(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式５’ＧＴＣＧＴＴ３’で表されるコア塩基配列と、前記コア塩基配列を連結する１以上の塩基からなる連結塩基配列とからなり、前記コア塩基配列を５〜９含むことを特徴とする免疫刺激オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記連結塩基配列が、Ｃ、ＴＴ又はＴＣのいずれかであることを特徴とする請求項１に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド。
【請求項３】
塩基配列が５’−ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ−３’（配列番号２）であることを特徴とする請求項１又は２に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド。
【請求項４】
塩基配列が５’−ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ−３’（配列番号３）であることを特徴とする請求項１又は２に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド。
【請求項５】
塩基配列が５’−ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ−３’（配列番号４）であることを特徴とする請求項１又は２に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする治療剤。
【請求項７】
前記治療剤がアレルギー疾患用の治療剤であることを特徴とする請求項６に記載の治療剤。
【請求項８】
前記アレルギー疾患が花粉アレルギー症であることを特徴とする請求項７に記載の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫刺激オリゴヌクレオチドおよび前記免疫刺激オリゴヌクレオチドを含む治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は免疫系の多くの細胞に存在し、先天性免疫反応に関連する。脊椎動物において、このファミリーはＴＬＲ１〜ＴＬＲ１１と呼ばれる１１種のタンパク質からなり、それらは、細菌、真菌、寄生虫、およびウィルスからの病原体関連分子パターンを認識する。
【０００３】
ＴＬＲファミリーの中のＴＬＲ９は、細菌ＤＮＡおよび合成オリゴヌクレオチド内の非メチル化ＣｐＧモチーフ（以下ＣｐＧと記す）を認識することが知られている（非特許文献２、４）。細菌性ＤＮＡは、マクロファージおよびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞によるサイトカイン産生を誘導する。細菌性ＤＮＡの細胞活性化は、非メチル化されたＣｐＧを中心に含む短い配列によるとされている。
【０００４】
細菌性ＤＮＡがマクロファージを刺激して、ＩＬ−１２およびＴＮＦ−αの産生を誘導することも報告されている（非特許文献３）。これらのサイトカインは、さらにＢ細胞からＩＬ−１２およびＩＦＮ−γの産生を誘導することが知られている。また、細菌性ＤＮＡまたはＣｐＧを含む免疫刺激オリゴヌクレオチドのいずれかをＢ細胞に添加することによりＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γの産生を誘導することが報告されている（非特許文献５、６）。これらの結果は、ＣｐＧ含有配列がＴｈ１型の免疫応答を誘導する能力を有することを示している。
【０００５】
Ｔｈ１型の免疫応答の誘導を示す免疫刺激オリゴヌクレオチドを利用した治療法が研究されている（非特許文献１）。例えば、抗原と免疫刺激ヌクレオチドの結合体、あるいはそれに類する近接体を投与する方法が見出されている。結合体の投与によって、特定の抗原に対するＴｈ２型免疫応答をダウンレギュレートしながら同じ抗原に対するＴｈ１型免疫応答を増強されることが示されている。このような処置は、アレルギー、腫瘍、自己免疫疾患などの疾患に有効であることが述べられている（非特許文献７、８、９、１６）。
【０００６】
天然のＤＮＡに存在するホスホジエステル結合を有するオリゴヌクレオチドは細胞内および細胞培地中において様々な核酸分解活性によって分解されやすい。そのため、核酸分解酵素の攻撃標的であるヌクレオチド間のホスホジエステル結合を置換することによる安定化、さらにその結果としてのＴｈ１型の免疫応答の誘導の増加の検討が行われている。頻繁に用いられている置換方法としては、ホスホジエステルからホスホロチオエートへの置換である（非特許文献１０、１１）。免疫刺激オリゴヌクレオチドのパリンドローム外のＣｐＧ配列をホスホチロオエート修飾することにより、免疫応答の誘導が増強されることも報告されている（非特許文献１２）。
