(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シロシンゴピン及びミトコンドリア阻害剤を含む、医薬組成物であって、該ミトコンドリア阻害剤がメトホルミン又はフェンホルミンである、医薬組成物。
【請求項２】
シロシンゴピン及びメトホルミンを含む、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
シロシンゴピンとミトコンドリア阻害剤の相対量（重量比）が、１対１０と１対１，０００の間である、請求項１又は２記載の医薬組成物。
【請求項４】
シロシンゴピンとメトホルミンの相対量（重量比）が、１対１０と１対２００の間である、請求項２記載の医薬組成物。
【請求項５】
癌又は自己免疫疾患の処置において用いるためのシロシンゴピンとミトコンドリア阻害剤の組み合わせであって、該ミトコンドリア阻害剤がメトホルミン又はフェンホルミンである、組み合わせ。
【請求項６】
ミトコンドリア阻害剤が、メトホルミンである、請求項５記載の組み合わせ。
【請求項７】
癌腫、肉腫、白血病、骨髄腫、リンパ腫、及び神経系の癌の処置に用いるための、請求項５記載のシロシンゴピンとミトコンドリア阻害剤の組み合わせ。
【請求項８】
免疫抑制処置に用いるための、請求項５記載のシロシンゴピンとミトコンドリア阻害剤の組み合わせ。
【請求項９】
皮膚、神経系、結合組織、筋肉、神経系、造血系、骨及び内蔵器官の自己免疫疾患の処置に用いるための、請求項８記載のシロシンゴピンとミトコンドリア阻害剤の組み合わせ。
【請求項１０】
シロシンゴピン及びミトコンドリア阻害剤が、同一の医薬組成物の一部である、請求項５〜９のいずれか１項記載のシロシンゴピンとミトコンドリア阻害剤の組み合わせ。
【請求項１１】
シロシンゴピン及びミトコンドリア阻害剤が、異なる医薬組成物におけるものである、請求項５〜９のいずれか１項記載のシロシンゴピンとミトコンドリア阻害剤の組み合わせ。
【請求項１２】
癌又は自己免疫疾患の処置用医薬組成物の製造のための、シロシンゴピンとミトコンドリア阻害剤の組み合わせの使用であって、該ミトコンドリア阻害剤がメトホルミン又はフェンホルミンである、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、シロシンゴピンとミトコンドリア阻害剤（例えば、メトホルミン又はオリゴマイシン）の組み合わせ、及び癌の処置及び臨床的免疫抑制の達成のためのシロシンゴピンとミトコンドリア阻害剤の組み合わせの使用に関する。
【０００２】
背景技術
抗癌治療は、治療的介入（例えば、手術、放射線療法、及び化学療法）の組み合わせを利用する。手術及び放射線療法は、一般に、腫瘍成長の主要な部分に局所的に限られ、一方、化学療法は、腫瘍の再成長を予防するか、又は遠位の腫瘍病巣に対して適用される。放射線療法又は手術が選択肢にないとき、化学療法剤は、腫瘍成長を低減して、疾患の進行を管理するためにも用いられる。
【０００３】
免疫抑制剤を臨床上用いて、自分自身の身体を標的にする病的な免疫反応（自己免疫）、又はアレルギーで見られる行き過ぎた免疫反応が抑制される。それらを用いて、免疫系により引き起こされる移植片拒絶も処置される。免疫応答の基礎は、Ｔ細胞の活性化及び増殖、続く抗原刺激であり、そしてそれらは、順に、Ｂ細胞のためのヘルパー細胞、制御性細胞、又はエフェクター細胞として働く。免疫抑制剤（例えば、ラパマイシン又はシクロスポリンＡ）は、初期Ｔ細胞活性化／増殖を阻害することにより、作用する。癌と免疫応答の両方が細胞増殖に関与するので、薬剤（例えば、ラパマイシン又はその類似体）のいくつかは、当初、免疫抑制のために用いられていたが、後に、抗癌剤としての活用が見出された（Recher et al., Blood 2005, 105:2527-34）。
【０００４】
化学療法薬は、併用療法において最も効果的に用いられる。論理的根拠は、薬剤耐性癌細胞が発生する可能性を低減するために、異なるメカニズムを介して働く薬剤を適用することである。併用療法はまた、ある種の薬剤併用について、最適な併用用量が副作用を最小にすることも可能にする。このことは、本質的な細胞過程（例えば、ＤＮＡ複製、細胞分裂）を標的とするか、又はＤＮＡ損傷を誘導し、従って、一般的な細胞毒性効果を有する標準的な化学療法剤として極めて重要である。最終的に、２種の化合物の併用処置は、単一の化合物によっては誘導されない予期せぬ相乗効果及び引き金効果を見出し得る。近年、薬剤を用いて、また、腫瘍免疫賦活剤の設定で、すなわち、手術に先立って、腫瘍塊が低減されるか、又は長期生存が改善され得る。
【０００５】
シロシンゴピンは、レセルピンの合成誘導体であり、抗高血圧薬及び抗精神病薬である（J.A.M.A., Vol. 170, Nr.17, Aug. 22, 1959, p. 2092）。シロシンゴピンは、１９５０年代後期に臨床上導入された。より少ない副作用を有する良好な薬剤の開発に起因し、レセルピンは今日滅多に用いられない。レセルピンは、カテコールアミンの枯渇を導く小胞アミノ酸輸送体の阻害により作用し、この作用法は、抗高血圧作用を有する全レセルピン誘導体により共有されていると信じられている。それは臨床上用いられてきたが、シロシンゴピンは、レセルピンに比べ、比較的あまり研究されておらず、抗癌剤として今まで研究されたことがない。
【０００６】
ミトコンドリアは、細胞のエネルギー産生システムを包含し、これにより、代謝由来の電子が、複合体Ｉ、ＩＩＩ及びＩＶからの陽子の放出、及びアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の形態の化学エネルギーの同時形成を伴った複合体Ｖを介した陽子の還流を導く電子移動鎖（ＥＴＣ）の複合体Ｉ〜ＩＶを通り過ぎる。酸素は、最終電子受容体として働き、Ｈ２Ｏに還元される。複合体から押し出された陽子は、基質からこの膜を介して膜間空間へと通り、正の膜電位１５０〜２００ｍＶを生じることから、このプロセスの重要点は、内部ミトコンドリア膜である。色素、例えば、ＴＭＲＭ（テトラメチルローダミンメチルエステル）は、この膜を通り、ミトコンドリア基質中に蓄積し、これにより、蛍光シグナルの強度は膜電位の強さに依存する。多数の十分に記載された薬剤は、ミトコンドリア機能を阻害し、ミトコンドリア毒性剤と見なされ得る。いわゆる脱共役剤（例えば、ＦＣＣＰ（カルボニルシアニド−ｐ−トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン））は、ＡＴＰ合成からの陽子流を脱共役し、ＡＴＰ合成の欠如を生じる膜電位の崩壊を導く。多数の十分に記載されたミトコンドリア阻害剤は、メトホルミン、ロテノン、エピベルベリン、ピエリシジンＡ（複合体Ｉの全阻害剤）、マロン酸ナトリウム及びテノイルトリフルオロアセトン（複合体ＩＩの阻害剤）、アンチマイシンＡ（複合体ＩＩＩ阻害剤）、シアン化カリウム及びアジ化ナトリウム（複合体ＩＶの阻害剤）、及びオリゴマイシン（複合体Ｖ阻害剤）を含むＥＴＣの異なる複合体を標的にする。ミトコンドリアは、先祖的に貪食された細菌であると考えられている。それらは、ＥＴＣのいくつかの成分、並びにミトコンドリアのリボソームの成分をコードするＤＮＡゲノムを含有する。ミトコンドリアのゲノムを標的にする薬剤、例えば、ヌクレオシド類似体の一種である、ある種のＨＩＶ阻害剤（例えば、スタブジン（Ｄ４Ｔ））は、ＥＴＣ及びミトコンドリアのエネルギー産生システムを最終的に破壊するので、ミトコンドリアにとって毒である。
【０００７】
メトホルミンは、広く用いられる２型糖尿病のためのビグアニド薬剤である。それは、毒性に起因して糖尿病においてもはや用いられない２種のビグアニドである、ブホルミン及びフェンホルミンに関連する。メトホルミンは安全かつ十分に許容され、糖尿病の長期（５０年を超える間）管理に用いられており、世界中で最も処方される抗糖尿病薬である。２型糖尿病の処置におけるメトホルミンの主な臨床上の利点は、高血糖を低減するための肝性糖新生の抑制、及びインスリン感受性の改善であり；これらの効果は、ＡＭＰ活性化タンパク質キナーゼ（ＡＭＰＫ）活性のメトホルミン依存性刺激により発揮されると考えられている。この効果の基礎は、メトホルミン及び他のビグアニドがミトコンドリアの呼吸鎖（電子移動鎖）の複合体Ｉを阻害するという事実である（El-Mir et al., J Biol Chem 2000, 275:223-228）。メトホルミンを服用している糖尿病患者対無関連の抗糖尿病薬剤を服用している糖尿病患者のメタアナリシスにより、メトホルミン服用コホートが、癌の発生率がより少ないことが明らかになった（Evans et al., BMJ 2005, 330:1304-5; Bowker et al., Diabetes Care 2006, 29:254-8）。これにより、最近の研究を刺激して、進行中の多数の研究及び実験で抗癌剤又は予防薬としてメトホルミンが使用されている（Gonzalez-Angulo et al., Clin Cancer Res 2010, 16:1695-700を参照）。
【０００８】
発明の概要
本発明は、シロシンゴピンとミトコンドリア阻害剤（例えば、メトホルミン（及び関連ビグアニドフェンホルミン、及びブホルミン）又はオリゴマイシン）の組み合わせ、及びシロシンゴピン及びミトコンドリア阻害剤を含む医薬組成物に関する。
【０００９】
本発明はまた、癌の処置のため、特に、癌腫、白血病、骨髄腫、及びリンパ腫の処置のため、及び自己免疫、移植医学、及び免疫抑制が望まれる他の場合（例えば、皮膚の疾患、特に、乾癬、神経系、特に、多発性硬化症、及び造血系の疾患、特に、貧血）に免疫抑制を達成するための、シロシンゴピンとミトコンドリア阻害剤（例えば、メトホルミン(及び関連ビグアニドフェンホルミン、及びブホルミン)又はオリゴマイシン）の組み合わせ、及びシロシンゴピン及びミトコンドリア阻害剤を含む医薬組成物の使用；癌の処置、及び免疫抑制の達成のための、医薬組成物を調製するための、シロシンゴピンとミトコンドリア阻害剤（例えば、メトホルミン(及び関連ビグアニドフェンホルミン、及びブホルミン)又はオリゴマイシン）の使用、及びシロシンゴピンとミトコンドリア阻害剤（例えば、メトホルミン(及び関連ビグアニドフェンホルミン、及びブホルミン)又はオリゴマイシン）の組み合わせ、又はシロシンゴピン及びミトコンドリア阻害剤を含む医薬組成物を用いた、癌の処置及び免疫抑制達成方法に関する。
【００１０】
さらに、本発明は、癌細胞がシロシンゴピン併用処置に応答するかどうかを決定する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】図１：メトホルミンとシロシンゴピンは、インビトロで協同して、腫瘍細胞を殺傷する。Ａ〜Ｈ：異なる細胞株。Ｍ＝メトホルミン，Ｓ＝シロシンゴピン。ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ変換細胞増殖アッセイ。細胞を９６ウェルマイクロタイタープレートに播種し、示した濃度で化合物を加えた。播種した細胞密度は、１ウェル当たり５，０００〜１５，０００個の細胞の範囲であり、各細胞種について実験的に決定した。プレートを３日間インキュベーションし、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ変換により増殖を測定した。無処理の対照に対して、成長を正規化し、パーセンテージとして示した（Ｙ軸）。パネルＡ〜Ｅは、感受性細胞のパネルにおける阻害曲線を示し、一方パネルＦは、非応答性のＨＴ１０８０線維肉腫細胞における成長曲線を示している。パネルＧ〜Ｈは、２種の非癌性ヒト線維芽細胞株（Ｆｉｂ３及びＦｉｂ４）の結果を示す。各細胞株について、左パネルは、メトホルミンの用量設定を、シロシンゴピンとの併用処置のため選択した濃度（５mM）を示す垂直の破線で示す。右パネルは、同様に、シロシンゴピン単独（実線）、及び５mM  メトホルミンの存在下でのシロシンゴピンでの処理（破線）の成長曲線を示す。全データポイントをトリプリケートで行った。
