(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトTLR4/MD2受容体のアゴニストとして作用しリピドAを含むリガンドを実質的に欠く外膜を含む、生存可能で、絶対的な（non-conditional）、変異大腸菌(E. coli)であって、（a）(Kdo)2-リピドIVAの生合成を乱す、kdsD、kdsA、kdsB、gutQおよびwaaAからなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子における変異、（b）PagPおよびEptAの酵素的活性を実質的に不活性化する、遺伝子pagPおよびeptAの各遺伝子における変異、および（c）msbA遺伝子またはyhjD遺伝子におけるサプレッサー変異を含む、前記変異大腸菌。
【請求項２】
遺伝子pagPおよびeptAの各遺伝子が欠失している、請求項1記載の生存可能で、絶対的な、変異大腸菌。
【請求項３】
K12株、W3110、MG1655、B/r、BL21、O157:h7、042、101-1、1180、1357、1412、1520、1827-70、2362-75、3431、53638、83972、929-78、98NK2、ABU 83972、B、B088、B171、B185、B354、B646、B7A、C、c7122、CFT073、DH1、DH5α、E110019、E128010、E74/68、E851/71、EAEC 042、EPECa11、EPECa12、EPECa14、ETEC、H10407、F11、F18+、FVEC1302、FVEC1412、GEMS_EPEC1、HB101、HT115、KO11、LF82、LT-41、LT-62、LT-68、MS 107-1、MS 119-7、MS 124-1、MS 145-7、MS 79-2、MS 85-1、NCTC 86、Nissle 1917、NT:H19、NT:H40、NU14、O103:H2、O103:HNM、O103:K+、O104:H12、O108:H25、O109:H9、O111:H-、O111:H19、O111:H2、O111:H21、O111:NM、O115:H-、O115:HMN、O115:K+、O119:H6、O119:UT、O124:H40、O127a:H6、O127:H6、O128:H2、O131:H25、O136:H-、O139:H28 (菌株E24377A/ETEC)、O13:H11、O142:H6、O145:H-、O153:H21、O153:H7、O154:H9、O157:12、O157:H-、O157:H12、O157:H43、O157:H45、O157:H7 EDL933、O157:NM、O15:NM、O177:H11、O17:K52:H18 (菌株UMN026/ExPEC)、O180:H-、O1:K1/APEC、O26、O26:H-、O26:H11、O26:H11:K60、O26:NM、O41:H-、O45:K1 (菌株S88/ExPEC)、O51:H-、O55:H51、O55:H6、O55:H7、O5:H-、O6、O63:H6、O63:HNM、O6:K15:H31 (菌株536/UPEC)、O7:K1 (菌株IAI39/ExPEC)、O8 (菌株IAI1)、O81 (菌株ED1a)、O84:H-、O86a:H34、O86a:H40、O90:H8、O91:H21、O9:H4 (菌株HS)、O9:H51、ONT:H-、ONT:H25、OP50、Orough:H12、Orough:H19、Orough:H34、Orough:H37、Orough:H9、OUT:H12、OUT:H45、OUT:H6、OUT:H7、OUT:HNM、OUT:NM、RN587/1、RS218、55989/EAEC、B/BL21、B/BL21-DE3、SE11、SMS-3-5/SECEC、UTI89/UPEC、TA004、TA155、TX1999、およびVir68からなる群より選択される大腸菌株由来である、請求項1または2記載の生存可能で、絶対的な、変異大腸菌。
【請求項４】
lpxL遺伝子における変異をさらに含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の生存可能で、絶対的な、変異大腸菌。
【請求項５】
lpxM遺伝子における変異をさらに含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の生存可能で、絶対的な、変異大腸菌。
【請求項６】
lpxP遺伝子における変異をさらに含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の生存可能で、絶対的な、変異大腸菌。
【請求項７】
lpxL遺伝子、lpxM遺伝子およびlpxP遺伝子の各遺伝子における変異をさらに含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の生存可能で、絶対的な、変異大腸菌。
【請求項８】
kdsD、gutQ、lpxL、lpxM、pagP、lpxPおよびeptA遺伝子の発現が大腸菌において乱されている、請求項１〜7のいずれか一項記載の生存可能で、絶対的な、変異大腸菌。 
【請求項９】
msbA変異がMsbA-P18S、MsbA-L48F、MsbA-P50S、MsbA-T283A、およびMsbA-R310Sからなる群より選択されるアミノ酸置換をもたらす、請求項1〜8のいずれか一項記載の生存可能で、絶対的な、変異大腸菌。
【請求項１０】
MsbAタンパク質においてP18Sのアミノ酸置換をもたらす、msbA遺伝子における変異を含む、請求項9記載の生存可能で、絶対的な、変異大腸菌。 
【請求項１１】
yhjDにおける変異が、アミノ酸置換YhjD-R134Cをもたらす、請求項1〜10のいずれか一項記載の生存可能で、絶対的な、変異大腸菌。
【請求項１２】
42℃での増殖を可能にする少なくとも1つのさらなるサプレッサー変異をさらに含む、請求項1〜11のいずれか一項記載の生存可能で、絶対的な、変異大腸菌。 
【請求項１３】
RecAまたはEndAをコードする遺伝子が変異または欠失している、請求項1〜12のいずれか一項記載の生存可能で、絶対的な、変異大腸菌。 
【請求項１４】
Fプラスミド、F'プラスミド、またはF線毛の産生をコードする遺伝子をさらに含む、請求項1〜13のいずれか一項記載の生存可能で、絶対的な、変異大腸菌。 
【請求項１５】
バクテリオファージfd、バクテリオファージM13、またはfdもしくはM13に関連するバクテリオファージを増殖させることができる、請求項1〜14のいずれか一項記載の生存可能で、絶対的な、変異大腸菌。 
【請求項１６】
細胞外DNAを取り込むようにコンピテントである、請求項1〜15のいずれか一項記載の生存可能で、絶対的な、変異大腸菌。
【請求項１７】
lpp遺伝子における変異をさらに含む、請求項1〜16のいずれか一項記載の生存可能で、絶対的な、変異大腸菌。 
【請求項１８】
ヒトTLR4/MD2のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に含まないDNAサンプルを作製する方法であって、 
(a) 請求項1〜17のいずれか一項で定義された変異大腸菌を得る段階; 
(b) 大腸菌にDNAベクターを導入し、大腸菌にDNAベクターを増幅させるように、DNAベクターで形質転換された大腸菌を増殖させる段階; および 
(c)増幅されたDNAを有する該大腸菌から、標準的なDNA単離プロトコルによってDNAサンプルを収集する段階 を含む、前記方法。 
【請求項１９】
ヒトTLR4/MD2のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に含まないタンパク質サンプルを作製する方法であって、 
(a) 請求項1〜17のいずれか一項で定義された変異大腸菌を得る段階; 
(b) 機能的プロモーターから発現される関心対象のタンパク質をコードする遺伝子と選択マーカー遺伝子との両方を含むDNAベクター発現構築物を該大腸菌に導入する段階; 
(c) DNAベクター発現構築物で形質転換された該大腸菌を増殖させる段階; 
(d) DNAベクター発現構築物で形質転換された該大腸菌が関心対象のタンパク質を発現することを可能にするまたは誘導する段階; ならびに 
(e) 該大腸菌を取り出して、関心対象のタンパク質を放出させる段階 を含む、前記方法。
【請求項２０】
大腸菌が、0.1 M〜0.9 Mの範囲のNaCl濃度を有する培地中で増殖する、請求項18または19記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、2010年3月12日付で出願された米国仮特許出願第61/313,562号の優先権を主張する非仮出願であり、その開示はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、TLR4/MD-2のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に欠くグラム陰性細菌を対象とする。本発明は同様に、そのようなグラム陰性細菌を作製する方法およびその使用を対象とする。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
リポ多糖(LPS)は、グラム陰性細菌における主要な外膜表面結合成分であり、哺乳類宿主免疫応答における一連の病理学的および生理学的活動と関連している。これらの細菌によって引き起こされるLPS媒介毒性は概して、Toll様受容体4 (TLR4)/MD-2のアゴニストとして機能しうる、LPSの疎水性部分であるリピドAによるものである。リピドAは、6つのアシル鎖が付着した2つのグルコサミン残基を含む。
【０００４】
Kdo (3-デオキシ-D-マンノ-オクツロソン酸)はLPSの必須成分と考えられ、大腸菌(E. coli)の増殖に必要な最小のLPS構造は、リピドAと付着している2つのKdo残基(Kdo2-リピドA)であると考えられている。Kdoの生合成はAPI (D-アラビノース5-リン酸イソメラーゼ)から始まり、これがD-リブロース5-リン酸(Ru5P)をA5P (D-アラビノース5-リン酸)に変換する。大腸菌K-12においては、2つのAPI遺伝子kdsDおよびgutQが存在する。次に、A5Pはホスホエノールピルビン酸(PEP)と縮合されてKdo 8-リン酸(Kdo8P)を形成し、これが次に加水分解されてKdoを形成する。Kdoはその後、糖ヌクレオチドCMP-Kdoとして活性化され、これが最終的にリピドIVAへ移されてKdo2-リピドIVAを形成する。Kdo依存性アシルトランスフェラーゼLpxLおよびLpxMは、それぞれ、ラウリン酸およびミリスチン酸をKdo2-リピドIVAへ移してKdo2-リピドAを形成する。
【０００５】
API遺伝子(kdsDおよびgutQ)の両方が欠失し、したがってKdoを欠いた大腸菌株K-12 TCM15は、外因性A5Pを供給されなければ生存できない(例えば、Meredith and Woodard, Identification of GutQ from Escherichia coli as a D-arabinose 5-phosphate isomerase, J Bacteriol 187:6936, 2005（非特許文献1）を参照のこと)。本発明は、TLR4/MD-2のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に欠く生存可能なグラム陰性細菌を特徴とする。TLR4/MD-2に関するさらなる情報は、例えば、Qureshi et al., J. Exp. Med., Vol. 189, No.4, February 15, 1999, Pages 615-625（非特許文献2）; Shimazu et al., J. Exp. Med., Volume 189, Number 11, June 7, 1999, Pages 1777-1782（非特許文献3）; Poltorak et al., Science 282, 2085 (1998)（非特許文献4）で見出すことができ、これらの開示は、その開示が本発明と一致する限りにおいてその全体が参照により本明細書に組み入れられる。例えば、リガンドはリピドAまたは6-アシル脂質を含むことができる。生存可能なグラム陰性細菌はサプレッサー変異を含み、これによって、普通なら不可欠なKdoを欠くにもかかわらず生存が可能になる。Mamatらは、大腸菌TCM15派生株の絶対的な、yhjDおよびmsbA遺伝子におけるサプレッサー変異について記述している(Mol Microbiol 67(3):633, 2008（非特許文献5）を参照のこと)。
【０００６】
本明細書において記述されるいずれの特徴または特徴の組み合わせも、こうしたいずれかの組み合わせに含まれる特徴が、文脈、本明細書、および当業者の知識から明らかとなるものと互いに矛盾していなければ、本発明の範囲内に含まれる。本発明のさらなる利点および局面は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲において明らかである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Meredith and Woodard, Identification of GutQ from Escherichia coli as a D-arabinose 5-phosphate isomerase, J Bacteriol 187:6936, 2005
【非特許文献２】Qureshi et al., J. Exp. Med., Vol. 189, No.4, February 15, 1999, Pages 615-625
【非特許文献３】Shimazu et al., J. Exp. Med., Volume 189, Number 11, June 7, 1999, Pages 1777-1782
【非特許文献４】Poltorak et al., Science 282, 2085 (1998)
【非特許文献５】Mamat et al., Mol Microbiol 67(3):633, 2008
【発明の概要】
【０００８】
概要
本発明は、TLR4/MD2のアゴニストとして作用するリガンド(例えば、リピドA、6-アシルリポ多糖など)を実質的に欠く、とりわけ、ヒトTLR4/MD2のアゴニストを欠く外膜を含む生存可能なグラム陰性細菌を特徴とする。このリガンドは、哺乳動物における共刺激免疫応答分子の産生を活性化(例えば、マクロファージを誘導して炎症のメディエーターを合成)しうる。いくつかの態様において、グラム陰性細菌は大腸菌(Escherichia coli)株(例えば、KPM22、KPM22 L1、KPM22 L11、KPM22 L13、KPM22 L14、KPM22 L15、KPM22 L18、KPM22 L20、KPM316、KPM318、KPM334〜KPM362)またはシュードモナス属(Pseudomonas)の株である。
【０００９】
生存可能なグラム陰性細菌は、機能的なアラビノース-5-リン酸(A5P)イソメラーゼKdsDおよびGutQの活性の低下をさらに含みうる。いくつかの態様において、活性の低下を有するアラビノース-5-リン酸イソメラーゼの残存活性は、Kdo生合成経路の基質を提供するのに不十分である(例えば、当業者によって理解されるようにKdo生合成経路の基質がゼロまたは不十分である)。いくつかの態様において、これは両遺伝子の完全な欠失によって達成される。本発明のKPM318およびいくつかの前の菌株において、lpxL lpxM欠失により、補充物としてのA5Pの存在下での増殖時に、脂質型をリピドIVAに限定しながら、Kdo合成の完全な回復が(A5Pにおける増殖によって)可能になる。
【００１０】
いくつかの態様において、生存可能なグラム陰性細菌は、1つまたは複数のサプレッサー変異、例えば、リピドIVAを輸送する輸送体の能力を増大させる輸送体(例えば、MsbA-P50S、MsbA-P18S、MsbA-T283A、MsbA-R310SまたはMsbA-L48FのようなMsbA)におけるサプレッサー変異、膜タンパク質YhjDに影響を及ぼすサプレッサー変異(例えば、YhjD-R134C)、42℃での増殖を可能にするサプレッサー変異などをさらに含む。
【００１１】
いくつかの態様において、1つもしくは複数の遺伝子(例えば、lpxL、lpxM、pagP、lpxPおよび/もしくはeptA)が実質的に欠失し、ならびに/または1つもしくは複数の酵素(例えば、LpxL、LpxM、PagP、LpxPおよび/もしくはEptA)が実質的に不活性である。例えば、生存可能なグラム陰性細菌は、1つまたは複数の遺伝子(例えば、lpxL、lpxM、pagP、lpxP、eptA)の部分的な欠失または完全な欠失の部位に、部位特異的リコンビナーゼのスカー(scar)配列を含むことができ、大腸菌株は限定されるものではないが、KPM279、KPM280、KPM288、KPM290、KPM296、KPM300、KPM303、KPM310、KPM312、KPM314、KPM316、KPM317、KPM318、KPM334〜KPM362を含むことができる。いくつかの態様において、DNA制限酵素および/もしくはDNAメチル化酵素をコードする遺伝子、ならびに/またはrecAおよび/もしくはendAをコードする遺伝子が変異または欠失している。
【００１２】
細菌はさまざまな増殖特性を示しうる。例えば、いくつかの態様において、細菌は42℃で指数関数的に増殖することができる。例えば、いくつかの態様において、細菌は、37℃超で約35分未満、約40分未満、または約45分未満の対数期倍加時間を示す。いくつかの態様において、細菌は、約0.1 M〜0.9 Mの塩濃度で生存し続ける。
【００１３】
いくつかの態様において、細菌は、抗生物質に対する耐性を与える手段を含む。いくつかの態様において、細菌は、Fプラスミドを含むか、F'プラスミドを含むか、またはF線毛の産生をコードする遺伝子を含む。いくつかの態様において、細菌は、バクテリオファージfd、バクテリオファージM13、またはfdもしくはM13に関連するバクテリオファージを増殖させることができる。いくつかの態様において、細菌は、細胞外DNAを取り込むようにコンピテント(例えば、エレクトロコンピテント)である。
【００１４】
本発明は同様に、当該グラム陰性細菌に由来する外膜であって、TLR4/MD2のアゴニストであるリガンドを実質的に欠く該外膜を特徴とする。例えば、外膜は、本明細書において記述されるグラム陰性細菌に由来しうる。本発明は同様に、リピドA前駆体リピドAまたはリピドIVAをアシル化することができるO-アシルトランスフェラーゼを欠く生存可能なグラム陰性細菌(例えば、大腸菌および/またはシュードモナス属などの、本明細書において記述されるグラム陰性細菌)を特徴とする。O-アシルトランスフェラーゼはLpxL、LpxM、LpxP、およびPagPを含みうる。
【００１５】
いくつかの態様において、本明細書において記述されるグラム陰性細菌はドナー細菌である。例えば、グラム陰性ドナー細菌は、オープンリーディングフレームの欠失を有する遺伝子(例えば、lpxL、lpxM、pagP、lpxP、eptA)と抗生物質(例えば、カナマイシン、ペニシリン、ネオマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、またはアンピシリン)に対する耐性を与える手段とを含むDNAカセットを含むことができ、このカセットは、部位特異的リコンビナーゼ酵素の標的となる部位に隣接している。
【００１６】
本発明は同様に、40℃超の温度で指数関数的に増殖することができるグラム陰性細菌であって、TLR4/MD2のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に欠く該グラム陰性細菌を選択する方法を特徴とする。いくつかの態様において、この方法は、TLR4/MD2受容体のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に欠き、かつ約30℃〜40℃での増殖を可能にするサプレッサー変異を有する菌株(例えば、本明細書において記述される菌株)を、増殖させる段階; 該菌株を適切な栄養培地にプレーティングする段階; および単一の細菌コロニーが現れるまで、プレーティングした菌株を42℃でインキュベートする段階を含む。
【００１７】
本発明は同様に、lpxL、lpxM、pagP、lpxP、およびeptAなどの遺伝子を実質的に欠く細菌を構築する方法を特徴とする。この方法は、TLR4/MD2受容体のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に欠く外膜を含む生存可能なグラム陰性細菌(例えば、本明細書において記述される菌株)を得る段階を含む。いくつかの態様において、生存可能なグラム陰性細菌は、オープンリーディングフレームの欠失を有する改変された標的遺伝子である改変遺伝子(例えば、改変された抗生物質耐性遺伝子)を含むDNAカセットを含む。DNAカセットは、抗生物質に対する耐性を与える手段をさらに含んでいてもよく、および/または、部位特異的リコンビナーゼの適切な標的部位に隣接していてもよい。この方法は、細菌をP1 vir形質導入に供する段階、および相同組換えによって、標的遺伝子を改変遺伝子(例えば、改変された抗生物質耐性遺伝子)で置き換える段階をさらに含む。いくつかの態様において、この方法は、抗生物質耐性遺伝子に隣接する配列に対して作用できる部位特異的リコンビナーゼの一過性導入によって抗生物質耐性遺伝子を欠失させ、それにより耐性遺伝子を欠失させかつ部位特異的リコンビナーゼに特有のスカーを残す段階をさらに含む。
【００１８】
本発明は同様に、TLR4/MD2のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に含まないDNAサンプルおよび/またはタンパク質サンプルを作製する方法を特徴とする。この方法は、TLR4/MD2受容体のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に欠く外膜を含むグラム陰性細菌(例えば、本明細書において記述される菌株)であって、細胞外DNAを取り込むようにコンピテントである該細菌を得る段階を含む。DNAサンプルを作製するために、この方法は、DNAベクターを増幅する細菌にDNAベクターを導入する段階、および標準的なDNA単離プロトコルによって細菌からDNAサンプルを収集する段階をさらに含む。そのようなDNA単離プロトコルは当業者に周知である。
