(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
クリプトコッカス・フラベセンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）株３Ｃ（ＮＲＲＬ Ｙ−５０３７８）からなる、プロチオコナゾール耐性のクリプトコッカス・フラベセンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）株を有する微生物集団であって、クリプトコッカス・フラベセンス３Ｃは、温室試験において、無治療対照対象群と比較して、親クリプトコッカス・フラベセンスＯＨ１８２．９より３０％以上の赤カビ病の減少効果を有する、微生物集団。
【請求項２】
微生物が生物学的に純粋である、請求項１の微生物集団。
【請求項３】
穀物用植物の頭部にクリプトコッカス・フラベセンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）株３Ｃ（ＮＲＲＬ Ｙ−５０３７８）からなる微生物アンタゴニストを塗付し、前記微生物アンタゴニストは、無治療対照群と比較して赤カビ病のレベルの減少に効果的な量を塗付する、上記穀物用植物の赤カビ病を食い止める方法であって、クリプトコッカス・フラベセンス３Ｃは、温室試験において、無治療対照対象群と比較して、親クリプトコッカス・フラベセンスＯＨ１８２．９より３０％以上の赤カビ病の減少効果を有する、方法。
【請求項４】
前記微生物アンタゴニストが、生物学的に純粋である請求項３の方法。
【請求項５】
前記微生物アンタゴニストを、成長のハード・ダフ・ステージに先立って頭部に塗付する請求項３の方法。
【請求項６】
前記微生物アンタゴニストを、開花中、頭部に塗付する、請求項３の方法。
【請求項７】
前記微生物アンタゴニストを、開花に先立って頭部に塗付する、請求項３の方法。
【請求項８】
前記穀物が大麦と小麦である、請求項３の方法。
【請求項９】
前記穀物は小麦である、請求項５の方法。
【請求項１０】
農学的に許容可能なキャリア（担体）における、クリプトコッカス・フラベセンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）株３Ｃ（ＮＲＲＬ Ｙ−５０３７８）からなる微生物アンタゴニストで穀物用植物の赤カビ病を食い止めるための組成物であって、クリプトコッカス・フラベセンス３Ｃは、温室試験において、無治療対照対象群と比較して、親クリプトコッカス・フラベセンスＯＨ１８２．９より３０％以上の赤カビ病の減少効果を有する組成物。
【請求項１１】
微生物アンタゴニストが、生物学的に純粋である、請求項１０の組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本発明は、赤カビ病の抑制のための新しい生物防除剤に関する。
【技術分野】
【０００２】
従来技術の説明
世界中の、半湿潤および湿潤な穀物生産地域全域にわたり、赤カビ病（ＦＨＢ）は、小麦および大麦の深刻な病気である（ＭｃＭｕｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，Ｓｃａｂ  ｏｆ  ｗｈｅａｔ  ａｎｄ  ｂａｒｌｅｙ：  ａ  ｒｅ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｏｆ  ｄｅｖａｓｔａｔｉｎｇ  ｉｍｐａｃｔ．  Ｐｌａｎｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ，  ８１，  １３４０−１３４８；  ａ  ｒｅ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｏｆ  ｄｅｖａｓｔａｔｉｎｇ  ｉｍｐａｃｔ  ．  Ｐｌａｎｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ，  ８１，  １３４０−１３４８；  Ｍｕｔｈｏｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｋｅｎｙａｎ  ｗｈｅａｔ  ｖａｒｉｅｔｉｅｓ  ｔｏ  ｈｅａｄ  ｂｌｉｇｈｔ，  ｆｕｎｇａｌ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，  １５０，  ３０−３６；  Ｙｕ．  Ｇａｇｋａｅｖａ  ａｎｄ  Ｙｌｉ−Ｍａｔｔｉｌａ，  ２００４，  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ  ｉｎ  Ｅｕｒｏｐｅ  ａｎｄ  Ａｓｉａ，  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，  １１０，  ５５１−５６２）。ＦＨＢは、まず始めに赤カビ病Ｓｃｈｗａｂｅグループ２（Ａｏｋｉ  ａｎｄ  Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，  １９９９，  Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ  ｓｐ．  ｎｏｖ．，  ｆｏｒｍｅｒｌｙ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ａｓ  ｔｈｅ  Ｇｒｏｕｐ  １  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆ．  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ，  Ｍｙｃｏｌｏｇｉａ，  ９１，  ５９７−６０９）  （完全時代＝ジベレラ・ゼアエ（ｐｅｒｆｅｃｔ  ｓｔａｔｅ  ＝  Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｚｅａｅ）（Ｓｃｈｗｅｉｎ．）  Ｐｅｔｃｈ）によって引き起こされる。穀物収率損失を引き起こすことに加えて、ジベレラ・ゼアエは、穀物品質（Ｃａｒｄｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｍｙｃｏｔｏｘｉｎｓ：ｔｈｅ  ｃｏｓｔ  ｏｆ  ａｃｈｉｅｖｉｎｇ  ｆｏｏｄ  ｓｅｃｕｒｉｔｙ  ａｎｄ  ｆｏｏｄ  ｑｕａｌｉｔｙ，    ＡＰＳ  Ｎｅｔ：  Ｆｅａｔｕｒｅ  ｓｔｏｒｙ  Ａｕｇｕｓｔ，  ２００１）および動物衛生（Ｍａｒａｓａｓ，  １９９１，  Ｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｆｕｓａｒｉａ，  ｉｎ：  Ｍｙｃｏｔｏｘｉｎｓ  ａｎｄ  Ａｎｉｍａｌ  Ｆｏｏｄｓ，  Ｊ．Ｅ．  Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｒ．Ｓ．  Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，  ｅｄｓ．