(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
昆虫細胞において組換えタンパク質を発現するためのベクターであって、単一のオープンリーディングフレーム内に、５’から３’方向に、
ａ）前記昆虫細胞において機能的であるペプチド分泌シグナル、
ｂ）６−メチルグアニン−ＤＮＡ−メチルトランスフェラーゼ酵素（ＭＧＭＴ、ＥＣ２．１．１．６３）、または、配列番号４と少なくとも９０％同一であるか、もしくは配列番号２のＳＮＡＰ突然変異体と少なくとも９０％同一である、その機能的ＭＧＭＴ突然変異体、および
ｃ）組換えタンパク質
をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、ベクター。
【請求項２】
前記ＭＧＭＴ酵素が配列番号４のタンパク質である、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項３】
前記ＭＧＭＴ突然変異体が配列番号２のＳＮＡＰタンパク質である、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項４】
前記オープンリーディングフレームが、前記ペプチドシグナルと同じ昆虫細胞において機能的である誘導プロモーターと機能的に連結されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項５】
前記分泌ペプチドシグナルおよび前記誘導プロモーターが昆虫細胞において機能的である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項６】
前記昆虫細胞がショウジョウバエＳ２細胞である、請求項５に記載の発現ベクター。
【請求項７】
前記組換えタンパク質が診断用および／または治療用タンパク質および／またはポリペプチドからなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項８】
前記診断用および治療用タンパク質および／またはポリペプチドが、
−細菌またはウイルス免疫原性タンパク質、および
−血液因子、抗凝固因子、増殖因子、ホルモン、治療用酵素およびモノクローナル抗体およびサイトカイン、
−抗腫瘍タンパク質、
−微生物、ウイルスおよび／または寄生虫ポリペプチド、
−癌抗原などの抗原
からなる群から選択される、請求項７に記載の発現ベクター。
【請求項９】
前記細菌またはウイルス免疫原性タンパク質が、デング熱ウイルス、日本脳炎（ＪＥ）ウイルス、ダニ媒介脳炎（ＴＢＥ）ウイルス、黄熱（ＹＦ）ウイルス、ウスツ（ＵＳＵ）ウイルス、ロシオウイルス、マレー脳炎（ＭＶＥ）ウイルス、ベッセルブロン（ＷＳＬ）ウイルス、ジカウイルスもしくは西ナイル（ＷＮ）ウイルス由来のＥＤＩＩＩタンパク質、またはリフトバレー熱（ＲＶＦ）ウイルスもしくはトスカナ（ＴＯＳ）ウイルス由来の核タンパク質Ｎ、またはチクングニアウイルス由来のＥ２エンベロープタンパク質の可溶型、または西ナイルウイルスのＥエンベロープタンパク質の可溶型である、
請求項８に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
前記診断用および治療用タンパク質がＩＦＮα、グランザイムＭ、ＦａｓＬ、ＳＳＸ２、ＮＥＲＣＭＳＬ、ｈＳＵＬＦ２ΔＴＭＤおよびＣＮＴＮ４からなる群から選択される、請求項７に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
前記ＭＧＭＴ酵素が配列番号３または配列番号６８のＤＮＡ配列によりコードされている、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
前記ＭＧＭＴ酵素突然変異体が配列番号１または配列番号４７のＤＮＡ配列によりコードされている、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項１３】
少なくとも１つのペプチド切断部位をさらにコードする、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項１４】
前記ペプチド切断部位が、ＭＧＭＴ酵素またはその突然変異体と組換えタンパク質との間に位置する、請求項１３に記載の発現ベクター。
【請求項１５】
標識をさらにコードする、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項１６】
前記標識が組換えタンパク質のＣ末端に位置する、請求項１５に記載の発現ベクター。
【請求項１７】
スペーサー配列をさらにコードする、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項１８】
前記スペーサー配列が前記ＭＧＭＴ酵素またはその突然変異体と前記組換えタンパク質との間、かつ／または前記組換えタンパク質と前記標識との間に位置する、請求項１７に記載の発現ベクター。
【請求項１９】
−ペプチドＢｉＰ昆虫シグナル、
−配列番号２のＳＮＡＰタンパク質、
−請求項１０に定義される組換えタンパク質、
−エンテロキナーゼペプチド切断部位、
−ポリヒスチジン標識、および
−アミノ酸配列グリシン−グリシン−グリシン−セリン（ＧＧＧＳ）を有する２つのスペーサー配列
をコードする、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項２０】
−ＢｉＰ様ペプチドシグナル、
−配列番号２のＳＮＡＰタンパク質、
−請求項１０に定義される組換えタンパク質、
−ｐｒｏＴＥＶペプチド切断部位、
−ポリヒスチジン標識、および
−アミノ酸配列グリシン−グリシン−グリシン−セリン（ＧＧＧＳ）を有する２つのスペーサー配列
をコードする、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項２１】
昆虫細胞において組換えタンパク質を発現するためのベクターであって、単一のオープンリーディングフレーム内に、５’から３’方向に、
ａ）ＢｉＰ様ペプチドシグナル、
ｂ）配列番号４のＭＧＭＴタンパク質または配列番号２のＳＮＡＰタンパク質、
ｃ）２つのｐｒｏＴＥＶペプチド切断部位、
ｄ）ポリヒスチジン標識、および
ｅ）アミノ酸配列グリシン−グリシン−グリシン−セリン（ＧＧＧＳ）を有する２つのスペーサー配列
をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、ベクター。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の発現ベクターを含んでなるプラスミドにより安定にトランスフェクトされた組換え細胞。
【請求項２３】
配列番号５９または配列番号６９を含んでなる、請求項２２に記載の発現ベクターを含んでなるプラスミドにより安定にトランスフェクトされた組換え細胞。
【請求項２４】
細菌である、請求項２２に記載の安定にトランスフェクトされた組換え細胞。
【請求項２５】
前記細菌が大腸菌細胞である、請求項２４に記載の安定にトランスフェクトされた組換え細胞。
【請求項２６】
細菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞、または鳥類細胞である、請求項２２に記載のトランスフェクトされた組換え細胞。
【請求項２７】
ショウジョウバエＳ２細胞またはその誘導体；ＣＨＯ細胞、ＹＢ２／Ｏ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞またはそれらの誘導体；およびＥＢｘ細胞から選択される、請求項２６に記載のトランスフェクトされた組換え細胞。
【請求項２８】
前記鳥類細胞が、ＥＢ６６細胞またはそれらの誘導体である、請求項２６に記載のトランスフェクトされた組換え細胞。
【請求項２９】
請求項１〜２１のいずれか一項に定義される発現ベクターを生産するための、請求項２２〜２８のいずれか一項に記載の組換え細胞の使用。
【請求項３０】
組換えタンパク質を生産するための、請求項２２、２３、２６または２７のいずれか一項に記載の昆虫組換え細胞の使用。
【請求項３１】
請求項１〜５および７〜１８のいずれか一項に記載の発現ベクターにより安定にトランスフェクトされた、昆虫組換え細胞。
【請求項３２】
キイロショウジョウバエ細胞である、請求項３１に記載の安定にトランスフェクトされた細胞。
【請求項３３】
前記キイロショウジョウバエ細胞がショウジョウバエＳ２細胞である、請求項３２に記載の安定にトランスフェクトされた細胞。
【請求項３４】
ｉ）前記発現ベクターが、
−配列番号１９、または２０１０年８月１９日にthe Centre National de Culture et de Microorganismes（ＣＮＣＭ），パスツール研究所（フランス パリ）に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４３５７として寄託された細胞にクローニングされたヌクレオチド配列を含んでなるベクター、
−配列番号２２、または２０１０年１０月２７日にthe Centre National de Culture et de Microorganismes（ＣＮＣＭ），パスツール研究所に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４３８１として寄託された細胞にクローニングされたヌクレオチド配列を含んでなる請求項７のベクター、
−配列番号２１、または２０１０年１０月２７日にthe Centre National de Culture et de Microorganismes（ＣＮＣＭ），パスツール研究所に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４３８２として寄託された細胞にクローニングされたヌクレオチド配列を含んでなる請求項７のベクター、
−配列番号９、または２０１０年９月２９日にthe Centre National de Culture et de Microorganismes（ＣＮＣＭ），パスツール研究所に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４３６８として寄託された細胞にクローニングされたヌクレオチド配列を含んでなるベクター、
−配列番号２０、または２０１０年９月２９日にthe Centre National de Culture et de Microorganismes（ＣＮＣＭ），パスツール研究所に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４３６９として寄託された細胞にクローニングされたヌクレオチド配列を含んでなる請求項７のベクター、
−配列番号１０または５９または６９を含んでなる請求項２１のベクター、
−配列番号６４、または２０１１年１２月９日にthe Centre National de Culture et de Microorganismes（ＣＮＣＭ），パスツール研究所に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４５８１として寄託された細胞にクローニングされたヌクレオチド配列のベクター、
−配列番号７１のベクター、
−配列番号５５、配列番号５７もしくは７２もしくは７４、配列番号７７、７９もしくは８１、配列番号８９、配列番号８４もしくは８６、配列番号９２、または配列番号９６を含んでなる請求項１０のベクター
からなる群から選択されるか、あるいは
ｉｉ）それが、
−２０１０年８月１９日にthe Centre National de Culture et de Microorganismes（ＣＮＣＭ），パスツール研究所に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４３５７として寄託された細胞、
−２０１０年１０月２７日にthe Centre National de Culture et de Microorganismes（ＣＮＣＭ），パスツール研究所に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４３８１として寄託された細胞、
−２０１０年１０月２７日にthe Centre National de Culture et de Microorganismes（ＣＮＣＭ），パスツール研究所に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４３８２として寄託された細胞、
−２０１０年９月２９日にthe Centre National de Culture et de Microorganismes（ＣＮＣＭ），パスツール研究所に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４３６８として寄託された細胞、
−２０１０年９月２９日にthe Centre National de Culture et de Microorganismes（ＣＮＣＭ），パスツール研究所に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４３６９として寄託された細胞、
−２０１１年１２月５日にthe Centre National de Culture et de Microorganismes（ＣＮＣＭ），パスツール研究所（フランス ７５７２４ パリ セデックス １５ リュ デュ ドクトール ル ２５）に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４５６５として寄託された細胞、
−２０１１年１２月５日にthe Centre National de Culture et de Microorganismes（ＣＮＣＭ），パスツール研究所（フランス ７５７２４ パリ セデックス １５ リュ デュ ドクトール ル ２５）に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４５６６として寄託された細胞、
−２０１１年１２月５日にthe Centre National de Culture et de Microorganismes（ＣＮＣＭ），パスツール研究所（フランス ７５７２４ パリ セデックス １５ リュ デュ ドクトール ル ２５）に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４５６７として寄託された細胞、
−２０１１年１２月５日にthe Centre National de Culture et de Microorganismes（ＣＮＣＭ），パスツール研究所（フランス ７５７２４ パリ セデックス １５ リュ デュ ドクトール ル ２５）に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４５６８として寄託された細胞、
−２０１１年１２月５日にthe Centre National de Culture et de Microorganismes（ＣＮＣＭ），パスツール研究所（フランス ７５７２４ パリ セデックス １５ リュ デュ ドクトール ル ２５）に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４５６９として寄託された細胞、
−２０１１年１２月５日にthe Centre National de Culture et de Microorganismes（ＣＮＣＭ），パスツール研究所（フランス ７５７２４ パリ セデックス １５ リュ デュ ドクトール ル ２５）に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４５７０として寄託された細胞、
−２０１１年１２月５日にthe Centre National de Culture et de Microorganismes（ＣＮＣＭ），パスツール研究所（フランス ７５７２４ パリ セデックス １５ リュ デュ ドクトール ル ２５）に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４５７１として寄託された細胞、
−２０１１年１２月５日にthe Centre National de Culture et de Microorganismes（ＣＮＣＭ），パスツール研究所（フランス ７５７２４ パリ セデックス １５ リュ デュ ドクトール ル ２５）に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４５７２として寄託された細胞、
−２０１１年１２月８日にthe Centre National de Culture et de Microorganismes（ＣＮＣＭ），パスツール研究所（フランス ７５７２４ パリ セデックス １５ リュ デュ ドクトール ル ２５）に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４５７６として寄託された細胞、
−２０１１年１２月８日にthe Centre National de Culture et de Microorganismes（ＣＮＣＭ），パスツール研究所（フランス ７５７２４ パリ セデックス １５ リュ デュ ドクトール ル ２５）に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４５７７として寄託された細胞、
−２０１１年１２月８日にthe Centre National de Culture et de Microorganismes（ＣＮＣＭ），パスツール研究所（フランス ７５７２４ パリ セデックス １５ リュ デュ ドクトール ル ２５）に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４５７８として寄託された細胞、
−２０１１年１２月８日にthe Centre National de Culture et de Microorganismes（ＣＮＣＭ），パスツール研究所（フランス ７５７２４ パリ セデックス １５ リュ デュ ドクトール ル ２５）に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４５７９として寄託された細胞、
−２０１１年１２月８日にthe Centre National de Culture et de Microorganismes（ＣＮＣＭ），パスツール研究所（フランス ７５７２４ パリ セデックス １５ リュ デュ ドクトール ル ２５）に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４５８０として寄託された細胞、
−２０１１年１２月９日にthe Centre National de Culture et de Microorganismes（ＣＮＣＭ），パスツール研究所（フランス ７５７２４ パリ セデックス １５ リュ デュ ドクトール ル ２５）に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４５８３として寄託された細胞、
−２０１１年１２月９日にthe Centre National de Culture et de Microorganismes（ＣＮＣＭ），パスツール研究所（フランス ７５７２４ パリ セデックス １５ リュ デュ ドクトール ル ２５）に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４５８４として寄託された細胞、
−２０１１年１２月９日にthe Centre National de Culture et de Microorganismes（ＣＮＣＭ），パスツール研究所（フランス ７５７２４ パリ セデックス １５ リュ デュ ドクトール ル ２５）に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４５８５として寄託された細胞、および
−２０１１年１２月９日にthe Centre National de Culture et de Microorganismes（ＣＮＣＭ），パスツール研究所（フランス ７５７２４ パリ セデックス １５ リュ デュ ドクトール ル ２５）に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４５８６として寄託された細胞
からなる群から選択される
請求項３２または３３に記載の安定にトランスフェクトされたＳ２細胞。
【請求項３５】
請求項１〜４、６〜１８、２０および２１のいずれか一項に記載の発現ベクターにより安定にトランスフェクトされた、脊椎動物組換え細胞。
【請求項３６】
哺乳動物細胞である、請求項３５に記載の安定にトランスフェクトされた細胞。
【請求項３７】
前記哺乳動物細胞が、ＣＨＯ細胞、ＹＢ２／Ｏ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞またはそれらの誘導体である、請求項３６に記載の安定にトランスフェクトされた細胞。
【請求項３８】
前記発現ベクターが、配列番号５７もしくは７２もしくは７４（目的タンパク質がＩＦＮαである場合）、配列番号７７、７９もしくは８１（目的タンパク質が癌抗原ＳＳＸ２である場合）、配列番号５５（目的タンパク質がグランザイムＭである場合）、配列番号８９（目的タンパク質がＦａｓＬである場合）、配列番号８４もしくは８６（目的タンパク質が癌抗原ＮＥＲＣＭＳＬである場合）、または配列番号９２（目的タンパク質がコンタクチンＣＮＴＮ４である場合）、または配列番号９６（目的タンパク質がｈＳＵＬＦ２ΔＴＭＤである場合）を含んでなる請求項１０のベクターである、請求項３５〜３７のいずれか一項に記載の安定にトランスフェクトされた哺乳動物細胞。
【請求項３９】
組換えタンパク質の発現を増強する方法であって、前記タンパク質およびペプチド分泌シグナルを、酵素６−メチルグアニン−ＤＮＡ−メチルトランスフェラーゼ酵素（ＭＧＭＴ、ＥＣ２．１．１．６３）、または、配列番号４と少なくとも９０％同一であるか、もしくは配列番号２のＳＮＡＰ突然変異体と少なくとも９０％同一である、その機能的ＭＧＭＴ突然変異体とともに共発現させることを含んでなり、前記共発現が昆虫細胞で行われる、方法。
