(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
0005889189.tif 000101
（式中、
【化２】
0005889189.tif 000102
は、単結合または二重結合を表し、但し、
【化３】
0005889189.tif 000103
が単結合を表す場合、
−−−−が単結合を表し、
Ｕおよび／またはＵ’は、同一であり、または異なっており、互いに独立してＨを表し、
Ｗおよび／またはＷ’は、同一であり、または異なっており、互いに独立して、ＯＨ、−ＯＲ、−ＯＣＯＲ、−ＣＯＯＲ、−ＯＣＯＯＲ、−ＯＣＯＮＲＲ’、Ｎ１０およびＣ１１が環内に含まれるような環式カルバマート、ＮＲＣＯＮＲＲ’、−ＯＣＳＮＨＲ、Ｎ１０およびＣ１１が環内に含まれるような環式チオカルバマート、−ＳＨ、−ＳＲ、−ＳＯＲ、−ＳＯＯＲ、−ＳＯ３−、−ＮＲＳＯＯＲ’、ＮＲＲ’、Ｎ１０およびＣ１１が環内に含まれるような環式アミン、−ＮＲＯＲ’、−ＮＲＣＯＲ’、−Ｎ３、−ＣＮ、Ｈａｌまたはトリアルキルホスホニウムもしくはトリアリールホスホニウム基を表すことを条件とし、且つ
【化４】
0005889189.tif 000104
が二重結合を表す場合、
ＷおよびＷ’が結合している−−−−は単結合を表し、並びにＷおよびＷ’はＨを表し、且つ
ＵおよびＵ’が結合している−−−−、並びにＵおよびＵ’は、存在せず、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ１’およびＲ２’は、同一であり、または異なっており、互いに独立して、Ｈ、ＨａｌまたはＨａｌ、ＣＮ、ＮＲＲ’、ＣＦ３、ＯＲ、アリールもしくはヘテロアリール基もしくはＳ（Ｏ）ｑＲ（ｑ＝０、１または２）から選択される１個以上の置換基により場合により置換されている（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基を表し、
あるいは
Ｒ１およびＲ２ならびに／またはＲ１’およびＲ２’は、それぞれ、＝ＣＨ２または＝ＣＨ−ＣＨ３を一緒に形成し、
ＹおよびＹ’は、同一であり、または異なっており、互いに独立してＨまたはＯＲを表し、
Ｍは、ＣＨまたはＮを表し、
ＡＬＫおよびＡＬＫ’は、同一であり、または異なっており、互いに独立して（Ｃ１−Ｃ６）アルキレン基を表し、
ＲおよびＲ’は、互いに独立してＨ、またはＨａｌ、ＣＮ、ＮＲＲ’、ＣＦ３、ＯＲもしくはアリールもしくはヘテロアリール基から選択される１個以上の置換基により場合により置換されている（Ｃ１−Ｃ６）アルキルもしくはアリール基を表し、
Ｌは、
−Ｌ１−Ｌ２−基（Ｌ１は、ＡＬＫまたはＯＡＬＫ基を介してＭを含む芳香族環に結合しており、以下の基の１種：
【化５】
0005889189.tif 000105
を表し、およびＬ２は、−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−を介してＬ１に結合している−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ３−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｉ−ＡＬＫ−基を表す。）、
あるいは
ＯＡＬＫ基を介してＭを含む芳香族環に結合している−Ｏ−ＡＬＫ−ＮＲ３−ＡＬＫ−Ｓ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｉ−ＡＬＫ−基を表し、
Ｒ３は、Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基を表し、
ｉは、１から４０の範囲の整数を表し、
Ｚｂは、単結合、−Ｏ−または−ＮＨ−を表し、およびＲｂは、Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ３−Ｃ７）シクロアルキル、アリール、ヘテロアリールまたは（Ｃ３−Ｃ７）ヘテロシクロアルキル基を表し、あるいはＺｂは、単結合を表し、およびＲｂは、Ｈａｌを表す。）
の化合物。
【請求項２】
ｉが、１から２０の範囲の整数を表す、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
ｉが、１から１０の範囲の整数を表す、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
式：
【化６】
0005889189.tif 000106
の請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
式（ＩＡ）または（ＩＢ）：
【化７】
0005889189.tif 000107
の請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
ＹおよびＹ’が、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ基を表す、請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
Ｌが、
【化８】
0005889189.tif 000108
から選択される、請求項１から請求項６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
Ｌが、
【化９】
0005889189.tif 000109
から選択される、請求項１または請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
Ｌが、
【化１０】
0005889189.tif 000110
から選択される、請求項１または請求項７に記載の化合物。
【請求項１０】
−ＣＯＺｂＲｂが、
【化１１】
0005889189.tif 000111
の各基を表し、ＩＧは、少なくとも１個の誘導基を表す、請求項１から請求項９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１１】
以下：
【化１２】
0005889189.tif 000112
の１つから選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
コンジュゲートを調製する方法であって、
（ｉ）場合により緩衝化された結合剤の水溶液および請求項１から請求項１１のいずれか一項に定義される化合物の溶液を接触させて反応させること、
（ｉｉ）次いで、段階（ｉ）において形成されたコンジュゲートを、反応しなかった式（Ｉ）の化合物から、および／または反応しなかった結合剤から、および／または形成され得る凝集物から場合により分離すること
からなる方法。
【請求項１３】
−Ｃ（＝Ｏ）ＺｂＲｂ基が、共有結合の形成による式（Ｉ）の化合物の結合剤への結合を確保するように、結合剤上に存在する化学基に関して反応性である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
段階（ｉｉ）が、
−段階（ｉ）において形成したコンジュゲートを、未反応の結合剤から、および溶液中に存在すると考えられる凝集物から分離すること、
あるいは
−段階（ｉ）のコンジュゲートを、未反応の式（Ｉ）の化合物および形成され得る凝集物からのみ分離し、反応しなかった結合剤は溶液中に残すこと
からなる、請求項１２または請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
結合剤が、リガンド、タンパク質、抗体、タンパク質もしくは抗体フラグメント、ペプチド、オリゴヌクレオチドまたはオリゴ糖である、請求項１２から請求項１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
反応を２０から４０℃の温度において行い、および／または反応の継続時間が１から２４時間の間で変動する、請求項１２から請求項１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
段階（ｉ）または（ｉｉ）後、コンジュゲートの溶液を限外濾過および／または膜分離の段階（ｉｉｉ）に供する、請求項１２から請求項１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
結合剤が、１から１０の平均ＤＡＲを特徴とする抗体であり、
ＤＡＲは、式ＤＡＲ＝ｃＤ／ｃＡにより計算され、
式中、
【化１３】
0005889189.tif 000113
であり、
ＡＬＯ１およびＡＬＯ２は、ＳＥＣスペクトルの対応するピークに基づき計測される波長ＬＯ１およびＬＯ２におけるコンジュゲートの水溶液の吸光度を示し、
ｅＤ  ＬＯ１およびｅＤ  ＬＯ２は、それぞれ、コンジュゲーション前の２つの波長ＬＯ１およびＬＯ２におけるピロロ［１，４］ベンゾジアゼピン二量体のモル吸光係数を示し、
ｅＡ  ＬＯ１およびｅＡ  ＬＯ２は、それぞれ、２つの波長ＬＯ１およびＬＯ２における裸抗体のモル吸光係数を示し、
ＬＯ１＝２８０ｎｍおよびＬＯ２＝３２０ｎｍである、
請求項１２から請求項１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１から請求項１１のいずれか一項に記載の化合物の、式：
【化１４】
0005889189.tif 000114
の二量体がＭに対してパラ位で共有結合している結合剤の調製における使用。
【請求項２０】
結合剤が、抗体である、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
二量体が、式：
【化１５】
0005889189.tif 000115
を有する、請求項１９または請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
ＹおよびＹ’が、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ基を表す、請求項１９から請求項２１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２３】
コンジュゲートの溶液を調製する方法であって、
（ｉ）場合により緩衝化された結合剤の水溶液および請求項１から請求項１１のいずれか一項に定義される化合物の溶液を接触させて反応させること、
（ｉｉ）次いで、段階（ｉ）において形成されたコンジュゲートを、反応しなかった式（Ｉ）の化合物から、および／または反応しなかった結合剤から、および／または形成され得る凝集物から分離すること、および
（ｉｉｉ）段階（ｉｉ）で分離したコンジュゲートの溶液を得ること
からなる方法。
【請求項２４】
請求項１から請求項１１のいずれか一項に記載の化合物および少なくとも１種の賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項２５】
抗癌剤として使用するための、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
式Ｐ２
【化１７】
0005889189.tif 000116
の化合物
あるいは式：
【化１８】
0005889189.tif 000117
（式中、Ｌ＊は、
【化１９】
0005889189.tif 000118
から選択され、
Ｌ、Ｍ、ＡＬＫ、ＡＬＫ’、Ｒ３、ＺｂおよびＲｂは、請求項１から１１のいずれか一項に定義されるとおりであり、
ＥおよびＥ’は、互いに独立して、−ＯＨ基または脱離基を表す。）
の化合物の、
請求項１から請求項１１のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物の調製における中間体としての使用。
【請求項２７】
脱離基が、ハロゲン原子またはメシラート、トシラート、ノシラートもしくは−ＯＰＰｈ３＋基から選択される、請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
以下：
【化２０】
0005889189.tif 000119
0005889189.tif 000120
並びに上記化合物において、−ＣＯＯＨ末端官能基が、−ＣＯＯ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル末端官能基により置き換えられたものおよび／または−ＳＨ末端官能基が、ジスルフィド官能基により置き換えられたもの、の１種から選択される化合物の、
請求項１から請求項１１のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物の調製における中間体としての使用。
【請求項２９】
請求項１から請求項１１のいずれか一項に記載の化合物の、抗癌剤の製造における使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピロロ［１，４］ベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）二量体コンジュゲート、これらを含む組成物および特に抗癌剤としてのこれらの治療的用途に関する。本発明はまた、コンジュゲートの調製方法、抗癌剤としてのこれらの用途および二量体自体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ピロロ［１，４］ベンゾジアゼピン二量体は、細胞のＤＮＡに共有結合することにより作用する抗癌剤である。これらの誘導体は、出願ＷＯ００／１２５０８およびＷＯ２００５／０８５２６０ならびに以下の刊行物Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２００５，４０，６４１−６５４、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９８８，２９（４０），５１０５−５１０８に記載されている。
【０００３】
コンジュゲートの化学的性質は、長年にわたり公知であり、細胞毒性剤、例えばマイタンシノイド（ＷＯ０４１０３２７２）、タキサン（ＷＯ０６０６１２５８）、レプトマイシン（ＷＯ０７１４４７０９）またはＣＣ−１０６５およびこのアナログ（ＷＯ２００７１０２０６９）などの幾つかのファミリーに適用されてきた。コンジュゲートに関して、Ｍｏｎｎｅｒｅｔ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ｄｕ  Ｃａｎｃｅｒ，２０００，８７（１１），８２９−３８、Ｒｉｃａｒｔ  Ａ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２００７，４，２４５−２５５、Ｓｉｎｇｈ  Ｒ．ａｎｄ  Ｒｉｃｋｓｏｎ  Ｈ．Ｋ．，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２００９，５２５，４４５−４６７も参照。
【０００４】
先行技術
ピロロ［１，４］ベンゾジアゼピン二量体コンジュゲートは、出願ＷＯ０７０８５９３０またはＷＯ２００９／０１６５１６に既に記載されている。使用される二量体は、さらに特定すると、式：
【０００５】
【化１】
0005889189.tif 000002
（式中、Ｔは、−Ｇ−Ｄ−（Ｚ）ｐ−ＳＺａまたは−Ｇ−Ｄ−（Ｚ）ｐ−Ｃ（＝Ｏ）ＺｂＲｂにより置換されているアリールまたはヘテロアリール基を表すことができる。）を有する。Ｇは、単結合もしくは二重結合あるいは−Ｏ−、−Ｓ−もしくは−ＮＲ−を表す。Ｄは、単結合あるいは以下の基の１種：−Ｅ−、−Ｅ−ＮＲ−、−Ｅ−ＮＲ−Ｆ−、−Ｅ−Ｏ−、−Ｅ−Ｏ−Ｆ−、−Ｅ−ＮＲ−ＣＯ−、−Ｅ−ＮＲ−ＣＯ−Ｆ−、−Ｅ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｅ−、−Ｅ−ＣＯ−Ｆ、−Ｅ−Ｓ−、−Ｅ−Ｓ−Ｆ−、−Ｅ−ＮＲ−ＣＳ−、−Ｅ−ＮＲ−ＣＳ−Ｆ−を表し、ＥおよびＦは、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉアルキル（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｊ−、−アルキル（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉ−アルキル−−、ＣＨ２ＣＨ２）ｉ−、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉシクロアルキル（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｊ−、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉヘテロシクリル（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｊ−、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉアリール（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｊ−、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉヘテロアリール（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｊ−、−アルキル−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉアルキル（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｊ−、−アルキル−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉ−、−アルキル−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉシクロアルキル（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｊ−、−アルキル（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉヘテロシクリル（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｊ−、−アルキル−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉアリール（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｊ−、−アルキル（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉヘテロアリール（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｊ−、−シクロアルキル−アルキル−、−アルキル−シクロアルキル−、−ヘテロシクリル−アルキル−、−アルキル−ヘテロシクリル−、−アルキル−アリール−、−アリール−アルキル−、−アルキル−ヘテロアリール−、−ヘテロアリール−アルキル−から選択される。ｉおよびｊは、０から２０００の範囲の整数を表す。Ｚはアルキル基を表し、ｐは０または１の値を有する整数である。
【０００６】
本発明の化合物の一部を特徴付ける基Ｌ２＝−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ３−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｉ−ＡＬＫ−は、アミド単位（−ＣＯＮＲ３−）を含み、ＷＯ０７０８５９３０またはＷＯ２００９／０１６５１６において単位−Ｅ−ＣＯＮＲ−Ｆ（Ｅ＝アルキルおよびＦ＝−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｉ−アルキル−）のみに対応し得る。しかしながら、フェニルまたはピリジニル環に結合しており、Ｌ２に結合している基Ｌ１は、これら２つの特許出願において記載も示唆もされていない。具体的には、これは単位Ｇにのみ対応し得る。実際、Ｇは、結合（単結合、二重結合、三重結合）のみあるいは−Ｏ−、−Ｓ−もしくは−ＮＲ−であり得る。リンカー−Ｏ−ＡＬＫ−ＮＲ３−ＡＬＫ−Ｓ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｉ−ＡＬＫ−により特徴付けられる本発明の他の化合物に関して、ＷＯ０７０８５９３０またはＷＯ２００９／０１６５１６の単位Ｄはいずれも、アミン基ＮＲ３および結合−Ｓ−の組合せを提供しない。以下の二量体が、ＷＯ２００９／０１６５１６に記載されている。
【０００７】
【化２】
0005889189.tif 000003
【０００８】
しかし、これらの二量体はいずれも、本発明に記載のものと同様のリンカーを含まない（特に−ＡＬＫ−Ｓ−単位を含まない。）。
【０００９】
従って、２つの出願ＷＯ０７０８５９３０およびＷＯ２００９／０１６５１６は、本発明の化合物を記載も示唆もしていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第００／１２５０８号