，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  ＦＬ；  Ｂｅａｒｄａｌｌ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，  １９９４，  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ  ｗｉｔｈ  ｍｙｃｏｔｏｘｉｎｓ  ａｓ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｃａｕｓｅｓ，  ｉｎ  Ｍｙｃｏｔｏｘｉｎｓ  ｉｎ  Ｇｒａｉｎ：  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  Ｏｔｈｅｒ  ｔｈａｎ  Ａｆｌａｔｏｘｉｎ  （ＭＩＬＬＥＲ，  Ｊ．Ｄ．  ＆  ＴＲＥＮＨＯＬＭ，  Ｈ．Ｌ．，  Ｅｄｓ．）．  Ｅａｇａｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓｔ．Ｐａｕｌ，  ＭＮ，  ｐｐ．  ３８７−��９；  Ｐｅｓｔｋａ  ａｎｄ  Ｂｏｎｄｙ，  １９９４，  Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｍｙｃｏｔｏｘｉｎｓ，  ｉｎ  Ｍｙｃｏｔｏｘｉｎｓ  ｉｎ  Ｇｒａｉｎ：  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  Ｏｔｈｅｒ  ｔｈａｎ  Ａｆｌａｔｏｘｉｎ    （ＭＩＬＬＥＲ，  Ｊ．Ｄ．  ＆  ＴＲＥＮＨＯＬＭ，  Ｈ．Ｌ．，  Ｅｄｓ．）  Ｅａｇａｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓｔ．  Ｐａｕｌ，  ＭＮ，  ｐｐ．  ３３９−３５８）に悪影響を及ぼす可能性があるエストロゲン性ゼラレノン毒素（Ｆ−２）（Ｈｅｓｓｅｌｔｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７８，  Ｆｕｎｇｉ，  ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ  Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｚｅａｅ，  ａｎｄ  ｚｅａｒａｌｅｎｏｎｅ  ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｗｈｅａｔ．    Ｍｙｃｏｌｏｇｉａ，  ７０，  １４−１８）およびトリコテセン系デオキシニバレノール（ＤＯＮ，  ｖｏｍｉｔｏｘｉｎ）  （Ｓｎｉｊｄｅｒｓ，  １９９０，  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅａｄ  ｂｌｉｇｈｔ  ａｎｄ  ｍｙｃｏｔｏｘｉｎ  ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｗｈｅａｔ，  ａ  ｒｅｖｉｅｗ．    Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，  ９６，  １８７−１９８）などのマイコトキシンを生産する可能性がある。
【０００３】
穀物の生産および品質に対するＦＨＢの影響を減らすことは、やっかいな問題を残している。防カビ剤は、時にＦＨＢを減少させることもあるが（Ｗｉｌｃｏｘｓｏｎ，  １９９６，  Ｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅａｄ  ｂｌｉｇｈｔ，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｔｒｏｐｉｃａｌ  Ｐｌａｎｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ，  １４，  ２７−５０；  Ｓｕｔｙ  ａｎｄ  Ｍａｕｌｅｒ−Ｍａｃｈｎｉｋ，  １９９７，  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｅａｒ  ｂｌｉｇｈｔ  ｏｎ  ｗｈｅａｔ−ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｚｅａｅ，  ｔｈｅ  ｔｅｌｅｏｍｏｒｐｈ  ｏｆ  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ  ｗｉｔｈ  Ｆｏｌｉｃｕｒ，  ｉｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ４ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  （ＤＥＨＮＥ，  Ｈ．Ｗ．，  ＡＤＡＭ，  Ｇ．，  ＤＩＥＫＭＡＮＮ，  Ｍ．，  ＦＲＡＨＭ，  Ｊ．，  ＭＡＵＬＥＲ−ＭＡＣＨＮＩＫ  ＆  ＶＡＮ  ＨＡＬＴＥＲＥＮ，  Ｐ．，  Ｅｄｓ）．  Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ．，  ｐｐ．  ２４３−２４６；  Ｊｏｎｅｓ，  １９９９，  Ｓｅｅｄｌｉｎｇ  ｂｌｉｇｈｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｉｎ  ｓｐｒｉｎｇ  ｗｈｅａｔ  ｄａｍａｇｅｄ  ｂｙ  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ  Ｇｒｏｕｐ  ２．  Ｐｌａｎｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ，  ８３，  １０１３−１０１８）、殺菌剤耐性の報告および穀物中のデオキシニバレノール剤含有量の増加事例は、その使用による残存物が懸念されうる（Ｍａｕｌｅｒ−Ｍａｃｈｎｉｋ  ａｎｄ  Ｚａｈｎ，  １９９４，  Ｅａｒ  ｆｕｓａｒｉｏｓｅｓ  ｉｎ  ｗｈｅａｔ−ｎｅｗ  ｆｉｎｄｉｎｇｓ  ｏｎ  ｔｈｅｉｒ  ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｗｉｔｈ  Ｆｏｌｉｃｕｒ  （ｔｅｂｕｃｏｎａｚｏｌｅ）．  Ｐｆｌａｎｚｅｎｓｃｈｕｔｚ−Ｎａｃｈｒｉｃｈｔｅｎ  Ｂａｙｅｒ，  ４７，  １２９−１５５；  Ｒａｍｉｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓ  ｏｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ  ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｆｒｏｍ  Ａｒｇｅｎｔｉｎｉａｎ  ｗｈｅａｔ．  Ｃｒｏｐ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，  ２３，  １１７−１２５；  Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ，  ２０００，  Ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｗｈｅａｔ  ｈｅａｄ  ｓｃａｂ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎ  Ｃｈｉｎａ，  ｉｎ  Ｐｒｏｃ．  