(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
0005889912.tif 000030
から選択される化合物であって、
Ｌは、
0005889912.tif 000031
Ｅは、
0005889912.tif 000032
ｎは２、３、４、５、又は６であり；
ｍは２、３、又は４であり；及び
ｑは０又は１である化合物。
【請求項２】
Ｌが、
0005889912.tif 000033
である請求項１の化合物。
【請求項３】
ｎが５である、請求項２の化合物。
【請求項４】
Ｌが、
0005889912.tif 000034
である請求項１の化合物。
【請求項５】
ｎが４及びｍが３である、請求項４の化合物。
【請求項６】
構造、
0005889912.tif 000035
を有する請求項１の化合物。
【請求項７】
構造、
0005889912.tif 000036
を有する請求項１の化合物。
【請求項８】
構造、
0005889912.tif 000037
を有する請求項１の化合物。
【請求項９】
構造、
0005889912.tif 000038
を有する請求項１の化合物。
【請求項１０】
式Ｉａ又はＩｂ
0005889912.tif 000039
から選択される抗体−薬剤コンジュゲートであって：
Ｌは、
0005889912.tif 000040
ｎは２、３、４、５、又は６であり；
ｍは２、３、又は４であり；
ｑは０又は１であり；
ｐは１から４であり；及び
Ａｂは抗体である抗体−薬剤コンジュゲート。
【請求項１１】
構造
0005889912.tif 000041
から選択される、請求項１０の抗体−薬剤コンジュゲート。
【請求項１２】
抗体が、遊離システインアミノ酸を通してリンカー（Ｌ）にコンジュゲートしたシステイン操作抗体（Ａｂ）である、請求項１０の抗体−薬剤コンジュゲート。
【請求項１３】
システイン操作抗体の遊離システインアミノ酸が重鎖のＡ１１８Ｃ（ＥＵ番号付け）である、請求項１２の抗体−薬剤コンジュゲート。
【請求項１４】
システイン操作抗体の遊離システインアミノ酸が軽鎖のＶ２０５Ｃ（Ｋａｂａｔの番号付け）である、請求項１２の抗体−薬剤コンジュゲート。
【請求項１５】
システイン操作抗体が遊離のシステインアミノ酸及び配列番号１−４９から選択される重鎖の配列又は配列番号５０−９８から選択される軽鎖の配列を含み、該配列中のシステインが遊離のシステインアミノ酸である、請求項１２の抗体−薬剤コンジュゲート。
【請求項１６】
システイン操作抗体が
（ｉ）システイン操作抗体をコードする核酸配列を変異誘発し；
（ｉｉ）システイン操作抗体を発現し；及び
（ｉｉｉ）システイン操作抗体を単離し精製すること
を含む工程により調製される請求項１２に記載の抗体−薬剤コンジュゲート。
【請求項１７】
システイン操作抗体が、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、及びＦａｂ断片から選択される、請求項１２に記載の抗体−薬剤コンジュゲート。
【請求項１８】
システイン操作抗体が親抗体の一以上のアミノ酸残基を一以上の遊離システインアミノ酸と置換することを含む工程により調製され、親抗体が抗原に選択的に結合し、かつシステイン操作抗体が親抗体と同じ抗原に選択的に結合する、請求項１２に記載の抗体−薬剤コンジュゲート。
【請求項１９】
抗体がレセプター（１）−（５１）：
（１）ＢＭＰＲ１Ｂ（骨形成タンパク質レセプタータイプＩＢ型）；
（２）Ｅ１６（ＬＡＴ１，ＳＬＣ７Ａ５）；
（３）ＳＴＥＡＰ１（前立腺の６回膜貫通型上皮抗原）；
（４）０７７２Ｐ（ＣＡ１２５，ＭＵＣ１６）；
（５）ＭＰＦ（ＭＰＦ，ＭＳＬＮ，ＳＭＲ，巨核球増強因子、メソテリン）；
（６）Ｎａｐｉ３ｂ（ＮＡＰＩ−３Ｂ，ＮＰＴＩＩｂ，ＳＬＣ３４Ａ２，溶質輸送体ファミリー３４（リン酸ナトリウム），メンバー２，ＩＩ型ナトリウム依存性リン酸トランスポーター３ｂ）；
（７）Ｓｅｍａ５ｂ（ＦＬＪ１０３７２，ＫＩＡＡ１４４５，Ｍｍ．４２０１５，ＳＥＭＡ５Ｂ，ＳＥＭＡＧ，セマフォリン ５ｂ Ｈｌｏｇ，セマドメイン（ｓｅｍａ ｄｏｍａｉｎ），７回トロンボスポンジン反復（１型及び１型様），膜貫通ドメイン（ＴＭ）および短い細胞質ドメイン，（セマフォリン）５Ｂ）；
（８）ＰＳＣＡ ｈｌｇ（２７０００５０Ｃ１２Ｒｉｋ，Ｃ５３０００８Ｏ１６Ｒｉｋ，ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ ２７０００５０Ｃ１２，ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ ２７０００５０Ｃ１２ 遺伝子）；
（９）ＥＴＢＲ（エンドセリンタイプＢレセプター）；
（１０）ＭＳＧ７８３（ＲＮＦ１２４，仮想タンパク質ＦＬＪ２０３１５）；
（１１）ＳＴＥＡＰ２（ＨＧＮＣ＿８６３９，ＩＰＣＡ−１，ＰＣＡＮＡＰ１，ＳＴＡＭＰ１，ＳＴＥＡＰ２，ＳＴＭＰ，前立腺癌関連遺伝子１，前立腺癌関連タンパク質１，前立腺の６回膜貫通型上皮抗原２，６回膜貫通型前立腺タンパク質）；
（１２）ＴｒｐＭ４（ＢＲ２２４５０，ＦＬＪ２００４１，ＴＲＰＭ４，ＴＲＰＭ４Ｂ，一過性レセプター電位カチオンチャネル，サブファミリーＭ，メンバー４）；
（１３）ＣＲＩＰＴＯ（ＣＲ，ＣＲ１，ＣＲＧＦ，ＣＲＩＰＴＯ，ＴＤＧＦ１，奇形癌腫由来増殖因子）；
（１４）ＣＤ２１（ＣＲ２（補体レセプター２）又はＣ３ＤＲ（Ｃ３ｄ／エブスタインバーウイルスレセプター）又はＨｓ．７３７９２）；
（１５）ＣＤ７９ｂ（ＣＤ７９Ｂ，ＣＤ７９β，ＩＧｂ（免疫グロブリン関連β），Ｂ２９）；
（１６）ＦｃＲＨ２（ＩＦＧＰ４，ＩＲＴＡ４，ＳＰＡＰ１Ａ（ＳＨ２ドメイン含有ホスファターゼアンカータンパク質１ａ），ＳＰＡＰ１Ｂ，ＳＰＡＰ１Ｃ）；
（１７）ＨＥＲ２；
（１８）ＮＣＡ；
（１９）ＭＤＰ；
（２０）ＩＬ２０Ｒα
（２１）ブレビカン
（２２）ＥｐｈＢ２Ｒ；
（２３）ＡＳＬＧ６５９；
（２４）ＰＳＣＡ；
（２５）ＧＥＤＡ；
（２６）ＢＡＦＦ−Ｒ（Ｂ細胞活性化因子レセプター，ＢＬｙＳレセプター３，ＢＲ３）；
（２７）ＣＤ２２（Ｂ細胞レセプターＣＤ２２−Ｂアイソフォーム）；
（２８）ＣＤ７９ａ（ＣＤ７９Ａ，ＣＤ７９α，免疫グロブリン関連α；
（２９）ＣＸＣＲ５（バーキットリンパ腫レセプター１）；
（３０）ＨＬＡ−ＤＯＢ（ＭＨＣクラスＩＩ分子のベータサブユニット）；
（３１）Ｐ２Ｘ５（プリンレセプターＰ２Ｘリガンド開口型イオンチャネル５）；
（３２）ＣＤ７２（Ｂ細胞分化抗原ＣＤ７２，Ｌｙｂ−２）；
（３３）ＬＹ６４（リンパ球抗原６４（ＲＰ１０５），ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）ファミリーのＩ型膜タンパク質）；
（３４）ＦｃＲＨ１（Ｆｃレセプター様タンパク質１）；
（３５）ＩＲＴＡ２（免疫グロブリンスーパーファミリーレセプタートランスロケーション関連２）；
（３６）ＴＥＮＢ２（推定上の膜貫通型プロテオグリカン）；
（３７）ＰＭＥＬ１７（シルバーホモログ；ＳＩＬＶ；Ｄ１２Ｓ５３Ｅ；ＰＭＥＬ１７；（ＳＩ）；（ＳＩＬ）；ＭＥ２０；ｇｐ１００）；
（３８）ＴＭＥＦＦ１（ＥＧＦ様及び２つのフォリスタチン様ドメインを有する膜貫通型タンパク質１；Ｔｏｍｏｒｅｇｕｌｉｎ−１；Ｈ７３６５；Ｃ９ｏｒｆ２；Ｃ９ＯＲＦ２；Ｕ１９８７８；Ｘ８３９６１）；
（３９）ＧＤＮＦ−Ｒａ１（ＧＤＮＦファミリーレセプターアルファ１；ＧＦＲＡ１；ＧＤＮＦＲ；ＧＤＮＦＲＡ；ＲＥＴＬ１；ＴＲＮＲ１；ＲＥＴ１Ｌ；ＧＤＮＦＲ−アルファ１；ＧＦＲ−ＡＬＰＨＡ−１；Ｕ９５８４７；ＢＣ０１４９６２）；
（４０）Ｌｙ６Ｅ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｅ；Ｌｙ６７，ＲＩＧ−Ｅ，ＳＣＡ−２，ＴＳＡ−１）；
（４１）ＴＭＥＭ４６（シサホモログ２（アフリカツメガエル）；ＳＨＩＳＡ２）；
（４２）Ｌｙ６Ｇ６Ｄ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｇ６Ｄ；Ｌｙ６−Ｄ，ＭＥＧＴ１）；
（４３）ＬＧＲ５（ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役型受容体５；ＧＰＲ４９，ＧＰＲ６７）；
（４４）ＲＥＴ（ｒｅｔプロトオンコジーン；ＭＥＮ２Ａ；ＨＳＣＲ１；ＭＥＮ２Ｂ；ＭＴＣ１；（ＰＴＣ）；ＣＤＨＦ１２；Ｈｓ．１６８１１４；ＲＥＴ５１；ＲＥＴ−ＥＬＥ１）；
（４５）ＬＹ６Ｋ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｋ；ＬＹ６Ｋ；ＨＳＪ００１３４８；ＦＬＪ３５２２６）；
（４６）ＧＰＲ１９（Ｇタンパク質共役型受容体１９；Ｍｍ．４７８７）；
（４７）ＧＰＲ５４（ＫＩＳＳ１レセプター；ＫＩＳＳ１Ｒ；ＧＰＲ５４；ＨＯＴ７Ｔ１７５；ＡＸＯＲ１２）；
（４８）ＡＳＰＨＤ１（アスパラギン酸β−ヒドロキシラーゼドメイン含有１；ＬＯＣ２５３９８２）；
（４９）チロシナーゼ（ＴＹＲ；ＯＣＡＩＡ；ＯＣＡ１Ａ；チロシナーゼ；ＳＨＥＰ３）；
（５０）ＴＭＥＭ１１８（リングフィンガータンパク質，膜貫通型２；ＲＮＦＴ２；ＦＬＪ１４６２７）；及び
（５１）ＧＰＲ１７２Ａ（Ｇタンパク質共役型受容体１７２Ａ；ＧＰＣＲ４１；ＦＬＪ１１８５６；Ｄ１５Ｅｒｔｄ７４７ｅ）
の一以上に結合する、請求項１０に記載の抗体−薬剤コンジュゲート。
【請求項２０】
請求項１０〜１９の何れか一項に記載の抗体−薬剤コンジュゲート化合物と薬学的に許容される希釈剤、担体又は賦形剤を含む薬学的組成物。
【請求項２１】
化学療法剤の治療的有効量を更に含む、請求項２０の薬学的組成物。
【請求項２２】
請求項１０〜１９の何れか一項に記載の抗体−薬剤コンジュゲート化合物又は請求項２０の薬学的組成物を含む、癌治療のための医薬。
【請求項２３】
抗体−薬剤コンジュゲート化合物と併用して、患者に化学療法剤が投与される、請求項２２の医薬。
【請求項２４】
哺乳動物の癌の治療のための医薬の製造における、請求項１０〜１９の何れか一項に記載の抗体−薬剤コンジュゲート化合物の使用。
【請求項２５】
請求項１０〜１９の何れか一項に記載の抗体−薬剤コンジュゲート化合物；
容器；及び
パッケージ挿入物又は化合物が癌を治療するために使用することができることを示すラベルを含む製造品。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
関連出願  
本出願は、２０１０年１１月１７日に出願された米国仮出願第６１／４１４，５３５号の利益を主張し、それは参照によりその全体が援用される。
【技術分野】
【０００２】
発明の分野
本発明は一般的に、治療又は診断の用途による抗体−薬剤コンジュゲートを形成するための、メイタンシノイド薬剤部分にコンジュゲートした抗体に関する。抗体はアラニニルメイタンシノイド薬剤リンカー試薬との結合のための反応性の遊離システインアミノ酸で操作することができる。本発明はまた、哺乳動物細胞、又は関連する病理学的状態のインビトロ、インサイツ、及びインビボでの診断または治療において、アラニニルメイタンシノイド抗体−薬剤コンジュゲート化合物を使用する方法にも関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
抗体薬剤複合体（ＡＤＣ）は、抗原発現腫瘍細胞に対して強力な細胞傷害性薬剤を標的とし、内部移行、そして薬剤の放出、及びそれによってそれらの抗腫瘍活性を増強することにより抗体と細胞傷害性薬剤の両方の理想的な特性を組み合わせた目的とされる化学療法分子である。所与の標的抗原に対するＡＤＣの開発の成功は、抗体の選択、リンカーの設計及び安定性、細胞毒性薬の効能及び抗体に対する薬とリンカーの結合様式の最適化に依存する。ｐＨと酸化還元感度およびプロテアーゼ感受性についてのリンカーの特性は、内部移行と細胞毒性薬剤部分の放出に影響を与える。ＡＤＣのジスルフィド含有リンカーの細胞内の切断は、エンドソームとリソソームの酸化電位によって制限され、恐らくはエンドサイトーシス経路内の還元的開裂によっては放出されない(Austin et al (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102(50):17987-17992)。還元開裂は、細胞膜で起こり得、遊離薬剤により腫瘍と影響を受けやすい正常細胞のバイスタンダー殺傷効果を付与する。薬剤の不適切な放出は毒性に寄与する可能性がある。ひとたび内在化すると、ＡＤＣの効力は、薬剤活性においてタンパク質分解消化に依存する。リンカーの安定性は、ＡＤＣの有効性及び毒性の両方で重要な役割を果たしている(Alley et al (2008) Bioconjugate Chem. 19:759-765)。ｍｃｃなどの安定したリンカーは、不安定な、ジスルフィドリンカーよりも有効かつ安全であり、治療のウィンドウを拡大している。
【０００４】
システイン置換（チオＭａｂｓとチオＦａｂｓ）を有する抗体は、システインがコンジュゲーションのために利用可能であるが、免疫グロブリンのフォールディングと会合を乱さないか又はその抗原結合及びエフェクター機能を変化させない部位で操作することができる(Junutula, et al., 2008b Nature Biotech., 26(8):925-932; Dornan et al (2009) Blood 114(13):2721-2729;米国特許第７５２１５４１号；米国特許第７７２３４８５号；国際公開第２００９／０５２２４９号）。これらのチオＭａｂｓはその後操作されたシステインチオール基を通して細胞傷害性薬剤に結合させることができ、均一な化学量論（抗体あたり約２薬剤）でチオＭａｂ薬剤複合体（ＴＤＣ）を得る。異なる抗原に対する複数の抗体を用いた研究は、ＴＤＣは異種移植モデルにおいて、従来のＡＤＣと同じくらい有効であり、関連する前臨床モデルにおいて高用量で許容されることを示している。チオＭａｂ薬剤コンジュゲートは、抗体の異なる部分に（軽鎖−Ｆａｂ、重鎖−Ｆａｂ及び重鎖−Ｆｃ）結合した薬剤により操作されている。ＴＤＣのインビトロとインビボの安定性、有効性及びＰＫ特性は、その均質性および細胞毒性薬に対する部位特異的結合に起因して、従来のＡＤＣを上回るユニークな利点を提供する。
【０００５】
メイタンシノイド、ＤＭ１からなり、トラスツズマブに結合した抗体−薬剤複合体（ＡＤＣは）、ＨＥＲ２過剰発現トラスツズマブ感受性及び耐性腫瘍細胞株及びヒト癌の異種移植モデルにおいて強力な抗腫瘍活性を示す。トラスツズマブ−ｍｃｃ−ＤＭ１（Ｔ−ＤＭ１）は、現在、疾患がＨＥＲ２指向療法に抵抗性である患者における第ＩＩ相臨床試験で評価を受けている（Beeram et al (2007) “トラスツズマブ−ｍｃｃ−ＤＭ１（Ｔ−ＤＭ１）の第Ｉ試験、ＨＥＲ２＋転移性乳癌（ＢＣ）の患者におけるファーストインクラスＨＥＲ２抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）(A phase I study of trastuzumab-mcc-DM1 (T-DM1), a first-in-class HER2 antibody-drug conjugate (ADC), in patients (pts) with HER2+ metastatic breast cancer (BC))”，第４３回米国臨床腫瘍学会６月１日（Abs 1042; Kropら，欧州癌会議ＥＣＣＯ、ポスター２１１８，９月２３−２７日，２００７，バルセロナ；米国特許第７０９７８４０号米国特許第２００５／０２７６８１２号；米国特許第２００５／０１６６９９３号）。
【０００６】
メイタンシノイド、有糸分裂阻害薬メイタンシンの誘導体は、ビンカアルカロイド薬と同様に微小管に結合する(Issell BF et al (1978) Cancer Treat. Rev. 5:199-207; Cabanillas F et al. (1979) Cancer Treat Rep, 63:507-9。メイタンシノイド、ＤＭ１からなり、トラスツズマブに結合した抗体−薬剤複合体（ＡＤＣは）、ＨＥＲ２過剰発現トラスツズマブ感受性及びトラスツズマブ耐性腫瘍細胞株及びヒト乳癌の異種移植モデルにおいて強力な抗腫瘍活性を示す。ｍｃｃリンカーを介して抗ＨＥＲ２マウス乳癌抗体ＴＡ.１に結合したメイタンシノイドのコンジュゲートは、ジスルフィドリンカーを有する対応するコンジュゲートより２００倍弱かった(Chari et al (1992) Cancer Res. 127-133)。メイタンシノイド、ＤＭ１からなり、トラスツズマブに結合した抗体−薬剤複合体（ＡＤＣは）、ＨＥＲ２過剰発現トラスツズマブ感受性及び耐性腫瘍細胞株及びヒト癌の異種移植モデルにおいて強力な抗腫瘍活性を示す。
【０００７】
トラスツズマブ−ｍｃｃ−ＤＭ１（トラスツズマブ エムタンシン（ｅｍｔａｎｓｉｎｅ）、トラスツズマブ−ＤＭ１；Ｔ−ＤＭ１；ＰＲＯ１３２３６５）は、特にＨＥＲ２陽性乳癌の治療のために設計された新規な抗体−薬剤複合体（ＡＤＣ）であり、薬剤対抗体の比が約３．４：１で、リジン側鎖を介してトラスツズマブに結合した（米国特許第６４０７２１３号）、細胞傷害性薬剤ＤＭ１（チオール含有メイタンシノイド微小管阻害薬剤）からなる。Ｔ−ＤＭ１は、ＨＥＲ２＋転移性乳癌の治療のために開発されている(Beeram M, Burris H, Modi S et al. (2008) J Clin Oncol 26: May 20 付録; 要旨 1028)。Ｔ−ＤＭ１は、トラスツズマブと同様の親和性でＨＥＲ２と結合する。そのような結合は、Ｔ−ＤＭ１抗腫瘍活性に必要である（ハーセプチン（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ）（登録商標）治験薬概要書、ジェネンテック社、サウスサンフランシスコ、カリフォルニア州、２００７年７月）。ＨＥＲ２に結合した後、Ｔ−ＤＭ１は、レセプター媒介性の内部移行を受け、ＤＭ１の細胞内放出およびその後の細胞死をもたらすと仮説がたてられている(Austin CD, De Maziere AM, Pisacane PI, et al. (2004) Mol Biol Cell 15(12):5268-5282）。
【０００８】
様々なリンカーを持つトラスツズマブ−メイタンシノイドＡＤＣを、インビトロとインビボでの有効性、薬物動態および前臨床試験における毒性について試験した(Phillips et al (2008) Cancer Res. 68(22):9280-9290)。非還元チオエーテル結合（ｍｃｃ）を通してＤＭ１に結合したトラスツズマブは、非結合トラスツズマブ又はジスルフィドリンカーを通して他のメイタンシノイドに結合したトラスツズマブに比べて優れた活性を示した。非還元性リンカーを通してＤＭ１に結合したトラスツズマブは、評価された還元ジスルフィドリンカー以上に有効性と薬物動態の改善及び毒性の減少を提示するため、トラスツズマブ−ｍｃｃ−ＤＭ１が臨床開発のために選択された。
【０００９】
ＤＭ１は、天然に存在するエステルアンサマイトシンＰ３から派生したチオール含有メイタンシノイドである(Remillard S, Rebhun LI, Howie GA, et al. (1975) Science 189(4207):1002-1005.3; Cassady JM, Chan KK, Floss HG. (2004) Chem Pharm Bull 52(1):1-26.4)。関連する植物エステル、メイタンシンは、約８００人の患者において、３週間ごとに、単一用量として又は３日間連続して２．０ｍｇ／ｍ２の用量で投与され、化学療法剤として研究されてきた(Issell BF, Crooke ST. (1978) Maytansine. Cancer Treat Rev 5:199-207)。非臨床的活性にもかかわらず、クリニックにおけるメイタンシンの活性は安全に送達されうる用量で控えめであった。用量制限毒性（ＤＬＴ）は、吐き気、嘔吐、下痢（しばしば便秘が続く）からなる消化管のものだった。これらの毒性は用量依存性であってスケジュール依存性ではなかった。末梢神経障害（主に感覚）が報告され、既存の神経障害を持つ患者で最も顕著であった。肝トランスアミナーゼ、アルカリフォスファターゼ、総ビリルビンの無症状の一時的な上昇が報告された。脱力感、倦怠感、不快、及び不眠を含む体質的な毒性が一般的であった。あまり一般的でない毒性として注入部位の静脈炎と軽度の骨髄抑制を含んでいた。薬剤の更なる開発は、狭い治療濃度域のために、１９８０年代に放棄された。
【００１０】
これまでの臨床結果は、Ｔ−ＤＭ１は、ＨＥＲ２指向療法を受けながらも進行したＨＥＲ２陽性ＭＢＣ患者に利益をもたらすことを示唆している。トラスツズマブ−ｍｃｃ−ＤＭ１（Ｔ−ＤＭ１）は、疾患がＨＥＲ２指向療法に抵抗性である患者での第ＩＩ相臨床試験において現在評価を受けている(Beeram et al (2007) “トラスツズマブ−ＭＣＣ−ＤＭ１（Ｔ−ＤＭ１）の第Ｉ試験、ＨＥＲ２＋転移性乳癌（ＢＣ）の患者におけるファーストインクラスＨＥＲ２抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）(A phase I study of trastuzumab-mcc-DM1 (T-DM1), a first-in-class HER2 antibody-drug conjugate (ADC), in patients (pts) with HER2+ metastatic breast cancer (BC))”，第４３回米国臨床腫瘍学会６月１日(Abs 1042; Kropら，欧州癌会議ＥＣＣＯ、ポスター２１１８，９月２３−２７日，２００７，バルセロナ；米国特許第７０９７８４０号；米国特許第２００５／０２７６８１２号；米国特許第２００５／０１６６９９３号）。
【００１１】
抗体−薬剤コンジュゲートの最適なリンカー部分は全身循環において安定であるが標的部位での効率的な薬剤放出を可能にする(Alley et al (2008) Bioconjugate Chem. 19:759-765; Christie et al (2010) Bioconjugate Chem. 21:1779-1787；米国特許出願公開第２００８／０２９９６６８号）。マレイミド結合ＡＤＣは、チオールの逆マイケル付加を受けて、標的レセプター結合の前に薬剤を放出することができる(Alley et al (2008) Bioconjugate Chem. 19:759-765)。ＴＭＡｂ−ｍｃｃ−ＤＭ１及びチオ−ＴＭＡｂ−ｍｐｅｏ−ＤＭ１抗体コンジュゲートは両方とも、ｍｃｃ−マレイミド又はｍｐｒｏ−マレイミドにＤＭ１のチオール基を結合するリンカー中にマレイミドを有する米国特許第７０９７８４０号；米国特許出願公開第２００５／０２７６８１２号；米国特許出願公開第２００５／０１６６９９３号）。抗体のシステインチオールがラット及びマウス血漿とマレイミド基を通して連結されている抗体−薬剤コンジュゲートのインキュベーションにより、アルブミン−薬剤コンジュゲートを形成し、マレイミド薬剤コンジュゲートを放出するチオールの逆マイケル付加及びアルブミンシステインチオールによる付加と一致する(Alley et al (2008) Bioconjugate Chem. 19:759-765)。類似した方法で、ＡＤＣの薬剤部分ＤＭ１のチオールの逆マイケル付加は、抗体からの薬剤の消失、及びアルブミン抗体、システイン抗体又はグルタチオン−抗体付加体の形成をもたらすことができる。チオマレイミド結合のこの切断の不安定性は、投与したＡＤＣの効力を低下させる。メイタンシンに結合したマレイミド基を持たない新しいリンカーは、標的と結合する前の血漿中において、逆マイケル付加又は他のメカニズムによって非特異的メイタンシン薬剤の喪失を防ぎ得る。
【発明の概要】
【００１２】
概要
本発明の一態様は、抗体−薬剤コンジュゲートを形成するために、抗体へのコンジュゲーション用に式Ｉの新規リンカ−薬剤化合物を提供することである。
0005889912.tif 000002
ここで：
Ｌは、
0005889912.tif 000003
Ｅは、
0005889912.tif 000004
【００１３】
ｎは２、３、４、５、又は６；ｍは２、３又は４；およびｑは０又は１。
本発明の一態様は、式Ｉのリンカー薬剤化合物から調製された式Ｉａ及びＩｂの新規抗体−薬剤コンジュゲートを提供することである。
0005889912.tif 000005
0005889912.tif 000006
ここで：
Ｌは、
0005889912.tif 000007
ｍは２、３、４、５または６；ｍは２、３、又は４；ｑは０又は１；ｐは１から４であり、Ａｂは抗体である。
【００１４】
抗体は、遊離システインアミノ酸を通してリンカーＬにコンジュゲートしたシステイン操作抗体（Ａｂ）であってもよい。
【００１５】