【図１Ｂ】図１：メトホルミンとシロシンゴピンは、インビトロで協同して、腫瘍細胞を殺傷する。Ａ〜Ｈ：異なる細胞株。Ｍ＝メトホルミン，Ｓ＝シロシンゴピン。ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ変換細胞増殖アッセイ。細胞を９６ウェルマイクロタイタープレートに播種し、示した濃度で化合物を加えた。播種した細胞密度は、１ウェル当たり５，０００〜１５，０００個の細胞の範囲であり、各細胞種について実験的に決定した。プレートを３日間インキュベーションし、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ変換により増殖を測定した。無処理の対照に対して、成長を正規化し、パーセンテージとして示した（Ｙ軸）。パネルＡ〜Ｅは、感受性細胞のパネルにおける阻害曲線を示し、一方パネルＦは、非応答性のＨＴ１０８０線維肉腫細胞における成長曲線を示している。パネルＧ〜Ｈは、２種の非癌性ヒト線維芽細胞株（Ｆｉｂ３及びＦｉｂ４）の結果を示す。各細胞株について、左パネルは、メトホルミンの用量設定を、シロシンゴピンとの併用処置のため選択した濃度（５mM）を示す垂直の破線で示す。右パネルは、同様に、シロシンゴピン単独（実線）、及び５mM  メトホルミンの存在下でのシロシンゴピンでの処理（破線）の成長曲線を示す。全データポイントをトリプリケートで行った。
【図１Ｃ】図１：メトホルミンとシロシンゴピンは、インビトロで協同して、腫瘍細胞を殺傷する。Ａ〜Ｈ：異なる細胞株。Ｍ＝メトホルミン，Ｓ＝シロシンゴピン。ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ変換細胞増殖アッセイ。細胞を９６ウェルマイクロタイタープレートに播種し、示した濃度で化合物を加えた。播種した細胞密度は、１ウェル当たり５，０００〜１５，０００個の細胞の範囲であり、各細胞種について実験的に決定した。プレートを３日間インキュベーションし、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ変換により増殖を測定した。無処理の対照に対して、成長を正規化し、パーセンテージとして示した（Ｙ軸）。パネルＡ〜Ｅは、感受性細胞のパネルにおける阻害曲線を示し、一方パネルＦは、非応答性のＨＴ１０８０線維肉腫細胞における成長曲線を示している。パネルＧ〜Ｈは、２種の非癌性ヒト線維芽細胞株（Ｆｉｂ３及びＦｉｂ４）の結果を示す。各細胞株について、左パネルは、メトホルミンの用量設定を、シロシンゴピンとの併用処置のため選択した濃度（５mM）を示す垂直の破線で示す。右パネルは、同様に、シロシンゴピン単独（実線）、及び５mM  メトホルミンの存在下でのシロシンゴピンでの処理（破線）の成長曲線を示す。全データポイントをトリプリケートで行った。
【図１Ｄ】図１：メトホルミンとシロシンゴピンは、インビトロで協同して、腫瘍細胞を殺傷する。Ａ〜Ｈ：異なる細胞株。Ｍ＝メトホルミン，Ｓ＝シロシンゴピン。ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ変換細胞増殖アッセイ。細胞を９６ウェルマイクロタイタープレートに播種し、示した濃度で化合物を加えた。播種した細胞密度は、１ウェル当たり５，０００〜１５，０００個の細胞の範囲であり、各細胞種について実験的に決定した。プレートを３日間インキュベーションし、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ変換により増殖を測定した。無処理の対照に対して、成長を正規化し、パーセンテージとして示した（Ｙ軸）。パネルＡ〜Ｅは、感受性細胞のパネルにおける阻害曲線を示し、一方パネルＦは、非応答性のＨＴ１０８０線維肉腫細胞における成長曲線を示している。パネルＧ〜Ｈは、２種の非癌性ヒト線維芽細胞株（Ｆｉｂ３及びＦｉｂ４）の結果を示す。各細胞株について、左パネルは、メトホルミンの用量設定を、シロシンゴピンとの併用処置のため選択した濃度（５mM）を示す垂直の破線で示す。右パネルは、同様に、シロシンゴピン単独（実線）、及び５mM  メトホルミンの存在下でのシロシンゴピンでの処理（破線）の成長曲線を示す。全データポイントをトリプリケートで行った。
【図１Ｅ】図１：メトホルミンとシロシンゴピンは、インビトロで協同して、腫瘍細胞を殺傷する。Ａ〜Ｈ：異なる細胞株。Ｍ＝メトホルミン，Ｓ＝シロシンゴピン。ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ変換細胞増殖アッセイ。細胞を９６ウェルマイクロタイタープレートに播種し、示した濃度で化合物を加えた。播種した細胞密度は、１ウェル当たり５，０００〜１５，０００個の細胞の範囲であり、各細胞種について実験的に決定した。プレートを３日間インキュベーションし、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ変換により増殖を測定した。無処理の対照に対して、成長を正規化し、パーセンテージとして示した（Ｙ軸）。パネルＡ〜Ｅは、感受性細胞のパネルにおける阻害曲線を示し、一方パネルＦは、非応答性のＨＴ１０８０線維肉腫細胞における成長曲線を示している。パネルＧ〜Ｈは、２種の非癌性ヒト線維芽細胞株（Ｆｉｂ３及びＦｉｂ４）の結果を示す。各細胞株について、左パネルは、メトホルミンの用量設定を、シロシンゴピンとの併用処置のため選択した濃度（５mM）を示す垂直の破線で示す。右パネルは、同様に、シロシンゴピン単独（実線）、及び５mM  メトホルミンの存在下でのシロシンゴピンでの処理（破線）の成長曲線を示す。全データポイントをトリプリケートで行った。
【図１Ｆ】図１：メトホルミンとシロシンゴピンは、インビトロで協同して、腫瘍細胞を殺傷する。Ａ〜Ｈ：異なる細胞株。Ｍ＝メトホルミン，Ｓ＝シロシンゴピン。ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ変換細胞増殖アッセイ。細胞を９６ウェルマイクロタイタープレートに播種し、示した濃度で化合物を加えた。播種した細胞密度は、１ウェル当たり５，０００〜１５，０００個の細胞の範囲であり、各細胞種について実験的に決定した。プレートを３日間インキュベーションし、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ変換により増殖を測定した。無処理の対照に対して、成長を正規化し、パーセンテージとして示した（Ｙ軸）。パネルＡ〜Ｅは、感受性細胞のパネルにおける阻害曲線を示し、一方パネルＦは、非応答性のＨＴ１０８０線維肉腫細胞における成長曲線を示している。パネルＧ〜Ｈは、２種の非癌性ヒト線維芽細胞株（Ｆｉｂ３及びＦｉｂ４）の結果を示す。各細胞株について、左パネルは、メトホルミンの用量設定を、シロシンゴピンとの併用処置のため選択した濃度（５mM）を示す垂直の破線で示す。右パネルは、同様に、シロシンゴピン単独（実線）、及び５mM  メトホルミンの存在下でのシロシンゴピンでの処理（破線）の成長曲線を示す。全データポイントをトリプリケートで行った。
【図１Ｇ】図１：メトホルミンとシロシンゴピンは、インビトロで協同して、腫瘍細胞を殺傷する。Ａ〜Ｈ：異なる細胞株。Ｍ＝メトホルミン，Ｓ＝シロシンゴピン。ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ変換細胞増殖アッセイ。細胞を９６ウェルマイクロタイタープレートに播種し、示した濃度で化合物を加えた。播種した細胞密度は、１ウェル当たり５，０００〜１５，０００個の細胞の範囲であり、各細胞種について実験的に決定した。プレートを３日間インキュベーションし、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ変換により増殖を測定した。無処理の対照に対して、成長を正規化し、パーセンテージとして示した（Ｙ軸）。パネルＡ〜Ｅは、感受性細胞のパネルにおける阻害曲線を示し、一方パネルＦは、非応答性のＨＴ１０８０線維肉腫細胞における成長曲線を示している。パネルＧ〜Ｈは、２種の非癌性ヒト線維芽細胞株（Ｆｉｂ３及びＦｉｂ４）の結果を示す。各細胞株について、左パネルは、メトホルミンの用量設定を、シロシンゴピンとの併用処置のため選択した濃度（５mM）を示す垂直の破線で示す。右パネルは、同様に、シロシンゴピン単独（実線）、及び５mM  メトホルミンの存在下でのシロシンゴピンでの処理（破線）の成長曲線を示す。全データポイントをトリプリケートで行った。
【図１Ｈ】図１：メトホルミンとシロシンゴピンは、インビトロで協同して、腫瘍細胞を殺傷する。Ａ〜Ｈ：異なる細胞株。Ｍ＝メトホルミン，Ｓ＝シロシンゴピン。ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ変換細胞増殖アッセイ。細胞を９６ウェルマイクロタイタープレートに播種し、示した濃度で化合物を加えた。播種した細胞密度は、１ウェル当たり５，０００〜１５，０００個の細胞の範囲であり、各細胞種について実験的に決定した。プレートを３日間インキュベーションし、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ変換により増殖を測定した。無処理の対照に対して、成長を正規化し、パーセンテージとして示した（Ｙ軸）。パネルＡ〜Ｅは、感受性細胞のパネルにおける阻害曲線を示し、一方パネルＦは、非応答性のＨＴ１０８０線維肉腫細胞における成長曲線を示している。パネルＧ〜Ｈは、２種の非癌性ヒト線維芽細胞株（Ｆｉｂ３及びＦｉｂ４）の結果を示す。各細胞株について、左パネルは、メトホルミンの用量設定を、シロシンゴピンとの併用処置のため選択した濃度（５mM）を示す垂直の破線で示す。右パネルは、同様に、シロシンゴピン単独（実線）、及び５mM  メトホルミンの存在下でのシロシンゴピンでの処理（破線）の成長曲線を示す。全データポイントをトリプリケートで行った。
【図２】図２：長期メトホルミンとシロシンゴピン併用処置の経時変化。Ａ５４９及びＯＰＭ２細胞を、それぞれ、１０，０００細胞/mlと１００，０００細胞/mlの開始細胞密度で播種し、化合物（Ｍ＝メトホルミン，Ｓ＝シロシンゴピン）を示した濃度で添加した。対照のため、細胞を溶媒（０．１％  ＤＭＳＯ）とインキュベーションした。指示した時間ポイントで、細胞カウントのため、ウェルをサンプリングした（ｄ＝処置の日）。細胞密度をＹ軸にプロットした（×１０００細胞/ml）。
【図３Ａ】図３：メトホルミンとシロシンゴピンの併用処置によるアポトーシスの誘導。ＯＰＭ２及びＲＰＭＩ８２２６細胞を、１００，０００細胞／５ml培地の密度で播種し、化合物を加えた。ＯＰＭ２：５μM  シロシンゴピン（Ｓ）、２mM  メトホルミン（Ｍ）。ＲＰＭＩ８２２６：２μM  シロシンゴピン（Ｓ）、１mM  メトホルミン（Ｍ）。化合物なし＝Ｃ（対照）、シロシンゴピンとメトホルミンの組み合わせ＝Ｓ＋Ｍ。３日後に、培養液５００μlを回収し、細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーター）分析のため、ヨウ化プロピジウム／アネキシンＶで染色した。アネキシンＶは、アポトーシスのマーカーであり、ＦＩＴＣ結合抗体を用いて、ＦＬ１チャンネル上で、検出されるものであった。生細胞を染色するためのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）排除染色を、同時にＦＬ３チャンネル上で検出した。各測定値について、ＰＩ及びアネキシンＶネガティブ細胞は、生細胞集団を表す（白色の棒）。早期アポトーシス細胞は、ＰＩネガティブ、アネキシンＶポジティブであり（斜線の棒）、後期アポトーシス細胞は、ＰＩポジティブ、アネキシンＶポジティブである（黒色の棒）。棒を、総細胞集団のパーセンテージとしてＹ軸上にプロットする。
