(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトにおける非経口的使用のための水中油型エマルジョンを調製するためのプロセスであって、該プロセスは、
（ａ）培養の間に高収量でスクアレンを生産する酵母からスクアレンを精製する工程であって、該酵母が、動物由来産物を含まない制御された培地中で増殖させられる、工程；および
（ｂ）工程（ａ）において精製した該スクアレンと、水性成分とを合わせて、該ヒトにおける非経口的使用のための水中油型エマルジョンを形成する工程
を包含し、ここで、該非経口的使用は、薬学的使用である、プロセス。
【請求項２】
ヒトにおける非経口的使用のための水中油型エマルジョンを調製するためのプロセスであって、該プロセスは、
（ａ）培養の間に高収量でスクアレンを生産する酵母から精製したスクアレンを得る工程であって、該酵母が、動物由来産物を含まない制御された培地中で増殖させられる、工程；および
（ｂ）工程（ａ）の該スクアレンと、水性成分とを合わせて、該ヒトにおける非経口的使用のための水中油型エマルジョンを形成する工程
を包含し、ここで、該非経口的使用は、薬学的使用である、プロセス。
【請求項３】
前記酵母が、≧５％の細胞乾燥重量のスクアレンを生産する、請求項１〜２のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項４】
前記酵母が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項５】
前記酵母が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項４に記載のプロセス。
【請求項６】
前記酵母が、サイトゾルに存在する短縮型のＨＭＧＲ酵素を発現する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項７】
前記酵母が、修飾されていない親株と比較して、ＨＭＧＲを高度に発現する修飾された株である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項８】
前記酵母が、修飾されていない親株と比較して、ザイモステロール−２４−メチルトランスフェラーゼおよび／もしくはエルゴスタ−５，７，２４（２８）−トリエノール−２２−デヒドロゲナーゼを過小発現する修飾された株である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項９】
前記酵母が、変異型オキシドスクアレンシクラーゼを発現する、請求項１〜８のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１０】
前記酵母が、破壊されたスクアレンエポキシダーゼを有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記酵母が、培養の間にスクアレン収量を増大させる因子の存在下で増殖させられる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１２】
前記因子が、アリルアミン、ボリコナゾール、６−アミノ−２−ｎ−ペンチルチオベンゾチアゾール、チアミン、または、チオカルバメートである、請求項１１に記載のプロセス。
【請求項１３】
前記酵母が、スクアレン精製の前に、部分的嫌気条件下もしくは完全嫌気条件下で増殖させられる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１４】
前記スクアレンが、（重量で）９７％超純粋である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１５】
前記ヒトにおける非経口的使用のための水中油型エマルジョンが、サブミクロン直径を有する油滴を有する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１６】
前記ヒトにおける非経口的使用のための水中油型エマルジョンが、マイクロフルイダイズされたエマルジョンである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１７】
前記ヒトにおける非経口的使用のための水中油型エマルジョンが、スクアレンおよびポリソルベート８０を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、米国仮出願第６１／１９０，４８６号の利益を主張し、上記米国仮出願の全容は参照によって本明細書に援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、スクアレンを、例えば、水中油型エマルジョンにおける使用のために、製造する分野にある。
【背景技術】
【０００３】
（背景技術）