本発明の一態様は、式Ｉａ又はＩｂの抗体−薬剤コンジュゲート及び薬学的に許容される希釈剤、担体又は賦形剤を含む薬学的組成物である。
【００１６】
本発明の一態様は、患者に対して、式Ｉａ又はＩｂの抗体−薬剤コンジュゲートを含む薬学的組成物を含む、癌の治療方法である。
【００１７】
本発明の一態様は、哺乳動物における、癌の治療のための医薬の製造における、式Ｉａ又はＩｂの抗体−薬剤コンジュゲートの使用である。
【００１８】
本発明の一態様は、式Ｉａ又はＩｂの抗体−薬剤コンジュゲート；容器；パッケージ挿入物又は化合物が癌を治療するために使用することができることを示すラベルを含む製造品である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１ａ】図１ａは、薬剤−リンカー中間体、ｍａｌ−ｈｅｘ−ａｌａ−Ｍａｙ ５の合成を示す。
【図１ｂ】図１ｂは、薬剤中間体、３−（Ｓ−（Ｎ−メチルアラニニル）メイタンシノール ４ａの合成を示す。
【図２】図２は、薬剤−リンカー中間体、ｂｒａ−ｈｅｘ−ａｌａ−Ｍａｙ ８の合成を示す。
【図３】図３は、薬剤−リンカー中間体、ｍａｌ−ＰＥＧ３−ａｌａ−Ｍａｙ １４の合成を示す。
【図４】図４は、薬剤−リンカー中間体、ｂｒａ−ＰＥＧ３−ａｌａ−Ｍａｙ １８の合成を示す。
【図５】図５ａおよび図５ｂは、（１）ビヒクル（ＡＤＣバッファー），（２）ＬＣ−Ｖ２０５Ｃ−チオ−ＴＭＡｂ−ｍｐｅｏ−ＤＭ１，（３）ＬＣ−Ｖ２０５Ｃ−チオ−ＴＭＡｂ−ｍａｌ−ＰＥＧ３−ａｌａ−Ｍａｙ，（４）ＨＣ−Ａ１１８Ｃ−チオ−ＴＭＡｂ−ｍａｌ−ＰＥＧ３−ａｌａ−Ｍａｙ，（５）ＬＣ−Ｖ２０５Ｃ チオ−ＴＭＡｂ−ｍａｌ−ｈｅｘ−ａｌａ−Ｍａｙ，（６）ＴＭＡｂ−ｍｃｃ−ＤＭ１（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ−ｍｃｃ−ＤＭ１，Ｔ−ＤＭ１），（７）ＬＣ−Ｖ２０５Ｃ−チオ抗ｇＤ５Ｂ６−ｍａｌ−ＰＥＧ３−ａｌａ−Ｍａｙ，（８）ＬＣ−Ｖ２０５Ｃ−チオ抗ｇＤ５Ｂ６−ｍａｌ−ｈｅｘ−ａｌａ−Ｍａｙ（実施例６、８）を投与後に、ＣＲＬのｎｕ／ｎｕマウスの乳腺脂肪体に播種したＭＭＴＶ−ＨＥＲ２ Ｆｏ５トランスジェニック乳腺腫瘍において、時間に対してフィットさせた腫瘍体積変化のプロットを示す。全ての抗体−薬剤コンジュゲート（単一用量）を１０ｍｇ／ｋｇで静脈内投与した。抗ｇＤ５Ｂ６はコントロール抗体であり、それに対応する抗原はＦｏ５腫瘍組織では発現しない。
【図６】図６は、（１）ビヒクル：ヒスチジンバッファー＃８：２０ｍＭのヒスチジン酢酸，ｐＨ５．５，２４０ｍＭスクロース，０．０２％ ＰＳ ２０，（４）ＨＣ−Ａ１１８Ｃ−チオ−ＴＭＡｂ−ｍａｌ−ＰＥＧ３−ａｌａ−Ｍａｙ，５ｍｇ／ｋｇ，（４）ＨＣ−Ａ１１８Ｃ−チオ−ＴＭＡｂ−ｍａｌ−ＰＥＧ３−ａｌａ−Ｍａｙ，１０ｍｇ／ｋｇ，（１０）ＨＣ−Ａ１１８Ｃ チオ抗ｇＤ５Ｂ６−ｂｒａ−ＰＥＧ３−ａｌａ−Ｍａｙ，５ｍｇ／ｋｇ，（１０）ＨＣ−Ａ１１８Ｃ チオ抗ｇＤ５Ｂ６−ｂｒａ−ＰＥＧ３−ａｌａ−Ｍａｙ，１０ｍｇ／ｋｇ，（１１）ＨＣ−Ａ１１８Ｃ チオ ＴＭＡｂ−ｂｒａ−ＰＥＧ３−ａｌａ−Ｍａｙ，５ｍｇ／ｋｇ，（１１）ＨＣ−Ａ１１８Ｃ チオ ＴＭＡｂ−ｂｒａ−ＰＥＧ３−ａｌａ−Ｍａｙ，１０ｍｇ／ｋｇ，（１２）ＨＣ−Ａ１１８Ｃ，ＬＣ−Ｖ２０５Ｃ チオ−ＴＭＡｂ−ｍａｌ−ＰＥＧ３−ａｌａ−Ｍａｙ，５ｇｍ／ｋｇ，（１２）ＨＣ−Ａ１１８Ｃ，ＬＣ−Ｖ２０５Ｃ チオ−ＴＭＡｂ−ｍａｌ−ＰＥＧ３−ａｌａ−Ｍａｙ，１０ｇｍ／ｋｇを投与後に、ＣＲＬのｎｕ／ｎｕマウスの乳腺脂肪体に播種したＭＭＴＶ−ＨＥＲ２ Ｆｏ５トランスジェニック乳腺腫瘍において、時間に対してフィットさせた腫瘍体積変化のプロットを示す。全ての抗体−薬剤コンジュゲート（単一用量）は、研究の開始時に１回静脈内投与された。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
典型的実施態様の詳細な説明
本発明の特定の実施態様に対して詳細に述べ、その例は、付随する構造と式に示される。本発明は説明される実施態様と併せて説明されるが、それらの実施態様に本発明を限定するものではないことが理解されるであろう。一方、本発明は、特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内に含まれ得る全ての代替、改変、および均等物を包含することを意図している。
【００２１】
当業者は、本発明の実施において使用され得る本明細書に記載のものに類似するか又は等価な多くの方法および材料を認識するであろう。本発明は、説明される方法と材料に決して限定されない。
【００２２】
別に規定されない限り、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるように、本明細書で使用される技術用語および科学用語は同じ意味を持ち、Singleton et al (1994) Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2nd Ed., J. Wiley & Sons, New York, NY; and Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immunobiology, 5th Ed., Garland Publishing, New Yorkと一致する。
【００２３】
定義
特に明記しない限り、本明細書で使用する以下の用語と語句は、以下の意味を有することが意図される。
【００２４】
商品名が本明細書で使用されるとき、出願人は、商品名製品の製剤、ジェネリック医薬品、及び商品名製品の活性薬学的成分を独立に包含することを意図する。
【００２５】
用語「抗体」は本明細書において最も広範な意味で使用され、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二量体、多量体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、およびそれらが所望の生物学的活性を示すものであれば、抗体断片を特に網羅する。抗体は、マウス、ヒト、ヒト、キメラ、又は他の種に由来し得る。抗体は、特異的抗原を認識し結合することができる免疫系によって産生されるタンパク質である。(Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immuno Biology, 5th Ed., Garland Publishing, New York)。標的抗原は、複数の抗体のＣＤＲによって認識され、エピトープとも呼ばれる多数の結合部位を一般的に有している。異なるエピトープに特異的に結合する抗体の各々は異なる構造を有している。従って、一つの抗原は、複数の対応する抗体を有し得る。抗体は、完全長の免疫グロブリン分子又は完全長免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、即ち、目的の標的の抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子又はその部分を含み、そのような標的は、限定されないが、癌細胞又は自己免疫疾患に関連する自己免疫抗体を産生する細胞を含む。本明細書に開示される免疫グロブリンは、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＡ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１及びＩｇＡ２）又は免疫グロブリン分子のサブクラスとすることができる。免疫グロブリンは任意の種に由来することができる。しかしながら、一態様では、免疫グロブリンは、ヒト、マウス、又はウサギ起源のものである。
【００２６】
「抗体断片」は、完全長抗体の一部、一般にはその抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；ダイアボディ、線形抗体；ミニボディー(Olafsen et al (2004) Protein Eng. Design & Sel. 17(4):315-323)、Ｆａｂ発現ライブラリーによって生成された断片、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、ＣＤＲ（相補性決定領域）、及び癌細胞抗原、ウイルス抗原または微生物抗原に免疫特異的に結合する上記の何れかのエピトープ結合断片、単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体を含む。
【００２７】
本明細書中で用いる用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわちこの集団を含む個々の抗体は、微量で存在し得る天然に生じる可能性のある突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であって、単一の抗原部位に対するものである。更に、典型的には、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含む、ポリクローナル抗体製剤とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対して指向される。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、それらが、他の免疫グロブリンにより汚染されずに合成される点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られる抗体の特徴を示し、いずれかの特定の方法による抗体の生産を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って用いるべきモノクローナル抗体は、Kohler et al (1975) Nature, 256:495によって最初に記載されたハイブリドーマ方法によって作成されてもよく、あるいは組換えＤＮＡ方法によって作成されてもよい（例えば、米国特許第４８１６５６７号；米国特許第５８０７７１５号を参照）。「モ「モノクローナル抗体」は、例えば、Clackson et al (1991) Nature, 352:624-628; Marks et al (1991) J. Mol. Biol., 222:581-597記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離してもよい。
【００２８】
本明細書中のモノクローナル抗体は、具体的には、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の種に由来する又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一又は相同であるが、その（それらの）鎖の残部は別の種に由来する又は別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一又は相同である「キメラ」抗体、並びにそのような抗体の断片を、それらが望ましい生物学的活性を示す限り、包含し得る（米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison et al (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855）。本明細書における対象のキメラ抗体には、非ヒト霊長類（例えば旧世界ザル、類人猿など）及びヒト定常領域配列に由来する可変ドメイン抗原結合配列を含む霊長類化抗体が含まれる。
【００２９】
本明細書において「インタクトな抗体」とは、ＶＬ及びＶＨドメイン、並びに軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖定常ドメインン、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む、抗体である。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列定常ドメイン）又はそのアミノ酸配列変異体であり得る。インタクトな抗体は、抗体のＦｃ定常領域（天然型配列Ｆｃ領域またはアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域）に起因し得る生物学的活性を指す、１つ以上の「エフェクター機能」を有し得る。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞傷害；Ｆｃレセプター結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；ファゴサイトーシス；及び細胞表面レセプター、例えば、Ｂ細胞レセプター及びＢＣＲなどのダウンレギュラーションが挙げられる。
【００３０】
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、インタクトな抗体は、異なる「クラス」に割り当てることができる。インタクトな免疫グロブリン抗体の５つの主要なクラスがあり：ＩｇＡ，ＩｇＤ，ＩｇＥ，ＩｇＧ，及びＩｇＭ；これらのうちのいくつかは、「サブクラス」（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、及びＩｇＡ２）へとさらに分割され得る。種々のクラスの抗体に対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。種々のクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び３次元構造は、周知である。Ｉｇ形態はヒンジの修飾又はヒンジ欠損形態を含む(Roux et al (1998) J. Immunol. 161:4083-4090; Lund et al (2000) Eur. J. Biochem. 267:7246-7256；米国特許出願公開第２００５／００４８５７２号；米国特許出願公開第２００４／０２２９３１０号）。
【００３１】
「遊離システインアミノ酸」は、親抗体で操作され、チオール官能基（−ＳＨ）を有し、分子内または分子間ジスルフィド架橋として対合されないシステインアミノ酸残基を指す。
【００３２】
「チオール反応性値」という用語は、遊離システインアミノ酸の反応性の定量的特性評価である。チオール反応性値は、チオール反応性試薬と反応するシステイン操作された抗体中の遊離システインアミノ酸のパーセンテージであり、最大値１に換算される。例えば、チオール反応性試薬、例えばビオチン−マレイミド試薬と収率１００％で反応してビオチン標識化抗体を生成するシステイン操作された抗体上の遊離システインアミノ酸は、１．０というチオール反応性値を有する。チオール反応性試薬と収率８０％で反応する同一の又は異なる親抗体にて操作される別のシステインアミノ酸は、０．８のチオール反応性値を有する。チオール反応性試薬と全く反応できない同一の又は異なる親抗体にて操作される別のシステインアミノ酸は、チオール反応性値は０である。特定のシステインのチオール反応性値の決定は、ＥＬＩＳＡアッセイ、質量分析、液体クロマトグラフィー、オートラジオグラフィーまたは他の定量的分析試験により実行され得る。
【００３３】
「親抗体」は、１つ以上のアミノ酸残基が１つ以上のシステイン残基に置換されるアミノ酸配列を含む抗体である。親抗体は、天然型または野生型配列を含み得る。親抗体は、他の天然型、野生型または修飾形態の抗体に比して、先在アミノ酸配列修飾（例えば、付加、欠失および／または置換）を有し得る。親抗体は、目的の標的抗原、例えば生物学的に重要なポリペプチドを指向する。非ポリペプチド抗原（例えば、腫瘍関連糖脂質抗原；米国特許第５０９１１７８号参照）に対して向けられる抗体も意図される。
【００３４】
典型的な親抗体は、細胞表面および膜貫通受容体、ならびに腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）について親和性と選択制を有する抗体を含む。
【００３５】
「ファージディスプレイ」は、変異体ポリペプチドをファージ、例えば繊維状ファージ、粒子の表面においてコートタンパク質に対する融合タンパク質として提示する手法である。ファージディスプレイ法の一つの有用性は、ランダム化されたタンパク質変異体の大規模なライブラリーを、高親和性で標的分子に結合するそれらの配列について迅速かつ効率的にソートすることができるという事実にある。ファージ上のペプチド及びタンパク質ライブラリーの提示は、何百万ものポリペプチドから特異的結合特性を持つものをスクリーニングするために利用されてきた。多価ファージディスプレイ方法は、典型的には繊維状ファージのｐＩＩＩ又はｐＶＩＩＩとの融合体を通して小さなランダムペプチド及び小タンパク質を提示するために利用されてきた（Wells及びLowman (1992) Curr. Opin. Struct. Biol., 3: 355-362とその中の引用文献）。一価のファージディスプレイでは、タンパク質又はペプチドのライブラリーがファージコートタンパク質又はその一部に融合され、野生型タンパク質の存在下で低レベルで発現される。アビディティー効果は多価のファージと比較して低下しているので、選別は内在性のリガンド親和性に基づいており、ファージミドベクターが使われるが、このベクターはＤＮＡ操作を単純化する。Lowman及びWells (1991) Methods: A companion to Methods in Enzymology 3:205-0216。ファージディスプレイは抗体様分子を産生するための技術を含む(Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immunobiology, 5th Ed., Garland Publishing, New York, p627-628; Lee et al ）。
【００３６】
「ファージミド」は、細菌の複製起点、例えばＣｏ１Ｅ１及びバクテリオファージの遺伝子間領域のコピーを有するプラスミドベクターである。ファージミドは、繊維状バクテリオファージ及びラムドイドバクテリオファージを含む、任意の既知のバクテリオファージで使用できる。プラスミドは、一般に、抗生物質耐性の選択マーカーも含む。これらのベクターにクローニングされたＤＮＡのセグメントは、プラスミドとして増殖することができる。これらのベクターを備える細胞がファージ粒子の生産のために必要なすべての遺伝子を備えているとき、プラスミドの複製様式はローリングサークル複製に変化し、プラスミドＤＮＡの１つの鎖のコピーとパッケージファージ粒子を生成する。ファージミドは感染性又は非感染性ファージ粒子を形成しうる。この用語は、異種ポリペプチドがファージ粒子の表面で提示されるように遺伝子融合体として異種ポリペプチド遺伝子と結合したファージコートタンパク質遺伝子又はその断片を含むファージミドを含む。
【００３７】
「リンカー」、「リンカーユニット」又は「連結（ｌｉｎｋ）」は、抗体を薬剤部分に共有結合させる原子鎖を含む。様々な実施態様において、リンカーは２価のラジカルであり、Ｌとして特定される。
【００３８】
本明細書中で使用される立体化学的な規定および規約は、一般に、 S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York;及びEliel, E. and Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds (1994) John Wiley & Sons, Inc., New Yorkに従う。多くの有機化合物が、光学活性形態で存在し、すなわち、これらは、平面偏光の平面を回転する能力を有する。光学的に活性な化合物の記載において、接頭語のＤ及びＬ、又はＲ及びＳは、そのキラル中心に関する分子の絶対配置を表示するために使用される。接頭語ｄ及びｌ又は（＋）及び（−）は、化合物による平面偏光の回転の符号を表し、（−）又はｌは、この化合物が左旋性であることを意味する。（＋）又はｄの接頭語を持つ化合物は、右旋性である。所定の化学構造について、これらの立体異性体は、互いに鏡像対称であることを除いて同一である。特定の立体異性体はまた、エナンチオマーと呼ばれ、そのような異性体の混合物は、しばしばエナンチオマー混合物と呼ばれる。エナンチオマーの５０：５０混合物は、ラセミ混合物もしくはラセミ体と呼ばれ、これは、化学反応もしくはプロセスにおいて立体選択性もしくは立体特異性が存在しない場合に生じ得る。「ラセミ混合物」および「ラセミ体」なる用語は、光学活性を有さない、２つのエナンチオマー種の等モル濃度の混合物をいう。
【００３９】
「薬学的に受容可能な塩」なる語句は、本明細書中で使用される場合、抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）の薬学的に受容可能な有機もしくは無機の塩をいう。典型的な塩としては、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硝酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、酸性酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチシン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、サッカリン酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、およびパモ酸塩（ｐａｍｏａｔｅ）（すなわち、１，１’−メチレン−ビス−（２−ヒドロキシ−３−ナフトエート）が挙げられるが、これらに限定されない。薬学的に受容可能な塩は、酢酸イオン、コハク酸イオンもしくは他の対イオンのような別の分子の包含を含み得る。対イオンは、親化合物上の電荷を安定化させる任意の有機部分もしくは無機部分であり得る。さらに、薬学的に受容可能な塩は、１つより多くの荷電した原子をその構造内に有し得る。多数の荷電した原子がその薬学的に受容可能な塩の一部分である場合、多数の対イオンを有し得る。したがって、薬学的に受容可能な塩は、１以上の荷電した原子及び／又は１以上の対イオンを有し得る。
【００４０】
以下の略称が、本明細書中で使用され、指定された定義を有する：ＢＭＥはβ−メルカプトエタノール、ＢｏｃはＮ−（ｔ−ブトキシカルボニル）、ｃｉｔはシトルリン（２−アミノ−５−ウレイドペンタン酸）、ｄａｐはドラプロイン（ｄｏｌａｐｒｏｉｎｅ）、ＤＣＣは１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド、ＤＣＭはジクロロメタン、ＤＥＡはジエチルアミン、ＤＥＡＤはジエチルアゾジカルボキシレート、ＤＥＰＣはジエチルホスホリルシアニデート、ＤＩＡＤはジイソプロピルアゾジカルボキシレート、ＤＩＥＡはＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、ｄｉｌはドライソロイシン（ｄｏｌａｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ）、ＤＭＡはジメチルアセトアミド、ＤＭＡＰは４−ジメチルアミノピリジン、ＤＭＥはエチレングリコールジメチルエーテル（もしくは１，２−ジメトキシエタン）、ＤＭＦはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ＤＭＳＯはジメチルスルホキシド、ｄｏｅはドラフェニン（ｄｏｌａｐｈｅｎｉｎｅ）、ｄｏｖはＮ，Ｎ−ジメチルバリン、ＤＴＮＢは５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）、ＤＴＰＡはジエチレントリアミンペンタ酢酸、ＤＴＴはジチオトレイトール、ＥＤＣＩは１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩、ＥＥＤＱは２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロキノリン、ＥＳ−ＭＳはエレクトロスプレー質量分析、ＥｔＯＡｃは酢酸エチル、ＦｍｏｃはＮ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）、ｇｌｙはグリシン、ＨＡＴＵはＯ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ、Ｎ、Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、ＨＯＢｔは１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、ＨＰＬＣは高速液体クロマトグラフィー、ｉｌｅはイソロイシン、ｌｙｓはリジン、ＭｅＣＮ（ＣＨ３ＣＮ）はアセトニトリル、ＭｅＯＨはメタノール、Ｍｔｒは４−アニシルジフェニルメチル（もしくは４−メトキシトリチル）、ｎｏｒは（１Ｓ、２Ｒ）−（＋）−ノルエフェドリン、ＰＡＢはｐ−アミノベンジルカルバモイル、ＰＢＳはリン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７）、ＰＥＧはポリエチレングリコール、Ｐｈはフェニル、Ｐｎｐはｐ−ニトロフェニル、ＭＣは６−マレイミドカプロイル、ｐｈｅはＬ−フェニルアラニン、ＰｙＢｒｏｐはブロモトリ−ピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、ＳＥＣはサイズ排除クロマトグラフィー、Ｓｕはスクシンイミド、ＴＦＡはトリフルオロ酢酸、ＴＬＣは薄層クロマトグラフィー、ＵＶは紫外線、およびｖａｌはバリン。
