(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物の木部の発達を促進させる方法であって、
当該植物において、配列番号１に記載のアミノ酸配列の第６７番目のアミノ酸をグルタミンからロイシンに置換したアミノ酸配列を有する、ＲａｂＧ３ｂタンパク質の突然変異体（ＲａｂＧ３ｂＣＡ）を過発現させることにより、木部の発達を促進させることを特徴とする、
前記方法。
【請求項２】
植物の木部の発達を促進させる方法であって、
当該植物において、配列番号３に記載の塩基配列を有する、ＲａｂＧ３ｂタンパク質の突然変異体（ＲａｂＧ３ｂＣＡ）をコードする遺伝子を過発現させることにより、木部の発達を促進させることを特徴とする、
前記方法。
【請求項３】
配列番号１に記載のアミノ酸配列の第６７番目のアミノ酸をグルタミンからロイシンに置換したアミノ酸配列を有する、ＲａｂＧ３ｂタンパク質の突然変異体（ＲａｂＧ３ｂＣＡ）を含む、植物の木部の発達促進剤。
【請求項４】
配列番号３に記載の塩基配列を有する、ＲａｂＧ３ｂタンパク質の突然変異体（ＲａｂＧ３ｂＣＡ）をコードする遺伝子、又は、当該遺伝子を含む発現ベクターを含む、植物の木部の発達促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲａｂＧ３ｂ蛋白質を過発現させることにより、植物バイオマスを増加させる方法及び当該遺伝子を含むベクター、並びにそのベクターを含む形質転換植物体及びその形質転換植物体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
農業、園芸、バイオマス転換及び他の産業（例えば、製紙産業、蛋白質または他の化合物に対する生産因子としての植物）において、特に改善された植物は、分子技術を用いて収得可能である。例えば、作物栽培学の優れた有用性は、全体またはその任意の器官またはその任意の数の器官として植物の大きさを調節することから生じることができる。
【０００３】
同様に、全体の植物の大きさ及び高さ、または植物の特定の部分、または成長速度、または苗木の生命力を制御することは、特定の産業においてより適切な植物の生産を可能とする。例えば、特定の農作物及び木の種における高さの減少は、より容易な収穫が可能なため有用である。代案的に、植物の増加した高さ及び厚さ、または器官の大きさ及び器官の数は、食品、飼料、燃料及び／または化学物質での処理に有用なより多くのバイオマスを提供することによって有効となり得る（エネルギー効率及び再生エネルギーに関する米国エネルギー部のウェブサイトを参照）。商業的に好ましい特性の別の例は、折花の茎の長さの増加、葉の大きさ及び形状の増加または変更及び種及び／または実の増進を含む。また、器官の大きさ、器官の数及びバイオマスにおける変化は、副生成物のような構成分子の重量における変化及び植物がこれらの化合物の製造への転換をもたらす。
【０００４】
農耕科学、農業、作物学、園芸、及び森林科学分野の専門家及び研究者は、現在、増加している世界人口に食糧を供給し再生可能な原料の供給を保障するために、効能ある増加した成長を有する植物を探して生産するために、絶え間ない努力を重ねている。前記科学分野において高いレベルの研究は、集団において、食物、飼料、化学及びエネルギーの維持可能な供給源を提供するのに、全世界のすべての地理的環境及び気候において重要なリーダーのレベルであることを明示する。
【０００５】
農作物性能の操作は、植物育種により、数世紀にわたって通常的に達成してきた。しかし、育種過程は、時間がかかり、労働集約的である。また、適切な育種プログラムは、各々の相対的な植物種に対して特異的に設計されなければならない。
【０００６】
一方、優れた過程は、より良い農作物を提供するための植物を製作するために、分子遺伝学的なアプローチを試すのに用いられてきた。植物において組み換え核酸分子の導入及び発現により、研究者等は、現在、独特の地理学及び／または気候環境にもかかわらず、より効率よく成長し、より多くの産物を生産するために合わせられた植物種を有する集団を提供するための準備が整っている。このような新たなアプローチは、１つの植物種に限らず、複合的な他の植物種に適用可能であるという追加の利点がある（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１３５：６１５）。
【０００７】
この過程にもかかわらず、現在、特定の環境条件に左右される特定の要求に合わせるための林業または農業の植物成長を改善させる一般的に適用可能な過程が高く要望されている。最後に、本発明は、植物が成長しなければならず、植物において組み換えＤＮＡ分子の発現により特定化される利益の追求及び特定の環境に左右される多様な農作物の利益を最大化するための植物の大きさ、器官の数、植物成長速度、植物構造及び／またはバイオマスを有用に操作することに関するものである。これらの分子は、植物自体に由来可能であり、単に高いか低いレベルで発現したり、分子が他の植物種に由来可能である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記の問題を解決し、上記の必要性によりなされたものであって、本発明の目的は、植物バイオマスの増加に関与するタンパク質を提供することである。
【０００９】
また、本発明の他の目的は、植物バイオマスの増加に関与する遺伝子を提供することである。
【００１０】
さらに、本発明のさらに他の目的は、前記遺伝子を用いた植物バイオマスの増加方法を提供することである。
【００１１】
また、本発明のさらに他の目的は、前記遺伝子を含む形質転換植物の生産方法を提供することである。
【００１２】
なお、本発明のさらなる目的は、前記形質転換植物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記の目的を達成するために、本発明は、小さいＧＴＰ結合タンパク質であるＲａｂＧ３ｂタンパク質またはそのタンパク質の突然変異体及びそのタンパク質またはその突然変異体をコード化する遺伝子を過発現させることにより、植物バイオマスを増加させる方法を提供する。
【００１４】
本願において、「バイオマス」は、対象の産物を含む有用な生物学的物質を言及し、この物質は、対象の産物を分離または濃縮する追加の過程で意図的に回収される。「バイオマス」は、実またはその部分または種、葉、または茎または根を含むことができ、ここで、これらは、産業的目的について特に関心のある植物の部分である。植物物質について言及したように、「バイオマス」は、対象の産物を含むか、または植物の任意の構造を含む。
【００１５】
本願において、「形質転換」は、これを実行可能な手段の例を下記に述べ、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を介した形質転換［双子葉植物の形質転換（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  ４８：４４３；Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８５：２４４４）、単子葉植物の形質転換（Ｙａｍａｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．３０：３２１−９；Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７：２３７；Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ３：３７１）］、及び生物学的（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）方法（Ｐ．Ｔｉｊｅｓｓｅｎ、「Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ」Ｉｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ及びＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｐ．Ｃ．ｖａｎｄ  ｄｅｒ  Ｖｌｉｅｔ、ｅｄ．，ｃ．１９９３  ｂｙ  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）、電気穿孔法、インプランタ（ｉｎ  ｐｌａｎｔａ）技術などを含む。外因性核酸を含む植物は、本願においては、第１の遺伝子導入植物については「Ｔ０」、第１の世代については「Ｔ１」として言及される。
【００１６】
本発明の一具体例において、使用されたＲａｂＧ３ｂタンパク質またはそのタンパク質をコード化する遺伝子配列は、シロイヌナズナ（ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）に由来するものであるが、関心の対象である異なる種からのＲａｂＧ３ｂ遺伝子または偽遺伝子も使用することができる。
【００１７】
本発明の一具体例において、前記ＲａｂＧ３ｂタンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有することが好ましいが、配列番号１に記載のアミノ酸配列のいずれか１つ以上のアミノ酸を、置換、欠失、付加などの方法により突然変異させ、本発明が目的とするバイオマスの増加効果を有するすべての突然変異体が本発明の範囲内に属し、その例は、配列番号１に記載のアミノ酸のうち６７番残基を、グルタミンからロイシンに置換した配列を有する突然変異体である。
