(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
イネにおける縞葉枯病に対する抵抗性又は感受性を判定するための方法であって、
被検イネが有する、Ｓｔｖｂ遺伝子座の下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一の多型を検出する工程と
（ａ）配列番号：５に記載の塩基配列の４６８〜５２８位からなる領域、又は該領域に対応する領域の繰り返しの有無
（ｂ）配列番号：５に記載の塩基配列の４０１位、又は該部位に対応する部位における塩基が、グアニン又はアデニンである１塩基多型
（ｃ）配列番号：５に記載の塩基配列の７５３位、又は該部位に対応する部位における塩基が、シトシン又はチミンである１塩基多型、
前記（ａ）に記載の多型を検出した場合において、前記領域又は該領域に対応する領域が繰り返して存在していなければ、前記被検イネは縞葉枯病に対して抵抗性を示すイネであると判定し、前記領域又は該領域に対応する領域が繰り返して存在していれば、前記被検イネは縞葉枯病に対して感受性を示すイネであると判定し、
前記（ｂ）に記載の多型を検出した場合において、前記部位又は該部位に対応する部位における塩基がグアニンであれば、前記被検イネは縞葉枯病に対して抵抗性を示すイネであると判定し、前記部位又は該部位に対応する部位における塩基がアデニンであれば、前記被検イネは縞葉枯病に対して感受性を示すイネであると判定し、
前記（ｃ）に記載の多型を検出した場合において、前記部位又は該部位に対応する部位における塩基がシトシンであれば、前記被検イネは縞葉枯病に対して抵抗性を示すイネであると判定し、前記部位又は該部位に対応する部位における塩基がチミンであれば、前記被検イネは縞葉枯病に対して感受性を示すイネであると判定する工程とを、含む方法。
【請求項２】
イネにおける縞葉枯病に対する抵抗性がＭｏｄａｎ由来であるか否かを判定するための方法であって、
請求項１に記載の方法によって、縞葉枯病に対する抵抗性を有すると判定されたイネにおいて、当該イネが有するＳｔｖｂ遺伝子座の下記（ｄ）の多型を検出する工程と、
（ｄ）配列番号：１４に記載の塩基配列の４４４〜６０４位からなる領域、又は該領域に対応する領域の有無、
前記工程において、前記領域が検出された場合には、前記イネにおける縞葉枯病に対する抵抗性がＭｏｄａｎ由来であると判定し、前記領域が検出されない場合には、前記イネにおける縞葉枯病に対する抵抗性がＭｏｄａｎ由来ではないと判定する工程とを、含む方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の方法に用いられるための試薬であって、Ｓｔｖｂ遺伝子座の塩基配列に相補的な連続する少なくとも１５塩基の塩基配列を含み、下記（ｉ）又は（ii）に記載のオリゴヌクレオチドである試薬
（ｉ）下記（ａ）〜（ｄ）のうちのいずれか一の多型を挟み込むように設計された一対のオリゴヌクレオチド
（ii）下記（ａ）〜（ｄ）のうちのいずれか一の多型を含む塩基配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
（ａ）配列番号：５に記載の塩基配列の４６８〜５２８位に対応する領域、又は該領域に対応する領域の繰り返しの有無
（ｂ）配列番号：５に記載の塩基配列の４０１位に対応する部位、又は該部位に対応する部位における塩基が、グアニン又はアデニンである１塩基多型
（ｃ）配列番号：５に記載の塩基配列の７５３位に対応する部位、又は該部位に対応する部位における塩基が、シトシン又はチミンである１塩基多型
（ｄ）配列番号：１４に記載の塩基配列の４４４〜６０４位からなる領域の有無。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イネにおける縞葉枯病に対する抵抗性又は感受性を判定するための方法に関する。より詳しくは、被検イネが有するＳｔｖｂ遺伝子座の多型を検出することにより、縞葉枯病に対する抵抗性又は感受性を判定する方法、該方法によって縞葉枯病に対する抵抗性を有すると判定されたイネにおいて、当該抵抗性がＭｏｄａｎ由来であるか否かを判定するための方法、及びこれら方法に用いられる試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
イネ縞葉枯病はイネを侵す代表的なウイルス病であり、ヒメトビウンカ（Ｌａｏｄｅｌｐｈａｘ ｓｔｒｉａｔｅｌｌｕｓ）が媒介するウイルスによって発病する。媒介虫であるヒメトビウンカは、日本ではムギやイネ科雑草で越冬し、春先の移植時期に水田に移動分散してイネにウイルスを伝搬する。「コシヒカリ」、「日本晴」等の代表的な日本水稲は全てこの病気に感受性であり、１９６０年代及び１９８０年代に縞葉枯病が大発生した際には多大な被害がもたらされた。
【０００３】
一方、日本陸稲及び外国水稲品種には多くの縞葉枯病に対する抵抗性品種が存在することが明らかになっている（非特許文献１）。イネに縞葉枯病に対する抵抗性をもたらす遺伝子としては、インド型品種が持つ抵抗性遺伝子Ｓｔ２ｉ（後のＳｔｖｂ−ｉ）と、日本陸稲が持つ抵抗性遺伝子Ｓｔ１及びＳｔ２（後のＳｔｖａ及びＳｔｖｂ）とが同定されている（非特許文献２及び３）。そして、これらの知見に基づき、１９６０年代に外国稲が持つ縞葉枯病抵抗性の導入が積極的に進められ、パキスタン原産のインド型品種「Ｍｏｄａｎ」が持つ抵抗性遺伝子Ｓｔｖｂ−ｉを導入した「Ｓｔ．Ｎｏ．１」及び「中国３１号」が中国農業試験場（現在の近畿中国四国農業研究センター）において育成された（非特許文献４）。また、これらの抵抗性系統を中間母本として実用品種が次々と育成され、現在栽培されている主食用抵抗性品種のほぼ全ての品種が「Ｍｏｄａｎ」に由来するＳｔｖｂ−ｉを保有するものとなっている。また、Ｓｔｖｂ−ｉに関しては抵抗性が崩壊したという報告は無く、導入から約４０年間にわたり安定した抵抗性を示している。
【０００４】
イネ縞葉枯病の抵抗性検定の手法としては、イネ縞葉枯病ウイルス（ＲＳＶ、Ｒｉｃｅ ｓｔｒｉｐｅ ｖｉｒｕｓ）を保毒するヒメトビウンカを用いた幼苗検定法（非特許文献５）が一般的であるが、縞葉枯病抵抗性を調べるためにはウンカの維持・管理が必須となり、ウイルス保毒虫の選抜、接種及び病徴の判定に至るまで多大な労力並びに時間、熟練した技術が必要となるという問題がある。このため、抵抗性遺伝子と密接に連鎖するＤＮＡマーカーＳＴ１０を用いた選抜システムが構築されており、縞葉枯病抵抗性品種の育成において大きく貢献してきた（非特許文献６、特許文献１）。
【０００５】
しかしながら、ＳＴ１０はインド型品種の大部分が保有する縞葉枯病抵抗性遺伝子Ｓｔｖｂ−ｉ（非特許文献５）の中で、Ｍｏｄａｎに由来するＳｔｖｂ−ｉについての選抜を可能とするマーカーである。このため、Ｓｔｖｂ−ｉを有すると思われる縞葉枯病抵抗性品種においても、ＳＴ１０をマーカーとして用いた場合に、感受性品種と同様、増幅産物を示さない品種が存在することが判明している（非特許文献６）。また、インド型品種の多収性を日印交雑によって導入した飼料イネ等や新規需要米の育種においては、「Ｍｏｄａｎ」以外のインド型品種から縞葉枯病抵抗性が導入された品種も多い。このような飼料イネ品種等の育成においては、ＳＴ１０を用いたＤＮＡマーカー選抜は利用できず、ヒメトビウンカを用いた接種検定を行わなければならなかった。
【０００６】
一方、Ｓｔｖｂ−ｉ以外の抵抗性遺伝子としては，陸稲由来のＳｔｖａとＳｔｖｂとが同定されており（非特許文献２）、これらの抵抗性遺伝子をコシヒカリに導入した準同質遺伝子系統も育成されている。また、新規の抵抗性遺伝子探索の一環としてＣゲノム野生種であるＯ．ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓが持つ縞葉枯病抵抗性遺伝子をコシヒカリに導入した準同質遺伝子系統も育成されている。ＳｔｖｂとＳｔｖｂ−ｉとは第１１染色体長腕領域に座乗する複対立遺伝子であり（非特許文献２）、Ｃゲノム野生種由来の縞葉枯病抵抗性遺伝子についても同じ遺伝子座の抵抗性遺伝子であることが示唆されている（非特許文献７）。
【０００７】
このように、複数種の抵抗性遺伝子源が利用されている縞葉枯病抵抗性品種の育成の状況下（図１  参照）、縞葉枯病に対する抵抗性又は感受性の判定においては、労力、時間及び技術を要する生物検定に依らず、かつ、特定の抵抗性遺伝子源を有するイネのみに適用が限定されない方法の開発が求められてきたが、未だ実現されていない。
