(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＦＬＷＥ（配列番号：４）、ＫＦＬＷＥ（配列番号：５）、ＦＡＲＦＬＷＥＷＡＳＶＲＦＳＷ（配列番号：６）およびＦＧＫＦＬＷＥＷＡＳＡＲＦＳＷ（配列番号：７）からなる群から選択される、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）特異的エピトープ。
【請求項２】
請求項１に記載のＨＢＶ特異的エピトープと担体の組み合わせを含む複合体。
【請求項３】
担体が、ペプチド、血清アルブミン、免疫グロブリン、ヘモシアニンおよび多糖類から選択される少なくとも１つである、請求項２に記載の複合体。
【請求項４】
請求項１に記載のＨＢＶ特異的エピトープをコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項４に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
【請求項６】
微生物細胞またはウイルス、または哺乳動物細胞の表面でのＨＢＶ特異的エピトープの発現を導くプロモーターまたはシグナルタンパク質をコードする配列をさらに含む、請求項５に記載の組換えベクター。
【請求項７】
請求項５または６に記載の組換えベクターで形質転換された組換え微生物またはウイルスまたは哺乳動物細胞。
【請求項８】
形質転換された組換え微生物またはウイルスまたは哺乳動物細胞が、組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、組換え酵母、組換えバクテリオファージ、および組換え哺乳動物細胞から選択される、請求項７に記載の組換え微生物またはウイルスまたは哺乳動物細胞。
【請求項９】
請求項５〜８のいずれか１項に記載の組換えベクター、組換え微生物またはウイルスまたは哺乳動物細胞を培養する段階を含む、配列番号４〜７のいずれか１つで決定されるＨＢＶ特異的エピトープを生産する方法。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のエピトープ、エピトープを含む複合体、またはエピトープをコードするポリヌクレオチドを含むワクチン組成物。
【請求項１１】
ｉｎ  ｖｉｖｏで注入されたときに抗体の形成を促進する、医薬上許容されるアジュバントをさらに含む、請求項１０に記載のワクチン組成物。
【請求項１２】
アジュバントが、アルミニウム塩（Ａｌ（ＯＨ）３、ＡＬＰＯ４）、スクワレン、ソルビタン、ポリソルベート８０、ＣｐＧ、リポソーム、コレステロール、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、およびグルコピラノシル脂質Ａ（ＧＬＡ）から選択される少なくとも１つである、請求項１１に記載のワクチン組成物。
【請求項１３】
ポリヌクレオチドが医薬上許容される担体中に含まれる、請求項１０に記載のワクチン組成物。
【請求項１４】
医薬上許容される担体がウイルスベクターまたは非ウイルスベクターである、請求項１３に記載のワクチン組成物。
【請求項１５】
配列番号４〜７のいずれか１つで決定されるＨＢＶ特異的エピトープ、前記エピトープを含む複合体、または前記エピトープをコードするポリヌクレオチドを使用する、配列番号４〜７のいずれか１つで決定されるＨＢＶ特異的エピトープに特異的に結合する抗体または抗体断片を製造するためのインビトロまたは（ヒトを除く）インビボでの方法。
【請求項１６】
抗体が、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
配列番号４〜７のいずれか１つで決定されるＨＢＶ特異的エピトープ、前記エピトープを含む複合体、または前記エピトープをコードするポリヌクレオチドを使用する抗体の製造方法が、ＨＢＶ特異的エピトープ、複合体またはポリヌクレオチドを動物（ヒトを除く）に接種し、接種された動物から配列番号４〜７のいずれか１つで決定されるＨＢＶ特異的エピトープに特異的に結合する抗体をスクリーニングおよび生成することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
ヒト化または脱免疫化工程をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ヒト化工程が、動物から生産された抗体のＣＤＲ配列を、ヒト抗体のフレームワークに接合することを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
親和性を増加させ、免疫原性を減少させるために、少なくとも１つのアミノ酸配列を置換、挿入および欠失させる工程をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
動物が、ヒト由来配列と同じ抗体を生産できるトランスジェニック動物である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
トランスジェニック動物が、トランスジェニックマウスである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ディスプレイ技術が用いられる、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
ディスプレイ技術がファージディスプレイ、バクテリアディスプレイまたはリボゾームディスプレイのいずれかから選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ディスプレイ技術に用いられるライブラリーが、ヒト由来抗体の配列を有するように設計される、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
配列番号４〜７のいずれか１つで決定されるＨＢＶ特異的エピトープまたは前述のエピトープを含む複合体を使用して、配列番号４〜７のいずれか１つで決定されるＨＢＶ特異的エピトープに特異的に結合する抗体をスクリーニングする（すなわち、パニングを実施する）ことをさらに含む、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のエピトープ、エピトープを含む複合体またはエピトープをコードするポリヌクレオチドを含む、ＨＢＶ特異的エピトープ検出のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス（以下、「ＨＢＶ」と称す）に特異的なエピトープおよびその使用に関する。本明細書に開示されたエピトープが、変異による改変から保存的な位置（「変異誘発」による変異が起こらない）であるため、エピトープに対する抗体を含む組成物または上述のエピトープを含むワクチン組成物は、ＨＢＶ変異による治癒効果の悪化を起こす可能性が非常に低く、それゆえ、ＨＢＶ治療に非常に有用である。