Ｉｎｔ．  Ｓｙｍｐ．  Ｗｈｅａｔ  Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｓｃａｂ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  （ＲＡＵＰＰ，  Ｗ．  Ｊ．，  ＭＡ，  Ｚ．，  ＣＨＥＮ，  Ｐ．  ＆  ＬＩＵ，  Ｄ．，  Ｅｄｓ．）．  Ｎａｎｊｉｎｇ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，  Ｊｉａｎｇｓｕ，  Ｃｈｉｎａ，  ｐｐ．  ２５８��２７３；  Ｇａｌｅ  ｅｔ  ａｌ，  ２００２，  Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ  ｆｒｏｍ  ｗｈｅａｔ  ｆｉｅｌｄｓ  ｉｎ  ｅａｓｔｅｒｎ  Ｃｈｉｎａ，  Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，９２，  １３１５−１３２２）。小穀物の抵抗性栽培品種もしくは解剖学上変種の開発は（Ｌｅｇｚｄｉｎａ  ａｎｄ  Ｂｕｅｒｓｔｍａｙｒ，  ２００４，  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅａｄ  ｂｌｉｇｈｔ  ａｎｄ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｙｃｏｔｏｘｉｎｓ  ｉｎ  ｇｒａｉｎ  ｏｆ  ｈｕｌｌｅｓｓ  ａｎｄ  ｃｏｖｅｒｅｄ  ｂａｒｌｅｙ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｒｅａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ４０，  ６１−６７）、ＦＨＢの減少が期待できるが、理想的な農学的形質を持った高い抵抗性栽培品種はまだ開発されていない（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，  １９９４；  Ｂｕｓｈｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｃｅｒｅａｌｓ，  Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，  ２０，  １３７−１４９；  Ｂａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ  ｉｎ  ｗｈｅａｔ，  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  １００，  １−８）。ジベレラ・ゼアエの遺伝子学的な多様性は（Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  Ｇｅｎｅａｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｎｃｏｒｄａｎｃｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  ｍａｔｉｎｇ  ｔｙｐｅ  ｌｏｃｕｓ  ａｎｄ  ｓｅｖｅｎ  ｏｔｈｅｒ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｇｅｎｅｓ  ｓｕｐｐｏｒｔｓ  ｆｏｒｍａｌ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｉｎｅ  ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｉｕｍ  ｃｌａｄｅ，  Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ４１，  ６００−６２３；  ＭｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  Ｂａｒｒａｇｅ  ｚｏｎｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅｌｙ  ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ  （Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｚｅａｅ）  ｉｓｏｌａｔｅｓ．  Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，  ９４，  ４３２−４３７；  Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ａｍｏｎｇ  ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｏｆ  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅａｄ  ｂｌｉｇｈｔ  ｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ，  Ｐｌａｎｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ，８５，  ４０４−４１０；  Ｃｕｍａｇｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｚｅａｅ  （Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）  ｔｏｗａｒｄ  ｗｈｅａｔ，  Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，  ９４，  ５２０−５２６）、防カビおよび抵抗栽��品種の効果の予想耐久性について懸念をもたらす。畑の慣行耕起は、病原体接種の産生の減少およびそれに付随してＦＨＢの減少に部分的に効果的であるが、（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔｉｌｌａｇｅ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｎ  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅａｄ  ｂｌｉｇｈｔ  ｏｆ  ｗｈｅａｔ，  Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，  ２０，  ９５−１０３；  Ｄｉｌｌ−Ｍａｃｋｙ  ａｎｄ  Ｊｏｎｅｓ，  ２０００，  Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｐｒｅｖｉｏｕｓ  ｃｒｏｐ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ａｎｄ  ｔｉｌｌａｇｅ  ｏｎ  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅａｄ  ｂｌｉｇｈｔ  ｏｆ  ｗｈｅａｔ，  Ｐｌａｎｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ，  ８４，  ７１−７６；  Ｐｅｒｅｙｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  Ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎｄ  ｉｎｏｃｕｌｕｍ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｚｅａｅ  ｉｎ  ｗｈｅａｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ，  Ｐｌａｎｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ，  ８８，  ７２４−７３０）、土壌保全のためには、最小耕作が好適な農作業である。