(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然ではコードされないアミノ酸を含む改変レラキシンポリペプチドであって、
（ａ）前記レラキシンポリペプチドは、Ａ鎖残基１、Ａ鎖残基５、Ａ鎖残基１３、Ａ鎖残基１８およびＢ鎖残基７からなる群より選択される位置が天然ではコードされないアミノ酸で置換されている、配列番号４またはそれと少なくとも９０％配列同一性のレラキシンＡ鎖ポリペプチドおよび配列番号５もしくは配列番号６またはそれらと少なくとも９０％配列同一性のレラキシンＢ鎖ポリペプチドを含み、
（ｂ）前記天然ではコードされないアミノ酸は、ポリマーまたは水溶性ポリマーに連結されている、
改変レラキシンポリペプチド。
【請求項２】
天然ではコードされないアミノ酸を含む改変レラキシンポリペプチドであって、
（ａ）前記レラキシンポリペプチドは、Ａ鎖残基１、Ａ鎖残基５、Ａ鎖残基１３、Ａ鎖残基１８およびＢ鎖残基７からなる群より選択される位置が天然ではコードされないアミノ酸で置換されている、配列番号４のレラキシンＡ鎖ポリペプチドおよび配列番号５または配列番号６のレラキシンＢ鎖ポリペプチドを含み、前記Ａ鎖および前記Ｂ鎖はそれぞれ、最大１つのさらなるアミノ酸置換を含み、
（ｂ）前記天然ではコードされないアミノ酸は、ポリマーまたは水溶性ポリマーに連結されている、
改変レラキシンポリペプチド。
【請求項３】
前記天然ではコードされないアミノ酸が、カルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジド基、ヒドラジン基、セミカルバジド基、アジド基またはアルキン基からなる群より選択される官能基を含む、請求項１または２に記載の改変レラキシンポリペプチド。
【請求項４】
前記天然ではコードされないアミノ酸が、オキシム連結またはトリアゾール連結により、前記ポリマーまたは水溶性ポリマーに連結されている、請求項１または２に記載の改変レラキシンポリペプチド。
【請求項５】
前記オキシム連結がカルボニル成分およびアミノオキシ成分の反応により形成されるか、または前記トリアゾール連結がアジド成分およびアルキン成分の反応により形成される、請求項４に記載の改変レラキシンポリペプチド。
【請求項６】
前記天然ではコードされないアミノ酸が、フェニルアラニン類似体または誘導体であるか、または、カルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジド基、ヒドラジン基、セミカルバジド基、アジド基もしくはアルキン基を含むパラ置換、オルト置換もしくはメタ置換フェニルアラニンから選択されるか、または、パラ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンもしくはパラ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンである、請求項１−５のいずれかに記載の改変レラキシンポリペプチド。
【請求項７】
前記ポリマーまたは水溶性ポリマーがオリゴ糖を含む、請求項１−６のいずれかに記載の改変レラキシンポリペプチド。
【請求項８】
前記ポリマーまたは水溶性ポリマーがポリ（エチレングリコール）を含む、請求項１−６のいずれかに記載の改変レラキシンポリペプチド。
【請求項９】
前記ポリ（エチレングリコール）が、０．１ｋＤａ〜１００ｋＤａの平均分子量を有する、請求項８に記載の改変レラキシンポリペプチド。
【請求項１０】
前記改変レラキシンポリペプチドが、組換え型であるか、真核宿主細胞において産生されるか、非真核宿主細胞において産生されるか、またはインビトロ翻訳により産生される、請求項１−９のいずれかに記載の改変レラキシンポリペプチド。
【請求項１１】
前記改変レラキシンポリペプチドが、配列番号４および配列番号５からなるヒトレラキシンに比べて、インビボ半減期の増加を示す、請求項１−１０のいずれかに記載の改変レラキシンポリペプチド。
【請求項１２】
前記半減期が、少なくとも２倍延長されている、請求項１１に記載の改変レラキシンポリペプチド。
【請求項１３】
前記半減期が、少なくとも１０倍延長されている、請求項１１に記載の改変レラキシンポリペプチド。
【請求項１４】
天然ではコードされないアミノ酸を含む改変レラキシンポリペプチドであって、
（ａ）前記レラキシンポリペプチドは、位置Ａ鎖残基１が天然ではコードされないアミノ酸で置換されている、配列番号４のレラキシンＡ鎖ポリペプチドおよび配列番号５または配列番号６のレラキシンＢ鎖ポリペプチドを含み、
（ｂ）前記天然ではコードされないアミノ酸は、ポリマーに連結されているパラ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンを含む、改変レラキシンポリペプチド。
【請求項１５】
前記天然ではコードされないアミノ酸が、カルボニル成分およびアミノオキシ（ヒドロキシルアミン）成分の反応により形成されるオキシム連結により、前記ポリマーに連結されている、請求項１４に記載の改変レラキシンポリペプチド。
【請求項１６】
前記改変レラキシンポリペプチドが生物学的に活性である、請求項１−１５のいずれかに記載の改変レラキシンポリペプチド。
【請求項１７】
医薬の製造のための請求項１−１６のいずれかに記載の改変レラキシンポリペプチドの使用。
【請求項１８】
冠動脈疾患、拡張機能障害、収縮期高血圧、原発性高血圧、二次性高血圧から選択される疾患の処置のための；または、血管収縮またはＮＯ産生を調節するための；またはエンドセリン−ｌ（ＥＴ−１）媒介血管収縮の処置において使用するための；または、心不全またはうっ血性心不全の処置において使用するための、医薬の製造のための請求項１−１６のいずれかに記載の改変レラキシンポリペプチドの使用。
【請求項１９】
Ａ鎖残基１、Ａ鎖残基５、Ａ鎖残基１３、Ａ鎖残基１８およびＢ鎖残基７からなる群より選択される位置が天然ではコードされないアミノ酸で置換されている、配列番号４またはそれと少なくとも９０％配列同一性のレラキシンＡ鎖ポリペプチドおよび配列番号５もしくは配列番号６またはそれらと少なくとも９０％配列同一性のレラキシンＢ鎖ポリペプチドを含む少なくとも１つのレラキシンポリペプチドをコードする単離核酸であって、前記核酸が、前記天然ではコードされないアミノ酸をコードする少なくとも１つのセレクターコドンを含む、単離核酸。
【請求項２０】
前記セレクターコドンが、アンバーコドン、オーカーコドン、オパールコドン、ユニークコドン、レアコドンおよび４塩基コドンからなる群より選択される、請求項１９に記載の単離核酸。
【請求項２１】
請求項１−１６のいずれかに記載の改変レラキシンポリペプチドの作製方法であって、（１）前記レラキシンＡ鎖ポリペプチドおよび前記レラキシンＢ鎖ポリペプチドをコードし、前記天然ではコードされないアミノ酸をコードするセレクターコドンを含むポリヌクレオチドまたは複数ポリヌクレオチド、（２）直交性ＲＮＡシンテターゼ、および（３）直交性ｔＲＮＡを含む細胞を、前記天然ではコードされないアミノ酸を含むレラキシンポリペプチドの発現を可能とする条件下で培養すること；および前記天然ではコードされないアミノ酸を含むレラキシンポリペプチドを精製すること、を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、任意選択により、少なくとも１つの天然ではコードされないアミノ酸で改変されているレラキシンポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
成熟ヒトレラキシンは、出産前の生殖器官のリモデリングに関与し、従って、分娩過程を円滑化することがわかっている、約６０００ダルトンのペプチドホルモンである。このタンパク質は、標的器官の結合組織の再構成を調節し、妊娠と出産の間の器官構造の必要な変化を生じさせると考えられている。Ｈｉｓａｗ、Ｆ．Ｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、２３：６６１−６６３（１９２６）；Ｓｃｈｗａｂｅ、Ｃ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、７５：５０３−５７０（１９７７）；Ｊａｍｅｓ、Ｒ．ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、２６７：５４４−５４６（１９７７）、を参照されたい。レラキシンの概説については、Ｓｈｅｒｗｏｏｄ、Ｄ．生殖の生理機能（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）、１６章、「レラキシン（Ｒｅｌａｘｉｎ）」、Ｋｎｏｂｉｌ、Ｅ．ａｎｄ  Ｎｅｉｌｌ、Ｊ．、ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）、（Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、ｐｐ．５８５−６７３（１９８８）に記載されている。レラキシンの血中循環濃度は、妊娠の全９ヶ月のあいだ高く、出産後急速に低下する。
【０００３】
妊娠の主要ホルモンである一方で、レラキシンは、また、非妊娠女性ならびに男性中で検出されており（Ｂｒｙａｎｔ−Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ、Ｇ．Ｄ．、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、３：６２−９０（１９８２）および  Ｗｅｉｓｓ、Ｇ．、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、４６：４３−５２（１９８４））、つい最近には、心不全の治療に有用であることがわかった。
【０００４】
心不全は、人体組織の代謝要求の対応に必要な血液を、心臓ポンプで移送できないこととして定義されている。ポンピング能力の低下は、心筋組織の損失または損傷が原因であることが最も多い。その結果として、心室排出が抑えられ、これは、心室充満圧および心室壁応力の増加、および心拍出量の減少に繋がる。心拍出量の減少に対する生理的応答として、多くの神経内分泌反射神経が活性化され、これが、全身性の血管収縮、心臓および体液貯留の交感神経刺激を引き起こす。これらの反射応答は、最初は心拍出量を高める傾向があるが、長期的には、それらは有害である。生じた末梢抵抗の増加は、心臓の後負荷を高め、血液容量の増加が心室充満圧をさらに高める。これらの変化は、心臓の交感神経刺激の増加と相まって、残りの機能的心筋への要求に対し、心臓がさらに代償不全になることが多くなる。
【０００５】
多くの心血管障害の共通の終点であるうっ血性心不全は、心臓が末梢組織に適切に灌流することができない場合に生ずる。最近の推計では、米国の約４百万人がこの疾患であると診断され、これらの症例の内の５０％超が、診断の５年以内に死に至る［Ｔａｙｌｏｒ、Ｍ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ｉｎ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２２、８５−９４（１９８７）］。
【０００６】
現在のうっ血性心不全を含む心不全の治療は、心筋に対する過度の要求を起こさせないで、心拍出量を増加させることに焦点が置かれている。これらの目的を達成するためには、利尿薬、血管拡張剤および強心剤の種々の組み合わせを使用して、血液容量の低減、末梢抵抗の低減、および心収縮力の増加が行われる。従って、現在の治療は、個別患者の臨床的要求を満たすために、複数の薬剤の効果のバランスに依存しており、使用薬剤に対する有害反応に悩まされている。
【０００７】
例えば、利尿剤は、カリウムおよびマグネシウムの血漿中濃度を低減させ、ジギタリス投与を受けている患者の不整脈の発生率を増加させる。利尿薬は、体液量欠乏により硝酸塩の循環効果を高め、心臓の充満圧、心拍出量および全身動脈圧の減少を生ずる可能性がある。
【０００８】
αアドレナリン受容体遮断薬は、冠血管灌流を損なう全身動脈圧の顕著な低下を生じる可能性がある。
【０００９】
アンジオテンシン変換酵素阻害剤は、動脈圧に対し類似の効果を有し、さらに、カリウム血漿中濃度の過剰増加に繋がる可能性がある。
【００１０】
正の収縮性を生ずる薬剤、例えば、ジギタリスやβアドレナリン受容体遮断薬は、不整脈を誘発する可能性がある。さらに、ジギタリスは、狭い治療指数を有し、カテコールアミン類似体は全て、受容体ダウンレギュレーションにより、有効性を急速に弱める傾向がある。
【００１１】
このように、動脈および静脈拡張ならびに心臓収縮性に関する生理学的に統合された応答を生じる、現在の治療薬の持つ欠点のない治療薬に対する要求がある。
【００１２】
レラキシンは、ブタ、マウス、ウマ、サメ、トラ、ラット、ホシザメおよびヒトを含む種々の種から精製されており、インスリンおよびインスリン様増殖因子に対し少なくとも１次および２次構造相同性を示すが、しかし、種間相同性は非常に低いと思われる。ヒトでは、レラキシンは、妊婦の黄体（ＣＬ）中にほとんどの量が存在するが、脳中の特定の核は、レラキシン受容体を有し、他の核は、レラキシン用のメッセンジャーＲＮＡを含んでいる。レラキシン受容体を有するいくつかの細胞の核が、視床下部領域で見つかっている。
【００１３】
２つのヒト遺伝子型、（Ｈ１）と（Ｈ２）が特定されている。Ｈｕｄｓｏｎ、Ｐ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３０１：６２８−６３１（１９８３）；Ｈｕｄｓｏｎ、Ｐ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ、３：２３３３−２３３９（１９８４）；および米国特許第４，７５８，５１６号および同４，８７１，６７０号。１つの遺伝子型（Ｈ２）のみが、ＣＬ中で転写されることがわかっている。（Ｈ１）型が別の組織部位で発現するか否か、または、それが疑似遺伝子を表すのかどうかは、不明確なままである。合成ヒトレラキシン（Ｈ２）および特定のヒトレラキシン類似体の生物活性の試験により、生物活性に必要なレラキシンコア、ならびに生物活性に影響しないメチオニンの特定のアミノ酸置換が明らかになった。Ｊｏｈｎｓｔｏｎ、ｅｔ  ａｌ．、ペプチド：構造と機能（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ）、Ｐｒｏｃ．Ｎｉｎｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ、Ｄｅｂｅｒ、Ｃ．Ｍ．、ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．１９８５）。
【００１４】
レラキシンの作製方法は、また、米国特許第４，８３５，２５１号ならびに同時係属の米国出願第０７／９０８，７６６号（国際出願ＰＣＴ  ＵＳ９０／０２０８５号）および同０８／０８０，３５４号（国際出願ＰＣＴ  ＵＳ９４／０６９９号）、に記載されている。心臓血管治療および神経変性疾患治療におけるレラキシンの使用方法は、米国特許第５，１６６，１９１号およびおよび米国出願第０７／９０２，６３７号（国際出願ＰＣＴ  ＵＳ９２／０６９２７号）に記載されている。ヒトレラキシンの特定の処方は、承認米国出願第０８／０５０，７４５号に記載されている。
【００１５】
組換え型ヒトレラキシン（Ｈ２）は、現在、強皮症患者のフェーズ１ヒト臨床試験中である。強皮症は、組織再構成の不均衡を伴い、コラーゲンの過剰産生を生じ、最終的に、皮膚（および罹患器官）の膨潤および硬化に繋がる疾患である。最近のレラキシンを投与する治療では、長期の繰り返し注入が必要である。
【発明の概要】
【００１６】
本発明は、任意選択で、少なくとも１つの天然ではコードされないアミノ酸で改変されているレラキシンポリペプチドを提供する。本明細書は、いくつかの実施形態を提供するが、これらの実施形態は、本発明の例示のためのものであり、請求項で定められる本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではないことは理解されたい。
【００１７】
本発明の別の態様では、少なくとも１つの天然ではコードされないアミノ酸を有するレラキシンポリペプチドが、少なくとも１つの水溶性ポリマーに結合される。
【００１８】
一態様では、本発明は、治療有効量のレラキシンを投与して、それを必要としている哺乳動物の血管新生を促進する方法に関する。別の実施形態では、レラキシンは、少なくとも約１ｎｇ／ｍｌの血清濃度を維持するために十分な量を投与される。さらなる実施形態では、レラキシンポリペプチドは、ヒトレラキシン（ｈＲ２）である。
【００１９】
本発明は、低下した動脈コンプライアンスの個体を有効量のレラキシン受容体アゴニストを含む製剤を使って治療する方法を提供する。好ましい実施形態では、レラキシン受容体アゴニストは、組換え型ヒトレラキシン、例えば、ヒトＨ２レラキシンである。
【００２０】
本発明の一実施形態では、本発明は、対象の動脈コンプライアンスを高める方法を提供し、前記方法は、測定前記対象の全体動脈コンプライアンスの測定、前記全体動脈コンプライアンスが健康な対象の全体動脈コンプライアンスと比べて、前記対象で低下していることの判定、および前記対象にレラキシン含有医薬製剤を投与して前記対象の動脈コンプライアンスを増加させることを含む。全体動脈コンプライアンスは、一実施形態では、面積法を使って大動脈圧波形の拡張期崩壊から測定できる。別の実施形態では、全体動脈コンプライアンスは、パルス圧力に対する一回拍出量の比率として計算できる。ここで、一回拍出量は、心拍数に対する心拍出量の比率として定義される。
【００２１】
関連実施形態では、対象の局所的動脈コンプライアンスまたは領域性動脈コンプライアンスは、全体動脈コンプライアンス測定に追加して、またはその代用として測定可能であり、局所または領域性動脈コンプライアンスが類似の状態の健康な個体で予期される局所または領域性動脈コンプライアンスに比べて低い場合には、その個体の動脈コンプライアンスを高めるためにレラキシンを投与できる。
【００２２】
さらなる実施形態では、レラキシンが投与される対象は、１つまたは複数の以下の障害に罹患している：アテローム性動脈硬化、１型糖尿病、２型糖尿病、冠動脈疾患、強皮症、脳卒中、拡張機能障害、家族性高コレステロール血症、収縮期高血圧、原発性高血圧、二次性高血圧、左室肥大、長期喫煙関連動脈壁硬化、肥満症関連動脈壁硬化、年齢関連動脈壁硬化、全身性エリテマトーデス、子癇前症、および高コレステロール血症。関連実施形態では、本発明は、閉経期前後の、閉経期の、および閉経後の女性および１つの上述の障害の危険のある個体の動脈コンプライアンスを高める方法を提供する。
【００２３】
さらなる本発明の実施形態では、レラキシンの投与は、投与前の測定動脈コンプライアンスに比べて、少なくとも１０％、１５％、２０％またはそれ超、動脈コンプライアンスを高める。またさらなる実施形態では、本発明は、０．５〜８０ｎｇ／ｍｌのレラキシン血清濃度を維持できるように、所定の速度で、動脈コンプライアンスの低下した個体へのレラキシンの投与を提供する。一実施形態では、レラキシンは、１つの天然ではコードされないアミノ酸を有する組換え型ヒトレラキシンである。また別の実施形態では、レラキシンは、２つ以上の天然ではコードされないアミノ酸を有するレラキシンである。さらに別の本発明の実施形態では、レラキシンは、水溶性ポリマーに結合した天然ではコードされないアミノ酸を有する。関連実施形態では、レラキシンは、注射可能製剤で、徐放製剤として、または持続点滴として毎日投与できる。
【００２４】
別の態様では、本発明は、治療有効量のレラキシンを投与することによる感染症または虚血性創傷の治療に関する。特に、好ましい実施形態では、感染症または虚血性創傷は、障害が血行不良による酸素の欠乏から生じたものである。
【００２５】
さらに別の本発明の態様では、感染症または虚血性創傷の治療用薬剤の製造のための、または血管新生促進用薬剤の製造のための、本発明のレラキシンポリペプチドの使用方法を提供する。別の態様では、本発明は、骨変性関節機能不全の治療に関し、また、別の態様では、骨変性関節機能不全の治療は、限定されないが、グルコサミン等の１つまたは複数のアジュバントに加えて、ｈＲ２を含む。別の態様では、本発明は、アルツハイマー病の治療に関し、また、別の態様では、アルツハイマー病の治療は、限定されないが、エストロゲン等の１つまたは複数のアジュバントに加えて、ｈＲ２を含む。別の実施形態では、本発明は、哺乳動物に治療有効量の本明細書の組成物を投与することを含む、哺乳動物の生殖生理を調節する方法に関する。
【００２６】
本発明は、アンギオテンシン−ＩＩ（ＡｎｇＩＩ）媒介血管収縮を治療する方法をさらに提供する。これらの方法は、一般的に、ＡｎｇＩＩの血管収縮効果を戻す、抑制する、または低減するのに有効な量のレラキシンを含む製剤を投与することを含む。
【００２７】
本発明は、エンドセリン−ｌ（ＥＴ−１）媒介血管収縮を治療する方法をさらに提供する。これらの方法は、一般的に、ＥＴ−１の血管収縮効果を戻す、抑制する、または低減するのに有効な量のレラキシンを含む製剤を投与することを含む。一部の実施形態では、この方法は、レラキシンを個体に投与することにより、血管中の細胞のエンドセリンＢ型受容体活性を高めることを含む。
【００２８】
本発明は、虚血状態の治療方法をさらに提供し、一般的に、血管新生および／または血管拡張を刺激、または促進するのに有効な量のレラキシンを含む製剤を投与し、それにより、虚血状態を治療することを含む。この方法は、種々の虚血状態の治療に有用である。一部の実施形態では、この方法は、心筋梗塞の結果生ずる虚血状態の治療のために提供される。他の実施形態では、この方法は、創傷に関連する虚血状態の治療のために提供される。従って、本発明は、創傷治癒を促進する方法をさらに提供する。
【００２９】
本発明は、血管新生および／または血管拡張性サイトカイン発現を刺激する方法をさらに提供し、一般的に、血管拡張、および／または、血管新生サイトカイン産生を刺激または促進するのに有効な量のレラキシンを含む製剤を投与することを含む。一部の実施形態では、この方法は、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）および／または血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）の発現の刺激を提供する。このような方法は、疾患部位またはその近くで血流を増やすことにより治療可能な各種疾患の治療に有用である。
【００３０】
本発明は、腎臓血管拡張および超濾過を増やす方法をさらに提供し、一般的に、レラキシンを含む製剤を投与することを含む。これらの方法は、種々の腎臓病状の治療に有用である。従って、本発明は、血管収縮に関連した腎臓病状を治療する方法をさらに提供する。
【００３１】
本発明は、肺高血圧を低下させる方法をさらに提供し、一般的に、レラキシンを含む製剤を投与することを含む。
【００３２】
Ｃｏｎｎｅｔｉｃｓ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＢＡＳ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｃ．に帰属する特許の、それぞれ、米国特許第６，２１１，１４７号および同６，７８０，８３６号（両特許は、参照により本明細書に組み込まれる）では、レラキシンを使った血管新生促進方法が開示されている。Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．に帰属する、米国特許第５，７５９，８０７号（参照により本明細書に組み込まれる）では、プロレラキシンからの原核生物のレラキシン産生プロセスが開示されている。米国特許第６，２５１，８６３号は、それぞれ状態に応じて、グルコサミン硫酸塩およびエストロゲンをさらに含むレラキシン薬剤の投与により、骨変性関節機能不全の治療方法およびアルツハイマー病の治療方法を開示する。この明細書も、また、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【００３３】
一部の実施形態では、レラキシンポリペプチドは、１つまたは複数の翻訳後修飾を含む。一部の実施形態では、レラキシンポリペプチドは、リンカー、ポリマー、または生物学的分子に連結される。一部の実施形態では、レラキシンポリペプチドは、二官能性ポリマー、二官能性リンカー、または少なくとも１つの追加のレラキシンポリペプチドに連結される。
【００３４】
一部の実施形態では、天然ではコードされないアミノ酸が、水溶性ポリマーに連結される。一部の実施形態では、水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）部分を含む。一部の実施形態では、天然ではコードされないアミノ酸が、リンカーで水溶性ポリマーに連結されるか、または水溶性ポリマーに結合される。一部の実施形態では、ポリ（エチレングリコール）分子は、二官能性ポリマーである。一部の実施形態では、二官能性ポリマーは、第２のポリペプチドに連結される。一部の実施形態では、第２のポリペプチドは、レラキシンポリペプチドである。
【００３５】
一部の実施形態では、レラキシンポリペプチドは、ポリ（エチレングリコール）部分を含む水溶性ポリマーに連結した少なくとも２つのアミノ酸を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸は、天然ではコードされないアミノ酸である。
【００３６】
一部の実施形態では、レラキシンポリペプチドは、ポリ（エチレングリコール）部分を含む水溶性ポリマーに連結した少なくとも２つのアミノ酸を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸は、天然ではコードされないアミノ酸である。
【００３７】
一部の実施形態では、１つまたは複数の天然ではコードされないアミノ酸が、レラキシンもしくはプロレラキシンポリペプチド、レラキシン類似体、プロレラキシン、レラキシンＡ鎖、レラキシンＢ鎖Ａｌａ１Ａｓｐレラキシン、またはレラキシンポリペプチドのいずれかの１つまたは複数の以下の位置に組み込まれる：Ａ鎖中の位置１（すなわち、Ｎ末端）の前、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端）、およびそれらのいずれかの組み合わせ（配列番号：４）および／またはＢ鎖中の位置１（すなわち、Ｎ末端）の前、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０（配列番号：５または配列番号：６の対応するアミノ酸）。一部の実施形態では、１つまたは複数の天然ではコードされないアミノ酸が、レラキシンもしくはプロレラキシンポリペプチドのいずれかの１つまたは複数の以下の位置に組み込まれる：Ａ鎖中の位置１（すなわち、Ｎ末端）の前、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端）、およびそれらのいずれかの組み合わせ（配列番号：１または配列番号：２もしくは３の対応するアミノ酸）。一部の実施形態では、１つまたは複数の天然ではコードされないアミノ酸が、レラキシン中の１つまたは複数の以下の位置に組み込まれる：位置１（すなわち、Ｎ末端）の前、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９（すなわち、配列番号：３のタンパク質のカルボキシル末端）。
【００３８】
一部の実施形態では、天然ではコードされないアミノ酸が、Ａ鎖中のアミノ酸の位置１に組み込まれる（配列番号４）。一部の実施形態では、天然ではコードされないアミノ酸が、Ａ鎖中のアミノ酸の位置５に組み込まれる（配列番号４）。一部の実施形態では、天然ではコードされないアミノ酸が、Ｂ鎖中のアミノ酸の位置７に組み込まれる（配列番号５または配列番号６）。一部の実施形態では、天然ではコードされないアミノ酸が、Ａ鎖中のアミノ酸の位置２に組み込まれる（配列番号４）。一部の実施形態では、天然ではコードされないアミノ酸が、Ａ鎖中のアミノ酸の位置１３に組み込まれる（配列番号４）。一部の実施形態では、天然ではコードされないアミノ酸が、Ｂ鎖中のアミノ酸の位置５に組み込まれる（配列番号５または配列番号６）。一部の実施形態では、天然ではコードされないアミノ酸が、Ａ鎖中のアミノ酸の位置１８に組み込まれる。一部の実施形態では、天然ではコードされないアミノ酸が、Ｂ鎖中のアミノ酸の位置５に組み込まれる。一部の実施形態では、天然ではコードされないアミノ酸が、Ｂ鎖中のアミノ酸の位置２８に組み込まれる。一部の実施形態では、１つまたは複数の天然ではコードされないアミノ酸が、レラキシンポリペプチド中の以下の位置の１つに組み込まれる：Ａ鎖中のアミノ酸位置１、２、５、１３、１８（配列番号４または配列番号１、配列番号２、配列番号３、または他の既知のレラキシン配列の対応するアミノ酸）。一部の実施形態では、１つまたは複数の天然ではコードされないアミノ酸が、レラキシンポリペプチド中の以下の位置の１つに組み込まれる：Ａ鎖中のアミノ酸の位置１、２、５、１３（配列番号４または配列番号１、配列番号２、配列番号３、または他の既知のレラキシン配列の対応するアミノ酸）。一部の実施形態では、１つまたは複数の天然ではコードされないアミノ酸が、レラキシンポリペプチド中の以下の位置の１つに組み込まれる：Ａ鎖中のアミノ酸の位置１、２、５（配列番号４または配列番号１、配列番号２、配列番号３、または他の既知のレラキシン配列の対応するアミノ酸）。一部の実施形態では、１つまたは複数の天然ではコードされないアミノ酸が、レラキシンポリペプチド中の以下の位置の１つに組み込まれる：Ａ鎖中のアミノ酸の位置２または５（配列番号４または配列番号１、配列番号２、配列番号３、または他の既知のレラキシン配列の対応するアミノ酸）。
【００３９】
一部の実施形態では、天然ではコードされないアミノ酸が、レラキシンポリペプチド中の以下の位置の１つに組み込まれる：Ｂ鎖中のアミノ酸の位置５または７（配列番号５もしくは配列番号６、または配列番号：１、２、もしくは３の対応するアミノ酸位置）。一部の実施形態では、天然ではコードされないアミノ酸が、Ｂ鎖中の位置７に組み込まれる（配列番号５もしくは配列番号６、または配列番号：１、２、もしくは３の対応するアミノ酸位置）。一部の実施形態では、天然ではコードされないアミノ酸が、Ｂ鎖中の位置５に組み込まれる（配列番号５もしくは配列番号６、または配列番号：１、２、もしくは３の対応するアミノ酸位置）。一部の実施形態では、天然ではコードされないアミノ酸が、Ｂ鎖中の位置７に組み込まれる（配列番号５もしくは配列番号６、または配列番号：１、２、もしくは３の対応するアミノ酸位置）。
【００４０】
一実施形態では、天然ではコードされないアミノ酸が、レラキシンポリペプチド中の以下の位置の１つに組み込まれる：Ａ鎖中のアミノ酸位置１、５、２、１３、１８（配列番号４または配列番号１、２、３の対応するアミノ酸位置）、Ｂ鎖中のアミノ酸位置７、５（配列番号５もしくは６、または配列番号１、２、３の対応するアミノ酸位置）。一部の実施形態では、１つまたは複数の天然ではコードされないアミノ酸が、レラキシンポリペプチド中の以下の位置の１つに組み込まれる：Ａ鎖中のアミノ酸位置１、５、２、１３、１８（配列番号４または配列番号１、２、３の対応するアミノ酸位置）、Ｂ鎖中のアミノ酸位置７、５（配列番号５もしくは６、または配列番号１、２、３の対応するアミノ酸位置）。
【００４１】
一部の実施形態では、限定されないが：Ａ鎖中の位置１（すなわち、Ｎ末端）の前、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端）、およびいずれかのそれらの組み合わせ（配列番号４または既知のレラキシン配列の対応するアミノ酸）および／またはＢ鎖中の位置１（すなわち、Ｎ末端）の前、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０（配列番号５もしくは６または既知のレラキシン配列の対応するアミノ酸）の位置を含む１つまたは複数のこれらの位置の天然ではコードされないアミノ酸は、水溶性ポリマーに連結される。一部の実施形態では、限定されないが：Ａ鎖中の１、２、５、１３、１８（配列番号１または既知のレラキシン配列の対応するアミノ酸）の位置を含む１つまたは複数のこれらの位置の天然ではコードされないアミノ酸は、水溶性ポリマーに連結される。一部の実施形態では、限定されないが：Ａ鎖中の１、２、５（配列番号１または既知のレラキシン配列の対応するアミノ酸）の位置を含む１つまたは複数のこれらの位置の天然ではコードされないアミノ酸は、水溶性ポリマーに連結される。一部の実施形態では、限定されないが：Ａ鎖中の２、５（配列番号１または既知のレラキシン配列の対応するアミノ酸）の位置を含む１つまたは複数のこれらの位置の天然ではコードされないアミノ酸は、水溶性ポリマーに連結される。一部の実施形態では、限定されないが：Ａ鎖中の２、５、１３、１８（配列番号１または既知のレラキシン配列の対応するアミノ酸）の位置を含む１つまたは複数のこれらの位置の天然ではコードされないアミノ酸は、水溶性ポリマーに連結される。一部の実施形態では、限定されないが：Ｂ鎖中の５、７（配列番号５もしくは６または配列番号１、２、３の対応するアミノ酸位置）の位置を含む１つまたは複数のこれらの位置の天然ではコードされないアミノ酸は、水溶性ポリマーに連結される。一部の実施形態では、Ｂ鎖中の位置５の天然ではコードされないアミノ酸（配列番号５もしくは６または配列番号１、２、３の対応するアミノ酸位置）は、水溶性ポリマーに連結される。一部の実施形態では、天然ではコードされないＢ鎖中の位置７のアミノ酸（配列番号５もしくは６または配列番号１、２、３の対応するアミノ酸位置）は、水溶性ポリマーに連結される。
【００４２】
一部の実施形態では、１つまたは複数の天然ではコードされないアミノ酸が、レラキシンまたはプロレラキシンポリペプチドのいずれかの中の１つまたは複数の以下の位置に組み込まれる：Ｂ鎖中の位置５、７（配列番号５もしくは６または配列番号１、２、３の対応するアミノ酸位置）およびＡ鎖中の位置１、５、２、１３、１８（配列番号４または配列番号１、２、３の対応するアミノ酸位置）。一部の実施形態では、１つまたは複数の天然ではコードされないアミノ酸が、レラキシンまたはプロレラキシンポリペプチドのいずれかの中の１つまたは複数の以下の位置に組み込まれる：Ｂ鎖中の位置５、７（配列番号５もしくは６または配列番号１、２、３の対応するアミノ酸位置）およびＡ鎖中の位置１、５、２、１３、１８（配列番号４または配列番号１、２、３の対応するアミノ酸位置）。また、これらの天然ではコードされないアミノ酸は、水溶性ポリマーに連結される。
【００４３】
本発明の方法は、血管新生の促進、血管拡張の促進、非降圧性血管拡張の促進、限定されないが、腎臓高血圧症、肺高血圧症、および心臓高血圧症、等の高血圧症の治療に使用可能である（米国特許第６，７２３，７０２号；および同６，７８０，８３６号（両特許は参照によってその全体が組み込まれる）は、レラキシン類似体結晶の生成と使用について開示している）。
【００４４】
製剤
本発明を幅広く実施する際には、また、製剤は、天然ではコードされないアミノ酸含有混合物の内の少なくとも１つの成分を有する、２つ以上のレラキシン、レラキシンダイマー、レラキシン類似体、アシル化レラキシン、またはアシル化レラキシン類似体の混合物を含んでもよいことが意図されている。本発明の別の実施形態では、天然ではコードされないアミノ酸を含む混合物の内の少なくとも１つの成分を有する２つ以上のレラキシン、レラキシン類似体、アシル化レラキシン、アシル化レラキシン類似体の混合物を含む製剤は、また、少なくとも１つの天然ではコードされないアミノ酸に結合された少なくとも１つの水溶性ポリマーを含む。
【００４５】
本発明は、また、不均一混合物を含み、この場合、レラキシンポリペプチドおよびレラキシン類似体が本発明で開示の方法により調製され、その後、混合されて、製剤がそれを必要としている患者に投与でき、その製剤は、例えば、２５％のＢ鎖中の位置２８に天然ではコードされないアミノ酸を含むペグ化されているレラキシンポリペプチド、２５％のＢ鎖中の位置１０に天然ではコードされないアミノ酸を含むレラキシンポリペプチド、水溶性ポリマーに結合した前記アミノ酸、および５０％のレラキシンのＢ鎖中の位置３１に天然ではコードされないアミノ酸（配列番号２；あるいは、配列番号４、６、８、１０、または１２）を有するレラキシンポリペプチドを含む。異なるパーセンテージのレラキシンポリペプチド変異体の全ての異なる混合物で、レラキシンポリペプチドは、（１）異なる大きさのＰＥＧを有するか、または（２）ＰＥＧが配列中の異なる位置に含まれる、という多様性を含む。これは、例であり、本発明により可能となる製剤を限定するものと解釈されるべきでなく、また、当業者には明らかであろう。さらなる実施形態では、製剤混合物中に含まれるべきレラキシンポリペプチド変異体は、変動する解離時間により選択され、それを必要としている患者に、レラキシンの徐放を提供することができる。
【００４６】
本発明の製剤は、グルカゴンを含んでもよい。
【００４７】
吸入用の製剤を含む本発明の他の実施形態
さらなる本発明の実施形態では、肺への投与を介した患者の使用に対する強化された薬物動態学的および薬力学的特性を有するレラキシン類似体の産生のために本明細書で開示の技術の使用が可能であり、投与後少なくとも６時間、さらに典型的には、少なくとも８、１０、１２、１４、１８、２４時間以上持続するレラキシンの高められた血中濃度が得られる。別の本発明の実施形態は、吸入剤として患者に投与されるように計画された治療製剤に適するレラキシン類似体の有利な混合物を可能とする。
【００４８】
一部の本発明の実施形態では、天然レラキシン分子中の以下の部位は、天然ではコードされないアミノ酸で置換されてもよく、さらに、任意選択で、水溶性ポリマー、例えば、ＰＥＧの共有結合によりさらに改変されてもよい：ＡおよびＢ鎖の２つのＣ末端、Ａｒｇ２２Ｂ、Ｈｉｓ１０Ｂ、Ｈｉｓ５Ａ、Ｇｌｕ４Ａ、Ｇｌｕｌ７Ａ、Ｇｌｕｌ３Ｂ、およびＧｌｕ２１Ｂ。
【００４９】
天然レラキシンに加えて、本発明は、１つまたは複数の水溶性ポリマー、例えば、ＰＥＧの組み込み用部位を提供することができるシグナル配列中に置換または挿入された１つまたは複数の天然ではコードされないアミノ酸を有する非天然のレラキシンポリペプチドおよびレラキシン類似体を提供する。この本発明の実施形態は、特に、レラキシン分子中に、例えば、改善された酵素分解耐性を有するＰＥＧ−レラキシンを形成するために、追加の、カスタマイズされたペグ化部位を導入するのに有用である。このような手法は、活性、安定性、溶解度、および薬理学的特性の間の所望のバランスを有する最適化レラキシンコンジュゲートの設計において、さらに大きな柔軟性を提供する。変異は、すなわち、レラキシン分子内の任意の番号の位置での部位特異的変異により行うことができる。本発明で使用するＰＥＧは、直鎖、フォーク状、分岐、ダンベル型、等の種々の構造をとり得る。通常、ＰＥＧは、レラキシン分子上の所望の部位または複数部位に結合するのに適した活性化基で活性化される。活性化ＰＥＧは、レラキシンとの反応のために末端に反応基を有する。代表的な活性化ＰＥＧ誘導体およびこれらの薬剤をレラキシン等の薬剤にコンジュゲートする方法は当技術分野で既知であり、Ｚａｌｉｐｓｋｙ、Ｓ．、ｅｔ  ａｌ．、ポリエチレングリコール化学：バイオ技術および生物医学への応用（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、中の「ポリペプチドの改変のための機能化ポリ（エチレングリコール）の使用（Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  Ｐｏｌｙ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌｓ）ｆｏｒ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ）」Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ、Ｐｌｅｎｕｓ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）、およびＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、１６：１５７−１８２（１９９５）にさらに記載されている。
【００５０】
特定の本発明の実施形態では、コンジュゲートのＰＥＧ部分は、ポリマーまたはポリマー−レラキシンコンジュゲートの水可溶性を大きく変えるのに効果的な１つまたは複数の親油性基が欠けている。すなわち、本発明のポリマーまたはコンジュゲートの非レラキシン部分は、親水性よりも親油性が大きいと考えられる原子の基（例えば、約２から８〜１２炭素原子を有する炭素鎖）を含むことができるが、しかし、このような基または複数基の存在が、ポリマーまたはコンジュゲートの親水性を大きく変えるのに有効でない場合は、このような成分を、本発明のコンジュゲート中に含むことができる。すなわち、レラキシン、レラキシンポリペプチド、およびレラキシン類似体の部位特異的変異により、本発明のレラキシンコンジュゲートそれ自体が、親油性または両親媒性ではなく、親水性を示してもよい。親油性成分が存在してもよい特定の本発明の実施形態では、その成分は、ＰＥＧ鎖の末端に位置しないのが好ましい。
【００５１】
本発明のコンジュゲートに使用される分岐ＰＥＧには、国際公開第９６／２１４６９号に記載のものが含まれる。この特許の内容は、参照によりその全体が明示的に本明細書に組み込まれる。通常、分岐ＰＥＧは、式Ｒ（ＰＥＧ−−ＯＨ）ｎにより表すことができ、ここで、Ｒは、中央の「コア」分子を表し、ｎは、アームの数を表す。分岐ＰＥＧは、中央コアを有し、それから２つ以上の「ＰＥＧ」アームが伸びている。分岐配置では、分枝高分子コアは、レラキシンに結合用の単一の反応部位を有する。本発明で使用する分岐ＰＥＧは、通常、４つ未満のＰＥＧアームを含み、さらに好ましくは、３つ未満のＰＥＧアームを含む。分岐ＰＥＧは、単一の反応部位を有する利点を提供し、直鎖ＰＥＧよりも大きな、より密度の高いポリマー雲で結合する。１つの特定のＰＥＧ分岐タイプは、（ＭｅＯ−ＰＥＧ−）ｐＲ−−Ｘで表すことができ、ここで、ｐは２または３に等しく、Ｒは、中心コア構造、例えば、それに結合した２つまたは３つのＰＥＧアームを有するリシンまたはグリセリンであり、Ｘは、レラキシンへの結合のために活性化しているか、または活性化されうる任意の適切な官能基を表す。１つの特に好ましい分岐ＰＥＧは、構造ｍＰＥＧ２−リシンスクシンイミドを有するｍＰＥＧ２−ＮＨＳ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｌａｂａｍａ）である。
【００５２】
さらに別の分岐構造では、「ペンダント型ＰＥＧ」は、ＰＥＧ鎖の末端よりはむしろＰＥＧ骨格に沿った位置のタンパク質結合用の反応基を有する。レラキシンとの結合のためにＰＥＧ骨格から伸びた反応基は、同じであっても、異なっていてもよい。ペンダント型ＰＥＧ構造は、有用でありうるが、しかし、一般的には、特に、吸入のための組成物用としては、あまり好ましくない。
【００５３】
あるいは、ＰＥＧ−レラキシンコンジュゲートのＰＥＧ部分は、ポリマー鎖の一端に分岐部分、およびレラキシンへの結合のために分岐部分に連結した２つ（または２の任意の倍数）の遊離反応基を有するフォーク型構造であってもよい。代表的フォーク型ＰＥＧは、国際公開第９９／４５９６４号に記載されている。この内容は、参照により明示的に本明細書に組み込まれる。フォーク型ポリエチレングリコールは、任意選択で、ポリマー鎖の反対側の末端にアルキルまたは「Ｒ」基を含んでもよい。さらに具体的には、本発明によるフォーク型ＰＥＧ−レラキシンコンジュゲートは、式：Ｒ−ＰＥＧ−Ｌ（Ｙ−レラキシン）ｎを有し、ここで、Ｒはアルキルであり、Ｌは加水分解的に安定な分岐点であり、Ｙはフォーク型ポリマーのレラキシンに対する化学結合を提供する結合基であり、ｎは２の倍数である。Ｌは、単一「コア」基、例えば、「−−ＣＨ−−」を表してもよく、またはさらに長い原子鎖を含んでもよい。代表的Ｌ基には、リシン、グリセリン、ペンタエリスリトール、またはソルビトールが含まれる。通常、分岐部分内の特定の分岐部原子は炭素である。
【００５４】
特定の本発明の実施形態では、フォーク型ＰＥＧのレラキシン分子に対する結合（Ｙ）は、加水分解的に安定である。好ましい実施形態では、ｎは２である。レラキシン上の反応部位とのコンジュゲートの前に、適切なＹ部分には、限定されないが、活性エステル、活性炭酸塩、アルデヒド、イソシアナート、イソチオシアナート、エポキシド、アルコール、マレイミド、ビニルスルホン、ヒドラジド、ジチオピリジン、およびヨードアセトアミドが含まれる。適切な活性化基の選択は、所望のレラキシン分子への結合部位に依存し、当業者なら容易に決定できる。得られたＰＥＧ−レラキシンコンジュゲート中の対応するＹ基は、活性化フォーク型ポリマーのレラキシン上の適切な部位との反応から得られるものである。このような最終結合の特異的な固有の特性は、当業者には明らかであろう。例えば、反応性フォーク型ＰＥＧが、活性化エステル、例えば、スクシンイミドまたはマレイミドエステルを含む場合は、レラキシン上のアミン部位を介したコンジュゲーションは、対応するアミド結合の形成に繋がることになる。これらの特定のフォーク型ポリマーは、特に、魅力的である。理由は、それらが２：１以上のＰＥＧに対するレラキシンのモル比率を有するコンジュゲートを提供するからである。このようなコンジュゲートは、レラキシン受容体部位をあまり遮断しそうにないが、それでも、酵素分解、例えば、レラキシン分解酵素に対しレラキシンを保護するための設計に対する柔軟性を提供する。
【００５５】
関連実施形態では、フォーク型ＰＥＧ−レラキシンコンジュゲートは、本発明で使用可能であり、式：Ｒ−［ＰＥＧ−Ｌ（Ｙ−レラキシン）２］ｎで表される。この例では、Ｒは、それに結合した少なくとも１つのＰＥＧ−ジレラキシンコンジュゲートを有する天然ではコードされないアミノ酸を表す。具体的には、本発明の態様による好ましいフォーク型ポリマーは、ｎが、１、２、３、４、５、および６からなる群より選択されるものである。別の実施形態では、レラキシン内の非天然アミノ酸、レラキシンポリペプチド、またはレラキシン類似体およびポリマー分岐点の間の化学結合は、分解可能（すなわち、加水分解的に不安定）であってもよい。あるいは、１つまたは複数の分解可能結合がポリマー骨格に含まれ、インビボで最初に投与されたコンジュゲートより小さいＰＥＧ鎖を有するＰＥＧ−レラキシンコンジュゲートの生成を可能としてもよい。例えば、大きな、比較的不活性のコンジュゲート（すなわち、それに結合した１つまたは複数の高分子量ＰＥＧ鎖、例えば、約１０，０００超の分子量を有する１つまたは複数のＰＥＧ鎖で、コンジュゲートが基本的に生物活性を持たない）が投与され、次に、肺中または血流中で、加水分解されて、元々存在するＰＥＧ鎖の部分を有する生理活性のコンジュゲートを生成することができる。加水分解的に分解可能な結合のインビボ切断に際し、遊離レラキシン（分解可能結合の位置に応じて）またはそれに結合された小さいポリエチレンタグを有するレラキシンが放出され、肺により、および／または血液中の循環により、より容易に吸収される。
【００５６】
本発明のこの実施形態の１つの特徴では、全身性循環への放出の前のレラキシンの酵素分解とは対照的に、加水分解の前に、インタクトポリマー−コンジュゲートが投与時に最小に分解され、それにより、切断可能な結合の加水分解が、活性レラキシンの血流中への遅い放出速度を管理するのに有効となる。
【００５７】
生理学的に切断可能な適切な結合には、限定されないが、エステル、炭酸塩エステル、カルバマート、硫酸塩、リン酸塩、アシルオキシアルキルエーテル、アセタール、およびケタールが含まれる。このようなコンジュゲートは、貯蔵および投与時に安定な生理学的に切断可能な結合を持たなくてはならない。例えば、ＰＥＧ−切断可能結合−レラキシンコンジュゲートは、最終医薬組成物の製造時に、適切な送達媒体中の溶解時に、使用の場合には、経路に関わらず、投与時に、健全性を維持しなければならない。
【００５８】
従って、別の本発明の実施形態では、１つまたは複数の天然ではコードされないアミノ酸が、単一鎖レラキシンまたは単一鎖レラキシン類似体に組み込まれる。
【００５９】
一部の実施形態では、本発明のポリペプチドは、シグナル配列中の１つまたは複数の天然ではコードされないアミノ酸の置換、付加、または欠失を含む。一部の実施形態では、本発明のポリペプチドは、本明細書内で開示のレラキシンまたはレラキシン類似体もしくはポリペプチドのいずれかのシグナル配列中の１つまたは複数の天然ではコードされないアミノ酸の置換、付加、または欠失を含む。一部の実施形態では、本発明のポリペプチドは、シグナル配列中の１つまたは複数の天然でコードされるアミノ酸の置換、付加、または欠失、ならびに本明細書で開示のレラキシンまたはレラキシン類似体もしくはポリペプチドのいずれかのシグナル配列中の１つまたは複数の天然ではコードされないアミノ酸の置換、付加、または欠失を含む。一部の実施形態では、本明細書で開示のレラキシンまたはレラキシン類似体もしくはポリペプチドのいずれかの１つまたは複数の非天然アミノ酸がリーダーまたはシグナル配列中に組み込まれる。
【００６０】
一部の実施形態では、レラキシンポリペプチドは、限定されないが、タンパク質、ポリペプチド、小分子、または核酸を含む、レラキシンポリペプチド受容体または結合相手に対するレラキシンポリペプチドの親和性を調節する置換、付加、または欠失を含む。一部の実施形態では、レラキシンポリペプチドは、置換、付加、または欠失のない対応するレラキシンの安定性と比べた場合に、レラキシンポリペプチドの安定性を高める置換、付加、または欠失を含む。安定性および／または溶解度は、当業者には既知のいくつかの異なるアッセイを使って測定可能である。このようなアッセイには、限定されないが、ＳＥ−ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣが含まれる。一部の実施形態では、レラキシンポリペプチドは、置換、付加、または欠失のない対応するレラキシンの免疫原性と比べて、レラキシンポリペプチドの免疫原性を調節する置換、付加、または欠失を含む。一部の実施形態では、レラキシンポリペプチドは、置換、付加、または欠失のない対応するレラキシンの血清中半減期または循環時間に比べて、レラキシンポリペプチドの血清中半減期または循環時間を調節する置換、付加、または欠失を含む。
【００６１】
一部の実施形態では、レラキシンポリペプチドは、置換、付加、または欠失のない対応するレラキシンの水溶解度に比べて、レラキシンポリペプチドの水溶解度を高める置換、付加、または欠失を含む。一部の実施形態では、レラキシンポリペプチドは、置換、付加、または欠失のない対応するレラキシンの溶解度に比べて、宿主細胞中で産生されたレラキシンポリペプチドの溶解度を高める置換、付加、または欠失を含む。一部の実施形態では、レラキシンポリペプチドは、置換、付加、または欠失のない対応するレラキシンの発現または合成に比べて、宿主細胞中でのレラキシンポリペプチドの発現を増やすか、またはインビトロでの合成を増やす置換、付加、または欠失を含む。この置換を含むレラキシンポリペプチドは、アゴニスト活性を保持し、宿主細胞中での発現レベルの保持、または改善を行う。一部の実施形態では、置換、付加、または欠失のない対応するレラキシンのプロテアーゼ抵抗性に比べて、レラキシンポリペプチドは、レラキシンポリペプチドのプロテアーゼ抵抗性を高める置換、付加、または欠失を含む。一部の実施形態では、レラキシンポリペプチドは、置換、付加、または欠失のない対応するレラキシンポリペプチドとの相互作用に対する受容体の活性に比べて、レラキシン受容体のシグナル伝達活性を調節する置換、付加、または欠失を含む。一部の実施形態では、レラキシンポリペプチドは、置換、付加、または欠失のない対応するレラキシンポリペプチドの結合に比べて、別の分子、例えば、受容体への結合を調節する置換、付加、または欠失を含む。一部の実施形態では、レラキシンポリペプチドは、置換、付加、または欠失のない対応するレラキシンポリペプチドの抗ウイルス活性に比べて、抗ウイルス活性を調節する置換、付加、または欠失を含む。一部の実施形態では、レラキシンポリペプチドは、置換、付加、または欠失のない対応するレラキシンポリペプチドのブドウ糖代謝活性に比べて、ブドウ糖代謝活性を高める置換、付加、または欠失を含む。
【００６２】
一部の実施形態では、レラキシンポリペプチドは、置換、付加、または欠失のない対応するレラキシンの適合性に比べて、レラキシンポリペプチドの医薬品防腐剤（例えば、ｍ−クレゾール、フェノール、ベンジルアルコール）との適合性を高める置換、付加、または欠失を含む。この高められた適合性は、貯蔵中のタンパク質の生理化学的特性および生物活性を維持する保存用医薬製剤の調製を可能にするであろう。
【００６３】
一部の実施形態では、１つまたは複数の操作された結合が、１つまたは複数の非天然アミノ酸を使って作られる。分子内の結合は、多くの方法で作ることができ、これには、限定されないが、タンパク質中の２つのアミノ酸の間の適切な条件下での反応（片方または両方のアミノ酸が、非天然アミノ酸であってよい）；それぞれが天然でコードされるものでも、または天然ではコードされないものでもよい２つのアミノ酸のリンカー、ポリマー、または他の分子との適切な条件下での反応；等が含まれる。
【００６４】
一部の実施形態では、レラキシンポリペプチド中の１つまたは複数のアミノ酸の置換は、１つまたは複数の天然に存在する、または天然ではコードされないアミノ酸を使って行うことができる。一部の実施形態では、レラキシンポリペプチド中のアミノ酸の置換は、天然に存在する、または天然ではコードされないアミノ酸を使って行うことができる。ただし、少なくとも１つの置換が天然ではコードされないアミノ酸を使って行われる場合に限る。一部の実施形態では、レラキシンポリペプチド中の１つまたは複数のアミノ酸置換は、１つまたは複数の天然に存在するアミノ酸、および追加で、少なくとも１つの置換は、天然ではコードされないアミノ酸を使って行うことができる。
【００６５】
一部の実施形態では、天然ではコードされないアミノ酸は、カルボニル基、アセチル基、アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、セミカルバジド基、アジド基、またはアルキン基を含む。
【００６６】
一部の実施形態では、天然ではコードされないアミノ酸は、カルボニル基を含む。一部の実施形態では、天然ではコードされないアミノ酸は、構造：
【化１】
0006054294.tif 000002
を有する。
【００６７】
式中、ｎは０〜１０であり；Ｒ１はアルキル、アリール、置換アルキル、または置換アリールであり；Ｒ２はＨ、アルキル、アリール、置換アルキル、および置換アリールであり；Ｒ３はＨ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり；さらに、Ｒ４はＨ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である。
【００６８】
一部の実施形態では、天然ではコードされないアミノ酸は、アミノオキシ基を含む。一部の実施形態では、天然ではコードされないアミノ酸は、ヒドラジド基を含む。一部の実施形態では、天然ではコードされないアミノ酸は、ヒドラジン基を含む。一部の実施形態では、天然ではコードされないアミノ酸残基は、セミカルバジド基を含む。
【００６９】
一部の実施形態では、天然ではコードされないアミノ酸残基は、アジド基を含む。一部の実施形態では、天然ではコードされないアミノ酸は、構造：
【化２】
0006054294.tif 000003
を有する。
式中、ｎは０〜１０であり；Ｒ１はアルキル、アリール、置換アルキル、置換アリールであるか、または存在せず；ＸはＯ、Ｎ、Ｓであるか、または存在せず；ｍは０〜１０であり；Ｒ２はＨ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基、およびＲ３はＨ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である。
【００７０】
一部の実施形態では、天然ではコードされないアミノ酸は、アルキン基を含む。一部の実施形態では、天然ではコードされないアミノ酸は、構造：
【化３】
0006054294.tif 000004
を有する。
式中、ｎは０〜１０であり；Ｒ１はアルキル、アリール、置換アルキル、または置換アリールであり；ＸはＯ、Ｎ、Ｓであるか、または存在せず；ｍは０〜１０であり；Ｒ２はＨ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり、およびＲ３はＨ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である。
【００７１】
一部の実施形態では、ポリペプチドは、レラキシンポリペプチドアゴニスト、部分アゴニスト、アンタゴニスト、部分アンタゴニスト、または逆アゴニストである。一部の実施形態では、レラキシンポリペプチドアゴニスト、部分アゴニスト、アンタゴニスト、部分アンタゴニスト、または逆アゴニストは、水溶性ポリマーに連結された天然ではコードされないアミノ酸を含む。一部の実施形態では、水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）部分を含む。一部の実施形態では、レラキシンポリペプチドアゴニスト、部分アゴニスト、アンタゴニスト、部分アンタゴニスト、または逆アゴニストは、天然ではコードされないアミノ酸および１つまたは複数の翻訳後修飾、リンカー、ポリマー、または生物学的活性分子を含む。
【００７２】
本発明は、また、ストリンジェント条件下、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、および１２のレラキシンポリペプチドをコードする核酸にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む単離核酸を提供する。本発明は、また、ストリンジェント条件下、配列番号１および２のレラキシンポリペプチドをコードする核酸にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む単離核酸を提供する。本発明は、また、ストリンジェント条件下、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、および１２で示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドまたは複数ポリヌクレオチドを含む単離核酸を提供し、ここで、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つのセレクターコドンを含む。本発明は、また、ストリンジェント条件下、配列番号１および２で示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドまたは複数ポリヌクレオチドを含む単離核酸を提供し、ここで、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つのセレクターコドンを含む。本発明は、配列番号１および２で示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離核酸を提供する。本発明は、また、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、および１２で示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離核酸を提供する。本発明は、１つまたは複数の天然ではコードされないアミノ酸を有する配列番号１および２で示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離核酸を提供する。本発明は、また、１つまたは複数の天然ではコードされないアミノ酸を有する配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、および１２で示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離核酸を提供する。いくつかの異なるポリヌクレオチドが、本発明のいずれかのポリペプチドをコードできることは、当業者には、容易に明らかになることである。
【００７３】
一部の実施形態では、セレクターコドンは、アンバーコドン、オーカーコドン、オパールコドン、ユニークコドン、レアコドン、５塩基コドン、および４塩基コドンからなる群より選択される。
【００７４】
本発明は、また、水溶性ポリマーに連結されたレラキシンポリペプチドの作製方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、天然ではコードされないアミノ酸を含む単離レラキシンポリペプチドを天然ではコードされないアミノ酸と反応する成分を含む水溶性ポリマーと接触させることを含む。一部の実施形態では、レラキシンポリペプチドに組み込まれた天然ではコードされないアミノ酸が、それ以外の２０の共通アミノ酸のいずれとも反応しない水溶性ポリマーと反応する。一部の実施形態では、レラキシンポリペプチドに組み込まれた天然ではコードされないアミノ酸が、それ以外の２０の共通アミノ酸のいずれとも反応しないリンカー、ポリマー、または生物学的に活性な分子と反応する。
【００７５】
一部の実施形態では、水溶性ポリマーに連結されたレラキシンポリペプチドは、カルボニル含有アミノ酸を含むレラキシンポリペプチドを、アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジドまたはセミカルバジド基を含むポリ（エチレングリコール）分子と反応させることにより生成される。一部の実施形態では、アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジドまたはセミカルバジド基は、アミド結合を介してポリ（エチレングリコール）分子に連結される。一部の実施形態では、アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジドまたはセミカルバジド基は、カルバマート結合を介して、ポリ（エチレングリコール）分子と連結される。
【００７６】
一部の実施形態では、水溶性ポリマーに連結されたレラキシンポリペプチドは、カルボニル基を含むポリ（エチレングリコール）分子を、アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジドまたはセミカルバジド基を含む天然ではコードされないアミノ酸含有ポリペプチドと反応させることにより作られる。
【００７７】
一部の実施形態では、水溶性ポリマーに連結されたレラキシンポリペプチドは、アルキン含有アミノ酸を含むレラキシンポリペプチドを、アジド部分を含むポリ（エチレングリコール）分子と反応させることにより作られる。一部の実施形態では、アジドまたはアルキン基は、アミド結合を介して、ポリ（エチレングリコール）分子に連結される。
【００７８】
一部の実施形態では、水溶性ポリマーに連結されたレラキシンポリペプチドは、アジド含有アミノ酸を含むレラキシンポリペプチドを、アルキン部分を含むポリ（エチレングリコール）分子と反応させることにより作られる。一部の実施形態では、アジドまたはアルキン基は、アミド結合を介して、ポリ（エチレングリコール）分子に連結される。
【００７９】
一部の実施形態では、ポリ（エチレングリコール）分子は、約０．１ｋＤａ〜約１００ｋＤａの分子量を有する。一部の実施形態では、ポリ（エチレングリコール）分子は、０．１ｋＤａ〜５０ｋＤａの分子量を有する。
【００８０】
一部の実施形態では、ポリ（エチレングリコール）分子は、分枝高分子である。一部の実施形態では、ポリ（エチレングリコール）分枝高分子の各分岐部は、１ｋＤａ〜１００ｋＤａ、または１ｋＤａ〜５０ｋＤａの分子量を有する。
【００８１】
一部の実施形態では、レラキシンポリペプチドに連結された水溶性ポリマーは、ポリアルキレングリコール部分を含む。一部の実施形態では、レラキシンポリペプチドに組み込まれた天然ではコードされないアミノ酸残基は、カルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジド基、ヒドラジン、セミカルバジド基、アジド基、またはアルキン基を含む。一部の実施形態では、レラキシンポリペプチドに組み込まれた天然ではコードされないアミノ酸残基は、カルボニル部分およびアミノオキシ、ヒドラジド、ヒドラジン、またはセミカルバジド部分含有水溶性ポリマーを含む。一部の実施形態では、レラキシンポリペプチドに組み込まれた天然ではコードされないアミノ酸残基は、アルキン部分およびアジド部分含有水溶性ポリマーを含む。一部の実施形態では、レラキシンポリペプチドに組み込まれた天然ではコードされないアミノ酸残基は、アジド部分およびアルキン部分含有水溶性ポリマーを含む。
【００８２】
本発明は、また、天然ではコードされないアミノ酸を含むレラキシンポリペプチドおよび薬学的に許容可能なキャリアーを含む組成物を提供する。一部の実施形態では、天然ではコードされないアミノ酸は、水溶性ポリマーに連結される。
【００８３】
本発明は、また、レラキシンポリペプチドをコードするセレクターコドン含有ポリヌクレオチドを含む細胞を提供する。一部の実施形態では、この細胞は、天然ではコードされないアミノ酸をレラキシンポリペプチド中へ置換するために、直交性ＲＮＡシンテターゼおよび／または直交ｔＲＮＡを含む。
【００８４】
本発明は、また、天然ではコードされないアミノ酸を含むレラキシンポリペプチドを作る方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、レラキシンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは複数ポリヌクレオチド、直交性ＲＮＡシンテターゼおよび／または直交ｔＲＮＡを含む細胞を、レラキシンポリペプチドの発現を可能とする条件下で培養し、レラキシンポリペプチドを細胞および／または培地から精製することを含む。
【００８５】
本発明は、また、レラキシンポリペプチドの治療の半減期、血清中半減期または循環時間を増加させる方法を提供する。本発明は、また、レラキシンポリペプチドの免疫原性を調節する方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、天然レラキシンポリペプチド中のいずれか１つまたは複数のアミノ酸を、天然ではコードされないアミノ酸で置換する、および／またはレラキシンポリペプチドを、リンカー、ポリマー、水溶性ポリマー、または生物学的に活性な分子に連結することを含む。
【００８６】
本発明は、また、有効量の本発明のレラキシン分子を使って、これによる治療を必要としている患者を治療する方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、天然ではコードされないアミノ酸を含むレラキシンポリペプチドおよび薬学的に許容可能なキャリアーを含む治療有効量の医薬組成物を患者に投与することを含む。一部の実施形態では、天然ではコードされないアミノ酸は、水溶性ポリマーに連結されている。一部の実施形態では、レラキシンポリペプチドは、グリコシル化されている。一部の実施形態では、レラキシンポリペプチドは、グリコシル化されていない。
【００８７】
本発明は、また、少なくとも１つのアミノ酸が、配列番号１および２で示される配列、または天然ではコードされないアミノ酸で置換されていることを除いた、いずれかの他のレラキシンポリペプチド配列（これらの非制限的例は、配列番号３〜１２であろう）を含むレラキシンポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、天然ではコードされないアミノ酸は、水溶性ポリマーに連結されている。一部の実施形態では、水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）成分を含む。一部の実施形態では、天然ではコードされないアミノ酸は、カルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジド基、ヒドラジン基、セミカルバジド基、アジド基、またはアルキン基を含む。
【００８８】
本発明は、また、薬学的に許容可能なキャリアー、および配列番号１〜１２で示される配列、または少なくとも１つのアミノ酸が天然ではコードされないアミノ酸で置換されているいずれかの他のレラキシンポリペプチド配列を含むレラキシンポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。本発明は、また、薬学的に許容可能なキャリアー、およびＡおよびＢ鎖（例えば、配列番号１、２、および３；配列番号４および５または４および６は、レラキシンを作るであろう）、または少なくとも１つのアミノ酸が天然ではコードされないアミノ酸で置換されているいずれかの他のレラキシンポリペプチド配列を含むレラキシンポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。本発明は、また、薬学的に許容可能なキャリアー、および配列番号１、２、および／または３で示される配列を含むレラキシンポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。本発明は、また、薬学的に許容可能なキャリアー、および配列番号１〜３で示される配列を含むレラキシンポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、天然ではコードされないアミノ酸は、サッカライド成分を含む。一部の実施形態では、水溶性ポリマーは、サッカライド成分を介してポリペプチドに連結される。一部の実施形態では、リンカー、ポリマー、または生物学的に活性な分子が、サッカライド成分を介してレラキシンポリペプチドに連結される。
【００８９】
本発明は、また、単一アミノ酸の位置で、レラキシンポリペプチドに共有結合で連結された水溶性ポリマーを含むレラキシンポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）成分を含む。一部の実施形態では、水溶性ポリマーに共有結合で連結されたアミノ酸は、ポリペプチド中の天然ではコードされないアミノ酸である。
【００９０】
本発明は、少なくとも１つのリンカー、ポリマー、または生物学的に活性な分子を含むレラキシンポリペプチドを提供し、前記リンカー、ポリマー、または生物学的に活性な分子は、リボソームによりポリペプチドに組み込まれた天然ではコードされないアミノ酸の官能基を介してポリペプチドに結合される。一部の実施形態では、ポリペプチドは、モノペグ化されている。本発明は、また、１つまたは複数の天然ではコードされないアミノ酸に結合されたリンカー、ポリマー、または生物学的に活性な分子を含むレラキシンポリペプチドを提供し、前記天然ではコードされないアミノ酸は、リボソームによりポリペプチドの事前に選択した部位に組み込まれる。
【００９１】
レラキシンリーダーまたはシグナル配列は、本発明の範囲に含まれ、これらの配列の一例は、プロインスリンとして認めることができる。選択された異種のリーダーまたはシグナル配列は、例えば、宿主細胞分泌系により認識および処理され、宿主細胞により分泌され、および可能ならシグナルペプチダーゼにより切断されるものでなければならない。本発明のレラキシンまたはレラキシンポリペプチドまたは類似体による状態または障害の治療方法は、シグナルまたはリーダーペプチドのある場合、または無い場合のレラキシンによる治療を含むことを意味する。
【００９２】
本発明は、また、ブドウ糖代謝の増加を誘導する方法を提供し、前記方法は、ブドウ糖代謝活性の増加を誘導するのに有効な量のレラキシンを前記細胞に投与することを含む。
【００９３】
別の実施形態では、１つまたは複数の天然ではコードされないアミノ酸を含むレラキシンポリペプチドの、限定されないが、ＰＥＧを含む別の分子へのコンジュゲーションは、非天然アミノ酸とのコンジュゲーションに使われる唯一の化学反応により、実質的に精製されたレラキシンを提供する。１つまたは複数の天然ではコードされないアミノ酸を含むレラキシンの、ＰＥＧ等の別の分子へのコンジュゲーションは、実質的に純粋なレラキシンを与えるためのコンジュゲーションステップの前に、または後に行われる他の精製技術で行ってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】図１は、置換のために選択された一部のアミノ酸残基位置に沿って示されたレラキシンの結晶構造のモデルである。
【図２】図２は、置換のために選択された一部のアミノ酸残基位置に沿って示されたレラキシンの結晶構造のモデルである。
【図３】図３は、置換のために選択された一部のアミノ酸残基位置に沿って示されたレラキシンの結晶構造のモデルである。
【図４】図４は、ヒトレラキシンのＡおよびＢ鎖の構造図である。
【図５】図５は、鎖Ｂ１のアミノ酸をＡｌａとし、また、バリンを置換してＡ鎖の１３番目のアミノ酸位置のパラアセチルフェニルアラニンとした方法により産生したプロレラキシンのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【図６Ａ】図６Ａは、レーン１の分子量マーカーの隣の非ペグ化レラキシンＶ１３ｐＡＦならびにレーン３および７（非還元（ＮＲ）および還元（Ｒ））の組換えおよび非組換えＷＴレラキシンのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。Ｂは、レーン１の分子量マーカーの脇のレーン３および４（非還元（ＮＲ）および還元（Ｒ））のペグ化レラキシンＶ１３ｐＡＦのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【図７】図７は、種々のペグ化ＡＶＩ３および野性型レラキシンポリペプチドに対するＳＤラット血清レラキシン濃度（ｎｇ／ｍＬ）の経時グラフを示す。
【図８Ａ】図８Ａは、実施例４０の全ＰＥＧ−ＲＬＸ皮下投与群に対する群平均血清濃度ＶＳ時間の比較グラフである。単回注射用量を各動物に投与した。各群あたりＮ＝５。記号は、群の血清濃度ＶＳ時間の平均±ＳＤを示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、０．５ｍｇ／ｋｇの２０ＫＰＥＧ−ＡＱ１−ＲＬＸ皮下投与ＳＤラットの個別動物血清濃度−時間曲線のグラフである。単回皮下用量を各動物に投与した。各群、Ｎ＝５動物。
【図９Ａ】図９Ａは、０．５ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ２０−ＡＡ５−ＲＬＸ皮下投与ＳＤラットの個別動物血清濃度−時間曲線のグラフである。単回皮下用量を各動物に投与した。各群、Ｎ＝５動物。
【図９Ｂ】図９Ｂは、０．５ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ２０−ＡＲ１８−ＲＬＸ皮下投与ＳＤラットの個別動物血清濃度−時間曲線のグラフである。単回皮下用量を各動物に投与した。各群、Ｎ＝５動物。
【図１０Ａ】図１０Ａは、０．５ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ２０−ＢＶ７−ＲＬＸ静脈内投与ＳＤラットの個別動物血清濃度−時間曲線のグラフである。単回静脈内用量を各動物に投与した。各群、Ｎ＝５動物。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、０．５ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ２０−ＢＷ２８−ＲＬＸ静脈内投与ＳＤラットの個別動物血清濃度−時間曲線のグラフである。単回静脈内用量を各動物に投与した。各群、Ｎ＝５動物。
【図１１】図１１は、０．５ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ２０−ＡＶ１３−ＲＬＸ静脈内投与ＳＤラットの個別動物血清濃度−時間曲線のグラフである。単回静脈内用量を各動物に投与した。各群、Ｎ＝５動物。
【図１２Ａ】図１２Ａは、皮下投与ｗｔ  ｒｈレラキシンに対する群平均血清濃度ＶＳ時間の比較のグラフでである。単回注射用量を各動物に投与した。群あたりＮ＝５動物。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、０．５ｍｇ／ｋｇのｗｔ  ｒｈレラキシン静脈内投与ＳＤラットの個別動物血清濃度−時間曲線のグラフである。単回静脈内用量を各動物に投与した。各群当たり、Ｎ＝５動物。
【図１３Ａ】図１３Ａは、皮下または静脈内投与全ＰＥＧ−ＲＬＸ群に対する群平均血清濃度ＶＳ時間の比較のグラフでである。単回注射用量を各動物に投与した。群あたりＮ＝３〜５動物。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、０．２５ｍｇ／ｋｇの２０ＫＰＥＧ−ＡＱ１−ＲＬＸ静脈内投与ＳＤラットの個別動物血清濃度−時間曲線のグラフである。単回静脈内用量を各動物に投与した。各群当たり、Ｎ＝４動物。
【図１４Ａ】図１４Ａは、０．５ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ２０−ＡＱ１−ＲＬＸ皮下投与ＳＤラットの個別動物血清濃度−時間曲線のグラフである。単回皮下用量を各動物に投与した。各群当たり、Ｎ＝５動物。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、０．２５ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ２０−ＡＱ１−ＲＬＸ皮下投与ＳＤラットの個別動物血清濃度−時間曲線のグラフである。単回皮下用量を各動物に投与した。各群当たり、Ｎ＝３動物。
【図１５】図１５は、０．１２５ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ２０−ＡＱ１−ＲＬＸ静脈内投与ＳＤラットの個別動物血清濃度−時間曲線のグラフである。単回皮下用量を各動物に投与した。各群当たり、Ｎ＝５動物。
【図１６Ａ】図１６Ａは、平均ＰＥＧ−レラキシン消失半減期ＶＳ投与量のグラフである。エラーバー＝ＳＤ。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、平均ＰＥＧ−レラキシンＡＵＣｉｎｆＶＳ投与量のグラフである。エラーバー＝ＳＤ。
【図１７Ａ】図１７Ａは、平均ＰＥＧ−レラキシンＣｍａｘＶＳ投与量のグラフである。エラーバー＝ＳＤ。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、平均ＰＥＧ−レラキシンクリアランスＶＳ投与量の得グラフである。エラーバー＝ＳＤ。
【図１８Ａ】図１８Ａは、平均ＰＥＧ−レラキシン量分布ＶＳ投与量のグラフである。エラーバー＝ＳＤ。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、０．２５ｍｇ／ｋｇの２０Ｋ  ＰＥＧ−ＡＱ１レラキシン単回静脈内または皮下注射後の、血清濃度−時間の比較グラフである。
【図１９Ａ】図１９のパートＡ〜Ｆは、実施例４３のフェーズＩ由来のデータを示す。図１９Ａは、水摂取量と尿量に与える野性型レラキシンのＩＶ注入の効果を示す。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、フェーズＩの−１６〜０時間のロングエバンスラット各群に対するベースライン尿量を示す。
【図１９Ｃ】図１９Ｃは、ヘマトクリットに対する野性型レラキシンＩＶ注入の効果を示す。
【図１９Ｄ】図１９Ｄは、雌ロングエバンスラットにおける血漿ＢＵＮに対する野性型レラキシンＩＶ注入の効果を示す。
【図１９Ｅ】図１９Ｅは、フェーズＩの０〜６時間のロングエバンスラット各群に対する水摂取量を示す。
【図１９Ｆ】図１９Ｆは、フェーズＩの０〜６時間のロングエバンスラット各群に対する尿量を示す。
【図２０Ａ】図２０のパートＡ〜Ｉは、実施例４３の、ビークル（対照群）および位置１のＰＥＧに結合したｐＡＦにより置換されたＡ鎖を有する２０Ｋ  ＰＥＧ−レラキシン変異体の０．１Ｘ、０．３Ｘおよび１Ｘ投与を含む試験群への投与後のフェーズＩＩ由来のデータを示す。図２０Ａは、水摂取量および尿量に対する効果を示す。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、注射後のロングエバンスラット各群の血漿ナトリウム変化レベルに対する効果を示す。
【図２０Ｃ】図２０Ｃは、注射後のロングエバンスラット各群の血漿ナトリウムレベルに対する効果を示す。
【図２０Ｄ】図２０Ｄは、ＰＥＧ−レラキシンの血漿容量オスモル濃度に対する効果を示す。
【図２０Ｅ】図２０Ｅは、ＰＥＧ−レラキシンＩＶ注入の血漿容量オスモル濃度変化に対する効果を示す。
【図２０Ｆ】図２０Ｆは、ＰＥＧ−レラキシン投与のＢＵＮレベルに対する効果を示す。
【図２０Ｇ】図２０Ｇは、フェーズＩＩの０〜６時間のＰＥＧ−レラキシン投与のロングエバンスラット各群の水摂取量に対する効果を示す。
【図２０Ｈ】図２０Ｈは、フェーズＩＩの−１６〜０時間のベースラインのロングエバンスラット各群の尿量を示す。
【図２０Ｉ】図２０Ｉは、フェーズＩＩの０〜６時間のロングエバンスラット各群の尿量に対するＰＥＧ−レラキシン投与の効果を示す。
【００９５】
定義
本発明は、本明細書記載の特定の方法、プロトコル、細胞株、構築物、および試薬に限定されず、変更してもよいことは理解されよう。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明する目的のためのものであり、本発明の範囲を制限する意図はなく、本発明の範囲は、添付の請求項のみにより限定されることは理解されよう。
【００９６】
本明細書および添付の請求項で使われる、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈から明確に別義が示されなければ、複数の参照を含む。従って、例えば、「レラキシン」または「レラキシンポリペプチド」ならびに種々のハイフンで結んだおよびハイフンで結ばない形への参照は、１つまたは複数のこのようなタンパク質への参照であり、当業者に既知のその等価物を含む、等々。
【００９７】
特に断らなければ、本明細書で使用される全ての技術および科学的用語は、本発明が属する当業者に通常理解されているのと同じ意味を有する。本明細書記載のものに類似または等価ないずれかの方法、装置、および物質は、本発明の実施または試験に使用可能であるが、好ましい方法、装置および物質は、以降で記載される。
【００９８】
本明細書で取り上げられる全ての出版物および特許は、出版物に記載されている、例えば、本発明に関連して使用できる可能性がある構築物や方法の説明および開示の目的で、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で考察される出版物は、本出願の出願日の前のそれらの開示の目的のみで提供される。本明細書中のどのような内容も、発明者が、先行発明の理由またはいずれかの他の理由で、このような開示に先行する権利がないことを承認するものと解釈されるべきではない。
【００９９】
用語の「実質的に精製された」は、実質的にまたは基本的に、天然環境中、すなわち、組換え産生レラキシンポリペプチドの場合には、天然の細胞、または宿主細胞中で、認められる、通常、タンパク質に随伴するまたは相互に混じり合う成分を含まないレラキシンポリペプチドを意味する。実質的に細胞材料を含まないレラキシンポリペプチドは、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満（乾燥重量で）の混入タンパク質を有するタンパク質調製物を含む。レラキシンポリペプチドまたはその変異体が、宿主細胞により組換え産生される場合は、タンパク質は、細胞の乾燥重量の約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、約５％、約４％、約３％、約２％、または約１％もしくはそれ未満で存在してもよい。レラキシンポリペプチドまたはその変異体が、宿主細胞により組換え産生される場合は、タンパク質、培地中で、細胞の乾燥重量の約５ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ、約ｌｇ／Ｌ、約７５０ｍｇ／Ｌ、約５００ｍｇ／Ｌ、約２５０ｍｇ／Ｌ、約１００ｍｇ／Ｌ、約５０ｍｇ／Ｌ、約１０ｍｇ／Ｌ、または約ｌｍｇ／Ｌもしくはそれ未満で存在してもよい。従って、適切な方法、例えば、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＥＣ、およびキャピラリー電気泳動法により測定して、本発明の方法により産生される「実質的に精製された」レラキシンポリペプチドは、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％の純度レベル、特に、少なくとも約７５％、８０％、８５％、およびそれ超の純度レベル、特に、少なくとも約９０％の純度レベル、少なくとも約９５％の純度レベル、少なくとも約９９％以上の純度レベルであってもよい。
【０１００】
「組換え型宿主細胞」または「宿主細胞」は、挿入に使用される方法、例えば、直接取込、形質導入、ｆ−接合（ｆ−ｍａｔｉｎｇ）、または当分野で既知の組換え型宿主細胞を形成する他の方法にかかわらず、外因性のポリヌクレオチドを含む細胞を意味する。外因性のポリヌクレオチドは、非組込み型ベクター、例えば、プラスミドとして保持されてもよく、あるいは、宿主ゲノム中に組み込まれてもよい。
【０１０１】
本明細書で使用される用語の「培地（ｍｅｄｉｕｍ）」または「培地（ｍｅｄｉａ）」は、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞、植物宿主細胞、真核生物宿主細胞、哺乳類宿主細胞、ＣＨＯ細胞、原核生物宿主細胞、大腸菌、またはシュードモナス宿主細胞、等のいずれかの宿主細胞、および細胞含有物を支持または含むことができるいずれかの培地、溶液、固形、半固形、または剛体支持体を含む。従って、この用語は、増殖ステップの前または後の培地を含む、その中で宿主細胞が増殖する培地、例えば、その中にレラキシンポリペプチドが分泌された培地、を包含してもよい。この用語は、また、例えば、レラキシンポリペプチドが細胞内で産生され、宿主細胞が溶解されるか、または破壊されて、レラキシンポリペプチドを放出する場合の、宿主細胞ライセートを含む緩衝液または試薬を包含してもよい。
【０１０２】
タンパク質リフォールディングに関連して本明細書で使われる「還元剤」は、還元状態でスルフヒドリル基を持ち、分子内または分子間ジスルフィド結合を還元するいずれかの化合物または材料と定義される。適切な還元剤には、限定されないが、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール、ジチオエリスリトール、システイン、システアミン（２−アミノエタンチオール）、および還元グルタチオンが含まれる。各種の還元剤が本発明の方法および組成物での使用に適切であることは、当業者には自明であろう。
【０１０３】
タンパク質リフォールディングに関連して本明細書で使われる「酸化剤」は、酸化される化合物から電子を取り除くことができるいずれかの化合物または材料と定義される。適切な酸化剤には、限定されないが、酸化グルタチオン、シスチン、シスタミン、酸化ジチオトレイトール、酸化エリスリトール、および酸素が含まれる。各種の酸化剤が本発明の方法および組成物での使用に適切であることは、当業者には自明であろう。
【０１０４】
本明細書で使用される「変性剤（Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）」または「変性剤（ｄｅｎａｔｕｒａｎｔ）」は、タンパク質の可逆的アンフォールディングを起こすいずれかの化合物または材料と定義される。変性剤（Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）または変性剤（ｄｅｎａｔｕｒａｎｔ）の強さは、特定の変性剤（Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）または変性剤（ｄｅｎａｔｕｒａｎｔ）の特性と濃度の両方により測定される。適切な変性剤（Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）または変性剤（ｄｅｎａｔｕｒａｎｔ）は、カオトロープ、洗浄剤、有機溶剤、水混和性溶剤、リン脂質、またはこのような薬剤の２つ以上の組み合わせであってもよい。適切なカオトロープには、限定されないが、尿素、グアニジン、およびナトリウムチオシアナートが含まれる。有用な洗浄剤には、限定されないが、強力洗浄剤、例えば、ナトリウムドデシル硫酸塩、またはポリオキシエチレンエーテル（例えば、ツイーンまたはトリトン洗浄剤）、サルコシル、マイルド非イオン性洗浄剤（例えば、ジギトニン）、マイルド陽イオン洗浄剤、例えば、Ｎ−（２、３−オレイルオキシ）−プロピル−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウム、マイルドイオン洗浄剤（例えば、コール酸ナトリウムまたはデオキシコール酸ナトリウム）または限定されないが、スルホベタイン（両性界面活性剤）、３（（３−コールアミドプロピル）ジメチルアミノ）−１−プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳ）、および３−（（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ）−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳＯ）等の双性イオン洗浄剤を含んでもよい。有機、水混和性溶剤、例えば、アセトニトリル、低級アルカノール（特に、Ｃ２〜Ｃ４アルカノール、例えば、エタノールまたはイソプロパノール）、または低級アルカンジオール（特に、Ｃ２〜Ｃ４アルカンジオール、例えば、エチレングリコール）は、変性剤として使用可能である。本発明に有用なリン脂質は、天然リン脂質、例えば、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、およびホスファチジルイノシトールまたは合成リン脂質誘導体もしくは変異体、例えば、ジヘキサノイルホスファチジルコリンまたはジヘプタノイルホスファチジルコリンであってもよい。
【０１０５】
本明細書で使われる「リフォールディング」は、ジスルフィド結合含有ポリペプチドを、ジスルフィド結合を基準にして、不適切な折り畳み、または折り畳まれていない状態から、天然のまたは正しい折り畳み高次構造に変換するいずれかのプロセス、反応または方法を意味する。
【０１０６】
本明細書で使われる「コフォールディング」は、特に、相互に作用する少なくとも２つのポリペプチドを用いて、折り畳まれていない、または不適切な折り畳みポリペプチドを天然の、正しい折り畳みのポリペプチドへの変換を行うリフォールディングプロセス、反応、または方法を意味する。
【０１０７】
本明細書で使われる用語の「プロインスリン」は、式：Ｂ−Ｃ−Ａの適切なクロスラインタンパク質であり、
式中：
Ａは、レラキシンのＡ鎖またはその機能性誘導体であり；
Ｂは、レラキシンのＢ鎖またはε−アミノ基を有するその機能性誘導体であり；さらに
Ｃは、プロインスリンの連結ペプチドである。好ましくは、プロインスリンは、ヒトレラキシンのＡ鎖、ヒトレラキシンのＢ鎖であり、また、Ｃは、天然連結ペプチドである。プロインスリンが天然配列の場合は、プロインスリンは、３つの遊離アミノ基：フェニルアラニン（１）（α−アミノ基）、リシン（２９）（ε−アミノ基）およびリシン（６４）（ε−アミノ基）を有する。
【０１０８】
本明細書で使われる用語の「レラキシン類似体」は、式：Ａ−Ｂのレラキシン活性を示す適切なクロスラインタンパク質であり、
式中：
Ａは、レラキシンのＡ鎖、またはレラキシンＡ鎖の機能性誘導体であり；また、Ｂは、レラキシンのＢ鎖またはε−アミノ基を有するレラキシンＢ鎖の機能性誘導体であり、少なくともＡまたはＢの内の１つが、天然配列からのアミノ酸改変を含む。
【０１０９】
本明細書では、用語レラキシンが複数の、または一般的な感覚で使われる場合はいつでも、天然インスリンならびにそのレラキシン類似体および誘導体が包含されることが意図されている。本明細書で使われる「レラキシンポリペプチド」は、ＣｙｓＡ７およびＣｙｓＢ７の間、ならびにＣｙｓＡ２０およびＣｙｓＢ１９の間にジスルフィド架橋、ならびにＣｙｓＡ６およびＣｙｓＡ１１の間に内部ジスルフィド架橋を含む、ヒトレラキシンに類似の分子構造を持ち、レラキシン活性を有する化合物を意味する。
【０１１０】
本明細書で使われる用語の「レラキシン」は、ヒトレラキシンを指し、そのアミノ酸配列および空間構造は、よく知られている。ヒトレラキシンは、ジスルフィド結合で架橋した２１アミノ酸のＡ鎖および３０アミノ酸のＢ鎖から構成される。適切に架橋したレラキシンは、３つのジスルフィド架橋を含み：１つはＡ鎖の位置７およびＢ鎖の位置７の間、２つめは、Ａ鎖の位置２０およびＢ鎖の位置１９の間、および３つめは、Ａ鎖の位置６および１１の間、である［Ｎｉｃｏｌ、Ｄ．Ｓ．Ｈ．Ｗ．ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ、Ｌ．Ｆ．、Ｎａｔｕｒｅ、１８７、４８３−４８５（Ｉ９６０）］。
【０１１１】
レラキシンペプチドは、限定されないが、レラキシン、ヒト；レラキシン、ブタ；ＩＧＦ−１、ヒト；レラキシン様増殖因子ＩＩ（６９−８４）；プロレラキシン様増殖因子ＩＩ（６８−１０２）、ヒト；プロレラキシン様増殖因子ＩＩ（１０５−１２８）、ヒト；［ＡｓｐＢ２８］−レラキシン、ヒト；［ＬｙｓＢ２８］−レラキシン、ヒト；［ＬｅｕＢ２８］−レラキシン、ヒト；［ＶａｌＢ２８］−レラキシン、ヒト；［ＡｌａＢ２８］−レラキシン、ヒト；［ＡｓｐＢ２８、ＰｒｏＢ２９］−レラキシン、ヒト；［ＬｙｓＢ２８、ＰｒｏＢ２９］−レラキシン、ヒト；［ＬｅｕＢ２８、ＰｒｏＢ２９］−レラキシン、ヒト；［ＶａｌＢ２８、ＰｒｏＢ２９］−レラキシン、ヒト；［ＡｌａＢ２８、ＰｒｏＢ２９］−レラキシン、ヒト；［ＧｌｙＡ２１］−レラキシン、ヒト；［ＧｌｙＡ２１  ＧｌｎＢ３］−レラキシン、ヒト；［ＡｌａＡ２１］−レラキシン、ヒト；［ＡｌａＡ２１  ＧｌｎＢ３］レラキシン、ヒト；［ＧｌｎＢ３］−レラキシン、ヒト；［ＧｌｎＢ３０］−レラキシン、ヒト；［ＧｌｙＡ２１  ＧｌｕＢ３０］−レラキシン、ヒト；［ＧｌｙＡ２１  ＧｌｎＢ３  ＧｌｕＢ３０］−レラキシン、ヒト；［ＧｌｎＢ３  ＧｌｕＢ３０］−レラキシン、ヒト；Ｂ２２〜Ｂ３０レラキシン、ヒト；Ｂ２３〜Ｂ３０レラキシン、ヒト；Ｂ２５〜Ｂ３０レラキシン、ヒト；Ｂ２６〜Ｂ３０レラキシン、ヒト；Ｂ２７〜Ｂ３０レラキシン、ヒト；Ｂ２９〜Ｂ３０レラキシン、ヒト；ヒトレラキシンのＡ鎖、およびヒトレラキシンのＢ鎖、を含む。
【０１１２】
用語の「レラキシン類似体」は、実質的にヒトレラキシンのそれぞれＡ鎖および／またはＢ鎖と同じアミノ酸配列を有するが、レラキシン類似体のレラキシン活性を破壊しない１つまたは複数のアミノ酸欠失、１つまたは複数のアミノ酸置換、および／または１つまたは複数のアミノ酸付加を有する点で、ヒトレラキシンのＡ鎖およびＢ鎖とは異なるＡ鎖およびＢ鎖を有するタンパク質を意味する。レラキシンの等電点「より高い」等電点を有するレラキシン類似体は、レラキシン類似体の１つの型である。別の型のレラキシン類似体は、「モノマーレラキシン類似体」である。
【０１１３】
「モノマーレラキシン類似体」は、ヒトレラキシンの速効性類似体であり、例えば、位置Ｂ２８のＰｒｏが、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、またはＡｌａで置換され、位置Ｂ２９のＬｙｓがＬｙｓであるか、またはＰｒｏで置換されているヒトレラキシンを含む。ｄｅｓ（Ｂ２７）ヒトレラキシンとしても知られる別のモノマーレラキシン類似体は、Ｂ鎖位置２７のＴｈｒが、欠失しているヒトレラキシンである。モノマーレラキシン類似体は、Ｃｈａｎｃｅ、Ｒ．Ｅ．、ｅｔａｌ．、米国特許第５，５１４，６４６号（１９９６年５月７日発行）；Ｂｒｅｍｓ、Ｄ．Ｎ．、ｅｔａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、５、５２７−５３３（１９９２）；Ｂｒａｎｇｅ、Ｊ．Ｊ．Ｖ．、ｅｔ  ａｌ．、欧州特許第２１４，８２６号（１９８７年３月１８日発行）；およびＢｒａｎｇｅ、Ｊ、Ｊ．Ｖ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１、９３４−９４０（１９９１）、に記載されている。本製剤に採用されるモノマーレラキシン類似体は、ヒトレラキシンと同じ位置で適切に架橋している。
【０１１４】
レラキシンペプチドは、限定されないが、レラキシン、ヒト；レラキシン、ブタ；ＩＧＦ−Ｉ、ヒト；レラキシン様増殖因子ＩＩ（６９〜８４）；プロレラキシン様増殖因子ＩＩ（６８〜１０２）、ヒト；プロレラキシン様増殖因子ＩＩ（１０５〜１２８）、ヒト；［ＡｓｐＢ２８］−レラキシン、ヒト；［ＬｙｓＢ２８］−レラキシン、ヒト；［ＬｅｕＢ２８］−レラキシン、ヒト；［ＶａｌＢ２８］−レラキシン、ヒト；［ＡｌａＢ２８］−レラキシン、ヒト；［ＡｓｐＢ２８、ＰｒｏＢ２９］−レラキシン、ヒト；［ＬｙｓＢ２８、ＰｒｏＢ２９］−レラキシン、ヒト；［ＬｅｕＢ２８、ＰｒｏＢ２９］−レラキシン、ヒト；［ＶａｌＢ２８、ＰｒｏＢ２９］−レラキシン、ヒト；［ＡｌａＢ２８、ＰｒｏＢ２９］−レラキシン、ヒト；［ＧｌｙＡ２１］−レラキシン、ヒト；［ＧｌｙＡ２１  ＧｌｎＢ３］−レラキシン、ヒト；［ＡｌａＡ２１］−レラキシン、ヒト；［ＡｌａＡ２１  ＧｌｎＢ３］レラキシン、ヒト；［ＧｌｎＢ３］−レラキシン、ヒト；［ＧｌｎＢ３０］−レラキシン、ヒト；［ＧｌｙＡ２１  ＧｌｕＢ３０］−レラキシン、ヒト；［ＧｌｙＡ２１  ＧｌｎＢ３  ＧｌｕＢ３０］−レラキシン、ヒト；［ＧＩｎＢ３  ＧｌｕＢ３０］−レラキシン、ヒト；Ｂ２２−Ｂ３０レラキシン、ヒト；Ｂ２３−Ｂ３０レラキシン、ヒト；Ｂ２５−Ｂ３０レラキシン、ヒト；Ｂ２６−Ｂ３０レラキシン、ヒト；Ｂ２７−Ｂ３０レラキシン、ヒト；Ｂ２９−Ｂ３０レラキシン、ヒト；ヒトレラキシンＡ鎖、およびヒトレラキシンＢ鎖を含む。
【０１１５】
