片は次の通り準備した。用いられたＤＮＡ配列：Ｆｏｒｗａｒｄ  ｓｔｒａｎｄ
５’−ＣＧＡＡＣＡＡＴＴＣＡＧＣＧＧＣＴＴＴＡＡＣＣＧＧＡＣＧＣＴＣＧＡＣＧＣＣＡＴＴＡＡＴＡＡＴＧＴＴＴＴＣ−３’５２ ｎｔ,Ｒｅｖｅｒｓｅ ｓｔｒａｎｄ
５’−ＧＡＡＡＡＣＡＴＴＡＴＴＡＡＴＧＧＣＧＴＣＧＡＧＣＧＴＣＣＧＧＴＴＡＡＡＧＣＣＧＣＴＧＡＡＴＴＧＴＴＣＧ−３’５２ ｎｔ,Ｆｏｗｒａｒｄ ｓｔｒａｎｄの５に[３２Ｐ]と標識した後、Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｓｔｒａｎｄと混ぜて１００℃で５分間変成させた後、徐々に冷ましながらアニーリングしてｄｓＤＮＡを作製した。前記二本鎖ＤＮＡは、完全に相補的であるため、末端の形態は平滑である。バッファーは、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．９、７０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０１ｍｇ/ｍｌのＢＳＡ、１ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含む。
【００４６】
結果は、図３に示されている。図３に示すように、野生型ＫＯＤのみを入れた場合には、３’末端から１４ｎｔが切られた産物（ｕｐｐｅｒ  ｐｒｏｄｕｃｔ、３８ｎｔ）の比率が２８％に過ぎなかったが、ｅｘｏ−突然変異ＫＯＤポリメラーゼを追加した場合は、最大４６％まで約２倍増加したのを確認することができた。
【００４７】
対照的に、３’末端から１５ｎｔ〜４０ｎｔ程度切られた産物（ｌｏｗｅｒ  ｐｒｏｄｕｃｔ、１２ｎｔ〜３２ｎｔ）の量は、突然変異を用いなかった場合と比較して約半分ほどに減少したことが分かった。
【００４８】
すべての反応において、ｅｘｏ−突然変異ＫＯＤポリメラーゼの添加は、全体生成産物の量に大きい影響を与えていなかった（図３のＡ、Ｔｏｔａｌ  ｃｌｅａｖｅｄ）。
【００４９】
このような結果は、野生型ＫＯＤポリメラーゼと、ｅｘｏ−突然変異ＫＯＤポリメラーゼとを共に用いた場合、野生型ＫＯＤポリメラーゼの活性を競争的に抑制して、最適の長さの５’オーバーハングを生成する可能性があることを示すものである。
【００５０】
[実施例２：競争的抑制方法によるクローニング効率向上]
野生型ＫＯＤポリメラーゼと、ｅｘｏ−突然変異ＫＯＤポリメラーゼとを共に用いて、５’オーバーハングを最適な長さに調節した場合、実際クローニング効率を増大させるかを調べるために次のように実験を行った。
【００５１】
野生型ＫＯＤポリメラーゼ０．５ｐｍｏｌを基準に、野生型ＫＯＤポリメラーゼとｅｘｏ−突然変異ＫＯＤポリメラーゼ酵素は１：０、１：１、及び１：４のモル比で用いた。前記各比率の混合酵素を、２ｋｂの平滑末端を持つＰＣＲ断片４０ｎｇとＳｍａＩで線形化されたｐＵＣ１９ベクター８０ｎｇと共に３７℃で１５分間ＤＮＡ連結反応を行って、バッファーは実施例１と同様である。
【００５２】
反応後の産物をＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αに、リン酸カルシウム法により形質転換した後、アンピシリンを含むプレートに塗抹した後３７℃でコロニーが形成される時まで培養した。
【００５３】
結果は、図４に示されている。図４に示したように、野生型ＫＯＤポリメラーゼとｅｘｏ−突然変異ＫＯＤポリメラーゼの比率を１：０、１：１、そして１：４の割合で用いた結果、ｅｘｏ−突然変異ＫＯＤポリメラーゼを添加した場合、コロニーの数が最大２倍以上増加するのを確認することができた。また、用いられた三つの条件で共に９０％以上のクローニング成功率を示した。また、４℃、２５℃、３７℃、及び５０℃で同じ実験を行った結果、他の温度でより３７℃において２倍〜３倍以上コロニーが生成された。
【００５４】
このような結果は、競争的抑制方式によって、５’オーバーハングの長さを最も適した形で調節してクローニング効率を向上させる可能性があることを示すものである。
【００５５】
以上、本願の例示的な実施例に対して詳細に説明したが、本願の権利範囲はこれに限定されるのではなく、次の請求範囲で定義している本願の基本概念を利用した当業者の様々な変形及び改良形態も本願の権利範囲に属する。
【００５６】
本発明で使われたすべての技術用語は、別途定義されない限り、本発明の関連分野で通常の当業者が一般的に理解するものと同じ意味で使われる。本明細書に参考文献と記載されるすべての刊行物の内容は、本発明に導入される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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