(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫原をコードする自己複製ＲＮＡの非ウイルス性送達によって大型哺乳動物において免疫応答を惹起するのに使用するための、該ＲＮＡを含む組成物であって、該組成物は、（ｉ）単位用量あたり２μｇ〜１００μｇの該免疫原コードＲＮＡ；または（ｉｉ）該哺乳動物の体重１ｋｇあたり０．１μｇ〜１．５μｇの該免疫原コードＲＮＡを含み、該組成物は、（ｉ）リポソーム；（ｉｉ）非毒性かつ生分解性のポリマー微粒子；および／もしくは（ｉｉｉ）サブミクロンのカチオン性水中油型エマルジョンを含む送達システムとの組み合わせにおいて投与されることを特徴とし、かつ、該大型哺乳動物がヒト、ウマ、ウシまたはブタである、組成物。
【請求項２】
骨格筋組織に投与するためのものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
注射によって投与するためのものである、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
注射が、針を介する注射である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＲＮＡが、プラス鎖である、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
前記ＲＮＡが、アルファウイルスベースのＲＮＡレプリコンである、請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
前記ＲＮＡ分子が、（ｉ）前記自己複製ＲＮＡ分子からＲＮＡを転写し得るＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、および（ｉｉ）免疫原をコードする、請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
前記ポリメラーゼが、アルファウイルスレプリカーゼである、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記ＲＮＡ分子が、アルファウイルス構造タンパク質をコードしない、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ＲＮＡが、細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生生物に対する免疫応答を誘発し得る免疫原をコードする、請求項１〜９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
前記免疫原が、（ａ）ＲＳウイルス（ＲＳＶ）糖タンパク質ＦなどのＲＳＶ；（ｂ）インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルスおよびインフルエンザＣウイルスなどのオルソミクソウイルス；または（ｃ）単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ６）、ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ７）、およびヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ８）などのヘルペスウイルスに対してインビボで免疫応答を誘発し得る、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記大型哺乳動物が、ウシもしくはヒトである、請求項１〜１１のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
免疫原をコードする自己複製ＲＮＡの非ウイルス性送達によって大型哺乳動物において免疫応答を惹起するのに使用するための薬学的組成物であって、該薬学的組成物は、単位用量あたり２μｇ〜１００μｇの該免疫原コードＲＮＡを含み、該薬学的組成物は、（ｉ）リポソーム；（ｉｉ）非毒性かつ生分解性のポリマー微粒子；および／もしくは（ｉｉｉ）サブミクロンのカチオン性水中油型エマルジョンを含む送達システムとの組み合わせにおいて投与されることを特徴とし、かつ、該大型哺乳動物がヒト、ウマ、ウシまたはブタである、薬学的組成物。
【請求項１４】
免疫原をコードする自己複製ＲＮＡの非ウイルス性送達によって大型哺乳動物において免疫応答を惹起するのに使用するための薬学的組成物であって、該薬学的組成物は、該哺乳動物の体重１ｋｇあたり０．１μｇ〜１．５μｇの該免疫原コードＲＮＡを含み、該薬学的組成物は、（ｉ）リポソーム；（ｉｉ）非毒性かつ生分解性のポリマー微粒子；および／もしくは（ｉｉｉ）サブミクロンのカチオン性水中油型エマルジョンを含む送達システムとの組み合わせにおいて投与されることを特徴とし、かつ、該大型哺乳動物がヒト、ウマ、ウシまたはブタである、薬学的組成物。
【請求項１５】
免疫原をコードする自己複製ＲＮＡの非ウイルス性送達によって大型哺乳動物において免疫応答を惹起するための医薬の製造における薬学的組成物の使用であって、該医薬は、単位用量あたり２μｇ〜１００μｇの該免疫原コードＲＮＡを含み、該薬学的組成物は、（ｉ）リポソーム；（ｉｉ）非毒性かつ生分解性のポリマー微粒子；および／もしくは（ｉｉｉ）サブミクロンのカチオン性水中油型エマルジョンを含む送達システムとの組み合わせにおいて投与されることを特徴とし、かつ、該大型哺乳動物がヒト、ウマ、ウシまたはブタである、使用。
【請求項１６】
免疫原をコードする自己複製ＲＮＡの非ウイルス性送達によって大型哺乳動物において免疫応答を惹起するための医薬の製造における薬学的組成物の使用であって、該医薬は、該哺乳動物の体重１ｋｇあたり０．１μｇ〜１．５μｇの該免疫原コードＲＮＡを含み、該薬学的組成物は、（ｉ）リポソーム；（ｉｉ）非毒性かつ生分解性のポリマー微粒子；および／もしくは（ｉｉｉ）サブミクロンのカチオン性水中油型エマルジョンを含む送達システムとの組み合わせにおいて投与されることを特徴とし、かつ、該大型哺乳動物がヒト、ウマ、ウシまたはブタである、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国仮出願第６１／３６１，７９４号（２０１０年７月６日出願）の利益を主張し、上記米国仮出願の全容は、全ての目的のために、参考として本明細書に援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、免疫化のためのＲＮＡの非ウイルス性送達の分野にある。
【背景技術】
【０００３】
（背景技術）
動物を免疫化するための核酸の送達は、数年間にわたり目標であった。種々のアプローチが、試験されてきており、それらとしては、ＤＮＡもしくはＲＮＡの使用、ウイルスもしくは非ウイルス性送達ビヒクルの使用（またはさらには「裸の」ワクチンにおいて、送達ビヒクルなし）、複製もしくは非複製ベクターの使用、またはウイルスもしくは非ウイルス性ベクターの使用が挙げられる。
【０００４】
種々の異なる用量の核酸が、以前のインビボ研究において送達されてきた。参考文献１（非特許文献１）は、５０μｇのリポプレックス（ｌｉｐｏｐｌｅｘｅｄ）ｍＲＮＡもしくはＤＮＡをマウスに送達したが、舌内（ｉｎｔｒａｇｌｏｓｓａｌ）１μｇおよび１０μｇの用量もまた使用して、舌組織におけるルシフェラーゼ発現を分析した。参考文献２（非特許文献２）は、１２μｇの、インフルエンザウイルスヌクレオタンパク質をコードするｍＲＮＡをマウスに送達した。参考文献３（非特許文献３）は、０．１μｇ、１μｇもしくは１０μｇの、β−ガラクトシダーゼをコードする自己複製ＲＮＡをマウスに送達した。参考文献４（非特許文献４）は、１０μｇの、狂犬病ウイルス糖タンパク質をコードする自己複製ＲＮＡをマウスに送達した。参考文献５（非特許文献５）は、合計で２μｇもしくは４μｇの、インフルエンザヘマグルチニンをコードするＤＮＡをヒトに送達したが、ＲＮＡを送達しなかった。
【０００５】
ＤＮＡワクチンでの経験は、小動物（例えば、マウス）での初期の研究を促進していたが、技術が大型動物（例えば、ヒト）へと移行したときに、効力が低下することが明らかになった。従って、非常に高用量が必要とされる（例えば、μｇではなくｍｇ）が、臨床グレードのＤＮＡを製造することは、費用がかかる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｊｏｈａｎｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  （１９９５）  ２３：１４９５−１５０１．
【非特許文献２】Ｍａｒｔｉｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  （１９９３）  ２２：１７１９−２２．
【非特許文献３】Ｙｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  （１９９９）  ５：８２３−２７．
【非特許文献４】Ｓａｘｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｖｅｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  （２００９）  １３６：３６−４４．
【非特許文献５】Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｖａｃｃｉｎｅ  （２００９）  ２７：２５０６−１２．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
さらに改善された核酸ワクチンへの必要性が存在している。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の開示）
本発明の第１の局面によれば、免疫原をコードするＲＮＡは、２μｇ〜１００μｇの用量において大型哺乳動物に送達される。以下に示されるように、用量  ６６μｇは、ウシにおいて免疫原性である。ウシ成体は、ヒト成人の体重の約１０倍の体重を有するので、本発明者らは、５〜１０μｇ  ＲＮＡというヒト用量が現実的であることを示した。
【０００９】
本発明の第２の局面によれば、免疫原をコードするＲＮＡは、０．１μｇ／ｋｇ〜１．５μｇ／ｋｇの用量において大型哺乳動物に送達される。以下に示されるように、用量  約０．９４μｇ／ｋｇは、ウシにおいて免疫原性である。先行技術の研究では、マウスにおいて１００ｎｇ〜１０μｇ  ＲＮＡを使用していた（約２０ｇの体重では、これは５μｇ／ｋｇ〜５００μｇ／ｋｇである）。
【００１０】
従って、本発明は、大型哺乳動物において免疫応答を惹起するための方法を提供し、上記方法は、上記哺乳動物に、２μｇ〜１００μｇの用量の免疫原コードＲＮＡを投与する工程を包含する。
【００１１】
本発明はまた、大型哺乳動物において免疫応答を惹起するためのインビボでの方法において使用するための免疫原コードＲＮＡを提供し、ここで上記方法は、２μｇ〜１００μｇの上記ＲＮＡを上記哺乳動物に投与する工程を包含する。
【００１２】
本発明はまた、大型哺乳動物においてインビボでの免疫応答を惹起するための医薬の製造における免疫原コードＲＮＡの使用を提供し、ここで上記医薬は、単位用量あたり２μｇ〜１００μｇの免疫原コードＲＮＡを有する。
【００１３】
本発明はまた、大型哺乳動物のための薬学的組成物を提供し、上記薬学的組成物は、単位用量あたり２μｇ〜１００μｇの免疫原コードＲＮＡを含む。０．５ｍｌという代表的投与容積において、上記免疫原コードＲＮＡの濃度は、よって、４μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌである。
【００１４】
本発明はまた、大型哺乳動物に投与するための薬学的組成物の単位用量を提供し、ここで上記単位用量は、２μｇ〜１００μｇの免疫原コードＲＮＡを含む。
【００１５】
本発明はまた、大型哺乳動物に投与するための薬学的組成物を含む送達デバイス（例えば、シリンジ、ネブライザ、噴霧器、吸入器、皮膚パッチなど）を提供し、ここで上記デバイス中の組成物は、２μｇ〜１００μｇの免疫原コードＲＮＡを含む。
【００１６】
本発明はまた、大型哺乳動物への投与のための薬学的組成物を含む密封シールされた（ｈｅｒｍｅｔｉｃａｌｌｙ  ｓｅａｌｅｄ）容器を提供し、ここで上記容器中の組成物は、２μｇ〜１００μｇの免疫原コードＲＮＡを含む。
【００１７】
本発明はまた、大型哺乳動物において免疫応答を惹起するための方法を提供し、上記方法は、上記哺乳動物に、上記哺乳動物の体重１ｋｇあたり０．１μｇ〜１．５μｇのＲＮＡを投与する工程を包含する。
【００１８】
本発明はまた、大型哺乳動物において免疫応答を惹起するためのインビボでの方法において使用するための免疫原コードＲＮＡを提供し、ここで上記方法は、上記哺乳動物の体重１ｋｇあたり０．１μｇ〜１．５μｇのＲＮＡを投与する工程を包含する。
【００１９】
本発明はまた、大型哺乳動物においてインビボでの免疫応答を惹起するための医薬の製造における免疫原コードＲＮＡの使用を提供し、ここで上記医薬は、上記哺乳動物の体重１ｋｇあたり０．１μｇ〜１．５μｇの免疫原コードＲＮＡを有する。
【００２０】
（投与）
本発明は、大型哺乳動物へのＲＮＡの投与を包含する。投与部位は、通常は、筋組織（例えば、骨格筋）である。筋肉内投与の代わりとしては、皮内投与、鼻内投与、眼内投与、皮下投与、腹腔内投与、静脈内投与、間隙投与、口内投与、経皮投与、もしくは舌下投与が挙げられるが、これらに限定されない。２つの好ましい経路は、皮内投与および筋肉内投与である。
【００２１】
投与は、種々の方法で達成され得る。例えば、針（例えば、皮下針）を介する注射が使用され得、特に、筋肉内投与、皮下投与、眼内投与、腹腔内投与もしくは静脈内投与のために使用され得る。針なし注射は、代替として使用され得る。
【００２２】
筋肉内注射は、本発明に従ってＲＮＡを投与する好ましい方法である。上腕、三角筋もしくは大腿筋（例えば、前外側大腿）への注射が、代表的である。
【００２３】
上記投与部位は、免疫細胞（例えば、マクロファージ（例えば、骨髄由来マクロファージ）、樹状細胞（例えば、骨髄由来形質細胞様樹状細胞および／もしくは骨髄由来骨髄樹状細胞）、単球（例えば、ヒト末梢血単球）など）、および非免疫細胞（例えば、筋細胞（これは、多核性であってもよいし、線維の束（ｆａｓｃｉｃｌｅ）へと構成されてもよい）および／もしくは線維芽細胞）の両方を含み得る。上記免疫細胞は、投与時に存在し得るが、通常、投与後、その部位に浸潤する。例えば、侵襲性投与によって引き起こされる（例えば、上記投与部位において針によって引き起こされる）組織損傷は、上記損傷した領域へと免疫細胞を浸潤させ得る。
【００２４】
ＲＮＡは、上記免疫細胞および／もしくは上記非免疫細胞の細胞質に入る。進入は、エンドサイトーシスを介してであり得る。免疫細胞のエンドソームの中で、上記ＲＮＡは、ＴＬＲ７（ｓｓＲＮＡ）、ＴＬＲ８（ｓｓＲＮＡ）もしくはＴＬＲ３（ｄｓＲＮＡ）に結合し得、それによって、先天的免疫経路を誘発する。ＲＮＡが、免疫細胞および非免疫細胞の上記エンドソームから上記細胞質へと逃れる場合、上記ＲＮＡは、ＲＮＡヘリカーゼに結合し得（例えば、ＲＩＧ−Ｉ様レポーターファミリー（すなわち、ＲＬＲ）において、例えば、ＲＩＧ−Ｉ（ＲＬＲ−１）、ＭＤＡ５（ＲＬＲ−２）および／もしくはＬＧＰ２（ＲＬＲ−３））、これもまた、先天的免疫経路を誘発する。上記ＲＮＡはまた、上記免疫細胞および／もしくは非免疫細胞において翻訳され得、上記免疫原の発現をもたらし、最終的には、ＭＨＣシステムを介して上記発現された免疫原の提示をもたらす。上記細胞はまた、Ｉ型インターフェロンおよび／もしくは炎症促進性（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）サイトカインを分泌して、局所的アジュバント効果を提供し得る。
【００２５】
上記ＲＮＡは、裸のＲＮＡとして（例えば、単に、ＲＮＡの水性溶液として）送達され得るが、免疫細胞および非免疫細胞両方への進入を増強するため、また、その後の細胞内効果を増強するために、そして良好な免疫原性効果に必要とされるＲＮＡの量を低下させるためにも、上記ＲＮＡは、好ましくは、送達システム（例えば、粒子もしくはエマルジョンの送達システム）と組み合わせて投与される。３つの有用な興味深い送達システムは、（ｉ）リポソーム、（ｉｉ）非毒性でかつ生分解性のポリマー微粒子、（ｉｉｉ）サブミクロンのカチオン性水中油型エマルジョンである。リポソームは、好ましい送達システムである。
【００２６】
本発明の第１の局面によれば、免疫原をコードするＲＮＡは、２μｇ〜１００μｇの用量において大型哺乳動物に送達される。例えば、上記用量は、５μｇ〜７５μｇ、６μｇ〜５０ｇ、７μｇ〜２５μｇ、８μｇ〜２０μｇ、もしくは９μｇ〜１５μｇであり得る。具体的な用量は、５μｇ、６μｇ、７μｇ、８μｇ、９μｇ、１０μｇ、１１μｇ、１２μｇ、１３μｇ、１４μｇ、１５μｇ、２０μｇ、２５μｇ、３０μｇ、３５μｇ、４０μｇ、４５μｇ、５０μｇ、６０μｇ、７０μｇ、８０μｇ、９０μｇ、もしくは１００μｇであり得る。ヒト用量は、５〜１０μｇであり得る。
【００２７】
本発明の第２の局面によれば、免疫原をコードするＲＮＡは、０．１μｇ  ＲＮＡ／ｋｇ  体重〜１．５μｇ  ＲＮＡ／ｋｇ  体重の用量において大型哺乳動物に送達される。例えば、上記用量は、０．２μｇ／ｋｇ〜１．２μｇ／ｋｇ、０．３μｇ／ｋｇ〜１．１μｇ／ｋｇ、０．４μｇ／ｋｇ〜１．０μｇ／ｋｇ、０．５μｇ／ｋｇ〜１．０μｇ／ｋｇ、もしくは０．５μｇ／ｋｇ〜１．５μｇ／ｋｇであり得る。具体的な用量は、０．１μｇ／ｋｇ、０．１５μｇ／ｋｇ、０．２μｇ／ｋｇ、０．２５μｇ／ｋｇ、０．３μｇ／ｋｇ、０．４μｇ／ｋｇ、０．５μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、もしくは１．２μｇ／ｋｇであり得る。
【００２８】
（リポソーム）
種々の両親媒性脂質は、リポソームとして、ＲＮＡ含有水性コアを被包するように、水性環境中で二重層を形成し得る。これら脂質は、アニオン性、カチオン性もしくは両性イオン性の親水性頭部（ｈｅａｄ  ｇｒｏｕｐ）を有し得る。アニオン性リン脂質からのリポソームの形成は、１９６０年代にさかのぼり、カチオン性リポソーム形成脂質は、１９９０年代以来研究されてきた。いくつかのリン脂質はアニオン性であるのに対して、他のものは、両性イオン性であり、他のものはカチオン性である。リン脂質の適切なクラスとしては、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、およびホスファチジル−グリセロールが挙げられるが、これらに限定されず、いくつかの有用なリン脂質は、表１に列挙される。有用なカチオン性脂質としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジステアリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎジメチル−３−アミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）。両性イオン性脂質としては、アシル両性イオン性脂質およびエーテル両性イオン性脂質が挙げられるが、これらに限定されない。有用な両性イオン性脂質の例は、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＣおよびドデシルホスホコリンである。上記脂質は、飽和もしくは不飽和であり得る。リポソームを調製するための少なくとも１つの不飽和脂質の使用は、好ましい。不飽和脂質が２つのテールを有する場合、両方のテールが、不飽和であり得、または上記不飽和脂質は、１つの飽和テールおよび１つの不飽和テールを有し得る。
【００２９】
リポソームは、単一の脂質から、もしくは脂質の混合物から形成され得る。混合物は、（ｉ）アニオン性脂質の混合物、（ｉｉ）カチオン性脂質の混合物、（ｉｉｉ）両性イオン性脂質の混合物、（ｉｖ）アニオン性脂質とカチオン性脂質との混合物、（ｖ）アニオン性脂質と両性イオン性脂質との混合物、（ｖｉ）両性イオン性脂質とカチオン性脂質との混合物、または（ｖｉｉ）アニオン性脂質、カチオン性脂質、および両性イオン性脂質の混合物を含み得る。同様に、混合物は、飽和脂質および不飽和脂質の両方を含み得る。例えば、混合物は、ＤＳＰＣ（両性イオン性、飽和）、ＤｌｉｎＤＭＡ（カチオン性、不飽和）、および／もしくはＤＭＧ（アニオン性、飽和）を含み得る。脂質の混合物が使用される場合、上記混合物中の成分である脂質のすべてが、両親媒性である必要はない（例えば、１種以上の両親媒性脂質が、コレステロールと混合され得る）。
【００３０】
脂質の親水性部分は、ＰＥＧ化され得る（すなわち、ポリエチレングリコールの共有結合によって改変され得る）。この改変は、上記リポソームの安定性を増大させ得、そして上記リポソームの非特異的吸着を妨げ得る。例えば、脂質は、参考文献６および７に開示されるもののような技術を使用して、ＰＥＧに結合体化され得る。ＰＥＧの種々の長さが使用され得る（例えば、０．５〜８ｋＤａ）。
【００３１】
ＤＳＰＣ、ＤｌｉｎＤＭＡ、ＰＥＧ−ＤＭＧおよびコレステロールの混合物が、実施例において使用される。
【００３２】
リポソームは、通常は、３つの群に分けられる：多層小胞（ＭＬＶ）；小さな単層小胞（ＳＵＶ）；および大きな単層小胞（ＬＵＶ）。ＭＬＶは、各小胞において複数の二重層を有し、いくつかの別個の水性区画を形成する。ＳＵＶおよびＬＵＶは、水性コアを被包する単一の二重層を有する；ＳＵＶは、代表的には、直径≦５０ｎｍを有し、ＬＵＶは、直径＞５０ｎｍを有する。本発明で有用なリポソームは、理想的には、５０〜２２０ｎｍの範囲の直径を有するＬＵＶである。様々な直径を有するＬＵＶの集団を含む組成物に関しては：（ｉ）少なくとも８０％（数で）は、２０〜２２０ｎｍの範囲の直径を有するべきであり、（ｉｉ）上記集団の平均直径（Ｚａｖ（強度で））は、理想的には、４０〜２００ｎｍの範囲にあり、そして／または（ｉｉｉ）上記直径は、多分散指数＜０．２を有するべきである。参考文献１のリポソーム／ＲＮＡ複合体は、６００〜８００ｎｍの範囲の直径を有し、高い多分散性を有すると予測される。
