(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ターゲット核酸配列を上流オリゴヌクレオチド及びＰＴＯ（プロービング及びタギングオリゴヌクレオチド、Ｐｒｏｂｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔａｇｇｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とハイブリッド形成させる工程であって、前記上流オリゴヌクレオチドは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を含み、前記ＰＴＯは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を含む３’−ターゲッティング部位及び（ｉｉ）前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’−タギング部位を含み、前記３’−ターゲッティング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリッド形成され、前記５’−タギング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリッド形成されず、前記上流オリゴヌクレオチドは、前記ＰＴＯの上流に位置する工程と、
（ｂ）前記ＰＴＯの切断のための条件下で、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素に前記工程（ａ）の結果物を接触させる工程であって、前記上流オリゴヌクレオチド又はその伸長鎖は、前記５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による前記ＰＴＯの切断を誘導して、このような前記切断は、前記ＰＴＯの５’−タギング部位又は５’−タギング部位の一部を含む断片を放出する工程と、
（ｃ）前記ＰＴＯから放出された前記断片とＣＴＯ（キャプチャリング及びテンプレーティングオリゴヌクレオチド、Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）をハイブリッド形成させる工程であって、前記ＣＴＯは、３’→５’方向に（ｉ）前記ＰＴＯの前記５’−タギング部位又は前記５’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位及び（ｉｉ）前記ＰＴＯの前記５’−タギング部位及び前記３’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み、前記ＰＴＯから放出された前記断片は、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリッド形成される工程と、
（ｄ）工程（ｃ）の結果物及び鋳型依存的核酸ポリメラーゼを利用して伸長反応を行う工程であって、前記ＣＴＯの前記キャプチャリング部位にハイブリッド形成された前記断片は、伸長されて伸長二本鎖を形成し、前記伸長二本鎖のＴｍ値は、（ｉ）前記断片の配列及び／又は長さ、（ｉｉ）前記ＣＴＯの配列及び／又は長さ、又は（ｉｉｉ）前記断片の前記配列及び／又は長さと前記ＣＴＯの前記配列及び／又は長さ、により調節することができ、前記伸長二本鎖は、（ｉ）前記断片及び／又はＣＴＯに連結された少なくとも一つの標識、（ｉｉ）前記伸長反応の間に前記伸長二本鎖内に挿入された標識、（ｉｉｉ）前記断片及び／又は前記ＣＴＯに連結された少なくとも一つの標識と前記伸長反応の間に前記伸長二本鎖内に挿入された標識、又は（ｉｖ）インターカレーティング標識（Ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ  Ｌａｂｅｌ）、によりターゲットシグナルを提供する工程と、
（ｅ）前記伸長二本鎖がその二本鎖形態を維持する指定の温度で前記ターゲットシグナルを測定することにより、前記伸長二本鎖を検出する工程であって、これにより、前記伸長二本鎖の存在は、前記ターゲット核酸配列の存在を示し、前記伸長二本鎖は固相基質上に固定化されない工程と、
を含むことを特徴とする、液相におけるＰＴＯＣＥ（ＰＴＯ切断及び伸長）アッセイによりＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法。
【請求項２】
前記伸長二本鎖により提供される前記ターゲットシグナルは、工程（ｄ）の伸長の間に提供され、非切断ＰＴＯ及び前記ＣＴＯ間のハイブリッド形成物は、非ターゲットシグナルを提供しない請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記伸長二本鎖により提供される前記ターゲットシグナルは、工程（ｃ）における前記断片及び前記ＣＴＯの前記ハイブリッド形成により提供され、工程（ｄ）における前記伸長二本鎖の前記形成は、前記ターゲットシグナルを維持し、非切断ＰＴＯ及び前記ＣＴＯ間の前記ハイブリッド形成物は、非ターゲットシグナルを提供し、前記指定温度は、前記ハイブリッド形成物を解離させて前記非ターゲットシグナルが除去される温度である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ターゲットシグナルは、前記断片及び／又は前記ＣＴＯに連結された少なくとも一つの標識により提供される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記断片は、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識を有し、工程（ｃ）における前記断片及び前記ＣＴＯのハイブリッド形成は、前記相互作用的二重標識からのシグナルの変化を誘導してターゲットシグナルを提供し、前記伸長二本鎖は、前記ターゲットシグナルを維持する請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＣＴＯは、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識を有し、工程（ｃ）における前記断片及び前記ＣＴＯの前記ハイブリッド形成は、前記相互作用的二重標識からのシグナルの変化を誘導して前記ターゲットシグナルを提供し、前記伸長二本鎖は、前記ターゲットシグナルを維持する請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記ＣＴＯは、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識を有し、工程（ｄ）における前記断片の前記伸長は、前記相互作用的二重標識からのシグナルの変化を誘導して前記ターゲットシグナルを提供する請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記断片は、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識の一つを有し、前記ＣＴＯは、前記相互作用的二重標識の他の一つを有し、前記工程（ｃ）における前記断片及び前記ＣＴＯの前記ハイブリッド形成は、前記相互作用的二重標識からのシグナルの変化を誘導して前記ターゲットシグナルを提供し、前記伸長二本鎖は、前記ターゲットシグナルを維持する請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記断片又は前記ＣＴＯは、単一標識を有し、工程（ｃ）における前記断片及び前記ＣＴＯの前記ハイブリッド形成は、前記単一標識からのシグナルの変化を誘導して前記ターゲットシグナルを提供し、前記伸長二本鎖は、前記ターゲットシグナルを維持する請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＣＴＯは、単一標識を有し、工程（ｄ）における前記断片の前記伸長は、前記単一標識からのシグナルの変化を誘導し、前記ターゲットシグナルを提供する請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
前記標識は、非切断ＰＴＯ及び前記ＣＴＯ間のハイブリッド形成物が形成される場合、前記ハイブリッド形成物が工程（ｄ）において非ターゲットシグナルを提供しない範囲内に位置する請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
前記標識は、非切断ＰＴＯ及び前記ＣＴＯ間のハイブリッド形成物が形成される場合、前記ハイブリッド形成物が工程（ｄ）において非ターゲットシグナルを提供する範囲内に位置し、前記伸長二本鎖のＴｍ値は、前記非切断ＰＴＯ及び前記ＣＴＯ間の前記ハイブリッド形成物のＴｍ値より高い請求項４に記載の方法。
【請求項１３】
前記ターゲットシグナルは、前記伸長反応の間に前記伸長二本鎖内に挿入された単一標識により提供され、前記挿入された単一標識は、前記伸長反応の間に挿入されたヌクレオチドに連結されており、工程（ｄ）における前記断片の前記伸長は、前記単一標識からのシグナルの変化を誘導し、前記工程（ｄ）における前記ターゲットシグナルを提供する請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記伸長反応の間に挿入された前記ヌクレオチドは、第１非天然塩基（ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ  ｂａｓｅ）を有し、前記ＣＴＯは、前記第１非天然塩基に対して特異的結合親和性のある第２非天然塩基を有するヌクレオチドを有する請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ターゲットシグナルは、前記伸長反応の間に前記伸長二本鎖内に挿入された標識と前記断片及び／又は前記ＣＴＯに連結された標識により提供され、前記挿入された標識は、前記伸長反応の間に挿入されたヌクレオチドに連結されており、前記二つの標識は、レポーター分子及びクエンチャー分子の相互作用的二重標識であり、工程（ｄ）における前記断片の前記伸長は、前記相互作用的二重標識からのシグナルの変化を誘導し、前記ターゲットシグナルを提供する請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記伸長反応の間に挿入された前記ヌクレオチドは、第１非天然塩基（ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ  ｂａｓｅ）を有し、前記ＣＴＯは、前記第１非天然塩基に対して特異的結合親和性のある第２非天然塩基を有するヌクレオチドを有する請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記上流オリゴヌクレオチドは、上流プライマー又は上流プローブである請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記方法は、工程（ａ）−（ｂ）、（ａ）−（ｄ）又は（ａ）−（ｅ）を反復する工程と、その反復サイクルの間に変性過程とをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
工程（ａ）−（ｅ）は、一つの反応容器又は個別反応容器で実施される請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記方法は、少なくとも２種のターゲット核酸配列を検出するために行われ、前記上流オリゴヌクレオチドは、少なくとも２種のオリゴヌクレオチドを含み、前記ＰＴＯは、少なくとも２種のＰＴＯを含み、前記ＣＴＯは、少なくとも１種のＣＴＯを含む請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記方法は、下流プライマーの存在下で行われる請求項１から２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
（ａ）ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を含む上流オリゴヌクレオチドと、
（ｂ）ＰＴＯ（プロービング及びタギングオリゴヌクレオチド、Ｐｒｏｂｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔａｇｇｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）であって、前記ＰＴＯは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を含む３’−ターゲッティング部位及び（ｉｉ）前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’−タギング部位を含み、前記３’−ターゲッティング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリッド形成され、前記５’−タギング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリッド形成されず、前記上流オリゴヌクレオチドは、前記ＰＴＯの上流に位置し、前記上流オリゴヌクレオチド又はその伸長鎖は、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による前記ＰＴＯの切断を誘導し、このような前記切断は、前記ＰＴＯの前記５’−タギング部位又は前記５’−タギング部位の一部を含む断片を放出する前記ＰＴＯと、
（ｃ）ＣＴＯ（キャプチャリング及びテンプレーティングオリゴヌクレオチド、Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）であって、前記ＣＴＯは、３’→５’方向に（ｉ）前記ＰＴＯの５’−タギング部位又は前記５’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位及び（ｉｉ）前記ＰＴＯの５’−タギング部位及び前記３’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み、前記ＰＴＯから放出された前記断片は、前記ＣＴＯの前記キャプチャリング部位にハイブリッド形成され、そして、前記ＣＴＯの前記キャプチャリング部位にハイブリッド形成された前記断片は、鋳型依存的核酸ポリメラーゼにより伸長されて伸長二本鎖を形成する前記ＣＴＯと、
を含み、請求項１から２１のいずれかに記載の方法に用いられることを特徴とする、ＰＴＯＣＥ（ＰＴＯ切断及び伸長）アッセイによりＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＴＯＣＥ（ＰＴＯ切断及び伸長、ＰＴＯ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｎｄ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）アッセイによるターゲット核酸配列の検出に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡハイブリッド形成（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）は、分子生物学の基本的な過程であり、イオン強度、塩基構成、核酸断片の長さ、ミスマッチング程度及び変性剤の存在により影響を受ける。ＤＮＡハイブリッド形成ベースの技術は、特定核酸配列の決定に非常に有用な道具となり、臨床診断、遺伝子研究及び法医学的実験分析に明確に役に立つだろう。
【０００３】
しかし、ハイブリッド形成にのみ依存する従来方法及び過程では、プローブと非ターゲット配列間の非特異的なハイブリッド形成による擬陽性結果が発生する可能性が高い。したがって、従来の方法及び過程は、信頼度を改善しなければならない問題点が残っている。
【０００４】
プローブハイブリッド形成過程の他にも、追加的に酵素的反応を利用した幾つかの接近法、例えば、ＴａｑＭａｎＴＭプローブ方法が提示された。
【０００５】
ＴａｑＭａｎＴＭプローブ方法において、ターゲット核酸配列にハイブリッド形成された標識プローブは、上流プライマー依存的ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性により切断され、ターゲット配列の存在を示すシグナルを発生させる（特許文献１〜３）。ＴａｑＭａｎＴＭプローブ方法は、シグナル発生のための二つのアプローチを提示する：重合依存的切断（ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｌｅａｖａｇｅ）及び重合非依存的切断（ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｌｅａｖａｇｅ）。重合依存的切断において、上流プライマーの伸長は、必ず核酸ポリメラーゼが標識プローブの５’−末端に接触する前に起こらなければならない。伸長反応が進行されつつ、ポリメラーゼは、標識プローブの５’−末端を徐々に切断する。重合非依存的切断において、上流プライマー及び標識プローブは、非常に近接してターゲット核酸にハイブリッド形成され、上流プライマーの３’−末端と核酸ポリメラーゼの結合は、前記核酸ポリメラーゼが標識プローブの５’−末端に接触するようにして、標識が放出される。また、ＴａｑＭａｎＴＭプローブ方法は、その５’−末端部位にターゲット配列とハイブリッド形成されない５’−テイル領域を有する標識プローブが切断され、５’−テイル領域を含む断片が形成されることを開示している。
【０００６】
ターゲット配列に非相補的な５’−テイル領域を有するプローブが５’ヌクレアーゼにより切断され、５’−テイル領域を含む断片が放出される幾つかの方法が報告された。
【０００７】
例えば、特許文献４は、ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性により切断される切断構造を開示している。鋳型に対して非相補的な５’部位及び鋳型に対して相補的な３’部位を含むオリゴヌクレオチドが鋳型にハイブリッド形成され、上流オリゴヌクレオチドは、非常に近接して鋳型にハイブリッド形成される切断構造が例示されている。切断構造は、５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ又は減少された合成活性を有する修飾ＤＮＡポリメラーゼにより切断され、鋳型に非相補的な５’部位が放出される。その後、放出された５’部位は、ヘアピン構造を有するオリゴヌクレオチドにハイブリッド形成されて切断構造を形成し、これにより漸進的な切断反応が誘導されてターゲット配列が検出される。
【０００８】
特許文献５は、３’−末端がブロッキングされた上流オリゴヌクレオチドを有する切断構造が、５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ又はＦＥＮヌクレアーゼにより切断され、非相補的な５’フラップ（ｆｌａｐ）部位が放出され、放出された５’フラップ部位は、サイズ分析又は相互作用的二重標識により検出される過程を開示している。米国特許第６，８９３，８１９号は、検出可能な放出されたフラップが核酸合成依存的な、フラップ媒介連続的増幅方法により生成されることを開示している。この方法において、一番目の切断構造から放出されたフラップは、核酸合成依存的な方式で二番目の切断構造を切断してフラップを放出させ、放出されたフラップを検出する。
【０００９】
液相における蛍光−標識プローブのハイブリッド形成により、一種類の蛍光標識を利用するとしても、メルティングカーブ分析により多数のターゲット核酸配列を同時的に検出することができる。しかし、相互作用的二重標識プローブの５’ヌクレアーゼ媒介切断によりターゲット配列を検出する従来の技術は、マルチプレックスターゲット検出において、互いに異なるターゲット配列に対して互いに異なる種類の蛍光標識を必要とし、このような蛍光標識の種類数の限界のため、検出されるターゲット配列の数は制限される。
【００１０】
特許文献６は、ターゲット核酸配列に非相補的な５’部位を有するプローブの切断及びキャプチャープローブのハイブリッド形成を利用したターゲット検出方法を開示している。標識は、非相補的な５’部位に位置する。ターゲット配列にハイブリッド形成された標識プローブは、切断されて断片を放出して、以後断片は、キャプチャープローブとハイブリッド形成され、ターゲット配列の存在が検出される。この方法において、非切断された／完全な（ｕｎｃｌｅａｖｅｄ／ｉｎｔａｃｔ）プローブは、キャプチャープローブとハイブリッド形成されないことが必須的である。このためには、短い長さを有するキャプチャープローブが固相基質上に固定化されなければならない。しかし、このような制限は、固相基質におけるハイブリッド形成の効率性を低めて、また反応条件の最適化も難しくする。
【００１１】
したがって、より便利で、且つ信頼性及び再現性のある方式で、ハイブリッド形成だけではなく５’核酸分解反応（５’ｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）のような酵素的反応により、液相及び固相でターゲット配列、より好ましくは、複数のターゲット配列を検出するための新規な接近法に対する開発要求が高まっている。また、当業界で標識（特に、蛍光標識）種類の数に制限されない新規なターゲット検出方法が要求されている。
【００１２】
本明細書全体にかけて多数の特許及び文献が参照され、その引用が表示されている。引用された特許及び文献の開示内容は、その全体が本明細書に参照として取り込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】米国特許第５，２１０，０１５号明細書
【特許文献２】米国特許第５，５３８，８４８号明細書
【特許文献３】米国特許第６，３２６，１４５号明細書
【特許文献４】米国特許第５，６９１，１４２号明細書
【特許文献５】米国特許第７，３８１，５３２号明細書
【特許文献６】米国出願公開番号第２００８−０２４１８３８号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明者らは、より改善された正確性及び便宜性を有し、特に、マルチプレックス方式においてターゲット配列を検出する新規なアプローチを開発するために鋭意研究した。その結果、本発明者らは、ターゲット配列を検出するための新規なプロトコールを立案して、このようなターゲット検出は、プローブハイブリッド形成、酵素的プローブ切断、伸長及び伸長二本鎖（Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ）の検出により達成される。本発明のプロトコールは、固相反応だけではなく、液相反応にも好適に適用され、より改善された正確性及び便宜性を有して複数のターゲット配列が検出されるようにする。
【００１５】
したがって、本発明の目的は、ＰＴＯＣＥ（ＰＴＯ切断及び伸長）アッセイを利用し、ＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法を提供することにある。
【００１６】
本発明の他の目的は、ＰＴＯＣＥ（ＰＴＯ切断及び伸長）アッセイを利用し、ＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出するためのキットを提供することにある。
【００１７】
本発明の他の目的及び利点は、発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面により、さらに明確にされる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ＰＴＯ切断及び伸長アッセイ（ＰＴＯＣＥ  ａｓｓａｙ）に利用されるＰＴＯ（Ｐｒｏｂｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔａｇｇｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）及びＣＴＯ（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）の図式的な構造を示す。好ましくは、ＰＴＯ及びＣＴＯの３’−末端は、ブロッキングされて伸長が防止される。
【図２】メルティング分析を含むＰＴＯＣＥアッセイを図式的に示す。ＣＴＯは、そのテンプレーティング部位にレポーター分子及びクエンチャー分子を有する。
【図３】メルティング分析を含むＰＴＯＣＥアッセイを図式的に示す。ＣＴＯは、そのテンプレーティング部位にレポーター分子を有する。前記レポーター分子は、一本鎖形態上に存在するかあるいは二本鎖形態上に存在するかによって異なるシグナル強度を示すことが要求される。
【図４】メルティング分析を含むＰＴＯＣＥアッセイを図式的に示す。ＣＴＯは、そのテンプレーティング部位にｉｓｏ−ｄＣ残基及びレポーター分子を有する。クエンチャー−ｉｓｏ−ｄＧＴＰは、伸長反応の間に伸長二本鎖内に挿入（ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）される。
【図５】メルティング分析を含むＰＴＯＣＥアッセイを図式的に示す。ＰＴＯは、その５’−タギング部位にレポーター分子を有し、ＣＴＯは、そのテンプレーティング部位にｉｓｏ−ｄＣ残基を有する。クエンチャー−ｉｓｏ−ｄＧＴＰは、伸長反応の間に伸長二本鎖内に挿入される。
【図６】メルティング分析を含むＰＴＯＣＥアッセイを図式的に示す。ＰＴＯは、その５’−タギング部位にレポーター分子及びクエンチャー分子を有する。
【図７】メルティング分析を含むＰＴＯＣＥアッセイを図式的に示す。ＰＴＯは、その５’−タギング部位にレポーター分子を有する。前記レポーター分子は、一本鎖形態上に存在するかあるいは二本鎖形態上に存在するかによって異なるシグナル強度を示すことが要求される。
【図８】メルティング分析を含むＰＴＯＣＥアッセイを図式的に示す。ＰＴＯは、その５’−タギング部位にクエンチャー分子を有して、ＣＴＯは、そのキャプチャリング部位にレポーター分子を有する。
【図９】指定温度における検出を含むＰＴＯＣＥアッセイを図式的に示す。ＣＴＯは、そのテンプレーティング部位にレポーター分子及びクエンチャー分子を有する。ＣＴＯは、その３’−末端を介して固相基質上に固定化される。
【図１０】指定温度における検出を含むＰＴＯＣＥアッセイを図式的に示す。レポーター標識ｄＡＴＰは、伸長反応の間に伸長二本鎖内に挿入される。ＣＴＯは、その３’−末端を介して固相基質上に固定化される。
【図１１】指定温度における検出を含むＰＴＯＣＥアッセイを図式的に示す。ＣＴＯは、そのテンプレーティング部位にｉｓｏ−ｄＣ残基を有し、レポーター−ｉｓｏ−ｄＧＴＰは、伸長反応の間に伸長二本鎖内に挿入される。ＣＴＯは、その３’−末端を介して固相基質上に固定化される。
【図１２】指定温度における検出を含むＰＴＯＣＥアッセイを図式的に示す。ＰＴＯは、その５’−タギング部位にレポーター分子を有する。ＣＴＯは、その５’−末端を介して固相基質上に固定化される。
【図１３】インターカレーティング標識を利用する指定温度における検出を含むＰＴＯＣＥアッセイを図式的に示す。ＣＴＯは、その５’−末端を介して固相基質上に固定化される。
【図１４】メルティング分析を含むＰＴＯＣＥアッセイによるＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ遺伝子の検出結果を示す。ＣＴＯは、そのテンプレーティング部位にレポーター分子及びクエンチャー分子を有する。
【図１５】メルティング分析を含むＰＴＯＣＥアッセイによるＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ遺伝子の検出結果を示す。ＰＴＯは、その５’−末端にクエンチャー分子を有し、ＣＴＯは、その３’−末端にレポーター分子を有する。
【図１６】伸長二本鎖のＴｍ値がＣＴＯ配列により調節されるという結果を示す。
【図１７Ａ】ＰＣＲ増幅を利用したＰＴＯＣＥアッセイによるＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ遺伝子の検出結果を示す。ＣＴＯは、そのテンプレーティング部位にレポーター分子及びクエンチャー分子を有する。図１７Ａは、リアルタイムＰＣＲ検出を含むＰＴＯＣＥアッセイの結果を示す。
【図１７Ｂ】ＰＣＲ増幅を利用したＰＴＯＣＥアッセイによるＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ遺伝子の検出結果を示す。ＣＴＯは、そのテンプレーティング部位にレポーター分子及びクエンチャー分子を有する。図１７Ｂは、ポスト−ＰＣＲメルティング分析を含むＰＴＯＣＥアッセイの結果を示す。
【図１８Ａ】ＰＣＲ増幅を利用したＰＴＯＣＥアッセイによるＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ遺伝子の検出結果を示す。ＣＴＯは、その５’−末端にｉｓｏ−ｄＣ残基及びレポーター分子を有する。クエンチャー−ｉｓｏ−ｄＧＴＰは、伸長反応の間に伸長二本鎖内に挿入される。図１８Ａは、リアルタイムＰＣＲ検出を含むＰＴＯＣＥアッセイの結果を示す。
【図１８Ｂ】ＰＣＲ増幅を利用したＰＴＯＣＥアッセイによるＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ遺伝子の検出結果を示す。ＣＴＯは、その５’−末端にｉｓｏ−ｄＣ残基及びレポーター分子を有する。クエンチャー−ｉｓｏ−ｄＧＴＰは、伸長反応の間に伸長二本鎖内に挿入される。図１８Ｂは、ポスト−ＰＣＲメルティング分析を含むＰＴＯＣＥアッセイの結果を示す。
【図１９Ａ】ＰＣＲ増幅を利用したＰＴＯＣＥアッセイによるＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ遺伝子の検出結果を示す。ＰＴＯは、その５’−末端にクエンチャー分子を有して、ＣＴＯは、その３’−末端にレポーター分子を有する。図１９Ａは、リアルタイムＰＣＲ検出を含むＰＴＯＣＥアッセイの結果を示す。
【図１９Ｂ】ＰＣＲ増幅を利用したＰＴＯＣＥアッセイによるＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ遺伝子の検出結果を示す。ＰＴＯは、その５’−末端にクエンチャー分子を有して、ＣＴＯは、その３’−末端にレポーター分子を有する。図１９Ｂは、ポスト−ＰＣＲメルティング分析を含むＰＴＯＣＥアッセイの結果を示す。
【図２０】ポスト−ＰＣＲメルティング分析を含むＰＴＯＣＥアッセイによるＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＮＧ）遺伝子及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＳＡ）遺伝子の同時的検出結果を示す。ＣＴＯは、そのテンプレーティング部位にレポーター分子及びクエンチャー分子を有する。
【図２１Ａ】マイクロアレイにおけるメルティング分析を含むＰＴＯＣＥアッセイによるＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ遺伝子の検出結果を示す。ＣＴＯは、その５’−末端を介して固定化される。ＰＴＯは、その５’−タギング部位にレポーター分子を有する。
【図２１Ｂ】マイクロアレイにおけるメルティング分析を含むＰＴＯＣＥアッセイによるＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ遺伝子の検出結果を示す。ＣＴＯは、その５’−末端を介して固定化される。ＰＴＯは、その５’−タギング部位にレポーター分子を有する。
【図２２Ａ】マイクロアレイにおいて、指定温度におけるリアルタイム検出を含むＰＴＯＣＥアッセイによるＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ遺伝子の検出結果を示す。ＣＴＯは、その５’−末端を介して固定化される。ＰＴＯは、その５’−タギング部位にレポーター分子を有する。
【図２２Ｂ】マイクロアレイにおいて、指定温度におけるリアルタイム検出を含むＰＴＯＣＥアッセイによるＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ遺伝子の検出結果を示す。ＣＴＯは、その５’−末端を介して固定化される。ＰＴＯは、その５’−タギング部位にレポーター分子を有する。
【図２３Ａ】マイクロアレイにおいて、指定温度におけるリアルタイム検出を含むＰＴＯＣＥアッセイによるＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ遺伝子の検出結果を示す。  ＣＴＯは、その３’−末端を介して固定化され、そのテンプレーティング部位にレポーター分子及びクエンチャー分子を有する。
