(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、生分解性を有するアミノ酸配列を有する遺伝子組み換えゼラチンから構成される多孔質体であって以下の特性を有する多孔質体からなる細胞支持体。
（ａ）気孔率：８１％以上９９．９９％以下
（ｂ）平均気孔サイズ：１０〜４００μｍ
（ｃ）気孔間連通孔を有する、及び
（ｄ）吸水率：１０００％以上９９００％以下
【請求項２】
遺伝子組み換えゼラチンのGrand average of hydropathicity（GRAVY）値が、０．３以下−５．０以上である、請求項１に記載の細胞支持体。
【請求項３】
遺伝子組み換えゼラチンが架橋されている、請求項１又は２に記載の細胞支持体。
【請求項４】
架橋がアルデヒド類、縮合剤、又は酵素により施される、請求項３に記載の細胞支持体。
【請求項５】
遺伝子組み換えゼラチンが、
式：Ａ−［（Gly−Ｘ−Ｙ）n］m−Ｂ
（式中、Ａは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎは３〜１００の整数を示し、ｍは２〜１０の整数を示す。なお、n個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）
で示される、請求項１から４の何れか１項に記載の細胞支持体。
【請求項６】
遺伝子組み換えゼラチンが、
式：Gly-Ala-Pro-［（Gly−Ｘ−Ｙ）63］3−Gly
（式中、63個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、63個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。なお、63個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）
で示される、請求項１から５の何れか１項に記載の細胞支持体。
【請求項７】
遺伝子組み換えゼラチンが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１から６の何れか１項に記載の細胞支持体。
【請求項８】
遺伝子組み換えゼラチンを架橋した後、攪拌し、その後に凍結乾燥する工程を含む、請求項１から７の何れか１項に記載の細胞支持体の製造方法。
【請求項９】
請求項１から７の何れか１項に記載の細胞支持体を含む再生医療材料。
【請求項１０】
請求項１から７の何れか１項に記載の細胞支持体と移植細胞とを含む、再生医療材料。
【請求項１１】
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、生分解性を有するアミノ酸配列を有する遺伝子組み換えゼラチンから構成される多孔質体であって以下の特性を有する多孔質体からなる骨再生材。
（ａ）気孔率：８１％以上９９．９９％以下
（ｂ）平均気孔サイズ：１０〜４００μｍ
（ｃ）気孔間連通孔を有する、及び
（ｄ）吸水率：１０００％以上９９００％以下
【請求項１２】
遺伝子組み換えゼラチンのGrand average of hydropathicity（GRAVY）値が、０．３以下−５．０以上である、請求項１１に記載の骨再生材。
【請求項１３】
遺伝子組み換えゼラチンが架橋されている、請求項１１又は１２に記載の骨再生材。
【請求項１４】
架橋がアルデヒド類、縮合剤、又は酵素により施される、請求項１３に記載の骨再生材。
【請求項１５】
遺伝子組み換えゼラチンが、
式：Ａ−［（Gly−Ｘ−Ｙ）n］m−Ｂ
（式中、Ａは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎは３〜１００の整数を示し、ｍは２〜１０の整数を示す。なお、n個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）
で示される、請求項１１から１４の何れか１項に記載の骨再生材。
【請求項１６】
遺伝子組み換えゼラチンが、
式：Gly-Ala-Pro-［（Gly−Ｘ−Ｙ）63］3−Gly
（式中、63個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、63個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。なお、63個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）で示される、請求項１１から１５の何れか１項に記載の骨再生材。
【請求項１７】
遺伝子組み換えゼラチンが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１１から１６の何れか１項に記載の骨再生材。
【請求項１８】
遺伝子組み換えゼラチンを架橋した後、攪拌し、その後に凍結乾燥する工程を含む、請求項１１から１７の何れか１項に記載の骨再生材の製造方法。
【請求項１９】
請求項１１から１７の何れか１項に記載の骨再生材を含む再生医療材料。
【請求項２０】
請求項１１から１７の何れか１項に記載の骨再生材と移植細胞とを含む、再生医療材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を均一に分布させることができる細胞支持体、及び骨再生材に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、機能障害や機能不全に陥った生体組織・臓器の再生を計る再生医療の実用化が進められている。再生医療は、生体が持っている自然治癒能力だけでは回復できなくなった生体組織において、細胞、足場及び成長因子の三因子を使って元の組織と同じような形態や機能を再び作り出す新たな医療技術である。近年では、細胞を使った治療が徐々に実現されつつある。例えば、自家細胞を用いた培養表皮、自家軟骨細胞を用いた軟骨治療、間葉系幹細胞を用いた骨再生治療、筋芽細胞を用いた心筋細胞シート治療、角膜上皮シートによる角膜再生治療、神経再生治療などが挙げられる。これらの新たな治療は、従来の人工物による代替医療（人工骨補填剤やヒアルロン酸注射）とは異なり、生体組織の修復・再生を図るため、高い治療効果を得られる。実際、自家細胞を用いた培養表皮や培養軟骨などの製品が上市されている。【０００３】
しかし、上記のような細胞を用いた治療に際しては、治療効果のばらつきの問題や、予期せぬ副作用の問題が懸念され、かつ実際に問題になっている。このような問題の原因としては、培養して得られた細胞の不均一さ、移植部位における細胞の生着不均一さが大きな原因と考えられる。【０００４】
例えば、軟骨細胞においては、培養過程において、脱分化しやすいことが知られており、状態を一定に保った培養法が望まれている。また、一般に細胞はその存在する状態、特に細胞の密度によって、その状態を変化させてしまうことが知られている。例えば、現在治療への応用が期待されている間葉系幹細胞（MSC）にあっては、細胞密度が薄い状態では脂肪細胞へ、逆に細胞密度が高い状態では骨細胞へと分化しやすいことが知られており、他の細胞においても細胞密度を一定にコントロールすることは非常に重要な要素となる。【０００５】
同時に、細胞を生体内での環境により近い状態で効率良く培養するには、三次元培養技術が重要であることが多くの報告によって実証されている。しかし、三次元基材に細胞を播種した場合、細胞が基材中に均一に分布することはなく、基材中で偏ってしまうことが知られているため、三次元培養においては細胞密度を一定に保つことが困難である。三次元培養における細胞培養は、基材の細胞への接着性、基材の構造、基材の親疎水性などの物性、及び生物学的、化学的性質に依存していると推測されるが、三次元基材中で細胞を均一に分布させ、細胞密度を一定に保つことは一般に困難である。その結果、細胞の状態が三次元基材中で同一ではない状態が形成されてしまい、細胞の均一性に問題を生じる。【０００６】
また、得られた細胞の移植治療にあたっては、細胞の懸濁液を注入する以外にも、例えば軟骨細胞のアテロコラーゲン・ゲル包埋培養のように、培養した細胞を基材とともに移植することが行われている。この場合、培養後に三次元基材と細胞からなる構造物を、移植部位の形状に合せてトリミングして移植するが、細胞が三次元基材中で不均一に分布する場合、トリミングによって得られた移植用断片にも細胞の分布ムラが生じ、治療効果を強く発現する箇所と、発現しにくい箇所が生じ、更には細胞の密度ムラによって、移植断片の物理的性質・物理的強度にもムラが生じる。これらのムラは治療効果のバラツキや移植断片の生着率低下の要因となり、予期した治療効果を上げられないという結果を引き起こす。さらに、上記したような三次元基材に求められる適性としては、移植へ利用することから、生体親和性、望ましくは、生分解性（体内で自然に分解される必要から）を有する素材で構成されていることが重要である。しかし、これら全ての要件を満たす三次元基材は存在していなかった。【０００７】