【図３Ｂ】図３：メトホルミンとシロシンゴピンの併用処置によるアポトーシスの誘導。ＯＰＭ２及びＲＰＭＩ８２２６細胞を、１００，０００細胞／５ml培地の密度で播種し、化合物を加えた。ＯＰＭ２：５μM  シロシンゴピン（Ｓ）、２mM  メトホルミン（Ｍ）。ＲＰＭＩ８２２６：２μM  シロシンゴピン（Ｓ）、１mM  メトホルミン（Ｍ）。化合物なし＝Ｃ（対照）、シロシンゴピンとメトホルミンの組み合わせ＝Ｓ＋Ｍ。３日後に、培養液５００μlを回収し、細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーター）分析のため、ヨウ化プロピジウム／アネキシンＶで染色した。アネキシンＶは、アポトーシスのマーカーであり、ＦＩＴＣ結合抗体を用いて、ＦＬ１チャンネル上で、検出されるものであった。生細胞を染色するためのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）排除染色を、同時にＦＬ３チャンネル上で検出した。各測定値について、ＰＩ及びアネキシンＶネガティブ細胞は、生細胞集団を表す（白色の棒）。早期アポトーシス細胞は、ＰＩネガティブ、アネキシンＶポジティブであり（斜線の棒）、後期アポトーシス細胞は、ＰＩポジティブ、アネキシンＶポジティブである（黒色の棒）。棒を、総細胞集団のパーセンテージとしてＹ軸上にプロットする。
【図４Ａ】図４：構造上関連する化合物であるレセルピンは、メトホルミンと協同しない。レセルピン（Ｒ）とメトホルミン（Ｍ）で、同様の濃度範囲に渡り、６．５及びＯＰＭ２細胞を併用処理し、並行してシロシンゴピン（Ｓ）で処理した。左パネルは、レセルピン単独での成長増殖に対する効果を示す。右パネルは、メトホルミン（５mM）の存在下でのシロシンゴピン（実線）又はレセルピン（破線）の成長阻害を示す。全データポイントをトリプリケートで行い、成長を、それぞれの無処理対照に対して正規化し、パーセンテージとして表した（Ｙ軸）。
【図４Ｂ】図４：構造上関連する化合物であるレセルピンは、メトホルミンと協同しない。レセルピン（Ｒ）とメトホルミン（Ｍ）で、同様の濃度範囲に渡り、６．５及びＯＰＭ２細胞を併用処理し、並行してシロシンゴピン（Ｓ）で処理した。左パネルは、レセルピン単独での成長増殖に対する効果を示す。右パネルは、メトホルミン（５mM）の存在下でのシロシンゴピン（実線）又はレセルピン（破線）の成長阻害を示す。全データポイントをトリプリケートで行い、成長を、それぞれの無処理対照に対して正規化し、パーセンテージとして表した（Ｙ軸）。
【図５Ａ】図５：マウス同系腫瘍モデルにおけるシロシンゴピンとメトホルミンの併用処置のインビボ効果。免疫適合性ＤＢＡマウスの側腹部に、６．５細胞（Colombi et al., Oncogene 2011, 30:1551-65）を注射した。腫瘍が１００mm2の大きさに達したとき、薬剤処置を開始した。マウスを処置群に分け、腹腔内に、ＰＢＳ（水平の棒）、シロシンゴピン（Ｓ，黒塗りのダイア形，２mg/kg体重）、メトホルミン（Ｍ，黒塗りの三角形，２５０mg/kg体重）、及びメトホルミンとシロシンゴピン（Ｓ＋Ｍ，十字を引いた正方形）を、毎日、１５日間注射した。腫瘍の大きさが過剰になったとき（１５日）、マウスを屠殺し、測定のため腫瘍を解剖した。（Ａ）処置の経過に渡り測定した腫瘍面積（mm2）を示すグラフ，ｄ＝日数。（Ｂ）屠殺時のマウスの平均体重（ｇ）。各棒の上の記号（ｎ）は、処置群当たりのマウスの数を示している。
【図５Ｂ】図５：マウス同系腫瘍モデルにおけるシロシンゴピンとメトホルミンの併用処置のインビボ効果。免疫適合性ＤＢＡマウスの側腹部に、６．５細胞（Colombi et al., Oncogene 2011, 30:1551-65）を注射した。腫瘍が１００mm2の大きさに達したとき、薬剤処置を開始した。マウスを処置群に分け、腹腔内に、ＰＢＳ（水平の棒）、シロシンゴピン（Ｓ，黒塗りのダイア形，２mg/kg体重）、メトホルミン（Ｍ，黒塗りの三角形，２５０mg/kg体重）、及びメトホルミンとシロシンゴピン（Ｓ＋Ｍ，十字を引いた正方形）を、毎日、１５日間注射した。腫瘍の大きさが過剰になったとき（１５日）、マウスを屠殺し、測定のため腫瘍を解剖した。（Ａ）処置の経過に渡り測定した腫瘍面積（mm2）を示すグラフ，d=日数。（Ｂ）屠殺時のマウスの平均体重（ｇ）。各棒の上の記号（ｎ）は、処置群当たりのマウスの数を示している。
【図６】図６：シロシンゴピンは、ビグアニドフェンホルミンと協同する。左パネル：メトホルミン類似体フェンホルミン（Ｐ）で３日間、６．５細胞を処理し、細胞増殖アッセイにより成長を測定した。右パネル：次第に増加する濃度のフェンホルミンと共にシロシンゴピン（Ｓ）で、６．５細胞を併用処理した。Ｙ軸：無処理の対照に対する％成長。
【図７】図７：メトホルミンとシロシンゴピンの併用処理は、３日目に測定したフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）刺激性Ｔ細胞増殖を阻害する。ヒト抹消血白血球を、フィトヘマグルチニンの存在又は不存下で培養した。フィトヘマグルチニンの存在下(右パネル)、次第に増加する量のシロシンゴピンの４mM  メトホルミンとの組み合わせは、低濃度のシロシンゴピンでＴ細胞増殖をはっきりと阻害するが(破線)、メトホルミンの不存下では阻害しない(直線)。しかしながら、ＰＨＡ刺激の不存下（左パネル）で、生存細胞（顕微鏡下で観察される）は、３日目に増殖していない。この生存は、シロシンゴピンをメトホルミンと組み合わせることにより、ただ最小限で影響される（破線）。
【図８Ａ】図８：シロシンゴピンは、ミトコンドリア機能の種々の阻害剤と協同する。マウス６．５細胞を、シロシンゴピン単独（Ｓ，実線）、又はミトコンドリア機能の種々の阻害剤（破線）：（Ａ）ロテノン  ５０nM、（Ｂ）ピエリシジンＡ  １．２５nM、（Ｃ）エピベルベリン  ０．６２５μM、（Ｄ）２−テノイルトリフルオロアセトン（ＴＴＦＡ）  １００μM、（Ｅ）マロン酸ナトリウム  ３０mM、（Ｆ）アンチマイシンＡ  ５nM、（Ｇ）ＫＣＮ  ５mM、（Ｈ）アジ化ナトリウム  １．２５mM、（Ｉ）オリゴマイシン  １nM、（Ｊ）カルボニルシアニド−ｐ−トリフルオロメトキシフェニル−ヒドラゾン（ＦＣＣＰ）  １０μM、（Ｋ）スタブジン  ２００μMの存在下で量を決定した。細胞を種々の化合物の存在下で成長させ、処置の３日後に増殖アッセイにより成長阻害を測定した。各データポイントをトリプリケートで行い、１００％に設定した無処理の対照に対して、成長を正規化した。
【図８Ｂ】図８：シロシンゴピンは、ミトコンドリア機能の種々の阻害剤と協同する。マウス６．５細胞を、シロシンゴピン単独（Ｓ，実線）、又はミトコンドリア機能の種々の阻害剤（破線）：（Ａ）ロテノン  ５０nM、（Ｂ）ピエリシジンＡ  １．２５nM、（Ｃ）エピベルベリン  ０．６２５μM、（Ｄ）２−テノイルトリフルオロアセトン（ＴＴＦＡ）  １００μM、（Ｅ）マロン酸ナトリウム  ３０mM、（Ｆ）アンチマイシンＡ  ５nM、（Ｇ）ＫＣＮ  ５mM、（Ｈ）アジ化ナトリウム  １．２５mM、（Ｉ）オリゴマイシン  １nM、（Ｊ）カルボニルシアニド−ｐ−トリフルオロメトキシフェニル−ヒドラゾン（ＦＣＣＰ）  １０μM、（Ｋ）スタブジン  ２００μMの存在下で量を決定した。細胞を種々の化合物の存在下で成長させ、処置の３日後に増殖アッセイにより成長阻害を測定した。各データポイントをトリプリケートで行い、１００％に設定した無処理の対照に対して、成長を正規化した。
【図８Ｃ】図８：シロシンゴピンは、ミトコンドリア機能の種々の阻害剤と協同する。マウス６．５細胞を、シロシンゴピン単独（Ｓ，実線）、又はミトコンドリア機能の種々の阻害剤（破線）：（Ａ）ロテノン  ５０nM、（Ｂ）ピエリシジンＡ  １．２５nM、（Ｃ）エピベルベリン  ０．６２５μM、（Ｄ）２−テノイルトリフルオロアセトン（ＴＴＦＡ）  １００μM、（Ｅ）マロン酸ナトリウム  ３０mM、（Ｆ）アンチマイシンＡ  ５nM、（Ｇ）ＫＣＮ  ５mM、（Ｈ）アジ化ナトリウム  １．２５mM、（Ｉ）オリゴマイシン  １nM、（Ｊ）カルボニルシアニド−ｐ−トリフルオロメトキシフェニル−ヒドラゾン（ＦＣＣＰ）  １０μM、（Ｋ）スタブジン  ２００μMの存在下で量を決定した。細胞を種々の化合物の存在下で成長させ、処置の３日後に増殖アッセイにより成長阻害を測定した。各データポイントをトリプリケートで行い、１００％に設定した無処理の対照に対して、成長を正規化した。
【図８Ｄ】図８：シロシンゴピンは、ミトコンドリア機能の種々の阻害剤と協同する。マウス６．５細胞を、シロシンゴピン単独（Ｓ，実線）、又はミトコンドリア機能の種々の阻害剤（破線）：（Ａ）ロテノン  ５０nM、（Ｂ）ピエリシジンＡ  １．２５nM、（Ｃ）エピベルベリン  ０．６２５μM、（Ｄ）２−テノイルトリフルオロアセトン（ＴＴＦＡ）  １００μM、（Ｅ）マロン酸ナトリウム  ３０mM、（Ｆ）アンチマイシンＡ  ５nM、（Ｇ）ＫＣＮ  ５mM、（Ｈ）アジ化ナトリウム  １．２５mM、（Ｉ）オリゴマイシン  １nM、（Ｊ）カルボニルシアニド−ｐ−トリフルオロメトキシフェニル−ヒドラゾン（ＦＣＣＰ）  １０μM、（Ｋ）スタブジン  ２００μMの存在下で量を決定した。細胞を種々の化合物の存在下で成長させ、処置の３日後に増殖アッセイにより成長阻害を測定した。各データポイントをトリプリケートで行い、１００％に設定した無処理の対照に対して、成長を正規化した。
【図８Ｅ】図８：シロシンゴピンは、ミトコンドリア機能の種々の阻害剤と協同する。マウス６．５細胞を、シロシンゴピン単独（Ｓ，実線）、又はミトコンドリア機能の種々の阻害剤（破線）：（Ａ）ロテノン  ５０nM、（Ｂ）ピエリシジンＡ  １．２５nM、（Ｃ）エピベルベリン  ０．６２５μM、（Ｄ）２−テノイルトリフルオロアセトン（ＴＴＦＡ）  １００μM、（Ｅ）マロン酸ナトリウム  ３０mM、（Ｆ）アンチマイシンＡ  ５nM、（Ｇ）ＫＣＮ  ５mM、（Ｈ）アジ化ナトリウム  １．２５mM、（Ｉ）オリゴマイシン  １nM、（Ｊ）カルボニルシアニド−ｐ−トリフルオロメトキシフェニル−ヒドラゾン（ＦＣＣＰ）  １０μM、（Ｋ）スタブジン  ２００μMの存在下で量を決定した。細胞を種々の化合物の存在下で成長させ、処置の３日後に増殖アッセイにより成長阻害を測定した。各データポイントをトリプリケートで行い、１００％に設定した無処理の対照に対して、成長を正規化した。
【図８Ｆ】図８：シロシンゴピンは、ミトコンドリア機能の種々の阻害剤と協同する。マウス６．５細胞を、シロシンゴピン単独（Ｓ，実線）、又はミトコンドリア機能の種々の阻害剤（破線）：（Ａ）ロテノン  ５０nM、（Ｂ）ピエリシジンＡ  １．２５nM、（Ｃ）エピベルベリン  ０．６２５μM、（Ｄ）２−テノイルトリフルオロアセトン（ＴＴＦＡ）  １００μM、（Ｅ）マロン酸ナトリウム  ３０mM、（Ｆ）アンチマイシンＡ  ５nM、（Ｇ）ＫＣＮ  ５mM、（Ｈ）アジ化ナトリウム  １．２５mM、（Ｉ）オリゴマイシン  １nM、（Ｊ）カルボニルシアニド−ｐ−トリフルオロメトキシフェニル−ヒドラゾン（ＦＣＣＰ）  １０μM、（Ｋ）スタブジン  ２００μMの存在下で量を決定した。細胞を種々の化合物の存在下で成長させ、処置の３日後に増殖アッセイにより成長阻害を測定した。各データポイントをトリプリケートで行い、１００％に設定した無処理の対照に対して、成長を正規化した。
