(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）第一の抗体／ヒトＮＧＡＬ複合体を形成させるために、ヒトＮＧＡＬ単量体及びヒトＮＧＡＬ二量体を含有することが疑われる検査試料を少なくとも１つの第一の抗体と接触させる工程と、ここで、前記少なくとも１つの捕捉第一の抗体はヒトＮＧＡＬに結合し、並びにＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２４を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−２３２２−４５５によって産生される抗体及びＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２６を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−９０３−４３０によって産生される抗体からなる群から選択される抗体である；
（ｂ）第二の抗体／ヒトＮＧＡＬ／第一の抗体複合体を形成させるために、前記抗体／ヒトＮＧＡＬ複合体を、ヒトＮＧＡＬに結合し、及び検出可能な標識に連結された第二の抗体と接触させる工程と、ここで、前記第二の抗体は前記第一の抗体とは異なり、並びにＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２４を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−２３２２−４５５によって産生される抗体及びＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２６を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−９０３−４３０によって産生される抗体からなる群から選択される抗体である；
（ｃ）工程（ｂ）において形成された第二の抗体／ヒトＮＧＡＬ／第一の抗体複合体の量に基づいて、検査試料中に含有されたヒトＮＧＡＬ単量体の量を少なくとも約７５％の特異性で測定する工程と；
を含む、検査試料中のヒトＮＧＡＬ単量体の量を測定する方法。
【請求項２】
前記検査試料と接触される前又は後に、前記少なくとも１つの第一の抗体が固相上に固定化されている、請求項１の方法。
【請求項３】
前記第二の抗体／ヒトＮＧＡＬ／第一の抗体複合体の形成前に、前記少なくとも１つの第一の抗体が固相上に固定化されている、請求項２の方法。
【請求項４】
前記第一の抗体／ヒトＮＧＡＬ複合体の形成前に、前記少なくとも１つの第一の抗体が固相上に固定化されている、請求項３の方法。
【請求項５】
前記第一の抗体／ヒトＮＧＡＬ複合体の形成後に、前記少なくとも１つの第一の抗体が固相上に固定化されている、請求項３の方法。
【請求項６】
前記方法があらゆる還元剤の不存在下で行われる、請求項１から５の何れかの方法。
【請求項７】
少なくとも１つの還元剤の存在下で又は少なくとも１つの還元剤での前記検査試料の処理後に、工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）が行われる、請求項１から５の何れかの方法。
【請求項８】
前記少なくとも１つの還元剤が、ジチオスレイトール、２−メルカプトエタノール、２−メルカプトエチルアミン及びトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンからなる群から選択される、請求項７の方法。
【請求項９】
前記少なくとも１つの還元剤が約０．１ｍＭから約５００ｍＭの量で存在する、請求項７の方法。
【請求項１０】
前記検出可能な標識が、放射性標識、酵素標識、化学発光標識、蛍光標識、熱測定標識及び免疫連鎖反応標識からなる群から選択される、請求項１から９の何れかの方法。
【請求項１１】
前記検出可能な標識がアクリジニウムである、請求項１０の方法。
【請求項１２】
前記方法が、約１００ｎｇ／ｍＬより大きな尿ＮＧＡＬのレベルで、ＮＧＡＬ二量体と比較してＮＧＡＬ単量体に対して約４倍特異的である、請求項１から１１の何れかの方法。
【請求項１３】
前記方法が自動化されたシステム又は半自動化されたシステムでの使用のために適合されている、請求項１から１２の何れかの方法。
【請求項１４】
（１）あらゆる還元剤の不存在下で、及び、少なくとも１つの還元剤の存在下又は少なくとも１つの還元剤での前記検査試料の処理後に、それぞれ、以下の（ａ）及び（ｂ）を行う工程と、
（ａ）第一の抗体／ヒトＮＧＡＬ複合体を形成させるために、ヒトＮＧＡＬ単量体及びヒトＮＧＡＬ二量体を含有することが疑われる検査試料を少なくとも１つの第一の抗体と接触させる工程と、ここで、前記少なくとも１つの第一の抗体はヒトＮＧＡＬに結合し、並びにＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２４を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−２３２２−４５５によって産生される抗体及びＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２６を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−９０３−４３０によって産生される抗体からなる群から選択される抗体である；
（ｂ）第二の抗体／ヒトＮＧＡＬ／第一の抗体複合体を形成させるために、前記第一の抗体／ヒトＮＧＡＬ複合体を、ヒトＮＧＡＬに結合し、及び検出可能な標識に連結された第二の抗体と接触させる工程、ここで、前記第二の抗体は前記第一の抗体とは異なり、並びにＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２４を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−２３２２−４５５によって産生される抗体及びＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２６を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−９０３−４３０によって産生される抗体からなる群から選択される抗体である；
（２）工程（ｂ）において形成された第二の抗体／ヒトＮＧＡＬ／第一の抗体複合体の量を測定する工程と、ここで、工程（ａ）及び（ｂ）は、あらゆる還元剤の不存在下で行われる；
（３）工程（ｂ）において形成された前記第二の抗体／ヒトＮＧＡＬ／第一の抗体複合体の量を測定する工程と、ここで、工程（ａ）及び（ｂ）は、少なくとも１つの還元剤の存在下又は少なくとも１つの還元剤での前記検査試料の処理後に行われる；並びに
（４）工程（２）において測定された第二の抗体／ヒトＮＧＡＬ／第一の抗体複合体の量及び工程（３）において測定された第二の抗体／ヒトＮＧＡＬ／第一の抗体複合体の量に基づいて、前記検査試料中のヒトＮＧＡＬ二量体に対するヒトＮＧＡＬ単量体の割合を測定する工程と；
を含む、検査試料中に含有されるヒトＮＧＡＬ二量体に対するヒトＮＧＡＬ単量体の割合を測定する方法。
【請求項１５】
前記検査試料との接触前又は後に、前記少なくとも１つの第一の抗体が固相上に固定化されている、請求項１４の方法。
【請求項１６】
前記第二の抗体／ヒトＮＧＡＬ／第一の抗体複合体の形成前に、前記少なくとも１つの第一の抗体が固相上に固定化されている、請求項１５の方法。
【請求項１７】
前記第一の抗体／ヒトＮＧＡＬ複合体の形成前に、前記少なくとも１つの第一の抗体が固相上に固定化されている、請求項１６の方法。
【請求項１８】
前記第一の抗体／ヒトＮＧＡＬ複合体の形成後に、前記少なくとも１つの第一の抗体が固相上に固定化されている、請求項１６の方法。
【請求項１９】
前記少なくとも１つの還元剤が、ジチオスレイトール、２−メルカプトエタノール、２−メルカプトエチルアミン及びトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンからなる群から選択される、請求項１４から１８の何れかの方法。
【請求項２０】
前記少なくとも１つの還元剤が約０．１ｍＭから約５００ｍＭの量で存在する、請求項１４から１９の何れかの方法。
【請求項２１】
前記検出可能な標識が、放射性標識、酵素標識、化学発光標識、蛍光標識、熱測定標識及び免疫ポリメラーゼ連鎖反応標識からなる群から選択される、請求項１４の方法。
【請求項２２】
前記検出可能な標識がアクリジニウムである、請求項２１の方法。
【請求項２３】
前記検査試料が尿又は血液試料である、請求項１４から２２の何れかの方法。
【請求項２４】
前記検査試料中に存在するＮＧＡＬのレベルに基づいて、前記対象の尿細管細胞傷害状態を評価するために実施される、請求項１４から２３の何れかの方法。
【請求項２５】
前記尿細管細胞傷害が虚血性腎傷害、腎毒性傷害及び腎臓の尿細管細胞に影響を与える他の傷害からなる群から選択される傷害を含む、請求項２４の方法。
【請求項２６】
前記方法が自動化されたシステム又は半自動化されたシステムでの使用のために適合されている、請求項１４から２５の何れかの方法。
【請求項２７】
検量用物質又は対照として、配列番号１又は１３の配列を含むグリコシル化されたヒトＮＧＡＬを使用することをさらに含む、請求項１４から２６の何れかの方法。
【請求項２８】
検査試料中のヒトＮＧＡＬ抗原の存在を検出する方法であって、
（１）ヒトＮＧＡＬを含有することが疑われる検査試料を、第一の抗体及び第二の抗体に、第一の抗体／ヒトＮＧＡＬ／第二の抗体複合体の形成を可能とする時間及び条件下で接触させること、並びに
（２）前記ヒトＮＧＡＬ抗原の存在の指標として、形成された何れかの第一の抗体／ヒトＮＧＡＬ／第二の抗体複合体を検出すること
を含み、
前記第一の抗体及び第二の抗体は、
（ａ）ヒトＮＧＡＬへ特異的に結合する単離された抗体、ここで、該抗体は、配列番号５のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域及び配列番号６のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を有する；
（ｂ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２４を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−２３２２−４５５によって産生された抗体；
（ｃ）ヒトＮＧＡＬへ特異的に結合する単離された抗体、ここで、該抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域及び配列番号８のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を有する；及び
（ｄ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２６を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−９０３−４３０によって産生された抗体；
からなる群からそれぞれ選択され、前記第二の抗体は前記第一の抗体とは異なり、
前記方法は、ＮＧＡＬ二量体と比べてＮＧＡＬ単量体について約４倍特異的である、方法。
【請求項２９】
ヒトＮＧＡＬを含有することが疑われる前記検査試料を、前記第一の抗体及び前記第二の抗体に同時に又は順次に接触させる、請求項２８の方法。
【請求項３０】
前記方法が自動化されたシステム又は半自動化されたシステムでの使用のために適合されている、請求項２８又は２９の方法。
【請求項３１】
第一の抗体及び第二の抗体を含む免疫診断試薬並びに指示書を含む、ヒトＮＧＡＬを検出するための診断用キットであって、前記第一の抗体及び第二の抗体は、
（ａ）ヒトＮＧＡＬへ特異的に結合する単離された抗体、ここで、該抗体は、配列番号５のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域及び配列番号６のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を有する；及び
（ｂ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２４を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−２３２２−４５５によって産生された抗体；
からなる群からそれぞれ選択され、前記第二の抗体は前記第一の抗体とは異なり、
前記キットは、ＮＧＡＬ二量体と比べてＮＧＡＬ単量体について約４倍特異的である、診断用キット。
【請求項３２】
（ａ）配列番号２又は１０の配列を含むグリコシル化されたヒトＮＧＡＬ、及び
（ｂ）配列番号１又は１３の配列を含むグルコシル化されたヒトＮＧＡＬ
からなる群から選択される検量用物質又は対照をさらに含む、請求項３１の診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の情報）
本願は、全て２００７年１０月１９日に出願された米国仮特許出願６０／９８１，４７０号、６０／９８１，４７１号及び６０／９８１，４７３号並びに全て２００８年４月１６日に出願された米国非仮特許出願１２／１０４，４０８号、１２／１０４，４１０号及び１２／１０４，４１３号の優先権を主張し、これらの各々は、その全体が参照により組み込まれる。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、ＮＧＡＬイムノアッセイ及びキット並びにイムノアッセイ及びキットにおいて、グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬ及び哺乳動物ＮＧＡＬに結合する抗体を使用する方法に関する。このようなイムノアッセイ及びキットは、とりわけ、単量体の改善された検出を場合によって与える。前記方法及びキットは、検査試料中のヒトＮＧＡＬ単量体の量を測定するために、並びに検査試料中に含有されるヒトＮＧＡＬ二量体に対するヒトＮＧＡＬ単量体の割合を測定するために使用することができる。
【背景技術】
【０００３】
リポカリンは、細菌からヒトまで様々な生物中に見出される細胞外リガンド結合タンパク質のファミリーである。リポカリンは、小さな疎水性分子の結合及び輸送、栄養素の輸送、細胞増殖の制御並びに免疫応答の調節、炎症及びプロスタグランジン合成など、多くの異なる機能を有している。さらに、幾つかのリポカリンは、細胞制御プロセスにも関与しており、様々な病状における診断及び予後のマーカーとしての役割を果たす。例えば、α糖タンパク質の血漿レベルは、妊娠中に、並びに癌化学療法、腎機能不全、心筋梗塞、関節炎及び多発性硬化症などの症状の診断及び予後においてモニターされる。
【０００４】
１９９３年に、ヒト好中球由来の新規リポカリン好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（又はＮＧＡＬ、リポカリン−２若しくはＬＣＮ２としても知られる。）が同定された。ＮＧＡＬは、単量体並びにホモ及びヘテロ二量体形態で存在する２５ｋＤａのリポカリンであり、後者は、ヒト好中球ゼラチナーゼとの４６ｋＤａ二量体として存在する。ＮＧＡＬの三量体形態も同定されている。ＮＧＡＬは、活性化されたヒト好中球の特異的顆粒から分泌される。相同的なタンパク質が、マウス（２４ｐ３／ウテロカリン）及びラット（α（２）−ミクログロブリン関連タンパク質／ν関連リポカリン）中に同定されている。構造的データは、８本鎖のβバレルを有するＮＧＡＬの典型的なリポカイン折り畳みを確認したが、リポカリン中に通常見られるより極性が高く、正に帯電したアミノ酸残基とともに整列された異常に大きな空洞を有している。２５ｋＤａＮＧＡＬタンパク質は、細菌由来のリポ多糖及びホルミルペプチドなどの小さな親油性物質を結合すると考えられており、炎症の調節物質として機能し得る。
【０００５】
急性腎不全又は慢性腎不全などの腎臓の傷害又は病気は、（病気、傷害などの）様々な異なる原因に由来し得る。腎臓の傷害及び病気の早期同定及び治療は、疾病の進行を妨げる上で有用である。現在、腎機能のバイオマーカーとして、血清クレアチニンがしばしば使用されている。しかしながら、血清クレアチニンの測定は、筋肉質量、性別、人種及び服薬によって影響を受ける。残念なことに、これらの制約のために、しばしば、著しい損傷が既に生じた後でなければ、腎臓病の診断が得られない。
【０００６】
ＮＧＡＬは、急性腎臓傷害又は腎臓病に対する初期マーカーである。活性化されたヒト好中球の特異的な顆粒によって産生される他に、ＮＧＡＬは、尿細管上皮の損傷に応答して、ネフロンによっても産生され、尿細管間質性（ＴＩ）傷害のマーカーである。ＮＧＡＬレベルは、正常な血清クレアチニンレベルと比べて、穏やかな「無症候性」腎虚血の後でさえ、虚血又は腎毒性由来の急性尿細管壊死（ＡＴＮ）において上昇する。さらに、ＮＧＡＬは、慢性腎臓病（ＣＫＤ）の場合に、腎臓によって発現されることが知られている。上昇した尿のＮＧＡＬレベルは、進行性の腎不全として示唆されている。ＮＧＡＬは動物及びヒトの両モデルにおいて、虚血性又は腎毒性傷害後の極めて早期に、腎臓尿細管によって顕著に発現されることが以前に示されている。ＮＧＡＬは、尿中に素早く分泌され（ＮＧＡＬは、尿中において、容易に検出及び測定できる。）、虚血性傷害の他のあらゆる公知の尿又は血清マーカーの出現に先行する。このタンパク質はプロテアーゼ耐性であり、ＮＧＡＬの尿細管発現の忠実なマーカーとして尿中に回収できることを示唆する。さらに、例えば、血液からろ過される腎臓の外側に由来するＮＧＡＬは、尿中に出現せず、むしろ、近位尿細管によって定量的に吸収される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＮＧＡＬを検出するための様々なイムノアッセイが本分野において公知である。本明細書に前述されているように、ＮＧＡＬは、単量体として、二量体（ホモ二量体又はヘテロ二量体）として、及び三量体としてさえ見出される。従って、検査試料中のＮＧＡＬ単量体、二量体又は三量体を特異的に検出及び識別することができる新規抗体及びイムノアッセイに対する要望が本分野において存在する。さらに、検査試料中に含有される二量体に対する単量体の相対的割合を定量することができるイムノアッセイに対する要望も本分野において存在する。このような新規抗体及びイムノアッセイは、とりわけ、患者中のあらゆる腎傷害又は腎臓病の程度を評価し、腎傷害又は腎臓病に罹患している患者の腎臓の状態をモニターし、又は患者中の何れかの腎傷害の程度を評価し、その後、患者の腎臓の状態をモニターするために使用することができる。本発明のさらなる目的及び利点が、本明細書に提供されている記載から明らかとなる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一実施形態において、本発明は、検査試料中のヒトＮＧＡＬ単量体の量を測定するための方法に関する。該方法は、
（ａ）第一の抗体／ヒトＮＧＡＬ複合体を形成させるために、ヒトＮＧＡＬ単量体及びヒトＮＧＡＬ二量体を含有することが疑われる検査試料を少なくとも１つの第一の抗体（例えば、捕捉抗体）と接触させる工程（前記少なくとも１つの捕捉第一の抗体はヒトＮＧＡＬに結合し、並びにＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２４を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−２３２２−４５５によって産生される抗体及びＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２６を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−９０３−４３０によって産生される抗体からなる群から選択される抗体（例えば、捕捉抗体）である。）；
（ｂ）第二の抗体／ヒトＮＧＡＬ／第一の抗体複合体を形成させるために、前記抗体／ヒトＮＧＡＬ複合体を、ヒトＮＧＡＬに結合し、及び検出可能な標識に連結されている第二の抗体と接触させる工程（前記第二の抗体は前記第一の抗体とは異なり、並びにＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２４を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−２３２２−４５５によって産生される抗体及びＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２６を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−９０３−４３０によって産生される抗体からなる群から選択される抗体である。）；並びに
（ｃ）工程（ｂ）において形成された第二の抗体／ヒトＮＧＡＬ／第一の抗体複合体の量に基づいて、検査試料中に含有されたヒトＮＧＡＬ単量体の量を少なくとも約７５％の特異性で測定する工程；
を含む。
【０００９】
上記方法において、検査試料は、尿又は血液である。具体的には、検査試料は、尿である。
【００１０】
上記方法において、前記方法は、検査試料中に存在するＮＧＡＬのレベルに基づいて、対象の尿細管細胞傷害状態を評価するために実施される。具体的には、尿細管細胞傷害は、虚血性腎傷害、腎毒性傷害及び腎臓の尿細管細胞に影響を与えるあらゆる他の傷害からなる群から選択される傷害を含む。
【００１１】
上記方法において、少なくとも１つの第一の抗体は、検査試料と接触させる前又は後に、固相上に固定化される。場合によって、少なくとも１つの第一の抗体は、第二の抗体／ヒトＮＧＡＬ／第一の抗体複合体の形成前に、固相上に固定化される。場合によって、少なくとも１つの第一の抗体は、第一の抗体／ヒトＮＧＡＬ複合体の形成前に、固相上に固定化される。場合によって、少なくとも１つの第一の抗体は、第一の抗体／ヒトＮＧＡＬ複合体の形成後に、固相上に固定化される。
【００１２】
一態様において、上記方法は、あらゆる還元剤の不存在下で行われる。あるいは、上記方法において、工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は、少なくとも１つの還元剤の存在下で又は少なくとも１つの還元剤での前記検査試料の処理後に行われる。少なくとも１つの還元剤は、ジチオスレイトール、２−メルカプトエタノール、２−メルカプトエチルアミン及びトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンからなる群から選択される。少なくとも１つの還元剤は、約０．１ｍＭから約５００ｍＭの量、特に、約０．１ｍＭから約１００ｍＭの量で存在する。別の態様において、前記方法は自動化されたシステム又は半自動化されたシステムでの使用のために適合されている。
【００１３】
上記方法において使用される検出可能な標識は、放射性標識、酵素標識、化学発光標識、蛍光標識、熱測定標識及び免疫連鎖反応標識からなる群から選択される。具体的には、検出可能な標識は、アクリジニウムである。特に、前記方法は、最適には、アッセイの検量範囲全体を通じて（例えば、ＮＧＡＬ、特に、尿ＮＧＡＬの約１ｎｇ／ｍＬから最大約２０００ｎｇ／ｍＬ）、ＮＧＡＬ二量体と比較してＮＧＡＬ単量体に対して約４倍特異的である。
【００１４】
別の実施形態において、本発明は、検査試料中に含有されるヒトＮＧＡＬ二量体に対するヒトＮＧＡＬ単量体の割合を測定する方法に関する。該方法は、
（ａ）第一の抗体／ヒトＮＧＡＬ複合体を形成させるために、ヒトＮＧＡＬ単量体及びヒトＮＧＡＬ二量体を含有することが疑われる検査試料を少なくとも１つの第一の抗体と接触させる工程（前記少なくとも１つの第一の抗体はヒトＮＧＡＬに結合し、並びにＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２４を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−２３２２−４５５によって産生される抗体及びＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２６を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−９０３−４３０によって産生される抗体からなる群から選択される抗体である。）；
（ｂ）第二の抗体／ヒトＮＧＡＬ／第一の抗体複合体を形成させるために、前記第一の抗体／ヒトＮＧＡＬ複合体を、ヒトＮＧＡＬに結合し、及び検出可能な標識に連結された第二の抗体と接触させる工程（前記第二の抗体は前記第一の抗体とは異なり、並びにＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２４を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−２３２２−４５５によって産生される抗体及びＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２６を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−９０３−４３０によって産生される抗体からなる群から選択される抗体である。）；
（ｃ）工程（ｂ）において形成された第二の抗体／ヒトＮＧＡＬ／第一の抗体複合体の量を測定する工程（工程（ａ）及び（ｂ）は、あらゆる還元剤の不存在下で行われる。）；
（ｄ）工程（ｂ）において形成された前記第二の抗体／ヒトＮＧＡＬ複合体の量を測定する工程（工程（ａ）及び（ｂ）は、少なくとも１つの還元剤の存在下で又は少なくとも１つの還元剤での前記検査試料の処理後に行われる。）；並びに
（ｅ）工程（ｃ）において測定された第二の抗体／ヒトＮＧＡＬ／第一の抗体複合体の量及び工程（ｄ）において測定された第二の抗体／ヒトＮＧＡＬ／第一の抗体複合体の量を比較することに基づいて、前記検査試料中のヒトＮＧＡＬ二量体に対するヒトＮＧＡＬ単量体の割合を測定する工程；
を場合によって含む。
【００１５】
上記方法において、少なくとも１つの第一の抗体が、検査試料と接触させる前又は後に、固相上に場合によって固定化される。場合によって、少なくとも１つの第一の抗体は、第二の抗体／ヒトＮＧＡＬ／第一の抗体複合体の形成前に、固相上に固定化される。場合によって、少なくとも１つの第一の抗体は、第一の抗体／ヒトＮＧＡＬ複合体の形成前に、固相上に固定化される。さらに別の実施形態において、場合によって、少なくとも１つの第一の抗体は、第一の抗体／ヒトＮＧＡＬ複合体の形成後に、固相上に固定化される。少なくとも１つの還元剤は、ジチオスレイトール、２−メルカプトエタノール、２−メルカプトエチルアミン及びトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンからなる群から選択される。少なくとも１つの還元剤は、約０．１ｍＭから約５００ｍＭの量、特に、約０．１ｍＭから約１００ｍＭの量で存在する。場合によって、上記方法は自動化されたシステム又は半自動化されたシステムでの使用のために適合されている。
【００１６】
上記方法において使用される検出可能な標識は、放射性標識、酵素標識、化学発光標識、蛍光標識、熱測定標識及び免疫連鎖反応標識からなる群から選択される。具体的には、検出可能な標識は、アクリジニウムである。
【００１７】
上記方法において、検査試料は、尿又は血液である。具体的には、検査試料は、尿である。
【００１８】
上記方法において、前記方法は、検査試料中に存在するＮＧＡＬのレベルに基づいて、対象の尿細管細胞傷害状態を評価するために実施される。具体的には、尿細管細胞傷害は、虚血性腎傷害、腎毒性傷害及び腎臓の尿細管細胞に影響を与える他の傷害からなる群から選択される傷害を含む。
【００１９】
別の実施形態において、本発明は、検査試料中の哺乳動物ＮＧＡＬの存在を検出するための方法の改良に関する。該方法は、
（ａ）哺乳動物ＮＧＡＬ／抗体複合体の形成を可能とする時間及び条件下で、哺乳動物ＮＧＡＬを含有することが疑われる検査試料を、前記哺乳動物ＮＧＡＬに対して特異的な少なくとも１つの抗体と接触させる工程；及び
（ｂ）前記哺乳動物ＮＧＡＬの存在の指標として、形成された何れかの哺乳動物ＮＧＡＬ／抗体複合体を検出する工程；
を含み、
前記改良が、検量用物質又は対照として、明細書に前述されている検量用物質又は対照を使用することを含み、特に、検量用物質又は対照は、配列番号１又は１３の配列を含むグリコシル化されたヒトＮＧＡＬである。
【００２０】
さらに別の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されている検量用物質又は対照を含む哺乳動物ＮＧＡＬの検出のための診断用キットに関し、特に、検量用物質又は対照は、
（ａ）配列番号２又は１０の配列を含むグリコシル化されたヒトＮＧＡＬ及び
（ｂ）配列番号１又は１３の配列を含むグリコシル化されたヒトＮＧＡＬ
からなる群から選択される検量用物質又は対照を含む。
【００２１】
別の実施形態において、本発明は、検査試料中のヒトＮＧＡＬ抗原の存在を検出するための方法の存在を検出するための方法の改良に関し、該方法は、
（ａ）ヒトＮＧＡＬ／抗体複合体の形成を可能とする時間及び条件下で、ヒトＮＧＡＬを含有することが疑われる検査試料を本明細書に記載されている免疫診断試薬と接触させること、及び
（ｂ）前記ヒトＮＧＡＬ抗原の存在の指標として、形成された何れかのヒトＮＧＡＬ／抗体複合体を検出すること
を含む。
【００２２】
一般に、本明細書にさらに論述されているように、免疫診断用試薬は、
（ａ）配列番号１、２、１０又は１３に記載されているヒトＮＧＡＬタンパク質のアミノ酸残基１１２、１１８及び１４７を含む立体構造的エピトープへ特異的に結合する抗体；
（ｂ）ヒトＮＧＡＬへ特異的に結合する単離された抗体（該抗体は、配列番号５のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域を有する。）；
（ｃ）ヒトＮＧＡＬへ特異的に結合する単離された抗体（該抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を有する。）；
