(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象への第１免疫原性組成物および第２免疫原性組成物の投与によって該対象に免疫原に対する免疫応答を初回免疫し、追加免疫する方法において使用するための製品であって、該製品は、
（ａ）レンチウイルスベクター粒子を含む第１免疫原性組成物であって、該レンチウイルスベクター粒子が、アルファウイルスエンベロープと、該免疫原またはその免疫原性断片をコードするレンチウイルスベクターゲノムとを含む、第１免疫原性組成物、ならびに
（ｂ）（ｉ）少なくとも該免疫原またはその免疫原性断片および（ｉｉ）ＴＬＲ４アゴニストを含む第２免疫原性組成物
を含み、ここで、該方法において、該第１免疫原性組成物は、該第２免疫原性組成物の前に、または、該第２免疫原性組成物と同時に投与される、製品。
【請求項２】
対象に免疫原に対する免疫応答を初回免疫し、追加免疫する方法において使用するための製品であって、該製品は、
レンチウイルスベクター粒子を含む第１免疫原性組成物であって、該レンチウイルスベクター粒子が、アルファウイルスエンベロープと、該免疫原またはその免疫原性断片をコードするレンチウイルスベクターゲノムとを含む、第１免疫原性組成物
を含み、ここで、該方法は、（ｉ）少なくとも該免疫原またはその免疫原性断片および（ｉｉ）ＴＬＲ４アゴニストを含む第２免疫原性組成物の前に、または、該第２免疫原性組成物と同時に、該第１免疫原性組成物を該対象に投与することを含む、製品。
【請求項３】
対象に免疫原に対する免疫応答を初回免疫し、追加免疫する方法において使用するための製品であって、該製品は、
（ｉ）少なくとも該免疫原またはその免疫原性断片および（ｉｉ）ＴＬＲ４アゴニストを含む第２免疫原性組成物
を含み、ここで、該方法は、レンチウイルスベクター粒子を含む第１免疫原性組成物であって、該レンチウイルスベクター粒子が、アルファウイルスエンベロープと、該免疫原またはその免疫原性断片をコードするレンチウイルスベクターゲノムとを含む、第１免疫原性組成物の投与後に、または、該第１免疫原性組成物の投与と同時に、該対象に該第２免疫原性組成物む投与することを含む、製品。
【請求項４】
前記第１免疫原性組成物は少なくとも２回投与で投与されるか、または前記第２免疫原性組成物は少なくとも２回投与で投与される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用するための製品。
【請求項５】
前記第１免疫原性組成物および前記第２免疫原性組成物は同時に投与され、そして２回投与で投与される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用するための製品。
【請求項６】
前記ＴＬＲ４アゴニストは、以下の構造：
【化１】
0006054942.tif 000007
の化合物であり、ここで、式中、Ａ１とＡ２は、水素、ホスフェート、およびリン酸塩の群より独立して選択され、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、Ｃ３〜Ｃ２３で表される３〜２３個の炭素を有するヒドロカルビル基から独立して選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用するための製品。
【請求項７】
Ａ１はホスフェートまたはリン酸塩であり、Ａ２は水素であり、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はウンデシルであり、Ｒ２およびＲ４はトリデシルである、請求項６に記載の使用するための製品。
【請求項８】
前記化合物は、安定な水中油型乳剤中に製剤されている、請求項６または７に記載の使用するための製品。
【請求項９】
前記免疫原は、（ａ）腫瘍関連抗原であるか、または（ｂ）ウイルス、細菌、真菌、および寄生虫から選ばれる感染性微生物に由来する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用するための製品。
【請求項１０】
前記免疫原は、腎細胞癌抗原、前立腺癌抗原、中皮腫抗原、膵癌抗原、メラノーマ抗原、乳癌抗原、肺癌抗原、および卵巣癌抗原から選ばれる腫瘍関連抗原である、請求項９に記載の使用するための製品。
【請求項１１】
前記免疫原は、前立腺酸性ホスファターゼ、前立腺特異的抗原、ＮＫＸ３．１、前立腺特異的膜抗原、ＰＲＡＭＥ、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、Ｌａｇｅ（ＮＹ‐ＥＳＯ‐１としても知られる）、ＳＡＧＥ、ＨＡＧＥ、ＧＡＧＥ、Ｐｌｕ‐１、ＨＡＳＨ‐１、ＨａｓＨ‐２、Ｃｒｉｐｔｏ、Ｃｒｉｐｔｉｎ、ＭＡＲＴ‐１／Ｍｅｌａｎ‐Ａ、ｇｐ１００、ｇｐ７５、ｍｄａ‐７、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質、ｐ５３、Ｒａｓ、ｃ‐Ｍｙｃ、Ａ‐Ｒａｆ、Ｂ‐ＲａｆおよびＣ‐Ｒａｆ、ＭＡＧＥ‐Ａ１、ＭＡＧＥ‐Ａ２、ＭＡＧＥ‐Ａ３、ＭＡＧＥ‐Ａ４、ＭＡＧＥ‐Ａ６、ＭＡＧＥ‐Ａ１０、ＭＡＧＥ‐Ａ１２、ＭＡＲＴ‐１、ＢＡＧＥ、ＤＡＭ‐６、‐１０、ＧＡＧＥ‐１、ＧＡＧＥ‐２、ＧＡＧＥ‐８、ＧＡＧＥ‐３、ＧＡＧＥ‐４、ＧＡＧＥ‐５、ＧＡＧＥ‐６、ＧＡＧＥ‐７Ｂ、ＮＡ８８‐Ａ、ＭＡＲＴ‐１、ＭＣ１Ｒ、Ｇｐ１００、ＰＳＭ、ＴＲＰ‐１、ＴＲＰ‐２、ＡＲＴ‐４、ＣＡＭＥＬ、ＣＥＡ、Ｃｙｐ‐Ｂ、ｈＴＥＲＴ、ｈＴＲＴ、ｉＣＥ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＰＲＡＭＥ、Ｐ１５、ＲＵ１、ＲＵ２、ＳＡＲＴ‐１、ＳＡＲＴ‐３、ウィルムス腫瘍抗原（ＷＴ１）、ＡＦＰ、β‐カテニン／ｍ、カスパーゼ‐８／ｍ、ＣＥＡ、ＣＤＫ‐４／ｍ、ＥＬＦ２Ｍ、ＧｎＴ‐Ｖ、Ｇ２５０、ＨＳＰ７０‐２Ｍ、ＨＳＴ‐２、ＫＩＡＡ０２０５、ＭＵＭ‐１、ＭＵＭ‐２、ＭＵＭ‐３、ミオシン／ｍ、ＳＡＲＴ‐２、ＴＲＰ‐２／ＩＮＴ２、７０７‐ＡＰ、アネキシンＩＩ、ＣＤＣ２７／ｍ、ＴＰＩ／ｍｂｃｒ‐ａｂｌ、ＢＣＲ‐ＡＢＬ、インターフェロン調節因子４（ＩＲＦ４）、ＥＴＶ６／ＡＭＬ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、Ｐｍｌ／ＲＡＲ、腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー１（ＴＡＣＳＴＤ１）ＴＡＣＳＴＤ２、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲおよびＥＧＦＲｖＩＩＩ）、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、インテグリン結合キナーゼ（ＩＬＫ）、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５、ＳＴＡＴ６、ＨＩＦ‐１、ＨＩＦ‐２、核内因子κＢ（ＮＦ‐κＢ）、Ｎｏｔｃｈ１〜４、ｃ‐Ｍｅｔ、ラパマイシンの哺乳類の標的（ｍＴＯＲ）、ＷＮＴ、ＰＭＳＡ、ＰＲ‐３、ＭＤＭ２、メソテリン、腎臓細胞癌-５Ｔ４、ＳＭ２２‐α、炭酸脱水酵素Ｉ（ＣＡＩ）およびＩＸ（ＣＡＩＸ）（Ｇ２５０としても知られる）、ＳＴＥＡＤ、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＧＤ２、プロテイナーゼ３、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＥｐｈＡ２、ＭＬ‐ＩＡＰ、ＥｐＣＡＭ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、ＡＬＫ、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ポリシアル酸、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＧＤ３、フコシルＧＭ１、メソテリアン、ＰＳＣＡ、ｓＬｅ、ＰＬＡＣ１、ＧＭ３、ＢＯＲＩＳ、Ｔｎ、ＧＬｏｂｏＨ、ＮＹ‐ＢＲ‐１、ＲＧｓ５、ＳＡＲＴ３、ＳＴｎ、ＰＡＸ５、ＯＹ‐ＴＥＳ１、スパーム・プロテイン１７、ＬＣＫ、ＨＭＷＭＡＡ、ＡＫＡＰ‐４、ＳＳＸ２、ＸＡＧＥ１、Ｂ７Ｈ３、レグマイン、ＴＩＥ２、Ｐａｇｅ４、ＭＡＤ‐ＣＴ‐１、ＦＡＰ、ＭＡＤ‐ＣＴ‐２およびｆｏｓ関連抗原１である、請求項９に記載の使用するための製品。
【請求項１２】
前記免疫原はウイルス由来である、請求項９に記載の使用するための製品。
【請求項１３】
前記ウイルスは単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ‐２）である、請求項１２に記載の使用するための製品。
【請求項１４】
前記レンチウイルスベクター粒子はヌクレオチド配列を抗原提示細胞に送達する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の使用するための製品。
【請求項１５】
前記抗原提示細胞は樹状細胞であり、好ましくはＤＣ‐ＳＩＧＮを発現する樹状細胞である、請求項１４に記載の使用するための製品。
【請求項１６】
前記エンベロープは、配列番号１と比較して少なくとも１つのアミノ酸変化を有するアミノ酸配列を含むシンドビスウイルスＥ２糖タンパク質を含む、請求項１５に記載の使用するための製品であって、配列番号１の残基１６０は存在しないかグルタミン酸以外のアミノ酸であり、該Ｅ２糖タンパク質は、シンドビスウイルスＥ３タンパク質に融合されていない、使用するための製品。
【請求項１７】
前記Ｅ２糖タンパク質は、樹状細胞特異的細胞間接着分子‐３結合ノンインテグリン（ＤＣ‐ＳＩＧＮ）に結合する、請求項１６に記載の使用するための製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本特許出願は、２０１１年４月８日に出願された米国特許仮出願第６１／４７３，６６０号の優先権を主張するものであり、この米国特許仮出願は、参照によりその全体が組み込まれる。
【０００２】
配列表に関する表明
本願に関連する配列表は紙のコピーの代わりにテキスト形式で提供され、ここに参照することにより本明細書に組み込まれる。配列表を格納したテキストファイルの名称は「４６４４１Ａ＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」である。このテキストファイルは１６３，８４０バイトであり、作成日は２０１２年４月６日であり、ＥＦＳ‐Ｗｅｂを介して電子的に提出される。
【背景技術】
【０００３】
技術分野
本開示は、概して、免疫原に対して特異的な免疫応答を亢進する方法に関し、この免疫応答の亢進は、少なくとも２つの組成物で対象を免疫して、免疫原に対する体液性免疫応答および細胞性免疫応答を誘発することにより行われる。
【０００４】
関連技術の説明
宿主の免疫系は、病原微生物に対する防御応答を迅速かつ特異的に開始する手段を提供し、また、悪性腫瘍の拒絶に寄与する手段を提供する。免疫応答は、一般に、分化Ｂリンパ球が抗原に特異的な抗体を産生する体液性応答、および様々な機序により種々のＴリンパ球が抗原を排除する細胞媒介性応答を含むものと説明されている。例えば、特定の抗原を認識する能力のあるＣＤ４（ＣＤ４＋とも呼ばれる）ヘルパーＴ細胞は、サイトカイン等の可溶性メディエーターを放出して、免疫系のさらなる細胞を動員し免疫応答に参加させることにより、応答することができる。ＣＤ８（ＣＤ８＋とも呼ばれる）細胞傷害性Ｔ細胞も特定の抗原を認識する能力があり、抗原を有している細胞または粒子に結合して、この細胞または粒子を破壊するか損傷させることができる。特に、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を含む細胞媒介性免疫応答は、腫瘍細胞の除去、および微生物（ウイルス、細菌、寄生虫等）に感染した細胞の除去にとって重要であり得る。
【０００５】
癌には広範囲の疾患が含まれ、世界のおよそ４人に１人が癌に冒されている。ＣＴＬ応答は効果的な癌ワクチンの重要特性であるが、効果的なＣＤ４Ｔ細胞支援も、増殖性ＣＤ８ Ｔ細胞活性化で重要な役割を果たすことが見込まれ、よって臨床的有用性を提供することが見込まれる。最近、転移性去勢抵抗性前立腺癌の治療用の、自己由来の樹状細胞（ＤＣ）をベースにしたワクチンであるシプロイセルＴ（ＰＲＯＶＥＮＧＥ（登録商標））が米国食品医薬局（ＦＤＡ）に承認されたが、この治療に関連する延命効果は中程度の４．１ヶ月であり、改善の必要性は今もなお大きい（例えば非特許文献１を参照）。ポックスウイルスベクターをベースにしたワクチンであるＰｒｏｓｔＶａｃ（登録商標）ＶＦも、フェーズＩＩで有意な延命効果を示している（例えば非特許文献２を参照）。シプロイセルＴ、ＰｒｏｓｔＶａｃ（登録商標）ＶＦ等の能動免疫療法は、去勢抵抗性疾患の最新の標準治療を含む化学療法レジメンと比較して、概して耐容性がよい（例えば非特許文献３;非特許文献４を参照）。これらの臨床的成果は、癌条件において免疫応答を利用して、患者予後を改善でき生存期間を延長できることを実証するものである。
【０００６】
微生物感染に関しては、マラリア、結核、ＨＩＶ‐ＡＩＤＳ、その他のウイルス感染、例えば単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）感染（世界中の外陰部潰瘍の主要原因）等が、世界の健康問題に寄与し続けている。世界各地において、ＨＳＶ‐２の感染が警戒すべき速度で増加している（例えば、Corey et al., J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 35:435 (2004)を参照）。米国の総ＨＳＶ‐２血清有病率は２０％を超えており、発展途上国のＨＳＶ‐２有病率は３０％〜５０％と推定されている。成人がＨＳＶ‐２感染の甚大な苦痛を受けるだけでなく、新生児ＨＳＶ‐２感染の発生率も上昇している。治療した場合でも、ＨＳＶ‐２由来の新生児脳炎の死亡率は１５％を超え、さらに、ＨＳＶ‐２感染した乳児における神経学的疾病は、生存症例の３０〜５０％を占める。ＨＳＶ‐２の流行に付随して、ＨＳＶ‐２感染がＨＩＶ‐１の獲得と伝染のリスクを実質的に高めているという純然たる現実がある。アフリカからのデータによれば、ＨＳＶ‐２感染はＨＩＶ伝染のリスクを７倍も増加させる可能性があり、新規に獲得されたＨＩＶの症例の半分もの数がＨＳＶ‐２感染に直接起因している（例えば、Abu-Raddadet al., PLoS ONE 3(5):e2230 (2008)を参照）。全体的に見て、ＨＳＶ‐２に感染した個体は、ＨＩＶを獲得する相対リスクが２倍強増加する。
【０００７】
薬理学的介入が広範に使用されているにもかかわらず、成人および小児の集団におけるＨＳＶ‐２感染は増加し続けている。感染早期に抗ウイルス薬を高用量で与えると、ＨＳＶ伝染を減少させることができるが、潜伏感染を防止することはない（例えば、Corey et al., Sex Transm. Dis. 12:215 (1985)を参照）。近年の実験では、早期介入にもかかわらず、バラシクロビルを用いた連続した抑制的投与で低減したＨＳＶ伝染の割合は５０％未満であった（例えば、Coreyet al., N. Engl. J. Med. 350:11 (2004)を参照）。抗ウイルス薬に代わる方法、例えば局所用殺菌薬等は、臨床的に立証されていない。こうした理由から、主要権威者の多くは、ＨＳＶ‐２疾患の健康影響を減少させるにはワクチン投与が不可欠であると考えている。
【０００８】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、単純ヘルペスウイルス、マラリア、抗生物質耐性菌等の感染症微生物に対して強い体液性応答および／または細胞媒介性応答を誘発することは、予防の成功および感染治療にとって重要であり、こうした感染症微生物に対抗するワクチン（改良ワクチンを含む）の必要性が存在する。加えて、癌ワクチン効力の改善に向けた大きな可能性と必要性が存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Kantoff, et al., New Engl. J. Med.(2010)363(5):411
【非特許文献２】Kantoff, et al., J. Clin. Oncol.(2010)28(7):1099
【非特許文献３】Petrylak, et al.,N. Engl. J. Med.(2004)351(15):1513
【非特許文献４】Sylwester, etal., J. Exp. Med.(2005)202(5):673
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本明細書において、免疫原性組成物、これらの免疫原性組成物の調製物、ならびに、１つ以上の免疫原および関連抗原に対して特異的な免疫応答を誘発するための、これらの調製物および組成物の使用方法を提供する。１つの実施形態では、対象に免疫応答を誘発する方法を提供し、この方法は、（ａ）少なくとも第１免疫原を含む第１免疫原性組成物を少なくとも１回の投与で対象に投与し、この少なくとも１つの免疫原は、第１指定抗原に対して特異的な免疫応答を誘発する能力を有し；および（ｂ）第１免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを含む第２免疫原性組成物を、少なくとも１回投与で対象に投与することを含み、これにより、第１指定抗原に対して特異的な免疫応答を誘発する。特定の実施形態では、（ｉ）第１免疫原性組成物はアジュバントをさらに含み；（ｉｉ）第２組成物はアジュバントをさらに含み；または（ｉｉｉ）第１組成物と第２組成物の各々がアジュバントをさらに含む。ある実施形態では、第２免疫原性組成物は、第１免疫原性組成物の投与の後に投与される。他のある実施形態では、第２免疫原性組成物は、第１免疫原性組成物の投与の前に投与される。さらに別のある実施形態では、第１免疫原性組成物および第２免疫原性組成物は同時に投与される。特別な実施形態では、第１免疫原性組成物は少なくとも２回投与で投与されるか、または第２免疫原性組成物は少なくとも２回投与で投与される。さらに他の実施形態では、第１免疫原性組成物は（ａ）２回投与；（ｂ）３回投与；（ｃ）４回投与；または（ｄ）５回投与で投与される。別の実施形態では、２回以上で投与される場合、（ａ）第１免疫原性組成物の各投与は、第２免疫原性組成物の投与より前に投与されるか；（ｂ）第１免疫原性組成物の少なくとも１回の投与は、第２免疫原性組成物の投与の後に投与されるか；（ｃ）第１免疫原性組成物の少なくとも１回の投与は、第２免疫原性組成物の投与と同時に投与されるか；（ｄ）第１免疫原性組成物の少なくとも１回の投与は、第２免疫原性組成物の投与より前に投与され、第１免疫原性組成物の残りの投与の各々は、第２免疫原性組成物の投与の後に投与されるか；または（ｅ）第１組成物の各投与は、第２組成物と同時に投与される。これらの方法および実施形態の各々に関して、第１免疫原が誘発する免疫応答は、第１指定抗原に対して特異的なＣＤ４Ｔ細胞免疫応答を含み、ある実施形態では、第１免疫原が誘発する免疫応答は、第１指定抗原に対して特異的なＣＤ８ Ｔ細胞免疫応答を含み、他のある実施形態では、第１免疫原が誘発する免疫応答は、第１指定抗原に対して特異的なＣＤ４Ｔ細胞免疫応答およびＣＤ８ Ｔ細胞免疫応答を含む。
【００１１】
上記および本明細書に記載の方法のある実施形態では、第１免疫原性組成物は第２免疫原をさらに含み、組換え発現ベクターは第２免疫原をコードするヌクレオチド配列をさらに含み、第２免疫原は第２指定抗原に対して特異的な免疫応答を誘発する。ある特定の実施形態では、第１指定抗原と第２指定抗原は同一である。他のある特定の実施形態では、第１指定抗原と第２指定抗原は互いに異なる。上記および本明細書に記載の方法のある他の実施形態では、組換え発現ベクターは、第２指定抗原に対して特異的な免疫応答を誘発する能力のある第２免疫原をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。ある特定の実施形態では、第１指定抗原と第２指定抗原は同一である。他のある特定の実施形態では、第１指定抗原と第２指定抗原は互いに異なる。このような方法に関する特定の実施形態では、第１免疫原が誘発する免疫応答は、第１指定抗原に対して特異的なＣＤ４Ｔ細胞応答を含む。このような方法に関する特定の実施形態では、第２免疫原が誘発する免疫応答は、第２指定抗原に対して特異的なＣＤ８ Ｔ細胞応答を含む。
【００１２】
上記および本明細書に記載の方法の特定の実施形態では、１つ以上の免疫原性組成物がアジュバントを含む場合、アジュバントは無毒性リピドＡ関連アジュバントである。ある特定の実施形態では、この無毒性リピドＡ関連アジュバントはグルコピラノシルリピドＡ（ＧＬＡ）であり；より特定の実施形態では、ＧＬＡは安定な水中油型乳剤中で製剤化される。
【００１３】
上記および本明細書に記載の方法の他の特定の実施形態では、第１指定抗原は、（ａ）腫瘍関連抗原であるか、または（ｂ）ウイルス、細菌、真菌、および寄生虫から選ばれる感染性微生物に由来する。より特別な実施形態では、第１指定抗原は、腎細胞癌抗原、前立腺癌抗原、中皮腫抗原、膵癌抗原、メラノーマ抗原、乳癌抗原、肺癌抗原、および卵巣癌抗原から選ばれる腫瘍関連抗原である。さらにより特別な実施形態では、前立腺癌抗原は、前立腺酸性ホスファターゼ、前立腺特異的抗原、ＮＫＸ３．１、または前立腺特異的膜抗原である。他の特定の実施形態では、第１指定抗原はウイルスに由来する。より特別な実施形態では、ウイルスは単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ‐２）である。ある特定の実施形態では、第１指定抗原は、ＨＳＶ‐２ＵＬ１９ポリペプチドまたはＨＳＶ‐２ ｇＤポリペプチドである。
【００１４】
上記および本明細書に記載の方法の他の特別な実施形態では、第１指定抗原および第２指定抗原に対して特異的な免疫応答を誘発する場合、第１指定抗原と第２指定抗原の各々は、腫瘍関連抗原である。より特別な実施形態では、第１指定抗原と第２指定抗原の各々は、腎細胞癌抗原、前立腺癌抗原、中皮腫抗原、膵癌抗原、メラノーマ抗原、乳癌抗原、肺癌抗原、および卵巣癌抗原から選ばれる。さらにより特別な実施形態では、第１指定抗原と第２指定抗原の各々は、前立腺酸性ホスファターゼ、前立腺特異的抗原、ＮＫＸ３．１、または前立腺特異的膜抗原から選ばれる前立腺癌抗原である。他の特定の実施形態では、第１指定抗原と第２指定抗原の各々は、ウイルス、細菌、真菌、および寄生虫から選ばれる感染性微生物に由来する抗原である。より特別な実施形態では、感染症生物はウイルスであり、より特定の実施形態では、このウイルスは単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ‐２）である。ある実施形態では、第１指定抗原と第２指定抗原の少なくとも一方はＨＳＶ‐２ＵＬ１９ポリペプチドであり、第１指定抗原と第２指定抗原の他方はＨＳＶ‐２ ｇＤポリペプチドである。
【００１５】
上記および本明細書に記載の方法の他の特別な実施形態では、組換え発現ベクターは、レンチウイルスベクターゲノム、ポックスウイルスベクターゲノム、ワクシニアウイルスベクターゲノム、アデノウイルスベクターゲノム、アデノウイルス関連ウイルスベクターゲノム、ヘルペスウイルスベクターゲノム、およびアルファウイルスベクターゲノムから選ばれる。特定の実施形態では、組換え発現ベクターはベクター粒子に組み込まれ、ある特別な実施形態では、このベクター粒子は、組換え発現ベクターを抗原提示細胞に送達する。特別な実施形態では、抗原提示細胞は樹状細胞である。特定の実施形態では、ベクター粒子は、レンチウイルスベクターゲノムを含むレンチウイルスベクター粒子；ポックスウイルスベクターゲノムを含むポックスウイルスベクター粒子；ワクシニアウイルスベクターゲノムを含むワクシニアウイルスベクター粒子；アデノウイルスベクターゲノムを含むアデノウイルスベクター粒子；アデノウイルス関連ウイルスベクターゲノムを含むアデノウイルス関連ウイルスベクター粒子；ヘルペスウイルスベクターゲノムを含むヘルペスウイルスベクター粒子；またはアルファウイルスベクターゲノムを含むアルファウイルスベクター粒子である。より特別な実施形態では、ベクター粒子は、レンチウイルスベクターゲノムを含むレンチウイルスベクター粒子である。さらにより特別な実施形態では、レンチウイルスベクター粒子は、配列番号１と比較して少なくとも１つのアミノ酸変化を有するアミノ酸配列を含むシンドビスウイルスＥ２糖タンパク質を含むエンベロープをさらに含み、この場合、配列番号１の残基１６０は存在しないかグルタミン酸以外のアミノ酸であり、このＥ２糖タンパク質は、シンドビスウイルスＥ３タンパク質を含む融合タンパク質の一部分ではない。さらに特定の実施形態では、Ｅ２糖タンパク質は、樹状細胞特異的細胞間接着分子‐３結合ノンインテグリン（ＤＣ‐ＳＩＧＮ）に結合する。
【００１６】
１つの実施形態では、本明細書において調製物も提供する。１つの実施形態では、この調製物は、（ａ）第１指定抗原に対して特異的な免疫応答を誘発する能力のある少なくとも第１免疫原を含む第１免疫原性組成物と、（ｂ）第１免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを含む第２免疫原性組成物と、を含む。ある特別な実施形態では、第１免疫原が誘発する特異的な免疫応答は、第１指定抗原に対して特異的なＣＤ４Ｔ細胞応答を含む。別の特別な実施形態では、第１免疫原が誘発する特異的な免疫応答は、第１指定抗原に対して特異的なＣＤ８ Ｔ細胞応答を含む。他の特別な実施形態では、第１免疫原が誘発する免疫応答は、第１指定抗原に対して特異的なＣＤ４Ｔ細胞免疫応答とＣＤ８ Ｔ細胞免疫応答を含む。上記および本明細書に記載の調製物の別の実施形態では、これらの調製物は、（ａ）第１指定抗原を有している腫瘍細胞に対して細胞傷害性Ｔリンパ球応答を誘発する際に用いるために提供される。他の特定の実施形態では、上記および本明細書に記載の調製物は、第１指定抗原を有している感染症微生物に対して細胞傷害性Ｔリンパ球応答を誘発する際に用いるために提供される。他の特定の実施形態では、上記および本明細書に記載の調製物は、腫瘍関連抗原を有する複数の腫瘍細胞を含む腫瘍の発生または再発の可能性を低減する際に用いるために提供される。別の実施形態では、これらの調製物は、感染性微生物により引き起こされる感染を防止または治療する際に用いるために提供される。
【００１７】
提供する調製物のさらなる実施形態では、第１免疫原性組成物は第２免疫原をさらに含み、組換え発現ベクターは第２免疫原をコードするヌクレオチド配列をさらに含み、第２免疫原は第２指定抗原に対して特異的な免疫応答を誘発する。１つの特別な実施形態では、第１指定抗原と第２指定抗原は同一である。別の特別な実施形態では、第１指定抗原と第２指定抗原は互いに異なる。上記および本明細書に記載の調製物のさらに他の特別な実施形態では、組換え発現ベクターは、第２指定抗原に対して特異的な免疫応答を誘発する能力のある第２免疫原をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。ある特別な実施形態では、第１指定抗原と第２指定抗原は同一であり、他の特別な実施形態では、第１指定抗原と第２指定抗原は互いに異なる。これらの実施形態では、第１免疫原が誘発する特異的な免疫応答は、第１指定抗原に対して特異的なＣＤ４Ｔ細胞応答を含む。また、これらの調製物の実施形態に関して、第２免疫原が誘発する免疫応答は、第２指定抗原に対して特異的なＣＤ８ Ｔ細胞応答を含む。
【００１８】
上記および本明細書で提供する調製物の実施形態に関して、（ａ）第１免疫原性組成物はアジュバントをさらに含み、（ｂ）第２免疫原性組成物はアジュバントをさらに含み、または（ｃ）第１免疫原性組成物と第２免疫原性組成物の各々がアジュバントをさらに含む。より特別な実施形態では、アジュバントは無毒性リピドＡ関連アジュバントである。さらにより特別な実施形態では、無毒性リピドＡ関連アジュバントはグルコピラノシルリピドＡ（ＧＬＡ）であり、特別な実施形態では、このＧＬＡは安定な水中油型乳剤中で製剤化される。
【００１９】
上記および本明細書で提供する調製物の実施形態に関して、第１指定抗原は、（ａ）腫瘍関連抗原であるか、または（ｂ）ウイルス、細菌、真菌、および寄生虫から選ばれる感染性微生物に由来する。特別な実施形態では、第１指定抗原は、腎細胞癌抗原、前立腺癌抗原、中皮腫抗原、膵癌抗原、メラノーマ抗原、乳癌抗原、肺癌抗原、および卵巣癌抗原から選ばれる腫瘍関連抗原である。より特別な実施形態では、前立腺癌抗原は、前立腺酸性ホスファターゼ、前立腺特異的抗原、ＮＫＸ３．１、または前立腺特異的膜抗原である。他の特別な実施形態では、第１指定抗原はウイルスに由来する。より特別な実施形態では、ウイルスは単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ‐２）である。さらに別の特別な実施形態では、第１指定抗原は、ＨＳＶ‐２ＵＬ１９ポリペプチドまたはＨＳＶ‐２ ｇＤポリペプチドである。
【００２０】
上記および本明細書に記載の調製物の他の実施形態では、調製物の誘発する免疫応答が、第１指定抗原と第２指定抗原に対して特異的な免疫応答を含む場合、第１指定抗原と第２指定抗原の各々は、腫瘍関連抗原である。より特別な実施形態では、第１指定抗原と第２指定抗原の各々は、腎細胞癌抗原、前立腺癌抗原、中皮腫抗原、膵癌抗原、メラノーマ抗原、乳癌抗原、肺癌抗原、および卵巣癌抗原から選ばれる。さらに別のより特定の実施形態では、第１指定抗原と第２指定抗原の各々は、前立腺酸性ホスファターゼ、前立腺特異的抗原、ＮＫＸ３．１、または前立腺特異的膜抗原から選ばれる前立腺癌抗原である。他の特別な実施形態では、第１指定抗原と第２指定抗原の各々は、ウイルス、細菌、真菌、および寄生虫から選ばれる感染性微生物に由来する抗原である。特定の１つの実施形態では、感染症生物はウイルスである。特定の実施形態では、ウイルスは単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ‐２）である。さらに別の特別な実施形態では、第１指定抗原と第２指定抗原の少なくとも一方はＨＳＶ‐２ＵＬ１９ポリペプチドであり、第１指定抗原と第２指定抗原の他方はＨＳＶ‐２ ｇＤポリペプチドである。
【００２１】
上記および本明細書に記載の調製物の他の実施形態では、組換え発現ベクターは、レンチウイルスベクターゲノム、ポックスウイルスベクターゲノム、ワクシニアウイルスベクターゲノム、アデノウイルスベクターゲノム、アデノウイルス関連ウイルスベクターゲノム、ヘルペスウイルスベクターゲノム、およびアルファウイルスベクターゲノムから選ばれる。１つの特別な実施形態では、組換え発現ベクターはベクター粒子に組み込まれる。さらに別の特別な実施形態では、ベクター粒子は、組換え発現ベクターを抗原提示細胞に送達する能力を有する。より特別な実施形態では、抗原提示細胞は樹状細胞である。他の特別な実施形態では、ベクター粒子は、レンチウイルスベクターゲノムを含むレンチウイルスベクター粒子；ポックスウイルスベクターゲノムを含むポックスウイルスベクター粒子；ワクシニアウイルスベクターゲノムを含むワクシニアウイルスベクター粒子；アデノウイルスベクターゲノムを含むアデノウイルスベクター粒子；アデノウイルス関連ウイルスベクターゲノムを含むアデノウイルス関連ウイルスベクター粒子；ヘルペスウイルスベクターゲノムを含むヘルペスウイルスベクター粒子；またはアルファウイルスベクターゲノムを含むアルファウイルスベクター粒子である。さらに特定の実施形態では、ベクター粒子は、レンチウイルスベクターゲノムを含むレンチウイルスベクター粒子である。さらにより特別な実施形態では、レンチウイルスベクター粒子は、配列番号１と比較して少なくとも１つのアミノ酸変化を有するアミノ酸配列を含むシンドビスウイルスＥ２糖タンパク質を含むエンベロープをさらに含み、この場合、配列番号１の残基１６０は存在しないかグルタミン酸以外のアミノ酸であり、このＥ２糖タンパク質は、シンドビスウイルスＥ３タンパク質を含む融合タンパク質の一部分ではない。さらに特定の実施形態では、Ｅ２糖タンパク質は、樹状細胞特異的細胞間接着分子‐３結合ノンインテグリン（ＤＣ‐ＳＩＧＮ）に結合する。
【００２２】
上記および本明細書に記載の調製物の別の実施形態では、これらの調製物は、（ａ）第１指定抗原；（ｂ）第２指定抗原；または（ｃ）第１指定抗原と前記第２指定抗原、のいずれかを有している腫瘍細胞に対して、細胞傷害性Ｔリンパ球応答を誘発する際に用いるために提供される。他の特定の実施形態では、上記および本明細書に記載の調製物は、（ａ）第１指定抗原；（ｂ）第２指定抗原；または（ｃ）第１指定抗原と前記第２指定抗原、のいずれかを有している感染症微生物に対して、細胞傷害性Ｔリンパ球応答を誘発する際に用いるために提供される。他の特定の実施形態では、上記および本明細書に記載の調製物は、腫瘍関連抗原を有する複数の腫瘍細胞を含む腫瘍の発生または再発の可能性を低減する際に用いるために提供される。別の実施形態では、これらの調製物は、感染性微生物により引き起こされる感染を防止または治療する際に用いるために提供される。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
対象に免疫応答を誘発する方法であって、（ａ）少なくとも第１免疫原を含む第１免疫原性組成物を少なくとも１回の投与で該対象に投与し、該少なくとも１つの免疫原は、第１指定抗原に対して特異的な免疫応答を誘発する能力を有し；および（ｂ）該第１免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを含む第２免疫原性組成物を、少なくとも１回の投与で該対象に投与することを含み、
これにより、該第１指定抗原に対して特異的な免疫応答を誘発する、前記方法。
（項目２）
前記第１免疫原は第１ポリペプチドであり、前記ヌクレオチド配列は、該第１ポリペプチドとは異なる第２ポリペプチドをコードする、項目１に記載の方法。
（項目３）
（ｉ）前記第１免疫原性組成物はアジュバントをさらに含み；（ｉｉ）前記第２組成物はアジュバントをさらに含み；または（ｉｉｉ）該第１組成物と該第２組成物の各々がアジュバントをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記第２免疫原性組成物は、前記第１免疫原性組成物の投与の後に投与される、項目１または項目３に記載の方法。
（項目５）
前記第２免疫原性組成物は、前記第１免疫原性組成物の投与の前に投与される、項目１または項目３に記載の方法。
（項目６）
前記第１免疫原性組成物および前記第２免疫原性組成物は同時に投与される、項目１または項目３に記載の方法。
（項目７）
前記第１免疫原性組成物は少なくとも２回投与で投与されるか、または前記第２免疫原性組成物は少なくとも２回投与で投与される、項目１〜５のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記第１免疫原性組成物は（ａ）２回投与；（ｂ）３回投与；（ｃ）４回投与；（ｄ）または５回投与で投与される、項目１または項目３に記載の方法。
（項目９）
（ａ）前記第１免疫原性組成物の各投与は、前記第２免疫原性組成物の投与より前に投与されるか；（ｂ）前記第１免疫原性組成物の少なくとも１回の投与は、前記第２免疫原性組成物の投与の後に投与されるか；（ｃ）前記第１免疫原性組成物の少なくとも１回の投与は、前記第２免疫原性組成物の投与と同時に投与されるか；（ｄ）前記第１免疫原性組成物の少なくとも１回の投与は、前記第２免疫原性組成物の投与より前に投与され、前記第１免疫原性組成物の残りの投与の各々は、前記第２免疫原性組成物の投与の後に投与されるか；または（ｅ）該第１組成物の各投与は、該第２組成物と同時に投与される、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記第１免疫原が誘発する前記免疫応答は、前記第１指定抗原に対して特異的なＣＤ４
Ｔ細胞免疫応答を含む、項目１〜９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記第１免疫原が誘発する前記免疫応答は、前記第１指定抗原に対して特異的なＣＤ８
Ｔ細胞免疫応答を含む、項目１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記第１免疫原性組成物は第２免疫原をさらに含み、前記組換え発現ベクターは該第２免疫原をコードするヌクレオチド配列をさらに含み、該第２免疫原は第２指定抗原に対して特異的な免疫応答を誘発する、項目１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記第１指定抗原と前記第２指定抗原は同一である、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記第１指定抗原と前記第２指定抗原は互いに異なる、項目１２に記載の方法。
（項目１５）
前記組換え発現ベクターは、第２指定抗原に対して特異的な免疫応答を誘発する能力のある第２免疫原をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、項目１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記第１指定抗原と前記第２指定抗原は同一である、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記第１指定抗原と前記第２指定抗原は互いに異なる、項目１５に記載の方法。
（項目１８）
前記第１免疫原が誘発する前記免疫応答は、前記第１指定抗原に対して特異的なＣＤ４
Ｔ細胞応答を含む、項目１２〜１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記第２免疫原が誘発する前記免疫応答は、前記第２指定抗原に対して特異的なＣＤ８
Ｔ細胞応答を含む、項目１２〜１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記アジュバントは無毒性リピドＡ関連アジュバントである、項目３〜１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記無毒性リピドＡ関連アジュバントはグルコピラノシルリピドＡ（ＧＬＡ）である、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
ＧＬＡは安定な水中油型乳剤中で製剤化される、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記第１指定抗原は、（ａ）腫瘍関連抗原であるか、または（ｂ）ウイルス、細菌、真菌、および寄生虫から選ばれる感染性微生物に由来する、項目１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記第１指定抗原は、腎細胞癌抗原、前立腺癌抗原、中皮腫抗原、膵癌抗原、メラノーマ抗原、乳癌抗原、肺癌抗原、および卵巣癌抗原から選ばれる腫瘍関連抗原である、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記前立腺癌抗原は、前立腺酸性ホスファターゼ、前立腺特異的抗原、ＮＫＸ３．１、または前立腺特異的膜抗原である、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記第１指定抗原はウイルス由来である、項目２３に記載の方法。
（項目２７）
前記ウイルスは単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ‐２）である、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記第１指定抗原はＨＳＶ‐２ ＵＬ１９ポリペプチドまたはＨＳＶ‐２ ｇＤポリペプチドである、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記第１指定抗原および前記第２指定抗原の各々は腫瘍関連抗原である、項目１２〜２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記第１指定抗原および前記第２指定抗原の各々は、腎細胞癌抗原、前立腺癌抗原、中
皮腫抗原、膵癌抗原、メラノーマ抗原、乳癌抗原、肺癌抗原、および卵巣癌抗原から選ばれる、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記第１指定抗原および前記第２指定抗原の各々は、前立腺酸性ホスファターゼ、前立腺特異的抗原、ＮＫＸ３．１、または前立腺特異的膜抗原から選ばれる前立腺癌抗原である、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記第１指定抗原および前記第２指定抗原の各々は、ウイルス、細菌、真菌、および寄生虫から選ばれる感染性微生物に由来する抗原である、項目１２〜２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
前記感染症微生物はウイルスである、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記ウイルスは単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ‐２）である、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記第１指定抗原と前記第２指定抗原の少なくとも一方はＨＳＶ‐２ ＵＬ１９ポリペ
プチドであり、前記第１指定抗原と前記第２指定抗原の他方はＨＳＶ‐２ｇＤポリペプチドである、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記組換え発現ベクターは、レンチウイルスベクターゲノム、ポックスウイルスベクターゲノム、ワクシニアウイルスベクターゲノム、アデノウイルスベクターゲノム、アデノウイルス関連ウイルスベクターゲノム、ヘルペスウイルスベクターゲノム、およびアルファウイルスベクターゲノムから選ばれる、項目１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
前記組換え発現ベクターはベクター粒子に組み込まれる、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記ベクター粒子は前記組換え発現ベクターを抗原提示細胞に優先的に送達する、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記抗原提示細胞は樹状細胞であり、好ましくはＤＣ‐ＳＩＧＮを発現する樹状細胞である、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記ベクター粒子は、前記レンチウイルスベクターゲノムを含むレンチウイルスベクター粒子；前記ポックスウイルスベクターゲノムを含むポックスウイルスベクター粒子；前記ワクシニアウイルスベクターゲノムを含むワクシニアウイルスベクター粒子；前記アデノウイルスベクターゲノムを含むアデノウイルスベクター粒子；前記アデノウイルス関連ウイルスベクターゲノムを含むアデノウイルス関連ウイルスベクター粒子；前記ヘルペスウイルスベクターゲノムを含むヘルペスウイルスベクター粒子；または前記アルファウイルスベクターゲノムを含むアルファウイルスベクター粒子である、項目３７〜３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
前記ベクター粒子は、前記レンチウイルスベクターゲノム、およびＤＣ‐ＳＩＧＮを発現する樹状細胞に該レンチウイルスベクター粒子を優先的に送達するエンベロープを含むレンチウイルスベクター粒子であり、該エンベロープは、随意に、アルボウイルスエンベロープの変異体、またはアルファウイルスエンベロープの変異体である、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記ベクター粒子はアルファウイルスベクター粒子であり、該アルファウイルスベクター粒子は、ＤＣ‐ＳＩＧＮを発現する樹状細胞に該アルファウイルスベクター粒子を優先
的に送達するエンベロープを含む、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記レンチウイルスベクター粒子は、配列番号１と比較して少なくとも１つのアミノ酸変化を有するアミノ酸配列を含むシンドビスウイルスＥ２糖タンパク質を含むエンベロープをさらに含む、項目４２に記載の方法であって、配列番号１の残基１６０は存在しないかグルタミン酸以外のアミノ酸であり、該Ｅ２糖タンパク質は、シンドビスウイルスＥ３タンパク質を含む融合タンパク質の一部分ではない、前記方法。
（項目４４）
前記Ｅ２糖タンパク質は、樹状細胞特異的細胞間接着分子‐３結合ノンインテグリン（ＤＣ‐ＳＩＧＮ）に結合する、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
（ａ）第１指定抗原に対して特異的な免疫応答を誘発する能力のある少なくとも第１免疫原を含む第１免疫原性組成物と、（ｂ）該第１免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを含む第２免疫原性組成物と、を含む調製物。
（項目４６）
前記第１免疫原が誘発する前記特異的な免疫応答は、前記第１指定抗原に対して特異的なＣＤ４ Ｔ細胞応答を含む、項目４５に記載の調製物。
（項目４７）
前記第１免疫原が誘発する前記特異的な免疫応答は、前記第１指定抗原に対して特異的なＣＤ８ Ｔ細胞応答を含む、項目４５に記載の調製物。
（項目４８）
前記第１免疫原性組成物は第２免疫原をさらに含み、前記組換え発現ベクターは該第２免疫原をコードするヌクレオチド配列をさらに含み、該第２免疫原は第２指定抗原に対して特異的な免疫応答を誘発する、項目４５〜４７のいずれか一項に記載の調製物。
（項目４９）
前記第１指定抗原と前記第２指定抗原は同一である、項目４８に記載の調製物。
（項目５０）
前記第１指定抗原と前記第２指定抗原は互いに異なる、項目４８に記載の調製物。
（項目５１）
前記組換え発現ベクターは、第２指定抗原に対して特異的な免疫応答を誘発する能力のある第２免疫原をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、項目４５に記載の調製物。
（項目５２）
前記第１指定抗原と前記第２指定抗原は同一である、項目５１に記載の調製物。
（項目５３）
前記第１指定抗原と前記第２指定抗原は互いに異なる、項目５１に記載の調製物。
（項目５４）
前記第１免疫原が誘発する前記免疫応答は、前記第１指定抗原に対して特異的なＣＤ４
Ｔ細胞応答を含む、項目５１〜５３のいずれか一項に記載の調製物。
（項目５５）
前記第２免疫原が誘発する前記免疫応答は、前記第２指定抗原に対して特異的なＣＤ８
Ｔ細胞応答を含む、項目５１〜５３のいずれか一項に記載の調製物。
（項目５６）
（ａ）前記第１免疫原性組成物はアジュバントをさらに含み、（ｂ）前記第２免疫原性組成物はアジュバントをさらに含み；または（ｃ）前記第１免疫原性組成物と前記第２免疫原性組成物の各々がアジュバントをさらに含む、項目４５〜５５のいずれか一項に記載の調製物。
（項目５７）
前記アジュバントは無毒性リピドＡ関連アジュバントである、項目５６に記載の調製物。
（項目５８）
前記無毒性リピドＡ関連アジュバントはグルコピラノシルリピドＡ（ＧＬＡ）である、項目５７に記載の調製物。
（項目５９）
ＧＬＡは安定な水中油型乳剤中で製剤化される、項目５８に記載の調製物。
（項目６０）
前記第１指定抗原は、（ａ）腫瘍関連抗原であるか、または（ｂ）ウイルス、細菌、真菌、および寄生虫から選ばれる感染性微生物に由来する、項目４５〜５９のいずれか一項に記載の調製物。
（項目６１）
前記第１指定抗原は、腎細胞癌抗原、前立腺癌抗原、中皮腫抗原、膵癌抗原、メラノーマ抗原、乳癌抗原、肺癌抗原、および卵巣癌抗原から選ばれる腫瘍関連抗原である、項目６０に記載の調製物。
（項目６２）
前記前立腺癌抗原は、前立腺酸性ホスファターゼ、前立腺特異的抗原、ＮＫＸ３．１、または前立腺特異的膜抗原である、項目６１に記載の調製物。
（項目６３）
前記第１指定抗原はウイルス由来である、項目６０に記載の調製物。
（項目６４）
前記ウイルスは単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ‐２）である、項目６３に記載の調製物。
（項目６５）
前記第１指定抗原はＨＳＶ‐２ ＵＬ１９ポリペプチドまたはＨＳＶ‐２ ｇＤポリペプチドである、項目６４に記載の調製物。
（項目６６）
前記第１指定抗原および前記第２指定抗原の各々は腫瘍関連抗原である、項目４９〜５９のいずれか一項に記載の調製物。
（項目６７）
前記第１指定抗原および前記第２指定抗原の各々は、腎細胞癌抗原、前立腺癌抗原、中皮腫抗原、膵癌抗原、メラノーマ抗原、乳癌抗原、肺癌抗原、および卵巣癌抗原から選ばれる、項目６６に記載の調製物。
（項目６８）
前記第１指定抗原および前記第２指定抗原の各々は、前立腺酸性ホスファターゼ、前立腺特異的抗原、ＮＫＸ３．１、および前立腺特異的膜抗原から選ばれる前立腺癌抗原である、項目６７に記載の調製物。
（項目６９）
前記第１指定抗原および前記第２指定抗原の各々は、ウイルス、細菌、真菌、および寄生虫から選ばれる感染性微生物に由来する抗原である、項目４８〜５９のいずれか一項に記載の調製物。
（項目７０）
前記感染症微生物はウイルスである、項目６９に記載の調製物。
（項目７１）
前記ウイルスは単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ‐２）である、項目７０に記載の調製物。
（項目７２）
前記第１指定抗原と前記第２指定抗原の少なくとも一方はＨＳＶ‐２ ＵＬ１９ポリペ
プチドであり、前記第１指定抗原と前記第２指定抗原の他方はＨＳＶ‐２ｇＤポリペプチドである、項目７１に記載の調製物。
（項目７３）
前記組換え発現ベクターは、レンチウイルスベクターゲノム、ポックスウイルスベクタ
ーゲノム、ワクシニアウイルスベクターゲノム、アデノウイルスベクターゲノム、アデノウイルス関連ウイルスベクターゲノム、ヘルペスウイルスベクターゲノム、およびアルファウイルスベクターゲノムから選ばれる、項目４５〜７２のいずれか一項に記載の調製物。
（項目７４）
前記組換え発現ベクターはベクター粒子に組み込まれる、項目７３に記載の調製物。
（項目７５）
前記ベクター粒子は前記組換え発現ベクターを抗原提示細胞に送達する能力を有する、項目７４に記載の調製物。
（項目７６）
抗原提示細胞は樹状細胞である、項目７５に記載の調製物。
（項目７７）
前記ベクター粒子は、前記レンチウイルスベクターゲノムを含むレンチウイルスベクター粒子；前記ポックスウイルスベクターゲノムを含むポックスウイルスベクター粒子；前記ワクシニアウイルスベクターゲノムを含むワクシニアウイルスベクター粒子；前記アデノウイルスベクターゲノムを含むアデノウイルスベクター粒子；前記アデノウイルス関連ウイルスベクターゲノムを含むアデノウイルス関連ウイルスベクター粒子；前記ヘルペスウイルスベクターゲノムを含むヘルペスウイルスベクター粒子；または前記アルファウイルスベクターゲノムを含むアルファウイルスベクター粒子である、項目７４〜７６のいずれか一項に記載の調製物。
（項目７８）
前記ベクター粒子は、前記レンチウイルスベクターゲノムを含むレンチウイルスベクター粒子である、項目７７に記載の調製物。
（項目７９）
前記レンチウイルスベクター粒子は、配列番号１と比較して少なくとも１つのアミノ酸変化を有するアミノ酸配列を含むシンドビスウイルスＥ２糖タンパク質を含むエンベロープをさらに含む、項目７８に記載の調製物であって、配列番号１の残基１６０は存在しないかグルタミン酸以外のアミノ酸であり、該Ｅ２糖タンパク質は、シンドビスウイルスＥ３タンパク質を含む融合タンパク質の一部分ではない、前記調製物。
