(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳癌患者の、エストロゲン受容体陽性かつＨＥＲ２陰性である腫瘍において乳癌の転帰を予測するための方法であって、
（ａ）上記患者由来の腫瘍試料において、以下の８つの遺伝子：ＵＢＥ２Ｃ、ＢＩＲＣ５、ＤＨＣＲ７、ＳＴＣ２、ＡＺＧＰ１、ＲＢＢＰ８、ＩＬ６ＳＴ、及びＭＧＰのＲＮＡ発現レベルを決定すること、
（ｂ）上記セットの遺伝子の発現レベル値であって、上記腫瘍試料において決定した当該値を数学的に組合せて、組合せスコアを得ること、但し、上記組合せスコアは上記患者の予後を示す、
を含み、
上記患者が、内分泌療法を受けているか、又は内分泌治療を受けることが予定されている、上記方法。
【請求項２】
上記内分泌療法がタモキシフェン又はアロマターゼ阻害剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
乳癌再発又は癌関連死を生じるリスクが予測される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
上記発現レベルが、メッセンジャーＲＮＡ発現レベルとして決定される、請求項１から３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
上記発現レベルが、以下の少なくとも１つによって決定される、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法：
ＰＣＲに基づく方法、
マイクロアレイに基づく方法、及び
ハイブリダイゼーションに基づく方法。
【請求項６】
発現レベルの上記決定が、ホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍試料又は新鮮凍結腫瘍試料におけるものである、請求項１から５の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１つのマーカー遺伝子の発現レベルが、少なくとも１つの参照遺伝子又は計算平均発現値に対する発現パターンとして決定される、請求項１から６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
数学的に組合せる上記工程が、所定の遺伝子の発現レベルを表す値にアルゴリズムを適用する工程を含む、請求項１から７の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
上記アルゴリズムが、所定の遺伝子の発現レベルを表す上記値の線形結合である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
既定の遺伝子の発現レベルの代表値に関する値に係数が乗じられる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
１つ、又は２つ以上の閾値が上記組合せスコアに関して決定される、請求項１から１０の何れか１項に記載の方法であって、該閾値は、該組合せスコアに該閾値を適用することによって、高リスク及び低リスク；高リスク、中間リスク及び低リスク；又はそれより多いリスク群に識別するものである、上記方法。
【請求項１２】
高い組合せスコアが、細胞毒性化学療法の効果を示す、請求項１から１１の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３】
遺伝子の発現レベル値を数学的に組合せて、組合せスコアを得る上記工程において、患者の結節状態に関する情報が処理される、請求項１から１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
上記結節状態が陰性である場合には結節状態に関する上記情報はある数値であり、かつ上記結節状態が陽性である場合には該情報は異なる数値であり、かつ上記結節状態が未知である場合には該情報は異なるか又は同一の数値である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１から１４の何れか１項に記載の方法を実施するためのキットであって、
該キットは、遺伝子の組合せにおける該遺伝子の配列に、又は該遺伝子の断片の配列に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドセットを含み、
上記組合せは、ＵＢＥ２Ｃ、ＢＩＲＣ５、ＤＨＣＲ７、ＳＴＣ２、ＡＺＧＰ１、ＲＢＢＰ８、ＩＬ６ＳＴ、及びＭＧＰの８つの遺伝子を含む、上記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳癌の疾患転帰の予後診断のための方法、キット及びシステムに関する。より具体的には、本発明は、乳癌患者の腫瘍試料中のマーカー遺伝子の発現レベルの測定に基づく乳癌の予後診断に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳癌は、西側諸国において、女性における癌による死亡の主因の１つである。より具体的には、乳癌は、米国だけで、およそ４０，０００人の女性の生命を奪い、そして毎年およそ２００，０００人の女性において診断されている。最近数十年に渡り、全身性アジュバント療法は、早期乳癌において顕著な生存率の向上に繋がっている。この臨床上の経験により、大半の乳癌患者に対して全身性アジュバント療法を提案すると言う推奨の一致に繋がっている（ＥＢＣＡＧ）。乳癌においては、一般的に実施される腫瘍の外科的除去及びそれに続く腫瘍床の放射線照射に加えて適用され得る、多数の治療オプションが利用可能である。３つの主な、そして概念的に異なる戦略は、内分泌治療、化学療法、及び標的療法を用いた治療である。内分泌剤(endocrine agents)を用いた治療のための必要条件は、腫瘍組織において、ホルモン受容体、すなわちエストロゲン受容体若しくはプロゲステロン受容体のいずれか、又はその両方が発現していることである。大規模な患者群において試験した際に異なる作用様式と疾患転帰における相違を有する、いくつかの内分泌剤が利用可能である。タモキシフェンは、過去３０年、内分泌治療の主力であった。大規模臨床試験によって、タモキシフェンが腫瘍再発リスクを有意に減少させることが示された。さらなる治療オプションは、新規内分泌薬剤クラスに属するアロマターゼ阻害剤に基づくものである。エストロゲン結合の競合阻害剤であるタモキシフェンとは対照的に、アロマターゼ阻害剤は、エストロゲン自体の産生を遮断し、それによって、エストロゲン受容体陽性腫瘍細胞に対する増殖刺激を減少させる。それでも、内分泌治療にもかかわらず再発を経験する患者もあり、そして特に、これらの患者はさらなる療法薬剤から効果を得る可能性がある。アントラサイクリン、タキサン及びその他薬剤を用いた化学療法が、エストロゲン受容体陽性患者並びにエストロゲン受容体陰性患者において、疾患再発を減少させるのに効果があることが示されている。ＮＳＡＢＰ−２０試験では、リンパ節転移陰性エストロゲン受容体陽性患者において、タモキシフェン単独と、タモキシフェンを追加した化学療法とが比較されたが、併用治療の方が、タモキシフェン単独よりも効果があることが示された。しかしながら、タモキシフェン単独と、タモキシフェンを追加した化学療法とが比較された、ＩＢＣＳＧ  ＩＸ試験は、細胞傷害性剤の添加について、何ら有意な効果は示されなかった。近年、腫瘍細胞表面上のＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原に対する抗体の全身投与が、Ｈｅｒ２ｎｅｕ過剰発現腫瘍を有する患者において、再発リスクを数倍減少させることが示されている。さらに、全てではないとしても様々な薬剤治療の殆どのものは、患者の生活の質を著しく損ない得る多くの潜在的な副作用を有する（シャピロ（Ｓｈａｐｉｒｏ）及びレヒト（Ｒｅｃｈｔ）、２００１；ガンズ（Ｇａｎｚ）ら、２００２）。このため、過剰治療並びに過少治療を回避するために、個々の患者に関し、注意深いリスク評価に基づいて治療戦略を選択することを余儀なくされる。ＨＥＲ２／ｎｅｕ陰性及びエストロゲン受容体陽性の腫瘍（管腔型）と比較して、ＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性腫瘍、並びにＨＥＲ２／ｎｅｕ及���エストロゲン受容体発現の欠如によって特徴付けられる腫瘍（基底型）において、化学療法の利点が相対的に大きいことから、治療決定が最も困難となるのは、悪性度分類、腫瘍サイズ又はリンパ節病変のような古典的な臨床要因が、化学療法を用いるべきか否かという疑問に明確な答えを提供しない管腔腫瘍に関係する。この医学的なニーズに対処するために、２１遺伝子アッセイ、ゲノム・グレード指標アッセイ(genome grade index assay)並びその他、新規の分子ツールが開発されている。
【０００３】
治療ガイドラインは、通常、その分野において有名な専門家によって開発される。欧州においては、２００９年以来、セント・ガレン（Ｓｔ  Ｇａｌｌｅｎ）ガイドラインでは、ＨＥＲ２陽性乳癌患者、並びにＨＥＲ２陰性及びＥＲ陰性疾患の患者に対して、化学療法が推奨されている。ＨＥＲ２陰性及びＥＲ陽性疾患の患者において、化学療法の有用性に関する不確実性が生じている。個人に対してバランスが取れた治療決定を行うため、癌再発の可能性が最も有用な基準として用いられている。リンパ節状態、腫瘍悪性度分類、腫瘍サイズ及びその他の臨床基準は、再発のリスクに関する情報を提供するため、有用である。最近になって、複数遺伝子アッセイは、標準臨床リスク因子よりも優れた情報、或いは該因子に対する付加的な情報を提供することが示されている。増殖マーカーは有力な予後情報を提供するものと思われると、一般に認識されている。こうした予測因子の優れた例としては、アジェンディア（Ａｇｅｎｄｉａ）社のマンマプリント（Ｍａｍｍａｐｒｉｎｔ）試験、ベリデックス（Ｖｅｒｉｄｅｘ）社の再発スコア（Relapse Score）、及びジュール・ボルデ（Ｊｕｌｅｓ  Ｂｏｒｄｅｔ）研究所で開発され、そしてイプソジェン（Ｉｐｓｏｇｅｎ）社にライセンス供与されたゲノム・グレード・インデックス（Genomic Grade Index）がある。これらアッセイは全て、少なくとも７０個の遺伝子の発現レベルの決定に基づいており、そして、全て、ホルマリン固定及びパラフィン包埋によってひどく分解はを受けておらず、[アールエヌレーター（商標）（ＲＮＬａｔｅｒＴＭ）中で輸送]新鮮な組織から単離されたＲＮＡ用に開発されている。別の優れた複数遺伝子アッセイは、ジェノミック・ヘルス社（Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｉｎｃ．）の再発スコア試験(Recurrence Score test)である。該試験は、ホルマリン固定パラフィン包埋組織試料からＲＮＡを抽出後、１６個の癌関連遺伝子及び５個の参照遺伝子の発現レベルを決定する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、現在のツールは、最も重要な臨床リスク群、即ち標準的な臨床パラメータに基づいて中間の再発リスクを有する乳癌患者において、臨床的有効性及び有用性に欠けている。従って、患者予後診断に基づいて、治療決定を最適化する、より優れたツールが必要である。化学療法を回避する臨床的有用性に関しては、術後、終には遠隔転移を発症してしまう患者を過少治療しないために、高い感度及び高い陰性適中率の試験が必要である。
【０００５】
アジュバント療法について臨床的決定を行うのに有用な材料及び方法の継続的な必要性に関し、本発明は、容易にアクセス可能な臨床的及び実験的データに基づいて、乳癌の予後診断のための進歩した方法の必要性を満たす。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
