(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルボマーに架橋されたプロテアーゼを含む安定化プロテアーゼであって、前記プロテアーゼの一級アミンの一部が、前記カルボマーのカルボキシル基に架橋され、前記プロテアーゼの残った未反応の一級アミンの一部が、アミン反応性架橋剤を介してお互いに架橋され、該安定化プロテアーゼがさらに糖ポリマーを含む、安定化プロテアーゼ。
【請求項２】
前記架橋が、１重量％〜５重量％の前記アミン反応性架橋剤によって行われる、請求項１に記載の安定化プロテアーゼ。
【請求項３】
前記安定化プロテアーゼが、０．１％〜５％の前記糖ポリマーを含む、請求項１に記載の安定化プロテアーゼ。
【請求項４】
前記糖ポリマーが、アルギン酸ナトリウム及びキサンタンガムからなる群より選択される、請求項３に記載の安定化プロテアーゼ。
【請求項５】
前記糖ポリマーがアルギン酸ナトリウムである、請求項４に記載の安定化プロテアーゼ。
【請求項６】
前記プロテアーゼが、パパイン、フィシン、ブロメラインおよびアクチニジンからなる群より選択される、請求項１に記載の安定化プロテアーゼ。
【請求項７】
前記プロテアーゼがパパインである、請求項６に記載の安定化プロテアーゼ。
【請求項８】
０．１％〜５％の前記プロテアーゼを含む、請求項６に記載の安定化プロテアーゼ。
【請求項９】
前記アミン反応性架橋剤が、ジメチルアジピミデート（ＤＭＡ）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベラート（ＢＳ３）、ジメチルスベリミダート（ＤＭＳ）、ジメチルピメリミデート（ＤＭＰ）およびジスクシンイミジルスベラート（ＤＳＳ）からなる群より選択される、請求項１に記載の安定化プロテアーゼ。
【請求項１０】
前記プロテアーゼがパパインであり、前記アミン反応性架橋剤がＤＭＡである、請求項１に記載の安定化プロテアーゼ。
【請求項１１】
さらに防腐剤を含む、請求項１の安定化プロテアーゼ。
【請求項１２】
前記防腐剤が、フェノキシエタノールおよび安息香酸を含む、請求項１１に記載の安定化プロテアーゼ。
【請求項１３】
前記防腐剤がジオシドを含む、請求項１１に記載の安定化プロテアーゼ。
【請求項１４】
安定化プロテアーゼを形成する方法であって、
プロテアーゼの一級アミンの一部を、カルボマーのカルボキシル基に反応させることにより、第一架橋反応を実施すること、
アミン反応性架橋剤を介して、前記第一架橋反応が施されたプロテアーゼ上で第二架橋反応を実施すること、ここで、前記第一架橋反応が施されたプロテアーゼの残った未反応の一級アミンの一部が前記アミン反応性架橋剤を介してお互いに架橋され、および、
前記第二架橋反応を実施した後に、糖ポリマーを加えること、
を含む安定化プロテアーゼを形成する方法。
【請求項１５】
前記第一架橋反応を、架橋剤カルボジイミド１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩およびＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドを用いて実施する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記第二架橋反応を実施するための前記架橋剤が、ジメチルアジピミデート（ＤＭＡ）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベラート（ＢＳ３）、ジメチルスベリミダート（ＤＭＳ）、ジメチルピメリミデート（ＤＭＰ）およびジスクシンイミジルスベラート（ＤＳＳ）からなる群より選択されるものである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記第二架橋反応を実施するための前記架橋剤がＤＭＡである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記第二架橋反応を、１重量％〜５重量％のアミン反応性架橋剤によって実施する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記糖ポリマーがアルギン酸ナトリウムである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
皮膚に塗布することにより乾燥、加齢または損傷皮膚を処置するための、１つまたはそれ以上の請求項１に記載の安定化プロテアーゼを含む化粧組成物。
【請求項２１】
局所塗布することによる創傷またはやけどデブリードマンのための、１つまたはそれ以上の請求項１に記載の安定化プロテアーゼを含む組成物。
【請求項２２】
カルボマーに架橋されたプロテアーゼを含む安定化プロテアーゼであって、前記プロテアーゼの一級アミンの一部が前記カルボマーのカルボキシル基に架橋され、前記プロテアーゼの残った未反応の一級アミンの一部がアミン反応性架橋剤を介してお互いに架橋され、前記アミン反応性架橋剤がジメチルアジピミデート、ビス（スルホスクシンイミジル）スベラート、ジメチルスベリミダート、ジメチルピメリミデートおよびジスクシンイミジルスベラートからなる群より選択され、前記架橋が１重量％〜５重量%の前記アミン反応性架橋剤によって行われる、安定化プロテアーゼ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（優先権）