（項目８０）
前記Ｅ２糖タンパク質は、樹状細胞特異的細胞間接着分子‐３結合ノンインテグリン（ＤＣ‐ＳＩＧＮ）に結合する、項目７９に記載の調製物。
（項目８１）
（ａ）前記第１指定抗原；（ｂ）前記第２指定抗原；または（ｃ）前記第１指定抗原および前記第２指定抗原、のいずれかを有している腫瘍細胞に対して細胞傷害性Ｔリンパ球応答を誘発する際に用いる、項目６０〜６２および６６〜６８のいずれか一項に記載の調製物。
（項目８２）
（ａ）前記第１指定抗原；（ｂ）前記第２指定抗原；または（ｃ）前記第１指定抗原および前記第２指定抗原、のいずれかを有している感染症微生物に対して細胞傷害性Ｔリンパ球応答を誘発する際に用いる、項目６０、６３〜６５、および６９〜７２のいずれか一項に記載の調製物。
（項目８３）
前記腫瘍関連抗原を有する複数の腫瘍細胞を含む腫瘍の発生または再発の可能性を低減する際に用いる、項目６０〜６２および６６〜６８のいずれか一項に記載の調製物。
（項目８４）
前記感染性微生物により引き起こされる感染を防止または治療する際に用いる、項目６０、６３〜６５、および６９〜７２のいずれか一項に記載の調製物。
【００２３】
本明細書で使用する「単離」という用語は、ある物質が、その元の環境（例えば、自然発生している場合は自然環境）から除去されることを意味する。例えば、生きている動物に存在する自然発生の核酸またはポリペプチドは単離されないが、自然体系において共存している物質の一部または全部から分離された同一の核酸またはポリペプチドは、単離される。このような核酸はベクターの一部になり得る。ベクターの一部となることができる核酸は、その核酸の自然環境の一部でないという点で、やはり単離することができる。単離したポリペプチドもしくはタンパク質またはその断片は、組成物の構成成分となり得、また、その組成物がポリペプチドの自然環境の一部でないという点で、やはり単離され得る。「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖の産生に関与するＤＮＡセグメントを意味し、遺伝子には、コーディング領域の前後の領域である「リーダーとトレーラー」が含まれ、さらに、個々のコーディングセグメント（エキソン）間の介在配列（イントロン）が含まれる。本明細書では、アミノ酸を単一文字および３文字コードで参照する場合があり、こうした文字コードは当技術分野において教科書的な周知の知識であり、よって当業者に熟知されている。本明細書で使用する「融合ポリペプチド」という用語は、「融合タンパク質」と交換可能に使用することもでき、特に別段の指示がない限り、この２つの用語は、区別可能な特性または特徴を有する分子を示すことは意図されていない。
【００２４】
本明細書および添付の請求項において、文脈上明らかに別の指示をしている場合を除き、単数形の「a」、「an」、および「the」は複数の指示対象を含む。したがって、例えば「an antigen」と称している場合は複数の当該抗原を含み、「acell」または「the cell」と称している場合は、１つ以上の細胞および当業者に対して公知のその均等物（例えば複数の細胞）等を含む。同様に、「acompound」または「a composition」と称している場合は、複数の当該化合物または組成物を含み、文脈上明らかに別の指示をしている場合を除き、１つ以上の化合物または組成物を指す。ある方法のステップが記述または請求項でクレームされ、特定の順序で生じるように記述されている場合、第１のステップが第２のステップより「先」（すなわち、前）に生じる（または実施される）という記述は、書き換えるとすれば、第２のステップが第１のステップの「後」に生じる（または実施される）という記述と同じ意味を有する。数字または数値範囲に言及する際の「約」という用語は、言及している数字または数値範囲が実験上のばらつきの範囲内（または統計的実験誤差の範囲内）の近似値であることを意味し、したがって、数字または数値範囲は、記載されている数字または数値範囲の１％〜１５％の間で変動し得る。「comprising」（〜を含む）（および「comprise」、「comprises」、「having」（〜を有する）、「including」（〜を含む）等の関連用語）は、他のある実施形態、例えば、本明細書に記載の物質組成、組成物、方法、工程等の実施形態が、記載されている特性「からなる」、または「本質的になる」ことがあり得ることを除外することは意図されていない。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ＨＳＶ‐２ ＵＬ１９タンパク質に特異的なＣＤ４免疫応答を示す。各５匹のマウス群に対し、初回／追加免疫投与計画（０日目に初回免疫／２１日目に追加免疫）を通じて、５μｇの組換えＨＳＶ‐２ＵＬ１９と、安定な水中油型乳剤中で製剤化された５μｇのグルコピラノシルリピドＡ（ＧＬＡ）（ＧＬＡ‐ＳＥ）、安定な水中油型乳剤（ＳＥ）、またはＰＢＳ（なし）との組み合わせを用いて免疫した。ペプチドを含有するＵＬ１９Ｔ細胞エピトープを用いて生体外で再刺激した後、脾臓ＣＤ４ Ｔ細胞応答を測定した。細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）の後に蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）を行うことにより、ＩＦＮ‐γ、ＴＮＦ‐α、およびＩＬ‐２のレベルを測定した。各群のサイトカイン陽性ＣＤ４Ｔ細胞のパーセント値を図示する。
【図２】ＨＳＶ‐２ ＵＬ１９タンパク質に対する免疫応答を示す。各５匹のマウス群を、アジュバントとしてＧＬＡ‐ＳＥを混合したｒＵＬ１９タンパク質（ｒタンパク質＋ＧＬＡ／ＳＥ）、またはＨＳＶ‐２ポリペプチド、ＵＬ１９をコードするレンチウイルスベクター（ＤＣ‐ＮＩＬＶ）（イミューンデザイン社、ワシントン州シアトル）（レンチベクター）のいずれかで免疫した。抗体力価を測定し（右）、脾臓ＵＬ１９に特異的なＣＤ４Ｔ細胞およびＣＤ８ Ｔ細胞のＩＦＮ‐γおよびＴＮＦ‐αの産生をＩＣＳで分析した（左）。ボックス領域内の数字は、ＩＦＮ‐γ＋およびＴＮＦ‐α＋のＣＤ４細胞またはＣＤ８細胞のパーセント値を表す。
【図３】マウスに対し、卵白アルブミンをコードするＤＣ‐ＮＩＬＶで最初に免疫し（ＬＶ）、次いで、ＰＢＳ、ＧＬＡ／ＳＥ単独、組換え卵白アルブミンとＳＥの組み合わせ（ｒＰ＋ＳＥ）、またはアジュバントとしてＧＬＡ‐ＳＥを混合した卵白アルブミン（ｒＰ＋ＧＬＡ／ＳＥ）で追加免疫し、これらのマウスに誘発された免疫応答を図示する。追加免疫から４日後に、動物から脾臓細胞を単離した。卵白アルブミンに特異的な脾臓ＣＤ８Ｔ細胞のＩＦＮ‐γおよびＴＮＦ‐αの産生を、ＩＣＳで分析した。各象限内の数字は、ＩＦＮ‐γ＋およびＴＮＦ‐α＋のＣＤ８細胞のパーセント値を表す。
【図４Ａ】図４Ａおよび４Ｂは、ＧＬＡ‐ＳＥを用いて製剤化した組換えＨＳＶ‐２ ＵＬ１９で免疫し、ＵＬ１９をコードしたＤＣ‐ＮＩＬＶで免疫したマウスの免疫応答を示す。各５匹のＣ５７ＢＬ／６マウス群を、アジュバントとしてＧＬＡ‐ＳＥを混合したｒＵＬ１９タンパク質（ｒＰ＋ＧＬＡ／ＳＥ）またはＰＢＳで免疫し、アジュバントとしてＧＬＡ‐ＳＥを混合したｒＵＬ１９タンパク質、またはＵＬ１９をコードするポリヌクレオチドを含有するＤＣ‐ＮＩＬＶ（ＬＶ）で追加免疫した。追加免疫から１０日後に、動物から脾臓細胞を単離した。ＣＤ４、ＣＤ８のいずれかのＵＬ１９エピトープを含有する単鎖１５アミノ酸長ペプチドを用いて生体外で刺激した後、脾臓ＵＬ１９に特異的なＣＤ４Ｔ細胞およびＣＤ８ Ｔ細胞のＩＦＮ‐γ、ＴＮＦ‐α、およびＩＬ‐２の産生をＩＣＳで分析した。図４Ａ（左）は、各群の代表的マウス１匹のサイトカイン産生を示す。図４Ａの右側は、２種類のＣＤ８ＵＬ１９エピトープの各々で刺激されたサイトカイン陽性ＣＤ８ Ｔ細胞のパーセント値を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、免疫された各群から得た動物で測定したトータルＩｇＧを表す。図４Ｂでは、アジュバントとしてＧＬＡ‐ＳＥを混合したｒＵＬ１９タンパク質を「ｒＰ」と表示している。ＢＬＤ：検出レベル未満（Below Level of Detection）。
【図５Ａ】図５Ａおよび５Ｂは、アジュバントであるＧＬＡ／ＳＥを用いて製剤化した組換えタンパク質で免疫し、次いで、アジュバントを混合した組換えタンパク質およびこのタンパク質をコードするレンチウイルスベクターで追加免疫した動物の免疫応答を示す。各５匹のＣ５７ＢＬ／６マウス群を、アジュバントとしてＧＬＡ‐ＳＥを混合したｒＵＬ１９タンパク質（ｒＰ＋ＧＬＡ／ＳＥ）またはＰＢＳで免疫し、アジュバントとしてＧＬＡ‐ＳＥを混合したｒＵＬ１９タンパク質（ｒＰ＋ＧＬＡ／ＳＥ）およびＵＬ１９をコードしたポリヌクレオチドを含有するＤＣ‐ＮＩＬＶ（ＬＶ）で追加免疫した。追加免疫から１０日後に、動物から脾臓細胞を単離した。ＣＤ４ＵＬ１９エピトープまたはＣＤ８ ＵＬ１９エピトープを含有する単鎖１５アミノ酸長ペプチドを用いて生体外で刺激した後、ＵＬ１９に特異的な脾臓ＣＤ４ Ｔ細胞およびＣＤ８Ｔ細胞のＩＦＮ‐γ、ＴＮＦ‐α、およびＩＬ‐２の産生をＩＣＳで分析した。図５Ａ（左）は、各群の代表的マウス１匹のサイトカイン産生を示す。図５Ａの右側は、２種類のＣＤ４ＵＬ１９エピトープの各々で刺激されたサイトカイン陽性ＣＤ４ Ｔ細胞のパーセント値、および２種類のＣＤ８ ＵＬ１９エピトープの各々で刺激されたサイトサイン陽性ＣＤ８Ｔ細胞のパーセント値を表す。  追加免疫から５日後および１０日後に、各群の動物から血清を取得し、特異的ＩｇＧ抗体を検出した。
【図５Ｂ】図５Ｂは、免疫された各群から得た動物で測定したトータルＩｇＧを表す。図５Ｂでは、アジュバントとしてＧＬＡ‐ＳＥを混合したｒＵＬ１９タンパク質を「ｒＰ」と表示している。４つのデータセットは動物のＩｇＧ力価を示し、左から右に、（１）ＰＢＳ（初回免疫組成物１°）を与えられた後、アジュバントとしてＧＬＡ‐ＳＥを混合したｒＵＬ１９タンパク質およびＵＬ１９をコードするＤＣ‐ＮＩＬＶ（ｒＰ＋ＬＶ）（追加免疫組成物２°）で免疫された動物（追加免疫から５日後に血清を取得）；（２）ＰＢＳ（初回免疫組成物１°）を与えられた後、ｒＰ＋ＬＶ（追加免疫組成物２°）で免疫された動物（追加免疫から１０日後に血清を取得）；（３）アジュバントとしてＧＬＡ‐ＳＥを混合したｒＵＬ１９タンパク質（ｒＰ）（初回免疫組成物１°）を与えられた後、ｒＰ＋ＬＶ（追加免疫組成物２°）で免疫された動物（追加免疫から５日後に血清を取得）；（４）ｒＰ（初回免疫組成物１°）を与えられた後、ｒＰ＋ＬＶ（追加免疫組成物２°）で免疫された動物（追加免疫から１０日後に血清を取得）を表す。
【図６】本明細書に記載の免疫原性組成物を用いて特異的ＣＤ４ Ｔ細胞応答、特異的ＣＤ８ Ｔ細胞応答、および特異的抗体応答を誘発するために使用し得る、代表的な免疫投与計画をいくつか示す。免疫原：目的の組換えまたは単離ポリペプチド（複数可）；免疫原をコードするベクター：目的のポリペプチド（複数可）をコードするポリヌクレオチドを含有する組換え発現ベクター。
【図７】ＤＣ‐ＮＩＬＶがＧａｇ特異的な強いＣＤ８ Ｔ細胞応答を発生させることを示す。
【図８】ＳＩＶ‐Ｇａｇ組換えタンパク質で免疫した後に強いＴｈ１ ＣＤ４ Ｔ細胞を得るには、ＧＬＡが必要であることを示す。
【図９】ＳＩＶ‐Ｇａｇ組換えタンパク質＋ＧＬＡ‐ＳＥ、およびＳＩＶ‐Ｇａｇを発現するＤＣ‐ＮＩＬＶを用いた異種の初回ワクチン投与、追加ワクチン投与、追加ワクチン投与が、ＣＤ８抗原特異的Ｔ細胞応答とＣＤ４抗原特異的Ｔ細胞応答の両方を引き起こすことを示す。
【図１０】異種のワクチン投与により発生するＣＤ８およびＴＨ１ ＣＤ４ Ｔ細胞応答を、ｒＳＩＶ‐Ｇａｇ＋ＧＬＡ‐ＳＥを用いて追加免疫できることを示す。
【図１１】ＤＣ‐ＮＩＬＶにより発生するＣＤ８ Ｔ細胞応答を、合成長鎖ペプチド＋ＧＬＡ‐ＳＥを用いて追加免疫できることを示す。ＳＩＶ‐Ｇａｇのアミノ酸２８９〜３３３が表示されている（ＧＰＫＥＰＦＱＳＹＶＤＲＦＹＫＳＬＲＡＥＱＴＤＡＡＶＫＮＷＭＴＱＴＬＬＩＱＮＡＮＰＤＣＫＬ；配列番号４２）。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
詳細な説明
従来、感染症等の疾患および病態に対するワクチン投与には、対象をある組成物（初回免疫組成物）で免疫した後、別の組成物（追加免疫組成物）免疫するという戦略が含まれている。しかしながら、今までの二重ワクチン投与戦略では、ＣＤ４、ＣＤ８両方のＴ細胞応答、ならびに多くの疾患および病態に対して十分な保護を提供する体液性免疫は十分に誘発していない。
【００２７】
本明細書において、対象に免疫応答を誘発する二重免疫戦略を改善するための組成物および方法を提供する。この免疫応答は、体液性免疫応答、細胞性免疫応答、ＣＤ４およびＣＤ８の両方のＴリンパ球免疫応答を含み、１つ以上の抗原に対する完全な適応免疫応答を提供する。したがって、本明細書に記載の組成物はワクチンとして開発され製剤化され得る。したがって、記載されている方法は、体液性免疫応答と細胞性免疫応答の両方を誘発することが臨床成績を改善し、あるいは、最適な効果を得る上でこれらの両方の応答の誘発が必要な、様々な疾患、障害、および病態（癌、感染症等）を治療し防止する（すなわち、生物学的、臨床的、および／または統計的に有意な方法で発症または再発の可能性またはリスクを低減する）上で有用である。
【００２８】
本明細書において、投与を必要とする対象にいずれかの順序で同時または逐次的に投与される、２つの異なる免疫原性組成物を提供する。免疫原性組成物の少なくとも１つは、免疫原に対して特異的な体液性応答（すなわち抗体応答）および／または特異的なＣＤ４Ｔ細胞応答（メモリーＣＤ４ Ｔ細胞応答を含み得る応答）を誘発し、免疫原性組成物のうち少なくとも１つは、免疫原に対して特異的なＣＤ８ Ｔ細胞応答（細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を含み得る応答）を誘発する。ある実施形態では、２つの免疫原性組成物の一方は、特異的な体液性応答および／または特異的なＣＤ４Ｔ細胞応答を誘発する上でより効果的であり、２つの免疫原性組成物の他方は、特異的なＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘発する上でより効果的であり得る。
【００２９】
一方の免疫原性組成物は、目的の指定抗原に対して特異的な免疫応答を誘発する能力のある少なくとも１つの免疫原を含む。この免疫原性組成物は、当該免疫原および指定抗原に対して特異的な免疫応答の誘発を亢進するアジュバント、または、この誘発に必要とされ得るアジュバントをさらに含んでよい。第２の免疫原組成物は、免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを含む。組換え発現ベクターは、免疫原をコードするヌクレオチド配列と機能的に連結した少なくとも１つの調節配列をさらに含み、よって組換え発現ベクターは、免疫原の発現を指示する能力を有する。ある特別な実施形態では、組換え発現ベクターはベクター粒子（例えばウイルスベクター粒子）に組み込まれる。本明細書でさらに述べる通り、免疫原は、指定抗原の免疫原性断片であっても、全長の指定抗原（もしくはその免疫原性変異体）であってもよく、または、１つ以上の免疫原性断片を含む融合タンパク質であっても、全長の指定抗原（もしくはその免疫原性変異体）を含む融合タンパク質であってもよい。
【００３０】
したがって、本明細書で使用する「免疫原」という用語は、以下のポリペプチド：（ａ）全長の抗原、（２）抗原の免疫原性断片、（３）全長抗原または免疫原性断片の免疫原性変異体、（４）異なるポリペプチドの一部分を含む、これらのキメラ融合物、および（５）これらのコンジュゲート、に該当するポリペプチド群全体を指す。したがって、「免疫原」は、（ｉ）第１指定抗原、（ｉｉ）その免疫原性断片、または（ｉｉｉ）第１指定抗原に対して特異的な免疫応答を誘発する能力のあるその変異体、のいずれかを含むポリペプチドを表す。
【００３１】
例えば、このような免疫原性変異体は、抗原の少なくとも１０個の隣接アミノ酸に渡って少なくとも９０％のアミノ酸同一性を保持するか、または抗原の少なくとも１５個の隣接アミノ酸に渡って少なくとも８５％のアミノ酸同一性を保持する（例えば、エンベロープタンパク質または腫瘍関連抗原）。別の例として、このような免疫原性断片は、抗原の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４８、または５０個の隣接アミノ酸を含む。他の例は、抗原の少なくとも５０個の隣接アミノ酸に渡って、または抗原の少なくとも１００個の隣接アミノ酸に渡って、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％．９８％、もしくは９９％の同一性を含む。
【００３２】
本明細書に記載の方法において、免疫原を含む第１免疫原性組成物と、この「免疫原」をコードするヌクレオチド配列を含む第２免疫原性組成物に言及しているとき、第２免疫原性組成物のコードされた免疫原ポリペプチドは、第１免疫原性組成物のポリペプチド免疫原と同一のアミノ酸配列を有する必要はないものと理解される。したがって、本明細書に記載の方法および組成物では、第１免疫原性組成物が抗原の少なくとも１つ、２つ、３つ、もしくはそれ以上の小さな断片を含み（例えば、エンベロープタンパク質または腫瘍関連抗原）、第２免疫原性組成物が全長抗原もしくはその比較的大きな断片をコードするヌクレオチド配列を含むこと、またはその逆が企図されている。例えば、第１ポリペプチドは、抗原の小さな免疫原性断片、すなわち約５０アミノ酸以下の長さの免疫原性断片であり、第２ポリペプチドは、全長抗原またはその比較的大きな断片、すなわち約５０アミノ酸以上の長さの断片であり、随意に、全長抗原の少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有する。
【００３３】
本明細書で提供する他の特別な実施形態では、第２免疫原はいずれかの免疫原性組成物に含まれる。第２免疫原は、指定抗原に対する免疫応答を誘発する能力を有し、この指定抗原は、第１免疫原が誘発する特異的免疫応答の対象である指定抗原と同一でも、異なっていてもよい。別の特別な実施形態では、第１免疫原は、特異的なＣＤ４Ｔ細胞免疫応答を誘発し、特異的な抗体応答も誘発でき、第２免疫原は、少なくともＣＤ８ Ｔ細胞免疫応答は誘発する。ある特定の実施形態では、免疫される対象に対する第２免疫原での免疫は、組換え発現ベクターによる第２免疫原の発現のみを介することが意図される。したがって、第１免疫原を含む（さらにアジュバントも含み得る）免疫原性組成物は第２免疫原が欠如し、組換え発現ベクターは、第１免疫原をコードしかつ第２免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００３４】
本明細書に記載の免疫原性組成物および方法は、感染症、特に、良好なワクチンも感染後治療も提供されていない感染症（例えば、ＨＩＶ、ＨＳＶ‐２等のウイルス感染およびマラリア等の寄生虫感染）の防止または治療に有用であり得る。他の実施形態では、本明細書に記載の免疫原性組成物および方法は、癌および悪性腫瘍の治療および／またはその発症可能性の低減に使用し得る。
【００３５】
以下、免疫原性組成物、免疫原性組成物を含む調製物、ならびにこれらの調製物および組成物の使用方法の様々な実施形態を詳しく述べる。
【００３６】
免疫原性組成物
本明細書に記載する様々な免疫原性組成物は、協調的な免疫戦略で使用された場合に、特異的な適応免疫反応を誘発するのに有用な組成物である。ある１つの免疫原性組成物は、少なくとも１つの免疫原を含み、生理学的に適切な（すなわち薬剤的に許容可能または適切な）アジュバントをさらに含み得る。この第１免疫原性組成物に含まれる免疫原は、通常は単離された免疫原であり、この単離された免疫原は、その自然環境から単離されたものでも、組換えにより産生されたものでもよい。参照の便のため、第１免疫原性組成物に存在する免疫原を、本明細書では単離／組換え免疫原と呼ぶ。第２の別の組成物は、この免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを含む。第２の免疫原性組成物も、アジュバントをさらに含み得る。第１の組成物と第２の組成物の両方がアジュバントを含む場合、各組成物に含まれるアジュバントは同一でも、異なっていてもよい。
【００３７】
２つの異なる組成物を対象に投与すると、上記少なくとも１つの免疫原および各々の目的の抗原（本明細書では指定抗原とも称する）に対して特異的な免疫応答が誘発される。特異的な免疫応答には、特異的な体液性免疫応答（すなわち特異的な抗体応答）および特異的な細胞性免疫応答（ＣＤ４Ｔ細胞応答とＣＤ８ Ｔ細胞応答を含む）が含まれ、各応答は免疫原に対して特異的であり、よって目的の指定抗原に対して特異的である。本明細書で言及している免疫原性調製物は、これらの２つの免疫原性組成物を含み、本明細書では、これらの免疫原性組成物を便宜上、第１免疫原性組成物、第２免疫原性組成物と称する場合がある。したがって、１つの実施形態では、免疫原性調製物は、（ａ）指定抗原に対して特異的な免疫応答を誘発する能力のある少なくとも１つの単離／組換え免疫原を含む少なくとも１つの免疫原性組成物と、（ｂ）この少なくとも１つの免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを含む少なくとも１つの第２の免疫原性組成物と、を含む。調製物に含まれるこれらの免疫原性組成物は、免疫原および各々の指定抗原に対して特異的な免疫応答を誘発するために、対象に同時に投与しても、いずれかの順序で逐次的に投与してもよい。免疫原性組成物の各々と、これらの組成物の使用について、本明細書でより詳細に述べる。
【００３８】
各免疫原性組成物は、生理学的に（または薬剤的に）許容可能または適切な少なくとも１つの賦形剤をさらに含むことができる。医薬組成物中で用いる賦形剤または担体として当業者に対して公知の、生理学的または薬剤的に適切な任意の賦形剤または担体（すなわち、活性成分の活性に干渉しない無毒性物質）を、本明細書に記載の免疫原性組成物中で使用してよい。代表的な賦形剤には、タンパク質の安定性と完全性を維持する希釈剤および担体が含まれる。治療用の賦形剤はよく知られており、例えばRemington: The Science and Practice of Pharmacy (Gennaro, 21st Ed.Mack Pub. Co., Easton, PA (2005))に記載され、本明細書においてより詳細に説明される。
【００３９】
組換え発現ベクターがコードし発現する免疫原は指定抗原と同一であってよく、すなわち、免疫原は、指定抗原の代表的な全長アミノ酸配列を含んでよい。あるいは、免疫原は、指定抗原の変異体を含んでもよく、この場合の変異体は、代表的な全長指定抗原と高い割合の同一性を共有し、指定抗原の機能特性、例えば特異的な免疫応答を誘発する能力を保持する。あるいは、免疫原は、指定抗原の免疫原性断片であってもよい。指定抗原の変異体もしくは断片である免疫原は、統計的、臨床的、および／または生物学的に有意な方法で、対象に免疫応答（例えば体液性応答、すなわちＢ細胞応答）、または細胞媒介性応答（すなわちＴ細胞応答（細胞傷害性Ｔリンパ球応答を含む））、または体液性応答と細胞媒介性応答の両方を誘発する能力を示す。目的の指定抗原、ならびに指定抗原の免疫原性断片および免疫原性変異体について、本明細書でより詳細に述べる。
【００４０】
少なくとも１つの単離／組換え免疫原を含む免疫原性組成物に関して、免疫原はポリペプチドまたはペプチドであってよく、このポリペプチドまたはペプチドは、分子生物学およびタンパク質単離の分野で日常的に実践されている方法に従って、宿主細胞中で組換えにより産生され、次いで宿主細胞から単離されるか、宿主細胞培養物から単離された（すなわち、元の宿主細胞環境から除去された）ものである。本明細書および当技術分野で説明され当業者が熟知している方法に従って免疫原が組換えにより産生される場合、この免疫原を組換え免疫原とも称する。あるいは、免疫原は、ウイルス、細菌、寄生虫、真菌、腫瘍細胞等の天然源から単離または除去されていてもよい。天然源から１つ以上の免疫原および抗原を単離する方法は、当技術分野で説明されており、当技術分野で日常的に実践されている方法および手法に従って、当業者が経験に基づき容易に決定することもできる。
【００４１】
本明細書に記載の通り、第２免疫原性組成物に含まれる組換え発現ベクターは、上記少なくとも１つの免疫原をコードするヌクレオチド配列（本明細書ではポリヌクレオチド配列とも称する）を含む。組換え発現ベクターは、コードするヌクレオチド配列と機能的に連結した少なくとも１つの調節配列をさらに含み、よってこのベクターは、免疫原の発現を指示する能力を有する。組換え発現ベクターがコードし発現する免疫原は指定抗原と同一であってよく、すなわち、免疫原は、指定抗原の代表的な全長アミノ酸配列を含んでよい。あるいは、免疫原は、指定抗原の変異体を含んでもよく、この場合の変異体は、代表的な全長指定抗原と高い割合の同一性を共有し、指定抗原の機能特性、例えば特異的な免疫応答を誘発する能力を保持する。あるいは、コードされる免疫原は、指定抗原の免疫原性断片であってもよい。指定抗原の変異体もしくは断片である免疫原は、統計的、臨床的、および／または生物学的に有意な方法で、対象に免疫応答（例えば体液性応答、すなわちＢ細胞応答）、または細胞媒介性応答（すなわちＴ細胞応答（細胞傷害性Ｔリンパ球応答を含む））、または体液性応答と細胞媒介性応答の両方を誘発する能力を示す。目的の指定抗原、ならびに指定抗原の免疫原性断片および免疫原性変異体について、本明細書でより詳細に述べる。
【００４２】
ある実施形態では、組換え発現ベクターはベクター粒子（例えばウイルスベクター粒子または細胞粒子）に組み込まれる。組換え発現ベクターまたはこのベクターを含むベクター粒子は、粒子を標的細胞に導入（すなわち送達）することを可能にする形で構築される。ある実施形態では、標的細胞は抗原提示細胞である。より特別な実施形態では、標的細胞は、樹状細胞等のプロフェッショナル抗原提示細胞である。次に、標的細胞内で免疫原が発現し、免疫原またはその断片が抗原提示細胞の表面に提示され、免疫原に対して特異的な免疫応答が誘発され、よって各々の指定抗原に対して特異的な免疫応答が誘発される。
【００４３】
他の実施形態では、少なくとも１つの単離／組換え免疫原を含む（かつアジュバントをさらに含み得る）免疫原性組成物は、少なくとも１つの追加の免疫原をさらに含む（すなわち、免疫原は少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれより多数であり、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれより多数の免疫原と言い換えることができる）。ある実施形態では、免疫原性組成物は、２つ以上の単離／組換え免疫原（すなわち少なくとも２つの免疫原）を含み、多価の免疫原性組成物を形成することができる。２つ以上の免疫原をアジュバントと組み合わせる場合には、免疫原性組成物は、個別にアジュバントと共に製剤化された個々の免疫原を含んでよく、その後、アジュバントを混合した複数の免疫原を組み合わせて免疫原性組成物を形成する。あるいは、２つ以上の免疫原とアジュバントを一緒にして製剤化してもよい。ある特別な実施形態では、追加の免疫原（例えば第２、第３等の免疫原）の各々は、第１免疫原と同一の指定抗原に対する免疫応答を誘発できる。他の特別な実施形態では、追加の免疫原（例えば第２、第３等の免疫原）の各々は、それぞれ異なる（例えば第２、第３等の）指定抗原に対して特異的な免疫応答を誘発できる。
【００４４】
ある代替の実施形態では、多価の免疫原性組成物は、少なくとも２つの免疫原を含む細胞可溶化物、細胞小器官、または細胞上清を含み得る。例えば、元の環境から除去される免疫原（例えば、微生物から得られる免疫原）を微生物から部分的に単離して、免疫原性組成物中に２つ以上の免疫原が存在するようにできる。同様に、腫瘍細胞から得られる免疫原を腫瘍細胞から部分的に単離して、免疫原性組成物中に２つ以上の腫瘍関連抗原が存在するようにできる。
【００４５】
組換え発現ベクターを含む免疫原性組成物に関して、ヌクレオチド配列は、１つ超の免疫原、例えば少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれより多数の免疫原（すなわち２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれより多数の免疫原）をコードし得る。ある特別な実施形態では、追加の免疫原（例えば第２、第３等の免疫原）の各々は、第１免疫原と同一の指定抗原に対する免疫応答を誘発できる。他の特別な実施形態では、追加の免疫原（例えば第２、第３等の免疫原）の各々は、それぞれ異なる（例えば第２、第３等の）指定抗原に対して特異的な免疫応答を誘発できる。
【００４６】
特定の実施形態では、上記少なくとも１つの単離／組換え免疫原を含む（かつアジュバントをさらに含み得る）一方の免疫原性組成物（第１免疫原性組成物とも称する）は、免疫原に対して特異的な、よって指定抗原に対して特異的なＣＤ４Ｔ細胞応答を誘発する能力があり、また免疫原および指定抗原に対する体液性応答（すなわち、特異的な抗体応答または抗原特異的な抗体応答）も誘発できる。免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを含む他方の免疫原組成物（すなわち第２免疫原性組成物）は、免疫原に対して特異的なＣＤ８Ｔ細胞応答を誘発する能力があり、したがって指定抗原に対して特異的なＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘発する能力を有する。本明細書でより詳細に述べる通り、免疫原は１つ以上の免疫原性領域を有し、この領域は、免疫原に対して特異的なＣＤ４Ｔ細胞応答およびＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘発する能力のあるエピトープ（複数可）を含む。
【００４７】
他の特定の実施形態では免疫原性調製物が提供され、この場合、少なくとも１つの単離／組換え免疫原（便宜上、第１免疫原と呼ぶ）を含む第１免疫原性組成物は、少なくとも１つの追加の単離／組換え免疫原をさらに含み得る。他の実施形態では、第２の、別の免疫原性組成物に含まれる組換え発現ベクターは、第１免疫原をコードでき、少なくとも１つの追加の免疫原をコードできる。さらに別の代替の実施形態では、第１免疫原性組成物は少なくとも２つの単離／組換え免疫原を含み、第２免疫原性組成物は、第１免疫原および少なくとも１つの追加の免疫原をコードするヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを含む。
【００４８】
２つ以上の免疫原に対する免疫応答の誘発が所望されるある実施形態では、少なくとも１つの免疫原は、少なくとも特異的体液性応答および／またはＣＤ４Ｔ細胞応答を含む免疫応答を誘発する能力があり、少なくとも１つの追加の免疫原は、少なくとも特異的ＣＤ８ Ｔ細胞免疫応答を含む免疫応答を誘発する能力がある。したがって、１つの実施形態において本明細書で提供する免疫原性調製物は、（ａ）第１単離／組換え免疫原を含む（かつアジュバントをさらに含み得る）免疫原性組成物（第１免疫原組成物とも称する）と、（ｂ）第１免疫原と第２免疫原をコードしその発現を指示する組換え発現ベクターを含む第２免疫原性組成物と、を含み、少なくとも第２免疫原は特異的ＣＤ８Ｔ細胞応答を誘発する能力を有する。ある実施形態では、上記少なくとも２つの免疫原の各々は、同一の指定抗原に対する免疫応答を誘発する能力を有する。あるいは、上記少なくとも２つの免疫原の各々は、異なる指定抗原に対して特異的な免疫応答を誘発する能力を有する（便宜上、異なる指定抗原をそれぞれ第１指定抗原、第２指定抗原等とも称する）。
【００４９】
免疫原および指定抗原
本明細書に記載される方法で使用される、および、本明細書に記載される使用法のための免疫原は、１つの免疫原性組成物に含まれる単離抗原および／もしくは組換え免疫原であり得るし、および／または第２の免疫原性組成物に含まれる組換え発現ベクターによってコードされ、その免疫原には、特定の免疫応答が望まれる任意の免疫原が含まれる。ある実施形態では、その免疫原は目的の指定抗原の代表的な全長型アミノ酸配列を含む、または、その免疫原はそれぞれの指定抗原の免疫原性断片であり得る。他の特定の実施形態では、免疫原は指定抗原の変異体を含むことができ、その変異体は代表的な全長型指定抗原と高パーセントの同一性を共有し、代表的なアミノ酸配列を含む指定抗原と実質的に同じレベルの免疫原性を示す（すなわち、変異体が、代表的抗原または野生型抗原の免疫原性と比較して統計的、臨床的および／または生物学的に有意な程度にまで免疫原性のレベルを保持する）。特に、免疫原性断片または指定抗原の変異体である免疫原は、対象において液性免疫応答（すなわち、特定の抗体を発現することになるＢ細胞応答）または細胞介在性応答（すなわち、ＣＤ４Ｔ細胞応答および／またはＣＤ８Ｔ細胞応答、ならびに細胞傷害性Ｔリンパ球応答を含む））または液性応答と細胞介在性応答の両方を誘導する能力を統計学的、臨床的または生物学的に有意な方式で保持する。目的の指定抗原ならびにそれらの免疫原性断片および免疫原性変異体は本明細書においてより詳細に説明される。
【００５０】
本明細書においてより詳細に説明されるように、免疫原は、対象において指定抗原に特異的な免疫応答を誘導することが可能である少なくとも１つの免疫原性領域または免疫原性エピトープを含む。１つの特別な実施形態では、前記免疫原は、それぞれ、その免疫原に特異的であり、したがって、それぞれの指定抗原に特異的である抗体応答、ＣＤ４Ｔ細胞応答およびＣＤ８Ｔ細胞応答のうちのいずれか１つ以上を誘導することができるように１つ以上の免疫原性領域を含む。したがって、その免疫原性領域は、抗体応答、ＣＤ４Ｔ細胞応答およびＣＤ８Ｔ細胞応答のうちの１つ以上を誘導する少なくとも１つのエピトープ（すなわち、１つ以上のエピトープ）を含む。
【００５１】
細胞介在性免疫応答は細胞傷害性Ｔリンパ球応答を含み、その応答は、免疫原またはそれぞれの指定抗原を産生または発現する細胞（例えば、腫瘍細胞、細菌細胞、ウイルス、寄生生物、または真菌細胞）または感染性粒子（例えば、ウイルス粒子）を破壊する、またはそれらに損傷を与えることができる。免疫された対象にとって有益である液性応答または細胞介在性免疫応答またはそれらの両方が対応する疾患または障害に関連する任意の抗原を免疫原として使用することができる。
【００５２】
多数の疾患および障害に関連する抗原が当技術分野において周知である。目的の抗原（すなわち、指定抗原）は、疾患または障害と関連すると以前から知られている場合がある、または、当技術分野において公知であり、実施されている任意の方法によって疾患または障害に関連する抗原と特定される場合がある。例えば、患者が苦しんでいる癌の種類に関連する抗原は、腫瘍関連抗原など、公知である場合があり、または、当技術分野において実施されている様々な方法のうちのいずれかによって腫瘍自体から特定される場合がある。ある実施形態では、前記指定抗原は癌細胞（すなわち、腫瘍細胞）に由来する腫瘍関連抗原（本明細書において腫瘍抗原とも呼ばれる）であり、そして、１つ以上のそのような腫瘍抗原は癌の免疫療法に有用であり得る。非限定的な例として、腫瘍関連抗原は前立腺癌、乳癌、大腸直腸癌、肺癌、膵臓癌、腎臓癌、中皮腫、卵巣癌または黒色腫に由来し得る。これらの腫瘍関連抗原およびその他の腫瘍関連抗原は本明細書および当技術分野において記載される。
【００５３】
ある実施形態では、免疫原は、前記指定抗原であり、腫瘍または悪性腫瘍に由来する全長タンパク質を含む。他の特定の実施形態では、免疫原は、そのようなタンパク質に由来する１つ以上のエピトープを含有する１つ以上の免疫原性断片を含む。さらに他の実施形態では、免疫原は、腫瘍細胞に由来する全長型指定抗原を含む融合ポリペプチド、または腫瘍細胞に由来する指定抗原の１つ、２つ、３つ、もしくはそれ以上の免疫原性断片を含む融合ポリペプチドを含む。他の実施形態では、２つ以上の指定抗原に対する免疫応答の誘導に使用するために免疫原性組成物を調製するとき、融合ポリペプチドは、その２つ以上の指定抗原のそれぞれについて、全長型抗原またはその１つ以上の免疫原性断片の任意の組合せを含むことができる。例として、融合ポリペプチドは１つの腫瘍関連抗原にから得られる１つ以上の免疫原性断片を含むことができ、そして、第２の異なる腫瘍関連抗原から得られる１つ以上の免疫原性断片をさらに含む。融合タンパク質は、免疫原性のポリペプチドまたはペプチドに加えて、時に免疫学の分野でキャリアータンパク質と呼ばれる、目的の免疫原に対する免疫応答を増強する少なくとも１つのポリペプチドまたはペプチドを含むことができる。
【００５４】
代表的な腫瘍関連抗原または腫瘍細胞由来抗原にはＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ３およびＭＡＧＥ４（または、国際特許出願公開第９９／４０１８８号に開示されるものなどの他のＭＡＧＥ抗原）、ＰＲＡＭＥ、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、Ｌａｇｅ（ＮＹ‐ＥＳＯ‐１としても知られる）、ＳＡＧＥ、ならびにＨＡＧＥ（例えば、国際特許出願公開第９９／５３０６１号を参照のこと）またはＧＡＧＥ（Robbins et al., Curr. Opin. Immunol. 8:628-36 (1996)、 Van den Eyndeet al., Int. J. Clin. Lab. Res. 27:81-86 (1997)、Van den Eynde et al., Curr.Opin. Immunol. 9:648-93 (1997)、 Correale et al., J. Natl. Cancer Inst. 89: 293(1997)）が含まれる。腫瘍抗原のこれらの非限定的な例は、黒色腫、肺癌、肉腫、および膀胱癌などの広範囲の種類の腫瘍で発現する。例えば、米国特許第６，５４４，５１８号を参照のこと。前立腺癌腫瘍関連 抗原には、例えば、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺酸性ホスファターゼ（ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ）、ＮＫＸ３．１および６回膜貫通前立腺上皮性抗原（ＳＴＥＡＰ）が含まれる(Hubert et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 14523-28, 1999、例えば、 Reiter etal., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95:1735-40, 1998、Nelson, et al., Proc. Natl.Acad. Sci. USA 96:3114-19 (1999)、国際公開第９８／１２３０２号、米国特許第５，９５５，３０６号、同第５，８４０，８７１号および同５，７８６，１４８号、国際特許出願公開第９８／２０１１７号、同第００／０４１４９号、同第９８／１３７４１８号も参照のこと）。
【００５５】
他の腫瘍関連抗原にはＰｌｕ‐１ (J. Biol. Chem.274:15633-45, 1999)、ＨＡＳＨ‐１、ＨａｓＨ‐２、Ｃｒｉｐｔｏ（Salomon et al., Bioessays 199,21:61-70、米国特許第５，６５４，１４０号）およびＣｒｉｐｔｉｎ（米国特許第５，９８１，２１５号）が含まれる。さらに、腫瘍抗原は、多くの癌の治療に有用な、短１０アミノ酸長ペプチドである全長型ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ、国際特許出願公開第９５／２０６００号）などの自己ペプチドホルモンであり得る。
【００５６】
腫瘍抗原には、ＨＥＲ‐２／ｎｅｕの発現などの、腫瘍関連抗原の発現を特徴とする癌に由来する腫瘍抗原が含まれる。目的の腫瘍関連抗原には、メラニン細胞‐黒色腫系列抗原であるＭＡＲＴ‐１／Ｍｅｌａｎ‐Ａ、ｇｐ１００、ｇｐ７５、ｍｄａ‐７、チロシナーゼおよびチロシナーゼ関連タンパク質などの系列特異的腫瘍抗原が含まれる。例示的な腫瘍関連抗原には、ｐ５３、Ｒａｓ、ｃ‐Ｍｙｃ、細胞質性セリン／トレオニンキナーゼ（例えば、Ａ‐Ｒａｆ、Ｂ‐ＲａｆおよびＣ‐Ｒａｆ、サイクリン依存性キナーゼ）、ＭＡＧＥ‐Ａ１、ＭＡＧＥ‐Ａ２、ＭＡＧＥ‐Ａ３、ＭＡＧＥ‐Ａ４、ＭＡＧＥ‐Ａ６、ＭＡＧＥ‐Ａ１０、ＭＡＧＥ‐Ａ１２、ＭＡＲＴ‐１、ＢＡＧＥ、ＤＡＭ‐６、‐１０、ＧＡＧＥ‐１、‐２、‐８、ＧＡＧＥ‐３、‐４、‐５、‐６、‐７Ｂ、ＮＡ８８‐Ａ、ＭＡＲＴ‐１、ＭＣ１Ｒ、Ｇｐ１００、ＰＳＡ、ＰＳＭ、チロシナーゼ、ＴＲＰ‐１、ＴＲＰ‐２、ＡＲＴ‐４、ＣＡＭＥＬ、ＣＥＡ、Ｃｙｐ‐Ｂ、ｈＴＥＲＴ、ｈＴＲＴ、ｉＣＥ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ホスホイノシチド３‐キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、ＴＲＫ受容体、ＰＲＡＭＥ、Ｐ１５、ＲＵ１、ＲＵ２、ＳＡＲＴ‐１、ＳＡＲＴ‐３、ウィルムス腫瘍抗原（ＷＴ１）、ＡＦＰ、  ‐カテニン／ｍ、カスパーゼ‐８／ｍ、ＣＥＡ、ＣＤＫ‐４／ｍ、ＥＬＦ２Ｍ、ＧｎＴ‐Ｖ、Ｇ２５０、ＨＳＰ７０‐２Ｍ、ＨＳＴ‐２、ＫＩＡＡ０２０５、ＭＵＭ‐１、ＭＵＭ‐２、ＭＵＭ‐３、ミオシン／ｍ、ＲＡＧＥ、ＳＡＲＴ‐２、ＴＲＰ‐２／ＩＮＴ２、７０７‐ＡＰ、アネキシンＩＩ、ＣＤＣ２７／ｍ、ＴＰＩ／ｍｂｃｒ‐ａｂｌ、ＢＣＲ‐ＡＢＬ、インターフェロン調節因子４（ＩＲＦ４）、ＥＴＶ６／ＡＭＬ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、Ｐｍｌ／ＲＡＲ  、腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー１（ＴＡＣＳＴＤ１）ＴＡＣＳＴＤ２、受容体チロシンキナーゼ（例えば、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）（特に、ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ））、細胞質性チロシンキナーゼ（例えば、ｓｒｃ‐ファミリー、ｓｙｋ‐ＺＡＰ７０ファミリー）、インテグリン結合キナーゼ（ＩＬＫ）、シグナルトランスデューサーおよび転写活性化因子であるＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５およびＳＴＡＴ６、低酸素誘導因子（例えば、ＨＩＦ‐１    およびＨＩＦ‐２  ）、核内因子κＢ（ＮＦ‐κＢ）、Ｎｏｔｃｈ受容体（例えば、Ｎｏｔｃｈ１〜４）、ｃ‐Ｍｅｔ、ラパマイシン（ｍＴＯＲ）の哺乳類の標的、ＷＮＴ、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）、およびそれらの調節性サブユニット、ＰＭＳＡ、ＰＲ‐３、ＭＤＭ２、メソテリン、腎臓細胞癌-５Ｔ４、ＳＭ２２‐α、炭酸脱水酵素Ｉ（ＣＡＩ）およびＩＸ（ＣＡＩＸ）（Ｇ２５０としても知られる）、ＳＴＥＡＤ、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＧＤ２、プロテイナーゼ３、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＥｐｈＡ２、ＭＬ‐ＩＡＰ、ＥｐＣＡＭ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、ＡＬＫ、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ポリシアル酸、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＧＤ３、フコシルＧＭ１、メソテリアン（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉａｎ）、ＰＳＣＡ、ｓＬｅ、ＰＬＡＣ１、ＧＭ３、ＢＯＲ���Ｓ、Ｔｎ、ＧＬｏｂｏＨ、ＮＹ‐ＢＲ‐１、ＲＧｓ５、ＳＡＲＴ３、ＳＴｎ、ＰＡＸ５、ＯＹ‐ＴＥＳ１、スパーム・プロテイン１７、ＬＣＫ、ＨＭＷＭＡＡ、ＡＫＡＰ‐４、ＳＳＸ２、ＸＡＧＥ１、Ｂ７Ｈ３、レグマイン（ｌｅｇｕｍａｉｎ）、ＴＩＥ２、Ｐａｇｅ４、ＭＡＤ‐ＣＴ‐１、ＦＡＰ、ＭＡＤ‐ＣＴ‐２、ｆｏｓ関連抗原１、ならびにイディオタイプのうちのいずれか１つ以上から由来する腫瘍抗原、またはそれらのうちのいずれか１つ以上を含む腫瘍抗原が含まれるが、これらに限定されない。
【００５７】
免疫原には、腫瘍細胞で変異した遺伝子に由来する、または腫瘍細胞において正常細胞と比較して異なるレベルで転写される遺伝子に由来するエピトープ領域またはエピトープ性ペプチドを含む腫瘍抗原、例えば、テロメラーゼ酵素、サービビン、メソテリン、変異型ｒａｓ、ｂｃｒ／ａｂｌ転移、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、変異型ｐ５３または野生型ｐ５３、チトクロームＰ４５０  １Ｂ１、およびＮ‐アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ‐Ｖなどの異常発現イントロン配列、骨髄腫およびＢ細胞リンパ腫で独自のイディオタイプを生成するクローン性の免疫グロブリン遺伝子再構成、ヒトパピローマウイルスタンパク質Ｅ６およびＥ７、エプスタイン・バール・ウイルスタンパク質ＬＭＰ２などの癌ウイルスのプロセスに由来するエピトープ領域またはエピトープ性ペプチドを含む腫瘍抗原、癌胎児性抗原およびα‐フェトプロテインなどの腫瘍選択的発現を有する非変異型癌胎児性タンパク質が含まれる。Boon et al., Ann. Rev. Immunol. 12:337-65 (1994)、 Renkvist et al.,Cancer Immunol. Immunother. 50:3-15 (2001)も参照のこと。
【００５８】
他の実施形態では、免疫原は、ウイルス、真菌、寄生生物および細菌などの病原性微生物または日和見病原性微生物（本明細書において感染症微生物とも呼ばれる）から得られる、または由来する。ある実施形態では、そのような微生物に由来する免疫原には、選択される指定抗原である全長タンパク質が含まれる。他の特定の実施形態では、免疫原は、そのようなタンパク質に由来する１つ以上のエピトープを含有する１つ以上の免疫原性断片を含む。さらに他の実施形態では、免疫原は、微生物に由来するタンパク質の１つ、２つ、またはそれ以上の免疫原性断片を含む融合ポリペプチドを含む。さらに他の実施形態では、免疫原は、微生物に由来する指定抗原の全長型指定抗原を含む、または、微生物に由来する指定抗原の１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の免疫原性断片を含む融合ポリペプチドを含む。他の実施形態では、感染症微生物の２つ以上の指定抗原に対する免疫応答の誘導に使用するために免疫原性組成物を調製するとき、融合ポリペプチドはその２つ以上の指定抗原のそれぞれについて全長型抗原またはその１つ以上の免疫原性断片の任意の組合せを含むことができる。例として、融合ポリペプチドは、１つの微生物抗原（すなわち、ウイルス性抗原、細菌性抗原、寄生生物性抗原または真菌性抗原）から得られる１つ以上の免疫原性断片を含むことができ、第２の異なる微生物抗原（すなわち、第２の異なるウイルス性抗原、細菌性抗原、寄生生物性抗原または真菌性抗原）から得られる１つ以上の免疫原性断片をさらに含むことができる。融合タンパク質は、免疫原性のポリペプチドまたはペプチドに加えて、時に免疫学の分野でキャリアータンパク質と呼ばれる、目的の免疫原に対する免疫応答を増強する少なくとも１つのポリペプチドまたはペプチドを含むことができる。
【００５９】
本明細書に記載される免疫原性組成物中で使用される指定抗原および免疫原として企図されており、そして、本明細書に記載されるベクターおよびベクター粒子によりコードされる抗原が由来する例示的な病原性生物には、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ）、インフルエンザＡ、ＢおよびＣ、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を含むブドウ球菌属の種、および肺炎レンサ球菌を含むストレプトコッカス属の種が含まれる。当業者が理解するように、本明細書に記載されるような免疫原として使用されるこれらの病原性微生物および他の病原性微生物に由来するタンパク質は当技術分野において公知であり、そして、そのようなタンパク質のアミノ酸配列（およびそれらの種）およびそれらのタンパク質をコードするヌクレオチド配列は出版物ならびにＧＥＮＢＡＮＫ、Ｓｗｉｓｓ‐ＰｒｏｔおよびＴｒＥＭＢＬなどの公開されているデータベースにおいて見出すことができる。
【００６０】
免疫原であり得る、および、本明細書に記載されるように使用され得るヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に由来する抗原には、ＨＩＶビリオン構造タンパク質（例えば、ｇｐ１２０、ｇｐ４１、ｐ１７、ｐ２４）、プロテアーゼ、逆転写酵素、またはｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒおよびｖｐｕによりコードされるＨＩＶタンパク質のいずれかが含まれる。ＨＩＶタンパク質およびそれらの免疫原性断片は当業者に周知であり、そして、多数の公開データベースのいずれかに見つけ出すことができる（例えば、 Vider-Shalit et al., AIDS 23(11):1311-18 (2009)、Watkins, Mem. Inst.Oswaldo Cruz. 103(2):119-29 (2008)、Gao et al., Expert Rev. Vaccines (4Suppl):S161-68 (2004)を参照のこと）。（例えば、 Klimstra et al., 2003. J. Virol. 77:12022-32、Bernard et al., Virology 276:93-103 (2000)、 Byrnes et al., J. Virol. 72:7349-56 (1998)、 Lieberman et al., AIDS Res Hum. Retroviruses 13(5): 383-92(1997)、Menendez-Arias et al., Viral Immunol. 11(4): 167-181 (1998) も参照のこと。
【００６１】