定義
特段に定義しない限り、本明細書で用いる技術的用語及び科学的用語は、本発明が属する技術分野における当業者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。
【０００７】
「癌」と言う用語は、如何なる、病期、悪性度分類、組織形態学的特徴、侵襲性、或いは罹患組織又は細胞凝集の悪性度にも限定されるものではない。
【０００８】
疾患の「転帰を予測する」と言う用語は、本明細書において、所定の療法を受けている患者の転帰の予測、及び治療されていない患者の予後診断の両方を含むものと意図される。「転帰の予測」と言う用語は、特に、患者が、転移若しくは局所再発を発症するか、又は死するリスクに関係する。
【０００９】
「予測」と言う用語は、本明細書において、腫瘍を所定の療法で治療した際の、腫瘍悪性度の個別評価、又は予測される患者の生存率[全生存（overall survival;ＯＡＳ）若しくは無病生存率(disease free survival;ＤＦＳ）]に関する。これとは対照的に、「予後診断」と言う用語は、腫瘍が未治療のままであった際の、腫瘍悪性度の個別評価、又は予測される患者の生存率[全生存（overall survival;ＯＡＳ）若しくは無病生存率(disease free survival;ＤＦＳ）]に関する。
【００１０】
本発明の意義の範囲内において「転帰」とは、疾患経過において到達する所定の状態である。この疾患転帰は、例えば、臨床状態であってもよく、例えば「疾患の再発」、「転移の発症」、「リンパ節転移の発症」、「遠隔転移の発症」、「生存」、「死亡」、「腫瘍寛解率」、病期又は悪性度分類等の臨床状態であってもよい。
【００１１】
「リスク」とは、被験体又は患者が特定の疾患転帰を発症又は到達する可能性に関する数値であると解される。「リスク」という用語は、本発明の背景において、患者の健康状態に関する、任意の肯定的意味合い又は否定的意味合いを有するとは解されず、単に、所定の状態の発生又は進行の可能性又は尤度を指す。
【００１２】
「臨床データ」と言う用語は、患者の健康状態に関する入手可能なデータ及び情報の全体に関するものであり、限定されるものでは無いが、年齢；性別；体重；閉経／ホルモン状態；疾病学的データ（ｅｔｉｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｄａｔａ）；既往歴データ；組織病理学；血液検査若しくは尿検査などのインビトロ診断法によって得られたデータ；Ｘ線、コンピュータ断層撮影、ＭＲＩ、ＰＥＴ、スペクト(spect)、超音波等の画像検査法；電気生理学的データ、遺伝子解析、遺伝子発現解析、生検評価、術中所見が含まれる。
【００１３】
「リンパ節陽性」、「リンパ節陽性と診断される」、「結節転移」又は「リンパ節転移」と言う用語は、リンパ節転移があると以前診断されている患者を意味する。これは、排出リンパ節、近傍リンパ節、及び遠位リンパ節転移の両方を含むものとする。この過去の診断法自体は、本発明の方法の一部を形成しない。寧ろ、これは、患者を選択するための前提条件であり、その患者の試料が本発明の一実施形態に用いられ得る。この過去の診断法は、当該技術分野に知られる任意の適切な方法によって為されるかもしれず、その方法には、限定される訳ではないが、リンパ節切除及び病理分析、生検分析、転移を示すバイオマーカーのインビトロ解析、画像診断法（例えば、コンピュータ断層撮影、Ｘ線、磁気共鳴イメージング、超音波）、及び術中所見が含まれる。
【００１４】
本発明の背景において、「生体試料」とは、生物有機体に由来するか、又は生物有機体と接触している試料である。生体試料の例としては、細胞、組織、体液、洗浄液、塗抹標本試料、生検標本、血液、尿、唾液、痰、血漿、血清、細胞培養上清等がある。
【００１５】
「腫瘍試料」とは、無傷（インタクト；ｉｎｔａｃｔ）であるか、或いは分解されている腫瘍細胞を含有する生体試料である。該試料は、任意の生物組織又は体液であってもよい。こうした試料には、限定されるわけではないが、痰、血液、血清、血漿、血球（例えば、白血球）、組織、針生検試料若しくは細針生検試料、細胞含有体液、尿、腹水、及び胸水、脳脊髄液、涙液、又はそれらから単離された細胞が含まれる。これにはまた、組織切片も含まれてもよく、例えば組織学的目的のために採取された凍結切片又は固定切片、或いは顕微解剖された細胞又はその細胞外部分も含まれ得る。分析すべき腫瘍試料は、吸引若しくは穿刺、切除によって、或いは生検若しくは切除された細胞材料を導くそｎ他任意の外科的方法によって採取された新生物病変由来の組織材料であってもよい。こうしたものは、患者から得られる腫瘍細胞又は腫瘍細胞断片を含む。細胞は、例えば乳頭吸引、乳管洗浄細胞診、細針生検によって採取した、或いは誘発性乳頭分泌物若しくは自発性乳頭分泌物から採取した、細胞「塗抹標本（スメア；smear）」中で見られてもよい。別の実施形態においては、試料は体液である。こうした液には、例えば、血液、血清、血漿、リンパ液、腹水、婦人科体液、又は尿が含まれるが、これらの液に限定されるものではない。
【００１６】
「遺伝子」とは、機能性ＲＮＡ産物を産生するのに必要な情報を含有する核酸セグメントのセットである。「遺伝子産物」とは、遺伝子の転写又は発現を通じて産生される生体分子であり、例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ又は翻訳されたタンパク質がある。
【００１７】
「ｍＲＮＡ」とは、遺伝子の転写産物であり、当業者によって理解される一般的な意味を有するものである。「ｍＲＮＡ由来の分子」は、ｍＲＮＡ鋳型から化学的に又は酵素的に得られる分子であり、例えばｃＤＮＡがある。
【００１８】
「発現レベル」と言う用語は、遺伝子発現の決定されたレベルを指す。これは、絶対値として決定された遺伝子発現レベルであってもよいし、或いは参照遺伝子（例えばハウスキーピング遺伝子）と比較して決定された遺伝子発現レベルであってもよいし、２個以上の参照遺伝子の平均と比較して決定された遺伝子発現レベルであってもよいし、或いは（例えばＤＮＡチップ解析において）平均発現値と比較して決定された遺伝子発現レベルであってもよいし、或いは参照試料を用いること無く別の情報を与える、情報提示遺伝子(インフォマティブ遺伝子；informative gene)と比較して決定された遺伝子発現レベルであってもよい。遺伝子発現レベルは、例えばその遺伝子のｍＲＮＡ転写物の量にシグナル強度が相関するシグナルを得ることによって直接に測定されてもよいし、或いは例えば免疫組織化学法、ＣＩＳＨ法、ＥＬＩＳＡ法又はＲＩＡ法によって、タンパク質レベルで間接に、遺伝子発現レベルを得てもよい。発現レベルは、また、参照試料に対する競合反応によって得てもよい。アッセイにおいて、何らかの物理的パラメータ、例えば蛍光発光を測定することによって決定される発現値を、さらなる情報プロセシングのために用いられ得る数値として割り当ててもよい。
【００１９】
本発明の意義の範囲内において「発現レベルの参照パターン」とは、発現レベルの別のパターンと比較するために用いられ得る、発現レベルの任意のパターンとして解される。本発明の好ましい実施形態においては、発現レベルの参照パターンは、例えば、参照群の役割を果たす、健常個体群、疾患罹患個体群、又は特定種類の治療法を受けている疾患罹患個体群、或いは転帰良好若しくは転帰不良である個体群で観察される発現レベルの平均パターンである。
【００２０】
本発明の意義の範囲内において「発現レベルを数学的に組合せる」と言う用語は、決定した遺伝子発現レベルから数値を得ること、並びに１以上の当該数値にアルゴリズムを適用し、組合せ数値(combined numerical value)又は組合せスコア（combined score）を得ることであると解される。
【００２１】
「アルゴリズム」とは、ある一連の演算を実施し、情報を生じるプロセスである。
【００２２】
「スコア」とは、アルゴリズムを用いて発現レベルを数学的に組合せることによって得られた数値である。スコアはまた、発現レベル、並びに例えば臨床データ等のその他情報から得てもよい。スコアは、患者の疾患の転帰に関連し得る。
【００２３】
「識別関数」は、対象又は事象を分類するのに用いられる変数セットの関数である。従って、識別関数は、患者、試料又は事象から入手可能なデータ又はパラメータに応じて、患者、試料又は事象を、一のカテゴリー又は複数のカテゴリーに分類することを可能にする。こうした分類は、当業者に周知の統計分析の標準的手段である。例えば、患者は、上記患者、試料又は事象から得られたデータに応じて、「高リスク」若しくは「低リスク」、「転移の可能性が高い」若しくは「転移の可能性が低い」、「治療が必要」若しくは「治療が不要」と分類され得る。分類は、「高いに対して低い」に限定されず、複数のカテゴリー、グレード決定等で実施され得る。分類はまた、広義には識別スコアとして解され、この場合、例えば相対的に高いスコアが遠隔転移の可能性が比較的高いこと、例えば遠隔転移の（全）リスクを表す。分類を可能にする識別関数の例には、これらに限定されるものでは無いが、サポート・ベクタ・マシン（support vector machines;ＳＶＭ）、ｋ近傍法（k-nearest neighbors;ｋＮＮ）、（単純）ベイズモデル[(naive) Bayes models]、線形回帰モデルによって定義される関数、又は、例えばサブグループ発見において、決定木（ディシジョン・ツリー）において、データの論理的分析（logical analysis of data;ＬＡＤ）等において、区分的に定義される関数が含まれる。広義には、数学的方法又はアルゴリズムの連続スコア値が説明のため例示され、例えば相関係数、予測、サポート・ベクタ・マシン・スコア、その他の類似性に基づく方法、これらの組合せ等が挙げられる。
【００２４】
「治療方法(therapy modality)」、「治療様式(therapy mode)」、「レジメン(regiomen)」並びに「治療レジメン(therapy regimen)」と言う用語は、癌療法のための、抗腫瘍剤、及び／又は抗血管形成剤、及び／又は免疫刺激剤、及び／又は血球増殖剤、及び／又は放射線療法、及び／又は温熱療法、及び／又は低体温法の適時連続した若しくは同時の投与又は適用を指す。これらの投与は、アジュバント様式及び／又はネオアジュバント様式で実施し得る。こうした「プロトコル」の構成は、単一薬剤の投与量、適用の時間枠、及び定義された療法ウインドウ(therapy window)内での投与頻度において、変化し得る。現在、様々な薬剤及び／又は様々な物理的方法の多様な組合せ、並びに多様なスケジュールが研究されている。
【００２５】
「細胞毒性化学療法」は、細胞増殖及び／又は細胞生存に影響を及ぼす様々な治療法を指す。治療には、アルキル化剤、代謝拮抗剤、アントラサイクリン、植物アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、並びにモノクローナル抗体及びキナーゼ阻害剤を含むその他抗腫瘍剤の投与が含まれ得る。特に、細胞毒性治療は、タキサン治療と関連し得る。タキサンは、微小管機能を阻害することによって、細胞分裂を遮断する植物アルカロイドである。原型のタキサンは、元来はタキソールとして知られる天然物のパクリタキセル(paclitaxel)であり、タイヘイヨウイチイ（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｙｅｗ）の樹木の樹皮から初めて得られたものである。ドセタキセル(docetaxel)はパクリタキセルの半合成類似体である。タキサンは、微小管の安定性を増進させ、分裂後期中の染色体の分離を防止する。
【００２６】