【０００２】
本発明はまた、上記のエピトープに対する抗原特異的抗体の製造方法にも関し、本発明によって製造されたそのようなエピトープに対する抗原特異的抗体はｉｎ  ｖｉｖｏで投与されたときに優れた特異性を示す。
【背景技術】
【０００３】
背景技術
ＨＢＶは、ヘパドナウイルス科ファミリーに属するＤＮＡゲノムを有するウイルスであり、急性および／または慢性肝炎を引き起こす。一般に、ＨＢＶは少なくとも８％の互いに異なる遺伝子配列を有する８つの遺伝子型に分類されるか、他方では、ＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の２つの抗原決定基（すなわち、エピトープ）（ｄ／ｙ、ｗ／ｒ）に基づいて９つの抗原型（すなわち、ａｄｗ、ａｄｒ、ａｙｗ、ａｙｒ、など）に分類される。世界中の３億５０００万人が慢性のＨＢＶに感染し、特に、韓国および中国の人口の約５〜８％が慢性ＨＢＶ感染を有している。ＨＢＶ感染はこれらの地域の肝疾患と肝臓癌の主な原因である。現在、ワクチンの開発によって上記の感染がいくらか保護できるが、多くの患者が、まだＨＢＶによって引き起こされた慢性のＢ型肝炎感染に罹患している。ＨＢＶによって引き起こされた慢性感染は、肝炎ならびに肝硬変および肝がんを誘発し得、非感染の人々と比べると、慢性感染症の人は約３００倍の肝臓癌の増加を示す。ＷＨＯ調査によると、慢性Ｂ型肝炎は肝臓癌の主な原因の約８０％であるとされる。
【０００４】
ヌクレオシドアナログとして最近開発され、市場で利用できる慢性Ｂ型肝炎薬として、例えばラミブジン、アデフォビル・ジピボキシルなどを含み得る。これらの薬物は、ＨＢＶポリメラーゼの逆転写酵素を阻害し、ＨＢＶ  ＤＮＡ複製を阻害し得る。しかしながら、上記の薬物のいずれも３年などの長期間に投与される場合に、患者の約７５％が薬物耐性ウイルスを有し、それゆえ、治癒効果の悪化の問題を伴う。肝移植の後の垂直感染または感染を防ぐため、上記の薬は一般的にＢ型肝炎免疫グロブリン（ＨＢＩＧ）と共に使用される。
【０００５】
現在のＨＢＩＧは高い抗ＨＢｓＡｇ抗体力価（ｔｉｔｅｒ）の提供者の血漿からイオン交換精製およびウイルス不活化により製造される。
【０００６】
しかしながら、現在利用可能なＨＢＩＧは、その限られた利用性、低い特異的活性および感染性病原体の混入の可能性により、治療抗体の理想的な源ではない。
【０００７】
現在この分野で使用されているワクチンによりｉｎ  ｖｉｖｏで生成される抗体は、ほとんどがＨＢＶのエピトープを認識する抗体であることが知られている。しかしながら、そのような抗体から逃れる変異体、例えば、ＨＢｓＡｇの位置１４５のグリシンをアルギニンで置換することにより生成されたＧ１４５変異体が最近報告されている。加えて、さまざまなエスケープ変異体が見出され、それゆえ、既存のＨＢＶ薬は、十分な治癒効果を表すことの制限を伴う。したがって、ＨＢＶ複製に関連するＨＢＶの生存に必要な部位に対応するエピトープに特異的に結合し、その結果、変異による治癒効果の悪化を引き起こさないＨＢＶ治療抗体および／またはＨＢＶワクチンへの要求が高まっている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
発明の開示
技術課題
上記の問題を解決するために、本発明は、ＲＦＬＷＥ（配列番号：４）またはＫＦＬＷＥ（配列番号：５）および、特にＨＢＶの生存に必要な部位であり、それゆえ変異が起こらない保存的位置に相当する、ＦＡＲＦＬＷＥＷＡＳＶＲＦＳＷ（配列番号：６）またはＦＧＫＦＬＷＥＷＡＳＡＲＦＳＷ（配列番号：７）などのアミノ酸配列を有するエピトープを含む、ＨＢＶ特異的エピトープを提供する。
【０００９】
本発明の他の目的は、上記のエピトープ、エピトープを含むＨＢＶワクチン組成物またはワクチン、および上記のエピトープを適用することによりエピトープに特異的に結合できる抗体の製造方法、ならびに上記の方法で製造された抗体を含むＨＢＶ治療組成物または治癒剤を提供することである。
【００１０】
本発明のまたさらなる目的は、上記のエピトープまたはエピトープをコードするポリヌクレオチドを有するＨＢＶ検出のための組成物またはキットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
課題の解決手段
本発明の発明者らは；ＨＢＶ表面抗原に特異的に結合するヒト抗体（ＰＣＴ／ＫＲ２０１０／００４４４５を参照、以下、「発明の抗体」と称する）のエピトープがＲＦＬＷＥ（配列番号：４）またはＫＦＬＷＥ（配列番号：５）を含む配列、および、特にＦＡＲＦＬＷＥＷＡＳＶＲＦＳＥ（配列番号：６）またはＦＧＫＦＬＷＥＷＡＳＡＲＦＳＥ（配列番号：７）またはその部分に相当し；そのようなエピトープ部位が有利に保存的であり、ＨＢＶ複製に重要でＨＢＶ生存に必要であることを見出した。その結果、本発明は上記の発見により完成された。前述のエピトープのうち、配列番号：４および配列番号：６を有するエピトープはＨＢＶのａｄｒサブタイプ（配列番号：１）である一方で、配列番号：５および配列番号：７を有するエピトープは、ＨＢＶのａｙｗサブタイプのエピトープに相当する。
【００１２】
本発明による、配列番号４から７のいずれかによって決定されるＨＢＶ特異的エピトープは、ワクチンなどの組成物として使用される場合に有効性を増加させるために、三次元構造を保持し得るかまたは担体との結合形態（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｆｏｒｍ）として使用され得る。本明細書で使用される担体は、生物利用可能であり、本発明の所望の効果を示すいかなるものも含み得、ペプチド、血清アルブミン、免疫グロブリン、ヘモシアニン、多糖類などから選択できるが、特に限定されない。
【００１３】
配列番号４から７のいずれかによって決定されるＨＢＶ特異的エピトープそれ自体またはそれらの担体との複合体は、ＨＢＶ治療のためのワクチン組成物として有効であり得る。この点で、ワクチン組成物はさらに薬学的に許容できるアジュバントまたは賦形剤を含み得る。そのようなアジュバントは、ｉｎ  ｖｉｖｏでアジュバントを注入することによって抗体の形成を促進する役目を果たし、本発明の目的の達成を可能にするいかなるもの、より具体的に、アルミニウム塩（Ａｌ（ＯＨ）３、ＡＬＰＯ４）、スクワレン、ソルビタン、ポリソルベート８０、ＣｐＧ、リポソーム、コレステロール、モノホスホリル脂質（ＭＰＬ）Ａ、およびグルコピラノシル脂質（ＧＬＡ）Ａから選択される少なくとも１つを含み得るが、それに特に限定されない。