本明細書に記載される組成物中の免疫原としての使用が考えられており、そして、本明細書に記載されるベクターおよびベクター粒子によりコードされる単純ヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ１およびＨＳＶ２）に由来する抗原にはＨＳＶ後期遺伝子から発現されるタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。後期群の遺伝子は主にビリオン粒子を形成するタンパク質をコードする。そのようなタンパク質には、ウイルスのカプシドを形成する（ＵＬ）由来の５つのタンパク質、すなわち、ＵＬ６、ＵＬ１８、ＵＬ３５、ＵＬ３８および主要カプシドタンパク質ＵＬ１９、ＵＬ４５およびＵＬ２７が含まれ、それらのそれぞれを本明細書に記載されるような免疫原として使用することができる（例えば、 McGeoch et al., Virus Res. 117:90-104 (2006)、 Mettenleiter et al.,Curr. Opin. Microbiol. 9: 423-29 (2006) を参照のこと）。本明細書において免疫原としての使用が考えられている他の例示的なＨＳＶタンパク質にはＩＣＰ２７タンパク質（Ｈ１、Ｈ２）、糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）および糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）が含まれる。ＨＳＶゲノムは少なくとも７４遺伝子を含み、それぞれが、Ｔ細胞応答（ＣＴＬ応答を含む）、Ｂ細胞反応、またはＣＴＬ応答とＢ細胞反応の両方を誘導するための免疫原として潜在的に使用することができるタンパク質をコードする。
【００６２】
ヒト（例えば、 Corey et al., “Genital Herpes,” inSexually Transmitted Diseases, Holmes et al., eds. (McGraw-Hill, New York,1999) 285-312を参照のこと）および動物モデル（例えば、 Parr et al., J. Virol. 72:2677 (1998) を参照のこと）でのＨＳＶ‐２に対する防御免疫応答が、適切なＨＳＶ‐２ワクチン製剤が望ましく、入手可能な目的物であることを示唆する。過去４０年間にわたり、アジュバントと製剤した不活化全ＨＳＶ調製物およびサブユニットＨＳＶタンパク質を使用するヒトでの一連のＨＳＶワクチンの治験が米国と欧州で行われてきた。いくつかの短期の試験でこれらのワクチンに中程度の治療効果が観察されたが、より長期の経過観察ウィンドウを有する適切に管理された治験からの結果はほとんど期待外れである（例えば、Rajcani et al., Folia Microbiol. (Praha) 51:67 (2006) を参照のこと）。
【００６３】
欧州では、１９６０年代と１９７０年代に大規模な臨床試験が、ホルムアルデヒド不活化ＨＳＶ（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ社の治験）または加熱不活化ＨＳＶ（Ｌｕｐｉｄｏｎ  Ｈの治験）を用いて行われた。ＨＳＶの再発の重症度と頻度の改善が報告されたが、これらの治験のうちのほんのわずかな部分集合がプラセボ対照化、および二重盲検化された。さらに、これらのワクチンは長期の治療効果を付与しなかった。１９８０年代の母体胎児間ＨＳＶ‐２伝達の研究より、ＨＳＶ‐２血清陽性の女性の幼児は、短期間でＨＳＶ‐２を獲得した女性よりも低い伝達のリスクを有することが示されたが、これは、ＨＳＶ‐２糖タンパク質であるｇＤおよびｇＢに対する中和抗体（ｎＡｂ）が防御能を付与する可能性があることを示唆する（例えば、 Koelle et al., Clin. Microbiol. Rev. 16: 96 (2003) を参照のこと）。これらのＨＳＶ‐２糖タンパク質に対するｎＡｂを作製することが計画され、１９９０年代に米国で行われたＧｌａｘｏ‐Ｓｍｉｔｈ  ＫｌｉｎｅおよびＣｈｉｒｏｎによる治験では、３つの異なるアジュバントであるアルム、ＭＦ‐５９（水中油型）、およびモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）と製剤したｇＤのみ、またはｇＤとｇＢを含む組換えサブユニットワクチンが試験された。これらのワクチンは血清陰性の個体でＨＳＶ‐２特異的ｎＡｂを誘発または追加増幅し、ＨＳＶ‐１血清陽性の個体でｎＡｂと交差反応する（例えば、Burke, Rev. Infect. Dis. 13 Suppl 11:S906-S911 (1991) を参照のこと）。しかしながら、目標のレベルの液性免疫原性にまで達したにもかかわらず、これらのワクチンは男性では治療効果を示さず、そして、女性では一時的な効能のみを示した。このことは、抗ＨＳＶ中和抗体は不十分であり、強力なＴ細胞免疫を発生させることが有効なＨＳＶワクチンに必要である可能性が高い（例えば、Corey et al., JAMA 282: 331 (1999)、 Stanberry, et al., N. Engl. J. Med.347:1652 (2002) を参照のこと）。
【００６４】
以前に実施されたＨＳＶワクチン治験は、ＨＳＶ‐２の感染からヒトを防御するにはｎＡｂは十分ではない可能性があることを示し、そして、データは、ＨＳＶ‐２特異的Ｔ細胞がウイルスの獲得、伝達、および再活性化の低下において重要な役割を果たすことを示唆した（例えば、前述の Corey et al., JAMA (1999)を参照のこと）。例えば、Ｔ細胞機能に欠陥を有する個体はＨＳＶ‐２感染のより長く、より重症のエピソードを有し、そして、ＨＳＶ‐２病変の長期にわたる生検検査では、ＣＤ８Ｔ細胞の浸潤に相関するウイルスのクリアランスを有する（例えば、Koelle et al., J. Clin. Invest. 101:1500 (1998) を参照のこと）。さらなるＨＳＶ検査により、１型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１）応答は動物モデルにおいて防御的であったこと（例えば、Koelle, et al., J. Immunol. 166:4049 (2001)、 Zhu, et al., J. Exp. Med. 204:595(2007) を参照のこと）、ＨＳＶ‐２再活性化の重症度と頻度がＨＳＶ特異的Ｔ細胞の頻度と逆に相関したこと、および、ＨＳＶ‐２特異的なＣＴＬの生殖器病変への浸潤がウイルスのクリアランスと相関したこと（例えば、Koelle et al., J. Infect. Dis. 169:956 (1994)、 Koelle et al., J. Clin. Invest.110:537 (2002)、前述のKoelle et al., J. Clin. Invest. (1998)を参照のこと）が示されている。これらの発見は、粘膜でのＨＳＶ‐２クリアランスにＣＤ８Ｔ細胞応答およびＴｈ１ＣＤ４Ｔ細胞応答を関連付けるサブユニットワクチン試験のデータと一致する（例えば、Posavad et al., Nat. Med. 4:381 (1998) を参照のこと）。さらに、陰部ヘルペスの解決後に真皮表皮接合部で長期にわたってＨＳＶ‐２特異的ＣＤ８Ｔ細胞が検出されている（例えば、Cattamanchi et al., Clin. Vaccine Immunol. 15:1638 (2008) を参照のこと）。
【００６５】
本明細書に記載される本免疫原性組成物および方法のある実施形態での使用が企図されているサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来する抗原にはＣＭＶ構造タンパク質、ウイルス複製の最初期相および初期相の間に発現するウイルス抗原、糖タンパク質ＩおよびＩＩＩ、カプシドタンパク質、コートタンパク質、低分子マトリックスタンパク質ｐｐ６５（ｐｐＵＬ８３）、ｐ５２（ｐｐＵＬ４４）、ＩＥ１およびＩＥ２（ＵＬ１２３およびＵＬ１２２）、ＵＬ１２８からＵＬ１５０までの遺伝子クラスター由来のタンパク質産物 (Rykman, et al., J. Virol. 2006 Jan;80(2):710-22)、エンベロープ糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）、ｇＨ、ｇＮ、ならびにｐｐ１５０が含まれる。当業者が理解するように、本明細書に記載される免疫原として使用されるＣＭＶタンパク質はＧｅｎＢａｎｋ、Ｓｗｉｓｓ‐ＰｒｏｔおよびＴｒＥＭＢＬなどの公開データベースにおいて見出すことができる（例えば、Bennekov et al., Mt. Sinai J. Med. 71 (2): 86-93 (2004)、 Loewendorf et al., J.Intern. Med. 267(5):483-501 (2010)、 Marschall et al., Future Microbiol.4:731-42 (2009)を参照のこと）。
【００６６】
ある実施形態での使用が企図されているエプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ）に由来する抗原にはＥＢＶ溶解タンパク質ｇｐ３５０およびｇｐ１１０、ならびにエプスタイン・バール・核抗原（ＥＢＮＡ）‐１、ＥＢＮＡ‐２、ＥＢＮＡ‐３Ａ、ＥＢＮＡ‐３Ｂ、ＥＢＮＡ‐３Ｃ、ＥＢＮＡ‐リーダータンパク質（ＥＢＮＡ‐ＬＰ）および潜伏期膜タンパク質（ＬＭＰ）‐１、ＬＭＰ‐２ＡおよびＬＭＰ‐２Ｂ（例えば、 Lockey et al., Front. Biosci. 13:5916-27 (2008) を参照のこと）を含む潜伏感染期に産生されるＥＢＶタンパク質が含まれる。
【００６７】
本明細書に記載される免疫原としての使用が企図されている呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）に由来する抗原には、ＲＳＶゲノムによりコードされる１１種のタンパク質、すなわち、ＮＳ１、ＮＳ２、Ｎ（ヌクレオカプシドタンパク質）、Ｍ（マトリックスタンパク質）であるＳＨ、ＧおよびＦ（ウイルス性コートタンパク質）、Ｍ２（第２マトリックスタンパク質）、Ｍ２‐１（伸長因子）、Ｍ２‐２（転写調節）、ＲＮＡポリメラーゼ、およびリンタンパク質Ｐ、またはそれらの免疫原性断片のいずれかが含まれる。
【００６８】
免疫原としての使用が企図されている水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）に由来する抗原には、ＶＳＶゲノムによりコードする５種の主要タンパク質、すなわち、大タンパク質（Ｌ）、糖タンパク質（Ｇ）、核タンパク質（Ｎ）、リンタンパク質（Ｐ）、およびマトリックスタンパク質（Ｍ）、およびそれらの免疫原性断片のうちのいずれか１つが含まれる（例えば、 Rieder et al., J. Interferon Cytokine Res. (2009) (9):499-509、Roberts et al., Adv. Virus Res. (1999) 53:301-19を参照のこと）。
【００６９】
ある実施形態での使用が企図されているインフルエンザウイルスに由来する抗原にはヘマグルチニン（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、マトリックスタンパク質であるＭ１およびＭ２、ＮＳ１、ＮＳ２（ＮＥＰ）、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ１‐Ｆ２、ならびにＰＢ２が含まれる。例えば、 Nature 437 (7062): 1162-66を参照のこと。
【００７０】
ウイルス抗原である免疫原の例には、アデノウイルスポリペプチド、アルファウイルスポリペプチド、カリシウイルスポリペプチド（例えば、カリシウイルスカプシド抗原）、コロナウイルスポリペプチド、ジステンパーウイルスポリペプチド、エボラウイルスポリペプチド、エンテロウイルスポリペプチド、フラビウイルスポリペプチド、肝炎ウイルス（ＡＥ）ポリペプチド（肝炎Ｂコア抗原または表面抗原、肝炎ＣウイルスＥ１糖タンパク質またはＥ２糖タンパク質、コアタンパク質、または非構造タンパク質）、ヘルペスウイルスポリペプチド（本明細書において考察されるヘルペスウイルスポリペプチド、および単純ヘルペスウイルスまたは水痘帯状疱疹ウイルスの糖タンパク質を含む）、感染性腹膜炎ウイルスポリペプチド、白血病ウイルスポリペプチド、マールブルグウイルスポリペプチド、オルトミクソウイルスポリペプチド、パピローマウイルスポリペプチド、パラインフルエンザウイルスポリペプチド（例えば、ヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼポリペプチド）、パラミクソウイルスポリペプチド、パルボウイルスポリペプチド、ペスチウイルスポリペプチド、ピコルナウイルスポリペプチド（例えば、ポリオウイルスカプシドポリペプチド）、ポックスウイルスポリペプチド（例えば、ワクシニアウイルスポリペプチド）、狂犬病ウイルスポリペプチド（例えば、狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｇ）、レオウイルスポリペプチド、レトロウイルスポリペプチド、およびロタウイルスポリペプチドも含まれるが、これらに限定されない。
【００７１】
ある実施形態では、指定抗原として細菌抗原を選択することができ、細菌抗原またはその免疫原性の断片もしくは変異体を免疫原として使用することができる。ある実施形態では、目的の細菌抗原は分泌型ポリペプチドであり得る。他の特定の実施形態では、免疫応答の誘導に免疫原として有用であり得る細菌抗原には、細菌の細胞外表面に露出するポリペプチドの単数または複数の部分を有する抗原が含まれる。細胞表面に露出するポリペプチド免疫原は宿主中で免疫細胞および／または抗体に到達可能であり、したがって、組換え発現ベクターによりコードされる有用な免疫原であり得、そして、本明細書に記載される免疫原を含む免疫原性組成物（アジュバントをさらに含むことができる）に含まれ得る。
【００７２】
免疫原としての使用が企図されているメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を含むブドウ球菌属の種に由来する抗原にはＡｇｒシステム、ＳａｒおよびＳａｅ、Ａｒｌシステム、Ｓａｒホモログ（Ｒｏｔ、ＭｇｒＡ、ＳａｒＳ、ＳａｒＲ、ＳａｒＴ、ＳａｒＵ、ＳａｒＶ、ＳａｒＸ、ＳａｒＺおよびＴｃａＲ）、ＳｒｒシステムおよびＴＲＡＰなどの病原性調節因子が含まれる。免疫原として機能することができる他のブドウ球菌属のタンパク質にはＣｌｐタンパク質、ＨｔｒＡ、ＭｓｒＲ、アコニターゼ、ＣｃｐＡ、ＳｖｒＡ、Ｍｓａ、ＣｆｖＡおよびＣｆｖＢが含まれる（例えば、 Staphylococcus: Molecular Genetics, 2008 Caister Academic Press,Ed. Jodi Lindsayを参照のこと）。黄色ブドウ球菌の２つの種類（Ｎ３１５およびＭｕ５０）のゲノムが配列決定されており、例えば、ＰＡＴＲＩＣ(PATRIC: The VBI PathoSystems Resource Integration Center, Snyder et al.,Nucleic Acids Res. (2007) 35: 401-406)で公開されている。当業者が理解するように、免疫原として使用されるブドウ球菌属タンパク質はＧｅｎＢａｎｋ、Ｓｗｉｓｓ‐Ｐｒｏｔ、およびＴｒＥＭＢＬなどの他の公開データベースにおいても見出すことができる。
【００７３】
本明細書に記載されるある実施形態で免疫原としての使用が企図されている肺炎レンサ球菌に由来する抗原にはニューモリシン、ＰｓｐＡ、コリン結合タンパク質Ａ（ＣｂｐＡ）、ＮａｎＡ、ＮａｎＢ、ＳｐｎＨＬ、ＰａｖＡ、ＬｙｔＡ、Ｐｈｔ、およびピリンタンパク質（ＲｒｇＡ、ＲｒｇＢ、ＲｒｇＣ）が含まれる。肺炎レンサ球菌の免疫原性タンパク質は、当技術分野において公知でもあり、および、免疫原としての使用が企図されている（例えば、 Zysk et al., Infect. Immun. 2000 68(6):3740-43を参照のこと）。肺炎レンサ球菌の病原性株の完全ゲノム配列が配列決定されており（例えば、Tettelin H, et al., Science (2001) 293(5529):498-506を参照のこと）、そして、当業者が理解するように、本明細書に記載される組成物で使用される肺炎レンサ球菌のタンパク質はＧｅｎＢａｎｋ、Ｓｗｉｓｓ‐Ｐｒｏｔ、およびＴｒＥＭＢＬなどの他の公開データベースにおいて見出すこともできる。本開示に記述される免疫原として特に関心があるタンパク質には、その肺炎球菌の表面に露出することが予測される病原性因子およびタンパク質が含まれる（例えば、前述のTettelin et al.、 Frolet et al., BMC Microbiol. (2010) Jul 12;10:190、 Rigden, etal., Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. (2003) 38(2):143-68、 Jedrzejas, Microbiol.Mol. Biol. Rev. (2001) 65(2):187-207を参照のこと）。
【００７４】
免疫原として使用することができる細菌抗原の例にはアクチノマイセス属のポリペプチド、バシラス属のポリペプチド、バクテロイデス属のポリペプチド、ボルデテラ属のポリペプチド、バルトネラ属のポリペプチド、ボレリア属のポリペプチド（例えば、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）のＯｓｐＡ）、ブルセラ属のポリペプチド、カンピロバクター属のポリペプチド、カプノサイトファーガ属のポリペプチド、クラミジア属のポリペプチド、コリネバクテリウム属のポリペプチド、コクシエラ属のポリペプチド、デルマトフィルス属のポリペプチド、エンテロコッカス属のポリペプチド、エーリキア属のポリペプチド、エシェリキア属のポリペプチド、フランシセラ属のポリペプチド、紡錘菌属のポリペプチド、ヘモバルトネラ属のポリペプチド、ヘモフィルス属のポリペプチド（例えば、インフルエンザ菌ｂ型外膜タンパク質）、ヘリコバクター属のポリペプチド、クレブシエラ属のポリペプチド、Ｌ‐型菌のポリペプチド、レプトスピラ属のポリペプチド、リステリア属のポリペプチド、マイコバクテリウム属のポリペプチド、マイコプラズマ属のポリペプチド、ナイセリア属のポリペプチド、ネオリケッチア属のポリペプチド、ノカルディア属のポリペプチド、パスツレラ属のポリペプチド、ペプトコッカス属のポリペプチド、ペプトストレプトコッカス属のポリペプチド、ニューモコッカス属のポリペプチド（すなわち、肺炎レンサ球菌のポリペプチド）（本明細書の説明を参照のこと）、プロテウス属のポリペプチド、シュードモナス属のポリペプチド、リケッチア属のポリペプチド、ロシャリメア属のポリペプチド、サルモネラ属のポリペプチド、シゲラ属のポリペプチド、ブドウ球菌属ポリペプチド、Ａ群レンサ球菌のポリペプチド（例えば、化膿レンサ球菌のＭタンパク質）、Ｂ群レンサ球菌（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）のポリペプチド、トレポネーマ属のポリペプチド、およびエルシニア属のポリペプチド（例えば、ペスト菌のＦ１およびＶ抗原）が含まれるが、これらに限定されない。
【００７５】
免疫原であり得る真菌抗原の例にはアブシジア属のポリペプチド、アクレモニウム属のポリペプチド、アルテルナリア属のポリペプチド、アスペルギルス属のポリペプチド、バシジオボルス属のポリペプチド、ビポラリス属のポリペプチド、ブラストミセス属のポリペプチド、カンジダ属のポリペプチド、コクシジオイデス属のポリペプチド、コニディオボルス属のポリペプチド、クリプトコッカス属のポリペプチド、クルブラリア属のポリペプチド、エピデルモフィトン属のポリペプチド、エクソフィアラ属のポリペプチド、ゲオトリクム属のポリペプチド、ヒストプラズマ属のポリペプチド、マズレラ属のポリペプチド、マラセジア属のポリペプチド、ミクロスポルム属のポリペプチド、モニリエラ属のポリペプチド、モルティエラ属のポリペプチド、ムコール属のポリペプチド、ペシロマイセス属のポリペプチド、アオカビ属のポリペプチド、フィアレモニウム（Ｐｈｉａｌｅｍｏｎｉｕｍ）属のポリペプチド、フィアロフォラ属のポリペプチド、プロトテカ属のポリペプチド、シュードアレシェリア属のポリペプチド、シュードミクロドキウム（Ｐｓｅｕｄｏｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ）属のポリペプチド、フハイカビ属のポリペプチド、リノスポリジウム属のポリペプチド、クモノスカビ属のポリペプチド、スコレコバシジウム（Ｓｃｏｌｅｃｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属のポリペプチド、スポロトリクス属のポリペプチド、ステンフィリウム（Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ）属のポリペプチド、白癬菌属のポリペプチド、トリコスポロン属のポリペプチド、およびキシロフィファ（Ｘｙｌｏｈｙｐｈａ）属のポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
【００７６】
原生動物性寄生生物抗原の例にはバベシア属のポリペプチド、バランチジウム属のポリペプチド、ベスノイチア属のポリペプチド、クリプトスポリジウム属のポリペプチド、アイメリア属のポリペプチド、エンセファリトゾーン属のポリペプチド、エントアメーバ属のポリペプチド、ジアルジア属のポリペプチド、ハンモンジア（Ｈａｍｍｏｎｄｉａ）属のポリペプチド、ヘパトゾーン属のポリペプチド、イソスポラ属のポリペプチド、リーシュマニア属のポリペプチド、ミクロスポリジア属のポリペプチド、ネオスポラ属のポリペプチド、ノセマ属のポリペプチド、ペンタトリコモナス属のポリペプチド、マラリア原虫属のポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。蠕虫性寄生生物抗原の例にはアカントケイロネマ属のポリペプチド、エアルロストロンギラス（Ａｅｌｕｒｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）属のポリペプチド、アンシロストーマ属のポリペプチド、アンチオストロンギルス属のポリペプチド、アスカリス属のポリペプチド、ブルギア属のポリペプチド、ブノストムム属のポリペプチド、キャピラリア属のポリペプチド、シャベルティア（Ｃｈａｂｅｒｔｉａ）属のポリペプチド、クーペリア属のポリペプチド、クレノソーマ（Ｃｒｅｎｏｓｏｍａ）属のポリペプチド、ディクチオカウルス属のポリペプチド、腎虫のポリペプチド、ジペタロネーマ属のポリペプチド、ジフィロボスリウム属のポリペプチド、ジピリジウム（Ｄｉｐｌｙｄｉｕｍ）属のポリペプチド、ディロフィラリア属のポリペプチド、ドラカンクルス属のポリペプチド、エンテロビウス属のポリペプチド、フィラロイデス属のポリペプチド、ヘモンカス属のポリペプチド、ラゴキルアスカリス属のポリペプチド、ロア糸状虫属のポリペプチド、マンソネラ属のポリペプチド、ムエレリウス（Ｍｕｅｌｌｅｒｉｕｓ）属のポリペプチド、ナノフィエタス（Ｎａｎｏｐｈｙｅｔｕｓ）属のポリペプチド、ネカトール属のポリペプチド、ネマトジルス（Ｎｅｍａｔｏｄｉｒｕｓ）属のポリペプチド、エソファゴストム属のポリペプチド、オンコセルカ属のポリペプチド、オピストルキス属のポリペプチド、オステルタジア属のポリペプチド、パラフィラリア属のポリペプチド、パラゴニムス属のポリペプチド、パラスカリス（Ｐａｒａｓｃａｒｉｓ）属ポリペプチド、フィサロプテラ属のポリペプチド、プロトストロンギルス（Ｐｒｏｔｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）属のポリペプチド、セタリア属のポリペプチド、スピロセルカ（Ｓｐｉｒｏｃｅｒｃａ）属のポリペプチド、スピロメトラ属のポリペプチド、ステファノフィラリア（Ｓｔｅｐｈａｎｏｆｉｌａｒｉａ）属のポリペプチド、ストロンギロイデス属のポリペプチド、ストロンギルス属のポリペプチド、テラジア属のポリペプチド、トキサスカリス属のポリペプチド、トキソカラ属のポリペプチド、トリキネラ属のポリペプチド、トリコストロンギルス属のポリペプチド、トリチュリス属のポリペプチド、ウンシナリア属のポリペプチド、およびウケレリア属のポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。（例えば、熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質（ＰｆＣＳＰ））、スポロゾイト表面タンパク質２（ＰｆＳＳＰ２）、肝臓期抗原１のカルボキシル末端（ＰｆＬＳＡ１ｃ‐ｔｅｒｍ）、および輸出タンパク質１（ＰｆＥｘｐ‐１）、ニューモシスチス属のポリペプチド、サルコシスチス属ポリペプチド、シストソーマ属のポリペプチド、タイレリア属のポリペプチド、トキソプラズマ属のポリペプチド、およびトリパノソーマ属のポリペプチド。
【００７７】
外部寄生生物抗原の例には、ノミ、カタダニおよびヒメダニを含むマダニ、ユスリカ、カ、スナバエ、ブユ、ウシアブ、ツノサシバエ、メクラアブ、ツェツェバエ、サシバエ、蠅蛆症の原因のハエおよびヌカカなどの飛行性昆虫、アリ、クモ、シラミ、ダニ、ならびにトコジラミおよびサシガメなどのナンキンムシに由来するポリペプチド（感染防御抗原ならびにアレルゲンを含む）が含まれるが、これらに限定されない。
【００７８】
液性応答（すなわち、Ｂ細胞反応）または細胞介在性反応（細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を含む）または両方のいずれかを含む免疫応答の誘導は、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、らい菌（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）、およびリステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕｌａ）などのその他の生物の食作用または殺滅に寄与することもできる。ＣＴＬ免疫応答は緑膿菌、結核菌、ライ菌およびリステリア・イノキュアの殺滅に寄与する（例えば、 Oykhman et al., J. Biomed. Biotechnol. (2010: 249482);２０１０年６月２３日に電子出版、を参照のこと）。したがって、本明細書に記載される免疫原性組成物に有用であり、組換え発現ベクターおよびそれらのベクターを含むベクター粒子によってコードされ得る免疫原はこれらの細菌に由来することもができる。細菌種のいずれか１つの細菌ゲノムによってコードされ、および、その細菌によって発現される多数のポリペプチドのアミノ酸配列は当技術分野および公開されているタンパク質配列データベースにおいて容易に見出すことができる（例えば、Stover et al., Nature 406:959 (2000) も参照のこと）。
【００７９】
本明細書に記載されるような免疫原は真菌または寄生生物から得ることができる、または、由来し得る。ＣＴＬ免疫応答を含む免疫応答を誘導する代表的な寄生生物にはマンソン住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａｍａｎｓｏｎｉ）、赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｅｏｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、トキソプラズマ原虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）、および熱帯マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）が含まれる（例えば、前述の Oykhmanを参照のこと）。したがって、これらの寄生生物に由来する、またはこれらの寄生生物から得られるタンパク質抗原はそれぞれの寄生生物に対する免疫応答を誘導するための免疫原として有用であり得る。免疫原はまた、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）およびカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）（例えば、前述のOykhmanを参照のこと）を含むが、これらに限定されない真菌の種から得ることができる、または、これらの種に由来し得る。
【００８０】
免疫原性ポリペプチド（例えば、本明細書および／または当技術分野において記載される腫瘍関連抗原または微生物抗原のいずれか）の少なくとも１つの免疫原性断片を含むポリペプチドを免疫原として使用することができ、および本明細書に記載される組換え発現ベクターにコードすることができる。免疫原性断片は少なくとも１つのＴ細胞エピトープまたは少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含む。その免疫原性断片は免疫原性ポリペプチドのうちの少なくとも６、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはそれ以上の連続するアミノ酸から構成され得る。その免疫原性断片は、前述の数の間の任意の数の連続するアミノ酸を含むことができ、その結果、例えば、免疫原性断片は免疫原性ポリペプチドの約６〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００の間、またはそれ以上の連続するアミノ酸である。その免疫原性断片は直鎖状エピトープを形成する十分な数の連続するアミノ酸を含むことができる、および／または、その断片が、単数または複数の非直鎖状エピトープ（当技術分野において立体構造エピトープとも呼ばれる）を提供するために前記断片を得た全長型ポリペプチドと同じ（または、十分に類似している）三次元構造に折り畳まれることを可能にするのに十分な数の連続するアミノ酸を含むことができる。免疫原性断片が全長型ポリペプチドと類似の立体構造に折り畳まれているか評価するための検査は、例えば、天然型のエピトープまたは折り畳まれていないエピトープに特異的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体と反応するそのタンパク質の能力、他のリガンド結合機能を保持していること、およびそのポリペプチド断片のプロテアーゼ消化に対する感受性または抵抗性を含む（例えば、 Sambrook et al., Molecular Cloning:  A Laboratory Manual, 3ded., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (2001) を参照のこと）。したがって、例として、全長型ポリペプチドに特異的に結合する抗体の結合能と結合レベルが断片と全長型ポリペプチドで実質的に同じ（すなわち、代表的な全長型抗原または野生型全長型抗原の免疫原性と比較して、統計的、臨床的および／または生物学的に十分な程度まで結合レベルが保持されている）であるとき、そのポリペプチド断片の三次元構造は全長型ポリペプチドと十分に類似している。
【００８１】
目的のポリペプチドまたはその免疫原性断片の三次元構造の決定は，その免疫原性断片が全長型ポリペプチドに見出されるようなアミノ酸の空間配置を保持しているかどうか決定するための日常用いる方法論により実行することができる。例えば、 Bradley et al., Science 309:1868-71 (2005)、 Schueler-Furman et al.,Science 310:638 (2005)、 Dietz et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 103:1244 (2006)、Dodson et al., Nature 450:176 (2007)、 Qian et al., Nature 450:259 (2007) を参照のこと。細胞膜を貫通すると知られている、または考えられているポリペプチドの膜貫通セグメントおよび膜トポロジーを予想するのに有用なソフトウェア、例えば、ＰＳＯＲＴまたはＰＳＯＲＴ  ＩＩ、およびＳｐｓｃａｎ（ウィスコンシン配列解析パッケージ、ジェネティクス・コンピュータ・グループ）も当技術分野において利用可能である（例えば、Nakai et al., Trends Biochem. Sci. 24:34-36 (1999)を参照のこと）。
【００８２】
当業者は、目的の指定抗原の代表的なアミノ酸配列を与えられると、上記の技法とは別に、または、それらと組み合わせてそのポリペプチド抗原の潜在的なエピトープを特定することができる（例えば、 Jameson and Wolf, Comput. Appl. Biosci. 4:181-86 (1988) を参照のこと）。別の例として、ＨｏｐｐとＷｏｏｄｓは、ポリペプチド領域の親水性とそれらの抗原性の間の密接な相関の経験的な証明に基づく親水性法について説明している（例えば、Hopp, Pept. Res. 6:183-90 (1993); Hofmann et al., Biomed. Biochim. Acta46:855-66 (1987) を参照のこと）。Ｂ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープの特定にコンピュータプログラムも利用可能である。ＥＰＩＰＬＯＴと呼ばれるＢＡＳＩＣプログラムは、１３種の異なるスケールで柔軟性、親水性および抗原性を計算およびプロットすることによりタンパク質の一次構造からそれらの中のＢ細胞抗原部位を予想する（例えば、Menendez et al., Comput. Appl. Biosci. 6:101-105 (1990) を参照のこと）。例えば、VanRegenmortel, Methods: a companion to Methods in Enzymology, 9: 465-472 (1996)、Pellequer et al., 「Epitope predictions from the primary structure of proteins,”In Peptide antigens: a practical approach (ed. G.B. Wisdom), pp. 7-25; OxfordUniversity Press, Oxford (1994)、 Van Regenmortel, 「Molecular dissection ofprotein antigens” In Structure of antigens (ed. M.H.V. Van Regenmortel), Vol.1, pp. 1-27. CRC Press, Boca Raton (1992) も参照のこと。
【００８３】
免疫原として使用することができる指定抗原のＴ細胞エピトープは、Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら(Immunogenetics50: 213-219 (1999))、Ｐａｒｋｅｒら（前述）により開発されたアルゴリズムに基づくペプチドモチーフ検索プログラムを用いて、またはDoytchinova and Flower, Immunol. Cell Biol. 80(3):270-9 (2002)、 Blythe et al.,Bioinformatics 18:434-439 (2002)、 Guan et al., Applied Bioinformatics 2:63-66(2003)、 Flower et al., Applied Bioinformatics 1:167-176 (2002)、 Mallios,Bioinformatics 17: 942-48 (2001)、 Schirle et al., J. Immunol. Meth. 257:1-16(2001)に記載されるものなどの方法を用いることにより特定することもできる。
【００８４】
本明細書に記載される組成物および方法において免疫原として使用することができる指定微生物抗原または指定腫瘍抗原のエピトープ領域は当技術分野においても説明される。例として、 Lamb et al., Rev. Infect. Dis. Mar - Apr: Suppl 2:s443-447 (1989)、Lamb et al., EMBO J. 6:1245-49 (1987)、 Lamb et al., Lepr. Rev. Suppl 2:131-37(1986)、 Mehra et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7013-27 (1986)、 Horsfall etal., Immunol. Today 12:211-13 (1991)、 Rothbard et al., Curr. Top. Microbiol.Immunol. 155:143-52 (1990)、 Singh et al., Bioinformatics 17:1236-37 (2001)、DeGroot et al., Vaccine 19:4385-95 (2001)、 DeLalla et al., J. Immunol.163:1725-29 (1999)、 Cochlovius et al., J. Immunol. 165:4731- 41 (2000)、Consogno et al., Blood 101:1039-44 (2003)、 Roberts et al., AIDS Res. Hum.Retrovir. 12:593-610 (1996)、 Kwok et al., Trends Immunol. 22:583-88 (2001)、Novak et al., J. Immunol. 166:6665-70 (2001)を参照のこと。
【００８５】
エピトープ領域を特定するその他の方法には、Hoffmeister et al.,Methods  29:270-281 (2003)、Maecker et al.,  J. Immunol. Methods255:27-40 (2001)に記載される方法が含まれる。エピトープを特定する検定法は本明細書に記載されており、当業者に知られており、そして、例えば、Current Protocols in Immunology, Coligan et al. (Eds), John Wiley & Sons,New York, NY (1991)に記載される方法を含む。
【００８６】
目的の指定抗原の免疫原性領域および／またはエピトープの特定は、当業者が日常的に実施する方法および技術を用いて、当業者により、および／またはコンピュータ解析とコンピュータモデリングにより容易に決定することもできる。経験的方法は、例として、タンパク質の特定の長さの連続するアミノ酸を含むポリペプチド断片を合成すること、または１つ以上のプロテアーゼを使用することによる断片を作製することとその次の当技術分野において日常的に実施されている多数の結合アッセイ法または免疫アッセイ法のうちのいずれか１つを用いてその断片の免疫原性を決定することを含む。抗体（ポリクローナル、モノクローナル、またはその抗原結合断片）の断片に特異的に結合する能力を決定する代表的な方法にはＥＬＩＳＡ、放射免疫アッセイ、イムノブロット、競合的結合アッセイ、蛍光活性化セルソーター分析（ＦＡＣＳ）、および表面プラズモン共鳴が含まれるが、これらに限定されない。
【００８７】
Ｔ細胞エピトープとＢ細胞エピトープの配列は公開されているデータベースから得ることができる。例えば、Ｔ細胞識別腫瘍抗原を含むペプチドデータベースは、インターネット上に、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙにより提供される定期的に更新されるペプチドデータベースに見出すことができる（ｃａｎｃｅｒｉｍｍｕｎｉｔｙ（ドット）ｏｒｇ／ｐｅｐｔｉｄｅｄａｔａｂａｓｅ／Ｔｃｅｌｌｅｐｉｔｏｐｅｓ．ｈｔｍを参照のこと）。米国国立アレルギー感染症研究所により維持される別の利用可能なデータベースはＢ細胞エピトープとＴ細胞エピトープの検索ツールを提供し、エピトープ解析ツールを提供する（ｉｍｍｕｎｏｅｐｉｔｏｐｅ（ドット）ｏｒｇの免疫エピトープデータベースおよび分析資源（Ｉｍｍｕｎｅ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ）を参照のこと）。
【００８８】
ある特定の例では、抗原特異的Ｔ細胞株またはクローン、例えば、腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）、ウイルス特異的または細菌特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）が利用可能であるとき、特定の抗原を用いて調製された標的細胞を用いて適切なエピトープの存在について調べるスクリーニングにこれらの細胞を使用することができる。無作為的または選択的な合成ペプチドライブラリーを使用してそのような標的を調製することができるが、それらのライブラリーは標的細胞をＣＴＬによる溶解に感受性にするために使用される。Ｔ細胞株またはクローンが利用可能であるとき、適切なエピトープを特定するための別のアプローチは組換えＤＮＡ法を用いることである。ＣＴＬ感受性標的の遺伝子ライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーをまず調製し、非感受性標的細胞に形質移入する。これによって、ＣＴＬエピトープを含有するペプチドのタンパク質前駆体をコードする遺伝子の特定とクローニングが可能になる。この方法の第２段階は、少なくとも１つのＣＴＬエピトープをコードする領域を絞るために当該のクローン化された遺伝子から短縮型遺伝子を調製することである。その遺伝子があまり大きくない場合は、この段階は任意である。第３段階は、標的をＣＴＬに感受性にするために使用される、例えば、１０〜２０アミノ酸長で、５〜１０残基の重複を有する合成ペプチドを調製することである。単数または複数のペプチドが適切なエピトープを含有することが示されるとき、所望により、エピトープを含有する最小サイズのペプチドを確定するためにより小さいペプチドを調製することができる。これらのエピトープは、ＣＴＬエピトープとしては９〜１０残基内に収まり、ヘルパーＴリンパ球（ＨＴＬ）エピトープとしては最大で２０残基または３０残基に収まることが普通だが、必ずしもそうではない。
【００８９】
あるいは、特定の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子が非共有結合するペプチドの直接溶出とその後の溶出ペプチドのアミノ酸配列決定によりエピトープを明らかにすることができる（例えば、 Engelhard et al., Cancer J. 2000 May;6 Suppl 3:S272-80を参照のこと）。簡単に説明すると、ＨＰＬＣなどの精製方法を用いて溶出ペプチドを分離し、標的をＣＴＬ溶解に感受性にする能力またはＨＴＬでサイトカイン分泌の増加を誘導する能力について個々の画分を試験する。前記のペプチドを含む画分が特定されている場合、さらにそれを精製し、そして、配列分析にかける。タンデムマススペクトロメトリーを用いてそのペプチド配列を決定することもできる。その後、正しい配列とペプチドが特定されたことを確認するために、合成ペプチドを調製し、ＣＴＬまたはＨＴＬを用いてそれを試験する。
【００９０】
Ｔｈ応答を誘発する可能性があるペプチドモチーフを検索するＴｓｉｔｅｓプログラム（例えば、 Rothbard and Taylor, EMBO J. 7:93-100, 1988、 Deavin et al., Mol.Immunol. 33:145-155, 1996を参照のこと）などのコンピュータ解析を用いてエピトープを特定することもできる。マウスおよびヒトのＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩとの結合に適切なモチーフを有するＣＴＬペプチドをＢＩＭＡＳ(Parker et al., J. Immunol. 152:163, 1994) および他のＨＬＡペプチド結合予想分析に従って特定することができる。簡単に説明すると、ＭＨＣ結合モチーフの存在について、例えば、微生物の構成成分または微生物抗原、または腫瘍細胞の構成成分または腫瘍抗原に由来するタンパク質配列を調査する。それぞれのＭＨＣ対立遺伝子について存在するこれらの結合モチーフは、通常９〜１０アミノ酸残基長であるＭＨＣクラスＩ結合ペプチドの２位（または３位）および９位（または１０位）に通常存在する保存されたアミノ酸残基である。その後、ＭＨＣ結合モチーフを担持するそれらの配列を含む合成ペプチドを調製し、次に、ＭＨＣ分子に結合するそのようなペプチドの能力についてそれらを試験する。多数の空（非占有）ＭＨＣ分子を発現する細胞を用いるか（細胞結合アッセイ）、精製したＭＨＣ分子を用いてＭＨＣ結合アッセイを行うことができる。次に、最後に、無感作の個体でＣＴＬ応答を誘導するＭＨＣ結合ペプチドの能力について、インビトロでヒトリンパ球を用いるか、インビボでＨＬＡ遺伝子導入動物を用いてそれらを試験する。ペプチド感作化標的細胞、およびウイルス感染細胞または腫瘍細胞などの自然状態で抗原をプロセッシングする標的を用いてこれらのＣＴＬを試験する。免疫原性をさらに確認するために、ＨＬＡ  Ａ２遺伝子導入マウスモデルおよび／または様々なインビトロ活性化アッセイのうちのいずれかを用いてペプチドを試験することができる。
【００９１】
ある実施形態では、免疫原には、それぞれの免疫原について当技術分野において公知であり利用可能であるアミノ酸配列に１つ以上のアミノ酸の置換、挿入または欠失を有する指定抗原のポリペプチド種が含まれる。保存的アミノ酸置換は周知であり、それはポリペプチド中に自然界で起こる場合があり、または、ポリペプチドが組換え技術で作製されるときに導入される場合もある。よく知られ、日常的に実施されている突然変異形成方法を用いてポリペプチドにアミノ酸置換、欠失および付加を導入することができる（例えば、 Sambrook et al. Molecular Cloning:  A Laboratory Manual, 3ded., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (2001) を参照のこと）。所望の置換、欠失または挿入により変更された複数の特定のコドンを有する変異型ポリヌクレオチドを提供するためにオリゴヌクレオチド指向性部位特異的（またはセグメント特異的）突然変異形成方法を用いることができる。所望の欠失に隣接する都合がよい制限エンドヌクレアーゼ部位を使用することにより、免疫原として使用することができる指定抗原の欠失変異体または短縮変異体を構築することもできる。制限に続いて、突出部を埋め、ＤＮＡを再ライゲーションすることができる。あるいは、免疫原ポリペプチド変異体を調製するために、アラニンスキャニング突然変異形成、エラー・プローンポリメラーゼ連鎖反応突然変異形成などの無作為突然変異形成技法、およびオリゴヌクレオチド指向性突然変異形成を用いることができる（例えば、前述のSambrooket al.を参照のこと）。特定の指定抗原（またはそのポリペプチド断片）の種（または変異体）には、当技術分野において公知の代表的なアミノ酸配列のいずれかとアミノ酸配列が少なくとも８５％、９０％、９５％または９９％同一であるポリペプチド免疫原が含まれる。
【００９２】
これらのポリペプチド免疫原変異体はそれぞれの指定抗原の１つ以上の生物学的活性または機能を保持する。特に、指定抗原の変異体である免疫原は、対象において免疫応答（例えば、液性応答（すなわち、Ｂ細胞応答）、細胞介在性応答（すなわち、Ｔ細胞応答（細胞傷害性Ｔリンパ球応答を含む））または液性応答と細胞介在性応答の両方を誘導する能力を統計学的、臨床的または生物学的に有意な方式で保持する。ポリペプチドに変異を導入するために、ポリペプチド断片を調製するために、断片および変異体を単離するために、およびそれらを分析するために当技術分野において日常的に実施されている多数の分子生物学、タンパク質発現、およびタンパク質単離の技術および方法を考えると、所望の生物学的活性を有する免疫原ポリペプチド変異体および断片は容易に、そして、過度な実験を行うことなく作製され得る。
【００９３】
当業者に公知の様々な基準が、ペプチドまたはポリペプチドの特定の位置で置換されているアミノ酸が保存されている（または、類似している）かどうかを示す。例えば、類似アミノ酸置換または保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、類似している側鎖を有するアミノ酸残基で置換されている置換である。類似アミノ酸は以下の分類に含まれ得る：塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、ヒスチジン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン）。プロリンは、分類することがさらに難しいと考えられているが、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（例えば、ロイシン、バリン、イソロイシン、およびアラニン）と特性を共有する。ある特定の環境では、グルタミン酸のグルタミンによる置換またはアスパラギン酸のアスパラギンによる置換は、グルタミンとアスパラギンはそれぞれグルタミン酸とアスパラギン酸のアミド誘導体であるという点で類似置換だと見なすことができる。当技術分野において理解される場合、２つのポリペプチド間の「類似性」は、ポリペプチドのアミノ酸配列とそのアミノ酸配列に対する保存的な代わりのアミノ酸を第２ポリペプチドの配列と（例えば、ＧＥＮＥＷＯＲＫＳ、Ａｌｉｇｎ、ＢＬＡＳＴアルゴリズム、または、本明細書に記載されており、当技術分野において実施されている他のアルゴリズムを用いて）比較することにより決定される。
【００９４】
本明細書が免疫原性断片について述べる場合、それぞれの変異体が非変異体ポリペプチドまたは断片に類似する立体構造に折りたたまれるかどうか評価するための検定法は、含まれる、例えば、天然型のエピトープまたは折り畳まれていないエピトープに特異的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体と反応するそのタンパク質の能力、リガンド結合機能を保持していること、およびその変異型タンパク質のプロテアーゼ消化に対する感受性または抵抗性を含む（前述のSambrook et al.を参照のこと）。そのような変異体を、当業者が日常的に実施する、本明細書に記載される方法または当技術分野において公知の他の方法に従って特定、特性解析および／または作製することができる。
【００９５】
本明細書に記載される免疫原性組成物に含まれる単離免疫原／組換え免疫原は、分子生物学および／またはポリペプチド精製分野において日常的に実施される様々な方法および技術に従って作製および調製され得る。目的の免疫原を組換え技術により作製するために使用される発現ベクターの構築は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら (1989年版および2001年版; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory Press, NY) およびＡｕｓｕｂｅｌら (Current Protocols in MolecularBiology (2003))に記載されるように、制限エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーション、形質転換、プラスミド精製およびＤＮＡ配列決定を含むが、これらに限定されない当技術分野において公知の多数の適切な分子生物学的工学技法の内のいずれかを用いて達成され得る。それぞれの組換え発現コンストラクトのポリヌクレオチド配列は、効率的な転写および翻訳を達成するために、少なくとも１つの適切な発現制御配列（調節配列とも呼ばれる）、例えば、リーダー配列と、とりわけ、免疫原をコードするヌクレオチド配列に機能するように結合しているプロモーターを含む。
【００９６】
