(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＡＨ１２遺伝子が導入された酵母の形質転換体を、３５℃以上４０℃未満で、培養液のＯＤ６００が０．５〜５．５になるまで培養する高温培養工程と、
前記高温培養工程後、前記形質転換体を３５℃未満で培養する低温培養工程と、
を有することを特徴とするリシノール酸産生酵母の培養方法。
【請求項２】
前記低温培養工程における前記形質転換体の培養温度が、１０〜３３℃である請求項１に記載のリシノール酸産生酵母の培養方法。
【請求項３】
前記酵母がシゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）属酵母である請求項１または２に記載のリシノール酸産生酵母の培養方法。
【請求項４】
前記ＦＡＨ１２遺伝子が、トウゴマ（Ricinus communis）、レスクェレラ・フェンドレリ（Lesquerella fendleri）または麦角菌（Claviceps purpurea）由来である請求項１〜３のいずれか一項に記載のリシノール酸産生酵母の培養方法。
【請求項５】
ＦＡＨ１２遺伝子が導入された酵母の形質転換体を請求項１〜４のいずれか一項に記載のリシノール酸産生酵母の培養方法により培養した後、得られた形質転換体からリシノール酸を取得することを特徴とするリシノール酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母によりリシノール酸を産生させる方法に関する。より詳細には、ＦＡＨ１２遺伝子が導入された酵母の形質転換体を培養することにより、該形質転換体にリシノール酸を産生させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、ウレタン製品等の化成品の原料は、専ら石油資源に頼っている。地球温暖化対策により、石油資源に代わる代替材料が模索されており、リシノール酸が注目されている。リシノール酸は、トウゴマ（Ricinus communis）を絞ったひまし油の８０〜９０％を占めており、ひまし油から精製したものが使用されている。しかし、トウゴマにはリシンという猛毒の蛋白質が含まれており、取り扱いに注意を要する上、植物資源であるため、安定供給には不安がある。そこで、ひまし油以外からリシノール酸を安全かつ安定して製造する方法の開発が望まれている。
【０００３】
リシノール酸は、鎖長が炭素数１８であり、不飽和結合が１つと１２位に水酸基を持つ脂肪酸であり、Δ１２−ヒドロキシラーゼにより、オレイン酸の１２位に水酸基を導入することによって生産できる。野生型の酵母はΔ１２−ヒドロキシラーゼを有していないため、リシノール酸を産生することはできない。そこで、本発明者らは、分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe、以下、Ｓ．ポンベ）が、脂肪酸組成としてオレイン酸の含有量が８割程度と高いことに着目して、Ｓ．ポンベに異種生物由来のΔ１２−ヒドロキシラーゼ遺伝子を導入し、リシノール酸の生産を試みた。この結果、Ｓ．ポンベの形質転換体においてリシノール酸が生産されることが確認されたが、リシノール酸の生産量が多くなるほど宿主の増殖が遅くなることも分かった（非特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】石川大輔、他８名、日本分子生物学会年会講演要旨集、２００９年、第３２巻、第２号、第７０ページ。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで本発明の目的は、リシノール酸産生酵母を、増殖性とリシノール産生性のバランスをとりながら効率よく培養する方法、およびリシノール酸の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者等は、前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ＦＡＨ１２(Fatty acid hydroxylase）遺伝子が導入された酵母の形質転換体を、比較的高温で培養することにより、増殖阻害を抑制し得ること、また、高温培養により充分に培養させた後、温度シフトし、より低温で培養することによって、該形質転換体内のリシノール酸含有量を高められることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
本発明のリシノール酸産生酵母の培養方法、およびリシノール酸の製造方法は下記［１］〜［５］である。
［１］ＦＡＨ１２遺伝子が導入された酵母の形質転換体を、３５℃以上４０℃未満で、培養液のＯＤ６００が０．５〜５．５になるまで培養する高温培養工程と、
前記高温培養工程後、前記形質転換体を３５℃未満で培養する低温培養工程と、
を有することを特徴とするリシノール酸産生酵母の培養方法。
［２］前記低温培養工程における前記形質転換体の培養温度が、１０〜３３℃である前記［１］のリシノール酸産生酵母の培養方法。
［３］前記酵母がシゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）属酵母である前記［１］または［２］のリシノール酸産生酵母の培養方法。
［４］前記ＦＡＨ１２遺伝子が、トウゴマ（Ricinus communis）、レスクェレラ・フェンドレリ（Lesquerella fendleri）または麦角菌（Claviceps purpurea）由来である前記［１］〜［３］のいずれかのリシノール酸産生酵母の培養方法。
［５］ＦＡＨ１２遺伝子が導入された酵母の形質転換体を前記［１］〜［４］のいずれかのリシノール酸産生酵母の培養方法により培養した後、得られた形質転換体から、リシノール酸を取得することを特徴とするリシノール酸の製造方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のリシノール酸産生酵母の培養方法により、リシノール酸産生酵母を、増殖性とリシノール酸生産性のバランスをとりながら効率よく培養できる。
また、該形質転換体を用いた本発明のリシノール酸の製造方法により、産生されたリシノール酸を簡便に取得できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ｐＳＬ１０−ＣｐＦＡＨ１２およびｐＳＬ１０−ＬｆＦＡＨ１２のベクターの構築手順を模式的に示した図である。
【図２】ｐＲＥＰ１−ＲｃＦＡＨ１２、ｐＲＥＰ１−ＬｆＦＡＨ１２、およびｐＲＥＰ１−ＣｐＦＡＨ１２のベクターの構築手順を模式的に示した図である。
【図３】ＹＥｐ３５２−ＣｐＦＡＨ１２のベクターの構築手順を模式的に示した図である。
【図４】参考例１において、Ｓ．ポンベおよびＳ．セレビシエの脂肪酸含有量を測定した結果を示した図である。
【図５】参考例３において、ｐＲＥＰ１−ＬｆＦＡＨ１２を導入したＳ．ポンベの形質転換体のガスクロマトグラフ分析の結果のチャート図である。
【図６】実施例１において、各形質転換体をスポットしたプレートをインキュベートした後の各プレートの写真図である。
【図７】実施例２において、各形質転換体を、３０℃または３７℃で培養した場合の増殖曲線を示した図である。
【図８】実施例３における各培養条件のスキーム図である。
【図９】実施例３において、各培養条件における培養液のＯＤ６００、培養液１ｍＬ当たりの乾燥菌体重量、および培養液１ｍＬ当たりの各種脂肪酸の含有量を測定した結果を示した図である。
【図１０】実施例３において、脂肪酸組成の経時変化を示した図である。
【図１１】実施例４における各培養条件のスキーム図である。