「内分泌治療」又は「ホルモン治療」（ときに「抗ホルモン治療」ともまた称される）は、ホルモンシグナル伝達を標的とする治療を指し、例えば、ホルモン阻害、ホルモン受容体阻害、ホルモン受容体アゴニスト又はアンタゴニストの使用、スカベンジャー受容体又はオーファン受容体の使用、ホルモン誘導体の使用、及びホルモン産生への干渉がある。特定の例としては、エストロゲン受容体のシグナル伝達を調節するタモキシフェン(tamoxifen)療法、又はステロイドホルモン産生を干渉するアロマターゼ治療がある。
【００２７】
タモキシフェンは、乳癌の治療に用いられる経口活性選択的エストロゲン受容体調節薬（selective estrogen receptor modulator;ＳＥＲＭ）であり、そして現在、この目的のために、世界で最も販売実績がある薬剤である。タモキシフェンは、ノバデックス（Ｎｏｌｖａｄｅｘ）、イスツバル（Ｉｓｔｕｂａｌ）、及びバロデックス（Ｖａｌｏｄｅｘ）と言う商標名で販売されている。しかしながら、該薬剤は、特許満了前であっても、一般名「タモキシフェン」の一般名で広く参照されていたし、さらに、依然として広くそのように参照されている。タモキシフェン及びタモキシフェン誘導体は、腫瘍及びその他標的組織上のエストロゲン受容体に競合的に結合し、ＲＮＡ合成を減少させ、かつエストロゲン効果を阻害する核複合体を生成する。
【００２８】
ステロイド受容体は、ステロイドホルモンに関するシグナル伝達を行う細胞内受容体（典型的には細胞質）である。例には、Ｉ型受容体、特に性ホルモン受容体、例えばアンドロゲン受容体、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体；グルココルチコイド受容体、ミネラルコルチコイド受容体；及びＩＩ型受容体、例えばビタミンＡ受容体、ビタミンＤ受容体、レチノイド受容体、甲状腺ホルモン受容体が含まれる。
【００２９】
「ハイブリダイゼーションに基づく方法」と言う用語は、本明細書において、相補的な一本鎖核酸又はヌクレオチド類似体を結合し、単一の二本鎖分子にするプロセスを与える方法を指す。ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体は、通常の条件下でその相補体に結合し、その結果、２つの完全に相補的な鎖は、互いに容易に結合する。生物解析においては、相補的な標的配列を見出すため、頻繁に標識された一本鎖プローブが用いられる。こうした配列が試料中に存在するならば、プローブは上記配列にハイブリダイズし、次いでこれを標識によって検出することが出来る。ハイブリダイゼーションに基づくその他の方法は、マイクロアレイ法及び／又はバイオチップ法を含む。これらの方法では、プローブは固相に固定されており、該固相を次いで試料に曝露する。相補的な核酸が試料中に存在する場合、これらはプローブにハイブリダイズし、従って検出することが出来る。これらの手法はまた、「アレイに基づく方法」として知られている。ハイブリダイゼーションに基づくさらに別の方法は、以下に記載されるＰＣＲである。発現レベルの決定の場合、例えばハイブリダイゼーションに基づく方法を用いて、所定の遺伝子に関するｍＲＮＡの量を決定し得る。
【００３０】
遺伝子又はその断片の配列に特異的に結合することが可能であるオリゴヌクレオチドは、遺伝子又は遺伝子産物、例えば遺伝子のｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡ、又はそれらの断片に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドに関する。遺伝子又は遺伝子産物を特異的に検出するために、遺伝子の全配列を検出する必要はない。約２０〜１５０塩基の断片は、特異的ハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な配列特異的情報を含む。
【００３１】
「ＰＣＲに基づく方法」という用語は、本明細書において、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む方法に関する。これは、インビトロの酵素による複製によって、核酸、例えばＤＮＡを指数関数的に増幅する方法である。ＰＣＲは、インビトロ技術であるため、ＤＮＡと言う形態に制限されることなく実施可能であり、大幅に改変し、広範囲の遺伝子操作を実施することが可能である。発現レベルの決定に関しては、例えば、ＰＣＲに基づく方法を用いて、（１）逆転写酵素を用いて、完全ｍＲＮＡプール（いわゆるトランスクリプトーム）をｃＤＮＡに逆転写し、さらに（２）各プライマーを用いて、所定のｃＤＮＡの存在を検出することによって、所定のｍＲＮＡの存在を検出することも出来る。この手法は、一般に、逆転写酵素ＰＣＲ（ｒｔＰＣＲ）として知られている。
【００３２】
さらに、ＰＣＲに基づく方法は、例えばリアルタイムＰＣＲを含み、発現レベルの解析、キネティックＰＣＲ又は定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）に特に適している。
【００３３】
「定量的ＰＣＲ」（ｑＰＣＲ）と言う用語は、試料中の鋳型の定量を可能にする任意の種類のＰＣＲ法を指す。定量リアルタイムＰＣＲは、例えばタックマン（ＴａｑＭａｎ）技術又はライトサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ）技術のような性能又は産物検出の様々な技術を含む。タックマン（ＴａｑＭａｎ）技術では、例えば、二重標識蛍光プローブを用いる。タックマン（ＴａｑＭａｎ）リアルタイムＰＣＲでは、従来のＰＣＲにおけるような終点ではなくて、ＰＣＲの指数関数段階の間でのフルオロフォアを介した産物の蓄積を測定する。産物の指数関数的増加を用いて、閾値サイクルのＣＴ、即ち蛍光における有意な指数関数的増加が検出されるＰＣＲサイクルの数が決定されるが、このＣＴは、反応に存在するＤＮＡ鋳型のコピー数に直接相関するものである。反応の設定は、従来のＰＣＲに非常に類似するものであるが、ＰＣＲチューブ中の蛍光分子の測定を可能にするリアルタイムサーマルサイクラー中で実施される。通常のＰＣＲとは異なり、タックマン（7ＴａｑＭａｎ）リアルタイムＰＣＲにおいては、プローブが、すなわちＤＮＡ鋳型内の２０〜６０個のヌクレオチドのセグメントに相補的であり、かつ２つのプライマーの間に位置する一本鎖オリゴヌクレオチドが、反応に添加される。蛍光レポーター又はフルオロフォア（例えば６−カルボキシフルオレセイン、頭字語：ＦＡＭ、又はテトラクロロフルオレセイン、頭字語：ＴＥＴ）及び消光剤（例えばテトラメチルローダミン、頭字語：ＴＡＭＲＡ、又はジヒドロシクロピロロインドール・トリペプチド「ブラックホール消光剤」、頭字語：ＢＨＱ）を、プローブの５’末端及び３’末端それぞれに共有結合させる［２］。プローブに結合させたフルオロフォア及び消光剤の間が非常に近接していると、フルオロフォアからの蛍光が阻害される。ＰＣＲの間、ＤＮＡ合成が開始すると、Ｔａｑポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性が、鋳型にアニーリングしているプローブのその部分を分解する。プローブの分解によって、プローブから蛍光が放出され、消光剤への近接状態が解除されることにより消光効果が軽減され、かつフルオロフォアの蛍光放出が可能になる。従って、リアルタイムＰＣＲサーマルサイクラーにおいて検出される蛍光は、放出されたフルオロフォア及びＰＣＲ中に存在するＤＮＡ鋳型の量に直接比例する。
【００３４】
「アレイ」又は「マトリックス」は、装置上のアドレス可能な位置又は「アドレス」の配置を意味する。位置は、二次元アレイ、三次元アレイ、又はその他マトリックス形式で配置されてもよい。位置の数は、数個から少なくとも数十万の範囲であり得る。最も重要ことは、各位置は、完全に独立な反応部位に相当する。アレイには、限定されるものでも無いが、核酸アレイ、タンパク質アレイ及び抗体アレイが含まれる。「核酸アレイ」とは、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、ポリヌクレオチド、ヌクレオチド類似体のポリマー、モルホリノ又は遺伝子のより大きい部分等の核酸プローブを含有するアレイを指す。アレイ上の核酸及び／又は類似体は、好ましくは一本鎖である。プローブがオリゴヌクレオチドであるアレイは、「オリゴヌクレオチド・アレイ」又は「オリゴヌクレオチド・チップ」と称される。本明細書において「マイクロアレイ」はまた、少なくとも約１００／ｃｍ2、好ましくは少なくとも約１０００／ｃｍ2の密度の不連続部位を有する領域のアレイである、「バイオチップ」又は「生物学的チップ」も指す。
【００３５】
本発明の意義の範囲内において「プライマー対」及び「プローブ」とは、分子生物学の分野において当業者に周知である、これら用語の一般的な意味を有するものとする。本発明の好ましい実施形態においては、「プライマー対」及び「プローブ」は、検出し又は定量しようとする標的ポリヌクレオチドの領域に同一であるか、相補的であるか、相同であるか、又は該領域の相補体に相同である配列を有するポリヌクレオチド分子と解される。さらに別の実施形態においては、ヌクレオチド類似体はまた、プライマー及び／又はプローブとしての使用のためにも構成される。キネティックＰＣＲ又はリアルタイムＰＣＲのアプリケーションのために用いられるプローブ技術は、例えば、アプライド・バイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から入手可能なタックマン（ＴａｑＭａｎ）（登録商標）システム、スコーピオン（Scorpion）（登録商標）プライマー等の伸長プローブ、デュアル・ハイブリダイゼーション・プローブ(Dual Hybridisation Probes)、ケミコン・インターナショナル社（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｉｎｃ）から入手可能なアンプリフルア（Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒ）（登録商標）、又は小溝結合剤(minor groove binder)であり得る。
【００３６】
本発明の意義の範囲内において、「個々に標識されたプローブ」とは、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド又はヌクレオチド類似体、並びにプローブの検出又は定量に有用な標識を含む分子プローブと解される。好ましい標識は、蛍光分子、発光分子、放射性分子、酵素分子、及び／又は消光分子である。
【００３７】
本発明の意義の範囲内において、「アレイ化プローブ」とは、固定されたプローブの集合であると解され、好ましくは規則的な配置で固定されたものである。本発明の好ましい実施形態においては、個々の「アレイ化プローブ」は、固体支持体上、例えば「チップ」上のそれら各位置によって特定され得る。
【００３８】
「実質的に相同な」と言う用語は、一本鎖核酸配列に関係して用いられる場合、上記のような低ストリンジェンシーの条件下で、一本鎖核酸配列にハイブリダイズ可能な（すなわちその相補体である）任意のプローブを指す。
【００３９】
発明の概要
一般論としては、本発明は、結節陰性又は結節陽性、エストロゲン受容体陽性、かつＨＥＲ２／ＮＥＵ陰性の乳癌患者、特に内分泌療法を受けている患者、例えばタモキシフェンで治療されている患者の再発リスクを評価する方法を提供する。エストロゲン受容体状態は、一般に、免疫組織化学法を用いて決定され、ＨＥＲ２／ＮＥＵ（ＥＲＢＢ２）状態は、一般に、免疫組織化学及び蛍光インサイチュ・ハイブリダイゼーションを用いて決定される。しかしながら、エストロゲン受容体状態及びＨＥＲ２／ＮＥＵ（ＥＲＢＢ２）状態は、本発明のためには、例えば免疫組織化学法、蛍光インサイチュー・ハイブリダイゼーション（fluorescence in situ hybridization;ＦＩＳＨ）、又はＲＮＡ発現解析等の任意の適切な方法によって決定され得る。