【００１４】
配列番号４から７で定義されて、本発明により提供されるＨＢＶ特異的エピトープをコードするポリヌクレオチドは、ＤＮＡワクチンとして使用され得る。ここで、ポリヌクレオチドは、そのものとしていかなるベクターもなしで使用されるか、また他方では、ウイルス性または非ウイルスベクターで補助され得る。本明細書で使用されるウイルス性または非ウイルスベクターは、（本発明が関係する）当分野で一般的に利用可能ないかなるものも含み得る。ウイルスベクターは、好ましくは、アデノウィルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルスなどを含み、一方で、非ウイルスベクターはカチオン性ポリマー、非イオン性ポリマー、リポソーム、脂質、リン脂質、親水性ポリマー、疎水性ポリマー、および前述の材料から選択された少なくとも１つとの組み合わせを含み得るが、それらに限定されない。
【００１５】
本発明は、本発明による配列番号４から７のいずれか１つで決定されるＨＢＶ特異的エピトープをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクター、組換えベクターを含む宿主細胞、および上記の組換えベクターまたは宿主細胞を使用する、本発明による配列番号４から７のいずれか１つで決定されるＨＢＶ特異的エピトープの製造方法を提供する。
【００１６】
本発明において、「組換え型ベクター」は、遺伝子挿入物を発現するために遺伝子挿入物と動作可能に結合した（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）必要な調節要素を含む遺伝子産物である適当な宿主細胞から標的タンパク質を示す発現ベクターである。本発明において、用語、「動作可能に結合した」は、一般的な機能を実行するために、標的タンパク質をコードする核酸配列に機能的に結合した核酸発現制御配列を示す。組換え型ベクターの動作可能な結合は、本発明が関係する技術で周知の遺伝子組み換え技術で実施され得る。また、部位特異的ＤＮＡ開裂および結合は、本発明が関係する技術で一般的に知られている酵素を使用することで容易に実施され得る。
【００１７】
本発明で使用可能な適切な発現ベクターは、プロモーター、開始コドン、終止コドン、ポリアデニル化信号、エンハンサーなどの発現調節要素ならびに膜標的化または分泌のためのシグナル配列を含み得る。開始コドンおよび終止コドンは一般的に免疫原性標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列の一部であるとみなされ、遺伝子産物が投与されるとき、コード配列とインフレームでありながら個体中で動作を示す必要がある。一般的なプロモーターは、構成的であるか、または誘導的であり得る。原核細胞は、例えばｌａｃ、ｔａｃ、Ｔ３およびＴ７プロモーターを含み得るが、これらに特に限定されるというものではない。真核細胞は、例えば、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳がんウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）および、特にＨＩＶの長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、モロニーウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーターならびにβ−アクチンプロモーター、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、ヒト金属結合性タンパク質プロモーターを含み得るが、これらに特に限定されるというものではない。
【００１８】
発現ベクターは、ベクターを含む宿主細胞を選択するために選択マーカーを含み得る。選択マーカーは、ベクターで形質転換された細胞の選別のために機能し、薬物耐性、栄養要求、細胞毒性への耐性、表面タンパク質の発現などの選択可能な表現型を提供するマーカーを含み得る。選択マーカー発現する細胞が選択剤で処理された条件下でのみ生存可能であるため、形質転換細胞がスクリーニングされ得る。反復可能な発現ベクターのために、ベクターは複製が開始される特定の核酸配列としての複製開始点を含み得る。発現された組換えベクターはプラスミド、ウイルス、コスミドなどのさまざまなベクターを含み得る。原核細胞および真核生物の様々な宿主細胞が所望の遺伝子を発現し、所望のタンパク質を作成する限り、組換えベクターは特に制限されないが、ベクターが強大な発現を実現する強大な活性を有するプロモーターを所有し、自然界のものと同様に多量の外来タンパク質を生産することが好ましい。
【００１９】
特に、配列番号４から７のいずれか一つで決定されるＨＢＶ特異的エピトープを発現するために、様々な発現ホストベクターの組み合わせが使用され得る。真核生物に好適な発現ベクターは、例えば、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス、アデノウィルス、アデノ随伴ウイルス、サイトメガロウイルス、レンチウイルス、および／または、レトロウイルス由来の発現調節配列を含み得るが、これらに特に限定されるというものではない。バクテリア宿主に使用される発現ベクターは、例えば、ｐＥＴ、ｐＲＳＥＴ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＧＥＸ２Ｔ、ｐＵＣベクター、ｃｏｌ  Ｅ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９などの大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）から得られる細菌プラスミドおよびそれらの派生物；広い宿主をもつＲＰ４プラスミド；λｇｔ１０およびλｇｔ１１、ＮＭ９８０などの様々なファージ・ラムダ派生物として例示されるファージＤＮＡ；一本鎖のフィラメント型ＤＮＡファージ、Ｍ１３など、を含み得る。昆虫細胞に有用なベクターはｐＶＬ９４１であり得る。
【００２０】