【０００８】
また、前述の通り、１９６０年代に主食用品種に導入された縞葉枯病抵抗性は、Ｍｏｄａｎに由来するＳｔｖｂ−ｉ遺伝子に起因するが、この遺伝子近傍には穂いもち抵抗性遺伝子Ｐｂ１が連鎖していることが知られている（非特許文献８）。このため、縞葉枯病抵抗性と穂いもち抵抗性とが同時に導入できるという利点に着目して、Ｐｂ１についてもＤＮＡマーカーによる選抜システムが構築され（非特許文献９）、耐病性を目的とした水稲育種に積極的に利用されてきた。
【０００９】
しかしながら、Ｍｏｄａｎ以外のインド型品種に由来するＳｔｖｂ−ｉ遺伝子については、近傍領域に穂いもち抵抗性遺伝子が連鎖しているかどうかは不明であり、Ｍｏｄａｎ以外のインド型品種由来抵抗性を持つ飼料イネ及び新規需要米品種の育成にはＰｂ１選抜マーカーは用いることができなかった。
【００１０】
また、２００６年に育成されたタチアオバはアメリカ品種「Ｌｅｍｏｎｔ」から転び型倒伏抵抗性を導入したホールクロップサイレージ用品種であるが、育成系譜上にＭｏｄａｎ由来縞葉枯病抵抗性品種「祭り晴」が入っているため、縞葉枯病抵抗性の由来は不明であった（非特許文献１０）。
【００１１】
このように、縞葉枯病抵抗性のマーカー選抜においては、穂いもち抵抗性遺伝子Ｐｂ１の導入等の観点から、その抵抗性の由来の特定、特にその抵抗性がＭｏｄａｎ由来の抵抗性であるか否かを判定することが重要であるが、未だかかる判定を可能とする方法は開発されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開平１１−８９５８３号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｗａｓｈｉｏ，Ｏ．ら、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｂｒｅｅｄ．、１９６７年、１７巻、９１〜９８ページ
【非特許文献２】Ｗａｓｈｉｏ，Ｏ．ら、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｂｒｅｅｄ．、１９６８年、１８巻、９６〜１０１ページ
【非特許文献３】Ｗａｓｈｉｏ，Ｏ．ら、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｂｒｅｅｄ．１９６８年、１８巻、１６７〜１７２ページ
【非特許文献４】鳥山国士ら、中国農業試験場報告．Ａ，作物部・環境部、１９６６年１２月、第１３号、４１〜５４ページ
【非特許文献５】鷲尾養ら、中国農業試験場報告．Ａ，作物部・環境部、１９６８年、第１６号、３９〜１９７ページ
【非特許文献６】早野由里子ら、育種学研究、２０００年、２巻、２号、６７〜７２ページ
【非特許文献７】前田英郎ら、近畿中国四国農業研報、２００７年、第６号、２９〜３８ページ
【非特許文献８】Ｆｕｊｉｉ．Ｋ．ら、Ｂｒｅｅｄ．Ｓｃｉ．、２０００年、５０巻、１８３〜１８８ページ
【非特許文献９】遠山孝通ら、愛知農総試研報、１９９８年、第３０号、２７〜３４ページ
【非特許文献１０】坂井真ら、九州沖縄農研報、２００９年、第５０号、１〜２０ページ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、イネにおける縞葉枯病に対する抵抗性又は感受性を判定するための方法であって、労力、時間及び技術を要する生物検定に依らず、かつ、特定の抵抗性遺伝子源を有するイネのみに適用が限定されない方法を提供することにある。さらなる本発明の目的は、上記方法により縞葉枯病に対する抵抗性を有すると判定されたイネにおいて、その抵抗性がＭｏｄａｎ由来であるか否かを判定する方法を提供することにある。また、本発明は、これら方法に用いられる試薬を提供することをも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、前記目的を達成すべく、先ず、Ｍｏｄａｎ由来縞葉枯病抵抗性品種と、縞葉枯病感受性品種との塩基配列の比較を行い、Ｓｔｖｂ−ｉ遺伝子領域にＰＣＲ用プライマーを数ｋｂ毎に設計した（表１及び図２  参照）。そして、Ｍｏｄａｎ由来抵抗性品種及び感受性品種のみならず、Ｍｏｄａｎ以外のインド型品種に由来する抵抗性品種、日本陸稲の抵抗性遺伝子Ｓｔｖｂ（Ｓｔｖｂ−ｉの対立遺伝子）を保有する抵抗性品種、Ｃゲノム野生種であるＯ．ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓが持つ抵抗性遺伝子を保有する抵抗性品種について、これらのプライマーを用いたＰＣＲによって増幅される断片の長さ及び該断片の塩基配列について検討を行った。その結果、ＳＴ７１プライマーセットによって増幅された断片に関して、抵抗性品種においては配列番号：１３に記載の６１塩基からなるリピート（６１ｂｐリピート）が１つ、感受性品種においては２つ存在しているため、当該断片長を比較することにより、特定の抵抗性遺伝子源を有するイネに限定されず広く、縞葉枯病に対する抵抗性又は感受性を判定できることを見出した。
【００１６】
また、感受性品種である日本晴のＳＴ７１増幅断片を含む領域の塩基配列（配列番号：５に記載の塩基配列）の４０１位（又は該部位に対応する部位）がアデニン（Ａ）であるのに対し、抵抗性品種においてはグアニン（Ｇ）であること、及び、感受性品種においては、配列番号：５に記載の塩基配列の７５３位（又は該部位に対応する部位）がチミン（Ｔ）であるのに対し、抵抗性品種においてはシトシン（Ｃ）であることを明らかにした。そして、ＳＴ７１プライマーセットによって増幅された断片における、これら１塩基多型を検出することによっても、同様に、イネにおける縞葉枯病に対する抵抗性又は感受性を判定できることを見出した。
【００１７】
さらに、本発明者らは、ＳＴ６４プライマーセットを用いたＰＣＲ分析を組み合わせることにより、前記多型の検出により見出された縞葉枯病に対する抵抗性が、Ｍｏｄａｎに由来するか否かを判定できることをも見出し、本発明を完成するに至った。
【００１８】
すなわち、本発明は、被検イネが有するＳｔｖｂ遺伝子座の多型を検出することにより、縞葉枯病に対する抵抗性又は感受性を判定する方法、該方法によって縞葉枯病に対する抵抗性を有すると判定されたイネにおいて、その抵抗性がＭｏｄａｎ由来であるか否かを判定する方法、及び、これらの方法に用いられるプライマー等の試薬に関し、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。
（１）  イネにおける縞葉枯病に対する抵抗性又は感受性を判定するための方法であって、被検イネが有する、Ｓｔｖｂ遺伝子座の下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一の多型を検出することを特徴とする方法
（ａ）配列番号：５に記載の塩基配列の４６８〜５２８位からなる領域、又は該領域に対応する領域の繰り返しの有無
（ｂ）配列番号：５に記載の塩基配列の４０１位、又は該部位に対応する部位における１塩基多型
（ｃ）配列番号：５に記載の塩基配列の７５３位、又は該部位に対応する部位における１塩基多型。
（２）  イネにおける縞葉枯病に対する抵抗性がＭｏｄａｎ由来であるか否かを判定するための方法であって、（１）に記載の方法によって、縞葉枯病に対する抵抗性を有すると判定されたイネにおいて、当該イネが有するＳｔｖｂ遺伝子座の下記（ｄ）の多型を検出することを特徴とする方法
（ｄ）配列番号：１４に記載の塩基配列の４４４〜６４４位からなる領域、又は該領域に対応する領域における挿入又は欠失。
（３）  （１）又は（２）に記載の方法に用いられるための試薬であって、Ｓｔｖｂ遺伝子座の塩基配列に相補的な連続する少なくとも１５塩基の塩基配列を含み、下記（ｉ）又は（ii）に記載のオリゴヌクレオチドである試薬
（ｉ）下記（ａ）〜（ｄ）のうちのいずれか一の多型を挟み込むように設計された一対のオリゴヌクレオチド
（ii）下記（ａ）〜（ｄ）のうちのいずれか一の多型を含む塩基配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
（ａ）配列番号：５に記載の塩基配列の４６８〜５２８位に対応する領域、又は該領域に対応する領域の繰り返しの有無
