(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
異常なＡＣＥ活性を特徴とする高血圧前症または高血圧症から選択される病態を治療または予防するための薬剤の製造での、配列ＦＳＹまたは配列ＦＴＹのみからなる、または、配列ＦＳＹまたは配列ＦＴＹを含む、ＡＣＥ阻害活性がある３〜２０のアミノ酸のペプチドの使用。
【請求項２】
前記ペプチドは配列ＦＳＹを含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記ペプチドが、配列ＦＳＹまたは配列ＦＴＹを含む３〜４のアミノ酸によってのみからなる、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記ペプチドが配列ＦＳＹまたは配列ＦＴＹのみからなる、請求項１記載の使用。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか１項に記載の使用であって、前記ペプチドは以下から選択される１つ以上の修飾を含むペプチドの使用。
（ｉ）Ｎ末端キャッピング、
（ｉｉ）Ｃ末端キャッピング、
（ｉｉｉ）リン酸化、
（ｉｖ）グリコシル化、
（ｖ）Ｄ構造での１つ以上のアミノ酸、および
（ｖｉ）非遺伝的にコードされた１つ以上のアミノ酸、
を含むペプチド。
【請求項６】
配列ＦＳＹまたは配列ＦＴＹのみからなる、単離されたペプチド。
【請求項７】
薬学的に許容可能な賦形剤とともに請求項６に記載のペプチドを含む医薬組成物。
【請求項８】
以下を含む医薬組成物。
（ｉ）ＡＣＥ阻害活性があり、かつ、配列ＦＳＹまたは配列ＦＴＹのみからなる、または、配列ＦＳＹまたは配列ＦＴＹを含む３〜２０のアミノ酸のペプチド、
（ｉｉ）さらなる抗高血圧剤。
【請求項９】
賦形剤または担体とともに請求項６に記載のペプチドを含む栄養補助食品組成物。
【請求項１０】
脂肪、炭水化物、タンパク質、繊維、灰、ミネラルおよびビタミンから選択される１つ以上の栄養補助食品成分とともに、ＡＣＥ阻害活性があり、かつ、配列ＦＳＹまたは配列ＦＴＹのみからなる、または、配列ＦＳＹまたは配列ＦＴＹを含む３〜２０のアミノ酸のペプチドを含む栄養補助食品組成物。
【請求項１１】
ＡＣＥ阻害活性があり、かつ、配列ＦＳＹまたは配列ＦＴＹのみからなる、または、配列ＦＳＹまたは配列ＦＴＹを含む３〜２０のアミノ酸のペプチドを含む食物または飼料。
【請求項１２】
ＡＣＥ阻害活性があり、かつ、配列ＦＳＹまたは配列ＦＴＹのみからなる、または、配列ＦＳＹまたは配列ＦＴＹを含む３〜２０のアミノ酸のペプチドを食用材料と結合させることを含む請求項１１に記載の食物または飼料を作る方法。
【請求項１３】
ＡＣＥ活性を阻害するインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）の方法での、ＡＣＥ阻害活性があり、かつ、配列ＦＳＹまたは配列ＦＴＹのみからなる、または、配列ＦＳＹまたは配列ＦＴＹを含む３〜２０のアミノ酸のペプチドの使用。
【請求項１４】
前記ペプチドが配列ＦＳＹまたは配列ＦＴＹのみからなる、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記ペプチドが配列ＦＳＹまたは配列ＦＴＹのみからなる、請求項１０に記載の栄養補助食品組成物。
【請求項１６】
前記ペプチドが配列ＦＳＹまたは配列ＦＴＹのみからなる、請求項１１に記載の食物または飼料。
【請求項１７】
前記食物または飼料は、インスタント粉製品、食品バー、肉および肉類似製品、魚および魚類似製品、朝食シリアル、植物性脂肪スプレッド、マヨネーズ、乳製品、豆乳製品、パスタ、麺、焼き物食品、レディーミール、乳児用調製粉乳、ベビーフード、ペットフード、家畜飼料および水産養殖飼料から選択される、請求項１１または請求項１６に記載の食物または飼料。
【請求項１８】
前記ペプチドが配列ＦＳＹまたは配列ＦＴＹのみからなる、請求項１２に記載の食物または飼料を作る方法。
【請求項１９】
前記ペプチドが配列ＦＳＹまたは配列ＦＴＹのみからなる、請求項１３に記載のペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡＣＥ阻害特性、その変異体、前記を含む組成物およびその使用、具体的には高血圧症の治療等の医療での使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
高血圧症は、脳卒中、心臓発作、心不全および動脈瘤の危険因子のひとつであり、慢性腎不全の主原因である。動脈圧の緩やかな上昇であっても平均余命を短くする。
【０００３】
高血圧症はアンジオテンシンＩ変換酵素（ＡＣＥ）を標的化することによって治療され得る。ＡＣＥは身体のレニン・アンジオテンシン系（ＲＡＳ）に関与する酵素である。それはデカペプチドアンギオテンシンＩをオクタペプチドアンギオテンシンＩＩへの転換に触媒作用を及ぼすエキソペプチダーゼである。アンギオテンシンＩＩは、血管を収縮させ、血圧を上昇させる。また、副腎皮質からアルドステロンの放出を刺激する。アルドステロンは、遠位ネフロン、腎内でナトリウム貯留を促し、血圧も上昇させる。
【０００４】
ＡＣＥ阻害剤は、特に血圧の調節、心不全の治療、脳卒中の予防、および高血圧または糖尿病の人々の腎へのダメージを予防するために使用される。また、心臓発作後の生存の改善もする。多く使用されるＡＣＥ阻害剤には、ベナゼプリル（ロテンシン）、カプトプリル（カポテン）、エナラプリル（バソテック）、ホシノプリル（モノプリル）、リシノプリル（プリニビル、ゼストリル）、モエキシプリル（ウニバスク）、ペリンドプリル（アセオン）、キナプリル（アクプリル）、ラミプリル（アルテース）、およびトランドラプリル（マビック）がある。この薬剤であっても望まない副作用が多くあり、および／または十分な効果が得られないため、他のＡＣＥ阻害剤が必要とされている。
