(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミドを作製する方法であって：
（ａ）Ｅｃｄｉｆ、ｃｅｒ、ｐｓｉ、ｐｉｆおよびｍｗｒから選択される部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えを起こすことができない第１の宿主細胞環境において、前記部位特異的リコンビナーゼ標的部位に隣接した選択可能なマーカー遺伝子を含むプラスミドを培養するステップであって、ここで前記第１の宿主細胞環境は、ＰｅｐＡ、ＡｒｇＲおよびＡｒｃＡをコードする遺伝子のうちの１つ以上に不活性化変異を含む、ステップ；および
（ｂ）続いて、前記選択可能なマーカー遺伝子が切除されるように、前記部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えを起こすことができる第２の宿主細胞環境において前記プラスミドを培養するステップであって、ここで前記第２の宿主細胞環境が、活性バージョンのＰｅｐＡおよびＡｒｇＲまたはＡｒｃＡを含み、かつＸｅｒＣおよびＸｅｒＤから選択される部位特異的リコンビナーゼを含む、ステップを含む、方法。
【請求項２】
（ｃ）前記選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミドを細胞培養物中で維持するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｄ）前記選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミドを前記第２の宿主細胞環境から単離するステップをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の宿主細胞環境および前記第２の宿主細胞環境が、異なる細胞内にある、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の宿主細胞環境および前記第２の宿主細胞環境が、同じ宿主細胞内に形成される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記第１の宿主細胞環境および前記第２の宿主細胞環境が、一時的に分離される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記選択可能なマーカー遺伝子が、抗生物質耐性遺伝子である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記選択可能なマーカー遺伝子が、前記第１の宿主細胞環境および／または前記第２の宿主細胞環境に必須であるが、それらには存在しない代謝産物の産生を可能にする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記第１の宿主細胞環境および／または前記第２の宿主細胞環境が、グラム陰性細菌細胞である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１の宿主細胞環境および前記第２の宿主細胞環境が、エシェリキア属、サルモネラ属、赤痢菌属、アグロバクテリウム属、シュードモナス属、およびビブリオ属から独立して選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記プラスミドが、１つ以上の目的の遺伝子をコードする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミドを作製する方法に関する。詳細には、本発明は、選択可能なマーカー遺伝子の発現に基づいた選択および続くこの選択可能なマーカー遺伝子の切除を可能にする条件下で、選択可能なマーカー遺伝子を含むプラスミドを培養する方法に関する。本発明はまた、治療用およびワクチン用の組換えタンパク質の産生のためのこのような方法によって作製されたプラスミドの使用、治療用ＤＮＡおよびＤＮＡワクチンの生産、ならびに生きた細菌ベクターを用いた組換えタンパク質およびＤＮＡの患者への送達にも関する。
【０００２】
本明細書で言及される全ての文書は、参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
プラスミドは、細菌、古細菌、および一部の単細胞真核生物、例えば、酵母に自然に存在する自己複製ＤＮＡ分子である。近年、プラスミドは、組換えタンパク質遺伝子の発現に関わるバイオテクノロジー産業にとって、およびＤＮＡ治療およびＤＮＡワクチンとして不可欠なものになってきた。このような用途では、目的の遺伝子をコードするプラスミドは、一般に、改変されて細菌宿主細胞、例えば、大腸菌で複製される。プラスミドは、しばしば、プラスミドが消失した細胞を死滅させるために成長培地に選択抗生物質が添加される抗生物質選択を使用した形質転換後のプラスミドを含む細胞の同定を可能にする抗生物質耐性遺伝子をコードする。
【０００４】
しかしながら、プラスミド選択および維持に抗生物質を使用するいくつかの不都合な点が存在する。第１に、宿主細胞における抗生物質耐性遺伝子の恒常的発現は、細胞に代謝負荷をかけ、プラスミドの生存度を下げ、かつプラスミドの消失の頻度を上げる。第２に、抗生物質は、製造中のさらなる汚染物質となり、選択圧が、発酵中の抗生物質の分解によって低下する。第３に、ＤＮＡ治療およびＤＮＡワクチンの場合、抗生物質耐性遺伝子の使用は、環境中の病原体に伝達されるリスクがあり、抗生物質耐性病原株につながる。これは、生きた細菌株が、患者への遺伝子送達用ベクターとして使用された場合の急性リスクである。したがって、抗生物質耐性遺伝子を使用しないでプラスミド選択の機構を開発する必要がある。
【０００５】
発現される選択可能なマーカー遺伝子、例えば、宿主染色体の除去されたコピーを補完する必須遺伝子の機能性コピーを必要とする代替技術が開発された。チミジル酸シンターゼ遺伝子ｔｈｙＡ（非特許文献１）またはジアミノピメリン酸（ｄｉａｍｐｉｎｏｐｉｍｅｌｉｃ  ａｃｉｄ）合成に関与するａｓｄ遺伝子（非特許文献２）が、染色体遺伝子が機能性でない細胞内のプラスミドの選択遺伝子として使用されてきた。この両方のアプローチおよび抗生物質選択は共に、同じ重大な欠点：細胞に対する大きな代謝負荷となり、かつプラスミド消失を選択的に有利にする選択可能なマーカー遺伝子の存在および発現を有する（非特許文献３）。
【０００６】
選択可能なマーカー遺伝子の発現を必要としない、従って細胞に対する代謝負荷の軽減となる２つのさらなる技術が開発された。ＯＲＴ（オペレーター−リプレッサータイトレーション（Ｏｐｅｒａｔｏｒ−Ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ  Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ））は、必須染色体遺伝子が誘導プロモーターの制御下におかれる改変宿主細胞を利用する。リプレッサータンパク質が、プロモーター近傍のオペレーター配列に結合して、必須遺伝子の発現を阻止するため、インデューサーが存在しない場合は細胞が死ぬ。ＯＲＴ細菌細胞が、オペレーター配列を含む多コピープラスミドで形質転換されると、リプレッサーは、プラスミドによって結合除去され、必須遺伝子の発現が可能となるため、細胞の成長、従ってプラスミド選択および維持が可能となる（非特許文献４）。
【０００７】
他の選択可能なマーカー遺伝子を含まない系、ｏｒｉＳＥＬＥＣＴは、分子遺伝学の研究開発に使用されるプラスミドの大多数に見られる複製のｐＭＢ１起源を利用する。ｐＭＢ１  ｏｒｉは、そのコピー数を調節するためにアンチセンスＲＮＡを自然に産生し、ｏｒｉＳＥＬＥＣＴ細胞は、このＲＮＡが、必須遺伝子を調節するリプレッサーまたは毒素遺伝子のいずれかとの遺伝子融合で操作される対応するセンス配列のｍＲＮＡと相互作用するように改変されるため、プラスミドの存在が細胞の生存に必要となる（Ｃｒａｎｅｎｂｕｒｇｈ、２００５、特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第０６／００３４１２号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】ＭｃＮｅｉｌら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２０００）６６：１２１６〜１２１９
【非特許文献２】Ｄｅｇｒｙｓｅ、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９１）２２７：４９〜５１
【非特許文献３】Ｂｅｎｔｌｅｙら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．（１９９０）３５：６６８〜６８１
【非特許文献４】Ｃｒａｎｅｎｂｕｒｇｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（２００１）２９：ｅ２６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
これら両方の選択可能マーカー遺伝子を含まない発現系の不都合な点は、微生物細胞の染色体を遺伝子改変する必要があることである。これは、多くの種で技術的に困難であり、遺伝子操作を容易に行うことができる種であっても、多くの時間と労力を要する。したがって、選択可能なマーカー遺伝子を含まず、かつ宿主細胞の遺伝子改変を必要としないプラスミド選択系を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の説明）
本発明者らは、選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミドを産生する系を開発した。この系の開発では、本発明者らは、驚くべきことに、選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミドを、プラスミド維持系を用いずに宿主細胞に維持できることを見出した。当業者は、プラスミド維持系の非存在下ではプラスミドが宿主細胞から消失すると予期していたため、この知見は予想外である。この驚くべき知見は、選択可能なマーカー遺伝子の切除後の細胞にかかる代謝負荷の大幅な減少によるものである可能性が高い。
【００１２】
したがって、第１の態様では、本発明は、選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミドを作製する方法に関し、この方法は：
（ａ）部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えを起こすことができない第１の宿主細胞環境において、部位特異的リコンビナーゼ標的部位に隣接した選択可能なマーカー遺伝子を含むプラスミドを培養するステップ；および
（ｂ）続いて、部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えが起こり得る第２の宿主細胞環境においてプラスミドを培養し、選択可能なマーカー遺伝子を切除するステップを含む。
【００１３】
（宿主細胞環境）
用語「宿主細胞環境」は、宿主細胞自体および宿主細胞環境の条件を包含する。したがって、宿主細胞環境は、プラスミドが第１の宿主細胞から第２の宿主細胞に移動すると、または宿主細胞の条件が変更されると変化する。後者の場合は、第１の宿主細胞環境と第２の宿主細胞環境が、一時的に分離される。宿主細胞の条件は、一般に、細胞が培養される条件を変更することによって変更される。変更できる条件は、限定するものではないが、容量オスモル濃度、温度、インデューサーの存在または非存在、細胞の成長段階、およびＤＮＡの二次構造または超らせん性を変更する化学種（ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）の存在を含む。
【００１４】