【図１２】実施例４において、各培養条件における培養液のＯＤ６００、培養液１ｍＬ当たりの乾燥菌体重量、および培養液１ｍＬ当たりの各種脂肪酸の含有量を測定した結果を示した図である。
【図１３】実施例５における各培養条件のスキーム図である。
【図１４】実施例５において、各培養液の温度シフト時点および培養終了時点の培養液のＯＤ６００、培養終了時点の培養液１ｍＬ当たりの乾燥菌体重量、並びに培養終了時点の培養液１ｍＬ当たりの各種脂肪酸の含有量を測定した結果を示した図である。
【図１５】実施例６における各培養条件のスキーム図である。
【図１６】実施例６において、各培養液の培養終了時点の培養液のＯＤ６００、および培養終了時点の培養液１ｍＬ当たりの各種脂肪酸の含有量を測定した結果を示した図である。
【図１７】実施例７において、各株のガスクロマトグラフ分析の結果のチャート図である。
【図１８】実施例７において、各株の培養液１ｍＬ当たりの各種脂肪酸の、総脂肪酸含有量に対する含有割合（％）の結果を示した図である。
【図１９】実施例８において、各形質転換体をスポットしたプレートをインキュベートした後の各プレートの写真図である。
【図２０】実施例９において、各株の培養液１ｍＬ当たりの各種脂肪酸の総脂肪酸含有量に対する含有比率の結果を示した図である。
【図２１】参考例４において、各形質転換体を、２０℃または３０℃で培養した場合の増殖曲線を示した図である。
【図２２】実施例１０において、各株の脂肪酸組成の結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
［ＦＡＨ１２遺伝子が導入された酵母の形質転換体（リシノール酸産生酵母）］
本発明におけるリシノール酸産生酵母は、ＦＡＨ１２遺伝子が導入された酵母の形質転換体である。酵母に導入するＦＡＨ１２遺伝子は、オレイン酸の１２位の炭素原子に水酸基を導入し得るΔ１２−ヒドロキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子であれば、特に限定されず、微生物由来であってもよく、植物由来であってもよい。具体的には、例えば、トウゴマのＦＡＨ１２（ＲｃＦＡＨ１２）（GenBank ID.No.： AAC49010.1）をコードする遺伝子（ＲｃＦＡＨ１２遺伝子）、レスクェレラ・フェンドレリのＦＡＨ１２（ＬｆＦＡＨ１２）（GenBank ID.No.： AAC32755.1）をコードする遺伝子（ＬｆＦＡＨ１２遺伝子）、麦角菌のＦＡＨ１２（ＣｐＦＡＨ１２）（GenBank ID.No.： ACF37070.1）をコードする遺伝子（ＣｐＦＡＨ１２遺伝子）、フィサリア・リンドヘイメリ（Physaria lindheimeri）のｏｌｅａｔｅ  １２−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ（GenBank ID.No.：ABQ01458.1）をコードする遺伝子、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）のｕｎｎａｍｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔ（GenBank ID.No.：CAK37451.1）をコードする遺伝子、が挙げられる。なお、GenBankはＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）のデータベースである。本発明では、ＲｃＦＡＨ１２遺伝子、ＬｆＦＡＨ１２遺伝子またはＣｐＦＡＨ１２遺伝子が好ましく、Δ１２−ヒドロキシラーゼ活性がより高いため、ＣｐＦＡＨ１２遺伝子がより好ましい。
【００１１】
（酵母）
ＦＡＨ１２遺伝子が導入される宿主は、酵母であれば特に限定されず、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae、以下、Ｓ．セレビシエ)をはじめとするサッカロミセス（Saccharomyces）属酵母、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）属酵母、クリュイベロミセス（Kluyveromyces）属酵母、ピキア（Pichia）属酵母、カンジダ（Candida）属酵母が挙げられる。中でも、オレイン酸含有量が高いことから、シゾサッカロミセス属酵母であることが好ましい。シゾサッカロミセス属酵母としては、たとえば、Ｓ．ポンベ、シゾサッカロミセス・ジャポニカス（Schizosaccharomyces japonicus）、シゾサッカロミセス・オクトスポラス（Schizosaccharomyces octosporus）が挙げられ、Ｓ．ポンベが好ましい。
【００１２】
また、宿主とする酵母は、野生型であってもよく、用途に応じて特定の遺伝子を欠失または失活させた変異型であってもよい。特定の遺伝子を欠失または失活させる方法としては、公知の方法を用いられる。具体的には、Latour法（Nucleic  Acids  Research誌、第34巻、e11ページ、2006年；国際公開第２００７／０６３９１９号パンフレット等に記載）を用いることにより遺伝子を欠失させられる。また、変異剤を用いた突然変異分離法（酵母分子遺伝学実験法、１９９６年、学会出版センター）や、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を利用したランダム変異法（PCR  Methods  Application誌、第2巻、28-33ページ、1992年）等により遺伝子の一部に変異を導入することにより該遺伝子を失活させられる。特定遺伝子を欠失または失活させたシゾサッカロミセス属酵母宿主としては、たとえば、国際公開第２００２／１０１０３８号、国際公開第２００７／０１５４７０号等に記載されている。
また、特定の遺伝子の削除または不活性化を行う部分はＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）部分であってもよく、発現調節配列部分であってもよい。特に好ましい方法は、構造遺伝子のＯＲＦ部分をマーカー遺伝子に置換するＰＣＲ媒介相同組換え法（Yeast誌、第14巻、943-951ページ、1998年）による削除または不活性化の方法である。
【００１３】
さらに宿主となる酵母には、形質転換体を選択するためのマーカーを有するものを用いることが好ましい。たとえば、ある遺伝子が欠落していることにより特定の栄養成分が生育に必須である宿主を使用することが好ましい。目的遺伝子配列を含むベクターにより形質転換をして形質転換体を作製する場合、ベクターにこの欠落している遺伝子（栄養要求性相補マーカー）を組み込んでおくことにより、形質転換体は宿主の栄養要求性が消失する。この宿主と形質転換体の栄養要求性の相違により、両者を区別して形質転換体を得られる。
たとえば、オロチジン５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｕｒａ４遺伝子）が欠失または失活してウラシル要求性となっている酵母を宿主とし、ｕｒａ４遺伝子（栄養要求性相補マーカー）を有するベクターにより形質転換した後、ウラシル要求性が消失したものを選択することにより、ベクターが組み込まれた形質転換体を得られる。宿主において欠落により栄養要求性となる遺伝子は、形質転換体の選択に用いられるものであればｕｒａ４遺伝子には限定されず、イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｅｕ１遺伝子）等であってもよい。
【００１４】
（発現カセット）