【請求項４０】
前記ＭＧＭＴ酵素が配列番号４のタンパク質である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＭＧＭＴ突然変異体酵素が配列番号２のＳＮＡＰタンパク質である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
細胞培養において組換えタンパク質を生産する方法であって、
ａ）請求項１〜２０の発現ベクターを提供すること、
ｂ）前記発現ベクターを昆虫細胞に導入すること、
ｃ）前記昆虫細胞に導入されたヌクレオチドの発現を可能として組換えタンパク質を生産すること
を含んでなる、方法。
【請求項４３】
前記組換えタンパク質が、回収された細胞培養上清の少なくとも４０ｍｇ／Ｌまたはそれを上回って発現される、請求項３９〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
複製ベクターまたは欠陥ベクターを感染させた昆虫細胞において異種タンパク質の生産を増強するための、６−メチルグアニン−ＤＮＡ−メチルトランスフェラーゼ酵素（ＭＧＭＴ、ＥＣ２．１．１．６３）、または、配列番号４と少なくとも９０％同一であるか、もしくは配列番号２のＳＮＡＰ突然変異体と少なくとも９０％同一である、その機能的ＭＧＭＴ突然変異体の使用。
【請求項４５】
前記ＭＧＭＴ酵素が配列番号４のタンパク質である、請求項４４に記載の使用。
【請求項４６】
前記ＭＧＭＴ突然変異体が配列番号２のＳＮＡＰタンパク質である、請求項４４に記載の使用。
【請求項４７】
保存培地中、血漿中もしくはバッファー中での組換えタンパク質の半減期を改善するため、薬剤もしくはワクチンとして用いられる組換えタンパク質の半減期を改善するため、または診断キットで用いられる組換えタンパク質の半減期を改善するために、組換えタンパク質と融合される保護ポリペプチドとしての、６−メチルグアニン−ＤＮＡ−メチルトランスフェラーゼ酵素（ＭＧＭＴ、ＥＣ２．１．１．６３）、または、配列番号４のタンパク質と少なくとも９０％同一であるか、もしくは配列番号２のＳＮＡＰ突然変異体と少なくとも９０％同一である、その機能的ＭＧＭＴ突然変異体の使用。
【請求項４８】
前記組換えタンパク質がインスリン、ＩＦＮα、グランザイムＭ、ＳＳＸ２、ＦａｓＬ、エンドスルファターゼ（ｈＳＵＬＦ）、コンタクチンおよびメソテリン（ＮＥＲＭＣＳＬ）の中から選択される、請求項４７に記載の使用。
【請求項４９】
前記ペプチド分泌シグナルが昆虫ｓｓＢｉＰ、ＢｉＰ様ペプチドシグナルおよび西ナイルウイルスのエンベロープＥタンパク質からなる群から選択される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子工学および分子生物学の分野に関する。特に、本発明は、宿主細胞におけるタンパク質生産の新規なエンハンサーに関する。さらに、本発明は、前記エンハンサータンパク質をコードするＤＮＡ配列を含有するベクター、また、真核生物（例えば、ヒトなどの哺乳動物）タンパク質およびウイルスタンパク質を含む、医薬使用のための工業生産酵素またはタンパク質などの組換えタンパク質を発現させるためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
目的ポリペプチドまたはタンパク質が組換え生物または細胞で生産されるタンパク質生産系は、商業的バイオテクノロジーの中軸である。
【０００３】
大腸菌(E. coli)などの宿主における細菌発現に基づいた最も初期の系は、真核生物宿主、特に、培養哺乳動物細胞、培養および完全昆虫の形態双方での昆虫細胞、ならびにヒツジおよびヤギなどのトランスジェニック哺乳動物に基づく系と結びついてきた。
【０００４】
原核細胞培養系は維持が容易で、実施も安価である。しかしながら、原核細胞は真核生物のタンパク質の翻訳後修飾が可能でない。さらに、多くのタンパク質が不適切に折り畳まれ、それらの再折り畳みを行う特別な手順を必要とし、製造コストが加算される。
【０００５】
真核細胞培養系は、いくつかの出願に記載されている。例えば、哺乳動物細胞は翻訳後修飾が可能であり、一般に、適切に折り畳まれた可溶性のタンパク質を生産する。哺乳動物細胞系の主要な欠点には、特殊で高コストの培養設備の必要性、その培養系全体が失われかねない感染リスク、および有害である可能性のある哺乳動物タンパク質が最終産物を汚染するリスクが含まれる。別法としては、昆虫細胞がポリペプチド発現に用いられる。昆虫細胞で用いられる最も汎用されている発現系は、バキュロウイルスベクターに基づくものである。バキュロウイルス発現ベクターは、バキュロウイルスの主構造タンパク質をコードするバキュロウイルスのポリヘドリン遺伝子を、強力な天然ポリヘドリンプロモーターの制御下、異種遺伝子に置き換えることにより構築される。培養昆虫宿主細胞に組換えウイルスを感染させ、それにより生産されたタンパク質は、細胞自体から、または好適な分泌シグナルを用いる場合には培養培地から回収することができる。
【０００６】
しかしながら、両系とも、組換えタンパク質発現レベルおよび品質の再現性、培養物の感染に関連する問題があり、特殊な培養設備を必要とする場合がある。さらに、ある種のタンパク質の生産のためのバキュロウイルス原株は、ＧＭＰ条件下で作製しなければならない場合があり、時間が経てば常に安定というわけではない。
【０００７】
タンパク質発現のためのショウジョウバエ細胞、特に、キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)Ｓ２細胞は、米国特許第５，５５０，０４３号、同第５，６８１，７１３号および同第５，７０５，３５９号に開示されている。目的タンパク質が感染昆虫細胞の溶解時にのみ提供される従来技術のバキュロウイルス系とは対照的に、Ｓ２細胞に基づく方法は、異種タンパク質の連続細胞発現系を提供し、従って、より高い発現レベルをもたらす。
【０００８】
宿主細胞における異種タンパク質の発現を増強するための他の手段もいくつか提案されており、例えば、米国特許第５，９１９，６８２号には、ｔａｃプロモーターの制御下でｐＣＷベクターを用いて原核生物において機能的硝酸シンターゼを過剰生産し、シャペロンを有するタンパク質を共発現させる方法が記載されている。また、米国特許第４，７５８，５１２号は、それらのＤＮＡ配列内に、その生物に外来産物分解能の低下を示させる特定の突然変異を有する宿主細胞の生産に関するものである。これらの変異型宿主生物は、遺伝的に操作された外来タンパク質の収量を高めるために使用することができる。
【０００９】
脊椎動物細胞、特に、哺乳動物細胞もまた、組換えタンパク質の発現に広く使用されてきた。培養系で増殖する細胞から経時的タンパク質生産の量は、例えば、細胞密度、細胞周期、タンパク質の細胞生合成速度、細胞の生存率および成長を支えるために使用される培地の条件、ならびに培養細胞の寿命（すなわち、プログラムされた細胞死、またはアポトーシスに屈するまでの期間）などのいくつかの因子によって決まる。培養細胞の生存率および寿命を改善する種々の方法が、例えば、栄養素、細胞密度、酸素および二酸化炭素含量、乳酸デヒドロゲナーゼ、ｐＨ、浸透圧、異化代謝産物などを制御することにより所望のタンパク質の生産性を高める方法とともに開発されてきた。
【００１０】
異種組換えタンパク質を生産するための他の宿主細胞、特に、植物細胞および酵母細胞も使用可能である。
【００１１】
哺乳動物起源の多くの医薬タンパク質が植物で合成されている。これらの範囲は、年間需要量が５００トンを超えるヒト血清アルブミンなどの血液製剤から、必要量はもっと少ないサイトカインおよびその他のシグナル伝達分子に及ぶ。ほとんどの植物由来タンパク質は、トランスジェニックタバコで生産され、葉から直接抽出されている。一般に、これらのタンパク質は総可溶性タンパク質の０．１％未満といった低レベルで生産される。このような低レベルの生産は、おそらく、最も重要なものの中でも、不十分なタンパク質折り畳みおよび安定性を伴う複数の因子の組合せを表している。もっと最近では、ヒトタンパク質をはるかに高いレベルで発現させるためにタバコ葉緑体系が使用されている(MA JKC et al, 2004)。
【００１２】
酵母系は、長年、工業的および生物薬剤的用途で大量のタンパク質を生産するための主力品であった。酵母は、十分定義された培地で極めて高密度まで増殖させることができる。酵母内の組換えタンパク質は過剰発現させることができ、従って、その産物は細胞から分泌され、発酵溶液中での回収に利用することができる。酵母により分泌されたタンパク質は、コンセンサスグリコシル化部位で高度にグリコシル化されている。従って、酵母系における組換えタンパク質の発現は、歴史的に、翻訳後グリコシル化パターンがタンパク質の機能に影響を及ぼさないタンパク質に限られてきた。サッカロミセス属(Sacharomyces)、シゾサッカロミセス・ポムベ(Scizosacchromyces pombe)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)およびハンセヌラ・ポリモルファ(Hansanuela polymorpha）を含むいくつかの酵母発現系が組換えタンパク質発現に使用されている。最近、酵母において組換え糖タンパク質産生能を有する新規な系が、哺乳動物細胞で産生される分泌型ヒト糖タンパク質と類似するグリコシル化配列を持って現れた。ピキア・パストリスのグリコシル化経路は、Ｎ−グリコシル化中間体に高マンノース鎖を付加する内因性酵素を排除することにより改良された。さらに、ヒト化オリゴ糖鎖の合成に関与する少なくとも５つの活性酵素が特異的にＰ．パストリスに導入された。酵母において大量のヒト化糖タンパク質を生産できるということは、グリコシル化構造が極めて均一で容易に精製できるという意味で有利となる。さらに、哺乳動物細胞よりもはるかに短い発酵時間の酵母での流加生産を使用することにより、哺乳動物ウイルスおよび他の哺乳動物宿主糖タンパク質によるクロスコンタミネーションが解消できる。
【００１３】
しかしながら、これらの系を使用することで、異種タンパク質の生産は培養細胞上清においておよそ１〜２ｍｇ／Ｌとなり、工業製品の目標値に比べて極めて低い。
【００１４】
よって、有意に高レベルの異種タンパク質発現を達し得る系を提供する差し迫った必要性がある。
【発明の概要】
【００１５】
本発明はこの必要性に応え、生産レベルをタンパク質生産の既存の手段の１００倍に（すなわち、上清中のタンパク質が２００ｍｇ／Ｌに）達するタンパク質発現法を提供する。
【００１６】
本発明者らは、実際に、ヒト６−メチルグアニン−ＤＮＡ−メチルトランスフェラーゼ（ｈＭＧＭＴ）タンパク質に由来のタンパク質をコードするヌクレオチドベクター（前記ｈＭＧＭＴ由来タンパク質が目的タンパク質に直接的または非直接的に連結されている）を使用すれば、前記目的タンパク質の生産が平均４０ｍｇ／Ｌ〜２００ｍｇ／Ｌの収量まで高められることを証明した。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】（Ａ）５’から３’方向に、シグナルペプチド、ＭＧＭＴ  ｍＲＮＡ配列、スペーサー、プロテアーゼ切断部位、組換えタンパク質遺伝子（外来遺伝子）、スペーサー、および標識（Ｈｉｓ６）−タグを含む、本発明のＭＧＭＴ融合タンパク質配列をコードするｍＲＮＡの概略図、および（Ｂ）ｉ）昆虫ｓｓＢｉＰシグナルペプチド（斜体）、ｉｉ）ＳＮＡＰをコードするエンハンサー配列（グレー）、ｉｉｉ）ＤＮＡスペーサー配列、ｉｖ）エンテロキナーゼ部位をコードする配列（太字）、ｖ）クローニング部位ＥｃｏＲＶ／Ｘｍａｌ（下線）およびｖｉ）Ｈｉｓタグ標識をコードするＤＮＡ（太字の斜体）を含んでなるベクターの同じ部分のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列（配列番号５も参照）を開示する。
【図２】（Ａ）Ｈｉｓタグ標識に連結された、融合タンパク質ＳＮＡＰ（グレー）およびリフトバレー熱ウイルスのＮ核タンパク質（ＲＶＦ．Ｎ、太字）のアミノ酸配列（両タンパク質はスペーサーＧＧＧＳにより分離されている）、（Ｂ）１０日間カドミウムで刺激した場合または刺激しなかった場合の、配列番号１９のＤＮＡベクター（ＳＮＡＰ−ＲＶＦ）によりトランスフェクトされたＳ２細胞の細胞上清に対する、抗Ｈｉｓｔａｇ抗体を用いた免疫ブロットアッセイ、および（Ｃ）大腸菌Ｂ２１溶解液の不溶性（ＩＮＳ）または可溶性（ＳＯＬ）タンパク質画分に対する抗Ｈｉｓ抗体を用いて行った免疫ブロットアッセイ（前記細菌はｐＥＴ３０２／ＲＶＦ．Ｎ＋ｐｒｏＴＥＶ＋ＧＳＴプラスミドを担持している）、（Ｄ）１０日間刺激Ｓ２細胞からの、ＴａｌｏｎカラムおよびＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５カラムを用いた分泌キメラタンパク質ＳＮＡＰ−ＲＶＦ．Ｎの二段階精製後に得られる連続画分サンプル中のＳＮＡＰ−ＲＶＦ．Ｎの量を示す免疫ブロットアッセイを開示する。
【図３】（Ａ）Ｈｉｓタグ標識（太字）に連結された融合タンパク質ＳＮＡＰ（斜体）および西ナイルウイルス由来エンベロープタンパク質Ｅの可溶型（グレー）のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列（これらのタンパク質はスペーサーＧＧＧＳにより分離されている）（配列番号２０）、および（Ｂ）１０日間カドミウムで刺激した場合または刺激しなかった場合の、ＳＮＡＰ−ＷＮｓＥをコードする本発明のＤＮＡベクター（配列番号２０）でトランスフェクトされたＳ２細胞の上清中における、西ナイルウイルスのエンベロープタンパク質Ｅタンパク質の可溶型の分泌を示す、抗Ｈｉｓタグ抗体を用いた免疫ブロットアッセイを開示する。
【図４】（Ａ）ＢｉＰペプチドシグナル、ＭＧＭＴ様コード配列（ＳＮＡＰ様）、ＩＦＮα配列（ｈｕＩＦＮΑＩ）の各側の２つのｐｒｏ−ＴＥＶ切断部位もよびＨｉｓタグ標識を含むＤＮＡカセットのスキーム、（Ｂ）融合タンパク質ＳＮＡＰ（グレー、その前に昆虫ペプチドシグナル（斜体）がある）およびＩＦＮα（太字）、その後のＨｉｓタグ標識（太字の斜体）のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列（前記ＳＮＡＰとＩＦＮαタンパク質はエンテロキナーゼ切断部位（下線）およびスペーサー配列ＧＧＧＳで分離されている）、（Ｃ）Ｃｄ２＋で刺激した場合または刺激しなかった場合の、ＩＦＮαをコードする本発明のベクターによりトランスフェクトされたＳ２細胞（Ｓ２／ＳＮＡＰ−ＩＦＮ）または対照ベクターによりトランスフェクトされたＳ２細胞の上清においてＩＦＮα発現を検出するための、抗Ｈｉｓタグ抗体を用いた免疫ブロットアッセイ、（Ｄ）１０日間のカドミウム含有または不含で誘導された、Ｓ２／ＤｅＳＮＡＰｕｎｉｖ−ＩＦＮα細胞の上清１０μｌに対する、抗ＳＮＡＰ抗体を用いた免疫ブロットアッセイ、（Ｅ）ウミシイタケルシフェラーゼを発現するチクングニアウイルスを感染させたＨｅＬａ細胞におけるルシフェラーゼ活性（前記細胞は、種々の用量の、商業ソース（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ）から入手したＩＦＮαまたは本発明の方法により生産されたＩＦＮαで処理した）、（Ｆ）ウミシイタケルシフェラーゼを発現するチクングニアウイルスを感染させたＨｅＬａ細胞におけるルシフェラーゼ活性（前記細胞は、種々の用量の、本発明の生産方法により得られたＳＮＡＰ−ＩＦＮαタンパク質で処理した）を開示する。
【図５】本発明の組換えタンパク質生産法の様々な行程を示す。
【図６】（Ａ）融合タンパク質ＳＮＡＰ（グレー、その前に昆虫ペプチドシグナルがある）、およびグランザイムＭ、その後のＨｉｓタグ標識のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列（前記ＳＮＡＰとグランザイムＭタンパク質は、エンテロキナーゼ切断部位およびスペーサー配列ＧＧＧＳで分離されている）、（Ｂ）ＳＮＡＰ中のＧｒＭプロテアーゼの３つの可能性のある切断部位を強調した、キメラ融合タンパク質ＳＮＡＰ−ＧｒＭの概略図、（Ｃ）ＧｒＭをコードする本発明のベクターによりトランスフェクトされたＳ２細胞（Ｓ２／ＳＮＡＰ−ＧｒＭ、配列番号５５）の上清におけるＳＮＡＰ−ＧｒＭの発現を検出するための、抗ＳＮＡＰ抗体または抗Ｈｉｓタグ抗体を用いた免疫ブロットアッセイを開示する。
【図７】（Ａ）ＢｉＰ様ペプチドシグナル、ＭＧＭＴコード配列、ＩＦＮα配列（ｈｕＩＦＮΑＩ）の各側の２つのｐｒｏ−ＴＥＶ切断部位、およびＨｉｓタグ標識を含むユニバーサルＤＮＡカセットのスキーム、（Ｂ）融合タンパク質ＳＮＡＰ（グレー、その前に昆虫ＢｉＰ様ペプチドシグナルがある）、およびヒトＩＦＮα１（太字のアミノ酸）、その後のＨｉｓタグ標識のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列（前記ＳＮＡＰタンパク質とＩＦＮαタンパク質は、ｐｒｏＴＥＶ切断部位およびスペーサー配列ＧＧＧＳで分離されている）、（Ｃ）ペプチドシグナルを含まずにＳＮＡＰ単独をコードするベクター（ｐＳＮＡＰｆベクター）またはその前にデング熱ウイルスペプチドシグナルがあるＳＮＡＰ単独をコードする（ｐＤＶｌｓｓｐｒＭ−ＳＮＡＰ）ベクター、または（Ａ）に定義されるＤＮＡ配列を含んでなるＩＦＮαをコードする本発明のベクター（ｐＤｅＳＮＡＰ−４／ＳＮＡＰ−ＩＦＮΑ１、配列番号５７）のいずれかによりトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞の上清におけるＳＮＡＰ−ＩＦＮαの発現を検出するための、抗ＳＮＡＰ抗体を用いた免疫ブロットアッセイを開示する。
【図８】（Ａ）はＢｉＰ様ペプチドシグナル、ＳＮＡＰコード配列、２つのｐｒｏ−ＴＥＶ切断部位、Ｈｉｓタグ標識、目的遺伝子のクローニングのための４つのユニークなクローニング部位ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＶ、ＸｍａＩ、およびＡｐａＩ、ならびにスペーサー配列ＧＧＧＳを含むユニバーサルＤＮＡカセット（ＤｅＳＮＡＰ  ｕｎｉｖ、配列番号５９および６０）を開示する。５’末端のユニークな部位ＮｈｅＩと３’末端のユニークな部位ＮｏｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩは、哺乳動物発現ベクター（例えば、プラスミドｐｃＤＮＡ３またはｐＣＩ−ｎｅｏ）におけるサブクローニング工程に必要であり、５’末端のユニークな部位ＢｇｌＩＩと３’末端のＡｇｅＩは、無脊椎動物ＤＥＳ系におけるサブクローニング工程に必要である。（Ｂ）のスキームは、ＢｉＰ様ペプチドシグナル、ＭＧＭＴコード配列、２つのｐｒｏ−ＴＥＶ切断部位、Ｈｉｓタグ標識、目的遺伝子のクローニングのための４つのユニークなクローニング部位ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＶ、ＸｍａＩ、およびＡｐａＩ、ならびにスペーサー配列ＧＧＧＳを含むユニバーサルＤＮＡカセット（ＤｅＭＧＭＴ  ｕｎｉｖ、配列番号６９および７０）を開示する。
【図９】目的外来遺伝子をＤｅＭＧＭＴ  Ｕｎｉｖに挿入するための手段を開示する。
【図１０】−８０℃、４℃、２５℃または３７℃で４日間（Ａ）、または−８０℃、４℃、２５℃または３７℃で２ヶ月間（Ｂ）インキュベートしたＳＮＡＰ融合タンパク質ＣＨＩＫ．ｓＥ２−ＳＮＡＰ、ＳＮＡＰ−ＷＮ．ＥＤＩＩＩおよびＳＮＡＰ−ＩＦＮαＩの温度感受性を開示する。
【図１１】１０日のカドミウム誘導後（＋）または誘導なし（−）の、Ｓ２細胞に導入された本発明のベクターによる、全上清（Ａ）または種々の画分（Ｂ）中の融合タンパク質ＳＮＡＰ−ＳＳＸ２およびＳＮＡＰ−ｓＦａｓＬの生産を開示する。
【図１２】（Ａ）ＢｉＰ様ペプチドシグナル、ＭＧＭＴコード配列（ＳＮＡＰ様）、ＳＳＸ２癌抗原の各側の２つのｐｒｏ−ＴＥＶ切断部位、およびＨｉｓタグ標識を含むユニバーサルＤＮＡカセットのスキーム、（Ｂ）ＢｉＰ様ペプチドシグナル、ＭＧＭＴコード配列、ＮＥＲＭＣＳＬタンパク質の各側の２つのｐｒｏ−ＴＥＶ切断部位、およびＨｉｓタグ標識を含むユニバーサルＤＮＡカセットのスキーム、（Ｃ）ＩＦＮα、ＳＳＸ２およびＮＥＲＭＣＳＬの細胞外または細胞内生産を示す、２日間の一時的トランスフェクトＨｅＬａ細胞に対する、マウス抗ＳＮＡＰ抗体を用いた免疫ブロットアッセイを開示する。
【図１３】（Ａ）ＢｉＰ様ペプチドシグナル、ＭＧＭＴコード配列（ＳＮＡＰ様）、ｈＳＵＬＦ−２ΔＴＭＤポリペプチドの各側の２つのｐｒｏ−ＴＥＶ切断部位、およびＨｉｓタグ標識を含むユニバーサルＤＮＡカセットのスキーム、（Ｂ）融合タンパク質ＳＮＡＰ（濃いグレー、その前に昆虫ＢｉＰ様ペプチドシグナルがある）およびｈＳＵＬＦ−２ΔＴＭＤ、その後のＨｉｓタグ標識のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列（前記ＳＮＡＰとｈＳＵＬＦ−２ΔＴＭＤタンパク質は、ｐｒｏＴＥＶ切断部位およびスペーサー配列ＧＧＧＳで分離されている）、および（Ｃ）２日間ｐｃＤＮＡ３／ＤｅＳＮＡＰｕｎｉｖ−ｈＳＵＬＦ−２ΔＴＭＤで一時的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞により分泌されたキメラＤｅＳＮＡＰ−ｈＳＵＬＦ−２ΔＴＭＤの酵素活性を開示する。
【図１４】（Ａ）ＢｉＰペプチドシグナル、ＭＧＭＴコード配列（ＳＮＡＰ様）、ＮＥＲＭＣＳＬタンパク質の各側の２つのｐｒｏ−ＴＥＶ切断部位、およびＨｉｓタグ標識を含むＤＮＡカセットのスキーム、および（Ｂ）Ｃｄ２＋で刺激した場合または刺激していない場合の、ＮＥＲＭＣＳＬタンパク質をコードする本発明のベクターによりトランスフェクトされたＳ２細胞（Ｓ２／ＳＮＡＰ−ＮＥＲＭＣＳＬ）またはチクングニアウイルスの可溶性タンパク質Ｅ２をコードするベクター（ＣＨＩＫ．ｓＥ２−ＳＮＡＰ）によりトランスフェクトされたＳ２細胞のいずれかの上清においてＮＥＲＭＣＳＬタンパク質の発現を検出するための、抗ＳＮＡＰ抗体を用いた免疫ブロットアッセイを開示する。