組換えベクターは、形質転換細胞を形成するために宿主細胞に挿入され、本明細書で好適に使用される宿主細胞は、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）またはスタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）などの原核細胞；アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）などのカビ；ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）などの酵母；低級真核細胞、高等真核細胞、すなわち、昆虫細胞などの真核細胞、を含み得る。宿主細胞は、好ましくは、植物、および／または、哺乳動物由来、特に、サル腎細胞７（ＣＯＳ７）、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／Ｏ、チャイニーズハムスター卵巣  （ＣＨＯ）細胞、Ｗ１３８、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ＭＤＣＫ、骨髄腫細胞株、ＨｕＴ７８細胞、および／または、ＨＥＫ２９３細胞由来であるが、これらに特に限定されるというものではない。最も好ましくは、ＣＨＯ細胞が使用される。
【００２１】
本発明における、用語「宿主細胞への形質転換」は、有機体、細胞、組織および／または期間に核酸を導入するためのいかなる技術を含み、当分野においてよく知られるように、形質転換を実施する宿主細胞により、標準的技術が好適に選択され得る。そのような技術のうち、電気穿孔法、原形質溶融、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、炭化ケイ素繊維を用いる攪拌、アグロバクテリウム介在形質転換、ＰＥＧで仲介された形質転換、デキストラン硫酸塩およびリポフェクタミン、ならびに乾燥／阻害があるがこれらに特に限定されない。培地中で組換えベクターを発現する形質転換体を培養することにより、配列番号４から７のいずれか１つで決定されるＨＢＶ特異的エピトープが多量に形成され得る。培地および培養条件は、使用される宿主細胞によって、一般的に使用されるものから適当に選ばれ得る。培養の間、温度、培地のｐＨ、培養時間などのいくつかの条件が、適切な細胞の成長とタンパク質の大量生産を可能にするために調整され得る。上記のとおり、配列番号４〜７のいずれか１つで決定されるＨＢＶ特異的エピトープは、培地または細胞分解物から、組換え方法によって回収され、いかなる従来の生化学的分離技術で分離または精製され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）；  Ｄｅｕｓｃｈｅｒ，  Ｍ．，  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  １８２．  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ  （１９９０））。この目的のため、電気泳動、遠心分離、ゲル濾過、沈殿、透析、クロマトグラフィー(イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、免疫吸着クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなど)、等電点収束、それらの様々な変化、およびそれらの組み合わせなどの様々な方法が利用され得るが、これらに特に限定されるというものではない。
【００２２】
本発明は、配列番号４〜７のいずれか１つで決定されるＨＢＶ特異的エピトープを、微生物またはウイルス表面で発現する方法を提供する。この場合、誘導プロモーターまたはシグナルタンパク質をコードする配列を含む組換えベクターならびに上記の組換えベクターを含む様々な微生物またはウイルスが使用され得る。特に、組換え大腸菌、酵母および／またはバクテリオファージが適切な微生物および／またはウイルスであるが、これらに特に限定されるというわけではない。配列番号４〜７のいずれか１つで決定されるＨＢＶ特異的エピトープの上述の微生物またはウイルスの表面上での発現のために、本発明が関係する技術でよく知られているディスプレイ技術が使用され得る。特に、配列番号４〜７のいずれか１つで決定されるＨＢＶ特異的エピトープをコードするポリヌクレオチド配列は、微生物細胞またはウイルス表面での発現を導くプロモーターまたはシグナルタンパク質をコードする配列と組み合わせられ（または、結合され）、その結果、ＨＢＶ特異的エピトープを発現し得る。あるいは、表面発現タンパク質をコードする遺伝子部位の一部を削除した後、配列番号４〜７のいずれか１つで決定されるＨＢＶ特異的エピトープをコードするポリヌクレオチド配列が削除された部分に挿入され得る。しかしながら、本発明は特に以上の方法に限定されるというものではない。上述の方法により、微生物またはウイルス表面で発現する、配列番号４〜７のいずれか１つで決定されるＨＢＶ特異的エピトープそのものが分離され、本発明の所望の使用のために精製され得る。さらに、本発明のエピトープは、配列番号４〜７のいずれか１つで決定されるＨＢＶ特異的エピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、表面で発現され、その後スクリーニングされた抗体を得るように、使用され得る。
【００２３】
さらに、本発明は、配列番号４〜７のいずれか１つで決定されるＨＢＶ特異的エピトープ、前述のエピトープを含む複合体、または前述のエピトープをコードするポリヌクレオチドを使用することを含む、配列番号４〜７のいずれか１つで決定されるＨＢＶ特異的エピトープと特異的に結合した抗体またはその抗体断片を製造するための方法を提供する。そのような抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得、配列番号４〜７のいずれか１つで決定されるＨＢＶ特異的エピトープに結合する特性を有する限り、それらの断片もまた、本発明の範囲に含まれる。特に、発明の抗体または断片は、例えば：それらの全てが配列番号４〜７のいずれか１つで決定されるＨＢＶ特異的エピトープに結合する特性を有する、一本鎖抗体、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、三重特異性抗体（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、四重特異性抗体（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ、ｓｃＦｖ、ドメイン抗体、二重特異性抗体（ｄｕａｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、低分子化抗体（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ｓｃａｐ、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、ＩｇＧ４抗体、抗体非可変領域の派生物、およびタンパク質足場に基づく合成抗体を含み得るが、これらに特に限定されるというものではない。発明の抗体の特性が維持される限り、可変領域で変異する抗体もまた、本発明の範囲に含まれ得る。これは可変領域でのアミノ酸の保存的置換で例示され得る。