サメ肝油は、スクアレン（２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエン）といわれる分枝状の不飽和テルペノイドを含む。スクアレンは、ヒトワクチンでは、水中油型エマルジョンにおける使用が公知であり、例えば、ＭＦ５９エマルジョンは、インフルエンザワクチンを補助するために使用される。スクアレンはまた、他の薬学的製品（例えば、軟膏剤、坐剤）および化粧品において使用されている。
【０００４】
スクアレンの現在の供給源は、主に魚油、そして特に、サメ肝油である。特に、厳格な製造基準（例えば、ＮｏｖａｒｔｉｓによるＭＦ５９の生産の間に使用されるもの）が遵守されていない場合には、サメ肝油から抽出されたスクアレンの使用と関連する問題が存在し得る。例えば、サメは、ヒトに対しても感染性であるかまたはヒトにとって有害である物質を生産する病原体に感染している可能性があり、そしてＴＳＥもしくはＴＳＥ様サメ因子が、存在し得る［例えば、参考文献１−３（非特許文献１〜３）］。さらに、サメは、ヒトに対する毒素（例えば、カーチャトキシン（ｃａｒｃｈａｔｏｘｉｎ））を含み得る。従って、安価で低グレードのスクアレン供給源は、ヒトの薬学的使用には適していない。ヒトレシピエントへの危害のリスクは、上記スクアレンが、免疫学的アジュバントの一部である状況において高まり得る。なぜなら、当然のことながら、アジュバントは、不純物に対して強力な不要の免疫応答を誘導し得るからである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】ＢｏｒｕｃｉｎｓｋａおよびＦｒａｓｃａ、Ｊ  Ｆｉｓｈ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、２００２年、２５：２８７〜９８
【非特許文献２】Ｂｅｒｔｏｎｅら、Ｊ  Ｆｉｓｈ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、１９９６年、１９：４２９〜３４
【非特許文献３】Ｂｒｉｏｎｅｓら、Ｊ  Ｖｅｔ  Ｍｅｄ  Ｂ、１９９８年、４５：４４３〜５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、サメ由来スクアレンの安価な低グレード供給源を使うのではなく、スクアレンの薬学的使用（例えば、ＭＦ５９の製造において使用される場合）は、より高いグレードの材料を利用するが、これら高品質スクアレンは高価であり、利用が制限される。このような高価な供給源は、例えば、発展途上国における使用には、有用ではない。
【０００７】
非常に高価であることなしに、これら高い薬学的標準を満たすスクアレン供給源を見いだすことは、有用である。従って、実現性のある代替のスクアレン供給源は、特に、上記スクアレンがヒトにおける非経口的使用について、および／もしくは免疫学的アジュバントにおける使用について意図される場合に、望ましい。薬学的グレードのスクアレンのより安価な供給源は、容易にサメを入手できないか、もしくは例えば、Ｎｏｖａｒｔｉｓによって現在使用されている高価な薬学グレードの物質を容易に有することができないかのいずれかである発展途上国において特に有用である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の開示）
本発明は、スクアレンを高度に生産（ｈｙｐｅｒ−ｐｒｏｄｕｃｅ）する酵母からスクアレンを調製するための方法に関する。酵母は、（一般に安全とみなされる）ＧＲＡＳ生物であるので、薬学的使用のための有用なスクアレン供給源である。さらに、上記スクアレンは、病原体、プリオンおよび環境毒素による汚染なしに調製され得る（例えば、酵母は、もともと（ａ  ｐｒｉｏｒｉ）水銀を含まない）。ワクチン分野において、酵母は、既に使用されている（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原の組換え発現のために）ので、いかなる特定の規制的懸念も存在しない（すなわち、酵母由来スクアレンは、免疫学的アジュバントの調製における使用に特に適している）。最後に、酵母培養技術は、広く行き渡っておりかつ容易に技術移転しやすい。
【０００９】
従って、本発明は、純粋なスクアレンを調製するためのプロセスを提供し、上記プロセスは、（ａ）培養の間に高収量でスクアレンを生産する酵母を増殖させる工程；および（ｂ）上記工程（ａ）において増殖させた酵母からスクアレンを精製する工程を包含する。上記精製されたスクアレンは、医薬、食品、食品添加物、化粧品などの調製における成分として使用され得る。
【００１０】
本発明はまた、スクアレン含有産物を調製するためのプロセスを提供し、上記プロセスは、（ａ）培養の間に高収量でスクアレンを生産する酵母から精製されたスクアレンを得る工程；および（ｂ）上記工程（ａ）のスクアレンと、非スクアレン成分とを合わせて、上記スクアレン含有産物を形成する工程を包含する。
【００１１】
本発明はまた、精製スクアレンの製造のために、培養の間に高収量でスクアレンを生産する酵母の使用を提供する。
【００１２】
