(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナンセンス突然変異による疾患である遺伝子疾患の治療又は予防のための薬剤であって、式（Ｉ）の化合物又はその塩、溶媒和物、包接化合物、水和物若しくは多形体を含む薬剤。
【化１】
0005877200.tif 000005
【請求項２】
前記遺伝子疾患は、以下の遺伝子疾患：ナンセンス突然変異によるβサラセミア、ナンセンス突然変異によるエーラス・ダンロス症候群、ナンセンス突然変異による乳児重症ミオクロニーてんかん、ナンセンス突然変異による色覚異常、ナンセンス突然変異による網膜色素変性症、ナンセンス突然変異によるアッシャー症候群１Ｃ型、ナンセンス突然変異による内転握り／内反足症候群（ａｄｄｕｃｔｅｄ  ｔｈｕｍｂ−ｃｌｕｂｆｏｏｔ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ナンセンス突然変異によるアラジール症候群、ナンセンス突然変異によるアルストレム症候群、ナンセンス突然変異によるアンチトロンビン欠乏症、ナンセンス突然変異によるカーニー複合、ナンセンス突然変異によるクラリーノ症候群、ナンセンス突然変異によるダイアモンド−ブラックファン貧血、ナンセンス突然変異による骨髄性プロトポルフィリン症、ナンセンス突然変異によるファブリー病、ナンセンス突然変異による第ＸＩＩＩ因子欠損症、ナンセンス突然変異によるファンコニ−ビッケル症候群、ナンセンス突然変異による魚臭症候群、ナンセンス突然変異によるゴーシェ病、ナンセンス突然変異による遺伝性出血性毛細血管拡張症、ナンセンス突然変異によるホモシスチン尿症、ナンセンス突然変異によるジュベール症候群及び関連疾患、ナンセンス突然変異によるクラッベ病、ナンセンス突然変異によるＬ−２−ヒドロキシグルタル酸尿症、ナンセンス突然変異によるメチルマロン酸血症、ナンセンス突然変異によるニーマン・ピック病、ナンセンス突然変異によるピーターズプラス症候群、ナンセンス突然変異によるタウンズ・ブロックス病、ナンセンス突然変異によるフォン・ヴィレブランド病、ナンセンス突然変異によるウィスコット・アルドリッチ症候群、ナンセンス突然変異による歌舞伎症候群、ナンセンス突然変異によるドルフマン−シャナリン症候群、ナンセンス突然変異によるレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ欠損症／魚眼病、ナンセンス突然変異によるマルファン症候群、ナンセンス突然変異によるムコ多糖症、ナンセンス突然変異によるアミロイドーシス、ナンセンス突然変異による遅発型小児性神経セロイドリポフスチン沈着症（Ｌａｔｅ  Ｉｎｆａｎｔｉｌｅ  Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｃｅｒｏｉｄ  Ｌｉｐｏｆｕｓｃｉｎｏｓｉｓ）、ナンセンス突然変異によるコエンザイムＱ１０欠乏症、ナンセンス突然変異によるペルオキシソーム形成異常症、ナンセンス突然変異によるリソソーム蓄積症、ナンセンス突然変異による大腸がん、ナンセンス突然変異による先天性エンテロペプチダーゼ欠損症、ナンセンス突然変異による嚢胞性線維症、ナンセンス突然変異によるハンガリアンポイツ・イエーガー症候群、ナンセンス突然変異によるジャーベル・ランゲニールセン症候群、ナンセンス突然変異によるリンチ症候群、ナンセンス突然変異による微絨毛封入体病、ナンセンス突然変異によるポイツ・イエーガー症候群、ナンセンス突然変異によるキサンチン尿症、ナンセンス突然変異によるアシドーシス、ナンセンス突然変異によるアルポート症候群、ナンセンス突然変異によるバルデー・ビードル症候群、ナンセンス突然変異によるバート・ホッグ・デュベ症候群、ナンセンス突然変異によるデント病、ナンセンス���然変異によるギテルマン症候群、ナンセンス突然変異による遺伝性平滑筋腫症及び腎細胞がん、ナンセンス突然変異による遺伝性球状赤血球症、ナンセンス突然変異によるレーバー先天性黒内障、ナンセンス突然変異によるリジン尿性蛋白不耐症、ナンセンス突然変異によるネフロン癆、ナンセンス突然変異による多発性腎嚢胞、ナンセンス突然変異による偽性低アルドステロン症、ナンセンス突然変異による腎形成不全、ナンセンス突然変異による散発性明細胞腎細胞がん、ナンセンス突然変異による２型乳頭状腎細胞がん、ナンセンス突然変異による泌尿器顔面症候群、ナンセンス突然変異によるフォンヒッペル・リンドウ病、ナンセンス突然変異によるウィルムス腫瘍、ナンセンス突然変異によるＸ連鎖型アルポート症候群、ナンセンス突然変異によるＸ連鎖性低リン血症性くる病、ナンセンス突然変異による高尿酸血症性腎症（若年性／髄質嚢胞腎）、ナンセンス突然変異による結節性硬化症、ナンセンス突然変異によるネフローゼ症候群／先天性ネフローゼ症候群、ナンセンス突然変異によるフィンランド型ネフローゼ症候群、ナンセンス突然変異によるステロイド抵抗性ネフローゼ症候群３、ナンセンス突然変異による早期発症ネフローゼ症候群／ピアソン症候群、ナンセンス突然変異によるデニス・ドラッシュ症候群、ナンセンス突然変異によるネフローゼ症候群／シムケ免疫性骨形成不全、ナンセンス突然変異による原発性グルココルチコイド耐性、ナンセンス突然変異によるＸ連鎖性低リン酸血症、ナンセンス突然変異による原発性高シュウ酸尿症１型、ナンセンス突然変異による偽性低アルドステロン症１型、ナンセンス突然変異による近位尿細管性アシドーシス、ナンセンス突然変異による無βリポ蛋白血症及びホモ接合体性家族性低βリポ蛋白血症、ナンセンス突然変異によるアルパーズ症候群、ナンセンス突然変異によるカルバミルリン酸合成酵素Ｉ欠損症、ナンセンス突然変異によるコレステロールエステル蓄積症、ナンセンス突然変異によるシトリン欠損症、ナンセンス突然変異によるデュビン・ジョンソン症候群、ナンセンス突然変異による骨髄性プロトポルフィリン症、ナンセンス突然変異による第Ｖ因子欠損症、ナンセンス突然変異による糖原病、ナンセンス突然変異による血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子欠損症）、ナンセンス突然変異による血友病Ｂ（第ＩＸ因子欠損症）、ナンセンス突然変異による肝細胞がん、ナンセンス突然変異による肝骨髄性ポルフィリン症、ナンセンス突然変異による遺伝性痙性対麻痺、ナンセンス突然変異による低βリポ蛋白血症、ナンセンス突然変異による遺伝性第ＸＩ因子欠損症、ナンセンス突然変異による若年発症成人型糖尿病、ナンセンス突然変異による小球性貧血及び鉄欠乏症、ナンセンス突然変異によるミトコンドリアＤＮＡ枯渇症候群、ナンセンス突然変異によるフェニルケトン尿症、ナンセンス突然変異による多発性肝嚢胞、ナンセンス突然変異による晩発性皮膚ポルフィリン症、ナンセンス突然変異による進行性家族性肝内胆汁うっ滞症、ナンセンス突然変異によるウィルソン病、ナンセンス突然変異による常染色体優性高コレステロール血症、ナンセンス突然変異による第ＸＩＩ因子欠損症、ナンセンス突然変異による第Ｘ因子欠損症、ナンセン���突然変異による低フィブリノーゲン血症、ナンセンス突然変異による無フィブリノーゲン血症、ナンセンス突然変異による第ＶＩＩ因子欠損症、ナンセンス突然変異による無ガンマグロブリン血症、ナンセンス突然変異による無巨核球性血小板減少症、ナンセンス突然変異による赤血球異形成貧血ＩＩ型、ナンセンス突然変異によるデュシェンヌ型・ベッカー型筋ジストロフィー、ナンセンス突然変異による中心核ミオパチー、ナンセンス突然変異による肢帯型筋ジストロフィー又は三好ミオパチー、ナンセンス突然変異によるウルリッヒ病、ナンセンス突然変異による脊髄性筋萎縮症、ナンセンス突然変異による栄養障害型表皮水疱症、ナンセンス突然変異によるヘイリーヘイリー病、ナンセンス突然変異によるヘルリッツ型接合部型表皮水疱症、並びに、ナンセンス突然変異によるネザートン症候群から選択される、請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
前記遺伝子疾患は、以下の遺伝子疾患：ナンセンス突然変異による無βリポ蛋白血症及びホモ接合体性家族性低βリポ蛋白血症、ナンセンス突然変異によるアルパーズ症候群、ナンセンス突然変異によるカルバミルリン酸合成酵素Ｉ欠損症、ナンセンス突然変異によるコレステロールエステル蓄積症、ナンセンス突然変異によるシトリン欠損症、ナンセンス突然変異によるデュビン・ジョンソン症候群、ナンセンス突然変異による骨髄性プロトポルフィリン症、ナンセンス突然変異による第Ｖ因子欠損症、ナンセンス突然変異による糖原病、ナンセンス突然変異による血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子欠損症）、ナンセンス突然変異による血友病Ｂ（第ＩＸ因子欠損症）、ナンセンス突然変異による肝細胞がん、ナンセンス突然変異による肝骨髄性ポルフィリン症、ナンセンス突然変異による遺伝性痙性対麻痺、ナンセンス突然変異による低βリポ蛋白血症、ナンセンス突然変異による遺伝性第ＸＩ因子欠損症、ナンセンス突然変異による若年発症成人型糖尿病、ナンセンス突然変異による小球性貧血及び鉄欠乏症、ナンセンス突然変異によるミトコンドリアＤＮＡ枯渇症候群、ナンセンス突然変異によるフェニルケトン尿症、ナンセンス突然変異による多発性肝嚢胞、ナンセンス突然変異による晩発性皮膚ポルフィリン症、ナンセンス突然変異による進行性家族性肝内胆汁うっ滞症、ナンセンス突然変異によるウィルソン病、ナンセンス突然変異による常染色体優性高コレステロール血症、ナンセンス突然変異による第ＸＩＩ因子欠損症、ナンセンス突然変異による第Ｘ因子欠損症、ナンセンス突然変異による低フィブリノーゲン血症、ナンセンス突然変異による無フィブリノーゲン血症、並びに、ナンセンス突然変異による第ＶＩＩ因子欠損症から選択される、請求項１に記載の薬剤。