【図８Ｇ】図８：シロシンゴピンは、ミトコンドリア機能の種々の阻害剤と協同する。マウス６．５細胞を、シロシンゴピン単独（Ｓ，実線）、又はミトコンドリア機能の種々の阻害剤（破線）：（Ａ）ロテノン  ５０nM、（Ｂ）ピエリシジンＡ  １．２５nM、（Ｃ）エピベルベリン  ０．６２５μM、（Ｄ）２−テノイルトリフルオロアセトン（ＴＴＦＡ）  １００μM、（Ｅ）マロン酸ナトリウム  ３０mM、（Ｆ）アンチマイシンＡ  ５nM、（Ｇ）ＫＣＮ  ５mM、（Ｈ）アジ化ナトリウム  １．２５mM、（Ｉ）オリゴマイシン  １nM、（Ｊ）カルボニルシアニド−ｐ−トリフルオロメトキシフェニル−ヒドラゾン（ＦＣＣＰ）  １０μM、（Ｋ）スタブジン  ２００μMの存在下で量を決定した。細胞を種々の化合物の存在下で成長させ、処置の３日後に増殖アッセイにより成長阻害を測定した。各データポイントをトリプリケートで行い、１００％に設定した無処理の対照に対して、成長を正規化した。
【図８Ｈ】図８：シロシンゴピンは、ミトコンドリア機能の種々の阻害剤と協同する。マウス６．５細胞を、シロシンゴピン単独（Ｓ，実線）、又はミトコンドリア機能の種々の阻害剤（破線）：（Ａ）ロテノン  ５０nM、（Ｂ）ピエリシジンＡ  １．２５nM、（Ｃ）エピベルベリン  ０．６２５μM、（Ｄ）２−テノイルトリフルオロアセトン（ＴＴＦＡ）  １００μM、（Ｅ）マロン酸ナトリウム  ３０mM、（Ｆ）アンチマイシンＡ  ５nM、（Ｇ）ＫＣＮ  ５mM、（Ｈ）アジ化ナトリウム  １．２５mM、（Ｉ）オリゴマイシン  １nM、（Ｊ）カルボニルシアニド−ｐ−トリフルオロメトキシフェニル−ヒドラゾン（ＦＣＣＰ）  １０μM、（Ｋ）スタブジン  ２００μMの存在下で量を決定した。細胞を種々の化合物の存在下で成長させ、処置の３日後に増殖アッセイにより成長阻害を測定した。各データポイントをトリプリケートで行い、１００％に設定した無処理の対照に対して、成長を正規化した。
【図８Ｉ】図８：シロシンゴピンは、ミトコンドリア機能の種々の阻害剤と協同する。マウス６．５細胞を、シロシンゴピン単独（Ｓ，実線）、又はミトコンドリア機能の種々の阻害剤（破線）：（Ａ）ロテノン  ５０nM、（Ｂ）ピエリシジンＡ  １．２５nM、（Ｃ）エピベルベリン  ０．６２５μM、（Ｄ）２−テノイルトリフルオロアセトン（ＴＴＦＡ）  １００μM、（Ｅ）マロン酸ナトリウム  ３０mM、（Ｆ）アンチマイシンＡ  ５nM、（Ｇ）ＫＣＮ  ５mM、（Ｈ）アジ化ナトリウム  １．２５mM、（Ｉ）オリゴマイシン  １nM、（Ｊ）カルボニルシアニド−ｐ−トリフルオロメトキシフェニル−ヒドラゾン（ＦＣＣＰ）  １０μM、（Ｋ）スタブジン  ２００μMの存在下で量を決定した。細胞を種々の化合物の存在下で成長させ、処置の３日後に増殖アッセイにより成長阻害を測定した。各データポイントをトリプリケートで行い、１００％に設定した無処理の対照に対して、成長を正規化した。
【図８Ｊ】図８：シロシンゴピンは、ミトコンドリア機能の種々の阻害剤と協同する。マウス６．５細胞を、シロシンゴピン単独（Ｓ，実線）、又はミトコンドリア機能の種々の阻害剤（破線）：（Ａ）ロテノン  ５０nM、（Ｂ）ピエリシジンＡ  １．２５nM、（Ｃ）エピベルベリン  ０．６２５μM、（Ｄ）２−テノイルトリフルオロアセトン（ＴＴＦＡ）  １００μM、（Ｅ）マロン酸ナトリウム  ３０mM、（Ｆ）アンチマイシンＡ  ５nM、（Ｇ）ＫＣＮ  ５mM、（Ｈ）アジ化ナトリウム  １．２５mM、（Ｉ）オリゴマイシン  １nM、（Ｊ）カルボニルシアニド−ｐ−トリフルオロメトキシフェニル−ヒドラゾン（ＦＣＣＰ）  １０μM、（Ｋ）スタブジン  ２００μMの存在下で量を決定した。細胞を種々の化合物の存在下で成長させ、処置の３日後に増殖アッセイにより成長阻害を測定した。各データポイントをトリプリケートで行い、１００％に設定した無処理の対照に対して、成長を正規化した。
【図８Ｋ】図８：シロシンゴピンは、ミトコンドリア機能の種々の阻害剤と協同する。マウス６．５細胞を、シロシンゴピン単独（Ｓ，実線）、又はミトコンドリア機能の種々の阻害剤（破線）：（Ａ）ロテノン  ５０nM、（Ｂ）ピエリシジンＡ  １．２５nM、（Ｃ）エピベルベリン  ０．６２５μM、（Ｄ）２−テノイルトリフルオロアセトン（ＴＴＦＡ）  １００μM、（Ｅ）マロン酸ナトリウム  ３０mM、（Ｆ）アンチマイシンＡ  ５nM、（Ｇ）ＫＣＮ  ５mM、（Ｈ）アジ化ナトリウム  １．２５mM、（Ｉ）オリゴマイシン  １nM、（Ｊ）カルボニルシアニド−ｐ−トリフルオロメトキシフェニル−ヒドラゾン（ＦＣＣＰ）  １０μM、（Ｋ）スタブジン  ２００μMの存在下で量を決定した。細胞を種々の化合物の存在下で成長させ、処置の３日後に増殖アッセイにより成長阻害を測定した。各データポイントをトリプリケートで行い、１００％に設定した無処理の対照に対して、成長を正規化した。
【図９】図９：ミトコンドリア機能の阻害剤は単独で、６．５細胞を殺傷しない。シロシンゴピンとの相乗的殺傷に利用される濃度での、種々のミトコンドリア標的薬剤の６．５細胞の成長に対する効果。１００％に設定した無処理細胞（黒色の棒）に対して、成長を正規化した。各データポイントをトリプリケートで行い、３日後に増殖アッセイを用いて、成長を測定した。（Ａ）ロテノン、（Ｂ）ピエリシジンＡ、（Ｃ）エピベルベリン、（Ｄ）２−テノイルトリフルオロアセトン、（Ｅ）マロン酸ナトリウム、（Ｆ）アンチマイシンＡ、（Ｇ）ＫＣＮ、（Ｈ）アジ化ナトリウム、（Ｉ）オリゴマイシン、（Ｊ）カルボニルシアニド−ｐ−トリフルオロメトキシ−フェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）、（Ｋ）スタブジン。
【図１０Ａ】図１０：nM以下の濃度でのシロシンゴピン及びオリゴマイシンによるヒト癌細胞の相乗的殺傷。（Ａ）マウス細胞株６．５、（Ｂ）ヒト前骨髄球性白血病細胞株ＨＬ６０、及び（Ｃ）ヒト多発性骨髄腫細胞株ＯＰＭ２について図１に記載したとおり、細胞成長増殖アッセイ（３日）を行った。オリゴマイシンの不存下（実線）、５００pM  オリゴマイシン（点線）及び１nM  オリゴマイシン（破線）の存在下で、シロシンゴピン（Ｓ）を用量設定した。
【図１０Ｂ】図１０：nM以下の濃度でのシロシンゴピン及びオリゴマイシンによるヒト癌細胞の相乗的殺傷。（Ａ）マウス細胞株６．５、（Ｂ）ヒト前骨髄球性白血病細胞株ＨＬ６０、及び（Ｃ）ヒト多発性骨髄腫細胞株ＯＰＭ２について図１に記載したとおり、細胞成長増殖アッセイ（３日）を行った。オリゴマイシンの不存下（実線）、５００pM  オリゴマイシン（点線）及び１nM  オリゴマイシン（破線）の存在下で、シロシンゴピン（Ｓ）を用量設定した。
【図１０Ｃ】図１０：nM以下の濃度でのシロシンゴピン及びオリゴマイシンによるヒト癌細胞の相乗的殺傷。（Ａ）マウス細胞株６．５、（Ｂ）ヒト前骨髄球性白血病細胞株ＨＬ６０、及び（Ｃ）ヒト多発性骨髄腫細胞株ＯＰＭ２について図１に記載したとおり、細胞成長増殖アッセイ（３日）を行った。オリゴマイシンの不存下（実線）、５００pM  オリゴマイシン（点線）及び１nM  オリゴマイシン（破線）の存在下で、シロシンゴピン（Ｓ）を用量設定した。
【図１１】図１１：シロシンゴピン処理は、用量依存性の方法でミトコンドリアの膜電位を増加する。マウス６．５細胞をＴＭＲＭで処理し（パネル１〜６）、加えてＦＣＣＰ（パネル２）、０．１μM（パネル３）、０．５μM（パネル４）、２μM（パネル５）、又は５μM（パネル６）のシロシンゴピンと予めインキュベーションし、蛍光強度を測定した。細い線：対照細胞又はＦＣＣＰ処理細胞（パネル２）の蛍光強度。太い線は、シロシンゴピンとさらに予めインキュベーションした細胞を示す（パネル３〜６）。Ｘ軸は蛍光強度を示し、Ｙ軸は相対細胞数を示す。ＦＣＣＰ処理後の蛍光ピークの左へのシフト（パネル２）は、膜電位の減少又は喪失を示し、右へのシフト（パネル４〜６）は、シロシンゴピン処理に際した膜電位の増加を示す（太い線と細い線を比較する）。
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明は、シロシンゴピンとミトコンドリア阻害剤（例えば、メトホルミン又はオリゴマイシン）の組み合わせ、及びシロシンゴピン及びミトコンドリア阻害剤を含む医薬組成物に関する。
【００１３】
本発明は、さらに、癌の処置、特に、癌腫、白血病、骨髄腫、及びリンパ腫の処置、及び免疫不全、例えば、自己免疫の処置のための、シロシンゴピンとミトコンドリア阻害剤の組み合わせの使用、及びシロシンゴピン及びミトコンドリア阻害剤を含む医薬組成物の使用に関する。
【００１４】
本発明において解釈される「ミトコンドリア阻害剤」は、ミトコンドリア活性を低減し、様々な程度のミトコンドリア毒性（mitochondriotoxic）の特性を示す化合物を含む。ミトコンドリア阻害剤は、いわゆる脱共役剤（ミトコンドリアにおいてＡＴＰ合成からの陽子の流れを脱共役する）、及びミトコンドリアにおける電子移動鎖（ＥＴＣ）の異なる複合体を標的とする阻害剤（例えば、電子移動鎖の複合体Ｉ、複合体ＩＩ、複合体ＩＩＩ、複合体ＩＶ、及び複合体Ｖ）を含む。本発明によるミトコンドリア阻害剤であると考えられるさらなる化合物は、ミトコンドリアのゲノムを標的とするミトコンドリア毒性化合物である。
【００１５】
広く処方されている薬剤の多くは、ミトコンドリア毒性に起因する副作用を発揮する。これらのミトコンドリア毒性薬剤はまた、本発明によるミトコンドリア阻害剤とも考えられる。かかるミトコンドリア毒性又はミトコンドリア阻害性の薬剤は、シロシンゴピンと協同し、シロシンゴピンと併用したとき、抗癌剤となる。ミトコンドリア毒性薬剤は、非常に異なる臨床状態の処置のために用いられてきた（Cohen et al., Dev Disabil Res Rev 2010, 16:189-199）。
【００１６】
本発明によるミトコンドリア阻害剤は、以下を含む：
ミトコンドリア副作用を伴って肝臓又は胆嚢疾患に用いられる薬剤、例えば、テトラサイクリン、イブプロフェン、アミオダロン、ピルプロフェン、タモキシフェン、バルプロエート、クロロキン、キニジン、クロルプロマジン、ケトコナゾール、シクロスポリンＡ、リファンピシン（rifampicine）、及びグリブリン（glyburine）；
電子伝達系複合体Ｉの阻害剤、例えば、アミタール、カプサイシン、ハロペリドール、リスペリドン、メトホルミン、ブホルミン、フェンホルミン、ブピバカイン、リドカイン、ハロタン、ダントロレン、フェニトイン、クロフィブラート、及びフェノフィブラート；
電子伝達系複合体ＩＩの阻害剤、例えば、シクロホスファミド及びケトコナゾール；
電子伝達系複合体ＩＩＩの阻害剤、例えば、アンチマイシンＡ、アセトアミノフェン、イソフルレン、及びセボフルラン；
電子伝達系複合体ＩＶの阻害剤、例えば、セファロリジン、セファゾリン、及びセファロチン；
ミトコンドリアＤＮＡ合成の阻害剤、例えば、ＡＺＴ（イトブジジン（itovudidine））、ｄ４Ｔ（スタブジン）、ｄｄＩ（ディダノシン）、及びｄｄＣ（ザルシタビン）；
酸化的リン酸化の脱共役剤、例えば、ペンタミジン、インドメタシン、フルオキセチン、プロポフォール、アスピリン、ブビバカイン（bubivacaine）、トルカポン、及びジニトロフェノール；
酸化還元メカニズムを介して酸素分子をスーパーオキシドに還元する薬剤、例えば、ドキソルビシン、イソニアジド、ゲンタマイシン、及びフルオロキノロン；及び
ミトコンドリアの遺伝子転写の阻害剤、例えば、インターフェロン−α、及びインターフェロン−γ。
【００１７】
メトホルミンは、式（１）
【化１】
0005940559.tif 000002
の３−（ジアミノメチリデン）−１，１−ジメチルグアニジンハイドロクロライドである。
【００１８】
考えられる他のビグアニドは、例えば、フェンホルミン又はブホルミンであり、好ましくは、フェンホルミンである。
【００１９】
フェンホルミンは、式（２）
【化２】
0005940559.tif 000003
の１−（ジアミノメチリデン）−２−（２−フェニルエチル）グアニジンである。
【００２０】
シロシンゴピンは、式（３）
【化３】
0005940559.tif 000004
