(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子マイクロアレイを作製する方法であって、
ａ）その表面上に固定された１つ又は複数の鋳型分子を示す第１の支持表面（鋳型表面）と、対向する第２の支持表面（捕捉表面又はマイクロアレイ表面）とを準備することと、
ｂ）出力分子を前記鋳型分子から無細胞の酵素反応系及び／又は化学反応系を介して産生することと、
ｃ）前記第１の支持表面上での前記鋳型分子の配置と前記第２の支持表面上での対応する前記出力分子の堆積との間の相関関係によって、該第１の支持表面と該第２の支持表面との間の流体を介して、該出力分子を第２の支持表面へと移動させることと、
を含み、
ｄ）工程ｂ）の開始前に、ある固定位置での前記支持表面のアセンブリがなされ、ここで、工程ｂ）の開始は、対向する隔てられた第１の支持表面と第２の支持表面との間に形成される、マイクロ流体インキュベーションチャンバ（マイクロ流体ギャップ）の形態での、空間的隔離によって妨げられ、マイクロ流体インキュベーションチャンバへの無細胞の酵素反応系及び／又は化学反応系の導入が、該出力分子の産生を導き、該出力分子の該第２の支持表面への移動を可能にすることを特徴とする、方法。
【請求項２】
工程ｂ）の開始は、対向する隔てられた第１の支持表面と第２の支持表面との間に形成される、マイクロ流体インキュベーションチャンバ（マイクロ流体ギャップ）の形態での、空間的隔離によって妨げられ、該空間的隔離が、２つの表面の直接的な物理的接触を妨げる、工程ｂ）の開始前に空気を含む前記第１の支持表面と前記第２の支持表面との間の空間的隔離である、請求項１に記載の、方法。
【請求項３】
前記工程ｂ）の開始が、さらに、
―前記無細胞の酵素反応系及び／又は化学反応系の活性を抑える又は遮断するｐＨ値及び／又は温度等の該無細胞の酵素反応系及び／又は化学反応系を遮断する化学環境又はエネルギー環境、及び／又は、
―前記無細胞の酵素反応系を遮断する、電場若しくは磁場及び／又は電位を用いる内力場又は外力場、
によって、妨げられることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記マイクロ流体インキュベーションチャンバが、前記第１の支持表面と前記第２の支持表面との間に位置する膜を含まないことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
複数のマイクロアレイの作製のために、単一の第１の支持表面を複数回使用して繰り返すことができることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
工程ｂ）の開始の阻止は、
―Ｈ＋イオンの発生、及び続くｐＨ変化をもたらす二酸化チタンでコーティングされた表面の光処理により、ｐＨ感受性分子の機能的変化を誘導するｐＨ変化、
―帯電分子、誘電分子若しくは磁性分子又は表面特性の変化を誘導する静的及び／又は動的な電場及び／又は磁場の変化、
―分子構造又は分子力学の変化を誘導する温度の変化であって、加温の際に反応の開始が起こる、温度の変化、
―必須の反応成分と結合した光切断性の化学置換基の使用等といった、光誘導性の反応により遮断分子、光感受性分子又はケージド分子の変化を誘導する照射であって、光による処理が該反応成分を放出させ、反応の開始、及び／又はケージドビオチン若しくは他の分子の光誘導性の放出等といったケージド化合物の放出を可能にする、照射、又は、
―それらの組合せ、
による、活性状態から不活性状態への、又は不活性状態から活性状態への分子の分子スイッチングに関するものであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記鋳型分子が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、クローンＤＮＡフラグメント、プラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ若しくはｃＤＮＡライブラリ、ＰＣＲ産物、合成ＤＮＡ若しくはＤＮＡオリゴヌクレオチド、ｍＲＮＡ、又は合成ＲＮＡ等の核酸又は核酸様分子であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記無細胞酵素反応系が、
ＤＮＡポリメラーゼ、又はＤＮＡ増幅酵素若しくは酵素系、
ＲＮＡポリメラーゼ、又はＲＮＡ増幅酵素若しくは酵素系、
逆転写酵素、又はＲＮＡからＤＮＡへの転写酵素若しくは酵素系、又は、
タンパク質合成系又はＤＮＡからＲＮＡへの転写及びＲＮＡからタンパク質への翻訳に必要とされる酵素ミックス等の無細胞発現ミックス、又は、大腸菌、細菌起源、ウサギの網状赤血球、昆虫起源、ヒト及びコムギ胚芽等の原核細胞系又は真核細胞系から選択される無細胞溶解物、
であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法によって、分子マイクロアレイを作製するためのデバイスであって、
ａ）その表面上に固定された１つ又は複数の鋳型分子を示す第１の支持表面（鋳型表面）と、
ｂ）前記第１の支持表面とアセンブリした第２の支持表面（捕捉表面又はマイクロアレイ表面）であって、該第２の支持表面が、その表面に出力分子を共有結合的に又は非共有結合的に付着させるように構成された固定化剤でプレコートされており、
ｃ）無細胞の酵素反応系及び／又は化学反応系のために、物理的に隔てられた対向する第１の支持表面と第２の支持表面との間に形成されるマイクロ流体インキュベーションチャンバ（マイクロ流体ギャップ）であって、それにより支持表面のアセンブリが無細胞の酵素反応系及び／又は化学反応系の開始と切り離される、マイクロ流体インキュベーションチャンバ（マイクロ流体ギャップ）と、
ｄ）前記インキュベーションチャンバへの流体注入口及び／又は排出口と、
ｅ）固定位置に２つの対向する支持表面を保持するための手段と、
ｆ）２つの対向する支持表面間の空間として前記インキュベーションチャンバを維持するための手段と、
を備える、デバイス。
【請求項１０】
請求項９のデバイスであって、
ａ．該マイクロ流体インキュベーションチャンバが、前記第１と第２の支持表面間に位置する膜を含まない、
ｂ．該マイクロ流体インキュベーションチャンバが、空気を含む、
ｃ．２つの対向する支持表面間を空間として該インキュベーションチャンバを維持するための手段が、前記第１と第２の支持表面間のスペーサである、及び／又は
ｄ．２つの対向する支持表面間を空間として該インキュベーションチャンバを維持するための手段が、一つ又はそれ以上の三次元構造（３Ｄ）のフローセルである、
デバイス。
【請求項１１】
前記支持表面間の空間的隔離の高さが、１００μｍ未満、又は８０μｍ未満、又は６５μｍ、又は６０μｍ未満、又は４０μｍ未満、又は２０μｍ以下であることを特徴とする、請求項９又は１０に記載のデバイス。
【請求項１２】
前記第１の支持表面及び前記第２の支持表面が、ガラス、プラスチック、ナイロン、又は他のタイプの天然若しくは合成のポリマー若しくは膜、又はポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）であることを特徴とする、請求項９〜１１のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１３】
長さが６０ｍｍ〜１４０ｍｍ、８０ｍｍ〜１２０ｍｍ又は１０５ｍｍであり、幅が３０ｍｍ〜９０ｍｍ、４０ｍｍ〜８０ｍｍ又は６０ｍｍの携帯サイズであることを特徴とする、請求項９〜１２のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１４】
固定位置に２つの対向する支持表面を保持するための前記手段が、該２つの支持表面に対する上方ブラケット、下方ブラケット、又は側方ブラケットのいずれかとして位置している、取付けブラケット（ホルダ）に関するものであり、該支持表面又は取付けブラケット（ホルダ）が、機械的張力、磁力、スプリングシステム、表面への誘導レールによって適所に保持し、それにより固定位置に２つの支持表面を保持することを特徴とする、請求項９〜１３のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１５】
前記固定化剤が、前記出力分子を該表面に共有結合若しくは非共有結合するように構成されるものであり、又は前記固定化剤が、発現されるタンパク質であるヘキサヒスチジンで代表されるポリヒスチジン配列と共有結合若しくは非共有結合するように構成される抗体によって代表されるタンパク質固定化剤であり、該タンパク質固定化剤がＮｉ−ＮＴＡ、ペプチド、ドメイン又はタンパク質で代表されるキレート剤であり、該タンパク質固定化剤が前記タグ及び／又はアビジンで代表されるビオチン結合分子に特異的な抗体であることを特徴とする、請求項９〜１４のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１６】
前記第１の支持表面が、
核酸又は核酸様分子のマイクロアレイ、
核酸を示すシークエンシングチップ、
表面上の核酸の空間的に規定された分布、
ビースアレイ又は構造化表面上の核酸の空間的に規定された分布、又は、
核酸を含有する液体材料又は固体材料の空間的に規定された分布、
であることを特徴とする、請求項９〜１５のいずれか一項に記載のデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子マイクロアレイを生成するためのデバイス及び方法に関する。そのため、本発明は、酵素過程又は化学過程を介した鋳型分子マイクロアレイからの出力分子の産生と、該出力分子の所望の分子マイクロアレイ上への移動とによって、タンパク質マイクロアレイ、ＤＮＡマイクロアレイ及びＲＮＡマイクロアレイ（概して核酸マイクロアレイ）を生成するための普遍的なアプローチに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡからタンパク質へのアレイ複写における現行の技術水準
