(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プールされた間葉系幹細胞、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む組成物であって、１ｍｌあたり１００万細胞〜３００万細胞の範囲の濃度の前記間葉系幹細胞、８５％〜９５％の範囲の濃度の前記ウシ胎仔血清、及び５％〜１５％の範囲の濃度の前記ジメチルスルホキシドを含む、組成物。
【請求項２】
プールされた間葉系幹細胞、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ  Ａ（商標）及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む組成物であって、１５ｍｌあたり２５００万細胞〜２億細胞の範囲の濃度の前記間葉系幹細胞、１％〜６％の範囲の濃度の前記ヒト血清アルブミン、８０％〜９０％の範囲の濃度の前記Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ  Ａ（商標）、及び５％〜１０％の範囲の濃度の前記ジメチルスルホキシドを含む、組成物。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の組成物及びその取扱説明書を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、幹細胞プロセシング、及び臨床用途のための幹細胞ベースの組成物を得る方法に関する。具体的には、本開示は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を単離するために吸引した骨髄をプロセシングする方法、及び更なる臨床用途のためのその大規模培養／増殖に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）は、有核細胞の０．００１％〜０．０１％を占める微量（rare）細胞集団として骨髄中に存在し、培養下でその幹細胞性を失うことなく急速に成長及び増殖することができる。ｈＭＳＣは、（１）単離の容易さ、（２）高い増殖能、（３）遺伝的安定性、（４）分離株ごとの再現特性（reproducible attributes）、（５）再現性（reproducible characteristics）、（６）組織工学原理との適合性というその特性のために、多くの損傷組織において修復を増進する可能性を有する。
【０００３】
ＭＳＣ及びＭＳＣ様細胞は現在、脂肪組織、羊水、骨膜（periostium）及び胎児組織を含む骨髄以外の様々な組織から単離されており、表現型不均一性を示す。表現型的には、ＭＳＣは複数のマーカーを発現するが、残念ながらそのいずれもＭＳＣに特異的なものではない。
【０００４】
ヒト骨髄から得られる間葉系幹細胞（ｈＢＭＳＣ）は、骨形成系列、脂肪生成系列及び軟骨形成系列、並びに肝細胞、心筋細胞及びニューロンを含む他の種類の組織又は細胞への比較的容易なアクセス可能性及び分化能のために、広く研究されている。その多能性及び自己複製能（self-renewal）のために、再生医療における用途を有する自己複製細胞源として、この幹細胞への関心が高まっている。加えて、培養基質への接着性に基づくその単離は、非間葉（non-mesenchymal）系列を除去する直接的戦略となり、特異的な表面マーカーの発現に左右される複雑な細胞単離法への依存を減らす。
【０００５】
骨髄由来ＭＳＣによる制限は、その少ない量であり、臨床用途には大量のＭＳＣが必要とされる。本開示は、骨髄由来ＭＳＣをプロセシングする方法、及び臨床用途のためのその更に大規模な増殖を提供する。
【発明の概要】
【０００６】
したがって、本開示は、間葉系幹細胞、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含むマスターセルバンク組成物を調製する方法であって、以下の工程：
ａ）骨髄細胞を得るとともに培養培地で希釈すること、及び該希釈した細胞を遠心分離し、第１のペレットを得ること、及び該第１のペレットを前記培養培地で再希釈すること、
ｂ）密度勾配溶液を前記再希釈したペレットに添加すること、及び遠心分離し、界面にバフィー層を得ること、
ｃ）等容量の前記培養培地を前記バフィー層に再添加すること、及び遠心分離し、第２のペレットを得ること、続いて該第２のペレットを前記培養培地に懸濁すること、及びインキュベートし、約８０％〜８５％のコンフルエンシーを達成すること、
ｄ）前記培養培地を吸引すること、及び前記コンフルエントな細胞をダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）で洗浄すること、その後該細胞を０．２５％トリプシンで処理すること、及び該処理した細胞を再インキュベートすること、
ｅ）前記再インキュベートした細胞を中和培地で中和すること、並びに該細胞を再遠心
分離して第３のペレットを得ること、続いて該第３のペレットを前記培養培地に懸濁すること、並びに約８５％〜９５％のＦＢＳ及び約５％〜１５％のＤＭＳＯを含む凍結培地で細胞を凍結すること、並びに
ｆ）前記凍結した細胞をトリプシン処理すること、及び該トリプシン処理した細胞を前記凍結培地に再懸濁し、前記マスターセルバンク組成物を得ること、
を含む、間葉系幹細胞、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含むマスターセルバンク組成物を調製する方法；
間葉系幹細胞、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含むワーキングセルバンク組成物を調製する方法であって、以下の工程：
ａ）上記のようなマスターセルバンク組成物を、種々のドナーから得た骨髄細胞から調製すること、
ｂ）前記組成物から細胞ペレットを得ること、続いて該細胞ペレットを培養培地に懸濁すること、及び該細胞を均等な割合でプールし、細胞の集合体を得ること、
ｃ）前記細胞の集合体を前記培養培地で培養すること、その後インキュベートし、約８０％〜８５％のコンフルエンシーを達成すること、及び上記の工程（ｄ）を再び行うこと、
ｄ）前記再インキュベートした細胞を前記培養培地で中和すること、続いて該細胞を遠心分離し、第２のペレットを得ること、及び該第２のペレットを前記培養培地に懸濁し、培養細胞を得ること、並びに
ｅ）前記培養細胞を再遠心分離すること、並びに約８５％〜９５％のＦＢＳ及び約５％〜１５％のＤＭＳＯを含む凍結培地で該細胞ペレットを凍結し、前記ワーキングセルバンク組成物を得ること、
を含む、間葉系幹細胞、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含むワーキングセルバンク組成物を調製する方法；
間葉系幹細胞、Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ  Ａ、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を、任意で薬学的に許容可能な添加剤とともに含む組成物を調製する方法であって、以下の工程：