組換え発現ベクターを用いて宿主細胞を遺伝子操作して、組換え技術により免疫原、またはその断片もしくは変異体を作製する。本明細書に記載されるポリペプチドおよび融合ポリペプチドのそれぞれが適切なプロモーターの制御下で哺乳類細胞、酵母、細菌、昆虫、または、他の細胞で発現することができる。ＤＮＡコンストラクトに由来するＲＮＡを使用してそのようなタンパク質を作製するために無細胞翻訳システムを使用することもできる。原核生物宿主および真核生物宿主と使用する適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、例えば、Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ThirdEdition, Cold Spring Harbor, New York, (2001)により説明される。
【００９７】
一般に、目的の免疫原の作製に有用な組換え発現ベクターは、複製起点、宿主細胞の形質転換を可能にする選択マーカー、例えば、大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子および出芽酵母のＴＲＰ１遺伝子、および下流にある構造配列の転写を管理する高発現遺伝子由来のプロモーターを含む。プロモーターは、中でも、３‐ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）などの解糖系酵素、α因子、酸性ホスファターゼまたはヒートショックタンパク質をコードするオペロンに由来し得る。異種性の構造配列を翻訳開始配列および翻訳終止配列と共に適切な相で組み立てる。
【００９８】
任意により、免疫原をコードするヌクレオチド配列とインフレームで異種性配列を挿入して、例えば、組換え発現産物の精製を簡便にする、所望の特性を付与するペプチドまたはポリペプチドを与えることができる。そのような特定ペプチドには含まれるポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）またはＦＬＡＧ（登録商標）エピトープタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ、配列番号３５）、β‐ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ＧＳＴ、またはＸＰＲＥＳＳ（商標）エピトープタグ（ＤＬＹＤＤＤＤＫ、配列番号４１；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カールスバード、カリフォルニア州）などが含まれる（例えば、米国特許第５，０１１，９１２号；Hopp et al., (Bio/Technology 6:1204 (1988) を参照のこと）。例えば、ｐＢＡＤ／Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内に提供されるヘキサヒスチジンタグのように、ベクターが親和性配列を供給する場合がある。あるいは、合成により親和性配列を付加することができるし、または核酸コード配列を（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて）組換え技術により作製するためのプライマーを操作して親和性配列を挿入することもできる。
【００９９】
発現コンストラクト（例えば、クローニングベクター、シャトルベクター、または発現コンストラクト）を用いて遺伝子操作（形質導入、形質転換または形質移入）により記載される組換え発現コンストラクトを含有する宿主細胞を作製することができる。ベクターまたはコンストラクトはプラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形状であり得る。プロモーターの活性化、形質転換体の選択、またはコードされるヌクレオチド配列の増幅に適切であるように改変されている、従来の栄養培地で操作された宿主細胞を培養することができる。温度、ｐＨなどのような特定の宿主細胞に適した培養条件の選択と維持は容易に当業者に明らかになる。好ましくは、ポリペプチドの作製用に当技術分野で構築されている方法論に従って、宿主細胞を持続的増殖培養に適応させて細胞株を得ることができる。ある実施形態では、細胞株は不死細胞株であり、それは、長期培養の後に繰返し（生育可能でありながら、少なくとも１０回）継代培養することができる細胞を指す。
【０１００】
機能的プロモーターと機能可能な読み枠で適切な翻訳開始シグナルおよび翻訳終止シグナルと共に所望の免疫原をコードする構造ＤＮＡ配列を発現ベクターにそうにゅうすることによって、有用な細菌性発現コンストラクトを構築する。そのコンストラクトは、そのベクターコンストラクトの維持を保証し、所望により、宿主での増幅をもたらすための１つ以上の表現型選択マーカーおよび単数の複製起点を含むことができる。任意により他の種を使用することもできるが、形質転換に適切な原核生物宿主には大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌ならびにシュードモナス属、ストレプトマイセス属およびブドウ球菌属内の様々な種が含まれる。他の任意のプラスミドまたはベクターが宿主内で複製可能であり、増殖可能である限り、それらを使用することができる。したがって、例えば、目的の免疫原または指定抗原をコードするヌクレオチド配列は、ポリペプチドの発現用の様々な組換え発現コンストラクトのいずれか１つに含まれ得る。そのようなベクターおよびコンストラクトは染色体ＤＮＡ配列、非染色体ＤＮＡ配列および合成ＤＮＡ配列、例えば、細菌性プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡの組合せから得られるベクター、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病ウイルスなどのウイルスＤＮＡを含む。しかしながら、他の任意のベクターが宿主内で複製可能であり、増殖可能であるかぎり、それを組換え発現コンストラクトの調製のために使用することができる。
【０１０１】
様々な方法により適切なＤＮＡ配列をベクターに挿入することができる。一般に、当技術分野において公知の手法によりＤＮＡ配列を適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入する。クローニング、ＤＮＡ単離、増幅および精製の標準的技法、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼなどを含む酵素反応の標準的技法、ならびに様々な分離技法は、当業者に公知で、彼らにより一般的に用いられる技法である。多数の標準的技法が、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら(Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publ. Assoc.Inc. & John Wiley & Sons, Inc., 2003))、Ｓａｍｂｒｏｏｋら (MolecularCloning:  A Laboratory Manual, 3rd Ed., (Cold Spring Harbor Laboratory2001))、Ｍａｎｉａｔｉｓら(Molecular Cloning, (Cold Spring Harbor Laboratory 1982))、 および他のものに記載されている。
【０１０２】
発現ベクター内にポリペプチド免疫原をコードするＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡ合成を管理するための少なくとも１つの適切な発現制御配列（例えば、プロモーターまたは制御型プロモーター）に機能するように結合している。そのような発現制御配列の代表例には、ＬＴＲプロモーターまたはＳＶ４０プロモーター、大腸菌のｌａｃプロモーターまたはｔｒｐプロモーター、ラムダファージのＰＬプロモーター、および原核細胞または真核細胞またはそれらのウイルスで遺伝子発現を制御することが知られている他のプロモーターが含まれる。ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは、選択マーカーを有する他のベクターを用いて任意の所望の遺伝子からプロモーター領域を選択することができる。特定の細菌性プロモーターにはｌａｃＩプロモーター、ｌａｃＺプロモーター、Ｔ３プロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、ラムダＰＲプロモーター、ラムダＰＬプロモーター、およびｔｒｐプロモーターが含まれる。真核生物性プロモーターにはＣＭＶ最初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターおよび後期プロモーター、レトロウイルスのＬＴＲプロモーター、およびマウスのメタロチオネイン‐Ｉプロモーターが含まれる。適切なベクターおよびプロモーターの選択ならびに少なくとも１つの免疫原をコードするヌクレオチド配列に機能するように結合している少なくとも１つのプロモーターまたは制御型プロモーターを含むある特定の組換え発現コンストラクトの調製は十分に当業者のレベルの範囲内である。
【０１０３】
誘導可能制御型プロモーターおよび／または厳密な制御型プロモーターの設計と選択は当技術分野において公知であり、特定の宿主細胞と発現システムに依存する（例えば、Guzman et al., J. Bacteriology 177:4121-30 (1995)、 Smith et al., J.Biol. Chem. 253:6931-33 (1978)、 Hirsh et al., Cell 11:545-50 (1977)に記載される大腸菌アラビノースオペロン（ＰｂａｄまたはＰａｒａ）；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ラホヤ、カリフォルニア州）から入手可能なＰＥＴ発現システム（米国特許第４，９５２，４９６号を参照のこと）；ｔｅｔ調節発現システム(Gossenet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-51 (1992); Gossen et al., Science268:1766-69 (1995))；ＣＬＯＮＴＥＣＨ社のＣｒｅａｔｏｒ（商標）クローニングキットと使用することが考えられているｐＬＰ‐ＴＲＥ２アクセプターベクター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、パロアルト、カリフォルニア州）を参照のこと。例えば、Sauer, Methods 14:381-92 (1998); Furth, J. Mamm. Gland Biol. Neoplas. 2:373(1997))も参照のこと。例えば、 Cascio, Artif. Organs 25:529 (2001) を参照のこと）。
【０１０４】
免疫原コード核酸配列をバキュロウイルスシャトルベクターにクローン化することができ、次にそれをバキュロウイルスと組み換えて、例えば、Ｓｆ９宿主細胞を感染するために使用される組換えバキュロウイルス発現コンストラクトを作製する（例えば、 Baculovirus Expression Protocols, Methods in Molecular Biology Vol.39, Richardson, Ed. (Human Press 1995); Piwnica-Worms, “Expression of Proteinsin Insect Cells Using Baculoviral Vectors,” Section II, Chapter 16 in ShortProtocols in Molecular Biology, 2nd Ed., Ausubel et al., eds., (John Wiley& Sons 1992) を参照のこと）。
【０１０５】
単離免疫原および組換え免疫原の精製に使用され得る方法は、例として、組換え免疫原を培地に分泌する適切な宿主／ベクターシステムからの上清の獲得、および、その後のその培地の市販のフィルターを使用する濃縮を含み得る。濃縮後、その濃縮物を親和性マトリックスまたはイオン交換樹脂などの単一の適切な精製マトリックスまたは一連の適切なマトリックスにアプライすることができる。組換えポリペプチドをさらに精製するために１つ以上の逆相ＨＰＬＣステップを用いることができる。免疫原または指定抗原をその自然環境から単離するときにこれらの精製方法を用いることもできる。
【０１０６】
本明細書に記載される単離／組換え免疫原のうちの１つ以上の大規模生産に適した方法はバッチ細胞培養を含み、その培養は適切な培養条件を維持するためにモニターされ、管理される。本明細書に記載されており、当技術分野において公知である方法であって、当地および外地の規制官庁の法律とガイドラインに適合する方法に従って、免疫原の精製を実行することができる。
【０１０７】
アジュバントおよびアジュバント組成物
本明細書に記載されるように、免疫原性組成物は、免疫原に対する免疫応答およびそのそれぞれの指定抗原に対する免疫応答を増強（または、向上、増大）する（すなわち、免疫原および指定抗原に対する特定の免疫応答のレベルを、アジュバントを投与しない場合の特定の免疫応答のレベルと比較して、統計的、生物学的または臨床的に有意な方式で上昇させる）ことが企図されている少なくとも１つのアジュバントをさらに含むことができる。ある実施形態では、免疫原性組成物は、単離された、および／または、組換え技術によるものであり得る少なくとも１つの免疫原と少なくとも１つのアジュバントを含む。
【０１０８】
他の特定の実施形態では、少なくとも１つの免疫原をコードし、免疫原の発現を管理することができる組換え発現ベクターを含む免疫原性組成物はアジュバントをさらに含む。他の特定の実施形態では、少なくとも１つの免疫原を含む免疫原性組成物と組換え発現ベクターを含む免疫原性組成物の両方がアジュバントをさらに含む。さらに他の実施形態では、組換え発現ベクターを含む免疫原性組成物とアジュバントを組み合わせる代わりに、または、この免疫原性組成物と同時にアジュバントを投与する代わりに、後でアジュバントを投与し、そして、ベクターを含む免疫原性組成物と異なる経路および／または部位によってアジュバントを投与することができる。組換え発現ベクターを含む免疫原性組成物の投与後にアジュバントを投与するとき、免疫原性組成物の投与から１８時間、２４時間、３６時間、７２時間または１日、２日、３日、４、日、５日、６日、または７日（１週間）後にアジュバントを投与する。免疫応答のレベルを判定する方法および技術は本明細書においてより詳細に説明され、そして、当技術分野において日常的に実施されている。
【０１０９】
免疫原性組成物に含まれ、本明細書に記載される方法で使用され得る代表的なアジュバントには以下のものが含まれるが、必ずしもそれらに限定されない。これらの方法で使用され得るアジュバントには、免疫原およびそれぞれの指定抗原に特異的な液性応答、細胞性応答、または液性応答と細胞性応答の両方の増強に有用なアジュバントが含まれる。細胞性免疫応答は、免疫原およびそのそれぞれの指定抗原に特異的なＣＤ４Ｔ細胞応答（メモリーＣＤ４Ｔ細胞応答を含み得る）およびＣＤ８Ｔ細胞応答を含む。細胞性応答は、免疫原（または免疫原を担持もしくは発現する細胞もしくは粒子）に対する細胞傷害性Ｔ細胞応答（ＣＴＬ応答）を含む場合もある。所望のアジュバントは、免疫応答の定性的形式に悪影響を与え得る免疫原の立体構造変化を引き起こすことなく、免疫原に対する応答を増大する。適切なアジュバントには、アルム（硫酸アルミニウムカリウム）などのアルミニウム塩、または、他のアルミニウム含有アジュバント；非限定的な例として、無毒性モノホスホリルリピドＡなどの無毒性リピドＡ関連アジュバント（例えば、 Tomai et al., J. Biol. Response Mod. 6:99-107 (1987); Persing etal., Trends Microbiol. 10:s32-s37 (2002) を参照のこと）；本明細書に記載されるＧＬＡ；３デ‐Ｏ‐アシル化モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）（例えば、英国特許出願番号第２２２０２１１号を参照のこと）；南米に見られるシャボンノキの樹皮から単離されるトリテルペングリコシドまたはサポニンを含むＱＳ２１およびＱｕｉｌＡなどのアジュバント（例えば、Kensil et al., in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds.Powell and Newman, Plenum Press, NY, 1995);米国特許第５，０５７，５４０号を参照のこと）が含まれる。他の適切なアジュバントには、任意によりモノホツホリルリピドＡなどの免疫促進剤と併せた（スクアレンまたはピーナッツ油などの）水中油型乳剤が含まれる（例えば、Stoute et al., N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997) を参照のこと）。別の適切なアジュバントはＣｐＧである（例えば、Klinman, Int. Rev. Immunol. 25(3-4):135-54 (2006)、 米国特許第７，４０２，５７２号；欧州特許第７７２６１９号を参照のこと）。
【０１１０】
本明細書に記載されるように、適切なアジュバントは、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムまたは硫酸アルミニウムなどのアルミニウム塩である。ＭＰＬまたは３‐ＤＭＰ、ＱＳ２１、ポリグルタミン酸またはポリリシンなどの重合アミノ酸または単量体アミノ酸などの他の特定の免疫促進剤と共に、または、他の特定の免疫促進剤無しでそのようなアジュバントを使用することができる。別のクラスの適切なアジュバントは水中油型乳液製剤（本明細書において安定水中油型乳剤とも呼ばれる）である。ムラミルペプチド（例えば、Ｎ‐アセチルムラミル‐Ｌ‐トレオニル‐Ｄ‐イソグルタミン（Ｔｈｒ‐ＭＤＰ）、Ｎ‐アセチル‐ノルムラミル‐Ｌ‐アラニル‐Ｄ‐イソグルタミン（Ｎｏｒ‐ＭＤＰ）、Ｎ‐アセチルムラミル‐Ｌ‐アラニル‐Ｄ‐イソグルタミニル‐Ｌ‐アラニン‐２‐（１’‐２’ジパルミトイル‐ｓｎ‐‐グリセロ‐３‐ヒドロキシホスホリルオキシ）‐エチルアミン（ＭＴＰ‐ＰＥ）、Ｎ‐アセチルグルクサミニル‐Ｎ‐アセチルムラミル‐Ｌ‐Ａｌ‐Ｄ‐イソグル‐Ｌ‐Ａｌａ‐ジパルミトキシプロピルアミド（ＤＴＰ‐ＤＰＰ）セラミド（商標））、または、他の細菌細胞璧成分などの他の特定の免疫促進剤と共にそのようなアジュバントを任意により使用することができる。水中油型乳剤には、（１）モデル１１０Ｙミクロフリューダイザ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、ニュートン、マサチューセッツ州）などのミクロフリューダイザを使用してサブミクロン粒子に製剤する、５％スクアレン、０．５％ツイーン８０および０．５％スパン８５を含有する（任意により様々な量のＭＴＰ‐ＰＥを含有する）ＭＦ５９（国際公開第９０／１４８３７号）；（２）サブミクロン乳剤にするためにミクロフリューダイザにかけた、または、それより大きい粒子サイズの乳剤を作製するためにボルテックスにかけた１０％スクワラン、０．４％ツイーン８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１およびＴｈｒ‐ＭＤＰを含有するＳＡＦ、ならびに（３）２％スクアレン、０．２％ツイーン８０、ならびにモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコール酸（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）よりなる群からの１つ以上の細菌細胞璧成分、好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（商標））を含有するＲｉｂｉアジュバントシステム（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、ハミルトン、モンタナ州）が含まれる。また、上述したように、適切なアジュバントには、Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（商標）（ＱＳ２１、Ａｑｕｉｌａ、ウースター、マサチューセッツ州）などのサポニンアジュバント、またはＩＳＣＯＭ（免疫促進複合体）およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸなど、それから作製される粒子が含まれる。他のアジュバントには完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）（非ヒトでの使用には適切だが、ヒトでの使用には不適切である）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）が含まれる。他のアジュバントには、インターロイキン（ＩＬ‐１、ＩＬ‐２およびＩＬ‐１２）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ‐ＣＳＦ）、および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのサイトカインが含まれる。
【０１１１】
本明細書に記載されるように、アジュバントは無毒性リピドＡ関連（またはリピドＡ誘導体）アジュバントであり得る。特定の実施形態では、アジュバントはＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストとして作用するその能力に基づいて選択される。例として、ＴＬＲ４アゴニストとして作用し、そして、本明細書に記載される組成物に使用することができる無毒性リピドＡ関連アジュバントはＤＳＬＰである。ＤＳＬＰ化合物は、グルコースおよびアミノ置換グルコースから選択される２つの単糖基が結合して形成される二糖（ＤＳ）基を含み、その二糖は単数のリン基（Ｐ）と複数の脂質基（Ｌ）の両方に化学的に結合するという特徴を共有する。より具体的には、その二糖は、それぞれ６個の炭素を有する２つの単糖単位から形成されると考えることができる。前記二糖では、前記単糖のうちの１つが還元末端を形成し、他方の単糖が非還元末端を形成する。便宜上、従来の炭水化物番号付命名法に従って、還元末端を形成する単糖の炭素は１位、２位、３位、４位、５位および６位と位置を示して表されるが、非還元末端を形成する単糖の対応する炭素は１’位、２’位、３’位、４’位、５’位および６’位と位置を示して表される。ＤＳＬＰでは、非還元末端の１位の炭素がエーテル基（−Ｏ−）またはアミノ基（−ＮＨ−）のどちらかを介して還元末端の６’位の炭素に連結されている。リン酸基は、好ましくは非還元末端の４’炭素を介して二糖に結合する。脂質基のそれぞれが、アミド結合（−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−）またはエステル結合（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−）のどちらかを介して二糖に結合し、その場合、カルボニル基が脂質基に結合する。前記二糖は、アミド基またはエステル基に結合することができる７つの位置、すなわち、非還元末端の２’位、３’位および６’位ならびに還元末端の１位、２位、３位および４位を有する。
【０１１２】
脂質基は少なくとも６個の炭素、好ましくは少なくとも８個の炭素、およびより好ましくは少なくとも１０個の炭素を有し、その場合、それぞれの事例で、前記脂質基は２４個以下の炭素、２２個以下の炭素、または２０個以下の炭素を有する。１つの実施形態では、前記脂質基は合わせて６０〜１００個の炭素、好ましくは、７０〜９０個の炭素を提供する。脂質基は炭素原子と水素原子のみからなることができる。すなわち、それはヒドロカルビル脂質基であり得る。または、脂質基は１つのヒドロキシル基を含むことができる。すなわち、それはヒドロキシル置換脂質基であり得る。または、脂質基はエステル基を含むことができ、次に、そのエステル基、すなわち、エステル置換脂質のカルボニル（−Ｃ（Ｏ）−）を介してヒドロカルビル脂質またはヒドロキシル置換脂質基に結合する。ヒドロカルビル脂質基は飽和型または不飽和型であり得るが、不飽和型ヒドロカルビル脂質基は隣接する炭素原子の間に１つの二重結合を有する。
【０１１３】
ＤＳＬＰは３つ、または４つ、または５つ、または６つまたは７つの脂質基を含む。１つの態様では、ＤＳＬＰは３〜７つの脂質基を含み、別の態様では、ＤＳＬＰは４〜６つの脂質基を含む。１つの態様では、前記脂質基は、ヒドロカルビル脂質、ヒドロキシル置換脂質、およびエステル置換脂質から独立して選択される。１つの態様では、１位、４’位および６’位がヒドロキシルで置換されている。１つの態様では、単糖単位はそれぞれグルコサミンである。ＤＳＬＰは遊離酸形態であっても塩形態、例えば、アンモニウム塩であってもよい。
【０１１４】
ある実施形態では、ＤＳＬＰ上の脂質は以下によって説明される：３’位は−Ｏ−（ＣＯ）−ＣＨ２−ＣＨ（Ｒａ）（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒｂ）で置換され、２’位は−ＮＨ−（ＣＯ）−ＣＨ２−ＣＨ（Ｒａ）（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒｂ）で置換され、３位は−Ｏ−（ＣＯ）−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）（Ｒａ）で置換され、２位は−ＮＨ−（ＣＯ）−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）（Ｒａ）で置換され、ＲａとＲｂのそれぞれはデシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシルから選択され、これらの用語のそれぞれは置換型ヒドロカルビル基を指す。１つの実施形態では、Ｒａはウンデシルであり、Ｒｂはトリデシルであり、このアジュバントは、例えば、米国特許出願公開第２００８／０１３１４６６号では、「ＧＬＡ」と記述される。Ｒａがウンデシルであり、Ｒｂがトリデシルである化合物は、例えば、ＰＨＡＤ（商標）アジュバントとしてＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄ社から入手可能であるような、立体化学的に限定された形態で使用され得る。
【０１１５】
１つの態様では、ＤＳＬＰは、３Ｄ‐ＭＰＬとして知られる、天然化合物の混合物である。ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ社は彼らのＭＰＬ（商標）アジュバントとして、医薬品グレードで３Ｄ‐ＭＰＬアジュバントを商業生産する。３Ｄ‐ＭＰＬは科学文献および特許文献に広く記載されている。例えば、Vaccine Design:  the subunit and adjuvant approach,Powell M.F. and Newman, M.J.編, 第 21章のUlrich, J.T. および Myers, K. R.によるMonophosphoryl Lipid A as an adjuvant:  past experiences and newdirections, Plenum Press, New York (1995) および米国特許第４，９１２，０９４号を参照のこと。
【０１１６】
別の態様では、ＤＳＬＰアジュバントは（ｉ）非還元末端グルコサミンのヘキソースアミン１位および還元末端グルコサミンのヘキソースアミン６位の間のエーテル結合を介して非還元末端グルコサミンに結合している還元末端グルコサミンを有するジグルコサミン骨格、（ｉｉ）非還元末端グルコサミンのヘキソースアミン４位に結合しているＯ‐ホスホリル基、ならびに（ｉｉｉ）６個までの脂肪族アシル鎖を含み、その脂肪族アシル鎖のうちの１つがエステル結合を介して還元末端グルコサミンの３‐ヒドロキシに結合し、その脂肪族アシル鎖のうちの１つがアミド結合を介して非還元末端グルコサミンの２‐アミノに結合し、そして、１２個より多い炭素原子を有するアルカノイル鎖にエステル結合を介して結合するテトラデカノイル鎖を含み、ならびにその脂肪族アシル鎖のうちの１つがエステル結合を介して非還元末端グルコサミンの３‐ヒドロキシに結合し、そして、１２個より多い炭素原子を有するアルカノイル鎖にエステル結合を介して結合するテトラデカノイル鎖を含むと記載される場合がある。例えば、米国特許出願公開第２００８／０１３１４６６号を参照のこと。
【０１１７】
別の態様では、前記アジュバントは米国特許出願公開第２０１０／０３１０６０２号に記載される、６つの脂質基を有する合成二糖であり得る。
【０１１８】
別の態様では、ＤＳＬＰアジュバントは、化学式（Ｉ）によって記述され、グルコピラノシルリピドＡ（ＧＬＡ）と言う名称であり：
【化１】
0006054942.tif 000002
【０１１９】
式中、部分Ａ１と部分Ａ２は、水素、ホスフェート、およびリン酸塩からなる群より独立して選択される。ナトリウムとカリウムはリン酸塩の代表的な対イオンである。部分Ｒ１、部分Ｒ２、部分Ｒ３、部分Ｒ４、部分Ｒ５および部分Ｒ６は、Ｃ３〜Ｃ２３で表される３〜２３個の炭素を有するヒドロカルビル基から独立して選択される。明確にするために付け加えると、部分が複数の構成物を有する特定の群「から独立して選択される」とき、１番目の部分に選ばれた構成物は２番目の部分に選ばれる構成物の選択に多少なりとも影響を与える、または、制限を与えることが無いことが理解されるべきであると説明される。部分Ｒ１、部分Ｒ３、部分Ｒ５および部分Ｒ６が結合する炭素原子は非対称であり、したがって、Ｒ立体化学かＳ立体化学のどちらかで存在し得る。１つの実施形態ではそれらの炭素原子の全てがＲ立体化学の配置にあり、別の実施形態ではそれらの炭素原子の全てがＳ立体化学の配置にある。「ヒドロカルビル」は完全に水素と炭素から形成される化学部分であって、その炭素原子の配置が直鎖型または分岐型非環状または環状であり得、そして、隣接する炭素原子の間の結合は完全に単結合であり得、すなわち、飽和ヒドロカルビルをもたらすことができ、または、任意の２つの隣接する炭素原子の間に二重結合または三重結合が存在することができ、すなわち、不飽和型ヒドロカルビルをもたらすことができ、そして、そのヒドロカルビル基の炭素原子数が３と２４炭素原子の間である化学部分を指す。ヒドロカルビルはアルキルであり得、その場合、代表的な直鎖アルキルには、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシルなどを含む、メチル、エチル、ｎ‐プロピル、ｎ‐ブチル、ｎ‐ペンチル、ｎ‐ヘキシルなどが含まれ、分岐アルキルにはイソプロピル、ｓｅｃ‐ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ‐ブチル、イソペンチル、などが含まれる。代表的な飽和型環状ヒドロカルビルにはシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、などが含まれ；不飽和型環状ヒドロカルビルにはシクロペンテニルおよびシクロヘキセニルなどが含まれる。不飽和型ヒドロカルビルは隣接する炭素原子の間に少なくとも１つの二重結合または三重結合を含有する（そのヒドロカルビルが非環状である場合、それぞれ「アルケニル」または「アルキニル」と呼ばれ、そのヒドロカルビルが少なくとも部分的に環状である場合、それぞれシクロアルケニルおよびシクロアルキニルと呼ばれる）。代表的な直鎖および分岐アルケニルにはエチレニル、プロピレニル、１‐ブテニル、２‐ブテニル、イソブチレニル、１‐ペンテニル、２‐ペンテニル、３‐メチル‐１‐ブテニル、２‐メチル‐２‐ブテニル、２、３‐ジメチル‐２‐ブテニルなどが含まれ、代表的な直鎖および分岐アルキニルにはアセチレニル、プロピニル、１‐ブチニル、２‐ブチニル、１‐ペンチニル、２‐ペンチニル、３‐メチル‐１‐ブチニルなどが含まれる。式（Ｉ）のアジュバントは当技術分野において公知の合成方法、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ国際特許出願公開第２００９／０３５５２８号ならびに国際公開第２００９／０３５５２８号に見出される出版物に開示される合成方法によって得ることができる。その出版物のそれぞれも参照により本明細書に組み込まれる。そのアジュバントのうちのある特定の物は購入することもできる。
【０１２０】
ＤＳＬＰアジュバントは当技術分野において公知の合成方法、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ国際特許出願公開第２００９／０３５５２８号ならびに国際公開第２００９／０３５５２８号に見出される出版物に開示される合成方法によって得ることができる。その出版物のそれぞれも参照により本明細書に組み込まれる。商業的に合成されるＤＳＬＰアジュバント、例えば、式（Ｉ）のアジュバントは実質的に均一な形態に調製することができ、現在のＤＳＬＰ分子、例えば、式（Ｉ）の化合物に関して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％純粋な調製物と言える。所与のアジュバント調製物の純度の判定は、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、マススペクトロスコピーおよび／または核磁気共鳴分析によるような、適切な分析化学方法論を知っている者によって容易に実行され得る。天然の供給源から得られるＤＳＬＰアジュバントは通常容易に化学的に純粋な形態で調製されず、したがって、合成的に調製されたアジュバントが、本明細書に記載される組成物と方法に使用するのに好ましいアジュバントである。先に議論したように、前記のアジュバントのうちのある特定の物は購入することができる。１つのそのようなＤＳＬＰアジュバントは、アラバマ州アラバスターのＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ社のカタログに見出される製品番号６９９８００であり、以下のＥ１０と併せてＥ１を参照のこと。
【０１２１】
様々な実施形態では、前記アジュバントは式（Ｉ）の化学構造を有するが、部分Ａ１、部分Ａ２、部分Ｒ１、部分Ｒ２、部分Ｒ３、部分Ｒ４、部分Ｒ５および部分Ｒ６は、これらの部分についてこれまでに提供された選択肢からなる部分集合から選択され、これらの部分集合はＥ１、Ｅ２などにより以下で特定される。
【０１２２】
Ｅ１：Ａ１はホスフェートまたはリン酸塩であり、Ａ２は水素である。
【０１２３】
Ｅ２：Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はＣ３〜Ｃ２１アルキルであり、Ｒ２およびＲ４はＣ５〜Ｃ２３ヒドロカルビルである。
【０１２４】
Ｅ３：Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はＣ５〜Ｃ１７アルキルであり、Ｒ２およびＲ４はＣ７〜Ｃ１９ヒドロカルビルである。
【０１２５】
Ｅ４：Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はＣ７〜Ｃ１５アルキルであり、Ｒ２およびＲ４はＣ９〜Ｃ１７ヒドロカルビルである。
【０１２６】
Ｅ５：Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はＣ９〜Ｃ１３アルキルであり、Ｒ２およびＲ４はＣ１１〜Ｃ１５ヒドロカルビルである。
【０１２７】
Ｅ６：Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はＣ９〜Ｃ１５アルキルであり、Ｒ２およびＲ４はＣ１１〜Ｃ１７ヒドロカルビルである。
【０１２８】
Ｅ７：Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はＣ７〜Ｃ１３アルキルであり、Ｒ２およびＲ４はＣ９〜Ｃ１５ヒドロカルビルである。
【０１２９】
Ｅ８：Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はＣ１１〜Ｃ２０アルキルであり、Ｒ２およびＲ４はＣ１２〜Ｃ２０ヒドロカルビルである。
【０１３０】
Ｅ９：Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はＣ１１アルキルであり、Ｒ２およびＲ４はＣ１３ヒドロカルビルである。
【０１３１】
Ｅ１０：Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はウンデシルであり、Ｒ２およびＲ４はトリデシルである。
【０１３２】
ある実施形態では、Ｅ２〜Ｅ１０のそれぞれが実施形態Ｅ１と組み合わされる、および／またはＥ２〜Ｅ９のヒドロカルビル基がアルキル基、好ましくは直鎖アルキル基である。ＤＳＬＰアジュバント、例えば、式（Ｉ）のアジュバントは、それぞれ以下に考察されるように、任意により共アジュバントと共に医薬組成物に製剤され得る。これに関して、ＧＬＡアジュバントの水性製剤（ＡＦ）および安定乳液製剤（ＳＥ）などの製剤を提供する米国特許出願公開第２００８／０１３１４６６号を参照するが、これらの製剤は式（Ｉ）のアジュバントのいずれにも用いることができる。ある特別な実施形態では、免疫原性組成物は、安定水中油型乳剤（ＳＥ）（ＧＬＡ／ＳＥまたはＧＬＡ‐ＳＥ）に製剤され、その後、少なくとも１つの免疫原と混合されるＧＬＡアジュバント（式Ｉを参照のこと）を含む。
【０１３３】
以下に、および本明細書においてより詳細に記載されるように、非限定的な例として、アルミニウム塩とＤＳＬＰアジュバント、アルミニウム塩とＱＳ２１、ＤＳＬＰアジュバントとＱＳ２１、ならびにアルムナアルミニウム塩、ＱＳ２１およびＭＰＬまたはＧＬＡなど、任意により２つ以上の異なるアジュバントを同時に使用することができる。また、任意により、アルミニウム塩、ＱＳ２１、およびＭＰＬのいずれか、ならびにそれらのあらゆる組合せと併せて不完全フロイントアジュバントを使用することができる（例えば、 Chang et al., Advanced Drug Delivery Reviews 32, 173-186 (1998) を参照のこと）。
【０１３４】
ある実施形態では、ＤＳＬＰアジュバント、例えば、式（Ｉ）のアジュバントは、任意により、それぞれ以下で考察される共アジュバントまたは本明細書に記載される、もしくは、当技術分野において入手可能である他の任意のアジュバントと共に医薬品（またはアジュバント組成物）に製剤され得る。これに関して、ＧＬＡアジュバントの水性製剤（ＡＦ）および安定乳液製剤（ＳＥ）などの製剤を提供する米国特許出願公開第２００８／０１３１４６６号を参照するが、その製剤は式（Ｉ）のアジュバントのいずれにも用いることができる。
【０１３５】
本明細書で提供されるように、式ＩのアジュバントなどのＤＳＬＰアジュバントは、本明細書において共アジュバントと呼ばれる第２のアジュバントと併用され得る。３つの代表的な実施形態では、共アジュバントは送達システムであり得る、または共アジュバントは免疫増強剤であり得る、または共アジュバントは送達システムと免疫増強剤の両方として機能する組成物であり得る（例えば、 O’Hagan et al., Pharm. Res. 21(9):1519-30 (2004) を参照のこと）。共アジュバントは、Ｔｏｌｌ様受容体ファミリー生体分子のメンバーを介して作用する免疫増強剤であり得る。例えば、共アジュバントは、ＴＬＲ４アゴニストかＴＬＲ８アゴニストかＴＬＲ９アゴニストのいずれかのように、その一次作用機序に対して選択され得る。あるいは、または、加えて、共アジュバントはそのキャリアー特性に対して選択され得る。例えば、共アジュバントは乳剤、リポソーム、マイクロパーティクルまたはアルムであり得る。
【０１３６】
１つの実施形態では、共アジュバントはアルムであり、この用語はリン酸アルミニウム（ＡｌＰＯ４）および水酸化アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）３）などのアルミニウム塩を指す。アルムが共アジュバントとして使用されるとき、そのアルムは１，０００μｇに対して約１００μｇ、または８００μｇに対して約２００μｇ、または７００μｇに対して約３００μｇ、または６００μｇに対して約４００μｇの用量で免疫原性組成物（または免疫原性組成物を含む製剤）に存在し得る。式（Ｉ）のアジュバントは通常アルムの量よりも少ない量で存在し、そして、様々な特別な実施形態では、式（Ｉ）のアジュバントはアルムの重量に対して重量ベースで０．１〜１％、または１〜５％、または１〜１０％、または１〜１００％の割合で存在する。
【０１３７】
１つの特定の実施形態では、アジュバントはワクチンまたは免疫原性組成物中での使用に充分なアジュバント特性を有する乳剤である。そのような乳剤には水中油型乳剤が含まれる。不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）は１つのそのようなアジュバントである。別の適切な水中油型乳剤はＭＦ‐５９（商標）アジュバントであり、それはスクアレン、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ツイーン（商標）８０界面活性剤としても知られる）およびソルビタントリオレエートを含有する。スクアレンは、アマランサスの種子、コメぬか、コムギ胚芽およびオリーブを含む植物供給物（主に植物油）からも入手可能であるが、もともとサメ肝油から得られた天然有機化合物である。他の適切なアジュバントは、鉱物油系アジュバントであるＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ５０Ｖ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ２０６、およびＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＭＳ１３１２を含むＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）アジュバント（Ｓｅｐｐｉｃ  Ｉｎｃ．、フェアフィールド、ニュージャージー州）である。共アジュバントには鉱物油が存在していてもよいが、１つの実施形態では、本明細書に記載される免疫原性組成物の油性成分は全て、代謝可能な油である。
【０１３８】
本明細書に記載される方法の実施において共アジュバントとして使用することができる免疫増強剤の例には、ＭＰＬ（商標）、ＭＤＰおよび誘導体、オリゴヌクレオチド、二本鎖ＲＮＡ、代替病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰＳ）、サポニン、小分子免疫増強剤（ＳＭＩＰ）、サイトカインならびにケモカインが含まれる。
【０１３９】
１つの実施形態では、共アジュバントはＭＰＬ（商標）アジュバントであり、それはＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅから購入することができる（もともと、モンタナ州ハミルトンのＲｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｎｃ．社が開発した）。例えば、 Ulrich および Myers, Vaccine Designの第２１章:  The Subunit andAdjuvant Approach, Powell および Newman編,  Plenum Press, New York (1995) を参照のこと。ＭＰＬ（商標）アジュバントに関連し、そして、本明細書に記載される組成物および方法で使用される共アジュバントとして適切であるものはＡＳ０２（商標）アジュバントおよびＡＳ０４（商標）アジュバントである。ＡＳ０２（商標）アジュバントは、ＭＰＬ（商標）アジュバントおよびＱＳ‐２１（商標）アジュバント（本明細書の別の部分で考察されているサポニンアジュバント）の両方を含む水中油型乳剤である。ＡＳ０４（商標）アジュバントはＭＰＬ（商標）アジュバントとアルムを含有する。ＭＰＬ（商標）アジュバントはサルモネラ・ミネソタ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）Ｒ５９５株のリポ多糖（ＬＰＳ）から、ＬＰＳの弱酸と塩基による加水分解とそれに続く改変型ＬＰＳの精製により調製される。
【０１４０】
別の実施形態では、共アジュバントは、シャボンノキ種の樹皮から得られるものなどのサポニン、または修飾サポニンである（例えば、米国特許第５，０５７，５４０号；同第５，２７３，９６５号；同第５，３５２，４４９号；同第５，４４３，８２９号；および同５，５６０，３９８号を参照のこと）。マサチューセッツ州レキシントンのＡｎｔｉｇｅｎｉｃｓ、Ｉｎｃ．社が販売する製品ＱＳ‐２１（商標）アジュバントは、式（Ｉ）のアジュバントと共に使用することができる代表的なサポニン含有共アジュバントである。そのサポニンに関連する、代わりの共アジュバントは、もともとＩｓｃｏｔｅｃ（スウェーデン）が開発したＩＳＣＯＭ（商標）ファミリーアジュバントであり、それは通常、シャボンノキに由来するサポニンまたは合成類似体、コレステロール、およびリン脂質から形成され、それらは全てハチの巣様構造に形成される。
【０１４１】
さらに別の実施形態では、共アジュバントは、共アジュバントとして機能するサイトカインである（例えば、 Lin et al., Clin. Infect. Dis. 21(6):1439-49 (1995)、 Taylor,Infect. Immun. 63(9):3241-44 (1995)、およびEgilmez, Chap. 14 in Vaccine Adjuvantsand Delivery Systems, John Wiley & Sons, Inc. (2007) を参照のこと）。様々な実施形態では、前記サイトカインは、例えば、顆粒球‐マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ‐ＣＳＦ）（例えば、Change et al., Hematology 9(3):207-15 (2004)、 Dranoff, Immunol. Rev. 188:147-54(2002)、および米国特許第５，６７９，３５６号を参照のこと）；またはＩ型インターフェロン（例えば、インターフェロン‐α（ＩＦＮ‐α）またはインターフェロン‐β（ＩＦＮ‐β））、もしくはＩＩ型インターフェロン（例えば、インターフェロン‐γ（ＩＦＮ‐γ）（例えば、Boehm et al., Ann. Rev. Immunol. 15:749-95 (1997); および Theofilopoulos  etal., Ann. Rev. Immunol. 23:307-36 (2005) を参照のこと）などのインターフェロン；インターロイキン‐１α（ＩＬ‐１α）、インターロイキン‐１β（ＩＬ‐１β）、インターロイキン‐２（ＩＬ‐２）（例えば、Nelson, J. Immunol. 172(7):3983-88 (2004) を参照のこと）；インターロイキン‐４（ＩＬ‐４）、インターロイキン‐７（ＩＬ‐７）、インターロイキン‐１２（ＩＬ‐１２）（例えば、Portielje et al., Cancer Immunol. Immunother. 52(3):133-44 (2003); andTrinchieri, Nat. Rev. Immunol. 3(2):133-46 (2003) を参照のこと）；インターロイキン‐１５（ＩＬ‐１５）、インターロイキン‐１８（ＩＬ‐１８）を特に含むインターロイキン；胎児肝臓チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、または腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）であり得る。式（Ｉ）のアジュバントなどのＤＳＬＰアジュバントは、ワクチン抗原と混合される前にサイトカインと共製剤され得る、または、抗原、ＤＳＬＰアジュバント（例えば、式（Ｉ）のアジュバント）およびサイトカイン共アジュバントは別々に製剤され、その後、混合され得る。
【０１４２】
ある実施形態では、免疫原（単離免疫原および／または組換え免疫原であり得る）を含む免疫原性組成物およびアジュバントを一緒に製剤する。他の特定の実施形態では、免疫原性組成物が２つ以上の免疫原を含むとき、アジュバントはそれぞれの免疫原と別々に製剤されてよく、または、その２つ以上の免疫原はアジュバントと一緒に製剤されて単一の免疫原性組成物を形成することができる。２つ以上の免疫原を対象に投与することが企図されているとき、および、それぞれの免疫原が別々にアジュバントと製剤されるとき、それぞれ組成物を混合して単一の免疫原性組成物を形成することができる。
【０１４３】
他の特定の実施形態では、免疫原を含む免疫原性組成物または免疫原をコードする組換え発現ベクターを含む組成物、またはそのベクターを含むベクター粒子は、アジュバントを含む他に、別々のバイアルに包装され、供給される。免疫原性組成物およびアジュバントのそれぞれが、薬学的に許容可能な（すなわち、生理学的に適切または許容可能な）賦形剤であって、本明細書においてより詳細に記載される賦形剤と混合され得る。通常、目的の治療用途を示す適切なラベルをそれぞれの組成物と共に包装する。アジュバントおよび／または賦形剤の選択は免疫原、組換え発現ベクター、および／またはベクター粒子の安定性、投与経路、投薬スケジュール、ならびにワクチン投与される種に対するアジュバントの効力に左右される。ヒトでの投与について、薬学的に許容可能なアジュバントは関連規制機関がヒトへの投与について承認した、または承認できるものである。例えば、本明細書において考察され、当技術分野において公知であるように、完全フロイントアジュバントはヒトへの投与に適切ではない。
【０１４４】
本明細書に記載される免疫学的組成物および方法での使用に有用なアジュバントは、そのアジュバントを投与する対象にとって生理学的または薬学的に適切なアジュバントである。アジュバント組成物は少なくとも１つのアジュバント（すなわち、１つ以上のアジュバント）と、任意により、少なくとも１つの生理学的または薬学的に適切な（または許容可能な）賦形剤を含む。医薬組成物における使用が当業者に知られている任意の生理的な、または、薬学的に適切な賦形剤または担体（すなわち、有効成分の活性を干渉しない無毒性物質）を本明細書に記載されるアジュバント組成物中に使用することができる。代表的な賦形剤には、アジュバントの成分の安定性と完全性を維持する希釈剤および担体が含まれる。治療用途に適した賦形剤は周知であり、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Gennaro, 21st Ed.Mack Pub. Co., Easton, PA (2005)) に記載されており、そして、本明細書においてより詳細に記載される。
【０１４５】
組換え発現ベクター
１つの実施形態では、免疫原およびそのそれぞれの指定抗原に対する免疫応答を誘導する少なくとも１つの免疫原をコードするポリヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターが提供される。免疫原からの効率的な転写および翻訳を得るために、それぞれのベクター中のコードポリヌクレオチド配列は、本明細書においてより詳細に記載される少なくとも１つの適切な発現制御配列（調節性発現配列または機構とも呼ばれる）（例えば、プロモーター、エンハンサー、リーダー）を含み、それはコードポリヌクレオチド配列に機能するように結合している。これらの組換え発現ベクターは、こうして、組換え発現ベクターまたは組換え発現ベクターを含有するベクター粒子で形質転換、形質導入または形質移入されている任意の適切な宿主細胞において免疫原の発現または少なくとも２つの免疫原の共発現を管理するようになる。