【図２３Ｂ】マイクロアレイにおいて、指定温度におけるリアルタイム検出を含むＰＴＯＣＥアッセイによるＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ遺伝子の検出結果を示す。  ＣＴＯは、その３’−末端を介して固定化され、そのテンプレーティング部位にレポーター分子及びクエンチャー分子を有する。
【図２４】マイクロアレイにおいて、指定温度におけるエンドポイント検出を含むＰＴＯＣＥアッセイによる単一又は複数のターゲット検出結果を示す。ＣＴＯは、その５’−末端を介して固定化される。ＰＴＯは、その５’−タギング部位にレポーター分子を有する。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＮＧ）遺伝子及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＳＡ）遺伝子は、ターゲット核酸配列として利用した。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、ＰＴＯＣＥ（ＰＴＯ切断及び伸長、ＰＴＯ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｎｄ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）アッセイによりターゲット核酸配列を検出する新規な方法、及びＰＴＯＣＥ（ＰＴＯ切断及び伸長）アッセイによりターゲット核酸配列を検出するためのキットを提供す。
【００２０】
本発明は、ハイブリッド形成反応だけではなく、ターゲット核酸配列の存在依存的に生じる酵素的反応も含む。
【００２１】
Ｉ．メルティング分析を含むＰＴＯＣＥによるターゲット検出過程
本発明の一様態によると、本発明は、
（ａ）ターゲット核酸配列を上流オリゴヌクレオチド及びＰＴＯ（プロービング及びタギングオリゴヌクレオチド、Ｐｒｏｂｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔａｇｇｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とハイブリッド形成させる工程であって、前記上流オリゴヌクレオチドは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を含み、前記ＰＴＯは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を含む３’−ターゲッティング部位及び（ｉｉ）前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’−タギング部位を含み、前記３’−ターゲッティング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリッド形成され、前記５’−タギング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリッド形成されず、前記上流オリゴヌクレオチドは、前記ＰＴＯの上流に位置する工程と、
（ｂ）前記ＰＴＯの切断のための条件下で、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素に前記工程（ａ）の結果物を接触させる工程であって、前記上流オリゴヌクレオチド又はその伸長鎖は、前記５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による前記ＰＴＯの切断を誘導し、このような前記切断は、前記ＰＴＯの５’−タギング部位又は５’−タギング部位の一部を含む断片を放出する工程と、
（ｃ）前記ＰＴＯから放出された前記断片とＣＴＯ（キャプチャリング及びテンプレーティングオリゴヌクレオチド、Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）をハイブリッド形成させる工程であって、前記ＣＴＯは、３’→５’方向に（ｉ）前記ＰＴＯの５’−タギング部位又は５’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位及び（ｉｉ）前記ＰＴＯの５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み、前記ＰＴＯから放出された前記断片は、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリッド形成される工程と、
（ｄ）前記工程（ｃ）の結果物及び鋳型依存的核酸ポリメラーゼを利用して伸長反応を行う工程であって、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリッド形成された前記断片は、伸長されて伸長二本鎖を形成して、前記伸長二本鎖は、（ｉ）前記断片の配列及び／又は長さ、（ｉｉ）前記ＣＴＯの配列及び／又は長さ又は（ｉｉｉ）前記断片の配列及び／又は長さと前記ＣＴＯの配列及び／又は長さにより調節可能なＴｍ値を有する工程と、
（ｅ）一定範囲の温度で前記伸長二本鎖をメルティング（ｍｅｌｔｉｎｇ）し、前記伸長二本鎖の存在を示すターゲットシグナルを提供する工程であって、前記ターゲットシグナルは、（ｉ）前記断片及び／又は前記ＣＴＯに連結された少なくとも一つの標識、（ｉｉ）前記伸長反応の間に前記伸長二本鎖内に挿入された標識、（ｉｉｉ）前記伸長反応の間に前記伸長二本鎖内に挿入された標識と前記断片及び／又は前記ＣＴＯに連結された標識又は（ｉｖ）インターカレーティング標識（Ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ  Ｌａｂｅｌ）により提供される工程と、
（ｆ）前記ターゲットシグナルを測定することにより、前記伸長二本鎖を検出する工程であって、前記伸長二本鎖の存在は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す工程と、
を含み、ＰＴＯＣＥ（ＰＴＯ切断及び伸長）アッセイによりＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法を提供する。
【００２２】
本発明者らは、より改善された正確性及び便宜性を有し、特に、マルチプレックス方式においてターゲット配列を検出する新規なアプローチを開発するために鋭意研究した。その結果、本発明者らは、ターゲット配列を検出するための新規なプロトコールを立案し、このようなターゲット検出は、プローブハイブリッド形成、酵素的プローブ切断、伸長及び伸長二本鎖（ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ）の検出により達成される。本発明のプロトコールは、固相反応だけではなく、液相反応にも好適に適用され、より改善された正確性及び便宜性を有して複数のターゲット配列が検出されるようにする。
【００２３】
本発明は、下記の連続的なイベントを利用する；プローブハイブリッド形成；ＰＴＯ（Ｐｒｏｂｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔａｇｇｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）の切断及び伸長；ターゲット依存的な伸長二本鎖の形成；及び伸長二本鎖の検出。したがって、本発明は、ＰＴＯＣＥ（ＰＴＯ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｎｄ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）アッセイと命名される。
【００２４】
本発明において、伸長二本鎖は、メルティング分析又は指定温度における検出により伸長二本鎖の存在を示すシグナルを提供する標識を有することに特徴がある。また、伸長二本鎖は、調節可能なＴｍ値を有する特徴を有し、これは、複数のターゲット検出又は非ターゲットシグナルとの区別において重要な役割をする。
【００２５】
ターゲット核酸が存在する場合にのみ伸長二本鎖が生成されるため、伸長二本鎖の存在は、ターゲット核酸の存在を示す。
【００２６】
以下、メルティング分析を含むＰＴＯＣＥアッセイをさらに詳細に説明する。
【００２７】
工程（ａ）：ターゲット核酸配列と上流オリゴヌクレオチド及びＰＴＯのハイブリッド形成
本発明によると、まずターゲット核酸配列を上流オリゴヌクレオチド及びＰＴＯ（Ｐｒｏｂｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔａｇｇｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とハイブリッド形成させる。
【００２８】
本明細書で使用される用語‘ターゲット核酸’、‘ターゲット核酸配列’又は‘ターゲット配列’は、検出しようとする核酸配列を意味し、ハイブリッド形成、アニーリング又は増幅条件下でプライマー又はプローブとアニーリング又はハイブリッド形成される。
【００２９】
本明細書で使用される用語‘プローブ（ｐｒｏｂｅ）’は、ターゲット核酸配列に実質的に相補的な部位又は部位を含む一本鎖核酸分子を意味する。
【００３０】
本明細書で使用される用語‘プライマー’は、オリゴヌクレオチドを意味するもので、核酸鎖（鋳型）に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件、即ち、ヌクレオチドとＤＮＡポリメラーゼのような重合剤の存在、そして適した温度とｐＨの条件で合成の開始点として作用できる。
【００３１】
好ましくは、プローブ及びプライマーは、一本鎖デオキシリボヌクレオチド分子である。好ましくは、プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。本発明で利用されるプローブ又はプライマーは、天然（ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）ｄＮＭＰ（即ち、ｄＡＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＣＭＰ及びｄＴＭＰ）、変形ヌクレオチド又は非天然ヌクレオチドを含むことができる。また、プローブ又はプライマーは、リボヌクレオチドを含むことができる。
【００３２】
プライマーは、重合剤の存在下で伸長産物の合成をプライミングさせることができるほど十分長くなければならない。プライマーの適した長さは、例えば、温度、応用分野及びプライマーのソース（ｓｏｕｒｃｅ）を含む複数の要素によって決定される。本明細書で使用された用語‘アニーリング’又は‘プライミング’は、鋳型核酸にオリゴデオキシヌクレオチド又は核酸が並置（ａｐｐｏｓｉｔｉｏｎ）されることを意味し、前記並置は、ポリメラーゼがヌクレオチドを重合させて、鋳型核酸又はその一部分に相補的な核酸分子を形成するようにする。
【００３３】
本明細書で使用された用語‘ハイブリッド形成（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）’は、相補的な一本鎖核酸が二本鎖核酸を形成することを意味する。ハイブリッド形成は、二つの核酸鎖間の相補性が完全である場合（Ｐｅｒｆｅｃｔ  ｍａｔｃｈ）に起こるか、又は一部ミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）塩基が存在しても起これる。ハイブリッド形成に必要な相補性の程度は、ハイブリッド形成条件によって変わり、特に温度によって調節され得る。
【００３４】
上流オリゴヌクレオチド及びＰＴＯとターゲット核酸配列のハイブリッド形成は、最適化過程により一般に決定される、適したハイブリッド形成条件下で行うことができる。温度、成分の濃度、ハイブリッド形成及び洗浄時間、バッファー成分及びこれらのｐＨ及びイオン強度のような条件は、オリゴヌクレオチド（上流オリゴヌクレオチド及びＰＴＯ）の長さ、ＧＣ量及びターゲットヌクレオチド配列などの多様な因子によって様々である。例えば、相対的に短いオリゴヌクレオチドを利用する場合、低い厳格条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）を選択することが好ましい。ハイブリッド形成のための詳細な条件は、Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ５  ，  Ｎ．Ｙ．（２００１）；及びＭ．Ｌ．Ｍ．  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｉｎｃ．  Ｎ．Ｙ．（１９９９）で確認できる。
【００３５】
用語‘アニーリング’と‘ハイブリッド形成’に差はなく、本明細書で混用される。
【００３６】
上流オリゴヌクレオチド及びＰＴＯは、ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を含む。本明細書で使用される用語‘相補的’は、所定のアニーリング条件又は厳格条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）下でプライマー又はプローブがターゲット核酸配列に選択的にハイブリッド形成するほど十分相補的なことを意味し、用語‘実質的に相補的（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）’及び‘完全に相補的（ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）’を包括する意味を有し、好ましくは、完全に相補的なことを意味する。
【００３７】
ＰＴＯの５’−タギング部位は、ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を有する。ＣＴＯ（キャプチャリング及びテンプレーティングオリゴヌクレオチド、Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）のテンプレーティング部位は、ＰＴＯの５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を有する。本明細書で使用される用語‘非相補的’は、所定のアニーリング条件又は厳格条件下でプライマー又はプローブがターゲット核酸配列に選択的にハイブリッド形成するほど十分非相補的なことを意味し、用語‘実質的に非相補的（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｎｏｎ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）’及び‘完全に非相補的（ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ  ｎｏｎ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）’を包括する意味を有し、好ましくは、完全に非相補的なことを意味する。
【００３８】
本明細書で使用される用語‘ＰＴＯ（プロービング及びタギングオリゴヌクレオチド、Ｐｒｏｂｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔａｇｇｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）’は、（ｉ）プローブとしての役割をする３’−ターゲッティング部位及び（ｉｉ）ターゲット核酸配列とのハイブリッド形成後に切断されてＰＴＯから放出され、ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を有する５’−タギング部位を含むオリゴヌクレオチドを意味する。ＰＴＯの５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位は、必ず５’→３’の順に位置する。図１でＰＴＯを図式的に示す。
【００３９】
好ましくは、３’−ターゲッティング部位がターゲット核酸配列にハイブリッド形成され、５’−タギング部位は、ターゲット核酸配列にハイブリッド形成されない厳格条件下で工程（ａ）のハイブリッド形成が実施される。
【００４０】
ＰＴＯは、特定の長さである必要はない。例えば、ＰＴＯの長さは、１５−１５０ヌクレオチド、１５−１００ヌクレオチド、１５−８０ヌクレオチド、１５−６０ヌクレオチド、１５−４０ヌクレオチド、２０−１５０ヌクレオチド、２０−１００ヌクレオチド、２０−８０ヌクレオチド、２０−６０ヌクレオチド、２０−５０ヌクレオチド、３０−１５０ヌクレオチド、３０−１００ヌクレオチド、３０−８０ヌクレオチド、３０−６０ヌクレオチド、３０−５０ヌクレオチド、３５−１００ヌクレオチド、３５−８０ヌクレオチド、３５−６０ヌクレオチドまた３５−５０ヌクレオチドの長さを有することができる。ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位がターゲット核酸配列に特異的にハイブリッド形成される限り、如何なる長さも有することができる。例えば、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位は、１０−１００ヌクレオチド、１０−８０ヌクレオチド、１０−５０ヌクレオチド、１０−４０ヌクレオチド、１０−３０ヌクレオチド、１５−１００ヌクレオチド、１５−８０ヌクレオチド、１５−５０ヌクレオチド、１５−４０ヌクレオチド、１５−３０ヌクレオチド、２０−１００ヌクレオチド、２０−８０ヌクレオチド、２０−５０ヌクレオチド、２０−４０ヌクレオチド又は２０−３０ヌクレオチドの長さを有することができる。５’−多銀部部位は、ＣＴＯのテンプレーティング部位に特異的にハイブリッド形成された後に伸長される限り、如何なる長さも有することができる。例えば、ＰＴＯの５’−タギング部位は、５−５０ヌクレオチド、５−４０ヌクレオチド、５−３０ヌクレオチド、５−２０ヌクレオチド、１０−５０ヌクレオチド、１０−４０ヌクレオチド、１０−３０ヌクレオチド、１０−２０ヌクレオチド、１５−５０ヌクレオチド、１５−４０ヌクレオチド、１５−３０ヌクレオチド又は１５−２０ヌクレオチドの長さを有することができる。
【００４１】
ＰＴＯの３’−末端は、３’−ＯＨターミナル（ｔｅｒｍｉｎａｌ）を有することもできる。好ましくは、ＰＴＯの３’−末端は、‘ブロッキング’され、その伸長が防止される。
【００４２】
ブロッキングは、従来の方法により達成できる。例えば、ブロッキングは、最後のヌクレオチドの３’ヒドロキシル基にビオチン、標識、ホスフェート基、アルキル基、非ヌクレオチドリンカー、ホスホロチオエート又はアルカン−ジオール残基のような化学的部分（ｍｏｉｅｔｙ）を追加して実施できる。択一的に、ブロッキングは、最後のヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基を除去するか、又はジデオキシヌクレオチドのように、３’−ヒドロキシル基のないヌクレオチドを利用して実施できる。
【００４３】
択一的に、ＰＴＯがヘアピン構造を有するようにデザインすることができる。
【００４４】
ＰＴＯの５’−タギング部位及びターゲット核酸配列間の非ハイブリッド形成は、特定ハイブリッド形成条件下でそれらの間に安定した二本鎖が形成されない（ｎｏｎ−ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）ことを意味する。本発明の好ましい具現例によると、ターゲット核酸配列とのハイブリッド形成に関与しないＰＴＯの５’−タギング部位は、一本鎖を形成する。
【００４５】
上流オリゴヌクレオチドは、ＰＴＯの上流に位置する。
【００４６】
また、ターゲット核酸配列にハイブリッド形成された上流オリゴヌクレオチド又はその伸長鎖は、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素によるＰＴＯの切断を誘導する。
【００４７】
上流オリゴヌクレオチドによるＰＴＯ切断の誘導は、二つの方式で達成できる：（ｉ）上流オリゴヌクレオチド伸長非依存的な切断誘導；及び（ｉｉ）上流オリゴヌクレオチド伸長依存的な切断誘導。
【００４８】
上流オリゴヌクレオチドが５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による前記ＰＴＯの切断反応を誘導するに十分な程度にＰＴＯに近接して位置する場合、上流オリゴヌクレオチドに結合した前記酵素は、伸長反応無しにＰＴＯを切断する。その反面、上流オリゴヌクレオチドがＰＴＯから離隔されている場合、ポリメラーゼ活性を有する酵素（例えば、鋳型依存的ポリメラーゼ）は、上流オリゴヌクレオチド（例えば、上流プライマー）の伸長を促進させて、伸長産物に結合された５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素はＰＴＯを切断する。
【００４９】
したがって、上流オリゴヌクレオチドは、二つの方式でＰＴＯに対して相対的に位置することができる。上流オリゴヌクレオチドは、伸長非依存的な方式でＰＴＯの切断を誘導するに十分なほどＰＴＯに近接した位置に位置することができる。択一的に、上流オリゴヌクレオチドは、伸長−依存的な方式でＰＴＯ切断を誘導するに十分な程度にＰＴＯから離隔された位置に位置することができる。
【００５０】
本明細書において、地点（ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）又は位置（ｌｏｃａｔｉｏｎｓ）を言及しながら使用される用語‘近接（ａｄｊａｃｅｎｔ）’は、上流オリゴヌクレオチドがＰＴＯの３’−ターゲッティング部位のすぐ近くに位置して、ニック（ｎｉｃｋ）を形成することを意味する。また、前記用語は、上流オリゴヌクレオチドがＰＴＯの３’−ターゲッティング部位から１〜３０ヌクレオチド、１〜２０ヌクレオチド又は１〜１５ヌクレオチド離隔されて位置することを意味する。
【００５１】
本明細書において、地点又は位置を言及しながら使用される用語‘離隔（ｄｉｓｔａｎｔ）’は、伸長反応が起こるに十分な程度のある位置又は場所を含む。
【００５２】
本発明の好ましい具現例によると、上流オリゴヌクレオチドは、伸長依存的な方式でＰＴＯの切断を誘導するに十分なほどＰＴＯから離隔されて位置することができる。
【００５３】
本発明の好ましい具現例によると、上流オリゴヌクレオチドは、上流プライマー又は上流プローブである。上流プライマーは、伸長非依存的な切断誘導又は伸長依存的な切断に適しており、上流プローブは、伸長非依存的な切断誘導に適している。
【００５４】
選択的に、上流オリゴヌクレオチドは、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−の一部と部分的に重なる配列（ｐａｒｔｉａｌ−ｏｖｅｒｌａｐｐｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を有することができる。好ましくは、重なる配列は、１〜１０ヌクレオチド長さであり、より好ましくは、１〜５ヌクレオチド、さらに好ましくは、１〜３ヌクレオチドである。上流オリゴヌクレオチドがＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−の一部と部分的に重なる配列（ｐａｒｔｉａｌ−ｏｖｅｒｌａｐｐｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を有する場合、工程（ｂ）の切断反応において、３’−ターゲッティング部位は、５’−タギング部位と共に部分的に切断される。また、重なる配列は、３’−ターゲッティング部位の所望の特定位置が切断されるようにする。
【００５５】
本発明の好ましい具現例によると、上流プライマーは、その伸長鎖を通じて、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素によるＰＴＯの切断を誘導する。
【００５６】
上流オリゴヌクレオチドがターゲット核酸配列にハイブリッド形成されたＰＴＯの切断を誘導してＰＴＯの５’−タギング部位又はＰＴＯの５’−タギング部位の一部を含む断片が放出される限り、上流オリゴヌクレオチドによる切断反応のための従来技術は、本発明に適用することができる。例えば、米国特許第５，２１０，０１５号、第５，４８７，９７２号、第５，６９１，１４２号、第５，９９４，０６９号、第７，３８１，５３２号及び米国出願公開番号第２００８−０２４１８３８号は、本発明に応用することができる。
【００５７】
本発明の好ましい具現例によると、前記方法は、下流プライマーの存在下で実施される。下流プライマーは、ＰＴＯにハイブリッド形成されるターゲット核酸配列を追加的に生成させて、ターゲット検出の感度を向上させる。
【００５８】
本発明の好ましい具現例によると、上流プライマー及び下流プライマーを利用する場合、プライマーの伸長のために追加的に鋳型依存的核酸ポリメラーゼを使用する。
【００５９】
本発明の好ましい具現例によると、上流オリゴヌクレオチド（上流プライマー又は上流プローブ）、下流プライマー及び／又はＰＴＯの５’−タギング部位は、本発明者により開発された二重プライミングオリゴヌクレオチド（ＤＰＯ）構造を有する。ＤＰＯ構造を有するオリゴヌクレオチドは、従来プライマー及びプローブに比べて非常に改善されたターゲット特異度を示す（参照：ＷＯ  ２００６／０９５９８１；Ｃｈｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｕａｌ  ｐｒｉｍｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ＳＮＰ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  ＣＹＰ２Ｃ１９  ｇｅｎｅ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ３５：６ｅ４０（２００７））。
【００６０】
本発明の好ましい具現例によると、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位は、本発明者により開発された変形二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造を有する。変形二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造は、従来プローブに比べて非常に改善されたターゲット特異性を示す（参照：ＷＯ  ２０１１／０２８０４１）。
【００６１】
工程（ｂ）：ＰＴＯから断片の放出
次いで、ＰＴＯの切断のための条件下で工程（ａ）の結果物を、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素に接触させる。ターゲット核酸配列にハイブリッド形成されたＰＴＯは、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断され、ＰＴＯの５’−タギング部位又は５’−タギング部位の一部を含む断片を放出する。
【００６２】
本明細書で使用される用語‘ＰＴＯの切断のための条件’は、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素によりターゲット核酸配列にハイブリッド形成されたＰＴＯの切断が発生されるに十分な条件、例えば、温度、ｐＨ、イオン強度及びバッファ、オリゴヌクレオチドの長さ及び配列、そして酵素を意味する。例えば、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素としてＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが利用される場合、ＰＴＯの切断のための条件は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２及び温度を含む。
【００６３】
ＰＴＯがターゲット核酸配列にハイブリッド形成される場合、その３’−ターゲッティング部位は、ハイブリッド形成に含まれるが、５’−タギング部位は、ターゲット核酸配列にハイブリッド形成されず、一本鎖を形成する（参照：図２）。このように、一本鎖及び二本鎖構造を全部含むオリゴヌクレオチドは、当業界に知られた多様な技術により、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素を利用して切断できる。
【００６４】
ＰＴＯの切断位置は、上流オリゴヌクレオチド（上流プローブ又は上流プライマー）の種類、上流オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成位置及び切断条件によって多様である（参照：米国特許第５，２１０，０１５号、第５，４８７，９７２号、第５，６９１，１４２号、第５，９９４，０６９号及び第７，３８１，５３２号又は米国出願公開番号第２００８−０２４１８３８号）。
【００６５】
ＰＴＯの切断反応のために、多数の従来技術を利用することができ、５’−タギング部位又は５’−タギング部位の一部を含む断片を放出する。
【００６６】
まとめてみると、工程（ｂ）の切断反応において、三つの切断位置があり得る。第一の切断位置は、ＰＴＯのハイブリッド形成部位（３’−ターゲッティング部位）及び非ハイブリッド形成部位（５’−タギング部位）間のジャンクション位置（ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ）である。第二の切断位置は、ＰＴＯの５’−タギング部位の３’−末端から３’−方向に一部ヌクレオチド離隔された位置である。第二の切断位置は、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部に位置できる。第三の切断位置は、ＰＴＯの５’−タギング部位の３’−末端から５’−方向に一部ヌクレオチド離隔された位置である。
【００６７】
本発明の好ましい具現例によると、上流プライマーが伸長されつつ、５’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的ポリメラーゼによりＰＴＯの切断が始まる位置は、ＰＴＯ及びターゲット核酸配列間の二本鎖が始まる地点又はその地点から１〜３ヌクレオチド離隔された位置である。
【００６８】
したがって、本明細書で５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素によるＰＴＯの切断を言及しながら使用される用語‘ＰＴＯの５’−タギング部位又は５’−タギング部位の一部を含む断片’は、（ｉ）５’−タギング部位、（ｉｉ）５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部及び（ｉｉｉ）５’−タギング部位の一部を含む意味で使用される。また、本明細書で用語‘ＰＴＯの５’−タギング部位又は５’−タギング部位の一部を含む断片’は、‘ＰＴＯ断片’で表現される。
【００６９】
本明細書において、ＰＴＯの５’−タギング部位の一部、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部及びＣＴＯのキャプチャリング部位の５’−末端の一部のように、ＰＴＯ又はＣＴＯを言及しながら使用される用語‘一部（ｐａｒｔ）’は、１〜４０、１〜３０、１〜２０、１〜１５、１〜１０又は１〜５ヌクレオチドで構成されたヌクレオチド配列を意味し、好ましくは、１、２、３又は４ヌクレオチドである。
【００７０】
本明細書の好ましい具現例によると、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素は、５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ又はＦＥＮヌクレアーゼであり、より好ましくは、５’ヌクレアーゼ活性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ又はＦＥＮヌクレアーゼである。
【００７１】