本発明におけるリシノール酸産生酵母は、ＦＡＨ１２遺伝子をコードする領域を含む構造遺伝子配列（ＦＡＨ１２遺伝子配列）、並びに該遺伝子を発現させるためのプロモーター配列およびターミネーター配列を含む発現カセットを、酵母に導入することにより作製できる。ＦＡＨ１２遺伝子配列としては、麦角菌等由来のＦＡＨ１２をコードする遺伝子をそのまま用いてもよいが、宿主として用いる酵母内での発現量を増大させるために、前記遺伝子配列を、宿主での高発現遺伝子において使用頻度の高いコドンに改変することが好ましい。
【００１５】
発現カセットとは、蛋白質を発現するために必要なＤＮＡの組み合わせであり、該蛋白質をコードする構造遺伝子と宿主である酵母内で機能するプロモーターとターミネーターとを含む。
前記発現カセットには、さらに、５’−非翻訳領域、３’−非翻訳領域のいずれか１つ以上が含まれていてもよい。好ましい発現カセットは、ＦＡＨ１２遺伝子配列、プロモーター、ターミネーター、５’−非翻訳領域、３’−非翻訳領域を全て含む発現カセットである。さらに、栄養要求性相補マーカー等の遺伝子を有していてもよい。
【００１６】
プロモーターとターミネーターは、宿主である酵母内で機能してＦＡＨ１２を発現できるものであればよい。酵母内で機能するプロモーターとしては、酵母が本来有するプロモーター（転写開始活性が高いものが好ましい）や酵母が本来有しないプロモーター（ウイルス由来のプロモーターなど）を使用できる。プロモーターはベクター内に２種以上存在していてもよい。
シゾサッカロミセス属酵母が本来有するプロモーターとしては、たとえば、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター、チアミンの代謝に関与するｎｍｔ１遺伝子プロモーター、グルコースの代謝に関与するフルクトース−１、６−ビスホスファターゼ遺伝子プロモーター、カタボライト抑制に関与するインベルターゼ遺伝子のプロモーター（国際公開第９９／２３２２３号参照）、熱ショック蛋白質遺伝子プロモーター（国際公開第２００７／２６６１７号参照）などが挙げられる。
シゾサッカロミセス属酵母が本来有しないプロモーターとしては、たとえば、特開平５−１５３８０号公報、特開平７−１６３３７３号公報、特開平１０−２３４３７５号公報に記載されている動物細胞ウイルス由来のプロモーターが挙げられ、ｈＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーターが好ましい。
シゾサッカロミセス属酵母内で機能するターミネーターとしては、シゾサッカロミセス属酵母が本来有するターミネーターやシゾサッカロミセス属酵母が本来有しないターミネーターを使用できる。ターミネーターはベクター内に２種以上存在していてもよい。
ターミネーターとしては、たとえば、特開平５−１５３８０号公報、特開平７−１６３３７３号公報、特開平１０−２３４３７５号公報に記載されているヒト由来のターミネーターが挙げられ、ヒトリポコルチンＩのターミネーターが好ましい。
【００１７】
（ベクター）
本発明におけるリシノール酸産生酵母は、具体的には、前記発現カセットを含むベクターにより宿主である酵母を形質転換することにより得られる。形質転換に用いるベクターは、環状ＤＮＡ構造または線状ＤＮＡ構造を有するベクターに、該発現カセットを組み込むことにより製造できる。該発現カセットが、宿主の細胞内で染色体外遺伝子として保持される形質転換体を作製する場合には、該ベクターは、宿主細胞内で複製されるための配列、即ち、自律複製配列（Autonomously Replicating Sequence: ARS）を含むプラスミドであることが好ましい。一方で、該発現カセットが、宿主細胞の染色体中に組み込まれた形質転換体を作製する場合には、該ベクターは、線状ＤＮＡ構造であり、かつＡＲＳを有していないものとして、宿主細胞へ導入されることが好ましい。たとえば、該ベクターは、線状ＤＮＡからなるベクターであってもよく、宿主への導入時に、線状ＤＮＡに切り開くための制限酵素部位を備える環状ＤＮＡ構造のベクターであってもよい。該ベクターがＡＲＳを有するプラスミドの場合、ＡＲＳ部分を削除して線状ＤＮＡ構造、またはＡＲＳ部分を開裂させることによりＡＲＳの機能を失活させた線状ＤＮＡ構造とした後、宿主へ導入できる。
【００１８】
該ベクターは、形質転換体を選択するためのマーカーを有することが好ましい。該マーカーとしては、たとえば、ｕｒａ４遺伝子（栄養要求性相補マーカー）、イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｅｕ１遺伝子）が挙げられる。
【００１９】
リシノール酸産生酵母の製造に用いられる前記発現カセットを含むベクターは、たとえば、外来構造遺伝子を導入するためのクローニングサイトを備える公知の発現ベクター中の該クローニングサイトに、ＦＡＨ１２遺伝子配列を挿入することによって製造できる。また、公知の発現ベクターに、ＦＡＨ１２遺伝子配列を含む発現カセットを組み込むことによっても製造できる。
【００２０】
（形質転換体の製造方法）
本発明におけるリシノール酸産生酵母は、前記発現カセットを、染色体中に有するか、または、染色体外遺伝子として有する. 発現カセットを染色体中に有するとは、宿主細胞の染色体中の１カ所以上に発現カセットが組み込まれていることであり、染色体外遺伝子として有するとは、発現カセットを含むプラスミドを細胞内に有するということである。形質転換体の継代培養が容易であることから、該発現カセットを染色体中に有することが好ましい。
【００２１】
形質転換方法は、公知の形質転換方法をいずれも用いられる。該形質転換方法としては、たとえば、酢酸リチウム法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、ガラスビーズ法など従来周知の方法や、特開２００５−１９８６１２号公報記載の方法が挙げられる。また、市販の酵母形質転換用キットを用いてもよい。
【００２２】
形質転換を行った後、通常は得られた形質転換体を選抜する。選抜方法としては、たとえば、以下に示す方法が挙げられる。前記栄養要求性マーカーにより形質転換体を選択できる培地によりスクリーニングし、得られたコロニーから複数を選択する。選抜した形質転換体に対してパルスフィールドゲル電気泳動法によるゲノム解析を行うことにより、染色体に組み込まれたベクターの数や発現カセットの数を調べられる。
【００２３】
［リシノール酸産生酵母の培養方法］
酵母にＦＡＨ１２を発現させた場合、通常の培養温度（３０℃程度）では増殖阻害がかかるが、比較的高温で培養した場合には増殖阻害がかからない。高温条件下では、ＦＡＨ１２の発現が抑制されるか、または発現したＦＡＨ１２のΔ１２−ヒドロキシラーゼ活性が失活若しくは低下するためと推察される。本発明では、リシノール酸産生酵母をまず高温で培養した後、培養温度を低温にシフトさせることによって、該酵母内でリシノールを産生させる。はじめに高温で培養することにより、温度シフト後にもＦＡＨ１２による増殖阻害の影響を抑制しつつ、ＦＡＨ１２によるリシノール酸産生を促進し得る。
すなわち、本発明のリシノール酸産生酵母の培養方法は、ＦＡＨ１２遺伝子が導入された酵母の形質転換体を、３５℃以上４０℃未満で、培養液のＯＤ６００が０．５〜５．５になるまで培養する高温培養工程と、前記高温培養工程後、前記形質転換体を３５℃未満で培養する低温培養工程とを有することを特徴とする。
【００２４】
酵母の培養温度があまりに高い場合には、温度ストレスにより増殖がかえって低下する。リシノール酸産生酵母を３５℃以上４０℃未満で培養することにより、過度の高温ストレスを受けることなく、ＦＡＨ１２による増殖阻害作用を充分に抑制し得る。高温培養工程における培養温度は、３５〜３９℃が好ましく、３５〜３８℃がより好ましい。
【００２５】