【００３３】
適切なリポソームを調製するための技術は、当該分野で周知である（例えば、参考文献８〜１０を参照のこと）。１つの有用な方法は、参考文献１１に記載され、（ｉ）脂質のエタノール溶液、（ｉｉ）核酸の水性溶液、および（ｉｉｉ）緩衝液を混合する工程、続いて、混合、平衡化、希釈および精製の工程を包含する。本発明の好ましいリポソームは、この混合プロセスによって得られ得る。
【００３４】
ＲＮＡは、好ましくは、上記リポソーム内に被包されるので、上記リポソームは、水性のＲＮＡ含有コアの周りに外層を形成する。この被包は、ＲＮＡをＲＮａｓｅ消化から保護することが見いだされた。上記リポソームは、いくらかの外部ＲＮＡ（例えば、上記リポソームの表面に）を含み得るが、上記ＲＮＡのうちの少なくとも半分（および理想的には、そのうちのすべて）が被包される。
【００３５】
（ポリマー微粒子）
種々のポリマーは、ＲＮＡを被包もしくは吸着するように微粒子を形成し得る。実質的に非毒性のポリマーの使用は、レシピエントが上記粒子を安全に受容し得ることを意味し、生分解性ポリマーの使用は、上記粒子が、長期的な残存を回避するように送達後に代謝され得ることを意味する。有用なポリマーはまた、薬学的グレードの処方物の調製を補助するために、滅菌可能である。
【００３６】
適切な非毒性かつ生分解性のポリマーとしては、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリラクトン（ポリカプロラクトンを含む）、ポリジオキサノン、ポリバレロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリシアノアクリレート、チロシン誘導ポリカーボネート、ポリビニル−ピロリジノンもしくはポリエステル−アミド、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３７】
いくつかの実施形態において、上記微粒子は、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、例えば、ポリ（ラクチド）（「ＰＬＡ」）、ラクチドとグリコリドとのコポリマー、例えば、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（「ＰＬＧ」）、およびＤ，Ｌ−ラクチドとカプロラクトンとのコポリマーから形成される。有用なＰＬＧポリマーとしては、以下の範囲のラクチド／グリコリドモル比、例えば、２０：８０〜８０：２０（例えば、２５：７５、４０：６０、４５：５５、５０：５０、５５：４５、６０：４０、７５：２５）を有するものが挙げられる。有用なＰＬＧポリマーとしては、例えば、５，０００〜２００，０００Ｄａ（例えば、１０，０００〜１００，０００Ｄａ、２０，０００〜７０，０００Ｄａ、３０，０００〜４０，０００Ｄａ、４０，０００〜５０，０００Ｄａ）の分子量を有するものが挙げられる。
【００３８】
上記微粒子は、理想的には、０．０２μｍ〜８μｍの範囲の直径を有する。様々な直径を有する微粒子の集団を含む組成物に関して、少なくとも８０％（数で）は、０．０３〜７μｍの範囲の直径を有するべきである。
【００３９】
適切な微粒子を調製するための技術は、当該分野で周知である（例えば、参考文献１０、１２（特に、第７章）および参考文献１３を参照のこと）。ＲＮＡの吸着を促進するために、微粒子は、カチオン性界面活性剤および／もしくは脂質（例えば、参考文献１４および１５において開示されるとおり）を含み得る。ポリマー微粒子を作製するための代替法は、成形する工程および硬化させる工程（例えば、参考文献１６に開示されるとおり）による。
【００４０】
本発明の微粒子は、４０〜１００ｍＶのゼータ電位を有し得る。
【００４１】
リポソームに勝る微粒子の１つの利点は、微粒子が安定な貯蔵のために容易に凍結乾燥されることである。
【００４２】
ＲＮＡは、上記微粒子に吸着させられ得、吸着は、上記微粒子中にカチオン性材料（例えば、カチオン性脂質）を含むことによって促進される。
【００４３】
（カチオン性水中油型エマルジョン）
水中油型エマルジョンは、インフルエンザワクチンへのアジュバントに関して公知である（例えば、ＦＬＵＡＤＴＭ製品の中のＭＦ５９ＴＭアジュバント、およびＰＲＥＰＡＮＤＲＩＸＴＭ製品中のＡＳ０３アジュバント）。本発明に従うＲＮＡ送達は、水中油型エマルジョンを利用し得るが、ただし、上記エマルジョンは、１個以上のカチオン性分子を含む。例えば、カチオン性脂質は、上記エマルジョン中に含まれて、負に荷電したＲＮＡが付着し得る正の液滴表面を提供し得る。
【００４４】
上記エマルジョンは、１種以上の油を含む。適切な油としては、例えば、動物供給源（例えば、魚類）もしくは植物供給源に由来するものが挙げられる。上記油は、理想的には、生分解性（代謝可能）でありかつ生体適合性である。植物性油の供給源としては、堅果、種子および穀物が挙げられる。落花生油、大豆油、ココナッツ油、およびオリーブ油（最も一般的に入手しやすい）は、堅果油を例示する。ホホバ油が使用され得、これは、例えば、ホホバ豆から得られる。種子油としては、サフラワー油、綿実油、ヒマワリ種子油、ごま種子油などが挙げられる。穀物群において、コーン油は、最も容易に入手可能であるが、他の穀類（例えば、小麦、オート麦、ライ麦、コメ、テフ、ライコムギなど）の油もまた、使用され得る。グリセロールおよび１，２−プロパンジオールの６〜１０個の炭素の脂肪酸エステルは、種子油中に天然には存在しないが、上記堅果および種子の油から始まる適切な材料の加水分解、分離およびエステル化によって調製され得る。哺乳動物の乳汁に由来する脂肪および油は、代謝可能であるので、使用され得る。動物供給源から純粋な油を得るために必要な分離、精製、鹸化および他の手段の手順は、当該分野で周知である。
【００４５】
大部分の魚類は、容易に採取し得る代謝可能な油を含む。例えば、たら肝油、サメ肝油、および鯨油（例えば、鯨蝋）は、本明細書で使用され得る魚油のうちのいくらかを例示する。多くの分枝鎖の油は、５炭素のイソプレン単位において生化学的に合成され、テルペノイドと一般に言われる。好ましいエマルジョンは、スクアレン、分枝状、不飽和テルペノイドであるサメ肝油（Ｃ３０Ｈ５０；［（ＣＨ３）２Ｃ［＝ＣＨＣＨ２ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）］２＝ＣＨＣＨ２−］２；２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエン；ＣＡＳ  ＲＮ  ７６８３−６４−９）を含む。スクアラン（スクアレンの飽和アナログ）もまた、使用され得る。魚油（スクアレンおよびスクアランを含む）は、市販の供給源から容易に利用可能であるか、または当該分野で公知の方法によって得られ得る。
【００４６】
他の有用な油は、トコフェロール（特に、スクアレンとの組み合わせにおいて）である。エマルジョンの油相がトコフェロールを含む場合、α−トコフェロール、β−トコフェロール、γ−トコフェロール、δ−トコフェロール、ε−トコフェロールもしくはζ−トコフェロールのうちのいずれかが使用され得るが、α−トコフェロールが好ましい。Ｄ−α−トコフェロールおよびＤＬ−α−トコフェロールはともに、使用され得る。好ましいα−トコフェロールは、ＤＬ−α−トコフェロールである。スクアレンおよびトコフェロール（例えば、ＤＬ−α−トコフェロール）を含む油の組み合わせが、使用され得る。
【００４７】
上記エマルジョン中の油は、油の組み合わせ（例えば、スクアレンと少なくとも１種のさらなる油）を含み得る。
【００４８】
上記エマルジョンの水性成分は、ただの水（ｐｌａｉｎ  ｗａｔｅｒ）（例えば、ｗ．ｆ．ｉ．）であり得るか、またはさらなる成分（例えば、溶質）を含み得る。例えば、上記水性成分は、緩衝液を形成するために塩を含み得る（例えば、クエン酸塩もしくはリン酸塩（例えば、ナトリウム塩））。代表的な緩衝液としては、以下が挙げられる：リン酸緩衝液；Ｔｒｉｓ緩衝液；ホウ酸緩衝液；コハク酸緩衝液；ヒスチジン緩衝液；もしくはクエン酸緩衝液。緩衝化された水相が好ましく、緩衝液は、代表的には、５〜２０ｍＭ範囲において含まれる。
【００４９】
上記エマルジョンはまた、カチオン性脂質を含む。好ましくは、この脂質は、上記エマルジョンの形成および安定化を促進し得るように、界面活性剤である。有用なカチオン性脂質は、一般には、生理学的条件下で正に荷電する窒素原子を含む（例えば、三級アミンもしくは四級アミンとして）。この窒素は、両親媒性界面活性剤の親水性頭部（ｈｅａｄ  ｇｒｏｕｐ）に存在し得る。有用なカチオン性脂質としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、３’−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣコレステロール）、ジメチルジオクタデシル−アンモニウム（ＤＤＡ  例えば、ブロミド）、１，２−ジミリストイル−３−トリメチル−アンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、ジパルミトイル（Ｃ１６：０）トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＰＴＡＰ）、ジステアロイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）。他の有用なカチオン性脂質は、以下である：塩化ベンザルコニウム（ＢＡＫ）、塩化ベンゼトニウム、セトリミド（ｃｅｔｒａｍｉｄｅ）（これは、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミドならびにおそらく少量のデデシルトリメチルアンモニウムブロミドおよびヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドを含む）、セチルピリジニウムクロリド（ＣＰＣ）、セチルトリメチルアンモニウムクロリド（ＣＴＡＣ）、Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ポリオキシエチレン（１０）−Ｎ−タロウ−ｌ，３−ジアミノプロパン、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルトリメチル−アンモニウムブロミド、混合アルキル−トリメチル−アンモニウムブロミド、ベンジルジメチルドデシルアンモニウムクロリド、ベンジルジメチルヘキサデシル−アンモニウムクロリド、ベンジルトリメチルアンモニウムメトキシド、セチルジメチルエチルアンモニウムブロミド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、メチルベンゼトニウムクロリド、デカメトニウムクロリド、メチル混合トリアルキルアンモニウムクロリド、メチルトリオクチルアンモニウムクロリド、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［２  （２−メチル−４−（１，１，３，３テトラメチルブチル）−フェノキシ］−エトキシ）エチル］−ベンゼンメタンアミニウムクロリド（ＤＥＢＤＡ）、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、［ｌ−（２，３−ジオレイルオキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ，トリメチルアンモニウムクロリド、１，２−ジアシル−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（アシル基＝ジミリストイル、ジパルミトイル、ジステアロイル、ジオレオイル）、ｌ，２−ジアシル−３（ジメチルアンモニオ）プロパン（アシル基＝ジミリストイル、ジパルミトイル、ジステアロイル、ジオレオイル）、ｌ，２−ジオレオイル−３−（４’−トリメチル−アンモニオ）ブタノイル−ｓｎ−グリセロール、１，２−ジオレオイル３−スクシニル−ｓｎ−グリセロールコリンエステル、コレステリル（４’−トリメチルアンモニオ）ブタノエート、Ｎ−アルキルピリジニウム塩（例えば、セチルピリジニウムブロミドおよびセチルピリジニウムクロリド）、Ｎ−アルキルピペリジニウム塩、ジカチオン性ボラ型電解質（Ｃ１２Ｍｅ６；Ｃ１２Ｂｕ６）、ジアルキルグリセチルホスホリルコリン、リゾレシチン、Ｌ−α  ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン、コレステロールヘミスクシネートコリンエステル、リポポリアミン、以下が挙げられるが、これらに限定されない、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノール−アミドスペルミン（ＤＰＰＥＳ）、リポポリ−Ｌ（もしくはＤ）−リジン（ＬＰＬＬ、ＬＰＤＬ）、Ｎ−グルタリルホスファチジルエタノールアミンに結合体化したポリＬ（もしくはＤ）−リジン、ペンダントアミノ基を有するジドデシルグルタメートエステル（Ｃ１２ＧｌｕＰｈＣｎＮ＋）、ペンダントアミノ基を有するジテトラデシルグルタメートエステル（Ｃ１２ＧｌｕＰｈＣｎＮ＋）、コレステロールのカチオン性誘導体（コレステリル−３  β−オキシスクシンアミドエチレントリメチルアンモニウム塩、コレステリル−３  β−オキシスクシンアミドエチレン−ジメチルアミン、コレステリル−３  β−カルボキシアミドエチレントリメチルアンモニウム塩、およびコレステリル−３  β−カルボキシアミドエチレンジメチルアミンが挙げられるが、これらに限定されない）。他の有用なカチオン性脂質は、参考文献１７および１８において記載される。
【００５０】
上記カチオン性脂質は、好ましくは、生分解性（代謝可能）でかつ生体適合性である。
【００５１】
上記油およびカチオン性脂質に加えて、エマルジョンは、非イオン性界面活性剤および／もしくは両性イオン性界面活性剤を含み得る。このような界面活性剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般に、Ｔｗｅｅｎといわれる）（特に、ポリソルベート２０およびポリソルベート８０）；エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）、および／もしくはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー（ＤＯＷＦＡＸＴＭ商品名の下で販売されている）（例えば、直鎖状のＥＯ／ＰＯブロックコポリマー）；オクトキシノール（これは、反復するエトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の数が変動し得る）（オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、もしくはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）は、特に興味深い）；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；リン脂質（例えば、ホスファチジルコリン（レシチン））；ラウリル、セチル、ステアリルおよびオレイルアルコールに由来するポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として公知）（例えば、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ  ３０））；ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル；ならびにソルビタンエステル（一般に、Ｓｐａｎとして公知）（例えば、ソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ  ８５）およびソルビタンモノラウレート）。上記エマルジョン中に含めるための好ましい界面活性剤は、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ  ８０；ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、Ｓｐａｎ  ８５（ソルビタントリオレエート）、レシチンおよびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である。
【００５２】
これら界面活性剤の混合物は、上記エマルジョン中に含まれ得る（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ８０／Ｓｐａｎ  ８５混合物、もしくはＴｗｅｅｎ ８０／Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００混合物）。ポリオキシエチレンソルビタンエステル、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ  ８０）およびオクトキシノール、例えば、ｔ−オクチルフェノキシ−ポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）の組み合わせもまた、適切である。別の有用な組み合わせは、ラウレス  ９とポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールを含む。有用な混合物は、１０〜２０の範囲のＨＬＢ値を有する界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０（ＨＬＢ  １５．０を有する））および１〜１０の範囲のＨＬＢ値を有する界面活性剤（例えば、ソルビタントリオレエート（ＨＬＢ  １．８を有する））を含み得る。
【００５３】
最終エマルジョン中の好ましい油の量（容積％）は、２〜２０％（例えば、５〜１５％、６〜１４％、７〜１３％、８〜１２％）である。約４〜６％もしくは約９〜１１％のスクアレン含有量は、特に有用である。
【００５４】
最終エマルジョン中の好ましい界面活性剤の量（重量％）は、０．００１％〜８％である。例えば：ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えば、ポリソルベート８０）０．２〜４％、特に、０．４〜０．６％、０．４５〜０．５５％、約０．５％もしくは１．５〜２％、１．８〜２．２％、１．９〜２．１％、約２％、もしくは０．８５〜０．９５％、もしくは約１％；ソルビタンエステル（例えば、ソルビタントリオレエート）０．０２〜２％、特に、約０．５％もしくは約１％；オクチルもしくはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）０．００１〜０．１％、特に、０．００５〜０．０２％；ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ラウレス  ９）０．１〜８％、好ましくは、０．１〜１０％および特に、０．１〜１％もしくは約０．５％。
【００５５】
油および界面活性剤の絶対量、およびそれらの比は、広い制限内で変動し得る（とはいえ、エマルジョンをなお形成する制限内で）。当業者は、所望のエマルジョンを得るために上記成分の相対的割合を容易に変動できるが、油および界面活性剤について４：１〜５：１の重量比が、代表的である（油が過剰）。
【００５６】
エマルジョンの免疫刺激活性を確実にするために（特に、大型動物において）重要なパラメーターは、油滴サイズ（直径）である。最も有効なエマルジョンは、サブミクロン範囲にある液滴サイズを有する。適切には、上記液滴サイズは、範囲５０〜７５０ｎｍにある。最も有用には、上記平均液滴サイズは、２５０ｎｍ未満（例えば、２００ｎｍ未満、１５０ｎｍ未満）である。上記平均液滴サイズは、有用なことには、８０〜１８０ｎｍの範囲にある。理想的には、上記エマルジョンの油滴のうちの少なくとも８０％（数で）は、直径２５０ｎｍ未満であり、好ましくは、少なくとも９０％がそうである。エマルジョンにおいて平均液滴サイズ、およびサイズ分布を決定するための装置は、市販されている。これらは、代表的には、動的光散乱および／または単一粒子光学検知（ｓｉｎｇｌｅ−ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｓｅｎｓｉｎｇ）、例えば、Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，  ＵＳＡ）から入手可能なＡｃｃｕｓｉｚｅｒＴＭおよびＮｉｃｏｍｐＴＭのシリーズの機器、またはＭａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  （ＵＫ）製のＺｅｔａｓｉｚｅｒＴＭ機器、またはＨｏｒｉｂａ（Ｋｙｏｔｏ，  Ｊａｐａｎ）製のＰａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｅ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｚｅｒ機器の技術を使用する。
【００５７】
理想的には、液滴サイズの分布（数で）は、唯一の最大を有する（すなわち、２つの最大を有するものではなく、平均あたりに分布した液滴の単一集団がある（モード））。好ましいエマルジョンは、＜０．４（例えば、０．３、０．２もしくはこれより小さい）の多分散性を有する。
【００５８】
サブミクロンの液滴および狭いサイズ分布を有する適切なエマルジョンは、マイクロフルイダイゼーション（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓａｔｉｏｎ）の使用によって得られ得る。この技術は、高圧および高速で、幾何的に固定されたチャネルを通る投入成分の流れを推進させることによって、平均油滴サイズを低下させる。これら流れは、チャネル壁、チャンバー壁および互いと接する。結果として得られる剪断力、衝撃力およびキャビテーション力は、液滴サイズの低下を引き起こす。マイクロフルイダイゼーションの反復工程は、所望の液滴サイズ平均および分布を有するエマルジョンが達成されるまで行われ得る。
【００５９】