【００１８】
本発明は、前記本発明のタンパク質またはその突然変異体をコード化する遺伝子は、配列番号２または配列番号３に記載の核酸配列と実質的な同一性を有することが好ましいが、これに限定されない。
【００１９】
本発明において、ポリヌクレオチド配列の「実質的な同一性」という用語は、ポリヌクレオチドが標準パラメータを用い、下記のプログラムを用いて、参照配列と比較して６０％以上の配列同一性、通常は７０％以上、より通常は８０％以上、及び最も好ましくは、９０％以上の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。当該分野の熟練者は、これらの値が、コドン縮重、アミノ酸類似性、読取フレームの位置づけなどを考慮し、２つのヌクレオチド配列により暗号化されたタンパク質の相応する同一性を測定するように、適切に調節できることを認識するはずである。
【００２０】
配列同一性パーセント及び配列類似性を測定するのに適したアルゴリズムの例は、文献（参照：Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０、１９９０）に記載されたブラスト（ＢＬＡＳＴ）アルゴリズムである。ブラスト分析を行うためのソフトウェアは、国立生物学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のウェブサイトより利用可能である。
【００２１】
本発明の一具体例において、前記遺伝子の発現は、プロモーターの調節下にあることが好ましい。
【００２２】
本発明に記載された方法を用いて植物バイオマスの増加に関連する遺伝子に作動的に連結させて発現させるのに適したプロモーターは、形質転換される植物の同一種からまたは異種からのものを使用することができる。また、プロモーターは、本発明の遺伝子に対して同一種に由来するか、または異種に由来することができる。また、本発明の方法に使用するためのプロモーターは、１つ以上の下記に記載されたのと共通する発現プロファイルを有するプロモーターの組み合わせを含むことができるキメラプロモーターを含むことができる。
【００２３】
植物ゲノムＤＮＡにおいてプロモーター領域を確認し特性化する方法は、当該分野の熟練者に周知であり、例えば、文献［参照：Ｊｏｒｄａｎｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １：８５５−８６６、１９８９；Ｂｕｓｔｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １：８３９−８５４、１９８９；Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．７：４０３５−４０４４、１９８８；Ｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ３：３０９−３１６、１９９１；及びＺｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１０：１０６９−１０７９、１９９６］に記載されている。
【００２４】
このプロモーター配列の例は、アミノ酸パーミアーゼ遺伝子に対するプロモーター（ＡＡＰ１）（例：シロイヌナズナからのＡＡＰ１プロモーター）（参照：Ｈｉｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１４：５３５−５４４、１９９８）、オレイン酸１２−ヒドロキシラーゼ：デサチュラーゼ遺伝子に対するプロモーター（例：レスクレラフェンドレリからＬＦＡＨ１２に指名されたプロモーター）（参照：Ｂｒｏｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１３：２０１−２１０、１９９８）、２Ｓ２アルブミン遺伝子に対するプロモーター（例：シロイヌナズナからの２Ｓ２プロモーター）（参照：Ｇｕｅｒｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  ｃｅｌｌ  ２：４６９−４７８、１９９０）、脂肪酸エロンガーゼ遺伝子プロモーター（ＦＡＥｌ）（例：シロイヌナズナからのＦＡＥ１プロモーター）（参照：Ｒｏｓｓａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４６：７１７−７１５、２００１）、及び葉状の子葉遺伝子プロモーター（ＬＥＣ２）（例：シロイヌナズナからのＬＥＣ２プロモーター）（参照：Ｋｒｏｊ  ｅｔ  ａｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３０：６０６５−６０７３、２００３）を含む。また、本発明の一実施例で使用されたＣａＭｖ（ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）３５Ｓプロモーターも含むことができる。
【００２５】
また、本発明は、植物バイオマス関連遺伝子の発現を促進可能な１つ以上の調節遺伝子に作動的に連結されたＲａｂＧ３ｂ遺伝子を暗号化する核酸配列を含む植物バイオマス増進用発現ベクターを提供する。
【００２６】
本発明において、「ベクター」または「発現ベクター」は、外因性ＤＮＡにこれを挿入可能な、通常二本鎖のＤＮＡ鎖をいう。ベクターまたはレプリコンは、例えば、プラスミドまたはウイルスに由来可能である。ベクターは、宿主細胞内でベクターの自己複製を促進させる「レプリコン」ポリヌクレオチド配列を含む。また、当該技術に関し、「レプリコン」という用語は、宿主染色体内にベクター配列の組み換えを標的化したり、あるいはその他の促進させるポリヌクレオチド配列を含む。
【００２７】
また、外因性ＤＮＡが初期に、例えば、ＤＮＡウイルスベクター内に挿入できるとしても、ウイルスベクターＤＮＡの宿主細胞内への形質転換は、ウイルスＤＮＡのウイルスＲＮＡベクター分子内への転換をもたらすことができる。外因性ＤＮＡは、異種ＤＮＡと定義され、これは、例えば、ベクター分子を複製し、選別可能または選別可能なマーカーまたは形質転換遺伝子を暗号化する、宿主細胞内で天然的に発見されないＤＮＡである異種ＤＮＡと定義される。ベクターは、外因性または異種ＤＮＡを適した宿主細胞内に伝達するために用いられる。宿主細胞内において、ベクターは、宿主染色体ＤＮＡとは独立してまたは一致しないように複製可能であり、いくつかのベクターコピー及びその挿入ＤＮＡを生成させることができる。
【００２８】
また、ベクターは、外因性または異種ＤＮＡの宿主染色体内への挿入を標的化することができる。また、ベクターは、挿入ＤＮＡのｍＲＮＡ分子への転写を許容したり、または挿入ＤＮＡの多数のコピーのＲＮＡへの複製を誘発する必須成分を含むことができる。一部の発現ベクターは、追加でタンパク質分子内にｍＲＮＡの解読を許容する挿入ＤＮＡに近接した配列成分を含有する。したがって、多くのｍＲＮＡ分子及び挿入ＤＮＡによって暗号化されたポリペプチドは迅速に合成可能である。
【００２９】
本発明の「形質転換遺伝子ベクター」という用語は、ＤＮＡの挿入断片、すなわち、宿主細胞内でｍＲＮＡ内に挿入されるか、またはＲＮＡとして複製される「形質転換遺伝子」をいう。
【００３０】
本発明において、「形質転換遺伝子」という用語は、ＲＮＡに転換される挿入ＤＮＡ断片のみを意味するのではなく、ＲＮＡの転写または複製に必要なベクターの部位を意味する。また、形質転換遺伝子は、タンパク質を生産可能な開放読取フレームを含有するポリヌクレオチド配列を必須的に含む必要がない。
【００３１】
本発明において、「形質転換された宿主細胞」、「形質転換された」及び「形質転換」という用語は、ＤＮＡの細胞内への導入をいう。細胞は「宿主細胞」と名づけられ、これは原核または真核細胞であり得る。代表的な原核宿主細胞は、各種大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の菌株を含む。代表的な真核宿主細胞は、植物細胞（例：キャノーラ、綿花、カメリナ、アルファルファ、大豆、稲、燕麦、小麦、大麦、またはトウモロコシ細胞など）、酵母細胞、昆虫細胞または動物細胞である。導入されたＤＮＡは、一般的に、ＤＮＡが挿入された断片を含有するベクターの形態である。導入されたＤＮＡ配列は、宿主細胞と同一種、または宿主細胞とは異なる種に由来するか、または、これは宿主種由来の一部のＤＮＡ及び一部の外因性ＤＮＡを含有するハイブリッドＤＮＡ配列であり得る。
【００３２】
本発明において、「植物」という用語は、全体の植物、植物器官（例：葉、茎、花、根など）、種及び植物細胞（組織培養細胞を含む）及びこれらの子孫を含む。本発明の方法に使用可能な植物の群は、一般的に、単子葉植物及び双子葉植物の両方を含む形質転換技術に適用可能な高等植物の群、及び藻類のような特定の下等植物などと広範囲である。これは、倍数体、二倍体及び半数体を含む各種の倍数性レベルの植物を含む。
【００３３】
本発明のＲａｂＧ３ｂを過発現させる形質転換植物は、例えば、植物内にＲａｂＧ３ｂ遺伝子に作動的に連結されたプロモーターを暗号化する遺伝子転移ベクター（例：プラスミド、ウイルスなど）を形質感染させることによって収得可能である。
【００３４】