【００４０】
本発明は、乳癌患者の、エストロゲン受容体陽性かつＨＥＲ２陰性である腫瘍において乳癌の転帰を予測するための方法であって、
（ａ）上記患者由来の腫瘍試料において、以下の９つの遺伝子：ＵＢＥ２Ｃ、ＢＩＲＣ５、ＲＡＣＧＡＰ１、ＤＨＣＲ７、ＳＴＣ２、ＡＺＧＰ１、ＲＢＢＰ８、ＩＬ６ＳＴ、及びＭＧＰの少なくとも２つのＲＮＡ発現レベルを決定すること、
（ｂ）上記セットの遺伝子の発現レベル値であって、上記腫瘍試料において決定した当該値を数学的に組合せて、組合せスコアを得ること、但し、上記組合せスコアは上記患者の予後を示す、
を含む、上記方法に関する。一の実施形態においては、少なくとも３個、４個、５個又は６個の遺伝子が選択される。
【００４１】
本発明のさらなる実施形態においては、当該方法は、以下を含む：
（ａ）上記患者由来の腫瘍試料において、以下の８つの遺伝子：ＵＢＥ２Ｃ、ＲＡＣＧＡＰ１、ＤＨＣＲ７、ＳＴＣ２、ＡＺＧＰ１、ＲＢＢＰ８、ＩＬ６ＳＴ、及びＭＧＰのＲＮＡ発現レベルを決定すること、
（ｂ）上記セットの遺伝子の発現レベル値であって、上記腫瘍試料において測定した当該値を数学的に組合せて、組合せスコアを得ること、但し、上記組合せスコアは上記患者の予後を示す。
【００４２】
さらなる実施形態においては、本発明の方法は、以下を含む：
（ａ）上記患者由来の腫瘍試料において、以下の８つの遺伝子：ＵＢＥ２Ｃ、ＢＩＲＣ５、ＤＨＣＲ７、ＳＴＣ２、ＡＺＧＰ１、ＲＢＢＰ８、ＩＬ６ＳＴ、及びＭＧＰのＲＮＡ発現レベルを測定すること、
（ｂ）上記セットの遺伝子の発現レベル値であって、上記腫瘍試料において測定した当該値を数学的に組合せて、組合せスコアを得ること、但し、上記組合せスコアは上記患者の予後を示す。
【００４３】
本発明のさらに別の実施形態においては、
ＢＩＲＣ５は、ＵＢＥ２Ｃ又はＴＯＰ２Ａ又はＲＡＣＧＡＰ１又はＡＵＲＫＡ又はＮＥＫ２又はＥ２Ｆ８又はＰＣＮＡ又はＣＹＢＲＤ１又はＤＣＮ又はＡＤＲＡ２Ａ又はＳＱＬＥ又はＣＸＣＬ１２又はＥＰＨＸ２又はＡＳＰＨ又はＰＲＳＳ１６又はＥＧＦＲ又はＣＣＮＤ１又はＴＲＩＭ２９又はＤＨＣＲ７又はＰＩＰ又はＴＦＡＰ２Ｂ又はＷＮＴ５Ａ又はＡＰＯＤ又はＰＴＰＲＴによって置換されてもよく、但し、置換後、８つの異なる遺伝子が選択される；かつ
ＵＢＥ２Ｃは、ＢＩＲＣ５又はＲＡＣＧＡＰ１又はＴＯＰ２Ａ又はＡＵＲＫＡ又はＮＥＫ２又はＥ２Ｆ８又はＰＣＮＡ又はＣＹＢＲＤ１又はＡＤＲＡ２Ａ又はＤＣＮ又はＳＱＬＥ又はＣＣＮＤ１又はＡＳＰＨ又はＣＸＣＬ１２又はＰＩＰ又はＰＲＳＳ１６又はＥＧＦＲ又はＤＨＣＲ７又はＥＰＨＸ２又はＴＲＩＭ２９によって置換されてもよく、但し、置換後、８つの異なる遺伝子が選択される；かつ
ＤＨＣＲ７は、ＡＵＲＫＡ、ＢＩＲＣ５、ＵＢＥ２Ｃ、又は、ＢＩＲＣ５若しくはＵＢＥ２Ｃを置換し得る任意のその他遺伝子によって置換されてもよく、但し、置換後、８つの異なる遺伝子が選択される；かつ
ＳＴＣ２は、ＩＮＰＰ４Ｂ又はＩＬ６ＳＴ又はＳＥＣ１４Ｌ２又はＭＡＰＴ又はＣＨＰＴ１又はＡＢＡＴ又はＳＣＵＢＥ２又はＥＳＲ１又はＲＢＢＰ８又はＰＧＲ又はＰＴＰＲＴ又はＨＳＰＡ２又はＰＴＧＥＲ３によって置換されてもよく、但し、置換後、８つの異なる遺伝子が選択される；かつ
ＡＺＧＰ１は、ＰＩＰ又はＥＰＨＸ２又はＰＬＡＴ又はＳＥＣ１４Ｌ２又はＳＣＵＢＥ２又はＰＧＲによって置換されてもよく、但し、置換後、８つの異なる遺伝子が選択される；かつ
ＲＢＢＰ８は、ＣＥＬＳＲ２又はＰＧＲ又はＳＴＣ２又はＡＢＡＴ又はＩＬ６ＳＴで置換されてもよく、但し、置換後、８つの異なる遺伝子が選択される；かつ
ＩＬ６ＳＴは、ＩＮＰＰ４Ｂ又はＳＴＣ２又はＭＡＰＴ又はＳＣＵＢＥ２又はＡＢＡＴ又はＰＧＲ又はＳＥＣ１４Ｌ２又はＥＳＲ１又はＧＪＡ１又はＭＧＰ又はＥＰＨＸ２又はＲＢＢＰ８又はＰＴＰＲＴ又はＰＬＡＴによって置換されてもよく、但し、置換後、８つの異なる遺伝子が選択される；かつ
ＭＧＰは、ＡＰＯＤ又はＩＬ６ＳＴ又はＥＧＦＲによって置換されてもよい、但し、置換後、８つの異なる遺伝子が選択される。
【００４４】
本発明の一態様によれば、上記のような方法であって、上記組合せスコアが、細胞毒性化学療法の効果を示す、当該方法が提供される。
【００４５】
患者が内分泌療法を受ける前に、本発明の方法を用いると、内分泌療法の有効性の予測が可能になる。
【００４６】
以下の表２には、上記マーカー遺伝子のそれぞれの過剰発現が、内分泌療法を受けている患者において、転帰良好又は転帰不良を示すかどうかが示されている。従って、当業者は、所定の遺伝子の効果を考慮に入れた数学的組合せ、即ちアルゴリズムを構築することも可能である。例えば、その過剰発現が転帰良好を示す遺伝子の和又は加重和は、高いリスクスコアが転帰良好を示すアルゴリズムとなる。アルゴリズムの有効性は、臨床記録とともに患者の腫瘍試料を分析することによって調べてもよく、例えば、転帰良好の患者及び転帰不良の患者についてスコアを別々に決定し、そして比較してもよい。当業者となる生物統計学者は、さらなる数学的方法、例えば識別関数を適用して、最適化されたアルゴリズムを得ることを知っている。アルゴリズムは、例えば感度又は特異性に関して最適化され得る。アルゴリズムは、マーカー遺伝子の遺伝子発現を測定するために用いられる特定の解析プラットフォーム、例えば定量的ＰＣＲに適応され得る。
【００４７】
本発明の一態様によれば、上記の如く方法であって、上記内分泌療法がタモキシフェン又はアロマターゼ阻害剤を含む、当該方法が提供される。
【００４８】
本発明の一態様によれば、上記の如く方法であって、再発するリスクが予測される、当該方法が提供される。
【００４９】
本発明の一態様によれば、、上記の如く方法であって、上記発現レベルが非タンパク質発現レベルとして決定される、当該方法が提供される。
【００５０】
本発明の一態様によれば、上記の如く方法であって、上記発現レベルがＲＮＡ発現レベルとして決定される、当該方法が提供される。
【００５１】
本発明の一態様によれば、上記の如く方法であって、上記発現レベルが以下の少なくとも１つによって決定される、当該方法が提供される：
ＰＣＲに基づく方法、
マイクロアレイに基づく方法、及び
ハイブリダイゼーションに基づく方法。
【００５２】
本発明の一態様によれば、上記の如く方法であって、発現レベルの上記決定が、ホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍試料又は新鮮凍結腫瘍試料におけるものである、当該方法が提供される。
【００５３】
本発明の一態様によれば、上記の如く方法であって、少なくとも１つのマーカー遺伝子の発現レベルが、少なくとも１つの参照遺伝子又は計算平均発現値に対する発現パターンとして決定される、当該方法が提供される。
【００５４】
本発明の一態様によれば、上記の如く方法であって、数学的に組合せる上記工程が、所定の遺伝子の発現レベルを表す値にアルゴリズムを適用する工程を含む、当該方法が提供される。
【００５５】
本発明の一態様によれば、上記の如く方法であって、上記アルゴリズムが、所定の遺伝子の発現レベルを表す上記値の線形結合(linear combination)である、当該方法が提供される。
【００５６】
本発明の一態様によれば、上記の如く方法であって、所定の遺伝子の発現レベルの代表値に関する値に係数が乗じられる、当該方法が提供される。
【００５７】
本発明の一態様によれば、上記の如く方法であり、１つ、又は２つ以上の閾値が上記組合せスコアに関して決定される方法であって、該閾値が、該組合せスコアに当該閾値を適用することによって、高リスク及び低リスク；高リスク、中間リスク及び低リスク；又はそれより多いリスク群に識別する、上記方法が提供される。
【００５８】
本発明の一態様によれば、上記の如く方法であって、高い組合せスコアは、より積極的な療法、例えば細胞毒性化学療法の効果を示す、当該方法が提供される。当業者は、この点で「高スコア」が、参照値又はカットオフ値に関連すると理解する。当業者はさらに、組合せスコアを得るために用いる特定のアルゴリズムに応じて、カットオフ値又は参照値よりも低い「低」スコアもまた、より積極的な療法、例えば細胞毒性化学療法の効果を示し得ることを理解する。これは、転移の高リスクと正の相関を有する遺伝子をアルゴリズムの要素として考慮し、その結果、全体の高スコアが、高リスクとの正の相関を有する遺伝子の高発現を示す場合である。
【００５９】
本発明の一態様によれば、上記の如く方法であって、上記遺伝子の発現レベル値を数学的に組合せて、組合せスコアを得る工程において、患者の結節状態に関する情報が処理される、当該方法が提供される。
【００６０】
本発明の一態様によれば、上記の如く方法であって、上記結節状態が陰性である場合、結節状態に関する上記情報は≦０の数値であり、並びに、上記結節状態が陽性であるか又は未知である場合、当該情報は＞０の数値である、上記方法が提供される。本発明の例示的な実施形態においては、陰性の結節状態は値０を割り当てられ、未知の結節状態は値０．５を割り当てられ、並びに陽性の結節状態は値1を割り当てられる。アルゴリズム内では、結節状態の異なる加重を反映するのに、その他の値を選択し得る。
【００６１】
本発明はさらに、上記の如く方法を実施するためのキットであって、該キットは、遺伝子の組合せにおける該遺伝子の配列に又は該遺伝子の断片の配列に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドセットを含み、
（ｉ）上記組合せが、以下の少なくとも８つの遺伝子：ＵＢＥ２Ｃ、ＢＩＲＣ５、ＤＨＣＲ７、ＳＴＣ２、ＡＺＧＰ１、ＲＢＢＰ８、ＩＬ６ＳＴ、及びＭＧＰを含むか；又は
（ｉｉ）上記組合せが、以下の少なくとも１０の遺伝子：ＢＩＲＣ５、ＡＵＲＫＡ、ＰＶＡＬＢ、ＮＭＵ、ＳＴＣ２、ＲＢＢＰ８、ＰＴＧＥＲ３、ＣＸＣＬ１２、ＣＤＨ１、及びＰＩＰを含むか；又は
（ｉｉｉ）上記組合せが、以下の少なくとも９つの遺伝子：ＢＩＲＣ５、ＤＨＣＲ７、ＲＡＣＧＡＰ１、ＰＶＡＬＢ、ＳＴＣ２、ＩＬ６ＳＴ、ＰＴＧＥＲ３、ＣＸＣＬ１２、及びＡＢＡＴを含むか；又は
（ｉｖ）上記組合せが、以下の少なくとも９つの遺伝子：ＤＨＣＲ７、ＲＡＣＧＡＰ１、ＮＭＵ、ＡＺＧＰ１、ＲＢＢＰ８、ＩＬ６ＳＴ、及びＭＧＰを含む、
上記キットに関する。
【００６２】
本発明はさらに、請求項１から１７の何れか１項に記載の方法を実施するためのキットの使用であって、該キットは、遺伝子の組合せにおける該遺伝子の配列に又は該遺伝子の断片の配列に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドセットを含み、
（ｉ）上記組合せが、以下の少なくとも８つの遺伝子：ＵＢＥ２Ｃ、ＢＩＲＣ５、ＤＨＣＲ７、ＳＴＣ２、ＡＺＧＰ１、ＲＢＢＰ８、ＩＬ６ＳＴ、及びＭＧＰを含むか；又は
（ｉｉ）上記組合せが、以下の少なくとも１０の遺伝子：ＢＩＲＣ５、ＡＵＲＫＡ、ＰＶＡＬＢ、ＮＭＵ、ＳＴＣ２、ＲＢＢＰ８、ＰＴＧＥＲ３、ＣＸＣＬ１２、ＣＤＨ１、及びＰＩＰを含むか；又は
（ｉｉｉ）上記組合せが、以下の少なくとも９つの遺伝子：ＢＩＲＣ５、ＤＨＣＲ７、ＲＡＣＧＡＰ１、ＰＶＡＬＢ、ＳＴＣ２、ＩＬ６ＳＴ、ＰＴＧＥＲ３、ＣＸＣＬ１２、及びＡＢＡＴを含むか；又は
（ｉｖ）上記組合せが、以下の少なくとも９つの遺伝子：ＤＨＣＲ７、ＲＡＣＧＡＰ１、ＮＭＵ、ＡＺＧＰ１、ＲＢＢＰ８、ＩＬ６ＳＴ、及びＭＧＰを含む、
上記使用に関する。１９．ＡＫＲ１Ｃ３遺伝子、ＭＡＰ４遺伝子及びＳＰＲ１遺伝子の発現レベルを表す値を処理し、組合せスコアを得ることが可能なコンピュータプログラム製品であって、該装置は、上記値を数学的に組合せることによって該値を処理し、組合せスコアを得ることが可能であり、上記組合せスコアは、患者における細胞毒性化学療法の効果を示す、上記コンピュータプログラム製品。