マイクロフルイダイゼーションの代替として、参考文献１９で開示されるように、熱的方法が、相反転を引き起こすために使用され得る。これら方法はまた、狭い粒径分布を有するサブミクロンエマルジョンを提供し得る。
【００６０】
好ましいエマルジョンは、フィルター滅菌され得る（すなわち、それらの液滴は、２２０ｎｍフィルターを通過し得る）。滅菌を提供するだけでなく、この手順はまた、上記エマルジョンにおける任意の大きな液滴を除去する。
【００６１】
特定の実施形態において、上記エマルジョン中のカチオン性脂質は、ＤＯＴＡＰである。上記カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ  ＤＯＴＡＰを含み得る。例えば、上記カチオン性水中油型エマルジョンは、ＤＯＴＡＰを、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．１ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．３ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．４ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．６ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．７ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２４ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２２ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１８ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１２ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．９ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．８ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．７ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ、約１．１ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ、約１．３ｍｇ／ｍｌ、約１．４ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ、約１．６ｍｇ／ｍｌ、約１２ｍｇ／ｍｌ、約１８ｍｇ／ｍｌ、約２０ｍｇ／ｍｌ、約２１．８ｍｇ／ｍｌ、約２４ｍｇ／ｍｌなどにおいて含み得る。例示的実施形態において、上記カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ  ＤＯＴＡＰ（例えば、０．８ｍｇ／ｍｌ、１．２ｍｇ／ｍｌ、１．４ｍｇ／ｍｌもしくは１．６ｍｇ／ｍｌ）を含む。
【００６２】
特定の実施形態において、上記カチオン性脂質は、ＤＣコレステロールである。上記カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ  ＤＣコレステロールにおいてＤＣコレステロールを含み得る。例えば、上記カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．４ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．６２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約２．４６ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約３．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約４ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約４．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約４．９２ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約４．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約４ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約３．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２．４６ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約０．６２ｍｇ／ｍｌ、約０．１５ｍｇ／ｍｌ、約０．３ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ、約０．６２ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ、約２．４６ｍｇ／ｍｌ、約４．９２ｍｇ／ｍｌなどのＤＣコレステロールを含み得る。例示的実施形態において、上記カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．６２ｍｇ／ｍｌ〜約４．９２ｍｇ／ｍｌ  ＤＣコレステロール（例えば、２．４６ｍｇ／ｍｌ）を含む。
【００６３】
特定の実施形態において、上記カチオン性脂質は、ＤＤＡである。上記カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ  ＤＤＡを含み得る。例えば、上記カチオン性水中油型エマルジョンは、ＤＤＡを、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約４．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約４ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約３．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１．４５ｍｇ／ｍｌ、約０．２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．４ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．７３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１．４５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約２．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約３．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約４ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約４．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ、約１．４５ｍｇ／ｍｌなどにおいて含み得る。あるいは、上記カチオン性水中油型エマルジョンは、ＤＤＡを、約２０ｍｇ／ｍｌ、約２１ｍｇ／ｍｌ、約２１．５ｍｇ／ｍｌ、約２１．６ｍｇ／ｍｌ、約２５ｍｇ／ｍｌにおいて含み得る。例示的実施形態において、上記カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．７３ｍｇ／ｍｌ〜約１．４５ｍｇ／ｍｌ  ＤＤＡ（例えば、１．４５ｍｇ／ｍｌ）を含む。
【００６４】
患者に投与するための本発明の特定の好ましい組成物は、スクアレン、ｓｐａｎ  ８５、ポリソルベート８０、およびＤＯＴＡＰを含む。例えば：スクアレンは、５〜１５ｍｇ／ｍｌにおいて存在し得る；ｓｐａｎ  ８５は、０．５〜２ｍｇ／ｍｌにおいて存在し得る；ポリソルベート８０は、０．５〜２ｍｇ／ｍｌにおいて存在し得る；そしてＤＯＴＡＰは、０．１〜１０ｍｇ／ｍｌにおいて存在し得る。上記エマルジョンは、ｓｐａｎ  ８５およびポリソルベート８０を同じ量で含み得る（容積で）。上記エマルジョンは、界面活性剤より多くのスクアレンを含み得る。上記エマルジョンは、ＤＯＴＡＰより多くのスクアレンを含み得る。
【００６５】
（ＲＮＡ）
本発明は、免疫原をコードするＲＮＡのインビボ送達を包含する。上記ＲＮＡは、先天的免疫経路を誘発し得、また、翻訳され、上記免疫原の発現をもたらす。
【００６６】
上記ＲＮＡは、プラス鎖であるので、それは、任意の介在複製工程（ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｓｔｅｐ）（例えば、逆転写）を必要とせずに、翻訳され得る。
【００６７】
好ましいプラス鎖ＲＮＡは、自己複製性である。自己複製ＲＮＡ分子（レプリコン）は、あらゆるタンパク質なしで哺乳動物細胞に送達される場合でも、上記自己複製ＲＮＡ分子自体からの転写によって（上記自己複製ＲＮＡ分子自体から生じるアンチセンスコピーを介して）、複数の娘ＲＮＡの生成をもたらし得る。自己複製ＲＮＡ分子は、従って、代表的には、細胞への送達後に直接翻訳され得るプラス鎖分子であり、この翻訳は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを提供し、次いで、このことから、上記送達されるＲＮＡからのアンチセンス転写物およびセンス転写物の両方が生じる。従って、上記送達されるＲＮＡは、複数の娘ＲＮＡの生成をもたらす。これら娘ＲＮＡ、および同一線上（ｃｏｌｌｉｎｅａｒ）のサブゲノム転写物は、コードされる免疫原のインサイチュ発現を提供するためにそれ自体が翻訳されてもよいし、送達されたＲＮＡと同じセンスのさらなる転写物（上記免疫原のインサイチュ発現を提供するように翻訳される）を提供するように転写されてもよい。この一連の転写の全体的な結果は、上記導入されたレプリコンＲＮＡの数の非常に多くの増幅であるので、上記コードされた免疫原は、上記細胞の主なポリペプチド生成物になる。
【００６８】
自己複製を達成するための１つの適切なシステムは、アルファウイルスベースのＲＮＡレプリコンを使用することである。これらプラス鎖レプリコンは、細胞への送達後に翻訳されて、レプリカーゼ（もしくはレプリカーゼ−転写酵素）を与える。上記レプリカーゼは、上記送達されるプラス鎖ＲＮＡのゲノムマイナス鎖コピーを作り出す複製複合体を提供するように自己切断するポリプロテインとして翻訳される。これらマイナス鎖転写物は、これ自体が、上記プラス鎖親ＲＮＡのさらなるコピーを与え、そしてまた、上記免疫原をコードするサブゲノム転写物を与えるように転写され得る。従って、上記サブゲノム転写物の翻訳は、上記感染した細胞による上記免疫原のインサイチュ発現をもたらす。適切なアルファウイルスレプリコンは、シンドビス・ウイルス、セムリキ森林ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルスなどに由来するレプリカーゼを使用し得る。変異型ウイルスもしくは野生型ウイルスの配列が使用され得る（例えば、ＶＥＥＶの弱毒化ＴＣ８３変異体は、レプリコンにおいて使用されてきた［２０］）。
【００６９】
好ましい自己複製ＲＮＡ分子は、従って、（ｉ）上記自己複製ＲＮＡ分子からＲＮＡを転写し得るＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、および（ｉｉ）免疫原をコードする。上記ポリメラーゼは、アルファウイルスレプリカーゼ（例えば、アルファウイルスタンパク質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３およびｎｓＰ４のうちの１種以上を含む）であり得る。
【００７０】
天然のアルファウイルスゲノムは、上記非構造レプリカーゼポリプロテインに加えて、構造的ビリオンタンパク質をコードするのに対して、本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、アルファウイルス構造タンパク質をコードしないことが好ましい。従って、好ましい自己複製ＲＮＡは、細胞においてそれ自体のゲノムＲＮＡコピーの生成をもたらし得るが、ＲＮＡ含有ビリオンの生成はもたらさない。これらビリオンを生成できないことは、野生型アルファウイルスとは異なり、上記自己複製ＲＮＡ分子が、感染性形態においてそれ自体を永続させられないことを意味する。野生型ウイルスにおいて永続に必要な上記アルファウイルス構造タンパク質は、本発明の自己複製ＲＮＡになく、それらの位置は、上記目的の免疫原をコードする遺伝子によってしめられている。その結果、上記サブゲノム転写物は、上記構造的アルファウイルスビリオンタンパク質ではなく、上記免疫原をコードする。
【００７１】
従って、本発明で有用な自己複製ＲＮＡ分子は、２個のオープンリーディングフレームを有し得る。第１の（５’側）オープンリーディングフレームは、レプリカーゼをコードし；第２の（３’側）オープンリーディングフレームは、免疫原をコードする。いくつかの実施形態において、上記ＲＮＡは、例えば、さらなる免疫原（以下を参照のこと）をコードするために、もしくは補助ポリペプチドをコードするために、さらなる（例えば、下流の）オープンリーディングフレームを有し得る。
【００７２】
自己複製ＲＮＡ分子は、上記コードされるレプリカーゼと適合性である５’配列を有し得る。
【００７３】
自己複製ＲＮＡ分子は、種々の長さを有し得るが、それらは、代表的には、５０００〜２５０００ヌクレオチド長（例えば、８０００〜１５０００ヌクレオチド、もしくは９０００〜１２０００ヌクレオチド）である。従って、上記ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ送達において認められるものより長い。
【００７４】
本発明で有用なＲＮＡ分子は、５’キャップ（例えば、７−メチルグアノシン）を有し得る。このキャップは、上記ＲＮＡのインビボ翻訳を増強し得る。
【００７５】
本発明で有用なＲＮＡ分子の５’ヌクレオチドは、５’トリホスフェート基を有し得る。キャップされたＲＮＡにおいて、これは、５’から５’への架橋を介して、７−メチルグアノシンに連結され得る。５’トリホスフェートは、ＲＩＧ−Ｉ結合を増強し得る。
【００７６】
ＲＮＡ分子は、３’ポリ−Ａテールを有し得る。それはまた、その３’末端付近にポリＡポリメラーゼ認識配列（例えば、ＡＡＵＡＡＡ）を含み得る。
【００７７】
本発明で有用なＲＮＡ分子は、代表的には、一本鎖である。一本鎖ＲＮＡは、一般には、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＲＮＡヘリカーゼおよび／もしくはＰＫＲに結合することによってアジュバント効果を開始し得る。二本鎖形態（ｄｓＲＮＡ）において送達されたＲＮＡは、ＴＬＲ３に結合し得、このレセプターはまた、一本鎖ＲＮＡの複製の間に、もしくは一本鎖ＲＮＡの二次構造内のいずれかで形成されるｄｓＲＮＡによって誘発され得る。
【００７８】
本発明に有用なＲＮＡ分子は、便宜上、インビトロ転写（ＩＶＴ）によって調製され得る。ＩＶＴは、細菌においてプラスミド形態において作られ、増やされたか、または合成で作製された（例えば、遺伝子合成および／もしくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）操作法によって）（ｃＤＮＡ）テンプレートを使用し得る。例えば、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、バクテリオファージＴ７、Ｔ３もしくはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ）は、ＤＮＡテンプレートからＲＮＡを転写するために使用され得る。適切なキャッピングおよびポリＡ付加反応は、必要時に使用され得る（しかし、上記レプリコンのポリＡは、通常、上記ＤＮＡテンプレート内にコードされる）。これらＲＮＡポリメラーゼは、転写される５’ヌクレオチドについてストリンジェントな要件を有し得、いくつかの実施形態において、これらの要件は、上記ＩＶＴ転写ＲＮＡが、自己がコードするレプリカーゼの基質として効率的に機能し得ることを確実にするために、上記コードされたレプリカーゼの要件とマッチしなければならない。
【００７９】
参考文献２１において考察されるように、上記自己複製ＲＮＡは、（任意の５’キャップ構造に加えて）改変された核酸塩基を有する１個以上のヌクレオチドを含み得る。従って、上記ＲＮＡは、以下を含み得る：ｍ５Ｃ（５−メチルシチジン）、ｍ５Ｕ（５−メチルウリジン）、ｍ６Ａ（Ｎ６−メチルアデノシン）、ｓ２Ｕ（２−チオウリジン）、Ｕｍ（２’−Ｏ−メチルウリジン）、ｍ１Ａ（ｌ−メチルアデノシン）；ｍ２Ａ（２−メチルアデノシン）；Ａｍ（２’−Ｏ−メチルアデノシン）；ｍｓ２ｍ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−メチルアデノシン）；ｉ６Ａ（Ｎ６−イソペンテニルアデノシン）；ｍｓ２ｉ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６イソペンテニルアデノシン）；ｉｏ６Ａ（Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）；ｍｓ２ｉｏ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）；ｇ６Ａ（Ｎ６−グリシニルカルバモイルアデノシン）；ｔ６Ａ（Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン）；ｍｓ２ｔ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン）；ｍ６ｔ６Ａ（Ｎ６−メチル−Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン）；ｈｎ６Ａ（Ｎ６．−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）；ｍｓ２ｈｎ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）；Ａｒ（ｐ）（２’−Ｏ−リボシルアデノシン（ホスフェート））；Ｉ（イノシン）；ｍ１１（１−メチルイノシン）；ｍ’Ｉｍ（１，２’−Ｏ−ジメチルイノシン）；ｍ３Ｃ（３−メチルシチジン）；Ｃｍ（２Ｔ−Ｏ−メチルシチジン）；ｓ２Ｃ（２−チオシチジン）；ａｃ４Ｃ（Ｎ４−アセチルシチジン）；ｆ５Ｃ（５−ホルミル（ｆｏｎｎｙｌ）シチジン）；ｍ５Ｃｍ（５，２−Ｏ−ジメチルシチジン）；ａｃ４Ｃｍ（Ｎ４アセチル２ＴＯメチルシチジン）；ｋ２Ｃ（リシジン）；ｍ１Ｇ（１−メチルグアノシン）；ｍ２Ｇ（Ｎ２−メチルグアノシン）；ｍ７Ｇ（７−メチルグアノシン）；Ｇｍ（２’−Ｏ−メチルグアノシン）；ｍ２２Ｇ（Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン）；ｍ２Ｇｍ（Ｎ２，２’−Ｏ−ジメチルグアノシン）；ｍ２２Ｇｍ（Ｎ２，Ｎ２，２’−Ｏ−トリメチルグアノシン）；Ｇｒ（ｐ）（２’−Ｏ−リボシルグアノシン（ホスフェート））；ｙＷ（ワイブトシン）；ｏ２ｙＷ（ペルオキシワイブトシン）；ＯＨｙＷ（ヒドロキシワイブトシン）；ＯＨｙＷ＊（改変下（ｕｎｄｅｒｍｏｄｉｆｉｅｄ）ヒドロキシワイブトシン）；ｉｍＧ（ワイオシン）；ｍｉｍＧ（メチルグアノシン）；Ｑ（キューオシン）；ｏＱ（エポキシキューオシン）；ｇａｌＱ（ガラクトシル（ｇａｌｔａｃｔｏｓｙｌ）−キューオシン）；ｍａｎＱ（マンノシル−キューオシン）；ｐｒｅＱｏ（７−シアノ−７−デアザグアノシン）；ｐｒｅＱｉ（７−アミノメチル−７−デアザグアノシン）；Ｇ＊（アルカエオシン（ａｒｃｈａｅｏｓｉｎｅ））；Ｄ（ジヒドロウリジン）；ｍ５Ｕｍ（５，２’−Ｏ−ジメチルウリジン）；ｓ４Ｕ（４−チオウリジン）；ｍ５ｓ２Ｕ（５−メチル−２−チオウリジン）；ｓ２Ｕｍ（２−チオ−２’−Ｏ−メチルウリジン）；ａｃｐ３Ｕ（３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン）；ｈｏ５Ｕ（５−ヒドロキシウリジン）；ｍｏ５Ｕ（５−メトキシウリジン）；ｃｍｏ５Ｕ（ウリジン５−オキシ酢酸）；ｍｃｍｏ５Ｕ（ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル）；ｃｈｍ５Ｕ（５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン））；ｍｃｈｍ５Ｕ（５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチルエステル）；ｍｃｍ５Ｕ（５−メトキシカルボニルメチルウリジン）；ｍｃｍ５Ｕｍ（Ｓ−メトキシカルボニルメチル−２−Ｏ−メチルウリジン）；ｍｃｍ５ｓ２Ｕ（５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン）；ｎｍ５ｓ２Ｕ（５−アミノメチル−２−チオウリジン）；ｍｎｍ５Ｕ（５−メチルアミノメチルウリジン）；ｍｎｍ５ｓ２Ｕ（５−メチルアミノメチル−２−チオウリジン）；ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ（５−メチルアミノメチル−２−セレノウリジン）；ｎｃｍ５Ｕ（５−カルバモイルメチルウリジン）；ｎｃｍ５Ｕｍ（５−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン）；ｃｍｎｍ５Ｕ（５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン）；ｃｎｍｍ５Ｕｍ（５−カルボキシメチルアミノメチル−２−Ｌ−Ｏメチルウリジン）；ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ（５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン）；ｍ６２Ａ（Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデノシン）；Ｔｍ（２’−Ｏ−メチルイノシン）；ｍ４Ｃ（Ｎ４−メチルシチジン）；ｍ４Ｃｍ（Ｎ４，２−Ｏ−ジメチルシチジン）；ｈｍ５Ｃ（５−ヒドロキシメチルシチジン）；ｍ３Ｕ（３−メチルウリジン）；ｃｍ５Ｕ（５−カルボキシメチルウリジン）；ｍ６Ａｍ（Ｎ６，Ｔ−Ｏ−ジメチルアデノシン）；ｒｎ６２Ａｍ（Ｎ６，Ｎ６，Ｏ−２−トリメチルアデノシン）；ｍ２’７Ｇ（Ｎ２，７−ジメチルグアノシン）；ｍ２’２’７Ｇ（Ｎ２，Ｎ２，７−トリメチルグアノシン）；ｍ３Ｕｍ（３，２Ｔ−Ｏ−ジメチルウリジン）；ｍ５Ｄ（５−メチルジヒドロウリジン）；ｆ５Ｃｍ（５−ホルミル−２’−Ｏ−メチルシチジン）；ｍ１Ｇｍ（１，２’−Ｏ−ジメチルグアノシン）；ｍ’Ａｍ（（１，２−Ｏ−ジメチルアデノシン）イリノメチルウリジン）；ｔｍ５ｓ２Ｕ（Ｓ−タウリノメチル−２−チオウリジン）；ｉｍＧ−１４（４−デメチルグアノシン）；ｉｍＧ２（イソグアノシン）；もしくはａｃ６Ａ（Ｎ６−アセチルアデノシン）、ヒポキサンチン、イノシン、８−オキソ−アデニン、７−置換されたその誘導体、ジヒドロウラシル、シュードウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−アミノウラシル、５−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキルウラシル、５−メチルウラシル、５−（Ｃ２−Ｃ６）−アルケニルウラシル、５−（Ｃ２−Ｃ６）−アルキニルウラシル、５−（ヒドロキシメチル）ウラシル、５−クロロウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシシトシン、５−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキルシトシン、５−メチルシトシン、５−（Ｃ２−Ｃ６）−アルケニルシトシン、５−（Ｃ２−Ｃ６）−アルキニルシトシン、５−クロロシトシン、５−フルオロシトシン、５−ブロモシトシン、Ｎ２−ジメチルグアニン、７−デアザグアニン、８−アザグアニン、７−デアザ−７−置換グアニン、７−デアザ−７−（Ｃ２−Ｃ６）アルキニルグアニン、７−デアザ−８−置換グアニン、８−ヒドロキシグアニン、６−チオグアニン、８−オキソグアニン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２，４−ジアミノプリン、２，６−ジアミノプリン、８−アザプリン、置換された７−デアザプリン、７−デアザ−７−置換プリン、７−デアザ−８−置換プリン、または無塩基ヌクレオチド。