(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
転移性黒色腫を持つ患者から得た７．５ｍＬの血液検体であって、循環黒色腫細胞を含む疑いのある混合細胞集団を含む血液検体において、転移性黒色腫を持つ患者の全生存率を予測する方法であって、
（ａ）前記検体の画分を濃縮することであって、前記画分が前記循環黒色腫細胞を含む、ことと、
（ｂ）希少細胞の構造的完全性が無傷であることを確認することと、
（ｃ）前記無傷の希少細胞を分析することであって、前記分析することが疾患進行との相関を示す、ことと、
（ｄ）前記血液検体中の循環黒色腫細胞の数を評価することとを含み、
前記数が２以上の場合に、前記患者の全生存率が平均生存時間で２ヶ月であると予測し、
循環黒色腫細胞の数が２未満の場合に、前記患者の全生存率が平均生存時間で１２ヶ月であると予測する、方法。
【請求項２】
前記画分が、前記黒色腫細胞に特異的に結合する生物学的特異的なリガンドに結合した常磁性体粒子を、他の群を実質的に除外して区別するよう、外部的に印加される磁場を用いた免疫磁気的な濃縮によって得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生物学的特異的なリガンドが黒色腫細胞接着分子ＣＤ１４６である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記構造的完全性が、免疫細胞化学的手順、ＦＩＳＨ手順、フローサイトメトリー手順、画像サイトメトリー手順、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される手順によって測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記構造的完全性が、核酸色素、高分子量黒色腫関連抗原に特異的なモノクローナル抗体によって判断される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記構造的完全性が、白血球及び内皮特異的抗体を使用して、共濃縮された白血球及び循環内皮細胞を除外することによって更に確認される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記特異的抗体がＣＤ４５及びＣＤ３４である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＣＤ４５及びＣＤ３４を更に含有して、共濃縮された白血球及び循環内皮細胞を除外する、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
ＦＩＴＣ標識された抗−Ｋｉ６７が追加されて、循環内の活性細胞周期のＣＭＣの割合を測定する、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
進行した黒色腫の治療は、その異質組織病理学、及び腫瘍進行中に蓄積される構成の変化によって複雑なものとなっている。転移性乳癌又は結腸直腸癌の患者の循環腫瘍細胞の計数及び特徴付けは、臨床的に重要性の高い独立した予後及び予測情報を提供することが示されており、患者管理の監視に使用することができる。
【０００２】
循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）は、原発癌（治癒が可能な疾患段階）と転移性疾患（多くの悪性腫瘍において死亡の主要因であり続けている）との間の重要な関連を示してきた。臨床研究により、ＣＴＣは転移性乳癌において予後及び予測の強力なバイオマーカーであることが示されており、前立腺癌及び結腸直腸癌においても同様の結果が報告されている。これらのデータは、ＣＴＣが、潜在する生物学的促進性転移性癌を表わすことを示しており、これらの細胞を更に細胞分析及び分子分析することにより、転移の分子調節及び治療に対する反応について、新しい洞察を明らかにできることを示唆している。