接種材料の長距離拡散および多毛作が病原体の代替宿主として作用する可能性を考えると（Ｃｈｏｎｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｅｄｌｉｎｇ  ｒｏｏｔｓ  ｏｆ  １４  ｃｒｏｐ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｔｏ  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ  ｆｒｏｍ  ｗｈｅａｔ  ｈｅａｄ，  Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，  ２３，  １３２−１３７）、輪作は支持できない解決法である。
【０００４】
ＦＨＢの生物学的防除は、１９９０年代半ば以降、かなりの関心を引き付けており、また大幅な進歩がもたらされている（Ｐｅｒｏｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６，  Ｃｏｎｔｒｏｌｅ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃｏ  ｄａ  ｇｉｂｅｒｅｌａ  ｄｏ  ｔｒｉｇｏ，  Ｆｉｔｏｐａｔｏｌｏｇｉａ  Ｂｒａｓｉｌｉｅｒａ，  ２１，  ２４３−２４９；  Ｂｕｊｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈａｅｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．  ｏｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｒｉｔｈｅｃｉａ  ａｎｄ  ａｓｃｏｓｐｏｒｅｓ  ｏｆ  Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｚｅａｅ，  Ｐｌａｎｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ，  ８５，  ９７７−９８４；  Ｓｃｈｉｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅａｄ  ｂｌｉｇｈｔ  ｏｆ  ｗｈｅａｔ  ａｎｄ  ｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  ｇｒａｉｎ  ｖｉａ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ，  ｉｎ    Ｍｙｃｏｔｏｘｉｎｓ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  Ｓａｆｅｔｙ  （ＤｅＶＲＩＥＳ，  Ｊ．Ｗ．，  ＴＲＵＣＫＳＥＳＳ，  Ｍ．Ｗ．  ＆  ＪＡＣＫＳＯＮ，  Ｌ．Ｓ．，  Ｅｄｓ．）．  Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐｐ．  ５３−６９；  ｄａ  Ｌｕｚ  ｅｔ  ａｌ，  ２００３，  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ，  ｉｎ  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅａｄ  ｂｌｉｇｈｔ  ｏｆ  ｗｈｅａｔ  ａｎｄ  ｂａｒｌｅｙ  （ＬＥＯＮＡＲＤ，  Ｋ．Ｊ．  ＆  ＢＵＳＨＮＥＬＬ，  Ｗ．Ｒ．，  Ｅｄｓ．）  ＡＰＳ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓｔ．  Ｐａｕｌ，  ＭＮ，  ３８１−３９４；  Ｇｉｌｂｅｒｔ  ＆  Ｆｅｒｎａｎｄｏ．  ２００４，  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｚｅａｅ  （ａｎａｍｏｒｐｈ  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）．  Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，  ２６，  １−９）。民衆の支持、他の疾病管理尺度との互換性、および耐久性は全て、ＦＨＢの生物学的抑制のための戦略開発の好適な支援要因である。
【０００５】
Ｓｃｈｉｓｌｅｒら（米国特許第６，５６２，３３７号）は、ＦＨＢ抑制可能な優性アンタゴニストである４つの酵母と１つの細菌の分離について説明した。これらの微生物は、小麦の葯から採取されており、ｔｈｅ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＮＲＲＬ）の受入番号ＮＲＲＬ  Ｙ‐３０２１６に保管されていたクリプトコッカス・フラベセンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）ＯＨ１８２．９（当初Ｃ．ｎｏｄａｅｎｓｉｓに分類されていた）酵母が含まれる。近年、Ｓｃｈｉｓｌｅｒらは、ＦＨＢに対する生物学的防除剤としての微生物のコリン活用株の選定を公開した（２００６，  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｃｈｏｌｉｎｅ−ｍｅｔａｂｏｌｉｚｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｔｏ  ｒｅｄｕｃｅ  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅａｄ  ｂｌｉｇｈｔ，  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ，  ３９，  ４９７−５０６）。
【０００６】
ＦＨＢの生物学的防除剤の開発のための努力は効果があったが、化学防カビ剤の開発と使用も、穀物におけるＦＨＢ減少のための薬剤において、有益な手段にとどまっている。ごく最近では、殺菌性化学プロチオコナゾールはＦＨＢの減少のための小麦の開花期における使用に関して免責資格を獲得した。
【０００７】
しかし、これらおよび他の進歩にもかかわらず、需要は依然として、ＦＨＢ生物学的防除における使用のための改良微生物にある。
【発明の概要】