【請求項４】
前記遺伝子疾患は、以下の遺伝子疾患：ナンセンス突然変異によるアシドーシス、ナンセンス突然変異によるアルポート症候群、ナンセンス突然変異によるバルデー・ビードル症候群、ナンセンス突然変異によるバート・ホッグ・デュベ症候群、ナンセンス突然変異によるデント病、ナンセンス突然変異によるギテルマン症候群、ナンセンス突然変異による遺伝性平滑筋腫症及び腎細胞がん、ナンセンス突然変異による遺伝性球状赤血球症、ナンセンス突然変異によるレーバー先天性黒内障、ナンセンス突然変異によるリジン尿性蛋白不耐症、ナンセンス突然変異によるネフロン癆、ナンセンス突然変異による多発性腎嚢胞、ナンセンス突然変異による偽性低アルドステロン症、ナンセンス突然変異による腎形成不全、ナンセンス突然変異による散発性明細胞腎細胞がん、ナンセンス突然変異による２型乳頭状腎細胞がん、ナンセンス突然変異による泌尿器顔面症候群、ナンセンス突然変異によるフォンヒッペル・リンドウ病、ナンセンス突然変異によるウィルムス腫瘍、ナンセンス突然変異によるＸ連鎖型アルポート症候群、ナンセンス突然変異によるＸ連鎖性低リン血症性くる病、ナンセンス突然変異による高尿酸血症性腎症（若年性／髄質嚢胞腎）、ナンセンス突然変異による結節性硬化症、ナンセンス突然変異によるネフローゼ症候群／先天性ネフローゼ症候群、ナンセンス突然変異によるフィンランド型ネフローゼ症候群、ナンセンス突然変異によるネフローゼ症候群、ナンセンス突然変異によるステロイド抵抗性ネフローゼ症候群３、ナンセンス突然変異による早期発症ネフローゼ症候群／ピアソン症候群、ナンセンス突然変異によるデニス・ドラッシュ症候群、ナンセンス突然変異によるネフローゼ症候群／シムケ免疫性骨形成不全、ナンセンス突然変異による原発性グルココルチコイド耐性、ナンセンス突然変異によるＸ連鎖性低リン酸血症、ナンセンス突然変異による原発性高シュウ酸尿症１型、ナンセンス突然変異による偽性低アルドステロン症１型、並びに、ナンセンス突然変異による近位尿細管性アシドーシスから選択される、請求項１に記載の薬剤。
【請求項５】
前記遺伝子疾患は、以下の遺伝子疾患：ナンセンス突然変異による大腸がん、ナンセンス突然変異による先天性エンテロペプチダーゼ欠損症、ナンセンス突然変異による嚢胞性線維症、ナンセンス突然変異によるハンガリアンポイツ・イエーガー症候群、ナンセンス突然変異によるジャーベル・ランゲニールセン症候群、ナンセンス突然変異によるリンチ症候群、ナンセンス突然変異による微絨毛封入体病、ナンセンス突然変異によるポイツ・イエーガー症候群、及び、ナンセンス突然変異によるキサンチン尿症から選択される、請求項１に記載の薬剤。
【請求項６】
前記遺伝子疾患は、以下の遺伝子疾患：ナンセンス突然変異によるβサラセミア、ナンセンス突然変異によるエーラス・ダンロス症候群、ナンセンス突然変異による内転握り／内反足症候群（ａｄｄｕｃｔｅｄ  ｔｈｕｍｂ−ｃｌｕｂｆｏｏｔ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ナンセンス突然変異によるアラジール症候群、ナンセンス突然変異によるアルストレム症候群、ナンセンス突然変異によるアンチトロンビン欠乏症、ナンセンス突然変異によるカーニー複合、ナンセンス突然変異によるクラリーノ症候群、ナンセンス突然変異によるダイアモンド−ブラックファン貧血、ナンセンス突然変異による骨髄性プロトポルフィリン症、ナンセンス突然変異によるファブリー病、ナンセンス突然変異による第ＸＩＩＩ因子欠損症、ナンセンス突然変異によるファンコニ−ビッケル症候群、ナンセンス突然変異による魚臭症候群、ナンセンス突然変異による遺伝性出血性毛細血管拡張症、ナンセンス突然変異によるホモシスチン尿症、ナンセンス突然変異によるジュベール症候群及び関連疾患、ナンセンス突然変異によるクラッベ病、ナンセンス突然変異によるＬ−２−ヒドロキシグルタル酸尿症、ナンセンス突然変異によるメチルマロン酸血症、ナンセンス突然変異によるニーマン・ピック病、ナンセンス突然変異によるピーターズプラス症候群、ナンセンス突然変異によるタウンズ・ブロックス病、ナンセンス突然変異によるフォン・ヴィレブランド病、ナンセンス突然変異によるウィスコット・アルドリッチ症候群、ナンセンス突然変異による歌舞伎症候群、ナンセンス突然変異によるドルフマン−シャナリン症候群、ナンセンス突然変異によるレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ欠損症／魚眼病、ナンセンス突然変異によるマルファン症候群、ナンセンス突然変異によるムコ多糖症、ナンセンス突然変異によるアミロイドーシス、ナンセンス突然変異による遅発型小児性神経セロイドリポフスチン沈着症（Ｌａｔｅ  Ｉｎｆａｎｔｉｌｅ  Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｃｅｒｏｉｄ  Ｌｉｐｏｆｕｓｃｉｎｏｓｉｓ）、ナンセンス突然変異によるコエンザイムＱ１０欠乏症、ナンセンス突然変異によるペルオキシソーム形成異常症、ナンセンス突然変異によるリソソーム蓄積症、並びに、ナンセンス突然変異による色覚異常から選択される、請求項１に記載の薬剤。
【請求項７】
前記遺伝子疾患は、以下の遺伝子疾患：ナンセンス突然変異による網膜色素変性症、ナンセンス突然変異によるアッシャー症候群１Ｃ型、ナンセンス突然変異による栄養障害型表皮水疱症、ナンセンス突然変異によるヘイリーヘイリー病、ナンセンス突然変異によるヘルリッツ型接合部型表皮水疱症、及び、ナンセンス突然変異によるネザートン症候群から選択される、請求項１に記載の薬剤。
【請求項８】
注射に適した１以上の薬学的に許容される賦形剤を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項９】
前記ナンセンス突然変異を含む遺伝子の翻訳によって生じるｍＲＮＡ未熟終止コドンの読み飛ばしを促進できる化合物をさらに含む、請求項８に記載の薬剤。
【請求項１０】
前記化合物は３−［５−（２−フルオロフェニル）−１，２，４−オキサジアゾル−３−イル］安息香酸である、請求項９に記載の薬剤。
【請求項１１】
患者又は患畜の遺伝子がナンセンス突然変異を有するかどうかを診断するエクスビボ方法であって、
エクスビボで前記患者又は患畜の細胞を請求項１に記載の薬剤の非存在下と存在下で培養する工程と；
エクスビボで合成されたＲＮＡ及び／又はタンパク質を前記患者又は患畜の細胞から抽出する工程を含み、
請求項１に記載の薬剤の存在下で培養した細胞から精製したＲＮＡ及び／又はタンパク質の量が、請求項１に記載の薬剤の非存在下で培養した細胞から精製したＲＮＡ及び／又はタンパク質の量と比較して増加していれば前記患者又は患畜がナンセンス突然変異を有することが示される方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、「ナンセンス突然変異による疾患（ｎｏｎｓｅｎｓｅ−ｍｕｔａｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｉｓｅａｓｅ）」とも呼ばれるナンセンス突然変異によって引き起こされる遺伝子疾患の治療、予防又は診断に用いられる化合物に関する。また、本発明は、上記化合物を含む医薬組成物にも関する。さらに、本発明は、所定の遺伝子中のナンセンス突然変異の有無を判断する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ナンセンス突然変異は、メッセンジャーＲＮＡ（以下、ｍＲＮＡという）中のセンスコドンを未熟終止コドンに変換させる、遺伝子のインフレーム変異である。未熟終止コドン（以下、ＰＴＣという）は、正常な終止コドンの上流にある遺伝子のコード配列に位置する終止コドンを意味する。正常な終止コドンは遺伝子翻訳を停止させて完全長の野生型タンパク質の合成が可能である。ＰＴＣは野生型タンパク質の合成を妨げ、変異遺伝子のサイレンシングをもたらす。タンパク質が欠乏（部分的又は完全欠乏）すると病変が生じる。例えば、ジストロフィンタンパク質をコードする遺伝子中にＰＴＣが存在すると、ナンセンス突然変異によるデュシェンヌ型筋ジストロフィーを少年に引き起こす。
【０００３】