【０１４６】
本明細書に記載される組換え発現ベクターは、本明細書においてより詳細に記載される１つ以上の免疫原（すなわち、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つの免疫原など）をコードすることができる。特定の実施形態では、組換え発現ベクターは、感染性微生物（例えば、ウイルス、細菌、真菌または寄生生物）由来の少なくとも１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の免疫原をコードすることができる。感染症微生物から得られた免疫原および指定抗原は、本明細書においてより詳細に記載される。例として、免疫原はＵＬ１９もしくはｇＤなどのＨＳＶ‐２タンパク質（もしくはその免疫原性変異体）であり得る、または、ＨＳＶ‐２タンパク質の免疫原性断片もしくは免疫原性領域であり得る。別の特別な実施形態では、本明細書に記載される組換え発現ベクターは少なくとも１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の腫瘍関連抗原、またはそれらの免疫原性変異体もしくは免疫原性断片をコードすることができる。これらの腫瘍関連抗原は本明細書においてより詳細に記載され、そして、例えば、腎臓細胞癌抗原、前立腺癌抗原（例えば、前立腺酸性ホスファターゼ、前立腺特異的抗原、ＮＫＸ３．１、および前立腺特異的膜抗原）、中皮腫抗原、膵臓癌抗原、黒色腫抗原、乳癌抗原、大腸直腸癌抗原、肺癌抗原、卵巣癌抗原、または本明細書および当技術分野において記載される任意の癌もしくは腫瘍に関連する抗原に由来する腫瘍関連抗原であり得る。
【０１４７】
組換え発現ベクターは、本明細書に記載される免疫原のうちのいずれか１つ以上の発現に使用することができる。特定の実施形態では、組換え発現ベクターは、所望の免疫応答（すなわち、特定の液性応答（すなわち、Ｂ細胞反応）および／または特定の細胞介在性免疫応答の誘導。それらの免疫応答には免疫原特異的ＣＤ４Ｔ細胞応答および／またはＣＤ８Ｔ細胞応答が含まれ、そのＣＤ８Ｔ細胞応答には細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答が含まれてもよい）を誘導する適切な細胞（例えば、抗原提示細胞すなわち、樹状細胞などの、その細胞表面上にペプチド／ＭＨＣ複合体を提示する細胞）または組織（例えば、リンパ組織）に送達される。したがって、組換え発現ベクターは、例えば、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球または樹状細胞特異的ＴＲＥなどのリンパ組織特異的転写調節エレメント（ＴＲＥ）を含むこともできる。リンパ組織特異的ＴＲＥは当技術分野において公知である（例えば、 Thompson et al., Mol. Cell. Biol. 12, 1043-53 (1992)、 Todd et al.,J. Exp. Med. 177, 1663-74 (1993)、 Penix et al., J. Exp. Med. 178:1483-96 (1993)を参照のこと）。
【０１４８】
特定の実施形態では、組換え発現ベクターはプラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡである。本明細書に記載されるような免疫原をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含有するプラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡは当技術分野において周知である標準的技法を用いて容易に構築される。ベクターゲノムは通常、後でパッケージング細胞株またはプロデューサー細胞株に形質移入することができるプラスミドの形態に構築され得る。プラスミドは一般に細菌内でのプラスミドの複製に有用な配列を含む。そのようなプラスミドは当技術分野において周知である。さらに、原核生物性複製起点を含むベクターは、その発現が薬品耐性などの検出可能マーカーまたは選択マーカーを付与する遺伝子を含むこともできる。典型的な細菌性薬品耐性製品は、アンピシリンまたはテトラサイクリンに対する耐性を付与する製品である。プラスミドに正しいヌクレオチド配列が組み込まれていることを確認するための分析では、そのプラスミドは大腸菌で複製され、精製され、制限エンドヌクレアーゼ消化によって分析されることができ、および／またはそのヌクレオチド配列は従来法で決定されることができる。
【０１４９】
他の特定の実施形態では、組換え発現ベクターはウイルス性ベクターである。代表的な組換え発現ウイルス性ベクターにはレンチウイルス性ベクターゲノム、ポックスウイルス性ベクターゲノム、ワクシニアウイルス性ベクターゲノム、アデノウイルス性ベクターゲノム、アデノウイルス関連ウイルス性ベクターゲノム、ヘルペスウイルス性ベクターゲノム、およびアルファウイルス性ベクターゲノムが含まれる。ウイルス性ベクターは、生きており、弱毒化されており、条件複製性または複製欠損型であってよく、典型的には、非病原性（欠損型）、複製可能ウイルス性ベクターである。
【０１５０】
例として、特別な実施形態では、ウイルス性ベクターがワクシニアウイルス性ベクターゲノムであるとき、目的の免疫原をコードするポリヌクレオチドはワクシニアウイルス性ベクターの非必須部位に挿入され得る。そのような非必須部位は、例えば、 Perkus et al., Virology 152:285 (1986)、 Hruby et al., Proc. Natl.Acad. Sci. USA 80:3411 (1983)、 Weir et al., J. Virol. 46:530 (1983)に記載される。ワクシニアウイルスとの使用に適切なプロモーターにはＰ７．５（例えば、Cochran et al., J. Virol. 54:30 (1985) を参照のこと）、Ｐ１１（例えば、 Bertholet, et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:2096 (1985) を参照のこと）、およびＣＡＥ‐１（例えば、 Patel et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:9431 (1988) を参照のこと）が含まれるが、これらに限定されない。ワクシニアの高弱毒化株はヒトでの使用により許容可能なものであり、それにはＬｉｓｔｅｒ、特定のゲノム欠失を含むＮＹＶＡＣ（例えば、Guerra et al., J. Virol. 80:985-98 (2006); Tartaglia et al., AIDS Research andHuman Retroviruses 8:1445-47 (1992) を参照のこと）またはＭＶＡ（例えば、 Gheradi et al., J. Gen.Virol. 86:2925-36 (2005); Mayr et al., Infection 3:6-14 (1975) を参照のこと）が含まれる。Ｈｕら(J. Virol. 75:10300-308 (2001), 癌治療用ベクターとしてのヤバ様疾患ウイルスの使用について記載）；米国特許第５，６９８，５３０号および同第６，９９８，２５２号も参照のこと。例えば、米国特許第５，４４３，９６４号も参照のこと。米国特許第７，２４７，６１５号および同第７，３６８，１１６号も参照のこと。
【０１５１】
ある実施形態では、アデノウイルスベクターまたはアデノウイルス関連ウイルスベクターは、目的の免疫原を発現するために使用され得る。いくつかのアデノウイルスベクターシステムおよびそのベクターを投与する方法が記載されている（例えば、 Molin et al., J. Virol. 72:8358-61 (1998)、 Narumi et al., Am J.Respir. Cell Mol. Biol. 19:936-41 (1998)、 Mercier et al., Proc. Natl. Acad.Sci. USA 101:6188-93 (2004)、米国特許第６，１４３，２９０号、同第６，５９６，５３５号、同第６，８５５，３１７号、同第６，９３６，２５７号、同第７，１２５，７１７号、同第７，３７８，０８７号、同第７，５５０，２９６を参照のこと）。
【０１５２】
レトロウイルス性ベクターゲノムには、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、異所性レトロウイルス、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、および組合せに基づくものが含まれ得る（例えば、 Buchscher et al., J. Virol. 66:2731-39 (1992)、 Johann et al., J.Virol. 66:1635-40 (1992)、 Sommerfelt et al., Virology 176:58-59 (1990)、 Wilsonet al., J. Virol. 63:2374-78 (1989)、 Miller et al., J. Virol. 65:2220-24 (1991)、Miller et al., Mol. Cell Biol. 10:4239 (1990)、 Kolberg, NIH Res. 4:43 1992、Cornetta et al., Hum. Gene Ther. 2:215 (1991) を参照のこと）。
【０１５３】
より特別な実施形態では、組換え発現ウイルス性ベクターはレンチウイルス性ベクターゲノムである。そのゲノムは、ヒト遺伝子療法用途に見出されるものを含む、多数の適切な、利用可能なレンチウイルスゲノム系ベクターのいずれかに由来し得る（例えば、 Pfeifer et al., Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2:177-211 (2001) を参照のこと）。適切なレンチウイルス性ベクターゲノムにはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ‐１）、ＨＩＶ‐２、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、およびマエディ／ビスナウイルスに基づくものが含まれる。レンチウイルスの望ましい特性は、標的細胞は必ずしも分裂細胞ではなく、または、刺激されて分裂するわけではないが、レンチウイルスは分裂細胞にも非分裂細胞にも感染することができることである。一般に、そのゲノムとエンベロープ糖タンパク質は様々なウイルスによって異なり、そのため、生じるウイルス性ベクター粒子がシュードタイプされる。そのベクターゲノムの安全特性が好適に組み込まれる。安全特性には自己不活化ＬＴＲと非挿入性ゲノムが含まれる。代表的なベクターはパーッケージングシグナル（ｐｓｉ）、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、スプライスドナー、スプライスアクセプター、中央部ポリプリン区域（ｃＰＰＴ）、およびＷＰＲＥエレメントを含有する。ある特定の代表的な実施形態では、ウイルス性ベクターゲノムは、ＨＩＶ‐１ゲノムまたはＳＩＶゲノムなどのレンチウイルスゲノム由来の配列を含む。ウイルスゲノムコンストラクトはレンチウイルスの５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲに由来する配列を含むことができ、特にレンチウイルスの５’ＬＴＲに由来するＲ配列およびＵ５配列ならびにレンチウイルスの不活化もしくは自己不活化３’ＬＴＲを含むことができる。そのＬＴＲ配列は任意の種の任意のレンチウイルスに由来するＬＴＲ配列であり得る。例えば、それらはＨＩＶ、ＳＩＶ、ＦＩＶまたはＢＩＶのＬＴＲ配列であり得る。典型的には、前記ＬＴＲ配列はＨＩＶのＬＴＲ配列である。
【０１５４】
前記ベクターゲノムは不活化または自己不活化３’ＬＴＲを含むことができる（例えば、その両方の全体が組み込まれる、Zufferey et al., J. Virol. 72: 9873, 1998、 Miyoshi et al., J. Virol.72:8150, 1998を参照のこと）。自己不活化ベクターは一般に３’長末端反復配列（ＬＴＲ）のエンハンサー配列とプロモーター配列に欠失を有し、それはベクターの挿入の際に５’ＬＴＲにコピーされる。一例では、３’ＬＴＲのＵ３エレメントはそのエンハンサー配列、ＴＡＴＡボックス、Ｓｐ１およびＮＦ‐κＢ部位に欠失を含む。自己不活化３’ＬＴＲの結果として、進入と逆転写の後に作成されるプロウイルスは不活化５’ＬＴＲを含む。そのベクターゲノムの可動化のリスクおよび近傍の細胞性プロモーターへのＬＴＲの影響を低減することにより安全性を向上することが原理である。自己不活化３’ＬＴＲは、当技術分野において公知の任意の方法によって構築することができる。
【０１５５】
任意により、ウイルス性コンストラクトの中でレンチウイルスの５’ＬＴＲのＵ３配列を異種性プロモーター配列などのプロモーター配列で置換してもよい。これにより、パッケージング細胞株から回収されるウイルスのタイターを上昇させることができる。エンハンサー配列を含んでもよい。パッケージング細胞株中でウイルス性ＲＮＡゲノムの発現を上昇させる任意のエンハンサー／プロモーターの組合せを使用することができる。一例では、ＣＭＶエンハンサー／プロモーター配列を使用する（例えば、米国特許第５，３８５，８３９号および同第５，１６８，０６２号を参照のこと）。
【０１５６】
ある実施形態では、挿入不全であるようにレンチウイルス性ベクターゲノムを構築することにより、挿入性突然変異形成のリスクを最小にする。非挿入性ベクターゲノムを作製するために様々なアプローチを遂行することができる。これらのアプローチは、不活性なインテグレースを含むタンパク質をコードするようにｐｏｌ遺伝子のインテグレース酵素成分に変異を導入することを必要とする。ベクターゲノム自体は挿入を防ぐために改変され得るが、例えば、片方または両方の付着部位に変異もしくは欠失を形成することにより、または、欠失もしくは改変によって３’ＬＴＲ近位ポリプリン区域（ＰＰＴ）を機能しないようにすることによる。さらに、非遺伝的アプローチが利用可能であり、これらには、インテグレースの１つ以上の機能を阻害する薬物が含まれる。それらのアプローチは相互排除的ではない。すなわち、それらのアプローチのうちの２つ以上を同時に用いることができる。例えば、インテグレースと付着部位の両方が非機能的であり得る、または、インテグレースとＰＰＴ部位が非機能的であり得る、または、付着部位とＰＰＴ部位が非機能的であり得る、または、それらの全てが非機能的であり得る。
【０１５７】
インテグレースは、ウイルスの二本鎖平滑末端ＤＮＡの切断、および染色体標的部位の２本のストランドの５’リン酸へのその末端の結合に関与する。インテグレースは３つの機能性ドメイン、すなわち、亜鉛結合モチーフ（ＨＨＣＣ）を含むＮ末端ドメイン、触媒性コアおよび保存的ＤＤ３５Ｅモチーフ（ＨＩＶ‐１のＤ６４、Ｄ１１６、Ｅ１５２）を含む中央部コアドメイン、ならびにＤＮＡ結合特性を有するＣ末端ドメインを有する。インテグレースに導入された点突然変異は正常な機能を妨害するのに十分である。多数のインテグレースの変異が作製され、特徴が分析されている（例えば、 Philpott and Thrasher, Human Gene Therapy 18:483, 2007、 Apolonia, ユニバーシティー・カレッジ・オブ・ロンドンに提出された学位論文、２００９年４月,pp, 82-97、 Engelman et al., J. Virol. 69: 2729, 1995、 Nightingale et al., Mol.Therapy, 13: 1121, 2006を参照のこと）。インテグレースタンパク質をコードする配列は欠失または変異形成されて、好ましくは逆転写酵素活性または核内移行を著しく損なうことなくそのタンパク質を不活性にすることができ、それによってプロウイルスの標的細胞ゲノムへの挿入のみを防止する。容認可能な変異がインテグレースの触媒作用、鎖転移、ａｔｔ部位への結合、宿主染色体ＤＮＡへの結合、および他の機能を低下させる。例えば、ＨＩＶまたはＳＩＶのインテグレースの残基３５での単一のアスパラギン酸からアスパラギンへの置換はウイルス性ＤＮＡの挿入を完全に消失させる。インテグレースの欠失は一般にＣ末端ドメインに限定される。残基２３５〜２８８のコード配列の欠失により有用な非機能性インテグレースがもたらされる（例えば、Engelman et al., J. Virol. 69:2729, 1995を参照のこと）。さらなる例として、例えば、Ａｓｐ６４（残基番号はＨＩＶ‐１について与えられており、他のレンチウイルスまたはレトロウイルスのインテグレースについて対応する残基番号は当業者によって容易に決定され得る）（例えば、Ｄ６４Ｅ、Ｄ６４Ｖ）、Ａｓｐ１１６（例えば、Ｄ１１６Ｎ）、Ａｓｎ１２０（例えば、Ｎ１２０Ｋ）、Ｇｌｕ１５２、Ｇｌｎ１４８（例えば、Ｑ１４８Ａ）、Ｌｙｓ１５６、Ｌｙｓ１５９、Ｔｒｐ２３５（例えば、Ｗ２３５Ｅ）、Ｌｙｓ２６４（例えば、Ｋ２６４Ｒ）、Ｌｙｓ２６６（例えば、Ｋ２６６Ｒ）、Ｌｙｓ２７３（例えば、Ｋ２７３Ｒ）に変異を形成することができる。他の変異を形成し、挿入、導入遺伝子の発現、および他の望ましいパラメータについて試験することができる。これらの機能の検査法は周知である。核酸配列の化学合成を含む様々な技法のうちのいずれかにより変異を形成することができる。インテグレースに１つの変異を形成することができる、または、これらの変異のうちの２つ以上が存在し得る。例えば、インテグレースは２つのアミノ酸、３つのアミノ酸、４つのアミノ酸などに変異を有することができる。
【０１５８】
あるいは、または、インテグレースへの変異の使用と組み合わせて、Ｕ３およびＵ５中の付着部位（ａｔｔ）に変異形成することもできる。インテグレースは、これらの部位に結合し、ベクターゲノムの両端で３’末端ジヌクレオチドを切断する。ＣＡジヌクレオチドが凹んだ３’末端に位置し、そのＣＡがプロセッシングに必要とされ、そのヌクレオチドの変異が宿主染色体への挿入を阻止する。ＣＡジヌクレオチドのうちのＡは挿入に最も重要なヌクレオチドであり、前記ゲノムの両端の変異が最良の結果をもたらす（例えば、Brown et al., J. Virol. 73:9011 (1999) を参照のこと）。一例では、それぞれの末端のＣＡをＴＧに変更する。他の例では、それぞれの末端のＣＡを一方の末端ではＴＧに変更し、他方の末端ではＧＴに変更する。他の例では、それぞれの末端ＣＡを欠失し、他の例では、それぞれの末端でＣＡのうちのＡを欠失する。
【０１５９】
挿入は３’ＬＴＲの近位に位置するポリプリン区域（ＰＰＴ）の変異または欠失によって阻害することもできる（例えば、国際公開第２００９／０７６５２４号を参照のこと）。ＰＰＴは、プラス鎖ＤＮＡ合成用のプライマー結合部位として機能することができる、約１５ヌクレオチドからなるポリプリン配列である。この例では、ＰＰＴの変異または欠失は逆転写過程を標的とする。特定の機序に縛られることを望むものではないが、ＰＰＴに変異または欠失を形成することにより、直鎖状ＤＮＡの産生が著しく低下し、そして、基本的に１‐ＬＴＲ  ＤＮＡ環のみが産生される。挿入は直鎖状二本鎖ＤＮＡベクターゲノムを必要とし、それ無しでは挿入は基本的に消去される。本明細書で述べるように、ＰＰＴは変異または欠失によって非機能的になり得る。通常、約１５ヌクレオチドのＰＰＴ全体が欠失されるが、いくつかの実施形態では、それより短い１４ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１１ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、９ヌクレオチド、８ヌクレオチド、７ヌクレオチド、６ヌクレオチド、５ヌクレオチド、４ヌクレオチド、３ヌクレオチドおよび２ヌクレオチドの欠失が形成され得る。変異が形成されるとき、特にＰＰＴの５’半分に通常複数の変異が形成されるが（例えば、 McWilliams et al., J. Virol. 77:11150, 2003を参照のこと）、最初の４塩基中の一変異および二変異がなお転写を低下させる。ＰＰＴの３’末端に形成された変異は一般により劇的な効果を有する（例えば、Powell et al., J. Virol. 70:5288, 1996を参照のこと）。
【０１６０】
ベクターゲノムを非挿入性にするこれらの様々なアプローチは一つずつ、または、組み合わせて用いることができる。冗長化機序によるフェールセーフベクターを構築するために２つ以上のアプローチの使用が用いられ得る。したがって、ＰＰＴの変異もしくは欠失をａｔｔ部位の変異もしくは欠失、もしくはインテグレースの変異と組み合わせることができ、または、ＰＰＴの変異もしくは欠失をａｔｔ部位の変異もしくは欠失とインテグレースの変異の両方と組み合わせることができる。同様に、ａｔｔ部位の変異もしくは欠失とインテグレースの変異を互いに組み合わせることができる、または、ＰＰＴの変異もしくは欠失と組み合わせることができる。
【０１６１】
本明細書に記載されるように、レンチウイルス性ベクターコンストラクトは哺乳類細胞での発現用のプロモーターを含有する。プロモーターには、本明細書においてより詳細に考察されるが、例えば、ヒトユビキチンＣプロモーター（ＵｂｉＣ）、サイトメガロウイルス最初期プロモーター（ＣＭＶ）、およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターが含まれる。Ｕ３領域はすぐ上流のＰＰＴ（ポリプリン区域）配列を含むことができる。ある特別な実施形態では、少なくとも３種の異なる（３’末端の）Ｕ３領域のうちのいずれか１つがレンチウイルス性ベクターに含まれ得る（配列番号２１〜２３を参照のこと）。そのコンストラクトはＵ３領域に欠失を含有する。ＳＩＮコンストラクトはＵ３にＴＡＴＡボックスを除去する約１３０ヌクレオチドの欠失を有し（例えば、 Miyoshi, et al. J. Virol. 72: 8150, 1998、 Yu et al., Proc. Natl.Acad. Sci. USA 83: 3194, 1986を参照のこと）、それによりＬＴＲプロモーター活性を消失させる。コンストラクト７０３および７０４中の欠失はレンチウイルスベクターの発現を上昇させる（例えば、Bayer et al., Mol. Therapy 16: 1968, 2008を参照のこと）。さらに、コンストラクト７０４は３’ＰＰＴの欠失を含有し、それがベクターの挿入を減少させる（例えば、国際公開第２００９／０７６５２４号を参照のこと）。全体の参照によりそれぞれ組込まれる米国特許出願公開第１２／８４２，６０９号および国際特許出願公開第２０１１／０１１５８４号（国際特許出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ１０／０４２８７０号）も参照のこと。
【０１６２】
調節性発現配列
本明細書に記載されるように、組換え発現ベクターは少なくとも１つの調節性発現配列を含む。ある実施形態では、組換え発現ベクターがウイルス性ベクターゲノムを含むとき、特定の標的細胞において少なくとも１つの免疫原の発現が望まれる。例えばレンチウイルス性ベクターでは、免疫原をコードするポリヌクレオチド配列は５’ＬＴＲ配列と３’ＬＴＲ配列の間に位置するのが典型的である。さらに、コードヌクレオチド配列は、特定の様式で免疫原の発現を調節する他の遺伝的または調節性配列または機構、例えば、プロモーターまたはエンハンサーを含む転写調節配列と機能的関係で機能するように結合するのが好ましい。ある特定の例では、有用な転写調節配列は、時間的にも空間的にも活性に関して強力に調節されるものである。コードされるポリペプチドの発現の調節に使用され得る発現制御エレメントは当技術分野において公知であり、それらには誘導プロモーター、恒常的プロモーター、分泌シグナル、エンハンサー、および他の調節性配列が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６３】
免疫原および他の任意の発現可能な配列をコードするポリヌクレオチドは通常内部プロモーター／エンハンサー調節性配列と機能的関係にある。レンチウイルス性ベクターコンストラクトに関して、「内部」プロモーター／エンハンサーはウイルス性ベクターの５’ＬＴＲ配列と３’ＬＴＲ配列の間に位置するものであり、目的のコードポリヌクレオチド配列に機能するように結合している。内部プロモーター／エンハンサーは、機能的関係にある遺伝子の発現を上昇させることが知られているプロモーター、エンハンサーまたはプロモーター／エンハンサーの組合せであり得る。「機能的関係」および「機能するように結合している」は、非限定的だが、プロモーターおよび／またはエンハンサーが適切な分子と接触すると目的の配列が発現するように、その配列がプロモーターおよび／またはエンハンサーに対して正しい位置および方向にあることを意味する。
【０１６４】
内部プロモーター／エンハンサーの選択は免疫原の所望の発現パターンおよび公知のプロモーター／エンハンサーの具体的な特性に基づく。したがって、内部プロモーターは恒常的に活性である場合もある。使用することができる恒常的プロモーターの非限定的な例にはユビキチンプロモーター（例えば、米国特許第５５１０４７４号、国際公開第９８／３２８６９号を参照のこと）、ＣＭＶプロモーター（例えば、 Thomsen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:659, 1984、 米国特許第５１６８０６２号を参照のこと）、β‐アクチンプロモーター(Gunning et al. 1989 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4831-4835)、 およびｐｇｋプロモーター（例えば、Adra et al. 1987 Gene 60:65-74、 Singer-Sam et al. 1984 Gene 32:409-417、およびDobson et al. 1982 Nucleic Acids Res. 10:2635-2637を参照のこと）が含まれる。
【０１６５】
あるいは、プロモーターは組織特異的プロモーターであり得る。いくつかの実施形態では、プロモーターは標的細胞特異的プロモーターである。例えば、プロモーターは、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１０３、ＴＬＲ、ＤＣ‐ＳＩＧＮ、ＢＤＣＡ‐３、ＤＥＣ‐２０５、ＤＣＩＲ２、マンノース受容体、Ｄｅｃｔｉｎ‐１、Ｃｌｅｃ９Ａ、ＭＨＣクラスＩＩを含む、樹状細胞により発現される任意の産物に由来し得る。さらに、プロモーターは、免疫原の誘導性発現を可能にするように選択され得る。テトラサイクリン応答システム、ｌａｃオペレーター‐リプレッサーシステム、ならびに、ヒートショック、金属イオン、例えばメタロチオネインプロモーター、インターフェロン、低酸素状態、ステロイド、例えばプロゲステロンまたはグルココルチコイド受容体プロモーター、放射線、例えばＶＥＧＦプロモーターを含む、様々な環境の変化または生理的変化に応答するプロモーターを含む誘導性発現の多数のシステムが当技術分野において公知である。免疫原コードポリヌクレオチド配列のそれぞれの所望の発現を得るためにプロモーターの組合せを使用することもできる。当業者は、生物または目的の標的細胞でのポリヌクレオチド配列の所望の発現パターンに基づいてプロモーターを選択することができる。
【０１６６】
ウイルス性ベクターゲノムを含む組換え発現ベクターは少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＩＩＩの応答プロモーターを含むことができる。このプロモーターは目的のポリヌクレオチド配列に機能するように結合することができ、また、終止配列に結合することもできる。さらに、１つより多いＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＩＩＩのプロモーターを組み込むことができる。ＲＮＡポリメラーゼＩＩおよびＩＩＩのプロモーターは当業者に周知である。例えば、Paule and White, Nucleic Acids Res., Vol. 28, pp 1283-1298 (2000)に適切な範囲のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのプロモーターを見出すことができる。ＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＩＩＩのプロモーターはまた、ＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＩＩＩに下流のＲＮＡコード配列を転写させることができる任意の合成または操作ＤＮＡ断片を含む。さらに、ウイルス性ベクターゲノムの一部として使用されるＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＩＩＩ（ＰｏｌＩＩまたはＩＩＩ）のプロモーターまたは複数のプロモーターは誘導性であり得る。任意の適切な誘導性のＰｏｌＩＩまたはＩＩＩのプロモーターは本明細書に記載される方法で使用され得る。特に適切なＰｏｌＩＩまたはＩＩＩのプロモーターには、Ohkawaand Taira, Human Gene Therapy, 11:577-585 (2000) およびMeissner et al., NucleicAcids Res., 29:1672-1682 (2001)において提供されるテトラサイクリン 応答 プロモーターが含まれる。
【０１６７】
内部エンハンサーは、目的のポリヌクレオチド配列の発現を上昇させるために、ウイルス性ベクターゲノムを含む組換え発現ベクターに存在してもよい。例えば、ＣＭＶエンハンサー（例えば、 Boshart et al., Cell 41:521, 1985を参照のこと）を使用することができる。ＨＩＶ、ＣＭＶなどのウイルスゲノムおよび哺乳類ゲノムにある多数のエンハンサーが特定され、特徴分析されている（例えば、ＧｅｎＢａｎｋなどの公開データベースを参照のこと）。エンハンサーは、異種性プロモーターと組み合わせて使用することができる。当業者は所望の発現パターンに基づいて適切なエンハンサーを選択することができる。
【０１６８】
特定の標的細胞へウイルス性ベクターゲノムを含む組換え発現ベクターを標的送達するとき、そのベクターゲノムは、その標的細胞によって認識され、目的の配列、ウイルス性要素（ベクターがウイルス性ベクターのとき）、および本明細書で考察される他の配列に機能するように結合しているプロモーターを通常含む。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合を許し、転写を開始させる核酸配列により形成される発現制御エレメントである。プロモーターは誘導的、恒常的、時間活性的、または組織特異的であり得る。誘導性プロモーターの活性は生物性または非生物性要因の存在または不在によって誘導される。誘導性プロモーターが機能するように結合している遺伝子の発現は生物の発生、その製造のある特定の段階で、または特定の組織でオンオフされ得るので、誘導性プロモーターは遺伝子工学で有用なツールであり得る。誘導性プロモーターは化学的調節プロモーターおよび物理的調節プロモーターとして分類され得る。典型的な化学調節プロモーターには、アルコール調節プロモーター（例えば、アルコールデヒドロゲナーゼＩ（ａｌｃＡ）遺伝子プロモーター）、テトラサイクリン調節プロモーター（例えば、テトラサイクリン応答プロモーター）、ステロイド調節プロモーター（例えば、ラットグルココルチコイド受容体（ＧＲ）ベースプロモーター、ヒトエストロゲン受容体（ＥＲ）ベースプロモーター、蛾エクダイソン受容体ベースプロモーター、およびステロイド／レチノイド／甲状腺受容体スーパーファミリーに基づくプロモーター）、金属調節プロモーター（例えば、メタロチオネイン遺伝子ベースプロモーター）、および病因関連プロモーター（例えば、アラビドプシスおよびトウモロコシ病原体関連（ＰＲ）タンパク質ベースプロモーター）が含まれるが、これらに限定されない。典型的な物理的調節プロモーターには、温度調節プロモーター（例えば、ヒートショックプロモーター）および光調節プロモーター（例えば、ダイズＳＳＵプロモーター）が含まれるが、これらに限定されない。他の代表的なプロモーターは別の場所、例えば、米国特許商標庁のデータベースを検索することで見出すことができる特許および特許出願公開に記載されている。
【０１６９】
当業者は特定の状況に基づいて適切なプロモーターを選択することができる。プロモーターを発現予定のポリヌクレオチド配列に機能するように結合する方法が周知であるように、多くの異なるプロモーターが当技術分野において周知である。パッケージング細胞および標的細胞で発現を管理するために天然プロモーター配列および多くの異種性プロモーターの両方を使用することができる。異種性プロモーターは一般に天然プロモーターと比較してより多い転写およびより高い所望のタンパク質の収率をもたらすため、異種性プロモーターが通常使用される。
【０１７０】
プロモーターは、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、およびサルウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得ることができる。プロモーターは、標的細胞と適合性があることを条件に、例えば、異種性哺乳類プロモーター、例えば、アクチンプロモーターもしくは免疫グロブリンプロモーター、ヒートショックプロモーター、または天然の配列と通常結合しているプロモーターであり得る。１つの実施形態では、プロモーターはウイルス性発現システム内の天然のウイルス性プロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは樹状細胞特異的プロモーターである。樹状細胞特異的プロモーターは、例えば、ＣＤ１１ｃプロモーターであり得る。
【０１７１】
ベクターにエンハンサー配列を挿入することにより転写を上昇させることができる。エンハンサーは通常ｃｉｓ作動性ＤＮＡエレメントであり、たいていは約１０〜３００塩基対長であり、プロモーターに作用してその転写を上昇させる。現在では、多くのエンハンサー配列が哺乳類遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α‐フェトプロテイン、およびインスリン）および真核細胞ウイルスから知られている。例には、複製起点の後期側に存在するＳＶ４０エンハンサー（塩基対１００〜２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側に存在するポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、抗原特異的ポリヌクレオチド配列の５’側または３’側の位置でベクターに継ぎ合わせることができるが、好ましくはプロモーターの５’部位に位置する。
【０１７２】
発現ベクターは、転写の終止およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含むこともできる。これらの配列は多くの場合、真核生物またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’非翻訳領域に、時には３’非翻訳領域に見出され、当技術分野において周知である。
【０１７３】
ウイルス性ベクターゲノムを含む組換え発現コンストラクションはその他の遺伝的エレメントを含有することもできる。前記コンストラクトに含まれ得るエレメントの種類は多少なりとも限定されず、特定の結果を達成するように選択され得る。例えば、標的細胞内での組換え発現ベクターまたはウイルスゲノムの核移行を促進するシグナルが含まれ得る。そのようなシグナルの例はＨＩＶ‐１のフラップシグナルである。標的細胞内でのプロウイルス挿入部位の特徴分析を容易にするその他の調節性配列が含まれ得る。例えば、ｔＲＮＡアンバーサプレッサー配列は前記コンストラクトに含まれ得る。例えば、ニワトリβ‐グロビン由来のインシュレーター配列をウイルスゲノムコンストラクトに含むこともできる。このエレメントは、標的細胞内での挿入プロウイルスのメチル化効果とヘテロクロマチン化効果に起因するサイレンシングの機会を低下させる。さらに、インシュレーターは、染色体上の挿入部位の周囲のＤＮＡに由来する正または負の位置効果から内部エンハンサー、プロモーターおよび外来性ポリヌクレオチド配列を遮蔽することができる。さらに、ベクターゲノムを含む組換えコンストラクトは、目的の遺伝子の発現を増強することが企図されている１つ以上の遺伝的エレメントを含有することができる。例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス応答エレメント（ＷＲＥ）をコンストラクト内に配置してもよい（例えば、 Zufferey et al. 1999. J. Virol. 74:3668-81、 Deglon et al., 2000.Hum. Gene Ther. 11:179-90を参照のこと）。
【０１７４】
組換え発現ベクターがウイルス性ベクターゲノムであるとき、そのウイルス性ベクターゲノムは、ウイルス性ベクターゲノムコンストラクトの産生のためにパッケージング細胞株またはプロデューサー細胞株に形質移入され得るプラスミド形態に通常構築される。そのプラスミドは一般に細菌でのプラスミドの複製に有用な配列を含む。そのようなプラスミドは当技術分野において周知である。さらに、原核生物の複製起点を含むベクターは、その発現が薬品耐性などの検出可能マーカーまたは選択マーカーを付与する遺伝子を含むこともできる。典型的な細菌性薬品耐性製品は、アンピシリンまたはテトラサイクリンに対する耐性を付与する製品である。
【０１７５】
ある特定の形態では、組換え発現ベクターは樹状細胞（ＤＣ）成熟因子／刺激因子をコードするポリヌクレオチド配列を含有する。代表的な刺激性分子にはＧＭ‐ＣＳＦ、ＩＬ‐２、ＩＬ‐４、ＩＬ‐６、ＩＬ‐７、ＩＬ‐１５、ＩＬ‐２１、ＩＬ‐２３、ＴＮＦα、Ｂ７．１、Ｂ７．２、４‐１ＢＢ、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、薬品誘導性ＣＤ４０（ｉＣＤ４０）などが含まれる。これらのポリヌクレオチドは通常、樹状細胞でコード配列の発現を管理する１つ以上の調節性エレメントの制御下にある。ある他の特定の実施形態では、免疫原とＧＭ‐ＣＳＦの両方をコードするヌクレオチド配列の発現を管理し、それを含む組換え発現ベクターが排除される。樹状細胞の成熟はワクチン投与の成功に寄与する（例えば、 Banchereau et al., Nat. Rev. Immunol. 5:296-306 (2005)、 Schuler etal., Curr. Opin. Immunol. 15:138-147 (2003)、 Figdor et al., Nat. Med.10:475-480 (2004) を参照のこと）。ＤＣは成熟によって抗原捕捉に能動的に関与する細胞からＴ細胞プライミングに特殊化した細胞に変容する。例えば、ＣＤ４ヘルパーＴ細胞に対するＣＤ４０ＬによるＣＤ４０の関与はＤＣの成熟に重要なシグナルであり、ＣＤ８＋Ｔ細胞を強力に活性化することになる。そのような刺激性分子は成熟因子または成熟刺激因子とも呼ばれる。免疫チェックポイントは癌における機能性細胞免疫の活性化に対する重要な障壁を表し、そして、ＣＴＬＡ４およびプログラムド・デス‐１（ＰＤ‐１）を含むＴ細胞に対する阻害性リガンドに特異的なアンタゴニスト抗体は医療機関で評価されている標的因子の例である。慢性感染症および癌における重要な耐性機構は、高レベルのＰＤ‐１を発現する抗原特異的Ｔ細胞の機能的消耗である。治療免疫の効力が免疫チェックポイントコントロールとの組合せにより著しく増強されることが示されているので、非限定的な例として、当業者は、免疫チェックポイントを阻害する代わりのアプローチはプログラムド・デス（ＰＤ）リガンド１および２（ＰＤ‐Ｌ１／Ｌ２）の発現を阻害することであると予想することができる。阻害を達成する一つの方法は、適切な分子のうちの１つ以上をコードするレンチウイルスベクターゲノムなどのウイルス性ベクターゲノムで形質導入されたＤＣにおいてＰＤ‐Ｌ１／Ｌ２の発現を抑制する、本明細書に記載されるものなどのＲＮＡ分子の発現によるものである。ＤＣの成熟または免疫チェックポイント、例えば、ＰＤ‐１リガンドなどの特定のエレメントの発現は、ＭＨＣクラスＩＩなどの表面マーカーの上方制御のフローサイトメトリー分析により、ならびに、例えば、本明細書に記載される技術および方法を実行することによってケモカインおよびサイトカインの発現をプロファイリングすることにより特徴分析することができる。
【０１７６】
所望の免疫原を発現する細胞の特定を可能にするために、検出可能な産物、たいていはタンパク質をコードする配列を含むことができる。例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光マーカータンパク質を目的のポリヌクレオチド配列（すなわち、少なくとも１つの免疫原をコードする）と共に組換え発現コンストラクトに組み込む。他の例では、そのタンパク質は抗体によって検出可能であり得る、または、そのタンパク質は基質に作用して検出可能な産物を生じる酵素であり得る、または形質移入もしくは形質導入された標的細胞の選択を可能にする、例えば、ハイグロマイシン耐性などの薬品耐性を付与するタンパク質産物であり得る。典型的な選択遺伝子は、抗生物質または、真核細胞での使用に適切な他の毒素、例えば、当技術分野において公知の物の中でもネオマイシン、メトトレキサート、ブラストサイジンに対する耐性を付与するタンパク質、または栄養要求性欠損を補完するタンパク質、または培地から取り除かれている重要な栄養を供給するタンパク質をコードする。選択マーカーは任意により別個のプラスミドに存在し、共形質移入により導入され得る。
【０１７７】
本明細書に記載されるベクター粒子に関して、パッケージング細胞内で所望のベクター粒子の産生に必要な本明細書に記載されるようなエンベロープ分子または１つ以上のＤＣ成熟因子をコードする配列のうちの２つ以上を含む、１つ以上の多シストロン性発現単位を用いることができる。多シストロン性ベクターを使用することで必要とされる核酸分子の総数が減り、したがって、複数のベクターゲノムからの発現の調整に関わる困難の可能性を避けることができる。多シストロン性ベクターでは、発現予定の様々なエレメントが１つ以上のプロモーター（および必要に応じて他の発現制御エレメント）に機能するように結合している。いくつかの形態では、多シストロン性ベクターは、少なくとも１つの目的の免疫原（すなわち、１つ以上の）をコードする配列、レポーター産物をコードする配列、および１つ以上のベクター粒子成分をコードする配列を含む。組換えコンストラクトが、免疫原をコードするポリヌクレオチドを含むある実施形態では、そのコンストラクトは任意によりＤＣ成熟因子をコードする。ある特定の他の実施形態では、多シストロン性ベクターは、免疫原、ＤＣ成熟因子、および、発現ベクターがウイルス性発現ベクターのとき、任意によりウイルス成分のそれぞれをコードするポリヌクレオチド配列を含む。さらに他の実施形態では、多シストロン性ベクターは発現を管理し、そして、少なくとも２つ以上の免疫原をコードする。
【０１７８】
多シストロン性発現ベクターで発現する予定のそれぞれの成分は、同一のプロモーターから様々なタンパク質の別々の発現を可能にするために、例えば、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントまたはウイルス性２Ａエレメントによって分けられ得る。ＩＲＥＳエレメントおよび２Ａエレメントは当技術分野において公知である（例えば、米国特許第４，９３７，１９０号、 de Felipe et al. 2004. Traffic 5: 616-626を参照のこと）。１つの実施形態では、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）、およびゾセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａ）ウイルス（ＴａＶ）（例えば、Szymczak et al. 2004 Nat. Biotechnol. 22: 589-594を参照のこと）由来の２Ａ様配列に結合したフューリン切断部位配列（ＲＡＫＲ）（例えば、Fang et al. 2005 Nat. Biotech. 23: 584-590を参照のこと）などのオリゴヌクレオチドが多シストロン性ベクター内で遺伝的エレメントを分けるために使用される。特定の多シストロン性ベクターの効力は、標準的なプロトコルを用いて遺伝子のそれぞれの発現を検出することにより容易に試験することができる。
【０１７９】
特定の例では、ウイルス性ベクターゲノムは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー／プロモーター配列、ＨＩＶの５’ＬＴＲ由来のＲ配列およびＵ５配列、パッケージング配列（ψ）、ＨＩＶ‐１のフラップシグナル、内部エンハンサー、内部プロモーター、目的の遺伝子、ウッドチャック肝炎ウイルス応答エレメント、ｔＲＮＡアンバーサプレッサー配列、エンハンサー配列の欠失を有するＵ３エレメント、ニワトリβ‐グロビンインシュレーター、ならびにＨＩＶの３’ＬＴＲのＲ配列およびＵ５配列を含む。いくつかの例では、ベクターゲノムは完全なレンチウイルスの５’ＬＴＲと自己不活化３’ＬＴＲを含む（例えば、 Iwakuma et al. Virology 15:120, 1999を参照のこと）。
【０１８０】
Sambrook et al. (1989 and 2001 editions;Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY)、 Coffin et al. (Retroviruses. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.(1997))、および “RNA Viruses: A Practical Approach” (Alan J. Cann, Ed., OxfordUniversity Press, (2000)) に記載されるような、制限エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーション、形質転換、プラスミド精製、およびＤＮＡ配列決定の標準的技法を含むが、これらに限定されない、当技術分野において公知の任意の適切な遺伝子工学技術を用いてベクターゲノムの構築を達成することができる。前述の文献のそれぞれが、その全体の参照により本明細書に組み込まれる。
【０１８１】
哺乳類細胞での一過性発現用に構築されているベクターを使用することもできる。一過性発現は、宿主細胞が多コピーの発現ベクターを蓄積し、次に、その発現ベクター中の免疫原特異的ポリヌクレオチドによりコードされる高レベルのポリペプチドを合成するように、宿主細胞内で高効率に複製することができる発現ベクターを使用することを含む。前述のSambrook et al., pp. 16.17-16.22, 1989 を参照のこと。ポリペプチドの発現への応用に適切な他のベクターおよび方法が当技術分野において周知であり、そして、特定の状況に容易に適合される。
【０１８２】
本明細書において提供される教示および当技術分野における知識を用いることにより、当業者は、特定の発現システムの効力はレポータータンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターでパッケージング細胞を形質移入すること、および適切な技法を用いて発現を測定すること、例えば、緑色蛍光タンパク質複合体からの蛍光を測定することにより検査され得ることを理解する。他の適切なレポーター遺伝子は当技術分野において周知である。
【０１８３】
免疫原をコードするポリヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターは、免疫原の生産のために使用することができる。組換え発現ベクターは、免疫原をコードするポリヌクレオチドに機能するように結合している、プロモーターまたはエンハンサーなどの調節性発現配列を少なくとも１つ含む。それぞれの免疫原の組換え生産に適切な宿主細胞を形質転換、形質導入または形質移入するために前記発現ベクターのそれぞれが使用され得る。免疫原の産生に適切な宿主細胞には原核細胞、酵母細胞および高等真核細胞（例えば、ＣＨＯおよびＣＯＳ）が含まれる。免疫原はそれぞれ、タンパク質技術分野で公知であり、日常的に実施されている様々な単離方法（親和性クロマトグラフィー、高圧液体クロマトグラフィーを含む）、および分取電気泳動）のいずれか１つを用いて各々の宿主細胞または宿主細胞培養物から単離され得る。ある実施形態では、本明細書に記載されるように、単離された免疫原は次に薬学的に適切な賦形剤と製剤されて免疫原性組成物を提供することができる。
【０１８４】
組換え技術によりポリペプチドを産生する特定の方法は一般に周知であり、日常的に用いられている。例えば、分子生物学的手法はＳａｍｂｒｏｏｋら (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold SpringHarbor Laboratory, New York, 1989；Sambrook et al., 3rd ed., Cold Spring HarborLaboratory, New York, (2001)もまた参照のこと）により説明されている。ＤＮＡ配列決定は、Ｓａｎｇｅｒら (Proc. Natl.Acad. Sci. USA 74:5463 (1977)) およびＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｐｌｃ配列決定ハンドブックと含んでいるその改良点に記載されるように実行され得る。
【０１８５】
ベクター粒子
別の実施形態では、ベクター粒子が提供される。ベクター粒子は、少なくとも１つの免疫原をコードするポリヌクレオチド配列を含む、本明細書に記載される組換え発現ベクターのうちのいずれか１つを含む。ある特定の他の実施形態では、ベクター粒子は、特定の免疫応答を誘導する少なくとも１つの免疫原をコードするポリヌクレオチド配列を含む１つの組換え発現ベクター（第１組換え発現ベクターとも呼ばれる）を含む組換え発現システムを含む。少なくとも１つの（本明細書に記載されるような）免疫原をコードするポリヌクレオチドを標的細胞に送達する方法も本明細書において提供される。特定の実施形態では、標的細胞は、抗原提示細胞である免疫細胞であり、より特別な実施形態では、本明細書に記載されるように、標的細胞は樹状細胞である。そのような方法はポリヌクレオチドを送達する媒体と標的細胞の接触（すなわち、相互作用の許可）を含む。本明細書に記載されるように、組換え発現ベクターは多シストロン性であり、少なくとも２つの免疫原をコードし、そして、少なくとも２つ免疫原の発現を管理し得る。本明細書において詳細に記載される特定の実施形態では、ポリヌクレオチドの送達方法は、免疫原をコードするポリヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを含むベクター粒子を対象に投与することにより細胞を接触させることを含む。ベクター粒子、組換え発現ベクター、ポリヌクレオチドおよび免疫原は、本明細書においてより詳細に考察される。