【００１９】
タンパク質サンプルを作製するために、この方法は、機能的プロモーターから発現される関心対象のタンパク質をコードする遺伝子と選択マーカー遺伝子との両方を含むDNAベクター発現構築物を細菌に導入する段階、細菌を増殖させる段階および細菌が関心対象のタンパク質を発現することを可能にするまたは誘導する段階、ならびに細菌を収集して、関心対象のタンパク質を放出するように該細菌を処理する段階を含むことができる。いくつかの態様において、細菌はlolA、lolB、および/またはlppなどの1つまたは複数の遺伝子における変異または欠失を含む。いくつかの態様において、タンパク質サンプルを作製するために、この方法は、機能的プロモーターから発現される関心対象のタンパク質をコードする遺伝子と選択マーカー遺伝子との両方を含むDNAベクター発現構築物を細菌に導入する段階、細菌を増殖させる段階および細菌が関心対象のタンパク質を発現することを可能にするまたは誘導する段階、ならびに培地中に関心対象のタンパク質を残すように、培地から細菌を除去する段階を含むことができる。
【００２０】
本発明は同様に、TLR4/MD2受容体のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に含まない細菌(例えば、本明細書において記述される菌株)のライブラリーであって、一連のタンパク質バリアントを発現する細菌ライブラリーを特徴とする。細菌ライブラリーは、哺乳動物細胞に基づくアッセイにおいてタンパク質バリアントを活性についてスクリーニングするのに有用でありうる。いくつかの態様において、ライブラリーのメンバーはファージディスプレイにより、またはライブラリーのプロトタイプメンバーを発現するプラスミドベクターの変異誘発により、作製される。
【００２１】
好ましくは、細菌は、アラビノース-5-リン酸を補充したリッチ培地中で、アラビノース-5-リン酸を欠いた同一のリッチ培地中で増殖するのと少なくとも同じくらい迅速に増殖することができ、アラビノース-5-リン酸に依存した外膜組成の選択が、補充物によってより遅い増殖速度がもたらされることなく可能になる。補充物ありの増殖は、補充なしの増殖速度の少なくとも95%、および好ましくは補充なしの速度よりも速い速度であるはずである。
【００２２】
本明細書において記述される生存可能なグラム陰性細菌、そのさまざまな成分、試薬、および/または材料は、キットの形態で利用可能でありうる。例えば、いくつかの態様において、キットは、TLR4/MD2のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に含まない外膜を有する生存可能なグラム陰性細菌(例えば、本明細書において記述される菌株)であって、細胞外DNAを取り込むようにコンピテントである該細菌を含む。
[本発明1001]
TLR4/MD2のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に欠く外膜を含む、生存可能なグラム陰性細菌。
[本発明1002]
リガンドがリピドAを含む、本発明1001の生存可能なグラム陰性細菌。
[本発明1003]
リガンドが6-アシル脂質多糖を含む、本発明1001の生存可能なグラム陰性細菌。
[本発明1004]
リガンドが、哺乳動物における共刺激免疫応答分子の産生を活性化することができる、本発明1001の生存可能なグラム陰性細菌。
[本発明1005]
リガンドが、炎症のメディエーターを合成するようにマクロファージを誘導することができる、本発明1001の生存可能なグラム陰性細菌。
[本発明1006]
大腸菌(Escherichia coli)である、本発明1001の生存可能なグラム陰性細菌。
[本発明1007]
K12、B/r、W3110、MG1655、B/r、BL21、O157:h7、042、101-1、1180、1357、1412、1520、1827-70、2362-75、3431、53638、83972、929-78、98NK2、ABU 83972、B、B088、B171、B185、B354、B646、B7A、C、c7122、CFT073、DH1、DH5α、E110019、E128010、E74/68、E851/71、EAEC 042、EPECa11、EPECa12、EPECa14、ETEC、H10407、F11、F18+、FVEC1302、FVEC1412、GEMS_EPEC1、HB101、HT115、KO11、LF82、LT-41、LT-62、LT-68、MS 107-1、MS 119-7、MS 124-1、MS 145-7、MS 79-2、MS 85-1、NCTC 86、Nissle 1917、NT:H19、NT:H40、NU14、O103:H2、O103:HNM、O103:K+、O104:H12、O108:H25、O109:H9、O111:H-、O111:H19、O111:H2、O111:H21、O111:NM、O115:H-、O115:HMN、O115:K+、O119:H6、O119:UT、O124:H40、O127a:H6、O127:H6、O128:H2、O131:H25、O136:H-、O139:H28 (菌株E24377A/ETEC)、O13:H11、O142:H6、O145:H-、O153:H21、O153:H7、O154:H9、O157:12、O157:H-、O157:H12、O157:H43、O157:H45、O157:H7 EDL933、O157:NM、O15:NM、O177:H11、O17:K52:H18 (菌株UMN026/ExPEC)、O180:H-、O1:K1/APEC、O26、O26:H-、O26:H11、O26:H11:K60、O26:NM、O41:H-、O45:K1 (菌株S88/ExPEC)、O51:H-、O55:H51、O55:H6、O55:H7、O5:H-、O6、O63:H6、O63:HNM、O6:K15:H31 (菌株536/UPEC)、O7:K1 (菌株IAI39/ExPEC)、O8 (菌株IAI1)、O81 (菌株ED1a)、O84:H-、O86a:H34、O86a:H40、O90:H8、O91:H21、O9:H4 (菌株HS)、O9:H51、ONT:H-、ONT:H25、OP50、Orough:H12、Orough:H19、Orough:H34、Orough:H37、Orough:H9、OUT:H12、OUT:H45、OUT:H6、OUT:H7、OUT:HNM、OUT:NM、RN587/1、RS218、55989/EAEC、B/BL21、B/BL21-DE3、SE11、SMS-3-5/SECEC、UTI89/UPEC、TA004、TA155、TX1999、およびVir68からなる群より選択される大腸菌株である、本発明1001の生存可能なグラム陰性細菌。
[本発明1008]
シュードモナス属(Pseudomonas)の株である、本発明1001の生存可能なグラム陰性細菌。
[本発明1009]
機能的なアラビノース-5-リン酸(A5P)イソメラーゼKdsDおよびGutQの活性の低下をさらに含む、本発明1001の生存可能なグラム陰性細菌。
[本発明1010]
輸送体におけるサプレッサー変異をさらに含み、それによってリピドIVAを輸送する輸送体の能力が増大する、本発明1001の生存可能なグラム陰性細菌。
[本発明1011]
42℃での増殖を可能にする少なくとも1つのさらなるサプレッサー変異をさらに含む、本発明1010の生存可能なグラム陰性細菌。
[本発明1012]
輸送体がMsbAである、本発明1010の生存可能なグラム陰性細菌。
[本発明1013]
輸送体が対立遺伝子MsbA-P50S、MsbA-P18S、MsbA-T283A、MsbA-R309S、またはMsbA-D498Vの1つである、本発明1012の生存可能なグラム陰性細菌。
[本発明1014]
膜タンパク質YhjDに影響を及ぼすサプレッサー変異をさらに含む、本発明1001の生存可能なグラム陰性細菌。
[本発明1015]
膜タンパク質YhjDがYhjD-R134Cである、本発明1014の生存可能なグラム陰性細菌。
[本発明1016]
42℃での増殖を可能にする少なくとも1つのさらなるサプレッサー変異をさらに含む、本発明1014の生存可能なグラム陰性細菌。
[本発明1017]
KPM22、KPM22 L1、KPM22 L11、KPM22 L13、KPM22 L14、KPM22 L15、KPM22 L18、およびKPM22 L20からなる群より選択される大腸菌K-12菌株である、本発明1001の生存可能なグラム陰性細菌。
[本発明1018]
lpxL、lpxM、pagP、lpxP、およびeptAからなる群より選択される1つまたは複数の遺伝子が実質的に欠失している、本発明1001の生存可能なグラム陰性細菌。
[本発明1019]
KPM279、KPM280、KPM288、KPM290、KPM296、KPM300、KPM303、KPM310、KPM312、KPM314、KPM316、KPM317、KPM318、およびKPM320からなる群より選択される大腸菌K-12菌株である、本発明1018の生存可能なグラム陰性細菌。
[本発明1020]
TLR4/MD2のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に欠く外膜を含む生存可能なグラム陰性細菌であって、少なくとも1つの改変を含む大腸菌K-12菌株(KPM316)である、該生存可能なグラム陰性細菌。
[本発明1021]
TLR4/MD2のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に欠く外膜を含む生存可能なグラム陰性細菌であって、少なくとも1つの改変を含む大腸菌K-12菌株(KPM318)である、該生存可能なグラム陰性細菌。
[本発明1022]
1つまたは複数の酵素が、LpxL、LpxM、PagP、LpxP、およびEptAからなる群より選択され、かつ実質的に不活性である、本発明1001の生存可能なグラム陰性細菌。
[本発明1023]
lpxL、lpxM、pagP、lpxP、eptAの1つまたは複数の遺伝子の部分的な欠失または完全な欠失の部位に、部位特異的リコンビナーゼのスカー(scar)配列を含む、本発明1022の生存可能なグラム陰性細菌。
[本発明1024]
抗生物質に対する耐性を与える手段を含む、本発明1001の生存可能なグラム陰性細菌。
[本発明1025]
37℃超で約35分未満の対数期倍加時間を示す、本発明1001の生存可能なグラム陰性細菌。
[本発明1026]
37℃超で約40分未満の対数期倍加時間を示す、本発明1001の生存可能なグラム陰性細菌。
[本発明1027]
37℃超で約45分未満の対数期倍加時間を示す、本発明1001の生存可能なグラム陰性細菌。
[本発明1028]
DNA制限酵素またはDNAメチル化酵素をコードする遺伝子が変異または欠失している、本発明1001の生存可能なグラム陰性細菌。
[本発明1029]
recAまたはendAをコードする遺伝子が変異または欠失している、本発明1001の生存可能なグラム陰性細菌。
[本発明1030]
Fプラスミド、F'プラスミド、またはF線毛の産生をコードする遺伝子をさらに含む、本発明1001の生存可能なグラム陰性細菌。
[本発明1031]
バクテリオファージfd、バクテリオファージM13、またはfdもしくはM13に関連するバクテリオファージを増殖させることができる、本発明1001の生存可能なグラム陰性細菌。
[本発明1032]
42℃で指数関数的に増殖することができる、本発明1001の生存可能なグラム陰性細菌。
[本発明1033]
細胞外DNAを取り込むようにコンピテントである、本発明1001の生存可能なグラム陰性細菌。
[本発明1034]
エレクトロコンピテントである、本発明1033の生存可能なグラム陰性細菌。
[本発明1035]
約0.1 M〜0.9 Mの塩濃度で生存し続ける、本発明1001の生存可能なグラム陰性細菌。
[本発明1036]
TLR4/MD2のアゴニストであるリガンドを実質的に欠くグラム陰性細菌の外膜。
[本発明1037]
リピドIVAをアシル化することができるO-アシルトランスフェラーゼを欠く、生存可能なグラム陰性細菌。
[本発明1038]
大腸菌種である、本発明1037の生存可能なグラム陰性細菌。
[本発明1039]
シュードモナス属の種である、本発明1037の生存可能なグラム陰性細菌。
[本発明1040]
O-アシルトランスフェラーゼが、LpxL、LpxM、LpxP、PagPからなる群より選択される、本発明1037の生存可能なグラム陰性細菌。
[本発明1041]
TLR4/MD2のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に欠き、40℃超の温度で指数関数的に増殖することができるグラム陰性細菌を、選択する方法であって、
(a) TLR4/MD2受容体のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に欠き、かつ約30℃〜40℃での増殖を可能にするサプレッサー変異を有する菌株を、増殖させる段階;
(b) 該菌株を適切な栄養培地にプレーティングする段階; および
(c) 単一の細菌コロニーが現れるまで、プレーティングした菌株を42℃でインキュベートする段階
を含む、前記方法。
[本発明1042]
(a) TLR4/MD2のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に欠く外膜と; 
(b) lpxL、lpxM、pagP、lpxP、およびeptAからなる群より選択される、オープンリーディングフレームの欠失を有する遺伝子
を含むDNAカセットであって、抗生物質に対する耐性を与える手段をさらに含み、かつ部位特異的リコンビナーゼ酵素の標的となる部位に隣接している、該DNAカセットと
を含む、生存可能なグラム陰性ドナー細菌。
[本発明1043]
抗生物質がカナマイシン、ペニシリン、ネオマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、またはアンピシリンである、本発明1001の生存可能なグラム陰性ドナー細菌。
[本発明1044]
lpxL、lpxM、pagP、lpxP、およびeptAからなる群より選択される遺伝子を実質的に欠く細菌を構築する方法であって、
(a) TLR4/MD2受容体のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に欠く外膜と; 
オープンリーディングフレームの欠失を有する改変された標的遺伝子である改変遺伝子を含むDNAカセットであって、抗生物質に対する耐性を与える手段をさらに含み、かつ部位特異的リコンビナーゼの適切な標的部位にさらに隣接している、該DNAカセットと
を含む生存可能なグラム陰性細菌を得る段階;
(b) 細菌をP1 vir形質導入に供する段階; ならびに
(c) 相同組換えによって、標的遺伝子を改変遺伝子で置き換える段階
を含む、前記方法。
[本発明1045]
改変遺伝子が、改変された抗生物質耐性遺伝子である、本発明1044の方法。
[本発明1046]
抗生物質耐性遺伝子に隣接する配列に対して作用できる部位特異的リコンビナーゼの一過性導入によって抗生物質耐性遺伝子を欠失させ、それにより耐性遺伝子を欠失させかつ部位特異的リコンビナーゼに特有のスカーを残す後続の段階をさらに含む、本発明1045の方法。
[本発明1047]
グラム陰性細菌が、KPM279、KPM280、KPM288、KPM290、KPM296、KPM300、KPM303、KPM310、KPM312、KPM314、KPM316、KPM317、KPM318、およびKPM320からなる群より選択される大腸菌K-12菌株である、本発明1044の方法。
[本発明1048]
TLR4/MD2のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に含まないDNAサンプルを作製する方法であって、
(a) TLR4/MD2受容体のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に欠く外膜を含むグラム陰性細菌であって、細胞外DNAを取り込むようにコンピテントである、該細菌
を得る段階;
(b) DNAベクターを増幅するように機能する該細菌にDNAベクターを導入する段階; および
(c)増幅されたDNAを有する該細菌から、標準的なDNA単離プロトコルによってDNAサンプルを収集する段階
を含む、前記方法。
[本発明1049]
TLR4/MD2受容体のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に含まないタンパク質サンプルを作製する方法であって、
(a) TLR4/MD2受容体のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に欠く外膜を含むグラム陰性細菌であって、細胞外DNAを取り込むようにコンピテントである、該細菌
を得る段階;
(b) 機能的プロモーターから発現される関心対象のタンパク質をコードする遺伝子と選択マーカー遺伝子との両方を含むDNAベクター発現構築物を該細菌に導入する段階;
(c) DNAベクター発現構築物で形質転換された該細菌を増殖させる段階;
(d) DNAベクター発現構築物で形質転換された該細菌が関心対象のタンパク質を発現することを可能にするまたは誘導する段階; ならびに
(e) 該細菌を収集して、関心対象のタンパク質を放出するように該細菌を処理する段階
を含む、前記方法。
[本発明1050]
TLR4/MD2のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に含まないタンパク質サンプルを作製する方法であって、
(a) TLR4/MD2受容体のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に欠く外膜を含むグラム陰性細菌であって、遺伝子lolA、lolB、またはlppの少なくとも1つが変異または欠失しており、細胞外DNAを取り込むようにコンピテントである、該細菌
を得る段階;
(b) 機能的プロモーターから発現される関心対象のタンパク質をコードする遺伝子と選択マーカー遺伝子との両方を含むDNAベクター発現構築物を該細菌に導入する段階;
(c) DNAベクター発現構築物で形質転換された該細菌を培地中で増殖させる段階;
(d) DNAベクター発現構築物で形質転換された該細菌が関心対象のタンパク質を発現することを可能にするまたは誘導する段階; ならびに
(e) 培地中に関心対象のタンパク質を残すように、培地から該細菌を除去する段階
を含む、前記方法。
[本発明1051]
TLR4/MD2のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に含まない細菌のライブラリーであって、一連のタンパク質バリアントを発現し、哺乳動物細胞に基づくアッセイにおいて該タンパク質バリアントを活性についてスクリーニングするのに有用である、細菌ライブラリー。
[本発明1052]
ライブラリーのメンバーがファージディスプレイにより作製される、本発明1051のライブラリー。
[本発明1053]
ライブラリーのメンバーが、ライブラリーのプロトタイプメンバーを発現するプラスミドベクターの変異誘発により作製される、本発明1051のライブラリー。
[本発明1054]
TLR4/MD2のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に含まない外膜を有し、細胞外DNAを取り込むようにコンピテントである、生存可能なグラム陰性細菌
を含むキット。
【００２３】
定義
「生存可能な無毒性グラム陰性細菌」という用語は、TLR4/MD2のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に含まない外膜を含む生存可能なグラム陰性細菌株をさす。
【００２４】
本明細書において互換的に用いられる「細胞」および「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」という用語は、ベクター、典型的には発現ベクターで形質転換される能力がある、または形質転換された細胞をさす。本明細書において用いられる宿主細胞はグラム陰性細菌でありうる。そのような用語は特定の対象細胞をさすだけでなく、そのような細胞の子孫または潜在的子孫もさすことが理解されよう。変異または環境的影響のいずれかにより後続の世代においてある種の改変が起こりうるので、そのような子孫は、実際には、親細胞と同一ではない可能性があるが、それでも、本明細書において用いられる用語の範囲内に含まれる。
【００２５】
「培地(media)」および「培地(culture medium)」という用語は、当技術分野において認識されており、一般的には、生細胞の培養に用いられる任意の物質または調製物をさす。
【００２６】
例えば、グラム陰性細菌の菌株からリピドIVAを得るという文脈において用いられる場合の「に由来する」という用語は、細菌またはタンパク質から得られうるリピドIVAをさし、タンパク質の断片または部分を含むことが意図される。
【００２７】
遺伝子または遺伝子発現に関して、本明細書において用いられる場合の「欠損のある」という用語は、遺伝子が野生型遺伝子ではないこと、ならびに生物体が野生型の遺伝子型および/または野生型の表現型をもたないことを意味しうる。欠損のある遺伝子、遺伝子型、または表現型は、その正常な発現が乱されるもしくは失われるような、その遺伝子における、または遺伝子の発現(例えば、転写または転写後の)を制御する遺伝子における、変異の結果である可能性がある。「乱された遺伝子発現」は、完全な阻害、および野生型遺伝子発現より低い遺伝子発現の減少(例えば、漏出変異におけるような)の両方を含むことが意図される。
【００２８】