（ｄ）ヒトＮＧＡＬへ特異的に結合する単離された抗体（前記抗体は、配列番号５のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域及び配列番号６のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を有する。）；
（ｅ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２４を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−２３２２−４５５によって産生された抗体；
（ｆ）ヒトＮＧＡＬへ特異的に結合する単離された抗体（前記抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域を有する。）；
（ｇ）ヒトＮＧＡＬへ特異的に結合する単離された抗体（前記抗体は、配列番号８のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を有する。）；
（ｈ）ヒトＮＧＡＬへ特異的に結合する単離された抗体（前記抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域及び配列番号８のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を有する。）；及び
（ｉ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２６を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−９０３−４３０によって産生された抗体；
からなる群から選択される１つ又はそれ以上の抗体を含む。
【００２３】
従って、さらに、本発明は、上記免疫診断用試薬及び指示書を含むヒトＮＧＡＬを検出するための診断用キットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、ヒトＮＧＡＬ野生型抗原配列（配列番号１）を示している。固有のヒトＮＧＡＬシグナルペプチド残基は、斜字体で記載され、下線が付されている。ｐＪＶ−ＮＧＡＬ−Ａ３プラスミド中の野生型ヒトＮＧＡＬ配列は、太字で記載されている。Ｃ末端中の６×Ｈｉｓタグには、下線が付されている。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬタンパク質及び哺乳動物ＮＧＡＬタンパク質に結合する抗体が発見された。これらのＮＧＡＬタンパク質及び単独の又は組み合わされた抗体は、例えば、診断アッセイの成分として様々な用途を有し、又はイムノアッセイキット中に存在する。
【００２６】
全てのＮＧＡＬポリヌクレオチド及びポリペプチド配列並びに野生型ＮＧＡＬ組換え抗原（ｒＡｇ）及び変異体Ｃ８７ＳＮＧＡＬＮＧＡＬｒＡｇクローン、サブクローン、ハイブリッド及びハイブリドーマ（名称及び付番を含む。）は、２００７年１０月１９日に出願された米国仮特許出願６０／９８１，４７０号（参照により、これらに関するその教示に関して組み込まれる。）に記載されているとおりである。
【００２７】
ある種の哺乳動物ＮＧＡＬタンパク質に結合する抗体も発見された。これらの抗ＮＧＡＬ抗体（本明細書において、「ＮＧＡＬ抗体」とも大まかに表記される。）は、２００７年１０月１９日に出願された米国仮特許出願６０／９８１，４７１号（参照により、これらに関するその教示に関して組み込まれる。）に記載されているとおりである。
【００２８】
Ａ．定義
本明細書に使用されているように、文脈上明確に反対の記述がなければ、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」には、複数表記が含まれる。本明細書での数的範囲の引用に関して、その間に介在する各数字は、同じ正確度で明示的に想定される。例えば、範囲６から９の場合、６及び９に加えて、数字７及び８が想定され、範囲６．０から７．０の場合、数字６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９及び７．０が明示的に想定される。
【００２９】
ａ）抗体
本明細書において使用される、「抗体」という用語は、モノクローナル抗体、多重特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体（完全又は部分的にヒト化）、動物抗体（一態様において、鳥（例えば、アヒル又はガチョウ））、別の態様において、サメ又はクジラ、さらに別の態様において、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、マウスなど）及びヒト以外の霊長類（例えば、カニクイザル、チンパンジーなどのサル）を含む哺乳動物）、組換え抗体、キメラ抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド結合されたＦｖ（ｓｄＦｖ）及び抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体など）及び上記の何れかの機能的に活性なエピトープ結合断片を表す。特に、抗体には、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な断片、すなわち、抗原結合部位を含有する分子が含まれる。免疫グロブリン分子は、あらゆる種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスであり得る。単純化のために、分析物に対する抗体は、「抗分析物抗体」又は単に「分析物抗体」（例えば、ＮＧＡＬ抗体）の何れかとしばしば称される。
【００３０】
ｂ）尿細管細胞傷害
本明細書において使用される「尿細管細胞傷害」という表現は、多数の疾病又は疾患のプロセスによって引き起こされ得る、突然の（急性）又は時間をかけてゆっくり低下する（慢性）腎若しくは腎臓不全又は機能障害を意味する。尿細管細胞傷害の急性及び慢性形態は何れも、生命を脅かす代謝異常をもたらし得る。
【００３１】
ｃ）急性腎臓病
「急性尿細管細胞傷害」は、急性虚血性腎傷害（ＩＲＩ）又は急性腎毒性腎傷害（ＮＲＩ）を意味する。ＩＲＩには、虚血傷害及び慢性虚血傷害、急性腎不全、急性糸球体腎炎及び急性尿細管間質性腎障害が含まれるが、これらに限定されない。ＮＲＩ毒性には、敗血症（感染）、ショック、外傷、腎臓結石、腎感染症、薬物毒性、毒（ｐｏｉｓｏｎ）又は毒物（ｔｏｘｉｎ）又は放射線造影色の注射後が含まれるが、これらに限定されない。
【００３２】
ｄ）慢性腎臓病
本明細書において互換的に使用される「慢性尿細管細胞傷害」、「進行性腎臓病」、「慢性腎臓病（ＣＲＤ）」、「慢性腎臓病（ＣＫＤ）」という用語には、突然の現象ではなく、ある期間にわたって発生して、尿細管細胞機能の漸進的低下又は尿細管細胞傷害の悪化を引き起こすあらゆる腎臓症状又は機能障害が含まれる。慢性腎臓病が継続した場合の１つの終末点は、「慢性腎不全（ＣＲＦ）」である。例えば、本明細書において互換的に使用される慢性腎臓病又は慢性腎傷害には、慢性的な感染によって引き起こされる症状又は機能障害、慢性的炎症、糸球体腎炎、血管疾患、間質性腎炎、薬物、毒物、外傷、腎臓結石、長期の高血圧、糖尿病、うっ血性心不全、鎌形赤血球貧血症及び他の造血機能障害に由来する腎障害、肝炎、ＨＩＶ、パルボウイルス及びＢＫウイルス（ヒトポリオーマウイルス）に関連する腎障害、嚢胞性腎臓病、先天性奇形、閉塞、悪性腫瘍、原因不明の腎臓病、ループス腎炎、膜性糸球体腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎、局所的糸球体硬化症、微小変化型疾患、クリオグロブリン血症、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）陽性血管炎、ＡＮＣＡ陰性血管炎、アミロイドーシス、多発性骨髄腫、軽鎖沈着症、腎臓移植の合併症、腎臓移植の慢性的拒絶、慢性同種移植腎障害及び免疫抑制剤の慢性効果が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、慢性腎臓病又は慢性腎傷害は、慢性腎不全又は慢性糸球体腎炎を表す。
【００３３】
ｅ）免疫診断試薬
本発明における「免疫診断試薬」は、ＮＧＡＬタンパク質の領域に特異的に結合する１つ又はそれ以上の抗体を含む。免疫診断試薬は、２００７年１０月１９日に出願された米国仮特許出願６０／９８１，４７１号（免疫診断試薬に関するその教示に関して、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている。
【００３４】
ｆ）ＮＧＡＬポリヌクレオチド及びポリペプチド配列
ＮＧＡＬポリヌクレオチド及びポリペプチド配列は、２００７年１０月１９日に出願された米国仮特許出願６０／９８１，４７０号（ＮＧＡＬポリヌクレオチド及びポリペプチド配列に関するその教示に関して、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されているとおりである。一般に、ＮＧＡＬは、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受付番号ＧｅｎｐｅｐｔＣＡＡ５８１２７（配列番号１）、ＡＡＢ２６５２９、ＸＰ ８６２３２２、ＸＰ ５４８４４１、Ｐ８０１０８、Ｐ１１６７２、Ｘ８３００６．１、Ｘ９９１３３．１、ＣＡＡ６７５７４．１、ＢＣ０３３０８９．１、ＡＡＨ３３０８９．１、Ｓ７５２５６．１、ＡＤ１４１６８．１、ＪＣ２３３９、１ＤＦＶＡ、１ＤＦＶＢ、１Ｌ６ＭＡ、１Ｌ６ＭＢ、１Ｌ６ＭＣ、１ＮＧＬＡ、１ＱＱＳＡ、１Ｘ７１Ａ、１Ｘ７１Ｂ、１Ｘ７１Ｃ、１Ｘ８９Ａ、１Ｘ８９Ｂ、１Ｘ８９Ｃ、１Ｘ８ＵＡ、１Ｘ８ＵＢ及び１Ｘ８ＵＣとして記載されているものなど、あらゆるＮＧＡＬ配列であり得る。ＮＧＡＬポリヌクレオチド及びポリペプチド（例えば、ポリアミノ酸）配列は、天然に見出される配列に基づいて、天然に見出されるとおりであり、単離され、合成的、半合成的、組換え又はその他である。一実施形態において、ＮＧＡＬは、ヒトＮＧＡＬ（「ｈＮＧＡＬ」としても知られる。）である。別段の記載がなければ、ＮＧＡＬポリペプチド配列は、天然に典型的に見出される２０残基のアミノ酸シグナルペプチドを差し引いた（及び他のあらゆるシグナルペプチド配列を差し引いた）成熟ヒトＮＧＡＬ配列に従って付番される。シグナルペプチドが存在する場合、例えば、残基−１から−２０のように負の数字が付番され、コードポリヌクレオチド配列に対しては同じ付番が適用される。
【００３５】
同様に、ＮＧＡＬのＮ末端の開始Ｍｅｔ残基は、原核生物（例えば、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ））中で産生されたＮＧＡＬ又は合成（半合成を含む。）若しくは誘導された配列中のみに存在し、真核生物（例えば、ヒトを含む哺乳動物細胞及び酵母細胞）中で産生されるＮＧＡＬ中には存在しない。従って、存在する場合には、開始Ｍｅｔ残基は本明細書において負の数として（例えば、残基−１として）カウントされ、原核及び真核両バックグラウンド中でポリヌクレオチド配列が同じように複製及び転写され、差異は翻訳のレベルで存在するので、真核生物と比較して原核生物のバックグラウンド又は発現系中のポリヌクレオチド配列に対して類似の調整を行わなかった。
【００３６】
従って、本明細書の開示は、原核生物及び／又は真核生物バックグラウンド中に存在し及び／又は産生される（例えば、その結果、コドン認識に対する最適化を有する）異なる多数のＮＧＡＬポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を（例えば、免疫原として、及び／又は抗体結合研究において）包含する。要するに、配列は、（ａ）シグナルペプチド、（ｂ）成熟ＮＧＡＬ配列中のＮ末端に存在する開始Ｍｅｔ残基、（ｃ）成熟ＮＧＡＬタンパク質に先行するシグナルペプチドの先頭に存在する開始Ｍｅｔ残基及び（ｄ）当業者に自明なものなどの他の変動を保有若しくはコードしてもよく、又は保有若しくはコードしなくてもよい。
【００３７】
典型的な配列には、本明細書中に記載されているもの、すなわち、配列番号１（シグナルペプチドを含むＮＧＡＬ野生型ポリペプチド）、配列番号２（シグナルペプチドを含むＮＧＡＬ変異体ポリペプチド）、配列番号１０（シグナルペプチドを一切含まず、並びに原核生物中で産生され及びＭｅｔ開始コドンが存在するときには、Ｍｅｔ開始残基が先行し得るが、Ｍｅｔ開始コドンが存在するか否かに関わらず、真核生物中で産生されたときにはＭｅｔ開始残基が存在しないＮＧＡＬ変異体ポリペプチド）、配列番号１３（シグナルペプチドを一切含まず、並びに原核生物中で産生され及びＭｅｔ開始コドンが存在するときには、Ｍｅｔ開始残基が先行し得るが、Ｍｅｔ開始コドンが存在するか否かに関わらず、真核生物中で産生されたときにはＭｅｔ開始残基が存在しないＮＧＡＬ野生型ポリペプチド）；配列番号３（シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＮＧＡＬ野生型ポリヌクレオチド配列）；配列番号４（シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むＮＧＡＬ変異体ポリヌクレオチド）；配列番号１２（何れかのシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを含まないが、Ｍｅｔ開始コドン、例えば、ＡＴＧあり又はなしに、場合によってＮ末端にさらに先行することができる、合成又は真核生物発現用のＮＧＡＬ変異体ポリヌクレオチド）、配列番号９（何れかのシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを含まないが、Ｍｅｔ開始コドン、例えば、ＡＴＧあり又はなしに、場合によってＮ末端にさらに先行することができる、合成又は真核生物発現用のＮＧＡＬ変異体ポリヌクレオチド）が含まれるが、これらに限定されない。
【００３８】
ｇ）グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬ
グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬ（例えば、免疫原として、及び／又は様々な抗体の結合を評価するために使用される）は、２００７年１０月１９日に出願された米国仮特許出願６０／９８１，４７０号（参照により、この点に関するその教示に関して組み込まれる。）に記載されているとおりである。
【００３９】
一般に、本明細書において使用される場合、本明細書において互換的に使用される「オリゴ糖部分」又は「オリゴ糖分子」という用語は、インビボ又はインビトロでのグリコシル化によって、（例えば、哺乳動物のＮＧＡＬなどのグリコシル化されたポリペプチドを産生するために）ポリペプチドに付着させることができる１つ又はそれ以上の単糖残基を含む炭水化物含有分子を表す。ポリペプチドに付着されたオリゴ糖部分の数が明示的に表示されている場合を除き、本明細書において引用される「オリゴ糖部分」という表記は全て、ポリペプチドに付着された１つ又はそれ以上のこのような部分を表すものとする。好ましくは、前記炭水化物含有分子を付着させることができるポリペプチドは、すなわち、本明細書中にさらに記載されている「グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬ」を提供するために野生型又は変異体哺乳動物ＮＧＡＬである。
【００４０】
「インビボグリコシル化」という用語は、インビボで、例えば、例えばＮ結合型及びＯ結合型グリコシル化によって、ポリペプチドの発現のために使用されるグリコシル化細胞中での翻訳後プロセッシングの間に起こるオリゴ糖部分のあらゆる付着を意味するものとする。通常、Ｎ−グリコシル化されたオリゴ糖部分は、５つの単糖残基（すなわち、２つのＮ−アセチルグルコサミン残基及び３つのマンノース残基）から構成される共通の基本的コア構造を有する。正確なオリゴ糖構造は、グリコシル化を行う問題の生物及び具体的なポリペプチドに大きく依存する。
【００４１】
「インビトログリコシル化」という用語は、場合によって架橋剤を用いて、オリゴ糖部分をポリペプチドの付着基へ共有結合させることを通常含む、インビトロで行われる合成的グリコシル化を表す。インビトログリコシル化は、様々な異なる化学を用いて、化学的に合成されたオリゴ糖構造をポリペプチド（例えば、哺乳動物ＮＧＡＬなど）に付着させることによって達成することができる。例えば、使用され得る化学は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をタンパク質に付着させるために使用される化学であり、場合によって短いスペーサーを介して、オリゴ糖が官能基に連結される。インビトログリコシル化は、約０．０２から約２．０ｍＬの容量で、約０．５から約２．０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で、約４．０から約７．０のｐＨの適切な緩衝液中で実施することができる。他のインビトログリコシル化法は、例えば、Ａｐｌｉｎ他によるＷＯ８７／０５３３０、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ中のＬｕｎｄｂｌａｄ他によるＣＲＣＣｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５９−３０６（１９８１）、Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２３：３７５９−３７６５（１９８２）及びＤｏｅｂｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：２１９３−２１９９（１９８２）に記載されている。
【００４２】
ｈ）ヒトＮＧＡＬ断片
ヒトＮＧＡＬ断片（例えば、免疫原、検量用物質、対照として、及び／又は様々な抗体の結合を評価するために使用される）は、２００７年１０月１９日に出願された米国仮特許出願６０／９８１，４７０号（参照により、この点に関するその教示に関して組み込まれる。）に記載されているとおりである。
【００４３】
一般に、本明細書において使用される「ヒトＮＧＡＬ断片」は、本明細書において、成熟ヒトＮＧＡＬ又はシグナルペプチドを含むＮＧＡＬの全体より少ない部分を含むポリペプチドを表す。特に、ヒトＮＧＡＬ断片は、配列番号１、２、１０又は１３の約５から約１７８まで又は約１７９の連続するアミノ酸を含む。特に、ヒトＮＧＡＬ断片は、配列番号１、２、１０又は１３の約５から約１７０の連続するアミノ酸を含む。特に、ヒトＮＧＡＬ断片は、配列番号１、２、１０又は１３の少なくとも約５個の連続するアミノ酸、配列番号１、２、１０若しくは１３の少なくとも約１０個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１３のアミノ酸の少なくとも約１５個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１３の少なくとも約２０個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１３の少なくとも約２５個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１３のアミノ酸の少なくとも約３０個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１３の少なくとも約３５個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１３の少なくとも約４０個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１３の少なくとも約４５個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１３の少なくとも約５０個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１３の少なくとも約５５個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１３の少なくとも約６０個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１３の少なくとも約６５個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１３の少なくとも約７０個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１３の少なくとも約７５個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１３の少なくとも約８０個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１３の少なくとも約８５個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１３の少なくとも約９０個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１３の少なくとも約９５個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１３の少なくとも約１００個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１３の少なくとも約１０５個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１３の少なくとも約１１０個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１３の少なくとも約１１５個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１３の少なくとも約１２０個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１３の少なくとも約１２５個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１３の少なくとも約１３０個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１３の少なくとも約１３５個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１３の少なくとも約１４０個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１３の少なくとも約１４５個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１３の少なくとも約１５０個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１３の少なくとも約１６０個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１３の少なくとも約１６５個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１３の少なくとも約１７０個の連続するアミノ酸残基又は配列番号１、２、１０若しくは１３の少なくとも約１７５個の連続するアミノ酸残基を含む。
【００４４】
本発明によって想定されるヒトＮＧＡＬ断片の例には、以下のものが含まれるが、これらに限定されない。
【００４５】
（ａ）配列番号１、２、１０又は１３のアミノ酸残基１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７及び１１８を含む少なくとも約７個の連続するアミノ酸のヒトＮＧＡＬ断片（配列番号１及び２の付番は、シグナルペプチド及び何れかのＭｅｔ開始残基直後の成熟配列のＧｌｎ残基から始まり、シグナルペプチド及び何れかのＭｅｔ開始残基は、本明細書に前述されているように、負の付番が為される。）；
（ｂ）配列番号１、２、１０又は１３のアミノ酸残基１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８及び１１９を含む少なくとも約８個の連続するアミノ酸のヒトＮＧＡＬ断片（配列番号１及び２の付番は、シグナルペプチド及び何れかのＭｅｔ開始残基直後の成熟配列のＧｌｎ残基から始まる。）；
（ｃ）配列番号１、２、１０又は１３のアミノ酸残基１１２、１１８及び１４７を含む少なくとも約３６個の連続するアミノ酸のヒトＮＧＡＬ断片（配列番号１及び２の付番は、シグナルペプチド及び何れかのＭｅｔ開始残基直後の成熟配列のＧｌｎ残基から始まる。）；
（ｄ）配列番号１、２、１０又は１３のアミノ酸残基１５及び１０９を含む少なくとも約９５個の連続するアミノ酸のヒトＮＧＡＬ断片（配列番号１及び２の付番は、シグナルペプチド及び何れかのＭｅｔ開始残基直後の成熟配列のＧｌｎ残基から始まる。）；
（ｅ）配列番号１、２、１０又は１３のアミノ酸残基１５、１０９及び１５８を含む少なくとも約１４４個の連続するアミノ酸のヒトＮＧＡＬ断片（配列番号１及び２の付番は、シグナルペプチド及び何れかのＭｅｔ開始残基直後の成熟配列のＧｌｎ残基から始まる。）；
（ｆ）配列番号１、２、１０又は１３のアミノ酸残基１５、１０９、１５８及び１５９を含む少なくとも約１４５個の連続するアミノ酸のヒトＮＧＡＬ断片（配列番号１及び２の付番は、シグナルペプチド及び何れかのＭｅｔ開始残基直後の成熟配列のＧｌｎ残基から始まる。）；又は
（ｇ）配列番号１、２、１０又は１３のアミノ酸残基１５、１０９、１５８、１５９及び１６０を含む少なくとも約１４６個の連続するアミノ酸のヒトＮＧＡＬ断片（配列番号１及び２の付番は、シグナルペプチド及び何れかのＭｅｔ開始残基直後の成熟配列のＧｌｎ残基から始まる。）。
【００４６】
場合によって、本明細書に記載されているように使用されるこのようなヒトＮＧＡＬ断片は、配列番号３、４又は１２の対応する配列によって部分的に又は完全にコードされる。これらの線に沿って、一実施形態において、本発明は、配列番号４若しくは１２の配列を含む又は配列番号４若しくは１２の配列からなる単離され、精製され、又は単離及び精製されたヒトＮＧＡＬポリヌクレオチドの使用を提供する。
【００４７】
ｉ）ＮＧＡＬハイブリッド
本明細書において使用される「ＮＧＡＬハイブリッド」又は「ＮＧＡＬハイブリドーマ」という用語は、目的の抗ＮＧＡＬ抗体を産生するハイブリドーマクローン又はサブクローン（明記されているとおりの）を表す。一般に、同じ種類のサブクローンから得られたものと比較すると、ハイブリドーマクローンによって産生された抗体の親和性には、幾らか小さな変動が存在し得る（例えば、クローンの純度を反映する。）。比較により、同じクローンを起源とし、さらに、目的の抗ＮＧＡＬ抗体を産生する全てのハイブリドーマサブクローンは、同じ配列及び／又は同じ構造の抗体を産生することが十分に確立されている。ＮＧＡＬハイブリッドは、２００７年１０月１９日に出願された米国仮特許出願６０／９８１，４７１号（参照により、ＮＧＡＬハイブリッドに関するその教示に関して組み込まれる。）に記載されているとおりである。
【００４８】
ｊ）特異性
本明細書において使用されるヒトＮＧＡＬの量に対する「特異性」は、約７５％の特異性が約２５％の交叉反応性と等しく、約９０％の特異性は約１０％の交叉反応性に等しいなどように、二量体に対する交叉反応性の逆数として定義される（すなわち、特異性は、１／交叉反応性と等しい。）。本明細書において、ＮＧＡＬ単量体に対して約７５％特異的であるアッセイは、ＮＧＡＬ二量体との約２５％の交叉反応性を示す。これを記述する別の方法は、単量体に対して約７５％の特異性を有するアッセイは、ＮＧＡＬ二量体と比較して、ＮＧＡＬ単量体に対して約４倍特異的であることである。
【００４９】
ｋ）特異的結合
本明細書において、「特異的結合」という用語は、特定の部位において、別の結合パートナーよりある結合パートナー（例えば、２つのポリペプチド、ポリペプチドと核酸分子又は２つの核酸分子）に優先的に結合することと定義される。「特異的に結合する」という用語は、非特異的な標的分子（例えば、特異的に認識される部位を欠如する無作為な分子）に比べて、標的分子／配列に対する結合の優先性（例えば、親和性）は、少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも５倍及び最も好ましくは少なくとも１０倍又は２０倍であることを示す。
【００５０】
ｌ）結合パートナー
本明細書において使用される「結合パートナー」とは、結合ペアの一員、すなわち、分子の１つが第二の分子に結合する分子のペアである。特異的に結合する結合パートナーは、「特異的結合パートナー」と称される。イムノアッセイにおいて一般的に使用される抗原及び抗体結合パートナーの他に、他の特異的な結合パートナーは、ビオチン及びアビジン、炭水化物及びレクチン、相補的ヌクレオチド配列、エフェクター及び受容体分子、補因子及び酵素、酵素阻害剤及び酵素などが含まれ得る。さらに、特異的な結合パートナーは、元の特異的結合パートナーの類縁体である対（例えば、分析物−類縁体）を含み得る。免疫反応性の特異的結合パートナーには、抗原、抗原断片、抗体及び抗体断片（モノクローナル及びポリクローナルの両方）並びにこれらの複合体が含まれる（組換えＤＮＡ法によって形成されるものを含む。）。
【００５１】
ｍ）エピトープ
本明細書において使用される「エピトープ」又は「目的のエピトープ」という用語は、認識され、その特異的結合パートナー上の相補的部位に結合することができる何れかの分子上の部位を表す。分子と特異的結合パートナーは、特異的結合ペアの一部である。例えば、エピトープは、ポリペプチド、タンパク質、ハプテン、炭水化物抗原（糖脂質、糖タンパク質又はリポ多糖など（但し、これらに限定されない。））又は多糖であり得、その特異的結合パートナーは抗体であり得る（但し、これに限定されない。）。
【００５２】
特に、エピトープは、抗原（すなわち、抗体が結合するタンパク質）の特定領域（１つ又はそれ以上のアミノ酸から構成される。）を表す。より具体的には、抗原性エピトープは、抗体結合ドメインの表面上の相補的領域（パラトープ）と相互作用するタンパク質表面上の領域である。従って、エピトープは、抗体との静電的相互作用、疎水的相互作用及び水素結合に関与し、表面の正しい形状、その柔軟性及び構造的動力学に必要とされる残基も含有する。抗原性エピトープに対して強固な支持の役割を有する、埋め込まれた「第二球体」残基も存在する。