本発明に適した５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、多様なバクテリア種から得た熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであり、これは、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  （Ｔａｑ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  （Ｔｔｈ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｈｅｒｍｉｓ  ｆｌａｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｅｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｎｔｒａｎｉｋｉａｎｉｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｈｌｉａｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｉｇｎｉｔｅｒｒａｅ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｌａｃｔｅｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｒ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｎｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｉｌｖａｎｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ  Ｚ０５、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｓｐｓ  １７、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ  ａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｂａｒｏｓｓｉ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｏｅｓｅｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ  ｏｃｃｕｌｔｕｍ、Ａｑｕｉｆｅｘ  ｐｙｒｏｐｈｉｌｕｓ及びＡｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｅｕｓを含む。最も好ましくは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼである。
【００７２】
択一的に、本発明は、ポリメラーゼ活性をより少なく有するように変形された、５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用することができる。
【００７３】
使用されるＦＥＮ（ｆｌａｐ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）ヌクレアーゼは、５’フラップ特異的ヌクレアーゼ（５’ｆｌａｐ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）である。
【００７４】
本発明に適しているＦＥＮヌクレアーゼは、多様なバクテリア種から得たＦＥＮヌクレアーゼを含み、これは、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ａｒｃｈａｅａｇｌｏｂｕｓ  ｖｅｎｅｆｉｃｕｓ、Ａｒｃｈａｅａｇｌｏｂｕｓ  ｐｒｏｆｕｎｄｕｓ、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ  ｂｒｉｅｒｌｙｉ、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ  ａｍｂｉｖａｌｅｎｓ、Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ  ｂｒｏｃｋｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｉｌｌｉｇｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｇｎｅｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ及びＡｒｃｈａｅａｇｌｏｂｕｓ  ｖｅｎｅｆｉｃｕｓを含む。
【００７５】
工程（ａ）において上流プライマーを利用する場合、ＰＴＯの切断のための条件は、上流プライマーの伸長反応を含むことが好ましい。
【００７６】
本発明の好ましい具現例によると、工程（ａ）において上流プライマーが使用され、前記上流プライマーの伸長のために鋳型依存的ポリメラーゼが使用され、前記鋳型依存的ポリメラーゼは、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素と同一な酵素である。
【００７７】
選択的に、工程（ａ）において上流プライマーが使用され、前記上流プライマーの伸長のために鋳型依存的ポリメラーゼが使用され、前記鋳型依存的ポリメラーゼは、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素と異なる酵素である。
【００７８】
工程（ｃ）：ＰＴＯから放出された断片とＣＴＯのハイブリッド形成
ＰＴＯから放出された断片は、ＣＴＯ（キャプチャリング及びテンプレーティングオリゴヌクレオチド、Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とハイブリッド形成される。
【００７９】
ＣＴＯは、３’→５’方向に（ｉ）ＰＴＯの５’−タギング部位又は５’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位及び（ｉｉ）ＰＴＯの５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含む。
【００８０】
ＣＴＯは、ＰＴＯから放出された断片の伸長のための鋳型の役割をする。プライマーとしての役割をする前記断片は、ＣＴＯにハイブリッド形成され、伸長されて二本鎖を形成する。
【００８１】
テンプレーティング部位がＰＴＯの５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位に非相補的な配列を有する限り、如何なる配列も含むことができる。また、テンプレート部位がＰＴＯから放出された断片の伸長のための鋳型の役割ができる限り、如何なる配列も含むことができる。
【００８２】
上述のように、ＰＴＯの５’−タギング部位を有する断片が放出される場合、ＣＴＯのキャプチャリング部位は、５’−タギング部位に相補的なヌクレオチド配列を含むようにデザインすることが好ましい。５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位の５’−末端一部を有する断片が放出される場合、ＣＴＯのキャプチャリング部位は、５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位の５’−末端一部に相補的なヌクレオチド配列を含むようにデザインすることが好ましい。ＰＴＯの５’−タギング部位の一部を有する断片が放出される場合、ＣＴＯのキャプチャリング部位は、５’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むようにデザインすることが好ましい。
【００８３】
さらに、ＰＴＯの切断位置を予想することにより、ＣＴＯのキャプチャリング部位をデザインすることができる。例えば、ＣＴＯのキャプチャリング部位が５’−タギング部位に相補的なヌクレオチド配列を含むようにデザインされる場合、５’−タギング部位の一部を有する断片又は５’−タギング部位を有する断片は、キャプチャリング部位とハイブリッド形成でき、以後伸長される。５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位の５’−末端一部を含む断片が放出される場合、前記断片は、５’−タギング部位に相補的なヌクレオチド配列を含むようにデザインされたＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリッド形成でき、前記断片の３’−末端部位にミスマッチヌクレオチドが存在するにもかかわらず、成功的に伸長できる。これは、プライマーの３’−末端が一部ミスマッチヌクレオチド（例えば、１〜３ミスマッチヌクレオチド）を含むにもかかわらず、プライマーが反応条件によって伸長できるからである。
【００８４】
５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位の５’−末端一部を含む断片が放出される場合、ＣＴＯのキャプチャリング部位の５’−末端一部は、前記切断された３’−ターゲッティング部位の５’−末端一部に相補的なヌクレオチド配列を有するようにデザインすることにより、ミスマッチヌクレオチドに係わる問題を解決することができる（参照：図１）。
【００８５】
好ましくは、切断された３’−ターゲッティング部位の５’−末端一部に相補的なＣＴＯのキャプチャリング部位の５’−末端一部のヌクレオチド配列は、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位上の予想される切断位置によって選択できる。切断された３’−ターゲッティング部位の５’−末端一部に相補的なＣＴＯのキャプチャリング部位の５’−末端一部のヌクレオチド配列は、１〜１０ヌクレオチドであることが好ましくは、より好ましくは、１〜５ヌクレオチド、さらに好ましくは、１〜３ヌクレオチドである。
【００８６】
ＣＴＯの３’−末端は、断片とのハイブリッド形成に含まれない追加的なヌクレオチドを含むことができる。また、ＣＴＯが前記断片と安定してハイブリッド形成される限り、ＣＴＯのキャプチャリング部位は、前記断片の一部（例えば、その３’−末端部位を含む断片の一部）にのみ相補的なヌクレオチド配列を含むことができる。
【００８７】
本明細書で使用される用語‘５’−タギング部位又は５’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位’は、上述のようにＣＴＯのキャプチャリング部位の多様なデザイン及び構成を含んで説明される。
【００８８】
ＣＴＯは、ヘアピン構造を有するようにデザインすることができる。
【００８９】
ＣＴＯの長さは、多様である。例えば、ＣＴＯは、７−１，０００ヌクレオチド、７−５００ヌクレオチド、７−３００ヌクレオチド、７−１００ヌクレオチド、７−８０ヌクレオチド、７−６０ヌクレオチド、７−４０ヌクレオチド、１５−１０００ヌクレオチド、１５−５００ヌクレオチド、１５−３００ヌクレオチド、１５−１００ヌクレオチド、１５−８０ヌクレオチド、１５−６０ヌクレオチド、１５−４０ヌクレオチド、２０−１０００ヌクレオチド、２０−５００ヌクレオチド、２０−３００ヌクレオチド、２０−１００ヌクレオチド、２０−８０ヌクレオチド、２０−６０ヌクレオチド、２０−４０ヌクレオチド、３０−１０００ヌクレオチド、３０−５００ヌクレオチド、３０−３００ヌクレオチド、３０−１００ヌクレオチド、３０−８０ヌクレオチド、３０−６０ヌクレオチド又は３０−４０ヌクレオチドの長さである。ＣＴＯのキャプチャリング部位は、ＰＴＯから放出された断片に特異的にハイブリッド形成される限り、如何なる長さも有することができる。例えば、ＣＴＯのキャプチャリング部位は、５−１００ヌクレオチド、５−６０ヌクレオチド、５−４０ヌクレオチド、５−３０ヌクレオチド、５−２０ヌクレオチド、１０−１００ヌクレオチド、１０−６０ヌクレオチド、１０−４０ヌクレオチド、１０−３０ヌクレオチド、１０−２０ヌクレオチド、１５−１００ヌクレオチド、１５−６０ヌクレオチド、１５−４０ヌクレオチド、１５−３０ヌクレオチド又は１５−２０ヌクレオチドの長さを有することができる。また、ＣＴＯのテンプレーティング部位は、ＰＴＯから放出された断片の伸長反応で鋳型の役割ができる限り、如何なる長さも有することができる。例えば、ＣＴＯのテンプレーティング部位は、２−９００ヌクレオチド、２−４００ヌクレオチド、２−３００ヌクレオチド、２−１００ヌクレオチド、２−８０ヌクレオチド、２−６０ヌクレオチド、２−４０ヌクレオチド、２−２０ヌクレオチド、５−９００ヌクレオチド、５−４００ヌクレオチド、５−３００ヌクレオチド、５−１００ヌクレオチド、５−８０ヌクレオチド、５−６０ヌクレオチド、５−４０ヌクレオチド、５−３０ヌクレオチド、１０−９００ヌクレオチド、１０−４００ヌクレオチド、１０−３００ヌクレオチド、１５−９００ヌクレオチド、１５−１００ヌクレオチド、１５−８０ヌクレオチド、１５−６０ヌクレオチド、１５−４０ヌクレオチド又は１５−２０ヌクレオチドの長さを有することができる。
【００９０】
ＣＴＯの３’−末端は、３’−ＯＨターミナルを有することができる。好ましくは、ＣＴＯの３’−末端は、その伸長が防止されるようにブロッキングされる。例えば、ブロッキングは、ＣＴＯの最後のヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基にビオチン、標識、ホスフェート基、アルキル基、非ヌクレオチドリンカー、ホスホロチオエート又はアルカン−ジオール残基のような化学的部分（ｍｏｉｅｔｙ）を追加して実施できる。択一的に、ブロッキングは、最後のヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基を除去するか、又はジデオキシヌクレオチドのように、３’−ヒドロキシル基のないヌクレオチドを利用して実施できる。
【００９１】
ＰＴＯから放出された断片は、ＣＴＯとハイブリッド形成され、断片の伸長に適した形態を提供する。また、非切断ＰＴＯがその５’−タギング部位を介してＣＴＯのキャプチャリング部位とハイブリッド形成されるとしても、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位は、ＣＴＯにハイブリッド形成されず、伸長二本鎖の形成が防止される。
【００９２】
工程（ｃ）におけるハイブリッド形成は、工程（ａ）におけるハイブリッド形成に対する説明を参照して詳細に説明できる。
【００９３】
工程（ｄ）：断片の伸長
鋳型−依存的核酸ポリメラーゼ及び工程（ｃ）の結果物を利用して伸長反応を行う。ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリッド形成された断片は、伸長され、伸長二本鎖を形成する。その反面、ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリッド形成された非切断ＰＴＯは伸長されず、これにより、伸長二本鎖も形成されない。
【００９４】
本明細書で使用される用語‘伸長二本鎖’は、ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリッド形成された断片が鋳型依存的核酸ポリメラーゼとＣＴＯのテンプレーティング部位を鋳型として利用して伸長される伸長反応により形成された二本鎖を意味する。
【００９５】
伸長二本鎖は、非切断ＰＴＯ及びＣＴＯ間のハイブリッド形成物（ｈｙｂｒｉｄ）のＴｍ値と異なるＴｍ値を有する。
【００９６】
好ましくは、伸長二本鎖は、非切断ＰＴＯ及びＣＴＯ間のハイブリッド形成物のＴｍ値より高いＴｍ値を有する。
【００９７】
伸長二本鎖のＴｍ値は、（ｉ）断片の配列及び／又は長さ、（ｉｉ）ＣＴＯの配列及び／又は長さ、又は（ｉｉｉ）断片の配列及び／又は長さとＣＴＯの配列及び／又は長さにより調節可能である。
【００９８】
工程（ｅ）において伸長二本鎖のメルティングにより伸長二本鎖の存在を示すターゲットシグナルが提供されるように伸長二本鎖の調節可能なＴｍ値を使用することは、本発明の顕著な特徴である。
【００９９】
本明細書で使用される用語‘Ｔｍ’は、二本鎖核酸分子の集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）の半分が一本鎖分子に解離されるメルティング温度を意味する。Ｔｍ値は、ハイブリッド形成されるヌクレオチドの長さ及びＧ／Ｃ含量により決定される。Ｔｍ値は、Ｗａｌｌａｃｅ  ｒｕｌｅ（Ｒ．Ｂ．  Ｗａｌｌａｃｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６：３５４３−３５４７（１９７９））及びｎｅａｒｅｓｔ−ｎｅｉｇｈｂｏｒ方法（ＳａｎｔａＬｕｃｉａ  Ｊ．  Ｊｒ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５：３５５５−３５６２（１９９６））；  Ｓｕｇｉｍｏｔｏ  Ｎ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２４：４５０１−４５０５（１９９６））のような従来の方法により計算できる。
【０１００】
本発明の好ましい具現例によると、Ｔｍ値は、実際使用する反応条件下での実際のＴｍ値を意味する。
【０１０１】
工程（ｄ）において利用される鋳型依存的核酸ポリメラーゼは、如何なる核酸ポリメラーゼでも可能であり、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩの‘Ｋｌｅｎｏｗ’断片、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ及びバクテリオファージＴ７  ＤＮＡポリメラーゼである。好ましくは、ポリメラーゼは、多様なバクテリア種から得られる熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであり、これは、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  （Ｔａｑ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  （Ｔｔｈ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｈｅｒｍｉｓ  ｆｌａｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｅｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｎｔｒａｎｉｋｉａｎｉｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｈｌｉａｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｉｇｎｉｔｅｒｒａｅ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｌａｃｔｅｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｒ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｎｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｉｌｖａｎｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ  Ｚ０５、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｓｐｓ  １７、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ  ａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｂａｒｏｓｓｉ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｏｅｓｅｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ  ｏｃｃｕｌｔｕｍ、Ａｑｕｉｆｅｘ  ｐｙｒｏｐｈｉｌｕｓ及びＡｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｅｕｓを含む。最も好ましくは、鋳型依存的核酸ポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼである。
【０１０２】
本発明の好ましい具現例によると、工程（ｂ）において利用される５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素は、工程（ｄ）において利用される鋳型依存的核酸ポリメラーゼと同一である。より好ましくは、工程（ｂ）において利用される５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素、上流プライマーの伸長のために利用される鋳型依存的核酸ポリメラーゼ及び工程（ｄ）において利用される鋳型依存的核酸ポリメラーゼは、互いに同一である。
【０１０３】
伸長二本鎖は、（ｉ）ＰＴＯ断片及び／又はＣＴＯに連結された少なくとも一つの標識、（ｉｉ）伸長反応の間に伸長二本鎖内に挿入された標識、（ｉｉｉ）伸長反応の間に伸長二本鎖内に挿入された標識及びＰＴＯ断片及び／又はＣＴＯに連結された標識又は（ｉｖ）インターカレーティング標識（Ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ  Ｌａｂｅｌ）に由来する標識を有する。
【０１０４】
ターゲット核酸配列が存在する場合、伸長二本鎖が形成されるため、伸長二本鎖の存在は、ターゲット核酸配列の存在を示すことができる。直接的な方式で伸長二本鎖の存在を検出するためには、検出可能なシグナルを提供する標識を有する伸長二本鎖が工程（ｄ）において形成される。伸長二本鎖に利用される標識は、伸長二本鎖が二本鎖であるか一本鎖であるかによってシグナル変化を提供し、最終的に伸長二本鎖のメルティングにより伸長二本鎖の存在を示すターゲットシグナルを提供する。
【０１０５】
工程（ｅ）：伸長二本鎖のメルティング
伸長反応に続けて、伸長二本鎖は、一定範囲の温度でメルティングされ、伸長二本鎖の存在を示すターゲットシグナルを提供する。
【０１０６】
ターゲットシグナルは、（ｉ）前記断片及び／又は前記ＣＴＯに連結された少なくとも一つの標識、（ｉｉ）前記伸長反応の間に前記伸長二本鎖内に挿入された標識、（ｉｉｉ）前記伸長反応の間に前記伸長二本鎖内に挿入された標識及び前記断片及び／又は前記ＣＴＯに連結された標識又は（ｉｖ）インターカレーティング標識（Ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ  Ｌａｂｅｌ）により提供される。
【０１０７】
本明細書で使用される用語‘ターゲットシグナル’は、伸長二本鎖の存在を示すことのできるあらゆるシグナルを意味する。例えば、ターゲットシグナルは、標識からのシグナル（シグナル発生又は消滅）、標識からのシグナルの変化（シグナル増加又は減少）、メルティングカーブ、メルティングパターン及びメルティング温度（又はＴｍ値）を含む。
【０１０８】
本発明の好ましい具現例によると、ターゲットシグナルは、メルティング工程で伸長二本鎖の標識からのシグナルの変化である。シグナルの変化は、少なくとも二つの異なる温度でシグナルを測定することにより得ることができる。択一的に、ターゲットシグナルは、一定温度範囲で伸長二本鎖の標識からのシグナルを測定することにより得られるメルティングカーブ、メルティングパターン及びメルティング温度（又はＴｍ値）である。好ましくは、温度の範囲は、メルティングカーブ分析のための温度の範囲又は伸長二本鎖のＴｍ値の周囲温度である。
【０１０９】
伸長二本鎖は、非切断ＰＴＯ及びＣＴＯ間のハイブリッド形成物より高いＴｍ値を有する。したがって、伸長二本鎖及びハイブリッド形成物は、互いに異なるメルティングパターンを示す。このような異なるメルティングパターンは、非ターゲットシグナルとターゲットシグナルとを区別できるようにする。異なるメルティングパターン又はメルティング温度は、適した標識システムと共にターゲットシグナルを発生させる。
【０１１０】
メルティングは、従来技術により実施でき、例えば、熱、アルカリ、ホルムアミド、ウレア及びグリコサール処理、酵素方法（例えば、ヘリカーゼ作用）、及び結合タンパク質を含むが、これらに限定されるものではない。例えば、メルティングは、８０℃〜１０５℃範囲の温度で熱処理して達成できる。上述の処理の一般的な方法は、Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）により提供される。
【０１１１】
本発明に使用される適した標識システムは、これらの種類、位置及びシグナルの発生方式の側面において多様である。
【０１１２】
本発明に有用な標識システムは、下記の通りに詳細に説明できる：
【０１１３】
（ｉ）断片及び／又はＣＴＯに連結された標識
本発明の好ましい具現例によると、前記シグナルは、断片及び／又はＣＴＯに連結された少なくとも一つの標識により提供される。伸長二本鎖は、ＰＴＯ断片及びＣＴＯ間に形成されるため、ＰＴＯ断片又はＣＴＯの標識は、伸長二本鎖に存在し、メルティング工程でターゲットシグナルを提供する。
【０１１４】
標識は、相互作用的二重標識及び単一標識を含む。
【０１１５】
（ｉ−１）相互作用的二重標識
相互作用的標識システムは、供与体分子及び受容体分子間にエネルギーが非放射能的（ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｉｖｅｌｙ）に伝達されるシグナル発生システムである。相互作用的標識システムの代表的例として、ＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）標識システムは、蛍光レポーター分子（供与体分子）及びクエンチング分子（受容体分子）を含む。ＦＲＥＴにおいてエネルギー供与体は、蛍光性であるが、エネルギー受容体は、蛍光性又は非蛍光性である。相互作用的標識システムの他の形態において、エネルギー供与体は、非蛍光性、例えば、発色団（ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅ）であり、エネルギー受容体は、蛍光性である。相互作用的標識システムのまた他の形態において、エネルギー供与体は、発光性、例えば、生物発光性、化学発光性又は電気化学発光性であり、受容体は、蛍光性である。供与体分子及び受容体分子は、本発明においてそれぞれレポーター分子及びクエンチャー分子で説明できる。
【０１１６】
好ましくは、伸長二本鎖の存在（即ち、ターゲット核酸配列の存在）を示すシグナルは、相互作用的標識システムにより発生され、最も好ましくは、ＦＲＥＴ標識システム（即ち、相互作用的二重標識システム）である。
【０１１７】
具現例１（鎖内相互作用的二重標識）
相互作用的二重標識システムの具現例１において、断片又はＣＴＯは、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識を有し、前記工程（ｅ）における伸長二本鎖のメルティングは、相互作用的二重標識からのシグナルの変化を誘導し、工程（ｅ）においてターゲットシグナルを提供する。相互作用的二重標識システムの具現例１は、図２、６及び９で図式的に示す。具現例１は、鎖内相互作用的二重標識と命名される。
【０１１８】
図２における具現例１（鎖内相互作用的二重標識）
例示された具現例は、図２を参考して説明される。ＣＴＯのテンプレーティング部位は、レポーター分子及びクエンチャー分子を有する。ターゲット核酸配列にハイブリッド形成されたＰＴＯは、切断されて断片を放出して、前記断片は、ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリッド形成されて伸長され、伸長二本鎖を形成する。
【０１１９】
工程（ｄ）において伸長二本鎖が形成される場合、ＣＴＯのレポーター分子及びクエンチャー分子は、構造的に離隔され、クエンチャー分子がレポーター分子からのシグナルをアンクエンチングして、工程（ｅ）において伸長二本鎖がメルティングされる場合、レポーター分子及びクエンチャー分子は、構造的に互いに近接し、クエンチャー分子がレポーター分子からのシグナルをクエンチングして、これにより、ターゲットシグナルが提供され、工程（ｅ）において伸長二本鎖の存在を示す。
【０１２０】
本明細書で使用される表現‘レポーター分子及びクエンチャー分子は、構造的に近接した’は、断片又はＣＴＯの形態的構造、例えば、ランダムコイル（ｃｏｉｌ）及びヘアピン構造により、レポーター分子及びクエンチャー分子が３次元的に互いに隣接するようになることを意味する。
【０１２１】
本明細書で使用される表現‘レポーター分子及びクエンチャー分子は、構造的に離隔されて’は、二本鎖の形成による断片又はＣＴＯの形態的構造の変化により、レポーター分子及びクエンチャー分子が３次元的に離隔されることを意味する。
【０１２２】
好ましくは、工程（ｅ）において提供されるターゲットシグナルは、工程（ｅ）において発生される蛍光シグナルの変化を測定して得られるメルティングカーブ、メルティングパターン又はＴｍ値を含む。
【０１２３】
本発明の好ましい具現例によると、伸長二本鎖メルティングに依存的にレポーター分子からのシグナルがクエンチングされるか又はアンクエンチングされる限り、レポーター分子及びクエンチャー分子は、ＣＴＯの如何なる位置にも位置できる。
【０１２４】
本発明の好ましい具現例によると、レポーター分子及びクエンチャー分子は、両方ともＣＴＯのテンプレーティング部位又はキャプチャリング部位に連結される。
【０１２５】
本発明の好ましい具現例によると、レポーター分子及びクエンチャー分子は、ＣＴＯの５’−末端及び３’−末端に位置する。
【０１２６】
本発明の好ましい具現例によると、ＣＴＯのレポーター分子及びクエンチャー分子の一つは、その５’−末端又はその５’−末端から１〜５ヌクレオチド離隔された位置にあり、他の一つは、ＣＴＯの立体構造（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）によって、レポーター分子からのシグナルをクエンチング又はアンクエンチングする位置に位置する。
【０１２７】
本発明の好ましい具現例によると、ＣＴＯのレポーター分子及びクエンチャー分子の一つは、その３’−末端又はその３’−末端から１〜５ヌクレオチド離隔された位置にあり、他の一つは、ＣＴＯの立体構造によって、レポーター分子からのシグナルをクエンチング又はアンクエンチングする位置に位置する。
【０１２８】
本発明の好ましい具現例によると、レポーター分子及びクエンチャー分子は、互いに最大８０ヌクレオチド離隔された位置に位置し、より好ましくは、最大６０ヌクレオチド、さらに好ましくは、最大３０ヌクレオチド、最も好ましくは、最大２５ヌクレオチドである。本発明の好ましい具現例によると、レポーター分子及びクエンチャー分子は、少なくとも４ヌクレオチド離隔された位置に位置し、より好ましくは、少なくとも６ヌクレオチド、さらに好ましくは、少なくとも１０ヌクレオチド、最も好ましくは、少なくとも１５ヌクレオチドである。
【０１２９】
本発明において、非切断ＰＴＯ及びＣＴＯ間のハイブリッド形成物が形成できる。
【０１３０】
図２に示されたように、ＣＴＯのテンプレーティング部位が相互作用的二重標識で標識される場合、非切断ＰＴＯ及びＣＴＯ間のハイブリッド形成物の標識からのシグナルの変化は誘導されない。したがって、ハイブリッド形成物は、非ターゲットシグナルを提供しない。
【０１３１】
ＣＴＯのキャプチャリング部位が相互作用的二重標識で標識される場合、メルティング工程で非切断ＰＴＯ及びＣＴＯ間のハイブリッド形成物は、非ターゲットシグナルを提供する。このような場合、伸長二本鎖及びハイブリッド形成物のＴｍ値の差異により、伸長二本鎖のターゲットシグナルとハイブリッド形成物の非ターゲットシグナルとを区別することができる。
【０１３２】
図６における具現例１（鎖内相互作用的二重標識）
例示された具現例は、図６を参考して説明される。ＰＴＯの５’−タギング部位は、レポーター分子及びクエンチャー分子を有する。ターゲット核酸配列にハイブリッド形成されたＰＴＯは、切断され、レポーター分子及びクエンチャー分子を有する５’−タギング部位を含む断片を放出する。前記断片は、ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリッド形成される。
【０１３３】
工程（ｄ）において伸長二本鎖が形成される場合、断片のレポーター分子及びクエンチャー分子は、構造的に離隔され、クエンチャー分子がレポーター分子からのシグナルをアンクエンチングし、工程（ｅ）において伸長二本鎖がメルティングされる場合、レポーター分子及びクエンチャー分子は、構造的に互いに近接し、クエンチャー分子がレポーター分子からのシグナルをクエンチングして、これにより、ターゲットシグナルが提供され、工程（ｅ）において伸長二本鎖の存在を示す。
【０１３４】
本発明の好ましい具現例によると、伸長二本鎖のメルティングによってレポーター分子からのシグナルがクエンチングされるか又はアンクエンチングされる限り、レポーター分子及びクエンチャー分子は、断片の如何なる位置にも位置できる。
【０１３５】
本発明の好ましい具現例によると、断片のレポーター分子及びクエンチャー分子の一つは、その５’−末端又はその５’−末端から１〜５ヌクレオチド離隔された位置にあり、他の一つは、断片の立体構造によって、レポーター分子からのシグナルをクエンチング又はアンクエンチングする位置に位置する。
【０１３６】