本明細書は、２０１０年１月１９日に出願された米国仮特許出願第６１／２９６，０５２号明細書に対する優先権を主張する。
【０００２】
スキンケア剤として使用するための、植物由来の固定化および架橋プロテアーゼを合成することに関する発明が開示される。得られる安定化プロテアーゼは、その固定化特性のために、皮膚へわずかしか浸透しない。その架橋特性によって、そして特定の実施形態において、物理的添加物を介したその安定化のために、活性が維持される。本発明は特に、局所皮膚塗布にて使用される、連結パパイン生成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
プロテアーゼの活性は、表皮性ホメオスタシスにおいて重要である。したがって、プロテアーゼは、皮膚に塗布された時に、種々の潜在的な利点を持つが、特定の制限を受ける。パパインは、パパイヤや、特定の他の植物から由来する強力なプロテアーゼである。しかしながら、溶液状態で、活性を急速に失う。これは、パパインが、それ自身を消化し、ならびに変性を受けるからであり、これはすべてのプロテアーゼが同様である。さらに、これらのパパイン生成物を局所スキンケア薬剤として使用する場合に、皮膚浸透および皮膚炎症に関して、従来のパパイン生成物において他の困難が発生する場合がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そのような制限を持たない、スキンケアでの使用のための、プロテアーゼ生成物、より具体的にはパパイン生成物を開発することが非常に望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
従来技術における上述の困難を乗り越えるために、本発明の例示的実施形態は、本明細書にて記述された説明された技術を介した、改変安定架橋プロテアーゼ生成物、および具体的には改変安定架橋プロテアーゼ生成物が提供される。
【０００６】
例えば、本発明のいくつかの実施形態において、安定架橋パパイン生成物を得るために、パパインを、例えば第一架橋反応にて、カルボマーまたはカルボポールのようなポリマー上に固定化し、ついで第二架橋反応を、例えば、ジメチルアジピミデート（ＤＭＡ）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベラート（ＢＳ３）、ジメチルスベリミダート（ＤＭＳ）、ジメチルピメリミデート（ＤＭＰ）およびジスクシンイミジルスベラート（ＤＳＳ）のような、アミン反応性である低分子量のホモ二機能架橋剤を加えることによって続いて実施する。
【０００７】
本発明の例示的実施形態において、第一架橋反応および第二架橋反応を、安定架橋パパイン生成物を得るために実施し、ついで安定架橋パパインをさらに、例えば糖または糖ポリマーのような物理的安定剤を用いて安定化させる。例えば、アルギン酸ナトリウムを、本発明の例示的実施形態にしたがって、物理的安定剤として使用してもよい。
【０００８】
上記架橋安定化パパイン性生成物はまた、上記安定化パパイン生成物を、特定の防腐剤系、または水中油処方内に加えることによって、さらに安定化してもよい。
【０００９】
本発明の例示的実施形態にしたがった、固定化、架橋および安定化プロテアーゼ（例えばパパイン）複合体の利点には、
１）最小皮膚浸透、
２）溶液中または乾燥形態中、タンパク質分解活性の保持
３）最小皮膚炎症
４）処方の簡便さ
が含まれるが、これらに限定はされない。
【００１０】
本発明のまた他の実施形態において、安定化プロテアーゼを含む、化粧品、パーソナルケア、および薬理学的組成物が記述される。
【００１１】
以下の図は、例示の目的のみで提示されており、限定を意図しない。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明にしたがった安定架橋プロテアーゼを形成するための架橋反応を示す図である。
【図２】図１で図示した架橋反応を受けた、本発明の例示的実施形態にしたがった、安定架橋パパイン生成物を示す図である。
【図３】１２週間まで、種々の温度にて、本発明の例示的実施形態にしたがった安定化パパインの試料を保存した後の０日活性の割合を示す図である。
【図４】１２週間まで、種々の温度にて、ＤＭＡ試料なしで保存した後の、０日活性の割合を示す図である。
【図５】シグマ（Ｓｉｇｍａ）パパイン標準曲線を示す図である。
【図６（ａ）】本発明の例示的実施形態にしたがった、１２週間まで、種々の温度にて安定化パパイン試料を保存した後に維持された、０日活性の割合を示す図である。
【図６（ｂ）】１２週間まで、種々の温度にてＤＭＡ試料なしで保存した後に維持された、０日活性の割合を示す図である。
【図７】本発明の例示的実施形態にしたがった、安定架橋パパイン生成物中では、遊離活性パパインは見られなかったことを示すチャートである。
【図８】０．２％のＢＳ３を含む試料、およびいかなるＢＳ３をも含まない対照試料の、異なる温度での１週間後の、活性の割合を示すチャートである。
【図９】０．１％アルギン酸塩をともなう、またはこれをともなわない安定化パパインの試料の、４週間後維持活性の割合を示すチャートである。