さらなる態様では、本発明は、変異体タンパク質をコードする組換え核酸、変異体核酸を含む発現ベクター、変異体核酸および／または発現ベクターを含む宿主細胞、および変異体タンパク質を産生する方法、を提供する。さらなる態様では、本発明は、医薬品キャリアを、通常、含む治療有効量の変異体タンパク質を患者に投与することによるレラキシン応答性障害の治療を提供する。さらなる態様では、本発明は、ＭＨＣ  Ｃ１ａｓｓＩＩエピトープを変えることにより、レラキシンポリペプチドの免疫原性を調節する（特に、免疫原性を低減させる）方法を提供する。
【０１１６】
用語の「レラキシンポリペプチド」は、また、薬学的に許容可能な塩ならびにプロドラッグ、および塩のプロドラッグ、多形、水和物、溶媒和物、生物学的に活性な断片、生物学的に活性な変異体および天然レラキシンの立体異性体、ならびに天然レラキシンのアゴニスト、擬態性、およびアンタゴニスト変異体、およびそのポリペプチド融合体を含む。アミノ末端、カルボキシル末端、またはその両方に追加のアミノ酸を含む融合体は、用語の「レラキシンポリペプチド」に包含される。代表的融合体は、限定されないが、例えば、リーダーまたシグナルペプチドまたはその一部を欠いたメチオニンが、成熟型のレラキシンの組換え体発現から得られたレラキシンのＮ末端に連結されているメチオニルレラキシン（メチオニンが結合した組換え体発現から得られたレラキシンのＮ末端に連結される）、のための融合体（限定されないが、ポリヒスチジンまたは親和性エピトープへの精製を含む）、血清アルブミン結合ペプチドとの融合体および血清タンパク質、例えば、血清アルブミンとの融合体、を含む。米国特許第５，７５０，３７３号（参照によって本明細書に組み込まれる）は、新規タンパク質、例えば、成長ホルモンおよびそれぞれの受容体分子に対する改変された結合特性を有する抗体断片変異体、を選択する方法を記載している。この方法は、対象タンパク質をコードする遺伝子を、繊維状ファージＭ１３の遺伝子ＩＩＩコートタンパク質のカルボキシ末端ドメイン、レラキシンを含むキメラ分子および１つまたは複数の他の分子に融合することを含む。キメラ分子は、レラキシンまたは他の分子の片方または両方の特異的領域または断片を含むことができる。いずれかのこのような断片は、標準的な生化学的方法により、または断片をコードするポリヌクレオチドを発現させることにより、タンパク質から調製できる。レラキシン、またはその断片は、人血清アルブミン（ＨＳＡ）、Ｆｃ、またはそれらの一部を含む融合タンパク質として産生可能である。このような融合構築物は、レラキシン、またはその断片の、真核生物宿主細胞中での発現強化のために適している。代表的ＨＳＡ部分は、Ｎ末端ポリペプチド（アミノ酸１〜３６９、１〜４１９、およびアミノ酸１から始まる中間の長さ）を含む（米国特許第５，７６６，８８３号、および国際公開第９７／２４４４５号に記載。これらの特許は、参照によって本明細書に組み込まれる）。他のキメラポリペプチドは、ＨＳＡのＣ末端側およびＮ末端側終端のそれぞれに結合した、レラキシンを有するＨＳＡタンパク質、またはその断片を含んでもよい。このようなＨＳＡ構築物は、米国特許第５，８７６，９６９号に開示されている。この特許は、参照によって本明細書に組み込まれる。他の融合体は、レラキシンを、ａ）免疫グロブリンのＦｃ部；ｂ）免疫グロブリンのＦｃ部の類似体；およびｃ）免疫グロブリンのＦｃ部の断片、と融合することにより作製できる。
【０１１７】
種々の文献により、ポリマーコンジュゲーションまたはグリコシル化によるポリペプチドの改変について開示されている。用語の「レラキシンポリペプチド」は、ポリマー、例えば、ＰＥＧにコンジュゲートされたポリペプチドを含み、さらに、システイン、リシン、または他の残基の１つまたは複数の追加の誘導体化から構成されてもよい。さらに、レラキシンポリペプチドは、リンカーまたはポリマーを含んでもよく、この場合、リンカーまたはポリマーがコンジュゲートされるアミノ酸は、本発明による非天然アミノ酸であっても、またはリシンまたはシステインへの結合等の当技術分野で既知の技術を利用して、天然でコードされるアミノ酸にコンジュゲートしてもよい。
【０１１８】
用語の「レラキシンポリペプチド」は、また、グリコシル化レラキシン、例えば、限定されないが、いずれかのアミノ酸位置でグリコシル化されたポリペプチド、Ｎ結合またはＯ結合グリコシル化型のポリペプチドを含む。単一ヌクレオチド変化を含む変異体もまた、レラキシンポリペプチドの生物学的に活性な変異体と見なされる。さらに、スプライス変異体も含まれる。また、用語の「レラキシンポリペプチド」は、いずれか１つまたは複数のレラキシンポリペプチドのレラキシンポリペプチドヘテロダイマー、ホモダイマー、ヘテロマルチマー、またはホモマルチマー、またはいずれかの他のポリペプチド、タンパク質、炭水化物、ポリマー、小分子、リンカー、リガンド、または化学手段により連結された、または融合タンパク質として発現された他の生物学的に活性な任意の型の分子、ならびに例えば、特異的欠失または生物活性を維持している他の改変を含むポリペプチド類似体、を含む。
【０１１９】
用語の「レラキシンポリペプチド」または「レラキシン」は、１つまたは複数のアミノ酸置換、付加または欠失を含むレラキシンポリペプチドを包含する。本発明のレラキシンポリペプチドは、１つまたは複数の非天然アミノ酸の改変と併せて、１つまたは複数の天然アミノ酸の改変から構成されてもよい。限定されないが、医薬品安定性を調節する置換、１つまたは複数のレラキシンポリペプチド生物活性を調節する置換、例えば、限定されないが、アゴニスト活性の増加、ポリペプチドの溶解度の増加、プロテアーゼ感受性の減少、ポリペプチドのアンタゴニストへの変換、等、を含む天然レラキシンポリペプチド中の種々のアミノ酸位置の代表的置換が報告されており、これらは、用語の「レラキシンポリペプチド」に包含される。一部の実施形態では、レラキシンアンタゴニストは、レラキシン分子の受容体結合領域に存在する水溶性ポリマーに連結された天然ではコードされないアミノ酸を含む。
【０１２０】
一部の実施形態では、レラキシンポリペプチドは、レラキシンポリペプチドの生物活性を調節する付加、置換または欠失をさらに含む。一部の実施形態では、レラキシンポリペプチドは、レラキシンポリペプチドの抗ウイルス活性を調節する付加、置換または欠失をさらに含む。一部の実施形態では、レラキシンポリペプチドは、レラキシンポリペプチドの抗ウイルス活性を高める付加、置換または欠失をさらに含む。例えば、付加、置換または欠失は、１つまたは複数のレラキシンの特性また活性を調節してもよい。例えば、付加、置換または欠失は、レラキシン受容体の親和性の調節、循環半減期の調節、治療半減期の調節、ポリペプチド安定性の調節、プロテアーゼによる切断の調節、用量の調節、放出またはバイオアベイラビリティの調節、精製の促進、または特定の投与経路を改善または変更ができる。同様に、レラキシンポリペプチドは、プロテアーゼ切断配列、反応基、抗体結合ドメイン（限定されないが、ＦＬＡＧまたはポリＨｉｓを含む）または他の親和性に基づく配列（限定されないが、ＦＬＡＧ、ポリＨｉｓ、ＧＳＴ、等を含む）または検出（限定されないが、ＧＦＰを含む）、精製またはポリペプチドの他の特性を改善する連結分子（限定されないが、ビオチンを含む）を含んでもよい。
【０１２１】
用語の「レラキシンポリペプチド」は、また、同じまたは異なる天然ではコードされないアミノ酸側鎖に、天然でコードされるアミノ酸側鎖に、またはリンカーを介して間接的に連結（限定されないが、天然ではコードされないアミノ酸側鎖を介して直接連結されたものを含む）されるホモダイマー、ヘテロダイマー、ホモマルチマー、およびヘテロマルチマーを包含する。代表的リンカーには、限定されないが、小分子有機化合物、種々の長さの水溶性ポリマー、例えば、ポリ（エチレングリコール）またはポリデキストラン、または種々の長さのポリペプチドが含まれる。
【０１２２】
「天然ではコードされない（ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｅｎｃｏｄｅｄ）アミノ酸」は、２０共通アミノ酸またはピロールリジンまたはセレノシステインの内の１つではないアミノ酸を指す。用語「天然ではコードされない（ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｅｎｃｏｄｅｄ）アミノ酸」と同義に使うことができる他の用語は、「非天然（ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ）アミノ酸」「非天然（ｕｎｎａｔｕｒａｌ）アミノ酸」「天然に存在しない（ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌｌｙ−ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）アミノ酸」ならびに、それらの様々な位置にハイフォン挿入した、およびハイフォン挿入のないバージョンである。用語の「天然ではコードされないアミノ酸」は、また、限定されないが、天然でコードされるアミノ酸（限定されないが、２０共通アミノ酸またはピロールリジンおよびセレノシステインを含む）の改変（例えば、翻訳後修飾）により生成されるアミノ酸であるが、翻訳複合体により成長するポリペプチド鎖中に天然で組み込まれるものではないアミノ酸を含む。このような天然に存在しないアミノ酸の例には、限定されないが、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−トレオニン、およびＯ−フォスフォチロシンが含まれる。
【０１２３】
「アミノ末端修飾基」は、ポリペプチドのアミノ末端に結合可能ないずれかの分子を指す。同様に、「カルボキシ末端修飾基」は、ポリペプチドのカルボキシ末端に結合可能ないずれかの分子を指す。末端修飾基には、限定されないが、種々の水溶性ポリマー、ペプチドまたはタンパク質、例えば、血清アルブミン、またはペプチド血清半減期を延長する他の成分が含まれる。
【０１２４】
用語の「官能基」、「活性成分」、「活性化基」、「脱離基」、「反応部位」、「化学反応基」および「化学反応成分」は、当技術分野および本明細書で使用され分子の別々の、限定できる部分またはユニットを指す。この用語は、化学技術分野では幾分同義語的であり、本明細書では、一部の機能または活性を示し、他の分子と反応する分子の一部を指す。
【０１２５】
本明細書で使われる用語の「結合」または「リンカー」は、通常、化学反応の結果形成され、典型的には、共有結合である基または結合を指すのに使われる。加水分解的に安定な結合は、結合が、水中で実質的に安定であり、限定されないが、場合によっては、永遠も含む長期間、生理学的条件下等で、有用なｐＨ値で水と反応しないことを意味する。加水分解的に不安定または分解可能な結合は、結合が例えば、血液中を含む水中または水溶液中で分解可能であることを意味する。酵素的に不安定または分解可能な結合は、結合が１つまたは複数の酵素により分解されうることを意味する。当技術分野で理解されているように、ＰＥＧおよび関連ポリマーは、ポリマー骨格またはポリマー骨格と１つまたは複数のポリマー分子の末端官能基の間のリンカー基中に分解可能な結合を含むことができる。例えば、ＰＥＧカルボン酸または活性化ＰＥＧカルボン酸と、生理活性物質上のアルコール基との反応により形成されたエステル結合は、通常、生理学的条件下で加水分解して、薬剤を放出する。他の加水分解により分解可能な結合には、限定されないが、炭酸塩結合；アミンとアルデヒドの反応により得られるイミン結合；アルコールとリン酸基の反応により形成されるリン酸塩エステル結合；ヒドラジドとアルデヒドの反応生成物であるヒドラゾン結合；アルデヒドとアルコールの反応生成物であるアセタール結合；蟻酸塩とアルコールの反応生成物であるオルトエステル結合；アミン基（限定されないが、ポリマー、例えば、ＰＥＧの末端にあるものを含む）とペプチドのカルボキシル基により形成されるペプチド結合；およびホスホラミダイト基（限定されないが、ポリマーの末端にあるものを含む）とオリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシル基により形成されるオリゴヌクレオチド結合、が含まれる。
【０１２６】
本明細書で使われる場合の用語の「生物学的に活性な分子」、「生物学的に活性な成分」または「生理活性物質」は、生物学系、経路、分子、または生物に関する相互作用のいずれかの物理的または生化学的特性に影響を及ぼすことができるいずれかの物質を意味し、限定されないが、ウイルス、細菌、バクテリオファージ、トランスポゾン、プリオン、昆虫、真菌、植物、動物、およびヒトを含む。本明細書で使われるように、特に、生物学的に活性な分子は、限定されないが、ヒトまたは他の動物の疾患の診断、治癒、軽減、治療、または予防のための、またはそれ以外には、ヒトまたは動物の肉体的または精神的な満足な状態を高めるためのいずれかの物質を含む。生物学的に活性な分子の例には、限定されないが、ペプチド、タンパク質、酵素、小分子薬剤、ワクチン剤、免疫原、ハードドラッグ、ソフトドラッグ、炭水化物、無機原子または分子、色素、脂質、ヌクレオシド、放射性核種、オリゴヌクレオチド、トキソイド、毒素、原核および真核細胞、ウイルス、多糖類、ウイルス、細菌、昆虫、動物またはいずれかの他の細胞もしくは細胞型から得られたまたはそれら由来核酸およびその一部、リポソーム、微小粒子およびミセルが含まれる。レラキシンポリペプチドは、ミセル製剤で添加してもよい；米国特許第５，８３３，９４８号参照。本特許は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。本発明での使用に適する生理活性物質の種類には、限定されないが、薬剤、プロドラッグ、放射性核種、造影剤、ポリマー、抗生物質、殺菌剤、抗ウイルス剤、抗炎症剤、抗腫瘍薬、心血管治療薬、抗不安薬、ホルモン、増殖因子、ステロイド剤、微生物由来毒素、等、が含まれる。
【０１２７】
「二官能性ポリマー」は、特異的に他の成分（限定されないが、アミノ酸側鎖を含む）と反応して、共有結合または非共有結合を形成できる２つの別々の官能基を含むポリマーを指す。特定の生物学的に活性な成分上の基と反応する１つの官能基、および第２の生物学的成分上の基と反応する別の基を有する二官能性リンカーは、第１の生物学的に活性な成分、二官能性リンカーおよび第２の生物学的に活性な成分を含むコンジュゲートを形成するために使用できる。種々の化合物のペプチドへの結合のための多くの方法とリンカー分子が知られている。例えば、欧州特許第１８８，２５６号；米国特許第４，６７１，９５８号、同４，６５９，８３９号、同４，４１４，１４８号、同４，６９９，７８４号；同４，６８０，３３８号；および同４，５６９，７８９号を参照されたい。これらの特許は、参照によって本明細書に組み込まれる。「多官能性ポリマー」は、特異的に他の成分（限定されないが、アミノ酸側鎖を含む）と反応し、共有結合または非共有結合を形成できる２つ以上の別々の官能基を含むポリマーを指す。二官能性ポリマーまたは多官能性ポリマーは、いずれか所望の長さまたは分子量であってもよく、また、レラキシンに連結された１つまたは複数の分子およびその受容体またはレラキシンの間に特定の所望の間隔または高次構造を与えるように選択されてもよい。
【０１２８】
置換基が、左から右への記述による従来の化学式により指定される場合は、それらは、右から左への構造の記述から得られるであろう化学的に等価な置換基を同様に包含する。例えば、構造ＣＨ２Ｏは、構造−ＯＣＨ２に等価である。
【０１２９】
用語の「置換基」は、限定されないが、「非干渉置換基」を含む。「非干渉置換基」は、安定な化合物を得る基である。適切な非干渉置換基またはラジカルには、限定されないが、ハロ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル、Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ１２アラルキル、Ｃ１〜Ｃ１２アルカリル、Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルケニル、フェニル、置換フェニル、トルオイル、キシレニル、ビフェニル、Ｃ２〜Ｃ１２アルコキシアルキル、Ｃ２〜Ｃ１２アルコキシアリール、Ｃ７〜Ｃ１２アリールオキシアルキル、Ｃ７〜Ｃ１２オキシアリール、Ｃ１〜Ｃ６アルキルスルフィニル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルスルホニル、−−（ＣＨ２）ｍ−−Ｏ−−（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）（ｍは１〜８）、アリール、置換アリール、置換アルコキシ、フルオロアルキル、ヘテロ環式ラジカル、置換ヘテロ環式ラジカル、ニトロアルキル、−−ＮＯ２、−−ＣＮ、−−ＮＲＣ（Ｏ）−−（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、−−Ｃ（Ｏ）−−（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、Ｃ２〜Ｃ１０アルキルチオアルキル、−−Ｃ（Ｏ）Ｏ−−（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、−−ＯＨ、−−ＳＯ２、＝Ｓ、−−ＣＯＯＨ、−−ＮＲ２、カルボニル、−−Ｃ（Ｏ）−−（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）−ＣＦ３、−−Ｃ（Ｏ）−ＣＦ３、−−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−−（Ｃ１〜Ｃ１０アリール）−Ｓ−−（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）、−−Ｃ（Ｏ）−−（Ｃ１〜Ｃ１０アリール）、−−（ＣＨ２）ｍ−−Ｏ−−（−−（ＣＨ２）ｍ−−Ｏ−−（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）（各ｍは１〜８）、−−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−−Ｃ（Ｓ）ＮＲ２、−−ＳＯ２ＮＲ２、−−ＮＲＣ（Ｏ）ＮＲ２、−−ＮＲＣ（Ｓ）ＮＲ２、それらの塩、等が含まれる。本明細書で使われる各Ｒは、Ｈ、アルキルまたは置換アルキル、アリールまたは置換アリール、アラルキル、またはアルカリルである。
【０１３０】
用語の「ハロゲン」は、フッ素、塩素、ヨウ素、および臭素を含む。
【０１３１】
それ自身としての、または別の置換基の一部としての用語の「アルキル」は、特に指定のない限り、直鎖もしくは分岐鎖、または環式炭化水素基、またはそれらの組み合わせを意味し、完全飽和でも、モノまたは多価不飽和であってもよく、また、ジ−および多価ラジカルを含んでもよく、指定された数の炭素原子を有する（すなわち、Ｃ１〜Ｃ１０は、１〜１０炭素を意味する）。飽和炭化水素基の例には、限定されないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチル、例えば、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチルの相同体および異性体、等の基が含まれる。不飽和アルキル基は、１つまたは複数の二重結合または三重結合を有するものである。不飽和アルキル基の例には、限定されないが、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２、４−ペンタジエニル、３−（１、４−ペンタジエニル）、エチニル、１−および３−プロピニル、３−ブチニル、およびさらに高級相同体および異性体が含まれる。用語の「アルキル」は、特に指定のない限り、また、下記でさらに詳細に定義される「ヘテロアルキル」等のアルキル誘導体を含むことが意図されている。炭化水素基に限定されているアルキル基は、「ホモアルキル」と命名されている。
【０１３２】
それ自身としての、または別の置換基の一部としての用語の「アルキレン」は、限定されないが、構造−ＣＨ２ＣＨ２−および−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−により例示されるように、アルカン由来の二価ラジカルを意味し、「ヘテロアルキレン」として下に記載される基をさらに含む。通常、アルキル（またはアルキレン）基は、１〜２４炭素原子を有し、１０以下の炭素原子を有する基は、本明細書記載の方法および組成物の特定の実施形態である。「低級アルキル」または「低級アルキレン」は、より短い鎖のアルキルまたはアルキレン基で、通常は、８以下の炭素原子を有する。
【０１３３】
用語の「アルコキシ」、「アルキルアミノ」および「アルキルチオ」（またはチオアルコキシ）は、それらの従来の意味で使われ、それぞれ、酸素原子、アミノ基、または硫黄原子、を介して分子の残りの部分に結合したアルキル基を指す。
【０１３４】
用語の「ヘテロアルキル」は、それ自身として、または別の用語と組み合わせて、特に指定のない限り、安定な直鎖もしくは分岐鎖、または環式炭化水素基、またはそれらの組み合わせを意味し、指定された数の炭素原子およびＯ、Ｎ、ＳｉおよびＳからなる群より選択される少なくとも１つのヘテロ原子から構成され、窒素および硫黄原子は、任意選択で、酸化されてもよく、また、窒素ヘテロ原子は、任意選択で、四級化されてもよい。ヘテロ原子Ｏ、ＮおよびＳおよびＳｉは、ヘテロアルキル基のいずれの内部位置に置かれてもよく、または、アルキル基が分子の残りに結合される位置に置かれてもよい。限定されないが、例には、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２、−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ３、および−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３が含まれる。例えば、−ＣＨ２−ＮＨ−ＯＣＨ３および−ＣＨ２−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ３）３のように、２つまでのヘテロ原子が連続配置できる。同様に、用語の「ヘテロアルキレン」は、それ自身として、または別の置換基の一部として、ヘテロアルキル由来の二価ラジカルを意味し、限定されないが、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−および−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−で例示される。ヘテロアルキレン基に対しては、同じまたは異なるヘテロ原子は、また、鎖末端の片方または両方を占めることができる（限定されないが、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノ、アミノオキシアルキレン、等を含む）。またさらに、アルキレンおよびヘテロアルキレン結合基に対しては、結合基の式が記述される方向からは、結合基の配向は示されない。例えば、式Ｃ（Ｏ）２Ｒ’は、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’および−Ｒ’Ｃ（Ｏ）２の両方を表す。
【０１３５】
用語の「シクロアルキル」および「ヘテロシクロアルキル」、特に指定のない限り、それ自身として、または別の用語と組み合わせて、それぞれ、環式バージョンの「アルキル」および「ヘテロアルキル」を表す。従って、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルは、飽和、部分不飽和および完全不飽和環式結合を含む。さらに、ヘテロシクロアルキルに対しては、ヘテロ原子は、ヘテロ環が分子の残りの部分に結合している位置を占めることができる。シクロアルキルに例には、限定されないが、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、シクロヘプチル、等が含まれる。ヘテロシクロアルキルの例には、限定されないが、１−（１、２、５、６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルフォリニル、３−モルフォリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−いる、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニル、等が含まれる。さらに、この用語は、二環式および三環式構造を包含する。同様に、用語の「ヘテロシクロアルキレン」は、それ自身として、または別の置換基の一部として、ヘテロシクロアルキル由来の二価ラジカルを意味し、用語の「シクロシクロアルキレン」は、それ自身として、または別の置換基の一部として、シクロアルキル由来の二価ラジカルを意味する。
【０１３６】
本明細書で使われる用語の「水溶性ポリマー」は、水性溶剤に可溶のいずれかのポリマーを指す。水溶性ポリマーのレラキシンポリペプチドへの結合には、限定されないが、非改変型に比べて、延長されたもしくは調節された血清半減期、または延長されたもしくは調節された治療半減期、調節された免疫原性、調節された物理的関連特性、例えば、凝集およびマルチマー形成、変更された受容体結合、１つまたは複数の結合相手に対する変更された結合、および変更された受容体ダイマー化またはマルチマー化、等の変化をもたらすことができる。水溶性ポリマーは、それ自身の生物活性を持っても、持たなくてもよく、レラキシンを、限定されないが、１つまたは複数のレラキシンポリペプチド、または１つまたは複数の生物学的に活性な分子を含む他の物質に結合するためのリンカーとして利用されてもよい。適切なポリマーには、限定されないが、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、それらのモノＣ１〜Ｃ１０アルコキシまたはアリールオキシ誘導体（米国特許第５，２５２，７１４号に期さされている。この特許は、参照によって本明細書に組み込まれる）、モノメトキシポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアミノ酸、ジビニルエーテルマレイン酸無水物、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）−メタクリルアミド、デキストラン、デキストラン硫酸塩等のデキストラン誘導体、ポリプロピレングリコール、ポリ酸化プロピレン／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ヘパリン、ヘパリン断片、多糖類、オリゴ糖、グリカン、セルロースおよび限定されないがメチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロース等のセルロース誘導体、デンプンおよびデンプン誘導体、ポリペプチド、ポリアルキレングリコールおよびその誘導体、ポリアルキレングリコールの共重合体およびその誘導体、ポリビニルエチルエーテル、およびアルファ−ベータポリ［（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパルトアミド、等、またはそれらの混合物が含まれる。このような水溶性ポリマーの例には、限定されないが、ポリエチレングリコールおよび血清アルブミンが含まれる。
【０１３７】
本明細書で使われる用語の「ポリアルキレングリコール」または「ポリ（アルケングリコール）」は、ポリエチレングリコール（ポリ（エチレングリコール））、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール、およびそれらの誘導体を指す。用語の「ポリアルキレングリコール」は、直鎖および分枝高分子の両方および０．１ｋＤａ〜１００ｋＤａの平均分子量を包含する。他の代表的実施形態は、例えば、市販品サプライヤーのカタログ、例えば、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのカタログ「生物医学への適用のためのポリエチレングリコールと誘導体（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ  ａｎｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」（２００１）、に挙げられている。
【０１３８】
用語の「アリール」は、特に指定のない限り、一緒に縮合、または共有結合した単一環でも、複数環（限定されないが、１〜３環を含む）でもよい多価不飽和、芳香族炭化水素置換基を意味する。用語の「ヘテロアリール」は、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４ヘテロ原子を含むアリール基（または環）を指し、ここで、窒素および硫黄原子は、任意選択で、酸化されてもよく、また、窒素原子は、任意選択で、四級化されてもよい。ヘテロアリール基は、ヘテロ原子を介して分子の残りの部分に結合できる。アリールおよびヘテロアリール基の非制限的例には、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソキサゾリル、４−イソキサゾリル、５−イソキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジニル、４−ピリミジニル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンズイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル、および６−キノリルが含まれる。上記アリールおよびヘテロアリール環系のそれぞれに対する置換基は、下記に記載の受容可能な置換基群から選択される。
【０１３９】
簡略のために、用語の「アリール」は、他の用語（限定されないが、アリールオキシ、アリールチオキシ、アリールアルキルを含む）と組み合わせて使われる場合は、上記で定義のアリールおよびヘテロアリール環の両方を含む。従って、用語の「アリールアルキル」は、炭素原子（限定されないが、メチレン基を含む）が、例えば、酸素原子により置換されたアルキル基（限定されないが、フェノキシメチル、２−ピリジルオキシメチル、３−（１−ナフチルオキシ）プロピル、等を含む）を含むアルキル基に、アリール基（限定されないが、ベンジル、フェネチル、ピリジルメチル、等を含む）が結合されているラジカルを含むことが意図されている。
【０１４０】
上記用語のそれぞれ（限定されないが、「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「アリール」および「ヘテロアリール」を含む）は、指定されたラジカルの置換および未置換型の両方を含むことが意図されている。ラジカルの各タイプに対する代表的置換基は、以下に示される。
【０１４１】
アルキルおよびヘテロアルキルラジカル（限定されないが、アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、およびヘテロシクロアルケニルと呼ばれることが多い基を含む）に対する置換基は、限定されないが、下記から選択される１つまたは複数の種々の基であってもよい：−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ”、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ”Ｒ’”ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ”、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）Ｒ’、ＮＲ’Ｃ（Ｏ）ＮＲ”Ｒ”’、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ”Ｒ”’）＝ＮＲ””、ＮＲＣ（ＮＲ’Ｒ”）＝ＮＲ’”、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ”、ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮおよび−ＮＯ２ 。置換数はゼロから（２ｍ’＋ｌ）の範囲（ｍ’は、このラジカルの炭素原子の合計数）の数であり、Ｒ’、Ｒ”、Ｒ’”およびＲ””は、それぞれ独立に、水素、置換または未置換ヘテロアルキル、置換または未置換アリールを指し、限定されないが、１〜３ハロゲン、置換または未置換アルキル、アルコキシまたはチオアルコキシ基、またはアリールアルキル基で置換されたアリールを含む。本発明の化合物が、２つ以上のＲ基を含む場合、例えば、２つ以上のこれらの基が存在する場合は、Ｒ基のそれぞれがＲ’、Ｒ”、Ｒ”’およびＲ””基として独立に選択される。Ｒ’およびＲ”が同じ窒素原子に結合されている場合は、それらは、窒素原子と組み合わされて、５−、６−、また７−員環を形成できる。例えば、−ＮＲ’Ｒ”は、限定されないが、１−ピロリジニルおよび４−モルフォリニルを含むことが意図される。上記置換基の考察から、当業者なら、用語の「アルキル」が、水素基以外の基、例えば、ハロアルキル（限定されないが、−ＣＦ３および−ＣＨ２ＣＦ３を含む）およびアシル（限定されないが、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３、等を含む）に結合された炭素原子を含む基を含むことが意図されていることが理解されよう。
【０１４２】
アルキルラジカルに関し記載された置換基と同様に、アリールおよびヘテロアリール基に対する置換基は、種々あり、限定されないが、下記から選択される：ハロゲン、ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ”、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ”Ｒ”’、ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ”、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）Ｒ’、ＮＲ’Ｃ（Ｏ）ＮＲ”Ｒ”’、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ”Ｒ’”）＝ＮＲ””、ＮＲＣ（ＮＲ’Ｒ”）＝ＮＲ”’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ”、ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮおよび−ＮＯ２、−Ｒ’、−Ｎ３、−ＣＨ（Ｐｈ）２、フルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルコキシ、およびフルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル。置換数は、ゼロから芳香族環系の開放原子価の合計数の範囲の数であり、Ｒ’、Ｒ”、Ｒ”’およびＲ””は、独立に、水素、アルキル、ヘテロアルキル、アリールおよびヘテロアリールから選択される。本発明の化合物が２つ以上のＲ基を含む場合は、例えば、２つ以上のこれらの基が存在する場合、それぞれのＲ基は独立にＲ’、Ｒ”、Ｒ’”およびＲ””基としてそれぞれ選択される。
【０１４３】
本明細書で使用される用語の「調節された血清半減期」は、非改変型に比べて、改変レラキシンの循環半減期の正のまたは負の変化を意味する。血清半減期は、レラキシン投与後の種々の時点で血液サンプルを採取して、各試料中の分子濃度を求めることにより測定される。血清濃度と時間の相関により、血清半減期の計算が可能となる。延長された血清半減期は、少なくとも約２倍であることが望ましいが、例えば、それにより、納得のいく投与計画が可能となるか、または毒作用が避けられる場合は、さらに短い延長も有用である可能性がある。一部の実施形態では、延長は少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、または少なくとも約１０倍である。
【０１４４】
本明細書で使われる用語の「調節された治療半減期」は、非改変型に比べて、治療有効量のレラキシンの半減期の正のまたは負の変化を意味する。治療半減期は、投与後の種々の時点での分子の薬物動態学的および／または薬力学的特性の測定により求められる。延長された治療の半減期により、特段の有益な投与計画、特段の有益な全用量が可能となるか、または望ましくない作用が避けられるのが望ましい。一部の実施形態では、延長された治療半減期により、増加した効力、増加または減少した改変分子の標的への結合、プロテアーゼ等の酵素による分子の増加または減少した分解、または非改変分子の別の作用パラメータもしくは機序の増加または減少または分子受容体媒介クリアランスの増加または減少が生ずる。
【０１４５】
用語の「単離された」は、核酸またはタンパク質に適用される場合、核酸またはタンパク質が、天然状態では随伴している少なくとも一部の細胞成分を含まない、または核酸またはタンパク質が、そのインビボまたはインビトロで産生時の濃度より高いレベルに濃縮されていることを意味する。それは、均質の状態であってもよい。単離された物質は、乾燥または半乾燥状態であってもよく、または限定されないが、水溶液を含む溶液状態でもよい。それは、追加の薬学的に許容可能なキャリアーおよび／または賦形剤を含む医薬組成物の成分であってもよい。純度と均一性は、通常、分析化学技術、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法または高速液体クロマトグラフィーを使って測定される。製剤中に存在する主要種であるタンパク質は、実質的に精製される。特に、単離遺伝子は、遺伝子に隣接し、対象遺伝子以外のタンパク質をコードする読み枠から分離される。用語の「精製された」は、核酸またはタンパク質が、電気泳動ゲル中で実質的に１つのバンドを生ずることを意味する。特に、それは、核酸またはタンパク質が、少なくとも８５％純粋、少なくとも９０％純粋、少なくとも９５％純粋、少なくとも９９％またはそれ超純粋であることを意味してよい。
【０１４６】
用語の「核酸」は、単鎖または二重鎖型のデオキシリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、またはリボヌクレオチドおよびそれらのポリマーを指す。特に限定されなければ、この用語は、参照核酸と類似の結合特性を有し、天然ヌクレオチドに類似の方式で代謝される天然ヌクレオチドの既知の類似体を含む核酸を包含する。特に別段の限定がなければ、この用語は、また、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、アンチセンス技術で使われるＤＮＡ類似体（ホスホロチオアート、ホスホロアミダート、等）を含むオリゴヌクレオチド類似体を指す。特段の記載が無ければ、特定の核酸配列は、また、保存的に改変されたその変異体（限定されないが、縮重コドン置換を含む）、相補的配列ならびに明示的に示された配列を暗黙的に含む。特に、縮重コドン置換は、第３の位置の１つまたは複数の選択された（または全ての）コドンが混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することにより行うことができる（Ｂａｔｚｅｒｅｔａｌ．、核酸Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。
【０１４７】
用語の「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書では同義に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。すなわち、ポリペプチドに関する記述は、ペプチドの記述およびタンパク質の記述に等しく適用でき、逆もまた同じである。この用語は、天然アミノ酸ポリマー、ならびに、１つまたは複数のアミノ酸残基が天然ではコードされないアミノ酸であるアミノ酸ポリマーに適用できる。本明細書で使われるこの用語は、アミノ酸残基が、共有結合のペプチド結合で連結されている任意の長さのタンパク質を含む任意の長さのアミノ酸鎖を包含する。
【０１４８】
用語の「アミノ酸」は、天然に存在する、および天然に存在しないアミノ酸、ならびにアミノ酸類似体および天然アミノ酸に類似の方式で機能するアミノ酸模倣体を指す。天然でコードされるアミノ酸は、２０共通アミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリン）ならびに、ピロールリジンおよびセレノシステインである。アミノ酸類似体は、天然アミノ酸と同じ基本的化学構造、すなわち、水素に結合した炭素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルフォキシド、メチオニンメチルスルホニウムを有する化合物を指す。このような類似体は、改変Ｒ基（例えば、ノルロイシン）または改変ペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を保持している。アミノ酸への参照は、例えば、天然タンパク新生Ｌ−アミノ酸；Ｄ−アミノ酸、化学的改変アミノ酸、例えば、アミノ酸変異体および誘導体；天然非タンパク新生アミノ酸、例えば、β−アラニン、オルニチン、等；および当技術分野でアミノ酸の特徴であるとわかっている特性を有する化学的合成化合物を含む。非天然アミノ酸の例には、限定されないが、α−メチルアミノ酸（例えば、α−メチルアラニン）、Ｄ−アミノ酸、ヒスチジン様アミノ酸（例えば、２−アミノヒスチジン、β−ヒドロキシヒスチジン、ホモヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジンおよびα−メチルヒスチジン）、側鎖に追加のメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）、および側鎖のカルボン酸官能基が、スルホン酸基（例えば、システイン酸）で置換されているアミノ酸が含まれる。合成非天然アミノ酸、置換アミノ酸、または１つまたは複数のＤ−アミノ酸を含む非天然アミノ酸の本発明のタンパク質への組込みは、いくつかの異なる方式の中で有利である可能性がある。Ｄ−アミノ酸含有ペプチド、等は、Ｌ−アミノ酸含有対応物に比べて、増加したインビトロまたはインビボ安定性を示す。従って、Ｄ−アミノ酸を組み込むペプチド等の作製は、より大きな細胞内安定性が所望または必要な場合、特に有用でありうる。さらに具体的には、Ｄ−ペプチド等は、内在性ペプチダーゼおよびプロテアーゼ抵抗性であり、それにより、必要に応じ、分子の改善された生物学的利用率、および延長されたインビボ寿命を与える。さらに、Ｄ−ペプチド、等は、ヘルパーＴ細胞に対する主要組織適合抗原クラスＩＩ拘束性提示に対し効率的に処理できず、従って、全生物で液性免疫応答を誘発しそうにない。
【０１４９】
本明細書では、アミノ酸は、よく知られている３文字記号またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会推奨の１文字記号で参照される。ヌクレオチドは、同様に、一般に受け入れられている１文字コードで参照される。
【０１５０】
「保存的に改変された変異体」は、アミノ酸および核酸配列の両方に適用できる。特定の核酸配列に関して、「保存的に改変された変異体」は、同じまたは基本的に同じアミノ酸配列をコードする核酸、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は、基本的に同じ配列を指す。遺伝暗号縮退のために、多数の機能的に同じ核酸が任意の所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵは全て、アミノ酸のアラニンをコードする。従って、アラニンがコドンにより指定される全ての位置で、コードされるポリペプチドを変えることなく、コドンを上記対応するコドンのいずれかに変更できる。このような核酸のバリエーションは、「サイレントバリエーション」であり、これは、保存的改変バリエーションの一種である。本明細書のポリペプチドをコードする全ての核酸配列は、また、全ての可能な核酸のサイレントバリエーションを表している。当業者なら、核酸の各コドン（通常、メチオニン用の唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常、トリプトファン用の唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を改変して、機能的に同じ分子を得ることができることを理解するであろう。従って、核酸のポリペプチドをコードする各サイレントバリエーションは、各記載配列中に必然的に含まれている。
【０１５１】
アミノ酸配列に関して、当業者は、単一アミノ酸または少量のパーセンテージのコード化配列中でのアミノ酸の変更、付加、削除を行う、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列へのそれぞれ置換、欠失または付加は、変更が化学的に類似のアミノ酸によるアミノ酸の欠失、アミノ酸の付加またはアミノ酸の置換をもたらす場合は、「保存的に改変された変異体」であることをわかるであろう。機能的に類似のアミノ酸を与える保存的置換表は、当業者には既知である。このような保存的に改変された変異体は、本発明の多型変異体、種間相同体、および対立遺伝子に追加されるものであり、これらを排除するものではない。
【０１５２】
機能的に類似のアミノ酸を与える保存的置換表は、当業者には既知である。下記の８群は、それぞれ、相互に保存的置換されるアミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）
【０１５３】
（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、タンパク質：構造と分子特性（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）（Ｗ  Ｈ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．；２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  １９９３、を参照のこと）。
【０１５４】
用語の「同じ」またはパーセント「同一性」は、２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の存在下では、２つ以上の同じ配列または部分列を指す。下記の配列比較アルゴリズム（または他の当業者に利用可能なアルゴリズム）の１つを使って、またはマニュアル整列と目視検査により測定して、比較ウインドウまたは指定領域全体で、最大一致を得るために比較し整列させた場合に、それらが、あるパーセンテージ（すなわち、指定領域全体で約６０％同一性、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％同一性）同じであるアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する場合は、配列は、「実質的に同じ」である。この定義は、また、試験配列の相補配列を指す。同一性は、少なくとも約５０アミノ酸もしくはヌクレオチド長さの領域にわたって、または７５〜１００アミノ酸またはヌクレオチド長さの領域にわたって、または指定されない場合は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの全体配列にわたって存在してもよい。ヒト以外の種由来の相同体を含む本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチド配列またはその断片を有する標識プローブを使って、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でライブラリーを選別し、完全長ｃＤＮＡおよび前記ポリヌクレオチド配列を含むゲノムクローンを単離するステップを含むプロセスにより得ることができる。このようなハイブリダイゼーション技術は、当業者にはよく知られている。
【０１５５】
配列比較のために、典型的には、１つの配列が参照配列として使用して、これに対し、試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使う場合には、試験および参照配列を、コンピュータに入力し、必要に応じ、部分列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトのプログラムパラメータを使用しても、または代わりのパラメータを指定してもよい。次に、配列比較アルゴリズムにより、プログラムパラメータに基づき、参照配列に比較して、試験配列のパーセント配列同一性が計算される。
【０１５６】
本明細書で使われる「比較ウインドウ」は、２つの配列が任意選択で整列された後で、配列を同じ数の近接位置の参照配列と比較できる、２０〜６００、普通は約５０〜約２００、さらに普通には約１００〜約１５０、からなる群より選択される近接位置の数のいずれか１つのセグメントに対する参照を含む。比較のための配列の整列方法は、当業者には既知である。比較のための配列の最適整列化は、限定されないが、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９７０）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ、Ｍａｔｈ．２：４８２ｃの局地的相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性整列アルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４の類似性探索方法、これらのアルゴリズムの計算機による実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、またはマニュアル整列化と目視検査による方法（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、分子生物学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（１９９５付録）を参照）等によって行うことができる。
【０１５７】
パーセント配列同一性および配列類似性の測定に適切なアルゴリズムの一例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２、およびＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０、にそれぞれ記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、米国国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）から公的に入手可能であり、これは、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖからＷＷＷで入手可能である。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータのＷ、Ｔ、およびＸは、整列化の感度と速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして、単語長（Ｗ）：１１、期待値（Ｅ）：１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両鎖の比較、を使用する。アミノ酸配列に対してのＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、単語長：３、および期待値（Ｅ）：１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５、を参照）、アライメント（Ｂ）：５０、期待値（Ｅ）：１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較、を使用する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、通常、「低複雑度」フィルター：オフで行われる。
【０１５８】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、また、２つの配列の間の類似性の統計的分析を行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７、参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより得られる類似性の１つの測定値は、最小和確率（Ｐ（Ｎ））で、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間のマッチングが偶然に起こる確率の指標を与える。例えば、試験核酸の参照核酸に対する比較で、最小和確率が約０．２未満、または約０．０１未満、または約０．００１未満の場合、核酸は、参照配列に類似であると見なされる。
【０１５９】
語句の「〜に選択的に（または特異的に）ハイブリダイズする」は、その配列が複合混合物（限定されないが、全細胞性またはライブラリーＤＮＡもしくはＲＮＡ）中に存在する場合に、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下での、特定のヌクレオチド配列のみへの分子の結合、二重鎖化、またはハイブリダイズを指す。
【０１６０】
語句の「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」は、当技術分野で知られているような、低イオン強度および高温度の条件下、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、もしくは他の核酸模倣体、またはそれらの組み合わせの配列のハイブリダイゼーションを指す。典型的には、ストリンジェント条件下で、プローブが核酸複合混合物（限定されないが、全細胞性またはライブラリーＤＮＡもしくはＲＮＡを含む）中の標的部分列にハイブリダイズするが、複合混合物中の他の配列にはハイブリダイズしない。ストリンジェント条件は、配列依存性であり、異なる環境では、違ったものになるであろう。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションへの広範囲なガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ、生化学と分子生物学における研究技術−核酸プローブを使ったハイブリダイゼーション（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ｐｒｏｂｅｓ）、「ハイブリダイゼーションの原理の概要と核酸アッセイ戦略（Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｓｓａｙｓ）」（１９９３）、に認められる。通常、ストリンジェント条件は、規定イオン強度とｐＨで、特異的配列に対して融解温度（Ｔｍ）より約５〜１０℃低くなるように選択される。Ｔｍは、（規定イオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下）平衡状態で５０％の標的に対し相補的なプローブが標的配列にハイブリダイズする温度である（標的配列は、Ｔｍで過剰に存在するので、平衡時に５０％のプローブが占有される）。ストリンジェント条件は、塩濃度がｐＨ７．０〜８．３で、約１．０Ｍナトリウムイオン未満の濃度、典型的には約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン濃度（または他の塩）であり、短いプローブ（限定されないが、１０〜５０ヌクレオチドを含む）に対して、温度は少なくとも約３０℃および長いプローブ（限定されないが、５０ヌクレオチドより長い、等）に対しては少なくとも約６０℃であってもよい。ストリンジェント条件は、また、不安定化剤、例えば、フォルムアミドの添加により達成してもよい。選択的または特異的ハイブリダイゼーションに対して、ポジティブシグナルは、少なくともバックグラウンドの２倍、任意選択でバックグラウンドの１０倍のハイブリダイゼーションであってよい。代表的ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、以下のようであってもよい：５０％フォルムアミド、５ＸＳＳＣ、および１％ＳＤＳ、４２℃で培養、または５ＸＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃で培養、０．２ＸＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを使い６５℃で洗浄。このような洗浄を、５、１５、３０、６０、１２０分、またはそれより長い時間行ってもよい。
【０１６１】
本明細書で使われる用語の「真核生物」は、系統学的ユーカリアドメイン、例えば、動物（限定されないが、哺乳類、昆虫類、爬虫類、鳥類、等を含む）、繊毛虫類、植物（限定されないが、単子葉類、双子葉類、藻類、等を含む）、真菌類、酵母、鞭毛虫類、微胞子虫類、原生生物、等に属する生物を指す。
【０１６２】
本明細書で使われる用語の「非真核生物」は、非真核の生物を指す。例えば、非真核の生物は、真正細菌（限定されないが、大腸菌、高度好熱菌、バチルス・ステアロサーモフィルス、蛍光菌、緑膿菌、プチダ菌、等を含む）系統学的ドメイン、またはアーケア（限定されないが、メタノコッカスジャナスキー、メタノバクテリウム・サーモアウトトロフィクス、ハロバクテリウム、例えば、ハロフェラックス・ボルカニおよびハロバクテリウム種ＮＲＣ−１、アーケオグロブス・フルギダス、パイロコッカス・フリオサス、パイロコッカス・ホリコシイ、アエロパイラム・ペルニクス、等を含む）系統学的ドメインに属する。
【０１６３】
本明細書で使われる用語の「対象」は、治療、観察または実験の対象である動物、一部の実施形態では、哺乳動物、および他の実施形態では、ヒトを指す。動物は、ペット動物（例えば、イヌ、ネコ、等）、家畜（例えば、雌ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、等）または実験動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、等）であってもよい。
【０１６４】
本明細書で使われる用語の「有効量」は、１つまたは複数の治療されるべき疾患の症状、状態または障害を、ある程度軽減すると思われる改変非天然アミノ酸ポリペプチドの投与量を指す。本明細書記載の改変非天然アミノ酸ポリペプチドを含む組成物は、予防、強化、および／または治療処置のために投与できる。
【０１６５】
用語の「強化する」または「強化」は、所望の効果の効力または持続期間を増やすか、または延長することを意味する。従って、治療薬の効果の強化に関して、用語「強化」は、効力または持続期間に関し、系に対する他の治療薬の効果を増やすか、または延長する能力を指す。本明細書で使われる「強化有効量」は、所望の系の別の治療薬の効果を強化するのに適切な量を指す。患者に使用される場合は、この使用に対し有効な量は、重症度および疾患、障害、または状態の経過、前治療、患者の健康状態および薬剤に対する応答、ならびに治療医師の判断に依存することになる。
【０１６６】
本明細書で使われる用語の用語「改変された」は、所与のポリペプチドになされた何らかの変化、例えば、ポリペプチドの長さ、アミノ酸配列、化学構造の変化、ポリペプチドの翻訳時修飾、または翻訳後修飾、を指す。「（改変された）」の形の用語は、考察対象ポリペプチドは任意選択で改変されてもよい、すなわち、考察しているポリペプチドは、改変されても、されなくてもよいことを意味する。
【０１６７】
用語の「翻訳後修飾により改変された」は、ポリペプチド鎖中に組み込まれた後で、アミノ酸に発生する天然または非天然アミノ酸のいずれかの改変を指す。この用語は、例としてではあるが、インビボ翻訳時修飾、インビトロ翻訳時修飾（例えば、細胞のない翻訳系中での）、インビボ翻訳後修飾およびインビトロ翻訳後修飾、を包含する。
【０１６８】
予防への適用では、レラキシンポリペプチドを含む組成物は、特定の疾患、障害または状態に罹りやすい、あるいはその危険がある患者に投与すされる。このような場合の量は、「予防有効量」と定義される。この使い方でも、正確な量は、また、患者健康状態、体重、等に依存する。ルーチン的な実験（例えば、漸増投与臨床試験）により、当業者の技能範囲内でこのような予防有効量が決められるようにうまく考えられている。
【０１６９】
用語の「保護された」は、特定の反応条件下で化学的反応性官能基の反応を防ぐ「保護基」または成分の存在を指す。保護基は、保護される化学反応基のタイプに応じて変わる。例えば、化学反応基がアミンまたはヒドラジドの場合は、保護基は、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）および９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）の群から選択できる。化学的反応基がチオールの場合は、保護基は、オルトピリジルジスルフィドであってよい。化学的反応基がカルボン酸、例えば、ブタン酸またはプロピオン酸、またはヒドロキシル基の場合は、保護基は、ベンジルまたはアルキル基、例えば、メチル、エチル、またはｔｅｒｔ−ブチルであってよい。感光性基、例えば、ＮｖｏｃおよびＭｅＮｖｏｃを含む当技術分野で既知の他の保護基も、また、本明細書記載の方法および組成物中またはこれらと共に使用可能である。当技術分野で既知の他の保護基も、また、本明細書記載の方法および組成物中またはこれらと共に使用可能である。例としてではあるが、ブロッキング／保護基は、下記から選択できる：
【化４】
0006054294.tif 000005
【０１７０】
他の保護基は、Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｗｕｔｓ、有機合成における保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、３ｒｄ  Ｅｄ．、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９９、に記載されている。この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１７１】
治療への適用では、改変非天然アミノ酸ポリペプチドを含む組成物は、治療または少なくとも部分的に疾患、障害または状態の症状を停止するのに充分な量で、既に疾患、状態または障害に罹患している患者に投与される。このような量は、「治療有効量」と定義され、重症度および疾患、障害または状態の経過、前治療、患者の健康状態および薬剤に対する応答、ならびに治療医師の判断に依存する。ルーチン的な実験（例えば、漸増投与臨床試験）により、当業者の技能範囲内でこのような予防有効量が決められるようにうまく考えられている。
【０１７２】
本発明のレラキシンポリペプチドは、血管収縮、ＮＯ産生、ＥＴ−１、ＡｎｇＩＩ、および血小板凝集を調節するのに使用できる。本発明の一実施形態では、治療を必要としている患者は、治療を求めている状態のベースラインに対し、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１００％超、１５０％、１５０％超、２００％、２００％超だけ患者の血管収縮が減少すると想定される治療量の本発明のレラキシンポリペプチド投与を受ける。別の本発明の実施形態は、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１００％超、１５０％、１５０％超、２００％、２００％超だけ、ＮＯ産生を増やすために治療有効量のレラキシンポリペプチドを投与することによる、それを必要としている患者のＮＯ産生を増加させるための治療方法である。
【０１７３】
本発明の一実施形態は、治療量の本発明レラキシンポリペプチドを使って患者の血小板凝集を１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１００％超、１５０％、１５０％超、２００％、２００％超、だけ低減するそれを必要としている患者の治療方法である。別の本発明の実施形態は、治療量のレラキシンポリペプチドを使って、それを必要としている患者の肥大を減らすための治療方法である。別の本発明実施形態は、治療量の本発明のレラキシンポリペプチドを使って、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１００％超、１５０％、１５０％超、２００％、２００％超、だけ患者のＣＦ刺激タンパク質合成を減らすための、それを必要としている患者の治療方法である。別の本発明の実施形態は、治療有効量のレラキシンポリペプチドを投与して、ＮＯ産生を、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１００％超、１５０％、１５０％超、２００％、２００％超、だけ増やし、患者のＡＮＰ発現を増やすための、それを必要としている患者の治療方法である。
【０１７４】
本方法により、本発明のｐｅｇレラキシンは、野性型レラキシンに比べて、ＡＵＣが１０倍；１５倍増加；１５倍超増加；２０倍増加；２０倍超増加；２５倍増加；２５倍超増加；３０倍増加；３０倍超増加；３５倍増加；３５倍超増加；４０倍増加；４０倍超増加；４５倍増加；４５倍超増加；５０倍増加；５０倍超増加；５５倍増加；５５倍超増加；６０倍増加；６０倍超増加；６５倍増加；６５倍超増加；７０倍増加；７０倍超増加；７５倍増加；７５倍超増加；８０倍増加；８０倍超増加；８５倍増加；８５倍超増加；９０倍増加；９０倍超増加；９５倍増加；９５倍超増加；１００倍増加；１００倍超増加する。
【０１７５】
用語の「治療」は、予防および／または治療の処置を指すために使用される。
【０１７６】
本明細書の天然ではコードされないアミノ酸ポリペプチドは、天然に通常認められる原子質量または質量数とは異なる原子質量または質量数を有する原子で置換された１つまたは複数の原子を有する同位体標識化合物を含んでもよい。本発明の化合物化合物中に組み込み可能な同位体の例には、水素、炭素、窒素、酸素、フッ素および塩素の同位体、例えば、それぞれ、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、１７Ｏ、３５Ｓ、１８Ｆ、３６Ｃ１が含まれる。本明細書記載の特定の同位体標識化合物、例えば、放射性同位元素、例えば、３Ｈおよび１４Ｃが組み込まれた化合物は、薬剤および／または基質組織分布アッセイに有用となりうる。さらに、同位体、例えば、重水素、すなわち、２Ｈによる置換は、より大きな代謝安定性、例えば、インビボ半減期の増加または投与量要求の低減から生じる特定の治療上の利点を提供できる。
【０１７７】
限定されないが、ジアステレオマー、鏡像異性体、およびこれらの混合物を含む全ての異性体は、本明細書記載の組成物の一部と見なされる。追加の、またはさらなる実施形態では、天然ではコードされないアミノ酸ポリペプチドは、後で所望の治療効果を含む所望の効果を生み出すために使用される代謝物の産生が必要な生物に投与して、代謝される。追加の、またはさらなる実施形態は、天然ではコードされないアミノ酸ポリペプチドの活性代謝物である。
【０１７８】
一部の状況では、天然ではコードされないアミノ酸ポリペプチドは、互変異性体として存在してもよい。さらに、本明細書記載の天然ではコードされないアミノ酸ポリペプチドは、非溶媒和型として存在しても、薬学的に許容可能な溶剤、例えば、水、エタノール、等との溶媒和型として存在してもよい。溶媒和型も、また、本明細書で開示されているとみなされる。当業者は、本明細書の一部の化合物は、いくつかの互変異性型として存在可能であることに気付くであろう。全てのこのような互変異性型は、本明細書記載の組成物の一部であると見なされる。
【０１７９】
特段の指示がなければ、従来の質量分析、ＮＭＲ、ＨＰＬＣ、タンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術および薬理学の方法が、当業者の技能範囲内で、採用される。
【発明を実施するための形態】
【０１８０】
発明の詳細な説明
Ｉ．緒言
少なくとも１つの非天然アミノ酸を含むレラキシンポリペプチドが本発明で提供される。本発明の特定の実施形態では、少なくとも１つの非天然アミノ酸を有するレラキシンポリペプチドは、少なくとも１つの翻訳後修飾を含む。一実施形態では、少なくとも１つの翻訳後修飾が、限定されないが、下記を含む分子の結合を含む：標識、色素、ポリマー、水可溶性ポリマー、ポリエチレングリコール誘導体、光架橋剤、放射性核種、細胞障害性化合物、薬剤、親和標識、光親和標識、反応性化合物、樹脂、第２のタンパク質またはポリペプチドまたはポリペプチド類似体、抗体または抗体断片、金属キレート剤、補助因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスポリヌクレオチド、サッカライド、水可溶性デンドリマー、シクロデキストリン、抑制性リボ核酸、生体材料、ナノ粒子、スピン標識、フルオロフォア、金属含有成分、放射性成分、新規官能基、他の分子と共有結合または非共有結合で相互作用する基、フォトケージ化成分、光化学作用照射励起成分、光異性化可能な成分、ビオチン、ビオチン誘導体、ビオチン類似体、重原子組込み成分、化学的切断可能な基、光切断可能基、延長側鎖、炭素結合型糖、レドックス活性剤、アミノチオ酸、毒成分、同位体標識成分、生物物理学的プローブ、リン光基、化学発光基、高電子密度基、磁性基、インターカレート基、発色団、エネルギー遷移剤、生理活性物質、検出可能標識、小分子、量子ドット、ナノトランスミッター、放射性核種標識ヌクレオチド、放射性核種標識トランスミッター、中性子捕獲剤、もしくはいずれかの上記の組み合わせ、または、特定の反応基に適切であると当業者にわかる化学的方法を利用して少なくとも１つの第１の反応基を含む非天然アミノ酸に対する第２の反応基を含む、任意の他の望ましい化合物または物質。例えば、第１の反応基が、アルキニル成分（限定されないが、非天然アミノ酸の、プロパルギル基がアセチレン成分とも呼ばれることがあるｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニンを含む）であり、第２の反応基がアジド成分であり、［３＋２］付加環化化学方法が利用される。別の例では、第１の反応基は、アジド成分（限定されないが、非天然アミノ酸の、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンを含む）であり、第２の反応基がアルキニル成分である。特定の本発明の改変レラキシンポリペプチドの実施形態では、少なくとも１つの少なくとも１つの翻訳後修飾を含む非天然アミノ酸（限定されないが、ケト官能基を含む非天然アミノ酸を含む）が、使用され、この場合、少なくとも１つの翻訳後修飾は、サッカライド成分を含む。特定の実施形態では、翻訳後修飾は、インビボで真核細胞中で行われるか、または非真核細胞で行われる。リンカー、ポリマー、水溶性ポリマー、または他の分子は、その分子をポリペプチドに結合させることができる。分子は、直接ポリペプチドに結合してもよい。
【０１８１】
特定の実施形態では、タンパク質は、ある宿主細胞によりインビボで行われる少なくとも１つの翻訳後修飾を含み、その翻訳後修飾は、通常は、別の宿主細胞型によっては行われない。特定の実施形態では、タンパク質は、真核細胞によりインビボでおこなわれる少なくとも１つの翻訳後修飾を含み、その翻訳後修飾は、通常は、非真核細胞によっては行われない。翻訳後修飾の例には、限定されないが、グリコシル化、アセチル化、アシル化、脂質修飾、パルミチン酸化、パルミタート付加、リン酸化、糖脂質結合修飾、等が含まれる。
【０１８２】
一部の実施形態では、レラキシンポリペプチドは、ポリペプチドのグリコシル化、アセチル化、アシル化、脂質修飾、パルミチン酸化、パルミタート付加、リン酸化、または糖脂質結合修飾のための１つまたは複数の天然ではコードされないアミノ酸を含む。一部の実施形態では、レラキシンポリペプチドは、ポリペプチドのグリコシル化のための１つまたは複数の天然ではコードされないアミノ酸を含む。一部の実施形態では、レラキシンポリペプチドは、ポリペプチドのグリコシル化、アセチル化、アシル化、脂質修飾、パルミチン酸化、パルミタート付加、リン酸化、または糖脂質結合修飾のための１つまたは複数の天然でコードされるアミノ酸を含む。一部の実施形態では、レラキシンポリペプチドは、ポリペプチドのグリコシル化のための１つまたは複数の天然でコードされるアミノ酸を含む。
【０１８３】
一部の実施形態では、レラキシンポリペプチドは、ポリペプチドのグリコシル化を強化する１つまたは複数の天然ではコードされないアミノ酸付加および／または置換を含む。一部の実施形態では、レラキシンポリペプチドは、ポリペプチドのグリコシル化を強化する１つまたは複数の欠失を含む。一部の実施形態では、レラキシンポリペプチドは、ポリペプチド中の異なるアミノ酸のグリコシル化を強化する１つまたは複数の天然ではコードされないアミノ酸付加および／または置換を含む。一部の実施形態では、レラキシンポリペプチドは、ポリペプチド中の異なるアミノ酸のグリコシル化を強化する１つまたは複数の欠失を含む。一部の実施形態では、レラキシンポリペプチドは、ポリペプチドの天然ではコードされないアミノ酸のグリコシル化を強化する１つまたは複数の天然ではコードされないアミノ酸付加および／または置換を含む。一部の実施形態では、レラキシンポリペプチドは、ポリペプチド中の天然でコードされるアミノ酸のグリコシル化を強化する１つまたは複数の天然ではコードされないアミノ酸付加および／または置換を含む。一部の実施形態では、レラキシンポリペプチドは、ポリペプチド中の異なるアミノ酸のグリコシル化を強化する１つまたは複数の天然でコードされるアミノ酸付加および／または置換を含む。一部の実施形態では、レラキシンポリペプチドは、ポリペプチド中の天然でコードされるアミノ酸のグリコシル化を強化する１つまたは複数の天然ではコードされないアミノ酸付加および／または置換を含む。一部の実施形態では、レラキシンポリペプチドは、ポリペプチド中の天然ではコードされないアミノ酸のグリコシル化を強化する１つまたは複数の天然ではコードされないアミノ酸付加および／または置換を含む。
【０１８４】
一実施形態では、翻訳後修飾は、ＧｌｃＮＡｃ−アスパラギン結合によるオリゴ糖のアスパラギンへの結合を含む（限定されないが、オリゴ糖が（ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ）２−Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ、等を含む場合を含む）。別の実施形態では、翻訳後修飾は、オリゴ糖（限定されないが、Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ、等を含む）のＧａｌＮＡｃ−セリン、ＧａｌＮＡｃ−トレオニン、ＧｌｃＮＡｃ−セリン、またはＧｌｃＮＡｃ−トレオニン結合によるセリンまたはトレオニンへの結合を含む。特定の実施形態では、本発明のタンパク質またはポリペプチドは、分泌または局在化配列、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジンタグ、ＧＳＴ融合体、等を含んでもよい。分泌シグナル配列の例には、限定されないが、原核生物分泌シグナル配列、真核生物分泌シグナル配列、細菌発現向け５’−最適化真核生物分泌シグナル配列、新規分泌シグナル配列、ペクチン酸リアーゼ分泌シグナル配列、ＯｍｐＡ分泌シグナル配列、およびファージ分泌シグナル配列が含まれる。分泌シグナル配列の例には、限定されないが、ＳＴＩＩ（原核生物）、ＦｄＧＩＩＩおよびＭ１３（ファージ）、Ｂｇ１２（酵母）、ならびにトランスポゾン由来のシグナル配列ｂｌａ、が含まれる。いずれかのこのような配列は、限定されないが、１つのシグナル配列を異なるシグナル配列で置換、リーダー配列を異なるリーダー配列で置換、等の改変がなされて、ポリペプチドに所望の結果を提供できる。
【０１８５】
対象のタンパク質またはポリペプチドは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または１０以上の非天然アミノ酸を含んでもよい。非天然アミノ酸は、同じでも、または異なってもよく、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ超の異なる非天然アミノ酸を含むタンパク質中の、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ超の異なる部位であってもよい。特定の実施形態では、天然型のタンパク質中に存在する内の、全部よりも少ないが、少なくとも１つの特定のアミノ酸が、非天然アミノ酸で置換される。
【０１８６】
本発明は、少なくとも１つの天然ではコードされないアミノ酸を含むレラキシンをベースにした方法および組成物を提供する。少なくとも１つの天然ではコードされないアミノ酸のレラキシンへの導入により、限定されないが、共通２０アミノ酸とは反応しないが、１つまたは複数の天然ではコードされないアミノ酸との反応を含む、特異的化学反応を伴うコンジュゲーション化学の適用が可能となる。一部の実施形態では、天然ではコードされないアミノ酸を含むレラキシンは、天然ではコードされないアミノ酸の側鎖を介して、水溶性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に、連結される。本発明は、ＰＥＧ誘導体によるタンパク質の選択的改変のための高度に効率的な方法を提供し、この方法は、限定されないが、２０天然に組み込まれたアミノ酸中には認められない官能基または置換基（限定されないが、ケトン、アジドまたはアセチレン成分）を含むアミノ酸等の遺伝的にコードされないアミノ酸の、セレクターコドンに応答した、タンパク質中への選択的組み込み、およびその後のこれらのアミノ酸の適切な反応性ＰＥＧ誘導体による改変を含む。一旦組み込まれると、アミノ酸側鎖は、天然ではコードされないアミノ酸中に存在する特定の官能基または置換基に対し適切な、当業者には既知の化学的方法を利用することにより改変できる。既知の広範囲の化学的方法は、水溶性ポリマーをタンパク質中に組み込むための本発明での使用に適している。このような方法には、限定されないが、限定されないが、それぞれアセチレンまたはアジド誘導体等を使った、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化反応が含まれる（例えば、Ｐａｄｗａ、Ａ．、総合有機合成（Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、Ｖｏｌ．４、（１９９１）Ｅｄ．Ｔｒｏｓｔ、Ｂ．Ｍ．、Ｐｅｒｇａｍｏｎ、Ｏｘｆｏｒｄ、ｐ．１０６９−１１０９；およびＨｕｉｓｇｅｎ、Ｒ．  、１、３−双極子付加環化（Ｄｉｐｏｌａｒ  Ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ）、（１９８４）Ｅｄ．Ｐａｄｗａ、Ａ．、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐ．１−１７６、を参照）。
【０１８７】
Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化方法は、求核置換反応よりはむしろ、付加環化を伴うので、タンパク質は、極端に高い選択性で改変できる。この反応は、室温の水性の条件下、触媒量のＣｕ（Ｉ）塩の反応混合物への添加により、優れた位置選択性（１、４＞１、５）で実行できる。例えば、Ｔｏｒｎｏｅ、ｅｔ  ａｌ．、（２００２）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６７：３０５７−３０６４；および、Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖ、ｅｔａｌ．、（２００２）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４１：２５９６−２５９９；および国際公開第０３／１０１９７２号、を参照されたい。［３＋２］付加環化により本発明のタンパク質に付加できる分子には、限定されないが、アジドまたはアセチレン誘導体を含む実質的に適切な官能基または置換基を有するいずれかの分子が含まれる。これらの分子は、それぞれ、限定されないがｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニンを含むアセチレン基、または限定されないがｐ−アジド−フェニルアラニンを含むアジド基、を有する非天然アミノ酸に付加できる。
【０１８８】
Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化から得られる５員環は、通常は、還元環境中で可逆的ではなく、水性環境下で長時間、加水分解に対し安定である。結果的に、各種物質の物理的および化学的特性は、厳しい水性の条件下で、本発明の活性ＰＥＧ誘導体を使って、変更できる。またさらに重要なことに、アジドおよびアセチレン成分は相互に特異的（しかも、例えば、遺伝的にコードされた２０共通アミノ酸のいずれとも反応しない）であるため、タンパク質は、１つまたは複数の特異的部位で、極端に高い選択性で改変できる。
【０１８９】
本発明は、また、１つまたは複数のアセチレンまたはアジド成分を有するＰＥＧ誘導体および関連親水性高分子の水溶性かつ加水分解的に安定な誘導体を提供する。アセチレン成分を有するＰＥＧポリマー誘導体は、セレクターコドンに応答してタンパク質に選択的に導入されたアジド成分との結合に対し高度に選択的である。同様に、アジド成分を含むＰＥＧポリマー誘導体は、セレクターコドンに応答してタンパク質に選択的に導入されたアセチレン成分との結合に対し、高度に選択的である。
【０１９０】
さらに具体的には、アジド成分は、限定されないが、アルキルアジド、アリールアジドおよびこれらのアジドの誘導体を含む。アルキルおよびアリールアジドの誘導体は、アセチレン特異的反応性が維持される限り、他の置換基を含んでもよい。アセチレン成分は、アルキルおよびアリールアセチレン、およびそれぞれの誘導体を含む。アルキルおよびアリールアセチレンの誘導体は、アジド特異的反応性が維持される限り、他の置換基を含んでもよい。
【０１９１】
本発明は、各種の官能基、置換基または成分を有する物質と、限定されないが、次のものを含む他の物質とのコンジュゲートを提供する：標識；色素；ポリマー；水可溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；放射性核種；細胞障害性化合物；薬剤；親和標識；光親和標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質またはポリペプチドまたはポリペプチド類似体；抗体または抗体断片；金属キレート剤；補助因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；サッカライド；水可溶性デンドリマー；シクロデキストリン；抑制性リボ核酸；生体材料；ナノ粒子；スピン標識；フルオロフォア、金属含有成分；放射性成分；新規官能基；共有結合でまたは非共有結合で他の分子と相互作用する基；フォトケージ化成分；光化学作用照射励起性成分；光異性化可能な成分；ビオチン；ビオチン誘導体；ビオチン類似体；重原子を組み込んだ成分；化学的切断可能な基；光切断可能基；延長側鎖；炭素結合型糖；レドックス活性剤；アミノチオ酸；毒成分；同位体標識成分；生物物理学的プローブ；リン光基；化学発光基；高電子密度基；磁性基；インターカレート基；発色団；エネルギー遷移剤；生理活性物質；検出可能標識；小分子；量子ドット；ナノトランスミッター；放射性核種標識ヌクレオチド；放射性核種標識トランスミッター；中性子捕獲剤；もしくはいずれかの上記の組み合わせ、またはいずれかの他の望ましい化合物または物質。本発明は、また、アジドまたはアセチレン成分を有する物質と、対応するアセチレンまたはアジド成分を有するＰＥＧポリマー誘導体とのコンジュゲートを含む。例えば、アジド成分を含むＰＥＧポリマーは、遺伝的にコードされないアミノ酸を有するタンパク質中の位置のアセチレン官能性を有する生物学的に活性な分子に結合できる。ＰＥＧおよび生物学的に活性な分子が連結される結合には、限定されないが、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化生成物が含まれる。
【０１９２】
ＰＥＧが、生体材料の表面を改質するために使用できることは、当技術分野で充分確立されている（例えば、米国特許第６，６１０，２８１号；Ｍｅｈｖａｒ、Ｒ．、Ｊ．Ｐｈａｒｍ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．、３（１）：１２５−１３６（２０００）を参照。これらの文献は、参照によって本明細書に組み込まれる）。本発明は、また、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化結合を介して表面に結合した１つまたは複数の反応性アジドまたはアセチレン部位および１つまたは複数の本発明のアジドまたはアセチレン含有ポリマーを有する表面を含む生体材料を含む。生体材料および他の物質は、また、アジドまたはアセチレン結合以外の結合によって、例えば、カルボン酸、アミン、アルコールまたはチオール成分を含む結合によってアジドまたはアセチレン活性化ポリマー誘導体に結合し、その後の反応で利用できるアジドまたはアセチレン成分を残すことができる。
【０１９３】
本発明は、本発明のアジドおよびアセチレン含有ポリマーの合成方法を含む。アジド含有ＰＥＧ誘導体の場合には、アジドは、ポリマーの炭素原子に直接結合できる。あるいは、アジド含有ＰＥＧ誘導体は、１つの末端にアジド成分を有する連結剤を従来法の活性化ポリマーに結合させ、それにより、得られたポリマーの末端にアジド成分を持たせることにより調製できる。アセチレン含有ＰＥＧ誘導体の場合には、アセチレンを、ポリマーの炭素原子に直接結合させることができる。あるいは、アセチレン含有ＰＥＧ誘導体は、１つの末端にアセチレン成分を有する連結剤を従来法の活性化ポリマーに結合させ、それにより、得られたポリマーの末端にアセチレン成分を持たせることにより調製できる。
【０１９４】
さらに具体的には、アジド含有ＰＥＧ誘導体の場合には、少なくとも１つの活性ヒドロキシル成分を有する水溶性ポリマーが反応して、さらに反応性の高い成分、例えば、メシラート、トレシラート、トシラートまたはハロゲン脱離基、を有する置換ポリマーを生成する。ハロゲン化スルホニル酸、ハロゲン原子および他の脱離基含有ＰＥＧ誘導体の調製と使用は、当業者には既知である。得られた置換ポリマーは、次に、反応して、ポリマーの末端でより反応性の高い成分をアジド成分に置換する。あるいは、少なくとも１つの活性求核または求電子成分を有する水溶性ポリマーが末端にアジドを有する連結剤と反応してＰＥＧポリマーと連結剤の間で共有結合を形成し、アジド成分がポリマーの末端に配置される。アミン、チオール類、ヒドラジド、ヒドラジン、アルコール、カルボキシラート、アルデヒド、ケトン、チオエステルチオエステル、等の求核および求電子成分が、当業者には知られている。
【０１９５】
さらに具体的には、アセチレン含有ＰＥＧ誘導体の場合には、少なくとも１つの活性ヒドロキシル成分を有する水溶性ポリマーが反応して、アセチレン成分を含む前駆物質からハロゲンまたは他の活性化脱離基を置換する。あるいは、少なくとも１つの活性求核または求電子成分を有する水溶性ポリマーが末端にアセチレンを有する連結剤と反応し、ＰＥＧポリマーと連結剤の間に共有結合を形成して、アセチレン成分がポリマーの末端におかれる。有機合成に関するハロゲン成分、活性化脱離基、求核および求電子成分の使用と調製、ならびにＰＥＧ誘導体の使用は、当技術分野の実務担当者の間では充分に確立されている。
【０１９６】
本発明は、また、他の物質の付加によるタンパク質の選択的改変を行い、改変タンパク質に変える方法を提供し、この物質には、限定されないが、水溶性ポリマー、例えば、アジドまたはアセチレン成分を含むＰＥＧおよびＰＥＧ誘導体が含まれる。アジドおよびアセチレン含有ＰＥＧ誘導体は、表面および分子の特性を改変するために使用できる。この表面および分子の特性の改変は、生体適合性、安定性、溶解度および免疫原性低減にとって重要であり、また一方で、当技術分野で従来既知のものよりＰＥＧ誘導体のタンパク質との結合に対する選択性の高い手段を提供する。
【０１９７】
本発明で使用する組換え核酸の一般的作製方法
多くの本発明の実施形態では、対象レラキシンポリペプチドをコードする核酸は、単離され、クローン化され、また、しばしば組換え方法を使って改変される。このような実施形態は、限定されないが、タンパク質発現のため、または変異体、誘導体、発現カセット、またはレラキシンポリペプチド由来の他の配列の生成の間等に、使用される。一部の実施形態では、本発明のポリペプチドをコードする配列は、異種のプロモーターに機能的に連結されている。
【０１９８】
レラキシンポリペプチドをコードする天然ではコードされないアミノ酸を含むヌクレオチド配列は、限定されないが、配列番号１および配列番号２で示されるアミノ酸配列を有し、効果関連アミノ酸残基の挿入（すなわち、組み込みまたは置換）または除去（すなわち、欠失または置換）を起こさせるようにヌクレオチド配列を変える、等により、親ポリペプチドのアミノ酸配列をベースに合成できる。ヌクレオチド配列は、従来法の部位特異的変異誘発により都合よく改変できる。あるいは、ヌクレオチド配列は、限定されないが、オリゴヌクレオチドシンセサイザーを使う等の化学合成により調製でき、この場合、オリゴヌクレオチドが所望のポリペプチドのアミノ酸配列に基づき設計され、好ましくは、組換えポリペプチドが産生される宿主細胞に適したコドンが選択される。
【０１９９】
本発明は、組換え遺伝学の分野のルーチン技術を利用する。本発明で使用される一般的方法を開示する基本的な内容は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、分子クローニング、実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃ１ｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）（３ｒｄ  ｅｄ．２００１）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、遺伝子導入と発現：実験マニュアル（Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）（１９９０）；および、分子生物学における最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、ｅｄｓ．、１９９４））、に含まれる。
【０２００】
分子生物学的技術を記載する一般的な内容は、Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｒｎｅｌ、分子クローニング技術ガイド、酵素学による方法（Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃ１ｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、ｖｏｌｕｍｅ  １５２  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、分子クローニング、実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃ１ｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）（２ｎｄ  Ｅｄ．）、Ｖｏｌ．１−３、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）および分子生物学における最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、ｅｄｓ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、（１９９９から追補）（「Ａｕｓｕｂｅｌ」））、に含まれる。これらの文献は、変異誘発、ベクター、プロモータの使用および、限定されないが、非天然アミノ酸、直交ｔＲＮＡ、直交性シンテターゼ、およびそれらの対を含むタンパク質の産生用セレクターコドンを含む遺伝子またはポリヌクレオチドの生成、等に関連した多くの関連トピックスについて記載している。
【０２０１】
限定されないが、新規シンテターゼまたはｔＲＮＡを産生するため、ｔＲＮＡ分子を変異させるため、シンテターゼをコードするポリヌクレオチドを変異させるため、ｔＲＮＡのライブラリー構築のため、シンテターゼのライブラリー構築のため、セレクターコドン生成のため、対象タンパク質またはポリペプチド中に非天然アミノ酸をコードするセレクターコドンを挿入するため、等の種々の目的のために、種々の型の変異誘発が本発明で使用される。これらには、限定されないが、部位特異的、ランダム点変異誘発、相同組換え、ＤＮＡシャフリングまたは他の再帰的変異誘発、キメラ構築、ウラシル含有テンプレート使用変異誘発、オリゴヌクレオチド指定変異誘発、ホスホロチオエート改変ＤＮＡ変異誘発、ギャップ二重鎖ＤＮＡ等使用変異誘発、ＰＣＴ媒介変異誘発、またはこれらのいずれかの組み合わせが含まれる。さらなる適切な方法には、ポイントミスマッチ修復、修復欠損宿主株使用変異誘発、制限選択および制限精製、欠失変異誘発、全遺伝子合成による変異誘発、二重鎖切断修復、等が含まれる。限定されないが、キメラ構築物を含む変異誘発もまた、本発明に含まれる。一実施形態では、変異誘発は、限定されないが、配列、配列比較、物理学的性質、２次、３次、４次構造、結晶構造、等の天然分子または改変もしくは変異天然分子の既知の情報により導かれうる。
【０２０２】