ａ）上記のようなワーキングセルバンク組成物を調製すること、
ｂ）間葉系幹細胞を前記組成物から得ること、続いて該細胞を培養培地で培養すること、及びインキュベートし、約８０％〜８５％のコンフルエンシーを達成すること、及び上記の工程（ｄ）を再び行うこと、
ｃ）前記再インキュベートした細胞を前記培養培地で中和すること、その後該細胞を遠心分離し、細胞ペレットを得ること、該細胞ペレットをＤＰＢＳで洗浄すること、続いて再遠心分離し、第２の細胞ペレットを得ること、
ｄ）前記第２の細胞ペレットを前記完全培地に懸濁すること、及び該細胞を培養すること、続いて該培養細胞をインキュベートすること、及び前記完全培地を該インキュベートした細胞に添加し、約８０％〜８５％のコンフルエンシーを達成すること、
ｅ）前記コンフルエントな細胞をトリプシン処理すること、及び該細胞を前記ＤＰＢＳで再洗浄すること、続いて該再洗浄した細胞を０．２５％トリプシンで処理すること、及び該処理した細胞をインキュベートすること、続いて該インキュベートした細胞を前記完全培地で中和すること、
ｆ）前記中和した細胞を遠心分離すること、及び該遠心分離した細胞を前記ＤＰＢＳで洗浄すること、続いて再遠心分離し、第３のペレットを得ること、並びに
ｇ）前記第３のペレットを前記Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ−Ａ、前記ＤＭＳＯ及び前記ヒト血清アルブミンとともに凍結すること、並びに任意で薬学的に許容可能な添加剤を添加し、前記組成物を得ること
を含む、間葉系幹細胞、Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ  Ａ、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を、任意で薬学的に許容可能な添加剤とともに含む組成物を調製する方法；
間葉系幹細胞、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ  Ａ及びジメチ
ルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を、任意で薬学的に許容可能な添加剤とともに含む組成物；
間葉系幹細胞、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含むマスターセルバンク組成物又はワーキングセルバンク組成物；並びに
上記の組成物及び取扱説明書を含むキット
に関する。
【０００７】
本開示が容易に理解され、実用化されるように、ここでは添付の図面を参照して説明される例示的な実施形態に言及する。図面は下記の発明を実施するための形態とともに、本明細書中に援用され、本明細書の一部を形成し、本開示に従って実施形態を更に説明し、様々な原理及び利点を明らかにする役割を果たす。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】マスターセルバンク（ＭＣＢ）の達成に関する工程を示すフローチャートである。
【図２】ワーキングセルバンク（ＷＣＢ）の達成に関する工程を示すフローチャートである。
【図３】最終組成物／治験薬（ＩＰ）／治験用医薬品（ＩＭＰ）の達成に関する工程を示すフローチャートである。
【図４】紡錘状かつ線維芽細胞様の特徴的形態を示す継代５の治験薬（ＩＰ）の写真である（倍率１００倍）。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本開示は、間葉系幹細胞、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含むマスターセルバンク組成物を調製する方法であって、以下の工程：
ａ．骨髄細胞を得るとともに培養培地で希釈すること、及び該希釈した細胞を遠心分離し、第１のペレットを得る、遠心分離すること、及び該第１のペレットを前記培養培地で再希釈すること、
ｂ．密度勾配溶液を前記再希釈したペレットに添加すること、及び遠心分離し、界面にバフィー層を得る、遠心分離すること、
ｃ．等容量の前記培養培地を前記バフィー層に再添加すること、及び遠心分離し、第２のペレットを得る、遠心分離すること、続いて該第２のペレットを前記培養培地に懸濁すること、及びインキュベートし、約８０％〜約８５％のコンフルエンシーを達成する、インキュベートすること、
ｄ．前記培養培地を吸引すること、及び前記コンフルエントな細胞をダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）で洗浄すること、その後該細胞を０．２５％トリプシンで処理すること、及び該処理した細胞を再インキュベートすること、
ｅ．前記再インキュベートした細胞を中和培地で中和すること、並びに該細胞を再遠心分離して第３のペレットを得る、再遠心分離すること、続いて該第３のペレットを前記培養培地に懸濁すること、並びに約８５％〜９５％のＦＢＳ及び約５％〜１５％のＤＭＳＯを含む凍結培地で細胞を凍結すること、並びに
ｆ．前記凍結した細胞をトリプシン処理すること、及び該トリプシン処理した細胞を前記凍結培地に再懸濁し、前記マスターセルバンク組成物を得る、再懸濁すること
を含む、間葉系幹細胞、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含むマスターセルバンク組成物を調製する方法に関する。
【００１０】
本開示の一実施形態では、前記インキュベーションを５％ＣＯ２インキュベーター内、約３７℃の温度で行い、前記コンフルエンシーが、前記培養培地を約７日後〜８日後に補充することによって得られ、前記中和培地がダルベッコ変法イーグル培地−ノックアウト（ＤＭＥＭ  ＫＯ）、約１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及び約０．５％のＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐを含み、前記再インキュベーションを３７℃のインキュベーター内で約２分間〜３
分間行う。
【００１１】
本開示は、間葉系幹細胞、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含むワーキングセルバンク組成物を調製する方法であって、以下の工程：
ａ．上記のようなマスターセルバンク組成物を、種々のドナーから得た骨髄細胞から調製すること、
ｂ．前記組成物から細胞ペレットを得ること、続いて該細胞ペレットを培養培地に懸濁すること、及び該細胞を均等な割合でプールし、細胞の集合体を得ること、
ｃ．前記細胞の集合体を前記培養培地で培養すること、その後インキュベートし、約８０％〜８５％のコンフルエンシーを達成すること、及び上記の工程（ｄ）を再び行うこと、
ｄ．前記再インキュベートした細胞を前記培養培地で中和すること、続いて該細胞を遠心分離し、第２のペレットを得ること、及び該第２のペレットを前記培養培地に懸濁し、培養細胞を得ること、並びに
ｅ．前記培養細胞を再遠心分離すること、並びに約８５％〜９５％のＦＢＳ及び約５％〜１５％のＤＭＳＯを含む凍結培地で細胞ペレットを凍結し、前記ワーキングセルバンク組成物を得ること、
