(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
膵臓癌由来のＢＳＤＬまたはＦＡＰＰに対する結合に対して、モノクローナル抗体１６Ｄ１０と競合する抗体、またはそのフラグメントもしくは誘導体であって、１：１０および１：１００の間のモノクローナル抗体１６Ｄ１０対前記抗体の比で、膵臓癌由来のＢＳＤＬまたはＦＡＰＰに対するモノクローナル抗体１６Ｄ１０の結合を、少なくとも７０％だけ減少させる、ここで、モノクローナル抗体１６Ｄ１０は、２００４年３月１６日に番号Ｉ−３１８８の下でパリのＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）に寄託されたハイブリドーマによって産生され得る抗体である、抗体、またはそのフラグメントもしくは誘導体。
【請求項２】
請求項１に記載の抗体であって、膵臓癌由来のＢＳＤＬまたはＦＡＰＰに対する結合に対する前記抗体およびモノクローナル抗体１６Ｄ１０の間の競合が、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロット、またはＢＩＡＣＯＲＥ分析によって評価される、抗体。
【請求項３】
請求項１または２に記載の抗体であって、１：１０および１：１００の間のモノクローナル抗体１６Ｄ１０対前記抗体の比で、膵臓癌由来のＢＳＤＬまたはＦＡＰＰに対するモノクローナル抗体１６Ｄ１０の結合を、少なくとも９０％だけ減少させる、抗体。
【請求項４】
ヒト化されているか、キメラかまたはヒト抗体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項５】
ＩｇＧ型である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項６】
一本鎖抗体である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項７】
インビボまたはインビトロで膵臓の病状を検出するために使用し得る診断組成物を調製するための請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体の使用。
【請求項８】
膵臓の病状が膵臓癌である、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
被験体由来の生物学的サンプルと請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体とを接触させ、前記抗体と前記生物学的サンプルとの間の免疫反応から生じる免疫複合体の形成を検出することを含んでなる、膵臓の病状を患う被験体をインビトロで検出するための情報を得るための方法。
【請求項１０】
前記生物学的サンプルが膵臓組織のサンプルである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記生物学的サンプルが、膵液、血清および尿の中から好適に選択される生物学的液体である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
膵臓の病状が膵臓癌である、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体、および場合により、生物学的サンプルと前記抗体との間の免疫反応から生じる免疫複合体を検出するための手段を含んでなる、膵臓の病状の診断のためのキット。
【請求項１４】
被験体の尿を回収し、前記尿と、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体とを接触させ、前記抗体と前記尿との間の免疫反応から生じる免疫複合体の形成を検出することを含んでなる、膵臓の病状を患う被験体をインビトロで検出するための情報を得るための方法。
【請求項１５】
膵臓の病状が膵臓癌である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体を含んでなる医薬組成物。
【請求項１７】
膵臓疾患の予防的または治療的処置を目的とする医薬品を調製するための請求項１６に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１８】
膵臓疾患が膵臓癌である、請求項１７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膵構造から誘導される糖ペプチド、抗体ならびに診断および治療におけるそれらの応用に関する。
【０００２】
より具体的には、本発明は、Ｉ型糖尿病を患う患者において誘導される抗体によって認識され、ヒトまたは動物由来の生物学的液体から精製される多様なグリコシル化エピトープを（単独または組み合わせで）担持するＢＳＤＬおよび／またはＦＡＰＰの天然のＣ−末端糖ペプチドを得ること、ならびにＦＡＰＰおよび／またはＢＳＤＬのＣ末端ペプチドをコードするｃＤＮＡおよび前記糖ペプチドを組み立てるのに必要な異なるグリコシルトランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡを含有する細胞系統から生物工学によって産生される前記組換え糖ペプチドに関する。本発明はまた、ＢＳＤＬおよび／またはＦＡＰＰの組換えならびに／あるいは天然のＣ−末端糖ペプチドを認識するモノクローナル抗体、ならびに糖尿病および膵外分泌部の癌のような膵臓の病状または他の任意の病状ならびに前記病状の治療もしくは予防プロトコルにおける診断あるいは予防的または治療的処置に使用することができる免疫原性因子、診断薬および治療用薬剤としての前記糖ペプチドならびに前記モノクローナル抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
膵外分泌部の癌は、消化器癌の２０％を占め、最も進行性のものの１つである。仏国では、例えば、毎年４，０００例の新たな症例が診断される。さらに、その頻度は、世界の多くの地域で顕著に上昇している。１年生存率は２０％以下、５年生存率は３％以下であり、平均生存期間は診断後３〜４箇月である。癌は診断されるのが遅く、主に腹膜および肝転移の形成を介して、迅速に進行する。さらに、腫瘍が解剖学的に深部に局在すること、高感度かつ特異的な早期生物学的マーカーが存在しないことおよびその無症候性のため、診断は常に遅れる。現在、化学療法および放射線に対して難治性を示す膵外分泌癌の有効な治療は認められていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従って、これらの疾患を診断するために利用可能な膵臓癌または他の膵臓の病状の特異的マーカーを有し、有効な処置を提供するための製品を有することが所望される。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
今回、広範な研究後、かつ驚くべき様式で、本出願人らは、膵臓腫瘍細胞の表面で発現される膵臓の病状、特に、膵臓癌の特異的マーカーを見出した。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本出願人らは、糖尿病患者において、胆汁酸塩依存性リパーゼ（ＢＳＤＬ）のＣ末端ペプチドのグリコシル化抗原構造に対して指向された循環抗体を見出した。
【０００７】
本出願人らはまた、ヒト胎児膵腺房タンパク質（ｈｕｍａｎ  ｆｅｔｏａｃｉｎａｒ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＦＡＰＰ）のＣ末端部において発現されるグリコシル化エピトープに対するモノクローナルおよびポリクローナル抗体が、ヒト膵臓腫瘍細胞系統を特異的に認識するが、膵臓由来ではない腫瘍細胞は認識しないことを見出した。
【０００８】
本出願人らはまた、ヒト胎児膵腺房タンパク質（ＦＡＰＰ）のＣ末端部において発現されるグリコシル化エピトープに対するモノクローナルおよびポリクローナル抗体が、ヒト膵臓腫瘍細胞系統を特異的に認識するが、正常な膵臓組織は認識しないことを見出した。
【０００９】
本出願人らは、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰのＣ末端部において発現されるグリコシル化エピトープに対する抗体が尿中のＢＳＤＬ−およびＦＡＰＰ−由来糖ペプチドを検出し得ることを見出した。特に、ＦＡＰＰのＣ末端部において発現されるグリコシル化エピトープに対する抗体は、尿中の糖ペプチドを検出し得、膵臓の病状、特に、膵臓癌を伴う被験体を同定することが可能である。
【００１０】
従って、より具体的には、本出願人らは、糖ペプチド構造を有する化合物であって、そのペプチド部は、正常な膵分泌物に存在するＢＳＤＬ、消化性脂質分解酵素の反復Ｃ末端配列に基づくか、またはＦＡＰＰ（ＢＳＤＬの癌胎児性形態）の反復Ｃ末端配列に基づく上記化合物が、膵臓の病状のそのような特異的マーカーを構成することを見出した。
【００１１】
実際、ＢＳＤＬおよびＦＡＰＰは、配列Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒおよびグリコシル化部位を有する７アミノ酸を伴う一般的な不変部を含んでなる１１アミノ酸の反復Ｃ末端ペプチド配列を含んでなる。前記一般的な不変部は、しばしばグルタミン酸によって置換されるグリシンによっていずれか一方の部位において隣接され、Ｎ末端側においてアミノ酸ＡｓｐおよびＳｅｒを含有する。
【００１２】
本出願人らはまた、宿主細胞によって、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）からの発現および分泌によって調製され得る糖ペプチド構造を有する化合物であって、Ｃ末端ペプチドの１つもしくはそれ以上の反復配列、特にＢＳＤＬの組換え体、例えば、１６反復配列のすべてまたは一部をコードするＤＮＡ分子を含む遺伝子構築物を含んでなり、また、特に、コア２β（１−６）Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、α（１−３）およびα（１−４）フコシルトランスフェラーゼ活性を有するフコシルトランスフェラーゼＦＵＴ３、またはα（１−３）フコシルトランスフェラーゼ活性のみを有するフコシルトランスフェラーゼＦＵＴ７よりなる群において選択されるオース−トランスフェラーゼ（ｏｓｅ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）活性を伴う少なくとも１つの酵素をコードするＤＮＡ分子などの遺伝子構築物を含んでなる上記化合物が、膵臓癌の前記特異的マーカーを構築することを見出した。
【００１３】
従って、本出願は、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰの１１アミノ酸よりなる１〜４０反復Ｃ末端ポリペプチドを含んでなる特に組換え体の、おそらく単離または精製された糖ペプチドを対象物として有し、前記ポリペプチドは、グリコシル化され、Ｉ型糖尿病を伴う患者において誘導される抗体との特異的免疫反応を惹起するグリコシル化エピトープを担持し、そして
−  またはそうでなければヒトまたは動物由来の生物学的液体から精製され、
−  またはそうでなければ、組換え体であり、グリコシル化を引き起こすのに必要な酵素機構を含んでなる従来の宿主細胞における発現によって産生され、前記宿主細胞は、前記ポリペプチドをコードする遺伝子ならびにグリコシルトランスフェラーゼから、ならびに特に、コア２β（１−６）Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（Ｃ２ＧｎＴと略称される）、α（１−３）ガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ３（ＦＵＴ３と略称される）およびフコシルトランスフェラーゼ７（ＦＵＴ７と略称される）から選択される１つもしくはそれ以上の酵素をコードする遺伝子を含んでなるように遺伝子改変されている。
【００１４】
本発明の実施の他の好適な条件において、上記糖ペプチドは、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰの１１アミノ酸を伴う１〜４０グリコシル化反復Ｃ末端ペプチドより本質的になり、前記グリコシル化ペプチドより特に独占的になる。それ故に、従って、本発明は、１１アミノ酸、好ましくは：Ｄ−Ｓ−Ｇ／Ｅ−Ａ−Ｐ−Ｐ−Ｖ−Ｐ−Ｐ−Ｔ−Ｇ／Ｅ（配列番号１４）の反復Ｃ末端ペプチド配列の反復を含んでなるか、または本質的になる単離された、精製されたまたは組換え糖ペプチドに関する。前記糖ペプチドは、１〜４０反復を含有することができる。好適な実施形態では、前記糖ペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０反復を含んでなる。好ましくは、糖ペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０反復を含んでなる。特定の実施形態では、糖ペプチドは、１、２、３、４、５、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０反復を含んでなる。別の代替的な実施形態では、糖ペプチドは、１〜１５の間の反復（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５反復）、好ましくは、２〜１０の間の反復（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０反復）を含んでなる。さらなる実施形態では、糖ペプチドは、１７〜４０の間の反復（例えば、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０反復）を含んでなる。本発明を行うための好適な条件において、上記の糖ペプチドは、１〜４０、好ましくは、４〜２５、より具体的には、６〜１６反復Ｃ末端ポリペプチドを含んでなる。特定の実施形態では、糖ペプチドは、６反復を含んでなるか、または本質的になる。
【００１５】
好ましくは、本発明に従う糖ペプチドは、コア２β（１−６）Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（Ｃ２ＧｎＴ）、α（１−３）およびα（１−４）フコシルトランスフェラーゼ活性を有するフコシルトランスフェラーゼＦＵＴ３、またはα（１−３）フコシルトランスフェラーゼ活性のみを有するフコシルトランスフェラーゼＦＵＴ７よりなる群において選択されるオース−トランスフェラーゼ活性を有する１つもしくはそれ以上の酵素によってグリコシル化される。特定の実施形態では、本発明に従う糖ペプチドは、酵素Ｃ２ＧｎＴおよびＦＵＴ３によってグリコシル化されている。代替的実施形態では、本発明に従う糖ペプチドは、酵素Ｃ２ＧｎＴおよびＦＵＴ７によってグリコシル化されている。本発明はまた、酵素Ｃ２ＧｎＴ、ＦＵＴ３およびＦＵＴ７によってグリコシル化されている糖ペプチドを包含する。好適な実施形態では、本発明に従う糖ペプチドは、α（１−３）ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧＴ）によってさらにグリコシル化されている。従って、本発明に従う糖ペプチドが組換え体である場合、それを産生する宿主細胞は、前記ポリペプチドをコードする遺伝子ならびにグリコシルトランスフェラーゼから、特に、Ｃ２ＧｎＴ、ＦＵＴ３およびＦＵＴ７のなかから選択される１つもしくはそれ以上の酵素をコードする遺伝子を含んでなる。好適な実施形態では、前記宿主細胞は、α（１−３）ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧＴ）をコードする遺伝子をさらに含んでなる。
【００１６】
特に好適な実施形態では、本発明は、配列番号１４に記載され、コア２β（１−６）Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（Ｃ２ＧｎＴ）、α（１−３）およびα（１−４）フコシルトランスフェラーゼ活性を有するフコシルトランスフェラーゼＦＵＴ３、またはα（１−３）フコシルトランスフェラーゼ活性を有するフコシルトランスフェラーゼＦＵＴ７よりなる群において選択されるオース−トランスフェラーゼ活性を有する１つもしくはそれ以上の酵素によってグリコシル化されるペプチド配列の１〜４０反復を含んでなる組換え体の、単離または精製された糖ペプチドに関し、前記糖ペプチドは、α（１−３）ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧＴ）によってさらにグリコシル化される。