「従来の構成（classical setup）」でのタンパク質−マイクロアレイの作製は、タンパク質を細胞において合成し、その後タンパク質を溶解細胞から精製し、タンパク質溶液をマイクロアレイ上へと移動するものである。これは通常、各々のタンパク質で個々に行われる。全てのタンパク質溶液を精製したら、分配システムを用いて、タンパク質−マイクロアレイを生成する。この技法は、１０年以上にわたって用いられているが、煩雑なものであるとともに、時間及び費用、特に細胞培養物の維持及び細胞におけるタンパク質発現に対して相当な労力を必要とする。これにより大抵の場合で、各々のタンパク質−マイクロアレイに対するコストが１０００ユーロを超えることとなる。
【０００３】
チップ上でのタンパク質のｉｎ  ｓｉｔｕでの化学合成は、自然に細胞から生じたタンパク質と比較して生成物の純度が不十分であるとともに、合成収率が低いことから、奏功していない。短いタンパク質フラグメント、いわゆるペプチドのみがｉｎ  ｓｉｔｕ合成に適用可能である。しかしながら、情報価値及び重要性のためには、好ましくは自然に発現された完全長タンパク質を用いて、最適な生化学試験を行う必要がある。
【０００４】
マイクロアレイをベースとする完全長タンパク質の合成に対するアプローチが、ＤＮＡからタンパク質を直接産生するために開発されている。２０１０年２月に公表された論稿［２］は、様々なアプローチ及び変法を示している。この論稿は、これらのうちどの方法が、鋳型ソースであるＤＮＡアレイからタンパク質アレイを生成するために既に実現されているかを重視している。基本となるメッセージの一つは、ＤＮＡがリボソーム結合部位、プロモータ等の幾つかの機能的「情報」単位をコードしている場合にのみ、タンパク質を合成することができるということである。無細胞発現ミックス（mix）によってＤＮＡが認識及び処理され、次いで無細胞発現ミックスがＤＮＡを転写し、ｍＲＮＡを対応するタンパク質ヘと翻訳するには、ＤＮＡは「発現可能（expression ready）」でなければならないといえる。
【０００５】
２００１年には、He及びTaussigがＰＩＳＡシステムを公表している［３］（特許文献１）。ここでは、ＤＮＡを、分配する直前に無細胞発現ミックスと混合していた。続いて小さな液滴を表面上へと移動させた。液滴のそれぞれが、添加したＤＮＡに従ってタンパク質を生成する。タンパク質配列内において、Ｈｉｓタグがコードされる。このＨｉｓタグが、いわゆるニッケル−ＮＴＡ表面ヘと特異的に結合する。十分なタンパク質が生成された後、表面全体を洗い流し、それから液体で洗浄する。これにより、Ｈｉｓタグを含有しない全てのＤＮＡ及び全てのタンパク質が取り除かれる。Ｈｉｓタグを含有するタンパク質のみが表面に貼り付き、それにより全ての他のタンパク質から「精製」及び分離されることになる。このマイクロアレイは、タンパク質間相互作用の結合測定に直接使用することができる。２００６年には、この方法で作製された、１３０００個の異なるタンパク質又はタンパク質フラグメントを含有するタンパク質−マイクロアレイが公表された［４］。
【０００６】
ＰＩＳＡシステムは、（従来の組換えタンパク質合成方法と比較して）煩雑な個々のタンパク質精製の労力を避けるものであるが、マイクロアレイ表面へと移動させる直前に各々の鋳型ＤＮＡ配列を無細胞発現系と混合するための労力は未だに莫大なものである。また、ＰＩＳＡシステムは、マイクロアレイ上の各々のスポットに対して全く同じ条件下、特に濃度及び時間のパラメータに関して全く同じ条件下で行う必要がある。これは、自動分注装置（pipetting robot）を用いて多大な困難を伴った場合にのみ実現することができる。
【０００７】
２００４年には、LaBearが、ＤＮＡアレイからタンパク質アレイを作製するためのＮＡＰＰＡシステム（核酸プログラム型タンパク質アレイ（Nucleic Acid Programmable Protein Array））を公表した（特許文献２）［５］。ここでは、２つの結合剤分子を備える表面が必要とされる。Ｈｉｓタグに対する抗体及びストレプトアビジンが使用される。この二重結合剤表面上に、ＤＮＡ−マイクロアレイを、表面に結合するタグを含有するＤＮＡでプリントした。ビオチン化ＤＮＡを概念実証に使用した。これらのＤＮＡ−マイクロアレイは、最大２年間保管することができる。ＮＡＰＰＡ−マイクロアレイ全体の貯蔵寿命は、抗体及びＤＮＡの貯蔵寿命によって制限される。使用の直前に、完全なマイクロアレイを無細胞発現系で覆う。スポット自体のＤＮＡによって規定される各々のスポット上で、自由に拡散する様々なタンパク質が合成される。しかしながら、各々のタンパク質は、該抗体に結合する特別な配列を含有する。そのため、純粋な統計的尤度により、該抗体は表面に結合する。ＤＮＡスポットの上に直接タンパク質が生成されることから、タンパク質のほとんどがスポット上に又はそのすぐ近くで結合する。洗浄工程後、ＤＮＡ及び所望のタンパク質のみが表面上に残り、新たに合成されたタンパク質を含むマイクロアレイを実験に使用することができる。２００８年には、およそ１０００個のタンパク質を含むタンパク質マイクロアレイが公表された［６］。
【０００８】
ＰＩＳＡと比較した上でのＮＡＰＰＡの利点は、ＤＮＡ−マイクロアレイ（正：microarray）調製がタンパク質合成から切り離されることである。ＰＩＳＡでは、タンパク質は、マイクロアレイの作製中及び作製後に直接かつ生得的に合成されるが、ＮＡＰＰＡシステムでは、多くのＤＮＡ−マイクロアレイを作製し、長期間保管することが可能になる。タンパク質が新たに合成されることが実験的使用に重要である。そのため、ＮＡＰＰＡシステムは、「オンデマンド（on-demand）」タンパク質マイクロアレイといわれている。欠点は、ストレプトアビジン（正：streptavidin）及び抗体のような表面上の二重結合剤系であり（コスト要素の増大をもたらす）、加えてそれらが表面上にＤＮＡとともに残ることである（非特異的な結合の可能性が高くなる）。
【０００９】
２００８年には、He et al（Michael Taussigのグループ）は、オリジナルのＤＮＡ−マイクロアレイを採取し、タンパク質−マイクロアレイとして複数のコピーを生成することを可能にする方法であるＤＡＰＡシステムを公表した［１］（特許文献３）。このシステムでは、タンパク質コードＤＮＡが、市販のエポキシ官能基を有する表面上にＤＮＡ−マイクロアレイとして分配される。これは、従来のＤＮＡ−マイクロアレイ生成と同様に行われる。
【００１０】
ＤＡＰＡシステムでは、ＤＮＡアレイと第２の表面との間に膜を配置することによって、ＤＮＡアレイを第２の表面に接触させる。膜は予め無細胞発現系に浸しておき、該無細胞発現系は直ぐにＤＮＡ鋳型との接触を開始し、マイクロアレイから各々のスポットのＤＮＡに基づきタンパク質を生成する（ＰＩＳＡ構成と同様）。タンパク質が膜を通って拡散し、第２の表面に結合する。このようにして、タンパク質−マイクロアレイが生成される。捕獲表面として、ニッケル−ＮＴＡ表面が使用され、該ＤＮＡ内において、この捕獲表面に対する特異的な結合配列として一致する（according）Ｈｉｓタグがコードされる。およそ３時間後、サンドイッチを開放し、ＤＮＡ−マイクロアレイ及びタンパク質−マイクロアレイを洗浄する。次いで、タンパク質−マイクロアレイを実験に使用することができ、ＤＮＡ−マイクロアレイを、次のタンパク質コピーを作製するまで保管するか、又は次のタンパク質−マイクロアレイを作製するために直ぐに再度使用することができる。
【００１１】
拡散によって、ＤＮＡスポットよりも大きなタンパク質スポットが作製され、更に該プロセスに固有の拡散の特徴である不鮮明な縁が生じる。拡散による縁の不鮮明さは、膜の薄さ、及び結果として生じるＤＮＡ−アレイからタンパク質捕獲表面までの拡散距離に関連して小さくなる。
【００１２】
ＰＩＳＡ及びＮＡＰＰＡと比較して、ＤＡＰＡシステムの最も明らかな利点は、複数のタンパク質−マイクロアレイコピーを、１つだけのオリジナルの単一ＤＮＡ−マイクロアレイから生成することができることである。更なる利点は、ＮＡＰＰＡシステムのように、タンパク質−マイクロアレイ上には障害となる（disturbing）ＤＮＡはなく、全体として（at all）タンパク質−マイクロアレイ表面上には１つの捕捉しか必要とされないことである。それにもかかわらず、このシステムによって、初めに１つのＤＮＡ−マイクロアレイから複数のタンパク質−マイクロアレイ複製物を作製することが可能である。これは、他の全てのシステムに対して完全に新規のもの（novum）である。
【００１３】
しかしながら、タンパク質−マイクロアレイを生成するための上記のＤＡＰＡのワークフローは、主に膜自体に固有の又は膜に関連する幾つかの好ましくない特性を保持する。
【００１４】
第１に、膜と両アレイ表面との間に実際に物理的に「硬質の」接触が存在し、これによって経時的に使用を通じて擦過傷及び／又は物理的摩耗が生じる。これはタンパク質アレイ表面を損傷させ、後の使用を制限することになる。更にＤＮＡアレイが損傷し、このことによって、ＤＮＡがコピープロセスによって変性又は破壊される（ablated）までに作製されるタンパク質アレイの総数に関してその寿命が制限される。
【００１５】