低温培養工程における培養温度を、高温培養工程よりも低い温度、すなわち３５℃未満にすることで、増殖阻害作用が抑制されつつ、ＦＡＨ１２によるリシノール酸産生が促進される。但し、酵母の培養温度があまりに低い場合には、温度ストレスにより増殖がかえって低下する。そこで、低温培養工程における培養温度は、１０〜３３℃が好ましく、１５〜３３℃がより好ましく、２０〜３０℃がさらに好ましい。
【００２６】
低温培養工程移行後にも、リシノール酸産生酵母が充分に増殖でき、培養液当たりのリシノール酸産生量を改善し得るため、酵母の増殖がある程度盛んな状態、特に対数増殖期にある段階で、高温培養工程から低温培養工程へ移行することが好ましい。このため、本発明においては、形質転換体の培養液のＯＤ６００が５．５以下の時点で、好ましくは５以下の時点で、より好ましくは４，４以下の時点で、高温培養工程から低温培養工程へ移行する。また、高温培養工程から低温培養工程へ移行する時点における形質転換体の培養液のＯＤ６００は、０．５以上であり、０．５５以上であることがより好ましく、１．４以上であることがさらに好ましい。特に、リシノール酸産生酵母を、３５℃以上４０℃未満で、培養液のＯＤ６００が１．４〜４．４になるまで培養した後、当該培養液の温度を低温にシフトさせてさらに培養を続けることにより、より大量のリシノール酸を産生できる。培養液及びその希釈液のＯＤ６００は、例えば、分光光度計を使用して常法により測定できる。
【００２７】
本発明のリシノール酸産生酵母の培養方法では、高温培養工程および低温培養工程のいずれでも、リシノール酸産生酵母は、培養温度以外は一般的な酵母の培養方法と同様にして培養できる。たとえば、培養液には、宿主とした酵母の培養に用いられる公知の培養培地を用いることができ、宿主が資化しうる炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、宿主の培養を効率良く行えるものであればよい。培養液としては、天然培地を用いてもよく、合成培地を用いてもよい。
【００２８】
炭素源としては、たとえばグルコース、フルクトース、スクロース等の糖が挙げられる。
窒素源としては、たとえばアンモニア、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機酸または無機酸のアンモニウム塩、ペプトン、カザミノ酸が挙げられる。
無機塩類としては、たとえばリン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウムが挙げられる。
【００２９】
培養には公知の細胞培養方法を用いることができ、たとえば振盪培養、攪拌培養等により行える。
培養は、回分培養であってもよく、連続培養であってもよい。また、培養時間は適宜決定できる。
【００３０】
［リシノール酸の製造方法］
本発明のリシノール酸の製造方法は、本発明のリシノール酸産生酵母の培養方法により培養されたＦＡＨ１２遺伝子が導入された酵母の形質転換体から、リシノール酸を取得することを特徴とする。
培養されたリシノール酸産生酵母からのリシノール酸の抽出・精製は、溶剤抽出法等の一般的に脂肪酸の抽出・精製に使用される公知の手法により実施できる。例えば、リシノール酸産生酵母を培養した後、得られた培養液を遠心分離して菌体を回収し、該菌体をメタノール中でグラスビーズ等を用いて破砕しながら、クロロホルム／メタノール（１：２）を加えて抽出し、その後精製することにより、リシノール酸を精製できる。
また、リシノール酸は、ガスクロマトグラフィ法等の公知の手法で検出および定量できる。
【実施例】
【００３１】
以下、実施例等を示して本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は以下の記載によっては限定されない。
なお、以下の実施例等において、酵母の培養液および該希釈液のＯＤ値は、分光光度計ＵＶ１６００（島津製作所製）を用いて測定した。
【００３２】
［酵母］
以下の実施例等において、Ｓ．ポンベは、ロイシンおよびウラシル要求株ＡＲＣ０１０（遺伝子型：ｈ− 、ｌｅｕ１−３２、ｕｒａ４−Ｄ１８）（国際公開第２００７／０１５４７０号パンフレット参照。）を用いた。また、Ｓ．セレビシエは、ＢＹ４７４１（遺伝子型：ＭＡＴａ  ｈｉｓ３Δ１  ｌｅｕ２Δ０  ｍｅｔ１５Δ０  ｕｒａ３Δ０）を用いた。
Ｓ．ポンベは、プラスミドを維持するために必要な選択圧に依存して、ＥＭＭＳまたはＥＭＭＳドロップアウト培地中で培養した（Alfa et al., 1993 ,“A laboratory course manual.”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.）。ＥＭＭＳは通常の培養時に使用され、窒素が制限された最小培地（ＥＭＭ−Ｃ／Ｎ３）がリシノール酸産生には使用された。発明者らによる従前の実験結果から、ＥＭＭ−Ｃ／Ｎ３中で培養したほうが脂肪酸含有量が高くなることが示唆されていたためである。ＥＭＭ培地は、０．５％（ｗ／ｖ）の塩化アンモニウム、２％（ｗ／ｖ）のグルコースを含有していた。一方、ＥＭＭ−Ｃ／Ｎ３は、塩化アンモニウムの濃度は０．１％にまで低減されており、グルコース濃度が１０％にまで増大していた。ｎｍｔ１プロモーターの下、遺伝子発現を抑制するために、１５μＭ（５μｇ／ｍＬ）のチアミンを使用した。
Ｓ．セレビシエは、プラスミドを維持するために必要な選択圧に依存して、最小合成培地（ＳＤ）、合成完全培地（ＳＣ）または合成完全ドロップアウト培地中で培養した（Sherman, et.al., 1986, “Methods in yeast genetics. ”,  Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.）。最小合成培地またはＳＣは、０．１７％（ｗ／ｖ）のアミノ酸およびアンモニウム塩不含有イーストニトロジェンベース（Bactoyeast nitrogen base、Ｄｉｆｃｏ社製）、２％（ｗ／ｖ）のグルコース、および０．５％（ｗ／ｖ）の硫酸アンモニウムを含有していた。窒素が制限された最小培地（ＮＳＤ）では、硫酸アンモニウム含有量が０．１％にまで低減されており、グルコース濃度が１０％にまで増大していた(Yazawa, et.al., 2007,“Heterologous production of dihomo-gamma-linolenic acid in yeast Saccharomyces cerevisiae.”, Appl Env Microbiol, vol.73, pp.6965-6971)。
【００３３】
［プラスミド構築］
ＲｃＦＡＨ１２遺伝子、ＬｆＦＡＨ１２遺伝子、およびＣｐＦＡＨ１２遺伝子のコード領域を含む酵母の形質転換用プラスミドを構築した。ＤＮＡ操作の標準的な技術は、SambrookおよびRussellの方法（“Molecular cloning: A laboratory manual.  3rd ed.”, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.）に準じて行った。また、プラスミド構築は、大腸菌ＤＨ５α（Ｆ−ｅｎｄＡ１、ｈｓｄＲ１７、ｓｕｐＥ４４、ｔｈｉ−１、ｒｅｃＡ１、ｇｙｒＡ９６、ｒｅｌＡ１、Δ（ａｒｇＦ−ｌａｃＺ）Ｕ１６９、Φ８０、Δ（ｌａｃＺ）Ｍ１５）株を用いて行った。当該ＤＨ５α株は、アンピシリンまたはカナマイシンを添加したＬＢ培地（Luria-Bertani broth）中で培養した。
【００３４】