「グラム陰性細菌」という用語は、当技術分野において認識されており、一般的には、グラム染色(例えば、クリスタルバイオレットとヨウ素との着色複合体の沈着)を保持しない細菌をさす。例示的なグラム染色において、細胞を、まず、加熱によりスライドに固定し、すべての細菌(すなわち、グラム陰性およびグラム陽性の両方)により取り込まれる塩基性色素(例えば、クリスタルバイオレット)で染色する。スライドを、その後、染色を定着させるためにヨウ素-KI混合物で処理し、アセトンまたはアルコールで洗浄し、最後に、異なる色の淡染色性色素(例えば、サフラニン)で対比染色する。グラム陽性生物体は、最初のバイオレット染色を保持するが、グラム陰性生物体は、有機溶媒により脱色され、このゆえに、対比染色を示す。グラム陰性細菌および細胞株には、限定されるわけではないが、エシェリキア属の種(Escherichia spp.)、シゲラ属の種(Shigella spp.)、サルモネラ属の種(Salmonella spp.)、カンピロバクター属の種(Campylobacter spp.)、ナイセリア属の種(Neisseria spp.)、ヘモフィルス属の種(Haemophilus spp.)、アエロモナス属の種(Aeromonas spp.)、フランシセラ属の種(Francisella spp.)、エルシニア属の種(Yersinia spp.)、クレブシエラ属の種(Klebsiella spp.)、ボルデテラ属の種(Bordetella spp.)、レジオネラ属の種(Legionella spp.)、シトロバクター属の種(Citrobacter spp.)、クラミジア属の種(Chlamydia spp.)、ブルセラ属の種(Brucella spp.)、シュードモナス属の種(Pseudomonas spp.)、ヘリコバクター属の種(Helicobacter spp.)、およびビブリオ属の種(Vibrio spp.)が挙げられる。
【００２９】
本明細書において用いられる場合、「変異グラム陰性細菌」、「LPS変異グラム陰性細菌」、「kdsDおよびgutQ変異グラム陰性細菌」、「API変異グラム陰性細菌」という用語、または同類語は、例えば、gutQ、kdsD、kdsA、kdsB、waaA、msbA、yhjD遺伝子、または任意の他の生合成、プロセッシング、もしくは輸送遺伝子の1つまたは複数において1回または複数回、変異しており、それにより、LPSまたはTLR4/MD2のアゴニストとして作用する他のリガンドを実質的に欠く外膜を生成する、本発明のグラム陰性細菌を含む。
【００３０】
「分子の免疫原性部分」は、対象においてその分子に対して免疫反応を誘発する能力がある分子の部分をさす。
【００３１】
LPSまたはリピドIVA分子に適用される場合の「単離された」という用語は、他の細菌成分から、特に外膜から、単離されている(例えば、部分的または完全な単離)LPSまたはリピドIVAをさす。
【００３２】
本明細書において用いられる場合、配列(例えば、タンパク質のアミノ酸配列、遺伝子の核酸配列)に関して用いられる時の「部分」という用語は、参照配列の任意の量(例えば、アミノ酸配列または核酸配列の0.001%、0.1%、1%、10%、30%、50%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99.999%)を表す。
【００３３】
本明細書において用いられる場合の「調節」という用語は、上方制御(すなわち、例えば、アゴナイズする(agonizing)、または増強することによる、活性化、または刺激)および下方制御(すなわち、(例えば、アンタゴナイズする(antagonizing)、減少させる、または阻害することによる、阻害または抑制)の両方をさす。「誘導性」という用語は、特に、恒常的ではなく、刺激(例えば、温度、重金属、または他の培地添加物)に応答して起こる遺伝子発現をさす。
【００３４】
「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸(DNA)、および適切な場合にはリボ核酸(RNA)などのポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドをさす。この用語はまた、等価物として、ヌクレオチド類似体から生成したRNAまたはDNAのいずれかの類似体、ならびに記述される態様に応じて適切に、一本鎖(センスまたはアンチセンス)および二本鎖ポリヌクレオチドを含むことが理解されるはずである。
【００３５】
本明細書において用いられる場合、「トランスフェクション」という用語は、核酸媒介性遺伝子移入によるレシピエント細胞への核酸の導入(例えば、発現ベクターを介して)を意味する。本明細書において用いられる場合、「形質転換」は、細胞の遺伝子型が外因性DNAまたはRNAの細胞取り込みの結果として変化する過程をさす。例証的な態様において、形質転換細胞は、kdsDおよびgutQ遺伝子の1つまたは複数の変異型を発現するものである。形質転換細胞はまた、gutQ、kdsD、kdsA、kdsB、waaA、msbA、yhjD遺伝子の発現を干渉する、または任意の他の生合成、プロセッシング、もしくは輸送遺伝子の発現を干渉する核酸を発現するものでありうる。
【００３６】
本明細書において用いられる場合、「導入遺伝子」は、細胞へ導入されている核酸(例えば、変異kdsD、gutQ、kdsA、kdsB、waaA、msbA、yhjD遺伝子、または任意の他の生合成、プロセッシング、もしくは輸送遺伝子、またはそれらのアンチセンス転写産物)を意味する。導入遺伝子は、それが導入されるトランスジェニック動物もしくは細胞に対して、部分的にもしくは完全に異種性、例えば、外来性であってもよく、または、それが導入される生物体もしくは細胞の内因性遺伝子に相同性であってもよいが、この場合は、該導入遺伝子は、挿入された細胞のゲノムを変化させるように、動物もしくは細胞のゲノムへ挿入される、もしくは挿入されるように設計される。導入遺伝子はまた、エピソームの形で細胞に存在しうる。
【００３７】
本明細書において用いられる場合、状態または疾患について対象を「処置する」という用語は、状態または疾患の少なくとも1つの症状を治すこと、および寛解させることを包含するよう意図される。
【００３８】
「ベクター」という用語は、それが連結している別の核酸を輸送する能力がある核酸分子をさす。機能的に連結している遺伝子の発現を方向づける能力があるベクターは、本明細書では「発現ベクター」といわれる。
【００３９】
本明細書において用いられる場合、「発現システム」という用語は、mRNAが転写されうる、および/またはmRNAがタンパク質、構造RNA、もしくは他の細胞成分へと翻訳されうる条件下での発現ベクターをさす。発現システムは、インビトロ発現システムであり、これは、市販されているか、もしくは当技術分野公知の技術に従って容易に作られるか、または発現ベクターを含む真核細胞もしくは原核細胞などのインビボ発現システムでありうる。一般的に、組換えDNA技術における有用な発現ベクターは、しばしば、「プラスミド」の形をとり、そのプラスミドは、一般的に、それらのベクター型において、染色体に結合していない環状二本鎖DNAループをさす。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドが最も一般的に用いられるベクターの形であるため、互換的に用いられる。しかしながら、本発明は、等価の機能を果たし、かつ当技術分野において周知である、またはこの点に関して後で当技術分野において知られるようになる、そのような他の型の発現ベクター(例えば、コスミド、ファージミド、およびバクテリオファージベクター)を含むことが意図される。
【００４０】
「生存可能な」という用語は、リッチ培地を含む適切な栄養培地中で、細胞が複数の世代にわたって指数関数的に増殖かつ分裂することができること、および細胞が、その細胞種に典型的な保存条件の下で保存され、その後、再増殖することができることを意味する。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】大腸菌KPM22ならびにKPM22様菌株KPM22 L1、KPM22 L11、KPM22 L13、KPM22 L14、KPM22 L15、KPM22 L18、およびKPM22 L20の増殖曲線を示す。世代時間は37℃にて200 rpmで振盪しながらLB培地中で決定された。世代時間(これらの条件下での)は以下の通りであるものと計算された: KPM22 40分、KPM22 L1 37分、KPM22 L11 39分、KPM22 L13 59分、KPM22 L14 44分、KPM22 L15 40分、KPM22 L18 36分、およびKPM22 L20 55分。
【図２】37℃にてルリア・ベルターニ(Luria-Bertani; LB)培地中または37℃にて15 μMのD-アラビノース5-リン酸(A5P)および10 μMのD-グルコース6-リン酸(G6P)を補充したLB培地中のいずれかでの大腸菌株KPM288 (KPM22 L1 ΔlpxL::Km+)および菌株KPM290 (KPM22 L11 ΔlpxL::Km+)の増殖曲線を示す。LB培地での世代時間は以下の通りであるものと計算された: KPM288 45分、KPM290 43分。A5PおよびG6Pを補充したLB培地での増殖の結果は次の通りであった: KPM288は2〜3世代後、指数関数的な増殖が止まった、KPM290 46分。
【図３】LB培地、15 μM A5Pおよび10 μM G6Pを補充したLB培地、Super Broth (SB)培地(10 g/L NaClを含有する)、または15 μM A5Pおよび10 μM G6Pを補充したSB培地(10 g/L NaClを含有する)中のいずれかの37℃での大腸菌株KPM303 (KPM22 L11 ΔlpxL ΔlpxM)の増殖曲線を示す。SB培地はLB培地と比べてKPM303の増殖速度を改善しなかった。しかしながら、A5PおよびG6Pを補充したLB培地中での増殖とは対照的に、KPM303は、A5PおよびG6Pを補充したSB中で培養された場合、2〜3世代後も指数関数的な増殖をし続けた。
【図４】SB培地または15 μM A5Pおよび10 μM G6Pを補充したSB中のいずれかの37℃での大腸菌株KPM303 (KPM22 L11 ΔlpxL ΔlpxM)、KPM312 (KPM22 L11 ΔlpxL ΔlpxM ΔpagP)、およびKPM316 (KPM22 L11 ΔlpxL ΔlpxM ΔpagP ΔlpxP)の増殖曲線を示す。SB培地での世代時間は以下の通りであった: KPM303 54分、KPM312 50分、KPM316 46分。A5PおよびG6Pを補充したSB培地での世代時間は以下の通りであった: KPM303 39分、KPM312 42分、KPM316 42分。
【図５】10 mM MgSO4および2 mM CaCl2を補充したSB培地または10 mM MgSO4、2 mM CaCl2、15 μM A5P、および10 μM G6Pを補充したSB培地中のいずれかの37℃での大腸菌株KPM316の増殖曲線を示す。KPM316は、10 mM MgSO4および2 mM CaCl2を含むSB中で51分の世代時間を有した。KPM316は、10 mM MgSO4、2 mM CaCl2、15 μM A5P、および10 μM G6Pを含むSB中で46分の世代時間を有した。
【図６】SB中または15 μM A5P、および10 μM G6Pを補充したSB中のいずれかで37℃にて増殖させた大腸菌株KPM316およびKPM318の増殖曲線を示す。倍加時間は39〜44分の範囲内で非常に類似している。
【図７】10 mM MgSO4および2 mM CaCl2を補充したSB培地または10 mM MgSO4、2 mM CaCl2、15 μM A5P、および10 μM G6Pを補充したSB培地中のいずれかの37℃での大腸菌株KPM296-6およびKPM316の増殖曲線を示す。10 mM MgSO4および2 mM CaCl2を含むSB培地中でのKPM296-6の増殖速度は48分であった。10 mM MgSO4、2 mM CaCl2、15 μM A5P、および10 μM G6Pを含むSB中では、KPM296-6の増殖速度は42分であった。
【図８】42℃にてKPM296から選択された一連の独立した分離株の増殖曲線。増殖は42℃にてSB培地中であった。個々の分離株は挿入図において付番されており、その増殖曲線を表すために用いた記号と合わせられている。世代時間のかなりのバラツキがみられるが、それぞれが指数関数的な増殖を示す。
【図９】KPM318におけるO-アシルトランスフェラーゼ遺伝子の欠失およびeptA遺伝子の欠失を確認するための、各遺伝子に隣接するプライマーによって産生されたPCR産物の分析。分析した各遺伝子に対しKPM318に加え対照として親菌株BW30270を用いている。鋳型DNA、および特定のPCRプライマー対が設計された遺伝子が示されている。いずれの場合にも親菌株BW30270がKPM318の場合にみられたものよりも大きいPCR産物をもたらすことをみてとることができる。KPM318では全遺伝子の代わりにスカー配列だけが残っている。
【図１０】図10Aおよび10B：菌株BW30270、KPM316およびKPM318のHEK-Blue(商標)アッセイ。(A) 菌株の外膜調製物、および(B) 全細胞。各ウェルに加えた細胞の数(cfu - コロニー形成単位としての)または外膜調製物の質量が示されている。アッセイキットに同梱されている大腸菌K-12由来の参照LPSをすべての実験で同時に扱ったが、これを質量比に基づき最も直接的に比較可能な外膜データとの比較のために示してある。
【図１１】大腸菌株KPM316 (A)およびKPM318 (B)から単離されたLPS分子の負イオン様式での電荷デコンボリューションされたエレクトロスプレイ・イオン化フーリエ変換イオンサイクロトロン(ESI FT-ICR)質量スペクトル。示された質量数は、中性分子のモノアイソトピックピークを指す。1178.66 uでのピークは、既知の経路中間体と一致しないので、LPSの単離中に作製されたリピドIVA (1404.86 u)のトリアシル化分解産物である可能性が最も高い。
【図１２】図12a〜g：大腸菌KPM316 (msbA52 ΔkdsD ΔgutQ ΔlpxL ΔlpxM ΔpagP ΔlpxP)の配列。msbAの野生型対立遺伝子はmsbA52で置き換えられ、その際に965895位のCがTに置き換えられ、MsbAタンパク質において18番目のアミノ酸のプロリンの代わりにセリンをもたらす。以下が親菌株から欠失された: ΔgutQ (図12b)、ΔkdsD (図12c)、ΔlpxL (図12d)、ΔlpxM (図12e)、ΔpagP (図12f)、およびΔlpxP (図12g)。
【図１３】親菌株MG1655と比べてKPM316では、msbA52変異およびLPS合成遺伝子を不活性化する欠失/挿入に加え、単一のヌクレオチド変化が存在する。どのような特徴的な表現型をもたらすかは知られていない、または予測されていない。
【図１４】図14a〜h：大腸菌(Escherichia coli) KPM318 (msbA52 ΔkdsD ΔgutQ ΔlpxL ΔlpxM ΔpagP ΔlpxP ΔeptA)。msbAの野生型対立遺伝子はmsbA52で置き換えられ、その際に965895位のCがTに置き換えられ、MsbAタンパク質において18番目のアミノ酸のプロリンの代わりにセリンをもたらす。以下が親菌株から欠失された: ΔgutQ (図14b)、ΔkdsD (図14c)、ΔlpxL (図14d)、ΔlpxM (図14e)、ΔpagP (図14f)、ΔlpxP (図14g)、およびΔeptA (図14f)。
【図１５】BW30270およびKPM318菌株はScripps Core DNA配列決定施設にてIllumina配列決定を用いて配列決定された。すべての単一ヌクレオチド多型(SNP)および欠失/挿入多型(DIP)が示されている。これらのSNPおよびDIPはBlattnerのMG1655菌株とのこれらの菌株の比較に基づいて割り当てられている。読み出しの100%で検出されたものだけが記されている。オリジナルのKPM22 L11菌株におけるmsbA-P18Sサプレッサー対立遺伝子が特定された。
【図１６】30℃にてSB培地中で増殖させた4種のKPM-318温度耐性派生株KPM334、KPM335、KPM336、およびKPM337の増殖を評価した。
【図１７】30℃にてA5P/G6Pを補充したSB培地中で増殖させた4種のKPM-318温度耐性派生株KPM334、KPM335、KPM336、およびKPM337の増殖を評価した。
【図１８】37℃にてSB培地中で増殖させた4種のKPM-318温度耐性派生株KPM334、KPM335、KPM336、およびKPM337の増殖を評価した。
【図１９】37℃にてA5P/G6Pを補充したSB培地中で増殖させた4種のKPM-318温度耐性派生株KPM334、KPM335、KPM336、およびKPM337の増殖を評価した。
【図２０】42℃にてSB培地中で増殖させた4種のKPM-318温度耐性派生株KPM334、KPM335、KPM336、およびKPM337の増殖を評価した。
【図２１】42℃にてA5P/G6Pを補充したSB培地中で増殖させた4種のKPM-318温度耐性派生株KPM334、KPM335、KPM336、およびKPM337の増殖を評価した。
【図２２】図22a〜d：4種のKPM-318温度耐性派生株KPM334、KPM335、KPM336、およびKPM337は、Scripps Core DNA配列決定施設にてIllumina配列決定を用いて配列決定された。すべての単一ヌクレオチド多型(SNP)および欠失/挿入多型(DIP)が示されている。これらのSNPおよびDIPはBlattnerのMG1655菌株とのこれらの菌株の比較に基づいて割り当てられている。読み出しの100%で検出されたものだけが記されている。オリジナルのKPM22 L11菌株におけるmsbA-P18Sサプレッサー対立遺伝子が特定された。
【図２３】LB培地中42℃で増殖させた大腸菌KPM337から単離されたリピドIVA (1404.86 u)の負イオン様式でのESI FT-ICR質量スペクトル。示された質量数は、中性分子のモノアイソトピック質量を指す。トリアシル化リピドAに対応するピーク(1178.67 u)は、既知の経路中間体と一致しないので、リピドIVAの単離および/またはイオン化の間に作製された人為産物である可能性が高い。
【図２４】A5P/G6Pを補充したLB培地中42℃で増殖させた大腸菌KPM334から単離されたLPSの負イオン様式でのESI FT-ICR質量スペクトル。示された質量数は、中性分子のモノアイソトピック質量を指す。
【図２５】A5P/G6Pを補充したLB培地中42℃で増殖させた大腸菌KPM335から単離されたLPSの負イオン様式でのESI FT-ICR質量スペクトル。示された質量数は、中性分子のモノアイソトピック質量を指す。
【図２６】A5P/G6Pを補充したLB培地中42℃で増殖させた大腸菌KPM337から単離されたLPSの負イオン様式でのESI FT-ICR質量スペクトル。示された質量数は、中性分子のモノアイソトピック質量を指す。
【図２７】A5P/G6Pを補充したLB培地中37℃で増殖させた大腸菌KPM318から単離されたLPSの負イオン様式でのESI FT-ICR質量スペクトル(対照)。示された質量数は、中性分子のモノアイソトピック質量を指す。ピークの割り当ては表1に記載されている。
【図２８】LB培地またはA5P/G6Pを補充したLB培地中のいずれかで37℃にて増殖させたKPM316およびKPM318の細菌細胞懸濁液におけるLPSの検出。大腸菌K-12野生型菌株BW30270を対照として用いた。
【図２９】大腸菌株BW30270、KPM316、KPM318およびKPM334からのLPS/リピドIVA単離物によって引き起こされたHEK-Blue細胞における相対的NF-κB誘導。
【図３０】大腸菌株KPM316およびKPM318から単離されたLPS/リピドIVAサンプルのアンタゴニスト活性を決定するためのヒトTNF-α ELISA。詳細は、本書中のプロトコルを参照されたい。
【図３１】4% AB-血清を含有する培地中の大腸菌株KPM316およびKPM318に由来するLPS/リピドIVAサンプルによって引き起こされたヒトマクロファージにおけるTNF-α放出。大腸菌K-235のS-LPSを対照として用いた。
【図３２】無血清培地中の大腸菌株KPM316およびKPM318に由来するLPS/リピドIVAサンプルによって引き起こされたヒトマクロファージにおけるTNF-α放出。大腸菌K-235のS-LPSを対照として用いた。
【図３３】大腸菌株KPM316およびKPM318に由来するLPS/リピドIVAサンプルで刺激されたHEK293 hTLR4/MD2 #33細胞におけるIL-8放出。大腸菌K-235のS-LPSを対照として用いた。
【図３４】大腸菌株KPM316およびKPM318に由来するLPS/リピドIVAサンプルで刺激されたHEK293 hTLR2 #2細胞におけるIL-8放出。大腸菌K-235のS-LPSを対照として用いた。
【図３５】細胞質MalE-LacZα発現(上パネル)および周辺質MalE-LacZα発現(下パネル)のためのプラスミドpMAL-c2およびpMAL-p2のマップ。
【図３６】タンパク質抽出物(各10 μg)および培地(各10 μl)のSDS-PAGE分析。タンパク質抽出物は非誘導細胞および3時間の誘導時間後の細胞から調製した。培地は終夜IPTG誘導の条件下で増殖させた細胞から得た。サンプルを、10%ポリアクリルアミドゲルを用いて分離し、クマシーブルーで染色した。レーンMにおいて分子量タンパク質マーカー(広範囲(Broad Rnage) - Bio-Rad)を泳動した。
【図３７】タンパク質抽出物(各10 μg)および培地(各10 μl)のSDS-PAGE分析。タンパク質抽出物は非誘導細胞および3時間の誘導時間後の細胞から調製した。培地は終夜IPTG誘導の条件下で増殖させた細胞から得た。サンプルを、10%ポリアクリルアミドゲルを用いて分離し、クマシーブルーで染色した。レーンMにおいて分子量タンパク質マーカー(広範囲 - Bio-Rad)を泳動した。
【図３８】タンパク質抽出物(各8 μg)および培地(各10 μl)のSDS-PAGE分析(上パネル)。タンパク質抽出物は非誘導細胞および終夜誘導後の細胞から調製した。培地は終夜IPTG誘導の条件下で増殖させた細胞から得た。サンプルを、10%ポリアクリルアミドゲルを用いて分離し、クマシーブルーで染色した。免疫ブロット(下パネル)のため、各タンパク質抽出物8 μgおよび各培養上清2.5 μlをSDS-PAGEに供した。ブロットされた膜を抗MalEおよびアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスIgG (H+L)抗体でプロービングし、ニトロブルーテトラゾリウム(NBT)および5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸(BCIP)基質の存在下で発色させた。レーンMにおいて分子量タンパク質マーカー(広範囲 - Bio-Rad)を泳動した。