第２に、膜は通常、タンパク質をタンパク質アレイコピー上へと予測不能に伝達する不均質材料である。膜自体が、不織であり、そのためランダム材料であることから、不明確なものである。この材料内において、生成される分子の拡散は、全方向性ではなく、異方性（好ましい方向とそれほど好ましくない方向とが存在することを意味する）であるとして記載されている。該材料内で使用される繊維のために、繊維に沿った、又は繊維のランダム若しくは準ランダム（semi-random）配列により支持される特定の方向での拡散が生じ得る。これによって、オリジナルのＤＮＡ画像の数学的コンボリューション及び膜の不均質性によるものである、生じるタンパク質パターンの不均質性が引き起こされる。各々のコピープロセスには新たな膜が必要とされるため、各々のコピーは、膜の微細構造の相違から次のコピーとは本質的に異なる。この影響は、ＤＮＡアレイ上での構造サイズが小さければ、より強いものとなる。そのため、膜を介した予測不能の再現不可能な移動という要因によって、このコピープロセスの最小分解能及び該方法の再現性が制限される。
【００１６】
第３に、タンパク質産生の生化学的反応は、膜をＤＮＡに接触させた直後に開始する。そのため、ＤＮＡ−アレイと、膜と、第２の表面との積層体のアセンブリが、反応の開始と自動的に結び付く。このことによって、幾つかの反応体のアセンブリと、並行したマイクロアレイ作製の開始とが妨げられる。特に複数のアセンブリが同時に起こる場合には、反応の開始が明確ではない。更にこれにより再現性も低減する。
【００１７】
第４に、膜の取り付けが、その薄さ及びそれによる取扱い難さのために課題となっている。これは、膜が薄くなれば、タンパク質アレイの品質が良好になるが、薄いと濡れた膜がより脆く、膜の取扱いがより難しくなり、場合によってはそれ自体の重量で崩れるか、湾曲するか、又は気泡が混入するということによって強められる。更にこれにより再現性も低減する。
【００１８】
ＤＮＡ−アレイと、膜と、第２の表面とのアセンブリの間は、気泡が膜に混入してはいけない。これは、熟練者及び経験豊富な人（skilled and experienced personnel）でなれれば防ぐことができない。
【００１９】
さらに、最近の刊行物によると、ＤＡＰＡデバイスは複雑であり、そのためあまり複雑ではない構成と比較して誤差が生じやすい。
【００２０】
更なる欠点は、１つのタンパク質−マイクロアレイの生成には、活性成分（無細胞酵素ミックス）が主として膜内で結合するか、又は膜と相互作用し、それにより鋳型ＤＮＡの転写酵素及び翻訳酵素からの隔離が或る程度生じることにより、主に反応の効率が制限されることから３時間を超える時間が必要とされることである。さらに、膜を通るタンパク質産物の拡散には、更なる時間が必要となる。これによって、タンパク質コピーの生成のための発現時間の長期化が起こる。
【００２１】
これらの全ての欠点が、主に該プロセスが膜媒介性の反応系及び出力分子移動に応じたものであることから、ＤＡＰＡシステムの本質的に低い再現性を引き起こす。アセンブリによって、膜、ひいては無細胞発現系の接触が起こり、直ぐにタンパク質が産生される。アセンブリと反応の開始とを切り離すことは、上記のＤＡＰＡ構成では不可能である。この特定の欠点が、システム全体の再現性を損なわせる。
【００２２】
これらの欠点を考慮して、無細胞発現を用いてＤＮＡからタンパク質を合成するためのマイクロ流体アプローチが幾つか存在する。しかしながら、マイクロ流体分野のこれらの刊行物［７〜１０］は、より少ない無細胞発現ミックスでより多くのタンパク質を得ることにのみ注目しており、タンパク質マイクロアレイを作製することには注目していない。
【００２３】
ＤＮＡからＤＮＡ／ＲＮＡへのアレイのコピーにおける現行の技術水準
ＤＮＡ−マイクロアレイの広範な商業的利用可能性のために、ほとんどの研究グループは、オリジナルのＤＮＡ−マイクロアレイを採取し、ＤＮＡ−マイクロアレイ又はＲＮＡ−マイクロアレイに関するコピーを作製することを目的としていない。それにもかかわらず、マイクロアレイのＤＮＡからＤＮＡへのコピーに関して幾らかの進展が見られる。
【００２４】
２００１年には、Kumar et al［１１、１２］が、「希釈系列のマイクロアレイ」を生成するために、コンタクトプリント法を使用した。それにより、ＤＮＡ−マイクロアレイが可逆的な化学結合によって表面上にプリントされた。このＤＮＡ−マイクロアレイを、アクリルアミド表面に密接に等角接触させた。このアクリルアミド表面の化学特性によって、ＤＮＡの化学結合がマスターマイクロアレイから可逆的に開放され、一部のＤＮＡが鋳型（又はマスター）から新たなアレイ上へと分解した。次いで、ＤＮＡがアクリルアミド上に共有結合した。この工程を何回か繰り返すことができ、全てのＤＮＡが取り除かれるまで、マスターアレイを枯渇させた。生成されたＤＮＡマイクロアレイのコピーは、２つの形式で作製することができる。
【００２５】
同じ分解時間が常に適用された場合、希釈系列のＤＮＡが生成され、以下のコピーそれぞれに関してより少ないＤＮＡを含有するＤＮＡマイクロアレイのコピーがもたらされた。実験によって決定された分解時間の増大とともに適用された場合、全てのコピーは、ほぼ同量のＤＮＡを含有していた。このため、この技法を用いて、ＤＮＡマスターマイクロアレイのコピーを生成することが可能であるが、ＤＮＡマスターマイクロアレイは経時的に枯渇する。初期ＤＮＡ量は全て、コピーを作製することのみに分配される。そのため、これは増幅ではなく、複製である。
【００２６】
Yu et alは、２００５年にＤＮＡマイクロアレイのアフィニティコピーを提示した［１３］。ここでは、一次ＤＮＡマイクロアレイがプリントされた。この一次ＤＮＡマイクロアレイは、一次マイクロアレイ上の一致するＤＮＡに結合するチオール修飾ｃＤＮＡを含有していた、ＤＮＡのミックスとインキュベートした。そのため、ｃＤＮＡが一次マイクロアレイの異なるスポット上へと正確にハイブリダイズする。次いで、金コーティング表面を一次マイクロアレイと密接に等角接触させる。この近接近により、チオール基が金表面と相互作用するとともに、共有結合する。２つの表面を加熱し、分割することにより、初期ＤＮＡマイクロアレイのネガコピーを作製した。
【００２７】
これでは、ネガコピーを作製することしかできない。チオール金結合系を使用しても、ネガコピーのネガコピーを作製することはできず、このことは、該プロセスをネガコピーのみを作製するものに制限している。さらに、硬質の表面間の密接な等角接触は、非常に強い機械的応力、並びにそのため特に表面の薄い金コーティングの擦過傷及び機械的摩耗を引き起こすことから、極めて好ましくない。さらにＤＮＡは、マイクロアレイ上で直接増幅せず、前合成した後にハイブリダイゼーションにかけた。
【００２８】
２００６年には、S. Kim et alは、「ホールマスク（hole mask）」の形態のスペーサを用いることで異なる表面間の等角接触を避けた［１４］。S. Kim et alは、マイクロアレイをプリントし、ｃＤＮＡをマイクロアレイの異なるスポット上へとハイブリダイズした。次いで、ホールをスポットの位置に正確に含むマスクをその上に設け、液体で満たした。このサンドイッチ上には、ナイロン膜を適用した。熱及び誘引（attractive）電場を印加することにより、ｃＤＮＡが一次表面から放出され、ナイロン膜に移動した。ＤＮＡマイクロアレイのネガコピーが生成された。ブロッキング後、表面を実験に使用することができる。
【００２９】
この構成でも、マイクロアレイのネガコピーが可能であるが、このネガコピーの表面の正確なブロッキングによって、ネガコピーからこのプロセスを繰り返すことが可能となり、そのようにしてネガコピーのネガコピー（negative negative copy）及びそのためポジコピーが可能となる。さらに、ｃＤＮＡは、アレイ上でｉｎ  ｓｉｔｕ合成されず、調製されたミックスとして一次表面上でインキュベートされた。更なる欠点はホールマスク（holed mask）である。ホールマスクは、一次ＤＮＡマイクロアレイのフォーマット、特にスポットの格子に正確に存在していなければならず、かつ正確に位置していなければならない。７５ｍｍの顕微鏡スライドガラスの長さ及び１００μｍのスポットサイズの場合、マスクは、０．０８度未満の傾き下に置かなければならず、マイクロアレイの新たなフォーマットには、新たなホールマスクを作製しなければならない。
【００３０】
同年の２００６年には、Y. Kim et al［１５］は、マイクロアレイのＤＮＡからＤＮＡへのコピーのための先端コピー技術を提示していた。初めに、一次ＤＮＡマイクロアレイを基板上にプリントした。次いで、ＤＮＡ−ポリメラーゼをこの表面上に直接使用し、ｃＤＮＡを生成した。ポリメラーゼ用のプライマーはビオチン修飾を既に含有するものであった。ポリメラーゼによる増幅後、各々のスポットは、ビオチンで標識した一致するｃＤＮＡを含有するものであった。次いで、ストレプトアビジンでコーティングした二次表面を一次表面に強く接触させる。近接近により、ビオチンはストレプトアビジンと結合する。加熱により、ＤＮＡとｃＤＮＡとの間の結合強度は低くなり、両表面が互いに分割される。これにより、ネガコピーが二次表面上に残る。
【００３１】
この構成の利点は、ＤＮＡが、マイクロアレイ上で直接ｉｎ  ｓｉｔｕ増幅され、そのため前合成が必要とされないことである。またビオチンとストレプトアビジンとの間の特異的な結合により、移動の特異性が高い。欠点は、アレイの機械的損傷を引き起こす表面間の密接な等角接触であり、ネガコピーのみしか得ることができないことである。このプロセスは、ストレプトアビジン−ビオチン結合系を用いても繰り返すことができず、そのためポジコピーを維持すべき場合には、他の結合対を評価しなければならない。
【００３２】
アレイのコピーに関する従来技術に関する結論
ＤＮＡからＤＮＡへのコピーに関して、Y. Kim et al［１５］のみが複製プロセスに有益であるとして酵素ＤＮＡ増幅系を使用するという結論に至った。これは、ＤＮＡ配列に関係なくコピーを作製するために、「ＤＮＡインク」を本質的に送達させるが、S. Kim et al［１４］は、表面間の密接な等角接触を避け、機械的摩耗を防ぎ、更に液体内にＤＮＡを移動させるものであると認識していた。初期ＤＮＡのポジコピーを実現した人はいなかった。