【図１０】シグマパパイン標準曲線である。
【図１１】２５℃および４０℃での、１０日後の遊離パパインの安定性における、糖または糖ポリマーの効果を示すチャートである。
【図１２】０．４％パパインの、２週間後維持された活性の割合を示すチャートである。
【図１３（ａ）】ＤＭＡによって架橋され、さらにアルギン酸ナトリウムと反応した、安定架橋パパイン生成物を示している図である。
【図１３（ｂ）】１２週間までの間、種々の温度にて１％ＤＭＡ試料を保存した後に維持された活性の割合を示すチャートである。
【図１３（ｃ）】１２週間までの間、種々の温度にて、ＤＭＡなしで保存した後の、０日活性の割合を示すチャートである。
【図１４】連結パパインの活性維持におけるＤＭＡの効果を示すグラフである。
【図１５】異なる温度で、１２週間後、連結パパイン試料における活性を示すチャートである。
【図１６】シグマ（Ｓｉｇｍａ）パパイン標準曲線である。
【図１７】処方中に維持された連結パパイン（ＤＭＡあり）の活性を示すチャートである。
【図１８】処方中に維持された連結パパイン（ＤＭＡなし）の活性を示すチャートである。
【図１９】処方内に維持される連結パパインの活性を示すグラフである。
【図２０】プラセボ処方中のシグマパパインに対する標準曲線である。
【図２１】油および水処方中に維持される連結パパインの活性を示すチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
他に定義しない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同一の意味を持つ。本明細書で記述したものと同様の、または等価の方法および材料を、本発明の実施または試験で使用することができるが、適切な方法および物質が以下に記述される。本明細書で言及されるすべての発行物、特許明細書、特許および他の参考文献は、そのすべてが参考文献によって組み込まれている。矛盾する場合、定義を含む本明細書が規定するであろう。さらに、材料、方法および実施例は、説明のためのみであり、制限することを意図しない。
【００１４】
本発明の他の特徴および利点が、以下の詳細な記述から、および請求項から明らかになろう。当業者に明らかであるように、本明細書で記述した特定の特徴および実施形態は、任意の他の特徴または実施形態と組み合わせることができる。
【００１５】
表皮はいくつかの階層（ｓｔｒａｔａ）または層（ｌａｙｅｒｓ）からなる。最外部層である角質層は、下の階層から、数日の経過にわたって上向きに移動した死細胞からなる。これらの死細胞は通常、より深いレベルでより新しい細胞の増殖を刺激する表皮落屑と呼ばれる工程を介して、皮膚の表面から脱離する。皮膚は若ければ若いほど、加齢または損傷皮膚よりも、この工程においてより効率的である。結果として、加齢皮膚はくすみ、厚く、引き締まっていない。これは、日光への曝露のような環境因子、アンドロゲン、エストロゲンおよび上皮増殖因子のようなホルモンの影響、およびビタミンＡおよびＤの欠如のようなビタミン欠如によって悪化する場合がある。プロテアーゼ活性は、落屑工程における鍵となる因子である。したがって、皮膚スムージングやアンチエージングのような化粧効果のために、皮膚にプロテアーゼを塗布することが望ましい。しかしながら、化粧または他の用途におけるプロテアーゼの利用は、３つの主要な制限、不安定性、アレルギー誘発の可能性および皮膚浸透を持つことが知られている。
【００１６】
本発明は、少なくとも部分的に、本明細書で「安定化（ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ）」プロテアーゼとしても称される、プロテアーゼ・カルボマー・コポリマーを形成するための、ある特定の架橋反応を通して、プロテアーゼが安定化可能であるという発見に基づいている。そのような安定化プロテアーゼは、カルボマーに架橋したプロテアーゼを含み、そこでプロテーゼの第一アミンは、カルボマーのカルボキシル基に架橋し、プロテアーゼのアミンがさらに、アミン反応性架橋剤によって架橋される。本発明の一つの実施形態において、安定化プロテアーゼはさらに、物理的安定剤、例えば糖または糖ポリマーを含む。
【００１７】
そのような安定化プロテアーゼ生成物を形成する方法もまた開示されており、第一架橋反応は、プロテアーゼの一級アミンを、カルボマーのカルボキシル基へ架橋するために実施され、第二架橋反応は、アミン反応性架橋剤を介して実施される。
【００１８】
プロテアーゼ
プロテアーゼは、タンパク質の分解を触媒する酵素である。プロテインはそれ自身タンパク質であり、自己分解を受ける傾向があり、本来不安定である。このタンパク質性の性質はまた、それらをアレルギー誘発性とする。さらに、タンパク質を分解するそれらの能力のために、表皮のより深い層に浸透し、その下の階層に障害を与える場合がある。本発明での使用のために適切なプロテアーゼとしては、パパイン、フィチン、ブロメラインおよびアクチニダインが挙げられる。
【００１９】