ＪＡＫ１、ＳＹＮＪ２又はＣＬＰＴＭ１遺伝子中にＰＴＣが存在すると、ナンセンス突然変異による前立腺がんが引き起こされることが知られている（非特許文献１を参照）。ＧＡＢＡＡ受容体サブユニット遺伝子中にＰＴＣが存在すると、ナンセンス突然変異によるてんかんが引き起こされることも知られている（非特許文献２）。
【０００４】
特許文献１には、ナンセンス突然変異による疾患の治療に有用な化合物が開示されている。この文献に開示された化合物はインドール誘導体であり、あらかじめ２種のプラスミドで形質転換したＨｅＬａがん細胞と、ＤＭＤ（デュシェンヌ型筋ジストロフィー）患者由来の２種のリンパ芽球細胞株に対して試験されている。特許文献２には、ナンセンス突然変異により生じるＰＴＣによって引き起こされる遺伝子疾患の治療に有用な化合物が開示されている。特許文献２に開示された化合物の一つ（アタルレン（ａｔａｌｕｒｅｎ））は現在、ナンセンス突然変異による血友病Ａ及びＢの経口治療剤として第２ａ相臨床試験において、ナンセンス突然変異によるメチルマロン酸血症の第２相試験において、さらに、ナンセンス突然変異による嚢胞性線維症患者の第３相試験において検討されている。ナンセンス突然変異によるデュシェンヌ型・ベッカー型筋ジストロフィー患者の第２ａ相試験は既に完了している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００８／１０１９３５号
【特許文献２】国際公開第２００４／０９１５０２号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＪＡＫ１，ＳＹＮＪ２  ａｎｄ  ＣＬＰＴＭ１  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ，ｕｓｉｎｇ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｎｓｅｎｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｃａｙ  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ”ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（２００５）
【非特許文献２】“Ｍａｋｉｎｇ  ｓｅｎｓｅ  ｏｆ  ｎｏｎｓｅｎｓｅ  ＧＡＢＡＡ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｐｉｌｅｐｓｉｅｓ”ｉｎ  Ｃｅｌｌ（２０１０）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的の一つは、ナンセンス突然変異によって引き起こされる遺伝子疾患を治療することが可能な化合物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
従って、本発明は、ナンセンス突然変異による疾患である遺伝子疾患の治療又は予防に用いられる式（Ｉ）の化合物又はその塩、溶媒和物、包接化合物、水和物若しくは多形体を提供する。
【０００９】
【化１】
0005877200.tif 000002
【００１０】
式（Ｉ）の化合物（２−アミノ−７−イソプロピル−５−オキソ−５Ｈ−クロメノ［２，３−ｂ］ピリジン−３−カルボン酸）は一般的にアンレキサノクス（ａｍｌｅｘａｎｏｘ）と呼ばれており、現在、経口投与時には喘息及びアレルギー性鼻炎の治療用、局所投与時には口内炎治療用の治療剤として用いられている。
【００１１】
また、アフタ性潰瘍の治療にも用いられている（Ａｐｈｔｈａｓｏｌ（登録商標））。抗炎症作用及び抗アレルギー作用を有することで知られており、気管支喘息の治療でも用いられている。その安全性プロファイルは周知である。
【００１２】
国際公開第２００９／１５１５６９号は、ＢＡＲ（β（２）−アドレナリン受容体）アゴニストを患者又は患畜に投与することによってＢ細胞増殖性疾患を治療する方法に関する。ＢＡＲアゴニストの投与は単独治療として行うことも、ＰＤＥ酵素阻害剤のような１以上の他の薬剤と組み合わせて行うこともできる。本発明の化合物はＰＤＥ阻害剤として挙げられた多くの化合物の中の一つである。国際公開第２００９／１５１５６９号には、上記増殖機構に遺伝子変異が関与していることは記載も示唆もされていない。
【００１３】
国際公開第２００８／０２１２１０号は、各表に列挙された化合物を用いて神経変性疾患を治療する方法に関する。本発明の化合物は表１ａに抗ヒスタミン剤（Ｈ１）、ロイコトリエン受容体拮抗薬、抗アレルギー薬及び抗炎症薬として開示されている。国際公開第２００８／０２１２１０号には、それらの治療対象の疾患に遺伝子変異が関与していることは開示も示唆もされていない。
【００１４】
国際公開第２０１０／１３９９８５号は、好中球増加に関連する疾患の治療に本発明の化合物を使用することを開示している。好中球増加は、血液中の好中性顆粒球量が多い患者又は患畜の状態に対して用いる用語である。好中球は、哺乳類において最も多く存在する白血球の一種である。好中球は炎症性疾患と関係があり、炎症過程において、特に細菌感染、環境暴露及びある種のがんにおいて最初の反応となるものである。国際公開第２０１０／１３９９８５号には、上記化合物をナンセンス突然変異による疾患の治療に使用することは開示も示唆もされていない。
【００１５】
また、米国特許出願公開第２００７／０１３５４７３号明細書は、Ｓ１００ファミリーの１以上のタンパク質を発現する腫瘍細胞に関連する疾患の治療に本発明の化合物を使用することを開示している。上記化合物は、上記腫瘍の進行及び／又は転移を遅延させるのに有効であると考えられている。Ｓ１００タンパク質は様々な細胞内及び細胞外機能に関与している。Ｓ１００タンパク質は、タンパク質リン酸化、転写因子、Ｃａ＋＋恒常性、細胞骨格成分の動態、酵素活性、細胞増殖及び分化、並びに、炎症反応の制御に関係している。しかしながら、米国特許出願公開第２００７／０１３５４７３号明細書には、ナンセンス突然変異による疾患の治療に式（Ｉ）の化合物を使用することは開示も示唆もされていない。また、ナンセンス突然によって引き起こされる疾患にＳ１００タンパク質が関係しているという証拠は示されていない。
【００１６】
本出願人らは、式（Ｉ）の化合物が、以下に説明するように、変異遺伝子に応じて、ナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解（以下、ＮＭＤという）の阻害能を有し、及び／又は、読み飛ばし（ｒｅａｄｔｈｒｏｕｇｈ）効果を示すことを見出した。従って、本発明の化合物によって機能性タンパク質の合成が可能となる。
【００１７】
理論的には、ＰＴＣがｍＲＮＡに存在する場合、リボソームは短縮されたタンパク質（短縮タンパク質）を合成する。短縮タンパク質は野生型タンパク質に比べて短いペプチド鎖を有する。野生型タンパク質は、対応の遺伝子が全く変異していない場合に合成されるタンパク質を意味する。短縮タンパク質は機能性を有していてもいなくてもよい。すなわち、短縮タンパク質は野生型タンパク質による効果と同様な効果を細胞又は全身に及ぼす場合も、及ぼさない場合もある。ＰＴＣを含むｍＲＮＡが有機体により除去されてから、定常状態の翻訳が行われる。このＰＴＣを含むｍＲＮＡの分解は、ナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解（ＮＭＤ）とも呼ばれる。ＮＭＤは全ての真核生物に生来備わっている質的監視機構である。ＮＭＤはＰＴＣを含むｍＲＮＡを分解しようとする。
【００１８】
ナンセンス突然変異を有する遺伝子の翻訳によって得られる短縮タンパク質が機能性を有する場合もある。短縮タンパク質が野生型タンパク質より短いにもかかわらず、短縮タンパク質の機能性が発現してもよい。すなわち、短縮タンパク質は野生型と異なっていたとしても、野生型タンパク質と同様な効果を細胞や有機体に及ぼすものであってもよい。この場合、短縮タンパク質は野生型の表現型を発現する。結果的に、この場合には、ＮＭＤが阻害されると、機能性短縮タンパク質は細胞内に留まり、まるで対応の遺伝子がナンセンス突然変異を全く有さないかのように野生型タンパク質と同様な機能を細胞内、従って有機体内で示す。
【００１９】
ＮＭＤ機構は周知であり、幾つかの刊行物に記載されている（Ｃｏｎｔｉ，Ｅ．ａｎｄ  Ｅ．Ｉｚａｕｒｒａｌｄｅ，Ｎｏｎｓｅｎｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｍＲＮＡ  ｄｅｃａｙ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ  ａｃｒｏｓｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，２００５．１７（３）：ｐ．３１６−２５、及び、Ｍａｑｕａｔ，Ｌ．Ｅ．，Ｎｏｎｓｅｎｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｍＲＮＡ  ｄｅｃａｙ：ｓｐｌｉｃｉｎｇ，ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍＲＮＰ  ｄｙｎａｍｉｃｓ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，２００４．５（２）：ｐ．８９−９９を参照）。