【０００３】
患者の血液中の循環黒色腫細胞（ＣＭＣ）を取得し、計数し、特徴付けするために、ＣＴＣを取得し、計数し、特徴付けする方法が改良された。２００８年１０月２０日に出願された米国特許出願第１２／２５４１８８号の血液中の循環黒色腫細胞の自動計数及び特徴付けを参照されたい。本出願は、参照により本明細書に組み込まれる。この方法によってＣＭＣを取得し、計数し、特徴付けした場合でも、転移性黒色腫を持つ患者の短期間生存に関する予測値は未知であった。本発明は、転移性黒色腫を持つ患者の全生存率を予測する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１】全血からの既知数のスパイクされたＳＫ−Ｍｅｌ  ２８細胞の回収。健常ドナー検体中にスパイクされたＳＫ−Ｍｅｌ  ２８細胞（即ち、０個、５個、１８個、７２個、２８０個及び１１８３個の細胞が、各細胞レベルの合計５つの異なる検体で２日のそれぞれに５人の健常ドナーからの７．５ｍＬの血液中にスパイクされた）。スパイクされた細胞の数を、観察された回収細胞の数に対してプロットした。
【図２】列Ａ〜Ｅは、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩ（登録商標）ソフトウエアによって、黒色腫患者からの検体中のＤＡＰＩ信号とＰＥ信号の両方を有する対象として識別された対象を表す。サムネイル画像は、右から左に、Ｋｉ６７  ＦＩＴＣ信号、ＣＤ４５  ＡＰＣ又はＣＤ３４  ＡＰＣ信号、ＤＡＰＩ信号、ＨＭＷ−ＭＡＡ  ＰＥ信号、及びＤＡＰＩ信号（紫）とＨＭＷ−ＭＡＡ（緑）信号のオーバーレイを表す。列Ａの細胞は、ＣＤ４５及び／又はＣＤ３４を発現するので黒色腫細胞として除外され、列Ｂ及びＣの細胞は、Ｋｉ６７を発現しない黒色腫細胞として分類され、列Ｄ及びＥの細胞は、Ｋｉ６７を発現する黒色腫細胞として分類される。
【図３】黒色腫患者からの７．５ｍＬの血液から得られたＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩ（登録商標）からの典型的なＣＭＣ画像の一覧。
【図４Ａ】５５人の健常ドナーの７．５ｍＬの血液中と４４人の転移性黒色腫患者からの７９個の検体中とのＣＭＣの有病率（パネルＡ）。
【図４Ｂ】５５人の健常ドナーの７．５ｍＬの血液中と１６人の黒色腫患者からの１９個の検体中のＣＭＣを示すＫｉ６７の百分率（パネルＢ）。
【図５】全血７．５ｍｌあたり２個未満の循環黒色腫細胞を含む群の転移性黒色腫を持つ患者と、全血７．５ｍｌあたり２以上の循環黒色腫細胞を含む群の患者の全生存率のカプラン−マイヤー推定量。全生存時間は各採血時から計算された。平均生存期間は、２個未満のＣＭＣを含む群では１２．１ヶ月であり、それに対して２個以上のＣＭＣを含む人の場合は２．０ヶ月である（ログランク検定によりＰ＝０．００１。７．５ｍｌあたり２細胞以上の患者の死亡危険率が３．２）。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
本発明は、転移性黒色腫を有する患者の全生存率を予測する方法であって、
ａ）転移性黒色腫を持つ患者から７．５ｍＬの血液検体を取得することであって、前記検体が、循環黒色腫細胞を含む疑いのある混合細胞集団を含む、ことと、
ｂ）前記検体の画分を濃縮することであって、前記画分が前記循環黒色腫細胞を含む、ことと、
ｃ）前記希少細胞の構造的完全性が無傷であることを確認することと、
ｄ）前記無傷の希少細胞を分析することであって、前記分析することが疾患進行との相関を示す、ことと、
ｅ）前記血液検体中の循環黒色腫細胞の数を評価することとを含み、
数が２以上の場合に、前記患者の全生存率が低くなると予測し、
循環黒色腫細胞の数が２未満の場合に、前記患者の全生存率が高くなると予測する、方法を含む。
【０００６】
