(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトを含む動物におけるポックスウイルス感染に対する防御免疫応答をワクチン接種後４日以内に誘導するために感染性ポックスウイルスへの曝露の４日前〜２日前に投与するためのワクチンの製造に、改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）を使用する方法であって、前記投与が第一の投与である使用方法。
【請求項２】
前記投与が単回投与である、請求項１記載の使用方法。
【請求項３】
ＭＶＡがＭＶＡ−ＢＮである、請求項１または２に記載の使用方法。
【請求項４】
ＭＶＡがＭＶＡ株のＭＶＡ５７５およびＭＶＡ５７２から選択される、請求項１または２に記載の使用方法。
【請求項５】
ウイルスがクローン精製されたウイルスである、請求項１〜４のいずれか１つに記載の使用方法。
【請求項６】
ウイルスが血清を含まない培養工程において得られている、請求項１〜５のいずれか１つに記載の使用方法。
【請求項７】
ＭＶＡが１０５〜５×１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌの用量で投与される、請求項３〜６のいずれか１つに記載の使用方法。
【請求項８】
ＭＶＡが静脈内、筋肉内または皮下に投与される、請求項１〜７のいずれか１つに記載の使用方法。
【請求項９】
免疫応答が天然痘感染に対するものである、請求項１〜８のいずれか１つに記載の使用方法。
【請求項１０】
ＭＶＡが組み換えＭＶＡである、請求項１〜９のいずれか１つに記載の使用方法。
【請求項１１】
組み換えＭＶＡが少なくとも１種の異種核酸配列を含む、請求項１０記載の使用方法。
【請求項１２】
異種核酸配列が少なくとも１種の抗原、抗原エピトープおよび／または治療用化合物をコードする配列である、請求項１１記載の使用方法。
【請求項１３】
抗原エピトープおよび／または抗原が感染性因子の抗原エピトープおよび／または抗原である、請求項１２記載の使用方法。
【請求項１４】
感染性因子がウイルス、真菌、病原性の単細胞真核および／または原核生物、寄生生物から選択される、請求項１３記載の使用方法。
【請求項１５】
ウイルスが、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、パラミクソウイルス、肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルスの科から、または出血熱を引き起こすウイルスから選択される、請求項１４記載の使用方法。
【請求項１６】
免疫防御が、抗原エピトープおよび／または抗原が由来する感染性因子に対するものでもある、請求項１３〜１５のいずれか１つに記載の使用方法。
【請求項１７】
ヒトを含む動物におけるポックスウイルス感染に対する防御免疫応答をワクチン接種後４日以内に誘導するために感染性ポックスウイルスへの曝露の４日前〜２日前に投与するための、改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）を含むワクチンであって、前記投与が第一の投与であるワクチン。
【請求項１８】
前記投与が単回投与である、請求項１７記載のワクチン。
【請求項１９】
ＭＶＡがＭＶＡ−ＢＮである、請求項１７または１８に記載のワクチン。
【請求項２０】
ＭＶＡがＭＶＡ株のＭＶＡ５７５およびＭＶＡ５７２から選択される、請求項１７または１８に記載のワクチン。
【請求項２１】
ウイルスがクローン精製されたウイルスである、請求項１７〜２０のいずれか１つに記載のワクチン。
【請求項２２】
ウイルスが血清を含まない培養工程において得られている、請求項１７〜２１のいずれか１つに記載のワクチン。
【請求項２３】
ＭＶＡが１０５〜５×１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌの用量で投与される、請求項１７〜２２のいずれか１つに記載のワクチン。
【請求項２４】
ＭＶＡが静脈内、筋肉内または皮下に投与される、請求項１７〜２３のいずれか１つに記載のワクチン。
【請求項２５】
免疫応答が天然痘感染に対するものである、請求項１７〜２４のいずれか１つに記載のワクチン。
【請求項２６】
ＭＶＡが組み換えＭＶＡである、請求項１７〜２５のいずれか１つに記載のワクチン。
【請求項２７】
組み換えＭＶＡが少なくとも１種の異種核酸配列を含む、請求項２６記載のワクチン。
【請求項２８】
異種核酸配列が少なくとも１種の抗原、抗原エピトープおよび／または治療用化合物をコードする配列である、請求項２７記載のワクチン。
【請求項２９】
抗原エピトープおよび／または抗原が感染性因子の抗原エピトープおよび／または抗原である、請求項２８記載のワクチン。
【請求項３０】
感染性因子がウイルス、真菌、病原性の単細胞真核および／または原核生物、寄生生物から選択される、請求項２９記載のワクチン。
【請求項３１】
ウイルスが、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、パラミクソウイルス、肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルスの科から、または出血熱を引き起こすウイルスから選択される、請求項３０記載のワクチン。
【請求項３２】
免疫防御が、抗原エピトープおよび／または抗原が由来する感染性因子に対するものでもある、請求項２９〜３１のいずれか１つに記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトを含む動物において複製能力のないポックスウイルスを前記のヒトを含む動物に接種することによる、ポックスウイルスおよびポックスウイルス感染、例えば天然痘に対する防御免疫応答の急速な誘導に関する。前記のポックスウイルスの例としては、改変ワクシニアウイルスアンカラ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  Ａｎｋａｒａ：ＭＶＡ）が挙げられる。本発明はさらに、ウイルス、例えば、異種抗原および／または抗原エピトープを発現する組み換えＭＶＡを接種されるヒトを含む動物において複製能力のない組み換えポックスウイルスを、前記の異種抗原および／または抗原エピトープに対する、例えば、感染性因子の一部である抗原および／または抗原エピトープに対する防御免疫応答の急速な誘導に使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの疾患、例えば感染症用に、ワクチンが開発されており、または開発の途中にある。これらのワクチンは特定の期間内に防御免疫応答を誘導する。ほとんどのワクチンは、集団においてはむしろまれである疾患に対する予防接種に使用されているため、通常は、免疫応答の発生が特に急速である必要はない。しかしながら、免疫応答、例えば、防御免疫応答が出来るだけ早くに発生すべき状況が存在する。これは、天然痘またはその他のヒトのポックスウイルス疾患の大発生における場合が考えられる。
【０００３】
天然痘の原因因子は、オルトポックスウイルス属の一員である天然痘ウイルス（ｖａｒｉｏｌａ  ｖｉｒｕｓ）である。同様にポックスウイルス科におけるオルトポックス属の一員であるワクシニアウイルスは、天然痘に対して免疫状態にするための生ワクチンとして使用されてきた。世界的規模のワクシニアウイルスを用いた予防接種の成功により、天然痘ウイルスの根絶が達成された（天然痘の世界的根絶。非特許文献１）。その間に、ほとんどの感染性天然痘ウイルスの系統は撲滅された。しかし、天然痘または天然痘様疾患を誘発するポックスウイルスが重大な健康問題となる可能性を排除することはできない。さらに、動物のポックスウイルス疾患がヒトに広がる危険性も存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｆｉｎａｌ  ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｌｏｂａｌ  ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｅｒｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｍａｌｌｐｏｘ  ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ；  Ｈｉｓｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｎｏ．  ４，  Ｇｅｎｅｖａ：  Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，  １９８０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