（式中、レセルピンの３，４，５−トリメトキシベンゾエート部分の４−メトキシ基は、４−エトキシカルボニルオキシ基により置換されている）のレセルピンの誘導体であり、式（４）
【化４】
0005940559.tif 000005
に示されるとおりである。
【００２１】
シロシンゴピンと協同することが示された、さらなるミトコンドリア阻害剤は以下：
（５Ａ）ロテノン（ミトコンドリア電子伝達系複合体Ｉの阻害剤）：
【化５】
0005940559.tif 000006
（５Ｂ）ピエリシジンＡ（複合体Ｉ阻害剤）：
【化６】
0005940559.tif 000007
（５Ｃ）エピベルベリン（複合体Ｉ阻害剤）：
【化７】
0005940559.tif 000008
（５Ｄ）２−テノイルトリフルオロアセトン（複合体ＩＩ阻害剤）：
【化８】
0005940559.tif 000009
（５Ｅ）マロン酸ナトリウム（複合体ＩＩ阻害剤）：ＣＨ２（ＣＯＯＮａ）２
（５Ｆ）アンチマイシンＡ（複合体ＩＩＩ阻害剤）：
【化９】
0005940559.tif 000010
（５Ｇ）シアン化カリウム（複合体ＩＶ阻害剤）：ＫＣＮ
（５Ｈ）アジ化ナトリウム（複合体ＩＶ阻害剤）：ＮａＮ３
（５Ｉ）オリゴマイシン（複合体Ｖ阻害剤）：
【化１０】
0005940559.tif 000011
（５Ｊ）カルボニルシアニド−ｐ−トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）（ミトコンドリア膜脱共役剤）：
【化１１】
0005940559.tif 000012
及び（５Ｋ）スタブジン（ミトコンドリア遺伝毒性剤）：
【化１２】
0005940559.tif 000013
である。
【００２２】
塩基性化合物とその酸付加塩との間の密接な関係を考慮して、塩基性窒素原子を有するメトホルミン、フェンホルミン、及び他のミトコンドリア阻害剤は、遊離塩基又は任意のその酸付加塩を意味する。マロン酸ナトリウム、シアン化カリウム、及びアジ化ナトリウムは、他のアルカリ塩、例えば、マロン酸カリウム、シアン化ナトリウム、アジ化カリウム、又は同様にそのアンモニウム塩に相当する。陽イオン化合物エピベルベリン（５Ｃ）は、任意の医薬的に許容され得る陰イオン、例えば、塩化物塩、硫酸水素塩、メタンスルホン酸塩、又はリン酸二水素塩をもたらし得る。
【００２３】
同様に、シロシンゴピンは、遊離塩基又は任意のその酸付加塩を意味する。塩は、特に、シロシンゴピンの医薬的に許容され得る塩である。
【００２４】
かかる塩は、例えば、酸付加塩として、好ましくは、有機酸又は無機酸を用いて形成される。適当な無機酸は、例えば、ハロゲン酸、例えば、塩酸、硫酸、又はリン酸である。適当な有機酸は、例えば、カルボン酸、ホスホン酸、スルホン酸又はスルファミン酸、例えば、酢酸、プロピオン酸、オクタン酸、デカン酸、ドデカン酸、グリコール酸、乳酸、フマル酸、コハク酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アミノ酸、例えば、グルタミン酸又はアスパラギン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、シクロヘキサンカルボン酸、アダマンタンカルボン酸、安息香酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、フタル酸、フェニル酢酸、マンデル酸、桂皮酸、メタン−又はエタン−スルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、エタン−１，２−ジスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、１，５−ナフタレン−ジスルホン酸、２−、３−又は４−メチル−ベンゼンスルホン酸、メチル硫酸、エチル硫酸、ドデシル硫酸、Ｎ−シクロヘキシルスルファミン酸、Ｎ−メチル−、Ｎ−エチル−又はＮ−プロピル−スルファミン酸、又は他の有機プロトン酸、例えば、アスコルビン酸である。
【００２５】
本発明による医薬組成物は、例えば、経腸投与（例えば、経鼻、口腔、直腸、又は特に、経口投与）用組成物、及び非経腸投与（例えば、静脈内、筋肉内又は皮下投与）用組成物である。組成物は、シロシンゴピン及びミトコンドリア阻害剤（例えば、メトホルミン又はオリゴマイシン）を単独、又は好ましくは、医薬的に許容され得る担体と一緒に含む。シロシンゴピンとミトコンドリア阻害剤の組み合わせの投薬量は、処置されるべき疾患、及び種、年齢、体重、個々の状態、個々の薬剤動態データ、及び投与形態に依存する。
【００２６】
医薬組成物は、約１％〜約９５％のシロシンゴピンとミトコンドリア阻害剤（例えば、メトホルミン又はオリゴマイシン）の組み合わせを含み、１回用量の投与形態は、好ましい実施態様において、約２０％〜約９０％のシロシンゴピンとミトコンドリア阻害剤の組み合わせを含み、１回用量型ではない形態は、好ましい実施態様において、約５％〜約２０％のシロシンゴピンとミトコンドリア阻害剤の組み合わせを含む。単位投与形態は、例えば、被服錠剤及び非被覆錠剤、アンプル剤、バイアル、座薬、又はカプセル剤である。さらなる投与形態は、例えば、軟膏、クリーム剤、ペースト剤、フォーム剤、チンキ剤、点滴剤、噴霧剤、及び分散剤である。例えば、シロシンゴピンとミトコンドリア阻害剤の組み合わせ約０．０５ｇ〜約１．０ｇを含有するカプセル剤である。
【００２７】
本発明の医薬組成物は、それ自体既知の手法で（例えば、通常の混合、造粒、被覆、溶解又は凍結乾燥過程により）調製される。
【００２８】
シロシンゴピンとミトコンドリア阻害剤（例えば、メトホルミン又はオリゴマイシン）の組み合わせ溶液、及び同様に懸濁液又は分散液、特に、等調水溶液、分散液又は懸濁液（例えば、シロシンゴピンとミトコンドリア阻害剤の組み合わせを単独、又は担体（例えば、マンニトール）と一緒に含む凍結乾燥組成物の場合、使用前に作ることができる）の使用が好ましい。医薬組成物は、殺菌されていてもよく、及び／又は賦形剤、例えば、保存剤、安定剤、湿潤剤、及び／又は乳化剤、可溶化剤、浸透圧を制御するための塩及び／又は緩衝剤を含んでいてもよく、及びそれ自体既知の手法で（例えば、通常の溶解及び凍結乾燥過程により）調製される。当該溶液又は懸濁液は、粘度増強剤、典型的には、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、カルボキシメチル−セルロース、デキストラン、ポリビニル−ピロリドン、又はゼラチン、又は同様に可溶化剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ８０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）を含んでいてもよい。
【００２９】
油中懸濁液は、注射目的には普通、油成分として、植物、合成、又は半合成油を含む。これに関して特筆すべきは、酸成分として８〜２２、特に、１２〜２２個の炭素原子を有する長鎖脂肪酸を含有する液体脂肪酸エステルから作られ得ることである。これらの脂肪酸エステルのアルコール成分は、最大６個の炭素原子を有し、及び１価又は多価、例えば、１、２又は３価のアルコール、特に、グリコール及びグリセロールである。脂肪酸エステルの混合物として、植物油、例えば、綿実油、アーモンドオイル、オリーブ油、ヒマシ油、ゴマ油、大豆油、及び落花生油は、特に有用である。
【００３０】
注入可能な製剤の製造（例えば、アンプル又はバイアルへの充填、及び容器の密封）は、通常、無菌条件下で行われる。
【００３１】
好ましい固形経口投与形態に適当な担体は、特に、充填剤、例えば、糖、例えば、ラクトース、サッカロース、マンニトール又はソルビトール、セルロース調製剤、及び／又はリン酸カルシウム、例えば、トリリン酸カルシウム又はリン酸水素カルシウム、及び同様に結合剤、例えば、でんぷん、例えば、コーン、小麦、米、又はジャガイモでんぷん、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、及び／又はポリビニルピロリドン、及び／又は所望なら、崩壊剤、例えば、上述のスターチ、同様にカルボキシメチルでんぷん、架橋ポリビニルピロリドン、アルギン酸又はその塩、例えば、アルギン酸ナトリウムである。さらなる賦形剤は、特に、流量調製剤及び滑沢剤、例えば、ケイ酸、タルク、ステアリン酸又はその塩、例えば、ステアリン酸マグネシウム又はカルシウム、及び／又はポリエチレングリコール、又はその誘導体である。
【００３２】
錠剤コアは、とりわけ、濃縮糖溶液（アラビアゴム、タルク、ポリビニル−ピロリドン、ポリエチレングリコール及び／又はチタニウムジオキシドを含み得る）を用いた、適当な（場合により、腸溶性の）コーティング、又は適当な有機溶媒又は溶媒混合物中のコーティング溶液を用いて、或は腸溶性コーティングである適当なセルロース調製（例えば、フタル酸アセチルセルロース又はフタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース）溶液の製造のため、提供され得る。染料又は色素は、錠剤又は錠剤コーティングに、例えば、シロシンゴピンとミトコンドリア阻害剤の組み合わせを同定する目的のため、又は異なる用量を示すために加えられてもよい。
【００３３】
経口投与用の医薬組成物はまた、ゼラチンからなる硬カプセル剤、及び同様にゼラチン及び可塑剤、例えば、グリセロール又はソルビトールからなる軟密封カプセル剤を含む。硬カプセル剤は、顆粒の形態、例えば、充填剤、例えば、コーンスターチ、結合剤、及び／又は流動促進剤、例えば、タルク又はステアリン酸マグネシウム、及び場合により安定剤との混合物中に、シロシンゴピンとミトコンドリア阻害剤の組み合わせを含有してもよい。軟カプセル剤において、シロシンゴピンとミトコンドリア阻害剤の組み合わせは、好ましくは、安定な液体賦形剤、例えば、脂肪油、パラフィン油、又は液体ポリエチレングリコール、又はエチレン又はプロピレングリコールの脂肪酸エステルに溶解又は懸濁され、そしてそれに、安定剤及び界面活性剤、例えば、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル型のものが、加えられてもよい。
【００３４】
直腸投与に適当な医薬組成物は、例えば、シロシンゴピンとミトコンドリア阻害剤（例えば、メトホルミン又はオリゴマイシン）の組み合わせ、及び座剤基剤からなる座剤である。適当な座剤基剤は、例えば、天然又は合成トリグリセリド、パラフィン炭化水素、ポリエチレングリコール、又は高級アルカノールである。
【００３５】
非経腸投与のため、シロシンゴピンとミトコンドリア阻害剤の組み合わせ水溶液、又は粘度増強物質、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール及び／又はデキストラン、及び所望なら、安定剤を含有する水性の注射懸濁液が、特に適している。シロシンゴピンとミトコンドリア阻害剤の組み合わせはまた、場合により賦形剤と一緒に、凍結乾燥物の形態であることもでき、非経腸投与前に、適当な溶媒を加えることにより、溶液にすることもできる。例えば、非経腸投与のために用いられる溶液はまた、輸液としても利用され得る。
【００３６】
好ましい保存剤は、例えば、酸化防止剤、例えば、アスコルビン酸、又は殺菌剤、例えば、ソルビン酸又は安息香酸である。
【００３７】