【０１８６】
ある実施形態では、ベクター粒子はウイルス性ベクター粒子であり、そして、他の特定の実施形態では、ベクター粒子は、粒子に由来するａ細菌ｓｕｃｈａｓ、例えば、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、サルモネラ属の種、マイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、大腸菌、シゲラ属の種、およびエルシニア属の種などの細菌に由来する粒子である（例えば、 Paterson, Semin. Immunol (2010) 22:183、 Loessner, Expert Opin.Biol. Ther. (2004) 4:157、 Daudel, Expert Rev. Vaccines (2007) 6:97を参照のこと）。代表的なウイルス性ベクター粒子には、レンチウイルス性ベクターゲノムを含むレンチウイルス性ベクター粒子；ポックスウイルスベクターゲノムを含むポックスウイルスベクター粒子；ワクシニアウイルスベクターゲノムを含むワクシニアウイルスベクター粒子；アデノウイルスベクターゲノムを含むアデノウイルスベクター粒子；アデノウイルス関連ウイルスベクターゲノムを含むアデノウイルス関連ウイルスベクター粒子；ヘルペスウイルスベクターゲノム（例えば、単純ヘルペスウイルスＩまたはＩＩ）を含むヘルペスウイルスベクター粒子；またはアルファウイルスベクターゲノムを含むアルファウイルスベクター粒子が含まれる。
【０１８７】
より特定の実施形態では、ベクター粒子は、（上で詳細が記載されている）レンチウイルス性ベクターゲノムを含むレンチウイルス性ベクター粒子である。特に、少なくとも１つの免疫原をコードする配列をＤＣに送達するためにレンチウイルス性ベクター粒子（ビリオン、レンチウイルス粒子と呼ぶこともできる）を使用することによる、細胞標的化および樹状細胞（ＤＣ）標的化の方法と組成物が本明細書において提供される。レンチウイルス性ベクター粒子は、シンドビスウイルスＥ２に由来するエンベロープ糖タンパク質変異体、および目的の配列を含むゲノムを含む組換え発現コンストラクト、および任意により他の成分を含む。その糖タンパク質変異体は、標準シンドビスウイルス株であるＨＲ由来の糖タンパク質と比較して、ヘパラン硫酸への低下した結合を示す。そのエンベロープ糖タンパク質はレンチウイルス性ベクター粒子による樹状細胞の感染を促進する。本明細書で使用される場合、感染を「促進する」は、形質導入を促進する、と同じであり、標的細胞へのシュードタイプ化レトロウイルス粒子またはレンチウイルス粒子の受容体介在性進入の促進または増強において単体で、または他の分子と共同して作用するそのエンベロープ糖タンパク質の役割を指す。
【０１８８】
一般に、レンチウイルス性ベクター粒子は、機能性ベクター粒子の形成に必要な要素を共同してコードしている１つ以上のプラスミドベクターおよび／または挿入エレメントを含む細胞株によって産生される。これらのレンチウイルス性ベクター粒子は通常複製能が無い、すなわち、それらは一回の感染ができるだけである。レンチウイルス性ベクター粒子を形成する様々な遺伝的成分を分けるためには、プロデューサー細胞の染色体に挿入される複数のプラスミドベクターまたはそれぞれの発現カセットを活用することが最も多い。しかしながら、レンチウイルス成分の全てを有する単一のプラスミドベクターを使用することができる。一例では、パッケージング細胞株は、ＬＴＲ、ｃｉｓ作用性パッケージング配列、および目的の配列（すなわち、少なくとも、１つの免疫原をコードするヌクレオチド配列）を含むウイルス性ベクターゲノムを含有する１つ以上のプラスミド、ウイルスの酵素成分および構造成分（例えば、ｇａｇおよびｐｏｌ）をコードする少なくとも１つのプラスミド、ならびにアルボウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードする少なくとも１つのプラスミドで形質移入される。ウイルス性粒子は細胞膜から発芽し、そして、目的の配列を含有する２つのＲＮＡゲノムを通常含むコアと樹状細胞を標的とするアルボウイルスエンベロープ糖タンパク質を含む。ある実施形態では、アルボウイルス糖タンパク質はシンドビスウイルスＥ２糖タンパク質であり、その糖タンパク質は標準株ＨＲのＥ２と比較して、ヘパラン硫酸へ結合が低下するように操作されている。これには、通常、ＨＲ  Ｅ２糖タンパク質配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸変化が関わる。同様に、Ｅ２糖タンパク質は樹状細胞への標的化特異性を上昇させるように操作され得る。
【０１８９】
理論に捉われることを望むものではないが、ウイルス粒子の細胞表面への結合はエンドサイトーシスを誘導し、ウイルスをエンドソームと接触させ、膜融合を誘発し、およびウイルスコアの細胞質への進入を可能にすると考えられている。挿入性レンチウイルス性ベクター粒子を利用するある実施形態では、逆転写とその産物の核への移行の後、ウイルスのゲノムが標的細胞ゲノムに挿入され、目的の配列を標的細胞のゲノムに組み込む。しかしながら、挿入性突然変異形成の機会を低下させ、そして、指定免疫原の一過性発現を促進するため、他の実施形態は非挿入性レンチウイルス性ベクター粒子（すなわち、標的細胞ゲノムに挿入しないもの）を利用するが、代わりにエピソームから目的の配列を発現する。どちらの例でも、感染したＤＣは次に目的の配列（例えば、免疫原および任意により刺激性分子）を発現する。その後、免疫原は樹状細胞によってプロセッシングを受け、Ｔ細胞およびＢ細胞に提示され、抗原特異的免疫応答を引き起こすことができる。上記の特定の経路は、樹状細胞が抗原特異的免疫応答を刺激することができる限り、必要とされない。
【０１９０】
予防効果または治療効果をもたらすために、本明細書に記載される免疫原性組成物の形状でウイルス粒子が対象に投与され得る。樹状細胞の感染と免疫原産物の発現の後にその産物に対して免疫応答が引き起こされる。
【０１９１】
樹状細胞（ＤＣ）は免疫応答の開始と制御にとって必須の抗原提示細胞である。ＤＣは２つの経路に沿って発生することができる。１つの経路は単球に無関係であり、第２の経路は単球に由来する（Ｍｏ‐ＤＣ）。血液単球は、ＧＭ‐ＣＳＦおよびＩＬ‐４と培養されると、樹枝状形態および適応免疫を開始する強力な能力を（例えば、 Bender et al., J. Immunol. Methods 196(2):121 (1996)、 Sallusto etal., J. Exp. Med. 179(4), 1109 (1994) を参照のこと）、インビボを含む、ヒトで適応免疫を開始する能力を（例えば、Dhodapkar, et al., J. Clin. Invest 104(2), 173 (1999)、 Schuler-Thurner, etal.,  J. Immunol. 165(6):3492 (2000) を参照のこと）獲得する。より効果的な免疫原特異的Ｔ細胞応答は、生体外での細胞操作を必要とすることなく、免疫原を直接Ｍｏ‐ＤＣに効率的に送達するベクター粒子ワクチン、特にレンチウイルス性ベクター粒子システムを使用することにより達成され得る。ヒトＭｏ‐ＤＣは高レベルの２つのＣ型レクチン受容体、マンノース受容体（ＭＭＲ）およびＤＣ特異的細胞接着分子‐３‐結合非インテグリン（ＤＣ‐ＳＩＧＮ）を発現する。本明細書においてより詳細に説明されるように、免疫原の発現は、ＤＣ‐ＳＩＧＮを標的とするように操作されている組換えレンチウイルス性ベクターを使用してＭｏ‐ＤＣに標的化され得る。
【０１９２】
選択的にＤＣ‐ＳＩＧＮに結合する改変型シンドビスウイルス（ＳＩＮ）糖タンパク質からなるＤＣ‐ＳＩＧＮ標的化エンベロープであるＳＶＧｍｕは記載のとおりに修飾されている（本明細書の説明、および米国特許出願公開第１２／８４２，６０９号、国際特許出願公開第２０１１／０１１５８４号を参照のこと）。前記レンチウイルス性ベクターは、マウスでの一回の免疫の後で非常に機能的なＣＤ８Ｔ細胞免疫応答を誘導した（例えば、 Dai, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A (2009)、 Yang, et al.,Nat. Biotechnol. 26(3), 326 (2008) を参照のこと）。このプロトタイプは２つの大規模な改変によって非常に進んだものとなっている。本明細書に記載されるレンチウイルス性ベクターは、ＤＣ‐ＳＩＧＮ受容体を介して真皮ＤＣに感染することが知られているアルボウイルスである天然のＳＩＮ（例えば、Gardner, et al., J. Virol. 74(24), 11849 (2000)、 Klimstra, et al., J. Virol.77(22), 12022 (2003) を参照のこと) に基づく、 広範に存在するヘパラン硫酸 受容体への結合 (例えば、 Klimstra et al.,J. Virol. 72(9), 7357 (1998) を参照のこと）を防止するように改変されている糖タンパク質エンベロープ（ＳＩＮｖａｒ１という名称）を含む。ＳＩＮｖａｒ１エンベロープは、親ＳＶＧｍｕエンベロープと比較して上昇した生産性とインビボ機能の両方を付与する。そのベクターもまた、非機能的となっている変異型インテグレース（ｐｏｌＤ６４Ｖ）（例えば、Apolonia, et al., Mol. Ther. 15(11), 1947 (2007) を参照のこと）、およびＬＴＲのＵ３領域（ａｔｔまで）と３’ＬＴＲポリプリン区域（ＰＰＴ）の欠失を有するベクター骨格の組合せにより、冗長的に挿入不能である。したがって、無効なインテグレースに加えて、そのベクター骨格からなる組成物が全長型ベクターゲノム（自己不活化変異）の転写を防止し、感染したＤＣにおいて、染色体挿入のための鋳型ではない、単一ＬＴＲから逆転写されたエピソーム性ｄｓＤＮＡ環をもたらす（例えば、Bayer, et al., Mol. Ther. 16(12):1968 (2008)、 Breckpot et al., J. Virol. (2010)、Ma et al., Mol. Ther. 10(1):139 (2004) を参照のこと）。Ｒｅｖを除く調節性タンパク質とアクセサリータンパク質の全てを含む、親ＨＩＶゲノムの約７５％がＤＣ‐ＮＩＬＶから取り除かれている。一回の注射の後でＤＣ‐ＮＩＬＶは非常に安定な腫瘍抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞応答を誘導する。レンチベクターによるワクチン投与の効力は少なくとも部分的にはＴＬＲ３およびＴＬＲ７パターン認識受容体の関与に左右される（例えば、Beignon et al., J. Virol. (2009)、前述の Breckpot et al.を参照のこと)。
【０１９３】
ウイルス性ベクターのエンベロープ
節足動物に担持されるウイルス（アルボウイルス）は、感染しているカなどの媒介性節足動物によってヒト、ウマまたは鳥などの宿主に伝達されるウイルスである。アルボウイルスは、アルファウイルスおよびフラビウイルスを含むウイルスのサブファミリーにさらに分類されるが、それらは正極性の一本鎖ＲＮＡゲノムと糖タンパク質含有エンベロープを有する。例えば、デング熱ウイルス、黄熱ウイルスおよび西ナイルウイルスはフラビウイルス科に属し、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルスおよびベネズエラ馬脳炎ウイルスはアルファウイルス科のメンバーである（例えば、 Wang et al., J. Virol. 66, 4992 (1992) を参照のこと）。シンドビスウイルスのエンベロープは２つの膜貫通糖タンパク質を含み（例えば、Mukhopadhyay et al. Nature Rev. Microbiol. 3, 13 (2005) を参照のこと）、Ｅ１は融合に関与すると考えられており、そして、Ｅ２は細胞結合に関与すると考えられている。シンドビスウイルスエンベロープ糖タンパク質は、オンコレトロウイルスおよびレンチウイルスを含む他のレトロウイルスをシュードタイプすることが知られている。
【０１９４】
本明細書において考察されるように、レンチウイルス系ベクターゲノムをシュードタイプするためにアルボウイルスエンベロープ糖タンパク質を使用することができる。「シュードタイプ化」レンチウイルスは、レンチウイルスゲノムとは別個のウイルスによりコードされる１つ以上のエンベロープ糖タンパク質を有するレンチウイルス粒子である。エンベロープ糖タンパク質は本明細書に記載されるように修飾、変異形成または操作され得る。
【０１９５】
シンドビスウイルスと他のアルファウイルスのエンベロープはウイルス粒子膜の脂質二重層と合体し、そして、通常、複数コピーの２つの糖タンパク質、Ｅ１およびＥ２を含む。それぞれの糖タンパク質は膜貫通領域を持ち、Ｅ２は約３３残基の細胞質ドメインを有するが、Ｅ１の細胞質尾部は非常に短い（約２残基）。Ｅ１もＥ２も膜貫通領域内またはその近傍に結合しているパルミチン酸を有する。Ｅ２は最初、前駆体タンパク質として合成され、フューリンまたは、他のＣａ２＋依存性セリンプロテイナーゼにより切断されてＥ２とＥ３と呼ばれる小糖タンパク質になる。Ｅ２とＥ１をコードする配列の間に６Ｋと呼ばれるタンパク質をコードする配列が位置する。Ｅ３と６Ｋは、それぞれＥ２糖タンパク質とＥ１糖タンパク質を膜に輸送するために機能するシグナル配列である。シンドビスウイルスゲノム内で、シンドビスエンベロープタンパク質のコード領域はＥ３、Ｅ２、６ＫおよびＥ１をコードする配列を含む。本明細書において使用される場合、アルボウイルスウイルスの「エンベロープ」は少なくともＥ２を含み、そして、Ｅ１、６ＫおよびＥ３を含むこともできる。シンドビスウイルスＨＲ株のエンベロープ糖タンパク質の代表的な配列は配列番号１７として提示される。ある特定の別の実施形態では、Ｅ３配列が配列番号２０の残基１〜６５に対応するＥ３／Ｅ２糖タンパク質、または残基６２〜６５がＲＳＫＲであるその変異体（配列番号２７）がシュードタイプ化ウイルス性エンベロープに組み込まれてもよい。他のアルボウイルスのエンベロープ糖タンパク質の配列は、ＧｅｎＢａｎｋなどの公開データベースに見出すことができる。例えば、デングウイルス糖タンパク質をコードする配列は受託番号ＧＱ２５２６７７．１で（とりわけＧｅｎＢａｎｋにおいて）、および、ＮＣＢＩのウイルス多様性データベースにおいて見出すことができ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号とウイルス多様性データベースはエンベロープ糖タンパク質配列の参照により組み込まれる）、そして、ベネズエラ馬脳炎ウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードする代表的な配列は受託番号ＮＰ＿０４０８２４．１で見出すことができる（エンベロープ糖タンパク質の配列の参照により組み込まれる）。
【０１９６】
アルファウイルス、特にシンドビスウイルスに対する樹状細胞上の細胞性受容体はこれまで明確には特定されていないが、１つの受容体はＤＣ‐ＳＩＧＮであると思われる（例えば、 Klimstra et al., J. Virol. 77:12022, 2003を参照のこと）。「接着」、「結合」、「標的化」などの用語の使用は互換的に使用され、そして、それらはシンドビスウイルスエンベロープ糖タンパク質と細胞成分の間の相互作用の機構を示すことを意味してはいない。ＤＣ‐ＳＩＧＮ（樹状細胞特異的ＩＣＡＭ‐３（細胞接着分子３）結合非インテグリン；ＣＤ２０９としても知られる）は、急速結合と物体のエンドサイトーシスが可能であるＣ型レクチン様受容体である（例えば、Geijtenbeek et al. Annu. Rev. Immunol. 22: 33-54, 2004を参照のこと）。Ｅ２はＤＣ‐ＳＩＧＮを介して樹状細胞にウイルスを標的化するようである。本明細書において示されるように、ＤＣ‐ＳＩＧＮを発現する細胞は、ＤＣ‐ＳＩＧＮを発現しない同質遺伝子的細胞よりも（少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、または少なくとも１０倍良く）シンドビスウイルスＥ２でシュードタイプ化されているウイルス性ベクター粒子によって形質導入される。Ｅ２糖タンパク質がウイルスの感染を促進する機序にはＤＣ‐ＳＩＧＮが関わるようで、おそらく、ＤＣ‐ＳＩＧＮへの直接的な結合を介する、または、立体構造の変化を引き起こすことによる、または、他のある機序による。実際の機序に関わらず、Ｅ２による標的化はＤＣ‐ＳＩＧＮを発現する細胞、すなわち、樹状細胞が専門とする。
【０１９７】
シンドビスウイルスはまた、ヘパラン硫酸を介して細胞に結合するようである（例えば、Klimstra et al., J. Virol. 72: 7357, 1998、 Burmes et al., J. Virol. 72: 7349,1998を参照のこと）。ヘパラン硫酸および他の細胞表面グリコサミノグリカン類は大半の細胞種の表面上に見出されるので、ヘパラン硫酸とシンドビスエンベロープ糖タンパク質の間の相互作用を低下させることが望ましい。これは、シンドビスウイルスエンベロープのヘパラン硫酸への結合を減少させることによって、または、結合を上昇させる、例えば、シンドビスウイルスエンベロープの樹状細胞への親和性を上昇させることにより、またはその両方により達成することができる。結果として、他の細胞種によって発現され得る他の分子への、たとえエンベロープがＤＣ‐ＳＩＧＮに特異的であっても起こり得る非特異的結合が減少し、そして、改善された特異性が、所望の免疫応答を低下させ得る副作用または他の細胞種の対象外形質導入に伴う副作用などの、望ましくない副作用を避けるように機能し得る。ＤＣ‐ＳＩＧＮ発現細胞の相対的に特異的な形質導入の利点に代わって、または、それに加えて、シンドビスウイルスエンベロープＥ２糖タンパク質でシュードタイプ化されたウイルス粒子は、ＶＳＶ‐Ｇなどの糖タンパク質でシュードタイプ化されたウイルス粒子に対してその他の利点を提供することができる。そのような利点の例には補体介在性溶解の低下および／または神経細胞標的化の低下が含まれ、それらの両方がＶＳＶ‐Ｇシュードタイプ化ウイルス粒子の投与に伴うと考えられている。
【０１９８】
様々な例で、前記レンチウイルス性ベクター粒子はＤＣ‐ＳＩＧＮ発現細胞に特異的に結合し、そして、低下した、または抑制されたヘパラン硫酸への結合を有する。すなわち、シンドビスウイルスエンベロープＥ２糖タンパク質は、他の細胞種と比較して、ＤＣ‐ＳＩＧＮを発現する樹状細胞にウイルスを優先的に配向するように改変され得る。その他の研究のなかでも構造研究および分子モデリングから得られた情報を基に、エンベロープタンパク質、特にＥ２糖タンパク質およびＥ１糖タンパク質の変異体配列が、糖タンパク質がエンベロープタンパク質としてのそれらの機能を維持するが、所望の結合特異性、親和性、または結合レベルを持つように設計され、作製される。それぞれの糖タンパク質について候補変異体配列が作製され、最も望ましい特徴を有するエンベロープ糖タンパク質を特定するために、下記の方法または当技術分野において公知の他の方法を用いてそれらを検査することができる。
【０１９９】
シンドビスＥ２のある特定の変異体配列は、配列番号１と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異を残基１６０に有する。残基１６０は欠失されるかグルタミン酸以外のアミノ酸に変更される。変異は少なくとも１つのアミノ酸の置換であるのが最も一般的であるが、代わりに、１つ以上のアミノ酸の付加または欠失の場合がある。任意の追加のアミノ酸は少数であり、安全性を損なう場合がある抗原性エピトープ（例えば、ヘマグルチニンタグ配列）を含まないことが好ましい。２つ以上の変異が存在するとき、それらは両方とも同じ種類（例えば、置換）または異なる種類（例えば、置換と欠失）であり得る。複数の変異はタンパク質配列中に散在している場合も連続的に位置する場合もある。
【０２００】
例として、変異体配列は、配列番号１の約残基５０〜約残基１８０の領域に少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。この領域内にヘパラン硫酸への結合に関わるアミノ酸が存在する。Ｅ２の正味の正電荷を減少させることにより、ヘパラン硫酸との静電気的相互作用が低下することができ、ヘパラン硫酸への結合が低下することになる。この領域内の候補正荷電アミノ酸には、残基６３、７０、７６、８４、９７、１０４、１２９、１３１、１３３、１３９、１４８、１４９、１５９のリシンおよび残基６５、９２、１２８、１３７、１５７、１７０、１７２のアルギニンが含まれる（例えば、 Bear et al., Virology 347: 183-190, 2006を参照のこと）（配列番号１を参照のこと）。これらのアミノ酸のうちの少なくともいくつかはヘパラン硫酸へのＥ２の結合に直接関与する。リシンもしくはアルギニンの欠失、またはリシンもしくはアルギニンの中性アミノ酸もしくは負荷電アミノ酸での置換により正味の正電荷を減少させることができる。例えば、これらのリシンおよびアルギニンのうちの１つ以上をグルタミン酸またはアスパラギン酸で置換することができる。ある実施形態は、リシン７０、７６または１５９のうちの少なくとも１つの置換を有する。Ｅ２糖タンパク質の代表的なアミノ酸配列は、配列番号３〜１６に示されている。Ｅ２がＥ３とのポリタンパク質として発現する場合、中性のＥ３／Ｅ２切断部位に隣接するリシンが維持される。すなわち、その認識配列と切断部位は不変である。あるいは、天然のエンドペプチダーゼ切断部位配列が異なるエンドペプチダーゼの認識配列で置換される。
【０２０１】
Ｅ２のある特定の変異体もまた、樹状細胞への結合に正に影響するように改変されている。標準ＨＲ配列中の残基１６０に見られるグルタミン酸の変異が樹状細胞への結合を改善することができる（例えば、 Gardner et al., J. Virol. 74, 11849, 2000を参照のこと）。残基１６０の欠失または残基１６０の置換などの変異がある特定の変異体に見られる。特定の変異体では、非荷電アミノ酸がＧｌｕに置換されており、他の変異体では、非酸性アミノ酸がＧｌｕに置換されている。典型的には、Ｇｌｕ１６０は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシンを含む小アミノ酸または脂肪族アミノ酸のうちの１つで置換されている。
【０２０２】
他の変異体は２つ以上のアミノ酸変異を含む。これらの変異体に典型的なことに、その変異のうちの１つはＧｌｕ１６０であり、残りの変異は、配列番号１の残基約５０〜約１８０に及ぶ領域のリシンおよびアルギニンのうちの１つ以上の変更である。その変異体のある特定のものはＧｌｕ１６０の非酸性残基への変更または欠失、および非塩基性アミノ酸によるリシン７０、リシン７６またはリシン１５９のうちの１つ以上の変更を含む。いくつかの特定の変異体はＧｌｕ１６０のＧｌｙへの、Ｌｙｓ７０のＧｌｕへの、およびＬｙｓ１５９のＧｌｕへの置換；Ｇｌｕ１６０のＧｌｙへの、Ｌｙｓ７０、７６および１５９のＧｌｕへの置換；Ｇｌｕ１６０の欠失およびＬｙｓ７０と１５９のＧｌｕへの置換；ならびにＧｌｕ１６０の欠失およびＬｙｓ７０、７６および１５９のＧｌｕへの置換を含む（例えば、配列番号３〜１６を参照のこと）。
【０２０３】
ある実施形態では、Ｅ２タンパク質はまず少なくともＥ３との融合体であるポリタンパク質、またはリーダー配列との融合体であるポリタンパク質として発現する。そのリーダー配列がＥ３であるか、または別の配列であるかに関係なく、ウイルス性エンベロープ中のＥ２にＥ３または、他のリーダー配列があってはならない。別の研究では、Ｅ２はＥ３／Ｅ２癒合タンパク質（例えば、ＳＶＧｍｕと呼ばれるＥ３／Ｅ２融合タンパク質）ではないことが好ましい。ある実施形態では、Ｅ２はＥ３‐Ｅ２‐６Ｋ‐Ｅ１ポリタンパク質の一部として発現する。シンドビスウイルスはもともとＥ２をポリタンパク質の一部として発現し、そして、Ｅ３／Ｅ２、Ｅ２／６Ｋの接合領域、および６Ｋ／Ｅ１の接合領域はエンドペプチダーゼにより認識され、切断される配列を有する。通常、Ｅ３／Ｅ２接合部はフューリンまたはフューリン様セリンエンドペプチダーゼによって残基６５と６６の間で切断される。フューリンは、２つのアミノ酸によって分けられているアルギニン残基対に対する特異性を有する。フューリンによるＥ３／Ｅ２切断を維持するためには、残基６２〜６６（ＲＳＫＲＳ；配列番号２６）は２つのアミノ酸で分けられている２つのアルギニン残基とセリン残基を維持すべきである。あるいは、Ｅ３／Ｅ２フューリン切断配列または他の切断配列のうちのいずれかの代わりに異なる切断配列を使用することができる。アスパラギン酸エンドペプチダーゼ（例えば、カテプシンＤ、キモシン、ＨＩＶプロテアーゼ）、システインエンドペプチダーゼ（ブロメライン類、パパイン、カルパイン）、メタロエンドペプチダーゼ、（例えば、コラゲナーゼ、サーモリシン）、セリンエンドペプチダーゼ（例えば、キモトリプシン、第ＩＸａ因子、第Ｘ因子、トロンビン、トリプシン）、ストレプトキナーゼを含むが、これらに限定されないエンドペプチダーゼの認識部位および切断部位を組み込むことができる。これらの酵素の認識部位配列および切断部位配列は周知である。
【０２０４】
既に述べられているもの以外のＥ２中のアミノ酸を変更することもできる。一般に、変異体Ｅ２配列は基準Ｅ２配列に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有し、または、それは少なくとも８２％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９８％の配列同一性を有することができる。変異体糖タンパク質は、Ｅ２を含むエンベロープを有するウイルス粒子による樹状細胞の感染を促進する能力のような生物学的機能を示すべきである。ウイルス構築、細胞表面への付着、および感染の様々な局面で重要な役割を有するように見え有るエンベロープ糖タンパク質の領域が実験により特定されている。変異体を作製するとき、ガイドラインとして次の情報を使用することができる。Ｅ２の細胞質尾部、約残基４０８〜４１５はウイルス構築に重要である（例えば、 West et al. J. Virol. 80: 4458-4468, 2006を参照のこと；その全体に組み込まれる）。他の領域は二次構造の形成に関与し（約残基３３〜５３）、そして、輸送とタンパク質の安定性に関与する（約残基８６〜１１９）（例えば、Navaratmarajah et al., J. Virol. 363:124-147, 2007を参照のこと；その全体に組み込まれる）。変異体は約残基３７０〜３８０の膜を貫通する領域の疎水性特性を保持する場合がある。変異体は残基ＮＩＴ（残基１９６〜１９８）およびＮＦＴ（残基３１８〜３２０）の片方または両方にＮ‐結合グリコシル化部位を保持する場合があり、そして、パルミトイル化される部位（Ｃ３９６、Ｃ４１６およびＣ４１７）のうちの１つ以上を保持する場合がある（例えば、Strauss et al., Microbiol. Rev. 58, 491-562, 1994, pp. 499-509を参照のこと；その全体の参照により本明細書に組み込まれる）。他方では、有害事象を起こすことなくＥ２の多数の領域を変更することができる。例えば、Ｅ２の様々な位置へのトランスポゾンの挿入がなお生存可能なウイルスをもたらした（例えば、前述のNavaratmarajahを参照のこと）。
【０２０５】
ある実施形態では、Ｅ３タンパク質、６Ｋタンパク質またはＥ１タンパク質にタグペプチドを組み込んでもよい。いくつかの目的のためにＥ２にタグを組み込んでもよいが、タグはヒトの患者への投与用の製品での使用には望ましくない。タグペプチドは短い配列であるが（例えば、５〜３０アミノ酸）、エンベロープ発現とウイルス粒子内でのその存在の検出を容易にするためにそれを用いることができる。検出目的では、タグ配列は通常抗体または化学物質によって検出可能である。タグの別の使用法はウイルス粒子の精製を容易にすることである。ウイルスを吸収するためにタグの結合パートナーを含有する基質を使用することができる。その結合パートナーからタグを置換する部分を用いる処理により、ウイルスの溶出を達成することができ、または、そのタグ配列が切断可能な配列と結合している場合、適切なエンドペプチダーゼを用いる処理が好都合にもウイルスの遊離を可能にする（例えば、ＱｉａＧＥＮ（登録商標）カタログ、第Ｘａ因子プロテアーゼシステムを参照のこと）。タグペプチドの除去は、ウイルス粒子の動物対象での使用についての安全性目的から一般に望ましい。タグが除去されていない場合、そのタグに対する免疫応答が起こる場合がある。
【０２０６】
適切なタグには、なかでも、その抗体が市販されているＦＬＡＧ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）（配列番号３５）（米国特許第４，７０３，００４号、その全体が組み込まれる）、キチン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質、グルタチオン‐Ｓ‐トランスフェラーゼ、ポリ（Ｈｉｓ）（米国特許第４，５６９，７９４号、その全体が組み込まれる）、チオレドキシン、ＨＡ（ヘマグルチニン）タグが含まれるが、これらに限定されない。ポリ（Ｈｉｓ）はニッケルまたはコバルトなどの結合金属イオンを含有する親和性媒体に吸着され、低ｐＨ媒体で溶出され得る。
【０２０７】
樹状細胞を標的とするウイルスに組み込まれているエンベロープ糖タンパク質の特異性を決定するために、ベクター粒子を評価する場合がある。例えば、骨髄細胞の混合集団を対象から得て、インビトロで培養することができる。あるいは、ＤＣ‐ＳＩＧＮを発現する、または発現しない同質遺伝子的細胞株を得て、使用することができる。組換えウイルスは、骨髄細胞の混合集団または同質遺伝子的細胞株に投与することができ、そして、ウイルスに組み込まれているレポーター遺伝子の発現をその培養細胞で検査することができる。ある実施形態は限界希釈分析を用いる場合があり、その分析では細胞の混合集団を別々の部分に分割し、次にウイルスの量を減らしながら（例えば、それぞれの部で２倍、５倍、１０倍少ないウイルス）それらを別々に培養する。いくつかの実施形態では、混合細胞集団中の感染細胞の少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、７０％、８０％または９０％、または少なくとも約９５％がＤＣ‐ＳＩＧＮを発現する樹状細胞である。ある実施形態では、感染非樹状細胞（または非ＤＣ‐ＳＩＧＮ発現細胞）に対する感染樹状細胞の比率は少なくとも約２：１、少なくとも約３：１、少なくとも約４：１、少なくとも約５：１、少なくとも約６：１、少なくとも約７：１、少なくとも約８：１、少なくとも約９：１、少なくとも約１０：１、少なくとも約２０：１、少なくとも約３０：１、少なくとも約４０：１、少なくとも約５０：１、少なくとも約１００：１、少なくとも約２００：１、少なくとも約５００：１、少なくとも約１０００：１、少なくとも約５０００：１、少なくとも約１０、０００：１、またはそれ以上である。限界希釈では、導入ウイルスの希釈が高いほど（すなわち、少量であるほど）より高い選択性が通常見られる。
【０２０８】
様々な技法のうちのいずれかによりシュードタイプ化ウイルス粒子の活性を決定することができる。例えば、感染性効率（ＩＵ、感染性単位）を測定する好ましい方法は細胞にウイルス粒子を投与して、そのベクターゲノムにコードされる産物の発現を測定することによる。測定することができる任意の産物を使用することができる。１つの好都合な種類の産物は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光タンパク質である。使用することができる他の産物には、細胞表面上で発現するタンパク質（例えば、抗体結合による検出）、酵素などが含まれる。その産物が抗原であり、細胞が樹状細胞である場合、感染性／活性は免疫応答を測定することにより評価され得る。さらに、哺乳類動物で副作用を確認することが可能である。樹状細胞を特異的に標的とする能力を、例えば、細胞培養物で下記のように直接試験することもできる。
【０２０９】
本明細書に記載されるウイルス粒子を含むベクター粒子を調製して、それらの選択性および／または標的細胞膜の透過を容易にするそれらの能力について試験することもできる。非修飾型糖タンパク質を有するエンベロープを持つウイルス性粒子が比較対照として使用され得る。簡単に説明すると、標準的な感染アッセイを用いて、エンベロープ糖タンパク質の受容体を発現する細胞にウイルスが感染する。特定の時間の後、例えば、乾癬から４８時間後に細胞を収集することができ、ウイルス感染細胞のパーセンテージを、例えば、フローサイトメトリーによって決定することができる。ウイルス感染細胞のパーセンテージを産出することによって、選択性の採点をつけることができる。同様に、ウイルスタイターに対する変異体エンベロープ糖タンパク質の効果は、変異体エンベロープを含むウイルスが感染した細胞のパーセンテージを対応する野生型（非修飾型）エンベロープ糖タンパク質を含むウイルスが感染した細胞のパーセンテージで除算することによって定量され得る。特に適切な変異体は選択性と感染タイターの最良の組合せを有する。一度、変異体が選択されると、ウイルス濃縮アッセイを実行して、これらのウイルスが活性を損なうことなく濃縮され得ることを確認することができる。ウイルス上清を収集し、超遠心分離によりそれを濃縮する。ウイルスのタイターは、ウイルスのストック溶液を限界希釈し、エンベロープ糖タンパク質の受容体を発現する細胞を感染させ、上記のようなウイルスによって発現される産物の発現を測定することにより決定することができる。
【０２１０】
レンチウイルス性ベクター粒子の標的細胞への進入は別の種類の活性評価である。ＨＩＶ‐１ウイルスの透過を評価するためにＢｌａＭ‐Ｖｐｒ（β‐ラクタマーゼＶｐｒ）融合タンパク質が使用されている。融合の促進と標的細胞への透過におけるエンベロープタンパク質の効力を評価するために、ＢｌａＭとＥ１またはＥ２／Ｅ１融合タンパク質などのシンドビスウイルスエンベロープ糖タンパク質の融合を用いることができる。ウイルス性粒子は、例えば、ウイルス性エレメント、ＢｌａＭ‐Ｖｐｒ、および目的の変異体エンベロープ（および適切な場合、親和性分子）を含む１つ以上のベクターでのパッケージング細胞の一過性形質移入により調製され得る。結果生じるウイルスは、標的分子（または親和性分子）が（抗体などの）遊離結合阻害剤の不在下でも、存在下でも特異的に結合する分子を発現する細胞を感染させるために使用され得る。その後、細胞をＣＯ２独立培地で洗浄し、それらにＣＣＦ２色素（Ａｕｒｏｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンディエゴ、カリフォルニア州）を負荷することができる。切断反応を完了させるために室温でインキュベートした後、パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、フローサイトメトリーと顕微鏡観察でそれらを分析することができる。青色の細胞の存在は細胞質へのウイルスの透過を示す。ブロッキング抗体が付加される場合、青色の細胞がほとんどないことが予想される（例えば、 Cavrois et al., Nat. Biotechnol. 20:1151-54, 2002を参照のこと)。
【０２１１】
透過は低ｐＨに依存するかどうかを調べるために、および所望のｐＨ依存性を有するエンベロープ糖タンパク質を特定するために、ＮＨ４Ｃｌまたは、ｐＨを変化させる他の化合物を感染ステップで付加することができる（ＮＨ４Ｃｌがエンドソームの酸性コンパートメントを中和化する）。ＮＨ４Ｃｌの場合、青色の細胞の消失は、ウイルスの透過が低ｐＨ依存的であることを示す。さらに、その活性がｐＨ依存的であることを確認するために、塩化アンモニウム、クロロキン、コンカナマイシン、バフィロマイシンＡｌ、モネンシン、ニゲリシンなどのようなリソソーム作用性薬剤をインキュベーション緩衝液に付加してもよい。これらの薬剤はエンドソームコンパートメント内のｐＨを上昇させる（例えば、 Drose et al., J. Exp. Biol. 200, 1-8, 1997を参照のこと）。これらの薬剤の阻害効果はウイルスの融合と進入に対するｐＨの役割を示す。異なる膜融合性分子を提示するウイルス間での様々な進入カイネティクスを比較して最も適切なものを特定の適用に選択することができる。
【０２１２】
ＰＣＲベースの進入アッセイは、ウイルスの進入のカイネティクスの指標として逆転写をモニターし、ウイルスのＤＮＡ合成のカイネティクスを測定するために利用され得る。例えば、特定のエンベロープタンパク質分子を含むウイルス粒子は、そのエンベロープタンパク質分子の適切な結合パートナー（受容体）を発現するように操作されている、または、自然に発現する、２９３Ｔ細胞、ＤＣまたは他の任意の細胞などの標的細胞と共に培養される。直ぐに、または、（感染が起きるようにするために）一定の時間の後に、未結合のウイルスを除去し、ウイルス性核酸について細胞のアリコットを分析する。これらのアリコットからＤＮＡを抽出し、そして、ＬＴＲ特異的プライマーで開始される増幅分析、一般的には半定量的測定にかける。ＬＴＲ特異的ＤＮＡ産物の出現はウイルスの進入の成功を示す。
【０２１３】
ウイルス性ベクター粒子によるウイルス感染の後、標的樹状細胞が免疫原を発現する。生体外で接触させた場合、次に標的樹状細胞が、例えば、注射により患者に移植して戻され、そこでそれらは、所望の抗原に対する免疫応答を引き起こすことができる免疫細胞と相互作用する。好ましい実施形態では、組換えウイルスが患者に注入され、標的樹状細胞をその場で形質導入する。その後、樹状細胞は治療予定の疾患または障害に関連する特定の抗原を発現し、そして、患者はその疾患または障害に対する有効な免疫応答を開始することができる。
【０２１４】
ウイルス性ベクターゲノムは、１つよりも多い免疫原をコードするポリヌクレオチド配列を含有してよく、標的樹状細胞が形質導入されると、細胞に送達されるそれぞれの免疫原に対する免疫応答を引き起こす。いくつかの実施形態では、免疫原は単一の疾患または障害に関連する。他の実施形態では、免疫原は複数の疾患または障害に関連する。
【０２１５】
ベクター粒子のいくつかでは、ＤＣの成熟を活性化および／または刺激するＤＣ成熟因子は目的の免疫原コード配列と併せて送達される。ある特定の別の実施形態では、ＤＣはベクター粒子の送達前、ベクター粒子の送達と同時に、またはベクター粒子の送達後にＤＣ成熟因子の送達によって活性化される。ＤＣ成熟因子はベクター粒子の投与と別に供与され得る。
【０２１６】
本明細書に記載されるように、１つ以上の免疫調節因子またはＤＣ成熟因子は、ベクター粒子に含有される１つ以上の配列によってコードされ、その粒子が樹状細胞に進入または感染した後に発現され得る。免疫調節因子をコードする配列はまた、１つ以上の免疫原をコードするベクター粒子とパッケージング細胞株に共形質移入される別のベクター中に提供され得る。
【０２１７】
本明細書に記載される方法は対象において養子免疫療法に使用され得る。上記のように、望ましい免疫応答を引き起こす免疫原が特定される。所望の免疫原をコードするポリヌクレオチドを得てベクター粒子にパッケージする。標的樹状細胞を患者から入手し、所望の免疫原をコードするポリヌクレオチドを含有するベクター粒子で形質導入する。その後、樹状細胞は、前記患者に移植して戻される。
【０２１８】
ベクター粒子（例えば、本明細書に記載されるウイルス性ベクター粒子）はインビボで注入して良く、その粒子はＤＣに感染し、目的の免疫原コードヌクレオチド配列を送達する。ウイルス粒子の量は少なくとも３×１０６感染性単位（ＩＵ）であり、そして、少なくとも１×１０７ＩＵ、少なくとも３×１０７ＩＵ、少なくとも１×１０８ＩＵ、少なくとも３×１０８ＩＵ、少なくとも１×１０９ＩＵ、または少なくとも３×１０９ＩＵであり得る。ＧＦＰまたはルシフェラーゼなどのマーカーがベクター粒子に含まれる組換え発現ベクターに存在するポリヌクレオチド配列によって共発現される場合、その発現を観察することにより発現を評価するために、選択された間隔で、受容者のリンパ器官に由来するＤＣを使用することができる。ベクター粒子がレンチウイルス性ベクター粒子であるとき、ベクター粒子の生体分布を分析するために核酸モニタリング技法および逆転写酵素（ＲＴ）活性の測定もまた使用され得る。ベクター粒子（レンチウイルス性ベクター粒子を含む）で処置された受容者の末梢血単核球細胞、リンパ節、脾臓、または悪性腫瘍組織または標的病原体感染組織に由来するＴ細胞は抗原刺激に対する応答の大きさと持続性から評価され得る。インビボ遺伝子送達の特異性について、ＤＣ以外の上皮細胞およびリンパ細胞などの組織細胞を分析してもよい。
【０２１９】
免疫応答
本明細書に記載されるように、免疫原に対する免疫応答を誘導する方法が提供される。免疫応答に関与する免疫システムの細胞は一般に免疫細胞と呼ばれ、リンパ球およびアクセサリー細胞などの非リンパ細胞を含む。リンパ球は、外来の抗原を特異的に認識し、それらに応答する細胞であり、アクセサリー細胞は特定の抗原に特異的ではないが、免疫応答の認識期と活性化期に関与する。例えば、単核食細胞（マクロファージ）、他の白血球（例えば、好中球、好酸球、好塩基球を含む顆粒球）、および樹状細胞は免疫応答の誘導においてアクセサリー細胞として機能する。リンパ球の外来抗原による活性化が、抗原を排除しようと機能する多数のエフェクター機構を誘導または誘発することになる。そのエフェクター機構に影響または関与する単核食細胞などのアクセサリー細胞はエフェクター細胞とも呼ばれる。
【０２２０】
主要クラスのリンパ球には、大顆粒リンパ球であるＢリンパ球（Ｂ細胞）、Ｔリンパ球（Ｔ細胞）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。Ｂ細胞は抗体を産生することができる。Ｔリンパ球はヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋（本明細書および当技術分野においてＣＤ４とも呼ばれる））および細胞溶解性または細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋（本明細書および当技術分野においてＣＤ８とも呼ばれる））にさらに分類される。ヘルパー細胞は、増殖とＴ細胞ならびにＢ細胞およびマクロファージを含む他の細胞の分化を促進し、炎症性白血球をリクルートおよび活性化するサイトカインを分泌する。調節性Ｔ細胞またはサプレッサーＴ細胞と呼ばれる別のサブグループのＴ細胞は免疫システムの活性化を積極的に抑制し、病原的な自己反応性、すなわち、自己免疫疾患を予防する。
【０２２１】
免疫応答を誘導するための本明細書に記載される方法は、様々な種類のＴ細胞（すなわち、Ｔリンパ球）が関与する細胞介在性免疫応答の誘導に有用である。細胞介在性応答では、その様々な種類のＴリンパ球は多数の機序により抗原を排除するように作用する。例えば、特定の抗原を認識することができるヘルパーＴ細胞は、サイトカインなどの可溶性メディエーターを放出することにより応答して免疫システムのその他の細胞を免疫応答に関与するようにリクルートすることができる。また、細胞傷害性Ｔ細胞は抗原を特異的に認識することができ、抗原担持細胞または粒子に結合することにより応答してそれを破壊または損傷することができる。免疫応答を誘導するための本明細書に記載される方法は、本明細書および当技術分野においてＢ細胞反応とも呼ばれる液性応答を誘導することもできる。液性応答は、抗原（または免疫原）に特異的に結合する抗体の産生を含む。抗体は、形質細胞として知られる、分化したＢリンパ球によって産生される。
【０２２２】
本明細書に記載され、当業者が精通する周知の免疫学的方法のうちの任意の数の方法によって、免疫応答が誘導されるかということ、および宿主または対象で誘導される免疫応答の種類を決定することができる。本明細書に記載されるように、免疫応答の存在およびレベルを決定する方法および技術には、例えば、蛍光共鳴エネルギー移動法、蛍光分極法、時間分解蛍光共鳴エネルギー移動法、シンチレーション近接アッセイ、レポーター遺伝子測定法、蛍光消光酵素基質、発色性酵素基質および電気化学発光、（酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ、免疫ブロッティング、免疫組織化学などのような）免疫アッセイ、表面プラズモン共鳴、レポーター遺伝子を使用するものなどの細胞ベースの検定法、および機能性検定法（例えば、免疫機能および免疫応答性を測定する検定法）が含まれる。
【０２２３】
そのような検定法には、可溶性抗体、サイトカイン（例えば、ＩＦＮ‐γ、ＩＬ‐２、ＩＬ‐４、ＩＬ‐１０、ＩＬ‐１２、ＩＬ‐６、ＩＬ‐２３、ＴＮＦ‐α、およびＴＧＦ‐β）、リンホカイン、ケモカイン、ホルモン、成長因子などのような可溶性メディエーター、ならびに他の可溶性の小ペプチド、炭水化物、ヌクレオチドおよび／または脂質メディエーターの存在およびレベルのインビボまたはインビトロでの決定が含まれるが、必ずしもそれに限定されない。免疫アッセイには、免疫システム細胞の機能的特性または構造的特性の変化、例えば、細胞増殖、運動性の変化、特定の遺伝子発現または細胞溶解行動などの特別な活性の誘導；刺激に応答した樹状細胞の成熟などの細胞成熟；Ｔｈ１応答とＴｈ２応答の間の関係の変化；表面抗原発現プロファイルの変化またはアポトーシス（プログラム細胞死）の開始を含む免疫システム細胞による細胞分化を分析することにより細胞活性化状態の変化を決定することが含まれる。これらおよび類似の検定法を実行する手法は、例えば、Lefkovits (Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebookof Techniques, 1998)におそらく見出される。Current Protocols in Immunology; Weir, Handbookof Experimental Immunology, Blackwell Scientific, Boston, MA (1986)、Mishell andShigii (eds.) Selected Methods in Cellular Immunology, Freeman Publishing, SanFrancisco, CA (1979)、 Green and Reed, Science 281:1309 (1998) およびこれに引用される参照文献も参照のこと。）
【０２２４】
免疫原とそれぞれの目的の指定抗原に特異的に結合する抗体の存在および／またはレベルの決定は、ＥＬＩＳＡ、免疫沈殿、免疫ブロッティング、向流免疫電気泳動、放射免疫アッセイ、ドットブロットアッセイ、阻害または競合アッセイなど（例えば、米国特許第４，３７６，１１０号および同第４，４８６，５３０号、 Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory (1988) を参照のこと）を含むが、これらに限定されない、当技術分野において日常的に実施されているいくつかの免疫アッセイのうちのいずれか１つを用いて決定され得る。免疫アッセイはまた、免疫原に特異的に結合する抗体のクラスとアイソタイプを決定するために面空きアッセイを実行され得る。免疫原に特異的に結合し、免疫された対象における抗体特異的免疫応答を検出する免疫アッセイにおいて対照として使用され得る抗体（ポリクローナルおよび／またはモノクローナルまたはそれらの抗原結合断片）は一般に当業者に公知の様々な技法のいずれかにより調製され得る。例えば、Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)、 Peterson, ILAR J. 46:314-19 (2005)、 (Kohler et al., Nature, 256:495-97(1976)、 Kohler et al.,  Eur. J. Immunol. 6:511-19 (1975)、 Coligan et al.(eds.), Current Protocols in Immunology, 1:2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons1991)、 米国特許第４，９０２，６１４号、同第４，５４３，４３９号および同第４，４１１，９９３号、 Monoclonal Antibodies,Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett etal. (eds.) (1980)、 Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.),Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988) を参照のこと。例えば、 Brand et al., PlantaMed. 70:986-92 (2004)、 Pasqualini et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:257-59(2004) も参照のこと。免疫原またはその免疫原性断片または前記の免疫原もしくはその免疫原性断片を担持する細胞もしくは粒子は、ポリクローナル抗体かモノクローナル抗体のどちらかの産生のために動物を免疫することに使用され得る。
【０２２５】
サイトカインのレベルは、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、細胞内サイトカイン染色法およびフローサイトメトリー、およびそれらの組合せ（例えば、細胞内サイトカイン染色法とフローサイトメトリー）を含む、本明細書に記載され、当技術分野において実施されている方法に従って決定され得る。免疫応答の抗原特異的誘発または刺激の結果生じる免疫細胞増殖およびクローン増殖は、脾臓細胞またはリンパ節由来の細胞などのリンパ球の単離、抗原でのその細胞の刺激、および、例えば、トリチウム標識チミジンの取込またはＭＴＴアッセイなどの非放射性アッセイによるサイトカイン産生、細胞増殖および／または細胞生存の測定によって判定され得る。本明細書に記載される免疫原のＴｈ１免疫応答とＴｈ２免疫応答の間のバランスに対する影響は、例えば、ＩＦＮ‐γ、ＩＬ‐１２、ＩＬ‐２およびＴＮＦ‐βのようなＴｈ１サイトカインならびにＩＬ‐４、ＩＬ‐５、ＩＬ‐９、ＩＬ‐１０およびＩＬ‐１３のようなタイプ２サイトカインのレベルを決定することにより調査され得る。
【０２２６】
ＣＴＬ免疫応答のレベルおよびメモリーＣＤ４Ｔ細胞応答のレベルは、本明細書に記載され、当技術分野において日常的に実施されている多数の免疫学的方法のうちのいずれか１つによって決定され得る。ＣＴＬ免疫応答のレベルは、本明細書に記載される組成物、ベクターまたはベクター粒子のうちのいずれか１つの投与前に決定されてよく、その後、メモリーＣＤ４Ｔ細胞を補助する組成物、ベクターまたはベクター粒子のうちの１つ以上を投与した後の適切な時点でのＣＴＬ免疫応答のレベルとの比較のために使用され得る。ＣＴＬ活性を決定する細胞傷害性アッセイは、当技術分野において日常的に実施されているいくつかの技術および方法のうちのいずれか１つを用いて実行され得る（例えば、 Henkart et al., “Cytotoxic T-Lymphocytes” in FundamentalImmunology, Paul (ed.) (2003 Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia,PA), pages 1127-50, およびこれに引用される参照文献を参照のこと）。
【０２２７】