さらに、急速な免疫応答の誘導が望ましい他の状況もまたあり得ることであり、例えば、急に世界のある地域へ旅行する必要がある場合には、このような地域の風土病である疾患に対する急速な免疫応答の誘導が望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ヒトを含む動物に、このヒトを含む動物において複製能力のないポックスウイルスを投与する段階を含む、ヒトを含む動物において防御免疫応答を急速に誘導するための方法に関する。本発明はさらに、前記の複製能力のないポックスウイルスを防御免疫応答の急速な誘導のためのワクチンの製造に使用する方法、および防御免疫応答の急速な誘導のためのワクチンとしてのポックスウイルスに関し、前記のポックスウイルスは前記のヒトを含む動物において複製能力がない。
【０００７】
「複製能力のないポックスウイルス」という語句および「感染性の子孫ウイルスを複製することができない」ウイルスという同義の語句は、ワクチン接種される動物の細胞においては全く複製することができないポックスウイルス、および、ポックスウイルスを投与されるヒトを含む動物の免疫系により制御される複製活性がわずかに残っているウイルスを表す。
【０００８】
本発明の１つの実施態様において、複製能力のないポックスウイルスは、該ウイルスをワクチンとして使用するヒトを含む動物の細胞に感染できないウイルスである。「細胞に感染できない」ウイルスは、ウイルスまたは少なくともウイルスゲノムが宿主細胞に組み込まれる程度には、宿主細胞と相互作用することができるウイルスである。本発明に使用されるウイルスは、ワクチン接種されるヒトを含む動物の細胞に感染することができるが、ワクチン接種される動物の細胞中で感染性の子孫ウイルスを複製することができないか、またはポックスウイルスを投与されるヒトを含む動物の免疫系によって制御される複製活性だけがわずかに残る。
【０００９】
第一の動物種の細胞に感染はできるが、この細胞中で感染性の子孫ウイルスを複製することができないウイルスは、第二の動物種で異なる挙動を示し得ると考えられる。例えばヒトにとって、ＭＶＡ−ＢＮおよびその誘導体（下記を参照）は、ヒトの細胞に感染はできるが、ヒト細胞中で感染性の子孫ウイルスを複製することができないウイルスである。同じウイルスがニワトリにおいては非常に効率的に複製され、すなわち、ニワトリにおいてＭＶＡ−ＢＮは細胞に感染することができ、感染性の子孫ウイルスを複製することができるウイルスである。特定の動物種に対してどのウイルスが選択されるべきかは当業者に公知である。ウイルスがマウス中で複製できるか否かを判定できる試験が国際公開第０２／４２４８０号パンフレットに記載されており、この試験はＡＧＲ１２９マウス株（下記を参照）、ならびに成熟ＢおよびＴ細胞を産生することができず、それ自体が重篤な免疫低下状態にあって複製ウイルスの影響を非常に受けやすいその他の任意のマウス株を使用している。このマウスモデルにおいて得られた結果はヒトに対しても指標となるものである。
【００１０】
本発明の１つの実施態様において、本発明のウイルスは少なくとも１種の動物種の少なくとも１種のタイプの細胞において複製することができる。従って、ワクチン接種および／または治療される動物への投与前にウイルスを増幅させることが可能である。例としては、ＣＥＦ（ニワトリ胚線維芽細胞）中で増幅させることができるが、ヒト中で感染性の子孫ウイルスを複製することができないウイルスであるＭＶＡ−ＢＮが挙げられる。
【００１１】
本発明の１つの実施態様においては、改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）がヒトおよび数種の動物種、例えばマウスおよびヒト以外の霊長類において使用される。ＭＶＡは極めて安全であることが知られている。ＭＶＡは、ワクシニアウイルスのアンカラ株（ＣＶＡ）をニワトリ胚線維芽細胞で長期間にわたり連続継代することによって作出された（概要については「Ｍａｙｒ，  Ａ．，  Ｈｏｃｈｓｔｅｉｎ−Ｍｉｎｔｚｅｌ，  Ｖ．  ａｎｄ  Ｓｔｉｃｋｌ，  Ｈ．  ［１９７５］  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ３，  ６−１４；  Ｓｗｉｓｓ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．  ５６８，  ３９２」を参照のこと）。ブダペスト条約の要件に従って寄託されており、本発明の実施に有用なＭＶＡウイルスの例としては、１９９４年１月２７日に欧州動物細胞カルチャーコレクション（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）：ソールズベリー、ＵＫ）に寄託番号ＥＣＡＣＣ  ９４０１２７０７で寄託されたＭＶＡ５７２、２０００年１２月７日にＥＣＡＣＣ  ０１２０７０７で寄託されたＭＶＡ５７５、および２０００年８月３０日にＥＣＡＣＣ番号０００８３００８で寄託されたＭＶＡ−ＢＮが挙げられる。
【００１２】
本発明の１つの実施態様において、ＭＶＡ株はＭＶＡ−ＢＮおよびその誘導体である。ＭＶＡ−ＢＮおよびその誘導体の定義はＰＣＴ／ＥＰ０１／１３６２８に記載されている。
【００１３】
簡単に述べると、ＰＣＴ／ＥＰ０１／１３６２８に開示されているＭＶＡ−ＢＮおよびその誘導体は、以下の特性：
（ｉ）ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）および細胞株ＢＨＫにおいて増殖的複製ができるが、ヒト細胞株では増殖的複製ができない。本発明の１つの実施態様において、ヒト細胞株は、ヒト骨肉種細胞株１４３Ｂ、ヒトケラチノサイト細胞株ＨａＣａｔ、またはヒト子宮頸部癌細胞株ＨｅＬａである。
【００１４】
（ｉｉ）重篤な免疫低下状態にあるマウスの生体内で複製することができない
（ｉｉｉ）致死攻撃感染モデルにおいて、公知の株ＭＶＡ５７５（ＥＣＡＣＣ  Ｖ００１２０７０７）と比較して高い免疫原性を誘導する、および／または
（ｉｖ）ワクシニアウイルスプライム／ワクシニアウイルスブースト法において、ＤＮＡ−プライム／ワクシニアウイルスブースト法と比較して、少なくとも実質的に同一の免疫性レベルを誘導する、
のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または全てを有することを特徴とする。
【００１５】
ＭＶＡ株が上記の特徴（ｉ）〜（ｉｖ）のうちの１つまたはそれ以上を有するかどうかの判定に使用される試験に関する詳細な説明は、国際公開第０２／４２４８０号パンフレット（ＰＣＴ／ＥＰ０１／１３６２８）に示されている。この文献にはまた、所望の特性を有するウイルスをどのように得ることができるかについても開示されている。ＭＶＡ株が上記の特徴のうちの１つまたはそれ以上を有し、従って、本発明の上記実施態様におけるウイルスであるかどうかを当業者が試験する方法について、下記において簡潔に概説する。下記の概説は、国際公開第０２／４２４８０号パンフレットの本願に関する関連事項を下記の記載に限定するものではない。むしろ、国際公開第０２／４２４８０号パンフレットは、参照することにより全体として本明細書中に組み込まれる。
【００１６】
ヒト細胞株、例えば細胞株ＨａＣＡＴ（Ｂｏｕｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．  １９８８，  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １０６（３）：  ７６１−７１）またはＨｅＬａにおける「増殖的複製ができない」という語句は、本願においては国際公開第０２／４２４８０号パンフレットに定義されるとおりに使用される。従って、細胞株において「増殖的複製ができない」ウイルスは、前記の細胞株において１未満の増幅比を示すウイルスである。ウイルスの「増幅比」とは、感染細胞から産生されるウイルス（アウトプット）の、最初の段階で細胞への感染に元々使用した量（インプット）に対する比率である。アウトプットとインプット間の比率が「１」とは、感染細胞から産生されるウイルスの量が細胞への感染に最初に使用された量と同一である増幅状態と定義される。本発明の１つの実施態様において、ヒト細胞株における「増殖的複製ができない」ウイルスは、上記のヒト細胞株ＨｅＬａ、ＨａＣａｔおよび１４３Ｂのいずれにおいても、１．０（平均値）以下または０．８（平均値）以下の増幅比を有することができる。
【００１７】