本発明はまた、精製スクアレンを調製するためのプロセスを提供し、上記プロセスは、（ａ）酵母培養物を、上記酵母が高収量でスクアレンを生産する条件下で増殖させる工程；（ｂ）スクアレンが≧９７重量％純粋であるように、上記スクアレンを上記培養酵母から精製する工程、を包含する。
【００１３】
本発明はまた、水中油型エマルジョンを調製するためのプロセスを提供し、上記プロセスは、（ａ）培養の間に高収量でスクアレンを生産する酵母からスクアレンを精製する工程；および（ｂ）上記工程（ａ）において精製したスクアレンと、水性成分とを合わせて、上記水中油型エマルジョンを形成する工程、を包含する。
【００１４】
従って、本発明は、水中油型エマルジョンを調製するためのプロセスを提供し、上記プロセスは、（ａ）培養の間に高収量でスクアレンを生産する酵母から精製されたスクアレンを得る工程；および（ｂ）上記工程（ａ）のスクアレンと、水性成分とを合わせて、上記水中油型エマルジョンを形成する工程、を包含する。
【００１５】
本発明はまた、免疫原性組成物（例えば、ワクチン）を調製するためのプロセスを提供し、上記プロセスは、上記のように、水中油型エマルジョンを調製する工程、および上記エマルジョンと、免疫原とを混合する工程、を包含する。
【００１６】
本発明はまた、このようにして免疫原性組成物を調製するためのキットを調製するためのプロセスを提供し、上記プロセスは、上記のように水中油型エマルジョンを調製する工程、上記エマルジョンを第１の容器にパッケージする工程、および上記キット形態の上記第１の容器と、第２の容器とを組み合わせる工程であって、ここで上記第２の容器は、免疫原を含む、工程を包含する。上記免疫原は、乾燥形態もしくは水性形態にあり得る。
【００１７】
本発明はまた、動物における（例えば、哺乳動物における）免疫応答を惹起するためのプロセスを提供し、上記プロセスは、上記方法において調製された免疫原性組成物を、上記動物に投与する工程を包含する。
【００１８】
本発明はまた、哺乳動物における免疫応答を惹起するための医薬の製造において使用するためのスクアレンを提供し、ここで上記スクアレンは、（ｉ）培養の間に高収量でスクアレンを生産する酵母から精製され、（ｉｉ）水性成分と合わされて、上記医薬に含めるために、水中油型エマルジョンを形成する。
【００１９】
本発明は、水中油型エマルジョンを調製するためのプロセスを提供し、上記プロセスは、（ａ）酵母培養物を、上記酵母が高収量でスクアレンを生産する条件下で増殖させる工程；（ｂ）上記培養酵母からスクアレンを精製する工程；および（ｃ）工程（ｂ）において精製したスクアレンと、水性成分とを合わせて、上記水中油型エマルジョンを形成する工程を包含する。
【００２０】
本発明はまた、スクアレンを使用するプロセスにおいて、培養の間に高収量でスクアレンを生産する酵母から精製されたスクアレンを使用することからなる改善を提供する。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
スクアレン含有産物を調製するためのプロセスであって、該プロセスは、（ａ）培養の間に高収量でスクアレンを生産する酵母から精製したスクアレンを得る工程；および（ｂ）該工程（ａ）のスクアレンと、非スクアレン成分とを合わせて、該スクアレン含有産物を形成する工程を包含する、プロセス。
（項目２）
水中油型エマルジョンを調製するためのプロセスであって、該プロセスは、（ａ）培養の間に高収量でスクアレンを生産する酵母からスクアレンを精製する工程；および（ｂ）該工程（ａ）において精製したスクアレンと、水性成分とを合わせて、該水中油型エマルジョンを形成する工程を包含する、プロセス。
（項目３）
水中油型エマルジョンを調製するためのプロセスであって、該プロセスは、（ａ）培養の間に高収量でスクアレンを生産する酵母から精製したスクアレンを得る工程；および（ｂ）該工程（ａ）の精製したスクアレンと、水性成分とを合わせて、該水中油型エマルジョンを形成する工程を包含する、プロセス。
（項目４）
前記酵母が、≧５％の細胞乾燥重量のスクアレンを生産する、前述の項目のいずれかに記載のプロセス。
（項目５）
前記酵母が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓである、前述の項目のいずれかに記載のプロセス。
（項目６）
前記酵母が、サイトゾル位置を有する短縮型のＨＭＧＲ酵素を発現する、前述の項目のいずれかに記載のプロセス。
（項目７）
前記酵母が、修飾されていない親株と比較して、ＨＭＧＲを高度に発現する修飾された株である、前述の項目のいずれかに記載のプロセス。
（項目８）
前記酵母が、修飾されていない親株と比較して、ザイモステロール−２４−メチルトランスフェラーゼおよび／もしくはエルゴスタ−５，７，２４（２８）−トリエノール−２２−デヒドロゲナーゼを過小発現する修飾された株である、前述の項目のいずれかに記載のプロセス。
（項目９）
前記酵母が、変異型オキシドスクアレンシクラーゼを発現する、前述の項目のいずれかに記載のプロセス。
（項目１０）
前記酵母が、妨害されたスクアレンエポキシダーゼを有する、前述の項目のいずれかに記載のプロセス。