【００１７】
「単離された糖ペプチド」は、前記化合物がそれらの天然の環境から分離されることを意味すると理解される。従って、前記化合物は、それらの天然の環境の他の成分のいくつかまたはすべてから分離される。
【００１８】
「精製された糖ペプチド」は、前記化合物が、少なくとも約１、好ましくは、少なくとも２、３、４または５倍の因数だけ、混合物において富化されることを意味すると理解される。用語「精製された」は、化合物が絶対的に純粋であることを必ずしも意味しない。例えば、前記化合物は、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％の純度を有することができる。しかし、好ましくは、前記化合物は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動において唯一の単一のバンドを生じる。
【００１９】
それらが得られる任意の適切な分離および／または精製方法を使用することができる。特定の実施形態では、糖ペプチドは、ヒトまたは動物被験体由来の生物学的液体から精製される。生物学的液体は、血清、尿、膵液および乳汁分泌物よりなる群において選択され得る。好ましくは、生物学的液体は尿である。好適な実施形態では、被験体は、膵臓疾患、好ましくは、膵臓癌を患い得るかまたは患っている患者である。別の実施形態では、糖ペプチドは、細胞培養物から精製される。さらなる実施形態では、糖ペプチドは、組織サンプル、好ましくは、膵臓組織、特に膵臓組織腫瘍から精製される。
【００２０】
本出願の思想において、用語「糖型」はグリコシル化エピトープを指す。グリコシル化エピトープは、１つもしくはそれ以上のグリコシル化鎖を包含し得る。用語「ｍＡｂ」（仏語で「Ａｃｍ」）は、モノクローナル抗体を指し、用語「ｐＡｂ」（仏語で「Ａｃｐ」）はポリクローナル抗体を指す。
【００２１】
特定の実施形態では、本発明は、本発明に従う抗体との特異的免疫反応を惹起することができる本発明に従う糖ペプチドに関する。好ましくは、糖ペプチドは、Ｊ２８および１６Ｄ１０から選択される１つもしくはそれ以上の抗体との特異的免疫反応を惹起することができる。場合により、糖ペプチドは、Ｊ２８との特異的免疫反応を惹起する。あるいは、それは、１６Ｄ１０との特異的免疫反応を惹起する。
【００２２】
遺伝子操作において古典的に使用される宿主細胞は、酵素、例えば、一般にペプチドのセリンまたはスレオニン残基上にＮ−アセチルガラクトサミンを付加するα−３Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼを天然に含有する。例えば、これは、そのような酵素を含有するＣ１２７、ＣＯＳ、ＣＨＯまたはＣＨＯ−Ｋ１のような広範に使用される宿主細胞の場合にあてはまる。
【００２３】
本出願および以下のその内容において、用語「従来の宿主細胞」は、糖ペプチドの産生のために通常使用される細胞、好ましくは、ヒト細胞もしくはＣ１２７、ＣＯＳ細胞のような動物細胞、またはヨウトガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）卵巣細胞のような昆虫細胞、特にＣＨＯまたはＣＨＯ−Ｋ１細胞を示す。そのような適切な従来の宿主細胞は、特に、その遺伝子機構および多様なグリコシル化エピトープを作製するその能力に基づいて、選択され得る。前記選択を行うために、酵素アッセイを行って、使用を所望する宿主細胞における特に、α−３Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの存在を検出することができる。
【００２４】
使用されるグリコシルトランスフェラーゼは、動物、または好ましくはヒト由来であり得る。
【００２５】
本発明の実施の好適な条件において、遺伝子改変された従来の宿主細胞は、前記ポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子ならびにコア２β（１−６）Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（Ｃ２ＧｎＴ）およびフコシルトランスフェラーゼ３（ＦＵＴ３）をコードする少なくとも１つの遺伝子を含んでなる。
【００２６】
特に、膵臓癌における適用のための本発明の実施の他の好適な条件において、遺伝子改変された従来の宿主細胞は、前記ポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子ならびにコア２β（１−６）Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（Ｃ２ＧｎＴ）、フコシルトランスフェラーゼ３（ＦＵＴ３）およびα（１−３）ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧＴ）をコードする少なくとも１つの遺伝子を含んでなる。
【００２７】
特に、Ｉ型糖尿病における適用のための本発明の実施のなお他の好適な条件において、遺伝子改変された従来の宿主細胞は、前記ポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子ならびにグルコシルトランスフェラーゼのコア２β（１−６）Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（Ｃ２ＧｎＴ）およびフコシルトランスフェラーゼ７（ＦＵＴ３）をコードする少なくとも１つの遺伝子を含んでなる。
【００２８】
反復Ｃ末端ペプチドのすべてまたは一部をグリコシル化することができる。好ましくは、すべての反復配列がグリコシル化され、一般に、１６配列、より具体的には、６配列、および特に、２配列がグリコシル化される。
【００２９】
グリコシル化は、１つもしくはそれ以上のＮ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、シアル酸、グルコース、ガラクトース、フコースによることができる。
【００３０】
本発明の実施のなお他の好適な条件において、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって評価される上記の糖ペプチドのサイズは、有利には２０〜１２０ｋＤａの間に含まれ、好ましくは２０〜８５ｋＤａの間に含まれ、より具体的には４５〜８３ｋＤａの間に含まれる。
【００３１】
特に、Ｃ２−Ｆ３−１６Ｒ、Ｃ２−Ｆ３−ＧＴ−６Ｒおよびより具体的にはＣ２−Ｆ３−６ＲおよびＣ２−Ｆ７−１６Ｒと称される糖ペプチドが考慮される。Ｃ２−Ｆ３−１６Ｒは、Ｃ２ＧｎＴおよびＦＵＴ３によってグリコシル化される１６反復を有する糖ペプチドを表す。Ｃ２−Ｆ３−ＧＴ−６Ｒは、Ｃ２ＧｎＴ、ＦＵＴ３およびＧＴによってグリコシル化される６反復を有する糖ペプチドを表す。Ｃ２−Ｆ３−６Ｒは、Ｃ２ＧｎＴおよびＦＵＴ３によってグリコシル化される６反復を有する糖ペプチドを表す。Ｃ２−Ｆ７−１６Ｒは、Ｃ２ＧｎＴおよびＦＵＴ７によってグリコシル化される１６反復を有する糖ペプチドを表す。好ましくは、本発明に従う糖ペプチドは、Ｃ２−Ｆ３−６Ｒ、Ｃ２−Ｆ３−ＧＴ−６Ｒ、Ｃ２−Ｆ７−６Ｒ、Ｃ２−Ｆ７−ＧＴ−６Ｒ、Ｃ２−Ｆ３−Ｆ７−６Ｒ、およびＣ２−Ｆ３−Ｆ７−ＧＴ−６Ｒよりなる群において選択される。
【００３２】
糖ペプチドＣ２−Ｆ７−１６Ｒを産生する細胞系統は、２００４年３月１６日に番号Ｉ−３１８９でパリのＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）に寄託された。
【００３３】
当業者であれば、ペプチドは、機能を変更することなく、いくらか構造的に改変し得ることを知っている。
【００３４】
ペプチドは、改変がその免疫学的特徴に影響を及ぼさない限り、欠失、置換、付加またはアミノ酸のアシル化のような官能基化のようなそのアミノ酸の１つもしくはそれ以上の改変を含有することができる。特に、改変は、保存的アミノ酸（即ち、類似の物理化学的特徴を有する）による置換であり得る。例えば、一般に、イソロイシン残基によるロイシン残基の置換は、かかる特性に影響を及ぼさない。一般に、改変は、ペプチドの４０％未満、特に、３０％未満、好ましくは、２０％未満、およびより具体的には、１０％未満のアミノ酸を含有しなければならない。改変されたペプチドが変性されない（例えば、加熱のような物理的処置を受けることができる）ことにより、改変された誘導体によって誘導される抗体が生来の構造に対して活性を有し、そのコンホメーションの部位を保存することは、重要である。
【００３５】
一般に、上記の改変された糖ペプチドと上記の生来の糖ペプチドとの間の改変、相同性または類似性、ならびに使用、または本発明に従う免疫原性化合物の破傷風トキソイドのような免疫原性タンパク質への結合の態様については、特に、国際公開第Ａ−８６／０６４１４号パンフレットまたはＥＰ−Ａ−０．２２０．２７３号明細書またはそうでなければ国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ８６／００８３１号明細書などを参照することができる。
【００３６】
本発明の対象である糖ペプチドは、特に、ヒトまたは動物由来の膵液、血清、乳汁、尿もしくは羊水から調製することができる。好適な実施形態では、本発明に従う糖ペプチドは、ヒトあるいは動物由来の尿から単離および／または精製される。好ましくは、尿はヒト由来である。好適な実施形態では、尿は、膵臓の病状を患い得るかまたは患っている患者由来である。好ましくは、膵臓の病状は膵臓癌である。当業者であれば、本糖ペプチドを精製および／または単離するために使用することができる技術に精通している。特に、糖ペプチドは、例えば、前記方法に限定されることなく、遠心分離、限外ろ過、濃縮工程、排除もしくはアフィニティーカラム上での液体クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーまたは陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィー、電気泳動あるいは前記技術の組み合わせを使用して、精製することができる。特に、Ｊ２８および１６Ｄ１０などの本発明に従う糖ペプチドに特異的な抗体は、アフィニティー精製に使用することができる。精製プロトコルの例については、実験７に記載されている。従って、本発明は、被験体の尿を回収し、尿から前記糖ペプチドを精製することを含んでなる本発明に従う糖ペプチドの調製方法に関する。
【００３７】
本発明は、さらに特に、膵臓の病状、特に、膵臓癌を患い得るかまたは患っている患者の尿から精製および／または単離される本発明に従う糖ペプチドに関する。以下に記載のとおり、前記精製された糖ペプチドは、免疫療法による予防または治療的処置のために使用することができる。例えば、それらは、医薬組成物および／またはワクチン組成物を調製するために使用することができる。
【００３８】
本糖ペプチドは、組換え体であり、以下の通りに調製することができる。
【００３９】
ＣＨＯ−Ｋ１のような従来の適切な宿主細胞系統は、所望されるトランスフェラーゼの相補的ＤＮＡを含んでなるプラスミドで、または例えば、リポフェクタミンを使用することによって、所望されるトランスフェラーゼ、例えば、グリコシルトランスフェラーゼのコア２β（１−６）Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（Ｃ２ＧｎＴ）、フコシルトランスフェラーゼ３（ＦＵＴ３）、フコシルトランスフェラーゼ７（ＦＵＴ７）もしくはα（１−３）ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧＴ）の相補的ＤＮＡを含んでなるプラスミドにより、トランスフェクトされる。
【００４０】
得られる細胞系統は、発現および好ましくは、組換えペプチドの分泌を可能にするプラスミド、例えば、本発明の糖ペプチド、例えば、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰのＣ末端ドメインをコードするｃＤＮＡを含有するｐＳｅｃＴａｇプラスミドによって、トランスフェクトされる。配列番号６、８、１０および１２は、本発明に従う糖ペプチドをコードする配列の例である。
【００４１】
所望されるｃＤＮＡを含有する細胞系統を培養することによって得られる組換え糖ペプチドは、次いで、例えば、ポリアクリルアミドゲル上であるいは液体および／またはアフィニティークロマトグラフィーによって有利に精製され、所望であれば、それは、同定のためにＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析される。
【００４２】
もちろん、他の任意の適切な方法によって、宿主細胞に、本糖ペプチドを調製するために必要な遺伝子を転移することが可能である。
【００４３】
上記の方法の実施の好適な条件において、ＣＨＯ−Ｋ１のような適切な細胞系統は、グリコシルトランスフェラーゼのコア２β（１−６）Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（Ｃ２ＧｎＴ）、フコシルトランスフェラーゼ３（ＦＵＴ３）、および本発明に従う糖ペプチド、例えば、ＦＡＰＰまたは特に、ＢＳＤＬのＣ末端ポリペプチドドメインの相補的ＤＮＡを含んでなるプラスミドで、この順でトランスフェクトされる。
【００４４】
有利な様式において、ＣＨＯ細胞系統および特に、ＣＨＯ−Ｋ１細胞系統が宿主細胞として使用される。
【００４５】
有利な様式において、プラスミドｐＳｅｃＴａｇ、ｐｃＤＮＡ−３またはｐＢＫ−ＣＭＶは、プラスミドとして使用される。
【００４６】
さらに一般的には、本発明はまた、グリコシル化を引き起こすのに必要な酵素機構を含んでなる従来の宿主細胞に、本発明に従うポリペプチドをコードする遺伝子およびグリコシルトランスフェラーゼから選択される１つもしくはそれ以上の酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子を、所望される糖ペプチドの発現および場合により分泌を可能にする条件下で転移し、予期される糖ペプチドを単離することを特徴とする上記方法などの、糖ペプチドの調製方法を対象物として有する。
【００４７】
本発明に従う糖ペプチド、および特に、ＦＡＰＰまたはＢＳＤＬの天然もしくは誘導体糖ペプチドは、ロンバアルド（Ｌｏｍｂａｒｄｏ）ら１９７８年、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、５２７：１４２−１４９頁、またはアバウアキル（Ａｂｏｕａｋｉｌ）ら１９８８年、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、９６１：２９９−３０８頁、またはワング（Ｗａｎｇ）およびジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）、１９８３年、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３３：４５７−４６１頁またはそうでなければブラックベルグ（Ｂｌａｃｋｂｅｒｇ）およびヘルネル（Ｈｅｒｎｅｌｌ）、１９８１年、Ｅｕｒ  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１６：２２１−２２５頁に記載のものなどのクロマトグラフィー方法によって、任意のヒトまたは動物由来の生物学的液体もしくは組織であれば何であれ、特に、血清、尿、膵液、乳汁分泌物、組織または細胞ホモジネートなどから単離されるタンパク質から調製することができる。均質なタンパク質は、次いで、任意の酵素、特に、タンパク質分解に関与する酵素的用法、または化学的方法のいずれかによって、加水分解される。
【００４８】
天然の糖ペプチドは、特に、マス（Ｍａｓ）ら１９９７年、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、７：７４５−７５２頁、またはワング（Ｗａｎｇ）ら１９９５年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３４：１０６３９−１０６４４頁において記載のクロマトグラフィー方法（ゲルろ過、アフィニティーおよび免疫アフィニティー、イオン交換など）、または他の任意の方法によって、単離することができる。
【００４９】
前記糖ペプチドはまた、先に示した通り生物学的液体または組織から直接、または前記生物学的液体または組織の上記の酵素的もしくは化学的処置の後に精製、単離することができる。
【００５０】
ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰの前記天然の糖ペプチドのグリコシル化は、特に、上記および下記に示される病状の診断のためまたは前記病状に対するワクチン化のため、または本発明の目的である抗体を入手もしくは産生させるために下記において使用されるグリカン構造を入手するために、任意の化学的あるいは酵素的経路（グリコシダーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼの生来の、可溶性組換え体、特に膜の使用）によって、改変することができる。
【００５１】
さらに、本発明の天然のまたは組換え糖ペプチドのペプチド配列を改変することが可能である。
【００５２】
本発明の目的である天然および特に組換え体の単離または精製された糖ペプチドは、極めて興味深い特性を有する。特に、それらは、膵臓の病状に特異的な顕著な免疫原性特性を示す。
【００５３】
前記特性は、実験セクションにおいて以下に例示される。それらは、医薬品としての上記糖ペプチドの使用を正当化する。
【００５４】
これが、本発明が、ヒトまたは動物身体の治療処置の方法におけるその使用のため（即ち、医薬品として）の上記の糖ペプチドをもまた対象物として有する理由である。
【００５５】
本発明に従う医薬品は、例えば、細胞に基づく免疫療法：患者の免疫系（樹状または他の細胞など）の活性化による自家ワクチン化のため、糖尿病の病状、より一般的には、１つもしくはそれ以上の前記糖ペプチドの使用を必要とする他の任意の病状を罹患した患者における前記構造に対して指向された循環抗体の検出によるＩ型糖尿病のような所定の病状の診断のための膵臓癌、乳癌の免疫療法（免疫化、ワクチン化）、予防的および／または治療的処置において使用することができる。
【００５６】
それらはまた、炎症、転移の形成および病原体による進入の阻害のような他の生物学的システムにおいても使用することができる。
【００５７】
従って、本発明は、本発明に従う糖ペプチドを含んでなる医薬組成物またはワクチン組成物に関する。特に、本発明は、配列番号１４に記載され、コア２β（１−６）Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（Ｃ２ＧｎＴ）、α（１−３）およびα（１−４）フコシルトランスフェラーゼ活性を有するフコシルトランスフェラーゼＦＵＴ３、またはα（１−３）フコシルトランスフェラーゼ活性を有するフコシルトランスフェラーゼＦＵＴ７よりなる群において選択されるオース−トランスフェラーゼ活性を有する１つもしくはそれ以上の酵素によってグリコシル化されるペプチド配列の１〜４０反復を含んでなる糖ペプチドを含んでなる医薬組成物またはワクチン組成物に関する。場合により、前記糖ペプチドは、酵素Ｃ２ＧｎＴおよびＦＵＴ３によってグリコシル化される。場合により、前記糖ペプチドは、酵素Ｃ２ＧｎＴおよびＦＵＴ７によってグリコシル化される。場合により、前記糖ペプチドは、酵素Ｃ２ＧｎＴ、ＦＵＴ３およびＦＵＴ７によってグリコシル化される。好ましくは、前記糖ペプチドは、α（１−３）ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧＴ）によってさらにグリコシル化される。好適な実施形態では、前記糖ペプチドは、１〜１５の間の前記反復を含んでなる。前記糖ペプチドは、組換え体であるかまたは生物学的液体から精製され得る。好ましくは、前記生物学的液体は、尿、特に、膵臓の病状、特に、膵臓癌を患う被験体由来の尿である。特定の実施形態では、前記糖ペプチドは、抗原提示細胞、好ましくは、樹状細胞上に充填される。
【００５８】
本発明はまた、本発明に従う糖ペプチドあるいは医薬組成物またはワクチン組成物の医薬品としての使用に関する。特に、本発明は、癌、炎症性障害、脈管の病状または病原体による感染症よりなる群において選択される疾患の予防的もしくは治療的処置を目的とする医薬品を調製するための本発明に従う糖ペプチドあるいは医薬組成物またはワクチン組成物の使用に関する。好ましくは、疾患は、乳癌または膵臓癌である。好適な実施形態では、本発明は、膵臓の病状、特に、膵臓癌の処置または予防を目的とする医薬品を調製するための本発明に従う糖ペプチドまたは医薬組成物もしくはワクチン組成物に関する。好適な実施形態では、糖ペプチドは、膵臓の病状、好ましくは、膵臓癌を患う被験体の尿からの精製によって得られる。
【００５９】
アジュバント処方においては、免疫原、この場合本発明に従う糖ペプチドを、例えば、ＩＳＡ５１を使用することによって、特に、油中水型エマルジョンに含めることができる。
【００６０】
免疫原性糖ペプチドを含有するワクチン製剤は、筋肉内（ｉｍ）、皮下（ｓｃ）、皮内（ｉｄ）経路による全身型または鼻内、口内、膣または直腸経路による粘膜型の免疫応答を誘導するのに適切な医薬処方で投与することができる。
【００６１】
免疫原性糖ペプチドを含有するワクチン製剤はまた、他の免疫原を含有することもできる。
【００６２】
ｓｃ、ｉｍ、ｉｄ経路によって投与される全身性医薬製剤は、免疫原性糖ペプチド、または免疫原包埋リン酸カルシウム懸濁液、または免疫原を吸着する水酸化アルミニウムを含有する油中水型エマルジョンであり得る。
【００６３】
ワクチン製剤は、賦形剤としてカルボポール（ｃａｒｂｏｐｏｌ）を伴うゲル、点鼻薬または噴霧薬の形態での内鼻経路および耐酸性カプセル、耐酸性顆粒または糖衣錠の形態での経口経路のために、処方することができる。
【００６４】
通常の用量は被験体および原因となる病状に従って変動し、例えば、ヒトにおいて、１０〜２０週間の間、２週間ごとに全身経路で投与される本発明に従う糖ペプチド、特に、以下の実施例４に記載の糖ペプチド１〜１００ｍｇであり得る。
【００６５】
本発明はまた、有効成分として少なくとも１つの上記の糖ペプチドを含有する医薬組成物を対象物として有する。
【００６６】
前記組成物において、有効成分は、生理学的に有効な用量で有利に存在し、特に、前記の成分は、有効なワクチン用量の少なくとも１つの上記有効成分を含有する。
【００６７】
医薬品として、上記の糖ペプチドは、消化管または非経口経路を目的とする医薬組成物に組み入れることができる。
【００６８】
例えば、前記医薬組成物は、固体または液体であり、例えば、単純な錠剤または糖衣錠、カプセル、顆粒、カラメル、坐剤、特に、注射用製剤のようなヒト医薬において通常使用される医薬処方として供給され得、それらは、通常の方法によって調製される。有効成分は、タルク、アラビアガム、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ココアバターなどの前記医薬組成物において通常用いられる賦形剤と共に、水性または非水性の動物性もしくは植物性脂肪、パラフィン誘導体、グリコールであるビヒクル、多様な湿潤剤、分散剤または乳化剤、保存剤を該医薬組成物の中に処方することができる。
【００６９】
本発明はまた、有効成分が許容可能な（特に、確立された方法に従って医薬上許容される）賦形剤と混合されることを特徴とする、上記のような組成物の調製方法を対象物として有する。
【００７０】
本発明は、膵臓癌または乳癌あるいは脈管の病状もしくは血管新生のような他の病状の治療的または予防的処置を目的とする医薬品を調製するための上記のような糖ペプチドの使用をさらに対象物として有する。
【００７１】
本発明は、本発明に従う糖ペプチドの有効量を投与することを含んでなる、被験体における癌、炎症性障害、脈管の病状または病原体による感染よりなる群において選択される疾患の予防的または治療的処置の方法にさらに関する。
【００７２】
癌処置、特に、前立腺癌の好適な実施形態において、糖ペプチドは、同種の抗原提示細胞に与えられ得る。好ましくは、抗原提示細胞は樹状細胞である。好適な様式では、抗原提示細胞は自己由来であり、即ち、それは、レシピエント被験体から先に取り出されているか、またはそれは、レシピエント被験体由来の幹細胞から誘導される。代替的に、抗原提示細胞は、同種の被験体（即ち、レシピエントに匹敵する）から採取されるサンプル由来である。従って、この実施形態において、本発明に従う医薬組成物またはワクチン組成物は、本発明に従う糖ペプチドを充填または「パルス」された抗原提示細胞を含んでなる。従って、本発明は、医薬品、特に、乳または膵臓癌、好ましくは、膵臓癌の処置もしくは予防のための医薬品として本発明に従う糖ペプチドを与えられ、または「パルス」された抗原提示細胞を含んでなる医薬組成物またはワクチン組成物の使用に関する。好適な実施形態では、糖ペプチドは、膵臓の病状、好ましくは、膵臓癌を患う被験体の尿からの精製によって得られる。最も所望される実施形態では、糖ペプチドは、処置された被験体の尿からの精製によって得られる。好ましくは、被験体はヒトである。本発明はまた、本発明に従う糖ペプチドを提供すること、および場合により、抗原提示細胞に与えられた前記糖ペプチドを投与することを含んでなる膵臓の病状、好ましくは、膵臓癌、または乳癌の治療的もしくは予防的処置の方法であって、前記投与は、膵臓の病状、好ましくは、膵臓癌、または乳癌を処置、減弱または予防することが可能である方法に関する。好適な実施形態では、処置された疾患は膵臓癌である。前記糖ペプチドは、組換え体であるかまたは生物学的サンプル、好ましくは、生物学的液体から単離され得る。好適な実施形態では、前記糖ペプチドは、膵臓の病状、好ましくは、膵臓癌、もしくは乳癌を患う被験体の尿から単離および／または精製される。好ましくは、前記糖ペプチドは、処置された被験体の尿から単離および／または精製される。従って、糖ペプチドを提供する工程は、生物学的液体、好ましくは、尿の回収、および前記糖ペプチドの精製を含んでなることができる。
【００７３】
上記の糖ペプチドの特性はまた、診断、特に、免疫酵素的方法におけるそれらの使用を正当化する。
【００７４】
これが、本発明がまた、それが上記のような少なくとも１つの糖ペプチドを含有することを特徴とするヒト生物学的サンプルにおける上記の糖ペプチドに対して指向された抗体の存在のインビトロでの診断のための組成物を対象物として有する理由である。
【００７５】
本発明はまた、上記の病状を患うヒト被験体、血清のようなヒト生物学的サンプルにおいて誘導された抗体の存在のインビトロでの検出および、より具体的には、膵臓癌または糖尿病の病状のインビトロでの診断のための方法を対象物として有し、診断の対象であるヒトから由来する、前記生物学的サンプルが、前記抗原と前記抗体との間の免疫複合体の形成を可能にする条件下で、上記または下記で規定される患者において誘導される抗体によって認識される抗原と接触され、前記抗体と抗原との間で形成される可能性のある免疫複合体が検出されることをを特徴とする。
【００７６】
本発明はまた、上記の病状を患うヒト被験体、生物学的サンプルにおいて誘導される抗体の検出のために必要な材料またはキット、特に、前記抗体の可能なキャリアを対象物として有し、それは、以下を含んでなることを特徴とする。
−  上記のような少なくとも１つの糖ペプチド、および
−  抗原と前記生物学的サンプルとの間の免疫反応から生じる免疫複合体を検出するための手段。
【００７７】
本発明の対象物である糖ペプチド（特に組換えの、単離または精製された）はまた、そのような糖尿病の病状を伴う患者におけるこれらの構造に対して指向された循環抗体の検出によるＩ型糖尿病のような所定の病状の診断において使用することができる。
【００７８】
特に、Ｃ２−Ｆ７−１６Ｒと命名された糖ペプチドは、Ｉ型糖尿病の診断のために使用される。
【００７９】
本発明の対象物である糖ペプチド（特に、組換えの、単離または精製された）は極めて興味深い抗原特性を所有するため、それらはまた、抗体（特にモノクローナル）の産生を可能にする。
【００８０】
それ故、本出願はまた、上記の規定を満たし、文献に記載され得る抗体Ｊ２８および他の任意の抗体を例外として、上記のような糖ペプチドで特異的な免疫反応を惹起する抗体（特に、モノクローナル）を対象物として有する。モノクローナル抗体は、任意のクラス、特に、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＡ由来であり得る。好ましくは、モノクローナル抗体はＩｇＧである。本発明に従う抗体は、その初期のクラスにもかかわらず、例えば、既知の分子生物学的方法（ルーイス（Ｌｅｗｉｓ）ら、１９９２年、Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，３：１４６−５２頁、ルーイス（Ｌｅｗｉｓ）ら、１９９３年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２８２９−３８頁、ホール（Ｈａｌｌ）ら、１９９４年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５４：５１７８−８５頁、シェパード（Ｓｈｅｐｈｅｒｄ）およびディーン（Ｄｅａｎ）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、２０００年、４７９頁）によって、別の免疫グロブリンのクラス由来の抗体に改変することができる。これらの同じモノクローナル抗体は、先に示された条件下でそれらを使用するように、前記組換えもしくは天然の糖ペプチドに対するそれらの認識部位を保存するために、遺伝子組み換えまたは他の任意の方法によって、ヒト化することができる。
【００８１】
特に、上記のような糖ペプチドの援助による哺乳動物の免疫化によって得られる抗体が選択される。
【００８２】
具体的には、本発明は、実施例に記載の抗体および特に、２００４年３月１６日にＩｇＧ型の番号Ｉ−３１８８および８Ｈ８下でパリのＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）に寄託されたハイブリドーマによって産生され得るＩｇＭ型の１６Ｄ１０抗体に関する。
【００８３】
好ましくは、本発明は、モノクローナル抗体１６Ｄ１０、そのフラグメントもしくは誘導体、およびモノクローナル抗体１６Ｄ１０と同じエピトープに本質的に結合する抗体よりなる群において選択されるモノクローナル抗体に関する。場合により、前記抗体は、ヒト化されているか、キメラかまたはヒトである。好ましくは、抗体はＩｇＧ型である。場合により、抗体は一本鎖抗体である。
【００８４】
抗体フラグメントまたは誘導体は、問題の抗体と実質的に同じ特異性を保存する実態を意味すると理解される。そのフラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２およびｓＦｖフラグメントであり得る（ブレイザル（Ｂｌａｚａｒ）ら、１９９７年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１５９：５８２１−５８３３頁およびバード（Ｂｉｒｄ）ら、１９８８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３−４２６頁）。本発明に従うＦｖ、Ｆａｂ、またはＦ（ａｂ）２フラグメントは、古典的な酵素消化方法によって得ることができる。その誘導体は、キメラ、ヒト化または一本鎖ｓｃＦｖ抗体であり得る。前記誘導体は、古典的な遺伝子操作方法によって得ることができる。抗体１６Ｄ１０の可変領域をコードするポリヌクレオチドは、例えば、１６Ｄ１０抗体−産生ハイブリドーマｃＤＮＡライブラリー由来の前記可変領域をクローニングすることによって、得ることができる。それらはまた、前記可変領域のヌクレオチド配列に基づく核酸合成によって、全体的または部分的に調製することができる。ラウトレッジ（Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅ）ら（「Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍａｎ、１３−４４、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｔｉｔｌｅｓ、Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ、英国（１９９３年）］またはログスカ（Ｒｏｇｕｓｋａ）ら、１９９６年、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９（１０）：８９５−９０４頁）により記載されているようなＣＤＲグラフティングの既知の技術によって、例えば、１６Ｄ１０のＣＤＲをコードするポリヌクレオチドを合成して、他の抗体、特に、ヒト由来および／またはＩｇＧ型の抗体の適切な領域に組み入れることができる。
【００８５】