例えば、自己複製ＲＮＡは、１つ以上の改変されたピリミジン核酸塩基（例えば、シュードウリジンおよび／もしくは５−メチルシトシン残基）を含み得る。しかし、いくつかの実施形態において、上記ＲＮＡは、改変された核酸塩基を含まず、改変されたヌクレオチドを含まなくてもよい（すなわち、上記ＲＮＡ中のヌクレオチドのすべては、標準的なＡ、Ｃ、ＧおよびＵというリボヌクレオチドである（任意の５’キャップ構造を除く。これは、７’−メチルグアノシンを含み得る））。他の実施形態において、上記ＲＮＡは、７’−メチルグアノシンを含む５’キャップを含み得、最初の１個、２個もしくは３個の５’リボヌクレオチドは、リボースの２’位においてメチル化され得る。
【００８０】
本発明で使用されるＲＮＡは、理想的には、ヌクレオチド間にホスホジエステル結合のみを含むが、いくつかの実施形態において、それは、ホスホロアミデート結合、ホスホロチオエート結合、および／もしくはメチルホスホネート結合を含み得る。
【００８１】
理想的には、投与されるＲＮＡは、１０種より少ない種の異なるＲＮＡ（例えば、５種、４種、３種、もしくは２種の異なる種）を含み；最も好ましくは、組成物は、単一のＲＮＡ種を含む（すなわち、上記組成物中の（例えば、リポソーム内の）すべてのＲＮＡ分子は、同じ配列および同じ長さを有する）。
【００８２】
（免疫原）
本発明で使用されるＲＮＡ分子は、ポリペプチド免疫原をコードする。上記ＲＮＡの投与後に、上記免疫原は、インビボで翻訳され、レシピエントにおける免疫応答を誘発し得る。上記免疫原は、細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生生物に対して（あるいは、いくつかの実施形態において、アレルゲンに対して；および他の実施形態において、腫瘍抗原に対して）免疫応答を誘発し得る。上記免疫応答は、抗体応答（通常は、ＩｇＧを含む）および／もしくは細胞媒介性免疫応答を含み得る。上記ポリペプチド免疫原は、代表的には、対応する細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生生物（またはアレルゲンもしくは腫瘍）ポリペプチドを認識する免疫応答を誘発するが、いくつかの実施形態において、上記ポリペプチドは、細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生生物のサッカリドを認識する免疫応答を誘発するように、ミモトープとして作用し得る。上記免疫原は、代表的には、表面ポリペプチド（例えば、アドヘシン、ヘマグルチニン、エンベロープ糖タンパク質、スパイク糖タンパク質など）である。
【００８３】
ＲＮＡ分子は、単一のポリペプチド免疫原もしくは複数のポリペプチドをコードし得る。複数の免疫原は、単一のポリペプチド免疫原（融合ポリペプチド）として、または別個のポリペプチドとして提示され得る。免疫原が、別個のポリペプチドとして発現される場合、これらのうちの１種以上は、上流のＩＲＥＳもしくはさらなるウイルスプロモーターエレメントとともに提供され得る。あるいは、複数の免疫原は、短い自己触媒性プロテアーゼ（例えば、口蹄疫ウイルス２Ａタンパク質）に融合された個々の免疫原をコードするポリプロテインから、またはインテインとして発現され得る。
【００８４】
参考文献１および２２とは異なり、上記ＲＮＡは、免疫原をコードする。不確かさを避けるために、本発明は、ホタルルシフェラーゼをコードするＲＮＡ、Ｅ．ｃｏｌｉ  β−ガラクトシダーゼの融合タンパク質をコードするＲＮＡ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＲＮＡを含まない。また、上記ＲＮＡは、全マウス胸腺ＲＮＡではない。
【００８５】
いくつかの実施形態において、上記免疫原は、これら細菌のうちの１種に対して免疫応答を誘発する：
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ：有用な免疫原としては、膜タンパク質、例えば、アドヘシン、オートトランスポーター、毒素、鉄獲得タンパク質、およびＨ因子結合タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。３種の有用なポリペプチドの組み合わせが、参考文献２３に開示される。
【００８６】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ：有用なポリペプチド免疫原は、参考文献２４に開示される。これらとしては、ＲｒｇＢ線毛サブユニット、β−Ｎ−アセチル−ヘキソサミニダーゼ前駆体（ｓｐｒ００５７）、ｓｐｒ００９６、一般的なストレスタンパク質（ｇｅｎｅｒａｌ  ｓｔｒｅｓｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ）ＧＳＰ−７８１（ｓｐｒ２０２１、ＳＰ２２１６）、セリン／スレオニンキナーゼＳｔｋＰ（ＳＰ１７３２）、および肺炎球菌表面アドヘシンＰｓａＡが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８７】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ：有用な免疫原としては、参考文献２５および２６に開示されるポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８８】
Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ：有用な百日咳免疫原としては、百日咳毒素もしくはトキソイド（ＰＴ）、線維状ヘマグルチニン（ＦＨＡ）、ペルタクチン、ならびに凝集原２および３が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８９】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ：有用な免疫原としては、参考文献２７に開示されるポリペプチド（例えば、溶血素、ｅｓｘＡ、ｅｓｘＢ、フェリクロム結合タンパク質（ｓｔａ００６）および／もしくはｓｔａ０１１リポプロテイン）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９０】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ：代表的な免疫原は、破傷風トキソイドである。
【００９１】
Ｃｏｒｎｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ：代表的な免疫原は、ジフテリアトキソイドである。
【００９２】
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ：有用な免疫原としては、参考文献２８および２９に開示されるポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９３】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ：有用な免疫原としては、参考文献２５に開示されるポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９４】
Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ：有用な免疫原としては、ＰｅｐＡ、ＬｃｒＥ、ＡｒｔＪ、ＤｎａＫ、ＣＴ３９８、ＯｍｐＨ様、Ｌ７／Ｌ１２、ＯｍｃＡ、ＡｔｏＳ、ＣＴ５４７、Ｅｎｏ、ＨｔｒＡおよびＭｕｒＧ（例えば、参考文献３０に開示されるとおり）が挙げられるが、これらに限定されない。ＬｃｒＥ［３１］およびＨｔｒＡ［３２］は、２つの好ましい免疫原である。
【００９５】
Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ：有用な免疫原としては、参考文献３３に開示されるポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９６】
Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ：有用な免疫原としては、ＣａｇＡ、ＶａｃＡ、ＮＡＰ、および／もしくはウレアーゼ［３４］が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９７】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：有用な免疫原としては、腸毒素産生性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＴＥＣ）、腸管凝集性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＡｇｇＥＣ）、分散接着性（ｄｉｆｆｕｓｅｌｙ  ａｄｈｅｒｉｎｇ）Ｅ．ｃｏｌｉ（ＤＡＥＣ）、腸病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＰＥＣ）、腸管外病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥｘＰＥＣ）および／もしくは腸管出血性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＨＥＣ）に由来する免疫原が挙げられるが、これらに限定されない。ＥｘＰＥＣ株としては、尿路病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＵＰＥＣ）および髄膜炎／敗血症関連Ｅ．ｃｏｌｉ（ＭＮＥＣ）が挙げられる。有用なＵＰＥＣポリペプチド免疫原は、参考文献３５および３６に開示される。有用なＭＮＥＣ免疫原は、参考文献３７に開示される。いくつかのＥ．ｃｏｌｉタイプに有用な免疫原は、ＡｃｆＤである［３８］。
【００９８】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ
Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ：有用な免疫原としては、参考文献３９および４０に開示されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９９】
【化１】
0005940064.tif 000002
【０１００】
【化２】
0005940064.tif 000003
いくつかの実施形態において、上記免疫原は、これらウイルスのうちの１種に対して免疫応答を誘発する：
オルソミクソウイルス：有用な免疫原は、インフルエンザＡ、ＢもしくはＣウイルスに由来し得る（例えば、ヘマグルチニン、ノイラミニダーゼもしくはマトリクスＭ２タンパク質）。上記免疫原がインフルエンザＡウイルスヘマグルチニンである場合、それは、任意のサブタイプ（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５もしくはＨ１６）に由来し得る。
【０１０１】
パラミクソウイルス科のウイルス：ウイルス免疫原としては、肺炎ウイルス（例えば、ＲＳウイルス、ＲＳＶ）、ルブラウイルス（例えば、ムンプスウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、パラインフルエンザ・ウイルス）、メタニューモウイルスおよびモルビリウイルス（例えば、麻疹ウイルス）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０２】
ポックスウイルス科：ウイルス免疫原としては、オルトポックスウイルス（例えば、真正痘瘡（大痘瘡および小痘瘡が挙げられるが、これらに限定されない））に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０３】
ピコルナウイルス：ウイルス免疫原としては、ピコルナウイルス（例えば、エンテロウイルス、ライノウイルス、ヘパルナウイルス、カルジオウイルスおよびアフトウイルス）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、上記エンテロウイルスは、ポリオウイルス（例えば、１型、２型、および／もしくは３型のポリオウイルス）である。別の実施形態において、上記エンテロウイルスは、ＥＶ７１エンテロウイルスである。別の実施形態において、上記エンテロウイルスは、コクサッキーＡもしくはＢウイルスである。
【０１０４】
ブンヤウイルス：ウイルス免疫原としては、オルソブンヤウイルス（例えば、カリフォルニア脳炎ウイルス）、フレボウイルス（例えば、リフトバレー熱ウイルス）、もしくはナイロウイルス（例えば、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０５】
ヘパルナウイルス：ウイルス免疫原としては、ヘパルナウイルス（例えば、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ））に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０６】
フィロウイルス：ウイルス免疫原としては、フィロウイルス（例えば、エボラウイルス（ザイールエボラウイルス、アイボリーコーストエボラウイルス、レストンエボラウイルスもしくはスーダンエボラウイルスを含む））またはマールブルグウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０７】
トガウイルス：ウイルス免疫原としては、トガウイルス（例えば、ルビウイルス、アルファウイルス、もしくはアルテリウイルス）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。これは、風疹ウイルスを含む。
【０１０８】
フラビウイルス：ウイルス免疫原としては、フラビウイルス（例えば、ダニ媒介脳炎（ＴＢＥ）ウイルス、デング（１、２、３もしくは４型）ウイルス、黄熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、キャサヌール森林ウイルス、ウエストナイル脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ロシア春夏脳炎ウイルス、ポワッサン脳炎ウイルス）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０９】
ペスチウイルス：ウイルス免疫原としては、ペスチウイルス（例えば、牛ウイルス性下痢（ＢＶＤＶ）、豚コレラ（ＣＳＦＶ）もしくはボーダー病（ＢＤＶ））に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１０】
ヘパドナウイルス：ウイルス免疫原としては、ヘパドナウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。組成物は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を含み得る。
【０１１１】
他の肝炎ウイルス：組成物は、Ｃ型肝炎ウイルス、デルタ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、もしくはＧ型肝炎ウイルスに由来する免疫原を含み得る。
【０１１２】
ラブドウイルス：ウイルス免疫原としては、ラブドウイルス（例えば、リッサウイルス（例えば、狂犬病ウイルス）およびベシクロウイルス（ＶＳＶ））に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１３】
カリシウイルス科：ウイルス免疫原としては、カリシウイルス科（例えば、ノーウォークウイルス（ノロウイルス）、およびノーウォーク様ウイルス（例えば、ハワイウイルスおよびスノーマウンテンウイルス））に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１４】
コロナウイルス：ウイルス免疫原は、ＳＡＲＳコロナウイルス、トリ伝染性気管支炎（ＩＢＶ）、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、およびブタ伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。上記コロナウイルス免疫原は、スパイクポリペプチドであり得る。
【０１１５】
レトロウイルス：ウイルス免疫原としては、オンコウイルス、レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ−１もしくはＨＩＶ−２）またはスプマウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１６】
レオウイルス：ウイルス免疫原としては、オルトレオウイルス、ロタウイルス、オルビウイルス、もしくはコルチウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１７】
パルボウイルス：ウイルス免疫原としては、パルボウイルスＢ１９に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１８】
ヘルペスウイルス：ウイルス免疫原としては、ヒトヘルペスウイルス（例えば、例示に過ぎないが、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（例えば、ＨＳＶ１型および２型）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ６）、ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ７）、およびヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ８））に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１９】
パポバウイルス：ウイルス免疫原としては、パピローマウイルスおよびポリオーマウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。上記（ヒト）パピローマウイルスは、血清型１、２、４、５、６、８、１１、１３、１６、１８、３１、３３、３５、３９、４１、４２、４７、５１、５７、５８、６３もしくは６５のもの（例えば、血清型６、１１、１６および／もしくは１８のうちの１種以上に由来する）であり得る。
【０１２０】
アデノウイルス：ウイルス免疫原としては、アデノウイルス血清型３６（Ａｄ−３６）に由来するものが挙げられる。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、上記免疫原は、魚類に感染するウイルス（例えば：伝染性サケ貧血ウイルス（ＩＳＡＶ）、サケ膵臓病ウイルス（ＳＰＤＶ）、伝染性膵臓壊死症ウイルス（ＩＰＮＶ）、アメリカナマズウイルス（ＣＣＶ）、魚類リンホシスチス病ウイルス（ＦＬＤＶ）、伝染性造血器壊死症ウイルス（ＩＨＮＶ）、コイヘルペスウイルス、サケピコルナ様ウイルス（大西洋サケピコルナ様ウイルスとしても公知）、ヤマメウイルス（ＬＳＶ）、大西洋サケロタウイルス（ＡＳＲ）、マスイチゴ病ウイルス（ＴＳＤ）、銀ザケ腫瘍ウイルス（ＣＳＴＶ）、もしくはウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ））に対する免疫応答を誘発する。