【特許文献２】国際公開第２００５／０８５２６０号
【特許文献３】国際公開第０４１０３２７２号
【特許文献４】国際公開第０６０６１２５８号
【特許文献５】国際公開第０７１４４７０９号
【特許文献６】国際公開第２００７１０２０６９号
【特許文献７】国際公開第０７０８５９３０号
【特許文献８】国際公開第２００９／０１６５１６号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２００５，４０，６４１−６５４
【非特許文献２】Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９８８，２９（４０），５１０５−５１０８
【非特許文献３】Ｍｏｎｎｅｒｅｔ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ｄｕ  Ｃａｎｃｅｒ，２０００，８７（１１），８２９−３８
【非特許文献４】Ｒｉｃａｒｔ  Ａ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２００７，４，２４５−２５５
【非特許文献５】Ｓｉｎｇｈ  Ｒ．ａｎｄ  Ｒｉｃｋｓｏｎ  Ｈ．Ｋ．，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２００９，５２５，４４５−４６７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明が解決しようとする技術的課題は、新規ピロロ［１，４］ベンゾジアゼピン二量体コンジュゲートを提供することである。
【００１３】
定義
以下の用語は添付の意味を有する。
【００１４】
コンジュゲート：細胞毒性化合物の少なくとも１種の分子に共有結合している細胞結合剤。
【００１５】
細胞結合剤；生物学的標的についての親和性を有する分子：細胞結合剤は、例えば、リガンド、タンパク質、抗体、さらに特定するとモノクローナル抗体、タンパク質もしくは抗体フラグメント、ペプチド、オリゴヌクレオチドまたはオリゴ糖であり得る。結合剤の役割は、生物学的活性化合物、例えば細胞毒性剤を生物学的標的に向けることである。
【００１６】
生物学的標的：癌性細胞またはこの腫瘍に関連する間質細胞の表面に優先的に局在している抗原（または抗原群）；これらの抗原は、例えば成長因子受容体、癌遺伝子産物または突然変異「腫瘍抑制」遺伝子産物、血管新生関連分子または接着分子であってよい。
【００１７】
アルキル基：アルカンからの水素原子の除去により得られる飽和脂肪族炭化水素基。アルキル基は、直鎖または分枝鎖であり得る。例として、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、２，２−ジメチルプロピルまたはヘキシル基を挙げることができる。
【００１８】
シクロアルキル基：環式構造内に含まれる３から８個の炭素原子を含む環式アルキル基。例として、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルまたはシクロヘキシル基を挙げることができる。
【００１９】
アリール基：ヘテロ原子を含まない単環または二環芳香族基。さらに特定すると、フェニルおよびナフチル基が関連する。
【００２０】
ヘテロアリール基：環内に含まれ、環を形成する炭素原子に連結している少なくとも１個のヘテロ原子（Ｏ、Ｓ、Ｎ）を含む単環または二環芳香族基。さらに特定すると、ピリジニル、ピロリル、チエニル、フラニル、ピリミジニルまたはトリアゾリル基が関連する。
【００２１】
ヘテロシクロアルキル基：環内に含まれ、環を形成する炭素原子に連結している少なくとも１個のヘテロ原子（Ｏ、Ｓ、Ｎ）を含むシクロアルキル基。
【００２２】
アルコキシ基：アルキル基が上記定義のとおりである−Ｏ−アルキル基。
【００２３】
アルカノイルオキシ基：アルキル基が上記定義のとおりである−Ｏ−ＣＯ−アルキル基。
【００２４】
アルキレン基：アルカンからの２個の水素原子の除去により得られる実験式−ＣｍＨ２ｍ−の飽和二価基。アルカンは、直鎖または分枝鎖であり得る。例として、メチレン（−ＣＨ２−）、エチレン（−ＣＨ２ＣＨ２−）、プロピレン（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ブチレン（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、イソブチレン（
【００２５】
【化３】
0005889189.tif 000004
）またはヘキシレン（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）基を挙げることができる。直鎖アルキレン基は、さらに特定すると式−（ＣＨ２）ｍ−（ｍは、整数を表す。）であり得る。
【００２６】
値の範囲内で、限界値が含まれる（例えば、タイプ「１から６の範囲であるｉ」の範囲は、限界値１および６を含む。
【００２７】
使用される略語
ＡｃＯＥｔ：酢酸エチル；ＡＬＫ：（Ｃ１−Ｃ１２）アルキレン基、さらに特定すると（Ｃ１−Ｃ６）アルキレン基；ＴＬＣ：薄層クロマトグラフィー；ＤＡＲ：薬物抗体比；ＤＢＵ：１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク−７−エン；ＤＣＣ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド；ＤＣＭ：ジクロロメタン；ＤＥＡＤ：ジエチルアゾジカルボキシラート；ＤＩＣ：Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド；ＤＩＰＥＡ：Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン；ＤＭＡ：ジメチルアセトアミド；ＤＭＡＰ：４−ジメチルアミノピリジン；ＤＭＥ：ジメトキシエタン；ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド；ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド；ｅ：モル吸光係数；ＥＥＤＱ：２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロキノリン；ＥＤＣｌ：Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド；ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸；Ｆｍｏｃ：フルオレニルメトキシカルボニル；ＰＧ：保護基；Ｈａｌ：ハロゲン原子；ＨＯＢｔ：１−ヒドロキシベンゾトリアゾール；ＨＥＰＥＳ：４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸；ＬＧ：脱離基；ＮＨＳ：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド；ＮＭＰ：Ｎ−メチルピロリジノン；ＲＰ：減圧；Ｒｆ：保持係数；ＳＥＣ：立体排除クロマトグラフィー；ＡＴ：周囲温度；ＴＢＤＭＳ：ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル；ＴＥＡ：トリエチルアミン；ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸；ＴＩＰＳ：トリイソプロピルシリル；ＴＨＦ：テトラヒドロフラン；ｒｔ：保持時間。
【００２８】
［図面］
図１は脱グリコシル化後の実施例１のコンジュゲートの高分解能質量スペクトルである。
図２は脱グリコシル化後の実施例２のコンジュゲートの高分解能質量スペクトルである。
図３は脱グリコシル化後の実施例３のコンジュゲートの高分解能質量スペクトルである。
図４は脱グリコシル化後の実施例４のコンジュゲートの高分解能質量スペクトルである。
図５は実施例６の脱グリコシル化されていないコンジュゲートの高分解能質量スペクトルである。
これらの図面は、デコンボリューション後の各コンジュゲートについて、０から８個のトマイマイシン二量体を保持するものの分布を示す（Ｄ０：二量体なし、Ｄｘ：ｘ個の二量体）。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
発明の記述
本発明は、式：
【００３０】
【化４】
0005889189.tif 000005
（式中、
【００３１】
【化５】
0005889189.tif 000006
は、単結合または二重結合を表し、但し、
【００３２】
【化６】
0005889189.tif 000007
が単結合を表す場合、
−−−−が単結合を表し、
Ｕおよび／またはＵ’は、同一であり、または異なっており、互いに独立してＨを表し、
Ｗおよび／またはＷ’は、同一であり、または異なっており、互いに独立して、ＯＨ、−ＯＲ、−ＯＣＯＲ、−ＣＯＯＲ、−ＯＣＯＯＲ、−ＯＣＯＮＲＲ’、Ｎ１０およびＣ１１が環内に含まれるような環式カルバマート、ＮＲＣＯＮＲＲ’、−ＯＣＳＮＨＲ、Ｎ１０およびＣ１１が環内に含まれるような環式チオカルバマート、−ＳＨ、−ＳＲ、−ＳＯＲ、−ＳＯＯＲ、−ＳＯ３−、−ＮＲＳＯＯＲ’、ＮＲＲ’、Ｎ１０およびＣ１１が環内に含まれるような環式アミン、−ＮＲＯＲ’、−ＮＲＣＯＲ’、−Ｎ３、−ＣＮ、Ｈａｌまたはトリアルキルホスホニウムもしくはトリアリールホスホニウム基を表すことを条件とし、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ１’およびＲ２’は、同一であり、または異なっており、互いに独立して、Ｈ、ＨａｌまたはＨａｌ、ＣＮ、ＮＲＲ’、ＣＦ３、ＯＲ、アリールもしくはヘテロアリール基もしくはＳ（Ｏ）ｑＲ（ｑ＝０、１または２）から選択される１個以上の置換基により場合により置換されている（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基を表し、
あるいは
Ｒ１およびＲ２ならびに／またはＲ１’およびＲ２’は、それぞれ、二重結合＝ＣＨ２または＝ＣＨ−ＣＨ３を一緒に形成し、
ＹおよびＹ’は、同一であり、または異なっており、互いに独立してＨまたはＯＲを表し、
Ｍは、ＣＨまたはＮを表し、
ＡＬＫおよびＡＬＫ’は、同一であり、または異なっており、互いに独立して（Ｃ１−Ｃ６）アルキレン基を表し、
ＲおよびＲ’は、互いに独立してＨ、またはＨａｌ、ＣＮ、ＮＲＲ’、ＣＦ３、ＯＲもしくはアリールもしくはヘテロアリール基から選択される１個以上の置換基により場合により置換されている（Ｃ１−Ｃ６）アルキルもしくはアリール基を表し、
Ｌは、
−Ｌ１−Ｌ２−基（Ｌ１は、ＡＬＫまたはＯＡＬＫ基を介してＭを含む芳香族環に結合しており、以下の基の１種：
−ＡＬＫ−Ｓ−
【００３３】
【化７】
0005889189.tif 000008
−Ｏ−ＡＬＫ−ＮＲ３−ＡＬＫ−Ｓ−
【００３４】
【化８】
0005889189.tif 000009
を表し、
およびＬ２は、−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−を介してＬ１に結合している−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ３−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｉ−ＡＬＫ−基を表す。）、
あるいは
ＯＡＬＫ基を介してＭを含む芳香族環に結合している−Ｏ−ＡＬＫ−ＮＲ３−ＡＬＫ−Ｓ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｉ−ＡＬＫ−基を表し、
Ｒ３は、Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基を表し、
ｉは、１から４０、特に１から２０、好ましくは１から１０の範囲の整数を表し、
Ｚｂは、単結合、−Ｏ−または−ＮＨ−を表し、およびＲｂは、Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ３−Ｃ７）シクロアルキル、アリール、ヘテロアリールまたは（Ｃ３−Ｃ７）ヘテロシクロアルキル基を表し、あるいはＺｂは、単結合を表し、およびＲｂは、Ｈａｌを表す。）の化合物に関する。
【００３５】
例示されたものを含む式（Ｉ）の化合物は、塩基もしくは医薬的に許容される酸との付加塩の形態またはさらにはこれらの塩基もしくはこれらの塩の水和物もしくは溶媒和物の形態で存在することができる。
【００３６】
さらに特定すると、フェニルまたはピリジニル核に結合している２個のＡＬＫおよびＡＬＫ’基は、両方とも、メチレン基を示す。
【００３７】
【化９】
0005889189.tif 000010
【００３８】
さらに特定すると、式（Ｉ）の化合物のうち、式（ＩＡ）または（ＩＢ）の化合物：
【００３９】
【化１０】
0005889189.tif 000011
が指摘される。
【００４０】
ＹおよびＹ’は、さらに特定すると（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ基、特にメトキシ基を表す。ＲおよびＲ’は、さらに特定すると、互いに独立してＨまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基を表すことができる。特定の形態によれば、Ｕ＝Ｕ’ならびに／またはＷ＝Ｗ’ならびに／またはＲ１＝Ｒ１’ならびに／またはＲ２＝Ｒ２’ならびに／またはＹ＝Ｙ’ならびに／またはフェニルもしくはピリジニル核に結合している２個のＡＬＫおよびＡＬＫ’基は同一である。
【００４１】
Ｌは、さらに特定すると以下の１種から選択することができる。
【００４２】
−ＡＬＫ−Ｓ−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｉ−ＣＨ２ＣＨ２−
【００４３】
【化１１】
0005889189.tif 000012
−Ｏ−ＡＬＫ−ＮＲ３−ＡＬＫ−Ｓ−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｉ−ＣＨ２ＣＨ２
【００４４】
【化１２】
0005889189.tif 000013
−Ｏ−ＡＬＫ−ＮＲ３−ＡＬＫ−Ｓ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｉ−ＣＨ２ＣＨ２−
これらのうち、ＡＬＫは、さらに特定すると（Ｃ１−Ｃ４）アルキレン基を表す。特に、ＡＬＫは、以下の１種であり得る。−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＭｅ２−または−ＣＨ２ＣＨ２ＣＭｅ２−。Ｌは、下記の表Ｉまたは表ＩＩに記載のものの１種であってもよい。
【００４５】
ｉは、１から４０、特に１から２０、好ましくは１から１０の範囲の整数を表す。ｉは、１から４０の範囲の値のそれぞれをとり得、特に、ｉは、３、４、５、６、７、８、９または１０の値を有し得る。
【００４６】
表Ｉは、式（ＩＡ）による化合物の代表例を記載する。この表の各化合物は、Ｍ＝ＣＨ（ベンゼン）またはＭ＝Ｎ（ピリジン）の形態で存在することができる。Ｍ＝Ｎである化合物は、より水溶性を示す。
【００４７】
【表１】
0005889189.tif 000014
0005889189.tif 000015
【００４８】
本発明による化合物は、結合剤上に存在する反応性化学基（ＲＣＧ２）に関して反応性である化学基−Ｃ（＝Ｏ）ＺｂＲｂ（ＲＣＧ１）を含む。ＲＣＧ１とＲＣＧ２との反応は、共有結合の形成による化合物の結合剤への結合を確保する。従って、化合物は、結合剤にコンジュゲートすることができる。さらに特定すると、Ｚｂは、Ｏを表し、この場合、ＲＣＧ１は、酸官能基（Ｒｂ＝Ｈ）またはエステル官能基を表す。さらに特定すると、−Ｃ（＝Ｏ）ＺｂＲｂは、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、特に−ＣＯＯＣＨ３または−ＣＯＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２を表す。好ましくは、エステル官能基のうち、ＲＣＧ２基に関して、特に抗体上に存在するアミノ基に関して良好な反応性を示す「活性化」エステルが挙げられる。活性化エステルの例は以下：
【００４９】
【化１３】
0005889189.tif 000016
（式中、ＩＧは、少なくとも１個の誘導基、例えば−ＮＯ２または−Ｈａｌ、特に−Ｆを表す。）のものである。以下の基、例えば
【００５０】
【化１４】
0005889189.tif 000017
または
【００５１】
【化１５】
0005889189.tif 000018
が関連し得る。別のタイプの−Ｃ（＝Ｏ）ＺｂＲｂ基は、以下： 
【００５２】
【化１６】
0005889189.tif 000019
のものである。
【００５３】
ＲＣＧ２の例として、抗体の表面に存在するリシン残基の側鎖により担持されるリシンのイプシロン−アミノ基、ヒンジ領域の糖基または鎖間ジスルフィド結合の還元によるシステインのチオールを挙げることができる（Ｇａｒｎｅｔｔ  Ｍ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，２００１，５３，１７１−２１６）。さらに近年、他のアプローチ、例えば突然変異によるシステインの導入（Ｊｕｎｕｔｕｌａ  Ｊ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，２６，９２５−９３２；ＷＯ０９０２６２７４）または他のタイプの化学的性質を可能とする非天然アミノ酸の導入（ｄｅ  Ｇｒａａｆ  Ａ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，２００９，Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ３，２００９（総説）；ＤＯＩ：１０．１０２１／ｂｃ８００２９４ａ；ＷＯ２００６／０６９２４６およびＣｈｉｎ  Ｊ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，ＪＡＣＳ，２００２，１２４，９０２６−９０２７（ＲｅＣｏｄｅ（登録商標）技術による。）が考慮されている。抗体を用いるこれらの結合方法は、これらの構造により全ての公知の結合剤に適用することができる。
【００５４】
従って、本発明による化合物は、式：
【００５５】
【化１７】
0005889189.tif 000020
の二量体がＭに対してパラ位で共有結合している結合剤の調製において使用することができる。
【００５６】
さらに特定すると、結合剤は抗体である。さらに特定すると、二量体は式：
【００５７】
【化１８】
0005889189.tif 000021
を有する。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】脱グリコシル化後の実施例１のコンジュゲートの高分解能質量スペクトルである。
【図２】脱グリコシル化後の実施例２のコンジュゲートの高分解能質量スペクトルである。
【図３】脱グリコシル化後の実施例３のコンジュゲートの高分解能質量スペクトルである。
【図４】脱グリコシル化後の実施例４のコンジュゲートの高分解能質量スペクトルである。
【図５】実施例６の脱グリコシル化されていないコンジュゲートの高分解能質量スペクトルである。
【００５９】
これらの図面は、デコンボリューション後の各コンジュゲートについて、０から８個のトマイマイシン二量体を保有するものの分布を示す（Ｄ０：二量体なし、Ｄｘ：ｘ個の二量体）。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
式（Ｉ）の化合物の調製方法
式（Ｉ）の化合物は、スキーム１に従って調製することができる。
【００６１】
【化１９】
0005889189.tif 000022
化合物Ｐ１、Ｐ’１およびＰ２は、一緒に反応してＰ３をもたらす。ＬＧおよびＬＧ’は、脱離基を示す。Ｌ３は、−Ｌ−Ｃ（＝Ｏ）ＺｂＲｂ基を表し得、この場合、Ｐ３は、式（Ｉ）の化合物を表す。Ｐ３が−Ｌ−Ｃ（＝Ｏ）ＺｂＲｂ基を表さない場合、１種以上の反応を使用してＬ３を−Ｌ−Ｃ（＝Ｏ）ＺｂＲｂ基に変換することが必要である。特に、−Ｃ（＝Ｏ）ＺｂＲｂ＝
【００６２】
【化２０】
0005889189.tif 000023
である場合、−Ｃ（＝Ｏ）ＺｂＲｂ基＝−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−Ｃ４）アルキルまたは−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アリルを末端に有するＬ３基を導入し、続いて−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ基に変換し、最終的にＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカルボナートまたはＮＨＳと反応させることが可能である。−ＣＯＯアルキル／アリルの−ＣＯＯＨへの変換は、水酸化リチウムによる処理により実施することができる。特にメチルエステルを使用することが特に有利である。Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカルボナートとの反応は、塩基、例えばＤＩＰＥＡの存在下で実施され、ＮＨＳとの反応は、カップリング剤、例えばＤＣＣの存在下で実施される。同様に、−Ｃ（＝Ｏ）ＺｂＲｂ＝