ＣｐＦＡＨ１２遺伝子のＤＮＡ配列（Meesapyodsuk and Qiu, 2008, Plant Physiology, vol.147, pp.1325−1333）は、Ｓ．ポンベにおいて好ましい使用頻度のコドンに改変した後、ＧＥＮＥＡＲＴ社（Regensburg, Germany）に依頼して化学合成した。合成されたＣｐＦＡＨ１２のＯＲＦは、５’末端と３’末端にそれぞれ人工的に付加されていた制限酵素部位を使用して、大腸菌のプラスミドｐＭＫ−ＣｐＦＡＨ１２から、制限酵素NcoIおよびSalIで二重消化したフラグメントとして切り出し、ｐＬ２４２８−９（略してｐＳＬ１０−ＣｐＦＡＨ１２）を構築するために、マルチクローニングサイトの制限酵素AarIおよびSalIで二重消化したプラスミドｐＳＬ１０に組み込んだ。合成されたプラスミドをｐＳＬ１０−ＣｐＦＡＨ１２とした。ｐＳＬ１０は、ｌｅｕ１マーカーを有する、染色体へ組み込まれるタイプのプラスミドであり、ｐＳＬ６プラスミド（Alimjan et al., Appl Microbiol Biotechnol, 2010, vol.85, pp.667−677）のｈＣＭＶプロモーター（ｈＣＭＶ−ｐ）をｎｍｔ１プロモーターに置換し、ＬＰＩターミネーター（ＬＰＩ−ｔｅｒ．）をｉｎｖ１ターミネーターに置換したプラスミドである。ｐＳＬ１０の塩基配列を配列番号１に示す。Ｓ．ポンベにｐＳＬ１０−ＣｐＦＡＨ１２を導入した形質転換体中では、チアミン非存在時には、ｎｍｔ１プロモーターの制御下でＣｐＦＡＨ１２が発現したが、チアミン存在時には発現は抑制された。
ｐＳＬ１０−ＣｐＦＡＨ１２（ｐＬ２４２８−９）と同様にして、ＬｆＦＡＨ１２遺伝子のＯＲＦを組み込んだｐＬ２４２７−８ (略してｐＳＬ１０−ＬｆＦＡＨ１２)を構築した。
図１に、ｐＳＬ１０−ＣｐＦＡＨ１２およびｐＳＬ１０−ＬｆＦＡＨ１２のベクターの構築手順を模式的に示した。なお、同様な手法によりｐＳＬ１０−ＲｃＦＡＨ１２も作製できる。
【００３５】
また、ｐＭＫ−ＣｐＦＡＨ１２から、制限酵素HindIIIおよびPvuIIで二重消化したフラグメントとしてＣｐＦＡＨ１２を切り出し、マルチクローニングサイトの制限酵素NdeIで消化したプラスミドｐＲＥＰ１に組み込んだ。合成されたプラスミドをｐＬ２４１４−１（略してｐＲＥＰ１−ＣｐＦＡＨ１２）とした。ｐＲＥＰ１は、Ｓ．セレビシエのＬＥＵ２マーカーを有する染色体外に存在するタイプのプラスミドである。Ｓ．ポンベにｐＲＥＰ１−ＣｐＦＡＨ１２を導入した形質転換体中では、チアミン非存在時には、ｎｍｔ１プロモーターの制御下でＣｐＦＡＨ１２が発現したが、チアミン存在時には発現は抑制された。
ｐＬ２３９０−１（略してｐＲＥＰ１−ＲｃＦＡＨ１２）は、ｐＧＡ４−ＲｃＦＡＨ１２Ｈ６を制限酵素NcoIおよびEcl136IIで二重消化したフラグメントとしてＲｃＦＡＨ１２を切り出し、マルチクローニングサイトの制限酵素NdeIで消化したプラスミドｐＲＥＰ１に組み込んだ。ｐＬ２３９１−６３（略してｐＲＥＰ１−ＬｆＦＡＨ１２）は、ｐＭＡ−ＬｆＦＡＨ１２を制限酵素SmaIおよびPvuIIで二重消化したフラグメントとしてＬｆＦＡＨ１２を切り出し、マルチクローニングサイトの制限酵素NdeIで消化したプラスミドｐＲＥＰ１に組み込んだ。
図２に、ｐＲＥＰ１−ＲｃＦＡＨ１２、ｐＲＥＰ１−ＬｆＦＡＨ１２、およびｐＲＥＰ１−ＣｐＦＡＨ１２のベクターの構築手順を模式的に示した。
【００３６】
また、ｐＭＫ−ＣｐＦＡＨ１２から、制限酵素EcoRIおよびXhoIで二重消化したフラグメントとしてＣｐＦＡＨ１２を切り出し、ｐＬ２３７９−２を構築するために、マルチクローニングサイトの制限酵素EcoRIおよびXhoIで二重消化したプラスミドＹＥｐ３５２ＧＡＰに組み込んだ。Ｓ．セレビシエにｐＬ２３７９−２（略してＹＥｐ３５２−ＣｐＦＡＨ１２）を導入した形質転換体中では、解糖系のＧＡＰＤＨプロモーターの制御下でＣｐＦＡＨ１２が発現した。
図３に、ＹＥｐ３５２−ＣｐＦＡＨ１２のベクターの構築手順を模式的に示した。なお、同様な手法によりＹＥｐ３５２−ＲｃＦＡＨ１２も作製できる。
【００３７】
［形質転換体の作製］
酵母細胞は、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＩＩ ｋｉｔ (Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ, ＣＡ， ＵＳＡ)を用いて、製造者により推奨されるプロトコールに従って形質転換した。
たとえば、ＣｐＦＡＨ１２遺伝子を染色体中に組み込む形で導入したＳ．ポンベの形質転換体の作製は、以下のようにして行った。すなわち、酵母の第２染色体のｌｅｕ１座にｐＳＬ１０−ＣｐＦＡＨ１２を組み込むため、ｐＳＬ１０−ＣｐＦＡＨ１２は制限酵素BsiWIによって消化し、得られた線状プラスミドをＳ．ポンベＡＲＣ０１０−１株に導入し、ｌｅｕ１＋の形質転換体を選抜した。
一方で、ＣｐＦＡＨ１２遺伝子を染色体外遺伝子として導入したＳ．ポンベの形質転換体は、ｐＲＥＰ１−ＣｐＦＡＨ１２をそのままＳ．ポンベＡＲＣ０１０−１株に導入し、ＬＥＵ２＋の形質転換体（すなわち、ロイシン要求性のない形質転換体）を選抜することによって作製した。
ＲｃＦＡＨ１２遺伝子またはＬｆＦＡＨ１２遺伝子を染色体中または染色体外に導入したＳ．ポンベの形質転換体は、ＣｐＦＡＨ１２遺伝子を染色体中または染色体外に導入したＳ．ポンベの形質転換体と同様にして作製した。
【００３８】
［参考例１］
Ｓ．ポンベおよびＳ．セレビシエの脂肪酸含有量を測定した。
具体的には、Ｓ．ポンベの場合は、ＥＭＭ−Ｃ／Ｎ３（ロイシンおよび／またはウラシル無含有培地）中で、３０℃で一晩前培養し、該前培養物を新しいＥＭＭ−Ｃ／Ｎ３に接種し、４０ｒｐｍで振とう培養した。Ｓ．セレビシエの場合は、ＮＳＤ培地を用いた。
得られた培養物の総脂肪酸含有量は、ガスクロマトグラフ分析によるKainouらの方法（2006, Yeast, vol.23, pp.605-612）に準じて行った。具体的には、以下に示す通りである。まず、脂肪酸分析は、温度制御環境下（１６０〜２３４℃、昇温速度：４．５℃／ｍｉｎ）で、ＴＣ−７０キャピラリーカラム（３０ｍ×０．２５ｍｍ（内径）、ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製）を備えたガスクロマトグラフ（ＧＣ２０１０、島津製作所製）に０．２μＬの培養液を投与して実施した。脂肪酸組成は、各ピークの面積に基づいて算出され、含有量は、標準としたヘプタデカン酸メチル（Ｃ１７：０)と比較することによって決定した。
【００３９】
測定結果を図４に示す。縦軸は全脂肪酸に対する各脂肪酸の含有量割合（％）である。Ｓ．セレビシエでは、オレイン酸（Ｃ１８：１）は３０％強含まれていたが、パルミトレイン酸（Ｃ１６：１）が約４５％と最も多かった。一方、Ｓ．ポンベでは、８０％強がオレイン酸（Ｃ１８：１）であり、その他の脂肪酸含有量はいずれも非常に少なかった。
【００４０】
［参考例２］
ｐＲＥＰ１、ｐＲＥＰ１−ＣｐＦＡＨ１２、ｐＲＥＰ１−ＲｃＦＡＨ１２、またはｐＲＥＰ１−ＬｆＦＡＨ１２を導入したＳ．ポンベの形質転換体を、それぞれチアミン存在下および非存在下で培養し、増殖能を調べた。
具体的には、まず、チアミン含有ＥＭＭ−Ｃ／Ｎ３−ＬＥＵ（ＥＭＭ−Ｃ／Ｎ３からロイシンが除去された培地）中、３０℃で一晩前培養した前培養液を、チアミン不添加のＥＭＭ−Ｃ／Ｎ３−ＬＥＵのプレート（アガー平板培地）またはチアミン含有ＥＭＭ−Ｃ／Ｎ３−ＬＥＵのプレートに塗布し、３０℃で４日間培養し、コロニーの形成の有無や、形成されたコロニーのサイズを調べた。
空ベクターであるｐＲＥＰ１を導入した形質転換体をチアミン含有プレートに塗布した場合に形成されたコロニーのサイズを基準として、その他の形質転換体の増殖能を評価した。評価結果を表１に示す。表１中、「＋＋＋」は生育が正常であり、「＋＋」は生育が若干悪く、「＋」は生育が悪く、「−」は増殖できなかったことを意味する。また、「遺伝子発現ＯＦＦ（チアミン有り）」はチアミン含有ＥＭＭ−Ｃ／Ｎ３−ＬＥＵプレートの結果を、「遺伝子発現ＯＮ（チアミン無し）」はチアミン不添加のＥＭＭ−Ｃ／Ｎ３−ＬＥＵプレートの結果を、それぞれ示す。