【０１２２】
真菌免疫原は、皮膚糸状菌類（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈｙｔｒｅｓ）（以下が挙げられる：
【０１２３】
【化３】
0005940064.tif 000004
【０１２４】
【化４】
0005940064.tif 000005
に由来し得る。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、上記免疫原は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ属（例えば、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐ．ｖｉｖａｘ、Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅもしくはＰ．ｏｖａｌｅ）に由来する寄生生物に対する免疫応答を誘発する。従って、本発明は、マラリアに対して免疫化するために使用され得る。いくつかの実施形態において、上記免疫原は、Ｃａｌｉｇｉｄａｅ科に由来する寄生生物、特に、Ｌｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ属およびＣａｌｉｇｕｓ属に由来する寄生生物（例えば、Ｌｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ  ｓａｌｍｏｎｉｓもしくはＣａｌｉｇｕｓ  ｒｏｇｅｒｃｒｅｓｓｅｙｉのようなフナムシ）に対する免疫応答を誘発する。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、上記免疫原は、以下に対する免疫応答を誘発する：花粉アレルゲン（樹木花粉、草本花粉、雑草の花粉、および草の花粉のアレルゲン）；昆虫もしくは蛛形類のアレルゲン（吸入、唾液および毒液のアレルゲン、例えば、ダニアレルゲン、ゴキブリアレルゲンおよび小虫アレルゲン、膜翅類毒液アレルゲン（ｈｙｍｅｎｏｐｔｈｅｒａ  ｖｅｎｏｍ  ａｌｌｅｒｇｅｎ））；動物の毛およびふけのアレルゲン（例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、マウスなどに由来する）；ならびに食物アレルゲン（例えば、グリアジン）。樹木、草および草本に由来する重要な花粉アレルゲンは、Ｆａｇａｌｅｓ、Ｏｌｅａｌｅｓ、Ｐｉｎａｌｅｓの分類学上の目およびスズカケノキ科（ｐｌａｔａｎａｃｅａｅ）（カバノキ（Ｂｅｔｕｌａ）、ハンノキ（Ａｌｎｕｓ）、ハシバミ（Ｃｏｒｙｌｕｓ）、シデ（Ｃａｒｐｉｎｕｓ）およびオリーブ（Ｏｌｅａ）、シーダー（ＣｒｙｐｔｏｍｅｒｉａおよびＪｕｎｉｐｅｒｕｓ）、プラタナス（Ｐｌａｔａｎｕｓ）が挙げられるが、これらに限定されない）、Ｐｏａｌｅｓの目（属Ｌｏｌｉｕｍ、Ｐｈｌｅｕｍ、Ｐｏａ、Ｃｙｎｏｄｏｎ、Ｄａｃｔｙｌｉｓ、Ｈｏｌｃｕｓ、Ｐｈａｌａｒｉｓ、Ｓｅｃａｌｅ、およびＳｏｒｇｈｕｍの草が挙げられる）、ＡｓｔｅｒａｌｅｓおよびＵｒｔｉｃａｌｅｓの目（属Ａｍｂｒｏｓｉａ、Ａｒｔｅｍｉｓｉａ、およびＰａｒｉｅｔａｒｉａの草本が挙げられる）から由来するそのようなものである。他の重要な吸入アレルゲンは、属ＤｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓおよびＥｕｒｏｇｌｙｐｈｕｓのチリダニ類、コナダニ類（ｓｔｏｒａｇｅ  ｍｉｔｅ）（例えば、Ｌｅｐｉｄｏｇｌｙｐｈｙｓ、ＧｌｙｃｙｐｈａｇｕｓおよびＴｙｒｏｐｈａｇｕｓ）、ゴキブリ、小虫およびノミに由来するもの（例えば、Ｂｌａｔｅｌｌａ、Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ、ＣｈｉｒｏｎｏｍｕｓおよびＣｔｅｎｏｃｅｐｐｈａｌｉｄｅｓ）、ならびに哺乳動物（例えば、ネコ、イヌおよびウマ）に由来するもの、毒液のアレルゲン（刺咬昆虫（ｓｔｉｎｇｉｎｇ  ｏｒ  ｂｉｔｉｎｇ  ｉｎｓｅｃｔ）に由来するようなもの、例えば、Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａの分類学上の目（蜂（Ａｐｉｄａｅ）、スズメバチ（Ｖｅｓｐｉｄｅａ）、およびアリ（Ｆｏｒｍｉｃｏｉｄａｅ）が挙げられる）が挙げられる）に由来するものである。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、上記免疫原は、以下から選択される腫瘍抗原である：（ａ）がん−精巣（ｃａｎｃｅｒ−ｔｅｓｔｉｓ）抗原、例えば、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＳＳＸ２、ＳＣＰ１ならびにＲＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥおよびＭＡＧＥファミリーのポリペプチド（例えば、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、およびＭＡＧＥ−１２）、これらは、例えば、黒色腫、肺、頭頸部、ＮＳＣＬＣ、乳房、胃腸、および膀胱の腫瘍に対処するために使用され得る；（ｂ）変異した抗原、例えば、ｐ５３（種々の固形腫瘍（例えば、結腸直腸がん、肺がん、頭頸部がん）と関連）、ｐ２１／Ｒａｓ（例えば、黒色腫、膵臓がんおよび結腸直腸がんと関連）、ＣＤＫ４（例えば、黒色腫と関連）、ＭＵＭ１（例えば、黒色腫と関連）、カスパーゼ−８（例えば、頭頸部がんと関連）、ＣＩＡ  ０２０５（例えば、膀胱がんと関連）、ＨＬＡ−Ａ２−Ｒ１７０１、β−カテニン（例えば、黒色腫と関連）、ＴＣＲ（例えば、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫と関連）、ＢＣＲ−ａｂｌ（例えば、慢性骨髄性白血病と関連）、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ＫＩＡ  ０２０５、ＣＤＣ−２７、およびＬＤＬＲ−ＦＵＴ；（ｃ）過剰発現された抗原、例えば、ガレクチン４（例えば、結腸直腸がんと関連）、ガレクチン９（例えば、ホジキン病と関連）、プロテイナーゼ３（例えば、慢性骨髄性白血病と関連）、ＷＴ  １（例えば、種々の白血病と関連）、炭酸脱水酵素（例えば、腎がんと関連）、アルドラーゼＡ（例えば、肺がんと関連）、ＰＲＡＭＥ（例えば、黒色腫と関連）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（例えば、乳がん、結腸がん、肺がんおよび卵巣がんと関連）、マンマグロビン、α−フェトプロテイン（例えば、肝がんと関連）、ＫＳＡ（例えば、結腸直腸がんと関連）、ガストリン（例えば、膵臓がんおよび胃がんと関連）、テロメラーゼ触媒タンパク質、ＭＵＣ−１（例えば、乳がんおよび卵巣がんと関連）、Ｇ−２５０（例えば、腎細胞がんと関連）、ｐ５３（例えば、乳がん、結腸がんと関連）、ならびにがん胎児性抗原（例えば、乳がん、肺がん、および胃腸管のがん（例えば、結腸直腸がん）と関連）；（ｄ）共通抗原（ｓｈａｒｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ）、例えば、黒色腫−メラノサイト分化抗原、例えば、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ  Ａ、ｇｐ１００、ＭＣ１Ｒ、メラノサイト刺激ホルモンレセプター、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質−１／ＴＲＰ１およびチロシナーゼ関連タンパク質−２／ＴＲＰ２（例えば、黒色腫と関連）；（ｅ）前立腺関連抗原（例えば、ＰＡＰ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＨ−Ｐ１、ＰＳＭ−Ｐ１、ＰＳＭ−Ｐ２（例えば、前立腺がんと関連））；（ｆ）イムノグロブリンイディオタイプ（例えば、骨髄腫およびＢ細胞リンパ腫と関連）。特定の実施形態において、腫瘍免疫原としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ｐ１５、Ｈｏｍ／Ｍｅｌ−４０、Ｈ−Ｒａｓ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ、エプスタイン・バー・ウイルス抗原、ＥＢＮＡ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原（Ｅ６およびＥ７を含む）、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ���肝炎ウイルスの抗原、ヒトＴリンパ球向性ウイルス抗原、
【０１２８】
【化５】
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（Ｍａｃ−２結合タンパク質／シクロフィリンＣ関連タンパク質）、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、ＴＰＳなど。
【０１２９】
（薬学的組成物）
ＲＮＡは、種々の疾患に対して被験体を免疫化するための薬学的組成物における成分として投与される。これら組成物は、代表的には、上記ＲＮＡに加えて、しばしば、上記で記載されるように送達システムの一部として薬学的に受容可能なキャリアを含む。薬学的に受容可能なキャリアの詳細な考察は、参考文献４１において入手可能である。
【０１３０】
本発明の薬学的組成物は、１種以上の低分子免疫強化因子を含み得る。例えば、上記組成物は、ＴＬＲ２アゴニスト（例えば、Ｐａｍ３ＣＳＫ４）、ＴＬＲ４アゴニスト（例えば、アミノアルキルグルコサミニドホスフェート（例えば、Ｅ６０２０））、ＴＬＲ７アゴニスト（例えば、イミキモド）、ＴＬＲ８アゴニスト（例えば、レシキモド）および／もしくはＴＬＲ９アゴニスト（例えば、ＩＣ３１）を含み得る。任意のこのようなアゴニストは、理想的には、分子量＜２０００Ｄａを有する。ＲＮＡが被包される場合、いくつかの実施形態において、このようなアゴニストもまた、上記ＲＮＡとともに被包されるが、他の実施形態において、それらは、被包されない。ＲＮＡが粒子に吸着させられる場合、いくつかの実施形態において、このようなアゴニストもまた、上記ＲＮＡと一緒に吸着させられるが、他の実施形態において、それらは吸着させられない。
【０１３１】
本発明の薬学的組成物は、上記粒子を、ただの水（ｐｌａｉｎ  ｗａｔｅｒ）（例えば、ｗ．ｆ．ｉ．）もしくは緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ホウ酸緩衝液、コハク酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、もしくはクエン酸緩衝液）中に含み得る。緩衝塩は、代表的には、５〜２０ｍＭ範囲において含まれる。
【０１３２】
本発明の薬学的組成物は、５．０〜９．５（例えば、６．０〜８．０）のｐＨを有し得る。
【０１３３】
本発明の組成物は、張度を与えるために、ナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム）を含み得る。１０±２ｍｇ／ｍｌ  ＮａＣｌの濃度が代表的である（例えば、約９ｍｇ／ｍｌ）。
【０１３４】
本発明の組成物は、金属イオンキレート化剤を含み得る。これらは、ホスホジエステル加水分解を加速し得るイオンを除去することによって、ＲＮＡ安定性を延長し得る。従って、組成物は、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＢＡＰＴＡ、ペンテト酸などのうちの１種以上を含み得る。このようなキレート化剤は、代表的には、１０〜５００μＭ（例えば、０．１ｍＭ）で存在する。クエン酸塩（例えば、クエン酸ナトリウム）はまた、キレート化剤として作用し得るのと同時に、有利なことには、緩衝化活性も提供し得る。
【０１３５】
本発明の薬学的組成物は、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇ（例えば、２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇ、もしくは２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇ）の重量オスモル濃度を有し得る。
【０１３６】
本発明の薬学的組成物は、１種以上の保存剤（例えば、チオメルサールもしくは２−フェノキシエタノール）を含み得る。水銀非含有組成物が好ましく、保存剤非含有ワクチンが調製され得る。
【０１３７】
本発明の薬学的組成物は、好ましくは、無菌である。
【０１３８】
本発明の薬学的組成物は、好ましくは、非発熱性である（例えば、１用量あたり＜１  ＥＵ（エンドトキシンユニット、標準尺度）、および好ましくは、１用量あたり＜０．１  ＥＵを含む）。
【０１３９】
本発明の薬学的組成物は、好ましくは、グルテンを含まない。
【０１４０】
本発明の薬学的組成物は、単位用量形態において調製され得る。いくつかの実施形態において、単位用量は、０．１〜１．０ｍｌ（例えば、約０．５ｍｌ）の容積を有し得る。
【０１４１】
上記組成物は、注射物として調製され得る（溶液もしくは懸濁物のいずれかとして）。上記組成物は、微細スプレーを使用する、肺投与（例えば、吸入器による）のために調製され得る。上記組成物は、鼻、耳もしくは眼への投与（例えば、スプレーもしくは滴剤として）のために調製され得る。筋肉内投与のための注射物が、代表的である。
【０１４２】
本発明の組成物のＲＮＡ含有量は、ＲＮＡ／単位用量の量に関して表される。ＲＮＡは、利用可能な技術を使用して、容易に定量される。
【０１４３】
ＲＮＡは、リボソームと組み合わせて送達されないので、本発明の薬学的組成物はリボソームを含まない。
【０１４４】
（処置方法および医療的使用）
本発明に従うＲＮＡ送達は、目的の免疫原に対してインビボで免疫応答を誘発するためのものである。上記免疫応答は、好ましくは、防御的であり、好ましくは、抗体および／もしくは細胞媒介性免疫を含む。上記方法は、ブースター応答を惹起し得る。
【０１４５】
免疫応答を惹起することによって、上記哺乳動物は、種々の疾患および／もしくは感染に対して（例えば、上記で考察されるように、細菌性疾患および／もしくはウイルス性疾患に対して）防御され得る。ＲＮＡ含有組成物は、免疫原性であり、より好ましくは、ワクチン組成物である。本発明に従うワクチンは、予防的（すなわち、感染を妨げるため）もしくは治療的（すなわち、感染を処置するため）のいずれかであり得るが、代表的には、予防的である。
【０１４６】
本発明に従って免疫化される哺乳動物は、大型動物（例えば、ヒトもしくは大型脊椎哺乳動物（例えば、ウマ、ウシ、シカ、ヤギ、ブタ、ラクダ、アンテロープ、ゾウ））である。上記ワクチンが予防的使用のためのものである場合、上記ヒトは、好ましくは、小児（例えば、幼児もしくは乳児）もしくはティーンエイジャーである；上記ワクチンが治療的使用のためのものである場合、上記ヒトは、好ましくは、ティーンエイジャーもしくは成人である。小児用に意図されたワクチンはまた、例えば、安全性、投与量、免疫原性などを評価するために、成人に投与され得る。
【０１４７】
本発明に従って調製されるワクチンは、小児および成人の両方を処置するために使用され得る。従って、ヒト患者は、１歳未満、５歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳、もしくは少なくとも５５歳であってもよい。上記ワクチンを受けるのに好ましい患者は、高齢者（例えば、≧５０歳、≧６０歳、および好ましくは、≧６５歳）、若年者（例えば、≦５歳）、入院患者、ヘルスケアワーカー、軍従事者および軍職員、妊婦、慢性疾患患者、もしくは免疫不全患者である。しかし、上記ワクチンは、これらの群にのみ適切であるわけではなく、より一般に、集団において使用され得る。
【０１４８】
本発明の組成物は、一般に、患者に直接投与される。直接送達は、非経口注射によって（例えば、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、もしくは組織の間隙空間に；参考文献１とは異なり、舌内注射（ｉｎｔｒａｇｌｏｓｓａｌ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）は、代表的には、本発明で使用されない）；または粘膜的に（例えば、直腸、経口（例えば、錠剤、スプレー）、膣、局所、経真皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）もしくは経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、鼻内、眼、耳、肺もしくは他の粘膜投与）達成され得る。注射は、針を介してであってもよい（例えば、皮下針）が、針なし注射が、代わりに使用され得る。代表的な筋肉内用量は、０．５ｍｌである。
【０１４９】
本発明は、全身免疫および／もしくは粘膜免疫を誘発するために、好ましくは、増強された全身免疫および／もしくは粘膜免疫を誘発するために、使用され得る。
【０１５０】
投与は、単一単位用量スケジュールもしくは複数単位用量スケジュールによってであり得る。複数用量は、一次免疫スケジュールにおいて、および／もしくはブースター免疫スケジュールにおいて使用され得る。複数用量スケジュールにおいて、種々の用量が、同じ経路もしくは異なる経路（例えば、非経口の一次と粘膜のブースト、粘膜の一次と非経口のブーストなど）によって与えられ得る。複数用量は、代表的には、少なくとも１週間間隔を空けて（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間など）投与される。一実施形態において、単位用量は、生後約６週間、１０週間、および１４週間で（例えば、世界保健機関の予防接種拡大計画（「ＥＰＩ」）においてしばしば使用されるように、６週齢、１０週齢および１４週齢において）投与され得る。代替の実施形態において、２回の一次単位用量が、約２ヶ月間間隔を空けて（例えば、約７週間、８週間もしくは９週間間隔を空けて）投与され、続いて、１回以上のブースター単位用量が、２回目の一次用量の約６ヶ月から１年後に（例えば、２回目の一次用量の約６ヶ月後、８ヶ月後、１０ヶ月後もしくは１２ヶ月後）に投与される。さらなる実施形態において、３回の一次用量が、約２ヶ月間間隔を空けて（例えば、約７週間、８週間もしくは９週間間隔を空けて）投与され、続いて、１回以上のブースター用量が、３回目の一次用量の約６ヶ月後から１年後に（例えば、３回目の一次用量の約６ヶ月後、８ヶ月後、１０ヶ月後もしくは１２ヶ月後に）投与される。
【０１５１】
（一般的実施形態）
本発明のいくつかの実施形態において、上記ＲＮＡは、改変なしのヌクレオチドを含む（上記を参照のこと）。他の実施形態において、上記ＲＮＡは、必要に応じて、少なくとも１つの改変ヌクレオチドを含み得るが、以下の特徴のうちの１つ以上（既に上記で開示されている）もまた、必要とされる：
Ａ．  上記ＲＮＡがリポソームとともに送達される場合、上記リポソームは、ＤＳＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡおよび／もしくはＤＬｅｎＤＭＡを含む。
Ｂ．  上記ＲＮＡがリポソームに被包される場合、上記リポソーム中の脂質の親水性部分は、ＰＥＧ化される。
Ｃ．  上記ＲＮＡがリポソームに被包される場合、上記リポソームの数で少なくとも８０％が、２０〜２２０ｎｍの範囲の直径を有する。
Ｄ．  上記ＲＮＡが微粒子とともに送達される場合、上記微粒子は、非毒性でかつ生分解性のポリマー微粒子である。
Ｅ．  上記ＲＮＡが微粒子とともに送達される場合、上記微粒子は、０．０２μｍ〜８μｍの範囲の直径を有する。
Ｆ．  上記ＲＮＡが微粒子とともに送達される場合、上記微粒子の数で少なくとも８０％は、０．０３〜７μｍの範囲の直径を有する。
Ｇ．  上記ＲＮＡが微粒子とともに送達される場合、上記組成物は、凍結乾燥される。
Ｈ．  上記ＲＮＡがエマルジョンとともに送達される場合、上記エマルジョンは、生分解性油（例えば、スクアレン）を含む。
Ｉ．  上記ＲＮＡがエマルジョンとともに送達される場合、上記エマルジョンは、１種以上のカチオン性分子、例えば、１種以上のカチオン性脂質を含む。
Ｊ．  上記ＲＮＡは３’ポリＡテールを有し、上記免疫原は、細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生生物に対してインビボで免疫応答を誘発し得る。
Ｋ．  上記ＲＮＡは、（ｉ）リポソーム、（ｉｉ）非毒性でかつ生分解性のポリマー微粒子、（ｉｉｉ）カチオン性のサブミクロンの水中油型エマルジョンから選択される送達系を用いて、金属イオンキレート化剤との組み合わせにおいて送達される。
【０１５２】
（一般）
本発明の粒子は、別段示されなければ、化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬理学の、当該分野の技術内の従来の方法を使用する。このような技術は、文献中に十分に説明されている。例えば、参考文献４２〜４８などを参照のこと。
【０１５３】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、Ｘから専らなってもよいし、何かさらなるものを含んでいてもよい（例えば、Ｘ＋Ｙ）。
【０１５４】
数値ｘに関して用語「約」とは、選択的であり、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０１５５】
語句「実質的に」とは、「完全に」を排除せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まない場合もある。必要な場合、語句「実質的に」は、本発明の定義から省略され得る。
【０１５６】
電荷、カチオン、アニオン、両性イオンなどへの言及は、ｐＨ７において取り扱われる。
【０１５７】
ＴＬＲ３は、Ｔｏｌｌ様レセプター３である。これは、先天的免疫系において重要な役割を果たす一回膜貫通レセプターである。既知のＴＬＲ３アゴニストは、ポリ（Ｉ：Ｃ）を含む。「ＴＬＲ３」は、このレセプターをコードする遺伝子の承認されたＨＧＮＣ名であり、その特有のＨＧＮＣ  ＩＤは、ＨＧＮＣ：１１８４９である。ヒトＴＬＲ３遺伝子のＲｅｆＳｅｑ配列は、ＧＩ：２４５９６２５である。