【００６３】
【化２１】
0005889189.tif 000024
である場合、−Ｃ（＝Ｏ）ＺｂＲｂ基＝−ＣＯＯＨを導入し、続いてＮ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾールと反応させることが可能である（ＪＡＣＳ，１９５８，８０，４４２３；ＪＡＣＳ，１９６０，８２，４５９６）。
【００６４】
化合物Ｐ１およびＰ’１は、特許出願ＷＯ００／１２５０８、ＷＯ００／１２５０７、ＷＯ２００５／０４０１７０、ＷＯ２００５／０８５２６０、ＷＯ０７０８５９３０もしくはＷＯ２００９／０１６５１６に記載されており、または全合成により利用可能である（Ｍｏｒｉ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９８６，４２，３７９３−３８０６）。Ｐ１および／またはＰ’１が式：
【００６５】
【化２２】
0005889189.tif 000025
のトマイマイシンを表す場合、
後者は、ＦＲ１５１６７４３の教示に従うことによりストレプトミセス・クロセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｒｏｃｅｕｓ）株を使用して、あるいは全合成（Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，１９８３，ＸＸＸＶＩ（３），２７６−２８２，Ｚ．Ｔｏｚｕｋａ，「Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｏｍａｙｍｙｃｉｎ．Ｔｏｔａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  Ｅ−ａｎｄ  Ｚ−ｔｏｍａｙｍｙｃｉｎｓ」を参照。）により調製することができる。市販のＰ１／Ｐ’１化合物も存在する。Ｗ／Ｗ’基の導入のため、イミン官能基（
【００６６】
【化２３】
0005889189.tif 000026
＝二重結合）が種々のＨＷ／ＨＷ’化合物（例えば、Ｈ２ＯまたはアルコールＲＯＨ）を添加することができる。
【００６７】
式Ｐ２の化合物に関して
これらの化合物は、式：
【００６８】
【化２４】
0005889189.tif 000027
（式中、
Ｌ、Ｍ、ＡＬＫ、ＡＬＫ’、ＺｂおよびＲｂは、上記定義のとおりであり、
ＥおよびＥ’は、互いに独立して、−ＯＨ基または脱離基を表す。）を有する。
【００６９】
Ｌは、さらに特定するとスキーム２、２’、３、３’、３’’、４、５、５’、６、６’、６’’、７に記載のものの１種を表すことができる。
【００７０】
式：
【００７１】
【化２５】
0005889189.tif 000028
（式中、Ｌ＊は、−ＡＬＫ−ＳＨ；−Ｏ−ＡＬＫ−ＮＲ３−ＡＬＫ−ＳＨ；
【００７２】
【化２６】
0005889189.tif 000029
から選択される。）の中間体
も指摘される。
【００７３】
本発明において、用語「脱離基」は、Ｐ２とＰ１またはＰ’１との不均一反応において、ＡＬＫおよびＬＧまたはＬＧ’を連結する共有結合の電子対を取り去りながら脱離する原子または原子群を示す。脱離基は、さらに特定するとハロゲン原子、特に塩素もしくは臭素またはメシラート、トシラート、ノシラートもしくは−ＯＰＰｈ３＋基から選択される。
【００７４】
他の下記のスキームについて、簡略化のため、以下の略語： 
【００７５】
【化２７】
0005889189.tif 000030
Ｌ１＝−ＡＬＫ−Ｓ−およびＬ２＝−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｉ−ＡＬＫ−が使用される。
【００７６】
【化２８】
0005889189.tif 000031
【００７７】
Ｐ２の調製
Ｐ２は、実施例３（スキーム２’）の教示により式
【００７８】
【化２９】
0005889189.tif 000032
の対応するハロゲン化ジオールから得られる。
【００７９】
【化３０】
0005889189.tif 000033
ｉ．保護基、例えばｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ（ＴＢＳ）などを使用する２個のアルコール官能基の保護、
ｉｉ．ｎ−ＢｕＬｉまたはマグネシウムをそれぞれ使用する対応する有機リチウムまたは有機マグネシウム誘導体の調製、
ｉｉｉ．アルコール官能基を形成するためのケトンへの求核付加、
ｉｖ．対応するチオアセタートの形成を介するチオールの調製（実施例３．７および３．８を参照。）、
ｖ．脱保護、
ｖｉ．ＬＧおよびＬＧ’の導入。メシラート基の場合、塩化メタンスルホニルが塩基、例えば第３級アミン（例えばＴＥＡまたはＤＩＰＥＡ）の存在下で使用される。実施例１．４を参照。
【００８０】
ハロゲン化ジオールおよび対応する保護ジオールの例は、ＷＯ２００９／０１６５１６の４８頁のスキーム１に記載のものである（スキーム１の化合物２および３）。保護ジオールの２つの例は、ＣＡＳ番号１８１２２５−４０−１および１８１２２５−４１−２のものである。
【００８１】
ハロゲン化ジオールは、対応する二酸またはジエステル化合物、例えばＣＡＳ番号１９３０１０−４０−１のものの還元により得ることができる。さらに、ピリジン（Ｍ＝Ｎ）の場合：Ｌｉｅｂｉｇｓ  Ａｎｎａｌｅｎ  ｄｅｒ  Ｃｈｅｍｉｅ，１９９１，１０，９８７−９８８またはＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，２００５，６１（７），１７５５−１７６３を参照（スキーム１の化合物３）。
【００８２】
Ｐ４の調製
ＡＬＫ＝ＣＨ２ＣＨ２である場合
Ｒ３＝Ｈである場合
【００８３】
【化３１】
0005889189.tif 000034
段階（ｉ）：アミドの形成および酸の活性化：２つの段階が、極性非プロトン性溶媒、例えばＤＣＭ中で連続的に実施される：アミン官能基とＮ−ヒドロキシスクシンイミジルハロアセタートとの反応に続く、カップリング剤、例えばＤＩＣの現場添加。
【００８４】
Ｒ３≠Ｈである場合
【００８５】
【化３２】
0005889189.tif 000035
段階（ｉｉ）：メチルエステル形態のカルボン酸およびトリフルオロアセトアミド形態のアミンの保護；反応は、２つの連続的な段階において極性非プロトン性溶媒、例えばＤＣＭ中で実施される：メタノールの存在下でのトリメチルシリルジアゾメタンによる処理による酸の保護に続く、無水トリフルオロ酢酸および塩基、例えばＴＥＡの添加によるアミンの保護。
段階（ｉｉｉ）：アミンのアルキル化およびエステルの鹸化；反応は、２つの連続的な段階において無水極性非プロトン性溶媒、例えばＴＨＦ中で実施される：離核基、例えばハロゲン化アルキルＲ３Ｈａｌを担持する試薬の存在下での塩基、例えばＮａＨによる処理に続く水酸化リチウムおよび水の添加によるアミンのアルキル化。
【００８６】
段階（ｉ）：段階（ｉｉｉ）に続き、Ｒ３＝Ｈである場合についての段階（ｉ）の反応が繰り返される。
【００８７】
ＡＬＫ≠ＣＨ２ＣＨ２である場合
Ｒ３＝Ｈである場合
【００８８】
【化３３】
0005889189.tif 000036
【００８９】
Ｒ３≠Ｈである場合
【００９０】
【化３４】
0005889189.tif 000037
段階（ｉｖ）：ＰＥＧ鎖の伸長；反応は、ＷＯ２００７／１２７４４０に記載のとおり、無水極性非プロトン性溶媒、例えばＴＨＦまたはＤＭＦ中で、ＮａＨまたはカリウムナフタレニドの作用により生成されたベンゾフェノン／イミン／ＰＥＧアルコールのアルコキシドによるハロゲン化エステルの処理により実施される。
段階（ｖ）：Ｗｅｓｓｊｏｈａｎｎ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９８９，５，３５９−６３に従う、パラジウム／炭素の存在下での水素化によるイミンの選択的開裂。
段階（ｖｉ）：無水トリフルオロ酢酸および塩基、例えばＴＥＡの添加によるアミンの保護。
【００９１】
アミノ／ＰＥＧアルコールは、例えばｉ＝３、４、７、８については市販されており、またはｉ＝３から１２についてはＵＳ７２３０１０１に記載の手順に従って、市販のＰＥＧジオールから調製することができる。ベンゾフェノンによるアミン官能基の保護は、ルイス酸、例えばＢＦ３エーテラートの存在下での共沸脱水により実施することができる。
【００９２】
【化３５】
0005889189.tif 000038
【００９３】
Ｐ２の調製
【００９４】
【化３６】
0005889189.tif 000039
ｉ．塩基、例えばＫ２ＣＯ３などの存在下での、極性溶媒、例えばＤＭＦ、ＴＨＦまたはＭｅＣＮ中での−ＯＨ官能基の１個（他の２個は、保護基を示すＰＧおよびＰＧ’により保護されている。）と、式Ｂｒ−ＡＬＫ−ＮＨＢｏｃのＢｏｃにより保護されているブロモアミンとの求核反応（例えばＷＯ０７０８５９３０の６３頁の条件を参照。）
【００９５】
代替的形態によれば、式：
【００９６】
【化３７】
0005889189.tif 000040
のヒドロキシジエステルによるブロモアミンの求核置換を実施し、次いで続いてエステル官能基を、例えば水素化ホウ素ナトリウムにより還元して−ＣＨ２ＯＨ官能基を生じさせることが可能である。これについて、ＷＯ２００７／０８５９３０の６２−６３頁に挙げられている求核置換および還元の条件を適用することが可能である。
【００９７】
ｉｉ．保護基の脱保護
ｉｉｉ．チタンイソプロポキシドの存在下での式ＨＣ（＝Ｏ）−ＡＬＫ−ＳＳＭｅのアルデヒドによる還元的アミノ化；反応は、周囲温度において無水極性非プロトン性溶媒、例えばＴＨＦ中で実施される。
ｉｖ．中間複合体が形成され、この複合体は、還元剤、例えばシアノ水素化ホウ素ナトリウムなどにより現場で還元される。
ｖ．ＬＧおよびＬＧ’の導入。メシラート基の場合、塩化メタンスルホニルが塩基、例えば第３級アミン（例えばＴＥＡ）の存在下で使用される。実施例１．４を参照。
【００９８】
スキーム３’’に表される代替的形態は、特にＫｉｔａｇａｗａ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，ＪＡＣＳ，２００６，１２８（４５），１４４４８−１４４４９により記載された方法の着想のもと、−ＡＬＫ−ＳＳＭｅ基を、アセチルチオアルキル鎖を第２級アミン上に導入するために使用されるＮＨＢｏｃ基上に導入することからなる。
【００９９】
【化３８】
0005889189.tif 000041
この代替的形態によれば、アルキル化は、中間体Ｈａｌ−ＡＬＫ−ＳＣＯＭｅ（例えばＨａｌ＝Ｉ）を使用して実施され、次いでチオールが塩基性媒体中での処理により遊離される。
【０１００】
ｖｉ．極性非プロトン性溶媒、例えばＤＭＦ中での炭酸セシウムの存在下でのチオアセチル基を担持するハロゲン化アルキルによるアルキル化。
ｖｉｉ．弱塩基性媒体中でのアセチル基の選択的開裂。
ｖｉｉｉ．中間体チオールのＭｅＳＳＯ２Ｍｅとの反応による−ＳＳＭｅ基の形成。
ｉｘ．保護基ＰＧおよびＰＧ’の開裂。
ｘ．ヒドロキシル基の離核基ＬＧ／ＬＧ’、好ましくはメシラート基への変換。
【０１０１】
【化３９】
0005889189.tif 000042
Ｒ３基＝（Ｃ１−Ｃ４）アルキルのＮＨ基上への導入は、合成の異なる段階において考えられる（例は、スキーム３’’’に挙げられる。）。この導入は、例えばアルデヒドを使用するヴァラッハ反応を用いることにより実施される（アルキル化ＮＨ→ＮＭｅがホルムアルデヒドを使用する実施例１．５を参照。）。
【０１０２】
Ｐ５に関して
Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ  ６１１０５，ＵＳＡ，Ｊｅｎｋｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ．，２０３３  Ｗ．ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ  Ｄｒ，Ａｌｌｅｎ，ＴＸ  ７５０１３−４６７５，ＵＳＡおよびＱｕａｎｔａ  ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ  Ｌｔｄ．，１９５  Ｗｅｓｔ  Ｏｌｅｎｔａｎｇｙ  Ｓｔｒｅｅｔ，Ｓｕｉｔｅ  Ｏ，Ｐｏｗｅｌｌ，Ｏｈｉｏ  ４３０６５−８７２０，ＵＳＡは、ＮＨＳ−ＰＥＧ−マレイミドにより示される一般式
【０１０３】
【化４０】
0005889189.tif 000043
の化合物を販売している。さらに特定すると、ＣＡＳ番号７５６５２５−９９−２の化合物が関連し得る。
【０１０４】
チオールのマレイミド単位への添加は、「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」，Ｇｒｅｇ  Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｉｎｃ．（ＩＳＢＮ−１３：９７８−０−１２−３７０５０１−３；ＩＳＢＮ−１０：０−１２−３７０５０１−０）の７２１頁に記載されている。
【０１０５】
【化４１】
0005889189.tif 000044
調製は、スキーム３に記載のものと同様であり、Ｐ５がＰ４により置き換えられる。
【０１０６】
スキーム４’に記載の代替的形態は、スキーム２および２’に記載のものと同様の調製に対応する。
【０１０７】
【化４２】
0005889189.tif 000045
【０１０８】
ｉ．ジスルフィドの還元による脱保護
【０１０９】
【化４３】
0005889189.tif 000046
【０１１０】
Ｐ２の調製
下記のスキーム５’に従って得られる式：
【０１１１】
【化４４】
0005889189.tif 000047
の化合物Ｐ２が使用される。
【０１１２】
【化４５】
0005889189.tif 000048
【０１１３】
ｉ．１位において単一保護されており、４位に末端位が離核ＬＧ基により官能化されたアルキル鎖を担持するピペラジンによる芳香族環のヒドロキシルのアルキル化。好ましくは、離核基はメシラート基であり、ウィリアムソン反応が無水極性非プロトン性溶媒、例えばＴＨＦまたはＤＭＦ中で水素化物の存在下で実施される。
ｉｉ．ＰＧおよびＰＧ’基がＴＢＤＭＳである場合の、好ましくは、酸性媒体中での、例えば塩酸またはＴＦＡの存在下でのＢｏｃ、ＰＧおよびＰＧ’基の脱保護。
【０１１４】
段階ｉおよびｉｉの代替的形態によれば、式：
【０１１５】
【化４６】
0005889189.tif 000049
のヒドロキシジエステルによるブロモアミンの求核置換を実施し、続いてエステル官能基を、例えば水素化ホウ素ナトリウムにより還元して−ＣＨ２ＯＨ官能基を生じさせることが可能である。これについて、ＷＯ２００７／０８５９３０の６２−６３頁に挙げられている求核置換および還元の条件を適用することが可能である。
【０１１６】
ｉｉｉ．ＮＨＳエステルを生じさせるための酸の最初の活性化後に実施されるカップリング。
ｉｖ．脱離基ＬＧおよびＬＧ’の導入。メシラート基の場合、塩化メタンスルホニルが塩基、例えば第３級アミン（例えばＴＥＡ）の存在下で使用される。
【０１１７】
【化４７】
0005889189.tif 000050
【０１１８】
Ｐ２の調製
下記のスキーム６に従って還元的アミノ化により得られる式：
【０１１９】
【化４８】
0005889189.tif 000051
の化合物Ｐ２が使用される。
【０１２０】
【化４９】
0005889189.tif 000052
【０１２１】
ｖ．例えばシアノボロヒドリドおよびチタンイソプロポキシドの存在下で実施される還元的アミノ化による−ＡＬＫ−ＳＳＭｅ基の導入。
【０１２２】
スキーム３’’に表されるものと同様であり、Ｋｉｔａｇａｗａ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，ＪＡＣＳ，２００６，１２８（４５），１４４４８−１４４４９により記載されているアルキル化法を使用する代替的形態は、スキーム６’’に挙げられる。
【０１２３】
【化５０】
0005889189.tif 000053
【０１２４】
ｉ．単一保護ピペラジンのアルキル化（スキーム５’の段階ｉ．を参照。）。
ｖｉ．酸性媒体中でのＢｏｃ基の選択的脱保護。
ｖｉｉ．極性非プロトン性溶媒、例えばＤＭＦ中での炭酸セシウムの存在下でのチオアセチル基を担持するハロゲン化アルキルによるアルキル化。
ｖｉｉｉ．弱塩基性媒体中でアセチル基の選択的開裂および塩基、例えばＴＥＡの存在下での中間体チオールのＭｅＳＳＯ２Ｍｅとの反応による−ＳＳＭｅ基の形成。
ｉｘ．保護基ＰＧおよびＰＧ’の開裂ならびにヒドロキシル基の、好ましくは塩化メタンスルホニルによるメシラートへの変換。
【０１２５】
【化５１】
0005889189.tif 000054
このスキームは、上記スキーム３から着想を得る。化合物Ｐ６は、例えば、ＷＯ０３０６８１４４（図７の化合物１０ａを参照。）に従って調製されるＣＡＳ番号５６４４７６−３２−０の化合物、あるいはＣＡＳ番号３０９９１６−９１−４の化合物であり得る。様々な鎖長ｉを有する類縁化合物は、対応するＰＥＧ化合物から出発して、ＷＯ０３０６８１４４の図７の同一の原理に従って調製することができる。
【０１２６】
Ｐ６に関して
【０１２７】
【化５２】
0005889189.tif 000055
は、下記のスキームに従って調製することができる。
【０１２８】
ＡＬＫ＝ＣＨ２ＣＨ２である場合
【０１２９】
【化５３】
0005889189.tif 000056
【０１３０】
ＡＬＫ≠ＣＨ２ＣＨ２である場合
【０１３１】
【化５４】
0005889189.tif 000057
【０１３２】
段階（ｉ）：メシラート形態のアルコールの活性化；反応は、無水極性非プロトン性溶媒、例えばＤＣＭ中で、塩基、例えばＴＥＡの存在下で塩化メシルによる処理により実施される。
段階（ｉｉ）：メシラート／ハロゲン交換；反応は、極性非プロトン性溶媒、例えばアセトンの還流下で、ハロゲン化ナトリウム、例えばヨウ化ナトリウムを用いて実施される。
段階（ｉｉｉ）：塩酸の溶液（例えば、ジオキサン中溶液）またはトリフルオロ酢酸を使用する脱保護。
段階（ｉｖ）：酸の活性化；反応は、極性非プロトン溶媒、例えばＤＣＭ中で周囲温度において、カップリング剤、例えばＤＣＣの存在下でＮＨＳによる処理により実施される。
段階（ｖ）：ＰＥＧ鎖の伸長；反応は、無水極性非プロトン溶媒、例えばＴＨＦまたはＤＭＦ中で、テトラヒドロピラン（ＴＨＰ）エーテル形態の単一保護されているＰＥＧジオールのアルコキシドによるハロゲン化エステルの処理により実施される。このタイプの単一保護ＰＥＧジオールの調製は、文献に十分に記載されている。例えば、Ｒｉｃｈａｒｄ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．，２００５，１１，７３１５−７３２１またはＳａｋｅｌｌａｒｉｏｕ  Ｅ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，２００３，５９，９０８３−９０９０を参照。
段階（ｖｉ）：０．１Ｎ塩酸溶液（例えば、ジオキサンまたはエタノール中溶液）を使用する脱保護。
【０１３３】
当業者は、下記の実施例の操作条件から着想を得ることができる。
【０１３４】
コンジュゲートの調製方法
コンジュゲートは、
（ｉ）場合により緩衝化された結合剤の水溶液および式（Ｉ）の化合物の溶液を接触させて反応させること、
（ｉｉ）次いで、段階（ｉ）において形成されたコンジュゲートを、反応しなかった式（Ｉ）の化合物から、および／または結合剤から、および／または形成され得る凝集物から場合により分離すること
からなる方法により得られる。
【０１３５】
代替的形態によれば、段階（ｉ）において形成したコンジュゲートは、段階（ｉｉ）において未反応の結合剤から、および溶液中に存在すると考えられる凝集物から分離される。別の代替的形態によれば、段階（ｉ）のコンジュゲートは、段階（ｉｉ）において、未反応の式（Ｉ）の化合物および形成され得る凝集物からのみ分離され、反応し得ない結合剤は溶液中に残される。
【０１３６】
式（Ｉ）の化合物は、好ましくは、ＲＣＧ２基に関して、特に抗体上に存在するアミノ基に関して反応性を示す活性化官能基−Ｃ（＝Ｏ）ＺｂＲｂを含む。相対的に非反応性または反応性が不十分な化学基は、当業者に公知の１種以上の化学反応を使用してより反応性の基に容易に変換することができる。例えば−ＣＯＯＨ＋Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド→
【０１３７】
【化５５】
0005889189.tif 000058