本明細書で認められる説明と例は、これらの手続きを記載している。追加の情報は、下記の出版物およびそこに引用された文献から見付けられる：Ｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、ＤＮＡ変異誘発方法（Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ＤＮＡ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）；概説（ｏｖｅｒｖｉｅｗ）、ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ．２５４（２）：１５７−１７８（１９９７）；Ｄａｌｅｅｔａｌ．、ホスホロチオエート法を使ったオリゴヌクレオチド指定ランダム変異誘発（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｍｅｔｈｏｄ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５７：３６９−３７４（１９９６）；Ｓｍｉｔｈ、インビトロ変異誘発（Ｉｎｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｇｅｎｅｔ．１９：４２３−４６２（１９８５）；Ｂｏｔｓｔｅｉｎ  ＆  Ｓｈｏｒｔｌｅ、インビトロ変異誘発の戦略と応用（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｎｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１１９３−１２０１（１９８５）；Ｃａｒｔｅｒ、部位特異的変異誘発（Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３７：１−７（１９８６）；Ｋｕｎｋｅｌ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、Ｆ、ａｎｄ  Ｌｉｌｌｅｙ、Ｄ．Ｍ．Ｊ．ｅｄｓ．、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ）（１９８７）中の、オリゴヌクレオチド定方向変異誘発の効率（Ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）；Ｋｕｎｋｅｌ、表現型の選択を伴わない迅速および効率的部位特異的変異誘発（Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８−４９２（１９８５）；Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、表現型の選択を伴わない迅速および効率的部位特異的変異誘発（Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）、酵素学による方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ）、１５４、３６７−３８２（１９８７）；Ｂａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．、新規ＤＮＡ結合特異性を有する変異Ｔｒｐサプレッサー（Ｍｕｔａｎｔ  Ｔｒｐｒｅｐｒｅｓｓｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ｎｅｗＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：２４０−２４５（１９８８）；Ｚｏｌｌｅｒ＆Ｓｍｉｔｈ、Ｍ１３由来ベクターを使ったオリゴヌクレオチド指定変異誘発：任意のＤＮＡ断片中の点変異の産生のための効率的および一般的手法（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｍ１３−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ：ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａｎｙ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：６４８７−６５００（１９８２）；Ｚｏｌｌｅｒ  ＆  Ｓｍｉｔｈ、Ｍ１３ベクターに挿入されたＤＮＡ断片のオリゴヌクレオチド指定変異誘発、酵素学による方法（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｃｌｏｎｅｄ  ｉｎｔｏ  Ｍ１３  ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ）、１００：４６８−５００（１９８３）；Ｚｏｌｌｅｒ  ＆  Ｓｍｉｔｈ、オリゴヌクレオチド指定変異誘発：２つのオリゴヌクレオチドプライマーおよび単鎖ＤＮＡテンプレートを使った簡便法、酵素学による方法（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｕｓｉｎｇ  ｔｗｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｉｍｅｒｓ  ａｎｄ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ  ｔｅｍｐｌａｔｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ）．１５４：３２９−３５０（１９８７）；Ｔａｙｌｏｒｅｔａｌ、制限酵素反応におけるニックの入ったＤＮＡ調製のためのホスホロチオエート修飾ＤＮＡの使用（Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｐｒｅｐａｒｅ  ｎｉｃｋｅｄ  ＤＮＡ）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：８７４９−８７６４（１９８５）；Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡを使ったオリゴヌクレオチド指定変異の高頻度迅速生成（Ｔｈｅ  ｒａｐｉｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｔ  ｈｉｇｈ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｕｓｉｎｇ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＤＮＡ）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：８７６５−８７８５（１９８５）；Ｎａｋａｍａｙｅ  ＆  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、ホスホロチオエート基による制限エンドヌクレアーゼＮｃｉ  Ｉ切断の抑制およびオリゴヌクレオチド指定変異誘発への適用（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｎｃｉ  Ｉ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｂｙ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｇｒｏｕｐｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：９６７９−９６９８（１９８６）；Ｓａｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．、ホスホロチオエートベースオリゴヌクレオチド指定変異誘発における５’−３’エキソヌクレアーゼ（５’−３’Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：７９１−８０２（１９８８）；Ｓａｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．、臭化エチジウムの存在下の制限エンドヌクレアーゼとの反応によるホスホロチオエート含有ＤＮＡの鎖特異的切断（Ｓｔｒａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｐｈ���ｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ＤＮＡ  ｂｙ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）、（１９８８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：８０３−８１４；Ｋｒａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、オリゴヌクレオチド指定変異形成向けギャップ二重鎖ＤＮＡ手法（Ｔｈｅ  ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）、Ｎｕｃｌ、Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：９４４１−９４５６（１９８４）；Ｋｒａｍｅｒ  ＆  Ｆｒｉｔｚ、ギャップ二重鎖ＤＮＡを介したオリゴヌクレオチド指定変異形成、酵素学による方法（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｖｉａ  ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ）．１５４：３５０−３６７（１９８７）；Ｋｒａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、オリゴヌクレオチド指定変異形成向けギャップ二重鎖ＤＮＡ手法における改良酵素インビトロ反応（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｉｎｖｉｔｒｏ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：７２０７（１９８８）；Ｆｒｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．、オリゴヌクレオチド指定変異形成：インビトロ酵素反応を使わないギャップ二重鎖ＤＮＡ法（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ：ａ  ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎｖｉｔｒｏ）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：６９８７−６９９９（１９８８）；Ｋｒａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、大腸菌のメチル指定ＤＮＡミスマッチ修復系により、異なる塩基／塩基ミスマッチが異なる効率で修正される（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｂａｓｅ／ｂａｓｅ  ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ  ａｒｅ  ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｍｅｔｈｙｌ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ＤＮＡ  ｍｉｓｍａｔｃｈ−ｒｅｐａｉｒ  ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｃｅｌｌ  ３８：８７９−８８７（１９８４）；Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ、Ｍ１３ベクターを使った改良オリゴヌクレオチド部位指定変異誘発（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｍ１３  ｖｅｃｔｏｒｓ）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：４４３１−４４４３（１９８５）；Ｃａｒｔｅｒ、Ｍ１３ベクターを使った改良オリゴヌクレオチド指定変異誘発、酵素学による方法（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｍｌ３  ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ）．１５４：３８２−４０３（１��８７）；Ｅｇｈｔｅｄａｒｚａｄｅｈ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、大きな欠失を生成するためのオリゴヌクレオチドの使用（Ｕｓｅ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｔｏ  ｇｅｎｅｒａｔｅ  ｌａｒｇｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：５１１５（１９８６）；Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．、スブチリシンの遷移状態を安定化における水素結合形成の重要性（Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｂｏｎｄ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｓｔａｔｅ  ｏｆ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）、Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ、Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ａ３１７：４１５−４２３（１９８６）；Ｎａｍｂｉａｒ  ｅｔ  ａｌ．、リボヌクレアーゼＳタンパク質をコードする遺伝子の全合成およびクローニング（Ｔｏｔａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅ  ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２３：１２９９−１３０１（１９８４）；Ｓａｋｍａｒ  ａｎｄ  Ｋｈｏｒａｎａ、ウシ桿体外節グアニンヌクレオチド結合タンパク質（トランスデューシン）のアルファサブユニットに対する遺伝子の全合成および発現（Ｔｏｔａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｌｐｈａ−ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  ｒｏｄ  ｏｕｔｅｒ  ｓｅｇｍｅｎｔ  ｇｕａｎｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎ））、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：６３６１−６３７２（１９８８）；Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．、カセット変異導入：指定部位での複数変異生成のための効率的方法（Ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｔ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｉｔｅｓ）、Ｇｅｎｅ  ３４：３１５−３２３（１９８５）；Ｇｒｕｎｄｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．、微小規模「ショットガン」遺伝子合成によるオリゴヌクレオチド指定変異誘発
（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ  ’ｓｈｏｔ−ｇｕｎ’  ｇｅｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３３０５−３３１６（１９８５）；Ｍａｎｄｅｃｋｉ、大腸菌プラスミド中のオリゴヌクレオチド指定二重鎖切断修復：部位特異的変異誘発法（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋ  ｒｅｐａｉｒ  ｉｎ  ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８３：７１７７−７１８１（１９８６）；Ａｒｎｏｌｄ、特異な環境に対するタンパク質工学（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｕｎｕｓｕａｌ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、４：４５０−４５５（１９９３）；Ｓｉｅｂｅｒ、ｅｔａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９：４５６−４６０（２００１）；Ｗ．Ｐ．Ｃ．Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  ３７０、３８９−９１（１９９４）；および、Ｉ．Ａ．Ｌｏｒｉｍｅｒ、Ｉ．Ｐａｓｔａｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３、３０６７−８（１９９５）。上記方法の中の多くに対する追加の詳細は、酵素学による方法、Ｖｏｌｕｍｅ１５４、で見つけることができる。これには、また、種々の変異誘発法に伴うトラブルシューティング問題に対する有用な制御手段を記載している。
【０２０３】
例えば、本発明の変異誘発、例えば、シンテターゼの変異ライブラリー、またはｔＲＮＡの改変、に使用するためのオリゴヌクレオチドは、通常、例えば、Ｎｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１２：６１５９−６１６８（１９８４）に記載の自動化シンセサイザーを使って、Ｂｅａｕｃａｇｅ  ａｎｄ  Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｓ．２２（２０）：１８５９−１８６２、（１９８１）に記載されている固相ホスホラミダイトトリエステル法により化学的に合成される。
【０２０４】
本発明は、また、真核生物宿主細胞、非真核生物宿主細胞、および直交ｔＲＮＡ／ＲＳ対を介した、非天然アミノ酸のインビボ組み込み用の生物に関する。宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチド、限定されないが、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであってもよい本発明のベクター等を含む本発明のポリヌクレオチドまたは構築物で、遺伝的に操作（限定されないが、形質転換、形質導入、または形質移入、を含む）されている。例えば、直交ｔＲＮＡ、直交ｔＲＮＡシンテターゼのコーディング領域、および誘導体化されるタンパク質は、所望の宿主細胞中で機能する遺伝子発現調節領域に機能的に連結される。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、バクテリア、ウイルス、裸のポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチドコンジュゲートの形であってもよい。ベクターは、細胞および／または微生物中に、次記を含む標準的な方法で導入される：電気穿孔（Ｆｒｏｍｍ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２、５８２４（１９８５））、ウイルスベクターによる感染、小ビーズまたは粒子のマトリックス中または表面上に核酸を含む小粒子を使った高速弾道貫入（Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３２７、７０−７３（１９８７））、等。核酸を細胞中へインビトロで導入する適切な技術には、リポソーム、微量注入、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法、等の使用が含まれる。インビボ遺伝子導入技術には、限定されないが、ウイルス（通常、レトロウイルス）ベクターを使ったトランスフェクションおよびウィルスコートタンパク質リポソーム媒介トランスフェクションが含まれる［Ｄｚａｕ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：２０５−２１０（１９９３）］。一部の状況では、細胞表面膜タンパク質または標的細胞特異的抗体、標的細胞上の受容体に対するリガンド、等の標的細胞をターゲットとする薬剤を含む核酸ソースを提供することが望ましい場合もある。リポソームが採用される場合には、ターゲティングのため、および／または取込を促進するために、エンドサイトーシスに関与する細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質が使用できる。このタンパク質としては、例えば、特定細胞型指向性カプシドタンパク質またはその断片、循環で内部移行するタンパク質に対する抗体、細胞内の局在部位を標的とし、細胞内半減期を延長するタンパク質、等がある。
【０２０５】
操作された宿主細胞は、例えば、選別ステップ、プロモーターの活性化または形質転換体の選択、等の作用に適切となるように改良された通常の栄養素培地中で培養できる。これらの細胞は、任意選択で、形質転換体中で培養してもよい。他の有用な文献には、限定されないが、細胞単離および培養に対して（例えば、その後の核酸単離のために）下記が含まれる：Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）動物細胞の培養、基本技術マニュアル（Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ、ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）、第３版、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋおよびそこに引用された文献；Ｐａｙｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）植物細胞および液体系中での組織培養（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｇａｍｂｏｒｇ  ａｎｄ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ（ｅｄｓ．）（１９９５）植物細胞、組織および器官培養（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）およびＡｔｌａｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｋｓ（ｅｄｓ．）微生物培地ハンドブック（Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ）（１９９３）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、ＦＬ。
【０２０６】
いくつかのよく知られた標的核酸を細胞中に導入する方法が利用可能であり、その内のいずれも本発明で使用できる。これらには、：レシピエント細胞のＤＮＡ含有細菌プロトプラストとの融合体、電気穿孔、微粒子銃、およびウイルスベクターによる感染（後でさらに考察）、等が含まれる。細菌細胞は、本発明のＤＮＡ構築物を含むプラスミドの数を増幅するために使用できる。細菌は、対数期まで成長し、細菌中のプラスミドは、当技術分野で既知の種々の方法で単離できる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ参照）。さらに、細菌からプラスミドを精製するキットが市販されている（例えば、ＥａｓｙＰｒｅｐ（登録商標）、ＦｌｅｘｉＰｒｅｐ（登録商標）、＜両方共Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ＞；ＳｔｒａｔａＣ１ｅａｎ（登録商標）＜Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ＞；および、ＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）＜Ｑｉａｇｅｎ＞を参照）。単離および精製プラスミドは、次に、さらに操作されて他のプラスミドを生成し、細胞に形質移入するために使用されるか、または生物に感染させるために関連ベクター中に組み込まれる。典型的ベクターは、転写および翻訳ターミネーター、転写および翻訳開始配列、ならびに特定の標的核酸の発現調節に有用なプロモーターを含む。ベクターは、任意選択で、少なくとも１つの独立したターミネーター配列、真核生物もしくは原核生物または両方でカセットの複製を可能とする配列（限定されないが、シャトルベクターを含む）および原核生物および真核生物系両方用の選択マーカーを含む遺伝子発現カセットを含む。ベクターは、原核生物、真核生物、または両方中での複製および組込みに適している。Ｇｉｌｌａｍ  ＆  Ｓｍｉｔｈ、Ｇｅｎｅ  ８：８１（１９７９）；Ｒｏｂｅｒｔｓ、ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３２８：７３１（１９８７）；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ、Ｅ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．６（１）：１０−１４（１９９５）；Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｂｅｒｇｅｒ（全て、前出）を参照されたい。クローニングに有用な細菌およびバクテリオファージのカタログは、例えば、ＡＴＣＣにより、例えば、細菌およびバクテリオファージのＡＴＣＣカタログ（Ｔｈｅ  ＡＴＣＣ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ）（１９９２）Ｇｈｅｒｎａ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ）ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ＡＴＣＣ、として提供されている。追加のシーケンシング、クローニングおよび他の分子生物学の態様のための基本的方法ならびに基礎理論的考察は、また、Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）組換えＤＮＡ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ）Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、ＮＹ、で見つけられる。さらに、基本的にいずれの核酸（および、標準品でも、非標準品でも、実質的にいずれの標識核酸でも）も、種々の市販業者、例えば、Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｄｌａｎｄ、ＴＸ：Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂのｍｃｒｃ．ｃｏｍから利用可能）、Ｔｈｅ  Ｇｒｅａｔ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒａｍｏｎａ、ＣＡ：Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂのｇｅｎｃｏ．ｃｏｍから利用可能）、ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ  Ｉｎｃ．（Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ：Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂのｅｘｐｒｅｓｓｇｅｎ．ｃｏｍから利用可能）、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）およびその他の多くの業者のいずれかにカスタムオーダー、または標準的オーダーができる。
【０２０７】
セレクターコドン
本発明のセレクターコドンは、タンパク質生合成機構の遺伝子コドンフレームワークを拡張する。例えば、セレクターコドンは、限定されないが、ユニーク３塩基コドン、ナンセンスコドン、例えば、限定されないが、アンバーコドン（ＵＡＧ）、オーカーコドンまたはオパールコドン（ＵＧＡ）等の停止コドン、非天然コドン、４つ以上の塩基コドン、レアコドン、等を含む。所望の遺伝子またはポリヌクレオチド中に導入可能なセレクターコドンの数は、限定されないが、少なくとも一部のレラキシンポリペプチドをコードする単一ポリヌクレオチド中の、１つ以上、２つ以上、３つ以上、４、５、６、７、８、９、１０以上を含む広範囲に及ぶことは、当業者には容易に明らかである。また、所望の遺伝子またはポリヌクレオチド中に導入可能なセレクターコドンの数は、限定されないが、少なくとも一部のレラキシンポリペプチドをコードするＡ鎖およびＢ鎖ポリヌクレオチド中の、１つ以上、２つ以上、３つ以上、４、５、６、７、８、９、１０以上の合計数を含む広範囲に及ぶことは、当業者には容易に明らかである。
【０２０８】
一実施形態では、方法は、１つまたは複数の非天然アミノ酸のインビボ組み込みのための停止コドンであるセレクターコドンの使用を含む。例えば、限定されないが、ＵＡＧを含む停止コドンを認識するＯ−ｔＲＮＡが産生され、所望の非天然アミノ酸を使ってＯ−ＲＳによりアミノアシル化される。このＯ−ｔＲＮＡは、天然宿主のアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼには認識されない。通常の部位特異的変異誘発は、対象ポリペプチドの対象部位に、限定されないが、ＴＡＧを含む停止コドンを導入するために使用できる。例えば、Ｓａｙｅｒｓ、Ｊ．Ｒ．、ｅｔ  ａｌ．（１９８８）、ホスホロチオエートベースオリゴヌクレオチド指定変異誘発における５’−３’エキソヌクレアーゼ（５’−３’Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ、１６：７９１−８０２、を参照されたい。Ｏ−ＲＳ、Ｏ−ｔＲＮＡおよび対象ポリペプチドをコードする核酸が、インビボで組み合わされる場合、非天然アミノ酸が、ＵＡＧコドンに応答して組み込まれ、指定位置に非天然アミノ酸を含むポリペプチドが生成する。
【０２０９】
非天然アミノ酸のインビボ組み込みは、真核生物宿主細胞の大きな変化もなく実行できる。例えば、ＵＡＧコドンに対する抑制効率は、限定されないが、アンバーサプレッサーｔＲＮＡを含むＯ−ｔＲＮＡ、および真核生物終結因子（限定されないが、ｅＲＦを含む）（これが停止コドンに結合し、成長しているペプチドのリボソームからの放出を開始する）の間の競合に依存するため、抑制効率は、限定されないが、Ｏ−ｔＲＮＡの発現レベル、および／またはサプレッサーｔＲＮＡの増加により調節できる。
【０２１０】
非天然アミノ酸は、また、レアコドンでコードすることもできる。例えば、インビトロタンパク質合成反応でのアルギニン濃度が低い場合、レアアルギニンコドンのＡＧＧが、アラニンでアシル化された合成ｔＲＮＡによるＡｌａの挿入に対し、効果的であるとわかる。例えば、Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３２：７９３９（１９９３）を参照されたい。このケースでは、合成ｔＲＮＡは、マイナーな大腸菌種として存在する天然ｔＲＮＡＡｒｇと競合する。一部の生物は、全てのトリプレットコドンは使わない。ミクロコッカスルテウスの未割り付けコドンＡＧＡは、インビトロ転写／翻訳抽出物中へのアミノ酸の挿入に利用されている。例えば、Ｋｏｗａｌ  ａｎｄ  Ｏｌｉｖｅｒ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．、２５：４６８５（１９９７）を参照されたい。本発明の成分は、これらのレアコドンをインビボで使って生成できる。
【０２１１】
セレクターコドンは、また、拡張コドン、限定されないが、４以上の塩基コドン、例えば、４、５、６、または７以上の塩基コドンを含む。４塩基コドンの例には、限定されないが、ＡＧＧＡ、ＣＵＡＧ、ＵＡＧＡ、ＣＣＣＵ、等が含まれる。５塩基コドンの例には、限定されないが、ＡＧＧＡＣ、ＣＣＣＣＵ、ＣＣＣＵＣ、ＣＵＡＧＡ、ＣＵＡＣＵ、ＵＡＧＧＣ、等が含まれる。本発明の特徴には、フレームシフト抑制に基づく拡張コドンの使用が含まれる。４以上の塩基コドンは、限定されないが、ひとつまたは複数の非天然アミノ酸、等を同じタンパク質中に挿入できる。例えば、限定されないが、アンチコドンループ、例えば、少なくとも８〜１０ｎｔアンチコドンループを有する特異的フレームシフトサプレッサーｔＲＮＡ、等の変異Ｏ−ｔＲＮＡの存在下、４以上の塩基コドンが単一アミノ酸として読み取られる。他の実施形態では、アンチコドンループは、限定されないが、少なくとも４塩基コドン、少なくとも５塩基コドン、または少なくとも６塩基コドン以上等をデコードできる。２５６の可能な４塩基コドンが存在するので、４以上の塩基コドンを使って同じ細胞中で複数の非天然アミノ酸をコードできる。Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、（２００２）コドンおよびアンチコドンサイズ限界の探索（Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｌｉｍｉｔｓ  ｏｆ  Ｃｏｄｏｎ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｃｏｄｏｎ  Ｓｉｚｅ）、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、９：２３７−２４４；Ｍａｇｌｉｅｒｙ、（２００１）遺伝暗号の拡張：４塩基コドンの効率的サプレッサーの選択と大腸菌のライブラリー手法を使った「シフトしやすい（Ｓｈｉｆｔｙ）」４塩基コドンの特定（Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ：Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ  ｏｆ  Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ  Ｃｏｄｏｎｓ  ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  “Ｓｈｉｆｔｙ”  Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ  Ｃｏｄｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、Ｊ．Ｍｏｌ、Ｂｉｏｌ．３０７：７５５−７６９、を参照されたい。
【０２１２】
例えば、４塩基コドンは、非天然アミノ酸を、インビトロ生合成法を使ってタンパク質中に組み込むのに使用されている。例えば、Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３２：７９３９；およびＨｏｈｓａｋａ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ．、１２１：３４、を参照されたい。ＣＧＧＧおよびＡＧＧＵは、２−ナフチルアラニンおよびリシンのＮＢＤ誘導体をストレプトアビジン中に、２つの化学的アシル化フレームシフトサプレッサーｔＲＮＡを使って、インビトロで同時に組み込むのに使用された。例えば、Ｈｏｈｓａｋａ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ．、１２１：１２１９４、を参照されたい。インビボ調査で、Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．は、ＮＣＵＡアンチコドンを有するｔＲＮＡＬｅｕ誘導体のＵＡＧＮコドンを抑制する能力を調べ（Ｎは、Ｕ、Ａ、Ｇ、またはＣであってよい）、４つ組みＵＡＧＡは、ＵＣＵＡアンチコドンを有するｔＲＮＡＬｅｕにより、１３〜２６％の効率で、０または−１フレームでのデコードがほとんど無い状態でコード可能であることを見出した。Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．、（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２９８：１９５、を参照されたい。一実施形態では、レアコドンまたはナンセンスコドンに基づく拡張コドンは、本発明で使用可能で、他の望ましくない部位でのミスセンス読み過ごしおよびフレームシフト抑制を減らすことができる。
【０２１３】
所与の系に対しては、セレクターコドンは、また、天然の３塩基コドンの１つを含んでもよく、その場合、内在系は、天然塩基コドンを使わない（または滅多に使わない）。例えば、これは、天然３塩基コドンを認識するｔＲＮＡを欠いている系および／または３塩基コドンがレアコドンである系を含む。
【０２１４】
セレクターコドンは、任意選択で、非天然塩基対を含んでもよい。これらの非天然塩基対では、既存遺伝子アルファベット文字をさらに拡張する１つの余分の塩基対は、トリプレットコドンの数を、６４から１２５に増やす。第３の塩基対の特性には、安定な、選択的塩基対形成、ポリメラーゼによる効率的な酵素によるＤＮＡ中への高精度組み込み、および発生期の非天然塩基対合成後のプライマー延長の効率的継続、が含まれる。方法と組成物に適用可能な非天然塩基対の記載には、例えば、Ｈｉｒａｏ、ｅｔ  ａｌ．、（２００２）、アミノ酸類似体のタンパク質中への組込みのための非天然塩基対（Ａｎｕｎｎａｔｕｒａｌ  ｂａｓｅ  ｐａｉｒ  ｆｏｒ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｉｎ  ｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０：１７７−１８２、が含まれる。また、Ｗｕ、Ｙ．、ｅｔ  ａｌ．、（２００２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：１４６２６−１４６３０、も参照されたい。他の関連出版物は、以下に挙げる。
【０２１５】
インビボ使用法に関しては、非天然ヌクレオシドは、膜透過性であり、リン酸化されて、対応するトリホスファートを形成する。さらに、増加した遺伝子情報は安定で、細胞内酵素には破壊されない。Ｂｅｎｎｅｒその他による以前の試みは、標準的なＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ対のものとは異なる水素結合パターン（その最も顕著な例は、イソＣ：イソＧ対である）を利用した。例えば、Ｓｗｉｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、（１９８９）Ｊ、Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１１：８３２２；およびＰｉｃｃｉｒｉｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ、３４３：３３；Ｋｏｏｌ、（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、４：６０２、を参照されたい。これらの塩基は、一般的に、天然塩基とはある程度まではミスペアを形成し、酵素的に複製され得ない。Ｋｏｏｌと共同研究者は、塩基間の疎水性パッキング相互作用が、水素結合に置き換わり、塩基対の形成を進行させることができることを示した。Ｋｏｏｌ、（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ、Ｂｉｏｌ．、４：６０２；およびＧｕｃｋｉａｎ  ａｎｄ  Ｋｏｏｌ、（１９９８）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、３６、２８２５、を参照されたい。上記全要求を満たす非天然塩基対を開発する試みで、Ｓｃｈｕｌｔｚ、Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇと共同研究者は、系統的に合成し、一連の非天然疎水性塩基を調べた。ＰＩＣＳ：ＰＩＣＳ自己相補塩基対が、天然塩基対よりも安定であることがわかり、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（ＫＦ）のクレノー断片により、ＤＮＡ中に効率的に組み込むことができている。例えば、ＭｃＭｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９９）Ｊ、Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２１：１１５８５−６；およびＯｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．、（２０００）Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２２：３２７４、を参照されたい。３ＭＮ：３ＭＮ自己相補塩基対は、ＫＦにより合成でき、生物学的機能にとって充分な効率と選択性を有する。例えば、Ｏｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．、（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２２：８８０３、を参照されたい。しかし、両塩基ともさらなる複製に対し、鎖ターミネーターとして作用する。最近、ＰＩＣＳ自己相補塩基対を複製するのに使用できる変異体ＤＮＡポリメラーゼが登場した。さらに、７ＡＩ自己相補塩基対が複製できる。例えば、Ｔａｅ  ｅｔ  ａｌ．、（２００１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２３：７４３９、を参照されたい。新規金属塩基対、Ｄｉｐｉｃ：Ｐｙ、も開発され、これは、Ｃｕ（ＩＩ）に結合時に安定対を形成する。Ｍｅｇｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．、（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２２：１０７１４、を参照されたい。拡張コドンおよび非天然コドンは、本質的に天然コドンに直交するので、本発明の方法は、この特性を利用して、それら用の直交性ｔＲＮＡを生成できる。
【０２１６】
翻訳回避系（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｂｙｐａｓｓｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）も、また、非天然アミノ酸の所望のポリペプチド中への組み込みに使用できる。翻訳回避系では、大きな配列が遺伝子中に組み込まれるが、タンパク質に翻訳されない。配列は、配列を読み飛ばし、挿入下流の翻訳を再開するようにリボソームを誘導するためのキューとして作用する構造を含む。
【０２１７】
特定の実施形態では、本発明方法および／または組成物で使われる対象タンパク質またはポリペプチド（またはその一部）は、核酸によりコードされる。典型的には、核酸は、少なくとも１つのセレクターコドン、少なくとも２つのセレクターコドン、少なくとも３つのセレクターコドン、少なくとも４つのセレクターコドン、少なくとも５つのセレクターコドン、少なくとも６つのセレクターコドン、少なくとも７つのセレクターコドン、少なくとも８セレクターコドン、少なくとも９セレクターコドン、１０以上のセレクターコドンを含む。
【０２１８】
対象タンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子は、当業者には既知の、および本明細書記載の方法を使って、例えば、非天然アミノ酸の組み込み用の１つまたは複数のセレクターコドンを含むように変異誘発できる。例えば、対象タンパク質用の核酸は、変異誘発されて、１つまたは複数のセレクターコドンを含み、１つまたは複数の非天然アミノ酸の組込みを提供する。本発明は、いずれかのこのような変異体み、これには、限定されないが、変異体、例えば、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む種々の型の内のいずれかのタンパク質を含む。同様に、本発明は、対応する核酸、すなわち、１つまたは複数の非天然アミノ酸をコードする１つまたは複数のセレクターコドンを有するいずれかの核酸、を含む。
【０２１９】
例えば、レラキシンポリペプチド等の対象タンパク質をコードする核酸分子は、容易に変異され、ポリペプチドの任意の所望の位置にシステインを導入できる。システインは、反応性分子、水溶性ポリマー、タンパク質、または各種の他の分子を、対象タンパク質に導入するのに広範に使用されている。ポリペプチドの所望の位置へのシステインの組込みに適切な方法は、当業者には既知であり、例えば、米国特許第６，６０８，１８３号（この特許は、参照によって本明細書に組み込まれる）に記載のもの、および標準的変異誘発技術がある。
【０２２０】
天然ではコードされないアミノ酸
非常に多くの種類の天然ではコードされないアミノ酸が、本発明での使用に適する。どのような数の天然ではコードされないアミノ酸も、レラキシンポリペプチド中に導入可能である。一般的に、導入された天然ではコードされないアミノ酸は、２０の共通の、遺伝的にコードされるアミノ酸（すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリン）に対し、実質的に化学的に不活性である。一部の実施形態では、天然ではコードされないアミノ酸は、２０の共通アミノ酸には認められない官能基（限定されないが、アジド、ケトン、アルデヒドおよびアミノオキシ基を含む）と、効率的、かつ選択的に反応して、安定なコンジュゲートを形成する側鎖官能基を含む。例えば、アジド官能基を含む天然ではコードされないアミノ酸を含むレラキシンポリペプチドは、ポリマー（限定されないが、ポリ（エチレングリコールを含む）または、代わりに、アルキン成分を含む第２のポリペプチドと反応し、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化生成物を形成するためのアジドおよびアルキン官能基の選択的反応により得られる安定なコンジュゲートを形成できる。
【０２２１】
アルファアミノ酸の一般的な構造を以下に図示する（式Ｉ）：
【化５】
0006054294.tif 000006
【０２２２】
天然ではコードされないアミノ酸は、通常、上記に挙げた式を有するいずれかの構造であり、Ｒ基は、２０の天然アミノ酸で使用されるもの以外の任意の置換基であり、本発明での使用に適切でありうる。本発明の天然ではコードされないアミノ酸は、通常、天然アミノ酸とは側鎖の構造のみが異なるものであるため、天然ではコードされないアミノ酸は、限定されないが、天然でコードされる、または天然でコードされないものを含む他のアミノ酸と、天然ポリペプチド中で形成されるのと同じ方式で、アミド結合を形成する。
【０２２３】
しかし、天然ではコードされないアミノ酸は、天然アミノ酸とは区別される側鎖基を有する。例えば、Ｒは、任意選択で、アルキル、アリール、アシル、ケト、アジド、ヒドロキシル、ヒドラジン、シアノ、ハロ、ヒドラジド、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、セレノ、スルホニル、ボラート、ボロナート、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、ヘテロ環式、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン、アミノ基、等またはこれらのいずれかの組み合わせを含む。本発明での使用に適切である可能性がある他の対象非天然アミノ酸には、限定されないが、光活性化可能な架橋剤を含むアミノ酸、スピン標識アミノ酸、蛍光アミノ酸、金属結合アミノ酸、金属含有アミノ酸、放射性アミノ酸、新規官能基を有するアミノ酸、共有結合でまたは非共有結合で他の分子と相互作用するアミノ酸、フォトケージ化および／または光異性化可能なアミノ酸、ビオチンまたはビオチン類似体含有アミノ酸、グリコシル化されたアミノ酸、例えば、糖置換セリン、他の炭水化物改変アミノ酸、ケト含有アミノ酸、ポリエチレングリコールまたはポリエーテル含有アミノ酸、重原子置換アミノ酸、化学的に切断可能なおよび／または光切断可能なアミノ酸、限定されないが、ポリエーテルまたは限定されないが、約１０炭素より約５以上長い炭素を含む長鎖炭化水素、等の天然アミノ酸に比べて延長側鎖を有するアミノ酸、炭素結合型糖含有アミノ酸、レドックス活性アミノ酸、アミノチオ酸含有アミノ酸、および１つまたは複数の毒成分を含むアミノ酸、が含まれる。
【０２２４】
本発明での使用に適切である可能性があり、水溶性ポリマーとの反応に有用である代表的な天然ではコードされないアミノ酸には、限定されないが、カルボニル、アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド、セミカルバジド、アジドおよびアルキン反応基を有するものが含まれる。一部の実施形態では、天然ではコードされないアミノ酸は、サッカライド部分を含む。このようなアミノ酸の例には、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−ガラクトサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−トレオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−アスパラギンおよびＯ−マンノサミニル−Ｌ−セリン、が含まれる。このようなアミノ酸の例には、また、アミノ酸とサッカライドの間の天然のＮ−またはＯ−結合が、限定されないが、アルケン、オキシム、チオエーテル、アミド、等を含む通常は天然には見られない共有結合による連結により置換されている例が含まれる。このようなアミノ酸の例には、また、天然のタンパク質には見られない糖類、例えば、２−デオキシブドウ糖、２−デオキシガラクトース、等が含まれる。
【０２２５】
本明細書で提供される天然ではコードされないアミノ酸の多くは、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（ａ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、またはＰｅｐｔｅｃｈ（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）から市販されている。市販されていないものは、本明細書で提供されるように、または当業者には既知の標準的な方法を使って、任意選択で、合成される。有機合成技術に関しては、例えば、有機化学（Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）：Ｆｅｓｓｅｎｄｏｎ  ａｎｄ  Ｆｅｓｓｅｎｄｏｎ、（１９８２、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｗｉｌｌａｒｄ  Ｇｒａｎｔ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｓｔｏｎ  Ｍａｓｓ．）；最新有機化学（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）：Ｍａｒｃｈ（Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９８５、Ｗｉｌｅｙａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；および最新有機化学（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）：Ｃａｒｅｙ  ａｎｄ  Ｓｕｎｄｂｅｒｇ（Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｐａｒｔｓ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ、１９９０、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、を参照されたい。また、米国特許第７，０４５，３３７号、および同７，０８３，９７０号を参照されたい。これらの特許は、参照によって本明細書に組み込まれる。新規側鎖を含む非天然アミノ酸に加えて、本発明での使用に適する可能性がある非天然アミノ酸は、また、任意選択で、限定されないが、式ＩＩおよびＩＩＩの構造：
【化６】
0006054294.tif 000007
【化７】
0006054294.tif 000008
により図示されるような改変骨格構造を含み、
式中、Ｚは、通常、ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、ＮＨ−Ｒ’、またはＳ−Ｒ’を含み；ＸおよびＹは、同じでも異なっていてもよいが、通常、ＳまたはＯを含み、ＲおよびＲ’は、任意選択で、同じでも異なっていてもよいが、通常、式Ｉを有する非天然アミノ酸のための上述のＲ基用同じ成分リスト、ならびに水素から選択される。例えば、本発明の非天然アミノ酸は、任意選択で、式ＩＩとＩＩＩで図示されるように、アミノまたはカルボキシル基に置換を含む。このタイプの非天然アミノ酸は、限定されないが、共通２０天然アミノ酸または非天然側鎖に対応する側鎖を有するα−ヒドロキシ酸、α−チオ酸、α−アミノチオカルボキシラート等を含む。さらに、α炭素位置での置換は、任意選択で、限定されないが、Ｌ、Ｄ、またはα−α−二置換アミノ酸、例えば、Ｄ−グルタメート、Ｄ−アラニン、Ｄ−メチル−Ｏ−チロシン、アミノ酪酸、等を含む。他の構造的代替物には、環式アミノ酸、例えば、プロリン類似体、ならびに３、４、６、７、８、および９員環プロリン類似体、βおよびγアミノ酸、例えば、置換β−アラニンおよびγ−アミノ酪酸が含まれる。
【０２２６】
多くの非天然アミノ酸は、天然アミノ酸、例えば、チロシン、グルタミン、フェニルアラニン、等をベースにしており、本発明での使用に適している。チロシン類似体には、限定されないが、パラ置換チロシン、オルト置換チロシン、およびメタ置換チロシンが含まれ、置換チロシンは、限定されないが、ケト基（限定されないが、アセチル基を含む）、ベンゾイル基、アミノ基、ヒドラジン、ヒドロキシアミン、チオール基、カルボキシ基、イソプロピル基、メチル基、Ｃ６−Ｃ２０直鎖または分岐炭化水素、飽和または不飽和の炭化水素、Ｏ−メチル基、ポリエーテル基、ニトロ基、アルキニル基、等を含む。さらに、多置換アリール環も、また、意図されている。本発明での使用に適する可能性があるグルタミン類似体には、限定されないが、ａ−ヒドロキシ誘導体、ｇ−置換誘導体、環式誘導体、およびアミド置換グルタミン誘導体が含まれる。本発明での使用に適する可能性があるフェニルアラニン類似体の例には、限定されないが、パラ置換フェニルアラニン、オルト置換フェニルアラニン、およびメタ置換フェニルアラニンが含まれ、置換基には、限定されないが、ヒドロキシ基、メトキシ基、メチル基、アリル基、アルデヒド、アジド、ヨード、ブロモ、ケト基（限定されないが、アセチル基を含む）、ベンゾイル、アルキニル基、等が含まれる。本発明での使用に適する可能性がある非天然アミノ酸の具体的な例には、限定されないが、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチル−フェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃｂ−セリン、Ｌ−ドーパ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨードフェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、およびｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン、等が含まれる。本発明での使用に適する可能性がある種々の非天然アミノ酸の構造の例は、例えば、「非天然アミノ酸のインビボ組み込み（Ｉｎｖｉｖｏ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ）」のタイトルの国際公開第２００２／０８５９２３号で提供されている。また、さらなるメチオニン類似体に関しては、Ｋｉｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．、（２００２）、Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒライゲーション反応による化学選択的改変のためのアジドの組換えタンパク質への組込み（Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｚｉｄｅｓ  ｉｎｔｏ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ｃｈｅｍｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ  ｌｉｇａｔｉｏｎ）、ＰＮＡＳ  ９９：１９−２４、も参照されたい。この文献は、参照によって本明細書に組み込まれる。「非天然アミノ酸およびポリペプチドを含む組成物、その方法および使用」のタイトルの国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ0６／４７���２２号（参照によって本明細書に組み込まれる）は、限定されないが、ｐ−アミノフェニルアラニンを含む芳香族アミン成分の還元アルキル化、および還元的アミノ化について記載している。
【０２２７】
一実施形態では、非天然アミノ酸（例えば、ｐ−（プロパルギルオキシ）−フェニルアラニン）を含むレラキシンポリペプチドの組成物が提供される。ｐ−（プロパルギルオキシ）−フェニルアラニンおよび、限定されないが、タンパク質および／または細胞、等を含む種々の組成物も提供される。一態様では、ｐ−（プロパルギルオキシ）−フェニルアラニン非天然アミノ酸を含む組成物は、直交性ｔＲＮＡをさらに含む。非天然アミノ酸は、限定されないが、アミノアシル結合により直交ｔＲＮＡに共有結合、直交ｔＲＮＡの末端リボース糖の３’ＯＨまたは２’ＯＨに共有結合、を含む直交ｔＲＮＡに結合（限定されないが、共有結合を含む）ができる。
【０２２８】
非天然アミノ酸を介してタンパク質中に組み込むことができる化学成分は、タンパク質の種々の利点および操作を提供する。例えば、ケト官能基の独特の反応性は、多くのヒドラジンまたはヒドロキシルアミン含有試薬のいずれかによるタンパク質のインビトロおよびインビボ選択的改変を可能とする。例えば、重原子非天然アミノ酸は、Ｘ線構造データの位相整合に有用でありうる。非天然アミノ酸を使った重原子の部位特異的導入は、また、重原子のための位置の選定に選択性および柔軟性を与える。光反応性非天然アミノ酸（限定されないが、ベンゾフェノンおよびアリールアジド（限定されないが、フェニルアジド等）側鎖を有するアミノ酸を含む）は、例えば、効率的インビボおよびインビトロによるタンパク質光架橋を可能とする。光反応性非天然アミノ酸の例には、限定されないが、ｐ−アジドフェニルアラニンおよびｐ−ベンゾイルフェニルアラニンが含まれる。光反応性非天然アミノ酸を含むタンパク質は、次に、光反応基が提供する時間的制御の励起により自在に架橋されうる。一例では、非天然アミノ酸のメチル基は、核磁気共鳴および振動分光法の使用による局所構造および動力学のプローブとして同位体標識した、限定されないが、メチル基等で置換できる。例えば、アルキニルまたはアジド官能基は、［３＋２］付加環化反応により分子を使ってタンパク質の選択的改変を可能とする。
【０２２９】
アミノ末端でポリペプチドに組み込まれる非天然アミノ酸は、２０の天然アミノ酸およびα−アミノ酸中に通用存在するＮＨ２基とは異なる第２の反応基（式Ｉ参照）に使われるもの以外のいずれかの置換基であるＲ基から構成できる。類似の非天然アミノ酸は、α−アミノ酸中に通常存在するＣＯＯＨ基（式Ｉ参照）とは異なる第２の反応基を有するカルボキシル末端の位置に組み込むことができる。
【０２３０】
本発明の非天然アミノ酸は、選択または設計して、２０天然アミノ酸で利用できない追加の特性を与えることができる。例えば、非天然アミノ酸は、任意選択で、設計または選択して、例えば、それらが組み込まれるタンパク質の生物学的特性を変えることができる。例えば、非天然アミノ酸のタンパク質中への組込みにより、任意選択で、以下の特性を変えることができる：毒性、体内分布、溶解度、安定性、例えば、熱、加水分解、三価、酵素分解耐性等、精製およびプロセッシング機能、構造特性、分光学的特性、化学および／または光化学的特性、触媒活性、レドックス潜在力、半減期、例えば、共有結合または非共有結合による他の分子との反応能力、等。
【０２３１】
非天然アミノ酸の構造および合成：カルボニル、カルボニル様、マスクカルボニル、保護カルボニル基、およびヒドロキシルアミン基
一部の実施形態では、本発明は、水溶性ポリマー、例えば、ＰＥＧに、オキシム結合によりに連結されたレラキシンを提供する。
【０２３２】
多くのタイプの天然ではコードされないアミノ酸がオキシム結合の形成に適する。これらには、限定されないが、カルボニル、ジカルボニル、またはヒドロキシルアミン基を含む天然ではコードされないアミノ酸が含まれる。このようなアミノ酸は、米国特許公開２００６／０１９４２５６号、同２００６／０２１７５３２、および号２００６／０２１７２８９号ならびに「非天然アミノ酸およびポリペプチドを含む組成物、その方法および使用（Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ、ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ、ａｎｄ  ｕｓｅｓ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ）」のタイトルの国際公開第２００６／０６９２４６号に記載されている。これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。天然ではコードされないアミノ酸は、また、米国特許第７，０８３，９７０号および同７，０４５，３３７号に記載されている。これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２３３】
本発明の一部の実施形態は、１つまたは複数の位置でパラアセチルフェニルアラニンアミノ酸で置換されているレラキシンポリペプチドを利用する。ｐ−アセチル−（＋／−）−フェニルアラニンおよびｍ−ａｃｅｌｙｌ−（＋／−）−フェニルアラニンの合成は、Ｚｈａｎｇ、Ｚ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２：６７３５−６７４６（２００３）に記載されている。この文献は、参照によって組み込まれる。他のカルボニル−またはジカルボニル−含有アミノ酸は、当業者によって同様に調製できる。さらに、本明細書に含まれる非天然アミノ酸の非制限的合成例が、米国特許第７，０８３，９７０号の図４、２４〜３４および３６〜３９に示されている。この特許は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２３４】
求電子反応基を有するアミノ酸は、特に、求核付加反応を介して分子を連結する種々の反応を可能とする。このような求電子反応基には、カルボニル基（ケト基およびジカルボニル基を含む）、カルボニル様基（カルボニル基（ケト基およびジカルボニル基を含む）に類似の反応性を有し、カルボニル基に構造的に類似である）、マスクカルボニル基（カルボニル基（ケト基およびジカルボニル基を含む）に容易に変換できる）、または保護カルボニル基（脱保護時にカルボニル基（ケト基およびジカルボニル基を含む）に類似の反応性を有する）が含まれる。このようなアミノ酸には、式（ＩＶ）：
【化８】
0006054294.tif 000009
の構造を有するアミノ酸が含まれ、
式中：
Ａは、任意選択であり、存在する場合は、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン（ａｌｋａｒｙｌｅｎｅ）、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｂは、任意選択であり、存在する場合は、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２、または３）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−、からなる群より選択されるリンカーで、各Ｒ’は、独立に、Ｈ、アルキル、または置換アルキルであり；
Ｊは、
【化９】
0006054294.tif 000010
であり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
各Ｒ”は、独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、または保護基、または２つ以上のＲ”基が存在する場合は、２つのＲ”は、任意選択で、ヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒ１は、任意選択であり、存在する場合は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；さらに
Ｒ２は、任意選択であり、存在する場合は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
各Ｒ３およびＲ４は、独立に、Ｈ、ハロゲン、低級アルキル、または置換低級アルキル、またはＲ３およびＲ４または２つのＲ３基は、任意選択で、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；または−Ａ−Ｂ−Ｊ−Ｒ基は、一緒に、二環式または三環式シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し、これらは、少なくとも１つのジカルボニル基を含むカルボニル基、保護ジカルボニル基を含む保護カルボニル基、またはマスクジカルボニル基を含むマスクカルボニル基を含み；
または−Ｊ−Ｒ基は一緒に単環式または二環式シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し、これらは少なくとも１つのジカルボニル基を含むカルボニル基、保護ジカルボニル基を含む保護カルボニル基、またはマスクジカルボニル基を含むマスクカルボニル基を含む；
但し、Ａが、フェニレンで、各Ｒ３がＨの場合は、Ｂが存在し；Ａが、−（ＣＨ２）４−であり、各Ｒ３がＨの場合は、Ｂは、−ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２ＣＨ２）−ではなく；さらにＡおよびＢが存在せず、各Ｒ３がＨの場合は、Ｒはメチルではないものとする。
【０２３５】
さらに、式（Ｖ）：
【化１０】
0006054294.tif 000011
の構造を有するアミノ酸が含まれ、
式中：
Ａは任意選択であり、存在する場合は、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｂは任意選択であり、存在する場合は、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２、または３）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−、からなる群より選択されるリンカーで、各Ｒ’は独立に、Ｈ、アルキル、または置換アルキルであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は任意選択であり、存在する場合は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；さらに
Ｒ２は任意選択であり、存在する場合は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドである；
但し、Ａが、フェニレンの場合は、Ｂが存在し；Ａが−（ＣＨ２）４−である場合は、Ｂは、−ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２ＣＨ２）−ではなく；さらにＡおよびＢが存在しない場合は、Ｒはメチルではないものとする。
【０２３６】
さらに、式（ＶＩ）：
【化１１】
0006054294.tif 000012
の構造を有するアミノ酸が含まれ、
式中：
Ｂは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２、または３）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−、からなる群より選択されるリンカーで、各Ｒ’は、独立に、Ｈ、アルキル、または置換アルキルであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は任意選択であり、存在する場合は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；さらに
Ｒ２は任意選択であり、存在する場合は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
各Ｒａは、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’（ｋは１、２、または３）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’、および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’−、からなる群より独立に選択され、各Ｒ’は、独立に、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである。
【０２３７】
さらに、下記のアミノ酸：
【化１２】
0006054294.tif 000013
が含まれ、
このような化合物は、任意選択で、アミノ保護基、カルボキシル保護基またはその塩である。さらに、いずれかの下記の非天然アミノ酸を非天然アミノ酸ポリペプチドに組み込むことができる。
【０２３８】
さらに、下記の式（ＶＩＩ）：
【化１３】
0006054294.tif 000014
の構造を有するアミノ酸が含まれ、
式中、
Ｂは任意選択であり、存在する場合は、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２、または３）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−、からなる群より選択されるリンカーで、各Ｒ’は、独立に、Ｈ、アルキル、または置換アルキルであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は任意選択であり、存在する場合は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；さらに
Ｒ２は任意選択であり、存在する場合は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
各Ｒａは、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’ｋは１、２、または３）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’、および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’、からなる群より独立に選択され、各Ｒ’は、独立に、Ｈ、アルキル、または置換アルキルであり；さらにｎは０〜８である；
但し、Ａが、−（ＣＨ２）４−である場合は、Ｂは、−ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２ＣＨ２）−ではないものとする。
【０２３９】
さらに、下記のアミノ酸：
【化１４】
0006054294.tif 000015
が含まれ、
このような化合物は、任意選択でアミノ保護された化合物、任意選択でカルボキシル保護された化合物、任意選択でアミノ保護およびカルボキシル保護された化合物またはそれらの塩である。さらに、これらの非天然アミノ酸およびいずれかの下記の非天然アミノ酸は、非天然アミノ酸ポリペプチド中に組み込むことができる。
【０２４０】
さらに、下記の式（ＶＩＩＩ）：
【化１５】
0006054294.tif 000016
の構造を有するアミノ酸が含まれ、
式中、
Ａは任意選択であり、存在する場合は、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｂは任意選択であり、存在する場合は、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２、または３）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−、からなる群より選択されるリンカーで、各Ｒ’は、独立に、Ｈ、アルキル、または置換アルキルであり；
Ｒ１は任意選択であり、存在する場合は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；さらに
Ｒ２は任意選択であり、存在する場合は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドである。
【０２４１】
さらに、下記の式（ＩＸ）：
【化１６】
0006054294.tif 000017
の構造を有するアミノ酸が含まれ、
Ｂは任意選択であり、存在する場合は、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２、または３）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−、からなる群より選択されるリンカーで、各Ｒ’は、独立に、Ｈ、アルキル、または置換アルキルであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は任意選択であり、存在する場合は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；さらに
Ｒ２は任意選択であり、存在する場合は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
各Ｒａは、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’（ｋは１、２、または３）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’、および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’、からなる群より独立に選択され、各Ｒ’は独立に、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである。
【０２４２】
さらに、下記のアミノ酸：
【化１７】
0006054294.tif 000018
が含まれ、
このような化合物は、任意選択でアミノ保護された化合物、任意選択でカルボキシル保護された化合物、任意選択でアミノ保護およびカルボキシル保護された化合物、またはそれらの塩である。さらに、これらの非天然アミノ酸およびいずれかの下記の非天然アミノ酸は、非天然アミノ酸ポリペプチド中に組み込むことができる。
【０２４３】
さらに、下記の式（Ｘ）：
【化１８】
0006054294.tif 000019
の構造を有するアミノ酸が含まれ、
式中、
Ｂは任意選択であり、存在する場合は、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２、または３）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−、からなる群より選択されるリンカーで、各Ｒ’は、独立に、Ｈ、アルキル、または置換アルキルであり；
ＲはＨ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は任意選択であり、存在する場合は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；さらに
Ｒ２は任意選択であり、存在する場合は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
各Ｒａ、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’（ｋは１、２、または３）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’、および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’、からなる群より独立に選択され、各Ｒ’は、独立に、Ｈ、アルキル、または置換アルキルであり；さらに
ｎは、０〜８である。
【０２４４】
さらに、下記のアミノ酸：
【化１９】
0006054294.tif 000020
が含まれ、
このような化合物は、任意選択でアミノ保護された化合物、任意選択でカルボキシル保護された化合物、任意選択でアミノ保護およびカルボキシル保護された化合物、またはそれらの塩である。さらに、これらの天然アミノ酸およびいずれかの下記の非天然アミノ酸は、非天然アミノ酸ポリペプチド中に組み込むことができる。
【０２４５】
モノカルボニル構造に加えて、本明細書記載の非天然アミノ酸は、ジカルボニル、ジカルボニル様、マスクジカルボニルおよび保護ジカルボニル基、等の基を含んでもよい。
【０２４６】
例えば、下記の式（ＸＩ）：
【化２０】
0006054294.tif 000021
の構造を有するアミノ酸が含まれ、
式中、
Ａは任意選択であり、存在する場合は、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｂは任意選択であり、存在する場合は、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−、Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２、または３）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、Ｃ（Ｏ）−、Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、およびＣ（Ｒ’）２Ｎ（Ｒ’）Ｎ（Ｒ’）−、からなる群より選択されるリンカーで、各Ｒ’は独立に、Ｈ、アルキル、または置換アルキルであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は任意選択であり、存在する場合は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；さらに
Ｒ２は任意選択であり、存在する場合は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドである。
【０２４７】
さらに、下記の式（ＸＩＩ）：
【化２１】
0006054294.tif 000022
の構造を有するアミノ酸が含まれ、
Ｂは任意選択であり、存在する場合は、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２、または３）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−、からなる群より選択されるリンカーで、各Ｒ’は、独立に、Ｈ、アルキル、または置換アルキルであり；
ＲはＨ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は任意選択であり、存在する場合は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；さらに
Ｒ２は任意選択であり、存在する場合は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
各Ｒａは、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’（ｋは１、２、または３）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’、および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’、からなる群より独立に選択され、各Ｒ’は、独立に、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである。
【０２４８】
さらに、下記のアミノ酸：
【化２２】
0006054294.tif 000023
が含まれ、
このような化合物は、任意選択でアミノ保護された化合物、任意選択でカルボキシル保護された化合物、任意選択でアミノ保護およびカルボキシル保護された化合物、またはそれらの塩である。さらに、これらの非天然アミノ酸およびいずれかの下記の非天然アミノ酸は、非天然アミノ酸ポリペプチド中に組み込むことができる。
【０２４９】
さらに、下記の式（ＸＩＩＩ）：
【化２３】
0006054294.tif 000024
の構造を有するアミノ酸が含まれ、
式中、
Ｂは任意選択であり、存在する場合は、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２、または３）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−、からなる群より選択されるリンカーで、各Ｒ’は独立に、Ｈ、アルキル、または置換アルキルであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は任意選択であり、存在する場合は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；さらに
Ｒ２は任意選択であり、存在する場合は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
各Ｒａは、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’（ｋは１、２、または３）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’、および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’、からなる群より独立に選択され、各Ｒ’は、独立に、Ｈ、アルキル、または置換アルキルであり；さらに、ｎは、０〜８である。
【０２５０】
さらに、下記のアミノ酸：
【化２４】
0006054294.tif 000025
が含まれ、
このような化合物は、任意選択でアミノ保護された化合物、任意選択でカルボキシル保護された化合物、任意選択でアミノ保護およびカルボキシル保護された化合物、またはそれらの塩である。さらに、これらの非天然アミノ酸、およびいずれかの下記の非天然アミノ酸は、非天然アミノ酸ポリペプチド中に組み込むことができる。
【０２５１】
さらに、下記の式（ＸＩＶ）：
【化２５】
0006054294.tif 000026
の構造を有するアミノ酸が含まれ、
式中：
Ａは任意選択であり、存在する場合は、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は任意選択であり、存在する場合は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；さらに
Ｒ２は任意選択であり、存在する場合は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｘ１は、Ｃ、Ｓ、またはＳ（Ｏ）であり；さらにＬは、アルキレン、置換アルキレン、Ｎ（Ｒ’）（アルキレン）またはＮ（Ｒ’）（置換アルキレン）であり、Ｒ’は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルである。
【０２５２】
さらに、下記の式（ＸＩＶ−Ａ）：
【化２６】
0006054294.tif 000027
の構造を有するアミノ酸が含まれ、
式中：
Ａは任意選択であり、存在する場合は、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は任意選択であり、存在する場合は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；さらに
Ｒ２は任意選択であり、存在する場合は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｌは、アルキレン、置換アルキレン、Ｎ（Ｒ’）（アルキレン）またはＮ（Ｒ’）（置換アルキレン）であり、Ｒ’は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルである。
【０２５３】
さらに、下記の式（ＸＩＶ−Ｂ）：
【化２７】
0006054294.tif 000028
の構造を有するアミノ酸が含まれ、
式中：
Ａは任意選択であり、存在する場合は、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は任意選択であり、存在する場合は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；さらに
Ｒ２は任意選択であり、存在する場合は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｌは、アルキレン、置換アルキレン、Ｎ（Ｒ’）（アルキレン）またはＮ（Ｒ’）（置換アルキレン）であり、Ｒ’は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルである。
【０２５４】
さらに、下記の式（ＸＶ）：
【化２８】
0006054294.tif 000029
の構造を有するアミノ酸が含まれ、
式中：
Ａは任意選択であり、存在する場合は、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は任意選択であり、存在する場合は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；さらに
Ｒ２は任意選択であり、存在する場合は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｘ１は、Ｃ、Ｓ、またはＳ（Ｏ）であり；
ｎは、０、１、２、３、４、または５であり；
各ＣＲ８Ｒ９基のそれぞれのＲ８およびＲ９は、Ｈ、アルコキシ、アルキルアミン、ハロゲン、アルキル、アリール、からなる群より独立に選択され、またはＲ８およびＲ９のいずれかは、一緒に＝Ｏもしくはシクロアルキルを形成でき、またはＲ８基に隣接するいずれかは、一緒にシクロアルキルを形成できる。
【０２５５】
さらに、下記の式（ＸＶ−Ａ）：
【化２９】
0006054294.tif 000030
の構造を有するアミノ酸が含まれ、
式中：
Ａは任意選択であり、存在する場合は、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は任意選択であり、存在する場合は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；さらに
Ｒ２は任意選択であり、存在する場合は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
ｎは、０、１、２、３、４、または５であり；
各ＣＲ８Ｒ９基のそれぞれのＲ８およびＲ９は、Ｈ、アルコキシ、アルキルアミン、ハロゲン、アルキル、アリール、からなる群より独立に選択され、またはまたはＲ８およびＲ９のいずれかは、一緒に＝Ｏもしくはシクロアルキルを形成でき、またはＲ８基に隣接するいずれかは、一緒にシクロアルキルを形成できる。
【０２５６】
さらに、下記の式（ＸＶ−Ｂ）：
【化３０】
0006054294.tif 000031
の構造を有するアミノ酸が含まれ、
式中：
Ａは任意選択であり、存在する場合は、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は任意選択であり、存在する場合は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；さらに
Ｒ２は任意選択であり、存在する場合は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
ｎは、０、１、２、３、４、または５であり；
各ＣＲ８Ｒ９基のそれぞれのＲ８およびＲ９は、Ｈ、アルコキシ、アルキルアミン、ハロゲン、アルキル、アリール、からなる群より独立に選択され、またはＲ８およびＲ９のいずれかは、一緒に＝Ｏもしくはシクロアルキルを形成でき、またはＲ８基に隣接するいずれかは、一緒にシクロアルキルを形成できる。
【０２５７】
さらに、式（ＸＶＩ）：
【化３１】
0006054294.tif 000032
の構造を有するアミノ酸が含まれ、
式中：
Ａは任意選択であり、存在する場合は、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は任意選択であり、存在する場合は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；さらに
Ｒ２は任意選択であり、存在する場合は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｘ１は、Ｃ、Ｓ、またはＳ（Ｏ）であり；Ｌは、アルキレン、置換アルキレン、Ｎ（Ｒ’）（アルキレン）またはＮ（Ｒ’）（置換アルキレン）であり、Ｒ’は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルである。
【０２５８】
さらに、下記の式（ＸＶＩ−Ａ）：
【化３２】
0006054294.tif 000033
の構造を有するアミノ酸が含まれ、
式中：
Ａは任意選択であり、存在する場合は、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は任意選択であり、存在する場合は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；さらに
Ｒ２は任意選択であり、存在する場合は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｌは、アルキレン、置換アルキレン、Ｎ（Ｒ’）（アルキレン）またはＮ（Ｒ’）（置換アルキレン）であり、Ｒ’は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルである。
【０２５９】
さらに、下記の式（ＸＶＩ−Ｂ）：
【化３３】
0006054294.tif 000034
の構造を有するアミノ酸が含まれ、
式中：
Ａは任意選択であり、存在する場合は、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキル；
Ｒ１は任意選択であり、存在する場合は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；さらに
Ｒ２は任意選択であり、存在する場合は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｌは、アルキレン、置換アルキレン、Ｎ（Ｒ’）（アルキレン）またはＮ（Ｒ’）（置換アルキレン）であり、Ｒ’は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルである。
【０２６０】
さらに、式（ＸＶＩＩ）：
【化３４】
0006054294.tif 000035
の構造を有するアミノ酸が含まれ、
式中：
Ａは任意選択であり、存在する場合は、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｍは、−Ｃ（Ｒ３）−、
【化３５】
0006054294.tif 000036
であり、
（ａ）は、Ａ基への結合を示し、（ｂ）は、それぞれのカルボニル基への結合を示し、Ｒ３およびＲ４は、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、もしくは置換シクロアルキル、から独立に選択され、またはＲ３およびＲ４または２つのＲ３基または２つのＲ４基は、任意選択で、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒは、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｔ３は、結合のＣ（Ｒ）（Ｒ）、Ｏ、またはＳであり、Ｒは、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は任意選択であり、存在する場合は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；さらに
Ｒ２は任意選択であり、存在する場合は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドである。
【０２６１】
さらに、式（ＸＶＩＩＩ）：
【化３６】
0006054294.tif 000037
の構造を有するアミノ酸が含まれ、
式中：
Ｍは、−Ｃ（Ｒ３）−、
【化３７】
0006054294.tif 000038
であり、
（ａ）は、Ａ基への結合を示し、（ｂ）は、それぞれのカルボニル基への結合を示し、Ｒ３およびＲ４は、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、もしくは置換シクロアルキル、から独立に選択され、またはＲ３およびＲ４または２つのＲ３基または２つのＲ４基は、任意選択で、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒは、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｔ３は、結合のＣ（Ｒ）（Ｒ）、Ｏ、またはＳであり、Ｒは、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は任意選択であり、存在する場合は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；さらに
Ｒ２は任意選択であり、存在する場合は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり、
各Ｒａは、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’（ｋは１、２、または３）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’、および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’、からなる群より独立に選択され、各Ｒ’は、独立に、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである。
【０２６２】
さらに、式（ＸＩＸ）：
【化３８】
0006054294.tif 000039
の構造を有するアミノ酸が含まれ、
式中：
Ｒは、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；Ｔ３は、Ｏ、またはＳである。
【０２６３】
さらに、式（ＸＸ）：
【化３９】
0006054294.tif 000040
の構造を有するアミノ酸が含まれ、
式中：
Ｒは、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルである。
【０２６４】
さらに、下記の式（ＸＸＩ）：
【化４０】
0006054294.tif 000041
の構造を有するアミノ酸が含まれる。
【０２６５】
一部の実施形態では、非天然アミノ酸を含むポリペプチドは、化学的に修飾されて反応性カルボニルまたはジカルボニル官能基を生成する。例えば、コンジュゲーションに有用なアルデヒド官能性は、隣接アミノおよびヒドロキシル基を有する官能性から生成できる。例えば、生物学的に活性な分子がポリペプチドである場合には、Ｎ末端セリンまたはトレオニン（普通に存在しても、化学または酵素消化により露出されてもよい）は、軽度の酸化的切断条件下で、過ヨウ素酸塩を使ってアルデヒド官能性を生成するために使用できる。例えば、Ｇａｅｒｔｎｅｒ、ｅｔ．ａｌ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．３：２６２−２６８（１９９２）；Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ、Ｋ．＆  Ｓｔｒｏｈ、Ｊ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．３：１３８−１４６（１９９２）；Ｇａｅｒｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：７２２４−７２３０（１９９４）、を参照されたい。しかし、当技術分野で既知の方法は、ペプチドまたはタンパク質のＮ末端にあるアミノ酸に限定される。
【０２６６】
本発明では、隣接ヒドロキシルおよびアミノ基を有する非天然アミノ酸は、「マスクされた」アルデヒド官能性としてポリペプチド中へ組み込むことができる。例えば、５−ヒドロキシリシンは、ε−アミンに隣接したヒドロキシル基を有する。アルデヒドを生成する反応条件は、通常、軽度の条件下のナトリウムメタ過ヨウ素酸のモル過剰を添加し、ポリペプチド内の他の部位での酸化を避けることを含む。酸化反応のｐＨは、通常、約７．０である。典型的反応は、ポリペプチド緩衝溶液に、ナトリウムメタ過ヨウ素酸塩の約１．５モルの過剰添加と、続けて、暗所での約１０分間のインキュベーションを含む。例えば、米国特許第６，４２３，６８５号を参照されたい。
【０２６７】
カルボニルまたはジカルボニル官能性は、ヒドロキシルアミン含有試薬と水溶液中、軽度の条件下で選択的に反応して、対応する生理学的条件で安定なオキシム結合を形成できる。例えば、Ｊｅｎｃｋｓ、Ｗ．Ｐ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ、８１、４７５−４８１（１９５９）；Ｓｈａｏ、Ｊ．ａｎｄ  Ｔａｍ、Ｊ、Ｐ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：３８９３−３８９９（１９９５）を参照されたい。さらに、カルボニルまたはジカルボニル基の特有の反応性が、他のアミノ酸側鎖の存在下、選択的改変を可能とする。例えば、Ｃｏｒｎｉｓｈ、Ｖ．Ｗ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｊ、Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８：８１５０−８１５１（１９９６）；Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ、Ｋ．Ｆ、＆  Ｓｔｒｏｈ、Ｊ、Ｇ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．３：１３８−１４６（１９９２）；Ｍａｈａｌ、Ｌ．Ｋ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６：１１２５−１１２８（１９９７）を参照されたい。
【０２６８】
非天然アミノ酸の構造および合成：ヒドロキシルアミン含有アミノ酸
米国特許出願第１１／３１６、５３４号（米国特許公開第２００６０１８９５２９号）は、参照によってその全体が組み込まれる。従って、米国特許出願第１１／３１６，５３４号（米国特許公開第２００６０１８９５２９号）中のセクションＶ（タイトルは「非天然アミノ酸」）、パートＢ（タイトルは「非天然アミノ酸の構造および合成：ヒドロキシルアミン含有アミノ酸」）で提供されている本開示は、あたかもこのような開示が本明細書中に完全に存在する場合と同程度に、本明細書記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチドおよび改変非天然アミノ酸ポリペプチドの製作、精製、特徴付け、および使用のための方法、組成物（式Ｉ〜ＸＸＸＶを含む）、技術および戦略に完全に適用できる。米国特許公開第２００６／０１９４２５６号、同２００６／０２１７５３２号、および同２００６／０２１７２８９号ならびに「非天然アミノ酸およびポリペプチドを含む組成物、それに関連する方法、およびその使用（Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ、ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ、ａｎｄ  ｕｓｅｓ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ）」のタイトルの国際公開第２００６／０６９２４６号は、また、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２６９】
非天然アミノ酸の化学合成