【００３３】
ＤＮＡからタンパク質へのコピーに関して、ＤＮＡ−マイクロアレイのタンパク質−マイクロアレイへの変換を可能にする、２つの重要な生成系（ＰＩＳＡ及びＮＡＰＰＡ）が存在する。しかしながら、両系はＤＮＡ−マイクロアレイを使用するとともに消費する。Taussig et al［１］は、自身のＰＩＳＡシステムを、オリジナルの鋳型ＤＮＡ−マイクロアレイを使い尽くすことなく、複数のタンパク質−マイクロアレイコピーを作製することを可能にするＤＡＰＡレイアウトへと改良させている。しかし、この系は、アセンブリと反応の開始とが結び付いていることから、その開始条件に関しては本質的に規定されていない。このため、再現性が制限されており、異なる表面間の硬質の接触により、更に機械的摩耗によって、アレイの品質及び再現性が損なわれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００３４】
【特許文献１】国際公開第０２／１４８６０号
【特許文献２】米国特許第６，８００，４５３号
【特許文献３】国際公開第２００６／１３１６８７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３５】
本発明の目的は、当該技術分野で知られる課題を克服する、分子マイクロアレイを生成するためのデバイス及び方法を提供することであった。本発明の更なる目的は、同じ構成（デバイス、方法及びシステム）で、同一のワークフローによって、ＤＮＡ−マイクロアレイ、ＲＮＡ−マイクロアレイ及びタンパク質−マイクロアレイを作製することを可能にするための統一的なアプローチを提供することであった。従来技術を鑑みると、本発明の根底をなす技術的課題は、タンパク質、ＤＮＡ又はＲＮＡ等の分子の鋳型表面から捕捉表面への高速かつ制御可能で再現性のある伝達を可能にするための改善された又は代替的なデバイス及び方法の提供と見ることができる。更なる技術的課題は、好ましくは規定の条件下で、オリジナルの鋳型アレイに対する機械的応力を最小限に抑えながら、出力分子の生成及び該出力分子の移動をもたらす反応の開始からの鋳型アレイ表面と捕捉アレイ表面とのアセンブリの完全な切り離しを与えることであった。
【課題を解決するための手段】
【００３６】
この課題は、独立請求項の特徴によって解決される。本発明の好ましい実施の形態は、従属請求項によって与えられる。
【００３７】
本発明の様々な態様、例えば本明細書に記載される方法、アレイ、デバイス及びシステムは、全て引用される従来技術を鑑みて、新規性及び進歩性のある特徴で規定されるように、統一的な発明を表すものである。分子マイクロアレイを、２つの表面間に位置する膜層の助けなしに、タンパク質、ＤＮＡ又はＲＮＡ等の出力分子の産生、及び該出力分子の鋳型表面から捕捉マイクロアレイ表面への移動によって、作製することができることは、本件出願日には知られてはいなかった。このような膜層がなければ、本明細書に記載されるように、反応の開始をデバイスのアセンブリと切り離し、様々な利点を与えることが可能となる。鋳型表面と捕捉表面との間のマイクロ流体ギャップ又はインキュベーションチャンバを使用することは、本明細書に記載の正確な分子移動には不適であるとこれまでは考えられてきた。そのため、出力分子の移動を、膜支持体を必要とすることなく小量の流体中で確実に行うことができることは、驚くべきことであった。本発明の全ての態様は、この新たに発展させた原理に基づき、これを利用したものであり、そのため本発明の様々な態様、例えば方法、デバイス、アレイ及びシステムに対して統一的な概念が与えられる。
【００３８】
したがって、本発明の目的は、分子マイクロアレイを作製する方法であって、
ａ）その表面上に固定された１つ又は複数の鋳型分子を示す第１の支持表面（鋳型表面）と、対向する第２の支持表面（捕捉表面又はマイクロアレイ表面）とを準備することと、
ｂ）出力分子を前記鋳型分子から無細胞の酵素反応系及び／又は化学反応系を介して産生することと、
ｃ）前記第１の支持表面上での前記鋳型分子の配置と前記第２の支持表面上での対応する前記出力分子の堆積との間の相関関係によって、該第１の支持表面と該第２の支持表面との間の流体を介して、該出力分子を第２の支持表面へと移動させることと、
を含み、
ｄ）前記支持表面のアセンブリが工程ｂ）の開始とは切り離され、そのため工程ｂ）の開始が除去可能な制限手段によって妨げられる、
ことを特徴とする、方法を提供することである。
【００３９】
一実施の形態では、本発明の方法は、前記除去可能な制限手段が、
２つの表面の直接的な物理的接触を妨げる、前記第１の支持表面と前記第２の支持表面との間の空間的隔離、
前記無細胞の酵素反応系及び／又は化学反応系の活性を抑える又は遮断するｐＨ値及び／又は温度等の該無細胞の酵素反応系及び／又は化学反応系を遮断する化学環境又はエネルギー環境、及び／又は、
前記無細胞の酵素反応系を遮断する、電場若しくは磁場及び／又は電位を用いる内力場又は外力場、
であることを特徴とする。
【００４０】
これまで、マイクロアレイを作製するための類似のシステム及び方法は、鋳型表面と捕捉表面との間の膜層によって制限されてきた。鋳型層と捕捉層とのアセンブリが、無細胞の酵素反応系及び／又は化学反応系を誘導／開始する必要なく達成することができたことは驚くべきことであった。上に記載されるように除去可能な制限手段を該方法に加えることによって、例えば取り付け済みの鋳型表面と捕捉表面とを備える既製のキット又はデバイスを販売する際に重大な欠点となる、部品の損傷又はマイクロアレイ作製の即時の開始のリスクを伴わず、アセンブリを確実に起こすことが可能である。取り付けられた鋳型表面及び／又は捕捉表面を備えるこのような既製のキットは更に、本発明の主題である。
【００４１】
好ましい実施の形態では、本発明の方法は、前記支持表面間の空間的隔離が、対向する隔てられた第１の支持表面と第２の支持表面との間に形成されるマイクロ流体インキュベーションチャンバ（マイクロ流体ギャップ）であることを特徴とする。
【００４２】
好ましい実施の形態では、本発明の方法は、前記マイクロ流体インキュベーションチャンバが、前記第１の支持表面と前記第２の支持表面との間に位置する膜を含まないことを特徴とする。
【００４３】
分子マイクロアレイを、２つの表面間に位置する膜層の助けなしに、タンパク質、ＤＮＡ又はＲＮＡ等の出力分子の産生、及び該出力分子の鋳型表面から捕捉マイクロアレイ表面への移動によって、作製することができることは、本件出願日には知られてはいなかった。鋳型表面と捕捉表面との間のマイクロ流体ギャップ又はインキュベーションチャンバを使用することは、本明細書に記載の正確な分子移動には不適であるとこれまでは考えられてきた。そのため、出力分子の移動を、膜支持体を必要とすることなく小量の流体中で確実に行うことができることは、驚くべきことであった。
【００４４】
「マイクロ流体（microfluidic）」という用語は、ｍｍ未満の規模、数ｎｍ程度の大きさから数百ｎｍ、数μｍ又は数百μｍまでといった小さな寸法で分布された流体を指す。得られる液体の量は、通常μＬ、ｎＬ、ｐＬ又はｆＬ単位で扱われるような非常に僅かなものであり、分子アレイを作製する際に酵素試薬を非常に節約して使用することができる。
【００４５】
好ましい実施の形態では、本発明の方法は、前記制限手段の除去が、無細胞の酵素反応系及び／又は化学反応系の前記マイクロ流体インキュベーションチャンバへの導入によって行われ、それにより前記出力分子の産生が誘導され、該出力分子の前記第２の支持表面への移動が可能となることを特徴とする。
【００４６】
好ましい実施の形態では、本発明の方法は、前記第１の支持表面と前記第２の支持表面とが、請求項１の工程ｂ）による無細胞の酵素反応系及び／又は化学反応系を介した前記出力分子の産生の開始前においては、好ましくは
機械的張力又はスプリングシステムによって、互いに対向して固定位置に保持されていることを特徴とする。
【００４７】
先の実施の形態は、本発明と、支持表面の位置決めが方法の開始なしでは不可能であったＤＡＰＡ等の従来方法とのかなりの相違を明らかにしている。
【００４８】
一実施の形態では、本発明の方法は、複数のマイクロアレイの作製のために、単一の第１の支持表面を複数回使用して繰り返すことができることを特徴とする。
【００４９】
膜特徴部の除去及びマイクロ流体系との置き換えによって、単一鋳型表面、好ましくは表面上にスポットされたＤＮＡライブラリを含む単一鋳型表面を、分子アレイの作製のために複数回使用することが可能となる。これは細かな改良であるように見えるが、鋳型としてＤＮＡアレイを再生する必要性を回避することから、特に数百又は数千のアレイを伴うタンパク質−タンパク質結合アッセイ又は他の分子相互作用研究を行う必要がある大規模プロジェクトに関して、膨大なコスト及び労力が節約される。このようにして本方法は、膨大なコストの節約を可能にし、ハイスループットアプローチの再現性を高める。
【００５０】
一実施の形態では、本発明の方法は、前記除去可能な制限手段が、該方法を開始するために必要に応じて修飾及び／又は除去することができる、前記無細胞の酵素反応系及び／又は化学反応系を遮断する及び／又は前記出力分子と前記第２の支持表面との結合を遮断する、前記第１の支持表面及び／又は前記第２の支持表面上に存在する化学的遮断剤、又は該無細胞の酵素反応系に必須の化学化合物の枯渇又は制限に関するものであることを特徴とする。
【００５１】
一実施の形態では、本発明の方法は、前記無細胞の酵素反応系及び／又は化学反応系の遮断が、反応成分の必須の−ＯＨ基と結合した光切断性の化学置換基の使用に関するものであり、光による処理が該反応成分を放出させ、反応の開始、又はＡＴＰ、必須の塩又はビタミン若しくは金属イオン等の補酵素のような必須の反応成分の前記第１の表面又は前記第２の表面への結合及び／又は捕捉を可能にし、そのため反応の開始が充填又は外部インパルスの際にのみ起こることを特徴とする。