【００４１】
システイン操作抗体
本発明の化合物は、野生型抗体又は親抗体の一以上のアミノ酸が、システインアミノ酸と置換される、システイン操作抗体を含む。抗体の任意の形態は、そのように操作、即ち変異導入されうる。例えば、親Ｆａｂ抗体断片は、システイン操作Ｆａｂを形成するように操作され得、本明細書中で「チオＦａｂ（チオＦａｂ）」と呼ばれる。同様に、親モノクローナル抗体は、「チオＭａｂ（チオＭａｂ）」を形成するように操作され得る。一部位変異は、チオＦａｂにおいて１つの操作システイン残基を生じ、一方、ＩｇＧ抗体のダイマーの性質に起因して、一部位変異は、チオＭａｂにおいて２つの操作システイン残基を生じる。置換された（「操作された」）システイン（Ｃｙｓ）残基を有する変異体は、新規に導入された操作チオール基の反応性について評価される。チオール反応性値は、０から１．０の範囲の相対的な数値の項であり、任意のシステイン操作抗体について測定され得る。本発明のシステイン操作抗体のチオール反応性値は、０．６〜１．０；０．７〜１．０；又は０．８〜１．０の範囲内である。
【００４２】
本発明の設計方法、選択方法および調製方法は、求電子性官能基と反応性であるシステイン操作抗体を可能とする。これらの方法は、さらに、指定され、設計された、選択的部位にジルコニウム原子を有する抗体ジルコニウムコンジュゲート（ＡＺＣ）化合物などの抗体コンジュゲート化合物を可能にする。抗体表面上の反応性システイン残基は、マレイミド又はハロアセチルなどのチオール反応性基を通してジルコニウム部分を特異的にコンジュゲートすることを可能とする。Ｃｙｓ残基のチオール機能のマレイミド基に対する求核反応性は、タンパク質内の他のアミノ酸の機能性、例えばリジン残基のアミノ基又はＮ末端アミノ基などに比べ約１０００倍高い。ヨードアセチル試薬及びマレイミド試薬のチオール固有の機能性によりアミン基と反応し得るが、より高いｐＨ（＞９．０）及びより長い反応時間を要する(Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London)。
【００４３】
本発明のシステイン操作抗体は、好ましくは、野生型、親抗体のカウンターパートの抗原結合能力を保持する。従って、システイン操作抗体は、好ましくは特異的には、抗原に結合することが可能である。そのような抗原としては、例えば、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、細胞表面レセプタータンパク質及び他の細胞表面分子、膜貫通タンパク質、シグナル伝達タンパク質、細胞生存調節因子、細胞増殖調節因子、組織発達又は分化関連付けられている分子（例えば、既知であるか又は機能性に寄与すると疑われるもの）、リンホカイン、サイトカイン、細胞周期の調節に関与する分子、脈管形成に関与する分子、及び血管新生に関連付けられている分子（例えば、既知であるか又は機能性に寄与すると疑われるもの）を含む。腫瘍関連抗原は、クラスター分化因子（すなわちＣＤタンパク質）である可能性がある。システイン操作抗体が結合することができる抗原は、上記のカテゴリのいずれかのサブセットのメンバーであり得、前記カテゴリの他のサブセットは（対象の抗原に関して）異なる特性を持つ他の分子／抗原を含む。
【００４４】
親抗体は、米国特許第５８２１３３７号の表３に記載されるｈｕＭＡｂ４Ｄ５−１、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−２、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−３、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−４、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−５、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−６、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−７及びｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８（トラスツズマブ、ハーセプチン（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ）（登録商標））から選択されるヒト化抗体であってもよく、本明細書に記述されるヒト化５２０Ｃ９抗体（国際公開第９３／２１３１９号）及びヒト化２Ｃ４抗体が参照により本明細書に明確に援用される。
【００４５】
本発明のシステイン操作抗体は、部位特異的かつ効率的にチオール反応性試薬と結合させることができる。チオール反応性試薬は、多機能リンカー試薬、キャプチャ、すなわち親和性、標識試薬（例えば、ビオチン−リンカー試薬）、検出標識（例えば、フルオロフォア試薬）、固相固定化試薬（例えばＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭ、ポリスチレン、又はガラス）、又はジルコニウムリンカー中間体であり得る。チオール反応性試薬の一例はＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）である。典型的な実施態様において、チオＦａｂのビオチンリンカー試薬との反応は、ビオチン標識化チオＦａｂを与え、それによって操作されたシステイン残基が検出され測定され得る。チオＦａｂの多機能性リンカー試薬との反応は多機能性リンカー付きのチオＦａｂを与え、それにより更にジルコニウム成分又は別の標識と反応され得る。チオＦａｂのジルコニウムリンカー中間体との反応はチオＦａｂジルコニウムコンジュゲートを与える。
【００４６】
ここで記載される典型的な方法は一般に抗体の同定及び産生に適用され得、より一般的には本明細書に記載された設計及びスクリーニング工程の適用を通じて別のタンパク質に適用され得る。
【００４７】
このようなアプローチは、反応基が、例えば、マレイミド、ヨードアセトアミド、ピリジルジスルフィド、又は他のチオール反応性結合パートナーである、他のチオール反応性剤の結合に適用され得る（(Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2; Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2; Hermanson, G. in Bioconjugate Techniques (1996) Academic Press, San Diego, pp. 40-55, 643-671）。パートナーは、細胞毒性剤（例えば、ドキソルビシン又は百日咳毒素などの毒素）、フルオレセイン様又はローダミン様蛍光色素などのフルオロフォア、イメージング又は放射線治療の金属のためのキレート剤、ペプチジル又は非ペプチジル標識又は検出タグ、又はポリエチレングリコールの様々なアイソフォームなどのクリアランス修飾剤、第３の成分に結合するペプチド、又はその他の炭水化物又は親油性剤であり得る。
【００４８】
典型的な抗体断片であるｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８で同定された部位は、ここでは主に抗体の定常ドメインにあり、抗体の全ての種にわたって保存されている。これらの部位は、さらに特定の抗体の構造の構造設計及び知識を必要とせずに、かつ抗体の可変ドメインに固有の抗原結合特性の干渉することなく、他の抗体に広く適用可能であるべきである。
【００４９】
癌の治療に有用なシステイン操作抗体は、限定されないが、細胞表面レセプター及び腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する抗体を含む。そのような抗体は、（標識成分に結合していない）ネイキッド抗体、又は式Ｉの抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）として使用することができる。腫瘍関連抗原は、当技術分野で知られており、当該技術分野で周知の方法及び情報を使用して、抗体を生成する際に使用するために調製することができる。癌の診断及び治療のための効果的な細胞標的を発見する試みにおいて、研究者は、一つ以上の正常な非癌細胞上に比べて癌細胞の一つ以上の特定の型の表面上に特異的に発現された膜貫通ポリペプチド又はそうでなければ腫瘍関連ポリペプチドを同定しようとしてきた。しばしば、そのような腫瘍関連ポリペプチドは、非癌細胞の表面上に比べてより豊富に癌細胞の表面に発現している。そのような腫瘍関連細胞表面の抗原ポリペプチドの同定は、抗体ベースの治療を経由して破壊するために癌細胞を特異的に標的とする能力を生じさせてきた。
【００５０】
腫瘍関連抗原ＴＡＡの例は、限定されないが、下にリストされたＴＡＡ（１）−（５１）を含む。便宜上、これらの抗原に関連する情報で当該技術分野で知られているすべては以下にリストされ、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の核酸及びタンパク質の配列同定規則に従い、名前、代替名、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号及び主要参照文献を含む。ＴＡＡ（１）−（５１）に対応する核酸とタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋなどの公共のデータベースで利用可能である。抗体により標的とされる腫瘍関連抗原は引用文献で同定された配列に対して少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を含むか、又は引用文献に記載の配列を有するＴＡＡとして、実質的に同一な生物学的特性又は特徴を示す全てのアミノ酸配列変異体及びアイソフォームを含む。たとえば、変異体配列を有するＴＡＡは、一般に、リストされた対応する配列を持つＴＡＡに特異的に結合する抗体に特異的に結合することができる。本明細書に具体的に引用される文献中の配列及び開示は参照により明示的に援用される。
【００５１】
腫瘍関連抗原（１）−（５１）：
（１）ＢＭＰＲ１Ｂ（骨形成タンパク質レセプタータイプＩＢ型，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１２０３）
ｔｅｎ Ｄｉｊｋｅ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４ （５１５５）：１０１−１０４（１９９４），Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １４ （１１）：１３７７−１３８２（１９９７））；国際公開第２００４０６３３６２号（請求項２）；国際公開第２００３０４２６６１号（請求項１２）；米国特許出願公開第２００３１３４７９０−Ａ１号（頁３８−３９）；国際公開第２００２１０２２３５号（請求項１３；頁２９６）；国際公開第２００３０５５４４３号（頁９１−９２）；国際公開第２００２９９１２２号（実施例２；頁５２８−５３０）；国際公開第２００３０２９４２１号（請求項６）；国際公開第２００３０２４３９２号（請求項２；図１１２）；国際公開第２００２９８３５８号（請求項１；頁１８３）；国際公開第２００２５４９４０号（頁１００−１０１）；国際公開第２００２５９３７７号（頁３４９−３５０）；国際公開第２００２３０２６８号（請求項２７；頁３７６）；国際公開第２００１４８２０４号（実施例；図４）
ＮＰ＿００１１９４骨形成タンパク質レセプター，タイプＩＢ／ｐｉｄ＝ＮＰ＿００１１９４．１−
相互参照：ＭＩＭ：６０３２４８；ＮＰ＿００１１９４．１；ＡＹ０６５９９４
【００５２】
（２）Ｅ１６（ＬＡＴ１，ＳＬＣ７Ａ５，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３４８６）
Biochem. Biophys. Res. Commun. 255 (2), 283-288 (1999), Nature 395 (6699):288-291 (1998), Gaugitsch, H.W., et al (1992) J. Biol. Chem. 267 (16):11267-11273)；国際公開第２００４０４８９３８号（実施例２）；国際公開第２００４０３２８４２号（実施例ＩＶ）；国際公開第２００３０４２６６１号（請求項１２）；国際公開第２００３０１６４７５号（請求項１）；国際公開第２００２７８５２４号（実施例２）；国際公開第２００２９９０７４号（請求項１９；頁１２７−１２９）；国際公開第２００２８６４４３号（請求項２７；頁２２２，３９３）；国際公開第２００３００３９０６号（請求項１０；頁２９３）；国際公開第２００２６４７９８号（請求項３３；頁９３−９５）；国際公開第２０００１４２２８号（請求項５；頁１３３−１３６）；米国特許出願公開第２００３２２４４５４号（図３）；国際公開第２００３０２５１３８号（請求項１２；頁１５０）；
ＮＰ＿００３４７７溶質担体ファミリー７（カチオン性アミノ酸輸送体，ｙ＋
システム），メンバー５／ｐｉｄ＝ＮＰ＿００３４７７．３−ホモサピエンス
相互参照：ＭＩＭ：６００１８２；ＮＰ＿００３４７７．３；ＮＭ＿０１５９２３；ＮＭ＿００３４８６＿１
【００５３】
（３）ＳＴＥＡＰ１（前立腺の６回膜貫通型上皮抗原，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１２４４９）
Cancer Res. 61 (15), 5857-5860 (2001), Hubert, R.S., et al (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (25):14523-14528)；国際公開第２００４０６５５７７号（請求項６）；国際公開第２００４０２７０４９号（図１Ｌ）；欧州特許第１３９４２７４号（実施例１１）；国際公開第２００４０１６２２５号（請求項２）；国際公開第２００３０４２６６１号（請求項１２）；米国特許出願公開第２００３１５７０８９号（実施例５）；米国特許出願公開第２００３１８５８３０号（実施例５）；米国特許出願公開第２００３０６４３９７号（図２）；国際公開第２００２８９７４７号（実施例５；頁６１８−６１９）；国際公開第２００３０２２９９５号（実施例９；図１３Ａ，実施例５３；頁１７３，実施例２；図２Ａ）；
ＮＰ＿０３６５８１ 前立腺の６回膜貫通型上皮抗原
相互参照：ＭＩＭ：６０４４１５；ＮＰ＿０３６５８１．１；ＮＭ＿０１２４４９＿１
【００５４】
（４）０７７２Ｐ（ＣＡ１２５，ＭＵＣ１６，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ３６１４８６）
J. Biol. Chem. 276 (29):27371-27375 (2001))；国際公開第２００４０４５５５３号（請求項１４）；国際公開第２００２９２８３６号（請求項６；図１２）；国際公開第２００２８３８６６号（請求項１５；頁１１６−１２１）；米国特許出願公開第２００３１２４１４０号（実施例１６）；相互参照：ＧＩ：３４５０１４６７；ＡＡＫ７４１２０．３；ＡＦ３６１４８６＿１
【００５５】
（５）ＭＰＦ（ＭＰＦ，ＭＳＬＮ，ＳＭＲ，巨核球増強因子、メソテリン，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５８２３）
Yamaguchi, N., et al Biol. Chem. 269 (2), 805-808 (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (20):11531-11536 (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (1):136-140 (1996), J. Biol. Chem. 270 (37):21984-21990 (1995))；国際公開第２００３１０１２８３号（請求項１４）；（国際公開第２００２１０２２３５号（請求項１３；頁２８７−２８８）；国際公開第２００２１０１０７５号（請求項４；頁３０８−３０９）；国際公開第２００２７１９２８号（頁３２０−３２１）；国際公開第９４１０３１２号（頁５２−５７）；相互参照：ＭＩＭ：６０１０５１；ＮＰ＿００５８１４．２；ＮＭ＿００５８２３＿１
【００５６】
（６）Ｎａｐｉ３ｂ（ＮＡＰＩ−３Ｂ，ＮＰＴＩＩｂ，ＳＬＣ３４Ａ２，溶質輸送体ファミリー３４（リン酸ナトリウム），メンバー２，ＩＩ型ナトリウム依存性リン酸トランスポーター３ｂ，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００６４２４）
J. Biol. Chem. 277 (22):19665-19672 (2002), Genomics 62 (2):281-284 (1999), Feild, J.A., et al (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 258 (3):578-582)；国際公開第２００４０２２７７８号（請求項２）；欧州特許第１３９４２７４号（実施例１１）；国際公開第２００２１０２２３５号（請求項１３；頁３２６）；欧州特許第８７５５６９号（請求項１；頁１７−１９）；国際公開第２００１５７１８８号（請求項２０；頁３２９）；国際公開第２００４０３２８４２号（実施例ＩＶ）；国際公開第２００１７５１７７号（請求項２４；頁１３９−１４０）；
相互参照：ＭＩＭ：６０４２１７；ＮＰ＿００６４１５．１；ＮＭ＿００６４２４＿１
【００５７】
（７）Ｓｅｍａ５ｂ（ＦＬＪ１０３７２，ＫＩＡＡ１４４５，Ｍｍ．４２０１５，ＳＥＭＡ５Ｂ，ＳＥＭＡＧ，セマフォリン ５ｂ Ｈｌｏｇ，セマドメイン（ｓｅｍａ ｄｏｍａｉｎ），７回トロンボスポンジン反復（１型及び１型様），膜貫通ドメイン（ＴＭ）および短い細胞質ドメイン，（セマフォリン）５Ｂ，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＢ０４０８７８）
Nagase T., et al (2000) DNA Res. 7 (2):143-150)；国際公開第２００４０００９９７号（請求項１）；国際公開第２００３００３９８４号（請求項１）；国際公開第２００２０６３３９号（請求項１；頁５０）；国際公開第２００１８８１３３号（請求項１；頁４１−４３，４８−５８）；国際公開第２００３０５４１５２号（請求項２０）；国際公開第２００３１０１４００号（請求項１１）；
受託番号：Ｑ９Ｐ２８３；ＥＭＢＬ；ＡＢ０４０８７８；ＢＡＡ９５９６９．１．Ｇｅｎｅｗ；ＨＧＮＣ：１０７３７；
【００５８】
（８）ＰＳＣＡ ｈｌｇ （２７０００５０Ｃ１２Ｒｉｋ，Ｃ５３０００８Ｏ１６Ｒｉｋ，ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ ２７０００５０Ｃ１２，ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ ２７０００５０Ｃ１２ 遺伝子，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ３５８６２８）；Ross et al (2002) Cancer Res. 62:2546-2553；米国特許出願公開第２００３１２９１９２号（請求項２）；米国特許出願公開第２００４０４４１８０号（請求項１２）；米国特許出願公開第２００４０４４１７９号（請求項１１）；米国特許出願公開第２００３０９６９６１号（請求項１１）；米国特許出願公開第２００３２３２０５６号（実施例５）；国際公開第２００３１０５７５８号（請求項１２）；米国特許出願公開第２００３２０６９１８号（実施例５）；欧州特許第１３４７０４６号（請求項１）；国際公開第２００３０２５１４８号（請求項２０）；
相互参照：ＧＩ：３７１８２３７８；ＡＡＱ８８９９１．１；ＡＹ３５８６２８＿１
【００５９】
（９）ＥＴＢＲ（エンドセリンタイプＢレセプター，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ２７５４６３）；
Nakamuta M., et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 177, 34-39, 1991; Ogawa Y., et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 178, 248-255, 1991; Arai H., et al Jpn. Circ. J. 56, 1303-1307, 1992; Arai H., et al J. Biol. Chem. 268, 3463-3470, 1993; Sakamoto A., Yanagisawa M., et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 178, 656-663, 1991; Elshourbagy N.A., et al J. Biol. Chem. 268, 3873-3879, 1993; Haendler B., et al J. Cardiovasc. Pharmacol. 20, s1-S4, 1992; Tsutsumi M., et al Gene 228, 43-49, 1999; Strausberg R.L., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16899-16903, 2002; Bourgeois C., et al J. Clin. Endocrinol. Metab. 82, 3116-3123, 1997; Okamoto Y., et al Biol. Chem. 272, 21589-21596, 1997; Verheij J.B., et al Am. J. Med. Genet. 108, 223-225, 2002; Hofstra R.M.W., et al Eur. J. Hum. Genet. 5, 180-185, 1997; Puffenberger E.G., et al Cell 79, 1257-1266, 1994; Attie T., et al, Hum. Mol. Genet. 4, 2407-2409, 1995; Auricchio A., et al Hum. Mol. Genet. 5:351-354, 1996; Amiel J., et al Hum. Mol. Genet. 5, 355-357, 1996; Hofstra R.M.W., et al Nat. Genet. 12, 445-447, 1996; Svensson P.J., et al Hum. Genet. 103, 145-148, 1998; Fuchs S., et al Mol. Med. 7, 115-124, 2001; Pingault V., et al (2002) Hum. Genet. 111, 198-206；国際公開第２００４０４５５１６号（請求項１）；国際公開第２００４０４８９３８号（実施例２）；国際公開第２００４０４００００号（請求項１５１）；国際公開第２００３０８７７６８号（請求項１）；国際公開第２００３０１６４７５号（請求項１）；国際公開第２００３０１６４７５号（請求項１）；国際公開第２００２６１０８７号（図１）；国際公開第２００３０１６４９４号（図６）；国際公開第２００３０２５１３８号（請求項１２；頁１４４）；国際公開第２００１９８３５１号（請求項１；頁１２４−１２５）；欧州特許第５２２８６８号（請求項８；図２）；国際公開第２００１７７１７２号（請求項１；頁２９７−２９９）；米国特許出願公開第２００３１０９６７６号；米国特許第６５１８４０４号（図３）；米国特許第５７７３２２３号（請求項１ａ；Ｃｏｌ ３１−３４）；国際公開第２００４００１００４号；