本発明での使用に適する非天然アミノ酸の多くは、例えば、Ｓｉｇｍａ（ＵＳＡ）またはＡｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ、ＵＳＡ）から市販されている。市販されていないものは、任意選択で、本明細書で提供されているように、または種々の出版物で提供されているように、または当業者には既知の標準的な方法を使って、合成される。有機合成技術に関しては、例えば、有機化学（Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）：Ｆｅｓｓｅｎｄｏｎ  ａｎｄ  Ｆｅｓｓｅｎｄｏｎ、（１９８２、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｗｉｌｌａｒｄ  Ｇｒａｎｔ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｓｔｏｎ  Ｍａｓｓ．）；最新有機化学（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）：Ｍａｒｃｈ（Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９８５、Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；および最新有機化学（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）：Ｃａｒｅｙ  ａｎｄ  Ｓｕｎｄｂｅｒｇ（Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｐａｒｔｓ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ、１９９０、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照されたい。非天然アミノ酸の合成について記載している追加の出版物には、例えば、「非天然アミノ酸のインビボ組み込み（Ｉｎｖｉｖｏ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｕｎｎａｔｕｒａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ）」のタイトルの国際公開第２００２／０８５９２３号；Ｍａｔｓｏｕｋａｓ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９５）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、３８、４６６０−４６６９；Ｋｉｎｇ、Ｆ．Ｅ．＆  Ｋｉｄｄ、Ｄ．Ａ．Ａ．（１９４９）、フチル化中間体からのグルタミンおよびグルタミン酸のγ−ジペプチドの新規合成（Ａ  Ｎｅｗ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ａｎｄ  ｏｆ  ｙ−Ｄｉｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｆ  Ｇｌｕｔａｍｉｃ  Ａｃｉｄ  ｆｒｏｍ  Ｐｈｔｈｙｌａｔｅｄ  Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ）．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、３３１５−３３１９；Ｆｒｉｅｄｍａｎ、Ｏ．Ｍ．＆  Ｃｈａｔｔｅｒｒｊｉ、Ｒ．（１９５９）、抗腫瘍薬用モデル基質としてのグルタミン誘導体の合成（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ａｓ  Ｍｏｄｅｌ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉ−Ｔｕｍｏｒ  Ａｇｅｎｔｓ）．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８１、３７５０−３７５２；Ｃｒａｉｇ、Ｊ．Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）、７−クロロ−４［［４−（ジエチルアミノ）−ｌ−メチルブチル］アミノ］キノリン（クロロキン）の鏡像異性体の絶対配置（Ａｂｓｏｌｕｔｅ  Ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ  ｏｆ  ７−Ｃｈｌｏｒｏ−４［［４−（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−ｌ−ｍｅｔｈｙｌｂｕｔｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ（Ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ））．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５３、１１６７−１１７０；Ａｚｏｕｌａｙ、Ｍ．、Ｖｉｌｍｏｎｔ、Ｍ、＆  Ｆｒａｐｐｉｅｒ、Ｆ．（１９９１）、潜在的抗マラリア薬としてのグルタミン類似体（Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ａｓ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌｓ）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２６、２０１−５；Ｋｏｓｋｉｎｅｎ、Ａ．Ｍ．Ｐ．＆  Ｒａｐｏｐｏ���ｔ、Ｈ．（１９８９）、立体配置的に拘束されたアミノ酸類似体としての４−置換プロリンの合成（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ４−Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  Ｐｒｏｌｉｎｅｓ  ａｓ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ  Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ）．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５４、１８５９−１８６６；Ｃｈｒｉｓｔｉｅ、Ｂ．Ｄ．＆  Ｒａｐｏｐｏｒｔ、Ｈ．（１９８５）Ｌ−アスパラギンからの光学的に純粋なピペコラートの合成．アミノ酸脱カルボニルおよびイミニウムイオン環化による（＋）−アポビンカミンの全合成への適用（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｏｐｔｉｃａｌｌｙ  Ｐｕｒｅ  Ｐｉｐｅｃｏｌａｔｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｌ−Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｔｏｔａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  （＋）−Ａｐｏｖｉｎｃａｍｉｎｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｄｅｃａｒｂｏｎｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｉｎｉｕｍ  Ｉｏｎ  Ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ）．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５０：１２３９−１２４６；Ｂａｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、（１９８７）、ラジカル化学を使った新規アルファアミノ酸および誘導体の合成：Ｌ−およびＤ−アルファアミノアジピン酸、Ｌ−α−アミノピメリン酸および適した不飽和誘導体の合成（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  ａｌｐｈａ−Ａｍｉｎｏ−Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｌ−  ａｎｄ  Ｄ−ａｌｐｈａ−Ａｍｉｎｏ−Ａｄｉｐｉｃ  Ａｃｉｄｓ、Ｌ−ａｌｐｈａ−ａｍｉｎｏｐｉｍｅｌｉｃ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ  Ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４３：４２９７−４３０８；および、Ｓｕｂａｓｉｎｇｈｅ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９２）キスカル酸類似体：ベータヘテロ環式２−アミノプロピオン酸誘導体の合成およびその新規キスクアラート感作部位での活性（Ｑｕｉｓｑｕａｌｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  ２−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｔ  ａ  ｎｏｖｅｌｑｕｉｓｑｕａｌａｔｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ  ｓｉｔｅ）．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３５：４６０２−７、が含まれる。また、「タンパク質アレイ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｒｒａｙｓ）」のタイトルの米国特許公開第２００４／０１９８６３７号を参照されたい。この特許は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０２７０】
Ａ．カルボニル反応基
カルボニル反応基を有するアミノ酸は、特に、求核付加またはアルドール縮合反応を介して、分子（限定されないが、ＰＥＧまたは他の水溶性分子を含む）に連結するための種々の反応を可能とする。
【０２７１】
代表的なカルボニル含有アミノ酸は、以下のように表すことができる：
【化４１】
0006054294.tif 000042
式中、
ｎは、０〜１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル、または置換アリールであり；Ｒ２は、Ｈ、アルキル、アリール、置換アルキル、および置換アリールであり；Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり、さらにＲ４は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である。一部の実施形態では、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、Ｒ２は、単純アルキル（すなわち、メチル、エチル、またはプロピル）であり、ケトン成分は、アルキル側鎖に対してパラ位置に配置される。一部の実施形態では、ｎは１であり、Ｒ１は、フェニルであり、Ｒ２は、単純アルキル（すなわち、メチル、エチル、またはプロピル）であり、さらにケトン成分は、ケトン成分は、アルキル側鎖に対してメタ位置に配置される。
【０２７２】
ｐ−アセチル−（＋／−）−フェニルアラニンおよびｍ−アセチル−（＋／−）−フェニルアラニンの合成については、Ｚｈａｎｇ、Ｚ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２：６７３５−６７４６（２００３）に記載されている。この文献は、参照によって本明細書に組み込まれる。他のカルボニル含有アミノ酸は、当業者なら同様に調製できる。
【０２７３】
一部の実施形態では、天然ではコードされないアミノ酸を含むポリペプチドは、化学的に改変されて反応性カルボニル官能基を生成する。例えば、コンジュゲーションに有用なアルデヒド官能性は、隣接アミノおよびヒドロキシル基を有する官能性から生成できる。例えば、生物学的に活性な分子がポリペプチドの場合は、Ｎ末端セリンまたはトレオニン（普通に存在しても、化学または酵素消化により露出されてもよい）は、軽度の酸化的切断条件下で過ヨウ素酸塩を使ってアルデヒド官能性を生成するために使用できる。例えば、Ｇａｅｒｔｎｅｒ、ｅｔ  ａｌ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．３：２６２−２６８（１９９２）；Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ、Ｋ．＆  Ｓｔｒｏｈ、Ｊ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．３：１３８−１４６（１９９２）；Ｇａｅｒｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２６９：７２２４−７２３０（１９９４）、を参照されたい。しかし、当技術分野で既知の方法は、ペプチドまたはタンパク質のＮ末端にあるアミノ酸に限定される。
【０２７４】
本発明では、隣接ヒドロキシルおよびアミノ基を有する天然ではコードされないアミノ酸は、「マスクされた」アルデヒド官能性としてポリペプチド中に組み込むことができる。例えば、５−ヒドロキシリシンは、ε−アミンに隣接するヒドロキシル基を有する。アルデヒドを生成する反応条件は、通常、ポリペプチド内の他の部位での酸化を避けるために、軽度の条件下、モル過剰のメタ過ヨウ素酸ナトリウムの添加を含む。酸化反応のｐＨは、通常、約７．０である。典型的な反応は、約１．５モル過剰のメタ過ヨウ素酸ナトリウムのポリペプチド緩衝溶液への添加と、それに続く、暗所での約１０分間のインキュベーションを含む。例えば、米国特許第６，４２３，６８５号を参照のこと。この特許は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０２７５】
カルボニル官能性は、水溶液中で、軽度の条件下、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、またはセミカルバジド含有試薬と、選択的に反応して、それぞれ、対応する生理学的条件で安定なヒドラゾン、オキシム、またはセミカルバゾン結合を形成できる。例えば、Ｊｅｎｃｋｓ、Ｗ．Ｐ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８１、４７５−４８１（１９５９）；Ｓｈａｏ、Ｊ．ａｎｄ  Ｔａｍ、Ｊ．Ｐ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：３８９３−３８９９（１９９５）を参照されたい。さらに、カルボニル基特有の反応性により、他のアミノ酸側鎖の存在下で選択的改変が可能となる。例えば、Ｃｏｒｎｉｓｈ、Ｖ．Ｗ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８：８１５０−８１５１（１９９６）；Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ、Ｋ．Ｆ．＆  Ｓｔｒｏｈ、Ｊ．Ｇ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．３：１３８−１４６（１９９２）；Ｍａｈａｌ、Ｌ．Ｋ．、ｅｔ  ａｌ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６：１１２５−１１２８（１９９７）を参照されたい。
【０２７６】
Ｂ．ヒドラジン、ヒドラジドまたはセミカルバジド反応基
求核基、例えば、ヒドラジン、ヒドラジドまたはセミカルバジドを含む天然ではコードされないアミノ酸は、種々の求電子基（限定されないが、ＰＥＧまたは他の水溶性ポリマー等）と反応して、コンジュゲートを形成することを可能とする。
【０２７７】
代表的ヒドラジン、ヒドラジドまたはセミカルバジド含有アミノ酸は、下記のように表すことができる：
【化４２】
0006054294.tif 000043
式中、
ｎは、０〜１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル、もしくは置換アリールであるか、または存在せず；Ｘは、Ｏ、Ｎ、もしくはＳであるか、または存在せず；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり、さらにＲ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である。
【０２７８】
一部の実施形態では、ｎは４であり、Ｒ１は存在せず、ＸはＮである。一部の実施形態では、ｎは２であり、Ｒ１は存在せず、さらにＸは存在しない。一部の実施形態では、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、ＸはＯであり、さらに酸素原子は、アリール環上の脂肪族基に対し、パラ位置に配置される。
【０２７９】
ヒドラジド、ヒドラジン、およびセミカルバジド含有アミノ酸は、市販メーカーから入手可能である。例えば、Ｌ−グルタメート−γ−ヒドラジドは、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から入手可能である。市販されていない他のアミノ酸は、当業者なら調製可能である。例えば、米国特許第６，２８１，２１１号参照のこと。この特許は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０２８０】
ヒドラジド、ヒドラジンまたはセミカルバジド官能性を有する天然ではコードされないアミノ酸を含むポリペプチドは、アルデヒドまたは他の類似の化学反応性を有する官能基を含む種々の分子と効率的かつ選択的に反応できる。例えば、Ｓｈａｏ、Ｊ．ａｎｄ  Ｔａｍ、Ｊ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：３８９３−３８９９（１９９５）を参照されたい。ヒドラジド、ヒドラジンおよびセミカルバジド官能基の特有の反応性により、２０共通アミノ酸に存在する求核基（限定されないが、セリンもしくはトレオニンのヒドロキシル基、またはリシンもしくはＮ末端のアミノ基を含む）に比べて、アルデヒド、ケトンおよび他の求電子基に対し非常に反応しやすくなる。
【０２８１】
Ｃ．アミノオキシ含有アミノ酸
アミノオキシ（ヒドロキシルアミンとも呼ばれる）基を含む天然ではコードされないアミノ酸は、種々の求電子基（限定されないが、ＰＥＧまたは他の水溶性ポリマー等）と反応してコンジュゲートの形成を可能とする。ヒドラジン、ヒドラジドおよびセミカルバジドのように、アミノオキシ基の強化された求核性により、アルデヒドまたは類似の化学反応性を有する他の官能基を含む種々の分子と効率的かつ選択的に反応することが可能となる。例えば、Ｓｈａｏ、Ｊ、ａｎｄ  Ｔａｍ、Ｊ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：３８９３−３８９９（１９９５）；Ｈ．Ｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｃ．Ｂｅｒｔｏｚｚｉ、Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．３４：７２７−７３６（２００１）を参照されたい。ヒドラジン基との反応の結果は、対応するヒドラゾンであるのに対して、オキシムは、一般的に、アミノオキシ基とカルボニル含有基、例えば、ケトンとの反応により得られる。
【０２８２】
アミノオキシ基を含む代表的アミノ酸は、以下のように表すことができる：
【化４３】
0006054294.tif 000044
式中、
ｎは０〜１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル、または置換アリールであるか、または存在せず；Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであるか、または存在せず；ｍは０〜１０であり；Ｙ＝Ｃ（Ｏ）であるか、または存在せず；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり、Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である。一部の実施形態では、ｎは１であり、Ｒ１は、フェニルであり、Ｘは、Ｏであり、ｍは１であり、さらにＹは、存在する。一部の実施形態では、ｎは２であり、Ｒ１およびＸは存在せず、ｍは０であり、さらにＹは存在しない。
【０２８３】
アミノオキシ含有アミノ酸は、容易に入手可能なアミノ酸前駆物質（ホモセリン、セリンおよびトレオニン）から調製できる。例えば、Ｍ．Ｃａｒｒａｓｃｏ  ａｎｄ  Ｒ．Ｂｒｏｗｎ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６８：８８５３−８８５８（２００３）を参照されたい。特定のアミノオキシ含有アミノ酸、例えば、Ｌ−２−アミノ−４−（アミノオキシ）酪酸）は、天然ソースから単離された（Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ、Ｇ．、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ、６０：１６３５−１６４１（１９９７））。他のアミノオキシ含有アミノ酸は、当業者により調製可能である。
【０２８４】
Ｄ．アジドおよびアルキン反応基
アジドおよびアルキン官能基の特有の反応性により、これら官能基がポリペプチドおよび他の生物学的分子の選択的改変にとって非常に有用になる。一般的に、有機アジド、特に脂肪族アジド、およびアルキンは、通常の化学的反応条件に対し安定である。特に、アジドおよびアルキン官能基の両方は、天然ポリペプチドに認められる２０共通アミノ酸の側鎖（すなわち、Ｒ基）に対し不活性である。しかし、近接近すると、アジドおよびアルキン基の「バネ荷重」の性質が現れ、それらは、選択的かつ効率的に反応し、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化反応により、対応するトリアゾールを生成する。例えば、Ｃｈｉｎ    Ｊ．、ｅｔａｌ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１：９６４−７（２００３）；Ｗａｎｇ、Ｑ．、ｅｔ  ａｌ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５、３１９２−３１９３（２００３）；Ｃｈｉｎ、Ｊ．Ｗ．、ｅｔ  ａｌ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：９０２６−９０２７（２００２）、を参照されたい。
【０２８５】
Ｈｕｉｓｇｅｎ付加環化反応は、求核置換よりは、選択的付加環化反応（例えば、Ｐａｄｗａ、Ａ．、総合有機合成（Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、Ｖｏｌ、４、（ｅｄ．Ｔｒｏｓｔ、Ｂ、Ｍ．、１９９１）、ｐ、１０６９−１１０９；Ｈｕｉｓｇｅｎ、Ｒ．、１、３−双極性付加環化化学（１、３−Ｄｉｐｏｌａｒ  Ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、（ｅｄ、Ｐａｄｗａ、Ａ．、１９８４）、ｐ．１−１７６）を伴うので、アジドおよびアルキン含有側鎖を有する天然ではコードされないアミノ酸の組込みは、生成されたポリペプチドを天然ではコードされないアミノ酸の位置で選択的に改変することを可能にする。アジドまたはアルキン含有レラキシンポリペプチドを含む付加環化反応は、室温で水性の条件下、Ｃｕ（ＩＩ）をＣｕ（Ｉ）に還元する触媒量の還元剤の存在下、Ｃｕ（ＩＩ）（限定されないが、触媒量のＣｕＳＯ４の形を含む）のインサイツ添加により行うことができる。例えば、Ｗａｎｇ、Ｑ．、ｅｔ  ａｌ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５、３１９２−３１９３（２００３）；Ｔｏｒｎｏｅ、Ｃ．Ｗ．、ｅｔ  ａｌ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６７：３０５７−３０６４（２００２）；Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖ、ｅｔ  ａｌ．、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４１：２５９６−２５９９（２００２）を参照されたい。代表的還元剤には、限定されないが、アスコルビン酸塩、金属銅、キニーネ、ヒドロキノン、ビタミンＫ、グルタチオン、システイン、Ｆｅ２＋、Ｃｏ２＋、および印加電圧が含まれる。
【０２８６】
一部の例では、アジドおよびアルキン間のＨｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化反応が所望の場合は、レラキシンポリペプチドは、アルキン成分を含む天然ではコードされないアミノ酸を含み、さらに、アミノ酸に結合される水溶性ポリマーはアジド成分を含む。あるいは、逆の反応（すなわち、アミノ酸上のアジド成分および水溶性ポリマー上に存在するアルキン成分の反応）も、また、行うことができる。
【０２８７】
アジド官能基は、また、アリールエステル含有水溶性ポリマーと選択的に反応させ、アリールホスフィン成分で適切に官能性を持たせて、アミド結合を生成させることができる。アリールホスフィン基は、アジドをインサイツ還元し、得られたアミンは、効率的に近くのエステル結合と反応し、対応するアミドを生成する。例えば、Ｅ．Ｓａｘｏｎ  ａｎｄ  Ｃ．Ｂｅｒｔｏｚｚｉ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７、２００７−２０１０（２０００）を参照されたい。アジド含有アミノ酸は、アルキルアジド（限定されないが、２−アミノ−６−アジド−１−ヘキサン酸を含む）であっても、アリールアジド（ｐ−アジドフェニルアラニン）であってもよい。
【０２８８】
アリールエステルおよびホスフィン成分を含む代表的水溶性ポリマーは、以下のように表すことができる：
【化４４】
0006054294.tif 000045
式中、
Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓまたは存在しなくてもよく、Ｐｈはフェニル、Ｗは水溶性ポリマーであり、Ｒは、Ｈ、アルキル、アリール、置換アルキルおよび置換アリール基であってもよい。代表的Ｒ基には、限定されないが、−ＣＨ２、−Ｃ（ＣＨ３）３、−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ”、−ＳＲ’、−ハロゲン、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ”、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ”、−ＣＮおよび−ＮＯ２が含まれる。Ｒ’、Ｒ”、Ｒ’”およびＲ””は、それぞれ独立に、水素、置換または未置換ヘテロアルキル、１〜３ハロゲン置換アリールを含む置換または未置換アリール、置換または未置換アルキル、アルコキシまたはチオアルコキシ基、またはアリールアルキル基を指す。例えば、本発明の化合物が２つ以上のＲ基を含む場合は、それぞれのＲ基は、独立に、２つ以上のＲ’、Ｒ”、Ｒ’”およびＲ””基が存在する場合の、それぞれ、Ｒ’、Ｒ”、Ｒ’”およびＲ””基であるとして選択される。Ｒ’およびＲ”が同じ窒素原子に結合される場合は、それらは窒素原子と組み合わされて、５、６、または７員環を形成する。例えば、−ＮＲ’Ｒ”は、限定されないが、１−ピロリジニルおよび４−モルフォリニルを含むことを意味する。置換基の上記考察から、当業者なら、用語の「アルキル」は、水素基以外の基、例えば、ハロアルキル（限定されないが、−ＣＦ３およびＣＨ２ＣＦ３を含む）およびアシル（限定されないが、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３、等を含む）に結合した炭素原子を含む基を包含することが意図されていることを理解するであろう。
【０２８９】
アジド官能基は、また、チオエステル含有水溶性ポリマーと選択的に反応し、アリールホスフィン成分により適切に官能化され、アミド結合を生成することができる。アリールホスフィン基は、アジドをインサイツ還元し、得られたアミンは、チオエステル結合と効率的に反応し、対応するアミドを生成できる。
【０２９０】
チオエステルおよびホスフィン成分を含む代表的水溶性ポリマーは、下記のように表すことができる：
【化４５】
0006054294.tif 000046
式中、
ｎは、１〜１０であり；Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであっても、または存在しなくてもよく、Ｐｈはフェニルであり、Ｗは水溶性ポリマーである。
【０２９１】
代表的アルキン含有アミノ酸は、下記のように表すことができる：
【化４６】
0006054294.tif 000047
式中、
ｎは、０〜１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル、または置換アリールであるか、または存在せず；Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであるか、または存在せず；ｍは、０〜１０であり、Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基、およびＲ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である。一部の実施形態では、ｎは１、Ｒ１はフェニル、Ｘは存在せず、ｍは０であり、さらにアセチレン成分は、アルキル側鎖に対しパラ位置に配置される。一部の実施形態では、ｎは１、Ｒ１はフェニル、ＸはＯ、ｍは１であり、さらに、プロパルギルオキシ基は、アルキル側鎖（すなわち、Ｏ−プロパルギルチロシン）に対しパラ位置に配置される。一部の実施形態では、ｎは１、Ｒ１およびＸは存在せず、さらに、ｍは０（すなわち、プロパルギルグリシン）である。
【０２９２】
アルキン含有アミノ酸は、市販されている。例えば、プロパルギルグリシンは、Ｐｅｐｔｅｃｈ（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）から市販されている。あるいは、アルキン含有アミノ酸は、標準的方法により調製できる。例えば、ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニンは、例えば、Ｄｅｉｔｅｒｓ、Ａ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ａｍ、Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５：１１７８２−１１７８３（２００３）、に記載のように合成でき、４−アルキニル−Ｌ−フェニルアラニンは、Ｋａｙｓｅｒ、Ｂ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５３（７）：２４７５−２４８４（１９９７）、に記載のように合成できる。他のアルキン含有アミノ酸は、当業者なら調製できる。
【０２９３】
代表的アジド含有アミノ酸は、下記のように表すことができる：
【化４７】
0006054294.tif 000048
式中、
ｎは、０〜１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル、置換アリールであるか、または存在せず；Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであるか、または存在せず；ｍは、０〜１０であり；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり、さらにＲ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である。一部の実施形態では、ｎは１、Ｒ１はフェニル、Ｘは存在せず、ｍは０であり、さらに、アジド成分は、アルキル側鎖に対しパラ位置に配置される。一部の実施形態では、ｎは、０〜４であり、Ｒ１およびＸは、存在せず、さらにｍ＝０である。一部の実施形態では、ｎは１、Ｒ１はフェニル、ＸはＯ、ｍは２であり、さらに、（β−アジドエトキシ成分は、アルキル側鎖に対してパラ位置に配置される。
【０２９４】
アジド含有アミノ酸は、市販ソースから入手可能である。例えば、４−アジドフェニルアラニンは、Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ．（Ｗｏｏｄ  Ｄａｌｅ、ＩＬ）から入手可能である。市販されていないアジド含有アミノ酸に対しては、アジド基は、適切な脱離基（限定されないが、ハロゲン化物、メシラート、トシラート）の変位、または適切に保護されたラクトンの開口、等の当業者に既知の標準的方法を使って比較的容易に調製可能である。例えば、Ｍａｒｃｈによる先進有機化学（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）（Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９８５、Ｗｉｌｅｙａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、を参照されたい。
【０２９５】
Ｅ．アミノチオール反応基
ベータ置換アミノチオール官能基の特有の反応性のために、チアゾリジンの形成を介したアルデヒド基含有ポリペプチドおよび他の生物学的分子の選択的改変にとって、それらの基が非常に有益なものになっている。例えば、Ｊ．Ｓｈａｏ  ａｎｄ  Ｊ．Ｔａｍ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９５、１１７（１４）３８９３−３８９９、を参照されたい。一部の実施形態では、ベータ置換アミノチオールアミノ酸は、レラキシンポリペプチドに組み込まれ、その後、アルデヒド官能性を含む水溶性ポリマーと反応できる。一部の実施形態では、水溶性ポリマー、薬剤コンジュゲートまたは他の薬剤は、チアゾリジンの形成を介してベータ置換アミノチオールアミノ酸を含むレラキシンポリペプチドと結合できる。
【０２９６】
Ｆ．追加の反応基
限定されないが、パラアミノフェニルアラニンを含む本発明のレラキシンポリペプチドに組み込み可能な追加の反応基および天然ではコードされないアミノ酸は、下記の特許出願（これらは、全て参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている：米国特許公開第２００６／０１９４２５６号、同２００６／０２１７５３２号、同２００６／０２１７２８９号、同６０／７５５，３３８号；米国特許仮出願第６０／７５５，７１１号；同６０／７５５，０１８号；国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０６／４９３９７号；国際公開第２００６／０６９２４６号；米国特許仮出願第６０／７４３，０４１号；米国特許仮出願第６０／７４３，０４０号；国際公開第ＰＣＴ／ＵＳ０６／４７８２２号；米国特許仮出願第６０／８８２，８１９号；米国特許仮出願第６０／８８２，５００号；および米国特許仮出願第６０／８７０，５９４号。これらの出願は、また、限定されないが、コンジュゲーション用のヒドロキシルアミン（アミノオキシ）基を含むＰＥＧまた他のポリマー上に存在してもよい反応基についても考察している。
【０２９７】
細胞による非天然アミノ酸の取込
非天然アミノ酸の細胞取込は、非天然アミノ酸を設計・選択する場合に、限定されないが、タンパク質中への組込み、等のために通常考慮されるべき１つの課題である。例えば、α−アミノ酸の高電荷密度は、これらの化合物が細胞浸透性でありそうもないことを示唆している。天然アミノ酸は、タンパク質ベース輸送系の一群を介して真核細胞中に取り込まれる。どの非天然アミノ酸（もしあれば）を細胞に取り込むべきかの迅速選別を行うことができる。例えば、「タンパク質アレイ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｒｒａｙｓ）」のタイトルの米国特許公開第２００４／０１９８６３７号（参照によって本明細書に組み込まれる）；およびＬｉｕ、Ｄ．Ｒ、＆  Ｓｃｈｕｌｔｚ、Ｐ．Ｇ．（１９９９）、拡張遺伝コードを有する生物の進化に向けた進展（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｔｏｗａｒｄ  ｔｈｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｏｒｇａｎｉｓｍ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ）．ＰＮＡＳ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ９６：４７８０−４７８５、中の毒性アッセイを参照されたい。取込は、種々のアッセイにより分析されるが、細胞取込経路に受け入れられる非天然アミノ酸の設計に対する選択肢は、アミノ酸をインビボで生成する生合成経路を提供することである。
【０２９８】
非天然アミノ酸の生合成
多くの生合成経路は、アミノ酸および他の化合物生成のために、細胞中に既に存在する。特定の非天然アミノ酸のための生合成方法は、限定されないが細胞中を含む天然には存在しない可能性があるが、本発明は、このような方法を提供する。例えば、非天然アミノ酸用生合成経路は、任意選択で、新規酵素の添加または既存宿主細胞経路を変えることにより、宿主細胞中で生成される。追加の新規酵素は、任意選択で、天然酵素または人工的に創出した酵素であってもよい。例えば、ｐ−アミノフェニルアラニンの生合成は（「非天然アミノ酸のインビボ組み込み（Ｉｎｖｉｖｏ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ）」のタイトルの国際公開第２００２／０８５９２３号中の実施例で示されるように）、他の生物由来の既知の酵素の組み合わせの添加に依存している。これらの酵素の遺伝子は、遺伝子含有プラスミドによる細胞の形質転換により真核生物中に導入できる。細胞中で発現した場合、遺伝子は、所望の化合物を合成する酵素経路を提供する。任意選択で添加してもよい酵素の型の例は、下記の例で提供される。追加の酵素配列は、例えば、ジェンバンク中に見出すことができる。人工的創出酵素も、また、任意選択で、同様に細胞中に添加してもよい。この方法では、細胞機構および細胞資源は、操作されて非天然アミノ酸を産生する。
【０２９９】
生合成経路または既存経路の進化に使用するための新規酵素産生用として種々の方法が利用可能である。例えば、限定されないが、Ｍａｘｙｇｅｎ、Ｉｎｃ．（Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂのｍａｘｙｇｅｎ．ｃｏｍから利用可能）により開発されたような再帰的組換えが、任意選択で、新規酵素および経路を開発するために使用可能である。例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）、タンパク質のＤＮＡシャフリングによる急速インビトロ進化（Ｒａｐｉｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）、Ｎａｔｕｒｅ  ３７０（４）：３８９−３９１；および、Ｓｔｅｍｍｅｒ、（１９９４）、ランダム断片化および再構築によるＤＮＡシャフリング：分子進化のためのインビトロ組換え（ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｂｙ  ｒａｎｄｏｍ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ：Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、９１：１０７４７−１０７５１、を参照されたい。同様に、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ（Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂのｇｅｎｅｎｃｏｒ．ｃｏｍから利用可能）により開発されたＤｅｓｉｇｎＰａｔｈ（登録商標）は、限定されないが、細胞中のＯ−メチル−Ｌ−チロシンを生成するための経路操作を含む代謝経路操作に使用される。この技術は、限定されないが、機能ゲノミクス、ならびに分子進化および設計により特定されるものを含む新規遺伝子の組み合わせを使って、宿主生物中の既存経路を再構築する。Ｄｉｖｅｒｓａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ  のｄｉｖｅｒｓａ．ｃｏｍから利用できる）は、また、限定されないが、新規経路を生成用の急速遺伝子選別ライブラリーおよび遺伝子経路のための技術を提供する。
【０３００】
典型的には、本発明の操作生合成経路を使って産生された非天然アミノ酸は、限定されないが、天然細胞量であるが、他のアミノ酸の濃度に影響しない、または細胞資源を消耗しない程度の効率的タンパク質生合成に充分な濃度で産生される。この方式でインビボで産生される典型定期な濃度は、約１０ｍＭ〜約０．０５ｍＭである。特異的経路に対し望ましい酵素を産生するために使用される遺伝子を含むプラスミドを使って細胞が形質転換され、非天然アミノ酸が生成されるとすぐに、任意選択でインビボ選択を使ってリボソームでのタンパク質合成および細胞増殖の両方用の非天然アミノ酸の産生がさらに最適化される。
【０３０１】
非天然アミノ酸を有するポリペプチド
非天然アミノ酸の組み込みは、種々の目的のために行うことができ、これには、限定されないが、タンパク質構造および／または機能を目的に合わせて変更すること、サイズ、酸性度、求核性、水素結合、疎水性、プロテアーゼ標的部位のアクセシビリティー、成分の標的化（限定されないが、タンパク質アレイのため、を含む）、生物学的に活性な分子の付加、ポリマーの結合、放射性核種の結合、血清半減期の調節、組織浸透の調節（例えば、腫瘍）、活性輸送の調節、組織の調節、細胞もしくは器官特異性または分布、免疫原性の調節、プロテアーゼ抵抗性の調節、等を変更すること、が含まれる。非天然アミノ酸を含むタンパク質は、強化された、またはさらに完全に新規触媒的または生理学的特性を持つことができる。例えば、非天然アミノ酸のタンパク質中への包含により以下の特性が任意選択で変更される：毒性、体内分布、構造特性、分光学的特性、化学および／または光化学的特性、触媒能力、半減期（限定されないが、血清半減期を含む）、限定されないが、共有結合または非共有結合で他の分子と反応する能力、等。少なくとも１つの非天然アミノ酸を含むタンパク質を含む組成物は、限定されないが、新規治療薬、診断薬、触媒的酵素、産業用酵素、結合タンパク質（限定されないが、抗体を含む）、および限定されないが、タンパク質構造および機能の研究、に有用である。例えば、Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ、（２０００）、タンパク質構造および機能のプローブとしての非天然アミノ酸（Ｕｎｎａｔｕｒａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｓ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、４：６４５−６５２、を参照されたい。
【０３０２】
本発明の一態様では、組成物は、少なくとも１つの、限定されないが、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、少なくとも６つの、少なくとも７つの、少なくとも８つの、少なくとも９つの、または少なくとも１０以上の非天然アミノ酸を有する少なくとも１つのタンパク質を含む。非天然アミノ酸は、同じでも、異なってもよく、限定されないが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上の異なる非天然アミノ酸を含むタンパク質中に１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上の異なる部位があってもよい。別の態様では、組成物は、タンパク質中に存在する少なくとも１つの、しかし全部よりは少ない特定のアミノ酸を有するタンパク質を含む組成物が、非天然アミノ酸で置換される。２つ以上の非天然アミノ酸を有する所与のタンパク質に対し、非天然アミノ酸は、同じでも異なってもよい（限定されないが、タンパク質は、２つ以上の異なる型の非天然アミノ酸、または２つの同じ非天然アミノ酸を含んでもよい）。３つ以上の非天然アミノ酸を有する所与のタンパク質に対し、非天然アミノ酸は、同じであっても、異なっていても、または少なくとも１つの異なる非天然アミノ酸を含む同じ種類の複数の非天然アミノ酸の組み合わせであってもよい。
【０３０３】
少なくとも１つの非天然アミノ酸を有する対象タンパク質またはポリペプチドは、本発明の特徴である。本発明は、また、本発明の組成物と方法を使って産生された少なくとも１つの非天然アミノ酸を有するポリペプチドまたはタンパク質を含む。賦形剤（限定されないが、薬学的に許容可能な賦形剤を含む）もまた、タンパク質と一緒に存在してもよい。
【０３０４】
少なくとも１つの非天然アミノ酸を有する対象タンパク質またはポリペプチドを真核細胞中で産生することにより、タンパク質またはポリペプチドは、通常、真核生物の翻訳後修飾を含むことになる。特定の実施形態では、タンパク質は、少なくとも１つの非天然アミノ酸および少なくとも１つの真核細胞によりインビボで作られた翻訳後修飾を含み、この翻訳後修飾は、原核細胞によっては行われない。例えば、翻訳後修飾は、限定されないが、アセチル化、アシル化、脂質修飾、パルミチン酸化、パルミタート付加、リン酸化、糖脂質結合修飾、グリコシル化、等を含む。一態様では、翻訳後修飾は、ＧｌｃＮＡｃ−アスパラギン結合によるアスパラギンへのオリゴ糖（限定されないが、（ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ）２−Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ）を含む）の結合を含む。真核生物のタンパク質のＮ結合型オリゴ糖（追加の残基が存在してもよく、これは示されていない）の一部の例を挙げている表１を参照されたい。別の態様では、翻訳後修飾は、ＧａｌＮＡｃ−セリンもしくはＧａｌＮＡｃ−トレオニン結合、またはＧｌｃＮＡｃ−セリンもしくはＧｌｃＮＡｃ−トレオニン結合による、オリゴ糖（限定されないが、Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ、等）のセリンまたはトレオニンへの結合を含む。
【表１】
0006054294.tif 000049
【０３０５】
さらに別の態様では、翻訳後修飾は、前駆物質（限定されないが、カルシトニン前駆物質、カルシトニン遺伝子関連ペプチド前駆物質、プレプロ副甲状腺ホルモン、プレプロインシュリン、プロインシュリン、プレプロオピオメラノコルチン、プロオピオメラノコルチン、等を含む）のタンパク分解処理、多サブユニットタンパク質への構築または高分子の構築、細胞内の別の部位に対する翻訳（限定されないが、オルガネラ、例えば、小胞体、ゴルジ装置、核、リソソーム、ペルオキシソーム、ミトコンドリア、葉緑体、液胞、等、または分泌経路経由を含む）を含む。特定の実施形態では、タンパク質は、分泌または局在化配列、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリスチジンタグ、ＧＳＴ融合体、等を含む。
【０３０６】
非天然アミノ酸の１つの利点は、追加の分子を付加するために使用できる追加の化学成分を与えるということである。これらの改変は、真核生物または非真核細胞中でインビボで、またはインビトロで行うことができる。従って、特定の実施形態では、翻訳後修飾は、非天然アミノ酸を経由する。例えば、翻訳後修飾は、求核−求電子の反応を経由することができる。最近では、タンパク質選択的改変に使われるほとんどの反応は、限定されないが、α−ハロケトンとヒスチジンまたはシステイン側鎖の反応を含む求核および求電子反応相手の間の共有結合形成を含む。これらの場合の選択性は、タンパク質中の求核残基の数とアクセシビリティーにより測定できる。本発明のタンパク質では、非天然ケトアミノ酸のヒドラジドまたはアミノオキシ化合物とのインビトロおよびインビボでの反応、等の他のより選択性の高い反応を使うことができる。例えば、Ｃｏｒｎｉｓｈ、ｅｔ  ａｌ．、（１９９６）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１８：８１５０−８１５１；Ｍａｈａｌ、ｅｔ  ａｌ．、（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７６：１１２５−１１２８；Ｗａｎｇ、ｅｔ  ａｌ．、（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：４９８−５００；Ｃｈｉｎ、ｅｔ  ａｌ．、（２００２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：９０２６−９０２７；Ｃｈｉｎ、ｅｔ  ａｌ．、（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９９：１１０２０−１１０２４；Ｗａｎｇ、ｅｔ  ａｌ．、（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１００：５６−６１；Ｚｈａｎｇ、ｅｔ  ａｌ．、（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４２：６７３５−６７４６；および、Ｃｈｉｎ、ｅｔ  ａｌ．、（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０１：９６４−７、を参照されたい。これら全ては、参照によって本明細書に組み込まれる。これは、フルオロフォア、架橋薬剤（病原体）、サッカライド誘導体および細胞障害性分子等の試薬を含む宿主を使った、実質的に全てのタンパク質の選択的標識を可能とする。また、「糖タンパク質合成（Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」のタイトルの米国特許第６、９２７、０４２号（参照によって本明細書に組み込まれる）。限定されないが、アジドアミノ酸経由を含む翻訳後修飾は、また、Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ連結反応（限定されないが、トリアリールホスフィン試薬を使った）によっても行うことができる。例えば、Ｋｉｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．、（２００２）、Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ連結反応による化学選択的改変のための組換えタンパク質へのアジドの組込み（Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｚｉｄｅｓ  ｉｎｔｏ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ｃｈｅｍｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ  ｌｉｇａｔｉｏｎ）、ＰＮＡＳ  ９９：１９−２４、を参照されたい。
【０３０７】
本発明は、タンパク質の選択的改変のための高度に効率的な別の方法を提供し、この方法は、限定されないが、セレクターコドンに応答したアジドまたはアルキニル成分のタンパク質中への組込みを含む非天然アミノ酸遺伝子の組み込みを含む。これらのアミノ酸側鎖は、次に、限定されないが、それぞれ、アルキニルまたはアジド誘導体等を用いた非限定的Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化反応（例えば、Ｐａｄｗａ、Ａ、：総合有機合成（Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、Ｖｏｌ．４、（１９９１）Ｅｄ．Ｔｒｏｓｔ、Ｂ．Ｍ．、Ｐｅｒｇａｍｏｎ、Ｏｘｆｏｒｄ、ｐ．１０６９−１１０９；および、Ｈｕｉｓｇｅｎ、Ｒ．：１、３−双極性付加環化化学（１、３−Ｄｉｐｏｌａｒ  Ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、（１９８４）Ｅｄ．Ｐａｄｗａ、Ａ．、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐ．１−１７６）により改変できる。この方法は、求核置換よりも付加環化を伴うため、タンパク質は、非常に高い選択性で改変されうる。この反応は、室温の水性条件下、反応混合物に触媒量のＣｕ（Ｉ）塩の添加により、優れた位置選択性（１、４＞１、５）を伴って行うことができる。例えば、Ｔｏｒｎｏｅ、ｅｔ  ａｌ．、（２００２）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６７：３０５７−３０６４；および、Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖ、ｅｔ  ａｌ．、（２００２）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４１：２５９６−２５９９、を参照されたい。使用可能な別の方法は、テトラシステインモチーフを使ったビスヒ素化合物上のリガンド交換である。例えば、Ｇｒｉｆｆｉｎ、ｅｔ  ａｌ．、（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：２６９−２７２、を参照されたい。
【０３０８】
［３＋２］付加環化により本発明のタンパク質に付加できる分子は、アジドまたはアルキニル誘導体を有する実質的に全ての分子を含む。分子には、限定されないが、色素、フルオロフォア、架橋剤、サッカライド誘導体、ポリマー（限定されないが、ポリエチレングリコールの誘導体を含む）、光架橋剤、細胞障害性化合物、親和標識、ビオチン誘導体、樹脂、ビーズ、第２のタンパク質またはポリペプチド（またはさらに多くの）、ポリヌクレオチド（限定されないがＤＮＡ、ＲＮＡ、等）、金属キレート、補助因子、脂肪酸、炭水化物、等が含まれる。これらの分子は、それぞれ、限定されないが、ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン等のアルキニル基を有する非天然アミノ酸、または限定されないが、ｐ−アジド−フェニルアラニン等のアジド基を有する非天然アミノ酸に付加するする事ができる。
【０３０９】
天然ではコードされないアミノ酸を含むレラキシンポリペプチドのインビボ生成
本発明のレラキシンポリペプチドは、天然系ではコードされないアミノ酸を付加または置換するために、改変ｔＲＮＡおよびｔＲＮＡシンテターゼを使って、インビボで生成できる。
【０３１０】
天然ではコードされないアミノ酸を使うｔＲＮＡおよびｔＲＮＡシンテターゼを生成するための方法が、例えば、米国特許第７，０４５，３３７号および同７，０８３，９７０号に記載されている。これらの特許は、参照によって本明細書に組み込まれる。これらの方法は、翻訳系に対して内在性であるシンテターゼおよびｔＲＮＡとは無関係に機能する（また、その故に、「直交性」と呼ばれることもある）翻訳機構の生成を含む。通常、翻訳系は、直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）および直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含む。通常、Ｏ−ＲＳが、翻訳系の少なくとも１つの非天然アミノ酸でＯ−ｔＲＮＡをアミノアシル化し、Ｏ−ｔＲＮＡが、系中の他のｔＲＮＡによっては認識されない少なくとも１つのセレクターコドンを認識することが好ましい。翻訳系は、従って、天然ではコードされないアミノ酸を、コードされたセレクターコドンに応答して、系中で産生されたタンパク質中に挿入し、それにより、アミノ酸を、コードポリペプチド中の位置に「置換する」。
【０３１１】
特定の合成アミノ酸をポリペプチド中に挿入するための、各種の直交性ｔＲＮＡおよびアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが当技術分野で記載されており、これらは、通常、本発明での使用に適する。例えば、ケト特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが、Ｗａｎｇ、Ｌ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１００：５６−６１（２００３）およびＺｈａｎｇ、Ｚ．ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．４２（２２）：６７３５−６７４６（２００３）、に記載されている。代表的Ｏ−ＲＳ、またはその一部は、ポリヌクレオチド配列によりコードされ、米国特許第７，０４５，３３７号および同７，０８３，９７０号（それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているアミノ酸配列を含む。Ｏ−ＲＳとの使用に対応するＯ−ｔＲＮＡ分子は、また、米国特許第７，０４５，３３７号および同７，０８３，９７０号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。Ｏ−ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ対のさらなる例は、は、国際公開第２００５／００７８７０号、同２００５／００７６２４号；および同２００５／０１９４１５号に記載されている。
【０３１２】
アジド特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ系の例は、Ｃｈｉｎ、Ｊ．Ｗ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：９０２６−９０２７（２００２）、に記載されている。ｐ−アジド−Ｌ−Ｐｈｅに対する代表的Ｏ−ＲＳ配列には、限定されないが、米国特許第７，０８３，９７０号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように配列番号１４〜１６および２９〜３２のヌクレオチド配列ならびに配列番号４６〜４８および６１〜６４のアミノ酸配列が含まれる。本発明での使用に適した代表的Ｏ−ｔＲＮＡ配列には、限定されないが、米国特許第７，０８３，９７０号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示のように配列番号１〜３のヌクレオチド配列が含まれる。特定の天然ではコードされないアミノ酸に特異的なＯ−ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ対の他の例は、米国特許第７，０４５，３３７号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。ケトおよびアジドの両方を含むアミノ酸を出芽酵母に組み込むＯ−ＲＳおよびＯ−ｔＲＮＡが、Ｃｈｉｎ、Ｊ．Ｗ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１：９６４−９６７（２００３）、に記載されている。
【０３１３】
他のいくつかの直交性対が、報告されている。出芽酵母ｔＲＮＡおよびシンテターゼ由来のグルタミニル（例えば、Ｌｉｕ、Ｄ．Ｒ．、ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ、Ｐ．Ｇ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：４７８０−４７８５、参照）、アスパルチル（例えば、Ｐａｓｔｒｎａｋ、Ｍ．、ｅｔ  ａｌ．、（２０００）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ８３：２２７７−２２８６、参照）、およびチロシル（田尾Ｏｈｎｏ、Ｓ．、ｅｔ  ａｌ．、（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ、Ｊｐｎ．）１２４：１０６５−１０６８；および、Ｋｏｗａｌ、Ａ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．、（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８：２２６８−２２７３、参照）系が、大腸菌への非天然アミノ酸の組み込みの可能性について記載されている。大腸菌グルタミニル（例えば、Ｋｏｗａｌ、Ａ．Ｋ．、ｅｔ  ａｌ．、（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８：２２６８−２２７３、参照）およびチロシル（例えば、Ｅｄｗａｒｄｓ、Ｈ．、ａｎｄ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌ、Ｐ、（１９９０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：１６３３−１６４１、参照）シンテターゼ由来系の出芽酵母中での使用に関し記載されている。大腸菌チロシル系は、３−ヨード−Ｌ−チロシンの哺乳動物細胞へのインビボ組込のために使用されている。Ｓａｋａｍｏｔｏ、Ｋ．、ｅｔ  ａｌ．、（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：４６９２−４６９９、参照。
【０３１４】
Ｏ−ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼの使用は、天然ではコードされないアミノ酸をコードする特異的コドンの選択を含む。いずれのコドンも使用可能であるが、Ｏ−ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼが発現する細胞中の、希な、または決して使用されないコドンを選択するのが望ましい。例えば、代表的コドンは、ナンセンスコドン、例えば、停止コドン（アンバー、オーカー、およびオパール）、４以上の塩基コドンおよび希な、または使用されない他の天然３塩基コドンを含む。
【０３１５】
特異的セレクターコドンは、当技術分野で既知の変異誘発方法（限定されないが、部位特異的変異誘発、カセット変異導入、制限部位選択変異導入法、等を含む）を使って、レラキシンポリヌクレオチドコード配列中の適切な位置に導入できる。
【０３１６】
タンパク質生合成機構の成分、例えば、天然ではコードされないアミノ酸を組み込むのに使用できるＯ−ＲＳ、Ｏ−ｔＲＮＡ、および直交性Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対の生成方法が、Ｗａｎｇ、Ｌ．、ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：４９８−５００（２００１）；Ｃｈｉｎ、Ｊ．Ｗ、ｅｔ  ａｌ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：９０２６−９０２７（２００２）；Ｚｈａｎｇ、Ｚ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２：６７３５−６７４６（２００３）、に記載されている。天然ではコードされないアミノ酸のインビボ組み込みのための方法と組成物は、米国特許第７，０４５，３３７号に記載されている。この特許は、参照によって本明細書に組み込まれる。生物のインビボ翻訳系で使用するための直交性ｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンテターゼ対の選択方法は、また、米国特許第７，０４５，３３７号および同７，０８３，９７０号に記載されている。この特許は、参照によって本明細書に組み込まれる。「ケトアミノ酸のタンパク質への部位特異的組み込み（Ｓｉｔｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｋｅｔｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」のタイトルの国際公開第０４／０３５７４３号（参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）は、ケトアミノ酸の組込み用の直交性ＲＳおよびｔＲＮＡ対について記載しており、「真核生物の遺伝コードの拡張（Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ）」のタイトルの国際公開第０４／０９４５９３号（参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）は、天然ではコードされないアミノ酸の、真核生物宿主細胞中への組込みのための直交性ＲＳおよびｔＲＮＡ対について記載している。
【０３１７】
少なくとも１つの組換え直交性アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）の産生方法は：（ａ）限定されないが原核生物、例えば、メタノコッカスジャナスキー、メタノバクテリウム・サーモアウトトロフィクス、ハロバクテリウム、ハロバクテリア、大腸菌、Ａ．フルギドゥス、Ｐ．フリオスス、Ｐ．ホリコシ、Ａ．ペルニクス、Ｔ．サーモフィルス、等、または真核生物、を含む第１の生物由来の少なくとも１つのアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）由来の（任意選択で、変異体）ＲＳのライブラリーを生成すること；（ｂ）天然ではコードされないアミノ酸および天然アミノ酸の存在下でＲＳ（任意選択で、変異体ＲＳ）のライブラリーから直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をアミノアシル化するメンバーを選択（および／または選別）し、それにより活性（任意選択で、変異体）ＲＳのプールを提供すること；および／または、（ｃ）天然ではコードされないアミノ酸が無い場合は、Ｏ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する活性ＲＳ（限定されないが、変異体ＲＳを含む）を、そのプールから選択（任意選択で、負の選択によって）し、それにより、少なくとも１つの組換えＯ−ＲＳを提供することを含み；ここで、少なくとも１つの組換えＯ−ＲＳが、天然ではコードされないアミノ酸を有するＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する。
【０３１８】
一実施形態では、ＲＳは、不活性ＲＳである。不活性ＲＳは、活性ＲＳを変異させることにより作製できる。例えば、不活性ＲＳは、少なくとも約１つ、少なくとも約２つ、少なくとも約３つ、少なくとも約４つ、少なくとも約５つ、少なくとも約６つ、または少なくとも約１０以上のアミノ酸を、限定されないがアラニンを含む異なるアミノ酸に変異させることにより作製できる。
【０３１９】
変異体ＲＳのライブラリーは、限定されないが、タンパク質３次元ＲＳ構造に基づく合理的な設計、またはランダムもしくは合理的な設計技術によるＲＳヌクレオチドの変異誘発、等の種々の当技術分野で既知の技術を使って作製できる。例えば、変異体ＲＳは、部位特異的変異、ランダム変異、多様性生成組換え変異、キメラ構築、合理的な設計および他の本明細書記載の方法または当技術分野で既知の方法により、作製できる。
【０３２０】
一実施形態では、ＲＳ（任意選択で、変異体ＲＳ）のライブラリーから、限定されないが、天然ではコードされないアミノ酸および天然アミノ酸の存在下で直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をアミノアシル化する活性なメンバーの選択（および／または選別）は、限定されないが、抗生物質耐性遺伝子、等を含む正の選択または選別マーカー、および（任意選択で、変異体）ＲＳのライブラリーの複数の細胞中への導入（ここで、正の選択および／または選別マーカーは、限定されないが、アンバー、オーカー、またはオパールコドンを含む少なく１つのセレクターコドンを含む）；選択薬剤の存在下、複数の細胞の増殖；選択および／または選別薬剤の存在下、正の選択または選別マーカーの少なくとも１つのセレクターコドンを抑制することによる、生存する（または特異的応答を示す）細胞の特定と、それによる、活性（任意選択で、変異体）ＲＳプールを含む正に選択された細胞サブセットの提供、を含む。任意選択で、選択および／または選別薬剤濃度は、変えることができる。
【０３２１】
一態様では、正の選択マーカーは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子であり、セレクターコドンは、ＣＡＴ遺伝子中のアンバー停止コドンである。任意選択で、正の選択マーカーは、β−ラクタマーゼ遺伝子であり、セレクターコドンは、β−ラクタマーゼ遺伝子中のアンバー停止コドンである。別の態様では正の選別マーカーは、蛍光または発光選別マーカーまたは親和性ベースの選別マーカー（限定されないが、細胞表面マーカーを含む）を含む。
【０３２２】
一実施形態では、天然ではコードされないアミノ酸が無い場合にＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する活性ＲＳ（任意選択で、変異体）のプールからの負の選択または選別は、正の選択または選別由来の活性（任意選択で、変異体）ＲＳのプールに対する負の選択または選別マーカーの第２の生物の複数の細胞への導入（ここで、負の選択または選別マーカーは、少なくとも１つのセレクターコドン（限定されないが、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、等の抗生物質耐性遺伝子を含む）を含む）；および、天然ではコードされないアミノ酸および選別または選択薬剤を補充した第１の培地中で生存するか、または特異的選別応答を示すが、しかし、天然ではコードされないアミノ酸および選別または選択薬剤を補充していない第２の培地中では、生存できないか、または特異的応答を示さない細胞の特定、および、それによる少なくとも１つの組換えＯ−ＲＳを有する生存細胞または選別された細胞の提供、を含む。
【０３２３】
例えば、ＣＡＴ特定プロトコルは、任意選択で、適切なＯ−ＲＳ組換え体の決定に際し、正の選択および／または負の選別として作用する。例えば、クローンのプールは、任意選択で、１つまたは複数の天然ではコードされないアミノ酸を含む場合と含まない場合について、ＣＡＴ（少なくとも１つのセレクターコドンを含む）を含む増殖プレート上で複製される。天然ではコードされないアミノ酸を含むプレート上でひたすら増殖するコロニーは、従って、組換えＯ−ＲＳを含むと見なされる。一態様では、選択（および／または選別）薬剤の濃度は変えられる。一部の態様では、第１および第２の生物は、異なり、従って、第１および／または第２の生物は、任意選択で、原核生物、真核生物、哺乳動物、大腸菌、真菌、酵母、古細菌、真正細菌、植物、昆虫、原生生物、等を含む。他の実施形態では、選別マーカーは、蛍光または発光選別マーカーまたは親和性ベース選別マーカーを含む。
【０３２４】
別の実施形態では、活性（任意選択で、変異体）ＲＳのプールの選別または選択（限定されないが、負の選択を含む）は、正の選択ステップ由来の活性変異体ＲＳプールの単離、（ｂ）；負の選択または選別マーカー（ここで、負の選択または選別マーカーは、少なくとも１つのセレクターコドン（限定されないが、毒性マーカー遺伝子、例えば、リボヌクレアーゼバルナーゼ遺伝子は、少なくとも１つのセレクターコドンを含む）を含む）、および活性（任意選択で、変異体）ＲＳのプールの、第２の生物の複数の細胞中への導入；ならびに天然ではコードされないアミノ酸を補充していない第１の培地中で生存するか、または特異的選別応答を示すが、しかし、天然ではコードされないアミノ酸を補充した第２の培地中では生存できないか、または特異的選別応答を示さない細胞の特定、および、それによる、少なくとも１つの組換えＯ−ＲＳを有する生存または選別細胞の提供、を含み、ここで、少なくとも１つの組換えＯ−ＲＳは、天然ではコードされないアミノ酸に特異的である。一態様では、少なくとも１つのセレクターコドンは、約２つ以上のセレクターコドンを含む。このような実施形態は、任意選択で、少なくとも１つのセレクターコドンが、２つ以上のセレクターコドンを含み、第１と第２の生物（限定されないが、それぞれ、生物が、任意選択で、原核生物、真核生物、哺乳動物、大腸菌、真菌、酵母、古細菌、真正細菌、植物、昆虫、原生生物、等を含む）が異なる場合を含んでもよい。また、一部の態様では、ネガティブ選択マーカーが、リボヌクレアーゼバルナーゼ遺伝子（少なくとも１つのセレクターコドンを含む）を含む場合が含まれる。他の態様は、選別マーカーが、任意選択で、蛍光または発光選別マーカーまたは親和性ベース選別マーカーを含む場合を含む。本明細書の実施形態では、選別および／または選択は、任意選択で、多様な選別および／または選択厳密性を含んでもよい。
【０３２５】
一実施形態では、少なくとも１つの組換え直交性アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）の産生方法は、（ｄ）少なくとも１つの組換えＯ−ＲＳの単離；（ｅ）少なくとも１つの組換えＯ−ＲＳ由来のＯ−ＲＳ（任意選択で、変異された）の第２セットの生成；および、（ｆ）優先的にＯ−ｔＲＮＡをアミノアシル化する能力を含む変異Ｏ−ＲＳが得られるまで、ステップ（ｂ）と（ｃ）の繰り返し、をさらに含んでもよい。任意選択で、ステップ（ｄ）〜（ｆ）は、限定されないが、少なくとも約２回、繰り返される。一態様では、組換えＯ−ＲＳ由来の変異Ｏ−ＲＳの少なくとも１つの第２セットは、限定されないが、ランダム変異誘発、部位特異的変異誘発、組換えまたはそれらの組み合わせを含む変異誘発により生成されうる。
【０３２６】
上記方法の、限定されないが、正の選択／選別ステップ（ｂ）、負の選択／選別ステップ（ｃ）または正および負の選択／選別ステップ（ｂ）と（ｃ）の両方の選択／選別ステップの厳密性については、任意選択で、多様な選択／選別厳密性を含んでもよい。別の実施形態では、正の選択／選別ステップ（ｂ）、負の選択／選別ステップ（ｃ）または正および負の選択／選別ステップ（ｂ）と（ｃ）の両ステップは、レポーターの使用を含み、レポーターは、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）または発光により検出される。任意選択で、レポーターは、細胞表面上、ファージディスプレイ上、等で提示され、天然ではコードされないアミノ酸または類似体に伴う親和性または触媒活性に基づいて選択される。一実施形態では、変異シンテターゼは、細胞表面上、ファージディスプレイ上、等で提示される。
【０３２７】
組換え直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）の産生方法は、（ａ）第１の生物由来の、限定されないが、サプレッサーｔＲＮＡ等の少なくとも１つのｔＲＮＡ由来の変異体ｔＲＮＡライブラリーの生成；（ｂ）第１の生物由来ＲＳが無い場合は、ライブラリーから第２の生物由来のアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）によりアミノアシル化される（任意選択で、変異体）ｔＲＮＡの選択（限定されないが、負の選択を含む）または選別、およびそれによるｔＲＮＡ（任意選択で、変異体）のプールの提供；ならびに、（ｃ）ｔＲＮＡ（任意選択で、変異体）プールからの、導入直交性ＲＳ（Ｏ−ＲＳ）によりアミノアシル化されるメンバーの選択または選別と、それによる、少なくとも１つの組換えＯ−ｔＲＮＡの提供；を含み、ここで、少なくとも１つの組換えＯ−ｔＲＮＡは、セレクターコドンを認識し、第２の生物由来ＲＳには効率的に認識されず、Ｏ−ＲＳにより優先的にアミノアシル化される。一部の実施形態では、少なくとも１つのｔＲＮＡは、サプレッサーｔＲＮＡであり、および／または天然および／または非天然塩基の特有の３塩基コドンを含み、またはナンセンスコドン、レアコドン、非天然コドン、少なくとも４塩基を含むコドン、アンバーコドン、オーカーコドン、もしくはオパール停止コドンである。一実施形態では、組換えＯ−ｔＲＮＡは、直交性の改善を有する。一部の実施形態では、Ｏ−ｔＲＮＡは、任意選択で、改変を必要とせず、第２の生物から第１の生物へ移入されることは理解されよう。種々の実施形態では、第１および第２の生物は、同じまたは異なり、任意選択で、限定されないが、原核生物（限定されないが、メタノコッカスジャナスキー、メタノバクテリウム・サーモアウトトロフィクス、大腸菌、ハロバクテリア、等を含む）、真核生物、哺乳動物、真菌、酵母、古細菌、真正細菌、植物、昆虫、原生生物、等から選択される。さらに、組換えｔＲＮＡは、任意選択で、天然ではコードされないアミノ酸によりアミノアシル化され、天然ではコードされないアミノ酸は、天然で、または遺伝子操作によりインビボで生合成される。天然ではコードされないアミノ酸は、任意選択で、少なくとも第１と第２の生物に対し、増殖培地に添加される。
【０３２８】
一態様では、ライブラリーからの、アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼによりアミノアシル化される（任意選択で、変異体）ｔＲＮＡの選択（限定されないが、負の選択を含む）または選別（ステップ（ｂ））は、毒性マーカー遺伝子（ここで、毒性マーカー遺伝子は、少なくとも１つのセレクターコドン（または毒性もしくは静電剤または生物に必須の遺伝子の産生に繋がる遺伝子で、このようなマーカー遺伝子は、少なくとも１つのセレクターコドンを含む）を含む）および（任意選択で、変異体）ｔＲＮＡライブラリーの第２の生物由来の複数の細胞中への導入；ならびに、生存細胞の選択、を含み、ここで、生存細胞が、少なくとも１つの直交性ｔＲＮＡまたは非機能的ｔＲＮＡ（任意選択で、変異体）を含むｔＲＮＡプールを含む。例えば、生存細胞は、細胞密度比率比較アッセイ（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｒａｔｉｏ  ｃｅｌｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ａｓｓａｙ）を使って選択してもよい。
【０３２９】
別の態様では、毒性マーカー遺伝子は、２つ以上のセレクターコドンを含んでもよい。この方法の別の実施形態では、毒性マーカー遺伝子は、リボヌクレアーゼバルナーゼ遺伝子であり、リボヌクレアーゼバルナーゼ遺伝子は、少なくとも１つのアンバーコドンを含む。任意選択で、リボヌクレアーゼバルナーゼ遺伝子は、２つ以上のアンバーコドンを含んでもよい。
【０３３０】
一実施形態では、（任意選択で、変異体）ｔＲＮＡプールからの、導入直交性ＲＳ（Ｏ−ＲＳ）によりアミノアシル化されるメンバーの選択と選別は、Ｏ−ＲＳと一緒に、正の選択または選別マーカー遺伝子（正のマーカー遺伝子は、薬剤耐性遺伝子（限定されないが、少なくとも１つのセレクターコドン、例えば、少なくとも１つのアンバー停止コドンを含む□−ラクタマーゼ遺伝子を含む）または生物に必須の遺伝子、または毒性剤の解毒作用をもたらす遺伝子を含む）、および（任意選択で、変異体）ｔＲＮＡプールの、第２の生物由来の複数の細胞への導入；ならびに、限定されないが、抗生物質、等の選択または選別薬剤の存在下で増殖され、生存している、または選別された細胞の特定、および、それによる、少なくとも１つの組換えｔＲＮＡを有する細胞プールの提供、を含んでもよく、ここで、少なくとも１つの組換えｔＲＮＡが、Ｏ−ＲＳによりアミノアシル化され、少なくとも１つのセレクターコドンに応答して、アミノ酸を正のマーカー遺伝子によりコードされた翻訳産物中に挿入する。別の実施形態では、選択および／または選別薬剤の濃度は変えられる。
【０３３１】
特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対の生成方法が、提供される。方法は、（ａ）第１の生物からの少なくとも１つのｔＲＮＡ由来の変異体ｔＲＮＡライブラリーの生成；（ｂ）ライブラリーからの、第１の生物由来のＲＳが無い場合には、第２の生物由来のアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）によりアミノアシル化される（任意選択で、変異体）ｔＲＮＡの負の選択または選別、および、それによる、（変異体）ｔＲＮＡプールの提供；（ｃ）（任意選択で、変異体）ｔＲＮＡプールからの、導入直交性ＲＳ（Ｏ−ＲＳ）によるアミノアシル化されるメンバーの選択または選別と、それによる、少なくとも１つの組換えＯ−ｔＲＮＡの提供、を含む。少なくとも１つの組換えＯ−ｔＲＮＡは、セレクターコドンを認識し、第２の生物由来のＲＳにより効率的に認識されず、Ｏ−ＲＳにより優先的にアミノアシル化される。この方法は、また、（ｄ）第３の生物由来の少なくとも１つのアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）由来の（任意選択で、変異体）ＲＳライブラリーの生成；（ｅ）変異体ＲＳライブラリーからの、天然ではコードされないアミノ酸および天然アミノ酸の存在下で少なくとも１つの組換えＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化するメンバーの選択または選別と、それによる、活性（任意選択で、変異体）ＲＳプールの提供；ならびに、（ｆ）そのプールからの、天然ではコードされないアミノ酸が無い場合には、少なくとも１つの組換えＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する活性（任意選択で、変異体）ＲＳの負の選択または選別、およびそれによる、少なくとも１つの特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対の提供、を含み、ここで、少なくとも１つの特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対が、天然ではコードされないアミノ酸および少なくとも１つの組換えＯ−ｔＲＮＡに対し特異的である少なくとも１つの組換えＯ−ＲＳを含む。この方法で産生された特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対が、含まれる。例えば、特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対は、限定されないが、ｍｕｔＲＮＡＴｙｒ−ｍｕｔＴｙｒＲＳ対、例えば、ｍｕｔＲＮＡＴｙｒ−ＳＳ１２ＴｙｒＲＳ対、ｍｕｔＲＮＡＬｅｕ−ｍｕｔＬｅｕＲＳ対、ｍｕｔＲＮＡＴｈｒ−ｍｕｔＴｈｒＲＳ対、ｍｕｔＲＮＡＧｌｕ−ｍｕｔＧｌｕＲＳ対、等を含んでもよい。さらに、このような方法は、第１および第３の生物が、同じ（限定されないが、メタノコッカスジャナスキーを含む）場合を含む。
【０３３２】
インビボで第２の生物翻訳系で使用するための直交性ｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンテターゼ対の選択方法は、また、本発明に含まれる。その方法は、マーカー遺伝子、第１の生物から単離または由来するｔＲＮＡおよびアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）の、第２の生物由来の第１のセットの細胞への導入；マーカー遺伝子およびｔＲＮＡの、第２の生物由来の複製細胞セット中への導入；ならびに、複製細胞セット中では生存できない第１セット中の生存細胞の選択、または複製細胞セット中では示すことができないような、特異的選別応答を示す細胞の選別を含み、ここで、その第１セットおよび複製細胞セットが選択または選別薬剤の存在下増殖し、また、生存している、または選別された細胞が、第２の生物のインビボ翻訳系で使用するための直交性ｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンテターゼ対を含む。一実施形態では、比較および選択または選別が、インビボ相補性アッセイを含む。選択または選別薬剤の濃度は、変えることができる。
【０３３３】
本発明の生物は、種々の生物および種々の組み合わせを含む。例えば、本発明の方法の第１および第２の生物の生物は、同じでも、異なっていてもよい。一実施形態では、生物は、任意選択で、限定されないが、メタノコッカスジャナスキー、メタノバクテリウム・サーモアウトトロフィクス、ハロバクテリア、大腸菌、Ａ．フルギドゥス、Ｐ．フリオスス、Ｐ．ホリコシ、Ａ．ペルニクス、Ｔ．サーモフィルス、等を含む原核生物生物である。あるいは、生物は、任意選択で、限定されないが、植物（限定されないが、複合植物、例えば、単子葉植物、または双子葉植物を含む）、藻類、原生生物、真菌（限定されないが、酵母、等）、動物（限定されないが、哺乳動物、昆虫、節足動物、等）、等の真核生物を含む。別の実施形態では、第２の生物は、原核生物である。限定されないが、メタノコッカスジャナスキー、メタノバクテリウム・サーモアウトトロフィクス、ハロバクテリア、大腸菌、Ａ．フルギドゥス、ハロバクテリア、Ｐ．フリオスス、Ｐ．ホリコシ、Ａ．ペルニクス、Ｔ．サーモフィルス、等の原核生物である。あるいは、第２の生物は、限定されないが、酵母、動物細胞、植物細胞、菌類、哺乳動物細胞、等の真核生物であってもよい。種々の実施形態では、第１および第２の生物は異なる。
【０３３４】
レラキシンポリペプチド中の非天然アミノ酸の位置
本発明は、１つまたは複数の非天然アミノ酸のレラキシンポリペプチド中への組込みを意図している。１つまたは複数の非天然アミノ酸は、ポリペプチドの活性を破壊しない特定の位置に組み込むことができる。これは、限定されないが、疎水性のアミノ酸を疎水性のアミノ酸での、かさ高いアミノ酸をかさ高いアミノ酸での、親水性のアミノ酸を親水性のアミノ酸での置換、および／または非天然アミノ酸を活性にとって必要でない位置への挿入、等の「保存的」置換をする事により達成できる。
【０３３５】
種々の生化学的および構造的手法を採用して、インスリンポリペプチド内の所望の、天然ではコードされないアミノ酸で置換する部位を選択できる。ポリペプチド鎖のいずれの位置が、天然ではコードされないアミノ酸を組み込むための選択に適するかは、当業者には容易に明らかであり、選択は、いずれかの特定の所望の目的のために、または特定の所望の目的のない場合に、合理的な設計に基づいて、またはランダム選択によって行うことができる。所望の部位の選択は、限定されないが、下記のいずれかの所望の特性または活性を有するレラキシン分子の産生のためであってもよい。アゴニスト、スーパーアゴニスト、逆アゴニスト、アンタゴニスト、受容体結合修飾物質、受容体活性修飾物質、ダイマーまたはマルチマー形成、天然分子に比べて活性または特性の無変化、またはポリペプチドのいずれかの物理もしくは化学性質、例えば、溶解度、凝集、または安定性の操作対して活性または特性の無変化。例えば、レラキシンポリペプチドの生物活性に必要なポリペプチド中の位置は、当技術分野で既知の点変異分析、アラニン走査、飽和変異誘発および生物活性選別、または相同体走査法を使って特定できる。レラキシンポリペプチドの改変残基を特定するために使用できる他の方法には、限定されないが、以下が含まれる：配列プロファイリング（Ｂｏｗｉｅ  ａｎｄ  Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３（５０１６）：１６４−７０、（１９９１））、回転異性体ライブラリー選択（Ｄａｈｉｙａｔ  ａｎｄ  Ｍａｙｏ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  ５（５）：８９５−９０３（１９９６）；Ｄａｈｉｙａｔ  ａｎｄ  Ｍａｙｏ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８（５３３５）：８２−７（１９９７）；Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｅｌ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ４：２００６−２０１８（１９９５）；Ｈａｒｂｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９２（１８）：８４０８−８４１２（１９９５）；Ｋｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９：２４４−２５５（１９９４）；Ｈｅｌｌｉｎｇａ  ａｎｄ  Ｒｉｃｈａｒｄｓ、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９１：５８０３−５８０７（１９９４））；および残基対ポテンシャル（Ｊｏｎｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３：５６７−５７４、（１９９４））、およびタンパク質設計オートメーション（登録商標）技術を使った合理的設計、（米国特許第６，１８８，９６５号；同６，２６９，３１２号；同６，４０３，３１２号；国際公開第９８／４７０８９号を参照。これらの特許は、参照によって組み込まれる）。レラキシンの生物活性にとって重要な残基、医薬品安定性と関連のある残基、抗体エピトープまたは受容体結合残基は、変異されうる。米国特許第５，５８０，７２３号；同５，８３４，２５０号；同６，０１３，４７８号；同６，４２８，９５４号；および同６，４５１，５６１号（参照によって組み込まれる本明細書に組み込まれる）は、ポリペプチドの活性に影響を与える活性ドメインを、標的物質を使って特定することによる、レラキシン等のポリペプチドの構造および機能の系統的分析方法を記載している。アラニンまたは相同体系統的変異導入法に��り生物活性に重要であると特定されたもの以外の残基は、ポリペプチドに求められる所望の活性に応じて、天然ではコードされないアミノ酸による置換のための良い候補となる可能性がある。あるいは、生物活性に重要であると特定された位置もまた、再度、ポリペプチドに求められる所望の活性によっては、天然ではコードされないアミノ酸の置換のための良い候補である可能性がある。別の選択肢は、ポリペプチド鎖の各位置で天然ではコードされないアミノ酸で単純に逐次置換を行い、ポリペプチドの活性に与える効果を観察することであろう。非天然アミノ酸で置換する任意のポリペプチド中の位置の選択手段、技術、または方法のいずれも、本発明での使用に適することは、当業者には容易に明らかであろう。
【０３３６】
また、欠失を含むレラキシンポリペプチド変異体の構造および活性を調べて、天然ではコードされないアミノ酸による置換に耐えられそうなタンパク質の領域を特定することもできる。同様の方法で、プロテアーゼ消化およびモノクローナル抗体を使って、レラキシン受容体への結合に関与するレラキシンの領域を特定することができる。天然ではコードされないアミノ酸による置換に耐えられそうにない残基が除去されるとすぐに、残っている位置のそれそれの提案された置換の影響が調査でき、他のレラキシンファミリーメンバーおよびレラキシン受容体の３次元結晶構造から、モデルが作製できる。蛋白質構造データバンク（ＰＤＢ、Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂのｒｃｓｂ．ｏｒｇから利用可能）は、大きなタンパク質および核酸分子の３次元構造データを含む集中型データベースである。３次元構造データが利用できない場合には、ポリペプチドの二次および三次構造の検討を行うモデルを作ることができる。従って、当業者なら、天然ではコードされないアミノ酸で置換できる位置を容易に特定できる。
【表２】
0006054294.tif 000050
【表３】
0006054294.tif 000051
【０３３７】
一部の実施形態では、本発明レラキシンポリペプチドは、ポリペプチドの構造を破壊しないタンパク質の領域に配置された１つまたは複数の天然ではコードされないアミノ酸を含む。
【０３３８】
天然ではコードされないアミノ酸の代表的組込み残基は、潜在的受容体結合領域から除外されているものであっても、完全または部分的に溶媒露出されて、近傍の残基と最小限のまたは非水素結合相互作用を有するものであっても、近接反応性残基に最小限に露出されていて、１つまたは複数の露出面上にあっても、第２のレラキシンまたは他の分子またはその断片に並置された１つの位置または複数位置にあっても、３次元、２次、３次、または４次レラキシン構造、その受容体への結合または非結合、または別の生物学的に活性な分子への結合または非結合、から予測されるような、高度にフレキシブル、または構造的に剛直な領域にあっても、または、所望通りの完全構造の柔軟性または剛直生を変えることにより、レラキシンそれ自体、または１つまたは複数のレラキシンを含むダイマーもしくはマルチマーの高次構造を調節してもよい。
【０３３９】
当業者なら、このようなレラキシンの分析が、タンパク質の三次構造内に埋没しているアミノ酸残基に比べて、どのアミノ酸残基の表面が露出しているかの判定を可能とするかをわかっている。従って、表面が露出した残基のアミノ酸に対し、天然ではコードされないアミノ酸を置換するのが、本発明の実施形態である。
【０３４０】
一部の実施形態では、１つまたは複数の天然ではコードされないアミノ酸が、レラキシンの１つまたは複数の下記の位置に組み込まれる：Ａ鎖の位置１（すなわち、Ｎ末端）の前、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２（すなわち、タンパク質カルボキシル末端）、およびそれらの任意の組み合わせ（配列番号１）またはＢ鎖の位置１（すなわち、Ｎ末端）の前、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１（配列番号２）。
【０３４１】
レラキシンの結晶構造およびレラキシン受容体との相互作用の調査により、どの特定のアミノ酸残基が、完全にまたは部分的に溶媒に接近可能な側鎖を有するかを示すことができる。天然ではコードされないアミノ酸のこれらの位置での側鎖は、タンパク質表面から外れ、溶媒中に突き出てもよい。
【０３４２】
一部の実施形態では、限定されないが、１つまたは複数の下記の位置の天然ではコードされないアミノ酸は、水溶性ポリマーに結合する：Ａ鎖の位置１（すなわち、Ｎ末端）の前、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２（すなわち、タンパク質カルボキシル末端）、およびそれらの任意の組み合わせ（配列番号１）またはＢ鎖の位置１（すなわち、Ｎ末端）の前、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１（配列番号２）。
【０３４３】
各種の天然ではコードされないアミノ酸は、レラキシンポリペプチドの所与の位置に置換、または組込み可能である。一般的には、レラキシンポリペプチドまたは他のレラキシンファミリーメンバーまたはその受容体を有するレラキシン類似体の３次元結晶構造、保存的置換（すなわち、アリールベースの天然ではコードされないアミノ酸、例えば、Ｐｈｅ、ＴｙｒまたはＴｒｐを置換するｐ−アセチルフェニルアラニンまたはＯ−プロパルギルチロシン）のための優先度、およびレラキシンポリペプチドに導入が望まれる特異的コンジュゲーション化学（例えば、アルキン成分を有する水溶性ポリマーを使って、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化、または次に、ホスフィン成分を組み込むアリールエステルを有する水溶性ポリマーを使ってアミド結合形成を行うことが望まれる場合は、４−アジドフェニルアラニンの導入）の調査に基づいて、天然ではコードされない特定のアミノ酸が、組み込み用として選択される。
【０３４４】
一実施形態では、方法は、非天然アミノ酸のタンパク質中への組込み（ここで、非天然アミノ酸が第１の反応基を含む）；およびタンパク質を第２の反応基を含む分子（限定されないが、標識、色素、ポリマー、水可溶性ポリマー、ポリエチレングリコールの誘導体、光架橋剤、放射性核種、細胞障害性の化合物、薬剤、親和標識、光親和標識、反応性化合物、樹脂、第２のタンパク質またはポリペプチドまたはポリペプチド類似体、抗体または抗体断片、金属キレート剤、補助因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスポリヌクレオチド、サッカライド、水可溶性デンドリマー、シクロデキストリン、抑制性リボ核酸、生体材料、ナノ粒子、スピン標識、フルオロフォア、金属含有成分、放射性成分、新規官能基、共有結合または非共有結合で他の分子と相互作用する基、フォトケージ化成分、化学線励起成分、光異性化可能な成分、ビオチン、ビオチン誘導体、ビオチン類似体、重原子を組み込んだ成分、化学的切断可能な基、光切断可能基、延長側鎖、炭素結合型糖、レドックス活性剤、アミノチオ酸、毒成分、同位体標識成分、生物物理学的プローブ、リン光基、化学発光基、高電子密度基、磁性基、インターカレート基、発色団、エネルギー遷移剤、生理活性物質、検出可能標識、小分子、量子ドット、ナノトランスミッター、放射性核種標識ヌクレオチド、放射性核種標識トランスミッター、中性子捕獲剤、もしくは上記のいずれかの組み合わせ、またはいずれかの他の望ましい化合物もしくは物質、を含む）との接触をさらに含む。第１の反応基は、第２の反応基と反応し、［３＋２］付加環化によりその分子を非天然アミノ酸に結合する。一実施形態では、第１の反応基は、アルキニルまたはアジド成分であり、第２の反応基は、アジドまたはアルキニル成分である。例えば、第１の反応基は、アルキニル成分（限定されないが、非天然アミノ酸ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン中の）であり、第２の反応基は、アジド成分である。別の例では、第１の反応基は、アジド成分（限定されないが、非天然アミノ酸ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン中の）であり、第２の反応基は、アルキニル成分である。
【０３４５】