上記の通り、細胞を用いた再生医療の観点から、培養工程及び移植工程ともに、細胞を均一に分布させムラのない状態で保持できる三次元基材であると同時に、移植へ適用する必要性から、生体内で分解される素材で構成される三次元基材が求められているが、現在までのポリマー多孔質、コラーゲン三次元基材、又はコラーゲンゲル包埋培養では解決困難であった。【０００８】
一般に、生体組織は細胞と細胞外マトリックス（高分子構造体）から構成されており、種々の生命現象はそれらが複雑に相互作用の結果である。細胞は種々の成長因子（薬）を放出し、自身或いは他の細胞の機能に影響を与えている。一方、細胞から分泌される細胞外マトリックスは細胞の機能する水和空間を提供し、薬の貯蔵庫や足場としての機能を持ち、細胞の機能発現や分化に重大な影響を与えている。【０００９】
近年目覚しい進歩を遂げている再生医療は人工臓器や臓器移植に代わりうる高度先端医療として非常に注目を集めている。再生医療実現の為には、再生医療の主要な要素である細胞、培養装置、増殖因子（薬）、細胞の足場（人工細胞外マトリックス、材料）のそれぞれを巧みに使いこなすことが重要である。【００１０】
整形外科領域または歯科領域の骨再生は、再生医療領域において非常に注目を集めている領域の一つとして知られている。骨疾患が足や腰の場合は歩行不能となり、歯科の場合は食事摂取が困難となることから、骨疾患は著しいQOLの低下を引き起こす。【００１１】
現在、骨再生治療製剤として代表的なものとして、脊髄損傷を治療するInfuse（BMP-2とコラーゲンスポンジの組み合わせ）、歯槽骨を再生する骨補填剤としてBioOss（脱タンパク化したウシ粉砕骨）、Gem21（PDGFとβTCP）が知られている。一般に、骨再生治療製剤に必要な性質として、１．構造維持の為の強度、２．骨再生のためのスペース確保、３．骨再生する細胞の足場、４．骨再生する細胞の分化と増殖を誘発すること、５．骨再生に伴う分解性が知られている。骨再生治療製剤としての足場材料としては、コラーゲンやβTCP等が広く用いられている。また、研究レベルでは、コラーゲンの変性体であるゼラチンスポンジにｂFGFあるいはBMP-2を染み込ませることによる骨再生が行われている（Journal of Neurosurgery 91 851-856, 1999）。さらには、骨髄間葉系幹細胞を足場基材に含ませ培養した治療剤による骨再生治療も研究が行われている（廣瀬  志弘, 大串  始「再生培養骨組織を用いた骨の再生医療」ティッシュエンジニアリング2007, 178-183;2007.7）。【００１２】
骨再生とは、骨芽系細胞が骨基質を生成し骨細胞と骨基質からなる硬質な骨が形成されることを表し、骨芽系細胞によって達成される現象である。体外で増殖させた移植細胞（骨髄間葉系幹細胞等）を活用する場合は元より、増殖因子（薬）による骨再生効果も、周囲にある宿主由来細胞へ作用を及ぼすことで骨再生を誘導している。例えば、BMPは未分化間葉系細胞に作用して、骨芽細胞へと分化させ、骨芽細胞による骨形成を活性化させる。従って、骨再生の主体は細胞にある為、細胞の足場となる足場材料の重要性は極めて高い。【００１３】
再生医療全般に亘る代表的な足場材料としては、ゼラチンが良く知られている。ゼラチンは生体適合性が高く、安全性の高い素材として知られ、医療用途での応用実績が高い。同様に実績の高い素材としては、コラーゲンが知られているが、ゼラチンに比べて可溶性が低く、溶解液の濃度とpHにおける制約が大きい（数十％高濃度・中性溶液などに調整することが出来ない）。それ故、通常であれば加工・作製・成型可能な物が制限されてしまうことから、ゼラチンを用いた足場基材が望まれる。しかしながら、殊、骨再生治療の足場材料としてゼラチン基材はあまり適していないという認識が一般的である。例えば、ゼラチンスポンジは単独では骨再生を阻害するとの記載がある（田畑他、Journal of Neurosurgery 91 851-856, 1999）。また、石井らは（歯科医展望、97（３）、665-677,2001）、コラーゲンスポンジとゼラチンスポンジの及ぼす歯槽骨再性能への影響を調べ、ゼラチンはコラーゲンに比べて骨再性能を有さないと述べている。【００１４】
また、コラーゲンやセラミックス材料、合成ポリマーにおいても、足場材料単独での骨再生力が不十分であることから、BMPや自家血、自家骨髄間葉系幹細胞とのコンビネーショーンが報告されているのが現状である。【００１５】
これら足場材料において、足場材料が優良な骨再生能を示さない原因の一つとしては、「足場基材内への細胞浸潤（導入）能力」、「足場基材中での細胞分布・保持能力」が不十分であると考えられた。本発明者らは、足場基材が細胞支持体として、十分な細胞導入力・分布・保持力を有さないことが骨再生へ繋がらない原因であると考えた。【００１６】
例えば、特開昭６２−１２２５８６号公報においては、ポリエステルやポリプロピレンからなる、気孔率４０〜９５％、望ましくは６０〜８０％以下であるような多孔性支持体が記載されているが、当該気孔率の多孔性支持体は細胞を均一に分布・保持することができない。また、特開平８−８９２３９号公報においては多孔性のコラーゲンスポンジが記載されているが、コラーゲンスポンジでは、その疎水性に依存してなのか、素材の不均質性によるのか原因は定かでないが、細胞を三次元的に均一分布させることができないことが知られている。加えて、予め細胞を培養した後に移植する場合としては、コラーゲンゲルに細胞を包埋して培養するゲル包埋培養という手法も存在するが、細胞がゲル中で偏り分布が不均一になってしてしまう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】特開昭６２−１２２５８６号公報
【特許文献２】特開平８−８９２３９号公報
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Journal of Neurosurgery 91 851-856, 1999
【非特許文献２】廣瀬  志弘, 大串  始「再生培養骨組織を用いた骨の再生医療」ティッシュエンジニアリング2007, 178-183;2007.7
【非特許文献３】歯科医展望、97（３）、665-677,2001
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明は、上記した従来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、細胞を均一に分布させムラのない状態で保持でき、かつ生体内で分解される素材で構成されている三次元の細胞支持体を提供することを課題とした。更に本発明は、足場基材単独でも骨再生能力を有するような骨再生材、更には骨再生に適していないとされるゼラチン素材であっても骨再生能力を有するような骨再生材を提供することを課題とした。更に本発明は、上記の細胞支持体または骨再生材を用いた医療材料を提供することを課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討し、細胞接着性の生分解性材料を用いて所定の気孔率、平均気孔サイズ及び吸水率を有し、かつ気孔間連通孔を有する多孔質体を製造し、この多孔質体に細胞を播種して、多孔質体内における細胞の分布を調べた結果、細胞が当該多孔質体内に均一に分布し、また細胞が多孔質体から脱落することが少なく、多孔質体内に多くの細胞が見られることを見出した。また、ゼラチン、遺伝子組換えゼラチンを用いて製造した当該多孔質体について、ラット頭蓋骨欠損モデルにおける骨再生を評価した結果、当該多孔質構造体では良好な骨再生を示すことを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。【００２１】
即ち、本発明によれば、生分解性材料から構成される多孔質体であって以下の特性を有する多孔質体からなる細胞支持体が提供される。
（ａ）気孔率：８１％以上９９．９９％以下
（ｂ）平均気孔サイズ：１０〜４００μｍ
（ｃ）気孔間連通孔を有する、及び
（ｄ）吸水率：１０００％以上９９００％以下【００２２】
さらに本発明によれば、生分解性材料から構成される多孔質体であって以下の特性を有する多孔質体からなる骨再生材が提供される。
（ａ）気孔率：８１％以上９９．９９％以下
（ｂ）平均気孔サイズ：１０〜４００μｍ
（ｃ）気孔間連通孔を有する、及び
（ｄ）吸水率：１０００％以上９９００％以下【００２３】
好ましくは、生分解性材料のGrand average of hydropathicity（GRAVY）値は、０．３以下−５．０以上である。