【０００８】
我々はフザリウム・グラミネアラム（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）の優性アンタゴニストであるクリプトコッカス・フラベセンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）の新種株を発見した。これらの微生物は穀物において、とりわけ小麦と大麦におけるＦＨＢの抑制と制御に効果的である。本発明の株は前述クリプトコッカス・フラベセンス（Ｃ．ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）ＯＨ１８２．９（ＮＲＲＬ−Ｙ−３０２１６）のプロチオコナゾール耐性変異体である。なお、これらのプロチオコナゾール耐性変異体は親株ＯＨ１８２．９と比べ、フザリウム・グラミネアラム（Ｆ．  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）に対し有意な効果増強を驚くほど示す。
【０００９】
この発見における、本発明の目的は、小麦と大麦の先端にある大量のフザリウム・グラミネアラム（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）を抑制する新微生物株を提供することである。
【００１０】
本発明の別の目的は、小麦と大麦の先端にあるフザリウム・グラミネアラム（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）を抑制するのに効果的で、殺菌剤プロチオコナゾールへの耐性もある新微生物株を提供することである。
【００１１】
本発明のさらなる目的は、小麦と大麦の先端にあるフザリウム・グラミネアラム（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）を制御するのに効果的で、殺菌剤プロチオコナゾールとその派生物と合わせて塗付することもできる新微生物株を提供することである。
【００１２】
本発明のこの目的また他の目的は、次の解説より容易に明らかになる。
生物由来の沈殿物
【００１３】
クリプトコッカス・フラベセンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）の２つのプロチオコナゾール耐性株である、ＯＨ１８２．９変異３ＣとＯＨ１８２．９変異４Ｃは、米国の農業研究サービス機関の系統保存（ＮＲＲＬ）、１８１５  Ｎ．Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｔ．、ピオリア、ＩＬ、６１６０４、ＵＳＡ、におけるブダペスト条約のもと５月２１日、２０１０年に沈着しており、それぞれ受入番号ＮＲＲＬ  Ｙ−５０３７８とＮＲＲＬ  Ｙ−５０３７９として割り当てられている。株はクリプトコッカス・フラベセンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）の形態学的、かつ、文化財特徴を示す酵母であり、そしてその性質は、基本方法（Ｏｋｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６，  Ｃｒｙｐｔｏｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ａｎａｃａｒｄｉｉ新属、新種、ニガー種子寒天上のメラニンを形成しうるナイジェリア連邦共和国産新トリコスポロンのようなカプセル入りの担子菌類の酵母．  ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ，７：３３９−３５０）を使用して、２６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＤ１／Ｄ２  領域とｒＲＮＡ遺伝子のＩＴＳ  １＋２  ｒｅｇｉｏｎｓを使った配列間隔分析により確認された。系統発生ツリーは未矯正（‘ｐ’）置換モデルとの近隣結合、配列間隔を使用し構築され、アラインメントギャップは文字落ちとされ、全ての文字は非順序かつ同重量であった。ブートストラップ値は１００反復を基準とした。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の目的として、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）という用語の使用は、この有機体の有性（テレオモルフィック）段階と無性（アナモルフィック）段階の両方を含むことが意図されることが理解され、その上、さらにそれぞれ完全・不完全な菌の段階としてもみなされた。例えば、ジベレラ・ゼアエ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｚｅａｅ）のアナモルフィック段階はＦＨＢの原因となる物質、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）として知られる。この病気は、花もしくは先端（更別称、種子の先端）が不完全形態により生産された分生子、もしくは、接種発生後に接種された先端の感染症を用いてこの菌の完全形態により生産された子嚢胞子を接種されようになる結果である。
【００１５】
この中で「優れたアンタゴニスト」という表現は、微生物が統計的有意なレベルで、主題の株による無治療対照群の異常な赤かび病の誘発の抑制度あいを示すことに準拠して使用される。
【００１６】
この中で穀物という用語は、通常ＦＨＢの影響を受けやすいいずれかの穀物種について意味している。小麦や大麦はこの病気が示す大きな経済問題である２つの作物ではあるが、小麦、大麦、オート麦、ライ小麦が影響を受けやすいと報告される穀物として含まれる。これらの穀物のいずれもＦＨＢの制御の標的の種としてよい。
【００１７】
フザリウム・グラミネアラム（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）は開花期から先端成長のソフト・ダフ・ステージにかけて、穀物用植物の先端（花先端、種子の先端、もしくは穂）に最初に感染する。Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍの発芽した分生子もしくは子嚢胞子が、ホストの感染とＦＨＢの兆候の発達を開始するために葯と結合組織を貫通する。
【００１８】