【００２０】
特定の条件下では、終止コドン（未熟又は成熟）がｍＲＮＡに含まれているにもかかわらず、リボソームは終止コドンの位置にアミノ酸を組み入れることによって上記ｍＲＮＡをタンパク質に翻訳し続けることが知られている。この現象は「読み飛ばし（ｒｅａｄｔｈｒｏｕｇｈ）」と呼ばれている。ナンセンス変異の位置に組み入れられたアミノ酸は、野生型タンパク質に存在するアミノ酸と同一である場合も、異なる場合もある。結果として、得られるタンパク質は、ナンセンス変異の位置にあるアミノ酸のタンパク質機能に対する役割によって機能性を有していたりいなかったりする。
【００２１】
ここ何年か、インフレームＰＴＣを生じる変異に対する薬理学的手法を開発しようとする試みがなされている。それらの治療手法は、ＰＴＣの翻訳読み飛ばしを促進して、完全長の機能性タンパク質を十分な量、合成及び発現できるようにすることを目的としている。上記研究の多くにおいて、読み飛ばし薬はアミノグリコシド類、主にゲンタマイシンである。高濃度及び／又は長期治療によって腎障害や失聴などの重度の副作用が引き起こされるため、ゲンタマイシンの臨床的利点は限られている。近年、ＰＴＣ１２４すなわちアタルレンがＰＴＣの読み飛ばしを促進できる小有機化合物として同定された。国際公開第２００４／０９１５０２号はＰＴＣ１２４及び１，２，４−オキサジアゾール安息香酸誘導体を開示している。
【００２２】
本発明によれば、「ＮＭＤ阻害」はＮＭＤの部分的な又は完全な阻害を意味し、「ＰＴＣ読み飛ばし」はＰＴＣの部分的な又は完全な読み飛ばしを意味する。本発明の化合物が読み飛ばし効果を有することが見出された。従って、本発明の化合物は、ナンセンス突然変異によって引き起こされる遺伝子疾患（ナンセンス突然変異による疾患ともいう）の治療に用いることができる。上記ナンセンス突然変異はＮＭＤを活性化する変異を意味する。
【００２３】
本発明によれば、「機能性タンパク質」は野生型タンパク質と同様な細胞機能を示すことが可能な短縮されたタンパク質（短縮タンパク質）又は短縮されていないタンパク質（非短縮タンパク質）を意味する。本発明の化合物がＮＭＤを阻害する場合に機能性短縮タンパク質を得ることができる。本発明の化合物がＰＴＣの読み飛ばしを促進する場合に機能性非短縮タンパク質を得ることができる。ＮＭＤ阻害は完全な阻害であっても、単に部分的な阻害であってもよい。部分的な阻害の場合、本発明の化合物はＮＭＤを完全に抑制するものでなくてもよい。本発明の化合物がＮＭＤを部分的に又は完全に阻害すると、ＰＴＣを含むｍＲＮＡの量は増加し、結果として、該化合物による読み飛ばしの促進に有利になり得る。
【００２４】
細胞、組織及び／又は有機体全体において通常の活性を可能とするのに少量の機能性タンパク質で充分な場合もあることが知られている。患者又は患畜において野生型の表現型を得るのに低濃度の機能性タンパク質で充分な場合もある。本発明によれば、「患者又は患畜」という用語は、あらゆる生体、具体的には哺乳類のような動物、より具体的にはヒトに関する。
【００２５】
本発明の化合物によって、ナンセンス突然変異による疾患を治療及び／又は予防することができる。本発明の化合物によって、上記疾患症状の１以上を除去又は軽減することができる。
【００２６】
本発明の化合物は、上述した疾患に罹患した上述の任意の患者又は患畜に投与することができる。式（Ｉ）の化合物の塩を用いることができ、該塩は本発明において限定されない。例えば、式（Ｉ）の化合物をアルカリ化合物と反応させて得られる塩も本発明に包含される。そのような反応によって、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム又はアンモニウム塩及び塩化物を得ることができる。式（Ｉ）の化合物と少なくとも１つの有機又は無機酸の反応によって他の塩を調製することもできる。
【００２７】
本発明によれば、多形体という用語は本発明の化合物の非晶質形態又は結晶形態の任意の混合物に関する。
【００２８】
本発明によれば、ナンセンス突然変異によって引き起こされる疾患は限定されない。多くのナンセンス突然変異による疾患が開示されている。肝臓又は消化管の機能、腎臓機能、心臓血管機能、肺機能、筋肉機能、骨髄機能、中枢神経系機能、代謝、器官形成、炎症及び免疫などの身体の多くの器官又は機能がナンセンス突然変異による疾患によって影響を受け得る。
【００２９】
例えば、上記ナンセンス突然変異による疾患は以下から選択される。
ナンセンス突然変異によるβサラセミア、ナンセンス突然変異によるエーラス・ダンロス症候群、ナンセンス突然変異による乳児重症ミオクロニーてんかん、ナンセンス突然変異による色覚異常、ナンセンス突然変異による網膜色素変性症、ナンセンス突然変異によるアッシャー症候群１Ｃ型、ナンセンス突然変異による内転握り／内反足症候群（ａｄｄｕｃｔｅｄ  ｔｈｕｍｂ−ｃｌｕｂｆｏｏｔ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ナンセンス突然変異によるアラジール症候群、ナンセンス突然変異によるアルストレム症候群、ナンセンス突然変異によるアンチトロンビン欠乏症、ナンセンス突然変異によるカーニー複合、ナンセンス突然変異によるクラリーノ症候群、ナンセンス突然変異によるダイアモンド−ブラックファン貧血、ナンセンス突然変異による骨髄性プロトポルフィリン症、ナンセンス突然変異によるファブリー病、ナンセンス突然変異による第ＸＩＩＩ因子欠損症、ナンセンス突然変異によるファンコニ−ビッケル症候群、ナンセンス突然変異による魚臭症候群、ナンセンス突然変異によるゴーシェ病、ナンセンス突然変異による遺伝性出血性毛細血管拡張症、ナンセンス突然変異によるホモシスチン尿症、ナンセンス突然変異によるジュベール症候群及び関連疾患、ナンセンス突然変異によるクラッベ病、ナンセンス突然変異によるＬ−２−ヒドロキシグルタル酸尿症、ナンセンス突然変異によるメチルマロン酸血症、ナンセンス突然変異によるニーマン・ピック病、ナンセンス突然変異によるピーターズプラス症候群、ナンセンス突然変異によるタウンズ・ブロックス病、ナンセンス突然変異によるフォン・ヴィレブランド病、ナンセンス突然変異によるウィスコット・アルドリッチ症候群、ナンセンス突然変異による歌舞伎症候群、ナンセンス突然変異によるドルフマン−シャナリン症候群、ナンセンス突然変異によるレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ欠損症／魚眼病、ナンセンス突然変異によるマルファン症候群、ナンセンス突然変異によるムコ多糖症、ナンセンス突然変異によるアミロイドーシス、ナンセンス突然変異による遅発型小児性神経セロイドリポフスチン沈着症（Ｌａｔｅ  Ｉｎｆａｎｔｉｌｅ  Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｃｅｒｏｉｄ  Ｌｉｐｏｆｕｓｃｉｎｏｓｉｓ）、ナンセンス突然変異によるコエンザイムＱ１０欠乏症、ナンセンス突然変異によるペルオキシソーム形成異常症、ナンセンス突然変異によるリソソーム蓄積症、ナンセンス突然変異による大腸がん、ナンセンス突然変異による先天性エンテロペプチダーゼ欠損症、ナンセンス突然変異による嚢胞性線維症、ナンセンス突然変異によるハンガリアンポイツ・イエーガー症候群、ナンセンス突然変異によるジャーベル・ランゲニールセン症候群、ナンセンス突然変異によるリンチ症候群、ナンセンス突然変異による微絨毛封入体病、ナンセンス突然変異によるポイツ・イエーガー症候群、ナンセンス突然変異によるキサンチン尿症、ナンセンス突然変異によるアシドーシス、ナンセンス突然変異によるアルポート症候群、ナンセンス突然変異によるバルデー・ビードル症候群、ナンセンス突然変異によるバート・ホッグ・デュベ症候群、ナンセンス突然変異によるデント病、ナンセンス突然変異によるギテルマン症候群、ナン���ンス突然変異による遺伝性平滑筋腫症及び腎細胞がん、ナンセンス突然変異による遺伝性球状赤血球症、ナンセンス突然変異によるレーバー先天性黒内障、ナンセンス突然変異によるリジン尿性蛋白不耐症、ナンセンス突然変異によるネフロン癆、ナンセンス突然変異による多発性腎嚢胞、ナンセンス突然変異による偽性低アルドステロン症、ナンセンス突然変異による腎形成不全、ナンセンス突然変異による散発性明細胞腎細胞がん、ナンセンス突然変異による２型乳頭状腎細胞がん、ナンセンス突然変異による泌尿器顔面症候群、ナンセンス突然変異によるフォンヒッペル・リンドウ病、ナンセンス突然変異によるウィルムス腫瘍、ナンセンス突然変異によるＸ連鎖型アルポート症候群、ナンセンス突然変異によるＸ連鎖性低リン血症性くる病、ナンセンス突然変異による高尿酸血症性腎症（若年性／髄質嚢胞腎）、ナンセンス突然変異による結節性硬化症、ナンセンス突然変異によるネフローゼ症候群