【０００５】
多くの様々なペプチドにＡＣＥ阻害活性があることが認められており（Ｖｅｒｃｒｕｙｓｓｅら、Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２００５、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａ-Ｊ）、ＡＣＥ阻害活性を持つペプチドがさらに必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の発明者は、とりわけ良好なＡＣＥ阻害活性のあるペプチドを同定した。ペプチドには配列ＦＳＹがあり、Ｆはフェニルアラニンを表し、Ｐｈｅとも称され、Ｓはセリンを表し、Ｓｅｒとも称され、およびＹはチロシンを表し、Ｔｙｒとも称される。したがって、本発明は、１つの態様では配列番号１（ＦＳＹ）を含む、または、からなるペプチドを提供する。
【０００７】
本発明の発明者はまた、配列ＦＴＹを有する上記のペプチドの変異体にはとりわけ良好なＡＣＥ阻害活性があることも究明した。Ｔはトレオニンを表し、Ｔｈｒとも称される。したがって、本発明は、さらに別の態様では配列番号２（ＦＴＹ）を含む、または、からなるペプチドを提供する。
【０００８】
「ＦＳＹ／ＦＴＹ」は、ペプチドには配列ＦＳＹまたは配列ＦＴＹがあることを示すために、本明細書に使用される。
【０００９】
ペプチドは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０または５０のアミノ酸、好ましくは５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５または４以下のアミノ酸、例えば３〜２５、３〜１５、３〜１０、３〜８、３〜７、３〜６、３〜５または３〜４のアミノ酸を含み得、好ましくは４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８または２０のアミノ酸からなり得、最も好ましくは３アミノ酸からなり得る。多数のアミノ酸「からなる」ことによって、存在するアミノ酸の数が詳述された数を超えないことを意味するが、この表現はペプチドが非ペプチド部分をさらに含む可能性を除外しない。例えば、ペプチドは、以下に説明されるように、リン酸化され得、またはＣ末端キャップを含み得る。
【００１０】
したがって、ペプチドにはコアアミノ酸配列ＦＳＹまたはＦＴＹがある。「コアアミノ酸配列」とは、本明細書に使用するとき、ペプチドのＮ末端で始まり得、ペプチド内に内部配列であり得、ペプチドのＣ末端で終わり得、またはペプチドのＮ末端で始まり得、ペプチドのＣ末端で終わり得るアミノ酸の配列を意味する。コア配列のＮ末端および／またはＣ末端でのアミノ酸は、「フランキング」アミノ酸と呼ばれる。
【００１１】
ＦＳＹ／ＦＴＹペプチドは遺伝子組み換えであり得、すなわち大腸菌およびそこから精製されたもの等の宿主細胞内の異種遺伝子から発現され得る。非遺伝子組み換え源から得られてもよく、例えば、自然にペプチドを産生する動物または植物の試料から単離され得る。ＦＳＹ／ＦＴＹ配列を含むタンパク質を酵素的または化学的に分解（例えば加水分解）することによって得てもよい。ペプチド合成の標準的な方法（例えば固相合成）は、ペプチドを合成するために使用し得、ＦｍｏｃまたはＢｏｃ固相合成が好まれる。
【００１２】
したがって、単離ＦＳＹ／ＦＴＹペプチドを産生する方法も提供する。当該方法は上述の方法のいずれかを含み得る。好ましくは、当該方法は、タンパク質性組成物を加水分解して加水分解産物を得て、その加水分解産物からＦＳＹ／ＦＴＹペプチドを単離するステップを含む。
【００１３】
ＦＳＹ／ＦＴＹペプチドを産生する方法も提供し、当該方法はＦＳＹ／ＦＴＹモチーフを含むタンパク質を加水分解してＦＳＹ／ＦＴＹペプチドを含む組成物を得ることを含む。
【００１４】
特に断りがない限り、本明細書に記載の産生方法のいずれも、純粋なタンパク質またはタンパク質の混合物上で実施される。タンパク質の混合物は、例えば、頭、尾および／またはエビ、好ましくはホッコクアカエビの殻を含むエビ加工廃棄物であってもよい。
【００１５】
任意に、ペプチドはＦＳＹ／ＦＴＹアミノ酸配列の１、２または３の保存的置換、好ましくは１以下を含み得る。Ｓｅｒは極性が中立のアミノ酸であり、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、ＡｓｎまたはＧｌｎをＳｅｒについて置換することは保存的置換を表す。ＰｈｅおよびＴｙｒは芳香族アミノ酸であり、Ｐｈｅ、ＴｒｐまたはＴｙｒに対してそれぞれ独立して置換され得る。したがって、ＦＴＹ、ＹＳＹ、ＹＳＦ、ＦＣＹ、ＦＭＹ、ＦＮＹ等から選択されるコア配列を有するペプチドも熟慮される。
【００１６】
任意にペプチドは、コア配列および／またはフランキング配列に非遺伝学的にコードされるアミノ酸を含んでもよいが、コア配列はいかなる非遺伝学的にコードされるアミノ酸を含んでいないほうが好ましい。「非遺伝学的にコードされる」アミノ酸とは、その側鎖によって２０の遺伝学的にコードされるアミノ酸とは異なるアミノ酸を意味する。したがって、この用語は側鎖を意味するために本明細書に使用され、Ｌアミノ酸とＤアミノ酸を区別するために本明細書に使用されない。非遺伝学的なアミノ酸の例として、３-ヨード-Ｌ-チロシン、アジドアラニン、アジドホモアラニンおよびノルロイシンが挙げられる。
【００１７】