本明細書で使用されるとき、用語「濃縮する」は、ステップ（ａ）の血液検体からＣＭＣを分離することを意味する。濃縮する方法は、磁気粒子に結合された抗ＣＤ１４６の使用を含むがこれに限定されない。好ましい方法は、磁気ビーズに結合された黒色腫細胞上に存在する抗原に対する抗体を使用して血液検体から細胞を取得することである。用語「確認すること」は、分離された細胞がＣＭＣや他の細胞組成であるかどうかを判定することを意味する。確認方法は、黒色腫細胞に固有の核酸色素又はモノクローナル抗体の使用を含むがこれらに限定されない。好ましい確認方法は、様々な蛍光標識モノクローナル抗体でＣＭＣを染色することであり、好ましい抗体は、白血球と内皮細胞とを排除するＣＤ４５  ＆  ＣＤ３４と、黒色腫細胞を識別する高分子量黒色腫関連抗原ＨＭＷ−ＭＡＡである。用語「分析すること」は、取得したＣＭＣを評価して、ＣＭＣが、ＨＭＷ−ＭＡＡやＭＡＲＴ−１（Ｔ細胞によって認識された黒色腫抗原）などの様々な黒色腫固有マーカ及びＫｉ−６７などの他のマーカを示すかどうかを判定することを意味する。好ましい分析方法は、ＣＭＣがＫｉ−６７及び／又はＨＭＷ−ＭＡＡを示すかどうかを判定することを意味する。用語「評価すること」は、自動画像分析を含むがこれに限定されない方法を使用して検体中に何個のＣＭＣがあるかを決定することを意味する。好ましい評価方法は、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩ（登録商標）を使用する。
【０００７】
本発明は、以下の方法及び実施例によって実証される。これらの実施例及び方法は、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０００８】
以下の方法は、本発明の実施を容易にするために提供される
患者及び採血。血液は、健常ボランティアと、黒色腫を持つ患者とから、真空にされた１０ｍＬ血液ＣｅｌｌＳａｖｅ保存用採血チューブ（Ｖｅｒｉｄｅｘ  ＬＬＣ，Ｒａｒｉｔａｎ，ＮＪ）に抜き取られ、７２時間以内に処理された。
【０００９】
患者は全員、研究倫理委員会認定プロトコルを使用してＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｏｘｆｏｒｄ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌの腫瘍内科学部から登録された。全ての患者が文書によるインフォームドコンセントを提出した。４４人（男性２５人と女性１９人の）の患者を登録し、年齢は３１〜８１歳（平均５９歳）であった。最初の採血時に、３９／４４（８６％）が転移性疾患を持ち、５人の患者が、非切除のステージＩＩＩの疾病を持っていた。転移性疾患を持つ患者の３８／４４（７８％）は内臓疾病を持ち、５／４４（１１％）は内臓障害がなく、１人の患者に関しては転移部が記録されなかった。経過観察の中央値は、１０．１ヶ月であった。血液は、常に、静脈内治療の投与の前又は最低７日後に癌患者から抜き取られた。５５人の健常ボランティアを対照として含み、採血時に分かっている病気や発熱はなく、悪性疾患の履歴もなかった。
【００１０】
細胞培養と細胞スパイク。黒色腫細胞株ＳＫ−Ｍｅｌ２８を、１０％ウシ胎児血清を追加したＲＰＭＩ  １６４０を含むフラスコ内で培養し、その後でトリプシン処理なしに収穫した。細胞懸濁液は、トリパンブルー排除によって評価されるような生存率が９０％を超えたときだけ使用された。実際の細胞数を決定するために、２００μＬの緩衝剤と合計約２０，０００個のビーズを含む２０μＬの蛍光ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）を、５０μＬのＳＫ−Ｍｅｌ２８細胞のＬアリコットに添加した。ＳＫ−Ｍｅｌ２８細胞を検出のためにＰＥと結合した抗ＨＭＷ−ＭＡＡで染色した。検体の１００％が吸引されるまでビーズだけを収容した複製チューブをフローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）上に延ばした。これにより、２０μＬ中にあるビーズの数を正確に推定できた。次に、実験チューブを、各チューブ内のビーズが１０，０００個になるまでフローサイトメーターで３部試験した。単位体積当たりの既知のビーズ数を使用してＳＫ−Ｍｅｌ２８細胞の数を決定した。