本発明のフザリウム・グラミネアラム（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）アンタゴニストは、（米国特許第６，５６２，３３７号）をここで参照されることより組み込まれる内容で前述されるクリプトコッカス・フラベセンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）ＯＨ１８２．９  （ＮＲＲＬ  Ｙ−３０２１６，かつてはＣ．ｎｏｄａｅｎｓｉｓとして特定）により誘導された変異株である。クリプトコッカス・フラベセンス（Ｃ．ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）ＯＨ１８２．９は、穀物におけるＦＨＢの減少に効果的であるが、残念ながら低濃度の殺菌剤プロチオコナゾールだけでも影響を受ける。この感度はプロチオコナゾールで処理されるかさらに処理されるかの分野のＦＨＢに対するＣ．ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓの応用に限られている。我々は現在、親ＯＨ１８２．９に比べ、有意にプロチオコナゾール（プロチオコナゾールの存在下において成長することができる）への耐性を示すＣ．ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ  ＯＨ１８２．９の変異もしくは突然変異体が生産されるかもしれないことを発見している。また、驚くことに、少なくともいくつかのプロチオコナゾール耐性株は優れたフザリウム・グラミネアラム（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）のアンタゴニストであることと、ＦＨＢに対し親クリプトコッカス・フラベセンス（Ｃ．ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）ＯＨ１８２．９よりも大きな優れた有効性を示すことを発見した。
【００１９】
本発明のプロチオコナゾール耐性株は、プロチオコナゾールの増大濃度に酵母をさらす、持続的に一連の培養事象を使用して生産される。その例で今まで以上に詳しく説明されるように、親クリプトコッカス・フラベセンス（Ｃ．ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）ＯＨ１８２．９は、４ｐｐｍのプロチオコナゾールに至る少なくとも微量濃度と望ましくは約１ｐｐｍのプロチオコナゾールとを配合するニュートリエント培地で栽培され、成長を示している株は高濃度のプロチオコナゾールの培養に選択される。その工程は、少なくとも約２ｐｐｍから約１０ｐｐｍまでのプロチオコナゾール、好ましくは約５ｐｐｍのプロチオコナゾールを配合する栄養素媒体で成長可能な株を最終的に選出するため、殺菌剤の段階的増大濃度で培養された選出株と共に報告される。
【００２０】
回収されたプロチオコナゾール耐性クリプトコッカス・フラベセンス（Ｃ．ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）株を、望ましい穀物用植物、好ましい小麦におけるＦＨＢの重大性の減少有効性をその後検査する。つまり、プロチオコナゾール耐性変異体はフザリウム・グラミネアラム（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）の分生子を接種した穀物用植物の種子先端に導入された酵母の細胞内の植物生物学的検定を通過する。ある好適な実施形態においては、フザリウム・グラミネアラム（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）は固形化成長媒体で生産され、収穫した接種材料のレベルはおおよそ約１０４〜１０６分生子／ｍｌとなるべきであり、好ましくは水性の懸濁液の約１０５分生子／ｍｌである。媒体もしくは適切な緩衝材におけるプロチオコナゾール耐性酵母アンタゴニストの細胞は約１０７〜１０８ｃｆｕ／ｍｌレベルに導入される。ある本発明の実施形態では、フザリウム・グラミネアラム（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）の分生子と試験株の細胞は、弱リン酸塩緩衝材で結合され、約１０μＬの懸濁液は植物の種子先端の接種に用いられる。そして植物は菌による感染をもたらす１００％相対湿度に近い状況下で約３日間培養される。病気の進行が顕著となるのに十分な期間を経た後（通常、約２週間の接種を要す）、酵母変異を種子の先端の処理に使用し、それはＦＨＢの目立った兆候を低下させ、後続の評価のために選択された。
【００２１】
上述された植物生物学的検定に選ばれたプロチオコナゾール耐性酵母変異は随意に１番目のものに類似したより高度な反復する植物の種子先端の生物学的検定である２番目のものに依存する。酵母は適切な媒体で、生物学的検定での使用で大幅に拡大するまで再成長する。しかしながら、この第２の植物生物学的検定において、この実践が工場内で広く使用されるに続いて株が液体培養で株が成長するより好ましく、液体培養の状況下で成長する際に、アンタゴニストは生物学的効率を示さなければならない。個々の株の細胞とフザリウム・グラミネアラム（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）の懸濁液の分生子を含むコロニー化した培養液は前述されたように種子の先端の接種に使用する。細胞と分生子の懸濁液は接種に先立って前結合することができる。１番目の植物生物学的検定と同様に、種子の先端の処理に使用され、ＦＨＢの可視症状を減少させる酵母変異は、対象アンタゴニストとして選択される。
【００２２】
フザリウム・グラミネアラム（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）統制におけるアンタゴニストの有効性の確認は、開花植物がＦ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍの分生子との接種前、最中又はその後の試験株の細胞とともに取り扱われる、大規模な温室調査または現地調査においてされ得る。本植物処置はｂｏｎａ  ｆｉｄｅ  フィールド適用として同様の方式で処理され得る。
【００２３】
ＯＨ１８２．９のプロチオコナゾール耐性変異体は、原系統および変異系細胞が比較溶培分裂法を用いて生産された際に、プロチオコナゾール耐性変異体が、疾病重症度症候群を少なくとも５０％、または、小麦についての複製温室または社会実験において原系統よりも少なくとも２５％それぞれ減少した場合、野生型ＯＨ１８２．９原系統よりも優勢であると決定される。疾病重症度は、個々の小麦先端の表面部の平均比率を算出することで決定される、またそれはＦ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍによる感染の兆候を示す。
【００２４】
前述の方法を用いて、我々は優勢ＦＨＢアンタゴニストの２種の新種プロチオコナゾール耐性株に分離する：クリプトコッカス・フラベセンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、ＯＨ１８２．９変異３ＣおよびＯＨ１８２．９変異４Ｃである。本方法が、穀物用植物においてＦＨＢを減少するためにより大きな有効性を示す、クリプトコッカス・フラベセンス（Ｃ．  ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）  ＯＨ１８２．９のプロチオコナゾール耐性変異体をさらに分離する為に繰り返さるかもしれないと想定される。
【００２５】
本クリプトコッカス・フラベセンス（Ｃ．  ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）ＯＨ１８２．９のプロチオコナゾール耐性変異体は通常、炭素源、窒素源および微生物による吸収可能な無機塩類や効果的な細胞成長の支持を含む媒体の有酸素液体培養中に、培養される。望ましい炭素源はグルコースのようなヘキソースだが、他のアミノ酸のような吸収可能な原料は置き換えられてもよい。多くの無機やタンパク性物質は成長過程中の窒素源として使用されるかもしれない。