【００６３】
本発明はさらに、遺伝子の組合せの発現レベルを表す値を処理することが可能なコンピュータプログラム製品であって、上記値を数学的に組合せることによって該値を処理し、組合せスコアを得ることが可能であり、上記組合せスコアは、患者における細胞毒性化学療法の効果を示す、上記コンピュータプログラム製品に関する。
【００６４】
上記コンピュータプログラム製品は、データ記憶媒体上に保存されてもよいし、又は所定の遺伝子の発現レベルを表す値を出力することが可能な診断システム上に実装されてもよく、例えばリアルタイムＰＣＲシステム上に実装されてもよい。
【００６５】
コンピュータプログラム製品が、データキャリアー上に保存されるか、又はコンピュータ上で実行される場合、操作する者は、各遺伝子の発現レベルに関して得られた発現値を入力することが出来る。次いで、コンピュータプログラム製品は、アルゴリズムを適用して、所定の患者に関して、細胞毒性化学療法の効果を示す組合せスコアを生成し得る。
【００６６】
本発明の方法は、少数の遺伝子のみ用いることに基づいて、疾患転帰の信頼性が高い予測を提供するという利点を有する。本発明の方法は、特に、内分泌治療、例えばタモキシフェンによるものに対する、ＥＳＲ１陽性及びＥＲＢＢ２陰性と分類される腫瘍を有する患者の反応を分析するのに適していることが見出されている。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】図１は、組合せ群におけるＴ５スコアの９５％信頼区間を伴う補正ハザード単位比のフォレストＦｏｒｒｅｓｔプロット）、並びに遠隔転移を終点として用いた、ＡＢＣＳＧ０６及び０８研究の個々の治療群を示す。
【図２】図２は、Ｔ５スコア値に従って、高リスク又は低リスクとして階層化した、組合せＡＢＣＳＧ０６及び０８群に由来のＥＲ＋、ＨＥＲ−、Ｎ０−３患者のカプラン・マイヤー（Ｋａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ）分析を示す。
【図３】図３は、訓練データにける発現の結合分布を示す。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００６８】
本発明を、例示的実施形態及び付随する図とともに説明する。
【００６９】
図１は、組合せ群におけるＴ５スコアの９５％信頼区間を伴う補正ハザード単位比のフォレストＦｏｒｒｅｓｔプロット）、並びに遠隔転移を終点として用いた、ＡＢＣＳＧ０６及び０８研究の個々の治療群を示す。
【００７０】
図２は、Ｔ５スコア値に従って、高リスク又は低リスクとして階層化した、組合せＡＢＣＳＧ０６及び０８群に由来のＥＲ＋、ＨＥＲ−、Ｎ０−３患者のカプラン・マイヤー（Ｋａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ）分析を示す。
【００７１】
本明細書において提示される新規予測試験のためのアルゴリズムとするために組合せることが出来るマーカー遺伝子の特有な組合せが、本明細書において開示される。技術的には、本発明の方法は、以下の２つの技術を用いて実施され得る：１）新鮮腫瘍組織又は固定腫瘍組織からのトータルＲＮＡの単離、並びに２）上記単離核酸のキネティックＲＴ−ＰＣＲ。或いは、代替技術を用いることによって、例えばマイクロアレイによって、又はタンパク質レベルでの測定によって、発現レベルを測定することも考慮される。
【００７２】
本発明の方法は、発現値を得ることを目的とした腫瘍から単離したＲＮＡ種の定量、並びにそれに続く、上記決定された発現値のバイオインフォマティクス解析に基づく。ＲＮＡ種は、任意の種類の腫瘍試料から単離することが可能であり、例えば生検試料、塗抹標本試料、切除腫瘍材料、新鮮凍結腫瘍組織又はパラフィン包埋ホルマリン固定腫瘍組織から単離することが可能である。まず、ＵＢＥ２Ｃ遺伝子、ＢＩＲＣ５遺伝子、ＤＨＣＲ７遺伝子、ＲＡＣＧＡＰ１遺伝子、ＡＵＲＫＡ遺伝子、ＰＶＡＬＢ遺伝子、ＮＭＵ遺伝子、ＳＴＣ２遺伝子、ＡＺＧＰ１遺伝子、ＲＢＢＰ８遺伝子、ＩＬ６ＳＴ遺伝子、ＭＧＰ遺伝子、ＰＴＧＥＲ３遺伝子、ＣＸＣＬ１２遺伝子、ＡＢＡＴ遺伝子、ＣＤＨ１遺伝子、及びＰＩＰ遺伝子の特定の組合せ、又は表記されるようなそれらの特定の組合せをコードする遺伝子のＲＮＡレベルを決定する。これらの発現値に基づいて、数学的組合せ、例えば式Ｔ５、Ｔ１、Ｔ４、又はＴ５ｂ（以下を参照されたい）に従って、予後スコアが計算される。高スコア値は、遠隔転移の発症に関する高リスクを示し、低スコア値は遠隔転移の低リスクを示す。その結果、高スコア値はまた、患者が、より積極的な療法、例えば細胞毒性化学療法の効果を得るであろう高リスク患者であることも示す。
【００７３】
本実施例は、タモキシフェンを用いてアジュバント設定で均質に治療された複数患者の腫瘍を用いた予後遺伝子の同定に基づくものである。さらに、関連遺伝子の同定は、ＲＮＡ発現レベルに基づいてＥＳＲ１陽性かつＥＲＢＢ２陰性と分類される腫瘍に限定された。加えて、中間リスク、例えばグレード２の腫瘍を分離することを可能にする遺伝子が、アルゴリズム開発のために考慮された。最後に、アフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）ＨＧ＿Ｕ１３３ａアレイから定量リアルタイムＰＣＲへのプラットフォームの移行、並びに新鮮凍結組織からＦＦＰＥ組織への試料種類の移行を行って、プラットフォーム及び組織の種類には依存しない、強固なアルゴリズム性能を確保した。その結果、上述のような原発性腫瘍由来のＲＮＡ種の発現レベル決定、並びにそれに続く複素多変量解析(complex and multivariate analysis)によって、アジュバント設定でタモキシフェンのみで治療した際の、リンパ節陰性又は陽性初期乳癌と診断された患者における疾患再発の尤度を予測するための優れた方法が提供される。従って、該試験は、競合者のものよりも少ない遺伝子に依存するものであるが、特に標準的臨床因子に基づいて中間の再発リスクを示すと考えられる腫瘍について、高い感度及び陰性適中率に関する、優れた情報を提供する。
【００７４】
ハミルトン社製マイクロラボ・スターレット（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ＭＩＣＲＯＬＡＢ  ＳＴＡＲｌｅｔ）液体処理ロボット上で、１つ１０μｍの全ＦＦＰＥ組織切片から、シリカビーズに基づき、かつ完全に自動化された、シーメンス（Ｓｉｅｍｅｎｓ）社のＲＮＡ単離法を用いて、トータルＲＮＡを抽出した（１７）。該ロボット、バッファー、及び化学薬品は、シーメンス（Ｓｉｅｍｅｎｓ）社のヴァーサント（ＶＥＲＳＡＮＴ）（登録商標）ｋＰＣＲ分子システム[シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティクス（Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）社、ニューヨーク州タリータウン；米国においては商業的に入手不可能]の一部であった。簡潔に説明すると、１５０μＬのＦＦＰＥバッファー（ＦＦＰＥバッファー、研究試薬、シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティクス社）を各切片に添加し、振盪しながら８０℃で３０分間インキュベートして、パラフィンを融解した。冷却した後、プロテイナーゼＫを添加し、そして６５℃で３０分間インキュベートした。溶解後、４０μＬのシリカコーティング酸化鉄ビーズとともに、６５℃で１５分間インキュベートする工程によって、組織残屑を溶解液から除去した。組織破片が表面に結合したビーズを磁石で分離し、溶解物を、標準的な２ｍＬディープ・ウェルプレートに移した（９６ウェル）。ここで、トータルＲＮＡ及びＤＮＡを４０μＬの未使用ビーズに結合させ、室温でインキュベートした。６００μＬの溶解バッファーを添加することによって、カオトロピック条件を生じさせた。次いで、ビーズを磁気的に分離し、上清を廃棄した。その後、表面に結合した核酸を３回洗浄した後、磁化を行い、吸引し、そして上清を廃棄した。その後、振盪しながらビーズを１００μＬの溶出バッファーとインキュベートすることによって、核酸を溶出させた。最後に、ビーズを分離して、そして上清を１２μＬのＤＮアーゼＩミックス[２μＬ  ＤＮアーゼＩ（ＲＮアーゼ非含有）；１０μＬの１０ｘＤＮアーゼＩバッファー；アンビオン／アプライド・バイオシステムズ社（Ａｍｂｉｏｎ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ドイツ・ダルムシュタット]とインキュベートして、混入するＤＮＡを除去した。３７℃で３０分間インキュベートした後、ＤＮＡ非含有トータルＲＮＡ溶液を分注し、−８０℃で保存するか、又は逆転写キネティックＰＣＲ（ＲＴｋＰＣＲ）によるｍＲＮＡ発現解析に直接用いた。最大３つの参照遺伝子（ＲＰＬ３７Ａ、ＣＡＬＭ２、ＯＡＺ１）、並びに最大１６個の標的遺伝子の遺伝子発現に関し、エー・ビー・アイ・プリズム（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ）（登録商標）７９００ＨＴ[アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社、ドイツ・ダルムシュタット]において、一工程ＲＴ−ｋＰＣＲで、全ての試料を解析した。製造元の指示に従って、ＲＯＸ（６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン）を伴うスープ―スクリプト（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ）（登録商標）ＩＩＩプラチナ（Ｐｌａｔｉｎｕｍ）（登録商標）一工程定量ＲＴ−ＰＣＲシステム（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社、ドイツ・カールスルーエ）を用いた。各プローブ及びプライマーを表１に示す。ＰＣＲ条件��以下の通りであった：５０℃３０分間、９５℃２分間、その後、９５℃１５秒間及び６０℃３０秒間を４０サイクル。全てのＰＣＲアッセイはトリプリケートで行った。ＲＮＡ収量に関する代理マーカーとして、ハウスキーピング遺伝子であるＲＰＬ３７Ａのサイクル閾値（Ｃｔ）を別の箇所に記載されるように用いた（１７）。標的遺伝子の相対遺伝子発現レベルを、以下の式を用い、デルタＣｔ法によって計算した：
２０−（Ｃｔ（標的）−平均（Ｃｔ（参照遺伝子）））。
【００７５】
アフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）ＨＧ＿Ｕ１３３ａアレイ（新鮮凍結組織）から定量的リアルタイムＰＣＲ（ＦＦＰＥ組織）へのプラットフォーム移行を、以下のように計算した。両プラットフォームを用いて、１５８人の患者に由来する材料を測定して、対を成す試料を得た。デルタＣｔ値をＰＣＲデータから計算した。下限（下限未満のすべての値を下限に設定する）を適用し、次いで底２の対数を計算することによってＬｏｇ２発現値を計算した。下限の適用によって、低発現遺伝子／試料に関する相対的測定ノイズ増加の影響を減少させる；２０の下限を用い、０．１〜２００の間の下限もまた上手く機能する。デルタＣｔ値（ＰＣＲ由来）とｌｏｇ２発現値（アフィメトリクス；Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ由来）との間のピアソン相関係数(Pearson correlation coefficient)を最大化することによって、各ＰＣＲ測定遺伝子に関して、ＨＧ＿Ｕ１３３ａプローブセットを選択した。他の相関測定値、例えばスピアマン相関係数（Spearman correlation coefficient）もまた上手く機能するであろう。大抵の場合、最適相関プローブセットは意図される遺伝子に属し、残りの場合に関しては、さらなる処理のためにはＰＣＲ遺伝子を除外した。プラットフォーム間で不良な相関を示す遺伝子もまた除外したが、ここでは０．７のピアソン相関係数に対する閾値を用いた（０．５〜０．８の間の値も上手く機能する）。両プラットフォームに関して、教師なしｚ変換値を計算し、それらを組合せることによって、プラットフォーム変換を完了させ、次いで、単一のＰＣＲデルタＣｔ値を以下の工程によって、アフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）スケールに変換する：（ｉ）係数が、ＰＣＲデータのｚ変換によって決定される、アフィン線形変換(affine linear transformation)を適用し、（ｉｉ）係数が、アフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）データのｚ変換によって決定される、逆アフィン線形変換(inverse affine linear transformation)を適用し、（ｉｉｉ）ｌｏｇ２を反転させる、すなわち底２に対して指数関数を計算する。２倍ｚ変換(two-fold z-transformation)の代替法は、線形回帰又はより高次の回帰、ロバスト回帰又は主成分に基づく方法であり、これらもまた、上手く機能するであろう。
【００７６】
プライマー及びプローブの配列は以下の通りであった。
【００７７】
【表１】
0005940517.tif 000002
0005940517.tif 000003
【００７８】
以下の表２には、本発明の方法で用いられた遺伝子であり、特定の実施形態Ｔ５、Ｔ１、Ｔ４、及びＴ５ｂで用いられた遺伝子が列挙されている。表２にはまた、所定の遺伝子の過剰発現が、タモキシフェン療法下で転帰良好又は転帰不良を示すかどうかも示されている。表２には、遺伝子の機能、細胞内領域局在性及び該遺伝子が関与する細胞プロセスが列挙されている。
【００７９】
【表２】
0005940517.tif 000004
0005940517.tif 000005
【００８０】
以下の表３は、各アルゴリズムに用いた遺伝子の組合せを示す。
【００８１】
【表３】
0005940517.tif 000006
【００８２】
以下の表４は、本発明のマーカー遺伝子のＡｆｆｙプローブセットＩＤ及びタックマン（ＴａｑＭａｎ）デザインＩＤマッピングを示す。
【００８３】
【表４】
0005940517.tif 000007
【００８４】
以下の表５には、本発明のマーカー遺伝子の正式名称、アントレ遺伝子ＩＤ(Entrez GeneID)、遺伝子バンクアクセション番号(gene bank accession number)及び染色体位置が示されている。
【００８５】
【表５】
0005940517.tif 000008
【００８６】
アルゴリズム例Ｔ５：
アルゴリズムＴ５は、各メンバーが２つの遺伝子の線形組合せである４つのメンバーのコミッティである。Ｔ５の数式を以下に示す。表記法はＴ１に関するものと同じである。Ｔ５は、遺伝子発現データのみから計算可能である。
【００８７】
riskMember1 = 0.434039 [0.301..0.567] * (0.939 * BIRC5 -3.831)
-0.491845 [-0.714..-0.270] * (0.707 * RBBP8 -0.934)
riskMember2 = 0.488785 [0.302..0.675] * (0.794 * UBE2C -1.416)
-0.374702 [-0.570..-0.179] * (0.814 * IL6ST -5.034)
riskMember3 = -0.39169 [-0.541..-0.242] * (0.674 * AZGP1 -0.777)
+0.44229 [0.256..0.628] * (0.891 * DHCR7 -4.378)
riskMember4 = -0.377752 [-0.543..-0.212] * (0.485 * MGP +4.330)
-0.177669 [-0.267..-0.088] * (0.826 * STC2 -3.630)
risk = riskMember1 + riskMember2 + riskMember3 + riskMember4
【００８８】
各行の左の係数は、ＣＯＸ比例ハザード回帰係数として計算され、角括弧中の数字は、これらの係数に関する９５％信頼限界を示す。言い換えると、（０．９３９*ＢＩＲＣ５−３．８３１）の項に０．４３４０３９を乗じる代わりに、０．３０１と０．５６７との間における任意の係数を乗じてもよく、それでもなお９５％信頼限界内の予測結果を生じ得る。各行右側の丸括弧中の項は、ＰＣＲからアフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）へのプラットフォーム移行を示し、変数ＰＶＡＬＢ、ＣＤＨ１、・・・は、参照遺伝子によって正規化されたＰＣＲに基づく発現（デルタＣｔ値）を示し、丸括弧内の全項は、対応するプローブセットのアフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）マイクロアレイ発現値の対数（底２）に対応する。
【００８９】
アルゴリズムＴ５の性能は、無作為臨床試験であるＡＢＣＳＧ０６（ｎ＝３３２）又はＡＢＣＳＧ０８（ｎ＝１２４４）に参加した、陽性リンパ節が３より多くなく、そしてＥＲ＋、ＨＥＲ２−腫瘍を有する、タモキシフェン(Tamoxifen)又はアナストロゾール(Anastrozole)治療患者において試験した。図１に示すように、Ｃｏｘ回帰分析によって、Ｔ５スコアは、全ての試験群において遠隔転移の発症と有意な関連性を有することが明らかにされている。
【００９０】
Ｔ５スコアに関する予め定義したカットオフ値を用いて、組合せＡＢＣＳＧ群の患者を分類した後、カプラン・マイヤー（Ｋａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ）分析を行った。遠隔転移の発症リスクが低い患者は、≦−９．３のＴ５スコアを有していたのに対し、遠隔転移の発症リスクが高い患者は、−９．３を超えるＴ５スコアを有していた。図２に示すように、両リスク群の非常に有意な分離が観察される。
【００９１】
重要なことに、腫瘍サイズ、腫瘍悪性度及び結節状態などの臨床的パラメータの入力に基づき療法選択を補助するオンラインツールである「アジュバント！オンライン（Ａｄｊｕｖａｎｔ！  Ｏｎｌｉｎｅ）」に対して、Ｔ５スコアを評価及び比較した。アジュバント！オンライン（Ａｄｊｕｖａｎｔ！Ｏｎｌｉｎｅ）の再発リスクスコアに対して、Ｔ５スコアを、二変量Ｃｏｘ回帰によって試験した場合、両スコアは、遠隔転移の発症と有意な関連性が依然としてあった。Ｔ５（カットオフ値−９．３）に従って、それぞれ、アジュバント！オンライン（Ａｄｊｕｖａｎｔ！Ｏｎｌｉｎｅ）（カットオフ値８）に対して階層化した、二分されたデータを用いて二変量Ｃｏｘ回帰を行ったところ、再び、臨床エンドポイントとなる転移までの時間と、極めて有意で、かつ独立した関連性が得られた。
【００９２】
【表６】
0005940517.tif 000009
【００９３】
例示のカプラン・マイヤー（Ｋａｐｌａｎ  Ｍｅｙｅｒ）曲線が図１に示されているが、高い（Ｈｉｇｈ）＝高リスク群、低い（Ｌｏｗ）＝低リスク群である（予め定義したカットオフ値に応じたものである）。
【００９４】
Ｔ５スコアの高い値は、所定の期間における遠隔転移の発生リスクの増加を示す。
【００９５】
これは、タモキシフェンで治療されていた患者に対して、さらにアロマターゼ阻害剤で治療されていた患者に対しても当てはまることが示されている。
【００９６】
アルゴリズム例Ｔ１：
アルゴリズムＴ１は、各メンバーが最大４つの変数の線形組合せである３つのメンバーのコミッティである。一般に、変数は、遺伝子発現又は臨床変数であってもよい。Ｔ１においては、唯一の非遺伝子変数として、患者がリンパ節陰性であれば、０とコード化されるリンパ節状態があり、患者がリンパ節陽性であれば１とコード化されるリンパ節状態がある。Ｔ１の数式を以下に示す。
【００９７】
riskMember1 = +0.193935 [0.108..0.280] * (0.792 * PVALB -2.189)
-0.240252 [-0.400..-0.080] * (0.859 * CDH1 -2.900)
-0.270069 [-0.385..-0.155] * (0.821 * STC2 -3.529)
+1.2053 [0.534..1.877] * nodalStatus
riskMember2 = -0.25051 [-0.437..-0.064] * (0.558 * CXCL12 +0.324)
-0.421992 [-0.687..-0.157] * (0.715 * RBBP8 -1.063)
+0.148497 [0.029..0.268] * (1.823 * NMU -12.563)
+0.293563 [0.108..0.479] * (0.989 * BIRC5 -4.536)
riskMember3 = +0.308391 [0.074..0.543] * (0.812 * AURKA -2.656)
-0.225358 [-0.395..-0.055] * (0.637 * PTGER3 + 0.492)
-0.116312 [-0.202..-0.031] * (0.724 * PIP + 0.985)
risk = + riskMember1 + riskMember2 + riskMember3
【００９８】
各行の左の係数は、ＣＯＸ比例ハザード回帰係数として計算され、角括弧中の数字は、これらの係数に関する９５％信頼限界を示す。各行右側の丸括弧中の項は、ＰＣＲからアフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）へのプラットフォーム移行を示し、変数ＰＶＡＬＢ、ＣＤＨ１、・・・は、参照遺伝子によって正規化されたＰＣＲに基づく発現を示し、丸括弧内の全項は、対応するプローブセットのアフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）マイクロアレイ発現値の対数（底２）に対応する。
【００９９】
アルゴリズム例Ｔ４：
アルゴリズムＴ４は、モチーフの線形組合せである。アフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）データセット及びＰＣＲデータの数回の解析における上位１０の遺伝子をモチーフにクラスター化した。クラスターに属していない遺伝子を単一遺伝子モチーフとして用いた。Ｃｏｘ比例ハザード回帰係数は多変量分析において見出された。
【０１００】
一般に、モチーフは、単一遺伝子発現、又は相関のある遺伝子の平均遺伝子発現であってよい。Ｔ４の数式を以下に示す。
【０１０１】
prolif = ((0.84  [0.697..0.977] * RACGAP1 -2.174) + (0.85 [0.713..0.988] *DHCR7 -3.808)+ (0.94 [0.786..1.089] * BIRC5 -3.734)) / 3
motiv2 = ((0.83  [0.693..0.96] * IL6ST -5.295) + (1.11 [0.930..1.288] * ABAT -7.019) + (0.84 [0.701..0.972] * STC2 -3.857)) / 3
ptger3 =  (PTGER3 * 0.57 [0.475..0.659] + 1.436)
cxcl12 =  (CXCL12 * 0.53 [0.446..0.618] + 0.847)