好ましくは、生分解性材料は、蛋白質、ポリペプチド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、PLGA、キチン、キトサン、セルロース及びヒアルロン酸から選択される少なくとも１種以上である。
好ましくは、生分解性材料は、天然又は遺伝子組み換えゼラチン、天然又は遺伝子組み換えフィブロネクチン、あるいは天然又は遺伝子組み換えラミニンである。【００２４】
好ましくは、生分解性材料は架橋されている。
好ましくは、架橋はアルデヒド類、縮合剤、又は酵素により施される。
好ましくは、生分解性材料が、遺伝子組み換えゼラチンである。【００２５】
好ましくは、遺伝子組み換えゼラチンは、
式：Ａ−［（Gly−Ｘ−Ｙ）n］m−Ｂ
（式中、Ａは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎは３〜１００の整数を示し、ｍは２〜１０の整数を示す。なお、n個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）
で示される。【００２６】
好ましくは、遺伝子組み換えゼラチンは、
式：Gly-Ala-Pro-［（Gly−Ｘ−Ｙ）63］3−Gly
（式中、63個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、63個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。なお、63個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）
で示される。【００２７】
好ましくは、遺伝子組み換えゼラチンは、
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、生分解性を有するアミノ酸配列、
を有する。【００２８】
好ましくは、本発明の細胞支持体は、生分解性材料を架橋した後、攪拌し、その後に凍結乾燥することによって製造される。
本発明によればさらに、上記した本発明の細胞支持体を含む再生医療材料が提供される。
本発明によればさらに、上記した本発明の細胞支持体と移植細胞とを含む、再生医療材料が提供される。【００２９】
好ましくは、本発明の骨再生材は、生分解性材料を架橋した後、攪拌し、その後に凍結乾燥することによって製造される。
本発明によればさらに、上記した本発明の骨再生材を含む再生医療材料が提供される。
本発明によればさらに、上記した本発明の骨再生材と移植細胞とを含む、再生医療材料が提供される。
【発明の効果】
【００３０】
本発明の細胞支持体は、細胞を均一に分布・保持することができ、生体内で分解される素材で構成されている三次元の細胞支持体である。本発明の細胞支持体は、細胞支持体単独でも骨再生能力を有し、骨再生治療に用いることができる。加えて、本発明の過程で得られた三次元構造を付与することによって、一般には骨再生に適していないとされるゼラチン素材であっても、骨再生能力を有する足場構造体として提供することができる。本発明の細胞支持体を再生医療のために使用することにより、ばらつきを抑制した治療効果を達成でき、また予期せぬ副作用の問題も解消することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、遺伝子組み換えゼラチンのハイドロゲルをマウスの背部皮下へ埋殖し、残存ゲル量を経時的に測定した結果を示す。
【図２】図２は、遺伝子組み換えゼラチンのハイドロゲルをマウスの背部皮下へ埋殖した後の病理切片の画像（ヘマトキシリンエオジン染色）を示す。
【図３】図３は、遺伝子組み換えゼラチンスポンジの内部断面構造について走査型電子顕微鏡で観察した画像（５％スポンジの断面）を示す。
【図４】図４は、遺伝子組み換えゼラチンスポンジの内部断面構造について走査型電子顕微鏡で観察した画像（１０％スポンジの断面）を示す。
【図５】図５は、コラーゲンスポンジの切片写真（Ｄａｙ１）を示す。
【図６】図６は、コラーゲンスポンジの切片写真（Ｄａｙ４）を示す。
【図７】図７は、遺伝子組み換えゼラチンスポンジ（１０％）の切片写真（直径８ｍｍ、高さ５ｍｍ）（Ｄａｙ１）を示す。
【図８】図８は、遺伝子組み換えゼラチンスポンジ（１０％）の切片写真（直径８ｍｍ、高さ５ｍｍ）（Ｄａｙ４）を示す。
【図９】図９は、アテロコラーゲンハニカムスポンジの切片写真（Ｄａｙ１）を示す。
【図１０】図１０は、アテロコラーゲンハニカムスポンジの切片写真（Ｄａｙ４）を示す。
【図１１】図１１は、遺伝子組み換えゼラチンスポンジ（１０％）の切片写真（２ｍｍ×２ｍｍ×３ｍｍ）（Ｄａｙ１）を示す。
【図１２】図１２は、遺伝子組み換えゼラチンスポンジ（１０％）の切片写真（２ｍｍ×２ｍｍ×３ｍｍ）（Ｄａｙ４）を示す。
【図１３】図１３は、コラーゲンゲル包埋培養の切片写真（Ｄａｙ１）を示す。
【図１４】図１４は、コラーゲンゲル包埋培養の切片写真（Ｄａｙ４）を示す。
【図１５】図１５は、コラーゲンゲル上培養の切片写真（Ｄａｙ１）を示す。
【図１６】図１６は、コラーゲンゲル上培養の切片写真（Ｄａｙ４）を示す。
【図１７】図１７は、細胞接着性試験（DNA assay）の結果を示す。
【図１８】図１８は、細胞接着性試験（DNA assay）の結果を示す。
【図１９】図１９は、遺伝子組み換えゼラチンでコーティングしたプレートへの細胞接着の様子を示す。
【図２０】図２０は、ラット頭蓋骨欠損モデルを示す。左：肉眼写真、右：μCT写真（Micro-CT image: Tissue Eng (2007) 13(3):501-12）
【図２１】図２１は、骨再生量、及び骨再生割合のデータを示す。
【図２２】図２２は、遺伝子組換えゼラチンパウダー、遺伝子組換えゼラチンスポンジを移植した群の代表的な病理写真を示した。
【図２３】図２３は、天然ゼラチンスポンジを移植した群の代表的な病理写真を示した。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
（１）生分解性材料
（１−１）生分解性材料の種類
本発明の細胞支持体は、少なくとも1種以上の生分解性材料で構成される。本発明で用いる生分解性材料は、生体内で分解される限り、その種類は特に限定されない。本発明で用いられる生分解性材料は、Grand average of hydropathicity（GRAVY）値で表される親疎水性指標において、０．３以下−５．０以上であることが好ましく、０．０以下−３．０以上であることがさらに好ましく、上記を満たす親水性ポリペプチドが特に好ましい。Grand average of hydropathicity（GRAVY）値は、『Gasteiger E., Hoogland C., Gattiker A., Duvaud S., Wilkins M.R., Appel R.D., Bairoch A.;Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server;(In) John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005). pp. 571-607』及び『Gasteiger E., Gattiker A., Hoogland C., Ivanyi I., Appel R.D., Bairoch A.; ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.; Nucleic Acids Res. 31:3784-3788(2003).』の方法により得ることができる。
【００３３】
生分解性材料の具体例としては、蛋白質、ポリペプチド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、PLGA、キチン、キトサン、セルロース、及びヒアルロン酸から選択される少なくとも１種以上の材料を用いることが好ましい。上記の中でも、蛋白質又はポリペプチドが好ましく、特にゼラチン、フィブロネクチン、又はラミニンなどが好ましい。これらの蛋白質は遺伝子組み換え体でも天然体でもよい。遺伝子組み換え蛋白質の具体例としては、遺伝子組み換えゼラチン、プロネクチン、遺伝子組み換えフィブロネクチン、遺伝子組み換えラミニンが挙げられる。上記の中で最も好ましいのは、遺伝子組み換えゼラチンである。遺伝子組み換えゼラチンについては本明細書中において後記する。
【００３４】