フィチンは、イチジクの木の果実である、イチジクの乳液から単離された、非特異的スルフヒドリルプロテアーゼである。フィチンは、Ｆｉｃｕｓ  ｃａｒｉｃａおよびＦｉｃｕｓ  ｇｌａｂａｔｒａからもっとも一般的に得られる。しかしながら、フィチンはまた、Ｆｉｃｕｓ  ｅｌａｓｔｉｃａおよびＦｉｃｕｓ  ｉｎｓｉｐｉｄａのような他のイチジク種の果実からも単離される場合がある。ブロメラインは、パイナップル（Ａｎａｎａｓ  ｃｏｍｏｓｕｓ）の幹および／または果実から単離されるスルフヒドリルプロテアーゼである。アクチジンとしても知られるアクチニダインは、キウイフルーツ（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ  ｄｅｌｉｃｉｏｓａ）から得られるシステインプロテアーゼである。パパインは、パパイヤ（Ｃａｒｃｉａ  ｐａｐａｙａ）およびマウンテンパパイヤ（Ｖａｓｃｏｎｃｅｌｌｅａ  ｃｕｎｄｉｎａｍａｒｃｅｎｓｉｓ）から得られるシステインプロテアーゼであり、若くは熟していない果実の樹液よりほとんどの場合得られる。プロテアーゼは、０．１重量％〜５重量％の濃度で存在する。
【００２０】
カルボマー
プロテアーゼはカルボマー上にまず固定化する。カルボマーは、任意の種々のポリアルコールアリルエーテル類（例えばアリルエーテルペンタエリスリトール、スクロースのアリルエーテルまたはプロピレンのアリルエーテル）と架橋する、高分子量を有するアクリル酸のホモポリマーである。適切なカルボマーの例としては、カルボマー９１０、カルボマー９３４、カルボマー９３４ｐ、カルボマー９４０およびカルボマー９４１が挙げられ、数字の添え字はポリマー鎖の平均分子量を示している。本明細書で使用するように、「固定化（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ）」プロテアーゼまたは「連結（ｌｉｎｋｅｄ）」プロテアーゼは、第一架橋反応を介して、カルボマーと反応したプロテアーゼを意味する。この第一架橋反応のために適切な架橋剤は、カルボキシル基を一級アミンに結合可能な薬剤である。適切な架橋剤の１つの例は、水溶性カルボジイミド１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドである。ＥＤＣは、カルボキシル基を一級アミンに結合するために使用する、ゼロ長架橋剤である。ＥＤＣは、カルボキシル酸基と反応して、Ｏ−アシルイソウレア基を与え、これは、遊離アミン基との反応の後架橋を形成する。ＥＤＣは、反応の過程にわたり、二置換尿素への変換される、本実施様態内での最初の架橋剤である。ＮＨＳは酸エステルであり、架橋の速度を増加させ、架橋反応の間未変化で残る触媒である。
【００２１】
化学的架橋剤
いったんカルボマー上に固定化されると、固定化プロテアーゼを、第二架橋反応中、アミン反応性架橋剤と反応させて、本明細書で「安定化プロテアーゼ（ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｐｒｏｔｅａｓｅ）」とも呼ばれる、プロテアーゼ・カルボマー・コポリマーを形成させる。架橋剤は好ましくは低分子量架橋剤であり、架橋剤は完全に、またはほぼ完全に、第二架橋反応中で反応する。使用可能な適切な架橋剤の例としては、ジメチルアジピミデート（ＤＭＡ）、ジメチルピメリミデート（ＤＭＰ）、ジメチルスベリミデート（ＤＭＳ）、ジメチル３，３ジチオビスのようなイミドエステル架橋剤が挙げられる。アミン反応性架橋剤は、約０．０５重量％〜約５重量％、好ましくは約１％〜５％の範囲の種々の濃度で提供されてもよい。特定の実施形態において、ＤＭＡが利用される。
【００２２】
物理的安定剤
化学的架橋の後、固定化および架橋プロテアーゼを任意選択でさらに、例えば糖または糖ポリマーのような物理的安定剤により固定化される。適切な糖または糖ポリマーの例は、アルギン酸ナトリウム、トレハロース、マンニトール、グリセロールおよびキサンタンである。１つの実施形態において、アルギン酸ナトリウムが利用される。そのような物理的安定剤は、約０．１重量％〜５重量％の濃度で含まれてもよい。
【００２３】
本発明の安定化プロテアーゼのうちの１つの実施形態を形成するための架橋反応の図を、図１にて示している。安定化パパイン生成物の図を図２で示している。
【００２４】
適用／処方
本発明の安定化プロテアーゼは、最小皮膚浸潤を有し、溶液または乾燥形態でのタンパク質活性を維持し、最小皮膚刺激を有し、処方中に提供するのが比較的容易である。したがって、本発明の例示的実施形態は、従来技術のプロテアーゼ生成品、とりわけ安定化パパイン生成品実施様態と比較して、より安定で、非常に安全なプロテアーゼ生成品を提供する。
【００２５】
安定化プロテアーゼは、例えば剥奪調製物、しわ取りおよび／またはアンチエージング調製物、入浴剤、ヘアケア調製物、液体および固体石けん、クレンジング溶液、モイストクリーニング布、油または粉末、抗ニキビ調製物のような、化粧品およびパーソナルケア処方中での使用に適切である。安定化プロテアーゼは、１つまたはそれ以上の本発明の安定化プロテアーゼを、処置が必要な乾燥、加齢または損傷皮膚に塗布することによって、乾燥、加齢または損傷皮膚を処置するために特に適切である。
【００２６】
化粧品および／またはパーソナルケア処方は、例えば油中水または水中油エマルジョン、アルコール性またはアルコール含有処方、イオン性または非イオン性両親媒性脂質のベシクル分散体、またはゲルのような形態であってよい。例示的な化粧品および／またはパーソナルケア処方は、約０．５重量％〜約５重量％、好ましくは約１％〜３％の安定化プロテアーゼを含む。