一部の例では、天然ではコードされないアミノ酸置換は、レラキシンポリペプチド内の他の付加、置換または欠失と組み合わされ、他のレラキシンポリペプチドの生物学的特色を呈する。一部の例では、他の付加、置換または欠失は、レラキシンポリペプチドの安定性（限定されないが、タンパク分解に対する抵抗性）を高めることができ、または受容体に対するレラキシンポリペプチドの親和性を高めることができる。一部の例では、他の付加、置換または欠失は、レラキシンポリペプチドの医薬品安定性を高めることができる。一部の例では、他の付加、置換または欠失は、レラキシンポリペプチドの抗ウイルス活性を強化することができる。一部の例では、他の付加、置換または欠失は、レラキシンポリペプチドの溶解度（限定されないが、大腸菌または他の宿主細胞中で発現した場合）を高めることができる。一部の実施形態では、付加、置換または欠失は、大腸菌または他の組換え宿主細胞中で発現後のレラキシンポリペプチドの溶解度を高めることができる。一部の実施形態では、大腸菌または別の組換え宿主細胞中での発現後のポリペプチドの溶解度を高めることに繋がる非天然アミノ酸の組み込み用の別の位置に加えて、天然でコードされるまたは非天然アミノ酸による置換用の位置が選択される。一部の実施形態では、レラキシンポリペプチドは、レラキシンポリペプチド受容体、結合タンパク質、もしくは関連するリガンドに対する親和性を調節する、レラキシン受容体への結合後のシグナル伝達を調節する、循環半減期を調節する、放出またはバイオアベイラビリティを調節する、精製を促進する、または特定の投与経路を改善もしくは変更する別の付加、置換もしくは欠失を含む。一部の実施形態では、レラキシンポリペプチドは、受容体に対するレラキシン変異体の親和性を高める付加、置換または欠失を含む。同様に、レラキシンポリペプチドは、化学または酵素切断配列、プロテアーゼ切断配列、反応基、抗体結合ドメイン（限定されないが、ＦＬＡＧまたはポリＨｉｓ、等）または他の親和性に基づく配列（限定されないが、ＦＬＡＧ、ポリＨｉｓ、ＧＳＴ、等）または検出（限定されないが、ＧＦＰ、等）、精製、組織もしくは細胞膜を介した輸送、プロドラッグ放出もしくは活性化、レラキシンサイズ減少、またはほかのポリペプチドの特性を改善する連結分子（限定されないが、ビオチン、等）を含んでもよい。
【０３４６】
一部の実施形態では、天然ではコードされないアミノ酸の置換は、レラキシンアンタゴニストを生成する。一部の実施形態では、天然ではコードされないアミノ酸は、受容体結合に関連する領域に置換または付加される。一部の実施形態では、レラキシンアンタゴニストは、レラキシンをアンタゴニストとして作用させる少なくとも１つの置換を含む。一部の実施形態では、レラキシンアンタゴニストは、レラキシン分子の受容体結合領域に存在する水溶性ポリマーに結合した天然ではコードされないアミノ酸を含む。
【０３４７】
一部の例では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ超のアミノ酸が、１つまたは複数の天然ではコードされないアミノ酸で置換される。一部の例では、レラキシンポリペプチドは、１つまたは複数の天然ではコードされないアミノ酸の置換されたものに対し、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ超の天然アミノ酸に対する置換をさらに含む。例えば、一部の実施形態では、レラキシン中の１つまたは複数の残基が１つまたは複数の天然ではコードされないアミノ酸で置換される。一部の例では、１つまたは複数の天然ではコードされない残基が、１つまたは複数の低級分子量直鎖または分岐ＰＥＧに結合され、それにより、単一の、より大きい分子量のＰＥＧに結合した種に比べて、結合親和性を高め、同等の血清半減期を延長する。
【０３４８】
一部の実施形態では、下記のレラキシン残基の２つまでが、１つまたは複数の天然ではコードされないアミノ酸で置換される。
【０３４９】
非真核生物および真核生物中での発現
クローン化レラキシンポリヌクレオチドの高レベル発現を得るために、典型的には、本発明のレラキシンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、転写、転写／翻訳ターミネーターを指示する強力なプロモーター、およびタンパク質をコードする核酸が、翻訳開始のためのリボソーム結合部位を含む発現ベクター中にサブクローニングされる。適切な細菌プロモーターは、当業者には既知であり、また、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ、に記載されている。
【０３５０】
本発明のレラキシンポリペプチド発現用細菌発現系は、限定されないが、大腸菌、バチルス種、蛍光菌、緑膿菌、プチダ菌、およびサルモネラ菌（Ｐａｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅ  ２２：２２９−２３５（１９８３）；Ｍｏｓｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３０２：５４３−５４５（１９８３））、等で利用可能である。このような発現系のキットは、市販されている。哺乳動物細胞、酵母、および昆虫細胞に対する真核生物発現系は、当業者には既知であり、市販されている。直交性ｔＲＮＡおよびアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（上述の）を使用して、本発明のレラキシンポリペプチドの発現を行う場合には、発現用宿主細胞は、直交性成分を使用するそれらの能力に基づいて選択される。代表的宿主細胞には、グラム陽性細菌（限定されないが、Ｂ．ブレビス、枯草菌、またはストレプトマイセス、等）およびグラム陰性細菌（大腸菌、蛍光菌、緑膿菌、プチダ菌）、ならびに酵母および他の真核細胞が含まれる。Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を含む細胞は、本明細書記載のように使用可能である。
【０３５１】
本発明の真核生物宿主細胞または非真核生物宿主細胞は、有用な大量の非天然アミノ酸を含むタンパク質を合成する能力を提供する。一態様では、組成物は、任意選択で、限定されないが、少なくとも１０μｇ、少なくとも５０μｇ、少なくとも７５μｇ、少なくとも１００μｇ、少なくとも２００μｇ、少なくとも２５０μｇ、少なくとも５００μｇ、少なくとも１ｍｇ、少なくとも１０ｍｇ、少なくとも１００ｍｇ、少なくとも１つのｇ、またはそれ超の非天然アミノ酸、またはタンパク質のインビボ産生方法で達成できる量を含むタンパク質を含む（組換えタンパク質産生および精製に関する詳細は、本明細書で提供される）。別の態様では、タンパク質は、任意選択で、組成物中に、限定されないが、少なくとも１０μｇのタンパク質、少なくとも５０μｇのタンパク質／Ｌ、少なくとも７５μｇのタンパク質／Ｌ、少なくとも１００μｇのタンパク質／Ｌ、少なくとも２００μｇのタンパク質／Ｌ、少なくとも２５０μｇのタンパク質／Ｌ、少なくとも５００μｇのタンパク質／Ｌ、少なくとも１ミリグラムのタンパク質／Ｌ、または少なくとも１０ｍｇのタンパク質／Ｌまたはそれ超の濃度で、限定されないが、細胞ライセート、緩衝液、医薬品緩衝液、または他の液体懸濁液（限定されないが、限定されないが、約１ｎｌ〜約１００Ｌ以上の範囲の容量で）として存在する。少なくとも１つの非天然アミノ酸を含むタンパク質の真核細胞中での大量の産生（限定されないが、通常、他の方法、例えば、インビトロ翻訳、で可能な量より多い）は、本発明の１つの特徴である。
【０３５２】
本発明の真核生物宿主細胞または非真核生物宿主細胞は、有用な大量の非天然アミノ酸を含むタンパク質を生合成する能力を提供する。例えば、非天然アミノ酸含有タンパク質は、限定されないが、少なくとも１０μｇ／Ｌ、少なくとも５０μｇ／Ｌ、少なくとも７５μｇ／Ｌ、少なくとも１００μｇ／Ｌ、少なくとも２００μｇ／Ｌ、少なくとも２５０μｇ／Ｌ、または少なくとも５００μｇ／Ｌ、少なくとも１ｍｇ／Ｌ、少なくとも２ｍｇ／Ｌ、少なくとも３ｍｇ／Ｌ、少なくとも４ｍｇ／Ｌ、少なくとも５ｍｇ／Ｌ、少なくとも６ｍｇ／Ｌ、少なくとも７ｍｇ／Ｌ、少なくとも８ｍｇ／Ｌ、少なくとも９ｍｇ／Ｌ、少なくとも１０ｍｇ／Ｌ、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００ｍｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌまたはそれ超のタンパク質濃度で、細胞抽出物、細胞ライセート、培地、緩衝液、等中で産生出来る。
【０３５３】
レラキシンの発現に適するいくつかのベクターが市販されている。真核生物宿主用の有用な発現ベクターには、限定されないが、ＳＶ４０ウシパピローマウイルス、アデノウイルスおよびサイトメガロウイルス由来発現制御配列を含むベクターが含まれる。このようなベクターは、ｐＣＤＮＡ３．１（＋）＼Ｈｙｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）およびｐＣＩ−ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ、ＵＳＡ）を含む。細菌プラスミド、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＥＴ３ａおよびｐＥＴ１２ａ等の大腸菌由来プラスミド、より広宿主域プラスミド、例えば、ＲＰ４、ファージＤＮＡ、例えば、多くのファージラムダ誘導体、例えば、ＮＭ９８９、ならびに他のＤＮＡファージ、例えば、Ｍ１３および繊維状単鎖ＤＮＡファージ、を使用可能である。２μプラスミドおよびその誘導体、ＰＯＴ１ベクター（米国特許第４、９３１、３７３号（参照によって組み込まれる））、（Ｏｋｋｅｌｓ、Ａｎｎ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃｅｄ．Ｓｃｉ．７８２、２０２２０７、１９９６）に記載のｐＪＳＯ３７ベクターおよびｐＰＩＣＺＡ、ＢまたはＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、酵母宿主細胞と共に使用できる。昆虫細胞用のベクターには、限定されないが、ｐＶＬ９４１、ｐＢＧ３１１（Ｃａｔｅ  ｅｔ  ａｌ．、「ミュラー管サプレッサーのためのウシおよびヒト遺伝子の単離と動物細胞中でのヒト遺伝子の発現（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂｏｖｉｎｅ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｓ  ｆｏｒ  Ｍｕｌｌｅｒｉａｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｉｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ）」、Ｃｅｌｌ、４５、ｐｐ．６８５９８（１９８６））、ｐＢｌｕｅｂａｃ４．５およびｐＭｅｌｂａｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）が含まれる。
【０３５４】
また、レラキシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、シグナルペプチドをコードする配列を含んでも含まなくてもよい。ポリペプチドが発現した細胞から分泌されるべき場合、シグナルペプチドが存在する。このようなシグナルペプチドは、どのような配列でもよい。シグナルペプチドは、原核生物由来でも、真核生物由来でもよい。Ｃｏｌｏｍａ、Ｍ（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １５２：８９１０４）には、哺乳動物細胞中で使用されるシグナルペプチド（マウスＩｇカッパ軽鎖シグナルペプチド）について記載されている。他のシグナルペプチドには、限定されないが、出芽酵母由来のα因子シグナルペプチド（米国特許第４、８７０、００８号。この特許は、参照によって本明細書に組み込まれる）、マウス唾液アミラーゼのシグナルペプチド（Ｏ．Ｈａｇｅｎｂｕｃｈｌｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  ２８９、１９８１、ｐｐ．６４３−６４６）、改変カルボキシペプチダーゼシグナルペプチド（Ｌ．Ａ．Ｖａｉｌｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ４８、１９８７、ｐｐ．８８７−８９７）、酵母ＢＡＲＩシグナルペプチド（国際公開第８７／０２６７０号。この特許は、参照によって本明細書に組み込まれる）、および酵母アスパラギン酸プロテアーゼ３（ＹＡＰ３）シグナルペプチド（Ｍ．Ｅｇｅｌ−Ｍｉｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｙｅａｓｔ  ６、１９９０、ｐｐ．１２７−１３７、参照）が含まれる。
【０３５５】
適切な哺乳類宿主細胞の例は、当業者には既知である。このような宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、（例えば、ＣＨＯ−Ｋ１；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）、ミドリザル細胞（ＣＯＳ）（例えば、ＣＯＳ１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５０）、ＣＯＳ７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５１））；マウス細胞（例えば、ＮＳ／Ｏ）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞株（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６３２またはＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１０）、およｂいヒト細胞（例えば、ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３））、ならびに組織培養液中の植物細胞であってもよい。これらの細胞株および他のものは、公共の保管場所、例えば、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄから入手可能である。レラキシンポリペプチドの改善されたグリコシル化を提供するために、哺乳類宿主細胞は、例えば、米国特許第５，０４７，３３５号に記載されているように、シアル酸転移酵素、例えば、１、６−シアル酸転移酵素を発現するように改変できる。この特許は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０３５６】
外因性のＤＮＡを哺乳類宿主細胞へ導入する方法には、限定されないが、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、電気穿孔、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、ウイルスベクターおよびＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫに記載の、リポフェクタミン２０００を使った、およびＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＵＳＡに記載のＦｕＧＥＮＥ６を使ったトランスフェクション方法、が含まれる。これらの方法は、当技術分野でよく知られており、また、Ａｕｓｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）、１９９６、分子生物学における最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ、に記載されている。例えば、（動物細胞バイオテクノロジー、方法およびプロトコル（Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）、Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｎｉｇｅｌ  Ｊｅｎｋｉｎｓ、１９９９、Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．、ＵＳＡ、およびＨａｒｒｉｓｏｎ  Ｍａｓｓ．ａｎｄ  Ｒａｅ  ＩＦ、細胞培養の一般的方法（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ）、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９７）に開示のように確立された方法に従って、哺乳動物細胞の培養を行うことができる。
【０３５７】
発現系、培養、および単離
レラキシンポリペプチドは、適切などのような数の発現系、例えば、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞、および細菌、等の発現系中でも発現させることができる。代表的発現系の説明は、以下に提供される。
【０３５８】
酵母  本明細書で使われる用語の「酵母」は、レラキシンポリペプチドをコードする遺伝子を発現することができる種々の酵母のいずれかを含む。このような酵母には、限定されないが、有子嚢胞子酵母（エンドマイセタレス）、担子菌酵母および不完全菌類（ブラストミセス）群に属する酵母、が含まれる。有子嚢胞子酵母は、２つのファミリー、スペルモフトラ科およびサッカロミセス科、に分割される。後者は、４つの亜科、シゾサッカロミセス亜科（例えば、シゾサッカロミセス属）、ナドソニオイデ亜科、リポミコイデアエ亜科およびサッカロミセス亜科（例えば、ピキア属、クリベロミセス属およびサッカロミセス属）から構成される。担子菌酵母には、ロイコスポリジウム属、ロドスポリジウム属、スポリディオボラス属、フィロバシディウム属、およびフィロバジエラ属が含まれる。不完全菌類（ブラストミセス）群に属する酵母は、スポロボロミセス科（例えば、スポロボロミセス属およびブレラ属）およびクリプトコックス科（例えば、カンジダ属）の２つのファミリーに分割される。
【０３５９】
本発明での使用に対し特に関心が高いのは、ピキア属、クリベロマイセス属、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、ハンゼヌラ属、トルロプシス属、およびカンジダ属の種であり、これには、限定されないが、Ｐ．パストリス、Ｐ．グレリモンディー、出芽酵母、Ｓ．カールスベルゲンシス、Ｓ．ジアスタチカス、Ｓ．ドウグラシー、Ｓ．クルイヴェリ、Ｓ、ノルベンシス、Ｓ．オビホルミス、Ｋ．ラクチス、Ｋ．フラギリス、Ｃ．アルビカンス、Ｃ．マルトーザ、およびＨ．ポリモルファ、が含まれる。
【０３６０】
適切なレラキシンポリペプチド発現用酵母の選択は、当業者の技量の範囲内にあることである。発現用酵母宿主の選択で、適切な宿主には、例えば、良好な分泌能力、低タンパク分解性活性、良好な分泌能力、良好な可溶正タンパク質の産生、および全体頑強性を有することが示されたものが含まれる。酵母は、通常、限定されないが、Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ）、およびアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（「ＡＴＣＣ」）（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）等の種々のソースから入手可能である。
【０３６１】
用語の「酵母宿主」または「酵母宿主細胞」は、組換えベクターまたは他のトランスファーＤＮＡのためのレシピエントとして使われる可能性のある、または使われている酵母を含む。この用語は、組換えベクターまたは他のトランスファーＤＮＡの挿入された元の酵母宿主細胞の子孫を含む。単一の親細胞の子孫は、偶発的または意図的変異に起因して、形態学、またはゲノム、または全ＤＮＡ補体の点で、必ずしも完全に元の親に同じでなくてもよいことは理解されよう。関連特性、例えば、ヌクレオチドレラキシンポリペプチドをコードする配列の存在、を特徴とする親に充分に類似の親細胞の子孫は、この定義で意図される子孫に含まれる。
【０３６２】
染色体外レプリコンまたは組み込み型ベクターを含む発現および形質転換ベクターが、多くの酵母宿主中での形質転換のために開発されている。例えば、Ｓ．セレビシア（芽酵母）（Ｓｉｋｏｒｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、ＧＥＮＥＴＩＣＳ（１９８９）１２２：１９；Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ．（１９８３）１５３：１６３；Ｈｉｎｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ、ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ（１９７８）７５：１９２９）；Ｃ．アルビカンス（Ｋｕｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．、ＭＯＬ．ＣＥＬＬ．ＢＩＯＬ．（１９８６）６：１４２）；Ｃ．マルトーザ（Ｋｕｎｚｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．ＢＡＳＩＣＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．（１９８５）２５：１４１）；Ｈ．ポリモルファ（Ｇｌｅｅｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ．ＧＥＮ．ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．（１９８６）１３２：３４５９；Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ、ＭＯＬ．ＧＥＮＥＴＩＣＳ  ＡＮＤ  ＧＥＮＯＭＩＣＳ（１９８６）２０２：３０２）；Ｋ．フラギリス（Ｄａｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ．（１９８４）１５８：１１６５）；Ｋ．ラクチス（ＤｅＬｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ．（１９８３）１５４：７３７；Ｖａｎｄｅｎ  Ｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ、ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（ＮＹ）（１９９０）８：１３５）；Ｐ．グレリモンディー（Ｋｕｎｚｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ、ＢＡＳＩＣ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．（１９８５）２５：１４１）；Ｐ．パストリス（米国特許第５，３２４，６３９号；同４，９２９，５５５号；および同４，８３７，１４８号；Ｃｒｅｇｇ  ｅｔ  ａｌ、ＭＯＬ．ＣＥＬＬ．ＢＩＯＬ．（１９８５）５：３３７６）；分裂酵母（Ｂｅａｃｈ  ｅｔ  ａｌ、ＮＡＴＵＲＥ  （１９８２）３００：７０６）；およびアルカン資化酵母；偽巣性コウジ菌（Ｂａｌｌａｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ、ＢＩＯＣＨＥＭ．ＢＩＯＰＨＹＳ．ＲＥＳ．ＣＯＭＭＵＮ．（１９８３）１１２：２８４−８９；Ｔｉｌｂｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ、ＧＥＮＥ（１９８３）２６：２０５−２２１；およびＹｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ、ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ（１９８４）８１：１４７０−７４）；クロコウジカビ（Ｋｅｌｌｙ  ａｎｄ  Ｈｙｎｅｓ、ＥＭＢＯＪ．（１９８５）４：４７５−４７９）；Ｔ．リージア（欧州特許第ＥＰ０２４４２３４号）；および糸状菌、例えば、パンカビ、アオカビ類、トリポクラジウム（国際公開第９１／００３５７号）用に、発現ベクターが開発されている。それぞれが、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０３６３】
酵母ベクターに対する制御配列は、当業者に既知であり、限定されないが、遺伝子、例えば、アルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）（欧州特許第ＥＰ０２８４０４４号）；エノラーゼ；グルコキナーゼ；ブドウ糖−６−リン酸塩イソメラーゼ；グリセルアルデヒド−３−リン酸塩脱水素酵素（ＧＡＰまたはＧＡＰＤＨ）；ヘキソキナーゼ；ホスホフルクトキナーゼ；３−ホスホグリセリン酸塩ムターゼ；およびピルビン酸キナーゼ（ＰｙＫ）（欧州特許第ＥＰ０３２９２０３号）由来のプロモーター領域を含む。酸ホスファターゼをコードする酵母ＰＨ０５遺伝子も、また、有用なプロモーター配列を提供できる（Ｍｉｙａｎｏｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．、ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ、ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ（１９８３）８０：１）。酵母宿主と使用するための他の適切なプロモーター配列は、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．（１９８０）２５５：１２０７３）；および他の糖分解酵素、例えば、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、およびグルコースリン酸イソメラーゼ（Ｈｏｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．、ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ（１９７８）１７：４９００；Ｈｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．ＡＤＶ．ＥＮＺＹＭＥ  ＲＥＧ．（１９６９）７：１４９）用のプロモーターを含むことができる。追加の増殖条件による転写制御の利点を有する誘導型酵母プロモーターは、アルコール脱水素酵素２；イソチトクロームＣ；酸ホスファターゼ；メタロチオネイン；グリセルアルデヒド−３−リン酸塩脱水素酵素；窒素代謝関連分解酵素；およびマルトースおよびガラクトース利用に関与する酵素用のプロモーター領域を含んでもよい。酵母発現に使用するための適切なベクターおよびプロモーターは、欧州特許第ＥＰ００７３６５７号にさらに記載されている。
【０３６４】
酵母エンハンサーは、また、酵母プロモーターと一緒に使用できる。さらに、合成プロモーターもまた、酵母プロモーターとして機能できる。例えば、酵母プロモーターの上流活性化配列（ＵＡＳ）は、別の酵母プロモーターの転写活性化領域を連結でき、合成ハイブリッドプロモーターを生成する。このようなハイブリッドプロモーターの例には、ＧＡＰ転写活性化領域に連結されたＡＤＨ調節配列を含む。米国特許第４、８８０、７３４号および同４、８７６、１９７号を参照されたい。これらの特許は、参照によって本明細書に組み込まれる。ハイブリッドプロモーターの他の例には、糖分解酵素遺伝子、例えば、ＧＡＰまたはＰｙＫの転写活性化領域と組み合わせて、ＡＤＨ２、ＧＡＬ４、ＧＡＬ１０、またはＰＨ０５遺伝子の調節配列から構成されるプロモーターが含まれる。欧州特許第ＥＰ０１６４５５６号を参照されたい。さらに、酵母プロモーターは、酵母ＲＮＡポリメラーゼと結合し、転写を開始する能力を有する非酵母由来天然プロモーターを含んでもよい。
【０３６５】
酵母発現ベクターの一部を含むことが可能な他の制御領域には、例えば、ＧＡＰＤＨまたはエノラーゼ遺伝子由来のターミネーターを含んでもよい（Ｈｏｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．（１９８１）２５６：１３８５）。さらに、２μプラスミド由来の複製起点は、酵母に適する。酵母中で使用するための適切な選択遺伝子は、酵母プラスミド中に存在するｔｒｐ１遺伝子である。Ｔｓｃｈｕｍｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、ＧＥＮＥ（１９８０）１０：１５７；Ｋｉｎｇｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＧＥＮＥ（１９７９）７：１４１を参照されたい。ｔｒｐｌ遺伝子は、トリプトファン中で増殖する能力を欠いた酵母変異体株用の選択マーカーを提供する。同様に、Ｌｅｕ２欠損酵母株（ＡＴＣＣ２０、６２２または３８、６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する既知のプラスミドにより補完される。
【０３６６】
外因性のＤＮＡを酵母宿主中に導入する方法は、当業者には既知であり、通常、限定されないが、スフェロプラストまたはアルカリカチオンで処理したインタクト酵母宿主細胞の形質転換を含む。例えば、酵母の形質転換は、Ｈｓｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．、ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ（１９７９）７６：３８２９およびＶａｎＳｏｌｉｎｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．ＢＡＣＴ、（１９７７）１３０：９４６、に記載の方法に従って行うことができる。しかし、通常、ＤＮＡを細胞に導入する他の方法、例えば、核注入、電気穿孔、またはプロトプラスト融合による方法も、ＳＡＭＢＲＯＯＫ  ＥＴ  ＡＬ．、分子クローニング：ラボマニュアル（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢ．ＭＡＮＵＡＬ）（２００１）、に記載のように使用できる。酵母宿主細胞は、その後、当業者に既知の標準的な方法を使って培養できる。
【０３６７】
異種のタンパク質を酵母宿主細胞中で発現させる他の方法は、当業者に既知である。一般的には、米国特許公開第２００２００５５１６９号、米国特許第６，３６１，９６９号；同６，３１２，９２３号；同６，１８３，９８５号；同６，０８３，７２３号；同６，０１７，７３１号；同５，６７４，７０６号；同５，６２９，２０３号；同５，６０２，０３４号；および同５，０８９，３９８号；米国再発行特許第ＲＥ３７，３４３号および同ＲＥ３５，７４９号；国際公開第９９／０７８６２号；同９８／３７２０８号；および同９８／２６０８０号；欧州特許第ＥＰ０９４６７３６号；同ＥＰ０７３２４０３号；同ＥＰ０４８０４８０号；国際公開第９０／１０２７７号；欧州特許第ＥＰ０３４０９８６号；同ＥＰ０３２９２０３号；同ＥＰ０３２４２７４号；および同ＥＰ０１６４５５６号、を参照されたい。また、Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＡＮＴＯＮＩＥ  ＶＡＮ  ＬＥＥＵＷＥＮＨＯＥＫ（１９９２）６２（ｌ−２）：７９−９３；Ｒｏｍａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．、ＹＥＡＳＴ（１９９２）８（６）：４２３−４８８；Ｇｏｅｄｄｅｌ、酵素学の方法（ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮＥ  ＮＺＹＭＯＬＯＧＹ）（１９９０）１８５：３−７、も参照されたい。これらはそれぞれ、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０３６８】
酵母宿主株は、発酵槽中で当業者には既知の標準的流加回分発酵法を使った増幅段階の間に成長させてもよい。発酵方法は、特定の酵母宿主の炭素利用経路または発現制御モードにおける差異を考慮するように合わせる事ができる。例えば、サッカロミセス酵母宿主の発酵は、単一ブドウ糖供給、複合窒素ソース（例えば、カゼイン加水分解物）、および複数のビタミン補充を要求する可能性がある。対照的に、メチロトローフ酵母Ｐ．パストリスは、グリセリン、メタノール、および痕跡のミネラルの供給を要求する可能性があるが、単なるアンモニウム（窒素）塩のみが最適増殖および発現に必要であるに過ぎない。例えば、米国特許第５，３２４，６３９号；Ｅｌｌｉｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．ＰＲＯＴＥＩＮ  ＣＨＥＭ．（１９９０）９：９５；およびＦｉｅｓｃｈｋｏ  ｅｔ  ａｌ．、ＢＩＯＴＥＣＨ．ＢＩＯＥＮＧ．（１９８７）２９：１１１３、を参照されたい。これら文献は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０３６９】
しかし、このような発酵方法は、採用された酵母宿主株に関係しないある種の共通の特徴を有しうる。例えば、増殖制限栄養素、通常は炭素、を増幅段階の間に発酵槽に添加し、最大成長を可能とする事ができる。さらに、発酵方法は、通常、適切な量の炭素、窒素、基底塩、リン、および他の少量の栄養素（ビタミン、痕跡のミネラルおよび塩、等）を含むように作られている発酵培地を利用する。ピキアでの使用に適した発酵培地の例は、米国特許第５，３２４，６３９号および同５，２３１，１７８号に記載されている。これらの特許は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０３７０】
バキュロウイルス感染昆虫細胞  用語の「昆虫宿主」または「昆虫宿主細胞」は、組換えベクターまたは他のトランスファーＤＮＡに対し、レシピエントとして使用可能な、または使用されている昆虫を指す。この用語は、形質移入されている元の昆虫宿主細胞の子孫を含む。単一の親細胞の子孫は、偶発的または意図的変異に起因して、形態学、またはゲノム、または全ＤＮＡ補体の点で、必ずしも完全に元の親に同じでなくてもよいことは理解されよう。関連特性、例えば、ヌクレオチドレラキシンポリペプチドをコードする配列の存在、を特徴とする親に充分に類似の親細胞の子孫は、この定義で意図される子孫に含まれる。レラキシンポリペプチドのバキュロウイルス発現は、本発明、およびｒＤＮＡ技術、ポリペプチドまたはその前駆物質の使用に有用である。理由は、レラキシンは、細菌、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母または真菌を含むどのような数の宿主細胞中でも生合成できるからである。本発明の実施形態は、レラキシン、改変レラキシン、レラキシンポリペプチド、またはレラキシン類似体の細菌、酵母または哺乳動物細胞中での生合成を含む。本発明の別の実施形態は、大腸菌または酵母中で行われる生合成を含む。哺乳動物細胞および遺伝子導入動物中での生合成の例は、Ｈａｋｏｌａ、Ｋ．［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１２７：５９−６９、（１９９７）］に記載されている。
【０３７１】
レラキシンポリペプチドの発現に適した昆虫細胞の選択は、当業者には既知である。いくつかの昆虫種が、当技術分野で充分に記載され、また、市販されており、これには、ネッタイシマカ、カイコ、キイロショウジョウバエ、ヨトウガ、およびイラクサギンウワバが含まれる。発現用昆虫宿主の選択で、適切な宿主には、とりわけ、良好な分泌能力、低タンパク分解活性、および全体頑強性を有することを示すものを含めることができる。昆虫は、通常、種々のソースから入手可能であり、これには、限定されないが、Ｉｎｓｅｃｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ）；およびアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（「ＡＴＣＣ」）（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）が含まれる。
【０３７２】
一般的に、バキュロウイルス感染昆虫発現系の成分には、導入ベクター（通常は細菌プラスミド）が含まれ、これは、バキュロウイルスゲノム断片および発現される異種の遺伝子の挿入用の簡便な制限酵素部位の両方；導入ベクター中のバキュロウイルス特異的断片に相同な配列を有する野性型バキュロウイルス（これは、バキュロウイルスゲノム中の異種遺伝子の相同組換えを可能とする）；および適切な昆虫宿主細胞と成長培地、を含む。ベクター構築、細胞への形質移入、プラーク採取、培養による細胞増殖、等に使われる物質、方法および技術は、当技術分野で既知であり、これらの技術を説明したマニュアルを利用可能である。
【０３７３】
異種遺伝子の導入ベクター中への挿入後、ベクターおよび野性型ウイルスゲノムは、昆虫宿主細胞に形質移入され、そこで、ベクターとウイルスゲノムが組み換えられる。パッキングされた組換えウイルスが発現し、組換えプラークが特定され、精製される。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系用の物質および方法は、キット形態で、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から市販されている。これらの技術の一般的な内容は、当業者には既知であり、ＳＵＭＭＥＲＳ  ＡＮＤ  ＳＭＩＴＨ、ＴＥＸＡＳ  ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬ  ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴ  ＳＴＡＴＩＯＮ  ＢＵＬＬＥＴＩＮ  ＮＯ．１５５５（１９８７）、中で充分に記載されている。この文献は、参照によって本明細書に組み込まれる。また、ＲＩＣＨＡＲＤＳＯＮ、分子生物学の３９の方法：バキュロウイルス発現プロトコル（３９  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ：ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ）（１９９５）；ＡＵＳＵＢＥＬ  ＥＴ  ＡＬ．、分子生物学の最新プロトコル（ＣＵＲＲＥＮＴＰ  ＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ）１６．９−１６．１１（１９９４）；ＫＩＮＧ  ＡＮＤ  ＰＯＳＳＥＥ、バキュロウイルス系：ラボガイド（ＴＨＥ  ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳ  ＳＹＳＴＥＭ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＧＵＩＤＥ）（１９９２）；およびＯ’ＲＥＩＬＬＹ  ＥＴ  ＡＬ．、バキュロウイルス発現ベクター：実験マニュアル（ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＶＥＣＴＯＲＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ）（１９９２）、も参照されたい。
【０３７４】
実際、バキュロウイルス／昆虫細胞発現系を使った種々の異種タンパク質の産生が当業者に知られている。例えば、米国特許第６，３６８，８２５号；同６，３４２，２１６号；同６，３３８，８４６号；同６，２６１，８０５号；同６，２４５，５２８号；同６，２２５，０６０号；同６，１８３，９８７号；同６，１６８，９３２号；同６，１２６，９４４号；同６，０９６，３０４号；同６，０１３，４３３号；同５，９６５，３９３号；同５，９３９，２８５号；同５，８９１，６７６号；同５，８７１，９８６号；同５，８６１，２７９号；同５，８５８，３６８号；同５，８４３，７３３号；同５，７６２，９３９号；同５，７５３，２２０号；同５，６０５，８２７号；同５，５８３，０２３号；同５，５７１，７０９号；同５，５１６，６５７号；同５，２９０，６８６号；国際公開第０２／０６３０５号；同０１／９０３９０号；同０１／２７３０１号；同０１／０５９５６号；同００／５５３４５号；同００／２００３２号；同９９／５１７２１号；同９９／４５１３０号；同９９／３１２５７号；同９９／１０５１５号；同９９／０９１９３号；同９７／２６３３２号；同９６／２９４００号；同９６／２５４９６号；同９６／０６１６１号；同９５／２０６７２号；同９３／０３１７３号；同９２／１６６１９号；同９２／０２６２８号；同９２／０１８０１号；同９０／１４４２８号；同９０／１００７８号；同９０／０２５６６号；同９０／０２１８６号；同９０／０１５５６号；同８９／０１０３８号；同８９／０１０３７号；同８８／０７０８２号、を参照されたい。これらは、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０３７５】
バキュロウイルス／昆虫細胞発現系で有用なベクターは当技術分野で知られており、例えば、バキュロウイルスのオートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）由来の昆虫発現および導入ベクターを含む。このベクターは、ヘルパー非依存性、ウイルス発現ベクターである。この系由来のウイルス発現ベクターは、通常、強力なウイルスポリヘドリン遺伝子プロモーターを使用し、異種の遺伝子の発現を進行させる。一般的には、Ｏ’ＲｅｉｌｌｙＥＴＡＬ．、バキュロウイルス発現ベクター：実験マニュアル（ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＶＥＣＴＯＲＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ）（１９９２）、を参照されたい。
【０３７６】
外部遺伝子のバキュロウイルスゲノムへの挿入の前に、プロモーター、リーダー（必要に応じ）、対象コード配列、および転写終止配列を含む上述の成分が、通常、中間転移構築物（導入ベクター）として組み上げられる。中間転移構築物は、細菌等の宿主中で安定な維持が可能なレプリコン、例えば、染色体外の配列（例えば、プラスミド）中で維持されることが多い。レプリコンは、複製系を有し、従って、クローニングおよび増幅のための適切な宿主中で維持されることを可能とする。さらに具体的には、プラスミドは、ポリヘドリンポリアデニル化シグナル（Ｍｉｌｌｅｒ、ＡＮＮ．ＲＥＶ．ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．（１９８８）４２：１７７）、ならびに原核生物アンピシリン耐性（ａｍｐ）遺伝子および大腸菌中での選択と増殖用の複製起点を含むことができる。
【０３７７】
外部遺伝子をＡｃＮＰＶ中に導入するためによく使用される導入ベクターの１つは、ｐＡｃ３７３である。当業者に既知の他の多くのベクターも、また、意図されており、例えば、ポリヘドリン開始コドンをＡＴＧからＡＴＴに変更し、ＡＴＴから３２塩基対下流にＢａｍＨＩクローニング部位を導入するｐＶＬ９８５が含まれる。Ｌｕｃｋｏｗ  ａｎｄ  Ｓｕｍｍｅｒｓ、ＶＩＲＯＬＯＧＹ  １７０：３１（１９８９）、を参照されたい。他の市販のベクターには、例えば、ＰＢｌｕｅＢａｃ４．５／Ｖ５−Ｈｉｓ；ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２；ｐＭｅｌＢａｃ；ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）が含まれる。
【０３７８】
異種遺伝子の挿入後、導入ベクターおよび野性型バキュロウイルスゲノムは昆虫細胞宿主中に同時形質移入される。異種のＤＮＡをバキュロウイルスウイルスの所望の部位に導入する方法は、当技術分野で既知である。ＳＵＭＭＥＲＳ  ＡＮＤ  ＳＭＩＴＨ、ＴＥＸＡＳ  ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬ  ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴ  ＳＴＡＴＩＯＮ  ＢＵＬＬＥＴＩＮＮＯ．１５５５（１９８７）；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．、ＭＯＬ．ＣＥＬＬ．ＢＩＯＬ．（１９８３）３：２１５６；Ｌｕｃｋｏｗ  ａｎｄ  Ｓｕｍｍｅｒｓ、ＶＩＲＯＬＯＧＹ（１９８９）１７０：３１、を参照されたい。例えば、挿入は、遺伝子、例えば、相同二重交差組換えによるポリヘドリン遺伝子（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｄｏｕｂｌｅ  ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）中へ行ってもよい；また、挿入は、所望のバキュロウイルス遺伝子中に操作により組み込まれた制限酵素部位中へ行ってもよい。Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、ＢＩＯＥＳＳＡＹＳ（１９８９）１１（４）：９１、を参照されたい。
【０３７９】
トランスフェクションは、電気穿孔で行ってもよい。ＴＲＯＴＴＥＲＡＮＤＷＯＯＤ、分子生物学の３９の方法（３９  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ）（１９９５）；Ｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｋｉｎｇ、Ｊ．ＧＥＮ．ＶＩＲＯＬ．（１９８９）７０：３５０１、を参照されたい。あるいは、リポソームを使って、昆虫細胞に組換え体発現ベクターおよびバキュロウイルスを移入してもよい。例えば、Ｌｉｅｂｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＢＩＯＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ（１９９９）２６（１）：３６；Ｇｒａｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ（１９９８）３７：６０５０；Ｎｏｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．（１９９８）２７３（２２）：１３５７０；Ｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．、ＰＲＯＴＥＩＮ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＡＮＤ  ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ（１９９８）１２：３２３；Ｓｉｆｆｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ、ＮＡＴＵＲＥ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ（１９９８）１８：４５；ＴＩＬＫＩＮＳ  ＥＴ  ＡＬ．、細胞生物学：ラボハンドブック（ＣＥＬＬＢＩＯＬＯＧＹ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＨＡＮＤＢＯＯＫ）１４５−１５４（１９９８）；Ｃａｉ  ｅｔ  ａｌ．、ＰＲＯＴＥＩＮ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＡＮＤ  ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ（１９９７）１０：２６３；Ｄｏｌｐｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＮＡＴＵＲＥ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ（１９９７）１７：４９１；Ｋｏｓｔ  ｅｔ  ａｌ、ＧＥＮＥ（１９９７）１９０：１３９；Ｊａｋｏｂｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ．ＢＩＯＬ、ＣＨＥＭ．（１９９６）２７１：２２２０３；Ｒｏｗｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．（１９９６）２７１（３７）：２２３７６；Ｒｅｖｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．（１９９６）２７１（３９）：２３６０７−１０；Ｓｔａｎｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．（１９９５）２７０：４１２１；Ｓｉｓｋ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ．ＶＩＲＯＬ．（１９９４）６８（２）：７６６；およびＰｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ、ＢＩＯＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ（１９９３）１４（２）：２７４、を参照されたい。市販のリポソームには、例えば、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（登録商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）が含まれる。さらに、リン酸カルシウムトランスフェクションを使ってもよい。ＴＲＯＴＴＥＲ  ＡＮＤ  ＷＯＯＤ、分子生物学の３９の方法（３９  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ）（１９９５）；Ｋｉｔｔｓ、ＮＡＲ（１９９０）１８（１９）：５６６７；およびＭａｎｎ  ａｎｄ  Ｋｉｎｇ、Ｊ．ＧＥＮ．ＶＩＲＯＬ．（１９８９）７０：３５０１、を参照されたい。
【０３８０】
バキュロウイルス発現ベクターは、通常、バキュロウイルスプロモーターを含む。バキュロウイルスプロモーターは、バキュロウイルスＲＮＡポリメラーゼに結合可能な、およびコード配列（例えば、構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流（３’）方向転写の開始が可能ないずれかのＤＮＡ配列である。プロモーターは、転写開始領域を有し、これは、通常、コード配列の５’末端の近位に置かれる。この転写開始領域は、典型的には、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。バキュロウイルスプロモーターは、また、エンハンサーと呼ばれる第２のドメインを持ってもよく、存在する場合には、通常、構造遺伝子に対し遠位にある。さらに、発現は、調節されても、または恒常的であってもよい。
【０３８１】
感染サイクルの後期に大量に転写された構造遺伝子は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例には、ウイルス多面体タンパク質をコードする遺伝子由来の配列（ＦＲＩＥＳＥＮ  ＥＴ  ＡＬ．、バキュロウイルスの分子生物学（ＴＨＥ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ  ＯＦ  ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳＥＳ）（１９８６）中のバキュロウイルス遺伝子発現の調節（Ｔｈｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）；欧州特許第ＥＰ０１２７８３９号および同０１５５４７６号）およびｐ１０タンパク質をコードする遺伝子（Ｖｌａｋ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ．ＧＥＮ．ＶＩＲＯＬ．（１９８８）６９：７６５）が含まれる。
【０３８２】
新規形成バキュロウイルス発現ベクターは、感染性組換えバキュロウイルス中にパッケージングされ、その後、成長プラークが当業者に既知の技術により精製されうる。Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ、ＢＩＯＥＳＳＡＹＳ（１９８９）１１（４）：９１；ＳＵＭＭＥＲＳ  ＡＮＤ  ＳＭＩＴＨ、ＴＥＸＡＳ  ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬ  ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴ  ＳＴＡＴＩＯＮ  ＢＵＬＬＥＴＩＮ  ＮＯ．１５５５（１９８７）、を参照されたい。
【０３８３】
組換えバキュロウイルス発現ベクターは、いくつかの昆虫細胞中への感染用として開発された。例えば、組換えバキュロウイルスは、特に、ネッタイシマカ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ−１２５）、カイコ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−８９１０）、キイロショウジョウバエ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．１９６３）、ヨトウガ、およびイラクサギンウワバ、のために開発された。Ｗｒｉｇｈｔ、ＮＡＴＵＲＥ（１９８６）３２１：７１８；Ｃａｒｂｏｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．ＶＩＲＯＬ．（１９８５）５６：１５３；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．、ＭＯＬ．ＣＥＬＬ．ＢＩＯＬ．（１９８３）３：２１５６、を参照されたい。一般的な内容としては、Ｆｒａｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、ＩＮ  ＶＩＴＲＯ  ＣＥＬＬ．ＤＥＶ．ＢＩＯＬ．（１９８９）２５：２２５、を参照されたい。さらに具体的には、バキュロウイルス発現ベクター系に使用される細胞株には、通常、限定されないが、Ｓｆ９（ヨトウガ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ、ＣＲＬ−１７１１）、Ｓｆ２１（ヨトウガ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｃａｔ．Ｎｏ．１１４９７−０１３（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ））、Ｔｒｉ−３６８（イラクサギンウワバ）、およびＨｉｇｈ−Ｆｉｖｅ（登録商標）ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４（イラクサギンウワバ）が含まれる。
【０３８４】
細胞培地培地は、バキュロウイルス／発現における異種のポリペプチドの直接および融合発現の両方用が市販されており、細胞培養技術は、通常、当業者に既知である。
【０３８５】
大腸菌、シュードモナス種、および他の原核生物  細菌発現技術は当業者には既知である。細菌宿主での使用のために各種のベクターが利用可能である。ベクターは、単一コピーベクターでも、低または高多コピーベクターであってもよい。ベクターは、クローニングおよび／または発現用として作用してもよい。多くのベクターの市場での入手可能性、およびベクターの制限酵素切断地図および特性の説明マニュアルも含め、これらに関する豊富な文献を考慮すれば、ベクターについての詳細な考察はここでは必要ないであろう。よく知られているように、ベクターは通常、選択を可能とするマーカーを含む。このマーカーは、細胞障害性の薬剤耐性、原栄養性または免疫を付与できる。複数のマーカーが存在し、異なる特性を提供する場合が多い。
【０３８６】
細菌プロモーターは、結合細菌ＲＮＡポリメラーゼに結合でき、コード配列（例えば、構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流（３’）方向への転写を開始できるいずれかのＤＮＡ配列である。プロモーターは、転写開始領域を有し、これは、通常、コード配列の５’末端近くに置かれる。この転写開始領域は、典型的には、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。細菌プロモーターは、また、オペレーターと呼ばれる第２のドメインを持ってもよく、これは、ＲＮＡ合成が始まる位置の隣接ＲＮＡポリメラーゼ結合部位とオーバーラップしてもよい。遺伝子サプレッサータンパク質がオペレーターに結合でき、それにより、特異的遺伝子の転写を抑制するので、オペレーターは、負に調節されている（誘導可能）転写を許可する。オペレーター等の負の調節配列が無い場合は、構成的発現が起こりうる。さらに、正の調節は、遺伝子活性化因子タンパク質結合配列により実現でき、これが存在する場合には、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列に対し近位（５’）にある。遺伝子活性化因子タンパク質の例は、異化代謝産物活性化因子タンパク質（ＣＡＰ）であり、これは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のラックオペロンの転写を開始するのを支援し［Ｒａｉｂａｕｄ  ｅｔ  ａｌ、ＡＮＮＵ．ＲＥＶ．ＧＥＮＥＴ．（１９８４）１８：１７３］、調節発現は、従って、正または負であってよく、それにより、転写を強化または低減化してよい。
【０３８７】
代謝経路酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例には、糖代謝酵素例えば、ガラクトース、ラクトース（ｌａｃ）［Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、ＮＡＴＵＲＥ（１９７７）１９８：１０５６］、およびマルトース由来のプロモーター配列が含まれる。追加の例には、生合成酵素、例えば、トリプトファン（ｔｒｐ）由来のプロモーター配列が含まれる［Ｇｏｅｄｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、ＮＵＣ、ＡＣＩＤＳ  ＲＥＳ．（１９８０）８：４０５７；Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＮＵＣＬ．ＡＣＩＤＳ  ＲＥＳ．（１９８１）９：７３１；米国特許第４，７３８，９２１号；欧州特許ＥＰ  Ｐｕｂ．Ｎｏ．０３６７７６および同１２１７７５号（参照によって本明細書に組み込まれるれる）］。β−ガラクトシダーゼ（ｂｌａ）プロモーター系［インターフェロン（「ＩＦＮ」）３（Ｅｄ．Ｉ．Ｇｒｅｓｓｅｒ）中のＷｅｉｓｓｍａｎｎ（１９８１）「インターフェロン（「ＩＦＮ」）のクローニングおよび他の誤り」（Ｔｈｅｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｍｉｓｔａｋｅｓ）．］、バクテリオファージラムダＰＬ［Ｓｈｉｍａｔａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．、ＮＡＴＵＲＥ（１９８１）２９２：１２８］およびＴ５［米国特許第４，６８９，４０６号（参照によって本明細書に組み込まれる）］プロモーター系は、また、有用なプロモーター配列を提供する。本発明の好ましい方法では、強力なプロモーター、例えば、Ｔ７プロモーターを利用して、レラキシンポリペプチドを高レベルで誘導する。このようなベクターの例は、当業者には既知で、ＮｏｖａｇｅｎのｐＥＴ２９シリーズ、および国際公開第９９／０５２９７号に記載のｐＰＯＰベクターが含まれる。この特許は、参照によって本明細書に組み込まれる。このような発現系は、宿主細胞生存率または成長パラメータを犠牲にすることなく、宿主中で高レベルのレラキシンポリペプチドを産生する。ｐＥＴ１９（Ｎｏｖａｇｅｎ）は、当技術分野で知られているもう一つのベクターである。
【０３８８】
さらに、天然では発生しない合成プロモーターもまた、細菌プロモーターとして機能する。例えば、１つの細菌またはバクテリオファージプロモーターの転写活性化配列は、別の細菌またはバクテリオファージプロモーターのオペロン配列と連結され、合成ハイブリッドプロモーターを生成できる［米国特許第４，５５１，４３３号（参照によって本明細書に組み込まれる］。例えば、ｌａｃプロモーターは、ｔｒｐプロモーターおよびラックオペロン配列の両方から構成され、ラックプレッサーにより調節されるハイブリッドｔｒｐ−ラックプロモーターであり［Ａｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＧＥＮＥ（１９８３）２５：１６７；ｄｅ  Ｂｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．（１９８３）８０：２１］、さらに、細菌プロモーターは、細菌ＲＮＡポリメラーゼに結合し、転写を開始させる能力を有する非細菌由来天然プロモータを含むことができる。非細菌由来天然プロモーターは、また、適合するＲＮＡポリメラーゼと結合して、原核生物中の一部の遺伝子の高レベルの発現を起こすことができる。バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ／プロモーター系は、結合したプロモーター系の一例である［Ｓｔｕｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．ＭＯＬ、ＢＩＯＬ．（１９８６）１８９：１１３；Ｔａｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９８５）８２：１０７４］。さらに、ハイブリッドプロモーターは、また、バクテリオファージプロモーターおよび大腸菌オペレーター領域から構成されてもよい（欧州特許ＥＰＰｕｂ．Ｎｏ．２６７８５１号）。
【０３８９】
機能性プロモーター配列に加えて、効率的リボソーム結合部位も、また、原核生物中の外部遺伝子の発現に有用である。大腸菌では、リボソーム結合部位は、シャイン・ダルガーノ（ＳＤ）配列と呼ばれ、開始コドン（ＡＴＧ）および開始コドンの３〜１１ヌクレオチド上流の位置の３〜９ヌクレオチド長さの配列を含む［Ｓｈｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．、ＮＡＴＵＲＥ（１９７５）２５４：３４］。弱いリボソーム結合部位を有する真核生物遺伝子および原核生物遺伝子を発現させるために［Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．「大腸菌中のクローン化遺伝子の発現」、分子クローニング：実験マニュアル（“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ”、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃ１ｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、１９８９］、ＳＤ配列は、ＳＤ配列と大腸菌１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端との間の塩基の対形成により、ｍＲＮＡのリボソームへの結合を促進すると考えられている［生物学的調節および成長：遺伝子発現（Ｅｄ．Ｒ．Ｆ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒ、１９７９）中のＳｔｅｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．「メッセンジャーＲＮＡ中の遺伝子シグナルおよびヌクレオチド配列」］。
【０３９０】
用語の「細菌宿主」または「細菌宿主細胞」は、組換えベクターまたは他のトランスファーＤＮＡ用にレシピエントとして使用できる、または使用されている細菌を指す。この用語は、形質移入されている元の細菌宿主細胞の子孫を含む。単一親細胞の子孫は、偶発的または意図的変異に起因して、形態学、またはゲノム、または全ＤＮＡ補体の点で、必ずしも完全に元の親に同じでなくてもよいことは理解されよう。関連特性、例えば、ヌクレオチドレラキシンポリペプチドをコードする配列の存在、を特徴とする親に充分に類似の親細胞の子孫は、この定義で意図される子孫に含まれる。
【０３９１】
レラキシンポリペプチドの発現に適した宿主細菌の選択は、当業者には既知である。発現用細菌宿主の選択において、適切な宿主には、とりわけ、良好な封入体形成能力、低タンパク分解活性、および全体頑強性を有すると認められるものを含めてもよい。細菌宿主は、通常、種々のソースから入手可能であり、限定されないが、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ）；およびアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（「ＡＴＣＣ」）（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）が含まれる。産業／医薬品発酵は、通常、Ｋ株由来細菌（例えば、Ｗ３１１０）またはＢ株由来細菌（例えば、ＢＬ２１）を使用する。これらの株は、特に、有用である．理由は、それらの成長パラメータは、非常によく知られており、頑強であるからである。さらに、これらの株は、非病原性であり、安全性および環境の理由から、商業的に重要である。適切な大腸菌宿主の他の例には、限定されないが、ＢＬ２１、ＤＨ１０Ｂの株、またはこれらの誘導体が含まれる。本発明の方法の別の実施形態では、大腸菌宿主は、限定されないが、ＯＭＰ−およびＬＯＮ−を含むプロテアーゼマイナス株である。宿主細胞株は、限定されないが、蛍光菌、緑膿菌、およびプチダ菌等のシュードモナスの種であってもよい。株ＭＢ１０１と命名されている蛍光菌次亜種１は、組換え型産生に有用であることがわかっており、治療用タンパク質産生プロセスに利用可能である。シュードモナス発現系の例には、Ｔｈｅ  Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｄｌａｎｄ、ＭＩ：Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂのｄｏｗ．ｃｏｍで利用可能）から宿主株として入手可能な系が含まれる。
【０３９２】
組換え宿主細胞株が樹立される（すなわち、発現構築物が宿主細胞中に導入され、適切な発現構築物を有する宿主細胞が単離される）とすぐに、レラキシンポリペプチドの産生に適した条件下で、組換え宿主細胞株が培養される。当業者には明らかなように、組換え宿主細胞株の培養方法は、利用される発現構築物および宿主細胞の固有の特性に依存する。組換え宿主株は、通常、当業者に既知の方法を使って培養される。組換え宿主細胞は、典型的には、炭素、窒素、および無機塩類の同化可能なソース、ならびに、任意選択で、ビタミン、アミノ酸、増殖因子、および当業者に既知の他のタンパク性の培養補充剤を含む液体培地中で培養される。宿主細胞の液体培養培地は、任意選択で、望ましくない微生物の増殖を防ぐための抗生物質または抗真菌剤、および／または、限定されないが、発現ベクター含有宿主細胞を選択するための抗生物質、等の化合物、を含んでもよい。
【０３９３】
組換え宿主細胞は、バッチまたは連続型のいずれかで、細胞採取（レラキシンポリペプチドが細胞内に蓄積する場合に）または培養液上清の採取のいずれかを行って、バッチまたは連続型で培養できる。原核生物宿主細胞中で産生する場合は、バッチ培養および細胞採取が好ましい。
【０３９４】
本発明のレラキシンポリペプチドは、通常、組換え系で発現後、精製される。レラキシンポリペプチドは、当該技術分野で既知の種々の方法により、宿主細胞から、または培地から精製できる。細菌宿主細胞で産生されたレラキシンポリペプチドは、低い可溶性か、または不溶性（封入体の形で）であってもよい。本発明の一実施形態では、組換え産生タンパク質の溶解度の増加のために選択されるレラキシンポリペプチド中のアミノ酸置換が、本明細書に開示、ならびに当技術分野で既知の方法を使って、容易に行える。不溶性のタンパク質の場合には、タンパク質は、宿主細胞ライセートから遠心分離により集められ、続いて、細胞のホモジナイゼーションを行うことができる。低い可溶性のタンパク質の場合には、限定されないが、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、等の化合物が、添加され、部分的に可溶性タンパク質の沈殿を誘導できる。次に、沈殿したタンパク質は、遠心分離を使って都合よく集めることができる。組換え宿主細胞は、破壊するか、またはホモジナイズして、当業者に既知の種々の方法を使って、細胞内から封入体を放出させることができる。宿主細胞破壊またはホモジナイズは、限定されないが、酵素的細胞破壊、超音波処理、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイゼーション、または高圧放出破壊（ｈｉｇｈ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）等のよく知られた技術を使って行うことができる。本発明の方法の一実施形態では、高圧放出技術を使って大腸菌宿主細胞を破壊し、レラキシンポリペプチドの封入体を放出させる。レラキシンポリペプチドの封入体を取り扱う場合は、可溶化、機械的剪断またはタンパク質分解等の因子による損失を無くして、封入体の収率を最大化するために、繰り返しの際のホモジナイゼーション時間を最小限にするのが都合がよいと思われる。
【０３９５】
不溶性または沈殿したレラキシンポリペプチドは、本技術分野で既知のいくつかの適切な可溶化剤を使って可溶化できる。レラキシンポリペプチドは、尿素または塩酸グアニジンを使って可溶化できる。大きなバッチが従来の扱いやすいバッチサイズを使って産生出来るように、可溶化レラキシンポリペプチドの容量は、最小限にすべきである。組換え宿主が数千リットルの容量のバッチで増殖できる場合は、この因子は、大規模商業環境では重要であろう。さらに、大規模商業環境でレラキシンポリペプチドを製造する場合は、特に、ヒトの医薬品用途に対しては、機械や容器、またはタンパク質産物それ自体を損傷する可能性のある強力な薬品は、可能なら避けるべきである。本発明の方法で、より強力な変性剤の塩酸グアニジンの代わりに、より穏やかな変性剤の尿素がレラキシンポリペプチド封入体を可溶化するのに使用できることが示された。尿素の使用は、レラキシンポリペプチド封入体を効率的に可溶化する間にレラキシンポリペプチドの製造および精製プロセスで使用されるステンレス鋼設備に対する損傷のリスクを大きく低減する。
【０３９６】
可溶性レラキシンタンパク質の場合には、レラキシンは、細胞周辺腔または培地中へ分泌されてもよい。さらに、可溶性レラキシンは、宿主細胞の細胞質中に存在してもよい。精製ステップ実行の前に、可溶性レラキシンを濃縮するのが望ましいと思われる。標準的な方法を使って可溶性レラキシンを、例えば、細胞ライセートまたは培地から濃縮することができる。さらに、当業者に既知の標準的な方法を使って宿主細胞を破壊し、宿主細胞の細胞質または細胞周辺腔から可溶性レラキシンを放出させることができる。
【０３９７】
レラキシンポリペプチドが、融合タンパク質として産生される場合は、融合配列は除去できる。融合配列の除去は、酵素的または化学的切断により行うことができる。融合配列の酵素的除去は、当業者に既知の方法を使って行うことができる。当業者には明らかなように、融合配列の除去用酵素の選択は、融合の固有の特性により決定され、反応条件は、酵素の選択により特定されるであろう。化学的切断は、限定されないが、臭化シアン、ＴＥＶプロテアーゼ、および他の試薬を含む当業者には既知の試薬を使って行うことができる。切断されたレラキシンポリペプチドは、当業者には既知の方法により切断された融合配列から精製できる。このような方法は、当業者には明らかなように、融合配列およびレラキシンポリペプチドの素性および性質により決定できる。精製方法は、限定されないが、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーもしくは透析またはこれらのいずれかの組み合わせを含んでもよい。
【０３９８】
レラキシンポリペプチドは、また、精製してタンパク質溶液からＤＮＡを除去できる。ＤＮＡは、当技術分野で既知のいずれかの適切な方法、例えば、沈殿反応またはイオン交換クロマトグラフィー等、により除去でき、限定されないが、プロタミン硫酸塩等の核酸沈殿剤を使って沈殿により除去してもよい。レラキシンポリペプチドは、限定されないが、遠心分離または濾過、等の標準的な、よく知られた方法を使って、沈殿したＤＮＡから分離できる。レラキシンポリペプチドがヒトの治療のために使用され、本発明の方法により宿主細胞ＤＮＡを薬学的に許容可能なレベルに減らす環境では、宿主核酸分子の除去は重要な因子である。
【０３９９】
限定されないが、発酵槽、振盪フラスコ、流動層バイオリアクター、中空糸バイオリアクター、ローラーボトルカルチャーシステム、および撹拌槽バイオリアクターシステム等の小規模または大規模発酵のための方法は、タンパク質発現にも使用可能である。これらの方法のそれぞれは、バッチ、流加バッチ、または連続モードプロセスで行うことができる。
【０４００】
本発明のヒトレラキシンポリペプチドは、通常、当技術分野で標準的な方法を使って回収できる。例えば、培地または細胞ライセートは、遠心分離または濾過して、細胞性壊死組織片を除去できる。上清は、濃縮または希釈して、所望の容量にしてもよく、または適切な緩衝液中に透析濾過し、さらなる精製用の準備を整えてもよい。本発明のレラキシンポリペプチドのさらなる精製は、インタクト型からの脱アミドおよび短縮された形のレラキシンポリペプチド変異体の分離を含む。
【０４０１】
下記の代表的方法のいずれかは、本発明のレラキシンポリペプチドの精製に採用できる：親和性クロマトグラフィー；陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー（限定されないが、ＤＥＡＥセファロースを使って）；シリカクロマトグラフィー；高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）；逆相ＨＰＬＣ；ゲル濾過（限定されないが、セファデックスＧ−７５を使って）；疎水性相互作用クロマトグラフィー；サイズ排除クロマトグラフィー；金属キレートクロマトグラフィー；限外濾過／透析濾過；エタノール沈殿；硫酸アンモニウム沈殿法；等電点電気泳動；置換クロマトグラフィー；電気泳動的法（限定されないが、分取等電点電気泳動）、差分溶解度（限定されないが、硫酸アンモニウム沈殿法を含む）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、または抽出。
【０４０２】
限定されないが、非天然アミノ酸含有タンパク質、非天然アミノ酸含有ペプチド、非天然アミノ酸含有タンパク質に対する抗体、非天然アミノ酸含有タンパク質の結合相手、等の本発明のタンパク質は、当業者に既知の標準的方法に従って、部分的に、または実質的に均質に精製できる。従って、本発明のポリペプチドは、当業者に既知のいくつかの方法により、回収および精製できる。これらの方法には、限定されないが、下記のいずれかの方法が含まれる：アンモニウム硫酸塩またはエタノール沈殿、酸または塩基抽出、カラムクロマトグラフィー、アフィニティカムクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、ゲル電気泳動法、等。タンパク質リフォールディングステップは、所望通りの適切な折り畳みの成熟タンパク質を作るのに使用できる。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、親和性クロマトグラフィー、または他の適切な方法が、高純度が望まれる最終精製ステップで使用可能である。一実施形態では、非天然アミノ酸（または非天然アミノ酸含有タンパク質もしくはペプチド）に対し作られた抗体は、限定されないが、親和性に基づく１つまたは複数の非天然アミノ酸を含むタンパク質またはペプチドの精製のために、精製剤として使用される。所望通りに部分的または均質に精製されるとすぐに、ポリペプチドが、限定されないが、アッセイ成分、治療薬、予防薬、診断薬、研究試薬、および／または抗体産生用免疫原として、任意選択で各種の用途に使用される。本発明のポリペプチドに対して精製された抗体は、ルーチンプロトコルを使って、ポリペプチドまたはエピトープ含有断片、または細胞を、動物、好ましくは非ヒト動物へ投与することにより得ることができる。当業者なら、種々の既知の技術を使って抗体を生成できるであろう。また、遺伝子導入マウス、または他の哺乳動物を含む他の生物が、ヒト化抗体の発現に使用できる。上述の抗体は、ポリペプチドを発現しているクローンの単離もしくは特定またはポリペプチドの精製に採用可能である。本発明のポリペプチドに対する抗体は、また、疾患の治療に採用可能である。
【０４０３】
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、また、ワクチン剤としても使用できる。従って、さらなる態様では、本発明は、例えば、サイトカイン産生Ｔ細胞または細胞障害性Ｔ細胞を含む抗体および／またはＴ細胞免疫応答の生成に充分な、また、疾患が既に個体中で定着しているか否かにかかわらず、前記動物を疾患から保護するのに充分な、本発明のポリペプチドを哺乳動物に接種することを含む、哺乳動物で免疫応答を誘導する方法に関する。哺乳動物の免疫応答は、また、このような免疫応答をインビボで誘導し、本発明の疾患から前記動物を保護する抗体を産生するために、ポリヌクレオチドの発現を指示し、ポリペプチドをコードするベクターを介して本発明のポリペプチドの送達を含む方法により誘導できる。ベクター投与の１つの方法は、粒子上のコーティングとして、または他の方法で加速して所望の細胞中に入れることである。このような核酸ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、改変核酸、またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを含んでもよい。ワクチンとしての試料には、ポリペプチドまたは核酸ベクターが、通常、ワクチン製剤（組成物）として提供されることになる。製剤は、適切なキャリアーをさらに含んでもよい。ポリペプチドは、胃で破砕される可能性があるので、非経口的に（例えば、皮下、筋肉内、静脈内、または皮内注射で）投与されてもよい。非経口投与に適した製剤は、抗酸化剤を含んでもよい水性または非水性無菌注射溶液、緩衝液、静菌薬およびレシピエントの血液と等張性の製剤を形成する溶質；および懸濁剤または糊料を含んでもよい水性および非水性の無菌の懸濁液、を含む。ワクチン製剤は、また、当業者に既知の製剤の免疫原性を高めるアジュバント系を含んでもよい。投与量は、ワクチンの特異的活性に依存するが、ルーチン実験により容易に決定できるであろう。
【０４０４】
代替系による発現
非組換え宿主細胞、辺誘発宿主細胞、または無細胞系中のタンパク質に、非天然アミノ酸を導入するいくつかの戦略が採用されている。これらの系は、また、本発明のレラキシンポリペプチドの作製に使用するのに適する。反応性側鎖、例えば、Ｌｙｓ、ＣｙｓおよびＴｙｒを使ったアミノ酸の誘導体化は、リシンのＮ２−アセチルリシンへの変換に繋がる。化学合成は、また、非天然アミノ酸を組み込むための直接的方法を提供する。最近の酵素連結反応およびネイティブ化学ペプチド断片ライゲーションの開発により、さらに大きなタンパク質の作製が可能となっている。例えば、Ｐ．Ｅ．Ｄａｗｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓ．Ｂ．Ｈ．Ｋｅｎｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ、６９：９２３（２０００）、を参照されたい。化学的ペプチド連結反応およびネイティブ化学ライゲーションは、米国特許第６，１８４，３４４号、米国特許公開第２００４／０１３８４１２号、同２００３／０２０８０４６号、国際公開第０２／０９８９０２号、および同０３／０４２２３５号に記載されている。これらは、参照によって本明細書に組み込まれる。所望の非天然アミノ酸で化学的にアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡが、タンパク質生合成を支援できるインビトロ抽出物に添加されている一般的なインビトロ生合成方法を使って、１００を越える非天然アミノ酸が、実質的に任意のサイズの種々のタンパク質中に部位特異的に組み込まれている。例えば、Ｖ．Ｗ．Ｃｏｒｎｉｓｈ、Ｄ．Ｍｅｎｄｅｌ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ、Ａｎｇｅｗ、Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、１９９５、３４：６２１（１９９５）；Ｃ．Ｊ．Ｎｏｒｅｎ、Ｓ．Ｊ、Ａｎｔｈｏｎｙ−Ｃａｈｉｌｌ、Ｍ．Ｃ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈ、Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ、非天然アミノ酸のタンパク質への部位特異的組み込みの一般的的方法（Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１８２−１８８（１９８９）；および、Ｊ．Ｄ．Ｂａｉｎ、Ｃ．Ｇ．Ｇｌａｂｅ、Ｔ．Ａ．Ｄｉｘ、Ａ．Ｒ．Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ、Ｅ．Ｓ．Ｄｉａｌａ、非天然アミノ酸のポリペプチドへの生合成による部位特異的組み込み（Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｉｎｔｏ  ａ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：８０１３−８０１４（１９８９）、を参照されたい。タンパク質安定性、タンパク質折り畳み、酵素機序、およびシグナル伝達の調査のために、様々な官能基がタンパク質中に組み込まれている。
【０４０５】
本明細書に記載の他の文献に加えて、種々の精製／タンパク質折り畳み方法が当業者に既知であり、これらには、限定されないが、下記のものが含まれる：Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ、タンパク質精製（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．（１９８２）；Ｄｅｕｔｓｃｈｃｒ、酵素学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）Ｖｏｌ．１８２：タンパク質精製ガイド（Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．（１９９０）；Ｓａｎｄａｎａ、（１９９７）タンパク質の生物学的分離（Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．；Ｂｏｌｌａｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）タンパク質の方法（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）、２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、ＮＹ；Ｗａｌｋｅｒ、（１９９６）タンパク質プロトコルハンドブック（Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ）、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＪ、Ｈａｍｓ  ａｎｄ  Ａｎｇａｌ、（１９９０）タンパク質精製の適用：実践的手法（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ａｎｇａｌ、タンパク質の精製方法：実践的手法（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｓｃｏｐｅｓ、（１９９３）、タンパク質精製：原理と実践（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ）３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、ＮＹ；Ｊａｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｒｙｄｅｎ、（１９９８）タンパク質精製：原理、高精度法と適用（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ、ＨｉｇｈＲｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、ＮＹ；およびＷａｌｋｅｒ（１９９８）、タンパク質プロトコル（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）（ＣＤ−ＲＯＭ）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＪ；およびそれらの中で引用されている文献。
【０４０６】
真核生物宿主細胞または非真核生物宿主細胞中の非天然アミノ酸を有する対象タンパク質またはポリペプチドを産生する利点の１つは、通常、タンパク質またはポリペプチドが、本来の高次構造に折り畳まれる点にある。しかし、特定の本発明実施形態では、当業者は、合成、発現および／または精製後、タンパク質またはペプチドが、所望の関連ポリペプチド高次構造とは異なる高次構造を持つ可能性があることに気付くであろう。本発明の一態様では、発現タンパク質またはポリペプチドは、任意選択で、変性され、その後、復元される。これは、当技術分野で既知の方法を利用して行うことができ、この方法には、限定されないが、対象タンパク質またはポリペプチドにシャペロニンを添加する、タンパク質を不安定化薬剤、例えば、グアニジンＨＣｌ中で可溶化する、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼを利用する、等の方法が含まれる。
【０４０７】
一般的に、発現ポリペプチドを変性させ、還元して、その後、ポリペプチドを好ましい高次構造にリフォールディングさせるのが望ましい場合もある。例えば、グアニジン、尿素、ＤＴＴ、ＤＴＥ、および／またはシャペロニンを、対象翻訳産物に添加してもよい。タンパク質の還元、変性および復元方法は、当業者には既知である（上記文献、およびＤｅｂｉｎｓｋｉ、ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８：１４０６５−１４０７０；Ｋｒｅｉｔｍａｎ  ａｎｄ  Ｐａｓｔａｎ（１９９３）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．、４：５８１−５８５；およびＢｕｃｈｎｅｒ、ｅｔ  ａｌ．、（１９９２）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２０５：２６３−２７０、を参照）。例えば、Ｄｅｂｉｎｓｋｉ、ｅｔ  ａｌ．、は、グアニジン−ＤＴＥ中の封入体タンパク質の変性および還元について記載している。タンパク質は、限定されないが、酸化グルタチオンおよびＬ−アルギニン等のレドックス緩衝液中でリフォールディングできる。リフォールディング試薬は、流し込んでまたは他の方法で１つまたは複数のポリペプチドまたは他の発現産物と接触させることができ、逆の方法も可能である。
【０４０８】
原核生物のレラキシンポリペプチド産生の場合は、産生されたレラキシンポリペプチドは、ミスフォールドされている可能性があり、従って、生物活性が無いか、または低下している。タンパク質の生物活性は、「リフォールディング」により回復できる。一般的に、ミスフォールディングレラキシンポリペプチドは、例えば、１つまたは複数のカオトロピック剤（例えば、尿素および／またはグアニジン）およびジスルフィド結合を還元できる還元剤（例えば、ジチオトレイトール、ＤＴＴまたは２−メルカプトエタノール、２−ＭＥ）を使った、ポリペプチド鎖の可溶化（レラキシンポリペプチドが、また、不溶性ある場合）、アンフォールディングおよび還元によりリフォールディングされる。次に、中等度の濃度のカオトロープで、酸化剤（例えば、酸素、シスチンまたはシスタミン）が添加され、これによりジスルフィド結合の再構成が可能となる。レラキシンポリペプチドは、当技術分野で既知の標準的方法、例えば、米国特許第４，５１１，５０２号、同４，５１１，５０３号、および同４，５１２，９２２号、に記載の方法を使ってリフォールディングされる。これらの特許は、参照によって本明細書に組み込まれる。レラキシンポリペプチドは、また、他のタンパク質と同時フォールディングされ、ヘテロダイマーまたはヘテロマルチマーを形成できる。
【０４０９】
リフォールディング後、レラキシンは、さらに精製されてもよい。レラキシンの精製は、当業者に既知の種々の技術を使って行うことができ、これには、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー等、またはこれらの任意の組み合わせが含まれる。さらなる精製には、また、精製されたタンパク質の乾燥または沈殿ステップを含んでもよい。
【０４１０】
精製後、レラキシンは、異なる緩衝液に取り替えてもよく、および／または限定されないが、透析濾過および透析を含む当技術分野で既知の種々の方法のいずれかにより濃縮してもよい。単一の精製されたタンパク質として提供されているレラキシンは、凝集および沈殿しがちである。
【０４１１】
精製されたレラキシンは、少なくとも９０％純粋（逆相高速液体クロマトグラフィー、ＲＰ−ＨＰＬＣ、またはナトリウムドデシル硫酸塩−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定して）または少なくとも９５％純粋、または少なくとも９８％純粋、または少なくとも９９％以上純粋であってもよい。正確なレラキシンの純度の数値に関わらず、レラキシンは、医薬品としての使用、またはさらなるプロセシング、例えば、ＰＥＧ等の水溶性ポリマーとのコンジュゲーション用の使用にとって、充分に純粋である。
【０４１２】
特定のレラキシン分子は、他の有効成分またはタンパク質（賦形剤、キャリアー、および安定剤、血清アルブミン、等以外の）が無い場合は、治療薬として使用可能であり、または、別のタンパク質またはポリマーと複合化してもよい。
【０４１３】
一般的精製方法  種々の単離ステップのいずれか１つは、細胞ライセート、抽出物、培地、封入体、宿主細胞の細胞周辺腔、宿主細胞の細胞質、または他のレラキシンポリペプチド含有物質に対して、または、限定されないが、下記を含むいずれかの単離ステップから得られた任意のレラキシンポリペプチドに対して行うことができる：親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）、逆相ＨＰＬＣ（「ＲＰ−ＨＰＬＣ」）、拡張吸着流動床、またはいずれかの組み合わせおよび／またはそれらの、任意の適切な順での繰り返し。
【０４１４】
本明細書記載の技術を実行する際に使われる設備および他の必要な材料は、市販されている。ポンプ、フラクションコレクター、モニター、レコーダー、および全体システムは、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）、およびＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）から入手可能である。限定されないが、交換基質材料、メディア、および緩衝液等のクロマトグラフ用材料は、また、このような会社から入手可能である。
【０４１５】
本明細書記載のカラムクロマトグラフィープロセスの平衡化、および他のステップ、例えば、洗浄および溶出は、特殊な設備、例えば、ポンプを使って、より高速に行うことができる。市販のポンプには、限定されないが、ＨＩＬＯＡＤ（登録商標）ポンプＰ−５０、蠕動ポンプＰ−ｌ、ポンプＰ−９０１、およびポンプＰ−９０３（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）が含まれる。
【０４１６】
フラクションコレクターの例には、ＲｅｄｉＦｒａｃフラクションコレクター、ＦＲＡＣ−１００およびＦＲＡＣ−２００フラクションコレクター、ならびにＳＵＰＥＲＦＲＡＣ（登録商標）フラクションコレクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）が含まれる。ミキサーも入手可能で、ｐＨおよび線形濃度勾配を形成できる。市販のミキサーには、勾配ミキサーＧＭ−１およびインラインミキサー（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）が含まれる。
【０４１７】
クロマトグラフィープロセスは、任意の市販のモニターを使ってモニターできる。このようなモニターは、ＵＶ、ｐＨ、および伝導度等の情報を集めるために使用できる。検出器の例には、モニターＵＶ−１、ＵＶＩＣＯＲＤ（登録商標）Ｓ  ＩＩ、モニターＵＶ−ＭＩＩ、モニターＵＶ−９００、モニターＵＰＣ−９００、モニターｐＨ／Ｃ−９００、および伝導度モニター（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）が含まれる。実際、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）から種々のＡＫＴＡ（登録商標）システム、を含む全体システムが、市販されている。
【０４１８】
本発明一実施形態では、例えば、レラキシンポリペプチドが還元されて、最初に得られた精製レラキシンポリペプチドは、尿素中での変性により変性され、続けて、還元剤（例えば、ＤＴＴ）を含むトリス緩衝液中に適切なｐＨで希釈することができる。別の実施形態では、レラキシンポリペプチドは、尿素中で約２Ｍ〜約９Ｍの濃度範囲で変性され、続けて、ｐＨ、約５．０〜約８．０の範囲のトリス緩衝液中で希釈される。本実施形態のリフォールディング混合物は、次に、インキュベートできる。一実施形態では、リフォールディング混合物は、室温で、４〜２４時間インキュベートされる。還元および変性されたレラキシンポリペプチド混合物は、次に、さらに単離または精製されてもよい。
【０４１９】
本明細書で述べたように、最初のレラキシンポリペプチド混合物のｐＨは、いずれかの後の単離ステップの実施の前に調節してもよい。さらに、最初のレラキシンポリペプチド混合物またはいずれかの後工程のそれの混合物は、当技術分野で既知の技術で濃縮できる。さらに、最初のレラキシンポリペプチド混合物またはいずれかの後工程のそれの混合物を含む溶出緩衝液は、当業者に既知の技術を使って、次の単離ステップに適した緩衝液と交換できる。
【０４２０】
イオン交換クロマトグラフィー  一実施形態および任意選択としての追加のステップでは、イオン交換クロマトグラフィーを、最初のレラキシンポリペプチド混合物に対し行うことができる。一般的なイオン交換クロマトグラフィーについては：原理と方法（ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ）（Ｃａｔ．Ｎｏ．１８−１１１４−２１、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ））、を参照されたい。市販のイオン交換カラムには、ＨＩＴＲＡＰ（登録商標）、ＨＩＰＲＥＰ（登録商標）、およびＨＩＬＯＡＤ（登録商標）カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、が含まれる。このようなカラムは、  強陰イオン交換体、例えば、Ｑセファロース（登録商標）ＦａｓｔＦｌｏｗ、Ｑセファロース（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、およびＱセファロース（登録商標）ＸＬ；強陽イオン交換体、例えば、ＳＰセファロース（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、ＳＰセファロース（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、およびＳＰセファロース（登録商標）ＸＬ；弱陰イオン交換体、例えば、ＤＥＡＥセファロース（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ；および弱陽イオン交換体、例えば、ＣＭセファロース（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を利用している。陰イオンまたは陽イオン交換カラムクロマトグラフィーは、実質的に精製されたレラキシンポリペプチドを単離する精製プロセスの各ステージでレラキシンポリペプチドに対し実施できる。陽イオン交換クロマトグラフィーステップは、いずれかの適切な陽イオン交換基質を使って行うことができる。有用な陽イオン交換基質には、限定されないが、繊維質、多孔性、非多孔性、微粒性、ビーズ状、または架橋陽イオン交換基質材料が含まれる。このような陽イオン交換基質材料には、限定されないが、セルロース、アガロース、デキストラン、ポリアクリラート、ポリビニル、ポリスチレン、シリカ、ポリエーテル、または前出のいずれかの複合材が含まれる。
【０４２１】