【０００７】
ＤＮＡのチオール化は核酸分解酵素に対する抵抗性を高めるが、非特異的な蛋白質吸着の起因となり、細胞毒性等の副作用を示す。またＤＮＡ結合蛋白との相互作用が弱められるため免疫刺激活性の低下を招く（非特許文献１３）。従って、チオール修飾がＣｐＧのＴｈ１型の免疫応答を低下させている可能性がある。また動物実験では、通常、チオール修飾ＣｐＧが用いられるが、致命的な副作用をもたらすことが報告されている（非特許文献１４）。
【０００８】
ホスホジエステルヌクレオチドからのみ構成されるＣｐＧを含む配列にデオキシグアニル酸の繰り返し構造（ポリＧ配列）を付加することによって、免疫応答の誘導が増強されることが報告されている（非特許文献１５）。ポリＧ配列は自然界では染色体ＤＮＡの末端部分（テロメア）に存在し、四重鎖ＤＮＡ構造を形成することがしられている。そのために、ＣｐＧを含む免疫刺激オリゴヌクレオチドの末尾に付加されたポリＧにより、免疫刺激オリゴヌクレオチドが高次構造を形成し、核酸分解に対する抵抗性が高まり、免疫応答が安定に行われると考えられる。
【０００９】
一方、ポリＧそのものはマウスＢ細胞ではＩＦＮ−γ産生を抑制することが報告されており、Ｇの付加は活性の消失・抑制にも影響することが懸念される（非特許文献１７）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００８−１号公報
【特許文献２】特開２００５−２３７３２８号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｗｅｉｎｅｒ  ＧＪ，Ｌｉｕ  ＨＭ，Ｗｏｏｌｄｒｉｄｇｅ  ＪＥ，Ｄａｈｌｅ  ＣＥ，Ｋｒｉｅｇ  ＡＭ：Ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ＣｐＧ  ｍｏｔｉｆ  ａｒｅ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｓ  ｉｍｍｕｎｅ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９７，９４：１０８３３−１０８３７．
【非特許文献２】Ｈｅｍｍｉ  Ｈ，Ｔａｋｅｕｃｈｉ  Ｏ，Ｋａｗａｉ  Ｔ，Ｋａｉｓｈｏ  Ｔ，Ｓａｔｏ  Ｓ，Ｓａｎｊｏ  Ｈ，  Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  Ｍ，Ｈｏｓｈｉｎｏ  Ｋ，Ｗａｇｎｅｒ  Ｈ，Ｔａｋｅｄａ  Ｋ，Ａｋｉｒａ  Ｓ：Ａ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＤＮＡ．Ｎａｔｕｒｅ  ２０００，４０８：７４０−７４５．
【非特許文献３】Ｔａｋｅｓｈｉｔａ  Ｆ，Ｌｅｉｆｅｒ  ＣＡ，Ｇｕｒｓｅｌ  Ｉ，  Ｉｓｈｉｉ  ＫＪ，Ｔａｋｅｓｈｉｔａ  Ｓ，Ｇｕｒｓｅｌ  Ｍ，Ｋｌｉｎｍａｎ  ＤＭ：  Ｃｕｔｔｉｎｇ  ｅｄｇｅ：ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ９  ｉｎ  ＣｐＧ  ＤＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００１，１６７：３５５５−３５５８．
【非特許文献４】Ｋｒｉｅｇ  ＡＭ：ＣｐＧ  ｍｏｔｉｆｓ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００２，２０：７０９−７６０．
【非特許文献５】Ｍａｇｇｉ  Ｅ，Ｐａｒｒｏｎｃｈｉ  Ｐ，Ｍａｎｅｔｔｉ  Ｒ，  Ｓｉｍｏｎｅｌｌｉ  Ｃ，Ｐｉｃｃｉｎｎｉ  ＭＰ，Ｒｕｇｉｕ  ＦＳ，  Ｄｅ  Ｃａｒｌｉ  Ｍ，  Ｒｉｃｃｉ  Ｍ，  Ｒｏｍａｇｎａｎｉ  Ｓ：  Ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＩＦＮ−ｇａｍｍａ  ａｎｄ  ＩＬ−４  ｏｎ  ｔｈｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｔｈ１  ａｎｄ  Ｔｈ２  ｃｌｏｎｅｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９２，１４８：２１４２−２１４７．