本願において使用される場合に「平均」という語句は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０回またはそれ以上の回数の実験から得られる平均値を表す。生物系の固有の可変性により、１回の実験が平均値から逸脱し得ることは、当業者において理解されているところである。
【００１８】
「生体内で複製できない」という語句は、国際公開第０２／４２４８０号パンフレットに定義されるとおりに本願において使用される。従って、この語句は、国際公開第０２／４２４８０号パンフレットにおいて説明されるように、マウスモデル中で複製しないウイルスを表す。国際公開第０２／４２４８０号パンフレットにおいて使用されるマウスは、成熟Ｂ細胞およびＴ細胞を産生できない（ＡＧＲ１２９マウス）。ＭＶＡ−ＢＮおよびその誘導体は、腹腔内投与により１０７ｐｆｕのウイルスをマウスに感染させた後、少なくとも４５日（平均値）の平均期間内、例えば、少なくとも６０日（平均値）以内、または少なくとも９０日（平均値）以内はＡＧＲ１２９マウスを殺害しない。本発明の１つの実施態様において、「生体内で複製できない」ウイルスはさらに、腹腔内投与により１０７ｐｆｕのウイルスをマウスに感染させた後、４５日（平均値）、あるいは６０日（平均値）、あるいは９０日（平均値）は、ＡＧＲ１２９の器官または組織からウイルスを回収できないことを特徴とする。ＡＧＲ１２９マウスの代わりに、成熟ＢおよびＴ細胞を製造することができず、それ自体が重篤な免疫低下状態にあって複製ウイルスの影響を非常に受けやすいその他の任意のマウス株を使用することができる。前記マウスモデルにおいて得られたデータはヒトに関しての予測に役立つものである。従って、１つの実施態様において、本発明のウイルス、例えばＭＶＡ−ＢＮおよびその誘導体はヒトにおいて全く複製しない。ヒトでのＭＶＡ−ＢＮおよびその誘導体の複製の挙動に対する「複製能力のないポックスウイルス」および「感染性の子孫ウイルスを複製できないウイルス」という語句に関連する段落における定義を用いると、これらのウイルスも、ポックスウイルスを投与されるヒトの免疫系によって制御される複製活性がわずかに残る本発明の範囲内に含まれる。
【００１９】
ＭＶＡ株が「公知の株ＭＶＡ５７５と比較して高い免疫原性」を有するかどうかを測定するために用いられる致死攻撃感染実験の詳細については、国際公開第０２／４２４８０号パンフレットで説明されている。このような致死攻撃感染モデルでは、ワクチン接種されていないマウスは、複製可能なワクシニア株、例えば、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ株Ｌ９２９ＴＫ＋またはＩＨＤ−Ｊの感染後に死亡する。複製可能なワクシニアウイルスの感染を、致死攻撃感染モデルに関する記載において「攻撃感染（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）」と呼ぶ。攻撃感染の４日後にマウスを通常死亡させ、卵巣におけるウイルス力価をＶＥＲＯ細胞を用いる標準的なプラークアッセイにより測定する。ウイルス力価を、ワクチン非接種マウスならびにＭＶＡ−ＢＮおよびその誘導体を接種したマウスに関して測定する。より具体的には、ＭＶＡ−ＢＮおよびその誘導体は、この試験において、１０２ＴＣＩＤ５０／ｍｌのウイルスの接種後に、卵巣のウイルス力価がワクチン非接種マウスと比較して少なくとも７０％（平均値）、あるいは少なくとも８０％（平均値）、あるいは少なくとも９０％（平均値）減少することを特徴とする。
【００２０】
国際公開第０２／４２４８０号パンフレットに開示される「アッセイ１」および「アッセイ２」のうちの一方において測定したＣＴＬ応答が、ワクシニアウイルスプライム／ワクシニアウイルスブースト法において、ＤＮＡ−プライム／ワクシニアウイルスブースト法と比較して少なくとも実質的に同一である場合には、ワクシニアウイルス、例えば、ＭＶＡ株は、ワクシニアウイルスプライム／ワクシニアウイルスブースト法において、ＤＮＡ−プライム／ワクシニアウイルスブースト法と比較して、少なくとも実質的に同一の免疫性レベルを誘導するとみなされる。本発明の１つの実施態様において、国際公開第０２／４２４８０号パンフレットに開示される「アッセイ１」および「アッセイ２」の両方において測定した場合に、ワクシニアウイルスプライム／ワクシニアウイルスブースト法におけるＣＴＬ応答は、ＤＮＡ−プライム／ワクシニアウイルスブースト法と比較して少なくとも実質的に同一である。本発明の１つの実施態様において、ワクシニアウイルスプライム／ワクシニアウイルスブースト投与後のＣＴＬ応答は、上記アッセイのうちの少なくとも一方において、ＤＮＡ−プライム／ワクシニアウイルスブースト法と比較して高い。本発明の１つの実施態様において、ＣＴＬ応答は両方のアッセイにおいて高い。
【００２１】
本発明の１つの実施態様において、ＭＶＡ−ＢＮの誘導体は、（ｉ）ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）およびベビーハムスター腎臓細胞株ＢＨＫにおいては増殖的複製ができるが、ヒト細胞株においては増殖的複製ができず、本発明の１つの実施態様におけるヒト細胞株は、ヒト骨肉種細胞株１４３Ｂ、ヒトケラチノサイト細胞株ＨａＣａｔおよびヒト子宮頸部癌細胞株ＨｅＬａであるという点、および（ｉｉ）重篤な免疫低下状態にあるマウスの生体内において複製できないこと、により特徴付けられる。
【００２２】
本発明の１つの実施態様において、ウイルスはクローン精製されたウイルス、例えば単一クローンのウイルスである。
【００２３】
本発明の１つの実施態様において、ウイルスは、血清に含まれる因子の感染リスクを減少させるために血清を含まない条件下で産生／継代されたウイルスである。
【００２４】
本発明におけるＭＶＡは、１０４〜１０９ＴＣＩＤ５０／ｍｌの濃度範囲、例えば１０５〜５×１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌの濃度範囲、または例えば１０６〜１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌの濃度範囲において投与される。実際の濃度は、ウイルスのタイプおよびワクチン接種される動物種に依存する。ＭＶＡ−ＢＮに関しては、皮下投与される場合の通常のワクチン接種用量は、５×１０７ＴＣＩＤ５０〜５×１０８ＴＣＩＤ５０、例えば、約１×１０８ＴＣＩＤ５０を含む。
【００２５】
本発明の１つの実施態様において、上記のように定義されるポックスウイルス、例えば、ＭＶＡ株（例えばＭＶＡ−ＢＮ）およびその誘導体は、急速な防御免疫応答を誘導するために単回投与において投与される。臨床データにより、ＭＶＡ−ＢＮの単回接種によって、ワクチン接種された個体のほぼ１００％において免疫応答が検出できることが示された。
【００２６】
本発明の別の実施態様において、上記のように定義されるポックスウイルス、例えば、ＭＶＡ株（例えばＭＶＡ−ＢＮ）およびその誘導体は、同種のプライムブースト法にも使用することができ、すなわち、ＭＶＡのようなポックスウイルスを第一のワクチン接種に使用し、そして第一のワクチン接種において使用されたものと同一のまたは同類のポックスウイルス株を投与することによって、第一のワクチン接種において発生した免疫応答を高めることができる。上記のように定義されるポックスウイルス、例えばＭＶＡ（例えばＭＶＡ−ＢＮ）およびその誘導体は、異種プライム−ブースト法にも使用することができ、この際には、１回またはそれ以上のワクチン接種を上記のように定義されるポックスウイルスで行い、１回またはそれ以上のワクチン接種を別のタイプのワクチン、例えば、別のウイルスワクチン、蛋白質もしくは核酸ワクチンで行う。
【００２７】
投与形態は、静脈内、皮内、鼻腔内または皮下でよい。乱切法のようなその他の任意の投与を使用することもできる。
【００２８】