pvalb =  (PVALB * 0.67 [0.558..0.774] -0.466)
【０１０２】
各遺伝子に関する因数及び補正値は、ＰＣＲからアフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）へのプラットフォーム移行を示し、変数ＲＡＣＧＡＰ１、ＤＨＣＲ７、・・・は、ＣＡＬＭ２及びＰＰＩＡによって正規化されたＰＣＲに基づく発現を示し、丸括弧内の全項は、対応するプローブセットのアフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）マイクロアレイ発現値の対数（底２）に対応する。
【０１０３】
角括弧中の数字は、これらの因数に関する９５％信頼限界を示す。
【０１０４】
該アルゴリズムは、臨床変数と組合せるとさらに優れた性能を示すため、結節状態を付加した。Ｔ４においては、結節状態は、患者がリンパ節陰性であれば、０とコード化され、そして患者がリンパ節陽性であれば１とコード化される。これを伴うと、アルゴリズムＴ４は以下となる。
【０１０５】
risk = -0.32 [-0.510..-0.137] * motiv2
+ 0.65 [0.411..0.886] * prolif
- 0.24 [-0.398..-0.08] * ptger3 
- 0.05 [-0.225..0.131] * cxcl12 
+ 0.09 [0.019..0.154] * pvalb
+ nodalStatus
【０１０６】
Ｃｏｘ比例ハザード回帰係数としてリスク係数を計算したが、角括弧中の数字はこれらの係数に関する９５％信頼限界を示す。
【０１０７】
アルゴリズムＴ５ｂは、各メンバーが４つの遺伝子の線形組合せである２つのメンバーのコミッティである。Ｔ５ｂの数式を以下に示すが、表記法はＴ１及びＴ５に関するものと同じである。Ｔ５ｂにおいて、非遺伝子変数は、患者がリンパ節陰性であれば、０とコード化される結節状態であり、患者がリンパ節陽性であれば１とコード化される結節状態であり、さらにリンパ節状態が未知である場合、０．５とコード化されるリンパ節状態である。Ｔ５ｂは以下によって定義される。
【０１０８】
riskMember1 = 0.359536 [0.153..0.566] * (0.891 * DHCR7 -4.378)
-0.288119 [-0.463..-0.113] * (0.485 * MGP + 4.330)
+0.257341 [0.112..0.403] * (1.118 * NMU -5.128)
-0.337663 [-0.499..-0.176] * (0.674 * AZGP1 -0.777)
riskMember2 = -0.374940 [-0.611..-0.139] * (0.707 * RBBP8 -0.934)
-0.387371 [-0.597..-0.178] * (0.814 * IL6ST -5.034)
+0.800745 [0.551..1.051] * (0.860 * RACGAP1 -2.518)
+0.770650 [0.323..1.219] * Nodalstatus
risk = riskMember1 + riskMember2
【０１０９】
当業者は、これらのアルゴリズムが特定の例を表していること、そして表２に示すような転帰を伴う遺伝子発現の関連性に関する情報に基づき、ルーチン的な技術を用い、代替アルゴリズムを確立可能であることを理解する。
【０１１０】
遺伝子のサブセットを用いることによるアルゴリズムの単純化
「アルゴリズム例Ｔ５」は、それぞれ目的の２遺伝子を有する４つのメンバーからなるコミッティ予測因子である。各メンバーは、独立かつ自己完結型の遠隔再発予測因子であり、さらなる各メンバーは、アルゴリズムが、乳癌患者の転移までの時間、死までの時間又は生存可能性を予測することに関する安定性（ロバスト性）及び予測力に寄与する。以下の方程式は「アルゴリズム例Ｔ５」を示し、読み取りを容易にするため、小数点以下の数値を２桁で切り捨てとし、角括弧中の範囲は係数の概算範囲を列挙したものである（平均＋／−３標準偏差）。
【０１１１】
Ｔ５アルゴリズム:
+0.41 [0.21..0.61] * BIRC5 -0.33 [-0.57..-0.09] * RBBP8
+0.38 [0.15..0.61] * UBE2C -0.30 [-0.55..-0.06] * IL6ST
-0.28 [-0.43..-0.12] * AZGP1 +0.42 [0.16..0.68] * DHCR7
-0.18 [-0.31..-0.06] * MGP -0.13 [-0.25..-0.02] * STC2
c-indices: trainSet=0.724,
【０１１２】
アルゴリズム中の遺伝子名は、上記のような１個以上のハウスキーピング遺伝子と比較した、遺伝子のｍＲＮＡ発現相違を示す。
【０１１３】
調査群（ｆｉｎｄｉｎｇ  ｃｏｈｏｒｔ）とは異なる群を分析すると（２３４腫瘍試料）、驚くべきことに、「元のＴ５アルゴリズム」を幾何か単純化してもなお、元のＴ５アルゴリズムに有意には劣らない診断性能が得られることが判った。最も簡易な単純化は、コミッティ予測因子を１つのメンバーのみに減らすことであった。
「１メンバー・コミッティ」の性能に関する例を以下に示す。
【０１１４】
member 1 only:
+0.41 [0.21..0.61] * BIRC5 -0.33 [-0.57..-0.09] * RBBP8
c-indices: trainSet=0.653, independentCohort=0.681
member 2 only:
+0.38 [0.15..0.61] * UBE2C -0.30 [-0.55..-0.06] * IL6ST
c-indices: trainSet=0.664, independentCohort=0.696
member 3 only:
-0.28 [-0.43..-0.12] * AZGP1 +0.42 [0.16..0.68] * DHCR7
c-indices: trainSet=0.666, independentCohort=0.601
member 4 only:
-0.18 [-0.31..-0.06] * MGP -0.13 [-0.25..-0.02] * STC2
c-indices: trainSet=0.668, independentCohort=0.593
【０１１５】
２３４個の試料の独立した群において示されるような１メンバー・コミッティの性能は、完全アルゴリズムの性能に比較すると、顕著に低下している。それでもなお、より少ないメンバーからなるコミッティを用いれば、より単純でかつ費用の掛からない乳癌再発又は乳癌死のリスク予測が可能であり、このようなリスク予測は特定の診断目的には許容され得る。
【０１１６】
１より多いが４より少ないメンバーを次第に組合せて新規予後コミッティ予測因子アルゴリズムとすれば、しばしば、１メンバー・コミッティと比較して、診断性能において小さいものの有意な増加に繋がる。驚くべきことに、コミッティメンバーのある組合せによっては顕著な改善があったのに対し、他の組合せでは殆ど改善が無かったことが分かった。当初は、利用する遺伝子が反映する生物学的モチーフが類似するようなメンバーの組合せは、非常に異なる生物学的モチーフを反映するメンバーの組合せよりも、より小さな改善しか生じないと言う仮説を立てていた。それにもかかわらず、この仮定は当てはまらなかった。ある遺伝子の組合せが、遺伝子の別の組合せよりもより高い予後診断力を示すアルゴリズムを生じることを予測するための規則性は特定出来なかった。有望な組合せは、実験データに基づいてのみ選択可能であった。
【０１１７】
単純化されているが、なお強力なアルゴリズムが得られる、組合せたコミッティメンバーの組合せであって、特定された組合せを以下に示す。
【０１１８】
members 1 and 2 only:
+0.41 [0.21..0.61] * BIRC5 -0.33 [-0.57..-0.09] * RBBP8
+0.38 [0.15..0.61] * UBE2C -0.30 [-0.55..-0.06] * IL6ST
c-indices: trainSet=0.675, independentCohort=0.712
members 1 and 3 only:
+0.41 [0.21..0.61] * BIRC5 -0.33 [-0.57..-0.09] * RBBP8
-0.28 [-0.43..-0.12] * AZGP1 +0.42 [0.16..0.68] * DHCR7
c-indices: trainSet=0.697, independentCohort=0.688
members 1 and 4 only:
+0.41 [0.21..0.61] * BIRC5 -0.33 [-0.57..-0.09] * RBBP8
-0.18 [-0.31..-0.06] * MGP -0.13 [-0.25..-0.02] * STC2
c-indices: trainSet=0.705, independentCohort=0.679
members 2 and 3 only:
+0.38 [0.15..0.61] * UBE2C -0.30 [-0.55..-0.06] * IL6ST
-0.28 [-0.43..-0.12] * AZGP1 +0.42 [0.16..0.68] * DHCR7
c-indices: trainSet=0.698, independentCohort=0.670
members 1, 2 and 3 only:
+0.41 [0.21..0.61] * BIRC5 -0.33 [-0.57..-0.09] * RBBP8
+0.38 [0.15..0.61] * UBE2C -0.30 [-0.55..-0.06] * IL6ST
-0.28 [-0.43..-0.12] * AZGP1 +0.42 [0.16..0.68] * DHCR7
c-indices: trainSet=0.701, independentCohort=0.715
【０１１９】
完全にコミッティメンバーを除外するのでは無く、異なるコミッティメンバー由来の単一遺伝子又は複数遺伝子を省略することも可能であるが、全アルゴリズムの再訓練が必要である。それでもなお、これもまた実行する利点が有り得る。全メンバー又は個々の遺伝子を省略することによって生じる単純化アルゴリズムの性能は、大部分が同程度のものである。
【０１２０】
遺伝子置換によるアルゴリズム変形
上記アルゴリズム、例えば上記の「アルゴリズム例Ｔ５」はまた、１以上の遺伝子を１以上のその他遺伝子で置換することによっても改変することも出来る。こうした改変目的としては、特定のプラットフォーム上で測定するのが困難な遺伝子を、このプラットフォーム上のアッセイにより適している遺伝子で置換することがある。こうした移行は、出発アルゴリズムと比較して、性能の改善を必ずしも生じない可能性もあるが、特定の診断プラットフォームに予後診断アルゴリズムを移植する手がかりが得られ得る。一般に、予測アルゴリズムの診断力を保持しつつ、１つの遺伝子を別の遺伝子に置換することは、一の遺伝子を、[例えばピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）相関係数によって示される]高い相関性で共発現する遺伝子に置換することにより、最適に達成可能である。それでもなお、１つのプラットフォーム上では高度に相関する２つの遺伝子のｍＲＮＡ発現が、別のプラットフォーム上で評価した場合には、互いに極めて独立したものであるかもしれないことに留意しなければならない。従って、こうした見かけ上容易な置換は、実験的に実行に移した際に、失望するほど劣った結果、並びに驚くほど強力な結果を生じ得るが、これは常に、使用するプラットフォームが評価不能であることによる。この手順を反復することによって、幾つかの遺伝子を置換し得る。