ペプチドの安定性はいわゆるエンドキャッピング、すなわちＮ末端およびＣ末端アミノ酸の化学修飾によって改善され得ることがよく知られている。典型的なエンドキャッピングとして、Ｃ末端のアミド化およびＮ末端のアセチル化または脱アミノ化が挙げられる。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるペプチドには修飾Ｃ末端および／または修飾Ｎ末端があり、好ましくはアミド化されるＣ末端および／またはアセチル化または脱アミノ化されるＮ末端がある。
【００１８】
Ｌ構造が好ましく、好ましくはペプチドのアミノ酸のすべてはＬ構造内にあるが、ペプチドはＤ構造内に１つ以上のアミノ酸を含んでもよい。任意に、アミノ酸の半分以上またはすべてはＤ構造内にある。任意にコア配列だけはＬ-アミノ酸を含み、フランキング配列（複数可）は１つ以上のＤ-アミノ酸を含み、またはその逆もある。
【００１９】
任意に、コア配列および／またはフランキング配列のアミノ酸の１つ以上はグリコシル化されてもよい。任意に、コア配列および／またはフランキング配列の１つ以上のアミノ酸はリン酸化されてもよい。
【００２０】
ペプチドを構成するアミノ酸は、ペプチド結合、好ましくはα-ペプチド結合を経由して典型的には接続されるだろう。これは一種のアミド結合である。しかしながら、アミノ酸の１つ以上は非ペプチド結合によって接続されてもよい。
【００２１】
好ましくは、ペプチドは直鎖であるが、任意に環状または分岐鎖であってもよい。
【００２２】
用語「ＦＳＹ／ＦＴＹペプチド」は、上に定義されるペプチド、すなわち本明細書に説明される修飾の１つ以上を任意に含み得る配列ＦＳＹ／ＦＴＹからなる、または、を含むペプチドを意味するために、本明細書では便宜上使用される。
【００２３】
ＦＳＹペプチドにはＡＣＥ阻害活性がある。実施例１に示すように、発明者は約４μＭ（いくつかの計測値の平均）のＡＣＥ阻害に関して、ＩＣ50を有するＦＳＹペプチドを提供した。Ｄｒａｇｎｅｓらの方法を用いる典型的な計測値は、約２．２μＭのＡＣＥ阻害に関してＩＣ50を示した。Ｖｅｒｍｅｉｒｓｓｅｎの方法では、約７．７μＭのＡＣＥ阻害に関してＩＣ50を計測した。
【００２４】
ＦＴＹペプチドにもＡＣＥ阻害活性がある。実施例２に示すように、発明者は約５９μＭ（Ｄｒａｇｎｅｓらの方法を用いて）のＡＣＥ阻害に関してＩＣ50を有するＦＴＹペプチドを提供した。Ｖｅｒｍｅｉｒｓｓｅｎの方法では、約２７４μＭのＡＣＥ阻害に関してＩＣ50を計測した。
【００２５】
したがって、ＡＣＥ阻害に関して、ペプチドのＩＣ50は、好ましくは、４００、３００、２００、１９０、１８０、１７０、１００、８０、６０、４０、３０または２０μＭ未満、最も好ましくは、１８、１６、１４、１２、１０、８、７、６、５、４、３、または２μＭ未満、例えば約４μＭ、好ましくは訳３、２、１．７または１μＭである。例えば、ペプチドのＩＣ50は、約１〜２０、１〜１０、１〜６、１〜４または１〜２μＭであり得る。
【００２６】
ＡＣＥ阻害には以下に説明されるように、様々な治療応用がある。本明細書に熟慮される治療応用はどれも、ＦＳＹ／ＦＴＹがＡＣＥ活性を阻害する。ＦＳＹ／ＦＴＹペプチドはそれゆえ、異常なＡＣＥ活性を特徴とするいかなる病態も治療するために使用され得る。「異常な」ＡＣＥ活性とは、ＡＣＥ活性が高すぎる、すなわち健康な対象より高いことを意味する。このような病態の例に高血圧前症および高血圧症がある。他の見方では、ＦＳＹ／ＦＴＹペプチドは、ＡＣＥ阻害から恩恵を受けることができるいかなる対象、例えば高血圧前症または高血圧症である、または発現のリスクにある対象を治療するために使用され得る。
【００２７】
本明細書に開示される治療応用には、ＦＳＹ／ＦＴＹペプチドがＡＣＥ阻害に有効な量で使用されることは理解されるものである。
【００２８】
したがって、態様ではさらに、薬学的に許容可能な担体または賦形剤とともにＦＳＹ／ＦＴＹペプチドを含む医薬組成物を提供する。
【００２９】
態様ではさらに、治療に使用、好ましくは血圧を低下させるおよび／または高血圧前症または高血圧症の発現または進行を予防または低減するのに使用するために、ＦＳＹ／ＦＴＹペプチドを提供する。
【００３０】
また、必要とする対象にＡＣＥ阻害に有効量の本明細書に開示のＦＳＹ／ＦＴＹペプチドを投与することを含むＡＣＥ活性を阻害する方法も提供する。
【００３１】
また、必要とする対象に薬学的に有効量の本明細書に開示のＦＳＹ／ＦＴＹペプチドを投与することを含む高血圧前症または高血圧症の発現または進行を治療または予防する方法も提供する。
【００３２】
ＡＣＥ阻害活性は、既知の方法を用いて、例えばＡＣＥ（Ｓｉｇｍａ  Ａ  ６７７８）と基質ＨＨＬ（Ｓｉｇｍａ  Ｈ  １６３５）との間の酵素反応から最終産生物の馬尿酸（ＨＡ）を計測することによって、Ｃｕｓｈｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｈｅｕｎｇ（１９７１）により報告される方法に基づいて、アッセイされてもよい。（ＣＵＳＨＭＡＮ、Ｄ．Ｗ．＆ＣＨＥＵＮＧ、Ｈ．Ｓ．（１９７１）。ラットの細胞におけるアンギオテンシン転換酵素の濃度。Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  Ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  ２５０（１）、２６１-２６５  ａｎｄ  Ｄｒａｇｎｅｓら。Ｊ  Ｆｏｏｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ２００９；２２：７１４-１７）。他の適切なアッセイは、Ｖｅｒｍｅｉｒｓｓｅｎら（２００２）、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５１（２００２），ｐａｇｅｓ  ７５−８７によって開示され、参照により本明細書に組み込まれる。端的に言えば、これは、ＡＣＥ阻害が基質フランアクリロイル-Ｐｈｅ-Ｇｌｙ-ＧｌｙおよびＡＣＥのソースであるウサギ肺アセトン抽出を用いて計測される分光光度法手法である。ＩＣ50は決定され得る。ＩＣ50は、活性が５０％阻害される濃度として定義される。