【発明の具体的説明】
【００１８】
本発明者らは、６−メチルグアニン−ＤＮＡ−メチルトランスフェラーゼ酵素（ＭＧＭＴ）と目的組換えタンパク質との共発現が、Ｓ２細胞などの昆虫細胞ならびにＨｅＬａ細胞などの哺乳動物細胞での前記組換えタンパク質の生産を大幅に改善することを見出した。
【００１９】
６−メチルグアニン−ＤＮＡ−メチルトランスフェラーゼ酵素（ＭＧＭＴ、ＡＴアーゼまたはＡＧＴとしても知られ、以下、「ＭＧＭＴ」と称する）は、ＩＵＢＭＢ酵素命名法でＥＣ２．１．１．６３の番号が付けられている。この酵素は、２０７アミノ酸残基の６−アルキルグアニン−ＤＮＡ−アルキルトランスフェラーゼＤＮＡ修復酵素であり、細胞におけるその機能は、アルキル化されたＤＮＡを修復することである。より厳密には、ＭＧＭＴは、ＳＮ２反応においてメチル基を反応性システイン残基（Ｃｙｓ  １４５）へ転移することにより、ＤＮＡの０６−メチル化グアニンに作用する。この修復機構は、タンパク質が不可逆的に不活性化されるので、異常なものである(Pegg A.E. et al, Mutat. Res. 2000; 462, 82-100)。この酵素は現在、分子生物学において、０６−ベンジルグアニン誘導体での不可逆的標識反応を介してタンパク質をin vivoにおいてリポーター分子で標識するために使用されている(Juillerat A. et al, Chemistry & Biology, vol.10, 313-317, 2003およびＷＯ２００５／０８５４７０)。
【００２０】
ＭＧＭＴに由来する種々の酵素がこれまでに記載されている(Lim A. et al, EMBO J. 15: 4050-4060, 1996; Daniels D.S. et al, EMBO J. 19: 1719-1730, 2000; Juillerat A. et al, Chemistry & Biology, vol.10, 313-317, 2003、ＷＯ２００５／０８５４７０、ＷＯ２００４／０３１４０５)。特に、アミノ酸１８２で末端切断された突然変異Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ｇｌｙ１３１Ｌｙｓ、Ｇｌｙ１３２Ｔｈｒ、Ｍｅｔ１３４Ｌｅｕ、Ａｒｇ１３５Ｓｅｒ、Ｃｙｓ１５０Ｓｅｒ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕを含む２０ｋＤａの変異型タンパク質が見出されている（ＷＯ２００５／０８５４７０ではいわゆる「ＡＧＴ２６」突然変異体、ＷＯ２００６／１１４４０９では「ＳＮＡＰ２６」とも称される）。この特定の突然変異体「ＳＮＡＰ２６」は、高い標識活性を有することが示されている。しかしながら、それが結合している組換えタンパク質の発現を増強し得るということはこれまでに示されたり示唆されたりしたことはない。
【００２１】
本発明者らは、ここで初めて、宿主細胞、特に、無脊椎動物および脊椎動物宿主細胞においてタンパク質生産を増強するための、ＭＧＭＴ酵素（ＥＣ２．１．１．６３）、その突然変異体、触媒ドメインまたは部分断片の使用を提案する。この増強効果は、宿主細胞が、少なくともｉ）前記宿主細胞内で機能的なペプチド分泌シグナル、ｉｉ）ＭＧＭＴ酵素、その突然変異体、触媒ドメインまたは部分断片、およびｉｉｉ）目的タンパク質を含んでなる融合ポリペプチドを発現する場合に見られる。増強効果を生じさせるには、ＭＧＭＴ酵素は、直接的または間接的に（スペーサーおよびその他のアミノ酸を導入してもよい）目的タンパク質と物理的に連結される。特定の理論に縛られるものではないが、ＭＧＭＴ酵素は、タンパク質、例えば、宿主細胞からの分泌に有利とし、合成された融合ポリペプチドを宿主細胞の上清中で安定化させることにより、またはその合成および宿主細胞からの分泌の最中およびその後にそれが代謝されるのを防ぐために、シャペロンとして働き得ると考えられる。
【００２２】
さらに、ＭＧＭＴは、αヘリックスを含んでなる３次元球状構造を有することも見出されており(Wibley J.E.A. et al, 2000)、ＭＧＭＴの足場の役割と適合している。
【００２３】
本明細書において、「宿主」細胞とは、「無脊椎動物」細胞、脊椎動物細胞、植物細胞、酵母細胞、または原核生物細胞などの組換えタンパク質を生産するために使用可能な任意の細胞である。宿主細胞は好ましくは、無脊椎動物細胞および脊椎動物細胞である。
【００２４】
無脊椎動物は種々の門を含んでなり、最も知られたものとして、昆虫、クモ類、甲殻類、軟体動物類、環形動物類、つるあし類、放射相称動物、腔腸動物類および滴虫類がある。無脊椎動物は現在、海綿や扁形動物などの単純な生物から節足動物や軟体動物などの複雑な動物まで、３０を超える門に分類されている。本発明において、無脊椎動物細胞は好ましくは、ショウジョウバエまたは蚊細胞などの昆虫細胞、より好ましくは、ショウジョウバエＳ２細胞である。
【００２５】
宿主細胞株として有用な脊椎動物生物由来の細胞の例としては、非ヒト胚性幹細胞またはその誘導体、例えば、鳥類ＥＢＸ細胞；ＳＶ４０配列により形質転換されたサル腎臓ＣＶＩ株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）；ヒト胚性腎臓株（２９３）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）；マウスセルトリ細胞［ＴＭ４］；サル腎臓細胞（ＣＶＩ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳癌細胞（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ラット肝細胞腫細胞［ＨＴＣ、Ｍ１．５］；ＹＢ２／Ｏ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ  ＣＲＬ１６６２）；ＮＩＨ３Ｔ３；ＨＥＫおよびＴＲＩ細胞が挙げられる。本発明において、脊椎動物細胞は好ましくは、ＥＢＸ、ＣＨＯ、ＹＢ２／Ｏ、ＣＯＳ、ＨＥＫ、ＮＩＨ３Ｔ３細胞またはそれらの誘導体である。
【００２６】
本発明において使用可能な植物細胞は、タバコ栽培品種Ｂｒｉｇｈｔ  Ｙｅｌｌｏｗ２（ＢＹ２）およびニコチアナ・タバカム(Nicotiana Tabaccum)１（ＮＴ−１）である。
【００２７】
本発明において使用可能な酵母細胞は、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポムベ(Schizosaccharomyces pombe)およびハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、ならびにピキア・パストリス(Pichia pastoris)およびピキア・メタノリカ(Pichia methanolica)などのメチル資化酵母(methylotropic yeast)である。
【００２８】
本発明において使用可能な原核生物細胞は、一般に、大腸菌または枯草菌(Bacillus Subtilis)である。
【００２９】
よって、本発明は、少なくともａ）好ましくは無脊椎動物細胞または脊椎動物細胞で機能的なペプチド分泌シグナル、およびｂ）６−メチルグアニン−ＤＮＡ−メチルトランスフェラーゼ酵素、その突然変異体、部分断片または触媒ドメインをコードするヌクレオチド発現ベクターを開示する。
【００３０】
本明細書において用語「ベクター」は、外来遺伝子のＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列を、それが形質転換されて、導入された配列の発現を促進するように宿主細胞に導入することができる担体を意味する。ベクターとしては、例えば、プラスミド、ファージ、およびウイルスが含まれてよく、下記に詳しく述べる。実際に、目的タンパク質の発現が望まれる宿主細胞に導入可能な組換え核酸構築を作製するために、いずれのタイプのプラスミド、コスミド、ＹＡＣまたはウイルスベクターでも使用可能である。あるいは、特定のタイプの宿主細胞で目的タンパク質の発現が望まれる場合には、所望の細胞種または組織種に選択的に感染するウイルスベクターを使用することができる。また、本発明において重要なのは、遺伝子療法に使用するための（すなわち、核酸分子を宿主生物に送達することができる）ベクターである。
【００３１】
ウイルスベクターは、例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイル、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、および望ましい細胞向性を備えた他の組換えウイルスなどである。ウイルスベクターを構築および使用するための方法は当技術分野で公知である（Miller and Rosman, BioTechniques, 7:980-990, 1992参照）。
【００３２】
本発明において実際に好ましいウイルスベクターは、脊椎動物および無脊椎動物細胞における使用に十分適したものである。
【００３３】
無脊椎動物細胞の場合、好ましいベクターは、節足動物ベクターであるアルボウイルスであり、西ナイルウイルスが特に好ましい。無脊椎動物細胞で効率的に発現されることが知られている他のベクターとしては、バキュロウイルスがある。
【００３４】
脊椎動物細胞の場合、レンチウイルス、ＡＡＶ、バキュロウイルスおよびアデノウイルスベクターが好ましい。哺乳動物宿主細胞における発現に適したベクターはまた、非ウイルス（例えば、プラスミドＤＮＡ）起源のものであってもよい。好適なプラスミドベクターとしては、限定されるものではないが、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ）、ｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＣＤＭ８およびｐＭＴ２ＰＣ、ｐＶＡＸおよびｐｇＷｉｚが挙げられる。
【００３５】
原核生物細胞の場合、プラスミド、バクテリオファージおよびコスミドベクターが好ましい。原核生物系で用いるのに好適なベクターとしては、限定されるものではないが、ｐＢＲ３２２（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、ｐＵＣ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐ  Ｐｏｌｙ、ｐＴｒｃ；ｐＥＴ  １１ｄ；ｐＩＮ；およびｐＧＥＸベクターが挙げられる。
【００３６】
植物細胞の場合、Ｔｉプラスミドなどのプラスミド発現ベクター、ならびにカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）およびタバコモザイクウイルスＴＭＶなどのウイルス発現ベクターが好ましい。
【００３７】
酵母細胞における組換えタンパク質の発現は、組込み型ベクター（ＹＩｐ）、エピソームプラスミド（ＹＥｐ）、および動原体プラスミド（ＹＣｐ）という３タイプのベクターを用いて行うことができ、酵母（例えば、Ｓ．セレビシエ）での発現に好適なベクターとしては、限定されるものではないが、ｐＹｅｐＳｅｃｌ、ｐＭＦａ、ｐＪＲＹ８８、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）およびｐＴＥＦ−ＭＦ（Ｄｕａｌｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  ｃｏｄｅ：Ｐ０３３０３）が挙げられる。
【００３８】
遺伝子療法に使用可能なベクターは当技術分野で周知である。それらは例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、麻疹ウイルス、泡沫状ウイルスまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。ウイルスベクターは複製能を持つこともできるし、または複製欠陥型または複製障害型となるように遺伝的に不能にすることができる。好ましい遺伝子療法ベクターは、ＷＯ１９９９／０５５８９２、米国特許第６，６８２，５０７号およびＷＯ２００１／２７３００に記載されているようなＤＮＡ  Ｆｌａｐベクターである。
【００３９】
ＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質または酵素などの発現産物を「コードする」配列は、発現された際にそのＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質または酵素の生産をもたらすヌクレオチド配列であり；すなわち、そのヌクレオチド配列はそのＲＮＡを「コードする」か、またはそのポリペプチド、タンパク質または酵素のアミノ酸配列をコードする。
【００４０】
本発明において、酵素の「触媒ドメイン」とは、酵素の活性部位、または言い換えれば、その基質の触媒反応（ここでは、ＳＮ２反応におけるメチル基の反応性システイン残基への転移）を生じる酵素分子の一部を意味する。従って、用語「その触媒ドメイン」とは、好ましくは天然ＭＧＭＴ酵素の触媒活性の少なくとも８０％を有する、ＭＧＭＴポリペプチドの任意の断片または相同配列を表す。これらの断片（「部分断片」とも呼ばれる）は、２０〜１８０の間、好ましくは３０〜１００の間のアミノ酸を含んでなり得る。前記触媒ドメインの相同配列は、前記触媒活性の部分的または全面的喪失をもたらす１以上の突然変異を持ち得る。
【００４１】
本発明において、ＭＧＭＴ酵素は、配列番号４の配列のヒトＭＧＭＴ（ＮＰ＿００２４０３．２で示される）、ＮＰ＿０３２６２４．１（配列番号４５）で示されるマウスＭＧＭＴ、ＮＰ＿０３６９９３．１（配列番号４６）で示されるラットＭＧＭＴまたはそれらの相同配列であり得る。
【００４２】
用語「相同」とは、配列類似性を有する配列を意味する。用語「配列類似性」は、その総ての文法形において、核酸配列またはアミノ酸配列間の同一性または一致の程度を意味する。本発明において、２つのアミノ酸配列は、そのアミノ酸の少なくとも約８０％、あるいは少なくとも約８１％、あるいは少なくとも約８２％、あるいは少なくとも約８３％、あるいは少なくとも約８４％、あるいは少なくとも約８５％、あるいは少なくとも約８６％、あるいは少なくとも約８７％、あるいは少なくとも約８８％）、あるいは少なくとも約８９％、あるいは少なくとも約９０％、あるいは少なくとも約９１％、あるいは少なくとも約９２％、あるいは少なくとも約９３％、あるいは少なくとも約９４％、あるいは少なくとも約９５％、あるいは少なくとも約９６％、あるいは少なくとも約９７％、あるいは少なくとも約９８％、あるいは少なくとも約９９％が類似している場合に「相同」である。好ましくは、類似のまたは相同なポリペプチド配列は、Needleman and Wunschのアルゴリズムを使用することにより同定される。
【００４３】
好ましくは、６−メチルグアニン−ＤＮＡ−メチルトランスフェラーゼ酵素との相同配列は、配列番号４と少なくとも６４％のアミノ酸配列同一性、好ましくは、少なくとも約６５％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約６６％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約６７％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約６８％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約６９％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約７０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約７１％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約７２％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約７３％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約７４％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約７５％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約７６％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約７７％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約７８％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約７９％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも８０％のアミノ酸同一性、あるいは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性およびあるいは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有する。好ましい態様では、配列番号４の相同な配列は、配列番号４と少なくとも６４％、好ましくは７０％、より好ましくは８０％同一である。
【００４４】
より好ましい相同ＭＧＭＴ配列は、その位置が配列番号４（ＳＮＡＰ２６の開始メチオニン残基は配列番号４の３２番のメチオニン残基に相当する）を参照して容易に転移できる、ＷＯ２００５／０８５４７０に記載の突然変異を含む（従って、配列番号４において対応するものを得るためには、ＷＯ２００５／０８５４７０に開示されている位置に３１個のアミノ酸を付加する）。
【００４５】
好ましくは、本発明において有用なＭＧＭＴ相同配列は、１〜３０個の間、好ましくは６〜２５個の間、特には、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されている、かつ／またはＣ末端の１〜４０個、好ましくは１〜２０個、特には１０〜２０個のアミノ酸、より好ましくは１５個のアミノ酸が欠失されている配列番号４の野生型ＭＧＭＴ配列に相当する。
【００４６】
好ましい態様では、ＭＧＭＴ相同配列は、配列番号４に比べて以下の突然変異：
（Ａ）Ａｒｇで置換されたＬｙｓ３１、もしくはＳｅｒで置換されたＭｅｔ３２、もしくはＡｌａで置換されたＣｙｓ９３、もしくはＡｌａで置換されたＬｙｓ１５６、もしくはＴｈｒで置換されたＡｌａ１５８、もしくはＡｌａで置換されたＡｒｇ１５９、もしくはＬｙｓで置換されたＧｌｙ１６２、もしくはＴｈｒで置換されたＧｌｙ１６３、もしくはＬｅｕで置換されたＭｅｔ１６５、もしくはＳｅｒで置換されたＡｒｇ１６６、もしくはＳｅｒで置換されたＣｙｓ１８１、もしくはＧｌｙで置換されたＡｓｎ１８８、もしくはＧｌｕで置換されたＳｅｒ１９０、もしくはＰｒｏで置換されたＧｌｙ２１４、もしくはＡｌａで置換されたＳｅｒ２１５、もしくはＧｌｙで置換されたＳｅｒ２１６、もしくはＩｌｅで置換されたＧｌｙ２１７、もしくはＧｌｙで置換されたＬｅｕ２１８、もしくはＰｒｏで置換されたＧｌｙ２２０、もしくはＧｌｙで置換されたＡｌａ２２１、もしくはＳｅｒで置換されたＴｒｐ２２２、または
（Ｂ）Ａｒｇ−Ｓｅｒで置換されたＬｙｓ３１−Ｍｅｔ３２、もしくはＴｈｒ−Ａｌａで置換されたＡｌａ１５８−Ａｒｇ１５９、もしくはＬｙｓ−Ｔｈｒで置換されたＧｌｙ１６２−Ｇｌｙ１６３、もしくはＬｅｕ−Ｓｅｒで置換されたＭｅｔ１６５−Ａｒｇ１６６、もしくはＬｙｓ−Ｔｈｒ／Ｌｅｕ−Ｓｅｒで置換されたＧｌｙ１６２−Ｇｌｙ１６３／Ｍｅｔ１６５−Ａｒｇ１６６、もしくはＧｌｙ／Ｇｌｕで置換されたＡｓｎ１８８／Ｓｅｒ１９０、もしくはＰｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙで置換されたＧｌｙ２１４−Ｓｅｒ２１５−Ｓｅｒ２１６−Ｇｌｙ２１７−Ｌｅｕ２１８、もしくはＰｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒで置換されたＧｌｙ２２０−Ａｌａ２２１−Ｔｒｐ２２２、好ましくは（Ａ）に挙げられた他の任意のアミノ酸置換との組合せ、または
（Ｃ）Ｌｅｕ２２３の後での末端切断（アミノ酸２２４〜２３８が欠失）、好ましくは、（Ａ）または（Ｂ）に挙げられた他の任意のアミノ酸置換との組合せ
を含む。
【００４７】
好ましいＭＧＭＴ相同配列は、Ｌｅｕ２２３の後で末端切断されたものである。
【００４８】
好ましいＭＧＭＴ相同配列は、（Ｂ）の改変のうち２つが存在し、場合によりＬｅｕ２２３の後で末端切断されたものである。
【００４９】
好ましいＭＧＭＴ相同配列は、（Ｂ）の改変のうち３つが存在し、場合によりＬｅｕ２２３の後で末端切断されたものである。
【００５０】
好ましいＭＧＭＴ相同配列は、（Ｂ）の改変のうち４つが存在し、場合によりＬｅｕ２２３の後で末端切断されたものである。
【００５１】
好ましいＭＧＭＴ相同配列は、（Ｂ）の改変のうち５つが存在し、場合によりＬｅｕ２２３の後で末端切断されたものである。
【００５２】
好ましいＭＧＭＴ相同配列は、（Ｂ）の改変のうち６つが存在し、場合によりＬｅｕ２２３の後で末端切断されたものである。
【００５３】
他の好ましいＭＧＭＴ相同配列は、（Ａ）に開示されている改変の中から選択される２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の突然変異の組合せと、場合によりＬｅｕ２２３の後での末端切断を含むものである。
【００５４】
特に好ましいのは、突然変異Ｌｙｓ３１Ａｒｇ、Ｍｅｔ３２Ｓｅｒ、Ｃｙｓ９３Ａｌａ、Ｌｙｓ１５６Ａｌａ、Ａｌａ１５８Ｔｈｒ、Ａｒｇ１５９Ａｌａ、Ｇｌｙ１６２Ｌｙｓ、Ｇｌｙ１６３Ｔｈｒ、Ｍｅｔ１６５Ｌｅｕ、Ａｒｇ１６６Ｓｅｒ、Ｃｙｓ１８１Ｓｅｒ、Ａｓｎ１８８Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１９０Ｇｌｕ、Ｇｌｙ２１４Ｐｒｏ、Ｓｅｒ２１５Ａｌａ、Ｓｅｒ２１６Ｇｌｙ、Ｇｌｙ２１７Ｉｌｅ、Ｌｅｕ２１８Ｇｌｙ、Ｇｌｙ２２０Ｐｒｏ、Ａｌａ２２１Ｇｌｙ、Ｔｒｐ２２２ＳｅｒおよびＬｅｕ２２３の後での末端切断を含む相同配列（すなわち、配列番号２のＳＮＡＰ配列）である。