【００２４】
ここで、そのような「保存的置換」は通常アミノ酸を、元のアミノ酸配列と同様の特性を有する別のアミノ酸残基に置換することを意味する。例えば、リジン、アルギニン、およびヒスチジンは、塩基側鎖を有し、順に同様の特性を示す。他方で、アスパラギン酸およびグルタミン酸の両方は、酸性側鎖を有し、互いに同様の特性を示す。加えて、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システインおよびトリプトファンは、それらが非帯電極性側鎖を有することから互いに類似である一方で、アラニン、バリン、ロイシン、トレオニン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニンおよびメチオニンは、それらが無極性側鎖を有することから、互いに類似である。さらに、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびヒスチジンは、それら芳香族側鎖を有することから、互いに類似である。結果として、アミノ酸置換が上記の類似の特性を有する群のいずれかに起こっても、特性における著しい変化が見出され得ないことは、当業者に明白であろう。したがって、発明の抗体の特定の性質が保持されるなら、可変領域での保存的置換により変異している、抗体の作成のための方法もまた、本発明の範囲の中に含まれ得る。
【００２５】
配列番号４〜７のいずれか１つで決定されるＨＢＶ特異的エピトープに結合する抗体は、（本発明が関係する）当業者に既知のいかなる方法によって作製され得る。特に、配列番号４〜７のいずれか１つで決定されるＨＢＶ特異的エピトープ、エピトープを含む複合体または上述されたエピトープをコードするポリヌクレオチドを動物に接種後、接種された動物から、配列番号４〜７のいずれか１つで決定されるＨＢＶ特異的エピトープに結合する抗体が生産され、スクリーニングされ、順に得られる。
【００２６】
本明細書で使用される動物は、トランスジェニック動物、特にヒト由来配列と同じ抗体を生産できるトランスジェニックマウス、を含み得る。トランスジェニックマウスを用いて得られる、減少した免疫原性を有するいわゆる完全ヒト抗体は、米国特許番号５，５６９，８２５号；５，６３３，４２５号および７，５０１，５５２号等に記載のいずれか１つにより生産され得る。上述の動物がヒト由来配列と同じ抗体を生産するように好ましく形質転換されていない場合、動物から得られた抗体を用いて、米国特許番号５，２２５，５３９号；５，８５９，２０５号；６，６３２，９２７号；５，６９３，７６２号６，０５４，２９７号；６，４０７，２１３号；および国際公開番号１９９８／５２９７６号に記載されるいずれか１つの方法によりヒト化または脱免疫化工程がさらに実施され得、その結果、ｉｎ  ｖｉｖｏ処理に有用な抗体が好適に生産され得る。特に、そのようなヒト化または脱免疫化は、動物から生産された抗体のＣＤＲ配列を、ヒト抗体のフレームワークに接合するためのＣＤＲ接合を含み得、親和性を増加させ、免疫原性を減少させるために、さらに少なくとも１つのアミノ酸配列を置換、挿入および欠失させるＣＤＲウォーキング（ＣＤＲ−ｗａｌｋｉｎｇ）工程を含み得る。
【００２７】
配列番号４〜７のいずれか１つで決定されるＨＢＶ特異的エピトープ、エピトープを含む複合体および／またはエピトープをコードするポリヌクレオチドの代わりに、全ＨＢＶが免役源として用いられる場合、ＨＢＶ結合能（時々、「結合」と省略される）を有する抗体をほとんどスクリーニング（よく「パニング」と称す）し、次いで第一にスクリーニングされた抗体のうち、配列番号４〜７のいずれか１つで決定されるＨＢＶ特異的エピトープを特異的に認識する抗体を追加でパニングする工程、が使用され得る。あるいは、第一にスクリーニングされたＨＢＶ結合抗体のうち、配列番号４〜７のいずれか１つで決定されるＨＢＶ特異的エピトープの重要な部位が変異されたＨＢＶと結合しないかまたは減少した結合を有する抗体をスクリーニングする方法であって、方法が配列番号４〜７のいずれか１つで決定されるＨＢＶ特異的エピトープの重要な部位の変異を引き起こすことを含む、方法もまた使用され得る。
【００２８】
一方で、当分野で周知のディスプレイ技術により、配列番号４〜７のいずれか１つで決定されるＨＢＶ特異的エピトープに結合するヒト抗体が生産および選別され得る。そのようなディスプレイ技術はファージディスプレイ、バクテリアディスプレイまたはリボゾームディスプレイから選択され得るが、これらに特に制限されるというものではない。ライブラリーの作成およびディスプレイは、例えば：米国特許番号５，７３３，７４３号、７，０６３，９４３号、６，１７２，１９７号、６，３４８，３１５号、６，５８９，７４１号等に開示される、慣用技術により容易に実施され得る。特に、上述のディスプレイに使用されるライブラリーは、ヒト由来抗体の配列を有するように設計され得る。特に、上記の方配列番号４〜７のいずれか１つで決定されるＨＢＶエピトープまたはエピトープを含む複合体を適用することによる、配列番号４〜７のいずれか１つで決定されるＨＢＶ特異的エピトープのみに特異的に結合する抗体をスクリーニング（またはパニング）することによって特徴付けられ得る
【００２９】
最終的に、本発明は、配列番号４〜７のいずれか１つで決定されるエピトープ、エピトープを含む複合体またはエピトープをコードするポリヌクレオチドを含むＨＢＶ検出組成物またはキットを提供する。本発明のＨＢＶ検出組成物またはキットは、ＨＢＶ変異の有意な影響下でなくても、ＨＢＶ感染の迅速および正確な診断を可能にするという利点を有し得る。配列番号４〜７のいずれか１つで決定されるエピトープ、エピトープを含む複合体またはエピトープをコードするポリヌクレオチドを含むＨＢＶ検出キットは、例えば一般的な酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、蛍光活性化細胞分類法（ＦＡＣＳ）などを含む様々な方法を利用するために製造され得る。さらに、本発明のエピトープをコードするポリヌクレオチドが使用されている場合、ハイブリダイゼーションは一般的なハイブリダイゼーション技術で検出され得る。