本発明において使用されるポックスウイルスは、ＭＶＡ株（例えばＭＢＡ−ＢＮ）およびその誘導体のような非組み換えポックスウイルスでよい。この場合には、ワクチン接種は、天然痘のようなポックスウイルス感染に対する防御免疫応答を急速に誘導するために行われる。従って、本発明において、上記のように定義されるポックスウイルス、例えば、ＭＶＡ株（例えばＭＢＡ−ＢＮ）およびその誘導体は、天然痘に対する防御免疫応答の急速な誘導に適している。このことは実施例１に例示されており、ここでは、ＭＶＡ−ＢＮ（本発明の株）および非ＭＶＡ株（例えばＤｒｙｖａｘおよびＥｌｓｔｒｅｅ）を接種後、病原性のワクシニアウイルス株に対して、マウスにおいて防御免疫応答が発生するまでにどのくらいかかるかが比較されている。これらの株は、ＭＶＡ−ＢＮとは対照的に、完全に複製可能である。マウスのＭＶＡ−ＢＮ単回接種により、４、３および２日以内に著しい防御免疫応答が引き起こされる点において、ＭＶＡ−ＢＮがＥｌｓｔｅｅおよびＤｙｖａｘと比較して明らかに改善された特性を有することが示されている。このことは、例えば、ＭＶＡ−ＢＮの接種の２、３または４日後に投与された病原性ワクシニアウイルス株Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｒｅｓｅｒｖｅ（ＶＶ−ＷＲ）の力価を、肺において評価することによって実証されている。ワクチン接種の３日後にマウスに１２．５×ＭＬＤ５０のＶＶ−ＷＲを用いて攻撃感染を施した場合に、標準的用量のＭＶＡ−ＢＮを接種されたマウスではＶＶ−ＷＲのウイルス力価は検出されなかったのに対し、ＤｒｙｖａｘまたはＥｌｓｔｒｅｅ接種されたマウスは防御されず、ワクチン接種されていないコントロールマウスの力価と非常に類似した肺における力価を有していた。ワクチン接種の４日後にマウスに５０×ＭＬＤ５０を用いて攻撃感染を施した場合に、標準的用量のＭＶＡ−ＢＮを接種されたマウスではＶＶ−ＷＲのウイルス力価は検出されなかったのに対し、ＤｒｙｖａｘまたはＥｌｓｔｒｅｅを接種されたマウスは防御されず、ワクチン接種されていないコントロールマウスの力価と非常に類似した肺における力価を有していた。ＭＬＤ５０という語句は、接種されたマウスの５０％が死亡する病原性ワクシニアウイルス株の濃度を表す。
【００２９】
マウスのデータはヒトに関する予測に役立つものである。さらに、致死用量の５０倍の病原性ウイルスの濃度は、通常、特に天然痘を誘発するヒトポックスウイルスに関しては本来は生じないものである。
【００３０】
本発明の１つの実施態様において、「ヒトを含む動物における防御免疫応答の急速な誘導」という語句は、好ましくは、本発明のウイルス接種後、７日以内、６日以内、５日以内、４日以内、３日以内、または２日以内の防御免疫応答の発生を表す。このことは、ワクシニアウイルス株の複製に基づいて、防御免疫応答が慣用の天然痘ワクチンに対して発生するまでには少なくとも１０〜１４日かかることが本技術分野においては定説であったので、予期されなかったことである。防御免疫応答の誘導の速さは、実施例において記載される動物モデルにおいて評価することができる。前記モデルはまた、ヒトに関しての予測に役立つものである。従って、本発明の１つの実施態様において、ポックスウイルスワクチンは、マウスにおける急速な免疫応答を誘導するのに有効であり、マウスに有効用量のポックスウイルスワクチン、例えば、ＭＶＡ（例えばＭＶＡ−ＢＮ）およびその誘導体を接種し、そしてワクチン接種の４日後にそれぞれ１×、１２．５×および５０×ＭＬＤ５０のＶＶ−ＷＲでの攻撃感染を施した場合、ウイルスの肺における力価は実施例において記載される試験系で測定すると平均５×１０３ｐｆｕ（ｌｏｇ３．６９に相当）以下である。あるいは、有効用量のポックスウイルスワクチン接種の３日後にそれぞれ１×および１２．５×ＭＬＤ５０のＶＶ−ＷＲでの攻撃感染を施した後は、この値は平均５×１０３ｐｆｕ（ｌｏｇ３．６９に相当）以下である。大まかに言うと、ウイルスが実施例に記載の肺における力価アッセイおよび体重アッセイにおいて、ＭＶＡ−ＢＮと類似の挙動を示す場合には、このウイルスはマウスにおける防御免疫応答の急速な誘導を引き起こす。従って、実施例に記載される範囲、閾値、条件およびパラメーターは、防御免疫応答を急速に誘導するとみなされる他のポックスウイルスワクチンに関しても一般的な意味において適用される。このことより、実施例に示されるデータおよび情報を、このパラグラフにおいて欠けているデータおよび情報、例えば、試験系の記載に関する情報を補足するために通常使用できることは明らかである。
【００３１】
あるいは、防御免疫応答の誘導の速さは、下記において説明される血清変換試験で評価することができる；この場合、セロコンバージョンが観察される時間点が、防御免疫応答が誘導された時間点とみなされる。
【００３２】
本発明の１つの実施態様において、ヒトを含む動物は、ポックスウイルス感染に関してナイーブなヒトを含む動物であり、すなわち、ポックスウイルスに接触したことがなく、ポックスウイルスワクチンを接種されたことがないヒトを含む動物である。
【００３３】
関連する実施態様において、ヒトを含む動物は、ポックスウイルスに接触し、そして／またはポックスウイルスを接種されたヒトを含む動物である。ヒトを含むこれらの動物は、ポックスウイルスおよび／またはポックスウイルスワクチン（例えばＭＶＡ）に対する免疫応答が生じ得る。
【００３４】
「防御免疫応答」という語句は、ワクチン接種された動物が、病原性因子であって、それに対してワクチン接種がなされた因子の感染を制御できることを意味する。通常、発達した「防御免疫応答」を有する動物は、軽度ないし中度の臨床症状のみが現れるか、または全く症状が現れない。通常、特定の因子に対する「防御免疫応答」を有する動物は、この因子の感染の結果として死亡することはない。
【００３５】
上記で指摘のように、ヒトにおいて天然痘に対する防御免疫応答を発生させるためのＭＶＡ−ＢＮまたはその誘導体の濃度は、５×１０７ＴＣＩＤ５０〜５×１０８ＴＣＩＤ５０の範囲内、例えば１×１０８ＴＣＩＤ５０であり、該ウイルスは皮下または筋肉内に投与することができる。
【００３６】
上記で定義されるようなポックスウイルス、例えばＭＶＡ株（例えばＭＶＡ−ＢＮ）およびその誘導体を接種した後の急速な免疫防御の発達のメカニズムは、ワクチン接種されたヒトを含む動物がナイーブな動物（以前にポックスウイルスに接触したことがない動物）、または以前にポックスウイルスに接触していない動物（例えば、ワクチン接種により）であるかどうかに依存しているようである。ナイーブなヒトを含む動物において、本発明のポックスウイルス、例えばＭＶＡ−ＢＮまたはその誘導体を投与すると、ワクチン接種後の最初の２、３日は中和抗体が検出されないとしても、免疫系が有効に感作される。病原性ウイルスの感染は、有効に初回抗原刺激を受けた免疫系が前記の感染を思いのほか効率的にそして速く制御できるように免疫系を高める。本発明のウイルスを接種されたナイーブな動物は、単回ワクチン接種のみを行った後、病原性ウイルスであって、これに対してワクチン接種がなされたウイルスの感染に対して、容易に防御することができる。
【００３７】
本発明において定義されるウイルス、例えばＭＶＡ−ＢＮおよびその誘導体はまた、防御免疫応答がこの状況でも急速に発生するように、思いのほか効率的にそして速く、以前にポックスウイルスと接触したことのある動物における先のワクチン接種の効果を高める。
【００３８】
防御免疫応答の誘導の速さはまた、ヒトを含む動物の本発明のウイルス、例えばＭＶＡ（例えばＭＶＡ−ＢＮ）およびその誘導体の接種後における、思いのほか速いセロコンバージョンによっても反映される。ヒト以外の霊長類において、セロコンバージョンが１０日以内、例えば７日以内に起こることが示されており、これは、Ｅｌｓｔｒｅｅのような他の天然痘ワクチンの接種後におけるセロコンバージョンよりも１週間早い。ＭＶＡ−ＢＮおよびその誘導体の接種後におけるセロコンバージョンをどのように評価するかについては下記に記載されるとおりである。その他のウイルスを接種した後にセロコンバージョンの試験を行う場合には、同一の試験原理を必要な変更を加えて適用する。前記の他のウイルスにより誘導されるセロコンバージョンを評価するのに必要な改変は、ＭＶＡ−ＢＮ特異的ＩｇＧ抗体の全量を定量化する代わりに前記の他のウイルスに特異的なＩｇＧ抗体の全量を定量化することだけである。サンプルが陽性かどうかを評価するためのｃｕｔ  ｏｆｆ値および基準は、本技術分野の技術水準内にある任意の小さな改変を伴って、基本的に同一の方法で決定される。ＭＶＡ−ＢＮ（またはその誘導体）を用いたワクチン接種後におけるセロコンバージョンを評価するために、ＭＶＡ−ＢＮ（Ｒ）特異的ＩｇＧ抗体の全量を試験血清において直接ＥＬＩＳＡ法を用いて定量化する。ＥＬＩＳＡは、血清における抗体の検出に使用される感度の高い方法である。ＭＶＡ−ＢＮ（Ｒ）特異的ＥＬＩＳＡは、試験用ヒト血清におけるＩｇＧ抗体の全量を検出するために使用される標準的な結合ＥＬＩＳＡである。ＥＬＩＳＡの結果は、対数の傾向線を直接分析することにより得られるエンドポイントの抗体力価として表される。ｃｕｔ  ｏｆｆまたはエンドポイントの吸光度を０．３５と定義した。サンプルのエンドポイント力価は、例えば、市販のコンピュータープログラムＥｘｃｅｌ（ｙ軸に光学密度（ＯＤ）、そしてｘ軸に血清希釈系列のｌｏｇ）を使用することにより対数プロットを作成することによって決定する。また、ヒト以外の霊長類におけるデータはヒトに対する予測に役立つものである。試験サンプルの１：５０希釈において該サンプルのＯＤが０．３５より大きい場合には、試験サンプルは陽性であるとみなされる。幾何平均力価（ＧＭＴ）は、Ｌｏｇ１０に変換した力価の平均の真数をとることにより計算される。ＧＭＴは通常、ＥＬＩＳＡ力価として報告される力価である。セロコンバージョン率は、最初にセロネガティブであって、ＭＶＡ特異的ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡにおいて１：５０以上の抗体力価が出現する被験者のパーセントとして定義される。従って、本発明の実施態様において、「ヒトを含む動物における防御免疫応答の急速な誘導」という語句は、本発明のウイルスの接種後１０日以内、７日以内、６日以内、５日以内、４日以内、３日以内または２日以内の、上記のように定義される試験とともに上記のように定義されるセロコンバージョンを表す。