したがって、第２の態様では、本発明は、選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミドを作製する方法に関し、この方法は：
（ａ）部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えを起こすことができない第１の宿主細胞において、部位特異的リコンビナーゼ標的部位に隣接した選択可能なマーカー遺伝子を含むプラスミドを培養するステップ；および
（ｂ）続いて、部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えが起こり得る第２の宿主細胞においてプラスミドを培養し、選択可能なマーカー遺伝子を切除するステップを含む。
【００１５】
第３の態様では、本発明は、選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミドを作製する方法に関し、この方法は：
（ａ）部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えが起こり得ないようにする容量オスモル濃度の宿主細胞において、部位特異的リコンビナーゼ標的部位に隣接した選択可能なマーカー遺伝子を含むプラスミドを培養するステップ；および
（ｂ）続いて、部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えが起こり得るように宿主細胞の容量オスモル濃度を変更して、選択可能なマーカー遺伝子を切除するステップを含む。
【００１６】
第４の態様では、本発明は、選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミドを作製する方法に関し、この方法は：
（ａ）部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えが起こり得ないようにする温度の宿主細胞において、部位特異的リコンビナーゼ標的部位に隣接した選択可能なマーカー遺伝子を含むプラスミドを培養するステップ；および
（ｂ）続いて、部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えが起こり得るように宿主細胞の温度を変更して、選択可能なマーカー遺伝子を切除するステップを含む。
【００１７】
第５の態様では、本発明は、選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミドを作製する方法に関し、この方法は：
（ａ）部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えが起こり得ないようにするインデューサーの存在しない宿主細胞において、部位特異的リコンビナーゼ標的部位に隣接した選択可能なマーカー遺伝子を含むプラスミドを培養するステップ；および
（ｂ）続いて、部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えが起こり得るように宿主細胞にインデューサーを添加して、選択可能なマーカー遺伝子を切除するステップを含む。
【００１８】
第６の態様では、本発明は、選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミドを作製する方法に関し、この方法は：
（ａ）プラスミドのＤＮＡの二次構造または超らせん性を変更して、細胞が、部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えを起こし得ないようにする化学種が存在する宿主細胞において、部位特異的リコンビナーゼ標的部位に隣接した選択可能なマーカー遺伝子を含むプラスミドを培養するステップ；および
（ｂ）続いて、部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えが起こり得るように細胞中の化学種のレベルを変更して、選択可能なマーカー遺伝子を切除するステップを含む。
【００１９】
第７の態様では、本発明は、選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミドを作製する方法に関し、この方法は：
（ａ）部位特異的リコンビナーゼ標的部位に作用して、細胞が、部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えを起こし得ないようにすることができる部位特異的リコンビナーゼが存在しない第１の宿主細胞において、部位特異的リコンビナーゼ標的部位に隣接した選択可能なマーカー遺伝子を含むプラスミドを培養するステップ；および
（ｂ）続いて、部位特異的リコンビナーゼ標的部位に作用することができる部位特異的リコンビナーゼが存在する第２の宿主細胞においてプラスミドを培養して、選択可能なマーカー遺伝子を切除するステップを含む。
【００２０】
一実施形態では、宿主細胞環境は、上記の１つ以上の変更によって変更することができる。
【００２１】
（部位特異的リコンビナーゼ）
一実施形態では、本発明の方法は、第２の宿主細胞環境において選択可能なマーカー遺伝子を切除することができる内因性部位特異的リコンビナーゼを利用する。これは、宿主細胞を遺伝子改変する必要をなくすため有利であり、この方法が、より単純かつより効率的になる。用語「内因性」は、部位特異的リコンビナーゼが第２の宿主細胞環境と同じ細胞型を起源とする意味で使用される。一般に、部位特異的リコンビナーゼは、第２の宿主細胞環境を起源とする、すなわち第２の宿主細胞環境は、部位特異的リコンビナーゼを発現できる遺伝子を含めるために遺伝子操作されていない。
【００２２】
当業者には、本発明の方法においてプラスミドに作用する内因性部位特異的リコンビナーゼの性質が、このプラスミド内に存在する部位特異的リコンビナーゼ標的部位の性質に依存することは明らかであろう。
【００２３】
内因性部位特異的リコンビナーゼの利用は、トランス型の外来性リコンビナーゼの導入を必要としないため、従来技術よりも有利である。これは、リコンビナーゼを発現させるために宿主細胞環境を変更する必要がないため、方法を単純にし、方法を迅速、割安、かつより効率的にする。さらなる実施形態では、内因性部位特異的リコンビナーゼは、ＸｅｒＣ、ＸｅｒＤ、ＣｏｄＶ、ＲｉｐＸ、Ｃｒｅ、Ｉｎｔ、Ｘｉｓ、Ｐ２２、Ｆｌｐ、およびＲ１の１つ以上を含むことができる。
【００２４】
一実施形態では、内因性部位特異的リコンビナーゼは、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ、Ｒ、ＸｅｒＣ、ＸｅｒＤ、ＲｉｐＸ、およびＣｏｄＶから選択することができる。
【００２５】
別の実施形態では、内因性部位特異的リコンビナーゼはトランスポザーゼであることができる。
【００２６】
好ましくは、部位特異的リコンビナーゼは、ＸｅｒＣおよびＸｅｒＤである。より好ましくは、ＸｅｒＣおよびＸｅｒＤ部位特異的リコンビナーゼは内因性である。
【００２７】
原核生物中のＸｅｒ組換え系は、複製後の正確な染色体分離を保障し、かつＲｅｃＡによって生成される染色体二量体を単量体に戻すために必須であり、複製された染色体の分離を可能にする。Ｘｅｒリコンビナーゼは、チロシンリコンビナーゼファミリーのメンバーであり、グラム陰性菌、例えば、大腸菌中のＸｅｒＣおよびＸｅｒＤ（Ｂｌａｋｅｌｙら、Ｃｅｌｌ、１９９３、７５：３５１−３６１）、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓおよび他のグラム陽性菌中のＣｏｄＶおよびＲｉｐＸ（Ｓｃｉｏｃｈｅｔｔｉら、１９９９、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８１：６０５３−６０６２）によって代表される。Ｘｅｒリコンビナーゼは、ｄｉｆとして知られている染色体の２８塩基対標的配列に作用する（ＬｅｓｌｉｅおよびＳｈｅｒｒａｔｔ、１９９５、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１４：１５６１−１５７０；Ｓｃｉｏｃｈｅｔｔｉら、２００１、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８３：１０５８−１０６８）。タンパク質ＦｔｓＫは、大腸菌におけるＸｅｒ組換えに必要であり（Ｒｅｃｃｈｉａら、１９９９、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１８：５７２４−５７３４）、そしてＦｔｓＫ相同体は、細菌で広く保存されているが、古細菌では見られない（ＲｅｃｃｈｉａおよびＳｈｅｒｒａｔｔ、１９９９、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３４：１１４６−１１４８）。
【００２８】
内因性Ｘｅｒリコンビネーション系は、線状ＤＮＡ分子の宿主細胞染色体への組み込み後に抗生物質耐性遺伝子を染色体から切除する技術（「Ｘｅｒ−ｃｉｓｅ」）に以前から使用されていた（ＢｌｏｏｒおよびＣｒａｎｅｎｂｕｒｇｈ、２００６、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、７２：２５２０−２５２５）。
【００２９】
内因性Ｘｅｒ組換え系は、プラスミド二量体を分離するようにも機能する。組換えを容易にするために、プラスミド二量体は、ｄｉｆに機能的に等価な部位特異的リコンビナーゼ認識部位を含む。これらの部位は、ｃｅｒおよびｐｓｉである。ｃｅｒは、大腸菌プラスミドＣｏｌＥ１で見られ（ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｈｅｒｒａｔｔ、１９８４、Ｃｅｌｌ、３６：１０９７−１５１１０３）、ｐｓｉは、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａプラスミドｐＳＣ１０１で見られる（Ｃｏｒｎｅｔら、１９９４、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７６：３１８８−３１９５）。
【００３０】
プラスミド二量体が形成されると、Ｘｅｒ組換え系は、ｃｅｒおよびｐｓｉ部位でＤＮＡ組換えを行うことによって二量体を２つの単量体に戻すように機能する。しかしながら、染色体ｄｉｆ部位とは異なり、ＸｅｒＣおよびＸｅｒＤは、〜１８０ｂｐの補助配列（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）も存在する場合には、プラスミド標的部位のみに作用する（ＨａｙｅｓおよびＳｈｅｒｒａｔｔ、１９９７）。ｃｅｒのこれらの補助配列は、タンパク質ＰｅｐＡ（アミノペプチダーゼＡ）およびＡｒｇＲ（アルギニン生合成経路リプレッサー）の結合部位であり、ｐｓｉの補助配列は、タンパク質ＰｅｐＡおよびＡｒｃＡの結合部位である（Ｃｏｌｌｏｍｓら、１９９８、Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２８：５２１−５３０）。この構成は、Ｘｅｒ組換えがプラスミドに対して方向性を有するようにするために必要である、すなわち二量体化によって自然に形成される直接反復二量体分離部位にのみ機能する。
【００３１】
前述のＸｅｒ−ｃｉｓｅ系は、補助配列の要件から、プラスミド二量体を分離するためにプラスミドに直接適用することができない。
【００３２】
一実施形態では、部位特異的リコンビナーゼは、誘導性であるか、または恒常的に発現され得る。一部の実施形態では、部位特異的リコンビナーゼは、好ましくは誘導性である。特に、本発明の方法が、同じ宿主細胞内に存在する第１の宿主細胞環境および第２の宿主細胞環境を利用する場合、部位特異的リコンビナーゼは、好ましくは誘導性である。この実施形態の範囲内では、リコンビナーゼの発現は、容量オスモル濃度、温度、インデューサーの存在または非存在、細胞の成長段階、およびＤＮＡの二次構造または超らせん性を変更する化学種の存在の１つ以上を変更することによって誘発することができる。