【発明の効果】
【００３０】
発明の有利な効果
詳細な説明から明らかなように、本発明により提供されるＨＢＶ特異的エピトープは実質的に、突然変異誘発を起こさない保存的位置である。したがって、前述のエピトープに対する抗体を含む組成物またはワクチン組成物は、ＨＢＶ変異などによる治癒効果の悪化を起こす可能性が比較的低く、結果としてＨＢＶ治療および／または診断に友好的に使用される。
【００３１】
図面の簡単な説明
本発明の上記および他の目的、特徴、および利点は添付の図面に関連して提供される好ましい実施形態の以下の記載から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、発明の抗体のエピトープを特定するためのＨＢＶ表面抗原タンパク質変異体への結合能の変化の分析結果を示す。
【００３３】
【図２】図２は発明のエピトープを含むＨＢＶ表面抗原タンパク質のループ構造を示す。
【００３４】
【図３】図３は表面抗原タンパク質をコードするゲノムＳ  ＯＲＦが、ポリメラーゼをコードするゲノムＰ  ＯＲＦに部分的に重なるＨＢＶゲノム構造を示す。
【００３５】
【図４】図４はＨＢＶポリメラーゼ変異体を作製する工程を示す。
【００３６】
【図５】図５はＨＢＶ  ＰｏｌフリーレプリコンおよびＨＢＶポリメラーゼ変異体の、ＨｅｐＧ２細胞への同時の感染により実施される相補性試験工程を示す。
【００３７】
【図６】図６はサザンブロット分析によるそれぞれのＨＢＶポリメラーゼ変異体のＨＢＶ複製能力の試験結果（ＨＢＶ  ＤＮＡ複製中間体、すなわちグラフ右側のＲＣ、ＤＬ、ＳＳ  ＤＮＡ、の比較）を示す。
【００３８】
【図７】図７は、ＲＮａｓｅ保護アッセイでのそれぞれのＨＢＶポリメラーゼ変異体によるプレゲノムＲＮＡパッケージングへの影響の試験結果を示す。
【００３９】
【図８】図８はマウスでＨＢＶウイルス粒子を発生させるための水圧注入で使用されるＨＢＶ遺伝子ベクターの連鎖地図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
発明を実施するための最良の形態
以下に、本発明の好ましい実施形態が実施例を詳細に参照して説明されるが、そのような実施例は説明に役立つ目的だけのためであり、本発明の範囲を限定する意図ではない。
【実施例】
【００４１】
【表１】
0005977346.tif 000002
【００４２】
表から、発明の抗体が、ＨＢＶ表面抗原タンパク質の３個のアミノ酸残基（ＡＡ）で起こった変異を有する８個（８）のクローンで結合能を失ったことが見出された（図１参照）。すなわち、図１に示される８つのクローンに関して、ウサギポリクローナル抗体が結合能を示したことが確認され、順に変異ＨＢＶ表面抗原タンパク質を通常に発現したが、発明の抗体はそれに結合しなかった。
【００４３】
８個のクローンをアッセイした結果、各々が、それぞれ１６０Ｒ（１６０Ｒは、位置１６０に位置するアミノ酸Ｒを意味する、以下同じ）、１６３Ｗおよび１６４Ｅ（配列番号１）に少なくとも１回の変異を有することが見出された。すなわち、上記の配列は発明の抗体のエピトープに対応する部位として決定され得る。そのような結果から、発明の抗体のエピトープが、ＲＦＬＷＥ（配列番号４）を含み、結合能があるＨＢＶのａｙｗサブタイプにおけるエピトープがＫＦＬＷＥ（配列番号５）を含むことが見出された。
【００４４】
具体的に、配列番号４または５で決定される配列を有するエピトープは、上記のエピトープが存在するＨＢＶ表面部位の２つのループのうちのマイナー・ループに対応するＦＡＲＦＬＷＥＷＡＳＶＲＦＳＷ（配列番号６）またはＦＧＫＦＬＷＥＷＡＳＡＲＦＳＷ（配列番号７）であり得る（図２参照）。
【００４５】
［実施例２］
【００４６】
発明の抗体のエピトープの特性の特定
【００４７】
（１）ＨＢＶポリメラーゼ（ＨＢＶ  Ｐｏｌ）変異体の作製
【００４８】
発明の抗体のエピトープは、ＨＢＶ  ａｙｗサブタイプの表面抗原ＯＲＦ（Ｓ  ＯＲＦ）に１６０Ｋ、１６３Ｗ、および１６４Ｅ（配列番号２）を含み、そこでは、エピトープをコードするＨＢＶ表面抗原のＯＲＦ配列がＨＢＶポリメラーゼをコードするＨＢＶ  Ｐ  ＯＲＦに重なる。特に、ＨＢＶポリメラーゼの５０４Ｉ、５０６Ｍ、５０７Ｇ、および５０８Ｖ（配列番号３参照）はエピトープがエピトープをコードするＯＦＲ遺伝子によってコードされる部位に対応し得る（図３参照）。簡潔に、ＨＢＶ  Ｓ  ＯＲＦの上述の部位での変異もまた、ＨＢＶ  Ｐ  ＯＲＦの変異に関与する。
【００４９】
ＨＢＶポリメラーゼは、他のウイルス性ポリメラーゼと著しく異なる特徴を有する。第一に、ＨＢＶポリメラーゼは、ＲＮＡ（プレゲノムＲＮＡ：ｐｇＲＮＡ）からそのＤＮＡを合成する逆転写酵素活性を有し；第二に、逆転写開始の間、ＨＢＶポリメラーゼは、タンパク質プライミングを行うプライマーとしてそれ自体を使用し；第三に、正しいメカニズムはまだ特定されていないが、プライマー転移およびテンプレートスイッチングが複製の間実行される。
【００５０】
一方で、上記の通り、ＨＢＶを中和する発明の抗体のエピトープ部位をコードするオープン・リーディング・フレーム（「ＯＲＦ」）、すなわち、ＨＢＶ表面抗原の中の発明的な抗体のエピトープ部位、は、ＨＢＶポリメラーゼをコードする別のＯＲＦに重なり得る。したがって、発明の抗体のエピトープをコードするＯＲＦと重なるＨＢＶ  Ｐ  ＯＲＦによってコードされる、ＨＢＶポリメラーゼ部位の影響を調査するため、ＨＢＶウイルス複製の際に、前述のエピトープの変異可能性を調査した。
【００５１】
この目的のため、ＨＢＶ  Ｐ  ＯＲＦで発明の抗体のエピトープに重なる部位に存在するアミノ酸をアラニンに置換した変異体をマニピュレーションで作製し、ＨＢＶポリメラーゼ（「ＨＢＶ  Ｐｏｌ」）の逆転写酵素活性への作製された変異体の影響の調査に供された。第一に、ＨＢＶ  Ｐｏｌポリメラーゼの５０３Ｋ、５０４Ｉ、５０６Ｍ、５０７Ｇ、および５０８Ｖを置換することによって得られる、Ｋ５０３Ａ（Ｋ５０３Ａは、位置５０３のアミノ酸ＫがＡに変異したことを意味する、以下同じ）Ｉ５０４Ａ、Ｍ５０６Ａ、Ｇ５０７ＡおよびＶ５０８Ａなどの変異体、ならびに自然に発生した変異体Ｖ５０８Ｌが、図４に示されるように、作製された。次いで、前述のエピトープ部位に変異を有する、ＨＢＶポリメラーゼのゲノム複製機能の変化が相補性試験で調査された。特に、フレーム・シフト変異がＨＢＶ  Ｐ  ＯＲＦに由来し、ＨＢＶポリメラーゼが欠失した活性を示す、ＨＢＶ  Ｐｏｌヌルレプリコン、ならびに、変異が上記に由来するＨＢＶポリメラーゼを発現するプラスミドが、ＨｅｐＧ２細胞で感染された（図５参照）。その後、ＨＢＶゲノム複製はサザンブロット分析およびＲＮａｓｅ保護アッセイ（ＲＰＡ）によって検査された。