【００５５】
いっそうより好ましい態様では、ＭＧＭＴ酵素は、配列番号２のＳＮＡＰ変異型タンパク質またはその同族体である。配列番号２のＳＮＡＰ突然変異体は、ヒト６−メチルグアニン−ＤＮＡ−メチルトランスフェラーゼ（ＮＰ＿００２４０３．２、配列番号４）のアミノ酸配列と７７％の相同性を有し、マウス６−メチルグアニン−ＤＮＡ−メチルトランスフェラーゼ（ＮＰ＿０３２６２４．１、配列番号４５）のアミノ酸配列と７０％の相同性を有する。
【００５６】
好ましくは、ＳＮＡＰタンパク質に対する前記相同配列は、配列番号２の配列のＳＮＡＰタンパク質に対して少なくとも、８０％、好ましくは８１％、より好ましくは８２％、より好ましくは８３％、より好ましくは８４％、より好ましくは８５％、好ましくは８６％、より好ましくは８７％、より好ましくは８８％、より好ましくは８９％、より好ましくは９０％、より好ましくは９１％、より好ましくは９２％、より好ましくは９３％、より好ましくは９４％、より好ましくは９５％）、より好ましくは９６％、いっそうより好ましくは９７％を超える同一性を示す。
【００５７】
好ましくは、本発明のヌクレオチド発現ベクターは、目的タンパク質をコードする異種ＤＮＡ配列のインフレーム挿入を可能とするクローニング部位をさらに含んでなる。
【００５８】
本発明において意味するように、用語「ペプチド分泌シグナル（peptidic secretion signal）」は、タンパク質の輸送を指示する短い（３〜６０アミノ酸長の）ペプチド鎖を表す。
【００５９】
本発明に適当な分泌シグナルの例としては、限定されるものではないが、接合因子（ＭＦ）α（米国特許第５，８７９，９２６号）；インベルターゼ（ＷＯ８４／０１１５３）；ＰＨＯ５（デンマーク特許第３６１４／８３号）；ＹＡＰ３（酵母アスパラギン酸プロテアーゼ３；ＷＯ９５／０２０５９）；およびＢＡＲ１（ＷＯ８７／０２６７０）のシグナルペプチド配列が挙げられる。
【００６０】
本発明において、このペプチド分泌シグナルは、好ましくは、無脊椎動物細胞もしくは脊椎動物細胞のいずれか、または両方で機能的である。
【００６１】
昆虫細胞において機能的なペプチド分泌シグナルの例としては、昆虫ｓｓＢｉＰ（例えば、配列番号１１のＤＮＡ配列を有する配列番号４８）、配列番号５１のＢｉＰ様ペプチドシグナル（例えば、配列番号５０のＤＮＡ配列を有する）、およびアルボウイルスに存在する任意のペプチドシグナル、例えば、西ナイルウイルスのエンベロープＥタンパク質（配列番号１５）がある。
【００６２】
興味深いことに、上述のＢｉＰ様ペプチドシグナルは、無脊椎動物細胞と脊椎動物細胞の両方において機能的である。このＢｉＰ様シグナルは、最後のグリシンアミノ酸が、デング熱ウイルスのＥタンパク質の切断部位に相当するアミノ酸配列Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ａｌａ（配列番号６１）で置換された、配列番号４８のＢｉＰペプチドシグナルに相当する。よって、このＢｉＰ様シグナルは、有利にも、そのタンパク質が翻訳されて、宿主細胞の上清中に分泌されたところで切断される。
【００６３】
酵母宿主細胞、例えば、Ｓ．セレビシエでの発現にも様々な分泌シグナルが利用可能である。これらには、プレプロα因子、ＨＳｐ１５０、ＰＨＯ１、ＳＵＣ２、ＫＩＬＭ１(killer toxin type 1)、およびＧＧＰ１が含まれる。
【００６４】
クローニング部位は、目的タンパク質をコードする遺伝子の発現系へのクローニングを助ける配列である。これには制限部位、または制限認識部位、すなわち、制限酵素により認識される特異的ヌクレオチド配を含むＤＮＡ分子上の位置が含まれる（例えば、図面を参照）。これらは一般に回文配列であり（制限酵素は通常、ホモ二量体として結合するため）、特定の制限酵素は、その認識部位内または近傍のいずれかの場所で、配列を２つのヌクレオチドの間で切断することができる。クローニング部位は当業者に周知である。
【００６５】
より好ましくは、ヌクレオチド発現ベクターは、前記クローニング部位に挿入された目的の異種タンパク質または異種ポリペプチドをコードする異種ＤＮＡ配列をさらに含んでなる。
【００６６】
用語「異種」とは、天然に存在しない要素の組合せを意味する。例えば、本発明は、「目的のタンパク質／ポリペプチド」をコードする「異種ＤＮＡ配列」を含み、これらのＤＮＡ配列は、タンパク質発現に使用される宿主細胞には天然に存在しないか、その宿主細胞の染色体部位内にはない。
【００６７】
目的の異種タンパク質またはポリペプチドをコードする異種ＤＮＡ配列が本発明のヌクレオチドベクター内に挿入される場合、好ましくは、それが、前記ペプチドシグナル、前記ＭＧＭＴ酵素、その突然変異体または同族体と、前記目的異種タンパク質／ポリペプチドとを含んでなる融合ポリペプチドをコードする。
【００６８】
本発明の好ましい態様では、前記ＭＧＭＴ酵素をコードするＤＮＡ配列は、前記目的異種タンパク質をコードするＤＮＡ配列の５’または３’、好ましくは、５’に位置する。従って、ＭＧＭＴ酵素は目的の異種タンパク質／ポリペプチドと直接的または間接的に連結され、好ましくは、目的の異種タンパク質／ポリペプチドのＮ末端に位置する。
【００６９】
ＩＦＮαなどの目的の異種タンパク質／ポリペプチドの活性ドメインがそのＣ末端部分に位置する場合には、その前記ＭＧＭＴ酵素をコードするＤＮＡ配列は、前記目的異種タンパク質／ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の５’に位置することが特に好ましい。同様に、目的の異種タンパク質／ポリペプチドの活性ドメインがそのＮ末端部分に位置する場合には、前記ＭＧＭＴ酵素をコードするＤＮＡ配列は、前記目的の異種タンパク質／ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の３’に位置することが特に好ましいと言える。
【００７０】
より厳密には、第１の側面において、本発明は、宿主細胞、好ましくは、無脊椎動物および／または脊椎動物宿主細胞、より好ましくは、昆虫細胞において、組換えタンパク質を発現するためのベクターであって、単一のオープンリーディングフレーム内に、５’から３’方向に、
ａ）前記宿主細胞において機能的であるペプチド分泌シグナル、
ｂ）６−メチルグアニン−ＤＮＡ−メチルトランスフェラーゼ酵素（ＭＧＭＴ、ＥＣ２．１．１．６３）、その突然変異体または触媒ドメイン、および
ｃ）組換えタンパク質
をコードするヌクレオチド配列を含んでなるベクターに関する。
【００７１】
本発明において、用語「組換えタンパク質」または「目的タンパク質」は、タンパク質生産細胞に対して外来である遺伝子産物またはポリペプチドを表し、好ましくは、診断用および治療用タンパク質またはポリペプチドからなる群から選択される。
【００７２】
より好ましくは、前記診断用および治療用タンパク質またはポリペプチドは、
・細菌またはウイルス免疫原性タンパク質、より好ましくは、（感染性、病原性）ウイルスタンパク質、例えば、デング熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、黄熱ウイルス、ウスツウイルス、ロシオウイルス、マレー脳炎ウイルス、ベッセルブロンウイルス、ジカウイルスもしくは西ナイルウイルス由来のＥＤＩＩＩタンパク質、またはリフトバレー熱ウイルスもしくはトスカナウイルス由来の核タンパク質Ｎ、またはチクングニアウイルス由来のＥ２エンベロープタンパク質の可溶型、または西ナイルウイルスのＥエンベロープタンパク質の可溶型、
・血液因子、抗凝固因子、増殖因子、ホルモン、ワクチン、治療用酵素、モノクローナル抗体およびサイトカイン（ＩＦＮα、グランザイムＭおよびＦａｓＬなど）、
・抗原、例えば、癌抗原（癌精巣抗原ＳＳＸ２など）、またはＥＲＣ／メソテリンのＮ末端領域（ＮＥＲＣＭＳＬ）、
・抗腫瘍タンパク質、例えば、ＦａｓＬ、またはヘパラン硫酸６−Ｏ−エンドスルファターゼ（ｈＳＵＬＦ）、
・微生物、ウイルスおよび／または寄生虫ポリペプチド、
・他の任意の有用タンパク質（例えば、コンタクチン）
からなる群から選択される。
【００７３】
タンパク質ＦａｓＬは、抗腫瘍薬として使用可能なアポトーシス誘導タンパク質である。これは例えば配列番号８８によりコードされている。
【００７４】
ｈＳｕｌｆタンパク質（またはｈＳＵＬＦ）は、ヘパリン硫酸の構造を調節し、in vivoにおいて悪性細胞の増殖および進行に劇的な影響を持つヘパラン硫酸６−Ｏ−エンドスルファターゼである(Dai et al, 2005)。本発明において、これは、好ましくは、ｈＳｕｌｆ２タンパク質、より好ましくは、その溶解度を高めるためにトランスメンブランドメイン（ＴＭＤ）が欠失されたｈＳｕｌｆ−２ΔＡＭＤ（この突然変異体は配列番号９５のアミノ酸配列を有し、例えば、配列番号９４によりコードされている）である。
【００７５】
本発明のベクターはまた、目的のペプチドおよび／またはポリペプチドを発現および精製するために使用することができる。本発明において用語「ペプチド」および「ポリペプチド」は、ペプチド結合により連結されたアミノ酸モノマー（「残基」とも呼ばれる）の短いポリマーを表す同義語であるものとする。これらのポリマーは、好ましくは、１００残基未満、より好ましくは、５０残基未満を含有する。
【００７６】
特に、本発明のベクターは、細菌、ウイルスまたは寄生虫ポリペプチドなどの診断用微生物ポリペプチドを発現および精製するために使用可能である。このようなポリペプチドの例としては、細菌、ウイルスまたは寄生虫により分泌または発現される抗原ペプチド、ムチンおよび／または毒素がある。好ましくは、前記抗原ペプチドは、インフルエンザウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｇ型肝炎ウイルス、ＨＩＶウイルス、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、ウスツウイルス、西ナイルウイルス、リフトバレー熱ウイルス、トスカナウイルス、チクングニアウイルス、呼吸器合胞体ウイルス(Respiratory Synticial virus)、ロシオウイルス、マレー脳炎ウイルス、ベッセルブロンウイルス、ジカウイルス、リンパ性脈絡髄膜炎ウイルス(Lymphocytic Choreomeningitis virus)、ヒトパルボウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、または任意の同定済みウイルスにより発現される。好ましくは、前記抗原ペプチドは、寄生原虫（赤痢アメーバー(Entamoeba histolytica)もしくはランブル鞭毛虫(Giardia lamblia)など）、蠕虫（線虫、条虫もしくは吸虫など）、または節足動物（甲殻類、昆虫、クモ類など）により発現される。好ましくは、前記抗原ペプチドは、例えば、連鎖球菌属(Streptococcus)、ブドウ球菌属(Staphylococcus)、および大腸菌属の感染性細菌により発現される。感染性毒素は当技術分野で周知である。例えば、ボツリヌス菌神経毒、ウェルシュ菌(Clostridium perfringens)ε毒素、リシン、サキシトキシン、志賀毒素、テトロドトキシン、ブドウ球菌内毒素などが挙げられる。ムチンも当技術分野で公知である。ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５ＢおよびＭＵＣ２がその例である。これらの例に限定されるものではなく、いずれのペプチド／ポリペプチドでも本発明の方法により発現させることができる。
【００７７】
コンタクチンは、もっぱら神経系で発現される免疫グロブリンスーパーファミリーに属す分子のサブグループである（Shimoda and Watanabe, 2009の総説を参照）。コンタクチンは精神障害、特に自閉症に関連づけられている。本発明の系により生産すべき好ましいコンタクチンは、コンタクチン２および４である。コンタクチン４（ＣＮＴＮ４）は、例えば、配列番号９１（全長タンパク質ＮＰ＿７８３２００．１のアミノ酸１９〜９９０に相当）によりコードされている。
【００７８】
多くの癌抗原が、癌を治療するための有効なワクチンであることが知られている。このようなポリペプチド（Cheever et al, 2009のリストを参照)を大量に生産することは、有効な癌ワクチンを得るために極めて重要であると思われる。興味深いことに、本発明のベクターは、免疫療法に使用可能な高レベルの組換え癌抗原を得ること、または癌の診断法において抗体を生産することを可能とする。
【００７９】
ＳＳＸ２およびＮＥＲＣＭＳＬは、癌抗原の２つの例である。ＳＳＸ２癌抗原は、配列番号７６（Ｇｅｎｅｂａｎｋ：ＮＭ＿１７５６９８）を有するＤＮＡによりコードされている。ＥＲＣ／メソテリン（ＮＥＲＣＭＳＬ）のＮ末端領域は、配列番号８３によりコードされている。この抗原は、悪性中皮(malign mesothelium)に罹患している患者において検出抗原として慣用されている。
【００８０】
いずれのタンパク質でも本発明の方法により生産することができる。
【００８１】
さらに、好ましいタンパク質として、インスリン、ＩＦＮ、ＦａｓＬ、メソテリン、ｈＳＵＬＦまたはコンタクチンなどの治療用タンパク質がある。
【００８２】
もっと一般には、好ましいタンパク質は、これまで大量に生産することが難しかったものである。このようなタンパク質としては、例えば、ＦａｓＬ、グランザイムＭ、ｈＳＵＬＦ、メソテリンおよびコンタクチンがある。
【００８３】
前記ペプチドシグナル、前記ＭＧＭＴ酵素、突然変異体または触媒ドメイン、および前記目的組換えタンパク質を含んでなる融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、そのペプチドシグナルと同じ宿主細胞で機能的である誘導プロモーターと機能的に連結することができる。
【００８４】
より好ましくは、本発明のベクターにおいて、前記オープンリーディングフレームは、そのペプチドシグナルと同じ宿主細胞で機能的である誘導プロモーターと機能的に連結される。
【００８５】
あるコード配列は、ＲＮＡポリメラーゼがそのコード配列をＲＮＡへと転写し、次に、トランスＲＮＡスプライシングを受け（それがイントロンを含む場合）、その配列がタンパク質をコードしていればタンパク質へと翻訳される場合に、細胞内で発現制御配列（すなわち、転写制御配列および翻訳制御配列）と「機能的に連結されている」という。
【００８６】
「プロモーター」とは、下流（すなわち、二本鎖ＤＮＡのセンス鎖上の３’側）に機能的に連結されたＤＮＡの転写がそれから開始され得る、ヌクレオチド配列である。プロモーター配列内には、転写開始部位（好都合には、例えばヌクレアーゼＳ１を用いたマッピングにより見出される）、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見られる。
【００８７】
本発明において、遺伝子発現を制御するために使用可能なプロモーターは、例えば、無脊椎動物細胞または脊椎動物細胞において機能的なものである。例えば、無脊椎動物細胞では、メタロチオネイン遺伝子の調節配列が使用可能である(Brinster et al, Nature, 296:39-42, 1982)。
【００８８】
好ましくは、本発明のベクター中に存在する誘導プロモーターは、昆虫細胞、より好ましくはショウジョウバエ細胞でプロモーター活性を有する。それは例えば、ショウジョウバエメタロチオネインプロモーター(Lastowski-Perry et al, J.Biol. Chem. 260: 1527 (1985))であり、このプロモーターは金属、例えば、ＣｕＳＯ４の存在下で高レベルの遺伝子転写を指示する。
【００８９】
あるいは、構成プロモーターであって金属の添加を必要としないショウジョウバエアクチン５Ｃ遺伝子プロモーターも使用可能である(B. J. Bond et al, Mol. Cell. Biol. 6:2080 (1986))。他の既知のショウジョウバエプロモーターの例としては、例えば、誘導型熱ショックプロモーター（Ｈｓｐ７０）およびＣＯＰＩＡ  ＬＴＲプロモーターが挙げられる。ＳＶ４０初期プロモーターは、ショウジョウバエメタロチオネインよりも低いレベルの発現を与える。
【００９０】
好ましくは、本発明のベクター中に存在する誘導プロモーターは、キイロショウジョウバエ細胞、好ましくはショウジョウバエＳ２細胞においてプロモーター活性を有する。これは例えば、Lastowski-Perry et al, J.Biol. Chem. 260: 1527 (1985)に十分に記載されているメタロチオネインプロモーターである。
【００９１】
哺乳動物細胞における構成的発現に好適なプロモーターとしては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、ホスホグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）−１のチミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーターが挙げられる。外的に供給される化合物により調節される誘導型真核生物プロモーターとしては、限定されるものではないが、亜鉛誘導メタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系（ＷＯ９８／１００８８）、エクジソン昆虫プロモーター、テトラサイクリン抑制プロモーター、テトラサイクリン誘導プロモーター、ＲＵ４８６誘導プロモーターおよびラパマイシン誘導プロモーターが挙げられる。
【００９２】
好ましくは、本発明のベクター中に存在するプロモーターは、哺乳動物細胞、好ましくはＨｅＬａ細胞においてプロモーター活性を有する。それは例えば、ＳＶ４０プロモーターである。
【００９３】
酵母宿主細胞におけるタンパク質発現のためには、ある範囲の酵母プロモーターが利用可能である。ＡＤＨ２、ＳＵＣ２などいくつかのものは誘導型であり、ＧＡＰＤＨなどの他のものは発現が構成的である。酵母での発現に好適な他のプロモーターとしては、ＴＥＦ、ＰＧＫ、ＭＦα、ＣＹＣ−１、ＧＡＬ−１、ＧＡＬ４、ＧＡＬ１０、ＰＨＯ５、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰまたはＧＡＰＤＨ）、およびアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）プロモーターが挙げられる。
【００９４】
植物細胞における使用では、最もよく使用されているプロモーターはカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターまたはその増強型であるが、ハイブリッド（ｏｃｓ）３ｍａｓプロモーター、またはトウモロコシ(Maize)およびシロイヌナズナ(A.Thaliana)由来のユビキチンプロモーターなどのいくつかの別のプロモーターも使用可能である。これらの構成プロモーターとは対照的に、イネα−アミラーゼＲＡｍｙ３Ｄプロモーターは糖欠乏により誘導される(Hellwig S et al, 2004)。
【００９５】
大腸菌宿主細胞における発現に好適なプロモーターとしては、限定されるものではないが、バクテリオファージλｐＬプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＴＲＰプロモーターおよびＩＰＴＧ誘導ｐＴＡＣプロモーターが挙げられる。
【００９６】
前記ペプチド分泌シグナルと誘導プロモーターは同じ宿主細胞において機能的であることが好ましい。
【００９７】
より好ましくは、前記ペプチド分泌シグナルと誘導プロモーターは、ショウジョウバエＳ２細胞および脊椎動物細胞の両方において機能的である。
【００９８】
プロモーターに適用される場合の用語「誘導」は、当業者に十分に理解されている。本質的に、誘導プロモーターの制御下での発現は、適用された刺激に応答して「スイッチが入る」か、または増大する。この刺激の性質はプロモーターによって異なる。いくつかの誘導プロモーターは、適当な刺激が存在しなければほとんど発現しないかまたは検出可能なレベルの発現を生じない（または全く発現しない）。他の誘導プロモーターは、刺激が存在しなければ検出可能な構成的発現を生じる。どんな発現レベルも刺激の不在下にある場合、いずれの誘導プロモーターからの発現も適正な刺激の存在下で増大する。
【００９９】
ひと度、適当なベクターが構築され、選択された宿主細胞、好ましくは、ショウジョウバエ細胞株にトランスフェクトされれば、誘導プロモーターに対して適当な誘導因子を添加することで異種タンパク質の発現が誘導される。例えば、カドミウムまたは銅は、Ｈｓｐ７０プロモーターの誘導因子である。アクチン５Ｃプロモーターなどの構成プロモーターでは、発現に誘導因子の必要はない。
【０１００】
本発明のヒトＭＧＭＴ酵素は好ましくは、ヒトＭＧＭＴ遺伝子配列ＮＭ＿００２４１２．３、遺伝子ＩＤ４２５５（配列番号：３）または配列番号６８の最適化配列（わずか５０％のＧ／Ｃを含んでなる）によりコードされている。しかしながらやはり、そのいずれの相同配列も、それが機能的ＭＧＭＴ酵素、その突然変異体または触媒ドメイン、好ましくは、配列番号４または配列番号２をコードする限り、本発明において使用可能である。
【０１０１】
前記ＭＧＭＴ突然変異体をコードする好ましいＤＮＡ配列は、配列番号１のＳＮＡＰ  ＤＮＡ配列、またはＧ／Ｃ含量が５１％であること以外は配列番号２をコードする配列番号４７もしくは配列番号６７のＤＮＡ配列である。
【０１０２】
本発明の別の態様では、本発明のヌクレオチドベクターは、目的タンパク質の発現を、それがそれ由来の断片である全長酵素で得られるレベルの少なくとも０．５倍高める生物活性を保持する、ＭＧＭＴ酵素の断片（例えば、配列番号４の断片）、またはその同族体の断片（例えば、配列番号２の配列のＭＧＭＴ突然変異体の断片）を少なくともコードする。一例として、配列番号４の全長酵素を用いた場合のその生産レベルが１００ｍｇ／Ｌであれば、生産レベルが少なくとも５０ｍｇ／Ｌである（配列番号４の全長酵素の場合と同じ実験条件で）配列番号４のいずれの断片も本発明の範囲内に包含される。