本発明で用いる生分解性材料は細胞接着性であることが好ましい。細胞接着性が高い素材を用いることによって、細胞の漏出や不均一分布を抑制できると考えられるからである。細胞接着性を定量的に記述することは困難であるが、これら高分子材料には細胞接着性を高める工夫がなされていてもよく、具体的な方法としては１．「基材表面に対する細胞接着基質（フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン）や細胞接着配列（アミノ酸一文字表記で現わされる、ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列、及びＨＡＶ配列）ペプチドによるコーティング」、２．「基材表面のアミノ化、カチオン化」、３．「基材表面のプラズマ処理、コロナ放電による親水性処理」といった方法が利用され得る。
【００３５】
（１−２）架橋
本発明で用いる生分解性材料は、架橋されているものでもよいし、架橋されていないものでもよいが、架橋されているものが好ましい。架橋方法としては、熱架橋、化学架橋、アルデヒド類（例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなど）による架橋、縮合剤（カルボジイミド、シアナミドなど）による架橋、酵素架橋、光架橋、ＵＶ架橋、疎水性相互作用、水素結合、イオン性相互作用など公知の方法を用いることができるが、グルタルアルデヒドを用いて架橋されていることが最も好ましい。
【００３６】
光架橋としては、光反応性基を導入した高分子への光照射、あるいは光増感剤の存在化での光照射によるものが挙げられる。光反応性基としては、例えば、シンナミル基、クマリン基、ジチオカルバミル基、キサンテン色素、カンファキノンが挙げられる。
【００３７】
酵素による架橋を行う場合、酵素としては、生分解性材料間の架橋作用を有するものであれば特に限定されないが、好ましくはトランスグルタミナーゼおよびラッカーゼ、最も好ましくはトランスグルタミナーゼを用いて架橋を行うことができる。トランスグルタミナーゼで酵素架橋するタンパク質の具体例としては、リジン残基およびグルタミン残基を有するタンパク質であれば特に制限されない。トランスグルタミナーゼは、哺乳類由来のものであっても、微生物由来のものであってもよく、具体的には、味の素（株）製アクティバシリーズ、試薬として発売されている哺乳類由来のトランスグルタミナーゼ、例えば、オリエンタル酵母工業（株）製、Upstate USA Inc.製、Biodesign International製などのモルモット肝臓由来トランスグルタミナーゼ、ヤギ由来トランスグルタミナーゼ、ウサギ由来トランスグルタミナーゼなど、ヒト由来の血液凝固因子（Factor XIIIa、Haematologic Technologies， Inc.社）などが挙げられる。
【００３８】
生分解性材料の架橋には、生分解性材料の溶液と架橋剤を混合する過程とそれらの均一溶液の反応する過程の２つの過程を有する。
【００３９】
本発明において生分解性材料を架橋剤で処理する際の混合温度は、溶液を均一に攪拌できる限り特に限定されないが、好ましくは０℃〜４０℃であり、より好ましくは０℃〜３０℃であり、より好ましくは３℃〜２５℃であり、より好ましくは３℃〜１５℃であり、さらに好ましくは３℃〜１０℃であり、特に好ましくは３℃〜７℃である。
【００４０】
生分解性材料と架橋剤を攪拌した後は温度を上昇させることができる。反応温度としては架橋が進行する限りは特に限定はないが、生分解性材料の変性や分解を考慮すると実質的には０℃〜６０℃であり、より好ましくは０℃〜４０℃であり、より好ましくは３℃〜２５℃であり、より好ましくは３℃から１５℃であり、さらに好ましくは３℃〜１０℃であり、特に好ましくは３℃〜７℃である。
【００４１】
（１−３）遺伝子組み換えゼラチン
本発明で用いることができる遺伝子組み換えゼラチンは、コラーゲンに特徴的なGly-X-Yで示される配列（Ｘ及びＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す）の繰り返しを有するものが好ましい（複数個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい）。好ましくは、細胞接着シグナルを一分子中に２配列以上含まれている。本発明で用いる遺伝子組み換えゼラチンとしては、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する遺伝子組み換えゼラチンを用いることができ、例えばEP1014176A2、US6992172、WO2004-85473、WO2008/103041等に記載のものを用いることができるが、これらに限定されるものではない。本発明で用いる遺伝子組み換えゼラチンとして好ましいものは、以下の態様の遺伝子組み換えゼラチンである。
【００４２】
本発明で用いる遺伝子組み換えゼラチンは天然のゼラチン本来の性能から、生体適合性に優れ、且つ天然由来ではないことでＢＳＥなどの懸念がなく、非感染性に優れている。また、本発明で用いる遺伝子組み換えゼラチンは天然のものに比して均一であり、配列が決定されているので、強度、分解性においても後述の架橋等によってブレを少なく精密に設計することが可能である。
【００４３】
遺伝子組み換えゼラチンの分子量は2 KDa以上100 KDa以下であることが好ましい。より好ましくは2.5 KDa以上95KDa以下である。より好ましくは5 KDa以上90 KDa以下である。最も好ましくは、10 KDa以上90KDa以下である。
【００４４】
遺伝子組み換えゼラチンは、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列の繰り返しを有する。ここで、複数個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ において、Ｇｌｙはグリシン、Ｘ及びＹは、任意のアミノ酸（好ましくは、グリシン以外の任意のアミノ酸）を表す。コラーゲンに特徴的なＧＸＹ配列とは、ゼラチン・コラーゲンのアミノ酸組成および配列における、他のタンパク質と比較して非常に特異的な部分構造である。この部分においてはグリシンが全体の約３分の１を占め、アミノ酸配列では３個に１個の繰り返しとなっている。グリシンは最も簡単なアミノ酸であり、分子鎖の配置への束縛も少なく、ゲル化に際してのヘリックス構造の再生に大きく寄与している。Ｘ，Ｙであらわされるアミノ酸はイミノ酸（プロリン、オキシプロリン）が多く含まれ、全体の１０％〜４５％を占めることが好ましい。好ましくはその配列の８０％以上、更に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上のアミノ酸がＧＸＹの繰り返し構造であることが好ましい。
【００４５】
一般的なゼラチンは極性アミノ酸のうち、電荷を持つものと無電荷のものが１：１で存在する。ここで、極性アミノ酸とは具体的にシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、アルギニンを指し、このうち極性無電荷アミノ酸とはシステイン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシンを指す。本発明で用いる遺伝子組み換えゼラチンにおいては、構成する全アミノ酸のうち、極性アミノ酸の割合が１０〜４０％であり、好ましくは２０〜３０％である。且つ該極性アミノ酸中の無電荷アミノ酸の割合が５％以上２０％未満、好ましくは１０％未満であることが好ましい。さらに、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン、システインのうちいずれか１アミノ酸、好ましくは２以上のアミノ酸を配列上に含まないことが好ましい。
【００４６】
一般にポリペプチドにおいて、細胞接着シグナルとして働く最小アミノ酸配列が知られている（例えば、株式会社永井出版発行「病態生理」Ｖｏｌ．９、Ｎｏ．７（１９９０年）５２７頁）。本発明で用いる遺伝子組み換えゼラチンは、これらの細胞接着シグナルを一分子中に２以上有することが好ましい。具体的な配列としては、接着する細胞の種類が多いという点で、アミノ酸一文字表記で現わされる、ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列、及びＨＡＶ配列の配列が好ましく、さらに好ましくはＲＧＤ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＩＫＶＡＶ配列及びＨＡＶ配列、特に好ましくはＲＧＤ配列である。ＲＧＤ配列のうち、好ましくはＥＲＧＤ配列である。
【００４７】
本発明で用いる遺伝子組み換えゼラチンにおけるＲＧＤ配列の配置として、ＲＧＤ間のアミノ酸数が０〜１００の間、好ましくは２５〜６０の間で均一でないことが好ましい。
【００４８】
この最小アミノ酸配列の含有量は、細胞接着・増殖性の観点から、タンパク質１分子中３〜５０個が好ましく、さらに好ましくは４〜３０個、特に好ましくは５〜２０個である。最も好ましくは１２個である。