陽イオン交換基質は、強および弱陽イオン交換体を含むいずれかの適切な陽イオン交換体であってよい。強陽イオン交換体は、広範なｐＨ領域でイオン化したまま残ることができ、従って、広いｐＨ領域にわたってレラキシンに結合できる。弱陽イオン交換体は、しかし、ｐＨに応じて、イオン化を失う可能性がある。例えば、弱陽イオン交換体は、約ｐＨ４またはｐＨ５以下になると、ｐＨ機能として電荷を失う可能性がある。適切な強陽イオン交換体は、限定されないが、荷電官能基、例えば、スルホプロピル（ＳＰ）、メチルスルホナート（Ｓ）、またはスルホエチル（ＳＥ）を含む。陽イオン交換基質は、好ましくは、約２．５〜約６．０のレラキシン結合ｐＨ領域を有する強陽イオン交換体であってもよい。あるいは、強陽イオン交換体は、約ｐＨ２．５〜約ｐＨ５．５のレラキシン結合ｐＨ領域を有してもよい。陽イオン交換基質は、約３．０のレラキシン結合ｐＨを有する強陽イオン交換体であってもよい。あるいは、陽イオン交換基質は、好ましくは、約６．０〜約８．０のレラキシン結合ｐＨ領域を有する強陽イオン交換体であってもよい。陽イオン交換基質は、好ましくは、約８．０〜約１２．５のレラキシン結合ｐＨ領域を有する強陽イオン交換体であってもよい。あるいは、強陽イオン交換体は、約ｐＨ８．０〜約ｐＨ１２．０のレラキシン結合ｐＨ領域を有してもよい。
【０４２２】
レラキシンのロードの前に、陽イオン交換基質は、例えば、カラムの数倍量の希釈した弱酸、例えば、ｐＨ３のカラム４倍量の２０ｍＭ酢酸を使って平衡化できる。平衡化後、レラキシンを添加し、ここでも、弱酸溶液、例えば、弱酢酸またはリン酸溶液を使って、実質的に精製されたレラキシンの溶出の前に、カラムを１〜数回洗浄できる。例えば、カラム約２〜４倍量のｐＨ３の２０ｍＭ酢酸を、カラムの洗浄に使用できる。例えば、ｐＨ５．５の０．１Ｍ塩化ナトリウムと混合した、カラム２〜４倍量のｐＨ５．５の０．０５Ｍ酢酸ナトリウム、または０．０５Ｍ酢酸ナトリウムを使ったさらなる洗浄剤も使用可能である。あるいは、当技術分野で既知の方法を使い、陽イオン交換基質を、カラムの数倍量の希釈した弱塩基を使って平衡化できる。
【０４２３】
あるいは、実質的に精製されたレラキシンは、レラキシンを基質から置換するために、陽イオン交換体基質を充分低いｐＨまたはイオン強度を有する緩衝液と接触させることにより溶出できる。溶出緩衝液のｐＨは、約ｐＨ２．５〜約ｐＨ６．０の範囲であってもよい。さらに具体的には、溶出緩衝液のｐＨは、約ｐＨ２．５〜約ｐＨ５．５、約ｐＨ２．５〜約ｐＨ５．０の範囲であってもよい。溶出緩衝液は、約３．０．のｐＨを有してもよい。さらに、溶出緩衝液の量は、広範に変動してもよく、一般的には、約２〜約１０カラム容量の範囲であろう。
【０４２４】
レラキシンポリペプチドの陽イオン交換体基質に吸着後、実質的に精製されたレラキシンポリペプチドを、レラキシンポリペプチドを基質から置換するのに充分に高いｐＨまたはイオン強度を有する緩衝液と接触させることにより溶出できる。実質的に精製されたレラキシンポリペプチドの高ｐＨ溶出に使用する適切な緩衝液には、限定されないが、少なくとも約５ｍＭ〜少なくとも約１００ｍＭの濃度範囲のクエン酸塩、リン酸塩、蟻酸塩、酢酸塩、ＨＥＰＥＳ、およびＭＥＳ緩衝液を含むことができる。
【０４２５】
逆相クロマトグラフィー  当業者に既知の適切なプロトコルを使ってタンパク質を精製するためにＲＰ−ＨＰＬＣを行うことができる。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＡＮＡＬ  ＢＩＯＣＨＥＭ．（１９８２）１２４：２１７−２３０（１９８２）；Ｒｉｖｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．ＣＨＲＯＭ．（１９８３）２６８：１１２−１１９；Ｋｕｎｉｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．ＣＨＲＯＭ．（１９８６）３５９：３９１−４０２、を参照されたい。実質的に精製されたレラキシンポリペプチドを単離するために、レラキシンポリペプチドに対しＲＰ−ＨＰＬＣを行うことができる。この際に、限定されないが、少なくとも約Ｃ３〜少なくとも約Ｃ３０、少なくとも約Ｃ３〜少なくとも約Ｃ２０、または少なくとも約Ｃ３〜少なくとも約Ｃ１８の樹脂を含む各種の長さのアルキル官能性を有するシリカ誘導体化樹脂が使用できる。あるいは、高分子樹脂が使用できる。例えば、ＴｏｓｏＨａａｓ  Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍｅ  ＣＧ１０００ｓｄ樹脂が使用可能で、これは、スチレンポリマー樹脂である。各種のアルキル鎖長のシアノまたは高分子樹脂もまた、使用できる。さらに、ＲＰ−ＨＰＬＣカラムは、溶媒、例えば、エタノールで洗浄できる。Ｓｏｕｒｃｅ  ＲＰカラムは、ＲＰ−ＨＰＬＣカラムのもう一つの例である。
【０４２６】
イオン対形成剤および有機修飾剤、例えば、メタノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン、アセトニトリルまたはエタノールを含む適切な溶出緩衝液を、ＲＰ−ＨＰＬＣカラムからレラキシンポリペプチドを溶出するのに使用できる。最もよく使われるイオン対形成剤には、限定されないが、酢酸、ギ酸、過塩素酸、リン酸、トリフルオロ酢酸、ヘプタフルオロ酪酸、トリエチルアミン、テトラメチルアンモニウム、テトラブチルアンモニウム、および酢酸トリエチルアンモニウム、が含まれる。溶出は、１つまたは複数の勾配または均一濃度条件を使って行うことができるが、分離時間を短くし、ピーク幅を減らすためには勾配条件が好ましい。別の方法は、異なる溶媒濃度範囲の２つの勾配の使用を含む。本明細書での使用のための適切な溶出緩衝液の例には、限定されないが、酢酸アンモニウムとアセトニトリル溶液を含んでもよい。
【０４２７】
疎水性相互作用クロマトグラフィー精製技術
レラキシンポリペプチドに対し、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を行うことができる。一般的な説明は、疎水性相互作用クロマトグラフィーハンドブック：原理と方法（ＨＹＤＲＯＰＨＯＢＩＣ  ＩＮＴＥＲＡＣＴＩＯＮ  ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＨＹ  ＨＡＮＤＢＯＯＫ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ）（Ｃａｔ．Ｎｏ．１８−１０２０−９０、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を参照されたい。本文献は、参照によって本明細書に組み込まれる。適切なＨＩＣ基質には、限定されないが、アガロース、架橋アガロース、セファロース、セルロース、シリカ、デキストラン、ポリスチレン、ポリ（メタクリルラート）基質を含むアルキルまたはアリール置換基質、例えば、ブチル、ヘキシル、オクチルまたはフェニル置換基質、および限定されないが、ポリエチレンアミン樹脂またはブチルもしくはフェニル置換ポリ（メタクリルラート）基質を含む混合モード樹脂を含んでもよい。疎水性の相互作用カラムクロマトグラフィー用市販のソースには、限定されないが、ＨＩＴＲＡＰ（登録商標）、ＨＩＰＲＥＰ（登録商標）、およびＨＩＬＯＡＤ（登録商標）カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）が含まれる。
【０４２８】
簡単に説明すると、ロードの前に、ＨＩＣカラムは、当業者に既知の標準的緩衝液、例えば、酢酸／塩化ナトリウム溶液またはアンモニウム硫酸塩含有ＨＥＰＥＳを使って平衡化できる。アンモニウム硫酸塩は、ＨＩＣカラムにロードのための緩衝液として使用可能である。レラキシンポリペプチドをロード後、次に、カラムを、望ましくない物質を除き、ＨＩＣカラム上のレラキシンポリペプチドを保持できる標準的緩衝液と条件を使って洗浄できる。レラキシンポリペプチドは、カラムの約３〜約１０倍量の標準的緩衝液、例えば、ＥＤＴＡおよび平衡化緩衝液よりも低いアンモニウム硫酸塩濃度を含むＨＥＰＥＳ緩衝液、または特に酢酸／塩化ナトリウム緩衝液で、溶出できる。また、例えば、カリウムリン酸塩勾配を使った線形減少塩勾配を、使ってレラキシン分子を溶出できる。次に、溶出剤は、例えば、濾過、例えば、透析濾過または限外濾過により濃縮することができる。透析濾過は、レラキシンポリペプチドを溶出するのに使用した塩を除去するために使用できる。
【０４２９】
他の精製技術  例えば、ゲル濾過（ゲル濾過：原理と方法（ＧＥＬ  ＦＩＬＴＲＡＴＩＯＮ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ）（Ｃａｔ．Ｎｏ．１８−１０２２−１８、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）（参照によって本明細書に組み込まれる）、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー（適切な基質には、限定されないが、ＨＡ−Ｕｌｔｒｏｇｅｌ、Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、ＣＨＴセラミックヒドロキシアパタイト（ＢｉｏＲａｄ）、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  ＨＴＰヒドロキシアパタイト（ＢｉｏＲａｄ）が含まれる）、ＨＰＬＣ、拡張吸着流動床、限外濾過、透析濾過、凍結乾燥、等、を使ったさらに別の単離ステップを、最初のレラキシンポリペプチド混合物またはいずれかの後工程のそれの混合物に対し、いずれかの過剰塩を除去し、次の単離ステップまたは最終製品の製剤に対して緩衝液を適切な緩衝液で置換するために、行うことができる。
【０４３０】
当業者に既知の技術を使って、本明細書記載の各ステップで、実質的に精製されたレラキシンポリペプチドを含むレラキシンポリペプチドの収率を、モニターできる。このような技術は、また、最後の単離ステップ後の実質的に精製されたレラキシンポリペプチドの収率を評価するために使うことができる。例えば、レラキシンポリペプチドの収率は、いくつかの種々のアルキル鎖長を有する逆相高圧液体クロマトグラフィーカラム、例えば、シアノＲＰ−ＨＰＬＣ、Ｃ１８ＲＰ−ＨＰＬＣ；ならびに陽イオン交換ＨＰＬＣおよびゲル濾過ＨＰＬＣのいずれかを使ってモニターできる。
【０４３１】
本発明の具体的実施形態では、各精製ステップ後のレラキシンの収率は、各精製ステップに対し、出発材料中のレラキシンの少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％．少なくとも約９９％、少なくとも約９９．９％、または少なくとも約９９．９９％、でありうる。
【０４３２】
純度は、標準的な方法、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使って、またはウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡアッセイを使ってレラキシンポリペプチドを測定することにより決定できる。例えば、ポリクローナル抗体は、負の制御酵母発酵および陽イオン交換回収から単離されたタンパク質に対して生成させることができる。抗体は、また、混入宿主細胞タンパク質の存在を検出するために使用できる。
【０４３３】
ＲＰ−ＨＰＬＣ材料のＶｙｄａｃ  Ｃ４（Ｖｙｄａｃ）は、シリカゲル粒子を含み、その表面は、Ｃ４−アルキル鎖を保持している。タンパク性不純物からのレラキシンポリペプチドの分離は、疎水性の相互作用の強度の差異に基づいている。溶出は、希釈トリフルオロ酢酸中のアセトニトリル勾配を使って行われる。分取ＨＰＬＣは、ステンレス鋼カラム（２．８〜３．２ＬのＶｙｄａｃ  Ｃ４シリカゲルを充填）を使って行われる。ヒドロキシアパタイトＵｌｔｒｏｇｅｌ溶出液は、トリフルオロ酢酸を添加して酸性化され、Ｖｙｄａｃ  Ｃ４カラムにロードされる。洗浄と溶出には、希釈トリフルオロ酢酸中のアセトニトリル勾配が使用される。画分が集められ、直ちにリン酸塩緩衝液で中和される。ＩＰＣの許容限度内にあるレラキシンポリペプチド画分がプールされる。
【０４３４】
ＤＥＡＥセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）材料は、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基から構成され、これは、セファロースビーズの表面に教諭結合している。レラキシンポリペプチドのＤＥＡＥ基への結合は、イオン相互作用により媒介される。アセトニトリルおよびトリフルオロ酢酸は、保持されることなくカラムを通過する。これらの物質が洗い流された後、痕跡の不純物は、低ｐＨの酢酸塩緩衝液を使ってカラムを洗浄することにより除去される。次に、カラムが中性のリン酸塩緩衝液で洗浄され、レラキシンポリペプチドが高められたイオン強度の緩衝液で溶出される。カラムにＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｆａｓｔ  ｆｌｏｗを充填する。カラム容量は、３〜１０ｍｇレラキシンポリペプチド／ｍｌゲルの範囲のレラキシンポリペプチドのロードになるように調整される。カラムは、水および平衡化緩衝液（ナトリウム／カリウムリン酸塩）で洗浄される。ＨＰＬＣ溶出液のプールされた画分がロードされ、カラムが平衡化緩衝液で洗浄される。次に、カラムが洗浄緩衝液（酢酸ナトリウム緩衝液）で洗浄され、続いて、平衡化緩衝液で洗浄される。その後、レラキシンポリペプチドが溶出緩衝液（塩化ナトリウム、ナトリウム／カリウムリン酸塩）を使ってカラムから溶出され、マスター溶出プロファイルに基づいて単一画分に集められる。ＤＥＡＥセファロースカラムの溶出液は、指定伝導度に調節される。得られた医薬品有効成分は、無菌濾過され、テフロンボトルに入れて、−７０℃で貯蔵される。
【０４３５】
採用できるさらなる方法には、限定されないが、エンドトキシンを除去するステップが含まれる。エンドトキシンは、グラム陰性宿主細胞、例えば、大腸菌の外膜上に存在するリポ多糖類（ＬＰＳ）である。エンドトキシンレベルを低減する法王は当業者には既知であり、限定されないが、シリカ担体、ガラス粉末またはヒドロキシアパタイト、逆相、親和性、サイズ排除、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、これらの方法の組み合わせ、等を使った精製技術が含まれる。混入物、例えば、対象ポリペプチド由来の共遊走タンパク質を除去するには、変更されたまたは追加の方法が必要となる可能性がある。エンドトキシンレベルの測定方法は、当業者には既知であり、限定されないが、リムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）アッセイが含まれる。Ｅｎｄｏｓａｆｅ（登録商標）−ＰＴＳアッセイは、ハンドヘルド分光光度計に加えて、ＬＡＬ試薬、発色基質、および対照標準エンドトキシンを予めロードしたカートリッジを利用する比色、シングルチューブシステムである。代替方法には、限定されないが、９６ウエルフォーマットを使用する比濁法であるカイネティックＬＡＬ法が含まれる。
【０４３６】
各種の方法および手続きを使って、１つまたは複数の天然ではコードされないアミノ酸を含むレラキシンタンパク質の収率と純度を評価することができ、限定されないが、これらには、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、質量分析（限定されないが、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを含む）および当業者には既知のタンパク質を特徴付ける他の方法が含まれる。
【０４３７】
さらなる方法には、限定されないが、以下の方法が含まれる：タンパク質染色方法と組み合わせたＳＤＳ−ＰＡＧＥ、イムノブロッティング、マトリクス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）、液体クロマトグラフィー／質量分析、等電点電気泳動、分析用陰イオン交換、等電点電気泳動、および円偏光二色性。
【０４３８】
選択圧組込みと呼ばれるインビボ法は、野性型シンテターゼの無差別性を活用するために開発された。例えば、Ｎ．Ｂｕｄｉｓａ、Ｃ．Ｍｉｎｋｓ、Ｓ．Ａｌｅｆｅｌｄｅｒ、Ｗ．Ｗｅｎｇｅｒ、Ｆ．Ｍ．Ｄｏｎｇ、Ｌ．Ｍｏｒｏｄｅｒ  ａｎｄ  Ｒ．Ｈｕｂｅｒ、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．、１３：４１（１９９９）、を参照されたい。細胞に特定の天然アミノ酸を供給する重要な代謝経路が遮断されている栄養要求株は、わずかの濃度の天然アミノ酸を含む最少培地中で成長するが、一方、標的遺伝子の転写は抑制されている。定常増殖相の発生で、天然アミノ酸が枯渇し、非天然アミノ酸類似体で置換される。組換えタンパク質の発現の誘導により、非天然類似体を含むタンパク質の蓄積がもたらされる。例えば、この戦略を使って、ｏ、ｍおよびｐ−フルオロフェニルアラニンがタンパク質中に組み込まれ、ＵＶスペクトル中に、容易に特定できる２つの特徴的ショルダーを示す。例えば、Ｃ．Ｍｉｎｋｓ、Ｒ．Ｈｕｂｅｒ、Ｌ．Ｍｏｒｏｄｅｒ  ａｎｄ  Ｎ．Ｂｕｄｉｓａ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２８４：２９（２０００）を参照；トリフルオロメチオニンは、バクテリオファージＴ４リゾチーム中のメチオニンを置換し、キトオリゴ糖リガンドとの交互作用を１９Ｆ  ＮＭＲで調査するために使用された。例えば、Ｈ、Ｄｕｅｗｅｌ、Ｅ．Ｄａｕｂ、Ｖ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｆ．Ｈｏｎｅｋ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３６：３４０４（１９９７）を参照；さらにトリフルオロロイシンは、ロイシンの代わりに組み込まれ、ロイシンジッパータンパク質の熱的および化学的安定性の増加に繋がっている。例えば、Ｙ．Ｔａｎｇ、Ｇ．Ｇｈｉｒｌａｎｄａ、Ｗ．Ａ．Ｐｅｔｋａ、Ｔ．Ｎａｌｃａｊｉｍａ、Ｗ．Ｆ．ＤｅＧｒａｄｏ  ａｎｄ  Ｄ．Ａ．Ｔｉｒｒｅｌｌ、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、４０：１４９４（２００１）を参照。さらに、セレノメチオニンおよびテルロメチオニンは、種々の組換えタンパク質中に組み込まれ、Ｘ線結晶学における相の固溶を促進する。例えば、Ｗ．Ａ．Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ、Ｊ．Ｒ．Ｈｏｒｔｏｎ  ａｎｄ  Ｄ．Ｍ．Ｌｅｍａｓｔｅｒ、ＥＭＢＯ  Ｊ．、９：１６６５（１９９０）；Ｊ．Ｏ．Ｂｏｌｅｓ、Ｋ．Ｌｅｗｉｎｓｋｉ、Ｍ．Ｋｕｎｋｌｅ、Ｊ．Ｄ．Ｏｄｏｍ、Ｂ．Ｄｕｎｌａｐ、Ｌ．Ｌｅｂｉｏｄａ  ａｎｄ  Ｍ．Ｈａｔａｄａ、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、１：２８３（１９９４）；Ｎ．Ｂｕｄｉｓａ、Ｂ．Ｓｔｅｉｐｅ、Ｐ．Ｄｅｍａｎｇｅ、Ｃ．Ｅｃｋｅｒｓｋｏｍ、Ｊ．Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｒ．Ｈｕｂｅｒ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２３０：７８８（１９９５）；および、Ｎ．Ｂｕｄｉｓａ、Ｗ．Ｋａｒｎｂｒｏｃｋ、Ｓ．Ｓｔｅｉｎｂａｃｈｅｒ、Ａ．Ｈｕｍｍ、Ｌ．Ｐｒａｄｅ、Ｔ．Ｎｅｕｅｆｅｉｎｄ、Ｌ．Ｍｏｒｏｄｅｒ  ａｎｄ  Ｒ．Ｈｕｂｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２７０：６１６（１９９７）、を参照されたい。アルケンまたはアルキン機能性を有するメチオニン類似体は、また、効率的に組み込まれ、化学的手段による追加のタンパク質の改変を可能としている。例えば、Ｊ．Ｃ．ｖａｎ  Ｈｅｓｔ  ａｎｄ  Ｄ．Ａ．Ｔｉｒｒｅｌｌ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、４２８：６８（１��９８）；Ｊ．Ｃ．、ｖａｎ  Ｈｅｓｔ、Ｋ、Ｌ．Ｋｉｉｃｋ  ａｎｄ  Ｄ．Ａ、Ｔｉｒｒｅｌｌ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２２：１２８２（２０００）；および、Ｋ．Ｌ．Ｋｉｉｃｋ  ａｎｄ  Ｄ．Ａ．Ｔｉｒｒｅｌｌ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、５６：９４８７（２０００）；米国特許第６，５８６，２０７号；米国特許公開第２００２／００４２０９７号を参照されたい。これらは、参照によって本明細書に組み込まれる。この方法の成功は、アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼによる非天然アミノ酸類似体の認識に依存し、一般的に、タンパク質翻訳の正確さを確実にするために高い選択性を必要とする。この方法の範囲を拡張する１つの方法は、アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼの基質特異性を緩和することであり、限られた数のケースで達成されている。例えば、大腸菌フェニルアラニルｔＲＮＡシンテターゼ（ＰｈｅＲＳ）中のＡｌａ２９４のＧｌｙによる置換が、基質結合ポケットのサイズを大きくし、ｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン（ｐ−Ｃｌ−Ｐｈｅ）によるｔＲＮＡＰｈｅのアシル化が起こる。Ｍ．Ｔｂｂａ、Ｐ．Ｋａｓｔ  ａｎｄ  Ｈ．Ｈｅｎｎｅｃｋｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３３：７１０７（１９９４）を参照されたい。この変異体ＰｈｅＲＳを含む大腸菌株は、フェニルアラニンの代わりに、ｐ−Ｃ１−フェニルアラニンまたはｐ−Ｂｒ−フェニルアラニンの組み込みを可能とする。例えば、Ｍ、Ｉｂｂａ  ａｎｄ  Ｈ．Ｈｅｎｎｅｃｋｅ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、３６４：２７２（１９９５）；ａｎｄ、Ｎ．Ｓｈａｒｍａ、Ｒ．Ｆｕｒｔｅｒ、Ｐ．Ｋａｓｔ  ａｎｄ  Ｄ．Ａ．Ｔｉｒｒｅｌｌ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、４６７：３７（２０００）、を参照されたい。同様に、大腸菌チロシル−ｔＲＮＡシンテターゼのアミノ酸結合部位近傍の点変異Ｐｈｅ１３０Ｓｅｒは、アザチロシンがチロシンより効率的に組み込まれるようにすることが示された。Ｆ．Ｈａｍａｎｏ−Ｔａｋａｋｕ、Ｔ．Ｉｗａｍａ、Ｓ．Ｓａｉｔｏ−Ｙａｎｏ、Ｋ．Ｔａｋａｋｕ、Ｙ．Ｍｏｎｄｅｎ、Ｍ．Ｋｉｔａｂａｔａｋｅ、Ｄ．Ｓｏｉｌ  ａｎｄ  Ｓ．Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７５：４０３２４（２０００）、を参照されたい。
【０４３９】
非天然アミノ酸をタンパク質中にインビボで組み込む別の戦略は、プルーフリーディング機序を有するシンテターゼを改変することである。これらのシンテターゼは、識別することができず、従って、同族天然アミノ酸に構造的に類似のアミノ酸を活性化する。この誤差は、別の部位で修正され、ミスチャージアミノ酸をｔＲＮＡから脱アシル化してタンパク質翻訳の正確さを維持する。シンテターゼのプルーフリーディング作用が機能しない場合は、誤って活性化された構造類似体は、編集機能を逃れ、組み込まれる可能性がある。この手法は、最近、バリル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＶａｌＲＳ）を使って立証された。Ｖ．Ｄｏｒｉｎｇ、Ｈ．Ｄ．Ｍｏｏｔｚ、Ｌ．Ａ、Ｎａｎｇｌｅ、Ｔ．Ｌ．Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ、Ｖ．ｄｅ  Ｃｒｅｃｙ−Ｌａｇａｒｄ、Ｐ．Ｓｃｈｉｍｍｅｌ  ａｎｄ  Ｐ、Ｍａｒｌｉｅｒｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２９２：５０１（２００１）、を参照されたい。ＶａｌＲＳは、ｔＲＮＡＶａｌをＣｙｓ、Ｔｈｒ、またはアミノ酪酸（Ａｂｕ）を使って誤ってアミノアシル化できる；これらの非同族アミノ酸は、その後、編集ドメインにより加水分解される。大腸菌染色体のランダム変異誘発後、ＶａｌＲＳの編集部位に変異がある変異体大腸菌株が、選択された。この編集不完全ＶａｌＲＳは、ｔＲＮＡＶａｌにＣｙｓをミスチャージする。Ａｂｕは、Ｃｙｓに立体的に似ている（Ｃｙｓの−ＳＨ基がＡｂｕの−ＣＨ３で置換されている）ので、この変異体大腸菌株がＡｂｕの存在下増殖する場合、変異体ＶａｌＲＳは、また、Ａｂｕをタンパク質中に組み込む。質量分析は、元のタンパク質中の各バリン位置で、約２４％のバリンが、Ａｂｕにより置換されていることを示す。
【０４４０】
固相相合成および半合成法も、また、いくつかの新規アミノ酸を含むタンパク質の合成を可能としている。例えば、下記の出版物およびそこに引用された文献を参照されたい：Ｃｒｉｃｋ、Ｆ．Ｈ．Ｃ．、Ｂａｒｒｅｔｔ、Ｌ．Ｂｒｅｎｎｅｒ、Ｓ．Ｗａｔｔｓ−Ｔｏｂｉｎ、Ｒ．タンパク質用遺伝コードの一般的な性質（Ｇｅｎｅｒａｌ  ｎａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）．Ｎａｔｕｒｅ．１９２：１２２７−１２３２（１９６１）；Ｈｏｆｍａｎｎ、Ｋ．、Ｂｏｈｎ、Ｈ．ポリペプチドの研究（Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ）．ＸＸＸＶＩ．Ｓ−ペプチド断片のＳ−タンパク質活性化効力に与えるピラゾール−イミダゾール置換の効果（Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｐｙｒａｚｏｌｅ−ｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｓ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ｏｆ  ａｎ  Ｓ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）、Ｊ．Ａｍ  Ｃｈｅｍ．８８（２４）：５９１４−５９１９（１９６６）；Ｋａｉｓｅｒ、Ｅ．Ｔ．合成手法ｔｏ酵素を含む生物学的に活性なペプチドおよびタンパク質の合成手法（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｅｎｙｚｍｅｓ）、Ａｃｃ  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ．２２：４７−５４（１９８９）；Ｎａｋａｔｓｕｋａ、Ｔ．、Ｓａｓａｋｉ、Ｔ．、Ｋａｉｓｅｒ、Ｅ．Ｔ．半合成酵素チオスブチリシンにより触媒されたペプチドセグメント結合（Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｅｇｍｅｎｔ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅ  ｔｈｉｏｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）、Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．１０９：３８０８−３８１０（１９８７）；Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ、Ｍ．、Ｋｅｎｔ、ＳＢＨ．非保護合成ペプチドかみ合わせによるタンパク質構築：骨格操作ＨＩＶプロテアーゼ（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｄｏｖｅｔａｉｌｉｎｇ  ｕｎｐｒｏｔｅｃｔｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｂａｃｋｂｏｎｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ＨＩＶ  ｐｒｏｔｅａｓｅ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２５６（５０５４）：２２１−２２５（１９９２）；Ｃｈａｉｋｅｎ、Ｉ．Ｍ．半合成ペプチドおよびタンパク質（Ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１（３）：２５５−３０１（１９８１）；Ｏｆｆｏｒｄ、Ｒ．Ｅ．化学手段によるタンパク質工学？（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｂｙ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｅａｎｓ？）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．．１（３）：１５１−１５７（１９８７）；および、Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｄ．Ｙ．、Ｂｕｒｎｉｅｒ、Ｊ．、Ｑｕａｎ、Ｃ．、Ｓｔａｎｌｅｙ、Ｍ．、Ｔｏｍ、Ｊ．、Ｗｅｌｌｓ、Ｊ．Ａ．非天然触媒残基を使ったリボヌクレアーゼＡ全合成のためのペプチドリガーゼの設計（Ａ  Ｄｅｓｉｇｎｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｇａｓｅ  ｆｏｒ  Ｔｏｔａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ａ  ｗｉｔｈ  Ｕｎｎａｔｕｒａｌ  Ｃａｔａ���ｙｔｉｃ  Ｒｅｓｉｄｕｅｓ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２６６（５１８３）：２４３（１９９４）。
【０４４１】
化学的改変は、補助因子、スピン標識およびオリゴヌクレオチド等の種々の非天然側鎖のタンパク質へのインビトロ導入のために使用されてきた。例えば、下記を参照されたい。Ｃｏｒｅｙ、Ｄ．Ｒ．、Ｓｃｈｕｌｔｚ、Ｐ．Ｇ．ハイブリッド配列特異的単鎖デオキシリボヌクレアーゼの生成（Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｙｂｒｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２３８（４８３２）：１４０１−１４０３（１９８７）；Ｋａｉｓｅｒ、Ｅ．Ｔ．、Ｌａｗｒｅｎｃｅ  Ｄ．Ｓ．、Ｒｏｋｉｔａ、Ｓ．Ｅ．酵素特異性の化学的改変（Ｔｈｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．５４：５６５−５９５（１９８５）；Ｋａｉｓｅｒ、Ｅ．Ｔ．、Ｌａｗｒｅｎｃｅ、Ｄ．Ｓ．酵素活性部位の化学的変異（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｙｚｍｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅｓ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２２６（４６７４）：５０５−５１１（１９８４）；Ｎｅｅｔ、Ｋ．Ｅ．、Ｎａｎｃｉ  Ａ、Ｋｏｓｈｌ  ａｎｄ、Ｄ．Ｅ．チオールスブチリシンの特性（Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｉｏｌ−ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）、Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４３（２４）：６３９２−６４０１（１９６８）；Ｐｏｌｇａｒ、Ｌ、ｅｔＭ．Ｌ．Ｂｅｎｄｅｒ．合成により形成した活性部位を含む新規酵素、チオールスブチリシン（Ａｎｅｗｅｎｚｙｍｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃａｌｌｙ  ｆｏｒｍｅｄ  ａｃｔｉｖｅｓｉｔｅ．Ｔｈｉｏｌ−ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）．Ｊ．Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．８８：３１５３−３１５４（１９６６）；および、Ｐｏｌｌａｃｋ、Ｓ．Ｊ．、Ｎａｋａｙａｍａ、Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ、Ｐ、Ｇ、抗体結合部位への求核試薬および分光学的プローブの導入（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｅｓ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｐｒｏｂｅｓ  ｉｎｔｏ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２４２（４８８１）：１０３８−１０４０（１９８８）。
【０４４２】
あるいは、化学修飾アミノアシル−ｔＲＮＡを使う生合成法が、いくつかの生物物理学的プローブをインビトロ合成タンパク質中に組み込むために使用されてきた。下記の出版物および引用文献を参照されたい：Ｂｒｕｎｎｅｒ、Ｊ．新規光標識および架橋方法（Ｎｅｗ  Ｐｈｏｔｏｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄｓ）、Ａｎｎｕ．ＲｅｖＢｉｏｃｈｅｍ、６２：４８３−５１４（１９９３）；および、Ｋｒｉｅｇ、Ｕ．Ｃ．、Ｗａｌｔｅｒ、Ｐ．、Ｈｏｈｎｓｏｎ、Ａ．Ｅ．シグナル認識粒子の５４−キロダルトンポリペプチドの発生期プレプロラクチのシグナル配列の光架橋（Ｐｈｏｔｏｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｎａｓｃｅｎｔ  ｐｒｅｐｒｏｌａｃｔｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ５４−ｋｉｌｏ  ｄａｌｔｏｎ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８３（２２）：８６０４−８６０８（１９８６）。
【０４４３】
以前に、非天然アミノ酸が、化学的アミノアシル化サプレッサーｔＲＮＡの、所望のアンバーナンセンス変異を含む遺伝子でプログラムされたタンパク質合成反応への添加により、インビトロで部位特異的にタンパク質中に組み込まれうることを示した。これらの手法を使って、いくつかの共通２０アミノ酸を構造的に近い相同体、例えば、特定のアミノ酸を栄養要求する株を使って、フルオロフェニルアラニンをフェニルアラニンに置換できる。例えば、Ｎｏｒｅｎ、Ｃ．Ｊ．、Ａｎｔｈｏｎｙ−Ｃａｈｉｌｌ、Ｇｒｉｆｆｉｔｈ、Ｍ．Ｃ．、Ｓｃｈｕｌｔｚ、Ｐ．Ｇ．非天然アミノ酸のタンパク質への部位特異的組み込みのための一般的方法（Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１８２−１８８（１９８９）；Ｍ．Ｗ．Ｎｏｗａｋ、ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６８：４３９−４２（１９９５）；Ｂａｉｎ、Ｊ．Ｄ．、Ｇｌａｂｅ、Ｃ．Ｇ．、Ｄｉｘ、Ｔ．Ａ．、Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ、Ａ．Ｒ．、Ｄｉａｌａ、Ｅ．Ｓ．非天然アミノ酸のポリペプチド中への生合成による部位特異的組み込み（Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｉｎｔｏ  ａ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）、Ｊ．Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ、１１１：８０１３−８０１４（１９８９）；Ｎ．Ｂｕｄｉｓａ  ｅｔ  ａｌ．、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１３：４１−５１（１９９９）；Ｅｌｌｍａｎ、Ｊ．Ａ．、Ｍｅｎｄｅｌ、Ｄ．、Ａｎｔｈｏｎｙ−Ｃａｈｉｌｌ、Ｓ．、Ｎｏｒｅｎ、Ｃ．Ｊ．、Ｓｃｈｕｌｔｚ、Ｐ．Ｇ．非天然アミノ酸を部位特異的にタンパク質中に導入するための生合成方法（Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚ．、ｖｏｌ．２０２、３０１−３３６（１９９２）；および、Ｍｅｎｄｅｌ、Ｄ．、Ｃｏｍｉｓｈ、Ｖ．Ｗ．＆  Ｓｃｈｕｌｔｚ、Ｐ．Ｇ．拡張遺伝コードを使った部位指定変異誘発（Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ａｎ  Ｅｘｐａｎｄｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ）、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｔｒｕｃｔ．２４、４３５−６２（１９９５）を参照されたい。
【０４４４】
例えば、停止コドンＵＡＧを認識し、非天然アミノ酸を使って化学的にアミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡが、調製された。従来の部位指定変異誘発を使って、タンパク質遺伝子中の対象部位に停止コドンＴＡＧが導入された。例えば、Ｓａｙｅｒｓ、Ｊ．Ｒ．、Ｓｃｈｍｉｄｔ、Ｗ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、Ｆ．ホスホロチオエートベースオリゴヌクレオチド指定変異誘発における５’−３’エキソヌクレアーゼ（Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｓｉｓ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、１６（３）：７９１−８０２（１９８８）、を参照されたい。インビトロ転写／翻訳系で、アシル化サプレッサーｔＲＮＡと変異体遺伝子が組み合わされた場合、ＵＡＧコドンに応答して非天然アミノ酸が組み込まれ、これにより、指定位置にアミノ酸を含むタンパク質が得られた。［３Ｈ］−Ｐｈｅおよびα−ヒドロキシ酸を使って実験により、ＵＡＧコドンにより、所望のアミノ酸のみが、指定位置に組み込まれ、このアミノ酸は、タンパク質中の他のどの部位にも組み込まれないことが示された。例えば、Ｎｏｒｃｎ、ｅｔ  ａｌ、前出、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０（６）：４２５−４３２；および、Ｅｌｌｍａｎ、Ｊ．Ａ．、Ｍｅｎｄｅｌ、Ｄ．、Ｓｃｈｕｌｔｚ、Ｐ．Ｇ．新規骨格構造のタンパク質中への部位特異的組み込み（Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｂａｃｋｂｏｎｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２５５（５０４１）：１９７−２００（１９９２）、を参照されたい。
【０４４５】
ｔＲＮＡは、限定されないが、化学的または酵素的アミノアシル化等の任意の方法または技術により、所望のアミノ酸でアミノアシル化されてもよい。
【０４４６】
アミノアシル化は、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼまたは限定されないが、リボザイムを含む他の酵素分子、により行われる。用語の「リボザイム」は、「触媒ＲＮＡ」と同義に使われる。Ｃｅｃｈと共同研究者（Ｃｅｃｈ、１９８７、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３６：１５３２−１５３９；ＭｃＣｏｒｋｌｅ  ｅｔ  ａｌ．、１９８７、ＣｏｎｃｅｐｔｓＢｉｏｃｈｅｍ．６４：２２１−２２６）は、触媒として作用可能な天然ＲＮＡ（リボザイム）の存在を立証した。しかし、これらの天然ＲＮＡ触媒は、リボ核酸基質の切断およびスプライシングに対し作用することがわかっているが、最近のリボザイムの人工的進化に向けた開発は、触媒のレパートリーを種々の化学反応に拡張した。研究により、自らの（２’）３’−終端へのアミノアシル−ＲＮＡ結合を触媒できるＲＮＡ分子（Ｉｌｌａｎｇａｋｅｋａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．、１９９５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７：６４３−６４７）、およびアミノ酸を１つのＲＮＡ分子から別の分子に移すことができるＲＮＡ分子を特定した（Ｌｏｈｓｅ  ｅｔ  ａｌ．、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  ３８１：４４２−４４４）。
【０４４７】
米国特許公開第２００３／０２２８５９３号（参照によって本明細書に組み込まれる）は、リボザイムの構築方法および天然でコードされるおよび天然ではコードされないアミノ酸を含むｔＲＮＡのアミノアシル化でのそれらの使用について記載している。限定されないが、リボザイムを含むｔＲＮＡをアミノアシル化できる基質固定型の酵素分子は、アミノアシル化産物の効率的な親和性精製を可能とする。適切な基質の例には、アガロース、セファロース、および磁気ビーズが含まれる。基質固定型のアミノアシル化用リボザイムの産生と使用については、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００３、１０：１０７７−１０８４および米国特許公開第２００３／０２２８５９３号に記載されている。これらは、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０４４８】
化学的アミノアシル化法には、限定されないが、アミノアシル化にシンテターゼの使用を避けるために、Ｈｅｃｈｔと共同研究者（Ｈｅｃｈｔ、Ｓ．Ｍ、Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．１９９２、２５、５４５；Ｈｅｃｋｌｅｒ、Ｔ．Ｇ．；Ｒｏｅｓｓｅｒ、Ｊ．Ｒ．；Ｘｕ、Ｃ．；Ｃｈａｎｇ、Ｐ．；Ｈｅｃｈｔ、Ｓ．Ｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９８８、２７、７２５４；Ｈｅｃｈｔ、Ｓ．Ｍ．；Ａｌｆｏｒｄ、Ｂ．Ｌ．；Ｋｕｒｏｄａ、Ｙ．；Ｋｉｔａｎｏ、Ｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７８、２５３、４５１７）およびＳｃｈｕｌｔｚ、Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ、Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ、等（Ｃｏｒｎｉｓｈ、Ｖ．Ｗ．；Ｍｅｎｄｅｌ、Ｄ．；Ｓｃｈｕｌｔｚ、Ｐ．Ｇ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．１９９５、３４、６２１；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、Ｓ．Ａ．；Ｅｌｌｍａｎ、Ｊ、Ａ．；Ｓｃｈｕｌｔｚ、Ｐ．Ｇ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９１、１１３、２７２２；Ｎｏｒｅｎ、Ｃ．Ｊ．；Ａｎｔｈｏｎｙ−Ｃａｈｉｌｌ、Ｓ、Ｊ．；Ｇｒｉｆｆｉｔｈ、Ｍ．Ｃ．；Ｓｃｈｕｌｔｚ、Ｐ．Ｇ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８９、２４４、１８２；Ｂａｉｎ、Ｊ．Ｄ．；Ｇｌａｂｅ、Ｃ．Ｇ．；Ｄｉｘ、Ｔ．Ａ．；Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ、Ａ．Ｒ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８９、１１１、８０１３；Ｂａｉｎ、Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ  １９９２、３５６、５３７；Ｇａｌｌｉｖａｎ、Ｊ．Ｐ．；Ｌｅｓｔｅｒ、Ｈ．Ａ．；Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ、Ｄ、Ａ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１９９７、４、７４０；Ｔｕｒｃａｔｔｉ、ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、１９９６、２７１、１９９９１；Ｎｏｗａｋ、Ｍ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９５、２６８、４３９；Ｓａｋｓ、Ｍ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６、２７１、２３１６９；Ｈｏｈｓａｋａ、Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９９、１２１、３４）（これらは、参照によって本明細書に組み込まれる）、により導入された方法が含まれる。このような方法または他の化学的アミノアシル化法は、ｔＲＮＡ分子をアミノアシル化するのに使用可能である。
【０４４９】
触媒ＲＮＡを生成する方法は、無作為化リボザイム配列の別のプールの生成、プールに対し指定方向への進化の実施、所望のアミノアシル化活性でプールを選別、および、所望のアミノアシル化活性を示すリボザイムの配列の選択を含んでもよい。
【０４５０】
リボザイムは、アシル化活性を促進するモチーフおよび／または領域、例えば、ＧＧＵモチーフおよびＵ−リッチ領域を含んでもよい。例えば、Ｕ−リッチ領域は、アミノ酸基質の認識を促進でき、ＧＧＵ−モチーフは、ｔＲＮＡの３’終端を有する塩基対を形成できることが報告された。組み合わせると、ＧＧＵおよびモチーフおよびＵ−リッチ領域は、アミノ酸およびｔＲＮＡの両方の同時認識を促進し、それにより、ｔＲＮＡの３’末端のアミノアシル化を促進する。
【０４５１】
リボザイムは、ｔＲＮＡＡｓｎＣＣＣＧとコンジュゲートされた部分的に無作為化ｒ２４ｍｉｎｉを使ったインビトロ選択と、それに続く、活性クローン中に認められるコンセンサス配列の系統的操作により生成できる。この方法により得られる代表的リボザイムは、「Ｆｘ３リボザイム」と命名され、米国特許公開第２００３／０２２８５９３号（参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されており、同族非天然アミノ酸を付加された種々のアミノアシル−ｔＲＮＡの合成用の多用途触媒として機能する。
【０４５２】
基質のへの固定化は、アミノアシル化ｔＲＮＡの効率的親和性精製を可能とするために使用できる。適切な基質例には、限定されないが、アガロース、セファロース、および磁気ビーズが含まれる。リボザイムは、ＲＮＡの化学構造を利用して樹脂上に固定化できる。例えば、ＲＮＡのリボース上の３’−シスジオールは、過ヨウ素酸塩で酸化されて、対応するジアルデヒドができ、樹脂上へのＲＮＡの固定化を促進できる。安価なヒドラジド樹脂を含む種々の型の樹脂が使用でき、ヒドラジド樹脂の場合、還元的アミノ化により、樹脂とリボザイムの間の相互作用から不可逆的結合が作られる。アミノアシル−ｔＲＮＡの合成は、このオンカラムアミノアシル化技術により、顕著に促進できる。Ｋｏｕｒｏｕｋｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００５；３６：２３９−４は、カラムベースアミノアシル化システムについて記載している。
【０４５３】
アミノアシル化ｔＲＮＡの単離は、種々の方法で行うことができる。１つの適切な方法は、緩衝液、例えば、１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む酢酸ナトリウム溶液、５０ｍＭ  Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（３−プロパンスルホン酸）、１２．５ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．０、１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む緩衝液、または単純にＥＤＴＡ緩衝水（ｐＨ７．０）でアミノアシル化ｔＲＮＡをカラムから溶出することである。
【０４５４】
アミノアシル化ｔＲＮＡを、翻訳反応により作られたポリペプチド中の選択位置でｔＲＮＡがアミノアシル化された際に使用したアミノ酸を組み込むために、翻訳反応に添加することができる。本発明のアミノアシル化ｔＲＮＡが使用可能な翻訳系の例には、限定されないが、細胞ライセートが含まれる。細胞ライセートは、入力ｍＲＮＡからポリペプチドのインビトロ翻訳に必要な反応成分を提供する。このような反応成分の例には、限定されないが、リボソームタンパク質、ｒＲＮＡ、アミノ酸、ｔＲＮＡ、ＧＴＰ、ＡＴＰ、翻訳開始および伸長因子ならびに翻訳関連追加因子、が含まれる。さらに、翻訳系は、バッチ翻訳でも、区分化された翻訳であってもよい。バッチ翻訳系は、単一区画中で反応成分を結合するが、いっぽう、区分化された翻訳系は、翻訳効率を阻害する可能性のある反応産物から翻訳反応成分を分離する。このような翻訳系は、市販されている。
【０４５５】
さらに、結合転写／翻訳系を使用できる。結合転写／翻訳系は、入力ＤＮＡの対応するｍＲＮＡへの転写を可能とし、これが、次に、反応成分により翻訳される。市販の結合転写／翻訳の例は、Ｒａｐｉｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＲＴＳ、Ｒｏｃｈｅ  Ｉｎｃ．）である。この系は、翻訳成分、例えば、リボソームおよび翻訳因子を提供するための大腸菌ライセートを含む混合物を含む。さらに、翻訳で使用するための入力ＤＮＡのｍＲＮＡテンプレートへの転写のために、ＲＮＡポリメラーゼが含まれる。ＲＴＳは、反応区画間に挿入する膜を介して、供給／廃棄区画および転写／翻訳区画を含む反応成分の区画化を使用できる。
【０４５６】
ｔＲＮＡアミノアシル化は、限定されないが、トランスフェラーゼ、ポリメラーゼ、触媒抗体、多官能性タンパク質、等含む他の薬剤によって行うことができる。
【０４５７】
Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ  ２００５  Ｏｃｔ  １０；ｐａｇｅｓ  ３０−３３でＳｔｅｐｈａｎは、天然ではコードされないアミノ酸をタンパク質に組み込むさらなる方法について記載している。Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．２００１  Ｏｃｔ；８（４）：７５９−６９でＬｕ等は、タンパク質が化学的に非天然アミノ酸を含む合成ペプチドに連結される方法（発現タンパク質連結反応）について記載している。
【０４５８】
微量注入技術も、また、非天然アミノ酸をタンパク質中に組み込むために使用された。例えば、Ｍ、Ｗ．Ｎｏｗａｋ、Ｐ．Ｃ、Ｋｅａｒｎｅｙ、Ｊ．Ｒ．Ｓａｍｐｓｏｎ、Ｍ．Ｅ．Ｓａｋｓ、Ｃ．Ｇ．Ｌａｂａｒｃａ、Ｓ．Ｋ．Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ、Ｗ．Ｇ．Ｚｈｏｎｇ、Ｊ．Ｔｈｏｒｓｏｎ、Ｊ．Ｎ．Ａｂｅｌｓｏｎ、Ｎ．Ｄａｖｉｄｓｏｎ、Ｐ．Ｇ、Ｓｃｈｕｌｔｚ、Ｄ．Ａ．Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ  ａｎｄ  Ｈ．Ａ．Ｌｅｓｔｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６８：４３９（１９９５）；および、Ｄ．Ａ．Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ、Ｃｕｒｒ．Ｏｎｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、４：６４５（２０００）、を参照されたい。アフリカツメガエル卵母細胞が、インビトロで作られた２つのＲＮＡ種：標的タンパク質をコードし、対象アミノ酸位置にＵＡＧ停止コドンを有するｍＲＮＡおよび所望の非天然アミノ酸でアミノアシル化したアンバーサプレッサーｔＲＮＡ、を同時注入された。次に、卵母細胞の翻訳機構が、ＵＡＧにより指定される位置に非天然アミノ酸を挿入する。この方法は、膜内在性タンパク質の構造−機能のインビボ調査を可能とし、通常、インビトロ発現系の影響を受けにくい。例には、蛍光共鳴エネルギー転移による距離の測定のための蛍光アミノ酸のタキキニンニューロキニン−２受容体への組込み、（例えば、Ｇ．Ｔｕｒｃａｔｔｉ、Ｋ．Ｎｅｍｅｔｈ、Ｍ、Ｄ．Ｅｄｇｅｒｔｏｎ、Ｕ．Ｍｅｓｅｔｈ、Ｆ．Ｔａｌａｂｏｔ、Ｍ．Ｐｅｉｔｓｃｈ、Ｊ．Ｋｎｏｗｌｅｓ、Ｈ．ＶｏｇｅｌａｎｄＡ、Ｃｈｏｌｌｅｔ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１：１９９９１（１９９６）、を参照）；イオンチャネル中の表面露出残基を特定するためのビオチン化アミノ酸の組込み（例えば、Ｊ．Ｐ．Ｇａｌｌｉｖａｎ、Ｈ．Ａ．Ｌｅｓｔｅｒ  ａｎｄ  Ｄ．Ａ．Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、４：７３９（１９９7）を参照）；イオンチャネル中の立体構造の変化をリアルタイムでモニターするためのケージ化チロシン類似体の使用（例えば、Ｊ．Ｃ．Ｍｉｌｌｅｒ、Ｓ．Ｋ．Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ、Ｐ．Ｍ．Ｅｎｇｌａｎｄ、Ｄ．Ａ．Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ  ａｎｄ  Ｈ．Ａ．Ｌｅｓｔｅｒ、Ｎｅｕｒｏｎ、２０：６１９（１９９８）を参照）；および、ゲーティング機構探査用イオンチャネルバックボーンを変えるためのアルファヒドロキシアミノ酸の使用（例えば、Ｐ．Ｍ．Ｅｎｇｌａｎｄ、Ｙ．Ｚｈａｎｇ、Ｄ．Ａ．Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ  ａｎｄ  Ｈ．Ａ．Ｌｅｓｔｅｒ、Ｃｅｌｌ、９６：８９（１９９９）；および、Ｔ．Ｌｕ、Ａ．Ｙ．Ｔｉｎｇ、Ｊ．Ｍａｉｎｌａｎｄ、Ｌ．Ｙ．Ｊａｎ、Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚａｎｄ  Ｊ．Ｙａｎｇ、Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、４：２３９（２００１）を参照）、を含む。
【０４５９】
非天然アミノ酸を直接タンパク質中にインビボで直接組み込む能力は、各種の利点を提供する。これには、限定されないが、変異体タンパク質の高収率、技術的容易さ、変異体タンパク質を細胞中で、または可能な限り生体中で調査できる可能性および治療の処置および診断用途でのこれらの変異体タンパク質の使用が含まれる。種々の大きさ、酸性度、求核性、疎水性、および他の特性を有する非天然アミノ酸をタンパク質に付与する能力は、プローブタンパク質機能を探査および新規特性を有する新規タンパク質または生物の生成の両方を行うための、合理的に、かつ系統的にタンパク質の構造を操作する我々の能力を大きく拡張できる。
【０４６０】
部位特異的にパラ−Ｆ−Ｐｈｅを組み込む１つの試みでは、酵母アンバーサプレッサーｔＲＮＡＰｈｅＣＵＡ／フェニルアラニルｔＲＮＡシンテターゼ対をｐ−Ｆ−Ｐｈｅ抵抗性で、Ｐｈｅ栄養要求性大腸菌株中で使用した。例えば、Ｒ．Ｆｕｒｔｅｒ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．、７：４１９（１９９８）、を参照されたい。
【０４６１】
無細胞（インビトロ）翻訳系を使って、本発明のレラキシンポリヌクレオチドの発現を得ることも可能である。翻訳系は、細胞性でも、無細胞であってもよく、原核生物でも、真核生物であってもよい。細胞翻訳系には、限定されないが、全細胞調製、例えば、透過処理細胞または細胞培養が含まれ、この場合、所望の核酸配列は、ｍＲＮＡに転写され、ｍＲＮＡは翻訳される。無細胞翻訳系は、市販されており、多くの異なるタイプと系がよく知られている。無細胞系の例には、限定されないが、原核生物ライセート、例えば、大腸菌ライセート、および真核生物のライセート、例えば、コムギ胚芽抽出物、昆虫細胞ライセート、ウサギ網状赤血球ライセート、ウサギ卵母細胞ライセートおよびヒト細胞ライセートが含まれる。真核生物の抽出物またはライセートは、得られたタンパク質がグリコシル化、リン酸化または別の方法で修飾されているのが好ましい。理由は、多くのこのような修飾は、真核生物系のみで可能だからである。一部のこれらの抽出物およびライセートは、市販されている（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．；Ａｍｅｒｓｈａｍ；Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ、Ｉ１１．；ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ；Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、Ｎ．Ｙ．）。膜状抽出物、例えば、ミクロソーム膜を含むイヌ膵臓抽出物も利用可能であり、分泌タンパク質の翻訳にとって有用である。これらの系では、ｍＲＮＡをテンプレート（インビトロ翻訳）として、またはＤＮＡをテンプレート（インビトロ転写と翻訳を合わせて）として含むことができ、インビトロ合成は、リボソームにより指示される。無細胞タンパク質発現系の開発に多くの努力がなされてきた。例えば、Ｋｉｍ、Ｄ．Ｍ．ａｎｄ  Ｊ．Ｒ．Ｓｗａｒｔｚ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７４：３０９−３１６（２００１）；Ｋｉｍ、Ｄ．Ｍ．ａｎｄＪ、Ｒ．Ｓｗａｒｔｚ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、２２、１５３７−１５４２、（２０００）；Ｋｉｍ、Ｄ．Ｍ．、ａｎｄ  Ｊ．Ｒ．Ｓｗａｒｔｚ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ、１６、３８５−３９０、（２０００）；Ｋｉｍ、Ｄ．Ｍ．、ａｎｄ  Ｊ．Ｒ．Ｓｗａｒｔｚ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、６６、１８０−１８８、（１９９９）；およびＰａｔｎａｉｋ、Ｒ．ａｎｄ  Ｊ、Ｒ．Ｓｗａｒｔｚ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２４、８６２−８６８、（１９９８）；米国特許第６、３３７、１９１号；米国特許公開第２００２／００８１６６０号；国際公開第００／５５３５３号；同９０／０５７８５号、を参照されたい。これらは、参照によって本明細書に組み込まれる。天然ではコードされないアミノ酸を含むレラキシンポリペプチドの発現に適用できる別の手法には、ｍＲＮＡ−ペプチド融合技術が含まれる。例えば、Ｒ．Ｒｏｂｅｒｔｓ  ａｎｄ  Ｊ．Ｓｚｏｓｔａｋ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９４：１２２９７−１２３０２（１９９７）；Ａ．Ｆｒａｎｋｅｌ、ｅｔ  ａｌ．、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：１０４３−１０５０（２００３）、を参照されたい。この手法では、ピューロマイシンに連結されたｍＲＮＡテンプレートが、リボソーム上でペプチドに翻訳される。１つまたは複数のｔＲＮＡ分子が改変された場合は、非天然アミノ酸が同様にペプチド中に組み込まれうる。最後のｍＲＮＡコドンが読み取られた後で、ピューロマイシンは、ペプチドのＣ末端に結合する。得られたｍＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートが、インビトロアッセイで興味ある特性を有すると分かった場合は、ｍＲＮＡ配列からその固有の特性を容易に明らかにできる。この方法では、１つまたは複数の天然ではコードされないアミノ酸を含むレラキシンポリペプチドライブラリーを選別し、所望の特性を有するポリペプチドを特定できる。さらに最近では、精製された成分を含むインビトロリボソーム翻訳が天然ではコードされないアミノ酸で置換されたペプチドの合成を可能にすると報告されている。例えば、Ａ．Ｆｏｒｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）１００：６３５３（２００３）、を参照されたい。
【０４６２】
再構成翻訳系も使用できる。また、精製された翻訳因子を使った系では、ライセートの組み合わせまたは精製された翻訳因子、例えば、開始因子−１（ＩＦ−１）、ＩＦ−２、ＩＦ−３（αまたはβ）、伸長因子Ｔ（ＥＦ−Ｔｕ）、または終結因子を補充したライセートの混合物の場合と同様に、ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳に成功している。無細胞系は、また、連結された転写／翻訳系であってもよく、この場合、ＤＮＡがこの系に導入され、ｍＲＮＡに転写され、ｍＲＮＡが、分子生物学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｆ．Ｍ、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ、ｅｄｉｔｏｒｓ、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、１９９３（本文献は、具体的に参照によって組み込まれる））に記載のように翻訳される。真核生物の転写系に転写されたＲＮＡは、特定の翻訳系で有利な可能性のあるヘテロ核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）の形でも、または５’−末端キャップ（７−メチルグアノシン）および３’−末端ポリＡテイルの成熟ｍＲＮＡの形でもよい。例えば、キャップｍＲＮＡは、網状赤血球ライセート系で高効率に翻訳される。
【０４６３】
レラキシンポリペプチドに結合したポリマー
本明細書記載の非天然アミノ酸ポリペプチドに対して、本明細書記載の組成物、方法、技術および戦略を使って種々の修飾を行うことができる。これらの修飾には、ポリペプチドの非天然アミノ酸成分への、限定されないが、次記のさらなる官能性の組込みが含まれる：、標識；色素；ポリマー；水可溶性ポリマー；ポリエチレングリコール誘導体；光架橋剤；放射性核種；細胞障害性化合物；薬剤；親和標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質またはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体；抗体または抗体断片；金属キレート剤；補助因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；サッカライド；水可溶性デンドリマー；シクロデキストリン；抑制性リボ核酸；生体材料；ナノ粒子；スピン標識；フルオロフォア、金属含有成分；放射性成分；新規官能基；共有結合または非共有結合で他の分子と相互作用する基；フォトケージ化成分；化学線励起成分；光異性化可能成分；ビオチン；ビオチン誘導体；ビオチン類似体；重原子組込み成分；化学的切断可能基；光切断可能基；延長側鎖；炭素結合型糖；レドックス活性剤；アミノチオ酸；毒成分；同位体標識成分；生物物理学的プローブ；リン光基；化学発光基；高電子密度基；磁性基；インターカレート基；発色団；エネルギー遷移剤；生理活性物質；検出可能標識；小分子；量子ドット；ナノトランスミッター；放射性核種標識ヌクレオチド；放射性核種標識トランスミッター；中性子捕獲剤；または上記のいずれかの組み合わせ、またはいずれかの他の望ましい化合物もしくは物質。本明細書記載の組成物、方法、技術および戦略の説明用非制限的例として、次の説明は、そこに記載された組成物、方法、技術および戦略も（必要に応じ、当業者なら本明細書の本開示を使ってできるであろう適切な修飾を加えて）限定されないが、上に挙げたものを含む他の官能性の付加に適用できるという了解の下で、非天然アミノ酸ポリペプチドへのポリマーの付加に焦点を置くことにする。
【０４６４】
各種のポリマーおよび他の分子は、本発明のレラキシンポリペプチドに結合し、レラキシンポリペプチドの生物学的な特性を調節でき、および／またはレラキシン分子に新規生物学的特性を与えることができる。これらのポリマーは、天然でコードされるアミノ酸経由で、天然ではコードされないアミノ酸、または天然もしくは非天然アミノ酸のいずれかの官能性置換基、または天然もしくは非天然アミノ酸に付加されたいずれかの置換基もしくは官能基経由で、レラキシンポリペプチドに連結できる。ポリマーの分子量は、限定されないが、約１００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａ以上を含む広い範囲であってもよい。ポリマーの分子量は、約１００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａであってもよく、限定されないが、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、１，０００Ｄａ、９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａ、および１００Ｄａ、が含まれる。一部の実施形態では、ポリマーの分子量は、約１００Ｄａ〜約５０，０００Ｄａである。一部の実施形態では、ポリマーの分子量は、約１００Ｄａ〜約４０，０００Ｄａである。一部の実施形態では、ポリマーの分子量は、約１，０００Ｄａ〜約４０，０００Ｄａである。一部の実施形態では、ポリマーの分子量は、約５，０００Ｄａ〜約４０，０００Ｄａである。一部の実施形態では、ポリマーの分子量は、約１０，０００Ｄａ〜約４０，０００Ｄａである。
【０４６５】
本発明は、ポリマー：タンパク質コンジュゲートの実質的に均一な製剤を提供する。本明細書で使われる「実質的に均一な」は、ポリマー：タンパク質コンジュゲート分子が、総タンパク質の半分を越えて観察されることを意味する。ポリマー：タンパク質コンジュゲートは、生物活性を有し、本明細書で提供されるこの「実質的に均一な」ペグ化レラキシンポリペプチド製剤は、均一製剤の利点、例えば、ロット−ロット間の薬物動態学に関する予測の臨床的適用の容易さ、を示すのに充分に均一である製剤である。
【０４６６】
ポリマー：タンパク質コンジュゲート分子の混合物を調製するために選択することもでき、本明細書で提供される利点は、混合物に含めるためのモノ−ポリマー：タンパク質コンジュゲートの比率を選択できることである。従って、必要に応じ、種々の数の結合ポリマー成分（すなわち、ジ−、トリ−、テトラ−、等）を含む種々のタンパク質の混合物を調製し、前記コンジュゲートを本発明の方法を使って調製したモノ−ポリマー：タンパク質コンジュゲートと結合し、所定の比率のモノ−ポリマー：タンパク質コンジュゲートを含む混合物を得ることができる。
【０４６７】
選択ポリマーは、選択ポリマーが結合されるタンパク質が、水性の環境、例えば、生理的環境の中で沈殿しないように、水溶性であってもよい。ポリマーは、分岐でも非分岐でもよい。最終製剤製品の治療上の使用のために、ポリマーは、薬学的に許容可能なものになろう。
【０４６８】
ポリマーの例には、限定されないが、ポリアルキルエーテルおよびそのアルコキシキャッピング類似体（例えば、ポリオキシエチレングリコール、ポリオキシエチレン／プロピレングリコール、およびそのメトキシまたはエトキシキャッピング類似体、特に、ポリオキシエチレングリコール、後者は、ポリエチレングリコールまたはＰＥＧとしても知られる）；ポリビニルピロリドン；ポリビニルアルキルエーテル；ポリオキサゾリン、ポリアルキルオキサゾリンおよびポリヒドロキシアルキルオキサゾリン；ポリアクリルアミド、ポリアルキルアクリルアミド、およびポリヒドロキシアルキルアクリルアミド（例えば、ポリヒドロキシプロピルメタアクリルアミドおよびその誘導体）；ポリヒドロキシアルキルアクリラート；ポリシアル酸およびその類似体；親水性ペプチド配列；多糖類およびその誘導体、例えば、デキストランおよびデキストラン誘導体、例えば、カルボキシメチルデキストラン、デキストラン硫酸塩、アミノデキストラン；セルロースおよびその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース；キチンおよびその誘導体、例えば、キトサン、スクシニルキトサン、カルボキシメチルキチン、カルボキシメチルキトサン；ヒアルロン酸およびその誘導体；デンプン；アルギナート；コンドロイチン硫酸塩；アルブミン；プルランおよびカルボキシメチルプルラン；ポリアミノ酸およびそれらの誘導体、例えば、ポリグルタミン酸、ポリリジン、ポリアスパラギン酸、ポリアスパルトアミド；マレイン酸無水物共重合体、例えば、：スチレンマレイン酸無水物共重合体、ジビニルエチルエーテルマレイン酸無水物共重合体；ポリビニルアルコール；それらの共重合体；それらのターポリマー；それらの混合物；および上記の誘導体、が含まれる。
【０４６９】
ポリエチレングリコール分子のタンパク質分子に対する割合は、反応混合物中の濃度と共に変化する。一般的に、最適比率（最小限の過剰未反応タンパク質またはポリマーの存在下での反応効率の観点から）は、選択ポリエチレングリコールの分子量および利用可能反応基の数に基づいて決定できる。分子量に関しては、一般的には、ポリマー分子量が大きいほど、タンパク質に結合可能なポリマー分子の数は少なくなる。同様に、ポリマーの分岐も、これらのパラメータを最適化する際には考慮しなければならない。一般的に、分子量が大きいほど（または分岐部が多いほど）、ポリマー：タンパク質比率が大きい。
【０４７０】
本明細書で使われるように、ＰＥＧ：レラキシンポリペプチドコンジュゲートについて考察する場合、用語の「治療有効量」は、患者に対する所望の利益を与える量を指す。量は、個体毎に変わり、いくつかの因子、例えば、患者の全体身体条件、治療される状態の根底にある原因に依存する。治療に使われるレラキシンポリペプチドの量は、受容可能な変化の速度を与え、有益であるレベルでの所望の応答を維持する。本組成物の治療有効量は、公に入手可能な材料と手続きを使って、当業者により容易に確認可能である。
【０４７１】
水溶性ポリマーは、限定されないが、直鎖、フォーク型または分岐、等のどの構造型もよい。典型的には、水溶性ポリマーは、ポリ（アルキレングリコール）、例えば、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）であるが、ほかの水溶性ポリマーも使用できる。例として、ＰＥＧが本発明の特定の実施形態の記載に使用される。
【０４７２】
ＰＥＧは、よく知られた、水溶性ポリマーで、市販品として入手できる、または当業者に既知の方法に従い、エチレングリコールの開環重合により調製できる（Ｓａｎｄｌｅｒ  ａｎｄ  Ｋａｒｏ、ポリマー合成（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｖｏｌ．３、ｐａｇｅｓ  １３８−１６１）。用語の「ＰＥＧ」は、広範な意味で使用され、大きさの程度、またはＰＥＧ末端の修飾の有無を問わず、いずれかのポリエチレングリコール分子を含み、レラキシンポリペプチドに連結したものとして、式：ＸＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｙにより表すことができ、ここで、ｎは、２〜１０，０００、およびＸはＨまたは末端修飾であり、限定されないが、Ｃ１−４アルキル、保護基、または末端官能基、を含む。
【０４７３】
一部のケースでは、本発明で使用されるＰＥＧは、一端が、ヒドロキシまたはメトキシで終結する、すなわち、ＸはＨまたはＣＨ３（「メトキシＰＥＧ」）である。あるいは、ＰＥＧは、反応基で終結し、それにより、二官能性ポリマーを形成できる。典型的な反応基には、２０共通アミノ酸で認められる官能基との反応によく使われる反応基（限定されないが、マレイミド基、活性炭酸塩（限定されないが、ｐ−ニトロフェニルエステルを含む）、活性化エステル（限定されないが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ｐ−ニトロフェニルエステル）およびアルデヒドを含む）ならびに２０共通アミノ酸に不活性であるが、天然ではコードされないアミノ酸中に存在する相補的な官能基と特異的に反応する官能基（限定されないが、アジド基、アルキン基を含む）を含むことができる。上記式のＹで示される他のＰＥＧ末端は、直接または間接的に天然または天然ではコードされないアミノ酸を介してレラキシンポリペプチドに結合することに留意されたい。例えば、Ｙは、ポリペプチドのアミン基（限定されないが、リシンのε−アミンまたはＮ末端を含む）へのアミド、カルバマートまたは尿素結合であってもよい。あるいは、Ｙは、チオール基（限定されないが、システインのチオール基を含む）へのマレイミド結合であってもよい。あるいは、Ｙは、通常、２０共通アミノ酸を介しては利用できない残基への結合であってもよい。例えば、ＰＥＧ上のアジド基は、レラキシンポリペプチド上のアルキン基と反応して、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化産物を形成できる。あるいは、ＰＥＧ上のアルキン基は、天然ではコードされないアミノ酸に存在するアジド基と反応して、類似の産物を形成できる。一部の実施形態では、強求核剤（限定されないが、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、セミカルバジドを含む）は、天然ではコードされないアミノ酸に存在するアルデヒドまたはケトン基と反応して、該当する場合には、ヒドラゾン、オキシムまたはセミカルバゾンを形成でき、これは、場合によっては、適切な還元剤を使った処理によりさらに還元できる。あるいは、強求核剤が、天然ではコードされないアミノ酸を介してレラキシンポリペプチドに組み込まれ、水溶性ポリマー中に存在するケトンまたはアルデヒド基と優先的に反応させるのに使うことができる。
【０４７４】
実際の所望に応じ、どの分子量のＰＥＧでも使用可能であり、分子量は、限定されないが、所望に応じ、約１００ダルトン（Ｄａ）〜１００，０００Ｄａ以上（限定されないが、場合により０．１〜５０ｋＤａまたは１０〜４０ｋＤａを含む）を含む。ＰＥＧの分子量は、広範囲にわたってもよく、限定されないが、約１００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａ以上が含まれる。ＰＥＧは、約１００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａであってもよく、限定されないが、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、１，０００Ｄａ、９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａ、および１００Ｄａが含まれる。一部の実施形態では、ＰＥＧは、約１００Ｄａ〜約５０，０００Ｄａである。一部の実施形態では、ＰＥＧは、約１００Ｄａ〜約４０，０００Ｄａである。一部の実施形態では、ＰＥＧは、約１，０００Ｄａ〜約４０，０００Ｄａである。一部の実施形態では、ＰＥＧは、約５，０００Ｄａ〜約４０，０００Ｄａである。一部の実施形態では、ＰＥＧは、約１０，０００Ｄａ〜約４０，０００Ｄａである。限定されないが、１〜１００ｋＤａの範囲のＭＷを有する各鎖を有するＰＥＧ分子（限定されないが、１〜５０ｋＤａまたは５〜２０ｋＤａを含む）を含む分岐鎖ＰＥＧも使用できる。分岐鎖ＰＥＧの各鎖の分子量は、限定されないが、約１０００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａ以上であってもよい。分岐鎖ＰＥＧの各鎖の分子量は、約１，０００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａであってもよく、限定されないが、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、および１，０００Ｄａを含む。一部の実施形態では、分岐鎖ＰＥＧの各鎖の分子量は、約１，０００Ｄａ〜約５０，０００Ｄａである。一部の実施形態では、分岐鎖ＰＥＧの各鎖の分子量は、約１，０００Ｄａ〜約４０，０００Ｄａである。一部の実施形態では、分岐鎖ＰＥＧの各鎖の分子量は、約５，０００Ｄａ〜約４０，０００Ｄａである。一部の実施形態では、分岐鎖ＰＥＧの各鎖の分子量は、約５，０００Ｄａ〜約２０，０００Ｄａである。広範囲のＰＥＧ分子が、限定されないが、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｉｎｃ．カタログ、Ｎｅ���ｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓカタログ、等に記載されている。これらは参照により本明細書に組み込まれる。
【０４７５】
一般的に、ＰＥＧ分子の少なくとも１つの末端は、天然ではコードされないアミノ酸との反応用に利用可能である。例えば、アミノ酸側鎖との反応用にアルキンおよびアジド成分を有するＰＥＧ誘導体は、ＰＥＧを本明細書記載の天然ではコードされないアミノ酸に結合するために使用できる。天然ではコードされないアミノ酸がアジドを含む場合には、ＰＥＧは、典型的には、アルキン成分を含み、［３＋２］付加環化産物を形成するか、またはホスフィン基含有活性化ＰＥＧ種（すなわち、エステル、炭酸塩）を含み、アミド結合を形成することになる。あるいは、天然ではコードされないアミノ酸がアルキンを含む場合には、ＰＥＧは、典型的には、アジド成分を含み、［３＋２］Ｈｕｉｓｇｅｎ付加環化産物を形成することになる。天然ではコードされないアミノ酸がカルボニル基を含む場合は、ＰＥＧは、典型的には、強力な求核剤（限定されないが、ヒドラジド、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、またはセミカルバジド官能性を含む）を含み、それぞれ対応するヒドラゾン、オキシム、およびセミカルバゾン結合を形成することになる。他の選択肢では、上述の反応基の方向の逆を使用でき、すなわち、天然ではコードされないアミノ酸のアジド成分を、アルキン含有ＰＥＧ誘導体と反応させることができる。
【０４７６】
一部の実施形態では、ＰＥＧ誘導体を有するレラキシンポリペプチド変異体は、天然ではコードされないアミノ酸の側鎖上に存在する化学官能性と反応する化学官能性を含む。
【０４７７】
一部の実施形態では、本発明は、約８００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａの平均分子量を有する水溶性ポリマー骨格を含むアジドおよびアセチレン含有ポリマー誘導体を提供する。水可溶性ポリマーのポリマー骨格は、ポリ（エチレングリコール）であってもよい。しかし、限定されないが、ポリ（エチレン）グリコールおよびポリ（デキストラン）およびポリ（プロピレングリコール）等の他の関連ポリマーを含む各種水溶性ポリマーも、また、本発明の実施での使用に適切であり、用語のＰＥＧまたはポリ（エチレングリコール）の使用は、全てのこのような分子を包含し含むことが意図されていることは理解されたい。用語のＰＥＧは、限定されないが、二官能性ＰＥＧ、多分岐ＰＥＧ、誘導体化ＰＥＧ、フォーク型ＰＥＧ、分岐ＰＥＧ、ペンダントＰＥＧ（すなわち、ＰＥＧまたはポリマー骨格にぶら下がった１つまたは複数の官能基を有する関連ポリマー）、または内部に分解可能結合を有するＰＥＧを含む、いずれかの型のいポリ（エチレングリコール）（限定されな）を含む。
【０４７８】
ＰＥＧは、典型的には、無職透明、無臭、水に可溶、熱に安定、多くの化学薬品に不活性であり、加水分解または変質せず、通常非毒性である。ポリ（エチレングリコール）は、生体適合性であると考えられており、すなわち、ＰＥＧは、害を与えることなく、生きている組織または生物と共存できる。さらに具体的には、ＰＥＧは、実質的に、非免疫原性であり、すなわち、ＰＥＧが体内で免疫応答を生み出す傾向はない。体内でいくつかの望ましい機能を有する分子、例えば、生理活性物質に結合した場合、ＰＥＧは、薬剤をマスクする傾向があり、どの免疫応答も減らすかまたは除去でき、それにより、生物は、その薬剤の存在に耐えることができる。ＰＥＧコンジュゲートは、実質的な免疫応答を生み出す、または凝固または他の望ましくない影響を生じる傾向はない。式−−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−−ＣＨ２ＣＨ２−−（式中、ｎは、約３〜約４０００、典型的には、約２０〜約２０００である）を有するＰＥＧは、本発明での使用に適する。本発明の一部の実施形態では、約８００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａの分子量のＰＥＧは、ポリマー骨格として特に有用である。ＰＥＧの分子量は、広範囲にわたってよく、限定されないが、約１００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａ以上を含む。ＰＥＧの分子量は、約１００Ｄａ〜ｄ約１００，０００Ｄａであってもよく、限定されないが、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、１，０００Ｄａ、９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａ、および１００Ｄａが含まれる。一部の実施形態では、ＰＥＧの分子量は、約１００Ｄａ〜約５０，０００Ｄａである。一部の実施形態では、ＰＥＧの分子量は、約１００Ｄａ〜約４０，０００Ｄａである。一部の実施形態では、ＰＥＧの分子量は、約１，０００Ｄａ〜約４０，０００Ｄａである。一部の実施形態では、ＰＥＧの分子量は、約５，０００Ｄａ〜約４０，０００Ｄａである。一部の実施形態では、ＰＥＧの分子量は、約１０，０００Ｄａ〜約４０，０００Ｄａである。
【０４７９】
ポリマー骨格は、直鎖でも、分岐であってもよい。分枝高分子骨格は、通常、当技術分野で既知である。典型的には、分枝高分子は、中央分岐部コア部分および中央分岐部コアに連結した複数の直鎖ポリマー鎖を有する。ＰＥＧは、通常、エチレンオキシドに、種々のポリオール、例えば、グリセリン、グリセリンオリゴマー、ペンタエリスリトールおよびソルビトール、を付加して調製できる分岐型で使用される。中央分岐部は、また、リシン等のいくつかのアミノ酸から誘導できる。分岐ポリ（エチレングリコール）は、一般的形式のＲ（−ＰＥＧ−ＯＨ）ｍで表すことができる。式中、Ｒは、コア部分、例えば、グリセリン、グリセリンオリゴマー、またはペンタエリスリトール由来であり、ｍは、アームの数を表す。多分岐ＰＥＧ分子、例えば、米国特許第５，９３２，４６２号；同５，６４３，５７５号；同５，２２９，４９０号；同４，２８９，８７２号；米国特許公開第２００３／０１４３５９６号；国際公開第９６／２１４６９号；および同９３／２１２５９号、に記載のものもポリマー骨格として使用できる。これらの特許は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【０４８０】
分岐ＰＥＧは、また、フォーク型ＰＥＧの形でもよく、これはＰＥＧ（−−ＹＣＨＺ２）ｎ、で表され、式中、Ｙは、結合基であり、Ｚは、規定長さの原子鎖によりＣＨに連結された活性化末端基である。
【０４８１】
さらに別の分岐型のぶら下がりＰＥＧは、反応基例えば、ＰＥＧ鎖の末端ではなくＰＥＧ骨格に沿ったカルボキシルを有する。
【０４８２】
これらのＰＥＧ型に加えて、ポリマーは、また、骨格中に弱いまたは分解可能な結合を持った状態で調製できる。例えば、ＰＥＧは、ポリマー骨格中に加水分解を受けやすいエステル結合を伴って調製できる。下記に示すように、この加水分解は、ポリマーの低分子量断片：
−ＰＥＧ−ＣＯ２−ＰＥＧ−＋Ｈ２Ｏ→ＰＥＧ−ＣＯ２Ｈ＋ＨＯ−ＰＥＧ−
への切断を起こす。用語のポリ（エチレングリコール）またはＰＥＧは、限定されないが、本明細書で開示のものを含む、当技術分野で既知の全ての型を表す、または含むことは、当業者なら理解されよう。
【０４８３】
多くの他のポリマーも、また、本発明での使用に適する。一部の実施形態では、２〜約３００の終端を有する水可溶性のポリマー骨格は、本発明に特に有用である。適切なポリマーの例には、限定されないが、他のポリ（アルキレングリコール）、例えば、ポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）、その共重合体（限定されないが、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体を含む）、そのターポリマー、そられの混合物、等が含まれる。ポリマー骨格の各鎖の分子量は、変えることができるが、典型的には、分子量は、約８００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａ、場合によっては、約６，０００Ｄａ〜約８０，０００Ｄａの範囲にある。ポリマー骨格の各鎖の分子量は、約１００Ｄａ〜約１０，０００Ｄａであってもよく、限定されないが、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、１，０００Ｄａ、９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａ、および１００Ｄａを含む。一部の実施形態では、ポリマー骨格の各鎖の分子量は、約１００Ｄａ〜約５０，０００Ｄａである。一部の実施形態では、ポリマー骨格の各鎖の分子量は、約１００Ｄａ〜約４０，０００Ｄａである。一部の実施形態では、ポリマー骨格の各鎖の分子量は、約１，０００Ｄａ〜約４０，０００Ｄａである。一部の実施形態では、ポリマー骨格の各鎖の分子量は、約５，０００Ｄａ〜約４０，０００Ｄａである。一部の実施形態では、ポリマー骨格の各鎖の分子量は、約１０，０００Ｄａ〜約４０，０００Ｄａである。
【０４８４】
当業者なら、実質的に水溶性骨格の前述のリストは、決して網羅的ではなく、単に例示に過ぎず、上述の特性を有する全ての高分子材料が本発明での使用に適するものとして意図されていることに、気付くであろう。
【０４８５】
本発明の一部の実施形態では、ポリマー誘導体は、「多官能性」であり、ポリマー骨格は、官能基により官能化または活性化された少なくとも２つの終端、可能性としては、約３００もの終端を有することを意味する。多官能性ポリマー誘導体には、限定されないが、２つの終端を有する直鎖ポリマーを含み、各終端は官能基に結合され、この官能基は同じでも、異なっていてもよい。
【０４８６】
一実施形態では、ポリマー誘導体は、構造：
Ｘ−Ａ−ＰＯＬＹ−Ｂ−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ
を有し、
式中：
Ｎ＝Ｎ＝Ｎは、アジド成分であり；
Ｂは、連結成分で、これは存在しても、存在しなくてもよく；
ＰＯＬＹは、水可溶性非抗原性のポリマーであり；
Ａは、連結成分で、これは存在しても、存在しなくてもよく、またＢと同じでも異なっていていてもよく；さらに
Ｘは、第２の官能基である。
ＡおよびＢの連結成分の例には、限定されないが、１８までの官能性を含む多官能化アルキル基が含まれ、１〜１０炭素原子を含んでもよい。ヘテロ原子、例えば、窒素、酸素または硫黄は、アルキル鎖中に含まれてもよい。アルキル鎖は、また、ヘテロ原子の位置で分岐していてもよい。ＡおよびＢの連結成分の他の例には、限定されないが、１０までの官能性を含む多官能化アリール基が含まれ、５〜６炭素原子を含んでもよい。アリール基は、もう一つの炭素原子、窒素、酸素または硫黄原子で置換されてもよい。適切な結合基の他の例には、米国特許第５，９３２，４６２号；同５，６４３，５７５号；および米国特許公開第２００３／０１４３５９６号、に記載の結合基が含まれる。これらの特許は、参照によって本明細書に組み込まれる。当業者なら、連結成分の前述のリストは、決して、網羅的ではなく、単なる例示であり、上述の特性を有する全ての連結成分が本発明での使用に適するものとして意図されていることに気付くであろう。
【０４８７】
Ｘとしての使用のための適切な官能基の例には、限定されないが、ヒドロキシル、保護ヒドロキシル、アルコキシ、活性エステル、例えば、Ｎ−ヒドロキシサクシニミジルエステルおよび１−ベンゾトリアゾリルエステル、活性炭酸塩、例えば、Ｎ−ヒドロキシサクシニミジル炭酸塩およびｌ−ベンゾトリアゾリル炭酸塩、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリラート、メタクリルラート、アクリルアミド、活性スルホン、アミン、アミノオキシ、保護されたアミン、ヒドラジド、保護されたヒドラジド、保護されたチオール、カルボン酸、保護されたカルボン酸、イソシアナート、イソチオシアナート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセトアミド、エポキシド、グリオキサル、ジオン、メシラート、トシラート、トレシラート、アルケン、ケトン、およびアジド、が含まれる。当業者にはわかるように、アジド基との反応が起こらないように、選択Ｘ成分は、アジド基と相溶性で無ければならない。アジド含有ポリマー誘導体は、ホモ二官能性であってもよく、この場合は、第２の官能基（すなわち、Ｘ）もアジド成分であることを意味し、またはヘテロ二官能性であってもよく、この場合は、第２の官能基が異なる官能基であることを意味する。
【０４８８】
用語の「保護された」は、特定の反応条件下で化学的に反応する官能基の反応を防ぐ保護基または成分の存在を意味する。保護基は、保護される化学反応基のタイプに依存して変わる。例えば、化学反応基がアミンまたはヒドラジドの場合は、保護基は、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）および９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）の群から選択できる。化学反応基がチオールの場合は、保護基はオルトピリジルジスルフィドであってもよい。化学反応基がカルボン酸、例えば、ブタン酸もしくはプロピオン酸、またはヒドロキシル基の場合は、保護基は、ベンジルまたはアルキル基、例えば、メチル、エチル、もしくはｔｅｒｔ−ブチルであってよい。当技術分野で既知の他の保護基も、本発明で使用可能である。
【０４８９】
文献にある末端官能基の具体的な例には、限定されないが、Ｎ−サクシニミジル炭酸塩（例えば、米国特許第５，２８１，６９８号、同５，４６８，４７８号参照）、アミン（例えば、Ｂｕｃｋｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍａｋｒｏｍｏｌ、Ｃｈｅｍ．１８２：１３７９（１９８１）、Ｚａｌｉｐｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ．Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．１９：１１７７（１９８３）参照）、ヒドラジド（例えば、Ａｎｄｒｅｓｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．１７９：３０１（１９７８）参照）、サクシニミジルプロピオナートおよびサクシニミジルブタノアート（例えば、Ｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、ポリ（エチレングリコール）化学と生物学的適用（Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、ｐｐ１７０−１８１、Ｈａｒｒｉｓ  ＆  Ｚａｌｉｐｓｋｙ  Ｅｄｓ．、ＡＣＳ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．、１９９７、を参照；また、米国特許第５，６７２，６６２号も参照）、サクシニミジルスクシナート（例えば、Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ．７：１７５（１９８４）およびＪｏｐｐｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．１８０：１３８１（１９７９）参照）、サクシニミジルエステル（例えば、米国特許第４，６７０，４１７号参照）、ベンゾトリアゾール炭酸塩（例えば、米国特許第５、６５０、２３４号参照）、グリシジルエーテル（例えば、Ｐｉｔｈａ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ．ＪＢｉｏｃｈｅｍ．９４：１１（１９７９）、Ｅｌｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３：３５４（１９９１）参照）、オキシカルボニルイミダゾール（例えば、Ｂｅａｕｃｈａｍｐ、ｅｔ  ａｌ．、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３１：２５（１９８３）、Ｔｏｎｄｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １：２５１（１９８５）参照）、ｐ−ニトロフェニル炭酸塩（例えば、Ｖｅｒｏｎｅｓｅ、ｅｔ  ａｌ．、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１１：１４１（１９８５）；およびＳａｒｔｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２７：４５（１９９１）参照）、アルデヒド（例えば、Ｈａｒｒｉｓｅｔａｌ．Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．Ｃｈｅｍ．Ｅｄ．２２：３４１（１９８４）、米国特許第５，８２４，７８４号、米国特許第５，２５２，７１４号参照）、マレイミド（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）８：３４３（１９９０）、Ｒｏｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．、ペプチドとタンパク質の化学（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）２：２９（１９８４）、およびＫｏｇａｎ、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃｏｍｍ．２２：２４１７（１９９２）参照）、オルトピリジルジスルフィド（例えば、Ｗｏｇｈｉｒｅｎ、ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．４：３１４（１９９３）参照）、アクリロイル（例えば、Ｓａｗｈｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２６：５８１（１９９３）参照）、ビニルスルホン（例えば、米国特許第５，９００，４６１号参照）、が含まれる。��ての上記文献と特許は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０４９０】
本発明特定の実施形態では、本発明のポリマー誘導体は、構造：
Ｘ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−−ＣＨ２ＣＨ２−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ
を有するポリマー骨格を含み、
式中：
Ｘは、上述のような官能基であり；
ｎは、約２０〜約４０００である。
別の実施形態では、本発明のポリマー誘導体は、構造：
Ｘ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｗ−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ
を有するポリマー骨格を含み、
式中：
Ｗは、１〜１０炭素原子を含む脂肪族または芳香族リンカー成分；
ｎは、約２０〜約４０００であり；さらに
Ｘは、上述のような官能基であり、ｍは、１〜１０である。
【０４９１】
本発明のアジド含有ＰＥＧ誘導体は、当技術分野で既知の種々の方法および／または本明細書で開示の種々の方法で調製できる。以下に示す１つの方法では、約８００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａの平均分子量を有し、第１の官能基に結合した第１の末端および適切な脱離基に結合した第２の末端を有する水溶性ポリマー骨格が、アジド陰イオン（これは、いずれかのナトリウム、カリウム、ｔｅｒｔ−ブチルアンモニウム等の内のいくつかの適切な対イオンと対形成していてもよい）と反応する。脱離基は、求核置換を受け、アジド成分により置換され、所望のアジド含有ＰＥＧポリマーを生成する。
Ｘ−ＰＥＧ−Ｌ＋Ｎ３−→Ｘ−ＰＥＧ−Ｎ３
【０４９２】
示したように、本発明での使用に適切なポリマー骨格は、式Ｘ−ＰＥＧ−Ｌを有し、式中、ＰＥＧは、ポリ（エチレングリコール）であり、Ｘは、アジド基と反応しない官能基であり、Ｌは、適切な脱離基である。適切な官能基の例には、限定されないが、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、アセタール、アルケニル、アミン、アミノオキシ、保護アミン、保護ヒドラジド、保護チオール、カルボン酸、保護カルボン酸、マレイミド、ジチオピリジン、およびビニルピリジン、ならびにケトンが含まれる。適切な脱離基の例には、塩化物、臭化物、ヨウ化物、メシラート、トレシラート、およびトシラートが含まれる。
【０４９３】
本発明のアジド含有ポリマー誘導体調製用の別の方法では、アジド官能性を有する連結剤を、平均分子量約８００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａの水溶性ポリマー骨格と接触させる。ここで、連結剤は、ＰＥＧポリマー上の化学官能性と選択的に反応し、アジド含有ポリマー誘導体産物を形成する化学官能性を有し、アジドは、結合基によりポリマー骨格から分離されている。