【０１０３】
本発明の別の態様では、ヌクレオチド発現ベクターは少なくとも１つのペプチド切断部位をコードし、これは好ましくはＭＧＭＴ酵素またはその触媒ドメインと目的組換えタンパク質との間に位置する。
【０１０４】
ペプチド切断部位（「ペプチド切断部位」とも呼ばれる）は、少なくとも１つのプロテアーゼ酵素（中でも例えば、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ）により認識されるアミノ酸配列である。ペプチド切断部位の一例は、例えば配列番号１２のＤＮＡ配列によりコードされている、配列番号６２のエンテロキナーゼ切断部位（ＡｓｐＡｓｐＡｓｐＡｓｐＬｙｓ／Ａｓｐ）である。このエンテロキナーゼは、配列のＣ末端での切断により不活性トリプシノーゲンを活性トリプシンに変換することが知られているセリンプロテアーゼ酵素（ＥＣ３．４．２１．９）である：Ｖａｌ−（Ａｓｐ）４−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ〜（トリプシノーゲン）→Ｖａｌ−（Ａｓｐ）４−Ｌｙｓ（ヘキサペプチド）＋Ｉｌｅ−Ｖａｌ〜（トリプシン）。エンテロキナーゼは、Ｌｙｓの前に４つのＡｓｐがあり、後にプロリン残基がある場合は、リシンの後で切断する。
【０１０５】
もう１つの有用なペプチド切断部位は、配列番号５３または配列番号６５のアミノ酸配列（Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｔｙｒ  Ｐｈｅ  Ｇｌｎ  ＧｌｙまたはＳｅｒ）を有し、例えば、配列番号５２または配列番号６６のＤＮＡ配列によりコードされている、いわゆる「ＴＥＶプロテアーゼ」の切断部位である。ＴＥＶプロテアーゼは、タバコエッチ病ウイルスによりコードされているタンパク質である核封入体の２７ｋＤａの触媒ドメインに対する一般名である。これは市販されている（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。
【０１０６】
また、デング熱ウイルス血清型１（配列番号６１）由来の膜前駆体ｐｒＭの切断部位も、本発明のベクターにおいて使用可能である。
【０１０７】
別の態様では、本発明のヌクレオチド発現ベクターは、さらに標識をコードし、この標識は、好ましくは、本発明の融合ポリペプチド（ペプチドシグナル、ＭＧＭＴタンパク質またはその同族体と組換えタンパク質とを含んでなる）における組換えタンパク質のＣ末端に位置する。
【０１０８】
本発明において、「標識」とは、宿主細胞の粗溶解液からのポリペプチドの回収を助けることに特化されたものであり、好ましくは、蛍光タンパク質、ポリヒスチジン（ポリ−ｈｉｓ）またはポリ−ヒスチジン−グリシン（ポリ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ；ｆｌｕ  ＨＡタグ；ｃ−ｍｙｃタグ、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグ、Ｆｌａｇ−ペプチド、α−チューブリンエピトープ、またはＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグを含んでなる群から選択される。しかしながら、他のいずれの標識も使用可能である。本発明の好ましい態様では、ベクターは、配列番号１４を有するヘキサヒスチジンタグをコードするＤＮＡを含んでなる。
【０１０９】
別の態様では、本発明のヌクレオチド発現ベクターは、さらにスペーサー配列をコードし、このスペーサー配列は、好ましくは、ＭＧＭＴ酵素（またはその触媒ドメイン）と目的組換えタンパク質との間、および／または目的組換えタンパク質と標識との間に位置する。
【０１１０】
本発明において、スペーサー配列は、連結されている２つのポリペプチドを空間的に分離することに特化された少なくとも３つのアミノ酸を含んでなるアミノ酸配列である（従って、これらのポリペプチドは間接的に連結される）。このようなスペーサーは、例えば、アミノ酸配列グリシン−グリシン−グリシン−セリン（ＧＧＧＳ、配列番号６３）であってよく、それをコードするＤＮＡスペーサー配列は配列番号１３であり得る。本発明において、このＤＮＡ配列は以下「ＤＮＡスペーサー配列」と称し、ＭＧＭＴまたはその触媒ドメインをコードするＤＮＡと組換えＤＮＡ配列との間の、好ましくは、ペプチド切断部位をコードするＤＮＡ配列の上流に配置される。
【０１１１】
本発明により開示されるヌクレオチド発現ベクターは、配列番号９の配列、配列番号１０の配列または配列番号６４（クローニング部位に目的の組換え遺伝子が挿入されていないエンプティーベクターに相当）を有し得る。特定の態様では、本発明のベクターは、
・ペプチドＢｉＰ昆虫シグナル（好ましくは、Ｓ２ショウジョウバエ細胞において機能的である）または上記で定義されたＢｉＰ様シグナル、
・配列番号４のＭＧＭＴタンパク質または配列番号２のＳＮＡＰタンパク質、
・目的組換えタンパク質、
・エンテロキナーゼペプチド切断部位または上記で定義されたｐｒｏＴＥＶ切断部位、
・ポリヒスチジン標識、および
・アミノ酸配列グリシン−グリシン−グリシン−セリン（ＧＧＧＳ、配列番号６３）を有する２つのスペーサー配列
をコードし得る。
【０１１２】
より好ましい態様では、本発明の発現ベクターは、
・配列番号４８のペプチドＢｉＰ昆虫シグナル、
・配列番号４のＭＧＭＴタンパク質または配列番号２のＳＮＡＰタンパク質、
・目的組換えタンパク質、
・配列番号６２のエンテロキナーゼペプチド切断部位、
・ポリヒスチジン標識、および
・アミノ酸配列グリシン−グリシン−グリシン−セリン（ＧＧＧＳ）を有する２つのスペーサー配列
をコードする。
【０１１３】
別の好ましい態様では、本発明の発現ベクターは、
・配列番号５１のＢｉＰ様ペプチドシグナル、
・配列番号４のＭＧＭＴタンパク質または配列番号２のＳＮＡＰタンパク質、
・目的組換えタンパク質、
・配列番号５３のｐｒｏＴＥＶペプチド切断部位、
・ポリヒスチジン標識、および
・アミノ酸配列グリシン−グリシン−グリシン−セリン（ＧＧＧＳ）を有する２つのスペーサー配列
をコードする。
【０１１４】
このようなベクターは例えば、配列番号１９（目的タンパク質がＲＶＦウイルスの核タンパク質Ｎである場合）、配列番号２０（目的タンパク質が西ナイルウイルスの核タンパク質Ｎである場合）、配列番号２１もしくは５７もしくは７２もしくは７４（目的タンパク質がＩＦＮαである場合）、配列番号７７、７９もしくは８１（目的タンパク質が癌抗原ＳＳＸ２である場合）、配列番号５５（目的タンパク質がグランザイムＭである場合）、配列番号８９（目的タンパク質がＦａｓＬである場合）、配列番号８４もしくは８６（目的タンパク質が癌抗原ＮＥＲＣＭＳＬである場合）、または配列番号９２（目的タンパク質がコンタクチンＣＮＴＮ４である場合）の配列を含んでなる。
【０１１５】
第２の側面において、本発明はまた、宿主細胞において組換えタンパク質を発現するベクターであって、単一のオープンリーディングフレーム内に、５’から３’方向に、
ａ）ペプチド分泌シグナル、
ｂ）配列番号４のＭＧＭＴタンパク質または配列番号２のＳＮＡＰタンパク質、
ｃ）少なくとも１つのペプチド切断部位、
ｄ）ポリヒスチジン標識、および
ｅ）少なくとも１つのスペーサー配列
をコードするヌクレオチド配列を含んでなるベクターを開示する。
【０１１６】
好ましい態様では、前記ペプチド分泌シグナルは、配列番号５０のＢｉＰ様ペプチドシグナルである。
【０１１７】
どちらかといえば好ましい態様では、前記ベクターは、配列番号５２の２つのｐｒｏＴＥＶペプチド切断部位および／または配列番号６３のアミノ酸配列を有する２つのスペーサー配列を含んでなる。
【０１１８】
特に好ましい態様では、前記ベクターは、配列番号５９または配列番号６９の配列を含んでなり、前記配列は本出願ではそれぞれ、ユニバーサルＤｅＳＮＡＰカセット「ＤｅＳＮＡＰ  Ｕｎｉｖ」およびＤｅＭＧＭＴカセット「ＤｅＭＧＭＴ  Ｕｎｉｖ」と呼ばれる。
【０１１９】
これらの「ＤｅＳＮＡＰ  Ｕｎｉｖ」（配列番号５９）および「ＤｅＭＧＭＴ  Ｕｎｉｖ」（配列番号６９）は、異種タンパク質を生産するために宿主細胞をトランスフェクトすることに特化されたいずれの種類のベクター、すなわち、脊椎動物ベクター（ｐｃＤＮＡ３またはｐＣＩ−ｎｅｏベクター）ならびに無脊椎動物ベクター（ＤＥＳ系に有用なｐＭＴ／ＢｉＰ／Ｖ５−ＨｉｓＡ、以下の例を参照）にも挿入することができるので、「ユニバーサル」配列として維持される。
【０１２０】
前記ユニバーサル配列を含んでなるプラスミドの例は、配列番号６４（ＤｅＳＮＡＰ  Ｕｎｉｖを含んでなるｐＵＣ５７）および配列番号７１（ＤｅＭＧＭＴ  Ｕｎｉｖを含むｐＵＣ５７）である。
【０１２１】
ひと度、目的タンパク質の異種配列がその中にクローニングされれば、このようなベクターは、有利には、目的タンパク質を大量に生産するように脊椎動物または無脊椎動物宿主細胞のいずれかにトランスフェクトすることができる。
【０１２２】
第３の側面において、本発明は、前記ＤｅＳＮＡＰ  ＵｎｉｖベクターまたはＤｅＭＧＭＴ  Ｕｎｉｖベクターにより、すなわち、単一のオープンリーディングフレーム内に、５’から３’方向に、
ａ）ペプチド分泌シグナル、
ｂ）配列番号４のＭＧＭＴタンパク質または配列番号２のＳＮＡＰタンパク質、
ｃ）少なくとも１つのペプチド切断部位、
ｄ）ポリヒスチジン標識、および
ｅ）少なくとも１つのスペーサー配列
（各成分は上記で定義された通り）
をコードするヌクレオチド配列を含んでなる発現ベクターにより安定にトランスフェクトされた組換え細胞を対象とする。
【０１２３】
それは好ましくは、配列番号６４（ＤｅＳＮＡＰ  Ｕｎｉｖを含んでなるｐＵＣ５７）または配列番号７１（ＤｅＭＧＭＴ  Ｕｎｉｖを含むｐＵＣ５７）のプラスミド、または少なくとも配列番号５９（ＤｅＳＮＡＰ  Ｕｎｉｖ）もしくは配列番号６９（ＤｅＭＧＭＴ  Ｕｎｉｖ）のヌクレオチド配列を含んでなる。
【０１２４】
好ましくは、本発明のこの側面において、前記組換え細胞は大腸菌細胞である。
【０１２５】
この組換え細胞は、本発明の発現ベクター、好ましくは、配列番号５９のＤｅＳＮＡＰ  Ｕｎｉｖを含んでなるもの（配列番号６４など）または配列番号６９のＤｅＭＧＭＴ  Ｕｎｉｖを含んでなるもの（配列番号７１など）を増幅および精製するために使用される。
【０１２６】
よって、本発明はまた、本発明の発現ベクター（前記ベクターは上記で定義された通り）のいずれかを生産するためのこの組換え細胞の使用を対象とする。
【０１２７】
本発明のヌクレオチド発現ベクターはまた、選択マーカーおよび／またはターミネーター配列をコードする遺伝子も含んでなり得る。
【０１２８】
本構築物に含まれ得る選択マーカー遺伝子は一般に、抗生物質（例えば、ブラストサイジン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、クロラムフェニコール）耐性などの選択可能な表現型を付与するものである。
【０１２９】
第４の側面において、本発明は、宿主細胞、好ましくは、無脊椎動物または脊椎動物細胞、より好ましくは、昆虫細胞において機能的であるペプチド分泌シグナルと上記で定義された６−メチルグアニン−ＤＮＡ−メチルトランスフェラーゼ酵素（ＭＧＭＴ）（ＥＣ２．１．１．６３）、その突然変異体または触媒ドメインとを含んでなる融合ポリペプチドに関する。
【０１３０】
この融合ポリペプチドでは、前記ＭＧＭＴ酵素は好ましくは配列番号４のタンパク質、配列番号２のＳＮＡＰタンパク質突然変異体またはその同族体である。
【０１３１】
この融合ポリペプチドは好ましくは、上記で定義された目的組換えタンパク質をさらに含んでなり、この目的組換えタンパク質は、好ましくは、上記で定義されたＭＧＭＴ酵素またはその触媒ドメインおよび／または標識のＣ末端に位置する。この標識は好ましくはポリヒスチジン標識であり、好ましくは、目的組換えタンパク質のＣ末端に位置する。
【０１３２】
本発明の融合ポリペプチドは、配列番号３３〜４３、配列番号５６もしくは配列番号５８（目的組換えタンパク質がＧｒＭである場合）、配列番号７３もしくは７５（目的組換えタンパク質がＩＦＮαである場合）、配列番号７８もしくは８０もしくは８２（目的組換えタンパク質が癌抗原ＳＳＸ２である場合）、配列番号８５もしくは８７（目的組換えタンパク質がＮＥＲＣＭＳＬである場合）、配列番号９０（目的組換えタンパク質がＦａｓＬである場合）、または配列番号９３（目的組換えタンパク質がＣＮＴＮ４である場合）のアミノ酸配列であり得る。
【０１３３】
興味深いことに、本発明の融合タンパク質は、４℃で数ヶ月間、分解せずに保存することができる。この保存中のin vitro安定化効果は、ＭＧＭＴタンパク質の足場特性、および／またはＭＧＭＴタンパク質が存在するために高濃度が得られること（一般に少なくとも４０ｍｇ／ｍＬ）の結果である可能性がある。
【０１３４】
より重要なことには、このＭＧＭＴとの会合は、分泌されたタンパク質の精製工程中、組換えタンパク質を安定化させる。従って、これは、必要とする被験体にひと度投与されれば、in vivoで組換えタンパク質を安定化させるために使用することができる。ＭＧＭＴとのカップリングは、in vivoにおけるこのような組換えタンパク質の寿命を延長するための手段となり得る。このin vivo安定化効果は、現在検討中である。
【０１３５】
第５の側面において、本発明は、本発明の発現ベクターを含んでなる無脊椎動物組換え宿主細胞に関する。
【０１３６】
無脊椎動物細胞は、昆虫、クモ類、甲殻類、軟体動物類、環形動物類、つるあし類、放射相称動物、腔腸動物類および滴虫類由来のいずれの細胞であってもよい。本発明において、無脊椎動物細胞は、好ましくは昆虫細胞、例えば、ショウジョウバエまたは蚊細胞である。無脊椎動物細胞は、より好ましくは、ショウジョウバエＳ２細胞である。
【０１３７】
ショウジョウバエＳ２細胞は広く記載されている。この細胞は、室温（２４±１℃）にて懸濁培養で維持できることから、タンパク質の高収量生産に特に適している。培養培地は５〜１０％（ｖ／ｖ）の間の熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＭ３である。本発明の好ましい態様では、培養培地は５％ＦＢＳを含有する。誘導後、細胞は無血清培地で培養する。この培地では、Ｓ２細胞は懸濁培養で、例えば、２５０ｍＬ〜２０００ｍＬのスピナーフラスコ中、５０〜６０ｒｐｍで撹拌しながら増殖させることができる。細胞密度は一般に１０６〜１０７細胞／ｍＬの間に維持する。
【０１３８】
本発明はまた、本発明の発現ベクターを含んでなる組換えＳ２ショウジョウバエ細胞を対象とし、前記発現ベクターは好ましくは、
・プラスミド配列番号６４（ＤｅＳＮＡＰ  Ｕｎｉｖを含むｐＵＣ５７）、または２０１１年１２月９日に、ブタペスト条約に従い、the Centre National de Culture et de Microorganismes（ＣＮＣＭ），パスツール研究所（フランス ７５７２４ パリ セデックス １５ リュ デュ ドクトール ル ２５）に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４５８１として寄託された細胞にクローニングされたヌクレオチド配列、
・配列番号１９、または２０１０年８月１９日に、ブタペスト条約に従い、the Centre National de Culture et de Microorganismes（ＣＮＣＭ），パスツール研究所（フランス ７５７２４ パリ セデックス １５ リュ デュ ドクトール ル ２５）に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４３５７として寄託された細胞にクローニングされたヌクレオチド配列を含んでなるベクター、
・配列番号２２、または２０１０年１０月２７日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes（ＣＮＣＭ），パスツール研究所に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４３８１として寄託された細胞にクローニングされたヌクレオチド配列を含んでなる本発明のベクター、
・配列番号２１、または２０１０年１０月２７日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes（ＣＮＣＭ），パスツール研究所に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４３８２として寄託された細胞にクローニングされたヌクレオチド配列を含んでなる本発明のベクター、
・配列番号９、または２０１０年９月２９日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes（ＣＮＣＭ），パスツール研究所に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４３６８として寄託された細胞にクローニングされたヌクレオチド配列のベクター、
・配列番号２０、または２０１０年９月２９日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes（ＣＮＣＭ），パスツール研究所に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４３６９として寄託された細胞にクローニングされたヌクレオチド配列を含んでなる本発明のベクター、
・配列番号７１のベクター、
・配列番号５７もしくは７２もしくは７４（目的タンパク質がＩＦＮαである場合）、配列番号７７、７９もしくは８１（目的タンパク質が癌抗原ＳＳＸ２である場合）、配列番号５５（目的タンパク質がグランザイムＭである場合）、配列番号８９（目的タンパク質がＦａｓＬである場合）、配列番号８４もしくは８６（目的タンパク質が癌抗原ＮＥＲＣＭＳＬである場合）、配列番号９２（目的タンパク質がコンタクチンＣＮＴＮ４である場合）、または配列番号９６（目的タンパク質がｈＳＵＬＦ−２ΔＴＭＤである場合）を含んでなる本発明のベクター
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなる。
【０１３９】
本発明の安定にトランスフェクトされたＳ２細胞はまた、
・２０１０年８月１９日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes（ＣＮＣＭ），パスツール研究所（フランス ７５７２４ パリ セデックス １５ リュ デュ ドクトール ル ２５）に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４３５７として寄託された細胞、
・２０１０年１０月２７日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes（ＣＮＣＭ），パスツール研究所（フランス ７５７２４ パリ セデックス １５ リュ デュ ドクトール ル ２５）に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４３８１として寄託された細胞、
・２０１０年１０月２７日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes（ＣＮＣＭ），パスツール研究所（フランス ７５７２４ パリ セデックス １５ リュ デュ ドクトール ル ２５）に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４３８２として寄託された細胞、
・２０１０年９月２９日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes（ＣＮＣＭ），パスツール研究所（フランス ７５７２４ パリ セデックス １５ リュ デュ ドクトール ル ２５）に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４３６８として寄託された細胞、
・２０１０年９月２９日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes（ＣＮＣＭ），パスツール研究所（フランス ７５７２４ パリ セデックス １５ リュ デュ ドクトール ル ２５）に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４３６９として寄託された細胞、
・２０１１年１２月５日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes（ＣＮＣＭ），パスツール研究所（フランス ７５７２４ パリ セデックス １５ リュ デュ ドクトール ル ２５）に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４５６５として寄託された細胞、
・２０１１年１２月５日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes（ＣＮＣＭ），パスツール研究所（フランス ７５７２４ パリ セデックス １５ リュ デュ ドクトール ル ２５）に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４５６６として寄託された細胞、
・２０１１年１２月５日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes（ＣＮＣＭ），パスツール研究所（フランス ７５７２４ パリ セデックス １５ リュ デュ ドクトール ル ２５）に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４５６７として寄託された細胞、
・２０１１年１２月５日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes（ＣＮＣＭ），パスツール研究所（フランス ７５７２４ パリ セデックス １５ リュ デュ ドクトール ル ２５）に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４５６８として寄託された細胞、