【００４１】
【表１】
0005881003.tif 000002
【００４２】
ＲｃＦＡＨ１２を発現させた場合には、外来蛋白質を発現させていない場合と同程度の増殖能であったが、ＬｆＦＡＨ１２を発現させた形質転換体は、ＲｃＦＡＨ１２を発現させた形質転換体よりも増殖能が低下しており、ＣｐＦＡＨ１２を発現させた形質転換体は非常に増殖能が低下していることがわかった。つまり、ＬｆＦＡＨ１２やＣｐＦＡＨ１２を発現させることによって、増殖能が低下した。
【００４３】
［参考例３］
ｐＲＥＰ１−ＬｆＦＡＨ１２を導入したＳ．ポンベの形質転換体を培養し、リシノール酸をはじめとする脂肪酸の含有量を調べた。
具体的には、まず、チアミン含有ＥＭＭ−Ｃ／Ｎ３−ＬＥＵ中、３０℃で一晩前培養した前培養液を、ＥＭＭ−Ｃ／Ｎ３−ＬＥＵ中に接種し、３０℃、４０ｒｐｍで５日間振とう培養した。得られた培養物の各脂肪酸の含有量を、参考例１と同様にしてガスクロマトグラフ分析によって測定した。測定の結果得られたチャート図を図５に示す。該形質転換体では、リシノール酸の標準サンプルと同じ位置にピークが検出された。すなわち、該形質転換体ではリシノール酸が生産されていることが確認できた。
【００４４】
［実施例１］
ＣｐＦＡＨ１２遺伝子を染色体中に組み込んだＳ．ポンベの形質転換体（以下、ＣｐＦＡＨ１２インテグラント株）の各培養温度における増殖能を調べた。
具体的には、ＣｐＦＡＨ１２インテグラント株にｕｒａ４マーカーを含む空ベクターｐＲＥＰ２を導入した形質転換体（ＣｐＦＡＨ１２株）と、Ｓ．ポンベにｐＳＬ１０およびｐＲＥＰ２を導入した形質転換体（コントロール株）を、それぞれチアミンが添加されていないＥＭＭ−Ｃ／Ｎ３−ＵＲＡ，ＬＥＵ中、３７℃で一晩、培養液のＯＤ６００が約４になるまで前培養した。該前培養液を同種の新しい培地で希釈し、さらに、１０倍希釈系列を調整し、各１０μＬずつを、１５μＭのチアミン含有ＥＭＭ−Ｃ／Ｎ３−ＵＲＡ，ＬＥＵプレート（発現抑制条件）またはチアミン不添加のＥＭＭ−Ｃ／Ｎ３−ＵＲＡ，ＬＥＵプレート（発現誘導条件）上にスポットした。該プレートを３７℃、３５℃、３０℃、２５℃、または２０℃で４〜９日間インキュベートした。
インキュベート後の各プレート表面の写真図を図６に示す。図中、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」はコントロール株の結果であり、「ＣｐＦＡＨ１２」はＣｐＦＡＨ１２株の結果を示す。また、図中、白い部分がコロニーである。チアミン含有プレート（図中、「＋Ｔｈｉａｍｉｎｅ」）では、２０℃、９日間培養した場合のみ、ＣｐＦＡＨ１２株がコントロール株よりもやや増殖能が低かったものの、その他の培養条件では両形質転換体の増殖能に特段の差はなかった。一方、参考例２ではＣｐＦＡＨ１２を発現させた株ではほとんど増殖が観察されなかったにも関わらず、チアミン不含有プレート（図中、「Ｎｏ  Ｔｈｉａｍｉｎｅ」）では、濃い濃度でスポットとした場合に、全ての培養条件でＣｐＦＡＨ１２株の増殖が確認できた。但し、３７℃、４日間培養した場合を除き、ＣｐＦＡＨ１２株のほうがコントロール株よりも明らかに増殖能が低かった。すなわち、ＣｐＦＡＨ１２の発現誘導条件下のＣｐＦＡＨ１２インテグラントの増殖能は培養温度に影響され、３７℃で前培養した後に培養温度を低下させた場合には、増殖能は低下するものの、増殖自体は可能であること、および３７℃ではほとんど低下しないことがわかった。
【００４５】
［実施例２］
実施例１で用いたＣｐＦＡＨ１２株およびコントロール株の、３０℃または３７℃の液体培地中の増殖能を調べた。
具体的には、ＣｐＦＡＨ１２株およびコントロール株を、チアミン不添加のＥＭＭ−Ｃ／Ｎ３−ＵＲＡ，ＬＥＵ中、３７℃で一晩前培養した。該前培養物を、前培養と同種の新しい培地で、ＯＤ６００が０．０５になるように希釈した後、３０℃または３７℃で３６時間、攪拌培養した。６３０ｎｍの濁度を自動検出器（Ｂｉｏ−Ｐｌｏｔｔｅｒ、東洋測器製）でモニターすることにより、液体培地中の増殖曲線を描いた。図７に増殖曲線を示す。図７（Ａ）は３０℃で培養した結果であり、図７（Ｂ）は３７℃で培養した結果である。図中、三角がＣｐＦＡＨ１２株の増殖曲線を、円がコントロール株の増殖曲線を、それぞれ示す。３７℃で培養した場合よりも、３０℃で培養した場合には、ＣｐＦＡＨ１２株はコントロール株よりも明らかに増殖が抑制されていた。
【００４６】
［実施例３］
３７℃から２０℃または１５℃に培養温度をシフトさせるタイミングの、ＣｐＦＡＨ１２インテグラント株のリシノール酸産生に対する影響を評価した。
図８は、評価方法のスキーム図である。まず、ＣｐＦＡＨ１２インテグラント株を、チアミンが添加されていないＥＭＭ−Ｃ／Ｎ３−ＵＲＡ，ＬＥＵ中、３７℃で一日間前培養した。次いで、培養した細胞を、前培養と同種の新しい培地で、ＯＤ６００が０．０５になるように希釈した後、最初に３７℃で１日間（ＯＤ６００が５、対数増殖期後期）または２日間（ＯＤ６００が６、定常増殖期初期）培養し、その後２０℃または１５℃に培養温度をシフトさせて５日間培養した。対照として、前培養と同種の新しい培地で、ＯＤ６００が０．０５になるように希釈した後、温度シフトせずに３７℃で７日間培養した（図８の下段）。液体培養は全て、４０ｒｐｍで振とう培養した。
【００４７】
本培養開始後１日経過ごとに、培養液の一部をサンプリングし、培養液のＯＤ６００、培養液１ｍＬ当たりの乾燥菌体重量（ＤＣＷ）、および培養液１ｍＬ当たりの各種脂肪酸の含有量を測定した。培養液のＯＤ６００は実施例２と同様にして、各種脂肪酸の含有量は参考例１と同様にして、それぞれ測定した。培養液のＯＤ６００および培養液１ｍＬ当たりの乾燥菌体重量の測定結果を図９（Ａ）に、各種脂肪酸の含有量の測定結果を図９（Ｂ）に、それぞれ示す。図９（Ｂ）中、「Ｃ１８：１−ＯＨ」はリシノール酸を、「Ｃ１８：２」はリノレン酸を、「Ｏｔｈｅｒｓ」はその他の脂肪酸の総和を、それぞれ示す。培養液のＯＤ６００および培養液１ｍＬ当たりの乾燥菌体重量は、培養温度の温度シフトによってはあまり差がなかった。しかし、各種脂肪酸の含有量は、温度シフトせずに３７℃で培養し続けた場合、３７℃で２日間培養した後に２０℃または１５℃にシフトした場合には、リシノール酸の含有量は非常に低かった。これに対して、３７℃で１日間培養した後に２０℃または１５℃にシフトした場合には、培養時間の経過とともにリシノール酸の含有量が顕著に増大していた。該結果から、培養温度が３７℃の場合、および増殖が定常状態になった後に低温へ温度シフトした場合には、リシノール酸が産生されないことが分かった。培養温度が３７℃の場合等でリシノール酸産生が行われないのは、ＣｐＦＡＨ１２が発現しないため、またはＣｐＦＡＨ１２の活性が非常に低下するためと推察される。
【００４８】
さらに、図１０に、脂肪酸組成の経時的変化を示す。図１０（Ａ）は３７℃で１日間培養した後に２０℃にシフトして５日間培養した場合、図１０（Ｂ）は３７℃で２日間培養した後に２０℃にシフトして５日間培養した場合、図１０（Ｃ）は３７℃で７日間培養した場合の結果である。３７℃で２日間培養した後に２０℃にシフトした場合には、３７℃で７日間培養した場合と同様、脂肪酸組成はほとんど経時的変化がなかった。これに対して３７℃で１日間培養した後に２０℃にシフトした場合には、培養時間の経過と共にオレイン酸含有割合が低下し、逆にリシノール酸含有割合が増大した。その他の脂肪酸の含有割合は、ほとんど経時的変化がなかった。