【００６０】
（１０）ＭＳＧ７８３（ＲＮＦ１２４，仮想タンパク質 ＦＬＪ２０３１５，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１７７６３）；
国際公開第２００３１０４２７５号（請求項１）；国際公開第２００４０４６３４２号（実施例２）；国際公開第２００３０４２６６１号（請求項１２）；国際公開第２００３０８３０７４号（請求項１４；頁６１）；国際公開第２００３０１８６２１号（請求項１）；国際公開第２００３０２４３９２号（請求項２；図９３）；国際公開第２００１６６６８９号（実施例６）；
相互参照：遺伝子座番号：５４８９４；ＮＰ＿０６０２３３．２；ＮＭ＿０１７７６３＿１
【００６１】
（１１）ＳＴＥＡＰ２（ＨＧＮＣ＿８６３９，ＩＰＣＡ−１，ＰＣＡＮＡＰ１，ＳＴＡＭＰ１，ＳＴＥＡＰ２，ＳＴＭＰ，前立腺癌関連遺伝子１，前立腺癌関連タンパク質１，前立腺の６回膜貫通型上皮抗原２，６回膜貫通型前立腺タンパク質，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ４５５１３８）
Lab. Invest. 82 (11):1573-1582 (2002))；国際公開第２００３０８７３０６号；米国特許出願公開第２００３０６４３９７号（請求項１；図１）；国際公開第２００２７２５９６号（請求項１３；頁５４−５５）；国際公開第２００１７２９６２号（請求項１；図４Ｂ）；国際公開第２００３１０４２７０号（請求項１１）；国際公開第２００３１０４２７０号（請求項１６）；米国特許出願公開第２００４００５５９８号（請求項２２）；国際公開第２００３０４２６６１号（請求項１２）；米国特許出願公開第２００３０６０６１２号（請求項１２；図１０）；国際公開第２００２２６８２２号（請求項２３；図２）；国際公開第２００２１６４２９号（請求項１２；図１０）；
相互参照：ＧＩ：２２６５５４８８；ＡＡＮ０４０８０．１；ＡＦ４５５１３８＿１
【００６２】
（１２）ＴｒｐＭ４（ＢＲ２２４５０，ＦＬＪ２００４１，ＴＲＰＭ４，ＴＲＰＭ４Ｂ，一過性レセプター電位カチオンチャネル，サブファミリーＭ，メンバー４，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１７６３６）
Xu, X.Z., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (19):10692-10697 (2001), Cell 109 (3):397-407 (2002), J. Biol. Chem. 278 (33):30813-30820 (2003))；米国特許出願公開第２００３１４３５５７号（請求項４）；国際公開第２０００４０６１４号（請求項１４；頁１００−１０３）；国際公開第２００２１０３８２号（請求項１；図９Ａ）；国際公開第２００３０４２６６１号（請求項１２）；国際公開第２００２３０２６８号（請求項２７；頁３９１）；米国特許出願公開第２００３２１９８０６号（請求項４）；国際公開第２００１６２７９４号（請求項１４；図１Ａ−Ｄ）；
相互参照：ＭＩＭ：６０６９３６；ＮＰ＿０６０１０６．２；ＮＭ＿０１７６３６＿１
【００６３】
（１３）ＣＲＩＰＴＯ（ＣＲ，ＣＲ１，ＣＲＧＦ，ＣＲＩＰＴＯ，ＴＤＧＦ１，奇形癌腫由来増殖因子，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００３２０３又はＮＭ＿００３２１２）
Ciccodicola, A., et al EMBO J. 8 (7):1987-1991 (1989), Am. J. Hum. Genet. 49 (3):555-565 (1991))；米国特許出願公開第２００３２２４４１１号（請求項１）；国際公開第２００３０８３０４１号（実施例１）；国際公開第２００３０３４９８４号（請求項１２）；国際公開第２００２８８１７０号（請求項２；頁５２−５３）；国際公開第２００３０２４３９２号（請求項２；図５８）；国際公開第２００２１６４１３号（請求項１；頁９４−９５，１０５）；国際公開第２００２２２８０８号（請求項２；図１）；米国特許第５８５４３９９号（実施例２；Ｃｏｌ １７−１８）；米国特許第５７９２６１６号（図２）；
相互参照：ＭＩＭ：１８７３９５；ＮＰ＿００３２０３．１；ＮＭ＿００３２１２＿１
【００６４】
（１４）ＣＤ２１（ＣＲ２（補体レセプター２）又はＣ３ＤＲ（Ｃ３ｄ／エブスタインバーウイルスレセプター）又はＨｓ．７３７９２ Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ２６００４）
Fujisaku et al (1989) J. Biol. Chem. 264 (4):2118-2125); Weis J.J., et al J. Exp. Med. 167, 1047-1066, 1988; Moore M., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84, 9194-9198, 1987; Barel M., et al Mol. Immunol. 35, 1025-1031, 1998; Weis J.J., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 5639-5643, 1986; Sinha S.K., et al (1993) J. Immunol. 150, 5311-5320；国際公開第２００４０４５５２０号（実施例４）；米国特許出願公開第２００４００５５３８号（実施例１）；国際公開第２００３０６２４０１号（請求項９）；国際公開第２００４０４５５２０号（実施例４）；国際公開第９１０２５３６号（図９．１−９．９）；国際公開第２００４０２０５９５号（請求項１）；
受託番号：Ｐ２００２３；Ｑ１３８６６；Ｑ１４２１２；ＥＭＢＬ；Ｍ２６００４；ＡＡＡ３５７８６．１．
【００６５】
（１５）ＣＤ７９ｂ（ＣＤ７９Ｂ，ＣＤ７９β，ＩＧｂ（免疫グロブリン関連β（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｂｅｔａ）），Ｂ２９，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号 ＮＭ＿０００６２６又は１１０３８６７４）
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (7):4126-4131, Blood (2002) 100 (9):3068-3076, Muller et al (1992) Eur. J. Immunol. 22 (6):1621-1625)；国際公開第２００４０１６２２５号（請求項２，図１４０）；国際公開第２００３０８７７６８号，米国特許出願公開第２００４１０１８７４号（請求項１，頁１０２）；国際公開第２００３０６２４０１号（請求項９）；国際公開第２００２７８５２４号（実施例２）；米国特許出願公開第２００２１５０５７３号（請求項５，頁１５）；米国特許第５６４４０３３号；国際公開第２００３０４８２０２号（請求項１，頁３０６及び３０９）；国際公開第９９／５５８６５８号，米国特許第６５３４４８２号（請求項１３，図１７Ａ／Ｂ）；国際公開第２０００５５３５１号（請求項１１，頁１１４５−１１４６）；
相互参照：ＭＩＭ：１４７２４５；ＮＰ＿０００６１７．１；ＮＭ＿０００６２６＿１
【００６６】
（１６）ＦｃＲＨ２（ＩＦＧＰ４，ＩＲＴＡ４，ＳＰＡＰ１Ａ（ＳＨ２ドメイン含有ホスファターゼアンカータンパク質１ａ），ＳＰＡＰ１Ｂ，ＳＰＡＰ１Ｃ，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０３０７６４，ＡＹ３５８１３０）
Genome Res. 13 (10):2265-2270 (2003), Immunogenetics 54 (2):87-95 (2002), Blood 99 (8):2662-2669 (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (17):9772-9777 (2001), Xu, M.J., et al (2001) Biochem. Biophys. Res. Commun. 280 (3):768-775；国際公開第２００４０１６２２５号（請求項２）；国際公開第２００３０７７８３６号；国際公開第２００１３８４９０号（請求項５；図１８Ｄ−１−１８Ｄ−２）；国際公開第２００３０９７８０３号（請求項１２）；国際公開第２００３０８９６２４号（請求項２５）；
相互参照：ＭＩＭ：６０６５０９；ＮＰ＿１１０３９１．２；ＮＭ＿０３０７６４＿１
【００６７】
（１７）ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ１１７３０）
Coussens L., et al Science (1985) 230(4730):1132-1139); Yamamoto T., et al Nature 319, 230-234, 1986; Semba K., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 6497-6501, 1985; Swiercz J.M., et al J. Cell Biol. 165, 869-880, 2004; Kuhns J.J., et al J. Biol. Chem. 274, 36422-36427, 1999; Cho H.-S., et al Nature 421, 756-760, 2003; Ehsani A., et al (1993) Genomics 15, 426-429；国際公開第２００４０４８９３８号（実施例２）；国際公開第２００４０２７０４９号（図１Ｉ）；国際公開第２００４００９６２２；国際公開第２００３０８１２１０；国際公開第２００３０８９９０４号（請求項９）；国際公開第２００３０１６４７５号（請求項１）；米国特許出願公開第２００３１１８５９２号；国際公開第２００３００８５３７号（請求項１）；国際公開第２００３０５５４３９号（請求項２９；図１Ａ−Ｂ）；国際公開第２００３０２５２２８号（請求項３７；図５Ｃ）；国際公開第２００２２２６３６号（実施例１３；頁９５−１０７）；国際公開第２００２１２３４１号（請求項６８；図７）；国際公開第２００２１３８４７号（頁７１−７４）；国際公開第２００２１４５０３号（頁１１４−１１７）；国際公開第２００１５３４６３号（請求項２；頁４１−４６）；国際公開第２００１４１７８７号（頁１５）；国際公開第２０００４４８９９号（請求項５２；図７）；国際公開第２０００２０５７９号（請求項３；図２）；米国特許第５８６９４４５号（請求項３；Ｃｏｌ ３１−３８）；国際公開第９６３０５１４号（請求項２；頁５６−６１）；欧州特許第１４３９３９３号（請求項７）；国際公開第２００４０４３３６１号（請求項７）；国際公開第２００４０２２７０９号；国際公開第２００１００２４４号（実施例３；図４）；
受託番号：Ｐ０４６２６；ＥＭＢＬ；Ｍ１１７６７；ＡＡＡ３５８０８．１．ＥＭＢＬ；Ｍ１１７６１；ＡＡＡ３５８０８．１．
【００６８】
（１８）ＮＣＡ（ＣＥＡＣＡＭ６，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ１８７２８）；
Barnett T., et al Genomics 3, 59-66, 1988; Tawaragi Y., et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 150, 89-96, 1988; Strausberg R.L., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99:16899-16903, 2002；国際公開第２００４０６３７０９；欧州特許第１４３９３９３号（請求項７）；国際公開第２００４０４４１７８号（実施例４）；国際公開第２００４０３１２３８号；国際公開第２００３０４２６６１号（請求項１２）；国際公開第２００２７８５２４号（実施例２）；国際公開第２００２８６４４３号（請求項２７；頁４２７）；国際公開第２００２６０３１７号（請求項２）；
受託番号：Ｐ４０１９９；Ｑ１４９２０；ＥＭＢＬ；Ｍ２９５４１；ＡＡＡ５９９１５．１．ＥＭＢＬ；Ｍ１８７２８；
【００６９】
（１９）ＭＤＰ（ＤＰＥＰ１，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＢＣ０１７０２３）
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (26):16899-16903 (2002))；国際公開第２００３０１６４７５号（請求項１）；国際公開第２００２６４７９８号（請求項３３；頁８５−８７）；特公平５−００３７９０号公報（図６−８）；国際公開第９９４６２８４号（図９）；
相互参照：ＭＩＭ：１７９７８０；ＡＡＨ１７０２３．１；ＢＣ０１７０２３＿１
【００７０】
（２０）ＩＬ２０Ｒα（ＩＬ２０Ｒａ，ＺＣＹＴＯＲ７，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ１８４９７１）；
Clark H.F., et al Genome Res. 13, 2265-2270, 2003; Mungall A.J., et al Nature 425, 805-811, 2003; Blumberg H., et al Cell 104, 9-19, 2001; Dumoutier L., et al J. Immunol. 167, 3545-3549, 2001; Parrish-Novak J., et al J. Biol. Chem. 277, 47517-47523, 2002; Pletnev S., et al (2003) Biochemistry 42:12617-12624; Sheikh F., et al (2004) J. Immunol. 172, 2006-2010；欧州特許第１３９４２７４号（実施例１１）；米国特許出願公開第２００４００５３２０号（実施例５）；国際公開第２００３０２９２６２号（頁７４−７５）；国際公開第２００３００２７１７号（請求項２；頁６３）；国際公開第２００２２２１５３号（頁４５−４７）；米国特許出願公開第２００２０４２３６６号（頁２０−２１）；国際公開第２００１４６２６１号（頁５７−５９）；国際公開第２００１４６２３２号（頁６３−６５）；国際公開第９８３７１９３号（請求項１；頁５５−５９）；
受託番号：Ｑ９ＵＨＦ４；Ｑ６ＵＷＡ９；Ｑ９６ＳＨ８；ＥＭＢＬ；ＡＦ１８４９７１；ＡＡＦ０１３２０．１．
【００７１】
（２１）ブレビカン（ＢＣＡＮ，ＢＥＨＡＢ，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ２２９０５３）
Gary S.C., et al Gene 256, 139-147, 2000; Clark H.F., et al Genome Res. 13, 2265-2270, 2003; Strausberg R.L., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16899-16903, 2002；米国特許出願公開第２００３１８６３７２号（請求項１１）；米国特許出願公開第２００３１８６３７３号（請求項１１）；米国特許出願公開第２００３１１９１３１号（請求項１；図５２）；米国特許出願公開第２００３１１９１２２号（請求項１；図５２）；米国特許出願公開第２００３１１９１２６号（請求項１）；米国特許出願公開第２００３１１９１２１号（請求項１；図５２）；米国特許出願公開第２００３１１９１２９号（請求項１）；米国特許出願公開第２００３１１９１３０号（請求項１）；米国特許出願公開第２００３１１９１２８号（請求項１；図５２）；米国特許出願公開第２００３１１９１２５号（請求項１）；国際公開第２００３０１６４７５号（請求項１）；国際公開第２００２０２６３４号（請求項１）；
【００７２】
（２２）ＥｐｈＢ２Ｒ（ＤＲＴ，ＥＲＫ，Ｈｅｋ５，ＥＰＨＴ３，Ｔｙｒｏ５，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４４４２）
Chan,J. and Watt, V.M., Oncogene 6 (6), 1057-1061 (1991) Oncogene 10 (5):897-905 (1995), Annu. Rev. Neurosci. 21:309-345 (1998), Int. Rev. Cytol. 196:177-244 (2000))；国際公開第２００３０４２６６１号（請求項１２）；国際公開第２０００５３２１６号（請求項１；頁４１）；国際公開第２００４０６５５７６号（請求項１）；国際公開第２００４０２０５８３号（請求項９）；国際公開第２００３００４５２９号（頁１２８−１３２）；国際公開第２０００５３２１６号（請求項１；頁４２）；
相互参照：ＭＩＭ：６００９９７；ＮＰ＿００４４３３．２；ＮＭ＿００４４４２＿１
【００７３】
（２３）ＡＳＬＧ６５９（Ｂ７ｈ，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＸ０９２３２８）
米国特許出願公開第２００４０１０１８９９号（請求項２）；国際公開第２００３１０４３９９号（請求項１１）；国際公開第２００４０００２２１号（図３）；米国特許出願公開第２００３１６５５０４号（請求項１）；米国特許出願公開第２００３１２４１４０号（実施例２）；米国特許出願公開第２００３０６５１４３号（図６０）；国際公開第２００２１０２２３５号（請求項１３；頁２９９）；米国特許出願公開第２００３０９１５８０号（実施例２）；国際公開第２００２１０１８７号（請求項６；図１０）；国際公開第２００１９４６４１号（請求項１２；図７ｂ）；国際公開第２００２０２６２４号（請求項１３；図１Ａ−１Ｂ）；米国特許出願公開第２００２０３４７４９号（請求項５４；頁４５−４６）；国際公開第２００２０６３１７号（実施例２；頁３２０−３２１，請求項３４；頁３２１−３２２）；国際公開第２００２７１９２８号（頁４６８−４６９）；国際公開第２００２０２５８７号（実施例１；図１）；国際公開第２００１４０２６９号（実施例３；頁１９０−１９２）；国際公開第２０００３６１０７号（実施例２；頁２０５−２０７）；国際公開第２００４０５３０７９号（請求項１２）；国際公開第２００３００４９８９号（請求項１）；国際公開第２００２７１９２８号（頁２３３−２３４，４５２−４５３）；国際公開第０１１６３１８号；
【００７４】
（２４）ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原前駆体，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＪ２９７４３６）
Reiter R.E., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1735-1740, 1998; Gu Z., et al Oncogene 19, 1288-1296, 2000; Biochem. Biophys. Res. Commun. (2000) 275(3):783-788；国際公開第２００４０２２７０９号；欧州特許第１３９４２７４号（実施例１１）；米国特許出願公開第２００４０１８５５３号（請求項１７）；国際公開第２００３００８５３７号（請求項１）；国際公開第２００２８１６４６号（請求項１；頁１６４）；国際公開第２００３００３９０６号（請求項１０；頁２８８）；国際公開第２００１４０３０９号（実施例１；図１７）；米国特許出願公開第２００１０５５７５１号（実施例１；図１ｂ）；国際公開第２０００３２７５２号（請求項１８；図１）；国際公開第９８５１８０５号（請求項１７；頁９７）；国際公開第９８５１８２４号（請求項１０；頁９４）；国際公開第９８４０４０３号（請求項２；図１Ｂ）；
受託番号：Ｏ４３６５３；ＥＭＢＬ；ＡＦ０４３４９８；ＡＡＣ３９６０７．１．
【００７５】
（２５）ＧＥＤＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ２６０７６３）；
ＡＡＰ１４９５４脂肪腫ＨＭＧＩＣ融合パートナー様タンパク質（ｆｕｓｉｏｎ−ｐａｒｔｎｅｒ−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）／ｐｉｄ＝ＡＡＰ１４９５４．１ − ホモ・サピエンス
種：ホモサピエンス（ヒト）
国際公開第２００３０５４１５２号（請求項２０）；国際公開第２００３０００８４２号（請求項１）；国際公開第２００３０２３０１３号（実施例３，請求項２０）；米国特許出願公開第２００３１９４７０４号（請求項４５）；
相互参照：ＧＩ：３０１０２４４９；ＡＡＰ１４９５４．１；ＡＹ２６０７６３＿１
【００７６】
（２６）ＢＡＦＦ−Ｒ（Ｂ細胞活性化因子レセプター，ＢＬｙＳレセプター３，ＢＲ３，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ１１６４５６）；ＢＡＦＦレセプター／ｐｉｄ＝ＮＰ＿４４３１７７．１ − ホモサピエンス
Thompson, J.S., et al Science 293 (5537), 2108-2111 (2001)；国際公開第２００４０５８３０９号；国際公開第２００４０１１６１１；国際公開第２００３０４５４２２号（実施例；頁３２−３３）；国際公開第２００３０１４２９４号（請求項３５；図６Ｂ）；国際公開第２００３０３５８４６号（請求項７０；頁６１５−６１６）；国際公開第２００２９４８５２号（Ｃｏｌ １３６−１３７）；国際公開第２００２３８７６６号（請求項３；頁１３３）；国際公開第２００２２４９０９号（実施例３；図３）；
相互参照：ＭＩＭ：６０６２６９；ＮＰ＿４４３１７７．１；ＮＭ＿０５２９４５＿１；ＡＦ１３２６００
【００７７】
（２７）ＣＤ２２（Ｂ細胞レセプターＣＤ２２−Ｂアイソフォーム，ＢＬ−ＣＡＭ，Ｌｙｂ−８，Ｌｙｂ８，ＳＩＧＬＥＣ−２，ＦＬＪ２２８１４，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＫ０２６４６７）；
Wilson et al (1991) J. Exp. Med. 173:137-146；国際公開第２００３０７２０３６号（請求項１；図１）；
相互参照：ＭＩＭ：１０７２６６；ＮＰ＿００１７６２．１；ＮＭ＿００１７７１＿１
【００７８】
（２８）ＣＤ７９ａ（ＣＤ７９Ａ，ＣＤ７９α，免疫グロブリン関連α（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｌｐｈａ），免疫グロブリンベータ（ＣＤ７９Ｂ）と共有結合性に相互作用し、ＩｇＭ分子と表面上で複合体を形成し、Ｂ細胞分化に関与するシグナルを伝達するＢ細胞特異的タンパク質），等電点：４．８４，分子量：２５０２８ ＴＭ：２［Ｐ］遺伝子染色体：１９ｑ１３．２，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１７７４．１０）
；国際公開第９２０７５７４号（図１）；米国特許第５６４４０３３号；Ha et al (1992) J. Immunol. 148(5):1526-1531; Mueller et al (1992) Eur. J. Biochem. 22:1621-1625; Hashimoto et al (1994) Immunogenetics 40(4):287-295; Preud'homme et al (1992) Clin. Exp. Immunol. 90(1):141-146; Yu et al (1992) J. Immunol. 148(2) 633-637; Sakaguchi et al (1988) EMBO J. 7(11):3457-3464；
【００７９】
（２９）ＣＸＣＲ５（バーキットリンパ腫レセプター１は、ＣＸＣＬ１３ケモカインによって活性化され、リンパ球遊走及び体液性防御において機能し、ＨＩＶ−２感染、おそらくエイズ、リンパ腫、骨髄腫、及び白血病の発症において役割を果たす、Ｇタンパク質共役型受容体）；３７２アミノ酸，等電点：８．５４ 分子量：４１９５９ ＴＭ：７［Ｐ］遺伝子染色体：１１ｑ２３．３，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１７０７．１）