【００３９】
上記のように定義されるポックスウイルス、例えば、ＭＶＡ株（ＭＶＡ−ＢＮ）およびその誘導体は、組み換えＭＶＡ−ＢＮおよびその誘導体のような組み換えポックスウイルスであってもよい。本発明の組み換えウイルス、例えば、組み換えＭＶＡ−ＢＮおよびその誘導体は、少なくとも１種の異種核酸配列を含むことができる。本明細書において使用される「異種」という語句は、通常は実在のウイルスに密接に関連しては見られない核酸配列の任意の組み合わせに対して用いられる。異種配列は、非ワクシニア源から選択される抗原エピトープまたは抗原であってもよい。本発明の１つの実施態様において、前記の組み換えウイルスは、感染性因子由来の抗原エピトープまたは抗原である抗原エピトープまたは抗原を１種またはそれ以上発現する。該感染性因子は、いずれの感染性因子でもよく、例えば、ウイルス、真菌、病原性単細胞真核および／または原核生物、または寄生生物であってもよい。感染性因子の例としては、熱帯熱マラリア原虫、ミコバクテリア、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、パラミクソウイルス、肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、出血熱を引き起こすウイルス、例えば、ハンタウイルスまたはフィロウイルス、すなわち、エボラウイルスまたはマルブルクウイルスが挙げられる。
【００４０】
この実施態様において、上記のように定義される組み換えポックスウイルスは、ポックスウイルス感染に対する急速な免疫応答を誘導するために使用できるだけでなく、さらに（または二者択一的に）、組み換えウイルスに含まれる異種核酸から発現した異種抗原エピトープ／抗原に対する急速な免疫応答を誘導するために使用することもできる。従って、一例として、組み換えＭＶＡがＨＩＶエピトープまたは黄熱病ウイルスエピトープを発現する場合には、組み換えＭＶＡをそれぞれＨＩＶおよび黄熱病ウイルスに対する急速な免疫応答の誘導に使用することができる。
【００４１】
代わりにＭＶＡの免疫原性をさらに増加させる抗原エピトープ／抗原を発現することができる組み換えウイルスもまた、本発明の範囲内に含まれる。
【００４２】
本発明において使用される組み換えウイルスは、治療用化合物を発現する異種遺伝子／核酸を含むこともできる。ウイルス中において異種核酸によりコードされる「治療用化合物」は、例えば、アンチセンス核酸のような治療用核酸、または所望の生物学的活性を有するペプチドまたは蛋白質であってもよい。
【００４３】
本発明の１つの実施態様において、異種核酸配列の発現は、ポックスウイルスプロモーターの転写制御下にあってもよい。好適なポックスウイルスプロモーターの例は、牛痘ＡＴＩプロモーターである（国際公開第０３／０９７８４４号パンフレット参照）。
【００４４】
本発明の１つの実施態様において、異種核酸配列の挿入は、ウイルスゲノムの非必須領域中になされる。本発明のもう１つの実施態様において、異種核酸配列は、ＭＶＡゲノムの天然に存在する欠失部位に挿入される（ＰＣＴ／ＥＰ９６／０２９２６に開示されている）。あるいは、異種配列は、ポックスウイルスゲノムの遺伝子間領域に挿入することができる（国際公開第０３／０９７８４５号パンフレット参照）。ポックスウイルスゲノムへの異種配列の挿入方法は、当業者に公知である。
【００４５】
非組み換えウイルスに関する実施態様についての上述の定義は全て、組み換えウイルスに関する実施態様にも適用される。
【００４６】
＜本発明の概要＞
ヒトを含む動物における防御免疫応答を急速に誘導するためのワクチンの製造にポックスウイルスを使用する方法であって、ポックスウイルスが前記のヒトを含む動物において複製能力がない、前記の使用方法。
【００４７】
ヒトを含む動物に、前記のヒトを含む動物において複製能力がないポックスウイルスを投与する段階を含む、ヒトを含む動物において防御免疫応答を急速に誘導する方法。
【００４８】
防御免疫応答が７日以内に発生する、上記の使用方法または方法。
【００４９】
ポックスウイルスが改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）である、上記の使用方法または方法。
【００５０】
ＭＶＡがＭＶＡ株のＭＶＡ５７５、ＭＶＡ５７２およびＭＶＡ−ＢＮから選択される、上記の使用方法または方法。
【００５１】
ウイルスがクローン精製されたウイルスである、上記の使用方法または方法。
【００５２】
ウイルスが血清を含まない培養工程において得られている、上記の使用方法または方法。
【００５３】
ポックスウイルスが１０５〜５×１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌの用量で投与される、上記の使用方法または方法。
【００５４】
ポックスウイルスが静脈内、筋肉内または皮下に投与される、上記の使用方法または方法。
【００５５】
防御免疫応答がポックスウイルス感染に対する防御免疫応答である、上記の使用方法または方法。
【００５６】
免疫応答が天然痘感染に対するものである、上記の使用方法または方法。
【００５７】
ポックスウイルスが組み換えポックスウイルスである、上記の使用方法または方法。
【００５８】
組み換えポックスウイルスが少なくとも１種の異種核酸配列を含む、上記の使用方法または方法。
【００５９】
異種核酸配列が少なくとも１種の抗原、抗原エピトープ、および／または治療用化合物をコードする配列である、上記の使用方法または方法。
【００６０】
抗原エピトープおよび／または抗原が感染性因子の抗原エピトープおよび／または抗原である、上記の使用方法または方法。
【００６１】
抗原因子がウイルス、真菌、病原性の単細胞真核および／または原核生物、寄生生物から選択される、上記の使用方法または方法。
【００６２】
ウイルスが、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、パラミクソウイルス、肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルスの科から、または出血熱を引き起こすウイルスから選択される、上記の使用方法または方法。
【００６３】
免疫防御が、抗原エピトープおよび／または抗原が由来する感染性因子に対するものである、上記の使用方法または方法。
【００６４】
＜図面の簡単な説明＞
図１：１×ＭＬＤ５０のＶＶ−ＷＲでの鼻腔内攻撃感染後における、異なるワクチンを接種したマウスの体重変化。ＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下に、ＭＶＡ−ＢＮ（Ｒ）、Ｅｌｓｔｒｅｅ、Ｄｒｙｖａｘ、または生理食塩水（ＰＢＳ）を、マウスあたり４×１０４ＴＣＩＤ５０のＶＶ−ＷＲを用いる攻撃感染の４日前に、あるいはＭＶＡ−ＢＮ（Ｒ）を攻撃感染の３日または２日前に接種した。体重を攻撃感染（０日目）の前に測定し、その後、攻撃感染後に毎日、各日同じ時間に測定した。グラフは、正規化された個々の値（０日目をベースラインの値とした）を用いて、時間に対する群あたりの平均体重の変化を表す。
【００６５】
図２：１２．５×ＭＬＤ５０のＶＶ−ＷＲでの鼻腔内攻撃感染後における、異なるワクチンを接種したマウスの体重変化。ＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下に、ＭＶＡ−ＢＮ（Ｒ）、Ｅｌｓｔｒｅｅ、Ｄｒｙｖａｘ、または生理食塩水（ＰＢＳ）を、マウスあたり５×１０５ＴＣＩＤ５０のＶＶ−ＷＲを用いる攻撃感染の４日前に、あるいはＭＶＡ−ＢＮ（Ｒ）を攻撃感染の３日前に接種した。体重を攻撃感染（０日目）の前に測定し、その後、攻撃感染後に毎日、各日同じ時間に測定した。グラフは、正規化された個々の値（０日目をベースラインの値とした）を用いて、時間に対する群あたりの平均体重の変化を表す。
【００６６】