本発明の好ましい具現例によると、レポーター分子及びクエンチャー分子は、互いに最大５０ヌクレオチド離隔された位置に位置し、より好ましくは、最大４０ヌクレオチド、さらに好ましくは、最大３０ヌクレオチド、最も好ましくは、最大２０ヌクレオチドである。本発明の好ましい具現例によると、レポーター分子及びクエンチャー分子は、少なくとも４ヌクレオチド離隔された位置に位置し、より好ましくは、少なくとも６ヌクレオチド、さらに好ましくは、少なくとも１０ヌクレオチド、最も好ましくは、少なくとも１５ヌクレオチドである。
【０１３７】
図６に示されたように、非切断ＰＴＯ及びＣＴＯ間のハイブリッド形成物は、メルティング工程で非ターゲットシグナルを提供する。このような場合、伸長二本鎖及びハイブリッド形成物のＴｍ値の差異により、伸長二本鎖のターゲットシグナルとハイブリッド形成物の非ターゲットシグナルとを区別することができる。
【０１３８】
具現例２（鎖内相互作用的二重標識）
相互作用的二重標識システムの具現例２において、断片は、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識の一つを有し、ＣＴＯは、相互作用的二重標識の他の一つを有し、前記工程（ｅ）における伸長二本鎖のメルティングは、相互作用的二重標識からのシグナルの変化を誘導し、工程（ｅ）においてターゲットシグナルを提供する。
【０１３９】
例示された具現例は、図８を参考して説明される。
【０１４０】
工程（ｄ）において伸長二本鎖が形成される場合、ＰＴＯに連結されたクエンチャー分子により、ＣＴＯに連結されたレポーター分子からのシグナルがクエンチングされる。工程（ｅ）において伸長二本鎖がメルティングされる場合、レポーター分子及びクエンチャー分子は、互いに離隔され、クエンチャー分子がレポーター分子からのシグナルをアンクエンチングして、これにより、ターゲットシグナルが提供され、工程（ｅ）において伸長二本鎖の存在を示す。
【０１４１】
好ましくは、工程（ｅ）において提供されるターゲットシグナルは、相互作用的二重標識からの蛍光シグナルの変化を測定して得られるメルティングカーブ、メルティングパターン又はＴｍ値を含む。
【０１４２】
伸長二本鎖のクエンチャー分子によりレポーター分子からのシグナルがクエンチングされる限り、レポーター分子及びクエンチャー分子は、ＰＴＯ断片及びＣＴＯの如何なる位置にも位置できる。
【０１４３】
本発明の好ましい具現例によると、ＰＴＯのレポーター分子又はクエンチャー分子は、５’−タギング部位の５’−末端に位置する。
【０１４４】
本発明の好ましい具現例によると、ＣＴＯのレポーター分子又はクエンチャー分子は、その３’−末端に位置する。
【０１４５】
図８に示されたように、非切断ＰＴＯ及びＣＴＯ間のハイブリッド形成物は、メルティング工程で非ターゲットシグナルを提供する。このような場合、伸長二本鎖及びハイブリッド形成物のＴｍ値の差異により、伸長二本鎖のターゲットシグナルとハイブリッド形成物の非ターゲットシグナルとを区別することができる。
【０１４６】
本発明に有用なレポーター分子及びクエンチャー分子は、当業界に知られた如何なるものでも利用できる。その例は、下記の通りである：Ｃｙ２ＴＭ（５０６）、ＹＯ−ＰＲＯＴＭ−１（５０９）、ＹＯＹＯＴＭ−１（５０９）、Ｃａｌｃｅｉｎ（５１７）、ＦＩＴＣ（５１８）、ＦｌｕｏｒＸＴＭ（５１９）、ＡｌｅｘａＴＭ（５２０）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  １１０（５２０）、Ｏｒｅｇｏｎ  ＧｒｅｅｎＴＭ  ５００（５２２）、Ｏｒｅｇｏｎ  ＧｒｅｅｎＴＭ  ４８８（５２４）、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭ（５２５）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ＧｒｅｅｎＴＭ（５２７）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  １２３（５２９）、Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ＧｒｅｅｎＴＭ（５３１）、Ｃａｌｃｉｕｍ  ＧｒｅｅｎＴＭ（５３３）、ＴＯ−ＰＲＯＴＭ−１（５３３）、ＴＯＴＯ１（５３３）、ＪＯＥ（５４８）、ＢＯＤＩＰＹ５３０／５５０（５５０）、Ｄｉｌ（５６５）、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ（５６８）、ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８（５６８）、ＢＯＤＩＰＹ５６４／５７０（５７０）、Ｃｙ３ＴＭ（５７０）、ＡｌｅｘａＴＭ  ５４６（５７０）、ＴＲＩＴＣ（５７２）、Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ＯｒａｎｇｅＴＭ（５７５）、Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ  Ｒ＆Ｂ（５７５）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ（５７５）、Ｃａｌｃｉｕｍ  ＯｒａｎｇｅＴＭ（５７６）、Ｐｙｒｏｎｉｎ  Ｙ（５８０）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂ（５８０）、ＴＡＭＲＡ（５８２）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ＲｅｄＴＭ（５９０）、Ｃｙ３．５ＴＭ（５９６）、ＲＯＸ（６０８）、Ｃａｌｃｉｕｍ  ＣｒｉｍｓｏｎＴＭ（６１５）、ＡｌｅｘａＴＭ  ５９４（６１５）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（６１５）、Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄ（６２８）、ＹＯ−ＰＲＯＴＭ−３（６３１）、ＹＯＹＯＴＭ−３（６３１）、Ｒｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（６４２）、Ｃ−Ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（６４８）、ＴＯ−ＰＲＯＴＭ−３（６６０）、ＴＯＴＯ３（６６０）、ＤｉＤ  ＤｉｌＣ（５）（６６５）、Ｃｙ５ＴＭ（６７０）、Ｔｈｉａｄｉｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ（６７１）、Ｃｙ５．５（６９４）、ＨＥＸ（５５６）、ＴＥＴ（５３６）、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｂｌｕｅ（４４７）、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｇｏｌｄ  ５４０（５４４）、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｏｒａｎｇｅ  ５６０（５５９）、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ５９０（５９１）、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６１０（６１０）、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６３５（６３７）、ＦＡＭ（５２０）、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（５２０）、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−Ｃ３（５２０）、Ｐｕｌｓａｒ  ６５０（５６６）、Ｑｕａｓａｒ  ５７０（６６７）、Ｑｕａｓａｒ  ６７０（７０５）及びＱｕａｓａｒ  ７０５（６１０）。括弧の数字は、ナノメートル単位で表示した最大発光波長である。好ましくは、レポーター分子及びクエンチャー分子は、ＪＯＥ、ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ及びフルオレセインベースの標識を含む。
【０１４７】
適したレポーター−クエンチャー対は、たくさんの文献に開示されている：Ｐｅｓｃｅ  ら、ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ  （Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７１）；Ｗｈｉｔｅら、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７０）；Ｂｅｒｌｍａｎ，  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒａ  ｏｆ  Ａｒｏｍａｔｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７１）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｃｏｌｏｒ  ＡＮＤ  Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７６）；Ｂｉｓｈｏｐ，ｅｄｉｔｏｒ，Ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ（Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９７２）；Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，１９９２）；Ｐｒｉｎｇｓｈｅｉｍ，Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９４９）；Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｒ．Ｐ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  ６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．，１９９６）；  米国特許第３，９９６，３４５号及び第４，３５１，７６０号。
【０１４８】
本発明において、広範囲波長又は特定波長の蛍光をクエンチングできる非蛍光ブラッククエンチャー分子が利用できるということは、注目すべきことである。非蛍光ブラッククエンチャー分子の例は、ＢＨＱ及びＤＡＢＣＹＬである。
【０１４９】
ＣＴＯに適用されるＦＲＥＴ標識において、レポーターは、ＦＲＥＴの供与体を含み、クエンチャーは、ＦＲＥＴのその他のパートナー（受容体）を含む。例えば、フルオレセイン色素（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｄｙｅ）は、レポーターとして利用され、ロダミン色素（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ｄｙｅ）は、クエンチャーとして利用される。
【０１５０】
（ｉ−２）単一標識
また、本発明は、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを提供する単一標識システムを利用して好適に実施できる。
【０１５１】
本発明の好ましい具現例によると、断片又はＣＴＯは、単一標識を有し、工程（ｅ）における伸長二本鎖のメルティングは、単一標識からのシグナルの変化を誘導し、工程（ｅ）においてターゲットシグナルを提供する。
【０１５２】
図３における具現例１（単一標識システム）
例示された具現例は、図３を参考して説明される。ＣＴＯのテンプレーティング部位は、単一蛍光標識を有する。ターゲット核酸配列にハイブリッド形成されたＰＴＯは、切断されて断片を放出する。前記断片は、ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリッド形成されて伸長され、伸長二本鎖を形成する。伸長二本鎖の形成により、単一蛍光標識から出る蛍光の強度は、増加するようになる。伸長二本鎖が工程（ｅ）においてメルティングされる場合、単一蛍光標識から出る蛍光の強度は減少するようになり、これにより、ターゲットシグナルが提供され、工程（ｅ）において伸長二本鎖の存在を示す。
【０１５３】
本発明の好ましい具現例によると、伸長二本鎖のメルティングによって、単一標識からのシグナルの水準に変化がある限り、単一標識は、ＣＴＯの如何なる位置にも位置できる。
【０１５４】
本発明の好ましい具現例によると、単一標識は、ＣＴＯのテンプレーティング部位又はキャプチャリング部位に連結される。
【０１５５】
図３に示されたように、ＣＴＯのテンプレーティング部位が単一標識で標識される場合、非切断ＰＴＯ及びＣＴＯ間のハイブリッド形成物の標識からのシグナルの変化が誘導されない。したがって、ハイブリッド形成物は、非ターゲットシグナルを提供しない。
【０１５６】
ＣＴＯのキャプチャリング部位が単一標識で標識される場合、メルティング工程で非切断ＰＴＯ及びＣＴＯ間のハイブリッド形成物は、非ターゲットシグナルを提供する。このような場合、伸長二本鎖及びハイブリッド形成物のＴｍ値の差異により、伸長二本鎖のターゲットシグナルとハイブリッド形成物の非ターゲットシグナルとを区別することができる。
【０１５７】
図７における具現例２（単一標識システム）
例示された具現例は、図７を参考して説明される。ＰＴＯの５’−タギング部位は、単一蛍光標識を有する。ターゲット核酸配列にハイブリッド形成されたＰＴＯは、切断され、単一蛍光標識のある５’−タギング部位を含む断片を放出する。ハイブリッド形成により、５’−タギング部位の単一蛍光標識から出る蛍光の強度は増加する。伸長二本鎖が工程（ｅ）においてメルティングされる場合、単一蛍光標識から出るシグナル強度は減少するようになり、これにより、ターゲットシグナルが提供され、工程（ｅ）において伸長二本鎖の存在を示す。
【０１５８】
本発明の好ましい具現例によると、伸長二本鎖のメルティングによって、単一標識からのシグナルの水準に変化がある限り、単一標識は、ＰＴＯ断片の如何なる位置にも位置できる。
【０１５９】
図７に示されたように、非切断ＰＴＯ及びＣＴＯ間のハイブリッド形成物は、メルティング工程で非ターゲットシグナルを提供する。このような場合、伸長二本鎖及びハイブリッド形成物のＴｍ値の差異により、伸長二本鎖のターゲットシグナルとハイブリッド形成物の非ターゲットシグナルとを区別する。
【０１６０】
本明細書で使用される単一標識は、二本鎖上に存在するかあるいは一本鎖上に存在するかによって、異なるシグナルを提供することができなければならない。単一標識は、蛍光標識、発光標識、化学発光標識、電気化学的標識及び金属標識を含む。好ましくは、単一標識は、蛍光標識を含む。
【０１６１】
本発明で使用される単一蛍光標識の種類及び好ましい結合位置は、米国特許第７，５３７，８８６号及び第７，３４８，１４１号に開示されており、その教示事項は、本明細書に参照として取り込まれる。好ましくは、単一蛍光標識は、ＪＯＥ、ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ及びフルオレセインベースの標識を含む。標識されるヌクレオチドの残基は、５’−末端又は３’−末端より、オリゴヌクレオチド内の内部ヌクレオチド残基に位置することが好ましい。
【０１６２】
本発明において、有用な単一蛍光標識は、上述したレポーター及びクエンチャー分子に対する説明を参照して説明できる。
【０１６３】
特に、固相で本発明が単一標識を利用して実施される場合、一般的な蛍光標識を利用することができ、二本鎖上に存在するかあるいは一本鎖上に存在するかによって異なる強度を有する蛍光シグナルを提供することができるような特定な蛍光標識を必要としない。固相基質で提供されるターゲットシグナルは測定される。固定化されたＣＴＯを有する単一標識システムの具現例は、図１２で図式的に示す。
【０１６４】
固相基質上に固定化されたＣＴＯを利用する場合、化学的標識（例えば、ビオチン）又は酵素的標識（例えば、アルカリホスファターゼ、ペロキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ）を利用することができる。
【０１６５】
‘断片及び／又はＣＴＯに連結された標識’を利用する標識システムにおいて、非切断ＰＴＯ及びＣＴＯ間のハイブリッド形成物が形成される場合、標識は、前記ハイブリッド形成物が工程（ｅ）において非ターゲットシグナルを提供しない範囲内に位置する。択一的に、非切断ＰＴＯ及びＣＴＯ間のハイブリッド形成物が形成される場合、標識は、前記ハイブリッド形成物が工程（ｅ）において非ターゲットシグナルを提供する範囲内に位置することができ、前記伸長二本鎖のＴｍ値は、非切断ＰＴＯ及びＣＴＯ間のハイブリッド形成物のＴｍ値より高い。
【０１６６】
特に、非切断ＰＴＯ及びＣＴＯ間のハイブリッド形成物が非ターゲットシグナルを提供しない範囲内に位置する場合、前記ハイブリッド形成物のＴｍ値を含んでいる範囲は、ターゲット核酸配列の検出のための伸長二本鎖のＴｍ値を選択することに利用できる。
【０１６７】
（ｉｉ）伸長二本鎖内に挿入された標識
本発明は、伸長二本鎖の存在を示すターゲットシグナルを提供するために、伸長反応の間に伸長二本鎖内に挿入された標識を利用することができる。
【０１６８】
例えＰＴＯ断片又はＣＴＯが標識を有しなくても、伸長反応の間に伸長二本鎖内に挿入された標識を利用して、成功的に伸長二本鎖を標識させる。図１０及び１１は、単一−標識ヌクレオチドが伸長反応の間に伸長二本鎖内に挿入された具現例を図式的に示す（参照：図１０及び１１のＣ及びＤ）。また、本具現例は、メルティング分析を利用する他の具現例にも適用できる。
【０１６９】
本発明の好ましい具現例によると、ターゲットシグナルは、伸長反応の間に伸長二本鎖内に挿入された単一標識により提供され、前記挿入された単一標識は、伸長反応の間に挿入されたヌクレオチドに連結されており、工程（ｅ）における前記伸長二本鎖のメルティングは、単一標識からのシグナルの変化を誘導し、工程（ｅ）においてターゲットシグナルを提供する。
【０１７０】
例示された具現例は、図１０を参考して説明される。ターゲット核酸配列にハイブリッド形成されたＰＴＯは、切断されて断片を放出する。前記断片は、固相基質上に固定化されたＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリッド形成され、単一蛍光標識で標識されたヌクレオチドの存在下で伸長され、伸長二本鎖を形成する。伸長二本鎖からの蛍光シグナルは、ＣＴＯが固定化された固相基質のスポット上で検出できる。伸長二本鎖がメルティングされる場合、蛍光標識を有する鎖が放出され、スポット上ではそれ以上蛍光シグナルが検出されない（図１０では表れない）。したがって、シグナルの変化が伸長二本鎖のメルティングによりスポット上で提供され得る。即ち、ターゲットシグナルが提供され、工程（ｅ）において伸長二本鎖の存在を示す。
【０１７１】
工程（ｅ）において提供されるターゲットシグナルは、ＣＴＯ−固定化スポット上で蛍光強度の変化を測定して得られるメルティングカーブ、メルティングパターン又はＴｍ値を含む。
【０１７２】
本発明の好ましい具現例によると、図１１で図式的に示しているように、伸長反応の間に挿入されたヌクレオチドは、第１非天然塩基（ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ  ｂａｓｅ）を有し、ＣＴＯは、前記第１非天然塩基に対して特異的結合親和性のある第２非天然塩基を有する。好ましくは、第２非天然塩基を有するヌクレオチドは、ＣＴＯのテンプレーティング部位の如何なる位置にも位置する。
【０１７３】
本明細書で使用される用語‘非天然塩基’は、水素結合塩基対を形成できるアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）のような天然塩基の誘導体を意味する。本明細書で使用される用語‘非天然塩基’は、母化合物（ｍｏｔｈｅｒ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）として、天然塩基と異なる塩基対パターンを有する塩基を含み、例えば、米国特許第５，４３２，２７２号、第５，９６５，３６４号、第６，００１，９８３号及び第６，０３７，１２０号に記載されている。非天然塩基間の塩基対は、天然塩基と同様に、二つ又は三つの水素結合を含む。また、非天然塩基間の塩基対は、特定な方式でも形成される。
【０１７４】
非天然塩基の特定な例は、下記の塩基の塩基対の組み合わせを含む：ｉｓｏ−Ｃ／ｉｓｏ−Ｇ、ｉｓｏ−ｄＣ／ｉｓｏ−ｄＧ、Ｋ／Ｘ、Ｈ／Ｊ及びＭ／Ｎ（参照：米国特許第７，４２２，８５０号）。
【０１７５】
例示された具現例は、図１１を参考して説明される。第１非天然塩基（例えば、ｉｓｏ−ｄＧ）に対して特異的結合親和性のある第２非天然塩基（例えば、ｉｓｏ−ｄＣ）を有するヌクレオチドを含むＣＴＯに断片がハイブリッド形成される。単一蛍光標識で標識された第１非天然塩基を有するヌクレオチドの存在下で伸長が実施され、伸長二本鎖を形成する。伸長反応において、第１非天然塩基を有するヌクレオチドは、第２非天然塩基を有するヌクレオチドの向かい側の位置に挿入される。
【０１７６】
伸長二本鎖から出る蛍光シグナルは、固定化されたＣＴＯのある固相基質のスポット上で検出できる。伸長二本鎖がメルティングされる場合、蛍光標識を有する鎖が放出され、スポット上ではそれ以上蛍光シグナルが検出されない（図１１では表れない）。したがって、シグナルの差異が伸長二本鎖のメルティングによりスポット上で提供され得る。即ち、ターゲットシグナルは、工程（ｅ）において伸長二本鎖の存在を示す。
【０１７７】
伸長反応の間に伸長二本鎖内に挿入された標識を利用する場合、ハイブリッド形成物は伸長されないため、標識は、非切断ＰＴＯ及びＣＴＯ間のハイブリッド形成物内に含まれない。したがって、ハイブリッド形成物は、非ターゲットシグナルを提供しない。
【０１７８】
使用される単一標識の種類及び特徴は、本明細書で詳述した‘断片及び／又はＣＴＯに連結された標識’を利用する標識システムに対する説明を参照して説明できる。
【０１７９】
（ｉｉｉ）伸長二本鎖内に挿入された標識と断片又はＣＴＯに連結された標識
図４及び図５で図式的に示すように、本発明は、伸長反応の間に伸長二本鎖内に挿入された標識と断片及び／又はＣＴＯに連結された標識の組み合わせを利用した標識システムを利用することができる。
【０１８０】
本発明の好ましい具現例によると、ターゲットシグナルは、伸長反応の間に伸長二本鎖内に挿入された標識と断片及び／又はＣＴＯに連結された標識により提供され、挿入された標識は、伸長反応の間に挿入されたヌクレオチドに連結されており、前記二つの標識は、レポーター分子及びクエンチャー分子の相互作用的二重標識であって、前記工程（ｅ）における伸長二本鎖のメルティングは、相互作用的二重標識からのシグナルの変化を誘導し、工程（ｅ）におけるターゲットシグナルを提供する。
【０１８１】
より好ましくは、伸長反応の間に挿入されたヌクレオチドは、第１非天然塩基を有し、ＣＴＯは、第１非天然塩基に対して特異的結合親和性のある第２非天然塩基を有する。
【０１８２】
例示された具現例は、図４を参考して説明される。レポーター分子又はクエンチャー分子及び第１非天然塩基（例えば、ｉｓｏ−ｄＧ）に対して特異的結合親和性のある第２非天然塩基（例えば、ｉｓｏ−ｄＣ）を有するヌクレオチドを含むＣＴＯに断片がハイブリッド形成される。レポーター分子又はクエンチャー分子で標識された第１非天然塩基を有するヌクレオチドの存在下で伸長が実施され、伸長二本鎖を形成され、レポーター分子からのシグナルがクエンチャー分子によりクエンチングされる。伸長反応において、第１非天然塩基を有するヌクレオチドは、第２非天然塩基を有するヌクレオチドの向かい側の位置に挿入される。
【０１８３】
工程（ｅ）において伸長二本鎖がメルティングされる場合、レポーター分子及びクエンチャー分子は、互いに離隔され、クエンチャー分子がレポーター分子からのシグナルをアンクエンチングして、これにより、ターゲットシグナルが提供され、工程（ｅ）において伸長二本鎖の存在を示す。
【０１８４】
好ましくは、工程（ｅ）において提供されるターゲットシグナルは、相互作用的二重標識からのシグナルの変化を測定して得られるメルティングカーブ、メルティングパターン又はＴｍ値を含む。
【０１８５】
ＣＴＯ上における標識位置及び挿入される標識の挿入位置は、メルティング工程で前記二つの標識がシグナルの変化を誘導する相互作用的二重標識として作用する範囲内で決定される。
【０１８６】
より好ましくは、ＣＴＯのテンプレーティング部位は、レポーター分子又はクエンチャー分子及び第２非天然塩基を有するヌクレオチドを有する。工程（ｄ）における伸長反応は、クエンチャー又はレポーター分子及びＣＴＯの第２非天然塩基に対して特異的結合親和性のある第１非天然塩基を有するヌクレオチドの存在下で行われる。工程（ｄ）の伸長二本鎖の二つの非天然塩基は、塩基対を形成しながらクエンチャー分子によりレポーター分子からのシグナルをクエンチングし、シグナルの変化を誘導し、これによりターゲットシグナルが提供される。選択的に、断片は、レポーター分子又はクエンチャー分子を有し、ＣＴＯのテンプレーティング部位は、第２非天然塩基を有するヌクレオチドを有する。工程（ｄ）における伸長反応は、クエンチャー又はレポーター分子及びＣＴＯの第２非天然塩基に対して特異的結合親和性のある第１非天然塩基を有するヌクレオチドの存在下で行われる。工程（ｄ）の伸長二本鎖の二つの非天然塩基は、塩基対を形成しながら、クエンチングによってレポーター分子からのシグナルの変化を誘導し、これによりターゲットシグナルが提供される。
【０１８７】
また他の例示された具現例は、図５を参考して説明される。本具現例では、レポーター又はクエンチャー分子を含む断片が、第１非天然塩基（例えば、ｉｓｏ−ｄＧ）に対して特異的結合親和性のある第２非天然塩基（例えば、ｉｓｏ−ｄＣ）を有するヌクレオチドを含むＣＴＯにハイブリッド形成される。クエンチャー又はレポーター分子で標識された第１非天然塩基を有するヌクレオチドの存在下で伸長が実施され、伸長二本鎖が形成され、レポーター分子からのシグナルがクエンチャー分子によりクエンチングされる。伸長反応において、第１非天然塩基を有するヌクレオチドは、第２非天然塩基を有するヌクレオチドの向かい側の位置に挿入される。
【０１８８】
工程（ｄ）において伸長二本鎖が形成される場合、レポーター分子及びクエンチャー分子は、構造的に互いに離隔され、クエンチャー分子がレポーター分子からのシグナルをアンクエンチングし、前記工程（ｅ）において伸長二本鎖がメルティングされる場合、レポーター分子及びクエンチャー分子は、構造的に互いに近接し、クエンチャー分子がレポーター分子からのシグナルをクエンチングし、これにより、ターゲットシグナルが提供され、工程（ｅ）において伸長二本鎖の存在を示す。
【０１８９】
好ましくは、工程（ｅ）において提供されるターゲットシグナルは、相互作用的二重標識からのシグナルの変化を測定して得られるメルティングカーブ、メルティングパターン又はＴｍ値を含む。
【０１９０】
ＰＴＯの標識位置及び挿入される標識の挿入位置は、メルティング工程で二つの標識がシグナルの変化を誘導する相互作用的二重標識として作用する範囲内で決定される。
【０１９１】
伸長反応の間に伸長二本鎖内に挿入された標識を利用する場合、ハイブリッド形成物は伸長されないため、標識は、非切断ＰＴＯ及びＣＴＯ間のハイブリッド形成物内に含まれない。したがって、ハイブリッド形成物は、メルティング工程で非ターゲットシグナルを提供しない。
【０１９２】
（ｉｖ）インターカレーティング標識（（Ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ  ｌａｂｅｌ）
本発明は、伸長二本鎖の存在を示すターゲットシグナルを提供するインターカレーティング標識を使用することができる。試料内の二本鎖核酸分子がシグナルを発生させることができるため、固定化されたＣＴＯを利用する固相反応では、インターカレーティング標識がより有用である。
【０１９３】
本発明で有用なインターカレーティング標識の例は、ＳＹＢＲＴＭ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、ＰＯ−ＰＲＯＴＭ−１、ＢＯ−ＰＲＯＴＭ−１、ＳＹＴＯＴＭ４３、ＳＹＴＯＴＭ４４、ＳＹＴＯＴＭ４５、ＳＹＴＯＸＴＭＢｌｕｅ、ＰＯＰＯＴＭ−１、ＰＯＰＯＴＭ−３、ＢＯＢＯＴＭ−１、ＢＯＢＯＴＭ−３、ＬＯ−ＰＲＯＴＭ−１、ＪＯ−ＰＲＯＴＭ−１、ＹＯ−ＰＲＯＴＭ１、ＴＯ−ＰＲＯＴＭ１、ＳＹＴＯＴＭ１１、ＳＹＴＯＴＭ１３、ＳＹＴＯＴＭ１５、ＳＹＴＯＴＭ１６、ＳＹＴＯＴＭ２０、ＳＹＴＯＴＭ２３、ＴＯＴＯＴＭ−３、ＹＯＹＯＴＭ３、ＧｅｌＳｔａｒＴＭ及びｔｈｉａｚｏｌｅ  ｏｒａｎｇｅを含む。インターカレーティング染料が二本鎖核酸分子内に特異的に入り込んでシグナルを発生させる。
【０１９４】
伸長二本鎖の塩基対間にインターカレーティング染料が入り込む具現例を、図１３で図式的に示す（図１３のＣ及びＤ）。また、本具現例は、メルティング分析を利用する他の具現例にも適用できる。
【０１９５】
例示された具現例は、図１３を参考して説明される。固相基質上に固定されたＣＴＯのキャプチャリング部位に断片がハイブリッド形成される。インターカレーティング染料（例えば、ＳＹＢＲＴＭ  Ｇｒｅｅｎ）の存在下で伸長を実施し、インターカレーティング染料を含む伸長二本鎖を生成する。固定化されたＣＴＯがある固相基質のスポット上の伸長二本鎖から出る蛍光シグナルは、インターカレーティング蛍光染料を利用して検出できる。伸長二本鎖がメルティングされる場合、インターカレーティング蛍光染料が放出され、スポット上でそれ以上蛍光シグナルが検出されない（図１３では表れない）。したがって、ターゲットシグナルが提供され、工程（ｅ）において伸長二本鎖の存在を示す。
【０１９６】
非切断ＰＴＯ及びＣＴＯ間のハイブリッド形成物は、メルティング工程で非ターゲットシグナルを提供する。このような場合、伸長二本鎖及びハイブリッド形成物のＴｍ値の差異により、伸長二本鎖のターゲットシグナルとハイブリッド形成物の非ターゲットシグナルとを区別することができる（図１３では表れない）。
【０１９７】
好ましくは、工程（ｅ）において提供されるターゲットシグナルは、工程（ｅ）において発生される蛍光シグナルの変化を測定して得られるメルティングカーブ、メルティングパターン又はＴｍ値を含む。
【０１９８】
工程（ｆ）：ターゲットシグナルの検出
最終的に、伸長二本鎖は、工程（ｅ）において提供されるターゲットシグナルを測定することにより検出され、これにより、伸長二本鎖の存在は、ターゲット核酸配列の存在を示す。
【０１９９】
ターゲットシグナルの種類によって多様な方法により検出を実施することができる。
【０２００】
好ましい具現例によると、ターゲットシグナルの検出は、メルティング分析により実施される。
【０２０１】
本明細書で使用される用語‘メルティング分析’は、伸長二本鎖のメルティングによって、伸長二本鎖の存在を示すターゲットシグナルを得る方法を意味し、二つの異なる温度でシグナルを測定する方法、メルティングカーブ分析、メルティングパターン分析、及びメルティングピーク分析を含む。好ましくは、メルティング分析は、メルティングカーブ分析である。
【０２０２】
本明細書において好ましい具現例は、工程（ｅ）のメルティング以後にハイブリッド形成を実施し、前記伸長二本鎖の存在を示すターゲットシグナルを提供する。このような場合、伸長二本鎖の存在は、ハイブリッド形成カーブ分析により検出される。
【０２０３】
メルティングカーブ又はハイブリッド形成カーブは、従来の技術、例えば、米国特許第６，１７４，６７０号及び第５，７８９，１６７号、Ｄｒｏｂｙｓｈｅｖら、Ｇｅｎｅ  １８８：  ４５（１９９７））；Ｋｏｃｈｉｎｓｋｙ  ａｎｄ  Ｍｉｒｚａｂｅｋｏｖ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  １９：３４３（２００２）；Ｌｉｖｅｈｉｔｓら、Ｊ．  Ｂｉｏｍｏｌ．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｄｙｎａｍ．１１：７８３（１９９４）；及びＨｏｗｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：８７（１９９９）で説明するように得ることができる。例えば、メルティングカーブ又はハイブリッド形成カーブは、ハイブリッド形成厳格度（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）のパラメーターに対するアウトプットシグナル（ｏｕｔｐｕｔ  ｓｉｇｎａｌ）変化のグラフィックプロット（ｇｒａｐｈｉｃ  ｐｌｏｔ）又はディスプレイ（ｄｉｓｐｌａｙ）で構成できる。アウトプットシグナルは、ハイブリッド形成パラメーター対して直接的プロッティングをすることができる。典型的に、メルティングカーブ又はハイブリッド形成カーブは、例えば、Ｙ軸には二本鎖構造の程度（即ち、ハイブリッド形成程度）を示す蛍光が、Ｘ軸にはハイブリッド形成パラメーターがプロッティング（ｐｌｏｔｔｉｎｇ）されたアウトプットシグナルを有する。