（ｂ）配列番号：５に記載の塩基配列の４０１位に対応する部位、又は該部位に対応する部位における１塩基多型
（ｃ）配列番号：５に記載の塩基配列の７５３位に対応する部位、又は該部位に対応する部位における１塩基多型
（ｄ）配列番号：１４に記載の塩基配列の４４４〜６４４位からなる領域、又は該領域に対応する領域における挿入又は欠失。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、労力、時間及び技術を要する生物検定に依らず、かつ、特定の抵抗性遺伝子源を有するイネに適用範囲が限定されずに、イネにおける縞葉枯病に対する抵抗性又は感受性を判定することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】イネの第１１染色体長腕領域のＳｔｖｂ遺伝子座に座乗する複対立遺伝子（インド型品種の一種  Ｍｏｄａｎ由来のＳｔｖｂ−ｉ遺伝子、日本陸稲品種由来のＳｔｖｂ遺伝子等）と、従来の縞葉枯病抵抗性品種の選抜方法との従前の対応関係を示す、概略図である。
【図２】イネの第１１染色体長腕領域のＳｔｖｂ遺伝子座をＰＣＲにて解析するのに用いた各々のプライマーセット（ＳＴ４８、ＳＴ１０、ＳＴ６４、ＳＴ７１、ＳＴ７２、ＳＴ８２及びＳＴ８９）の増幅領域を示す、概略図である。
【図３】イネの第１１染色体長腕領域のＳｔｖｂ遺伝子座をＰＣＲにて解析するのに用いた各々のプライマーセット（ＳＴ１０、ＳＴ６４、ＳＴ７１及びＳＴ７２）の増幅領域の詳細を示す、概略図である。
【図４】幼苗検定法における、イネ縞葉枯病ウイルス（ＲＳＶ）が感染することにより生じる６段階の病徴型（Ａ（枯死）〜Ｄ（軽微な病徴））を示す図である。なお図中、黒色の領域及びドットは、イネ縞葉枯病において変色した領域及び部位を各々示す。
【図５】ＰＣＲ−ＳＳＰ（ＰＣＲ−配列特異的プライマー）法により、配列番号：５に記載の塩基配列の４６８〜５２８位に対応する領域、又は該領域に対応する領域の繰り返しの有無を検出するための好適な一態様を示す概略図である。なお図中、矢印はオリゴヌクレオチド（プライマー）の向き並びに該プライマーがハイブリダイズするゲノム上の位置を示す（図６においても同じ）。
【図６】ＰＣＲ−ＳＳＰ法により、配列番号：５に記載の塩基配列の４６８〜５２８位に対応する領域、又は該領域に対応する領域の繰り返しの有無を検出するための、図５に記載の態様とは異なる好適な一態様を示す概略図である。
【図７】縞葉枯病感受性品種（Ｓ）及び縞葉枯病抵抗性品種（Ｒ）のＳＴ７１プライマーセットによって増幅された断片を含む領域の塩基配列（１〜１２０ｂｐ）を比較分析することによって得られたアライメントを示す図である。なお図中、三角印は当該断片における１塩基多型を示す（以下、図８、１０及び１３においても同様）。
【図８】縞葉枯病感受性品種（Ｓ）及び縞葉枯病抵抗性品種（Ｒ）のＳＴ７１プライマーセットによって増幅された断片を含む領域の塩基配列（１２１〜２４０ｂｐ）を比較分析することによって得られたアライメントを示す図である。なお図中、「Ｆｏｒｗａｒｄ」及び付された下線は、ＳＴ７１プライマーセットのうちのフォワードプライマーの位置及び配列を示す。
【図９】縞葉枯病感受性品種（Ｓ）及び縞葉枯病抵抗性品種（Ｒ）のＳＴ７１プライマーセットによって増幅された断片を含む領域の塩基配列（２４１〜３６０ｂｐ）を比較分析することによって得られたアライメントを示す図である。なお図中、矢印は、ＳＴ７１プライマーセットのうちのフォワードプライマーの位置及び配列を示す。
【図１０】縞葉枯病感受性品種（Ｓ）及び縞葉枯病抵抗性品種（Ｒ）のＳＴ７１プライマーセットによって増幅された断片を含む領域の塩基配列（３６１〜４８０ｂｐ）を比較分析することによって得られたアライメントを示す図である。なお図中、矢印は、配列番号：１３に記載の６１塩基からなるリピート（６１ｂｐリピート）の位置及び配列を示す。
【図１１】縞葉枯病感受性品種（Ｓ）及び縞葉枯病抵抗性品種（Ｒ）のＳＴ７１プライマーセットによって増幅された断片を含む領域の塩基配列（４８１〜６００ｂｐ）を比較分析することによって得られたアライメントを示す図である。なお図中、「Ｒｅｐｅａｔ１」及び「Ｒｅｐｅａｔ２」、並びに付された矢印は、配列番号：１３に記載の６１塩基からなるリピート（６１ｂｐリピート）の位置及び配列を示す。また「和２１２８（Ｒ）」の塩基配列に付された矢印は、ＳＴ７１プライマーセットのうちのリバースプライマーの位置及び配列を示す。
【図１２】縞葉枯病感受性品種（Ｓ）及び縞葉枯病抵抗性品種（Ｒ）のＳＴ７１プライマーセットによって増幅された断片を含む領域の塩基配列（６０１〜７２０ｂｐ）を比較分析することによって得られたアライメントを示す図である。なお図中、「Ｒｅｖｅｒｓｅ」及び付された下線は、ＳＴ７１プライマーセットのうちのリバースプライマーの位置及び配列を示す。
【図１３】縞葉枯病感受性品種（Ｓ）及び縞葉枯病抵抗性品種（Ｒ）のＳＴ７１プライマーセットによって増幅された断片を含む領域の塩基配列（７２１〜８４０ｂｐ）を比較分析することによって得られたアライメントを示す図である。
【図１４】縞葉枯病感受性品種（Ｓ）及び縞葉枯病抵抗性品種（Ｒ）のＳＴ７１プライマーセットによって増幅された断片を含む領域の塩基配列（８４１〜９３１ｂｐ）を比較分析することによって得られたアライメントを示す図である。
【図１５】ＳＴ７１、ＳＴ６４及びＳＴ１０のプライマーセットを用いて、縞葉枯病感受性品種及び縞葉枯病抵抗性品種をＰＣＲ分析した結果を示す電気泳動の写真である。なお図中、星印が付された品種は縞葉枯病抵抗性品種である。また、黒丸が付された品種は、ＳＴ１０のプライマーセットを用いたＰＣＲ分析によって縞葉枯病感受性品種同様に増幅産物が得られないため、当該ＰＣＲ分析によってはＭｏｄａｎ由来の縞葉枯病抵抗性品種と判別できない品種であることを示す。
【図１６】縞葉枯病感受性品種（日本晴（Ｓ））及びＭｏｄａｎ由来の縞葉枯病抵抗性品種（Ｓｔ．Ｎｏ．１（Ｒ））のＳＴ６４プライマーセットによって増幅された断片を含む領域の塩基配列（１〜６００ｂｐ）を比較分析することによって得られたアライメントを示す図である。なお図中、「ＳＴ６４  Ｆｏｒｗａｒｄ」及び付された矢印は、ＳＴ６４プライマーセットのうちのフォワードプライマーの位置及び配列を示す。
【図１７】縞葉枯病感受性品種（日本晴（Ｓ））及びＭｏｄａｎ由来の縞葉枯病抵抗性品種（Ｓｔ．Ｎｏ．１（Ｒ））のＳＴ６４プライマーセットによって増幅された断片を含む領域の塩基配列（６０１〜１２００ｂｐ）を比較分析することによって得られたアライメントを示す図である。なお図中、「ＳＴ６４  Ｒｅｖｅｒｓｅ」及び付された矢印は、ＳＴ６４プライマーセットのうちのリバースプライマーの位置及び配列を示す。
【図１８】ＳＴ７１プライマーセットを利用して、被検イネにおける縞葉枯病に対する抵抗性又は感受性の判定し（ＳＴ７１選抜）、さらに該判定によって抵抗性を有するイネと判定された被検イネにおいて、ＳＴ６４プライマーセットを利用することにより、該抵抗性がＭｏｄａｎ由来の抵抗性であることを特定する（ＳＴ６４選抜）という、本発明の一態様を示す概略図である。なお、ＳＴ６４プライマーセットによって識別されるＭｏｄａｎに由来するＳｔｖｂ−ｉ遺伝子と、穂いもち抵抗性遺伝子Ｐｂ１とは連鎖することが知られているため、図１８に示す方法は、穂いもち抵抗性品種の選抜効率を向上させることにも寄与することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
＜イネにおける縞葉枯病に対する抵抗性又は感受性を判定するための方法＞
本発明は、イネにおける縞葉枯病に対する抵抗性又は感受性を判定するための方法であって、被検イネが有する、Ｓｔｖｂ遺伝子座の下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一の多型を検出することを特徴とする方法を提供する。
（ａ）配列番号：５に記載の塩基配列の４６８〜５２８位からなる領域、又は該領域に対応する領域の繰り返しの有無
（ｂ）配列番号：５に記載の塩基配列の４０１位、又は該部位に対応する部位における１塩基多型
（ｃ）配列番号：５に記載の塩基配列の７５３位、又は該部位に対応する部位における１塩基多型。
【００２２】