あるいは−ＣＯＯ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル→−ＣＯＯＨ→−ＣＯＯＨ＋Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド→
【０１３８】
【化５６】
0005889189.tif 000059
に変換することができる。
【０１３９】
抗体および式（Ｉ）の化合物の場合に適用可能な方法の例は、実施例１に挙げられるものである。
【０１４０】
結合剤の水溶液は、例えば緩衝液、例えばリン酸カリウムまたはＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ緩衝液）などを使用して緩衝化することができる。緩衝液は、結合剤の性質に依存する。式（Ｉ）の化合物は、極性有機溶媒、例えばＤＭＳＯまたはＤＭＡ中に溶解される。
【０１４１】
反応は、一般に２０から４０℃の温度において行われる。反応の継続時間は、１から２４時間の間で変動し得る。結合剤と式（Ｉ）の化合物との反応は、屈折率および／または紫外線検出器を用いるＳＥＣによりモニタリングして、これから進行の状態を決定することができる。グラフト化度が不十分である場合、反応をより長時間行うことができ、および／またはさらなる式（Ｉ）の化合物を添加することができる。コンジュゲーションに使用することができる具体的な条件のより詳細については、実施例パートに挙げられた一般的方法を参照することができる。
【０１４２】
当業者は、段階（ｉｉ）の分離のために利用可能な種々のクロマトグラフィー技術を有する。コンジュゲートは、例えば立体排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により、吸着クロマトグラフィー（例えばイオン交換クロマトグラフィー、ＩＥＣ）により、疎水相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）により、親和性クロマトグラフィーにより、混合担体、例えばセラミックヒドロキシアパタイト上でのクロマトグラフィーにより、またはＨＰＬＣにより精製することができる。透析または膜分離による精製も使用することができる。
【０１４３】
用語「凝集物」は、２種以上の結合剤間に形成され得る会合を意味すると解され、結合剤は、コンジュゲーションにより改変されているか、または改変されていない。凝集物は、多数のパラメーター、例えば溶液中の結合剤の高濃度、溶液のｐＨ、高い剪断力、グラフト化された二量体の数およびこれらの疎水性または温度の影響下で形成され得（Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｓｃｉ．，２００８，３１８，３１１−３１６への導入に引用された参考文献を参照。）、これらの一部の影響は正確に把握されないことがある。タンパク質または抗体の場合、ＡＡＰＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ，「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ」，２００６，８（３），Ｅ５７２−Ｅ５７９を参照することができる。凝集物の含有率は、公知技術、例えばＳＥＣを使用して決定することができる（これに関して、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３，２１２（２），４６９−４８０を参照。）。
【０１４４】
段階（ｉ）または（ｉｉ）後、コンジュゲートの溶液を限外濾過および／または膜分離の段階（ｉｉｉ）に供することができる。こうして、これらの段階の最後に水溶液のコンジュゲートが得られる。
【０１４５】
抗体
抗体（これに関して、Ｊａｎｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ」，５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照。）は、特に出願ＷＯ０４０４３３４４、ＷＯ０８０１０１０１、ＷＯ０８０４７２４２およびＷＯ０５００９３６９（抗ＣＡ６）に記載のものから選択することができる。抗体は、特にモノクローナル、ポリクローナルまたは多重特異的であり得る。抗体フラグメントも関連し得る。ネズミ、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体も関連し得る。
【０１４６】
コンジュゲート
コンジュゲートは、一般に、結合剤に結合している１から１０個程度のピロロ［１，４］ベンゾジアゼピン二量体（これは、グラフト化度または薬物抗体比（ＤＡＲ）である。）を含む。この数は、結合剤および二量体の性質ならびにさらにはコンジュゲーションに使用される操作条件（例えば、結合剤に関する二量体の当量数、反応時間、溶媒の性質および考えられる共溶媒の性質）に応じて変動する。結合剤および二量体を接触させることは、異なるＤＡＲにより互いに個々に異なる幾つかのコンジュゲート；場合により未反応の結合剤（不完全反応の場合）；および考えられる凝集物を含む混合物をもたらす。従って、最終溶液について、例えばＵＶ分光法により決定されるＤＡＲは、平均ＤＡＲに対応する。
【０１４７】
結合剤が抗体である場合、ＵＶ分光法は、ＤＡＲを決定するために使用される方法であり得る。この方法は、Ａｎｔｏｎｙ  Ｓ．Ｄｉｍｉｔｒｏｖ（Ｅｄ．），ＬＬＣ，２００９，「Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」，ｖｏｌ．５２５，４４５，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅに提示のものから着想を得る。この方法は、分離段階（ｉｉ）後にＬＯ１およびＬＯ２と示される２つの波長において、コンジュゲートの溶液の吸光度を計測することからなる。コンジュゲーション前に計測された裸抗体およびピロロ［１，４］ベンゾジアゼピン二量体の以下のモル吸光係数が使用される。
【０１４８】
ＬＯ１およびＬＯ２におけるコンジュゲートの溶液の吸光度（ＡＬＯ１およびＡＬＯ２）は、ＳＥＣスペクトル（これにより「ＤＡＲ（ＳＥＣ）」を計算することが可能となる。）の対応するピークに基づき、または慣用のＵＶ分光光度計（これにより「ＤＡＲ（ＵＶ）」を計算することが可能となる。）を使用することにより計測される。吸光度は、以下の形で表現することができ：
ＡＬＯ１＝（ｃＤ×ｅＤ  ＬＯ１）＋（ｃＡ×ｅＡ  ＬＯ１）
ＡＬＯ２＝（ｃＤ×ｅＤ  ＬＯ２）＋（ｃＡ×ｅＡ  ＬＯ２）
これらの式について、
ｃＤおよびｃＡは、それぞれ、ピロロ［１，４］ベンゾジアゼピン二量体に関するコンジュゲートの部分および抗体に関するコンジュゲートの部分の溶液中の濃度を示し、
ｅＤ  ＬＯ１およびｅＤ  ＬＯ２は、それぞれ、コンジュゲーション前の２つの波長ＬＯ１およびＬＯ２におけるピロロ［１，４］ベンゾジアゼピン二量体のモル吸光係数を示し、
ｅＡ  ＬＯ１およびｅＡ  ＬＯ２は、それぞれ、２つの波長ＬＯ１およびＬＯ２における裸抗体のモル吸光係数を示す。
【０１４９】
用語「裸抗体」は、ピロロ［１，４］ベンゾジアゼピン二量体が結合していない抗体、即ちコンジュゲーション段階前の抗体を意味すると解される。
【０１５０】
これら２つの式の解は、以下：
【０１５１】
ｃＤ＝［（ｅＡ  ＬＯ１×Ａ  ＬＯ２）−（ｅＡ  ＬＯ２×ＡＬＯ１）］／［（ｅＤ  ＬＯ２×ｅＡ  ＬＯ１）−（ｅＡ  ＬＯ２×ｅＤ  ＬＯ１）］
ｃＡ＝［ＡＬＯ１−（ｃＤ×ｅＤ  ＬＯ１）］／ｅＡ  ＬＯ１
となる。
【０１５２】
平均ＤＡＲはｃＤ／ｃＡに対応する。ピロロ［１，４］ベンゾジアゼピン二量体の場合、２つの波長ＬＯ１＝２８０ｎｍおよびＬＯ２＝３２０ｎｍが考慮される。ＳＥＣスペクトルに基づき計測された平均ＤＡＲは、好ましくは１から１０、好ましくは１．５から７である。
【０１５３】
コンジュゲートは、抗癌剤として使用することができる。結合剤の存在により、コンジュゲートは、健常細胞ではなく腫瘍細胞に関して高度に選択性となる。このことにより、抗癌活性を有する式（Ｉ）の化合物を腫瘍細胞の近接周囲または直接的に腫瘍細胞内部に向けることが可能となる（これに関して、癌の治療におけるモノクローナル抗体のコンジュゲートの使用を記載している以下の刊行物を参照：「Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ」，Ｃａｒｔｅｒ  Ｐ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．，２００８，１４，１５４−１６９；「Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ：ｃｏｎｆｅｒｒｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｔｏ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｄｒｕｇｓ」，Ｃｈａｒｉ  Ｒ．，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，２００８，４１，９８−１０７）。固形または非固形癌を治療することが可能である。
【０１５４】
コンジュゲートは、一般に１から１０ｍｇ／ｍｌの濃度において緩衝化水溶液の形態で配合される。この溶液は、このままの注入形態で注入することができ、あるいは注入溶液の形態に再希釈することができる。
【実施例】
【０１５５】
化学シフト（デルタ（ｐｐｍ））は、ｐｐｍで表現する。
【０１５６】
方法Ａ：高圧液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣＭＳ）
スペクトルは、Ｗａｔｅｒｓ  ＵＰＬＣ−ＳＱＤ装置により、ポジティブおよび／またはネガティブエレクトロスプレーモード（ＥＳ＋／−）で得た。クロマトグラフィー条件：カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ  ＢＥＨ  Ｃ１８  １．７μｍ−２．１×５０ｍｍ；溶媒：Ａ：Ｈ２Ｏ（０．１％ギ酸）、Ｂ：ＣＨ３ＣＮ（０．１％ギ酸）；カラム温度：５０℃；流速：１ｍｌ／分；勾配（２分）：０．８分で５から５０％のＢ；１．２分：１００％のＢ；１．８５分：１００％のＢ；１．９５分：５％のＢ。
【０１５７】
方法Ｂ：高圧液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣＭＳ）
スペクトルは、Ｗａｔｅｒｓ  ＺＱ装置により、ポジティブおよび／またはネガティブエレクトロスプレーモード（ＥＳ＋／−）で得た。クロマトグラフィー条件：カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ  Ｃ１８  ２．５μｍ  ３×５０ｍｍ；溶媒：Ａ：Ｈ２Ｏ（０．１％ギ酸）、Ｂ：ＣＨ３ＣＮ（０．１％ギ酸）；カラム温度：７０℃；流速：０．９ｍｌ／分；勾配（７分）：５．３分で５から１００％のＢ；５．５分：１００％のＢ；６．３分：５％のＢ。
【０１５８】
方法Ｃ：質量分析（ＭＳ）
スペクトルは、ＷＡＴＥＲＳ  ＧＣＴの装置（ＬＣを用いない直接導入）により化学イオン化（反応ガス：アンモニア）を使用して記録した。
【０１５９】
方法Ｄ：高圧液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣＭＳ）
スペクトルは、Ｗａｔｅｒｓ  ＵＰＬＣ−ＳＱＤ装置により、ポジティブおよび／またはネガティブエレクトロスプレーモード（ＥＳ＋／−）で得た。クロマトグラフィー条件：カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ  ＢＥＨ  Ｃ１８  １．７μｍ−２．１×５０ｍｍ；溶媒：Ａ：Ｈ２Ｏ（０．１％ギ酸）、Ｂ：ＣＨ３ＣＮ（０．１％ギ酸）；カラム温度：７０℃；流速：１ｍｌ／分；勾配（２分）：１分で５から５０％のＢ；１．３分：１００％のＢ；１．４５分：１００％のＢ；１．７５分：５％のＢ。
【０１６０】
方法Ｅ：高圧液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣＭＳ）
スペクトルは、Ｗａｔｅｒｓ  ＵＰＬＣ−ＳＱＤ装置により、ポジティブおよび／またはネガティブモードのエレクトロスプレーイオン化モード（ＥＳ＋／−）で得た。クロマトグラフィー条件：カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ  ＢＥＨ  Ｃ１８  １．７μｍ−２．１×５０ｍｍ；溶媒：Ａ：Ｈ２Ｏ（０．１％ギ酸）、Ｂ：ＣＨ３ＣＮ（０．１％ギ酸）；カラム温度：７０℃；流速：１ｍｌ／分；勾配（４分）：３．１５分で５から１００％のＢ；３．７５分：５％のＢ。
【０１６１】
方法Ｆ：高圧液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣＭＳ）
スペクトルは、Ｗａｔｅｒｓ  ＵＰＬＣ−ＳＱＤ装置により、ポジティブおよび／またはネガティブモードのエレクトロスプレーイオン化モード（ＥＳ＋／−）で得た。クロマトグラフィー条件：カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ  ＢＥＨ  Ｃ１８、１．７μｍ−２．１×３０ｍｍ；溶媒：Ａ：Ｈ２Ｏ（０．１％ギ酸）、Ｂ：ＣＨ３ＣＮ（０．１％ギ酸）；カラム温度：４５℃；流速：０．６ｍｌ／分；勾配（２分）：１分で５から５０％のＢ；１．３分：１００％のＢ；１．４５分：１００％のＢ；１．７５分：５％のＢ。
【０１６２】
方法Ｇ：コンジュゲートの脱グリコシル化および質量分析（ＨＲＭＳ）
脱グリコシル化は、グリコシダーゼを使用する酵素的消化についての技術である。脱グリコシル化は、５００μｌのコンジュゲート＋１００μｌのＴｒｉｓ  ＨＣｌの５０ｍＭ緩衝液＋１０μｌのグリカナーゼ−Ｆ酵素（１００単位の凍結乾燥酵素／１００μｌの水）から出発して実施する。混合物をボルテックスにかけ、３７℃において一晩維持する。次いで、脱グリコシル化された試料をＨＲＭＳにより分析する。場合に応じて、試料のＨＲＭＳ分析は、事前の脱グリコシル化を行うことなく実施することもできる。両方の場合、質量スペクトルは、Ｗａｔｅｒｓ  Ｑ−Ｔｏｆ−２装置によりポジティブエレクトロスプレーモード（ＥＳ＋）で得た。クロマトグラフィー条件：カラム：４μｍ  ＢｉｏＳｕｉｔｅ  ２５０  ＵＲＨ  ＳＥＣ  ４．６×３００ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ）；溶媒：Ａ：２５ｍＭギ酸アンモニウム＋１％のギ酸：Ｂ：ＣＨ３ＣＮ；カラム温度３０℃：流速０．４ｍｌ／分；均一濃度７０％Ａ＋３０％Ｂ（１５分）。
【０１６３】
本特許出願に記載の全ての中間体化合物は、式（Ｉ）の化合物の調製におけるこれらの使用について特許請求される。さらに特定すると、各実施例について、記載される全ての中間体化合物は、式（Ｉ）のそれぞれの化合物の調製におけるこれらの使用について特許請求される。
【０１６４】
［実施例１］
１．１．コンジュゲートの調製
コンジュゲートは、ｈｕ２Ｈ１１（ＷＯ２００８０１０１０１の１５頁にｈｕ５３  ２Ｈ１１としても公知。これは、アミノ酸配列の配列番号２４を有するＶＨを含む抗体である。）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミジル  ３−（２−｛２−［２−（２−｛３−［３−（２−｛［２−（２，６−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン−８−イルオキシメチル］ピリジン−４−イルオキシ）エチル］（メチル）アミノ｝−１，１−ジメチルエチルスルファニル）−２，５−ジオキソピロリジン−１−イル］プロパノイルアミノ｝エトキシ）エトキシ］エトキシ｝エトキシ）プロパノアートを反応させることにより調製する。
【０１６５】
５１６μｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミジル  ３−（２−｛２−［２−（２−｛３−［３−（２−｛［２−（２，６−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン−８−イルオキシメチル］ピリジン−４−イルオキシ）エチル］（メチル）アミノ｝−１，１−ジメチルエチルスルファニル）−２，５−ジオキソピロリジン−１−イル］プロパノイルアミノ｝エトキシ）エトキシ］エトキシ｝エトキシ）プロパノアートの５４０μｌのＤＭＡ中溶液を、０．０５Ｍ濃度のＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、０．０５Ｍ濃度のＮａＣｌおよび２ｍＭ濃度のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を有する２．１６ｍｌの水性緩衝液（ｐＨ＝８）中の８．１９ｍｇのｈｕ２Ｈ１１に添加する。ＡＴにおいて３時間撹拌した後、混合物をＭｉｌｌｅｘ（登録商標）−ＳＶ  ０．４５μＭ（ＰＶＤＦ  Ｄｕｒａｐｏｒｅ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通して濾過し、ＨＣｌの添加によりｐＨ＝６．５としたリン酸緩衝塩中で予備平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００プレップグレードカラム（Ｈｉｌｏａｄ（商標）２６／６０  ＧＥカラム）上で精製する。対象となる分画を合わせ、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５（Ｕｌｔｒａｃｅｌ  ５０ｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上で濃縮し、次いで１０％のスクロースおよび５％のＮＭＰを含む１０ｍＭ濃度のヒスチジンを有する水性緩衝液中で予備平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５（ＮＡＰ−５およびＮＡＰ−１０ＧＥカラム）に通して濾過する。
【０１６６】
得られたコンジュゲート（２．５ｍｌ）を、分光光度法により４−｛２−［メチル（２−メチル−２−メルカプトプロピル）アミノ］エトキシ｝−２，６−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン−８−イルオキシメチル］ピリジンの吸光係数（ｅ３１９ｎｍ＝８８４８Ｍ−１ｃｍ−１およびｅ２８０ｎｍ＝８６３４Ｍ−１ｃｍ−１）およびｈｕ２Ｈ１１の吸光係数（ｅ２８０ｎｍ＝２０８３８０Ｍ−１ｃｍ−１）を使用して定量し、１．５２ｍｇ／ｍｌの濃度における抗体分子当たり平均３．８個のトマイマイシン二量体が測定された。
【０１６７】
１．２．Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル  ３−（２−｛２−［２−（２−｛３−［３−（２−｛［２−（２，６−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン−８−イルオキシメチル］ピリジン−４−イルオキシ）エチル］（メチル）アミノ｝−１，１−ジメチルエチルスルファニル）−２，５−ジオキソピロリジン−１−イル］プロパノイルアミノ｝エトキシ）エトキシ］エトキシ｝エトキシ）プロパノアート
【０１６８】
【化５７】
0005889189.tif 000060
９．８２ｍｇの４−｛２−［メチル（２−メチル−２−メルカプトプロピル）アミノ］エトキシ｝−２，６−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン−８−イルオキシメチル］ピリジンの５０μｌのＤＭＡ中溶液および６．８ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミジル  ３−｛２−［２−（２−｛２−［３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロピロール−１−イル）プロパノイルアミノ］エトキシ｝エトキシ）エトキシ］エトキシ｝−プロパノアートの５０μｌのＤＭＡ中溶液を、樹脂上に支持された３．３ｍｇのジイソプロピルエチルアミン（３．７２ｍｍｏｌ／ｇ）に添加する。得られた混合物をＡＴにおいて２４時間撹拌し、次いでシリカ（Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ  Ｐｕｒｉｆｌａｓｈ  Ｓｉｌｉｃａ  １５／３５Ｕ  ２Ｇ）に通して、ＤＣＭ中０から１０％のメタノール勾配を使用して濾過する。所望の生成物を含む分画を合わせ、ＲＰ下で濃縮し、次いでシリカ（Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ  Ｐｕｒｉｆｌａｓｈ  Ｓｉｌｉｃａ  １５／３５Ｕ  ２Ｇ）上でのフラッシュクロマトグラフィーによりＤＣＭ中０から１０％のＭｅＯＨの勾配を使用して精製する。所望の生成物を含む分画を合わせ、ＲＰ下で濃縮する。１．１６ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミジル  ３−（２−｛２−［２−（２−｛３−［３−（２−｛［２−（２，６−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン−８−イルオキシメチル］ピリジン−４−イルオキシ）エチル］（メチル）アミノ｝−１，１−ジメチルエチルスルファニル）−２，５−ジオキソピロリジン−１−イル］プロパノイルアミノ｝エトキシ）エトキシ］エトキシ｝エトキシ）プロパノアートをこうして得る。ＬＣ／ＭＳ（Ｅ）：ｒｔ＝１．３８分；［Ｍ＋Ｈ］＋：ｍ／ｚ  １３２２。