／先天性ネフローゼ症候群、ナンセンス突然変異によるフィンランド型ネフローゼ症候群、ナンセンス突然変異によるステロイド抵抗性ネフローゼ症候群３、ナンセンス突然変異による早期発症ネフローゼ症候群／ピアソン症候群、ナンセンス突然変異によるデニス・ドラッシュ症候群、ナンセンス突然変異によるネフローゼ症候群／シムケ免疫性骨形成不全、ナンセンス突然変異による原発性グルココルチコイド耐性、ナンセンス突然変異によるＸ連鎖性低リン酸血症、ナンセンス突然変異による原発性高シュウ酸尿症１型、ナンセンス突然変異による偽性低アルドステロン症１型、ナンセンス突然変異による近位尿細管性アシドーシス、ナンセンス突然変異による無βリポ蛋白血症及びホモ接合体性家族性低βリポ蛋白血症、ナンセンス突然変異によるアルパーズ症候群、ナンセンス突然変異によるカルバミルリン酸合成酵素Ｉ欠損症、ナンセンス突然変異によるコレステロールエステル蓄積症、ナンセンス突然変異によるシトリン欠損症、ナンセンス突然変異によるデュビン・ジョンソン症候群、ナンセンス突然変異による骨髄性プロトポルフィリン症、ナンセンス突然変異による第Ｖ因子欠損症、ナンセンス突然変異による糖原病、ナンセンス突然変異による血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子欠損症）、ナンセンス突然変異による血友病Ｂ（第ＩＸ因子欠損症）、ナンセンス突然変異による肝細胞がん、ナンセンス突然変異による肝骨髄性ポルフィリン症、ナンセンス突然変異による遺伝性痙性対麻痺、ナンセンス突然変異による低βリポ蛋白血症、ナンセンス突然変異による遺伝性第ＸＩ因子欠損症、ナンセンス突然変異による若年発症成人型糖尿病、ナンセンス突然変異による小球性貧血及び鉄欠乏症、ナンセンス突然変異によるミトコンドリアＤＮＡ枯渇、ナンセンス突然変異によるミトコンドリアＤＮＡ枯渇症候群、ナンセンス突然変異によるフェニルケトン尿症、ナンセンス突然変異による多発性肝嚢胞、ナンセンス突然変異による晩発性皮膚ポルフィリン症、ナンセンス突然変異による進行性家族性肝内胆汁うっ滞症、ナンセンス突然変異によるウィルソン病、ナンセンス突然変異による常染色体優性高コレステロール血症、ナンセンス突然変異による第ＸＩＩ因子欠損症、ナンセンス突然変異による第Ｘ因子欠���症、ナンセンス突然変異による低フィブリノーゲン血症、ナンセンス突然変異による無フィブリノーゲン血症、ナンセンス突然変異による第ＶＩＩ因子欠損症、ナンセンス突然変異による無ガンマグロブリン血症、ナンセンス突然変異による無巨核球性血小板減少症、ナンセンス突然変異による赤血球異形成貧血ＩＩ型、ナンセンス突然変異によるデュシェンヌ型・ベッカー型筋ジストロフィー、ナンセンス突然変異による中心核ミオパチー、ナンセンス突然変異による肢帯型筋ジストロフィー又は三好ミオパチー、ナンセンス突然変異によるウルリッヒ病、ナンセンス突然変異による脊髄性筋萎縮症、ナンセンス突然変異による栄養障害型表皮水疱症、ナンセンス突然変異によるヘイリーヘイリー病、ナンセンス突然変異によるヘルリッツ型接合部型表皮水疱症、並びに、ナンセンス突然変異によるネザートン症候群。
【００３０】
一実施形態において、上記ナンセンス突然変異による疾患は、βサラセミア、マルファン症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、ウルリッヒ病、ハーラー症候群、がん、嚢胞性線維症、脊髄性筋萎縮症、デンプン症（ａｍｙｌｏｓｉｓ）、ＬＩＮＣＬ（遅発型小児性神経セロイドリポフスチン沈着症）、血友病、アルツハイマー病、アテローム性動脈硬化、巨人症、小人症、甲状腺機能低下症、甲状腺機能亢進症、肥満、パーキンソン病、ニーマン・ピック病、家族性高コレステロール血症、及び、網膜色素変性症から選択される。
【００３１】
幾つかの研究から、式（Ｉ）の化合物は肝臓、腎臓及び腸に分布させるのが好ましいことが示されている。肺、心臓、筋肉及び皮膚は、経口投与時に式（Ｉ）の化合物に暴露される割合がわずかに低い。疾患の生理病理学や上掲した各疾患の罹患器官を考慮すれば、本発明において、上記ナンセンス突然変異による疾患は以下から選択されるのが好ましい。
【００３２】
肝臓に影響を及ぼす疾患：ナンセンス突然変異による無βリポ蛋白血症及びホモ接合体性家族性低βリポ蛋白血症、ナンセンス突然変異によるアルパーズ症候群、ナンセンス突然変異によるカルバミルリン酸合成酵素Ｉ欠損症、ナンセンス突然変異によるコレステロールエステル蓄積症、ナンセンス突然変異によるシトリン欠損症、ナンセンス突然変異によるデュビン・ジョンソン症候群、ナンセンス突然変異による骨髄性プロトポルフィリン症、ナンセンス突然変異による第Ｖ因子欠損症、ナンセンス突然変異による糖原病、ナンセンス突然変異による血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子欠損症）、ナンセンス突然変異による血友病Ｂ（第ＩＸ因子欠損症）、ナンセンス突然変異による肝細胞がん、ナンセンス突然変異による肝骨髄性ポルフィリン症、ナンセンス突然変異による遺伝性痙性対麻痺、ナンセンス突然変異による低βリポ蛋白血症、ナンセンス突然変異による遺伝性第ＸＩ因子欠損症、ナンセンス突然変異による若年発症成人型糖尿病、ナンセンス突然変異による小球性貧血及び鉄欠乏症、ナンセンス突然変異によるミトコンドリアＤＮＡ枯渇、ナンセンス突然変異によるミトコンドリアＤＮＡ枯渇症候群、ナンセンス突然変異によるフェニルケトン尿症、ナンセンス突然変異による多発性肝嚢胞、ナンセンス突然変異による晩発性皮膚ポルフィリン症、ナンセンス突然変異による進行性家族性肝内胆汁うっ滞症、ナンセンス突然変異によるウィルソン病、ナンセンス突然変異による常染色体優性高コレステロール血症、ナンセンス突然変異による第ＸＩＩ因子欠損症、ナンセンス突然変異による第Ｘ因子欠損症、ナンセンス突然変異による低フィブリノーゲン血症、ナンセンス突然変異による無フィブリノーゲン血症、並びに、ナンセンス突然変異による第ＶＩＩ因子欠損症；
【００３３】
腎臓に影響を及ぼす疾患：ナンセンス突然変異によるアシドーシス、ナンセンス突然変異によるアルポート症候群、ナンセンス突然変異によるバルデー・ビードル症候群、ナンセンス突然変異によるバート・ホッグ・デュベ症候群、ナンセンス突然変異によるデント病、ナンセンス突然変異によるギテルマン症候群、ナンセンス突然変異による遺伝性平滑筋腫症及び腎細胞がん、ナンセンス突然変異による遺伝性球状赤血球症、ナンセンス突然変異によるレーバー先天性黒内障、ナンセンス突然変異によるリジン尿性蛋白不耐症、ナンセンス突然変異によるネフロン癆、ナンセンス突然変異による多発性腎嚢胞、ナンセンス突然変異による偽性低アルドステロン症、ナンセンス突然変異による腎形成不全、ナンセンス突然変異による散発性明細胞腎細胞がん、ナンセンス突然変異による２型乳頭状腎細胞がん、ナンセンス突然変異による泌尿器顔面症候群、ナンセンス突然変異によるフォンヒッペル・リンドウ病、ナンセンス突然変異によるウィルムス腫瘍、ナンセンス突然変異によるＸ連鎖型アルポート症候群、ナンセンス突然変異によるＸ連鎖性低リン血症性くる病、ナンセンス突然変異による高尿酸血症性腎症（若年性／髄質嚢胞腎）、ナンセンス突然変異による結節性硬化症、ナンセンス突然変異によるネフローゼ症候群／先天性ネフローゼ症候群、ナンセンス突然変異によるフィンランド型ネフローゼ症候群、ナンセンス突然変異によるステロイド抵抗性ネフローゼ症候群３、ナンセンス突然変異による早期発症ネフローゼ症候群／ピアソン症候群、ナンセンス突然変異によるデニス・ドラッシュ症候群、ナンセンス突然変異によるネフローゼ症候群／シムケ免疫性骨形成不全、ナンセンス突然変異による原発性グルココルチコイド耐性、ナンセンス突然変異によるＸ連鎖性低リン酸血症、ナンセンス突然変異による原発性高シュウ酸尿症１型、ナンセンス突然変異による偽性低アルドステロン症１型、並びに、ナンセンス突然変異による近位尿細管性アシドーシス；
【００３４】
腸に影響を及ぼす疾患：ナンセンス突然変異による大腸がん、ナンセンス突然変異による先天性エンテロペプチダーゼ欠損症、ナンセンス突然変異による嚢胞性線維症、ナンセンス突然変異によるハンガリアンポイツ・イエーガー症候群、ナンセンス突然変異によるジャーベル・ランゲニールセン症候群、ナンセンス突然変異によるリンチ症候群、ナンセンス突然変異による微絨毛封入体病、ナンセンス突然変異によるポイツ・イエーガー症候群、及び、ナンセンス突然変異によるキサンチン尿症；
【００３５】