【非特許文献６】Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ  Ｇ：Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１２．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ  １９９８，１７：２６９−２７８．
【非特許文献７】Ｊａｈｒｓｄｏｒｆｅｒ  Ｂ，Ｗｅｉｎｅｒ，ＧＪ：ＣｐＧ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ  ２００３，４：６８６−６９０．
【非特許文献８】Ｆｏｎｓｅｃａ  ＤＥ，Ｋｌｉｎｅ  ＪＮ：Ｕｓｅ  ｏｆ  ＣｐＧ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｉｎ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｓｔｈｍａ  ａｎｄ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  ２００９，６１：２５６−２６２．
【非特許文献９】Ｋｌｉｎｍａｎ  ＤＭ，Ｋｌａｓｃｈｉｋ  Ｓ，Ｓａｔｏ  Ｔ，  Ｔｒｏｓｓ  Ｄ：ＣｐＧ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ｆｏｒ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  ２００９，６１：２４８−２５５．
【非特許文献１０】Ｋｕｒｒｅｃｋ  Ｊ：Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ：Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｎｏｖｅｌ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２００３，２７０：１６２８−１６４４．
【非特許文献１１】Ａｇｒａｗａｌ  Ｓ，Ｚｈａｏ  Ｑ：Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  １９９８，  ２：５１９−５２８．
【非特許文献１２】Ｍｕｔｗｉｒｉ  ＧＫ，Ｎｉｃｈａｎｉ  ＡＫ，Ｂａｂｉｕｋ  Ｓ，Ｂａｂｉｕｋ，ＬＡ：Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＣｐＧ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２００４，９７：１−１７．
【非特許文献１３】Ｂｒｏｗｎ  ＤＡ，Ｋａｎｇ  ＳＨ，Ｇｒｙａｚｎｏｖ  ＳＭ，  ＤｅＤｉｏｎｉｓｉｏ  Ｌ，Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ  Ｏ，Ｓｕｌｌｉｖａｎ  Ｓ，Ｘｕ  Ｘ，Ｎｅｒｅｎｂｅｒｇ  ＭＩ：Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｏｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９４，２６９：２６８０１−２６８０５．
【非特許文献１４】Ｃｒｏｏｋｅ  ＲＭ：Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ  １９９１，６：６０９−６４６．
【非特許文献１５】Ｌｅｅ  ＳＷ，Ｓｏｎｇ  ＭＫ，Ｂａｅｋ  ＫＨ，Ｐａｒｋ  Ｙ，  Ｋｉｍ  ＪＫ，Ｌｅｅ  ＣＨ，Ｃｈｅｏｎｇ  ＨＫ，Ｃｈｅｏｎｇ  Ｃ，Ｓｕｎｇ  ＹＣ：  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａ  ｈｅｘａｍｅｒｉｃ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｇｕａｎｏｓｉｎｅ  ｒｕｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ＣｐＧ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅｉｒ  ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０００，１６５：３６３１−３６３９．
【非特許文献１６】Ｖｏｌｌｍｅｒ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  ６１：１９５-２０４．