本発明はまた、抗体１６Ｄ１０のＣＤＲを含んでなるタンパク質をコードする任意の核酸分子、および任意の組換えベクター、特に、前記核酸分子を含んでなる任意の発現ベクター、前記核酸または前記ベクターを含んでなる任意の宿主細胞を対象物として有する。
【００８６】
本発明はまた、上記のような抗糖ペプチド抗体の調製方法であって、哺乳動物を前記糖ペプチドの援助または任意のヒトまたは動物の生物学的組織もしくは液体、特に、正常および病理学的ヒト膵液から単離されるＦＡＰＰおよびＢＳＤＬの援助で免疫し、次いで、所望であれば、前記タンパク質のＣ末端ドメインを認識する予期される抗体を回収することを特徴とする方法を対象物として有する。
【００８７】
本出願は、上記のような抗糖ペプチド抗体の調製方法であって、上記のような天然もしくは組換え糖ペプチドの援助または上記のようなＦＡＰＰおよびＢＳＤＬの混合物の援助によって、免疫され、エプスタイン・バール（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）ウイルス（ＥＢＶ）によって形質転換された被験体由来のＢリンパ球をクローニングし、次いで、前記形質転換されたＢリンパ球から分泌される予期される抗体を回収することを特徴とする方法を対象物として同様に有する。
【００８８】
特に、本発明のモノクローナル抗体対象物は、上記のような糖ペプチドとの特異的な免疫反応を惹起することができる。
【００８９】
本発明の特定の実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体１６Ｄ１０またはＪ２８（それぞれ、ハイブリドーマ１６Ｄ１０またはＪ２８によって産生される）と同じエピトープに本質的に結合する。好ましくは、前記抗体はモノクローナル抗体である。好ましくは、本発明は、モノクローナル抗体１６Ｄ１０（ハイブリドーマ１６Ｄ１０によって産生される）に関するが、本発明はまた、抗体１６Ｄ１０に特異的に競合することができるモノクローナル抗体に関すると理解すべきである。同様に、特定の実施形態において、本発明に従うモノクローナル抗体は、抗体Ｊ２８に特異的に競合することができる。
【００９０】
目的の抗体と「同じエピトープまたは決定基に本質的に結合する」という用語は、抗体が前記目的の抗体と「競合する」ことを意味する。目的の抗体「と同じエピトープまたは決定基に本質的に結合する」という用語は、２つの抗体が全く同じエピトープを有さないことを意味する。しかし、特定の実施形態では、２つの抗体は同じエピトープを有することができる。モノクローナル抗体と「同じエピトープまたは決定基に本質的に結合する」という用語は、抗体が抗体１６Ｄ１０と「競合する」ことを意味する。一般に、目的の抗体（例えば、抗体１６Ｄ１０）「と同じエピトープまたは決定基に本質的に結合する」抗体は、抗体が、本発明に従う糖ペプチド、特に、ＢＳＤＬもしくはＦＡＰＰまたはそのフラグメント、好ましくは、本明細書に記載のＢＳＤＬまたはＦＡＰＰのＣ末端部、さらにより好ましくは、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰの１１アミノ酸の１つもしくはそれ以上の反復、あるいはそのフラグメントの一部から選択される１つもしくはそれ以上のタンパク質に対し、前記目的の抗体と「競合する」ことを意味する。他の例では、抗体がＢＳＤＬまたはＦＡＰＰと結合するための目的の抗体と「競合する」場合、抗体はＢＳＤＬまたはＦＡＰＰの同じエピトープもしくは決定基に本質的に結合する。
【００９１】
目的の抗体と「同じエピトープまたは決定基に本質的に結合する」という用語は、抗体が、前記目的の抗体が特異的に結合する任意のＢＳＤＬおよび／またはＦＡＰＰ分子のために、前記目的の抗体と「競合する」ことを意味する。モノクローナル抗体１６Ｄ１０と「同じエピトープまたは決定基に本質的に結合する」という用語は、抗体が、前記モノクローナル抗体１６Ｄ１０が特異的に結合する任意のＢＳＤＬおよび／またはＦＡＰＰ分子のために、前記モノクローナル抗体１６Ｄ１０と「競合する」ことを意味する。例えば、モノクローナル抗体１６Ｄ１０またはＪ２８と同じエピトープまたは決定基に本質的に結合する抗体は、それぞれＢＳＤＬまたはＦＡＰＰに結合するための前記抗体１６Ｄ１０またはＪ２８と「競合する」。
【００９２】
本明細書に記載のモノクローナル抗体と同じエピトープに本質的に結合する１つもしくはそれ以上の抗体の同定は、抗体間の競合を評価することができる任意の免疫学的スクリーニング方法を使用して、行うことができる。多くのアッセイが日常的に行われており、当業者に周知である（例えば、１９９７年８月２６日に特許査定された米国特許第５，６６０，８２７号明細書（本明細書において参考として具体的に援用される）を参照のこと）。抗体が結合するエピトープの同定は、本明細書に記載のモノクローナル抗体と同じエピトープに結合するか、または本質的に結合する抗体を必ずしも同定する必要がない。
【００９３】
例えば、研究しようとする候補抗体が、異なる動物原から得られているか、またはおそらく、異なるＩｇイソタイプを有する場合、簡単な競合アッセイを用いることができ、ここで、コントロール抗体（例えば、抗体１６Ｄ１０）および候補抗体が混合され（もしくは予め吸着され）、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ（両者とも抗体１６Ｄ１０に結合することが公知である）のいずれかを含有するサンプルと接触される。ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロット分析に基づくプロトコル、または（例えば、実施例に記載のような）ＢＩＡＣＯＲＥ分析の使用は、簡単な競合試験における使用に適切である。
【００９４】
特定の実施形態において、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ抗原サンプルと接触させる前に、コントロール抗体（例えば、抗体１６Ｄ１０）と多様な量の候補抗体（例えば、約１：１０または約１：１００）との混合物を最初に調製することが可能である。別の実施形態では、コントロール抗体および多様な量の候補抗体を、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ抗原サンプルとの接触時に簡単に混合することができる。（例えば、分別方法を使用するかまたは洗浄して結合抗体を取り出すことによって）結合抗体を遊離の抗体と区別し、（例えば、種もしくはイソタイプに特異的な第二抗体を使用するかまたは検出可能なタグで抗体１６Ｄ１０を標識することによって）抗体１６Ｄ１０を抗補抗体と区別することができる限り、抗補抗体が抗体１６Ｄ１０のＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ抗原への結合を減少するかどうかを決定し、それによって、候補抗体が抗体１６Ｄ１０と同じエピトープを本質的に認識するかどうかを示すことが可能である。全く関連性の無い抗体の存在下でのコントロール抗体の結合は、コントロール値の上限としての役割を果たすことができる。コントロール値の下限は、標識コントロール抗体（１６Ｄ１０）と全く同じエピトープ（１６Ｄ１０）を認識する非標識抗体とをインキュベートすることによって得ることができ、この方法では、標識抗体の結合を減少する競合を誘導する。１つの試験では、候補抗体の存在下における標識抗体の反応性の有意な減少は、候補抗体が同じエピトープを本質的に認識し、即ち、それが、標識抗体（１６Ｄ１０）と交差反応することを示す。約１：１０〜約１：１００の間の１６Ｄ１０抗体対候補抗体の比で、抗原ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰのそれぞれに対する抗体１６Ｄ１０の結合を少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは、少なくとも約６０％、またはさらにより好ましくは、少なくとも約７０％（例えば、６５〜１００％）だけ減少する任意の候補抗体は、１６Ｄ１０と同じエピトープまたは決定基抗体に本質的に結合する抗体とみなされる。好ましくは、前記候補抗体は、抗体１６Ｄ１０のＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ抗原への結合を、少なくとも約９０％（例えば、約９５％）だけ減少する。好ましくは、結合の減少の程度が異なり得ても、結合が同じ方法評価される場合、抗体１６Ｄ１０もまた、候補抗体のＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ抗原への結合を減少させる。
【００９５】
競合は、例えば、フローサイトメトリーアッセイによって、評価することができる。そのようなアッセイでは、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ抗原を担持する細胞、例えば、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰによってトランスフェクトされる細胞を、最初に、抗体１６Ｄ１０と共に、次いで、例えば、蛍光色素またはビオチンで標識された候補抗体と共にインキュベートする。飽和量の１６Ｄ１０とのプレインキュベーション後に観察される結合が、１６Ｄ１０とのプレインキュベーションを伴わない抗体で観察される結合（蛍光によって測定される）の約３０％、好ましくは、約４０％、約５０％、約８０％、もしくはそれ以上（例えば、約９０％）である場合、抗体は、抗体１６Ｄ１０と競合するとみなされる。あるいは、飽和量の候補抗体共にプレインキュベートされる細胞において標識１６Ｄ１０抗体（蛍光色素またはビオチンによって標識される）で観察される結合が抗体とのプレインキュベーションを伴わずに観察される結合の約８０％、好ましくは、約５０％、約４０％、約３０％、もしくはそれ以下（例えば、約２０％）である場合、抗体は、抗体１６Ｄ１０と競合するとみなされる。
【００９６】
有利な様式では、候補抗体が予め吸着され、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ抗原か固定化されている表面上において飽和濃度で適用される簡単な競合アッセイを使用することもできる。簡便な競合アッセイにおける表面は、好ましくはＢＩＡＣＯＲＥチップ（または表面プラズモン共鳴分析に匹敵する別の支持体）である。コントロール抗体（例えば、１６Ｄ１０）を、次いで、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰの飽和濃度で表面と接触させ、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰを担持する表面に対するコントロール抗体の結合を測定する。コントロール抗体の前記結合を、候補抗体の非存在下におけるコントロール抗体のＢＳＤＬまたはＦＡＰＰを担持する表面への結合と比較する。アッセイ試験では、候補抗体の存在下におけるコントロール抗体のＢＳＤＬまたはＦＡＰＰを担持する表面への結合の有意な減少は、候補抗体がコントロール抗体と交差反応するような方法で、候補抗体が、コントロール抗体と同じエピトープを本質的に認識することを示す。（抗体１６Ｄ１０のような）コントロール抗体のＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ抗原への結合を、少なくとも約３０％または好ましくは、約４０％だけ減少する任意の候補抗体は、コントロール抗体（例えば、１６Ｄ１０）と同じエピトープに本質的に結合する抗体とみなすことができる。好ましくは、前記候補抗体は、コントロール抗体（例えば、１６Ｄ１０）のＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ抗原への結合を、少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、もしくはそれ以上）だけ減少する。コントロールおよび候補抗体間の順序は反転することができ、即ち、コントロール抗体を最初に表面に結合させることができ、競合試験において、候補抗体が表面に実質的に接触されることが理解させるべきである。好ましくは、第二抗体（抗体が交差反応すると推定される）で観察される結合の減少は、より大きな振幅を有することが期待されるため、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰに最も高い親和性を示す抗体が、最初に、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰを担持する表面に結合される。そのような試験の他の例は、実施例および例えば、サウナル（Ｓａｕｎａｌ）およびリゲンモーテル（Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌ）、（１９９５年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１８３：３３−４１頁（その開示内容は本明細書において参考として援用される）に記載されている。
【００９７】
前記特性は、以下の実験のセクションにおいて例示される。それらは、膵臓癌、膵臓炎およびＩ型糖尿病を含むいくらかの膵臓の病状、しかしまた、乳癌または循環器系疾患の診断、予後および／または予測のための上記のモノクローナル抗体、ならびに特に、モノクローナル抗体８Ｈ８、１６Ｄ１０、１４Ｈ１０およびＢＳＤＬまたはＦＡＰＰのＣ末端部に対して指向される他のモノクローナル抗体の使用を正当化する。診断情報は、血清および／または尿アッセイから得ることができる。
【００９８】
抗体１６Ｄ１０は、特に興味深い特性を有する。事実、それは膵臓癌に特異的である。抗体は、正常な組織も、また腫瘍組織の他のタイプのいずれも認識しない。これらの２つの抗体は競合しないため、抗体１６Ｄ１０によって認識されるエピトープは、抗体Ｊ２８によって認識されるエピトープとは異なる。これらの結果を、実施例４に記載する。
【００９９】
従って、本発明は、膵臓の病状、特に、膵臓癌の好ましくは、インビトロでの検出を可能にする方法であって、生物学的サンプルと本発明に従う抗体とを接触させ、前記抗体と前記生物学的サンプルとの間の免疫反応から生じる免疫複合体の形成を検出することを含んでなる方法に関する。好ましくは、抗体は、抗体１６Ｄ１０、そのフラグメントもしくは誘導体、または前者と同じエピトープまたは決定基に本質的に結合する抗体である。好ましくは、生物学的サンプルは、膵臓組織（生検）または生物学的液体のサンプルである。生物学的サンプルは、組織スライス（免疫組織化学）またはサンプルに含有されるかもしくはサンプルを培養することによって誘導される細胞（免疫組織化学）であり得る。生物学的液体は、血清、尿、膵液および乳汁よりなる群において選択され得る。好ましくは、生物学的液体は尿である。本発明の抗体を標識することによって直接的に、または本発明の抗体（第二抗体、ストレプトアビジン／ビオチンタグなど）の存在を表す分子を添加することによって間接的に、複合体を検出することができる。例えば、標識化は、抗体と放射性もしくは蛍光タグとを結合させることによって、達成することができる。これらの方法は、当業者に周知である。
【０１００】
本発明はまた、膵臓の病状をインビボまたはインビトロで検出するために使用することができる診断組成物を調製するための本発明に従う抗体の使用に関する。好ましくは、抗体は、抗体１６Ｄ１０、そのフラグメントもしくは誘導体、または前者と同じエピトープまたは決定基に本質的に結合する抗体である。好ましくは、膵臓の病状は膵臓癌である。
【０１０１】
好適な実施形態では、本発明は、被験体における膵臓の病状、特に、膵臓癌の検出を可能にする方法であって、被験体の尿を回収し、前記尿と本発明に従う抗体とを接触させ、前記抗体と前記尿との間の免疫反応から生じる免疫複合体の形成を検出することを含んでなる方法に関する。好ましくは、抗体は、抗体１６Ｄ１０、そのフラグメントもしくは誘導体、または前者と同じエピトープまたは決定基に本質的に結合する抗体である。抗体はまた、抗体Ｊ２８、そのフラグメントもしくは誘導体、または前者と同じエピトープまたは決定基に本質的に結合する抗体である。好ましくは、膵臓の病状は膵臓癌である。本発明の抗体を標識することによって直接的に、または本発明の抗体（第二抗体、ストレプトアビジン／ビオチンタグなど）の存在を表す分子を添加することによって間接的に、複合体を検出することができる。これらの方法は、当業者に周知である。場合により、方法は、前記抗体とのインキュベーションの前に尿サンプルを処置する中間工程を含んでなることができる。例えば、前記工程は、尿の濃縮、糖ペプチドの富化または精製の工程などを含んでなることができる。