幾つかの器官に影響を及ぼす疾患：ナンセンス突然変異によるβサラセミア、ナンセンス突然変異によるエーラス・ダンロス症候群、ナンセンス突然変異による内転握り／内反足症候群（ａｄｄｕｃｔｅｄ  ｔｈｕｍｂ−ｃｌｕｂｆｏｏｔ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ナンセンス突然変異によるアラジール症候群、ナンセンス突然変異によるアルストレム症候群、ナンセンス突然変異によるアンチトロンビン欠乏症、ナンセンス突然変異によるカーニー複合、ナンセンス突然変異によるクラリーノ症候群、ナンセンス突然変異によるダイアモンド−ブラックファン貧血、ナンセンス突然変異による骨髄性プロトポルフィリン症、ナンセンス突然変異によるファブリー病、ナンセンス突然変異による第ＸＩＩＩ因子欠損症、ナンセンス突然変異によるファンコニ−ビッケル症候群、ナンセンス突然変異による魚臭症候群、ナンセンス突然変異によるゴーシェ病、ナンセンス突然変異による遺伝性出血性毛細血管拡張症、ナンセンス突然変異によるホモシスチン尿症、ナンセンス突然変異によるジュベール症候群及び関連疾患、ナンセンス突然変異によるクラッベ病、ナンセンス突然変異によるＬ−２−ヒドロキシグルタル酸尿症、ナンセンス突然変異によるメチルマロン酸血症、ナンセンス突然変異によるニーマン・ピック病、ナンセンス突然変異によるピーターズプラス症候群、ナンセンス突然変異によるタウンズ・ブロックス病、ナンセンス突然変異によるフォン・ヴィレブランド病、ナンセンス突然変異によるウィスコット・アルドリッチ症候群、ナンセンス突然変異による歌舞伎症候群、ナンセンス突然変異によるドルフマン−シャナリン症候群、ナンセンス突然変異によるレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ欠損症／魚眼病、ナンセンス突然変異によるマルファン症候群、ナンセンス突然変異によるムコ多糖症、ナンセンス突然変異によるアミロイドーシス、ナンセンス突然変異による遅発型小児性神経セロイドリポフスチン沈着症（Ｌａｔｅ  Ｉｎｆａｎｔｉｌｅ  Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｃｅｒｏｉｄ  Ｌｉｐｏｆｕｓｃｉｎｏｓｉｓ）、ナンセンス突然変異によるコエンザイムＱ１０欠乏症、ナンセンス突然変異によるペルオキシソーム形成異常症、並びに、ナンセンス突然変異によるリソソーム蓄積症。
【００３６】
式（Ｉ）の化合物は局所投与できることを考慮すれば、本発明において、上記ナンセンス突然変異による疾患は以下の皮膚又は目に影響を及ぼす疾患から選択することもできる。
ナンセンス突然変異による色覚異常、ナンセンス突然変異による網膜色素変性症、ナンセンス突然変異によるアッシャー症候群１Ｃ型、ナンセンス突然変異による栄養障害型表皮水疱症、ナンセンス突然変異によるヘイリーヘイリー病、ナンセンス突然変異によるヘルリッツ型接合部型表皮水疱症、及び、ナンセンス突然変異によるネザートン症候群。
【００３７】
通常、本発明の化合物は単独で（上述した任意の形態で）又は他の有効成分と組み合わせて、１以上の薬学的に許容される賦形剤との混合物として患者又は患畜に投与される。賦形剤は、投与様式や、化合物の溶解性及び安定性に対する賦形剤の影響に応じて適宜選択される。ガレヌス形態も該当する。
【００３８】
結果的に、本発明の第二の態様は、ナンセンス突然変異による疾患である遺伝子疾患の治療及び／又は予防に用いられる医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物は、有効成分として少なくとも１つの式（Ｉ）の化合物と、１以上の薬学的に許容される賦形剤を含む。本発明の組成物は本発明の化合物を含むため、該化合物自体と同様な毒性を有する。なお、本発明の化合物の毒性は経口投与に関しては既に評価されており、評価の対象は、任意に血中で代謝される場合もあるが上記分子自体の毒性であるため、注射製剤の毒性が異なることはないはずである。従って、本発明の組成物はすぐに使用することができ、医薬品として市販することができる。
【００３９】
一実施形態によれば、本発明の組成物は注射できる。この場合、賦形剤は液状である。活性分子は賦形剤に溶解又は懸濁させる。しかしながら、本発明の組成物はこの種の組成物に限定されない。
【００４０】
また、本発明は、読み飛ばし剤をさらに含む上述した医薬組成物に関する。読み飛ばし剤はＰＴＣの読み飛ばしを促進できる。ＰＴＣは、上記ナンセンス突然変異を有する遺伝子の転写により得られるｍＲＮＡ中に含まれる。本発明者らは、本発明の化合物と少なくとも１つの特定のＰＴＣ読み飛ばし分子の間に相乗効果がみられることを確認した。
【００４１】
上記読み飛ばし剤は３−［５−（２−フルオロフェニル）−１，２，４−オキサジアゾル−３−イル］安息香酸（国際公開第２００４／０９１５０２号に開示されたＰＴＣ１２４）であることが有利である。この読み飛ばし剤はあまり有効性が高くないため、高濃度となる量を患者又は患畜に投与しなければならない（１６〜４０ｍｇ／ｋｇ／日）。この読み飛ばし剤と本発明の化合物の間の相乗効果によって、該読み飛ばし剤の活性を高めることができる場合がある。よって、上記読み飛ばし剤の投与量がより少なくて済む。
【００４２】
従って、本発明の他の態様は、（ｉ）式（Ｉ）の化合物又はその塩、溶媒和物、包接化合物、水和物若しくは多形体と、
（ｉｉ）３−［５−（２−フルオロフェニル）−１，２，４−オキサジアゾル−３−イル］安息香酸の組み合わせに関する。治療有効成分（ｉ）（ｉｉ）は同時に、連続して又は一定時間をかけて投与することができる。
【００４３】
【化２】
0005877200.tif 000003
【００４４】
しかしながら、本発明においては、他の任意の読み飛ばし剤を本発明の化合物又はＰＴＣ１２４／式（Ｉ）の化合物の組み合わせと混合又は組み合わせてもよい。よって、この読み飛ばし剤は本発明の組成物中に含まれる。また、上記読み飛ばし剤を本発明の分子とともに同時投与又は遅延投与できるように別途調整してもよい。
【００４５】
当業者であれば、疾患がナンセンス突然変異によって引き起こされたものであるかどうかを判断することができる。所定のタンパク質に関して、そのタンパク質濃度が疾患に影響を及ぼすかどうかを検討することができる。当業者であれば、タンパク質濃度が低すぎることで引き起こされる所定の疾患がナンセンス突然変異による疾患であるかどうかを以下に述べる工程によって判断することができる。
・上記所定のタンパク質をコードする遺伝子を同定し、上記遺伝子の転写により得られるｍＲＮＡを同定する工程；及び、
・正常な遺伝子又は正常なｍＲＮＡと、上記疾患を罹患している患者又は患畜由来の遺伝子やｍＲＮＡを比較する工程。
【００４６】
また、本発明は、所定の遺伝子がナンセンス突然変異を有するかどうかを判断する方法に関する。上記所定の遺伝子はｍＲＮＡへ転写される。転写されたｍＲＮＡはＰＴＣを含み、所定の既知のタンパク質をコードしている。本発明の方法によれば、
・患者又は患畜の細胞を本発明の化合物又は医薬組成物とともに培養してＲＮＡ合成を行い；
・合成されたＲＮＡ及び／又はタンパク質を上記細胞から抽出し、さらに精製し、
・その後、精製されたＲＮＡを逆転写し、増幅してＲＮＡを定量できる。
【００４７】
一実施形態では、患者又は患畜の細胞は、ナンセンス突然変異が起こったと考えられる器官の細胞、又は、患者又は患畜由来の人工多能性幹細胞から分化した細胞である。別の実施形態では、精製したＲＮＡ及び／又はタンパク質の量が増加していれば、ＮＭＤ阻害及び／又は読み飛ばしが起こったこと、従ってナンセンス突然変異が存在することが示される。
【００４８】
結果として、本発明の方法によって、遺伝子疾患がナンセンス突然変異に少なくとも部分的に起因して引き起こされたものかどうかを判断することができる。従って、これにより治療を適合させることができる。
【００４９】
他の態様において、本発明は、式（Ｉ）の化合物又はそれを含む医薬組成物が、ナンセンス突然変異による遺伝子疾患と診断された患者又は患畜の治療に有効であるかどうかを評価する方法であって、
上記患者又は患畜を上記化合物又は上記医薬組成物で処置する工程と；
上記患者又は患畜の体内で少なくとも１つの疾患マーカーを観察するか、又は、合成されたＲＮＡ及び／若しくはタンパク質を上記患者又は患畜の細胞から抽出する工程を含み、上記疾患マーカーが変化しているか、又は、精製したＲＮＡ及び／若しくはタンパク質の量が増加していれば、ＮＭＤ阻害及び／又は読み飛ばしが起こったこと、故に上記治療が有効であることが示される方法に関する。
【００５０】
疾患マーカーは、ＰＴＣのせいで通常は合成されないタンパク質（短縮又は非短縮）であってもよい。また、疾患マーカーは疾患機構に関与する他の任意の物質、特に疾患の診断に通常用いられる任意の物質であってもよい。例えば、血友病Ａの場合、マーカーは第ＶＩＩＩ因子であってもよく、血友病Ｂの場合、マーカーは第ＩＸ因子であってもよく、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの場合、マーカーはジストロフィン自体であってもよく、嚢胞性線維症の場合、マーカーは汗中に排出される塩化物の濃度であってもよい。
【００５１】
また、本発明は、ナンセンス突然変異による遺伝子疾患を治療及び／又は予防するための医薬品の製造における、式（Ｉ）の化合物の使用に関する。
【００５２】
また、本発明は、ナンセンス突然変異による遺伝子疾患を治療する治療方法であって、式（Ｉ）の化合物及び／又は本発明の医薬組成物を投与する工程を含む方法に関する。