【０１２１】
こうしたアプローチの有効性は、バリデーション群に対するＴ５アルゴリズムスコア及びその変形の予測性能を評価することによって証明することが出来る。以下の表には、２つのバリデーション群における終点遠隔再発に関するｃ指数(c-index)が示されている。
【０１２２】
【表７】
0005940517.tif 000010
【０１２３】
ここでは、例としてＢＩＲＣ５が示されているが、Ｔ５遺伝子の１つを省略すると、予測性能が顕著に減少することが分かる。この遺伝子を別の遺伝子で置換すると、ほぼ同じ性能が得られる。
【０１２４】
遺伝子を置換する、より良い方法は、アルゴリズムを再訓練することである。Ｔ５は、４つの独立のコミッティメンバーからなるため、置換された遺伝子を含有するメンバーのみを再訓練することになる。以下の方程式は、上記のＴ５アルゴリズムの遺伝子の置換が、２３４人の乳癌患者の群において訓練されたことを示す。以下にはc指数の計算に関して１つのメンバーのみが示され、残りのメンバーは元のＴ５アルゴリズムから変化させずに用いられた。角括弧中の範囲は、係数の概算範囲を列挙する：平均＋／−３標準偏差。
【０１２５】
Member 1 of T5:
Original member 1:
+0.41 [0.21..0.61] * BIRC5 -0.33 [-0.57..-0.09] * RBBP8
c-indices: trainSet=0.724, independentCohort=0.705
replace BIRC5 by TOP2A in member 1:
+0.47 [0.24..0.69] * TOP2A -0.34 [-0.58..-0.10] * RBBP8
c-indices: trainSet=0.734, independentCohort=0.694
replace BIRC5 by RACGAP1 in member 1:
+0.69 [0.37..1.00] * RACGAP1 -0.33 [-0.57..-0.09] * RBBP8
c-indices: trainSet=0.736, independentCohort=0.743
replace RBBP8 by CELSR2 in member 1:
+0.38 [0.19..0.57] * BIRC5 -0.18 [-0.41..0.05] * CELSR2
c-indices: trainSet=0.726, independentCohort=0.680
replace RBBP8 by PGR in member 1:
+0.35 [0.15..0.54] * BIRC5 -0.09 [-0.23..0.05] * PGR
c-indices: trainSet=0.727, independentCohort=0.731
Member 2 of T5:
Original member 2:
+0.38 [0.15..0.61] * UBE2C -0.30 [-0.55..-0.06] * IL6ST
c-indices: trainSet=0.724, independentCohort=0.725
replace UBE2C by RACGAP1 in member 2:
+0.65 [0.33..0.96] * RACGAP1 -0.38 [-0.62..-0.13] * IL6ST
c-indices: trainSet=0.735, independentCohort=0.718
replace UBE2C by TOP2A in member 2:
+0.42 [0.20..0.65] * TOP2A -0.38 [-0.62..-0.13] * IL6ST
c-indices: trainSet=0.734, independentCohort=0.700
replace IL6ST by INPP4B in member 2:
+0.40 [0.17..0.62] * UBE2C -0.25 [-0.55..0.05] * INPP4B
c-indices: trainSet=0.725, independentCohort=0.686
replace IL6ST by MAPT in member 2:
+0.45 [0.22..0.69] * UBE2C -0.14 [-0.28..0.01] * MAPT
c-indices: trainSet=0.727, independentCohort=0.711
Member 3 of T5:
Original member 3:
-0.28 [-0.43..-0.12] * AZGP1 +0.42 [0.16..0.68] * DHCR7
c-indices: trainSet=0.724, independentCohort=0.705
replace AZGP1 by PIP in member 3:
-0.10 [-0.18..-0.02] * PIP +0.43 [0.16..0.70] * DHCR7
c-indices: trainSet=0.725, independentCohort=0.692
replace AZGP1 by EPHX2 in member 3:
-0.23 [-0.43..-0.02] * EPHX2 +0.37 [0.10..0.64] * DHCR7
c-indices: trainSet=0.719, independentCohort=0.698
replace AZGP1 by PLAT in member 3:
-0.23 [-0.40..-0.06] * PLAT +0.43 [0.18..0.68] * DHCR7
c-indices: trainSet=0.712, independentCohort=0.715
replace DHCR7 by AURKA in member 3:
-0.23 [-0.39..-0.06] * AZGP1 +0.34 [0.10..0.58] * AURKA
c-indices: trainSet=0.716, independentCohort=0.733
Member 4 of T5:
Original member 4:
-0.18 [-0.31..-0.06] * MGP -0.13 [-0.25..-0.02] * STC2
c-indices: trainSet=0.724, independentCohort=0.705
replace MGP by APOD in member 4:
-0.16 [-0.30..-0.03] * APOD -0.14 [-0.26..-0.03] * STC2
c-indices: trainSet=0.717, independentCohort=0.679
replace MGP by EGFR in member 4:
-0.21 [-0.37..-0.05] * EGFR -0.14 [-0.26..-0.03] * STC2
c-indices: trainSet=0.715, independentCohort=0.708
replace STC2 by INPP4B in member 4:
-0.18 [-0.30..-0.05] * MGP -0.22 [-0.53..0.08] * INPP4B
c-indices: trainSet=0.719, independentCohort=0.693
replace STC2 by SEC14L2 in member 4:
-0.18 [-0.31..-0.06] * MGP -0.27 [-0.49..-0.06] * SEC14L2
c-indices: trainSet=0.718, independentCohort=0.681
【０１２６】
キネティックＰＣＲを用いた定量に関して実験的に同定された単一遺伝子の置換は、通常、ｃ指数によって評価すると、Ｔ５アルゴリズムの予測性能に有意には影響を与えないことが判る。
【０１２７】
以下の表（表８）には、Ｔ５アルゴリズムの遺伝子に関し想定される置換遺伝子候補が示されている。各遺伝子候補は１つの表のセル中に示されているが、遺伝子名の後に、括弧書きでＴ５アルゴリズム中の元の遺伝子及び置換候補の発現の絶対ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）相関係数、並びにＨＧ−Ｕ１３３ＡプローブセットＩＤが記載されている。
【０１２８】
【表８】
0005940517.tif 000011
【０１２９】
以下の表（表９）には、上記表のために用いられるｑＲＴ−ＰＣＲプライマー及びプローブ配列が列挙されている。
【０１３０】
【表９】
0005940517.tif 000012
【０１３１】
可能な遺伝子置換候補の教師無し選択の第二の代替法は、アフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）データのみに基づくものである。これは、すでに公表されたデータ（例えばｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／からのもの）のみに基づいて実施可能であるという利点を有する。以下の表（表１０）には、アルゴリズムＴ１〜Ｔ５において用いられるプローブセットに関し、ＨＧ−Ｕ１３３ａプローブセット置換候補が列挙されている。これは、これらのアルゴリズムの訓練データに基づくものである。列の見出しは、遺伝子名及びプローブセットＩＤを太字で含む。次いで、１０の最適相関プローブセットが列挙され、表の各セルは、プローブセットＩＤ、括弧書きで相関係数、及び遺伝子名を含む。
【０１３２】
【表１０】
0005940517.tif 000013
【０１３３】
遺伝子又はプローブセットを選択した後、置換される遺伝子の発現値と新規遺伝子の発現値との間で数学的マッピングを定義しなければならない。幾つかの代替法があるが、ここでは「ＢＩＲＣ５のデルタＣｔ値をＲＡＣＧＡＰ１によって置換する」例に基づいて説明される。訓練データにおいて、発現の結合分布は図３におけるようなものである。
ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）相関係数は０．７３である。
【０１３４】
１つのアプローチは、ＲＡＣＧＡＰ１からＢＩＲＣ５へのマッピング関数を回帰によって生成することである。線形回帰が第一選択であり、そしてこの例では
ＢＩＲＣ５＝１．２２ * ＲＡＣＧＡＰ１−２．８５
を生じる。
【０１３５】
この方程式を用いて、例えばアルゴリズムＴ５におけるＢＩＲＣ５変数を、右辺によって容易に置換することが出来る。その他の例では、ロバスト回帰、多項式回帰又は一変量非線形前変換（univariate nonlinear pre-transformation）が適切でありうる。
【０１３６】
回帰法は、ＢＩＲＣ５に対する測定ノイズを仮定するが、ＲＡＣＧＡＰ１に対するノイズは仮定しない。従って、２つの変数の交換可能性に関して、マッピングは対称的ではない。対称的マッピングアプローチは、２つの一変量ｚ変換に基づくであろう。
【０１３７】
z = (BIRC5 - mean(BIRC5)) / std(BIRC5) and
z = (RACGAP1 - mean(RACGAP1)) / std(RACGAP1)
z = (BIRC5 - 8.09) / 1.29 = (RACGAP1 - 8.95) / 0.77
BIRC5 = 1.67 * RACGAP1 + -6.89
【０１３８】
その他例においてもなお、以下、その他の変換が適切であり得る：中央値及び／又はｍａｄによる正規化、非線形マッピング、又はその他。
【図１】
0005940517.tif 000014
【図２】
0005940517.tif 000015
【図３】
0005940517.tif 000016
【配列表】
0005940517000001.app