本明細書において使用されるとき、抗体が検出可能なレベルで、好ましくは約１０４Ｍ−１以上、または約１０５Ｍ−１以上、または約１０６Ｍ−１以上、または約１０７Ｍ−１以上、または１０８Ｍ−１以上の親和性定数、Ｋａで免疫原またはその免疫原性断片と反応する場合、結合パートナーまたは抗体が目的の抗原に「免疫特異的である」、「特異的である」または「特異的に結合する」と言われる。抗体のその同族の抗原に対する親和性は一般に解離定数ＫＤとも表現され、そして、抗体が１０−４Ｍ以下、または約１０−５Ｍ以下、または約１０−６Ｍ以下、または１０−７Ｍ以下、または１０−８Ｍ以下のＫＤで結合する場合、その抗体は目的の免疫原に特異的に結合する。
【０２２８】
結合パートナーまたは抗体の親和性は、例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄら (Ann.N.Y. Acad. Sci. USA 51:660 (1949)) によって記載されるものなど、従来の議場を用いて、および表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ；ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）により容易に決定することができる。表面プラズモン共鳴では、標的分子は固相上に固定化され、フローセルに沿って流れる移動相中の結合パートナー（またはリガンド）に曝される。固定化された標的へのリガンドの結合が起こる場合、局所的な屈折率が変化し、ＳＰＲ角度が変化することになるが、それは、反射光の強度の変化を検出することによりリアルタイムでモニターされ得る。ＳＰＲシグナルの変化速度が分析されて結合反応の結合期と解離期の見かけの速度定数をもたらすことができる。これらの値の比率が見かけの平衡定数（親和性）をもたらす（例えば、Wolff et al., Cancer Res. 53:2560-2565 (1993) を参照のこと）。
【０２２９】
生物試料は、免疫原を含む免疫原性組成物および免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを含む免疫原性組成物などの本明細書に記載される免疫原性組成物のうちのいずれか１つ以上を受容している対象、または、本明細書に記載される方法に従うアジュバントを含む１つ以上の組成物を含む、両方の免疫原性組成物を受容している対象において、免疫原および／またはそれぞれの指定抗原に対する免疫応答の存在とレベルを決定するために、その対象から得ることができる。本明細書において使用される「生物試料」は血液試料（それから血清または血漿が調製され得る）、生検試料、体液（例えば、肺洗浄液、腹水、粘膜洗浄液、滑液）、骨髄、リンパ節、組織外植片、器官培養物、または対象もしくは生物学的供給源由来の他の任意の組織もしくは細胞調製物であり得る。生物試料はまた、任意の免疫原性組成物を受容する前の対象から得てもよく、その生物試料はベースライン（すなわち、免疫前）データを構築するための対照として有用である。
【０２３０】
免疫応答を測定するための本明細書に記載される全ての免疫アッセイと方法について、当業者はまた、これらの方法を実施するときにどの対照が適切に含まれるか容易に認識および理解する。反応成分を相互作用させるのに十分な反応成分の濃度、緩衝液の種類、温度および時間は、本明細書に記載され、当業者が精通する方法に従って決定および／または調節され得る。
【０２３１】
免疫応答の誘導方法
１つ以上の抗原に対する適応性抗原特異的免疫応答を誘導するために少なくとも２つの異なる免疫原性組成物を投与することを含む方法が本明細書において提供される。本明細書に記載される免疫原性組成物を用いる対象の二重免疫により液性免疫応答と細胞性免疫応答（ＣＤ４Ｔ細胞応答およびＣＤ８Ｔ細胞応答を含む）が誘導される。その２つの免疫原性組成物は同時に、またはどちらかの順序で断続的に投与され得る。したがって、免疫応答のそれぞれが免疫原に特異的であり、したがって、それぞれの指定抗原に特異的である、ＣＤ４Ｔ細胞応答とＣＤ８Ｔ細胞応答（および、それは細胞傷害性Ｔ細胞応答を含み得る）を含む、液性免疫応答と細胞性応答の誘導方法が本明細書において提供される。これらの方法は、（単離された、および／または組換え産生された）少なくとも１つの免疫原を含む免疫原性組成物を投与すること、および免疫原をコードし、その発現を管理する組換え発現ベクターを含む第２の免疫原性組成物を投与することを含む。
【０２３２】
１つの実施形態では、指定抗原（便宜上、本明細書において第１指定抗原と呼ばれ得る）に対する特定の免疫応答を誘発することができる少なくとも１つの免疫原を含む免疫原性組成物を投与することによる、対象において１つ以上の指定抗原に特異的な免疫応答を誘導する方法が提供される。それらの方法は、免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを含む別の（すなわち、第２の異なる／異種性）免疫原性組成物を同時に投与すること、または断続的に投与すること（すなわち、前に、または、後に）をさらに含む。その組換え発現ベクターは、免疫原をコードするヌクレオチド配列に機能するように結合している少なくとも１つの調節性配列をさらに含み、したがって、その組換え発現ベクターは免疫原の発現を管理することができる。
【０２３３】
ある実施形態では、免疫応答を誘導するこれらの方法に従って投与される組換え発現ベクターはベクター粒子（例えば、ウイルスベクター粒子または細胞粒子）に組み込まれる。組換え発現ベクターまたはそのベクターを含むベクター粒子は、標的細胞にその粒子が導入（すなわち、送達）され得るように構築される。ある実施形態では、標的細胞は抗原提示細胞である。より特別な実施形態では、標的細胞は樹状細胞などのプロフェッショナル抗原提示細胞である。その後、免疫原（またはその断片）は標的細胞内で発現し、免疫原またはその断片が抗原提示細胞の表面に提示され、その免疫原に特異的な免疫応答を誘導し、したがって、それぞれの指定抗原に特異的な免疫応答を誘導する。
【０２３４】
少なくとも１つの免疫原（第１免疫原性組成物）を含む免疫原性組成物は、その免疫原性組成物を投与する、それを必要とする対象への投与にとって薬学的または生理学的に適切な少なくとも１つのアジュバントをさらに含むことができる。組換え発現ベクター（第２免疫原性組成物）を含む免疫原性組成物はアジュバントをさらに含むこともできる。第１組成物と第２組成物の両方がアジュバントを含む場合、そのアジュバントは同じでも異なっていてもよい。免疫原、それぞれの指定抗原、アジュバント、および組換え発現ベクターおよびベクター粒子は、本明細書において詳細に考察される。
【０２３５】
別の実施形態では、少なくとも１つの免疫原を含む（アジュバントをさらに含むことができる）免疫原性組成物が最初に投与され、続いて、少なくとも１つの免疫原を含む（アジュバントをさらに含むことができる）免疫原性組成物の投与と同時に、組換え発現ベクターを含む免疫原性組成物が投与される。言い換えると、少なくとも１つの免疫原を含む（アジュバントをさらに含むことができる）免疫原性組成物は第１または初回免疫であり、そして、組換え発現ベクターを含む免疫原性組成物も少なくとも１つの免疫原を含む（アジュバントをさらに含むことができる）免疫原性組成物の第２回投薬も追加免疫組成物として同時に投与される。
【０２３６】
他の実施形態では、少なくとも１つの免疫原を含む免疫原性組成物が少なくとも１つの追加の免疫原（または少なくとも第２免疫原）をさらに含む、免疫応答の誘導方法が提供される。本明細書に記載される方法の他の実施形態では、免疫原をコードし、第２免疫原性組成物に含まれる組換え発現ベクターも少なくとも１つの追加の免疫原をコードし、その発現を管理する。さらに別の実施形態では、少なくとも１つの免疫原を含む免疫原性組成物は少なくとも１つの追加の免疫原をさらに含み、そして、その他の（または第２）免疫原性組成物に含まれる組換え発現ベクターは少なくとも１つの追加の免疫原をコードし、その発現を管理する。第１および第２免疫原性組成物のそれぞれに含まれる免疫原同じでも異なっていてもよい。特定の実施形態では、第１組成物に含まれる少なくとも１つの追加の免疫原と第２免疫原性組成物に含まれる組換え発現ベクターがコードする少なくとも１つの追加の免疫原は同じである。本明細書において詳細に考察されるように、１つより多くの免疫原が免疫原性組成物に含まれる、または組換え発現ベクターにコードされるとき、それぞれの免疫原が同一または異なる指定抗原に対する特定の免疫応答を誘導し得る。
【０２３７】
したがって、１つの特別な実施形態では、少なくとも１つの免疫原を含む（アジュバントをさらに含むことができる）免疫原性組成物が少なくとも１つの追加の免疫原（すなわち、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、またはそれ以上の免疫原であり、それは２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上の免疫原と言い直すことができる））をさらに含む方法が提供される。ある実施形態では、少なくとも２つの免疫原（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上の免疫原）を含む免疫原性組成物は多価免疫原性組成物を形成する。２つ以上の免疫原がアジュバントと混合される例では、免疫原性組成物はアジュバントと別々に製剤されたそれぞれの免疫原を含むことができ、その後、アジュバント化した免疫原を混合して、対象に投与される免疫原性組成物を形成する。あるいは、２つ以上の免疫原をアジュバントと混合して一緒に製剤し、免疫原性組成物を形成することができる。ある特別な実施形態では、それぞれの追加の免疫原（例えば、第２、第３、第４、第５、第６免疫原など）のうちの１つ以上が第１免疫原と同じ指定抗原に対して免疫応答を誘導し得る。他の特別な実施形態では、それぞれの追加の免疫原（例えば、第２、第３、第４、第５免疫原など）がそれぞれ異なる指定抗原（例えば、第２、第３、第４、第５、第６指定抗原など）に特異的な免疫応答を誘導し得る。
【０２３８】
上記のように、ある実施形態では、免疫原性組成物中の組換え発現ベクターが多シストロン性であり、少なくとも１つの追加の免疫原（すなわち、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、またはそれ以上の免疫原であり、それは２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上の免疫原と言い直すことができる））をコードするヌクレオチド配列を含み得る方法が提供される。組換え発現ベクターは、それぞれの免疫原をコードするそれぞれのヌクレオチド配列とインフレームで全ての適切な調節性配列を含むように構築され、その結果、その組換え発現ベクターが導入される細胞でそれぞれの免疫原が発現する。ある特別な実施形態では、それぞれの追加の免疫原（例えば、第２、第３、第４、第５、第６免疫原など）のうちの１つ以上が第１免疫原と同じ指定抗原に対する免疫応答を誘導し得る。他の特別な実施形態では、追加の免疫原（例えば、第２、第３、第４、第５、第６免疫原など）のうちのそれぞれがそれぞれ異なる指定抗原（例えば、第２、第３、第４、第５、第６指定抗原など）に特異的な免疫応答を誘導し得る。
【０２３９】
他の特定の実施形態では、第１免疫原性組成物が少なくとも１つの単離／組換え免疫原（便宜上、第１免疫原と呼ぶ）を含み、少なくとも１つの追加単離／組換え免疫原をさらに含むことができる、免疫応答の誘導方法が提供される。他の実施形態では、その方法は、第１免疫原をコードし、少なくとも１つの追加の免疫原をコードする組換え発現ベクターを含む第２免疫原性組成物を投与することを含む。特別な実施形態では、第１免疫原性組成物は少なくとも２つの単離／組換え免疫原を含み、第２免疫原性組成物は少なくとも２つの免疫原をコードするヌクレオチド配列を含有する組換え発現ベクターを含む。
【０２４０】
２つ以上の免疫原が単離／組換え免疫原を含む免疫原性組成物に含まれるとき、および／または組換え発現ベクターに存在するポリヌクレオチド配列によってコードされるとき、それぞれの免疫原は、目的の指定抗原の２つの異なる免疫原性領域またはエピトープを含むアミノ酸配列を含むことができる。少なくとも１つの免疫原は少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含むことができ、または、Ｔ細胞エピトープを含むことができ、または、Ｂ細胞エピトープとＴ細胞エピトープの両方を含むアミノ酸配列を含むことができる。第２の異なる免疫原は異なるＢ細胞および／またはＴ細胞エピトープに対応するアミノ酸配列を含むことができる。２つ以上の免疫原が免疫原性組成物含まれるとき（または組換え発現ベクターにコードされるとき）、少なくとも１つの免疫原は少なくとも１つのＴ細胞エピトープ領域を含む。より特別な実施形態では、少なくとも１つのＴ細胞エピトープ領域は免疫原およびそれぞれの指定抗原に対してＣＤ８Ｔ細胞特異的な免疫応答を誘導することができる。
【０２４１】
ある実施形態では、２つ以上の免疫原に特異的な免疫応答の誘導が望ましいとき、少なくとも１つの免疫原は少なくとも特定の液性および／またはＣＤ４Ｔ細胞応答を含む免疫応答を誘導することができ、そして、少なくとも１つの追加の免疫原は少なくとも特定のＣＤ８Ｔ細胞免疫応答を含む免疫応答を誘導することができる。したがって、１つの実施形態では、それを必要とする対象に（ａ）第１単離／組換え免疫原（その組成物はアジュバントをさらに含むことができる）を含む免疫原性組成物（第１免疫原性組成物と呼ばれ得る）および（ｂ）第１免疫原と第２免疫原をコードし、それらの発現を管理する組換え発現ベクターを含む第２免疫原性組成物であって、少なくとも第２免疫原が特定のＣＤ８Ｔ細胞応答を誘導することができる第２免疫原組成物を投与することを含む方法が本明細書において提供される。ある実施形態では、少なくとも２つの免疫原のそれぞれが同じ指定抗原に対する免疫応答を誘導する能力を有する。あるいは、少なくとも２つの免疫原のそれぞれが異なる指定抗原（便宜上、それぞれ第１および第２指定抗原などとも呼ばれる）に特異的な免疫応答を誘導する能力を有する。
【０２４２】
本明細書に記載される方法の特別な実施形態では、２つの異なる免疫原性組成物がそれらを必要とする対象に断続的に投与される。１つの特別な実施形態では、その方法は、組換え発現ベクターを含む免疫原性組成物の投与前に、少なくとも１つの単離／組換え免疫原を含む（アジュバントをさらに含むことができる）免疫原性組成物を投与することを含む。言い換えると、ある実施形態では、前記方法は、単離／組換え免疫原を含む免疫原性組成物（その組成物はアジュバントをさらに含むことができる）の投与に続いて（すなわち、その後に）、組換え発現ベクターを含む免疫原性組成物を投与することを含む。
【０２４３】
他の実施形態では、組換え発現ベクターを含む免疫原性組成物は、単離／組換え免疫原を含む免疫原性組成物（その組成物はアジュバントをさらに含むことができる）の前に投与される。言い換えると、ある実施形態では、その方法は、組換え発現ベクターを含む免疫原性組成物の投与に続いて（すなわち、その後に）、少なくとも１つの免疫原を含む免疫原性組成物（アジュバントをさらに含むことができる）を投与することを含む。
【０２４４】
多種多様な免疫投与計画を用いることにより、本明細書に記載される二重免疫方法と免疫原性組成物を用いる免疫応答の誘導が達成され得る。図６に、免疫投与計画の代表的で、非網羅的なリストが提示されている。適応性抗原特異的免疫応答の誘導方法のこれらの、および追加の実施形態は以下および本明細書においてより詳細に説明される。
【０２４５】
特別な実施形態では、方法は、対象に１回よりも多く、単離／組換え免疫原を含む免疫原性組成物（説明しやすくするために、第１免疫原性組成物と呼ぶ）および／または組換え発現ベクターを含む免疫原性組成物（説明しやすくするために、第２免疫原性組成物と呼ぶ）を投与することを含む。特定の実施形態では、免疫原を含む免疫原性組成物（アジュバントをさらに含むことができる）は対象に少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、またはそれ以上の回数（例えば、２度（２回）、３回、４回、５回、またはそれ以上）投与される。言い換えると、複数用量（すなわち、２、３、４、５、６、またはそれ以上の用量）の第１免疫原性組成物が対象に投与される。第１免疫原性組成物が複数回（すなわち、２度（２回）、３回、４回、５回、またはそれ以上）投与されるとき、各回の第１免疫原性組成物の投与は断続的であってよく、そして、それぞれ全ての回で第２組成物の投与の前に第１組成物の投与がある。他の特定の実施形態では、第１組成物の１回の投薬の後、および第１組成物の次の投薬の前に第２組成物が投与される。例として、第１組成物が対象に２回投与されるとき、第１免疫原性組成物の第１投与（すなわち、第１投薬）後、およびその免疫原性組成物の第２投与（すなわち、第２投薬）前に第２組成物が投与され得る。別の特別な実施形態では、例えば、第１免疫原性組成物が３回投与されるとき（すなわち、３用量が投与される）、第１免疫原性組成物の第１投薬後および第２投薬前、第２投薬後および第３投薬前、または３回全ての投薬の後に第２組成物が投与され得る。さらに別の特別な実施形態では、例えば、第１免疫原性組成物が４回投与されるとき（すなわち、４用量が投与される）、第１免疫原性組成物の第１投薬後および第２投薬前、第２投薬後および第３投薬前、第３投薬後および第４投薬前、または４回全ての投薬の後に第２組成物が投与され得る。当業者は、５用量以上の第１免疫原性組成物が投与されるとき、複数回の第１免疫原性組成物の投薬のうちのいずれか１回の後に、または第１免疫原性組成物の全ての回の投薬の実施の後に第２組成物が投与され得ることを容易に理解する。別の実施形態では、第２免疫原性組成物が一度投与され、そして、第１免疫原性組成物の全て回の投与の前に投与される。
【０２４６】
さらに別の実施形態では、第１免疫原性組成物が複数回（すなわち、２回以上）投与されるとき、１回の第１免疫原性組成物の投薬は第２免疫原性組成物の投与と同時に投与され得る。例として、投与計画が２回の第１免疫原性組成物の投薬を実施することを含むとき、第２免疫原性組成物の同時投与と第１免疫原性組成物の第２投薬の前に第１投薬が実施され得る。追加例として、投与計画が３回以上の第１免疫原性組成物の投薬を実施することを含むとき、特定の投与計画に従って投与されることが企図されている第１免疫原性組成物の総投薬数に応じて、３回のうちの少なくとも１回の投薬が第２免疫原性組成物の投与と同時に実施され、そして、その他の回の第１免疫原性組成物の投薬が両方の組成物の同時投与前、両方の組成物の同時投与後に実施され得、または両方の組成物の同時投与前に１回以上の投薬が実施され得、そして、両方の組成物の同時投与の後に残りの回数の第１免疫原性組成物の投薬が実施され得る。
【０２４７】
ある特定の実施形態では、第１免疫原性組成物の投与が２回実施され、そして、（ａ）第１免疫原性組成物の第１投与後および第１免疫原性組成物の第２投与前、（ｂ）第１免疫原性組成物の第２投与後、（ｃ）第１免疫原性組成物の第１投与前、または（ｄ）第１免疫原性組成物の第１もしくは第２投与と同時に第２免疫原性組成物が投与される。別の特定の実施形態では、第１免疫原性組成物が３回投与され、そして、（ａ）第１免疫原性組成物の第１投与後および第１免疫原性組成物の第２投与前、（ｂ）第１免疫原性組成物の第２投与後および第１組成物の第３投与前、（ｃ）第１免疫原性組成物の第３投与後、（ｄ）第１免疫原性組成物の第１投与前、または（ｅ）第１免疫原性組成物の第１、第２もしくは第３投与と同時に第２免疫原性組成物が投与される。さらに別の特定の実施形態では、第１免疫原性組成物が４回投与され、そして、（ａ）第１免疫原性組成物の第１投与後および第１免疫原性組成物の第２投与前、（ｂ）第１免疫原性組成物の第２投与後および第１組成物の第３投与前、（ｃ）第１免疫原性組成物の第３投与後および第１組成物の第４投与前、（ｄ）第１免疫原性組成物の第４投与後、（ｅ）第１免疫原性組成物の第１投与前、または（ｆ）第１免疫原性組成物の第１、第２、第３もしくは第４投与と同時に第２免疫原性組成物が投与される。
【０２４８】
さらに他の特別な実施形態では、第２組成物（すなわち、少なくとも１つの免疫原をコードする組換え発現ベクターを含む免疫原性組成物）が２回投与され、そして、第１免疫原性組成物（すなわち、少なくとも１つの単離／組換え免疫原を含み、アジュバントをさらに含むことができる免疫原性組成物）が１回、２回、３回、４回、５回またはそれ以上投与される方法が提供される。第２組成物のその２回の投与（すなわち、２投薬）のそれぞれと第１免疫原性組成物の各投与（すなわち、第１投薬、第２投薬、第３投薬、第４投薬または第５投薬）は任意の順序で断続的に投与され得る。他の特定の実施形態では、第２免疫原性組成物の投薬のうちの少なくとも１回は第１免疫原性組成物の投薬と同時に実施される。
【０２４９】
本明細書に記載されるように、他の実施形態では、単離／組換え免疫原を含む免疫原性組成物（その組成物はアジュバントをさらに含むことができる）と免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを含む免疫原性組成物は少なくとも１回同時投与され得る。１つのそのような実施形態では、（１）免疫原を含み（その組成物はアジュバントをさらに含むことができる）、任意の順序で断続的に投与する免疫原性組成物の投与、（２）免疫原をコードする組換え発現ベクターを含む免疫原性組成物と同時に免疫原を含む免疫原性組成物の第２投薬を含む方法が本明細書において提供される。１つの特定の実施形態では、免疫原を含む免疫原性組成物は、組換え発現ベクターを含む免疫原性組成物と免疫原を含む免疫原性組成物（すなわち、免疫原を含む免疫原性組成物の第２投薬）の同時投与前に投与される。別の特別な実施形態では、免疫原を含む免疫原性組成物は、免疫原を含む免疫原性組成物との組換え発現ベクターを含む免疫原性組成物の同時投与後に投与される。さらにより特定の実施形態では、組換え／単離免疫原を含む免疫原性組成物（すなわち、第１免疫原性組成物）の各投薬は免疫原をコードする組換え発現ベクターを含む免疫原性組成物（すなわち、第２免疫原性組成物）の投薬と同時に実施される。より具体的には、第１免疫原性組成物の第１投薬が第２免疫原性組成物の第１投薬（初回免疫とも呼ばれる）と同時に実施され、その後、第１免疫原の第２投薬と第２免疫原性組成物の第２投薬（追加免疫とも呼ばれる）が同時に実施される方法が本明細書において提供される。ある実施形態では、対象は第１および第２免疫原性組成物の同時投与により３回目の免疫を受けてもよい。初回免疫と追加免疫の間の時間は本明細書においてより詳細に考察され、そして、前臨床試験および／または臨床試験の結果に基づき選択される。
【０２５０】
免疫原性組成物の断続的投与を含む、本明細書に記載される方法に関して、投薬の時間間隔は臨床治験を実施する当業者によって容易に決定され得る。ヒト対象への投与計画はまた、前臨床試験の結果および当技術分野における知識により情報を与えられ得る。ある実施形態では、免疫原性組成物の投薬の実施の時間間隔は少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日もしくは７日、もしくは１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間または８週間であり得、または少なくとも１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月もしくは１１か月、もしくは少なくとも１年、２年、３年もしくは４年であり得る。実例として、組換え発現ベクターを含む免疫原性組成物（考察しやすくするために、第２免疫原性組成物と呼ぶ）が免疫原を含む免疫原性組成物（考察しやすくするために、第１免疫原性組成物と呼ぶ）の少なくとも１回の投薬の後に投与されるとき、第２免疫原性組成物は、本明細書に記載される時間間隔または適切な前臨床試験および臨床試験により決定され得る時間間隔のうちのいずれか１つの時間間隔で第１免疫原性組成物の少なくとも１回の投薬の実施の後に投与される。ある実施形態では、対象は３回目、４回目または５回目に免疫原性組成物のうちの１つ以上と共に免疫され得る。３回目の免疫と２回目の免疫の間の時間は、第１免疫原性組成物と第２免疫原性組成物の投与の間の時間と同じでも異なっていてもよく、または、その間の時間は異なっていてよい。同一または異なる免疫原性組成物の投与の間の、本明細書に記載されるような時間間隔は、本明細書に記載される投与計画のいずれか（例えば、図６に例示される計画を含む）に関係する。
【０２５１】
上記の方法に従って、本明細書に記載される免疫原性組成物を投与することにより誘導される免疫応答は、それぞれの免疫原性組成物中に存在するそれぞれの免疫原に特異的であり、したがって、それぞれの免疫原に対応する指定抗原に特異的な液性応答および細胞性応答（ＣＤ４免疫応答およびＣＤ８免疫応答を含む）を包含する免疫応答を含む。単離／組換え免疫原を含む免疫原性組成物（その組成物はアジュバントをさらに含むことができる）、および免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを含む免疫原性組成物が断続的に投与されるとき、少なくとも最初に投与される組成物または複数の組成物（プライミング組成物と呼ぶこともできる）は免疫原およびそれぞれの指定抗原に特異的なＣＤ４Ｔ細胞応答を含む免疫応答を誘導することができる。プライミング組成物によって誘導される免疫応答は免疫原およびそれぞれの指定抗原に特異的な抗体応答を含むこともできる。２番目に投与される免疫原性組成物（追加免疫組成物と呼ぶこともできる）は、免疫原および指定抗原に特異的なＣＤ８Ｔ細胞応答を含む免疫応答を誘導する。追加免疫組成物の投与は抗原特異的抗体応答および／またはＣＤ４Ｔ細胞特異的な免疫応答を誘導または追加増幅することもできる。ある特別な実施形態では、および、本明細書に記載されるように、免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを含む免疫原性組成物の投与は、免疫原およびそれぞれの指定抗原に特異的なＣＤ８Ｔ細胞免疫応答を誘導することを少なくとも含む免疫応答を誘導することができる。
【０２５２】
本明細書に記載される免疫原性組成物の第１投与（すなわち、第１投薬）によって誘導される免疫応答は、その免疫原にそれぞれ特異的な液性免疫応答およびＣＤ４Ｔ細胞免疫応答を含むことができる。第１投薬は、単離／組換え免疫原を含む免疫原性組成物（アジュバントをさらに含むことができる）もしくは免疫原をコードし、その発現を管理する組換え発現ベクターを含む免疫原性組成物を投与することを含んでよく、または、第１投薬は前述の免疫原性組成物のそれぞれの同時投与を含んでよい。第２免疫（すなわち、追加免疫）はこれらの免疫原性組成物のうちの１つ以上の投与を含み、特定のＣＤ８Ｔ細胞免疫応答を含む免疫応答を誘導することができる。
【０２５３】
特定の実施形態では、少なくとも１つの単離／組換え免疫原を含む（およびアジュバントをさらに含むことができる）免疫原性組成物（第１免疫原性組成物とも呼ばれる）は、免疫原に特異的であり、したがって、それぞれの指定抗原に特異的なＣＤ４Ｔ細胞応答を含む免疫応答を誘導することができ、そして、その免疫応答はその免疫原に対する液性応答（すなわち、特異的な抗体応答または抗原特異的抗体応答）を誘導することを含むこともできる。免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを含むその他の免疫原性組成物（または第２免疫原性組成物）は免疫原に特異的であるＣＤ８Ｔ細胞応答を少なくとも誘導することができ、したがって、指定抗原に特異的なＣＤ８Ｔ細胞応答を誘導することができる。
【０２５４】
したがって、少なくとも１つの単離／組換え免疫原を含む免疫原性組成物（その組成物はアジュバントをさらに含むことができる）を、それを必要とする対象に投与すること、ならびに免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを含む免疫原性組成物を断続的および／または同時に投与することを含む、細胞傷害性Ｔ細胞応答（ＣＴＬ）の誘導方法が提供される。これらの方法は、複数の投与計画を含む、２つの免疫原性組成物の本明細書に記載される投与ステップのうちのいずれかに従って実行され得る。ＣＴＬ応答は、免疫原および／またはそれぞれの指定抗原を担持または提示する細胞または粒子に特異的である。ある特定の実施形態では、および、例として、免疫原が腫瘍関連抗原であるとき、ＣＴＬ応答は、免疫原および／または指定抗原を発現する腫瘍細胞に特異的である。免疫原および／または指定抗原は腫瘍細胞表面上に提示され得、したがって、細胞傷害性Ｔ細胞に到達可能である。本明細書において詳細に記載される方法および組成物は、したがって、腫瘍関連抗原を担持または発現する複数の腫瘍細胞を含む腫瘍の発生または再発の可能性を低下させるのに有用である。
【０２５５】
他の特定の実施形態では、免疫原および指定抗原は、ウイルス、細菌、寄生生物、または真菌などの感染症微生物に由来する場合があり、そして、ＣＴＬ免疫応答は、それぞれ免疫原および／または指定抗原を発現または担持するウイルス、細菌、寄生生物、または真菌に特異的である。したがって、本明細書に記載される方法は、それぞれの感染症生物が原因の感染症の予防または治療に有用である。
【０２５６】
また、本明細書に記載されるように、ある実施形態では、ＣＴＬ応答を誘導するこれらの方法は、多シストロン性であり、少なくとも１つの追加の免疫原（すなわち、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、またはそれ以上の免疫原であり、それは２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上の免疫原と言い直すことができる））をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを投与することを含むことができる。ある特別な実施形態では、追加の免疫原（例えば、第２、第３、第４、第５、第６免疫原など）のそれぞれが発現すると、それぞれが第１免疫原と同じ指定抗原に対して免疫応答を誘導し得る。他の特別な実施形態では、追加の免疫原（例えば、第２、第３、第４、第５、第６免疫原など）のそれぞれは異なる指定抗原（例えば、第２、第３、第４、第５、第６指定抗原など）にそれぞれ特異的な免疫応答を誘導し得る。他のある特定の実施形態では、少なくとも１つの単離／組換え免疫原を含む免疫原性組成物は、少なくとも２つの単離／組換え免疫原（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上の免疫原）を含んで多価免疫原性組成物を形成することができる。２つ以上の免疫原がアジュバントと混合される例では、免疫原性組成物はアジュバントと別々に製剤されたそれぞれの免疫原を含むことができ、その後、アジュバント化した免疫原を混合して、対象に投与される免疫原性組成物を形成する。あるいは、２つ以上の免疫原をアジュバントと混合して一緒に製剤し、免疫原性組成物を形成することができる。ある特別な実施形態では、それぞれの追加の免疫原（例えば、第２、第３、第４、第５、第６免疫原など）は第１免疫原と同じ指定抗原に対して免疫応答を誘導し得る。他の特別な実施形態では、それぞれの追加の免疫原（例えば、第２、第３、第４、第５免疫原など）はそれぞれ異なる指定抗原（例えば、第２、第３、第４、第５、第６指定抗原）に特異的な免疫応答を誘導することができる。
【０２５７】
本明細書に記載される方法および使用法の実施に関するより特別な実施形態では、アジュバント、例えば、無毒性リピドＡ関連アジュバントは免疫原と共に製剤され得る。他の特別な実施形態では、無毒性リピドＡ関連アジュバントなどのアジュバントは、免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを含む免疫原性組成物と組み合わせて投与され得る。なお一層特別な実施形態では、無毒性リピドＡ関連アジュバントはＧＬＡである。さらにより特別な実施形態では、ＧＬＡはＳＥと製剤されて、本明細書に記載される方法および組成物で使用される安定な水中油型乳液（ＧＬＡ／ＳＥ）を形成する。
【０２５８】
アジュバントが少なくとも１つの単離／組換え免疫原を含む免疫原性組成物に含まれるとき、そのアジュバントと免疫原は通常対象への投与前に組み合わせられる（すなわち、一緒に製剤される、混合される）。別の実施形態では、少なくとも１つの免疫原とアジュバントを含む免疫原性組成物は別々に、だが同時に対象に投与され得る。免疫原を含む免疫原性組成物とアジュバントが別々および同時に投与されるとき、免疫原性組成物とアジュバントのそれぞれが同一の経路を介して同じ部位に投与され得、または異なる経路を介して同じ部位に投与され得、または同一もしくは異なる投与経路により対象の異なる部位に投与され得る。ある実施形態では、アジュバントはＧＬＡ／ＳＥなどの無毒性リピドＡ関連アジュバントである。
【０２５９】
アジュバントが組換え発現ベクターを含む免疫原性組成物に含まれるとき、そのアジュバントは組換え発現ベクター（または組換え発現ベクターを含むベクター粒子）と組み合わされて（すなわち、一緒に製剤されて、混合されて）免疫原性組成物を形成することができる。他の実施形態では、組換え発現ベクターを含む免疫原性組成物（または組換え発現ベクターを含むベクター粒子）は別々の組成物であり、それらは同一の経路を介して同じ部位に投与され得、または異なる経路を介して同じ部位に投与され得、または同一もしくは異なる投与経路により対象の異なる部位に投与され得る。ある実施形態では、アジュバントはＧＬＡ／ＳＥなどの無毒性リピドＡ関連アジュバントである。
【０２６０】
別の特別な実施形態では、特定の免疫応答を誘導するための本明細書に記載される免疫方法は、アジュバントＧＬＡ／ＳＥおよび指定抗原に特異的な免疫応答を誘導することができる免疫原を含む免疫原性組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。本明細書に記載されるように、ＧＬＡはＴＬＲ４を標的とする。ＴＬＲ４は、下流シグナル伝達がＭｙＤ８８依存的経路とＴＲＩＦ依存的経路の両方を介して生じるという点でＴＬＲファミリーの中でも独特である。まとめると、これらの経路はＤＣ成熟、抗原プロセッシング／提示、Ｔ細胞プライミング、およびサイトカイン（例えば、ＩＬ‐１２、ＩＦＮα／β、およびＴＮＦα）の産生を刺激する（例えば、 Iwasaki et al., Nat. Immunol. 5:987 (2004) を参照のこと)。  
【０２６１】
ある実施形態では、本明細書に記載されるように、組換え発現ベクターはベクター粒子に組み込まれ、そして、本明細書に記載される方法は、免疫原をコードし、その発現を管理する組換え発現ベクターを含むベクター粒子を含む免疫原性組成物を投与することを含む。より特別な実施形態では、ベクター粒子はレンチウイルス性ベクター粒子などのウイルスベクター粒子である。本明細書に記載されるように、そのレンチウイルス性ベクター粒子は、樹状細胞（ＤＣ）に選択的に進入するために修飾型シンドビスウイルスエンベロープ糖タンパク質を用いる自己不活化、非挿入型レンチベクターであるＤＣ‐ＮＩＬＶであり得る。ＤＣにベクターが進入すると、ベクターがコードする免疫原の能動的転写と翻訳を介して産生された抗原性ペプチドがＭＨＣクラスＩ提示経路に導入される。任意の特定の理論に縛られることを望むものではないが、ＤＣ‐ＮＩＬＶの使用が堅固なＣＤ８Ｔ細胞応答を引き起こす。
【０２６２】
１つの実施形態では、組換え発現ベクターを含む免疫原性組成物または組換え発現ベクターを含むベクター粒子は対象に直接的に投与される。他の特別な実施形態では、標的細胞は、免疫原性組成物を投与する対象から単離され、ベクター粒子が生体外で標的細胞に導入され得る。その後、そのベクター粒子を含む標的化細胞が対象に導入される。
【０２６３】
なお一層特別な実施形態では、二重免疫方法は、アジュバントＧＬＡ／ＳＥと組み合わされている目的の組換え／単離免疫原を含む免疫原性組成物を投与することを含む。その方法は、免疫原をコードし、発現するＤＣ‐ＮＩＬＶを含む第２免疫原性組成物を投与することをさらに含む。これらの免疫原性組成物を使用するための代表的だが非網羅的な免疫投与計画が下の表１に示されている。
【表１】
0006054942.tif 000003
【０２６４】
本明細書に記載される方法は、免疫原およびそのそれぞれの指定抗原のうちのいずれか１つに特異的な免疫応答の誘導に有用である。本明細書においてより詳細に記載されるように、目的の指定抗原は腫瘍関連抗原または感染性微生物（例えば、ウイルス、細菌、真菌、または寄生生物）由来の抗原であり得る。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法は、腎臓細胞癌抗原、前立腺癌抗原、中皮腫抗原、膵臓癌抗原、黒色腫抗原、乳癌抗原、肺癌抗原および卵巣癌抗原を含むが、これらに限定されない腫瘍関連抗原に特異的な免疫応答の誘導に有用である。より特定の実施形態では、目的の指定抗原は前立腺癌抗原、例えば、前立腺酸性ホスファターゼ、前立腺特異的抗原、ＮＫＸ３．１、または前立腺特異的膜抗原である。
【０２６５】
別の特別な実施形態では、ＨＩＶ、ＣＭＶ、肝炎ウイルス、ＥＢＶ、ＲＳＶ、ＶＳＶ、インフルエンザまたはＨＳＶ‐２などのウイルス、または本明細書もしくは当技術分野において記載される他の任意の感染性ウイルスに対して対象を免疫するための組成物および方法が提供される。したがって、本明細書に記載される方法はウイルス抗原に特異的な免疫応答の誘導に使用され得る。より特別な実施形態では、目的の指定抗原はｇＤおよびＵＬ１９などのＨＳＶ‐２タンパク質である。
【０２６６】
本明細書において提供される二重免疫方法は、少なくとも１つの目的の指定抗原を担持または発現する細胞、粒子または微生物に対する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答の誘導のために使用され得る。特定の実施形態では、少なくとも１つの目的の指定抗原を発現する腫瘍細胞に対するＣＴＬ応答の誘導方法が本明細書において提供される。特定の実施形態では、指定抗原（または、その単数の部分もしくは複数の部分）が腫瘍細胞の細胞外表面上に存在し、細胞外環境に向かって露出する。本明細書に記載される方法は、目的の指定抗原である腫瘍関連抗原を担持、発現または分泌する（複数の腫瘍細胞を含む）腫瘍の発生または再発の可能性を低下させるのに（すなわち、発生または再発の可能性を統計学的、臨床的または生物学的に有意な方式で低下させるのに）有用である。
【０２６７】
他の特定の実施形態では、本明細書に記載される方法はウイルス、寄生生物、細菌、または真菌細胞などの微生物に対するＣＴＬ応答を誘導する。指定抗原は、微生物によって通常分泌される微生物抗原であり得、または微生物の細胞表面上に提示され、それによって、露出され、対象の免疫システムの分子および細胞による認識とそれらとの相互作用に利用可能である１つ以上の免疫原性領域を有する微生物抗原であり得る。したがって、対象の二重免疫を含む本明細書に記載される方法は、本明細書に記載される免疫原性組成物が対象に投与されない場合に悪化または発生するだろう微生物の感染の治療および／または予防（すなわち、微生物の感染の発生の可能性を統計学的、臨床的または生物学的に有意な方式で低下させること）に有用である。
【０２６８】
医療分野の当業者が理解するように、「治療する」および「治療」という用語は、対象（すなわち、ヒトまたは非ヒト動物であり得る患者、宿主）の疾患、障害または健康状態の医療管理を指す（例えば、 Stedman’s Medical Dictionaryを参照のこと）。一般に、適切な用量および治療計画は、治療利益および／または予防利益をもたらすのに十分な量の、本明細書において詳細に記載される免疫原および任意によりアジュバントを供与する。治療処置および／または予防方法もしくは防止方法の結果生じる治療利益および／または予防利益には、例えば、その目標が望ましくない生理的変化または障害の防止もしくは遅延化もしくは妨害（縮小化）である、またはそのような疾患もしくは障害の拡大もしくは重症度の防止もしくは遅延化もしくは妨害（縮小化）である臨床転帰の改善が含まれる。対象の治療による有益な、または望ましい臨床成果には、治療される疾患または障害から生じる、またはそれと関連する症状の減少、縮小または緩和、症状の発生の低下、生活の質の改善、より長い無疾患状態（すなわち、疾患の診断がなされる症状に基づく、対象が症状を示す可能性または傾向の減少）、疾患の程度の縮減、疾患状態の安定化（すなわち、非悪化）、疾患進行の遅延、疾患状態の改善または緩和、および（部分的または全体的の）検出可能または検出不可能の寛解、および／または全生存期間が含まれるが、これらに限定されない。「治療」は、対象が治療を受けなかった場合に予想される生存期間と比較した生存期間の延長を意味することもできる。本明細書に記載される方法および組成物を必要とする対象には疾患または障害を既に有しているもの、ならびに疾患または障害の発生を有しやすい、またはその危険性がある対象が含まれる。予防処置を必要とする対象には、疾患、健康状態または障害が防止される（すなわち、疾患または障害の発生または再発の可能性を低下させる）べき対象が含まれる。本明細書に記載される組成物（および、その組成物を含む調製物）および方法によりもたらされる臨床上の利益は、その組成物の投与が役立つことが企図されている対象でのインビトロアッセイ、前臨床試験および臨床試験の計画と実施によって評価され得る。適切な前臨床試験および臨床試験の計画と実施は適切な分野の当業者によって容易に実行され得る。
【０２６９】
単離／組換え免疫原、組換え発現ベクターおよび／またはベクター粒子は薬学的または生理学的に許容可能または適切な賦形剤または担体中で対象に投与され得る。薬学的に許容可能な賦形剤は生物学的に適合する媒体、例えば、本明細書においてより詳細に記載される、ヒトまたは、非ヒト哺乳類対象を含む他の非ヒト対象への投与に適切な生理食塩水である。
【０２７０】
組換え発現ベクターの投与に関して、治療上有効量は、治療を受けたヒトまたは非ヒト動物で医学的に望ましい結果（すなわち、十分な量の免疫原が発現して、統計的に、生物学的におよび／または有意な様式で免疫原に特異的な免疫応答（液性および／または細胞傷害性Ｔ細胞応答を含む細胞介在性応答）を誘導または増強する）をもたらすことができるポリヌクレオチドの量を与える。医療分野で周知のように、任意の１人の患者への投薬量は、患者の体格、体表面の面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与時間と投与経路、一般健康状態、および同時に投与されている他の薬品を含む多数の要因に左右される。用量は様々だが、組換え発現ベクターを含むベクター粒子の投与に好ましい用量は約１０６〜１０１２コピーのベクターポリヌクレオチド分子を提供するのに十分である。
【０２７１】
本明細書に記載される免疫原性組成物およびアジュバント組成物を含む医薬組成物は、医療分野の当業者によって決定されるように、治療（または予防）される疾患または健康状態に対して適切な方法で投与され得る。組成物の適切な用量と適切な投与期間および投与頻度は、患者の一般健康状態、患者の体格（すなわち、重量、質量、または体表面面積）、患者の疾患の種類と重症度、有効成分の特定の形状、および投与方法などの因子によって決定される。一般に、適切な用量および治療計画は、治療上の利益および／または予防上の利益（より頻繁な完全寛解もしくは部分寛解、またはより長い無疾患生存期間および／もしくは全生存期間、または症状の重症度の軽減などの臨床転帰の改善を含む、本明細書に記載されるような利益）をもたらすのに十分な量の組成物を供与する。予防上の使用について、用量は、疾患または障害に関連する疾患の発生を防止する、遅らせる、またはその重症度を減少させるのに十分であるべきである。本明細書に記載される方法に従って投与される免疫原性組成物の予防上の利益は（インビトロ動物試験およびインビボ動物試験を含む）前臨床試験および臨床試験を実行し、それらから得られたデータを、当業者が全て容易に実施することができる適切な統計的、生物学的および臨床的な方法および技術により分析して決定され得る。
【０２７２】
一般に、本明細書に記載され、用量で表される融合ポリペプチド、またはコードするポリヌクレオチドによってその場で産生され、用量で表される融合ポリペプチドを含む免疫原の量は宿主の体重１ｋｇ当たり約０．０１μｇから約１０００μｇの範囲にある。有効な治療を提供するのに十分な最小の投薬量の使用が通常好ましい。患者は一般に、治療または予防されている健康状態に適切な、当業者が精通しており、そして、本明細書に記載される検査法を用いて治療有効性または予防有効性についてモニターされ得る。液体の形状で投与されるとき、適切な用量のサイズは患者の体格によって変わるが、通常、１０〜６０ｋｇの対象に対して約１ｍｌから約５００ｍｌ（ｋｇ当たり約０．０１μｇから約１０００μｇまでを含む）までの範囲にある。最適な用量は一般に実験モデルおよび／または臨床治験を用いて決定され得る。最適な用量は対象の体質量、体表面面積、重量、または血液量に左右され得る。本明細書に記載されるように、適切な用量は患者の（例えば、ヒト）健康状態、すなわち、疾患ステージ、一般健康状態、ならびに年齢、性別および重量、および医療分野の当業者が精通する他の要因に左右される場合もある。
【０２７３】
医薬組成物は、例えば、局所投与、経口投与、腸内投与、経鼻（すなわち、鼻腔内）投与、吸入、髄腔内投与、経直腸投与、経膣投与、眼内投与、結膜下投与、舌下投与、皮内投与、結節内投与、腫瘍内投与、経皮投与、または、皮下、経皮、静脈内、筋肉内、胸骨内、空洞内、道管内、もしくは尿道内の注射もしくは点滴を含む非経口投与を含む任意の適切な投与方法のために製剤され得る。投与方法は本明細書においてより詳細に記載される。
【０２７４】
非経口投与について、担体は好ましくは水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ワックスまたは緩衝液を含む。経口投与について、上記の賦形剤またはマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカン、セルロース、カオリン、グリセリン、デンプンデキストリン、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、ブドウ糖、ショ糖および／もしくは炭酸マグネシウムなどの固形賦形剤もしくは担体のうちのいずれかを使用することができる。
【０２７５】
組換え／単離免疫原を含む免疫原性組成物および組換えベクターコンストラクトまたはベクター粒子を含む免疫原性組成物は、有効用量の免疫原を供与する任意の経路による送達のために製剤され得る。そのような投与方法には経口投与または注射による送達が含まれ、そして、液体の形状であり得る。液体医薬組成物には、例えば、以下のもののうちの１つ以上が含まれ得る：注射用水などの無菌希釈液、生理食塩水溶液、好ましくは生理食塩水、リンゲル溶液、塩化ナトリウム等張溶液、溶剤または懸濁媒体として働き得る不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の溶媒、抗菌材、抗酸化剤、キレート剤、緩衝液、および塩化ナトリウムまたはブドウ糖などの等張性調節用薬剤。非経口投与用調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射筒または複数回投与用バイアルに封入され得る。生理食塩水の使用が好まれ、そして、注射可能医薬組成物は好ましくは滅菌済みである。
【０２７６】
本明細書に記載される組換え発現ベクターなどの核酸分子を含む医薬組成物について、その核酸分子は、例えば、本明細書において提供されるベクター粒子および組換え発現コンストラクトなどの核酸、ならびに細菌性、ウイルス性および哺乳類発現システムを含む、当業者に公知の様々な送達システムのうちのいずれかの内部に存在し得る。ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）をそのような発現システムに組み込む技術は当業者に周知である。他の特定の実施形態では、組換え発現ベクターは、通常ＤＮＡであるが、例えば、 Ulmer et al., Science 259:1745-49 (1993) に記載され、Cohen, Science259:1691-92 (1993)により概説されるように「裸」であってもよい。裸ＤＮＡの取込は、そのＤＮＡを細胞に効率的に輸送される生物分解性ビーズに被覆することにより増加し得る。
【０２７７】
核酸分子は、当技術分野において記述されるいくつかの方法のうちのいずれか１つに従って細胞に送達され得る（例えば、 Akhtar et al., Trends Cell Bio. 2:139 (1992)、 Delivery Strategiesfor Antisense Oligonucleotide Therapeutics, ed. Akhtar, 1995, Maurer et al.,Mol. Membr. Biol. 16:129-40 (1999)、 Hofland and Huang, Handb. Exp. Pharmacol.137:165-92 (1999)、 Lee et al., ACS Symp. Ser. 752:184-92 (2000)、 米国特許第６，３９５，７１３号、国際特許出願公開第９４／０２５９５号）、Selbo et al., Int. J. Cancer 87:853-59 (2000)、 Selbo et al., Tumour Biol.23:103-12 (2002)、 米国特許出願公開第２００１／０００７６６６号および同第２００３／０７７８２９号を参照のこと）。当業者に公知のそのような送達方法には、リポソーム中でのカプセル化、イオントフォレーシスによる送達、または生物分解性重合体、ヒドロゲル、シクロデキストリン（例えば、Gonzalez et al., Bioconjug. Chem. 10:1068-74 (1999)、 Wang et al.,国際出願公開第０３／４７５１８号および国際公開第０３／４６１８５号を参照のこと）、ポリ（乳酸‐グリコール酸）共重合体（ＰＬＧＡ）およびＰＬＣＡミクロスフィア（ペプチドおよびポリペプチドおよび他の物質の送達にも有用）（例えば、米国特許第６，４４７，７９６号；米国特許出願公開第２００２／１３０４３０号を参照のこと）、生物分解性ナノカプセルおよび生体付着性ミクロスフィアなどの他の媒体への組み込みによる送達、またはタンパク質性ベクターによる送達（国際出願公開第００／５３７２２号）が含まれるが、これらに限定されない。別の実施形態では、核酸分子はまたポリエチレンイミン、およびポリエチレンイミン‐ポリエチレングリコール‐Ｎ‐アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ‐ＰＥＧ‐ＧＡＬ）誘導体またはポリエチレンイミン‐ポリエチレングリコール‐トリ‐Ｎ‐アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ‐ＰＥＧ‐トリＧＡＬ）誘導体（例えば、米国特許出願公開第２００３／００７７８２９号も参照のこと）などのその誘導体と製剤または複合体化され得る。
【０２７８】