本発明の方法を適用する「イネ」としては特に制限はない。後述の実施例において示す通り、日本型（ジャポニカ種、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  ｓｕｂｓｐ．ｊａｐｏｎｉｃａ）、インド型（インディカ種、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  ｓｕｂｓｐ．ｉｎｄｉｃａ）等を問わず、また水稲品種、陸稲品種等を問わず、さらに主食用、飼料用等を問わず、広く本発明の方法を適用することができる。
【００２３】
本発明において「縞葉枯病」とは、イネ縞葉枯ウイルス（ＲＳＶ）の感染によりイネに生じる病気である。この病気は、主に、ヒメトビウンカ（Ｌａｏｄｅｌｐｈａｘ ｓｔｒｉａｔｅｌｌｕｓ）が、摂食時に口吻から吐き出す唾液を通して、ウイルス保毒ウンカ体内で増殖しているＲＳＶが、イネ植物体内へ送り込まれ、接種されることにより生ずる。この病気に感染したイネ葉には、黄緑から黄白の縞状、細かい絣状の退色斑紋が生じ、やがて極めて薄い褐色や灰白色の条斑に変色する。また、幼苗期（生育初期）に感染・発病すると、新葉は展開しないままこより状に徒長し、やがて垂れ下がり、そのまま弧を描いたように、いわゆる幽霊症状を呈して枯死する。これらの発病株は早期に枯死するものが多い。退色斑紋の少ない、病徴の軽い株では、株全体が萎縮することもある。生育後期の発病では、穂が形成されない、されても未成熟のまま枯れるなどの症状が見られる。
【００２４】
本発明における「縞葉枯病に対する感受性」とは、イネがＲＳＶに感染する性質、すなわち、ＲＳＶがイネ植物体内に侵入し、定着することにより、当該イネにおいて前記症状等が生じる性質を意味し、例えば、非特許文献５において示されているような、ＲＳＶを保毒するヒメトビウンカを用いた幼苗検定法において、ＲＳＶを感染することにより生じる病徴型をＡ（枯死）からＤ（軽微な病徴）までの６段階に分類し（図４  参照）、各病徴型を示す個体数から下記式によって発病指数を算出し、感受性比較品種「杜稲」の発病指数を１００としたときの発病指数比が６０を越える性質が挙げられる。
【００２５】
発病指数＝（１００×Ａ苗数＋８０×Ｂ苗数＋６０×Ｂｔ苗数＋４０×Ｃｒ苗数＋２０×Ｃ苗数＋５×Ｄ苗数）／供試個体数。
【００２６】
また、本発明において「縞葉枯病に対する抵抗性」とは、ＲＳＶの感染に対するイネの抵抗性、すなわち、ＲＳＶがイネ植物体内に侵入しても定着せず、また定着しても、当該イネにおいて前記症状等が生じにくい性質を意味し、例えば、前記幼苗検定法において、前記発病指数比が６０以下である性質が挙げられる。この抵抗性により、イネにおけるＲＳＶの感染症状の発症、又は、発生した症状の程度が抑制される。
【００２７】
本発明における「Ｓｔｖｂ遺伝子座」とは、Ｓｔｖｂ遺伝子、及びその対立遺伝子（例えば、Ｓｔｖｂ−ｉ遺伝子）が座乗しているイネの第１１染色体長腕領域のことを意味する。
【００２８】
「多型」とは、遺伝学的には母集団中１％以上の頻度で存在している塩基変化と一般的に定義される。しかしながら、本発明における「多型」は、この定義に制限されず、１％未満の塩基の変化も「多型」に含む。また、本発明の方法において検出の対象となる「多型」は、一塩基多型、数十塩基が繰り返して存在している又は繰り返して存在していない多型及び数十塩基が欠失又は挿入している多型であり、より具体的には、下記（ａ）〜（ｃ）の多型である。
（ａ）配列番号：５に記載の塩基配列の４６８〜５２８位からなる領域、又は該領域に対応する領域の繰り返しの有無
（ｂ）配列番号：５に記載の塩基配列の４０１位、又は該部位に対応する部位における１塩基多型
（ｃ）配列番号：５に記載の塩基配列の７５３位、又は該部位に対応する部位における１塩基多型。
【００２９】
「配列番号：５に記載の塩基配列」は、縞葉枯病感受性品種である日本晴のＳｔｖｂ遺伝子座に由来する塩基配列である。配列番号：５に記載の塩基配列の「４６８〜５２８位からなる領域」は、検出対象となる繰り返し配列からなる多型の領域である。この領域に「対応する領域」とは、日本晴の繰り返し配列からなる多型の領域に対応する他品種の領域を意味する。
【００３０】
配列番号：５に記載の塩基配列の「４０１位」及び「７５３位」は、検出対象となる１塩基多型の部位である。また、この部位に「対応する部位」とは、日本晴の１塩基多型の部位に対応する他品種の部位を意味する。
【００３１】
「対応する領域」または「対応する部位」であるか否かは、後述の実施例において示す通り、例えば、ＤＮＡ解析ソフトウェア（ＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ等）やＢＬＡＳＴ  （ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）を利用し、他品種の塩基配列を、日本晴の塩基配列（配列番号：５に記載の塩基配列）と整列させた際に、日本晴の塩基配列の４６８〜５２８位からなる領域、４０１位、又は７５３位と同列になるか否かにより判定することができる。
【００３２】
以下、本発明の方法の好ましい態様を記載するが、本発明の方法はそれらの方法に限定されるものではない。
【００３３】
本発明の方法における多型の検出においては、まず、被検イネからＤＮＡ試料を調製する。ＤＮＡ試料は、例えば被検イネの組織（例えば、玄米）から調製することができる。イネの組織からゲノムＤＮＡを抽出する方法としては特に制限はなく、公知の手法を適宜選択して用いることができ、例えば、ＳＤＳフェノール法（尿素を含む溶液又はエタノール中に保存した組織を、タンパク質分解酵素（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ）、界面活性剤（ＳＤＳ）、及びフェノールで該組織のタンパク質を変性させ、エタノールで該組織からＤＮＡを沈殿させ抽出する方法）、ＣＴＡＢ法（高濃度のＣＴＡＢ（セチルメチルアンモニウムブロマイド、Ｃｅｔｙｌ  ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）を含む溶液中に組織を保存し、該組織のタンパク質と多糖類とを不容化して沈殿・除去し、エタノールで該組織からＤＮＡを沈殿させ抽出する方法）、アルカリ処理法（アルカリ溶液を用いてＤＮＡを抽出する簡易方法）が挙げられる。
【００３４】
前記（ａ）に記載の多型の検出は、かかる多型を含む領域を、後述のＳｔｖｂ遺伝子座の多型を挟み込むように設計された一対のオリゴヌクレオチドを用いて、前記ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ等によって増幅し、得られた増幅産物の分子量を対照の増幅産物の分子量と比較することにより実施することができる。
【００３５】
「対照」としては、例えば、縞葉枯病に対して抵抗性を示すことが知られているイネ、若しくは、縞葉枯病に対して感受性を示すことが知られているイネ、又は、Ｍｏｄａｎ由来の縞葉枯病に対する抵抗性を示すことが知られているイネ等から調製されたゲノムＤＮＡが挙げられる。
【００３６】
増幅産物の分子量を比較する方法としては、後述の実施例において示すような、検出する分子量に適したアガロースゲルを用いた電気泳動にて得られた増幅産物を分画した後、該増幅産物をエチジウムブロマイド等にて染色することにより検出する方法や、得られた増幅産物を質量分析機（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ等）にかけ質量測定を行う方法が挙げられる。
【００３７】
また、上記多型の検出は、Ｓｔｖｂ遺伝子座の多型を含むＤＮＡを単離し、単離したＤＮＡの塩基配列を決定することにより実施することができる。該ＤＮＡの単離は、例えば、後述のＳｔｖｂ遺伝子座の多型を挟み込むように設計された一対のオリゴヌクレオチドを用いて、ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ等によって行うことができる。単離したＤＮＡの塩基配列の決定は、マキサムギルバート法やサンガー法等、当業者に公知の方法で行うことができる。
【００３８】