を含む、間葉系幹細胞、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含むワーキングセルバンク組成物を調製する方法に関する。
【００１２】
本開示の一実施形態では、前記マスターセルバンク組成物が、約１００万細胞〜３００万細胞の範囲の間葉系幹細胞、約８５％〜９５％の範囲のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及び約５％〜１５％の範囲のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む。
【００１３】
本開示の別の実施形態では、幹細胞を融解すること、凍結培地を完全培地で中和すること、及び約１２００ｒｐｍ〜１５００ｒｐｍで約１０分間〜２０分間の間遠心分離し、細胞ペレットを得ることによって、前記細胞ペレットを得る。
【００１４】
本開示は、間葉系幹細胞、Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ  Ａ、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を、任意で薬学的に許容可能な添加剤とともに含む組成物を調製する方法であって、以下の工程：
ａ．上記のようなワーキングセルバンク組成物を調製すること、
ｂ．間葉系幹細胞を前記組成物から得ること、続いて該細胞を培養培地で培養すること、及びインキュベートし、約８０％〜８５％のコンフルエンシーを達成すること、及び上記の工程（ｄ）を再び行うこと、
ｃ．前記再インキュベートした細胞を前記培養培地で中和すること、その後該細胞を遠心分離し、細胞ペレットを得ること、該細胞ペレットをＤＰＢＳで洗浄すること、続いて再遠心分離し、第２の細胞ペレットを得ること、
ｄ．前記第２の細胞ペレットを前記完全培地に懸濁すること、及び該細胞を培養すること、続いて該培養細胞をインキュベートすること、及び前記完全培地を該インキュベートした細胞に添加し、約８０％〜８５％のコンフルエンシーを達成すること、
ｅ．前記コンフルエントな細胞をトリプシン処理すること、及び該細胞を前記ＤＰＢＳで再洗浄すること、続いて該再洗浄した細胞を０．２５％トリプシンで処理すること、及び該処理した細胞をインキュベートすること、続いて該インキュベートした細胞を前記完全培地で中和すること、
ｆ．前記中和した細胞を遠心分離すること、及び該遠心分離した細胞を前記ＤＰＢＳで洗浄すること、続いて再遠心分離し、第３のペレットを得ること、並びに、
ｇ．前記第３のペレットを前記Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ−Ａ、前記ＤＭＳＯ及び前記ヒト血清アルブミンとともに凍結すること、並びに任意で薬学的に許容可能な添加剤を添加し、前記組成物を得ること、を含む、間葉系幹細胞、Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ  Ａ、ヒト血清
アルブミン（ＨＳＡ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を、任意で薬学的に許容可能な添加剤とともに含む組成物を調製する方法に関する。
【００１５】
本開示の一実施形態では、前記ワーキングセルバンク組成物が、約１００万細胞〜３００万細胞の範囲の間葉系幹細胞、約８５％〜９５％の範囲のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及び約５％〜１５％の範囲のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を有する。
【００１６】
本開示の別の実施形態では、約１２００ｒｐｍ〜１５００ｒｐｍ、約２０℃〜２５℃の範囲の温度で約１０分間〜２０分間の範囲の期間、前記遠心分離を行う。
【００１７】
本開示の更に別の実施形態では、前記インキュベーションを５％ＣＯ２インキュベーター内、約３７℃の温度で行い、前記コンフルエンシーが、前記培養培地を約７日後〜８日後に補充することによって得られ、前記再インキュベーションを３７℃のインキュベーター内で約２分間〜３分間行う。
【００１８】
本開示の更に別の実施形態では、前記培養培地が、約８５％〜９５％の範囲の濃度のダルベッコ変法イーグル培地−ノックアウト（ＤＭＥＭ−ＫＯ）、約５％〜１５％の範囲の濃度のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、約０．５％〜２％の範囲の濃度のグルタミン、約０．１％〜１％の範囲の濃度のＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ、及び約０．５ｎｇ／ｍｌ〜５ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度の塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含む。
【００１９】
本開示は、間葉系幹細胞、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ  Ａ及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を、任意で薬学的に許容可能な添加剤とともに含む組成物に関する。
【００２０】
本開示は、間葉系幹細胞、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含むマスターセルバンク組成物又はワーキングセルバンク組成物に関する。
【００２１】
本開示の一実施形態では、約２５００万細胞〜２億細胞の範囲の濃度の前記間葉系幹細胞、約１％〜６％の範囲の濃度の前記ヒト血清アルブミン、約８０％〜９０％の範囲の濃度の前記Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ、及び約５％〜１０％の範囲の濃度の前記ジメチルスルホキシドを各々の低温保存バイアル内に含む。
【００２２】
本開示の別の実施形態では、約１００万細胞〜３００万細胞の範囲の濃度の前記間葉系幹細胞、約８５％〜９５％の範囲の濃度の前記ウシ胎仔血清、及び約５％〜１５％の範囲の濃度の前記ジメチルスルホキシドを各々の低温保存バイアル内に含む。
【００２３】
本開示の更に別の実施形態では、前記薬学的に許容可能な添加剤がＰｌａｓｍａｌｙｔｅ  Ａである。
【００２４】
本開示は、上記の組成物及び取扱説明書を含むキットに関する。
【００２５】
本開示は、骨髄由来ＭＳＣの治療用途のための単離、プーリング及び大規模増殖の方法を提示する。本開示は、移植用／移植前の新たに採取した間葉系幹細胞（ＭＳＣ／凍結融解ＭＳＣ）を、その生存性及び多能性を特定期間維持するために最適条件で保存／貯蔵する重要な方法も開示する。加えて、本開示は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、ヒト血清アルブミン、Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ  Ａ及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を薬学的に許容可能な賦形剤とともに含む、臨床用途のための組成物にも関する。本開示は、該組成物を得る方法にも関する。該方法は、吸引した骨髄からマスターセルバンクを樹立すること、続いてワーキングセルバンクを調製すること、及び最後に治験用医薬品の組成物を達成す