【００５３】
「立体構造的エピトープ」又は「不連続エピトープ」として知られるエピトープの特定の種類は、順序の上では不連続であるが、三次元空間中で互いに近接する残基によって形成されたエピトープの種類である。
【００５４】
ｎ）結合定数（例えば、ＫＤ、ｋａ及びｋｄ）
本明細書において互換的に使用される「平衡解離定数」又は「ＫＤ」という用語は、平衡状態での滴定測定において得られた値又は会合速度定数（ｋｏｎ）によって解離速度定数（ｋｏｆｆ）を除することによって得られた値を表す。会合速度定数、解離速度定数及び平衡解離定数は、抗原への抗体の結合親和性を表すために使用される。
【００５５】
「相対親和性」又は「相対的ＫＲ」という用語は、抗血清検査試料又はクローニングされていないハイブリッド検査試料を含む検査集団内で抗体／抗原ＫＤを測定するために同じ検査方法を用いて明らかにされた抗原への抗体の結合力として定義することができ、従って、「絶対的な」特異性データではなく、相対的な親和性値を与える。（例えば、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３２：４９（１９７７）及びＥｓｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，７ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐａｇｅ７４（１９９１）参照）。
【００５６】
本明細書において互換的に使用される「会合速度定数」、「ｋｏｎ」又は「ｋａ」という用語は、以下の式によって示されているように、標的抗原への抗体の結合速度又は抗体と抗原の間での複合体形成の速度を示す値を表す。
【００５７】
抗体（「Ａｂ」）＋抗原（「Ａｇ」）−＞Ａｂ−Ａｇ
本明細書において互換的に使用される「解離速度定数」、「ｋｏｆｆ」又は「ｋｄ」という用語は、以下の式によって示されているように、標的抗原から抗体が解離する速度又はＡｂ−Ａｇ複合体が経時的に遊離の抗体及び抗原へ分離することを示す値を表す。
【００５８】
Ａｂ＋Ａｇ＜−Ａｂ−Ａｇ
会合及び解離速度定数を測定するための方法は、本分野において周知である。蛍光を基礎とする技術を用いることによって、平衡状態にある生理的緩衝液中で試料を調べるための高い感度及び能力が得られる。ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｒ）（生物分子相互作用分析）アッセイなどの他の実験的アプローチ及び装置（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢから入手可能な装置、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ｃｏｍｐａｎｙ、Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用することが可能である。さらに、Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｂｏｉｓｅ，Ｉｄａｈｏ）から入手可能なＫｉｎＥｘＡ（Ｒ）（Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）も使用することが可能である。
【００５９】
ｏ）対象
本明細書において使用される「対象」及び「患者」という用語は、当該対象が治療の何れかの形態を有し、又は現在行っているかどうかに関わらず、互換的に使用される。本明細書において使用される「対象」という用語は、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット及びマウスなど）、ヒト以外の霊長類（例えば、カニクイザル、チンパンジーなどのサル）及びヒトを含む哺乳動物を表す。好ましくは、対象は、ヒトである。
【００６０】
ｐ）検査試料
本明細書において使用される「検査試料」という用語は、血清、血漿、血液（全血を含むが、これに限定されない。）、リンパ、尿又は対象の他の体液に由来する生物学的試料を表す。検査試料は、当業者に公知の定型的な技術を用いて調製することが可能である。好ましくは、検査試料は、尿又は血液である。
【００６１】
ｑ）前処理試薬（例えば、溶解、沈殿及び／又は可溶化試薬）
本明細書に記載されている診断アッセイにおいて使用される前処理試薬とは、何れかの細胞を溶解し、及び／又は検査試料中に存在する何らかの分析物を可溶化する試薬である。本明細書中にさらに記載されているように、前処理は、全ての試料に対して必要とは限らない。とりわけ、分析物（すなわち、ＮＧＡＬ）の可溶化には、試料に存在する何れかの内在性結合タンパク質からの分析物の放出を引き起こす。前処理試薬は、同種（分離工程を必要としない）又は異種（分離工程を必要とする）であり得る。異種の前処理試薬を使用すると、アッセイの次の工程に進む前に、検査試料からのあらゆる沈殿した分析物結合タンパク質の除去が存在する。前処理試薬は、（ａ）１つ若しくはそれ以上の溶媒及び塩、（ｂ）１つ若しくはそれ以上の溶媒、塩及び界面活性剤、（ｃ）界面活性剤、（ｄ）界面活性剤及び塩又は（ｅ）細胞溶解及び／若しくは分析物の可溶化に適したあらゆる試薬若しくは試薬の組み合わせを場合によって含むことができる。また、単独の又は他の何れかの前処理剤（例えば、溶媒、界面活性剤、塩など）と組み合わせたプロテアーゼを使用することができる。
【００６２】
ｒ）固相
本明細書において使用される「固相」は、不溶性であり、又はその後の反応によって不溶性となり得るあらゆる物質を表す。固相は、捕捉剤を誘引及び固定化するその固有の能力のために選択され得る。あるいは、捕捉剤を誘引及び固定化する能力を有する連結剤を固相に付着することができる。連結剤には、例えば、捕捉剤そのものに、又は捕捉剤に連結された帯電物質に関して反対の電荷を帯びた帯電物質が含まれ得る。一般に、連結剤は、固相上に固定化され（又は固相に付着され）、及び結合反応を通じて捕捉剤を固定化する能力を有するあらゆる結合パートナー（好ましくは、特異的な）であり得る。連結剤によって、アッセイの実施前又はアッセイの実施中に、捕捉剤が固相物質に間接的に結合することが可能となる。固相は、例えば、プラスチック、誘導化されたプラスチック、磁気又は非磁気金属、ガラス又はケイ素であり得、例えば、試験管、マイクロタイターウェル、シート、ビーズ、微粒子、チップ及び当業者に公知の他の構成などであり得る。
【００６３】
本明細書において使用される用語は、特定の実施形態のみを記載することを目的とするものであって、その他、限定を意図するものではない。
【００６４】
Ｂ．グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬ
（例えば、検量用物質又は対照として）本発明において使用されるグリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬは、２００７年１０月１９日に出願された米国仮特許出願６０／９８１，４７０号（参照により、この点に関するその教示に関して組み込まれる。）に記載されているとおりである。一般に、本発明は、あらゆる種類の哺乳動物ＮＧＡＬ（例えば、単離された、組換え、変異体、野生型、合成、半合成など）、特に、場合によってグリコシル化されている哺乳動物ＮＧＡＬ、特に本明細書に記載されているようなヒトＮＧＡＬの使用を想定する。このような哺乳動物ＮＧＡＬは、例えば、抗体を作製するための免疫原として、及び／又はこのような抗体の結合を評価する際に使用される。
【００６５】
一実施形態において、本発明は、単離されたグリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬの使用に関する。より具体的には、本発明は、少なくとも１つのオリゴ糖分子又は部分及び最大１０のオリゴ糖分子又は部分を含有するグリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬに関する。本発明において使用されるグリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬには、グリコシル化されたイヌＮＧＡＬ、グリコシル化されたネコＮＧＡＬ、グリコシル化されたラットＮＧＡＬ、グリコシル化されたマウスＮＧＡＬ、グリコシル化されたウマＮＧＡＬ、グリコシル化された非ヒト霊長類ＮＧＡＬ及びグリコシル化されたヒトＮＧＡＬが含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬは、ヒトＮＧＡＬである。さらに、グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬは、野生型ＮＧＡＬ（すなわち、野生型イヌＮＧＡＬ、野生型ネコＮＧＡＬ、野生型ラットＮＧＡＬ、野生型マウスＮＧＡＬ、野生型ウマＮＧＡＬ、野生型非ヒト霊長類ＮＧＡＬ又は野生型ヒトＮＧＡＬなどの（但し、これらに限定されない。）あらゆる野生型哺乳動物ＮＧＡＬ）であり得る。好ましくは、野生型哺乳動物ＮＧＡＬは、配列番号１（シグナルペプチドを含み、配列番号１の付番はシグナルペプチド及び何れかのＭｅｔ開始残基の直後の成熟配列のＧｌｎ残基から始まる。）又は配列番号１３（シグナルペプチドを含まない。）に示されているアミノ酸配列を有する野生型ヒトＮＧＡＬである。あるいは、グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬは、野生型哺乳動物ＮＧＡＬの対応するアミノ酸配列と比べたときに、１つ又はそれ以上のアミノ酸置換、欠失又は付加を含むアミノ酸配列を含むグリコシル化された変異体哺乳動物ＮＧＡＬであり得る。例えば、グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬは、野生型ヒトＮＧＡＬ（例えば、配列番号１又は１３参照）のアミノ酸配列は少なくとも１つのアミノ酸置換を含有するヒトＮＧＡＬであり得る。具体的には、少なくとも１つのアミノ酸置換を、配列番号１又は１３のアミノ酸残基８７に施すことができる。具体的には、配列番号１又は１３に示されているアミノ酸８７のシステインをセリンと置換することができる（例えば、配列番号２及び１０参照）。セリン又はシステイン以外のアミノ酸（例えば、グリシン又はアラニン）に対する他の置換を施すこともできる。さらに、定型的な実験操作を用いて、当業者により、配列番号１又は１３のアミノ酸残基８７における単一のアミノ酸置換以外の他のアミノ酸置換、欠失又は付加を施すことができる。
【００６６】
本明細書において使用される哺乳動物ＮＧＡＬ（例えば、場合によってグリコシル化された）は、組換えＤＮＡ技術を用いて、化学合成によって、又は化学合成と組換えＤＮＡ技術の組み合わせによって作製することができる。具体的には、哺乳動物ＮＧＡＬをコードするポリヌクレオチド配列は、目的の哺乳動物ＮＧＡＬをコードするポリヌクレオチド配列を単離又は合成することによって構築され得る。上述のように、哺乳動物ＮＧＡＬ（例えば、場合によってグリコシル化された）は、野生型哺乳動物ＮＧＡＬであり得、又は１つ以上のアミノ酸置換、欠失又は付加を含有する変異体哺乳動物ＮＧＡＬであり得る。このようなアミノ酸置換、欠失又は付加は、突然変異導入によるなど（例えば、Ｎｅｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｏｎｇ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １８０：１４７−１５１（１９８９）に記載されているような、周知の方法に従う部位指定突然変異導入、無作為突然変異導入又はシャッフリングを用いて）、本分野において公知の定型的技術を用いて施すことができる。
【００６７】
目的の哺乳動物ＮＧＡＬをコードするポリヌクレオチド配列は、オリゴヌクレオチド合成装置を使用することによるなど、オリゴヌクレオチドが所望の哺乳動物ＮＧＡＬ（野生型又は変異体）のアミノ酸配列に基づいて設計される化学合成によって、好ましくは、組換え哺乳動物ＮＧＡＬがその中で産生される宿主細胞中で好まれるコドンを選択することによって調製され得る。例えば、所望の哺乳動物ＮＧＡＬの一部をコードする幾つかの小さなオリゴヌクレオチドがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、連結又は連結連鎖反応（ＬＣＲ）によって合成及び組み立てられ得る。各オリゴヌクレオチドは、典型的には、相補的
組み立てのために５’又は３’突出を含有する。
【００６８】
（合成、部位指定突然変異導入又は別の方法によるなど）一旦組み立てられたら、目的の哺乳動物ＮＧＡＬをコードするポリヌクレオチド配列は、組換えベクター中に挿入され、所望の形質転換された宿主細胞中でのその発現のために必要な何れかの調節配列へ作用可能に連結され得る。
【００６９】
全てのベクター及び発現調節配列が、目的のポリヌクレオチド配列を発現するために等しく良好に機能し得るわけではなく、全ての宿主が同じ発現系とともに等しく良好に機能するわけではないが、当業者は、過度の実験操作なしに、本発明において使用するためのこれらのベクター、発現調節配列、最適化されたコドン及び宿主から容易に選択を行い得ると考えられる。ベクターは、宿主中で複製可能でなければならず、又は染色体中に組み込まれなければならないので、例えば、ベクターを選択する際には、宿主を検討しなければならない。ベクターのコピー数、そのコピー数を調節する能力及びベクターによってコードされる何らかの他のタンパク質の発現（抗生物質マーカーなど）も検討すべきである。発現調節配列を選択する際には、様々な要因も検討され得る。これらには、配列の相対的な強さ、その調節可能性及び特に、潜在的な二次構造に関して、哺乳動物ＮＧＡＬをコードするポリヌクレオチド配列とのその適合性が含まれるが、これらに限定されない。宿主は、選択されたベクターとのその適合性、コドン使用、分泌特性、ポリペプチドを正しく折り畳む能力、発酵又は培養の必要性、タンパク質をグリコシル化する能力（又は能力の欠如）及びヌクレオチド配列によってコードされる産物の精製の容易さなどを検討することによって選択すべきである。
【００７０】
組換えベクターは、自律的に複製するベクター、すなわち、染色体外成分として存在し、その複製が染色体の複製から独立しているベクター（プラスミドなど）であり得る。あるいは、ベクターは、宿主細胞中に導入されたときに、宿主細胞ゲノム中に組み込まれ、ベクターがその中に組み込まれている染色体と一緒に複製されるベクターであり得る。
【００７１】
ベクターは、好ましくは、哺乳動物ＮＧＡＬをコードするポリヌクレオチド配列はポリヌクレオチド配列の転写のために必要とされる追加セグメントに作用可能に連結されている発現ベクターである。ベクターは、典型的には、プラスミド又はウイルスＤＮＡに由来する。本明細書に挙げられている宿主細胞中での発現に適した多数の発現ベクターが市販されており、又は文献に記載されている。真核生物宿主に対する有用な発現ベクターには、ＳＶ４０、ウシ乳頭腫ウイルス、アデノウイルス及びサイトメガロウイルスから得られる発現調節配列を含むベクターが含まれるが、これらに限定されない。具体的なベクターには、ｐＣＤＮＡ３．１（＋）／Ｈｙｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）及びｐＣＩ−ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）が含まれる。酵母細胞中で使用するための発現ベクターの例には、２μプラスミド及びその誘導体、ＰＯＴ１ベクター（米国特許第４，９３１，３７３号参照）、ｐＪＳＯ３７ベクター（Ｏｋｋｅｌｓ，Ａｎｎ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７８２：２０２−２０７，（１９９６）に記載されている。）及びｐＰＩＣＺＡ、Ｂ又はＣ（Ｉｎｂｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が含まれるが、これらに限定されない。昆虫細胞中で使用するための発現ベクターの例には、ｐＶＬ９４１、ｐＢＧ３１１（Ｃａｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｏｖｉｎｅ  ａｎｄＨｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｓ  ｆｏｒＭｕｌｌｅｒｉａｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｉｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ”  Ｃｅｌｌ，４５：６８５−６９８（１９８６）、ｐＢｌｕｅｂａｃ４．５及びｐＭｅｌｂａｃ（何れも、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから入手可能である。）が含まれるが、これらに限定されない。本発明において使用するための好ましいベクターは、ｐＪＶ（Ａｂｂｏｔｔ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡから入手可能）である。
【００７２】
使用可能な他のベクターは、哺乳動物ＮＧＡＬをコードするポリヌクレオチド配列のコピー数を増幅することができる。このような増幅可能なベクターは、本分野において周知である。これらのベクターには、ＤＨＦＲ増幅（例えば、Ｋａｕｆｉｎａｎ、米国特許第４，４７０，４６１号、Ｋａｕｆｉｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ａ  Ｍｏｄｕｌａｒ  Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｃＤＮＡ  Ｇｅｎｅ：Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｏｆ  Ｓｉｇｎａｌｓ  Ｕｔｉｌｉｚｅｄ  Ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２：１３０４−１３１９（１９８２））及びグルタミン合成酵素（ＧＳ）増幅（例えば、米国特許第５，１２２，４６４号及び欧州特許出願０３３８，８４１号参照）によって増幅され得るベクターが含まれるが、これに限定されない。
【００７３】
組換えベクターは、目的の宿主細胞中でのベクターの複製を可能にするＤＮＡ配列をさらに含み得る。（宿主細胞が哺乳動物細胞である場合）このような配列の例は、ＳＶ４０の複製起点である。宿主細胞が酵母細胞である場合、ベクターの複製を可能にする適切な配列は、酵母プラスミド２μ複製遺伝子ＲＥＰ１から３及び複製起点である。
【００７４】
ベクターは、選択可能なマーカー、すなわち、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）又はシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）ＴＰＩ遺伝子をコードする遺伝子など（Ｐ．Ｒ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｇｅｎｅ，４０：１２５−１３０（１９８５）参照）、その産物が宿主細胞中の欠損を相補する遺伝子又はポリヌクレオチドをコードする遺伝子もしくはポリヌクレオチド又はアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ハイグロマイシン又はメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与するものも含み得る。糸状真菌の場合、選択可能なマーカーには、ａｍｄＳ、ｐｒｙＧ、ａｒｃＢ、ｎｉａＤ及びｓＣが含まれるが、これらに限定されない。
【００７５】
本明細書において使用される「調節配列」という用語は、哺乳動物ＮＧＡＬの発現に必要な又は有利なあらゆる成分を表す。各調節配列は、哺乳動物ＮＧＡＬをコードする核酸配列にとって固有又は外来であり得る。このような調節配列には、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、エンハンサー又は上流活性化配列、シグナルペプチド配列及び転写終結因子が含まれるが、これらに限定されない。最小限、調節配列は、哺乳動物ＮＧＡＬをコードするポリヌクレオチド配列に作用可能に連結された少なくとも１つのプロモーターを含む。
【００７６】
本明細書において使用される「作用可能に連結された」という用語は、配列の正常な機能が発揮され得るような互いに対する配置での、酵素的連結又はその他の手段による２つ又はそれ以上のポリヌクレオチド配列の共有結合を表す。例えば、プレ配列又は分泌リーダーをコードするポリヌクレオチド配列は、ポリペプチドの分泌に関与するプロタンパク質としてポリペプチドが発現された場合に、ポリペプチドに対するポリヌクレオチド配列に作用可能に連結されている。プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼした場合に、コード配列に作用可能に連結されている。リボソーム結合部位は、翻訳を促進するように配置されている場合に、コード配列に作用可能に連結されている。一般に、「作用可能に連結された」とは、連結されているポリヌクレオチド配列が連続しており、分泌性リーダーの場合には、連続しており及び読み取り相にあることを意味する。連結は、都合のよい制限部位での連結によって達成される。このような部位が存在しない場合には、標準的な組換えＤＮＡ法と組み合わせて、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが使用される。
【００７７】
本発明において、多様な発現調節配列が使用され得る。このような有用な発現調節配列には、前記発現ベクターの構造遺伝子に付随した発現調節配列及び原核若しくは真核細胞又はこれらのウイルスの遺伝子の発現を調節することが知られているあらゆる配列並びにこれらの様々な組み合わせが含まれる。哺乳動物細胞中での転写を誘導するための適切な調節配列の例には、ＳＶ４０及びアデノウイルスの初期及び後期プロモーター、例えば、アデノウイルス２主要後期プロモーター、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス前初期遺伝子プロモーター（ＣＭＶ）、ヒト延長因子１α（ＥＦ−１α）プロモーター、ドロソフィラ最小熱ショックプロテイン７０プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ヒトユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーター、ヒト成長ホルモン終結因子、ＳＶ４０又はアデノウイルスＥ１ｂ領域ポリアデニル化シグナル及びＫｏｚａｋコンセンサス配列（Ｋｏｚａｋ，  Ｊ  ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ，  １９６：９４７−５０（１９８７））が含まれる。
【００７８】
哺乳動物細胞中での発現を改善するために、合成イントロンが、哺乳動物ＮＧＡＬをコードするポリヌクレオチド配列の５’非翻訳領域中に挿入され得る。合成イントロンの一例は、プラスミドｐＣＩ−Ｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡから入手可能）から得られる合成イントロンである。
【００７９】
昆虫細胞中での転写を誘導するための適切な調節配列の例には、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーター、バキュロウイルス前初期遺伝子１プロモーター及びバキュロウイルス３９Ｋ後初期遺伝子プロモーター及びＳＶ４０ポリアデニル化配列が含まれるが、これらに限定されない。
【００８０】
酵母宿主細胞中で使用するための適切な調節配列の例には、酵母α接合系のプロモーター、酵母トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）プロモーター、酵母解糖系遺伝子又はアルコール脱水素酵素遺伝子由来のプロモーター、ＡＤＨ２−４ｃプロモーター及び誘導性ＧＡＬプロモーターが含まれる。
【００８１】
糸状真菌宿主細胞中で使用するための適切な調節配列の例には、ＡＤＨ３プロモーター及びターミネーター、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼトリオースリン酸イソメラーゼ又はアルカリプロテアーゼをコードする遺伝子に由来するプロモーター、エー・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）α−アミラーゼ、エー・ニガー又はエー・ニジュラス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｓ）グルコアミラーゼ、エー・ニジュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼ、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ又はリパーゼをコードする遺伝子に由来するプロモーター、ＴＰＩ１ターミネーター及びＡＤＨ３ターミネーターが含まれる。
【００８２】
哺乳動物ＮＧＡＬをコードするポリヌクレオチド配列は、シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含んでもよく、又は含まなくてもよい。哺乳動物ＮＧＡＬがその中で発現される細胞から分泌されるべき場合には、シグナルペプチドが存在する。このようなシグナルペプチドが存在する場合、このようなシグナルペプチドは、ポリペプチドの発現のために選択された細胞によって認識されるものであるべきである。シグナルペプチドは、目的の哺乳動物ＮＧＡＬに対して相同（例えば、目的の哺乳動物ＮＧＡＬとともに通常付随するシグナルペプチドであり得る。）若しくは異種（すなわち、目的の哺乳動物ＮＧＡＬとは別の源を起源とする。）であり得、又は宿主細胞に対して、相同又は異種であり得る（すなわち、宿主細胞から本来発現されるペプチドであり、又は宿主細胞から本来発現されないペプチド）。従って、シグナルペプチドは、原核生物性であり（例えば、細菌に由来する。）又は真核生物性（例えば、哺乳動物又は昆虫、糸状真菌又は酵母細胞に由来する。）であり得る。
【００８３】
シグナルペプチドの存在又は不存在は、例えば、哺乳動物ＮＧＡＬの産生のために使用される発現宿主細胞に依存する。糸状真菌において使用するために、シグナルペプチドは、アスペルギルス種のアミラーゼ又はグルコアミラーゼをコードする遺伝子、リゾムコール・ミエヘイリパーゼ若しくはプロテアーゼ又はフミコラ・ラヌギノサリパーゼをコードする遺伝子に都合よく由来し得る。昆虫細胞中で使用する場合、シグナルペプチドは、鱗翅目のマンジュカ・セクスタ（Ｍａｎｄｕｃａ  ｓｅｘｔａ）脂質動員ホルモン前駆体（米国特許第５，０２３，３２８号参照）、ミツバチのメリチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）、エクジステロイドＵＤＰグルコシル転移酵素（ｅｇｔ）（Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ４：３４９−３５７（１９９３）などの昆虫遺伝子（ＷＯ９０／０５７８３参照）又はヒト膵臓リパーゼ（ｈｐｌ）（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  ２８４：２６２−２７２（１９９７））に由来し得る。
【００８４】
哺乳動物細胞中で使用するためのシグナルペプチドの具体例には、マウスＩｇκ軽鎖シグナルペプチドが含まれる（Ｃｏｌｏｍａ，Ｍ，Ｊ．Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１５２：８９−１０４（１９９２））。酵母細胞中で使用する場合、適切なシグナルペプチドには、Ｓ．セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のα−因子シグナルペプチド（米国特許第４，８７０，００８号参照）、マウス唾液アミラーゼのシグナルペプチド（Ｏ．Ｈａｇｅｎｂｕｃｈｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，２８９：６４３−６４６（１９８１））、修飾されたカルボキシペプチダーゼシグナルペプチド（Ｌ．Ａ．Ｖａｉｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，４８：８８７−８９７（１９８７）参照）、酵母ＢＡＲ１シグナルペプチド（ＷＯ８７／０２６７０参照）及び酵母アスパラギン酸プロテアーゼ３（ＹＡＰ３）シグナルペプチド（Ｍ．Ｅｇｅｌ−Ｍｉｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｙｅａｓｔ，６：１２７−１３７（１９９０）参照）が含まれる。
【００８５】
本発明のグリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬを産生するために、細菌、真菌（酵母を含む。）、昆虫、哺乳動物又は他の適切な動物細胞若しくは細胞株及びトランスジェニック動物又は植物を含むあらゆる適切な宿主を使用し得る。イー・コリなどの非グリコシル化生物が使用される場合、本発明のグリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬを産生するために、イー・コリ中での発現の後に、好ましくは、適切なインビトログリコシル化が行われる。
【００８６】