【図３９】タンパク質抽出物(各8 μg)および培地(各10 μl)のSDS-PAGE分析(上パネル)。タンパク質抽出物は非誘導細胞および終夜誘導後の細胞から調製した。培地は終夜IPTG誘導の条件下で増殖させた細胞から得た。サンプルを、10%ポリアクリルアミドゲルを用いて分離し、クマシーブルーで染色した。免疫ブロット(下パネル)のため、各タンパク質抽出物8 μgおよび各培養上清2.5 μlをSDS-PAGEに供した。ブロットされた膜を抗MalEおよびアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスIgG (H+L)抗体でプロービングし、ニトロブルーテトラゾリウム(NBT)および5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸(BCIP)基質の存在下で発色させた。レーンMにおいて分子量タンパク質マーカー(広範囲 - Bio-Rad)を泳動した。
【図４０】タンパク質抽出物(各8 μg)および培地(各2.5 μl)の免疫ブロット分析。タンパク質抽出物は非誘導細胞および3時間の誘導時間後の細胞から調製した。培地は3時間のIPTG誘導の条件下で増殖させた細胞由来であった。サンプルを、10%ポリアクリルアミドゲルを用いて分離し、その後、ブロッティングならびに抗MalEおよびアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスIgG (H+L)抗体による膜のプロービングを行い、NBTおよびBCIP基質の存在下で発色させた。
【図４１】pMAL-p2菌株のタンパク質抽出物(各6 μg)および培地(各8 μl)のSDS-PAGE分析。タンパク質抽出物は非誘導細胞ならびに3時間、6時間、12時間、および24時間の誘導時間後の細胞から調製した。培地は3時間、6時間、12時間、および24時間の誘導後の細胞由来であった。サンプルを、10%ポリアクリルアミドゲルを用いて分離し、クマシーブルーで染色した。レーンMにおいて分子量タンパク質マーカー(広範囲 - Bio-Rad)を泳動した。
【図４２】pMAL-p2菌株のタンパク質抽出物(各6 μg)および培地(各10 μl)の免疫ブロット分析。タンパク質抽出物は非誘導細胞ならびに3時間、6時間、12時間、および24時間の誘導時間後の細胞から調製した。培地は3時間、6時間、12時間、および24時間の誘導後の細胞由来であった。サンプルを、10%ポリアクリルアミドゲルを用いて分離し、その後、ブロッティングならびに抗MalEおよびアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスIgG (H+L)抗体による膜のプロービングを行い、NBTおよびBCIP基質の存在下で発色させた。
【図４３】細胞質ApoA1発現(上パネル)および周辺質ApoA1発現(下パネル)のためのプラスミドpJexpress404:51149およびpJexpress404:51150のマップ。
【図４４】BW30270/pJexpress404:51149およびKPM318/pJexpress404:51149菌株から調製されたタンパク質抽出物(各6 μg)のSDS-PAGE分析。タンパク質抽出物は非誘導細胞ならびに3時間、6時間、12時間、および24時間の誘導時間後の細胞から得た。サンプルを、12%ポリアクリルアミドゲルを用いて分離し、クマシーブルーで染色した。レーンMにおいて分子量タンパク質マーカー(広範囲 - Bio-Rad)を泳動した。矢印はApoA1タンパク質を示す。
【図４５】KPM334/pJexpress404:51149およびKPM335/pJexpress404:51149菌株から調製されたタンパク質抽出物(各6 μg)のSDS-PAGE分析。タンパク質抽出物は非誘導細胞ならびに3時間、6時間、12時間、および24時間の誘導時間後の細胞から得た。サンプルを、12%ポリアクリルアミドゲルを用いて分離し、クマシーブルーで染色した。レーンMにおいて分子量タンパク質マーカー(広範囲 - Bio-Rad)を泳動した。矢印はApoA1タンパク質を示す。
【図４６】KPM336/pJexpress404:51149菌株から調製されたタンパク質抽出物(各6 μg)のSDS-PAGE分析。タンパク質抽出物は非誘導細胞ならびに3時間、6時間、12時間、および24時間の誘導時間後の細胞から得た。サンプルを、12%ポリアクリルアミドゲルを用いて分離し、クマシーブルーで染色した。レーンMにおいて分子量タンパク質マーカー(広範囲 - Bio-Rad)を泳動した。
【図４７】BW30270/pJexpress404:51150およびKPM318/pJexpress404:51150菌株から調製されたタンパク質抽出物(各6 μg)のSDS-PAGE分析。タンパク質抽出物は非誘導細胞ならびに3時間、6時間、12時間、および24時間の誘導時間後の細胞から得た。サンプルを、12%ポリアクリルアミドゲルを用いて分離し、クマシーブルーで染色した。レーンMにおいて分子量タンパク質マーカー(広範囲 - Bio-Rad)を泳動した。
【図４８】KPM334/pJexpress404:51150およびKPM335/pJexpress404:51150菌株から調製されたタンパク質抽出物(各6 μg)のSDS-PAGE分析。タンパク質抽出物は非誘導細胞ならびに3時間、6時間、12時間、および24時間の誘導時間後の細胞から得た。サンプルを、12%ポリアクリルアミドゲルを用いて分離し、クマシーブルーで染色した。レーンMにおいて分子量タンパク質マーカー(広範囲 - Bio-Rad)を泳動した。
【図４９】KPM336/pJexpress404:51150菌株から調製されたタンパク質抽出物(各6 μg)のSDS-PAGE分析。タンパク質抽出物は非誘導細胞ならびに3時間、6時間、12時間、および24時間の誘導時間後の細胞から得た。サンプルを、12%ポリアクリルアミドゲルを用いて分離し、クマシーブルーで染色した。レーンMにおいて分子量タンパク質マーカー(広範囲 - Bio-Rad)を泳動した。
【図５０】菌株KPM335/pJexpress404:51150の光学細胞密度(OD600) 対 生存細胞の数(cfu/ml)をApoA1発現誘導の間に評価した。
【図５１】BW30270/pJexpress404:51150およびKPM318/pJexpress404:51150菌株由来の培地のSDS-PAGE分析。培地は非誘導細胞ならびに3時間、6時間、12時間、および24時間の誘導時間後の細胞から得た。サンプルを、12%ポリアクリルアミドゲルを用いて分離し、クマシーブルーで染色した。負荷したサンプルの量については、表7〜11を参照されたい。
【図５２】KPM334/pJexpress404:51150およびKPM335/pJexpress404:51150菌株由来の培地のSDS-PAGE分析。培地は非誘導細胞ならびに3時間、6時間、12時間、および24時間の誘導時間後の細胞から得た。サンプルを、12%ポリアクリルアミドゲルを用いて分離し、クマシーブルーで染色した。負荷したサンプルの量については、表7〜11を参照されたい。
【図５３】KPM336/pJexpress404:51150の培地のSDS-PAGE分析。培地は非誘導細胞ならびに3時間、6時間、12時間、および24時間の誘導時間後の細胞から得た。サンプルを、12%ポリアクリルアミドゲルを用いて分離し、クマシーブルーで染色した。負荷したサンプルの量については、表7〜11を参照されたい。レーンMにおいて分子量タンパク質マーカー(広範囲 - Bio-Rad)を泳動した。
【図５４】BW30270/pJexpress404:51149およびKPM318/pJexpress404:51149菌株のタンパク質抽出物(各3 μg)の免疫ブロット分析。タンパク質抽出物は非誘導細胞ならびに3時間、6時間、12時間、および24時間の誘導時間後の細胞から調製した。サンプルを、10%ポリアクリルアミドゲルを用いて分離し、その後、ブロッティングならびにPenta-His抗体およびアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスIgG (H+L)抗体による膜のプロービングを行い、NBTおよびBCIP基質の存在下で発色させた。分子量タンパク質マーカー(広範囲 - Bio-Rad)をレーンMにおいて泳動し、ブロッティング後に標識化した。
【図５５】KPM334/pJexpress404:51149およびKPM335/pJexpress404:51149菌株のタンパク質抽出物(各3 μg)の免疫ブロット分析。タンパク質抽出物は非誘導細胞ならびに3時間、6時間、12時間、および24時間の誘導時間後の細胞から調製した。サンプルを、10%ポリアクリルアミドゲルを用いて分離し、その後、ブロッティングならびにPenta-His抗体およびアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスIgG (H+L)抗体による膜のプロービングを行い、NBTおよびBCIP基質の存在下で発色させた。分子量タンパク質マーカー(広範囲 - Bio-Rad)をレーンMにおいて泳動し、ブロッティング後に標識化した。
【図５６】KPM336/pJexpress404:51149のタンパク質抽出物(各3 μg)の免疫ブロット分析。タンパク質抽出物は非誘導細胞ならびに3時間、6時間、12時間、および24時間の誘導時間後の細胞から調製した。サンプルを、10%ポリアクリルアミドゲルを用いて分離し、その後、ブロッティングならびにPenta-His抗体およびアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスIgG (H+L)抗体による膜のプロービングを行い、NBTおよびBCIP基質の存在下で発色させた。分子量タンパク質マーカー(広範囲 - Bio-Rad)をレーンMにおいて泳動し、ブロッティング後に標識化した。
【図５７】BW30270/pJexpress404:51150およびKPM318/pJexpress404:51150菌株のタンパク質抽出物(各3 μg)の免疫ブロット分析。タンパク質抽出物は非誘導細胞ならびに3時間、6時間、12時間、および24時間の誘導時間後の細胞から調製した。サンプルを、12%ポリアクリルアミドゲルを用いて分離し、その後、ブロッティングならびにPenta-His抗体およびアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスIgG (H+L)抗体による膜のプロービングを行い、NBTおよびBCIP基質の存在下で発色させた。分子量タンパク質マーカー(広範囲 - Bio-Rad)をレーンMにおいて泳動し、ブロッティング後に標識化した。
【図５８】KPM334/pJexpress404:51150およびKPM335/pJexpress404:51150菌株のタンパク質抽出物(各3 μg)の免疫ブロット分析。タンパク質抽出物は非誘導細胞ならびに3時間、6時間、12時間、および24時間の誘導時間後の細胞から調製した。サンプルを、12%ポリアクリルアミドゲルを用いて分離し、その後、ブロッティングならびにPenta-His抗体およびアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスIgG (H+L)抗体による膜のプロービングを行い、NBTおよびBCIP基質の存在下で発色させた。分子量タンパク質マーカー(広範囲 - Bio-Rad)をレーンMにおいて泳動し、ブロッティング後に標識化した。
【図５９】KPM336/pJexpress404:51150のタンパク質抽出物(各3 μg)の免疫ブロット分析。タンパク質抽出物は非誘導細胞ならびに3時間、6時間、12時間、および24時間の誘導時間後の細胞から調製した。サンプルを、12%ポリアクリルアミドゲルを用いて分離し、その後、ブロッティングならびにPenta-His抗体およびアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスIgG (H+L)抗体による膜のプロービングを行い、NBTおよびBCIP基質の存在下で発色させた。分子量タンパク質マーカー(広範囲 - Bio-Rad)をレーンMにおいて泳動し、ブロッティング後に標識化した。
【図６０】BW30270/pJexpress404:51150およびKPM318/pJexpress404:51150菌株由来の培地の免疫ブロット分析。培地は非誘導細胞ならびに3時間、6時間、12時間、および24時間の誘導時間後の細胞から得た。サンプルを、12%ポリアクリルアミドゲルを用いて分離し、その後、ブロッティングならびにPenta-His抗体およびアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスIgG (H+L)抗体による膜のプロービングを行い、NBTおよびBCIP基質の存在下で終夜発色させた。負荷したサンプルの量については、表7〜11を参照されたい。
【図６１】KPM334/pJexpress404:51150およびKPM335/pJexpress404:51150菌株由来の培地の免疫ブロット分析。培地は非誘導細胞ならびに3時間、6時間、12時間、および24時間の誘導時間後の細胞から得た。サンプルを、12%ポリアクリルアミドゲルを用いて分離し、その後、ブロッティングならびにPenta-His抗体およびアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスIgG (H+L)抗体による膜のプロービングを行い、NBTおよびBCIP基質の存在下で終夜発色させた。負荷したサンプルの量については、表7〜11を参照されたい。
【図６２】KPM336/pJexpress404:51150の培地の免疫ブロット分析。培地は非誘導細胞ならびに3時間、6時間、12時間、および24時間の誘導時間後の細胞から得た。サンプルを、12%ポリアクリルアミドゲルを用いて分離し、その後、ブロッティングならびにPenta-His抗体およびアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスIgG (H+L)抗体による膜のプロービングを行い、NBTおよびBCIP基質の存在下で終夜発色させた。負荷したサンプルの量については、表7〜11を参照されたい。
【図６３】大腸菌株BW30270/pMAL-c2、KPM318 (LB)/pMAL-c2、およびKPM318 (LB A5P/G6P)/pMAL-c2について無作為に選択した4つの形質転換体から単離したpMAL-c2プラスミドのアガロースゲル電気泳動。これらのサンプルをTBE緩衝液中0.8%のアガロースゲル上での電気泳動に供した。レーン1、pMAL-c2対照; レーン2、BW30270/pMAL-c2 (1); レーン3、BW30270/pMAL-c2 (2); レーン4、BW30270/pMAL-c2 (3); レーン5、BW30270/pMAL-c2 (4); レーン6、KPM318 (LB)/pMAL-c2 (1); レーン7、KPM318 (LB)/pMAL-c2 (2); レーン8、KPM318 (LB)/pMAL-c2 (3); レーン9、KPM318 (LB)/pMAL-c2 (4); レーン10、KPM318 (LB A5P/G6P)/pMAL-c2 (1); レーン11、KPM318 (LB A5P/G6P)/pMAL-c2 (2); レーン12、KPM318 (LB A5P/G6P)/pMAL-c2 (3); レーン13、KPM318 (LB A5P/G6P)/pMAL-c2 (4); レーンM、1-kb Plus DNA Ladder (Invitrogen)。
【図６４】大腸菌株KPM334/pMAL-c2、KPM334/pMAL-p2、KPM335/pMAL-c2、およびKPM335/pMAL-p2について無作為に選択した2つの形質転換体から単離したpMAL-c2およびpMAL-p2プラスミドのアガロースゲル電気泳動。レーン1、pMAL-c2対照; レーン2、KPM334/pMAL-c2 (1); レーン3、KPM334/pMAL-c2 (2); レーン4、KPM335/pMAL-c2 (1); レーン5、KPM335/pMAL-c2 (2); レーン6、pMAL-p2対照; レーン7、KPM334/pMAL-p2 (1); レーン8、KPM334/pMAL-p2 (2); レーン9、KPM335/pMAL-p2 (1); レーン10、KPM335/pMAL-p2 (2); レーンM、1-kb Plus DNA Ladder (Invitrogen)。
【図６５】KPM菌株におけるlpxP野生型遺伝子およびΔlpxPノックアウト変異の存在を識別するための、プライマー対5EClpxPctrl/3EClpxPctrlを用いることにより得られたPCR産物のアガロースゲル電気泳動。潜在的なBW30270 (F'121 Tn10)菌株(レーン1)および8つのテトラサイクリン耐性KPM318 (F'121 Tn10)接合完了体(レーン2〜9)のバイオマスを鋳型として用いた。レーンMには1-kb Plus DNA Ladder (Invitrogen)が示されている。
【図６６】ヘルパープラスミドpMAK705 Km耐性 CATMUTのマップ。
【図６７】大腸菌株TOP10およびXL1-BlueをプラスミドpMAK705 Km耐性 CATMUTで形質転換した。得られたTOP10/pMAK705 Km耐性 CATMUTおよびXL1-Blue/pMAK705 Km耐性 CATMUT菌株をLB + 30 μg/mlカナマイシンおよびLB + 30 μg/mlカナマイシン + 15 μg/mlクロラムフェニコールのプレートの両方に画線した。
【図６８】構築された大腸菌株の例を提示する、表1を示す。
【図６９】ESI FT-ICR MS(図27)を用い大腸菌KPM318において検出されたグリコフォームのピークリストを載せた、表2を示す。
【図７０】IPTGによる誘導直前の細菌懸濁液の光学密度および細胞数を提供する、表3を示す。
【図７１】IPTG誘導3時間後の細菌懸濁液の光学密度および細胞数を提供する、表4を示す。
【図７２】IPTG誘導6時間後の細菌懸濁液の光学密度および細胞数を提供する、表5を示す。
【図７３】IPTG誘導12時間後の細菌懸濁液の光学密度および細胞数を提供する、表6を示す。
【図７４】IPTG誘導24時間後の細菌懸濁液の光学密度および細胞数を提供する、表7を示す。
【図７５】IPTGによる誘導直前に細胞から得た培地の量を決定するための過程を実証する、表8を示す。
【図７６】誘導3時間後に細胞から得た培地の量を決定するための過程を実証する、表9を示す。
【図７７】誘導6時間後に細胞から得た培地の量を決定するための過程を実証する、表10を示す。
【図７８】誘導12時間後に細胞から得た培地の量を決定するための過程を実証する、表11を示す。
【図７９】誘導24時間後に細胞から得た培地の量を決定するための過程を実証する、表12を示す。
【図８０】コンピテント細胞の数を提供する、表13を示す。
【図８１】大腸菌株BW30270、KPM318 (LB)およびKPM318 (LB A5P/G6P)の形質転換効率を提供する、表14を示す。
【図８２】大腸菌株KPM334、KPM335、KPM336およびKPM337の形質転換効率を提供する、表15を示す。
【図８３】大腸菌株BW30270、KPM318、KPM334、KPM335、KPM336およびKPM337から単離されたプラスミドpMAL-c2およびpMAL-p2の収量を提供する、表16を示す。
【図８４】ドナー(JC19022 F'121 Tn10) 500 μlに添加するレシピエント(BW30270およびKPM318)の量の算出について記述する、表17を示す。
【図８５】ドナー(JC19022 F'121 Tn10) 500 μlに添加するレシピエント(KPM334、KPM335、KPM336およびKPM337)の量の算出について記述する、表18を示す。
【図８６】M13KO7感染直前の菌株の光学密度(OD600)を提供する、表19を示す。
【図８７】M13KO7ヘルパーファージを感染させた後の潜在的F'121 Tn10接合完了体のカナマイシン耐性コロニーの数を提供する、表20を示す。
【図８８】本出願において言及される配列を提供する、表21を示す。
【図８９】各大腸菌株の構築経路を示す。
【図９０】各大腸菌株の構築経路を示す。
【図９１】各大腸菌株の構築経路を示す。
【図９２】図92Aおよび92B：HEK-Blueアッセイのプロトコルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
好ましい態様の説明
6つのアシル鎖が付着した2つのグルコサミン残基を含んだリポ多糖(LPS)の成分であるリピドAは、Toll様受容体4 (TLR4/MD-2)のアゴニストとして機能する。TLR4/MD-2は、いくつかの免疫系細胞、例えばマクロファージ、単球、および樹状細胞に存在する。LPS/リピドAを介したTLR4/MD-2の活性化は、共刺激免疫応答成分および分子の活性化につながり、最終的には内毒素性をもたらしうる。例えば、LPSがTLR4/MD-2 (ヒトでは)に結合されるようになると、サイトカイン産生が活性化され、補体が活性化され、凝固が活性化されうる。サイトカインにはインターロイキンIL-1、IL-6、IL-8、腫瘍壊死因子(TNF) (例えば、TNFα)、および血小板活性化因子が含まれうる。そのようなサイトカインは炎症および敗血性ショックのメディエーター(例えば、プロスタグランジン、ロイコトリエン)の産生を刺激しうる。補体C3aおよびC5aは、血管拡張に至るヒスタミン放出を引き起こし、および/または好中球走化性に影響を与えうる。血液凝固第XII因子は、血栓症、プラスミン活性化(線維素溶解、出血)などをもたらすいくつかの応答を活性化しうる。
【００４３】
グラム陰性細菌は、通常、その外膜の中に6-アシルLPSの大部分を含む。本発明は、Toll様受容体4 (TLR4)/MD-2のアゴニストとして作用する成分(例えば、リガンド)を実質的に欠く外膜を含む生存可能なグラム陰性細菌を特徴とする。その成分(例えば、リガンド)にはリピドA、6-アシル脂質(例えば6-アシルLPS)など、またはその組み合わせを含めることができる。通常のLPS (またはリピドA、6-アシル脂質)とは対照的に、リピドIVA、または4-アシルLPSはヒトTLR4/MD-2にあまり強固に結合せず、アゴニストとしてではなくTLR-4/MD2に対する穏やかなアンタゴニストとして作用する。いくつかの態様において、外膜において実質的に欠けているリガンドには、リピドIVA、またはリピドIVAの誘導体が含まれる。
【００４４】