通常、ベクターがプラスミドの場合、当該ベクターは、選別性マーカー遺伝子、例えば、カナマイシンへの耐性を暗号化するカナマイシン遺伝子を含む。植物形質転換の最も一般的な方法は、標的形質転換遺伝子を植物形質転換ベクター内にクローン化させた後、文献［参照：Ｈｏｅｃｋｅｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｎａｔｕｒｅ  ３０３：１７９−１８１、１９８３）］に記載されたように、ヘルパーＴｉプラスミドを含有するアグロバクテリウムツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｉｆａｃｉｅｎｓ）内に形質転換させる。追加の方法は、例えば、文献（参照：Ｍａｌｏｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ８：２３８、１９８９）に記載されている。形質転換遺伝子ベクターを含有するアグロバクテリウム細胞は、文献（参照：Ａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．８１：３０１−３０５、１９８６；Ｈｏｏｙｋａａｓ、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３：３２７−３３６、１９８９）に記載されたように形質転換される植物の葉断片と共に培養することができる。培養された植物宿主細胞の形質転換は、通常、前述したように、アグロバクテリウムツメファシエンスにより達成することができる。堅い細胞膜障壁を有さない宿主細胞の培養物は、一般的に、元々、文献（参照：Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：５４６、１９７８）に記載されており、文献（参照：Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄ．，１９８９  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ））に記載されたように変形されたリン酸カルシウム方法を用いて形質転換させる。しかし、ポリブレン（参照：Ｋａｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１１７２、１９８４）、原形質融合（参照：Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：２１６３、１９８０）、電気穿孔（参照：Ｎｅｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１：８４１、１９８２）、及び核内への直接的な微細注射（参照：Ｃａｐｅｃｃｈｉ、Ｃｅｌｌ  ２２：４７９、１９８０）のように、ＤＮＡを細胞内に導入するための他の方法も用いることができる。形質転換された植物細胞は、細胞を、例えば、カナマイシンと、適切な量の、カルス（ｃａｌｌｕｓ）及び若枝部（ｓｈｏｏｔ）を誘導するためのナフタレン酢酸及びベンジルアデニンのような光ホルモンを含有する培地上で成長させ、選別可能なマーカーにより選別することができる。その後、植物細胞を再生させて収得される植物は、当該分野の熟練者に公知の技術を用いて土壌に移すことができる。
【００３５】
前述した方法のほか、クローン化ＤＮＡを裸子植物、胞子植物、単子葉及び双子葉植物を含む広範囲な植物種内に移すための複数の方法が当該分野に広く公知されている［参照：Ｇｌｉｃｋ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、ｅｄｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａ、１９９３；Ｖａｓｉｌ、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、２５：９２５−９３７、１９９４；ａｎｄ  Ｋｏｍａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．１：１６１−１６５、１９９８（一般的な検討）；Ｌｏｏｐｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：１−９、１９９０；及びＢｒａｓｉｌｅｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７：４４１−４５２、１９９０（木の形質転換）；Ｅｉｍｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９：４８５−４９０、１９９２（ブラシカ（ｂｒａｓｓｉｃａ）の形質転換）；Ｈｉｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．６：２７１−２８２、１９９４；Ｈｉｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．３５：２０５−２１８、１９９７；Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２：４９１−５０６、１９９３；米国特許第５，５１６，６６８号及び第５，８２４，８５７号（稲の形質転換）；及び米国特許第５，９５５，３６２号（小麦の形質転換）；第５，９６９，２１３号（単子葉植物の形質転換）；第５，７８０，７９８号（トウモロコシの形質転換）；第５，９５９，１７９号及び第５，９１４，４５１号（大豆の形質転換）］。
【００３６】
代表例は、原形質体による電気穿孔促進されたＤＮＡ吸収（参照：Ｒｈｏｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：２０４−２０７、１９８８；Ｂａｔｅｓ、Ｍｅｔｈ．ＭｏＬ  Ｂｉｏｌ．１１１：３５９−３６６、１９９９；ＤΗａｌｌｕｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．ＭｏＬ  Ｂｉｏｌ．１１１：３６７−３７３、１９９９；米国特許第５，９１４，４５１号）；ポリエチレングリコールを使用した原形質体の処理（参照：Ｌｙｚｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３：１５１−１６１、１９８９；Ｄａｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１１１：３３５−３３４、１９９９）；及びＤＮＡを含む微細発射を用いた細胞の衝撃（ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）（参照：Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９１：４４０−４４４、１９８９；Ｂｏｙｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１５３４−１５３８、１９８８；Ｒｅｇｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  ＭｏＬ  Ｂｉｏｌ．２５：９５１−９６１、１９９４；Ｂａｒｃｅｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．５：５８３−５９２、１９９４；Ｖａｓｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１１：３４９−３５８、１９９９；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ、Ｐｌａｎｔ  ＭｏＬ  Ｂｉｏｌ．３５：１９７−２０３、１９９７；Ｆｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４０：５９−８０、１９９９）を含む。追加的に、植物形質転換ステップ及び技術は、文献（参照：Ｂｉｒｃｈ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ．Ｐｌａｎｔ  ＭｏＬ  Ｂｉｏｌ．４８：２９７、１９９７；Ｆｏｒｅｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ａｇｒｉｃ．３３：１５−３３、１９９７）で探すことができる。若干の変異は、当該技術が広範囲な植物種に適用可能である。
【００３７】
単子葉植物形質転換の場合、粒子衝撃は、通常、選別方法である。しかし、トウモロコシのような単子葉植物は、米国特許第５，５９１，６１６号に記載されたようなアグロバクテリウム形質転換方法を用いて形質転換させることができる。
【００３８】
単子葉植物、例えば、トウモロコシ形質転換を行うための他の方法は、胚形成懸濁液培養物からの細胞を繊維懸濁液［５％ｗ／ｖ、シラーＳＣ−９ウィスカー（Ｓｉｌａｒ  ＳＣ−９  ｗｈｉｓｋｅｒｓ）］及びプラスミドＤＮＡ（１μｇ／μｌ）を混合した後、これをボルテックスジェニーＩＩ（Ｖｏｒｔｅｘ  ＧＥＮＩＥ  ＩＩ）ボールテックスミキサ［米国、ニューヨーク・ボヘミア所在のＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製造］上の多数のサンプルヘッド内に直接置いたり、またはＭＩＸＯＭＡＴ歯のアマルガムミキサ［ｄｅｎｔａｌ  ａｍａｌｇａｍ  ｍｉｘｅｒ；カナダ・オンタリオ・バーリントン所在ののＤｅｇｕｓｓａ  Ｃａｎａｄａ社製造］のホルダ内に水平に置くのである。その後、形質転換は約６０秒（例えば、ボルテックスジェニーＩＩを用いる）の最高速度で混合したり、または１秒（ＭＩＸＯＭＡＴ）間固定速度で振とうさせて行うことができる。当該過程により安定した形質転換体が選別可能な細胞集団が生産される。植物は安定的に形質転換されたカルスから再生され、これらの植物及びこれらの子孫は、サザンハイブリッド化分析により形質転換されたことが明らかになった。