【００３３】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのＡＣＥの阻害には抗高血圧作用があり、ＦＳＹペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏの作用は高血圧のラット（ＳＨＲ）を自発的に使用してアッセイされ得る。ＳＨＲは高血圧のために広く受け入れられる動物モデルであり、適切な系統が商業的に繁殖されている。ＳＨＲは、若年時は正常な血圧であるが、年齢を重ねるにつれ、具体的には心臓収縮期の血圧が１５０ｍｍＨｇ以上の自発的で持続性の高血圧症を発現する。ＦＳＹ／ＦＴＹペプチドは、このラットにおける高血圧症を阻害する能力に関して試験され得る。阻害は完全な場合があり、すなわちいかなる高血圧症の発現も予防し、または、部分的に、治療を受けていないラットに比べて、ＦＳＹ／ＦＴＹペプチドの治療を受けたラットのほうが高血圧症の重症度が低かった。ＦＳＹ／ＦＴＹペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏでの抗高血圧作用は、他の動物でも試験され得、例えば高血圧症を患う対象に用いてまたはＦＳＹ／ＦＴＹペプチドの能力を試験することによって、血圧上昇させる１つ以上の薬剤の高血圧作用に反作用する。
【００３４】
血圧は一般的にミリメートル水銀柱（ｍｍＨｇ）で計測され、収縮期圧および拡張期圧の点から表される。収縮期圧は動脈内のピーク圧であり、心室が収縮しているときに心周期の終わり近くに起こる。拡張期圧は動脈内の最小圧であり、心室が血で満たされているときに心周期の最初近くに起こる。安静時、健康な成人の正常な計測値の例は、収縮期９０〜１２０ｍｍＨｇおよび拡張期６０〜８０ｍｍＨｇであり、例えば収縮期１１０ｍｍＨｇおよび拡張期７０（１１０／７０ｍｍＨｇと記す）である。
【００３５】
ヒトの場合、「高血圧」は、測定される毎に実質的に１４０／９０ｍｍＨｇまたはそれ以上の血圧として、典型的には定義される。つまり、１４０／９０ｍｍＨｇまたはそれ以上を「維持」する。しかしながら、「高血圧」は、正常な拡張期圧と組み合わされる高い収縮期圧、または正常な収縮期圧と組み合わされる高い拡張期圧も含む。したがって、本明細書に使用するときの「高血圧」または「高血圧症」は、収縮期圧が１４０ｍｍＨｇまたはそれ以上および／または拡張期圧が９０ｍｍＨｇまたはそれ以上を意味する。したがって、高血圧症の対象は、収縮期圧が少なくとも１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５または１７０ｍｍＨｇおよび／または拡張期圧が少なくとも９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５または１２０ｍｍＨｇであり得る。
【００３６】
血圧が１２０／８０と１３９／８９の間にあるとき、本明細書では「高血圧前症」と呼び、高血圧症を発現するリスクが増加しているヒト対象のことを示す。
【００３７】
他の動物の正常または高い血圧値は当該技術分野に知られている。
【００３８】
ＦＳＹ／ＦＴＹペプチドまたはＦＳＹ／ＦＴＹペプチドを含む組成物は、高血圧前症または高血圧症の治療または予防に使用され得る。したがって、冠動脈疾患（ＣＡＤ）または狭心症等の冠動脈心疾患（ＣＨＤ）、高血圧症、アテローム性動脈硬化、脳卒中、心筋梗塞、脳梗塞、および血管形成術後の再狭窄、不整脈、頻脈性不整脈、うっ血性心不全（ＣＨＦ）、大動脈弁逆流、脂質異常症、異常リポ蛋白血症、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害、微量アルブミン尿および糖尿病網膜症等の糖尿病を原因とする血管疾患、腎疾患、具体的には急性および慢性腎不全から選択される障害を治療または予防するのに具体的には役に立ち得る。上述のように、ＦＳＹ／ＦＴＹペプチドは、この治療応用すべてにＡＣＥ活性を阻害するために用いられる。
【００３９】
ＦＳＹ／ＦＴＹペプチドは、好ましくは、収縮期および／または拡張期の血圧を、投与後少なくとも１、２、３、４、５、６、７、１０、１４、２１または２８日間で、好ましくは約７日後に、少なくとも約１、約２、約３または約４ｍｍＨｇ、より好ましくは、少なくとも約５、６、７または８ｍｍＨｇ、好ましくは、少なくとも約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４または約１５ｍｍＨｇ、例えば約１〜２０、約２〜１５、約３〜１０または約５〜１０ｍｍＨｇ下げることができる。
【００４０】
いくつかの実施形態では、ＦＳＹ／ＦＴＹペプチドは、収縮期圧および／または拡張期圧の上昇を抑制する。この抑制は完全であり得、収縮期および／または拡張期の血圧を安定的に維持し、または、部分的に、収縮期および／または拡張期の血圧のいかなる上昇もゆっくりと低下させ得る。このような抑制は、例えば、ＦＳＹ／ＦＴＹペプチド投与前の期間に渡る収縮期および／または拡張期の血圧の任意の変化と、ＦＳＹ／ＦＴＹペプチド投与中の期間に渡る変化を比較することによって、評価され得る。ＦＳＹ／ＦＴＹペプチドを受けている対象の収縮期および／または拡張期の血圧の任意の変化とプラセボまたは治療を受けていない対照被験者を比較することによっても、評価されてもよい。