【００５２】
一実施の形態では、本発明の方法は、前記除去可能な制限手段が、
例えばＨ＋イオンの発生、及び続くｐＨ変化をもたらす二酸化チタンでコーティングされた表面の光処理により、ｐＨ感受性分子の機能的変化を誘導するｐＨ変化、
帯電分子、誘電分子若しくは磁性分子又は表面特性の変化を誘導する静的及び／又は動的な電場及び／又は磁場の変化、
ＤＮＡポリメラーゼ又はＲＮＡポリメラーゼの不活性状態をもたらす、温度の低下等といった、分子構造又は分子力学の変化を誘導する温度の変化であって、加温の際に反応の開始が起こる、温度の変化、
必須の反応成分と結合した光切断性の化学置換基の使用等といった、光誘導性の反応により遮断分子、光感受性分子又はケージド分子の変化を誘導する照射であって、光による処理が該反応成分を放出させ、反応の開始、及び／又はケージドビオチン若しくは他の分子の光誘導性の放出等といったケージド化合物の放出を可能にする、照射、又は、
それらの組合せ、
による、活性状態から不活性状態への、又は不活性状態から活性状態への分子の分子スイッチングに関するものであることを特徴とする。
【００５３】
一実施の形態では、本発明の方法は、前記鋳型分子が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、クローンＤＮＡフラグメント、プラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ若しくはｃＤＮＡライブラリ、ＰＣＲ産物、合成ＤＮＡ若しくはＤＮＡオリゴヌクレオチド、ｍＲＮＡ、又は合成ＲＮＡ等の核酸又は核酸様分子であることを特徴とする。
【００５４】
一実施の形態では、本発明の方法は、前記無細胞酵素反応系が、
ＤＮＡポリメラーゼ、又はＤＮＡ増幅酵素若しくは酵素系、
ＲＮＡポリメラーゼ、又はＲＮＡ増幅酵素若しくは酵素系、
逆転写酵素、又はＲＮＡからＤＮＡへの転写酵素若しくは酵素系、又は、
タンパク質合成系又はＤＮＡからＲＮＡへの転写及びＲＮＡからタンパク質への翻訳に必要とされる酵素ミックス等の無細胞発現ミックス、例えば大腸菌、細菌起源、ウサギの網状赤血球、昆虫起源、ヒト及びコムギ胚芽等の原核細胞系又は真核細胞系から選択される無細胞溶解物、
であることを特徴とする。
【００５５】
一実施の形態では、本発明の方法は、前記無細胞酵素反応系がＤＮＡポリメラーゼであり、前記出力分子がＤＮＡであり、ＤＮＡマイクロアレイが前記第２の支持表面上に生成されることを特徴とする。
【００５６】
一実施の形態では、本発明の方法は、前記無細胞酵素反応系がＲＮＡポリメラーゼであり、前記出力分子がＲＮＡであり、ＲＮＡマイクロアレイが前記第２の支持表面上に生成されることを特徴とする。
【００５７】
一実施の形態では、本発明の方法は、前記無細胞酵素反応系が逆転写酵素であり、前記出力分子がＤＮＡであり、ＤＮＡマイクロアレイが前記第２の支持表面上に生成されることを特徴とする。
【００５８】
一実施の形態では、本発明の方法は、前記無細胞酵素反応系が、ＤＮＡからＲＮＡへの転写及びＲＮＡからタンパク質への翻訳に必要とされる酵素ミックス等のタンパク質合成系又は無細胞発現ミックスであり、前記出力分子がタンパク質であり、タンパク質マイクロアレイが前記第２の支持表面上に生成されることを特徴とする。
【００５９】
本発明は更に、本明細書に記載の方法によって作製される分子アレイに関する。
【００６０】
本発明は更に、分子マイクロアレイを作製するための、好ましくは請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法を行うためのデバイスであって、
ａ）その表面上に固定された１つ又は複数の鋳型分子を示す第１の支持表面（鋳型表面）と、
ｂ）前記第１の支持表面とアセンブリした第２の支持表面（捕捉表面又はマイクロアレイ表面）と、
ｃ）無細胞の酵素反応系及び／又は化学反応系のために、物理的に隔てられた対向する第１の支持表面と第２の支持表面との間に形成されるマイクロ流体インキュベーションチャンバ（マイクロ流体ギャップ）であって、それにより支持表面のアセンブリが無細胞の酵素反応系及び／又は化学反応系の開始と切り離される、マイクロ流体インキュベーションチャンバ（マイクロ流体ギャップ）と、
ｄ）前記インキュベーションチャンバへの流体注入口及び／又は排出口と、
ｅ）固定位置に２つの対向する支持表面を保持するための手段と、
ｆ）２つの対向する支持表面間の空間として前記インキュベーションチャンバを維持するための手段と、
を備える、デバイスに関する。
【００６１】
本発明のデバイスは、従来技術を上回る新規性及び進歩性のある発展を与える上記の方法のあらゆる発明の特徴を示す。本デバイスは、鋳型表面と捕捉表面との間に形成されたマイクロ流体チャンバを介して、アセンブリと、無細胞の酵素反応系及び／又は化学反応系の開始とを切り離させる。表面は物理的隔離状態に保持され、そのため反応成分で充填されれば、該方法を開始することができる。このようなデバイスの構造は、マイクロ流体が出力分子の移動に十分な分解能をもたらすのに適切であるとは考えられていなかったことを考慮すると、従来技術において驚くべき進展である。例えば本発明のデバイスによるＤＮＡ鋳型からのタンパク質産生は、膜を用いたＤＡＰＡシステムと比較して改善とは言わないまでも同程度の移動をもたらすことは驚くべきことであった。本明細書で開示されるデバイスは、改善とは言わないまでも同程度のマイクロ流体チャンバにおけるタンパク質の産生及び移動の精度及び分解能で、移動に要する時間の大幅な低減ももたらす。
【００６２】
好ましい実施の形態では、本発明のデバイスは、前記マイクロ流体インキュベーションチャンバが、前記第１の支持表面と前記第２の支持表面との間に位置する膜を含まないことを特徴とする。
【００６３】
一実施の形態では、本発明のデバイスは、２つの対向する支持表面間の空間として前記インキュベーションチャンバを維持するための前記手段が、前記第１の支持表面と前記第２の支持表面との間のスペーサであることを特徴とする。
【００６４】
一実施の形態では、本発明のデバイスは、２つの対向する支持表面間の空間として前記インキュベーションチャンバを維持するための前記手段が、１つ又は複数の三次元構造化（３Ｄ）フローセル、好ましくは薄膜ポリマー材料又はポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）等の合成ポリマーのフローセルであることを特徴とする。「合成ポリマー」という用語は、フローセルの構築に適用することができるか、又はフローセルの構築に適した任意の合成ポリマー又は他の材料を指す。
【００６５】
一実施の形態では、本発明のデバイスは、前記流体注入口及び／又は排出口が、前記無細胞の酵素反応系及び／又は化学反応系を、前記インキュベーションチャンバ内へと及び／又は前記インキュベーションチャンバの外に圧送又はピペッティングするのに好適であることを特徴とする。
【００６６】
一実施の形態では、本発明のデバイスは、鋳型分子が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、クローンＤＮＡフラグメント、プラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ若しくはｃＤＮＡライブラリ、ＰＣＲ産物、合成ＤＮＡ若しくはＤＮＡオリゴヌクレオチド、ｍＲＮＡ、又は合成ＲＮＡ等の核酸又は核酸様分子から選択される分子のいずれかであることを特徴とする。
【００６７】
一実施の形態では、本発明のデバイスは、前記支持表面間の空間的隔離の高さが、１００μｍ未満、好ましくは８０μｍ未満、例えば６５μｍ、好ましくは６０μｍ未満、より好ましくは４０μｍ未満、例えば２０μｍ以下であることを特徴とする。
【００６８】
一実施の形態では、本発明のデバイスは、前記第１の支持表面及び前記第２の支持表面が、ガラス、プラスチック、ナイロン、又は他のタイプの天然若しくは合成のポリマー若しくは膜、例えばポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）であることを特徴とする。
【００６９】
一実施の形態では、本発明のデバイスは、前記第１の支持表面及び／又は前記第２の支持表面が、７６×２６×１ｍｍ３の寸法を有するような、顕微鏡検査に使用するのに好適である標準的なスライドガラス（複数の場合もある）であることを特徴とする。これらの寸法の僅かな偏差も、当業者にとっての常識として本発明の範囲内である。
【００７０】
一実施の形態では、本発明のデバイスは、好ましくは長さが６０ｍｍ〜１４０ｍｍ、８０ｍｍ〜１２０ｍｍ又はより好ましくは１０５ｍｍであり、幅が好ましくは３０ｍｍ〜９０ｍｍ、４０ｍｍ〜８０ｍｍ又はより好ましくは６０ｍｍの携帯サイズであることを特徴とする。
【００７１】
一実施の形態では、本発明のデバイスは、固定位置に２つの対向する支持表面を保持するための前記手段が、該２つの支持表面に対する上方ブラケット、下方ブラケット、又は側方ブラケットのいずれかとして位置している、取付けブラケット（ホルダ）に関するものであることを特徴とする。
【００７２】
一実施の形態では、本発明のデバイスは、前記支持表面又は前記取付けブラケット（ホルダ）を、機械的張力、磁力、スプリングシステム、表面への誘導レールによって適所に保持し、それにより固定位置に２つの支持表面を保持することを特徴とする。
【００７３】
一実施の形態では、本発明のデバイスは、前記第２の支持表面を、前記出力分子を該表面に共有結合又は非共有結合するように構成された固定化剤でプレコーティングしていることを特徴とする。
【００７４】