【００３９】
植物細胞、特に、トウモロコシの形質転換のための毛の使用は、例えば、米国特許第５，４６４，７６５号に記載されている。米国特許第５，９６８，８３０号は、大豆を形質転換させて再生させる方法を記載している。米国特許第５，９６９，２１５号は、サトウダイコンのような形質転換されたベターバルガリス（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）植物を生産するための形質転換技術を記載している。
【００４０】
各々の前記形質転換技術は利点・欠点を有する。各々の技術において、プラスミドからのＤＮＡを遺伝子操作することにより、これが目的の遺伝子だけでなく、選別可能でふるい分け可能なマーカー遺伝子も含有するようにする。ふるい分け可能なマーカー遺伝子を用いてプラスミドの統合されたコピー（当該作製物は、目的の遺伝子及び選別可能な遺伝子が単位として形質転換されるようにする）を有する細胞のみを選別するのに用いられる。選別可能な遺伝子は、目的の遺伝子を有する細胞のみを成功的に培養するための他の点検を提供する。
【００４１】
抗生剤耐性の選別可能なマーカーを用いた伝統的なアグロバクテリウム形質転換は、このような植物が動物及び人に対して抗生剤耐性を拡散させる過度の危険性を含むために問題となり得る。このような抗生剤マーカーは、植物を米国特許第５，７３１，１７９号に記載されたのと類似のアグロバクテリウム技術を用いた形質転換植物により、植物から除去可能である。抗生剤耐性問題は、米国特許第５，７１２，１３５号に記載されたようなバーまたはパット（ｐａｔ）の暗号化配列を用いて効果的に避けることができる。このような好ましいマーカーＤＮＡは、グルタミンシンテターゼ抑制剤、除草剤、ホスフィノスリシン（グルホシネート）及びグルホシネートアンモニウム塩（Ｂａｓｔａ、Ｉｇｎｉｔｅ）の作用を抑制させたり中和させる第２タンパク質またはポリペプチドを暗号化する。
【００４２】
１つ以上の前記遺伝子を含有するプラスミドは、前述した技術のいずれか１つにより植物原形質体またはカルス内に導入させる。マーカー遺伝子が選別可能な遺伝子の場合、ＤＮＡパッケージが混入された細胞のみが適切な植物毒素剤を使用した選別下に生存する。適切な細胞が確認されて増殖されると、植物が再生される。形質転換された植物からの子孫をテストすることにより、ＤＮＡパッケージが植物ゲノム内に成功的に統合されたことを確認しなければならない。
【００４３】
形質転換の成功に影響を及ぼす複数の因子が存在する。外因性遺伝子作製物の設計及び作製、及びこれの調節成分は、外因性配列の植物核の染色体ＤＮＡ内への統合及び細胞により発現する形質転換遺伝子の能力に影響を及ぼす。外因性遺伝子作製物を植物細胞核内に非致命的な方法で導入させるのに適した方法は必須的である。重要な点は、全体の植物が回収される場合に作製物が導入される細胞の類型が再生に対して補正可能な類型であるため、適切な再生プロトコールを提供しなければならないという点である。
【００４４】
また、原核細胞は、本発明の初期のクローン化段階のための宿主細胞として使用可能である。方法、ベクター、プラスミド及び宿主細胞システムは、このような初期のクローン化及び拡張段階に使用可能な当該分野における熟練者に周知であり、本願では記載しないものとする。
【００４５】
本発明の他の具体例において、プロモーターは、当該分野の熟練者に公知の方法を用いて形質転換される植物でＲａｂＧ３ｂのような植物バイオマス増加関連遺伝子を暗号化する遺伝子に作動的に連結させることができる。プロモーターの挿入は、遺伝子形質転換植物の発達する種において遺伝子の発現を許容するはずである。
【００４６】
本発明の方法において、形質転換植物は、単子葉及び双子葉植物を含むが、これらに限定されない。これらのうち、関心の対象である植物は、キャノラ、トウモロコシ、綿花、小麦、稲、大豆、大麦及びその他の種生産植物、及びアルファルファなどを含むが、これらに限定されない、その他の植物を含み、農業的、工業的、その他の産業的に関心の対象であるもののすべてを含む。
【００４７】
本明細書において、「異種配列」は、異なる種に由来するか、または同一種に由来する場合、元々の形態から実質的に変形されたオリゴヌクレオチド配列である。例えば、構造遺伝子に作動的に連結された異種プロモーターは、構造遺伝子とは異なる種に由来するか、または同一種の場合、元々の形態から実質的に変形されたものに由来する。
【００４８】
本明細書において、「プライマー」は、核酸混成化により相補的標的ＤＮＡ鎖にアニールされ、プライマーと標的ＤＮＡ鎖の間に混成体（ｈｙｂｒｉｄ）を形成し、次に、重合酵素、例えば、ＤＮＡ重合酵素により標的ＤＡＮ鎖に沿って延長される、分離された核酸である。本発明のプライマー対は、例えば、重合体連鎖反応（ＰＣＲ）または他の従来の核酸増幅方法による標的核酸配列を増幅するための前記使用を示す。
【００４９】
プローブとプライマーを製造して使用する方法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ  ｅｄ．，ｖｏｌ．１−３、ｅｄ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９（以下、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９」）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｅｄ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９２（周期的に改訂される）（以下、「Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２」）；及びＩｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、１９９０に説明されている。ＰＣＲ−プライマー対は、例えば、この目的のために開発されたＰｒｉｍｅｒ（Ｖｅｒｓｉｏｎ０．５、(C)１９９１、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）のようなコンピュータプログラムを用いて、公知の配列から導き出すことができる。
【００５０】
核酸の増幅は、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）を含む当業界で公知の多様な核酸増幅方法のいかなるものも利用可能である。多様な増幅方法が当業者に公知されており、特に、米国特許第４，６８３，１９５号と第４，６８３，２０２号及びＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ｅｄ．Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、１９９０に説明されている。ＰＣＲ増幅方法は、最大２２ｋｂのゲノムＤＮＡ及び最大４２ｋｂのバクテリオファージＤＮＡを増幅する程度に発展している（Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：５６９５−５６９９、１９９４）。
【００５１】
以下、本発明を説明する。
【００５２】
木部の導管（ｔｒａｃｈｅａｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ、以下「ＴＥ」という）は、植物維管束系の水を運ぶ木部として作用する。これを行うために、ＴＥは、２次的な細胞壁の肥厚（ｔｈｉｃｋｅｎｉｎｇ）及び細胞死を進行する。ＴＥの細胞死は、自食による典型的な発生学的にプログラム化された細胞死である。しかし、ＴＥ分化において、自食に関する証拠は知られていない。本発明は、小さいＧＴＰ結合タンパク質であるＲａｂＧ３ｂが自食作用によりＴＥ分化に関与することを明らかにした。野生型ＴＥ細胞の分化は、アラビドプシス培養システムで自食を経験することを発見した。自食とＴＥ分化の両方は、持続的に活性化突然変異体（ＲａｂＧ３ｂＣＡ）の過発現により顕著に促進され、優性ネガティブ突然変異体（ＲａｂＧ３ｂＤＮ）またはＲａｂＧ３ｂ  ＲＮＡｉ、ブラシノステロイド（ｂｒａｓｓｉｎｏｓｔｅｒｏｉｄ）インセンティブ突然変異体ｂｒｉ１−３０１、及び自食突然変異体ａｔｇ５−１を過発現する形質転換植物体で阻害された。この結果により、本発明は、ＴＥ分化中に自食が起き、自食の構成要素としてＲａｂＧ３ｂはＴＥ分化を調節することを示唆する。
【００５３】
木部の発達、特に、導管細胞の分化の最後の段階に起きる細胞死は、木部の完成に非常に重要な過程であり、この過程により、細胞質のすべての内容物が分解され、中空の木部を形成できるからである。本発明で確認したのは、自食がこの発達過程の細胞死を促進させるということである。結局、自食に関与するＲａｂＧ３ｂの活性化された形態であるＲａｂＧ３ｂＣＡを過発現したとき、木部発達過程中に自食が増幅され、これによって細胞死が促進され、窮極的に植物茎の木部の発達が促進されるということである。
【００５４】
本発明の重要性は、次のとおりである。