・２０１１年１２月５日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes（ＣＮＣＭ），パスツール研究所（フランス ７５７２４ パリ セデックス １５ リュ デュ ドクトール ル ２５）に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４５６９として寄託された細胞、
・２０１１年１２月５日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes（ＣＮＣＭ），パスツール研究所（フランス ７５７２４ パリ セデックス １５ リュ デュ ドクトール ル ２５）に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４５７０として寄託された細胞、
・２０１１年１２月５日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes（ＣＮＣＭ），パスツール研究所（フランス ７５７２４ パリ セデックス １５ リュ デュ ドクトール ル ２５）に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４５７１として寄託された細胞、
・２０１１年１２月５日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes（ＣＮＣＭ），パスツール研究所（フランス ７５７２４ パリ セデックス １５ リュ デュ ドクトール ル ２５）に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４５７２として寄託された細胞、
・２０１１年１２月８日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes（ＣＮＣＭ），パスツール研究所（フランス ７５７２４ パリ セデックス １５ リュ デュ ドクトール ル ２５）に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４５７６として寄託された細胞、
・２０１１年１２月８日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes（ＣＮＣＭ），パスツール研究所（フランス ７５７２４ パリ セデックス １５ リュ デュ ドクトール ル ２５）に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４５７７として寄託された細胞、
・２０１１年１２月８日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes（ＣＮＣＭ），パスツール研究所（フランス ７５７２４ パリ セデックス １５ リュ デュ ドクトール ル ２５）にthe Centre National de Culture et de Microorganismes（ＣＮＣＭ），パスツール研究所（フランス ７５７２４ パリ セデックス １５ リュ デュ ドクトール ル ２５）に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４５７８として寄託された細胞、
・２０１１年１２月８日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes（ＣＮＣＭ），パスツール研究所（フランス ７５７２４ パリ セデックス １５ リュ デュ ドクトール ル ２５）に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４５７９として寄託された細胞、
・２０１１年１２月８日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes（ＣＮＣＭ），パスツール研究所（フランス ７５７２４ パリ セデックス １５ リュ デュ ドクトール ル ２５）に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４５８０として寄託された細胞、
・２０１１年１２月９日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes（ＣＮＣＭ），パスツール研究所（フランス ７５７２４ パリ セデックス １５ リュ デュ ドクトール ル ２５）に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４５８２として寄託された細胞、
・２０１１年１２月９日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes（ＣＮＣＭ），パスツール研究所（フランス ７５７２４ パリ セデックス １５ リュ デュ ドクトール ル ２５）に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４５８３として寄託された細胞、
・２０１１年１２月９日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes（ＣＮＣＭ），パスツール研究所（フランス ７５７２４ パリ セデックス １５ リュ デュ ドクトール ル ２５）に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４５８４として寄託された細胞、
・２０１１年１２月９日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes（ＣＮＣＭ），パスツール研究所（フランス ７５７２４ パリ セデックス １５ リュ デュ ドクトール ル ２５）に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４５８５として寄託された細胞、および
・２０１１年１２月９日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes（ＣＮＣＭ），パスツール研究所（フランス ７５７２４ パリ セデックス １５ リュ デュ ドクトール ル ２５）に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４５８６として寄託された細胞
からなる群から選択することもできる。
【０１４０】
番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４３５７として寄託された組換え細胞は、配列番号１９（ｐＭＴ／ＢｉＰ／ＳＮＡＰ−ＲＶＦ．Ｎ／Ｈｉｓタグ）（ここで、ＲＶＦ．Ｎはリフトバレー熱ウイルス（ＲＶＦ）のＮ抗原である）のプラスミドベクターを含んでなる、安定なマクロファージショウジョウバエ細胞株Ｓ２である（Brehin et al, Virology 371 : 185, 2008参照）。
【０１４１】
番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４３８１として寄託された組換え細胞は、ＢｉＰ配列の後に配列番号２２（ＳＮＡＰ／ＷＮ．ＥＤＩＩＩ）（ここで、ＷＮ．ＥＤＩＩＩは西ナイルウイルスの糖タンパク質ＥのＩＩＩドメインである）が挿入されたプラスミドベクターｐＭＴ／ＢｉＰ／Ｖ５−Ｈｉｓタグを含んでなる、安定なマクロファージショウジョウバエ細胞株Ｓ２である。
【０１４２】
番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４３８２として寄託された組換え細胞は、配列番号２１（ＢｉＰ／ＳＮＡＰ／ＩＦＮα１）が挿入されたプラスミドベクターｐＭＴ／Ｖ５−Ｈｉｓタグを含んでなる、安定なマクロファージショウジョウバエ細胞株Ｓ２である。ＩＦＮα１は、配列番号３２のヒトα１インターフェロンである(Mokkim et al. Protein expression purif. 63:140, 2009)。
【０１４３】
ＣＮＣＭ  Ｉ−４３６９として寄託された組換え細胞は、配列番号２０（ＷＮ．ｓＥ／ＳＮＡＰ／ｈｉｓタグ）（ここで、ＷＮ．ｓＥは西ナイルウイルスのＥエンベロープタンパク質の可溶型である）を含有するプラスミドベクターｐＭＴ／ＢｉＰ／Ｖ５−Ｈｉｓタグを含んでなる、安定なマクロファージショウジョウバエ細胞株Ｓ２である。
【０１４４】
ＣＮＣＭ  Ｉ−４３６９として寄託された組換え細胞は、配列番号２０（ＷＮ．ｓＥ／ＳＮＡＰ／ｈｉｓタグ）（ここで、ＷＮ．ｓＥは西ナイルウイルスのＥエンベロープタンパク質の可溶型である）を含有するプラスミドベクターｐＭＴ／ＢｉＰ／Ｖ５−Ｈｉｓタグを含んでなる、安定なマクロファージマクロファージショウジョウバエ細胞株Ｓ２である。
【０１４５】
ＣＮＣＭ  Ｉ−４５６５として寄託された組換え細胞は、プラスミドベクターｐＭＴ／ＢｉＰ／ＳＮＡＰ＋ＤＶ１．ＥＤＩＩＩ／Ｈｉｓタグ（ここで、ＤＶ１．ＥＤＩＩＩはデング熱ウイルス１のＥＤＩＩＩタンパク質をコードし、配列番号２７の配列を有する）を含んでなる、安定なマクロファージマクロファージショウジョウバエ細胞株Ｓ２である。
【０１４６】
ＣＮＣＭ  Ｉ−４５６６として寄託された組換え細胞は、プラスミドベクターｐＭＴ／ＢｉＰ／ＳＮＡＰ＋ＤＶ２．ＥＤＩＩＩ／Ｈｉｓタグ（ここで、ＤＶ２．ＥＤＩＩＩはデング熱ウイルス２のＥＤＩＩＩタンパク質をコードし、配列番号２８の配列を有する）を含んでなる、安定なマクロファージマクロファージショウジョウバエ細胞株Ｓ２である。
【０１４７】
ＣＮＣＭ  Ｉ−４５６７として寄託された組換え細胞は、プラスミドベクターｐＭＴ／ＢｉＰ／ＳＮＡＰ＋ＤＶ３．ＥＤＩＩＩ／Ｈｉｓタグ（ここで、ＤＶ３．ＥＤＩＩＩはデング熱ウイルス３のＥＤＩＩＩタンパク質をコードし、配列番号２９の配列を有する）を含んでなる、安定なマクロファージショウジョウバエ細胞株Ｓ２である。
【０１４８】
ＣＮＣＭ  Ｉ−４５６８として寄託された組換え細胞は、プラスミドベクターｐＭＴ／ＢｉＰ／ＳＮＡＰ＋ＤＶ４．ＥＤＩＩＩ／Ｈｉｓタグ（ここで、ＤＶ４．ＥＤＩＩＩはデング熱ウイルス４のＥＤＩＩＩタンパク質をコードし、配列番号３０の配列を有する）を含んでなる、安定なマクロファージショウジョウバエ細胞株Ｓ２である。
【０１４９】
ＣＮＣＭ  Ｉ−４５６９として寄託された組換え細胞は、プラスミドベクターｐＭＴ／ＢｉＰ／ＳＮＡＰ＋ＹＦ．ＥＤＩＩＩ／Ｈｉｓタグ（ここで、ＹＦ．ＥＤＩＩＩは黄熱病ウイルスのＥＤＩＩＩタンパク質をコードし、配列番号３１の配列を有する）を含んでなる、安定なマクロファージショウジョウバエ細胞株Ｓ２である。
【０１５０】
ＣＮＣＭ  Ｉ−４５７０として寄託された組換え細胞は、プラスミドベクターｐＭＴ／ＢｉＰ／ＳＮＡＰ＋ＪＥ．ＥＤＩＩＩ／Ｈｉｓタグ（ここで、ＪＥ．ＥＤＩＩＩは日本脳炎ウイルスのＥＤＩＩＩタンパク質をコードし、配列番号２５の配列を有する）を含んでなる、安定なマクロファージショウジョウバエ細胞株Ｓ２である。
【０１５１】
ＣＮＣＭ  Ｉ−４５７１として寄託された組換え細胞は、プラスミドベクターｐＭＴ／ＢｉＰ／ＳＮＡＰ＋ＵＳＵ．ＥＤＩＩＩ／Ｈｉｓタグ（ここで、ＵＳＵ．ＥＤＩＩＩはウスツウイルスのＥＤＩＩＩタンパク質をコードし、配列番号２４の配列を有する）を含んでなる、安定なマクロファージショウジョウバエ細胞株Ｓ２である。
【０１５２】
ＣＮＣＭ  Ｉ−４５７２として寄託された組換え細胞は、プラスミドベクターｐＭＴ／ＢｉＰ／ＳＮＡＰ＋ＴＢＥ．ＥＤＩＩＩ／Ｈｉｓタグ（ここで、ＴＢＥ．ＥＤＩＩＩはダニ媒介脳炎ウイルスのＥＤＩＩＩタンパク質をコードし、配列番号２６の配列を有する）を含んでなる、安定なマクロファージショウジョウバエ細胞株Ｓ２である。
【０１５３】
ＣＮＣＭ  Ｉ−４５７６として寄託された組換え細胞は、プラスミドベクターｐＭＴ／ＢｉＰ／ＳＮＡＰ＋ＭＶＥ．ＥＤＩＩＩ／Ｈｉｓタグ（ここで、ＭＶＥ．ＥＤＩＩＩはマレー脳炎ウイルスのＥＤＩＩＩタンパク質をコードする）を含んでなる、安定なマクロファージショウジョウバエ細胞株Ｓ２である。
【０１５４】
ＣＮＣＭ  Ｉ−４５７７として寄託された組換え細胞は、プラスミドベクターｐＭＴ／ＢｉＰ／ＳＮＡＰ＋Ｒｏｃｉｏ．ＥＤＩＩＩ／Ｈｉｓタグ（ここで、Ｒｏｃｉｏ．ＥＤＩＩＩはロシオウイルスのＥＤＩＩＩタンパク質をコードする）を含んでなる、安定なマクロファージショウジョウバエ細胞株Ｓ２である。
【０１５５】
ＣＮＣＭ  Ｉ−４５７８として寄託された組換え細胞は、プラスミドベクターｐＭＴ／ＢｉＰ／ＳＮＡＰ＋ＳＬＥ．ＥＤＩＩＩ／Ｈｉｓタグ（ここで、ＳＬＥ．ＥＤＩＩＩはセントルイス脳炎ウイルスのＥＤＩＩＩタンパク質をコードする）を含んでなる、安定なマクロファージショウジョウバエ細胞株Ｓ２である。
【０１５６】
ＣＮＣＭ  Ｉ−４５７９として寄託された組換え細胞は、プラスミドベクターｐＭＴ／ＢｉＰ／ＳＮＡＰ＋ＷＳＬ．ＥＤＩＩＩ／Ｈｉｓタグ（ここで、ＷＳＬ．ＥＤＩＩＩはベッセルブロンウイルスのＥＤＩＩＩタンパク質をコードする）を含んでなる、安定なマクロファージショウジョウバエ細胞株Ｓ２である。
【０１５７】
ＣＮＣＭ  Ｉ−４５８０として寄託された組換え細胞は、プラスミドベクターｐＭＴ／ＢｉＰ／ＳＮＡＰ＋Ｚｉｋａ．ＥＤＩＩＩ／Ｈｉｓタグ（ここで、Ｚｉｋａ．ＥＤＩＩＩはジカウイルスのＥＤＩＩＩタンパク質をコードする）を含んでなる、安定なマクロファージショウジョウバエ細胞株Ｓ２である。
【０１５８】
ＣＮＣＭ  Ｉ−４５８３として寄託された組換え細胞は、プラスミドベクターｐＭＴ／ＢｉＰ／ＳＮＡＰ＋ＳＳＸ２／Ｈｉｓタグ（ここで、ＳＳＸ２は配列番号７６である）を含んでなる、安定なマクロファージショウジョウバエ細胞株Ｓ２である。
【０１５９】
ＣＮＣＭ  Ｉ−４５８４として寄託された組換え細胞は、プラスミドベクターｐＭＴ／ＢｉＰ／ＳＮＡＰ＋ＮＥＲＣＭＳＬ／Ｈｉｓタグ（ここで、ＮＥＲＣＭＳＬは配列番号８３である）を含んでなる、安定なマクロファージショウジョウバエ細胞株Ｓ２である。
【０１６０】
ＣＮＣＭ  Ｉ−４５８５として寄託された組換え細胞は、プラスミドベクターｐＭＴ／ＢｉＰ／ＳＮＡＰ＋ＧｒＭ／Ｈｉｓタグ（ここで、ＧｒＭは配列番号５４である）を含んでなる、安定なマクロファージショウジョウバエ細胞株Ｓ２である。
【０１６１】
ＣＮＣＭ  Ｉ−４５８６として寄託された組換え細胞は、プラスミドベクターｐＭＴ／ＢｉＰ／ＰｒｏＴＥＶ／Ｈｉｓタグ（ここで、ｐｒｏＴＥＶは配列番号５２である）を含んでなる、安定なマクロファージショウジョウバエ細胞株Ｓ２である。
【０１６２】
第６の側面において、本発明はまた、本発明の発現ベクターにより安定にトランスフェクトされた脊椎動物組換え細胞も対象とする。
【０１６３】
好ましくは、前記脊椎動物組換え細胞は哺乳動物細胞、好ましくは、ＣＨＯ、ＹＢ２／Ｏ、ＣＯＳ、ＨＥＫ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨｅＬａ細胞またはそれらの誘導体である。より好ましくは、この場合、本発明の発現ベクターは、配列番号５７もしくは７２もしくは７４（目的タンパク質がＩＦＮαである場合）、配列番号７７、７９もしくは８１（目的タンパク質が癌抗原ＳＳＸ２である場合）、配列番号５５（目的タンパク質がグランザイムＭである場合）、配列番号８９（目的タンパク質がＦａｓＬである場合）、配列番号８４もしくは８６（目的タンパク質が癌抗原ＮＥＲＣＭＳＬである場合）、配列番号９２（目的タンパク質がコンタクチンＣＮＴＮ４である場合）または配列番号９６（目的タンパク質がｈＳＵＬＦ２ΔＴＭＤである場合）を含んでなる。第７の側面において、本発明は、ペプチド分泌シグナルを含む前記タンパク質を、酵素６−メチルグアニン−ＤＮＡ−メチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）（ＥＣ２．１．１．６３）、その突然変異体または触媒ドメインとともに共発現させることを含んでなる、組換えタンパク質の発現を増強する方法に関する。前記共発現は好ましくは無脊椎動物細胞、より好ましくは昆虫細胞で行われる。
【０１６４】
より好ましくは、この方法において、ＭＧＭＴ酵素は、配列番号４のタンパク質またはその同族体、例えば、配列番号２のＳＮＡＰタンパク質またはその同族体である。
【０１６５】
本発明において、異種タンパク質の「発現を増強する」という用語は、組換え細胞の上清中、または細胞それ自体の中の前記タンパク質の発現が、従来技術、すなわち、前記タンパク質がＭＧＭＴまたはＳＮＡＰタンパク質とともに共発現されない場合の組換えベクターで得られる前記タンパク質の発現および／または分泌に比べて、少なくとも２倍、好ましくは５倍、より好ましくは１０倍、いっそうより好ましくは２０倍改善されることを意味する。好ましい態様では、「発現を増強する」という用語は、本発明のベクターでトランスフェクトされた宿主細胞の上清から少なくとも４０ｍｇ／Ｌ、好ましくは少なくとも５０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも６０ｍｇ／Ｌの目的タンパク質を回収可能であることを意味する。
【０１６６】
用語「共発現する」とは、ｉ）組換えタンパク質、ｉｉ）ＭＧＭＴ酵素、その突然変異体または触媒ドメイン、およびｉｉｉ）ペプチド分泌シグナルをコードするＤＮＡ配列が、同じ発現制御配列（すなわち、転写および翻訳制御配列）と機能的に連結され、それにより調節されることを意味する。従って、ペプチド分泌シグナル、異種目的タンパク質およびＭＧＭＴ酵素をコードするＤＮＡ配列の翻訳は、それらのタンパク質が上記で定義されたスペーサー配列および／または酵素切断部位により分離することができる融合ポリペプチドの形成をもたらす。
【０１６７】
本発明の融合ポリペプチドの「ペプチド分泌シグナル」は、好ましくは、無脊椎動物細胞もしくは脊椎動物細胞のいずれか、またはその両方において、より好ましくは昆虫細胞、いっそうより好ましくはショウジョウバエＳ２細胞において機能的である分泌シグナルである。
【０１６８】
昆虫細胞において機能的であるペプチド分泌シグナルの例としては、配列番号４８の昆虫ｓｓＢｉＰ、配列番号５１のＢｉＰ様シグナル、アルボウイルスに存在する任意のペプチドシグナル、例えば、西ナイルウイルスのエンベロープＥタンパク質（配列番号１５）がある。
【０１６９】
脊椎動物細胞および無脊椎動物細胞の両方において機能的なペプチド分泌シグナルの一例は、配列番号５１のＢｉＰ様シグナルである。
【０１７０】
第８の側面において、本発明は、上記のような本発明のベクター、または上記のような組換え宿主細胞の使用を含んでなる、目的組換えタンパク質の生産を改善するため、または組換えタンパク質を細胞培養で生産するための方法に関する。
【０１７１】
より厳密には、前記の、目的組換えタンパク質の生産を改善するため、または組換えタンパク質を細胞培養で生産するための方法は、
ａ）前記目的タンパク質をコードする本発明のヌクレオチド発現ベクターを提供する工程、
ｂ）前記発現ベクターを宿主細胞、好ましくは無脊椎動物または脊椎動物宿主細胞に導入する工程、
ｃ）前記宿主細胞内で導入されたヌクレオチドの発現を可能として前記目的組換えタンパク質を生産する工程
を含んでなる。
【０１７２】
好ましくは、前記無脊椎動物宿主細胞は、昆虫細胞、例えば、ショウジョウバエＳ２細胞である。
【０１７３】
好ましくは、前記脊椎動物宿主細胞は、哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ、ＹＢ２／Ｏ、ＣＯＳ、ＨＥＫ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨｅＬａ細胞またはそれらの誘導体である。
【０１７４】
この方法を使用することにより、目的組換えタンパク質は、少なくとも４０ｍｇ／Ｌ（回収細胞培養上清）以上の発現を示す。
【０１７５】
遺伝子産物を直接培地中に分泌するショウジョウバエ細胞株Ｓ２の使用は本発明の好ましい態様である（このような培地への直接分泌は効率的な一工程精製系を可能とする）。
【０１７６】
第９の態様において、本発明は、複製ベクターまたは欠陥ベクターに感染した、好ましくは無脊椎動物および／または脊椎動物宿主細胞、より好ましくは昆虫細胞または哺乳動物細胞において、組換えタンパク質の生産レベルを高めるための、酵素６−メチルグアニン−ＤＮＡ−メチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）（ＥＣ２．１．１．６３）、その突然変異体または触媒ドメインの使用に関する。
【０１７７】
このＭＧＭＴ酵素は、配列番号４の配列のヒトＭＧＭＴ（ＮＰ＿００２４０３．２として参照）、ＮＰ＿０３２６２４．１（配列番号４５）として示されるマウスＭＧＭＴ、ＮＰ＿０３６９９３．１（配列番号４６）として示されるラットＭＧＭＴ、その相同配列、またはその部分断片であり得る。
【０１７８】
好ましくは、このＭＧＭＴ変異酵素は、配列番号２のＳＮＡＰタンパク質、またはその同族体であり、すなわち、同族体は配列番号２の配列のＳＮＡＰタンパク質と少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％を超える同一性を示す。
【０１７９】
前記無脊椎動物細胞は、好ましくは、昆虫細胞、例えば、ショウジョウバエＳ２細胞である。
【０１８０】
好ましい態様では、本発明は、複製ベクターまたは欠陥ベクターに感染した脊椎動物細胞、例えば、哺乳動物細胞において、組換えタンパク質の生産レベルを高めるための、酵素６−メチルグアニン−ＤＮＡ−メチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）（ＥＣ  ２．１．１．６３）、その突然変異体、または触媒ドメインの使用に関する。
【０１８１】
前記脊椎動物細胞は、好ましくは、ＥＢＸ、ＣＨＯ、ＹＢ２／Ｏ、ＣＯＳ、ＨＥＫ、ＮＩＨ３Ｔ３細胞またはそれらの誘導体である。
【０１８２】
また、本発明は、組換え細胞において目的タンパク質の生産レベルを高めるための、ＭＧＭＴ酵素、その突然変異体または触媒ドメインをコードするＤＮＡ配列の使用に関する。
【０１８３】