【０４９４】
代表的反応スキームを下記に示す：
Ｘ−ＰＥＧ−Ｍ＋Ｎ−（リンカー）−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ→ＰＧ−Ｘ−ＰＥＧ−（リンカー）−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ
式中：
ＰＥＧは、ポリ（エチレングリコール）であり、Ｘは、キャッピング基、例えば、アルコキシまたは上述のような官能基であり；さらに
Ｍは、アジド官能性と反応しないが、Ｎ官能基とは効率的かつ選択的に反応する官能基である。
【０４９５】
適切な官能基の例には、限定されないが、Ｎがアミンの場合は、Ｍとしてカルボン酸、炭酸塩または活性エステル；Ｎがヒドラジドまたはアミノオキシ成分の場合は、Ｍとしてケトン；Ｎが求核剤の場合は、Ｍとして脱離基、が含まれる。
【０４９６】
粗製産物の精製は、既知の方法により行うことができ、これには、限定されないが、産物の沈殿反応と、必要に応じ、それに続くクロマトグラフィー、が含まれる。
【０４９７】
さらに具体的な例は、ＰＥＧジアミンのケースについて以下に示すが、この例では、アミンの１つが、保護基成分、例えば、ｔｅｒｔ−ブチル−Ｂｏｃで保護され、得られた単一保護ＰＥＧジアミンが、アジド官能性を有する連結成分と反応する：
ＢｏｃＨＮ−ＰＥＧ−ＮＨ２＋ＨＯ２Ｃ−（ＣＨ２）３−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ
【０４９８】
この例では、アミン基は、種々の活性化剤、例えば、チオニル塩化物またはカルボジイミド試薬およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドまたはＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールを使ってカルボン酸基に結合し、モノアミンＰＥＧ誘導体とアジド含有リンカー成分の間でアミド結合を形成できる。アミド結合の形成に成功した後で、得られたＮ−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｂｏｃ−保護アジド含有誘導体は、生理活性分子を直接修飾するのに使用できる、または他の有用な官能基を組み込むためにさらに念入りに作り上げることができる。例えば、Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ基は、強酸による処理により加水分解してω−アミノ−ＰＥＧ−アジドを生成する事ができる。得られたアミンは、有用なヘテロ二官能性試薬の生成用の他の有用な官能性、例えば、マレイミド基、活性化ジスルフィド、活性化エステル等を組み込むための合成手段として使用可能である。
【０４９９】
ヘテロ二官能性誘導体は、異なる分子をポリマーのそれぞれの末端に結合されることが所望の場合、特に、有用である。例えば、ω−Ｎ−アミノ−Ｎ−アジドＰＥＧは、活性化求電子基、例えば、アルデヒド、ケトン、活性化エステル、活性炭酸塩、等、を有する分子をＰＥＧの１つの末端に、さらに、アセチレン基を有する分子をＰＥＧのもう一つの末端に、結合するのを可能とするであろう。
【０５００】
本発明の別の実施形態では、ポリマー誘導体は、構造：
Ｘ−Ａ−ＰＯＬＹ−Ｂ−Ｃ≡Ｃ−Ｒ
を有し、
式中：
Ｒは、Ｈまたはアルキル、アルケン、アルコキシ、もしくはアリールもしくは置換アリール基であってもよく；
Ｂは、連結成分で、これは存在しても、存在しなくてもよく；
ＰＯＬＹは、水可溶性で非抗原性のポリマーであり；
Ａは、連結成分で、これは存在しても、存在しなくてもよく、またＢと同じであっても、異なっていてもよく；さらに
Ｘは、第２の官能基である。
【０５０１】
ＡとＢ用の連結成分の例には、限定されないが、１８までの官能性を含む多官能化アルキル基が含まれ、また、１〜１０炭素原子を含んでもよい。ヘテロ原子、例えば、窒素、酸素または硫黄は、アルキル鎖と一緒に含んでもよい。アルキル鎖は、また、ヘテロ原子の位置で分岐してもよい。ＡとＢ用の連結成分の他の例には、限定されないが、１０までの官能性を含む多官能化アリール基を含んでもよく、また、５〜６炭素原子を含んでもよい。アリール基は、もう一つの炭素原子、窒素、酸素、または硫黄原子で置換されてもよい。適切な結合基の他の例には、米国特許第５，９３２，４６２号および同５，６４３，５７５号、ならびに米国特許公開第２００３／０１４３５９６号に記載の結合基が含まれる。これらの特許は、参照によって本明細書に組み込まれる。当業者なら、前出の連結成分のリストは、決して網羅的なものではなく、単に例示が意図されており、上述の特性を有する各種の連結成分が本発明において有用であるものとして意図されていることを認識するであろう。
【０５０２】
Ｘとして使える適切な官能基の例には、ヒドロキシル、保護ヒドロキシル、アルコキシ、活性エステル、例えば、Ｎ−ヒドロキシサクシニミジルエステルおよび１−ベンゾトリアゾリルエステル、活性炭酸塩、例えば、Ｎ−ヒドロキシサクシニミジル炭酸塩および１−ベンゾトリアゾリル炭酸塩、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリラート、メタクリルラート、アクリルアミド、活性スルホン、アミン、アミノオキシ、保護アミン、ヒドラジド、保護ヒドラジド、保護チオール、カルボン酸、保護カルボン酸、イソシアナート、イソチオシアナート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセトアミド、エポキシド、グリオキサル、ジオン、メシラート、トシラート、およびトレシラート、アルケン、ケトン、ならびにアセチレン、が含まれる。当然のことながら、選択されたＸ成分は、アセチレン基との反応が起こらないように、アセチレン基と相溶性でければならない。アセチレン含有ポリマー誘導体は、ホモ二官能性であってもよく、この場合は、第２の官能基（すなわち、Ｘ）もアセチレン成分であることを意味し、またはヘテロ二官能性であってもよく、この場合は、第２の官能基が異なる官能基であることを意味する。
【０５０３】
本発明の別の実施形態では、ポリマー誘導体は、構造：
Ｘ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ≡ＣＨ
を有するポリマー骨格を含み、
式中：
Ｘは、上述のような官能基であり；
ｎは、約２０〜約４０００であり；さらに
ｍは、１〜１０である。
それぞれのヘテロ二官能性ＰＥＧポリマーの具体的な例は以下に示す。
【０５０４】
本発明のアセチレン含有ＰＥＧ誘導体は、当業者に既知の、および／または本明細書で開示の方法を使って調製できる。１つの方法では、約８００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａの平均分子量を有し、第１の官能基に結合した第１の末端および適切な求核基に結合した第２の末端を有する水溶性ポリマー骨格がＰＥＧ上の求核基との反応に適したアセチレン官能性および脱離基の両方を有する化合物と反応する。求核成分を有するＰＥＧポリマーおよび脱離基を有する分子が組み合わされると、脱離基が求核置換を受けて求核成分により置換され、所望のアセチレン含有ポリマーを生成する。
Ｘ−ＰＥＧ−Ｎｕ＋Ｌ−Ａ−Ｃ→Ｘ−ＰＥＧ−Ｎｕ−Ａ−Ｃ≡ＣＲ’
【０５０５】
明らかなように、反応に使用するために好ましいポリマー骨格は、式Ｘ−ＰＥＧ−Ｎｕを有し、式中、ＰＥＧは、ポリ（エチレングリコール）であり、Ｎｕは、求核成分であり、Ｘは、Ｎｕ、Ｌまたはアセチレン官能性と反応しない官能基である。
【０５０６】
Ｎｕの例には、限定されないが、主にＳＮ２型機序を介して反応すると思われるアミン、アルコキシ、アリールオキシ、スルフヒドリル、イミノ、カルボキシラート、ヒドラジド、アミノオキシ基が含まれる。Ｎｕ基のさらなる例には、主に求核付加反応を介して反応すると思われる官能基が含まれる。Ｌ基の例には、塩化物、臭化物、ヨウ化物、メシラート、トレシラート、およびトシラートならびに求核置換を受けると予測される他の基、ならびにケトン、アルデヒド、チオエステル、オレフィン、α−β不飽和カルボニル基、炭酸塩および求核剤により付加を受けると予測される他の求電子基が含まれる。
【０５０７】
本発明の別の実施形態では、Ａは、１〜１０炭素原子の脂肪族リンカーまたは６〜１４炭素原子の置換アリール環である。Ｘは、アジド基と反応しない官能基、およびＬは、適切な脱離基である。
【０５０８】
本発明のアセチレン含有ポリマー誘導体の別の調製方法では、約８００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａの平均分子量を有し、一端に保護官能基またはキャッピング剤を持ち、他端に適切な脱離基を持つＰＥＧポリマーと、アセチレン陰イオンとが接触させられる。
【０５０９】
代表的反応スキームを下記に示す：
Ｘ−ＰＥＧ−Ｌ＋−Ｃ≡ＣＲ’→Ｘ−ＰＥＧ−Ｃ≡ＣＲ’
式中：
ＰＥＧは、ポリ（エチレングリコール）であり、Ｘは、キャッピング基、例えば、アルコキシまたは上述のような官能基であり；さらに
Ｒ’は、Ｈ、アルキル、アルコキシ、アリールもしくはアリールオキシ基または置換アルキル、アルコキシ、アリールもしくはアリールオキシ基である。
【０５１０】
上記の例では、脱離基Ｌは、充分な濃度のアセチレン陰イオンと接触した場合に、ＳＮ２型置換を受けるのに充分に反応性でなければならない。アセチレン陰イオンによる脱離基のＳＮ２置換を行うために必要な反応条件は、当業者には既知である。
【０５１１】
粗製産物の精製は、通常、当技術分野で既知の方法で行うことができ、これには、限定されないが、産物の沈殿反応と、必要に応じ、それに続くクロマトグラフィー、が含まれる。
【０５１２】
水溶性ポリマーは、本発明のレラキシンポリペプチドに結合できる。水溶性ポリマーは、レラキシンポリペプチド中に組み込まれた天然ではコードされないアミノ酸もしくは天然ではコードされないもしくは天然でコードされるアミノ酸の任意の官能基もしくは置換基、または天然ではコードされないもしくは天然でコードされるアミノ酸に付加された任意の官能基もしくは置換基を介して連結されてもよい。あるいは、水溶性ポリマーは、天然アミノ酸（限定されないが、システイン、リシンまたはＮ−末端残基のアミン基を含む）を介して、天然ではコードされないアミノ酸を組み込んだレラキシンポリペプチドに連結される。一部のケースでは、本発明のレラキシンポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０非天然アミノ酸を含み、１つまたは複数の天然ではコードされないアミノ酸が、水溶性ポリマー（限定されないが、ＰＥＧおよび／またはオリゴ糖を含む）に連結される。一部のケースでは、本発明のレラキシンポリペプチドは、水溶性ポリマーに連結された１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ超の天然でコードされるアミノ酸をさらに含む。一部のケースでは、本発明のレラキシンポリペプチドは、水溶性ポリマーに連結された１つまたは複数の天然ではコードされないアミノ酸および水溶性ポリマーに連結された１つまたは複数の天然アミノ酸を含む。一部の実施形態では、本発明で使われる水溶性ポリマーは、非コンジュゲート型に比べて、レラキシンポリペプチドの血清半減期を延長する。
【０５１３】
本発明のレラキシンポリペプチドに連結された水溶性ポリマーの数（すなわち、ペグ化またはグリコシル化の程度）は、変えられた（限定されないが、増加または減少を含む）薬理的、薬物動態学的または薬力学的特性、例えば、インビボ半減期、を与えるように調節できる。一部の実施形態では、レラキシンの半減期は、非改変ポリペプチドに対して、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０パーセント、２倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、５０倍、または少なくとも約１００倍延長される。
【０５１４】
強求核基（すなわち、ヒドラジド、ヒドラジン、ヒドロキシルアミンまたはセミカルバジド）を含むＰＥＧ誘導体
本発明の一実施形態では、カルボニル含有天然ではコードされないアミノ酸を含むレラキシンポリペプチドが、ＰＥＧ骨格に直接連結された末端ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジドまたはセミカルバジド成分を含むＰＥＧ誘導体を使って改変される。
【０５１５】
一部の実施形態では、ヒドロキシルアミン末端ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−ＮＨ２
を有し、
式中、Ｒは、単純アルキル（メチル、エチル、プロピル、等）であり、ｍは、２〜１０であり、さらにｎは、１００〜１，０００（すなわち、平均分子量は、５〜４０ｋＤａ）である。
【０５１６】
一部の実施形態では、ヒドラジンまたはヒドラジド含有ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−ＮＨ−ＮＨ２
を有し、
式中、Ｒは、単純アルキル（メチル、エチル、プロピル、等）であり、ｍは、２〜１０であり、さらにｎは、１００〜１，０００であり、Ｘは、任意選択で、カルボニル基（Ｃ＝Ｏ）であるが、これは存在しても存在しなくてもよい。
【０５１７】
一部の実施形態では、セミカルバジド含有ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ２
を有し、
式中、Ｒは、単純アルキル（メチル、エチル、プロピル、等）であり、ｍは、２〜１０であり、さらにｎは、１００〜１，０００である。
【０５１８】
本発明の別の実施形態では、カルボニル含有アミノ酸を含むレラキシンポリペプチドは、アミド結合によりＰＥＧ骨格に連結された末端ヒドロキシルアミン、ヒドラジド、ヒドラジン、またはセミカルバジド成分を含むＰＥＧ誘導体で改変される。
【０５１９】
一部の実施形態では、ヒドロキシルアミン末端ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−ＮＨ２
を有し、
式中、Ｒは、単純アルキル（メチル、エチル、プロピル、等）であり、ｍは、２〜１０であり、さらにｎは、１００〜１，０００（すなわち、平均分子量は、５〜４０ｋＤａ）である。
【０５２０】
一部の実施形態では、ヒドラジンまたはヒドラジド含有ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−ＮＨ−ＮＨ２
を有し、
式中、Ｒは、単純アルキル（メチル、エチル、プロピル、等）であり、ｍは、２〜１０であり、さらにｎは、１００〜１，０００であり、Ｘは、任意選択で、カルボニル基（Ｃ＝Ｏ）であるが、これは存在しても存在しなくてもよい。
【０５２１】
一部の実施形態では、セミカルバジ含有ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ２
を有し、
式中、Ｒは、単純アルキル（メチル、エチル、プロピル、等）であり、ｍは、２〜１０であり、さらにｎは、１００〜１，０００である。
【０５２２】
本発明の別の実施形態では、カルボニル含有アミノ酸を含むレラキシンポリペプチドが、末端ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジドまたはセミカルバジド成分を含み、分岐ＰＥＧの各鎖が１０〜４０ｋＤａの範囲（５〜２０ｋＤａの範囲でもよい）のＭＷを有する分岐ＰＥＧ誘導体で改変される。
【０５２３】
本発明の別の実施形態では、天然ではコードされないアミノ酸を含むレラキシンポリペプチドが、分岐構造を有するＰＥＧ誘導体で改変される。例えば、一部の実施形態では、ヒドラジンまたはヒドラジド末端ＰＥＧ誘導体は、下記の構造：
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）］２ＣＨ（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−ＮＨ−ＮＨ２
を有し、
式中、Ｒは、単純アルキル（メチル、エチル、プロピル、等）であり、ｍは、２〜１０であり、さらにｎは、１００〜１，０００であり、Ｘは、任意選択で、カルボニル基（Ｃ＝Ｏ）であるが、これは存在しても存在しなくてもよい。
【０５２４】
一部の実施形態では、セミカルバジド基を含むＰＥＧ誘導体は、構造：
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２］２ＣＨ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ２
を有し、
式中、Ｒは、単純アルキル（メチル、エチル、プロピル、等）であり、Ｘは、任意選択で、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）であるか、または存在せず、ｍは、２〜１０であり、さらにｎは、１００〜１，０００である。
【０５２５】
一部の実施形態では、ヒドロキシルアミン基を含むＰＥＧ誘導体は、構造：
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２］２ＣＨ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−ＮＨ２
を有し、
式中、Ｒは、単純アルキル（メチル、エチル、プロピル、等）であり、Ｘは、任意選択で、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）であるか、または存在せず、ｍは、２〜１０であり、さらにｎは、１００〜１，０００である。
【０５２６】
水溶性ポリマーがレラキシンポリペプチドに連結する程度と部位は、レラキシンポリペプチド受容体に対するレラキシンポリペプチドの結合を調節できる。一部の実施形態では、結合は、レラキシンポリペプチド受容体に対しレラキシンポリペプチドが、平衡結合アッセイ、例えば、Ｓｐｅｎｃｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３：７８６２−７８６７（１９８８）、で記載されている方法により測定して、約４００ｎＭ以下のＫｄで、１５０ｎＭ以下のＫｄで、および場合によっては、１００ｎＭ以下のＫｄで結合するように配置される。
【０５２７】
ポリマーの活性化、ならびにペプチドのコンジュゲーションに対する方法と化学は、文献に記載されており、当技術分野で既知である。ポリマーの活性化によく使われる方法には、限定されないが、ブロモシアン、過ヨウ素酸塩、グルタルアルデヒド、ビエポキシド、エピクロロヒドリン、ジビニルスルホン、カルボジイミド、ハロゲン化スルホニル、トリクロロトリアジン、等を使った官能基の活性化が含まれる（Ｒ．Ｆ．Ｔａｙｌｏｒ、（１９９１）、タンパク質固定化。基礎と応用（ＰＲＯＴＥＩＮ  ＩＭＭＯＢＩＬＩＳＡＴＩＯＮ．ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ）、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎ．Ｙ．；Ｓ．Ｓ．Ｗｏｎｇ、（１９９２）、タンパク質コンジュゲーションおよび架橋の化学（ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＣＯＮＪＵＧＡＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＣＲＯＳＳＬＩＮＫＩＮＧ）、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ；Ｇ．Ｔ、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ、（１９９３）、親和性リガンド固定化技術（ＩＭＭＯＢＩＬＩＺＥＤ  ＡＦＦＩＮＩＴＹ  ＬＩＧＡＮＤ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．；Ｄｕｎｎ、Ｒ．Ｌ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｅｄｓ．高分子薬剤と薬剤デリバリーシステム（ＰＯＬＹＭＥＲＩＣ  ＤＲＵＧＳ  ＡＮＤ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ）、ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｖｏｌ．４６９、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．１９９１、を参照）。
【０５２８】
ＰＥＧの官能基化およびコンジュゲーションに関するいくつかの総説と論文が利用できる。例えば、Ｈａｒｒｉｓ、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｃ２５：３２５−３７３（１９８５）；Ｓｃｏｕｔｅｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １３５：３０−６５（１９８７）；Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８６６−８７４（１９９２）；Ｄｅｌｇａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ９：２４９−３０４（１９９２）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．６：１５０−１６５（１９９５）、を参照されたい。
【０５２９】
また、ポリマー活性化の方法は、国際公開第９４／１７０３９号、米国特許第５、３２４、８４４号、国際公開第９４／１８２４７号、同９４／０４１９３号、米国特許第５，２１９，５６４号、米国特許第５，１２２，６１４号、国際公開第９０／１３５４０号、米国特許第５、２８１、６９８号、および国際公開第９３／１５１８９号で見つけることができ、活性化ポリマーと酵素の間のコンジュゲーションの方法は、限定されないが、凝固因子ＶＩＩＩ（国際公開第９４／１５６２５号）、ヘモグロビン（国際公開第９４／０９０２７号）、酸素運搬分子（米国特許第４，４１２，９８９号）、リボヌクレアーゼおよび超酸化物ジスムターゼ（Ｖｅｒｏｎｅｓｅ  ａｔ  ａｌ．、Ａｐｐ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１１：１４１−５２（１９８５））、等で見つけることができる。全ての引用文献と特許は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０５３０】
ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン等の天然ではコードされないアミノ酸を含むレラキシンポリペプチドのペグ化（すなわち、いずれかの水溶性ポリマー付加）は、いずれかの都合のよい方法で行われる。例えば、レラキシンポリペプチドは、アルキン末端ｍＰＥＧ誘導体を使ってペグ化される。簡単に述べると、過剰の固体ｍＰＥＧ（５０００）−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨが、ｐ−アジド−Ｌ−Ｐｈｅ−含有レラキシンポリペプチドの水溶液に、攪拌を加えながら室温で添加される。典型的には、水溶液は、反応が行われるべきｐＨ（一般的には、約ｐＨ４〜１０）近傍のｐＫａを有する緩衝液で緩衝化される。ｐＨ７．５でのペグ化のための適切な緩衝剤の例には、例えば、限定されないが、ＨＥＰＥＳ、リン酸塩、ホウ酸塩、トリス−ＨＣｌ、ＥＰＰＳ、およびＴＥＳが含まれる。ｐＨは、連続してモニターされ、必要に応じ、調節される。反応は、通常、約１〜４８時間継続させる。
【０５３１】
反応産物は、その後、疎水性相互作用クロマトグラフィーに供せられ、遊離ｍＰＥＧ（５０００）−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨおよび非ブロック化ＰＥＧが分子の両端で活性化されると、レラキシンポリペプチド変異体分子と架橋を形成する可能性がある全てのペグ化レラキシンポリペプチドの高分子量複合体から、ペグ化レラキシンポリペプチド変異体が分離される。疎水性相互作用クロマトグラフィーの条件は、遊離ｍＰＥＧ（５０００）−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨがカラムを通過し、一方、１つまたは複数のＰＥＧ基にコンジュゲートされた１つのレラキシンポリペプチド変異体分子を含む所望の構成物の後で、全ての架橋されたペグ化レラキシンポリペプチド変異体複合体が溶出する条件である。適切な条件は、所望のコンジュゲートに対する架橋した複合体の相対的大きさに応じて変化し、当業者によって容易に決定される。所望のコンジュゲートを含む溶出液は、限外濾過で濃縮され、透析濾過により脱塩される。
【０５３２】
必要に応じ、疎水性のクロマトグラフィーから得たペグ化レラキシンポリペプチドは、当業者に既知の１つまたは複数の方法によりさらに精製できる。この方法には、限定されないが、親和性クロマトグラフィー；陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー（限定されないが、ＤＥＡＥセファロースを使って）；シリカクロマトグラフィー；逆相ＨＰＬＣ；ゲル濾過（限定されないが、セファデックスＧ−７５を使って）；疎水性相互作用クロマトグラフィー；サイズ排除クロマトグラフィー、金属キレートクロマトグラフィー；限外濾過／透析濾過；エタノール沈殿；硫酸アンモニウム沈殿法；等電点電気泳動；置換クロマトグラフィー；電気泳動による方法（限定されないが、分取等電点電気泳動）、差分溶解度（限定されないが、硫酸アンモニウム沈殿法を含む）、または抽出が含まれる。見かけ分子量は、球状タンパク質標準に対する比較によりＧＰＣから推定できる（Ｐｒｅｎｅｔａ、ＡＺ、タンパク質精製法、実践的手法（ＰＲＯＴＥＩＮ  ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＭＥＴＨＯＤＳ、Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ）（Ｈａｒｒｉｓ  ＆  Ａｎｇａｌ、Ｅｄｓ．）ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９、２９３−３０６）。レラキシン−ＰＥＧコンジュゲートの純度は、タンパク分解（限定されないが、トリプシン切断を含む）と、それに続く質量分析により評価できる。Ｐｅｐｉｎｓｋｙ  ＲＢ．、ｅｔ  ａｌ、Ｊ、Ｐｈａｒｍｃｏｌ．＆  Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２９７（３）：１０５９−６６（２００１）。
【０５３３】
本発明のレラキシンポリペプチドのアミノ酸に連結された水溶性ポリマーは、制限無く、さらに誘導体化できる。
【０５３４】
アジド含有ＰＥＧ誘導体
本発明の別の実施形態では、レラキシンポリペプチドは、天然ではコードされないアミノ酸の側鎖上に存在するアルキン成分と反応するアジド成分を含むＰＥＧ誘導体を使って改変される。一般的に、ＰＥＧ誘導体は、１〜１００ｋＤａの範囲の、また、一部の実施形態では、１０〜４０ｋＤａの範囲の平均分子量を有する。
【０５３５】
一部の実施形態では、アジド末端ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｎ３
を有し、
式中、Ｒは、単純アルキル（メチル、エチル、プロピル、等）であり、ｍは、２〜１０であり、さらに、ｎは、１００〜１，０００（すなわち、平均分子量は５〜４０ｋＤａ）である。
【０５３６】
別の実施形態では、アジド末端ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｐ−Ｎ３
を有し、
式中、Ｒは、単純アルキル（メチル、エチル、プロピル、等）であり、ｍは、２〜１０であり、ｐは、２〜１０であり、さらに、ｎは、１００〜１，０００（すなわち、平均分子量は５〜４０ｋＤａ）である。
【０５３７】
本発明の別の実施形態では、アルキン含有アミノ酸を含むレラキシンポリペプチドは、末端アジド成分を含む分岐ＰＥＧ誘導体で改変される。この分岐ＰＥＧの各鎖は、１０〜４０ｋＤａの範囲のＭＷで、５〜２０ｋＤａの範囲のＭＷであってもよい。例えば、一部の実施形態では、アジド末端ＰＥＧ誘導体は、下記の構造：
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）］２ＣＨ（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−（ＣＨ２）ｐＮ３
を有し、
式中、Ｒは、単純アルキル（メチル、エチル、プロピル、等）であり、ｍは、２〜１０であり、ｐは、２〜１０であり、ｎは、１００〜１，０００であり、さらに、Ｘは任意選択で、Ｏ、Ｎ、Ｓまたはカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）であり、それぞれのケースで、存在しても、存在しなくてよい。
【０５３８】
アルキン含有ＰＥＧ誘導体
本発明の別の実施形態では、レラキシンポリペプチドは、天然ではコードされないアミノ酸の側鎖上に存在するアジド成分と反応するアルキン成分を含むＰＥＧ誘導体で改変される。
【０５３９】
一部の実施形態では、アルキン末端ＰＥＧ誘導体は、下記の構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ≡ＣＨ
を有し、
式中、Ｒは、単純アルキル（メチル、エチル、プロピル、等）であり、ｍは、２〜１０であり、さらに、ｎは、１００〜１，０００（すなわち、平均分子量は５〜４０ｋＤａ）である。
【０５４０】
本発明の別の実施形態では、アルキン含有の天然ではコードされないアミノ酸を含むレラキシンポリペプチドは、アミド結合によりＰＥＧ骨格に連結された末端アジドまたは末端アルキン成分を含むＰＥＧ誘導体で改変される。
【０５４１】
一部の実施形態では、アルキン末端ＰＥＧ誘導体は、下記の構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｐ−Ｃ≡ＣＨ
を有し、
式中、Ｒは、単純アルキル（メチル、エチル、プロピル、等）であり、ｍは、２〜１０であり、ｐは２〜１０であり、さらに、ｎは、１００〜１，０００である。
【０５４２】
本発明の別の実施形態では、アジド含有アミノ酸を含むレラキシンポリペプチドは、末端アルキン成分を含む分岐ＰＥＧ誘導体で改変される。分岐ＰＥＧの各鎖は、１０〜４０ｋＤａの範囲のＭＷを有し、５〜２０ｋＤａの範囲のＭＷであってもよい。例えば、一部の実施形態では、アルキン末端ＰＥＧ誘導体は、下記の構造：
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）］２ＣＨ（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−（ＣＨ２）ｐＣ≡ＣＨ
を有し、
式中、Ｒは、単純アルキル（メチル、エチル、プロピル、等）であり、ｍは、２〜１０であり、ｐは、２〜１０であり、ｎは、１００〜１，０００あり、さらに、Ｘは、任意選択で、Ｏ、Ｎ、Ｓもしくはカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）であるか、または存在しない。
【０５４３】
ホスフィン含有ＰＥＧ誘導体
本発明の別の実施形態では、レラキシンポリペプチドは、天然ではコードされないアミノ酸の側鎖上に存在するアジド成分と反応するアリールホスフィン基をさらに含む活性化官能基（限定されないが、エステル、炭酸塩を含む）を含むＰＥＧ誘導体で改変される。一般的に、ＰＥＧ誘導体は、１〜１００ｋＤａの範囲、一部の実施形態では、１０〜４０ｋＤａの範囲の平均分子量を有する。
【０５４４】
一部の実施形態では、ＰＥＧ誘導体は、構造：
【化４８】
0006054294.tif 000052
を有し、
式中、ｎは、１〜１０であり；ＸはＯ、Ｎ、Ｓであっても、存在しなくてもよく、Ｐｈは、フェニルであり、さらに、Ｗは、水溶性ポリマーである。
【０５４５】
一部の実施形態では、ＰＥＧ誘導体は、構造：
【化４９】
0006054294.tif 000053
を有し、
式中、Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであっても、存在しなくてもよく、Ｐｈは、フェニルであり、Ｗは、水溶性ポリマーであり、さらに、Ｒは、Ｈ、アルキル、アリール、置換アルキルおよび置換アリール基であってもよい。代表的Ｒ基には、限定されないが、−ＣＨ２、−Ｃ（ＣＨ３）３、−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ”、−ＳＲ’、−ハロゲン、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ”、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ”、−ＣＮおよび−ＮＯ２が含まれる。Ｒ’、Ｒ”、Ｒ’”およびＲ””は、それぞれ、独立に、水素、置換または未置換ヘテロアルキル、置換または未置換アリール（限定されないが、１〜３ハロゲンで置換されたアリール置換を含む）、置換または未置換アルキル、アルコキシまたはチオアルコキシ基、またはアリールアルキル基を意味する。本発明の化合物が、２つ以上のＲ基を含む場合には、例えば、２つ以上のＲ’、Ｒ”、Ｒ’”およびＲ””基が存在する場合に、各Ｒ基が、それぞれＲ’、Ｒ”、Ｒ’”およびＲ””基であるように独立に選択される。Ｒ’およびＲ”が、同じ窒素原子に結合される場合は、それらは、窒素原子と組み合わされ、５、６、または７員環を形成することができる。例えば、−ＮＲ’Ｒ”は、限定されないが、１−ピロリジニルおよび４−モルフォリニルを含むことが意図されている。置換基の上記考察から、当業者なら、用語の「アルキル」が、水素基以外の基に結合した炭素原子を含む基、例えば、ハロアルキル（限定されないが、−ＣＦ３および−ＣＨ２ＣＦ３を含む）およびアシル（限定されないが、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３、等を含む）を含むことが意図されていることを理解されよう。
【０５４６】
他のＰＥＧ誘導体および一般的ペグ化技術
レラキシンポリペプチドに連結できる他の代表的ＰＥＧ分子、ならびにペグ化方法には、限定されないが、例えば、下記特許に記載のものが含まれる：米国特許公開第２００４／０００１８３８号；同２００２／００５２００９号；同２００３／０１６２９４９号；同２００４／００１３６３７号；同２００３／０２２８２７４号；同２００３／０２２０４４７号；同２００３／０１５８３３３号；同２００３／０１４３５９６号；同２００３／０１１４６４７号；同２００３／０１０５２７５号；同２００３／０１０５２２４号；同２００３／００２３０２３号；同２００２／０１５６０４７号；同２００２／００９９１３３号；同２００２／００８６９３９号；同２００２／００８２３４５号；同２００２／００７２５７３号；同２００２／００５２４３０号；同２００２／００４００７６号；同２００２／００３７９４９号；同２００２／０００２２５０号；同２００１／００５６１７１号；同２００１／００４４５２６号；同２００１／００２１７６３号；米国特許第６，６４６，１１０号；同５，８２４，７７８号；同５，４７６，６５３号；同５，２１９，５６４号；同５，６２９，３８４号；同５，７３６，６２５号；同４，９０２，５０２号；同５，２８１，６９８号；同５，１２２，６１４号；同５，４７３，０３４号；同５，５１６，６７３号；同５，３８２，６５７号；同６，５５２，１６７号；同６，６１０，２８１号；同６，５１５，１００号；同６，４６１，６０３号；同６，４３６，３８６号；同６，２１４，９６６号；同５，９９０，２３７号；同５，９００，４６１５，７３９，２０８号；同５，６７２，６６２号；同５，４４６，０９０号；同５，８０８，０９６号；同５，６１２，４６０号；同５，３２４，８４４号；同５，２５２，７１４号；同６，４２０，３３９号；同６，２０１，０７２号；同６，４５１，３４６号；同６，３０６，８２１号；同５，５５９，２１３号；同５，７４７，６４６号；同５，８３４，５９４号；同５，８４９，８６０号；同５，９８０，９４８号；同６，００４，５７３号；同６，１２９，９１２号；国際公開第９７／３２６０７号；欧州特許第２２９，１０８号；同４０２，３７８号；国際公開第９２／１６５５５号；同９４／０４１９３号；同９４／１４７５８号；同９４／１７０３９号；同９４／１８２４７号；同９４／２８０２４号；同９５／００１６２号；同９５／１１９２４号；同９５／１３０９０号；同９５／３３４９０号；同９６／０００８０号；同９７／１８８３２号；同９８／４１５６２号；同９８／４８８３７号；同９９／３２１３４号；同９９／３２１３９号；同９９／３２１４０号；同９６／４０７９１号；同９８／３２４６６号；同９５／０６０５８号；欧州特許第４３９５０８号；国際公開第９７／０３１０６号；同９６／２１４６９号；同９５／１３３１２号；欧州特許第９２１１３１号；国際公開第９８／０５３６３号；欧州特許第８０９９９６号；国際公開第９６／４１８１３号；同９６／０７６７０号；欧州特許第６０５９６３号；同５１０３５６号；同４００４７２号；同１８３５０３号および同１５４３１６号。これらの特許は、参照によって本明細書に組み込まれる。本明細書記載のいずれのＰＥＧ分子も、限定されないが、単鎖、分岐鎖、分岐鎖、単官能性、二官能性、多官能性、またはこれらのいずれかの組み合わせを含むいずれの形ででも使用可能である。
【０５４７】
追加のポリマーおよびＰＥＧ誘導体には、限定されないが、ヒドロキシルアミン（アミノオキシ）ＰＥＧ誘導体が含まれ、下記の特許に記載されている（これら全ては、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）：米国特許公開第２００６／０１９４２５６号、同２００６／０２１７５３２号、同２００６／０２１７２８９等、米国特許仮出願第６０／７５５，３３８号；同６０／７５５，７１１号；同６０／７５５，０１８号；国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０６／４９３９７号；国際公開第２００６／０６９２４６号；米国特許仮出願第６０／７４３，０４１号；同６０／７４３，０４０号；国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０６／４７８２２号；米国特許仮出願第６０／８８２，８１９号；同６０／８８２，５００号；および同６０／８７０，５９４号。
【０５４８】
異種のＦｃ融合タンパク質
上述のレラキシン化合物は、直接に、またはペプチドリンカーを介して免疫グロブリンのＦｃ部に融合してもよい。免疫グロブリンは、ジスルフィド結合によって一緒に保持されたポリペプチド鎖を含む、典型的には、２つの軽鎖と２つの重鎖を有する、分子である。各鎖では、１つのドメイン（Ｖ）が、分子の抗体特異性に応じて、可変アミノ酸配列を有する。もう一つのドメイン（Ｃ）は、逆に同じクラスの分子に共通な定常配列を有する。
【０５４９】
本明細書で使用されるように、免疫グロブリンのＦｃ部は、免疫学の分野の用語に通常与えられる意味を有する。具体的には、この用語は、抗体から２つの抗原結合領域（Ｆａｂ断片）を除くことにより得られる抗体断片を指す。Ｆａｂ断片を除く１つの方法は、免疫グロブリンをパパインプロテアーゼで消火することである。従って、Ｆｃ部は、両重鎖由来の定常領域の凡そ同じ大きさの断片から形成され、非共有結合性相互作用およびジスルフィド結合を介して結合する。Ｆｃ部分は、ヒンジ部を含み、ＣＨ２とＣＨ３ドメインを通って抗体のＣ末端まで広がることができる。ヒトおよびマウス免疫グロブリンの代表的ヒンジ部は、抗体エンジニアリング、実用ガイド（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ）、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ、Ｃ．Ａ、Ｋ．ｅｄ．、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、１９９２、で見つけることができる。ここでの教示は、参照によって本明細書に組み込まれる。Ｆｃ部分は、１つまたは複数のグリコシル化部位をさらに含むことができる。ヒンジ部、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン、ならびに１つのＮ−グリコシル化部位を含む多くの代表的Ｆｃタンパク質のアミノ酸配列は、当技術分野でよく知られている。
【０５５０】
異なるエフェクター機能および薬物動態学的特性を有する５つの型のヒト免疫グロブリンＦｃ領域：ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＥが存在する。ＩｇＧは、血清中に最も多い免疫グロブリンである。ＩｇＧは、また、全免疫グロブリン中で血清中最長半減期（２３日）を有する。他の免疫グロブリンとは異なり、ＩｇＧは、Ｆｃ受容体への結合後、効率的に再循環される。４つのＩｇＧサブクラス：Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、およびＧ４があり、それぞれが異なるエフェクター機能を有する。Ｇ１、Ｇ２、およびＧ３は、Ｃ１ｑ結合し、補体を固定することができるが、一方、Ｇ４はそれができない。Ｇ３がＧ１より効率的にＣ１ｑに結合できたとしても、Ｇ１は、補体直接細胞溶解の媒介に関し、より効率的である。Ｇ２は、非常に効率的に補体を固定する。ＩｇＧのＣ１ｑ結合部位は、ＣＨ２ドメインのカルボキシ末端領域に位置している。
【０５５１】
全てのＩｇＧサブクラスは、Ｆｃ受容体（ＣＤ１６、ＣＤ３２、ＣＤ６４）に結合でき、Ｇ１およびＧ３が、Ｇ２およびＧ４より効率的である。ＩｇＧのＦｃ受容体結合領域は、両ヒンジ部およびＣＨ２ドメインのカルボキシ末端領域に位置する残基により形成される。
【０５５２】
ＩｇＡは、モノマーおよびＪ−鎖により一緒に保持されるダイマー型の両方で存在できる。ＩｇＡは、血清中で２番目に多いＩｇであるが、半減期は６日に過ぎない。ＩｇＡは、３つのエフェクター機能を有する。それは、マクロファージおよび好酸球（それぞれ、食作用および脱顆粒の働きをする）上のＩｇＡ特異的受容体に結合する。そらは、また、未知の代替経路を介して、補体を固定することができる。
【０５５３】
ＩｇＭは、ペンタマーまたはヘキサマーとして発現し、これら両方共、Ｊ−鎖により一緒に保持されている。ＩｇＭは、５日の血清半減期を有する。それは、ＣＨ３ドメイン中にある結合部位を介してＣ１ｑに弱く結合をする。ＩｇＤは、３日の血清半減期を有する。何のエフェクター機能がこのＩｇに寄与可能かは明確ではない。ＩｇＥは、モノマーＩｇで、２．５日の血清半減期を有する。ＩｇＥは、２つのＦｃ受容体に結合し、これらの受容体は、脱顆粒を行わせ、炎症促進性物質の放出を生ずる。
【０５５４】
所望のインビボ効果に応じて、本発明の異種の融合タンパク質は、上述のアイソタイプのいずれかを含むことができ、または補体および／またはＦｃ受容体結合機能が変えられている変異Ｆｃ領域を含むこともできる。従って、本発明の異種融合タンパク質は、免疫グロブリンの全Ｆｃ部、免疫グロブリンのＦｃ部の断片、またはインターフェロンベータ化合物に融合されたそれらの類似体を含んでもよい。
【０５５５】
本発明の融合タンパク質は、単鎖タンパク質から、または多連鎖ポリペプチドとして構成される。２つ以上のＦｃ融合タンパク質は、それらが、Ｆｃ領域間で天然に形成されているジスルフィド結合を介して相互作用するように作ることができる。これらのマルチマーは、融合タンパク質のＦｃ部分のＮ末端に融合されたインターフェロンベータ化合物に対して同質であってもよく、または異質のインターフェロンベータ化合物を含んでいてもよい。
【０５５６】
融合タンパク質の最終構造に関係なく、ＦｃまたはＦｃ様領域は、Ｎ末端で融合されたインターフェロンベータ化合物のインビボ血漿半減期を延長する役割をすることができる。また、融合タンパク質化合物のインターフェロンベータ成分は、インターフェロンベータの少なくとも１つの生物活性を保持していなければならない。治療上のまたは循環半減期の増加は、本明細書記載のまたは当技術分野で既知の方法を使って立証することができる。この場合、融合タンパク質の半減期がインターフェロンベータ化合物単独の半減期と比較される。生物活性は、当技術分野で既知のインビトロおよびインビボ方法により測定できる。
【０５５７】
タンパク質分解により作られたＩｇＧ  Ｆｃ領域は、インタクトＩｇＧ分子と同じインビボ半減期を有し、Ｆａｂ断片は、急速に分解するので、半減期を延長する関連配列は、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメイン中に存在すると考えられている。さらに、高親和性Ｆｃ受容体またはＣ１ｑに結合しないＩｇＧ変異体の異化率は、親野性型抗体のクリアランス速度からは判別不能であり、異化の部位は、Ｆｃ受容体またはＣ１ｑ結合に関与する部位とは異なることを示すことが、文献で示されている［Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２９：２２１］。マウスＩｇＧ１  Ｆｃ領域を使った部位特異的変異誘発調査は、異化率を制御するＩｇＧ１  Ｆｃ領域の部位は、ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン界面に位置することを示唆した。Ｆｃ領域は、異化部位で改変し、融合タンパク質の半減期を最適化することができる。本発明の融合タンパク質に使われるＦｃ領域は、ＩｇＧ１由来でも、またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域由来でもよく、ヒンジ部を含むＣＨ２およびＣＨ３領域の両方を含んでもよい。
【０５５８】
異種アルブミン融合タンパク質
本明細書記載のレラキシンは、直接またはペプチドリンカー、水溶性ポリマー、もしくはプロドラッグリンカーを介してアルブミンまたはそれらの類似体、断片、もしくは誘導体に融合されてもよい。一般的に、本発明の融合タンパク質の一部であるアルブミンタンパク質は、ヒトを含むいずれの種からのクローン化アルブミン由来であってもよい。人血清アルブミン（ＨＳＡ）は、６６，５００の式量を有する５８５アミノ酸の単一の非グリコシル化ポリペプチド鎖から構成される。ヒトＨＡＳのアミノ酸配列は既知である［Ｍｅｌｏｕｎ、ｅｔ  ａｌ．（１９７５）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５８：１３６；Ｂｅｈｒｅｎｓ、ｅｔ  ａｌ．（１９７５）Ｆｅｄ．Ｐｒｏｃ．３４：５９１；Ｌａｗｎ、ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ９：６１０２−６１１４；Ｍｉｎｇｈｅｔｔｉ、ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：６７４７参照、これらは、参照によって本明細書に組み込まれる］。アルブミンの種々の多形変異体ならびに類似体および断片が記載されている［Ｗｅｉｔｋａｍｐ、ｅｔ  ａｌ．、（１９７３）Ａｎｎ．Ｈｕｍ．ジェネット．３７：２１９を参照］。例えば、欧州特許第３２２，０９４号では、種々のより短い形のＨＳＡが記載されている。これらのＨＳＡ断片のいくつかは、開示されており、ＨＳＡ（１−３７３）、ＨＳＡ（ｌ−３８８）、ＨＳＡ（ｌ−３８９）、ＨＳＡ（ｌ−３６９）、およびＨＳＡ（１−４１９）ならびに１−３６９および１−４１９の間の断片が含まれる。欧州特許第３９９，６６６号は、ＨＳＡ（１−１７７）およびＨＳＡ（ｌ−２００）ならびに断片ＨＳＡ（１−１７７）およびＨＳＡ（ｌ−２００）間の断片を含むアルブミン断片を開示している。
【０５５９】
本発明の異種融合タンパク質は、断片、類似体、および誘導体を含むいずれかのアルブミンタンパク質に結合したレラキシン化合物を含み、このような融合タンパク質は、生物学的に活性であり、レラキシン化合物単独よりも長い血漿半減期を有することは理解されよう。従って、融合タンパク質のアルブミン部は、必ずしも天然ヒトアルブミンと等しい血清半減期を有することを必要としない。天然ヒトアルブミンおよび対象レラキシン化合物の半減期に対し、より長い半減期、または中間的な半減期を有する断片、類似体、および誘導体が既知であるか、または生成される可能性がある。
【０５６０】
本発明の異種の融合タンパク質は、レラキシン化合物中、および／または融合タンパク質のＦｃまたはアルブミン部中に、保存的アミノ酸置換を有するタンパク質を包含する。「保存的置換」は、アミノ酸の、同じ正味電子電荷および凡そ同じ大きさと形を有する別のアミノ酸との置換である。脂肪族または置換脂肪族アミノ酸側鎖を有するアミノ酸は、側鎖中の炭素およびヘテロ原子合計数が、約４未満だけ異なる場合は、凡そ同じ大きさを有する。側鎖中の分岐部の数が、１つ未満だけ異なる場合は、それらはほぼ同じ形を有する。側鎖中にフェニルまたは置換フェニル基を有するアミノ酸は、凡そ同じ大きさと形を有すると考えられる。他に特に本明細書で提供される場合を除いて、保存的置換は、天然アミノ酸で行われるのが好ましい。
【０５６１】
野性型アルブミンおよび免疫グロブリンタンパク質は、種々のソースから入手可能である。例えば、これらのタンパク質は、検出可能レベルで対象ｍＲＮＡを発現する組織または細胞から調製されたｃＤＮＡライブラリーから入手できる。ライブラリーは、特定の対象タンパク質に対する公表されたＤＮＡまたはタンパク質配列を使って設計されたプローブで選別できる。例えば、免疫グロブリン軽鎖または重鎖定常領域は、Ａｄａｍｓ、ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９：２７１１−２７１９；Ｇｏｕｇｈｅｔ、ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９：２７０２−２７１０；Ｄｏｌｂｙ、ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：６０２７−６０３１；Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：７８６２−７８６２；Ｆａｌｋｎｅｒ、ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ  ２９８：２８６−２８８；およびＭｏｒｒｉｓｏｎ、ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：２３９−２５６、に記載されている。アルブミンタンパク質およびＤＮＡ配列を開示しているいくつかの文献には、Ｍｅｌｏｕｎ、ｅｔ  ａｌ．（１９７５）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５８：１３６；Ｂｅｈｒｅｎｓ、ｅｔ  ａｌ．（１９７５）Ｆｅｄ．Ｐｒｏｃ．３４：５９１；Ｌａｗｎ、ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ９：６１０２−６１１４；およびＭｉｎｇｈｅｔｔｉ、ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：６７４７、が含まれる。
【０５６２】
本発明の異種融合タンパク質のキャラクタリゼーション
本発明の融合タンパク質をキャラクタライズする多くの方法が存在する。これらの方法の一部には、限定されないが：タンパク質染色方法と組み合わせたＳＤＳ−ＰＡＧＥ、または抗ＩｇＧまたは抗ＨＳＡ抗体を使ったイムノブロッティング、が含まれる。他の方法には、例えば、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）、液体クロマトグラフィー／質量分析、等電点電気泳動、分析陰イオン交換、等電点電気泳動、および円偏光二色性、が含まれる。
【０５６３】
血清アルブミンに対する親和性強化
また、種々の分子を本発明のレラキシンポリペプチドに融合し、レラキシンポリペプチドの血清半減期を調製できる。一部の実施形態では、分子は、本発明のレラキシンポリペプチドに連結または融合され、動物中の内在性血清アルブミンに対する親和性を強化する。
【０５６４】
例えば、一部のケースでは、レラキシンポリペプチドおよびアルブミン結合配列の組換え融合体が作られ、代表的アルブミン結合配列には、限定されないが、レンサ球菌Ｇタンパク質由来のアルブミン結合ドメイン（例えば、Ｍａｋｒｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２７７：５３４−５４２（１９９６）およびＳｊｏｌａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１：１１５−１２３（１９９７）参照）、またはアルブミン結合ペプチド、例えば、Ｄｅｎｎｉｓ、ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３５０３５−３５０４３（２００２）に記載のものが含まれる。
【０５６５】
他の実施形態では、本発明のレラキシンポリペプチドは、脂肪酸でアシル化される。一部のケースでは、脂肪酸が血清アルブミンに対する結合を促進する。例えば、Ｋｕｒｔｚｈａｌｓ、ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１２：７２５−７３１（１９９５）を参照されたい。
【０５６６】
他の実施形態では、本発明のレラキシンポリペプチドは、血清アルブミン（限定されないが、人血清アルブミンを含む）に直接融合される。当業者なら、各種の他の分子もまた、本発明のレラキシンに連結され、血清アルブミンまたは他の血清成分への結合を調節できることに気付くであろう。
【０５６７】
レラキシンポリペプチドのグリコシル化
本発明は、１つまたは複数のサッカライド残基を有する天然ではコードされないアミノ酸を組み込んだレラキシンポリペプチドを含む。サッカライド残基は、天然（限定されないが、Ｎ−アセチルグルコサミンを含む）でも、または非天然（限定されないが、３−フルオロガラクトースを含む）であってもよい。糖類は、天然ではコードされないアミノ酸に、ＮまたはＯ結合型グリコシド結合（限定されないが、Ｎ−アセチルガラクトース−Ｌ−セリンを含む）でも、または非天然結合（限定されないが、オキシムまたは対応するＣ−またはＳ−連結グリコシド）で結合してもよい。
【０５６８】
サッカライド（限定されないが、グリコシルを含む）成分は、レラキシンポリペプチドにインビボまたはインビトロで付加できる。本発明の一部の実施形態では、カルボニル含有の天然ではコードされないアミノ酸を含むレラキシンポリペプチドは、アミノオキシ基で誘導体化したサッカライドで改変され、オキシム結合を介して連結された対応するグリコシル化ポリペプチドを生成する。天然ではコードされないアミノ酸に結合するとすぐに、サッカライドは、グリコシルトランスフェラーゼおよび他の酵素を使った処理によりさらに仕上げられ、レラキシンポリペプチドに結合したオリゴ糖を生成することができる。例えば、Ｈ．Ｌｉｕ、ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５：１７０２−１７０３（２００３）、を参照されたい。
【０５６９】
本発明の一部の実施形態では、カルボニル含有天然ではコードされないアミノ酸を含むレラキシンポリペプチドは、アミノオキシ誘導体として調製された確定した構造を有するグリカンで直接改変される。当業者なら、他の官能性、例えば、アジド、アルキン、ヒドラジド、ヒドラジン、およびセミカルバジドが、サッカライドを天然ではコードされないアミノ酸に連結させるために使用できることに気付くであろう。
【０５７０】
本発明の一部の実施形態では、アジドまたはアルキニル含有天然ではコードされないアミノ酸を含むレラキシンポリペプチドが、次に、限定されないが、それぞれ、アルキニルまたはアジド誘導体を使った、限定されないが、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化反応により改変できる。この方法は、タンパク質の非常に高い選択性での改変を可能とする。
【０５７１】
レラキシンダイマーおよびマルチマー
本発明は、また、は、また、レラキシンおよびレラキシン類似体の組み合わせ、例えば、ホモダイマー、ヘテロダイマー、ホモマルチマー、またはヘテロマルチマー（すなわち、トライマー、テトラマー、等）を提供し、１つまたは複数の天然ではコードされないアミノ酸を含むレラキシンが、別のレラキシンもしくはそのレラキシン変異体またはレラキシンもしくはそのレラキシン変異体ではないいずれかの他のポリペプチドに、ポリペプチド骨格に直接的にまたはリンカーを介して結合している。モノマーに比べて、増加した分子量のために、レラキシンダイマーまたはマルチマーコンジュゲートは、新しいまたは望ましい特性を示すことができ、これには、限定されないが、モノマーレラキシンに比べて、異なる薬理学的、薬物動態学的、薬力学的、調節された治療の半減期、または調節された血漿半減期が含まれる。モノマーレラキシン類似体の例に関しては、、例えば、Ｂａｌｓｃｈｍｉｄｔ、Ｐ．、ｅｔ  ａｌ．、１９９２年１１月１７日発行米国特許第５，１６４，３６６号；Ｂｒａｎｇｅ、Ｊ．、ｅｔ  ａｌ．、１９９７年４月８日発行米国特許第５，６１８，９１３号；Ｃｈａｎｃｅ、Ｒ．Ｅ．、ｅｔ  ａｌ．、１９９６年５月７日発行米国特許第５，５１４，６４６号；およびＥｒｔｌ、Ｊ．、ｅｔ  ａｌ．、１９９８年１２月２３日発行欧州特許第８８５，９６１号、を参照されたい。本発明の一部の実施形態は、１つまたは複数の天然ではコードされないアミノ酸残基を含むモノマーレラキシン類似体を提供し、また、一部の実施形態では、これらは、位置Ｂ２８が、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＶａｌまたはＡｌａであり、位置Ｂ２９のアミノ酸残基は、ＬｙｓまたはＰｒｏであるモノマーレラキシン類似体；Ｌｙｓ（Ｂ２８）Ｐｒｏ（Ｂ２９）−ヒトレラキシンを有するモノマーレラキシン類似体；モノマーレラキシン類似体Ａｓｐ（Ｂ２８）−ヒトレラキシン；およびモノマーレラキシン類似体Ｌｙｓ（Ｂ３）Ｉｌｅ（Ｂ２８）−ヒトレラキシン、を含む。一部の実施形態では、本発明のレラキシンダイマーがレラキシン受容体のシグナル伝達を調節する。他の実施形態では、本発明のレラキシンダイマーまたはマルチマーが、レラキシン受容体アンタゴニスト、アゴニスト、またはモジュレーターとして作用する。
【０５７２】
一部の実施形態では、ダイマーまたはマルチマーを含むレラキシン中に存在する１つまたは複数のレラキシン分子は、水溶性ポリマーに連結された天然ではコードされないアミノ酸を含む。
【０５７３】
一部の実施形態では、レラキシンポリペプチドは、限定されないが、Ａｓｎ−Ｌｙｓアミド結合またはＣｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合等を介して直接に連結される。一部の実施形態では、レラキシンポリペプチド、および／または連結非レラキシン分子は、ダイマー化を促進するために別々の天然ではコードされないアミノ酸を含み、限定されないが、第１のレラキシンポリペプチドの１つの天然ではコードされないアミノ酸中のアルキンおよび第２の分子の第２の天然ではコードされないアミノ酸中のアジドがＨｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化を介してコンジュゲートされる。あるいは、レラキシン、および／またはケトン含有天然ではコードされないアミノ酸を含む連結非レラキシン分子は、ヒドロキシルアミン含有天然ではコードされないアミノ酸を含む第２のポリペプチドにコンジュゲートされることができ、そのポリペプチドは、対応するオキシムの形成を介して反応する。
【０５７４】
あるいは、２つのレラキシンポリペプチド、および／または連結非レラキシン分子は、リンカーを介して連結される。いずれかのヘテロまたはホモ二官能性リンカーは、２つの分子、および／または連結非レラキシン分子を連結するために使用でき、それらの分子は同じ一次配列を持っても、異なる一次配列を持っていていてもよい。一部のケースでは、レラキシン、および／または連結非レラキシン分子を一緒に繋ぎ止めるために使用されるリンカーは、二官能性ＰＥＧ試薬であってもよい。リンカーは、広い範囲の分子量または分子長を持つことができる。より大きな、またはより小さな分子量リンカーは、レラキシンおよび連結実体間またはレラキシンおよびその受容体間、または、もしあれば、連結実体およびその結合相手間の、所望の空間関係または高次構造を提供するのに使用できる。より長い、またはより短い分子長を有するリンカーは、また、レラキシンおよび連結実体間、または、もしあれば、連結実体およびその結合相手間の所望の空隙または柔軟性を与えるのに使用できる。
【０５７５】
一部の実施形態では、本発明は、ダンベル構造を有する水可溶性二官能性リンカーを提供し、これは、下記を含む：ａ）ポリマー骨格の第１の末端の少なくともアジド、アルキン、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、またはカルボニル含有成分；およびｂ）ポリマー骨格の第２の末端の少なくとも第２の官能基。第２の官能基は、第１の官能基と同じであっても、異なっていてもよい。第２の官能基は、一部の実施形態では、第１の官能基と反応しない。一部の実施形態では、本発明は、分岐分子構造の少なくとも１つのアームを含む水可溶性化合物を提供する。例えば、分岐分子構造は、樹状であってもよい。
【０５７６】
一部の実施形態では、本発明は、水溶性活性化ポリマーとの反応により形成された１つまたは複数のレラキシンポリペプチドを含むマルチマーを提供する。前記水溶性活性化ポリマーは、構造：
Ｒ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｘ
を有し、
式中、ｎは、約５〜３，０００であり、ｍは、２〜１０であり、Ｘは、アジド、アルキン、ヒドラジン、ヒドラジド、アミノオキシ基、ヒドロキシルアミン、アセチル、またはカルボニル含有成分であってもよく、さらに、Ｒは、キャッピング基、官能基、または脱離基で、これらは、Ｘと同じでも異なってもよい。Ｒは、例えば、下記からなる群より選択される官能基であってもよい：ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、アルコキシル、Ｎ−ヒドロキシサクシニミジルエステル、１−ベンゾトリアゾリルエステル、Ｎ−ヒドロキシサクシニミジル炭酸塩、１−ベンゾトリアゾリル炭酸塩、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリラート、メタクリルラート、アクリルアミド、活性スルホン、アミン、アミノオキシ、保護アミン、ヒドラジド、保護されたヒドラジド、保護チオール、カルボン酸、保護カルボン酸、イソシアナート、イソチオシアナート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセトアミド、エポキシド、グリオキサル、ジオン、メシラート、トシラート、およびトレシラート、アルケン、およびケトン。
【０５７７】
レラキシンポリペプチドの活性およびレラキシン受容体に対するレラキシンポリペプチドの親和性の測定
レラキシンポリペプチド活性は、標準的または既知のインビトロまたはインビボアッセイを使って測定できる。レラキシンポリペプチドは、当技術分野で既知の適切な方法により、生物活性を分析できる。このようなアッセイには、限定されないが、インターフェロン（「ＩＦＮ」）応答遺伝子活性化、受容体結合アッセイ、抗ウイルス活性アッセイ、細胞変性阻止アッセイ、（Ｆａｍｉｌｌｅｔｔｉ  ｅｔ．ａｌ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７８：３８７−３９４）、抗増殖性アッセイ、（Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ  ａｎｄ  Ｓａｍｐｌｅ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１１９：５７９−５８２）、免疫調節アッセイ（米国特許第４，９１４，０３３号；同４，７５３，７９５号）、およびＭｅａｇｅｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、２６１：２１−３６（２００２）に記載されているような、ＭＨＣ分子の誘導をモニターするアッセイ（例えば、Ｈｏｋｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１１９：６８８−６９３）、が含まれる。
【０５７８】
３Ｔ３−１脂肪細胞のブドウ糖取込は、下記の方法を使って評価できる。３Ｔ３−Ｌ１細胞をアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．）から入手する。細胞をダルベッコ変法イーグル培地中に１０％鉄富化胎仔ウシ血清を含む増殖培地（ＧＭ）中で培養する。標準的脂肪細胞分化のために、細胞が培養密度に到達した２日後（ｄａｙ０と呼ぶ）、１０％胎仔ウシ血清、１０μｇ／ｍｌのレラキシン、１μＭデキサメタゾン、および０．５μＭイソブチルメチルキサンチンを含む分化培地（ＤＭ）に、細胞を４８時間接触させる。次に、１０％ウシ胎仔血清、および１０μｇ／ｍｌのレラキシンを含む分化後培地中で細胞を維持する。インビトロ効力は、当業者に既知のブドウ糖取込アッセイで測定できる。インビトロ効力は、細胞ベースアッセイにおけるレラキシン化合物のブドウ糖取込測定値として定義され、レラキシン化合物の生物学的効力の尺度である。それは、ＥＣ５０として表現でき、これは、単一用量反応実験で５０％活性を生ずる化合物の有効濃度である。
【０５７９】
０．１ｍＭ２−デオキシ−Ｄ−［１４Ｃ］ブドウ糖の蓄積によりアッセイされる、ブドウ糖輸送アッセイ−−レラキシン依存性−−ヘキソース取込は、以下のように測定される：１２ウエルプレートに入れた３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を、３７℃に暖めた、０．２％ＢＳＡ含有ＫＲＰ緩衝液（１３６ｍＭ  ＮａＣ１、４．７ｍＭ  ＫＣ１、１０ｍＭ  ＮａＰＯ４、０．９ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．９ｍＭ  ＭｇＳＯ４、ｐＨ７．４）で２回洗浄後、０．２％ＢＳＡを含むリーボビッツＬ−１５培地中で３７℃、２時間、室内気中でインキュベートし、再度０．２％ＢＳＡ緩衝液を含むＫＲＰで２回洗浄した後、ＫＲＰ、０．２％ＢＳＡ緩衝液中で、ワートマニン非存在（Ｍｅ２ＳＯのみ）下、またはワートマニン存在下、３７℃で３０分間、室内気中でインキュベートした。次に、レラキシンを加えて、１００ｎＭの最終濃度にし、１５分間保持し、最後の４分間で、２−デオキシ−Ｄ−［１４Ｃ］ブドウ糖の取込を測定する。１０μＭサイトカラシンＢの存在下測定した非特異的取込を、全体値から差し引いた。タンパク質濃度をＰｉｅｒｃｅビシンコニン酸アッセイで測定する。取込は常に、実験毎に、３回または４回繰り返して測定される。レラキシンの存在下の３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞のＦＧＦ−２１による短期および長期前処理の効果を検討することができる。
【０５８０】
ブドウ糖輸送アッセイ−−レラキシン非依存性−−３Ｔ３−Ｌ１繊維芽細胞を９６ウエルプレートに播種し、２週間、脂肪細胞（脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ））に分化させる。分化後、それらを無血清培地中で飢餓状態にさせ、本発明の種々のレラキシンポリペプチドで２４時間処理する。処理に際し、細胞を０．１％ＢＳＡ含有ＫＲＢＨ緩衝液で２回洗浄する。標識ブドウ糖の存在下、ＫＰＢＨ緩衝液中でブドウ糖取込をを行う。これにより、本発明により産生された種々のレラキシンポリペプチドおよび類似体、ならびにペグ化されているもの（ペグ化が天然分子の効率の低下の原因であることがわかっているので）の定性的評価が可能となり、また、異なるインスリンの効力を比較できる。さらに、エクスビボ組織モデルを使って、本発明のレラキシンポリペプチドが、ブドウ糖取込を誘導することが示される可能性がある。
【０５８１】
エクスビボブドウ糖輸送モデルでは、ブドウ糖輸送アッセイは、以下のように記載される：Ｋｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ緩衝液ストック溶液−ストック１：ＮａＣｌ（１．１６Ｍ）；ＫＣｌ（０．０４６Ｍ）；ＫＨ２ＰＯ４（０．０１１６Ｍ）；ＮａＨＣＯ３（０．０２５３Ｍ）。ストック２：ＣａＣｌ２（０．０２５Ｍ）；ＭｇＳＯ４（２Ｈ２Ｏ）（０．０１１６Ｍ）。ＢＳＡ：ＩＣＮ  Ｃｏｈｎ画分Ｖ、透析なしで直接に脂肪酸不含ＢＳＡを使用。培地調製：  ５０ｍｌのＫｒｅｂｓストック１を３９５ｍｌのｄＨ２Ｏに添加し、９５％Ｏ２／５％ＣＯ２を含むガスを１時間流す。５０ｍｌのストック２を加え、ｄＨ２Ｏで５００ｍｌにする。５００ｍｇのＩＣＮ脂肪酸不含ＢＳＡを加える。プレインキュベーションおよびインキュベーション培地：３２ｍＭマンニトール、８ｍＭブドウ糖、洗浄培地：４０ｍＭマンニトール、２ｍＭピルビン酸塩。輸送培地：３９ｍＭマンニトール、１ｍＭ２−ＤＧ；３２ｍＭマンニトール、８ｍＭ３−Ｏ−ＭＧ。レラキシン溶液：（ブタレラキシン［Ｌｉｌｌｙ］１００，０００，０００μＵ／ｍｌ）：２０００μＵ／ｍｌまたは１３．３ｎＭの最終濃度。放射性標識培地調製：使用した特異的活性：２ＤＧ＝１．５ｍＣｉ／ｍｌ；３−Ｏ−ＭＧ＝４３７μＣｉ／ｍｌ；または、マンニトール＝８μＣｉ／ｍ。ラットを０．１ｃｃのネンブタール／１００ｇ体重を使って麻酔する。筋肉組織を摘出し、０．９％食塩水ですすいだ後、プレインキュベーション培地（２ｍｌ）中に２９℃で１時間置く。筋肉組織をインキュベーション培地（２ｍｌ；レラキシンまたは試験化合物を含むこと以外は、プレインキュベーションと同じ）に移し、３０分間インキュベートする（実験条件に依存する）。その後、筋肉組織を、移し、２９℃で、培地（２ｍｌ）を使って１０分間洗浄し、次に、標識培地（１．５ｍｌ）に移し、１０分間（３−Ｏ−ＭＧ）または２０分間（２ＤＧ）保持する。筋肉組織をトリミングし、秤量して、ドライアイス上のポリプロピレンチューブに入れる。１ｍｌの１Ｎ  ＫＯＨをチューブに加え、１０〜１５分間、７０℃の水浴中に置き、数分毎にチューブをボルテックスする。チューブを氷上で冷却し、１ｍｌの１Ｎ  ＨＣｌを加え、よく混合する。２００μｌの上清を二通りにシンチレーションバイアルに入れ、既知の放射能基準と比較してシンチレーションカウンターでカウントする。
【０５８２】
収縮のため、プレインキュベーション／インキュベーション培地中で筋肉を最初１時間インキュベートする。１時間後、各対（ラット当たり１対）の１つの筋肉を刺激装置にピン留めし、もう一方の筋肉をインキュベーション培地の入った新しいフラスコに移す。１トレイン０．１ｍｓｅｃの各衝撃を使って７０Ｈｚの２００ｍｓｅｃトレインにより収縮した筋肉を刺激する。トレインは、１／ｓｅｃで、１０〜１５Ｖで２ｘ１０分間送出し、１分安静を挟む。刺激時間の最後に、筋肉を刺激装置から取り出し、洗浄培地中に１０分間置き、続けて、標識培地中に上記で大略述べたように置く。
【０５８３】
本発明のレラキシン、レラキシンポリペプチド、および／またはレラキシン類似体の平均量は、変わってもよいが、特に、有資格医師の推奨と処方に基づかなければならない。本発明のレラキシン、レラキシンポリペプチド、および／またはレラキシン類似体の正確な量は、治療される状態、治療される患者の状態の正確な型および／または重症度、ならびに組成物中の他の成分、等の因子に影響を受ける選択の問題である。本発明は、また、治療有効量の別の活性薬剤の投与を提供する。投与される量は、レラキシン、利用できるレラキシン治療法、および／または他のレラキシン類似体を使った治療に基づいて当業者により容易に決定できる。
【０５８４】
本発明の医薬組成物は、従来の方式で製造可能である。
【実施例】
【０５８５】
以下の実施例は、例示のために提供されており、請求発明を制限するものではない。
【０５８６】
実施例１
この実施例は、天然ではコードされないアミノ酸のレラキシン中への組込み部位の可能な多くの選択基準セット中の１つを記載する。
【０５８７】
図１〜４は、レラキシンの構造および配列を示し、下の表は、Ａ鎖、Ｂ鎖、レラキシンおよびプロレラキシンを有する配列を含む。レラキシンポリペプチドは、天然でコードされるアミノ酸を天然ではコードされないアミノ酸で置換することにより生成された。各ポリペプチドは、パラアセチルフェニルアラニン（ｐＡｃＦまたはｐＡＦ）で置換された１つのアミノ酸を有していた。生成ポリペプチドは、リーダー配列を欠き、Ａ／Ｂ鎖レラキシンポリペプチド（配列番号１〜３）であった。各生成ポリペプチドは、配列番号４の１、５、１８、１３、２の位置、または既知のレラキシン配列のいずれかのＡ鎖のこれらの位置、または配列番号５もしくは６の５、７、１８、２８と同じいずれかの既知のレラキシン配列のＢ鎖中の位置、の１つに、天然ではコードされないアミノ酸置換を有していた。図２は、ＰｙＭＯＬソフトウェア（ＤｅＬａｎｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）を使って標識されたヒトレラキシンおよび本発明のレラキシンポリペプチド中のパラアセチルフェニルアラニンで置換されたものに対応する一部のアミノ酸の構造を示す。
【０５８８】
タンパク質データバンク、または他のデータバンクからの結晶構造の使用と比較を含む、天然ではコードされないアミノ酸の組込みが好ましい部位の別の選択基準セットは、レラキシンの構造のモデル化に使用され、１）それらの受容体への結合を妨害しない、および２）タンパク質の内側に存在しないと思われる残基が特定される。一部の実施形態では、１つまたは複数の天然ではコードされないアミノ酸が、限定されないが、１つまたは複数のレラキシンの以下の位置に組み込まれる：配列番号４の１、５、１８、１３、２、またはいずれかの既知のレラキシン配列のＡ鎖のこれらの位置、または配列番号５もしくは６の５、７、１８、２８と同じいずれかの既知のレラキシン配列のＢ鎖中の位置。
【０５８９】
以下の基準を使って、天然ではコードされないアミノ酸の導入のためのレラキシンおよびレラキシン類似体の各位置を評価した：残基は（ａ）構造分析に基づいて判断して、受容体への結合を妨害してはならない、ｂ）アラニンまたは相同体系統的変異導入法による変異導入を受けていてはならない（ｃ）表面が露出し、さらに周辺残基との最小限のファンデルワールスまたは水素結合相互作用を示していなければならない、（ｄ）レラキシン変異体中で、欠失しているか、または可変でなければならない、（ｅ）天然ではコードされないアミノ酸での置換に際し保存的変化を生ずる可能性がある、および（ｆ）非常柔軟な領域または構造的に強固な領域のいずれかで見つかる可能性がある。加えて、レラキシン分子について、Ｃｘプログラム（Ｐｉｎｔａｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、１８、ｐｐ９８０）を利用して各タンパク質原子に対する突出の程度を評価するためのさらなる計算を行ってもよい。
【０５９０】
一部の実施形態では、１つまたは複数の天然ではコードされないアミノ酸がレラキシンのＡ鎖中の１つまたは複数の下記の位置に組み込まれる：位置１（すなわち、Ｎ末端）の前、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端）（配列番号４または配列番号１〜３の対応するアミノ酸）。一部の実施形態では、１つまたは複数の天然ではコードされないアミノ酸がレラキシンのＢ鎖中の１つまたは複数の下記の位置に組み込まれる：位置１（すなわち、Ｎ末端）の前、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端）（配列番号５もしくは６または配列番号１〜３の対応するアミノ酸）。一部の実施形態では、１つまたは複数の天然ではコードされないアミノ酸がレラキシン中の１つまたは複数の下記の位置に組み込まれる：１、５、３１、２、１３、２９、１８、５２（配列番号１または配列番号２および３の対応するアミノ酸）。一部の実施形態では、１つまたは複数の天然ではコードされないアミノ酸がレラキシンの下記の１つまたは複数の位置に組み込まれる：５、３１、２、１３、２９、１８、５２（配列番号１または配列番号２および３の対応するアミノ酸）。一部の実施形態では、１つまたは複数の天然ではコードされないアミノ酸がレラキシンの下記の１つまたは複数の位置に組み込まれる：１、５、３１、２、１３、２９（配列番号１または配列番号２および３の対応するアミノ酸）。一部の実施形態では、１つまたは複数の天然ではコードされないアミノ酸がレラキシンの下記の１つまたは複数の位置に組み込まれる：５、３１、２、１３、２９（配列番号１または配列番号２および３の対応するアミノ酸）。一部の実施形態では、１つまたは複数の天然ではコードされないアミノ酸がレラキシンの下記の１つまたは複数の位置に組み込まれる：１、５、３１、２、１３（配列番号１または配列番号２および３の対応するアミノ酸）。一部の実施形態では、１つまたは複数の天然ではコードされないアミノ酸がレラキシンの下記の１つまたは複数の位置に組み込まれる：５、３１、２、１３（配列番号１または配列番号２および３の対応するアミノ酸）。
【０５９１】
実施例２
この実施例は、大腸菌中の天然ではコードされないアミノ酸を含むレラキシンポリペプチドのクローニングおよび発現について詳述する。
【０５９２】
レラキシンのクローニング方法は、当業者には既知である。レラキシン用ポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列およびレラキシンの宿主細胞中へのクローニングについては、米国特許第４，７５８，５１６号；同５，１６６，１９１号；同５，１７９，１９５号、５，９４５，４０２号；および同５，７５９，８０７号；に詳細に記述されている。これらの特許は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０５９３】
レラキシンをコードするｃＤＮＡは、配列番号１２として示され、成熟ポリペプチドアミノ酸配列は、配列番号１として示される。
【表４−１】
0006054294.tif 000054
【表４−２】
0006054294.tif 000055
【０５９４】
直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）および直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含む導入された翻訳系を使用して、天然ではコードされないアミノ酸を含むレラキシンまたはレラキシン類似体を発現させる。Ｏ−ＲＳは、天然ではコードされないアミノ酸を有するＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する。次に、翻訳系は、コードされたセレクターコドンに応答して、天然ではコードされないアミノ酸をレラキシンまたはレラキシン類似体中に挿入する。適切なＯ−ＲＳおよびＯ−ｔＲＮＡ配列は、「アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ組成物およびその使用」のタイトルの国際公開第２００６／０６８８０２号（Ｅ９；配列番号１６）および「ｔＲＮＡ組成物およびその使用」のタイトルの国際公開第２００７／０２１２９７号（Ｆ１３；配列番号１７）に記載されている。これらの特許は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【表５−１】
0006054294.tif 000056
【表５−２】
0006054294.tif 000057
【０５９５】
改変レラキシンまたはレラキシン類似体遺伝子および直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ／ｔＲＮＡ対（所望の天然ではコードされないアミノ酸特異的）を含むプラスミドを使った大腸菌の形質転換により、天然ではコードされないアミノ酸のレラキシンポリペプチド中への部位特異的組み込みが可能となる。
【０５９６】
野性型成熟レラキシンは、標準的プロトコルを使ってｃＤＮＡ合成反応に続くＰＣＲにより増幅され、ｐＥＴ３０（ＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ）にクローニングされる。配列確認の前に、またはその後に、Ｎ末端ＨＨＨＨＨＨＳＧＧ配列を含むレラキシンが、大腸菌リポタンパク質プロモーター配列（Ｍｉｌｌｅｒ、Ｊ．Ｈ．、Ｇｅｎｅ、１９８６）由来の合成プロモーターの構成的制御下のメタノコッカスジャナスキー（ＭｊｔＲＮＡＴｙｒ／ＣＵＡ）由来のアンバーサプレッサーチロシルｔＲＮＡＴｙｒ／ＣＵＡ、ならびに大腸菌ＧｌｎＲＳプロモーターの制御下の直交性チロシル−ｔＲＮＡ−シンテターゼ（ＭｊＴｙｒＲＳ）を含む抑制ベクター中にサブクローニングされる。レラキシンの発現は、Ｔ７プロモーターの制御下で行われる。アンバー変異が、標準的ｑｕｉｃｋ  ｃｈａｎｇｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎプロトコルを使って導入される（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；ＬａＪｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）。構築物は、検証された配列である。
【０５９７】
長時間作用型レラキシン化合物の試験は、ＳＴＺ糖尿病ラットモデル（ＰＣＯ０８−４００−２０９）を使って行うことができる。
【０５９８】
パラアセチルフェニルアラニン（ｐＡｃＦ）を使った抑制
プラスミド（例えば、ｐｔ＿ＲＬＸ＿ＢＡ１＿ＡＶ１３ａｍ＿ｐ１３９５（ＡＸＩＤ２３８１））を使って、大腸菌株Ｗ３１１０Ｂ５７中に形質転換し、ＲＬＸ−ＢＡ１−ＡＶ１３ｐＡＦ  Ｗ３１１０  Ｂ２大腸菌株を産生した。ここでのＴ７ポリメラーゼの発現は、アラビノース誘導性プロモーターの制御下で行った。一晩の細菌培養液を、２ＸＹＴ培地含有振盪フラスコ中で１：１００に希釈し、３７℃で約０．８のＯＤ６００まで増殖させた。アラビノース（最終０．２％）およびパラアセチルフェニルアラニン（ｐＡｃＦ）を最終濃度の４ｍＭまでの添加によりタンパク質発現を誘導した。培養液を３７℃で５時間インキュベートした。細胞を沈殿物にし、Ｂ−ＰＥＲ溶解緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ）１００ｕｌ／ＯＤ／ｍｌ＋１０ｕｇ／ｍｌ  ＤＮアーゼに再懸濁後、３７℃で３０分間インキュベートした。細胞性物質を遠心分離で除去し、上清を取りだした。沈殿物を、等量のＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質ロード緩衝液中に再懸濁した。全試料をＭＥＳおよびＤＴＴを使って４〜１２％ＰＡＧＥゲルにロードした。レラキシンの精製方法は、当業者には既知であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット分析、またはエレクトロスプレーイオン化オントラップ質量分析、等により確認される。
【０５９９】
Ｈｉｓタグ変異体レラキシンタンパク質は、当業者には既知の方法を使って精製できる。ＰｒｏＢｏｎｄニッケルキレート樹脂（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を、製造メーカーから提供された標準的Ｈｉｓタグタンパク質精製方法に従って使用できる。タンパク質機能測定は、当技術分野で既知の方法、本出願および組み込まれた文献で提供される方法、により行うことができ、また、代わりに、生きている細胞のＥＬＩＳＡを開発し、本発明のレラキシンポリペプチドを評価することができる。
【表６−１】
0006054294.tif 000058
【表６−２】
0006054294.tif 000059
【表７−１】
0006054294.tif 000060
【表７−２】
0006054294.tif 000061
【０６００】
実施例３
この実施例は、プロレラキシンポリペプチドの大腸菌による発現について詳述する。
大腸菌は、８８アミノ酸からなる単鎖タンパク質としてプロレラキシンを発現した。トリプシンおよびカルボキシペプチダーゼによる消化で、ペプチドとリーダー配列の連結は取り除かれる。得られたペプチドは、インスリンスーパーファミリーの小さい６ｋＤａの２鎖ペプチドメンバーであり、２４残基のＡ鎖および２９残基のＢ鎖から構成される。構造的折り畳みは、２つの鎖間（Ｃｙｓｌ１−Ｃｙｓ３６、およびＣｙｓ２４−Ｃｙｓ４８）および１つの鎖内（Ｃｙｓｌ０−Ｃｙｓｌ５）ジスルフィド結合により一緒に保持されている２つのペプチド鎖を特徴とする。ヒトレラキシン−２の結晶構造に基づく三次構造は、３つのヘリカルセグメントおよび疎水性のコアを封入する短い伸長領域を含むコンパクトな折り畳みを示した。
【０６０１】
１つまたは複数の天然ではコードされないアミノ酸を有するレラキシンは、特有の化学作用を提供し、天然アミノ酸のパラアセチルフェニルアラニン（ｐＡｃＦ）による置換により、生合成により組み込まれた化学的反応性のカルボニル基を含む特異的ペグ化組換え変異体を可能とし、ポリ（エチレン）グリコール（ＰＥＧ）に対する特有の共有結合部位を提供する。
【０６０２】
実施例４
この実施例は、大腸菌によるプロレラキシンポリペプチド発現について詳述する。
【０６０３】
この実施例は、５Ｌの発酵槽を使ったレラキシンポリペプチド産生のスケールアップについて記載する。これらの方法およびスケールアップは、１０Ｌ、３０Ｌ、１５０Ｌおよび１０００Ｌバッチに対しても使用できる。本発明の一部の実施形態では、１Ｌ当たりの細胞培養に対し、少なくとも２ｇのレラキシンタンパク質が産生される。本発明の別の実施形態では、１Ｌ当たりの細胞培養に対し、少なくとも４ｇのレラキシンタンパク質が産生される。本発明の別の実施形態では、１Ｌ当たりの細胞培養に対し、少なくとも６ｇのレラキシンタンパク質が産生される。本発明の別の実施形態では、１Ｌ当たりの細胞培養に対し、少なくとも８ｇのレラキシンタンパク質が産生される。本発明の別の実施形態では、１Ｌ当たりの細胞培養に対し、少なくとも１０ｇのレラキシンタンパク質が産生される。本発明の別の実施形態では、１Ｌ当たりの細胞培養に対し、少なくとも１５ｇのレラキシンタンパク質が産生される。本発明の別の実施形態では、１Ｌ当たりの細胞培養に対し、少なくとも２０ｇのレラキシンタンパク質が産生される。
【０６０４】
２．１  シード振盪フラスコ
プラスミドｐｔ＿ＲＬＸ＿ＢＡ１＿ＡＶ１３ａｍ＿ｐｌ３９５（ＡＸＩＤ２３８１）を含む大腸菌株Ｗ３１１０Ｂ５７［Ｆ−ＩＮ（ｒｒｎＤ−ｒｒｎＥ）ｌａｍｄａ−ａｒａＢ：：ｇ１  ｔｅｔＡｆｈｕＡ：：ｄｈｆｒ  ｏｍｐＴ：：ｃａｔ］を使って、ＲＬＸ−ＢＡ１−ＡＶ１３ｐＡＦを産生する。単一の研究細胞バンク（ＲＣＢ）バイアルを−８０℃から取り出し、室温で解凍し、次に、５０μＬを使って、２５０ｍＬのバッフルしたエルレンマイヤーフラスコ中の、５０ｍＬの５０μｇ／ｍＬカナマイシン硫酸塩を補充した種培地（合成培地）に播種した。初代種培養液を３７℃、２５０ｒｐｍ（１インチ偏心距離）で約１８時間増殖させた。初代種培養液を、５０μｇ／ｍＬカナマイシン硫酸塩を補充した１００ｍＬの種培地を含む５００ｍＬのバッフルしたエルレンマイヤーフラスコ中の２次種培養液中で、６００ｎｍ波長（ＯＤ６００）で測定した光学密度値の０．０５まで継代培養した。二次種培養液を、３７℃、２５０ｒｐｍ（１インチ偏心距離）で約８時間またはＯＤ６００が２〜４に達する時間まで増殖させた。
【０６０５】
２．２  発酵槽
Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｂｉｏｓｔａｔ  Ｂ５−Ｌ容器を５０μｇ／Ｌのカナマイシン硫酸塩を補充した２．１Ｌの産生培地（合成培地）で満たした。二次種培養液を使って発酵槽で初期ＯＤ６００の０．０３５濃度で播種した。培養液を３７℃で増殖させ、溶解酸素を一次撹拌（４８０〜１２００ｒｐｍ）カスケードおよび二次Ｏ２カスケードを使って３０％（空気飽和）維持に設定した。６ｐｓｉ背圧を伴った５ＬＰＭの空気流量を発酵の間維持した。培養液のｐＨを１５％水酸化アンモニウムの添加により７．２±０．０５に設定し、泡制御の必要に応じ、Ｄｏｗ  ＣｈｅｍｉｃａｌのＰ２０００消泡剤を加えた。培養液が３５±５のＯＤ６００に達すると（バッチ培地中の初期グリセリンがほぼ消費されたとき）、２００ｍＬの大量供給を開始し、同時に、ｐＨ設定を７．２〜６．６に調節した。最初の大量供給の後で、０．２５ｍＬ／Ｌ／分の速度で連続供給を開始し、回収まで継続した。供給開始直後、２．５ｍＬ／Ｌ（０．２ｇ／Ｌ最終培養液容量）の１００ｇ／ＬＬ−Ａｌａ−ｐＡｃＦジペプチド水溶液を発酵槽に加えた。ジペプチドの添加の１５分後、培養液をＬ−アラビノース（処方はＰＴＲ−ＦＧＦ−００２に記載）を２ｇ／Ｌ（最終培養液容量）の濃度まで添加し誘導した。培養液をアラビノース添加後６時間増殖させ、採取した。
【０６０６】
図５は、これらの方法で産生した、Ａ鎖の１３番目のアミノ酸位置に、バリンを置換したＡｌａおよびパラアセチルフェニルアラニンとして鎖Ｂ１アミノ酸を有するプロレラキシンのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【０６０７】
実施例５
この実施例は、カルボニル含有アミノ酸の導入およびアミノオキシ含有ＰＥＧとのその後の反応に関し詳述する。
【０６０８】
この実施例は、ケトン含有天然ではコードされないアミノ酸を組み込んだレラキシンポリペプチドの生成方法を示す。このレラキシンポリペプチドは、その後、約５，０００ＭＷのアミノオキシ含有ＰＥＧと反応する。位置１（すなわち、Ｎ末端）の前、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２（すなわち、配列番号１のタンパク質のカルボキシル末端または配列番号３、５、７、９、１１の対応するミノ酸）のそれぞれの残基、および位置１（すなわち、Ｎ末端）の前、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２（すなわち、配列番号２のタンパク質のカルボキシル末端または配列番号４、６、８、１０、１２の対応するアミノ酸）のそれぞれの残基は、別々に下記の構造を有する天然ではコードされないアミノ酸で置換される：
【化５０】
0006054294.tif 000062
。
【０６０９】
ｐ−アセチルフェニルアラニンのレラキシン中への部位特異的組み込みで利用される配列は、上記実施例２で記載の、配列番号１および２（レラキシンのＡおよびＢ鎖）、および配列番号１６または１７（ｍｕｔｔＲＮＡ、Ｍ．スジャナスキー）、および１５、２９、３０または３１（ＴｙｒＲＳＬＷ１、５、または６）である。
【０６１０】
改変されるとすぐに、カルボニル含有アミノ酸を含むレラキシンポリペプチド変異体を、式：
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−ＮＨ２
を有するアミノオキシ含有ＰＥＧ誘導体と反応させる。
式中、Ｒはメチル、ｎは３、およびＮは約５，０００ＭＷである。２５ｍＭ  ＭＥＳ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）ｐＨ６．０、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）ｐＨ７．０、または１０ｍＭ酢酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）ｐＨ４．５中に、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解された精製ｐ−アセチルフェニルアラニン含有レラキシンを、１０〜１００倍過剰のアミノオキシ含有ＰＥＧと反応させ、室温で１０〜１６時間攪拌する（Ｊｅｎｃｋｓ、Ｗ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９５９、８１、ｐｐ４７５）。次に、速やかな精製および分析のために、ＰＥＧ−レラキシンを適切な緩衝液中に希釈する。
【０６１１】
実施例６
この実施例は、カルボニル含有アミノ酸の導入と、その後のアミノオキシ含有ＰＥＧとの反応に関し、詳述する。
【０６１２】
この実施例は、ケトン含有天然ではコードされないアミノ酸を組み込んだレラキシンポリペプチドの生成方法を示す。このレラキシンポリペプチドは、その後、約２０，０００ＭＷのアミノオキシ含有ＰＥＧと反応する。位置１（すなわち、Ｎ末端）の前、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４（すなわち、配列番号１のタンパク質のカルボキシル末端または配列番号２および３の対応するアミノ酸）のそれぞれの残基は、別々に下記の構造を有する天然ではコードされないアミノ酸で置換される：
【化５１】
0006054294.tif 000063
。
【０６１３】
ｐ−アミノフェニルアラニンのレラキシン中への部位特異的組み込みに利用される配列は、配列番号４および５または６（レラキシンのＡおよびＢ鎖）、ならびに配列番号１６または１７（ｍｕｔｔＲＮＡ、Ｍ．ジャナスキー）、ならびに上述の配列およびｐ−アミノフェニルアラニンの部位特異的組み込みのために組み込まれた配列である。
【０６１４】
改変されるとすぐに、カルボニル含有アミノ酸を含むレラキシンポリペプチド変異体を、式：
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−ＮＨ２
のアミノオキシ含有ＰＥＧ誘導体と反応させる。
式中、Ｒはメチル、ｎは３、さらにＮは約２０，０００ＭＷである。２５ｍＭ    ＭＥＳ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）ｐＨ６．０、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）ｐＨ７．０、または１０ｍＭ酢酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）ｐＨ４．５中に、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解された精製ｐ−アミノフェニルアラニン含有レラキシンを、１０〜１００倍過剰のアミノオキシ含有ＰＥＧと反応させ、室温で１０〜１６時間攪拌する（Ｊｅｎｃｋｓ、Ｗ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９５９、８１、ｐｐ４７５）。次に、速やかな精製および分析のために、ＰＥＧ−レラキシンを適切な緩衝液中に希釈する。
【０６１５】
実施例７
この実施例は、カルボニル含有アミノ酸の導入と、その後のアミノオキシ含有ＰＥＧとの反応に関し、詳述する。
【０６１６】
この実施例は、ケトン含有天然ではコードされないアミノ酸を組み込んだレラキシンポリペプチドの生成方法を示す。このレラキシンポリペプチドは、その後、約２０，０００ＭＷのアミノオキシ含有ＰＥＧと反応する。位置１（すなわち、Ｎ末端）の前、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３（すなわち、配列番号１のタンパク質のカルボキシル末端または配列番号２および３の対応するアミノ酸位置）のそれぞれの残基は、別々に下記の構造を有する天然ではコードされないアミノ酸で置換される：
【化５２】
0006054294.tif 000064
。
【０６１７】
ｐ−アミノフェニルアラニンのレラキシン中への部位特異的組み込みに利用される配列は、配列番号１３、および配列番号１６または１７（ｍｕｔｔＲＮＡ、Ｍ．ジャナスキー）、ならびに上述配列およびｐ−アミノフェニルアラニンの部位特異的組み込みのために組み込まれた配列である。
【０６１８】
改変されるとすぐに、カルボニル含有アミノ酸を含むレラキシンポリペプチド変異体を、式：
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−ＮＨ２
のアミノオキシ含有ＰＥＧ誘導体と反応させる。
式中、Ｒはメチル、ｎは３、さらに、Ｎは約２０，０００ＭＷである。２５ｍＭ  ＭＥＳ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）ｐＨ６．０、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）ｐＨ７．０、または１０ｍＭ酢酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）ｐＨ４．５中に、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解された精製ｐ−アミノルフェニルアラニン含有レラキシンを、１０〜１００倍過剰のアミノオキシ含有ＰＥＧと反応させ、室温で１０〜１６時間攪拌する（Ｊｅｎｃｋｓ、Ｗ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９５９、８１、ｐｐ４７５）。次に、速やかな精製および分析のために、ＰＥＧ−レラキシンを適切な緩衝液中に希釈する。
【０６１９】
実施例８
この実施例は、カルボニル含有アミノ酸の導入と、その後のアミノオキシ含有ＰＥＧとの反応に関し、詳述する。
【０６２０】
この実施例は、ケトン含有天然ではコードされないアミノ酸を組み込んだレラキシンポリペプチドの生成方法を示す。このレラキシンポリペプチドは、その後、約２０，０００ＭＷのアミノオキシ含有ＰＥＧと反応する。位置１（すなわち、Ｎ末端）の前、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４（すなわち、配列番号１のタンパク質のカルボキシル末端または配列番号２および３の対応するアミノ酸位置）のそれぞれの残基は、別々に下記の構造を有する天然ではコードされないアミノ酸で置換される：
【化５３】
0006054294.tif 000065
。
【０６２１】
ｐ−アミノフェニルアラニンのレラキシン中への部位特異的組み込みに利用される配列は、配列番号１、および配列番号１６または１７（ｍｕｔｔＲＮＡ、Ｍ．ジャナスキー）、ならびに上述の配列およびｐ−アミノフェニルアラニンの部位特異的組み込みのために組み込まれた配列である。