【００２７】
本発明の安定化プロテアーゼは、薬理学的用途、例えばデブリードマン用途にも適切である。デブリードマンは、例えば潰瘍性傷のような傷、またはやけどからの、治癒を補助するための、死亡したまたは損傷を受けた組織の除去である。本発明の１つの実施形態において、１つまたはそれ以上の本発明の安定化プロテアーゼが、創面切除が必要な傷またはやけどに塗布する。傷またはやけどの処置のための安定化プロテアーゼを含む例示的な処方および製品としては、絆創膏／包帯、パッチ、洗浄溶液、軟膏またはジェル、または合成組織が挙げられる。特定の実施形態において、デブリードマン組成物、例えば、絆創膏、包帯またはパッチは、任意選択で抗菌剤を含んでもよい。デブリードマン用途のためには、薬理学的組成物中に含まれる安定化プロテアーゼの量は、効果的に、壊死組織を切除し、傷内の膿を液体化させる量であり、合理的な時間（例えば７日間にわたり）内に実質的にすべてのそのような物質を除去するのに影響を与える量である。
【００２８】
スキンケア用途に加えて、本発明の安定化プロテアーゼはまた、プロテアーゼの安定形態が望まれる本技術分野で公知の他の適用においても適切である場合がある。１つの例示的適用はオーラルケア組成物である。
【００２９】
安定化プロテアーゼを含む局所組成物にはさらに、本発明の利点を受け入れられない形で変更しない限り、化粧品、パーソナルケア、または薬理学的組成物中で従来使用される種々の他の成分を含んでもよい。任意選択の従来の成分分類の非限定的な例としては、香料、顔料、カラーリング／着色料、エッセンシャルオイル、収斂剤、アンチエージング剤、抗ニキビ剤、アンチケーキング剤、消泡剤、抗菌剤、抗酸化剤、結合剤、ｐＨ調整剤、皮膚脱色および美白剤、皮膚調整剤、日焼け止め、防腐剤、抗炎症剤、保湿剤、増粘剤およびビタミン類が挙げられる。
【００３０】
化粧品、パーソナルケアおよび／または薬理学的用途の特定の実施形態に対しては、安定化プロテアーゼをともなう防腐剤系をさらに含むことが望ましい。酵素は、高温や、強乳化剤のような不適合化学物質の存在下のような劣悪な条件下で変性することが知られている。安定化タンパク質との利用のために適切で、とりわけ、安定化パパインに対して適切である防腐剤系の２つの例が以下である。
【００３１】
（ａ）フェノキシエタノール＋安息香酸
（ｂ）ジオシド（Ｄｉｏｃｉｄｅ）（フェノキシエタノール＋カプリルグリコール＋ヘキシレングリコールの混合）
【実施例】
【００３２】
本発明は以下の実施例にてさらに記述されるが、請求項に記述される本発明の範囲を限定はしない。
【００３３】
実施例１
そのタンパク質分解活性を保持し、遊離パパインを含む従来のパパイン生成物よりも安全である、安定パパイン生成物を、１％パパインをＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（ＮＨＳ）と一緒に、カルボジイミド１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）塩酸カルボジイミド（ＥＤＣ）を用いて、カルボポールに架橋する第一架橋反応を実施することによって産出した。次に、第二架橋反応を次いで実施し、そこで、固定化パパインをジメチルアジピミデート（ＤＭＡ）と反応させて、架橋パパインをさらに架橋し、それによって安定架橋パパイン生成物を形成した。ＤＭＡは１％の濃度で提供され、パパインは、１重量％の濃度で提供された。
【００３４】
上記安定化パパイン生成物の３つの実験ラボバッチを実施し、１２週間にわたる保存期間中、第一架橋パパインの酵素活性／安定性において、１％のＤＭＡの効果を判定した。本実験を実施するための反応条件を表１に説明する。
【表１】
0005848260.tif 000002
【００３５】
１％ＤＭＡあり、またはＤＭＡなしで種々の温度にて１２週間にわたる、固定化パパインの保持された活性を判定するための３つの個々のラボバッチの結果が、表２（ａ）〜５（ｂ）にて以下で説明される。表２（ａ）は、１％ＤＭＡも含む実験試料中の、連結固定化パパインの保持された活性の割合を示している。表２（ｂ）は、ＤＭＡを含まない対照試料中の固定化パパインの保持された活性の割合を示している。実験試料および対照試料は、対照試料がいかなるＤＭＡも含まなかったことを除いて、基本的に同一であった。
【００３６】
表２（ａ）−１％ＤＭＡと架橋した固定化パパイン
【表２（ａ）】
0005848260.tif 000003
【００３７】
表２（ｂ）−固定化パパイン（ＤＭＡなし）−対照
【表２（ｂ）】
0005848260.tif 000004
【００３８】
表３（ａ）−１％ＤＭＡと架橋した固定化パパイン
【表３（ａ）】
0005848260.tif 000005
【００３９】
表３（ｂ）−固定化パパイン（ＤＭＡなし）−対照
【表３（ｂ）】
0005848260.tif 000006
【００４０】
表４（ａ）−１％ＤＭＡと架橋した固定化パパイン
【表４（ａ）】
0005848260.tif 000007
【００４１】
表４（ｂ）−固定化パパイン（ＤＭＡなし）−対照
【表４（ｂ）】
0005848260.tif 000008
【００４２】