【００１１】
検体調製７．５ｍＬの血液を、１５ｍＬ  ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ（登録商標）ＡｕｔｏＰｒｅｐ（登録商標）検体チューブに移して６．５ｍＬの緩衝剤と混ぜ、１０分間８００ｇで遠心分離し、次に自動検体調製のためにＣｅｌｌＴｒａｃｋｓＡｕｔｏｐｒｅｐ（登録商標）（Ｖｅｒｉｄｅｘ  ＬＬＣ）上に置いた。試薬は、黒色腫細胞の取得と検出のために最適化され、黒色腫細胞と内皮細胞の両方を免疫磁気的に濃縮するためにＣＤ１４６抗体で被覆された強磁性流体と、取得効率を最大にするための取得強化試薬と、黒色腫細胞を識別するために高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）（クローン９．２．２７，Ｖｅｒｉｄｅｘ  ＬＬＣ）に結合するフィコエリトリン結合抗体と、白血球（ＣＤ４５，ｃｌｏｎｅ  ＨＩ３０，Ｖｅｒｉｄｅｘ  ＬＬＣ）と内皮細胞（ＣＤ３４，クローン５８１，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を識別するための２つのアロフィコシアニン共役抗体の混合物と、Ｋｉ−６７タンパク質（クローンＢ５６，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を識別するためのＦＩＴＣ結合抗体と、有核細胞を識別する核色素４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）と、細胞を洗浄し、透過化処理し、そして再懸濁するための緩衝剤とからなる。最終処理段階で、細胞をＭａｇＮｅｓｔ（登録商標）Ｃｅｌｌ  Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｄｅｖｉｃｅ（Ｖｅｒｉｄｅｘ  ＬＬＣ）中に再懸濁させた。ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩ（登録商標）を使用する分析の準備のため、ＭａｇＮｅｓｔ装置によって生成された磁界により、磁性標識付き細胞をカートリッジの分析面全体に均一に分散させる。
【００１２】
検体分析。ＭａｇＮｅｓｔを、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ  ＡｎａｌｙｚｅｒＩＩ（登録商標）４色半自動蛍光顕微鏡上に置く。４つの蛍光フィルタキューブごとのカートリッジの表面全体をカバーする画像フレームを取得する。ＰＥ並びにＤＡＰＩ陽性イベントを含む画像を、細胞螢光と形態に基づいてユーザによるイベントの分類のために一覧で示す。黒色腫細胞として定義される対象の基準には、円から楕円の形態、可視核（ＤＡＰＩ陽性）、ＨＭＷ−ＭＡＡの陽性染色、及びＣＤ４５とＣＤ３４の陰性染色が挙げられる。黒色腫細胞をＫＩ６７＋細胞とＫｉ６７−細胞に分けた。細胞計数の結果は、常に、血液７．５ｍＬ当たりの細胞数として表される。
【００１３】
黒色腫細胞検出の精度、感度及び直線性。精度、直線性及び感度の実験のために、ＳＫ−Ｍｅｌ２８細胞を、異なる６つの細胞レベル（０、５、１８、７２、２８０及び１１８３）でＣｅｌｌＳａｖｅ保存チューブ内に収集された７．５ｍＬの血液中にスパイクした。血液中にスパイクされた細胞の正確な数を、フローサイトメトリーによって求めた。血液をスパイクした２４時間後に、検体をＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ  ＡｕｔｏＰｒｅｐ（登録商標）で処理し、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩ（登録商標）で分析した。各細胞レベルに合計５つの異なる検体で２日間別々に検体試験を行った。