【０１５８】
ＴＬＲ７は、Ｔｏｌｌ様レセプター７である。これは、先天的免疫系において重要な役割を果たす一回膜貫通レセプターである。既知のＴＬＲ７アゴニストは、例えば、イミキモドを含む。「ＴＬＲ７」は、このレセプターをコードする遺伝子の承認されたＨＧＮＣ名であり、その特有のＨＧＮＣ  ＩＤは、ＨＧＮＣ：１５６３１である。ヒトＴＬＲ７遺伝子のＲｅｆＳｅｑ配列は、ＧＩ：６７９４４６３８である。
【０１５９】
ＴＬＲ８は、Ｔｏｌｌ様レセプター８である。これは、先天的免疫系において重要な役割を果たす一回膜貫通レセプターである。既知のＴＬＲ８アゴニストは、例えば、レシキモドを含む。「ＴＬＲ８」は、このレセプターをコードする遺伝子の承認されたＨＧＮＣ名であり、その特有のＨＧＮＣ  ＩＤは、ＨＧＮＣ：１５６３２である。ヒトＴＬＲ８遺伝子のＲｅｆＳｅｑ配列は、ＧＩ：２０３０２１６５である。
【０１６０】
ＲＩＧ−Ｉ様レセプター（「ＲＬＲ」）ファミリーは、先天的免疫系において重要な役割を果たす種々のＲＮＡヘリカーゼを含む［４９］。ＲＬＲ−１（ＲＩＧ−Ｉもしくはレチノイン酸誘導性遺伝子Ｉとしても公知）は、そのＮ末端付近にある２つのカスパーゼリクルートドメインを有する。上記ＲＬＲ−１ヘリカーゼをコードする遺伝子の承認されたＨＧＮＣ名は、「ＤＤＸ５８」（ＤＥＡＤ（Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ）ボックスポリペプチド５８（ＤＥＡＤ  （Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ）  ｂｏｘ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ５８）について）であり、その特有のＨＧＮＣ  ＩＤは、ＨＧＮＣ：１９１０２である。ヒトＲＬＲ−１遺伝子のＲｅｆＳｅｑ配列は、ＧＩ：７７７３２５１４である。ＲＬＲ−２（ＭＤＡ５もしくは黒色腫分化関連遺伝子５（ｍｅｌａｎｏｍａ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ５）としても公知）はまた、そのＮ末端付近にある２つのカスパーゼリクルートドメインを有する。ＲＬＲ−２ヘリカーゼをコードする遺伝子の承認されたＨＧＮＣ名は、「ＩＦＩＨ１」（ヘリカーゼＣドメイン１で誘導されるインターフェロン（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｅｌｉｃａｓｅ  Ｃ  ｄｏｍａｉｎ  １）について）であり、特有のＨＧＮＣ  ＩＤは、ＨＧＮＣ：１８８７３である。ヒトＲＬＲ−２遺伝子のＲｅｆＳｅｑ配列は、ＧＩ：  ２７８８６５６７である。ＲＬＲ−３（ＬＧＰ２もしくは遺伝学および生理学研究室２（ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２）としても公知）は、カスパーゼリクルートドメインを有さない。ＲＬＲ−３ヘリカーゼをコードする遺伝子の承認されたＨＧＮＣ名は、  「ＤＨＸ５８」（ＤＥＸＨ（Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｈｉｓ）ボックスポリペプチド５８について）であり、特有のＨＧＮＣ  ＩＤは、ＨＧＮＣ：２９５１７である。ヒトＲＬＲ−３遺伝子のＲｅｆＳｅｑ配列は、ＧＩ：１４９４０８１２１である。
【０１６１】
ＰＫＲは、二本鎖ＲＮＡ依存性プロテインキナーゼである。これは、先天的免疫系において重要な役割を果たす。「ＥＩＦ２ＡＫ２」（真核生物翻訳開始因子２−αキナーゼ２（ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ２−ａｌｐｈａ  ｋｉｎａｓｅ  ２）について）は、この酵素をコードする遺伝子の承認されたＨＧＮＣ名であり、その特有のＨＧＮＣ  ＩＤは、ＨＧＮＣ：９４３７である。ヒトＰＫＲ遺伝子のＲｅｆＳｅｑ配列は、ＧＩ：２０８４３１８２５である。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
大型哺乳動物において免疫応答を惹起する方法であって、該方法は、該哺乳動物に、２μｇ〜１００μｇの用量の免疫原コードＲＮＡを投与する工程を包含する、方法。
（項目２）
大型哺乳動物において免疫応答を惹起する方法であって、該方法は、該哺乳動物に、該哺乳動物の体重１ｋｇあたり０．１μｇ〜１．５μｇのＲＮＡを投与する工程を包含する、方法。
（項目３）
上記ＲＮＡが、骨格筋組織に投与される、前述の項目のいずれかに記載の方法。
（項目４）
上記ＲＮＡが、注射によって投与される、前述の項目のいずれかに記載の方法。
（項目５）
注射が、針を介する注射である、項目４に記載の方法。
（項目６）
上記ＲＮＡが、送達システムとの組み合わせにおいて投与される、前述の項目のいずれかに記載の方法。
（項目７）
上記送達システムが、
（ｉ）リポソーム；
（ｉｉ）非毒性かつ生分解性のポリマー微粒子；および／もしくは
（ｉｉｉ）サブミクロンのカチオン性水中油型エマルジョン
を含む、項目６に記載の方法。
（項目８）
上記ＲＮＡが、プラス鎖である、前述の項目のいずれかに記載の方法。
（項目９）
上記ＲＮＡが、自己複製ＲＮＡである、前述の項目のいずれかに記載の方法。
（項目１０）
上記ＲＮＡが、細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生生物に対する免疫応答を誘発し得る免疫原をコードする、前述の項目のいずれかに記載の方法。
（項目１１）
上記免疫原が、ＲＳウイルス糖タンパク質Ｆに対してインビボで免疫応答を誘発し得る、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
上記大型哺乳動物が、ウシもしくはヒトである、前述の項目のいずれかに記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【０１６２】
【図１】図１は、染色されたＲＮＡを有するゲルを示す。レーンは、（１）マーカー、（２）裸のレプリコン、（３）ＲＮａｓｅ処理後のレプリコン、（４）リポソームに被包されたレプリコン、（５）ＲＮａｓｅ処理後のリポソーム、（６）ＲＮａｓｅで処理し、次いで、フェノール／クロロホルム抽出に供したリポソーム、を示す。
【図２】図２は、リポソームの電子顕微鏡写真である。
【図３】図３は、ビリオンパッケージングされたレプリコン（四角）として、裸のＲＮＡ（三角）として、もしくは微粒子（丸）としてＲＮＡを送達した後、１日目、３日目および６日目でのタンパク質発現（相対光単位、ＲＬＵとして）を示す。
【図４】図４は、染色されたＲＮＡを有するゲルを示す。レーンは、（１）マーカー、（２）裸のレプリコン、（３）リポソームに被包されたレプリコン、（４）ＲＮａｓｅで処理し、次いで、フェノール／クロロホルム抽出に供したリポソームを示す。
【図５】図５は、ビリオンパッケージングされたレプリコン（四角）として、裸のＲＮＡ（菱形）として、もしくはリポソーム中（＋＝０．１μｇ、×＝１μｇ）においてＲＮＡを送達した後、１日目、３日目および６日目でのタンパク質発現を示す。
【図６】図６は、リポソーム被包ＲＮＡの４種の異なる用量を送達した後、１日目、３日目および６日目でのタンパク質発現を示す。
【図７】図７は、ビリオンパッケージングされたレプリコン（ＶＲＰもしくはＶＳＲＰ）、１μｇ  裸のＲＮＡ、および１μｇ  リポソーム被包ＲＮＡを与えられた動物における抗Ｆ  ＩｇＧ力価を示す。
【図８】図８は、ＶＲＰ、１μｇ  裸のＲＮＡ、および０．１ｇもしくは１μｇのリポソーム被包ＲＮＡを与えられた動物における抗Ｆ  ＩｇＧ力価を示す。
【図９】図９は、ＶＲＰ、または０．１ｇもしくは１μｇのリポソーム被包ＲＮＡのいずれかを与えられた動物における中和抗体力価を示す。
【図１０】図１０は、裸のＲＮＡ（丸）、リポソーム被包ＲＮＡ（三角および四角）、またはリポプレックス（ｌｉｐｏｐｌｅｘ）（逆三角）としてレプリコンを送達した後の発現レベルを示す。
【図１１】図１１は、レプリコンを裸のＲＮＡとして（０．０１〜１μｇ）、リポソーム被包ＲＮＡとして（０．０１〜１０μｇ）、またはビリオンとしてパッケージングされたものとして（ＶＲＰ、１０６  感染単位もしくはＩＵ）、送達した後のＦ特異的ＩｇＧ力価（２回目の用量後２週間）を示す。
【図１２】図１２は、レプリコンを裸のＲＮＡとして（１μｇ）、リポソーム被包ＲＮＡとして（０．１もしくは１μｇ）、またはビリオンとしてパッケージングされたものとして（ＶＲＰ、１０６  ＩＵ）、送達した後のＦ特異的ＩｇＧ力価（丸）およびＰＲＮＴ力価（四角）を示す。ナイーブマウスの力価もまた、示す。実線は、幾何平均を示す。
【図１３】図１３は、２回目の用量の４週間後、Ｆタンパク質中の主要なエピトープを表す合成ペプチドで再刺激した後の細胞内サイトカイン生成を示す。ｙ軸は、ＣＤ８＋ＣＤ４−の％サイトカイン＋を示す。
【図１４Ａ】図１４は、仔ウシの免疫化後６３日間（図１４Ａ）および２１０日間（図１４Ｂ）にわたるＦ特異的ＩｇＧ力価（平均ｌｏｇ１０力価±標準偏差）を示す。その４つの線は、６３日目において容易に区別され、下から上へ：ＰＢＳ陰性コントロール；リポソーム送達ＲＮＡ；エマルジョン送達ＲＮＡ：および「Ｔｒｉａｎｇｌｅ  ４」製品である。
【図１４Ｂ】図１４は、仔ウシの免疫化後６３日間（図１４Ａ）および２１０日間（図１４Ｂ）にわたるＦ特異的ＩｇＧ力価（平均ｌｏｇ１０力価±標準偏差）を示す。その４つの線は、６３日目において容易に区別され、下から上へ：ＰＢＳ陰性コントロール；リポソーム送達ＲＮＡ；エマルジョン送達ＲＮＡ：および「Ｔｒｉａｎｇｌｅ  ４」製品である。
【発明を実施するための形態】
【０１６３】
（発明を実施するための態様）
（ＲＮＡレプリコン）
種々のレプリコンは、以下で使用される。一般に、これらは、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）に由来する非構造タンパク質、シンドビス・ウイルス由来のパッケージングシグナル、およびシンドビス・ウイルスもしくはＶＥＥＶ変異体に由来する３’ＵＴＲを有するハイブリッドアルファウイルスゲノムに基づく。上記レプリコンは、約１０ｋｂ長であり、ポリＡテールを有する。
【０１６４】
アルファウイルスレプリコンをコードするプラスミドＤＮＡ（名称：ｐＴ７−ｍＶＥＥＶ−ＦＬ．ＲＳＶＦもしくはＡ３１７；ｐＴ７−ｍＶＥＥＶ−ＳＥＡＰもしくはＡ３０６；ｐＳＰ６−ＶＣＲ−ＧＦＰもしくはＡ５０）を、インビボでのＲＮＡ合成のテンプレートとして供した。上記レプリコンは、ＲＮＡ複製に必要とされるアルファウイルス遺伝的エレメントを含むが、粒子アセンブリに必要な遺伝子産物をコードするエレメントを欠いている；構造タンパク質は、代わりに、目的のタンパク質（レポーター（例えば、ＳＥＡＰもしくはＧＦＰ）または免疫原（例えば、全長ＲＳＶ  Ｆタンパク質）のいずれか）によって置き換えられるので、上記レプリコンは、感染性粒子の生成を誘導できない。上記アルファウイルスｃＤＮＡの上流にあるバクテリオファージ（Ｔ７もしくはＳＰ６）プロモーターは、インビトロで上記レプリコンＲＮＡの合成を促進し、上記ポリ（Ａ）テールの直ぐ下流にあるデルタ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）リボザイムは、その自己切断活性を介して正確な３’末端を生成する。
【０１６５】
適切な制限エンドヌクレアーゼで上記ＨＤＶリボザイムの下流で上記プラスミドＤＮＡを直線状にした後に、ランオフ転写物（ｒｕｎ−ｏｆｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）を、Ｔ７もしくはＳＰ６バクテリオファージ由来ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用して、インビトロで合成した。転写を、製造業者（Ａｍｂｉｏｎ）によって提供される指示書に従って、ヌクレオシドトリホスフェート（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰ）の各々の７．５ｍＭ（Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ）もしくは５ｍＭ（ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ）の存在下で、３７℃において２時間にわたって行った。転写の後、上記テンプレートＤＮＡを、ＴＵＲＢＯ  ＤＮａｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ）で消化した。上記レプリコンＲＮＡを、ＬｉＣｌで沈殿させ、ヌクレアーゼ非含有水中で再構成した。キャップのないＲＮＡを、ＳｃｒｉｐｔＣａｐ  ｍ７Ｇキャッピングシステム（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ユーザーマニュアルに概説されるとおり、ワクシニアキャッピング酵素（ＶＣＥ）で転写後にキャップした；このようにキャップしたレプリコンに、「ｖ」の接頭文字を付ける（例えば、ｖＡ３１７は、ＶＣＥによってキャップされたＡ３１７レプリコンである）。転写後キャップされたＲＮＡを、ＬｉＣｌで沈殿させ、ヌクレアーゼ非含有水中で再構成した。上記ＲＮＡサンプルの濃度を、ＯＤ２６０ｎｍを測定することによって決定した。上記インビトロ転写物の完全性を、変性アガロースゲル電気泳動によって確認した。
【０１６６】
（ＰＬＧ吸着）
微粒子を、５００ｍｇのＰＬＧ  ＲＧ５０３（５０：５０  ラクチド／グリコリドモル比、ＭＷ約３０ｋＤａ）および２０ｍｇのＤＯＴＡＰを使用して、Ｏｍｎｉ  Ｍａｃｒｏ  Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒを使用して作製した。上記粒子懸濁物を、１５０ｒｐｍにおいて一晩振盪し、次いで、２〜８℃で貯蔵するために、４０μｍ滅菌フィルタを通して濾過した。自己複製ＲＮＡを、上記粒子に吸着させた。１ｍＬのＰＬＧ／ＲＮＡ懸濁物を調製するために、ＰＬＧ粒子懸濁物の必要容積をバイアルに添加し、ヌクレアーゼ非含有水を添加して、容積９００μＬにした。１００μＬ  ＲＮＡ（１０μｇ／ｍＬ）を、一定に振盪しながら上記ＰＬＧ懸濁物に滴下した。ＰＬＧ／ＲＮＡを、室温において３０分間にわたってインキュベートした。再構成懸濁物１ｍＬについて、４５ｍｇ  マンニトール、１５ｍｇ  スクロースおよび２５０〜５００μｇのＰＶＡを添加した。上記バイアルを−８０℃で凍結し、凍結乾燥した。
【０１６７】
ＲＮＡ吸着を評価するために、１００μＬ  粒子懸濁物を、１０，０００ｒｐｍにおいて５分間にわたって遠心分離し、上清を集めた。ＰＬＧ／ＲＮＡを、１ｍＬ  ヌクレアーゼ非含有水を使用して再構成した。１００μＬ粒子懸濁物（１μｇ  ＲＮＡ）に、１ｍｇ  硫酸ヘパリンを添加した。上記混合物をボルテックスし、室温において３０分間にわたってＲＮＡ脱着のために静置させた。粒子懸濁物を遠心分離し、上清を集めた。
【０１６８】
ＲＮＡｓｅ安定性に関しては、１００μＬ  粒子懸濁物を、６．４ｍＡＵのＲＮａｓｅ  Ａとともに室温において３０分間にわたってインキュベートした。ＲＮＡｓｅを、０．１２６ｍＡＵのプロテイナーゼＫで、５５℃において１０分間にわたって不活性化した。１ｍｇの硫酸ヘパリンを添加して、上記ＲＮＡを脱着させ、続いて、遠心分離した。ＲＮＡを含むその上清サンプルを、ホルムアルデヒドローディング色素と混合し、６５℃において１０分間にわたって加熱し、１％変性ゲル（１レーンあたり４６０ｎｇ  ＲＮＡをローディング）を使用して分析した。
【０１６９】
発現を評価するために、Ｂａｌｂ／ｃマウスを、０日目に、１００μＬ筋肉内注射容積（５０μＬ／脚）中の１μｇ  ＲＮＡで免疫化した。血清を、１日目、３日目および６日目に集めた。タンパク質発現を、化学発光アッセイを使用して決定した。図３に示される様に、発現は、任意の送達粒子なし（丸）よりも、ＲＮＡをＰＬＧ（三角）によって送達した場合に高かった。
【０１７０】
（カチオン性ナノエマルジョン）
水中油型エマルジョンを、スクアレン、ｓｐａｎ  ８５、ポリソルベート８０、および種々の量のＤＯＴＡＰをマイクロフルイダイズすることによって調製した。簡潔には、油溶性成分（スクアレン、ｓｐａｎ  ８５、カチオン性脂質、脂質界面活性剤）を、ビーカー中で合わせ、脂質成分を有機溶媒中に溶解した。得られた脂質溶液を、油相に直接添加した。上記溶媒を、室温において２時間にわたって、換気フード中で蒸発させ、その後、水相と組み合わせ、上記サンプルをホモジナイズして、均質な供給原料を提供した。第一次エマルジョンを、アイスバス冷却コイル付きのマイクロフルイダイザーに３〜５回通した。上記バッチサンプルを、上記ユニットから取り出し、４℃において貯蔵した。
【０１７１】
このエマルジョンは、従って、カチオン性ナノエマルジョン（「ＣＮＥ」）を提供するためにカチオン性ＤＯＴＡＰが補充されていることを除いて、市販のＭＦ５９アジュバントに類似している。エマルジョン「ＣＮＥ１７」の最終組成は、１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．５）中、スクアレン（４．３重量％）、ｓｐａｎ  ８５（０．５重量％）、ポリソルベート８０（０．５重量％）、ＤＯＴＡＰ（１．４ｍｇ／ｍｌ）であった。
【０１７２】
ＲＮＡは、これらカチオン性エマルジョン中の油滴の表面に吸着する。ＲＮＡを吸着させるために、ＲＮＡ溶液を、ＲＮａｓｅ非含有水において適切な濃度へと希釈し、次いで、等容積のエマルジョンに直接添加し、同時に軽くボルテックスする。上記溶液を室温において約２時間静置して、吸着させる。得られた溶液を、投与する前に必要とされるＲＮＡ濃度へと希釈する。
【０１７３】
（リポソーム被包）
ＲＮＡを、参考文献１１および５０の方法によって作製したリポソーム中に被包した。上記リポソームを、１０％  ＤＳＰＣ（両性イオン性）、４０％  ＤｌｉｎＤＭＡ（カチオン性）、４８％  コレステロールおよび２％  ＰＥＧ結合体化ＤＭＧ（２ｋＤａ  ＰＥＧ）から作製した。これら割合は、総リポソーム中の％モルに言及する。
【０１７４】
ＤｌｉｎＤＭＡ（１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン）を、参考文献６の手順を使用して合成した。ＤＳＰＣ（１，２−ジアステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）を、Ｇｅｎｚｙｍｅから購入した。コレステロールを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから得た。ＰＥＧ結合体化ＤＭＧ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール），アンモニウム塩）、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン，塩化物塩）およびＤＣ−ｃｈｏｌ（３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロールヒドロクロリド）は、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓからであった。
【０１７５】
簡潔には、脂質をエタノール（２ｍｌ）中に溶解し、ＲＮＡレプリコンを、緩衝液（２ｍｌ，１００ｍＭ  クエン酸ナトリウム，ｐＨ６）中に溶解し、これらを２ｍｌの緩衝液と混合し、続いて、１時間平衡化させた。上記混合物を６ｍｌの緩衝液で希釈し、次いで、濾過した。得られた生成物は、リポソームを含み、約９５％の被包効率であった。
【０１７６】
例えば、１つの特定の方法において、新鮮な脂質ストック溶液を、エタノール中で調製した。３７ｍｇのＤｌｉｎＤＭＡ、１１．８ｍｇのＤＳＰＣ、２７．８ｍｇのコレステロールおよび８．０７ｍｇのＰＥＧ−ＤＭＧを秤量し、７．５５ｍＬのエタノール中に溶解した。新たに調製した脂質ストック溶液を、３７℃において約１５分間にわたって穏やかに振盪して、均質な混合物を形成した。次いで、７５５μＬの上記ストックを、１．２４５ｍＬ  エタノールに添加して、作業脂質ストック溶液２ｍＬを作製した。この脂質量を使用して、２５０μｇ  ＲＮＡを有するリポソームを形成した。ＲＮＡの２ｍＬ  作業溶液をまた、１００ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ６）中の約１μｇ／μＬのストック溶液から調製した。３つの２０ｍＬ  ガラスバイアル（撹拌子有り）を、ＲＮａｓｅ  Ａｗａｙ溶液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）ですすぎ、使用前に多量のＭｉｌｌｉＱ水で洗浄して、上記バイアルのＲＮａｓｅの汚染を除去した。上記バイアルのうちの１つを、上記ＲＮＡ作業溶液に使用し、他のものを脂質およびＲＮＡ混合物を集めるために使用した（後に記載されるとおり）。作業脂質溶液およびＲＮＡ溶液を、３７℃において１０分間にわたって加熱し、その後、３ｃｃ  ルーアーロックシリンジに入れた。２ｍＬ  クエン酸緩衝液（ｐＨ６）を、別の３ｃｃ  シリンジに入れた。ＲＮＡおよび脂質を含むシリンジを、ＦＥＰチューブ（フッ素化エチレン−プロピレン；使用したすべてのＦＥＰチューブは、２ｍｍ内径および３ｍｍ外径を有した；Ｉｄｅｘ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅから得た）を使用して、Ｔミキサー（ＰＥＥＫＴＭ  ５００μｍ  ＩＤ接合部，Ｉｄｅｘ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）に接続した。上記Ｔミキサーからの出口もまた、ＦＥＰチューブであった。上記クエン酸緩衝液を含む第３のシリンジを、別個の１つのチューブに接続した。次いで、すべてのシリンジを、流量７ｍＬ／分においてシリンジポンプを使用して作動させた。上記チューブ出口を、２０ｍＬ  ガラスバイアルに上記混合物を集めるように配置した（撹拌しながら）。上記撹拌子を取り出し、上記エタノール／水性溶液を、室温へと１時間にわたって平衡化させた。上記混合物のうちの４ｍｌを、５ｃｃ  シリンジに入れ、これを、ＦＥＰチューブの１つに接続し、別の５ｃｃ  シリンジを、等しい長さのＦＥＰチューブに接続し、等量の１００ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ６）を入れた。上記２本のシリンジを、上記シリンジポンプを使用して７ｍＬ／分の流量において作動させ、最終の混合物を、２０ｍＬ  ガラスバイアルに集めた（撹拌しながら）。次に、第２の混合工程（リポソーム）から集めた上記混合物を、Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑ膜（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから得られる、結合してアニオン性分子を除去するアニオン交換支持体）を通過させた。上記リポソームに関してこの膜を使用する前に、４ｍＬの１Ｍ  ＮａＯＨ、４ｍＬの１Ｍ  ＮａＣｌおよび１０ｍＬの１００ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ６）が、連続してこの膜を通過した。リポソームを、１０分間にわたって３７℃において加温し、その後、上記膜を通過させた。次に、接線流濾過を使用することによって、リポソームを２ｍＬ���濃縮し、１０〜１５容積の１×ＰＢＳに対して透析し、その後、最終生成物を収集した。上記ＴＦＦシステムおよび中空ファイバー濾過膜を、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｓ（Ｒａｎｃｈｏ  Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ）から購入し、上記製造業者のガイドラインに従って使用した。１００ｋＤ孔サイズカットオフおよび８ｃｍ２  表面積を有するポリスルホン中空ファイバー濾過膜を使用した。インビトロおよびインビボ実験に関しては、処方物を、１×ＰＢＳで、必要とされるＲＮＡ濃度へと希釈した。