図３：５０×ＭＬＤ５０のＶＶ−ＷＲでの鼻腔内攻撃感染後における、異なるワクチンを接種したマウスの体重変化。ＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下に、ＭＶＡ−ＢＮ（Ｒ）、Ｅｌｓｔｒｅｅ、Ｄｒｙｖａｘ、または生理食塩水（ＰＢＳ）を、マウスあたり２×１０６ＴＣＩＤ５０のＶＶ−ＷＲを用いる攻撃感染の４日前に、あるいはＭＶＡ−ＢＮ（Ｒ）を攻撃感染の３日前に接種した。体重を攻撃感染（０日目）の前に測定し、その後、攻撃感染後に毎日、各日同じ時間に測定した。グラフは、正規化された個々の値（０日目をベースラインの値とした）を用いて、時間に対する群あたりの平均体重の変化を表す。
【００６７】
図４、５および６：１×ＭＬＤ５０のＶＶ−ＷＲ（図４）、１２．５×ＭＬＤ５０のＶＶ−ＷＲ（図５）または５０×ＭＬＤ５０のＶＶ−ＷＲ（図６）での鼻腔内攻撃感染後の、死亡時または屠殺時の肺におけるウイルス量。各動物から肺を回収し、ウイルス量をベロ細胞における標準的なプラークアッセイを用いて測定した。バーは、群あたりの肺における平均力価±標準誤差を表す。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】１×ＭＬＤ５０のＶＶ−ＷＲでの鼻腔内攻撃感染後において、異なるワクチンを接種したマウスの体重変化を示す。
【図２】１２．５×ＭＬＤ５０のＶＶ−ＷＲでの鼻腔内攻撃感染後において、異なるワクチンを接種したマウスの体重変化を示す。
【図３】５０×ＭＬＤ５０のＶＶ−ＷＲでの鼻腔内攻撃感染後において、異なるワクチンを接種したマウスの体重変化を示す。
【図４】１×ＭＬＤ５０のＶＶ−ＷＲでの鼻腔内攻撃感染後の、死亡時または屠殺時の肺におけるウイルス量を示す。
【図５】１２．５×ＭＬＤ５０のＶＶ−ＷＲでの鼻腔内攻撃感染後の、死亡時または屠殺時の肺におけるウイルス量を示す。
【図６】５０×ＭＬＤ５０のＶＶ−ＷＲでの鼻腔内攻撃感染後の、死亡時または屠殺時の肺におけるウイルス量を示す。
【実施例】
【００６９】
以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、本発明をこの実施例に限定することを意図するものではない。
【００７０】
実施例１：１×、１２．５×または５０×ＭＬＤ５０のワクシニアウイルスＶＶ−Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ（ＶＶ−ＷＲ）で攻撃感染を施された、ＭＶＡ−ＢＮ、ＥｌｓｔｒｅｅまたはＤｒｙＶａｘ接種マウスにおける防御の開始
【００７１】
１．イントロダクション
天然痘ワクチン候補品の有効性の試験を行うために、マウスの鼻腔内ワクシニア攻撃感染モデルを開発した。このモデルにおいては、有効性を測定すべきワクチンを用いてマウスにワクチン接種を行う。コントロールマウスは、ワクチンの代わりに生理食塩水コントロールを受ける。ワクチン接種の数日後に、マウスに病原性ワクシニアウイルス株、例えば、ワクシニアウイルス株Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ（ＶＶ−ＷＲ）を感染させる。ワクシニアウイルス株Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ（ＶＶ−ＷＲ）のマウス致死用量５０（ＭＬＤ５０）を測定したところ、ワクチン接種していないマウスにおいては３．６×１０４ＴＣＩＤ５０であった。予備試験において、２５×または５０×ＭＬＤ５０のＶＶ−ＷＲで攻撃感染を施したＭＶＡ−ＢＮ接種ＢＡＬＢ／ｃマウスは、ウイルスの攻撃感染から迅速に回復し、臨床症状の明確な兆候を示さず、これらの動物の肺には病変が存在しないことが示された。別の予備試験においては、ＶＶ−ＷＲでの致死攻撃感染からの防御の確立に必要なワクチン接種後の時間を調べた：ＭＶＡ−ＢＮ（Ｒ）接種マウスにおける、ワクチン接種の３日後の、致死下用量（ｓｕｂ−ｌｅｔｈａｌ  ｄｏｓｅ）のＶＶ−ＷＲ（５×１０３ＴＣＩＤ５０／マウス）を用いた攻撃感染では、防御が認められた（体重減少およびウイルスの肺における力価に関して）。この実施例の目的は、ＶＶ−ＷＲでの致死攻撃感染後の防御の獲得に必要なＭＶＡ−ＢＮ（Ｒ）（またはＥｌｓｔｒｅｅもしくはＤｒｙｖａｘ）接種後の時間を絞り込むことにある。
【００７２】
２．ウイルスおよびコントロール：
＜試験ワクチン１＞
５．０Ｅ＋０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌの濃度の改変ワクシニアアンカラ−バーバリアンノルディック（ＭＶＡ−ＢＮ（Ｒ））。処方：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）中。
【００７３】
ＭＶＡ−ＢＮ（Ｒ）接種群では、ＭＶＡ−ＢＮ（Ｒ）ストックをさらに希釈せずに、２００μｌを皮下に投与した結果、最終用量は１．０Ｅ＋０８ＴＣＩＤ５０となった。
【００７４】
＜試験ワクチン２＞
１．０Ｅ＋０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌの公称濃度（ｎｏｍｉｎａｌ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を有するワクシニアウイルス株Ｅｌｓｔｒｅｅ；処方：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）中。
【００７５】
Ｅｌｓｔｒｅｅストックをさらに希釈せずに、２．５μｌを各マウスの尾に乱切法により投与した結果、最終用量は２．５Ｅ＋０５ＴＣＩＤ５０となった。
【００７６】
＜試験ワクチン３＞
２．９Ｅ＋０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌの公称濃度を有するＤｒｙＶａｘ；処方：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）中。
【００７７】
ＤｒｙＶａｘストックをさらに希釈せずに、８μｌを各マウスの尾に乱切法により投与した結果、最終用量は２．５Ｅ＋０５ＴＣＩＤ５０となった。
【００７８】
試験ワクチン１〜３をそれぞれ最適な用量および投与経路で投与した。
【００７９】
＜攻撃感染ウイルス＞
４．０Ｅ＋０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌの公称濃度を有するワクシニアウイルスＷｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ（ＶＶ−ＷＲ）。
【００８０】
８．０Ｅ＋０４ＴＣＩＤ５０／ｍｌおよび４．０Ｅ＋０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌの最終ワーキングストックを作製するために、ＶＶ−ＷＲ（４．０Ｅ＋０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）を以下のように希釈した：１×ＭＬＤ５０のＶＶ−ＷＲ／マウス（８．０Ｅ＋０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌのワーキングストック懸濁液）：１００μｌのＶＶ−ＷＲストック（４．０Ｅ＋０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）を９００μｌのＰＢＳに添加し、ボルテックスにより混合し（４．０Ｅ＋０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌの濃度を得る）、この懸濁液の１００μｌを９００μｌのＰＢＳに移し、再度ボルテックスにより混合し（４．０Ｅ＋０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌの濃度を得る）、この懸濁液の６００μｌを２４００μｌのＰＢＳに移し、ボルテックスで混合することにより、８．０Ｅ＋０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌの最終濃度を得た。５０×ＭＬＤ５０のＶＶ−ＷＲ／マウス（４．０Ｅ＋０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌのワーキングストック懸濁液）：３００μｌのＶＶ−ＷＲストック（４．０Ｅ＋０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）を２７００μｌのＰＢＳに添加し、ボルテックスにより混合することによって、４．０Ｅ＋０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌの最終濃度を得た。
【００８１】
＜生理食塩水コントロール＞
生理食塩水コントロール群においては、２００μｌのＰＢＳ（製造業者から供給）を個々のマウスへの皮下注射に使用した。