【００５３】
本発明、その特徴及び利点を以下の実施例及び図面に基づいて説明する。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】ホタルルシフェラーゼを用いて、ＨｅＬａ細胞における本発明の組成物のＮＭＤ阻害活性を示す。
【図２】Ｃａｌｕ−６細胞（遺伝子ナンセンス変異による肺がん患者由来の細胞）において本発明の組成物によるＮＭＤ阻害によってなされるＰ５３  ｍＲＮＡ安定化に対する活性分子濃度を示す。
【図３】Ｐ５３  ｍＲＮＡ／ＧＡＤＰＨ  ｍＲＮＡの比に対する本発明の組成物の活性分子濃度を示すグラフである。
【図４】本発明の組成物の存在下、Ｃａｌｕ−６細胞で合成された完全長Ｐ５３タンパク質を示す。
【図５】ＭＯＲ遺伝子がナンセンス突然変異を有するマウスモデルにおいて、マウス脳細胞中のｍＲＮＡ  ＭＯＲ濃度に対する活性化合物濃度を示す。
【図６】本発明の組成物とＰＴＣ１２４（未熟終止コドン読み飛ばし剤）の間の相乗効果を示す。
【図７】各種活性分子濃度で本発明の組成物とともに培養したＩＢ３細胞（ナンセンス突然変異による嚢胞性線維症患者由来の細胞）におけるＣＦＴＲ  ｍＲＮＡを示す。
【図８】本発明の組成物の存在下で培養したＩＢ３細胞におけるＣＦＴＲ  ｍＲＮＡ濃度に対する上記組成物の活性分子濃度を示す。
【図９】それぞれ本発明の活性化合物２５μｍｏｌ／Ｌを含む異なる３つの組成物とともに培養したＣａｌｕ−６細胞におけるＰ５３  ｍＲＮＡを示す。
【図１０】６−ＣＦＳＭＥｏ−細胞（ナンセンス突然変異による嚢胞性線維症患者由来の細胞）におけるヨウ化物流出に対する本発明の化合物の用量反応効果を示す。
【図１１】Ａ及びＢは、ナンセンス突然変異によるデュシェンヌ型筋ジストロフィー患者由来のＤＭＤ細胞におけるＰＴＣを含むジストロフィン遺伝子の発現に対する各種投与量の本発明の化合物の効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００５５】
下記実施例では式（Ｉ）の化合物を分子Ｇ０７と称する。試験では関連化合物Ｇ０８及びＧ０９も用いた。
【００５６】
【化３】
0005877200.tif 000004
【００５７】
実施例１：ホタルルシフェラーゼを用いたＮＭＤ阻害の測定
以下のＵＰＦタンパク質（ＵＰＦ１、ＵＰＦ２、ＵＰＦ３（ＵＰＦ３ａともいう）又はＵＰＦ３Ｘ（ＵＰＦ３ｂともいう））の１つがｍＲＮＡの３’ＵＴＲ部に存在すると、当該ｍＲＮＡにおいてＮＭＤが活性化される。ＵＰＦタンパク質が正常な終止コドンの下流に位置する場合には、この正常な終止コドンはＰＴＣと認識される。結果として、ＵＰＦタンパク質を含むｍＲＮＡはＮＭＤにより分解されることとなる。
【００５８】
ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡを発現するＨｅＬａ細胞株を使用した。ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡは３’ＵＴＲにＭＳ２結合部位を有する。上記細胞はさらに上記ＭＳ２タンパク質と上記４つのＵＰＦタンパク質のうちの１つからなる融合タンパク質を含んでいる。この融合タンパク質によって、ＵＰＦを正常な終止コドンの下流に（すなわち、上記ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ部に）配置できる。従って、正常な終止コドンはＰＴＣと認識される。その結果、ＮＭＤは活性化され、ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡを分解できる。
【００５９】
このように、上記細胞におけるルシフェラーゼ活性はＮＭＤ活性と直接関係がある。発光が弱ければＮＭＤが活性化されており、発光が強ければＮＭＤが阻害されている。Ｇ０７の存在下では、ルシフェラーゼ活性はコントロールウェルよりも高い。これは、Ｇ０７のＮＭＤ阻害活性を示している。
【００６０】
１０μｍｏｌ／ＬのＧ０７を含む１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）でＨｅＬａ細胞を培養した。
【００６１】
ｍＲＮＡに存在するＵＰＦタンパク質の種類にかかわらずＧ０７はＮＭＤを阻害するため、Ｇ０７は広く使用できるＮＭＤ阻害剤と考えられる。
【００６２】
実施例２：ナンセンス突然変異による肺がん患者由来の細胞に対するＧ０７の有益な効果
Ｃａｌｕ−６細胞（ＡＴＣＣ）はＰ５３遺伝子のコドン１９６にＵＧＡ  ＰＴＣを有する。このＣａｌｕ−６細胞は肺がん患者から単離されたものである。上記Ｃａｌｕ−６細胞のＲＮＡを逆転写し、放射性標識ヌクレオチドの存在下でＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）により増幅して、Ｐ５３  ｍＲＮＡ濃度及びＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ濃度を測定した（ＧＡＰＤＨはローディングコントロールとして用いる）。Ｃａｌｕ−６細胞はＰ５３遺伝子にナンセンス突然変異を有する。従って、Ｐ５３  ｍＲＮＡに対してＮＭＤ活性が示されるため、Ｃａｌｕ−６細胞ではＰ５３遺伝子は発現されない。逆転写され、増幅されたｍＲＮＡをアクリルアミドゲルにロードし、電気泳動させた。その後、アクリルアミドゲルをＷｈａｔｍａｎ（登録商標）紙上で乾燥させ、ホスホスクリーン（ｐｈｏｓｐｈｏｓｃｒｅｅｎ）（Ｋｏｄａｋ）に供した。Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ−ｒａｄ）を用いて、増幅された放射性標識種の定量を行った。漸増濃度のＧ０７のＤＭＳＯ溶液とともにＣａｌｕ−６細胞を約２０時間培養した。本実験はＧ０７のＮＭＤ阻害活性を確認するために行った。培養後、ＴｒｉＲｅａｇｅｎｔ（ＭＲＣ）を用いてＲＮＡを精製した後、ｃＤＮＡへ逆転写した。このｃＤＮＡは放射性標識ヌクレオチドの存在下でＰＣＲ増幅することができる。その結果を図２に示す。
【００６３】
図２は、Ｇ０７濃度の増加時のＰ５３  ｍＲＮＡ増加量を示す。Ｐ５３  ｍＲＮＡは通常はＮＭＤを介して分解される。よって、Ｐ５３  ｍＲＮＡ量の増加はその安定化によるものである。従って、Ｇ０７はＮＭＤ機構に対して用量反応活性を示すと考えられる。本実験によって、Ｇ０７のＮＭＤ阻害活性が確認でき、さらに、Ｇ０７が内因性ｍＲＮＡに対してＮＭＤを阻害できることがわかる。ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ）  ｍＲＮＡを増幅することで２レーン間のＰ５３  ｍＲＮＡの測定を標準化した。
【００６４】
図３は、Ｇ０７濃度が高いほど、細胞中のＰ５３  ｍＲＮＡ量が多いことを示している。
【００６５】
また、Ｇ０７によって、Ｃａｌｕ−６細胞において短縮Ｐ５３タンパク質と完全長Ｐ５３タンパク質の合成が可能である。よって、Ｇ０７は国際公開第２００８／１０１９３５号に開示された分子とは異なる。上記文献に開示された分子に関しては、短縮タンパク質しか検出されていない。この結果を図４に示す。Ｇ０７とともに培養した又は培養していないＣａｌｕ−６細胞から抽出したタンパク質を電気泳動ゲルにロードした後、ニトロセルロース膜に転写して、抗Ｐ５３抗体（抗Ｐ５３抗体は、Ｐ５３のアミノ末端部に対する抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ））とともに培養してからＰ５３タンパク質を検出した。得られた結果を図４に示す。図４によれば、Ｃａｌｕ−６細胞をＧ０７とともに約２０時間培養すると、完全長及び短縮Ｐ５３タンパク質が細胞により合成される。
【００６６】
また、図４には、完全長Ｐ５３タンパク質が機能性を有するかどうかを確認するためのＰ２１タンパク質の有無の分析も示されている。Ｐ５３が合成されると、Ｐ５３はＰ２１の発現を活性化する。ウエスタンブロット分析から、漸増濃度のＧ０７を用いた場合（２５及び１２５μＭ）、Ｐ２１が存在することが示された。よって、Ｇ０７によって合成できたＰ５３タンパク質はＷＴ  Ｐ５３タンパク質と同様にＰ２１発現を誘導する。結果的に、このように、本出願人らはＧ０７によって機能性の完全長Ｐ５３タンパク質を合成できることを確認した。
【００６７】
結果として、Ｇ０７によって完全長タンパク質の合成が可能となる。Ｇ０７によってＰＴＣ読み飛ばしを引き起こすこともできる。また、Ｇ０７によってその臨界段階においてＮＭＤを阻害し、その結果、完全長タンパク質を合成することもできる。合成された完全長タンパク質は野生型タンパク質であってもよい。
【００６８】
実施例３：インビボＮＭＤ阻害