一実施の形態では、本発明のデバイスは、前記固定化剤が、発現されるタンパク質であるヘキサヒスチジン等のポリヒスチジン配列と共有結合又は非共有結合するように構成された、抗体等のタンパク質固定化剤であり、該タンパク質固定化剤がＮｉ−ＮＴＡ、ペプチド、ドメイン又はタンパク質等のキレート剤であり、該タンパク質固定化剤が前記タグ及び／又はアビジン等のビオチン結合分子に特異的な抗体であることを特徴とする。
【００７５】
一実施の形態では、本発明のデバイスは、前記第１の支持表面が、
核酸又は核酸様分子のマイクロアレイ、
核酸を示すシークエンシングチップ、
表面上の核酸の空間的に規定された分布、
ビースアレイ又は構造化表面上の核酸の空間的に規定された分布、又は、
核酸を含有する液体材料又は固体材料の空間的に規定された分布、
であることを特徴とする。
【００７６】
本発明は更に、分子マイクロアレイを作製するためのシステムであって、
ａ）その表面上に固定された１つ又は複数の鋳型分子を示す第１の支持表面（鋳型表面）と、
ｂ）前記第１の支持表面とアセンブリする第２の支持表面（捕捉表面又はマイクロアレイ表面）であって、マイクロ流体インキュベーションチャンバ（マイクロ流体ギャップ）が、物理的に隔てられた対向する第１の（鋳型）支持表面と第２の（捕捉又はマイクロアレイ）支持表面との間に形成される、第２の支持表面と、
ｃ）前記インキュベーションチャンバへの流体注入口及び／又は排出口と、
ｄ）固定位置で２つの対向する支持表面を保持するための手段と、
ｅ）前記２つの対向する支持表面間の空間として前記インキュベーションチャンバを維持するための手段と、
を備え、
ｆ）マイクロアレイが、前記出力分子の産生及び該出力分子の前記第２の支持表面への移動を誘導する、前記マイクロ流体インキュベーションチャンバへの無細胞の酵素反応系及び／又は化学反応系の導入後に、前記鋳型分子からの該出力分子の生成、及び該出力分子の前記第２の支持表面（捕捉表面又はマイクロアレイ表面）の表面への移動によって形成される、システムに関する。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】スペーサ及び支持表面に対する注入口及び／又は排出口の様々な位置を示すＤＡＰＡ、本発明の設計１及び設計２のレイアウトの側面図及び上面図である。
【図２】第１の支持表面と第２の支持表面との間にあるスペーサに加えて、上方取付けブラケット、下方取付けブラケット及び側方取付けブラケット（ホルダ）を備える携帯型デバイスの設計１の斜視図である。
【図３】スクリュー要素を含む取付けブラケットを備える携帯型デバイスの設計２の斜視図である。
【図４】充填が一方の表面を通して起こる、クロージャ／密閉要素を示すプロトタイプ１の側面図及び上面図である。
【図５】充填が表面間の側方で起こる、支持表面と、スペーサと、チャンバと、注入口及び／又は排出口との構造及びアセンブリを示すプロトタイプ２の側面図、上面図及び斜視図である。
【図６】プロトタイプ１に類似しているが、自動充填ステーション又は保持カートリッジと適合させた、ペルチェ素子と覗き窓とを備えるプロトタイプ３の側面図である。
【図７】ＰＤＭＳで構築された、（１及び４（第１の支持表面及びスペーサ）の組み合わせとして）集積微細構造を組み込んだ構造を示すプロトタイプ４の側面図及び斜視図であり、ＤＮＡ−アレイが示され、該デバイスは、合成（プラスチック）材料の強化担体と、該デバイスの密閉のための隆起した縁（接着剤により貼り付けることもできる密閉縁又は境界）とを備える。
【図８】挿入フレームに加えて、マイクロ流体構造スペーサを特徴とする、注入口要素及び／又は排出口要素の代替配置を示すプロトタイプ５の側面図及び斜視図である。
【図９】均質かつ急速な充填のための代替的な注入口及び／又は排出口の配置、ＰＤＭＳ支持体、多分岐流体チャネルを示す流体チャンバの更なる設計の上面図である。
【図１０】注入口／排出口の供給管を備える、マイクロ流体チャンバとともに２つの支持表面を固定するためのヒンジ構造を示す、本発明のデバイスによるフローセル構造の斜視図である。
【図１１】２つの支持表面を確実かつ安定した構造に固定するのに、またマイクロ流体チャンバを密閉するのに使用されるクランプ構造の斜視図及び上面図である。スクリュー（機械的張力）システムは、上方取付けブラケットと、下方取付けブラケットと、側方取付けブラケット（ホルダ）とのアセンブリについて、スクリュー要素に加えて示されており、供給管を備える集積フローセルも示されている。
【図１２】キャスティングステーション装置を示す図である。（ａ）ＴＭＭＦが微細構造化したウェハ、（ｂ）遠心分離キャスティングフレームに入れたウェハ、（ｃ）分離キャストである。
【図１３】第１の支持表面のための鋳型核酸の作製を示す図であり、（ａ）Qiagen製の線形鋳型キットを用いた発現可能なＤＮＡ；プロモータ配列と、ＲＢＳと、開始コドン／停止コドンと、コード配列と重複した配列を有するタグとを有するアダプタプライマーを示している。（ｂ）様々な発現可能な増幅ＤＮＡ配列によるゲル電気泳動の結果。レーン１、レーン９及びレーン１６はラダーを示し、レーン２、レーン３及びレーン４は陰性対照を示し、レーン５、レーン２、レーン８及びレーン１０〜レーン１４はマイクロアレイに対して、タンパク質の産生において鋳型ＤＮＡとして使用される様々な増幅コード配列を示す。
【図１４】タンパク質アレイ；それぞれ携帯型デバイス、元となるＤＡＰＡシステム（ｅ＋ｆ）において、ｇｅｓｉｍプロッタでスポットした（ａ〜ｄ）、ＰＤＭＳフローセル（ａ〜ｄ）及びエポキシスライドガラス（ｅ＋ｆ）上でｅｒＤＮＡ鋳型から構築されたタンパク質マイクロアレイを示す図である。無細胞発現を起こさせ、続いてタンパク質スライドをＣｙ３マーキング抗体及びＣｙ５マーキング抗体で標識した。インキュベーション時間は、文献において３７℃で記載されるようなものであった。
【発明を実施するための形態】
【００７８】
本明細書に記載されるデバイス及び方法は、現行の技術水準の欠点を一部解消し、好ましくはＤＮＡアレイ、ＲＮＡアレイ及びタンパク質アレイの作製に使用することが可能である。
【００７９】
本発明は、オリジナルのＤＮＡ−マイクロアレイからタンパク質アレイのコピーを生成するための「ＤＡＰＡシステム」（ＤＮＡアレイからタンパク質アレイへのシステム）の改善を表す［１］。本発明により、同じようにオリジナルのＤＮＡアレイを、二重ＤＮＡアレイへと（ＤＮＡポリメラーゼ又は任意の他のＤＮＡ複製酵素若しくはＤＮＡ増幅酵素を用いることによって）、ＲＮＡアレイへと（ＲＮＡポリメラーゼを用いることによって）、又はタンパク質アレイへと（ＤＡＰＡシステムと同様の酵素系を用いることによって）コピーすることが可能となる。本発明により、オリジナルのＲＮＡアレイを、ＤＮＡアレイへと（逆転写酵素を用いることによって）又はタンパク質アレイへと（ＤＡＰＡシステムと同様の酵素系を用いることによって）コピーすることが可能となる。
【００８０】
本発明は特に、デバイスの特有の構造及びレイアウト、並びに新規のプロセスの提示に関する。第１に、オリジナルのマイクロアレイを含有する第１の支持表面と、続いてコピーを「捕捉する」第２の表面とが、いわゆる薄いマイクロ流体ギャップによって隔てられている。このマイクロ流体ギャップは、該方法の開始前に空気を含んでいるのが好ましく、このことが反応の開始を妨げ、増幅ミックスで充填されると、該方法が開始する。そのため、このレイアウトは、現行の技術水準を上回る２つの利点を備える。第１に、表面間の物理的接触がなく、機械的応力又は摩耗が抑えられる。第２に、反応を開始させなくてもデバイスのアセンブリが可能である。そのため、アセンブリと反応の開始とが切り離され、より詳細なプロセス誘導が可能になる。例えば、並行反応を、従来技術の方法及びデバイスに従うものよりも容易に同時に開始させることができる。
【００８１】
様々なレイアウトに応じて、第１の支持表面（鋳型表面、ＤＮＡマイクロアレイ）及び／又は第２の支持表面（捕捉表面又はマイクロアレイ表面、タンパク質マイクロアレイのコピー）は、マイクロ流体ギャップ自体を生じさせる（完全に、又は部分的に、又はそれを補助する）ための微細構造を更に含有し得るか、又はスペーサが、マイクロ流体ギャップを生じさせるために一次表面と二次表面との間に設けられ得る。一方の表面又はスペーサ上のこのような構造によって、標準的な顕微鏡スライドの形態での少なくとも１つのマイクロアレイの適用が可能になる。
【００８２】
加えて、マイクロ流体構造は、ＤＮＡアレイ及び捕捉表面上での高度に規定された位置との接触を示し、拡散を規定の方法において制限するこのようなマイクロキャビディと定義することができる。このようなマイクロ流体誘導を用いて、出力分子の拡散を誘導することもでき、ＤＡＰＡシステムと比較してより高度に規定されたより小さくかつはっきりした構造を実現することができる。
【００８３】
ＤＡＰＡ等の当該技術分野で既知のものと比較した本発明の更なる利点は、該方法を行うのに必要とされる無細胞の酵素反応系及び／又は化学反応系の量（amount and/or volume）の低減である。膜を無細胞の酵素反応ミックスで浸漬する（ＤＡＰＡ等の場合）には、大量の上記ミックスが必要となり、そのためコストが集約される。本発明のデバイスの小容量の反応チャンバによって、要求される使い捨ての反応ミックスの量の大幅な低減が可能となり、そのため大幅にコストが低減する。
【００８４】
図面は、本発明の方法及びデバイスの様々な適用形態を示す。
【００８５】
好ましいレイアウトでは、アセンブリは、アレイ（第１の表面及び第２の表面）間のスペーサをクランプすることによって実現される。
【００８６】
マイクロ流体ギャップに充填される酵素系に応じて、タンパク質−マイクロアレイの代わりにＤＮＡ−マイクロアレイ又はＲＮＡ−マイクロアレイを生成することが可能である。核酸ポリメラーゼといった対応する酵素系によって、一次アレイ上に核酸由来のＤＮＡ又はＲＮＡを生成することが可能である。