【００５２】
（２）サザンブロット分析
【００５３】
上記の通り、ＨＢＶ  ＰｏｌヌルレプリコンおよびＨＢＶポリメラーゼ変異を導く変異体が同時にＨｅｐＧ２細胞に感染され、続いて、４日後に複製されたウイルスＤＮＡを回収した。回収された材料はＨＢＶ  ＤＮＡ複製の調査に供された。
【００５４】
その結果、Ｋ５０３Ａ変異体に関して、野生型と比べて、ウイルスＤＮＡ複製は約１７％であった。この結果は、ＨＢＶポリメラーゼの５０３Ｋ部位がウイルスＤＮＡ模写のメカニズムに有意に関与することを示す。これに対して、Ｍ５０６ＡおよびＧ５０７Ａ変異体はほとんどウイルスＤＮＡ複製を示さなかった。この事実は、５０６Ｍおよび５０７ＧがＨＢＶポリメラーゼのウイルスＤＮＡ複製機構のための必須部位であることを示す。Ｉ５０４Ａ、Ｖ５０８Ａ、およびＶ５０８Ｌ変異体はそれぞれ、野生型と比べて約６５％、７０％および８２％のウイルスＤＮＡ複製を示した。すなわち、これらの変異体が実質的に野生型のものと同様のウイルスＤＮＡ模写を受けたと認められた。その結果、上記の変異体はＨＢＶ  ＤＮＡ複製において比較的低い関与を有することが決定された（図６を参照）。
【００５５】
（３）ＲＰＡ（ＲＮａｓｅ保護アッセイ）の結果
【００５６】
ＤＮＡ複製の前の予備段階として、ＲＮＡ（プレゲノムＲＮＡ：ｐｇＲＮＡ）のカプシド形成がＲＰＡ方法で検査された（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８３：  ８０３２−８０４０を参照）。
【００５７】
上記の通り、ＨＢＶ  ＰｏｌヌルレプリコンおよびＨＢＶポリメラーゼ変異を導く変異体が同時にＨｅｐＧ２細胞に感染され、続いて、３日後に細胞のウイルスコアおよび全ｐｇＲＮＡを回収した。回収された材料は、ｐｇＲＮＡがＨＢＶ  ＤＮＡ模写にテンプレートとして使用されるｐｇＲＮＡパッケージング範囲の定量分析に供された。
【００５８】
結果より、Ｋ５０３ＡおよびＧ５０７Ａ変異体が、野生型と比べて約２５％のｐｇＲＮＡパッケージングを示した。これは、５０３Ｋおよび５０７Ｇがウイルスのコア粒子へのｐｇＲＮＡのパッケージングに有意に関与することを示す。他方で、Ｍ５０６Ａ変異体は、野生型と比較して約７１％のｐｇＲＮＡパッケージングを示した。すなわち、５０６ＭのｐｇＲＮＡパッケージングへの関与が比較的低いことが見出された。他の変異体、例えばＩ５０４Ａ、Ｖ５０８ＡおよびＶ５０８Ｌ変異体は野生型とほぼ同じｐｇＲＮＡパッケージングを示し、それゆえ、これらの部位がほんのわずかしかｐｇＲＮＡパッケージングに関与しないと考えられる（図７参照）。
【００５９】
（４）ＨＢＶ複製の際のＨＢＶポリメラーゼ変異体の影響の総括的なレビュー
【００６０】
ＨＢＶポリメラーゼのＫ５０３Ａ変異体について、野生型と比べて、２５％だけのｐｇＲＮＡパッケージングが結果として生じた。ウイルス複製の最終産物としてのウイルスＤＮＡの定量化の結果、複製がｐｇＲＮＡパッケージングの範囲だけ実行されたことが見出された。したがって、５０３Ｋ部位は初期のｐｇＲＮＡパッケージングに強くすると考えられる（表２参照）。一方、ＨＢＡポリメラーゼのＭ５０６Ａ変異体は、実質的に野生型と同様の、約７１％のｐｇＲＮＡパッケージングを示した。しかしながら、ウイルス複製の最終産物としてのウイルスＤＮＡの定量化の結果は複製を全く示さなかった。この事実は、ＨＢＶポリメラーゼのＭ５０６はｐｇＲＮＡパッケージングに全く関与しないが、Ｍ５０６が、ｐｇＲＮＡをテンプレートとして用いる（−）ストランドＤＮＡを合成するためのウイルスＤＮＡ複製のメカニズム、すなわち、タンパク質プライミングまたはプライマー転移などの逆転写メカニズム、にかなり関与し得ることを意味する。
【００６１】
ＨＢＶポリメラーゼのＧ５０７Ａ変異体ついて、ｐｇＲＮＡパッケージングは野生型の２４％にすぎず、ウイルスＤＮＡ複製はほんのわずかしか実施されておらず、それゆえ、Ｍ５０７部位がｐｇＲＮＡ結合とポリメラーゼの逆転写の両方に重要な機能を有すると考えられ得る。さらに、Ｍ５０７部位には、カプシド形成の間、宿主因子としてのＨｓｐ９０などのタンパク質、および／または、ＨＢＶのコアタンパク質との相互作用における役割があり得る。
【００６２】
その間、ＨＢＶポリメラーゼの残りの変異体、Ｉ５０４Ａ、Ｖ５０８Ａ、およびＶ５０８Ｌは実質的に野生型のものと同様のｐｇＲＮＡパッケージング、および／またはウイルスＤＮＡ複製を示す。したがって、発明の抗体のエピトープとして見出されたＨＢＶ表面抗原タンパク質部位、１６０Ｋ、１６３Ｗおよび１６４ＥをコードするＨＢＶ  Ｓ  ＯＲＦに重なるＨＢＶ  Ｐ  ＯＲＦによってコードされるＨＢＶポリメラーゼの配列のうち、１６０Ｋおよび１６３Ｗ部位がウイルス複製と深く関連していることが見出された。変異がこれらの部位で引き起こされる場合、ウイルス複製が実施されない場合もあり、その結果、高い保存的位置である。したがって、上記の２個の変異体は存在せず、前述の部位への特異的結合抗体は、自然に発生した変異体および／または、抗ウイルス薬に耐性を示す変異体を治療するのに有効であり得る。
【００６３】
【表２】
0005977346.tif 000003
【００６４】
［実施例３］
【００６５】
発明の抗体のエピトープ変異体への結合および中和効果
【００６６】
（１）変異体の調製
【００６７】
発明の抗体のエピトープである、ＨＢＶ表面抗原タンパク質（ＨＢｓＡＧ）の１６３Ｗおよび１６４Ｅ  （配列番号１）の少なくとも１つが、変異体の作製の際にアラニンに置換された。血清型に関連している１６０Ｋは、変異において問題を有するため、その変異体は除かれた。加えて、１６４Ｅを１６４Ｄとする変異により得られた変異体が最近報告されたので、Ｅ１６４Ｄ変異体もまた作製され、使用された。上記のとおりに変異体を得たので、変異はまた、前述の変異体をコードするＨＢＶ  Ｓ  ＯＲＦに重なる、ＨＢＶ  Ｐ  ＯＲＦによってコードされたＨＢＶポリメラーゼの５０６Ｍ、５０７Ｇおよび５０８Ｖ（配列番号２）でも導かれた。ここで、ＨＢＶ表面抗原タンパク質の１６３Ｗおよび１６４Ｅの異形コドンによって、同じアミノ酸変異が起こるときでさえ、ＨＢＶポリメラーゼの変異体は、異なったアミノ酸配列を有する（表３を参照）。