【非特許文献１７】Ｈａｌｐｅｒｎ  ＭＤ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２９：４７−５２．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
ホスホジエステルヌクレオチドからのみ構成される非修飾型オリゴヌクレオチドは核酸分解酵素に対する耐性が低く、短時間で分解される。
しかし、核酸分解酵素に対する抵抗性を高めた既存のホスホチロオエート修飾ＣｐＧならびにポリＧ配列の付加では、副作用ならびに免疫刺激活性の消失・抑制といった問題がある。
本発明は、副作用が少なく、臨床応用の可能性を有する強力なＴｈ１免疫刺激活性を有する非修飾型オリゴヌクレオチドを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らはこの課題を解決するため、鋭意検討を重ねた結果、５’ＧＴＣＧＴＴ３’で構成される繰り返し単位を４以上含むオリゴヌクレオチドの中に、ヒトで高い免疫刺激活性、すなわち、ヒトにおいてＴｏｌｌ様受容体９を介した免疫応答の高い誘導活性を示すオリゴヌクレオチドを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、以下の構成を有する。
【００１４】
（１）一般式５’ＧＴＣＧＴＴ３’で表されるコア塩基配列と、前記コア塩基配列を連結する１以上の塩基からなる連結塩基配列とからなり、前記コア塩基配列を４以上含むことを特徴とする免疫刺激オリゴヌクレオチド。
【００１５】
（２）前記連結塩基配列が、Ｃ、ＴＴ又はＴＣのいずれかであることを特徴とする（１）に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド。
【００１６】
（３）塩基配列が５’−ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＣＧＴＣＧＴＴ−３’（配列番号１）であることを特徴とする（１）又は（２）に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド。
【００１７】
（４）塩基配列が５’−ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ−３’（配列番号２）であることを特徴とする（１）又は（２）に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド。
【００１８】
（５）塩基配列が５’−ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ−３’（配列番号３）であることを特徴とする（１）又は（２）に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド。
【００１９】
（６）塩基配列が５’−ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ−３’（配列番号４）であることを特徴とする（１）又は（２）に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド。
【００２０】
（７）（１）〜（６）のいずれかに記載の免疫刺激オリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする治療剤。
【００２１】
（８）前記疾患又は障害がアレルギー疾患であることを特徴とする（７）に記載の治療剤。
【００２２】
（９）前記アレルギー疾患が花粉アレルギー症であることを特徴とする（８）に記載の治療剤。
【発明の効果】
【００２３】
（１）本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドは、一般式５’ＧＴＣＧＴＴ３’で表されるコア塩基配列と、１以上の塩基からなる連結塩基配列とからなる構成なので、ホスホジエステルヌクレオチドのみから構成される非修飾型オリゴヌクレオチドとすることができる。前記コア塩基配列を４以上含む構成により、核酸分解酵素に対して耐性を有し、分解を抑制することができる。
また、ホスホジエステルヌクレオチドのみから構成し、ホスホロチオエートを含まない構成なので、治療薬の成分として利用した場合でも、副作用を生じさせないようにできる。
更にまた、本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドは、前記コア塩基配列を４以上含む構成なので、ヒトにおける免疫刺激活性を高めることができる。
以上により、副作用が少なく、臨床応用の可能性を有する強力なＴｈ１免疫刺激活性を有する非修飾型オリゴヌクレオチドを提供することができる。