【００３３】
（リコンビナーゼの導入）
上記の本発明の好ましい実施形態は、プラスミドが維持される第２の宿主細胞環境の遺伝子改変を必要としない。しかしながら、部位特異的リコンビナーゼ、例えば、Ｘｅｒリコンビナーゼ系が、第２の宿主細胞環境で自然に存在しない場合、本発明の方法は、適切な部位特異的リコンビナーゼまたはトランスポザーゼをコードする遺伝子を宿主細胞環境に導入することによって行うことができる。このアプローチは、部位特異的リコンビナーゼが第２の宿主細胞環境に存在する場合にも使用することができるが、第２の宿主細胞環境には自然に存在しない代替の部位特異的リコンビナーゼが望ましい。この実施形態では、代替の部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子を、第２の宿主細胞環境に導入することができる。
【００３４】
部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子は、染色体外要素に導入するか、または宿主細胞染色体に組み込むことができる。宿主細胞環境に導入するのに適したリコンビナーゼの例には、限定されるものではないが、バクテリオファージＰ１由来のＣｒｅ（ＤａｌｅおよびＯｗ、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、８８：１０５５８−１０５６２）、バクテリオファージλ由来のＩｎｔおよびＸｉｓ（Ｚｕｂｋｏら、２０００、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１８：４４２−４４５）、およびＰ２２（Ｗｕｌｆｆら、１９９３、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、９：２６１−２７１）、Ｆｌｐ（ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ、２０００、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、９７：６６４０−６６４５）、ならびに酵母由来のＲ（Ｓｕｇｉｔａら、２０００、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．、２２：４６１−４６９）が含まれる。トランス型で発現されるトランスポザーゼもまた、内部分離部位に隣接した選択可能なマーカー遺伝子を切除するために使用することができ（Ｓａｎｃｈｉｓら、１９９７、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６３：７７９−７８４）、従ってリコンビナーゼと同じ要領で宿主細胞環境に導入することができる。
【００３５】
プラスミドの選択可能なマーカー遺伝子は、宿主細胞環境に導入されるリコンビナーゼ系の部位特異的リコンビナーゼ標的部位に隣接される。本発明の方法は、内因性部位特異的リコンビナーゼ系が使用される場合、上記のように機能する。
【００３６】
（部位特異的リコンビナーゼ標的部位）
本発明の方法に使用されるプラスミド内に存在する選択可能なマーカー遺伝子は、部位特異的リコンビナーゼ標的部位によって隣接される。
【００３７】
部位特異的リコンビナーゼ標的部位は、部位特異的リコンビナーゼが案内される染色体またはプラスミドのＤＮＡ配列の一部である。部位特異的リコンビナーゼ標的部位が直列に存在する場合は、これらの部位特異的リコンビナーゼ標的部位に、１つ以上の部位特異的リコンビナーゼが作用して、これらの部位特異的リコンビナーゼ標的部位間に位置するＤＮＡの部分を切除することができる。
【００３８】
本発明の範囲内では、用語、部位特異的リコンビナーゼ標的部位は、トランスポザーゼ標的部位も含む。
【００３９】
上記説明されたように、Ｘｅｒリコンビナーゼ系は、原核生物では内因性であり、チロシンリコンビナーゼＸｅｒＣおよびＸｅｒＤを利用して染色体二量体およびプラスミド二量体の両方を分離する。
【００４０】
一実施形態では、部位特異的リコンビナーゼ標的部位は、ＸｅｒＣおよび／またはＸｅｒＤに結合することができる。
【００４１】
一実施形態では、部位特異的リコンビナーゼ標的部位は、任意のＸｅｒＣおよび／またはＸｅｒＤ結合部位とすることができる。例示的な部位は、宿主細胞染色体およびプラスミドから同定することができる。
【００４２】
部位特異的リコンビナーゼ標的部位は、プラスミドおよび染色体から自然発生するプラスミド二量体分離部位を結合することによって形成することができる。このようなハイブリッド部位の例として、配列が以下の表１に示されている、ｐｉｆ部位としても知られているｄｉｆ−ｐｓｉハイブリッド部位（Ｃｏｒｎｅｔら、１９９４、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７６：３１８８−３１９５）が挙げられる。ｐｉｆ部位は、ｐｓｉとは１つのヌクレオチドのみが異なっているが、プラスミドおよび染色体におけるＸｅｒ組換えを促進することができる。本発明のプロセスに使用されるさらなるハイブリッド部位は、ハイブリッド配列を作製し、これらのハイブリッド配列がプラスミド二量体分離部位として機能できるかを、単純な組換え試験、例えば、Ｂａｒｒｅら、２０００（Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、１４：２９７６−２９８８）に記載されている試験を用いて決定することによって開発することができる。
【００４３】
染色体またはプラスミドの局所超らせん性は、Ｘｅｒ組換えにおける重要な因子であると考えられるため、浸透圧条件または周囲のＤＮＡ配列が、染色体上でのみ正常に機能する部位、例えば、ｄｉｆを介してプラスミドにおけるＸｅｒ組換えを促進することができる状況が存在し得る。したがって、一実施形態では、部位特異的リコンビナーゼ標的部位は、ｄｉｆ部位とすることができる。
【００４４】
さらなる実施形態では、部位特異的リコンビナーゼ標的部位は、以下の表１に列記されている部位（すなわち、配列番号：１〜９）のいずれか１つ、または配列番号：１７、２０、または２３のいずれか１つに類似させることができる。部位特異的リコンビナーゼ標的部位は、配列番号：１〜９、１７、２０、または２３のいずれかを含む、またはこのいずれかからなる場合は、配列番号：１〜９、１７、２０、または２３の１つに類似していると見なされる。部位特異的リコンビナーゼ標的部位は、配列番号：１〜９、１７、２０、または２３のいずれか１つに対して５０％以上の配列同一性を有する場合、配列番号：１〜９、１７、２０、または２３の１つに類似していると見なされる。あるいは、部位特異的リコンビナーゼ標的部位は、配列番号：１〜９、１７、２０、または２３の１つに対して６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有することができる。これは、配列番号：１〜９、１７、２０、または２３のいずれか１つに対して１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、または１５のヌクレオチド置換を有する配列に等しいと考えることができる。配列番号：１〜９、１７、２０、または２３のいずれか１つの１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、または３４のヌクレオチドの断片を含む配列も、本発明の範囲内に含まれる。上記の断片または変異配列は、ＸｅｒＣおよび／またはＸｅｒＤに結合することができる。
【００４５】
当業者には、プラスミドに含まれる部位特異的リコンビナーゼ標的部位の性質が、本発明の方法を実施する第１および第２の宿主細胞環境では内因性である部位特異的リコンビナーゼに依存することは明らかであろう。
【００４６】
本発明の方法は、トランス型の外来性リコンビナーゼの導入を必要としないため、従来技術のプロセスに勝る利点を提供する。したがって、部位特異的リコンビナーゼ標的部位は、第２の細胞環境で内因性部位特異的リコンビナーゼによって作用され得なければならない。しかしながら、これは、部位特異的リコンビナーゼ標的部位もまた、プロセスが行われる細胞に対して内因性でなければならないという意味ではない。例えば、ある種の部位特異的リコンビナーゼが、他の種の部位特異的リコンビナーゼ標的部位に作用できるという証拠が存在する（Ｎｅｉｌｓｏｎら、１９９９、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３１：９１５−９２６）。加えて、部位特異的リコンビナーゼは、異なっている部位、例えば、大腸菌ｄｉｆ部位およびｐｓｉ−ｄｉｆハイブリッド（ｐｉｆ部位）を分離することを示した（Ｃｏｒｎｅｔら、１９９４、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７６：３１８８−３１９５）。
【００４７】
真核生物はまた、２つの部位特異的リコンビナーゼ標的部位間のＤＮＡを切除するように作用する天然の部位特異的リコンビナーゼも含む。例えば、酵母２ミクロンプラスミドのＦｌｐリコンビナーゼは、ＦＲＴ部位間のＤＮＡ組換えによりプラスミドの領域を反転させるように作用する。したがって、一実施形態では、部位特異的リコンビナーゼ標的部位は、ＦＲＴ部位とすることができる。
【００４８】
【表１】
0005889888.tif 000002
一実施形態では、部位特異的リコンビナーゼ標的配列は、互いに同じとすることができる。別の実施形態では、部位特異的リコンビナーゼ標的配列は、互いに異なり得る。
【００４９】
上記のように、補助配列は、プラスミドに存在する部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の部位特異的組換えを誘導する必要がある。したがって、一実施形態では、１つ以上の部位特異的リコンビナーゼ標的部位が、１つ以上のアクセサリータンパク質（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の結合部位に機能的に関連することができる。
【００５０】
アクセサリータンパク質の結合部位は、一般に補助部位と呼ばれる。
【００５１】
一実施形態では、補助配列は、アクセサリータンパク質ＰｅｐＡ、ＡｒｇＲ、またはＡｒｃＡの１つ以上の結合部位とすることができる。特定の実施形態では、補助配列は、ＰｅｐＡの結合部位およびＡｒｇＲまたはＡｒｃＡのいずれかの結合部位を含むことができる。
【００５２】
一実施形態では、補助配列は、以下に示されている配列に類似させることができ、これらの配列では、ＡｒｇＲ／ＡｒｃＡ結合部位の下に点線が引かれ、ＸｅｒＣＤ結合部位の下に１本の破線が引かれている。ＰｅｐＡは、ＡｒｇＲ／ＡｒｃＡ結合部位の周りの補助配列に結合するが、正確な位置は、特定されていない。
【００５３】
補助部位は、配列番号：１７、２０、または２３のいずれか１つを含む、またはこのいずれか１つからなる場合は、以下に列記されている部位の１つに類似していると見なされる。補助部位は、配列番号：１７、２０、または２３のいずれか１つに対して５０％以上の配列同一性を有する場合は、以下に列記されている部位の１つに類似していると見なされる。あるいは、補助部位は、配列番号：１７、２０、または２３のいずれか１つに対して６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有することができる。これは、配列番号：１７、３０、または２３のいずれか１つに対して１つ、２つ、３つ、または４つのヌクレオチド置換を有する配列と同等と考えることができる。配列番号：１７、２０、または２３のいずれか１つの８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７のヌクレオチドの断片を含む配列も、本発明の範囲内に含まれる。上記の断片または変異配列は、ＰｅｐＡ、ＡｒｇＲ、またはＡｒｃＡに結合することが可能である。