【０１０２】
本発明はまた、膵臓の病状、特に、被験体における膵臓癌の診断のための本発明に従う抗体の使用に関する。好ましくは、抗体は、抗体１６Ｄ１０、そのフラグメントもしくは誘導体、または前者と同じエピトープまたは決定基に本質的に結合する抗体である。抗体はまた、抗体Ｊ２８、そのフラグメントもしくは誘導体、または前者と同じエピトープまたは決定基に本質的に結合する抗体である。
【０１０３】
本発明は、本発明に従う抗体を含んでなる膵臓の病状、特に、膵臓癌のための診断キットに関する。前記キットは、生物学的サンプルと前記抗体との間の免疫反応から生じる免疫複合体を検出する手段、特に、前記抗体の検出を可能にする試薬をさらに含んでなることができる。特定の実施形態では、キットは、抗体１６Ｄ１０、そのフラグメントもしくは誘導体、または前者と同じエピトープまたは決定基に本質的に結合する抗体を含んでなる。
【０１０４】
これらの特性は、薬物と結合した前記抗体（化学療法）または放射性元素（放射線治療および放射線診断）またはそうでなければ新生物細胞の結果または挙動を改変する遺伝子（遺伝子治療）で腫瘍細胞を標的化することなどの膵外分泌部の癌の新規の治療プロトコルを開発するための上記のモノクローナル抗体の使用を正当化する。
【０１０５】
放射性元素を結合させた抗体は、原発性腫瘍および転移（二次腫瘍）の放射線局在化（ｒａｄｉｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）（免疫シンチグラフィー）において使用することができる。
【０１０６】
前記診断情報は、血清および／または尿アッセイにおいて獲得することができる。
【０１０７】
特に、本発明は、本発明に従う抗体、特に、膵臓腫瘍細胞を標的化して破壊するための膵臓癌の処置に使用することができる抗腫瘍活性物質と結合したモノクローナル抗体に関する。
【０１０８】
同様に、放射性元素（または他のもの）を前記抗体と結合させ、原発性腫瘍および転移の正確な局在化を可能にすることができる。前記抗体はまた、正常組織と腫瘍組織とを明確かつ正確に識別することを可能にすることができる。
【０１０９】
これらの同じ特性は、上記の病状のための新規の受動免疫療法を開発するための単独での、組み合わされたまたは診断もしくは治療用分子と結合された前記モノクローナル抗体の使用を正当化する。
【０１１０】
従って、本発明はまた、ヒト生物学的サンプルにおける上記のような病状のインビトロでの診断のための組成物であって、該組成物は、特に、少なくとも１つの放射性元素が結合した上記のような少なくとも１つのモノクローナル抗体を含有することを特徴とする上記組成物を対象物として有する。放射性元素の性質に依存して、前記組成物を使用して、膵臓の領域に治療的に照射することができる。
【０１１１】
診断組成物として、上記の抗体を許容可能な賦形剤と混合することができる。
【０１１２】
本発明はまた、診断しようとする個体由来のヒト生物学的サンプルにおいて糖尿病または新生物症状を罹患するヒト被験体において出現する上記のような糖ペプチドの存在を検出するためのキットを対象物として有し、それは以下を含んでなることを特徴とする。
−  上記のような少なくとも１つの抗体、および
−  抗原と生物学的サンプルとの間の免疫反応から生じる免疫複合体を検出するための手段。
【０１１３】
上記の糖ペプチドおよび抗体を用いる好適な条件はまた、先に記載の本発明の他の対象物、特に、診断方法にも当てはまる。
【０１１４】
本発明はまた、本発明に従う抗体を含んでなる医薬組成物に関する。好ましくは、抗体は、抗体１６Ｄ１０、そのフラグメントもしくは誘導体、または前者と同じエピトープまたは決定基に本質的に結合する抗体である。抗体はまた、抗体Ｊ２８、そのフラグメントもしくは誘導体、または前者と同じエピトープまたは決定基に本質的に結合する抗体である。組成物はまた、医薬上許容される支持体を含んでなることができる。特定の実施形態では、前記抗体は抗腫瘍物質と結合する。
【０１１５】
本発明は、本発明に従う抗体または医薬品としてのそのような抗体を含んでなる医薬組成物の使用にさらに関する。特に、本発明は、本発明に従う抗体または膵臓の病状、好ましくは、膵臓癌、もしくは乳癌の予防的または治療的処置を目的とする医薬品を調製するためのそのような抗体を含んでなる医薬組成物の使用に関する。好ましくは、抗体は、抗体１６Ｄ１０、そのフラグメントもしくは誘導体、または前者と同じエピトープまたは決定基に本質的に結合する抗体である。抗体はまた、抗体Ｊ２８、そのフラグメントもしくは誘導体、または前者と同じエピトープまたは決定基に本質的に結合する抗体である。特定の実施形態では、前記抗体は抗腫瘍物質と結合する。
【０１１６】
本発明は、膵臓の病状、特に、膵臓癌、または乳癌を患う被験体の予防的または治療的処置の方法であって、前記被験体に、有効量の本発明に従う抗体を投与することを含んでなり、前記投与は、被験体における膵臓の病状、特に膵臓癌、または乳癌の減少もしくは消失を生じる、方法に関する。好ましくは、抗体は、抗体１６Ｄ１０、そのフラグメントもしくは誘導体、または前者と同じエピトープまたは決定基に本質的に結合する抗体である。抗体はまた、抗体Ｊ２８、そのフラグメントもしくは誘導体、または前者と同じエピトープまたは決定基に本質的に結合する抗体である。特定の実施形態では、前記抗体は抗腫瘍物質と結合する。
【０１１７】
別のプロトコルでは、通常の用量は、処置される被験体および原因疾患に従って変動し、例えば、ヒトにおいて全身投与される体重の１キログラムあたり以下の実施例１８に記載のモノクローナル抗体１〜１０ｍｇを、２週間の間、１週間に１回であり得る。
【０１１８】
本発明はまた、新規産物（糖ペプチド、抗体など）ならびに先行技術において記載の産物より良好、より有効またはより純粋な新規の産物を提供することに関する。
【０１１９】
本発明を以下の実施例において例示する。
【実施例】
【０１２０】
組換え糖ペプチドの調製
ＢＳＤＬ（配列番号９）およびＦＡＰＰ（配列番号１３）の組換え糖ペプチドを、周知の細胞系統ＣＨＯ−Ｋ１、番号ＣＲＬ６１でＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ＡＴＣＣから入手することができる、線維芽細胞の形態を伴うチャイニーズハムスター卵巣腫瘍細胞系統から誘導される別々の株において発現させた（バック（Ｂｕｃｋ）ら、１９５８年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１０８：９４５−９５５頁）。
【０１２１】
標準的なアッセイ条件で検出可能なＣ２ＧｎＴグリコシルトランスフェラーゼ、α（１−２）フコシルトランスフェラーゼ、α（１−３）フコシルトランスフェラーゼ、α（１−４）フコシルトランスフェラーゼまたはα（１−３）ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を示さないという理由で、ＣＨＯ−Ｋ１細胞系統を選択した。
【０１２２】
プラスミド（クローニングされたｃＤＮＡ）の調製
異なる糖ペプチド成分の発現を可能にするクローニングされたｃＤＮＡは、チルグウィン（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ）ら［１９７９年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８：５２９４−５２９９頁］により記載の方法に従って、健康なヒト膵臓または例えば、ヒト膵腺癌由来の細胞系統ＳＯＪ−６［フジイ（Ｆｕｊｉｉ）ら、１９９０年、Ｈｕｍ．Ｃｅｌｌ．，３：３１−３６頁］のようなヒト膵臓腫瘍細胞系統の組織サンプルから抽出されるメッセンジャーＲＮＡのポリＡテイルとハイブリダイズするポリｄＴポリヌクレオチドプローブ（１８塩基）を用いて行われる逆転写によって得た。
【０１２３】
調製１：プラスミドｐＳｅｃ−ＦＡＰＰ
ヒト胎児膵腺房タンパク質（ＦＡＰＰ）（配列番号１０）をコードするｃＤＮＡの増幅物を、先に記載のヒト膵臓腫瘍系統ＳＯＪ−６から抽出される５μｇの全ＲＮＡから逆転写（５５℃で４５分間、逆転写キット、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州、米国）し、続いて、ヒトＢＳＤＬ（配列番号６）をコードするｃＤＮＡ配列から規定されるヌクレオチドプライマーＣ−ｔｅｒ／ＦＡＰＰ−ＢＳＤＬおよびＮ−ｔｅｒ／ＦＡＰＰを使用して、以下に記載の条件でＰＣＲを行った。ポリメラーゼ連鎖反応は、特に、グアニンおよびシトシンリッチのヌクレオチド配列の増幅を可能にする「Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ  ｃＤＮＡ  ＰＣＲ」キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）で行った。以下のプログラムを用いた。Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ９６サーモサイクラー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）において、９４℃で２分間の１サイクル、続いて、９４℃（変性）で１分間、５２℃（プライマーアニーリング）で１分間、および６８℃（伸長）で４分間の３５サイクル、続いて、６８℃で１０分間の１サイクル。
【０１２４】
プライマーは以下の配列を有する。
Ｎ−ｔｅｒ／ＦＡＰＰ（配列番号１）：
５’−ＴＴＣＧＴａａｇｃｔｔＧＣＧＡＡＧＣＴＧＧＧＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＡＧＡＡ−３’、
Ｃ−ｔｅｒ／ＦＡＰＰ−ＢＳＤＬ（配列番号２）：
５’−ＴＴＴＣＧＴｇａａｔｔｃＡＣＧＣＴＡＡＡＡＣＣＴＡＡＴＧＡＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＣＴＧ−３’。
【０１２５】
使用したＣ−ｔｅｒ／ＦＡＰＰ−ＢＳＤＬプライマー（配列番号２）は、ｃ−ｍｙｃエピトープの翻訳ならびに市販のベクターによって担持される６×ヒスチジンタグの翻訳を排除するように終末コドンを含んでなる。
【０１２６】
この様式で増幅されたｃＤＮＡ（ヌクレオチド１〜２１６９）（配列番号１２）は、シグナルペプチドを含まない。
【０１２７】
次いで、得られるｃＤＮＡをプラスミドｐＳｅｃ−Ｔａｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｅｅｋ、蘭国）にクローニングした。
【０１２８】
調製２：プラスミドｐＳｅｃ−１６Ｒ
正常な膵臓から抽出されたＲＮＡ由来のＢＳＤＬ（ヌクレオチド１０８９：Ｐｈｅ３６４からヌクレオチド２１６９：終止コドンまで、配列番号８および９）のＣ末端部をコードするｃＤＮＡを、プライマーＣ−ｔｅｒ／ＦＡＰＰ−ＢＳＤＬ（プライマー配列番号２、調製１を参照のこと）およびＮ−ｔｅｒ−Ｃｔを使用するＰＣＲによって、増幅した。
【０１２９】
Ｎ−ｔｅｒ−Ｃｔプライマーは、以下の配列を有した。
Ｎ−ｔｅｒ−Ｃｔ（配列番号３）：
５’−ＣＧＴＣＴＡａａｇｃｔｔＴＴＴＧＡＴＧＴＣＴＡＣＡＣＣＧＡＧＴＣＣ−３’。
【０１３０】
ポリメラーゼ連鎖反応は、先に記載の条件（調製１を参照のこと）で行った。
【０１３１】
次いで、得られるｃＤＮＡを、プラスミドｐＳｅｃ−Ｔａｇにクローニングした。
【０１３２】
調製３：プラスミドｐＳｅｃ−６Ｒ
プラスミドｐＳｅｃ−ＦＡＰＰに存在するＦＡＰＰ（ヌクレオチド１０８９：Ｐｈｅ３６４〜ヌクレオチド１８３９：終止コドンまで、配列番号１２および１３）のＣ末端部をコードするｃＤＮＡは、上記のヌクレオチドプライマーＮｏ２（Ｃ−ｔｅｒ／ＦＡＰＰ−ＢＳＤＬ）およびＮｏ３（Ｎ−ｔｅｒ−Ｃｔ）を使用するＰＣＲによって、増幅した。
【０１３３】
ポリメラーゼ連鎖反応は、調製１に記載の条件で行った。
【０１３４】
次いで、得られるｃＤＮＡを、プラスミドｐＳｅｃ−Ｔａｇにクローニングした。
【０１３５】
調製４：プラスミドｐＢＫ−αＧＴ
マウス心臓（Ｂａｌｂ／ｃマウス）から抽出されるＲＮＡ由来のα（１−３）ガラクトシルトランスフェラーゼ（ヌクレオチド−１０からヌクレオチド＋１１２２：終止コドンまで）をコードするｃＤＮＡを、マウスα（１−３）ガラクトシルトランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡ配列から規定されるプライマーＣｔｅｒ／αＧａｌおよびＮｔｅｒ／αＧａｌを使用するＰＣＲによって、増幅した。これらのプライマーは以下の配列を有する。
Ｎｔｅｒ／αＧａｌ（配列番号４）：５’−ＡＡＡＡＡｇａａｔｔｃＧＧＡＧＡＡＡＡＴＡＡＴＧＡＡＴ−３’。
Ｃｔｅｒ／αＧａｌ（配列番号５）：５’−ＡＡＡＡＡｇｇｇｃｃｃＡＣＡＡＡＧＴＣＡＧＡＣＡＴＴＡＴ−３’。
【０１３６】
ポリメラーゼ連鎖反応は、以下のプログラムに従って、「Ｔａｑ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ」キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ、仏国）により行った。Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ２４００サーモサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）において、９４℃で２分間の１サイクル、続いて、９４℃（変性）で１分間、５４℃（プライマーアニーリング）で１分間、および７４℃（伸長）で２分間の３５サイクル、次いで、７４℃で１０分間の１サイクル。
【０１３７】
次いで、得られるｃＤＮＡをプラスミドｐＢＫ−ＣＭＶ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、カリフォルニア州、米国）にクローニングした。
【０１３８】
調製５：プラスミドｐｃＤＮＡ３−Ｃ２β６ＧｎＴ−ｆｌａｇ
パニコット（Ｐａｎｉｃｏｔ）らＧｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９９９年、９：９３５−９４６頁により記載のグリコシルトランスフェラーゼのコア２β（１−６）Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡを、その３’末端でｆｌａｇエピトープをコードする配列を含んでなるベクターｐＣＤＮＡ−３にクローニングした。ｆｌａｇエピトープの発現は、形質転換された細胞におけるＣ２ＧｎＴ発現の検出を可能にする。
【０１３９】
以下の工程は、プラスミドの調製に共通であった。
ａ）連結
異なるＰＣＲ産物を、１％アガロースゲル上で分析し、「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」キット（Ｂｉｏ１０１）を使用して精製し、次いで、シャトルベクターｐＣＲ２．１ＴＯＰＯにサブクローニングし、ユニバーサルＭ１３およびリバースＭ１３プライマーにより、配列決定した（Ｅｕｒｏ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  Ｇｅｎｅｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｐａｒｉｓ、仏国）。次いで、ＰＣＲ産物を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩの作用によって、前記シャトルベクターから遊離させ、真核生物の発現および分泌プラスミドｐＳｅｃ−Ｔａｇにクローニングし、プラスミドｐＳｅｃ−ＦＡＰＰおよびｐＳｅｃ−１６Ｒ（１６ＲはＢＳＤＬのＣ末端ドメインに対応）（配列番号８）を得た。ＰＣＲによって得られるＦＡＰＰのＣ末端部をコードする相補的ＤＮＡを、精製およびＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ消化後にｐＳｅｃ−Ｔａｇプラスミドに直接クローニングし、プラスミドｐＳｅｃ−６Ｒ（６ＲはドメインＦＡＰＰのＣ末端に対応）（配列番号１２）を得た。配列決定は、ユニバーサルＴ７プライマーおよびＥｕｒｏ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  Ｇｅｎｅｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅによりこの目的のために合成されたＢＧＨ逆方向プライマーで行った。
【０１４０】