表５（ａ）−バッチ１（表３）、バッチ２（表４）、バッチ３（表５）の１％ＤＭＡと架橋した固定化パパインの保持された活性の％に対する平均値
【表５（ａ）】
0005848260.tif 000009
【００４３】
表５（ｂ）−バッチ１（表３）、バッチ２（表４）、バッチ３（表５）の固定化パパイン（ＤＭＡなし）の保持された活性の％に対する平均値
【表５（ｂ）】
0005848260.tif 000010
【００４４】
表２（ａ）〜表５（ｂ）の結果からみることができるように、実験試料中、１％ＤＭＡと架橋した固定化パパインの活性は、ＤＭＡと反応しなかった対照試料中の固定化パパインの活性よりも、種々の温度にわたり、著しく大きかった。したがって、パパインをカルボマーに架橋させる、第一架橋反応を受け、ついで１％ＤＭＡとの第二架橋反応を受けたパパインは、第一架橋反応を受けたが、ＤＭＡとの第二架橋反応を受けなかったパパインの対照試料よりも、著しく安定である。さらに、図３および図４は、１％ＤＭＡと架橋した固定化パパインの活性が、ＤＭＡと反応しなかった対照試料中の固定化パパインの活性よりも、種々の温度にわたり、著しく大きかった、表２（ａ）〜表５（ｂ）の結果を説明している。
【００４５】
以下の表６および図７で説明するように、実験試料および対照試料中のパパイン活性を、固定化パパインのユニット試料あたりの、蛍光の変化に基づいて判定した。図５で示したような、シグマ（Ｓｉｇｍａ）パパイン活性標準曲線を、本実施例にしたがって、１％ＤＭＡと架橋した固定化パパインの活性を定量化することを助けるために開発した。上記したように、ＥｎｚＣｈｅｋ（登録商標）プロテアーゼアッセイキット（Ｅ−６６３９）を使用して、標準曲線と、本発明の実験のユニット試料あたりの蛍光変化を得た。
【００４６】
表６−１％ＤＭＡあり、およびＤＭＡなし（対照）の固定化パパインに対する蛍光値
【表６】
0005848260.tif 000011
【００４７】
表７−ユニット／ｍｌで測定した、１％ＤＭＡありの固定化パパイン１％と、ＤＭＡなし（対照）の固定化パパインの活性
【表７】
0005848260.tif 000012
【００４８】
他の実験において、４℃、２５℃および４５℃にて１２週間にわたり、架橋１％パパインを、１％ＤＭＡとともに保存し、架橋１％パパインをＤＭＡなしで保存し、これらのパパイン試料の、これらの温度での安定性を判定した。この実験の結果は、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ＥｎｚＣｈｅｋ（登録商標）アッセイキットを用いてパパイン活性アッセイにより得られた。Ｎ＝３。
【００４９】
図６（ａ）〜図６（ｂ）に示すように、ＤＭＡとの固定化パパインの架橋は、連結パパインをＤＭＡとともに保存しなかった対照試料と比較して、２５℃および４５℃における生成物の安定性を著しく改善した。図６（ａ）は、ＤＭＡによって架橋された連結パパインを含む１２週間まで試料を保存した後に保持された活性の割合を示している。図６（ｂ）は、ＤＭＡなしの連結パパインを含む、１２週間まで保存した対照試料を示している。図６（ａ）にて図示したように、ＤＭＡによって架橋された連結パパイン生成物が、１２週間にわたり、４℃および２５℃において約８０％、４５℃にて約５０％の活性を保持したことが判定されたことがさらに留意される。
【００５０】
図７で示すように、また他の実験において、安定化パパイン中の遊離活性パパインの判定を実施した。本実験の結果は、本発明の例示的実施形態にしたがって、第一架橋反応中、ＥＤＣ／ＮＨＳによって架橋され、ついでさらに第二架橋反応において１％ＤＭＡによって架橋されたパパイン中では、遊離活性パパインは発見されなかったことが判定された、というものであった。一方で、架橋されなかった対照試料のパパイン中には、遊離パパインの有意な活性が見られた。
【００５１】
実施例２
実施例２において、第二架橋剤として使用されるＤＭＡの代わりに、０．２％の架橋剤ＢＳ３を使用して、第二架橋反応で固定化パパイン生成物を架橋した。０．２％ＢＳ３とともに保存した固定化パパインの実験試料、およびＢＳ３なしで保存した固定化パパインの対照試料の活性の割合を判定するためのプロトコール、反応物、反応条件および結果を、表８〜表１０にて説明し、以下で考察する。
【表８】
0005848260.tif 000013
【表９】
0005848260.tif 000014
【表１０】
0005848260.tif 000015
【００５２】
表１０および図８の結果から見ることが可能であるように、０．２％  ＢＳ３でさらに架橋された固定化１％パパインの活性は、ＢＳ３と反応しなかった対照試料中の固定化パパインの活性より、種々の温度で著しく大きかった。
【００５３】
実施例３
本実施例において、１％安定化パパインおよび０．１％アルギン酸ナトリウムを混合した。０．１％アルギン酸ナトリウムとともに保存した安定化パパインの実験試料、およびアルギン酸ナトリウムなしで保存した安定化パパイン生成物の対照試料の活性の％を判定するためのプロトコール、反応物、反応条件および結果を以下で考察する。
【表１１】
0005848260.tif 000016
【表１２】
0005848260.tif 000017
【表１３】
0005848260.tif 000018