【００４１】
例えばヒトおよび家畜動物または実験動物という任意の家畜といったいかなる哺乳動物も治療され得る。特定の例として、マウス、ラット、ブタ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ウサギ、ウシおよびサルが挙げられる。しかしながら、哺乳動物はヒトが好ましい。
【００４２】
用語「療法」または「治療」は、本明細書に使用するとき、確立された障害の治療的治療だけでなく、疾患を予防し得る予防療法も含む。用語「療法」または「治療」は、疾患と戦うまたは治癒するだけでなく、疾患またはそれに関連する1つ以上の症状の制御、減少または緩和も含む。
【００４３】
「有効量」は、本明細書に使用するとき、治療の本質に依拠して、治療有効量または予防有効量を意味する。治療有効量は、望まれる治療結果を達成するのに（適切な用量および投与レジームで）必要な量であると考えることができる。予防有効量は、望まれる予防結果を達成するのに（適切な用量および投与レジームで）必要な量であると考えることができる。その量は、疾患の重症度だけでなく、患者の体重、年齢および性別によっても変化する可能性がある。有利に、ＦＳＹ／ＦＴＹペプチドはＡＣＥ阻害有効量で使用され、好ましくは本明細書に挙げるいかなる病態の予防および／または治療的治療に効果的である。
【００４４】
態様ではさらに、本発明はＦＳＹ／ＦＴＹペプチドおよび任意にその他の成分を含む栄養補助食品組成物を提供する。用語「栄養補助食品」は、本明細書に使用するとき、栄養上の利益の他に健康上の利益を提供し得る。本発明の栄養補助食品にはＡＣＥ阻害活性がある。したがって、栄養補助食品は好ましくは血圧を下げ、および／または高血圧の発現または進行を予防または低減し得る。あるいはまたはさらに、とりわけ動物飼料として動物に与えると、免疫反応を刺激し、および／または成長を刺激し得る。
【００４５】
栄養補助食品組成物はサプリメントとして処方され得、例えばカプセル、錠剤または粉薬等の固形製剤、または溶液または懸濁液等の液体製剤があり得る。また、１つ以上の食用材料と組み合わせてまたは組み込んで、ヒト用食物、または非ヒト動物用飼料としても処方され得る。食用材料は固体でも液体であってもよい。
【００４６】
本発明のペプチドまたは栄養補助食品組成物を含むように形成され得る食品の例として、限定されないが、インスタント粉製品、キャンディーバーまたはタンパク質バー等の食品バー、肉および肉類似製品、魚または魚類似製品、朝食シリアル、植物性脂肪スプレッド、マヨネーズ、乳製品、豆乳製品、パスタ、麺、パン、ペストリー、ケーキおよびビスケット等の焼き物食品、レディーミール、乳児用調製粉乳およびベビーフードが挙げられる。
【００４７】
乳製品の適切な例として、バター、チーズ、アイスクリーム、ヨーグルト、ホイップクリーム、サワークリームおよびカッテージチーズが挙げられる。肉製品の例として、限定されないが、パテ、ハム、スパム、ソーセージおよび脂肪のない肉（ｗｈｏｌｅ  ｍｕｓｃｌｅ  ｍｅａｔ）等の加工肉が挙げられる。肉類似製品は、コーン（ｑｕｏｒｎ）または豆腐等の表面を肉にまねた肉様の野菜、真菌または乳タンパク質であってもよい。
【００４８】
本発明に記載のペプチドまたは栄養補助食品組成物を含むように形成され得るタンパク質を添加して栄養強化した液体飲料の限定されない例として、炭水化物を添加して栄養強化したソフトドリンク、ビール、フルーツジュース、フルーツの味がする飲料、野菜飲料、スポーツドリンク、豆乳飲料、粥飲料、乳児用調製粉乳、ミルク、ミルクの味がする飲料、ヤギミルク、液体ヨーグルト、バターミルクまたはその組み合わせが挙げられる。
【００４９】
本発明に記載のペプチドまたは栄養補助食品組成物を含むように形成され得る飼料は、ペットフードを含む任意の動物飼料であってもよい。飼料は乾燥または水分を含んだ形式でもよい。
【００５０】
食物、飼料または栄養補助食品組成物の典型的な成分として、ＦＳＹ／ＦＴＹペプチドの他に、粗タンパク質、粗脂肪、炭水化物、多糖類、スターチ、粗繊維、灰、ミネラル、微量元素、ビタミン、脂肪酸、タンパク質、ペプチド（ＦＳＹ／ＦＴＹペプチド以外の）、アミノ酸、ハーブ、脂質、抗酸化剤、カロチノイド、トコフェロール、トコトリエノール、フィトステロール、ポリフェノール、ビオフラボノイドおよび／または食物繊維が挙げられ得る。したがって、これは栄養補助食品組成物を調製するために使用され得る適切な食用材料の全例である。
【００５１】
動物飼料は、大部分の食物と同様に、炭水化物を含有する物質、タンパク質を含有する物質、および脂質を含有する物質から選択される１つ以上の成分を一般的に含有し、本発明の飼料はこの成分、好ましくは成分すべての組み合わせを１つ以上含有し得る。
【００５２】
適切なスターチを含む飼料／食物成分は、例えばトウモロコシ、大豆、コムギ、モロコシ、オオムギ、エンバク、およびその組み合わせから選択される穀物に由来し得る。適切なスターチを含む物質として、限定されないが、トウモロコシ粉、ひいたトウモロコシ、大豆粉、小麦粉、ひいたエンバク粉、シャープス、大豆かす、トウモロコシ粗粒、およびその組み合わせが挙げられる。
【００５３】
例えば魚粉、乾燥乳清、大豆かす等の粗タンパク質を含む物質、およびその混合物を使用することができる。他の適切なタンパク質を含む物質として、限定されないが、大豆タンパク質濃縮、大豆粉、血粉、血漿タンパク質、乾燥スキムミルク、乳清タンパク質濃縮、カノーラ粉、コーングルテンミール、小麦グルテンミール、イースト、ひまわり油かす、およびその組み合わせが挙げられる。
【００５４】