本発明はまた、ｉ）in vitroおよびin vivoにおいて組換えタンパク質を安定化させ、それによりｉｉ）in vitroおよびin vivoにおいてそれらの寿命を延長させるための、ＭＧＭＴ酵素、その突然変異体または触媒ドメインをコードするＤＮＡ配列の使用に関する。
【０１８４】
このようなＤＮＡ配列は、例えば、ヒトＭＧＭＴ遺伝子配列ＮＭ＿００２４１２．３、遺伝子ＩＤ４２５５（配列番号３）、または機能的ＭＧＭＴ酵素、その突然変異体もしくは触媒ドメインをコードするその任意の相同配列（好ましくは、配列番号１、配列番号４７、配列番号６７または配列番号６８）である。
【０１８５】
特に、本発明は、保存培地、血漿もしくはバッファー中での組換えタンパク質の半減期を延長するため、薬剤もしくはワクチンとして使用する組換えタンパク質の半減期を延長するため、または診断キットで使用する組換えタンパク質の半減期を延長するために、組換えタンパク質と融合または連結させる保護ポリペプチドとしての、６−メチルグアニン−ＤＮＡ−メチルトランスフェラーゼ酵素（ＭＧＭＴ、ＥＣ２．１．１．６３）、その突然変異体または触媒ドメインの使用に関する。
【０１８６】
本発明において、異種タンパク質の「生産レベルを改善する」または「生産レベルを高める」という用語とは、前記細胞の上清中または前記細胞内での前記タンパク質の発現が、従来技術の、すなわち、本発明のベクターを含まない、組換えベクターを用いた場合に得られる前記タンパク質の発現に比べて少なくとも２倍、好ましくは５倍、より好ましくは１０倍、いっそうより好ましくは２０倍改善されることを意味する。好ましい態様では、「生産を改善する」とは、本発明のベクターでトランスフェクトされた宿主細胞の上清から少なくとも４０ｍｇ／Ｌ、好ましくは少なくとも５０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも６０ｍｇ／Ｌの目的タンパク質を回収可能であることを意味する。
【０１８７】
好ましい態様では、前記組換えタンパク質は、インスリン、ＩＦＮ、ＳＳＸ２、グランザイムＭ、ＦａｓＬ、メソテリン（ＮＥＲＭＣＳＬ）、エンドスルファターゼ（ｈＳＵＬＦ）またはコンタクチンの中から選択される。
【０１８８】
特定の態様では、本発明はまた、目的組換えタンパク質の生産のための方法に関し、該方法は、
（ａ）目的組換えタンパク質をコードする異種ＤＮＡ配列を取得する工程；
（ｂ）前記異種ＤＮＡ配列を本発明のヌクレオチド発現ベクターに挿入する工程（該ベクターは例えば配列番号９、配列番号１０、配列番号６４または配列番号７１のＤＮＡ配列を有する）；
（ｃ）宿主細胞（好ましくは、昆虫細胞または哺乳動物細胞）を工程（ｂ）で得られたポリヌクレオチドでトランスフェクトする工程；
（ｄ）工程（ｃ）で得られた前記ポリヌクレオチドの発現を可能として目的タンパク質を生産する工程；
（ｅ）場合により、ＭＧＭＴポリペプチドを切断する工程、
（ｆ）目的タンパク質を回収する工程、
（ｇ）場合により、目的タンパク質を精製する工程
を含んでなる。
【０１８９】
本発明の方法の種々の工程を実施するためには、当業者の範囲内の従来の分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡ技術を使用することができる。このような技術は、文献で十分説明されている。例えば、Sambrook, Fitsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. （本明細書では「Sambrook et al., 1989」と称する）; DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D. N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins, eds. 1984); Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); B. E. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); F. M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)参照。
【０１９０】
用語「トランスフェクション」とは、真核生物宿主細胞が導入された遺伝子または配列を発現して目的の物質、本発明では導入された遺伝子または配列によりコードされているタンパク質を生産するように、宿主細胞に外来核酸を導入することを意味する。導入されたＤＮＡまたはＲＮＡを受容および発現する宿主細胞は「トランスフェクトされた」と言い、「トランスフェクタント」または「クローン」と言う。宿主細胞に導入されるＤＮＡまたはＲＮＡは、宿主細胞と同属もしくは同種の細胞、または異属もしくは異種の細胞を含め、いずれの起源のものであってもよい。
【０１９１】
本発明において、ポリヌクレオチドでの宿主細胞のトランスフェクションは、当技術分野における従来法、例えば、トランスフェクション、感染、またはエレクトロポレーションによって行うことができる。別の態様では、本発明のベクターはin vivoにおいてリポフェクション（裸のＤＮＡとして）、または他のトランスフェクション促進剤（ペプチド、ポリマーなど）を用いて導入することができる。合成陽イオン脂質を用いて、マーカーをコードする遺伝子のin vivoトランスフェクションのためのリポソームを作製することができる(Feigner et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84:7413-7417, 1987)。核酸の導入に有用な脂質化合物および組成物は、ＷＯ９５／１８８６３およびＷＯ９６／１７８２３、ならびに米国特許第５，４５９，１２７号に記載されている。標的化のために脂質を他の分子と化学的にカップリングしてもよい（Mackey et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:8027-8031, 1988参照）。ホルモンもしくは神経伝達物質などの標的ペプチド、および抗体などのタンパク質、または非ペプチド分子をリポソームと化学的にカップリングさせることができる。陽イオンオリゴペプチド（ＷＯ９５／２１９３１参照）、ＤＮＡ結合タンパク質由来のペプチド（ＷＯ９６／２５５０８参照）、または陽イオンポリマー（ＷＯ９５／２１９３１参照）などの、in vivoにおける核酸のトランスフェクションを助けるための他の分子も有用である。また、in vivoにおいて裸のＤＮＡプラスミドとしてベクターを導入することもできる。遺伝子療法用の裸のＤＮＡベクターは、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿法、遺伝子銃の使用、またはＤＮＡベクター輸送体の使用などの当技術分野で公知の方法により、所望の宿主細胞に導入することができる（Wu et al, J. Biol. Chem., 267:963-967, 1992; Wu and Wu, X Biol. Chem., 263:14621-14624, 1988; Williams et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88:2726-2730, 1991参照）。
【０１９２】
本明細書においてポリヌクレオチドの「発現を可能とする」という用語は、ベクター中に存在する調節配列の刺激（例えば、誘導プロモーターを活性化する刺激）と、必要な総ての成分がそのポリヌクレオチドの翻訳が起こるのに十分な量で存在することを意味する。
【０１９３】
必要であれば、生産された融合タンパク質のＭＧＭＴ／ＳＮＡＰポリペプチドの切断が、組換え細胞の上清中にまたは組換え細胞に、定義された切断部位を有するプロテアーゼを加えることによって得られる。例えば、エンテロキナーゼ切断部位ＤＤＤＫ／Ｄの切断は、組換え細胞の上清中にエンテロキナーゼ酵素を加えることによって得られる。あるいは、組換えタンパク質の寿命を延長するために、ＭＧＭＴ／ＳＮＡＰポリペプチドを維持することができる。
【０１９４】
さらに、当業者ならば、発現または分泌されたタンパク質またはポリペプチドが、本宿主細胞を維持または増殖させるために用いる培養培地中で検出できることが分かるであろう。培養培地は、遠心分離または濾過などの既知の手順によって宿主細胞から分離することができる。次にこのタンパク質またはポリペプチドは、そのタンパク質またはポリペプチドに特徴的な既知の特性を利用することにより、無細胞培養培地中で検出することができる。このような特性には、前記タンパク質またはポリペプチドの明瞭な免疫学的、酵素的または物理的特性を含み得る。例えば、タンパク質またはポリペプチドが独特な酵素活性を有する場合、その活性に関するアッセイは、宿主細胞により用いられた培養培地で行うことができる。さらに、所与のタンパク質またはポリペプチドに対して反応性のある抗体が利用可能であれば、このような抗体を用い、任意の既知の免疫アッセイにおいて前記タンパク質またはポリペプチドを検出することができる（例えば、Harlowe, et al., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Pressの場合）。
【０１９５】
目的タンパク質の回収は、限定されるものではないが、分取ディスクゲル電気泳動、等電点電気泳動、ＦＩＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、ゲル濾過、イオン交換および分配クロマトグラフィー、沈殿および塩析クロマトグラフィー、抽出および向流分配などを含む、当技術分野で周知の手段により媒介される。標識と結びついた本発明の組換え系において目的タンパク質を生産することが好ましいが、前記標識は、適当な固相マトリックス上でのクロマトグラフィーにより宿主細胞の粗溶解液からのポリペプチドの回収を容易にする。あるいは、タンパク質に対して、またはそれに由来するペプチドに対して生成された抗体は、回収試薬として使用可能である。
【０１９６】
精製のさらなる工程（ｇ）を行ってもよいが、興味深いことに、必ずしも必要でない。
【０１９７】
精製された材料は、もともと会合していた細胞成分を約５０％未満、好ましくは約７５％未満、最も好ましくは、約９０％未満含有し得る。「実質的に純粋」とは、当技術分野で公知の従来の精製技術を用いて達成することのできる最高の純度を示す。
【０１９８】
本発明の態様では、本発明の方法は、回収された細胞培養上清において少なくとも４０ｍｇ／Ｌ、好ましくは少なくとも５０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも６０ｍｇ／Ｌの実質的に純粋な目的タンパク質を得ることができる。
【０１９９】
本発明の目的組換えタンパク質および融合タンパク質（すなわち、組換えタンパク質単独の場合よりも安定な、ＭＧＭＴ／ＳＮＡＰポリペプチドとカップリングされた組換えタンパク質）は、種々の製品において有用であり得る。例えば、これらの組換えおよび／または融合タンパク質は、例えばウイルス感染の処置のための医薬組成物で使用可能である。
【０２００】
好ましい態様では、前記組換えタンパク質は、インスリン、ＩＦＮ、ＦａｓＬ、グランザイムＭ、ＳＳＸ２、メソテリン（ＮＥＲＭＣＳＬ）、エンドスルファターゼ（ｈＳＵＬＦ）またはコンタクチンの中から選択される。
【０２０１】
別の態様では、本発明は、上記の核酸ベクターを含んでなる感染性ウイルス粒子を提供する。一般に、このようなウイルス粒子は、
（ａ）本発明のウイルスベクターを好適な細胞株に導入する工程、
（ｂ）前記細胞株を、前記感染性ウイルス粒子の生産を可能とするために好適な条件下で培養する工程、
（ｃ）生産された感染性ウイルス粒子を前記細胞株の培養物から回収する工程、および
（ｄ）場合により、前記の回収された感染性ウイルス粒子を精製する工程
を含んでなる方法によって生産される。
【０２０２】
ウイルスベクターが欠陥型である場合、感染性粒子は通常、相補的細胞株において、または非機能的ウイルス遺伝子をトランスで供給するヘルパーウイルスを介して生産される。例えば、Ｅ１欠損アデノウイルスベクターを補足するのに好適な細胞株としては、２９３細胞ならびにＰＥＲ−Ｃ６細胞が挙げられる。感染性ウイルス粒子は培養上清から、または溶解後の細胞から回収することができる。それらは標準的技術（クロマトグラフィー、例えば、Ｗ０９６／２７６７７、ＷＯ９８／００５２４、Ｗ０９８／２２５８８、ＷＯ９８／２６０４８、ＷＯ００／４０７０２、ＥＰ１０１６７００およびＷＯ００／５０５７３に記載されているような塩化セシウム勾配中での超遠心分離）に従ってさらに精製することができる。
【０２０３】
よって、本発明は、本発明の発現ベクター、組換えタンパク質、融合タンパク質、宿主細胞またはウイルス粒子、またはその任意の組合せを含んでなる医薬組成物に関する。このような医薬組成物は、本発明の方法によって得られた、治療的量のベクター、粒子、細胞またはタンパク質を薬学上許容される担体と混合して含んでなる。
【０２０４】
この組成物は非経口的、静脈内または皮下に、全身投与することができる。全身投与される場合、本発明で用いられる治療組成物は、発熱物質不含の、非経口的に許容されるタンパク質溶液の形態である。ｐＨ、等張性、安定性などを考慮したこのような非経口的に許容されるタンパク質溶液の調製は、当業者の範囲内である。
【０２０５】
投与計画は、担当医により、薬物の作用を改変する種々の因子、例えば、患者の病態、体重、性別（sew）および食事、感染の重篤度、投与時間およびその他の臨床因子を考慮して決定される。医薬担体および医薬組成物の他の成分は当業者ならば選択することができる。
【０２０６】
さらに、本発明の融合タンパク質および組換えタンパク質は、例えばウイルス感染に対して哺乳動物対象に接種するためのワクチンの成分として使用してもよい。これらのタンパク質は単独で使用してもよいし、または他の組換えタンパク質もしくは治療用ワクチン薬剤とともに使用してもよい。このようなワクチンの成分は、当業者ならば決定することができる。
【０２０７】
本発明はまた、薬剤、特に、ワクチンの製造のための、本発明の融合タンパク質、発現ベクター、感染性ウイルス粒子、宿主細胞または医薬組成物の使用を包含する。
【０２０８】
本発明はまた、ヒトまたは動物生物を治療または予防する方法であって、前記生物に治療上有効な量の本発明の融合タンパク質、発現ベクター、感染性ウイルス粒子、宿主細胞または組成物を投与することを含んでなる方法を提供する。
【０２０９】
最後に、本発明のタンパク質、特に、ＳＮＡＰ−目的タンパク質融合物は、血液、血清、唾液などの体液中における癌、ウイルス感染またはウイルスタンパク質抗体の存在を検出するための診断薬として有用であり得る。これらのタンパク質はまた、体液および組織中のウイルスタンパク質を同定および／または単離するための方法で使用してもよい。よって、これらのタンパク質はこのような方法を実施するためのキットの成分となり得る。
【０２１０】
よって、別の側面において、本発明はまた、生体サンプル中の病原性または非病原性微生物の存在を同定するための、本発明の方法のいずれかによって得られた病原性または非病原性微生物由来の組換えタンパク質、またはＭＧＭＴもしくはＳＮＡＰタグ付き組換えタンパク質の使用に関する。好ましい態様では、前記病原性微生物はウイルスであり、前記ＭＧＭＴもしくはＳＮＡＰタグ付きタンパク質は、チクングニアウイルス、デング熱ウイルス、日本脳炎（ＪＥ）ウイルス、ダニ媒介脳炎（ＴＢＥ）ウイルス、黄熱（ＹＦ）ウイルス、ウスツ（ＵＳＵ）ウイルスもしくは西ナイルウイルス由来のＥＤＩＩＩ、またはリフトバレー熱ウイルスもしくはトスカナウイルス由来の核タンパク質Ｎなどのウイルスタンパク質である。
【０２１１】
本発明において、前記生体サンプルは、ウイルスに感染している可能性のある血液サンプル、尿サンプル、または任意の生体サンプルを意味する。
【実施例】
【０２１２】
１．プラスミドの構築
１．１．プラスミドｐＭＴ／ＢｉＰ／Ｖ５−Ｈｉｓ  Ａを使用した。このプラスミドは３６４２ヌクレオチドを含み、下記の特徴を含む：
・メタロチオネインプロモーター：塩基４１２〜７７８、
・転写開始：塩基７７８、
・ＭＴフォワードプライミング部位：塩基８１４〜８３１、
・ＢｉＰシグナル配列：塩基８５１〜９０４（配列番号１１）、
・多重クローニング部位：塩基９０６〜９９９、
・Ｖ５エピトープタグ：塩基１００３〜１０４４、
・ポリヒスチジン領域：塩基１０５４〜１０７４、
・ＢＧＨリバースプライミング部位：塩基１０９４〜１１１１、
・ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル：塩基１２６７〜１２７２、
・ｐＵＣ起点：塩基１７６５〜２４３８（相補鎖）、
・ｂｌａプロモーター：塩基３４４４〜３５４２（相補鎖）、
・アンピシリン（ｂｌａ）耐性遺伝子ＯＲＦ：塩基２５８３〜３４４３（相補鎖）。
【０２１３】
また、ｐＵＣ５７  Ａｍｐベクターも、本発明の目的で使用可能である。このベクターは下記のものを含んでなる。
・独特なクローニング部位ＥｃｏＲＩ、
・メタロチオネインプロモーター、
・西ナイルウイルスＩＳ−９８−ＳＴ１株由来ゲノムＲＮＡの５’非コード領域、
・翻訳開始コドン（ＡＴＧ）、
・西ナイルウイルスＩＳ−９８−ＳＴ１株由来エンベロープＥタンパク質のシグナルペプチド（配列番号１５）、
・２つのリピート配列と３’末端ステム−ループが削除された、西ナイルウイルスＩＳ−９８−ＳＴ１株由来ゲノムＲＮＡの３’非コード領域、
・Ｓ４０ポリＡシグナルモチーフ、
・独特なクローニング部位ＡｐａＩ。
【０２１４】
１．２．ＳＮＡＰのクローニング
配列番号２のＳＮＡＰタンパク質配列をコードするＤＮＡの増幅を、５’−ＳＮＡＰプライマーと３’−ＭＣＳプライマーの組合せを用い、ＰＣＲにより、ｐＭＴ／ＢｉＰ／ＣＨＩＫ．ｓＥ２＋ＳＮＡＰタグを鋳型として行った。
プライマー５’−ＳＮＡＰ：
【化１】
0005940554.tif 000002
（配列番号７）
プライマー３’−ＭＣＳ：
【化２】
0005940554.tif 000003
（配列番号８）
【０２１５】
次に、このＰＣＲ産物をＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩで消化し、ＤＥＳ系において線状化プラスミドｐ／ＭＴ／ＢｉＰ／Ｖ５−Ａの独特なＢｇｌＩＩ（ＭＣＳの５’末端）部位とＮｏｔＩ（ＭＣＳの３’末端）部位の間に挿入した。
【０２１６】
得られたプラスミドは配列番号９のｐＭＴ／ＢｉＰ／ＳＮＡＰ−Ｈｉｓタグベクターであり、下記のものを含んでなる：
・配列番号１１の昆虫ｓｓＢｉＰ配列、
・配列番号１のＳＮＡＰ  ＤＮＡ配列、
・配列番号１２のエンテロキナーゼ切断部位、
・ＥｃｏＲＶ−ＳｍａＩ制限部位、
・制限部位の下流に位置する、Ｈｉｓ６タグをコードするＤＮＡ（配列番号１４）、
・ｉ）エンハンサー配列とＥｃｏＲＶ−ＳｍａＩ制限部位の間、およびｉｉ）ＥｃｏＲＶ−ＳｍａＩ制限部位とＨｉｓ６タグをコードするＤＮＡの間に位置する、配列番号１３の２つのＤＮＡスペーサー配列。
【０２１７】
また、ｐＭＴ／ＢｉＰ／ＳＮＡＰ−Ｈｉｓタグベクターは、ｐＵＣ５７骨格から得ることもでき、配列番号１０の配列を有するベクターが得られる。このベクターは下記のものを含んでなる：
・独特なクローニング部位ＥｃｏＲＩ、
・メタロチオニン(Methallothionin)プロモーター、
・西ナイルウイルスＩＳ−９８−ＳＴ１株由来ゲノムＲＮＡの５’非コード領域、
・翻訳開始コドン、
・配列番号１５の、西ナイルウイルスＩＳ−９８−ＳＴ１株由来エンベロープＥタンパク質のシグナルペプチド、
・配列番号４７のＳＮＡＰ  ＤＮＡ配列、
・外来配列をインフレームで挿入するためのＳｍａＩ／ＸｍａＩにおける独特なクローニング部位ＥｃｏＲＶ、
・ＳＮＡＰエンハンサーＤＮＡとクローニング部位の間に位置する、配列番号１２のエンテロキナーゼ切断部位、
・ヘキサヒスチジンタグ配列をコードするＤＮＡ（配列番号１４）、
・エンハンサー配列とＥｃｏＲＶ−ＳｍａＩ制限部位の間、およびｉｉ）ＥｃｏＲＶ−ＳｍａＩ制限部位とＨｉｓ６タグをコードするＤＮＡの間に位置する、配列番号１３の２つのＤＮＡスペーサー配列、
・２つの翻訳停止コドン、
・２つのリピート配列と３’末端ステム−ループが削除された、西ナイルウイルスＩＳ−９８−ＳＴ１株由来ゲノムＲＮＡの３’非コード領域、
・Ｓ４０ポリＡシグナルモチーフ、および
・独特なクローニング部位ＡｐａＩ。
【０２１８】
また、ｐＭＴ／ＢｉＰ様／ＳＮＡＰ−Ｈｉｓタグベクターは、独特なＥｃｏＲＶ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位の間に配列番号５９（図８も参照）が挿入されたｐＵＣ５７骨格から得ることもできる。このベクターは配列番号６４の配列を有する。このベクターは下記のものを含んでなる：
・独特なクローニング部位ＥｃｏＲＩ、
・メタロチオニン(Methallothionin)プロモーター、
・西ナイルウイルスＩＳ−９８−ＳＴ１株由来ゲノムＲＮＡの５’非コード領域、
・翻訳開始コドン、
・配列番号１５の、西ナイルウイルスＩＳ−９８−ＳＴ１株由来エンベロープＥタンパク質のシグナルペプチド、
・配列番号４７のＳＮＡＰ  ＤＮＡ配列、
・外来配列をインフレームで挿入するための独特なクローニング部位ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＶ、ＡｐａIおよびＸｍａＩ、
・ＳＮＡＰエンハンサーＤＮＡとＨｉｓタグの間に位置する、配列番号５２の２つのｐｒｏＴＥＶ切断部位、
・ヘキサヒスチジンタグ配列をコードするＤＮＡ（配列番号１４）、
・ｉ）エンハンサー配列とＥｃｏＲＶ−ＳｍａI制限部位の間、およびｉｉ）ＡｐａＩ制限部位とＨｉｓ６タグをコードするＤＮＡの間に位置する、配列番号１３の２つのＤＮＡスペーサー配列、
・２つの翻訳停止コドン、
・２つのリピート配列と３’末端ステム−ループが削除された、西ナイルウイルスＩＳ−９８−ＳＴ１株由来ゲノムＲＮＡの３’非コード領域、
・Ｓ４０ポリＡシグナルモチーフ、および
・独特なクローニング部位ＡｐａＩ。
【０２１９】
１．３．目的遺伝子のクローニング
１．３．１．リフトバレー熱ウイルスの核タンパク質Ｎ（ＲＶＦ−Ｎ）