【００４９】
［実施例４］
３７℃から２０℃、２５℃または３０℃への培養温度シフトの、ＣｐＦＡＨ１２インテグラント株のリシノール酸産生に対する影響を評価した。
具体的には、図１１に示すように、まず、ＣｐＦＡＨ１２インテグラント株を、チアミンが添加されていないＥＭＭ−Ｃ／Ｎ３−ＵＲＡ，ＬＥＵ中、３７℃で一日間前培養した。次いで、培養した細胞を、前培養と同種の新しい培地で、ＯＤ６００が０．５になるように希釈した後、２０℃、２５℃または３０℃で１０日間、４０ｒｐｍで振とう培養した（図１１の上段）。対照として、前培養と同種の新しい培地で、ＯＤ６００が０．５になるように希釈した後、温度シフトせずに３７℃で１０日間、４０ｒｐｍで振とう培養した（図１１の下段）。
実施例３と同様に、本培養開始後１日経過ごとに、培養液の一部をサンプリングし、培養液のＯＤ６００、培養液１ｍＬ当たりの乾燥菌体重量（ＤＣＷ）、および培養液１ｍＬ当たりの各種脂肪酸の含有量を測定した。培養液のＯＤ６００および培養液１ｍＬ当たりの乾燥菌体重量の測定結果を図１２（Ａ）に、各種脂肪酸の含有量の測定結果を図１２（Ｂ）に、それぞれ示す。図１２（Ｂ）中、「Ｃ１８：１−ＯＨ」、「Ｃ１８：２」および「Ｏｔｈｅｒｓ」は図９（Ｂ）と同様である。
【００５０】
最終的なリシノール酸産生量は、本培養を２０℃で実施した場合が、２５℃または３０℃で実施した場合よりも多くなることが確認された。しかし、本培養を２５℃で行うほうが、利点があると考えられる。細胞増殖は２５℃のほうが良好であるため、本培養開始４日目では、２５℃の培養条件のほうが２０℃よりもリシノール酸の産生量が高かったためである。具体的には、培養液当たりのリシノール酸産生量は、２０℃で１０日間培養後には１６３．２μｇ／ｍＬであったが、２０℃で４日間培養後には４８．２μｇ／ｍＬでしかなかった。これに対して２５℃で４日間培養後には１０８．８μｇ／ｍＬであり、該生産量は、２０℃で１０日間培養した場合の６６％であった。さらにコストの点から、冷却コストを低減でき、かつ培養日数を１０日間から４日間に短縮することで培養コストを低減できるため、細胞増殖は２０℃よりも２５℃で行うほうが好ましい。このように、冷却コストを低減し、培養時間を短縮することで製造コストを低減できるため、工業上の観点からは、２５℃培養のほうが２０℃培養よりも好ましい。
【００５１】
［実施例５］
３７℃から２０℃に培養温度をシフトさせる時点の酵母の増殖状態の、ＣｐＦＡＨ１２インテグラント株のリシノール酸産生に対する影響を評価した。
具体的には、図１３に示すように、まず、ＣｐＦＡＨ１２インテグラント株を、チアミンが添加されていないＥＭＭ−Ｃ／Ｎ３−ＵＲＡ，ＬＥＵ中、３７℃で一日間前培養した。次いで、培養した細胞を、前培養と同種の新しい培地で、ＯＤ６００が０．０１〜０．１６の間様々な値になるように希釈した５つの本培養液を調製後、３７℃で１日間、４０ｒｐｍで振とう培養した後、培養液の温度を２０℃にシフトし、シフト後さらに５日間、４０ｒｐｍで振とう培養した（図１３の上段）。５つの培養液の温度シフト時のＯＤ６００は、それぞれ、０．５５（培養液Ａ）、１．４（培養液Ｂ）、２．５（培養液Ｃ）、４．４（培養液Ｄ）および５．５（培養液Ｅ）であった。対照として、前培養と同種の新しい培地で、ＯＤ６００が０．０５になるように希釈した後、温度シフトせずに３７℃で６日間、４０ｒｐｍで振とう培養した（図１３の下段）。
実施例３と同様にして、本培養終了時点の培養液のＯＤ６００、培養液１ｍＬ当たりの乾燥菌体重量（ＤＣＷ）、および培養液１ｍＬ当たりの各種脂肪酸の含有量を測定した。温度シフト開始時点および培養終了時点の培養液のＯＤ６００、並びに培養終了時点の培養液１ｍＬ当たりの乾燥菌体重量の測定結果を図１４（Ａ）に、培養終了時点の培養液１ｍＬ当たりの各種脂肪酸の含有量の測定結果を図１４（Ｂ）に、それぞれ示す。図１４（Ｂ）中、「Ｃ１８：１−ＯＨ」、「Ｃ１８：２」および「Ｏｔｈｅｒｓ」は図９（Ｂ）と同様である。さらに、総脂肪酸含有量に対する各脂肪酸の含有量比（質量％）を表２に示す。図１４および表２の各測定値は、独立した２回の試行を行い、その平均値である。
【００５２】
【表２】
0005881003.tif 000003
【００５３】
図１４（Ｂ）および表２に示す通り、培養液Ａ〜Ｅの全てでリシノール酸の産生が確認されたが、温度シフト時点の培養液のＯＤ６００が１．４〜４．４である培養液Ｂ〜Ｄが、培養液ＡおよびＥよりもリシノール酸産生量が多かった。該結果から、酵母が対数増殖期にある時点で温度シフトを行うことにより、より大量のリシノール酸を産生させ得ることが示唆された。
【００５４】
［実施例６］
３７℃から２０℃に培養温度をシフトさせる時点の培養液の濃度の、ＣｐＦＡＨ１２インテグラント株のリシノール酸産生に対する影響を評価した。
具体的には、図１５に示すように、まず、ＣｐＦＡＨ１２インテグラント株を、チアミンが添加されていないＥＭＭ−Ｃ／Ｎ３−ＵＲＡ，ＬＥＵ中、３７℃で一日間前培養した。次いで、培養した細胞を、前培養と同種の新しい培地で、ＯＤ６００が０．０７になるように希釈した後、３７℃で培養液のＯＤ６００が２．５になるまで４０ｒｐｍで振とう培養した後、培養液を遠心分離処理して菌体を回収した後、遠心分離処理前の菌体濃度の１倍、２倍、または４倍となるように、元々の培地または新しい同種の培地に懸濁して培養液を調製した。該培養液の温度を２０℃にシフトし、シフト後さらに５日間、４０ｒｐｍで振とう培養した。
実施例３と同様にして、本培養終了時点の培養液のＯＤ６００、および培養液１ｍＬ当たりの各種脂肪酸の含有量を測定した。測定結果を図１６に示す。図１６中、「Ｃ１８：１−ＯＨ」、「Ｃ１８：２」および「Ｏｔｈｅｒｓ」は図９（Ｂ）と同様である。また、「１×Ｕｓｅｄ」、「２×Ｕｓｅｄ」および「４×Ｕｓｅｄ」は、元々の培地で菌体濃度が遠心分離処理前の菌体濃度の１倍、２倍、または４倍になるように調製した培養液の結果であり、「１×Ｆｒｅｓｈ」、「２×Ｆｒｅｓｈ」および「４×Ｆｒｅｓｈ」は、新しい培地で菌体濃度が遠心分離処理前の菌体濃度の１倍、２倍、または４倍になるように調製した培養液の結果である。
【００５５】
遠心分離処理後の培養液の調製に新しい培地を用いたほうが、元々の培地を用いるよりも細胞増殖速度が速く、よって培養液１ｍＬ当たりのリシノール酸産生量も多くなった。また、遠心分離処理後の菌体の濃縮倍率が大きいほど、培養液１ｍＬ当たりのリシノール酸産生量も多くなった。しかし、総脂肪酸全体に占めるリシノール酸の含有割合は、各培養液において特に大きな差はなかった。
【００５６】
［実施例７］
３７℃から２０℃または３０℃への培養温度シフトの、実施例１で用いたＣｐＦＡＨ１２株およびコントロール株のリシノール酸産生に対する影響を評価した。
まず、ＣｐＦＡＨ１２株およびコントロール株をそれぞれ、チアミンが添加されていないＥＭＭ−Ｃ／Ｎ３−ＵＲＡ，ＬＥＵ中、３７℃で一日間前培養した。次いで、培養した細胞を、前培養と同種の新しい培地で、ＯＤ６００が０．５になるように希釈した後、２０℃、３０℃または３７℃に培養温度をシフトさせて４日間培養した。本培養開始後１日経過ごとに、培養液の一部をサンプリングし、参考例１と同様にして、培養液１ｍＬ当たりの各種脂肪酸の含有量を測定した。
本培養を２０℃で行った場合の各株のガスクロマトグラフ分析の結果のチャート図を図１７に示す。ＣｐＦＡＨ１２株では、リシノール酸の標準サンプルと同じ位置にピークが検出された。該ピークは、ＣｐＦＡＨ１２を発現していないコントロール株では観察されなかった。