ることを更に含む。
【００２６】
本開示の一実施形態では、本明細書中で使用される「治験用医薬品（ＩＭＰ）又は治験薬（ＩＰ）又は治療用組成物又は組成物」という用語は全て、主に骨髄由来同種間葉系幹細胞を、ヒト血清アルブミン、Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ  Ａ及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）とともに含む組成物を意味する。以下、本明細書中ではこれをＩＭＰと称する。
【００２７】
一実施形態では、本開示は、主に活性成分である間葉系幹細胞、ヒト血清アルブミン、Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ  Ａ及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む組成物、並びにそれを得る方法を提供する。間葉系幹細胞は、複数の健常ドナー、好ましくは１人〜５人のドナー、より好ましくは１人〜３人のドナーから吸引した骨髄に由来するものであり、マスターセルバンクの調製のための様々な処理を行う。さらに、ワーキングセルバンクは上記マスターセルバンクから得られ、これをその後、治療用途／臨床用途のための本組成物／（ＩＭＰ）に調合する。
【００２８】
ＭＳＣの単離、マスターセルバンク、ワーキングセルバンク及び治験薬の調製
ＭＣＢの調製：
本開示の一実施形態では、約６０ｍＬ〜７０ｍＬの骨髄を各健常ドナーの腸骨稜から無菌的に吸引し、個々の血液バッグに回収する。２０ｍｌ容の注射器を使用して、サンプルをセルストレーナー（１００μｍ）に通して骨片、血餅及び細胞集合体を除去し、遠心分離管に回収する。回収した骨髄を完全培養培地で希釈し、遠心分離を約１２００ｒｐｍ〜１５００ｒｐｍで約１０分間〜２０分間行う。完全培養培地はノックアウトダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ−ＫＯ）、ウシ胎仔血清（１０％）、グルタミン（１％）及びＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（ペニシリン（Penicillin）−ストレプトマイシン）（０．５％）を含む。上清を捨て、ペレットを完全培養培地で希釈する。別の遠心分離管にｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（密度勾配溶液）を取り、これに希釈した骨髄をその２倍容量添加し、約１２００ｒｐｍ〜１５００ｒｐｍで約１０分間〜２０分間、室温で遠心分離する（ここで、室温とは２０℃〜２５℃である）。界面に存在するバフィー層を回収し、細胞の計数を行う。
【００２９】
本開示の別の実施形態では、バフィーコートは単核細胞（ＭＮＣ）を含む。バフィーコート中に存在するＭＮＣを完全培養培地で洗浄する。各々のドナーから得られるＭＮＣ数は、ドナーの年齢及び生物学的性質に応じて異なる。平均数は約４億〜１０億である。残りのＭＮＣを１つのバイアル内で凍結させて、数をバイアルに記入する。バフィー層の残りに等容量の完全培養培地を添加し、約１２００ｒｐｍ〜１５００ｒｐｍで約１０分間〜２０分間遠心分離する。ペレットに培養培地を添加し、穏やかに再懸濁する。細胞を血球計算器で計数し、１つのＴ−７５フラスコにつき約４０００万個〜５０００万個のＭＮＣを播種し、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーターに移す。最初の培地交換は約７２時間の時点で行い、その後４８時間ごとに、フラスコが８０％〜８５％のコンフルエンシーに達するまで培地交換を行う。培地交換によって、ＭＳＣのみが特有のプラスチック付着性のために表面に付着することを確実にする。約４８時間〜約７２時間後、細胞を顕微鏡下でスクリーニングし、２枚の代表的な顕微鏡写真を撮影する。
【００３０】
本開示の一実施形態では、細胞を約８０％〜８５％のコンフルエンシーに達するまでフラスコ内で培養する。細胞が約８０％〜８５％コンフルエントである場合、完全培地を吸引し、細胞をダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）で２回洗浄する。１つのＴ−７５フラスコにつき約１ｍｌ〜２ｍｌのトリプシンを添加し、３７℃で約２分間〜３分間ンキュベートする。ＤＭＥＭ  ＫＯ、１０％のＦＢＳ及び０．５％のＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（ペニシリン−ストレプトマイシン）を含む中和培地でトリプシンの作用を中和し、中和したサンプルを回収し、約１２００ｒｐｍ〜１５００ｒｐｍで約１０分間〜２０分間、室温で遠心分離する。ペレットに完全培地を添加した後、細胞計数を行う。その後、約８５
％〜９５％のＦＢＳ及び約５％〜１５％のＤＭＳＯを含む凍結培地を用いて、ＭＳＣを１ｍｌ当たり約１００万個の濃度でバイアル内で凍結させる。これを継代０（Ｐ０）細胞（すなわち１本又は２本のバイアル）と称する。細胞の残りをセルスタック内で１平方ｃｍ当たり約６６６６細胞の播種密度で培養／増殖させ、７日目又は８日目（培養齢）に完全培地を交換し、０．２５％トリプシンを用いて１４日目〜１８日目にセルスタックを採取する。トリプシン処理した細胞を、ＤＭＥＭ  ＫＯ、１０％のＦＢＳ、０．５％のＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（ペニシリン−ストレプトマイシン）を含む中和培地で中和し、遠心分離管に回収し、約１２００ｒｐｍ〜１５００ｒｐｍで約１０分間〜２０分間遠心分離する。ペレットを完全培地に再懸濁して、細胞数を評価する。採取した細胞を、約８５％〜９５％のＦＢＳ及び約５％〜１５％のＤＭＳＯを含む凍結培地中、１ｍｌ当たり約１００万細胞〜３００万細胞の濃度でバイアル内で凍結させる。これを継代１（Ｐ１）細胞又はマスターセルバンクと称する。
【００３１】
ＷＣＢの調製：
本開示の別の実施形態では、各１バイアルのマスターセルバンクを取り、細胞を続いて計数し、各ドナーについて均等に（equal proportion）プールする。これをプーリングと称する。プーリングは２人、３人、４人、５人若しくはそれ以上のドナーによるもの、又は要件に従うものであり得る。全てのドナー細胞の計数及びプーリングの後、細胞を生存性について確認し、生存細胞を得られた細胞数に従って２個〜１０個のチャンバーにプレーティングする。その後、培養チャンバーを約３７℃の５％ＣＯ２インキュベーターに移す。４８時間〜７２時間ごとにセルスタックを顕微鏡下で観察し、２枚の代表的な顕微鏡写真を撮影する。７日〜８日ごとに、完全培養培地にＤＭＥＭ−ＫＯ、ＦＢＳ、グルタミン、Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ及び塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含む新たに調製した完全培地を補充する。チャンバー内の細胞が約８０％〜８５％コンフルエントになるまで細胞を培養する。