【実施例】
【００８７】
ＤＮＡからタンパク質へのコピーに関する適用例
膜の代わりにマイクロ流体ギャップを使用するプロトタイプを構築している。このマイクロ流体ギャップに、毛細管力によって液体を充填することができる。６５μｍ厚のスペーサが、プロトタイプ１（設計１）及びプロトタイプ２（設計２）（図１〜図５）において、液体を中に充填させながら、第１の表面と第２の表面との間の規定の距離及び無細胞発現系の流体誘導を可能にする。この携帯型デバイスは、容易なかつ高速のアセンブリを可能にし、２つの顕微鏡スライドを互いに固定した。完全なアセンブリ後、無細胞発現ミックスを、開口部を通して表面に（プロトタイプ１）（設計１）又はスペーサの側方上の小さな隙間に（プロトタイプ２）（設計２）注入することができる。ＤＡＰＡシステム及び膜を表面上に設けることと比較して、この実現された携帯型デバイスは、特に膜内では容易に決定することはできなかった、反応の開始時間、並びに正確な濃度及び容量に関して規定された反応の開始を可能にする。
【００８８】
そのため、タンパク質複製の反応は、（ＤＡＰＡシステムと同様に）アセンブリ時に開始することはない。該反応は、無細胞ミックスが注入された場合にのみ開始する。無細胞ミックスの注入後、携帯型デバイスを２５分〜４５分間、インキュベータ内に入れる。デバイスの重量が小さく、そのため熱容量が低いために、所望の反応温度が極めて急速に達成される。インキュベーション時間後、マイクロアレイ表面を互いに分割し、アレイを洗浄する。ＤＡＰＡアレイと比較して同程度の、また多くの場合アレイの改善を示す、陽性の結果が達成された。
【００８９】
プロトタイプ３（図６）は、流体チャネリングデバイスへと組み込むことができるより複雑なカートリッジである。プロトタイプ３は、片側からのペルチェ素子による流体の熱制御を可能にする。これによって、任意の所望の温度又は温度プロファイルの調整が可能となる。さらに、アレイ（タンパク質アレイ）が生成される側は光学的に遊離しており、このことはタンパク質合成を直接モニタリングすることが可能であることを意味している。接続プロトタイプは、シリンジポンプを通して充填することができるが、空であるか又は洗浄されていてもよい。
【００９０】
プロトタイプ４（図７）は、ＰＤＭＳのようなプラスチックから作製され、ＤＮＡ−マイクロアレイがスポットされている構造である。この構造は、反応容積全体を取り囲む薄い（高さ数十μｍの）フレームに嵌め込まれている。プロトタイプ４は、液体を出し入れするための注入ライン及び排出ラインも備える。第２の表面（タンパク質−マイクロアレイ）は、顕微鏡スライドガラスである。スライドガラス上に単純に「クランプする」ことによって、ＰＤＭＳは、この表面とのマイクロ流体ギャップを形成する。注入口及び排出口を通して、構築物全体に液体を充填することができる。単純なクランプによって、反応時間の間、アレイが互いに固定される。
【００９１】
同一の類似のレイアウトを、第２の表面（タンパク質−マイクロアレイ）側に実現させることもできる。このレイアウトでは、ＰＤＭＳは、好ましくはニッケル−ＮＴＡであり得る「タンパク質捕獲システム」でコーティングされていなければならない。第１の表面（ＤＮＡマイクロアレイ）は平板顕微鏡スライドである。
【００９２】
プロトタイプ５（図８）は、第２の表面（タンパク質マイクロアレイ）及び第１の表面（ＤＮＡ−マイクロアレイ）が引出し様機構でスライドされるＰＤＭＳ構造である。ＰＤＭＳ及び両ガラスがともに、マイクロ流体ギャップを形成する。このプロトタイプは、注入口及び排出口がＰＤＭＳ（漏出のリスクを少なくする）及び両表面内で実現され、第１の表面（ＤＮＡ−マイクロアレイ）及び第２の表面（タンパク質−マイクロアレイ）が標準的な顕微鏡ガラスのように実現されるために有益である（任意の特別な構造化ＤＮＡ−マイクロアレイ（正：microarray）及び／又はタンパク質−マイクロアレイの表面、ひいては研究室での使用者のより高い許容性を必要としない）。
【００９３】
図９は、マイクロ流体ギャップをスペーサの異なるレイアウトによって実現することができる方法を示している。マイクロ流体ギャップを実現させるスペーサは、更なる利点をもたらす。
【００９４】
第１の表面（ＤＮＡ−マイクロアレイ）と第２の表面（タンパク質−マイクロアレイ）とがマイクロ流体ギャップによって隔てられている。第１の表面と第２の表面との間の物理的な「硬質の」接触がなく、このことが機械的応力、摩耗及び擦過傷を防ぐ。これによって、ＤＮＡ−マイクロアレイの寿命の長期化が確保され、タンパク質−マイクロアレイコピーの品質が向上する。
【００９５】
デバイスのアセンブリと反応の開始とが切り離される。これによって、任意の時点でのアセンブリ、また後の任意の他の時点での反応の開始が可能となり、このことは反応の正確な制御を意味する。取扱い及びプロセスの誘導（アセンブリと反応の開始とを切り離すこと）のこれらの利点は、より良好なより再現性の高い反応条件及び要求に応じた反応の開始を可能にする。（ＤＡＰＡシステムと比較して）より容易なアセンブリが、
第１の表面（ＤＮＡ−アレイ）の微細構造、
第２の表面（タンパク質−アレイ）の微細構造、又は、
両表面間に設けられる微細構造化スペーサ（好ましい適用レイアウト）、
によって実現することができる。
【００９６】
スペーサの場合、両表面は標準的な顕微鏡スライドのフォーマットで実現することができ、更なる密閉の必要はない。これは、表面が配置され次第、スペーサ自体を密閉するものとして実現することができるためである。この単純なアセンブリが高速の処理時間を可能にする。そのため、ＤＮＡ−マイクロアレイを採取してからタンパク質−マイクロアレイを取り出すまでの取扱いプロセス全体に要する時間が、本発明の携帯型デバイスを用いると、ＤＡＰＡシステムでのおよそ３時間からおよそ３０分へと低減した。これはサイクル時間の大幅な低減によるものである。
【００９７】
このデバイス及び方法の利点は以下である：完全な機能性の保持下での問題のある膜のマイクロ流体ギャップでの置き換え、タンパク質生成、それぞれのＲＮＡ生成、それぞれのＤＮＡ生成、及びこれらの分子の第２の表面への移動、特にタンパク質の第１のＤＮＡ−マイクロアレイから第２のタンパク質−マイクロアレイ上への移動、デバイスのアセンブリと反応の開始とを切り離すこと。
【００９８】
現行の技術水準の方法の以下の欠点が回避されている：濡れた薄い膜の取扱いが困難であること、表面上に膜を設けることによる湾曲及び気泡、膜とＤＮＡ−マイクロアレイとの間の等角接触時の直接的な反応の開始、ＤＮＡ−マイクロアレイと膜との間の機械的接触によるＤＮＡ−マイクロアレイの物理的摩耗。
【００９９】
ＤＮＡからＤＮＡへのコピーの適用例
ＤＮＡからタンパク質へのコピーに使用する場合に対応する構成をＤＮＡからＤＮＡへのコピーへと実現することができる。ここでは一次表面は、例えば既知の開始配列及び終了（end）配列を含むＤＮＡを含有する。二次表面は、一次表面由来のＤＮＡの開始配列と同一のプライマーで（又は特定の構造で）均質にコーティングされている。
【０１００】
ＤＮＡポリメラーゼのようなＤＮＡ増幅ミックスにＤＮＡの既知の末端に適合するプライマーを充填することによって、［１５］等のように、各ＤＮＡ鎖がｃＤＮＡヘと増幅する。このシステムを加熱することによって、このｃＤＮＡが放出され、一次アレイのスポットから離れるように拡散する。このシステムを冷却することによって、放出されたｃＤＮＡが再び初期スポットに貼り付くか、又は二次表面のプライマーと相互作用する。そこで、ポリメラーゼが、ｃＤＮＡを二次表面のプライマー上へと増幅させ、共有結合したｃｃＤＮＡを生成し、またそのようにして初期ＤＮＡの同一の複製物を生成する。したがって、一次ＤＮＡ−マイクロアレイのＤＮＡ−マイクロアレイのポジコピーが二次表面上に作製される。
【０１０１】
さらに、ＤＮＡからタンパク質へのコピーと同じように、マイクロ流体ギャップを、第１の表面及び／又は第２の表面及び／又は両表面の間に位置するスペーサにおいて実現することができる。ＤＮＡからタンパク質へのコピーの利点は全てここでも適用される。さらにこのレイアウトでは、ＤＮＡ−マイクロアレイからポジコピーを実現することができる。
【０１０２】
第２の表面上の又は酵素ミックス中の異なるプライマーの選択によって、ネガコピーを生成することも可能である。これは、二次表面上の表面プライマーを終了配列に交換することにより実現することができ、開始プライマーを大量に添加しながら、小量の終了プライマーを溶液に添加するだけでよい。
【０１０３】
他のコピーの適用例
使用酵素ミックスに応じて、様々なコピーを実現することができる：
任意のＤＮＡ増幅ミックス、例えばリコンビナーゼ−ポリメラーゼ−増幅（ＲＰＡ）、等温ＤＮＡ増幅系又はＮＡＳＢＡによるＤＮＡからＤＮＡへのコピー；逆転写酵素、その後の二次表面とのライゲーション工程によるＲＮＡからＤＮＡへのコピー；例えばＲＮＡポリメラーゼのような任意のＲＮＡ増幅によるＤＮＡからＲＮＡへのコピー。
【０１０４】
ＤＮＡからタンパク質へのコピーの詳細な実験の説明
本明細書に与えられる実験例は、ＤＮＡマイクロアレイからの分子マイクロアレイの作製、好ましくはタンパク質マイクロアレイの作製のための単純な携帯型デバイスの実現に関するものであった。７６ｍｍ×２６ｍｍ×１ｍｍ（それぞれ、７５ｍｍ×２５ｍｍ×１ｍｍ、又は他の類似の寸法）の標準的なスライドガラスを、ＤＮＡマイクロアレイ及びタンパク質マイクロアレイのための担体スライドとして使用する。一実施形態では、マイクロアレイを作製するためのデバイスは、およそ４０μｍ厚の疎水性スペーサを備える。このスペーサは、更にマイクロ流体注入口（input）及び排出口（output）を備え、非常に低い高さ及び容量のインキュベーションチャンバとして機能する。精密に調整した機械的張力系によって、スライドを確実に位置調整しながら固定することに加えて、マイクロアレイに用いられるスライドの迅速な交換も可能になる。インキュベーションチャンバは、ピペット又は一般的に使用されるポンピングデバイスによって自動充填することができ、無細胞タンパク質発現系の酵素混合物がインキュベーションチャンバに充填される。この方法によって、タンパク質マイクロアレイを、ＤＮＡマイクロアレイから複雑でない迅速かつコスト効率の高い方法で作製することができる。このようなタンパク質マイクロアレイは、様々な種類のタンパク質分析、例えばタンパク質−タンパク質相互作用又はタンパク質−分子相互作用に特に使用される。