国際公開第２００４０４００００号；国際公開第２００４０１５４２６号；米国特許出願公開第２００３１０５２９２号（実施例２）；米国特許第６５５５３３９号（実施例２）；国際公開第２００２６１０８７号（図１）；国際公開第２００１５７１８８号（請求項２０，頁２６９）；国際公開第２００１７２８３０号（頁１２−１３）；国際公開第２０００２２１２９号（実施例１，頁１５２−１５３，実施例２，頁２５４−２５６）；国際公開第９９２８４６８号（請求項１，頁３８）；米国特許第５４４００２１号（実施例２，ｃｏｌ ４９−５２）；国際公開第９４２８９３１号（頁５６−５８）；国際公開第９２１７４９７号（請求項７，図５）；Dobner et al (1992) Eur. J. Immunol. 22:2795-2799; Barella et al (1995) Biochem. J. 309:773-779；
【００８０】
（３０）ＨＬＡ−ＤＯＢ（ペプチドを結合しそれらをＣＤ４＋Ｔリンパ球に提示するＭＨＣクラスＩＩ分子（Ｉａ抗原）のベータサブユニット）；２７３アミノ酸，等電点：６．５６ 分子量：３０８２０ ＴＭ：１［Ｐ］遺伝子染色体：６ｐ２１．３，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００２１１１．１）
Tonnelle et al (1985) EMBO J. 4(11):2839-2847; Jonsson et al (1989) Immunogenetics 29(6):411-413; Beck et al (1992) J. Mol. Biol. 228:433-441; Strausberg et al (2002) Proc. Natl. Acad. Sci USA 99:16899-16903; Servenius et al (1987) J. Biol. Chem. 262:8759-8766; Beck et al (1996) J. Mol. Biol. 255:1-13; Naruse et al (2002) Tissue Antigens 59:512-519；国際公開第９９５８６５８号（請求項１３，図１５）；米国特許第６１５３４０８号（Ｃｏｌ ３５−３８）；米国特許第５９７６５５１号（ｃｏｌ １６８−１７０）；米国特許第６０１１１４６号（ｃｏｌ １４５−１４６）；Kasahara et al (1989) Immunogenetics 30(1):66-68; Larhammar et al (1985) J. Biol. Chem. 260(26):14111-14119；
【００８１】
（３１）Ｐ２Ｘ５（プリンレセプターＰ２Ｘリガンド開口型イオンチャネル５は、細胞外ＡＴＰにより開閉されるイオンチャネルであり、シナプス伝達及び神経発生に関与する可能性があり、欠乏は、特発性排尿筋不安定性の病態生理の一因となり得る；４２２アミノ酸），等電点：７．６３，分子量：４７２０６ ＴＭ：１［Ｐ］遺伝子染色体：１７ｐ１３．３，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００２５５２．２）
Le et al (1997) FEBS Lett. 418(1-2):195-199；国際公開第２００４０４７７４９号；国際公開第２００３０７２０３５号（請求項１０）；Touchman et al (2000) Genome Res. 10:165-173；国際公開第２００２２２６６０号（請求項２０）；国際公開第２００３０９３４４４号（請求項１）；国際公開第２００３０８７７６８号（請求項１）；国際公開第２００３０２９２７７号（頁８２）；
【００８２】
（３２）ＣＤ７２（Ｂ細胞分化抗原ＣＤ７２，Ｌｙｂ−２） ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＥＱＵＥＮＣＥ Ｆｕｌｌ ｍａｅａｉｔｙ．．．ｔａｆｒｆｐｄ（１．．３５９；３５９アミノ酸），等電点：８．６６，分子量：４０２２５ ＴＭ：１［Ｐ］遺伝子染色体：９ｐ１３．３，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１７７３．１）
国際公開第２００４０４２３４６号（請求項６５）；国際公開第２００３０２６４９３号（頁５１−５２，５７−５８）；国際公開第２０００７５６５５号（頁１０５−１０６）；Von Hoegen et al (1990) J. Immunol. 144(12):4870-4877; Strausberg et al (2002) Proc. Natl. Acad. Sci USA 99:16899-16903；
【００８３】
（３３）ＬＹ６４（リンパ球抗原６４（ＲＰ１０５），ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）ファミリーのＩ型膜タンパク質であり、Ｂ細胞の活性化及びアポトーシスを制御し、機能喪失は全身性エリテマトーデスの患者における疾患活性の上昇に関連する）；６６１アミノ酸，等電点：６．２０，分子量：７４１４７ ＴＭ：１［Ｐ］遺伝子染色体：５ｑ１２，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００５５７３．１）
米国特許出願公開第２００２１９３５６７号；国際公開第９７０７１９８号（請求項１１，頁３９−４２）；Miura et al (1996) Genomics 38(3):299-304; Miura et al (1998) Blood 92:2815-2822；国際公開第２００３０８３０４７号；国際公開第９７４４４５２号（請求項８，頁５７−６１）；国際公開第２０００１２１３０号（頁２４−２６）；
【００８４】
（３４）ＦｃＲＨ１（Ｆｃレセプター様タンパク質１，Ｃ２タイプＩｇ様ドメイン及びＩＴＡＭドメインを含む免疫グロブリンＦｃドメインについての推定上のレセプターであり、Ｂ−リンパ球分化において役割を有し得る）；４２９アミノ酸，等電点：５．２８，分子量：４６９２５ ＴＭ：１［Ｐ］遺伝子染色体：１ｑ２１−１ｑ２２，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿４４３１７０．１）
国際公開第２００３０７７８３６号；国際公開第２００１３８４９０号（請求項６，図１８Ｅ−１−１８−Ｅ−２）；Davis et al (2001) Proc. Natl. Acad. Sci USA 98(17):9772-9777；国際公開第２００３０８９６２４号（請求項８）；欧州特許第１３４７０４６号（請求項１）；国際公開第２００３０８９６２４号（請求項７）；
【００８５】
（３５）ＩＲＴＡ２免疫グロブリンスーパーファミリーレセプタートランスロケーション関連２（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ２）、Ｂ細胞発生及びリンパ腫形成において役割を有し得る推定上の免疫レセプター；一部のＢ細胞悪性腫瘍においてトランスロケーションによる遺伝子の調節解除が発生する）；９７７アミノ酸，等電点：６．８８ 分子量：１０６４６８ ＴＭ：１［Ｐ］遺伝子染色体：１ｑ２１，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ヒト：ＡＦ３４３６６２，ＡＦ３４３６６３，ＡＦ３４３６６４，ＡＦ３４３６６５，ＡＦ３６９７９４，ＡＦ３９７４５３，ＡＫ０９０４２３，ＡＫ０９０４７５，ＡＬ８３４１８７，ＡＹ３５８０８５；マウス：ＡＫ０８９７５６，ＡＹ１５８０９０，ＡＹ５０６５５８；ＮＰ＿１１２５７１．１, 
国際公開第２００３０２４３９２号（請求項２，図９７）； Nakayama et al (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 277(1):124-127；国際公開第２００３０７７８３６号；国際公開第２００１３８４９０号（請求項３，図１８Ｂ−１−１８Ｂ−２）；
【００８６】
（３６）ＴＥＮＢ２（ＴＭＥＦＦ２，ｔｏｍｏｒｅｇｕｌｉｎ，ＴＰＥＦ，ＨＰＰ１，ＴＲ，増殖因子のＥＧＦ／ヘレグリンファミリー及びフォリスタチンに関連する推定上の膜貫通型プロテオグリカン）；３７４アミノ酸，ＮＣＢＩ受託番号：ＡＡＤ５５７７６，ＡＡＦ９１３９７，ＡＡＧ４９４５１，ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０５７２７６；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ：２３６７１；ＯＭＩＭ：６０５７３４；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｑ９ＵＩＫ５；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ１７９２７４；ＡＹ３５８９０７，ＣＡＦ８５７２３，ＣＱ７８２４３６
国際公開第２００４０７４３２０号（配列番号８１０）；特開２００４−１１３１５１号公報（配列番号２，４，８）；国際公開第２００３０４２６６１号（配列番号５８０）；国際公開第２００３００９８１４号（配列番号４１１）；欧州特許第１２９５９４４号（頁６９−７０）；国際公開第２００２３０２６８号（頁３２９）；国際公開第２００１９０３０４号（配列番号２７０６）；米国特許出願公開第２００４２４９１３０号；米国特許出願公開第２００４０２２７２７号；国際公開第２００４０６３３５５号；米国特許出願公開第２００４１９７３２５号；米国特許出願公開第２００３２３２３５０号；米国特許出願公開第２００４００５５６３号；米国特許出願公開第２００３１２４５７９号；Ｈｏｒｉｅ ｅｔ ａｌ（２０００）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ６７：１４６−１５２；Uchida et al (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 266:593-602; Liang et al (2000) Cancer Res. 60:4907-12; Glynne-Jones et al (2001) Int J Cancer. Oct 15;94(2):178-84；
【００８７】
（３７）ＰＭＥＬ１７ （シルバーホモログ（ｓｉｌｖｅｒ ｈｏｍｏｌｏｇ）；ＳＩＬＶ；Ｄ１２Ｓ５３Ｅ；ＰＭＥＬ１７；（ＳＩ）；（ＳＩＬ）；ＭＥ２０；ｇｐ１００）ＢＣ００１４１４；ＢＴ００７２０２；Ｍ３２２９５；Ｍ７７３４８；ＮＭ＿００６９２８； McGlinchey, R.P. et al (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (33), 13731-13736; Kummer, M.P. et al (2009) J. Biol. Chem. 284 (4), 2296-2306；
【００８８】
（３８）ＴＭＥＦＦ１（ＥＧＦ様及び２つのフォリスタチン様ドメインを有する膜貫通型タンパク質１；Ｔｏｍｏｒｅｇｕｌｉｎ−１；Ｈ７３６５；Ｃ９ｏｒｆ２；Ｃ９ＯＲＦ２；Ｕ１９８７８；Ｘ８３９６１）ＮＭ＿０８０６５５；ＮＭ＿００３６９２； Harms, P.W. (2003) Genes Dev. 17 (21), 2624-2629; Gery, S. et al (2003) Oncogene 22 (18):2723-2727；
【００８９】
（３９）ＧＤＮＦ−Ｒａ１（ＧＤＮＦファミリーレセプターアルファ１；ＧＦＲＡ１；ＧＤＮＦＲ；ＧＤＮＦＲＡ；ＲＥＴＬ１；ＴＲＮＲ１；ＲＥＴ１Ｌ；ＧＤＮＦＲ−アルファ１；ＧＦＲ−ＡＬＰＨＡ−１；Ｕ９５８４７；ＢＣ０１４９６２；ＮＭ＿１４５７９３）ＮＭ＿００５２６４； Kim,M.H. et al (2009) Mol. Cell. Biol. 29 (8), 2264-2277; Treanor, J.J. et al (1996) Nature 382 (6586):80-83；
【００９０】
（４０）Ｌｙ６Ｅ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｅ；Ｌｙ６７，ＲＩＧ−Ｅ，ＳＣＡ−２，ＴＳＡ−１）ＮＰ＿００２３３７．１；ＮＭ＿００２３４６．２；de Nooij-van Dalen,A.G. et al (2003) Int. J. Cancer 103 (6), 768-774; Zammit,D.J. et al (2002) Mol. Cell. Biol. 22 (3):946-952；
【００９１】
（４１）ＴＭＥＭ４６（シサホモログ（ｓｈｉｓａ ｈｏｍｏｌｏｇ）２（アフリカツメガエル）；ＳＨＩＳＡ２）ＮＰ＿００１００７５３９．１；ＮＭ＿００１００７５３８．１；Furushima,K. et al (2007) Dev. Biol. 306 (2), 480-492; Clark,H.F. et al (2003) Genome Res. 13 (10):2265-2270；
【００９２】
（４２）Ｌｙ６Ｇ６Ｄ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｇ６Ｄ；Ｌｙ６−Ｄ，ＭＥＧＴ１）ＮＰ＿０６７０７９．２；ＮＭ＿０２１２４６．２； Mallya, M. et al (2002) Genomics 80 (1):113-123; Ribas,G. et al (1999) J. Immunol. 163 (1):278-287；
【００９３】
（４３）ＬＧＲ５（ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役型受容体５；ＧＰＲ４９，ＧＰＲ６７）ＮＰ＿００３６５８．１；ＮＭ＿００３６６７．２；Salanti,G. et al (2009) Am. J. Epidemiol. 170 (5):537-545; Yamamoto,Y. et al (2003) Hepatology 37 (3):528-533；
【００９４】
（４４）ＲＥＴ（ｒｅｔプロトオンコジーン；ＭＥＮ２Ａ；ＨＳＣＲ１；ＭＥＮ２Ｂ；ＭＴＣ１；（ＰＴＣ）；ＣＤＨＦ１２；Ｈｓ．１６８１１４；ＲＥＴ５１；ＲＥＴ−ＥＬＥ１）ＮＰ＿０６６１２４．１；ＮＭ＿０２０９７５．４；Tsukamoto,H. et al (2009) Cancer Sci. 100 (10):1895-1901; Narita,N. et al (2009) Oncogene 28 (34):3058-3068；
【００９５】
（４５）ＬＹ６Ｋ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｋ；ＬＹ６Ｋ；ＨＳＪ００１３４８；ＦＬＪ３５２２６）ＮＰ＿０５９９９７．３；ＮＭ＿０１７５２７．３；Ishikawa,N. et al (2007) Cancer Res. 67 (24):11601-11611; de Nooij-van Dalen,A.G. et al (2003) Int. J. Cancer 103 (6):768-774；
【００９６】
（４６）ＧＰＲ１９（Ｇタンパク質共役型受容体１９；Ｍｍ．４７８７）ＮＰ＿００６１３４．１；ＮＭ＿００６１４３．２；Montpetit, A. and Sinnett,D. (1999) Hum. Genet. 105 (1-2):162-164; O'Dowd, B.F. et al (1996) FEBS Lett. 394 (3):325-329；
【００９７】
（４７）ＧＰＲ５４（ＫＩＳＳ１レセプター；ＫＩＳＳ１Ｒ；ＧＰＲ５４；ＨＯＴ７Ｔ１７５；ＡＸＯＲ１２）ＮＰ＿１１５９４０．２；ＮＭ＿０３２５５１．４； Navenot, J.M. et al (2009) Mol. Pharmacol. 75 (6):1300-1306; Hata, K. et al (2009) Anticancer Res. 29 (2):617-623；
【００９８】
（４８）ＡＳＰＨＤ１（アスパラギン酸β−ヒドロキシラーゼドメイン含有１；ＬＯＣ２５３９８２）ＮＰ＿８５９０６９．２；ＮＭ＿１８１７１８．３；Gerhard, D.S. et al (2004) Genome Res. 14 (10B):2121-2127；
【００９９】
（４９）チロシナーゼ（ＴＹＲ；ＯＣＡＩＡ；ＯＣＡ１Ａ；チロシナーゼ；ＳＨＥＰ３）ＮＰ＿０００３６３．１；ＮＭ＿０００３７２．４；Bishop,D.T. et al (2009) Nat. Genet. 41 (8):920-925; Nan, H. et al (2009) Int. J. Cancer 125 (4):909-917；
【０１００】
（５０）ＴＭＥＭ１１８（リングフィンガータンパク質，膜貫通型２；ＲＮＦＴ２；ＦＬＪ１４６２７）ＮＰ＿００１１０３３７３．１；ＮＭ＿００１１０９９０３．１；Clark, H.F. et al (2003) Genome Res. 13 (10):2265-2270; Scherer,S.E. et al (2006) Nature 440 (7082):346-351
【０１０１】
（５１）ＧＰＲ１７２Ａ（Ｇタンパク質共役型受容体１７２Ａ；ＧＰＣＲ４１；ＦＬＪ１１８５６；Ｄ１５Ｅｒｔｄ７４７ｅ）ＮＰ＿０７８８０７．１；ＮＭ＿０２４５３１．３； Ericsson, T.A. et al (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (11):6759-6764; Takeda, S. et al (2002) FEBS Lett. 520 (1-3):97-101．
【０１０２】
親抗体はまた、アルブミン結合ペプチド（ＡＢＰ）配列を有する融合タンパク質であってもよい（Dennis et al. (2002) “Albumin Binding As A General Strategy For Improving The Pharmacokinetics Of Proteins" J Biol Chem. 277:35035-35043；国際公開第０１／４５７４６号）。本発明の抗体は、（ｉ）Dennis et al (2002) J Biol Chem. 277:35035-35043の表ＩＩＩ及びＩＶ，頁３５０３８；（ｉｉ）米国特許出願公開第２００４０００１８２７号の［００７６］；及び（ｉｉｉ）国際公開第０１／４５７４６号の頁１２−１３に記載のＡＢＰ配列を有する融合タンパク質を含み、その全てが参照により本明細書に援用される。
【０１０３】
突然変異によるシステイン操作抗体を調製するため、出発ポリペプチドのアミノ酸配列変異体をコードするＤＮＡが当技術分野で公知の種々の方法により調製される。これらの方法は、ポリペプチドをコードする前に調製したＤＮＡの部位特異的（またはオリゴヌクレオチド介在性）変異誘発、ＰＣＲ変異誘発、及びカセット変異誘発による調製を含むがこれらに限定されない。組換え抗体の変異体は、制限断片の操作によって、又は合成オリゴヌクレオチドとの重複伸長ＰＣＲによっても構築されうる。変異誘発プライマーは、システインのコドンの置換をコードする。標準的な変異誘発法が、そのような変異システイン操作抗体をコードするＤＮＡを生成するために用いることができる。一般的なガイダンスはSambrook et al Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989;及びAusubel et al Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, N.Y., 1993に見出すことができる。
【０１０４】
部位特異的変異誘発法は、置換変異体、すなわち変異タンパク質を作製するための一つの方法である（Carter (1985) et al Nucleic Acids Res. 13:4431-4443; Ho et al (1989) Gene (Amst.) 77:51-59; 及びKunkel et al (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488）。出発ＤＮＡは、望ましい変異をコードするオリゴヌクレオチドをその出発ＤＮＡの一本鎖に最初にハイブリダイズすることで改変される。ハイブリダイゼーションの後、ＤＮＡポリメラーゼは、プライマーとしてハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドを使用し、テンプレートとして出発ＤＮＡの一本鎖を使用して、第二鎖全体を合成するために使用される。従って、所望の変異をコードするオリゴヌクレオチドが得られた二本鎖ＤＮＡに組み込まれる。部位特異的変異誘発法は、変異を誘発されるべきタンパク質を発現プラスミド内で発現する遺伝子内で行うことができ、得られたプラスミドは配列が決定され、望まれるシステイン置換変異生成の導入を確認する（Liu et al (1998) J. Biol. Chem. 273:20252-20260）。部位特異的プロトコールや形式は広く入手可能なもの、例えばＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）多重部位特異的変異生成キット（ストラタジーン、ラホーヤ、カリフォルニア州）である。
【０１０５】
ＰＣＲ突然変異誘発はまた、出発ポリペプチドのアミノ酸配列変異体を作るのに適している。Higuchi, (1990) in PCR Protocols, pp.177-183, Academic Press; Ito et al (1991) Gene 102:67-70; Bernhard et al (1994) Bioconjugate Chem. 5:126-132; 及びVallette et al (1989) Nuc. Acids Res. 17:723-733を参照。簡単に説明すると、ＰＣＲにおける出発物質としてテンプレートＤＮＡの少量が用いられる場合、テンプレートＤＮＡの対応する領域とは配列が若干異なるプライマーが、プライマーがテンプレートとは異なる場所においてのみ、テンプレート配列とは異なる特異的ＤＮＡ断片の比較的多量を産生するために用いることができる。
【０１０６】
変異体を調製するための別の方法であるカセット式変異誘発は、Wells et al (1985) Gene 34:315-323により記載される技術にもとずく。出発材料は、変異されるべき出発ポリペプチドを含むプラスミド（又は他のベクター）である。変異されるべき出発ＤＮＡのコドンが同定される。同定された変異部位のそれぞれの側にユニークな制限エンドヌクレアーゼ部位が存在する必要がある。そのような制限酵素部位が存在しない場合、それらは出発ポリペプチドＤＮＡの適切な場所でそれらを導入するために、上記オリゴヌクレオチド媒介突然変異誘発法を用いて生成される場合がある。プラスミドＤＮＡは、それを線形化するために、これらの部位で切断される。制限部位間のＤＮＡの配列をコードするが、望まれる変異を含む二本鎖オリゴヌクレオチドは、標準的な方法を用いて合成され、ここでオリゴヌクレオチドの二本鎖は別々に合成され、標準的な技術を用いて一緒にハイブリダイズされる。この二本鎖オリゴヌクレオチドは、カセットと呼ばれる。このカセットは、それが直接プラスミドにライゲーションすることができるように、線状プラスミドの両端と一致する５’及び３’の両端を持つように設計されている。このプラスミドは、今や変異ＤＮＡ配列を含む。コードされたシステインの置換を含む変異体ＤＮＡは、ＤＮＡ配列決定により確認することができる。
【０１０７】
単一の変異はまた、ＰＣＲに基づく変異誘発によって、テンプレートとして二本鎖プラスミドＤＮＡを用いたオリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発によって生成される(Sambrook and Russel, (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition; Zoller et al (1983) Methods Enzymol. 100:468-500; Zoller, M.J. and Smith, M. (1982) Nucl. Acids Res. 10:6487-6500)。
【０１０８】
４Ｄ５抗ＨＥＲ２チオＦＡＢの操作及びチオール反応性
システインは抗ＨＥＲ２ｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８ Ｆａｂ断片抗体の重鎖と軽鎖の各位置に導入された（米国特許第５８２１３３７号；Carter et al (1992) Proc. Natl. Acad. Sci., 89:4285-4289）。全４４０の重鎖変異と軽鎖変異は本明細書に記載の方法に従って調製された。チオール反応性はＰＨＥＳＥＬＥＣＴＯＲアッセイに従って測定された。重鎖配列は連続番号付けシステムによって番号が付けられる。軽鎖配列は、カバット番号付けシステムに従う。軽鎖において、カバットと連続番号付けは同じ番号を表示する。
【０１０９】