【００５４】
ｐＳＣ１０１（配列番号：１５）のｐｓｉ部位および補助配列
【００５５】
【化１】
0005889888.tif 000003
ＣｏｌＥＩ（配列番号：１８）のｃｅｒ部位および補助配列
【００５６】
【化２】
0005889888.tif 000004
ｐＪＨＣＭＷ１（配列番号：２１）のｍｗｒ部位および補助配列
【００５７】
【化３】
0005889888.tif 000005
（選択可能なマーカー遺伝子）
選択可能なマーカー遺伝子は、核酸分子の存在を検出するために使用することができる任意の遺伝子とすることができる。
【００５８】
一般に、抗生物質耐性遺伝子が、特定の核酸分子を含む細胞を識別するために当分野で使用される。したがって、一実施形態では、選択可能なマーカー遺伝子は、抗生物質を含む培地中での培養によるプラスミドを含む細胞の識別を可能にする抗生物質耐性遺伝子である。抗生物質耐性遺伝子は、当分野で知られており、これらの遺伝子のいずれも使用することができる。使用できる抗生物質耐性遺伝子の例として、限定されるものではないが、カナマイシン、ネオマイシン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、アンピシリン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、ネオマイシン、ブラストサイジン、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、エリスロマイシン、リンコマイシン、およびゼオシンに耐性を伝達する遺伝子を挙げることができる。本発明に従って使用することができる他の抗生物質耐性遺伝子は、Ｎｅｕ、１９９２、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５７  １０６４−１０７３に記載されている。
【００５９】
代替の実施形態では、選択可能なマーカー遺伝子は、宿主細胞環境に必須であるが宿主細胞環境に存在しない代謝産物の産生を可能にする。一実施形態では、選択可能なマーカー遺伝子は、細胞が宿主培養される培地で見られないアミノ酸のアミノ酸生合成経路に関与し得る。別の実施形態では、選択可能なマーカー遺伝子は、ジアミノピメリン酸合成に関与するチミジル酸シンターゼ遺伝子ｔｈｙＡまたはａｓｄ遺伝子とすることができる。
【００６０】
選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミドは、選択可能なマーカー遺伝子が存在しないプラスミドである。
【００６１】
（第１の宿主細胞環境）
第１の宿主細胞環境は、選択可能なマーカー遺伝子に隣接した部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えを起こすことができない。したがって、選択可能なマーカー遺伝子がプラスミド内に維持され、プラスミドを含む細胞を、選択可能なマーカー遺伝子の発現に基づいて選択することができる。
【００６２】
一実施形態では、細胞は、プラスミドの５０％未満が部位特異的に組換えられる場合は、部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えを起こすことができない。別の実施形態では、プラスミドの４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、５％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％未満、または０％が部位特異的に組換えられる場合は、細胞は、部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えを起こすことができない。
【００６３】
（変異）
一実施形態では、第１の宿主細胞環境は、プラスミドの部位特異的組換えに関与する１つ以上のタンパク質をコードする遺伝子における変異を含み得る。
【００６４】
部位特異的リコンビナーゼ、例えば、ＸｅｒＣまたはＸｅｒＤをコードする遺伝子に変異が存在しないのが好ましい。これは、これらのタンパク質が染色体分離を必要とし、かつこれらのタンパク質の機能型が存在しないと染色体分離が起きず、第１の宿主細胞環境が存続できないためである。
【００６５】
一実施形態では、アクセサリータンパク質ＰｅｐＡ、ＡｒｇＲ、またはＡｒｃＡのうちの１つ以上をコードする染色体遺伝子は、変異していることがある。
【００６６】
上記のように、ＰｅｐＡおよびＡｒｇＲは、ｃｅｒ部位でのプラスミドの部位特異的組換えに必要である一方、ＰｅｐＡおよびＡｒｃＡは、ｐｓｉ部位での部位特異的組換えに必要である。したがって、これらのアクセサリータンパク質をコードする遺伝子のうちの１つ以上における変異は、第１の宿主細胞環境で部位特異的組換えが起こるのを防止する。したがって、選択可能なマーカー遺伝子は、第１の宿主細胞環境に存在する場合はプラスミドによって維持され、選択圧を使用して、プラスミドを含む細胞を選択することができる。
【００６７】
ＰｅｐＡ、ＡｒｇＲ、またはＡｒｃＡタンパク質の１つ以上をコードする遺伝子の変異は、不活性化変異であり得る。このような変異は、これらのアクセサリータンパク質の１つ以上をコードする１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、または置換によって起こり得る。
【００６８】
別の実施形態では、変異が、１つ以上のアクセサリータンパク質の発現が防止される第１の宿主細胞環境に存在することがある。このような変異は、アクセサリータンパク質の発現に関与するタンパク質をコードする遺伝子中であり得る。あるいは、アクセサリータンパク質のｍＲＮＡの翻訳を防止するリプレッサーまたはアンチセンス配列を、過剰発現させることができる。
【００６９】
好ましい実施形態では、ＰｅｐＡ遺伝子の変異は、ｃｅｒまたはｐｓｉ部位のいずれかにおける組換えを細胞が起こすことができないようにするため、第１の宿主細胞環境は、この変異を含む。
【００７０】
第１の宿主細胞環境として使用されるアクセサリータンパク質の変異は、ＤＳ９５７、ＤＳ９４１  ｐｅｐＡ、ＤＳ９４１  ａｒｃＡ２、ＤＳ９４１  ａｒｃＡ：：Ｔｎ５（２．３）（Ｃｏｌｌｏｍｓら、１９９８、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２８（３）：５２１−５３０）、ＥＣＫ４２５３、およびＥＣＫ３２２６（Ｂａｂａら、２００６、Ｍｏｌ．Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００６）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｓｂ４１０００５０）から選択される変異大腸菌株とすることができる。
【００７１】
（容量オスモル濃度）
別の実施形態では、第１の宿主細胞環境は、この第１の宿主細胞環境の容量オスモル濃度が組換えが起きることを許容しないため、部位特異的組換え部位間の組換えを起こすことができない。
【００７２】
この実施形態の範囲内では、部位特異的リコンビナーゼ標的部位は、肺炎桿菌プラスミドｐＪＨＣＭＷ１のｍｗｒ部位とすることができる。この部位は、ｃｅｒに関連し、ＰｅｐＡおよびＡｒｇＲに結合する補助配列に隣接している（Ｐｈａｍら、２００２、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８４：１６０７−１６１６）。この浸透圧調節配列は、高い塩濃度の下では効率的なＸｅｒ組換えを可能にしないが、塩濃度がＬブロス中０．５％  ＮａＣｌ未満の場合は、結果として生じるＤＮＡ超らせん性の変化により、Ｘｅｒ組換えが可能となる（Ｔｒｉｇｕｅｒｏｓら、２００９、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、３７：３５８０−３５８７）。
【００７３】
したがって、この実施形態では、第１の宿主細胞環境は、２０９ｍｍｏｌ／ｋｇ（０．５％  ＮａＣｌ）以上の容量オスモル濃度を有することができる。第１の宿主細胞環境の容量オスモル濃度は、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、または０．１％  ＮａＣｌの濃度範囲が非組換えプラスミドの十分な部分を持続させることができるため、この濃度のＮａＣｌを含む培地中で第１の宿主細胞環境を培養することによって集団中の全てのプラスミドの完全な組換えに必要なレベルよりも高いレベルに維持することができる。理想的には、第１の宿主細胞環境の濃度は、０．５％よりも高い。宿主細胞が移される第２の環境は、０．１％未満のＮａＣｌ、理想的には０％のＮａＣｌを有する。
【００７４】
（温度）
別の実施形態では、第１の宿主細胞環境は、この第１の宿主細胞環境の温度が、組換えを起こすのに必要な温度よりも高いまたは低いため、部位特異的組換え部位間の組換えを起こすことができない。
【００７５】
（インデューサー）
別の実施形態では、第１の宿主細胞環境は、この第１の宿主細胞環境中にインデューサーが存在しないため、部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えを起こすことができない。このようなインデューサーは、組み換えを起こすのに必要であり得る。
【００７６】
（プラスミドの二次構造または超らせん性を変更する化学種）
部位特異的リコンビナーゼ標的部位間に組換えが起こるようにするために、プラスミドは、リコンビナーゼおよびアクセサリータンパク質がそれぞれ、部位特異的リコンビナーゼ標的部位および補助配列にアクセスするために正しい二次構造および超らせん性を有していなければならない。したがって、一実施形態では、第１の宿主細胞環境は、部位特異的リコンビナーゼおよび／またはアクセサリータンパク質がプラスミドの関連部位へのアクセスを許容しないプラスミドの二次構造または超らせん性を形成する化学種の存在のために、部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えを起こすことができない。このような化学種、例えば、臭化エチジウムは、ＤＮＡを挿入することができる。
【００７７】
（部位特異的リコンビナーゼの非存在）
さらなる実施形態では、第１の宿主細胞環境は、部位特異的リコンビナーゼ標的部位に作用することができる部位特異的リコンビナーゼの非存在により、部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えを起こすことができない。
【００７８】
（第２の宿主細胞環境）
第２の宿主細胞環境は、選択可能なマーカー遺伝子に隣接した部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えを起こすことができる。したがって、選択可能なマーカー遺伝子は、この選択可能なマーカー遺伝子に隣接した部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えによってプラスミドから切除される。
【００７９】
一実施形態では、細胞は、細胞の１％超が、プラスミドの部位特異的組換えを行うことができる場合は、部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えを起こすことができる。他の実施形態では、細胞は、プラスミドの２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％超、または１００％が、部位特異的に組換えられる場合は、部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えを起こすことができる。
【００８０】
（活性なＰｅｐＡ、ＡｒｇＡ、およびＡｒｃＡ）