【０１６９】
１．３．４−｛２−［メチル（２−メチル−２−メルカプトプロピル）アミノ］エトキシ｝−２，６−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン−８−イルオキシメチル］ピリジン
【０１７０】
【化５８】
0005889189.tif 000061
４０ｍｇのトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩および３６．６ｍｇのＮａＨＣＯ３の６８０μｌの水中溶液を、４０ｍｇの４−｛２−［メチル（２−メチル−２−メチルジスルファニルプロピル）アミノ］エトキシ｝−２，６−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン−８−イルオキシメチル］ピリジンの２．１ｍｌのメタノールおよび９３０μｌのＤＭＦ中溶液に添加する。混合物をＡＴにおいて４５分間撹拌し、次いでＲＰ下で濃縮し、シリカ（Ｍｅｒｃｋ  ＳｕｐｅｒＶａｒｉｏＦｌａｓｈ  １５ｇカラム、Ｓｉ６０  １５−４０μｍ）上でのフラッシュクロマトグラフィーにより、ＤＣＭ／アセトニトリルの９：１混合物中０から１０％のＭｅＯＨ勾配を使用して精製する。所望の生成物を含む分画を合わせ、ＲＰ下で濃縮する。２１ｍｇの４−｛２−［メチル（２−メチル−２−メルカプトプロピル）アミノ］エトキシ｝−２，６−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン−８−イルオキシメチル］ピリジンをこうして得る。ＬＣ／ＭＳ（Ｅ）：ｒｔ＝１．２８分；［Ｍ＋Ｈ］＋：ｍ／ｚ  ８０９；［Ｍ＋Ｈ２Ｏ＋Ｈ］＋：ｍ／ｚ  ８２７。
【０１７１】
１．４．４−｛２−［メチル（２−メチル−２−（メチルジスルファニル）プロピル）アミノ］エトキシ｝−２，６−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン−８−イルオキシメチル］ピリジン
【０１７２】
【化５９】
0005889189.tif 000062
１９．６μｌの塩化メタンスルホニルを、−２５℃に冷却した２２ｍｇの４−｛２−［メチル（２−メチル−２−（メチルジスルファニル）プロピル）アミノ］エトキシ｝−２，６−ビス（ヒドロキシメチル）ピリジンおよび５３μｌのＴＥＡの０．５ｍｌのＤＣＭ中溶液に添加する。３０分間撹拌した後、混合物を加水分解し、有機相を水により洗浄し、次いでＭｇＳＯ４で脱水し、ＲＰ下で濃縮する。こうして得られた残留物（２２ｍｇ）を、２０ｍｇのトマイマイシンの０．７ｍｌのＤＭＦ中溶液に添加し、さらに３０ｍｇのＫ２ＣＯ３および１２ｍｇのＫＩを添加する。混合物を３０℃において２時間撹拌し、次いで４ｍｌの水により加水分解する。得られた沈殿物を水により洗浄し、真空下で乾燥させ、次いでＤＣＭ中で溶解させ、ＲＰ下で濃縮し、シリカ（Ｍｅｒｃｋ  ＳｕｐｅｒＶａｒｉｏＦｌａｓｈ  １５ｇカラム、Ｓｉ６０  １５−４０μｍ）上でのフラッシュクロマトグラフィーにより、ＤＣＭ中０から５％のＭｅＯＨの勾配を使用して精製する。所望の生成物を含む分画を合わせ、ＲＰ下で濃縮する。８ｍｇの４−｛２−［メチル（２−メチル−２−（メチルジスルファニル）プロピル）アミノ］エトキシ｝−２，６−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン−８−イルオキシメチル］ピリジンをこうして得る。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ｄ−クロロホルム）：１．２８（ｓ，６Ｈ）；１．７６（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，６Ｈ）；２．３９（ｓ，３Ｈ）；２．４３（ｓ，３Ｈ）；２．６０（ｓ，２Ｈ）；２．９１（ｓ，２Ｈ）；２．９７（ｓ，４Ｈ）；３．９１（ｄ，Ｊ＝４．２Ｈｚ，２Ｈ）；４．００（ｓ，６Ｈ）；４．０９（ｓ，２Ｈ）；４．２７（ｓ，４Ｈ）；５．２７（ｓ，４Ｈ）；５．６１（ｑ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ）；６．８５（ｓ，２Ｈ）；７．００（ｓ，２Ｈ）；７．５６（ｓ，２Ｈ）；７．６５（ｄ，Ｊ＝４．２Ｈｚ，２Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ（Ａ）：ｒｔ＝０．７４分；［Ｍ＋Ｈ］＋：ｍ／ｚ  ８５５；［Ｍ−Ｈ］−：ｍ／ｚ  ８５３。
【０１７３】
１．５．４−｛２−［メチル（２−メチル−２−（メチルジスルファニル）プロピル）アミノ］エトキシ｝−２，６−ビス（ヒドロキシメチル）ピリジン
【０１７４】
【化６０】
0005889189.tif 000063
３６５μｌのギ酸を、０℃に冷却した３２２ｍｇの４−［２−（２−メチル−２−（メチルジスルファニル）プロピルアミノ）エトキシ］−２，６−ビス（ヒドロキシメチル）ピリジンの２６２μｌのホルムアルデヒド中懸濁液に添加する。混合物を１００℃において１と１／４時間加熱した。周囲温度に戻した後、混合物を加水分解し、次いで５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液をｐＨ＝１２が得られるまで添加する。水相をＡｃＯＥｔにより３回抽出し、合わせた有機相をＭｇＳＯ４で脱水し、ＲＰ下で濃縮する。３１０ｍｇの４−｛２−［メチル（２−メチル−２−（メチルジスルファニル）プロピル）アミノ］エトキシ｝−２，６−ビス（ヒドロキシメチル）ピリジンをこうして得る。
【０１７５】
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）：１．２６（ｓ，６Ｈ）；２．３９（ｓ，３Ｈ）；２．４０（ｓ，３Ｈ）；２．６０（ｓ，２Ｈ）；２．８８（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ）；４．１３（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ）；４．４５（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，４Ｈ）；５．３１（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ）；６．８５（ｓ，２Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ（Ａ）：ｒｔ＝０．２２分；［Ｍ＋Ｈ］＋：ｍ／ｚ  ３３３；［Ｍ＋ＨＣＯ２Ｈ−Ｈ］−：ｍ／ｚ  ３７７。
【０１７６】
１．６．４−［２−（２−メチル−２−（メチルジスルファニル）プロピルアミノ）エトキシ］−２，６−ビス（ヒドロキシメチル）ピリジン
【０１７７】
【化６１】
0005889189.tif 000064
２７０μｌの２−（メチルジチオ）イソブチルアルデヒドおよび７３０μｌのチタンイソプロポキシドを、３９０ｍｇの４−［２−アミノエトキシ］−２，６−ビス（ヒドロキシメチル）ピリジン（ＷＯ０７０８５９３０の１０１頁に記載の４−（２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）エトキシ）−２，６−ビス（ヒドロキシメチル）ピリジンからＢｏｃ基を脱保護した後に調製）の２ｍｌのＴＨＦ中懸濁液に添加する。２０分後、追加の２７０μｌの２−（メチルジチオ）イソブチルアルデヒドおよび追加の７３０μｌのチタンイソプロポキシドを添加し、混合物をＡＴにおいて２時間撹拌する。次いで、６ｍｌのエタノールを混合物に添加し、混合物をＡＴにおいて２０分間撹拌し、次いで１２４ｍｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを混合物に添加する。４５分間撹拌した後、追加の１２４ｍｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加し、１時間撹拌した後、混合物をＲＰ下で濃縮し、残留物をＡｃＯＥｔおよび水中で希釈する。得られた沈殿物を濾別し、１ＭのＨＣｌ水溶液中で溶解させる。得られた水相を５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液により塩基性ｐＨとし、ＤＣＭにより３回抽出し、合わせた有機相をＲＰ下で濃縮する。３２２ｍｇの４−［２−（２−メチル−２−（メチルジスルファニル）プロピルアミノ）エトキシ］−２，６−ビス（ヒドロキシメチル）ピリジンをこうして得る。
【０１７８】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）：１．２６（ｓ，６Ｈ）；１．８１（ｂｒｏａｄ  ｍ，１Ｈ）；２．３９（ｓ，３Ｈ）；２．６７（ｂｒｏａｄ  ｓ，２Ｈ）；２．９４（ｂｒｏａｄ  ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ）；４．１１（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ）；４．４５（ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，４Ｈ）；５．３２（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，２Ｈ）；６．８５（ｓ，２Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ（Ａ）：ｒｔ＝０．２４分；［Ｍ＋Ｈ］＋：ｍ／ｚ  ３４７。
【０１７９】
［実施例２］
２．１．コンジュゲートの調製
コンジュゲートを、実施例１と同様に、ｈｕ２Ｈ１１およびＮ−ヒドロキシスクシンイミジル  ３−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−｛［２−（２，６−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン−８−イルオキシメチル］ピリジン−４−イルオキシ）エチル］（メチル）アミノ｝−１，１−ジメチルエチルスルファニル）アセチルアミノ］エトキシ｝エトキシ）エトキシ］エトキシ｝プロパノアートを反応させることにより調製する。得られたコンジュゲートを、分光光度法により４−｛２−［メチル（２−メチル−２−メルカプトプロピル）アミノ］エトキシ｝−２，６−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン−８−イルオキシメチル］ピリジンの吸光係数（ｅ３１９ｎｍ＝８８４８Ｍ−１ｃｍ−１、ｅ２８０ｎｍ＝８６３４Ｍ−１ｃｍ−１）およびｈｕ２Ｈ１１の吸光係数（ｅ２８０ｎｍ＝２０８３８０Ｍ−１ｃｍ−１）を使用して定量する。抗体分子当たり平均５．６個のトマイマイシン二量体が測定された。
【０１８０】
２．１．Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル  ３−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−｛［２−（２，６−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン−８−イルオキシメチル］ピリジン−４−イルオキシ）エチル］（メチル）アミノ｝−１，１−ジメチルエチルスルファニル）アセチルアミノ］エトキシ｝エトキシ）エトキシ］−エトキシ｝プロパノアート
【０１８１】
【化６２】
0005889189.tif 000065
５．５ｍｇのＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカルボナートおよび１５μｌのＤＩＰＥＡを、１２ｍｇの３−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−｛［２−（２，６−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン−８−イルオキシメチル］ピリジン−４−イルオキシ）エチル］（メチル）アミノ｝−１，１−ジメチルエチルスルファニル）アセチルアミノ］エトキシ｝エトキシ）エトキシ］エトキシ｝プロパン酸の１ｍｌのＴＨＦおよび１ｍｌのＤＣＭ中溶液に添加する。ＡＴにおいて３時間後、４ｍｌのＤＣＭを添加し、得られた有機相を水により２回洗浄し、ＭｇＳＯ４で脱水し、ＲＰ下で濃縮し、残留物をシリカ（Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ  Ｐｕｒｉｆｌａｓｈ  Ｓｉｌｉｃａ  １５／３５Ｕ  ２Ｇ）上でのフラッシュクロマトグラフィーによりＤＣＭ中３から８％のメタノールの勾配を使用して精製する。８ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミジル  ３−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−｛［２−（２，６−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン−８−イルオキシメチル］ピリジン−４−イルオキシ）エチル］（メチル）アミノ｝−１，１−ジメチルエチルスルファニル）アセチルアミノ］エトキシ｝エトキシ）エトキシ］エトキシ｝プロパノアートをこうして得る。ＬＣ／ＭＳ（Ｅ）：ｒｔ＝１．３６分；［Ｍ＋２  Ｈ２Ｏ＋Ｎａ］＋：ｍ／ｚ  １２７０；［Ｍ＋Ｈ２Ｏ＋Ｎａ］＋：ｍ／ｚ  １２５２；［Ｍ＋Ｈ２Ｏ＋Ｈ］＋：ｍ／ｚ  １２２９；［Ｍ＋Ｈ］−：ｍ／ｚ  １２１１。
【０１８２】
２．２．３−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−｛［２−（２，６−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン−８−イルオキシメチル］ピリジン−４−イルオキシ）エチル］（メチル）アミノ｝−１，１−ジメチルエチルスルファニル）アセチルアミノ］エトキシ｝エトキシ）−エトキシ］エトキシ｝プロパン酸
【０１８３】
【化６３】
0005889189.tif 000066
１７．５μｌの水酸化リチウム水溶液および１００μｌの水を、１８ｍｇのメチル  ３−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−｛［２−（２，６−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン−８−イルオキシメチル］ピリジン−４−イルオキシ）エチル］（メチル）アミノ｝−１，１−ジメチルエチルスルファニル）アセチルアミノ］エトキシ｝エトキシ）エトキシ］エトキシ｝−プロパノアートの２７０μｌのＴＨＦ中溶液に添加する。２時間後、混合物をＤＣＭ中で希釈し、リン酸緩衝液をｐＨ＝３まで添加する。得られた水相をＤＣＭにより３回抽出し、合わせた有機相をＭｇＳＯ４で脱水し、ＲＰ下で濃縮し、残留物をシリカ（Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ  Ｐｕｒｉｆｌａｓｈ  Ｓｉｌｉｃａ  １５／３５Ｕ  ２Ｇ）上でのフラッシュクロマトグラフィーによりＤＣＭ中３から１５％のメタノールの勾配を使用して精製する。１１．５ｍｇの３−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−｛［２−（２，６−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン−８−イルオキシメチル］ピリジン−４−イルオキシ）エチル］（メチル）アミノ｝−１，１−ジメチルエチルスルファニル）アセチルアミノ］エトキシ｝−エトキシ）エトキシ］エトキシ｝プロパン酸をこうして得る。ＬＣ／ＭＳ（Ｄ）：ｒｔ＝０．８８分；［Ｍ＋Ｈ２Ｏ＋Ｎａ］＋：ｍ／ｚ  １１５４；［Ｍ＋Ｈ２Ｏ＋Ｈ］＋：ｍ／ｚ  １１３３；［Ｍ＋Ｈ］＋：ｍ／ｚ  １１１５。
【０１８４】
２．３．メチル  ３−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−｛［２−（２，６−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン−８−イルオキシメチル］ピリジン−４−イルオキシ）エチル］（メチル）アミノ｝−１，１−ジメチルエチルスルファニル）アセチルアミノ］エトキシ｝エトキシ）エトキシ］−エトキシ｝プロパノアート
実施例１に従って、メチル  ３−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−｛［２−（２，６−ビス（ヒドロキシメチル）ピリジン−４−イルオキシ）エチル］メチルアミノ｝−１，１−ジメチルエチルスルファニル）アセチルアミノ］エトキシ｝エトキシ）エトキシ］エトキシ｝−プロパノアートから調製する。
【０１８５】
【化６４】
0005889189.tif 000067
ＬＣ／ＭＳ（Ｄ）：ｒｔ＝０．９３分；［Ｍ＋Ｈ２Ｏ＋Ｈ］＋：ｍ／ｚ  １１４６；［Ｍ＋Ｈ］＋：ｍ／ｚ  １１２８。
【０１８６】
２．４．メチル  ３−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−｛［２−（２，６−ビス（ヒドロキシメチル）ピリジン−４−イルオキシ）エチル］（メチル）−アミノ｝−１，１−ジメチルエチルスルファニル）アセチルアミノ］エトキシ｝エトキシ）エトキシ］エトキシ｝プロパノアート
【０１８７】
【化６５】
0005889189.tif 000068
７３．７ｍｇのメチル  ３−［２−（２−｛２−［２−（２−ヨードアセチルアミノ）エトキシ］エトキシ｝エトキシ）エトキシ］プロパノアートの１ｍｌのＤＭＦおよび３９μｌのＤＩＰＥＡ中溶液を、４５ｍｇの４−｛２−［（２−メルカプト−２−メチルプロピル）（メチル）アミノ］エトキシ｝−２，６−ビス（ヒドロキシメチル）ピリジンの１ｍｌのＤＭＦ中溶液に添加する。ＡＴにおいて２４時間後、混合物をＲＰ下で濃縮し、シリカ（Ａｎａｌｏｇｉｘ  Ｓｕｐｅｒ  Ｆｌａｓｈ  ＳｉＯ２ＳＦ２５−８ｇ）上でのフラッシュクロマトグラフィーによりＤＣＭ中０から１０％のメタノールの勾配を使用して精製する。５３ｍｇのメチル  ３−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−｛［２−（２，６−ビス（ヒドロキシメチル）ピリジン−４−イルオキシ）エチル］（メチル）アミノ｝−１，１−ジメチルエチルスルファニル）アセチルアミノ］エトキシ｝エトキシ）エトキシ］エトキシ｝プロパノアートをこうして得る。
【０１８８】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）：１．２１（ｓ，６Ｈ）；２．４０（ｓ，３Ｈ）；２．５０  ｔｏ  ２．５６（ｍ，４Ｈ）；２．８７（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ）；３．１５  ｔｏ  ３．２３（ｍ，４Ｈ）；３．４０（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ）；３．４７  ｔｏ  ３．５２（ｍ，１２Ｈ）；３．５９（ｓ，３Ｈ）；３．６２（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ）；４．１３（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ）；４．４５（ｄ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，４Ｈ）；５．３１（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ）；６．８５（ｓ，２Ｈ）；７．９８（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，１Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ（Ａ）：ｒｔ＝０．３５分；［Ｍ＋Ｈ］＋：ｍ／ｚ  ６２０；［Ｍ＋２Ｈ］２＋：ｍ／ｚ  ３１０．５（ベースピーク）；［Ｍ−Ｈ＋ＨＣＯ２Ｈ］−：ｍ／ｚ  ６６４。
【０１８９】
２．５．メチル  ３−［２−（２−｛２−［２−（２−ヨードアセチルアミノ）エトキシ］エトキシ｝エトキシ）エトキシ］プロパノアート
【０１９０】