細菌宿主細胞の例には、バシラス、例えば、ビー・ブレビス（（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）又はビー・スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、シュードモナス又はストレプトミセスの系統などのグラム陽性細菌又はイー・コリの系統などのグラム陰性細菌が含まれるが、これらに限定されない。細菌宿主細胞中へのベクターの導入は、形質転換受容細胞（例えば、Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，  ８１：８２３−８２９（１９６１））又はＤｕｂｎａｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５６：２０９−２２１（１９７１））を用いた例えば、プロトプラスト形質転換（例えば、Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８：１１１−１１５（１９７９）参照）、電気穿孔（例えば、Ｓｈｉｇｅｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６：７４２−７５１（１９８８）参照）又は連結（例えば、Ｋｏｅｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，  １６９：５７７１−５２７８（１９８７）参照）によって実施され得る。
【００８７】
適切な糸状真菌宿主細胞の例には、アスペルギルス、例えば、エー・オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、エー・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）又はＡ．ニジュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）又はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の系統が含まれるが、これらに限定されない。真菌細胞は、当業者に公知の技術を用いて、プロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換及び細胞壁の再生を含む方法によって形質転換され得る。アスペルギルス宿主細胞の形質転換のための適切な手法は、欧州特許出願２３８０２３及び米国特許第５，６７９，５４３号に記載されている。フザリウム種を形質転換するための適切な方法は、「Ｍａｌａｒｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｇｅｎｅ，  ７８：１４７−１５６（１９８９）」及びＷＯ９６／００７８７によって記載されている。酵母は、「Ｂｅｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ｇｕａｒｅｎｔｅ，  Ｉｎ  Ａｂｅｌｓｏｎ，  Ｊ．Ｎ．ａｎｄ  Ｓｉｍｏｎ，  Ｍ．Ｉ．，  ｅｄｉｔｏｒｓ，  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌｕｍｅ  １９４，  ｐｐ  １８２−１８７，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；  Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，  １５３：１６３（１９８３）；及びＨｉｎｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，  ７５：１９２０（１９７８）」によって記載されている手法を用いて形質転換され得る。
【００８８】
好ましくは、本発明の哺乳動物ＮＧＡＬは、インビボでグリコシル化される。哺乳動物ＮＧＡＬがインビボでグリコシル化される場合、宿主細胞は、哺乳動物ＮＧＡＬの所望されるグリコシル化を作製することができる宿主細胞の群から選択される。従って、宿主細胞は、酵母細胞、昆虫細胞又は哺乳動物細胞から選択され得る。
【００８９】
適切な宿主細胞の例には、サッカロミセスの系統、例えば、エス・セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、スキゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クリベロミセス、ピー・パストリス又はピー・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）などのピキア、エイチ・ポリモルファ又はヤロウィアなどのハンセニュラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）の系統が含まれる。異種のポリヌクレオチドで酵母細胞を形質転換し、酵母細胞から異種のポリペプチドを産生する方法は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ，  ＵＳＡ  （ＹｅａｓｔｍａｋｅｒＴＭ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｋｉｔの製品プロトコール中）によって、及びＲｅｅｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  ９９：１９３−１９８（１９９２），  Ｍａｎｉｖａｓａｋａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２１：４４１４−４４１５（１９９３）及びＧａｎｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  １２１：１５９−１６４（１９９４）によって開示されている。
【００９０】
適切な昆虫宿主細胞の例には、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｆ９又はＳｆ２１）又はトリコプルシア・ニー細胞（ＨｉｇｈＦｉｖｅ）などの鱗翅目細胞株が含まれるが、これらに限定されない（米国特許第５，０７７，２１４号参照）。昆虫細胞の形質転換及び異種のポリペプチドの産生は、当業者に周知である。
【００９１】
適切な哺乳動物宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ミドリザル細胞株（ＣＯＳ）、マウス細胞（例えば、ＮＳ／Ｏ）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞株、ヒト細胞（ヒト胚性腎臓細胞（例えば、ＨＥＫ２９３）（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１５７３）など）及び組織培養中の植物細胞が含まれる。好ましくは、哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞株及びＨＥＫ２９３細胞株である。別の好ましい宿主細胞は、Ｂ３細胞株（例えば、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ａｂｂｏｔｔ  Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，  Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，  ＭＡ）又は別のジヒドロ葉酸還元酵素欠損（ＤＨＦＲ−）ＣＨＯ細胞株（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから入手可能）である。一態様において、本発明は、グリコシル化されたヒト野生型ＮＧＡＬ（すなわち、配列番号１又は１３のアミノ酸配列を有するもの）を産生し、２００６年１１月２１日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２０が付与されたＣＨＯ細胞株に関する。好ましくは、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２０を有するＣＨＯ細胞株によって産生される野生型ヒトＮＧＡＬは、約２５キロダルトン（ｋＤａ）の分子量を有する。別の態様において、本発明は、グリコシル化された変異体ヒトＮＧＡＬを産生するＣＨＯ細胞株に関する。好ましくは、グリコシル化された変異体ヒトＮＧＡＬは、野生型ヒトＮＧＡＬ（すなわち、配列番号１又は１３）のアミノ酸配列のアミノ酸８７に対応するアミノ酸においてアミノ酸置換を含む。より好ましくは、アミノ酸置換は、セリンによるシステインの置換である（配列番号２又は１０参照）。最も好ましくは、ＣＨＯ細胞株は、２００７年１月２３日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８１６８が付与されたＣＨＯ細胞株である。ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８１６８を有するＣＨＯ細胞株は、配列番号２又は１０のアミノ酸配列を含むグリコシル化された変異体ヒトＮＧＡＬを産生する。さらに別の態様において、本発明は、配列番号２又は１０のアミノ酸配列を含む単離された変異体グリコシル化されたヒトＮＧＡＬに関する。
【００９２】
哺乳動物の宿主細胞中に外来ポリヌクレオチドを導入する方法には、リン酸カルシウムによって媒介される形質移入、電気穿孔、ＤＥＡＥ−デキストランによって媒介される形質移入、リポソームによって媒介される形質移入、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００を用いる、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ，  Ｐａｉｓｌｅｙ，  ＵＫによって記載されているウイルスベクター及び形質移入方法が含まれる。これらの方法は、本分野において周知であり、例えば、Ａｕｓｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＵＳＡ  （１９９６）によって記載されている。哺乳動物細胞の培養は、例えば、「Ｊｅｎｋｉｎｓ，  Ｅｄ．，  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，ＵＳＡ（１９９９）」及び「Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｒａｅ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９７）」に開示されている確立された方法に従って実施される。
【００９３】
製造方法において、細胞は、本分野で公知の方法を用いて、哺乳動物ＮＧＡＬの産生に適した栄養素培地中で培養される。例えば、細胞は、振盪フラスコ培養、適切な培地中並びにグリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬを発現及び／又は単離させる条件下で行われる研究室用又は産業用発酵装置中での小規模若しくは大規模発酵（連続、バッチ、フェドバッチ又は固体状態発酵を含む。）によって培養される。培養は、本分野において公知の手法を用いて、炭素及び窒素源並びに無機塩を含む適切な栄養素培地中で行われる。適切な培地は、民間の業者から入手することができ、又は（例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログ中に）公開された組成に従って調製され得る。グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬが栄養素培地中に分泌される場合、哺乳動物ＮＧＡＬは、培地から直接回収され得る。哺乳動物ＮＧＡＬが分泌されない場合には、細胞可溶化液から回収することができる。
【００９４】
得られた哺乳動物ＮＧＡＬは、本分野において公知の方法によって回収され得る。例えば、哺乳動物ＮＧＡＬは、遠心、ろ過、抽出、スプレー乾燥、蒸発又は沈殿などの（但し、これらに限定されない。）慣用の手法によって、栄養素培地から回収され得る。
【００９５】
哺乳動物ＮＧＡＬは、クロマトグラフィー（イオン交換、アフィニティー、疎水性、等電点電気泳動及びサイズ排除など（但し、これらに限定されない。）、電気泳動手法（調製用等電点など（但し、これらに限定されない。））、溶解度の差（硫酸アンモニウム沈殿など（但し、これらに限定されない。））、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ又は抽出（例えば、Ｊ−Ｃ  Ｊａｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｒｓ  Ｒｙｄｅｎ，  ｅｄｉｔｏｒｓ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８９）参照）などの（但し、これらに限定されない。）本分野において公知の様々な手法によって精製され得る。
【００９６】
本明細書に記載されているグリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬ（野生型及び変異体）は、様々な異なる目的及び様々な異なる方法のために使用することができる。具体的には、本明細書に記載されているグリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬは、１つ若しくはそれ以上の検量用試料、１つ若しくはそれ以上の対照又は検査試料中の哺乳動物ＮＧＡＬを検出するためのアッセイ（好ましくは、イムノアッセイ）における１つ若しくはそれ以上の検量用試料の組み合わせとして使用することができる。グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬ（野生型及び変異体）は、２００７年１０月１９日に出願された米国仮特許出願６０／９８１，４７０号（ＮＧＡＬ抗原及び検量用試料又は対照に関するその教示に関して、参照により組み込まれる。）の主題の一部である。好ましくは、グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬは、配列番号１又は１３のアミノ酸配列を含む。あるいは、グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬは、配列番号２又は１０のアミノ酸配列を含む。
【００９７】
例えば、本明細書に記載されているグリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬは、検査試料中の哺乳動物ＮＧＡＬの存在を検出するための方法を改良するために使用することができる。検査試料中の哺乳動物ＮＧＡＬを検出するための前記方法の正確な工程及びこれらの工程の順序は重要でない。むしろ、方法の改良は、１つ若しくはそれ以上の検量用物質、１つ若しくはそれ以上の対照として、又は１つ若しくはそれ以上の検量用物質と対照の組み合わせとしての、本明細書に記載されているグリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬの使用を含む。例えば、このような方法は、
（ａ）哺乳動物ＮＧＡＬ／抗体複合体（哺乳動物抗体／捕捉抗体複合体など）の形成を可能とする時間及び条件下で、哺乳動物ＮＧＡＬを含有することが疑われる検査試料を、哺乳動物ＮＧＡＬに対して特異的な少なくとも１つの抗体（捕捉抗体など（但し、これに限定されない。））と接触させる工程；及び
（ｂ）前記哺乳動物ＮＧＡＬ抗原の存在の指標として、（連結物を添加することなどによって）形成された何れかの哺乳動物ＮＧＡＬ／抗体複合体を検出する工程；
を含み得、
前記方法は、少なくとも１つの検量用物質、少なくとも１つの対照として、又は少なくとも１つの検量用物質と少なくとも１つの対照の組み合わせとして、（配列番号１、配列番号２、配列番号１０若しくは配列番号１３又は配列番号１、配列番号２、配列番号１０若しくは配列番号１３の組み合わせ（すなわち、１つは検量用物質として使用され、１つは対照として使用されるなど）のアミノ酸配列を有するグリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬなどの）本明細書に記載されている少なくとも１つのグリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬを使用する。
【００９８】
（例えば、配列番号２又は１０に記載されているような）変異体ＮＧＡＬ（場合によって、グリコシル化されている。）を使用することの１つの主な利点は、野生型ＮＧＡＬを用いて作製された検量用物質は時間とともに二量体をゆっくり形成し得ることである。本明細書の実施例に記載されているように、伝統的なＮＧＡＬアッセイは二量体より単量体をよりよく検出するので、これは、単量体の喪失（すなわち、不安定性）として認識される。このために、検量用曲線はシフトし、減少した精度をもたらす。
【００９９】
本明細書に記載されているように、試料中のＮＧＡＬの存在を検出するためのキットにおいて、哺乳動物ＮＧＡＬ（例えば、グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬ）も、場合によって使用することができる。
【０１００】
さらに、哺乳動物ＮＧＡＬは、抗体作製のために動物を免疫化するための免疫原として使用することが可能であり、動物は、マウス、ウサギ、ニワトリ、ラット、ヒツジ、ヤギ、サメ、ラクダ、ウマ、ネコ、イヌ、非ヒト霊長類、ヒト又はその他の動物であり得る。一実施形態において、免疫原は、グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬ、特に、配列番号１、２、１０又は１３の配列を含むグリコシル化されたヒトＮＧＡＬを含む。別の実施形態において、哺乳動物ＮＧＡＬは、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ウマ、非ヒト霊長類、ヒト又は他の哺乳動物のものである。
【０１０１】
Ｃ．ヒトＮＧＡＬ抗体
ＮＧＡＬポリペプチドに対して誘導された抗体及びＮＧＡＬポリペプチドを用いて、このような抗体を作製する方法は、２００７年１０月１９日に出願された米国仮特許出願６０／９８１，４７１号（これらに関するその開示に関して、参照により、組み込まれる。）に記載されている。このような抗体は、本発明のアッセイにおけるその使用に関して、本明細書中にさらに記載されている。本発明は、野生型ヒトＮＧＡＬ（すなわち、配列番号１又は１３）又はヒトＮＧＡＬ断片に特異的に結合する抗体を使用する。抗体は、変異体又は非固有配列（例えば、配列番号２又は１０）を含むように、アミノ酸配列が野生型配列（配列番号１又は１３）の少なくとも１つのアミノ酸置換を含有するヒトＮＧＡＬにも場合によって結合する。
【０１０２】
特に、一態様において、本発明は、野生型ヒトＮＧＡＬ（すなわち、配列番号１又は１３、配列番号１の付番は、シグナルペプチド及び何れかのＭｅｔ開始残基の直後に存在する成熟配列のＧｌｎ残基から始まる。）の連続していないアミノ酸残基１１２、１１８及び１４７を含むエピトープ、例えば、立体構造的エピトープに結合する単離された抗体を使用する。別の態様において、本発明は、野生型ヒトＮＧＡＬ（すなわち、配列番号１又は１３）のアミノ酸残基１１２、１１８及び１４７並びに少なくとも１つのヒトＮＧＡＬタンパク質の追加のアミノ酸（追加のアミノ酸は、野生型ヒトＮＧＡＬ（すなわち、配列番号１又は１３）のアミノ酸残基１１７又は１１９である。）を含む立体構造的エピトープに結合する単離された抗体を使用する。さらに別の態様において、本発明は、野生型ヒトＮＧＡＬ（すなわち、配列番号１又は１３）のアミノ酸残基１１２、１１７、１１８、１１９及び１４７を含む立体構造的エピトープに結合する単離された抗体を使用する。
【０１０３】
別の態様において、本発明は、野生型ヒトＮＧＡＬに特異的に結合し、配列番号５のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域を有する単離された抗体に関する。
【０１０４】
別の態様において、本発明は、野生型ヒトＮＧＡＬに特異的に結合し、配列番号５のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域を有し、並びに、さらに（１）野生型ヒトＮＧＡＬタンパク質（すなわち、配列番号１又は１３）のアミノ酸残基１１２、１１８及び１４７、（２）野生型ヒトＮＧＡＬタンパク質（すなわち、配列番号１又は１３）のアミノ酸残基１１２、１１８及び１４７並びに野生型ＮＧＡＬタンパク質の少なくとも１つの追加のアミノ酸（追加のアミノ酸は、野生型ヒトＮＧＡＬ（すなわち、配列番号１又は１３）のアミノ酸残基１１７又は１１９である。）又は（３）野生型ヒトＮＧＡＬ（すなわち、配列番号１又は１３）のアミノ酸残基１１２、１１７、１１８、１１９及び１４７を含む立体構造的エピトープに結合する、単離された抗体に関する。
【０１０５】
別の態様において、本発明は、野生型ヒトＮＧＡＬに特異的に結合し、配列番号６のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を有する単離された抗体の使用に関する。
【０１０６】
別の態様において、本発明は、野生型ヒトＮＧＡＬに特異的に結合し、配列番号６のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を有し、並びに、さらに（１）野生型ヒトＮＧＡＬタンパク質（すなわち、配列番号１又は１３）のアミノ酸残基１１２、１１８及び１４７、（２）野生型ヒトＮＧＡＬタンパク質（すなわち、配列番号１又は１３）のアミノ酸残基１１２、１１８及び１４７並びに野生型ＮＧＡＬタンパク質の少なくとも１つの追加のアミノ酸（追加のアミノ酸は、野生型ヒトＮＧＡＬ（すなわち、配列番号１又は１３）のアミノ酸残基１１７又は１１９である。）又は（３）野生型ヒトＮＧＡＬ（すなわち、配列番号１又は１３）のアミノ酸残基１１２、１１７、１１８、１１９及び１４７を含む立体構造的エピトープに結合する、単離された抗体の使用に関する。
【０１０７】
別の態様において、本発明は、野生型ヒトＮＧＡＬに特異的に結合し、配列番号５のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域及び配列番号６のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を有する単離された抗体の使用に関する。
【０１０８】
別の態様において、本発明は、野生型ヒトＮＧＡＬに特異的に結合し、配列番号５のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域及び配列番号６のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を有し、並びに、さらに（１）野生型ヒトＮＧＡＬタンパク質（すなわち、配列番号１又は１３）のアミノ酸残基１１２、１１８及び１４７、（２）野生型ヒトＮＧＡＬタンパク質（すなわち、配列番号１又は１３）のアミノ酸残基１１２、１１８及び１４７並びに野生型ＮＧＡＬタンパク質の少なくとも１つの追加のアミノ酸（追加のアミノ酸は、野生型ヒトＮＧＡＬ（すなわち、配列番号１又は１３）のアミノ酸残基１１７又は１１９である。）又は（３）野生型ヒトＮＧＡＬ（すなわち、配列番号１又は１３）のアミノ酸残基１１２、１１７、１１８、１１９及び１４７を含む立体構造的エピトープに結合する、単離された抗体の使用に関する。
【０１０９】
さらに別の態様において、本発明は、２００６年１１月２１日に寄託されたＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２４を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−２３２２−４５５によって産生された抗体の使用に関する。マウスハイブリドーマ細胞株１−２３２２−４５５によって産生された抗体は、（１）野生型ヒトＮＧＡＬタンパク質（すなわち、配列番号１又は１３）のアミノ酸残基１１２、１１８及び１４７、（２）野生型ヒトＮＧＡＬタンパク質（すなわち、配列番号１又は１３）のアミノ酸残基１１２、１１８及び１４７並びに野生型ＮＧＡＬタンパク質の少なくとも１つの追加のアミノ酸（追加のアミノ酸は、野生型ヒトＮＧＡＬ（すなわち、配列番号１又は１３）のアミノ酸残基１１７又は１１９である。）又は（３）野生型ヒトＮＧＡＬ（すなわち、配列番号１又は１３）のアミノ酸残基１１２、１１７、１１８、１１９及び１４７を含む立体構造的エピトープに結合することができる。マウスハイブリドーマ細胞株１−２３２２−４５５は、配列番号５のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン及び配列番号６のアミノ酸配列を含む可変軽ドメインを有する。
【０１１０】
さらに別の態様において、本発明は、野生型ヒトＮＧＡＬに特異的に結合し、配列番号７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域を有する単離された抗体の使用に関する。
【０１１１】
さらに別の態様において、本発明は、野生型ヒトＮＧＡＬに特異的に結合し、配列番号７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域を有し、並びに、さらに（１）野生型ヒトＮＧＡＬタンパク質（すなわち、配列番号１又は１３）のアミノ酸残基１５及び１０９、（２）野生型ヒトＮＧＡＬタンパク質（すなわち、配列番号１又は１３）のアミノ酸残基１５及び１０９並びに野生型ＮＧＡＬタンパク質の少なくとも１つの追加のアミノ酸（追加のアミノ酸は、野生型ヒトＮＧＡＬ（すなわち、配列番号１又は１３）のアミノ酸残基１５８、１５９又は１６０である。）又は（３）野生型ヒトＮＧＡＬ（すなわち、配列番号１又は１３）のアミノ酸残基１５、１０９、１５８、１５９又は１６０を含む立体構造的エピトープに結合する、単離された抗体の使用に関する。
【０１１２】
さらに別の態様において、本発明は、野生型ヒトＮＧＡＬに特異的に結合し、配列番号８のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を有する単離された抗体の使用に関する。
【０１１３】
さらに別の態様において、本発明は、野生型ヒトＮＧＡＬに特異的に結合し、配列番号８のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を有し、並びに、さらに（１）野生型ヒトＮＧＡＬタンパク質（すなわち、配列番号１又は１３）のアミノ酸残基１５及び１０９、（２）野生型ヒトＮＧＡＬタンパク質（すなわち、配列番号１又は１３）のアミノ酸残基１５及び１０９並びに野生型ヒトＮＧＡＬタンパク質の少なくとも１つの追加のアミノ酸（追加のアミノ酸は、野生型ヒトＮＧＡＬ（すなわち、配列番号１又は１３）のアミノ酸残基１５８、１５９又は１６０である。）又は（３）野生型ヒトＮＧＡＬ（すなわち、配列番号１又は１３）のアミノ酸残基１５、１０９、１５８、１５９又は１６０を含む立体構造的エピトープに結合する、単離された抗体の使用に関する。
【０１１４】
別の態様において、本発明は、野生型ヒトＮＧＡＬに特異的に結合し、配列番号７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域及び配列番号８のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を有する単離された抗体の使用に関する。
【０１１５】
別の態様において、本発明は、野生型ヒトＮＧＡＬに特異的に結合し、配列番号７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域及び配列番号８のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を有し、並びに、さらに（１）野生型ヒトＮＧＡＬタンパク質（すなわち、配列番号１又は１３）のアミノ酸残基１５及び１０９、（２）野生型ヒトＮＧＡＬタンパク質（すなわち、配列番号１又は１３）のアミノ酸残基１５及び１０９並びに野生型ヒトＮＧＡＬタンパク質の少なくとも１つの追加のアミノ酸（追加のアミノ酸は、野生型ヒトＮＧＡＬ（すなわち、配列番号１又は１３）のアミノ酸残基１５８、１５９又は１６０である。）又は（３）野生型ヒトＮＧＡＬ（すなわち、配列番号１又は１３）のアミノ酸残基１５、１０９、１５８、１５９又は１６０を含む立体構造的エピトープに結合する、単離された抗体の使用に関する。
【０１１６】
さらに別の態様において、本発明は、２００６年１１月２１日に寄託されたＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２６を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−９０３−４３０によって産生された抗体の使用に関する。マウスハイブリドーマ細胞株１−９０３−４３０によって産生された抗体は、（１）野生型ヒトＮＧＡＬタンパク質（すなわち、配列番号１又は１３）のアミノ酸残基１５及び１０９、（２）野生型ヒトＮＧＡＬタンパク質（すなわち、配列番号１又は１３）のアミノ酸残基１５及び１０９並びに野生型ヒトＮＧＡＬタンパク質の少なくとも１つの追加のアミノ酸（追加のアミノ酸は、野生型ヒトＮＧＡＬ（すなわち、配列番号１又は１３）のアミノ酸残基１５８、１５９又は１６０である。）又は（３）野生型ヒトＮＧＡＬ（すなわち、配列番号１又は１３）のアミノ酸残基１５、１０９、１５８、１５９又は１６０を含む立体構造的エピトープに結合することができる。マウスハイブリドーマ細胞株１−９０３−４３０は、配列番号７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン及び配列番号８のアミノ酸配列を含む可変軽ドメインを有する。
【０１１７】
さらに別の実施形態において、本発明は、配列番号１、２、１０又は１３に記載されている（特に、配列番号１０又は１３に記載されている）ヒトＮＧＡＬタンパク質に特異的に結合する単離された抗体の使用に関し、
（ａ）残基Ｎ１１６に関して、約１Ｈ＝９．４７又は約１５Ｎ＝１１８．３０に位置する共鳴位置；
（ｂ）残基Ｑ１１７に関して、約１Ｈ＝７．７９又は約１５Ｎ＝１１７．６７に位置する共鳴位置；
（ｃ）残基Ｈ１１８に関して、約１Ｈ＝８．７５又は約１５Ｎ＝１１６．４３に位置する共鳴位置；
（ｄ）残基Ｔ１４１に関して、約１Ｈ＝７．９９又は約１５Ｎ＝１０９．０６に位置する共鳴位置；
（ｅ）残基Ｋ１４２に関して、約１Ｈ＝７．８２又は約１５Ｎ＝１１４．２５に位置する共鳴位置；