ＲＦＶ−Ｎタンパク質配列をコードするｃＤＮＡに対する突然変異誘発を、下記に挙げた５’−Ｎプライマーと３’−Ｎ’プライマーの組合せを用いてＰＣＲにより行った。
プライマー５’−Ｎ：
【化３】
0005940554.tif 000004
（配列番号１７）
プライマー３’−Ｎ：
【化４】
0005940554.tif 000005
（配列番号１８）
【０２２０】
１．３．２．非ウイルスタンパク質、例えば、インターフェロンＩＦＮα１またはグランザイムＭ
配列番号３２のヒトＩＦＮα１タンパク質配列も使用可能である。
【０２２１】
配列番号５４のヒトグランザイムＭタンパク質配列も使用可能である。グランザイムＭは、その基質をＭｅｔまたはＬｅｕの後で優先的に切断するキモトリプシン様セリンプロテアーゼである。グランザイムＭは、活性化された内在性のエフェクターであるナチュラルキラー細胞で構成的に発現される。このプロテアーゼはまた、抗ウイルス性および抗腫瘍性も有する(van Domselaar R. et al, The Journal of Immunology 2010; Hu D. et al, The Journal of Biological Chemistry 2010)。
【０２２２】
１．４．ｐＭＴ／ＢｉＰ／ＳＮＡＰ−ＨｉｓタグベクターまたはｐＭＴ／ＢｉＰ様／ＳＮＡＰ−Ｈｉｓタグベクターへのタンパク質コード遺伝子の挿入による、ｐＭＴ／ＢｉＰ／ＳＮＡＰ−タンパク質−ＨｉｓタグベクターまたはｐＭＴ／ＢｉＰ様／ＳＮＡＰ−タンパク質−Ｈｉｓタグベクターの取得
１．４．１．ＲＶＦ．Ｎ
１．３．１．項で得られたＰＣＲ産物をＢｓｓＨＩＩおよびＡｇｅＩで消化し、１．２．項で得られた線状化プラスミドｐ／ＭＴ／ＢｉＰ／ＳＮＡＰ−Ｈｉｓタグの、独特なＢｓｓＨＩＩ（ＳＮＡＰ遺伝子の３’末端）部位とＡｇｅＩ（シャトルベクターのＭＣＳの３’末端）の間に挿入した。
【０２２３】
得られるプラスミドは例えば、ｐＭＴ／ＢｉＰ／ＳＮＡＰ−ＲＶＦ．Ｎ／Ｈｉｓタグ（配列番号１９）である。
【０２２４】
１．４．２．種々のフラビウイルスのＥＤＩＩＩタンパク質
組換えフラビウイルス抗原に基づくＥＬＩＳＡまたは免疫ブロット試験の特異性を高めるために、Ｅタンパク質の抗原ドメインＩＩＩ（ＥＤＩＩＩ）は有望なアプローチであると思われる(Ludolfs et al. 2007)。西ナイル（ＷＮ）ウイルス、ウスツ（ＵＳＵ）ウイルス、日本脳炎（ＪＥ）ウイルス、ダニ媒介脳炎（ＴＢＥ）ウイルス、デング熱血清型１〜４（ＤＥＮ−１、−２、−３、−４）ウイルスおよび黄熱（ＹＦ）ウイルスからの組換えＥＤＩＩＩの製造に関して、本発明の方法を用いて試験した。
【０２２５】
人畜共通のＷＮ、ＵＳＵおよびＪＥウイルスは、ＪＥ血清型群に属す。ショウジョウバエＳ２誘導発現系（ＤＥＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、無脊椎動物細胞におけるフラビウイルス由来の個々のＥＤＩＩＩの大量生産のために選択されたものである。フラビウイルスＷＮ、ＵＳＵ、ＪＥ、ＴＢＥ、ＤＥＮ−１〜ＤＥＮ−４、およびＹＦ由来Ｅタンパク質の全長ドメインＩＩＩをコードする合成遺伝子を配列番号２３〜配列番号３１に一覧化する。ＥＤＩＩＩ配列を、１．２．で得られたプラスミドｐＭＴ／ＢｉＰ／ＳＮＡＰ−Ｈｉｓタグ中のＳＮＡＰタンパク質のＣ末端にインフレームで融合させ、融合タンパク質ＳＮＡＰ−ＥＤＩＩＩを作出した。
【０２２６】
１．４．３．ＩＦＮα
プラスミドｐＭＴ／ＢｉＰ／ＳＮＡＰ−ＩＦＮ−Ｈｉｓタグ（図４参照）およびｐＭＴ／ＢｉＰ様／ＳＮＡＰ−ＩＦＮ−Ｈｉｓタグ（図８の詳細を参照）を得た。
【０２２７】
１．４．４．グランザイムＭ
プラスミドｐＭＴ／ＢｉＰ／ＳＮＡＰ−ＧｒＭ−Ｈｉｓタグを得た（図６の詳細を参照）。
【０２２８】
２．宿主細胞へのトランスフェクション
２．１．Ｓ２細胞へのトランスフェクション
得られたプラスミドｐＭＴ／ＢｉＰ／ＳＮＡＰ−タンパク質−Ｈｉｓｔａｇ（Ｈｉｓｔａｇで終わる分泌融合タンパク質としてのＳＮＡＰタグを有するタンパク質の生産を可能とする）は、選択マーカーｐＣｏ−ＢｌａｓｔとともにＳ２細胞に同時トランスフェクトし、アンピシリン耐性を示す安定なＳ２／ｓＳＮＡＰ−タンパク質−Ｈｉｓｔａｇ細胞株を作出した。
【０２２９】
スピナー（１０００ｍｌ）で増殖させた安定なＳ２細胞株を重金属カドミウム（Ｃｄ２＋）で１０日間刺激し、細胞外培地からタンパク質を濃縮および精製した。
【０２３０】
重金属カドミウムで１０日間誘導した後に、安定なＳ２／ｓＳＮＡＰ−タンパク質−Ｈｉｓタグ細胞の上清には、分泌された、ＳＮＡＰタグを有するタンパク質の蓄積が見られた。
【０２３１】
ヤギ血清抗Ｈｉｓタグを用いた免疫ブロットアッセイにより、細胞外の、ＳＮＡＰタグを有するタンパク質を検出することができる（図２Ｂ、３Ｂ、４Ｂ、６Ｃ）参照。
【０２３２】
２．２．ＨｅＬａ細胞へのトランスフェクション
このプラスミドｐＭＴ／ＢｉＰ様／ＳＮＡＰ−ＩＦＮ−ＨｉｓｔａｇをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。
【０２３３】
抗ＳＮＡＰ抗体を用いた免疫ブロットアッセイにより、細胞外の、ＳＮＡＰタグを有するＩＦＮを検出することができる（図７Ｂ参照）。
【０２３４】
３．組換えタンパク質の精製
細胞外の、ＨｉｓタグおよびＳＮＡＰタグを有するタンパク質を、金属キレート樹脂およびＨＬＰＣ法を用いて精製した。
【０２３５】
３．１．ＲＶＦ−ＮおよびＴＯＳ−Ｎ
ＲＶＦ−Ｎ
Plate-Forme 5 Production de Proteines recombinantes et d'Anticorps (Institut Pasteur)との共同研究において、２リットルのＳ２／ｓＳＮＡＰ−ＲＶＦＶ．Ｎ−Ｈｉｓｔａｇ細胞上清から、Ｃｄ２＋刺激の１０日後に、精製度の高い、ＳＮＡＰタグを有するＲＶＦ．Ｎタンパク質が９７ｍｇもの量で得られた。
【０２３６】
ＴＯＳ−Ｎ
Plate-Forme 5 Production de Proteines recombinantes et d'Anticorps (Institut Pasteur)との共同研究において、２リットルのＳ２／ｓＳＮＡＰ−ＴＯＳ．Ｎ−Ｈｉｓｔａｇ細胞上清から、Ｃｄ２＋刺激の１０日後に、精製度の高い、ＳＮＡＰタグを有するＲＶＦ．Ｎタンパク質が４１ｍｇもの量で得られた。
【０２３７】
【表１】
0005940554.tif 000006
【０２３８】
３．２．可溶性ＩＦＮα１
可溶性ＩＦＮα１タンパク質は、エンテロキナーゼ酵素（Ｎｏｖａｇｅｎキット）を用いて切断することにより、ＳＮＡＰタグから遊離させた。
３．３．種々のフラビウイルス由来の抗原
【０２３９】
【表２】
0005940554.tif 000007
【０２４０】
・ＥＤＩＩＩ：フラビウイルスＥタンパク質（デング熱［ＤＥＮ］、西ナイル［ＷＮ］、日本脳炎［ＪＥ］、ウスツ［ＵＳＵ］、ダニ媒介脳炎［ＴＢＥ］、黄熱［ＹＦ］、マレー脳炎［ＭＶＥ］、ベッセルブロン［ＷＳＬ］、ロシオ、ジカ）由来のドメイン抗原ＩＩＩ
・ｅｃｔｏＭ：１型デング熱ウイルス由来Ｍタンパク質のエクトドメイン
・ＲＶＦ由来Ｎ遺伝子：リフトバレー熱ウイルスの核タンパク質Ｎ（主要ウイルス抗原）
・ＴＯＳ由来Ｎ遺伝子：トスカナウイルスの核タンパク質Ｎ（主要ウイルス抗原）
・ＷＮ由来ｓＥ：西ナイルウイルス由来エンベロープＥタンパク質の可溶型
・ＣＨＩＫ由来ｓＥ２：チクングニアウイルス由来エンベロープＥ２タンパク質の可溶型
・ＳＮＡＰ−ＩＦＮΑＩ：ＳＮＡＰと融合したインターフェロン−α１
【０２４１】
３．４．グランザイムＭの生産
７日で、１リットルの培養上清当たり１０ｍｇのＳＮＡＰ−ＧｒＭタンパク質が回収された。
【０２４２】
精製工程後、連結されたＧｒＭ酵素によるＳＮＡＰタンパク質の切断に対応する３つの形態のＳＮＡＰ−ＧｒＭが検出された（図６Ｃ参照）。
【０２４３】
このことは、ヒトプロテアーゼは本発明の方法により生産された後にも活性があることを明らかに意味する（下記参照）。
【０２４４】
４．ＳＮＡＰタグを有するタンパク質の制御
特異的抗体（目的タンパク質および／またはＨｉｓタグ標識を認識する）を用いた免疫ブロットアッセイは、細胞外の、ＳＮＡＰタグを有するタンパク質の実質的生産を検出した：
免疫ブロットアッセイは、ヤギ血清抗Ｈｉｓｔａｇを用いて、細胞外の、ＳＮＡＰタグを有するＲＶＦ．Ｎタンパク質を検出した（図２Ｂ）。ＲＶＦ．Ｎに対するヒトおよびマウス免疫血清は、組換え型の、ＳＮＡＰタグを有するＲＶＦ．Ｎタンパク質を特異的に認識する。
【０２４５】
特異的マウスポリクローナル血清を用いた免疫ブロットアッセイは、組換えＷＮとＵＳＵ  ＥＤＩＩＩの間で、高いレベルの配列類似性にもかかわらず交差反応性を示さなかった。よって、最近ヨーロッパでは可能性のある出現アルボウイルスとしてＵＳＵウイルス、およびそれより少ないがＪＥウイルスが特定されていることから、ＷＮＶ、ＪＥ、ＵＳＵから分泌された可溶性ＳＮＡＰ−ＥＤＩＩＩは、ＪＥ血清型群のメンバーの特異的診断のための組換えウイルス抗原として好適である。
【０２４６】
５．ＳＮＡＰタグを有する組換えタンパク質の活性
・誘導を受けたＳ２／ＳＮＡＰ−ＩＦＮα１細胞から分泌された可溶性組換えＳＮＡＰ−ＩＦＮα１はＣＨＩＫＶに対して強い抗ウイルス効果を示す
誘導１０日後に、Ｃｄ２＋刺激Ｓ２／ＳＮＡＰ−ＩＦＮα１（５×１０６細胞／ｍｌ）の上清（５ｍｌ）を回収した。細胞上清に対して、抗Ｈｉｓタグ抗体を用いた免疫ブロットにより、可溶性ＳＮＡＰ−ＩＦＮα１タンパク質の蓄積が見られた（下記参照）。ＳＮＡＰ−ＩＦＮα１の抗ウイルス活性を、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）遺伝子を発現するチクングニアウイルスに感染させたＨｅＬａ細胞で評価した。感染６時間後にＬｕｃ活性を測定した。ＨｅＬａ細胞における、ＣＨＩＫＶに対するその強力な抗ウイルス作用が知られるＩＦＮαｃｏｎ１（インファゲン）を内部アッセイとして使用した。Ｃｄ２＋刺激Ｓ２／ＳＮＡＰ−Ｔｏｓ．Ｎ（トスカナウイルス由来Ｎタンパク質）の上清を陰性対照として用いた。図４Ｃに示されたグラフは、１μｌの分泌ＳＮＡＰ−ＩＦＮα１または０．１μｇのインファゲンが感染宿主細胞内でのＣＨＩＫＶ複製を抑制できたことを示す。このグラフには、ＳＮＡＰ−ＩＦＮαの用量依存効果が示される。０．１μｌの可溶性ＳＮＡＰ−ＩＦＮα１または０．０１μｇのインファゲンでなお２０％のＬｕｃ活性が見られた。ＳＮＡＰ−ＴＯＳ−Ｎを用いた場合には、試験したより高い用量でも抗ウイルス作用は見られなかった。
【０２４７】
・グランザイムＭは、Ｓ２細胞の上清で産生された場合、活性型となる
これまでに述べたように、ベクターｐＭＴ／ＢｉＰ／ＳＮＡＰ−ＧｒＭ−ＨｉｓタグでトランスフェクトされたＳ２細胞の上清では、３つの形態のＳＮＡＰ−ＧｒＭが検出された（図６Ｃ参照）。
【０２４８】
これらの３つの形態は、連結されたＧｒＭ酵素によるＳＮＡＰタンパク質の切断に対応する。ＳＮＡＰは実際にＧｒＭの３つの潜在的切断部位を含んでいる（図６Ｂ参照）。抗Ｈｉｓ抗体または抗ＳＮＡＰ抗体のいずれかを用いたイムノアッセイでは、これらの３つの形態が実際に分泌された融合タンパク質ＳＮＡＰ−ＧｒＭの断片であることが明らかになった。
【０２４９】
小さい形態（３５ｋＤａ）は、精製過程でＳＮＡＰの大部分が欠損したＧｒＭに相当する。
【０２５０】
これらの結果は、本発明の系によって生産されたＧｒＭプロテアーゼが、ＳＮＡＰタンパク質と連結されているものの活性があることを明らかに示す。
【０２５１】
活性型のヒトプロテアーゼは組換え生産するのが極めて難しいことが知られているので、このことは実に興味深いことである。
【０２５２】
・ｈＳＵＬＦ−２ΔＴＭＤは、ＨＥＫ２９３細胞の上清で産生された場合、活性型となる
組換えプラスミドｐｃＤＮＡ３／Ｄｅ  ＳＮＡＰｕｎｉｖ−ｈＳＵＬＦ−２ΔＴＭＤでトランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞からｈＳＵＬＦ−２ΔＴＭＤが発現および精製された（図１３Ａ参照）。
【０２５３】
上清中に得られたｈＳＵＬＦ−２ΔＴＭＤポリペプチドの酵素活性を次のように評価した。
【０２５４】
ＨＥＫ２９３細胞をｐｃＤＮＡ３／ＤｅＳＮＡＰ−ｈＳＵＬＦ２ΔＴＭＤで一時的にトランスフェクトした。２日後に、細胞上清のアリコートを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５中２０ｍＭの非蛍光偽基質４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵＳ）とともにインキュベートし、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２をこの酵素（細胞馴化培地中）とともに、９６ウェルプレートにて３７℃で２〜４時間インキュベートした（１：１、Ｖ／Ｖ）。この酵素反応を、１．５Ｍ  ＮａＨＣＯ３／Ｎａ２ＣＯ３  ｐＨ１０．５を加える（１：１  ｖ／ｖ）ことによって停止させ、蛍光生成物である４−メチルウンベリフェロンを蛍光計（励起：３６０ｎｍ）によりモニタリングした。細胞上清中のＳＵＬＦ活性を４６０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）で測定した。
【０２５５】
興味深いことに、図１３Ｂに示されるように、分泌されたタンパク質（ＳＮＡＰと連結しているか？）は活性型である。
【０２５６】
６．ＳＮＡＰタグを有する組換えタンパク質の安定性
驚くことに、ＳＮＡＰペプチドを含んでなる融合タンパク質はその不在の場合よりもin vitroにおいてはるかに安定であることが見出された。
【０２５７】
精製度の高いＣＨＩＫ．ｓＥ２−ＳＮＡＰタンパク質、ＳＮＡＰ−ＷＮ．ＥＤＩＩＩタンパク質およびＳＮＡＰ−ＩＦＮΑＩタンパク質を、無菌ＰＢＳ中０．１ｍｇ／ｍｌ（Ｖｏｌ：０．１ｍｌ）の不飽和濃度で、−８０℃、４℃、２５℃もしくは３７℃で４日間、または同じ温度で２ヶ月間インキュベートした。
【０２５８】
タンパク質サンプル（１μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ４〜１２％で分離し、ＰａｇｅＢｌｕｅタンパク質染色溶液（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を用いて、クーマシーブリリアントブルーＧ−２５０色素で可視化した。
【０２５９】
図１０ＡおよびＢは、３つの異なる融合タンパク質のin vitro安定性を比較することによって得られた結果を示す。
【０２６０】
重要なことは、４℃で２ヶ月後、また、室温（２５℃）または３７℃で４日間インキュベーション後も、総ての融合タンパク質が完全な状態を呈していたことである。
【０２６１】
特に、ＩＦＮは体温（３７℃）で４日後も影響を受けず、３７℃で２ヶ月後にもなお観察されたことから、それをＳＮＡＰと連結することでin vivo安定性が著しく高められると思われる。
【０２６２】
７．Ｓ２細胞により産生されたＳＮＡＰ−ＲＶＦ．Ｎのin vitro検出
上述のプロトコールに従って産生されたＳＮＡＰ−ＲＶＦ．Ｎ融合タンパク質を、感染ヒツジの血清中の抗ＲＶＦ．Ｎ抗体を検出するための診断ツールとして用いた。
【０２６３】
これらの融合タンパク質を、市販の検出キット（ＢＤＳＬ製のＲＶＦ  ＩｇＧ検出キットおよびＩｄＶｅｔ製のＲＶＦ  ｍｕｌｔｉ−ｓｐｅｃｉｅｓ）を用いて試験および比較した。
【０２６４】
試験は４６のヒツジ血清で行った（なお、これらのヒツジはＲＶＦワクチンで免疫化したものであった）。ＳＮＡＰ−ＲＶＦ．Ｎ融合タンパク質をウェルの底に直接コーティングするか、またはビオチン化して、ストレプトアビジンをコーティングしたウェルに加えた。
【０２６５】
ＰＢＳ中０．２μｇの高純度組換え抗原ＳＮＡＰ−ＲＶＦ．Ｎ（濃度：２μｇタンパク質／ｍｌ）で４℃にて一晩直接コーティングしたマイクロ滴定９６ウェルプラークを用いた直接的ＥＬＩＳＡ法により、抗ＲＶＦ抗体を検出した。飽和後、希釈した血清をＳＮＡＰ−ＲＶＦ．Ｎとともにインキュベートした。ペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ＩｇＧを二次抗体として用いた。ペルオキシダーゼ基質系を用いてＥＬＩＳＡを行い、光学密度（ＯＤ）を４５０ｎｍで測定した。サンプル血清は、そのＯＤが非免疫血清のＯＤの２倍であった場合に陽性とみなした。
【０２６６】
興味深いことに、これらの結果は、ＳＮＡＰ−ＲＶＦ．Ｎ融合タンパク質が、ウェルに直接コーティングした場合には、市販のタンパク質と同じ感受性および特異性を与えることを示す（示されていない）。これらの結果は、それらのタンパク質をビオチン化した場合には再現しない。
【０２６７】
自然に免疫を獲得したウシから得られた血清でも同様の結果が得られた（データは示されていない）。
【０２６８】
これらの結果は、本発明の融合タンパク質が、生体サンプルにおいてウイルス感染または細菌感染を同定するための診断ツールとして使用可能であることを示す。
【０２６９】
８．マルチプレックスビーズに基づくイムノアッセイ
本発明において、体液中のアルボウイルスに対する抗体の迅速かつ同時検出のためにマルチプレックスビーズに基づくイムノアッセイが開発された。この系はｘＭＡＰ技術（Ｌｕｍｉｎｅｘ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に基づくものであり、特異的ヒト免疫グロブリンの捕捉試薬として抗原をコーティングしたマイクロスフェアの混合物を使用する。異なるマイクロスフェアセット（Ｍａｇｐｌｅｘ、Ｌｕｍｉｎｅｘ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を精製ＭＧＭＴ融合タンパク質、すなわち、第３．３節に記載のＳＮＡＰタグを有するウイルス組換えタンパク質：ｓＳＮＡＰ−ＤＶ１．ＥＤＩＩＩ、ｓＳＮＡＰ−ＤＶ２．ＥＤＩＩＩ、ｓＳＮＡＰ−ＤＶ３．ＥＤＩＩＩ、ｓＳＮＡＰ−ＤＶ４．ＥＤＩＩＩ、ｓＳＮＡＰ−ＷＮ．ＥＤＩＩＩ、ｓＳＮＡＰ−ＪＥ．ＥＤＩＩＩ、ｓＳＮＡＰ−ＵＳＵ．ＥＤＩＩＩ、ｓＳＮＡＰ−ＴＢＥ．ＥＤＩＩＩ、ｓＳＮＡＰ−ＹＦ．ＥＤＩＩＩ、ｓＳＮＡＰ−ＭＶＥ．ＥＤＩＩＩ、ｓＳＮＡＰ−ロシオ．ＥＤＩＩＩ、ｓＳＮＡＰ−ＷＳＬ．ＥＤＩＩＩ、ｓＳＮＡＰ−ジカ．ＥＤＩＩＩ、ＳＮＡＰ−ＤＶ１ｅｃｔｏＭ、ｓＳＮＡＰ−Ｎ．ＲＶＦ、ｓＳＮＡＰ−Ｎ．ＴＯＳ、およびＣＨＩＫ．ｓＥ２−ＳＮＡＰと連結した。組換え抗原は、ＭＧＭＴタンパク質の基質をリンカーとして用いてカルボキシルマイクロスフェア表面に共有結合させ（ＢＧ−ＰＥＧ−ＮＨ２、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、それにより、標準的アミンカップリング手順に比べて抗体捕捉効率を高めた。
【０２７０】
抗ＳＮＡＰタグ抗体および特異的マウスモノクローナル抗体を用いた技術のバリデーションにより、カップリング効率を確認し、長期の抗原安定性（最大６ヶ月）を証明した。ビーズコーティングその後の抗体捕捉には任意のペプチドまたはポリペプチドが使用可能であるので、この適用はウイルス抗原に限定されない。
【０２７１】
参考文献
0005940554.tif 000008
0005940554.tif 000009
【図１Ｂ】
0005940554.tif 000010
【図２Ａ−１】
0005940554.tif 000011
【図２Ａ−２】
0005940554.tif 000012
【図３Ａ−１】
0005940554.tif 000013
【図３Ａ−２】
0005940554.tif 000014
【図４Ｂ−１】
0005940554.tif 000015
【図４Ｂ−２】
0005940554.tif 000016
【図７Ｂ−１】
0005940554.tif 000017
【図７Ｂ−２】
0005940554.tif 000018
【図１０Ａ】
0005940554.tif 000019
【図１０Ｂ】
0005940554.tif 000020
【図１Ａ】
0005940554.tif 000021
【図２Ｂ】
0005940554.tif 000022
【図２Ｃ】
0005940554.tif 000023
【図２Ｄ】
0005940554.tif 000024
【図３Ｂ】
0005940554.tif 000025
【図４Ａ】
0005940554.tif 000026
【図４Ｃ】
0005940554.tif 000027
【図４Ｄ】
0005940554.tif 000028
【図４Ｅ】
0005940554.tif 000029
【図４Ｆ】
0005940554.tif 000030
【図５】
0005940554.tif 000031
【図６Ａ−１】
0005940554.tif 000032
【図６Ａ−２】
0005940554.tif 000033
【図６Ａ−３】
0005940554.tif 000034
【図６Ｂ】
0005940554.tif 000035
【図６Ｃ】
0005940554.tif 000036
【図７Ａ】
0005940554.tif 000037
【図７Ｃ】
0005940554.tif 000038
【図８Ａ】
0005940554.tif 000039
【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ−１】
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【図１３Ｂ−２】
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【図１３Ｂ−３】
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【図１３Ｂ−４】
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【図１３Ｂ−５】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【配列表】
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