【化６６】
0005889189.tif 000069
１１７．４ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミジルヨードアセタートの３ｍｌのＤＣＭ中溶液を、１００ｍｇの３−（２−｛２−［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］エトキシ｝エトキシ）プロパン酸に添加する。ＡＴにおいて２時間後、３３０μｌのＭｅＯＨを添加し、混合物を０℃に冷却する。３６０μｌのトリメチルシリルジアゾメタンのヘキサン中２Ｍ溶液を添加する。１時間後、混合物を５０μｌの酢酸の添加により中和し、次いで飽和ＮａＨＣＯ３水溶液をｐＨ＝８が得られるまで添加する。有機相をＭｇＳＯ４で脱水し、ＲＰ下で濃縮し、残留物をシリカ（Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ  Ｐｕｒｉｆｌａｓｈ  Ｓｉｌｉｃａ  １５／３５Ｕ  １０Ｇ）上でのフラッシュクロマトグラフィーによりＤＣＭ中０から１０％のメタノールの勾配を使用して精製する。１３２ｍｇのメチル  ３−［２−（２−｛２−［２−（２−ヨードアセチルアミノ）エトキシ］エトキシ｝エトキシ）エトキシ］−プロパノアートをこうして得る。
【０１９１】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）：２．５４（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ）；３．２０（ｑ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ）；３．４１（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ）；３．４８  ｔｏ  ３．５３（ｍ，１２Ｈ）；３．６０（ｓ，３Ｈ）；３．６３（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ）；３．６５（ｓ，２Ｈ）；８．２７（ｂｒｏａｄ  ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，１Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ（Ａ）：ｒｔ＝０．５４分；［Ｍ＋Ｈ］＋：ｍ／ｚ  ４４８；［Ｍ＋ＨＣＯ２Ｈ−Ｈ］−：ｍ／ｚ  ４９２。
【０１９２】
２．６．４−｛２−［（２−メルカプト−２−メチルプロピル）（メチル）アミノ］エトキシ｝−２，６−ビス（ヒドロキシメチル）ピリジン
【０１９３】
【化６７】
0005889189.tif 000070
１９８ｍｇのトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩の７３０μｌの水中溶液を、８０ｍｇの４−｛２−［メチル（２−メチル−２−（メチルジスルファニル）プロピル）アミノ］エトキシ｝−２，６−ビス（ヒドロキシメチル）ピリジンの１．９５ｍｌのメタノール中溶液に添加する。ＡＴにおいて２時間後、混合物をＲＰ下で濃縮し、残留物を１０ｍｌの水中で溶解させる。水相を水酸化ナトリウム水溶液の添加によりｐＨ＝８とし、次いでＡｃＯＥｔにより２回抽出する。合わせた有機相を飽和ＮａＣｌ水溶液により洗浄し、ＲＰ下で濃縮する。６８ｍｇの４−｛２−［（２−メルカプト−２−メチルプロピル）（メチル）アミノ］エトキシ｝−２，６−ビス（ヒドロキシメチル）ピリジンをこうして得る。
【０１９４】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）：１．２８（ｓ，６Ｈ）；２．４３（ｓ，３Ｈ）；２．５４（ｓ，２Ｈ）；２．６２（ｓ，１Ｈ）；２．９１（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ）；４．１５（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ）；４．４５（ｄ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，４Ｈ）；５．３０（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ）；６．８５（ｓ，２Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ（Ａ）：ｒｔ＝０．１１分；［Ｍ＋Ｈ］＋：ｍ／ｚ  ３０１。
【０１９５】
［実施例３］
３．１．コンジュゲートの調製
コンジュゲートを、実施例１と同様に、ｈｕ２Ｈ１１およびＮ−ヒドロキシスクシンイミジル  ３−（２−｛２−［２−（２−｛２−［１−（３，５−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾ−ジアゼピン−５−オン−８−イルオキシメチル］フェニル−４−イル）−１−メチルエチルスルファニル］アセチルアミノ｝エトキシ）エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）プロパノアートを反応させることにより調製する。
【０１９６】
得られたコンジュゲートを、分光光度法により、１−（１−メチル−１−（メチルジスルファニル）エチル）−３，５−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン−８−イルオキシメチル］ベンゼンの吸光係数（ｅ３１９ｎｍ＝８４６０Ｍ−１ｃｍ−１およびｅ２８０ｎｍ＝１０５３１Ｍ−１ｃｍ−１）およびｈｕ２Ｈ１１の吸光係数（ｅ２８０ｎｍ＝２０８３８０Ｍ−１ｃｍ−１）を使用して定量する。抗体分子当たり平均４．２個のトマイマイシン誘導体が測定された。
【０１９７】
３．２．Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル  ３−（２−｛２−［２−（２−｛２−［１−（３，５−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン−８−イルオキシメチル］フェニル−４−イル）−１−メチルエチルスルファニル］アセチルアミノ｝エトキシ）エトキシ］エトキシ｝エトキシ）プロパノアート
実施例２と同様に、３−（２−｛２−［２−（２−｛２−［１−（３，５−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン−８−イルオキシメチル］フェニル−４−イル）−１−メチルエチルスルファニル］アセチルアミノ｝エトキシ）エトキシ］エトキシ｝エトキシ）プロパン酸から調製する。
【０１９８】
【化６８】
0005889189.tif 000071
ＬＣ／ＭＳ（Ｆ）：ｒｔ＝１．２７分；［Ｍ＋Ｈ］＋：ｍ／ｚ  １１２３。
【０１９９】
３．３．３−（２−｛２−［２−（２−｛２−［１−（３，５−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン−８−イルオキシメチル］フェニル−４−イル）−１−メチルエチルスルファニル］アセチルアミノ｝エトキシ）エトキシ］エトキシ｝エトキシ）プロパン酸
実施例２と同様に、メチル  ３−（２−｛２−［２−（２−｛２−［１−（３，５−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン−８−イルオキシメチル］フェニル−４−イル）−１−メチル−エチルスルファニル］アセチルアミノ｝エトキシ）エトキシ］エトキシ｝エトキシ）プロパノアートから調製する。
【０２００】
【化６９】
0005889189.tif 000072
ＬＣ／ＭＳ（Ｆ）：ｒｔ＝１．１９分；［Ｍ＋Ｈ］＋：ｍ／ｚ  １０２６。
【０２０１】
３．４．メチル  ３−（２−｛２−［２−（２−｛２−［１−（３，５−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン−８−イルオキシメチル］フェニル−４−イル）−１−メチルエチルスルファニル］アセチルアミノ｝エトキシ）エトキシ］エトキシ｝エトキシ）プロパノアート
実施例２と同様に、メチル  ３−（２−｛２−［２−（２−｛２−［１−（３，５−ビス（ヒドロキシメチル）フェニル）−１−メチルエチルスルファニル］アセチルアミノ｝エトキシ）エトキシ］エトキシ｝エトキシ）プロパノアートから調製する。
【０２０２】
【化７０】
0005889189.tif 000073
ＬＣ／ＭＳ（Ｆ）：ｒｔ＝１．２８分；［Ｍ＋Ｈ］＋：ｍ／ｚ  １０４０。
【０２０３】
３．５．メチル  ３−（２−｛２−［２−（２−｛２−［１−（３，５−ビス（ヒドロキシメチル）フェニル）−１−メチルエチルスルファニル］−アセチルアミノ｝エトキシ）エトキシ］エトキシ｝エトキシ）プロパノアート
実施例２と同様に、３，５−ビス（ヒドロキシメチル）−１−（１−メルカプト−１−メチルエチル）ベンゼンから調製する。
【０２０４】
【化７１】
0005889189.tif 000074
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）：１．６４（ｓ，６Ｈ）；２．５３（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ）；２．９３（ｓ，２Ｈ）；３．１５（ｑ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ）；３．３７（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ）；３．４９（ｍ，１２Ｈ）；３．５９（ｓ，３Ｈ）；３．６２（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ）；４．４９（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，４Ｈ）；５．１３（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ）；７．１４（ｓ，１Ｈ）；７．３２（ｓ，２Ｈ）；７．８４（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ（Ｂ）：ｒｔ＝２．９８分；［Ｍ＋Ｈ］＋：ｍ／ｚ  ５３２；ベースピーク：ｍ／ｚ  ３５４；［Ｍ−Ｈ＋ＨＣＯ２Ｈ］−：ｍ／ｚ  ５７６。
【０２０５】
３．８．３，５−ビス（ヒドロキシメチル）−１−（１−メルカプト−１−メチルエチル）ベンゼン
【０２０６】
【化７２】
0005889189.tif 000075
４３ｍｇの５−ヒドロキシメチル−１−（１−メルカプト−１−メチルエチル）−３−［（ｔｅｒｔ−ブチル）ジメチルシラニルオキシメチル］ベンゼンの１ｍｌの酢酸／ＴＨＦ／水（３／１／１）混合物中溶液を、ＡＴにおいて４．５時間撹拌し、ＲＰ下で濃縮し、次いで残留物を３ｍｌの水中で溶解させる。水相のｐＨを１０％Ｎａ２ＣＯ３水溶液の添加により７とし、次いで水相をＡｃＯＥｔにより抽出する。有機相をＭｇＳＯ４で脱水し、ＲＰ下で濃縮する。１８ｍｇの３，５−ビス（ヒドロキシメチル）−１−（１−メルカプト−１−メチルエチル）ベンゼンをこうして得る。
【０２０７】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）：１．７６（ｓ，６Ｈ）；３．１９（ｓ，１Ｈ）；４．４８（ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，４Ｈ）；５．１４（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ）；７．１３（ｓ，１Ｈ）；７．３６（ｓ，２Ｈ）。ＭＳ（Ｃ）：ＣＩ：［Ｍ＋ＮＨ４］＋：ｍ／ｚ  ２３０。
【０２０８】
３．９．５−ヒドロキシメチル−１−（１−メルカプト−１−メチルエチル）−３−［（ｔｅｒｔ−ブチル）ジメチルシラニルオキシメチル］ベンゼン
【０２０９】
【化７３】
0005889189.tif 000076
１１４μｌのヒドラジン水和物を、３３６ｍｇの１−｛３−［（ｔｅｒｔ−ブチル）ジメチルシラニルオキシメチル］−５−（ヒドロキシメチル）フェニル｝−１−メチルエチルチオアセタートの３．７ｍｌのアセトニトリル中溶液に添加する。ＡＴにおいて３時間後、混合物をＲＰ下で濃縮し、残留物をシリカ（Ｂｉｏｔａｇｅ  ２５＋Ｍ）上でのフラッシュクロマトグラフィーにより、ヘプタン中０から５５％ＡｃＯＥｔの勾配を使用して精製する。２３０ｍｇの５−ヒドロキシメチル−１−（１−メルカプト−１−メチルエチル）−３−［（ｔｅｒｔ−ブチル）ジメチルシラニルオキシメチル］ベンゼンをこうして得る。
【０２１０】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）：０．０８（ｓ，６Ｈ）；０．９２（ｓ，９Ｈ）；１．７６（ｓ，６Ｈ）；３．１９（ｓ，１Ｈ）；４．４８（ｄ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ）；４．７１（ｓ，２Ｈ）；５．１４（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ）；７．１０（ｓ，１Ｈ）；７．３３  ｔｏ  ７．４２（ｍ，２Ｈ）。ＭＳ（Ｃ）：ＣＩ：［Ｍ＋ＮＨ４］＋：ｍ／ｚ  ３４４。
【０２１１】
３．１０．１−［３−［（ｔｅｒｔ−ブチル）ジメチルシラニルオキシメチル］−５−（ヒドロキシメチル）フェニル］−１−メチルエチルチオアセタート
【０２１２】
【化７４】
0005889189.tif 000077
４０４μｌのチオ酢酸および３７６ｍｇのヨウ化亜鉛を、１ｇの１−（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）−３，５−ビス［（ｔｅｒｔ−ブチル）ジメチルシラニルオキシメチル］ベンゼンの４．７ｍｌの１，２−ジクロロエタン中溶液に添加する。混合物を５０℃において４０分間加熱する。ＡＴに戻した後、塩を濾過により除去し、有機相をＲＰ下で濃縮し、残留物をシリカ（Ｂｉｏｔａｇｅ  ４０＋Ｍ）上でのフラッシュクロマトグラフィーによりヘプタン中０から３０％ＡｃＯＥｔの勾配を使用して精製する。２４８ｍｇの１−［３−［（ｔｅｒｔ−ブチル）ジメチルシラニルオキシメチル］−５−（ヒドロキシメチル）フェニル］−１−メチルエチル  チオアセタートをこうして得る。
【０２１３】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）：０．０８（ｓ，６Ｈ）；０．９１（ｓ，９Ｈ）；１．７９（ｓ，６Ｈ）；２．１７（ｓ，３Ｈ）；４．４８（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ）；４．７０（ｓ，２Ｈ）；５．１６（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ）；７．１１（ｓ，１Ｈ）；７．３３（ｓ，１Ｈ）；７．３５（ｓ，１Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ（Ａ）：ｒｔ＝１．２３分；［Ｍ＋Ｎａ］＋：ｍ／ｚ  ３９１
【０２１４】
３．１１．１−（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）−３，５−ビス［（ｔｅｒｔ−ブチル）ジメチルシラニルオキシメチル］ベンゼン
【０２１５】
【化７５】
0005889189.tif 000078
ヘキサン中１．６Ｍ溶液としての１０．５ｍｌのｎ−ＢｕＬｉを、−７１℃に冷却した４．３２ｇの１−ブロモ−３，５−ビス［（ｔｅｒｔ−ブチル）ジメチルシラニルオキシメチル］ベンゼン（Ｇ．Ｔ．Ｃｒｉｓｐ  ａｎｄ  Ｐ．Ｄ．Ｔｕｒｎｅｒ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，２０００，５６（４２），８３３５）の１５０ｍｌのＴＨＦ中溶液に滴加する。１時間３０分後、４．２７ｍｌのアセトンを滴加する。混合物をＡＴに戻し、次いで飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液により加水分解する。水相を１００ｍｌのＡｃＯＥｔにより抽出し、合わせた有機相をＭｇＳＯ４で脱水し、ＲＰ下で濃縮し、残留物をシリカ（Ｂｉｏｔａｇｅ  ６５＋Ｍ）上でのフラッシュクロマトグラフィーによりヘプタン中０から２０％ＡｃＯＥｔの勾配を使用して精製する。２．４８ｇの１−（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）−３，５−ビス［（ｔｅｒｔ−ブチル）ジメチルシラニルオキシメチル］ベンゼンをこうして得る。
【０２１６】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ−クロロホルム）：０．１１（ｓ，１２Ｈ）；０．９６（ｓ，１８Ｈ）；１．５９（ｓ，６Ｈ）；１．６９（ｓ，１Ｈ）；４．７６（ｓ，４Ｈ）；７．２１（ｓ，１Ｈ）；７．３３（ｓ，２Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ（Ｂ）：ｒｔ＝６．４３分；［Ｍ＋Ｎａ］＋：ｍ／ｚ  ４４７；ベースピーク：ｍ／ｚ  ４０７。
【０２１７】
［実施例４］
４．１．コンジュゲートの調製
コンジュゲートを、実施例１と同様に、ｈｕ２Ｈ１１およびＮ−ヒドロキシスクシンイミジル  ３−｛２−［２−（２−｛２−［２−（４−｛４−［２−（２，６−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン−８−イルオキシメチル］ピリジン−４−イルオキシ）エチル］ピペラジン−１−イル｝−１，１−ジメチル−４−オキソブチルスルファニル）アセチルアミノ］エトキシ｝エトキシ）エトキシ］エトキシ｝プロパノアートを反応させることにより調製する。得られたコンジュゲートを、分光光度法により吸光係数ｅ３２０ｎｍ＝７８７６Ｍ−１ｃｍ−１およびｅ２８０ｎｍ＝４３３４Ｍ−１ｃｍ−１（トマイマイシン二量体について）ならびにｅ２８０ｎｍ＝２０８３８０Ｍ−１ｃｍ−１（ｈｕ２Ｈ１１について）を使用して定量する：抗体分子当たり平均３．１３個のトマイマイシン二量体が測定された。
【０２１８】
４．２．Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル  ３−｛２−［２−（２−｛２−［２−（４−｛４−［２−（２，６−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン−８−イルオキシメチル］−ピリジン−４−イルオキシ）エチル］ピペラジン−１−イル｝−１，１−ジメチル−４−オキソブチルスルファニル）アセチルアミノ］−エトキシ｝エトキシ）エトキシ］エトキシ｝プロパノアート：
実施例２に従って、３−｛２−［２−（２−｛２−［２−（４−｛４−［２−（２，６−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン−８−イルオキシメチル］ピリジン−４−イルオキシ）エチル］ピペラジン−１−イル｝−１，１−ジメチル−４−オキソブチルスルファニル）アセチルアミノ］エトキシ｝エトキシ）−エトキシ］エトキシ｝プロパン酸から調製する
【０２１９】
【化７６】
0005889189.tif 000079
ＬＣ／ＭＳ（Ｂ）：ｒｔ＝３．２７分；［Ｍ＋Ｈ］＋：ｍ／ｚ  １３０９；［Ｍ＋２Ｈ］２＋：ｍ／ｚ  ６５５。
【０２２０】
４．３．３−｛２−［２−（２−｛２−［２−（４−｛４−［２−（２，６−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン−８−イルオキシメチル］ピリジン−４−イルオキシ）エチル］ピペラジン−１−イル｝−１，１−ジメチル−４−オキソブチルスルファニル）アセチルアミノ］エトキシ｝エトキシ）エトキシ］エトキシ｝プロパン酸
実施例２に従って、メチル  ３−｛２−［２−（２−｛２−［２−（４−｛４−［２−（２，６−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン−８−イルオキシメチル］ピリジン−４−イルオキシ）エチル］ピペラジン−１−イル｝−１，１−ジメチル−４−オキソブチルスルファニル）アセチルアミノ］エトキシ｝エトキシ）エトキシ］エトキシ｝プロパノアートから調製する
【０２２１】
【化７７】
0005889189.tif 000080
ＬＣ／ＭＳ（Ｂ）：ｒｔ＝３．１６分；［Ｍ＋Ｈ］＋：ｍ／ｚ  １２１２；［Ｍ＋２Ｈ］２＋：ｍ／ｚ  ６０６。
【０２２２】
４．４．メチル  ３−｛２−［２−（２−｛２−［２−（４−｛４−［２−（２，６−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン−８−イルオキシメチル］ピリジン−４−イルオキシ）エチル］−ピペラジン−１−イル｝−１，１−ジメチル−４−オキソブチルスルファニル）アセチルアミノ］エトキシ｝エトキシ）エトキシ］−エトキシ｝プロパノアート