【００３２】
本開示の一実施形態では、細胞が約８０％〜８５％のコンフルエンシーを達成した時点で、完全培地を吸引し、セルスタックをＤＰＢＳで２回洗浄する。洗浄後、トリプシンを添加し、細胞を約３７℃で約４分間〜５分間インキュベートし、その後中和培地で細胞を中和する。中和したサンプルを回収し、約１２００ｒｐｍ〜１５００ｒｐｍで約１０分間〜２０分間、室温で遠心分離する。それにより得られたペレットに完全培地を添加し、細胞を計数する。その後、細胞をセルスタック内で更に１継代、培養／増殖させて、細胞を採取し、遠心分離する。得られたペレットに完全培地を添加し、細胞を計数する。各バイアルが、約８５％〜９５％のＦＢＳ及び約５％〜１５％のＤＭＳＯを含む凍結ミックス（freezing mix）中に約１００万個〜３００万個のＭＳＣを含有するようにして、バイアルを約１８０℃〜１９６℃で凍結する。これにより、継代３（Ｐ３）のワーキングセルバンクが形成される。本開示において使用される低温貯蔵タンクは液体窒素を利用するものであり、このワーキングセルバンクを後の大規模増殖に使用する。
【００３３】
大規模増殖のための種調製：
本開示の一実施形態では、ＩＭＰ調合に必要とされる細胞の数に応じて特定数のＷＢＣバイアルを回復させ、計数する。細胞生存性を初めに確認し、生存細胞を１平方センチメートル当たり約１０００細胞の播種密度でプレーティングする。その後、バイアルを培養チャンバー、更に約３７℃に維持した５％ＣＯ２インキュベーターに移す。４８時間〜７２時間ごとにセルスタックを顕微鏡下でスクリーニングし、２枚の代表的な顕微鏡写真を撮影する。次いで、完全培地に新たに調製した完全培地を補充し、７日〜８日後に補充を繰り返す。次いで、チャンバーが約８０％〜８５％コンフルエントになるまで細胞を培養する。
【００３４】
本開示の別の実施形態では、細胞が約８０％〜８５％のコンフルエンシーを達成した時
点で、使用済み培地を吸引し、セルスタックをＤＰＢＳで２回洗浄する。洗浄後、トリプシンを添加し、約３７℃で約４分間〜５分間インキュベートし、中和培地で中和する。中和したサンプルを回収し、約１２００ｒｐｍ〜１５００ｒｐｍで約１０分間〜２０分間、室温（約２０℃〜２５℃の範囲）で遠心分離する。ペレットにＤＰＢＳを添加し、十分に混合し、約１２００ｒｐｍ〜１５００ｒｐｍで約１０分間〜２０分間遠心分離する。細胞を完全培地に再懸濁し、種細胞数を評価する（assess）。上記の細胞を継代４（Ｐ４）段階の種細胞と称する。
【００３５】
大規模生産：
本開示の一実施形態では、上記の計数した生存細胞を、複数の１０セルスタック（ＴＣＳ）（通常は２２．４ＴＣＳ）に１平方ｃｍ当たり約１０００細胞〜１１００細胞の播種密度で更に活発に増殖させる。その後、培養チャンバーを５％ＣＯ２インキュベーターに移す。
【００３６】
本開示の一実施形態では、４８時間〜７２時間ごとにセルスタックを顕微鏡下でスクリーニングし、２枚の代表的な顕微鏡写真を撮影する。７日目又は８日目に、使用済み培地を除去することなく、ｂＦＧＦを含む約５００ｍｌの完全培地を既存の１０セルスタックに添加することを、流加回分活性化プロセスと称する。
【００３７】
本開示の別の実施形態では、７日目又は８日目（培養齢）に流加回分活性化によって培地を補充し、０．２５％トリプシンを用いることによって１４日目〜１８日目にセルスタックを採取する。チャンバーが約８０％〜８５％コンフルエントになるまで細胞を培養する。
【００３８】
本開示の更に別の実施形態では、細胞が約８０％〜８５％コンフルエントに達した時点で、セルスタックから使用済み培地を別の遠心分離管に回収し、セルスタックをＤＰＢＳで２回洗浄する。洗浄後、トリプシンを添加し、約３７℃で約３分間〜４分間インキュベートし、回収した使用済み培地で中和する。中和したサンプルを遠心分離管に回収し、約１２００ｒｐｍ〜１５００ｒｐｍで約１０分間〜２０分間、室温で遠心分離する。細胞をＤＰＢＳに再懸濁し、約１２００ｒｐｍ〜１５００ｒｐｍで１０分間〜２０分間遠心分離することによって２回洗浄する。細胞を血球計算器で計数した後、最後のＤＰＢＳ洗浄を行う。最後の洗浄を行ったペレットに、Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ−Ａ、ＤＭＳＯ及びヒト血清アルブミンを含む凍結ミックスを添加し、全体をクライオバッグに移す。これは、間葉系幹細胞、Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ−Ａ、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）及びＤＭＳＯを含む本開示の最終ＩＭＰ／組成物であり、治療用途／臨床用途に使用することができる。
【００３９】
本開示の一実施形態では、骨髄から幹細胞を得ることに関するプロセスを下記に示す。
【００４０】
以下の実施例及び図面によって本開示を更に詳述する。しかしながら、これらの実施例は本開示の範囲を限定すると解釈されるものではない。
【実施例】
【００４１】
実施例１：
工程１：マスターセルバンク調製のための骨髄由来ＭＳＣの単離
１．  骨髄穿刺液を、セルストレーナー（１００μｍ）に通して遠心分離管に移し、骨片及び細胞集合体を除去する。
２．  骨髄をダルベッコ変法イーグル培地ノックアウト（ＤＭＥＭ−ＫＯ）、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、グルタミン及びＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐを含む完全培養培地で１：１の比率で希釈した後、穏やかに混合する。
３．  約１２００ｒｐｍ〜１５００ｒｐｍで約１０分間〜２０分間遠心分離する。
４．  上清を慎重に吸引し、ペレットを完全培養培地で希釈する。
５．  ５０ｍｌ容の遠心分離管にｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐを取り、これに希釈した骨髄をその２倍容量添加する（１：２の比率）。
６．  骨髄サンプルをｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ上に、サンプルとｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐとが混合しないように慎重に重層する。
７．  約１２００ｒｐｍ〜１５００ｒｐｍで約１０分間〜２０分間、室温で遠心分離する。
８．  ＲＢＣと血漿の多い層との間に存在するバフィー層から単核細胞を回収するために、他のいかなる層も吸引しないようにピペットをバフィー層の隅に４５°の角度で合わせて、バフィー層を慎重に吸引する。
９．  細胞を新たな遠心分離管に移し、細胞を血球計算器で計数する。
１０．  単核細胞（ＭＮＣ）の１０本のバイアルを凍結する（各々のバイアルは約１０００万細胞を含有する）。