重鎖ｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８変異体は、ＨＥＲ２レセプタータンパク質への効率的結合及びビオチン化試薬、ビオチン−ＰＥＯ−マレイミドとのチオール反応性に対して選択された（米国特許第７５２１５４１号）。ある重鎖変異体は、ＨＥＲ２ ＥＣＤへの結合を制限したか又は損なっているが、その理由はこれが抗体Ｆａｂの可変領域のＣＤＲに位置し、抗原結合（ＨＥＲ２）に重要な残基であるからである。Ｆａｂの定常ドメインに位置する残基の幾つかも貧弱なＨＥＲ２結合を生じるが、その理由はこれらの残基がＦａｂの構造とフォールディングに寄与する場合があり、従ってＭ１３ページ（ｐａｇｅ）上で貧弱な４Ｄ５−Ｆａｂ表示を生じるからである（Junutula, J.R. et al. (2008) J. Immunol Methods, 332:41-52）。貧弱なＨＥＲ２ ＥＣＤ結合を持つ重鎖ｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８変異体は、位置１，２１，３１，３３−３６，３８，４８−５０，５９，８７，９５，１０１，１０４，１２９，１３１，１３２，１３６，１５３，１５５，１５９，１６６，１６９，１７０，１７２，１９７，１９８，２０２，２１５，２１９にシステイン変異を含んでいた。野生型システイン変異体２２，９６，１４７，２０３，２２３が測定された。他の重鎖変異体はビオチン化試薬とのチオール反応性を制限していた。
【０１１０】
システイン操作法により導入されたＡ１２１Ｃ遊離システインアミノ酸が本明細書で説明され、配列番号３２は連続番号付けシステムにより示される。定常ドメインの先頭のこの残基は、ＥＵ番号付けシステムにより示されるＡ１１８Ｃ、又はカバットシステムによるＡ１１４Ｃでもある。本明細書に記載される抗体−薬剤コンジュゲートにおいてコンジュゲートした変異体（図５ａ及び５ｂ、表３及び実施例６）は、配列番号３２を含む抗体の指定のためにＥＵシステムのＡ１１８Ｃを用いている。
【０１１１】
遊離のシステインアミノ酸は表１の中央列の配列に隣接残基を伴って中央にある。重鎖の置換されたアミノ酸と位置が左の行に示される。重鎖ｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８変異体、表１の配列番号１〜４９はＨＥＲ２結合とチオール反応性値の約０．８以上を保持しており、野生型システイン変異体を除外している。配列番号１〜４９（表１）による抗体はチオール反応性を示しており、捕獲標識、検出標識、薬剤部分又は固体支持体との共有結合を形成するのに有用であり得る。表１の重鎖変異体は、チオＦａｂ又はチオＭａｂとして、例えば抗体−薬剤コンジュゲートとしてコンジュゲートし得る。
【０１１２】
0005889912.tif 000008
0005889912.tif 000009
軽鎖ｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８変異体は、ＨＥＲ２レセプターへの効率的結合及びビオチン化試薬、ビオチン−ＰＥＯ−マレイミドとのチオール反応性に対して選択された（米国特許第７５２１５４１号）。ある軽鎖変異体は、ＨＥＲ２への結合を制限したか又は損なっているが、その理由はこれが抗体Ｆａｂの可変領域のＣＤＲに位置し、抗原結合（ＨＥＲ２）に重要な残基であるからである。Ｆａｂの定常ドメインに位置する残基の幾つかはまた貧弱なＨＥＲ２結合を生じるが、その理由はこれらの残基がＦａｂの構造とフォールディングに寄与する場合があり、従ってＭ１３ページ（ｐａｇｅ）上で貧弱な４Ｄ５−Ｆａｂ表示を生じるからである（Junutula, J.R. et al. (2008) J. Immunol Methods, 332:41-52）。ＨＥＲ２に対する貧弱な結合を持つ軽鎖ｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８変異体は、位置４，２９−３２，３５，３６，５０，８２，８６，８９−９１，１１３，１１５，１１７，１２０，１２６，１２８，１３９，１４１，１４６，１４８，１７９，１８６，１９２，２０２にシステイン変異を含んでいた。野生型システイン変異体２３，１３４，１９４，２１４が測定された。他の軽鎖変異体はビオチン化試薬とのチオール反応性を制限していた。
【０１１３】
本明細書で説明され、システイン操作法により導入されたＶ２０５Ｃ遊離システインアミノ酸残基及び配列番号９６はカバット番号付けシステム及び連続番号付けシステムにより示される。本明細書に記載される抗体−薬剤コンジュゲートにおいてコンジュゲートしたＶ２０５変異体（図５ａ及び５ｂ、表３及び実施例６）は、配列番号９６を含む。
【０１１４】
遊離のシステインアミノ酸は表２の中央列の配列に隣接残基を伴って中央にある。軽鎖の置換されたアミノ酸と位置が左の行に示される。軽鎖ｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８変異体、表２の配列番号５０〜９８はＨＥＲ２結合とチオール反応性値の約０．８以上を保持しており、野生型システイン変異体を除外している。配列番号５０〜９８（表２）による抗体はチオール反応性を示しており、捕獲標識、検出標識、薬剤部分又は固体支持体との共有結合を形成するのに有用であり得る。表２の軽鎖変異体は、チオＦａｂ又はチオＭａｂとして、例えば抗体−薬剤コンジュゲートとしてコンジュゲートし得る。
【０１１５】
0005889912.tif 000010
0005889912.tif 000011
【０１１６】
コンジュゲーションのためのシステイン操作抗体の調製
所定の条件下では、システイン操作抗体は、ＤＴＴ（クリーランドの試薬、ジチオスレイトール）、又はＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩；Getz et al (1999) Anal. Biochem. Vol 273:73-80; Soltec Ventures, Beverly, MA）等の還元剤で処理することにより、リンカー試薬とのコンジュゲーションのために反応性になりうる。ＣＨＯ細胞で発現される完全長システイン操作モノクローナル抗体（チオＭａｂ）（Gomez et al (2010) Biotechnology and Bioeng. 105(4):748-760; Gomez et al (2010) Biotechnol. Prog. 26:1438-1445）が、新たに導入されたシステイン残基と培地中に存在するシステインの存在の間に形成する可能性のあるジスルフィド結合を還元するために、室温で一晩約５０倍過剰のＤＴＴにより還元された。還元されたチオＭａｂは１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５で希釈され、ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＦＦカラム上にロードされ、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ ７．５で溶出した。ジスルフィド結合は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ ７．５中で室温で３時間、１５培ＤＨＡＡによる再酸化を行うことにより、親モノクローナル抗体中に存在するシステイン残基との間で再形成された。当技術分野で公知の他の酸化体、すなわち、酸化剤、及び酸化条件を使用することができる。周囲の空気酸化もまた有効である。この穏やかな、部分的な再酸化工程は、高い忠実度で効率的に鎖内ジスルフィドを形成する。コンジュゲーションを生じさせてチオＭａｂ抗体−薬剤コンジュゲートを形成するために、およそ１．５培過剰の薬剤−リンカー中間体、例えば５、８、１４、１８を添加し、混合し、室温で１時間放置した。コンジュゲーション混合物をＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＦＦカラムにロードして溶出し、過剰の薬剤−リンカー中間体及び他の不純物を取り除いた。
【０１１７】
Ｎ−メチルアラニニルメイタンシノール薬剤部分
本発明の抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）薬剤部分（Ｄ）は、微小管阻害、有糸分裂阻害、トポイソメラーゼ阻害、又はＤＮＡインターカレーションを含む任意の作用機序を通じて細胞毒性又は細胞増殖抑制作用を有するメイタンシノイド誘導体である。
【０１１８】
メイタンシン化合物は、マイクロチューブリンタンパク質であるチュービュリンの重合阻害によって有糸分裂中の微小管の形成を阻害することによって、細胞増殖を阻害する（Remillard et al (1975) Science 189:1002-1005）。メイタンシン及びメイタンシノイドは非常に細胞傷害性であるが、癌治療におけるそれらの臨床用途は、それらの乏しい腫瘍選択性に主に起因するそれらの重篤な全身副作用によって非常に制限されている。メイタンシンを用いた臨床試験は、中枢神経系および胃腸系に対する深刻な副作用に起因して中断された（Issel et al (1978) Can. Treatment. Rev. 5:199-207）。
【０１１９】
メイタンシノイド薬剤部分は、抗体−薬剤コンジュゲートにおいて魅力的な薬剤部分である。なぜなら、これらは以下であるからである：（ｉ）発酵又は化学修飾、発酵産物の誘導体化によって調製するために比較的利用可能である、（ｉｉ）非ジスルフィドリンカーを通しての抗体に対するコンジュゲーションに適している官能基を用いた誘導体化に適している、（ｉｉｉ）血漿中で安定である、及び（ｉｖ）様々な腫瘍細胞株に対して有効である（米国特許出願公開第２００５／０１６９９３３号；国際公開第２００５／０３７９９２号；米国特許第５２０８０２０号）。
【０１２０】
メイタンシノイド誘導体は、公知の方法に従って、遺伝子工学技術を用いて生成される、天然起源から調製されるＮ−メチルアラニニルメイタンシノール化合物を含む（Yu et al (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 99:7968-7973；米国特許第６７９０９５４号；米国特許第７１９２７５０号）。最初にアフリカの低木から単離され（米国特許第３８９６１１１号）、メイタンシンは最も効率的に微生物発酵によって得られ（米国特許第４１５１０４２号；米国特許第６７９０９５４号；米国特許第７１９２７５０号；米国特許第７４３２０８８号）、Ｃ−３エステルアンサマイトシン混合物を産生する。Ｃ−３エステルの還元はメイタンシノールを産生する（米国特許第７４１１０６３号；米国特許第６３３３４１０号）。メイタンシノールのＣ−３ヒドロキシルは、アラニニルエステルを含み（米国特許第４１３７２３０号；米国特許第４２６０６０８号；米国特許第５２０８０２０号；及びChem. Pharm. Bull. (1984) 12:3441）、選択的に誘導体化され得る（米国特許第７３０１０１９号；米国特許第７２７６４９７号；米国特許第７４７３７９６号；米国特許第７５９８３７５号）。
【０１２１】
式Ｉの抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）のＮ−メチルアラニニルメイタンシノールの薬剤部分（Ｄ）は次の構造を有する：
0005889912.tif 000012
波線はリンカー（Ｌ）に対する結合部位を示す。
【０１２２】
メイタンシノイド薬剤部分の全ての立体異性体は、本発明の化合物、即ちＤ．のキラル炭素原子でのＲとＳコンフィギュレーションの任意の組み合わせを意図されている。一実施態様では、メイタンシノイド薬剤部分（Ｄ）は、次の立体化学を有する。
0005889912.tif 000013
【０１２３】
本発明の式Ｉの抗体−薬剤コンジュゲートのＮ−メチルアラニニルメイタンシノール薬剤部分（Ｄ）と薬剤−リンカー中間体は、米国特許出願公開第２００５／０２７６８１２号の２９頁と３２頁にそれぞれ例示されたｍｐｅｏ−ＤＭ１又はｍｃｃ−ＤＭ１結合など、メイタンシノイド薬剤部分のＮメチルアラニニル基に結合したアルキルチオマレイミド結合でなく、Ｎメチルアラニニル基に対するアミドアルキル結合又はアミドエチレンオキシ結合を含む。
【０１２４】
Ｎ−メチルアラニニルメイタンシノール薬剤−リンカー中間体
本発明はＮメチルアラニニルメイタンシノール薬剤−リンカー中間体化合物を包含し、ここでリンカーはＣ−３アラニニルメイタンシノイド部分に結合し、式Ｉを有する：
0005889912.tif 000014
Ｌは、
0005889912.tif 000015
Ｅは、
0005889912.tif 000016
ｎは２、３、４、５、又は６であり；
ｍは２、３、又は４であり；及び
ｑは０又は１である。
【０１２５】
リンカー（Ｌ）は、１つまたは複数のメイタンシノール薬剤部分（Ｄ）および抗体ユニット（Ａｂ）を連結して、式Ｉａ又はＩｂの抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）を形成するために用いることができる二官能性又は多官能性部分である。抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）は、薬剤と抗体に結合するための反応性官能基を有するリンカーを用いて都合良く調製することができる。システイン操作抗体（Ａｂ）のシステインチオールは、リンカー試薬又は薬剤−リンカー中間体の求電子性官能基（Ｅ）との結合を形成することができる。ブロモアセトアミド及びマレイミド官能基は、タンパク質のシステインチオールを含む、チオールと反応することが知られている（Schelte et al (2000) Bioconjugate Chem. 11:118-123; Alley et al (2008) Bioconjugate Chem. 19:759-765）。一態様において、リンカーは、抗体に存在する求核システインに対して反応性である求電子基を持つ反応性部位を有する。抗体のシステインチオールは、リンカー上の求電子基と反応性であり、リンカーに共有結合を形成する。有用な求電子性基としては、限定されないが、マレイミド基及びハロアセトアミド基を含む。システイン操作抗体は、Klussman, et al (2004), Bioconjugate Chemistry 15(4):765-773の７６６頁のコンジュゲーション方法、及び実施例６のプロトコルに従って、例えばマレイミドまたはα−ハロカルボニル等の求電子性官能基を持つリンカー試薬又は薬剤−リンカー中間体と反応する。
【０１２６】
チオール反応性官能基、求電子性官能基の例としては、限定されないが、マレイミド、α−ハロアセチル、スクシンイミドエステルなどの活性化エステル、４ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、テトラフルオロフェニルエステル、無水物、酸塩化物、塩化スルホニル、イソシアネート、イソチオシアネート、ビニルスルホン、クロロトリアジン、２−ハロピリジル、クロロピリミジン、及びエナミドが挙げられる。
【０１２７】
薬剤−リンカー中間体のリンカー部分は、２、３、４、５、又は６メチレン基のアルキルであり得、ここでＬは
0005889912.tif 000017
で、ｎは２、３、４、５又は６である。典型的な実施態様は、図１及び実施例１のｍａｌ−ｍｃ−ａｌａ−Ｍａｙ薬剤−リンカー中間体５であり、ここでＥはマレイミドでｎは５である。（Ｓ）−２−（メチルアミノ）プロパン酸（Ｎ−メチルＳ−アラニン）２による２，５−ジオキソピロリジン−１−イル ６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサノエート １のアシル化は、（Ｓ）−２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−Ｎ−メチルヘキサンアミド）プロパン酸３を与える。メイタンシノール４の３ヒドロキシルでの３とのカップリングはｍａｌ−ｈｅｘ−ａｌａ−Ｍａｙ ５を与え、抗体−薬剤コンジュゲートのＡｂ−ｈｅｘ−ｍｃ−ａｌａ−Ｍａｙを与えるための抗体とのコンジュゲーションの準備ができる。
【０１２８】
別の典型的な実施態様は、図２及び実施例２のｂｒａ−ｈｅｘ−ａｌａ−Ｍａｙ ８であり、ここでＥは２ブロモアセトアミドでｎは５である。（Ｓ）−２−（メチルアミノ）プロパン酸（Ｎ−メチルＳ−アラニン） ２による２，５−ジオキソピロリジン−１−イル ６−（２ブロモアセトアミド）ヘキサノエート６のアシル化は、（Ｓ）−２−（６−（２ブロモアセトアミド）−Ｎ−メチルヘキサンアミド）プロパン酸７を与える。メイタンシノール４の３ヒドロキシルでの７とのカップリングはｂｒａ−ｈｅｘ−ａｌａ−Ｍａｙ ８を与え、抗体−薬剤コンジュゲートのＡｂ−ａｃｅｔ−ｈｅｘ−ａｌａ−Ｍａｙを与えるための抗体とのコンジュゲーションの準備ができる。
【０１２９】
薬剤−リンカー中間体のリンカー部分Ｌは、エチレンオキシ（ＰＥＧ）ユニットを含み得、ここでＬは
0005889912.tif 000018
；ｎは２、３、４、５、又は６であり；ｍは２、３、又は４であり；及びｑは１である。典型的な実施態様は、図３及び実施例３のｍａｌ−ＰＥＧ３−ａｌａ−Ｍａｙ薬剤−リンカー中間体１４であり、ここでＥはマレイミドで、ｎは４，及びｍは３である。アジピン酸から形成される、モノＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、６−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イルオキシ）−６−オキソヘキサン酸９を、２，２’−（２，２’−オキシビス（エタン−２，１−ジイル）ビス（オキシ））ジエタンアミンと反応させて、１−アミノ−１３−オキソ−３，６，９−トリオキサ−１２−アザオクタデカン−１８−オイック酸１０を与える。メチル２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−カルボン酸により１０のマレイミドが形成され、１−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−１３−オキソ−３，６，９−トリオキサ−１２−アゾオクタデカン−１８−オイック酸１１を与える。１１のＮＨＳエステルがＮ−ヒドロキシスクシンイミドとＤＣＣにより形成され、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル−１−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−１３−オキソ−３，６，９−トリオキサ−１２−アザオクタデカン１８−オエート１２を与える。（Ｓ）−２−（メチルアミノ）プロパン酸（Ｎ−メチルＳ−アラニン）２による１２のアミド化は、（Ｓ）−１−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−１９，２０−ジメチル−１３，１８−ジオキソ−３，６，９−トリオキサ−１２，１９−ジアザヘニコサン−２１−オイック酸１３を与えた。メイタンシノール４の３ヒドロキシルでの１３とのカップリングはｍａｌ−ＰＥＧ３−ａｌａ−Ｍａｙ薬剤−リンカー中間体１４を与え、抗体−薬剤コンジュゲートのＡｂ−ｍａｌ−ＰＥＧ３−ａｌａ−Ｍａｙを与えるための抗体とのコンジュゲーションの準備ができる。
【０１３０】
別法として、メイタンシノール４を、ＴＨＦ／ＤＭＦ中で、Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、亜鉛トリフラート、及び（Ｓ）−３，４−ジメチルオキサゾリジン−２，５−ジオン２ａと反応させて、３−（Ｓ−（Ｎ−メチルアラニニル）メイタンシノール４ａを与えた（図１ｂ）。試薬２ａは、ＤＣＭ中で、（Ｓ）−２−（メチルアミノ）プロパン酸（Ｎ−メチルＳ−アラニン）２と三塩化リンから調製される。３−（Ｓ−（Ｎ−メチルアラニニル）メイタンシノール４ａを、１−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−１３−オキソ−３，６，９−トリオキサ−１２−アザオクタデカン−１８−オイック酸１１、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩、及びＮ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンと結合させて、ｍａｌ−ＰＥＧ３−ａｌａ−Ｍａｙ １４を与える（図３）。
【０１３１】
別の典型的な実施態様は、図４及び実施例４のｂｒａ−ＰＥＧ３−ａｌａ−Ｍａｙ １８であり、ここでＥは２ブロモアセトアミドでｎは４で，ｍは３である。１−アミノ−１３−オキソ−３，６，９−トリオキサ−１２−アザオクタデカン−１８−オイック酸１０は、臭化ブロムアセチルでアシル化され、１−ブロモ−２，１６−ジオキソ−６，９，１２−トリオキサ−３，１５−ジアザヘニコサン−２１−オイック酸１５を与える。１５のＮＨＳエステルがＤＣＭ中でＮ−ヒドロキシスクシンイミドとＤＣＣにより形成され、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル、１−ブロモ−２，１６−ジオキソ−６，９，１２−トリオキサ−３，１５−ジアザヘニコサン−２１−オエート１６を与える。（Ｓ）−２−（メチルアミノ）プロパン酸（Ｎ−メチルＳ−アラニン）２による１６のアミド化は、リンカー試薬、（Ｓ）−１−ブロモ−２２，２３−ジメチル−２，１６，２１−トリオキソ−６，９，１２−トリオキサ−３，１５，２２−トリアザテトラコサン−２４−オイック酸１７を与えた。メイタンシノール４の３ヒドロキシルでの１７とのカップリングはｂｒａ−ＰＥＧ３−ａｌａ−Ｍａｙ薬剤−リンカー中間体１８を与え、抗体−薬剤コンジュゲートのＡｂ−ａｃｅｔ−ＰＥＧ３−ａｌａ−Ｍａｙを与えるための抗体とのコンジュゲーションの準備ができる。
【０１３２】
別法として、３−（Ｓ−（Ｎ−メチルアラニニル）メイタンシノール４ａ（図１ｂ）を、１−ブロモ−２，１６−ジオキソ−６，９，１２−トリオキサ−３，１５−ジアザヘニコサン−２１−オイック酸１５、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩、及びＮ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンと結合させて、ｂｒａ−ＰＥＧ３−ａｌａ−Ｍａｙ １８を与える（図４）。
【０１３３】
アラニニルメイタンシノイド抗体−薬剤コンジュゲート
本発明の抗体−薬剤コンジュゲートは、抗体の反応性システインチオール基へのリンカー部分を通して共有結合したＮ−メチルアラニニルメイタンシノール薬剤部分からなる。
【０１３４】
抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）の例示的実施態様は、システイン操作抗体（Ａｂ）及びＮ−メチルアラニニルメイタンシノール薬剤部分（Ｄ）を含み、ここでその抗体は、一以上の遊離システインアミノ酸を有し、かつその抗体はリンカー部分（Ｌ）により、一以上の遊離システインアミノ酸を通してＤに結合され；その組成物は次の式を有する：
0005889912.tif 000019
ここでｐは１、２、３、又は４である。抗体分子にチオール反応性リンカー部分を介してコンジュゲートさせることができる薬剤部分の数は、本明細書に記載の方法によって導入されたシステイン残基の数によって制限される。従って、式Ｉの薬剤−リンカー中間体から調製された典型的なＡＤＣは、１つ、２つ、３つ、又は４つの操作されたシステインアミノ酸を有する抗体を含む。
【０１３５】
アラニニルメイタンシノイド抗体−薬剤コンジュゲートの典型的な実施態様は式ＩａでありＬはマレイミド部分を含み、そして式ＩｂでありＬはアセトアミドメチル部分を含む。
0005889912.tif 000020
Ｌは、
0005889912.tif 000021
ｎは２、３、４、５、又は６であり；
ｍは２、３、又は４であり；
ｑは０又は１であり；
ｐは１から４であり；及び
Ａｂは抗体である。
【０１３６】
式Ｉａのアラニニルメイタンシノイド抗体−薬剤コンジュゲートの典型的実施態様はＡｂ−ｍａｌ−ｈｅｘ−ａｌａ−Ｍａｙ：
0005889912.tif 000022
及びＡｂ−ｍａｌ−ＰＥＧ３−ａｌａ−Ｍａｙ：
0005889912.tif 000023
を含む。
【０１３７】
式Ｉｂのアラニニルメイタンシノイド抗体−薬剤コンジュゲートの典型的実施態様はＡｂ−ａｃｅｔ−ｈｅｘ−ａｌａ−Ｍａｙ：
0005889912.tif 000024
及びＡｂ−ａｃｅｔ−ＰＥＧ３−ａｌａ−Ｍａｙ：
0005889912.tif 000025
を含む。
【０１３８】