実施例２に従って、メチル  ３−｛２−［２−（２−｛２−［２−（４−｛４−［２−（２，６−ビス（ヒドロキシメチル）ピリジン−４−イルオキシ）エチル］ピペラジン−１−イル｝−１，１−ジメチル−４−オキソブチルスルファニル）−アセチルアミノ］エトキシ｝エトキシ）エトキシ］エトキシ｝プロパノアートから調製する
【０２２３】
【化７８】
0005889189.tif 000081
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）：１．２２（ｓ，６Ｈ）；１．６９（ｍ，８Ｈ）；２．３７（ｍ，２Ｈ）；２．４０（ｍ，２Ｈ）；２．４８（ｍ，２Ｈ）；２．５３（ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，２Ｈ）；２．７２（ｍ，２Ｈ）；２．９２（ｍ，２Ｈ）；３．０４（ｍ，２Ｈ）；３．１１（ｓ，２Ｈ）；３．１９（ｑ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，２Ｈ）；３．３９（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，２Ｈ）；３．４２（ｍ，４Ｈ）；３．４９（ｍ，１２Ｈ）；３．５９（ｓ，３Ｈ）；３．６２（ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，２Ｈ）；３．８６（ｓ，６Ｈ）；３．８８（ｍ，２Ｈ）；４．１０（ｍ，４Ｈ）；４．２２（ｍ，２Ｈ）；５．１７（ｄ，Ｊ＝１３．０Ｈｚ，２Ｈ）；５．２２（ｄ，Ｊ＝１３．０Ｈｚ，２Ｈ）；５．５５（ｍ，２Ｈ）；６．９４（ｓ，２Ｈ）；７．０９（ｓ，２Ｈ）；７．３８（ｓ，２Ｈ）；７．７７（ｄ，Ｊ＝３．９Ｈｚ，２Ｈ）；８．０１（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ（Ｂ）：ｒｔ＝３．３０分；［Ｍ＋Ｈ］＋：ｍ／ｚ  １２２５；［Ｍ＋２Ｈ］２＋：ｍ／ｚ  ６１３（ベースピーク）。
【０２２４】
４．５．メチル  ３−｛２−［２−（２−｛２−［２−（４−｛４−［２−（２，６−ビス（ヒドロキシメチル）ピリジン−４−イルオキシ）エチル］ピペラジン−１−イル｝−１，１−ジメチル−４−オキソブチルスルファニル）アセチルアミノ］エトキシ｝エトキシ）エトキシ］エトキシ｝−プロパノアート
実施例２に従って、４−（２−［４−（４−メルカプト−４−メチルペンタノイル）ピペラジン−１−イル］エトキシ）−２，６−ビス（ヒドロキシメチル）ピリジンから調製する
【０２２５】
【化７９】
0005889189.tif 000082
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）：全てのシグナルは幅広である、１．２２（ｓ，６Ｈ）；１．７１（ｍ，２Ｈ）；２．２０  ｔｏ  ２．５８（ｐａｒｔｉａｌｌｙ  ｍａｓｋｅｄ  ｍ，８Ｈ）；２．７５（ｍ，２Ｈ）；３．１２（ｍ，２Ｈ）；３．１９（ｍ，２Ｈ）；３．４７  ｔｏ  ３．５３（ｍ，１８Ｈ）；３．６０（ｍ，５Ｈ）；４．１８（ｍ，２Ｈ）；４．４６（ｍ，４Ｈ）；５．３１（ｍ，２Ｈ）；６．８６（ｓ，２Ｈ）；８．００（ｍ，１Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ（Ｂ）：ｒｔ＝２．２０分；［Ｍ＋Ｈ］＋：ｍ／ｚ  ７１７；［Ｍ−Ｈ＋ＨＣＯ２Ｈ］−：ｍ／ｚ  ７６１。
【０２２６】
４．６．４−（２−［４−（４−メルカプト−４−メチルペンタノイル）ピペラジン−１−イル］エトキシ）−２，６−ビス（ヒドロキシメチル）ピリジン
実施例２に従って、４−（２−［４−（４−メチル−４−（メチルジスルファニル）ペンタノイル）ピペラジン−１−イル］エトキシ）−２，６−ビス（ヒドロキシメチル）ピリジンから調製する
【０２２７】
【化８０】
0005889189.tif 000083
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）：１．３２（ｓ，６Ｈ）；１．７６（ｍ，２Ｈ）；２．３６  ｔｏ  ２．５３（ｐａｒｔｉａｌｌｙ  ｍａｓｋｅｄ  ｍ，６Ｈ）；２．６６（ｓ，１Ｈ）；２．７５（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，２Ｈ）；３．４０  ｔｏ  ３．５２（ｍ，４Ｈ）；４．１８（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，２Ｈ）；４．４６（ｓ，４Ｈ）；５．３０（ｖｅｒｙ  ｂｒｏａｄ  ｍ，２Ｈ）；６．８６（ｓ，２Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ（Ｂ）：ｒｔ＝０．７６分；［Ｍ＋Ｈ］＋：ｍ／ｚ  ３９８；［Ｍ−Ｈ］−：ｍ／ｚ  ３９６。
【０２２８】
４．７．４−（２−［４−（４−メチル−４−（メチルジスルファニル）ペンタノイル）ピペラジン−１−イル］エトキシ）−２，６−ビス（ヒドロキシメチル）ピリジン
【０２２９】
【化８１】
0005889189.tif 000084
３４４μＬのＴＥＡ、次いで１０分撹拌した後に７４８ｍｇの４−メチル−４−（メチルジスルファニル）ペンタン酸、４１７μｌのジイソプロピルカルボジイミドおよび６９ｍｇの１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物を、６００ｍｇの４−［２−（ピペラジン−１−イル）エトキシ］−２，６−ビス（ヒドロキシメチル）ピリジンの１２ｍｌのＤＭＦ中溶液に添加する。ＡＴにおいて１５時間後、混合物をＲＰ下で濃縮し、１５ｍｌの水を添加し、抽出をＡｃＯＥｔにより２回実施する。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で脱水し、ＲＰ下で濃縮し、残留物をシリカ（Ａｎａｌｏｇｉｘ  Ｓｕｐｅｒ  Ｆｌａｓｈ  ＳｉＯ２  ＳＦ２５−８０ｇ）上でのフラッシュクロマトグラフィーによりＤＣＭ中２から１０％のＭｅＯＨの勾配を使用して精製する。３９０ｍｇの４−（２−［４−（４−メチル−４−（メチルジスルファニル）ペンタノイル）ピペラジン−１−イル］エトキシ）−２，６−ビス（ヒドロキシメチル）ピリジンをこうして得る。
【０２３０】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）：１．２６（ｓ，６Ｈ）；１．７９（ｍ，２Ｈ）；２．３６（ｍ，２Ｈ）；２．３９（ｓ，３Ｈ）；２．４０  ｔｏ  ２５３（ｐａｒｔｉａｌｌｙ  ｍａｓｋｅｄ  ｍ，４Ｈ）；２．７５（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ）；３．４５（ｍ，４Ｈ）；４．１８（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ）；４．４６（ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，４Ｈ）；５．３０（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ）；６．８６（ｓ，２Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ（Ａ）：ｒｔ＝０．４２分；［Ｍ＋Ｈ］＋：ｍ／ｚ  ４４４；［Ｍ−Ｈ＋ＨＣＯ２Ｈ］−：ｍ／ｚ  ４８８。
【０２３１】
４．８．４−［２−（ピペラジン−１−イル）エトキシ］−２，６−ビス（ヒドロキシメチル）ピリジン
【０２３２】
【化８２】
0005889189.tif 000085
１９ｍｌのＨＣｌのジオキサン中４Ｍ溶液を、２．３ｇの４−（２−（４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピペラジン−１−イル）エトキシ）−２，６−ビス（ヒドロキシメチル）ピリジンの３３ｍｌのジオキサン中溶液に添加する。ＡＴにおいて１２時間後、得られた沈殿物を焼結ガラス漏斗上での濾過により回収し、ＭｅＯＨ中で溶解させ、次いでＲＰ下で濃縮し、残留物を４０ｍｌのＭｅＯＨ／水の１／１混合物中で希釈する。得られた溶液をＭｅｇａ  ＢＥ−ＳＣＸ、２５ＧＭ  １５０ＭＬ（Ｖａｒｉａｎ）上で堆積させる。相をＭｅＯＨにより洗浄した後、対象となる生成物をアンモニアのメタノール中２Ｎ溶液により溶出させる。ＭｅＯＨ／ＮＨ３相をＲＰ下で濃縮する。１．６ｇの４−［２−（ピペラジン−１−イル）エトキシ］−２，６−ビス（ヒドロキシメチル）ピリジンをこうして得る。
【０２３３】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）：２．４０（ｍ，４Ｈ）；２．６８（ｍ，６Ｈ）；４．１５（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ）；４．４４（ｍ，４Ｈ）；５．２９（ｍ，２Ｈ）；６．８５（ｓ，２Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ（Ａ）：ｒｔ＝０．１０分；［Ｍ＋Ｈ］＋：ｍ／ｚ  ２６８；［Ｍ＋２Ｈ］２＋：ｍ／ｚ  １３４．５；ベースピーク：ｍ／ｚ  １１３。
【０２３４】
４．９．４−（２−（４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピペラジン−１−イル）エトキシ）−２，６−ビス（ヒドロキシメチル）ピリジン
【０２３５】
【化８３】
0005889189.tif 000086
７７９ｍｇの水素化ホウ素ナトリウムおよび２．２９ｇのＣａＣｌ２を、３．１ｇのジエチル  ４−［２−（４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピペラジン−１−イル）エトキシ］ピリジン−２，６−ジカルボキシラートの１０５ｍｌのＥｔＯＨ中溶液に添加する。ＡＴにおいて３時間後、混合物を加水分解し、ＲＰ下で濃縮する。水を得られた残留物に添加し、得られた水相をＡｃＯＥｔにより４回抽出する。合わせた有機相を飽和ＮａＣｌ水溶液により洗浄し、次いでＲＰ下で濃縮する。２．４ｇの４−（２−（４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピペラジン−１−イル）エトキシ）−２，６−ビス（ヒドロキシメチル）ピリジンをこうして得る。
【０２３６】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）：１．３９（ｓ，９Ｈ）；２．４３（ｍ，４Ｈ）；２．７３（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ）；３．３０（ｐａｒｔｉａｌｌｙ  ｍａｓｋｅｄ  ｍ，４Ｈ）；４．１７（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ）；４．４５（ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，４Ｈ）；５．３０（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ）；６．８６（ｓ，２Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ（Ａ）：ｒｔ＝０．２４分；［Ｍ＋Ｈ］＋：ｍ／ｚ  ３６８。
【０２３７】
４．１０．ジエチル  ４−［２−（４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピペラジン−１−イル）エトキシ］ピリジン−２，６−ジカルボキシラート
【０２３８】
【化８４】
0005889189.tif 000087
４．５ｍｌのＴＥＡ、次いで２ｍｌの塩化メタンスルホニルを、０℃に冷却した５ｇの１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジンの１０２ｍｌのＤＣＭ中溶液に添加する。１時間後、混合物をＡＴに戻す。さらに１時間撹拌した後、混合物を加水分解し、有機相を水により２回洗浄し、ＭｇＳＯ４で脱水し、ＲＰ下で濃縮する。１４０ｍｌのＤＭＦをこうして得られた残留物（６．７ｇ）に添加し、混合物を６０℃とする。次いで、１９０ｍｇのケリダム酸のジエチルエステル（Ｓｃｒｉｍｉｎ  Ｐ．，Ｔｅｃｉｌｌａ  Ｐ．，Ｔｏｎｅｌｌａｔｏ  Ｕ．ａｎｄ  Ｖｅｎｄｒａｍｅ  Ｔ．Ｊ．，Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９８９，５４，５９８８）および５４９ｍｇのＫ２ＣＯ３を添加し、混合物を８０℃において２０時間加熱する。ＲＰ下で濃縮した後、混合物を加水分解し、ＡｃＯＥｔにより３回抽出し、合わせた有機相を飽和ＮａＣｌ溶液により洗浄し、ＲＰ下で濃縮し、残留物をシリカ（Ａｎａｌｏｇｉｘ  Ｓｕｐｅｒ  Ｆｌａｓｈ  ＳｉＯ２  ＳＦ２５−１５０ｇ）上でのフラッシュクロマトグラフィーによりヘプタン中６０から８５％のＡｃＯＥｔの勾配を使用して精製する。３．１ｇのジエチル  ４−［２−（４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピペラジン−１−イル）エトキシ］ピリジン−２，６−ジカルボキシラートをこうして得る。
【０２３９】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）：１．３４（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，６Ｈ）；１．３９（ｓ，９Ｈ）；２．４４（ｍ，４Ｈ）；２．７６（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ）；３．３０（ｐａｒｔｉａｌｌｙ  ｍａｓｋｅｄ  ｍ，４Ｈ）；４．３４（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ）；４．３８（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，４Ｈ）；７．７４（ｓ，２Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ（Ｂ）：ｒｔ＝２．８１分；［Ｍ＋Ｈ］＋：ｍ／ｚ  ４５２；［ＭＨ＋ＨＣＯ２Ｈ］−：ｍ／ｚ  ４９６。
【０２４０】
［実施例５］
５．１．４−｛２−［４−（２−メチル−２−（メチルジスルファニル）プロピル）ピペラジン−１−イル］エトキシ｝−２，６−ビス（ヒドロキシメチル）ピリジン
実施例１に従って、４−［２−（ピペラジン−１−イル）エトキシ］−２，６−ビス（ヒドロキシメチル）−ピリジンから調製する
【０２４１】
【化８５】
0005889189.tif 000088
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）：１．２５（ｓ，６Ｈ）；２．３９（ｓ，３Ｈ）；２．４０（ｓ，２Ｈ）；２．４４  ｔｏ  ２．５７（ｐａｒｔｉａｌｌｙ  ｍａｓｋｅｄ  ｍ，８Ｈ）；２．６９（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ）；４．１４（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ）；４．４５（ｄ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，４Ｈ）；５．２９（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ）；６．８５（ｓ，２Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ（Ｂ）：ｒｔ＝０．５１分；［Ｍ＋Ｈ］＋：ｍ／ｚ  ４０２。
【０２４２】
［実施例６］
６．１．コンジュゲートの調製
コンジュゲートを、実施例１と同様に、ｈｕ２Ｈ１１およびＮ−ヒドロキシスクシンイミジル  ３−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−｛［２−（２，６−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾ−ジアゼピン−５−オン−８−イルオキシメチル］ピリジン−４−イルオキシ）エチル］（メチル）アミノ｝−１，１−ジメチルエチルスルファニル）−アセチル（メチル）アミノ］エトキシ｝エトキシ）エトキシ］エトキシ｝プロパノアートを反応させることにより調製する。得られたコンジュゲートを、分光光度法により吸光係数ｅ３１９ｎｍ＝７７８９Ｍ−１ｃｍ−１およびｅ２８０ｎｍ＝４３６２Ｍ−１ｃｍ−１（トマイマイシン二量体について）およびｅ２８０ｎｍ＝２０８３８０Ｍ−１ｃｍ−１（ｈｕ２Ｈ１１について）を使用して定量する。抗体分子当たり平均２．９０個のトマイマイシン二量体が測定された。
【０２４３】
６．２．Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル  ３−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−｛［２−（２，６−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン−８−イルオキシメチル］ピリジン−４−イルオキシ）−エチル］（メチル）アミノ｝−１，１−ジメチルエチルスルファニル）アセチル（メチル）アミノ］エトキシ｝エトキシ）−エトキシ］エトキシ｝プロパノアート
実施例２に従って、３−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−｛［２−（２，６−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン−８−イルオキシメチル］ピリジン−４−イルオキシ）エチル］（メチル）アミノ｝−１，１−ジメチルエチルスルファニル）アセチル（メチル）アミノ］エトキシ｝エトキシ）−エトキシ］エトキシ｝プロパン酸から調製する。
【０２４４】
【化８６】
0005889189.tif 000089
ＬＣ／ＭＳ（Ｆ）：ｒｔ＝１．０２分；［Ｍ＋Ｈ］＋：ｍ／ｚ  １２２５；［Ｍ＋Ｈ２Ｏ＋Ｈ］＋：ｍ／ｚ  １２４３
【０２４５】
６．３．３−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−｛［２−（２，６−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン−８−イルオキシメチル］ピリジン−４−イルオキシ）エチル］（メチル）アミノ｝−１，１−ジメチルエチルスルファニル）アセチル（メチル）アミノ］エトキシ｝エトキシ）エトキシ］エトキシ｝プロパン酸
実施例２に従って、メチル  ３−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−｛［２−（２，６−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン−８−イルオキシメチル］ピリジン−４−イルオキシ）エチル］（メチル）アミノ｝−１，１−ジメチルエチルスルファニル）アセチル（メチル）アミノ］エトキシ｝エトキシ）−エトキシ］エトキシ｝プロパノアートから調製する。
【０２４６】
【化８７】
0005889189.tif 000090
ＬＣ／ＭＳ（Ｆ）：ｒｔ＝０．９７分；［Ｍ＋Ｈ］＋：ｍ／ｚ  １１２９
６．４．メチル  ３−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−｛［２−（２，６−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン−８−イルオキシメチル］ピリジン−４−イルオキシ）エチル］（メチル）アミノ｝−１，１−ジメチルエチルスルファニル）アセチル（メチル）アミノ］エトキシ｝−エトキシ）エトキシ］エトキシ｝プロパノアート
実施例２に従って、メチル  ３−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−｛［２−（２，６−ビス（ヒドロキシメチル）ピリジン−４−イルオキシ）エチル］（メチル）アミノ｝−１，１−ジメチルエチルスルファニル）アセチル（メチル）アミノ］エトキシ｝エトキシ）−エトキシ］エトキシ｝プロパノアートから調製する。
【０２４７】
【化８８】
0005889189.tif 000091
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）：吸収は幅広である、１．２０（ｓ，６Ｈ）；１．５８  ｔｏ  １．７３（ｍ，６Ｈ）；２．３８（ｓ，３Ｈ）；２．５２  ｔｏ  ３．０７（ｍ，１３Ｈ）；３．３６  ｔｏ  ３．６３（ｍ，２３Ｈ）；３．６７  ｔｏ  ３．９１（ｍ，８Ｈ）；４．０６  ｔｏ  ４．２６（ｍ，６Ｈ）；５．０２  ｔｏ  ５．２６（ｍ，４Ｈ）；５．３３  ｔｏ  ５．６０（ｍ，２Ｈ）；６．３９  ｔｏ  ７．４２（ｍ，６Ｈ）；７．７６（ｍ，２Ｈ）。
【０２４８】