また、本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドを有効成分として含有する送達複合体や免疫刺激剤を提供することができ、有益性および有用性の高い医薬品を提供することができる。
【００２４】
（２）本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドは、前記連結塩基配列が、Ｃ、ＴＴ又はＴＣのいずれかである構成なので、容易にかつ安定な免疫刺激オリゴヌクレオチドとすることができる。
【００２５】
（３）〜（６）本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドは、配列番号１から４のいずれかで示される塩基配列である構成なので、ヒトに対して免疫刺激活性を有する、オリゴヌクレオチドを提供することができる。
【００２６】
（７）本発明の治療剤は、先に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチドを含む構成なので、免疫系が正常に機能していない疾患または障害、あるいは免疫機能を増強させることが有効である疾患または障害を効果的に処置、予防もしくは改善することができる。
また、本発明の治療剤は、本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチド、またはこれらを有効成分として含有する送達複合体をアジュバントとして含むワクチンとすることができる。
以上により、本発明の治療剤は、有益性および有用性高い医薬品として利用できる。
【００２７】
（８）本発明の治療剤は、前記疾患又は障害がアレルギー疾患である場合には、本発明の実施形態である免疫刺激オリゴヌクレオチド、および免疫刺激オリゴヌクレオチドを有効成分として含有する送達複合体や免疫刺激剤が、アレルギー疾患に対する免疫機能をより増強させることができ、その処置、予防又は改善の効果をより高めることができる。
【００２８】
（９）本発明の治療剤は、前記アレルギー疾患が花粉アレルギー症である場合には、本発明の実施形態である免疫刺激オリゴヌクレオチドおよび免疫刺激オリゴヌクレオチドを有効成分として含有する送達複合体や免疫刺激剤が、花粉アレルギー症に対する免疫機能を更に増強させることができ、その処置、予防又は改善の効果を更に高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明および公知の免疫刺激オリゴヌクレオチドを処置した２９３ＸＬ−ｈＴＬＲ９細胞における転写因子ＮＦ−ｋＢの活性化の結果を示す図である。
【図２】本発明および公知の免疫刺激オリゴヌクレオチドを処置した２９３ＸＬ−ｈＴＬＲ９細胞における転写因子ＮＦ−ｋＢの活性化の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下、添付図面を参照しながら、本発明の実施形態である免疫刺激オリゴヌクレオチドおよびそのオリゴヌクレオチドを含む治療剤について説明する。
【００３１】
（本発明の実施形態）
＜免疫刺激オリゴヌクレオチド＞
本発明の実施形態である免疫刺激オリゴヌクレオチドは、一般式５’ＧＴＣＧＴＴ３’で表されるコア塩基配列（繰り返し単位）と、前記コア塩基配列を連結する１以上の塩基からなる連結塩基配列とからなり、前記コア塩基配列を４以上含む。
５’ＧＴＣＧＴＴ３’で構成されるコア塩基配列を４以上含むことにより、ヒトおよびマウスに対して高い免疫刺激活性を有する。また、核酸分解活性を有する血清中において１２時間では分解されず、血清中での安定性が高い。
【００３２】
なお、本実施形態において、免疫刺激オリゴヌクレオチドがヒトに対して免疫刺激活性を有するとは、ヒト胎児腎細胞をアデノウィルスのＥ１遺伝子によりトランスフォーメーションして樹立された細胞株ＨＥＫ２９３細胞に、ヒトＴＬＲ９の構造遺伝子を組み込み、ヒトＴＬＲ９が恒常的に発現するようにした２９３−ｈＴＬＲ９細胞において、転写因子ＮＦ−ｋＢの活性化を誘導する作用のことを示す。
【００３３】
前記連結塩基配列は、Ｃ、ＴＴ又はＴＣのいずれかであることが好ましい。連結塩基配列をＣ、ＴＴ又はＴＣのいずれかとすることにより、コア塩基配列を容易に連結できるとともに、免疫刺激活性に悪影響を与えない。
【００３４】
また、本発明の実施形態である免疫刺激オリゴヌクレオチドは、安定性の高いホスホジエステルヌクレオチドのみから構成される非修飾型オリゴヌクレオチドとする構成であり、核酸分解酵素に対して耐性を有し、分解を抑制することができる。
更にまた、ホスホジエステルヌクレオチドのみから構成し、ホスホロチオエートを含まない構成なので、治療薬の成分として利用した場合でも、副作用を生じさせないようにできる。