【００４９】
本発明で用いる遺伝子組み換えゼラチンにおいて、アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合は少なくとも０．４％であることが好ましく、遺伝子組み換えゼラチンが３５０以上のアミノ酸を含む場合に、３５０のアミノ酸の各ストレッチが少なくとも１つのＲＧＤモチーフを含むことが好ましい。アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合は、更に好ましくは少なくとも０．６％であり、更に好ましくは少なくとも０．８％であり、更に好ましくは少なくとも１．０％であり、更に好ましくは少なくとも１．２％であり、最も好ましくは少なくとも１．５％である。遺伝子組み換えゼラチン内のＲＧＤモチーフの数は、２５０のアミノ酸あたり、好ましくは少なくとも４、更に好ましくは６、更に好ましくは８、更に好ましくは１２以上１６以下である。ＲＧＤモチーフの０．４％という割合は、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも１つのＲＧＤ配列に対応する。ＲＧＤモチーフの数は整数であるので、０．４％の特徴を満たすには、２５１のアミノ酸からなるゼラチンは、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含まなければならない。好ましくは、本発明の遺伝子組み換えゼラチンは、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含み、より好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも３つのＲＧＤ配列を含み、さらに好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも４つのＲＧＤ配列を含む。本発明の遺伝子組み換えゼラチンのさらなる態様としては、少なくとも４つのＲＧＤモチーフ、好ましくは６つ、より好ましくは８つ、さらに好ましくは１２以上１６以下のＲＧＤモチーフを含む。
【００５０】
また、遺伝子組み換えゼラチンは部分的に加水分解されていてもよい。
【００５１】
本発明で用いる遺伝子組み換えゼラチンは、Ａ［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ ）ｎ］ｍＢ  の繰り返し構造を有することが好ましい。ｍとして好ましくは２〜１０、好ましくは３〜５である。ｎは３〜１００が好ましく、１５〜７０がさらに好ましく、５０〜６５が最も好ましい。
【００５２】
繰り返し単位には天然に存在するコラーゲンの配列単位を複数結合することが好ましい。ここで言う天然に存在するコラーゲンとは天然に存在するものであればいずれであっても構わないが、好ましくはI型、II型、III型、IV型、およびV型である。より好ましくは、I型、II型、III型である。別の形態によると、該コラーゲンの由来は好ましくは、ヒト、ウシ、ブタ、マウス、ラットである。より好ましくはヒトである。
【００５３】
本発明で用いる遺伝子組み換えゼラチンの等電点は、好ましくは5〜10であり、より好ましくは6〜10であり、さらに好ましくは7〜9.5である。
【００５４】
好ましくは、遺伝子組み換えゼラチンは脱アミン化されていない。
好ましくは、遺伝子組み換えゼラチンはテロペプタイドを有さない。
好ましくは、遺伝子組み換えゼラチンは天然コラーゲンをコードする核酸により調製された実質的に純粋なコラーゲン用材料である。
【００５５】
本発明で用いる遺伝子組み換えゼラチンとして特に好ましくは、
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列；又は
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上（さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上）の相同性を有し、生分解性を有するアミノ酸配列；
を有する遺伝子組み換えゼラチンである。
【００５６】
本発明で用いる遺伝子組み換えゼラチンは、当業者に公知の遺伝子組み換え技術によって製造することができ、例えばEP1014176A2、US6992172、WO2004-85473、WO2008/103041等に記載の方法に準じて製造することができる。具体的には、所定の遺伝子組み換えゼラチンのアミノ酸配列をコードする遺伝子を取得し、これを発現ベクターに組み込んで、組み換え発現ベクターを作製し、これを適当な宿主に導入して形質転換体を作製する。得られた形質転換体を適当な培地で培養することにより、遺伝子組み換えゼラチンが産生されるので、培養物から産生された遺伝子組み換えゼラチンを回収することにより、本発明で用いる遺伝子組み換えゼラチンを調製することができる。
【００５７】
（２）多孔質体
本発明の細胞支持体は、生分解性材料から構成される多孔質体であって以下の特性を有する多孔質体からなるものである。
【００５８】
（ａ）気孔率
本発明の細胞支持体（多孔質体）の気孔率は、嵩密度（ρ）と真密度（ρc）より、気孔率（P = １−ρ/ρc  （％））を求める。嵩密度（ρ）は、乾燥重量と体積から算出し、真密度（ρc）は、ハバード型形の比重瓶法により求めることができる。本発明の細胞支持体（多孔質体）の気孔率は、８１％以上９９．９９％以下であり、好ましくは９５．０１％以上９９．９％以下である。
【００５９】
（ｂ）平均気孔サイズ
本発明の細胞支持体（多孔質体）の平均気孔サイズは、内部断面構造を走査型電子顕微鏡で観察することで求められる。本発明の細胞支持体（多孔質体）の平均気孔サイズは１０〜４００μｍであり、好ましくは５０〜３００μｍであり、より好ましくは７０〜２００μｍである。
【００６０】
（ｃ）気孔間連通孔
本発明の細胞支持体においては、気孔間連通孔が存在している。気孔間連通孔が存在することによって、スポンジ外部からスポンジ深部に至るまで、気孔が連なることにより、スポンジへ播種した細胞が、スポンジ内部へと分散・拡散可能となる。また、気孔間連通孔は、上記機能を発揮するため、１０μｍ以上であることが好ましい。
【００６１】
（ｄ）吸水率
本発明の細胞支持体（多孔質体）の吸水率は、乾燥重量（W0）と、超純水を25℃で5分間自然に吸水させ、プラスチックシャーレ上にて余分な水を十分に除いた後の水膨潤時の重量（W1）を用いて、（W1 ÷ W0 × １００（％））により算出することができる。本発明の細胞支持体（多孔質体）の吸水率は、１０００％以上９９００％以下であり、好ましくは２０００％以上５０００％以下である。
【００６２】
生分解性材料から構成される多孔質体は、公知の方法を用いて製造することができる。例えば、上記した生分解性材料を、上記した方法で架橋した後、ホモジナイザーを用いて攪拌し、その後に凍結乾燥することにより、生分解性材料から構成される多孔質体を製造することができる。
【００６３】
（３）細胞支持体の用途
本発明の細胞支持体は、骨再生治療用の足場基材、治療剤として用いることが出来る。本発明の細胞支持体は単独で骨再生治療剤として用いることができる。骨再生、骨新生が必要な治療である限り、疾患は限定されるものではない。加えて、本発明の細胞支持体は、移植細胞や骨誘導薬剤と併用することによっても骨再生治療剤として用いることが出来る。骨誘導薬剤としては、例えばＢＭＰ（骨形成因子）やｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）が挙げられるが特に限定はされない。
【００６４】
また、本発明の細胞支持体は、再生医療を目的として生体に細胞を移植するための足場として使用することができる。即ち、本発明の細胞支持体は、再生医療材料として使用することができる。本発明の細胞支持体は、再生医療材料として使用する場合には、本発明の細胞支持体に細胞を播種し、細胞を内部に含む細胞支持体を、生体に移植することができる。即ち、移植細胞を含む本発明の細胞支持体を、再生医療材料として使用することができる。但し、本発明の細胞支持体の用途は、再生医療に限定されるわけではなく、移植を目的としない細胞の培養に用いることもできる。
【００６５】