上記多型を検出する別の方法としては、ＰＣＲ−ＳＳＰ（ＰＣＲ−配列特異的プライマー）法が挙げられる。前記（ａ）に記載の多型を検出する場合には、例えば、図５に示すように、後述の一対のオリゴヌクレオチドのうちの片方のオリゴヌクレオチドを前記繰り返し配列内に設計し、もう片方のオリゴヌクレオチドを前記繰り返し配列の外に設計する。こうして設計された一対のオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲにより、前記繰り返し配列を１個のみ有している被検イネに由来するゲノムＤＮＡを鋳型にした場合に得られる増幅産物は、１断片であるのに対し、前記繰り返し配列を２個有している被検イネに由来するゲノムＤＮＡを鋳型にした場合に得られる増幅産物は、前記断片と同じ鎖長の断片と、前記断片よりも長い鎖長の断片となるため、かかる一対のオリゴヌクレオチドを利用することにより、多型を検出することができる。また、例えば図６に示すように、一対のオリゴヌクレオチドを前記繰り返し配列内に設計する。こうして設計された一対のオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲにより、前記繰り返し配列を１個のみ有している被検イネに由来するゲノムＤＮＡを鋳型にした場合には増幅産物が得られないのに対し、前記繰り返し配列を２個有している被検イネに由来するゲノムＤＮＡを鋳型にした場合には増幅産物が得られるため、かかる一対のオリゴヌクレオチドを利用することにより、多型を検出することができる。
【００３９】
前記（ｂ）又は（ｃ）に記載の１塩基多型をＰＣＲ−ＳＳＰ法により検出する場合には、後述の一対のオリゴヌクレオチドのうちの片方のオリゴヌクレオチドの３’末端が前記部位の特定の塩基種に相補的な塩基種になるようように設計する。そして、このように設計された一対のオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲにより増幅されるのは、前記部位の特定の塩基種を有する被検イネに由来するゲノムＤＮＡを鋳型にした場合に限られ、前記部位が異なる塩基種である被検イネに由来するゲノムＤＮＡを鋳型にした場合は増幅されないため、かかる一対のオリゴヌクレオチドを利用することにより、１塩基多型を検出することができる。
【００４０】
上記多型を検出するためのさらに別の方法としては、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（ＰＣＲ−一本鎖高次構造多型）法が挙げられる。すなわち、後述の一対のオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲにより増幅して得られた２本鎖ＤＮＡを熱やアルカリ等で処理することにより変性させ、１本鎖ＤＮＡにした後、変性剤を含まないポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけると、ゲル中で１本鎖ＤＮＡは分子内相互作用により折り畳まれ、高次構造を形成することになる。そして、その折り畳まれ構造の相互作用は、塩基種の相違、特定の塩基配列の繰り返し数の相違、塩基配列の挿入又は欠失により変化するため、分離した当該１本鎖ＤＮＡを銀染色やラジオアイソトープにより検出し、当該１本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度を対照のそれと比較することにより、本発明にかかる多型を検出することができる。
【００４１】
上記多型を検出するさらに別の方法としては、インターカレーターを利用する方法が挙げられる。この方法においては、先ず、被検イネから前述の通りＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＤＮＡ二重鎖間に挿入されると蛍光を発するインターカレーターを含む反応系において、前記ＤＮＡ試料を鋳型として、本発明にかかる多型を含む塩基配列を増幅する。そして、前記反応系の温度を変化させ、前記インターカレーターが発する蛍光の強度の変動を検出し、検出した前記温度の変化に伴う前記蛍光の強度の変動を対照と比較する。このような方法としては、ＨＲＭ（ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｅｌｔｉｎｇ、高分解融解曲線解析）法が挙げられる。
【００４２】
上記多型を検出するさらに別の方法としては、多型を含む塩基配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを利用する方法が挙げられる。この方法においては、まず、被検イネから前述の通りＤＮＡ試料を調製する。一方で、多型を含む塩基配列にハイブリダイズし、レポーター蛍光色素及びクエンチャー蛍光色素が標識されたオリゴヌクレオチドプローブを調製する。そして、前記ＤＮＡ試料に、前記オリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせ、さらに前記オリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズした前記ＤＮＡ試料を鋳型として、多型を含む塩基配列を増幅する。そして、前記増幅に伴うオリゴヌクレオチドプローブの分解により、前記レポーター蛍光色素が発する蛍光を検出し、次いで検出した前記蛍光を対照と比較する。このような方法としては、ダブルダイプローブ法、いわゆるＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ法が挙げられる。
【００４３】
以上、本発明の方法の実施形態について説明したが、本発明の方法は上記実施形態に限定されるものではない。例えば、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）を利用した方法（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法）、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ法）、インベーダー（Ｉｎｖａｄｅｒ）法、パイロシークエンシング（Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）法、シングルヌクレオチドプライマー伸長（ＳＮｕＰＥ）法、アレル特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）ハイブリダイゼーション法、ＤＮＡアレイ法といった、多型を検出するための公知の技術も、本発明において利用しうる。
【００４４】
本発明の方法により、前記（ａ）に記載の多型を検出した場合において、配列番号：５に記載の塩基配列の４６８〜５２８位からなる領域、又は該領域に対応する領域が繰り返して存在していれば、その被検イネは縞葉枯病に対して感受性を示すイネであると判定することができる。一方、配列番号：５に記載の塩基配列の４６８〜５２８位からなる領域、又は該領域に対応する領域が繰り返して存在していなければ、その被検イネは縞葉枯病に対して抵抗性を示すイネであると判定することができる。この多型を検出する場合には、必ずしも多型を含む領域の塩基配列を決定する必要はなく、多型を含む領域を増幅して得られるＤＮＡ断片の分子量（例えば、増幅断片の長さ）を指標に多型を検出することができるため、簡便に縞葉枯病に対する抵抗性又は感受性を判定することができる。
【００４５】
また、前記（ｂ）に記載の多型を検出した場合において、配列番号：５に記載の塩基配列の４０１位、又は該部位に対応する部位がアデニンであれば、その被検イネは縞葉枯病に対して感受性を示すイネであると判定することができる。一方、配列番号：５に記載の４０１位、又は該部位に対応する部位がグアニンであれば、その被検イネは縞葉枯病に対して抵抗性を示すイネであると判定することができる。
【００４６】
さらに、前記（ｃ）に記載の多型を検出した場合において、配列番号：５に記載の塩基配列の７５３位、又は該部位に対応する部位がチミンであれば、その被検イネは縞葉枯病に対して感受性を示すイネであると判定することができる。一方、配列番号：５に記載の７５３位、又は該部位に対応する部位がシトシンであれば、その被検イネは縞葉枯病に対して抵抗性を示すイネであると判定することができる。
【００４７】
このように、前記（ａ）〜（ｃ）に記載のいずれか一種の多型を検出することにより、本発明のイネにおける縞葉枯病に対する抵抗性又は感受性を判定することができる。かかる判定の正確性をより向上させるという観点から、前記（ａ）〜（ｃ）に記載の複数の多型を組み合わせて検出してもよい。
【００４８】
＜イネにおける縞葉枯病に対する抵抗性がＭｏｄａｎ由来であるか否かを判定する方法＞