１１．  バフィー層の残りに等容量の完全培養培地を添加し、約１２００ｒｐｍ〜１５００ｒｐｍで約１０分間〜２０分間遠心分離する。
１２．  約１０ｍｌの培養培地をペレットに添加し、穏やかに再懸濁する。
１３．  細胞を血球計算器で計数する。
１４．  約４０００万個〜約５０００万個のＭＮＣ細胞をＴ−７５フラスコに移す。
１５．  培養チャンバーを３７℃の５％ＣＯ２インキュベーターに移し、約１０日間〜１５日間インキュベートする。
１６．  約４８時間後〜約７２時間後、セルスタックを顕微鏡下で観察し、２枚の代表的な顕微鏡写真を撮影する。
１７．  完全培地に７２時間後、及びその後４８時間ごとに新たに調製した完全培地を補充する。
１８．  チャンバー内の細胞が約８０％〜８５％コンフルエントになるまで細胞を培養する。
１９．  細胞が約８０％〜８５％コンフルエントになった時点で、完全培養培地を吸引し、セルスタックをダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）で２回洗浄する。
２０．  洗浄後、１つのフラスコにつき約２ｍｌの０．２５％トリプシンを添加し、３７℃のインキュベーター内で約２分間〜３分間インキュベートする。
２１．  トリプシンの作用を、１：４の比率の中和培地で中和する。
２２．  中和したサンプルを遠心分離管に回収し、約１２００ｒｐｍ〜１５００ｒｐｍで約１０分間〜２０分間、室温で遠心分離する。
２３．  ペレットに完全培地を添加し、細胞を計数する。
２４．  先の継代の３本〜１０本のバイアルを、８５％〜９５％のＦＢＳ及び５％〜１５％のＤＭＳＯを含む凍結培地中で、１ｍｌ当たり１００万細胞〜３００万細胞の最終濃度で凍結する。培養物を１セルスタック（ＣＳ）又は２ＣＳで、６６６６細胞／ｃｍ２の播種密度で増殖させて、ＭＣＢを得る。
２５．  培養物をトリプシン処理によって採取し、細胞ペレットを約８５％〜９５％のＦＢＳ及び５％〜１５％のＤＭＳＯを含む凍結培地に、１ｍｌ当たり約１００万細胞〜３００万細胞の最終細胞濃度で再懸濁する。
【００４２】
工程２：マスターセルバンクからのワーキングセルバンクの調製
２６．  複数のドナーの各々に由来するマスターセルバンクバイアルを各１本ずつ取る。２７．  バイアルを水浴中、約３７℃で融解する。
２８．  凍結培地を完全培地で１：９の比率で中和することによって細胞を回復させる。２９．  中和した懸濁液を約１２００ｒｐｍ〜１５００ｒｐｍで１０分間〜２０分間、室温で遠心分離する。
３０．  上清を捨て、ペレットを完全培地で再懸濁し、各ドナーの総生存細胞数を個々に計数する。
３１．  全てのドナーからの細胞を均等に混合する。これはプーリングと称される。プーリングは２人、３人、４人、５人又はそれ以上のドナーによるものであり得る。
３２．  計数し、１つ〜５つ又はそれ以上のドナー細胞を混合した後、生存性を確認し、生存細胞を、得られた細胞数に従って２個のチャンバー及び１０個のチャンバー内に約１０００細胞／ｃｍ２の播種密度でプレーティングする。
３３．  その後、培養チャンバーを約３７℃の５％ＣＯ２インキュベーターに移す。
３４．  ４８時間〜７２時間ごとにセルスタックを顕微鏡下でスクリーニングし、２枚の代表的な顕微鏡写真を撮影する。
３５．  ７日〜８日ごとに、完全培地にＤＭＥＭ−ＫＯ、ＦＢＳ、グルタミン、Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ及びｂＦＧＦを含む新たに調製した完全培地を補充する。
３６．  次いで、チャンバー内の細胞が約８０％〜８５％コンフルエントになるまで細胞を培養する。
３７．  細胞が約８０％〜８５％コンフルエントになった時点で、完全培地を吸引し、セルスタックをＤＰＢＳで２回洗浄する。
３８．  洗浄後、１個のチャンバーにつき約２０ｍｌの０．２５％トリプシンを添加し、３７℃のインキュベーター内で約４分間〜５分間インキュベートする。
３９．  トリプシンの作用を、１：４の比率の完全培地で中和する。
４０．  中和したサンプルを遠心分離管に回収し、約１２００ｒｐｍ〜１５００ｒｐｍで約１０分間〜２０分間、室温で遠心分離する。
４１．  ペレットに約１０ｍｌ〜２０ｍｌの完全培地を添加し、細胞を計数する。
４２．  細胞をセルスタック内で更に１継代増殖させて、工程３７〜４１の通りに細胞を採取する。
４３．  細胞を約１２００ｒｐｍ〜１５００ｒｐｍで約１０分間〜２０分間、室温で遠心分離し、上清を捨て、約５％〜１５％のＤＭＳＯ及び約８５％〜９５％のＦＢＳからなる凍結培地でペレットを再懸濁する。
４４．  穏やかに混合し、１００万細胞／ｍｌ〜３００万細胞／ｍｌの凍結培地を含有するようにクライオバイアルに充填し、継代３（Ｐ３）のＷＣＢという表示を付ける。
【００４３】
工程３：ワーキングセルバンクバイアルからの組成物の調製
４５．  ＩＭＰの要件に応じて必要数のワーキングセルバンクのバイアルを回復させ、細胞を計数し、その生存性を確認する。１つの１０チャンバーセルスタックにつき約６３６万個の生存細胞をプレーティングする。
４６．  培養チャンバーを約３７℃の５％ＣＯ２インキュベーターに移す。
４７．  ４８時間〜７２時間ごとにセルスタックを顕微鏡下で観察し、２枚の代表的な顕微鏡写真を撮影する。
４８．  ７日〜８日ごとに、完全培地に新たに調製した完全培地を補充する。
４９．  チャンバーが約８０％〜８５％コンフルエントになるまで細胞を培養する。
５０．  細胞が約８０％〜８５％コンフルエントになった時点で、使用済み培地を吸引し、セルスタックをＤＰＢＳで２回洗浄する。
５１．  洗浄後、１つのチャンバーにつき約２０ｍｌの０．２５％トリプシンを添加し、３７℃のインキュベーター内で約２分間〜３分間インキュベートする。
５２．  トリプシンの作用を、１：４の比率の完全培地で中和する。
５３．  中和したサンプルを遠心分離管に回収し、約１２００ｒｐｍ〜１５００ｒｐｍで約１０分間〜２０分間、室温で遠心分離する。
５４．  ペレットに約２０ｍｌのＤＰＢＳを添加し、十分に混合し、約１２００ｒｐｍ〜１５００ｒｐｍで１０分間〜約２０分間遠心分離する。
５５．  細胞を完全培地に再懸濁し、細胞数を測定する。上記の細胞をＰ４段階の種細胞と称する。
５６．  Ｐ４細胞を、再度の増殖のために複数の１０セルスタック（通常は２２．４ＴＣＳ）に１平方ｃｍ当たり約１０００細胞〜１１００細胞の播種密度で播種する。培養チャ
ンバーを５％ＣＯ２インキュベーターに移す。
５７．  ４８時間〜７２時間ごとにセルスタックを顕微鏡下でスクリーニングし、２枚の代表的な顕微鏡写真を撮影する。
５８．  ７日目又は８日目に、使用済み培地を除去することなく、ｂＦＧＦを含む約５００ｍｌの完全培地を１０セルスタックに添加する。
５９．  １４日目〜１８日目にチャンバーが約８０％〜８５％コンフルエントになった時点で、０．２５％トリプシンを用いてセルスタックを採取する。
６０．  細胞が約８０％〜８５％コンフルエントになった時点で、セルスタックから（from）使用済み培地を別の遠心分離管に回収し、セルスタックをＤＰＢＳで２回洗浄する。６１．  トリプシンを添加し、３７℃のインキュベーター内で約３分間〜４分間インキュベートし、回収した使用済み培地で中和する。