好ましい窒素源はアミノ酸または尿素だが、その他は気体アンモニア、無機硝酸塩や無機アンモニウム塩、ビタミン、プリン、ピリミジン、酵母エキス、牛肉エキス、プロテオースペプトン、大豆ミール、カゼインの加水分解質、醸造用可溶性物質などを含有する。これらの無機鉱物の中、培養液中に合体し得るのは、カルシウム、亜鉛、鉄、マンガン、マグネシウム、銅、コバルト、カリウム、ナトリウム、モリブデン酸塩、リン酸塩、硫酸塩［エステル］、塩化物、ホウ酸塩、またイオンの様な柔軟な能力を有する通例の塩類である。
【００２６】
本発明の酵母において、細胞成長が気温１〜３６度で達成され、選択温度は１５〜３度の範囲におかれた。培養液のｐＨは４と９の間で変化し得るが、望ましい動作範囲はｐＨ６から８である。通常、最大細胞生産量は、植菌後２０〜７２時間で得られる。
【００２７】
これより以下により詳細に論じるように、ＦＨＢの抑制は、穀物用植物の先端（種子の先端としても見なされる）へのＣ．ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ  ＯＨ１８２．９のプロチオコナゾール耐性変異体の、一つまたはそれより多い塗布によって達成されるかもしれない。次の用語「先端」または「種子の先端」は、種または原系統種子を含む穂を参照とする。アンタゴニストは、無治療対照群に関するＦＨＢのレベルを減少するために影響を及ぼす量で塗布される。
【００２８】
上述のプロチオコナゾール耐性変異体は単体で使われた際に影響を及ぼすが、任意だが望ましい実施形態中で、それらは他の周知の化学物質またはＦＨＢに対する生物学的駆除剤との組み合わせで塗布される。
上で述べたように、それらのプロチオコナゾールへの耐性のため、変異体が、プロチオコナゾールまたはその派生物との組み合わせで塗布されるかもしれない。あるいは、その変異体は、プロチオコナゾールまたはその派生物とは別々に取り扱われているか取り扱われる穀物用植物に塗布されるかもしれない。他の生物学的駆除剤の多様性はここでの使用と含有に適しているが、Ｐｅｒｏｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９６年（同上所収）、Ｂｕｊｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．２００１年（同上所収）、Ｓｃｈｉｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００２年（同上所収）、ｄａ  Ｌｕｚ  ｅｔ  ａｌ．２００３年（同上所収）、Ｇｉｌｂｅｒｔ  ＆  Ｆｅｒｎａｎｄｏ２００４年（同上所収）、また、Ｓｃｈｉｓｌｅｒｅｔ  ａｌ．による米国特許ネットワーク・オペレーティング・システム６，５６２，３３７および６，３１２，９４０、米国特許出願申請第１１／６４０，０９１号、分野２００６年１２月１５日、この参照によって援用される全ての内容により、発表されたそれらに限定されない。微生物アンタゴニストとの組み合わせで使うことが以下に発表された、Ｓｃｈｉｓｌｅｒの米国特許と係属中の特許出願、具体的にＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．（ＮＲＲＬ  Ｂ−３０２１０）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．（ＮＲＲＬ  Ｂ−３０２１１）、Ｔｏｒｕｌａ  ａｕｒｅｓ  （近年、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓと改名した）（ＮＲＲＬ  Ｙ−３０２１３）、未確認の酵母（ＮＲＲＬ  Ｙ−３０２１４）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  （ＮＲＲＬ  Ｂ−３０２１２）そしてＴｏｒｕｌａ  ｓｐ．  （近年、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕと改名した）（ＮＲＲＬ  Ｙ−３０２１５）。これらの付加的なアンタゴニストは本発明のアンタゴニストと共に塗布されるかもしれない、このような混合物中に、それらは別々にもしくは異なった時に塗布されるかもしれない。
【００２９】
本発明のプロチオコナゾール耐性変異体は、いずれの従来の方法によっても、穀物の先端へ塗布され得る。例えば、それらは水性噴霧として、水和剤として、もしくは粉末として塗布され得る。製剤はこれらの塗布形態に対して設定されており、通常は他の補助的な湿潤剤や付着剤等と共に適切な液体もしくは  固形担体を含む。でんぷん、多糖類、ナトリウム・アルギン酸塩、セルロース等はしばしば担体や付着剤としての製剤で使用される。
【００３０】
「有効量」や「抑制量」といった用語は、以下に述べる適切な条件下で、無治療対照群に生じることに関連する疾病レベル削減のために必要なアンタゴニスト治療量を参照してこれ以降使用される。
液体製剤の塗付の実際の比率は通常、最低、約１×１０３から約１×１０１０生細胞／ｍｌで、約１×１０６から約５×１０９生細胞／ｍｌが好ましい。
たいていの条件下で、本発明における株は、以下の例に表されるように、以下、約１×１０６から１×１０９生細胞／ｍｌの範囲で、塗布率に最適な影響を及ぼし、塗付様式を仮定すれば、実質上、小麦の先端の少なくとも約５０％に均一な接触が得られる。もしアンタゴニストが固形製剤として塗布されると、固形製剤の塗布率は、前述の液体治療率によって得られた、穀物の先端表面部のユニット毎の生細胞の比較数をもたらすことを導くよう制御されるべきである。
【００３１】
アンタゴニストは約５°Ｃから３５°Ｃの範囲で影響を及ぼすと想定される。選択温度範囲は１５〜３０°Ｃで、最適範囲は１８〜２８°Ｃであると考えられる。
【００３２】
アンタゴニストは、穀物成長におけるブート・ステージ後またはハード・ダフ・ステージ前のいかなるときにおいても、理論上、種子の先端に塗布され得る。穀物の先端は、開花の始まり（開花期）から核種成長のソフト・ダフ・ステージを通じて、Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ  によって、感染の影響のみを受けやすい。それ故に、生物学的駆除剤の塗布における最適な時期は、直接先行開花期から、遅くとも核種成長のソフト・ダフ・ステージまでである。開花以前の先端へのアンタゴニストの塗布は、小麦の先端が感染症を起こしやすくなるのに先立って、アンタゴニストが小麦の先端部にコロニーを作ることを可能にする。加えて、コロニーを作るために、また小さい花から現れる葯を守るために、アンタゴニストの位置は良い位置に設定されるだろう。しかしながら、もし、開花開始後、しかし成長のハード・ダフ・ステージ以前に塗布すると、アンタゴニストがまだ影響を及ぼすと期待されていた。しかし、長時間の遅延が、細胞製剤や塗布の方法によっては治療効果を減少するかもしれないと予想された。
【００３３】
下記の実施例は本発明をさらに説明するものであり、請求項によって定義される本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１
【００３４】