【００１４】
統計分析
主要評価項目は、検査日から何らかの原因による死亡日までの時間として測定される全生存時間であった。追跡調査までに死亡したか調査終了時にまだ生きていた患者は、生きていることがわかっている最後の期日又は調査終了日に打ち切られた。患者１人当たり複数の検体がある場合は、生存分析には最後の検体を使用した。カプラン−マイヤー法を使用して全生存率を計算し、生存プロットを作成した。コックス回帰モデルを使用して、死亡の危険率（ＨＲ）を決定した。結果をＳＰＳＳ  １６．０（ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，ＵＳＡ）で分析した。
【００１５】
（実施例１）
スパイクされた組織培養黒色腫細胞株（ＳＫ−Ｍｅｌ２８）の回収
この実施例では、ＳＫ−Ｍｅｌ２８細胞がスパイクされた全血を使用した分析操作について述べる。この調査に使用されたプロトコルは以下の通りであった。健常ボランティアから全血をＣｅｌｌＳａｖｅチューブに引き入れ、組織培養黒色腫ＳＫ−Ｍｅｌ２８細胞をスパイクした。様々な数のＳＫ−Ｍｅｌ２８細胞を血液にスパイクし、回収を測定した。健康ドナー検体（即ち、０、５、１８、７２、２８０及び１１８３個の細胞）中にスパイクされたＳＫ−Ｍｅｌ２８細胞の予想数を、検体中に観察されたＳＫ−Ｍｅｌ２８細胞の実数に対してプロットし、図１に示し、結果を表１にまとめた。５  ＳＫ−Ｍｅｌ２８スパイクにおいて、スパイクされた細胞の平均回収率は８８％であり、８８％と比べて最高スパイクにおける平均回収率は７４％であった。ピアソンＲ２相関係数は０．９９であった。予想通り、変動係数（ＣＶ）は、スパイクされた細胞の数が減少するほど増大し、１，１８３細胞スパイクの７％から５細胞スパイクの３１％までに及ぶ。ＳＫ−Ｍｅｌ２８細胞の回収は、６４〜１２０％であり、細胞数が少ない場合には減少しなかった。
【表１】
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【００１６】
循環黒色腫細胞の識別ＨＭＷ−ＭＡＡ  ＰＥ及びＨＭＷ−ＭＡＡ  ＰＥ、ＤＡＰＩ、ＣＤ４５／ＣＤ３４  ＡＰＣ及びＫｉ６７のオーバーレイのサムネイル画像を、検討のためにオペレータに示す。ＣＭＣに必要な特徴は、核の存在、ＨＭＷ−ＭＡＡの発現、細胞形態、及びＣＤ４５発現の又はＣＤ３４発現の欠如である。図２は、評価者に示される１人の黒色腫患者からの６つのイベントを示す。パネルＡは、ＤＡＰＩとＨＭＷ−ＭＡＡで染色し、ＣＤ３４及び／又はＣＤ４５でも染色した細胞を示し、したがってＣＭＣとして分類されない。パネルＢ、Ｃ、Ｄ及びＥは、ＤＡＰＩとＨＭＷ−ＭＡＡで染色した細胞を示すが、ＣＤ３４又はＣＤ４５ではそうではないのでＣＭＣとして分類される。パネルＢ及びＣにおけるＣＭＣは、Ｋｉ６７を示さず、一方、パネルＤ及びＥにおけるＣＭＣはＫｉ６７を示す。パネルＢにおけるＣＭＣが２つの核を含み、Ｋｉ６７で染色しなく、一方パネルＤにおけるＣＭＣは、盛んに分裂しているように見え、実際にＫｉ６７を示すことに注意されたい。ＣＭＣのサイズと、その核と細胞質との比率は、黒色腫患者内のＣＭＣ間と黒色腫患者間とで極めて大きく異なる。図３は、特徴的に円から楕円の形状と無傷の核とを有する様々な患者からのＣＭＣ画像の一覧を示す。細胞サイズは、４μｍ〜３０μｍまで幅広く変化した。小さい細胞集合と多核ＣＭＣも観察された。
【００１７】
（実施例２）
健常ボランティアと黒色腫患者とにおける循環黒色腫細胞の頻度