【００３５】
なお、一般に、生理活性を有する核酸において、少数の塩基が置換し、欠失し及び／又
は挿入された場合であっても、もとの核酸の生理活性が維持される場合があることは当業者において広く知られているところである。
【００３６】
従って、コア塩基配列を４以上含んでいれば、他のコア塩基配列及び連結塩基配列において、１個ないし４個の塩基が置換されていてもよい。この場合でも、コア塩基配列を４以上含む構成なので、ヒトおよびマウスに対して高い免疫刺激活性を有する。
【００３７】
また、コア塩基配列を４以上含んでいれば、他のコア塩基配列及び連結塩基配列において、１個ないし４個の塩基が欠失されていてもよい。この場合でも、コア塩基配列を４以上含む構成なので、ヒトおよびマウスに対して高い免疫刺激活性を有する。
【００３８】
また、コア塩基配列を４以上含んでいれば、他のコア塩基配列及び連結塩基配列において、１個ないし４個の塩基が挿入されていてもよい。この場合でも、コア塩基配列を４以上含む構成なので、ヒトおよびマウスに対して高い免疫刺激活性を有する。
【００３９】
このような置換、欠失及び／又は挿入の塩基数は、好ましくは２個以下であり、さらに好ましくは１個以下であり、最も好ましくは０個である。
また、置換、欠失及び／又は挿入の部位としては、コア塩基配列を４以上含み、ヒトに対する免疫刺激活性が維持されるのであれば、何ら限定されない。
【００４０】
本発明の実施形態である免疫刺激オリゴヌクレオチドは、例えば、次に示す配列番号１〜４の免疫刺激オリゴヌクレオチドである。
配列番号１：塩基配列が５’−ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＣＧＴＣＧＴＴ−３’である免疫刺激オリゴヌクレオチド。
配列番号２：塩基配列が５’−ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ−３’である免疫刺激オリゴヌクレオチド。
配列番号３：塩基配列が５’−ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ−３’である免疫刺激オリゴヌクレオチド。
配列番号４：塩基配列が５’−ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ−３’である免疫刺激オリゴヌクレオチド。
【００４１】
配列番号１〜４の免疫刺激オリゴヌクレオチドは、いずれも５’ＧＴＣＧＴＴ３’で構成されるコア塩基配列を４以上含み、ヒトに対して高い免疫刺激活性を有する。また、核酸分解活性を有する血清中において１２時間では分解されず、血清中での安定性が高い。
【００４２】
配列番号１〜４の免疫刺激オリゴヌクレオチドは、コア塩基配列を４以上含んでいれば、それらの塩基配列で１個ないし４個の塩基が置換し、欠失し及び／若しくは挿入されていてもよい。この場合でも、コア塩基配列を４以上含む構成なので、ヒトおよびマウスに対して高い免疫刺激活性を有する。
【００４３】
このような置換、欠失及び／又は挿入の塩基数は、好ましくは２個以下であり、さらに好ましくは１個以下であり、最も好ましくは０個である。また、置換、欠失及び／又は挿入の部位としては、コア塩基配列を４以上含み、ヒトに対する免疫刺激活性が維持されるのであれば、何ら限定されない。
【００４４】
本発明の実施形態である免疫刺激オリゴヌクレオチドは、従来の技術及び核酸合成装置で合成できる。
これらの合成方法は酵素的方法又は化学的方法であり、本発明の配列より長い配列の合成を含む方法であるが、必ずしもこれに限定されるものではない。
これらのオリゴヌクレオチドの合成技術、修飾技術は特許文献１、２及び非特許文献１〜１７においても用いられており、その他にも多数の報告が確認される公知の技術である。
【００４５】
＜治療剤＞
本発明の実施形態である治療剤（免疫刺激剤）は、本発明の実施形態である免疫刺激オリゴヌクレオチドを含む。
本発明の実施形態である治療剤は、免疫機能を増強させることができる本発明の実施形態である免疫刺激オリゴヌクレオチドを含むので、免疫機能を増強させることが有効である疾患又は障害を処置、予防又は改善できる。なお、免疫機能を増強させることが有効である疾患又は障害には、免疫系が正常に機能していない疾患または障害が含まれる。
【００４６】