ＫＩＭマウスにおいて、ＭＯＲ遺伝子はＮＭＤ活性化ナンセンス突然変異を有する。ＭＯＲ遺伝子は中枢神経系で発現される。０．２、２又は２０ｍｇ／ｋｇのＧ０７（それぞれ１Ｑ、２Ｑ又は３Ｑ）を溶解したＤＭＳＯ溶液をＫＩＭマウスに注射した。コントロール群はＤＭＳＯだけで処置した動物からなる。次に、注射から６、２４又は３２時間後に動物を安楽死させた。脳ホモジェネートから抽出したＲＮＡをＴｒｉＲｅａｇｅｎｔ（ＭＲＣ）を用いて精製した後、図２に関して説明したのと同様に分析した。図２に関して説明した実験との違いは、本例では、分析したｍＲＮＡは、ＭＯＲ遺伝子をコードするｍＲＮＡと、測定したＭＯＲ  ｍＲＮＡを定量するためにコントロールとして用いたＧＡＰＤＨ遺伝子をコードするｍＲＮＡである。左端から３個目までのウェルは野生型マウスの脳からのサンプルを半分希釈したものである。これら３個のウェルを用いて、定量的に好適でなければならないＰＣＲ条件を確認した。
【００６９】
図５には、ＭＯＲ及びＧＡＰＤＨ（後者はコントロールとして用いる）のｍＲＮＡ濃度の測定が示されている。ＲＮＡがＫＩＭマウスの脳由来であることを除き、図２に関して説明したのと同様な方法を用いた。一部のＫＩＭマウスにＧ０７を注射した。
【００７０】
１Ｑ及び２Ｑ濃度において、２４時間後にＭＯＲ  ｍＲＮＡの安定化が観察された。これはＮＭＤ阻害を示しており、故に、本実験によってＧ０７のインビボＮＭＤ阻害活性が確認される。
【００７１】
実施例４：Ｇ０７と読み飛ばし剤の併用
ＰＴＣ１２４（アタルレン又は３−［５−（２−フルオロフェニル）−１，２，４−オキサジアゾル−３−イル］安息香酸）は読み飛ばしを活性化する分子である。この分子はＮＭＤ阻害活性を示さない。コントロール（−）としてＤＭＳＯ、漸増濃度のＰＴＣ１２４のＤＭＳＯ溶液、及び、さらに２５μＭのＧ０７を含んだ漸増濃度のＰＴＣ１２４のＤＭＳＯ溶液中でＣａｌｕ−６細胞を培養した。培養開始から２４時間後に上記細胞からタンパク質を抽出し、ウエスタンブロットにより分析した。図６に示されるウエスタンブロットによれば（すなわち、非常に短い暴露時間後）、Ｇ０７とＰＴＣ１２４を含む培地で培養した細胞においてのみ完全長Ｐ５３タンパク質が観察できる。従って、これら２つの分子を併用すると相乗効果が示される。図６から、ＰＴＣ１２４とＧ０７の混合物を含む培地でＣａｌｕ−６細胞を培養すると、完全長Ｐ５３タンパク質の合成が改善することが示される。この改善は、各分子を別々に用いた場合にみられる改善よりも効果的である。従って、Ｇ０７とＰＴＣ１２４の間には相乗効果がみられる。
【００７２】
実施例５：ＩＢ３（嚢胞性線維症モデル）におけるＮＭＤ阻害
ＩＢ３細胞は、ＣＦＴＲ遺伝子のトリプトファンコドンの代わりに１２８２位にＰＴＣを有する。
【００７３】
ＤＭＳＯだけ（コントロールとして）又は漸増濃度のＧ０７のＤＭＳＯ溶液中でＩＢ３細胞（ＡＴＣＣ）をそれぞれ２０時間培養した。
【００７４】
培養後に得られたＲＮＡを精製し、ＲＴ−ＰＣＲを行って（ＰＴＣを含む）ＣＦＴＲ  ｍＲＮＡ量及び（コントロールとして用いる）ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ量を測定した。示されるＣＦＴＲ  ｍＲＮＡ量／ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ量の比に基づいて、ＣＦＴＲ  ｍＲＮＡの安定化の高まりを決定できる。この結果を図７に示す。この結果から、Ｃａｌｕ−６細胞で既に観察されたようなＧ０７のＮＭＤ阻害活性が確認できる。本実験では、Ｇ０７が複数の異なる種類の細胞においてＮＭＤ阻害能を示すことが示される。
【００７５】
図８に示されるように、培地中のＧ０７濃度が高いほど、通常であればＮＭＤにより分解されるｍＲＮＡがより安定化する。
【００７６】
これは、ＮＭＤ阻害が培地中のＧ０７濃度に依存することを示している。
【００７７】
実施例６：それぞれＧ０７、Ｇ０８及びＧ０９を含む各組成物のＮＭＤ阻害活性
それぞれ２５μＭのＧ０７、Ｇ０８及びＧ０９を含む各組成物とともにＣａｌｕ−６細胞を培養した。Ｃａｌｕ−６細胞でのＮＭＤ阻害の確認に関して上述したのと同様な実験を各組成物を用いて行った。結果を図９に示す。各２５μＭ組成物によってＮＭＤが阻害され、Ｃａｌｕ−６細胞においてＰ５３  ｍＲＮＡを安定化することができる。
【００７８】
実施例７：６−ＣＦＳＭＥｏ−細胞（嚢胞性線維症患者由来の細胞）におけるヨウ化物流出に対するＧ０７の用量反応効果
６−ＣＦＳＭＥｏ−細胞は、ＣＦＴＲ遺伝子のグルタミン２コドンの代わりにＰＴＣを有する。
【００７９】
６−ＣＦＳＭＥｏ−細胞を９６ウェルプレートに播種し、ハロゲン化物応答型蛍光色素である６−メトキシ−Ｎ−（３−スルホプロピル）キノリニウム（ＳＰＱ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１０ｍＭを一晩含ませておいた。細胞をヨウ化物バッファ（１３５ｍＭ  ＮａＩ、２．４ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、０．６ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１ｍＭ  ＣａＳＯ４、１０ｍＭデキストロース、及び、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．３）で２回洗浄した後、ヨウ化物バッファ中で３０分間培養した。基底蛍光を２分間測定した後、２０μＭホルスコリンと２００μＭ  ＩＢＭＸを含む硝酸塩バッファ（ＮａＩの代わりに１３５ｍＭ  ＮａＮＯ３を含む）によって上記ヨウ化物バッファを交換し、さらに蛍光を１０分間測定した。蛍光強度は、３４０ｎｍ励起フィルタと４５０ｎｍ蛍光フィルタを備えたＴｒｉｓｔａｒ  ＬＢ９４１マイクロプレートリーダー（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）を用いて１５秒毎に測定した。図１０の矢印は、上述したように、２０μＭホルスコリンと２００μＭ  ＩＢＭＸを含む硝酸塩バッファの添加を示す。使用したＧ０７濃度は、それぞれ０．２μＭ、１μＭ、５μＭ及び２５μＭであった。ヨウ化物流出における増加量は、独立した少なくとも４連の分析から得られた平均±ＳＥＭとして示される。Ｆｔは読み取り時間における蛍光量を示し、Ｆ０は、２０μＭホルスコリンと２００μＭ  ＩＢＭＸを含む上記硝酸塩バッファの添加前の平均蛍光量を示す。
【００８０】
図１０に示された結果から、Ｇ０７が６−ＣＦＳＭＥｏ−細胞に対して用量反応効果を示し、ＰＴＣを含むＣＦＴＲ遺伝子から機能性ＣＦＴＲタンパク質を合成できることが明らかである。
【００８１】
実施例８：ナンセンス突然変異によるデュシェンヌ型筋ジストロフィー患者由来の細胞（すなわちＤＭＤ細胞）におけるＰＴＣを含むジストロフィン遺伝子の発現に対するＧ０７の効果
図１１Ａの結果に関して、漸増量のＧ０７分子とともに又はコントロールとしてＤＭＳＯとともにＤＭＤ細胞を培養した。ＲＮＡをＲＮａｚｏｌ試薬を（ＭＲＣ）を用いて精製し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とｒａｎｄｏｍ  ｈｅｘａｍｅｒを用いて逆転写した。放射性標識ＣＴＰを用いたＰＣＲを行ってジストロフィン又はＧＡＰＤＨ  ｃＤＮＡを増幅した。増幅産物を５％ポリアクリルアミドゲルにロードした。その後、ゲルを乾燥させ、ホスホスクリーン上に暴露してＰｅｒｓｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏｒａｄ）により各増幅種を定量した。
【００８２】
図１１Ｂの結果に関して、漸増量のＧ０７分子とともに又はコントロールとしてＤＭＳＯとともにＤＭＤ細胞を培養した。上記細胞から抽出したタンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードし、ニトロセルロース膜に転写した。その後、ニトロセルロース膜を一次抗体（ジストロフィンタンパク質のアミノ末端部に対する抗ジストロフィン抗体（Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ）又は抗チューブリン抗体のいずれか）に暴露して各レーンのタンパク質ロード量を特定した。
【００８３】
図１１Ａ及びＢから、Ｇ０７は、ナンセンス変異によるデュシェンヌ型筋ジストロフィー患者由来の細胞においてＰＴＣを含むジストロフィン遺伝子の発現を助けることができることが示される。
【００８４】
図１１Ａに示されるように、漸増量のＧ０７によって、ジストロフィンｍＲＮＡが安定化される。この結果はＲＴ−ＰＣＲにより得られたものである。濃度５μＭで最大の効果が得られる。
【００８５】
図１１Ｂに示されるように、漸増量のＧ０７によって、ジストロフィンタンパク質が合成される（ジストロフィンタンパク質のアミノ末端部に対する抗体を用いたウエスタンブロットにより得られた結果）。５μＭでＧ０７の効果は最大となり、これは図１１Ａに示された結果と一致する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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