適切な脂肪を含む物質として、限定されないが、ラード、獣脂、大豆油、レシチン、ココナッツ油、乳清・脂肪混合物（ｗｈｅｙ-ｆａｔ  ｂｌｅｎｄ）、およびその組み合わせが挙げられる。
【００５５】
本発明のＦＳＹ／ＦＴＹペプチドは、微生物にとって培地または栄養補助剤としても形成され得る。
【００５６】
本発明の栄養補助食品組成物は、ＦＳＹ／ＦＴＹペプチドの適切（すなわち有効）用量を対象に投与するのに十分な量のＦＳＹ／ＦＴＹペプチドを含有し得、適切用量については医薬組成物の文脈で上に説明している。
【００５７】
本発明の栄養補助食品組成物は、陸生および水性動物を含むいかなる動物にも食物または飼料として提供され得る。動物は哺乳動物、魚類、鳥類、脊椎動物または無脊椎動物、例えば貝類、家畜（ｌｉｆｅｓｔｏｃｋ）、ペットおよびヒトであってもよい。
【００５８】
態様ではさらに、ＦＳＹ／ＦＴＹペプチドを含む栄養補助食品組成物を調製する方法を提供する。当該方法は、ＦＳＹ／ＦＴＹペプチドを食用材料と組み合わせることを含み得る。適切な食用材料は上に説明する。
【００５９】
もう１つ別の態様では、ＦＳＹ／ＦＴＹペプチドで強化される食物、飲料または飼料を調製する方法を提供する。当該方法はＦＳＹ／ＦＴＹペプチドを食用材料と組み合わせること、またはＦＳＹ／ＦＴＹペプチドを食物、飲料または飼料に組み込むことを含み得る。適切な食物、飲料または飼料は上に説明する。
【００６０】
もう１つ別の態様では、本発明は、本明細書に開示のＦＳＹ／ＦＴＹペプチドをコードする核酸分子を提供する。さらに、このような核酸分子の成分も提供する。好ましくは、核酸分子はプロモーター配列、および／または本明細書に開示のペプチドをコードする配列に操作可能に接続される転写開始点、および／または本明細書に開示のペプチドをコードする配列に操作可能に接続される転写または翻訳の終端配列を含む。
【００６１】
本発明の核酸分子は少なくとも９ヌクレオチドおよび好ましくは８００ヌクレオチド以下、より好ましくは５００、４００、３００、２００、１５０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０または１５ヌクレオチド以下を含む。核酸分子は好ましくは単離分子である。ＦＳＹ／ＦＴＹペプチドおよびその成分をコードする核酸鎖を含む一本鎖分子または二本鎖分子であってもよい。
【００６２】
転写開始コドンは一般的に、常にメチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）に翻訳され、核酸は典型的にメチオニンで開始するペプチドをコードする。したがって、配列ＭＦＳＹまたはＭＦＴＹからなるペプチドをコードし得、この配列を含む、または、からなるペプチドはさらに本発明の態様である。好ましくは、最初のメチオニンは切断可能なシグナル配列の部分であり、ペプチドの切断により配列ＦＳＹまたはＦＴＹからなるペプチドを放出することができる。
【００６３】
態様はさらに本明細書に定義の核酸分子を含むベクターに関する。ベクターはまた、複製の開始点、抗生物質耐性等の選択可能なマーカー、および／または複数のクローニングサイトに典型的に認められる要素も含み得る。ベクターはさらに発現ベクターであってもよく、例えば転写および／または翻訳の調節または核酸分子の発現のための調節エレメントといった要素をさらに含み得る。このような調節要素、例えばプロモーター、リボソーム結合サイト、エンハンサー、ターミネーター等は当該技術分野によく知られ、広く記述されている。
【００６４】
ベクターは、例えばプラスミドまたはウイルスであってもよく、好ましくはレトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノウイルスに関連するウイルスから選択される。
【００６５】
核酸は、本明細書に開示のいかなる態様においてもＦＳＹ／ＦＴＹペプチドの代わりに、または、に追加して使用され得る。したがって、もう１つ別の態様では、本発明は本明細書に定義の核酸分子および／または本明細書に定義のベクターを含む医薬組成物を、薬理学的に（薬学的に）許容可能な賦形剤とともに提供する。使用、とりわけ核酸の医薬の使用はさらに本発明の態様を表す。
【００６６】
もう１つ別の態様では、上に記述される核酸分子および／またはベクターを含有する組換え宿主細胞を提供する。宿主細胞は任意の原核生物または真核生物の細胞であってもよく、例えば大腸菌といったバクテリアおよびイースト細胞が好まれる。
【００６７】
ペプチドは、典型的にはペプチド結合とも呼ばれるアミド結合を経由して、少なくとも２つのアミノ酸を接続することによって形成される分子である。したがって、ペプチドは少なくとも２つのアミノ酸を含む、または、からなる。２つのアミノ酸からなるペプチドはジペプチド、３つのアミノ酸からなるペプチドはトリペプチド等と呼ばれる。２〜２０のアミノ酸からなるペプチドはオリゴペプチドとして意味され得、約５０未満のアミノ酸を持つペプチドはポリペプチドとして意味され得る。用語「タンパク質」は、大きなポリペプチドまたはポリペプチドの複合体を意味するために典型的に使用される。
【００６８】
本明細書にＦＳＹ／ＦＴＹ「ペプチド」と言及されるものはいずれも、ペプチドの形式で存在する分子を意味し、詳述される配列を含むタンパク質を含まないことを理解されるものである。「ペプチドの形式で存在する」とは、分子にはすなわち２〜５０アミノ酸というペプチドの大きさがあることを意味し、タンパク質等のもっと大きな実体の必須部分ではない。したがって、ペプチドは「遊離」または「単離」形式にあることを意味する。したがって、ＦＳＹ／ＦＴＹペプチドを含む組成物は、ＦＳＹ／ＦＴＹペプチドがペプチドの形式で存在する組成物である。