【０２０４】
ＰＴＯ及びＣＴＯは、天然（ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）ｄＮＭＰｓから構成できる。択一的に、ＰＴＯ及びＣＴＯは、変形ヌクレオチド又は非天然ヌクレオチド、例えば、ＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ、参照：ＰＣＴ出願第ＷＯ９２／２０７０２号）及びＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ、参照：ＰＣＴ出願第ＷＯ９８／２２４８９号、第ＷＯ９８／３９３５２号及び第ＷＯ９９／１４２２６号）を含むことができる。ＰＴＯ及びＣＴＯは、デオキシイノシン、イノシン、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロール及び５−ニトロインドールのようなユニバーサル塩基を含むことができる。用語‘ユニバーサル塩基’は、天然ＤＮＡ／ＲＮＡ塩基のそれぞれに対して、ほとんど区別無しに塩基対を形成することができるものを意味する。
【０２０５】
上述のように、ＰＴＯは、ＰＴＯの５’−タギング部位の３’−末端から３’−方向に離隔された一位置で切断できる。切断位置は、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−末端一部に位置できる。ＰＴＯ断片がＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−末端一部を含む場合、３’−ターゲッティング部位の５’−末端一部にハイブリッド形成されるＣＴＯの位置は、ユニバーサル塩基、縮重配列（Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）又はそれらの組み合わせを含むことができる。例えば、ＰＴＯがＰＴＯの５’−タギング部位の３’−末端から３’−方向に一つのヌクレオチド離隔された一位置で切断される場合、前記ヌクレオチドとのハイブリッド形成のために、ＣＴＯのキャプチャリング部位の５’−末端一部は、ユニバーサル塩基を含むことが有利である。ＰＴＯがＰＴＯの５’−タギング部位の３’−末端から３’−方向に２個のヌクレオチド離隔された一位置で切断される場合には、ＣＴＯのキャプチャリング部位の５’−末端は、縮重配列を含み、その３’−方向−近接ヌクレオチドは、ユニバーサル塩基を含むことが有利である。このように、３’−ターゲッティング部位の５’−末端一部の多様な位置でＰＴＯの切断が起こる場合、ＣＴＯにユニバーサル塩基及び縮重配列を利用することが有用である。また、上流プライマー伸長依存的な切断誘導下で、同一な５’−タギング部位を有するＰＴＯを複数のターゲット核酸配列のスクリーニングに利用する場合、３’−ターゲッティング部位の５’−末端一部が相異なっているＰＴＯ断片を生成することができる。このような場合、ユニバーサル塩基及び縮重配列は、ＣＴＯに有用に使用される。ＣＴＯにユニバーサル塩基及び縮重配列を利用する戦略は、複数のターゲット核酸配列のスクリーニングのために、一種のＣＴＯ又は最小限の種類のＣＴＯを使用するようにする。
【０２０６】
本発明の好ましい具現例によると、本発明の方法は、前記工程（ａ）−（ｂ）、（ａ）−（ｄ）又は（ａ）−（ｆ）を反復する工程と、その反復サイクルの間に変性過程とを追加的に含み、好ましくは、下流プライマーを共に含む。このような反復は、ターゲット核酸配列及び／又はターゲットシグナルを増幅させる。
【０２０７】
本発明の好ましい具現例によると、工程（ａ）−（ｆ）は、一つの反応容器又は個別反応容器で実施される。例えば、工程（ａ）−（ｂ）、（ｃ）−（ｄ）又は（ｅ）−（ｆ）を個別反応容器で実施することができる。
【０２０８】
本発明の好ましい具現例によると、工程（ａ）−（ｂ）及び（ｃ）−（ｆ）は、反応条件（特に、温度）によって、一つの反応容器でも同時的又は個別的に進行することができる。
【０２０９】
本発明では、検出及び／又は増幅しようとするターゲット核酸配列が、あらゆるＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＡＮ）及びＲＮＡ分子を含め、ある特定配列又は長さを有することを要求しない。
【０２１０】
ｍＲＮＡを初期物質として利用する場合、アニーリング工程の実施以前に逆転写工程が必須的であり、その詳細な内容は、Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）；及びＮｏｏｎａｎ，Ｋ．Ｆ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：１０３６６（１９８８）に開示されている。逆転写反応のためには、ランダムヘキサマー又はｍＲＮＡにハイブリッド形成されるオリゴヌクレオチドｄＴプライマーが利用できる。
【０２１１】
本発明で検出及び／又は増幅可能なターゲット核酸配列は、あらゆる天然（Ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）の原核細胞核酸、真核細胞（例えば、原生動物と寄生動物、菌類、酵母、高等植物、下等動物、及び哺乳動物と人間を含む高等動物）核酸、ウイルス（例えば、ヘルペスウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス、肝炎ウイルス、ポリオウイルスなど）核酸、又はウイロイド核酸を含む。
【０２１２】
また、本発明は、ヌクレオチド変異の検出に有用である。好ましくは、ターゲット核酸配列は、ヌクレオチド変異を含む。本明細書で使用される用語‘ヌクレオチド変異（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）’は、連続的ＤＮＡ断片又は配列の類似したＤＮＡ断片において、特定位置のＤＮＡ配列における全ての単一又は複数のヌクレオチド置換、欠失又は挿入を意味する。このような連続的ＤＮＡ断片は、一つの遺伝子又は一つの染色体のある他の部位を含む。このようなヌクレオチド変異は、突然変異（ｍｕｔａｎｔ）又は多形性対立遺伝子変異（Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ａｌｌｅｌｅ  ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ）でありえる。例えば、本発明で検出されるヌクレオチド変異は、ＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、突然変異、欠失、挿入、置換及び転座を含む。ヌクレオチド変異の例は、ヒトゲノムにある多様な変異（例えば、ＭＴＨＦＲ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）遺伝子の変異）、病原体の薬剤耐性に係わる変異及び癌発生関連変異を含む。
【０２１３】
ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異を検出する本発明において、使用されるプライマー又はプローブがターゲット核酸配列の前記ヌクレオチド変異に対して相補的な配列を有する場合、前記ヌクレオチド変異を含むターゲット核酸配列は、本明細書でマッチング鋳型（ｍａｔｃｈｉｎｇ  ｔｅｍｐｌａｔｅ）と記載される。使用されるプライマー又はプローブがターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に対して非相補的な配列を有する場合、前記ヌクレオチド変異を含むターゲット核酸配列は、本明細書でミスマッチング鋳型（ｍｉｓｍａｔｃｈｉｎｇ  ｔｅｍｐｌａｔｅ）と記載される。
【０２１４】
ヌクレオチド変異の検出のために、上流プライマーの３’−末端は、ターゲット核酸配列におけるヌクレオチド変異位置の向かい側に位置するようにデザインすることができる。本発明の好ましい具現例によると、上流プライマーの３’−末端は、ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に対して相補的な配列を有する。ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に対して相補的な配列を有する上流プライマーの３’−末端は、マッチング鋳型にアニーリングされて伸長され、ＰＴＯ切断を誘導する。結果物として、ＰＴＯ断片は、ＣＴＯにハイブリッド形成されてターゲットシグナルを提供する。逆に、上流プライマーの３’−末端がミスマッチング鋳型でヌクレオチド変異にミスマッチされる場合、上流プライマーがミスマッチング鋳型にハイブリッド形成されるとしても、伸長反応のためにプライマーの３’−末端のアニーリングが必須的な条件下では伸長されず、これにより、ターゲットシグナルが発生しない。
【０２１５】
択一的に、ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に対して相補的な配列を有するＰＴＯのハイブリッド形成に依存的なＰＴＯ切断を利用することができる。例えば、調節された条件下で、ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に対して相補的な配列を有するＰＴＯは、マッチング鋳型にハイブリッド形成された後、切断される。結果物として、ＰＴＯ断片は、ＣＴＯにハイブリッド形成されてターゲットシグナルを提供する。その反面、調節された条件下で、ＰＴＯは、ヌクレオチド変異位置に非相補的な配列を有するミスマッチング鋳型にハイブリッド形成されず、切断されない。このような場合、好ましくは、ＰＴＯのヌクレオチド変異に対する相補的な配列は、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の中間に位置する。
【０２１６】
択一的に、ヌクレオチド変異の検出のために、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−末端一部がターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に位置し、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−末端一部は、ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に対して相補的な配列を有することが好ましい。
【０２１７】
単一ヌクレオチド変異の検出のための具現例において、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−末端は、ターゲット核酸配列の単一ヌクレオチド変異に対して相補的な配列を有する。上述のように、マッチング鋳型にハイブリッド形成されたＰＴＯの切断は、例えば、上流プライマー伸長依存的な切断誘導下で、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−末端に対して３’−方向にすぐに近接（Ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ  ａｄｊａｃｅｎｔ）した一位置で誘導できる。ＰＴＯ断片の３’−末端は、単一ヌクレオチド変異に対して相補的なヌクレオチドを有する。ＰＴＯ断片は、ヌクレオチド変異に対応する配列を含むキャプチャリング部位を有するＣＴＯにハイブリッド形成された後、伸長されて伸長二本鎖を形成し、ターゲットシグナルを提供する。同一なＰＴＯが、単一ヌクレオチド変異を除いてはマッチング鋳型に対して同一な配列を有するミスマッチング鋳型にハイブリッド形成される場合には、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−末端から３’−方向に２個のヌクレオチドだけ離隔された位置でＰＴＯの切断が発生され得る。ＰＴＯ断片の３’−末端は、単一ヌクレオチド変異に相補的なヌクレオチド以外に、追加的に切断されるヌクレオチドを有する。追加的に切断されるヌクレオチドにハイブリッド形成されるＣＴＯの位置が、前記追加的に切断されるヌクレオチドに対して非相補的な配列を有するようにデザインされた場合、ＰＴＯ断片の３’−末端は、ＣＴＯにハイブリッド形成されず、調節された条件でＰＴＯ断片が伸長されない。例え、ＰＴＯ断片が伸長されて伸長二本鎖を形成しても、前記二本鎖は、ＰＴＯ及びミスマッチング鋳型間のハイブリッド形成による二本鎖とは異なるＴｍ値を有する。
【０２１８】
本発明の好ましい具現例によると、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−末端一部にヌクレオチド変異に対して相補的な配列を有するＰＴＯの切断位置は、マッチング鋳型又はミスマッチング鋳型とのハイブリッド形成に依存的に変わり、これにより、前記二つのハイブリッド形成イベントから放出されるＰＴＯ断片は、異なる配列を有し、好ましくは、その３’−末端一部、より好ましくは、その３’−末端で異なる配列を有する。
【０２１９】
本発明の好ましい具現例によると、ＰＴＯ断片の３’−末端一部の差異を考慮したＣＴＯのヌクレオチド配列の選択により、マッチング鋳型とミスマッチング鋳型とを区別することができる。
【０２２０】
本発明の好ましい具現例によると、本発明に利用されるターゲット核酸配列は、前増幅された核酸配列である。前増幅された核酸配列の利用は、本発明のターゲット検出の感度及び特異度を非常に高く増加させる。
【０２２１】
本発明の好ましい具現例によると、前記方法は、下流プライマーの存在下で実施される。
【０２２２】
少なくとも２種のターゲット核酸配列が同時に検出（マルチプレックス）されるという点で本発明の利点がさらに強調される。
【０２２３】
本発明の好ましい具現例によると、前記方法は、少なくとも２種（より好ましくは、少なくとも３種、さらに好ましくは、少なくとも５種）のターゲット核酸配列を検出するために実施される。
【０２２４】
本発明の好ましい具現例によると、前記方法は、少なくとも２種（より好ましくは、少なくとも３種、さらに好ましくは、少なくとも５種）のターゲット核酸配列を検出するために実施され、前記上流オリゴヌクレオチドは、少なくとも２種（より好ましくは、少なくとも３種、さらに好ましくは、少なくとも５種）のオリゴヌクレオチドを含み、ＰＴＯは、少なくとも２種（より好ましくは、少なくとも３種、さらに好ましくは、少なくとも５種）のＰＴＯを含み、ＣＴＯは、少なくとも１種（より好ましくは、少なくとも２種、さらに好ましくは、少なくとも３種、最も好ましくは、少なくとも５種）のＣＴＯを含み、前記少なくとも２種のターゲット核酸配列が存在する場合、前記方法は、少なくとも２種のターゲット核酸配列に対応する少なくとも２種のターゲットシグナルを提供する。
【０２２５】
少なくとも２個のＰＴＯの５’−タギング部位は、互いに同一な配列を有することができる。例えば、本発明がターゲット核酸配列のスクリーニングに実施される場合、ＰＴＯの５’−タギング部位は、同一な配列を有することができる。
【０２２６】
さらに、１種類のＣＴＯを多数のターゲット核酸配列の検出に利用することができる。例えば、５’−タギング部位に同一な配列を有するＰＴＯをターゲット核酸配列のスクリーニングに利用する場合、１種類のＣＴＯを利用することができる。
【０２２７】
本発明の好ましい具現例によると、少なくとも２種のターゲット核酸配列に対応する伸長二本鎖は、互いに異なるＴｍ値を有する。
【０２２８】
本発明の好ましい具現例によると、少なくとも２種のターゲット核酸配列に対応する少なくとも２種のターゲットシグナルは、互いに異なる種類の標識から提供される。
【０２２９】
本発明の好ましい具現例によると、少なくとも２種のターゲット核酸配列に対応する少なくとも２種のターゲットシグナルは、互いに同一な種類の標識から提供される。
【０２３０】
本発明の好ましい具現例によると、少なくとも２種のターゲット核酸配列に対応する少なくとも２種のターゲットシグナルは、互いに同一な種類の標識から提供され、少なくとも２種のターゲット核酸配列に対応する前記伸長二本鎖は、互いに異なるＴｍ値を有する。
【０２３１】
本明細書で使用される用語‘異なる種類の標識’は、検出可能なシグナルが異なる特徴を有する標識を意味する。例えば、蛍光レポーター標識としてのＦＡＭ及びＴＡＭＲＡが、異なる種類の標識として考えられるが、これは、これらの励起（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）及び放出波長が互いに相異なっているからである。
【０２３２】
メルティングカーブ分析により、少なくとも２種のターゲット核酸配列を同時的に検出するために本発明を実施し、少なくとも２種のターゲット核酸配列に対応する伸長二本鎖が互いに異なるＴｍ値を有する場合、１種類の標識（例えば、ＦＡＭ）を利用するとしても、少なくとも２種のターゲット核酸配列を検出することができる。
【０２３３】
固相に固定化されたＣＴＯを利用したターゲット検出
本発明の顕著な利点は、マイクロアレイのような固相でもターゲット核酸配列の検出が効果的であるということである。
【０２３４】
本発明の好ましい具現例によると、本発明は、固相で実施され、ＣＴＯは、その５’−末端又は３’−末端を介して固相基質上に固定化される。固相では、固相基質上で提供されるターゲットシグナルを測定する。
【０２３５】
固定化されたＣＴＯを利用する場合、上述した標識システムを利用したメルティング分析は、本発明の固相反応に適用できる。
【０２３６】
本発明の好ましい具現例によると、ターゲットシグナルは、断片に連結された単一標識、又は前記伸長反応の間に前記伸長二本鎖内に挿入された単一標識により提供される。特に、固相で本発明が単一標識を利用して行われる場合、一般的な蛍光標識を利用することができ、二本鎖上に存在するかあるいは一本鎖上に存在するかによって異なる強度を有する蛍光シグナルを提供することができる特定の蛍光標識を必要としない。
【０２３７】
固相基質上に固定化されたＣＴＯを利用する場合、化学的標識（例えば、ビオチン）又は酵素的標識（例えば、アルカリホスファターゼ、ペロキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ）を利用することができる。
【０２３８】
固相反応のために、ＣＴＯは、その５’−末端又は３’−末端（好ましくは、３’−末端）を介して固相基質の表面に直接的又は間接的に（好ましくは、間接的に）固定化される。また、ＣＴＯは、共有又は非共有結合方式で固相基質表面に固定化できる。固定化されたＣＴＯが固相基質表面に間接的に固定化される場合、適したリンカーを利用する。本発明で有用なリンカーは、固相基質表面上のプローブ固定化に利用されるリンカーなら如何なるものでもよい。例えば、アミン基を有するアルキル又はアリール化合物、又はチオール基を有するアルキル又はアリール化合物がリンカーとしてＣＴＯ固定化に利用できる。また、ポリ（Ｔ）テイル又はポリ（Ａ）テイルがリンカーとして使用できる。
【０２３９】
本発明の好ましい具現例によると、本発明で利用される固相基質は、マイクロアレイである。本発明の反応環境を提供するマイクロアレイは、当業界に知られた如何なるものでもよい。本発明の全ての過程、即ち、ターゲット核酸配列とのハイブリッド形成、切断、伸長、メルティング及び蛍光検出は、マイクロアレイ上で実施される。マイクロアレイ上に固定化されたＣＴＯは、ハイブリッド形成アレイ要素（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｂｌｅ  ａｒｒａｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ）として利用される。マイクロアレイを製作するための固相基質（Ｓｏｌｉｄ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）は、金属（例えば、金、金と銅の合金、アルミニウム）、金属オキシド、ガラス、セラミック、石英、シリコン、半導体、Ｓｉ／ＳｉＯ２ウェハー、ゲルマニウム、ガリウムアルセニド、カーボン、炭素ナノチューブ、ポリマー（例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン及びポリアクリルアミド）、セファロース、アガロース及びコロイドを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の複数の固定化されたＣＴＯは、固相基質上の一つのアドレサブル（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ）部位又は複数のアドレサブル部位に固定化され、固相基質は、２〜１，０００，０００個のアドレサブル部位を含むことができる。フォトリソグラフィー、インクゼッティング、機械的マイクロスポッティング及びその類似方法のような従来製作技術により、アレイ又は特定応用のためのアレイを生産するために、固定化されたＣＴＯが組み立てられる。
【０２４０】
固相で実施する本発明は、固定化されたＣＴＯ上の標識は物理的に離隔されているため、一種類の標識を利用するとしても、多数のターゲット核酸配列を同時的に検出することができる。したがって、固相において、本発明により検出可能なターゲット核酸配列の数は制限されない。
【０２４１】
ＩＩ．ターゲット核酸配列の増幅を利用した好ましい具現例
好ましくは、本発明は、ターゲット核酸配列を合成できる上流プライマー及び下流を含む一対のプライマーを利用し、ターゲット核酸配列の増幅を利用して同時的に実施される。
【０２４２】
本発明のまた他の様態によると、本発明は、
（ａ）ターゲット核酸配列を、上流プライマー及び下流プライマーを含む一対のプライマー及びＰＴＯ（プロービング及びタギングオリゴヌクレオチド、Ｐｒｏｂｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔａｇｇｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とハイブリッド形成させる工程であって、前記上流プライマー及び前記下流プライマーのそれぞれは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を含み、前記ＰＴＯは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を含む３’−ターゲッティング部位、及び（ｉｉ）前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’−タギング部位を含み、前記３’−ターゲッティング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリッド形成され、前記５’−タギング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリッド形成されず、前記ＰＴＯは、前記上流プライマーと前記下流プライマーとの間に位置し、前記ＰＴＯは、その３’−末端がブロッキングされて伸長が防止される工程と、
（ｂ）前記プライマーの伸長及び前記ＰＴＯの切断のための条件下で、５’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼに工程（ａ）の結果物を接触させる工程であって、前記ＰＴＯが前記ターゲット核酸配列にハイブリッド形成される場合、前記上流プライマーは伸長され、前記伸長鎖は、前記５’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼによる前記ＰＴＯの切断を誘導し、このような前記切断は、前記ＰＴＯの５’−タギング部位又は前記５’−タギング部位の一部を含む断片を放出する工程と、
（ｃ）前記ＰＴＯから放出された前記断片とＣＴＯ（キャプチャリング及びテンプレーティングオリゴヌクレオチド、Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）をハイブリッド形成させる工程であって、前記ＣＴＯは、３’→５’方向に（ｉ）前記ＰＴＯの前記５’−タギング部位又は前記５’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位及び（ｉｉ）前記５’−タギング部位及び前記３’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み、前記ＰＴＯから放出された前記断片は、前記ＣＴＯの前記キャプチャリング部位にハイブリッド形成される工程と、
（ｄ）前記工程（ｃ）の結果物及び鋳型依存的核酸ポリメラーゼを利用して伸長反応を行う工程であって、前記ＣＴＯの前記キャプチャリング部位にハイブリッド形成された前記断片は、伸長されて伸長二本鎖を形成し、前記伸長二本鎖は、（ｉ）前記断片の配列及び／又は長さ、（ｉｉ）前記ＣＴＯの配列及び／又は長さ又は（ｉｉｉ）前記断片の前記配列及び／又は長さと前記ＣＴＯの前記配列及び／又は長さにより調節可能なＴｍ値を有する工程と、
（ｅ）一定範囲の温度で前記伸長二本鎖をメルティング（ｍｅｌｔｉｎｇ）し、前記伸長二本鎖の存在を示すターゲットシグナルを提供する工程であって、前記ターゲットシグナルは、（ｉ）前記断片及び／又は前記ＣＴＯに連結された少なくとも一つの標識、（ｉｉ）前記伸長反応の間に前記伸長二本鎖内に挿入された標識、（ｉｉｉ）前記伸長反応の間に前記伸長二本鎖内に挿入された標識と前記断片及び／又は前記ＣＴＯに連結された標識又は（ｉｖ）インターカレーティング標識（Ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ  Ｌａｂｅｌ）により提供される工程と、
（ｆ）前記ターゲットシグナルを測定することにより、前記伸長二本鎖を検出する工程であって、前記伸長二本鎖の存在は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す工程と、
を含む、ＰＴＯＣＥ（ＰＴＯ切断及び伸長）アッセイによりＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法を提供する。
【０２４３】
本発明の好ましい具現例は、上述の本発明の工程を実施するため、その重複する内容は、本明細書の過度なる複雑性を避けるために、その記載を省く。
【０２４４】
本発明の好ましい具現例によると、前記方法は、前記工程（ａ）−（ｂ）、（ａ）−（ｄ）又は（ａ）−（ｆ）を反復する工程と、その反復サイクルの間に変性過程とをさらに含む。反応反復は、ターゲット核酸配列の増幅を伴う。好ましくは、前記増幅は、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号及び第４，８００，１５９号に開示されたＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）によって実施する。
【０２４５】
本発明の好ましい具現例によると、前記方法は、少なくとも２種のターゲット核酸配列を検出するために行われる。
【０２４６】
本発明の好ましい具現例によると、少なくとも２種のターゲット核酸配列に対応する少なくとも２種のターゲットシグナルは、同一な種類の標識から提供され、少なくとも２種のターゲット核酸配列に対応する前記伸長二本鎖は、互いに異なるＴｍ値を有する。
【０２４７】
ＩＩＩ．指定温度における検出過程を含むＰＴＯＣＥによるターゲット検出方法
本発明は、伸長二本鎖の形成と関連して発生するターゲットシグナルを利用するために変形させることができる。
【０２４８】
本発明のまた他の様態によると、本発明は、
（ａ）ターゲット核酸配列を上流オリゴヌクレオチド及びＰＴＯ（プロービング及びタギングオリゴヌクレオチド、Ｐｒｏｂｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔａｇｇｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とハイブリッド形成させる工程であって、前記上流オリゴヌクレオチドは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を含み、前記ＰＴＯは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を含む３’−ターゲッティング部位及び（ｉｉ）前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’−タギング部位を含み、前記３’−ターゲッティング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリッド形成され、前記５’−タギング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリッド形成されず、前記上流オリゴヌクレオチドは、前記ＰＴＯの上流に位置する工程と、
（ｂ）前記ＰＴＯの切断のための条件下で、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素に前記工程（ａ）の結果物を接触させる工程であって、前記上流オリゴヌクレオチド又はその伸長鎖は、前記５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による前記ＰＴＯの切断を誘導して、このような前記切断は、前記ＰＴＯの５’−タギング部位又は５’−タギング部位の一部を含む断片を放出する工程と、
（ｃ）前記ＰＴＯから放出された前記断片とＣＴＯ（キャプチャリング及びテンプレーティングオリゴヌクレオチド、Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）をハイブリッド形成させる工程であって、前記ＣＴＯは、３’→５’方向に（ｉ）前記ＰＴＯの前記５’−タギング部位又は前記５’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位及び（ｉｉ）前記ＰＴＯの前記５’−タギング部位及び前記３’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み、前記ＰＴＯから放出された前記断片は、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリッド形成される工程と、
（ｄ）工程（ｃ）の結果物及び鋳型依存的核酸ポリメラーゼを利用して伸長反応を行う工程であって、前記ＣＴＯの前記キャプチャリング部位にハイブリッド形成された前記断片は、伸長されて伸長二本鎖を形成し、前記伸長二本鎖は、（ｉ）前記断片の配列及び／又は長さ、（ｉｉ）前記ＣＴＯの配列及び／又は長さ又は（ｉｉｉ）前記断片の前記配列及び／又は長さと前記ＣＴＯの前記配列及び／又は長さにより調節可能なＴｍ値を有し、前記伸長二本鎖は、（ｉ）前記断片及び／又はＣＴＯに連結された少なくとも一つの標識、（ｉｉ）前記伸長反応の間に前記伸長二本鎖内に挿入された標識、（ｉｉｉ）前記断片及び／又は前記ＣＴＯに連結された少なくとも一つの標識と前記伸長反応の間に前記伸長二本鎖内に挿入された標識又は（ｉｖ）インターカレーティング標識（Ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ  Ｌａｂｅｌ）によりターゲットシグナルを提供する工程と、
（ｅ）前記伸長二本鎖がその二本鎖形態を維持する指定の温度で前記ターゲットシグナルを測定することにより、前記伸長二本鎖を検出する工程であって、これにより、前記伸長二本鎖の存在は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す工程と、
を含む、ＰＴＯＣＥ（ＰＴＯ切断及び伸長）アッセイによりＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法を提供する。
【０２４９】
本発明の好ましい具現例は、メルティング工程を除いては上述の本発明の工程を実施するため、その重複する内容は、本明細書の過度なる複雑性を避けるために、その記載を省く。
【０２５０】
ターゲットシグナルは、伸長二本鎖のメルティングで提供されるシグナルの変化を測定して提供されるため、上述のメルティング分析を利用する本発明は、少なくとも二つの異なる温度で標識から出るシグナルの検出を必要とする。
【０２５１】
ありそうもないことに、本発明の本様態において、伸長二本鎖自体が、伸長二本鎖が形成された場合と形成されなかった場合とを区別可能なシグナルを提供して、前記シグナルは、伸長二本鎖が二本鎖形態を維持する指定温度で検出され、これにより、ターゲット核酸配列の存在が決定される。
【０２５２】
本発明は、ターゲット核酸配列の存在を検出するために、伸長二本鎖の形成に係わるターゲットシグナルを測定するものである。
【０２５３】