【００５５】
木部は、木の木材層を構成する組織である。したがって、本発明の過発現したＲａｂＧ３ｂＣＡを木に過発現させ、シロイヌナズナで観察された同じ形質（すなわち、木部の増大）を形成できる場合、これは、産業的に応用可能な非常に重要な形質になる。なぜなら、これは、木のバイオマスの増加を意味するからである。現在、ポプラやユーカリの木などが代表的な木材原料となっている。木材は、パルプ、ペーパーの主な原料であり、さらに、現在最も大きな懸案になっているバイオエタノール（次世代の代替エネルギー）の生産における重要な原料として注目されている。
【００５６】
以下、本発明を詳細に説明する。
木部の分化に対するＲａｂＧ３ｂの作用
小さいＧＴＰ結合タンパク質であるＲａｂＧ３ｂは、プロテオーム分析によりサリチル酸反応タンパク質として同定された（Ｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。マイクロアレイ分析は、ＲａｂＧ３ｂがブラシノライド（ＢＬ）／Ｈ３ＢＯ３処理に反応して高く発現した（図１２）。
【００５７】
本発明では、（１）ＲａｂＧ３ｂがＴＥ分化に関与するか否か、（２）ＲａｂＧ３ｂが自食に関与するか否か、及び（３）自食がＴＥ分化に関与するか否かを調査した。
【００５８】
ＲａｂＧ３ｂノックダウン植物体（ＲａｂＧ３ｂＲＮＡｉ）を生成し、それは単にＲａｂＧ３ｂの発現がテストされたＲａｂＧ３系要素の中で減少し、ＲａｂＧ３ｂタンパク質がウェスタンブロット分析から分かるように検出されなかった（図１３）。それぞれ持続的に活性を有する（ＣＡ）及び優性ネガティブ（ＤＮ）ＲａｂＧ３ｂＣＡ及びＲａｂＧ３ｂＤＮの２つの異なるＲａｂＧ３ｂ形質転換植物体を機能分析に用いた。また、維管束の欠失を示すＢＲインセンシティブ突然変異体ｂｒｉ１−３０１（Ｃａｎｏ−Ｄｅｌｇａｄｏ、Ａ．，等（２００４）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１３１、５３４１−５３５１）、及び自食突然変異体ａｔｇ５−１（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ａ．Ｒ．，等（２００５）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１３８、２０９７−２１１０）を使用した。
【００５９】
植物の成長表現型を長周期条件（１６／８ｈ明／暗周期）下で調査した（図１）。顕著な表現型として、ＲａｂＧ３ｂＣＡ植物は、すべての他のテストした植物体に比べて茎でより大きく成長し、ＷＴ植物体と比較して茎の肥厚が１４％増加した（図１（ｂ）、（ｃ））。これに対し、ａｔｇ５−１植物体は、ＷＴより大きさがより短く、ｂｒｉ１−３０１植物体は、大きさが大きく減少したことを示した。抽薹（ｂｏｌｔｉｎｇ）において、ロゼット葉の数と抽薹時間を決定した。ＲａｂＧ３ｂＣＡ植物体は、他のものに比べて少し早く抽薹されたが（図１４）、葉の数における顕著な差はテストした植物体の中では観察されなかった（図１５）。この結果は、ＲａｂＧ３ｂＣＡ植物体で観察された増加した茎の長さが開花時間の調節の変更というよりは、より早い茎の成長に起因することを示す。
【００６０】
次に、維管束発達の変化と成長表現型間の可能な関連性を、３つの異なる位置からの花序（ｉｎｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）の茎の断面の組織分析により調査した（図２及び図３）。すべての植物の全体の維管束の表現型は正常であるのに対し、ＷＴと比較して、木部細胞の数は、ＲａｂＧ３ｂＣＡ花序の中間及び基底部で顕著に増加した（図２）。また、後生木部（ｍｅｔａｘｙｌｅｍ）及び原生木部（ｐｒｏｔｏｘｙｌｅｍ）の２つの異なるタイプに分けられる木部細胞の数量化は、後生木部細胞がＷＴと比較してＲａｂＧ３ｂＣＡ植物体の維管束で大きく増加したことを示した（図３、図４及び図１６）。
【００６１】
これとは対照的に、ＲａｂＧ３ｂＤＮ、ＲａｂＧ３ｂＲＮＡｉ、及びａｔｇ５−１植物体は、花序の茎の基底部で原生木部及び後生木部とも数が大きく減少した。この結果は、増加した茎の成長は、ＲａｂＧ３ｂＣＡ植物体で増加した木部の分化と関連があることを示す。また、ａｔｇ５−１植物体において、木部細胞の減少は、ＡＴＧ５及びＡＴＧ５リンクされた自食が木部の分化に関連し得ることを示唆する。
【００６２】
木部分化の指標である２次的な細胞壁の形成は、フロログルシノール−ＨＣｌによるリグニン染色（図１７（ａ）−（ｆ））及びリグニンの自己蛍光（図１７（ｇ）−（ｌ））により、花序の茎の断面で調査された。
【００６３】
リグニン化された細胞壁は、ＷＴと比較して、ＲａｂＧ３ｂＣＡ植物体で膨張したが、ＲａｂＧ３ｂＤＮ、ＲａｂＧ３ｂＲＮＡｉ、ｂｒｉ１−３０１、及びａｔｇ５−１植物体ではやや減少した。
【００６４】
花序の茎において、ＲａｂＧ３ｂの位置づけは、抗ＲａｂＧ３ｂ抗体を使用した免疫金電子顕微鏡法によって調査した（図１８）。ＲａｂＧ３ｂタンパク質は、主に、木部に位置している。皮層細胞において、金粒子が、原形質、液胞及び細胞壁を含む複数の位置で発見されたが（図１８（ｅ）−（ｈ））、それらの原形質の内容物を欠失した木部ＴＥ細胞では、ＲａｂＧ３ｂ免疫反応性が２次的細胞壁でのみ現れた（図１８（ｍ）−（ｐ））。
木部分化中におけるＲａｂＧ３ｂＣＡ培養細胞でのＴＥ形成の増加
木部の分化において、ＲａｂＧ３ｂの機能を定義するために、アラビドプシスｓ懸濁細胞の培養に対するインビトロ木部ＴＥ誘導システムを開発した。ＴＥ分化がＢＬ及びＨ３ＢＯ３処理によって誘導されたとき、ＲａｂＧ３ｂＣＡ細胞がＴＥ誘導４日後、液胞の崩壊及び細胞内容物のロスを主に経験する（図１９）。その後、ＷＴと比較して、ＲａｂＧ３ｂＣＡ細胞はＴＥでより顕著に発生した（図５）。対照的に、ＷＴに比べて、ＲａｂＧ３ｂＤＮ、ＲａｂＧ３ｂＲＮＡｉ、ａｔｇ５−１、及びｂｒｉ１−３０１のＴＥ誘導された培養で分化した細胞はほとんどなかった。強いリグニン染色は、ＲａｂＧ３ｂＣＡ細胞で追加的に観察された（図２０）。この結果は、ＲａｂＧ３ｂがＴＥ分化でポジティブの役割を果たし、ＡＴＧ５を介した自食もＴＥ分化にポジティプな影響を与えることを示唆する。
ＴＥ分化中における自食の活性化
ＲａｂＧ３ｂが自食でその機能によりＴＥ分化を調節するのかを決定するために、ＴＥ形成中に、自食の過程を酸性指向性染料ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ（ＬＴＧ）で自食胞／分解小体を染色して調査した（Ｖｉａ、Ｌ．Ｅ．，等（１９９８）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１１１、８９７−９０５）（図６）。ＴＥ誘導前、薄っすらと一部染色されたスポットを示すＲａｂＧ３ｂＣＡ細胞を除けば、テストされた植物の中でＬＴＧ染色された構造は検出されなかった（図６（ａ）−（ｅ））。ＢＬ及びＨ３ＢＯ３処理は、ＷＴ細胞でＬＴＧ染色された自食胞／分解小体様構造の形成を誘導し、これは、ＲａｂＧ３ｂＣＡ細胞で顕著に増加した（図６（ｋ）−（ｌ））。同一の誘導条件下において、ＬＴＧ染色された構造は、ＲａｂＧ３ｂＤＮ、ＲａｂＧ３ｂＲＮＡｉ、またはａｔｇ５−１細胞で形成されなかった（図６（ｃ）−（ｅ）、（ｈ）−（ｊ）、（ｍ）−（ｏ））。これらの結果により、自食はＴＥ分化中に発生し、これは、ＲａｂＧ３ｂのＧＴＰ結合形成により活性化可能であることが分かる。
ＴＥ分化中における数多くの自食構造を蓄積するＲａｂＧ３ｂＣＡ細胞
透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）分析は、ＴＥ分化中に細胞で微細構造的な変化を調査し、ＬＴＧ染色結果を確認するために行った（図７）。非誘導細胞は、テストされた植物の間で形態学的な差がほとんどなかった（図７（ａ）−（ｅ））。ＴＥ誘導に対して、ＢＬ／Ｈ３ＢＯ３処理４日後、ＷＴ細胞で細胞内容物の分解及び液胞の破壊が観察された（図７（ｆ））。この時期の間、ＷＴ細胞は、分解される細胞構成要素を含む自食胞／分解小体様構造を示す（図７（ｆ）、（ｐ））。ＲａｂＧ３ｂＣＡ細胞は、多数の自食胞／分解小体様構造を蓄積し、細胞器官及び細胞内容物のロスが速かに進行した（図７（ｇ）、（ｑ））。ＴＥ誘導７日後、ＲａｂＧ３ｂＣＡ細胞は、成熟したＴＥ細胞で完全に分解され、これは、空の原形質及び２次細胞壁の蓄積により証明され（図７（ｌ））、ＷＴ細胞は、ＴＥ分化の最後の段階に向かって引き続き進行していた（図７（ｋ））。対照的に、自食胞／分解小体様構造及びＴＥ関連の形態学的な変化は、誘導期間中、ＲａｂＧ３ｂＤＮ、ＲａｂＧ３ｂＲＮＡｉ、またはａｔｇ５−１細胞では観察されなかった（図７（ｈ）−（ｊ）、（ｍ）−（ｏ））。
【００６５】
ＴＥ分化過程中に、ＷＴ及びＲａｂＧ３ｂＣＡ細胞で自食構造の形成をさらに調査した（図８（ａ）−（ｈ））。ＷＴ細胞は、前自食胞（ｐｒｅａｕｔｏｐｈａｇｏｓｏｍａｌ）構造または細胞膜（ｐｈａｇｏｐｈｏｒｅｓ）を示し（図８（ｂ））、自食胞／分解小体様構造を伴った（図８（ｃ）、（ｄ））。類似の自食構造がＲａｂＧ３ｂＣＡ細胞で観察されたが、ＷＴ細胞より早期に形成されてより豊富であった（図８（ｅ）−（ｈ））。原形質物質及び細胞小器官（例えば、ミトコンドリア）を含む多くの細胞膜がＢＬ／Ｈ３ＢＯ３処理１日後に現れ（図８（ｅ））、自食胞の蓄積は、２日後に処理されたＲａｂＧ３ｂＣＡ細胞で観察され、ＷＴ細胞では引き続き前自食胞構造が膨張していた。本発明者等は、追加的にＲａｂＧ３ｂＣＡ細胞で自食活性化が一般的な自食条件である栄養欠乏に対しても現れるのかをテストした（図８（ｉ）−（ｐ））。同様に、ＷＴ及びＲａｂＧ３ｂＣＡ細胞とも、砂糖欠乏に反応して自食形態を示し、ＷＴに比べてＲａｂＧ３ｂＣＡ細胞で自食構造が時間的により早くそしてより豊富であった。この結果は、ＲａｂＧ３ｂが自食でポジティブ調節者であり、ＲａｂＧ３ｂ活性化された自食は、細胞死の過程を促進してＴＥ分化に寄与することを示唆する。