本明細書に記載される方法の特定の実施形態では、対象はヒトまたは非ヒト動物である。本明細書に記載される治療を必要とする対象は本明細書に記載される疾患、障害もしくは健康状態の症状もしくは続発症を示す場合があり、または、疾患、障害もしくは健康状態を発生する危険性がある場合がある。治療され得る非ヒト動物には哺乳類動物、例えば、非ヒト霊長類動物（例えば、サル、チンパンジー、ゴリラなど）、げっ歯類動物（例えば、ラット、マウス、スナネズミ、ハムスター、フェレット、ウサギ）、ウサギ目動物、イノシシ属動物（例えば、ブタ、ミニチュアブタ）、ウマ、イヌ、ネコ、ウシ、ならびに他の家畜、農場の動物および動物園の動物が含まれる。
【０２７９】
本明細書において提供される組成物は様々な形態、例えば、固体、液体、粉末、水性形態、または凍結乾燥形態であり得る。ウイルス性ベクター粒子および細菌性ベクター粒子を含むベクター粒子、免疫原性組成物ならびに組換え発現ベクターの投与に適切な薬学的賦形剤および担体の例は当技術分野において公知である．そのような賦形剤、担体および／または添加物は従来法によって製剤することができ、適切な用量で対象に投与され得る。本明細書に記載される組成物に含まれ得る、脂質、ヌクレアーゼ阻害剤、重合体およびキレート剤などの安定化剤は体内での組成物および組成物の成分の分解からの保護を補助することができる。
【０２８０】
本明細書において提供される、ウイルス性ベクター粒子および細菌性ベクター粒子を含むベクター粒子、免疫原性組成物、アジュバント組成物ならびに組換え発現ベクターはキットとして包装され得る。キットは任意により取扱説明書、装置およびその他の試薬などの１つ以上の構成物、ならびに前記方法の実施のためのチューブ、容器および注射筒などの構成物を含むことができる。代表的なキットは任意により取扱説明書、対象においてベクター粒子、組換え発現ベクターまたは免疫原を検出するための装置、および対象に単数の組成物または複数の組成物を投与するための装置を含むことができる。
【０２８１】
免疫原をコードするポリヌクレオチドを含むキットもまた本明細書において企図されている。そのようなキットは、ウイルスパッケージングコンポーネントをコードする少なくとも１つのプラスミドおよびシンドビスウイルスＥ２糖タンパク質変異体をコードするベクターを含むこともできる。いくつかのキットは、ウイルスパッケージングコンポーネントをコードする少なくとも１つのプラスミド、シンドビスウイルスＥ２糖タンパク質変異体をコードするベクター、および少なくとも１つのＤＣ成熟因子をコードするベクターを含む。
【０２８２】
目的の配列をコードする（通常、抗原または免疫原をコードする）ウイルス性ベクターを含み、ＤＣ成熟因子をコードするポリヌクレオチド配列を任意により含むキットも本明細書において企図されている。いくつかのキットでは、キットは、ウイルスパッケージングコンポーネントをコードする少なくとも１つのプラスミドおよびシンドビスウイルスＥ２糖タンパク質変異体をコードするベクターを含む。
【０２８３】
キットは使用説明書を含んでいてもよい。使用説明書は通常、組成物を投与するための、対象の適正な状態、適正な投薬量および適正な投与方法の決定方法を含む、投与方法について説明する。使用説明書は、治療期間にわたり対象をモニターするための手引きを含むこともできる。
【０２８４】
本明細書において提供されるキットは、本明細書に記載される免疫原性組成物のそれぞれの対象への投与のための、および／またはアジュバント組成物の対象への投与のための装置を含むこともできる。薬品、免疫原性組成物およびワクチンの投与のための当技術分野において公知の様々な装置のいずれかが、本明細書において提供されるキットに含まれ得る。代表的な装置には皮下注射針、静脈内注射針、カテーテル、無針注射装置、吸入器、および点眼器などの液体分注器が含まれるが、これらに限定されない。通常、組成物の投与装置はそのキットの活性がある成分と適合する。例えば、高圧注射装置などの無針注射装置は、高圧注射によって損傷を受けないベクター粒子、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを有するキットに含まれ得るが、高圧注射によって損傷を受けるベクター粒子、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを有するキットには通常含まれない。
【０２８５】
代表的な実施形態
本開示のいくつかの実施形態では、投与を必要とする対象に複数の免疫原性組成物を投与する。種々の側面に応じて、以下のパラメータが変更される。パラメータとは、免疫原性組成物の投与回数、免疫原性組成物の投与経路、対象における免疫原性組成物の投与部位、免疫原性組成物の活性成分（複数可）の濃度または量、ならびに免疫原性組成物中の免疫原および／またはアジュバントの数である。
【０２８６】
詳細な説明に記載されている上記実施形態に加えて、下記およびその組み合わせを含む実施形態が企図されている。
【０２８７】
１．対象において免疫応答を誘発する方法であって、
（ａ）以下を含む第１免疫原性組成物：
（１）（ｉ）第１指定抗原、（ｉｉ）その免疫原性断片、または（ｉｉｉ）第１指定抗原に対して特異的な免疫応答を誘発する能力のあるその変異体、のいずれかを含む第１ポリペプチド、および
（２）ＴＬＲ４アゴニストアジュバントまたは無毒性リピドＡ関連アジュバント
の初回投与を対象に投与することと、
（ｂ）組換え発現ベクターを優先的に抗原提示細胞に送達するベクター粒子を含む第２免疫原性組成物の初回投与を対象に投与することと、を含む方法であって、当該組換え発現ベクターは、（ｉ）第１指定抗原、（ｉｉ）その免疫原性断片、または（ｉｉｉ）第１指定抗原に対して特異的な免疫応答を誘発する能力のあるその変異体、のいずれかを含む第２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、
各々の投与量は、第１指定抗原に対して特異的な免疫応答を誘発または亢進する上で効果的な量である、方法。
【０２８８】
実施形態１において、第１ポリペプチドは第２ポリペプチドと同一でも、異なっていてもよい。
【０２８９】
２．免疫原性断片のいずれは、第１指定抗原に対して特異的な免疫応答を誘発する能力を保持し、例えば、当該抗原の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４８、または５０個の隣接アミノ酸を含む、実施形態１。
【０２９０】
３．免疫原性変異体のいずれかは、例えば抗原の少なくとも１０個の隣接アミノ酸に渡って少なくとも９０％のアミノ酸同一性を保持するか、または抗原の少なくとも１５個の隣接アミノ酸に渡って少なくとも８５％のアミノ酸同一性を保持し得る、実施形態１。他の例は、抗原の少なくとも５０個の隣接アミノ酸に渡って、または抗原の少なくとも１００個の隣接アミノ酸に渡って、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％．９８％、もしくは９９％の同一性を含む。
【０２９１】
４．第１ポリペプチドは抗原の小さな免疫原性断片であり、すなわち約５０アミノ酸以下の長さの免疫原性断片であり、第２ポリペプチドは全長抗原またはその比較的大きな断片であり、すなわち約５０アミノ酸以上の長さの断片であり、随意に、全長抗原の少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有する、実施形態１。
【０２９２】
実施形態１において、第２免疫原性組成物は、第１免疫原性組成物の後、前、または第１免疫原性組成物と同時に投与してよい。
【０２９３】
５．ポリペプチド免疫原を含む第１免疫原性組成物を投与した後に、ベクター粒子を含む第２免疫原性組成物を投与する、上記のいずれかの実施形態。
【０２９４】
６．第１および第２免疫原性組成物の初回投与の後、（ａ）第３免疫原性組成物の投与、または（ｂ）第１免疫原性組成物の２回目の投与、または（ｃ）第２免疫原性組成物の２回目の投与をさらに含む、上記のいずれかの実施形態。
【０２９５】
７．（ａ）初回投与と２回目投与の間の間隔、および／または（ｂ）２回目投与と３回目投与の間の間隔は、前回の免疫の後の２〜４週間、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２６、もしくは２８日間、または最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、もしくは５２週間、または最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０年間である、上記のいずれかの実施形態。
【０２９６】
８．第１免疫原性組成物が（ａ）２回投与、（ｂ）３回投与、（ｃ）４回投与、または（ｄ）５回投与で投与される、上記のいずれかの実施形態。上記投与の任意の組み合わせが企図されており、例えば、（ａ）第１免疫原性組成物の各投与は、第２免疫原性組成物の投与より前に投与されるか；（ｂ）第１免疫原性の少なくとも１回の投与は、第２免疫原性組成物の投与の後に投与されるか；（ｃ）第１免疫原性組成物の少なくとも１回の投与は、第２免疫原性組成物の投与と同時に投与されるか；（ｄ）第１免疫組成物の少なくとも１回の投与は、第２免疫組成物の投与より前に投与され、第１免疫原性組成物の残りの投与の各々は、第２免疫原性組成物の投与の後に投与されるか；または（ｅ）第１組成物の各投与は、第２組成物と同時に投与される。
【０２９７】
（ａ）第１にポリペプチドを含む免疫原性組成物、および（ｂ）第２にウイルスベクター粒子を含む免疫組成物を含む投与計画の実施の結果、抗原特異的な強いＣＤ４＋Ｔ細胞応答、強い抗体応答、および抗原特異的な強いＣＤ８＋Ｔ細胞応答を含む、優れた免疫応答が得られた。この投与計画を、（ｃ）第３にポリペプチドを含む免疫原性組成物で続けることにより、さらに優れた結果が得られた。一次応答（すなわち、初回免疫の後に観察される応答）と二次応答（すなわち、追加免疫の後に観察される応答）の両方とも、最大応答（例えば、ピーク高さ）および後続のメモリー応答（例えば、ｘ軸は時間、ｙ軸は、細胞総数に対するＣＤ４Ｔ細胞数またはＣＤ８ Ｔ細胞数の％値）について測定することができる。例として、本開示によれば、二次応答（すなわち、追加免疫の実施後に観察される応答）は初回免疫応答よりも最大応答とメモリー応答の少なくとも一方が大きい。この場合、「〜より大きい」とは、初回免疫（一次応答）の後に得られる対応する応答より最小または最大で１０％または２０％または３０％または４０％または５０％大きいことを意味する。例として、２回目の免疫は、ＣＤ８およびＣＤ４応答を少なくとも２５％亢進する。
【０２９８】
９．第１免疫原性組成物は別の免疫原をさらに含み、この免疫原は、（ｉ）第２指定抗原、（ｉｉ）その免疫原性断片、または（ｉｉｉ）第２指定抗原に対して特異的な免疫応答を誘発する能力のあるその変異体、のいずれかを含むポリペプチドである、上記のいずれかの実施形態。
【０２９９】
１０．（第２免疫原性組成物の）組換え発現ベクターは、別の免疫原をコードする別のヌクレオチド配列をさらに含み、この免疫原は、（ｉ）第２指定抗原、（ｉｉ）その免疫原性断片、または（ｉｉｉ）第２指定抗原に対して特異的な免疫応答を誘発する能力のあるその変異体、のいずれかを含むポリペプチドである、上記のいずれかの実施形態。
【０３００】
１１．第１指定抗原と第２指定抗原は同一であっても異なっていてもよい、上記のいずれかの実施形態。これらの実施形態では、第１指定抗原と第２指定抗原の両方に対して免疫応答が発生し、この免疫応答は、抗原特異的な強いＣＤ４＋Ｔ細胞応答、強い抗体応答、および抗原特異的な強いＣＤ８＋Ｔ細胞応答を含む。さらなる例として、第３指定抗原、あるいは第４または第５指定抗原に対する免疫応答を誘発するためのポリペプチドおよびウイルスベクターを含む免疫原性組成物を投与してよい。
【０３０１】
１２．（第１、第２、第３、第４、および／または第５の）抗原は、（ａ）腫瘍関連抗原であるか、または（ｂ）ウイルス、細菌、真菌、および寄生虫から選ばれる感染性微生物に由来する、上記のいずれかの実施形態。様々な例において、腫瘍関連抗原は、腎細胞癌抗原、前立腺癌抗原、中皮腫抗原、膵癌抗原、メラノーマ抗原、乳癌抗原、肺癌抗原、または卵巣癌抗原であり；随意に、前立腺癌抗原は、前立腺酸性ホスファターゼ、前立腺特異的抗原、ＮＫＸ３．１、または前立腺特異的膜抗原である。様々な例において、抗原はウイルス抗原であり、随意に単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ‐２）に由来する。抗原は、本明細書に記載の抗原のいずれであってもよい。
【０３０２】
１３．第１指定抗原と第２指定抗原は、例えば、同一の腫瘍または同一のウイルスもしくは他の微生物に由来する、互いに異なる抗原であってよい。あるいは、第１指定抗原と第２指定抗原は、異なる癌または異なるウイルスもしくは微生物に由来していてもよい。
【０３０３】
１４．第１免疫原性組成物のポリペプチドが、対象の体重１ｋｇあたり約０．０１μｇ〜約１０００μｇの範囲で含まれ得る、上記のいずれかの実施形態。様々な実施形態において、免疫原は、対象の体重１ｋｇあたり約０．１μｇ〜約１００μｇの範囲で存在する。
【０３０４】
１５．投与量は、抗原を有する細胞、例えば腫瘍細胞または微生物に対して、細胞傷害性Ｔリンパ球応答を誘発する上で有効な量である、上記のいずれかの実施形態。上記のいずれかの実施形態において、投与量は、腫瘍関連抗原を含む腫瘍の発生または再発の可能性を低減する上で効果的な量である。上記のいずれかの実施形態において、投与量は、微生物により引き起こされる疾患の発生の可能性または重症度を低減する上で効果的な量である。このような方法は、感染性微生物により引き起こされる感染を防止または治療し得る。
【０３０５】
１６．ＴＬＲ４アゴニストアジュバントまたは無毒性リピドＡ関連アジュバントは、モノホスホリルリピドＡ、もしくは３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、もしくはリピドＡ模倣物、もしくは上記でその全体が説明されている式ＩのＧＬＡ、もしくは式（Ｉａ）：
【化２】
0006054942.tif 000004
のＧＬＡ、または薬剤的に許容可能なその塩であり、式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６はＣ１１〜Ｃ２０アルキルであり；Ｒ２およびＲ４はＣ１２〜Ｃ２０アルキルであり；より特別な実施形態では、ＧＬＡは上記式（Ｉａ）を有し、式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６はＣ１１〜１４アルキルであり；Ｒ２およびＲ４はＣ１２〜１５アルキルであり；さらにより特別な実施形態では、ＧＬＡは上記式（Ｉａ）を有し、式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６はＣ１１アルキルであり；Ｒ２およびＲ４はＣ１３アルキルであり；
または、ＧＬＡは、以下の化学式（Ｉｂ）から選ばれる構造を有し：
【化３】
0006054942.tif 000005
もしくは薬剤的に許容可能なその塩であり、式中：Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、およびＬ６は同一であるか異なっており、独立してＯ、ＮＨ、および（ＣＨ２）から選ばれ；Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、およびＬ１０は同一であるか異なっており、各出現時に不存在またはＣ（＝Ｏ）であってよく；Ｙ１は酸性官能基であり；Ｙ２およびＹ３は同一であるか異なっており、それぞれ独立してＯＨ、ＳＨ、および酸性官能基から選ばれ；Ｙ４はＯＨまたはＳＨであり；Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６は同一であるか異なっており、それぞれ独立してＣ８〜Ｃ１３アルキル基から選ばれ；Ｒ２およびＲ４は同一であるか異なっており、それぞれ独立してＣ６〜Ｃ１１アルキル基から選ばれる。
【０３０６】
１７．いずれかの免疫原性組成物に（第１免疫原性組成物のＴＬＲ４アゴニストアジュバントまたは無毒性リピドＡ関連アジュバントに加えて）別のアジュバントが含まれる、上記のいずれかの実施形態。
【０３０７】
１８．アジュバント、好ましくはＧＬＡが、安定な水中油型乳剤中で製剤化される、上記のいずれかの実施形態。実施形態の例において、体重が少なくとも５０Ｋｇの人に注射する場合に、ＧＬＡは、注射１回あたり０．１〜１０μｇの量、または注射１回あたり０．２〜５μｇの量、または注射１回あたり０．５〜２．５μｇの量で存在する。
【０３０８】
１９．組換え発現ベクターを抗原提示細胞に優先的に送達するベクター粒子は、細胞、ウイルスベクター粒子、またはウイルス様粒子である、上記のいずれかの実施形態。
【０３０９】
２０．抗原提示細胞は樹状細胞であり、好ましくはＤＣ‐ＳＩＧＮを発現する樹状細胞である、上記のいずれかの実施形態。
【０３１０】
２１．ベクター粒子は、好ましくはレンチウイルスベクターゲノムを含み、あるいは、ポックスウイルスベクターゲノム、ワクシニアウイルスベクターゲノム、アデノウイルスベクターゲノム、アデノウイルス関連ウイルスベクターゲノム、ヘルペスウイルスベクターゲノム、およびアルファウイルスベクターゲノムを含む、上記のいずれかの実施形態。
【０３１１】
２２．ベクター粒子は、レンチウイルスベクターゲノムを含むレンチウイルスベクター粒子；ポックスウイルスベクターゲノムを含むポックスウイルスベクター粒子；ワクシニアウイルスベクターゲノムを含むワクシニアウイルスベクター粒子；アデノウイルスベクターゲノムを含むアデノウイルスベクター粒子；アデノウイルス関連ウイルスベクターゲノムを含むアデノウイルス関連ウイルスベクター粒子；ヘルペスウイルスベクターゲノムを含むヘルペスウイルスベクター粒子；またはアルファウイルスベクターゲノムを含むアルファウイルスベクター粒子である、上記のいずれかの実施形態。
【０３１２】
２３．ベクター粒子は、ＤＣ‐ＳＩＧＮを発現する樹状細胞に優先的にベクター粒子を送達するエンベロープタンパク質を含み、このエンベロープは、随意に、アルボウイルスエンベロープ、またはアルファウイルスエンベロープ、またはシンドビスウイルスエンベロープのいずれかの変異体（a variant of an Arbovirus envelope, or an alphavirus envelope, or aSindbis virus envelope）である、上記のいずれかの実施形態。
【０３１３】
２４．ベクター粒子はレンチウイルスベクター粒子であり、このレンチウイルスベクター粒子は、レンチウイルスゲノムを含み、かつ、ＤＣ‐ＳＩＧＮを発現する樹状細胞に優先的にベクターを送達するアルボウイルス由来の糖タンパク質、好ましくはアルファウイルス由来の糖タンパク質、随意にシンドビスウイルス由来の糖タンパク質、かつ随意に、位置１６０に変異を含むシンドビスウイルスＥ２糖タンパク質を含む（この糖タンパク質で偽型化された）、上記のいずれかの実施形態。あるいは、ベクター粒子はアルファウイルスゲノムを含み、ＤＣ‐ＳＩＧＮを発現する樹状細胞に優先的にベクターを送達するアルファウイルス糖タンパク質を含む。
【０３１４】
２５．レンチウイルスベクター粒子はエンベロープを含み、このエンベロープは、天然シンドビスＥ２のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％のアミノ酸同一性を有するシンドビスウイルスＥ２糖タンパク質変異体を含み、かつ（ａ）残基１６０のアミノ酸は存在しないかグルタミン酸以外のアミノ酸である、少なくとも１つの変異を含み、（ｂ）このＥ２糖タンパク質は、シンドビスウイルスＥ３タンパク質を含む融合タンパク質の一部分ではない、上記のいずれかの実施形態。
【０３１５】
２６．ベクター粒子は組換え発現ベクターを優先的に樹状細胞に送達し、随意に、ベクター粒子は優先的に樹状細胞を感染させ、例えば、感染した非樹状細胞（または非ＤＣ‐ＳＩＧＮ発現細胞）に対する感染した樹状細胞の比率は、少なくとも約２：１、少なくとも約３：１、少なくとも約４：１、少なくとも約５：１、少なくとも約６：１、少なくとも約７：１、少なくとも約８：１、少なくとも約９：１、少なくとも約１０：１、少なくとも約２０：１、少なくとも約３０：１、少なくとも約４０：１、少なくとも約５０：１、少なくとも約１００：１、少なくとも約２００：１、少なくとも約５００：１、少なくとも約１０００：１、少なくとも約５０００：１、少なくとも約１０，０００：１、またはそれより高い比率である、上記のいずれかの実施形態。
【０３１６】
２７．２つの組成物は異なる部位に投与され、随意に異なる投与経路で投与される、上記のいずれかの実施形態。例えば、投与経路は非経口、経腸、経口、筋肉内、皮内、皮下、腫瘍内、結節内、鼻腔内、経皮、吸入、粘膜、または局所であり得る。
【０３１７】
２８．ベクター粒子を含む第２免疫原性組成物は皮下投与または皮内投与される、上記のいずれかの実施形態。
【０３１８】
２９．アジュバントを含む組成物は皮下投与または筋肉内投与または経口投与される、上記のいずれかの実施形態。
【０３１９】
これらの実施形態の関連態様において、上記のいずれかの実施形態に記載の第１免疫原性組成物を含み、随意に上記のいずれかの特徴を含むキットを本明細書で開示する。
【０３２０】
これらの実施形態のさらなる関連態様において、上記のいずれかの方法で使用する（または、上記のいずれかの方法で使用する薬剤の調製で使用する）第１免疫原性組成物を本明細書に開示する。この第１免疫原性組成物は、
（１）（ｉ）第１指定抗原、（ｉｉ）その免疫原性断片、または（ｉｉｉ）第１指定抗原に対して特異的な免疫応答を誘発する能力のあるその変異体、のいずれかを含む第１ポリペプチド、および
（２）ＴＬＲ４アゴニストアジュバントまたは無毒性リピドＡ関連アジュバント
を含み、
このポリペプチドおよびアジュバントの各々の量は、第１指定抗原に対して特異的な免疫応答を誘発または亢進するのに効果的な量である。
【０３２１】
これらの実施形態のさらなる関連態様において、上記のいずれかの方法で使用する（または、上記のいずれかの方法で使用する薬剤の調製で使用する）第２免疫原性総生物も本明細書に開示する。この第２免疫原性組成物は、抗原提示細胞に優先的に組換え発現ベクターを送達するベクター粒子を含み、この組換え発現ベクターは、（ｉ）第１指定抗原、（ｉｉ）その免疫原性断片、または（ｉｉｉ）第１指定抗原に対して特異的な免疫応答を誘発する能力のあるその変異体、のいずれかを含む第２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、このベクター粒子の量は、第１指定抗原に対して特異的な免疫応答を誘発または亢進するのに効果的な量である。
【０３２２】
本開示に鑑みて、他の実施形態および使用は当業者には明らかであろう。以下の実施列は、単に種々の実施形態を実例で説明するために提供するものであり、本発明を何ら限定しないと解釈される。
【実施例】
【０３２３】
実施例１
免疫原に対する免疫応答：免疫原およびアジュバントの投与
本実施例は、Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）のアゴニストであるアジュバントを組み合わせた免疫原で誘発した免疫応答について述べる。
【０３２４】
材料：ＧＬＡはアバンティ・ポーラ・リピッド（アラバマ州アラバスター）により合成され、感染症研究所（Infectious Disease Research Institute）（ワシントン州シアトル）によりＳＥ中で製剤化される（例えば米国特許出願公開第２００８／０１３１４６６号および第２０１０／０３１０６０２号も参照のこと）。ＨＳＶ‐２組換えＵＬ１９タンパク質は、バキュロウイルス発現系（パラゴンバイオサービス、メリーランド州ボルチモア）内で発現される。代表的な全長ＵＬ１９ポリペプチド配列を配列番号３６に示す（例えばＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０４４４８８．１を参照）。これらの実施例で使われるＵＬ１９エピトープを含むペプチドのアミノ酸配列は、この全長ＵＬ１９ポリペプチドのアミノ酸位置を参照する。
【０３２５】
動物飼育：免疫設計研究所（Immunde Design ResearchInstitute）（ＩＤＲＩ）内の動物研究施設の専用動物スペースにマウスを収容する。この施設はＵＳＤＡ規則に準拠しており、実験動物福祉局（ＯＬＡＷ）から動物福祉保証（AnimalWelfare Assurance）を取得している。ＩＤＲＩは実験動物評価協会（Association for Assessment ofLaboratory Animal Care）（ＡＡＬＡＣ）の認証を取得済みであり、顧問獣医師を含む活動中の研究施設内実験動物委員会（InstitutionalAnimal Care and Use Committee）（ＩＡＣＵＣ）を有する。すべての動物プロトコルはＩＤＲＩ ＩＡＣＵＣのレビューと承認を受けている。必要に応じて、吸入二酸化炭素の制御投与および／または頸椎脱臼により動物を安楽死させる。これらの方法は、米国獣医師会の安楽死審議会の勧告に即している。
【０３２６】
５匹のマウスからなる群を、初回免疫／追加免疫投与計画を介して筋肉内投与により免疫した。５μｇの組換えＨＳＶ‐２ ＵＬ１９タンパク質と、安定な水中油型乳剤中で製剤化された５μｇのグルコピラノシルリピドＡ（ＧＬＡ）（ＧＬＡ‐ＳＥ）、安定な水中油型乳剤（ＳＥ）単独、またはＰＢＳとの組み合わせを用いて、０日目に初めてマウスを免疫し（初回免疫）し、次いで２１日目に追加免疫した（０日目の初回免疫／２１日目の追加免疫）。追加免疫から４日後に、動物を屠殺し動物から脾臓細胞を単離した。ＵＬ１９ペプチドのエピトープ１（アミノ酸９９７〜１０１１、配列ＮＹＦＳＳＩＲＱＰＶＶＱＨＡＲ（配列番号３７））またはエピトープ２（アミノ酸１１８５〜１１９９、配列ＣＥＦＩＡＴＰＶＡＴＤＩＮＹＦ（配列番号３８））を用いて生体外で再刺激した後、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）の後に蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）を実施してＩＦＮ‐γ、ＴＮＦ‐α、およびＩＬ‐２のレベルを判定することにより、脾臓のＣＤ４Ｔ細胞応答を測定した。結果を図１に示す。各群のサイトカイン陽性ＣＤ４ Ｔ細胞のパーセント値が図示されている。
【０３２７】
酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により抗体力価を測定した。マウスから血液試料を取得し、血清を調製した。組換えＵＬ１９タンパク質を塗布した９６ウェルのイムノアッセイプレートに、試料の段階希釈液を加えた。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートされた、マウスクラスおよびアイソタイプに特異的な抗体（抗ＩｇＧ、抗ＩｇＧ１、抗ＩｇＧ２ａ、および抗ＩｇＧ２ｂ）を用いて、特異的な抗ＵＬ１９抗体の存在を検出した。ＳｕｒｅＢｌｕｅ（登録商標）ＴＭＢマイクロウェル基質（ＫＰＬ、キルケガード＆ペリーラボラトリーズ、メリーランド州ゲイサーズバーグ）を用いて、標準のペルオキシダーゼアッセイにより結合ＨＲＰコンジュゲートを検出した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｐｌｕｓプレートリーダー（モレキュラーデバイス社、カリフォルニア州サニーベール）を用いて４５０ｎｍでプレートを読み取ることにより、反応物を定量化した。また、ＧＬＡ‐ＳＥと組み合わせた組換えＵＬ１９タンパク質で免疫されたマウスは、組換えＨＳＶ‐２ＵＬ１９タンパク質単独（ＰＢＳ中）で免疫されたマウスと比較して、特異的な抗体応答の発生が非常に多かった。
【０３２８】
実施例２
アジュバントと組み合わせた免疫原、およびウイルス組換え発現ベクターによる発現時に対する免疫応答
本実施例は、アジュバントと組み合わせた免疫原でマウスを免疫するか、免疫原をコードし発現する組換え発現ベクターを含むベクター粒子でマウスを免疫した場合に誘発される免疫応答について述べる。
【０３２９】
レンチウイルスベクター（ＤＣ‐ＮＩＬＶ）は、改変されたシンドビスウイルスエンベロープ糖タンパク質を用いて選択的に樹状細胞に侵入する、自己不活性化型の組込み欠損レンチウイルスである（例えば、国際公開第２０１１／０１１５８４号を参照）。簡単に説明すると、変異型インテグレース（ｐｏｌＤ６４Ｖ）を通じてベクターを冗長的に組込み不能にして非機能性にし（Apolonia et al., Mol. Ther. 15:1947 (2007)）、ベクター骨格からＬＴＲのＵ３領域（ａｔｔまで）および３’ＬＴＲポリプリン区域（ＰＰＴ）を欠失させた。したがって、無効にされたインテグレースに加えて、ベクター骨格の組成が全長ベクターゲノムの転写を妨げ（自己不活性型変異）、その結果、感染樹状細胞内に、染色体組込みのための鋳型でない、単一ＬＴＲの逆転写されたエピソーム性二本鎖ＤＮＡ環が得られる（Bayeret al., Mol. Ther. 16:1968 (2008); Kantor et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA106:18786-791 (2009); Epub 2009 Oct 20; Ma et al., Mol. Ther. 10:139 (2004)）。Ｒｅｖを除く調節タンパク質およびアクセサリータンパク質の全部を含め、親ＨＩＶゲノムの７５パーセントがＤＣ‐ＮＩＬＶから除去された。
【０３３０】
各５匹のマウス群を、アジュバントとしてＧＬＡ‐ＳＥを混合したｒＵＬ１９タンパク質を筋肉内投与するか、ＨＳＶ‐２ポリペプチド、ＵＬ１９をコードするレンチウイルスベクター（ＤＣ‐ＮＩＬＶ）（イミューンデザイン社、ワシントン州シアトル）を皮下投与することにより免疫した。組換えＵＬ１９タンパク質は、バキュロウイルス発現系（パラゴンバイオサービス、メリーランド州ボルチモア）内で発現される。抗体力価を測定し、脾臓ＵＬ１９に特異的なＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞のＩＦＮ‐γとＴＮＦ‐αの産生をＩＣＳで分析した（実験の詳細は実施例１を参照）。ＵＬ１９ペプチドエピトープ２（アミノ酸１１８５〜１１９９（配列番号３８）（実施例１を参照））を用いて生体外で再刺激した後、脾臓ＣＤ４Ｔ細胞応答を測定した。ＵＬ１９ ＣＤ８ペプチドエピトープ１（アミノ酸１０１７〜１０３１、配列ＥＮＡＬＴＹＡＬＭＡＧＹＦＫＭ（配列番号３９））とＵＬ１９ ＣＤ８ペプチドエピトープ２（アミノ酸１０４５〜１０５９、配列ＨＰＧＦＧＦＴＶＶＲＱＤＲＦＶ（配列番号４０））の組み合わせを用いて生体外で再刺激した後、脾臓ＣＤ８Ｔ細胞応答を測定した。データを図２（左側）に示す。
【０３３１】
実施例１に記載のように、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により抗体血清エンドポイント力価を測定した。屠殺の直前に、マウスから血液試料を取得した。特異抗体の力価（ＩｇＧ）を測定した。データを図２（右側）に示す。
【０３３２】
実施例３
免疫原（卵白アルブミン）に対する免疫応答：２つの免疫原性組成物の投与
本実施例は、免疫原をコードし発現する組換え発現ベクターを含むベクター粒子で最初にマウスを免疫し、次いで、アジュバントと組み合わせた免疫原でマウスを免疫した場合に誘発される免疫応答について述べる。
【０３３３】
各マウス群を、卵白アルブミンをコードするＤＣ‐ＮＩＬＶを皮下投与して免疫し、次いで、ＰＢＳ、ＧＬＡ／ＳＥ単独、組換え卵白アルブミンとＳＥの組み合わせ（ｒＰ＋ＳＥ）、アジュバントとしてＧＬＡ‐ＳＥを混合した卵白アルブミン（ｒＰ＋ＧＬＡ／ＳＥ）のいずれかを筋肉内投与して免疫した。追加免疫から４日後に、動物から脾臓細胞を単離した。卵白アルブミンに特異的な脾臓ＣＤ８Ｔ細胞のＩＦＮ‐γおよびＴＮＦ‐αの産生を、ＩＣＳで分析した。データを図３に示す。
【０３３４】
実施例４
免疫原（ＨＳＶ‐２ ＵＬ１９）に対する免疫応答：２つの免疫原性組成物の投与
本実施例は、マウスを、免疫原をコードし発現する組換え発現ベクターを含有するベクター粒子を含む免疫原性組成物で免疫した場合、アジュバントと組み合わせた免疫原を含む免疫原性組成物で免疫した場合、または、各免疫原性組成物で逐次的に免疫した場合に誘発される免疫応答について述べる。
【０３３５】
マウスを、ｒＵＬ１９タンパク質＋ＧＬＡ‐ＳＥの筋肉内投与、およびＨＳＶ‐２ポリペプチド、ＵＬ１９をコードするＤＣ‐ＮＩＬＶの皮下投与により免疫した。各５匹のＣ５７ＢＬ／６マウス群を、アジュバントとしてＧＬＡ‐ＳＥを混合したｒＵＬ１９タンパク質またはＰＢＳで免疫し、アジュバントとしてＧＬＡ‐ＳＥを混合したｒＵＬ１９タンパク質、またはＵＬ１９をコードしたポリヌクレオチドを含有するＤＣ‐ＮＩＬＶで追加免疫した。追加免疫から１０日後に、動物から脾臓細胞を単離した。ＣＤ４ＵＬ１９エピトープまたはＣＤ８ ＵＬ１９エピトープを含有する単鎖１５アミノ酸長ペプチドを用いて生体外で刺激した後、ＵＬ１９に特異的な脾臓ＣＤ４ Ｔ細胞およびＣＤ８Ｔ細胞のＩＦＮ‐γ、ＴＮＦ‐α、およびＩＬ‐２の産生をＩＣＳで分析した。各群の代表的マウス１匹のドットプロット図を図４Ａに示す。各ドットプロット図の右側に表示されている数値は、ＩＦＮ‐γ＋かつＴＮＦ‐α＋であるＣＤ４Ｔ細胞またはＣＤ８ Ｔ細胞の％値を表す。
【０３３６】
図４Ａ（右側）は、２つの異なるＣＤ８ ＵＬ１９エピトープ（ＣＤ８ ＵＬ１９ペプチドエピトープ１（アミノ酸１０１７〜１０３１、（配列番号３９）と、ＵＬ１９ＣＤ８ペプチドエピトープ２（アミノ酸１０４５〜１０５９、（配列番号４０）（実施例２を参照））の各々で刺激されたサイトカイン陽性ＣＤ８ Ｔ細胞のパーセント値を図示する。これらのデータは、アジュバントとしてＧＬＡ‐ＳＥを混合したｒＵＬ１９タンパク質（初回免疫組成物）で最初に免疫し、次いで、ＵＬ１９をコードするＤＣ‐ＮＩＬＶ（追加免疫組成物）で免疫した群の動物から得た脾臓ＣＤ８細胞から取得した。
【０３３７】
酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により抗体の中間点力価を測定した。最終免疫から１０日後のマウスから血液試料を取得し、血清を調製した。組換えＵＬ１９タンパク質を塗布した９６ウェルのイムノアッセイプレートに、試料の段階希釈液を加えた。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートされた、マウスクラスおよびアイソタイプに特異的な抗体（抗ＩｇＧ、抗ＩｇＧ１、抗ＩｇＧ２ａ、および抗ＩｇＧ２ｂ）を用いて、特異的な抗ＵＬ１９抗体の存在を検出した。ＳｕｒｅＢｌｕｅ（登録商標）ＴＭＢマイクロウェル基質（ＫＰＬ、キルケガード＆ペリーラボラトリーズ、メリーランド州ゲイサーズバーグ）を用いて、標準のペルオキシダーゼアッセイにより結合ＨＲＰコンジュゲートを検出した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｐｌｕｓプレートリーダー（モレキュラーデバイス社、カリフォルニア州サニーベール）を用いて４５０ｎｍでプレートを読み取ることにより、反応物を定量化した。中間点で測定した各動物の抗体力価を図４Ｂに示す。
【０３３８】
望ましいことであるが、意外にも、初回免疫されていない対照と比較して、ｒＵＬ１９＋ＧＬＡ‐ＳＥで初回免疫したマウスでは、一回のＤＣ‐ＮＩＬＶ免疫で引き起こされるＣＤ８Ｔ細胞応答が約５倍増加した。レンチベクターは単剤としてＴＨ１ ＣＤ４ Ｔ細胞を予備刺激しなかったが、追加刺激としてタンパク質／ＧＬＡ初回刺激に加えられると、驚いたことに、（組換えタンパク質ＧＬＡ追加免疫と）同等に効果的にＴＨ１ＣＤ４ Ｔ細胞応答を追加刺激した。
【０３３９】
実施例５
免疫原（ＨＳＶ‐２ ＵＬ１９）に対する免疫応答：２つの免疫原性組成物の投与
本実施例は、アジュバントと組み合わされた免疫原を含む免疫原性組成物と、免疫原をコードし発現する組換え発現ベクターを含有するベクター粒子を含む免疫原性組成物で、同時にマウスを免疫した場合に誘発される免疫応答について述べる。
【０３４０】
各５匹のＣ５７ＢＬ／６マウス群を、アジュバントとしてＧＬＡ‐ＳＥを混合したｒＵＬ１９タンパク質、またはＰＢＳを筋肉内投与して免疫し、アジュバントとしてＧＬＡ‐ＳＥを混合したｒＵＬ１９タンパク質の筋肉内投与、およびＵＬ１９をコードしたポリヌクレオチドを含有するＤＣ‐ＮＩＬＶの皮下投与により追加免疫した。追加免疫から１０日後に、動物から脾臓細胞を単離した。ＣＤ４ＵＬ１９エピトープまたはＣＤ８ ＵＬ１９エピトープを含有する単鎖１５アミノ酸長ペプチドを用いて生体外で刺激した後、ＵＬ１９に特異的な脾臓ＣＤ４ Ｔ細胞およびＣＤ８Ｔ細胞のＩＦＮ‐γ、ＴＮＦ‐α、およびＩＬ‐２の産生をＩＣＳで分析した。データを図５に示す。このデータは、ｒＰ＋ＧＬＡ／ＳＥおよびレンチウイルス由来ワクチンの同時送達により、抗原特異的な既存のＣＤ４Ｔ細胞プールが存在する場合と不存在の場合のどちらも、ＣＤ４、ＣＤ８両方の抗原特異的Ｔ細胞が効果的に産生されることを示唆している。図５Ａ（右側）は、２つの異なるＣＤ４ＵＬ１９エピトープ（ＣＤ４ペプチドエピトープ１およびＣＤ４ペプチドエピトープ２；実施例１を参照）の各々で刺激されたサイトサイン陽性ＣＤ４ Ｔ細胞のパーセント値と、２つの異なるＣＤ８ＵＬ１９エピトープ（ＣＤ８ペプチドエピトープ１およびＣＤ８ペプチドエピトープ２；実施例２および４を参照）の各々で刺激されたサイトサイン陽性ＣＤ８ Ｔ細胞のパーセント値を図示する。
【０３４１】
追加免疫から５日後および１０日後に、各群の動物から血清を取得し、特異的ＩｇＧ抗体を検出した。実施例４に記載のように、抗体の中間点の力価を測定した。各動物の中間点の特異的ＩｇＧ抗体力価を図５Ｂに示す。
【０３４２】
実施例６
第１免疫原とアジュバントを含む免疫原性組成物の投与、および第１免疫原と第２免疫原を発現するための組換え発現ベクターを含むベクター粒子の投与により誘発される免疫応答
ＤＣ‐ＮＩＬＶベクターの構築：実施例１に記載の通りにＤＣ‐ＮＩＬＶベクターを調製する。ＨＳＶ‐２タンパク質であるｇＤとＵＬ１９は、２つの抗原が自己開裂２Ａペプチドで分離されたマルチシストロン性ベクター内でコードされる（例えばSzymczak et al., Nat. Biotechnol. 22:589 (2004); Trichas et al.,BMC. Biol. 6:40 (2008); Yang et al., Gene Ther. 15:1411 (2008)を参照）。当技術分野で日常的に実践されている分子生物学的方法および手法に従って、ｇＤとＵＬ１９の両方を発現するように組換え発現ベクターを構築する。レンチウイルスベクターの構築については、国際公開第２０１１／０１１５８４号も参照のこと。
【０３４３】
ＨＳＶ‐２組換えタンパク質であるＵＬ１９とｇＤは、それぞれバキュロウイルス発現系（パラゴンバイオサービス、メリーランド州ボルチモア）内で発現される。ＧＬＡ／ＳＥを用いて製剤化されたｇＤ、ＧＬＡ／ＳＥを用いて製剤化されたＵＬ１９、およびＧＬＡ／ＳＥを用いて一緒に製剤化されたｇＤとＵＬ１９を含む、免疫原性組成物を調製する。
【０３４４】
各５匹のマウス群を、下の表１に示すように免疫する。初回免疫から２８日後に、１回目の追加免疫を投与する。１回目の追加免疫から２８日後に、２回目の追加免疫を受けるマウス群を免疫する。
【表２】
0006054942.tif 000006
【０３４５】
最終免疫から４日後に免疫応答（抗体、ＣＤ４ Ｔ細胞、およびＣＤ８ Ｔ細胞）を分析する。ただし１回だけ免疫を受けるマウスは例外であり、この場合１２日目に免疫応答を分析する。各マウスから血液試料を採取し、これらの動物から脾臓を除去する。ＧｕａｖａＥａｓｙＣｙｔｅ（商標）Ｐｌｕｓ（ミリポア、マサチューセッツ州ビルリカ）を介して総細胞数を測定する。フローサイトメトリーにより、各試料内のＣＤ８ Ｔ細胞とＣＤ４Ｔ細胞およびそのメモリー表現型（セントラル対エフェクター）の全体の頻度を測定する。また、基本的に上述されている通り、公知のＴ細胞エピトープを含有する１５アミノ酸長ペプチドを用いて生体外で脾細胞を刺激した後、ＩＣＳを実施することにより、抗原特異的なＴ細胞応答を分析し、ＩＦＮ‐γ、ＩＬ‐２、およびＴＮＦ‐αを産生するＴ細胞の存在を判定する（Liu et al., Nature 457(7225):87 (2009); Seder et al., Nat. Rev.Immunol. 8:247 (2008)）。ｇＤに対する特異的な抗体応答をＥＬＩＳＡで測定する。
【０３４６】
防御実験：各１０匹のマウス群を、初めて免疫し（初回免疫）（０日目）および２８日後に追加免疫する（２８日目）。いくつかのマウス群には、１回目の追加免疫から２８日後に２回目の追加免疫を与える（５６日目）。前の実験から得た結果をもとに、初回免疫、１回目免疫、および２回目免疫の各々の免疫原性組成物を決定する。２回目追加免疫から４日後（６０日目）に、ＨＳＶ‐２の少なくとも５０×ＬＤ５０でマウスを攻撃する。各免疫の日（すなわち０日目、２８日目、および５６日目）に、各動物から血液を回収する。攻撃から１日後、３日後、および５日後に、膣スワブを収集する。攻撃から１４日後に、生存している動物から膣スワブを収集し、次いで、これらの動物から血液と脾臓を回収する。エンドポイントには、生存およびウイルス力価減少が含まれる（１〜１０コピーに感受性のあるリアルタイムＨＳＶ‐２ＤＮＡ ＰＣＲで測定する）。上記のようにして、ｇＤとＵＬ１９に対して特異的な抗原特異抗体応答、ＣＤ４ Ｔ細胞応答、およびＣＤ８ Ｔ細胞応答を測定する。
【０３４７】
実施例７
初回／追加免疫投与計画がＳＩＶ‐ＧＡＧに対して強い機能性ＣＤ８Ｔ細胞応答を誘発する
本実施例は、免疫原をコードし発現する組換え発現ベクターを含むベクター粒子で最初にマウスを免疫（初回免疫）し、次いで、免疫原をコードし発現する組換え発現ベクターでマウスを免疫（追加免疫）した場合に誘発される免疫応答について述べる。
【０３４８】
（一群当たり４匹の）Ｃ５７ＢＬ／６マウス群を、初回免疫投与計画または初回／追加（０日目／２８日目）免疫投与計画を用いて、ＳＩＶ‐ＧａｇをコードするＤＣ‐ＮＩＬＶを２５倍の容量範囲に渡って皮下投与して１回免疫した。初回免疫の１２日後または追加免疫の５日後に、脾臓ＳＩＶ‐Ｇａｇ特異的ＣＤ８Ｔのエピトープ特異的機能性応答を分析した。この分析は、ＣＤ８ Ｔ細胞の公知の最小エピトープペプチドＡＬ１１（ＳＩＶ ＧＡＧのアミノ酸３１２〜３２２；ＡＡＶＫＮＷＭＴＱＴＬ；配列番号４３）またはＫＶ９（ＳＩＶＧＡＧのアミノ酸７６〜８４；ＫＳＬＹＮＴＶＣＶ；配列番号４４）を用いて生体外で刺激した後、ＩＦＮ‐γ、ＴＮＦ‐α、およびＩＬ‐２の産生を細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）で測定することにより行った。
【０３４９】
データを図７に示す。このデータは、プライム投与計画および初回／追加免疫投与計画（両方の免疫がウイルスベクター）の両方が、ドミナントＡＬ１１エピトープ、サブドミナントＫＶ９エピトープの双方に対し、用量依存的な強い機能性Ｇａｇ特異的ＣＤ８Ｔ細胞応答を発生させることを実証している。初回／追加免疫投与計画はさらに、双方のエピトープに対して観察される応答を少なくとも約２倍増加させた。
【０３５０】
実施例８
免疫原とアジュバントの投与がＴＨ１ ＣＤ４ Ｔ細胞応答を誘発する
本実施例は、アジュバント（ＧＬＡ）を組み合わせたＳＩＶ免疫原で誘発した免疫応答について述べる。
【０３５１】
初回／追加免疫投与計画（０日目の初回免疫／２１日目の追加免疫）を通じて、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（各群４匹）を、５μｇの組換えＳＩＶ‐Ｇａｇタンパク質＋５μｇのＧＬＡ‐ＳＥ、ＳＥ単独、またはＰＢＳを筋肉内投与して免疫した。ペプチドＤＤ１３（ＳＩＶ‐ＧＡＧのアミノ酸２９９〜３１１；ＤＲＦＹＫＳＬＲＡＥＱＴＤ；配列番号４５）を含有するＳＩＶ‐ＧａｇＣＤ４ Ｔ細胞エピトープを用いて生体外で再刺激した後、追加免疫から５日後に、脾臓ＣＤ４ Ｔ細胞応答としてＩＦＮ‐γ、ＴＮＦ‐α、およびＩＬ‐２をＩＣＳで測定した。
【０３５２】
結果を図８に示す。このデータは、ＳＩＶ‐Ｇａｇ組換えタンパク質で免疫した後に強いＴｈ１ ＣＤ４ Ｔ細胞応答を得るには、ＧＬＡ型のアジュバントが必要であることを実証している。
【０３５３】
実施例９
同一ビヒクルの複数回投与ワクチン接種と異種の複数回投与ワクチン接種投与計画の比較、および初回／追加免疫ワクチン投与の順序
本実施例では、ＳＩＶ‐Ｇａｇ組換えタンパク質＋ＧＬＡ‐ＳＥおよびＳＩＶ‐Ｇａｇ発現ＤＣ‐ＮＩＬＶを用いた、異種の、初回、追加、追加ワクチン投与により誘発される免疫応答について述べる。
【０３５４】
（各群４匹の）Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、表示されている免疫投与計画に従って、ｒＳＩＶ‐Ｇａｇ＋ＧＬＡ‐ＳＥの筋肉内投与、および／またはＳＩＶ‐ＧａｇをコードするＤＣ‐ＮＩＬＶの皮下投与により免役した。追加免疫から２５日後に、ＣＤ８Ｔ細胞の最小エピトープペプチドＡＬ１１、ＫＶ９、またはＣＤ４（ＤＤ１３）を用いて、抗原特異的なＣＤ４ Ｔ細胞およびＣＤ８ Ｔ細胞を分析し、ＩＦＮ‐γ、ＴＮＦ‐α、およびＩＬ‐２の産生をＩＣＳで分析した。結果を図９に示す。この結果は、ＳＩＶ‐Ｇａｇ組換えタンパク質＋ＧＬＡ‐ＳＥおよびＳＩＶ‐Ｇａｇ発現ＤＣ‐ＮＩＬＶを用いた異種の初回／追加／追加トワクチン投与により、ＣＤ８、ＣＤ４両方の抗原特異的Ｔ細胞応答が発生することを実証している。
【０３５５】
このデータは、ＧＬＡ型アジュバントを組み合わせた組換えタンパク質で３回免疫した場合、強いＣＤ４ Ｔ細胞応答を誘発するが、ＣＤ８Ｔ細胞応答は強くないことを示している。同様に、レンチウイルスで３回免疫した場合、強いＣＤ４ Ｔ細胞応答はないが、ＣＤ８ Ｔ細胞応答は非常に強く、ドミナントＡＬ１１エピトープに向かって劇的に傾斜している。対照的に、意外にも、異種投与計画ではＣＤ８Ｔ細胞とＣＤ４ Ｔ細胞の両方とも応答が強かった。ドミナントエピトープとサブドミナントエピトープの両方で、有意かつバランスの取れたＣＤ８ Ｔ細胞応答が観察された。さらに意外なことに、１回目の免疫（初回免疫）がタンパク質＋ＧＬＡで、後続の免疫（追加免疫）がウイルスベクターである投与計画で、初回免疫がウイルスベクターで、追加免疫がタンパク質である投与計画と比較して、ＣＤ８Ｔ細胞応答が優れていた。特に、タンパク質で初回免疫しウイルスベクターで追加免疫すると、サブドミナントエピトープＫＶ９に対するＣＤ８ Ｔ細胞応答が有意に大きく増加した。ワクチン投与の惹起により内在的な免疫優勢階層を変化させることは困難であるため、このことは予想外であった。サブドミナントエピトープに対する応答は、免疫応答の多様性にとって重要であり得、個体群全体でワクチン効力を向上させ得る。
【０３５６】
実施例１０
２回目追加免疫が、異種ワクチン投与によるＣＤ８ Ｔ細胞、Ｔｈ１ ＣＤ４ Ｔ細胞両方の応答を増加させる
本実施例は、ｒＳＩＶ‐ＧａｇとＧＬＡ‐ＳＥで追加免疫した異種ワクチン投与により誘発される免疫応答について述べる。
【０３５７】
（各群４匹の）Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、図１０に示す免疫投与計画に従って、ｒＳＩＶ‐Ｇａｇ＋ＧＬＡ‐ＳＥの筋肉内投与で免役し、ＳＩＶ‐ＧａｇをコードするＤＣ‐ＮＩＬＶの皮下投与により追加免疫した。免疫の間隔を２１日空けた。追加免疫から２５日後に、ＣＤ８（ＡＬ１１もしくはＫＶ９）またはＣＤ４（ＤＤ１３）Ｔ細胞のエピトープペプチドを用いて、抗原特異的ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞を分析し、ＩＦＮ‐γ、ＴＮＦ‐α、およびＩＬ‐２の産生をＩＣＳで分析した。
【０３５８】
結果を図１０に示す。この結果は、異種ワクチン投与により生じるＣＤ８ Ｔ細胞応答、ＴＨ１ ＣＤ４ Ｔ細胞応答の両方とも、タンパク質とＧＬＡ型アジュバントを用いた３回目の免疫（２回目の追加免疫）で亢進し得ることを実証している。２回投与のワクチン接種後の各々の応答と比較して、３回投与のワクチン接種投与計画は、ＣＤ８、ＣＤ４両方の抗原特異的Ｔ細胞応答をさらに増加させた。
【０３５９】
実施例１１
アジュバントを伴う合成長鎖ペプチドにより、ＤＣ‐ＮＩＬＶが発生させたＣＤ８ Ｔ細胞応答を追加刺激し得る
本実施例は、ＳＩＶ‐ＧａｇをコードするＤＣ‐ＮＩＬＶで誘発され、合成長鎖ペプチド（ＳＬＰ）とＧＬＡ‐ＳＥで追加免疫される免疫応答について述べる。
【０３６０】
（各群４匹の）Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、図１１に示す免疫投与計画に従い、初回／追加免疫投与計画（０日目の初回免疫／２１日目の追加免疫）を通じて、ＳＩＶ‐ＧａｇをコードするＤＣ‐ＮＩＬＶ、および／またはＳＩＶ‐Ｇａｇアミノ酸２８９〜３３３（配列番号４２）を含有するＳＬＰ（図１１にＡＬ１１エピトープを太字フォントで示す）プラスＧＬＡ‐ＳＥを用いて免疫した。追加免疫から２５日後に、ＣＤ８（ＡＬ１１）Ｔ細胞エピトープペプチドを用いて、抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞を分析し、ＩＦＮ‐γ、ＴＮＦ‐α、およびＩＬ‐２の産生をＩＣＳで分析した。
【０３６１】
結果を図１１に示す。この結果は、１回目と２回目の免疫に異なる免疫原変異体（例えば、全長免疫原と断片）を使用した場合に、本発明の方法が機能的であることを実証している。全長免疫原をコードするポリヌクレオチドを保有するレンチウイルスベクターで１回目の免疫（初回免疫）を行った後、小さな４５アミノ酸の免疫原断片で２回目の免疫（追加免疫）を行った場合、同じレンチウイルスを用いた追加免疫と比較して、ＣＤ８Ｔ細胞応答が亢進した。
【０３６２】
上記の種々の実施形態を組み合わせることにより、さらなる実施形態を提供することができる。本明細書で参照され、かつ／または出願データシートに列記されているすべての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許公表文献は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。上記実施形態の態様を必要に応じて修正して、これらの各種特許、出願、および公表文献の概念を使用することにより、その上さらなる実施形態を提供することができる。
【０３６３】
上記の詳細な説明に鑑みて、これらの変更および他の変更を実施形態に加えることができる。概して、下記の請求項で使用されている用語は、請求項を本明細書および請求項で開示される特定の実施形態に制限するものと解釈するのでなく、当該請求項の権利対象である均等物の全範囲と共に、あり得るすべての実施形態を含めるものと解釈すべきである。したがって、下記請求項は本開示に制限されない。
【図１】
0006054942.tif 000008
【図２】
0006054942.tif 000009
【図３】
0006054942.tif 000010
【図４Ａ】
0006054942.tif 000011
【図４Ｂ】
0006054942.tif 000012
【図５Ａ】
0006054942.tif 000013
【図５Ｂ】
0006054942.tif 000014
【図６】
0006054942.tif 000015
【図７】
0006054942.tif 000016
【図８】
0006054942.tif 000017
【図９】
0006054942.tif 000018
【図１０】
0006054942.tif 000019
【図１１】
0006054942.tif 000020
【配列表】
0006054942000001.app