本発明において、伸長二本鎖は、標識を有し、これにより、伸長二本鎖は、ターゲットシグナルを提供する。
【０２５４】
好ましくは、ターゲットシグナルは、指定温度で伸長二本鎖の標識から出るシグナル（シグナル発生又はシグナル消滅）を含む。
【０２５５】
本発明の標識は、上述したメルティング分析を利用した方法と同一な方式で実施することができる。図２〜１３において、指定温度における検出を少し変形した本発明の一様態を説明することができる。
【０２５６】
伸長二本鎖から出るターゲットシグナルを基本とした作動原理は、下記の通りである：（ｉ）断片の伸長は、標識からのシグナルの変化を誘導し、ターゲットシグナルを提供し、又は（ｉｉ）断片及びＣＴＯのハイブリッド形成は、標識からのシグナルの変化を誘導し、ターゲットシグナルを提供し、前記伸長二本鎖は、ターゲットシグナルを維持する。
【０２５７】
作動原理（ｉ）の具現例は、図９を参照して説明できる。固定化されたＣＴＯを利用する場合、本発明は、より効果的な方式で多数のターゲット核酸配列を検出する。固定化されたＣＴＯのテンプレーティング部位は、レポーター分子及びクエンチャー分子を有する。レポーター分子及びクエンチャー分子は、立体構造的に互いに近接して、クエンチャー分子がレポーター分子からのシグナルをクエンチングする。断片がＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリッド形成される場合、クエンチャー分子は、レポーター分子からのシグナルをクエンチングする。前記伸長二本鎖の形成により、レポーター分子及びクエンチャー分子は、立体構造的に互いに離隔するようになり、クエンチャー分子は、レポーター分子からのシグナルをアンクエンチングする。ターゲットシグナルは、伸長工程で提供される（図９のＣ及びＤ）。
【０２５８】
図９において、非切断ＰＴＯ及びＣＴＯ間のハイブリッド形成物（ｈｙｂｒｉｄ）は、伸長二本鎖を形成しない。したがって、クエンチャー分子は、依然としてレポーター分子からのシグナルをクエンチングするようになる。ハイブリッド形成物は、非ターゲットシグナルを提供しない。
【０２５９】
作動原理（ｉｉ）の具現例は、図６を参照して説明できる。図６は、メルティング分析を利用した方法だけではなく、本発明の様態も示す。ＰＴＯの５’−タギング部位は、レポーター分子及びクエンチャー分子を有する。レポーター分子及びクエンチャー分子は、構造的に互いに近接し、クエンチャー分子がレポーター分子からのシグナルをクエンチングする。ターゲット核酸配列にハイブリッド形成されたＰＴＯは切断され、レポーター分子及びクエンチャー分子を有する５’−タギング部位を含む断片を放出して、前記断片は、ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリッド形成される。前記ハイブリッド形成により、レポーター分子及びクエンチャー分子は、構造的に互いに離隔するようになり、クエンチャー分子は、レポーター分子からのシグナルをアンクエンチングする。ターゲットシグナルは、断片ハイブリッド形成工程で提供され、伸長二本鎖は、ターゲットシグナルを維持する（図６のＣ及びＤ）。
【０２６０】
図６において、非切断ＰＴＯ及びＣＴＯ間のハイブリッド形成物は、非ターゲットシグナルを提供し（図６のＣ及びＤ）、非ターゲットシグナルを除去するために、ハイブリッド形成物を解離させることを必要とする。したがって、ターゲットシグナルを測定する温度は、ハイブリッド形成物が解離されるように決定される。本発明の好ましい具現例によると、前記温度は、ハイブリッド形成物のＴｍ値を考慮して追加的に決定される。
【０２６１】
本発明の好ましい具現例によると、ハイブリッド形成物が部分的に解離される温度で伸長二本鎖は検出され得る。
【０２６２】
指定温度は、ハイブリッド形成物のＴｍ値から１０℃引いた温度より高く、好ましくは、ハイブリッド形成物のＴｍ値から５℃引いた温度より高く、より好ましくは、ハイブリッド形成物のＴｍ値より高い温度であり、さらに好ましくは、ハイブリッド形成物のＴｍ値に５℃足した温度より高い。
【０２６３】
本発明の好ましい具現例によると、伸長二本鎖により提供されるターゲットシグナルは、工程（ｄ）の伸長の間に提供され、図２〜４及び９〜１１に示されたように、前記非切断ＰＴＯ及びＣＴＯ間のハイブリッド形成物は、非ターゲットシグナルを提供しない。
【０２６４】
本発明の好ましい具現例によると、伸長二本鎖により提供されるターゲットシグナルは、工程（ｃ）における断片及びＣＴＯのハイブリッド形成により提供され、工程（ｄ）における前記伸長二本鎖の形成は、ターゲットシグナルを維持し、非切断ＰＴＯ及びＣＴＯ間の前記ハイブリッド形成物は、非ターゲットシグナルを提供し、図５〜８及び１２〜１３に示されたように、前記指定温度は、ハイブリッド形成物のＴｍ値より高い。
【０２６５】
非切断ＰＴＯ及びＣＴＯ間のハイブリッド形成物が非ターゲットシグナルを提供する場合（図６のパネルＤ）、非ターゲットシグナルを除去するために、ハイブリッド形成物を解離させることを必要とする。したがって、ターゲットシグナルを測定する温度は、ハイブリッド形成物が解離されるように決定される。
【０２６６】
本発明に有用な標識システムは、以下のように説明できる。
【０２６７】
（ｉ）断片及び／又はＣＴＯに連結された標識
（ｉ−１）相互作用的二重標識
相互作用的二重標識システムの具現例において、ＣＴＯは、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識を有し、工程（ｄ）における前記断片の伸長は、相互作用的二重標識からのシグナルの変化を誘導し、ターゲットシグナルを提供する。相互作用的二重標識システムの具現例１は、図２で図式的に示す。ターゲットシグナルは、伸長同期化（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚｅｄ）シグナル発生により提供される。
【０２６８】
本発明の好ましい具現例によると、レポーター分子及びクエンチャー分子は、ＣＴＯのテンプレーティング部位に位置することができる。
【０２６９】
本発明の好ましい具現例によると、ＣＴＯのレポーター分子及びクエンチャー分子の一つは、その５’−末端又はその５’−末端から１〜５ヌクレオチド離隔された位置にあり、他の一つは、ＣＴＯの形態によって、レポーター分子からのシグナルをクエンチング又はアンクエンチングする位置に位置する。
【０２７０】
相互作用的二重標識システムの具現例において、ＣＴＯは、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識を有し、工程（ｃ）における断片及びＣＴＯのハイブリッド形成は、相互作用的二重標識からのシグナルの変化を誘導してターゲットシグナルを提供し、前記伸長二本鎖は、ターゲットシグナルを維持する。
【０２７１】
本発明の好ましい具現例によると、レポーター分子及びクエンチャー分子は、ＣＴＯのキャプチャリング部位に位置することができる。
【０２７２】
本発明の好ましい具現例によると、ＣＴＯのレポーター分子及びクエンチャー分子の一つは、その３’−末端又はその３’−末端から１〜５ヌクレオチド離隔された位置にあり、他の一つは、ＣＴＯの形態によって、レポーター分子からのシグナルをクエンチング又はアンクエンチングする位置に位置する。
【０２７３】
本具現例において、非切断ＰＴＯ及びＣＴＯ間のハイブリッド形成物は、非ターゲットシグナルを提供し、前記ターゲットシグナルを測定する温度は、ハイブリッド形成物のＴｍ値を考慮して決定される。
【０２７４】
相互作用的二重標識システムの具現例において、断片は、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識を有して、工程（ｃ）における前記断片及びＣＴＯのハイブリッド形成は、相互作用的二重標識からのシグナルの変化を誘導してターゲットシグナルを提供し、前記伸長二本鎖は、ターゲットシグナルを維持する。相互作用的二重標識システムの具現例１は、図６で図式的に示す。
【０２７５】
本発明の好ましい具現例によると、断片のレポーター分子及びクエンチャー分子の一つは、その５’−末端又はその５’−末端から１〜５ヌクレオチド離隔された位置にあり、他の一つは、断片の形態によって、レポーター分子からのシグナルをクエンチングする位置に位置する。
【０２７６】
本具現例において、非切断ＰＴＯ及びＣＴＯ間のハイブリッド形成物は、非ターゲットシグナルを提供し、前記ターゲットシグナルを測定する温度は、ハイブリッド形成物のＴｍ値を考慮して決定される。
【０２７７】
相互作用的二重標識システムの具現例において、前記断片は、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識の一つを有し、ＣＴＯは、前記相互作用的二重標識の他の一つを有し、工程（ｃ）における前記断片及びＣＴＯのハイブリッド形成は、相互作用的二重標識からのシグナルの変化を誘導してターゲットシグナルを提供し、前記伸長二本鎖は、ターゲットシグナルを維持する。相互作用的二重標識システムの具現例は、図８で図式的に示す。
【０２７８】
レポーター分子からのシグナルがクエンチャー分子によりクエンチングされる限り、レポーター分子及びクエンチャー分子は、ＰＴＯ断片及びＣＴＯの如何なる位置にも位置できる。
【０２７９】
本発明の好ましい具現例によると、好ましくは、ＰＴＯのレポーター分子又はクエンチャー分子は、ＰＴＯの５’−末端に位置する。
【０２８０】
本発明の好ましい具現例によると、好ましくは、ＣＴＯのレポーター分子又はクエンチャー分子は、ＣＴＯの５’−末端に位置する。
【０２８１】
本具現例において、非切断ＰＴＯ及びＣＴＯ間のハイブリッド形成物は、非ターゲットシグナルを提供し、前記ターゲットシグナルを測定する温度は、ハイブリッド形成物のＴｍ値を考慮して決定される。
【０２８２】
（ｉ−２）単一標識
単一標識システムの具現例において、ＣＴＯは、単一標識を有して、工程（ｄ）における断片の伸長は、単一標識からのシグナルの変化を誘導し、ターゲットシグナルを提供する。単一標識システムの具現例は、図３で図式的に示す。ターゲットシグナルは、伸長同期化（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚｅｄ）シグナル発生により提供される。
【０２８３】
本発明の好ましい具現例によると、ＣＴＯのテンプレーティング部位は、単一標識で標識される。
【０２８４】
単一標識システムの具現例において、ＣＴＯは、単一標識を有し、工程（ｃ）における断片及びＣＴＯのハイブリッド形成は、相互作用的二重標識からのシグナルの変化を誘導してターゲットシグナルを提供し、前記伸長二本鎖は、ターゲットシグナルを維持する。
【０２８５】
本発明の好ましい具現例によると、ＣＴＯのキャプチャリング部位は、単一標識で標識される。
【０２８６】
本具現例において、非切断ＰＴＯ及びＣＴＯ間のハイブリッド形成物は、非ターゲットシグナルを提供し、前記ターゲットシグナルを測定する温度は、ハイブリッド形成物のＴｍ値を考慮して決定される。
【０２８７】
単一標識システムの具現例において、断片は、単一標識を有し、工程（ｃ）における断片及びＣＴＯのハイブリッド形成は、相互作用的二重標識からのシグナルの変化を誘導してターゲットシグナルを提供し、前記伸長二本鎖は、ターゲットシグナルを維持する。単一標識システムの具現例は、図１２で図式的に示す。
【０２８８】
本具現例において、非切断ＰＴＯ及びＣＴＯ間のハイブリッド形成物は、非ターゲットシグナルを提供し、前記ターゲットシグナルを測定する温度は、ハイブリッド形成物のＴｍ値を考慮して決定される。
【０２８９】
本明細書で使用される単一標識は、二本鎖上に存在するかあるいは一本鎖上に存在するかによって異なるシグナルを提供することができなければならない。単一標識は、蛍光標識、発光標識、化学発光標識、電気化学的標識及び金属標識を含む。好ましくは、単一標識は、蛍光標識を含む。本発明で使用される単一蛍光標識の種類及び好ましい結合位置は、米国特許第７，５３７，８８６号及び第７，３４８，１４１号に開示されており、これは、本明細書に参照として取り込まれる。好ましくは、単一蛍光標識は、ＪＯＥ、ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ及びフルオレセインベースの標識を含む。標識されるヌクレオチドの残基は、５’−末端又は３’−末端より、オリゴヌクレオチド内の内部ヌクレオチド残基に位置することが好ましい。
【０２９０】
本発明において、有用な単一蛍光標識は、上述したレポーター及びクエンチャー分子に対する説明を参照して説明できる。
【０２９１】
特に、固相で本発明が単一標識を利用して実施される場合、一般的な蛍光標識を利用することができ、二本鎖上に存在するかあるいは一本鎖上に存在するかによって異なる強度を有する蛍光シグナルを提供できる特定の蛍光標識を必要としない。
【０２９２】
固相基質上に固定化されたＣＴＯを利用する場合、化学的標識（例えば、ビオチン）又は酵素的標識（例えば、アルカリホスファターゼ、ペロキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ）を利用することができる。
【０２９３】
本発明の好ましい具現例によると、非切断ＰＴＯ及びＣＴＯ間のハイブリッド形成物が形成される場合、図２〜３及び９で示すように、前記ハイブリッド形成物が工程（ｄ）において非ターゲットシグナルを提供しない範囲内に断片及び／又はＣＴＯに連結された標識が位置する。
【０２９４】
選択的に、図６〜８及び１２から分かるように、非切断ＰＴＯ及びＣＴＯ間のハイブリッド形成物が形成される場合、前記ハイブリッド形成物が工程（ｄ）において非ターゲットシグナルを提供する範囲内に標識が位置することができ、前記伸長二本鎖のＴｍ値は、非切断ＰＴＯ及びＣＴＯ間のハイブリッド形成物より高い。
【０２９５】
（ｉｉ）伸長二本鎖内に挿入された標識
特に、本発明が固定化されたＣＴＯを利用して固相で実施される場合、図１０及び１１で図式的に示すように、本標識システムは、ターゲットシグナルを提供するのにより有用である。
【０２９６】
本発明の好ましい具現例によると、ターゲットシグナルは、伸長反応の間に伸長二本鎖内に挿入された単一標識により提供され、挿入された単一標識は、伸長反応の間に挿入されたヌクレオチドに連結されており、工程（ｄ）における断片の伸長は、単一標識からのシグナルの変化を誘導し、工程（ｄ）におけるターゲットシグナルを提供する。
【０２９７】
本発明の好ましい具現例によると、図１１で図式的に示すように、伸長反応の間に挿入されたヌクレオチドは、第１非天然塩基を有し、ＣＴＯは、第１非天然塩基に対して特異的結合親和性のある第２非天然塩基を有するヌクレオチドを有する。好ましくは、第２非天然塩基を有するヌクレオチドは、ＣＴＯのテンプレーティング部位の如何なる位置にも位置できる。
【０２９８】
伸長反応の間に伸長二本鎖内に挿入された標識を利用する場合、ハイブリッド形成物は伸長されないため、標識は非切断ＰＴＯ及びＣＴＯ間のハイブリッド形成物内に含まれない。したがって、ハイブリッド形成物は、非ターゲットシグナルを提供しない。
【０２９９】
（ｉｉｉ）伸長二本鎖内に挿入された標識と断片又はＣＴＯに連結された標識
図４及び５で図式的に示すように、本発明は、伸長反応の間に伸長二本鎖内に挿入された標識と断片及び／又はＣＴＯに連結された標識の組み合わせを利用した標識システムを利用することができる。
【０３００】
本発明の好ましい具現例によると、ターゲットシグナルは、伸長反応の間に伸長二本鎖内に挿入された標識と断片及び／又はＣＴＯに連結された標識により提供され、前記挿入された標識は、伸長反応の間に挿入されたヌクレオチドに連結されており、前記二つの標識は、レポーター分子及びクエンチャー分子の相互作用的二重標識であり、工程（ｄ）における断片の伸長は、相互作用的二重標識からのシグナルの変化を誘導し、ターゲットシグナルを提供する。
【０３０１】
より好ましくは、伸長反応の間に挿入されたヌクレオチドは、第１非天然塩基を有し、ＣＴＯは、第１非天然塩基に対して特異的結合親和性のある第２非天然塩基を有するヌクレオチドを有する。
【０３０２】
好ましくは、工程（ｅ）において提供されるターゲットシグナルは、工程（ｄ）の相互作用的二重標識からのシグナルである。
【０３０３】
伸長反応の間に伸長二本鎖内に挿入された標識を利用する場合、ハイブリッド形成物は伸長されないため、標識は非切断ＰＴＯ及びＣＴＯ間のハイブリッド形成物内に含まれない。したがって、ハイブリッド形成物は、非ターゲットシグナルを提供しない。
【０３０４】
（ｉｖ）インターカレーティング標識（Ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ  ｌａｂｅｌ）
本発明は、伸長二本鎖の存在を示すターゲットシグナルを提供するインターカレーティング標識を使用することができる。試料内二本鎖核酸分子がシグナルを発生させることができるため、固定化されたＣＴＯを利用する固相反応では、インターカレーティング標識がより有用である。
【０３０５】
例示された具現例は、図１３を参考して説明される。ターゲット核酸配列にハイブリッド形成されたＰＴＯは切断されて断片を放出する。前記断片は、ＣＴＯにハイブリッド形成される。インターカレーティング染料（例えば、ＳＹＢＲＴＭ  Ｇｒｅｅｎ）の存在下で伸長が実施され、インターカレーティング染料を含む伸長二本鎖が生成される。
【０３０６】
図１３において、非切断ＰＴＯ及びＣＴＯ間のハイブリッド形成物は、非ターゲットシグナルを提供し（図１３のＣ及びＤ）、非ターゲットシグナルを除去するために、ハイブリッド形成物を解離させることが必要である。したがって、ターゲットシグナルを測定する温度は、ハイブリッド形成物のＴｍ値を考慮して決定される。
【０３０７】
好ましくは、工程（ｅ）において提供されるターゲットシグナルは、インターカレーティング染料から出るシグナルである。
【０３０８】
本発明の好ましい具現例によると、ＰＴＯ及び／又はＣＴＯは、その３’−末端がブロッキングされ、伸長が防止される。
【０３０９】
本発明の好ましい具現例によると、上流オリゴヌクレオチドは、上流プライマー又は上流プローブである。
【０３１０】
本発明の好ましい具現例によると、上流オリゴヌクレオチドは、５’−ヌクレアーゼ活性を有する前記酵素によるＰＴＯの切断を誘導する程度にＰＴＯに近接して位置する。
【０３１１】
本発明の好ましい具現例によると、上流プライマーは、その伸長鎖を通じて、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素によるＰＴＯの切断を誘導する。
【０３１２】
本発明の好ましい具現例によると、前記方法は、工程（ａ）−（ｂ）、（ａ）−（ｄ）又は（ａ）−（ｅ）を反復する工程と、その反復サイクルの間に変性過程とをさらに含む。
【０３１３】
本発明の好ましい具現例によると、工程（ａ）−（ｂ）又は（ｃ）−（ｅ）は、一つの反応容器又は個別反応容器で実施される。
【０３１４】
本発明の好ましい具現例によると、前記方法は、少なくとも２種のターゲット核酸配列を検出するために行われ、前記上流オリゴヌクレオチドは、少なくとも２種のオリゴヌクレオチドを含み、ＰＴＯは、少なくとも２種のＰＴＯを含み、ＣＴＯは、少なくとも１種のＣＴＯを含み、前記少なくとも２種のターゲット核酸配列が存在する場合、前記方法は、少なくとも２種のターゲット核酸配列に対応する少なくとも２種のターゲットシグナルを提供する。
【０３１５】
本発明の好ましい具現例によると、上流オリゴヌクレオチドは、上流プライマーであり、前記上流プライマーの伸長のために、工程（ｂ）では鋳型依存的核酸ポリメラーゼを利用する。
【０３１６】
本発明の好ましい具現例によると、ＣＴＯは、その５’−末端又は３’−末端を介して固相基質上に固定化され、前記固相基質で提供されるターゲットシグナルを測定する。
【０３１７】
本発明の好ましい具現例によると、ターゲットシグナルは、断片に連結された単一標識、又は伸長反応の間に伸長二本鎖内に挿入された単一標識により提供される。
【０３１８】
本発明の好ましい具現例によると、前記方法は、下流プライマーの存在下で行われる。
【０３１９】
工程（ｅ）の検出は、リアルタイム方式、エンド−ポイント方式又は指定時間間隔方式で実施することができる。本発明が工程（ａ）−（ｂ）、（ａ）−（ｄ）又は（ａ）−（ｅ）を反復する工程を追加的に含む場合、指定温度における前記反復の各サイクルにおいて（即ち、リアルタイム方式）、指定温度における前記反復の終了時点で（即ち、エンド−ポイント方式）又は指定温度における前記反復の間、指定時間間隔のそれぞれでシグナル検出が実施されることが好ましい。好ましくは、前記検出は、リアルタイム方式で前記反復の各サイクルで実施して、検出の正確性と定量化を改善することができる。
【０３２０】
ＩＶ．ターゲット検出のためのキット
本発明の他の様態によると、本発明は、
（ａ）ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を含む上流オリゴヌクレオチドと、
（ｂ）ＰＴＯ（プロービング及びタギングオリゴヌクレオチド、Ｐｒｏｂｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔａｇｇｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅであって、前記ＰＴＯは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を含む３’−ターゲッティング部位及び（ｉｉ）前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’−タギング部位を含み、前記３’−ターゲッティング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリッド形成され、前記５’−タギング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリッド形成されず、前記上流オリゴヌクレオチドは、前記ＰＴＯの上流に位置し、前記上流オリゴヌクレオチド又はその伸長鎖は、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による前記ＰＴＯの切断を誘導し、このような前記切断は、前記ＰＴＯの前記５’−タギング部位又は前記５’−タギング部位の一部を含む断片を放出する前記ＰＴＯと、
（ｃ）ＣＴＯ（キャプチャリング及びテンプレーティングオリゴヌクレオチド、Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）であって、前記ＣＴＯは、３’→５’方向に（ｉ）前記ＰＴＯの５’−タギング部位又は前記５’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位及び（ｉｉ）前記ＰＴＯの５’−タギング部位及び前記３’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み、前記ＰＴＯから放出された前記断片は、前記ＣＴＯの前記キャプチャリング部位にハイブリッド形成され、そして、前記ＣＴＯの前記キャプチャリング部位にハイブリッド形成された前記断片は、鋳型依存的核酸ポリメラーゼにより伸長されて伸長二本鎖を形成する前記ＣＴＯと、
を含む、ＰＴＯＣＥ（ＰＴＯ切断及び伸長）アッセイによりＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出するためのキットを提供する。
【０３２１】
本発明のキットは、上述の本発明の検出方法を実施できるように構成されたものであるため、その共通する内容は、本明細書の過度なる複雑性を避けるために、その記載を省く。
【０３２２】
本発明の好ましい具現例によると、前記キットは、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素をさらに含む。
【０３２３】
本発明の好ましい具現例によると、前記キットは、鋳型依存的核酸ポリメラーゼをさらに含む。
【０３２４】
本発明の好ましい具現例によると、前記ＰＴＯ及び／又は前記ＣＴＯは、少なくとも一つの標識を有する。
【０３２５】
本発明の好ましい具現例によると、前記キットは、前記伸長反応の間に前記伸長二本鎖内に挿入される標識をさらに含む。
【０３２６】
本発明の好ましい具現例によると、前記キットは、伸長反応の間に伸長二本鎖内に挿入される標識をさらに含み、前記ＰＴＯ及び／又はＣＴＯは、少なくとも一つの標識を有する。
【０３２７】
本発明の好ましい具現例によると、前記キットは、インターカレーティング標識をさらに含む。
【０３２８】
本発明の好ましい具現例によると、前記標識は、単一標識又は相互作用的二重標識である。
【０３２９】
本発明の好ましい具現例によると、前記キットは、少なくとも２種のターゲット核酸配列の検出に利用され、上流オリゴヌクレオチドは、少なくとも２種のオリゴヌクレオチドを含み、ＰＴＯは、少なくとも２種のＰＴＯを含み、ＣＴＯは、少なくとも２種のＣＴＯを含む。
【０３３０】
本発明の好ましい具現例によると、前記ＣＴＯは、その５’−末端又は３’−末端を介して固相基質上に固定化される。
【０３３１】
本発明の好ましい具現例によると、前記キットは、下流プライマーをさらに含む。
【０３３２】
本明細書で詳述した本発明のキットは、バッファー、ＤＮＡポリメラーゼ助因子及びデオキシリボヌクレオチド−５−トリホスフェートのようなターゲット増幅ＰＣＲ反応（例えば、ＰＣＲ反応）に必要な試薬を選択的に含むことができる。選択的に、本発明のキットは、多様なポリヌクレオチド分子、逆転写酵素、多様なバッファー及び試薬、及びＤＮＡポリメラーゼ活性を抑制する抗体を含むことができる。また、キットは、陽性対照群及び陰性対照群反応を実施するに必須的な試薬を含むことができる。特定反応で使用される試薬の最適量は、本明細書の開示事項を習得した当業者により容易に決定できる。典型的に、本発明のキットは、上記言及された構成成分を含む別途の包装又は区分で製作される。
【０３３３】
本発明の特徴及び利点を要約すると、下記の通りである：
（ａ）本発明は、ターゲット核酸配列にハイブリッド形成されたＰＴＯ（プロービング及びタギングオリゴヌクレオチド、Ｐｒｏｂｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔａｇｇｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）が切断されて断片を放出し、前記断片は、ＣＴＯ（キャプチャリング及びテンプレーティングオリゴヌクレオチド、Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）にハイブリッド形成されて伸長二本鎖を形成するターゲット−依存的伸長二本鎖を提供する。伸長二本鎖は、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナル（シグナル発生又は消滅）又はシグナル変化（シグナル増加又は減少）を提供する。
（ｂ）伸長二本鎖の存在は、メルティングカーブ及び指定温度における検出（例えば、リアルタイム方式及びエンド−ポイント方式）のような多様な方法又は過程により決定される。
（ｃ）本発明は、一種類の標識（例えば、ＦＡＭ）のみを利用するとしても、メルティングカーブ分析により少なくとも２種のターゲット核酸配列を同時的に検出する。その反面、液相で実施される従来マルチプレックスリアルタイム方式は、検出可能な蛍光標識の数に係わる限界により、深刻な問題が生じる。本発明は、このような短所を成功的に克服し、マルチプレックスリアルタイム検出の応用を広めた。
（ｄ）本発明は、多数の標識システムを利用して実施できる。例えば、ＰＴＯ及び／又はＣＴＯの如何なる位置にも連結される標識は、伸長二本鎖を示すターゲットシグナルを提供するに利用できる。また、伸長反応の間に伸長二本鎖内に挿入された標識を本発明に利用できる。それだけではなく、このような標識の組み合わせを利用することができる。本発明に適用可能な多目的の標識システムは、実験的条件又は目的によって適した標識システムを選択するようになる。
（ｅ）本発明は、（ｉ）前記断片の配列及び／又は長さ、（ｉｉ）前記ＣＴＯの配列及び／又は長さ又は（ｉｉｉ）前記断片の前記配列及び／又は長さと前記ＣＴＯの前記配列及び／又は長さにより調節可能な指定Ｔｍ値を有するターゲット−依存的伸長二本鎖を提供する。
（ｆ）増幅産物を利用する従来のメルティングカーブ分析は、増幅産物の配列に依存し、これにより増幅産物の所望のＴｍ値を得ることが非常に難しかった。その反面、本発明は、増幅産物の配列ではなく、伸長二本鎖の配列に依存し、伸長二本鎖の所望のＴｍ値を選択することができる。したがって、本発明は、複数のターゲット配列を検出するに容易に適用することができる。
（ｇ）標識プローブ及びターゲット核酸配列間の直接的なハイブリッド形成を利用する従来メルティングカーブ分析は、プローブの非特異的ハイブリッド形成により、擬陽性シグナルが発生する可能性が高い。その反面、本発明は、ＰＴＯハイブリッド形成だけではなく、酵素的切断及び伸長を利用して、擬陽性シグナルの問題を完璧に克服した。
（ｈ）従来のメルティングカーブ分析のＴｍ値は、ターゲット核酸配列の配列変異による影響を受ける。しかし、本発明の伸長二本鎖は、ターゲット核酸配列の配列変異に関係なく、一定なＴｍ値を提供し、メルティングカーブ分析の卓越な正確性を保証する。
（ｉ）ＰＴＯの５’−タギング部位の配列及びＣＴＯの配列は、ターゲット核酸配列を考慮することなく選択することができるということは、注目すべきことである。これは、ＰＴＯの５’−タギング部位及びＣＴＯに対する配列全体を事前デザイン可能にする。ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位は、ターゲット核酸配列を考慮して製作しなければならないが、ＣＴＯは、ターゲット核酸配列の情報又はターゲット核酸配列に対する考慮無しに、既存の方式（ｒｅａｄｙ−ｍａｄｅ  ｆａｓｈｉｏｎ）で製作することができる。このような特徴は、マルチプレックスターゲット検出、特に、固相基質上に固定化されたＣＴＯを利用するマイクロアレイ上で格別な利点を提供する。
【０３３４】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとっては自明なことであろう。
【実施例】
【０３３５】
実施例１：  ＰＴＯＣＥ（Ｐｒｏｂｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔａｇｇｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ＆  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）アッセイの評価
伸長二本鎖がターゲット核酸配列の検出のためのターゲットシグナルを提供できるかを実験し、本発明の新規なアッセイであるＰＴＯＣＥ（ＰＴＯ切断及び伸長）を評価した。
【０３３６】
この評価のために、メルティング分析により伸長二本鎖の存在を検出するＰＴＯＣＥアッセイ（メルティング分析を含むＰＴＯＣＥアッセイ）を行った。本発明者らは、上流プライマーの伸長、ＰＴＯの切断及びＰＴＯ断片の伸長のために、５’ヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを利用した。
【０３３７】
アッセイを実施する間に形成された伸長二本鎖は、相互作用的二重標識を有するようにデザインした。伸長二本鎖の相互作用的二重標識は、（ｉ）レポーター分子及びクエンチャー分子で標識されたＣＴＯ（二重標識ＣＴＯ）又は（ｉｉ）クエンチャー分子を有するＰＴＯ及びレポーター分子を有するＣＴＯ（クエンチャー−標識ＰＴＯ及びレポーター−標識ＣＴＯ）により提供した。ＰＴＯ及びＣＴＯの３’末端は、カーボンスペーサー（ｃａｒｂｏｎ  ｓｐａｃｅｒ）でブロッキングした。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＮＧ）遺伝子に対する合成オリゴヌクレオチドをターゲット鋳型として利用した。
【０３３８】
１−１．  二重標識ＣＴＯを利用したＰＴＯＣＥアッセイ
ＰＴＯは、標識を有しない。ＣＴＯは、そのテンプレーティング（ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ）部位にクエンチャー分子（ＢＨＱ−１）及び蛍光レポーター分子（ＦＡＭ）を有する。本実施例で利用された合成鋳型、上流プライマー、ＰＴＯ及びＣＴＯの配列は、下記の通りである：
ＮＧ−Ｔ  ５’−ＡＡＡＴＡＴＧＣＧＡＡＡＣＡＣＧＣＣＡＡＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴＧＡＴＧＣＴＴＴＣＴＴＴＴＴＧＴＴＣＴＴＧＣＴＣＧＧＣＡＧＡＧＣＧＡＧＴＧＡＴＡＣＣＧＡＴＣＣＡＴＴＧＡＡＡＡＡ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １）