第１の宿主細胞環境が、アクセサリータンパク質ＰｅｐＡ、ＡｒｇＲ、およびＡｒｃＡをコードする遺伝子のうちの１つ以上に不活性化変異を含む実施形態では、第２の宿主細胞環境は、活性バージョンのＰｅｐＡ、ＡｒｇＲ、およびＡｒｃＡの１つ以上を含み得る。好ましくは、第２の宿主細胞環境は、組換えがｃｅｒまたはｐｓｉ部位で起こり得るように活性バージョンのＰｅｐＡとＡｒｇＲおよびＡｒｃＡの少なくとも一方を含む。一実施形態では、第２の宿主細胞環境は、第１の宿主細胞環境で不活性化される活性バージョンのアクセサリータンパク質のいずれかを含み得る。
【００８１】
（容量オスモル濃度）
第１の宿主細胞環境が、組換えが起こるのに必要な容量オスモル濃度よりも低い容量オスモル濃度に維持される実施形態では、第２の宿主細胞環境を、組換えを行うのに必要な容量オスモル濃度よりも高い容量オスモル濃度を呈するようにすることによって、組換えを起こし得るようにすることができる。
【００８２】
この実施形態は、部位特異的リコンビナーゼ標的部位が、肺炎桿菌プラスミドｐＪＨＣＭＷ１のｍｗｒ部位に類似している場合に起こり得る。
【００８３】
この実施形態では、第２の宿主細胞環境は、０．５％未満の塩の濃度による容量オスモル濃度を有することができる。一実施形態では、第１の宿主細胞環境の容量オスモル濃度は、０．５５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％超、またはそれ以上の塩の濃度に依存し得る。
【００８４】
当業者には、容量オスモル濃度を、第１の宿主細胞環境と第２の宿主細胞環境との間で様々な方法で変更できることは明らかであろう。一実施形態では、第１の宿主細胞環境を第２の宿主細胞環境に変換するために、この第１の宿主細胞環境を、塩を含まない培地で希釈することによって、容量オスモル濃度を変更することができる。あるいは、塩を含む第１の培地の細胞を遠心分離して細胞ペレットを作製し、塩を含む上清を除去し、そして細胞を塩を含まない培地中に再懸濁する。
【００８５】
（温度）
第１の宿主細胞環境が、組換えを起こすのに必要な温度よりも高いまたは低い温度に維持される実施形態では、第２の宿主細胞環境を、組換えを起こすのに必要な温度よりも高いまたは低い温度を呈するようにすることによって、組換えを起こし得るようにすることができる。
【００８６】
当業者には、この温度を、第１の宿主細胞環境と第２の宿主細胞環境との間で様々な方法で変更できることは明らかであろう。一実施形態では、この温度は、宿主細胞が培養される温度を変更することによって変更することができる。
【００８７】
（インデューサー）
第１の宿主細胞環境が、この第１の宿主細胞環境にインデューサーが存在しないために、部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えを起こすことができない実施形態では、第２の宿主細胞環境を、インデューサーの添加によって組換えを起こし得るようにすることができる。
【００８８】
当業者には、インデューサーを様々な方法で細胞に添加することができることは明らかであろう。一実施形態では、インデューサーの添加は、第１の宿主細胞環境から第２の宿主細胞環境に変換するために、宿主細胞が培養されている培地にインデューサーを添加することによって行うことができる。
【００８９】
（プラスミドの二次構造または超らせん性を変更する化学種）
部位特異的リコンビナーゼおよび／またはアクセサリータンパク質のプラスミドの関連部位へのアクセスを許容しないプラスミドの二次構造または超らせん性を形成する化学種の存在のために、第１の宿主細胞環境が、部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えを起こすことができない実施形態では、第２の宿主細胞環境を、この化学種の除去によって組換えを起こし得るようにすることができる。
【００９０】
当業者には、化学種を、様々な方法で細胞から除去できることは明らかであろう。化学種を含む第１の培地の細胞を遠心分離して細胞ペレットを作製し、この化学種を含む上清を除去し、そして細胞を化学種を含まない培地に再懸濁する。
【００９１】
（部位特異的リコンビナーゼの存在）
第１の宿主細胞環境が、部位特異的リコンビナーゼ標的部位に作用することができる部位特異的リコンビナーゼが存在しないために、部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えを起こすことができない実施形態では、第２の宿主細胞環境は、部位特異的リコンビナーゼ標的部位に作用することができる部位特異的リコンビナーゼの存在により、部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えを起こすことができる。
【００９２】
部位特異的リコンビナーゼ標的部位に作用することができる部位特異的リコンビナーゼを、第２の宿主細胞環境内に存在する別のプラスミドがコードすることができる、あるいは、第２の宿主細胞環境が別個の宿主細胞である場合は、部位特異的リコンビナーゼを、第２の宿主細胞の染色体に組み込むことができる。
【００９３】
（宿主細胞環境の選択）
一実施形態では、第２の宿主細胞は、腸内細菌科のメンバー（例えば、エシェリキア属、赤痢菌属、またはサルモネラ属）とすることができる。この実施形態の範囲内では、第１の宿主細胞環境は、ｐｅｐＡまたはａｒｇＲ／ａｒｃＡ変異を含む大腸菌株とすることができる。これにより、第１の宿主細胞環境内に存在するＸｅｒＣおよびＸｅｒＤタンパク質が、第１の宿主細胞環境内で部位特異的リコンビナーゼ標的部位の組み換えを行うことができない。
【００９４】
この実施形態はまた、第２の宿主細胞環境における組換えに必要なＸｅｒリコンビナーゼ標的部位およびアクセサリータンパク質標的部位が第１の宿主細胞環境に存在する場合にも起こり得る。
【００９５】
しかしながら、第１の宿主細胞環境が、第２の宿主細胞環境から十分に進化的に異なり、そのＸｅｒ組換え系が、第１の宿主細胞環境のプラスミドの部位特異的リコンビナーゼ認識部位に作用しない場合は、第１の宿主細胞環境は、ｐｅｐＡまたはａｒｇＲ／ａｒｃＡ変異を有する必要がない。
【００９６】
別の実施形態では、第１の宿主細胞環境は、原核細胞であり、プラスミドは、ＦＲＴ部位特異的リコンビナーゼ標的部位を含むことができる。原核細胞が、ＦＲＴ部位を組み換えるために必要なＦｌｐリコンビナーゼを含まないため、部位特異的リコンビナーゼ標的部位は、第１の宿主細胞環境では組み換えられず、１つ以上のアクセサリータンパク質をコードする遺伝子の変異が、第１の宿主細胞環境において一切必要ない。この実施形態では、第２の宿主細胞環境は、ＦＲＴ部位間の組換えを第２の宿主細胞環境で起こして選択可能なマーカー遺伝子を切除できるように、ＦＲＴ部位間の部位特異的な組換えを起こすことができる真核生物、例えば、酵母細胞とするべきである。
【００９７】
（宿主細胞の形質転換）
第１の宿主細胞環境が、部位特異的リコンビナーゼ標的部位に隣接した選択可能なマーカー遺伝子を含むプラスミドで形質転換されることを理解されたい。
【００９８】
第１の宿主細胞環境および第２の宿主細胞環境が、異なる細胞で形成される実施形態では、部位特異的リコンビナーゼ標的部位に隣接した選択可能なマーカー遺伝子を含むプラスミドを第１の宿主細胞環境から除去し、第２の宿主細胞環境に形質転換する。宿主細胞の形質転換の方法は、当分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、１９８９）に記載されている。部位特異的リコンビナーゼ標的部位に隣接した選択可能なマーカー遺伝子を含むプラスミドを第１の宿主細胞環境から分離する方法もまた、当分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、１９８９）に記載されている。好ましい実施形態では、形質転換は、エレクトロポレーションによって行うことができる。
【００９９】
第１の宿主細胞環境および第２の宿主細胞環境が、異なる細胞で形成される実施形態では、プラスミドの各宿主細胞環境への形質転換の方法は、同じでも良いし、異なっていても良い。
【０１００】
（細胞培養）
第１のステップにおいて、部位特異的リコンビナーゼ標的部位に隣接した選択可能なマーカー遺伝子を含むプラスミドを、部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えが起こり得ないようにする条件下で、第１の宿主細胞環境で培養する。このステップの範囲内において、プラスミドを含む細胞のみが維持されるように、細胞を選択圧の存在下で培養することができる。
【０１０１】
第２のステップにおいて、部位特異的リコンビナーゼ標的部位に隣接した選択可能なマーカー遺伝子を含むプラスミドを、選択可能なマーカー遺伝子が切除されるように部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えが起こり得るようにする条件下で、第２の宿主細胞環境で培養する。細胞培養の適切な条件は、当分野で公知である。一実施形態では、細胞培養条件は、成長に必要な全ての栄養を提供するブロス培地または寒天プレートにおける２５〜４２℃、理想的には３０〜３７℃の温度を含み得る。最も一般的な条件は、ＬＢ寒天またはＬＢブロスにおける３７℃であろう。
【０１０２】
当業者には、選択可能なマーカー遺伝子が瞬時に切除されないことは明らかであろう。したがって、第２の宿主細胞環境は、プラスミドを含む細胞のみが当初は維持されるように、当初は選択圧の存在を含み得る。
【０１０３】
一実施形態では、本方法は、選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミドを細胞培養中に維持するステップをさらに含むことができる。このステップは、選択可能なマーカー遺伝子の切除後に行うことができる。
【０１０４】
本発明者らは、驚くべきことに、本発明の方法に従って作製された選択可能なマーカー遺伝子遺伝子を含まないプラスミドを、プラスミド維持系の非存在下で第２の宿主細胞環境で維持できることを見出した。当業者は、プラスミド維持系が存在しないとプラスミドが消失すると予期していたため、これは驚くべきことである。本発明の方法に従って作製された選択可能なマーカー遺伝子遺伝子を含まないプラスミドは、選択可能なマーカー遺伝子の発現の非存在下での代謝負荷の減少により維持されると考えられる。
【０１０５】
さらなる実施形態では、本方法は、選択可能なマーカー遺伝子遺伝子を含まないプラスミドを第１および／または第２の宿主細胞環境から分離するステップをさらに含むことができる。プラスミド分離の方法は、当分野で周知であり、限定されるものではないが、ＢｉｒｎｂｏｉｍおよびＤｏｌｙ、１９７９、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、７：１５１３−１５２３に基づいた方法に従ったアルカリ溶解法による遠心分離および精製を含む。ＤＮＡは、第２の宿主細胞環境からの抽出後に分析することができる。
【０１０６】
（宿主細胞型）
第１および第２の宿主細胞環境は、任意の細胞型から形成することができる。第１および第２の宿主細胞環境は、同じ細胞型でも良いし、異なる細胞型でも良い。第１および第２の宿主細胞環境が同じ細胞型である場合、これらは、異なる菌株であっても良い。第１および第２の宿主細胞環境が、同じ細胞で形成される実施形態では、第１および第２の宿主細胞環境は、同じ細胞型となる。
【０１０７】
一実施形態では、第１の宿主細胞環境および／または第２の宿主細胞環境は、原核細胞とすることができる。この実施形態の範囲内では、第１の宿主細胞環境および第２の宿主細胞環境は、細菌細胞とすることができる。
【０１０８】