本明細書において用いられる場合、「実質的に欠く」という用語は、外膜が、ほぼゼロのアゴニストリガンドから、外膜20 μgを単一のアッセイウェルに添加したときのHEK-blueアッセイにおいて最大シグナルの約25%を超える応答を誘導することのないアゴニストリガンドのレベルまでを有することを意味する。いくつかの態様において、本発明にしたがって使用されうるHEK-Blueアッセイは、InvivoGen, 3950 Sorrento Valley Blvd., Suite 100, San Diego, CA 92121 (USA), カタログ番号hkb-htlr4から得ることができ、このアッセイプロトコルは図92に提示されている。例えば、いくつかの態様において、Toll様受容体4 (TLR4/MD-2)のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に欠く外膜は、外膜がリガンドを全く持たないことを意味する。いくつかの態様において、外膜は、1ウェルあたり20 μgまでの膜抽出物として試験したときのHEK-blue細胞に基づくアッセイにおいて検出限界を下回るレベルで存在するTLR4/MD-2に対する少量のアゴニストを持ちうる。ヒト細胞株HEK-blueはTLR4/MD-2シグナル伝達に極めて感受性であるように操作されており、このアッセイは、1ウェルあたりにLPS 20 pgしか存在しない場合でも非常に強いシグナルを与える。いくつかの態様において、非常に低いシグナル(例えば、最大値の約25%未満)が1ウェルあたり外膜20 μgのレベルでさえもみられる。
【００４５】
本発明のグラム陰性細菌は大腸菌を含むが、これに限定されることはない。例えば、シュードモナス属の種のような遠縁のグラム陰性の種も、その外膜の成分としてTLR4/MD2アゴニストを欠きながらも増殖するように操作することができる。いくつかの態様において、大腸菌株はK-12、W3110、MG1655、B/r、BL21、O157:h7、042、101-1、1180、1357、1412、1520、1827-70、2362-75、3431、53638、83972、929-78、98NK2、ABU 83972、B、B088、B171、B185、B354、B646、B7A、C、c7122、CFT073、DH1、DH5α、E110019、E128010、E74/68、E851/71、EAEC 042、EPECa11、EPECa12、EPECa14、ETEC、H10407、F11、F18+、FVEC1302、FVEC1412、GEMS_EPEC1、HB101、HT115、KO11、LF82、LT-41、LT-62、LT-68、MS 107-1、MS 119-7、MS 124-1、MS 145-7、MS 79-2、MS 85-1、NCTC 86、Nissle 1917、NT:H19、NT:H40、NU14、O103:H2、O103:HNM、O103:K+、O104:H12、O108:H25、O109:H9、0111:H-、O111:H19、O111:H2、O111:H21、O111:NM、O115:H-、O115:HMN、O115:K+、O119:H6、O119:UT、O124:H40、O127a:H6、O127:H6、O128:H2、O131:H25、O136:H-、O139:H28 (菌株E24377A / ETEC)、O13:H11、O142:H6、O145:H-、O153:H21、O153:H7、O154:H9、O157:12、O157:H-、O157:H12、O157:H43、O157:H45、O157:H7 EDL933、O157:NM、O15:NM、O177:H11、 > O17:K52:H18 (菌株UMN026 / ExPEC)、O180:H-、O1:K1 / APEC、O26、O26:H-、O26:H11、O26:H11:K60、O26:NM、O41:H-、O45:K1 (菌株S88 / ExPEC)、O51:H-、O55:H51、O55:H6、O55:H7、O5:H-、O6、O63:H6、O63:HNM、O6:K15:H31 (菌株536 / UPEC)、O7:K1 (菌株IAI39 / ExPEC)、O8 (菌株IAI1)、O81 (菌株ED1a)、O84:H-、O86a:H34、O86a:H40、O90:H8、O91:H21、O9:H4 (菌株HS)、O9:H51、ONT:H-、ONT:H25、OP50、Orough:H12、Orough:H19、Orough:H34、Orough:H37、Orough:H9、OUT:H12、OUT:H45、OUT:H6、OUT:H7、OUT:HNM、OUT:NM、RN587/1、RS218、55989 / EAEC、B / BL21、B / BL21-DE3、SE11、SMS-3-5 / SECEC、UTI89 / UPEC、TA004、TA155、TX1999、またはVir68である。
【００４６】
いくつかの態様において、本発明の生存可能なグラム陰性細菌は、機能的なD-アラビノース-5-リン酸(A5P)イソメラーゼ(API) KdsDおよびGutQの活性の低下を有する。機能的なAPI KdsDおよびGutQの活性の低下は、APIの実質的な不活性化、例えばAPIを実質的に不活性化するように機能する化学剤、APIを実質的に不活性化するように機能するドミナント・ネガティブタンパク質、APIに結合し、かつAPIを実質的に不活性化するように機能するその断片の抗体などの結果でありうる。いくつかの態様において、機能的なAPI KdsDおよびGutQの活性の低下は、APIをコードする遺伝子(例えば、kdsD、gutQ)における部分的または実質的な欠失または変異の結果でありうる。細菌には大腸菌K-12 TCM15、BL21、BL21(DE3)、W3110が含まれうる。
【００４７】
サプレッサー変異
本発明の生存可能なグラム陰性細菌は、膜中のいずれかのTLR4アゴニストを欠くにもかかわらず増殖を可能にするサプレッサー変異を含む。例えば、生存可能なグラム陰性細菌は、両方のAPI遺伝子を欠き(したがってKdoを欠き)、かつ外因性A5Pが供給されなければ生存できない、大腸菌K-12 TCM15に由来してもよい。生存可能なグラム陰性細菌は、両方のAPI遺伝子(およびKdo)を欠くにもかかわらず細菌を生存可能にするサプレッサー変異を含みうる。サプレッサー変異は機能獲得型サプレッサー変異および機能喪失型サプレッサー変異を含みうる。いくつかの態様において、サプレッサー変異は、輸送体または膜タンパク質、例えば、msbAによってコードされる輸送体MsbAまたはyhjDによってコードされる膜タンパク質YhjDをコードする遺伝子における変異である。サプレッサー変異は輸送体または膜タンパク質に、リピドIVAを輸送する能力の増大をもたらすことができる。サプレッサー変異はアミノ酸置換、例えば、MsbAにおけるアミノ酸の位置番号18での、もしくは位置番号50での、もしくは位置番号283での、もしくは位置番号310での、もしくは位置番号448での変異、またはYhjDにおけるアミノ酸の位置番号134での変異を含みうる。いくつかの態様において、サプレッサー変異は輸送体(例えば、MsbA)の発現の上方制御をもたらし、リピドIVAを輸送する細菌の能力が増大する。サプレッサー変異は上記の例に限定されない。細菌には大腸菌K-12 KPM22、KPM22 L1、KPM22 L11が含まれうる。いくつかの態様において、細菌には大腸菌K-12 KPM22 L13、KPM22 L14、KPM22 L15、KPM22 L18、KPM22 L20が含まれる。いくつかの態様においては、遠縁のグラム陰性細菌種(シュードモナス属など)において、そのネイティブのmsbA遺伝子を野生型の大腸菌msbA遺伝子それ自体で置き換えることができないとしても、大腸菌msbA遺伝子のサプレッサー対立遺伝子を用いることができる。
【００４８】
非復帰変異性菌株
野生型グラム陰性細菌では、O-アシルトランスフェラーゼLpxLおよびLpxMはO-結合脂質をKdo2-リピドIVAに付加し、TLR4/MD-2のアゴニストとして機能する6-アシル脂質を形成させる。Kdoの非存在下において、O-アシルトランスフェラーゼLpxLおよびLpxMは、リピドIVAを基質として用いることができず、O-結合脂質を付加しない。しかしながら、lpxL (LpxLをコードする)またはlpxM (LpxMをコードする)における変異は、酵素の特異性を改変し、トランスフェラーゼがリピドIVAを基質として用いることを可能にし、それによって、TLR4/MD-2のアゴニストとして機能する6-アシル脂質を作製することが可能である。あるいは、変異はlpxPまたはpagPのプロモーターまたはレギュレーターにおいて起こり、これらの通常は存在しないまたは非常に低い存在量のトランスフェラーゼの発現を活性化しうる。あるいは、変異はlpxLまたはlpxMのプロモーターまたはレギュレーターにおいて起こり、これがその過剰発現を活性化しうる。
【００４９】
これらの状況を回避するのに役立つように、本発明の細菌は、以下の遺伝子: lpxL、lpxM、pagP、およびlpxPの1つまたは複数における欠失(例えば部分的な欠失、実質的な欠失など)をさらに含みうる。あるいは、いくつかの態様において、1つまたは複数の酵素(例えば、LpxL、LpxM、PagP、LpxP)が細菌において実質的に不活性化される。いくつかの態様において、リピドAホスホエタノールアミントランスフェラーゼをコードする遺伝子eptAが部分的にまたは実質的に欠失される。いくつかの態様において、細菌は大腸菌K-12 KPM279 (KPM22 ΔlpxL::Km+)、KPM 280 (KPM22 ΔlpxM::Km+)、KPM 288 (KPM22 L1 ΔlpxL::Km+)、KPM 290 (KPM22 L11 ΔlpxL::Km+)、KPM 296 (KPM22 L11 ΔlpxL)、KPM 300 (KPM22 L11 ΔlpxLΔlpxM::Km+)、KPM 303 (KPM22 L11 ΔlpxL ΔlpxM)、KPM310 (KPM22 L11 ΔlpxL ΔlpxM ΔpagP::Km+)、KPM312 (KPM22 L11 ΔlpxL ΔlpxM ΔpagP)、KPM314 (KPM22 L11 ΔlpxL ΔlpxM ΔpagP ΔlpxP::Km+)、KPM316 (KPM22 L11 ΔlpxL ΔlpxM ΔpagP ΔlpxP)、KPM317 (KPM22 L11 ΔlpxL ΔlpxM ΔpagP ΔlpxP ΔeptA::Km+)もしくはKPM 318 (KPM22 L11 ΔlpxL ΔlpxM ΔpagP ΔlpxP ΔeptA)、またはこれらの菌株のさらなる派生株である。
【００５０】
実験用ツール
本発明は同様に、記述の生存可能なグラム陰性細菌に由来する、実験用ツール、試薬、菌株(例えば、基礎菌株、ドナー菌株)などを特徴とする。例えば、いくつかの態様において、本発明の細菌は、細胞外DNAを取り込むようにコンピテントである。いくつかの態様において、細菌はエレクトロコンピテントである。いくつかの態様において、細菌は、抗生物質(例えば、カナマイシン、ペニシリン、ネオマイシン、アンピシリンなど)に対する耐性を与える手段を含む。いくつかの態様において、細菌は、細胞上にハイスループットスクリーニング用のタンパク質を発現するための手段を含む。いくつかの態様において、細菌は研究用および/または治療用および/または診断用の組換えタンパク質を発現するための手段を含む。
【００５１】
細菌は、37℃超で(例えば、42℃で)増殖を可能にする少なくとも1つのさらなるサプレッサー変異を含むことができる。さらなるサプレッサー変異は、例えば、細菌の外膜を安定化することができ、または内膜から離れるような毒性前駆体の輸送を増強することができる。いくつかの態様において、細菌は、37℃超で、例えば約38℃で、約39℃で、約40℃で、約41℃で、約42℃で指数関数的に増殖することができる。
【００５２】
いくつかの態様において、細菌は、37℃超で約30分未満の対数期倍加時間を示す。あるいは、細菌は、37℃超で35分未満または40分未満または約45分未満の対数期倍加時間を示しうる。いくつかの態様において、細菌は、40℃超で約30分未満(または約35分未満または約40分未満または約45分未満)の対数期倍加時間を示す。いくつかの態様において、細菌は、42℃で約30分未満(または約35分未満または約40分未満または約45分未満)の対数期倍加時間を示す。いくつかの態様において、細菌株は大腸菌K-12 KPM296-6である。
【００５３】
いくつかの態様において、さらなるサプレッサー変異は、さまざまな塩濃度で増殖する細菌の能力を改変する(例えば、増強する)ことができる。いくつかの態様において、生存可能なグラム陰性細菌は約0.1 M〜0.9 Mの塩(NaCl)濃度において生存可能である。
【００５４】
ドナー菌株は新しいバリアント菌株を素早く構築する能力をもたらすことができる。ドナー菌株は上記の遺伝子改変の1つまたは複数、例えば、以下の遺伝子の1つにおける部分的または実質的な欠失を含むことができる: lpxL、lpxM、lpxP、pagG、eptA、kdsD、gutQなど。各ドナー欠失構築物は、欠失されたDNA配列に取って代わる選択マーカー遺伝子カセットを有し、このカセットには部位特異的な欠失部位が、これらを後に用いて、対応するリコンビナーゼの菌株への一過的または一時的な導入時に、選択マーカー遺伝子カセットを欠失できるような配向および配列で隣接している。
【００５５】
いくつかの態様において、細菌はさらに、Fプラスミドを含むか、F'プラスミドを含むか、またはF線毛の産生をコードする遺伝子を含む。いくつかの態様において、細菌は、バクテリオファージfd、バクテリオファージM13、またはfdもしくはM13に関連するバクテリオファージを増殖させることができる。いくつかの態様において、DNA制限酵素またはDNAメチル化酵素をコードする遺伝子が変異または欠失している。これによって未改変DNAまたはPCR増幅DNAの形質転換および/またはクローニングの増強を可能にすることができる。いくつかの態様において、recAまたはendAをコードする遺伝子が変異している、部分的に欠失している、または実質的に欠失している。recAのそのような不活性化または欠失は、プラスミドによる形質転換後に単量体プラスミドDNAを主に産生する宿主をもたらす。endAの不活性化はそのような菌株に導入されたプラスミドの超らせんDNAの収量の増加をもたらす。
【００５６】
本発明は同様に、TLR4/MD2受容体のアゴニストであるリガンドを実質的に欠くグラム陰性細菌の外膜を特徴とする。
【００５７】
本発明の細菌はドナー菌株として用いることができる。いくつかの態様において、ドナー菌株は、TLR4/MD2のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に欠く外膜を含むことができる。いくつかの態様において、ドナー菌株は、オープンリーディングフレームの欠失を有する遺伝子を含むDNAカセットを含む。例えば、遺伝子は、lpxL、lpxM、pagP、lpxP、およびeptAからなる群より選択することができる。DNAカセットは、抗生物質に対する耐性を与える手段および/またはリコンビナーゼ成分をさらに含むことができる。
【００５８】
本発明の細菌は、kdsD、gutQ、lpxL、lpxM、pagP、lpxP、およびeptAからなる群より選択される遺伝子の1つまたは複数において特に、操作された遺伝子の欠失の部位に「スカー」DNA配列を保持することができる。「スカー」は部位特異的な組換えによる選択カセットの欠失によって作製される。リコンビナーゼは、FLP、Cre、Int/Xis、Hin、Ginなどからなる群より選択されるものでありうる。作製されたスカーは同一のリコンビナーゼによるその後の組換えに対して活性であってもよく、あるいは、スカーは同一のリコンビナーゼによるさらなる組換え事象に対して不活性であってもよい。選択カセットDNAの欠失により得られる菌株は、類似の選択カセットを用いるさらなる遺伝子欠失のその後の移入のためのレシピエントとして再び使用することができるものであり、したがって、単一の菌株において複数の遺伝子欠失の構築が容易となる。
【００５９】
方法
本発明は同様に、TLR4/MD2のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に欠くグラム陰性細菌であって、40℃超の温度で指数関数的に増殖することができる該細菌を選択する方法を特徴とする。いくつかの態様において、この方法は、TLR4/MD2受容体のアゴニストとして作用するリガンド(例えば、リピドA、6-アシル脂質など)を実質的に欠き、かつ約30℃〜40℃での増殖を可能にするサプレッサー変異を有する細菌を、増殖させる段階を含む。この細菌を次に、適切な栄養培地にプレーティングし、42℃でインキュベートすることができる。そのような条件の下で現れる単一のコロニーは、TLR4/MD2のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に欠き、かつ42℃で指数関数的に増殖することができる細菌に相当する。
【００６０】
本発明は同様に、lpxL、lpxM、pagP、lpxP、およびeptAからなる群より選択される遺伝子を実質的に欠く細菌を構築する方法を特徴とする。この方法は、(i) TLR4/MD2のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に欠く外膜および(ii) オープンリーディングフレームの欠失を有する改変された標的遺伝子である改変遺伝子を含むDNAカセットであって、抗生物質に対する耐性を与える手段をさらに含み、かつ部位特異的リコンビナーゼの適切な標的部位にさらに隣接している該DNAカセットを含む生存可能なグラム陰性細菌を得る段階を含む。この方法は、細菌をP1 vir形質導入に供する段階、および標的遺伝子を、改変された耐性カセット遺伝子と相同組換えによって置き換える段階をさらに含む。その後に、部位特異的リコンビナーゼ酵素またはこの酵素をコードするDNAを細胞に導入すると、この酵素は、カセットに隣接している対応する認識部位に作用して組換えを触媒し、染色体にスカー配列のみを残す(以下の実施例3を参照のこと)。あるいは、上記の遺伝子欠失カセットは、「red-gam」相同組換え法(BMC Molecular Biology 2008, 9:20を参照のこと)を介し、PCR増幅された線状型のカセットを用いて、直接的に菌株の染色体に導入してもよい。上記のように、次いで耐性遺伝子をその後、部位特異的な組換え段階を用いて欠失させ、再度「スカー」配列を残す。P1 vir形質導入、線形DNAを用いたred-gam組換え、および部位特異的な組換えはすべて、当業者に周知の技術である。
【００６１】
細菌、例えば大腸菌のようなグラム陰性細菌は、DNAを増幅させるためのまたは関心対象のタンパク質を発現させるための発現システムとしてよく用いられる。場合によっては、細菌から得られ収集されるDNAまたはタンパク質には、細菌の成分、例えばTLR4/MD-2のアゴニストとして作用するリガンド(例えば、リピドA、LPS)が混入していることがある。混入は、哺乳動物宿主細胞株の一過性のトランスフェクション、細胞に基づくスクリーニングアッセイにおいてレポーター株として働く培養哺乳動物細胞の処理などの、さらなる実験および手順に悪影響を及ぼしうる。
【００６２】
本発明は同様に、TLR4/MD-2のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に含まないDNAサンプルを作製する方法を特徴とする。この方法は、TLR4/MD-2のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に欠く外膜を含むグラム陰性細菌を得る段階を含みうる。細菌は一般に、細胞外DNAを取り込むようにコンピテントである。DNAベクターは当業者に周知の標準的な方法を介して細菌に導入することができる。細菌はDNAベクターを増幅するように機能し、細菌を適切な培地中で増殖させることができる。増幅されたDNAサンプルは、当業者に周知の標準的なDNA単離プロトコルによって細菌から収集することができる。DNAの増幅に用いられる細菌は、TLR4/MD-2のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に欠くので、DNAサンプルもリガンドを実質的に欠く。これらの細菌から単離されたDNAは、プラスミドによりコードされるタンパク質の発現のための哺乳動物細胞の一過性のトランスフェクションに特に有用である。プラスミド宿主として利用される通常の大腸菌に由来するLPSは、一過性のトランスフェクション手順からのタンパク質の産生性および収量に悪影響を与えうる。
【００６３】
本発明は同様に、TLR4/MD2のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に含まないタンパク質サンプルを作製する方法を特徴とする。この方法は、TLR4/MD2のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に欠く外膜を含むグラム陰性細菌(細菌は細胞外DNAを取り込むようにコンピテントである)を得る段階、および当業者に周知の標準的なプロトコルによって細菌にDNAベクター発現構築物を導入する段階を含むことができる。DNAベクター発現構築物は、機能的プロモーターから発現される関心対象のタンパク質をコードする遺伝子も選択マーカー遺伝子もともに含む。いくつかの態様において、細菌は、遺伝子 lolA、lolB、またはlppの少なくとも1つにおける変異またはその欠失を含む。
【００６４】
DNAベクター発現構築物で形質転換された細菌を次いで、関心対象のタンパク質を細菌に発現させるように、(例えば、標準的な方法により)増殖させることができる。いくつかの態様において、細菌は関心対象のタンパク質を発現するように誘導される。関心対象のタンパク質を次いで、標準的な方法により細菌から収集することができる。いくつかの態様において、細菌は培地から除去されて、関心対象のタンパク質を培地中に残す。タンパク質発現に用いられる細菌は、TLR4/MD-2のアゴニストとして作用するリガンドを欠くので、タンパク質サンプルもリガンドを実質的に欠く。
【００６５】