【０１７７】
図２は、これら方法によって調製されるリポソームの例示的な電子顕微鏡写真を示す。これらリポソームは、被包された、全長ＲＳＶ  Ｆ抗原をコードするＲＮＡを含む。１つのバッチの動的光散乱は、平均直径１４１ｎｍ（強度で）もしくは７８ｎｍ（数で）を示した。
【０１７８】
被包されたＲＮＡのパーセンテージおよびＲＮＡの濃度を、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ  ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ  ＲＮＡ試薬キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって、製造業者の指示書に従って決定した。上記キット中に提供されたリボソームＲＮＡ標準を使用して、標準曲線を作成した。リポソームを、１×ＴＥ緩衝液（キットから）中で、１０×もしくは１００×に希釈し、その後、色素を添加した。別個に、リポソームを、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘを含む１×ＴＥ緩衝液中で１０×もしくは１００×に希釈し、その後、色素を添加した（上記リポソームを破壊するため。従って、総ＲＮＡをアッセイするため）。その後、等量の色素を各溶液に添加し、次いで、色素添加後の約１８０μＬの各溶液を、二連において、９６ウェル組織培養プレートに入れた。蛍光（励起４８５ｎｍ，発光５２８ｎｍ）を、マイクロプレートリーダーで読み取った。すべてのリポソーム処方物を、被包されたＲＮＡの量に基づいて、インビボで投与した。
【０１７９】
リポソームにおける被包は、ＲＮａｓｅ消化からＲＮＡを保護することを示した。実験では、３．８ｍＡＵのＲＮａｓｅ  Ａ／μｇ  ＲＮＡを使用し、３０分間にわたって室温においてインキュベートした。ＲＮａｓｅを、プロテイナーゼＫで、５５℃において１０分間にわたって不活性化した。次いで、サンプル  対  ２５：２４：１  ｖ／ｖ／ｖ，フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールの１：１  ｖ／ｖ混合物を添加して、上記ＲＮＡを上記脂質から水相へと抽出した。サンプルを、数秒間にわたってボルテックスすることによって混合し、次いで、１２ｋ  ＲＰＭにおける１５分間にわたる遠心分離に置いた。上記水相（上記ＲＮＡを含む）を取り出し、上記ＲＮＡを分析するために使用した。ローディング前に（４００ｎｇ  ＲＮＡ／ウェル）、上記サンプルすべてを、ホルムアルデヒドローディング色素とともにインキュベートし、１０分間にわたって６５℃において変性させ、室温へと冷却した。Ａｍｂｉｏｎ  Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍマーカーを使用して、上記ＲＮＡ構築物の分子量を概算した。上記ゲルを、９０Ｖにおいて泳動した。上記ゲルを、室温において１時間にわたって振盪することによって、製造業者のガイドラインに従って、水中の０．１％  ＳＹＢＲゴールドを使用して染色した。図１は、被包の非存在下でＲＮａｓｅがＲＮＡを完全に消化することを示す（レーン３）。ＲＮＡは、被包後に検出不能であり（レーン４）、これらリポソームがＲＮａｓｅで処理されても全く変化が認められない（レーン４）。ＲＮａｓｅ処理リポソームをフェノール抽出に供した後、消化されていないＲＮＡが認められる（レーン６）。４℃において１週間後ですら、上記ＲＮＡを、いかなるフラグメント化もなしに認めることができた（図４，矢印）。インビボでのタンパク質発現は、４℃において６週間および１回の凍結融解サイクル後にも変化しなかった。従って、リポソーム被包ＲＮＡは安定である。
【０１８０】
上記ＲＮＡのインビボ発現を評価するために、免疫原ではなく、レポーター酵素（ＳＥＡＰ；分泌型アルカリホスファターゼ）を、上記レプリコン中にコードさせた。発現レベルを、化学発光アルカリホスファターゼ基質を使用して、１×Ｐｈｏｓｐｈａ−Ｌｉｇｈｔ希釈緩衝液中で１：４希釈した血清中で測定した。８〜１０週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス（５匹／群）に、０日目に、０．１μｇもしくは１μｇ  ＲＮＡ用量で５０μｌ／脚を筋肉内に注射した。同じベクターを、１μｇにおいて上記リポソームなしで（ＲＮａｓｅ非含有１×ＰＢＳ中で）も投与した。ビリオンパッケージングされたレプリコンもまた、試験した。本明細書で使用したビリオンパッケージングされたレプリコン（「ＶＲＰ」と呼ぶ）を、参考文献５１の方法によって得た。ここでアルファウイルスレプリコンは、変異ＶＥＥＶに由来するか、またはシンドビスウイルスの３’ＵＴＲおよびシンドビスウイルスパッケージングシグナル（ＰＳ）を含むように操作されたＶＥＥＶのゲノムから得られるキメラであり、シンドビスウイルスキャプシドおよび糖タンパク質遺伝子をコードする欠損性ヘルパーＲＮＡと共にＢＨＫ細胞へと共エレクトロポレーション（ｃｏ−ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｎｇ）することによってパッケージングした。
【０１８１】
図５に示されるように、被包は、１μｇ用量においてＳＥＡＰレベルを約１／２対数増大させ、６日目において、０．１μｇ  被包用量からの発現は、１μｇ  非被包用量で認められたレベルに匹敵した。３日目までに、発現レベルは、ＶＲＰで達成されたものを超えた（四角）。従って、発現は、裸のＲＮＡコントロールと比較して、１０×低用量においてすら、上記ＲＮＡが上記リポソーム中に処方された場合に増大された。発現はまた、上記ＶＲＰコントロールと比較して高かったが、発現の動態は、非常に異なっていた（図５を参照のこと）。エレクトロポレーションを用いた上記ＲＮＡの送達は、上記裸のＲＮＡコントロールと比較して増大した発現を生じたが、これらレベルは、リポソームでのものより低かった。
【０１８２】
上記リポソーム群において認められる効果が、上記リポソーム成分にのみ起因したのか、または上記被包に関連していたのかを評価するために、上記レプリコンを、被包形態（２種の異なる精製プロトコルで，０．１μｇ  ＲＮＡ）において、または上記リポソームの形成後にこれらと混合して（非被包「リポプレックス」，０．１μｇ  ＲＮＡ）、または裸のＲＮＡ（１μｇ）として、投与した。図１０は、上記リポプレックスが、最低レベルの発現を与えたことを示し、これは、被包が強力な発現に必須であることを示す。
【０１８３】
さらなるＳＥＡＰ実験から、インビボで明らかな用量応答が示された。発現は、１ｎｇほどのＲＮＡの送達後にも認められた（図６）。被包レプリコンからの発現と裸のレプリコンからの発現とを比較するさらなる実験から、０．０１μｇ  被包ＲＮＡは、１μｇの裸のＲＮＡに等しいことが示された。ＲＮＡの０．５μｇ用量において、上記被包物質は、６日目において１２倍高い発現を与えた；０．１μｇ用量レベルでは、６日目において２４倍高かった。
【０１８４】
上記群において平均レベルで調べるだけでなく、個々の動物もまた研究した。いくらかの動物は、裸のレプリコンに対して非応答者であったのに対して、被包は、非応答者を排除した。
【０１８５】
さらなる実験では、ＤｌｉｎＤＭＡをＤＯＴＡＰで置換した。ＤＯＴＡＰリポソームは、裸のレプリコンより良好な発現を与えたが、それらは、ＤｌｉｎＤＭＡリポソームより劣っていた（１日目において２〜３倍の差異）。
【０１８６】
インビボでの免疫原性を評価するために、レプリコンを構築して、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）に由来する全長Ｆタンパク質を発現させた。これを、裸（１μｇ）、リポソーム中に被包（０．１もしくは１μｇ）、またはビリオン中でパッケージング（１０６  ＩＵ；「ＶＲＰ」）で、０日目および２１日目に送達した。図７は、２回目の用量の２週間後の抗ＦのＩｇＧ力価を示す。上記リポソームは、明らかに免疫原性を増強する。図８は、２週間後の力価を示す。この時点までに、０．１μｇの上記被包ＲＮＡと、１μｇの上記被包ＲＮＡと、上記ＶＲＰ群との間に統計学的差異は何らなかった。中和力価（６０％のプラーク減少として測定，「ＰＲＮＴ６０」）は、２回目の用量の２週間後に、これら３群において有意差はなかった（図９）。図１２は、２回目の用量の４週間後のＩｇＧ力価およびＰＲＮＴ力価の両方を示す。
【０１８７】
図１３は、上記ＲＮＡが堅調なＣＤ８  Ｔ細胞応答を誘発することを確認する。
【０１８８】
さらなる実験において、ＶＲＰ、０．１μｇ  リポソーム被包ＲＮＡ、もしくは１μｇ  リポソーム被包ＲＮＡを与えられたマウスにおけるＦ特異的ＩｇＧ力価を比較した。２回目の用量の後の種々の時点での力価比（ＶＲＰ：リポソーム）は、以下のとおりであった：
【０１８９】
【表１】
0005940064.tif 000007
従って、上記リポソーム被包ＲＮＡは、ビリオン送達で認められるのと本質的に同程度の免疫応答を誘導する。
【０１９０】
さらなる実験から、優れたＦ特異的ＩｇＧ応答が１０μｇ用量で示され、これは、１μｇおよび０．１μｇ用量についての応答と等しく、０．０１μｇ用量ではより低い応答が示された。図１１は、３種の異なる用量における裸の形態において、４種の異なる用量におけるリポソームにおいて、もしくはＶＲＰ（１０６  ＩＵ）として、上記レプリコンを与えられた動物におけるＩｇＧ力価を示す。１μｇ  リポソーム被包ＲＮＡで認められた応答は、ＶＲＰと比較した場合に統計的に有意ではなかった（ＡＮＯＶＡ）が、１０μｇ  リポソーム被包ＲＮＡで認められたより高い応答は、これらの群の両方と比較した場合、統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）。
【０１９１】
さらなる研究から、上記０．１μｇのリポソーム被包ＲＮＡは、０．１μｇの送達されたＤＮＡより遙かに高い抗Ｆ  ＩｇＧ応答を与え（２回目の用量の１５日後）、さらに、エレクトロポレーション（ＥｌｇｅｎＴＭ  ＤＮＡ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ，  Ｉｎｏｖｉｏ）によって送達された、上記Ｆ抗原をコードする２０μｇ  プラスミドＤＮＡより免疫原性であることが確認された。
【０１９２】
さらなる研究を、マウスの代わりにコットンラット（Ｓｉｇｍｏｄｏｎ  ｈｉｓｐｉｄｉｓ）において行った。１μｇ用量において、リポソーム被包は、裸のＲＮＡと比較して、Ｆ特異的ＩｇＧ力価を８．３倍に増大させ、ＰＲＮＴ力価を９．５倍に増大させた。上記抗体応答の大きさは、５×１０６  ＩＵ  ＶＲＰによって誘導されたものに等しかった。裸のＲＮＡおよびリポソーム被包ＲＮＡはともに、ＲＳＶチャレンジ（１×１０５  プラーク形成単位）から上記コットンラットを防御することができ、肺ウイルス負荷を少なくとも３．５対数減少させた。被包は、減少を約２倍に増大させた。
【０１９３】
（より高いＲＮＡ用量での宿主防御応答）
マウスを使用して、宿主防御応答（先天的免疫もしくは適応免疫）が、より高いＲＮＡ用量において、コードされる抗原への免疫応答を制限し得るか否かを調べた。
【０１９４】
３種の異なるＲＮＡをこの研究に使用した：（ｉ）ＲＳＶ−Ｆ（すなわち、ＲＳＶの表面融合糖タンパク質）を発現する「ｖＡ３１７」レプリコン；（ｉｉ）ＧＦＰを発現する「ｖＡ１７」レプリコン；および（ｉｉｉ）複製欠損性でありかつＧＦＰをコードする「ｖＡ３３６」。
【０１９５】
ＲＮＡを、裸で、もしくは４０％  ＤｌｉｎＤＭＡ、１０％  ＤＳＰＣ、４８％  Ｃｈｏｌ、および２％  ＰＥＧ−ＤＭＧ（割合は、総リポソームの％モルである）で作製されたリポソームとともに、送達した。これらリポソームを、７５μｇバッチにおいて調製した。エタノール中の新たな脂質ストック溶液を調製した。３７ｍｇのＤｌｉｎＤＭＡ、１１．８ｍｇのＤＳＰＣ、２７．８ｍｇのコレステロールおよび８．０７ｍｇのＰＥＧ−ＤＭＧを秤量し、７．５５ｍＬのエタノール中に溶解した。上記新たに調製された脂質ストック溶液を、３７℃において約１５分間にわたって穏やかに振盪して、均質な混合物を形成した。次いで、２２６．７μＬの上記ストックを、１．７７３ｍＬ  エタノールに添加して、作業脂質ストック溶液２ｍＬを作製した。この量の脂質を使用して、７５μｇ  ＲＮＡを有するリポソームを形成した。ＲＮＡの２ｍＬ  作業溶液をまた、１００ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ６）中の約１μｇ／μＬのストック溶液から調製した。３本の２０ｍＬ  ガラスバイアル（撹拌子つき）を、ＲＮａｓｅ  Ａｗａｙ溶液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）ですすぎ、使用前に多量のＭｉｌｌｉＱ水で洗浄して、上記バイアルのＲＮａｓｅ汚染を除去した。上記バイアルのうちの１本を、上記ＲＮＡ作業溶液に使用し、他のものを、上記脂質およびＲＮＡ混合物を集めるために使用した（後に記載されるとおり）。上記作業脂質溶液およびＲＮＡ溶液を、３７℃において１０分間にわたって加熱し、その後、３ｃｃ  シリンジに入れた。２ｍＬのクエン酸緩衝液（ｐＨ６）を、別の３ｃｃ  シリンジに入れた。ＲＮＡおよび上記脂質を含むシリンジを、ＦＥＰチューブを使用して、Ｔミキサー（ＰＥＥＫＴＭ  ５００μｍ  ＩＤ接合部）に接続した。上記Ｔミキサーからの出口もまた、ＦＥＰチューブであった。上記クエン酸緩衝液を含む第３のシリンジを、別個の１つのチューブに接続した。次いで、すべてのシリンジを、流量７ｍＬ／分においてシリンジポンプを使用して作動させた。上記チューブ出口を、２０ｍＬ  ガラスバイアルに上記混合物を集めるように配置した（撹拌しながら）。上記撹拌子を取り出し、上記エタノール／水性溶液を、室温へと１時間にわたって平衡化させた。次いで、上記混合物を、５ｃｃ  シリンジに入れ、これを、ＦＥＰチューブの１つにはめ、別の５ｃｃ  シリンジを、等しい長さのＦＥＰチューブに接続し、等量の１００ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ６）を入れた。上記２本のシリンジを、シリンジポンプを使用して７ｍＬ／分の流量で作動させ、最終の混合物を、２０ｍＬ  ガラスバイアルに集めた（撹拌しながら）。次に、ＴＦＦを使用して、リポソームを２ｍＬに濃縮し、１０〜１５容積の１×ＰＢＳに対して透析し、その後、最終生成物を収集した。上記ＴＦＦシステムおよび中空ファイバー濾過膜を、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｓから購入し、上記製造業者のガイドラインに従って使用した。１００ｋＤ孔サイズカットオフおよび２０ｃｍ２表面積を有するポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）中空ファイバー濾過膜（部品番号  Ｐ−Ｃ１−１００Ｅ−１００−０１Ｎ）を、使用した。インビトロ実験およびインビボ実験に関して、処方物を、１×ＰＢＳで必要とされるＲＮＡ濃度へと希釈した。
【０１９６】
上記４種のリポソーム処方物は、以下の特徴を有していた：
【０１９７】
【表２】
0005940064.tif 000008
ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたり５匹の動物）に、０日目および２１日目に、両側に筋肉内ワクチン接種（５０μＬ／脚）を与えた：
群１  裸の自己複製ＲＳＶ−Ｆ  ＲＮＡ（ｖＡ３１７，０．１μｇ）
群２  リポソーム中に被包された自己複製ＲＳＶ−Ｆ  ＲＮＡ（ｖＡ３１７，０．１μｇ）
群３  空のリポソームに添加された自己複製ＲＳＶ−Ｆ  ＲＮＡ（ｖＡ３１７，０．１μｇ）
群４  自己複製ＲＳＶ−Ｆ  ＲＮＡ（ｖＡ３１７，０．１μｇ）および自己複製ＧＦＰ  ＲＮＡ（ｖＡ１７，１０μｇ）の混合物
群５  自己複製ＲＳＶ−Ｆ  ＲＮＡ（ｖＡ３１７，０．１μｇ）および複製欠損性ＧＦＰ  ＲＮＡ（ｖＡ３３６，１０μｇ）の混合物
群６  リポソーム中に処方された自己複製ＲＳＶ−Ｆ  ＲＮＡ（ｖＡ３１７，０．１μｇ）、および自己複製ＧＦＰ  ＲＮＡ（ｖＡ１７，１０μｇ）の混合物
群７  リポソーム中に処方された自己複製ＲＳＶ−Ｆ  ＲＮＡ（ｖＡ３１７，０．１μｇ）、および複製欠損性ＧＦＰ  ＲＮＡ（ｖＡ３３６，１０μｇ）の混合物
群８  リポソーム中に処方された自己複製ＲＳＶ−Ｆ  ＲＮＡ（ｖＡ３１７，０．１μｇ）、およびリポソーム中に処方された自己複製ＧＦＰ  ＲＮＡ（ｖＡ１７，１μｇ）の混合物
群９  リポソーム中に処方された自己複製ＲＳＶ−Ｆ  ＲＮＡ（ｖＡ３１７，０．１μｇ）、およびリポソーム中に処方された複製欠損性ＧＦＰ  ＲＮＡ（ｖＡ３３６，１μｇ）の混合物
群１０  Ｆサブユニットタンパク質（５μｇ）。
【０１９８】
血清を、１４日目、３５日目および５１日目に、抗体分析のために集めた。Ｆ特異的血清ＩｇＧ力価（ＧＭＴ）を測定した；個々の動物が力価＜２５（検出限界）を有した場合、それには力価５を割り当てた。さらに、５１日目にＴ細胞分析のために脾臓をマウスから採取して、サイトカイン陽性かつＲＳＶ  Ｆ５１−６６ペプチド（ＣＤ４＋）もしくはＲＳＶ  ＦペプチドＦ８５−９３およびＦ２４９−２５８（ＣＤ８＋）に対して特異的である細胞を決定した。
【０１９９】
ＩｇＧ力価は、１０群においておよび非免疫化コントロールマウスにおいて以下のとおりであった：
【０２００】
【表３】
0005940064.tif 000009
５１日目でのＲＳＶ血清中和力価は、以下のとおりであった：
【０２０１】
【表４】
0005940064.tif 000010
５１日目にＲＳＶ  Ｆ特異的ＣＤ４＋脾臓Ｔ細胞を示す動物は、以下のとおりであった。ここで数字（％陽性細胞）は、上記刺激された応答が統計的に有意にゼロを上回った場合にのみ与える：
【０２０２】
【表５】
0005940064.tif 000011
５１日目にＲＳＶ  Ｆ特異的ＣＤ８＋脾臓Ｔ細胞を示す動物は、以下のとおりであった。ここで数字は、上記刺激された応答が統計的に有意にゼロを上回った場合にのみ与える：
【０２０３】
【表６】
0005940064.tif 000012
これら結果は、宿主防御応答が、上記送達されるベクターへの免疫応答を制限し得ることを示す。例えば、群２および群６〜９は、同じ自己複製抗原コードベクターを使用し、リポソーム中で送達したが、群６〜９はまた、１００倍もしくは１０倍過剰の、裸でもしくはリポソーム内部のいずれかで、および自己複製もしくは複製欠損性のいずれかで送達したＧＦＰコードベクターを有した。上記余分のＲＮＡは、特に、自己複製および／または被包された場合に、抗ＲＳＶ応答を低下させた。
【０２０４】
さらなる実験は、ＲＮＡに対する宿主応答が、タンパク質発現を制限し得るか否かを調べることを目的とした。従って、発現を、適応応答（抗体，Ｔ細胞）が明らかになる前の６日間のみ追跡した。上記「ｖＡ３０６」レプリコンは、ＳＥＡＰをコードする；上記「ｖＡ１７」レプリコンは、ＧＦＰをコードする；上記「ｖＡ３３６」レプリコンは、ＧＦＰをコードするが自己複製できない；上記「ｖＡ３３６＊」は、レプリコンは、ｖＡ３３６と同じであるが、ウリジンのうちの１０％を５−メチルウリジンで置換して調製した；上記「ｖＡ３３６＊＊」レプリコンは、ｖａ３３６と同じであるが、そのウリジン残基のうちの１００％が、Ｍ５Ｕである。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、０日目に、両側の筋肉内ワクチン接種（５０μＬ／脚）を与えた。動物（全３５匹）を、７群に分け（１群あたり５匹の動物）、以下のように免疫化した：
群１  ナイーブコントロール。
群２には、リポソーム中に処方したＲＮＡ（ｖＡ３０６，０．１μｇ，ＳＥＡＰ）を、リポソーム中に処方した自己複製ＲＮＡ（ｖＡ１７，１．０μｇ，ＧＦＰ）と混合して、０日目に、両側の筋肉内ワクチン接種（５０μＬ／脚）を与えた。