免疫系が正常に機能していない疾患または障害とは、アレルギー、悪性腫瘍があげられ、必ずしもこれに限定されるものではないが、好適な実施形態としては、上記疾患または障害がアレルギー疾患である。アレルギー疾患とは、花粉、ダニ、ハウスダストなどに由来する抗原物質を起因とし、鼻炎、結膜炎、皮膚炎、喘息などの炎症を症状とする疾患であるが、さらに好適な実施形態としては、上記アレルギー疾患が花粉アレルギー症である。花粉アレルギーとは特にスギ花粉由来の蛋白を抗原とするアレルギーを指すが、ブタクサ、ヒノキなどの他の花粉由来物質が抗原であっても良い。
【００４７】
本発明の実施形態である治療剤は、前記疾患又は障害がアレルギー疾患である場合には、本発明の実施形態である免疫刺激オリゴヌクレオチドが、アレルギー疾患に対する免疫機能をより増強させることができ、その処置、予防又は改善の効果をより高めることができる。
【００４８】
本発明の実施形態である治療剤は、前記アレルギー疾患が花粉アレルギー症である場合には、本発明の実施形態である免疫刺激オリゴヌクレオチドが、花粉アレルギー症に対する免疫機能を更に増強させることができ、その処置、予防又は改善の効果を更に高めることができる。
【００４９】
本発明の実施形態である治療剤は、医薬としての使用を目的とした送達複合体の形態で本発明の実施形態である免疫刺激オリゴヌクレオチドを含んでいてもよい。
送達複合体とは、例えば、免疫刺激オリゴヌクレオチドと他の物質との混合物もしくは結合体又は免疫刺激オリゴヌクレオチドを取り込ませたリポソームもしくはナノスフィアである。
送達複合体の好適な実施形態は、免疫刺激オリゴヌクレオチドを埋封したリポソームである。なお、埋封とは、リポソームの脂質膜表面との結合、脂質膜中への取り込み、あるいはリポソームの内腔への取り込みを指し示す。
しかし、送達複合体は、必ずしもこれらの形態に限定されるものではない。
【００５０】
本発明の実施形態である治療剤を用いる場合、投与経路は、皮下注射、皮内注射、静脈内注射、筋肉内注射、患部組織への注入、経鼻投与、経眼投与等、系咽頭投与、系肺投与、経皮投与が好ましい。
しかし、投与経路は、これらに限定されるものではない。
【００５１】
投与量は、患者の症状、治療目的、投与経路等により適宜選択されるが、通常、成人１日当り、オリゴヌクレオチド量として、０．１ｐＭ〜１０μＭ、好ましくは１ｐＭ〜０.１μＭ程度である。
また、免疫刺激オリゴヌクレオチドは、通常、採用される剤形を製剤する周知の製剤方法により製剤される。
【００５２】
免疫刺激オリゴヌクレオチド又は送達複合体は、ワクチンのアジュバントとしての用途をも有する。
ワクチンの使用可能な疾患は感染症である。感染症とは、ウィルス、細菌、真菌および原虫等を原因として発症する疾患である。
アジュバントとして使用する場合の投与量も、投与目的、投与経路等により適宜選択されるが、通常、上記と同程度の投与量でよい。
【００５３】
本発明の実施形態である免疫刺激オリゴヌクレオチドおよびその免疫刺激オリゴヌクレオチドを含む治療剤は、上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の技術的思想の範囲内で、種々変更して実施することができる。本実施形態の具体例を以下の実施例で示す。しかし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００５４】
（実施例１〜４、比較例１、２）
＜免疫刺激オリゴヌクレオチドの、２９３ＸＬ−ｈＴＬＲ９細胞において、転写因子ＮＦ−ｋＢの活性化の誘導＞
まず、式（５’ＧＴＣＧＴＴ３’）と一致している塩基配列を４つ含む免疫刺激オリゴヌクレオチド（実施例１：ＰＤ−ＯＤＮ２００６−ＴＣＧＴＣＧＴＴ；配列番号１）を構築した。
次に、式（５’ＧＴＣＧＴＴ３’）と一致している塩基配列を５つ含む免疫刺激オリゴヌクレオチド（実施例２：ＰＤ−ＯＤＮ２００６−ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ；配列番号２）を構築した。
次に、式（５’ＧＴＣＧＴＴ３’）と一致している塩基配列を６つ含む免疫刺激オリゴヌクレオチド（実施例３：ＰＤ−ＯＤＮ２００６−２００６；配列番号３）を構築した。
次に、式（５’ＧＴＣＧＴＴ３’）と一致している塩基配列を９つ含む免疫刺激オリゴヌクレオチド（実施例４：ＰＤ−ＯＤＮ２００６−２００６−２００６；配列番号４）を構築した。
【００５５】
次に、公知の免疫刺激オリゴヌクレオチドとして、ｎが３の配列（比較例１：ＰＤ−ＯＤＮ２００６；配列番号５）を用意した。ＰＤ−ＯＤＮ２００６は血清中の核酸分解酵素により容易に分解され、ヒトに対する免疫刺激活性が低いことが報告されている。
次に、公知の別の免疫刺激オリゴヌクレオチドとして、ｎが３の配列の３’末端にデオキシグアニル酸の５回繰り返し構造（ポリＧ５配列）を有する配列（比較例２：ＰＤ−ＯＤＮ２００６−Ｇ５；配列番号６）を用意した。ＰＤ−ＯＤＮ２００６−Ｇ５は核酸分解酵素に対して耐性を示していることが報告されている。