（ｆ）残基Ｅ１４３に関して、約１Ｈ＝７．４０又は約１５Ｎ＝１１４．００に位置する共鳴位置；及び
（ｇ）残基Ｅ１５０に関して、約１Ｈ＝８．７０又は約１５Ｎ＝１１８．８０に位置する共鳴位置；
からなる群から選択される、配列番号１又は１３の残基に対応するアミノ酸に対するアミド共鳴位置の少なくとも３つ、４つ又は５つ、特に、配列番号１、２、１０又は１３の（特に、配列番号１０又は１３の）残基に対応するアミノ酸に対するアミド共鳴位置の約２から６のＴＲＯＳＹプロトン−窒素相関ＮＭＲスペクトルにおいて、
前記抗体を（一般に、過剰に、特に化学量論的に過剰に）ヒトＮＧＡＬタンパク質に添加した結果として、前記抗体が添加されていない場合と比べて、前記抗体は、
（１）１Ｈ共鳴位置における約０．０５ｐｐｍから約１．０ｐｐｍ、特に、約０．０４ｐｐｍから約０．０６ｐｐｍ、特に、１Ｈ共鳴位置における約０．０５ｐｐｍの擾乱、
（２）１５Ｎ共鳴位置における約０．３ｐｐｍから約３．０ｐｐｍ、特に、約０．０１ｐｐｍから約２．０ｐｐｍの、特に約０．１ｐｐｍ、約０．３ｐｐｍ若しくは１５Ｎ共鳴位置における約０．６ｐｐｍの擾乱、又は
（３）共鳴強度の約２．５倍から約２０倍の減少、特に、蛍光強度の約３倍から約１５倍の減少、特に約４倍から約１０倍の減少、
を引き起こす。換言すれば、シフトは、野生型ＮＧＡＬタンパク質中の残基に対応する共鳴位置中に存在する。
【０１１８】
さらに別の実施形態において、本発明は、配列番号１、２、１０又は１３に記載されている（特に、配列番号１０又は１３に記載されている）ヒトＮＧＡＬタンパク質に特異的に結合する単離された抗体の使用に関し、
（ａ）残基Ｙ６４に関して、約１Ｈ＝９．１５又は約１５Ｎ＝１１３．３０に位置する共鳴位置；
（ｂ）残基Ｖ８４に関して、約１Ｈ＝９．３４又は約１５Ｎ＝１２１．５０に位置する共鳴位置；
（ｃ）残基Ｇ８６に関して、約１Ｈ＝８．３２又は約１５Ｎ＝１１１．６０に位置する共鳴位置；
（ｄ）残基Ｔ９３に関して、約１Ｈ＝９．３２又は約１５Ｎ＝１１２．８０に位置する共鳴位置；
（ｅ）残基Ｌ９４に関して、約１Ｈ＝７．７１又は約１５Ｎ＝１２２．７２に位置する共鳴位置；
（ｆ）残基Ｇ９５に関して、約１Ｈ＝９．３０又は約１５Ｎ＝１１３．７０に位置する共鳴位置；及び
（ｇ）残基Ｓ９９に関して、約１Ｈ＝８．１８又は約１５Ｎ＝１１４．５０に位置する共鳴位置；
からなる群から選択される配列番号１又は１３の残基に対応するアミノ酸に対するアミド共鳴位置の少なくとも３つ、４つ又は５つ、特に、配列番号１、２、１０又は１３の（特に、配列番号１０又は１３の）残基に対応するアミノ酸に対するアミド共鳴位置の約２から６のＴＲＯＳＹプロトン−窒素相関ＮＭＲスペクトルにおいて、
前記抗体を（一般に、過剰に、特に化学量論的に過剰に）ヒトＮＧＡＬタンパク質に添加した結果として、前記抗体が添加されていない場合と比べて、前記抗体は、
（１）１Ｈ共鳴位置における約０．０５ｐｐｍから約１．０ｐｐｍ、特に、約０．０４ｐｐｍから約０．０６ｐｐｍ、特に、１Ｈ共鳴位置における約０．０５ｐｐｍの擾乱、
（２）１５Ｎ共鳴位置における約０．３ｐｐｍから約３．０ｐｐｍ、特に、約０．０１ｐｐｍから約２．０ｐｐｍの、特に約０．１ｐｐｍ、約０．３ｐｐｍ若しくは１Ｈ共鳴位置における約０．６ｐｐｍの擾乱、又は
（３）共鳴強度の約２．５倍から約２０倍の減少、特に、約３倍から約１５倍の減少、特に共鳴強度の約４倍から約１０倍の減少、
を引き起こす。
【０１１９】
Ｄ．ＮＧＡＬ抗体を作製及び使用する方法
本発明のイムノアッセイにおいて使用される抗体は、本分野において公知の様々な異なる技術を用いて作製することができる。例えば、野生型ヒトＮＧＡＬに対するポリクローナル及びモノクローナル抗体は、適切な免疫原を含有する免疫原性調製物で適切な対象（ウサギ、ヤギ、マウス又は他の哺乳動物など（但し、これらに限定されない。））を免疫化することによって産生され得る。免疫化のために使用することができる免疫原には、ヒトＮＧＡＬを発現することが知られている不死化された細胞株ＮＳＯから得られる細胞などの細胞が含まれ得る。特に、本明細書において使用される抗体は、２００７年１０月１９日に出願された米国仮特許出願６０／９８１，４７１号（抗体に関するその教示に関して、参照により、組み込まれる。）に記載されているように作製することができる。
【０１２０】
あるいは、免疫原は、精製された若しくは単離されたヒト野生型ＮＧＡＬタンパク質そのもの（すなわち、配列番号１又は１３）又はそのヒトＮＧＡＬ断片であり得る。例えば、アフィニティークロマトグラフィー、免疫沈降又は本分野において周知である他の技術を用いて、タンパク質（ＮＳＯなど）を産生する細胞から単離された野生型ヒトＮＧＡＬ（配列番号１又は１３参照）を免疫原として使用することができる。あるいは、本分野において公知の定型的技術（合成装置など（但し、これに限定されない。））を使用する化学的合成を用いて、免疫原を調製することが可能である。
【０１２１】
次いで、抗体が野生型ヒトＮＧＡＬ又はヒトＮＧＡＬ断片に結合するかどうかを測定するために、対象中で産生される抗体をスクリーニングすることができる。このような抗体は、本明細書中に記載されている方法を用いてさらにスクリーニングすることができる（例えば、実施例５参照）。例えば、これらの抗体が野生型ヒトＮＧＡＬのアミノ酸残基１１２、１１８及び１４７又は野生型ヒトＮＧＡＬのアミノ酸残基１５及び１０９（配列番号１又は１３参照）に結合するかどうかを測定するために、これらの抗体をアッセイすることができる。所望される特徴を有する抗体を同定するための適切な方法が、本明細書に記載されている（実施例５参照）。さらに、変異体ＮＧＡＬ（配列番号２又は１０参照）に結合する抗体を用いて得られた結果は、野生型ＮＧＡＬの結合へ完全に翻訳可能であること、及び抗体は野生型ヒトＮＧＡＬ（配列番号１又は１３参照）の同等の残基に結合することが完全に理解される。従って、便宜上、特定の事例において変異体ＮＧＡＬを使用しない合理的基礎が欠如しなければ、抗体の結合特性を評価するために、変異体ＮＧＡＬを使用することができる。
【０１２２】
免疫原（すなわち、精製されたタンパク質、タンパク質を発現する腫瘍細胞又は組換え的に発現されたヒトＮＧＡＬタンパク質）の単位用量及び免疫化計画は、免疫化されるべき対象、その免疫状態及び対象の体重に依存する。対象中の免疫応答を増強させるために、免疫原はフロイントの完全又は不完全アジュバントなどのアジュバントとともに投与することができる。
【０１２３】
上記されているような免疫原での対象の免疫化は、ポリクローナル抗体応答を誘導する。免疫化された対象中の抗体力価は、固定化された抗原、すなわち、本明細書に記載されているようなヒトＮＧＡＬ（配列番号１若しくは１３又はそのヒトＮＧＡＬ断片）を用いるＥＬＩＳＡなどの標準的な技術によって、経時的にモニターすることができる。
【０１２４】
ヒトＮＧＡＬ（配列番号１若しくは１３又はそのヒトＮＧＡＬ断片）に対する抗体を生産する方法には、ヒト免疫グロビン遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを使用することが含まれる（例えば、ＷＯ９１／００９０６、ＷＯ  ９１／１０７４１又はＷＯ９２／０３９１８を参照）。あるいは、ヒトモノクローナル抗体は、ヒト抗体を産生する細胞又は組織（例えば、ヒト骨髄細胞、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）、ヒト胎児リンパ節組織又は造血性幹細胞）が移植された免疫欠損マウス中に抗原を導入することによって作製することができる。このような方法には、ＳＣＩＤ−ｈｕマウス（例えば、ＷＯ９３／０５７９６、米国特許第５，４１１，７４９号又はＭｃＣｕｎｅ  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：１６３２−１６３９（１９８８））又はＲａｇ−１／Ｒａｇ−２欠損マウス中で抗体を生産することが含まれる。ヒト抗体免疫欠損マウスも市販されている。例えば、Ｒａｇ−２欠損マウスは、Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）から入手可能である。
【０１２５】
モノクローナル抗体は、対象を免疫原で免疫化することによって作製することができる。免疫化後の適切な時点で、例えば、抗体力価が十分に高いレベルになった時点で、標準的な技術を用いてモノクローナル抗体を調製するために、抗体産生細胞を免疫化された動物から採集し、使用することができる。例えば、抗体産生細胞は、標準的な体細胞融合手法によって、ハイブリドーマ細胞を産生するために、骨髄腫細胞などの不死化細胞と融合させ得る。このような技術は本分野において周知であり、例えば、「Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２５６：４９５４９７  （１９７５）」によって最初に開発されたハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，  ４：７２  （１９８３））及びヒトモノクローナル抗体を作製するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．ｐｐ．７７−９６  （１９８５））が含まれる。モノクローナル抗体ハイブリドーマを作製するための技術は、当業者に周知である。
【０１２６】
モノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現し、及びヒトＮＧＡＬタンパク質で免疫化されたトランスジェニックマウスから抗体産生細胞、例えば、脾細胞を採集することによっても作製することができる。脾細胞は、ヒト骨髄腫との融合を通じて、又はエプシュタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）での形質転換を通じて不死化することができる。これらのハイブリドーマは、本分野において記載されているヒトＢ細胞又はＥＢＶ−ハイブリドーマ技術を用いて作製することができる（例えば、Ｂｏｙｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，欧州特許公開０  ６１４  ９８４号参照）。
【０１２７】
野生型ヒトＮＧＡＬタンパク質（配列番号１又は１３）又はそのヒトＮＧＡＬ断片に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、ハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることによって、例えば、不死化されたヒトＮＧＡＬタンパク質に特異的に結合する抗体を選択するためにスクリーニングすることによって、又は抗体が所望される特徴、すなわち、本明細書に記載されているアミノ酸残基においてヒトＮＧＡＬに結合する能力を有するかどうかを決定するために本明細書に記載されている抗体を検査することによって検出される。所望の特異性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、例えば、限界希釈手法、例えば、Ｗａｎｄｓ他（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ８０：２２５−２３２（１９８１））によって記載されている手法によってクローンがサブクリーニングされ、標準的な方法によって増殖され得る。
【０１２８】
本明細書に記載されているスクリーニングアッセイ中で陽性検査結果を示すモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、ハイブリドーマ細胞が培地中にモノクローナル抗体を分泌することによって、完全な抗体を産生するのに十分な条件下及び時間で、栄養素培地中において培養することができる。ハイブリドーマ細胞に適した組織培養技術及び培地は、本分野において全般に記載されている（例えば、Ｒ．Ｈ．Ｋｅｎｎｅｔｈ，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  Ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．（１９８０）参照。）。次いで、抗体を含有する馴化されたハイブリドーマ培養上清を収集することができる。サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィーなどの慣用の免疫グロブリン精製手法によって、場合によって培地から単離することができる。
【０１２９】
モノクローナル抗体は、組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブリーを構築し、ヒトＮＧＡＬタンパク質を用いてライブラリーをスクリーニングすることによって操作することができる。ファージディスプレイライブラリーを作製及びスクリーニングするためのキットは、市販されている（例えば、ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ，  Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．２７−９４００−０１；及びｔｈｅ  Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＳｕｒｆＺＡＰ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｋｉｔ，  Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．２４０６１２参照）。同様に、酵母ディスプレイベクターは本分野において公知であり、市販されている（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから入手可能なｐＹＤ１）。要約すれば、野生型ヒトＮＧＡＬタンパク質（配列番号１又は１３）に特異的に結合する抗体を発現するファージ又は酵母細胞を同定及び単離するために、抗体ライブラリーがスクリーニングされる。好ましくは、ライブラリーの一次スクリーニングは、固定化された野生型ヒトＮＧＡＬタンパク質又はその断片を用いたスクリーニングを含む。
【０１３０】
スクリーニング後に、ディスプレイファージ又は酵母が単離され、選択された抗体をコードするポリヌクレオチドをディスプレイファージ又は酵母から（例えば、ファージ又は酵母ゲノムから）回収し、周知の組換えＤＮＡ技術によって他の発現ベクター中に（例えば、サッカロミセス・セレビシアエ細胞、例えば、ＥＢＹ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）））サブクローニングすることができる。ポリヌクレオチドは、宿主細胞中でさらに操作し（例えば、さらなる定常領域などのさらなる免疫グロブリンドメインをコードする核酸に連結される。）、及び／又は発現させることができる。
【０１３１】
あるいは、抗体に対するヒト患者による応答を最小化するために、キメラ及びヒト化抗体などの抗体の組換え形態も調製することができる。非ヒト対象中で産生された又は非ヒト抗体遺伝子の発現に由来する抗体がヒトの中で治療的に使用される場合、抗体は様々な程度で外来と認識され、患者中で免疫応答が生成され得る。この免疫反応を最小限に抑え又は除去するための１つのアプローチは、キメラ抗体誘導体、すなわち、非ヒト動物可変領域及びヒト定常領域を組み合わせた抗体分子を作製することである。このような抗体は、元のモノクローナル抗体のエピトープ結合特異性を保持しているが、ヒトに投与されたときに免疫原性がより低下し得、従って、患者によって許容される可能性がより高い。
【０１３２】
キメラモノクローナル抗体は、本分野において公知の組換えＤＮＡ技術によって作製され得る。例えば、非ヒト抗体分子の定常領域をコードする遺伝子は、ヒト定常領域をコードする遺伝子で置換される（例えば、ＰＣＴ特許公開ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９、欧州特許出願１８４，１８７号又は欧州特許出願１７１，４９６号を参照されたい。）。
【０１３３】
抗原結合に関与していない可変領域の一部をヒト可変領域由来の等価な一部で置換することによって、キメラ抗体は、さらに「ヒト化」することができる。「ヒト化された」キメラ抗体の一般的な総説は、「Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：１２０２−１２０７（１９８５）及びＯｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  ４−２１４（１９８６）」に見出すことができる。このような方法には、重又は軽鎖の少なくとも１つから得られる免疫グロブリン可変領域の全部又は一部をコードする核酸配列を単離し、操作し、及び発現させることが含まれる。次いで、ヒト化キメラ抗体又はその断片をコードするｃＤＮＡを適切な発現ベクター中にクローニングすることができる。あるいは、適切な「ヒト化された」抗体は、相補性決定領域（ＣＤＲ）置換によって作製することができる（例えば、米国特許第５，２２５，５３９号；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３２１：５５２−５２５（１９８６）；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１．５３４（１９８８）；及びＢｅｉｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，．１４１：４０５３−４０６０（１９８８）参照）。
【０１３４】
野生型ヒトＮＧＡＬタンパク質（配列番号１又は３３）又はそのヒトＮＧＡＬ断片に対して特異的な抗体（例えば、ハムスター抗体）の結合特異性を保持する「ヒト」抗体ポリペプチド二量体を作製するために、エピトープインプリンティングも使用することができる。要約すれば、抗原への特異的結合を有する非ヒト可変領域（ＶＨ）及びヒト定常領域（ＣＨ１）をコードする遺伝子をイー・コリ中で発現させ、ヒトＶλ．Ｃλ遺伝子のファージライブラリーに感染させる。次いで、ヒトＮＧＡＬタンパク質への結合に関して、抗体断片を提示するファージをスクリーニングする。Ｖλ．Ｃλ．鎖の発現に関して、選択されたヒトＶλ遺伝子を再度クローニングし、これらの鎖を有するイー・コリをヒトＶＨＣＨ１遺伝子のファージライブラリーに感染させ、抗原によって被覆されたチューブを用いたスクリーニングの繰り返しにライブラリーを供する（ＷＯ９３／０６２１３参照）。
【０１３５】
別の態様において、本発明は、抗体が抗体断片であることを想定する。例えば、抗体断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ断片、ジスルフィド結合されたＦｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）及びＦ（ａｂ’）２断片が含まれ得るが、これらに限定されない。抗体断片を作製するために、様々な技術が当業者に公知である。例えば、このような断片は、完全な抗体のタンパク分解的消化を介して得ることができ（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ２４：１０７−１１７  （１９９２）及びＢｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２２９：８１（１９８５）参照）、又は組換え宿主細胞によって直接産生され得る。例えば、Ｆａｂ’−ＳＨ断片は、イー・コリから直接回収し、Ｆ（ａｂ’）２断片を形成するために化学的に連結することができる（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１６３−１６７（１９９２）参照）。別の実施形態において、Ｆ（ａｂ’）２は、Ｆ（ａｂ’）２分子の集合を促進するために、ロイシンジッパーＧＣＮ４を用いて形成される。あるいは、Ｆｖ、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）２断片は、組換え宿主細胞培養から直接単離することができる。一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）は、短い連結ペプチドを使用することにより軽及び／又は重鎖可変領域を連結することによって作製される（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４２：４２３−４２６（１９９８）参照）。連結ペプチドの例は、ＧＰＡＫＥＬＴＰＬＫＥＡＫＶＳ（配列番号１１）である。次いで、薬物の付着又は固体支持体への付着など、さらなる機能のためにリンカーを修飾することが可能である。本発明において使用することができる他のリンカー配列の例は、「Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４２：４２３−４２６  （１９８８），  Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  ８５：５８７９−５８８３  （１９８８）」及び「ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３４８：５５２−５５４  （１９９０）」に見出すことができる。
【０１３６】
一本鎖変形物は、組換え的に又は合成的に作製することができる。ｓｃＦｖの合成的産生のために、自動化された合成装置を使用することができる。ｓｃＦｖの組換え的産生のために、ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドを含有する適切なプラスミドは、適切な宿主細胞（酵母、植物、昆虫若しくは哺乳動物などの真核生物又はイー・コリなどの原核生物の何れか）中に導入することができる。目的のｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの連結などの定型的操作によって作製することができる。本分野において公知の標準的タンパク質精製技術を用いて、得られたｓｃＦｖを単離することができる。さらに、ダイアボディなどの一本鎖抗体の他の形態も、本発明によって想定される。ダイアボディは、ＶＨ及びＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上に発現されているが、同じ鎖上の２つのドメイン間の対合が不可能なほど短く、これにより、ドメインを別の鎖の相補的ドメインと対合させ、２つの抗原結合部位を作製するリンカーを用いて発現される二価の二重特異的抗体である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，  Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）；Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２：１１２１−１１２３（１９９４）参照）。
【０１３７】
さらに、本明細書に記載されている本発明の幾つかの態様において（例えば、対照としての使用）、市販の抗ＮＧＡＬ抗体又は文献に記載されている抗ＮＧＡＬ抗体又はその作製方法を使用することが可能であり得る。これらには、（１）抗ＮＧＡＬモノクローナル抗体（ＡｎｔｉｂｏｄｙＳｈｏｐ  Ａ／Ｓ，  Ｇｅｎｔｏｆｔｅ，  Ｄｅｎｍａｒｋから市販されているＨＹＢ２１１−０１、ＨＹＢ２１１−０２又はＨＹＢ２１１−０５）；（２）マウス抗ＮＧＡＬモノクローナル抗体（例えば、クローン番号６９７、カタログ番号ＨＭ２１９３Ｂ、ＨｙＣｕｌｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｕｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）；（３）ラット抗ＮＧＡＬモノクローナル抗体（例えば、クローン番号２２０３１０、カタログ番号ＭＡＢ１７５７，Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）；（４）遊離のＮＧＡＬ形態（すなわち、ヘテロ二量体中に複合体化されていない形態）を検出すると称されるＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ（Ｒ）ＮＧＡＬＥＬＩＳＡキットＤＬＣＮ２０（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，  ＭＮ）中に含有される抗ＮＧＡＬ抗体（米国特許出願公開２００７／０１９６８７６号）；（５）マウスハイブリドーマ細胞中で産生されるウサギ抗ヒトＮＧＡＬモノクローナル抗体（ＥＰ０  ７５６  ７０８及び米国特許第６，１３６，５２６号）；（６）ヒトＮＧＡＬに対する精製されたモノクローナル又はポリクローナル抗体（Ｋｊｅｌｄｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇ．Ｃｈｅｍ．，  ２６８：１０４２５−３２（１９９３）；Ｋｊｅｌｄｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９８（２）：１５５−６４（１９９６））；（７）ヒトＮＧＡＬに対するポリクローナル抗体（ＰＣＴ国際公開ＷＯ２００２／０３１５０７）及び／又は（８）ヒトＮＧＡＬに対するモノクローナル抗体を作製するためのＮＧＡＬの溶媒に露出したペプチドループ領域の使用を論述する（米国特許第７，０５６，７０２号及び米国特許出願公開ＵＳ２００４／０１１５７２８号）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３８】
本発明の抗体は、様々な用途を有する。一態様において、本発明の抗体は、１つ又はそれ以上の免疫診断試薬として使用することができる。例えば、本発明の抗体は、検査試料中のヒトＮＧＡＬ抗原の存在を検出するための１つ又はそれ以上の方法において１つ又はそれ以上の免疫診断試薬として使用することができる。より具体的には、本発明の抗体は、検査試料中のヒトＮＧＡＬの存在を検出するためのイムノアッセイにおいて１つ若しくはそれ以上の捕捉抗体、１つ若しくはそれ以上の連結抗体又は１つ若しくはそれ以上の捕捉抗体及び１つ若しくはそれ以上の連結抗体の両方として使用することができる。
【０１３９】
Ｅ．試料の収集及び前処理
例えば、本発明の抗体が免疫診断薬として及び／又はＮＧＡＬイムノアッセイキット中で使用される場合、尿、血液、血清及び血漿並びに他の体液を収集し、取り扱い及び処理するための本分野で周知の方法が本発明の実施に際して使用される。
【０１４０】
検査試料は、抗体、抗原、ハプテン、ホルモン、薬物、酵素、受容体、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドなどの目的ＮＧＡＬ分析物の他に、さらなる部分を含み得る。例えば、試料は、対象から得られた全血試料であり得る。検査試料、特に、全血は、本明細書に記載されているようなイムノアッセイの前に、例えば、前処理試薬で処理することが必要であり得、又は所望され得る。前処理が不要である場合でさえ（例えば、多くの尿試料）、前処理は、場合によって、単に便宜のために実施され得る（例えば、市販のプラットフォーム上での計画の一環として）。前処理試薬は、異種の因子又は同質の因子であり得る。
【０１４１】
本発明の異種の前処理試薬を用いると、前処理試薬は試料中に存在する分析物結合タンパク質（例えば、ＮＧＡＬを結合することができるタンパク質）を沈殿させる。このような前処理工程は、前処理剤の試料への添加によって形成された混合物の上清を沈殿した分析物結合タンパク質から分離することによって、あらゆる分析物結合タンパク質を除去することを含む。このようなアッセイでは、結合タンパク質が一切存在しない混合物の上清がアッセイにおいて使用され、抗体捕捉工程に直接進む。
【０１４２】
同質の前処理試薬が使用される場合には、このような分離工程は存在しない。抗体捕捉工程において、検査試料と前処理試薬の混合物全体を捕捉抗体と接触させる。このようなアッセイのために使用される前処理試薬は、典型的には、抗体捕捉工程の前に又は抗体補足抗体で抗体と遭遇している間に、前処理された検査試料混合物中に希釈される。このような希釈に関わらず、抗体捕捉の間に、検査試料混合物中に前処理試薬のある量（例えば、５Ｍメタノール及び／又は０．６Ｍエチレングリコール）がなお存在する（又は残存する）。
【０１４３】
前処理試薬は、本発明のイムノアッセイ及びキットとともに使用するのに適したあらゆる試薬であり得る。前処理は、（ａ）１つ若しくはそれ以上の溶媒（例えば、メタノール及びエチレングリコール）及び塩、（ｂ）１つ若しくはそれ以上の溶媒、塩及び界面活性剤、（ｃ）界面活性剤又は（ｄ）界面活性剤及び塩を場合によって含む。前処理試薬は本分野において公知であり、このような前処理は、文献に記載されているように（例えば、Ｙａｔｓｃｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｂｂｏｔｔ  ＴＤｘ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｓｓａｙ  Ｅｖａｌｕａｔｅｄ  ｆｏｒ  Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ  ｉｎ  Ｗｈｏｌｅ  Ｂｌｏｏｄ，  Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，  ３６：１９６９−１９７３  （１９９０）及びＷａｌｌｅｍａｃｑ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  ＡｘＳＹＭ  Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ  Ａｓｓａｙ：Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ＴＤｘ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｗｈｏｌｅ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  ＥＭＩＴ  Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ  Ａｓｓａｙｓ，  Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４５：  ４３２−４３５  （１９９９）参照）に記載されているように、及び／又は市販されているように、ＡｂｂｏｔｔＴＤｘ、ＡｘＳＹＭ（Ｒ）及びＡＴＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）分析装置（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）上でのアッセイのために使用されるように使用され得る。さらに、前処理は、Ａｂｂｏｔｔの米国特許第５，１３５，８７５号、ＥＰ０  ４７１  ２９３、２００６年１２月２９日に出願された米国特許出願６０／８７８，０１７号及び２００６年６月２１日に出願された米国特許出願１１／４９０６２４号（参照により、前処理に関するその教示に関して全体が組み込まれる。）に記載されているように行うことができる。また、単独で又は他の何れかの前処理剤（例えば、溶媒、界面活性剤、塩など）と組み合わせて、プロテアーゼを使用することができる。