α（１−３）ガラクトシルトランスフェラーゼをコードするＰＣＲ産物を、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＡｐａＩで遊離させ、精製し、次いで、ベクターｐＢＫ−ＣＭＶのＥｃｏＲＩ／ＡｐａＩ部位に直接連結し、プラスミドｐＢＫ−αＧＴを得た。
【０１４１】
ｂ）細菌の形質転換
５μｌアリコートの連結産物を、ハナハン（Ｈａｎａｈａｎ）［ハナハン（Ｈａｎａｈａｎ）、１９８３年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６：５５７−５８０頁］により記載のプロトコルに従って、５０μｌのコンピテント細菌細胞（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、株ＴＯＰ１０Ｆ’）と接触させた。２マイクロリットルの０．５Ｍβ−メルカプトエタノールを添加し、サンプルを氷上で３０分間、保持し、次いで、４２℃で３０秒間、熱ショック処理し、直ちに氷上に戻した。２分間後、サンプルを４５０μｌのＳＯＣ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で希釈した。細菌懸濁液を、１時間、３７℃で振盪しながらインキュベートした。次いで、ガラスビーズを使用して、細菌を、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを補充したＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｇｎｉ寒天を含有するペトリディッシュ上に拡げた。
【０１４２】
ｃ）プラスミドの精製
選択寒天培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリン）上での１８時間の培養後に出現した細菌コロニーを拾い出し、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２ｍｌのＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｇｎｉ液体培地に播種した。培養物を、８時間、３７℃で振盪しながらインキュベートし、次いで、１．５ｍｌの細菌懸濁液を、５，０００ｇで５分間、遠心分離した。細菌ペレットを、１００μｌの細菌膜不安定化緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、リボヌクレアーゼＡ１００μｇ／ｍｌ）に採取した。細菌懸濁液を２００μｌのアルカリ溶解緩衝液（２００ｍＭ  ＮａＯＨ、１％ＳＤＳ）の添加によって溶解し、調製物のｐＨを１５０μｌの３Ｍ酢酸カリウムｐＨ５．５で中和した。アルカリ溶解および中和工程には、氷上での５分間のインキュベーションを必要とする。細胞破砕物、変性したタンパク質および染色体ＤＮＡは、１０，０００ｇで１０分間、４℃での遠心分離によって排除した。次いで、上清を、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌでｐＨ８に安定化させたフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５／２４／１Ｖ／Ｖ／Ｖ）における１：２希釈により、フェノール−クロロホルムで抽出した。１０，０００ｇ、２分間、室温での遠心分離によって、水相と有機相を分離した。上部の水相を回収し、無水エタノール（−２０℃）で１：３希釈した。プラスミドＤＮＡを、１２，０００ｇ、１５分間、４℃での遠心分離によって沈殿させ、次いで、７０％エタノールで２回洗浄した。次いで、プラスミドＤＮＡを２０μｌの超純水に再懸濁し、−２０℃で保存した。
【０１４３】
細胞クローンの調製
調製６：細胞クローンＣＨＯ−Ｃ２および中間細胞のクローンの入手に関する一般的ポイント
ＣＨＯ−Ｋ１細胞系統を、その３’末端でｆｌａｇエピトープをコードする配列を含んでなるグリコシルトランスフェラーゼのコア２β（１−６）Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（Ｃ２ＧｎＴ）をコードするｃＤＮＡを含んでなるプラスミドｐｃＤＮＡ３−Ｃ２β６ＧｎＴ−ｆｌａｇでトランスフェクトした。ｆｌａｇエピトープの発現は、形質転換された細胞におけるＣ２ＧｎＴ発現の検出を可能にする。
【０１４４】
この意味で、ＣＨＯ−Ｋ１細胞をＨＡＭ−Ｆ１２培地で増殖させた。細胞が６０〜８０％コンフルエンスに達した場合、培養培地を取り出し、細胞表面をＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地で３回洗浄し、次いで、ウシ胎児血清を伴わないＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地で希釈した２００μｌのトランスフェクション溶液で覆った。トランスフェクション溶液は、上記のプラスミドおよびリポフェクタミン−リポソーム懸濁系（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有した。
【０１４５】
このようにして細胞を１６時間保持し、この時点で、トランスフェクション懸濁液を、少なくとも４週間の期間、適切な選択的抗生物質（ネオマイシン、ゼオシン（ｚｅｏｃｉｎ）またはハイグロマイシン）を含有する２ｍｌの完全ＨＡＭ−Ｆ１２培地で置き換えた。抗生物質の作用に対して耐性なクローンを単離し、次いで、増幅した。
【０１４６】
ネオマイシン（２５０μｇ／ｍｌ）によるこの様式で選択されたＣＨＯ−Ｋ１細胞クローンをＣＨＯ−Ｃ２と命名した。
【０１４７】
次いで、前記クローンＣＨＯ−Ｃ２を、以下の調製７に記載のプラスミドｐＳｅｃ−１６Ｒでトランスフェクトした。プラスミドｐＳｅｃ−１６ＲによるＣＨＯ−Ｃ２細胞の形質転換から生じるクローンをゼオシン（１ｍｇ／ｍｌ）で選択し、ＣＨＯ−Ｃ２−１６Ｒと命名した。
【０１４８】
ＣＨＯ−Ｋ１細胞はまた、上記の方法に従って、クロウスカ−ラオ（Ｋｕｋｏｗｓｋａ−Ｌａｌｌｏ）ら（１９９０年、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．４：１２８８−１３０３頁）に記載のフコシルトランスフェラーゼ３をコードするプラスミドｐＣＤＭ７−ＦＵＴ３、およびプラスミドｐＭａｍＮｅｏで同時トランスフェクトした。プラスミドｐＣＤＭ７−ＦＵＴ３によるＣＨＯ−Ｋ１細胞の形質転換から生じるＣＨＯ−Ｆ３クローンを、一方ではネオマイシン（２５０μｇ／ｍｌ）で、他方では、シアリルルイスｘモチーフのその高度発現について、選択した。前記発現は、抗体ＣＳＬＥＸ−１（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）の援助による間接免疫蛍光によって、検出した。この様式で、クローンＣＨＯ−Ｆ３が得られた。
【０１４９】
次いで、前記クローンＣＨＯ−Ｆ３を、以下の調製７に記載のプラスミドｐＳｅｃ−１６Ｒでトランスフェクトした。プラスミドｐＳｅｃ−１６ＲによるＣＨＯ−Ｆ３細胞の形質転換から生じるクローンをゼオシン（１ｍｇ／ｍｌ）で選択し、ＣＨＯ−Ｆ３−１６Ｒと命名した。
【０１５０】
ＣＨＯ−Ｋ１細胞はまた、プラスミドｐＣＤＭ７−ＦＵＴ３の代わりに、ロウ（Ｌｏｗｅ）ら（１９９１年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１７４６７−１７４７７頁）により記載のフコシルトランスフェラーゼ７をコードするプラスミドｐＣＤＭ８−ＦＵＴ７、次いで、プラスミドｐＳｅｃ１６Ｒでトランスフェクトした。先に記載の条件でのゼオシンおよびネオマイシンによる選択後、得られるクローンをＣＨＯ−Ｆ７−１６Ｒと命名した。
【０１５１】
ＦＡＰＰ（６Ｒ）のＣ末端ペプチドを発現する中間クローンを調製するために、プラスミドｐＳｅｃ１６Ｒの代わりにプラスミドｐＳｅｃ−６Ｒで細胞系統または細胞クローンＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｃ２およびＣＨＯ−Ｆ３をトランスフェクトすることによって、上記の方法を用いた（調製７に記載の方法を参照のこと）。しかし、Ｊ２８グリコシル化エピトープを組み立てるのに必要なグリコシルトランスフェラーゼＣ２ＧｎＴおよびフコシルトランスフェラーゼ３のみを、細胞系統の調製中に使用した。
【０１５２】
従って、上記の条件での抗生物質選択後に、３つの中間細胞のクローンＣＨＯ−６Ｒ、ＣＨＯ−Ｃ２−６ＲおよびＣＨＯ−Ｆ３−６Ｒを得た。
【０１５３】
調製７：細胞クローンＣＨＯ−１６Ｒ
ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、ＢＳＤＬのＣ末端ドメインをコードするｃＤＮＡがクローニングされた（調製２を参照のこと）プラスミドｐＳｅｃ−Ｔａｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｅｅｋ、蘭国）に対応するプラスミドｐＳｅｃ−１６Ｒでトランスフェクトした。これは、調製６におけるクローンＣＨＯ−Ｃ２の調製について行われた。
【０１５４】
ｐＳｅｃ−Ｔａｇプラスミドは、マウス免疫グロブリンκ軽鎖のＶ−Ｊ２Ｃ領域をコードする配列を担持する。前記配列は、プラスミドにおいてクローニングされたｃＤＮＡによってコードされるタンパク質を、それがトランスフェクトされている真核細胞の分泌経路に指向する。
【０１５５】
プラスミドｐＳｅｃ−１６ＲによるＣＨＯ−Ｋ１細胞の形質転換から生じるクローンはＣＨＯ−１６Ｒと命名し、対応する（糖）ペプチド［（糖）ペプチド１６Ｒ］の発現について選択した。
【０１５６】
調製８：細胞クローンＣＨＯ−Ｃ２−Ｆ３−１６Ｒ
調製６由来のクローンＣＨＯ−Ｃ２を、プラスミドｐＣＤＭ７−ＦＵＴ３およびハイグロマイシン耐性を付与するプラスミドｐＬＳＶＨｇ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）でトランスフェクトし、細胞クローンＣＨＯ−Ｃ２−Ｆ３を得た。
【０１５７】
ＣＨＯ−Ｃ２−Ｆ３細胞系統を調製７におけるようなプラスミドｐＳｅｃ−１６Ｒでトランスフェクトした。プラスミドｐＳｅｃ−１６ＲによるＣＨＯ−Ｃ２−Ｆ３細胞の形質転換から生じるクローンを、ＣＨＯ−Ｃ２−Ｆ３−１６Ｒと命名した。
【０１５８】
ＣＨＯ−Ｃ２−Ｆ３−１６Ｒは、シアリルルイスｘモチーフを発現し、抗体ｐＡｂＬ６４に対する反応性を示す。
【０１５９】
調製９：細胞クローンＣＨＯ−Ｃ２−Ｆ７−１６Ｒ
これは、調製８におけるように得られたが、但し、プラスミドｐＣＤＭ７−ＦＵＴ３の代わりにプラスミドｐＣＤＭ８−ＦＵＴ７を使用した。
【０１６０】
プラスミドｐＳｅｃ−１６ＲによるＣＨＯ−Ｃ２−Ｆ７細胞の形質転換から生じるクローンをＣＨＯ−Ｃ２−Ｆ７−１６Ｒと命名し、対応する細胞系統を、２００４年３月１６日に番号Ｉ−３１８９でパリのＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）に寄託した。
【０１６１】
調製８ならびに９で得られたクローンＣＨＯ−Ｃ２−Ｆ３−１６ＲおよびＣＨＯ−Ｃ２−Ｆ７−１６Ｒは、シリアルルイスｘモチーフを発現し、抗体ｐＡｂＬ６４に対する反応性を示す。
【０１６２】
調製１０：細胞クローンＣＨＯ−Ｃ２−Ｆ３−６Ｒ
調製８由来のクローンＣＨＯ−Ｃ２−Ｆ３は、調製６および７について記載のとおりに、プラスミドｐＳｅｃ−６Ｒ（調製３を参照のこと）でトランスフェクトし、クローンＣＨＯ−Ｃ２−Ｆ３−６Ｒを得た。このクローンは、中でもモノクローナル抗体Ｊ２８によって認識されるグリコシル化エピトープを有するペプチドを発現する。
【０１６３】
調製１１：細胞クローンＣＨＯ−Ｃ２−Ｆ３−ＧＴ−６Ｒ
調製１０由来のクローンＣＨＯ−Ｃ２−Ｆ３−６Ｒを、先に記載のように、プラスミドｐＢＫ−αＧＴ（調製４を参照のこと）でトランスフェクトし、モノクローナル抗体Ｊ２８によって認識されるグリコシル化エピトープならびにヒト血液における天然の循環抗体によって認識されるグリコシル化エピトープαＧａｌを有するクローンＣＨＯ−Ｃ２−Ｆ３−ＧＴ−６Ｒを得た。
【０１６４】
実施例１：ＢＳＤＬのＣ末端（ＣＨＯ−１６Ｒ）に対応するサイズおよび特徴を有する組換え糖ペプチド
組換え糖ペプチドは、適切な選択的抗生物質を補充した２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび０．１％フォンギゾン（ｆｏｎｇｉｚｏｎｅ）を含有するＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）における恒湿、５％ＣＯ２大気中１６時間、３７℃で細胞クローンＣＨＯ−１６Ｒ（調製７）の日常的培養によって、産生される。細胞を、２×１０４細胞／ｃｍ２の密度で接種した。
【０１６５】
培養培地を４８時間ごとに交換した。細胞がコンフルエンスに到達したら、それらをＣａＣｌ２およびＭｇＣｌ２を伴わないリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄し、次いで、トリプシン／０．０５％ＥＤＴＡで脱離させ、低速遠心分離（４００ｇ、３分間）により沈降させ、５ｍｌの培養培地に再懸濁した。
【０１６６】
細胞内免疫蛍光およびフローサイトメトリーを使用して、細胞クローンが目的の組換え糖ペプチドを発現することを確認した。
【０１６７】
組換え糖ペプチドを、液体クロマトグラフィー、続いて、アフィニティークロマトグラフィーによって精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０１６８】
ゲル上で、分泌されたペプチドが約７８ｋＤａおよび８３ｋＤａの異なる２つの分子量バンドに分離することを認めることができた。
【０１６９】
８３ｋＤａのバンドは、おそらく、グリコシル化ペプチドに対応する一方、７８ｋＤａのバンドは、非グリコシル化形態またはそれ程グリコシル化されていない形態のいずれかであり得る。
【０１７０】
従って、上記のクローンは、ＢＳＤＬのＣ末端に対応するサイズおよび特徴を有する糖ペプチドを発現すると思われる。
【０１７１】
実施例２：ＢＳＤＬのＣ末端（ＣＨＯ−Ｃ２−１６Ｒ）に対応するサイズおよび特徴を有する組換え糖ペプチド
実施例１に記載の方法を用いたが、但し、細胞クローンＣＨＯ−Ｃ２−１６Ｒ（調製６）を培養した。
【０１７２】
得られた組換え糖ペプチドを、液体クロマトグラフィー、続いて、アフィニティークロマトグラフィーによって精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０１７３】
ゲル上で、分泌されたペプチドが約７８ｋＤａおよび８３ｋＤａの異なる２つの分子量バンドに分離することを認めることができた。
【０１７４】
従って、上記のクローンは、ＢＳＤＬのＣ末端に対応するサイズおよび特徴を有する糖ペプチドを発現すると思われる。
【０１７５】
実施例３：ＢＳＤＬのＣ末端（ＣＨＯ−Ｆ３−１６Ｒ）に対応するサイズおよび特徴を有する組換え糖ペプチド
実施例１に記載の方法を用いたが、但し、細胞クローンＣＨＯ−Ｆ３−１６Ｒ（調製６）を培養した。
【０１７６】
得られた組換え糖ペプチドを、液体クロマトグラフィー、続いて、アフィニティークロマトグラフィーによって精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０１７７】
ゲル上で、分泌されたペプチドが約７８ｋＤａおよび８３ｋＤａの異なる２つの分子量バンドに分離することを認めることができた。
【０１７８】
従って、上記のクローンは、ＢＳＤＬのＣ末端に対応するサイズおよび特徴を有する糖ペプチドを発現すると思われる。
【０１７９】
実施例４：ＢＳＤＬのＣ末端（ＣＨＯ−Ｃ２−Ｆ３−１６Ｒ）に対応するサイズおよび特徴を有する組換え糖ペプチド
実施例１に記載の方法を用いたが、但し、細胞クローンＣＨＯ−Ｃ２−Ｆ３−１６Ｒ（調製８）を培養した。
【０１８０】
得られた組換え糖ペプチドを、液体クロマトグラフィー、続いて、アフィニティークロマトグラフィーによって精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０１８１】
ゲル上で、分泌されたペプチドが約７８ｋＤａおよび８３ｋＤａの異なる２つの分子量バンドに分離することを認めることができた。
【０１８２】
従って、上記のクローンは、ＢＳＤＬのＣ末端に対応するサイズおよび特徴を有する糖ペプチドを発現すると思われる。
【０１８３】
実施例５：ＢＳＤＬのＣ末端（ＣＨＯ−Ｆ７−１６Ｒ）に対応するサイズおよび特徴を有する組換え糖ペプチド
実施例１に記載の方法を用いたが、但し、細胞クローンＣＨＯ−Ｆ７−１６Ｒ（調製６）を培養した。
【０１８４】