【００５４】
表１３の結果より見ることが出来るように、０．１％アルギン酸ナトリウムとともに保存した安定化パパインの活性は、アルギン酸ナトリウムとともに保存しなかった対照試料中の安定化パパインの活性より、４週間にわたり、種々の温度にて著しく大きい。したがって、０．１％アルギン酸ナトリウムと反応した連結パパインは、アルギン酸ナトリウムを含まない上述したパパインの対照試料より、著しく安定である。さらに、図９は、アルギン酸ナトリウムをともなう安定化パパインの活性は、アルギン酸ナトリウムを含まなかった対照試料中の架橋パパインの活性より、４週間にわたり、種々の温度で著しく大きかった表１３の結果を説明している。
【００５５】
さらに、図１０にて示したように、吸収対ユニット／ｍｌを用いた、シグマ（Ｓｉｇｍａ）パパイン活性標準曲線を０．１％アルギン酸ナトリウムと一緒の連結１％パパインの活性を定量化することを補助するために開発した。
【００５６】
他の実験において、図１１にて示すように、糖および糖ポリマーの、２５℃および４０℃にて数日後の遊離パパインの安定性における効果を実施した。含まれた糖または糖ポリマーは、０．１％アルギン酸ナトリウム、５％トレハロース、５％マンニトール、５％グリセロール、０．１キサンタンガム、０．１％ＨＡ、５％スクロース、５％ソルビトールおよび糖なし対照であった。結果から、０．１％アルギン酸ナトリウムが、遊離パパインにおいて安定化効果を持つことがわかったことが留意される。０．１％アルギン酸ナトリウムのこの安定化効果がまた、本発明の安定化パパイン上でも観察された。
【００５７】
また他の実験において、図１２にて示すように、０．４％パパインで作製された、安定化パパインの２週間後保持された活性の割合を判定した。これらの実験のいくつかの試料において、連結パパインをアルギン酸ナトリウムで処理し、いくつかの試料において、連結パパインを無水物で処理し、いくつかの試料で連結パパインを無水物とアルギン酸ナトリウムで処理し、いくつかの試料で、連結パパインを上記のいずれによっても処理しなかった。図１２から得られるように、アルギン酸ナトリウムおよび無水物両方で処理した試料が、２週間それぞれの後、最も大きな％活性が保持され、処理を全くしなかった試料は、２週間それぞれ後、保持された活性％は最も低かった。
【００５８】
実施例４
実施例４において、固定化パパインを、第二架橋のために１％ＤＭＡと、さらなる安定化のために０．１％アルギン酸ナトリウムと反応させ、１．２％フェノキシエタノール＋０．２％安息香酸を含む防腐剤系の一部として含めた。本発明の１つの実施様態にしたがった安定化パパインの実験試料、および（ＤＭＡまたはアルギン酸ナトリウムなしの）連結パパイン生成物の対照試料の活性の％を判定するためのプロトコール、反応物、反応条件および結果を表１４にて説明し、以下で考察する。
【表１４】
0005848260.tif 000019
【表１５】
0005848260.tif 000020
【００５９】
0005848260.tif 000021
【００６０】
以上で言及したように、本発明の例示的実施形態にしたがった実験試料には、１％ＤＭＡ、１％パパイン６００（ＥＳＰ）、０．１％アルギン酸ナトリウム、１．２フェノキシエタノール＋０．２％安息香酸が含まれる。対照試料には、ＤＭＡが含まれなかったこと以外、すべて実験処方と同一の要素が含まれた。ＤＭＡの効果に対する、種々の温度において、１２週間にわたる連結パパインの保持活性における結果を以下に説明する。さらに、ＤＭＡ、連結パパインおよびアルギン酸ナトリウムの化学反応を１３（ａ）で示している。
【００６１】
以上のデータおよび図１３（ｂ）、図１３（ｃ）、図１４および図１５より得られるように、連結パパインの１％ＤＭＡとの架橋が、いかなるＤＭＡをも含まなかった対照試料と比較して、１２週間にわたり、種々の温度で、連結パパイン生成物の安定性を著しく改善した。
【００６２】
さらに、表１５で説明したように、実験試料および対照中のパパイン活性は、連結パパインのユニット試料あたりの蛍光の変化に基づいて判定された。図１６で示したように、シグマ（Ｓｉｇｍａ）パパイン標準曲線を、本実施形態にしたがって、さらに１％ＤＭＡで架橋した、固定化１％パパインの活性を定量化することを補助するために開発した。以上で言及したように、ＥｎｚＣｈｅｋ（登録商標）プロテアーゼアッセイキット（Ｅ−６６３９）を使用して、標準曲線と、本例示的実施形態にしたがってＤＭＡにより固定化したパパインの実験試料、およびＤＭＡなしの対照試料のユニット試料あたりの蛍光変化を得た。
【００６３】
実施例５
別の例示的実施形態において、固定化パパインを、さらなる架橋のために５％  ＤＭＡと反応させ、０．１％アルギン酸ナトリウムと反応させ、１．２％フェノキシエタノール＋０．２％安息香酸を含む、防腐剤系の一部として含めた。本実施形態に関するプロトコールおよび結果を以下に説明する。プラセボ処方には、ＤＭＡ以外の、実験処方のすべての成分が含まれた。
【表１６】
0005848260.tif 000022
【００６４】
0005848260.tif 000023
【００６５】
0005848260.tif 000024
【００６６】