【０１４４】
Ｆ．ＮＧＡＬイムノアッセイ
イムノアッセイは、サンドイッチフォーマットなどの（但し、これに限定されない。）本分野において公知のあらゆるフォーマットを用いて実施することができる。具体的には、本発明の一態様において、検査試料中のヒトＮＧＡＬ又はヒトＮＧＡＬ断片を分離及び定量するために、少なくとも２つの抗体が使用される。より具体的には、少なくとも２つの抗体は、「サンドイッチ」と称される免疫複合体を形成するヒトＮＧＡＬ又はヒトＮＧＡＬ断片のあるエピトープに結合する。一般に、イムノアッセイにおいて、検査試料中のヒトＮＧＡＬ又はヒトＮＧＡＬ断片を捕捉するために、１つ又はそれ以上の抗体を使用することが可能であり（これらの抗体は、「捕捉」抗体としばしば称される。）、サンドイッチに検出可能な（すなわち、定量可能な）標識を結合するために、１つ又はそれ以上の抗体を使用することができる（これらの抗体は、「検出抗体」、「連結物」としばしば称される。）。
【０１４５】
捕捉抗体、検出抗体又は捕捉及び検出抗体として、本発明の抗体を用いて、優れたイムノアッセイ、特に、サンドイッチアッセイを実施することができる。例えば、本発明の抗体の少なくとも１つ（マウスハイブリドーマ細胞株１−２３２２−４５５によって産生された抗体又はマウスハイブリドーマ細胞株１−９０３−４３０によって産生された抗体又はマウスハイブリドーマ細胞株１−２３２２−４５５によって産生された抗体とマウスハイブリドーマ細胞株１−９０３−４３０によって産生された抗体の組み合わせなど）は、第一の捕捉抗体として使用することができる。あるいは、２以上の捕捉抗体が使用される際には、本発明の抗体は、第二の又はそれ以降の捕捉抗体として使用することができる。あるいは、本発明の抗体の１つが捕捉抗体として使用されている場合には、（本発明の抗体以外の）異なる抗体は、第二の捕捉抗体として使用することができる。あるいは、本発明の抗体は、検出抗体としてのみ使用することができ、捕捉抗体としては使用できない。さらに別の代替物において、本発明の抗体は、捕捉及び検出抗体の両方として使用することができる。例えば、マウスハイブリドーマ細胞株１−２３２２−４５５によって産生される抗体を捕捉抗体として使用することができ、マウスハイブリドーマ細胞株１−９０３−４２２によって産生された抗体を検出抗体として使用することができる。あるいは、マウスハイブリドーマ細胞株１−９０３−４２２によって産生された抗体を捕捉抗体として使用し、及びハイブリドーマ細胞株１−２３２２−４５５によって産生された抗体を検出抗体として使用することができる。
【０１４６】
ヒトＮＧＡＬ又はヒトＮＧＡＬ断片に関して検査されている（例えば、これらを含有することが疑われている）検査試料は、少なくとも１つの捕捉抗体（又は複数の抗体）及び少なくとも１つの検出抗体（第二の検出抗体又は第三の検出抗体である。）と同時に又は順次に、任意の順序で接触させることができる。例えば、検査試料は少なくとも１つの捕捉抗体とまず接触させ、次いで（順次）少なくとも１つの検出抗体と接触させることができる。あるいは、検査試料は、少なくとも１つの検出抗体とまず接触させ、次いで（順次）少なくとも１つの捕捉抗体と接触させることができる。さらに別の代替例において、検査試料は、捕捉抗体及び検出抗体と同時に接触させることができる。
【０１４７】
サンドイッチアッセイフォーマットにおいて、第一の抗体／ヒトＮＧＡＬ複合体の形成を可能とする条件下で、ヒトＮＧＡＬ又はヒトＮＧＡＬ断片を含有すると疑われる検査試料をまず少なくとも１つの第一の捕捉抗体と接触させる。２以上の捕捉抗体が使用される場合、第一の複数の捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ複合体が形成される。サンドイッチアッセイにおいて、抗体、好ましくは、少なくとも１つの捕捉抗体は、検査試料中に予測されるヒトＮＧＡＬ又はヒトＮＧＡＬ断片の最大量のモル濃度過剰量で使用される。例えば、抗体の約５μｇ／ｍＬから約１ｍｇ／ｍＬ／ｍＬ緩衝液（例えば、微小粒子コーティング緩衝液）を使用することができる。
【０１４８】
場合によって、検査試料を少なくとも１つの捕捉抗体（例えば、第一の捕捉抗体）と接触させる前に、検査試料からの第一の抗体／ヒトＮＧＡＬ複合体の分離を促進するために、少なくとも１つの捕捉抗体を固体支持体に結合させることができる。ウェル、管又はビーズの形態のポリマー性材料から作製された固体支持体など（但し、これらに限定されない。）、本分野において公知のあらゆる固体支持体を使用することができる。１つの抗体（又は複数の抗体）は、吸着によって、化学的連結剤を用いた共有結合によって又は本分野によって公知の他の手段によって、固体支持体に結合させることができる（但し、このような結合は、ヒトＮＧＡＬ又はヒトＮＧＡＬ断片を結合する抗体の能力を妨害しない。）。あるいは、１つの抗体（又は複数の抗体）は、（例えば、Ｓｅｒａｄｙｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａから入手可能な、Ｐｏｗｅｒ−ＢｉｎｄＴＭ−ＳＡ−ＭＰストレプトアビジンによって被覆された微粒子を用いて）ストレプトアビジン又はビオチンで予め被覆された微粒子と結合させることができる。あるいは、１つの抗体（又は複数の抗体）は、抗種特異的モノクローナル抗体で予め被覆された微粒子を用いて結合させることができる。さらに、必要であれば、固体支持体は、抗体上の様々な官能基との反応性を許容するために誘導化することができる。このような誘導化には、無水マレイン酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドなどの（但し、これらに限定されない。）ある種のカップリング剤の使用が必要とされる。
【０１４９】
ヒトＮＧＡＬ若しくはヒトＮＧＡＬ断片に関して検査されている及び／又はヒトＮＧＡＬ若しくはヒトＮＧＡＬ断片を含有すると疑われている検査試料を少なくとも１つの捕捉抗体（例えば、第一の捕捉抗体）と接触させた後、第一の抗体（又は複数の抗体）−ヒトＮＧＡＬ複合体の形成を可能とするために、混合物を温置する。温置は、約２℃から約４５℃の温度で、約４．５から約１０．０のｐＨで、少なくとも約１分から約１８時間、好ましくは、約１から約２０分、より好ましくは約１８分間の期間、実施し得る。本明細書に記載されているイムノアッセイは、１つの工程で（検査試料、少なくとも１つの捕捉抗体及び少なくとも１つの検出抗体が全て、順次に又は同時に反応容器へ添加されることを意味する。）、又は２つ工程、３つの工程など、２以上の工程で実施することができる。
【０１５０】
（第一の又は複数の）捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ複合体の形成後、次いで、複合体を少なくとも１つの検出抗体（（第一の又は複数の）捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ／第二の抗体検出複合体の形成を可能とする条件下で）と接触させる。少なくとも１つの検出抗体は、イムノアッセイにおいて使用される第二、第三、第四などの抗体であり得る。捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ複合体が２以上の検出抗体と接触される場合、（第一の又は複数の）捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ／（複数の）検出抗体複合体が形成される。捕捉抗体（例えば、第一の捕捉抗体）と同様に、少なくとも第二の（及び後続の）検出抗体を捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ複合体と接触させる場合、（第一の又は複数の）捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ／（第二の又は複数の）検出抗体複合体の形成のために、上述の条件と類似の条件下での温置の期間が必要とされる。好ましくは、少なくとも１つの検出抗体は、検出可能な標識を含有する。検出可能な標識は、（第一の又は複数の）捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ／（第二の又は複数の）検出抗体複合体の形成前に、同時に又は後に、少なくとも１つの検出抗体（例えば、第二の検出抗体）に結合させることができる。本分野において公知のあらゆる検出可能な標識を使用することができる。例えば、検出可能な標識は、３Ｈ、１２５１、３５Ｓ、１４Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐなどの放射性標識、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース６−リン酸脱水素酵素などの酵素的標識、アクリジニウムエステル、ルミナール、イソルミノール、チオエステル、スルホンアミド、フェナントリジニウムエステルなどの化学発光標識、フルオレセイン（５−フルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、３’６−カルボキシフルオレセイン、５（６）−カルボキシフルオレセイン、６−ヘキサクロロ−フルオレセイン、６−テトラクロロフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナートなど）、ローダミン、フィコビリタンパク質、Ｒ−フィコエリトリンなどの蛍光標識、量子ドット（硫化亜鉛がキャッピングされたセレン化カドミニウム）、温度測定標識又は免疫ポリメラーゼ連鎖反応標識であり得る。標識への導入、標識の手法及び標識の検出は、「Ｐｏｌａｋ  ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｎｏｏｒｄｅｎ，  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  ｌｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，  Ｎ．Ｙ．（１９９７）」及び「（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎによって出版されたハンドブックとカタログの組み合わせである）Ｈａｕｇｌａｎｄ，  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（１９９６）」に見出される。
【０１５１】
検出可能な標識は、直接又は連結剤を介して抗体に結合させることができる。使用可能な連結剤の例は、Ｓｉｇｍａ−  Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯから市販されているＥＤＡＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、塩酸塩）である。使用可能な他の連結剤は、本分野において公知である。検出可能な標識を抗体に結合するための方法は、本分野において公知である。さらに、Ｎ１０−（３−スルホプロピル）−Ｎ−（３−カルボキシプロピル）−アクリジニウム−９−カルボキサミド（ＣＰＳＰ−アクリジニウムエステルとしても知られる。）又はＮ１０−（３−スルホプロピル）−Ｎ−（３−スルホプロピル）−アクリジニウム−９−カルボキサミド（ＳＰＳＰ−アクリジニウムエステルとしても知られる。）など、抗体への検出可能な標識の連結を容易にする末端基を既に含有する多くの検出可能な標識を購入又は合成することができる。
【０１５２】
（第一の又は複数の）捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ／（第二の又は複数の）検出抗体複合体は、標識の定量前に、検査試料の残りから分離させることが可能であるが、分離させなければならないわけではない。例えば、少なくとも１つの捕捉抗体（例えば、第一の捕捉抗体）がウェル又はビーズなどの固体支持体に結合されている場合、分離は、固体支持体との接触から（検査試料の）液体を除去することによって達成することができる。あるいは、少なくとも第一の捕捉抗体が固体支持体に結合されている場合、第一の捕捉抗体は、第一の（複数の）抗体／ヒトＮＧＡＬ／第二の（複数の）抗体複合体を形成するために、ヒトＮＧＡＬ含有試料及び少なくとも１つの第二の検出抗体と同時に接触させた後、固体支持体との接触から液体（検査試料）を除去することができる。少なくとも１つの第一の捕捉抗体が固体支持体に結合されていなければ、（第一の又は複数の）捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ／（第二の又は複数の）検出抗体複合体は、標識の量の定量のために、検査試料から除去する必要はない。
【０１５３】
標識された捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ／検出抗体複合体（例えば、第一の捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ／第二の検出抗体複合体）の形成後、本分野において公知の技術を用いて、複合体中の標識の量が定量される。例えば、酵素標識が使用されるのであれば、標識された複合体を、発色などの定量可能な反応を与える標識に対する基質と反応させる。標識が放射性標識であれば、標識はシンチレーションカウンターを用いて定量される。標識が蛍光標識であれば、１つの色（「励起波長」と知られる。）の光で標識を刺激し、刺激に応答して標識によって発光された別の色（「発光波長」として知られる。）を検出することによって、標識が定量される。標識が化学発光標識であれば、標識は、視覚的に又は光測定装置、Ｘ線フィルム、高速写真フィルム、ＣＣＤカメラなどを使用することによって、発光された光を検出して定量される。複合体中の標識の量が定量されたら、既知濃度のヒトＮＧＡＬ又はヒトＮＧＡＬ断片の系列希釈を用いて作製された標準曲線の使用によって、検査試料中のヒトＮＧＡＬ又はヒトＮＧＡＬ断片の濃度が測定される。ヒトＮＧＡＬ又はヒトＮＧＡＬ断片の系列希釈を使用する以外に、標準曲線は、重量分析、質量分析法によって及び本分野において公知の他の技術によって作製することができる。
【０１５４】
別の態様において、本発明の抗体は、ヒトＮＧＡＬ単量体とヒトＮＧＡＬ二量体（ヒトＮＧＡＬホモ二量体又はヒトＮＧＡＬヘテロ二量体など）の両方を含有すると疑われる検査試料中のヒトＮＧＡＬ単量体の量を測定するために使用することができる。より具体的には、本発明の抗体は、少なくとも約７５％の特異性で、検査試料中に含有されているヒトＮＧＡＬ単量体の量を測定するために、１つ又はそれ以上のイムノアッセイにおいて使用することができる。
【０１５５】
より具体的には、本発明の抗体は、検査試料中に含有されているヒトＮＧＡＬ単量体の量を特定するために、捕捉及び検出抗体として使用することができる。例えば、マウスハイブリドーマ細胞株１−２３２２−４５５によって産生される抗体又はマウスハイブリドーマ細胞株１−９０３−４２２によって産生される抗体などの１つ又はそれ以上の抗体を含む第一の捕捉抗体がイムノアッセイにおいて使用するために選択される場合、第一の捕捉抗体の他に、第二の捕捉抗体として使用するために、同じ又は異なる抗体を選択することができる。しかしながら、第二の捕捉抗体は第一の捕捉抗体によって結合されるエピトープと異なるエピトープに結合することが好ましい。あるいは、第二の捕捉抗体は、本発明の抗体以外の抗体であり得る。あるいは、第二の捕捉抗体が使用されない場合、第二の抗体、すなわち検出抗体は、例えば、マウスハイブリドーマ細胞株１−２３２２−４５５によって産生される抗体又はマウスハイブリドーマ細胞株１−９０３−４２２によって産生される抗体などの本発明の抗体の１つ又はそれ以上であり得る。上記第二の捕捉抗体と同様に、検出抗体は第一の捕捉抗体（存在する場合、第二の捕捉抗体）によって結合されるエピトープと異なるエピトープに結合することが好ましい。
【０１５６】
少なくとも１つの捕捉抗体として、又は少なくとも１つの検出抗体として、本発明の抗体を使用する本明細書に記載されているように実施されるイムノアッセイは、少なくとも約７５％の特異性で、検査試料中に含有されるヒトＮＧＡＬ単量体の量を測定することができる。好ましくは、イムノアッセイは、少なくとも約８５％の特異性で、検査試料中のヒトＮＧＡＬ単量体の量を測定することができる。最も好ましくは、イムノアッセイは、少なくとも約９０％の特異性で、検査試料中のヒトＮＧＡＬ単量体の量を測定することができる。さらに好ましくは、イムノアッセイは、少なくとも約９５％の特異性で、検査試料中のヒトＮＧＡＬ単量体の量を測定することができる。さらに最も好ましくは、イムノアッセイは、少なくとも約９８％の特異性で、検査試料中のヒトＮＧＡＬ単量体の量を測定することができる。
【０１５７】
特に、本明細書に記載されている方法及びイムノアッセイは、特に、アッセイの検量範囲（例えば、ＮＧＡＬ、特に、尿ＮＧＡＬの約１ｎｇ／ｍＬから最大約２０００ｎｇ／ｍＬ）全体にわたって、単量体に対して約７５％の特異性から最大約９８％までの特異性（例えば、ＮＧＡＬ二量体と比較して、少なくとも約４倍、例えば、約３から約５倍又は少なくとも約３、４、４．５若しくは５倍、ＮＧＡＬ単量体に対して特異的である。）を最適に有する。従って、本明細書に記載されている方法及びイムノアッセイは、ＮＧＡＬ（例えば、尿ＮＧＡＬを含む。）の約５ｎｇ／ｍＬから最大約２０００ｎｇ／ｍＬまで、特に、ＮＧＡＬ（例えば、尿ＮＧＡＬを含む。）の約１００ｎｇ／ｍＬから最大約２０００ｎｇ／ｍＬまで、特に、（ａ）ＮＧＡＬの約２００ｎｇ／ｍＬから最大約２０００ｎｇ／ｍＬまで、（ｂ）ＮＧＡＬの約２５０ｎｇ／ｍＬから最大約２０００ｎｇ／ｍＬまで、（ｃ）ＮＧＡＬの約３００ｎｇ／ｍＬから最大約２０００ｎｇ／ｍＬまで、（ｄ）ＮＧＡＬ（例えば、尿ＮＧＡＬを含む。）の約３５０ｎｇ／ｍＬから最大約２０００ｎｇ／ｍＬまで、（ｅ）ＮＧＡＬの約４００ｎｇ／ｍＬから最大約２０００ｎｇまで、及び（ａ）ＮＧＡＬ（例えば、尿ＮＧＡＬを含む。）の約５００ｎｇ／ｍＬから最大約２０００ｎｇ／ｍＬまでなど、ＮＧＡＬ（例えば、尿ＮＧＡＬを含む。）の約１５０ｎｇ／ｍＬから最大約２０００ｎｇ／ｍＬまで、少なくとも約７５％の特異性を示す。
【０１５８】
ヒトＮＧＡＬ単量体の量を測定するために検査されている検査試料は、少なくとも１つの捕捉抗体（又は複数の抗体）及び少なくとも１つの検出抗体（第二の検出抗体又は第三の検出抗体である。）と同時に又は順次に、任意の順序で接触させることができる。例えば、検査試料は少なくとも１つの捕捉抗体とまず接触させ、次いで（順次）少なくとも１つの検出抗体と接触させることができる。あるいは、検査試料は、少なくとも１つの検出抗体とまず接触させ、次いで（順次）少なくとも１つの捕捉抗体と接触させることができる。さらに別の代替例において、検査試料は、捕捉抗体及び検出抗体と同時に接触させることができる。
【０１５９】
サンドイッチアッセイフォーマットにおいて、第一の抗体／ヒトＮＧＡＬ複合体の形成を可能とする条件下で、本発明の抗体（例えば、マウスハイブリドーマ細胞１−２３２２−４５５によって産生される抗体又はマウスハイブリドーマ細胞１−９０３−４２２によって産生される抗体など）である少なくとも１つの第一の捕捉抗体と検査試料をまず接触させる。２以上の捕捉抗体が使用される場合、第一の複数の捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ複合体が形成される。サンドイッチアッセイにおいて、抗体、好ましくは、少なくとも１つの捕捉抗体は、検査試料中に予測されるヒトＮＧＡＬ又はヒトＮＧＡＬ断片の最大量のモル濃度過剰量で使用される。例えば、抗体の約５μｇ／ｍＬから約１ｍｇ／ｍＬ／ｍＬ緩衝液（例えば、微小粒子コーティング緩衝液）を使用することができる。
【０１６０】
場合によって、検査試料を少なくとも１つの捕捉抗体（例えば、第一の捕捉抗体）と接触させる前に、本明細書に前述されている技術を用いて、少なくとも１つの捕捉抗体を固体支持体に結合させることができる。ヒトＮＧＡＬ単量体及びヒトＮＧＡＬ二量体を含有すると疑われている検査試料を少なくとも１つの捕捉抗体（例えば、第一の捕捉抗体）と接触させた後、第一の抗体（又は複数の抗体）−ヒトＮＧＡＬ複合体の形成を可能とするために、混合物を温置する。温置は、約２℃から約４５℃の温度で、約４．５から約１０．０のｐＨで、少なくとも約１分から約１８時間、好ましくは、約１から約２０分、より好ましくは約１８分間の期間、実施し得る。本明細書に記載されているイムノアッセイは、１つの工程で（検査試料、少なくとも１つの捕捉抗体及び少なくとも１つの検出抗体が全て、順次に又は同時に反応容器へ添加されることを意味する。）、又は２つ工程、３つの工程など、２以上の工程で実施することができる。
【０１６１】
（第一の又は複数の）捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ複合体の形成後、次いで、複合体を少なくとも１つの検出抗体（（第一の又は複数の）捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ／第二の抗体検出複合体の形成を可能とする条件下で）と接触させる。少なくとも１つの検出抗体は、イムノアッセイにおいて使用される第二、第三、第四などの抗体であり得る。捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ複合体が２以上の検出抗体と接触される場合、（第一の又は複数の）捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ／（複数の）検出抗体複合体が形成される。捕捉抗体（例えば、第一の捕捉抗体）と同様に、少なくとも第二の（及び後続の）検出抗体を捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ複合体と接触させる場合、（第一の又は複数の）捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ／（第二の又は複数の）検出抗体複合体の形成のために、上述の条件と類似の条件下での温置の期間が必要とされる。好ましくは、少なくとも１つの検出抗体は、検出可能な標識を含有する。検出可能な標識は、本明細書に前述されているあらゆる検出可能な標識であり得る。
【０１６２】
検査試料中のヒトＮＧＡＬ単量体の量を測定するための本明細書に記載されているイムノアッセイは、あらゆる還元剤の不存在下で実施することができる。あるいは、イムノアッセイの工程の何れかの１つ又はそれ以上を、１つ又はそれ以上の還元剤の存在下で実施することができる。さらに別の例では、検査試料は、イムノアッセイ中で検査試料を使用する前に、１つ又はそれ以上の還元剤で処理される（すなわち、前処理される）ことができる。イムノアッセイにおいて、又は検査試料を前処理するために、あらゆる還元剤を使用することができる。使用可能な還元剤の例には、ジチオスレイトール、２−メルカプトエタノール、２−メルカプトエチルアミン及びトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンが含まれるが、これらに限定されない。イムノアッセイにおいて使用することができる、又は検査試料を前処理するために使用することができる還元剤の量は、約０．１ｍＭから約５００ｍＭ、特に、約０．１ｍＭから約１００ｍＭの量である。
【０１６３】
（第一の又は複数の）捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ／（第二の又は複数の）検出抗体複合体は、標識の定量前に、検査試料の残りから分離させることが可能であるが、分離させなければならないわけではない。例えば、少なくとも１つの捕捉抗体（例えば、第一の捕捉抗体）がウェル又はビーズなどの固体支持体に結合されている場合、分離は、固体支持体との接触から（検査試料の）液体を除去することによって達成することができる。あるいは、少なくとも第一の捕捉抗体が固体支持体に結合されている場合、第一の捕捉抗体は、第一の（複数の）抗体／ヒトＮＧＡＬ／第二の（複数の）抗体複合体を形成するために、ヒトＮＧＡＬ含有試料及び少なくとも１つの第二の検出抗体と同時に接触させた後、固体支持体との接触から液体（検査試料）を除去することができる。少なくとも１つの第一の捕捉抗体が固体支持体に結合されていなければ、（第一の又は複数の）捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ／（第二の又は複数の）検出抗体複合体は、標識の量の定量のために、検査試料から除去する必要はない。
【０１６４】
標識された捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ／検出抗体複合体（例えば、第一の捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ／第二の検出抗体複合体）の形成後、本分野において公知の技術を用いて、複合体中の標識の量が定量される。例えば、酵素標識が使用されるのであれば、標識された複合体を、発色などの定量可能な反応を与える標識に対する基質と反応させる。標識が放射性標識であれば、標識はシンチレーションカウンターを用いて定量される。標識が蛍光標識であれば、１つの色（「励起波長」と知られる。）の光で標識を刺激し、刺激に応答して標識によって発光された別の色（「発光波長」として知られる。）を検出することによって、標識が定量される。標識が化学発光標識であれば、標識は、視覚的に又は光測定装置、Ｘ線フィルム、高速写真フィルム、ＣＣＤカメラなどを使用することによって、発光された光を検出して定量される。複合体中の標識の量が定量されたら、既知濃度のヒトＮＧＡＬ単量体の系列希釈を用いて作製された標準曲線の使用によって、検査試料中のヒトＮＧＡＬ単量体の濃度が測定される。ヒトＮＧＡＬ単量体の系列希釈を使用する以外に、標準曲線は、重量分析、質量分析法によって及び本分野において公知の他の技術によって作製することができる。
【０１６５】
さらに別の態様において、本発明の抗体は、検査試料中に含有されるヒトＮＧＡＬ二量体に対するヒトＮＧＡＬ単量体の割合を測定するための方法において使用することができる。ヒトＮＧＡＬ二量体に対するヒトＮＧＡＬ単量体の割合を測定するための方法は、イムノアッセイの工程を少なくとも２回実施する（すなわち、イムノアッセイのある工程を繰り返す）ことを含む。より具体的には、本発明の抗体は、検査試料中に含有されるヒトＮＧＡＬ二量体に対するヒトＮＧＡＬ単量体の割合を測定するための捕捉及び検出工程として使用することができる。例えば、マウスハイブリドーマ細胞株１−２３２２−４５５によって産生された抗体又はマウスハイブリドーマ細胞株１−９０３−４２２によって産生された抗体などの１つ又はそれ以上の抗体を含む第一の捕捉抗体がイムノアッセイにおいて使用するために選択される場合、第一の捕捉抗体の他に、第二の捕捉抗体として、同じ又は異なる抗体を使用のために選択することができる。しかしながら、第二の捕捉抗体は第一の捕捉抗体によって結合されるエピトープと異なるエピトープに結合することが好ましい。あるいは、第二の捕捉抗体は、本発明の抗体以外の抗体であり得る。あるいは、第二の捕捉抗体が使用されない場合、第二の抗体、すなわち検出抗体は、例えば、マウスハイブリドーマ細胞株１−２３２２−４５５によって産生される抗体又はマウスハイブリドーマ細胞株１−９０３−４２２によって産生される抗体などの本発明の抗体の１つ又はそれ以上であり得る。上記第二の捕捉抗体と同様に、検出抗体は第一の捕捉抗体（及び、存在する場合、第二の捕捉抗体）によって結合されるエピトープと異なるエピトープに結合することが好ましい。
【０１６６】
本明細書において記載されているように実施されるイムノアッセイは、少なくとも１つの捕捉抗体として又は少なくとも１つの検出抗体として、本発明の抗体を使用するのみならず、イムノアッセイ中の特定の点において、１つ又はそれ以上の還元剤の使用も使用する。イムノアッセイにおいて、あらゆる還元剤を使用することができる。使用可能な還元剤の例には、ジチオスレイトール、２−メルカプトエタノール、２−メルカプトエチルアミン及びトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンが含まれるが、これらに限定されない。イムノアッセイにおいて使用することができる、又は検査試料を前処理するために使用することができる還元剤の量は、約０．１ｍＭから約５００ｍＭ、特に、約０．１ｍＭから約１００ｍＭである。
【０１６７】
具体的には、ヒトＮＧＡＬ二量体に対するヒトＮＧＡＬ単量体の割合を測定するために検査されている検査試料は、同時に又は順次に、あらゆる順序で、少なくとも１つの捕捉抗体及び少なくとも１つの検出抗体（第二の検出抗体又は第三の検出抗体の何れかである。）と接触させることができる。例えば、検査試料を、まず、少なくとも１つの捕捉抗体と接触させ、次いで（順次）、少なくとも１つの検出抗体と接触させることができる。あるいは、検査試料を、まず、少なくとも１つの検出抗体と接触させ、次いで（順次）、少なくとも１つの捕捉抗体と接触させることができる。さらに別の例において、検査試料は、捕捉抗体及び検出抗体と同時に接触させることができる。