一実施形態では、第１の宿主細胞環境および／または第２の宿主細胞環境は、グラム陰性細菌細胞とすることができる。この実施形態の範囲内では、第１の宿主細胞環境および第２の宿主細胞環境は、エシェリキア属、サルモネラ属、赤痢菌属、アグロバクテリウム属、シュードモナス属、およびビブリオ属から独立して選択することができる。さらに、この実施形態の範囲内では、第１の宿主細胞環境および第２の宿主細胞環境は、大腸菌およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ（Ｓｅｒｏｖａｒｓ  ＴｙｐｈｉおよびＴｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍを含む）から独立して選択することができる。
【０１０９】
別の実施形態では、第１の宿主細胞環境および／または第２の宿主細胞環境は、グラム陽性細菌細胞とすることができる。この実施形態の範囲内では、第１の宿主細胞環境および第２の宿主細胞環境は、バチルス属、ストレプトミセス属、リステリア属、乳酸杆菌属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、およびミコバクテリウム属から独立して選択することができる。さらに、この実施形態の範囲内では、第１の宿主細胞環境および第２の宿主細胞環境は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓまたはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ（例えば、ＢＣＧ株）から独立して選択することができる。
【０１１０】
別の実施形態では、第１の宿主細胞環境および／または第２の宿主細胞環境は、古細菌とすることができる。この実施形態の範囲内では、第１の宿主細胞環境および／または第２の宿主細胞環境は、酵母とすることができる。さらに、この実施形態の範囲内では、第１の宿主細胞環境および第２の宿主細胞環境は、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、サッカロミセス属、およびシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属から独立して選択することができる。
【０１１１】
別の実施形態では、第１の宿主細胞環境および／または第２の宿主細胞環境は、プラスミドを複製することができる非真菌真核生物とすることができる。この実施形態の範囲内では、第１の宿主細胞環境および第２の宿主細胞環境は、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｍａｓ）属、タマホコリカビ（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ）属、およびエントアメーバ属から独立して選択することができる。
【０１１２】
細胞が原核細胞である場合は、細胞は、ＲｅｃＡ＋細胞またはＲｅｃＡ−細胞とすることができる。
【０１１３】
本発明の範囲内では、提案された宿主細胞型のいずれも、弱毒化または非弱毒化宿主細胞とすることができる。
【０１１４】
第１の宿主細胞環境と第２の宿主細胞環境の全ての組み合わせが、本発明の範囲内で企図されることを理解されたい。
【０１１５】
（目的の遺伝子）
一実施形態では、本発明の方法に使用されるプラスミドは、目的の遺伝子を含む。目的の遺伝子は、組換え的に作製するのが望ましい、または治療に使用することができる任意の核酸またはタンパク質をコードすることができる。
【０１１６】
さらなる実施形態では、目的の遺伝子は、治療または予防に有用なタンパク質とすることができる。別の実施形態では、この遺伝子は、ワクチンとして使用するのに適した遺伝子とすることができる。
【０１１７】
（１ステップ法）
一般に、本発明の方法は、第１の宿主細胞環境および第２の宿主細胞環境を用いて上記のように行われる。しかしながら、代替の実施形態では、プラスミドは、合成または化学的に連結して、第２の宿主細胞環境に直接形質転換することができる。この方法は、第１の宿主細胞環境の必要性をなくすであろう。したがって、本発明は、選択可能なマーカー遺伝子が切除されるように、部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えを起こすことができる単一宿主細胞環境を利用する方法も包含する。
【０１１８】
この代替の方法は、プラスミドが、プラスミド維持系の非存在下で、選択可能なマーカー遺伝子の切除後の第２の宿主細胞環境内に維持される驚くべき利点を維持する。
【０１１９】
（プラスミド）
一実施形態では、本発明はまた、本発明の方法によって作製される選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミドも包含する。このプラスミドは、第２の宿主細胞環境から単離し、かつ／または精製することができる。
【０１２０】
別の実施形態では、本発明はまた、本発明の方法によって作製された選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミドを含む第２の宿主細胞環境も含む。
【０１２１】
別の実施形態では、本発明は、本発明の方法に従って作製されたプラスミドおよび薬学的に許容され得る賦形剤を含む組成物を含む。
【０１２２】
（プラスミドを含む宿主細胞）
一実施形態では、本発明はまた、選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミドを含む宿主細胞も包含する。このような宿主細胞は、プラスミド維持系を欠いていると言うこともできる。一実施形態では、宿主細胞内のプラスミドは、残存部位特異的リコンビナーゼ標的部位を含む。残存部位特異的リコンビナーゼ標的部位は、当初から存在する、２つの部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組み換え後にプラスミドに残った部位特異的リコンビナーゼ標的部位である。したがって、一実施形態では、宿主細胞内のプラスミドは、１つの部位特異的リコンビナーゼ標的部位を含むことができる。これにより、本発明の方法によって作製されたプラスミドを含む宿主細胞と、残存部位特異的リコンビナーゼ標的部位を含まない、代替の方法によって作製されたプラスミドを含む宿主細胞とを区別することができる。必要に応じて、宿主細胞は、上記説明したようにプラスミド維持系、例えば、ＯＲＴ（オペレーター−リプレッサータイトレーション）またはｏｒｉＳＥＬＥＣＴを含むことができる。
【０１２３】
一実施形態では、宿主細胞は、誘導性部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子を含むことができる。この誘導性部位特異的リコンビナーゼは、宿主細胞の染色体に存在することができる。
【０１２４】
一実施形態では、宿主細胞は、非改変宿主細胞とすることができる。
【０１２５】
プラスミド維持系を含まない非改変宿主細胞は、プラスミド維持系を含まない宿主細胞がプラスミドを維持するとは以前は予想していなかったため、本発明に従った方法によってのみ作製することができる。
【０１２６】
宿主細胞は、本発明の方法に関連して上記説明された任意の細胞型とすることができる。例えば、宿主細胞は、グラム陰性細菌細胞（例えば、エシェリキア属、サルモネラ属、赤痢菌属、アグロバクテリウム属、シュードモナス属、またはビブリオ属の）、グラム陽性細菌細胞（例えば、バチルス属、ストレプトミセス属、リステリア属、乳酸杆菌属、ラクトコッカス属、またはミコバクテリウム属の）、古細菌、酵母（例えば、ハンゼヌラ属、ピキア属、サッカロミセス属、またはシゾサッカロミセス属の）、またはプラスミドを複製できる非真菌真核生物（例えば、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｍａｓ）属、タマホコリカビ属、またはエントアメーバ属の）とすることができる。
【０１２７】
宿主細胞内のプラスミドに含まれる残存部位特異的リコンビナーゼ標的部位は、Ｅｃｄｉｆ、ｃｅｒ、ｐｓｉ、ｐｉｆ、ｍｗｒ、Ｂｓｄｉｆ、ｌｏｘＰ、ＦＲＴ、およびＲＳを含む、本発明の方法に関連して説明された任意の部位特異的リコンビナーゼ標的部位とすることができる。
【０１２８】
このような宿主細胞は、後述するように治療用またはワクチンとして有利に使用することができる。
【０１２９】
別の実施形態では、本発明は、選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミドを含む非改変宿主細胞および薬学的に許容され得る賦形剤を含む組成物を含む。
【０１３０】
（プラスミドおよび宿主細胞の用途）
本発明の範囲内では、本発明の方法に従って作製されたプラスミド、およびプラスミド維持系が存在しないプラスミドを含む宿主細胞は、多数の用途を有し得る。
【０１３１】
第１に、本発明の方法に従って作製されたプラスミド、およびプラスミド維持系が存在しないプラスミドを含む宿主細胞は、療法に使用することができる。この療法は、治療または予防とすることができる。
【０１３２】
（治療用またはワクチンとしての組換えタンパク質の生産）
一実施形態では、選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミドを含む形質転換細胞（すなわち第２の宿主細胞環境）を、栄養ブロスフラスコまたは発酵槽で増殖させて、タンパク質治療用またはタンパク質ワクチンとして使用するために後に回収される組換えタンパク質を生産する。
【０１３３】
（治療用ＤＮＡおよびＤＮＡワクチンの生産）
別の実施形態では、選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミドを含む形質転換細胞（すなわち第２の宿主細胞環境）を、栄養ブロスフラスコまたは発酵槽で増殖させて、ＤＮＡ治療用またはＤＮＡワクチンとして使用するために後に回収されるＤＮＡ配列を生産することができる。ＤＮＡ治療用またはＤＮＡワクチンは、一般にプラスミドの形態をとるが、次のプラスミドのプロセシングを受けた線状ＤＮＡ分子の形態をとることもできる。このようなプロセシングは、制限エンドヌクレアーゼの使用を含み得る。
【０１３４】
（生きた細菌ベクターを用いた組換えタンパク質およびＤＮＡの動物への送達）
別の実施形態では、選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミドを含む形質転換細胞（すなわち第２の宿主細胞環境）を、処置を必要とする動物に直接投与することができる。この実施形態の範囲内では、この細胞環境を、弱毒化しても良いし、弱毒化しなくても良い。この実施形態では、細胞は、治療効果または免疫効果が得られるように、その内容物を患者に放出することができる。例えば、弱毒化サルモネラ菌を使用して、組換え抗原を発現するプラスミドを消化管内面の粘膜免疫系に経口送達することができる（Ｌｅｃｋｅｎｂｙら、２００９、Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ．、４６：２０１−２０６）。あるいは、選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミドを含む第２の宿主細胞環境は、例えば、細胞が、アグロバクテリウム属のメンバーである場合は、プラスミドＤＮＡを植物に直接送達して遺伝子改変を可能にするために使用することができる（Ｅｂｉｎｕｍａら、２００１、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．、２０：３８３−３９２）。
【０１３５】
選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミド、または上記説明されたプラスミドを含む細胞を、当分野で公知の任意の方法によって患者に投与することができる。これらの方法は、限定されるものではないが、経口投与、皮内投与、皮下投与、筋内投与、粘膜内投与、静脈内投与、腹膜内投与、または経鼻投与を含む。
【０１３６】
本発明の範囲内では、処置される患者は、処置を必要とする任意の動物とすることができる。これは、ヒト、魚、イヌ、ネコ、サル、ヤギ、ラクダ、ブタ、ヒツジ、ラット、マウス、およびウマを含む。