【００８２】
３．方法および実験設計
＜試験系＞
特定病原体フリー（ＳＰＦ）の雌のＢａｌｂ／ｃマウスＨ−２ｄをＴａｃｏｎｉｃ  Ｍ＆Ｂ（Ｐ．Ｏ．  Ｂｏｘ  １０７９，  ＤＫ−８６８０  Ｒｙ，  デンマーク）から入手した。試験における動物の数：６０匹。攻撃感染の開始週
齢：９週。攻撃感染の開始時における体重範囲：１８〜２３グラム。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、天然痘ワクチンの免疫原性および有効性の試験に広く使用されている。この系統はＶＶ−ＷＲ攻撃感染に対して高い感受性を有する。
【００８３】
実験はデンマークの動物実験委員会（Ｄｙｒｅｆｏｒｓｏｇｓｔｉｌｓｙｎｅｔ）に従って実施した。
【００８４】
処置群への割当：到着時に動物を無作為に、試験群あたり（およびケージあたり）５匹の動物からなる処置群に割り当てた。
【００８５】
用量レベルの根拠：ＭＶＡ−ＢＮ（Ｒ）は、マウスにおいて強力な液性免疫応答および細胞性免疫応答を誘導することがこれまでの実験において実証されている最適用量で使用した。ＥｌｓｔｒｅｅおよびＤｒｙｖａｘは、ヒトに関して提唱されている用量で使用した。
【００８６】
＜ワクチン接種および攻撃感染スケジュール＞
全部で８０匹のマウスをこの試験において使用した（下記の表を参照のこと）。マウスに、ＭＶＡ−ＢＮ（Ｒ）またはＥｌｓｔｒｅｅまたはＤｒｙｖａｘのうちのいずれかを接種した４日後に、１×、１２．５×または５０×ＭＬＤ５０のＶＶ−ＷＲで攻撃感染を施した。追加の群においては、ＭＶＡ−ＢＮ（Ｒ）を接種した３日後に、１×、１２．５×または５０×ＭＬＤ５０のＶＶ−ＷＲでマウスに攻撃感染を施すか、またはＭＶＡ−ＢＮ（Ｒ）を接種した２日後に、１×ＭＬＤ５０のＶＶ−ＷＲでマウスに攻撃感染を施した。コントロール群では、前もってワクチンを接種することなしに、１×、１２．５×または５０×ＭＬＤ５０のＶＶ−ＷＲでマウスに攻撃感染を施した。１×、１２．５×または５０×ＭＬＤ５０のＶＶ−ＷＲを受けたコントロール動物は、もし最初の体重からの体重の減少が２０％を超える場合には、または、もし呼吸困難を患った場合には、攻撃感染の５または４日後にそれぞれ屠殺した。これは苦痛を減らすために行った。
【００８７】
【表１】
0005952112.tif 000002
【００８８】
＜群のサイズの根拠＞
この試験の一次エンドポイントは、ＶＶ−ＷＲでの鼻腔内攻撃感染の４または５日後での防御レベルにより測定される有効性であった。以前の前臨床の知見に基づくと、攻撃感染後にワクチン接種群の少なくとも９５％が防御されるのに対し、プラセボ処置群はわずか５％が防御されると考えられた。Ｆｉｓｈｅｒの正確確率検定（Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ  Ｅｘａｃｔ  ｔｅｓｔ）を用いると、５対５の群サイズは、有意水準（両側）α＝０．０５において８０％を超える検出力で有意差を実証するのに十分である。
【００８９】
＜ワクチン接種用試験物質の投与＞
ワクチン接種は、生物学的安全キャビネット（ＳＷ  １０００  ４０／ｃｌａｓｓ  ＩＩ，  Ｈｏｌｔｅｎ  Ｌａｍｉｎ  Ａｉｒ）中で行った。２００μｌのＭＶＡ−ＢＮ（Ｒ）（１×１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）または生理食塩水コントロール（２００μｌのＰＢＳ）で、１ｍｌの２９Ｇツベルクリン・インスリン用注射器（テルモ製）を用いて、後肢の皮膚のしわにおける皮下経路によりマウスにワクチン接種を施した。ＥｌｓｔｒｅｅおよびＤｒｙＶａｘを受けるマウスは、尾の乱切の前に麻酔を施された：７５ｍｇのケタミン、５ｍｇのキシラジンおよび水を含むフレッシュな混合物を調製し、８０μｌの麻酔薬を１ｍｌの２７Ｇインスリン用注射器を用いて皮下経路で投与した。１つのケージに属する全てのマウスに、ワクチン投与前に麻酔を行った。２．５μｌまたは８μｌのＥｌｓｔｒｅｅまたはＤｒｙｖａｘを尾での乱切により投与した。
【００９０】
＜肺の攻撃感染モデル＞
生物学的安全キャビネット（ＳＷ  １０００  ４０／ｃｌａｓｓ  ＩＩ，  Ｈｏｌｔｅｎ  Ｌａｍｉｎ  Ａｉｒ）において、麻酔を施したマウスの鼻腔内経路により試験物質（すなわちＶＶ−ＷＲ）を投与した。
【００９１】
水における７５ｍｇのケタミン、５ｍｇのキシラジンのフレッシュな混合物を麻酔薬として調製した。８０μｌの麻酔薬を１ｍｌの２９Ｇインスリン用注射器を用いて皮下経路で投与した。１つのケージに属する全てのマウスに、ＶＶ−ＷＲ試験物質の投与前に麻酔を行った。
【００９２】
生物学的安全キャビネット（ＳＷ  １０００  ４０／ｃｌａｓｓ  ＩＩ，  Ｈｏｌｔｅｎ  Ｌａｍｉｎ  Ａｉｒ）において、鼻腔内攻撃感染を実施した。攻撃感染ウイルスのワーキング希釈液を氷から取り出し、２、３秒間の穏やかなボルテックスにより混合した。５０μｌの希釈ＶＶ−ＷＲ試験物質を１００μｌのピペットを用いて計量した。麻酔を施したマウスの首の後側の皮膚／柔皮を持ち、同じ手の掌で体を支えた。試験物質をマウスの片方の外鼻孔にゆっくりと添加した。あえぎが止むまで、上述のようにマウスを持っていた。
【００９３】
健康障害のいずれかの兆候を観察するために、攻撃感染前（０日目）の動物、および攻撃感染後の動物を毎日観察した。攻撃感染前（０日目）および攻撃感染後の解剖の日まで毎日、疾患の進行を観察するために体重を測定した。
【００９４】
５０×ＭＬＤ５０のＶＶ−ＷＲを受けた生理食塩水群は、Ｄｙｒｅｆｏｒｓｏｇｓｔｉｌｓｙｎにより設定されたｃｕｔ  ｏｆｆ体重を超え、攻撃感染後４日目に屠殺した。１×または１２．５×ＭＬＤ５０のＶＶ−ＷＲを受けた生理食塩水群は、Ｄｙｒｅｆｏｒｓｏｇｓｔｉｌｓｙｎにより設定されたｃｕｔ  ｏｆｆ体重を超え、攻撃感染後５日目に屠殺した。１×ＭＬＤ５０のＶＶ−ＷＲで攻撃感染を施されたワクチン接種動物は、攻撃接種後５日目に屠殺されたのに対し、１２．５×または５０×ＭＬＤ５０のＶＶ−ＷＲで攻撃感染を施されたＭＶＡ−ＢＮ（Ｒ）接種動物は、攻撃感染後最後の８日目に屠殺された。
【００９５】
肺を除去し、肺におけるウイルスの全量をベロ細胞における標準的なプラークアッセイを用いて測定した。肺における力価が、ベロ細胞で我々のウイルス滴定の方法を用いたときに検出可能な最も低い力価である５×１０３ｐｆｕ以下の場合に、動物は完全に防御されているとみなした。
【００９６】
４．結果および考察
＜体重変化＞
１×ＭＬＤ５０のワクシニアウイルス株Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ（ＶＶ−ＷＲ）による４日後の攻撃感染後における、種々の天然痘ワクチンでのワクチン接種の効果を、この試験のいくつかの群において調べた。図１に示すように、１×ＭＬＤ５０のＶＶ−ＷＲで攻撃感染を施したワクチン非接種（生理食塩水コントロール）マウスの群における体重減少は、攻撃感染の３日後に最初に検出された。５日目に屠殺するまで、平均開始時体重から平均２０．９％減少したところまで体重減少が続いた。類似の体重減少が、ＶＶ−ＷＲでの攻撃感染の４日前にＥｌｓｔｒｅｅまたはＤｒｙｖａｘを接種した群において検出された：これらの群では、屠殺の日における平均体重が、開始時体重からそれぞれ２３．２％または２１．１％減少していた。ＶＶ−ＷＲでの攻撃感染の２日前にＭＶＡ−ＢＮ（Ｒ）を接種した群においては、最初の体重減少（平均開始時体重の約４％）は攻撃感染の２日後に検出された。この群では、攻撃感染４日後まで、開始時の平均体重から平均体重が１７．６％減少したところまで平均体重の減少が続いた。攻撃感染後５日目には、平均体重の減少は続かず、開始時の平均体重から１６．７％の減少であった。攻撃感染の３日前にＭＶＡ−ＢＮ（Ｒ）を接種した群においては、小さな体重減少のみが攻撃感染後３日目から検出され、攻撃感染後４日目において最も大きく減少し、開始時体重から４．２％減少した。この群においては、体重が５日目に最初の値まで回復した。攻撃感染の４日前にＭＶＡ−ＢＮ（Ｒ）を接種した群は、１×ＭＬＤ５０のＶＶ−ＷＲでの攻撃感染後にいずれの体重減少も示さなかった。
【００９７】