【０１６８】
サンドイッチアッセイフォーマットにおいて、第一の抗体／ヒトＮＧＡＬ複合体の形成を可能とする条件下で、本発明の抗体（例えば、マウスハイブリドーマ細胞株１−２３２２−４５５によって産生される抗体又はマウスハイブリドーマ細胞株１−９０３−４２２によって産生される抗体など）である少なくとも１つの第一の捕捉抗体と検査試料をまず接触させる。２以上の捕捉抗体が使用される場合、第一の複数の捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ複合体が形成される。サンドイッチアッセイにおいて、抗体、好ましくは、少なくとも１つの捕捉抗体は、検査試料中に予測されるヒトＮＧＡＬ又はヒトＮＧＡＬ断片の最大量のモル濃度過剰量で使用される。例えば、抗体の約５μｇ／ｍＬから約１ｍｇ／ｍＬ／ｍＬ緩衝液（例えば、微小粒子コーティング緩衝液）を使用することができる。
【０１６９】
場合によって、検査試料を少なくとも１つの捕捉抗体（例えば、第一の捕捉抗体）と接触させる前に、本明細書に前述されている技術を用いて、少なくとも１つの捕捉抗体を固体支持体に結合させることができる。ヒトＮＧＡＬ単量体及びヒトＮＧＡＬ二量体を含有すると疑われている検査試料を少なくとも１つの捕捉抗体（例えば、第一の捕捉抗体）と接触させた後、第一の（又は複数の）抗体−ヒトＮＧＡＬ複合体の形成を可能とするために、混合物を温置する。温置は、約２℃から約４５℃の温度で、約４．５から約１０．０のｐＨで、少なくとも約１分から約１８時間、好ましくは、約１から約２０分、最も好ましくは約１８分間の期間、実施し得る。本明細書に記載されているイムノアッセイは、１つの工程で（検査試料、少なくとも１つの捕捉抗体及び少なくとも１つの検出抗体が全て、順次に又は同時に反応容器へ添加されることを意味する。）、又は２つの工程、３つの工程など、２以上の工程で実施することができる。
【０１７０】
（第一の又は複数の）捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ複合体の形成後、次いで、複合体を少なくとも１つの検出抗体（（第一の又は複数の）捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ／第二の抗体検出複合体の形成を可能とする条件下で）と接触させる。少なくとも１つの検出抗体は、イムノアッセイにおいて使用される第二、第三、第四などの抗体であり得る。捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ複合体が２以上の検出抗体と接触される場合、（第一の又は複数の）捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ／（複数の）検出抗体複合体が形成される。捕捉抗体（例えば、第一の捕捉抗体）と同様に、少なくとも第二の（及び後続の）検出抗体を捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ複合体と接触させる場合、（第一の又は複数の）捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ／（第二の又は複数の）検出抗体複合体の形成のために、上述の条件と類似の条件下での温置の期間が必要とされる。好ましくは、少なくとも１つの検出抗体は、検出可能な標識を含有する。検出可能な標識は、本明細書に前述されているあらゆる検出可能な標識であり得る。
【０１７１】
（第一の又は複数の）捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ／（第二の又は複数の）検出抗体複合体は、標識の定量前に、検査試料の残りから分離させることが可能であるが、分離させなければならないわけではない。例えば、少なくとも１つの捕捉抗体（例えば、第一の捕捉抗体）がウェル又はビーズなどの固体支持体に結合されている場合、分離は、固体支持体との接触から（検査試料の）液体を除去することによって達成することができる。あるいは、少なくとも第一の捕捉抗体が固体支持体に結合されている場合、第一の捕捉抗体は、第一の（複数の）抗体／ヒトＮＧＡＬ／第二の（複数の）抗体複合体を形成するために、ヒトＮＧＡＬ含有試料及び少なくとも１つの第二の検出抗体と同時に接触させた後、固体支持体との接触から液体（検査試料）を除去することができる。少なくとも１つの第一の捕捉抗体が固体支持体に結合されていなければ、（第一の又は複数の）捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ／（第二の又は複数の）検出抗体複合体は、標識の量の定量のために、検査試料から除去する必要はない。
【０１７２】
標識された捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ／検出抗体複合体（例えば、第一の捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ／第二の検出抗体複合体）の形成後、本分野において公知の技術を用いて、複合体中の標識の量が定量される。例えば、酵素標識が使用されるのであれば、標識された複合体を、発色などの定量可能な反応を与える標識に対する基質と反応させる。標識が放射性標識であれば、標識はシンチレーションカウンターを用いて定量される。標識が蛍光標識であれば、１つの色（「励起波長」と知られる。）の光で標識を刺激し、刺激に応答して標識によって発光された別の色（「発光波長」として知られる。）を検出することによって、標識が定量される。標識が化学発光標識であれば、標識は、視覚的に又は光測定装置、Ｘ線フィルム、高速写真フィルム、ＣＣＤカメラなどを使用することによって、発光された光を検出して定量される。複合体中の標識の量が定量されたら、既知濃度のヒトＮＧＡＬ二量体又はヒトＮＧＡＬ単量体の系列希釈を用いて作製された標準曲線の使用によって、検査試料中のヒトＮＧＡＬ二量体及びヒトＮＧＡＬ単量体の濃度が測定される。ヒトＮＧＡＬ二量体及びヒトＮＧＡＬ単量体の系列希釈を使用する以外に、標準曲線は、重量分析、質量分析法によって及び本分野において公知の他の技術によって作製することができる。
【０１７３】
検査試料中のヒトＮＧＡＬ二量体とヒト単量体の量が測定された後、イムノアッセイの工程が繰り返される。イムノアッセイの工程を反復する際に、検査試料の新しい分取試料が使用される（イムノアッセイの工程を反復する際に使用される分取試料は、ヒトＮＧＡＬ二量体とヒトＮＧＡＬ単量体の量を測定するために使用される分取試料と異なることを意味する。）。検査試料の新しい分取試料を用いて実施されるべきイムノアッセイの工程は、イムノアッセイの工程の１つ又はそれ以上が少なくとも１つの還元剤の存在下で行われることを除き、上記の工程と同一である。あるいは、少なくとも１つの還元剤の存在下でイムノアッセイの１つ又はそれ以上の工程を実施することに代えて、イムノアッセイの工程を反復して使用されるべき検査試料の新しい分取試料は、イムノアッセイの工程を実施する前に、少なくとも１つの還元剤で処理する（すなわち、前処理する）ことができる。イムノアッセイ中での還元剤の使用は、検査試料中に含有されるあらゆる二量体を単量体に転化する。標識された捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ／検出抗体複合体の形成後、本分野において公知の技術を用いて、複合体中の標識の量が定量される。例えば、酵素標識が使用されるのであれば、標識された複合体を、発色などの定量可能な反応を与える標識に対する基質と反応させる。標識が放射性標識であれば、標識はシンチレーションカウンターを用いて定量される。標識が蛍光標識であれば、１つの色（「励起波長」と知られる。）の光で標識を刺激し、刺激に応答して標識によって発光された別の色（「発光波長」として知られる。）を検出することによって、標識が定量される。標識が化学発光標識であれば、標識は、視覚的に又は光測定装置、Ｘ線フィルム、高速写真フィルム、ＣＣＤカメラなどを使用することによって、発光された光を検出して定量される。複合体中の標識の量が定量されたら、既知濃度のヒトＮＧＡＬ単量体の系列希釈を用いて作製された標準曲線の使用によって、検査試料中のヒトＮＧＡＬ単量体の濃度が測定される。ヒトＮＧＡＬ単量体の系列希釈を使用する以外に、標準曲線は、重量分析的に、質量分析法によって及び本分野において公知の他の技術によって作製することができる。ヒトＮＧＡＬ単量体の量が測定されたら、還元剤なしにイムノアッセイが行われたときに測定された（第一の又は複数の）捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ複合体の量を、イムノアッセイが還元剤を用いて反復されたときに測定された（第一の又は複数の）捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ複合体の量と比較することによって、ヒトＮＧＡＬ二量体に対するヒトＮＧＡＬ単量体の比を測定することができる。
【０１７４】
例として、イムノアッセイの工程は、以下のように実施することができる。
【０１７５】
（ａ）第一の抗体／ヒトＮＧＡＬ複合体を形成させるために、ヒトＮＧＡＬ単量体及びヒトＮＧＡＬ二量体を含有することが疑われる検査試料と、ヒトＮＧＡＬに結合する少なくとも１つの第一の抗体と接触させる工程（前記少なくとも１つの捕捉第一の抗体は、マウスハイブリドーマ細胞株１−２３２２−４５５（該細胞株はＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２４を有する。）によって産生される抗体及びマウスハイブリドーマ細胞株１−９０３−４３０（該細胞株はＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２６を有する。）によって産生される抗体からなる群から選択される抗体である。）；
（ｂ）第二の抗体／ヒトＮＧＡＬ／第一の抗体複合体を形成させるために、前記第一の抗体／ヒトＮＧＡＬ複合体を、ヒトＮＧＡＬに結合し、及び検出可能な標識に連結された第二の抗体と接触させる工程（前記第二の抗体は、マウスハイブリドーマ細胞株１−２３２２−４５５（該細胞株はＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２４を有する。）によって産生される抗体及びマウスハイブリドーマ細胞株１−９０３−４３０（該細胞株はＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２６を有する。）によって産生される抗体からなる群から選択される抗体である。）；
（ｃ）工程（ｂ）において形成された第二の抗体／ヒトＮＧＡＬ／第一の抗体複合体の量を測定する工程（工程（ａ）及び（ｂ）は、あらゆる還元剤の不存在下で行われる。）；
（ｄ）少なくとも１つの還元剤の存在下で又は少なくとも１つの還元剤で検査試料を処理した後に工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を反復する工程；
（ｅ）工程（ｃ）の繰り返しにおいて形成された第二の抗体／ヒトＮＧＡＬ複合体の量を測定する工程；並びに
（ｆ）工程（ｃ）において測定された第二の抗体／ヒトＮＧＡＬ／第一の抗体複合体の量及び工程（ｅ）において測定された第二の抗体／ヒトＮＧＡＬ／第一の抗体複合体の量に基づいて、検査試料中のヒトＮＧＡＬ二量体に対するヒトＮＧＡＬ単量体の割合を測定する工程。
【０１７６】
別の実施形態において、ＮＧＡＬポリペプチドは、ＮＧＡＬの検出用イムノアッセイの改良においても最適に使用することができる。本明細書に記載されているこの具体的な方法は、捕捉及び／又は検出用のあらゆる抗体を用いて、あらゆるＮＧＡＬイムノアッセイにおいて使用することができる。一実施形態において、従って、本発明は、検査試料中の哺乳動物ＮＧＡＬの存在を検出する方法の改良を提供し、該方法は、
（ａ）哺乳動物ＮＧＡＬ／抗体複合体の形成を可能とする時間及び条件下で、哺乳動物ＮＧＡＬを含有することが疑われる検査試料を、前記哺乳動物ＮＧＡＬに対して特異的な少なくとも１つの抗体と接触させること；及び
（ｂ）前記哺乳動物ＮＧＡＬの存在の指標として、形成された何れかの哺乳動物ＮＧＡＬ／抗体複合体を検出すること；
を含み、
前記改良が、検量用物質又は対照として、本明細書に記載されているＮＧＡＬポリペプチドである検量用物質又は対照、特に、（ａ）配列番号２又は１０の配列を含むグリコシル化されたヒトＮＧＡＬ及び（ｂ）配列番号１又は１３の配列を含むグリコシル化されたヒトＮＧＡＬからなる群から選択される検量用物質又は対照を使用することを含む。改良されたＮＧＡＬアッセイの１つの変形において、検量用物質又は対照は、配列番号１又は１３の配列を含むグリコシル化されたヒトＮＧＡＬである。
【０１７７】
さらに、本明細書での使用に関して記載されている抗ＮＧＡＬ抗体は、例えば、検査試料中のヒトＮＧＡＬ抗原の存在を検出するための方法において、免疫診断剤として一般的に使用することもできる。前記方法は、
（１）ヒトＮＧＡＬ／抗体複合体の形成を可能とする時間及び条件下で、ヒトＮＧＡＬを含有することが疑われる検査試料を本明細書に記載されている免疫診断試薬と接触させる工程、並びに
（２）前記ヒトＮＧＡＬ抗原の存在の指標として、形成された何れかのヒトＮＧＡＬ／抗体複合体を検出する工程
を場合によって含み、
前記免疫診断試薬は、
（ａ）配列番号１、２、１０又は１３に記載されているヒトＮＧＡＬタンパク質のアミノ酸残基１１２、１１８及び１４７を含む立体構造的エピトープへ特異的に結合する抗体；
（ｂ）ヒトＮＧＡＬへ特異的に結合する単離された抗体（該抗体は、配列番号５のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域を有する。）；
（ｃ）ヒトＮＧＡＬへ特異的に結合する単離された抗体（該抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を有する。）；
（ｄ）ヒトＮＧＡＬへ特異的に結合する単離された抗体（前記抗体は、配列番号５のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域及び配列番号６のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を有する。）；
（ｅ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２４を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−２３２２−４５５によって産生された抗体；
（ｆ）ヒトＮＧＡＬへ特異的に結合する単離された抗体（該抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域を有する。）；
（ｇ）ヒトＮＧＡＬへ特異的に結合する単離された抗体（該抗体は、配列番号８のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を有する。）；
（ｈ）ヒトＮＧＡＬへ特異的に結合する単離された抗体（該抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域及び配列番号８のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を有する。）；及び
（ｉ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２６を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−９０３−４３０によって産生された抗体；
からなる群から選択される１つ又はそれ以上の抗体を含む。
【０１７８】
本明細書に記載されている方法（すなわち、イムノアッセイ及びキット）は、あらゆる時点で、あらゆる疾病、疾患、症状又は状態の評価において、ＮＧＡＬのあらゆる評価が実施される。例えば、本明細書に記載されている方法は、検査試料中に存在するＮＧＡＬのレベルの測定に基づいて、対象の尿細管細胞傷害の状態を評価するために使用することができる。評価されるべき対象は、現在、尿細管細胞傷害を有し、又は尿細管細胞傷害を発症するリスクを有し得る。
【０１７９】
本明細書に記載されている方法は、尿細管細胞傷害に対して対象を治療した後に、又は対象が尿細管細胞傷害を現在経験しながら、対象に対して実施することができる。
【０１８０】
本明細書に記載されている方法は、対象中での薬物又は他の治療剤の腎毒性副作用をモニターするために使用することができる。
【０１８１】
イムノアッセイは、外科的処置の後など（心臓手術、冠動脈バイパス手術、心血管手術、血管手術又は腎臓移植後など）、対象によって経験される現象の後に、対象が腎臓への低下した血液供給を経験した後に、（対象が、損傷を受けた心機能、卒中、外傷、敗血症及び脱水からなる群から選択される医学症状を有し、又は経験している場合）集中治療室への患者の入室後に、１つ若しくはそれ以上の医薬の対象への投与後に、又は１つ若しくはそれ以上の造影剤を対象に投与した後に使用することもできる。
【０１８２】
本明細書に記載されている方法は、慢性腎臓病を評価するために実施又は実行することもできる。
【０１８３】
本明細書中のある種の実施形態は、尿細管細胞傷害の状態を評価するために使用されたときに有利であることは言うまでもないが、イムノアッセイ及びキットは、他の疾病、例えば、癌、敗血症及びＮＧＡＬの評価を伴うあらゆる疾病、疾患又は症状においてＮＧＡＬを評価するためにも、場合によって使用することができる。
【０１８４】
より具体的には、腎疾患、疾病及び傷害の評価の他に（例えば、米国特許出願公開２００８／００９０３０４号、２００８／００１４６４４号、２００８／００１４６０４号、２００７／０２５４３７０号及び２００７／００３７２３２号参照）、本明細書に記載されているアッセイ及びアッセイ成分は、他のあらゆるＮＧＡＬアッセイにおいて、又はＮＧＡＬレベル若しくは濃度の評価が有用であると判明し得る他のあらゆる状況、例えば、癌関連アッセイ（例えば、全般的に又はより具体的に、膵臓癌、乳癌、卵巣／子宮癌、白血病、大腸癌及び脳癌が含まれるが、これらに限定されない。例えば、米国特許出願公開２００７／０１９８７６号参照；米国特許第５，６２７，０３４号及び５，８４６，７３９号も参照）、全身性炎症応答症候群（ＳＩＲＳ）、敗血症、重篤な敗血症、敗血症ショック及び多発性臓器機能障害症候群（ＭＯＤＳ）の診断（例えば、米国特許出願公開２００８／００５０８３２号及び２００７／００９２９１１号参照；米国特許第６，１３６，５２６号も参照）；血液学用途（例えば、細胞の種類の推測）；とりわけ子癇前症、肥満（メタボリックシンドローム）、インシュリン抵抗性、高血糖、組織再構築（ＭＭＰ−９と複合される場合、例えば、米国特許出願公開２００７／０１０５１６６号及び米国特許第７，１５３，６６０号参照）、自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ、炎症性腸疾患、多発性硬化症）、過敏性腸症候群（例えば、米国特許出願公開２００８／０１６６７１９及び２００８／００８５５２４参照）、神経変性疾患、呼吸器疾患、炎症、感染、歯周病（例えば、米国特許第５，８６６，４３２号参照）及び静脈血栓塞栓疾患を含む心血管疾患（例えば、米国特許出願公開２００７／０２６９８３６号）の評価においても場合によって使用することが可能である。
【０１８５】
Ｇ．ＮＧＡＬイムノアッセイキット
本発明は、単量体用の改良されたアッセイにおいて、検査試料中の哺乳動物ＮＧＡＬ抗原の存在を検出するためのキットも想定する。このようなキットは、本明細書に記載されている免疫診断試薬（例えば、抗体）の１つ又はそれ以上を含み得る。より具体的には、キットがイムノアッセイを実施するためのキットである場合、キットは、（１）哺乳動物ＮＧＡＬに特異的に結合する少なくとも１つの捕捉抗体、（２）少なくとも１つの連結物及び（３）イムノアッセイを実施するための１つ又はそれ以上の指示書を場合によって含有することができる。本発明の免疫診断試薬は、捕捉抗体として、検出抗体として、又は捕捉抗体及び検出抗体の両方として、このような検査キットに含めることができる。例えば、マウスハイブリドーマ細胞株１−２３２２−４５５によって産生される抗体を捕捉抗体としてキット中に含めることが可能であり、マウスハイブリドーマ細胞株１−９０３−４２２によって産生される抗体を検出抗体としてキットに含めることができる。あるいは、マウスハイブリドーマ細胞株１−９０３−４２２によって産生される抗体を捕捉抗体としてキットに含めることが可能であり、ハイブリドーマ細胞株１−２３２２−４５５によって産生される抗体を検出抗体としてキットに含めることができる。さらに別の例において、マウスハイブリドーマ細胞株１−２３２２−４５５によって産生される抗体又はマウスハイブリドーマ細胞株１−９０３−４２２によって産生される抗体を捕捉抗体としてキットに含めることができ、異なる抗体を検出抗体としてキットに含めることができる。さらに別の例において、マウスハイブリドーマ細胞株１−２３２２−４５５によって産生される抗体又はマウスハイブリドーマ細胞株１−９０３−４２２によって産生される抗体を検出抗体としてキットに含めることができ、異なる抗体を捕捉抗体としてキットに含めることができる。場合によって、キットは、少なくとも１つの検量用物質又は対照も含有することができる。あらゆる検量用物質又は対照をキット中に含めることができる。しかしながら、好ましくは、検量用物質又は対照は、哺乳動物ＮＧＡＬ、特に、本明細書において前述されているグリコシル化されたヒトＮＧＡＬ（例えば、野生型又は変異体）である。
【０１８６】
従って、本発明のキットは、少なくとも１つの検量用物質又は少なくとも１つの対照又は少なくとも１つの検量用物質及び少なくとも１つの対照の組み合わせを含むことができ、検量用物質又は対照は、本発明のグリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬを含む。好ましくは、少なくとも１つの検量用物質又は少なくとも１つの対照は、配列番号１、配列番号２、配列番号１０、配列番号１３及び配列番号１、２、１０又は１３の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を有するグリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬである。キットがイムノアッセイを実施するためのキットである場合、キットは、（１）哺乳動物ＮＧＡＬに特異的に結合する少なくとも１つの捕捉抗体、（２）少なくとも１つの連結物、（３）イムノアッセイを実施するための１つ若しくはそれ以上の指示書又は（４）項目（１）から（３）のあらゆる組み合わせを場合によってさらに含む。
【０１８７】
従って、本発明は、１つ若しくはそれ以上の組換え抗体又は本発明の哺乳動物ＮＧＡＬを含む診断用及び品質管理キットをさらに提供する。場合によって、本発明のアッセイ、キット及びキット成分は、市販のプラットフォーム上での使用（例えば、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬのＰｒｉｓｍ（Ｒ）、ＡｘＳＹＭ（Ｒ）、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）及びＥＩＡ  （ビーズ）プラットフォーム上でのイムノアッセイ並びに他の市販の及び／又はインビトロ診断用アッセイ）に対して最適化される。さらに、前記アッセイ、キット及びキット成分は、他の形式で、例えば、電気化学的な又はその他の携帯式又は治療場所でのアッセイ系に対して使用することができる。例えば、本発明は、ＴｎＩ、ＣＫＭＢ及びＢＮＰを含む幾つかの心臓マーカーに対するサンドイッチイムノアッセイを実施する市販のＡｂｂｏｔｔ  Ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  Ｃａｒｅ（ｉ−  ＳＴＡＴ（Ｒ），  Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，  ＩＬ）電気化学的イムノアッセイ系に対して適用可能である。イムノセンサー及び使い捨て検査装置中でイムノセンサーを作動させる方法は、例えば、米国特許出願公開２００３０１７０８８１号、２００４００１８５７７号、２００５００５４０７８号及び２００６０１６０１６４号（参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている。電気化学的なイムノセンサー及びイムノセンサーの他の種類の製造に関するさらなる背景は、米国特許第５，０６３，０８１号（同じく、これらに関するその記述に関して、参照により組み込まれる。）に見出される。
【０１８８】
場合によって、キットは、品質管理試薬（例えば、感度パネル、検量用試料及び陽性対照）を含む。品質管理試薬の調製は本分野において周知であり、例えば、様々な免疫診断用製品同封シート上に記載されている。ＮＧＡＬ感度パネルの一員は、例えば、適切なアッセイ緩衝液（例えば、リン酸緩衝液）中に本発明のＮＧＡＬ抗原又は抗体の既知量をスパイクすることによって、例えば、「低」から「高」にわたるＮＧＡＬ抗原又は抗体の既知量を含有する可変量で場合によって調製することができる。これらの感度パネルの一員は、アッセイの性能特性を確立するために場合によって使用され、さらに、場合によって、イムノアッセイキット試薬の完全性及びアッセイの標準化の有用な指標である。
【０１８９】
別の実施形態において、本発明は、アッセイの性能特性を評価し、並びに／又はアッセイ中に使用される抗原の完全性を定量及びモニターするための感度パネルとして使用するための１つ又はそれ以上の本発明の抗原及び／又は抗体を含む品質管理キットを提供する。
【０１９０】
さらに別の実施形態において、本発明の哺乳動物ＮＧＡＬ（例えば、グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬ）は、検量用物質及び／又は対照として使用することができる。キットに提供される抗体は、蛍光色素、放射性部分、酵素、ビオチン／アビジン標識、発色団、化学発光標識などの検出可能な標識を取り込むことができ、又はキットは、抗体を標識するための試薬若しくは抗体を検出するための試薬（例えば、検出抗体）及び／又は抗原を標識するための試薬若しくは抗原を検出するための試薬を含み得る。抗体、検量用試料及び／若しくは対照は別の容器中に与えることができ、又は、適切なアッセイフォーマット中に、例えばマイクロタイタープレート中に予め分配させることができる。
【０１９１】
さらに別の実施形態において、キットは、単独で、指示書とともに、又はキット及びキット成分の他の態様とともに、
（ａ）配列番号１、２、１０又は１３に記載されているヒトＮＧＡＬタンパク質のアミノ酸残基１１２、１１８及び１４７を含む立体構造的エピトープへ特異的に結合する抗体；
（ｂ）ヒトＮＧＡＬへ特異的に結合する単離された抗体（該抗体は、配列番号５のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域を有する。）；
（ｃ）ヒトＮＧＡＬへ特異的に結合する単離された抗体（該抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を有する。）；
（ｄ）ヒトＮＧＡＬへ特異的に結合する単離された抗体（該抗体は、配列番号５のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域及び配列番号６のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を有する。）；
（ｅ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２４を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−２３２２−４５５によって産生された抗体；
（ｆ）ヒトＮＧＡＬへ特異的に結合する単離された抗体（該抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域を有する。）；
（ｇ）ヒトＮＧＡＬへ特異的に結合する単離された抗体（該抗体は、配列番号８のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を有する。）；
（ｈ）ヒトＮＧＡＬへ特異的に結合する単離された抗体（該抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域及び配列番号８のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を有する。）；及び
（ｉ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２６を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−９０３−４３０によって産生された抗体；
からなる群から選択される１つ又はそれ以上の抗体を含む免疫診断剤を含むことができる。
【０１９２】
キットは、緩衝液、塩、酵素、酵素補因子、基質、検出試薬などの、診断アッセイを実施し又は品質管理評価を容易にするために必要とされる他の試薬を場合によって含み得る。検査試料を単離及び／又は治療するための緩衝液及び溶液などの他の成分（例えば、前処理試薬）も、キットに含め得る。キットは、１つ又はそれ以上の他の対照をさらに含み得る。キットの成分の１つ又はそれ以上は凍結乾燥させることができ、キットは、凍結乾燥された成分の再構成に適した試薬をさらに含み得る。
【０１９３】
キットの様々な成分は、場合によって、適切な容器中に与えられる。上述のように、容器の１つ又はそれ以上は、マイクロタイタープレートであり得る。さらに、キットは、試料を保持又は保存するための容器（例えば、血液又は尿試料用の容器又はカートリッジ）を含むことができる。適宜、キットは、反応容器、混合容器及び試薬又は検査試料の調製を容易にする他の成分も場合によって含有し得る。キットは、注射器、ピペット、鉗子、測定用スプーンなどの検査試料の取得を補助するための１つ又はそれ以上の機器も含み得る。