本発明の細胞支持体に支持される細胞は、目的に応じて適宜選択することができ、その種類は特に限定されない。好ましくは、動物細胞を使用することができ、特にヒト由来細胞を使用することができる。動物細胞（特に、ヒト由来細胞）の種類は、万能細胞、体性幹細胞、前駆細胞、又は成熟細胞の何れでもよい。万能細胞としては、例えば、ＥＳ細胞、ＧＳ細胞、又はｉＰＳ細胞を使用することができる。体性幹細胞としては、例えば、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、造血幹細胞、又は神経幹細胞を使用することができる。前駆細胞及び成熟細胞としては、例えば、皮膚、真皮、表皮、筋肉、心筋、神経、骨、軟骨、内皮、脳、上皮、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、脾臓、口腔内、角膜、又は毛に由来する細胞を使用することができる。このうち、最も好ましい細胞の一つとして軟骨細胞が挙げられる。ヒト由来細胞としては、例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、ＭＳＣ、軟骨細胞、骨芽細胞、骨芽前駆細胞、間充織細胞、筋芽細胞、心筋細胞、神経細胞、肝細胞、ベータ細胞、線維芽細胞、角膜内皮細胞、血管内皮細胞、角膜上皮細胞、又は造血幹細胞を使用することができる。治療用途においては、宿主由来の細胞を活用するのでも、外から移植細胞を用いるのでも構わない。また、細胞の由来は、自家細胞又は他家細胞の何れでも構わない。
【００６６】
なお、本発明の細胞支持体への細胞の播種が必要な場合は、常法により行えばよく、適当な容器内に置いた本発明の細胞支持体に対して、細胞を、例えば細胞懸濁液として播種すればよい。
【００６７】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００６８】
実施例１：遺伝子組み換えゼラチン
遺伝子組み換えゼラチン（リコンビナントゼラチン）として以下記載のCBE3を用意した（ＷＯ2008-103041に記載）。
ＣＢＥ３
分子量：51.6kD
構造： GAP[(GXY)63]3G
アミノ酸数：571個
ＲＧＤ配列：１２個
イミノ酸含量：３３％
ほぼ１００％のアミノ酸がＧＸＹの繰り返し構造である。
ＣＢＥ３のアミノ酸配列には、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン及びシステインは含まれていない。
ＣＢＥ３はＥＲＧＤ配列を有している。
等電点：9.34【００６９】
アミノ酸配列（配列表の配列番号１）（WO2008／103041号公報の配列番号３と同じ。但し末尾のＸは「Ｐ」に修正）
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G【００７０】
実施例２：遺伝子組み換えゼラチンのGRAVYの計算結果
遺伝子組み換えゼラチンCBE3について、蛋白質・ポリペプチドの親疎水性の指標であるGrand average of hydropathicity（GRAVY）値を求めた。GRAVY値については、『Gasteiger E., Hoogland C., Gattiker A., Duvaud S., Wilkins M.R., Appel R.D., Bairoch A.;Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server;(In) John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005). pp. 571-607』及び『Gasteiger E., Gattiker A., Hoogland C., Ivanyi I., Appel R.D., Bairoch A.; ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.; Nucleic Acids Res. 31:3784-3788(2003).』の方法により得た。その結果、遺伝子組み換えゼラチンCBE3のGRAVY値は−０．６８２であり、親水性が高い素材であることが明らかになった。【００７１】
実施例３：マウス皮下での遺伝子組み換えゼラチンの分解
遺伝子組み換えゼラチンCBE3について生体内での生分解性を証明するために、マウス皮下での分解性を調べた。遺伝子組み換えゼラチンCBE3について、グルタルアルデヒド（GA）を用いて架橋を施し、遺伝子組み換えゼラチンCBE3ハイドロゲル（５％CBE3を０．１％GA架橋したゲル、及び３％CBE3を０．０７５％GA架橋したゲル）を作製した。得られたハイドロゲルをDDYマウス（オスの８週令）の背部皮下へ埋殖し、経時変化を病理切片、及び残存ゲル量を測定した。【００７２】
残存ゲル量については、試験日数期間の経過後にゲルを取り出し、凍結乾燥し、残存したゲルを乾燥重量として、初期埋め込み時の乾燥重量と比較した。結果を図１に示す。図１に示す通り、５％CBE3を０．１％GA架橋したゲルの残存量は、埋め込み時に対して、５日で５５％、１４日で９％となり、生体内で徐々に分解していくことが明らかになった。３％CBE3を０．０７５％GA架橋したゲルについても、その残存量は、５．２日で４１％、１４．２日で７％となり、生体内で徐々に分解していくことが明らかになった。また、代表的な病理切片の画像（ヘマトキシリンエオジン染色）を図２に記す。遺伝子組み換えゼラチンCBE3ゲルが徐々に分解して、小さくなっている様子が分かる。上記の結果から、遺伝子組み換えゼラチンを素材として作製される基材は、生分解性を有することが実証された。【００７３】
実施例４：遺伝子組み換えゼラチンスポンジ(多孔質体)の作製
遺伝子組み換えゼラチンCBE3を用いて、スポンジ（多孔質体）を作製した。本実施例では、１０％CBE3のものと５％CBE3のものを作製している。以下の組成で溶液を調整し、グルタルアルデヒドを添加後、４℃にてホモジナイザー（AM-11、NIHONSEIKI製）で１７，０００rpmで４分間攪拌し、そのまま−８０℃で３時間急冷する。【００７４】
組成：
５％スポンジ１０mＬ分（CBE3：５００ｍｇ、超純水：９４２４μL、１N HCｌ：７６μL、３％グルタルアルデヒド:５００μL）
１０％スポンジ１０mＬ分（CBE3：１ｇ、超純水：９３４８μL、１N HCｌ：１５２μL、３％グルタルアルデヒド:５００μL）【００７５】
その後、４℃で１６時間静置して得られた物を、十分量の３７℃の０．２Mグリシン溶液中で４時間、振盪する。その後、１０Lの超純水で洗浄を８回（計４時間）繰り返してから、−８０℃で２時間凍結させる。その後、凍結乾燥機にて４日間凍結乾燥を行い、遺伝子組み換えゼラチンスポンジ（多孔質体）を得た。【００７６】
実施例５：遺伝子組み換えゼラチンスポンジの気孔率の測定
実施例４で得られた遺伝子組み換えゼラチンスポンジについて、気孔率を測定した。測定に当たっては、嵩密度（ρ）と真密度（ρc）を測定し、気孔率（Ｐ ＝ １−ρ/ρc（％））を求めた。遺伝子組み換えゼラチンスポンジの嵩密度（ρ）は、乾燥重量と体積から算出した。真密度（ρc）は、ハバード型形の比重瓶法により求めた。サンプル数（N）＝４の結果として、５％スポンジでは嵩密度が０．０３ｇ/ｃｍ3、真密度が１．０１ｇ/ｃｍ3、気孔率９７％（CV値は７％）を達成していることが明らかになった。また、１０％スポンジでは嵩密度が０．０５ｇ/ｃｍ3、真密度が１．２３ｇ/ｃｍ3、気孔率９６％（CV値は８％）を達成していることが明らかになった。【００７７】
実施例６：遺伝子組み換えゼラチンスポンジの吸水率測定
実施例４で得られた遺伝子組み換えゼラチンスポンジについて、吸水率を測定した。吸水率は、乾燥重量（W0）と、超純水を25℃で5分間自然に吸水させ、プラスチックシャーレ上にて余分な水を十分に除いた後の水膨潤時の重量（W1）を用いて、（W1 ÷ W0 × １００（％））により算出した。  その結果、５％スポンジのサンプル数（N）=5の平均として、吸水率は３６４０（％）であり、高い吸水率を有していることが明らかになった。【００７８】
実施例７：遺伝子組み換えゼラチンスポンジのSEM画像、及び平均気孔サイズの測定
実施例４で得られた遺伝子組み換えゼラチンスポンジについて、内部断面構造を走査型電子顕微鏡で観察した。代表的なSEM画像を図３（５％スポンジの断面）、及び図４（１０％スポンジの断面）に示す。これにより、得られた遺伝子組み換えゼラチンスポンジの多孔質内部構造が明らかになった。内部気孔サイズは、１０％スポンジが１０６．０±７．７μｍ（直径の個数平均として）であり、５％スポンジが１１４．８±１５．８μｍであった。また、図３及び図４からも分かるように、気孔間には気孔間連通孔が存在しており、これによって、スポンジ外部からスポンジ深部に至るまで、気孔が連なっていることが分かる。また、この気孔間連通孔は、１０μｍ以上のサイズであることが確認できることから、細胞が概連通孔を通過可能であることも分かる。上記の結果から、スポンジへ播種した細胞が、スポンジ内部へと分散・拡散可能であることが分かる。【００７９】
実施例８：コラーゲンスポンジ及び遺伝子組み換えゼラチンスポンジ内における細胞の分布の比較