以下に詳細に記載の研究に基づき、ミトコンドリア阻害剤、例えば、式（１）のメトホルミン、式（２）のフェンホルミン、又はさらに、式（５）のミトコンドリア阻害剤、特に、式（５Ｉ）のオリゴマイシン、及び式（４）のシロシンゴピンの組み合わせ、及び本発明によるミトコンドリア阻害剤及びシロシンゴピンを含む医薬組成物は、癌腫、肉腫、神経膠腫、白血病、リンパ腫、例えば、上皮性新生物、扁平細胞新生物、基底細胞性新生物、移行上皮新生物及び癌腫、腺腫及び腺癌、皮膚付属器新生物、粘膜表皮新生物、嚢胞性新生物、粘液性及び漿液性新生物、管状、小葉性及び髄様新生物、腺房細胞新生物、複合上皮新生物、分化性腺新生物（specialized gonadal neoplasms）、傍神経節腫及びグロムス腫瘍、母斑及びメラノーマ、肉腫を含む軟部腫瘍、線維腫性新生物（fibromatous neoplasms）、粘液腫性新生物（myxomatous neoplasms）、脂肪腫性新生物（lipomatous neoplasms）、筋腫性新生物（myomatous neoplasms）、複合混合間質性新生物（complex mixed and stromal neoplasms）、線維上皮新生物、滑膜様新生物（synovial like neoplasms）、中皮新生物、胚細胞新生物、絨毛性新生物、中腎腫、血管組織腫瘍、リンパ管腫瘍、骨性及び軟骨性新生物（osseous and chondromatous neoplasms）、巨細胞腫、種々の骨腫瘍、神経膠腫、神経膠芽腫、乏突起神経膠腫、神経上皮新生物（neuroepitheliomatous neoplasms）、髄膜腫、神経鞘腫、果粒細胞腫及び胞巣状軟部肉腫、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫、他のリンパ細網性新生物（lymphoreticular neoplasms）、形質細胞腫、肥満細胞腫、免疫増殖性疾患、急性及び慢性白血病を含む白血病、種々の骨髄増殖性疾患、リンパ増殖性疾患、及び骨髄異形成症候群を含む、異なる型の癌に対する治療上の有効性を示す。
【００３８】
以下に詳細に記載の研究に基づき、ミトコンドリア阻害剤、例えば、式（１）のメトホルミン、式（２）のフェンホルミン、又はさらに式（５）のミトコンドリア阻害剤、特に、式（５Ｉ）のオリゴマイシン、及び式（４）のシロシンゴピンの組み合わせ、及び本発明によるミトコンドリア阻害剤及びシロシンゴピンを含む医薬組成物は、膠原病、例えば、紅斑性狼瘡、強皮症、多発性筋炎／皮膚筋炎、混合性結合組織病、関節リウマチ、シェーグレン症候群、結節性多動脈炎（panarteriitis nodosa）、ウェゲナー肉芽腫症；全身性自己免疫疾患、例えば、関節リウマチ、グッドパスチャー症候群、ウェゲナー肉芽腫症、リウマチ性多発筋痛症、ギラン・バレー症候群、多発性硬化症；限局性自己免疫疾患、例えば、１型糖尿病、橋本甲状腺炎、グレーブス病、セリアック病、クローン病、潰瘍性大腸炎、アジソン病、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性肝炎、及び巨細胞性動脈炎を含む、Ｔ細胞増殖の阻止に感受性のある免疫疾患に対する治療上の有効性を示す。
【００３９】
本発明による、ミトコンドリア阻害剤とシロシンゴピンの組み合わせ、及びシロシンゴピン及びミトコンドリア阻害剤（例えば、メトホルミン又はオリゴマイシン）を含む医薬組成物は、一定の組み合わせの形態で適用されてもよい。かかる一定の組み合わせは、相対量（重量比）１対１０と１対１，０００の間、好ましくは、１対１００と１対２００の間、例えば、１対１３０の組み合わせで、シロシンゴピンとミトコンドリア阻害剤（例えば、メトホルミン）を含有してもよく、これにより、２型糖尿病の経験に基づいたメトホルミンの最大推奨１日用量は、２，５５０mgである。シロシンゴピンとオリゴマイシンの一定の組み合わせは、１，０００対１と１０，０００対１の間の相対量（重量比）でシロシンゴピンとオリゴマイシンを含有してもよい。あるいは、シロシンゴピンといくつかのミトコンドリア阻害剤（例えば、メトホルミン）間の共有結合が想定されてもよい。実際の理由のため、塩であるマロン酸ナトリウム（５Ｅ）、シアン化カリウム（５Ｇ）、及びアジ化ナトリウム（５Ｈ）は、細胞試験においてシロシンゴピンと協同することが示されているが、抗癌及び免疫抑制剤としてのシロシンゴピンの考えられる組み合わせパートナーではない。
【００４０】
あるいは、シロシンゴピンとミトコンドリア阻害剤（例えば、メトホルミン又はオリゴマイシン）の組み合わせは、２つの異なる別々の医薬組成物（場合によっては、キット中で一緒に提供される）にて適用されてもよい。シロシンゴピン及びミトコンドリア阻害剤（例えば、メトホルミン又はオリゴマイシン）の投与は、交互であってもよいか、又は化合物は、妥当な時間ウィンドウ内で互いに独立して与えられてもよい。
【００４１】
シロシンゴピン及びミトコンドリア阻害剤（例えば、メトホルミン又はオリゴマイシン）を含む医薬組成物は、さらに、他の化学療法剤と組み合わされてもよい。可能性のある組み合わせの治療剤は、特に、１個又は複数の細胞分裂阻害化合物又は細胞傷害性化合物、例えば、化学療法剤又はインダルビシン、シタラビン、インターフェロン、ヒドロキシウレア、ビスルファンを含む群より選択されるいくつか、又はポリアミン生合成の阻害剤、ｍＴＯＲ経路の阻害剤、ｍＴＯＲ−複合体１又はｍＴＯＲ複合体２の阻害剤、タンパク質キナーゼの阻害剤、特に、セリン／スレオニンタンパク質キナーゼの阻害剤、例えば、タンパク質キナーゼＣ、又はチロシンタンパク質キナーゼの阻害剤、例えば、上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ、サイトカイン、負の成長制御因子（negative growth regulator）、例えば、ＴＧＦ−β又はＩＦＮ−β、アロマターゼ阻害剤、古典的な細胞分裂阻害剤である、リン酸化タンパク質を有するＳＨ２ドメインの相互作用の阻害剤、Ｂｃｌ−２の阻害剤及びＢｃｌ−２ファミリーメンバーの調節剤、例えば、Ｂａｘ、Ｂｉｄ、Ｂａｄ、Ｂｉｍ、Ｎｉｐ３、及びＢＨ３の最適なタンパク質である。
【００４２】
シロシンゴピンとミトコンドリア阻害剤（例えば、メトホルミン又はオリゴマイシン）の組み合わせ、及びシロシンゴピン及びミトコンドリア阻害剤を含む医薬組成物は、特に、放射線療法、免疫療法、外科的介入、又はこれらの組み合わせと併用した癌治療のために投与されてもよい。長期間の治療は、他の処置戦略におけるアジュバント療法、又は手術と併用したネオアジュバント療法であるので、同様に可能性がある。他の可能性のある処置は、腫瘍退縮後、又は例えば、リスクのある患者における化学的予防治療後の患者の立場を維持するための治療である。
【００４３】
本発明はさらに、癌及び免疫不全（例えば、自己免疫）の処置方法であって、シロシンゴピンとミトコンドリア阻害剤（例えば、メトホルミン又はオリゴマイシン）の組み合わせを、該疾患に対して有効な量で、かかる処置を必要とする温血動物に投与することを含む方法に関する。シロシンゴピンとミトコンドリア阻害剤（例えば、メトホルミン又はオリゴマイシン）の組み合わせは、それ自体、又は特に、医薬組成物の形態で、予防的又は治療的に、好ましくは、該疾患に対して有効な量で、かかる処置を必要とする温血動物（例えば、ヒト）に投与することができる。体重約７０ｋｇを有する個体の場合、投与される１日用量は、本発明の組み合わせ約０．０５ｇ〜約３ｇであり、好ましくは、約０．２５ｇ〜約１．５ｇである。
【００４４】
本発明は、癌の処置、特に、上述の癌の処置のための、シロシンゴピンとミトコンドリア阻害剤（例えば、メトホルミン又はオリゴマイシン）の組み合わせの使用、及びシロシンゴピン及びミトコンドリア阻害剤を含む医薬組成物の使用に関する。より具体的には、本発明は、癌腫、肉腫、白血病、骨髄腫、リンパ腫、及び神経系の癌の処置のための、シロシンゴピンとミトコンドリア阻害剤の組み合わせの使用、及びシロシンゴピン及びミトコンドリア阻害剤を含む医薬組成物の使用に関する。さらに、本発明は、自己免疫、移植医学、及び免疫抑制が望まれる他の場合、特に、上で説明された、Ｔ細胞増殖の阻止に感受性のある免疫疾患、全身性自己免疫疾患、及び局所性自己免疫疾患において免疫抑制を達成するための、シロシンゴピンとミトコンドリア阻害剤の組み合わせの使用、及びシロシンゴピン及びミトコンドリア阻害剤を含む医薬組成物の使用に関する。より具体的には、本発明は、自己免疫疾患、例えば、皮膚、神経系、結合組織、筋肉、神経系、造血系、骨及び内蔵器官の自己免疫疾患、特に、乾癬、多発性硬化症、及び貧血の処置のための、シロシンゴピンとミトコンドリア阻害剤（例えば、メトホルミン又はオリゴマイシン）の組み合わせの使用、及びシロシンゴピン及びミトコンドリア阻害剤を含む医薬組成物の使用に関する。
【００４５】
それぞれの場合で用いられるべき、シロシンゴピン及びミトコンドリア阻害剤（例えば、メトホルミン又はオリゴマイシン）の好ましい相対量、医薬組成物の用量及び種類は、癌又は自己免疫疾患の種類、疾患の重篤度及び進行度、及び処置されるべき患者の具体的な状態に依存し、それに応じて、処置に対して責任のある医師により決定されなければならない。
【００４６】
本発明はさらに、上で説明された、癌又は自己免疫疾患の処置用医薬組成物の製造のための、シロシンゴピンとミトコンドリア阻害剤（例えば、メトホルミン又はオリゴマイシン）の組み合わせの使用に関する。
【００４７】
特に、本発明は、癌又は自己免疫疾患の処置方法であって、シロシンゴピンとミトコンドリア阻害剤（例えば、メトホルミン又はオリゴマイシン）の組み合わせ、又はシロシンゴピン及びミトコンドリア阻害剤を含む医薬組成物を、該疾患に対して有効な量で、かかる処置を必要とする温血動物に投与することを含む方法を提供する。
【００４８】
シロシンゴピン、及びメトホルミン、又は他のビグアニドの組み合わせを使用する理由
組み合わせスクリーニング（細胞が、１０００種類の薬剤及び薬剤様化合物について、高糖尿病剤であるメトホルミンプラスで併用処置される）が行われた。メトホルミン及びシロシンゴピンは、インビトロ及びインビボにおいて、協同して、種々の癌細胞を殺傷することが見出された。この効果は、２種の薬剤を併用したときにのみ観察され、それぞれの個々の化合物について最小細胞毒性を有している。
【００４９】
マウス肥満細胞株６．５（Colombi et al., Oncogene 2011, 30:1551-65）を、予備スクリーニングのために用いた。６．５細胞は、発癌性形質転換の多くの特徴（例えば、成長因子（ＩＬ３）依存性及びシグナル伝達経路依存の喪失）を示す。それらは、阻害剤の研究により示されるとおり、ＰＩ３Ｋ−ｍＴＯＲ−Ａｋｔ経路、並びにＭＡＰキナーゼ経路に依存している。これらの細胞は、多くの臨床薬に対して優れた感受性を示す。市販の薬剤ライブラリー（Prestwick Chemical Library）を用いた薬剤併用スクリーニングを、マウス６．５細胞にて、メトホルミン（２mM）の存在下で行い、メトホルミン併用薬として作用して、これらの細胞を相乗的に殺傷し得る化合物を同定した。
【００５０】
同定された最良の当たりは、シロシンゴピンであった。図１Ａは、メトホルミン単独では、５mMで、成長の２０％阻害を引き起こし（左パネル）、一方、シロシンゴピン単独では、実質的に非阻害である（右パネル、直線）ことを示している。しかしながら、次第に増加した濃度のシロシンゴピンは、５mM  メトホルミンと併用したとき（右パネル、破線）、劇的な阻害が２．５μM  シロシンゴピンで観察された。同様の知見を、一連のヒト癌株、具体的には、骨髄腫株ＯＰＭ２（図１Ｂ）、骨髄腫株ＲＰＭＩ８２２６（図１Ｃ）、Ｔ細胞白血病株Ｊｕｒｋａｔ（図１Ｄ）、慢性骨髄性白血病株Ｋ５６２（図１Ｅ）で得た。特に、これらの細胞株において、単独で用いた各化合物が最低限度の効果を有した濃度範囲で、併用活性は強力な活性を示した。ヒト線維肉腫株ＨＴ１０８０（図１Ｆ）、並びに２種の正常ヒト線維芽細胞株（図１Ｇ、Ｈ）において、細胞を両方の薬剤で併用処置したとき、成長の阻害を観察しなかった。このことは、一般的な細胞毒性よりむしろ特異的な応答の確証であり、正常ヒト線維芽細胞に対する活性の欠如は、効果が腫瘍特異的であることを示していた。表１は、試験したこれらの株及び追加の株のデータを要約しており、一緒に、シロシンゴピン／メトホルミン効果が、多種多様な癌組織特異的な癌細胞に対して作用し、これにより、用いた細胞株を、前臨床癌研究において広く用い、器官特異的悪性度の許容かつ代表的なモデルを表していることを示す。