上記データ表および図１７〜図１９より得られるように、固定化パパインの５％ＤＭＡによる架橋が、ＤＭＡを含まない対照試料と比較して、１２週間にわたり、種々の温度で固定化パパイン生成物の安定性を著しく改善した。
【００６７】
さらに、以上のデータ表にて説明したように、実験試料および対照中のパパイン活性を、固定化パパインのユニット試料あたりの蛍光変化に基づいて測定した。図２０で示したように、プラセボ処方中のシグマ（Ｓｉｇｍａ）パパインに対する標準曲線を、本実施形態にしたがった５％ＤＭＡと架橋した固定化１％パパインの活性を定量化することを補助するために開発した。以上で言及したように、ＥｎｚＣｈｅｋ（登録商標）プロテアーゼアッセイキット（Ｅ−６６３９）を使用して、標準曲線と、本例示的実施形態にしたがったＤＭＡにより連結したパパインの実験試料、およびＤＭＡなしの対照試料とのユニット試料あたりの蛍光変化を得た。
【００６８】
実施例６〜実施例８
以下は、１つまたはそれ以上の安定化プロテアーゼを用いて調製可能な処方の非限定例を表している。広く種々の同様の処方が、本技術分野で公知であり、その中に１つまたはそれ以上の安定化プロテアーゼを簡単に種々の濃度で組む込むことが可能である。
【００６９】
実施例６
例えば、例示的弾力性クリームゲルは、以下の表で示した組成物を含む。
【表１７】
0005848260.tif 000025
【００７０】
主容器内で、相Ａを混合する。粉末が水和し、バッチが均一になるまでの均一混合およびスイープ混合する。相Ａが均一の時、均一混合しながら、相Ｂを主容器に加える。均一になるまで混合する。均一混合しながら相Ｃを主容器に加える。均一になるまで混合する。均一混合しながら相Ｄを主容器に加える。均一になるまで混合する。相Ｅ成分を、１５０〜４０℃に、融解するまで暖める。相Ｅを予混合し、均一混合しながら主容器に加える。相Ｆを予混合する。すべてのパールが懸濁し、塊が存在しなくなるまで、混合する。混合を添加の間続ける。相Ｆを均一混合しながら主容器に加える。添加の後均一混合機を切り、均一になるまでスイープ混合する。
【００７１】
実施例７
例えば、例示的ローションは、以下の表中で示す組成物を含む。
【表１８】
0005848260.tif 000026
【００７２】
６５〜７０℃まで熱しながら、均一になるまで相Ａを混合する。別の容器中で、相Ｂを予混合する。７０〜７５℃まで、または均一になるまで熱する。相Ａおよび相Ｂの両方が所望される温度になった時、相Ｂを相Ａに加え、均一になるまで均一混合する。相ＡＢが均一になる時、冷却を始め、相Ｃを３５〜３０℃で加え、均一になるまで、プロップ混合器下で混合する。予混合した相Ｄを、均一混合器下で相ＡＢＣに加える。均一になるまで混合する。
【００７３】
実施例８
本実施形態において、Ｏ／Ｗ処方内での、１２週間まで、種々の温度で、連結パパインの安定性。結果を、処方を０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中にｎ＝３で懸濁した後、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ＥｎｚＣｈｅｋアッセイキットを用いて、パパイン活性アッセイによって得た。
【００７４】
図２１で示すように、連結パパイン生成物は、水中油処方によってさらに安定化される。約７５％の活性が、４５℃にて１２週間後維持される。処方は、試験したすべての温度で安定であることがわかった。これらの結果は、架橋パパイン生成物が油および水処方中に含まれる場合、この生成物はさらに安定化されることを示す。
【００７５】
本発明の例示的な実施形態を記述したが、付随する請求項の境界によって定義される、本発明の精神および範囲から逸脱することなしに、種々の改変がなされてもよいことが、当業者に容易に明らかになることがさらに留意される。
【図１】
0005848260.tif 000027
【図２】
0005848260.tif 000028
【図３】
0005848260.tif 000029
【図４】
0005848260.tif 000030
【図５】
0005848260.tif 000031
【図６（ａ）】
0005848260.tif 000032
【図６（ｂ）】
0005848260.tif 000033
【図７】
0005848260.tif 000034
【図８】
0005848260.tif 000035
【図９】
0005848260.tif 000036
【図１０】
0005848260.tif 000037
【図１１】
0005848260.tif 000038
【図１２】
0005848260.tif 000039
【図１３（ａ）】
0005848260.tif 000040
【図１３（ｂ）】
0005848260.tif 000041
【図１３（ｃ）】
0005848260.tif 000042
【図１４】
0005848260.tif 000043
【図１５】
0005848260.tif 000044
【図１６】
0005848260.tif 000045
【図１７】
0005848260.tif 000046
【図１８】
0005848260.tif 000047
【図１９】
0005848260.tif 000048
【図２０】
0005848260.tif 000049
【図２１】
0005848260.tif 000050