得られた組換え糖ペプチドを、液体クロマトグラフィー、続いて、アフィニティークロマトグラフィーによって精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０１８５】
分子量８３ｋＤａの単一のバンドがゲル上で認められた。
【０１８６】
実施例６：ＢＳＤＬのＣ末端（ＣＨＯ−Ｃ２−Ｆ７−１６Ｒ）に対応するサイズおよび特徴を有する組換え糖ペプチド
実施例１に記載の方法を用いたが、但し、細胞クローンＣＨＯ−Ｃ２−Ｆ７−１６Ｒ（調製９）を培養した。
【０１８７】
得られた組換え糖ペプチドを、液体クロマトグラフィー、続いて、アフィニティークロマトグラフィーによって精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０１８８】
ゲル上で、分泌されたペプチドが約７８ｋＤａおよび８３ｋＤａの異なる２つの分子量バンドに分離することを認めることができた。
【０１８９】
従って、上記のクローンは、ＢＳＤＬのＣ末端に対応するサイズおよび特徴を有する糖ペプチドを発現すると思われる。
【０１９０】
従って、上記のクローン（１６Ｒ）は、ＢＳＤＬのＣ末端に対応するサイズおよび特徴を有する糖ペプチドを発現すると思われる。
【０１９１】
実施例７〜１３：ＦＡＰＰのＣ末端に対応するサイズおよび特徴を有する組換え糖ペプチド
クローンＣＨＯ−Ｋ１（コントロール）、ＣＨＯ−６Ｒ（Ｅｘ７）、ＣＨＯ−Ｃ２−６Ｒ（Ｅｘ８）、ＣＨＯ−Ｆ３−６Ｒ（Ｅｘ９）、ＣＨＯ−Ｃ２−Ｆ３−６Ｒ（Ｅｘ１０）、ＣＨＯ−ＧＴ−６Ｒ（Ｅｘ１１）、ＣＨＯ−Ｃ２−ＧＴ−６Ｒ（Ｅｘ１２）およびＣＨＯ−Ｃ２−Ｆ３−ＧＴ−６Ｒ（Ｅｘ１３）により産生される組換えポリペプチドを、ポリアクリルアミドゲルあるいはそうでなければ液体および／またはアフィニティークロマトグラフィー上で精製し、アボウアキル（Ａｂｏｕａｋｉｌ）ら、１９８８年、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、９６１：２９９−３０８頁により記載の抗体ｐＡｂＬ６４、およびｍＡｂＪ２８を使用する免疫検出によって分析した。ＦＡＰＰの癌胎児性形態のＯ−グリコシル化から誘導されるフコシル化Ｊ２８糖ペプチドに特異的なマウスモノクローナル抗体ｍＡｂＪ２８については、パニコット（Ｐａｎｉｃｏｔ）らＧｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９９９年、９：９３５−９４６頁に記載されている。
【０１９２】
抗ＢＳＤＬポリクローナル抗体ｐＡｂＬ６４は、ヒト膵液から抗原を精製した後ウサギを免疫することによって得られた。前記抗体は、ＦＡＰＰ、ＢＳＤＬの癌胎児性形態を完全に認識する。
【０１９３】
アンチペプチドと命名されたＢＳＤＬタンパク質コアに特異的なポリクローナル抗体は、位置３４６のセリン残基とヘモシアニンに結合した位置３７０のグルタミンとの間に含まれるＢＳＤＬのペプチド配列に対応する合成ペプチドでウサギを免疫することによって得られた。
【０１９４】
前記２つの抗体を、タンパク質Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上で精製した。アンチペプチドを、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅゲルに結合したキーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）のカラム上でのアフィニティークロマトグラフィーによる第２の精製工程に供し、抗ＫＬＨ抗体を排除した。
【０１９５】
６Ｒ型の異なるクローンによって産生される組換えペプチドを、１０％ポリアクリルアミドゲル上に１レーンあたり１００μｇで充填し、分離し、次いで、ニトロセルロース膜にエレクトロトランスファーした。次いで、膜を、一方で抗体ｐＡｂＬ６４、および他方で抗体ｍＡｂＪ２８の存在下でインキュベートし、展開させた。
【０１９６】
両方の場合において、用いた抗体は、ネガティブコントロールとして使用されたトランスフェクトされていないＣＨＯ−Ｋ１細胞系統の場合を除いて、ＦＡＰＰのＣ−末端糖ペプチドの予想されるサイズに対応する５０ｋＤａのサイズを有するポリペプチドに特異的に結合した。
【０１９７】
実施例１４〜１９：抗糖ペプチドモノクローナル抗体
ＦＡＰＰのＣ末端に対応するサイズおよび特徴を有する組換え抗糖ペプチド抗体を、以下の通りに調製した。
段階Ａ−マウスの免疫化。
６週齢雄性Ｂａｌｂ／ｃマウスを、以下のプロトコルに従って免疫した。
０日目：５０：５０エマルジョン（１５０μｌ  ＮａＣｌ／１５０μｌ完全フロイントアジュバント）における正常および病的ヒト膵液（以下にＢＳＤＬ−ＦＡＰＰ  抗原と命名される）から精製されたＦＡＰＰおよびＢＳＤＬの２５μｇの混合物の腹腔内注入。
１５日目：５０：５０エマルジョン（１５０μｌ  ＮａＣｌ／１５０μｌ不完全フロイントアジュバント）における２５μｇのＢＳＤＬ−ＦＡＰＰ抗原での腹腔内チャレンジ
−  ３０日目：５０：５０エマルジョン（１５０μｌ  ＮａＣｌ／１５０μｌ不完全フロイントアジュバント）における２５μｇのＢＳＤＬ−ＦＡＰＰ抗原での腹腔内チャレンジ
−  １１０日目：５０：５０エマルジョン（１５０μｌ  ＮａＣｌ／１５０μｌ不完全フロイントアジュバント）における２０μｇのＢＳＤＬ−ＦＡＰＰ抗原での腹腔内チャレンジ
−  １４０日目：５０：５０エマルジョン（１５０μｌ  ＮａＣｌ／１５０μｌ不完全フロイントアジュバント）における２０μｇのＢＳＤＬ−ＦＡＰＰ抗原での腹腔内チャレンジ
−  ２１５日目：５０：５０エマルジョン（１５０μｌ  ＮａＣｌ／１５０μｌ不完全フロイントアジュバント）における２０μｇのＢＳＤＬ−ＦＡＰＰ抗原での腹腔内チャレンジ
−  ２４４日目：１００μｌの滅菌ＮａＣｌにおける１０μｇのＢＳＤＬ−ＦＡＰＰ抗原の静脈内注入。
−  ２４７日目：細胞融合。
【０１９８】
段階Ｂ−コーレル（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルステイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）のプロトコルに従う細胞融合
ａ）２４７日目に、選択したマウスを屠殺し、脾臓を取り出し、グループ分けした。脾臓の細胞をＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄した。２０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１％グルタミン、１％非必須アミノ酸および１％ピルビン酸ナトリウムを含有するＲＰＭＩ１６４０培地において予め増殖されたＰ３．Ｘ６３．Ａｇ８  ６５３骨髄腫細胞もまた、同じ培地で洗浄した。
【０１９９】
同時に、ＲＰＭＩによる非免疫Ｂａｌｂ／ｃマウスの腹腔洗浄により、腹膜マクロファージを回収した。
【０２００】
ハイブリドーマ形成のために、１個の骨髄腫細胞に対して５個の脾臓細胞の割合で、チューブにおいて脾臓細胞および骨髄腫細胞を混合した。遠心分離後、細胞ペレットを、７５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液ｐＨ７．５中５０％ポリエチレングリコール１５００の８００μｌに再懸濁した。３７℃での１分間の接触後、２０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地を緩徐に融合細胞に添加した。
【０２０１】
ｂ）初期培養は、２０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有し、５×１０−３Ｍヒポキサンチン、２×１０−５Ｍアミノプテリンおよび８×１０−４Ｍチミジンを補充したＲＰＭＩ培地の存在下、９６ウェルマイクロタイタープレート上で行った。次に、５×１０３腹膜マクロファージ、続いて１０５融合細胞を各ウェルに堆積させた。
【０２０２】
段階Ｃ−クローニングおよびサブクローニング
以下の段階Ｄに記載の方法によって選択される各ハイブリドーマは、１０、５、２、１および０．５細胞が腹膜マクロファージを含有するマイクロウェルに統計的に分配される限界希釈技術によるクローニングから生じた。従って、行われた２つのサブクローニング、複製されている各クローンおよびサブクローンを、９０％ＦＣＳおよび１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に凍結した。次いで、最後の作製由来のサブクローンを、インビボで拡大し、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて腹水を得、続いて、プロテインＡカラム上での免疫グロブリン精製を行った。
【０２０３】
段階Ｄ−ハイブリッド細胞選択方法
選択は、培養上清を使用する液相ＥＬＩＳＡ方法によって、行った。１００μｌの炭酸緩衝液ｐＨ８．５中５マイクログラムのＢＳＤＬ−ＦＡＰＰ抗原を、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェルに堆積させた。プレートを１２時間、４℃で活性化し、３００μｌの１ｍｇ／ｍｌウシアルブミンを２時間、飽和させた。次いで、プレートを洗浄し、ＢＳＤＬ−ＦＡＰＰ抗原に対して指向された抗体を潜在的に含有する１００μｌの細胞培養上清と共にインキュベートした。２時間のインキュベーション後、プレートを洗浄し、アルカリホスファターゼ標識第二抗体と共に２時間、インキュベートした。インキュベーションの終了時に、プレートを再度洗浄し、パラ−ニトロフェニルリン酸（１００μｌ、０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．２および１ｍＭ  ＣａＣｌ２中１ｍｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした。３７℃で１時間後、プレートを、マイクロプレートリーダー上、４１０ｎｍで読み取った。
【０２０４】
ＥＬＩＳＡ試験におけるそれらの応答について、約１５抗体を選択した。免疫原タンパク質としてＦＡＰＰを使用するウエスタンブロット（イムノインプリンティング）によるさらなる分析は、ハイブリドーマ７Ｂ４（実施例１４）、１１Ｄ７（実施例１５）、１４Ｈ９（実施例１６）、１４Ｈ１０（実施例１７）、１６Ｄ１０（実施例１８）および８Ｈ８（実施例１９）の選択を可能にした。
【０２０５】
ＩｇＭ抗体１６Ｄ１０を産生する細胞は、２００４年３月１６日に番号Ｉ−３１８８でパリのＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）に寄託された。
【０２０６】
実施例２０．天然由来の膜糖ペプチドの調製
実施例１４〜１９に記載のモノクローナル抗体によって認識されるエピトープを担持する膜糖ペプチドを、以下の様式で調製した。膵臓腫瘍細胞を、プラスチック製支持体上で培養し、次いで、それから非酵素的解離溶液（Ｓｉｇｍａ）で脱離させた。遠心分離（１０００ｒｐｍで２分間）によって得られる細胞ペレットを、音波処理（２×１５秒間）し、再度遠心分離した（２０分間、１４，０００ｒｐｍ、４℃）。リン酸緩衝液に懸濁されたペレットは、実施例１４〜１９に記載のモノクローナル抗体によって認識されるエピトープを担持する膜糖ペプチドに対応する。
【０２０７】
実施例２１
以下の組成を有するワクチンを調製した。
−  ＨａＰＴ−１膵臓細胞から単離された実施例２０由来の膜糖ペプチド、２０μｇ
−  ＡＬＵ−ｇｅｌ−ｓｅｒアジュバント（Ｓｅｒｖａ）  １５０μｌ
−  注射用水を含む賦形剤  １５０μｌ
【０２０８】
ワクチン化は、腫瘍細胞を動物の横腹に移植する２週間前、次いで１週間前の腹腔内注入によって、行った。前記ワクチン化の結果を、プラセボ（等張液の注入）の結果と比較した。
【０２０９】
実施例２２
実施例１８由来の抗体（１６Ｄ１０）の０．５ｍｇ／ｍｌ注射用等張液を調製した。
【０２１０】
コントロール実施例１：ＢＳＤＬのＣ末端に対応するサイズおよび特徴を有する組換え糖ペプチド
実施例１に記載の方法を用いたが、但し、細胞クローンＣＨＯ−Ｋ１を培養した。
【０２１１】
ゲルは、分子量７８ｋＤａまたは８３ｋＤａで任意のバンドを示さなかった。
【０２１２】
薬学的研究
実験１：膵外分泌癌の細胞免疫療法におけるＢＳＤＬおよびＦＡＰＰの組換えＣ−末端糖ペプチドの使用
【０２１３】
操作プロトコル：
ハムスター（９０〜１００ｇ）をいくらかの群に分け、３０分間のＵＶ曝露によって不活化したＨａＰＴ−１細胞を接種した。ハムスターに、実施例２０由来の糖ペプチドおよび２週間の間週１回の腹腔内注入によってＡＬＵ−ｇｅｌ−ｓｅｒアジュバントと混合された不活化細胞を接種した。最後の接種の２週間後、ハムスターにＨａＰＴ−１細胞の転移移植（皮下、横腹上）を行った。
【０２１４】
腫瘍増殖を毎週モニターし、腫瘍容積を、プラセボ（ＰＢＳのみ）を接種したコントロール群と比較した。
【０２１５】
結果：
腫瘍増殖曲線は、実施例２０由来の糖ペプチド（ＢＳＤＬおよび／またはＦＡＰＰのＣ末端ドメインに対して指向されたモノクローナル抗体Ｊ２８および１６Ｄ１０（実施例１８）によって認識される構造によって、大きな部分において提示される抗原）で免疫されるハムスターでは、有意に遅かった。
【０２１６】
実験の終了時、不活化された細胞を接種された群の腫瘍容積は、コントロール群より８０％低かった。
【０２１７】
ハムスターを屠殺し、免疫組織化学分析のために、膵臓および腫瘍組織サンプルを取り出した。モノクローナル抗体Ｊ２８および１６Ｄ１０ならびにポリクローナル抗体Ｌ６４を使用して、（それぞれ、モノクローナル抗体Ｊ２８および１６Ｄ１０によって認識される）１６Ｄ１０およびＪ２８エピトープならびにＦＡＰＰタンパク質コアの発現について試験した。
【０２１８】
腫瘍組織スライスの検査により、不活化された細胞を接種された群とコントロール群との間で、１６Ｄ１０およびＪ２８エピトープの発現の減少（後者の減少の方が小さい）が示された。
【０２１９】
従って、本発明に従うＢＳＤＬおよびＦＡＰＰのＣ−末端糖ペプチドは、膵外分泌癌の細胞免疫療法において使用することができる。
【０２２０】
実験２：糖尿病の病状診断における本発明に従う糖ペプチドの使用
操作プロトコル：
多様な膵臓および他の病状を患う患者由来の血清におけるＥＬＩＳＡ方法によって行われる一連の実験は、ＥＬＩＳＡプレートを活性化するために抗原として使用されるＢＳＤＬが、Ｉ型糖尿病患者由来の血清の約８０％に存在する抗体によって特異的に認識される一方、コントロール患者由来の血清で反応性であったのは１０％未満であったことを示した。膵臓炎、膵臓癌またはグレーブス病のような他の病状の患者由来の血清は反応性ではなかった（パニコット（Ｐａｎｉｃｏｔ）ら１９９９年、Ｄｉａｂｅｔｅｓ，４８：２３１６−２３２３頁）。
【０２２１】
実施例２、５および６由来の組換え糖ペプチドを、ウエスタンブロット（またはイムノインプリンティング）によって試験した。
【０２２２】
結果：
ＢＳＤＬ、および特にそのＣ末端ドメインは、糖尿病患者由来の血清によって認識される一方、ＢＳＤＬは、正常なコントロール患者由来の血清によって認識されなかった。
【０２２３】
実施例２および６由来の組換え糖ペプチドは、糖尿病（Ｉ型）患者由来の血清によって認識された。
【０２２４】
コントロール血清（健康な患者由来）は、前記３つの糖ペプチドのいずれも認識しなかった。
【０２２５】
従って、実施例に記載の本発明の正常および組換えＣ−末端糖ペプチドは、糖尿病の病状の診断に使用することができる。
【０２２６】
実験３：膵臓癌の診断におけるＦＡＰＰおよび／またはＢＳＤＬのＣ末端ドメインに対して指向されたモノクローナル抗体の使用
操作プロトコル：
ヒト膵臓腫瘍細胞系統ＳＯＪ−６およびＢｘ−ＰＣ−３ならびにヒト非膵臓腫瘍細胞系統Ｃａｃｏ−２およびＨｅｐ−Ｇ２を、モノクローナル抗体Ｊ２８、１６Ｄ１０（実施例１８）、および８Ｈ８（実施例１９）ならびにＢＳＤＬおよびＦＡＰＰのＣ末端ドメインに特異的なポリクローナル抗体（ｐＡｂ）Ｌ６４で処置した。それぞれの抗原−抗体複合体を、蛍光ウサギまたはマウスフルオレセイン結合Ｎ−イソチオシアネート抗ＩｇＧ抗体の援助で検出した。ＦＡＣＳ分析を使用して、それらの表面で、ＦＡＰＰおよびＢＳＤＬのＣ末端ドメインと会合した抗原の存在を検出した。
【０２２７】
結果：
モノクローナル抗体Ｊ２８および１６Ｄ１０（実施例１８）、ならびにポリクローナル抗体（ｐＡｂ）Ｌ６４は、ヒト膵臓腫瘍細胞系統ＳＯＪ−６の表面を特異的に認識し、Ｂｘ−ＰＣ−３はＣａｃｏ−２およびＨｅｐ−Ｇ２細胞のような試験したヒト非膵臓腫瘍細胞系統の表面を認識しなかった。