【０１３７】
別の実施形態では、本発明は、患者を予防接種または処置する方法を含み、この方法は、選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミドを含む形質転換細胞または本発明の方法に従って作製されるプラスミドを、薬学的に許容され得る量、患者に投与するステップを含む。
【０１３８】
別の実施形態では、本発明は、患者の予防接種または患者の疾患の処置に使用するための、選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミドを含む形質転換細胞または本発明の方法に従って作製されるプラスミドを含む。
【０１３９】
さらなる実施形態では、本発明は、患者を予防接種するまたは患者の疾患を処置するための薬剤の製造に使用するための、選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミドを含む形質転換細胞または本発明の方法に従って作製されるプラスミドを含む。
【０１４０】
（キットおよびキットに使用される宿主細胞）
一実施形態では、本発明は、本発明の方法を実施するためのキットを包含する。
【０１４１】
このキットは：
（ｉ）部位特異的リコンビナーゼ標的部位に隣接した選択可能なマーカー遺伝子を含むプラスミドを含む第１の宿主細胞環境であって、部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えを起こすことができない、第１の宿主細胞環境；および
（ｉｉ）選択可能なマーカー遺伝子が切除されるように、部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えを起こすことができる第２の宿主細胞環境を含み得る、またはこれらからなり得る。
【０１４２】
一実施形態では、キット内の第１および第２の宿主細胞環境は、別個の細胞内に存在することができる、すなわちキットは、第１の宿主細胞および第２の宿主細胞を含む。キット内に存在する宿主細胞は、任意の細胞型とすることができる。特に、宿主細胞は、本発明の方法に関連して上記説明された任意の細胞型に由来することができる。
【０１４３】
第１の宿主は、プラスミドの部位特異的組換えに関与する１つ以上のタンパク質をコードする遺伝子における変異を含むことができる。好ましくは、アクセサリータンパク質ＰｅｐＡ、ＡｒｇＲ、またはＡｒｃＡのうちの１つ以上をコードする染色体遺伝子は、第１の宿主細胞で変異され得る。
【０１４４】
第２の宿主細胞は、内因性ＸｅｒＣ／ＸｅｒＤおよび／または活性バージョンの１つ以上のアクセサリータンパク質ＰｅｐＡ、ＡｒｇＲ、またはＡｒｃＡの存在により、部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えを起こすことができる。
【０１４５】
部位特異的リコンビナーゼ標的部位は、本発明の方法に関連して説明された任意の部位特異的リコンビナーゼ標的部位とすることができる。
【０１４６】
キットは、取扱説明書も含み得る。
【０１４７】
本発明はまた、本発明のキットまたは方法におけるこの第１の宿主細胞環境として使用するのに適した宿主細胞も提供する。特に、本発明は、部位特異的リコンビナーゼ標的部位に隣接した選択可能なマーカー遺伝子を含むプラスミドを含む宿主細胞を提供し、この宿主細胞は、アクセサリータンパク質ＰｅｐＡ、ＡｒｇＲ、またはＡｒｃＡのうちの１つ以上をコードする染色体遺伝子のうちの１つ以上に不活性化変異をさらに含む。
【０１４８】
本発明のこの態様に従った宿主細胞は、任意の細胞型に由来することができる。特に、宿主細胞は、本発明の方法に関連して上記説明されたどの細胞型に由来しても良い。上記説明されたおよびキットの宿主細胞内のプラスミドに含まれる部位特異的リコンビナーゼ標的部位は、本発明の方法に関連して上記説明された任意の部位特異的リコンビナーゼ標的部位とすることができる。これらの宿主細胞のプラスミドの選択可能なマーカー遺伝子は、本発明の方法に関連して上記説明された任意の選択可能なマーカー遺伝子とすることができる。
【０１４９】
ここで、本発明を、実施例によってより詳細に説明する。実施例で説明される系に対する変更が可能であることを理解されたい。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミドを作製する方法であって：
（ａ）部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えを起こすことができない第１の宿主細胞環境において、上記部位特異的リコンビナーゼ標的部位に隣接した選択可能なマーカー遺伝子を含むプラスミドを培養するステップ；および
（ｂ）続いて、上記選択可能なマーカー遺伝子が切除されるように、上記部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えを起こすことができる第２の宿主細胞環境において上記プラスミドを培養するステップを含む、方法。
（項目２）
（ｃ）上記選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミドを細胞培養物中で維持するステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
（ｄ）上記選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミドを上記第２の宿主細胞環境から単離するステップをさらに含む、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
上記部位特異的リコンビナーゼ標的部位が、部位特異的な組換えを起こすために必要な補助配列に機能的に関連している、項目１〜３のいずれか１項に記載の方法。
（項目５）
上記第１の宿主細胞環境および上記第２の宿主細胞環境が、異なる細胞内にある、上述の項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目６）
上記第１の宿主細胞環境が、ＰｅｐＡ、ＡｒｇＲ、およびＡｒｃＡをコードする遺伝子のうちの１つ以上に不活性化変異を含む、項目５に記載の方法。
（項目７）
上記第２の宿主細胞環境が、活性バージョンのＰｅｐＡ遺伝子およびＡｒｇＲ遺伝子またはＡｒｃＡ遺伝子を含む、項目５または６に記載の方法。
（項目８）
上記第２の宿主細胞環境が、部位特異的リコンビナーゼを含む、項目５に記載の方法。
（項目９）
上記部位特異的リコンビナーゼが、内因性部位特異的リコンビナーゼである、項目７に記載の方法。
（項目１０）
上記第１の宿主細胞環境および上記第２の宿主細胞環境が、同じ宿主細胞内に形成される、項目１〜４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１）
上記第１の宿主細胞環境および上記第２の宿主細胞環境が、一時的に分離される、項目９に記載の方法。
（項目１２）
上記第２の宿主細胞環境が、誘導性部位特異的リコンビナーゼを含む、項目９または１０に記載の方法。
（項目１３）
上記第２の宿主細胞環境が、細胞の温度の変更、細胞の容量オスモル濃度の変更、細胞内のインデューサーのレベルの変更、または上記プラスミドの二次構造または超らせん性を変更する細胞内の化学種のレベルの変更によって形成される、項目９〜１２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４）
上記部位特異的リコンビナーゼが、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ、Ｒ、ＸｅｒＣ、ＸｅｒＤ、ＲｉｐＸ、およびＣｏｄＶから選択される、項目８、９、１２、または１３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１５）
上記部位特異的リコンビナーゼ標的部位が、トランスポザーゼ標的部位である、項目１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６）
上記部位特異的リコンビナーゼ標的部位が、Ｅｃｄｉｆ、ｃｅｒ、ｐｓｉ、ｐｉｆ、ｍｗｒ、Ｂｓｄｉｆ、ｌｏｘＰ、ＦＲＴ、およびＲＳから選択される、項目１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１７）
上記選択可能なマーカー遺伝子が、抗生物質耐性遺伝子である、上述の項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１８）
上記選択可能なマーカー遺伝子が、上記第１の宿主細胞環境および／または上記第２の宿主細胞環境に必須であるが、それらには存在しない代謝産物の産生を可能にする、項目１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
（項目１９）
上記第１の宿主細胞環境および／または上記第２の宿主細胞環境が、グラム陰性細菌細胞である、上述の項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目２０）
上記第１の宿主細胞環境および上記第２の宿主細胞環境が、エシェリキア属、サルモネラ属、赤痢菌属、アグロバクテリウム属、シュードモナス属、およびビブリオ属から独立して選択される、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
上記第１の宿主細胞環境および／または上記第２の宿主細胞環境が、グラム陽性細菌細胞である、項目１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
（項目２２）
上記第１の宿主細胞環境および上記第２の宿主細胞環境が、バチルス属、ストレプトミセス属、リステリア属、乳酸杆菌属、ラクトコッカス属、およびミコバクテリウム属から独立して選択される、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
上記第１の宿主細胞環境および／または上記第２の宿主細胞環境が古細菌である、項目１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
（項目２４）
上記第１の宿主細胞環境および／または上記第２の宿主細胞環境が酵母細胞である、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
上記第１の宿主細胞環境および上記第２の宿主細胞環境が、ハンゼヌラ属、ピキア属、サッカロミセス属、およびシゾサッカロミセス属から独立して選択される、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
上記第１の宿主細胞環境および／または上記第２の宿主細胞環境が、プラスミドを複製することができる非真菌真核生物である、項目１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
（項目２７）
上記第１の宿主細胞環境および上記第２の宿主細胞環境が、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｍａｓ）属、タマホコリカビ属、およびエントアメーバ属から独立して選択される、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
上記プラスミドが、１つ以上の目的の遺伝子をコードする、上述の項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目２９）
上述の項目のいずれか１項に記載の方法に従って作製されるプラスミド。
（項目３０）
選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミドを含む、非改変宿主細胞。