【００６９】
本発明のＦＳＹ／ＦＴＹペプチドおよび核酸分子は、一般的に、動物、植物、菌類または原核生物または有機体に由来する試料等の生態系内に、インサイツに存在し得るいかなる要素からも区別される限りでは、「単離された」または「精製された」分子である。しかしながら、配列は、有機体に認められる配列に対応しまたは実質的に相同であり得る。したがって、核酸分子または配列およびペプチドに言及して本明細書に使用されるときの用語「単離される」または「精製される」は、自然環境から単離、精製、または実質的に自由である、例えば、有機体から単離または精製されるときの分子を意味し、または技法的方法によって産生されるときの分子を意味し、すなわち組換えおよび合成的に産生された分子を含む。
【００７０】
したがって、このような用語は、核酸分子に関連して使用されるとき、他の核酸／遺伝子またはポリペプチド等の自然に関連している物質が実質的にない核酸を意味し得る。この用語はまた、組換えＤＮＡ技法によって産生されるときの細胞形質成分または培地が実質的になく、または化学的前駆体、または化学的合成時のその他の化学物質が実質的にない核酸も意味し得る。単離または精製された核酸はまた、核酸が由来する核酸に自然に隣接する配列（すなわち核酸の５‘および３’末端に位置する配列）、または、例えば遺伝子工学によって核酸に隣接させる配列（例えば、タグ配列または治療的価値のない他の配列）が実施的にない。
【００７１】
したがって、ペプチドに関連して使用されるとき、用語「単離される」または「精製される」は、細胞形質成分またはそれが由来するソースからのその他のタンパク質が実施的にないペプチドを典型的に意味する。いくつかの実施形態では、具体的には、ペプチドがヒトまたは動物に投与される場合に、このような単離または精製されたペプチドは、組換え技法による産生時の培地、または化学的前駆体、または化学的合成時の他の化学物質が実質的にない。このような単離または精製されたペプチドはまた、単離された核酸分子について、上述の配列等のフランキング配列もない。用語「遊離ペプチド（ｆｒｅｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ）」は、ペプチドがタンパク質の部分を形成しないことを示すために便宜上使用され得る。
【００７２】
本発明の医薬組成物は、当該技術分野に知られおよび文献に広く記述されている任意の通常の手法に従って調製される。したがって、ＦＳＹ／ＦＴＹペプチドは、他の活性物質（例を以下に記す）、１つ以上の通常の薬学的に許容可能な担体、希釈液および／または賦形剤等とともに任意に組み込まれてもよく、組成物のために特に使用するのに適しており、投与に適切である、または適切にさせる通常の製剤を産生する。液体、半固体または固体、例えば溶液、分散液、懸濁液、錠剤、丸薬、粉薬、小袋、カシェ剤、エリキシル剤、乳剤、シロップ等として処方されてもよい。例えば胃液耐性のある製剤として、および／または持続作用形式で提供されてもよい。経口、非経口、局所、直腸、生殖器、皮下、経尿道、経皮、鼻腔内、腹腔内、筋肉内および／または静脈内投与に、および／または吸入による投与に適した剤形でもよい。好ましい剤形は意図される投与様式および治療応用による。
【００７３】
代表的な実施形態では、医薬組成物はリポソーム型投与に適した剤形にあり、好ましくは、医薬組成物を含有するリポソームが提供される。リポソームを使用する時、必ずしも賦形剤をさらに含む必要はなく、ＦＳＹ／ＦＴＹペプチド、本明細書に記載の核酸分子および／または本明細書に記載のベクターを含有するリポソームを提供してもよい。
【００７４】
好まれる投与様式は経口である。生理的にに適合するいかなる担体、賦形剤、希釈剤、緩衝液または安定剤も本発明の組成物に使用してもよい。適切な担体、賦形剤、希釈剤、緩衝液および安定剤の例として、水、生理食塩水、リン酸処理された生理食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノール等の１つ以上の他に、その組み合わせも挙げられる。いくつかの場合では、等張剤、例えば糖、多価アルコール（例えばマンニトール、ソルビトール）、または塩化ナトリウムを含んでもよい。組成物はその他に、平滑剤、湿潤剤、乳化剤、沈殿防止剤、保存剤、甘味料、香料等を含んでもよい。本発明の組成物は、当該技術分野に良く知られている方法を用いて、対象に投与後、活性成分の放出を速く、持続的にまたは遅らせるために処方されてもよい。腸溶コーティングを任意に使用してもよい。
【００７５】
ＦＳＹ／ＦＴＹペプチドの他に、組成物はさらに、高血圧（前）症を治療するのに役に立つ他の薬剤等のさらに有効な成分を１つ以上含んでもよく、例として、ＡＣＥ阻害剤、アンギオテンシンＩＩ受容体ブロッカー（ＡＲＢ）薬、β-ブロッカー、利尿薬、カルシウムチャネルブロッカー、α-ブロッカー、および末梢血管拡張薬が挙げられる。好ましくは、さらに有効な成分は、さらに強力なＡＣＥ阻害剤であり、好ましくはペプチドである。したがって、１つ以上のさらに強力なＡＣＥ阻害ペプチドを組み合わせたＦＳＹ／ＦＴＹペプチドを含む医薬組成物または栄養補助食品組成物が提供される。さらなるＡＣＥ阻害ペプチドは、例えばＬＦ、ＦＬ、ＬＹ、ＬＶＫ、ＮＰＫ、ＮＶＹ、ＫＬＰ、ＬＹＫ、ＬＮＡ、ＬＶＡＫ、ＬＶＡＨ、ＬＬＴＫ、ＡＬＰＨ、ＬＬＬＫ、ＬＮＰＫおよびＶＬＡＨから選択される配列を含む、または、からなってもよい。好ましくは、このリストから選択される少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３ペプチドがある。
【００７６】