自食構造に位置するＲａｂＧ３ｂ
自食胞／分解小体構造に対するＲａｂＧ３ｂタンパク質の位置づけは、ＴＥ誘導されたＷＴ及びＲａｂＧ３ｂＣＡ細胞において、自食胞マーカータンパク質ＡＴＧ８ｅ及びＲａｂＧ３ｂに対する抗血清を使用した免疫金ＥＭによって分析した。ＷＴ及びＲａｂＧ３ｂＣＡ細胞とも、ＲａｂＧ３ｂタンパク質は、自食構造においてＡＴＧ８ｅタンパク質と同時に位置づけられた（図９（ａ）−（ｄ））。また、ＡＴＧ８ｅタンパク質のレベルは、ＷＴと比較してＲａｂＧ３ｂＣＡ細胞で増加し、ＢＬ／Ｈ３ＢＯ３処理されたＲａｂＧ３ｂＣＡ細胞で自食構造と大部分関連があり、さらに増加した（図９（ｅ））。
自食及び木部分化関連遺伝子の発現分析
Ｇｅｎｅｖｅｓｔｉｇａｔｏｒでマイクロアレイデータにより、３６の現在定義された自食遺伝子（ＡＴＧｓ）のうち、２０以上がＰＣＤまたはＢＬ／Ｈ３ＢＯ３処理中に上方調節された。したがって、自食の複数の段階で関連する１３ＡＴＧ遺伝子が選択され、それらの発現レベルをＴＥ分化中に調査した。テストされたＡＴＧ遺伝子のうち９つは、顕著な増加は示していなかった（２倍以下）が、４つのＡＴＧ遺伝子（ＡＴＧ６、８ｇ、１８ｈ、及びＶＰＳ３４）は、ＢＬ／Ｈ３ＢＯ３処理に対して２倍以上上方調節され、これは、自食がＴＥ分化に関与することをさらに裏付けるものである（図１０（ａ））。また、ＴＥ分化の後期段階で特異的な２群の遺伝子の発現レベルを調査した（ＰＣＤ関連遺伝子（ＢＦＮ１、ＸＣＰ１、ＡｔＸｙｎ３、及びＡｔＭＣ９）及び２次細胞壁関連遺伝子（ＩＲＸ１、３、５、１２、ＦＲＡ８、ＣｃＯＡＯＭＴ、及び４ＣＬ１）（図２１及び２２）。ＴＥ分化の初期段階を調節する維管束系関連転写因子遺伝子（ＡｔＨＢ８、ＡｔＨＢ１５、ＰＨＢ、ＰＨＶ、ＲＥＶ、ＶＮＤ６、及びＶＮＤ７）及びＢＲ関連遺伝子（ＢＲＩ１、ＢＲＬ１、２、及び３）の発現も調査した（図２３（ａ）及び図２４（ａ））。多くのテストされた遺伝子の転写体レベルは、ＴＥ誘導に対して大きく増加した。
【００６６】
上方調節されたＡＴＧｓ（ＡＴＧ６、８ｇ、１８ｈ、及びＶＰＳ３４）の発現は、ＴＥ誘導中にＷＴ、ＲａｂＧ３ｂＣＡ、及びａｔｇ５−１ｃｅｌｌｓ細胞で比較し、複数の細胞株間に差は現れなかった（図１０（ｂ））。ＡＴＧ８ｅタンパク質で大きな増加が未処理及びＢＬ／Ｈ３ＢＯ３処理されたＲａｂＧ３ｂＣＡ細胞ですでに観察された（図９（ｅ））ため、ＡＴＧ８ｅの発現は、ＷＴ、ＲａｂＧ３ｂＣＡ、及びａｔｇ５−１細胞で付加的に決定された（図２５）。ＡＴＧ８ｅの基底転写体のレベルは、ＷＴよりＲａｂＧ３ｂＣＡ細胞でより高かった。
【００６７】
上方調節されたＰＣＤ関連（ＡｔＭＣ９、ＸＣＰ１、及びＢＦＮ１）、２次細胞壁関連（ＩＲＸ１、５、１２及びＦＲＡ８）、維管束系関連転写因子（ＡｔＨＢ８、ＲＥＶ、及びＶＮＤ７）、及びＢＲ関連（ＢＲＬ２及びＢＲＬ３）遺伝子の発現は、ＷＴ、ＲａｂＧ３ｂＣＡ、及びａｔｇ５−１細胞で調査した。テストされたＰＣＤ及び２次細胞壁関連遺伝子は、ＴＥ分化において、ＷＴに比べてＲａｂＧ３ｂＣＡ細胞でより強く発現し（図１１）、これは、ＰＣＤ及び２次細胞壁の蓄積がＲａｂＧ３ｂＣＡ細胞で上方調節されることを示唆する。
【００６８】
維管束系関連転写因子及びＢＲ関連遺伝子の発現は、テストされた細胞間に顕著な差はなかった（図２３（ｂ）及び図２４（ｂ））。この結果は、ＲａｂＧ３ｂの機能が、初期の維管束の発生よりはＴＥ分化後により重要であることを示す。
【発明の効果】
【００６９】
本発明から分かるように、本発明のＲａｂＧ３ｂ遺伝子を過発現させた場合、野生型に比べてそのバイオマスが増加することを確認することができた。この効果は、ＲａｂＧ３ｂＣＡ細胞において、ＧＴＰ結合したＲａｂＧ３ｂは、自食過程を持続的に活性化することができ、多数の自食胞及び分解小体の蓄積によって行う。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１（ａ）】ＷＴ、ＲａｂＧ３ｂＣＡ、ＲａｂＧ３ｂＤＮ、ＲａｂＧ３ｂＲＮＡｉ、ａｔｇ５−１、及びｂｒｉ１−３０１植物体の表現型を示す図である。（ａ）は、ＷＴ、ＲａｂＧ３ｂＣＡ、ＲａｂＧ３ｂＤＮ、ＲａｂＧ３ｂＲＮＡｉ、ａｔｇ５−１、及びｂｒｉ１−３０１植物体の成長表現型。６週齢植物体を撮影。
【図１（ｂ）】ＷＴ、ＲａｂＧ３ｂＣＡ、ＲａｂＧ３ｂＤＮ、ＲａｂＧ３ｂＲＮＡｉ、ａｔｇ５−１、及びｂｒｉ１−３０１植物体の表現型を示す図である。星印はＷＴとの留意的差を示す（ｔテスト；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；ｎ＝１０）。実験は、類似の結果を有し、３回繰り返し行った。（ｂ）は、（ａ）における植物体の茎の長さ。星印はＷＴとの留意的差を示す（ｔテスト；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；ｎ＝１０）。実験は、類似の結果を有し、３回繰り返し行った。
【図１（ｃ）】ＷＴ、ＲａｂＧ３ｂＣＡ、ＲａｂＧ３ｂＤＮ、ＲａｂＧ３ｂＲＮＡｉ、ａｔｇ５−１、及びｂｒｉ１−３０１植物体の表現型を示す図である。星印はＷＴとの留意的差を示す（ｔテスト；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；ｎ＝１０）。実験は、類似の結果を有し、３回繰り返し行った。（ｃ）は、（ａ）の植物体の花序の茎の下端部で測定された茎の厚さ。
【図２】ＷＴ、ＲａｂＧ３ｂＣＡ、ＲａｂＧ３ｂＤＮ、ＲａｂＧ３ｂＲＮＡｉ、ａｔｇ５−１、及びｂｒｉ１−３０１植物体において花序の茎の維管束組織の発生を示す図である。（ａ）−（ｒ）は、トルイジンブルーで染色された６週齢のＷＴ、ＲａｂＧ３ｂＣＡ（＃４−２）、ＲａｂＧ３ｂＤＮ（＃２−１１）、ＲａｂＧ３ｂＲＮＡｉ（＃１−２）、ａｔｇ５−１、及びｂｒｉ１−３０１植物体から花序の茎の端（（ａ）−（ｆ））、中間（（ｇ）−（ｌ））、及び基底（（ｍ）−（ｒ））部位のレジン充填された横断面。Ｉｃ、維管束間形成層（ｉｎｔｅｒｆａｓｃｉｃｕｌａｒ  ｃａｍｂｉｕｍ）；Ｐｃ、前形成層［（ｐｒｏ）ｃａｍｂｉｕｍ］；Ｐｈ、師部；Ｘｙ、木部；Ｐｉ、髄（ｐｉｔｈ）．  バー＝（ａ）−（ｆ）で５０μｍ、（ｇ）−（ｒ）で１００μｍ。
【図３】ＷＴ、ＲａｂＧ３ｂＣＡ、ＲａｂＧ３ｂＤＮ、ＲａｂＧ３ｂＲＮＡｉ、ａｔｇ５−１、及びｂｒｉ１−３０１植物体において花序の茎の維管束パターンを示す図である。（ａ）−（ｒ）は、トルイジンブルーで染色された６週齢のＷＴ、ＲａｂＧ３ｂＣＡ（＃４−２）、ＲａｂＧ３ｂＤＮ（＃２−１１）、ＲａｂＧ３ｂＲＮＡｉ（＃１−２）、ａｔｇ５−１、及びｂｒｉ１−３０１植物体から花序の茎の端（（ａ）−（ｆ））、中間（（ｇ）−（ｌ））、及び基底（（ｍ）−（ｒ））部位のレジン充填された横断面。  Ｉｃ、維管束間形成層；Ｐｃ、前形成層［（ｐｒｏ）ｃａｍｂｉｕｍ］；Ｐｈ、師部；Ｍｘ、後生木部；Ｐｘ、原生木部；Ｐｉ、髄（ｐｉｔｈ）。  バー＝（ａ）−（ｆ）で２０μｍ、（ｇ）−（ｒ）で５０μｍ。
【図４】ＷＴ、ＲａｂＧ３ｂＣＡ、ＲａｂＧ３ｂＤＮ、ＲａｂＧ３ｂＲＮＡｉ、ａｔｇ５−１、及びｂｒｉ１−３０１植物体において木部細胞の定量分析を示す図である。  （ａ）−（ｃ）は、６週齢のＷＴ、ＲａｂＧ３ｂＣＡ（＃４−２）、ＲａｂＧ３ｂＤＮ（＃２−１１）、ＲａｂＧ３ｂＲＮＡｉ（＃１−２）、ａｔｇ５−１、及びｂｒｉ１−３０１植物体から花序の茎の端（（ａ））、中間（（ｂ））及び基底（（ｃ））部位で原生木部及び後生木部細胞の数及びこれらの結合した木部細胞数の定量化を示す。  星印は各ＷＴ細胞との留意的差を示す（ｔテスト；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；ｎ＝１０）。
【図５】ＷＴ、ＲａｂＧ３ｂＣＡ、ＲａｂＧ３ｂＤＮ、ＲａｂＧ３ｂＲＮＡｉ、ａｔｇ５−１、及びｂｒｉ１−３０１植物体において培養された細胞のＴＥ分化を示す図である。  （ａ）−（ｆ）は、ＴＥ分化培養された細胞の顕微鏡写真。２次的細胞壁の特性パターンを有する成熟したＴＥを星印で表した。バー＝１０μｍ。  （ｇ）は、ＴＥ形成の定量分析。（ａ）−（ｆ）でトルイジンブルー染色された培養細胞を撮影し、成熟したＴＥを、３００−５００細胞を含有する２００μｍ２の面積で計数した。  結果を独立した３回の実験の平均±ＳＥで示す。星印はＷＴとの留意的差を示す（ｔテスト；＊Ｐ＜０．０１）。
【図６】ＴＥ分化する培養細胞において自食活性化を示す図である。  （ａ）−（ｏ）は、ＷＴ、ＲａｂＧ３ｂＣＡ（＃４−２）、ＲａｂＧ３ｂＤＮ（＃２−１１）、ＲａｂＧ３ｂＲＮＡｉ（＃１−２）、ａｔｇ５−１、及びｂｒｉ１−３０１植物体から培養された細胞で自食構造のＬＴＧ染色を示す。培養された細胞を、ＢＬ／Ｈ３ＢＯ３処理０（（ａ）−（ｅ））、２（（ｆ）−（ｊ））、及び４（（ｋ）−（ｏ））日後にＬＴＧ染色を行った。緑色のスポットは、自食胞／分解小体構造を示す。  バー＝１０μｍ。