（項目３１）
残存部位特異的リコンビナーゼ標的部位を有しかつ選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミドを含む、宿主細胞。
（項目３２）
誘導性部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子を含む、項目３１に記載の宿主細胞。
（項目３３）
上記誘導性部位特異的リコンビナーゼが、上記宿主細胞の染色体に存在する、項目３２に記載の宿主細胞。
（項目３４）
項目３０に記載の非改変宿主細胞または項目３１〜３３のいずれか１項に記載の宿主細胞および薬学的に許容され得る担体を含む、組成物。
（項目３５）
項目３０に記載の非改変宿主細胞、項目３１〜３３のいずれか１項に記載の宿主細胞、または項目３４に記載の組成物を患者に投与するステップを含む、上記患者を予防接種または処置する方法。
（項目３６）
患者の予防接種または患者の疾患の処置に使用するための、項目３０に記載の非改変宿主細胞、項目３１〜３３のいずれか１項に記載の宿主細胞、または項目３４に記載の組成物。
（項目３７）
患者を予防接種するまたは患者の疾患を処置するための薬剤の製造に使用するための、項目３０に記載の非改変宿主細胞、項目３１〜３３のいずれか１項に記載の宿主細胞、または項目３４に記載の組成物。
（項目３８）
部位特異的リコンビナーゼ標的部位に隣接した選択可能なマーカー遺伝子を含むプラスミドを含む宿主細胞であって、アクセサリータンパク質ＰｅｐＡ、ＡｒｇＲ、またはＡｒｃＡのうちの１つ以上をコードする染色体遺伝子のうちの１つ以上に不活性化変異をさらに含む、宿主細胞。
（項目３９）
キットであって：
（ｉ）部位特異的リコンビナーゼ標的部位に隣接した選択可能なマーカー遺伝子を含むプラスミドを含む第１の宿主細胞環境であって、上記部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えを起こすことができない、第１の宿主細胞環境；および
（ｉｉ）上記選択可能なマーカー遺伝子が切除されるように、上記部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えを起こすことができる第２の宿主細胞環境
を含むか、またはこれらからなる、キット。
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】図１は、本発明の好ましい実施形態において抗生物質耐性遺伝子をプラスミドから切除することができるプロセスの図を示している。
【図２】図２は、プラスミドｐＯＲＴ３ＣＭＶ、ｐＯＲＴ３ａＣＭＶ、およびｐＯＲＴ４ＣＭＶの図を示している。
【図３】図３（Ａ）は、大腸菌ｐｅｐＡ変異株ＤＳ９５７に伝達されたプラスミドｐＯＲＴ３ＣＭＶおよびｐＯＲＴ４ＣＭＶを示している（「Ａｃ．ｓｅｑ」は、ｐｅｐＡおよびＡｒｇＲ／ＡｒｃＡ結合部位を含む補助配列を指し、「ｃａｔ」は、クロラムフェニコール耐性遺伝子であり；他のプラスミド要素は、例示されていない）。図３（Ｂ）は、非変異大腸菌株ＤＨ１へのプラスミドの形質転換後の直接反復ｐｓｉ部位におけるＸｅｒ組換えおよび補助配列によるプラスミドｐＯＲＴ３ＣＭＶからのプラスミドｐＯＲＴ３ａＣＭＶの作製を示している。図３（Ｃ）は、アガロースゲルにおける大腸菌ＤＨ１での毎日の継代培養中のｐＯＲＴ３ＣＭＶおよびｐＯＲＴ４ＣＭＶのプラスミドの調製を示している。
【図４】図４は、Ｘｅｒ組換え事象後にｃａｔ遺伝子が除去されたプラスミドｐＳＣ２ｃおよびその誘導体ｐＳＣ２を示している。
【図５】図５（Ａ）は、直接反復ｐｓｉ部位におけるＸｅｒ組換えおよび補助配列によるプラスミドｐＳＣ２ｃからのｐＳＣ２の作製を示し；図５（Ｂ）は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株ＳＬ３２６１での４日間の継代培養中の大腸菌ｐｅｐＡ変異株ＤＳ９５７由来ｐＳＣ２ｃおよびｐＳＣ２がＮｄｅＩ消化されたアガロースゲルを示している。
【発明を実施するための形態】
【０１５１】
（実施例１）
真核生物発現プラスミドｐＯＲＴｌ−ＣＭＶをｐＯＲＴ１から構築した（Ｃｒａｎｅｎｂｕｒｇｈら、２００１、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２９：ｅ２６）。発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）をＮｒｕＩおよびＰｖｕＩＩで切断して、ＰＣＭＶおよびｂＧＨ  ｐＡを含む領域を切除した。この断片を、ＨｉｎｃＩＩおよびＥｃｌｌ３６ＩＩで切断されたｐＯＲＴ１に連結してｐＯＲＴ１−ＣＭＶを作製した。
【０１５２】
クロラムフェニコール耐性遺伝子ｃａｔを、プライマー５’ＡＣＹＣおよび３’ＡＣＹＣを用いてｐＡＣＹＣ１８４（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｈｉｔｃｈｉｎ、Ｕ．Ｋ．）由来のＰＣＲ産物によって増幅し；次いで、これをＡｖｒＩＩで切断し、アルカリホスファターゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｓｅ）を用いて脱リン酸化し、次いでＦｓｅＩで切断した。ｐＳＣ１０１（ＤＳＭＺ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のｐｓｉ遺伝子座をコードする２つのＰＣＲ産物を、プライマー対５ＡｖｒＴＰＳＩと３ＡｖｒＰＳＩおよび５ＦｓｅＰＳＩと３ｆＳＥＰＳＩにより作製し；これらをそれぞれ、ＡｖｒＩＩおよびＦｓｅＩを用いて切断した。ｐＯＲＴｌ−ＣＭＶプラスミドをＡｖｒＩＩおよびＦｓｅＩを用いて切断し、脱リン酸化した。
【０１５３】
３断片連結を用いて、ｐＯＲＴ１−ＣＭＶ、ｐＡＣＹＣ１８４、およびＡｖｒＩＩ切断ｐｓｉ  ＰＣＲ産物を組み合わせて、ｐＯＲＴｃａｔＰＳＩと呼ばれる中間プラスミドを作製した。次いで、このプラスミドをＦｓｅＩで切断し、脱リン酸化し、ＦｓｅＩ切断ｐｓｉ  ＰＣＲ産物を連結して、ベクターｐＯＲＴ３−ＣＭＶ（直接反復方向におけるｐｓｉ部位）およびｐＯＲＴ４−ＣＭＶ（逆反復方向におけるｐｓｉ部位）を作製した。
【０１５４】
菌株ＤＨｌ（ｐＯＲＴ３ａ−ＣＭＶ）およびＤＨｌ（ｐＯＲＴ４−ＣＭＶ）を凍結ストックから固形成長培地に接種し、インキュベートして単一コロニーを得た。各菌株の単一コロニーを使用して、ＬＢブロス培養物に接種した。次いで、「０日目」と呼ばれるこれらの培養物を２４時間インキュベートした。６００ｎｍでの光学密度を測定し、「１日目」培養物に、測定された光学密度で接種し、「１日目」培養物を、２４時間インキュベートした。細胞世代の総数が４０を超えるまで、この手順を繰り返した。正規化サンプルを毎日採取し、後の分析のために凍結した。プラスミドＤＮＡを、「ミニプレップ」によって凍結サンプルから抽出し、アガロースゲル電気泳動法によって調べた。
【０１５５】
ｐＯＲＴ３−ＣＭＶにおける部位特異的リコンビナーゼ標的部位は、正しい相対方向（直接反復）にあるため、非改変大腸菌ＤＨ１細胞におけるＸｅｒ組換えにより、抗生物質耐性遺伝子を含まないプラスミドｐＯＲＴ３ａ−ＣＭＶを作製する。このプラスミドを、反復培養の期間（４日間）にわたって安定に維持する。ｐＯＲＴ４−ＣＭＶプラスミドは、部位特異的リコンビナーゼ標的部位が正しくない相対方向（逆反復）にある点のみがｐＯＲＴ３−ＣＭＶと異なっている。ｐＯＲＴ４−ＣＭＶが、非改変大腸菌ＤＨ１の同じ菌株に形質転換されると、Ｘｅｒ組換えが起こり得ないため、抗生物質耐性遺伝子が維持される。抗生物質耐性遺伝子による代謝負荷により、反復培養のわずか２日後にｐＯＲＴ４−ＣＭＶが細胞から消失した。これは、選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミドが、活性なプラスミド維持系を含むように改変されていない細菌細胞内で維持されることを実証している。
【０１５６】
（実施例２）
低コピー数の発現ベクターｐＳＣ２ｃを構築するために、プライマーＴｅｔｌａｃｃａｔ１およびＴｅｔｌａｃｃａｔ２を使用してｐＯＲＴ３−ＣＭＶのｐｓｉ隣接ｃａｔ遺伝子カセットを増幅し、その上流にｌａｃオペレーターを導入した。このＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１にクローニングして、ｐＣＲｃａｔｐｓｉを作製した。ｐＳＣ１０１の複製起点を、プライマーａ１０１およびａｓ１０１を用いてＰＣＲによって増幅し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングし、ｐＣＲ１０１を作製した。ｐｓｉ隣接ｃａｔ遺伝子カセットを含むｐＣＲｃａｔｐｓｉのＢｓｐＨＩ断片を、ｐＣＲ１０１のＢｓｐＨＩ断片に連結してｐ１０１ｃａｔを作製した。ｐａｇＣプロモーターを、プライマーＮｄｅｐａｇ１およびＢｓｐｐａｇ１を用いてサルモネラ菌ゲノムＤＮＡからＰＣＲによって作製した。このＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１にクローニングしてｐＣＲｐａｇ１を作製した。ＰＣＲプライマーＮｏｔｐａｇ１およびＮｏｔｐａｇ２を用いて、ｐＣＲｐａｇ１からｐａｇＣプロモーターを増幅した。ＮｏｔＩ処置ＰＣＲ産物をＮｏｔＩ切断ｐ１０１ｃａｔにクローニングしてｐＳＣ２ｃを作製した。大腸菌ｐｅｐＡ変異株を、必要なクローニング操作に使用した。
【０１５７】
ｐＳＣ２ｃプラスミドを、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＳＬ３２６１に形質転換し、この形質転換体を、クロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレート上で最初に選択した。単一コロニーを分離し、抗生物質の非存在下、ＬＢブロス中で一晩培養した。Ｘｅｒ組換えにより、ｃａｔ遺伝子が欠失してｐＳＣ２が形成され、ＳＬ３２６１（ｐＳＣ２）のクロラムフェニコール感受性コロニーを同定した。
【０１５８】
プラスミドの維持を評価するために、ＳＬ３２６１（ｐＳＣ２）の単一コロニーをＬＢブロスに接種し、２４時間インキュベートした（図５Ｂにおける「１日目」）。６００ｎｍでの光学密度を測定し、第２のＬＢブロス培養を、決定された光学密度で開始した。細胞世代の総数が４０を超えるまで、この手順を４日間にわたって繰り返した。正規化細胞サンプルを毎日採取し、プラスミドＤＮＡを抽出した。これらを、ＮｄｅＩ消化により線状にし、アガロースゲル電気泳動法にかけた。大腸菌ｐｅｐＡ変異株ＤＳ９５７から調製したプラスミドＤＮＡを参照として使用した（図５ＢにおけるｐＳＣ２ｃ）。このプラスミドは、４日間の反復培養にわたって安定に維持されたため、本発明が、サルモネラ菌内の低コピー数プラスミドにも適用可能であることを示唆している。
【０１５９】
参考文献
【０１６０】
【化４】
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【０１６１】
【化５】
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【図１】
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【図３】
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【図５】
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【図２】
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【図４】
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【配列表】
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