また、本発明は、前記イネにおける縞葉枯病に対する抵抗性又は感受性を判定するための方法によって縞葉枯病に対する抵抗性を有すると判定された被検イネにおいて、当該イネが有するＳｔｖｂ遺伝子座の下記（ｄ）の多型を検出することにより、当該イネにおける縞葉枯病に対する抵抗性がＭｏｄａｎ由来であるか否かを判定する方法を提供する。
（ｄ）配列番号：１４に記載の塩基配列の４４４〜６４４位からなる領域、又は該領域に対応する領域における挿入又は欠失。
【００４９】
「Ｍｏｄａｎ」は、パキスタン原産のインド型品種の一種であり、縞葉枯病に対する抵抗性遺伝子Ｓｔｖｂ−ｉを有する品種である。配列番号：１４に記載の塩基配列は、Ｍｏｄａｎ由来の縞葉枯病抵抗性品種であるＳｔ．Ｎｏ．１のＳｔｖｂ遺伝子座に由来する塩基配列である。配列番号：１４に記載の塩基配列の「４４４〜６４４位からなる領域」は、検出対象となる挿入／欠失多型を含む領域である。この領域に「対応する領域」とは、Ｓｔ．Ｎｏ．１の挿入／欠失多型の領域に対応する他品種の領域を意味する。
【００５０】
「対応する領域」であるか否かは、後述の実施例において示す通り、例えば、ＤＮＡ解析ソフトウェア（ＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ等）やＢＬＡＳＴ  （ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）を利用し、他品種の塩基配列をＳｔ．Ｎｏ．１の塩基配列（配列番号：１４に記載の塩基配列）と整列させた際に、Ｓｔ．Ｎｏ．１の塩基配列の４４４〜６４４位からなる領域と同列になるか否かにより判定することができる。
【００５１】
当該方法におけるＤＮＡの抽出並びに前記（ｄ）に記載の多型の検出は、上記の（ａ）に記載の多型の場合と同様である。さらに、ＰＣＲ−ＳＳＰに関しては、例えば、後述の一対のオリゴヌクレオチドのうちの片方のオリゴヌクレオチドを、挿入配列内に設計するか、または当該オリゴヌクレオチドの３’末端が挿入配列内にかかるように設計する。こうして設計された一対のオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲにより増幅されるのは、当該挿入配列を有する被検イネに由来するゲノムＤＮＡを鋳型にした場合に限られるため、かかる一対のオリゴヌクレオチドを利用することにより、挿入又は欠失を検出することができる。
【００５２】
本発明の方法により、前記（ｄ）に記載の多型を検出した場合において、配列番号：１４に記載の塩基配列の４４４〜６４４位からなる領域、又は該領域に対応する領域において、特徴的な挿入（例えば、配列番号：１４に記載の塩基配列の４４４〜５８９位からなる塩基配列の挿入）が認められれば、そのイネが示す縞葉枯病に対する抵抗性は、Ｍｏｄａｎ由来であると判定することができる。一方、配列番号：１４に記載の塩基配列の４４４〜６４４位からなる領域、又は該領域に対応する領域において、特徴的な欠失（例えば、配列番号：１４に記載の塩基配列の４４４〜５８９位からなる塩基配列の欠失）が認められれば、そのイネが示す縞葉枯病に対する抵抗性は、Ｍｏｄａｎ由来ではないと判定することができる。
【００５３】
また、穂いもち抵抗性遺伝子Ｐｂ１は、Ｍｏｄａｎに由来するＳｔｖｂ−ｉ遺伝子と連鎖することが知られているため、当該判定により、穂いもち抵抗性をも有する個体の選抜をも行うことができる。
【００５４】
＜本発明の方法に用いられるための試薬＞
さらに、本発明は、本発明の方法に用いられるための試薬であって、Ｓｔｖｂ遺伝子座の塩基配列に相補的な連続する少なくとも１５塩基の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを含む試薬を提供する。当該オリゴヌクレオチドには、オリゴヌクレオチドプライマー及びオリゴヌクレオチドプローブの双方が含まれる。当該オリゴヌクレオチドは、上記本発明の方法に使用し得る限り、Ｓｔｖｂ遺伝子座の塩基配列に対して完全に相補的である必要はない。
【００５５】
本発明のオリゴヌクレオチドの一つの好ましい態様は、本発明にかかる多型を挟み込むように設計された一対のオリゴヌクレオチド（プライマーセット）である。該オリゴヌクレオの長さは、通常１５〜１００塩基であり、好ましくは１７〜３０塩基である。なお、前述の通り、当該一対のオリゴヌクレオチドのうちのどちらか片方のオリゴヌクレオチドは、本発明にかかる多型の塩基配列の全部又は一部と相補的なものであってもよい。
【００５６】
本発明の一対のオリゴヌクレオチドの好適な例としては、前記（ａ）に記載の多型を検出する場合には、配列番号：２４及び２５に記載の塩基配列からなる一対のオリゴヌクレオチドが挙げられる。また、前記（ｄ）に記載の多型を検出する場合には、配列番号：２２及び２３に記載の塩基配列からなる一対のオリゴヌクレオチドが、本発明の一対のオリゴヌクレオチドの好適な例として挙げられる。
【００５７】
本発明のオリゴヌクレオチドの他の好ましい態様は、本発明にかかる多型を含む塩基配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチドプローブ）である。オリゴヌクレオチドプローブは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、アニーリング温度を５０℃としたＰＣＲ反応）において、本発明にかかる多型を含む塩基配列にハイブリダイズし、一方、他の領域のＤＮＡとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないものが好ましい。このような特異的なハイブリダイズが可能であれば、該オリゴヌクレオチドプローブは、本発明にかかる多型を含む塩基配列に対し、完全に相補的である必要はない。
【００５８】
また、本発明のオリゴヌクレオチドは、適宜、アイソトープ、蛍光色素、ビオチン等によって標識して用いてもよい。標識する方法としては、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、オリゴヌクレオチドの５’端を３２Ｐでリン酸化することにより標識する方法、及びクレノウ酵素等のＤＮＡポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素又はビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法等）を例示することができる。
【００５９】
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成機により作製することができる。オリゴヌクレオチドプローブは、制限酵素処理等によって取得される二本鎖ＤＮＡ断片として作製することもできる。また、本発明のオリゴヌクレオチドは、天然のヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）やリボヌクレオチド（ＲＮＡ））のみから構成されていなくともよく、非天然型のヌクレオチドにてその一部又は全部が構成されていてもよい。本発明に用いられる非天然型のヌクレオチドとしては、天然のヌクレオチドと同様の機能を有するものであれば特に制限されないが、本発明にかかる多型を含む塩基配列等に対するハイブリダイゼーションの効率を上昇させ、オリゴヌクレオチドプライマー及びオリゴヌクレオチドプローブの鎖長を短くすることができるという観点から、ＰＮＡ（ｐｏｌｙａｍｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、ＬＮＡ（登録商標、ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（登録商標、２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｂｒｉｄｇｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）、及びこれらの複合体が好ましい。なお、ＰＮＡは、ＤＮＡやＲＮＡのリン酸と５炭糖からなる主鎖をポリアミド鎖に置換したものである。ＬＮＡとはＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ、架橋化核酸）とも称され、ヌクレオチドの２’の酸素と４’の炭素を架橋したＲＮＡである。