ライブラリーはさまざまなタンパク質バリアントをスクリーニングするのに極めて有用なツールである。本発明は同様に、TLR4/MD2のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に含まない細菌のライブラリーを特徴とする。細菌ライブラリーは一連のタンパク質バリアントを発現することができる。いくつかの態様において、細菌ライブラリーは、哺乳動物細胞に基づくアッセイにおいてタンパク質バリアントを活性についてスクリーニングするために用いられるが、しかし、本発明は哺乳動物細胞に基づくアッセイに限定されない。ライブラリーのメンバーは、ファージディスプレイによって、ライブラリーのプロトタイプメンバーを発現するプラスミドベクターの変異誘発によって、または他の標準的な方法によって、作製することができる。
【００６６】
さまざまな試薬、菌株などをキットの形態で提供することができる(または他の試薬、菌株などと組み合わせることができる)。例えば、キットは、TLR4/MD2のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に欠く外膜を有する生存可能なグラム陰性細菌であって、細胞外DNAを取り込むようにコンピテントである該細菌を含むことができる。
【実施例】
【００６７】
以下に提供される例は、本発明をさらに明らかにするための例にすぎず、本発明の範囲を決して限定するものではない。
【００６８】
実施例1: 増殖速度の決定
以下の例では本発明によるさまざまな菌株の増殖速度の測定について記述する。本発明は以下の例に限定されない。菌株の増殖速度は指数関数的に増殖している培養物の600 nmでの細胞密度をモニタリングすることによって決定することができる。新鮮な終夜培養物を、予め加温された培地中で50分の1に希釈し、対数増殖中期(OD600 0.5〜0.6)まで細菌の増殖を継続させることができる。培養物を次いで、予め加温された培地中でOD600約0.005まで再度希釈し、世代時間の決定のために細胞を指数関数的に増殖させ続けることができる。培地はルリア・ベルターニ(Luria-Bertani; LB)培地を含むことができ、10 g/L NaClをさらに含むことができる。図1に示されるように、KPM22 L1、KPM22 L11、KPM22 L13、KPM22 L18、およびKPM22 L20を37℃で増殖させた。KPM22 L1、KPM22 L11、およびKPM22 L18はすべて、約36〜44分の世代時間を有していた。
【００６９】
図2に示されるように、大腸菌株KPM288 (KPM22 L1 ΔlpxL::Km+)および菌株KPM290 (KPM22 L11 ΔlpxL::Km+)を37℃のルリア・ベルターニ(Luria-Bertani; LB)培地中または37℃の、15 μMのD-アラビノース5-リン酸(A5P)および10 μMのD-グルコース6-リン酸(G6P)を補充したLB培地中のいずれかで増殖させた。LB培地での世代時間は以下の通りであるものと計算された: KPM288 45分、KPM290 43分。A5PおよびG6Pを補充したLB培地での増殖の結果は次の通りであった: KPM288は2〜3世代後、指数関数的な増殖が止まった、KPM290 46分。
【００７０】
図3に示されるように、大腸菌株KPM303 (KPM22 L11 ΔlpxL ΔlpxM)をLB培地、15 μM A5Pおよび10 μM G6Pを補充したLB培地、Super Broth (SB)培地(10 g/L NaClを含有する)、または15 μM A5Pおよび10 μM G6Pを補充したSB培地(10 g/L NaClを含有する)中のいずれかで37℃にて増殖させた。SB培地はLB培地と比べてKPM303の増殖速度を改善しなかった。しかしながら、A5PおよびG6Pを補充したLB培地中での増殖とは対照的に、KPM303は、A5PおよびG6Pを補充したSB中で培養された場合、2〜3世代後も指数関数的な増殖をし続けた。
【００７１】
図4に示されるように、大腸菌株KPM303 (KPM22 L11 ΔlpxL ΔlpxM)、KPM312 (KPM22 L11 ΔlpxL ΔlpxM ΔpagP)、およびKPM316 (KPM22 L11 ΔlpxL ΔlpxM ΔpagP ΔlpxP)をSB培地または15 μM A5Pおよび10 μM G6Pを補充したSB中のいずれかで37℃にて増殖させた。SB培地での世代時間は以下の通りであった: KPM303 54分、KPM312 50分、KPM316 46分。A5PおよびG6Pを補充したSB培地での世代時間は以下の通りであった: KPM303 39分、KPM312 42分、KPM316 42分。
【００７２】
図5に示されるように、大腸菌株KPM316を10 mM MgSO4および2 mM CaCl2を補充したSB培地または10 mM MgSO4、2 mM CaCl2、15 μM A5P、および10 μM G6Pを補充したSB培地中のいずれかで37℃にて増殖させた。KPM316は、10 mM MgSO4および2 mM CaCl2を含むSB中で51分の世代時間を有した。KPM316は、10 mM MgSO4、2 mM CaCl2、15 μM A5P、および10 μM G6Pを含むSB中で46分の世代時間を有した。
【００７３】
図6に示されるように、大腸菌株KPM316およびKPM318を、SB培地中または15 μM A5P、および10 μM G6Pを補充したSB培地中のいずれかで37℃にて増殖させた。KPM316およびKPM318はこれらの培地中で39〜44分の世代時間を示した。
【００７４】
実施例2: 温度耐性菌株の作製
以下の例では、KPM296の温度耐性派生株の作製について記述する。本発明は以下の例に限定されない。37℃でLB培地中にて増殖させたKPM296の新鮮な終夜培養物を、LB寒天プレートにプレーティングし、42℃でインキュベートすることができる。42℃でのインキュベーションを数日間、例えば4〜5日間続けることができる。42℃でコロニー形成能を有するクローンが現れうる(KPM296の42℃耐性派生株に相当する)。42℃耐性菌株は42℃のLB寒天プレート上での終夜増殖によって確認することができる。KPM296-6はKPM296の42℃耐性派生株である。
【００７５】
図7に示されるように、大腸菌株KPM296-6およびKPM316 (KPM22 L11 ΔlpxL ΔlpxM ΔpagP ΔlpxP)を10 mM MgSO4および2 mM CaCl2を有するSB中、または10 mM MgSO4、2 mM CaCl2、15 μM A5P、および10 μM G6Pを有するSB中のいずれかで37℃にて増殖させた。10 mM MgSO4および2 mM CaCl2を含むSB培地中でのKPM296-6の増殖速度は48分であった。10 mM MgSO4、2 mM CaCl2、15 μM A5P、および10 μM G6Pを含むSB中では、KPM296-6の増殖速度は42分であった。
【００７６】
図8に示されるように、KPM296から42℃での並行選択より独立的に単離された一連の大腸菌株を42℃にてSB培地中で増殖させた。KPM296-6を含めて、試験したほぼすべての分離株が42℃での指数関数的な増殖を、倍加時間のバラツキは広範でありながらも示す。親菌株KPM296は42℃にてLB培地中またはSB培地中で全く増殖することができなかった。
【００７７】
本方法では、KPM316およびKPM318を用いることによっても、42℃で増殖できる一連の独立した分離株を選択するのに成功した。
【００７８】
実施例3: 菌株構築
以下の例では上記の各種菌株の構築について記述する。本発明はこれらの例に限定されない。lpxL、lpxM、pagP、lpxP、および/またはeptA遺伝子を標的化するカナマイシン耐性カセットを、ファージλRedリコンビナーゼ手順を用いドナー菌株において作製することができ、次いでP1vir形質導入によりKPM菌株へ移入することができる。カナマイシン耐性遺伝子の切り出しは、FLPリコンビナーゼの存在下で行うことができ、温度感受性ヘルパープラスミドpCP20を除去することができる。P1vir形質導入および他のそのような技術は当業者に公知である。
【００７９】
例えば、ΔlpxL::Km+カセットをKPM22において作製し、菌株KPM279 (KPM22 ΔlpxL::Km+)を得ることができる。KPM279をP1vir形質導入によるKPM22 L1へのΔlpxL::Km+カセットの移入用のドナーとして用い、菌株KPM288 (KPM22 L1 ΔlpxL::Km+)を得ることができ、またはP1vir形質導入によるKPM22 L11へのΔlpxL::Km+カセットの移入用のドナーとして用い、菌株KPM290 (KPM22 L1 ΔlpxL::Km+)を得ることができる。
【００８０】
さらに、菌株KPM316 (KPM22 L11 ΔlpxL ΔlpxM ΔpagP ΔlpxP)は、それぞれ、標的化カセットのドナー菌株としてKPM280 (KPM22 ΔlpxM::Km+)、BW30270 ΔlpxP::Km+、およびBW30270 ΔpagP::Km+を用い(以下の順序の)アシルトランスフェラーゼでの連続的欠失によって得ることができる: KPM290 (KPM22 L11 ΔlpxL::Km+) > KPM 296 (KPM22 L11 ΔlpxL) > KPM 300 (KPM22 L11 ΔlpxL ΔlpxM::Km+) > KPM 303 (KPM22 L11 ΔlpxL ΔlpxM) > KPM310 (KPM22 L11 ΔlpxL ΔlpxM ΔpagP::Km+) > KPM312 (KPM22 L11 ΔlpxL ΔlpxM ΔpagP) > KPM314 (KPM22 L11 ΔlpxL ΔlpxM ΔpagP ΔlpxP::Km+) > KPM316 (KPM22 L11 ΔlpxL ΔlpxM ΔpagP ΔlpxP)。
【００８１】
KPM318は、BW30270ΔeptA::Km+でのλRedリコンビナーゼ手順により作製されたΔeptA::Km+のP1vir形質導入によってKPM317 (KPM316 ΔeptA::Km+)をもたらし、これから次に、FLPリコンビナーゼの一過性発現によってKmカセットを取り除くことによりKPM316から得られた。各欠失に隣接するプライマーを用いたPCR増幅を使って、親BW30270由来の対照DNAに対して欠失を確認した(図9)。いずれの場合にも、親菌株は、KPM318において欠失された遺伝子に隣接するプライマーで、より大きなPCR産物を示す。
【００８２】
実施例4: 他の試薬および方法
以下の例では本発明によって使用できる他の試薬および方法について記述する。本発明はこれらの例に限定されない。
【００８３】
内毒素(例えばLPS)の存在を標準的なアッセイによって検出することができる。例えば、HEK-Blue(商標) LPS Detection Kits (Invivogen, San Diego, CA)を用いることができる。このアッセイにおいて、HEK-Blue(商標)-4細胞はLPS (リピドA)に対し極めて感受性であり、わずか0.3 ng/mLのLPS (リピドA)の濃度を検出するために用いることができる。このアッセイは製造元のプロトコルにしたがって行うことができる。
【００８４】
全細胞および同様に細胞の外膜抽出物をHEK-Blue(商標) LPS Detection Kitで試験した。対照の野生型細胞および外膜を親のBW30270から調製し、これらをKPM316およびKPM318由来の細胞および抽出物のサンプルとともに試験した。図10に示した結果から、HEK-Blue(商標) LPSアッセイではわずか2 pgのLPSに応答し、LPS内毒素に対し極めて感受性であることが実証される。KPM316またはKPM318から調製されたサンプルのいずれのシグナルも、アッセイに加えた外膜が20マイクログラムでさえ、本質的にバックグラウンドレベルであり、TLR4/MD2シグナル伝達に対する効力が9桁小さかった。KPM316またはKPM318の全細胞も、4桁低いレベルで著しい応答を示したBW30270の全細胞とは対照的に、試験した最も高いレベルでも著しいシグナルを引き起こすことはできなかった。
【００８５】
KPM316の外膜抽出物のESI-質量スペクトルの分析から、リピドIVAおよびリピドIVA-エタノールアミンに対して予測された顕著な質量が示された(図11パネルA)。KPM318外膜のESI-MSから、エタノールアミントランスフェラーゼがこの菌株から欠失されていたので、予想通り、リピドIVAしか示されなかった(図10パネルA)。
【００８６】
P1vir形質導入は、感染により溶菌相へ入る変異バクテリオファージP1virを介してドナー菌株からレシピエント菌株に遺伝子/対立遺伝子を移動させるために用いられる標準的な方法である。P1 (P1vir)はおよそ90 kbのDNAをパッケージングすることができ、したがって、選択マーカーとともに一般的に用いられる。そのような実験を行うために、ドナー菌株(およびレシピエント菌株)を培養する。次いでP1virをドナー菌株培養物に加えることができ、培養物が完全に溶菌するまでモニタリングすることができる。次いで溶菌物を収集し、レシピエント細胞の培養物に加える。溶菌物とのレシピエント細胞のインキュベーションの後、選択マーカー(したがって関心対象の遺伝子)を有するコロニーを選択するために選択培地にレシピエント細胞をプレーティングする。
【００８７】
大腸菌K-12菌株の完全な配列がBlattner FRら(Science. 1997 Sep 5;277 (5331):1453-62)およびRiley Mら(Nucleic Acids Res. 2006 Jan 5;34(1): 1-9. Print 2006)において提供されている。KPM316菌株の作製は図12に概説されている。msbAの野生型対立遺伝子はmsbA52で置き換えられ、その際に965895位のCがTに置き換えられ、MsbAタンパク質において18番目のアミノ酸のプロリンの代わりにセリンをもたらす(図12a)。以下が親菌株から欠失された: ΔgutQ (図12b)、ΔkdsD (図12c)、ΔlpxL (図12d)、ΔlpxM (図12e)、ΔpagP (図12f)、およびΔlpxP (図12g)。KPM316配列を野生型菌株MG1655のそれと比較した(図13)。これらの変異の機能は未知である。
【００８８】
KPM318菌株の作製は図14に概説されている。msbAの野生型対立遺伝子はmsbA52で置き換えられ、その際に965895位のCがTに置き換えられ、MsbAタンパク質において18番目のアミノ酸のプロリンの代わりにセリンをもたらす(図14a)。以下が親菌株から欠失された: ΔgutQ (図14b)、ΔkdsD (図14c)、ΔlpxL (図14d)、ΔlpxM (図14e)、ΔpagP (図14f)、ΔlpxP (図14g)、およびΔeptA (図14f)。作製された菌株の例は表1に提供されている。
【００８９】
KPM318およびBW30270菌株はIllumina DNA配列決定装置を用いてScripps Core DNA配列決定施設で配列決定された。配列は40または60塩基の、両末端からの読み出し(paired end reads)を用いて作製された。DNAサンプルを各菌株から調製し、末端タグ化ライブラリーを作製するために用いた。参照レーンのほか、1レーンごとに最大で6つのライブラリーを流した。他のレーンはさらに関連性のないDNAの読み出しのために用い、これをさらなる内部対照として役立てた。単一ヌクレオチド多型(SNP)は参照ゲノム、つまりBlattnerのMG1655菌株との比較時にScripps分析プログラムによって100%変異体であると規定されるすべての単一塩基変化をさす。欠失/挿入多型(DIP)は、この場合も先と同様にMG1655を参照として用い、Scripps分析プログラムによって規定されるすべての欠失または挿入(最大で6 bp)をさす。読み出しの100%で検出されたものだけが提供される。全遺伝子欠失は別個の配列アライメントによって独立的に確認された。KPM318配列を野生型菌株BW30270の配列と比較した(図15)。配列決定によりmsbA-P18Sサプレッサー対立遺伝子が特定されたが、これはオリジナルのKPM菌株に存在することが以前に確立されていた(図14および15)。菌株の操作によって導入されたすべての既知の変化が100%の頻度で存在することが分かった。これは操作されたすべての欠失および点変異にも当てはまった。
【００９０】
より頑強な菌株を特定するために、KPM318の温度耐性派生株を単離した。37℃にてLB培地中で増殖させたKPM318の終夜培養物をLB寒天プレートにプレーティングし、42℃でインキュベートした。42℃で4〜5日間のプレートの継続的インキュベーションの後にだけ、高温でのコロニー形成能を取り戻したいくつかのクローンが得られた。無作為に選択したクローンの42℃耐性表現型を42℃、LB寒天プレート上での終夜増殖によって確認した。KPM318の一連の独立的な、非クローン性42℃耐性派生株が特定された。計24個の温度耐性KPM318派生株のなかで、菌株KPM318-9、KPM318-10、KPM318-19およびKPM318-23は、SB培地(図16、18および20)中、または15 μMのD-アラビノース5-リン酸(A5P)および10 μMのD-グルコース6-リン酸(G6P)を補充したSB培地中にて回復されたLPS生合成の条件下(図17、19および21)のいずれかで30℃、37℃および42℃の温度にて指数関数的に増殖することができる、最良の増殖特性を示した。それゆえ、これらの温度耐性菌株はある範囲の温度にわたって頑強な増殖特性を示す。
【００９１】
KPM318-9、KPM318-10、KPM318-19およびKPM318-23菌株は、Scripps Core DNA配列決定施設にてIllumina DNA配列決定装置を用いて配列決定された(図22)。42℃での菌株の生存可能性の主な原因となりうる特異的な変異が特定された。菌株KPM318-9およびKPM318-10は、リボソームリサイクリング因子を変化させるfrr-D61Y変異を発現する(図22aおよび22b)。KPM318-19菌株は、伸長因子Pをコードするefpにおいてフレームシフト変異を有する(図22c)。KPM318-23菌株は、デオキシシチジンデアミナーゼ遺伝子をコードするdcdにおいてP146およびL147の欠失を有する(図22d)。これらの変異の特異的機能は未知である。
【００９２】
KPM318-9、KPM318-10、KPM318-19およびKPM318-23菌株のLPS/リピドIVA組成を分析した。培養物(各2.5 L)を、LB培地またはA5P/G6Pを補充したLB培地中のいずれかにて静止期にまで42℃で増殖させた。LPS/リピドIVAを、A5P/G6Pを有するLB培地中で増殖させた菌株の場合にはオリジナルのフェノール-クロロホルム-石油エーテル(PCP)手順またはLBのみの培地で増殖させた菌株の場合には改変PCPプロトコルのいずれかを用いて各菌株の乾燥バイオマスから抽出した。次いで抽出物をESI FT-ICR質量分析に供した。LB培地中で増殖させたKPM318-23菌株は42℃でリピドIVA (1404.86 uでのピーク)を主に発現する(図23)。42℃耐性KPM318派生株を、A5P/G6Pを補充したLB培地中で増殖させた場合には、大腸菌K-12コアオリゴ糖の生合成が回復された。テトラアシル化前駆体リピドIVAと付着してはいたが、すべての菌株において異なるグリコフォームの類似混合物の発現が認められた(図24〜26)。A5P/G6Pを補充したLB培地中37℃で増殖させた親菌株KPM318から単離されたLPSを、これらすべての実験の対照として用いた(図27)。KPM318によって発現された異なるグリコフォームのいくつかの分子量が割り当て可能であり、表2に示されている。総合すれば、KPM318の42℃耐性派生株の全LPS/リピドIVA組成はK-12コアに典型的な不均一のオリゴ糖組成に関していずれの特性も示さなかった。これらの菌株のすべての外膜調製物はリピドAを示さなかった; それらはリピドIVAを含むだけであった。
【００９３】
LB/SB培地またはA5P/G6Pを補充したLB/SB培地中のいずれかで増殖させた各種KPM菌株から単離されたLPS/リピドIVAと細菌細胞の両方の生物学的活性を、HEK-Blue LPS検出アッセイ(InvivoGen)を用いて調べた。この検出アッセイ用の細菌細胞の調製のため、各菌株の終夜培養物1 mlを遠心分離によって沈降し、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)中で洗浄した。細菌細胞を殺処理するために、ペレットをその後、10×濃縮ペニシリン-ストレプトマイシン(Pen-Strep)のDPBS溶液1 mlに再懸濁した。混合物を室温で2時間インキュベートし、4℃で終夜保存した。同時に、終夜培養物の連続希釈液を終夜培養物/Pen-Strep殺処理細胞の細胞数(cfu/ml)の計算のために調製した。菌株のPen-Strep懸濁液を10×濃縮Pen-StrepのDPBS溶液中で108 cfu/mlに希釈し、懸濁液の連続希釈液を次に、10×濃縮Pen-StrepのDPBS溶液中で調製して107、106、105、104、103、102および101 cfu/mlの細菌細胞懸濁液を得た。菌株BW30270、KPM316およびKPM318由来の細菌細胞懸濁液の連続希釈液を用いた典型的なHEK-Blue LPS検出アッセイを図28に示す。対照菌株BW30270と比べて、LB培地中で増殖させたKPM316およびKPM318菌株由来の細菌細胞懸濁液のLPS活性は皆無かそれに近い。A5P/G6Pを補充した培地中で増殖させたKPM316およびKPM318菌株の活性にはわずかな増加が認められる。KPM316およびKPM318菌株から単離されたLPS/リピドIVAサンプルの連続希釈液によって誘導されるNFκB活性化は皆無かそれに近い(図29)。
【００９４】
LBのみの培地およびA5P/G6Pを補充したLB培地中42℃で増殖させた温度耐性菌株KPM318-9から単離されたLPS/リピドIVAの生物学的活性を、BW30270、KPM316およびKPM318由来のLPS/リピドIVAサンプルがHEK-Blue細胞においてNFκB活性化を誘導する能力と比較した。菌株BW30270をLB培地中37℃で増殖させ、その一方で、菌株KPM316およびKPM318は、LB培地またはA5P/G6Pを含有するLB培地中のいずれかで37℃にて培養した。KPM318-9の潜在的なアンタゴニスト活性を調べるために、KPM318-9から単離された一定量のLPS/リピドIVA(256 pg)を逓減量のBW30270由来LPSと混合した。LPM318-9由来のLPS/リピドIVAは、高濃度で存在する場合に、このアンタゴニストと競合するBW30270の能力によって実証される通りLPS活性の強力なアンタゴニストである(図29、レーン9〜12)。