【０１０５】
タンパク質マイクロアレイ技術は、ＤＮＡマイクロアレイで確立された技術に幾分遅れを取っている。タンパク質マイクロアレイ作製における現段階の課題の一つは、組換え発現、続く組換えタンパク質の精製、及びスライド上へのスポットによる完全長タンパク質生成である。代替案として、ペプチドの様々なｉｎ  ｓｉｔｕ化学合成方法が利用可能であるが、このような方法は主として、短ペプチドで利用可能なものであり、完全長タンパク質マイクロアレイの作製に関する現実的な選択肢ではない。
【０１０６】
本実験例は、ロバストなマイクロ流体携帯型デバイスによるＤＮＡマイクロアレイからの完全長タンパク質マイクロアレイの合成を示している。一実施形態では、単純なプロトタイプを作製しており、これは図１ａ）及び図１ｂ）に示される。これらの図で示されているプロトタイプは、当該技術分野で既知のＤＡＰＡシステムを上回る改善を示す。タンパク質の側方拡散を最小限に抑えるために、チャンバの密封及び極めて低容量のインキュベーションチャンバを設けることに加えて、インキュベーションチャンバの無気泡充填が更に展開され、更なる実施例において示されている。
【０１０７】
ＤＮＡ鋳型の生成
発現可能なＤＮＡ鋳型（ｅｒＤＮＡ）を任意の所与のヌクレオチド配列から生成するために、Qiagen製の線形鋳型キット（ＬＴＫ）を適用している。第１のＰＣＲ反応（ポリメラーゼ連鎖反応）において、コードＤＮＡ鋳型に対するおよそ２０ヌクレオチドの重複領域を示す、自ら構築したプライマーを、アダプタプライマー及び検出配列（例えばタグ）とともに、増幅によってオリジナルのＤＮＡ鎖に付加する。第２のＰＣＲ反応は、鋳型として第１のＰＣＲ反応の産物を使用して、アダプタプライマー（終止コドンとともに、Ｈｉｓタグ又はＳｔｒｅｐタグ等のタグ、及びＲＮＡポリメラーゼの結合を可能にする働きがある配列（Ｔ７プロモータ）及びリボソーム開始側（ribosomestart side）（ＲＢＳ）も添加するのが好ましい）を用いてＤＮＡ産物を伸長させる。このキットを用いて、ＤＮＡ鋳型を発現可能に増幅させ、その結果をゲル電気泳動実験によって示している（図１３）。ＰＣＲ産物の配列分析から所望の結果が確認される。これらの実験は、Qiagen製のＬＴＫキットによって、ＤＮＡ鋳型がタグ配列とともに伸長し、発現可能な増幅カセットとして産生されることを示している。
【０１０８】
携帯型デバイスの最適化
本発明の実施形態の一つは、接着剤によって接着し、続いて別のスライド又はカバーガラスで覆っている、およそ１００μｍ厚の自己接着性レーザー切断ポリエステルホイルの使用に基づくものである、非常に低い容量及び低い高さのマイクロ流体フローセルに関する。本発明のこの特定の形態は十分に機能するものではあるが、幾つかの他の細かな欠点を示す。例えば自己接着性ホイルは、ＤＮＡ鋳型とのインキュベーションに準最適なものであり、このホイルは或る特定の厚さでしか利用することができず、またこのホイルは一定の厚さを示すことがなく、フローセルの三次元構造では無気泡充填が不可能であり、注入及び排出には、ガラスでは困難であり得るスライドを通るアクセス、又は密閉することが困難であり得るこの構造の側方を通るアクセスを設ける必要がある。
【０１０９】
これらの細かな欠点を克服するために、携帯型デバイスの２つの更なる実施形態を作製している。２つの更なるデバイスの結果は、このデバイスの充填の改善、絶対的に正確な密閉及び単純な有用性を示している。変形形態の一つは、担体構造としてガラス製の標準的なスライドガラス（７６×２５×１ｍｍ３）のみを使用するものであり、もう一つの実施形態は、ＤＮＡアレイのインキュベーションチャンバが固定されている、ＰＤＭＳから構築された三次元構造化フローセルに基づくものである。
【０１１０】
構造化ＰＤＭＳフローセルを備える携帯型デバイス
この実施形態は、ＰＤＩＴＣを用いてＤＮＡ鋳型分子の固定のために機能化されている、微細構造化ＰＤＭＳスライドからなる（図７）。ＰＤＭＳスライドは、Ｎｉ−ＮＴＡでコーティングされたスライドで覆われている。インキュベーションチャンバの充填及び／又は空化（emptying）は、ＰＤＭＳスライドの開放によって行う。ＰＤＭＳスライドのマスターを圧延し、正確な形状を成形する。マニュアルフローステーションによって、ＰＤＭＳスライドの充填及び空化が可能である（図１２）。
【０１１１】
無気泡充填及び密閉能を改善するために、先に記載された構造を、フォトリソグラフィ法（図１２ａ）、例えばスピンコーティングによって、ドライフィルムフォトレジスト（ＴＭＭＦ、３０／４５μｍ厚）又はリキッドリキュールＳＵ−８を用いて作製した。構造化ウェハを、ＰＤＭＳスライドを流し込むための遠心分離鋳造用金型に入れた（図１２ｃ）。
【０１１２】
２つの標準的なスライドガラスのための携帯型デバイス
この実施形態によるデバイスは、両マイクロアレイに対して２つの標準的なスライドガラスとともに使用することを意図するものである。インキュベーションチャンバの充填は、疎水性でかつ弾性の密閉表面とともにスペーサで形成されるマイクロ流体チャネルを通って行なわれる。スペーサは、２５μｍ厚（通常、５００ｎｍ〜１５μｍ）のテフロン（登録商標）コーティングステンレス鋼（正：steel）板でできている（代替法は、３０μｍ〜８０μｍ厚のテフロンホイルの直接使用である）。このスライドは、確実な密閉を得るために、疎水性スペーサに対して強い力で押し込む必要がある。スライドを高速で置換するためのデバイスによって、様々なスライドの迅速でかつ容易な交換が可能になる。
【０１１３】
タンパク質アレイの無細胞タンパク質発現
２つの無細胞真核発現系を評価するために、ＥａｓｙＸＰｒｅｓｓ（Qiagen）及びＲＴＳ１００（5Prime）を、ＰＤＭＳフローセルの携帯型デバイス（高さおよそ６０μｍ、２ｍｍ×８ｍｍ（図６ａ及び図６ｂ）／２ｍｍ×５ｍｍ（図６ｃ及び図６ｄ）のインキュベーションチャンバ、及び膜を含む元となるＤＡＰＡシステム（図６ｅ及び図６ｆ））とともに使用した。２つのｅｒＤＮＡ鋳型を、ＰＤＭＳフローセルにおいてＧｅｓｉｍプロッタを用いて、エポキシコーティングスライドガラス上にスポットし、続いてそれぞれ９０／１８０分間（ＲＴＳ１００）、４０／９０分間（ＥａｓｙＸｐｒｅｓｓ）発現した。その後、スライドを抗Ｃｙ３標識抗体／Ｃｙ５標識抗体で標識した。
【０１１４】
実験例の概要
Qiagen製のＬＴＫを用いたｅｒＤＮＡの生成を評価し、任意の所与のＤＮＡ鋳型を既知のプライマー配列によって増幅することができることを実証している。さらに、実験を行った２つの無細胞発現系ＥａｓｙＸｐｒｅｓｓ及びＲＴＳ１００は陽性結果を示した。開発した携帯型デバイス及びその作製プロセスを検査し、有益な結果が得られることを示しており、この結果によって幾つかの場合での１５分〜２０分というタンパク質アレイの作製時間が実証されている。チャンバの高さを更に低減させることで、作製時間の削減が期待される。
【０１１５】
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【符号の説明】
【０１１６】
１  第１の支持表面（１つ又は複数の鋳型分子、例えば核酸を保有する鋳型表面）
２  第１の支持表面と第２の支持表面との間の空間的隔離（無細胞の酵素反応系及び／又は化学反応系を含有するのが好ましい）
２ａ  ＤＰＡシステムの膜
２ｂ  （マイクロ）流体インキュベーションチャンバ（マイクロ流体ギャップ）
３  その上に生成された分子が並べられる第２の支持表面（捕捉表面又はマイクロアレイ表面）
４  １と３との間に設けられる又はその中に集積される、２つの表面の直接の物理的接触を妨げる第１の支持表面と第２の支持表面との間にあるスペーサ
５  空気を充填する、空にする、及び／又は取り除くための流体注入口及び／又は排出口
６  流体のためのマイクロチャネルを備えるマイクロ流体構造
７  上方取付けブラケット（ホルダ）
８  下方取付けブラケット（ホルダ）
９  側方取付けブラケット（ホルダ）
１０  密閉及び／又は固定のためのクロージャ
１１  スクリュー要素
１２  ペルチェ素子
１３  １と４との組み合わせである集積微細構造
１４  供給管
１５  ＰＤＭＳ
１６  検出窓
１７  構造を固定する及び／又は封じ込めるためのクランプ取付けブラケット（クランプホルダ）
１８  接続ホースを含む開口部（穿孔穴）
１９  ＤＮＡ−アレイ
２０  合成（プラスチック）材料の強化担体
２１  密閉のための隆起した縁（密閉縁又は境界）
２２  表面を密閉するための挿入フレーム
２３  弾性ＰＤＭＳの崩壊の危険性を低減するためのＰＤＭＳの支持体
２４  均質かつ急速な充填のための多分岐流体チャネル
２５  ヒンジ
２６  取付けブラケット
２７  密閉のための張力を誘導する手段
【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図２】
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【図３】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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