ＮＧ−Ｒ  ５’−ＣＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＣＧＣ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）
ＮＧ−ＰＴＯ−１  ５’−ＡＣＧＡＣＧＧＣＴＴＧＧＣＴＧＣＣＣＣＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧ［Ｃ３  ｓｐａｃｅｒ］−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）
ＮＧ−ＣＴＯ−１  ５’−［ＢＨＱ−１］ＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣ［Ｔ（ＦＡＭ）］ＣＣＡＧＴＡＡＡＧＣＣＡＡＧＣＣＧＴＣＧＴ［Ｃ３  Ｓｐａｃｅｒ］−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）
（下線を引いた文字は、ＰＴＯの５’−タギング（ｔａｇｇｉｎｇ）部位を示す）
【０３３９】
ＮＧ遺伝子に対する合成鋳型（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）２ｐｍｏｌｅ、上流プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）１０ｐｍｏｌｅ、ＰＴＯ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）５ｐｍｏｌｅ、ＣＴＯ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）２ｐｍｏｌｅ、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  含有した２×マスターミックス１０μＬ、ｄＮＴＰｓ  ２００μＭ及びＨ−Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｏｌｇｅｎｔ、Ｋｏｒｅａ）１．６ｕｎｉｔを含有した２０μＬの最終容量で反応を実施した；前記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイムサーマルサイクラー（ＣＦＸ９６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に配置した；前記反応混合物を９５℃で１５分間変性し、９５℃で３０秒間、６０℃で６０秒間の過程を３０回繰り返した。反応後、反応混合物を３５℃に冷却し、３５℃で３０秒間維持させた後、３５℃から９０℃に徐々に加熱させることにより、メルティングカーブを得た。温度が上昇する間、蛍光を連続的に測定し、二本鎖ＤＮＡの解離をモニタリングした。メルティングピークは、メルティングカーブデータ由来である。
【０３４０】
図１４から分かるように、鋳型がある場合、伸長二本鎖の予想Ｔｍ値に対応する７６．５℃でピークが検出された。鋳型がない場合は、ピークが検出されなかった。本標識方法において、非切断ＰＴＯ及びＣＴＯ間のハイブリッド形成物（ｈｙｂｒｉｄ）は、如何なるシグナルも提供しないため、非切断ＰＴＯ及びＣＴＯ間のハイブリッド形成物に対応するピークは検出されなかった。ＰＴＯが存在しないか、あるいはＣＴＯが存在しない場合、如何なるピークも観察されなかった。
【０３４１】
１−２．クエンチャー−標識ＰＴＯ及びレポーター−標識ＣＴＯを利用したＰＴＯＣＥアッセイ
ＰＴＯは、その５’−末端をクエンチャー分子（ＢＨＱ−１）で標識した。ＣＴＯは、その３’−末端を蛍光レポーター分子（ＦＡＭ）で標識した。
【０３４２】
本実施例で利用された合成鋳型、上流プライマー、ＰＴＯ及びＣＴＯの配列は、下記の通りである：
ＮＧ−Ｔ  ５’−
ＡＡＡＴＡＴＧＣＧＡＡＡＣＡＣＧＣＣＡＡＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴＧＡＴＧＣＴＴＴＣＴＴＴＴＴＧＴＴＣＴＴＧＣＴＣＧＧＣＡＧＡＧＣＧＡＧＴＧＡＴＡＣＣＧＡＴＣＣＡＴＴＧＡＡＡＡＡ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）
ＮＧ−Ｒ  ５’−ＣＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＣＧＣ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）
ＮＧ−ＰＴＯ−２  ５’−  ［ＢＨＱ−１］ＡＣＧＡＣＧＧＣＴＴＧＧＣＴＴＴＡＣＴＧＣＣＣＣＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧ［Ｃ３  ｓｐａｃｅｒ］−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）
ＮＧ−ＣＴＯ−２  ５’−ＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＡＧＴＡＡＡＧＣＣＡＡＧＣＣＧＴＣＧＴ［ＦＡＭ］−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）
（下線を引いた文字は、ＰＴＯの５’−タギング（ｔａｇｇｉｎｇ）部位を示す）
【０３４３】
ＮＧ遺伝子に対する合成鋳型（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）２ｐｍｏｌｅ、上流プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）１０ｐｍｏｌｅ、ＰＴＯ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）５ｐｍｏｌｅ、ＣＴＯ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）２ｐｍｏｌｅ、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  含有した２×マスターミックス１０μＬ、ｄＮＴＰｓ  ２００μＭ及びＨ−Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｏｌｇｅｎｔ、Ｋｏｒｅａ）１．６ｕｎｉｔを含有した２０μＬの最終容量で反応を実施した；前記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイムサーマルサイクラー（ＣＦＸ９６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に配置した；前記反応混合物を９５℃で１５分間変性し、９５℃で３０秒、６０℃で６０秒間及び７２℃で３０秒間の過程を３０回繰り返した。反応後、反応混合物を３５℃に冷却し、３５℃で３０秒間維持させた後、３５℃から９０℃に徐々に加熱させることにより、メルティングカーブを得た。温度が上昇する間、蛍光を連続的に測定し、二本鎖ＤＮＡの解離をモニタリングした。メルティングピークは、メルティングカーブデータ由来である。
【０３４４】
図１５から分かるように、鋳型がある場合、伸長二本鎖の予想Ｔｍ値に対応する７７℃でピークが検出された。本標識方法において、非切断ＰＴＯ及びＣＴＯ間のハイブリッド形成物は、非ターゲットシグナルを提供するため、非切断ＰＴＯ及びＣＴＯ間のハイブリッド形成物の予想Ｔｍ値に対応する６４．０℃〜６４．５℃でピークが表れた。ＰＴＯが存在しないか、あるいはＣＴＯが存在しない場合、如何なるピークも観察されなかった
【０３４５】
これらの結果は、ターゲット−依存的な伸長二本鎖が生成され、前記伸長二本鎖は、ターゲット核酸配列の存在を示すターゲットシグナルを提供するということを示す。
【０３４６】
実施例２：伸長二本鎖Ｔｍ値の調節
本発明者らは、ＰＴＯＣＥアッセイにおいて、伸長二本鎖のＴｍ値がＣＴＯの配列により調節可能であるかを追加的に実験した。
【０３４７】
本実験のために、本発明者らは、テンプレーティング部位に異なる配列を有する３種のＣＴＯを利用した。ＰＴＯは、標識を有しない。３種のＣＴＯは、そのテンプレーティング部位にクエンチャー分子（ＢＨＱ−１）及び蛍光レポーター分子（ＦＡＭ）を有する。ＰＴＯ及びＣＴＯの３’−末端は、カーボンスペーサー（ｃａｒｂｏｎ  ｓｐａｃｅｒ）でブロッキングした。
【０３４８】
３種のＣＴＯのそれぞれを利用して、メルティング分析を含むＰＴＯＣＥアッセイを実施した。
【０３４９】
本実施例で利用された合成鋳型、上流プライマー、ＰＴＯ及びＣＴＯの配列は、下記の通りである：
ＮＧ−Ｔ  ５’−ＡＡＡＴＡＴＧＣＧＡＡＡＣＡＣＧＣＣＡＡＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴＧＡＴＧＣＴＴＴＣＴＴＴＴＴＧＴＴＣＴＴＧＣＴＣＧＧＣＡＧＡＧＣＧＡＧＴＧＡＴＡＣＣＧＡＴＣＣＡＴＴＧＡＡＡＡＡ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）
ＮＧ−Ｒ  ５’−ＣＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＣＧＣ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）
ＮＧ−ＰＴＯ−３  ５’−ＡＣＧＡＣＧＧＣＴＴＧＧＣＣＣＣＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧ［Ｃ３  ｓｐａｃｅｒ］  −３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）
ＮＧ−ＣＴＯ−１  ５’−［ＢＨＱ−１］ＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣ［Ｔ（ＦＡＭ）］ＣＣＡＧＴＡＡＡＧＣＣＡＡＧＣＣＧＴＣＧＴ［Ｃ３  Ｓｐａｃｅｒ］  −３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）
ＮＧ−ＣＴＯ−３  ５’−［ＢＨＱ−１］ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＣＴＣＣＴＣＣＡＧ［Ｔ（ＦＡＭ）］ＡＡＡＧＣＣＡＡＧＣＣＧＴＣＧＴ［Ｃ３  Ｓｐａｃｅｒ］  −３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）
ＮＧ−ＣＴＯ−４  ５’−［ＢＨＱ−１］ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＧ［Ｔ（ＦＡＭ）］ＡＡＡＧＣＣＡＡＧＣＣＧＴＣＧＴ［Ｃ３  Ｓｐａｃｅｒ］  −３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）
（下線を引いた文字は、ＰＴＯの５’−タギング（ｔａｇｇｉｎｇ）部位を示す）
【０３５０】
ＮＧ遺伝子に対する合成鋳型（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）２ｐｍｏｌｅ、上流プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）１０ｐｍｏｌｅ、ＰＴＯ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）５ｐｍｏｌｅ、ＣＴＯ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、８又は９）２ｐｍｏｌｅ、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  含有した２×マスターミックス１０μＬ、ｄＮＴＰｓ  ２００μＭ及びＨ−Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｏｌｇｅｎｔ、Ｋｏｒｅａ）１．６ｕｎｉｔを含有した２０μＬの最終容量で反応を実施した；前記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイムサーマルサイクラー（ＣＦＸ９６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に配置した；前記反応混合物を９５℃で１５分間変性し、９５℃で３０秒間、６０℃で６０秒間の過程を３０回繰り返した。反応後、反応混合物を３５℃に冷却し、３５℃で３０秒間維持させた後、３５℃から９０℃に徐々に加熱させることにより、メルティングカーブを得た。温度が上昇する間、蛍光を連続的に測定し、二本鎖ＤＮＡの解離をモニタリングした。メルティングピークは、メルティングカーブデータ由来である。
【０３５１】
図１６に示されているように、鋳型がある場合、７６．０℃、６９．０℃、又は６４．５℃でピークが検出された。それぞれのピークは、実験対象のＣＴＯによる伸長二本鎖の予想Ｔｍ値に対応する。
【０３５２】
これらの結果は、伸長二本鎖のＴｍ値がＣＴＯの配列により調節可能であることを示す。
【０３５３】
実施例３：リアルタイム検出又はメルティング分析を含む、ＰＴＯＣＥを利用したターゲット核酸配列の検出
本発明者らは、ＰＴＯＣＥアッセイがリアルタイムＰＣＲ方式（ｉ）又はポスト−ＰＣＲメルティング分析方式（ｉｉ）でターゲット核酸配列を検出できるかを実験した：（ｉ）ＰＴＯの切断及びＰＴＯ断片の伸長は、ＰＣＲ過程によりターゲット核酸の増幅を伴い、伸長二本鎖の存在を、各サイクルの指定温度で検出した（指定温度におけるリアルタイム検出を含むＰＴＯＣＥアッセイ）；又は（ｉｉ）ＰＴＯの切断及びＰＴＯ断片の伸長は、ＰＣＲ過程によりターゲット核酸の増幅を伴い、伸長二本鎖の存在を、ポスト−ＰＣＲメルティング分析により検出した（メルティング分析を含むＰＴＯＣＥアッセイ）。
【０３５４】
上流プライマーは、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素によるＰＴＯ切断と関与し、また、下流プライマーと共にＰＣＲ過程によるターゲット核酸配列増幅にも関与する。上流プライマーと下流プライマーの伸長、ＰＴＯの切断及びＰＴＯ断片の伸長に５’ヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを利用した。
【０３５５】
伸長二本鎖は、相互作用的二重標識を有するようにデザインした。伸長二本鎖の相互作用的二重標識は、（ｉ）レポーター分子及びクエンチャー分子で標識されたＣＴＯ、（ｉｉ）伸長反応の間に挿入されたクエンチャー−ｉｓｏ−ｄＧＴＰ及びレポーター分子とｉｓｏ−ｄＣ残基を有するＣＴＯ又は（ｉｉｉ）クエンチャー分子を有するＰＴＯ及びレポーター分子を有するＣＴＯにより提供された。ＰＴＯ及びＣＴＯの３’末端は、カーボンスペーサー（ｃａｒｂｏｎ  ｓｐａｃｅｒ）でブロッキングした。
【０３５６】
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＮＧ）のゲノムＤＮＡをターゲット核酸として利用した。
【０３５７】
３−１．二重標識ＣＴＯを利用したＰＴＯＣＥアッセイ
ＰＴＯは、標識を有せず、ＣＴＯは、そのテンプレーティング部位にクエンチャー分子（ＢＨＱ−１）及び蛍光レポーター分子（ＦＡＭ）を有する。
【０３５８】
本実施例で利用された上流プライマー、下流プライマー、ＰＴＯ及びＣＴＯの配列は、下記の通りである：
ＮＧ−Ｆ  ５’−ＴＡＣＧＣＣＴＧＣＴＡＣＴＴＴＣＡＣＧＣＴ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）
ＮＧ−Ｒ  ５’−ＣＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＣＧＣ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）
ＮＧ−ＰＴＯ−３  ５’−ＡＣＧＡＣＧＧＣＴＴＧＧＣＣＣＣＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧ［Ｃ３  ｓｐａｃｅｒ］  −３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）
ＮＧ−ＣＴＯ−１  ５’−［ＢＨＱ−１］ＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣ［Ｔ（ＦＡＭ）］ＣＣＡＧＴＡＡＡＧＣＣＡＡＧＣＣＧＴＣＧＴ［Ｃ３  Ｓｐａｃｅｒ］  −３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）
（下線を引いた文字は、ＰＴＯの５’−タギング（ｔａｇｇｉｎｇ）部位を示す）
【０３５９】
３−１−１．指定温度におけるリアルタイム検出を含むＰＴＯＣＥアッセイ
ＮＧのゲノムＤＮＡ  １００ｐｇ、下流プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）１０ｐｍｏｌｅ、上流プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）１０ｐｍｏｌｅ、ＰＴＯ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）５ｐｍｏｌｅ、ＣＴＯ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）２ｐｍｏｌｅ、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  含有した２×マスターミックス１０μＬ、ｄＮＴＰｓ  ２００μＭ及びＨ−Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｏｌｇｅｎｔ、Ｋｏｒｅａ）１．６ｕｎｉｔを含有した２０μＬの最終容量で反応を実施した；前記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイムサーマルサイクラー（ＣＦＸ９６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に配置した；前記反応混合物を９５℃で１５分間変性し、９５℃で３０秒間、６０℃で６０秒間、７２℃で３０秒間の過程を６０回繰り返した。各サイクルの６０℃でシグナルを検出した。伸長二本鎖が二本鎖形態を維持する範囲で検出温度を決定した。
【０３６０】
図１７Ａから分かるように、鋳型がある場合、ターゲットシグナル（Ｃｔ  ３１．３６）が検出された。鋳型がない場合は、如何なるシグナルも検出されなかった。
【０３６１】
３−１−２．メルティング分析を含むＰＴＯＣＥアッセイ
実施例３−１−１の反応後、反応混合物を３５℃に冷却し、３５℃で３０秒間維持させた後、３５℃から９０℃に徐々に加熱させることにより、メルティングカーブを得た。温度が上昇する間、蛍光を連続的に測定し、二本鎖ＤＮＡの解離をモニタリングした。メルティングピークは、メルティングカーブデータ由来である。
【０３６２】
図１７Ｂから分かるように、鋳型がある場合、伸長二本鎖の予想Ｔｍ値に対応する７６．０℃でピークが検出された。鋳型がない場合は、如何なるピークも検出されなかった。本標識方法において、非切断ＰＴＯ及びＣＴＯ間のハイブリッド形成物は、如何なるシグナルも提供しないため、非切断ＰＴＯ及びＣＴＯ間のハイブリッド形成物に対応するピークは検出されなかった。
【０３６３】
３−２．クエンチャー−ｉｓｏ−ｄＧＴＰ及びｉｓｏ−ｄＣ残基を有するレポーター−標識ＣＴＯを利用したＰＴＯＣＥアッセイ
ＰＴＯは、標識を有しない。ＣＴＯは、その５’−末端にレポーター分子（ＦＡＭ）及びｉｓｏ−ｄＣ残基を有する。ＰＴＯ断片の伸長反応の間、クエンチャー分子（ｄａｂｃｙｌ）で標識されたｉｓｏ−ｄＧＴＰは、ｉｓｏ−ｄＣ残基に対して相補的な位置に挿入される。
【０３６４】
本実施例で利用された上流プライマー、下流プライマー、ＰＴＯ及びＣＴＯの配列は、下記の通りである：
ＮＧ−Ｆ  ５’−ＴＡＣＧＣＣＴＧＣＴＡＣＴＴＴＣＡＣＧＣＴ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）
ＮＧ−Ｒ  ５’−ＣＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＣＧＣ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）
ＮＧ−ＰＴＯ−１  ５’−ＡＣＧＡＣＧＧＣＴＴＧＧＣＴＧＣＣＣＣＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧ［Ｃ３  ｓｐａｃｅｒ］  −３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）
ＮＧ−ＣＴＯ−５  ５’−［ＦＡＭ］［Ｉｓｏ−ｄＣ］ＣＴＣＣＴＣＣＡＧＴＡＡＡＧＣＣＡＡＧＣＣＧＴＣＧＴ［Ｃ３  ｓｐａｃｅｒ］  −３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）
（下線を引いた文字は、ＰＴＯの５’−タギング（ｔａｇｇｉｎｇ）部位を示す）
【０３６５】
３−２−１．指定温度におけるリアルタイム検出を含むＰＴＯＣＥアッセイ
ＮＧのゲノムＤＮＡ  １００ｐｇ、下流プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）１０ｐｍｏｌｅ、上流プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）１０ｐｍｏｌｅ、ＰＴＯ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）５ｐｍｏｌｅ、ＣＴＯ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）２ｐｍｏｌｅ及び２×プレクサー（登録商標）マスターミックス（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ４１００、Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）１０μＬを含有した２０μＬの最終容量で反応を実施した；前記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイムサーマルサイクラー（ＣＦＸ９６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に配置した；前記反応混合物を９５℃で１５分間変性し、９５℃で３０秒間、６０℃で６０秒間、７２℃で３０秒間の過程を６０回及び７２℃で３０秒間、５５℃で３０秒間の過程を５回繰り返した。各サイクルの６０℃でシグナルを検出した。伸長二本鎖が二本鎖形態を維持する範囲で検出温度を決定した。
【０３６６】
プレクサー（登録商標）マスターミックス内の５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを、上流プライマーと下流プライマーの伸長、ＰＴＯの切断及びＰＴＯ断片の伸長に利用した。
【０３６７】
図１８Ａから分かるように、鋳型がある場合、ターゲットシグナル（Ｃｔ  ３３．０３）が検出された。鋳型がない場合は、如何なるシグナルも検出されなかった。
【０３６８】
３−２−２．メルティング分析を含むＰＴＯＣＥアッセイ
実施例３−２−１の反応後、反応混合物を３５℃に冷却し、３５℃で３０秒間維持させた後、３５℃から９０℃に徐々に加熱させることにより、メルティングカーブを得た。温度が上昇する間、蛍光を連続的に測定し、二本鎖ＤＮＡの解離をモニタリングした。メルティングピークは、メルティングカーブデータ由来である。
【０３６９】
図１８Ｂから分かるように、鋳型がある場合、伸長二本鎖の予想Ｔｍ値に対応する７０．０℃でピークが検出された。鋳型がない場合は、如何なるピークも検出されなかった。本標識方法において、非切断ＰＴＯ及びＣＴＯ間のハイブリッド形成物は、如何なるシグナルも提供しないため、非切断ＰＴＯ及びＣＴＯ間のハイブリッド形成物に対応するピークは検出されなかった。
【０３７０】
３−３．クエンチャー−標識ＰＴＯ及びレポーター−標識ＣＴＯを利用したＰＴＯＣＥアッセイ
ＰＴＯの５’−末端は、クエンチャー分子（ＢＨＱ−１）で標識した。ＣＴＯの３’−末端は、蛍光レポーター分子（ＦＡＭ）で標識した。
【０３７１】
本実施例で利用された上流プライマー、下流プライマー、ＰＴＯ及びＣＴＯの配列は、下記の通りである：
ＮＧ−Ｆ  ５’−ＴＡＣＧＣＣＴＧＣＴＡＣＴＴＴＣＡＣＧＣＴ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）
ＮＧ−Ｒ  ５’−ＣＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＣＧＣ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）
ＮＧ−ＰＴＯ−４  ５’−［ＢＨＱ−１］ＡＣＧＡＣＧＧＣＴＴＧＣＣＣＣＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧ［Ｃ３  ｓｐａｃｅｒ］−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）
ＮＧ−ＣＴＯ−２  ５’−ＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＡＧＴＡＡＡＧＣＣＡＡＧＣＣＧＴＣＧＴ［ＦＡＭ］−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）
（下線を引いた文字は、ＰＴＯの５’−タギング（ｔａｇｇｉｎｇ）部位を示す）
【０３７２】
３−３−１．指定温度におけるリアルタイム検出を含むＰＴＯＣＥアッセイ
ＮＧゲノムＤＮＡ  １００ｐｇ、下流プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）１０ｐｍｏｌｅ、上流プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）１０ｐｍｏｌｅ、ＰＴＯ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）５ｐｍｏｌｅ、ＣＴＯ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）２ｐｍｏｌｅ、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  含有した２×マスターミックス１０μＬ、ｄＮＴＰｓ  ２００μＭ及びＨ−Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｏｌｇｅｎｔ、Ｋｏｒｅａ）１．６ｕｎｉｔを含有した２０μＬの最終容量で反応を実施した；前記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイムサーマルサイクラー（ＣＦＸ９６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に配置した；前記反応混合物を９５℃で１５分間変性し、９５℃で３０秒間、６０℃で６０秒間、７２℃で３０秒間の過程を６０回繰り返した。各サイクルの６０℃でシグナルを検出した。伸長二本鎖が二本鎖形態を維持する範囲で検出温度を決定し、前記温度は、非切断ＰＴＯ及びＣＴＯ間のハイブリッド形成物のＴｍ値より高い。
【０３７３】
図１９Ａから分かるように、鋳型がある場合、ターゲットシグナル（Ｃｔ  ２９．７９）が検出された。鋳型がない場合は、如何なるシグナルも検出されなかった。
【０３７４】
３−３−２．メルティング分析を含むＰＴＯＣＥアッセイ
実施例３−３−１の反応後、反応混合物を３５℃に冷却し、３５℃で３０秒間維持させた後、３５℃から９０℃に徐々に加熱させることにより、メルティングカーブを得た。温度が上昇する間、蛍光を連続的に測定し、二本鎖ＤＮＡの解離をモニタリングした。メルティングピークは、メルティングカーブデータ由来である。
【０３７５】
図１９Ｂから分かるように、鋳型がある場合、伸長二本鎖の予想Ｔｍ値に対応する７６．５℃でピークが検出された。本標識方法において、非切断ＰＴＯ及びＣＴＯ間のハイブリッド形成物は、非ターゲットシグナルを提供するため、鋳型がない場合、非切断ＰＴＯ及びＣＴＯ間のハイブリッド形成物のＴｍ値に対応するピークが４８．０℃で検出された。
【０３７６】
これらの結果は、リアルタイム検出又はメルティング分析を含むＰＴＯＣＥにより、ターゲット核酸配列を検出することができるということを示す。
【０３７７】
実施例４：メルティング分析を含むＰＴＯＣＥアッセイによる複数のターゲット核酸配列の検出
また、本発明者らは、メルティング分析を含むＰＴＯＣＥアッセイが、同一種類のレポーター分子を利用して複数のターゲット核酸配列を検出できるか実験した。
【０３７８】
ＰＴＯの切断及びＰＴＯ断片の伸長は、ＰＣＲ過程によりターゲット核酸の増幅を伴い、伸長二本鎖の存在を、ポスト−ＰＣＲメルティング分析（メルティング分析を含むＰＴＯＣＥアッセイ）により検出した。
【０３７９】
アッセイの間に形成された伸長二本鎖は、相互作用的二重標識を有するようにデザインした。伸長二本鎖の相互作用的二重標識は、そのテンプレーティング部位のレポーター分子及びクエンチャー分子で標識されたＣＴＯにより提供された。ＣＴＯは、同一な種類の蛍光レポーター分子（ＦＡＭ）を有するが、異なるＴｍ値の伸長二本鎖が生成される。ＰＴＯ及びＣＴＯの３’末端は、カーボンスペーサーでブロッキングした。
【０３８０】
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＮＧ）及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＳＡ）のゲノムＤＮＡをターゲット核酸として利用した。
【０３８１】
本実施例で利用された上流プライマー、下流プライマー、ＰＴＯ及びＣＴＯの配列は、下記の通りである：
ＮＧ−Ｆ  ５’−ＴＡＣＧＣＣＴＧＣＴＡＣＴＴＴＣＡＣＧＣＴ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）
ＮＧ−Ｒ  ５’−ＣＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＣＧＣ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）
ＮＧ−ＰＴＯ−３  ５’−ＡＣＧＡＣＧＧＣＴＴＧＧＣＣＣＣＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧ［Ｃ３  ｓｐａｃｅｒ］  −３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）
ＮＧ−ＣＴＯ−１  ５’−［ＢＨＱ−１］ＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣ［Ｔ（ＦＡＭ）］ＣＣＡＧＴＡＡＡＧＣＣＡＡＧＣＣＧＴＣＧＴ［Ｃ３  Ｓｐａｃｅｒ］  −３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）
ＳＡ−Ｆ  ５’−ＴＧＴＴＡＧＡＡＴＴＴＧＡＡＣＡＡＧＧＡＴＴＴＡＡＴＣ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）
ＳＡ−Ｒ  ５’−ＧＡＴＡＡＧＴＴＴＡＡＡＧＣＴＴＧＡＣＣＧＴＣＴＧ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）
ＳＡ−ＰＴＯ−１  ５’−ＡＡＴＣＣＧＡＣＣＡＣＧＣＡＴＴＣＣＧＴＧＧＴＣＡＡＴＣＡＴＴＣＧＧＴＴＴＡＣＧ［Ｃ３  ｓｐａｃｅｒ］  −３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）
ＳＡ−ＣＴＯ−１  ５’−［ＢＨＱ−１］ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＣＡ［Ｔ（ＦＡＭ）］ＡＧＣＧＴＧＧＴＣＧＧＡＴＴ［Ｃ３  ｓｐａｃｅｒ］  −３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）
（下線を引いた文字は、ＰＴＯの５’−タギング（ｔａｇｇｉｎｇ）部位を示す）
【０３８２】