【００６０】
上記の試薬においては、有効成分であるオリゴヌクレオチド以外に、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、保存剤等が必要に応じて混合されていてもよい。
【実施例】
【００６１】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００６２】
（実施例１）
先ず、Ｍｏｄａｎ由来イネ縞葉枯病抵抗性中間母本  Ｓｔ．Ｎｏ．１と、感受性品種日本晴との塩基配列の比較を行い、Ｓｔｖｂ−ｉ遺伝子領域（約４４ｋｂ長）にＰＣＲ用プライマーを数ｋｂ毎に設計した。設計したプライマーの配列等は表１に示す。また、プライマーが増幅する領域のゲノム上の位置関係については、図２及び３に示す。そして、これらプライマーを用いてＰＣＲを行い、抵抗性と感受性との品種間での多型の有無を調べた。
【００６３】
【表１】
0005889626.tif 000002
【００６４】
また、ＰＣＲに供する鋳型ＤＮＡの調製は、玄米を各品種系統３粒ずつ薬包紙に包んでペンチで粉砕し、市販のＤＮＡ簡易抽出溶液  ＤＮＡすいすい（株式会社リーゾ製）を用いて行った。また、ＰＣＲ反応液組成は、鋳型ＤＮＡ１０ｎｇ、プライマー各１００μＭ、ｄＮＴＰ各１２０μＭ、Ｔａｑポリメラーゼ（株式会社バイオメディカルサイエンス製）０．１ユニット、塩化マグネシウム１．５ｍＭとし，反応液量は１０μｌとした。そして、ＰＣＲ反応は、９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃３０秒にて３５サイクルを基本プログラムとして行い、次いで、得られたＰＣＲ反応産物は、３．０％アガロースゲルで電気泳動した後にエチジウムブロマイド染色し、電気泳動像を検出した。
【００６５】
その結果、Ｓｔｖｂ−ｉ遺伝子領域内に設定した６種のプライマーセット  ＳＴ４８、ＳＴ６４、ＳＴ７１、ＳＴ７２、ＳＴ８２及びＳＴ８９は、Ｍｏｄａｎに由来する抵抗性イネと感受性イネとの間で多型を示すことが明らかになった（表１  「Ｍｏｄａｎ−タイプ」及び「感受性タイプ（日本晴）」の項目  参照）。また、これら６種は塩基の挿入／欠失を利用したＳＳＬＰマーカーで、全て共優性であり、Ｍｏｄａｎに由来する抵抗性ホモ個体及びヘテロ個体の判別が可能であることが明らかになった。
【００６６】
（実施例２）
次に、これまでに報告のあるＭｏｄａｎ以外の縞葉枯病抵抗性品種（インド型イネ及び日本陸稲：Ｍｕｄｇｏ、ＩＲ８、ＩＲ２４、Ｋａｓａｌａｔｈ、Ｓｕｒｊｕｍｋｈｉ、Ｋａｒａｌａｔｈ、Ｓａｔｕｒｎ、Ｎａｔｏ、Ｃａｌｏｒｉｎａ、白米粉、中母農２号、Ｚｅｎｉｔｈ、戦捷、黒禾、陸稲農林１１号、陸稲農林２２号、陸稲農林２４号、赤ヤカン、白鬚）及び感受性品種（Ｋａｔａｋｕｔａｒａ，あきたこまち，コシヒカリ，黄金晴，坊主糯，北海赤毛）計２５品種に対する、これら６種のマーカーのＰＣＲ増幅パターンを、前記方法と同様の方法にて調べた。
【００６７】
その結果、図表には示さないが、ＳＴ４８、ＳＴ６４、ＳＴ７２、ＳＴ８２及びＳＴ８９は、Ｍｏｄａｎのみ、又はＭｏｄａｎを含む抵抗性品種の数種において、Ｍｏｄａｎと同じ増幅パターンを示した。また、感受性品種においてＭｏｄａｎと同じ増幅パターンを示すものはなかった。これに対して、ＳＴ７１は、Ｍｏｄａｎのみならず全供試抵抗性品種と感受性品種との間にて多型を示すことが明らかになった。
【００６８】
（実施例３）
そこで、ＳＴ７１に着目し、ＩＲ２４（インド型イネ、抵抗性）、日本陸稲の抵抗性遺伝子Ｓｔｖｂ（Ｓｔｖｂ−ｉの対立遺伝子）を保有する中国ＩＬ１号、及びその姉妹系統でＳｔｖｂを保有しない中系ＩＬ６号等の各々のＳＴ７１増幅断片の塩基配列を調べ、日本晴、コシヒカリ、Ｓｔ．Ｎｏ．１等の配列とともにＤＮＡシーケンスアセンブルソフトウェア「Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ」（ＧｅｎｅＣｏｄｅｓ社製）を用いて、比較した。得られた結果を図７〜１４に示す。
【００６９】
図７〜１４に示す通り、抵抗性品種においては配列番号：１３に記載の６１塩基からなるリピート（６１ｂｐリピート）が１つ、感受性品種においては２つ存在することが明らかになった（図１０及び１１の「Ｒｅｐｅａｔ１」及び「Ｒｅｐｅａｔ２」  参照）。また、感受性品種においては、日本晴のＳＴ７１増幅断片を含む領域の塩基配列（配列番号：５に記載の塩基配列）の４０１位、又は該部位に対応する部位がアデニン（Ａ）であるのに対し、抵抗性品種においては、当該部位に対応する部位がグアニン（Ｇ）であった（図１０  参照）。さらに、感受性品種においては、配列番号：５に記載の塩基配列の７５３位、又は該部位に対応する部位がチミン（Ｔ）であるのに対し、抵抗性品種においては、当該部位に対応する部位がシトシン（Ｃ）であることも明らかになった（図１３  参照）。従って、この６１ｂｐリピートをターゲットにしたマーカーＳＴ７１を用いることによって、インド型イネのＳｔｖｂ−ｉを有する抵抗性品種のみならず、日本陸稲のＳｔｖｂを有する抵抗性品種をも、感受性品種と判別できることが示唆された。
【００７０】
（実施例４）
次に、現在栽培されている代表的な飼料イネ及び新規需要米品種の中から縞葉枯病抵抗性１０品種（夢あおば、ホシアオバ、たちすがた、タカナリ、北陸１９３号、もちだわら、クサホナミ、クサノホシ、タチアオバ及びミナミユタカ）、感受性の４品種（クサユタカ、ミズホチカラ、モミロマン及びリーフスター）について、Ｓｔｖｂ遺伝子座乗領域に設計した６種のマーカー（ＳＴ４８、ＳＴ６４、ＳＴ７１、ＳＴ７２、ＳＴ８２、ＳＴ８９）及びＳＴ１０を用いてＰＣＲ分析を試みた。また、Ｍｏｄａｎに由来する日本水稲の抵抗性比較品種として「朝の光」、日本水稲の感受性比較品種として「日本晴」及び「コシヒカリ」についても当該ＰＣＲ分析を試みた。なお、これら品種の縞葉枯病抵抗性又は感受性については、イネ縞葉枯病幼苗検定により確認されている（表２  参照）。ＳＴ６４、ＳＴ７１及びＳＴ１０を用いて得られた結果を図１５及び表３に示す。
【００７１】
【表２】
0005889626.tif 000003
【００７２】
【表３】
0005889626.tif 000004
【００７３】
さらに、Ｍｏｄａｎ由来の抵抗性遺伝子Ｓｔｖｂ−ｉを導入した「Ｓｔ．Ｎｏ．１」のＳＴ６４増幅断片の塩基配列を調べ、「日本晴」のＳＴ６４増幅断片の塩基配列と比較した。得られた結果を図１６及び１７に示す。
【００７４】
図１５及び表３に示した結果から明らかなように、Ｓｔｖｂ遺伝子座の縞葉枯病抵抗性マーカー選抜に有効と思われる２種のマーカー  ＳＴ７１及びＳＴ６４が得られた。
【００７５】
すなわち、ＳＴ７１のＰＣＲ増幅産物長は、感受性品種が３８８ｂｐであるのに対して、抵抗性品種が３２７ｂｐとなり、抵抗性遺伝子の由来に関わらず、イネ縞葉枯病幼苗検定の結果と一致する結果となった。
【００７６】
また、図１６及び１７においても示されている通り、ＳＴ６４のＰＣＲ増幅産物長は、感受性品種が２０８ｂｐであるのに対して、Ｍｏｄａｎに由来するＳｔｖｂ−ｉを持つ抵抗性品種（朝の光）の増幅産物は３６２ｂｐとなり、また、タチアオバにおいても同じ断片長の増幅産物が得られた。さらに、他の抵抗性品種  ８品種（夢あおば、ホシアオバ、たちすがた、タカナリ、北陸１９３号、もちだわら、クサホナミ、クサノホシ）においては、感受性品種と同じ断片長付近に３本の増幅産物が確認された。また、抵抗性品種であるミナミユタカにおいては、感受性品種と同じ断片長のバンドが確認された。従って、ＳＴ６４を用いたＰＣＲ分析によって、抵抗性品種と感受性品種とは完全に判別することはできないものの、Ｍｏｄａｎに由来するＳｔｖｂ−ｉを持つ抵抗性品種（朝の光及びタチアオバ）とそれ以外の抵抗性品種とはＳＴ６４を利用することによって判別できることが明らかになった。
【００７７】
一方、ＳＴ１０を用いたＰＣＲ分析において、縞葉枯病抵抗性９品種（夢あおば、ホシアオバ、たちすがた、タカナリ、北陸１９３号、もちだわら、クサホナミ，クサノホシ、タチアオバ）は、Ｍｏｄａｎに由来するＳｔｖｂ−ｉを持つ抵抗性品種「朝の光」と同じ断片長（７２７ｂｐ）にバンドを示したが、抵抗性品種であるミナミユタカにおいては、感受性品種と同様に増幅産物が確認されなかった。このように、ＳＴ１０を用いたＰＣＲ分析によって、抵抗性品種と感受性品種とは完全に判別することはできず、さらに抵抗性品種において、Ｍｏｄａｎに由来するＳｔｖｂ−ｉを持つ抵抗性品種（朝の光及びタチアオバ）とそれ以外の抵抗性品種とを判別することもできないことが明らかになった。