【００９５】
ヒトTNF-α ELISAを、LB培地またはA5P/G6Pを含有するLB培地中のいずれかで37℃にて増殖させたKPM316およびKPM318菌株から単離されたLPS/リピドIVAで行った(図30〜32)。大腸菌K-235から単離されたS-LPSを陽性対照として用いた。Biocoll (密度: 1.077 g/mL)を用いて血液を分離した。単核細胞(MNC)を単離し、Hanks中で2回およびVLE RPMI中で1回洗浄した。M-CSFを含むTeflonバッグ中で単球をインキュベートすることによって単球をマクロファージへ分化させた。マクロファージを7日後に収集した。細胞の数を決定した。マクロファージを平底96ウェルプレートの中に、VLE RPMI + 100 U ペニシリン + 100 μg/ml ストレプトマイシン + 2 mM L-グルタミン + 4% AB-血清 (および血清不含)中1×105個の細胞/ウェルで播種した。LPS/リピドIVAサンプルをKPM316およびKPM318菌株から単離し、37℃および5% CO2にて30分間プレインキュベートした。S-LPS K-235をサンプルに4時間加えた。上清を除去し、4℃で終夜保存した。ELISAを行ってTNF-α活性を評価した(BD Biosciences #555212)。AB-血清不含VLE RPMI中でのLPSサンプルの連続希釈液を調製した。KPM318 LPS LB、KPM316 LPS LB、KPM318 LPS LBAG、およびKPM316 LPS LBAGを20 mM HEPES, pH 7.0中にて1 mg/mlで調製した。次いで100 ug/mL〜1 ng/mLの連続希釈液を調製した。プレートを、コーティング用緩衝液(PBS)中で250分の1希釈した捕捉用抗体でコーティングした。プレートを終夜撹拌し、その後、洗浄用緩衝液で3回洗浄した。プレートをアッセイ希釈液180 μl/ウェルでブロッキングし、室温で1時間撹拌した。プレートを洗浄用緩衝液で3回洗浄した。
【００９６】
サンプルをアッセイ希釈液中で希釈し、標準物質の連続希釈液を以下のように調製した。
1:212 = 500 pg/ml
1:2   = 250 pg/ml
1:2   = 125 pg/ml
1:2   = 62,5 pg/ml
1:2   = 31,25 pg/ml
1:2   = 15,6 pg/ml
1:2   = 7,8 pg/ml
1:2   = 3,9 pg/ml
プレートを室温で2時間、標準物質、サンプルおよびブランクとともに撹拌した。プレートを洗浄用緩衝液で3回洗浄した。検知溶液および検出用抗体(ビオチン化抗ヒトTNF-α)をプレートに1000分の1で加えた。酵素試薬(ストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体)を250分の1で加えた。プレートを室温で1時間撹拌し、その後、洗浄用緩衝液で3回洗浄した。プレートを基質用緩衝液中のTMB (20分の1)とともに暗所中で撹拌した。ウェルが青くなるまで、最低限30分間プレートをインキュベートした。50 μl/ウェルのH2SO4で反応を停止した。450 nmで吸光度を測定した。陽性対照K-235から単離されたLPS/リピドIVAは、試験したすべての濃度でTNF-α活性を強力に増加させた(図30)。KPM316およびKPM318菌株由来のLPS/リピドIVAは、試験したすべての濃度でK-235に由来するLPSによるTNF-αの誘導を阻害することが可能であった(図30); それゆえ、KPM316およびKPM318菌株から単離されたLPS/リピドIVAはLPS活性の強力なアンタゴニストである。4% AB-血清を含有する培地中で増殖させたKPM316およびKPM318菌株由来のLPS/リピドIVAは、マクロファージからのTNF-αの放出を阻害することが可能であった(図31)。無血清培地中で増殖させたKPM316およびKPM318菌株由来のLPS/リピドIVAは、マクロファージからのTNF-αの放出を阻害することが可能であった(図32)。それゆえ、KPM316およびKPM318菌株から単離されたLPS/リピドIVAはTNF-α活性の強力な阻害剤である。
【００９７】
LPSはヒト細胞においてTLR4受容体の活性化によりその炎症機能を及ぼすことが知られている。HEK293 hTLR4/MD2 #33細胞(図33)およびHEK293 hTLR4 #2細胞(図34)からのIL-8の放出を評価することにより、KPM316およびKPM318菌株由来のLPS/リピドIVAの生物学的活性を評価した。hTLR4/MD2 #33細胞はLPS結合に応答して、シグナルを生ずるのに対し、HEK293 hTLR4 #2細胞はペプチドグリカンに応答し、LPSに応答しない。それゆえ、後者の細胞株を用いて、LPS特異性を評価することができる。K-235菌株由来のS-LPSをこれらのアッセイにおける陽性対照として用いた。HEK293 hTLR4/MD2 #33細胞培地は、Pen/Strep/Gluおよび10% FCSを補充したDMEM (Biochrom)であった。ウェルの中に播種されたのは1ウェルあたりHEK293 hTLR4/MD2 #33細胞50,000個であった。細胞を24時間の間、LPS/リピドIVAサンプルの存在下で刺激し、その後、ヒトIL-8放出の測定を行った(BD Biosciences #555244)。KPM316およびKPM318菌株由来のLPS/リピドIVAは、HEK293 hTLR4/MD2 #33細胞からのIL-8の放出を遮断することが可能であった(図33)。これらの菌株由来のLPS/リピドIVA抽出物は、HEK293 hTLR2 #2細胞からのIL-8の放出を促進することが可能であったことから、粗抽出物であった(図34)。TLR2は、サイトカインシグナル伝達を引き起こしうる別の細菌成分であるペプチドグリカンの受容体である。遊離ペプチドグリカンの存在量は、これが通常は微量成分であるため、LPSのレベルよりも典型的にはかなり低い。ここでは、これを使って、抽出物には、細胞の外膜-周辺質に由来する材料が実際に含有されることを実証する。というのは、細胞の外膜-周辺質は、ペプチドグリカンが位置する場所であるからである。TLR4/MD2を過剰発現するHEK細胞(細胞株#33)はLPS結合に応答し、すなわち、IL-8を放出した(図33)のに対し、ペプチドグリカンに応答するTLR2を過剰発現するHEK細胞(細胞株#2)はLPSに応答しない(図34)。それゆえ、この対照から、どちらの場合にも外膜抽出物由来の何かがアッセイに実際に加えられていたことが確実である。
【００９８】
異種遺伝子を過剰発現するKPM318-9、KPM318-10、KPM318-19およびKPM318-23菌株の能力を評価した。標準的な増殖および誘導条件の下で大量に細胞質および周辺質MalEタンパク質バリアントを発現するこれらの菌株の能力を調べるためのモデルタンパク質としてMalE-LacZα融合タンパク質を用いた。BW30270、KPM318、KPM318-9、KPM318-10、KPM318-19およびKPM318-23菌株を、それぞれ、細胞質MalE-LacZα(図35、上パネル)および周辺質MalE-LacZα(図35、下パネル)の発現のために、プラスミドpMAL-c2およびpMAL-p2でそれぞれ形質転換した。以下の菌株が得られた。
BW30270/pMAL-c2 (対照)
KPM318/pMAL-c2
KPM318-9/pMAL-c2
KPM318-10/pMAL-c2
KPM318-19/pMAL-c2
KPM318-23/pMAL-c2
BW30270/pMAL-p2 (対照)
KPM318/pMAL-p2
KPM318-9/pMAL-p2
KPM318-10/pMAL-p2
KPM318-19/pMAL-p2
KPM318-23/pMAL-p2
0005977678.tif 000002
の発現を誘導するために、培養物がOD600およそ0.6の対数増殖中期に達した時点で
0005977678.tif 000003
を終濃度0.4 mMまで加えた。プラスミドpMAL-c2を保有する菌株の場合、細胞を誘導の前(非誘導)、誘導3時間後、および終夜誘導後に収集した。プラスミドpMAL-p2を有する菌株の場合、サンプルを非誘導細胞から、ならびに3時間、6時間、12時間、および24時間の誘導時間後に採取した。培地中にMalE-LacZαタンパク質を分泌する能力を、対照としてpMAL-c2菌株を用い、pMAL-p2プラスミドを保有する菌株についてさらに調べた。BugBuster試薬を製造元の推奨(Novagen)にしたがって用い、タンパク質抽出物を調製した。MalE (NEB)に対するモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロット分析を行って、MalE-LacZα発現を検出した。
【００９９】
MalE-LacZαの発現レベルはpMAL-c2菌株では誘導3時間後の時点で、ならびにpMAL-p2菌株では誘導3時間後および6時間後の時点で最も高かった(図36〜42)。MalE-LacZαの発現は菌株KPM318、KPM318-9およびKPM318-10において一貫して最も高く、BW30270野生型対照とほぼ同一の発現レベルを示した(図36〜42)。予想通り、クマシーブルー染色ポリアクリルアミドゲルでも免疫ブロットでも、プラスミドpMAL-c2を保有する菌株の培地中のMalE-LacZαは、タンパク質の細胞質発現のために検出されなかった(図36〜42)。対照的に、pMAL-p2菌株の培地中のMalE-LacZαタンパク質の存在量は、IPTG誘導の時間の増加とともに明らかに増加した。これはすべてのKPM変異体に当てはまっただけでなく、BW30270野生型菌株にも当てはまった(図36〜42)。培地中のMalE-LacZαの存在がKPM菌株での損なわれた外膜の結果としてのタンパク質の分泌の結果であるのか、または単に、本研究において用いられた実験条件下でのタンパク質の周辺質過剰発現による細胞溶菌の結果であるのかは不明である。MBPは大腸菌において高度に発現されることが公知である。KPM18温度耐性派生株は野生型の対照菌株BW30270に類似のタンパク質発現レベルを示した。これらの菌株は、細胞溶菌がなくてもタンパク質の回収を可能にする、野生型菌株よりも容易にMBPを分泌または漏出する。
【０１００】
ヒトApoA1タンパク質を産生するKPM318およびその温度耐性派生株の能力を調べた。company DNA 2.0により大腸菌のコドン用法について最適化されたapoA1遺伝子が合成され、pJexpress404中のTn5プロモーターの制御下にクローニングされた。ApoA1の周辺質発現のため、その遺伝子を大腸菌の主要な外膜プロテインAに対するompAのリーダー配列に融合させた。さらに、apoA1遺伝子の細胞質型も周辺質型もともに、6×His:タグコード配列にC末端融合させた。菌株を細胞質ApoA1 (図43、上パネル)および周辺質ApoA1 (図43、上パネル)の発現のために、それぞれ、pJexpress404:51149およびpJexpress404:51150で形質転換した。いくつかの試みにもかかわらず、菌株KPM318-23はpJexpress404:51149およびpJexpress404:51150発現ベクターで形質転換することができなかった。以下の菌株が得られた。
1. BW30270/pJexpress404:51149 (対照)
2. KPM318/pJexpress404:51149
3. KPM318-9/pJexpress404:51149
4. KPM318-10/pJexpress404:51149
5. KPM318-19/pJexpress404:51149
6. BW30270/pJexpress404:51150 (対照)
7. KPM318/pJexpress404:51150 
8. KPM318-9/pJexpress404:51150
9. KPM318-10/pJexpress404:51150
10. KPM318-19/pJexpress404:51150
培養物を、100 μg/mlアンピシリンを含有するSB培地5 ml中にて37℃で終夜増殖させた。終夜培養物(50分の1)を、100 μg/mlアンピシリンを含有する予め加温されたSB培地40 ml中で希釈した。培養物を37℃で増殖させ、OD600およそ0.6まで250 rpmで撹拌した。各菌株に対する細胞数(cfu/ml)を決定した(表3)。非誘導培養物を6,000 rpm (4℃)で10分間遠心分離した。さらなる分析のために各pJexpress404:51150-培養上清のアリコット1 mlを得た。1 mlの培養上清および細胞ペレットを凍結し、-80℃で保存した。IPTGを培養物に(終濃度0.4 mMで)加えた。細胞を37℃でインキュベートし、250 rpmで3時間撹拌した。各菌株に対する細胞数(cfu/ml) (表4)を評価した。3時間の誘導後、各培養物5 mlを取り出した。
1. BW30270/pJexpress404:51149 - 誘導(3時間)
2. KPM318/pJexpress404:51149 - 誘導(3時間)
3. KPM318-42C 9/pJexpress404:51149 - 誘導(3時間)
4. KPM318-42C 10/pJexpress404:51149 - 誘導(3時間)
5. KPM318-42C 19/pJexpress404:51149 - 誘導(3時間)
6. BW30270/pJexpress404:51150 - 誘導(3時間)
7. KPM318/pJexpress404:51150 - 誘導(3時間)
8. KPM318-42C 9/pJexpress404:51150 - 誘導(3時間)
9. KPM318-42C 10/pJexpress404:51150 - 誘導(3時間)
10. KPM318-42C 19/pJexpress404:51150 - 誘導(3時間)
誘導培養物を6,000 rpm (4℃)で10分間遠心分離した。さらなる分析のために各pJexpress404:51150-培養上清のアリコット1 mlを得た。1 mlの培養上清および細胞ペレットを-80℃で保存した。誘導を37℃および250 rpmで継続した。各培養物に対する細胞数(cfu/ml)を誘導6時間後の菌株で決定した(表5)。各培養物のアリコット3 mlを誘導6時間後に取り出した。
1. BW30270/pJexpress404:51149 - 誘導(6時間)
2. KPM318/pJexpress404:51149 - 誘導(6時間)
3. KPM318-42C 9/pJexpress404:51149 - 誘導(6時間)
4. KPM318-42C 10/pJexpress404:51149 - 誘導(6時間)
5. KPM318-42C 19/pJexpress404:51149 - 誘導(6時間)
6. BW30270/pJexpress404:51150 - 誘導(6時間)
7. KPM318/pJexpress404:51150 - 誘導(6時間)
8. KPM318-42C 9/pJexpress404:51150 - 誘導(6時間)
9. KPM318-42C 10/pJexpress404:51150 - 誘導(6時間)
10. KPM318-42C 19/pJexpress404:51150 - 誘導(6時間)
誘導培養物を6,000 rpm (4℃)で10分間遠心分離した。さらなる分析のために取り出したのは、各pJexpress404:51150培養上清のアリコット1 mlであった。1 mlの培養上清および細胞ペレットを凍結し、-80℃で保存した。誘導を37℃および250 rpmで継続した。細胞数(cfu/ml)を誘導12時間後の各菌株について決定した(表6)。各培養物のアリコット2 mlを12時間の誘導後に取り出した。
1. BW30270/pJexpress404:51149 - 誘導(12時間)
2. KPM318/pJexpress404:51149 - 誘導(12時間)
3. KPM318-42C 9/pJexpress404:51149 - 誘導(12時間)
4. KPM318-42C 10/pJexpress404:51149 - 誘導(12時間)
5. KPM318-42C 19/pJexpress404:51149 - 誘導(12時間)
6. BW30270/pJexpress404:51150 - 誘導(12時間)
7. KPM318/pJexpress404:51150 - 誘導(12時間)
8. KPM318-42C 9/pJexpress404:51150 - 誘導(12時間)
9. KPM318-42C 10/pJexpress404:51150 - 誘導(12時間)
10. KPM318-42C 19/pJexpress404:51150 - 誘導(12時間)
誘導培養物を6,000 rpm (4℃)で10分間遠心分離した。さらなる分析のために得たのは、各pJexpress404:51150-培養上清1 mlであった。1 mlの培養上清および細胞ペレットを凍結し、-80℃で保存した。誘導を37℃および250 rpmで継続した。各菌株に対する細胞数(cfu/ml)を誘導24時間後に決定した(表7)。24時間の誘導後に取り出したのは各培養物1 mlであった。
1. BW30270/pJexpress404:51149 - 誘導(24時間)
2. KPM318/pJexpress404:51149 - 誘導(24時間)
3. KPM318-42C 9/pJexpress404:51149 - 誘導(24時間)
4. KPM318-42C 10/pJexpress404:51149 - 誘導(24時間)
5. KPM318-42C 19/pJexpress404:51149 - 誘導(24時間)
6. BW30270/pJexpress404:51150 - 誘導(24時間)
7. KPM318/pJexpress404:51150 - 誘導(24時間)
8. KPM318-42C 9/pJexpress404:51150 - 誘導(24時間)
9. KPM318-42C 10/pJexpress404:51150 - 誘導(24時間)
10. KPM318-42C 19/pJexpress404:51150 - 誘導(24時間)
培養物を6,000 rpm (4℃)で10分間誘導した。pJexpress404:51150-培養上清をさらなる分析のために得た。1 mlの培養上清および細胞ペレットを凍結し、-80℃で保存した。非誘導細胞および誘導細胞を融解し、すべての細胞ペレットを1×BugBuster 300 μlに再懸濁した。サンプルに加えられたのは20 mg/mlのリゾチーム溶液3 μlおよびベンゾナーゼ0.5 μlであった。サンプルを振盪しながら室温で20分間インキュベートした。サンプルを20分間14,000 rpm (4℃)で遠心分離した。1×Bug Busterは以下を含有する。
10×濃縮BugBuster 1 ml
1 M Tris-HCl, pH 7.5 (20 mM Tris-HCl, pH 7.5) 200 μl
2-メルカプトEtOH (5 mM 2-メルカプトEtOH) 3.5 μl
【０１０１】
ヒトApoA1タンパク質の細胞質型も周辺質型もともに、12% SDS-PAGEによって分析した場合に、大腸菌株BW30270、KPM318、KPM318-9およびKPM318-10において発現されていたが、KPM318-19においては発現されていなかった(図44〜49)。29 kDaのバンドの見掛け上の相対分子量は、C末端ヒスチジンタグに融合されたタンパク質の算出質量(29.4 kDa)に一致していた。著しくは、周辺質に発現されたApoA1は、29 kDaおよび31 kDaの見掛け上の相対分子量を有する2本のバンドとして移動し、後者は31.4 kDaの非プロセッシングApoA1の算出質量と一致していた(図47および48)。ApoA1は大腸菌の細胞質に可溶性および不溶性タンパク質の混合物として発現されることがこれまでに明らかにされており、このことは、ApoA1の非プロセッシング型と推定されるものが、周辺質中のその最終目的地への輸送およびプロセッシングに到達できないタンパク質の不溶性画分を構成することを示唆している。しかしながら、本発明者らは、現在、より遅い移動性のバンドの出現がSDS-PAGE前の2分間の95℃でのサンプル調製の結果であるという可能性を排除することができない。いずれにせよ、これらの結果から、KPM菌株におけるApoA1の発現速度はBW30270におけるのと少なくとも同じくらい速く、少なくとも6時間の一定レベルを示したことが示唆される。
【０１０２】
MalE-LacZαで行われた実験とは対照的に、SDS-PAGE分析のための培地の容量は、ポリアクリルアミドゲル上に負荷された培養上清の量が全く同一のOD600値に由来するようにpJexpress404:51150保有細胞の光学密度(OD600)に関して調整された(表8〜12)。驚くべきことに、図50中の菌株KPM318-10/pJexpress404:51150で十分にまた同じように示された通り、すべての温度耐性菌株の光学細胞密度は増加したが、生存細胞の数はIPTG誘導の全期間にわたって減少した(表3〜7)。図51〜53に示されるように、pJexpress404:51150プラスミドを保有する菌株は、ApoA1を培地中に分泌することができなかった。弱いクマシー染色バンドはむしろ、細胞抽出物のタンパク質バンド形成パターンと似ており、したがって、細胞溶菌に由来する可能性が最も高かった。Penta-His抗体(QIAGEN)での免疫ブロットを用いることにより、本発明者らは、SDS-PAGE分析のすべての所見を確証することができた(図54〜62)。総合すれば、本発明者らのデータから、42℃耐性KPM318派生株KPM318-9およびKPM318-10はタンパク質発現に適した宿主であることが示唆される。細菌増殖、誘導およびサンプル調製のための条件の最適化は、関心対象のタンパク質の発現速度および収量をさらに改善するはずである。
【０１０３】