【００５１】
【表１】
0005940559.tif 000014
【００５２】
併用処置の経時的実験を、２種の感受性のあるヒト癌細胞株、ＯＰＭ２（多発性骨髄腫）及びＡ５４９（肺癌）にて行った。処置の９〜１０日後、成長を観察しなかった（図２）。観察した阻害が実際のアポトーシス細胞死に関与するかどうかを見るために、薬剤処理細胞を、アネキシンＶ（アポトーシスのマーカー）の膜表面発現について、細胞死を明らかにするヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色により分析した。併用薬剤処置を受けたＯＰＭ２及びＲＰＭＩ８２２６ヒト多発性骨髄腫細胞において、アポトーシス細胞数は、生細胞集団の対応する減少を伴って増加し、これにより、細胞殺傷のメカニズムとしてのアポトーシス導入が示された（図３）。化合物を単独で用いたとき、アポトーシス誘導を観察しなかった。
【００５３】
式（４）のシロシンゴピンは、抗高血圧剤である式（３）のレセルピンの人工誘導体であり、ラウオルフィア特異的化学骨格を共有している。他のラウオルフィア関連化合物、例えば、レセルピン、レセルピン酸（reserpinnic acid）、レシナミン（rescinnnamine）、ヨヒンビン酸、コリナンチンＨＣｌ、アジマリシン、ヨヒンビンＨＣｌ、及びラウオルシンＨＣｌは、癌試験細胞株において式（１）のメトホルミンとの有意な相互作用を示していない。シロシンゴピンに対する特異性を確かめるために、レセルピンを、６．５及びＯＰＭ２細胞において、様々な濃度について試験した。レセルピンのメトホルミンとの相互作用を観察せず（図４）、このことは、シロシンゴピンが、他のラウオルフィア誘導体に比べ、新規の方法で作用することを示唆している。
【００５４】
相互作用がインビボ状況においても持続するかどうかを試験するために、６．５細胞を免疫適合性ＤＢＡマウスに注射した。腫瘍が１００mm2の大きさに達したときに、処置を開始した。マウスに、シロシンゴピン（２mg/kg体重）、メトホルミン（２５０mg/kg体重）、又は両方を、毎日１５日間腹腔内注射し、腫瘍解剖及び測定のため屠殺した。図５Ａに示すように、二重処置は、腫瘍成長をうまく阻んだ。処置群間での体重における有意差はなく（図５Ｂ）、明確な毒性兆候も１つもなかった。
【００５５】
メトホルミンは、副作用（乳酸アシドーシス）に起因して、今日臨床上あまり用いられない抗糖尿病化合物であるフェンホルミン（式２）に類似のビグアニドである。シロシンゴピンと協同するかどうか、フェンホルミンを試験した。図６の左パネルに示すとおり、フェンホルミン処置単独では、１０μMまでの濃度で成長の阻害を導かない。しかしながら、この濃度のフェンホルミンは、次第に増加する濃度のシロシンゴピンと併用したとき（図６、右パネル）、強力な相乗効果を観察する。実際に、用量依存性相乗効果を、試験した全濃度のフェンホルミンで観察している。
【００５６】
抗原刺激による免疫応答の引き金は、Ｔ細胞の初期増殖に関与する。このＴ細胞刺激は、ポリクローナル刺激剤、例えば、レクチン、例えば、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）により模倣することができる。メトホルミンとシロシンゴピンの組み合わせは、ＰＨＡ刺激性Ｔ細胞増殖も阻害する。正常ヒト血液ドナーの抹消血から単離した白血球を試験し、メトホルミン、シロシンゴピン、又は両方と一緒にインキュベーションした３日後に、増殖を測定した。図７の右パネルに示すように、ＰＨＡ刺激性増殖は、シロシンゴピンをメトホルミン（４mM）と併用したとき（破線）、阻害に対して非常に敏感であるが、メトホルミンの不存下ではかなり少なかった（実線）。図７の左パネルは、ＰＨＡ不存下で３日間培養した抹消血白血球を示し、細胞はほとんど増殖しないが、生存していた。この生存は、４mM  メトホルミンの存在下では、次第に増加する濃度のシロシンゴピンの存在によっては影響されなかった（破線）。
【００５７】
シロシンゴピンとメトホルミン以外のミトコンドリア阻害剤の組み合わせを使用する理由  メトホルミンがＥＴＣの複合体Ｉをブロックするという事実は、ＥＴＣの他の阻害剤又は他のミトコンドリア毒性剤が、同様に、細胞殺傷においてシロシンゴピンと協同し得るかどうかの疑問を生じた。ミトコンドリアを標的にすることが周知の一連の薬剤を試験し、それ自体毒性がないか、又は最小の毒性しかない濃度の薬剤を用いた。用いた薬剤及び濃度を図８及び９に示す。次第に増加する量のシロシンゴピンと協同して試験したとき、ＥＴＣ複合体Ｉ阻害剤であるロテノン（図８Ａ）、ピエリシジンＡ（図８Ｂ）、エピベルベリン（図８Ｃ）との相乗的な殺傷を検出した。相乗的な殺傷を、同様に、複合体ＩＩ阻害剤ＴＴＦＡ（図８Ｄ）、及びマロン酸ナトリウム（図８Ｅ）、並びに複合体ＩＩＩ阻害剤アンチマイシンＡ（図８Ｆ）でも検出した。２種の複合体ＩＶ阻害剤、つまりＫＣＮ（図８Ｇ）及びアジ化ナトリウム（図８Ｈ）、並びに複合体Ｖ阻害剤オリゴマイシン（図８Ｉ）もまた、シロシンゴピンとの相乗的な細胞殺傷を誘導した。これらのデータは、シロシンゴピンが、ミトコンドリア阻害剤と一緒に適用したとき（ＥＴＣ阻害剤と一緒の場合）、細胞殺傷を誘導するということを確かにする。ＦＣＣＰは、ＡＴＰ合成由来のＥＴＣ鎖を脱共役する薬剤である。重要なことに、この薬剤は、シロシンゴピンとの相乗的な殺傷も誘導した（図８Ｊ）。ＥＴＣの幾つかの成分は、ミトコンドリアのゲノムによりコードされているので、ミトコンドリアのゲノムを損傷する薬剤は、同様にロシンゴピンと協同することが予測されるであろう。ミトコンドリアのゲノム複製に対して十分に記載の有害な副作用を有する逆転者酵素阻害剤である抗ＨＩＶ化合物スタブジンを試験した。図８Ｋに示されるように、スタブジンは、確かに、シロシンゴピンとの相乗的な殺傷を誘導した。注目すべきは、ＨＩＶ逆転写酵素阻害剤３ＴＣ（ラミブジンとしても知られ、かつ抗ミトコンドリア毒性を欠く）は、シロシンゴピンと協同しなかった。これらの実験の結果により、ＥＴＣ阻害剤は、一般に、非毒性濃度だがシロシンゴピンと組み合わせて用いたとき、シロシンゴピンと協同し、抗癌剤及び免疫抑制剤であるが、ＥＴＣ機能を間接的に危うくする抗ミトコンドリア剤でもあるという結論が導かれる。
【００５８】
実際上の理由から、塩であるマロン酸ナトリウム、シアン化カリウム、及びアジ化ナトリウムは、細胞試験においてシロシンゴピンと協同することが示されたが、抗癌剤及び地免疫抑制剤としてのシロシンゴピンの組み合わせパートナーとは考えられていない。しかしながら、シロシンゴピンの興味ある組み合わせパートナーは、例えば、オリゴマイシンであり、１nM未満の濃度でさえ、この化合物は、シロシンゴピンとの併用において（図１０）、シロシンゴピンの不存下での毒性効果（図９）なしで、ヒト癌株を殺傷する。
【００５９】
シロシンゴピン感受性を示すインビトロ試験
シロシンゴピンの癌治療への適用を見越して、癌細胞の感受性を予測するインビトロ試験を保有することが重要である。機能的標的は、ミトコンドリアであるとの良好な理由が存在する（メトホルミンと同様）ので、ミトコンドリア内膜の膜電位に対するシロシンゴピンの効果を試験した。ミトコンドリア呼吸は、内膜を介した膜間スペースへのミトコンドリア基質からの陽子の放出に関与するので、膜は、内側（ミトコンドリア基質中）より外側（すなわち、膜間スペース中）でより正に帯電している。より負に帯電している基質は、正に帯電した脂油性分子（例えば、ＴＭＲＭ（テトラメチルローダミンメチルエステル））を蓄積する。ＴＭＲＭは蛍光性であるので、電位差測定色素として機能し、それ自体がミトコンドリアの膜電位の容易な評価に役立つ。図１１（パネル３〜６）において、次第に増加する量のシロシンゴピンが、蛍光ＴＭＲＭシグナルの増加（右にシフトする）を生じることが示され、このことは、正の膜極性の増加を示している。蛍光ピークは、４０３（パネル１）から９５５（パネル９）へと任意の単位でシフトする。対照（パネル２）のため用いた脱共役剤であるＦＣＣＰの使用は、膜電位の予測された崩壊（４２任意単位まで低下した蛍光ピークの左へのシフトにより示される）を生じる。シロシンゴピンによるこの決定的な膜機能の混乱は、恐らく、既知の弱いミトコンドリア阻害剤であるメトホルミンとの相乗的な活性に寄与する一方で、シロシンゴピンのミトコンドリア効果の発見により、癌細胞のシロシンゴピン感受性について簡単な試験を実施することが可能になる。
【００６０】
これらの結果に基づき、本発明はさらに、癌細胞がシロシンゴピン処置に応答するかどうかを決定する方法であって、
（ａ）単一細胞懸濁液を調製し、適当な培地において癌細胞を培養し、
（ｂ）癌細胞をシロシンゴピンと一緒にインキュベーションし、
（ｃ）工程（ｂ）の癌細胞を、正に帯電した蛍光色素と一緒にインキュベーションし、
（ｄ）励起蛍光強度を測定し、次に、
（ｅ）工程（ｄ）の測定した蛍光強度を、正に帯電した蛍光色素単独とインキュベーションした癌細胞の測定し蛍光強度と比較する工程を含み、
ここで、シロシンゴピンと共に予めインキュベーションした癌細胞の蛍光強度の相対的増加は、シロシンゴピン処置応答性を示す、方法に関する。
【００６１】
実際的な目的のため、癌細胞は、シロシンゴピンとミトコンドリア阻害剤の組み合わせで処置されるべき可能性のある患者から単離された細胞である。かかる癌細胞の培養に適当な培地は、当該技術分野で周知であり、例えば、イスコブ変法ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）又はＲＰＭＩ１６４０培地を含む。試験に先立ち、生体外腫瘍材料由来の単一細胞懸濁液が調製されなければならない。さらに、適当な標準市販方法論が手元にあり、ここでは、物理的破壊及び酵素的切断工程が組み合わされている（例えば、MiltenyiBiotec（http://www.miltenyibiotec.com/downloads/6760/6764/30501/PDF1.pdf）による方法、又はInvitrogen（http://www.invitrogen.com/etc/medialib/en/filelibrary/pdf.Par.18492.File.dat/Dissociation_Cells_Y14477_Dissociation.pdf）による方法を参照）。試験のため、癌細胞を異なる濃度のシロシンゴピン（例えば、０．１μM及び１０μM）と、２〜８時間予めインキュベーションすることが望ましい。適当な正に帯電した蛍光色素は、ＴＭＲＭ（テトラメチルローダミンメチルエステル過塩素酸塩）である。考えられる他の正に帯電した蛍光色素は、ローダミンＴＭＲＥ（テトラメチルローダミンエチルエステル過塩素酸塩）、ローダミン１２３（ローダミンメチルエステル過塩素酸塩）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂ（テトラエチルローダミン塩酸塩）、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ  ＣＭＸＲｏｓ（登録商標）（ＣＡＳ指定１Ｈ，５Ｈ，１１Ｈ，１５Ｈ−キサンテノ［２，３，４−ｉｊ：５，６，７−ｉ’ｊ’］ジキノリジン−１８−イウム，９−［４−（クロロメチル）フェニル］−２，３，６，７，１２，１３，１６，１７−オクタヒドロ−，クロライド）、及びカルボシアニンＪＣ−１（５，５’，６，６’−テトラクロロ−１，１’，３，３’−テトラエチルベンゾイミダゾロカルボシアニンヨウ化物）、及びＤｉＯＣ６（３）（３，３’−ジヘキシルベンゾオキサゾロカルボシアニンヨウ化物）である。
【００６２】