【図７】ＴＥ分化する培養細胞において自食構造のＴＥＭイメージを示す図である。  （ａ）−（ｏ）は、ＷＴ、ＲａｂＧ３ｂＣＡ（＃４−２）、ＲａｂＧ３ｂＤＮ（＃２−１１）、ＲａｂＧ３ｂＲＮＡｉ（＃１−２）、ａｔｇ５−１、及びｂｒｉ１−３０１植物体から培養された細胞で自食構造のＬＴＧ染色を示す。培養された細胞を、原形質のＴＥＭイメージは、ＢＬ／Ｈ３ＢＯ３処理０（（ａ）−（ｅ））、２（（ｆ）−（ｊ））、及び４（（ｋ）−（ｏ））日後に撮影された。  （ｐ）、（ｑ）は、（ｆ）及び（ｇ）ボックスにおいて、イメージはそれぞれ（ｐ）及び（ｑ）で拡大される。  自食胞／分解小体様構造は矢印で表す。  バー＝（ａ）−（ｏ）で２μｍ、（ｐ）、（ｑ）で０．１μｍ。
【図８】ＴＥ分化及び砂糖欠乏に対するＷＴ及びＲａｂＧ３ｂＣＡ細胞において自食構造のＴＥＭイメージを示す図である。  （ａ）−（ｄ）は、ＷＴ細胞において自食構造の形成に対するＴＥ誘導の効果を示す。ＢＬ／Ｈ３ＢＯ３で１（（ａ））、２（（ｂ））、及び４（（ｃ）、（ｄ））日間処理されたＷＴ培養細胞の原形質のＴＥＭイメージを収集。  （ｅ）−（ｈ）は、ＲａｂＧ３ｂＣＡ細胞において自食構造の形成に対するＴＥ誘導の効果を示す。  ＢＬ／Ｈ３ＢＯ３で１（（ｅ））、２（（ｆ））、及び４（（ｇ）、（ｈ））日間処理されたＲａｂＧ３ｂＣＡ培養細胞の原形質のＴＥＭイメージを収集。  （ｉ）−（ｌ）は、ＷＴ細胞において自食構造の形成に対する砂糖欠乏の効果を示す。  砂糖欠乏後、０（（ｉ））、１（（ｊ））、及び２（（ｋ）、（ｌ））日後、ＷＴ苗木の原形質のＴＥＭイメージを収集。  （ｍ）−（ｐ）は、ＲａｂＧ３ｂＣＡ細胞において自食構造の形成に対する砂糖欠乏の効果を示す。砂糖欠乏後、０（（ｍ））、１（（ｎ））、及び２（（ｏ）、（ｐ））日後、ＲａｂＧ３ｂＣＡ苗木の原形質のＴＥＭイメージを収集。  Ｍ、ミトコンドリア；Ｇ、ゴルジ体；ＡＬ、自食胞／分解小体様構造；矢じり、前自食胞構造／隔離膜（ｐｈａｇｏｐｈｏｒｅ）；矢印、自食胞。バー＝０．５μｍ。
【図９】自食構造においてＲａｂＧ３ｂ及びＡＴＧ８ｅの同時位置づけを示す図である。  （ａ）−（ｄ）は、ＢＬ／Ｈ３ＢＯ３で４日間処理された培養細胞においてＲａｂＧ３ｂ及びＡＴＧ８ｅの同時位置づけに対する免疫金ラベリング。矢じり及び矢印は、それぞれＲａｂＧ３ｂ（２０−ｎｍ金）及びＡＴＧ８ｅ（１−ｎｍ金）を示す。（ａ）及び（ｃ）において、ボックスのイメージは（ｂ）及び（ｄ）で拡大される。  バー＝（ａ）、（ｃ）で０．２μｍ、（ｂ）、（ｄ）で０．１μｍ。  （ｅ）ＢＬ／Ｈ３ＢＯ３で４日間処理または未処理のＷＴ及びＲａｂＧ３ｂＣＡ培養細胞においてＲａｂＧ３ｂ及びＡＴＧ８ｅタンパク質の定量分析。ＲａｂＧ３ｂ及びＡＴＧ８ｅ金粒子は、（ｂ）及び（ｄ）で示すように、ＴＥＭイメージの１．５μｍ２の面積で計数された。結果を独立した６回の実験の平均±ＳＥで示す。  星印は各ＷＴ細胞との留意的差を示す（ｔテスト；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；ｎ＝１０）。
【図１０（ａ）】ＴＥ分化中に自食関連遺伝子の発現分析を示す図である。結果を独立した３回の実験の平均±ＳＥで示す。  （ａ）は、ＢＬ／Ｈ３ＢＯ３で処理されたＷＴ培養細胞においてＡＴＧ遺伝子の相対的発現。
【図１０（ｂ）】ＴＥ分化中に自食関連遺伝子の発現分析を示す図である。結果を独立した３回の実験の平均±ＳＥで示す。  （ｂ）は、ＢＬ／Ｈ３ＢＯ３で処理されたＷＴ、ＲａｂＧ３ｂＣＡ、及びａｔｇ５−１培養細胞で選別されたＡＴＧｓ（ＡＴＧ６、８ｇ、１８ｈ、及びＶＰＳ３４）遺伝子の相対的発現。
【図１１（ａ）】ＴＥ分化中に２次細胞壁関連遺伝子及びＰＣＤ関連遺伝子の発現分析を示す図である。結果を独立した３回の実験の平均±ＳＥで示す。  （ａ）、（ｂ）は、ＢＬ／Ｈ３ＢＯ３で処理されたＷＴ、ＲａｂＧ３ｂＣＡ、及びａｔｇ５−１培養細胞で選別されたＰＣＤ関連（ＸＣＰ１、ＡｔＭＣ９、及びＢＦＮ１）  （（ａ））及び２次細胞壁関連（ＩＲＸ１、５、１２、及びＦＲＡ８）
【図１１（ｂ）】ＴＥ分化中に２次細胞壁関連遺伝子及びＰＣＤ関連遺伝子の発現分析を示す図である。結果を独立した３回の実験の平均±ＳＥで示す。  （ｂ）は、ＢＬ／Ｈ３ＢＯ３で処理されたＷＴ、ＲａｂＧ３ｂＣＡ、及びａｔｇ５−１培養細胞で選別されたＰＣＤ関連（ＸＣＰ１、ＡｔＭＣ９、及びＢＦＮ１）（（ｂ））遺伝子の相対的発現。
【図１２】ＥＢＬ／Ｈ３ＢＯ３処理に対するアラビドプシスＲａｂＧ遺伝子の発現分析を示す図である。１、ＲａｂＧ１  ２、ＲａｂＧ２  ３ａ、ＲａｂＧ３ａ  ３ｂ、ＲａｂＧ３ｂ  ３ｃ、ＲａｂＧ３ｃ  ３ｄ、ＲａｂＧ３ｄ  ３ｅ、ＲａｂＧ３ｅ  ３ｆ、ＲａｂＧ３ｆを意味する。
【図１３（ａ）】ＷＴ及び２つの独立したＲａｂＧ３ｂＲＮＡｉラインにおいてＲａｂＧ３ｂの発現分析を示す図である。  （ａ）は、ＲａｂＧ３遺伝子系要素のＲＴ−ＰＣＲ分析。アクチンを対照群として使用する。
【図１３（ｂ）】ＷＴ及び２つの独立したＲａｂＧ３ｂＲＮＡｉラインにおいてＲａｂＧ３ｂの発現分析を示す図である。  （ｂ）は、ＲａｂＧ３ｂタンパク質のウェスタンブロット分析。全体のタンパク質をＳＤＳ電気泳動により分離し、Ｐｏｎｃｅａｕ  Ｓ染色（下端）及びａｎｔｉ−ＲａｂＧ３ｂ抗体でウェスタンブロット分析（上端）を行う。
【図１４】ＷＴ、ＲａｂＧ３ｂＣＡ、ＲａｂＧ３ｂＤＮ、ＲａｂＧ３ｂＲＮＡｉ、ａｔｇ５−１、及びｂｒｉ１−３０１植物体において抽薹時間を示す図である。実験は、類似の結果（ｎ＝１０）を有し、３回繰り返し行った。
【図１５】ＷＴ、ＲａｂＧ３ｂＣＡ、ＲａｂＧ３ｂＤＮ、ＲａｂＧ３ｂＲＮＡｉ、ａｔｇ５−１、及びｂｒｉ１−３０１植物体において抽薹の全体の葉数を示す図である。  実験は、類似の結果（ｎ＝１０）を有し、３回繰り返し行った。
【図１６】ＲａｂＧ３ｂＣＡ植物体の花序の茎の断面で細胞計数の例を示す図である。後生木部と原形木部細胞をそれぞれ桃色及び緑色で表した。  バー＝５０μｍ。
【図１７】ＷＴ、ＲａｂＧ３ｂＣＡ、ＲａｂＧ３ｂＤＮ、ＲａｂＧ３ｂＲＮＡｉ、ａｔｇ５−１、及びｂｒｉ１−３０１植物体において木部発生を示す図である。  （ａ）−（ｆ）は、フロログルシノール−ＨＣｌで染色されたリグニン化された木部細胞を示す６週齢植物体の花序の茎の断面。バー＝０．２ｍｍ。  （ｇ）−（ｌ）は、リグニン自己蛍光により同定されたリグニン化された木部細胞を示す６週齢植物体の花序の茎の断面。バー＝２０μｍ。
【図１８】ＷＴ植物体の花序の茎においてＲａｂＧ３ｂの免疫位置づけを示す図である。  ６週齢ＷＴ植物体の花序の茎の下端部で断面をＲａｂＧ３ｂタンパク質の免疫位置づけに用いた。陰性対照群は、免疫前の血清をラベルとして用いた。矢じりは、ＲａｂＧ３ｂに結合された金粒子を表す。ＣＷ、細胞壁；Ｖ、液胞。バー＝１μｍ（（ａ）−（ｄ））及び０．２μｍ（（ｅ）−（ｐ））。
【図１９】ＷＴ、ＲａｂＧ３ｂＣＡ、ＲａｂＧ３ｂＤＮ、ＲａｂＧ３ｂＲＮＡｉ、ａｔｇ５−１、及びｂｒｉ１−３０１植物体において培養された細胞のＴＥ分化を示す図である。  （ａ）−（ｌ）は、ＴＥ分化培養細胞の顕微鏡写真。培養された細胞は、ＢＬ／Ｈ３ＢＯ３処理０日（（ａ）−（ｆ））及び４日（（ｇ）−（ｌ））後、トルイジンブルーで染色した。バー＝１０μｍ。
【図２０】ＷＴ、ＲａｂＧ３ｂＣＡ、ＲａｂＧ３ｂＤＮ、ＲａｂＧ３ｂＲＮＡｉ、ａｔｇ５−１、及びｂｒｉ１−３０１植物体で培養された細胞のＴＥ分化を示す図である。  （ａ）−（ｌ）は、培養された細胞においてリグニン化されたＴＥ。培養された細胞は、ＢＬ／Ｈ３ＢＯ３処理０日（（ａ）−（ｆ））及び７日（（ｇ）−（ｌ））後、フロログルシノール−ＨＣｌで染色した。バー＝０．１ｍｍ。
【図２１】ＴＥ分化中に２次細胞壁関連遺伝子の発現分析を示す図である。  結果を独立した３回の実験の平均±ＳＥで示す。
【図２２】ＴＥ分化中にＰＣＤ関連遺伝子の発現分析を示す図である。  結果を独立した３回実験の平均±ＳＥで示す。
【図２３（ａ）】ＴＥ分化中に維管束系関連転写因子の発現分析を示す図である。結果を独立した３回の実験の平均±ＳＥで示す。  （ａ）は、ＢＬ／Ｈ３ＢＯ３で処理されたＷＴ培養細胞において維管束系関連転写因子の相対的発現を示す。
【図２３（ｂ）】ＴＥ分化中に維管束系関連転写因子の発現分析を示す図である。結果を独立した３回の実験の平均±ＳＥで示す。  （ｂ）は、ＢＬ／Ｈ３ＢＯ３で処理されたＷＴ、ＲａｂＧ３ｂＣＡ、及びａｔｇ５−１の培養細胞において維管束系関連転写因子遺伝子（ＡｔＨＢ８、ＲＥＶ、及びＶＮＤ７）の相対的発現を示す。
【図２４（ａ）】ＴＥ分化中にＢＲ関連遺伝子の発現分析を示す図である。結果を独立した３回の実験の平均±ＳＥで示す。  （ａ）は、ＢＬ／Ｈ３ＢＯ３で処理されたＷＴ培養細胞においてＢＲ関連遺伝子の相対的発現を示す。
【図２４（ｂ）】ＴＥ分化中にＢＲ関連遺伝子の発現分析を示す図である。結果を独立した３回の実験の平均±ＳＥで示す。  （ｂ）は、ＢＬ／Ｈ３ＢＯ３で処理されたＷＴ、ＲａｂＧ３ｂＣＡ、及びａｔｇ５−１の培養細胞でＢＲ関連遺伝子（ＢＲＩ１、ＢＲＬ１、ＢＲＬ２、及びＢＲＬ３）の相対的発現を示す。
【図２５】ＴＥ分化中にＡＴＧ８ｅ遺伝子の発現分析を示す図である。  全体のＲＮＡを、記載された時間の間、ＢＬ／Ｈ３ＢＯ３で処理されたＷＴ、ＲａｂＧ３ｂＣＡ、及びａｔｇ５−１の培養細胞から抽出し、リアルタイムでのｑＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。結果を独立した３回の実験の平均±ＳＥで示す。