ＮＧのゲノムＤＮＡ  １００ｐｇ、ＳＡのゲノムＤＮＡ  １００ｐｇ、各下流プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０及び１３）１０ｐｍｏｌｅ、上流プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２及び１４）１０ｐｍｏｌｅ、各ＰＴＯ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７及び１５）  ５ｐｍｏｌｅ、各ＣＴＯ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４及び１６）２ｐｍｏｌｅ、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  含有した２×マスターミックス１０μＬ、ｄＮＴＰｓ  ２００μＭ及びＨ−Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｏｌｇｅｎｔ、Ｋｏｒｅａ）１．６ｕｎｉｔを含有した２０μＬの最終容量で反応を実施した；前記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイムサーマルサイクラー（ＣＦＸ９６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に配置した；前記反応混合物を９５℃で１５分間変性し、９５℃で３０秒間、６０℃で６０秒間、７２℃で３０秒間の過程を６０回繰り返した。反応後、反応混合物を３５℃に冷却し、３５℃で３０秒間維持させた後、３５℃から９０℃に徐々に加熱させることにより、メルティングカーブを得た。温度が上昇する間、蛍光を連続的に測定し、二本鎖ＤＮＡの解離をモニタリングした。メルティングピークは、メルティングカーブデータ由来である。
【０３８３】
図２０から分かるように、鋳型がある場合、複数のターゲットシグナル（ＮＧのＴｍ：７５．５℃及びＳＡのＴｍ：６３．５℃）が検出された。鋳型がない場合は、如何なるシグナルも検出されなかった。
【０３８４】
これらの結果は、メルティング分析を含むＰＴＯＣＥアッセイは、ターゲット核酸に対応する伸長二本鎖が異なるＴｍ値を有する条件で同一な種類のレポーター分子（例えば、ＦＡＭ）を利用することにより、複数のターゲット核酸を検出することができるということを示す。
【０３８５】
実施例５：マイクロアレイにおけるメルティング分析を含むＰＴＯＣＥアッセイの評価
本発明者らは、マイクロアレイにおけるメルティング分析を含むＰＴＯＣＥアッセイを追加的に実験した。ＰＴＯ切断を、個別容器で実施し、ＣＴＯが固定化されたマイクロアレイに前記反応結果物の一部分を移した。伸長反応以後、伸長二本鎖の存在をメルティング分析により検出した。
【０３８６】
５’ヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを、上流プライマーの伸長、ＰＴＯの切断及びＰＴＯ断片の伸長に利用した。アッセイの間に形成された伸長二本鎖は、単一標識を有するようにデザインした。伸長二本鎖の単一標識は、その５’−末端が蛍光レポーター分子であるＱｕａｓａｒ５７０で標識されたＰＴＯにより提供された。ＰＴＯ及びＣＴＯの３’−末端は、カーボンスペーサーでブロッキングした。ＣＴＯは、リンカーとしてポリ（Ｔ）５を有し、その５’−末端にあるアミノ基（ＡｍｉｎｏＣ７）を利用してガラススライド表面に固定した。その５’−末端に蛍光レポーター分子（Ｑｕａｓａｒ５７０）を有するマーカープローブは、その３’−末端にあるアミノ基を利用してガラススライド表面に固定した。
【０３８７】
本実施例で利用された合成鋳型、上流プライマー、ＰＴＯ、ＣＴＯ及びマーカーの配列は、下記の通りである：
ＮＧ−Ｔ  ５’−ＡＡＡＴＡＴＧＣＧＡＡＡＣＡＣＧＣＣＡＡＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴＧＡＴＧＣＴＴＴＣＴＴＴＴＴＧＴＴＣＴＴＧＣＴＣＧＧＣＡＧＡＧＣＧＡＧＴＧＡＴＡＣＣＧＡＴＣＣＡＴＴＧＡＡＡＡＡ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）
ＮＧ−Ｒ  ５’−ＣＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＣＧＣ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）
ＮＧ−ＰＴＯ−５  ５’−［Ｑｕａｓａｒ５７０］ＡＣＧＡＣＧＧＣＴＴＧＧＣＴＴＴＡＣＴＧＣＣＣＣＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧ［Ｃ３  ｓｐａｃｅｒ］−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）
ＮＧ−ＣＴＯ−Ｓ１  ５’−［ＡｍｉｎｏＣ７］ＴＴＴＴＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＡＧＴＡＡＡＧＣＣＡＡＧＣＣＧＴＣＧＴ［Ｃ３  Ｓｐａｃｅｒ］−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）
Ｍａｒｋｅｒ  ５’−［Ｑｕａｓａｒ５７０］ＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴ［ＡｍｉｎｏＣ７］−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）
（下線を引いた文字は、ＰＴＯの５’−タギング（ｔａｇｇｉｎｇ）部位を示す）
【０３８８】
ＮＳＢ９  ＮＨＳスライド（ＮＳＢＰＯＳＴＥＣＨ、Ｋｏｒｅａ）をＣＴＯ及びマーカー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８及び１９）の製作に利用した。ＮＳＢスポッティングバッファー（ＮＳＢ  ｓｐｏｔｔｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）で最終濃度１０μＭになるように溶解させたＣＴＯ及びマーカーをＰｅｒｓｏｎａｌＡｒｒａｙｅｒＴＭ１６  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｐｏｔｔｅｒ（ＣａｐｉｔａｌＢｉｏ、Ｃｈｉｎａ）を利用し、ＮＳＢ９  ＮＨＳスライド上にプリントした。ＣＴＯ及びマーカーを２×１フォーマット（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ  ｓｐｏｔｓ）で並べてスポッティング（ｓｐｏｔｔｉｎｇ）して、このように製作されたマイクロアレイを、約８５％湿度に維持されるチャンバに一晩中インキュベートした。非特異的に結合されたＣＴＯ及びマーカーを除去するために、前記スライドを２×ＳＳＰＥ（０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．０２Ｍリン酸水素ナトリウム及び２．０ｍＭ  ＥＤＴＡ）、ｐＨ７．４及び７．０ｍＭ  ＳＤＳを含有したバッファー溶液に３７℃で３０分間洗浄して、蒸留水で洗浄した。その後、スライド遠心分離機を利用して、前記ＤＮＡ−機能化された（ＤＮＡ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ）スライドを乾燥し、使用前まで４℃暗室で保管した。
【０３８９】
ＮＧ遺伝子に対する合成鋳型（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）２ｐｍｏｌｅ、上流プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）１０ｐｍｏｌｅ、ＰＴＯ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）１ｐｍｏｌｅ及び２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  含有した２×マスターミックス２５μＬ、ｄＮＴＰｓ  ２００μＭ及びＨ−Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｏｌｇｅｎｔ、Ｋｏｒｅａ）４ｕｎｉｔを含有した５０μＬの最終容量で切断反応を実施した；前記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイムサーマルサイクラー（ＣＦＸ９６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に配置した；前記反応混合物を９５℃で１５分間変性し、９５℃で３０秒間、６３℃で６０秒間の過程を３０回繰り返した。
【０３９０】
ＣＴＯ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）が架橋結合（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ）されたＮＳＢガラススライドの表面上に組み立てられたチャンバに前記結果物の混合物３０μＬを適用した。スライドをｉｎ  ｓｉｔｕブロック方式でサーマルサイクラー（Ｇｅｎｅｐｒｏ  Ｂ４Ｉ、Ｃｈｉｎａ）に配置した。メルティング分析のために、６個の同一なスライドを製作した。伸長反応を５５℃で２０分間行った。その後、このように製作されたスライドを１分間室温でインキュベートした。最終的に、各スライドを４４℃、５２℃、６０℃、６８℃、７６℃又は８４℃で、蒸留水で１分間洗浄した。イメージ獲得は、共焦点レーザースキャナーＡｘｏｎ  ＧｅｎｅＰｉｘ４１００Ａ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ、ＵＳ）を利用し、５μｍピクセル解像度のスキャニングで行った。蛍光強度は、定量的なマイクロアレイ分析ソフトウェア、ＧｅｎｅＰｉｘ  ｐｒｏ６．０ソフトウェア（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ、ＵＳ）を利用して分析した。蛍光強度は、周辺バックグラウンドを除去した後、スポット中央値（ｓｐｏｔ−ｍｅｄｉａｎｓ）で表現した。再現性を調べるために、各スポットは、２個ずつスポッティングした。蛍光強度を、繰り返されたスポットの平均値で示した。
【０３９１】
図２１Ａ及び２１Ｂから分かるように、異なる洗浄温度により製作されたスポットからの蛍光強度を測定することにより、メルティングカーブを得た。前記メルティングカーブデータから伸長二本鎖の存在を決定した。
【０３９２】
実施例６：マイクロアレイにおけるリアルタイム検出を含むＰＴＯＣＥアッセイの評価
本発明者らは、マイクロアレイで指定温度におけるリアルタイム検出を含むＰＴＯＣＥアッセイを実験した。
【０３９３】
ＣＴＯが固定化されたマイクロアレイ上でＰＴＯの切断及びＰＴＯ断片の伸長を繰り返した。所定のサイクル毎に指定温度で伸長二本鎖の存在を検出した。
【０３９４】
５’ヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを、上流プライマーの伸長、ＰＴＯの切断及びＰＴＯ断片の伸長に利用した。
【０３９５】
アッセイの間に形成された伸長二本鎖は、単一標識又は相互作用的二重標識を有するようにデザインした。伸長二本鎖の単一標識は、レポーター分子で標識されたＰＴＯ（レポーター−標識ＰＴＯ）により提供された。伸長二本鎖の相互作用的二重標識は、レポーター分子及びクエンチャー分子で標識されたＣＴＯ（二重標識ＣＴＯ）により提供された。ＰＴＯ及びＣＴＯの３’末端は、カーボンスペーサーでブロッキングした。
【０３９６】
ＣＴＯは、リンカーとしてポリ（Ｔ）を有する。ＣＴＯは、その５’−末端又は３’−末端にあるアミノ基（ＡｍｉｎｏＣ７）を利用してガラススライド表面に固定した。その５’−末端に蛍光レポーター分子（Ｑｕａｓａｒ５７０）を有するマーカープローブは、その３’−末端にあるアミノ基を利用してガラススライド表面に固定した。ガラススライド上の蛍光強度は、指定温度で測定した。伸長二本鎖が二本鎖形態を維持する範囲で検出温度を決定した。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＮＧ）に対する合成オリゴヌクレオチドを鋳型として利用した。
【０３９７】
６−１．レポーター−標識ＰＴＯを利用したＰＴＯＣＥアッセイ
ＰＴＯは、その５’−末端に蛍光レポーター分子としてＱｕａｓａｒ５７０を有する。ＣＴＯは、その５’−末端を介して固定化させた。本標識方法では、伸長二本鎖が二本鎖形態を維持する範囲で検出温度を決定し、前記温度は、非切断ＰＴＯ及びＣＴＯ間のハイブリッド形成物のＴｍ値より高い。
【０３９８】
本実施例で利用された合成鋳型、上流プライマー、ＰＴＯ、ＣＴＯ及びマーカーの配列は、下記の通りである：
ＮＧ−Ｔ  ５’−ＡＡＡＴＡＴＧＣＧＡＡＡＣＡＣＧＣＣＡＡＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴＧＡＴＧＣＴＴＴＣＴＴＴＴＴＧＴＴＣＴＴＧＣＴＣＧＧＣＡＧＡＧＣＧＡＧＴＧＡＴＡＣＣＧＡＴＣＣＡＴＴＧＡＡＡＡＡ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）
ＮＧ−Ｒ  ５’−ＣＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＣＧＣ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）
ＮＧ−ＰＴＯ−５  ５’−［Ｑｕａｓａｒ５７０］ＡＣＧＡＣＧＧＣＴＴＧＧＣＴＴＴＡＣＴＧＣＣＣＣＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧ［Ｃ３  ｓｐａｃｅｒ］−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）
ＮＧ−ＣＴＯ−Ｓ１  ５’−［ＡｍｉｎｏＣ７］ＴＴＴＴＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＡＧＴＡＡＡＧＣＣＡＡＧＣＣＧＴＣＧＴ［Ｃ３  Ｓｐａｃｅｒ］−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）
Ｍａｒｋｅｒ  ５’−［Ｑｕａｓａｒ５７０］ＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴ［ＡｍｉｎｏＣ７］−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）
（下線を引いた文字は、ＰＴＯの５’−タギング（ｔａｇｇｉｎｇ）部位を示す）
【０３９９】
実施例５で利用されたものと同一なプロトコールでスライド製作を実施した。ＮＧ遺伝子に対する合成鋳型（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）２ｐｍｏｌｅ、上流プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）１０ｐｍｏｌｅ、ＰＴＯ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）１ｐｍｏｌｅ及び２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  含有した２×マスターミックス１５μＬ、ｄＮＴＰｓ  ２００μＭ及びＨ−Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｏｌｇｅｎｔ、Ｋｏｒｅａ）２．４ｕｎｉｔを含有した３０μＬの最終容量でＰＴＯＣＥ反応を実施した；ＣＴＯ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）が架橋結合（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ）されたＮＳＢガラススライドの表面上に組み立てられたチャンバに前記全体混合物を適用した。スライドをｉｎ  ｓｉｔｕブロック方式でサーマルサイクラー（Ｇｅｎｅｐｒｏ  Ｂ４Ｉ、Ｃｈｉｎａ）に配置した。サイクリング分析のために、５個の同一なスライドを製作した。ＰＴＯＣＥ反応を下記の通りに行った：９５℃で１５分間変性し、９５℃で３０秒間、６０℃で６０秒間及び５５℃で６０秒間の過程を０、５、１０、２０又は３０サイクル実施した。各サイクル数による反応以後、前記スライドを６４℃で蒸留水で１分間洗浄した。イメージ獲得は、共焦点レーザースキャナーＡｘｏｎ  ＧｅｎｅＰｉｘ４１００Ａ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ、ＵＳ）を利用し、５μｍピクセル解像度のスキャニングで行った。蛍光強度は、定量的なマイクロアレイ分析ソフトウェア、ＧｅｎｅＰｉｘ  ｐｒｏ６．０ソフトウェア（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ、ＵＳ）を利用して分析した。蛍光強度は、周辺バックグラウンドを除去した後、スポット中央値で表現した。再現性を調べるために、各スポットは、２個ずつスポッティングした。蛍光強度を、繰り返されたスポットの平均値で示した。
【０４００】
図２２Ａ及び２２Ｂから分かるように、鋳型がある場合、ターゲット核酸配列に対する蛍光強度は、サイクル数によって増加した（０サイクル＿ＲＦＵ：  １，３０４±０．７；  ５サイクル＿ＲＦＵ：  １８，９３９±１，３４２．１；  １０サイクル＿ＲＦＵ：  ３０，６１９±２８５．０；  ２０サイクル＿ＲＦＵ：  ５６，２４８±２，２０８．３；及び３０サイクル＿ＲＦＵ：  ６４，６４５±１，１１０．２）。鋳型がない場合は、サイクル数による蛍光強度の変化がなかった。
【０４０１】
６−２．二重標識ＣＴＯを利用したＰＴＯＣＥアッセイ
ＣＴＯは、その３’−末端を介して固定化され、テンプレーティング部位にクエンチャー分子（ＢＨＱ−２）及び蛍光レポーター分子（Ｑｕａｓａｒ５７０）を有する。
【０４０２】
本実施例で利用された合成鋳型、上流プライマー、ＰＴＯ、ＣＴＯ及びマーカーの配列は、下記の通りである：
ＮＧ−Ｔ  ５’−ＡＡＡＴＡＴＧＣＧＡＡＡＣＡＣＧＣＣＡＡＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴＧＡＴＧＣＴＴＴＣＴＴＴＴＴＧＴＴＣＴＴＧＣＴＣＧＧＣＡＧＡＧＣＧＡＧＴＧＡＴＡＣＣＧＡＴＣＣＡＴＴＧＡＡＡＡＡ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）
ＮＧ−Ｒ  ５’−ＣＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＣＧＣ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２）
ＮＧ−ＰＴＯ−６  ５’−  ＡＣＧＡＣＧＧＣＴＴＧＧＣＴＴＴＡＣＴＧＣＣＣＣＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧ［Ｃ３  ｓｐａｃｅｒ］−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）
ＮＧ−ＣＴＯ−Ｓ２  ５’−  ［ＢＨＱ−２］ＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣ［Ｔ（Ｑｕａｓａｒ５７０）］ＣＣＡＧＴＡＡＡＧＣＣＡＡＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ［ＡｍｉｎｏＣ７］−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）
Ｍａｒｋｅｒ  ５’−［Ｑｕａｓａｒ５７０］ＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴ［ＡｍｉｎｏＣ７］−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）
（下線を引いた文字は、ＰＴＯの５’−タギング（ｔａｇｇｉｎｇ）部位を示す）
【０４０３】
実施例５で利用されたものと同一なプロトコールでスライド製作を実施した。ＮＧ遺伝子に対する合成鋳型（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）２ｐｍｏｌｅ、上流プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）１０ｐｍｏｌｅ、ＰＴＯ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）１ｐｍｏｌｅ及び２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  含有した２×マスターミックス１５μＬ、ｄＮＴＰｓ  ２００μＭ及びＨ−Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｏｌｇｅｎｔ、Ｋｏｒｅａ）２．４ｕｎｉｔを含有した３０μＬの最終容量でＰＴＯＣＥ反応を実施した；ＣＴＯ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）が架橋結合（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ）されたＮＳＢガラススライドの表面上に組み立てられたチャンバに前記全体混合物を適用した。スライドをｉｎ  ｓｉｔｕブロック方式でサーマルサイクラー（Ｇｅｎｅｐｒｏ  Ｂ４Ｉ、Ｃｈｉｎａ）に配置した。サイクリング分析のために、５個の同一なスライドを製作した。ＰＴＯＣＥ反応を下記の通りに行った：９５℃で１５分間変性し、９５℃で３０秒間、６０℃で６０秒間及び５０℃で６０秒間の過程を０、５、１０、２０又は３０サイクル実施した。各サイクル数による反応以後、イメージ獲得は、共焦点レーザースキャナーＡｘｏｎ  ＧｅｎｅＰｉｘ４１００Ａ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ、ＵＳ）を利用し、５μｍピクセル解像度のスキャニングで行った。蛍光強度は、定量的なマイクロアレイ分析ソフトウェア、ＧｅｎｅＰｉｘ  ｐｒｏ６．０ソフトウェア（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ、ＵＳ）を利用して分析した。蛍光強度は、周辺バックグラウンドを除去した後、スポット中央値で表現した。再現性を調べるために、各スポットは、２個ずつスポッティングした。蛍光強度を、繰り返されたスポットの平均値で示した。
【０４０４】
図２３Ａ及び２３Ｂから分かるように、鋳型がある場合、ターゲット核酸配列に対する蛍光強度は、サイクル数によって増加した（０サイクル＿ＲＦＵ：  ２８，０７８±４６０．３；  ５サイクル＿ＲＦＵ：  ３５，９６７±５５５．１；  １０サイクル＿ＲＦＵ：  ４４，６７４±１８６．０；  ２０サイクル＿ＲＦＵ：  ６５，４２３±２．１；及び３０サイクル＿ＲＦＵ：  ６５，４２６±２．８）。鋳型がない場合は、サイクル数による蛍光強度の変化がなかった。
【０４０５】
実施例７：マイクロアレイにおいて、指定温度におけるエンド−ポイント検出を含むＰＴＯＣＥアッセイを利用した複数のターゲット核酸配列の検出
本発明者らは、マイクロアレイにおいて、指定温度におけるエンド−ポイント検出を含むＰＴＯＣＥアッセイを利用し、複数のターゲット検出を追加的に実験した。
【０４０６】
ＰＴＯ切断は、個別容器でＰＣＲ過程を利用して実施し、ＣＴＯの固定化されたマイクロアレイに前記結果物の適正量を移す。伸長反応以後、伸長二本鎖の存在を、指定温度におけるエンド−ポイント検出により検出した。
【０４０７】
５’ヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを、上流プライマーと下流プライマーの伸長、ＰＴＯの切断及びＰＴＯ断片の伸長に利用した。
【０４０８】
アッセイの間に形成された伸長二本鎖は、単一標識を有するようにデザインした。伸長二本鎖の単一標識は、５’−末端が蛍光レポーター分子であるＱｕａｓａｒ５７０で標識されたＰＴＯにより提供された。ＰＴＯ及びＣＴＯの３’−末端は、カーボンスペーサーでブロッキングした。
【０４０９】
ＣＴＯは、リンカーとしてポリ（Ｔ）５を有して、その５’−末端にあるアミノ基（ＡｍｉｎｏＣ７）を利用してガラススライドに固定した。その５’−末端に蛍光レポーター分子（Ｑｕａｓａｒ５７０）を有するマーカープローブは、その３’−末端にあるアミノ基を利用してガラススライドに固定した。
【０４１０】
ガラススライドの蛍光強度は、指定温度で測定した。伸長二本鎖が二本鎖形態を維持する範囲で検出温度を決定し、前記温度は、非切断ＰＴＯ及びＣＴＯ間のハイブリッド形成物のＴｍ値より高い。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＳＡ）及びＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＮＧ）のゲノムＤＮＡを利用した。
【０４１１】
本実施例で利用された上流プライマー、下流プライマー、ＰＴＯ、ＣＴＯ及びマーカーの配列は、下記の通りである：
ＮＧ−Ｆ  ５’−  ＴＡＣＧＣＣＴＧＣＴＡＣＴＴＴＣＡＣＧＣＴ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ５  ＮＯ：１０）
ＮＧ−Ｒ  ５’−ＣＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＣＧＣ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）
ＮＧ−ＰＴＯ−５  ５’−［Ｑｕａｓａｒ５７０］ＡＣＧＡＣＧＧＣＴＴＧＧＣＴＴＴＡＣＴＧＣＣＣＣＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧ［Ｃ３  ｓｐａｃｅｒ］−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）
ＮＧ−ＣＴＯ−Ｓ１  ５’−［ＡｍｉｎｏＣ７］ＴＴＴＴＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＡＧＴＡＡＡＧＣＣＡＡＧＣＣＧＴＣＧＴ［Ｃ３  Ｓｐａｃｅｒ］−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）
ＳＡ−Ｆ  ５’−ＴＧＴＴＡＧＡＡＴＴＴＧＡＡＣＡＡＧＧＡＴＴＴＡＡＴＣ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）
ＳＡ−Ｒ２  ５’−ＴＴＡＧＣＴＣＣＴＧＣＴＣＣＴＡＡＡＣＣＡ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）
ＳＡ−ＰＴＯ−２  ５’−［Ｑｕａｓａｒ５７０］  ＡＡＴＣＣＧＡＣＣＡＣＧＣＴＡＴＧＣＴＣＡＴＴＣＣＧＴＧＧＴＣＡＡＴＣＡＴＴＣＧＧＴＴＴＡＣＧ［Ｃ３  ｓｐａｃｅｒ］−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）
ＳＡ＿ＣＴＯ−Ｓ１  ５’−［ＡｍｉｎｏＣ７］ＴＴＴＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＣＣＣＣＡＧＣＡＴＡＧＣＧＴＧＧＴＣＧＧＡＴＴ  ［Ｃ３  Ｓｐａｃｅｒ］−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）
Ｍａｒｋｅｒ  ５’−［Ｑｕａｓａｒ５７０］ＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴ［ＡｍｉｎｏＣ７］−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）
（下線を引いた文字は、ＰＴＯの５’−タギング（ｔａｇｇｉｎｇ）部位を示す）
【０４１２】
実施例５で利用されたものと同一なプロトコールでスライド製作を実施した。
【０４１３】
各ＳＡ及び／又はＮＧのゲノムＤＮＡ  １００ｐｇ、各下流プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０及び／又は１３）１０ｐｍｏｌｅ、各上流プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２及び／又は２２）１０ｐｍｏｌｅ、ＰＴＯ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７及び／又は２３）１ｐｍｏｌｅ及び２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  含有した２×マスターミックス２５μＬ、ｄＮＴＰｓ  ２００μＭ及びＨ−Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｏｌｇｅｎｔ、Ｋｏｒｅａ）４ｕｎｉｔを含有した５０μＬの最終容量で切断反応を実施した；前記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイムサーマルサイクラー（ＣＦＸ９６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に配置した；前記反応混合物を９５℃で１５分間変性し、９５℃で３０秒間、６３℃で６０秒間の過程を６０回繰り返した。ＣＴＯ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８及び２４）が架橋結合（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ）されたＮＳＢガラススライドの表面上に組み立てられたチャンバに前記結果物の混合物３０μＬを適用した。スライドをｉｎ  ｓｉｔｕブロック方式でサーマルサイクラー（Ｇｅｎｅｐｒｏ  Ｂ４Ｉ、Ｃｈｉｎａ）に配置した。伸長反応を５５℃で２０分間行った。その後、このように製作されたスライドを６４℃で蒸留水で１分間洗浄した。各洗浄以後、イメージ獲得は、共焦点レーザースキャナーＡｘｏｎ  ＧｅｎｅＰｉｘ４１００Ａ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ、ＵＳ）を利用し、１０μｍピクセル解像度のスキャニングで行った。蛍光強度は、定量的なマイクロアレイ分析ソフトウェア、ＧｅｎｅＰｉｘ  ｐｒｏ６．０ソフトウェア（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ、ＵＳ）を利用して分析した。蛍光強度は、周辺バックグラウンドを除去した後、スポット中央値で表現した。再現性を調べるために、各スポットは、２個ずつスポッティングした。蛍光強度を、繰り返されたスポットの平均値で示した。
【０４１４】
図２４から分かるように、ＳＡ鋳型がある場合、ＳＡに対するターゲットシグナル（ＲＦＵ：  ６５，１９２±１９８．７）が検出された。ＮＧ鋳型がある場合、ＮＧに対するターゲットシグナル（ＲＦＵ：  ６５，３３２±１．４）が検出された。ＳＡ及びＮＧの鋳型が両方ともある場合、ＳＡに対するターゲットシグナル（ＲＦＵ：  ６５，３０２±０．７）及びＮＧ（ＲＦＵ  ６５，３０２±０．７）に対するターゲットシグナルも全て検出された。
【０４１５】
以上、本発明の望ましい具現例を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとっては、このような具体的な記述はただ望ましい具現例に過ぎなく、これに本発明の範囲が限定されないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物により定義されると言える。
【図１】
0006054357.tif 000002
【図２】
0006054357.tif 000003
【図３】
0006054357.tif 000004
【図４】
0006054357.tif 000005
【図５】
0006054357.tif 000006
【図６】
0006054357.tif 000007
【図７】
0006054357.tif 000008
【図８】
0006054357.tif 000009
【図９】
0006054357.tif 000010
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
0006054357.tif 000017
【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
0006054357.tif 000021
【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
0006054357.tif 000023
【図２０】
0006054357.tif 000024
【図２１Ａ】
0006054357.tif 000025
【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
0006054357.tif 000027
【図２２Ｂ】
0006054357.tif 000028
【図２３Ａ】
0006054357.tif 000029
【図２３Ｂ】
0006054357.tif 000030
【図２４】
0006054357.tif 000031
【配列表】
0006054357000001.app