上述したように、ＦＳＹ／ＦＴＹペプチドはコア配列を含有するが、１つ以上のフランキング配列および／または修飾も含み得る。したがって、態様ではさらに、少なくとも２つの異なるＦＳＹ／ＦＴＹペプチドを含む、または、からなる組成物を提供する。１つ以上のさらに強力なＡＣＥ阻害ペプチドも上で説明したように存在する。２つのＦＳＹ／ＦＴＹペプチドは、コア配列、フランキング配列（複数可）および／または修飾（複数可）が互いに異なる。したがって、本明細書に開示のいかなる態様の実施形態にも、２つ以上の異なるＦＳＹ／ＦＴＹペプチドが存在し得る。ＦＴＹペプチドと組み合わせたＦＳＹペプチドがとりわけ好まれる。
【００７７】
日々の適切な用量は容易に決定することができ、例えば１日に約１〜５ｍｇ、例えば約３ｍｇが適当であり得る。典型的な日々の用量は、対象の体重に依存し得る。専門的技術がある人間は１日あたり単一用量を投与することによって、または１日あたり２回またはそれ以上の低用量を投与することによって、適切な用量を達成できると解釈するだろう。
【００７８】
本発明の医薬組成物はしたがって、固体用量単位につき適量のＦＳＹ／ＦＴＹペプチド、例えば錠剤あたり約３ｍｇ、または液体製剤での対応する用量を含有するだろう。
【００７９】
態様ではさらに、ＦＳＹ／ＦＴＹペプチドを含む医薬組成物を調製する方法を提供する。当該方法は、薬学的に許容可能な担体、希釈液および／または賦形剤とともにＦＳＹ／ＦＴＹペプチドを組み込み、投与に適切なまたは適切にさせることのできる医薬組成物を産生することを含み得る。適当な担体、希釈剤および賦形剤については上述する。
【００８０】
もう１つ別の態様では、ＡＣＥ活性を阻害するｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法を提供し、当該方法はＦＳＹ／ＦＴＹペプチドの使用を含む。具体的には、ＦＳＹ／ＦＴＹペプチドは、細胞溶解物、細胞または組織試料内のＡＣＥの活性を調節するために使用され得る。このことはさらに、ＡＣＥおよびＡＣＥ阻害の効果への洞察を提供し得る。
【００８１】
表１は多くの様々なペプチドのＡＣＥ阻害活性の比較分析の結果を示す。
【００８２】
発明は以下の制限されない実施例に詳細に記載される。
実施例１
【００８３】
ＦＳＹペプチドは酵素アッセイを経由して分析し、ＡＣＥは基質ヒプリル-ヒスチジル-ロイシン（ＨＨＬ）から馬尿酸（ＨＡ）を産生する。ＨＡの濃度は定量的ＨＰＬＣ分析によって測定され、低下した濃度は阻害効果と相互関係があった。ＡＣＥ阻害活性は、本質的にはＤｒａｇｎｅｓら、Ｊ  Ｆｏｏｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ２００９；２２：７１４-１７に記載されているように、ＡＣＥ（Ｓｉｇｍａ  Ａ  ６７７８）と基質ＨＨＬ（Ｓｉｇｍａ  Ｈ１６３５）の間の酵素反応から最終産生物である馬尿酸（ＨＡ）を計測することによって、Ｃｕｓｈｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｈｅｕｎｇ（１９７１）によって報告された方法に基づいて究明にされた。ｐＨ８、３の１００ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液中の２ｍＭ  ＨＨＬで量１００μｌは、２５μｌの阻害剤（ホウ酸ナトリウム緩衝液に希釈したＦＳＹペプチド）で、３７℃で３０分間プレインキュベートした。その後、５０μｌのＡＣＥ（１０ｍＵ）を添加することによりアッセイを初期化した。酵素反応は、２１５μｌの１Ｍ  ＨＣｌを添加することにより停止した。
【００８４】
定量的ＨＰＬＣ分析は、対称シールド逆相Ｃ-１８インテリジェントスピードカラム（Ｓｙｍｍｅｔｒｙ-Ｓｈｉｅｌｄ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｈａｓｅ  Ｃ-１８  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｓｐｅｅｄ  ｃｏｌｕｍｎ）を用いて、島津（島津製作所、日本）製で実施した。ＨＡは、０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液およびＨＰＬＣグレードアセトニトリルからなる移動相を用いて、雰囲気温度で溶出した。２分間の直線勾配を用いて、５％アセトニトリルでの０．５分間の定組成溶離の後開始し、９０％アセトニトリルで終了した。流速は２ｍＬ／分を維持し、ＵＶ吸収は２２８ｎｍで計測した。ＡＣＥ活性の５０％を阻害するために必要とされるＡＣＥ阻害剤の濃度は、ＩＣ50として定義した。ＦＳＹペプチドのＩＣ50は、ＩＣ50を１．７μＭまで下げ、典型的な計測値は約２．２μＭにするといういくつかの決定事項で、平均約４μＭであることを究明した。
【００８５】
ＩＣ50を計測するためにＶｅｒｍｅｉｒｓｓｅｎら（上）による方法を使用したとき、約７．７μＭの値が計測された。
実施例２
【００８６】
配列ＦＴＹを有するＦＳＹペプチドの変異体のＡＣＥ阻害活性は、実施例１に記述の方法を用いてアッセイした。ＦＴＹペプチドのＩＣ50は、Ｄｒａｇｎｅｓら（上）の方法を用いると約５９μＭであり、Ｖｅｒｍｅｉｒｓｓｅｎら（上）の方法を用いると約２７４μＭであることが測定された。
実施例３
【００８７】
ＩＣ50値の測定は、正確なアッセイ条件に依存し、別々のアッセイで測定したＩＣ50値に意味のある比較を行うことを困難にした。そこで、ＦＳＹペプチドのＡＣＥ阻害活性を既知のＡＣＥ阻害ペプチドと比較するために、比較分析を実施した。ＡＣＥ阻害活性は、実施例１に記述のＤｒａｇｎｅｓらの方法を用いてアッセイした。結果は表１に示す。
【表１】
0005879356.tif 000002