赤カビ病アンタゴニストクリプトコッカス・フラベセンスＯＨ１８２．９（ＮＲＲＬ  Ｙ−３０２１６）のプロチオコナゾール耐性変異体を生産するために、株の純粋培養を−８０℃で保存された１０％の株のグリセロールストックから１／５強度のトリプシン大豆ブロス寒天（ＴＳＢＡ）上で始めた。２５℃で２４時間増殖後、細胞を約０．１００の初期光学濃度（Ａ６２０）を得るために、５０ｍｌ三角フラスコの殺菌剤プロチオコナゾール（ＰＴＣ）１ｐｐｍの含まれた１／５強度のトリプシン大豆ブロス（ＴＳＢ）１０ｍｌに移した。フラスコを２５０ｒｐｍで振動させ２５℃で５日間培養後、１／５ＴＳＢＡ＋１ｐｐｍＰＴＣの上に平板培養した。２５℃で数日間培養後に、コロニーの大部分より大きいサイズが得られた数個のコロニーが含まれたプレートを１／５ＴＳＢＡ＋１ｐｐｍＰＴＣ培地で生産した。それらのコロニーの中から４つを１／５ＴＳＢＡ＋１ｐｐｍＰＴＣで精製するために選んで筋状にした。それら４つの推定ＰＴＣ変異体の液体培養増殖工程は、液体および固体媒体のＰＴＣ濃度を段階的に５ｐｐｍの最終濃度まで増加するのを４〜５回繰り返され、各４つの分離変異列から生産された最大のコロニーが、わずかに高いＰＴＣ濃度を含む液体培養で次の増殖サイクルを始めるために選ばれた。
【００３５】
各４つの変異列は、以下のような温室試験における小麦の赤カビ病の削減効果に基づいて、ＯＨ１８２．９の野生型原系統と同等に評価された。硬質赤色春小麦（ノルム培養品種）を、温室作業台で植物バイオアッセイを行う前に植物成長室で栽培した。原系統ＯＨ１８２．９とＰＴＣＴ変異体１Ｃ、３Ｃ、４Ｃおよび５Ｃとのバイオマスを非バッフル、２５０ｒｐｍ、２．５ｃｍの軌道、２５℃で７２時間インキュベートし、使用する前に１／４強度にｄＨ２Ｏで希釈した２５ｍｌの液体培地（ＳＤＣＬ、Ｓｌｉｎｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ２００３．  Ｐｏｓｔｈａｒｖｅｓｔ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｐｏｔａｔｏ  ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ  ｂｙ  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｄｒｙ  ｒｏｔ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ．  Ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  １３：４７７−４９４）が入った１２５ｍｌ三角フラスコで生産した。ＦＨＢ病原体ジベレラ・ゼアエ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｚｅａ）株Ｚ−３６３９を２４℃、１２ｈ／ｄａｙｓで蛍光灯を７日間照射の下、Ｖ８分泌液寒天上で浄化し生産した。小麦開花期において、
ＯＨ１８２．９の細胞を、分生子懸濁液（３×１０４分生子／ｍｌ）の霧塗布の後、ただちに一処置あたり１４程度の小麦頭部に吹き付けた。頭部は分生子懸濁液が「病原体のみ」対照を努めた後、水で処理した。植物は湿気のあるテントの中に３日間置かれ、１６日後の疾病重症度とＰＴＣが含まれない１／５ＴＳＢの対数成長率が記録された。疾病重症度はＦ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍによる感染の兆候で示された、個々の穀物先端部の表面部の平均比率を計算することにより決定した。その変異列を１／５ＴＳＢ＋５ｐｐｍＰＴＣ培地で培養した際に得た１ｍｌあたり（ｃｆｕ／ｍｌ）の全体のコロニー形成単位についても比較した。ＯＨ１８２．９の原系統は、ＯＨ１８２．９の全ＰＴＣ耐性変異体が５×１０７ＣＦＵ／ｍｌ過剰に生産される間はこの培地では成長しない。
【００３６】
クリプトコッカス・フラベセンス（Ｃ．ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）ＯＨ１８２．９  ３Ｃおよび４Ｃのプロチオコナゾール耐性変異体は親株ＯＨ１８２．９より大きな有効性を顕著に示し、さらに持続された。結果を表１−３に示す。
【００３７】
なお、上記の詳細な説明は単に具体例であり、本発明の精神と範囲から逸脱しない範囲で改良および変更してもよい。
【００３８】
【表１】
0005889789.tif 000002
ａ列内で、手段は同じ文字が大きく異なると続かない。（Ｐ≦０．０５、ボンフェローニ分離手段）
ｂＤＳ＝疾病重症度、ＤＩ＝疾病の発生、１００Ｋｗｔ＝１００粒重
ｃプロリン＝プロチオコナゾール市販製剤を５ｏｚ／ａｃｒｅの割合で等しく塗付、ＯＨ１８２．９ＷＴ＝ＯＨ１８２．９の野生型株
【００３９】
【表２】
0005889789.tif 000003
ａ列内で、手段は同じ文字が大きく異なると続かない。（Ｐ＜０．０５ボンフェローニ分離手段）
ｂＤＳ＝疾病重症度、ＤＩ＝疾病の発生、１００Ｋｗｔ＝１００粒重、ＤＯＮ＝デオキシニバレノール
ｃプロリン＝プロチオコナゾール市販製剤を５ｏｚ／ａｃｒｅの割合で等しく塗付、ＯＨ１８２．９ＷＴ＝ＯＨ１８２．９の野生型株
【００４０】
【表３】
0005889789.tif 000004
ａ縦列内で、同じ文字が続く、もしくは続かない平均は、有意差がある。（Ｐ＜０．０５  Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ分離手段）
ｂＤＳ＝疾病重症度、ＤＩ＝疾病の発生、ＦＤＫ＝フザリウム被害粒、Ｙｉｅｌｄ＝１エーカー当たり、ブッシェルで表わす収穫高、ＴＷＴ＝１ブッシェル当たり、パウンドで表す試験重量、ＤＯＮ＝デオキシニバレノール
ｃプロリン＝５ｏｚ／ａｃｒｅ相当の用量で適用された市販のプロチオコナゾール製剤、ＯＨ１８２．９ＷＴ＝野生型ＯＨ１８２．９株
保管された微生物もしくは他の生物学的物質に関する表示
保管日：             ２０１０年５月２１日
受入番号：           ＮＲＲＬ  Ｙ−５０３７８
ＮＲＲＬ  Ｙ−５０３７９
保管期間の名称および住所：
Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＮＲＲＬ）
１８１５  Ｎ．  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｔｒｅｅｔ
Ｐｅｏｒｉａ，  ＩＬ，  ６１６０４  
Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ
保管日：      １９９９年９月７日
受入番号：    ＮＲＲＬ  Ｂ−３０２１０
ＮＲＲＬ  Ｂ−３０２１１
ＮＲＲＬ  Ｂ−３０２１２
ＮＲＲＬ  Ｙ−３０２１３
ＮＲＲＬ  Ｙ−３０２１４
ＮＲＲＬ  Ｙ−３０２１５
ＮＲＲＬ  Ｙ−３０２１６
保管期間の名称および住所：
Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＮＲＲＬ）
１８１５  Ｎ．  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｔｒｅｅｔ
Ｐｅｏｒｉａ，  ＩＬ  ６１６０４
Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