６２．  中和したサンプルを遠心分離管に回収し、約１２００ｒｐｍ〜１５００ｒｐｍで約１０分間〜２０分間、室温で遠心分離する。
６３．  細胞をＤＰＢＳに再懸濁し、約１２００ｒｐｍ〜１５００ｒｐｍで１０分間〜２０分間遠心分離することによって２回洗浄する。
６４．  細胞を血球計算器で計数した後、最後のＤＰＢＳ洗浄を行う。
６５．  最後の洗浄を行ったペレットに、約２億細胞のペレットにつき約１２．７５ｍｌのＰｌａｓｍａｌｙｔｅ−Ａ、約１．５ｍｌのＤＭＳＯ及び約０．７５ｍｌのヒト血清アルブミンを含む凍結ミックスを約１５ｍｌ添加する。全体をクライオバッグに移す。これは、間葉系幹細胞、Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ−Ａ、ヒト血清アルブミン及びＤＭＳＯを含む本開示の最終組成物であり、治療用途／臨床用途に使用することができる。
【００４４】
本開示の一実施形態では、各バイアルにおいて、マスターセルバンク組成物中の間葉系幹細胞は約１００万細胞であり、ワーキングセルバンク組成物中の間葉系幹細胞は約３００万細胞である。
【００４５】
実施例２：
マスターセルバンクの樹立
図１は、単離した骨髄からのマスターセルバンク（ＭＣＢ）の調製に関する主要な工程を示す。工程１０１は、１９歳〜３５歳の年齢群の健常ドナーの選択であり、工程１０３は、強制スクリーニング試験としてヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ１）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）及びサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）についてスクリーニングした、選択したドナーからの骨髄の吸引である。骨髄（６０ｍＬ〜８０ｍＬ）を複数のドナーの腸骨稜から全身麻酔下で無菌的に吸引する。工程１０５は、単核細胞（ＭＮＣ）のプレーティング／播種であり、その後に継代０（Ｐ０）のＭＳＣの採取（１０７）及びＰ０のＭＳＣの再播種（１０９）が続く。工程１１１は、マスターセルバンク（ＭＣＢ）を樹立するための継代１（Ｐ１）のＭＳＣの採取からなる。１１３は、約８５％〜９５％のＦＢＳ及び約５％〜１５％のＤＭＳＯを含む低温保存溶液中でのＭＣＢ（１００万細胞／ｍｌ〜３００万細胞／ｍＬ）の低温保存である。
【００４６】
ワーキングセルバンクの樹立
図２は、マスターセルバンク（ＭＣＢ）からのワーキングセルバンク（ＷＣＢ）の調製に関する主要な工程を説明するものである。工程２０１は複数のドナーからのＭＣＢのプーリング、２０３はＰ１  ＭＳＣの播種、２０５はＰ２  ＭＳＣの採取、２０７はＰ２  ＭＳＣの低温保存、２０９はＰ２  ＭＳＣの再播種、２１１はワーキングセルバンク（ＷＣＢ）を構成するＰ３  ＭＳＣの採取、２１３は約８５％〜９５％のＦＢＳ及び約５％〜１５％のＤＭＳＯを含む低温保存ミックス／凍結ミックス中での１００万細胞／ｍｌ〜３００万細胞／ｍｌアリコートのＭＳＣの低温保存である。
【００４７】
治験薬（ＩＰ）／治験用医薬品（ＩＭＰ）／治療用組成物の調合
図３は、治療用組成物（この用途で治験薬（ＩＰ）／治験用医薬品（ＩＭＰ）とも称される）を配合するために行われる様々な重要な工程を説明するものである。ＩＰは主に骨髄由来の同種間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を他の微量成分とともに含む。規定量のＰ３の細胞を含む必要数のバッグを回復させ、完全培養培地に播種して、ＩＰを形成する継代４（Ｐ４）細胞を採取する（３０１）。これを、Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ−Ａ、ＤＭＳＯ及びヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む凍結ミックス／低温保存ミックス中で更に低温保存することができる（３０３）。最終治験薬は２億個の細胞、１２．７５ｍｌのＰｌａｓｍａｌｙｔｅ−Ａ、１．５ｍｌのＤＭＳＯ及び０．７５ｍｌのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む（３０５）。
【００４８】
実施形態の１つでは、ＩＭＰは、約２５００万細胞〜約２億細胞の範囲の濃度の間葉系幹細胞、約１％〜約６％の範囲の濃度のヒト血清アルブミン、約８０％〜約９０％の範囲の濃度のＰｌａｓｍａｌｙｔｅ  Ａ、約５％〜約１０％の範囲の濃度のジメチルスルホキシドを含む。
【００４９】
実施例３：
一実施形態では、１９歳〜３５歳の年齢群の３人の健常ドナー（Ａ、Ｂ及びＣ）を選択する。強制スクリーニング試験として、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ１）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）及びサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）について患者をスクリーニングする。骨髄（６０ｍＬ〜８０ｍＬ）を３人のドナーの腸骨稜から深鎮静下で無菌的に吸引する。骨髄中のＭＳＣの量が０．０１〜０．００１％であることを考慮すると（Pittenger 199 9）、上記範囲を下回る量から得られるＭＳＣの量は試験を進行するのに少な過ぎ、上記範囲を上回る量はＲＢＣ等の不要な成分を生じるおそれがある。
【００５０】
【表１】
0006053853.tif 000002
【００５１】
骨髄穿刺液を、１００ｕｍ（細孔径）のセルストレーナー（strainer）に通して骨片及び血餅を除去することによって４本又は５本の遠心分離管に回収し、完全培養培地で１：１の比率で希釈する。この完全（complete）培養培地は、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、グルタミン及びＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐを添加したノックアウトダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ−ＫＯ）を含む。骨髄穿刺液を約１２００ｒｐｍ〜１５００ｒｐｍで約１０分間〜２０分間遠心分離して、血漿を除去する。上清を捨て、再懸濁した（resuspended）ペレットをＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ上に２：１の比率（懸濁したＢＭＡ：ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ）で重層する。単核細胞（ＭＮＣ）は、約１２００ｒｐｍ〜１５００ｒｐｍで約１０分間
〜２０分間の遠心分離後に得られるＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ密度勾配のバフィーコートに由来する。バフィーコート中に存在するＭＮＣを完全培養培地で再度洗浄する。各々のドナーから得られるＭＮＣ数は、ドナーの年齢及び生物学的性質に応じて異なる。平均数は約４億〜１０億である。
【００５２】