細胞のDNA形質転換能を評価した。エレクトロコンピテント細胞の調製のため、培養物を激しく振盪(220 rpm)させながら37℃で対数増殖中期(OD600 = 0.5〜0.7)まで増殖させた。細胞をその後、氷冷水で3回および氷冷10%グリセロールで2回洗浄した。最後に、細胞沈殿物を少量の氷冷10%グリセロールに再懸濁し、-80℃で保存するために50 μlのアリコットを調製した。最初に、本発明者らは、pMAL-c2によるKPM318の形質転換に及ぼす、回復されたK-12コアオリゴ糖生合成の影響を調べた。菌株BW30270を対照としてLB培地中で増殖させた一方で、KPM318を、LB培地およびA5P/G6Pを含有するLB培地中で培養した。菌株BW30270、KPM318 (LB)およびKPM318 (LB A5P/G6P)が、それぞれ、0.621、0.613および0.519の光学密度(OD600)に到達した時点で、エレクトロコンピテント細胞の調製のために細胞を収集した。形質転換のために全く同一の数のエレクトロコンピテント細胞を用いるために、本発明者らは、各菌株のコンピテント細胞1ミリリットルあたりのコロニー形成単位を決定した(表13)。
【０１０４】
KPM318 (LB)およびKPM318 (LB A5P/G6P)のエレクトロコンピテント細胞を氷冷10%グリセロールで7.3×108 cfu/mlに希釈し(3.65×107 cfu/50 μl)、プラスミドpMAL-c2 25 ngでそれぞれ形質転換した(図35)。形質転換混合物を連続的に希釈し、100 μg/mlのアンピシリンを含有するLB寒天プレートにプレーティングし、37℃でインキュベートした。表14中の結果は、菌株BW30270、KPM318 (LB)およびKPM318 (LB A5P/G6P)が同様の効率で形質転換されたことを実証する。このデータは、LBのみの培地中での増殖時に外膜においてリピドIVAを主に発現するKPM318 (図11)が、回復されたコアオリゴ糖生合成の条件の下でBW30270またはKPM318よりも高い効率で形質転換されなかったことをさらに示している。
【０１０５】
各菌株について無作為に選択した4つの形質転換体からのプラスミドpMAL-c2を37℃および200 rpmにて、100 μg/mlのアンピシリンを含有するLB培地中で増殖させた5 mlの終夜培養物から単離した。Wizard Plus Minipreps DNA Purification System (Promega)を用いてプラスミドを単離した。1 μlのサンプルをその後、TBE緩衝液中0.8%のアガロースゲル上で泳動した(図63)。電気泳動の結果から、プラスミドpMAL-c2の収量が大腸菌株BW30270/pMAL-c2、KPM318 (LB)/pMAL-c2、およびKPM318 (LB A5P/G6P)/pMAL-c2に対して明らかにほぼ同一であることが示唆された。
【０１０６】
次の段階として、42℃耐性KPM318派生株KPM318-9、KPM318-10、KPM318-19およびKPM318-23をプラスミドpMAL-c2およびpMAL-p2でそれぞれ形質転換した(図35)。細胞をSB培地中37℃で増殖させ、KPM318-9、KPM318-10、KPM318-19およびKPM318-23が、それぞれ、0.618、0.596、0.491および0.702の光学密度(OD600)に到達した時点でエレクトロコンピテント細胞の調製のために収集した。エレクトロコンピテント細胞をpMAL-c2 25 ngおよびpMAL-p2 25 ngでそれぞれ形質転換した。形質転換混合物の連続希釈液を次いで、100 μg/mlのアンピシリンを有するLB寒天プレートにプレーティングし、37℃でインキュベートした。42℃耐性KPM318菌株の形質転換効率は表15にまとめられている。KPM318-9、KPM318-10およびKPM318-19菌株は高い効率で形質転換されたが、プラスミドpMAL-c2およびpMAL-p2を取り込むKPM318-23の能力は、ほんのわずかにすぎなかった。事実、後者の結果は、プラスミドpJexpress404:51149およびpJexpress404:51150でKPM318-23を形質転換できないことと一致していた。
【０１０７】
Wizard Plus Minipreps DNA Purification Systemを製造元の推奨(Promega)にしたがって用い、KPM318-9/pMAL-c2、KPM318-9/pMAL-p2、KPM318-10/pMAL-c2、およびKPM318-10/pMAL-p2について無作為に選択した2つの形質転換体の5 mlの終夜培養物からプラスミドpMAL-c2およびpMAL-p2を単離した。サンプル(各1 μl)をTBE緩衝液中0.8%のアガロースゲル上で泳動した(図64)。最後に、単離されたプラスミドの収量を、上記のタンパク質発現試験に後に用いたそれらの菌株について決定した(表16)。総合すれば、高い形質転換効率も、標準的なミニプレップ培養から得られたプラスミドDNAの許容される収量も、KPM318-9およびKPM318-10がプラスミドDNA産生菌株の開発に適した「基礎菌株」であることを示唆している。
【０１０８】
ファージディスプレイライブラリーに由来するタンパク質のスクリーニングの用に供されるKPM「基礎菌株」を開発するためには、菌株はM13ファージによる感染を可能とするためにF'プラスミドを有しなくてはならない。本発明者らは、試験管接合(tube mating)プロトコルによりBW30270、KPM318、KPM318-9、KPM318-10、KPM318-19、およびKPM318-23にF'121 Tn10プラスミドを移入するためのドナー菌株として大腸菌JC19022 (F'121 Tn10)を用いた。培養物を激しく振盪(220 rpm)させながら培地5 ml中にて37℃で終夜増殖させた。JC19022 (F'121 Tn10)には10 μg/mlのテトラサイクリンを含有するLB培地を用い、BW30270にはLB培地を用い、KPM318およびその温度耐性派生株にはA5P/G6Pを補充したLB培地を用いた。終夜培養物の以下の希釈を、終夜増殖に用いたのと同じ培地を用いてセットアップした。
ドナー:       25 μl → 5 ml
50 μl → 5 ml
100 μl → 5 ml
200 μl → 5 ml
レシピエント: 25 μl → 5 ml
50 μl → 5 ml
100 μl→ 5 ml
200 μl → 5 ml
サンプルをおよそ2〜3時間37℃で激しく(220 rpm)振盪した。懸濁液(1 ml)の光学密度(OD600)を記録した。最適なOD600の範囲は0.08〜0.2である; 利用できる選択肢があるなら0.1に最も近いOD600での希釈を用いなくてはならない(これはドナーおよびレシピエント培養物にも当てはまる)。ドナー菌株の培地からテトラサイクリンを除去するために、培養物を遠心分離しなければならず、細胞ペレットをLB培地4 mlに再懸濁しなければならない。移入のために比率1:1のドナー:レシピエントを用いる。ドナー希釈液の希釈を決定し、これに500を乗じる。この値をレシピエントのOD600で除して、ドナー500 μlに加えるμl単位でのレシピエントの量を得る。ドナー培養物(500 μl)を適切な量のレシピエント培養物とともにインキュベートする(表17および18)。接合培養物を撹拌なしで2時間37℃でインキュベートする。培養物を次いで、さらに2時間37℃でインキュベートし、220 rpmで撹拌する。サンプルを激しくボルテックスして、接合対を破壊する。各接合に対してPBS (室温にまで予め加温された)中10-1、10-2、10-3、および10-4の希釈液を調製し、各々の非希釈および希釈接合培養物100 μlを、1 μg/mlのチアミンおよび10 μg/mlのテトラサイクリンを含有するM9寒天プレートに加えた。培養物を37℃でインキュベートした。潜在的な接合完了体を、1 μg/mlのチアミンおよび10 μg/mlのテトラサイクリンを含有するM9寒天プレート上に画線し、37℃でインキュベートした。試験管接合実験により、すべてのレシピエント菌株に対していくつかの潜在的な接合完了体が得られた。潜在的な接合完了体のサブセットをその後、ΔlpxPノックアウト変異の存在についてPCRにより調べて、偽陽性クローンとテトラサイクリン耐性KPM菌株とを区別した。図65に示されるように、試験したすべてのテトラサイクリン耐性KPM318接合完了体はΔlpxPノックアウト変異を含有し、このことから、KPM菌株へのF'121 Tn10プラスミドの移入の成功が示唆された。lpxP PCRを用いることにより、本発明者らはまた、必要とされるΔlpxPノックアウト変異を含んだ、KPM318-9、KPM318-10、KPM318-19およびKPM318-23のいくつかの潜在的なF'121 Tn10接合完了体を特定することができた。
【０１０９】
KPM318およびその42℃耐性派生株におけるF'121 Tn10プラスミドの存在の証拠を提供するために、ならびに接合完了体がM13に感染しやすいことを示すために、各菌株について無作為に選択した接合完了体4つを感染させるために、M13KO7ヘルパーファージを用いた。M13KO7は、M13複製起点のなかにともに挿入された、P15A由来の複製起点およびTn903由来のカナマイシン耐性遺伝子を含むので、感染後のカナマイシン耐性クローンの発現はM13KO7に所与の菌株が感染しやすいことの表れである。10 μg/mlのテトラサイクリンを含有するLB培地中の大腸菌JC19022 (F'121 Tn10)およびBW30270 (F'121 Tn10)、ならびに10 μg/mlのテトラサイクリンおよびA5P/G6Pを有するLB培地中のKPM318 (F'121 Tn10)および42℃耐性KPM318 (F'121 Tn10) 派生株の終夜培養物をセットアップした。BW30270およびKPM318菌株を対照として、それぞれ、LB培地およびA5P/G6Pを補充したLB培地中で増殖させた。培養物を37℃で激しく撹拌した(220 rpm)。以下の菌株および潜在的な接合完了体を増殖させた。
1. BW30270 (対照)
2. KPM318 (対照)
3. JC19022 (F'121 Tn10) (対照)
4. BW30270 (F'121 Tn10)-1
5. BW30270 (F'121 Tn10)-2
6. BW30270 (F'121 Tn10)-3
7. BW30270 (F'121 Tn10)-4
8. KPM318 (F'121 Tn10)-4
9. KPM318 (F'121 Tn10)-6
10. KPM318 (F'121 Tn10)-7
11. KPM318 (F'121 Tn10)-8
12. KPM318-9 (F'121 Tn10)-1
13. KPM318-9 (F'121 Tn10)-2
14. KPM318-9 (F'121 Tn10)-3
15. KPM318-9 (F'121 Tn10)-4
16. KPM318-10 (F'121 Tn10)-1
17. KPM318-10 (F'121 Tn10)-3
18. KPM318-10 (F'121 Tn10)-4
19. KPM318-10 (F'121 Tn10)-5
20. KPM318-19 (F'121 Tn10)-3
21. KPM318-19 (F'121 Tn10)-4
22. KPM318-19 (F'121 Tn10)-5
23. KPM318-19 (F'121 Tn10)-6
24. KPM318-23 (F'121 Tn10)-1
25. KPM318-23 (F'121 Tn10)-2
26. KPM318-23 (F'121 Tn10)-3
27. KPM318-23 (F'121 Tn10)-5
BW30270およびJC19022 (F'121 Tn10)の終夜培養物をLB培地3 ml (100分の1)中で増殖させ、KPM318および潜在的な接合完了体を、A5P/G6Pを補充したLB培地3 ml (50分の1)中で培養した。培養物を激しく振盪(280 rpm)させながら37℃で対数増殖初期まで増殖させた。懸濁液のOD600の決定のためにアリコット1 mlを取り出した(表19)。
【０１１０】
M13KO7感染実験によりKPM318およびその温度耐性派生株のすべての潜在的な接合完了体に対するカナマイシン耐性コロニーが得られた(表20)。カナマイシン耐性コロニーの数は菌株によってかなり違ったが、この結果から、(i) KPM菌株へのプラスミドF'121 Tn10の接合性移入が成功であった、および(ii) 菌株はM13感染をうけやすくなったことが示唆される。これは温度耐性KPM318派生株におけるファージディスプレイライブラリーの作製のための根本的な基盤となるはずである。
【０１１１】
大腸菌XL1-Blue由来のsupE44遺伝子をBW30270、KPM318およびその42℃耐性派生株に移入した。BW30270、KPM318およびその派生株におけるsupE44の選択を容易にするために、ヘルパープラスミドpMAK705 Km耐性 CATMUTを構築した(図66)。第一に、プラスミドpKD4のカナマイシン耐性遺伝子を、プライマー5BamHIKm耐性および3HindIIIKm耐性を用いて増幅し、その後、BamHIおよびHindIIIによるPCR産物の消化を行った。第二に、BamHI/HindIII消化したPCR産物を温度感受性プラスミドpMAK705のBamHI/HindIII部位にクローニングして、pMAK705 Km耐性を得た。最後に、位置番号10のコドンACCを、Change-IT Mutagenesis System (USB)による部位特異的変異誘発法においてプライマーCATamberおよびCATwtreverseを用いTAG (amber)ナンセンスコドンに置き換えた。
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cat遺伝子へのamberナンセンスコドンの導入を検証するため、大腸菌株TOP10およびXL1-BlueをプラスミドpMAK705 Km耐性 CATMUTで形質転換した。得られた菌株TOP10/pMAK705 Km耐性 CATMUTおよびXL1-Blue/pMAK705 Km耐性 CATMUTをLB + 30 μg/mlカナマイシンプレートおよびLB + 30 μg/mlカナマイシン + 15 μg/mlクロラムフェニコールプレートの両方に画線した(図67)。glnVの野生型対立遺伝子を保有するTOP10/pMAK705 Km耐性 CATMUTとは対照的に、XL1-Blue/pMAK705 Km耐性 CATMUT菌株はLB + 30 μg/mlカナマイシン + 15 μg/mlクロラムフェニコールプレート上で増殖することができ、supE44によるナンセンス変異の抑制を示唆するものであった(図67)。
【０１１２】
実施例5: KPM由来ΔendA ΔrecA菌株の構築
ΔrecA::Km耐性菌株KPM348、KPM349、KPM350、KPM351およびKPM352はそれぞれ、KPM343、KPM344、KPM345、KPM346およびKPM347に対応するΔendA菌株に由来するものであった。本実施例において用いられる場合のΔは、欠失を意味する。ΔrecA::Km耐性標的化カセットは、本質的には他のノックアウト変異の構築について記述したようにP1vir形質導入によってKPM343、KPM344、KPM345、KPM346およびKPM347に移入した。
1. ΔrecA::Km耐性変異を保有する大腸菌株BW26547を、形質導入用のドナーとして用いた。菌株は大腸菌遺伝子貯蔵センター(E.coli Genetic Stock Center)から得た。
2. ファージP1virを、30 μg/mlカナマイシンを有するLB培地中37℃で増殖させたBW26547に対し繁殖させて、ΔrecA::Km耐性形質導入溶菌液を得た。
3. 形質導入のため、ΔendAレシピエント菌株KPM343、KPM344、KPM345、KPM346およびKPM347を、A5P/G6Pを補充したLB培地中37℃で増殖させた。
4. 形質導入は標準的なプロトコルにしたがい、30 μg/mlカナマイシンを含有するLB寒天プレート上37℃で潜在的な形質導入体を選択して行った。
5. recAとgutQの距離は約6 kb (理論上の同時形質導入率: 約82%)にすぎず、したがって潜在的なカナマイシン耐性形質導入体を
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およびKPM菌株において欠失されたgutQ遺伝子の両方の存在についてPCRにより試験した。
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6. 結果として、ΔrecA::Km耐性およびオリジナルのΔgutQ変異を含有する菌株KPM348、KPM349、KPM350、KPM351およびKPM352が得られた。
7. カナマイシン耐性遺伝子をpCP20による一過性の形質転換を用い除去して、菌株KPM353、KPM354、KPM355、KPM356、およびKPM357を得る。
8. 上記のrecAプライマーはΔrecA最終菌株におけるKanR挿入断片の除去を特定するのに役立つ。
【０１１３】
実施例6: 大腸菌株の名称指定
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【０１１４】
以下の特許の以下の開示は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる: WIPO出願番号2007/084633。本明細書において引用される参考文献および刊行物は、これらの参考文献が本発明と一致する程度まで参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０１１５】
本発明のさまざまな修正は、本明細書において記述されるものに加えて、先述の記述から当業者に明らかであろう。そのような修正も添付の特許請求の範囲に入るように意図される。本出願において引用される各参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０１１６】
本発明の好ましい態様が示され記述されてきたが、添付の特許請求の範囲を超えない修正を本発明に加えられることが当業者には容易に明らかであろう。それゆえ、本発明の範囲は当然ながら以下の特許請求の範囲によって限定されるのみである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
0005977678.tif 000012
【図４】
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【図５】
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【図６】
0005977678.tif 000015
【図７】
0005977678.tif 000016
【図８】
0005977678.tif 000017
【図９】
0005977678.tif 000018
【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
0005977678.tif 000020
【図１１】
0005977678.tif 000021
【図１２ａ】
0005977678.tif 000022
【図１２ｂ】
0005977678.tif 000023
【図１２ｃ】
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【図１２ｄ】
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【図１２ｅ】
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【図１２ｆ】
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【図１２ｇ】
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【図１３】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１４ｃ】
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【図１４ｄ】
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【図１４ｅ】
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【図１４ｆ】
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【図１４ｇ】
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【図１４ｈ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２ａ】
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【図２２ｂ】
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【図２２ｃ】
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【図２２ｄ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【図８８−１】
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【図８８−２】
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【図８８−３】
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【図８９】
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【図９０】
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【図９１】
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【図９２Ａ】
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【図９２Ｂ】
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【配列表】
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