そしてこれらの配列の２９３ＸＬ−ｈＴＬＲ９細胞における転写因子ＮＦ−ｋＢの活性化の誘導のスクリーニングを行った。
【００５６】
２９３−ｈＴＬＲ９細胞（インビボジェン社）に転写因子ＮＦ−ｋＢの活性化を調べるためのレポーターアッセイ用プラスミドｐＮｉＦｔｙ−ｌｕｃ（インビボジェン社）ならびに遺伝子導入の標準化のためのプラスミドｐＧＬ４．７４（プロメガ社）をトランスフェクション試薬であるＬｙｏＶｅｃ（インビボジェン社）を用いて、導入した。
２４時間後、種々濃度のＰＤ−ＯＤＮ２００６−ＴＣＧＴＣＧＴＴ、ＰＤ−ＯＤＮ２００６−ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ、ＰＤ−ＯＤＮ２００６−２００６、ＰＤ−ＯＤＮ２００６−２００６−２００６、ＰＤ−ＯＤＮ２００６、およびＰＤ−ＯＤＮ２００６−Ｇ５を各々添加した。
免疫刺激オリゴヌクレオチド添加２４時間後に、２９３−ｈＴＬＲ９細胞を回収し、破砕し、細胞破砕液内のレポータータンパク質であるルシフェラーゼの発現量を定量した。
【００５７】
得られた細胞破砕液についてルシフェラーゼの発現量の定量を行った結果、図１のような結果が得られた。
オリゴヌクレオチド（０．１μＭ）を２９３／ｈＴＬＲ９細胞に処置すると、ＰＤ−ＯＤＮ２００６−ＴＣＧＴＣＧＴＴ、ＰＤ−ＯＤＮ２００６−ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ、ＰＤ−ＯＤＮ２００６−２００６、ＰＤ−ＯＤＮ２００６−２００６−２００６はＰＤ−ＯＤＮ２００６と比較して、高い転写因子ＮＦ−ｋＢの活性化の誘導を示した。
【００５８】
さらに、ＰＤ−ＯＤＮ２００６−ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ、ＰＤ−ＯＤＮ２００６−２００６、ＰＤ−ＯＤＮ２００６−２００６−２００６は公知の免疫刺激オリゴヌクレオチドであるＰＤ−ＯＤＮ２００６−Ｇ５よりも高い転写因子ＮＦ−ｋＢの活性化の誘導を示した。
特に、ＰＤ−ＯＤＮ２００６−２００６−２００６は０．０１μＭにおいても、ＰＤ−ＯＤＮ２００６およびＰＤ−ＯＤＮ２００６−Ｇ５と比較して、顕著に高い転写因子ＮＦ−ｋＢの活性化を示した。
このことから、低濃度において、ＰＤ−ＯＤＮ２００６−２００６−２００６は特に有用である。
【００５９】
５’ＧＴＣＧＴＴ３’はＴＬＲ９のアゴニストとして機能する繰り返し配列であり、本発明の配列番号１から４で示される塩基配列においては各々のオリゴヌクレオチドに含まれる数が異なる。
５’ＧＴＣＧＴＴ３’の繰り返し配列の数に応じて転写因子ＮＦ−ｋＢの活性化が起こることが当然ながら予想される。
５’ＧＴＣＧＴＴ３’の各々のオリゴヌクレオチドに含まれる濃度で転写因子ＮＦ−ｋＢの活性化を比較した結果、図２のような結果が得られた。
ＮＦ−ｋＢの活性化は測定液中の５’ＧＴＣＧＴＴ３’繰り返し配列の量に依存しているのではなく、繰り返し配列を４回以上１以上の塩基からなる連結塩基配列で直列につなげることによる効果により獲得されていることが示された。
【００６０】
これらの結果から、オリゴヌクレオチド配列ＰＤ−ＯＤＮ２００６−ＴＣＧＴＣＧＴＴ、ＰＤ−ＯＤＮ２００６−ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ、ＰＤ−ＯＤＮ２００６−２００６、およびＰＤ−ＯＤＮ２００６−２００６−２００６において、ヒトに対して免疫刺激活性を有することが確認された。
また、その活性は既知のＰＤ−ＯＤＮ２００６と比較して高かった。特に、ＰＤ−ＯＤＮ２００６−２００６−２００６は０．０１μＭにおいても十分な免疫刺激活性を有することが確認された。
【００６１】
以上、実施例１〜４において具体的に示された通り、配列番号１から４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは、ヒトに対して免疫刺激活性を有することが確認された。
また、これらのオリゴヌクレオチドは、核酸分解活性を有する血清中において１２時間では分解されず、血清中での安定性が高いことを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドおよびそのオリゴヌクレオチドを含む治療剤は、副作用が少なく臨床応用の可能性を有する強力なＴｈ１免疫刺激活性を有する非修飾型オリゴヌクレオチドに関するものであり、医薬産業、特にアレルギーに係る医薬産業において利用可能性がある。
【図１】
0005930146.tif 000002
【図２】
0005930146.tif 000003