【００６８】
【表３】
0005977346.tif 000004
【００６９】
（２）急性Ｂ型肝炎由来マウスを使用するｉｎ  ｖｉｖｏ効果の試験およびバリデーション
【００７０】
急性Ｂ型肝炎と同様の症状を導くために水圧注入でＣ５７ＢＬ６マウスにＨＢＶ  ＤＮＡを注入することにより、処置されたマウスはエピトープ変異が上記のように導かれるところで、発明の抗体の結合、ＨＢＶの結合および／またはマウスの血中のＨＢＶ中和能を調査するために使用された。使用されたＣ５７ＢＬ６マウスはＣｈａｒｌｅｓ  Ｌｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  （米国）から購入された、約２０ｇの６週齢のメスであった。表４に示されているように、１群あたり５匹のマウスの合計１２のグループが試験された。
【００７１】
【表４】
0005977346.tif 000005
【００７２】
各々のマウスは、マウスの体重当たり９．５用量％の比で０．３ｍＬ／分で尾静脈を通して、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）が挿入されたＨＢＶ  ＤＮＡ配列を含み、その結果急性Ｂ型肝炎を引き起こす、２０μｇのｐＨＢＶ−ＭＢＲＩベクター（Ｓｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１９，  １４６−１５３，  ２００６；表８参照）を注入することによって、処理された。４８時間後、表４に示すように、０．２ｍＬの発明の抗体をマウスの尾静脈を通して静脈に（ＩＶ）投与された。発明の抗体の注射の前（２４時間、４８時間）とその注射後（７２時間、９６時間）に、血清が分離され、ヤギ血清中に１０倍希釈され、次いでＧｅｎｅｄｉａ  ＨＢｓＡｇ  ＥＬＩＳＡ３．０（Ｇｒｅｅｎ  Ｃｒｏｓｓ  Ｃｏｒｐ．  ＭＳ（韓国））を通してＨＢＶ表面抗原タンパク質（表面抗原）の血液における濃度が測定された。ＨＢＶ  ＤＮＡに関して、本発明の抗体の注射の前（４８時間）と後（７２時間）に、血液ば分離され、血中のＨＢＶ  ＤＮＡの定量アッセイを実施するためにリアルタイムＰＣＲの後、発明の抗体のＨＢＶ中和能力の比較アッセイで分析された。
【００７３】
Ｇｅｎｅｄｉａ  ＨＢｓＡｇ  ＥＬＩＳＡ  ３．０による血中のＨＢｓＡｇの検出の結果、１０個の変異体が挿入されるならば、すべてのＨＢｓＡｇが適切に発現されることが確認された。１０変異型ＨＢｓＡｇが発明の抗体との結合をアッセイされたとき、１６３Ｗと１６４Ｅの両方がアラニンで置換されたＨＢｓＡｇ変異体は発明の抗体への結合を示さなかった。一方、１６３Ｗのみがアラニンで置換されたＨＢｓＡｇ変異体が、野生型と比べて７０％以上の結合能を示すことが見出された。加えて、アラニンで置換された１６４Ｅを有するＨＢｓＡｇ変異体は、野生型と比べて約３０％の結合能を示した。    Ｅ１６４Ｄ変異体について、結合特性は実質的に野生型と同様であった（表５参照）。
【００７４】
ＨＢｓＡｇでの変異は、上記のＨＢＶポリメラーゼ配列に影響を及ぼす。したがって、ＨＢＶ  ＤＮＡ複製で、ＨＢｓＡｇのアミノ酸残基がアラニンで置換されて作成され得る、ポリメラーゼ変異体の影響がアッセイされた。アッセイの結果は、１６３Ｗと１６４Ｅがすべて変異するならＨＢＶ  ＤＮＡ複製が全く起こらないことを明らかにした。    １６３Ｗおよび１６４Ｅの各々がアラニンで置換されたとき、１６３Ｗ変異体が複製を全く示さなかった一方で、１６４Ｅ変異体は、約３０〜７０％のＨＢＶ  ＤＮＡ複製があった。したがって、複製に、１６３Ｗ部位に対応するポリメラーゼのアミノ酸部位が非常に重要であることが特定された。
【００７５】
ＨＢｓＡｇ発現とＨＢＶ  ＤＮＡ複製がある１６４Ｅ変異体が、発明の抗体のＨＢＶ中和能力を特定するためにアッセイされた。その結果から、発明の抗体は野生型と比べて結合能が約７０％減少するので、ＨＢＶ中和能力が顕著に減少することが確認された。しかしながら、当分野で知られている天然の変異体である１６４Ｄ変異体について、発明の抗体は野生型と同様の結合能を示した。
【００７６】
【表５】
0005977346.tif 000006
【００７７】
前述の明細書に記載されるように、ＨＢｓＡｇの発明の抗体のエピトープは１６０Ｋ（ａｙｗ）または１６０Ｒ（ａｄｒ）、１６３Ｗおよび１６４Ｅを含む。特に、１６４Ｅ部位は、アラニン置換変異体を使用する実験で、発明の抗体を結合するための最も有力な位置として特定された。現在のところ、この位置が１６４Ｄに変異することが知られており、発明の抗体は１６４Ｄ変異体への中和能力を示した。一方、１６３Ｗ部位は発明の抗体の結合に有意に関与しないが、この部位での変異は、複製に重要な役割を果たすポリメラーゼ配列の変異をもたらし、それは順に、ＨＢＶ  ＤＮＡ複製に影響を及ぼす。したがって、以上の部位が非常に保存的な位置、すなわち、変異がほんのわずかしか起こらない位置であると予測され得る。事実、１６３Ｗでのいかなる変異もまだ報告されていない。最後に、１６０Ｋ（ａｙｗサブタイプのため）または１６０Ｒ（ａｄｒサブタイプのため）が、抗原型を決定するアミノ酸部位である。機能アッセイの結果から、これらは、ＨＢＶ複製と深く関連しているように特定され、その結果、変異がほんのわずかしか起こらない非常に保存的な位置として、予測される。
【配列表フリーテキスト】
【００７８】
配列番号１はＨＢＶ表面抗原タンパク質のアミノ酸配列（ａｄｒサブタイプ）を示す。
【００７９】
配列番号２はＨＢＶ表面抗原タンパク質のアミノ酸配列（ａｙｗサブタイプ）を示す。
【００８０】
配列番号３はＨＢＶポリメラーゼタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【００８１】
配列番号４は発明の抗体のエピトープ（ａｄｒサブタイプ）を示す。
【００８２】
ＲＦＬＷＥ
【００８３】
配列番号５は発明の抗体のエピトープ（ａｙｗサブタイプ）を示す。
【００８４】
ＫＦＬＷＥ
【００８５】
配列番号６は発明の抗体のエピトープ（ａｄｒサブタイプ）を示す。
【００８６】
ＦＡＲＦＬＷＥＷＡＳＶＲＦＳＷ
【００８７】
配列番号７は発明の抗体のエピトープ（ａｙｗサブタイプ）を示す。
【００８８】
ＦＧＫＦＬＷＥＷＡＳＡＲＦＳＷ
【図１】
0005977346.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
0005977346000001.app