本発明のＡＤＣ化合物は、抗癌活性についての有用性を持つものを含む。特に、化合物は、薬剤部分、即ち毒素にコンジュゲートした、即ちリンカーにより共有結合したシステイン操作抗体が含まれる。薬剤が抗体にコンジュゲートしていないときは薬剤は細胞毒性または細胞増殖抑制効果を持つ。薬剤部分の生物学的活性は、抗体との結合によってこうして調節される。本発明の抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）は、腫瘍組織への細胞毒性薬の有効用量を選択的に送達し、それによりより大きな選択性、即ちより少ない有効用量を達成することができる。
【０１３９】
インビトロの細胞増殖アッセイ
一般に、抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）の細胞毒性又は細胞増殖抑制効果は、細胞培養培地中で、レセプタータンパク質、例えばＨＥＲ２を有する哺乳動物細胞を細胞培地中でＡＤＣの抗体に曝露し；その細胞を約６時間から約５日間のある期間にわたって培養し；細胞生存率を測定することにより測定される。細胞ベースのインビトロアッセイが、本発明のＡＤＣの生存率（増殖）、細胞毒性、及びアポトーシスの誘導（カスパーゼ活性化）を測定するために用いられる。
【０１４０】
抗体−薬剤コンジュゲートのインビトロでの効力を細胞増殖アッセイにより測定した（実施例７）。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）ルミネセンス細胞生存率アッセイは、鞘翅目ルシフェラーゼの組換え発現に基づいた市販の（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、均質なアッセイ法である（米国特許第５５８３０２４号；５６７４７１３号及び５７００６７０号）。この細胞増殖アッセイは、代謝的に活性な細胞の指標である存在するＡＴＰの定量に基づいて、培養中の生存細胞の数を決定する（Crouch et al (1993) J. Immunol. Meth. 160:81-88；米国特許第６６０２６７７号）。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）アッセイは、９６ウェル形式で行い、自動化ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）に適応させた（Cree et al (1995) AntiCancer Drugs 6:398-404）。均質なアッセイ法では、血清添加培地で培養した細胞に直接単一試薬（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬）を追加することを含む。細胞の洗浄、培地の除去、及び複数のピペット操作は必要ではない。本システムは、試薬を添加して混合した後１０分以内で、３８４ウェルフォーマットでわずか１５細胞／ウェルを検出する。細胞は、ＡＤＣで連続的に処理され得るか、又はそれらはＡＤＣで処理されてＡＤＣから分離されても良い。一般に、細胞は短時間、即ち３時間処理され、連続的に処理された細胞と同様の効力の作用を示した。
【０１４１】
均質な「添加−混合−測定」の形式は、細胞の溶解と、存在するＡＴＰの量に比例する発光シグナルの生成とをもたらす。ＡＴＰの量は、培養物中に存在する細胞の数に直接比例する。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）アッセイは、使用される細胞の型および培地に依存して、一般には５時間よりも長い半減期を有する、ルシフェラーゼ反応により生成される「グロー型」の発光シグナルを生成する。生存細胞は、相対発光単位（ＲＬＵ）に反映される。基質のカブトムシルシフェリンは、組換えホタルルシフェラーゼによって酸化的に脱炭酸され、同時にＡＴＰのＡＭＰへの変換を伴い光子を生成する。
【０１４２】
５日目のインビトロＳＫ−ＢＲ−３細胞増殖アッセイの結果に対する試験サンプルの複数の濃度が表３に示される。
【０１４３】
全てのチオＭａｂ抗体−薬剤コンジュゲートはリンカーに関わらず類似のインビトロ効力を示し、これらのコンジュゲートはＴＭＡｂ−ｍｃｃ−ＤＭ１（ＩＣ５０：５ｎｇ／ｍｌ）に比較して約２倍小さい効力を示した（表３）。チオＭａｂ ＡＤＣの薬剤負荷（１．８ＤＡＲ）を従来のＡＤＣの薬剤負荷（３．５ＤＡＲ）と比較したときに、チオＭａｂによるインビトロでの効力の減少は、従来のＡＤＣに比例している。コントロールの非結合トラスツズマブ変異体又はチオトラスツズマブ変異体は、本アッセイで試験された最大１００００ｎｇ／ｍｌ濃度で非常にわずかか或いは全く活性を示さなかった。
0005889912.tif 000026
トラスツズマブ−ｍｃｃ−ＤＭ１（トラスツズマブ エムタンシン（ｅｍｔａｎｓｉｎｅ）、ＴＭＡｂ−ＭＣＣ−ＤＭ１、Ｔ−ＤＭ１）は、抗体−薬剤コンジュゲート（ＣＡＳ登録番号１３９５０４−５０−０）で、次の構造を有する：
0005889912.tif 000027
ここで、Ｔｒは、リンカー試薬スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）（シクロヘキサン−１−カルボキシレートから形成された、マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレートリンカー部分（ｍｃｃ）を通して、メイタンシノイド薬剤部分ＤＭ１（米国特許第５２０８０２０号；米国特許第６４４１１６３号）に結合したトラスツズマブである。薬剤の抗体に対する比率又は薬剤負荷は、上記のトラスツズマブ−ｍｃｃ−ＤＭ１の構造でｐにより表され、１から約８の整数値の範囲である。薬剤負荷の値は１から８である。トラスツズマブ−ｍｃｃ−ＤＭ１は、様々に負荷され結合した抗体−薬剤コンジュゲートの全混合物を含み、ここでは１、２、３、４、５、６、７、及び８の薬剤部分が抗体トラスツズマブに共有結合している（米国特許第７０９７８４０号；米国特許第２００５／０２７６８１２号；米国特許第２００５／０１６６９９３号）。
【０１４４】
インビボでの効力
ＴＭＡｂ−ｍｃｃ−ＤＭ１（６）と、ＤＭ１に共有結合したｍｐｅｏ（２） ｈｅｘ （５）及びＰＥＧ３（３），（４），（７），（８）リンカーを持つ様々なチオＭａｂコンジュゲート（実施例６）がＭＭＴＶ−ＨＥＲ２ Ｆｏ５トラスツズマブ耐性乳腺腫瘍モデルで試験され、これらの結果を図５ａ、５ｂ及び６に示した。ＭＭＴＶ−ＨＥＲ２ Ｆｏ５腫瘍移植片が、ＣＲＬのｎｕ／ｎｕマウスの番号２／３乳腺脂肪パッド中に移植された。腫瘍が平均体積で１８０ｍｍ３に達したとき、マウスが無作為化され、次いで試験の第０日にＤＭ１コンジュゲートの１回の静脈内投与（１０ｇ／ｋｇ）が与えられた。
【０１４５】
図５ａおよび図５ｂは、（１）ビヒクル（ＡＤＣバッファー），（２）ＬＣ−Ｖ２０５Ｃ−チオ−ＴＭＡｂ−ｍｐｅｏ−ＤＭ１，（３）ＬＣ−Ｖ２０５Ｃ−チオ−ＴＭＡｂ−ｍａｌ−ＰＥＧ３−ａｌａ−Ｍａｙ，（４）ＨＣ−Ａ１１８Ｃ−チオ−ＴＭＡｂ−ｍａｌ−ＰＥＧ３−ａｌａ−Ｍａｙ，（５）ＬＣ−Ｖ２０５Ｃ チオ−ＴＭＡｂ−ｍａｌ−ｈｅｘ−ａｌａ−Ｍａｙ，（６）ＴＭＡｂ−ｍｃｃ−ＤＭ１（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ−ｍｃｃ−ＤＭ１，Ｔ−ＤＭ１），（７）ＬＣ−Ｖ２０５Ｃ−チオ抗ｇＤ５Ｂ６−ｍａｌ−ＰＥＧ３−ａｌａ−Ｍａｙ，（８）ＬＣ−Ｖ２０５Ｃ−チオ抗ｇＤ５Ｂ６−ｍａｌ−ｈｅｘ−ａｌａ−Ｍａｙ（実施例６、８）を投与後に、ＣＲＬのｎｕ／ｎｕマウスの乳腺脂肪体に播種したＭＭＴＶ−ＨＥＲ２ Ｆｏ５トランスジェニック乳腺腫瘍において、時間に対してフィットさせた腫瘍体積変化のプロットを示す。全ての抗体−薬剤コンジュゲート（単一用量）は１０ｍｇ／ｋｇで静脈内投与した。抗ｇＤ５Ｂ６はコントロール抗体であり、それに対応する抗原はＦｏ５腫瘍組織では発現しない。
【０１４６】
（６）ＴＭＡｂ−ｍｃｃ−ＤＭ１は、１０ｍｇ／ｋｇで腫瘍増殖の一部の阻害を示し、それは、ＤＭ１投与量の５６０ｍｇ／ｍ２と同じである、全てのチオＴＭＡｂ−メイタンシノイドコンジュゲートは、より少ない薬剤負荷を有するにもかかわらず、同一の抗体濃度で、同等の活性を有していた。（３）ＬＣ−Ｖ２０５Ｃ−チオ−ＴＭＡｂ−ｍａｌ−ＰＥＧ３−ａｌａ−Ｍａｙは、（２）ＬＣ−Ｖ２０５Ｃ チオ−ＴＭＡｂ−ｍｐｅｏ−ＤＭ１とのｍｇ／ｋｇ用量の比較においてわずかに改善された活性を示した（図５ａ）。ｈｅｘとＰＥＧ３リンカーに結合するチオＭａｂは、低い薬剤負荷に起因してインビトロで２倍小さい効力を示してはいるものの、それらはＴＭＡｂ−ｍｃｃ−ＤＭ１に対して同等のインビボでの有効性を示しており、ｈｅｘとＰＥＧ３のアラニニルメイタンシノールリンカー薬剤部分が抗体−薬剤コンジュゲートの薬物動態特性を改善し得ることを示している。
【０１４７】
図６は、（１）ビヒクル：ヒスチジンバッファー＃８：２０ｍＭヒスチジン酢酸，ｐＨ５．５，２４０ｍＭ スクロース，０．０２％ ＰＳ ２０，（４）ＨＣ−Ａ１１８Ｃ−チオ−ＴＭＡｂ−ｍａｌ−ＰＥＧ３−ａｌａ−Ｍａｙ，５ｍｇ／ｋｇ投与量，１５０μｇ／ｍ２薬剤曝露，（４）ＨＣ−Ａ１１８Ｃ−チオ−ＴＭＡｂ−ｍａｌ−ＰＥＧ３−ａｌａ−Ｍａｙ，１０ｍｇ／ｋｇ投与量，３００μｇ／ｍ２薬剤曝露，（１０）ＨＣ−Ａ１１８Ｃチオ抗ｇＤ５Ｂ６−ｂｒａ−ＰＥＧ３−ａｌａ−Ｍａｙ，５ｍｇ／ｋｇ投与量，１２０μｇ／ｍ２薬剤曝露，（１０）ＨＣ−Ａ１１８Ｃ チオ抗ｇＤ５Ｂ６−ｂｒａ−ＰＥＧ３−ａｌａ−Ｍａｙ，１０ｍｇ／ｋｇ投与量，２４０μｇ／ｍ２薬剤曝露，（１１）ＨＣ−Ａ１１８ＣチオＴＭＡｂ−ｂｒａ−ＰＥＧ３−ａｌａ−Ｍａｙ，５ｍｇ／ｋｇ投与量，１１５μｇ／ｍ２薬剤曝露，（１１）ＨＣ−Ａ１１８ＣチオＴＭＡｂ−ｂｒａ−ＰＥＧ３−ａｌａ−Ｍａｙ，１０ｍｇ／ｋｇ投与量，２３０μｇ／ｍ２薬剤曝露，（１２）ＨＣ−Ａ１１８Ｃ，ＬＣ−Ｖ２０５Ｃチオ−ＴＭＡｂ−ｍａｌ−ＰＥＧ３−ａｌａ−Ｍａｙ，５ｇｍ／ｋｇ投与量，３２０μｇ／ｍ２薬剤曝露，（１２）ＨＣ−Ａ１１８Ｃ，ＬＣ−Ｖ２０５Ｃチオ−ＴＭＡｂ−ｍａｌ−ＰＥＧ３−ａｌａ−Ｍａｙ，１０ｇｍ／ｋｇ投与量，６４０μｇ／ｍ２薬剤曝露による投与後に、ＣＲＬのｎｕ／ｎｕマウスの乳腺脂肪体に播種したＭＭＴＶ−ＨＥＲ２ Ｆｏ５トランスジェニック乳腺腫瘍において、時間に対してフィットさせた腫瘍体積変化のプロットを示す。全ての抗体−薬剤コンジュゲート（単一用量）は、研究の開始時に１回静脈内投与された。９匹の動物の一群に、特定の用量で抗体−薬剤コンジュゲートを投与した。
【０１４８】
ビヒクルと陰性コントロール（１０）抗ｇＤ５Ｂ６抗体−薬剤コンジュゲートは腫瘍増殖作用を示さなかった。抗ＨＥＲ２抗体−薬剤コンジュゲート（４）、（１１）及び（１２）は用量依存性及びメイタンシノイド薬剤曝露依存性腫瘍増殖阻害を示した。（１２）ＨＣ−Ａ１１８Ｃ，ＬＣ−Ｖ２０５Ｃチオ−ＴＭＡｂ−ｍａｌ−ＰＥＧ３−ａｌａ−Ｍａｙは、システインが重鎖のＡ１１８と軽鎖のＶ２０５に導入された二重変異体である。薬剤−リンカー中間体、ｍａｌ−ＰＥＧ３−ａｌａ−Ｍａｙ １４（実施例３）は、薬剤／抗体の比率が３．９でほぼ定量的に、二重変異体ＨＣ−Ａ１１８Ｃ，ＬＣ−Ｖ２０５Ｃチオ−ＴＭＡｂへコンジュゲートしていた。１０ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート（１２）を投与された９匹の試験群の動物は２つの部分応答を示した。
【０１４９】
抗体−薬剤コンジュゲートの投与
本発明の抗体−薬剤コンジュゲートは治療されるべき疾患に適した任意の経路で投与され得る。ＡＤＣは典型的には非経口的に、すなわち点滴、皮下、筋肉内、静脈内、皮内、髄腔内および硬膜外に投与される。
【０１５０】
薬学的製剤
本発明の治療用抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）の薬学的製剤は、典型的には、非経口投与、すなわちボーラス、静脈内、腫瘍内注射用に、薬学的に許容される非経口ビヒクルとともに単位用量の注射可能形態で調製される。所望の程度の純度を有する抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）は、任意で凍結乾燥製剤または水溶液の形態で薬学的に許容される希釈剤、担体、賦形剤または安定剤（Remington's Pharmaceutical Sciences (1980) 16th edition, Osol, A. Ed.）と混合される。
【０１５１】
抗体−薬剤コンジュゲート治療
本発明の抗体−薬剤コンジュゲートは、例えば腫瘍抗原の過剰発現によって特徴付けられる種々の疾患または障害を治療するために用いられ得る。典型的な病気または過剰増殖性疾患には、良性または悪性腫瘍、白血病及びリンパ系悪性腫瘍が含まれる。他には、神経細胞、グリア、星状、視床下部、マクロファージ、上皮性、間質性、胞胚腔（ｂｌａｓｔｏｃｏｅｌｉｃ）、炎症性、血管新生及び自己免疫性を含む免疫に関する障害を含む。
【０１５２】
一般に、治療されるべき疾患又は障害は、癌などの過剰増殖性疾患である。ここで治療されるべき癌の例には、細胞腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病又は悪性リンパ腫を含むがこれらに限定されない。このような癌のより具体的な例には、扁平上皮癌（例えば上皮の扁平細胞癌）、小細胞肺癌を含む肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌及び肺の扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞性癌、胃腸癌を含む胃（ｇａｓｔｒｉｃ, ｓｔｏｍａｃｈ）癌、膵癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、大腸癌、直腸癌、大腸直腸癌、子宮内膜ないし子宮細胞腫、唾液腺細胞腫、腎臓癌又は腎癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝細胞腫、食道細胞腫、肝細胞腫、肛門部の細胞腫、陰茎細胞腫、並びに頭部及び頚部の癌が含まれる。
【０１５３】
ＡＤＣ化合物が治療において用いられ得る自己免疫性疾患は、リウマチ性疾患（例えば、関節リウマチ、シェーグレン症候群、強皮症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）及びループス腎炎などの狼瘡、多発性筋炎／皮膚筋炎、クリオグロブリン血症、抗リン脂質抗体症候群、及び乾癬の関節炎など）、変形性関節症、自己免疫性胃腸及び肝臓疾患（例えば、炎症性腸疾患（例えば潰瘍性大腸炎及びクローン病）、自己免疫性胃炎及び悪性貧血、自己免疫性肝炎、原発性胆管萎縮症、原発性硬化性胆管炎、及び小児脂肪便病など）、血管炎（例えば、チャング−シュトラウス血管炎、ウェゲナー肉芽腫症及び多発性動脈炎を含むＡＮＣＡ−関連血管炎）、自己免疫性神経学的疾患（例えば、多発性硬化症、眼球クローヌスミオクローヌス症候群、重症筋無力症、視神経脊髄炎、パーキンソン病、アルツハイマー病、及び自己免疫性多発性神経炎など）、腎臓疾患（例えば、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、及びベルガー病など）、自己免疫性皮膚科疾患（例えば、乾癬、蕁麻疹、蕁麻疹、尋常性天疱瘡、類天疱瘡、及び皮膚紅班性狼瘡など）、血液系疾患（例えば、血小板減少性紫斑病、血栓性血小板減少性紫斑病、輸血後の紫斑病、及び自己免疫溶血性貧血など）、アテローム性動脈硬化、ブドウ膜炎、自己免疫性聴覚疾患（例えば、内耳疾患及び聴力障害など）、ベーチェット病、レイノー症候群、臓器移植及び自己免疫性内分泌系疾患（例えば、インスリン依存型糖尿病（ＩＤＤＭ）などの糖尿病関連の自己免疫性疾患、アジソン病及び自己免疫性甲状腺疾患（例えばグレーブス病及び甲状腺炎）など）が含まれる。より好ましい前記疾患には、例えば、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、ＡＮＣＡ関連血管炎、狼瘡、多発性硬化症、シェーグレン症候群、グレーブス病、ＩＤＤＭ、悪性貧血、甲状腺炎及び糸球体腎炎が含まれる。
【０１５４】
疾患の予防又は治療のために、ＡＤＣの適量は、上記のように治療する疾患のタイプ、疾患の重症度及び過程、予防を目的としてか治療を目的として分子を投与するのか、現在の治療法、患者の病歴、及び抗体への反応、注意深い医師の判断により決定されるであろう。分子は、患者に対して、単回、又は一連の治療にわたって適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば一回以上の別個の投与によるか、連続注入によるかに関わらず、約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１から２０ｍｇ／ｋｇ）の分子が患者への投与のための初期候補用量となり得る。１つの典型的な一日当たりの用量は上記した要因に応じて約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲である。患者に投与されるべきＡＤＣの典型的な投与量は患者の体重の約０．１から約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。
【０１５５】
製造品
本発明の他の実施態様において、上述した障害の治療に有用な物質を含む製造品又は「キット」が提供される。製造品は、容器とラベルまたは容器上にあるまたは容器に付属するパッケージ挿入物を含む。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、ブリスター包装等を含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な物質から形成されうる。容器は、疾患の治療のために有効である抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）及び無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針による穴あきストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも一の活性剤はＡＤＣである。ラベルまたはパッケージ挿入物は、組成物が選択される疾患、例えば癌の治療のために使用されることを示している。別法として、または加えて、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化塩水、リンガー溶液およびデキストロース溶液を含む第二（または第三）の容器をさらに含んでもよい。これは、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、およびシリンジを含む、商業的およびユーザーの立場から望まれる他の物質をさらに含んでもよい。
【実施例】
【０１５６】
実施例１  ｍａｌ−ｈｅｘ−ａｌａ−Ｍａｙ ５の合成
（Ｓ）−２−（メチルアミノ）プロパン酸（Ｎ−メチルＳ−アラニン）２による２，５−ジオキソピロリジン−１−ｙｌ ６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサノエート １のアシル化は、（Ｓ）−２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−Ｎ−メチルヘキサンアミド）プロパン酸３を与える（図１ａ）。メイタンシノール４の３−ヒドロキシルで３とカップリングさせてｍａｌ−ｈｅｘ−ａｌａ−Ｍａｙ ５を与える。ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋８４３．５．１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ７．１１（ｓ，１Ｈ），６．７６（ｓ，２Ｈ），６．７２−６．６５（ｍ，２Ｈ），６．６０（ｄｄ，Ｊ＝１４．７，１１．４Ｈｚ，１Ｈ），５．６９（ｄｄ，Ｊ＝１４．９，９．１Ｈｚ，１Ｈ），５．４９（ｑ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，１Ｈ），４．６５（ｄｄ，Ｊ＝１１．９，２．１Ｈｚ，１Ｈ），４．１９（ｔｄ，Ｊ＝１０．３，４．１Ｈｚ，１Ｈ），３．９７（ｓ，３Ｈ），３．６２−３．５５（ｍ，２Ｈ），３．４１−３．３４（ｍ，５Ｈ），３．２３（ｄ，Ｊ＝１２．７Ｈｚ，１Ｈ），３．２０（ｓ，３Ｈ），２．９４（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，１Ｈ），２．８４（ｓ，３Ｈ），２．７２−２．６２（ｍ，１Ｈ），２．５６−２．４５（ｍ，１Ｈ），２．３３−２．２３（ｍ，１Ｈ），２．１４（ｄｄ，Ｊ＝１４．１，１．８Ｈｚ，１Ｈ），１．６８（ｓ，３Ｈ），１．６５−１．４２（ｍ，７Ｈ），１．２９（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ），１．２８−１．２５（ｍ，２Ｈ），１．２３（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ），０．８４（ｓ，３Ｈ）。
【０１５７】
実施例２  ｂｒａ−ｈｅｘ−ａｌａ−Ｍａｙ ８の合成
（Ｓ）−２−（メチルアミノ）プロパン酸（Ｎ−メチルＳ−アラニン）２による２，５−ジオキソピロリジン−１−イル ６−（２ブロモアセトアミド）ヘキサノエート６のアシル化は、（Ｓ）−２−（６−（２ブロモアセトアミド）−Ｎ−メチルヘキサンアミド）プロパン酸７を与える（図２）。メイタンシノール４の３−ヒドロキシルで７とカップリングさせてｂｒａ−ｈｅｘ−ａｌａ−Ｍａｙ ８を与える。
【０１５８】
実施例３  ｍａｌ−ＰＥＧ３−ａｌａ−Ｍａｙ １４の合成
２，２’−（２，２’−オキシビス（エタン−２，１−ジイル）ビス（オキシ））ジエタンアミン（Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ，５．００ｇ，０．０２６０ｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（５２５ｍＬ）に４−ジメチルアミノピリジン（３２０ｍｇ、０．００２６ｍｏｌ）が添加された。添加漏斗を使用して室温で、これに二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（５．６８ｇ，０．０２６０ｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（１００ｍＬ）が１時間にわたって添加された。（図３）。反応物は、最初は濁ったが、その後清澄となった。ＭｃＲｅｙｎｏｌｄｓ Ｋ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，（２００２），Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，１０：６２５に従い、反応物をさらに２時間撹拌し、次いで濃縮し、ＩＳＣＯ（０−２０％ ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）により精製し、ｔｅｒｔ−ブチル２−（２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチルカルバメートを淡黄色油として得た（２．７０ｇ，３６％）。ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋２９３．３．１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ５．７９（ｓ，１Ｈ），３．６９−３．５７（ｍ，８Ｈ），３．５６−３．４７（ｍ，４Ｈ），３．３２−３．２３（ｍ，２Ｈ），２．８４（ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，２Ｈ），１．４４（ｓ，９Ｈ）。
【０１５９】
ｔｅｒｔ−ブチル２−（２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチルカルバメート（１．２１９ｇ，４．１６９ｍｍｏｌ）とヘキサン二酸（アジピン酸、３．０４６ｇ，２０．８４ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（１００ｍＬ）を含有するフラスコに、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（１．２３ｇ，５．９８ｍｍｏｌ）が添加された。反応物を室温で撹拌すると白濁した。２時間後、溶液を０℃に冷却し、副生成物のＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシル尿素をろ過により除去した。反応物をシリカゲル上で濃縮し、ＩＳＣＯ（４０ｇ ｃｏｌｕｍｎ，０−１０％ ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）．により精製した。濃縮して、２，２−ジメチル−４，１８−ジオキソ−３，８，１１，１４−テトラオキサ−５，１７−ジアザトリコサン−２３−オイック酸を透明油として与えた（１．２８ｇ、７３％）。
ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋４２１．４．１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１０．５５（ｓ，１Ｈ），６．６５（ｓ，１Ｈ），５．２７（ｓ，１Ｈ），３．６７−３．６２（ｍ，８Ｈ），３．６０−３．５２（ｍ，４Ｈ），３．４８−３．４１（ｍ，２Ｈ），３．３５−３．２３（ｍ，２Ｈ），２．３５（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ），２．２５（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），１．４４（ｓ，９Ｈ）。
【０１６０】
２，２−ジメチル−４，１８−ジオキソ−３，８，１１，１４−テトラオキサ−５，１７−ジアザトリコサン−２３−オイック酸９（６８２．３ｍｇ，０．００１６２３ｍｏｌ）を含有するバイアルに、１，４−ジオキサン中の４Ｍ塩化水素を４ｍＬ添加した。反応物を３０分間撹拌し、次いで濃縮した。炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液（５．１ｍＬ）を加えた。溶液を０℃に冷却し、１０分間撹拌した後、Ｎ−メトキシカルボニルマレイミド（２５１．７ｍｇ，１．６２２ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を０℃で２０分間、より撹拌し、次いで室温に温めた。この溶液を、ＤＭＦで希釈し、ギ酸の５滴で急冷し、濾過し、ｒｐ−ＨＰＬＣにより精製し、１−アミノ−１３−オキソ−３，６，９−トリオキサ−１２−アザオクタデカン−１８−オイック酸１０を透明油として与えた（２９７ｍｇ，４６％）。ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋４０１．３．１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ８．６６（ｓ，１Ｈ），６．５６（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，１Ｈ），３．７３（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），３．６６−３．６０（ｍ，９Ｈ），３．５６（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，２Ｈ），３．４７−３．４１（ｍ，２Ｈ），２．３５（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ），２．２４（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），１．７７−１．５８（ｍ，４Ｈ）。
【０１６１】
メチル２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−カルボン酸により１０のマレイミドが形成され、１−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−１３−オキソ−３，６，９−トリオキサ−１２−アゾオクタデカン−１８−オイック酸１１を与える（Hermanson, G.T. “Bioconjugate Techniques", Second Edition, (2008) Academic Press, Elsevier）。１１のＮＨＳエステルがＤＣＭ中でＮ−ヒドロキシスクシンイミドとＤＣＣにより形成され、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル、１−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−１３−オキソ−３，６，９−トリオキサ−１２−アザオクタデカン−１８−オエート１２を与える。（Ｓ）−２−（メチルアミノ）プロパン酸（Ｎ−メチルＳ−アラニン）２による１２のアミド化は、（Ｓ）−１−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−１９，２０−ジメチル−１３，１８−ジオキソ−３，６，９−トリオキサ−１２，１９−ジアザヘニコサン−２１−オイック酸１３を与えた。マレイミド４の３−ヒドロキシルでの１３とのカップリングは、ｍａｌ−ＰＥＧ３−ａｌａ−Ｍａｙ薬剤−リンカー中間体１４を与える。
【０１６２】
別法では、メイタンシノール４（５０．０ｍｇ，０．０８８５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１．１２ｍＬ，１４．５ｍｍｏｌ）及びＴＨＦ（３８０ｍＬ，４．６ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（６２ｍＬ，０．３５ｍｍｏｌ）、亜鉛トリフラート（１２９ｍｇ，０．３５４ｍｍｏｌ）、及び（Ｓ）−３，４−ジメチルオキサゾリジン−２，５−ジオン２ａ（８０．０ｍｇ，０．６１９ｍｍｏｌ）が添加された（図１ｂ）。反応物を２４時間撹拌し、酢酸エチル（２ｍＬ）を添加し、次いで５分間かけて、飽和１：１炭酸水素ナトリウム（水溶液）／塩化ナトリウム（水溶液）の溶液２ｍＬを添加した。溶液を３０分間撹拌した後、塩を濾過し、酢酸エチルですすいだ。二相を分離し、水相を酢酸エチル３×２ｍＬで抽出した。混合した有機相を０．２５ｍＬまで濃縮した。酢酸エチル２ｍＬを加え、溶液を再び０．２５ｍＬまで減少させた。この希釈と濃度をもう一回行った。最後に、酢酸エチルを約２ｍＬ溶液となるように添加し、沈殿した塩を０．４５ミクロンのシリンジフィルターを通して濾過し、３−（Ｓ−（Ｎ−メチルアラニニル）メイタンシノール４ａを与えた（図１ｂ）。
【０１６３】
３−（Ｓ−（Ｎ−メチルアラニニル）メイタンシノール４ａの溶液に、１−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−１３−オキソ−３，６，９−トリオキサ−１２−アザオクタデカン−１８−オイック酸１１（６５．５ｍｇ，０．１６４ｍｍｏｌ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（３１．４ｍｇ，０．１６４ｍｍｏｌ）、及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（７．７１ｍＬ，０．０４４２ｍｍｏｌ）を添加した。反応液を２時間撹拌し、反応物を濾過し、ＲＰ−ＨＰＬＣで精製し、ｍａｌ−ＰＥＧ３−ａｌａ−Ｍａｙ １４を透明油として与えた（４８．８ｍｇ，５３％）。ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋１０３２．７．１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ６．８３（ｓ，１Ｈ），６．７１（ｓ，２Ｈ），６．７０−６．６４（ｍ，２Ｈ），６．４７−６．３７（ｍ，２Ｈ），６．２７（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，１Ｈ），５．６７（ｄｄ，Ｊ＝１５．３，９．１Ｈｚ，１Ｈ），５．３５（ｑ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，１Ｈ），４．７８（ｄｄ，Ｊ＝１２．０，２．８Ｈｚ，１Ｈ），４．２９（ｔ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ，１Ｈ），３．９８（ｓ，３Ｈ），３．７２（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ），３．６７−３．５６（ｍ，１２Ｈ），３．５４−３．４８（ｍ，３Ｈ），３．４４−３．３８（ｍ，２Ｈ），３．３６（ｓ，３Ｈ），３．１９（ｓ，３Ｈ），３．１１（ｄ，Ｊ＝１２．７Ｈｚ，１Ｈ），３．０１（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，１Ｈ），２．８４（ｓ，３Ｈ），２．６０（ｄｄ，Ｊ＝１４．１，１２．４Ｈｚ，１Ｈ），２．４８−２．３８（ｍ，１Ｈ），２．３０−２．１３（ｍ，４Ｈ），１．７５−１．５８（ｍ，８Ｈ），１．５２−１．４０（ｍ，１Ｈ），１．２９（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，６Ｈ），１．２２（ｄ，Ｊ＝１２．９Ｈｚ，１Ｈ），０．８０（ｓ，３Ｈ）。
【０１６４】
実施例４  ｂｒａ−ＰＥＧ３−ａｌａ−Ｍａｙ １８の合成
２，２−ジメチル−４，１８−ジオキソ−３，８，１１，１４−テトラオキサ−５，１７−ジアザトリコサン−２３−オイック酸９（３２１．８ｍｇ，０．７６５３ｍｍｏｌ）を含有するバイアルに、１ｍＬの塩化メチレンと１ｍＬのトリフルオロ酢酸を添加した。反応物を３０分間攪拌し、濃縮し、１−アミノ−１３−オキソ−３，６，９−トリオキサ−１２−アザオクタデカン−１８−オイック酸１０を得た（図３）。
【０１６５】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（７．６５ｍＬ）を１０のバイアルに添加し、溶液を０℃まで冷却した（図４）。臭化ブロモアセチル（７３ｍＬ，０．８４２ｍｍｏｌ）を添加し、続いてＮ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１６０ｍＬ，０．９１８ｍｍｏｌ）を添加した。４５分間撹拌した後、０．１％のギ酸を含む水２ｍＬを溶液に添加し、生成物をＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し、１−ブロモ−２，１６−ジオキソ−６，９，１２−トリオキサ−３，１５−ジアザヘニコサン−２１−オイック酸を透明油として与えた（８９．６ｍｇ，２７％）。 ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋４４１．３．１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．１２（ｓ，１Ｈ），６．４８（ｓ，１Ｈ），３．８９（ｓ，２Ｈ），３．６９−３．５４（ｍ，１２Ｈ），３．５３−３．４１（ｍ，４Ｈ），２．３６（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），２．２４（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），１．７６−１．５９（ｍ，４Ｈ）。
【０１６６】
１５のＮＨＳエステルがＤＣＭ中でＮ−ヒドロキシスクシンイミドとＤＣＣにより形成され、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル、１−ブロモ−２，１６−ジオキソ−６，９，１２−トリオキサ−３，１５−ジアザヘニコサン−２１−オエート１６を与える。（Ｓ）−２−（メチルアミノ）プロパン酸（Ｎ−メチルＳ−アラニン）２による１６のアミド化は、リンカー試薬、（Ｓ）−１−ブロモ−２２，２３−ジメチル−２，１６，２１−トリオキソ−６，９，１２−トリオキサ−３，１５，２２−トリアザテトラコサン−２４−オイック酸１７を与える。マレイミド４の３−ヒドロキシルでの１７とのカップリングは、ｂｒａ−ＰＥＧ３−ａｌａ−Ｍａｙ薬剤−リンカー中間体１８を与える（図４）。
【０１６７】
別法として、３−（Ｓ−（Ｎ−メチルアラニニル）メイタンシノール４ａの溶液に、１−ブロモ−２，１６−ジオキソ−６，９，１２−トリオキサ−３，１５−ジアザヘニコサン−２１−オイック酸１５（７２．２ｍｇ，０．１６４ｍｍｏｌ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（３１．４ｍｇ，０．１６４ｍｍｏｌ）、及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（７．７１ｍＬ，０．０４４２ｍｍｏｌ）を添加した。反応液を２時間撹拌し、反応物を濾過し、ＲＰ−ＨＰＬＣで精製し、ｂｒａ−ＰＥＧ３−ａｌａ−Ｍａｙ １８を透明油として与えた（５３．３ｍｇ，５６％）。ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋１０７３．０．１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．１０（ｓ，１Ｈ），６．８３（ｓ，１Ｈ），６．６６（ｓ，１Ｈ），６．６４（ｓ，１Ｈ），６．４８−６．３７（ｍ，２Ｈ），６．３２（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，１Ｈ），５．６８（ｄｄ，Ｊ＝１５．３，９．１Ｈｚ，１Ｈ），５．３１（ｑ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１Ｈ），４．７９（ｄｄ，Ｊ＝１２．０，２．８Ｈｚ，１Ｈ），４．２９（ｔ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ，１Ｈ），３．９８（ｓ，３Ｈ），３．８７（ｓ，２Ｈ），３．６５−３．６２（ｍ，９Ｈ），３．６１−３．５８（ｍ，３Ｈ），３．５４（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，２Ｈ），３．５０−３．４７（ｍ，３Ｈ），３．４２（ｄｄ，Ｊ＝９．８，４．９Ｈｚ，２Ｈ），３．３６（ｓ，３Ｈ），３．１９（ｓ，３Ｈ），３．１２（ｄ，Ｊ＝１２．７Ｈｚ，１Ｈ），３．００（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，１Ｈ），２．８５（ｓ，３Ｈ），２．６０（ｄｄ，Ｊ＝１４．１，１２．４Ｈｚ，１Ｈ），２．４９−２．１２（ｍ，６Ｈ），１．６９−１．５７（ｍ，７Ｈ），１．４６（ｑｄ，Ｊ＝１２．８，６．４Ｈｚ，１Ｈ），１．３１（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ），１．２８（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ），１．２３（ｄ，Ｊ＝１３．０Ｈｚ，１Ｈ），０．８０（ｓ，３Ｈ）。
【０１６８】
実施例５  還元及び再酸化によるコンジュゲーション用システイン操作抗体の調製
軽鎖アミノ酸はＫａｂａｔに従って番号付けされる（Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, (1991) 5th Ed., US Dept of Health and Human Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD）。重鎖アミノ酸は、Ｋａｂａｔシステムと記された場合を除いてＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされる（Edelman et al (1969) Proc. Natl. Acad of Sciences 63(1):78-85）。一文字アミノ酸略語が使用される。
【０１６９】
ＣＨＯ細胞で発現された全長のシステイン操作モノクローナル抗体（チオＭａｂ）は、細胞培養条件によって、システイン付加体（システイン）を有するか又は操作されたシステインにグルタチオン付加される。操作されたシステインの反応性チオール基を遊離させるために、チオＭａｂを、ｐＨが約８．０にて、５００ｍＭのホウ酸ナトリウム及び５００ｍＭ塩化ナトリウムに溶解させ、１ｍＭのＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩の約５０〜１００倍過剰で約１〜２時間３７℃で還元する。あるいは、ＤＴＴを還元試薬として用いることができる。鎖間ジスルフィド結合の形成は、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるか、又は逆相ＨＰＬＣ ＰＬＲＰカラムクロマトグラフィーを変性させるのいずれかによってモニターした。還元されたチオＭａｂは１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５で希釈され、ＨｉＴｒａｐ Ｓ カラム上にロードされ、０．３Ｍ塩化ナトリウムを含むＰＢＳで溶出した。溶出された還元型チオＭａｂは、３時間、ｐＨ７で、２ｍＭのデヒドロアスコルビン酸（ｄｈＡＡ）で処理されるか、又は一晩室温で２ｍＭの硫酸銅（ＣｕＳＯ４）水溶液で処理される。周囲の空気酸化もまた有効であり得る。バッファーはセファデックスＧ２５樹脂上で溶出によって交換され、１ｍＭのＤＴＰＡを含むＰＢＳで溶出される。チオール／Ａｂの値が、溶液の２８０ｎｍでの吸光度から還元された抗体濃度を決定すること及びＤＴＮＢ（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）との反応によるチオール濃度を決定すること、及び４１２ｎｍでの吸光度の決定によりチェックされる。
【０１７０】
液体クロマトグラフィー／質量分析は、拡張された質量範囲でＴＳＱ量子トリプル四重極質量分析計で行った（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）。サンプルは７５℃に加熱したＰＲＬＰ−Ｓ１０００ Ａ、マイクロボアカラム（５０ｍｍ×２．１ｍｍ，Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｈｒｏｐｓｈｉｒｅ，ＵＫ）でクロマトグラフィーにかけた。３０−４０％のＢの直線勾配（溶媒Ａ：０．０５％ＴＦＡ水溶液：アセトニトリル中０．０４％のＴＦＡ）が用いられ、溶離液は、エレクトロスプレー源を使用して直接イオン化された。データは、Ｘｃａｌｉｂｕｒデータシステムによって収集され、デコンボリューションは、ＰｒｏＭａｓｓ（Ｎｏｖａｔｉａ，ＬＬＣ，ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ）を用いて行った。ＬＣ／ＭＳ分析の前に、抗体又は薬剤コンジュゲート（５０マイクログラム）がＰＮＧａｓｅ Ｆ（２単位／ｍｌ；ＰＲＯｚｙｍｅ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）により３７℃で２時間処理され、Ｎ結合型糖を除去した。
【０１７１】
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）のサンプルが、ブチルＨＩＣ ＮＰＲカラム（２．５ミクロンの粒子サイズ、４．６ｍｍ×３．５ｃｍ）（東ソーバイオサイエンス）に注入され、０．８ｍｌ／分で０から７０％のＢの線形勾配で溶出した（Ａ：５０ｍＭリン酸カリウム中１．５Ｍの硫酸アンモニウム、ｐＨ７、Ｂ：５０ｍＭのリン酸カリウムｐＨ７、２０％イソプロパノール）。多波長検出器とＣｈｅｍｓｔａｔｉｏｎソフトウエアを備えたＡｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズＨＰＬＣシステムが、抗体当たりの薬剤の異なる比率を有する抗体種を分離し、定量化するために使用された。
【０１７２】
実施例６  抗体への薬剤−リンカー中間体のコンジュゲーション
実施例５の還元と再酸化法の後、システイン操作抗体をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）緩衝液に溶解し、氷上で冷却した。マレイミド又はブロモ酢酸などのチオール反応性官能基を含む５、８、１４及び１８などのメイタンシノイド薬剤リンカー中間体の抗体あたりの操作されたシステインに対して約１．５モル当量がＤＭＳＯに溶解され、アセトニトリルと水で希釈され、ＰＢＳ中で冷却され還元され再酸化された抗体に添加された。約１時間後、過剰のマレイミドを添加して反応を停止させ、未反応抗体のチオール基を覆った。反応混合物を遠心限外濾過により濃縮し、システイン操作トラスツズマブ抗体−薬剤コンジュゲートを精製し、ＰＢＳ中でのＧ２５樹脂を通する溶出によって脱塩し、無菌条件下で０．２μｍのフィルターを通して濾過し、貯蔵のために凍結した。
上記の手順で、式Ｉの以下のシステイン操作型Ｎ−メチルアラニニルメイタンシノール抗体−薬剤コンジュゲートが調製された：
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マレイミドＤＭ１コンジュゲート，（２）ＬＣＶ２０５Ｃチオ−ＴＭＡｂ−ｍｐｅｏ−ＤＭ１，平均薬剤付加ＤＡＲ＝１．７，及び（６）ＴＭＡｂ−ｍｃｃ−ＤＭ１，平均薬剤付加ＤＡＲ＝３．４が、米国特許出願公開第２００５／０２７６８１２号の実施例４の手順に従って調製され、それは参照により組み込まれる。
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【０１７３】
実施例７  インビトロ細胞増殖アッセイ
ＡＤＣの有効性は、以下のプロトコルを用いて細胞増殖アッセイにより測定した（ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ ＧＬＯＴＭ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ，Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ＴＢ２８８； Mendoza et al (2002) Cancer Res. 62:5485-5488）：
１．培地に約１０４細胞（ＳＫＢＲ−３，ＢＴ４７４，ＭＣＦ７又はＭＤＡ−ＭＢ−４６８）を含む細胞培養物の１００μｌのアリコートを、９６ウェルの不透明壁のプレートの各ウェルに沈着させた。
２．コントロールウェルは細胞無しで培地を含有して調製した。
３．ＡＤＣを実験ウェルに添加し、３−５日間インキュベートした。
４．プレートを約３０分間室温にて平衡化した。
５．各ウェル中に存在する細胞培養培地の容積に等しい容積のＣＥＬＬＴＩＴＥＲ ＧＬＯＴＭ試薬を加えた。
６．内容物をオービタルシェーカーで２分間混合して細胞溶解を誘導した。
７．プレートは、発光シグナルを安定化させるために１０分間室温でインキュベートした。
８．発光を記録し、ＲＬＵ＝相対発光単位としてグラフにて報告された。
データは、標準偏差誤差バーと共に、反復の各組について発光の平均値としてプロットされている。プロトコルはＣＥＬＬＴＩＴＥＲ ＧＬＯＴＭ発光細胞の変形である。
培地：ＳＫ−ＢＲ−３は５０／５０／１０％ＦＢＳ／グルタミン／２５０μｇ／ｍＬ Ｇ−４１８で生育し、ＯＶＣＡＲ−３はＲＰＭＩ／２０％ＦＢＳ／グルタミンで生育する。
【０１７４】
実施例８  高発現ＨＥＲ２トランスジェニック外植マウスにおける腫瘍増殖阻害、インビボでの有効性
Ｆｏ５マウス乳腺腫瘍モデルが、前述のように単一用量の静脈注射後に、（６）本発明のＴＭＡｂ−ｍｃｃ−ＤＭ１及び様々なチオ−ＴＭＡｂ−Ｍａｙのインビボ有効性を評価するために採用され（Phillips GDL, Li GM, Dugger DL, et al. Targeting HER2-Positive Breast Cancer with Trastuzumab-DM1, an Antibody-Cytotoxic Drug Conjugate. (2008) Cancer Res. 68:9280-90）、参照により本明細書に組み込まれる。Ｆｏ５モデルは、トランスジェニックマウスモデルであり、ヒトＨＥＲ２遺伝子が、マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーター（ＭＭＴＶ−ＨＥＲ２）の転写制御下で乳腺上皮において過剰発現される。ＨＥＲ２過剰発現は乳腺腫瘍の自発的な増殖を引き起こす。これらの樹立動物（樹立＃５［Ｆｏ５］）の一匹の乳腺腫瘍は腫瘍断片（〜２×２ｍｍの大きさ）の連続移植によってＦＶＢマウスの後の世代に伝播される。すべての研究は、実験動物の管理と使用に関するガイドラインに従って実施された。各抗体−薬剤コンジュゲート（単一用量は、）研究の開始、及び移植後第１４日に９匹の動物に静脈内投与した。初期腫瘍サイズは約２００ｍｍ３の体積であった。本発明による抗体−薬剤コンジュゲートとコントロールによる時間の経過による腫瘍増殖阻害の測定は図５ａ、５ｂ、及び６に示される。
明細書全体を通して引用された全ての特許、特許出願、及び参考文献は、出典明示により援用される。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【配列表】
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