ＬＣ／ＭＳ（Ａ）：ｒｔ＝０．７７分；［Ｍ＋Ｈ］＋：ｍ／ｚ  １１４２；［Ｍ＋２Ｈ］２＋：ｍ／ｚ  ５７１．５（ベースピーク）。
【０２４９】
６．５．メチル  ３−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−｛［２−（２，６−ビス（ヒドロキシメチル）ピリジン−４−イルオキシ）エチル］（メチル）−アミノ｝−１，１−ジメチルエチルスルファニル）アセチル（メチル）アミノ］エトキシ｝エトキシ）エトキシ］エトキシ｝−プロパノアート：
実施例２に従って、メチル  ３−｛２−［２−（２−｛２−［（２−ヨードアセチル）（メチル）アミノ］エトキシ｝−エトキシ）エトキシ］エトキシ｝プロパノアートから調製する。
【０２５０】
【化８９】
0005889189.tif 000092
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）：５０／５０の回転異性体の分割：１．２２（ｓ，３Ｈ）；１．２４（ｓ，３Ｈ）；２．４１（ｓ，３Ｈ）；２．５３（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ）；２．５６（ｍ，２Ｈ）；２．８０（ｓ，１Ｈ）；２．８８（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ）；３．０５（ｓ，２Ｈ）；３．３５  ｔｏ  ３．５８（ｍ，１８Ｈ）；３．５９（ｓ，３Ｈ）；３．６２（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ）；４．１３（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ）；４．４５（ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，４Ｈ）；５．２９（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ）；６．８５（ｓ，２Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ（Ｂ）：ｒｔ＝２．１８分；［Ｍ＋Ｈ］＋：ｍ／ｚ  ６３４；［Ｍ−Ｈ＋ＨＣＯ２Ｈ］−：ｍ／ｚ  ６７８。
【０２５１】
６．６．メチル  ３−｛２−［２−（２−｛２−［（２−ヨードアセチル）（メチル）アミノ］エトキシ｝エトキシ）エトキシ］エトキシ｝−プロパノアート
【０２５２】
【化９０】
0005889189.tif 000093
１１７．４ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミジルヨードアセタートの６．５ｍｌのＤＣＭ中溶液を、２１５ｍｇのメチル  ３−（２−｛２−［２−（２−（メチルアミノ）エトキシ）エトキシ］エトキシ｝エトキシ）プロパノアートに添加する。ＡＴにおいて２時間後、混合物をＲＰ下で濃縮し、残留物をシリカ（Ａｎａｌｏｇｉｘ  Ｓｕｐｅｒ  Ｆｌａｓｈ  ＳｉＯ２  ＳＦ２５−２４ｇ）上でのフラッシュクロマトグラフィーによりＤＣＭ中０から６％のＭｅＯＨの勾配を使用して精製する。２１０ｍｇのメチル  ３−｛２−［２−（２−｛２−［（２−ヨードアセチル）（メチル）アミノ］エトキシ｝エトキシ）エトキシ］エトキシ｝−プロパノアートをこうして得る。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）：５５／４５の回転異性体の分割、２．５４（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ）；２．８３（ｓ，１．３５Ｈ）；３．０２（ｓ，１．６５Ｈ）；３．３６  ｔｏ  ３．５５（ｍ，１６Ｈ）；３．６０（ｓ，３Ｈ）；３．６３（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ）；３．８３（ｓ，１．１Ｈ）；３．８８（ｓ，０．９Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ（Ａ）：ｒｔ＝０．６２分；［Ｍ＋Ｈ］＋：ｍ／ｚ  ４６２。
【０２５３】
６．７．メチル  ３−（２−｛２−［２−（２−（メチルアミノ）エトキシ）エトキシ］エトキシ｝エトキシ）プロパノアート
【０２５４】
【化９１】
0005889189.tif 000094
３ｍｌのＨＣｌのジオキサン中４Ｍ溶液を、３９０ｍｇのメチル  ３−［２−（２−｛２−［２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）（メチル）アミノ）エトキシ］エトキシ｝エトキシ）エトキシ］プロパノアートの５．３ｍｌのジオキサン中溶液に添加する。ＡＴにおいて１２時間後、混合物をＲＰ下で濃縮し、残留物を最少のメタノール中で溶解させ、Ｍｅｇａ  ＢＥ−ＳＣＸ、１０ＧＭ  ６０ＭＬ（Ｖａｒｉａｎ）上で堆積させる。相をＭｅＯＨにより洗浄した後、対象となる生成物をアンモニアのメタノール中２Ｎ溶液により溶出させる。メタノール／ＮＨ３相をＲＰ下で濃縮する。２７０ｍｇのメチル  ３−（２−｛２−［２−（２−（メチルアミノ）エトキシ）エトキシ］エトキシ｝エトキシ）プロパノアートをこうして得る。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）：２．２８（ｓ，３Ｈ）；２．５４（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ）；２．５９（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ）；３．４４（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ）；３．４７  ｔｏ  ３．５４（ｍ，１２Ｈ）；３．６０（ｓ，３Ｈ）；３．６３（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ（Ａ）（ＥＬＳＤ）：ｒｔ＝０．３０分；［Ｍ＋Ｈ］＋：ｍ／ｚ  ２９４。
【０２５５】
６．８．メチル  ３−［２−（２−｛２−［２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）（メチル）アミノ）エトキシ］エトキシ｝エトキシ）−エトキシ］プロパノアート
【０２５６】
【化９２】
0005889189.tif 000095
２ｍｌのトリメチルシリルジアゾメタンのヘキサン中２Ｍ溶液を、０℃に冷却した５００ｍｇの３−［２−（２−｛２−［２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）（メチル）アミノ）エトキシ］エトキシ｝エトキシ）−エトキシ］プロパン酸の４．８ｍｌのＭｅＯＨ中溶液に添加する。２時間後、混合物を１２０μｌの酢酸の添加により中和し、次いでＲＰ下で濃縮し、残留物をシリカ（Ａｎａｌｏｇｉｘ  Ｓｕｐｅｒ  Ｆｌａｓｈ  ＳｉＯ２  ＳＦ２５−４０ｇ）上でのフラッシュクロマトグラフィーによりＤＣＭ中０から５％のメタノールの勾配を使用して精製する。４００ｍｇのメチル  ３−［２−（２−｛２−［２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）（メチル）アミノ）エトキシ］エトキシ｝エトキシ）−エトキシ］プロパノアートをこうして得る。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）：１．３８（ｓ，９Ｈ）；２．５４（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ）；２．８０（ｂｒｏａｄ  ｓ，３Ｈ）；３．２９（ｐａｒｔｉａｌｌｙ  ｍａｓｋｅｄ  ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ）；３．４５  ｔｏ  ３．５５（ｍ，１４Ｈ）；３．５９（ｓ，３Ｈ）；３．６３（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ（Ａ）：ｒｔ＝０．８４分；［Ｍ＋Ｎａ］＋：ｍ／ｚ  ４１６（ベースピーク）；ＬＣ／ＭＳ（Ａ）：ｒｔ＝０．８４分；［Ｍ＋Ｎａ］＋：ｍ／ｚ  ４１６（ベースピーク）。
【０２５７】
６．９．３−［２−（２−｛２−［２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）（メチル）アミノ）エトキシ］エトキシ｝エトキシ）エトキシ］−プロパン酸
【０２５８】
【化９３】
0005889189.tif 000096
８５．４ｍｇのＮａＨを、０℃に冷却した５２０ｍｇの３−［２−（２−｛２−［２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）エトキシ］エトキシ｝エトキシ）エトキシ］プロパン酸の１４ｍｌのＴＨＦ中溶液に添加する。５分間撹拌した後、１５０μｌのヨードメタンを添加する。次いで、混合物をＡＴにおいて２時間撹拌し、次いでさらに１５０μｌのヨードメタンを添加する。ＡＴにおいて１２時間後、混合物を加水分解し、次いで０℃における水性酢酸の添加により酸性ｐＨとする。水相をＡｃＯＥｔにより３回抽出し、合わせた有機相をＭｇＳＯ４で脱水し、ＲＰ下で濃縮し、得られた粗製生成物を同一プロトコルに従って８５ｍｇのＮａＨおよび１７６μｌのヨードメタンとさらに２時間再度反応させる。５００ｍｇの３−［２−（２−｛２−［２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）（メチル）アミノ）エトキシ］エトキシ｝エトキシ）エトキシ］プロパン酸をこうして得る。ＬＣ／ＭＳ（Ｆ）：ｒｔ＝１．０１分；［Ｍ＋Ｈ］＋：ｍ／ｚ  ３８０。
【０２５９】
ＺｂＲｂ＝−ＯＭｅであり、Ｙ＝Ｙ’＝−ＯＭｅである式（ＩＡ）の化合物によるＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−Ａ１およびＨＣＴ１１６細胞系の増殖の阻害の評価
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−Ａ１またはＨＣＴ１１６細胞を、これらの指数増殖期においてトリプシン処理し、これらのそれぞれの培養培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２  Ｇｉｂｃｏ  ＃２１３３１、１０％ＦＣＳ  Ｇｉｂｃｏ  ＃１０５００−０５６、２ｎＭグルタミン  Ｇｉｂｃｏ  ＃２５０３０（ＭＤＡ細胞について）；ＤＭＥＭ  Ｇｉｂｃｏ  ＃１１９６０，１０％ＦＣＳ  Ｇｉｂｃｏ  ＃１０５００−０５６、２ｍＭグルタミン  Ｇｉｂｃｏ  ＃２５０３０（ＨＣＴ１１６細胞について））中で再懸濁させる。細胞懸濁液をＣｙｔｏｓｔａｒ９６ウェル培養プレート（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ、＃ＲＰＮＱ０１６３）中に、５０００個の細胞／ウェル（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−Ａ１、ＨＣＴ１１６）の密度において血清を含有する完全培養培地中で播種する。４時間培養した後、トマイマイシン二量体の連続希釈物を、各濃度についてトリプリケートにおいてウェルに添加する。細胞を、細胞毒性剤の存在下で５％ＣＯ２を含有する雰囲気下で３７℃において３日間培養する。４日目に、１０μｌの１４Ｃ−チミジン溶液（０．１μＣｉ／ウェル、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＃ＮＥＣ５６８２５０００）を各ウェルに添加する。１４Ｃ−チミジンの取り込みは、実験の開始９６時間後にＭｉｃｒｏＢｅｔａ放射能カウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して計測する。データは、細胞毒性剤により処理した細胞を用いて得られたカウントと、対照ウェルの細胞（培養培地単独により処理）を用いて得られたカウントとの比を決定することにより、生存％の形で表現する。
【０２６０】
【表２】
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ＺｂＲｂ＝−ＯＭｅである試験化合物が、強力な抗癌活性を有することが見出される。このことにより、別のＺｂＲｂ基を特徴とする類似の化合物が同一の活性を示す可能性があると想定することができる。
【０２６１】
ｈｕ２Ｈ１１−細胞毒性剤コンジュゲートによるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞系の増殖の阻害の評価
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、これらの指数増殖期においてトリプシン処理し、これらの培養培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２  Ｇｉｂｃｏ  ＃２１３３１、１０％ＦＣＳ  Ｇｉｂｃｏ  ＃１０５００−０５６、２ｎＭグルタミン  Ｇｉｂｃｏ  ＃２５０３０）中で再懸濁させる。細胞懸濁液をＣｙｔｏｓｔａｒ９６ウェル培養プレート（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ、＃ＲＰＮＱ０１６３）中に、５０００個の細胞／ウェルの密度において血清を含有する完全培養培地中で播種する。４時間培養した後、抗体−細胞毒性剤イムノコンジュゲートの連続希釈物を、１０−７から１０−１２Ｍで減少する濃度（各濃度についてトリプリケート）においてウェルに添加する。細胞を、抗体−細胞毒性剤イムノコンジュゲートの存在下で５％ＣＯ２を含有する雰囲気内で３７℃において３日間培養する。４日目に、１０μｌの１４Ｃ−チミジン溶液（０．１μＣｉ／ウェル、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＃ＮＥＣ５６８２５０００）を各ウェルに添加する。１４Ｃ−チミジンの取り込みは、実験の開始９６時間後にＭｉｃｒｏＢｅｔａ放射能カウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて計測する。データは、イムノコンジュゲートにより処理した細胞を用いて得られたカウントと、対照ウェルの細胞（培養培地単独により処理）を用いて得られたカウントとの比を決定することにより、生存％の形で表現する。ある実験＊において、裸抗体ｈｕ２Ｈ１１を、実験開始時に１μＭの濃度においてウェルに添加し、増殖の阻害を上記のとおり計測した。
【０２６２】
【表３】
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【０２６３】
非開裂性トマイマイシン二量体コンジュゲートの単量体安定性
国際出願ＷＯ０９０１６５１６の実施例３および５に記載のトマイマイシン二量体を用いて調製した非開裂性ｈｕ２Ｈ１１コンジュゲートは、３−５℃における数ヵ月の貯蔵後に、これらの単量体純度の経時的に減少する傾向を有する。具体的には、最初の単量体純度が９７．５％程度である、抗体分子当たり平均３から３．５個のトマイマイシン二量体を示す、１０％のスクロースおよび５％のＮＭＰを含有する１０ｍＭのヒスチジン濃度を有するｐＨ６．５の水性緩衝液中で配合されたこれらのコンジュゲートは、６から８ヵ月後に単量体純度が６から１５％低下し得る。この現象は、抗体分子当たり平均３．５個のトマイマイシン二量体を有し、同一貯蔵条件下で４ヵ月後に９９％超の単量体純度を保持する実施例３のコンジュゲートを用いると観察されず、従って、この特定のコンジュゲートのより良好な安定性が示唆される。長い期間モノマー純度を保持するコンジュゲートを利用可能とすることができることは、コンジュゲートの分野において所望される、一般的な目的である。
【０２６４】
進行性ヒト乳腺腺癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を保有する雌ＳＣＩＤマウスに対するｈｕ２Ｈ１１−細胞毒性剤コンジュゲートの抗腫瘍活性の評価
Ｃ１（国際出願ＷＯ０９０１６５１６の実施例５に記載のトマイマイシン二量体を用いて調製）およびＣ２（実施例３のコンジュゲート）と称される同一抗体ｈｕ２Ｈ１１の２種のコンジュゲートを、雌ＳＣＩＤマウスに皮下移植した計測可能な哺乳動物腫瘍ＭＤＡ−ＭＢ−２３１に対して、４種の用量レベルにおいて評価した。対照群は処理しなかった。２種のコンジュゲートの用量はμｇトマイマイシン二量体／ｋｇで挙げる。これらを、Ｃ１について１３日目、Ｃ２について２４日目に、静脈内（ＩＶ）ボーラスタイプの注射により８０、４０、２０および１０μｇ／ｋｇにおいて投与した。
【０２６５】
コンジュゲートの抗腫瘍活性の評価に関して、動物を毎日秤量し、カリパス定規を使用して腫瘍を週２回計測した。抗腫瘍活性は、最大耐量（ＭＴＤ）において評価した。コンジュゲートに関連して最低２０％の体重損失または１０％（以上）の致死率をもたらす用量を、毒性とみなす。動物の体重は腫瘍の重量を含む。式：重量（ｍｇ）＝［長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ）２］／２に従って腫瘍の重量を計算する。効力パラメーターは、ΔＴ／ΔＣ、平均退縮率、部分的または完全な退縮（ＰＲおよびＣＲ）および実験終了時における腫瘍不含マウス（ＴＦＭ）の数である。
【０２６６】
各処理マウス（Ｔ）および対照マウス（Ｃ）の腫瘍体積の変化は、規定の観察日の腫瘍の体積から実験開始日の腫瘍の体積を差し引くことにより、各腫瘍について計算する。平均ΔＴは処理群について計算し、平均ΔＣは対照群について計算する。次いで、比ΔＴ／ΔＣを計算し、百分率として表現する：ΔＴ／ΔＣ＝（デルタＴ／デルタＣ）×１００。
【０２６７】
用量は、４０％未満のΔＴ／ΔＣについて治療的に活性であり、１０％未満のΔＴ／ΔＣについて極めて活性であるとみなす。ΔＴ／ΔＣが０未満である場合、用量は高度に活性であるとみなし、次いで退縮率を計算する（Ｐｌｏｗｍａｎ  Ｊ．，Ｄｙｋｅｓ  Ｄ．Ｊ．，Ｈｏｌｌｉｎｇｓｈｅａｄ  Ｍ．，Ｓｉｍｐｓｏｎ−Ｈｅｒｒｅｎ  Ｌ．ａｎｄ  Ａｌｌｅｙ  Ｍ．Ｃ．，Ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｍｏｄｅｌｓ  ｉｎ  ＮＣＩ  ｄｒｕｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ｆｅｉｂｉｇ  Ｈ．Ｈ．ＢＡ，ｅｄｉｔｏｒ．Ｂａｓｅｌ：Ｋａｒｇｅｒ．；１９９９，ｐｐ．１０１−１２５）に従う。）。
【０２６８】
腫瘍退縮率は、処理の１日目の腫瘍体積と比較した規定の観察日の処理群における腫瘍体積の減少率と定義する。腫瘍退縮率は、規定の時間ｔにおいて、各動物について計算する。次いで、平均退縮率を群について計算する。
【０２６９】
【数１】
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【０２７０】
部分退縮（ＰＲ）：退縮は、腫瘍体積の減少が処理の開始時の腫瘍体積の５０％に達する場合に、部分的であると定義する。
【０２７１】
完全退縮（ＣＲ）：完全退縮は、腫瘍の体積＝０ｍｍ３である場合に得られる（ＣＲは、腫瘍の体積を計測することができない場合に存在するとみなす。）。
【０２７２】
ＴＦＭ：腫瘍不含マウスは、実験終了時（処理１００日超）に検出可能な腫瘍を示さないマウスと定義する。
【０２７３】
【表４】
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【０２７４】
単一用量投与スキームによれば、本実験においてこれら２種のコンジュゲートについて試験された最大用量（８０μｇ／ｋｇ）は、毒性であることが判明し、体重損失および致死をもたらす。
【０２７５】
ＭＴＤ（４０μｇ／ｋｇ）において、Ｃ１は極めて活性であり、最低で９．６％の体重損失、７％のΔＴ／Δおよび５匹のＳＣＩＤマウスについて３匹のＰＲをもたらす。２０および１０μｇ／ｋｇのより低い用量においてもＰＲをもたらさない抗腫瘍活性が観察された。
【０２７６】
ＭＴＤ（４０μｇ／ｋｇ）において、Ｃ２は高度に活性を示し、最低で５％の体重損失および９６．２％の腫瘍退縮をもたらし、６匹のマウスについて６匹のＰＲを示し、１匹のＴＦＭを含む。Ｃ２は、２０μｇ／ｋｇのより低い用量においても極めて活性であり、腫瘍退縮は６６．４％であり、６匹のマウスについて４匹がＰＲを示す。抗腫瘍活性は、１０μｇ／ｋｇの最低用量においても観察されたが、退縮またはＰＲをもたらさなかった。
【０２７７】
結論として、Ｃ２は、強力な抗癌活性を示し、Ｃ１よりも良好な活性を示し、同一用量のＣ１を用いて観察されなかったＭＴＤにおける腫瘍退縮、ＰＲおよびＴＦＭを示したことが見出される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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