実施例４：ＭＳＣ（Ｐ０）を得るためのＭＮＣの継代
単核画分（ＭＳＣも含有する）を、Ｔ−７５フラスコ（BD Biosciences）にプレーティングし、１０％ＦＢＳ、２００ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ及びＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐを添加したＤＭＥＭ−ＫＯを含む完全培養培地中で培養する。最適播種密度は１つのＴ−７５フラスコにつき約４０００万個〜５０００万個である。最初の培地交換は７２時間のインキュベーション後に行い、続く培地交換はその後４８時間ごとに、約８０％〜８５％のコンフルエンシーレベルが得られるまで行うものとする。細胞の十分な増殖及び非接着性細胞の除去を確実にするために、最大で５回の培地交換を行う。しかしながら、培地交換の回数は細胞のコンフルエンシーによって異なり得る。細胞がコンフルエントになった時点で、０．２５％トリプシン／０．５３ｍＭ  ＥＤＴＡ（Invitrogen）で解離し、６６６６細胞／ｃｍ２の比率で再播種する（継代１）。３日間〜５日間の培養の後、細胞は約８０％〜８５％のコンフルエンシーに達し、これを採取して、ＭＣＢとして１ｍｌ当たり１００万細胞〜３００万細胞を凍結する。表２はＰ０でのＭＳＣの単離の詳細を示す。
【００５３】
【表２】
0006053853.tif 000003
【００５４】
実施例５：継代（Ｐ１）−ＭＣＢ
複数の１セルスタック又は２セルスタックが、この段階での増殖に最適であることが分かる。複数の１セルスタック又は２セルスタックの使用は、５〜１０セルスタックに対して収率の点でより有益であり、セルスタックは、インキュベーション中に細胞のコンフルエンシーをモニタリングするために顕微鏡（microscope）下で観察するものとする。６６６６細胞／ｃｍ２の播種密度が最適であることが分かる。インキュベーション期間は、３７℃及び５％ＣＯ２で播種日から約６日〜９日である。個々のドナー細胞は、一様な細胞数のＰ１を得るために同じ方法でプロセシングし、１本のバイアルにつき１００万細胞で凍結し、約１８０℃〜１９６℃で貯蔵するものとする。上記の凍結したＰ１−ＭＣＢバイ
アルをＱＣ試験のために無作為に選択する。融解したＭＣＢは８５％超の生存性を有するものとし、この細胞の８０％超がＭＳＣ表面マーカー（純度の指標）に陽性であり、５％未満が陰性マーカーに陽性であるものとする。表３は継代１（Ｐ１）の概要を示す。
【００５５】
【表３】
0006053853.tif 000004
【００５６】
実施例６：継代（Ｐ２）
レシピエントからの拒絶を低減するのに必要とされる均質な生成物を得るために、個々のドナー細胞を混合することが必要である。この趣旨で、３人のドナーのＰ１バイアルを均等に混合し、１セルスタック又は２セルスタックに、ｂＦＧＦ強化完全培地中１０００細胞／ｃｍ２の播種密度でプレーティングする。培地交換を７日目〜８日目に行い、インキュベーション期間は３７℃及び５％ＣＯ２で播種日から１４日〜１８日である。融解したＭＣＢは８５％超の生存性を有するものとし、この細胞の８０％超がＭＳＣ表面マーカー（純度の指標）に陽性であり、５％未満が陰性マーカーに陽性であるものとする。
【００５７】
実施例７：継代（Ｐ３）
上記の活性細胞を、１０セルスタック及び対照として２セルスタック内で、ｂＦＧＦ強化完全培地中１０００細胞／ｃｍ２の播種密度で更に１回（at 1）継代培養する。培地交換を７日目〜８日目に行い、インキュベーション期間は３７℃及び５％ＣＯ２で播種日から１４日〜１８日である。Ｐ３は、それから得られるバイアルの数以外は、あらゆる面でＰ２のレプリカである。Ｐ２に適用可能なパラメータは全てＰ３にも適用可能である。これは、複数のバイアルに、各バイアルにつき１００万細胞〜３００万細胞で凍結するものとする。これらをＷＣＢ−Ｐ３細胞として使用する。
【００５８】
実施例８：継代（Ｐ４）−播種
ＷＣＢの２本又は３本のバイアルを取り、大規模ＩＭＰ調製のための種調製物（seed preparation）として、複数の１セルスタック又は２セルスタックにプレーティングする。これらの細胞はＰ３と同じ方法で播種及び採取する。
【００５９】
実施例９：継代（Ｐ５）−ＩＭＰ調製
上記の活性細胞を、複数の１０セルスタック及び対照として２セルスタック内で、ｂＦＧＦ強化完全培地中１０００細胞／ｃｍ２の播種密度で更に１回継代培養する。培地交換を７日目〜８日目に行い、インキュベーション期間は３７℃及び５％ＣＯ２で播種日から１４日〜１８日である。採取した細胞を、複数のクライオバッグ（各々２５００万細胞〜２億細胞）内に調合培地（formulation media）中で凍結する。融解したＭＣＢは８５％超の生存性を有するものとし、この細胞の８０％超がＭＳＣ表面マーカー（純度の指標）に陽性であり、５％未満が陰性マーカーに陽性であるものとする。これを治療用組成物／治験薬（ＩＰ）／治験用医薬品（ＩＭＰ）として臨床用途に使用する。下記表４はＩＰを得ることに関する種々の段階を示すものである。
【００６０】
【表４】
0006053853.tif 000005
【００６１】
実施例１０：特性研究
本開示の同種ＭＳＣは、複数のドナーに由来する成人ヒト間葉系幹細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ培養物である。これは、細胞表面表現型等の特異的な細胞マーカーを特徴とする間葉系幹細胞の均質集団からなる。本開示の間葉系幹細胞を、ＣＤ  １４、ＣＤ  １９、ＣＤ  ３４、ＣＤ  ４５、ＣＤ  ７３、ＣＤ  ９０、ＣＤ  １０５、ＣＤ  １３３、ＣＤ  １６６及びＨＬＡ−ＤＲマーカーを用いたフローサイトメトリーによって分析する。本開示の組成物のＭＳＣは、８０％超がＣＤ  ７３、ＣＤ  ９０、ＣＤ  １０５及びＣＤ  １６６に陽性であるが、１０％未満がＣＤ  １４、ＣＤ  １９、ＣＤ  ３４、ＣＤ  ４５、ＣＤ
１３３及びＨＬＡ−ＤＲに陽性である。下記表５は、本出願に開示の方法によって得られる継代５のＩＭＰの種々のバッチについてのフローサイトメトリーを用いたＣＤマーカーの比較を示すものである。
【００６２】
【表５】
0006053853.tif 000006
【００６３】
本開示の一実施形態では、キットは本開示の組成物、マスターセルバンク組成物又はワーキングセルバンク組成物、及び該組成物を調製するための取扱説明書を含む。組成物は間葉系幹細胞、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ  Ａ及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を、任意で薬学的に許容可能な添加剤とともに含む。さらに、マスターセルバンク組成物又はワーキングセルバンク組成物は、間葉系幹細胞、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む。
【図１】
0006053853.tif 000007
【図２】
0006053853.tif 000008
【図３】
0006053853.tif 000009
【図４】
0006053853.tif 000010