実施例４で得られた本発明の遺伝子組み換えゼラチンスポンジ（５％、１０％）と、比較用のコラーゲンスポンジ（新田ゼラチン：３５ｍｍディッシュ用）について、同じ形状（直径８ｍｍ、高さ５ｍｍの円柱状）に成型し、２４穴培養プレート内にて細胞をスポンジ上部より播種した。播種した細胞は、ヒト間葉系幹細胞（hMSC）で、８００万cells/mLの濃度で培地（タカラバイオ：MSCGM-CDTM BulletKitTM）に懸濁し、その懸濁液（２５０μL）をスポンジへ播種した。2時間静置後にプレート底面へ培地を添加し、Day1、Day4まで培養した。その結果、コラーゲンスポンジでは、播種した細胞がスポンジを通過して底面へと落ちてしまうものが多く存在したのに比べて、遺伝子組み換えゼラチンスポンジでは、底面へ脱落する細胞が少なかった。【００８０】
また、細胞を播種したスポンジについて、PBSで洗浄後、１０％ホルムアルデヒドにて固定、パラフィン包埋し、組織切片を作成した。染色は、HE染色を行い、スポンジ内部における細胞の分布を視覚化した。（図５、６、７、８）。その結果、比較用のコラーゲンスポンジでは細胞の分布が不均一になっているのに対し、本発明の遺伝子組み換えゼラチンスポンジでは、細胞がスポンジ内に均一に分布し、また細胞がスポンジから脱落することが少なく、スポンジ内に多くの細胞が見られることが判明した。尚、それぞれ、切片写真を区分けし、各区画に存在する細胞数をカウント後、各区画の占有面積（スポンジ内）で除することによって、単位面積当たりの細胞数を求めた。求めた単位面積当たりの細胞数について、バラツキをＣＶ値にて、図５，６，７，８に示した。このバラツキのＣＶ値によって、分布が均一であるかどうかが分かる。コラーゲンスポンジでは、Ｄａｙ１：４５％、Ｄａｙ４：５６％となり、非常に分布が不均一であるのに比べて、遺伝子組換えゼラチンスポンジでは、Ｄａｙ１：２９％、Ｄａｙ４：３０％と分布が均一であることが定量的にも分かる。また、コラーゲンスポンジでは、スポンジ自体の形状が培養とともに歪んでくることも欠点として確認された一方で、遺伝子組換えゼラチンスポンジでは、スポンジ自体の形状がしっかりと維持されていることも確認できた。【００８１】
実施例９：アテロコラーゲンスポンジ（ハニカム）及び遺伝子組み換えゼラチンスポンジ内における細胞の分布の比較
実施例４で得られた本発明の遺伝子組み換えゼラチンスポンジ（５％、１０％）と、比較用のアテロコラーゲンハニカムスポンジ（高研）、について、同じ形状（３ｍｍ×２ｍｍ×２ｍｍの直方体）に成型し、２４穴培養プレート内にて細胞をスポンジ上部より播種した。播種した細胞は、ヒト間葉系幹細胞（hMSC）で、８００万cells/mLの濃度で培地（タカラバイオ：MSCGM-CDTM BulletKitTM）に懸濁し、その懸濁液（１２μL）をスポンジへ播種した。2時間静置後にプレート底面へ培地を添加し、Day1、Day4まで培養した。その結果、比較用のアテロコラーゲンハニカムスポンジでは、播種した細胞がスポンジを通過して底面へと落ちてしまうものが多く存在したのに比べて、遺伝子組み換えゼラチンスポンジでは底面へ脱落する細胞が少なかった。【００８２】
また、細胞を播種したスポンジについて、PBSで洗浄後、１０％ホルムアルデヒドにて固定、パラフィン包埋し、組織切片を作成した。染色は、HE染色を行い、スポンジ内部における細胞の分布を視覚化した（図９，１０，１１，１２）。その結果、比較用のアテロコラーゲンハニカムスポンジでは、細胞の分布が不均一になっているのに対し、本発明の遺伝子組み換えゼラチンスポンジでは、細胞がスポンジ内に均一に分布し、また細胞がスポンジから脱落することが少なく、スポンジ内に多くの細胞が見られることが判明した。尚、それぞれ、切片写真を区分けし、各区画に存在する細胞数をカウント後、各区画の占有面積（スポンジ内）で除することによって、単位面積当たりの細胞数を求めた。求めた単位面積当たりの細胞数について、バラツキをＣＶ値にて、図９，１０，１１，１２に示した。このバラツキのＣＶ値によって、分布が均一であるかどうかが分かる。アテロコラーゲンハニカムスポンジでは、Ｄａｙ１：６６％、Ｄａｙ４：７９％となり、非常に分布が不均一であるのに比べて、遺伝子組換えゼラチンスポンジでは、Ｄａｙ１：２７％、Ｄａｙ４：１８％と分布が均一であることが定量的にも分かる。【００８３】
比較例１：コラーゲンゲル包埋培養法（比較用）
本発明の遺伝子組み換えゼラチンスポンジ内での細胞分布・細胞培養との比較として、コラーゲンゲル包埋培養を実施した。形状としては、実施例８と同じ円柱状の形態にて実施した。０．５％アテロコラーゲン溶液（高研：ＩＰＣ−５０、ＡｔｅｌｏＣｅｌｌ）と、培地（タカラバイオ：MSCGM-CDTM BulletKitTM）を１：１の割合で、4℃氷上にて混合した混合培地を作成した。混合培地に、ヒト間葉系幹細胞（hMSC）を８００万cells/mL濃度で懸濁し、懸濁液（５００μL）を４８穴プレートに播種した。３７℃、５％CO2で３０分静置することでゲル化させ、その後、十分量の培地を加え、４日間培養（Day4）した。培養の際、培地は毎日新しい培地に交換した。Day４のサンプルについて、ホルマリン固定、パラフィン包埋、切片を作成した。染色は、HE染色を行い、内部の細胞分布を視覚化した（図１３，１４）。尚、それぞれ、切片写真を区分けし、各区画に存在する細胞数をカウント後、各区画の占有面積（スポンジ内）で除することによって、単位面積当たりの細胞数を求めた。求めた単位面積当たりの細胞数について、バラツキをＣＶ値にて、図１３，１４に示した。このバラツキのＣＶ値によって、分布が均一であるかどうかが分かる。アテロコラーゲンゲル包埋培養では、Ｄａｙ１：４５％、Ｄａｙ４：５１％となり、非常に分布が不均一であった。結果、アテロコラーゲンゲル中で培養した細胞は、不均一な状態になることが示され、従来技術であるコラーゲンゲル包埋培養において問題とされているゲル中での細胞分布の不均一さ、が再現された。また、コラーゲンゲル包埋では、ゲル自体の形状が培養とともに歪んでくることも欠点として確認された。【００８４】
比較例２：コラーゲン上での細胞播種・細胞培養（比較用）
本発明の遺伝子組み換えゼラチンスポンジ内での細胞分布・細胞培養との比較として、コラーゲンゲル上への細胞播種・細胞培養を実施した。形状としては、実施例８と同じ円柱状の形態にて実施した。０．５％アテロコラーゲン溶液（高研：ＩＰＣ−５０、ＡｔｅｌｏＣｅｌｌ）と、培地（タカラバイオ：MSCGM-CDTM BulletKitTM）を4℃氷上で混合した混合培地を作成し、混合培地（５００μL）を４８穴プレートに添加した。３７℃、５％CO2で３０分静置することによって、コラーゲンゲルを得た。このコラーゲンゲルの上に、８００万cells/mLのhMSC細胞懸濁液を500μL播種し、４日間培養（Day4）した。培養の際、培地は毎日新しい培地に交換した。Day４のサンプルについて、ホルマリン固定、パラフィン包埋、切片を作成した。染色は、HE染色を行い、内部の細胞分布を視覚化した（図１５，１６）。その結果、アテロコラーゲンゲル上へ播種・培養した細胞は、ゲル上からゲル内へ移動することはできず、ゲル中へ均一な分布を見せることはなかった。【００８５】
実施例１０：細胞接着性試験
遺伝子組み換えゼラチンスポンジ中で、細胞が均一に分布可能であることの要因の一つとして、遺伝子組み換えゼラチンが細胞接着性を有することが考えられる。遺伝子組み換えゼラチンの細胞接着性が高いことによって、細胞の漏出や不均一分布を抑制できる可能性があるためである。そこで、遺伝子組み換えゼラチンの細胞接着性を調べるために、遺伝子組み換えゼラチンCBE3の細胞への接着性試験を行った。【００８６】
使用した細胞は、HUVEC（正常ヒト臍帯静脈内皮細胞：タカラバイオ社）を用いた。HUVECは一般に、各種基材への細胞接着が悪い細胞として知られている。HUVECの培養には、内皮細胞基本培地-2（無血清）（EBMTM-2）及び内皮細胞培地キット-2（2% FBS）（EGMTM-2 BulletKitTM）を用いた（タカラバイオ社）。継代時、及び細胞剥離時には、EDTA含有0.25%trypsin溶液を使用した。T-75フラスコにて十分量まで増殖させたHUVECをフラスコ底面から剥離し、遠心によって上清を除去した。その後、上記内皮細胞培地キット-2入りの内皮細胞基本培地-2で洗浄し、再度遠心によって上清を除去、内皮細胞培地キット-2を含まない内皮細胞基本培地-2に0.1%BSAを加えた溶液を添加・懸濁し、細胞計数盤にて生細胞の数をカウント、最終細胞濃度を50万cells/mLに調整した。【００８７】