【図２６】本発明の発現ベクターの開裂地図を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
以下、非限定的な実施形態に基づいて本発明をより詳細に説明する。ただし、下記の実施形態は、本発明を例示するための意図で記載されたものであって、本発明の範囲は、下記の実施形態により制限されるものではない。
実施例１：植物材料及び成長条件
シロイヌナズナ植物を長周期条件（１６−ｈ明／８−ｈ暗の周期下、２４℃成長室で成長させた。アラビドプシスカルスは、誘導培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ［ＭＳ］培地、ｐＨ５．８、３％スクロース、０．８％寒天及び２ｍｇ／ｌの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸［２，４−Ｄ］）上に若い苗木の子葉から生成した。懸濁細胞の培養は、３％スクロース及び１ｍｇ／ｌの２，４−Ｄが補なわれた５０ｍｌのＭＳ培地で１〜２ｇのカルスを接種して開始し、２４℃暗条件下で振とうしてサブ培養した。ＴＥ誘導のために、サブ培養された細胞を１μＭのＢＬ及び１０ｍＭのＨ３ＢＯ３を含有する２，４−Ｄ欠乏の新鮮培地に移した。部分標本（Ａｌｉｑｕｏｔｓ）を、追加分析のために、所与の時期に取った。砂糖欠乏を誘導するために、ＭＳ（１％スクロース）培地上に成長した１週齢の苗木を砂糖のないＭＳ培地に移し、暗条件下で成長させた。植物を移した後、０、１、及び２日後に取った。
実施例２：ＲａｂＧ３ｂノックダウン植物の生成
ＲａｂＧ３ｂのアグリコーラ（Ａｇｒｉｋｏｌａ）ＲＮＡｉノックダウンデリバリークローン（ＣＡＴＭＡ１ａ２１７９５）をＮｏｔｔｉｎｇｈａｍ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｒｅ（ＮＡＳＣ）から入手した。その構造を、アグロバクテリウムツメファシエンス菌株ＧＶ３１０１を用いて、真空浸透によりアラビドプシスに形質転換した（Ｃｌｏｕｇｈ  ａｎｄ  Ｂｅｎｔ、１９９８）。形質転換体（Ｔ１）をＢＡＳＴＡ抵抗性に基づいて選別した。Ｔ３同型接合体を回収し、ＲａｂＧ３ｂ発現の減少に対してテストを行った。２つの独立したライン（＃１−２及び＃３−１６）の追加分析のために使用した。
実施例３：ＲＮＡ分析
定量的リアルタイムでのＲＴ−ＰＣＲをＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０システム（Ｒｏｃｈｅ）でＫＡＰＡ  ＳＹＢＲ  ＦＡＳＴ  ｑＰＣＲを用いて行った。ＰＣＲ反応は、製造業者のプロトコールによって行われた。本発明に使用された遺伝子特異的なプライマーは表１に示した。テストされた遺伝子の発現をＵＢＱ５の持続的な発現レベルで標準化し、２−ΔΔｔ方法（Ｌｉｖａｋ  ａｎｄ  Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ、２００１）を用いて計算された。実験は、生物学的に独立したサンプルで、少なくとも３回繰り返し行った。
【００７２】
【表１】
0005848009.tif 000002
【００７３】
0005848009.tif 000003
【００７４】
実施例４：組織化学分析
植物サンプル（培養された細胞及び７週齢植物の花序の茎）を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）内の２．５％グルタルアルデヒド及び４％パラホルムアルデヒドを含む溶液で、４℃で４時間固定し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で洗い流し、常温で２時間、１％ＯｓＯ４で固定した。０．１Ｍ緩衝液で洗い流した後、サンプルを脱水し、ＬＲホワイトレジン（Ｌｏｎｄｏｎ  Ｒｅｓｉｎ）に充填した。
【００７５】
断面（１μｍ）を、超ミクロトーム（ＲＭＣ  ＭＴ  Ｘ）を用いて製造し、ろ過した１％トルイジンブルーで短く染色した。これらの断面を光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、ＢＸ５１ＴＲＦ）を用いて撮影し、イメージを、茎の厚さを測定し、維管束（ｎ＝１０）内の原生木部及び後生木部細胞を計数するために用いた。
【００７６】
ＴＥＭ分析のために、薄い断面（６０〜７０ｎｍ厚さ）を銅グリッド（１−ＧＮ、１５０メッシュ）上に収集し、酢酸ウラニル及びクエン酸鉛で染色し、ＴＥＭ（Ｐｈｉｌｉｐｓ、Ｔｅｃｎａｉ  １２）で調査した。
【００７７】
免疫位置づけのために、ニッケルグリッド上で収集された断面を、ＢＳＡ−ＴＢＳ緩衝液（５００ｍＭのＮａＣｌ、１％のＢＳＡ、０．３％のＴｗｅｅｎ２０、及び１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）で１時間ブロックした。その後、断面を、抗ＲａｂＧ３ｂ抗血清（ラビット）及び／または抗ＡＴＧ８ｅ抗血清（ラット）で、常温で４時間培養した。ＢＳＡ−ＴＢＳで洗い流した後、１次抗体結合を、抗ラビットＩｇＧ  （２０−ｎｍ金、Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）及び抗ラットＩｇＧ（１−ｎｍ金、Ｓｉｇｍａ）を用いて検出した。ＢＳＡ−ＴＢＳ及び脱イオン水で洗浄後、サンプルをＴＥＭ分析前に酢酸ウラニルで染色した。
実施例５：リグニン染色
リグニン染色は、Ｐｏｍａｒ、Ｆ．，等（２００２）Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｍａ２２０、１７−２８に記載されたように行った。花序の茎を染色するために、６週齢植物から花序の茎の中央部からの断面をカミソリで切断して製造した。断面及び培養された細胞をフロログルシノール溶液（２％エタノール／水、９５／５（ｖ／ｖ））で１分染色し、６ＮのＨＣｌに浸した。細胞培養サンプル及び染色された花序の茎サンプルの明視野（Ｂｒｉｇｈｔ  ｆｉｅｌｄ）写真は、それぞれ双眼顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＥＺ４Ｄ）及び光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、ＢＸ５１ＴＲＦ）を用いて収集した。リグニンの自己蛍光を、共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０  ＭＥＴＡ）を用いて４２０／４８０  ｎｍ励起／発光で検出した。
実施例６：ＬＴＧ染色
ＬＴＧ染色は、Ｌｉｕ、Ｙ．，等（２００５）Ｃｅｌｌ、１２１、５６７−５７７に記載されたように行った。培養された細胞を、１μＭのＬＴＧ  ＤＮＤ−２６（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で、暗条件で１時間培養した。イメージを、４８８／５０５ｎｍ励起／発光で、共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０  ＭＥＴＡ）を用いて得た。
【図１（ａ）】
0005848009.tif 000004
【図１（ｂ）】
0005848009.tif 000005
【図１（ｃ）】
0005848009.tif 000006
【図２】
0005848009.tif 000007
【図３】
0005848009.tif 000008
【図４】
0005848009.tif 000009
【図５】
0005848009.tif 000010
【図６】
0005848009.tif 000011
【図７】
0005848009.tif 000012
【図８】
0005848009.tif 000013
【図９】
0005848009.tif 000014
【図１０（ａ）】
0005848009.tif 000015
【図１０（ｂ）】
0005848009.tif 000016
【図１１（ａ）】
0005848009.tif 000017
【図１１（ｂ）】
0005848009.tif 000018
【図１２】
0005848009.tif 000019
【図１３（ａ）】
0005848009.tif 000020
【図１３（ｂ）】
0005848009.tif 000021
【図１４】
0005848009.tif 000022
【図１５】
0005848009.tif 000023
【図１６】
0005848009.tif 000024
【図１７】
0005848009.tif 000025
【図１８】
0005848009.tif 000026
【図１９】
0005848009.tif 000027
【図２０】
0005848009.tif 000028
【図２１】
0005848009.tif 000029
【図２２】
0005848009.tif 000030
【図２３（ａ）】
0005848009.tif 000031
【図２３（ｂ）】
0005848009.tif 000032
【図２４（ａ）】
0005848009.tif 000033
【図２４（ｂ）】
0005848009.tif 000034
【図２５】
0005848009.tif 000035
【図２６】
0005848009.tif 000036
【配列表】
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