【０１９４】
キットは、紙形態又はディスク、ＣＤ、ＤＶＤなどのコンピュータ読み取り可能な形態で提供され得る使用説明書を場合によってさらに含み得る。
【０１９５】
例として、限定することなく、ここで、本発明の実施例を記載する。
【０１９６】
Ｈ．方法及びアッセイキットの改良
キット（又はその成分）並びに以下にさらに記載されているアッセイによって、検査試料中のＮＧＡＬ抗原の濃度を測定する方法は、例えば、米国特許第５，０８９，４２４号及び同第５，００６，３０９号に記載されているように、並びに、例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）としてＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，  ＩＬ）によって市販されているように、様々な自動化又は半自動化されたシステム（固相が微粒子を含むシステムを含む。）で使用するために改良することができる。
【０１９７】
自動化されていないシステム（例えば、ＥＬＩＳＡ）と比較した自動化又は半自動化されたシステムの差の幾つかには、第一の特異的結合パートナー（例えば、ＮＧＡＬ捕捉抗体）が付着されている基質（サンドイッチ形成及び分析物の反応性に影響を与えることができる。）並びに捕捉の長さとタイミング、検出及び／又は何らかの場合によって行われる洗浄工程が含まれる。ＥＬＩＳＡなどの自動化されていないフォーマットは、試料及び捕捉試薬との相対的により長い温置時間を必要とし得るのに対して（例えば、約２時間）、自動化又は半自動化されたフォーマット（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ），Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は相対的により短い温置時間（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）に関して約１８分間）を有し得る。同様に、ＥＬＩＳＡなどの自動化されていない形式は、相対的により長い温置時間（例えば、約２時間）、連結物試薬などの検出抗体を温置し得るのに対して、自動化又は半自動化されたフォーマット（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ））は、相対的により短い温置時間（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）に関して約４分）を有し得る。
【０１９８】
Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能な他のプラットフォームには、ＡｘＳＹＭ（Ｒ）、ＩＭｘ（Ｒ）（例えば、参照により本明細書にその全体が組み込まれる米国特許第５，２９４，４０４号参照）、ＰＲＩＳＭ（Ｒ）、ＥＩＡ（ビーズ）及びＱｕａｎｔｕｍＴＭＩＩ並びに他のプラットフォームが含まれるが、これらに限定されない。さらに、アッセイ、キット及びキット成分は、他のフォーマット、例えば、電気化学的又は他の携帯式若しくは治療地点でのアッセイ系において使用することができる。本開示は、例えば、サンドイッチイムノアッセイを実施する市販のＡｂｂｏｔｔ  Ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  Ｃａｒｅ（ｉ−ＳＴＡＴ（Ｒ）、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）電気化学的イムノアッセイシステムに対して適用可能である。イムノセンサー並びに使い捨て検査装置におけるその製造及び操作方法は、例えば、米国特許第５，０６３，０８１号、米国特許出願公開２００３／０１７０８８１号、米国特許出願公開２００４／００１８５７７号、米国特許出願公開２００５／００５４０７８号及び米国特許出願公開２００６／０１６０１６４号（これらに関する教示に関して、参照により、その全体が組み込まれる。）に記載されている。
【０１９９】
特に、Ｉ−ＳＴＡＴ（Ｒ）システムへのＮＧＡＬアッセイの改造に関して、以下の構成が好ましい。微小加工されたシリコンチップは、金電流測定作用電極及び銀−塩化銀参照電極の一対を用いて製造される。作用電極の１つの上で、固定化された捕捉抗体を有するポリスチレンビーズ（直径０．２ｍｍ）が電極の上にパターン化されたポリビニルアルコールのポリマーコーティングに接着される。このチップは、イムノアッセイに適した流体装置フォーマットを有するＩ−ＳＴＡＴ（Ｒ）カートリッジ中に組み立てられる。カートリッジの試料保持チャンバーの壁の一部上に、アルカリホスファターゼ（又は他の標識）で標識された第二の検出抗体を含む層が存在する。カートリッジの流体袋内には、ｐ−アミノフェノールリン酸を含む水性試薬である。
【０２００】
作動時に、ＮＧＡＬ抗原を含有すると疑われる試料は、検査カートリッジの保持チャンバーに添加され、カートリッジはＩ−ＳＴＡＴ（Ｒ）読取装置中に挿入される。第二の抗体（検出抗体）が溶液中に溶解された後、カートリッジ内のポンプ要素がチップを含有する伝導路内に試料を押し出す。ここで、ポンプ要素は、ＮＧＡＬ抗原、ＮＧＡＬ捕捉抗体及び標識された検出抗体間でのサンドイッチの形成を促進するために、周期的に振動する。アッセイの最後から２番目の工程において、試料をチップから廃棄チャンバーの中に洗浄するために、液体は袋から伝導路の中に押し出される。アッセイの最後の工程において、アルカリホスファターゼ標識は、ｐ−アミノフェノールリン酸と反応してリン酸基を切断し、放出されたｐ−アミノフェノールを作用電極において電気化学的に酸化させる。測定された電流に基づいて、読取装置は、埋め込まれたアルゴリズム及び工場で測定された較正曲線を用いて、試料中のＮＧＡＬ抗原の量を計算することができる。
【０２０１】
さらに、本明細書に記載されている方法及びキットは、イムノアッセイを実施するための他の試薬及び方法を必ず包含することは言うまでもない。例えば、連結物希釈剤及び／又は検量用試料希釈剤として、例えば洗浄のために、本分野において公知の様々な緩衝液及び／又は使用するために容易に調製し、又は最適化され得る様々な緩衝液が包含される。典型的な連結物希釈剤は、ある種のキットにおいて使用され、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、塩、タンパク質ブロッキング剤、抗微生物剤及び界面活性剤を含有するＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）連結物希釈剤（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，  ＩＬ）である。典型的な検量用試料希釈剤は、ＭＥＳ、他の塩、タンパク質ブロッキング剤及び抗微生物剤を含有する緩衝液を含む、ある種のキットにおいて使用されるＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）ヒト連結物希釈剤（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，  ＩＬ）である。
【実施例１】
【０２０２】
市販の抗体を用いた典型的なＮＧＡＬアッセイ（固有のＮＧＡＬ）
本実施例は、２つの市販の抗体を使用する典型的なイムノアッセイを用いて、固有のＮＧＡＬ（本明細書に記載されているように、インビボから、例えば、血液等の材料から精製されたことを意味する。）の測定を例示する。
【０２０３】
固有のＮＧＡＬは、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）から購入した。ＮＧＡＬ単量体及び二量体の存在は、還元及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて測定した。ゲルは、購入した固有のＮＧＡＬの大部分は二量体から構成されることを示した（データは図示せず。）。単量体の少量が存在した可能性があるが、これはゲルから定量することはできなかった。
【０２０４】
これらの研究のために、室温で１時間、固有のＮＧＡＬの試料１３５μＬを１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）１５μＬと混合した。対照条件のために、１０ｍＭＤＴＴを水１５μＬと置き換えた。自動化されたＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）ｉ２０００分析装置（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）上でアッセイを行った。アッセイは、以下によって実施した。
【０２０５】
１．検査試料１０μＬを抗ＮＧＡＬ抗体（ＡｎｔｉｂｏｄｙＳｈｏｐＡ／Ｓ，Ｇｅｎｔｏｆｔｅ，Ｄｅｎｍａｒｋから得たＨＹＢ２１１−０１）で被覆した微粒子５０μＬと混合する。
【０２０６】
２．３３から３８℃で約１８分間、反応混合物を温置する。試料中のＮＧＡＬは、微粒子上の抗ＮＧＡＬ抗体を結合する。
【０２０７】
３．リン酸緩衝液で微粒子を洗浄する。
【０２０８】
４．アクリジニウム−抗ＮＧＡＬ抗体（ＡｎｔｉｂｏｄｙＳｈｏｐＡ／Ｓ，Ｇｅｎｔｏｆｔｅ，Ｄｅｎｍａｒｋから得たＨＹＢ２１１−０１）検出分子５０μＬを反応混合物に添加する。
【０２０９】
５．３３から３８℃で約４分間、反応混合物を温置する。アクリジニウム−抗ＮＧＡＬ抗体分子は、微粒子抗体に結合されたＮＧＡＬとサンドイッチを形成する。
【０２１０】
６．リン酸緩衝液で微粒子を洗浄する。
【０２１１】
７．捕捉されたアクリジニウム−ＮＧＡＬ標識に発光させるために、プレトリガー（酸溶液）及びトリガー（塩基性溶液）を添加する（発光は、ＲＬＵ（相対光単位））として、装置によって測定される。）。
【０２１２】
ＲＬＵは、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）システム上で使用される測定の光学単位に対する表記である。ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）光学システムは、本質的には、化学発光反応によって放出される光に対して光子数の計測を行う光増倍管（ＰＭＴ）である。化学発光反応によって生じた光の量は、反応混合物中に存在するアクリジニウム追跡物質の量に比例し、これにより、化学発光反応が生じた時点で反応混合物中に残存するアクリジニウムの量に同じく比例する患者の試料分析物の定量を可能とする。
【０２１３】
「相対光単位」という用語は、アクリジニウムのある量に対する光子計数の関係から得られる。各光学モジュールは、アクリジニウム標準の群を用いて較正される。化学発光反応が起きると、光が放出され、３秒の期間にわたって光子が測定される。ＰＭＴは、計数された光子をデジタル信号に変換し、次いで、デジタル信号は演算処理のために回路基板に送られる。光学回路基板はＰＭＴから得られたデジタル信号を計数された光子に比例するアナログ信号に変換し、アナログ信号は存在するアクリジニウムの量に比例する。次いで、このアナログシグナルは、さらに処理されて、ＲＬＵ値を与える。この関係は、光学モジュールを較正するための標準を作製するために確立され、異なるアクリジニウム標準はこれに割り当てられたＲＬＵ値を有する。従って、ＲＬＵ単位そのものは任意的なものであるが、ＲＬＵはアクリジニウムのある量に比例する（すなわち、関連する。）。
【０２１４】
得られたアッセイ応答曲線データは、下表１に示されている。
【０２１５】
【表１】
0005848006.tif 000002
【０２１６】
このデータから明らかなように、予想通り、固有のＮＧＡＬを用いた典型的ＮＧＡＬアッセイにおいて、ＮＧＡＬの量が増加するにつれて、アッセイ中で検出されたシグナルは増加した。
【実施例２】
【０２１７】
市販の抗体を用いる典型的なＮＧＡＬアッセイ
本実施例は、固有のＮＧＡＬホモ二量体（二量体）と比較した固有ＮＧＡＬ単量体の測定を実施例１の典型的イムノアッセイと比較する。
【０２１８】
ジチオスレイトール（「ＤＴＴ」：試料１３５μＬに１０ｍＭＤＴＴ１５μＬを添加した後、約１時間、混合及び温置した。）による固有ＮＧＡＬの還元がＮＧＡＬの測定に対して及ぼす影響も調べ、結果を下表２に示した。
【０２１９】
【表２】
0005848006.tif 000003
【０２２０】
表２から明らかなように、固有ＮＧＡＬをＤＴＴで還元した後、ＮＧＡＬ単量体へのＮＧＡＬ二量体の転化のために、アッセイ中に検出されたＮＧＡＬの濃度は増加した。これによって、市販の抗体を用いるイムノアッセイが二量体より単量体を優先的に検出することが確認される。これは、実施例１のイムノアッセイを用いた還元されていない抗原試料のアッセイにおいて、より少量のＮＧＡＬが検出されることを示唆し、及びこのような試料中のＮＧＡＬの正しい量は過小評価される可能性があり得ることを示唆する。
【実施例３】
【０２２１】
組換えヒトＮＧＡＬを用いた典型的ＮＧＡＬアッセイ
本実施例は、ＨＹＢ２１１−０１及びＨＹＢ２１１−０２抗体を使用する実施例１に記載されている典型的イムノアッセイを用いた、野生型組換えヒトＮＧＡＬ二量体と比較した野生型組換えヒトＮＧＡＬ単量体の優先的測定を例示する。
【０２２２】
本明細書中に明記されていない全ての野生型ＮＧＡＬ組換え抗原（ｒＡｇ）単量体又は二量体並びにあらゆる変異体Ｃ８７ＳＮＧＡＬｒＡｇクローン、サブクローン、ハイブリッド及びハイブリドーマ（名称及び付番を含む。）、ベクター、ベクター構築物及び抗体は全て、２００７年１０月１９日に出願された米国仮特許出願６０／９８１，４７０号（ＮＧＡＬ抗原に関するその教示に関して、参照により組み込まれる。）に全部記載されている。参照を容易にするために、これらの材料の幾つか、特に、（ヒトＮＧＡＬ野生型抗原配列（配列番号１）を示す）図１の米国仮特許出願６０／９８１，４７０号から得られる図解も、本明細書に含められる。
【０２２３】
ＣＨＯ細胞中で発現された野生型組換えヒトＮＧＡＬは、単量体として又は二量体として、ゲルろ過クロマトグラフィーによって精製された。ゲルろ過クロマトグラフィーによる試料の調製後に還元及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、ＮＧＡＬ単量体及び二量体の存在を確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、二量体調製物の大部分は二量体から構成されていることが確認された（データは図示せず。）。また、２５ｍＭ無機リン酸塩、０．５ＭＮａＣｌ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．０５％ＢＳＡ、５μｇ／ｍＬサラフロキサシン、０．１％ＮａＮ３、ｐＨ７．５中の単量体及び二量体ＮＧＡＬを用いて、検量用物質を調製した。各二量体検量用物質の試料２００μＬを、室温で２時間、１００ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）５μＬと混合した。アッセイは、実施例１に記載されているように、自動化されたＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）ｉ２０００分析装置（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）上で行った。
【０２２４】
応答曲線データは下表３に示されており、（ａ）イムノアッセイは二量体よりＮＧＡＬ単量体を優先的に検出すること、及び（ｂ）還元剤（例えば、ＤＴＴ）を用いて二量体を単量体へ転化させることによって、二量体検量アッセイの応答は単量体検量応答と等しくなることを示している。
【０２２５】
【表３】
0005848006.tif 000004
【０２２６】
下表４は、参照標準として単量体検量用物質を用いて濃度単位へ変換した後の同じデータを示している。二量体を単量体へ還元した後、二量体の単量体への転化のために、ＮＧＡＬの濃度は、平均２４８％増加した。
【０２２７】
【表４】
0005848006.tif 000005
【実施例４】
【０２２８】
二量体対単量体ＮＧＡＬ抗原を用いたイムノアッセイ性能の比較
様々な検量用物質の精度を測定するために、ＨＹＢ２１１−０１及びＨＹＢ２１１−０２抗体を用いるＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）ＮＧＡＬアッセイ上で、実施例３に記載されているように調製された単量体、二量体及びＤＴＴ処理された（２．４ｍＭＤＴＴ）野生型ＮＧＡＬ検量用物質を、比較検査した。得られた結果は、表５に示されている（下記）。
【０２２９】
【表５】
0005848006.tif 000006
【０２３０】
表５から明らかなように、変異体ＮＧＡＬを使用することの主な利点は、野生型ＮＧＡＬを用いて作製された検量用物質は時間とともに二量体をゆっくり形成し得ることである。アッセイは、二量体より単量体をよりよく「認識する」ので、これは、アッセイにおいて、単量体の喪失（すなわち、不安定性）として認識される。検量用曲線はこの現象のためにシフトする。さらに、例えば、市販の製品の作製のために使用される場合、ＮＧＡＬを精製するために高い濃度が必要なので、製造過程の間に、二量体は野生型ＮＧＡＬを形成する。このため、還元剤が必要となることによって、製造過程をさらに複雑化し、「還元された」抗原に伴う安定性の問題が生じる可能性が極めて高いプロセスがもたらされる。
【０２３１】
上記から明らかなように、ＤＴＴを添加した際に、単量体シグナルに合致する二量体シグナルの概ね定量的な回収が存在した。このことは、二量体検量用物質中の信号の喪失は、実際に、二量体及び単量体を認識することができない抗体対によるものであることを示唆する。
【実施例５】
【０２３２】
本発明のＮＧＡＬ抗体を用いた典型的ＮＧＡＬアッセイ
本実施例は、１−２３２２−４５５及び１−９０３−４３０細胞株によって産生された抗体（２００７年１０月１９日に出願された米国仮特許出願６０／９８１，４７１号（この点に関するその教示に関して、参照により組み込まれる。）から構成されるイムノアッセイを使用する別の形式を用いた、ＮＧＡＬ二量体と比較した組換えヒトＮＧＡＬ単量体の優先的測定を例示する。
【０２３３】
本実施例では、実施例３に記載されている組換えヒトＮＧＡＬ単量体及び二量体検量用物質を使用した。アッセイは、以下のように、自動化されたＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）ｉ２０００分析装置（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）上で行った。
【０２３４】
１．試料（ＮＧＡＬ単量体又は二量体検量用物質）１０μＬを、細胞株１−２３２２−４５５によって産生された抗ＮＧＡＬ抗体で被覆した微粒子５０μＬ及びトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）２０μＬと混合する。ＴＣＥＰは、ジスルフィド結合還元剤である。
【０２３５】
２．３３から３８℃で約１８分間、反応混合物を温置する。試料中のＮＧＡＬは、微粒子上の抗ＮＧＡＬ抗体を結合する。ＴＣＥＰは、二量体を単量体へ還元する。
【０２３６】
３．細胞株１−９０３−４３０によって産生されたアクリジニウム抗ＮＧＡＬ抗体検出分子５０μＬを反応混合物に添加する。
【０２３７】
４．３３から３８℃で約４分間、反応混合物を温置する。アクリジニウム−抗ＮＧＡＬ抗体分子は、微粒子抗体に結合されたＮＧＡＬとサンドイッチを形成する。
【０２３８】
５．リン酸緩衝液で微粒子を洗浄する。
【０２３９】
６．捕捉されたアクリジニウム−ＮＧＡＬ標識に発光させるために、プレトリガー（酸溶液）及びトリガー（塩基性溶液）を添加する（発光は、装置によって測定される。）。
【０２４０】
応答曲線データは、下表６に示されている。
【０２４１】
【表６】
0005848006.tif 000007
【０２４２】
これらの結果は、イムノアッセイが二量体よりＮＧＡＬ単量体を優先的に検出することを示す。単量体への二量体の転化がＤＴＴ以外の還元剤（本事例では、ＴＣＥＰ）によって達成され得ることも示している。さらに、還元剤は、実施例１及び２に記載されているように試料の前処理の間ではなく、一連のアッセイの温置の間に添加され得る。
【０２４３】
表７は、単量体検量用物質を参照として用いて、濃度単位へ転換した後の同じデータを示している。
【０２４４】
【表７】
0005848006.tif 000008
【実施例６】
【０２４５】
市販のＥＬＩＳＡキットと比べたＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）アッセイの増加した特異性
本実施例は、ＡｎｔｉｂｏｄｙＳｈｏｐＮＧＡＬＲａｐｉｄＥＬＩＳＡＫｉｔ（ＡｎｔｉｂｏｄｙＳｈｏｐＡ／Ｓ，Ｇｅｎｔｏｆｔｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）と比べた、１−２３２２−４５５及び１−９０３−４３０細胞株によって産生された抗体（２００７年１０月１９日に出願された米国仮特許出願６０／９８１，４７１号（この点に関するその教示に関して、参照により組み込まれる。）にさらに記載されている。）から構成されるイムノアッセイを使用する別の形式を用いた、ＮＧＡＬ二量体と比較した組換えヒトＮＧＡＬ単量体の優先的測定を例示する。
【０２４６】
本実施例では、実施例３に記載されている組換えヒトＮＧＡＬ二量体検量用物質を使用した。二量体検量用物質は、１５００ｎｇ／ｍＬ（「ＮＧＡＬ二量体高」）及び１５０ｎｇ／ｍＬ（「ＮＧＡＬ二量体低」）の濃度で、これらの実験のために使用した。
【０２４７】
ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）アッセイは、以下のように、自動化されたＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）ｉ２０００分析装置（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）上で行った。
【０２４８】
１．試料（ＮＧＡＬ二量体検量用物質）１０μＬを、０．５％生理的食塩水９０μＬと混合する。
【０２４９】
２．３３から３８℃で約７分間、反応混合物を温置する。
【０２５０】
３．この混合物２５μＬを取り出し、細胞株１−２３２２−４５５によって産生された抗ＮＧＡＬ抗体で被覆された微粒子５０μＬ及びＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）ライン希釈剤９０μＬ（Ｂｒｉｊ界面活性剤を加えたリン酸緩衝化生理的食塩水）と混合する。
【０２５１】
４．３３から３８℃で約１８分間、反応混合物を温置する。試料中のＮＧＡＬは、微粒子上の抗ＮＧＡＬ抗体を結合する。
【０２５２】
５．細胞株１−９０３−４３０によって産生されたアクリジニウム抗ＮＧＡＬ抗体検出分子５０μＬを反応混合物に添加する。
【０２５３】
６．３３から３８℃で約４分間、反応混合物を温置する。アクリジニウム−抗ＮＧＡＬ抗体分子は、微粒子抗体に結合されたＮＧＡＬとサンドイッチを形成する。
【０２５４】
７．リン酸緩衝液で微粒子を洗浄する。
【０２５５】
８．捕捉されたアクリジニウム−ＮＧＡＬ標識に発光させるために、プレトリガー（酸溶液）及びトリガー（塩基性溶液）を添加する（発光は、装置によって測定される。）。
【０２５６】
製造業者の指示書（Ｋｉｔ０３７，Ｒｅｖｉｓｉｏｎ２００６−０９−ＥＮ）に記載されているように、ＡｎｔｉｂｏｄｙＳｈｏｐＮＧＡＬＲａｐｉｄＥＬＩＳＡＫｉｔを実施した。
【０２５７】
ＮＧＡＬ二量体を用いて得られた典型的応答が、下表８に示されている。
【０２５８】
【表８】
0005848006.tif 000009
【０２５９】
これらの結果は、例えば、実施例４（５ｎｇ／ｍＬまで上昇した改善された特異性を示す。）の結果と合わせると、本明細書に記載されているアッセイは、アッセイの検量範囲全体を通じて（例えば、約１ｎｇ／ｍＬから最大約２０００ｎｇ／ｍＬ）改善された特異性を示すことを確認する。ＡｎｔｉｂｏｄｙＳｈｏｐＮＧＡＬＲａｐｉｄＥＬＩＳＡＫｉｔはＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）アッセイより多くの二量体を検出するので、結果は、さらに、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）ＮＧＡＬアッセイは、より高い二量体濃度において、ＡｎｔｉｂｏｄｙＳｈｏｐＮＧＡＬＲａｐｉｄＥＬＩＳＡＫｉｔより特異的であることを確認する。急性腎臓傷害に伴うＮＧＡＬのより高い濃度において、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）ＮＧＡＬアッセイは、ＡｎｔｉｂｏｄｙＳｈｏｐＮＧＡＬＲａｐｉｄＥＬＩＳＡＫｉｔより、単量体に対してより特異的であることになる。換言すれば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）ＮＧＡＬアッセイは、約１００ｎｇ／ｍＬより高いＮＧＡＬのレベルで、単量体に対してより特異的である。
【実施例７】
【０２６０】
ＡＴＣＣ寄託情報
野生型ＮＧＡＬｒＡｇＣＨＯ６６２細胞株は、２００６年１１月２１日に、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ  ２０１１０−２２０９のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２０を与えられた。
【０２６１】
変異体ＮＧＡＬｒＡｇＣＨＯＣ８７Ｓ細胞株（ＣＨＯ細胞クローン＃７３４（変異体Ｃ８７ＳＮＧＡＬｒＡｇＣＨＯ７３４としても知られる。））は、２００７年１月２３日に、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ  ２０１１０−２２０９のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８１６８を与えられた。
【０２６２】
マウスハイブリドーマ細胞株１−９０３−４３０及び１−２３２２−４５５は、２００６年１１月２１日に、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ  ２０１１０−２２０９のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（以下、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃと称する。）にそれぞれ寄託された。細胞株１−９０３−４３０には、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２６が割り当てられた。細胞株１−２３２２−４５５には、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２４が割り当てられた。
【０２６３】
当業者は、目的を遂行し、記載されている目的及び利点並びに本発明に固有の目的及び利点を取得するように、本発明が上手く適合されることを容易に理解する。本明細書に記載されている分子複合体及び方法、手法、処置、分子、具体的化合物は好ましい実施形態の本明細書における代表例であり、典型的なものであって、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、本明細書に開示されている本発明に様々な置換及び適合を変更し得ることが当業者に自明である。
【０２６４】
本明細書に挙げられている全ての特許及び公報は、本発明が属する分野の当業者の水準を示唆するものである。全ての特許及び公報は、個別の各公報が参照により具体的且つ個別に取り込まれると記されているのと同じ程度まで、参照によって本明細書に組み込まれる。特に、本開示と同時出願された以下の２つの米国特許出願、２００７年１０月１９日に出願された米国仮特許出願６０／９８１，４７１号及び２００７年１０月１９日に出願された米国仮特許出願６０／９８１，４７０号の全体が、参照により組み込まれる。
【０２６５】
本明細書に例示的に記載されている本発明は、本明細書に具体的に開示されていないあらゆる１つの要素又は複数の要素、１つの限定又は複数の限定の不存在下において適切に実施され得る。従って、例えば、本明細書の各事例において、「含む」、「実質的に〜からなる」及び「からなる」という用語の何れも、他の２つの用語の何れかと置換され得る。使用されている用語及び表現は、限定の用語ではなく、説明の用語として使用されており、このような用語及び表現の使用において、示されている及び記載されている特徴又はその一部のあらゆる均等物を除外することを意図するものではなく、特許請求の範囲に記載されている本発明の範囲内で、様々な修飾が可能であることが認められる。従って、本発明は好ましい実施形態及び場合によって存在する特徴によって具体的に開示されているが、本明細書に開示されている概念の修飾及び適合が当業者によって想到され得ること、並びにこのような修飾及び変更は、添付の特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲に属すると考えられることを理解すべきである。さらに、「定義」においてある種の用語が定義されており、「詳細な説明」の他の箇所で別段の定義、記載又は論述が為されている場合には、このような定義、記載及び論述は全て、このような用語に帰するものと理解しなければならない。また、このような用語及び表現の使用に際して、示されている及び記載されている特徴又はその一部のあらゆる均等物を除外することを意図するものではない。さらに、小見出し（例えば、「定義」）が「詳細な説明」において使用されているが、このような使用は、参照を容易にするためのものに過ぎず、ある見出し内に行われた何れかの開示をその見出しのみに限定することを意図するものではない。むしろ、１つの小見出しの下に為されたあらゆる開示は、それぞれのあらゆる他の小見出し下の開示を構成するものとする。
【図１】
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【配列表】
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