この実施例では、健常ボランティアと黒色腫患者の循環黒色腫細胞の頻度について述べる。健常ドナーからの５５個の血液検体と転移性黒色腫を持つ４４人の患者からの７９個の検体でＣＭＣを計数した。図４では、パネルＡが、対照群と患者の７．５ｍＬの血液中に検出されたＣＭＣの数を示す。ＣＭＣが検出された１７人の患者からの１９個の検体で、Ｋｉ６７発現の評価を判定した。Ｋｉ６７＋ＣＭＣの割合は、３４〜１００％二及び、平均８４％であった（ＳＤ２５）。図４のパネルＢは、Ｋｉ６７発現と、これらの検体中に検出されたＣＭＣの数を示す。５５人の健常ドナーでは、３つの細胞がＣＭＣとして分類され、３つは全てＫｉ６７を発現しなかった。
【００１８】
（実施例３）
黒色腫患者における循環黒色腫細胞及び全生存率。
対照群内の人には誰も２つ以上のＣＭＣが検出されず、このカットオフは、患者群を区別するために選択された。ＣＭＣが２個未満の患者の平均生存時間は、１２．１ヶ月（９５％信頼区間で９．７〜１４．４）であり、ＣＭＣが２以上の患者の平均生存時間の２．０ヶ月よりかなり長かった（９５％信頼区間で０〜４．９）（図５）。ログランクｐは０．００１であった。死亡危険率は、コックス回帰により３．２（９５％信頼区間で１．６〜６．５）であった。採血後１ヶ月以内に死亡した４人の患者のＣＭＣ数は比較的高かった（２、８、１０及び８０４３  ＣＭＣ／７．５ｍｌ）。
【００１９】
〔実施の態様〕
（１）  転移性黒色腫を持つ患者の全生存率を予測する方法であって、
（ａ）転移性黒色腫を持つ患者から７．５ｍＬの血液検体を取得することであって、前記検体が、循環黒色腫細胞を含む疑いのある混合細胞集団を含む、ことと、
（ｂ）前記検体の画分を濃縮することであって、前記画分が前記循環黒色腫細胞を含む、ことと、
（ｃ）希少細胞の構造的完全性が無傷であることを確認することと、
（ｄ）前記無傷の希少細胞を分析することであって、前記分析することが疾患進行との相関を示す、ことと、
（ｅ）前記血液検体中の循環黒色腫細胞の数を評価することとを含み、
前記数が２以上の場合に、前記患者の全生存率が低くなると予測し、
循環黒色腫細胞の数が２未満の場合に、前記患者の全生存率が高くなると予測する、方法。
（２）  前記画分が、前記黒色腫細胞に特異的に結合する生物学的特異的なリガンドに結合した常磁性体粒子を、他の群を実質的に除外して区別するよう、外部的に印加される磁場を用いた免疫磁気的な濃縮によって得られる、実施態様１に記載の方法。
（３）  前記生物学的特異的なリガンドが黒色腫細胞接着分子ＣＤ１４６である、実施態様２に記載の方法。
（４）  前記構造的完全性が、免疫細胞化学的手順、ＦＩＳＨ手順、フローサイトメトリー手順、画像サイトメトリー手順、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される手順によって測定される、実施態様１に記載の方法。
（５）  前記構造的完全性が、核酸色素、高分子量黒色腫関連抗原に特異的なモノクローナル抗体によって判断される、実施態様１に記載の方法。
（６）  前記構造的完全性が、白血球及び内皮特異的抗体を使用して、共濃縮された白血球及び循環内皮細胞を除外することによって更に確認される、実施態様５に記載の方法。
（７）  前記特異的抗体がＣＤ４５及びＣＤ３４である、実施態様６に記載の方法。
（８）  ＣＤ４５及びＣＤ３４を更に含有して、共濃縮された白血球及び循環内皮細胞を除外する、実施態様５に記載の方法。
（９）  ＦＩＴＣ標識された抗−Ｋｉ６７が追加されて、循環内の活性細胞周期のＣＭＣの割合を測定する、実施態様１に記載の方法。
（１０）  低い全生存率が、２ヶ月以下である、実施態様１に記載の方法。
【００２０】
（１１）  高い全生存率が、１２ヶ月である、実施態様１に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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