好ましい蛍光色素であるＴＭＲＭ（テトラメチルローダミンメチルエステル）での染色は、好ましくは、例えば、供給源であるＳｅｒｏｔｅｃにより示される標準的方法に従い行われる。蛍光は、４８８nmでの励起後、５７５nmで、好ましくは、標準的な市販で利用可能なフローサイトメーターにおいて、測定される。
【００６３】
癌細胞が、シロシンゴピンに対する反応性を示すなら、対応する患者は、恐らく、シロシンゴピンとミトコンドリア阻害剤との組み合わせにより有効に処置されるであろう。癌細胞がＴＭＲＭを用いた対応する蛍光試験において、シロシンゴピンに対して反応しないなら、患者がシロシンゴピンとミトコンドリア阻害剤の組み合わせで有効に処置され得る機会はわずかである。
【００６４】
実施例
細胞培養
マウス肥満細胞株６．５（Colombi et al., Oncogene 2011, 30:1551-65）を、ＩＭＤＭ、１０％  ＦＣＳ、２mM  Ｌ−グルタミン、１００U/ml  ペニシリン、１００μg/ml  ストレプトマイシン、及び５０μＭ  ２−メルカプトエタノールにて培養し、外因性ＩＬ−３を、Ｘ６３マウスＩＬ３分泌細胞由来の１％条件培地として加えた。ヒト白血病細胞株Ｊｕｒｋａｔ、Ｋ５６２、ＯＰＭ１、ＯＰＭ２、ＲＰＭＩ８２２６を、１０％  ＦＣＳ、２mM  Ｌ−グルタミンを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地にて成長させた。組み換えヒトＩＬ−６（Biomol）を、ＯＰＭ２及びＲＰＭＩ８２２６用の培地に１０ng/mlで加えた。他のヒト癌株ＭＤＡ−４６８、ＭＤＡ−２３１、Ａ５４９、Ｈ１２９９、ＡＮ３ＣＡ、ＪＵＳＯ、ＨＴ１０８０、ＭＥ−５９、ＨＬ６０、ＫＧ１、ＭＯＬＴ４、ＨｅＬａ、ＰＣ３、ＤＵ１４５、ＬｎＣＡＰ、ＬＮ２２９、Ｕ８７、及びＮＡ−８を、１０％  ＦＣＳ、２mM  Ｌ−グルタミン、及び５０μＭ  ２−メルカプトエタノールを含有するイスコブ培地にて成長させた。全細胞を、３７℃、５％  ＣＯ２にて成長させた。
【００６５】
試薬
メトホルミン及びフェンホルミン（Sigma）を、ＰＢＳ中１Ｍのストックとして調製し、４℃で維持し、シロシンゴピン（Extrasynthese）及びレセルピン（Sigma）を、ＤＭＳＯ中５mMのストックとして調製し、−２０℃で保存した。ピエリジシンＡ、エピベルベリン、ＴＴＦＡ、アンチマイシンＡ、オリゴマイシン（Sigma）、及びＦＣＣＰのストックを、ＤＭＳＯ中にて調製し；マロン酸ナトリウム、ＫＣＮ、及びＮａＮ３を、無菌の蒸留水に溶解し、そしてロテノン及びスタブジンストック溶液を、無水エタノール中にて作成した。
【００６６】
マウス肥満細胞株６．５
細胞株６．５については、最近記載されている（Colombi et al., Oncogene 2011, 30:1551-65）。これらの細胞を、１５Ｖ４肥満細胞（Nair et al., Oncogene 1992, 7:1963-72）をＰｔｅｎ腫瘍抑制遺伝子の欠損を導く変異原ＩＣＲ１９１で処理することにより、作成した。この欠損は、細胞のＩＬ−３依存性を無効にし、同系マウスにおいて腫瘍を形成した成長自律細胞を生じた。
【００６７】
マウス肥満細胞株６．５の阻害研究
マウス肥満細胞株６．５細胞を、nM濃度のｍＴＯＲ−阻害剤ラパマイシン（Colombi et al., Oncogene 2011, 30:1551-65）、又はＭＥＫ阻害剤ＵＯ１２６への感受性に対して示されるように、ＰＩ３Ｋ−ｍＴＯＲ−Ａｋｔ経路、並びにＭＡＰキナーゼ経路に依存している。
【００６８】
細胞増殖アッセイ
細胞を、適当な密度（細胞の種類に依存して、１ウェル当たり５，０００〜１５，０００細胞，１ウェル当たり培地１５０μl）にて、平底９６ウェルプレートに播種し、化合物を所望の濃度で加えた。３日後、０．１用量のＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（Invitrogen）を加えることにより、増殖をアッセイし、５３５／５９５nmの励起／放出にて、色素発生の４〜６時間後に、蛍光を読み取った。読み取り値を、無処理対照細胞に対して正規化し、対照の成長の割合として成長を表した。
【００６９】
アポトーシスアッセイ
アポトーシスを、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ（Invitrogen）、及びヨウ化プロピジウム対比染色により決定し、細胞をＦＡＣＳにより分析し、生／早期アポトーシス／後期アポトーシス細胞亜集団を分けた。１００，０００細胞／培地５mlの密度で細胞を播種し、示した化合物を加えた。３日後に培養物５００μlを回収し、細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ分析の前に、ＰＩ／アネキシンＶで染色した。
【００７０】
マウス同系腫瘍モデル
４×１０５個の６．５細胞を、ＰＢＳ１５０μl中にて、免疫適合性ＤＢＡマウスの側腹部に注射した。腫瘍の進行をモニターし、腫瘍が１００mm2の大きさに達したとき、処置を開始した。マウスに、毎日、メトホルミン（２５０mg/kg体重）、シロシンゴピン（２mg/kg体重）、又は組み合わせを１５日間、腹腔内注射し、その後、腫瘍組織の測定のため屠殺した。
【００７１】
メトホルミンとシロシンゴピンの組み合わせは、マウス肥満細胞６．５を殺傷する
市販の薬剤ライブラリー（Prestwick Chemical Library）を用いて、マウス６．５細胞にて、メトホルミン（２mM）の存在下で、薬剤併用スクリーニングを行い、これらの細胞を相乗的に殺傷するメトホルミン併用薬剤として作用し得る化合物を同定した。
【００７２】
フィトヘマグルチニン刺激Ｔ細胞増殖に対するメトホルミン及びシロシンゴピンの効果
倫理指針に従い、地元の献血センターから、正常ヒトバフィーコート細胞を得た。血液８０mlを、イスコブ培地２００mlで希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ勾配上にオーバーレイした。勾配を、１４００×ｇにて５分間遠心分離し、白血球分画を赤血球から分離した。接着細胞を取り除くために、細胞をコート組織培養ディッシュに１時間プレートし、残りの懸濁細胞を遠心分離により回収し、血球計算器によりカウントした。１ウェル当たり５０，０００個の細胞を、９６ウェルディッシュに播種し、種々の処理計画に従い、化合物を最終用量１５０μlになるよう加えた。刺激のため、フィトヘマグルチニンを終濃度１０μg/mlで加えた。３日目に、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅアッセイにより、増殖を測定した。
【００７３】
ＴＭＲＭ蛍光アッセイによるミトコンドリア膜の膜電位の測定
マウス６．５細胞を、２０分間、電位差測定用蛍光色素ＴＭＲＭ（テトラメチルローダミンメチルエステル，AbD Serotec，１００nM）で処理し、４８８nmで励起後５７５nmでの放出にて、フローサイトメーター（CellLabQuanta, Beckman Coulter）を用いて、蛍光強度を測定した。この色素は、陽子の放出に起因して、内膜の電位が外側より正に帯電しているとき、ミトコンドリア基質に蓄積する。対照のため、細胞を、１時間、膜電位を消失させ、蛍光強度を無効にする脱共役剤ＦＣＣＰ（カルボニルシアニド−ｐ−トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン）で予め処理した。示したとおり、細胞を次第に増加する濃度のシロシンゴピンで１時間予めインキュベーションし、続いてＴＭＲＭ染色することにより、シロシンゴピンの効果を評価した。
【図１Ａ）】
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【図１Ｂ）】
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【図１Ｃ）】
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【図１Ｄ）】
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【図１Ｅ）】
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【図１Ｆ）】
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【図１Ｇ）】
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【図１Ｈ）】
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【図２】
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【図３Ａ）】
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【図３Ｂ）】
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【図４Ａ）】
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【図４Ｂ）】
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【図５Ａ）】
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【図５Ｂ）】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ）】
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【図８Ｂ）】
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【図８Ｃ）】
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【図８Ｄ）】
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【図８Ｅ）】
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【図８Ｆ）】
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【図８Ｇ）】
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【図８Ｈ）】
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【図８Ｉ）】
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【図８Ｊ）】
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【図８Ｋ）】
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【図９】
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【図１０Ａ）】
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【図１０Ｂ）】
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【図１０Ｃ）】
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【図１１】
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