培養液１ｍＬ当たりの各種脂肪酸の、総脂肪酸含有量に対する含有割合（％）の結果を図１８に示す。図１８（Ａ）はコントロール株の結果であり、図１８（Ｂ）はＣｐＦＡＨ１２株の結果である。ＣｐＦＡＨ１２を発現していないコントロール株では、本培養の温度に関わらず、脂肪酸組成は全てほぼ同様であった。これに対してＣｐＦＡＨ１２株では、３７℃で培養した場合にはコントロール株の結果とほぼ変わらなかったのに対して、２０℃および３０℃で培養した場合には、オレイン酸の含有割合の低下に伴い、リシノール酸の含有割合が増大していた。２０℃の場合には、培養日数が長くなるにつれてリシノール酸含有割合が増大していた。３０℃の場合には、培養日数が２日目でリシノール酸の含有割合はピークを迎えていた。
【００５７】
［実施例８］
ｐＲＥＰ１、ｐＲＥＰ１−ＣｐＦＡＨ１２、ｐＲＥＰ１−ＲｃＦＡＨ１２、またはｐＲＥＰ１−ＬｆＦＡＨ１２を導入したＳ．ポンベの形質転換体を、それぞれチアミン存在下および非存在下で培養し、各培養温度における増殖能を調べた。
まず、各形質転換体をそれぞれ、チアミンが添加されていないＥＭＭ−Ｃ／Ｎ３−ＬＥＵ中、３７℃で一日間前培養した。次いで、該前培養液を同種の新しい培地で希釈し、さらに、１０倍希釈系列を調整し、各１０μＬずつを、１５μＭのチアミン含有ＥＭＭ−Ｃ／Ｎ３−ＬＥＵプレート（発現抑制条件）またはチアミン不添加のＥＭＭ−Ｃ／Ｎ３−ＬＥＵプレート（発現誘導条件）上にスポットした。該プレートを２０℃で１０日間、３０℃で５日間、または３７℃で５日間インキュベートした。インキュベート後の各プレート表面の写真図を図１９に示す。図中、白い部分がコロニーである。図中、「＋Ｔｈｉａｍｉｎｅ」がチアミン含有プレートであり、「Ｎｏ  Ｔｈｉａｍｉｎｅ」がチアミン不含有プレートである。
チアミン不含有プレートでは、培養温度にかかわらず、ｐＲＥＰ１−ＣｐＦＡＨ１２を導入した形質転換体およびｐＲＥＰ１−ＬｆＦＡＨ１２を導入した形質転換体では、ｐＲＥＰ１を導入した形質転換体よりも増殖能が低い傾向が観察された。
【００５８】
［実施例９］
ＲｃＦＡＨ１２遺伝子を染色体外遺伝子として導入したＳ．ポンベの形質転換体（以下、ｐＲＥＰ１−ＲｃＦＡＨ１２導入株）およびＬｆＦＡＨ１２遺伝子を染色体外遺伝子として導入したＳ．ポンベの形質転換体（以下、ｐＲＥＰ１−ＬｆＦＡＨ１２導入株）の３０℃で培養した場合の脂肪酸組成を調べた。対照として、ｐＲＥＰ１を導入したＳ．ポンベの形質転換体（以下、ｐＲＥＰ１導入株）を３０℃で培養した場合の脂肪酸組成を調べた。
まず、各株をチアミンが添加されていないＥＭＭ−Ｃ／Ｎ３−ＬＥＵ中、３０℃で一日間前培養した。次いで、培養した細胞を、前培養と同種の新しい培地またはチアミン含有ＥＭＭ−Ｃ／Ｎ３−ＬＥＵで、ＯＤ６００が０．０５になるように希釈した後、３０℃で７日間、４０ｒｐｍで振とう培養した。参考例１と同様にして、培養終了後の培養液１ｍＬ当たりの各種脂肪酸の含有量を測定した。培養液１ｍＬ当たりの各種脂肪酸の総脂肪酸含有量に対する含有比率の結果を図２０に示す。図２０中、「ｐＲＥＰ１」、「ＲｃＦＡＨ１２」、および「ＬｆＦＡＨ１２」はそれぞれ、ｐＲＥＰ１導入株、ｐＲＥＰ１−ＲｃＦＡＨ１２導入株、およびｐＲＥＰ１−ＬｆＦＡＨ１２導入株をチアミンが添加されていないＥＭＭ−Ｃ／Ｎ３−ＬＥＵ中で本培養した結果を示し、「ｐＲＥＰ１＋Ｔｈｉ」、「ＲｃＦＡＨ１２＋Ｔｈｉ」、および「ＬｆＦＡＨ１２＋Ｔｈｉ」はそれぞれ、ｐＲＥＰ１導入株、ｐＲＥＰ１−ＲｃＦＡＨ１２導入株、およびｐＲＥＰ１−ＬｆＦＡＨ１２導入株をチアミン含有ＥＭＭ−Ｃ／Ｎ３−ＬＥＵ中で本培養した結果を示す。
【００５９】
図２０に示すように、ｐＲＥＰ１−ＲｃＦＡＨ１２導入株およびｐＲＥＰ１−ＬｆＦＡＨ１２導入株では、チアミン含有培地ではｐＲＥＰ１導入株と同様、リシノール酸はほとんど含有されていなかったが、チアミンが添加されていない培地では、オレイン酸含有割合が低下し、リシノール酸の含有割合が上昇していた。すなわち、ＣｐＦＡＨ１２遺伝子を導入した形質転換体と同様、ＲｃＦＡＨ１２遺伝子またはＬｆＦＡＨ１２遺伝子を導入した形質転換体では、３０℃で培養した場合に、リシノール酸が産生されることがわかった。
【００６０】
［参考例４］
ＣｐＦＡＨ１２遺伝子を染色体外遺伝子として導入したＳ．セレビシエの形質転換体の増殖能を調べた。
具体的には、該Ｓ．セレビシエにＹＥｐ３５２−ＣｐＦＡＨ１２を導入した形質転換体（ＣｐＦＡＨ１２株）と、Ｓ．セレビシエに空ベクターＹＥｐ３５２ＧＡＰを導入した形質転換体（コントロール株）を、それぞれＳＣ−ＵＲＡ中、３０℃で一晩前培養した。該前培養物を、前培養と同種の新しい培地で、ＯＤ６００が０．０５になるように希釈した後、２０℃または３０℃で攪拌培養した。６３０ｎｍの濁度を自動検出器（Ｂｉｏ−Ｐｌｏｔｔｅｒ、東洋測器製）でモニターすることにより、液体培地中の増殖曲線を描いた。それぞれ独立した試行を３回行った。図２１に増殖曲線を示す。図２１（Ａ）は３０℃で培養した結果であり、図２１（Ｂ）は２０℃で培養した結果である。図中、三角がＣｐＦＡＨ１２株の増殖曲線［ＹＥｐ３５２−ＣｐＦＡＨ１２−１、ＹＥｐ３５２−ＣｐＦＡＨ１２−２、ＹＥｐ３５２−ＣｐＦＡＨ１２−３］を、円がコントロール株の増殖曲線［ＹＥｐ３５２ＧＡＰ−１、ＹＥｐ３５２ＧＡＰ−２、ＹＥｐ３５２ＧＡＰ−３］を、それぞれ示す。いずれの培養温度においても、コントロール株よりもＣｐＦＡＨ１２株のほうが、明らかに増殖が抑制されていた。すなわち、ＣｐＦＡＨ１２株の増殖のダブリングタイムは、コントロール株よりも１．４倍長くなっていた。
ＣｐＦＡＨ１２遺伝子を染色体中に組み込んだＳ．セレビシエの形質転換体は、ＣｐＦＡＨ１２遺伝子を染色体中に組み込んだＳ．ポンベの形質転換体と同様、ＣｐＦＡＨ１２を発現させることによって増殖が抑制されていた。つまり、ＣｐＦＡＨ１２遺伝子をＳ．セレビシエに導入することによって、Ｓ．ポンベに導入した場合と同様、リシノール酸を産生できることが示唆された。
【００６１】
［実施例１０］
ＣｐＦＡＨ１２遺伝子を染色体外遺伝子として導入したＳ．セレビシエの形質転換体を培養し、リシノール酸の産生能を調べた。対照として、Ｓ．セレビシエにＹＥｐ３５２ＧＡＰを導入した形質転換体を用いた。
まず、各株をＮＳＤ−ＵＲＡ中、２０℃または３０℃で一日間前培養した。次いで、培養した細胞を、前培養と同種の新しい培地で、ＯＤ６００が０．０５になるように希釈した後、２０℃または３０℃で５日間、４０ｒｐｍで振とう培養した。参考例１と同様にして、培養終了後の培養液１ｍＬ当たりの各種脂肪酸の含有量を測定した。脂肪酸組成（培養液１ｍＬ当たりの各種脂肪酸の総脂肪酸含有量に対する含有割合）の結果を図２２に示す。図２２中、「ＣｐＦＡＨ１２」および「ｅｍｐｔｙ」はそれぞれ、ＣｐＦＡＨ１２を染色体外遺伝子として導入した形質転換体、およびＳ．セレビシエにＹＥｐ３５２ＧＡＰを染色体外遺伝子として導入した形質転換体を本培養した結果を示す。
図２２に示すように、ＣｐＦＡＨ１２遺伝子を導入したＳ．セレビシエを２０℃または３０℃で培養した場合に、リシノール酸が産生されることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明のリシノール酸産生酵母の培養方法およびリシノール酸の製造方法により、リシノール酸を、酵母の形質転換体を用いて効率よく生産できるため、特に、リシノール酸またはひまし油が原料として使用されている化成品、塗料・印刷インキ、化粧品、医薬品、潤滑油等の製造分野において好適に用いられる。
【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図１９】
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【配列表】
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