【０６２２】
改変されるとすぐに、カルボニル含有アミノ酸を含むレラキシンポリペプチド変異体を、式：
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−ＮＨ２
のアミノオキシ含有ＰＥＧ誘導体と反応させる。
式中、Ｒはメチル、ｎは３、さらに、Ｎは約２０，０００ＭＷである。２５ｍＭ  ＭＥＳ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）ｐＨ６．０、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）ｐＨ７．０、または１０ｍＭ酢酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）ｐＨ４．５中に、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解された精製ｐ−アミノフェニルアラニン含有レラキシンを、１０〜１００倍過剰のアミノオキシ含有ＰＥＧと反応させ、室温で１０〜１６時間攪拌する（Ｊｅｎｃｋｓ、Ｗ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９５９、８１、ｐｐ４７５）。次に、速やかな精製および分析のために、ＰＥＧ−レラキシンを適切な緩衝液中に希釈する。
【０６２３】
実施例９
この実施例は、カルボニル含有アミノ酸の導入と、その後のアミノオキシ含有ＰＥＧとの反応に関し、詳述する。
【０６２４】
この実施例は、ケトン含有天然ではコードされないアミノ酸を組み込んだレラキシンポリペプチドの生成方法を示す。このレラキシンポリペプチドは、その後、約３０，０００ＭＷのアミノオキシ含有ＰＥＧと反応する。位置１（すなわち、Ｎ末端）の前、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４（すなわち、配列番号１のタンパク質のカルボキシル末端または配列番号２および３の対応する位置）のそれぞれの残基は、別々に下記の構造を有する天然ではコードされないアミノ酸で置換される：
【化５４】
0006054294.tif 000066
。
【０６２５】
ｐ−アミノフェニルアラニンのレラキシン中への部位特異的組み込みに利用される配列は、配列番号１（または配列番号２、もしくは３）、および配列番号１６または１７（ｍｕｔｔＲＮＡ、Ｍ．ジャナスキー）、ならびに上述の配列およびｐ−アミノフェニルアラニンの部位特異的組み込みのために組み込まれた配列である。
【０６２６】
改変されるとすぐに、カルボニル含有アミノ酸を含むレラキシンポリペプチド変異体を、式：
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−ＮＨ２
のアミノオキシ含有ＰＥＧ誘導体と反応させる。
式中、Ｒはメチル、ｎは３、さらに、Ｎは約３０，０００ＭＷである。２５ｍＭ  ＭＥＳ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）ｐＨ６．０、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）ｐＨ７．０、または１０ｍＭ酢酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）ｐＨ４．５中に、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解された精製ｐ−アミノフェニルアラニン含有レラキシンを、１０〜１００倍過剰のアミノオキシ含有ＰＥＧと反応させ、室温で１０〜１６時間攪拌する（Ｊｅｎｃｋｓ、Ｗ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９５９、８１、ｐｐ４７５）。次に、速やかな精製および分析のために、ＰＥＧ−レラキシンを適切な緩衝液中に希釈する。
【０６２７】
実施例１０
この実施例は、カルボニル含有アミノ酸の導入と、その後のアミノオキシ含有ＰＥＧとの反応に関し、詳述する。
【０６２８】
この実施例は、ケトン含有天然ではコードされないアミノ酸を組み込んだレラキシンポリペプチドの生成方法を示す。このレラキシンポリペプチドは、その後、約４０，０００ＭＷのアミノオキシ含有ＰＥＧと反応する。位置１（すなわち、Ｎ末端）の前、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４（すなわち、配列番号１のタンパク質のカルボキシル末端または配列番号２および３の対応する位置）のそれぞれの残基は、別々に下記の構造を有する天然ではコードされないアミノ酸で置換される：
【化５５】
0006054294.tif 000067
。
【０６２９】
ｐ−アミノフェニルアラニンのレラキシン中への部位特異的組み込みに利用される配列は、配列番号１３（または配列番号１、２、もしくは１４）、および配列番号１６または１７（ｍｕｔｔＲＮＡ、Ｍ．ジャナスキー）、ならびに上述の配列およびｐ−アミノフェニルアラニンの部位特異的組み込みのために組み込まれた配列である。
【０６３０】
改変されるとすぐに、カルボニル含有アミノ酸を含むレラキシンポリペプチド変異体を、式：
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−ＮＨ２
のアミノオキシ含有ＰＥＧ誘導体と反応させる。
式中、Ｒはメチル、ｎは３、さらに、Ｎは約４０，０００ＭＷである。２５ｍＭ  ＭＥＳ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）ｐＨ６．０、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）ｐＨ７．０、または１０ｍＭ酢酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）ｐＨ４．５中に、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解された精製ｐ−アミノフェニルアラニン含有レラキシンを、１０〜１００倍過剰のアミノオキシ含有ＰＥＧと反応させ、室温で１０〜１６時間攪拌する（Ｊｅｎｃｋｓ、Ｗ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９５９、８１、ｐｐ４７５）。次に、速やかな精製および分析のために、ＰＥＧ−レラキシンを適切な緩衝液中に希釈する。
【０６３１】
実施例１１
この実施例は、カルボニル含有アミノ酸の導入と、その後のアミノオキシ含有ＰＥＧとの反応に関し、詳述する。
【０６３２】
この実施例は、ケトン含有天然ではコードされないアミノ酸を組み込んだレラキシンポリペプチドの生成方法を示す。このレラキシンポリペプチドは、その後、約１０，０００ＭＷのアミノオキシ含有ＰＥＧと反応する。位置１（すなわち、Ｎ末端）の前、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４（すなわち、配列番号１のタンパク質のカルボキシル末端または配列番号２および３の対応する位置）のそれぞれの残基は、別々に下記の構造を有する天然ではコードされないアミノ酸で置換される：
【化５６】
0006054294.tif 000068
。
【０６３３】
ｐ−アミノフェニルアラニンのレラキシン中への部位特異的組み込みに利用される配列は、配列番号１３（または配列番号１、２、もしくは１４の対応する位置）、および配列番号１６または１７（ｍｕｔｔＲＮＡ、Ｍ．ジャナスキー）、ならびに上述の配列およびｐ−アミノフェニルアラニンの部位特異的組み込みのために組み込まれた配列である。
【０６３４】
改変されるとすぐに、カルボニル含有アミノ酸を含むレラキシンポリペプチド変異体は、式：
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−ＮＨ２
のアミノオキシ含有ＰＥＧ誘導体と反応する。
式中、Ｒはメチル、ｎは３、さらに、Ｎは約１０，０００ＭＷである。２５ｍＭ  ＭＥＳ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）ｐＨ６．０、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）ｐＨ７．０、または１０ｍＭ酢酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）ｐＨ４．５中に、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解された精製ｐ−アミノフェニルアラニン含有レラキシンを、１０〜１００倍過剰のアミノオキシ含有ＰＥＧと反応させ、室温で１０〜１６時間攪拌する（Ｊｅｎｃｋｓ、Ｗ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９５９、８１、ｐｐ４７５）。次に、速やかな精製および分析のために、ＰＥＧ−レラキシンを適切な緩衝液中に希釈する。
【０６３５】
実施例１２
アミド結合を介してＰＥＧに連結されたヒドロキシルアミン基から構成されるＰＥＧとのコンジュゲーション。
【０６３６】
下記の構造を有するＰＥＧ試薬は、実施例３〜９で記載された方法を使ってケトン含有天然ではコードされないアミノ酸に結合される：
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−ＮＨ２
式中、Ｒ＝メチル、ｎ＝４およびＮは約５，０００ＭＷ〜４０，０００ＭＷである。反応、精製、および分析条件は、当技術分野で記載の通りであり、既知である。
【０６３７】
実施例１３
この実施例は、２つの異なる天然ではコードされないアミノ酸のレラキシンポリペプチドおよびレラキシン類似体ポリペプチドへの導入に関し、詳述する。
【０６３８】
この実施例は、下記の残基中の２つの位置にケトン官能性を含む天然ではコードされないアミノ酸を組み込んだレラキシンポリペプチドの生成方法を示す：位置１（すなわち、Ｎ末端）の前、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４（すなわち、配列番号１のタンパク質のカルボキシル末端または配列番号２および３の対応する位置）。レラキシンポリペプチドは、セレクターコドンが核酸内の２つの異なる部位に導入されることを除いて、上述と同様に調製される。
【０６３９】
実施例１４
この実施例は、レラキシンポリペプチドまたはレラキシン類似体ポリペプチドのヒドラジド含有ＰＥＧへのコンジュゲーションおよびその後のインサイツ還元に関し詳述する。
【０６４０】
カルボニル含有アミノ酸を組み込んだレラキシンポリペプチドは、上述の方法に従って調製される。改変されるとすぐに、下記の構造を有するヒドラジド含有ＰＥＧがそのレラキシンポリペプチドにコンジュゲートされる：
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−Ｘ−ＮＨ−ＮＨ２
式中、Ｒ＝メチル、ｎ＝２、および、Ｎ＝５，０００；１０，０００、２０，０００；３０，０００；または４０，０００ＭＷであり、さらに、Ｘは、カルボニル（Ｃ＝Ｏ）基である。精製ｐ−アセチルフェニルアラニン含有レラキシンを、０．１〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度で、２５ｍＭ  ＭＥＳ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）ｐＨ６．０、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）ｐＨ７．０、または１０ｍＭ酢酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）ｐＨ４．５中に溶解し、１〜１００倍過剰のヒドラジド含有ＰＥＧと反応させ、ストック１Ｍ  ＮａＣＮＢＨ３（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を加えて、対応するヒドラゾンをインサイツ還元した後、Ｈ２Ｏに溶解し最終濃度の１０〜５０ｍＭにする。反応は、４℃〜ＲＴの温度で１８〜２４時間、暗所で行われる。約ｐＨ７．６の１Ｍトリス（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を５０ｍＭの最終トリス濃度にまで添加して、反応を停止するか、または反応物を速やかな精製のために適切な緩衝液中に希釈する。
【０６４１】
実施例１５
この実施例は、レラキシンポリペプチドまたはレラキシン類似体ポリペプチドのヒドラジド含有ＰＥＧへのコンジュゲーションおよびその後のインサイツ還元に関し詳述する。
【０６４２】
カルボニル含有アミノ酸を組み込んだレラキシンポリペプチドは、上述の方法に従って調製される。改変されるとすぐに、下記の構造を有するヒドラジド含有ＰＥＧがそのレラキシンポリペプチドにコンジュゲートされる：
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−Ｘ−ＮＨ−ＮＨ２
式中、Ｒ＝メチル、ｎ＝２、および、Ｎ＝２０，０００ＭＷであり、さらに、Ｘは、カルボニル（Ｃ＝Ｏ）基である。精製ｐ−アセチルフェニルアラニン含有レラキシンを、０．１〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度で、２５ｍＭ  ＭＥＳ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）ｐＨ６．０、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）ｐＨ７．０、または１０ｍＭ酢酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）ｐＨ４．５中に溶解し、１〜１００倍過剰のヒドラジド含有ＰＥＧと反応させ、ストック１Ｍ  ＮａＣＮＢＨ３（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を加えて、対応するヒドラゾンをインサイツ還元した後、Ｈ２Ｏに溶解し最終濃度の１０〜５０ｍＭにする。反応は、４℃〜ＲＴの温度で１８〜２４時間、暗所で行われる。約ｐＨ７．６の１Ｍトリス（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を５０ｍＭの最終トリス濃度にまで添加して、反応を停止するか、または反応物を速やかな精製のために適切な緩衝液中に希釈する。
【０６４３】
実施例１６
この実施例は、アルキン含有アミノ酸のレラキシンポリペプチドまたはレラキシン類似体ポリペプチド中への導入、およびｍＰＥＧ−アジドを使った誘導体化に関し詳述する。
【０６４４】
位置１（すなわち、Ｎ末端）の前、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４（すなわち、配列番号１のタンパク質のカルボキシル末端または配列番号２および３の対応する位置）の残基はそれぞれ、下記の天然ではコードされないアミノ酸で置換される：
【化５７】
0006054294.tif 000069
。
【０６４５】
ｐ−プロパルギルチロシンのレラキシンへの部位特異的組み込みに利用される配列は、上述の配列番号１（または配列番号２もしくは３の対応する位置）、配列番号１６または１７（ｍｕｔｔＲＮＡ、Ｍ．ジャナスキー）、および２２、２３または２４である。プロパルギルチロシン含有レラキシンポリペプチドは、大腸菌中で発現し、上述の条件を使って精製される。
【０６４６】
精製プロパルギルチロシン含有レラキシンを０．１〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度でＰＢ緩衝液（１００ｍＭナトリウムリン酸塩、０．１５Ｍ  ＮａＣ１、ｐＨ＝８）に溶解し、１０〜１０００倍過剰のアジド含有ＰＥＧを反応混合物に添加する。その後、触媒量のＣｕＳＯ４およびＣｕワイヤーを反応混合物に加える。混合物をインキュベーション（限定されないが、室温または３７℃で約４時間、または４℃で一晩）後、Ｈ２Ｏを添加し、混合物を透析膜を通して濾過する。この試料で、限定されないが、実施例３の記載と類似の方法で、付加の分析を行うことができる。この実施例では、ＰＥＧは、下記の構造を有する：
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−Ｎ３
式中、Ｒはメチル、ｎは４、および、Ｎ＝５，０００；１０，０００、２０，０００；３０，０００；または４０，０００ＭＷである。
【０６４７】
実施例１７
この実施例は、レラキシンポリペプチド中の大きな、疎水性のアミノ酸のプロパルギルチロシンによる置換に関し詳述する。
【０６４８】
レラキシンの、位置１（すなわち、Ｎ末端）の前、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４（すなわち、配列番号１のタンパク質のカルボキシル末端または配列番号２および３の対応する位置）の１つの領域内に存在するＰｈｅ、ＴｒｐまたはＴｙｒ残基は、上述のように、下記の天然ではコードされないアミノ酸により置換される：
【化５８】
0006054294.tif 000070
。
【０６４９】
改変されるとすぐ、ＰＥＧを、アルキン含有アミノ酸を含むレラキシンポリペプチド変異体に結合させる。ＰＥＧは、下記の構造を有する：
Ｍｅ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｎ３
また、結合方法は、上述の実施例の方法に類似となろう。これにより、天然の大きな疎水性アミノ酸とほぼ等配電子であり、ポリペプチド内の異なる部位のＰＥＧ誘導体で改変されている、天然ではコードされないアミノ酸を含むレラキシンポリペプチド変異体が生成されることになる。
【０６５０】
実施例１８
この実施例は、１つまたは複数のＰＥＧリンカーで分離された、レラキシンポリペプチドホモダイマー、ヘテロダイマー、ホモマルチマー、またはヘテロマルチマーの生成に関し詳述する。レラキシンポリペプチドマルチマーは、プロインスリンの間で、または本発明の成熟Ａ鎖およびＢ鎖レラキシンポリペプチドの間で形成されてもよい。
【０６５１】
上記実施例で産生されたアルキン含有レラキシンポリペプチド変異体を、式：
Ｎ３−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ３
の二官能性ＰＥＧ誘導体と反応させる。
式中、ｎは４であり、ＰＥＧは、約５，０００；１０，０００；２０，０００；３０，０００；または４０，０００ＭＷの平均ＭＷを有し、対応するレラキシンポリペプチドホモダイマーを生成する。ここで、２つのレラキシン分子は、ＰＥＧにより物理的に分離されている。類似の方式で、レラキシンポリペプチドを、１つまたは複数の他のポリペプチドに結合させ、ヘテロダイマー、ホモマルチマー、またはヘテロマルチマーを形成できる。結合、精製、および分析は、上記の実施例のように行える。
【０６５２】
実施例１９
この実施例は、１つまたは複数のＰＥＧリンカーにより分離されたレラキシンポリペプチドホモダイマー、ヘテロダイマー、ホモマルチマー、またはヘテロマルチマーの生成に関し詳述する。
レラキシンポリペプチドマルチマーは、Ａ鎖と他のＡ鎖の間、またはＢ鎖と他のＢ鎖の間で形成されてもよい。
【０６５３】
上記実施例で産生されたアルキン含有レラキシンポリペプチド変異体を、式：
Ｎ３−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ３
の二官能性ＰＥＧ誘導体と反応させる。
式中、ｎは４であり、ＰＥＧは、約５，０００；１０，０００；２０，０００；３０，０００；または４０，０００ＭＷの平均ＭＷを有し、対応するレラキシンポリペプチドホモダイマーを生成する。ここで、２つのレラキシン分子は、ＰＥＧにより物理的に分離されている。類似の方式で、レラキシンポリペプチドを、１つまたは複数の他のポリペプチドに結合させ、ヘテロダイマー、ホモマルチマー、またはヘテロマルチマーを形成できる。結合、精製、および分析は、上記実施例のように行える。
【０６５４】
実施例２０
この実施例は、サッカライド成分のレラキシンポリペプチドへの結合に関し詳述する。
【０６５５】
位置１（すなわち、Ｎ末端）の前、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４（すなわち、配列番号１のタンパク質のカルボキシル末端または配列番号２および３の対応する位置）の１つの残基が、上述のように、下記の天然ではコードされないアミノ酸で置換される：
【化５９】
0006054294.tif 000071
。
【０６５６】
改変されるとすぐに、カルボニル含有アミノ酸を含むレラキシンポリペプチド変異体を、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）のβ−連結アミノオキシ類似体と反応させる。レラキシンポリペプチド変異体（１０ｍｇ／ｍＬ）およびアミノオキシサッカライド（２１ｍＭ）を水性１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中で混合し、３７℃で７〜２６時間インキュベートする。サッカライドコンジュゲートレラキシンポリペプチド（５ｍｇ／ｍＬ）をＵＤＰ−ガラクトース（１６ｍＭ）およびβ−１、４−ガラシトシルトランスフェラーゼ（０．４ユニット／ｍＬ）と一緒に、１５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中、室温で４８時間インキュベートする事により、第２のサッカライドを第１のサッカライドに酵素的に連結する（Ｓｃｈａｎｂａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７０、２４５、５０５７−５０６１）。
【０６５７】
実施例２２
この実施例は、ペグ化レラキシンポリペプチドアンタゴニストの生成に関し詳述する。
【０６５８】
限定されないが、レラキシン受容体結合に関与する残基、等の残基は、上述のように下記の天然ではコードされないアミノ酸で置換される。改変されるとすぐに、カルボニル含有アミノ酸を含むレラキシンポリペプチド変異体を、式：
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−ＮＨ２
のアミノオキシ含有ＰＥＧ誘導体と反応させる。
式中、Ｒはメチル、ｎは４、および、Ｎは５，０００；１０，０００；２０，０００；３０，０００；または４０，０００ＭＷであり、ポリペプチド内の単一部位でＰＥＧ誘導体により改変されている、天然ではコードされないアミノ酸を含むレラキシンポリペプチドアンタゴニストを生成する。結合、精製、および分析は、上述のように行われる。
【０６５９】
実施例２１
レラキシン分子が直接連結されているレラキシンポリペプチドホモダイマー、ヘテロダイマー、ホモマルチマー、またはヘテロマルチマーの生成。
【０６６０】
アルキン含有アミノ酸を含むレラキシンポリペプチド変異体は、別のアジド含有アミノ酸を含むレラキシンポリペプチド変異体に直接結合させることができる。類似の方式で、レラキシンポリペプチドポリペプチドを、１つまたは複数の他のポリペプチドに結合させ、ヘテロダイマー、ホモマルチマー、またはヘテロマルチマーを形成できる。マルチマー形成に関するさらなる説明は、上記実施例１６と１７で提供されており、結合、精製、および分析は、上述のように行われる。
【０６６１】
実施例２２
ＰＥＧ−ＯＨ＋Ｂｒ−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ≡ＣＲ’→ＰＥＧ−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ≡ＣＲ’
Ａ                                      Ｂ
【０６６２】
ポリアルキレングリコール（Ｐ−ＯＨ）をアルキルハロゲン化物（Ａ）と反応させ、エーテル（Ｂ）を形成する。これらの化合物では、ｎは、１〜９の整数であり、Ｒ’は、直鎖または分岐鎖、飽和または不飽和のＣ１〜Ｃ２０アルキルもしくはヘテロアルキル基であってよい。Ｒ’は、また、Ｃ３〜Ｃ７飽和または不飽和の環式アルキルもしくは環式ヘテロアルキル、置換または未置換アリールもしくはヘテロアリール基、または置換または未置換アルカリル（アルキルは、Ｃ１〜Ｃ２０飽和または不飽和アルキル）もしくはヘテロアルカリル基であってよい。典型的には、ＰＥＧ−ＯＨは、８００〜４０，０００ダルトン（Ｄａ）の分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）である。
【０６６３】
実施例２３
ｍＰＥＧ−ＯＨ＋Ｂｒ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ→ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ
【０６６４】
分子量２０，０００Ｄａ（ｍＰＥＧ−ＯＨ  ２０ｋＤａ；２．０ｇ、０．１ｍｍｏｌ、Ｓｕｎｂｉｏ）のｍＰＥＧ−ＯＨを、ＴＨＦ（３５ｍＬ）中で、ＮａＨ（１２ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）で処理した。キシレン（０．５６ｍＬ、５ｍｍｏｌ、５０当量、Ａｌｄｒｉｃｈ）中の８０％重量溶液として溶解した臭化プロパルギル溶液、および触媒量のＫＩをその溶液に添加し、得られた混合物を２時間加熱還流した。水（１ｍＬ）を添加し、溶媒を真空下除去した。残渣にＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）を添加し、有機層を分離させ、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、容量を約２ｍＬに縮減した。このＣＨ２Ｃｌ２溶液をジエチルエーテル（１５０ｍＬ）に滴下した。得られた沈殿物を集め、冷ジエチルエーテルで数回洗浄し、乾燥して、プロパルギル−Ｏ−ＰＥＧを得た。
【０６６５】
実施例２４
ｍＰＥＧ−ＯＨ＋Ｂｒ−（ＣＨ２）３−Ｃ≡ＣＨ→ｍＰＥＧ−Ｏ−（ＣＨ２）３−Ｃ≡ＣＨ
【０６６６】
分子量２０，０００Ｄａ（ｍＰＥＧ−ＯＨ  ２０ｋＤａ；２．０ｇ、０．１ｍｍｏｌ、Ｓｕｎｂｉｏ）のｍＰＥＧ−ＯＨを、ＴＨＦ（３５ｍＬ）中で、ＮａＨ（１２ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）で処理した。５０当量の５−ブロモ−１−ペンチン（０．５３ｍＬ、５ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）および触媒量のＫＩをその混合物に添加した。得られた混合物を１６時間加熱還流した。水（１ｍＬ）を添加し、溶媒を真空下除去した。残渣にＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）を添加し、有機層を分離させ、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、容量を約２ｍＬに縮減した。このＣＨ２Ｃｌ２溶液をジエチルエーテル（１５０ｍＬ）に滴下した。得られた沈殿物を集め、冷ジエチルエーテルで数回洗浄し、乾燥して、対応するアルキンを得た。５−クロロ−１−ペンチンも類似の反応で使用できる。
【０６６７】
実施例２５
（１）  ｍ−ＨＯＣＨ２Ｃ６Ｈ４ＯＨ＋ＮａＯＨ＋Ｂｒ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ→ｍ−ＨＯＣＨ２Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ
（２）  ｍ−ＨＯＣＨ２Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ＋ＭｓＣｌ＋Ｎ（Ｅｔ）３→ｍ−ＭｓＯＣＨ２Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ
（３）  ｍ−ＭｓＯＣＨ２Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ＋ＬｉＢｒ→ｍ−Ｂｒ−ＣＨ２Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ
（４）  ｍＰＥＧ−ＯＨ＋ｍ−Ｂｒ−ＣＨ２Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ→ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ
【０６６８】
３−ヒドロキシベンジルアルコール（２．４ｇ、２０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５０ｍＬ）および水（２．５ｍＬ）中溶液に、最初に、粉末水酸化ナトリウム（１．５ｇ、３７．５ｍｍｏｌ）を加え、次に、キシレン（３．３６ｍＬ、３０ｍｍｏｌ）中の８０％重量溶液として溶解した臭化プロパルギル溶液を加えた。反応混合物を６時間加熱還流した。この混合物に、１０％クエン酸（２．５ｍＬ）を加え、真空下で溶媒を除去した。残渣を酢酸エチル（３ｘ１５ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層を飽和ＮａＣｌ溶液（１０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥後、濃縮して３−プロパルギルオキシベンジルアルコールを得た。
【０６６９】
塩化メタンスルホニル（２．５ｇ、１５．７ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（２．８ｍＬ、２０ｍｍｏｌ）を、化合物３（２．０ｇ、１１．０ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２中溶液に０℃で添加し、反応物を冷蔵庫中に１６時間置いた。通常の後処理後、メシラートを淡黄色オイルとして得た。このオイル（２．４ｇ、９．２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２０ｍＬ）に溶解し、ＬｉＢｒ（２．０ｇ、２３．０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１時間加熱還流した後、室温に冷却した。この混合物に、水（２．５ｍＬ）を添加し、真空下、溶媒を除去した。残渣を酢酸エチル（３ｘ１５ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層を飽和ＮａＣ１溶液（１０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥後、濃縮して、所望の臭化物を得た。
【０６７０】
２０ｋＤａのｍＰＥＧ−ＯＨ（１．０ｇ、０．０５ｍｍｏｌ、Ｓｕｎｂｉｏ）をＴＨＦ（２０ｍＬ）に溶解し、この溶液を氷浴中で冷却した。ＮａＨ（６ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を激しく攪拌しながら数分かけて添加し、続いて、上記で得た臭化物（２．５５ｇ、１１．４ｍｍｏｌ）および触媒量のＫＩを加えた。冷却浴を取り除き、得られた混合物を１２時間加熱還流し、水（１．０ｍＬ）を混合物に加えて、溶媒を真空下除去した。残渣にＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）を加え、有機層を分離させ、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥して、容量を約２ｍＬに縮減した。これをエーテル溶液（１５０ｍＬ）に滴下して、白色沈殿が生成し、これを集めＰＥＧ誘導体を得た。
【０６７１】
実施例２６
ｍＰＥＧ−ＮＨ２＋Ｘ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ≡ＣＲ’→ｍＰＥＧ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ≡ＣＲ’
【０６７２】
末端アルキン含有ポリ（エチレングリコール）ポリマーも、また、上記のように、末端官能基含有ポリ（エチレングリコール）ポリマーを、アルキン官能性を有する反応性分子に結合させることにより得ることができる。ｎは、１〜１０である。Ｒ’は、ＨまたはＣ１〜Ｃ４の低分子アルキル基であってよい。
【０６７３】
実施例２７
（１）ＨＯ２Ｃ−（ＣＨ２）２−Ｃ≡ＣＨ＋ＮＨＳ＋ＤＣＣ→ＮＨＳ（Ｏ）−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）２−Ｃ≡ＣＨ
（２）ｍＰＥＧ−ＮＨ２＋ＮＨＳ（Ｏ）−Ｃ（Ｏ）−｛ＣＨ２）２−Ｃ≡ＣＨ→ｍＰＥＧ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）２−Ｃ≡ＣＨ
【０６７４】
４−ペンチン酸（２．９４３ｇ、３．０ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）に溶解した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（３．８０ｇ、３．３ｍｍｏｌ）およびＤＣＣ（４．６６ｇ、３．０ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を室温で一晩攪拌した。得られた粗製ＮＨＳエステル７を、さらなる精製をせずに、以下の反応で使用した。
【０６７５】
分子量５，０００Ｄａ（ｍＰＥＧ−ＮＨ２、１ｇ、Ｓｕｎｂｉｏ）のｍＰＥＧ−ＮＨ２をＴＨＦ（５０ｍＬ）に溶解し、混合物を４℃に冷却した。ＮＨＳエステル７（４００ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）を、激しく攪拌を加えながら、何回かに分けて添加した。室温に暖める間、混合物を３時間攪拌し続けた。その後、水（２ｍＬ）を添加し、溶媒を真空下除去した。残渣にＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）を加え、有機を分離させ、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥して、容量を約２ｍＬに縮減した。このＣＨ２Ｃｌ２溶液をエーテル（１５０ｍＬ）に滴下した。得られた沈殿を集め真空乾燥した。
【０６７６】
実施例２８
この実施例は、ポリ（エチレングリコール）のメタンスルホニルエステル（ポリ（エチレングリコール）のメタンスルホナートまたはメシラートとの呼ばれる）の調製の典型例である。対応するトシラートおよびハロゲン化物も類似の方法で調製できる。
ｍＰＥＧ−ＯＨ＋ＣＨ３ＳＯ２Ｃｌ＋Ｎ（Ｅｔ）３→ｍＰＥＧ−Ｏ−ＳＯ２ＣＨ３→ｍＰＥＧ−Ｎ３
【０６７７】
１５０ｍＬのトルエン中のｍＰＥＧ−ＯＨ（ＭＷ＝３，４００、２５ｇ、１０ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下で２時間共沸蒸留し、溶液を室温に冷却した。４０ｍＬの無水ＣＨ２Ｃｌ２および２．１ｍＬの無水トリエチルアミン（１５ｍｍｏｌ）をその溶液に添加した。溶液を氷浴中で冷却し、１．２ｍＬの蒸留塩化メタンスルホニル（１５ｍｍｏｌ）を滴下した。溶液を窒素雰囲気下、室温で一晩攪拌し、２ｍＬの無水エタノールを加えて反応を停止させた。混合物を真空下で留去して、主に、トルエン以外の溶剤を除去し、濾過して、再度真空下濃縮した後、１００ｍＬのジエチルエーテル中で沈殿させた。濾液を冷ジエチルエーテルで数回洗浄し、真空乾燥してメシラートを得た。
【０６７８】
メシラート（２０ｇ、８ｍｍｏｌ）を７５ｍｌのＴＨＦに溶解し、溶液を４℃に冷却した。この冷却溶液に、ナトリウムアジド（１．５６ｇ、２４ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を窒素雰囲気下で２時間加熱還流した。溶剤を留去し、残渣をＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）で希釈した。有機画分をＮａＣｌ溶液で洗浄し、無水ＭｇＳＯ４上で乾燥した。容量を２０ｍｌに縮減し、１５０ｍｌの冷無水エーテルを加えて、生成物を沈殿させた。
【０６７９】
実施例２９
（１）Ｎ３−Ｃ６Ｈ４−ＣＯ２Ｈ→Ｎ３−Ｃ６Ｈ４ＣＨ２ＯＨ
（２）Ｎ３−Ｃ６Ｈ４ＣＨ２ＯＨ→Ｂｒ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−Ｎ３
（３）ｍＰＥＧ−ＯＨ＋Ｂｒ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−Ｎ３→ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−Ｎ３
【０６８０】
４−アジドベンジルアルコールは、米国特許第５，９９８，５９５号（参照によって本明細書に組み込まれる）に記載の方法を使って産生出来る。塩化メタンスルホニル（２．５ｇ、１５．７ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（２．８ｍＬ、２０ｍｍｏｌ）を、４−アジドベンジルアルコール（１．７５ｇ、１１．０ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２中溶液に０℃で添加し、反応物を冷蔵庫中に１６時間置いた。通常の後処理後、メシラートを淡黄色オイルとして得た。このオイル（９．２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２０ｍＬ）に溶解し、ＬｉＢｒ（２．０ｇ、２３．０ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を１時間加熱還流し、室温に冷却した。この混合物に、水（２．５ｍＬ）を加え、溶媒を真空下除去した。残渣を酢酸エチル（３ｘ１５ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層を飽和ＮａＣｌ溶液（１０ｍＬ）で洗浄後、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濃縮して、所望の臭化物を得た。
【０６８１】
２０ｋＤａのｍＰＥＧ−ＯＨ（２．０ｇ、０．１ｍｍｏｌ、Ｓｕｎｂｉｏ）をＴＨＦ（３５ｍＬ）中のＮａＨ（１２ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）で処理し、触媒量のＫＩと一緒に臭化物（３．３２ｇ、１５ｍｍｏｌ）をその混合物に添加した。得られた混合物を１２時間加熱還流した。水（１．０ｍＬ）を混合物に加え、溶媒を真空下で除去した。残渣にＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）を加え、有機層を分離させ、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥後、容量を約２ｍＬに縮減した。エーテル溶液（１５０ｍＬ）への滴下により、沈殿を生じさせ、これを集めてｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−Ｎ３を得た。
【０６８２】
実施例３０
ＮＨ２−ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈ＋Ｎ３−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２−ＮＨＳ→Ｎ３−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈ
【０６８３】
ＮＨ２−ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈ（ＭＷ３，４００Ｄａ、２．０ｇ）をＮａＨＣＯ３飽和水性溶液（１０ｍＬ）に溶解し、溶液を０℃に冷却した。３−アジド−１−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドプロピオナート（５当量）を激しく攪拌しながら添加した。３時間後、２０ｍＬのＨ２Ｏを加え、混合物を室温でさらに４５分攪拌した。ｐＨを０．５Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を使って３に調節し、ＮａＣｌを約１５ｗｔ％の濃度まで加えた。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬｘ３）で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥して濃縮した。冷ジエチルエーテルで析出させた後、生成物を濾過により集め、真空乾燥してω−カルボキシアジドＰＥＧ誘導体を得た。
【０６８４】
実施例３１
ｍＰＥＧ−ＯＭｓ＋ＨＣ≡ＣＬｉ→ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ≡Ｃ−Ｈ
【０６８５】
当技術分野で知られているように調製し、ＴＨＦ中で−７８℃冷却したリチウムアセチリド（４当量）の溶液に、ＴＨＦに溶解したｍＰＥＧ−ＯＭｓ溶液を激しく攪拌しながら滴下した。３時間後、反応物を室温まで暖め、１ｍＬのブタノールを添加して反応停止させた。２０ｍＬのＨ２Ｏを加え、混合物を室温でさらに４５分攪拌した。ｐＨを０．５Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を使って３に調節し、ＮａＣｌを約１５ｗｔ％の濃度まで加えた。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬｘ３）で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥後、濃縮した。冷ジエチルエーテルで析出させた後、生成物を濾過により集め、真空乾燥して１−（ブタ−３−イニルオキシ）−メトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）を得た。
【０６８６】
実施例３２
アジドおよびアセチレン含有アミノ酸は、Ｌ．Ｗａｎｇ、ｅｔ  ａｌ．、（２００１）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：４９８−５００、Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１：９６４−７（２００３））、Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、（２００２）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １２４：９０２６−９０２７；Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ、＆  Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ、（２００２）、Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏ  Ｃｈｅｍ  ３（１１）：１１３５−１１３７；Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ、ｅｔ  ａｌ．、（２００２）、ＰＮＡＳ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９９：１１０２０−１１０２４：および、Ｌ．Ｗａｎｇ、＆  Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ、（２００２）、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．、１：１−１１、に記載の方法を使って、部位選択的にタンパク質中に組み込むことができる。アミノ酸が組み込まれるとすぐに、ｐＨ８のリン酸塩緩衝液（ＰＢ）中の０．０１ｍＭタンパク質を使って、２ｍＭのＰＥＧ誘導体、１ｍＭのＣｕＳＯ４、および約１ｍｇのＣｕワイヤーの存在下、３７℃で４時間、付加環化反応が行われる。
【０６８７】
実施例３３
この実施例は、ｐ−アセチル−Ｄ、Ｌ−フェニルアラニン（ｐＡＦ）およびｍ−ＰＥＧ−ヒドロキシルアミン誘導体の合成に関し記載する。
【０６８８】
ラセミｐＡＦは、Ｚｈａｎｇ、Ｚ．、Ｓｍｉｔｈ、Ｂ．Ａ．Ｃ．、Ｗａｎｇ、Ｌ．、Ｂｒｏｃｋ、Ａ．、Ｃｈｏ、Ｃ．＆  Ｓｃｈｕｌｔｚ、Ｐ．Ｇ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、（２００３）４２、６７３５−６７４６、に以前に記載された方法を使って合成される。
【０６８９】
ｍ−ＰＥＧ−ヒドロキシルアミン誘導体を合成するために、以下の方法が完成されている。（Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−アミノオキシ）酢酸（０．３８２ｇ、２．０ｍｍｏｌ）および１、３−ジイソプロピルカルボジイミド（０．１６ｍＬ、１．０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（ＤＣＭ、７０ｍＬ）中溶液（室温（ＲＴ）で１時間攪拌されている）に、メトキシ−ポリエチレングリコールアミン（ｍ−ＰＥＧ−ＮＨ２、７．５ｇ、０．２５ｍｍｏｌ、Ｍｔ．３０Ｋ、ＢｉｏＶｅｃｔｒａより入手）およびジイソプロピルエチルアミン（０．１ｍＬ、０．５ｍｍｏｌ）を加える。反応物をＲＴで４８時間攪拌後、約１００ｍＬに濃縮する。混合物を冷エーテル（８００ｍＬ）に滴下する。ｔ−Ｂｏｃ保護生成物析出し、濾過により集めて、エーテル３ｘｌ００ｍＬで洗浄する。ＤＣＭ（１００ｍＬ）に再溶解し、エーテル（８００ｍＬ）中で２回析出させて、これをさらに精製する。生成物を真空乾燥し、７．２ｇ（９６％）を得て、ＮＭＲおよびニンヒドリン試験で確認する。
【０６９０】
上記で得られた保護生成物（７．０ｇ）の脱Ｂｏｃを、５０％ＴＦＡ／ＤＣＭ（４０ｍＬ）中、０℃で１時間、その後、ＲＴで、１．５時間、行う。真空下でほとんどのＴＦＡを除去後、ジオキサン（１ｍＬ）中の４Ｎ  ＨＣｌを残渣に添加することにより、ヒドロキシルアミン誘導体のＴＦＡ塩をＨＣｌ塩に変換する。沈殿物をＤＣＭ（５０ｍＬ）の溶解し、エーテル（８００ｍＬ）中で再析出させる。最終生成物（６．８ｇ、９７％）を濾過して集め、エーテル３ｘｌ００ｍＬで洗浄し、真空乾燥して、窒素下で貯蔵する。他のＰＥＧ（５Ｋ、２０Ｋ）ヒドロキシルアミン誘導体も、同じ方法を使って合成される。
【０６９１】
実施例３４
ペグ化レラキシンのインビボ調査
ＰＥＧ−レラキシン、非改変レラキシンおよび緩衝液をマウスまたはラットに投与する。結果は、非改変レラキシンに比べて、本発明のペグ化レラキシンの優れた活性および延長された半減期が示されることになると思われる。同様に、改変レラキシン、非改変レラキシン、および緩衝液をマウスまたはラットに投与する。
【０６９２】
薬物動態解析
本発明レラキシンポリペプチドは、静脈内または皮下経路でマウスに投与される。動物は、投薬前および投薬後の種々の時点で採血される。血漿は、各試料から集められ、ラジオイムノアッセイで分析される。排出半減期は、計算でき、本発明の天然ではコードされないアミノ酸を含むレラキシンポリペプチドおよび野性型レラキシンまたは種々のレラキシン類似体ポリペプチドの間で比較できる。同様に、本発明のレラキシンポリペプチドは、カニクイザルにも投与できる。動物は、投薬前および投薬後の種々の時点で採血される。血漿は、各試料から集められ、ラジオイムノアッセイで分析される。
【０６９３】
ポリペプチドは、複数の用量、連続注入、または単一用量、等によりマウスに投与できる。
【０６９４】
実施例３５
レラキシンは、Ｎｏｖａｇｅｎ発現システム（誘導可能Ｔ７プロモーター；ｐＥＴ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｍａｎｕａｌ、ｖｅｒｓｉｏｎ９、に詳細に記載されている。このマニュアルは、参照によって組み込まれる）、発現ベクターｐＥＴ３０ａおよび発現株ＢＬ２１（ＤＥ３）を使って発現される。
【０６９５】
２ｍＬのＬＢ／カナマイシン（１０μｇ／ｍｌ）培養液は、所望の類似体で形質転換されたＢＬ２１（ＤＥ３）プレートからのスイープにより播種される。これにより、コロニー間の発現レベルの変動を引き起こす効果が低減される。この培養液は、３７℃で激しく振盪を加えながら一晩増殖され、翌日、１０ｍｌのＬＢ／カナマイシン培養液は、一晩培養液（ＯＤ６００：約０．４〜０．５）由来の１ｍｌを播種される。一晩培養液の残りのｍＬは、グリセリンストックとして凍結してもよい。
【０６９６】
増殖培養液の１０ｍＬを３７℃にして、ＯＤ６００が０．８〜０．９に達するまで２５０ｒｐｍで３０〜４５分間振盪を加える。これを、次に、１ｍＭのＩＰＴＧで誘導し（１ｍＬを非誘導培養液対照として取っておいてもよい）、通常、誘導後３〜４時間で採取してＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。
【０６９７】
発現の経時変化（例えば、誘導後１、２、４、６時間の時点およびＯ／Ｎ）を取って、蓄積、タンパク質安定性、等の速度を測定することも可能である。
【０６９８】
ゲル分析：誘導後の所望の時点で、培養液から１ｍＬを採取し、細胞を遠心沈降させ、２Ｘ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥの１００μｌに再懸濁し、超音波処理して粘度を下げ、１０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供する。必要に応じ、非誘導対照または対照、および／または既知の陽性対照または標準と比較することができ、発現レベルを推定することができる（例えば、良好発現は、＞１００μｇ／ｍｌであろう）。ウェスタンブロット分析もまた使用できる。４ｍｌの培養液を残しておくこと、封入体を調製すること（不溶性の類似体を発現させる場合は）、および高発現タンパク質の同一性を確認するためにこれらの質量分析を行うことも、また、可能である。
【０６９９】
より大規模のタンパク質発現に対しては、＞２５０ｍＬのＬＢ／カナマイシン（１０μｇ／ｍｌ）に２５０μＬの凍結グリセリンストックを播種し、一晩増殖させる。次の日、１０Ｘ  １Ｌ  ＬＢ／カナマイシン培養液に、一晩培養液由来の２５ｍＬを播種する（ＯＤ６００：約０．１）。
【０７００】
１Ｌの培養液を３７℃、２５０ｒｐｍでＯＤ６００が０．８〜０．９に達するまで約２時間増殖させる。次に、１ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、誘導後４時間で、または翌朝採取する（採取には、４，０００ｒｐｍで１５分の遠心分離を使ってもよい）。エンドトキシンを減らし精製を促進することを望む場合は、ペレットを５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０（容器をすすぐには、ペレット当たり５０ｍｌ＋５０ｍｌ）ですすぐ。ペレットを一緒にプールし、再度遠心分離を行う。
【０７０１】
実施例３６
ピキア発現試験−ＤＮＡ調製、電気穿孔、発現プロトコル
この実施例は、本発明のレラキシンポリペプチドをピキア中で調製するプロトコルを提供する。配列番号３４、３５、３６、および３７が使用され、ピキア中へのクローニングのためにプラスミドが使用でき、このまたは他の改変プラスミド（改変は、当技術分野で既知の方法を使ってプラスミドに加えられる）を使って、ピキア中でレラキシンポリペプチドのタンパク質発現を得ることができる。
【０７０２】
プロトコルのｄａｙ１に、典型的には、消化されるμｇ  ＤＮＡ当たり、２Ｕの酵素を使った一晩の消化があり、また、５０ｍＬフラスコ中の１０ｍＬ  ＹＰｈｙＤ培養液中で、３０℃、２６０ｒｐｍで振盪しながらグリセリンストックを一晩播種する。
【０７０３】
ＤＮＡ調製
最初、１／１０容量の無菌の３Ｍ  ＮａＯＡｃ、次に、０．７容量の無菌のＩＰＡを加えてＤＮＡを析出させ、試料を激しく混合し、−２０℃または−７０℃で凍結まで一晩析出を続ける。その後、ＤＮＡを遠心分離（卓上遠心機、１４，０００ｒｐｍ／１０分）によりペレット化し、上清を取り除き、ペレットを５００μＬの無菌の７０％ＥＴＯＨで洗浄する。遠心分離（卓上遠心機、１４，０００ｒｐｍ／１０分）を行い、上清をデカント後、ペレットを１５〜２０分間空気乾燥する。ＤＮＡペレットを無菌の水で１μｇ／μｌの濃度に再懸濁し、ピキアを１０μｇＤＮＡで形質転換する。
【０７０４】
電気穿孔
ＯＤ６００の一晩培養液をＹＰｈｙＤでＯＤ６００＝０．２に希釈する。ＯＤ６００が０．８〜１．０になるまで、２６０ｒｐｍ、３０℃で培養液を振盪する。遠心分離（４０００ｒｐｍ／５分）により細胞を集める。培地をデカントし、２０ｍＬの氷冷無菌水で細胞を洗浄し、再度デカントし、繰り返す。水洗後、２０ｍＬの氷冷無菌１Ｍソルビトールでペレットを洗浄し、デカント後、洗浄細胞ペレットを６００μＬの１Ｍ冷ソルビトールに再懸濁し、その後これを氷上で貯蔵してもよい。
【０７０５】
無菌の１．５ｍＬエッペンドルフチューブ中で洗浄細胞からの５０μＬを１０μｇの直鎖状ＤＮＡと混ぜ、ゆっくり混合し、氷上で２５分間インキュベートする。長いピペットチップを使って、細胞／ＤＮＡ混合物を予め冷やした０．２ｃｍキュベットに移す。次の設定のＢｉｏＲａｄ  ＧｅｎｅＰｕｌｓａｒ  ＩＩ装置を使って細胞を電気穿孔する：２０００Ｖ、２００オーム、２５μＦｄ（単一パルスを使用）。その後、直ちに、０．５ｍＬのＹＰｈｙＤ培地をキュベットに加え、ピペット操作により混合する。全含有物を無菌の丸底チューブに移し、３０℃で３０分間ゆっくり（２００ｒｐｍ）振盪する。播種して、細胞を均等に広げ、プレートを反転させながら３０℃で３日間インキュベートする。
【０７０６】
インキュベーションの３日後、ループを使ってコロニーを採取し、５０ｍｌフラスコ中の１０ｍｌのＢＹＰｈｙＤ培地に播種し、３０℃で３日間インキュベートする。２０μｌプレート上のコロニーを数え、平均数を記録し、その後、株名およびクローン番号、レラキシン（すなわち、発現タンパク質）、ならびに日付の標識を付けた２セットのクライオバイアルを最初に用意して、細胞を採取する。培養液を１５ｍｌコニカルチューブに移し、各培養液のＯＤ６００を測定し、培養液をＹＰｈｙＤ培地で１：５０または１：２０に希釈する。培養液の一定分量をグリセリンストック用に保存する。その後、酵母をＲＴ、４０００ｒｐｍで５分間ペレット化し、上清を新しく標識した１５ｍＬコニカルチューブに移し、分析データ採取用に必要となるまで、−２０または−８０℃で貯蔵する。
【０７０７】
タンパク質発現解析
試料を４〜１２％ＮｕＰＡＧＥＴＢゲル（Ｎｏｖｅｘ）にかける。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試薬はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手、ウェスタンブロットまたは染色ゲル分析により解析。
培地の配合
Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｙｅａｓｔ  Ｐｈｙｔｏｎｅ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ（ＢＹＰｈｙＤ）
酵母エキス          １０ｇ／Ｌ
ファイトンペプトン      ２０ｇ／Ｌ
１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６）１００ｍｌ／Ｌ
１０Ｘ  ＹＮＢ          １００ｍＬ／Ｌ
２０％デキストロース              １００ｍＬ／Ｌ
Ｙｅａｓｔ  Ｐｈｙｔｏｎｅ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ（ＹＰｈｙＤ）
酵母エキス              １０ｇ／Ｌ
ファイトンペプトン          ２０ｇ／Ｌ
２０％デキストロース    １００ｍｌ／Ｌ
１０Ｘ  ＹＮＢ（１３．４％酵母ニトロゲンベース、硫酸アンモニウム含有、アミノ酸不含）
酵母ニトロゲンベース、    １３４ｇ／Ｌ
【０７０８】
実施例３７
レラキシンＡ２１Ｇ産生
この実施例では、４．０Ｌ培養液を発酵させて、１３．４ｇウエット細胞ペーストを産生し、トリトン−Ｘ１００含有および不含の場合について、封入体調製を行った。この方式で、２．０７ｇウエット封入体を産生し、その後、可溶化およびリフォールディングを行った。封入体を、３ｍＭの最終濃度に相当する、１ｇのウエット封入体（ＩＢ）当たり２００ｍＬのＨ２Ｏに再懸濁し、再懸濁液にシステインを加えた。次に、ｐＨを１１．５へ増加し、ＲＴで１時間かけてＩＢを可溶化した。その後、可溶化物のｐＨを１０．６±０．１に下げて、リフォールディングを起こさせ、２〜８℃で約７２時間貯蔵した。これらの結果を図１０に示す。最終ｐＨ３．０、０．４５μＭに達するまでＨＣｌを加えることにより、リフォールディング反応を停止させ、濾過後、さらに処理するまで、２〜８℃で貯蔵した。
【０７０９】
リフォールディングされたタンパク質を、トリス塩基を使ってリフォールディング停止後のｐＨを８．０に上げることにより精製し、Ｑ  ＨＰカラムに直接ロードした。この場合に示された装填物の伝導率は、＞３．５ｍＳ／ｃｍであった。操作条件は：（Ａ）２０ｍＭトリス、８．０；（Ｂ）２０ｍＭトリス、８．０；２００ｍＭ  ＮａＣｌ、を使い、３０ＣＶに対し０〜１００％Ｂ、とした。正確にリフォールディングされたプロインシュリンをプールし、７９ｍｇのプロインシュリンを回収した。
【０７１０】
限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）を行い、２５ｍＭの亜鉛を使って析出させ、析出したタンパク質に、２０ｍＭのＮａＯＡｃ、４．０を加えて２ｍｇ／ｍＬの濃度にし、これに、３０％ＡＣＮ、５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび２０Ｋ  ＰＥＧを加えて、最終の１０：１のタンパク質対ＰＥＧモル比率とし、２８℃で４８〜７２時間インキュベートした。
【０７１１】
ＰＥＧ反応物を０．５Ｘ  ＰＥＧ緩衝液Ａで１：１０（０．２２μＭ）に希釈し、濾過後、ＳＰ６５０Ｓカラムに供した。操作条件は：（Ａ）１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、４．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ；（Ｂ）１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、４．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．４Ｍ  ＮａＣｌ；２０ＣＶに対し０〜５０％Ｂとし、ＰＥＧ試料は１０ｍＭクエン酸Ｎａ、６．５；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中で処方した。これは図１２に示す。
【０７１２】
これらの方法は、非天然アミノ酸を有し、精製およびペグ化変異体の最終タンパク質量が０．ｌ〜２２ｍｇの範囲の、種々のレラキシンポリペプチドを産生するのに使用された。ＡＣＮは、ＰＥＧ反応でＰＥＧ／タンパク質混合物の可溶化を助けることが明らかになり、また、ｐＩ（等電点）での亜鉛沈殿が、ＣＡＮの存在下の濃縮を促進した。
【０７１３】
実施例３８
天然ではコードされないアミノ酸を含むペグ化レラキシンの安全性および／または有効性のヒト臨床試験
【０７１４】
目的：皮下に投与した天然ではコードされないアミノ酸を含むペグ化組換えヒトレラキシンの安全性および薬物動態学を観察すること。
【０７１５】
患者：２０〜４０才、体重６０〜９０ｋｇの１８名の健康なボランティアを本試験に登録。被験者は、実験室での血液学または血清化学に関する臨床的に有意な異常な数値が無く、尿毒性検査、ＨＩＶ検査、およびＢ型肝炎表面抗原が陰性である。被験者は、次記のいずれかの証拠があってなならない：高血圧症；何らかの原発性血液疾患の病歴；顕著な肝臓、腎臓、心臓血管、消化管、尿生殖器、代謝、神経疾患の病歴；貧血または発作障害の病歴；細菌または哺乳類由来生成物、ＰＥＧ、または人血清アルブミンに対する既知の感受性；カフェイン含有飲料に対する習慣性および大量消費者；試験登録の３０日以内のいずれか他の臨床試験への参加または輸血または献血の実施；試験登録の３ヶ月以内にレラキシンを受けた；試験登録の７日以内に病気をした；および試験登録の１４日以内の試験前身体検査または臨床実験室評価で顕著な異常があった。全ての被験者は、安全性に関し評価可能であり、薬物動態解析用の全ての血液収集は、予定通り行われる。全ての試験は、倫理委員会承認および患者の同意を得て行った。
【０７１６】
試験デザイン：これは、健康な男性ボランティアによるフェーズＩ、単一施設、非盲検、無作為化、２期クロスオーバー試験である。１８人の被験者は、２つの治療順群（９人被験者／群）の１つに無作為に割り当てられる。レラキシンは、等用量の天然ではコードされないアミノ酸を含むペグ化レラキシンおよび選択された市販製品を使って、２つの別々の投薬期間にわたりボーラスｓ．ｃ．注射として大腿上方に投与される。市販製品の投与の用量と頻度は、パッケージラベルのインストラクションの通りである。市販製品を使った追加の投薬、投薬頻度、または要望による他のパラメータは、追加の被験者群を含めることにより、試験に追加できる。各投薬期間は、１４日間の休薬期間で分離されている。被験者は、それぞれ２つの投薬期間に対し、少なくとも投薬前の１２時間および投薬後の７２時間試験施設に拘束される。しかし、投薬期間の間は拘束されない。さらにペグ化レラキシンで試験されるべき追加の投薬、頻度、または他のパラメータがある場合は、追加の被験者群が加えられる。試験レラキシン製剤は、天然ではコードされないアミノ酸を含むペグ化レラキシンである。
【０７１７】
血液サンプリング：直接静脈穿刺によりレラキシン投与前後に連続的に血液が採取される。血清レラキシン濃度測定用の静脈血液サンプル（５ｍＬ）が、投薬の約３０、２０、および１０分前に（３ベースライン試料）、および投薬後の凡そ次の時間：３０分ならびに１、２、５、８、１２、１５、１８、２４、３０、３６、４８、６０および７２時間に採取される。各血清試料は、２つの分割量に分けられる。全ての血清試料は、−２０℃で貯蔵される。血清試料は、ドライアイスに乗せて輸送される。ｄａｙ１の最初の投与の直前に、ｄａｙ４の朝に、ｄａｙ１６の投与の直前に、およびｄａｙ１９の朝に、空腹時臨床実験室試験（血液学、血清化学、および尿検査）が行われる。
【０７１８】
生化学分析方法：血清レラキシン濃度の測定に、ＥＬＩＳＡキットが使われる。
【０７１９】
安全性測定：各投薬の直前（Ｄａｙ１および１６）、ならびに各投薬後６、２４、４８、および７２時間にバイタルサインが記録される。安全性測定は、有害事象の発生率と型および臨床実験室試験のベースラインからの変化に基づいている。さらに、血圧を含むバイタルサイン測定値の試験前からの変化、および身体検査結果が評価される。
【０７２０】
データ分析：投与後の血清濃度値は、それぞれの投与後の値から、投薬３０、２０、および１０分前に集めた３つの試料由来のレラキシンレベルの平均化から決めた平均ベースラインレラキシン濃度を差し引くことにより、投与前ベースラインレラキシン濃度に対し補正される。投与前の血清レラキシン濃度が、アッセイの定量化レベルより低い場合は、その濃度は、平均値の計算に含まれない。薬物動態学的パラメータは、ベースラインレラキシン濃度に対し補正された血清濃度データから決定される。薬物動態学的パラメータは、最新バージョンのＢＩＯＡＶＬソフトウェアを使って、Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＶＡＸ８６００コンピュータシステム上でのモデル非依存法により計算される。下記の薬物動態学パラメータを測定する：ピーク血清濃度（Ｃｍａｘ）；ピーク血清濃度までの時間（ｔｍａｘ）；線形台形則を使用して計算された時間０から最後の血液サンプリング時間までの濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ）：（ＡＵＣ０−７２）；および消失速度定数から計算された消失半減期（ｔ１／２）。消失速度定数は、ｌｏｇ−線形濃度−時間プロットの終末相線形領域における連続データ点の線形回帰により推定される。各治療に対し、薬物動態学的パラメータの平均、標準偏差（ＳＤ）、および変動係数（ＣＶ）が計算される。パラメータ平均の比率（保存製剤／非保存製剤）が計算される。
【０７２１】
安全性の結果：有害事象の発生率は、治療群全体に均等に分布している。ベースラインまたは試験前臨床的実験室試験もしくは血圧からの臨床的に有意な変化は無く、また、試験前の身体検査結果およびバイタルサイン測定値からの顕著な変化は無い。２つの治療群に対する安全性プロファイルは、類似であると考えるべきである。
【０７２２】
薬物動態学的結果：天然ではコードされないアミノ酸を含むペグ化レラキシンを受けた後の全ての１８人の被験者の各測定時点での平均血清レラキシン濃度−時間プロファイル（ベースラインレラキシンレベルに対し無補正）。全ての被験者は、正常な生理学的範囲内で、投与前ベースラインレラキシン濃度を有するはずである。薬物動態学的パラメータは、投与前平均ベースラインレラキシン濃度に対し補正された血清データから測定され、Ｃｍａｘおよびｔｍａｘが求められる。いずれの選択された臨床的比較器に対しても、平均ｔｍａｘは、天然ではコードされないアミノ酸を含むペグ化レラキシンのｔｍａｘよりも有意に短い。消失半減期の値は、天然ではコードされないアミノ酸を含むペグ化レラキシンの消失半減期と比較して、試験した前臨床の比較器に対して、有意に短い。
【０７２３】
本試験は、健康な男性被験者で行われているが、他の患者集団；例えば、糖尿病の男性もしくは女性患者、癌の男性もしくは女性患者または慢性腎不全、小児腎不全患者、自己術前貯血プログラムを実施中の患者、または待機手術の予定のある患者でも、類似の吸収特性および安全性プロファイルが予測されるであろう。
【０７２４】
結論として、天然ではコードされないアミノ酸を含むペグ化レラキシンの単回用量皮下投与は、健康な男性被験者に対し安全で、耐容性良好であると思われる。比較に基づく有害事象発生率、臨床的実験室の値、バイタルサイン、および身体検査結果に基づいて、市販の形態のレラキシンおよび天然ではコードされないアミノ酸を含むペグ化レラキシンの安全性プロファイルは、同等であると思われる。天然ではコードされないアミノ酸を含むペグ化レラキシンは、潜在的に大きな臨床的有用性を患者および医療提供者に提供する。
【０７２５】
実施例３９
レラキシンの機能アッセイ開発
この実施例は、レラキシンの機能アッセイの詳細を提供する。
ヒト末梢血単球、ＴＨＰ−１細胞を、陽性対照イソプロテレノールおよびフォルスコリンと一緒に使って、測定可能なｃＡＭＰ増加を立証した。ＴＨＰ−１細胞を、５００ｕＭＩＢＭＸ中で３０分間プレインキュベートし、２ｕＭフォルスコリンで２０分間ＲＬＸとの同時刺激を行った。イソプロテレノール、フォルスコリン、ならびに野性型Ａ（Ｂ鎖の第１アミノ酸位置にアラニンを有する）、および変異体ＲＬＸ−ＢＡ１−ＡＶ１３ｐＡＦ（Ｂ鎖の第１アミノ酸位置にアラニンの骨格アミノ酸配列を有し、Ａ鎖の位置１３（バリン）のｐＡＦ置換を有し、結合した４つの異なるサイズ；５Ｋ、１０Ｋ、２０Ｋ、および３０ＫのＰＥＧを有するレラキシン変異体）を含むレラキシンポリペプチドを用いた（表５）。
【表８】
0006054294.tif 000072
【０７２６】
実施例４０
この実施例は、ＳＤラットの単回皮下注射後の２０ｋＤａペグ化レラキシンポリペプチドの薬物動態学的特性を評価する。
【０７２７】
約７〜８週齢（試験開始時約２８０ｇ）のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＣＲＬ）から入手した。この動物は、ＣＲＬでの頸静脈カテーテル挿入を受けた。試験の前に動物を３日間順化した。
【０７２８】
動物は、ｄａｙ１に単回皮下注射を受け、その後の８０時間にわたりＰＫ試料が集められた。血清濃度分析用血液サンプルが、下記のサンプリングスケジュール（サンプリング時間は、おおよその時間である）に従って、ＰＥＧ−レラキシンで処理された動物から採取された：
【０７２９】
Ｄａｙ１：投与前、投与後１、２、４、８、１２、２５、３４、５０、５８、７３および８０時間目
【０７３０】
化合物濃度は、Ａｍｂｒｘで開発されたアッセイに基づく架橋ＥＣＬＡを使って測定された。濃度は、対応する投与化合物から生成される検量線を使って計算され、エクセルスプレッドシートフォーマットで報告された（付録参照）。薬物動態学的パラメータは、モデル化プログラムＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ、バージョン５．１）を使って推定された。個別動物データに対し、ｌｉｎｅａｒ−ｕｐ／ｌｏｇ−ｄｏｗｎ台形積分を含むノンコンパートメント解析を使用し、濃度データを均等重みとした。２−コンパートメント、一次消失モデルおよびＧａｕｓｓ−Ｎｅｗｔｏｎ（Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｈａｒｔｌｅｙ）モデル適合方程式を使って、コンパートメント解析を行った。表６は、時間に対する群平均ＰＥＧ−レラキシン血清濃度値を示す。図８は、投与した全ＰＥＧ−レラキシン化合物についての、時間に対する群平均血清濃度の比較である。全用量群は、測定可能なレベルの血清ＰＥＧ−レラキシンを有していた。
【０７３１】
０．５ｍｇ／ｋｇＰＥＧ２０Ｋ−ＡＱ１−ＲＬＸのＳＣ投与動物に対する個別血清濃度ＶＳ時間のプロットを図９に示す。０．５ｍｇ／ｋｇＰＥＧ２０Ｋ−ＡＡ５−ＲＬＸのＳＣ投与動物に対する個別血清濃度ＶＳ時間のプロットを図１０に示す。０．５ｍｇ／ｋｇＰＥＧ２０Ｋ−ＡＲ１８−ＲＬＸのＳＣ投与動物に対する個別血清濃度ＶＳ時間のプロットを図１１に示す。０．５ｍｇ／ｋｇＰＥＧ２０Ｋ−ＢＶ７−ＲＬＸのＳＣ投与動物に対する個別血清濃度ＶＳ時間のプロットを図１２に、０．５ｍｇ／ｋｇＰＥＧ２０Ｋ−ＢＷ２８−ＲＬＸのＳＣ投与動物に対する個別血清濃度ＶＳ時間のプロットを図１３に、０．５ｍｇ／ｋｇＰＥＧ２０Ｋ−ＡＶ１３のＳＣ投与動物に対する個別血清濃度ＶＳ時間のプロットを図１４に、それぞれ示す。
【０７３２】
皮下投与動物に対する血清濃度ＶＳ時間データのノンコンパートメント解析を表６にまとめる。
【表９−１】
0006054294.tif 000073
【表９−２】
0006054294.tif 000074
【表１０】
0006054294.tif 000075
濃度ＶＳ時間曲線をノンコンパートメント解析（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ、バージョン４．１）により評価した。群あたりのＮ＝５ラット；消失ＨＬ：消失半減期；Ｃｍａｘ：測定最大血清濃度；Ｔｍａｘ：Ｃｍａｘに達した時間；ＡＵＣｉｎｆ：無限大に外挿された全血清試料／時点に対する濃度−時間曲線下面積；Ｃｌ：見かけの合計血清クリアランス；Ｖｚ：終末相の間の見かけの分布量
血清濃度測定に使ったＥＣＬＩＡ法で投与溶液を測定した。投与溶液をアッセイの範囲に入るように希釈した。全ての２０ＫＰＥＧ−ＲＬＸ投与溶液が、指定の３０パーセントの理論値からのズレ（ＰＤＴ）内に入った。下表８に、本試験用投与溶液分析の結果をまとめる。
【表１１】
0006054294.tif 000076
【０７３３】
実施例４１
この実施例は、ＳＤラットの単回皮下注射後の野性型（ＷＴ）レラキシン化合物の薬物動態学的特性を評価する。
【０７３４】
約５週齢（試験開始時約２８０ｇ）のＳＤラットをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＣＲＬ）から入手した。この動物は、ＣＲＬでの頸静脈カテーテル挿入を受けた。試験の前に動物を３日間順化した。
【０７３５】
動物は、ｄａｙ１に単回皮下注射を受け、その後の１２時間にわたりＰＫ試料が集められた。血清濃度分析用血液サンプルが、下記のサンプリングスケジュール（サンプリング時間は、おおよその時間である）に従って、ＷＴ  ｒｈレラキシンで処理された動物から採取された：Ｄａｙ１：投与前、投与後０．３３、０．６６、１、１．５、２、３、４、５、６、９および１２時間目。
【０７３６】
化合物濃度は、Ａｍｂｒｘで開発されたアッセイに基づく架橋ＥＣＬＡを使って測定された。濃度は、対応する投与化合物から生成される検量線を使って計算され、エクセルスプレッドシートフォーマットで報告された（付録参照）。薬物動態学的パラメータは、モデル化プログラムＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ、バージョン５．１）を使って推定された。個別動物データに対し、ｌｉｎｅａｒ−ｕｐ／ｌｏｇ−ｄｏｗｎ台形積分を含むノンコンパートメント解析を使用し、濃度データを均等重みとした。
【０７３７】
表９は、時間に対する群平均ｗｔ  ｒｈレラキシン血清濃度値を示す。図１は、ｗｔ  ｒｈレラキシンに対する群平均血清濃度ＶＳ時間の関係を比較したものである。全動物は測定可能なレベルの血清レラキシンを有していた。
【０７３８】
０．５ｍｇ／ｋｇ  ｗｔレラキシンのＳＣ投与動物に対する個別血清濃度ＶＳ時間のプロットを図２に示す。皮下投与動物の血清濃度ＶＳ時間データのノンコンパートメント解析を表２にまとめる。表９は、投与溶液分析のまとめである。投与溶液は、３０％未満またはそれに等しいＰＤＴの許容基準を満たした。
【表１２】
0006054294.tif 000077
【表１３】
0006054294.tif 000078
濃度ＶＳ時間曲線をノンコンパートメント解析（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ、バージョン４．１）により評価した。群あたりのＮ＝５ラット；消失ＨＬ：消失半減期；Ｃｍａｘ：測定最大血清濃度；Ｔｍａｘ：Ｃｍａｘに達した時間；ＡＵＣｉｎｆ：無限大に外挿された全血清試料／時点に対する濃度−時間曲線下面積；Ｃｌ：見かけの合計血清クリアランス；Ｖｚ：終末相の間の見かけの分布量。括弧中の数字は、標準偏差を意味する。
表１１
血清濃度測定に使ったＥＣＬＡ法で投与溶液を測定した。投与溶液をアッセイの範囲に入るように希釈した。全てのｗｔ  ｒｈレラキシン投与溶液が、指定の３０パーセントの理論値からのズレ（ＰＤＴ）内に入った。下表３に、本試験用投与溶液分析の結果をまとめる。
【表１４】
0006054294.tif 000079
【０７３９】
実施例４２
この実施例は、ＳＤラットの単回皮下注射後の野性型２０ｋＤａペグ化レラキシン化合物の薬物動態学的特性を評価する。
【０７４０】
約７〜８週齢（試験開始時約２８０ｇ）のＳＤラットをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＣＲＬ）から入手した。この動物は、ＣＲＬでの頸静脈カテーテル挿入を受けた。試験の前に動物を３日間順化した。動物は、ｄａｙ１に単回皮下注射を受け、その後の８２時間にわたりＰＫ試料が集められた。血清濃度分析用血液サンプルが、下記のサンプリングスケジュール（サンプリング時間は、おおよその時間である）に従って、ＰＥＧ−レラキシンで処理された動物から採取された：Ｄａｙ１：投与前、投与後１、３、５、１０、２５、３４、４８、５８、７２および８２時間目。
【０７４１】
化合物濃度は、Ａｍｂｒｘで開発されたアッセイに基づく架橋ＥＣＬＡを使って測定された。濃度は、対応する投与化合物から生成される検量線を使って計算され、エクセルスプレッドシートフォーマットで報告された（付録参照）。薬物動態学的パラメータは、モデル化プログラムＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ、バージョン５．１）を使って推定された。個別動物データに対し、ｌｉｎｅａｒ−ｕｐ／ｌｏｇ−ｄｏｗｎ台形積分を含むノンコンパートメント解析を使用し、濃度データを均等重みとした。２−コンパートメント、一次消失モデルおよびＧａｕｓｓ−Ｎｅｗｔｏｎ（Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｈａｒｔｌｅｙ）モデル適合方程式を使って、コンパートメント解析を行った。
【０７４２】
表１２は、群平均ＰＥＧ−レラキシン血清濃度値ｖｓ時間の関係を示す。
【表１５−１】
0006054294.tif 000080
【表１５−２】
0006054294.tif 000081
【０７４３】
実施例４３
この実施例は、雌ロングエバンスラットにおける野性型レラキシンおよびＰＥＧ−レラキシン変異体の薬理学的活性用量および全身性暴露を評価する。
【０７４４】
これらのシグナル生成試験の目的は、インビボ活性を確立し、ＰＥＧ−レラキシン変異体の薬理学的に活性な用量を決定することであった。これらの目的を達成するために、生理学的に関連するレラキシン応答性評価項目を、雌ロングエバンスラットで評価した。この項目には、水摂取量、尿量、ならびに選んだ尿および血液臨床化学が含まれる。候補評価項目の特定を可能とするために、最初に（フェーズ１）、インビトロでの目標抑制の０．３Ｘ、１Ｘおよび１０Ｘの血漿中濃度を達成するために計算された容量で野性型レラキシンを試験した。目標用量は、ボーラス静脈内（ＩＶ）投与、続いて、６時間の連続注入により送達された。０．３Ｘ、１Ｘ、および１０Ｘの野性型レラキシン容量は、それぞれ、ビークルに比べて、９５％、６８％、および３２％の水摂取量の増加を誘導した。平均血漿ナトリウム濃度のベースラインから２および６時間の変化は、ビークル（０Ｘ）に対しては−９．５および１．２ｍＥｑ／Ｌ；０．３Ｘでは−５．８および−９．０ｍＥｑ／Ｌ；１Ｘでは１、０および−１．５ｍＥｑ／Ｌ；１０Ｘでは−４．７および−１．４ｍＥｑ／Ｌ、であった。ベースラインから２および６時間の血漿モル浸透圧濃度の変化は、ビークル（０Ｘ）に対しては−２０．７および１．０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ水；０．３Ｘでは−１１、０および−１９、１ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ水；１Ｘでは０．３および−４．４ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ水；１０Ｘでは−１０．３および−３．８ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ水、であった。
【０７４５】
ＰＥＧ−レラキシン（フェーズ２）を、１μＬ／ｇ体重のボーラス容量で投与し、血液を投与の２および６時間後に集め、また、尿を投与後６時間間隔で集めた。０．１Ｘ、０．３Ｘおよび１Ｘ用量でのＰＥＧ−レラキシン処理により、ビークル群に比べて、それぞれ、９３％、１２８％および１０５％の水摂取量の増加が生じた。ベースラインから２および６時間の平均血漿ナトリウム濃度の変化は、ビークル（０Ｘ）に対し２．５および１．５ｍＥｑ／Ｌ；０．１Ｘでは−１．５および−４．８ｍＥｑ／Ｌ；０．３Ｘでは−４．０および−２．９ｍＥｑ／Ｌ；１Ｘでは−２．３および−４．０ｍＥｑ／Ｌであった。ベースラインから２および６時間の血漿モル浸透圧濃度の変化は、ビークル（０Ｘ）に対しては４．５および２．１ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ水；０．１Ｘでは−５．１および−１１．０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ水；０．３Ｘでは−８．２および−５．０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ水；１Ｘでは−５．６および−９．５ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ水であった。野性型またはＰＥＧ−レラキシンによる処理後の尿臨床化学値明確な変化は無かった。これらのデータは、インビボ活性を立証し、また、その後のＰＥＧ−レラキシンを使ったインビボ疾患モデル試験に対する理論的な用量選択を可能とする。
【表１６】
0006054294.tif 000082
a群１および２（１ｘおよび１０ｘ）を最初に評価し、また、飲料水消費、ヘマトクリット、および尿量に与える被験物質関連効果が明らかなために、第２セットのラットに対する用量は、それぞれ、群３と４のビークルと０．３Ｘに修正された。群１と２の間には、少なくとも３６時間の休薬期間があった。また、群３と４の間には、少なくとも３６時間の休薬期間が生じた。
b群１のラットは、第２の無作為化を受け、休薬期間後、群２に割り当てられた。群３のラットは、第２の無作為化を受け、群４に割り当てられ、動物番号００１〜００４は、群１と３であったため、そのまま群２と４に残された；しかし、群番号命名の群２と群４は、チューブラベルと試料特定をわかりやすくするために、使用された。
c野性型レラキシンは、１００μＬのボーラス容量、続けて、５０μＬ／時間の注入速度で静脈内注入された。
【表１７】
0006054294.tif 000083
aボーラス用量は、１μＬ／ｇ体重の容量で投与された。
【０７４６】
フェーズ１野性型レラキシン
供給メーカーの手術により両側頸静脈カテーテルを留置された１２〜１４週齢の雌ロングエバンスラットをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。２セットの４匹のラットを使用した、各セットを、２種の用量の野性型レラキシンの評価に使用した。群１と３は、それぞれ、群２と４に再使用されたために、群１と２ならびに群３と４の間に３６時間以上の休薬期間を入れた。ラットは、食物および水を自由に利用できるようにし、投与の開始前夜、およびＩＶボーラス投与および注入投与の開始後６時間、Ｃｕｌｅｘ  ＡＢＳ代謝ケージングシステム（Ｃｕｌｅｘ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｓａｍｐｌｅｒ、Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｃ）に収容した。
【０７４７】
フェーズ１野性型レラキシン投与
フェーズ１では、各ラットは、１時間のＩＶボーラスおよび６時間のＩＶ注入を受けた。すなわち、外科的埋め込み頸静脈カテーテル経由のＩＶボーラス注射、続いて外科的埋め込み頸静脈カテーテル経由のＩＶ注入を受けた。第１セットの群１と２のラットおよび第２セットの群３と４のラットの間に、少なくとも３６時間が休薬期間として与えられた。
【０７４８】
フェーズ２ＰＥＧ−レラキシン
供給メーカーの手術により両側頸静脈カテーテルを留置された１２〜１４週齢の雌ロングエバンスラットをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。４セットの４匹のラットを使用し、各セットを、１種の用量のＰＥＧ−レラキシンの評価に使用した。ＰＥＧ−レラキシンを投与されたラットは、ペグ化化合物の長期の血漿暴露のために、休薬期間後、再使用しなかった。ラットは、食物および水を自由に利用できるようにし、Ｃｕｌｅｘ  ＡＢＳ代謝ケージに収容した。
【０７４９】
フェーズ２ＰＥＧ−レラキシン投与
フェーズ２では、ラットは、外科的埋め込み頸静脈カテーテル経由の１時間のＩＶ注射を受けた。
【０７５０】
全てのボーラスおよびＩＶ投与溶液は、以下の全投与量溶液用の解凍および混合インストラクションに従って処方された：
【０７５１】
各投与製剤用の凍結試料ボトルを、解凍プロセスに対する１時間毎の検査を入れながら、４℃で３〜４時間解凍する。解凍が完了するとすぐに、製剤を泡を生じさせないように注意し、ゆっくり反転させながら混合した。静脈内投与の直前に各製剤をゆっくり、かつ完全に混合するように注意した。各投与製剤を投与に使用するまで４℃に維持した。
【０７５２】
投与量を、調製の直前に準備し、各群は、下記の濃度の投与を受けた：
【表１８】
0006054294.tif 000084
【０７５３】
この試験で使用された動物は、体重測定値、頸静脈カテーテル開存性および機能性からの受容可能な所見に基づいて選択された。試験開始前にまたは投与開始後の血液収集期間の間に、投薬または血液収集に不適切なカテーテルであると特定された動物は、試験から
はずされ、適切なカテーテルのラットと入れ替えられた。カテーテル留置ラットと化合物投与の入れ替えは、投薬スケジュール、スタッフの都合、およびベンダーからのラットの受入を考慮して、可能な限り早期に行われる。
【０７５４】
フェーズ１：動物は、試験前体重に従って、無作為化され、群１に割り当てられる。投与の完了後、群１のラットは、休薬期間後、第２の無作為化を受け、群２に再割り当てされる。投与の完了後、群３のラットは、休薬期間後、第２の無作為化を受け、群４に再割り当てされる。
【０７５５】
フェーズ２：動物は、試験前体重に従って、無作為化され、群５〜８に割り当てられる。
【０７５６】
投与開始後、毎日、約３０分ならびに１、２、４、および６時間目。身体的および行動の変化の目視検査を行い、動物の身体姿勢、被毛、活性、排泄物、等の変化を調べた。投与前に、定期的に体重を測定し、記録した。
【０７５７】
血液および尿試料、収集、処理、および分析
フェーズ１試験プロトコル
ベースライン尿収集は、投与前夜に開始され、１５〜１８時間続けられ、冷却（ウエットアイス）バイアル中に集められた。ベースライン血液サンプル（約４００μＬ全血）は、ベースライン尿収集の最後に集められた。実験の当日に、ラットは、被験物質ＩＶボーラス注射に続けて、シリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ  １１  ｐｌｕｓ）で左頸静脈カテーテル経由、５０μＬ／時間の量の一定の注入速度で６時間連続注入により野性型レラキシン投与を受けた。レラキシン注入の２時間および６時間後、２つの追加の血液サンプル（各約４００μＬ全血）を集めた。全血液サンプルを、Ｃｕｌｅｘ  ＡＢＳプログラム化サンプリング法を使って、右頸静脈カテーテル経由でＫ３ＥＤＴＡ抗凝固剤含有試料チューブに集め、処理するときまで試料を冷蔵環境中に貯蔵した。レラキシン注入の持続期間中を通して、尿を冷却バイアル中に連続的に集めた。各収集からの合計尿容量を記録し、２〜５ｍＬの各尿試料を約−８０℃維持に設定されたＳｅｖｅｎｔｈ  Ｗａｖｅ  Ｌａｂｓフリーザー中に貯蔵した。ボトル＋水の注入前後の重量を比較することにより、６時間注入期間中の水摂取量を記録した。６時間の連続注入後、注入ポンプを停止し、第２の用量評価を受けさせる前に、少なくとも３６時間の休薬期間をラットに取らせた。
【０７５８】
連続ＩＶ注入は、目標の安定な血漿薬剤濃度を維持するために必要であった。
フェーズ２試験プロトコル
ベースライン尿収集は、投与前夜に開始され、１５〜１８時間続けられ、冷却バイアル中に集められた。ベースライン血液サンプル（約４００μＬ全血）は、ベースライン尿収集の最後に集められた。実験当日、ラットは、１０ｍＬ／ｋｇ／日（１回用量）を越えない量で、単回用量のＰＥＧ−レラキシンを静脈内に投与された。レラキシン注入の２時間および６時間後、２つの追加の血液サンプル（各約４００μＬ全血）を集めた。全血液サンプルを、Ｃｕｌｅｘ  ＡＢＳプログラム化サンプリング法を使って、右頸静脈カテーテル経由でＫ３ＥＤＴＡ抗凝固剤含有試料チューブに集め、処理するときまで試料を冷蔵環境中に貯蔵した。サンプリングの間、ＰＥＧ−レラキシン投与後０〜６時間目に、尿を冷却バイアル中に連続的に集めた。各収集からの合計尿容量を記録し、２〜５ｍＬの各尿試料を約−８０℃維持に設定されたＳｅｖｅｎｔｈ  Ｗａｖｅ  Ｌａｂｓフリーザー中に貯蔵した。投与６時間後、鼠を死亡させた。薬剤注入期間の最初と最後のボトル＋水の重量を比較することにより、６時間注入期間中の水摂取量を記録した。
【０７５９】
病理学
本実施例で既に記載のように、尿試料を集めた。２〜５ｍＬの冷却尿試料をドライアリス上で凍結し、クレアチニンクリアランス測定用の尿クレアチニンおよびＢＵＮの分析のためにドライアイス上に置いてＡＶＬに輸送するまで、約−８０℃で維持するように設定されたフリーザー中に貯蔵した。
【０７６０】
血液サンプルを、抗凝固剤をしてＫ３ＥＤＴＡを使ったＣｕｌｅｘ  ＡＢＳを使って集めた。１５μＬの全血サンプルを未処理毛細管に入れ、一端を粘土でシールし、ヘマトクリット遠心機（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ＩＥＣ  ＭＢ遠心機）で５分間、遠心分離した。製造メーカーから提供されたマイクロヘマトクリット読み取り装置を使って、ヘマトクリット結果を得た。
【０７６１】
収集スケジュールおよび下記に挙げた手続きに従って、野性型およびＰＥＧ−レラキシンの全身性暴露測定ができるように血液を集めた。３つの収集間隔があった。収集時点は、フェーズ１およびフェーズ２に対し、投与後０、２、および６時間とした。フェーズ１：各時点当たり８動物。フェーズ２：各時点当たり１６動物。収集容量は、約４００μＬの全血。群１〜８の全動物は、３つの時点で採血した：野性型レラキシンＩＶ投与およびＰＥＧ−レラキシン投与群のＩＶ投与後に対し、それぞれ、ベースライン（投与前ｔ＝Ｏ）ならびに注入開始後２時間および６時間。ＩＶ注入投与の開始時間および実際の各採血の時間を各動物の生データに記録した。スポンサーの判断により、試験実施の間、全身性暴露測定用としてＡｍｂｒｘに血液を送らなかった。試料を約−８０℃維持に設定のＳｅｖｅｎｔｈ  Ｗａｖｅ  Ｌａｂｓフリーザー中で冷凍保存し、スポンサーに返却する予定である。
【０７６２】
フェーズ１野生型レラキシンの結果
ビークル（０Ｘ）処理ラットの６時間注入の間の平均水摂取量は、１．８ｍＬ／１００ｇ体重であり、０．３Ｘ、１Ｘおよび１０Ｘ野性型レラキシン処理ラットで、それぞれ、３．６、３．１、および２．４ｍＬ／１００ｇ体重に増加した。これらは、０．３Ｘ、１Ｘおよび１０Ｘ投与群で、ビークルに対し、それぞれ、９５％、６８％、３２％の増加である。
【０７６３】
ベースライン、投与開始後２および６時間の平均ヘマトクリットは、ビークル処理ラットで、それぞれ、３５．１％、３５．０％、および３４．３％；０．３Ｘ群では３３．１％、３３．７％、および３２．３％；１Ｘ群では３１．４Ｔ、３２．０％および３３．７％；１０Ｘ群では２９．７％、３１．９％および３０．４％であった。
【０７６４】
６時間注入の間の０．３Ｘ、１Ｘおよび１０Ｘ群の平均尿量は、ビークル（０Ｘ）処理に対して、それぞれ、１．８、１．５、１．２および１．２ｍＬ／１００ｇ体重であった。
【０７６５】
ベースライン、投与開始後２および６時間の平均血漿ナトリウム濃度は、ビークル（０Ｘ）群では１３９．３、１２９．８、１４０．５ｍＥｑ／Ｌ；０．３Ｘ群では１４１．８、１３６．０および１３２．８ｍＥｑ／Ｌ；１Ｘ群では１３８．８、１３９．８および１３７．３ｍＥｑ／Ｌ；１０Ｘ群では１３７．０、１３２．３および１３５．６ｍＥｑ／Ｌであった。２および６時間でのベースラインからの変化は、ビークル（０Ｘ）群に対し−９．５および１．２ｍＥｑ／Ｌ；０．３Ｘに対し−５．８および−９．５ｍＥｑ／Ｌ；１Ｘに対し１．０および−１．５ｍＥｑ／Ｌ；１０Ｘに対し−４．７および−１．４ｍＥｑ／Ｌであった。
【０７６６】
血漿モル浸透圧濃度は、下記式を使って計算した：モル浸透圧濃度（ＯＳＭ）＝（２＊ｎａ）＋（Ｇｌｕ／１８）＋（ＢＵＮ／２．８）。ベースライン、開始後２および６時間の平均血漿モル浸透圧濃度は、０．３Ｘ群では２７７．３ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ水；１Ｘ群では２９１．０、２９１．３および２８６．６ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ水；１０Ｘ群では２８６．４、２７６．１および２８２．６ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ水であった。２および６時間でのベースラインからの変化は、ビークル（０Ｘ）では−１０．７および１．０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ水；０．３Ｘでは−１１．０および−１９．１ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ水；１Ｘでは０．３および−４．４ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ水；１０Ｘでは−１０．３および−３．８ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ水であった。ＢＵＮ／Ｃｒ、Ｎａ排出の尿臨床化学データを下表にまとめる：
【表１９】
0006054294.tif 000085
【表２０】
0006054294.tif 000086
【表２１】
0006054294.tif 000087
単位：Ｎａ（ｍＥｑ／Ｌ）；クレアチニン（ｍｇ／ｄＬ）；ＢＵＮ（ｍｇ／ｄＬ）、ブドウ糖（ｍｇ／ｄＬ）、Ｋ（ｍｍｏｌ／Ｌ）．ＣｒＣｌ：ｍＬ／ｍｉｎ／１００ｇＢＷ
クレアチニンクリアランス（ＣｒＣ１）＝（Ｕｃｒｅａｔ．＊Ｕｖｏｌ）／（Ｐｃｒｅａｔ．＊Ｕ時間）
【表２２】
0006054294.tif 000088
【表２３】
0006054294.tif 000089
【０７６７】
フェーズ２ＰＥＧ−レラキシン変異体の結果
投与後６時間の間のビークル（０Ｘ）処理ラットの平均水摂取量は、１．５ｍＬ／１００ｇ体重で、０．１Ｘ、０．３Ｘおよび１ＸＰＥＧ−レラキシン変異体処理ラットでは、それぞれ、２．９、３．４、および３．１ｍＬ／１００ｇ体重に増加した。これらは、０．１Ｘ、０．３Ｘおよび１Ｘ群について、ビークル群に比べそれぞれ、９３％、１２８％および１０５％の増加に相当する。
【０７６８】
投与後６時間の間の平均尿量は、ビークルでは０．９、０．２、０．５および０．４ｍＬ／１００ｇ体重（それぞれ、０Ｘ、０．３Ｘおよび１Ｘ群に対し）であった。ベースライン、投与後２および６時間の平均血漿ナトリウム濃度は、ビークル（０Ｘ）群では、それぞれ、１３６．３、１３８．８および１３７．８ｍＥｑ／Ｌ；０．１Ｘ群では、それぞれ、１３８．５、１３７．０および１３３．７ｍＥｑ／Ｌ；０．３Ｘ群では、それぞれ、１３７．５、１３３．５および１３４、６ｍＥｑ／Ｌ；１Ｘ群では、それぞれ、１３７．３、１３５．０および１３３、３ｍＥｑ／Ｌであった。ベースラインからの２および６時間の変化は、ビークル（０Ｘ）では２．５および１．５ｍＥｑ／Ｌ；０．１Ｘでは−１．５および−４．８ｍＥｑ／Ｌ；０．３Ｘでは−４．０および−２．９ｍＥｑ／Ｌ；１Ｘでは−２．３および−４．０ｍＥｑ／Ｌであった。
【０７６９】
ベースライン、投与後２および６時間の平均血漿モル浸透圧濃度は、ビークル（０Ｘ）群では、それぞれ、２８５．４、２８９．９、および２８７．５ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ水；０．１Ｘ群では、それぞれ、２９２．７、２８７．６および２８１．７ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ水；０．３Ｘ群では、それぞれ、２８７．６、２７９．４および２８２．６ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ水；１Ｘ群では、それぞれ、２８９．３、２８３．７および２７９．４ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ水出会った。ベースラインからの２および６時間の変化は、ビークル（０Ｘ）では４．５および２．１ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ水；０．１Ｘでは−５．１および−１１、０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ水；０．３Ｘでは−８．２および−５．０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ水；１Ｘでは−５、６および−９．９ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ水であった。
【０７７０】
本明細書記載の実施例と実施形態は、例示の目的のみのためのものであるが、これらを考慮すると、当業者なら、種々の修正または変更を思いつくことができ、これらは、本出願の趣旨と範囲および添付請求項の範囲に入るであろうことは理解されよう。全ての出版物、特許、特許出願、および／または本出願に引用されている他の文書は、それぞれ個別の出版物、特許、特許出願、および／または他の文書が、それぞれに、あらゆる目的のために参照によって組み込まれることが指示されている場合と同程度に、あらゆる目的のために参照によってその全体が組み込まれる。
【図１】
0006054294.tif 000090
【図２】
0006054294.tif 000091
【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0006054294.tif 000096
【図９】
0006054294.tif 000097
【図１０】
0006054294.tif 000098
【図１１】
0006054294.tif 000099
【図１２】
0006054294.tif 000100
【図１３】
0006054294.tif 000101
【図１４】
0006054294.tif 000102
【図１５】
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【図１６】
0006054294.tif 000104
【図１７】
0006054294.tif 000105
【図１８】
0006054294.tif 000106
【図１９−１】
0006054294.tif 000107
【図１９−２】
0006054294.tif 000108
【図１９−３】
0006054294.tif 000109
【図２０−１】
0006054294.tif 000110
【図２０−２】
0006054294.tif 000111
【図２０−３】
0006054294.tif 000112
【図２０−４】
0006054294.tif 000113
【図２０−５】
0006054294.tif 000114
【図５】
0006054294.tif 000115
【配列表】
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