群３には、リポソーム中に処方したＲＮＡ（ｖＡ３０６，０．１μｇ，ＳＥＡＰ）を、リポソーム中に処方した非複製ＲＮＡ（ｖＡ３３６，１．０μｇ，ＧＦＰ）と混合して、０日目に、両側の筋肉内ワクチン接種（５０μＬ／脚）を与えた。
群４には、リポソーム中に処方したＲＮＡ（ｖＡ３０６，０．１μｇ，ＳＥＡＰ）を、リポソーム中に処方した非複製ＲＮＡ（ｖＡ３３６＊，１．０μｇ，ＧＦＰ）と混合して、０日目に、両側の筋肉内ワクチン接種（５０μＬ／脚）を与えた。
群５には、リポソーム中に処方したＲＮＡ（ｖＡ３０６，０．１μｇ，ＳＥＡＰ）を、リポソーム中に処方した非複製ＲＮＡ（ｖＡ３３６＊＊，１．０μｇ，ＧＦＰ）と混合して、０日目に、両側の筋肉内ワクチン接種（５０μＬ／脚）を与えた。
群６には、リポソーム中に処方したＲＮＡ（ｖＡ３０６，０．１μｇ，ＳＥＡＰ）を、群２〜５と同じ脂質用量における空のリポソームと混合して、０日目に、両側の筋肉内ワクチン接種（５０μＬ／脚）を与えた。
群７には、リポソーム中に処方したＲＮＡ（ｖＡ３０６，０．１μｇ，ＳＥＡＰ）を、リポソーム中に処方した自己複製ＲＮＡ（ｖＡ１７，１．０μｇ，ＧＦＰ）と混合して、０日目に、両側の筋肉内ワクチン接種（５０μＬ／脚）を与えた。
【０２０５】
０日目、３日目および６日目における血清ＳＥＡＰ活性（相対光単位）は、以下のとおりであった（ＧＭＴ）：
【０２０６】
【表７】
0005940064.tif 000013
複製能のある、ＧＦＰをコードするＲＮＡは、複製欠損性ＧＦＰ  ＲＮＡより、ＳＥＡＰの発現を抑制した。このことは、複製ＲＮＡに対する強力な宿主防御応答が、ＳＥＡＰ発現の抑制をもたらすことを示唆する。上記ＧＦＰ  ＲＮＡに応じて誘導されたインターフェロンが、ＳＥＡＰの発現を抑制したことは考えられることである。上記宿主応答／抑制モデル下では、ＲＮＡの宿主認識をブロックすることは、増大したＳＥＡＰ発現をもたらすと予測されるが、上記ＧＦＰ  ＲＮＡにおけるＵ残基の５’メチル化は、増大したＳＥＡＰと関連しなかった。このことは、ＲＮＡの宿主認識は、５’メチル化に反応しなかったことを示唆する。
【０２０７】
（送達容積）
流体力学的送達は、細胞膜の物理的障壁（大きい、膜不透過性の化合物が細胞に入らないようにする）を克服するための大きな容積の溶液の迅速な注射によって生じた力を使用する。この現象は、ＤＮＡワクチンの細胞内送達に有用であることが以前示された。
【０２０８】
筋肉内注射にとって代表的なマウス送達容積は、後肢に５０μｌである。これは、マウスの脚の筋肉に関して、比較的大きな容積である。対照的に、約０．５ｍｌというヒト筋肉内用量は、比較的小さい。マウスにおける免疫原性が容積依存性であれば、上記レプリコンワクチンの効力は、少なくとも一部は、流体力に因り得る。このことは、ヒトおよびより大きな動物において同じワクチンを使用することを促進しない。
【０２０９】
上記ｖＡ３１７レプリコンを、０日目および２１日目に、ＢＡＬＢ／ｃマウス（１０匹／群）に、両側の筋肉内ワクチン接種（５もしくは５０／脚）によって送達した：
群１には、裸のレプリコン（５０μＬ／脚において０．２μｇ）を与えた。
群２には、裸のレプリコン（５μＬ／脚において０．２μｇ）を与えた。
群３には、エマルジョン処方したレプリコン（０．２μｇ，５０μＬ／脚）を与えた。
群４には、エマルジョン処方したレプリコン（０．２μｇ，５μＬ／脚）を与えた。
群５には、リポソーム処方したレプリコン（０．２μｇ，５０μＬ／脚）を与えた。
群６には、リポソーム処方したレプリコン（０．２μｇ，５μＬ／脚）を与えた。
【０２１０】
血清を、１４日目および３５日目に、抗体分析のために集めた。Ｆ特異的血清ＩｇＧ  ＧＭＴは、以下であった：
【０２１１】
【表８】
0005940064.tif 000014
従って、上記処方されたレプリコンの免疫原性は、送達された容積に従って変動しなかった。従って、このことは、これらＲＮＡワクチンは、それらの効力に関して、流体力学的送達に依存しないことを示す。
【０２１２】
（大型哺乳動物研究）
大型動物研究を、ウシにおいて行った。仔ウシ（４〜６週齢，約６０〜８０ｋｇ，５頭／群）を、０日目、２１日目、８６日目および１４６日目に、６６μｇの、全長ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードするレプリコン  ｖＡ３１７で免疫化した。上記レプリコンを、リポソーム内部にもしくは上記ＣＮＥ１７エマルジョンとともに処方した。ＰＢＳ単独を、陰性コントロールとして使用し、承認されたワクチンを、陽性コントロールとして使用した（Ｆｏｒｔ  Ｄｏｄｇｅの「Ｔｒｉａｎｇｌｅ  ４」，死滅ウイルスを含む）。すべての仔ウシに、１４６日目に、ＭＦ５９エマルジョンをアジュバント添加した１５μｇ  Ｆタンパク質を与えた。１頭のウシには、８６日目に、Ｔｒｉａｎｇｌｅ  ４の代わりにＣＮＥ１７ベースのワクチンを誤ってワクチン接種してしまったので、そのデータは、１００日目から排除した。
【０２１３】
上記ＲＮＡワクチンは、ヒトＲＳＶ  Ｆをコードしたのに対して、上記「Ｔｒｉａｎｇｌｅ  ４」ワクチンは、ウシＲＳＶ  Ｆを含んだが、上記ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、ＢＲＳＶとＨＲＳＶとの間で非常に保存されている。
【０２１４】
上記リポソームは、上記で言及されるものと同じ割合のＤｌｉｎＤＭＡ、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびＰＥＧ−ＤＭＧを有した。エタノール中の新たな脂質ストック溶液を調製した。３７ｍｇのＤｌｉｎＤＭＡ、１１．８ｍｇのＤＳＰＣ、２７．８ｍｇのコレステロールおよび８．０７ｍｇのＰＥＧ−ＤＭＧを秤量し、７．５５ｍＬのエタノールに溶解した。上記新たに調製した脂質ストック溶液を、３７℃において約１５分間にわたって穏やかに振盪して、均質な混合物を形成した。次いで、２２６．７μＬの上記ストックを、１．７７３ｍＬ  エタノールに添加して、作業脂質ストック溶液２ｍＬを作製した。ＲＮＡの２ｍＬ  作業溶液もまた、１００ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ６）中に約１μｇ／μＬのストック溶液から調製した。３本の２０ｍＬ  ガラスバイアル（撹拌子つき）を、ＲＮａｓｅ  Ａｗａｙ溶液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）ですすぎ、使用前に多量のＭｉｌｌｉＱ水で洗浄して、上記バイアルのＲＮａｓｅ汚染を除去した。上記バイアルのうちの１本を、上記ＲＮＡ作業溶液に使用し、他のものを、上記脂質およびＲＮＡ混合物を集めるために使用した（後に記載されるとおり）。上記作業脂質溶液およびＲＮＡ溶液を、３７℃において１０分間にわたって加熱し、その後、３ｃｃ  シリンジに入れた。２ｍＬのクエン酸緩衝液（ｐＨ６）を、別の３ｃｃ  シリンジに入れた。ＲＮＡおよび上記脂質を含むシリンジを、ＦＥＰチューブを使用して、Ｔミキサー（ＰＥＥＫＴＭ  ５００μｍ  ＩＤ接合部）に接続した。上記Ｔミキサーからの出口もまた、ＦＥＰチューブであった。上記クエン酸緩衝液を含む第３のシリンジを、別個の１つのＦＥＰチューブに接続した。次いで、すべてのシリンジを、流量７ｍＬ／分においてシリンジポンプを使用して作動させた。上記チューブ出口を、２０ｍＬ  ガラスバイアルに上記混合物を集めるように配置した（撹拌しながら）。上記撹拌子を取り出し、上記エタノール／水性溶液を、室温へと１時間にわたって平衡化させた。次いで、上記混合物を、５ｃｃ  シリンジに入れ、これを、ＦＥＰチューブの１つにはめ、別の５ｃｃ  シリンジを、等しい長さのＦＥＰチューブに接続し、等量の１００ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ６）を入れた。上記２本のシリンジを、シリンジポンプを使用して７ｍＬ／分の流量で作動させ、最終の混合物を、２０ｍＬ  ガラスバイアルに集めた（撹拌しながら）。次に、上記第２の混合工程から集めた混合物（リポソーム）を、Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑ膜（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＡｎｎＡｒｂｏｒ，ＭＩ，ＵＳＡから得られる、結合してアニオン性分子を除去するアニオン交換支持体）を通過させた。上記リポソームが通過する前に、４ｍＬの１Ｍ  ＮａＯＨ、４ｍＬの１Ｍ  ＮａＣｌおよび１０ｍＬの１００ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ６）が、上記Ｍｕｓｔａｎｇ膜を連続して通過した。リポソームを、１０分間にわたって３７℃において加温し、その後、上記フィルターに通過させた。次に、ＴＦＦシステムを使用して、リポソームを２ｍＬに濃縮し、１０〜１５容積の１×ＰＢＳに対して透析し、その後、最終生成物を収集した。上記ＴＦＦシステムおよび中空ファイバー濾過膜を、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ��ａｂｓから購入し、上記製造業者のガイドラインに従って使用した。１００ｋＤ孔サイズカットオフおよび２０ｃｍ２表面積を有するポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）中空ファイバー濾過膜を使用した。インビトロおよびインビボ実験に関して、処方物を、１×ＰＢＳで、必要とされるＲＮＡ濃度へと希釈した。
【０２１５】
仔ウシに、２ｍｌの各実験ワクチンを与え、２×１ｍｌとして頸の各側に筋肉内投与した。対照的に、上記「Ｔｒｉａｎｇｌｅ  ４」ワクチンを、頸に単一２ｍｌ用量として与えた。
【０２１６】
０日目、１４日目、２１日目、３５日目、４２日目、５６日目、６３日目、８６日目、１００日目、１０７日目、１１４日目、１２１日目、１２８日目、１３５日目、１４６日目、１６０日目、１６７日目、１７４日目、１８１日目、１８８日目、１９５日目および２０２日目に、血清を、抗体分析のために集めた。個々の動物が検出限界未満の力価を有した場合、力価５を割り当てた。
【０２１７】
図１４Ａは、最初の６３日間にわたるＦ特異的ＩｇＧ力価を示す。上記ＲＮＡレプリコンは、両方の送達システムを使用して上記ウシにおいて免疫原性であったが、それは、上記認可されたワクチンより低い力価を与えた。すべてのワクチン接種したウシは、２回目の用量後にＦ特異的抗体を示した。力価は、上記２回目の用量の２〜６週間後の期間から非常に安定であった（そして上記ＲＮＡワクチンに関しては特に安定であった）。上記リポソーム送達システムでの力価は、上記エマルジョンでのものより緊密に密集した。
【０２１８】
図１４Ｂは、２１０日間にわたるＦ特異的血清ＩｇＧ力価（ＧＭＴ）を示す。最大２０２日目までの測定値は、以下のとおりであった：
【０２１９】
【表９】
0005940064.tif 000015
上記エマルジョンアジュバント添加ワクチンは、補体なしでアッセイされる場合に、Ｔｒｉａｎｇｌｅ  ４より高い力価で中和応答を誘導した（しかし、より変動しやすかった）。ＲＳＶ血清中和抗体力価は、以下のとおりであった：
【０２２０】
【表１０】
0005940064.tif 000016
この研究からのデータは、大型動物におけるＲＮＡレプリコン  ＲＳＶワクチンの構想の証明を提供し、上記エマルジョンアジュバント添加群における５頭の仔ウシのうちの２頭は、上記補体非依存性ＨＲＳＶ中和アッセイによって測定される場合、３回目のワクチン接種の後の良好な中和抗体力価を実証する。上記エマルジョンアジュバント添加ワクチンは、上記リポソームアジュバント添加ワクチンより免疫原性であるようであるが、複雑にする要因の１つは、上記第２のリポソーム用量に使用した材料が、新たに調製されなかったことであり、ＲＮＡの同じロットは、マウス免疫原性研究において、効力の低下を示した。従って、上記リポソームアジュバント添加ワクチンは、新たな材料がすべてのワクチン接種で使われたのであれば、より免疫原性であったと考えられる。
【０２２１】
補体とともにアッセイした場合、中和抗体は、すべてのワクチン接種したウシにおいて検出された。このアッセイにおいて、すべてのワクチン接種した仔ウシは、処方物にかかわらず、２回目のＲＮＡワクチン接種の後に、良好な中和抗体力価を有した。さらに、両方のＲＮＡワクチンが、Ｆ特異的血清ＩｇＧ力価を誘発した。上記Ｆ特異的血清ＩｇＧ力価は、２回目のワクチン接種後に数頭の仔ウシにおいて、および３回目のワクチン接種の後にすべての仔ウシにおいて、検出可能であった。
【０２２２】
ＭＦ５９アジュバント添加ＲＳＶ−Ｆは、すべての以前にワクチン接種した仔ウシにおいてＩｇＧ応答をブーストでき、ＲＮＡを以前にワクチン接種した仔ウシの補体非依存性ＨＲＳＶ中和力価をブーストできた。
【０２２３】
大型動物におけるＲＮＡワクチンの構想の証明は、小動物モデルから大型動物およびヒトへと移行する場合に以前に観察された、ＤＮＡベースのワクチンでの効力の喪失を踏まえると、特に重要である。ウシＤＮＡワクチンに代表的な用量は、０．５〜１ｍｇ［５２，５３］であるので、免疫応答がわずか６６μｇのＲＮＡで誘導されたことは、非常に有望である。
【０２２４】
本発明は、例示によって記載されてきたに過ぎず、本発明の範囲および趣旨内に留まりながら、改変が行われ得ることは、理解される。
【０２２５】
表１：有用なリン脂質
ＤＤＰＣ        １，２−ジデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＤＥＰＡ        １，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート
ＤＥＰＣ        １，２−エルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＤＥＰＥ        １，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン
ＤＥＰＧ        １，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスファチジル−ｒａｃ−（１−グリセロール．．．）
ＤＬＯＰＣ      １，２−リノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＤＬＰＡ        １，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート
ＤＬＰＣ        １，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＤＬＰＥ        １，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン
ＤＬＰＧ        １，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスファチジル−ｒａｃ−（１−グリセロール．．．）
ＤＬＰＳ        １，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルセリン
ＤＭＧ          １，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン
ＤＭＰＡ        １，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート
ＤＭＰＣ        １，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＤＭＰＥ        １，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン
ＤＭＰＧ        １，２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスファチジル−ｒａｃ−（１−グリセロール．．．）
ＤＭＰＳ        １，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルセリン
ＤＯＰＡ        １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート
ＤＯＰＣ        １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＤＯＰＥ        １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン
ＤＯＰＧ        １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスファチジル−ｒａｃ−（１−グリセロール．．．）
ＤＯＰＳ        １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルセリン
ＤＰＰＡ        １，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート
ＤＰＰＣ        １，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＤＰＰＥ        １，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン
ＤＰＰＧ        １，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスファチジル−ｒａｃ−（１−グリセロール．．．）
ＤＰＰＳ        １，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルセリン
ＤＰｙＰＥ      １，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン
ＤＳＰＡ        １，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート
ＤＳＰＣ        １，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＤＳＰＥ        １，２−ジステアロイル（Ｄｉｏｓｔｅａｒｐｙｌ）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン
ＤＳＰＧ        １，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスファチジル−ｒａｃ−（１−グリセロール．．．）
ＤＳＰＳ        １，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルセリン
ＥＰＣ          卵−ＰＣ
ＨＥＰＣ        水素化卵ＰＣ
ＨＳＰＣ        高純度水素化ダイズＰＣ
ＨＳＰＣ        水素化ダイズＰＣ
ＬＹＳＯＰＣ  ＭＹＲＩＳＴＩＣ    １−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＬＹＳＯＰＣ  ＰＡＬＭＩＴＩＣ    １−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＬＹＳＯＰＣ  ＳＴＥＡＲＩＣ      １−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ミルクスフィンゴミエリンＭＰＰＣ  １−ミリストイル，２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ  ３−ホスファチジルコリン
ＭＳＰＣ        １−ミリストイル，２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＰＭＰＣ        １−パルミトイル，２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＰＯＰＣ        １−パルミトイル，２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＰＯＰＥ        １−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン
ＰＯＰＧ        １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスファチジル−ｒａｃ−（１−グリセロール）．．．］
ＰＳＰＣ        １−パルミトイル，２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＳＭＰＣ        １−ステアロイル，２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＳＯＰＣ        １−ステアロイル，２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＳＰＰＣ        １−ステアロイル，２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
【０２２６】
【数１】
0005940064.tif 000017
【０２２７】
【数２】
0005940064.tif 000018
【図１】
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【図３】
0005940064.tif 000020
【図４】
0005940064.tif 000021
【図５】
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【図６】
0005940064.tif 000023
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図２】
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