一方、細胞接着性の比較試験のため、各種蛋白質（遺伝子組み換えゼラチンCBE3、フィブロネクチン、Fibrogen社製コラーゲン（以後Fibrogenと記載する）、豚皮由来ゼラチン（以後、PSKと記載する）、牛骨由来ゼラチン（以後、G1917Pと記載する））でコーティングしたプレートの準備を行った。PBS（リン酸緩衝液）に1mg/mL濃度で遺伝子組み換えゼラチンCBE3を溶解させ、遺伝子組み換えゼラチンCBE3溶解液を作製した。PBS（リン酸緩衝液）に1mg/mL濃度でフィブロネクチンを溶解させ、フィブロネクチン溶解液を作製した。PBS（リン酸緩衝液）に1mg/mL濃度でFibrogenを溶解させ、Fibrogen溶解液を作製した。PBS（リン酸緩衝液）に1mg/mL濃度でPSKを溶解させ、PSK溶解液を作製した。PBS（リン酸緩衝液）に1mg/mL濃度でG1917Pを溶解させ、G1917P溶解液を作製した。上記、溶解液は随時PBSで希釈しプレート添加に使用した。【００８８】
プレートには、Non-treated 96穴プレート（IWAKI）を使用した。Non-treated 96穴プレートに蛋白質濃度が0.02, 0.1, 0.2, 2.0μg/wellとなるように、PBSで上記溶解液を希釈した溶液を50μL/wellで添加した。その後、37℃で2時間インキュベート、溶液を除去した後に全てのwellに100μLのPBSを添加・洗浄し、PBSを除去（洗浄工程）した。該洗浄工程を3回行った。これによって、コーティング蛋白質及びコーティング濃度の異なるコーティングプレートを得た。【００８９】
本コーティングプレートに、上記で用意したHUVEC懸濁液（50万cells/mL）を100μLずつ播種した。37℃で1時間インキュベートした後、培地を吸引除去、100μLのPBSを添加して洗浄、PBSは吸引により除去した（PBS洗浄）。本PBS洗浄を3回行い、PBSを除去した状態のプレートを得た。【００９０】
得られたプレート上の細胞数定量には、DNA assayを使用した。得られたプレートのwellにそれぞれ100μLのSDS溶液（20mgのSDSを100mLの1×SSC溶液に溶解したもの：１×SSC溶液とは17.999gのNaClと8.823gのNa3Citrateを2Lの超純粋に溶解したものである）を加え、37℃で1時間静置する。得られた個々の溶液全量をそれぞれ96穴ブラックプレート（Non-treated）へ移し、100μLのHoechst溶液（Hoechst 33258を20μLと1×SSC溶液20mLを混合したもの）を全てのwellに添加し、プレートリーダーにて蛍光強度を測定した。用いたプレートリーダーはGemini EM（モレキュラーデバイス社）、励起波長355nm、測定波長460nmで蛍光強度を測定した。検量線は、細胞数を調整したHUVEC細胞の懸濁液で作成した。【００９１】
得られた細胞接着性試験（DNA assay）の結果を図１７及び図１８に示した。また、遺伝子組み換えゼラチンでコーティングしたプレートへの細胞接着の様子を図１９に写真として示した。上記の結果から、遺伝子組み換えゼラチンが良好な細胞接着性を有していることが示された。【００９２】
実施例１１：遺伝子組換えゼラチンパウダーの作製
遺伝子組み換えゼラチンCBE3を用いて、パウダー（粒子形状）を作製した。本実施例では、７．５％CBE3のものを作製している。以下の組成で溶液を調整し、グルタルアルデヒドを添加後、２５℃にて十分に攪拌した後、そのまま４℃で１６時間架橋反応を行う。【００９３】
組成：
７．５％スポンジ１０mＬ分（CBE3：７５０ｍｇ、超純水：８８９３．６μL、１N HCｌ：１０６．４μL、３％グルタルアルデヒド:１０００μL）【００９４】
４℃で１６時間静置・反応して得られた物を、十分量の３７℃の０．２Mグリシン溶液中で４時間、振盪する。その後、１０Lの超純水で洗浄を８回（計４時間）繰り返してから、−８０℃で２時間凍結させる。その後、凍結乾燥機にて４日間凍結乾燥を行い、得られた乾燥体をニューパワーミル（大阪ケミカル、ニューパワーミルＰＭ−２００５）で粉砕した。得られた粉砕物について、ステンレス製ふるいでサイズ分けし、５００〜７１０μｍ大のパウダー（粒子形状）を得た。【００９５】
実施例１２：ラット頭蓋骨欠損モデルにおける骨再生評価
骨再生能を評価する動物実験モデルとしてラット頭蓋骨欠損モデルを用いた（Tissue Eng (2007) 13(3):501-12）。ラット頭蓋骨欠損モデルは、一般的に骨補填剤の評価に用いられている。
Sprague−Dawleyラット（SDラット、雄、10-12週齢）を麻酔し、右側頭頂骨にドリル（Osada Success 40, 長田電気工業）にて円形の欠損部（φ = 5 mm）を作成した（図２０）。骨再生に影響する欠損部の骨片や血液を生理食塩水にて洗浄、除去。作製された欠損部へ、骨再生評価を行いたいサンプルを欠損部へ埋殖し、移植サンプルが欠損部から飛び散らないようにコラーゲン膜（ＢｉｏＧｉｄｅ)で蓋をした後、患部皮膚を縫合した。所定期間後（２週）ラットを開腹・放血させラットをサクリファイし、欠損させた患部の肉眼観察を実施した後、該頭部をホルマリン固定・脱灰してパラフィンに包埋。パラフィン包埋ブロックを薄切し、得られた切片をヘマトキシリン−エオシン(H＆E）染色して、標本を作製した。評価については、病理標本を光学顕微鏡により観察し、撮影した写真から組織をNew Bone、Mesenchyme、Granulationに分けて、それぞれの面積を計算した。欠損部における再生骨（New Bone）割合、また標本中の再生骨量（μｍ2）を評価した。【００９６】
実施例１３：遺伝子組換えゼラチンスポンジの骨再生率をラット頭蓋骨欠損部で評価
実施例４にて作製した遺伝子組換えゼラチンスポンジ（５％）、実施例１１にて作製した遺伝子組換えゼラチンパウダー（粒子状）を、実施例１２で作製したラット頭蓋骨欠損部分に移植した。移植物が飛散しないように、コラーゲン製膜（ＢｉｏＧｉｄｅ、Ｏｓｔｅｏｈｅａｌｔｈ社）を設置した。また、患部に何も適用しない群をコントロール群とした。【００９７】
結果、遺伝子組換えゼラチンパウダー（粒子状）を移植した群では、骨再生量は209928μｍ2、再生骨割合は6.8％であった。一方で、遺伝子組換えゼラチンスポンジを移植した群では、骨再生量は732104μｍ2、再生骨割合は50.0％に上り、極めて骨再生が早くに誘導されていることが分かった。これにより、同一素材であっても、本発明の構造を付与することによって、骨再生効果を著しく上昇させることが明らかとなった。【００９８】
図２１に、骨再生量、及び骨再生割合のデータを表にまとめた。また、図２２には、遺伝子組換えゼラチンパウダーを移植した群、及び遺伝子組換えゼラチンスポンジを移植した群、の代表的な病理写真を示した。【００９９】
実施例１４：天然ゼラチンスポンジ(多孔質体)の作製
動物由来天然ゼラチンＡＰＡＴ(Ｎｉｐｐｉ、ニッピゼラチン・ハイグレードゼラチンＡＰＡＴ)を用いて、天然ゼラチンスポンジ（多孔質体）を作製した。本実施例では、５％濃度のものを作製している。以下の組成で溶液を調整し、グルタルアルデヒドを添加後、４℃にてホモジナイザー（AM-11、NIHONSEIKI製）で１７，０００rpmで４分間攪拌し、そのまま−８０℃で３時間急冷する。【０１００】
組成：
５％スポンジ１０mＬ分（ＡＰＡＴ：５００ｍｇ、超純水：９４２４μL、１N HCｌ：７６μL、３％グルタルアルデヒド:５００μL）
その後、４℃で１６時間静置して得られた物を、十分量の３７℃の０．２Mグリシン溶液中で４時間、振盪する。その後、１０Lの超純水で洗浄を８回（計４時間）繰り返してから、−８０℃で２時間凍結させる。その後、凍結乾燥機にて４日間凍結乾燥を行い、天然ゼラチンスポンジ（多孔質体）を得た。【０１０１】
実施例１５：天然ゼラチンスポンジの骨再生率をラット頭蓋骨欠損部で評価
実施例１４にて作製した天然ゼラチンスポンジ（５％）を実施例１２で作製したラット頭蓋骨欠損部分に移植した。移植物が飛散しないように、コラーゲン製膜（ＢｉｏＧｉｄｅ、Ｏｓｔｅｏｈｅａｌｔｈ社）を設置した。また、患部に何も適用しない群をコントロール群とした。【０１０２】
結果、天然ゼラチンスポンジを移植した群では、骨再生量は819960μｍ2、再生骨割合は59.0％に上り、極めて骨再生が早くに誘導されていることが分かった。これにより、これまで一般には骨再生に適さないと考えられていた素材、天然ゼラチンであっても、本発明の構造を付与することによって、骨再生効果を著しく上昇させることが可能であることが明らかとなった。図２１に、骨再生量、及び骨再生割合のデータを表にまとめた。図２３に、天然ゼラチンスポンジを移植した群の代表的な病理写真を示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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