【００７８】
（実施例５）
次に、日本陸稲に由来する抵抗性遺伝子を導入したコシヒカリ準同質遺伝子系統として中国ＩＬ１号及び中国ＩＬ３号、並びにＣゲノム野生種であるＯ．ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓが持つ抵抗性遺伝子をコシヒカリに導入した準同質遺伝子系統として和２１２８について、ＳＴ４８、ＳＴ６４、ＳＴ７１、ＳＴ７２、ＳＴ８２、ＳＴ８９及びＳＴ１０を用いてＰＣＲ分析を試みた。なお、これら品種の縞葉枯病抵抗性又は感受性については、イネ縞葉枯病幼苗検定により確認されている（表２  参照）。また、ＳＴ６４、ＳＴ７１及びＳＴ１０を用いて得られた結果を図１５及び表３に示す。
【００７９】
図１５及び表３に示した結果から明らかなように、日本陸稲由来の抵抗性を持つ中国ＩＬ１号及び中国ＩＬ３号、並びにＣゲノム野生種由来の抵抗性を持つ和２１２８において、ＳＴ７１のＰＣＲ増幅産物は３２７ｂｐとなり、これらの系統においてもイネ縞葉枯病幼苗検定結果と一致する結果となった。一方、ＳＴ１０を用いたＰＣＲ分析においては、中国ＩＬ１号、中国ＩＬ３号及び和２１２８の増幅産物は、感受性品種と同様に確認されなかった。
【００８０】
以上の結果から、Ｓｔｖｂ遺伝子座乗領域に新たに設計したマーカーのうち、ＳＴ７１は供試した代表的な飼料イネ及び新規需要米品種の１４品種を抵抗性と感受性とを明確に区別することができた。さらに、ＳＴ７１ではＳｔｖｂを有する系統及びＣゲノム野生種Ｏ．ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ由来の抵抗性を持つ和２１２８についても抵抗性の判別結果が得られた。
【００８１】
従って、ＳＴ７１は供試した２４系統の全てにおいてＰＣＲ分析結果と縞葉枯病幼苗検定の結果とが一致し、インド型品種由来のＳｔｖｂ−ｉ、日本陸稲由来のＳｔｖｂ及びＣゲノム野生種由来の抵抗性等、縞葉枯病抵抗性の由来に関係なく選抜が可能となるマーカーとして利用できることが明らかになった。
【００８２】
また、ＳＴ７１は共優性マーカーであり、抵抗性の固定と分離とを識別することが可能である。さらに、ＰＣＲによる断片の増幅は安定しており、感受性断片と抵抗性断片との差が明確であるため（図１５  参照）、１．５％程度のアガロースゲルにおいても容易に感受性断片と抵抗性断片とを識別することができる。従って、主食用・飼料用を問わず水稲の育成系統は、ＳＴ７１を用いることにより、縞葉枯病抵抗性系統を選抜することが可能となった。
【００８３】
さらに、１９６０年代に主食用品種に導入された縞葉枯病抵抗性は、前述の通り、パキスタン原産のインド型品種Ｍｏｄａｎに由来するＳｔｖｂ−ｉ遺伝子によるが、この遺伝子近傍には穂いもち抵抗性遺伝子Ｐｂ１が連鎖していることが知られている。そのため、縞葉枯病抵抗性と穂いもち抵抗性とが同時に導入できるため、Ｐｂ１についてもＤＮＡマーカーによる選抜システムが構築され、耐病性を目的とした水稲育種には積極的に導入されてきた。
【００８４】
しかし、Ｍｏｄａｎ以外のインド型品種に由来するＳｔｖｂ−ｉ遺伝子については、近傍領域に穂いもち抵抗性遺伝子が連鎖しているかどうかは不明であり、Ｍｏｄａｎ以外のインド型品種由来抵抗性を持つ飼料イネ及び新規需要米品種の育成にはＰｂ１選抜マーカーは用いる事ができなかった。また、２００６年に育成されたタチアオバは、アメリカ品種「Ｌｅｍｏｎｔ」から転び型倒伏抵抗性を導入したホールクロップサイレージ用品種であるが、育成系譜上にＭｏｄａｎ由来縞葉枯病抵抗性品種「祭り晴」が入っているため、縞葉枯病抵抗性の由来は不明であった。
【００８５】
しかしながら、前述の通り、縞葉枯病抵抗性のマーカー選抜においては、ＳＴ７１を用いる事で縞葉枯病抵抗性遺伝子の由来に関係なく、抵抗性と感受性とを識別することが可能となった。さらに、ＳＴ６４を利用することにより、Ｍｏｄａｎに由来するＳｔｖｂ−ｉを持つ抵抗性品種（朝の光及びタチアオバ）とそれ以外の抵抗性品種とは判別することができ（表３  参照）、ひいては、Ｍｏｄａｎに由来するＳｔｖｂ−ｉ遺伝子と連鎖することが知られている穂いもち抵抗性遺伝子Ｐｂ１の選抜効率の向上に寄与できることが示唆された。
【００８６】
従って、これら２つのマーカーを組み合わせて用いることにより、図１８に示すようなイネ縞葉枯病抵抗性、Ｍｏｄａｎ由来の抵抗性、及び穂いもち抵抗性の識別システムを本発明は提供することができる。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
以上説明したように、本発明によれば、ＳＴ７１を用いることにより、縞葉枯病抵抗性系統を選抜することが可能となる。さらに、ＳＴ６４を利用することにより、Ｍｏｄａｎに由来するＳｔｖｂ−ｉを持つ抵抗性品種とそれ以外の抵抗性品種とを判別することができ、ひいては、Ｍｏｄａｎに由来するＳｔｖｂ−ｉ遺伝子と連鎖することが知られている穂いもち抵抗性遺伝子Ｐｂ１の選抜効率の向上に寄与できる。本発明の方法は、主食用・飼料用を問わず広く適用することができるため、水稲の系統の育成等において有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００８８】
配列番号１
＜２２３＞  和２１３０（縞葉枯病感受性品種）  ＳＴ７１
配列番号２
＜２２３＞  中系ＩＬ６号（縞葉枯病感受性品種）  ＳＴ７１
配列番号３
＜２２３＞  あきたこまち（縞葉枯病感受性品種）  ＳＴ７１
配列番号４
＜２２３＞  コシヒカリ（縞葉枯病感受性品種）  ＳＴ７１
配列番号５
＜２２３＞  日本晴（縞葉枯病感受性品種）  ＳＴ７１
配列番号６
＜２２３＞  Ｓｔ．Ｎｏ．１（縞葉枯病抵抗性品種）  ＳＴ７１
配列番号７
＜２２３＞  Ｍｏｄａｎ（縞葉枯病抵抗性品種）  ＳＴ７１
配列番号８
＜２２３＞  ＩＲ２４（縞葉枯病抵抗性品種）  ＳＴ７１
配列番号９
＜２２３＞  Ｋａｓａｌａｔｈ（縞葉枯病抵抗性品種）  ＳＴ７１
配列番号１０
＜２２３＞  陸稲農林２４号（縞葉枯病抵抗性品種）  ＳＴ７１
配列番号１１
＜２２３＞  中国ＩＬ１号（縞葉枯病抵抗性品種）  ＳＴ７１
配列番号１２
＜２２３＞  和２１２８（縞葉枯病抵抗性品種）  ＳＴ７１
配列番号１３
＜２２３＞  ６１ｂｐリピート
配列番号１４
＜２２３＞  Ｓｔ．Ｎｏ．１（縞葉枯病抵抗性品種）  ＳＴ６４
配列番号１５
＜２２３＞  日本晴（縞葉枯病感受性品種）  ＳＴ６４
配列番号１６
＜２２３＞  人工的に合成されたＳＴ４８フォワードプライマーの配列
配列番号１７
＜２２３＞  人工的に合成されたＳＴ４８リバースプライマーの配列
配列番号１８
＜２２３＞  人工的に合成されたＳＴ１０フォワードプライマーの配列
配列番号１９
＜２２３＞  人工的に合成されたＳＴ１０リバースプライマーの配列
配列番号２０
＜２２３＞  人工的に合成されたＳＴ６４フォワードプライマーの配列
配列番号２１
＜２２３＞  人工的に合成されたＳＴ６４リバースプライマーの配列
配列番号２２
＜２２３＞  人工的に合成されたＳＴ７１フォワードプライマーの配列
配列番号２３
＜２２３＞  人工的に合成されたＳＴ７１リバースプライマーの配列
配列番号２４
＜２２３＞  人工的に合成されたＳＴ７２フォワードプライマーの配列
配列番号２５
＜２２３＞  人工的に合成されたＳＴ７２リバースプライマーの配列
配列番号２６
＜２２３＞  人工的に合成されたＳＴ８２フォワードプライマーの配列
配列番号２７
＜２２３＞  人工的に合成されたＳＴ８２リバースプライマーの配列
配列番号２８
＜２２３＞  人工的に合成されたＳＴ８９フォワードプライマーの配列
配列番号２９
＜２２３＞  人工的に合成されたＳＴ８９リバースプライマーの配列
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
0005889626.tif 000020
【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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