【０２２８】
従って、ＦＡＰＰおよびＢＳＤＬのＣ末端ドメイン上に特異的に発現されるグリコシル化エピトープに対して指向されたモノクローナル抗体Ｊ２８および１６Ｄ１０は、膵臓腫瘍細胞を非膵臓腫瘍細胞から区別することが可能である。
【０２２９】
従って、ＦＡＰＰおよびＢＳＤＬのＣ末端ドメイン上で特異的に発現されるグリコシル化エピトープに対して指向されたモノクローナル抗体は、膵臓癌の診断に使用することができる。
【０２３０】
特に、前記抗体は、二次腫瘍（転移）が、膵臓由来であるかまたは別の由来の原発性腫瘍由来であるかどうかを決定することができる。
【０２３１】
実験４：本発明のモノクローナル抗体による膵臓新生物細胞の標的化
Ａ−ヒト膵臓組織切片に関する研究
操作プロトコル：
ＦＡＰＰおよび／またはＢＳＤＬのＣ末端ドメインに対して指向されたモノクローナル抗体によって認識されるグリコシル化エピトープの組織発現を、正常および癌ヒト膵臓組織切片に対する本発明の多様なモノクローナル抗体で行った免疫組織化学研究において、試験した。
【０２３２】
第１の工程では、膵臓組織を、４例の膵臓癌患者および５例の正常膵臓から得た。組織切片を、実施例１８（１６Ｄ１０）および１９（８Ｈ８）由来の抗体共にインキュベートした。
【０２３３】
第２の工程では、７例のヒト膵腫瘍組織サンプルおよび５例の非腫瘍組織（病理学者によって診断された）を５μｍ厚の切片にスライスし、アセトン中、４℃で乾燥し、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．６において再水和した。次いで、切片を、１時間、２５℃（ｍＡｂＪ２８およびｍＡｂ８Ｈ８、実施例１９）または１晩、４℃（ｍＡｂ１６Ｄ１０、実施例１８）のいずれかとインキュベートし、抗体は、Ｄａｋｏ希釈液（ＥｎＶｉｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｄａｋｏ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、丁国）中１：５０で希釈した。次いで、切片を適切なアルカリホスファターゼ標識第二抗体と共にインキュベートした。次いで、抗原−抗体複合体を、発色基質Ｆａｓｔ−Ｒｅｄで検出した。共焦点レーザー走査顕微鏡法による定量分析の場合、適切な第二抗体は、ストレプトアビジン−フルオロセインで標識された。次いで、切片を、顕微鏡下または共焦点レーザー蛍光顕微鏡により調べた。
【０２３４】
結果：
最初の実験では、実施例１８（１６Ｄ１０）由来のモノクローナル抗体は、４つの膵腫瘍組織サンプル由来の新生物細胞を特異的に認識した。
【０２３５】
５例の正常な膵臓組織では、反応は観察されなかった。
【０２３６】
実施例１９（８Ｈ８）由来のモノクローナル抗体は、正常な膵臓組織を好適に認識した。
【０２３７】
第２の実験では、研究した全部で７つの組織サンプルのうち、７つがｍＡｂ１６Ｄ１０（実施例１８）および５つがｍＡｂＪ２８によって認識された。免疫組織化学的結果を、図１ならびに表１および２に示す。ｍＡｂ１６Ｄ１０（実施例１８）は、腫瘍組織に対して極めて高い特異性を示す一方、ｍＡｂ８Ｈ８（実施例１９）は、正常な膵臓組織のみを認識した。ｍＡｂＪ２８は、腫瘍組織を好適に認識したが、いくつかの正常組織もまた認識したため、中間的な特異性を示した。表２は、抗体によって標識された組織切片上の蛍光強度を規定する共焦点レーザー顕微鏡の結果を示す。これらの抗体のうち、試験した他の腫瘍組織：肝臓、肺、胃、結腸、食道および甲状腺を認識したものは認められなかったことに留意すべきである。
【０２３８】
抗腫瘍活性な物質に結合した本発明のモノクローナル抗体は、膵臓腫瘍細胞を標的化および破壊するための膵臓癌の処置に使用することができる。
【０２３９】
同様に、放射性（または他の）元素を前記抗体と結合させ、原発性腫瘍および転移の正確な局在化を可能にすることができる。前記抗体はまた、正常組織と腫瘍組織との間の明確かつ鋭敏な区別を付与することができる。
【０２４０】
【表１】
0005977936.tif 000002
【０２４１】
【表２】
0005977936.tif 000003
【０２４２】
Ｂ−Ｊ２８グリコトープを担持する組換え糖ペプチドに対するｍＡｂＪ２８とｍＡｂ１６Ｄ１０（実施例１８）との間のＥＬＩＳＡ競合研究
操作プロトコル：
癌胎児性糖型Ｊ２８の形成に関与するグリコシルトランスフェラーゼを特徴付け、前記グリコトープを、遺伝子操作によって、エクスビボで再生した。それは、ＣＨＯ細胞おいて、前記構造を組み立てるのに必要なＦＡＰＰの組換えＣ末端ペプチド（６反復配列よりなる）ならびに２つのグリコシルトランスフェラーゼ、α（１−３／４）フコシルトランスフェラーゼＦＵＴ３およびコア２β（１−６）Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼから再構築した。Ｊ２８糖型（実施例１０）を担持するＦＡＰＰの組換えＣ末端糖ペプチドを、この細胞系統の培養上清に分泌させた。
【０２４３】
競合実験は、前記抗体の特異性を実証する目的で、Ｊ２８糖型を担持するＦＡＰＰの組換えＣ末端糖ペプチド（実施例１０）を含有する培養上清、ビオチン化ｍＡｂＪ２８および競合物としての上昇濃度のｍＡｂ１６Ｄ１０（実施例１８）の存在下で、ＥＬＩＳＡ試験により行った。
【０２４４】
プロトコルの原理は以下のとおりである。
１．ウェルの底部を、１：１０、１：２０、１：５０、１：１００に希釈された組換えＪ２８糖ペプチドを含有する濃縮された培養上清で被覆する。
【０２４５】
２．ビオチン化ｍＡｂＪ２８を、ウェルあたり１０ｎｇ（Ｅｘｐ．１）またはウェルあたり５ｎｇ（Ｅｘｐ．２）で、上昇濃度の精製されたｍＡｂ１６Ｄ１０と共に添加した。
【０２４６】
３．ビオチン化ｍＡｂＪ２８は、アルカリホスファターゼ結合抗ビオチン抗体（ｍＡｂ１６Ｄ１０に対する抗ビオチンＡｂコントロール＝０）の援助により、認識された。
【０２４７】
結果：
２つの実験の結果を示す図２は、競合物として使用される上昇濃度のｍＡｂ１６Ｄ１０（実施例８）（４倍過剰量をも伴う）の存在下で、ウェルの底部で被覆されたそのグリコトープに対するｍＡｂＪ２８の反応性の有意な消失が認められなかったことを示す。
【０２４８】
Ｃ−ヒト膵臓腫瘍細胞系統ＳＯＪ−６に対する抗体ｍＡｂＪ２８とｍＡｂ１６Ｄ１０との間のＦＡＣＳ競合研究
操作プロトコル：
モノクローナル抗体ｍＡｂＪ２８およびｍＡｂ１６Ｄ１０は、ヒト膵臓腫瘍細胞系統ＳＯＪ−６、Ｂｘ−ＰＣ−３を特異的に認識し、試験したヒト非膵臓腫瘍細胞系統を認識しなかった。
【０２４９】
ＦＡＣＳによる予備競合試験は、蛍光色素（Ａｌｅｘａ４８８）に結合したモノクローナル抗体ｍＡｂＪ２８および腹水の形態で競合物として使用される上昇濃度のモノクローナル抗体ｍＡｂ１６Ｄ１０（実施例１８）の存在下で、ヒト膵臓腫瘍細胞系統ＳＯＪ−６に対して行った。
【０２５０】
プロトコルの重要事項は以下のとおりである。
１．ヒト膵臓腫瘍ＳＯＪ−６細胞を脱離させ、固定化し、４℃でＢＳＡで飽和させた。
２．蛍光標識モノクローナル抗体ｍＡｂＪ２８を、サンプルあたり２ｎｇで、１：１００、１：４０、１：２０、１：２０、１：１０、１：４および１：２希釈でｍＡｂ１６Ｄ１０を含有する上昇濃度の腹水の存在下で添加した。
３．細胞をＦＡＣＳで分析した。
【０２５１】
結果：
結果を図３に示す。細胞のきわめて低い標識化（Ａｌｅｘａ−４８８標識ｍＡｂＪ２８による最初の実験のため）にもかかわらず、競合物として使用される上昇濃度の抗体ｍＡｂ１６Ｄ１０の存在下で、その糖型に対する抗体ｍＡｂＪ２８の反応性の有意な消失は、観察されなかった。
【０２５２】
実験５：膵外分泌癌の処置における本発明のモノクローナル抗体の使用
実験プロトコル：
６週齢ヌードマウス（ＮＭＲＩマウス）の２群に、−１日目に、実施例１８由来のモノクローナル抗体１６Ｄ１０を、１５０μｌの０．５ｍｇ／ｍｇ等張抗体溶液の用量で、または等張プラセボ溶液のいずれかを腹腔内接種した。
【０２５３】
０日目、２×１０６ＳＯＪ−６ヒト膵臓腫瘍細胞を、右横腹に皮下注入した。次いで、動物に、＋１、＋３、＋６、＋８および＋１０日目に、（上記の量で）モノクローナル抗体１６Ｄ１０または等張液を接種した。
【０２５４】
明白な皮下の腫瘍の容積を、各動物において、１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０週目に測定した。
【０２５５】
結果：
実施例１８由来のモノクローナル抗体で処置した動物における腫瘍増殖速度は、プラセボ処置動物より１０倍低かった。
【０２５６】
実験終了時（接種１０週間後）、コントロール動物から取り出した腫瘍のメジアン容積は１．２５であり、対して、処置された動物では０．１５ｃｍ３の顕著に低いメジアン値であった。
【０２５７】
従って、ＦＡＰＰおよび／またはＢＳＤＬのＣ末端ドメインに対して指向されるモノクローナル抗体ならびに特に、実施例１８由来のモノクローナル抗体は、膵臓癌の治療に使用することができる。
【０２５８】
実験６：膵臓癌の尿診断におけるＦＡＰＰおよび／またはＢＳＤＬのＣ末端ドメインに対して指向されたモノクローナル抗体の使用
操作プロトコル：
ウエスタンブロット、液体クロマトグラフィーおよび質量分析特徴付けによって行われる一連の実験により、健康な患者の尿における無傷（ｉｎｔａｃｔ）なＢＳＤＬの同定がもたらされた。これの所見に照らし合わせて、ＢＳＤＬ／ＦＡＰＰのＣ末端ドメインによって行われ、膵腺癌において出現する異なるグリコシル化エピトープＪ２８、１６Ｄ１０はまた、この癌を患う患者の尿に存在し得るものであった。
【０２５９】
結果：
予備ウエスタンブロット実験において得られる最初の結果を示す図４は、膵腺癌患者由来の尿サンプルにおけるＢＳＤＬ／ＦＡＰＰによって担持されるグリコシル化Ｊ２８エピトープの存在、および健康な個体由来の尿サンプルにおけるその非存在を示す。
【０２６０】
図４は、健康な被験体および癌患者の両方が、１１０ｋＤａに局在するｐＡｂＬ６４およびｍＡｂ８Ｈ８（実施例１９）に免疫活性を示す１つもしくは２つのバンドを有することを示す。一方、２つの群は、癌患者に認められるが健康な被験体には認められない１１０ｋＤａでｍＡｂＪ２８、ｍＡｂＪ２８−免疫反応性バンドに対する異なる反応性を示した。
【０２６１】
実験７：膵外分泌癌の細胞免疫療法におけるＢＳＤＬおよびＦＡＰＰの尿Ｃ−末端糖ペプチドの使用
操作プロトコル：
予備の結果は、ＢＳＤＬ／ＦＡＰＰによって担持されるグリコシル化Ｊ２８エピトープが、現時点で試験した膵腺癌患者由来の尿サンプル中に存在する一方、それは、健康な個体由来の尿サンプルには存在しないことを示した。侵襲的方法を伴わずに大量に得ることができる尿における前記腫瘍マーカーの存在は、ラマナタン（Ｒａｍａｎａｔｈａｎ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈ、２００４年、５４：２５４−６４頁、オネイル（Ｏ’Ｎｅｉｌｌ）ら、Ｂｌｏｏｄ、２００４年、１０４：２２３５−４６頁、ブラド（Ｖｌａｄ）ら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ、２００２年、１９６：１４３５−４６頁、シュミット（Ｓｃｈｍｉｄｔ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２００３年、６３：８９６２−６７頁により記載のような異なる有効な免疫療法プロトコルを開発するために、抗原の供給源としての役割を果たすことができる。そのような手段の１つは、それらの膵臓腫瘍が切除されている患者由来の樹状細胞を使用して、（ヤマナカ（Ｙａｍａｎａｋａ）ら、Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、２００３年、８９：１１７２−９頁、スバネ（Ｓｖａｎｅ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、２００４年、５３：６３３−４１頁、ユ（Ｙｕ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２００４年、６４：４９７３−９頁により記載のような）自家細胞免疫療法プロトコルを開発することである。次いで、患者の樹状細胞は、前記の同じ抗原を発現する残存腫瘍病巣に対して指向される免疫応答を誘導するために患者に再注入される前に、患者自体の抗原、即ち、尿から得られるＪ２８グリコトープ（およびおそらくまた、１６Ｄ１０グリコトープ）を担持するＢＳＤＬ／ＦＡＰＰのＣ末端糖ペプチドでエクスビボで充填される。
【０２６２】
今回、腫瘍抗原として、グリコシル化Ｊ２８エピトープを担持するＦＡＰＰの組換えＣ末端糖ペプチド（実施例１０）を使用する評価のもとでのヒト樹状細胞活性化の前記ストラテジーはまた、前記グリコシル化エピトープを担持するＢＳＤＬ／ＦＡＰＰの尿中Ｃ末端糖ペプチドを使用することによって、行うことができる。健康な個体の尿におけるＢＳＤＬを精製および特徴付けるために開発された精製プロトコル（除外およびアフィニティーカラム上での液体クロマトグラフィーと組み合わされた、遠心分離、限外ろ過および濃縮の異なる工程）は、膵腺癌患者の尿サンプル由来のＪ２８グリコトープ（およびまた１６Ｄ１０のグリコトープ）を担持するＢＳＤＬ／ＦＡＰＰを精製するために使用される。プロトコルは以下のとおりである。生来の尿は遠心分離されて、細胞破砕物が排除され、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐｓ（登録商標）ＹＭ−１０上での限外ろ過によって部分的に脱塩され、次いで、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２５カラム上で完全に脱塩される。回収した画分は、凍結乾燥され、次いで、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶出緩衝液、ｐＨ７．８、４００ｍＭ  ＮａＣｌ中に採取され、ＳｅｐｈａｃｒｙｌＴＭＳ−２００ゲル上に充填されて、それらの分子量に従ってタンパク質が分離される。Ｊ２８グリコトープ（および／または１６Ｄ１０糖型）を担持するＢＳＤＬ／ＦＡＰＰを含有する画分は回収され、透析され、凍結乾燥される。分子篩後に得られる凍結乾燥物は、ＰＢＳにおいて再水和され、Ｊ２８グリコトープ（およびおそらくまた１６Ｄ１０グリコトープ）を担持するＢＳＤＬ／ＦＡＰＰは、アガロース−ｍＡｂＪ２８カラムまたはヘパリンＳｅｐｈａｒｏｓｅカラム上でのイムノアフィニティークロマトグラフィーのいずれかによって精製される。Ｊ２８グリコトープ（および／または１６Ｄ１０糖型）を担持する精製されたＢＳＤＬ／ＦＡＰＰは、トリプシンまたは臭化シアンで消化されて、前記グリコトープを担持するＢＳＤＬ／ＦＡＰＰのＣ末端糖ペプチドが得られ、他に記載のようにＢＳＤＬ／ＦＡＰＰのＣ末端ドメインが単離される（マス（Ｍａｓ）ら、１９９７年、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，７：７４５−７５２）。膵腺癌患者の樹状細胞は、患者自体の尿から精製されるＪ２８グリコトープ（および／または１６Ｄ１０糖型）を担持する前記糖ペプチドの存在下で、培養される。パルスされた成熟樹状細胞の表面上の糖ペプチドの存在は、細胞が患者に再注入されて、抗腫瘍応答が誘導される前に、共焦点顕微鏡によって、確認される。
【図面の簡単な説明】
【０２６３】
【図１】２つの膵臓腫瘍組織（ＰＤＡＣ＝ＡＤＫ１ならびにＰＤＡＣ４＝ＡＤＫ４）におけるｍＡｂＪ２８およびｍＡｂ１６Ｄ１０の反応性を比較する研究を表す。
【図２】糖ペプチドＪ２８に対する抗体ｍＡｂＪ２８とｍＡｂ１６Ｄ１０との間の競合試験を表す。
【図３】ＳＯＪ−６細胞における抗体ｍＡｂＪ２８とｍＡｂ１６Ｄ１０との間の競合試験を表す。
【図４】ポリクローナル抗体ｐＡｂＬ６４、モノクローナル抗体ｍＡｂ８Ｈ８およびモノクローナル抗体ｍＡｂＪ２８の援助による健康な被験体（サンプル２９〜３６）および膵臓癌を伴う被験体（サンプル１〜５）由来の尿における競合免疫検出分析を表す。尿タンパク質を１０％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、次いで、ニトロセルロース膜にエレクトロトランスファーした。膜をｐＡｂＬ６４、ｍＡｂ８Ｈ８またはｍＡｂＪ２８と共にインキュベートした。左のレーン（Ｓｔｄ）は分子量マーカーに該当する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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