第二の群においては、マウスに１２．５×ＭＬＤ５０のＶＶ−ＷＲで攻撃感染を施し、マウスの体重をこの場合も攻撃感染前および攻撃感染後に毎日測定した。図２に示すように、ワクチン非接種（生理食塩水コントロール）マウスの群における体重減少は、攻撃感染の２日後に最初に検出された。５日目に屠殺するまで、平均開始時体重から平均２３．３％減少したところまで体重減少が続いた。従って、１×ＭＬＤ５０のＶＶ−ＷＲで攻撃感染を施したワクチン非接種群におけるよりも、１日早く体重減少が検出され、屠殺する日における体重減少はより顕著であった（図１参照）。ＶＶ−ＷＲによる攻撃感染の４日前にＥｌｓｔｒｅｅまたはＤｒｙｖａｘを接種した群では、ワクチン非接種マウスに類似した体重減少が検出された。ＶＶ−ＷＲでの攻撃感染の３日前にＭＶＡ−ＢＮ（Ｒ）を接種した群においては、最初のわずかな体重減少（平均開始時体重から約１．７％）が攻撃感染の２日後に検出された。この群では、攻撃感染４日後まで、開始時の平均体重から平均体重が１６．１％減少したところまで平均体重の減少が続いた。この群ではその後、平均体重が回復し始め、攻撃感染後８日目には平均開始時体重から２．３％減少した平均体重が検出された。攻撃感染の４日前にＭＶＡ−ＢＮ（Ｒ）を接種したマウスの群においては、平均開始時体重と比較して１０．８％の平均体重の減少が検出された。１３．８％という最も大きな平均体重の減少が、攻撃感染後３日目に検出された。体重の回復が次の日に認められ、攻撃感染後８日目に検出された平均体重は攻撃感染前と同程度であった。
【００９８】
第三の群においては、マウスに５０×ＭＬＤ５０のＶＶ−ＷＲで攻撃感染を施し、マウスの体重を今回も攻撃感染前および攻撃感染後に毎日測定した。図３に示すように、ワクチン非接種（生理食塩水コントロール）マウスの群における体重減少は、攻撃感染の１日後にすでに検出された。４日目に屠殺するまで、平均開始時体重から平均２０．１％減少したところまで体重減少が続いた。従って、１×または１２．５×ＭＬＤ５０のＶＶ−ＷＲで攻撃感染を施したワクチン非接種群におけるよりも、それぞれ２日または１日早く体重減少が検出された。ＥｌｓｔｒｅｅまたはＤｒｙｖａｘを接種した群では、攻撃感染後２日目に体重減少が検出され始め、そして、この群では攻撃接種４日後までに、それぞれ開始時体重から２０．１％または１９．７％の平均体重減少が認められた。ＶＶ−ＷＲでの攻撃感染の３日前にＭＶＡ−ＢＮ（Ｒ）を接種した群においては、最初の体重減少（平均開始時体重から約１．６％）は攻撃感染後１日目に検出された。この群では、攻撃感染後４日目に屠殺するまで、開始時の平均体重から平均体重が２４．０％減少したところまで平均体重の減少が続いた。攻撃感染の４日前にＭＶＡ−ＢＮ（Ｒ）を接種した群においては、最初の体重減少は攻撃感染後１日目に検出され、平均体重は、攻撃感染後４日目に平均開始時体重から２２．５％減少したところまで減少し続けた。次の日には体重の回復が検出され、攻撃感染後８日目には、平均体重は平均開始時体重から５．１％の減少であることが確認された。
【００９９】
＜肺における力価＞
マウスの死または屠殺後、肺を除去し、この組織中のウイルスの全量をベロ細胞における標準的なプラークアッセイを用いて測定した。肺における力価が、ベロ細胞で我々のウイルス滴定の方法を用いたときに検出可能な最も低い力価であるｌｏｇ１０  ３．６９（５×１０３ｐｆｕ）以下の場合に、動物は完全に防御されているとみなした。第一の群において、１×ＭＬＤ５０のＶＶ−ＷＲで攻撃感染を施したマウスを比較した。図４に示すように、ワクチン非接種マウスは、ｌｏｇ１０  ７．８１の平均ウイルス量（ｖｉｒｕｓ  ｌｏａｄ）を示した。攻撃感染の４日前にＥｌｓｔｒｅｅまたはＤｒｙｖａｘを接種したマウスは、ｌｏｇ１０  ７．７５およびｌｏｇ１０  ６．６８の平均肺ウイルス量を示した。従って、Ｅｌｓｔｒｅｅ接種マウスは肺におけるウイルス感染を防ぐことができず、Ｄｒｙｖａｘ接種マウスはある程度だけ肺におけるウイルス感染を防ぐことができた。攻撃感染の４日前にＭＶＡ−ＢＮ（Ｒ）を接種したマウスの群においては、肺でのウイルス力価は検出できず、従って、１×ＭＬＤ５０のＶＶ−ＷＲでの鼻腔内攻撃感染後のウイルス感染から完全に防御されている。ＭＶＡ−ＢＮ（Ｒ）の接種とＶＶ−ＷＲでの攻撃感染との間の間隔を４日から３または２日に短くすると、ウイルス陽性の肺の数が５匹のうちの１匹、または５匹のうちの４匹に増加し、これらはそれぞれｌｏｇ１０  ３．７７またはｌｏｇ１０  ４．６８の平均肺ウイルス力価を有していた。
【０１００】
第二の群において、１２．５×ＭＬＤ５０のＶＶ−ＷＲで攻撃感染を施したマウスを比較した。図５に示すように、ワクチン非接種マウスは、ｌｏｇ１０  ８．３８の平均ウイルス量を示した。攻撃感染の４日前にＥｌｓｔｒｅｅまたはＤｒｙｖａｘを接種したマウスは、ｌｏｇ１０  ８．１７およびｌｏｇ１０  ８．００の平均肺ウイルス量を示した。従って、Ｅｌｓｔｒｅｅ接種マウスおよびＤｒｙｖａｘ接種マウスは肺におけるウイルス感染を防ぐことができなかった。攻撃感染の４または３日前にＭＶＡ−ＢＮ（Ｒ）を接種したマウスの群においては、肺でのウイルス力価は検出できず、従って、１２．５×ＭＬＤ５０のＶＶ−ＷＲでの鼻腔内攻撃感染後のウイルス感染から完全に防御されている。第三の群において、５０×ＭＬＤ５０のＶＶ−ＷＲで攻撃感染を施したマウスを比較した。図６に示すように、ワクチン非接種マウスは、ｌｏｇ１０  ８．５９の平均ウイルス量を示した。攻撃感染の４日前にＥｌｓｔｒｅｅまたはＤｒｙｖａｘを接種したマウスは、ｌｏｇ１０  ８．４９およびｌｏｇ１０  ８．２５の平均肺ウイルス量を示した。従って、Ｅｌｓｔｒｅｅ接種マウスおよびＤｒｙｖａｘ接種マウスは肺におけるウイルス感染を防ぐことができなかった。
【０１０１】
ＭＶＡ−ＢＮ（Ｒ）を接種したマウスの群においては、攻撃感染の４日前にワクチン接種を施した場合には、肺でのウイルス力価は検出されなかった。従って、これらのマウスは、５０×ＭＬＤ５０のＶＶ−ＷＲでの鼻腔内攻撃感染後のウイルス感染から完全に防御されている。ＭＶＡ−ＢＮ（Ｒ）の接種とＶＶ−ＷＲでの攻撃感染との間の間隔を３日にしたマウスの群においては、ｌｏｇ１０  ７．６３の平均ウイルス量が検出された。従って、この群はある程度だけウイルス感染から防御されている。
【０１０２】
５．結論
ＶＶ−ＷＲでの致死的な鼻腔内攻撃感染からの「防御」を示すために、今回の試験では、体重減少からの回復、およびウイルスの肺における力価を測定した。
【０１０３】
１×、１２．５×または５０×ＭＬＤ５０のＶＶ−ＷＲで攻撃感染を施されたコントロール動物では、体重の継続的な減少が認められ、死後の肺において高いウイルス量を有していた（攻撃感染の用量が高くなると、肺で検出されるウイルス量も高くなる）。従って、これらのマウスは感染を制御することができなかった。
【０１０４】
天然痘ワクチン候補品ＩＭＶＡＭＵＮＥＴＭ（ＭＶＡ−ＢＮ（Ｒ））は、５０×ＭＬＤ５０までのＶＶ−ＷＲを用いた鼻腔内攻撃感染に対して防御をすることができた。この防御は初期の体重減少後の体重回復に関連しており、そして肺においてウイルスが存在しないことにも関連している。ＶＶ−ＷＲの攻撃感染用量を高くすると、攻撃感染の４日前にＭＶＡ−ＢＮ（Ｒ）を接種されたマウスにおいて体重回復に必要な攻撃感染後期間は長くなる：１２．５×ＭＬＤ５０のＶＶ−ＷＲを用いて攻撃感染を施した場合には、体重の回復が攻撃感染後４日目に検出されたのに対し、５０×ＭＬＤ５０のＶＶ−ＷＲを用いて攻撃感染を施した場合には、体重の回復は攻撃感染後５日目に検出された。さらに、この研究では、マウスへのＭＶＡ−ＢＮ（Ｒ）の接種と１×ＭＬＤ５０のＶＶ−ＷＲでの攻撃感染との間の時間間隔を２日まで減らすことができ、この時間間隔は、１×ＭＬＤ５０のＶＶ−ＷＲでの攻撃感染後の体重を安定化し、肺におけるウイルス力価を低下させるのに十分であることが明らかに示された。さらに、攻撃感染用量を増加すると、致死攻撃感染からの防御を得るために必要とされる、ＭＶＡ−ＢＮ（Ｒ）の接種と攻撃感染との間の時間間隔も延長される：５０×ＭＬＤ５０のＶＶ−ＷＲでの攻撃感染の場合には、３日間の間隔では不十分であるが、１２．５×ＭＬＤ５０のＶＶ−ＷＲでの攻撃感染の場合には、防御を獲得するためにはワクチン接種と攻撃感染との間の時間間隔は３日で十分であった。
【０１０５】
ＭＶＡ−ＢＮ（Ｒ）とは対照的に、第一および第二世代の天然痘ワクチンＤｒｙｖａｘおよびＥｌｓｔｒｅｅはそれぞれ、攻撃感染の４日前に投与した場合に、５０×ＭＬＤ５０までのＶＶ−ＷＲでの鼻腔内攻撃感染に対して防御することができなかった。この相違の理由は、投与経路の相違によるものであるかもしれない：ＭＶＡ−ＢＮ（Ｒ）はマウスの皮下に投与したのに対し（ヒトに対する臨床試験では皮下に投与される）、ＤｒｙｖａｘおよびＥｌｓｔｒｅｅは乱切法によりマウスに投与した（ヒトへも乱切法により投与された）。
【０１０６】
まとめると、この試験により、防御の発現に関して、ＤｒｙｖａｘおよびＥｌｓｔｒｅｅに対するＭＶＡ−ＢＮ（Ｒ）の優位性が明確に実証された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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