（項目１１）
前記酵母が、培養の間にスクアレン収量を増大させる因子の存在下で増殖させられる、前述の項目のいずれかに記載のプロセス。
（項目１２）
前記因子が、アリルアミン、ボリコナゾール、６−アミノ−２−ｎ−ペンチルチオベンゾチアゾール、チアミン、もしくはチオカルバメートである、項目１１に記載のプロセス。（項目１３）
前記酵母が、スクアレン精製の前に、部分的嫌気条件下もしくは完全嫌気条件下で増殖させられる、前述の項目のいずれかに記載のプロセス。
（項目１４）
前記酵母が、動物由来産物を含まない制御された培地中で増殖させられる、前述の項目のいずれかに記載のプロセス。
（項目１５）
前記スクアレンが、（重量で）９７％超純粋である、前述の項目のいずれかに記載のプロセス。
（項目１６）
前記水中油型エマルジョンが、サブミクロン直径を有する油滴を有する、項目２〜１５のいずれか１項に記載のプロセス。
（項目１７）
前記水中油型エマルジョンが、マイクロフルイダイズされたエマルジョンである、項目２〜１６のいずれか１項に記載のプロセス。
（項目１８）
前記水中油型エマルジョンが、スクアレンおよびポリソルベート８０を含む、項目２〜１７のいずれか１項に記載のプロセス。
（項目１９）
免疫原性組成物を調製するためのプロセスであって、該プロセスは、項目３〜１９のいずれか１項に記載のプロセスによって水中油型エマルジョンを調製する工程、および該エマルジョンと免疫原とを混合する工程を包含する、プロセス。
（項目２０）
免疫原性組成物を調製するためのキットを調製するためのプロセスであって、該プロセスは、項目３〜１９のいずれか１項に記載のプロセスによって、水中油型エマルジョンを調製する工程、該エマルジョンを第１の容器にパッケージする工程、およびキット形態中の該第１の容器と、第２の容器とを組み合わせる工程であって、ここで該第２の容器は免疫原を含む、工程を包含する、プロセス。
（項目２１）
哺乳動物における免疫応答を惹起するためのプロセスであって、該プロセスは、該哺乳動物に、項目１９に記載のプロセスによって、もしくは項目２０のキットを使用することによって調製された免疫原性組成物を投与する工程を包含する、プロセス。
（項目２２）
精製スクアレンを調製するためのプロセスであって、該プロセスは、（ａ）酵母培養物を、該酵母が高収量でスクアレンを生産する条件下で増殖させる工程、（ｂ）スクアレンが≧９７重量％純粋であるように、該培養された酵母から該スクアレンを精製する工程、を包含する、プロセス。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
（酵母におけるスクアレン生産）
本発明は、酵母から精製されたスクアレンを使用する。上記酵母は、高いスクアレン収量について選択された天然に存在する株もしくは変異株であり得るが、上記酵母は、一般に、スクアレンを高収量で生産するように操作された、遺伝的に操作された株である。別の可能性は、増大したスクアレン収量を生じる因子の存在下で、天然酵母株、変異酵母株もしくは操作された酵母株を培養することである。
【００２２】
スクアレンの収量は、特定の酵母における細胞乾燥重量（ｃｄｗ）の％として表され得る。通常の酵母である野生型Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ株は、代表的には、約０．５％  ｃｄｗでスクアレンを生産し得るのに対して、通常のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｕｖａｎｉｍ醸造用酵母は、約１．４％  ｃｄｗでスクアレンを生産し得る［４］。「高収量」でスクアレンを生産する酵母は、少なくとも２％  ｃｄｗがスクアレンである（例えば、≧３％、≧４％、≧５％、≧６％、≧７％、≧８％、≧９％、≧１０％、≧１１％、≧１２％、≧１３％、≧１４％、≧１５％以上のｃｄｗ）ものである。
【００２３】
スクアレン収量はまた、特定の酵母における総脂質のうちの％として表され得る。通常のＳ．ｕｖａｒｕｍ醸造用酵母は、総脂質のうちの３３％でスクアレンを生産する［４］。「高収量」でスクアレンを生産する酵母は、総脂質のうちの≧４０％（例えば、≧５０％、≧６０％など）でスクアレンを生産し得る。
【００２４】
上記スクアレンは、有利なことには、そのトランス配置（天然のアイソフォーム）が少なくとも９５％（例えば、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％、もしくは１００％）である。
【００２５】
高収量のスクアレンを有する天然に存在する変異酵母株は、当該分野で公知である（例えば、参考文献５に記載されるＴｏｒｕｌａｓｏｐｒａ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ株）。変異体は、変異（ランダム変異誘発もしくは指向性変異誘発のいずれか）（例えば、参考文献６および７に記載されるもの）を誘導し、続いて、変異誘発した細胞を、適切に高いスクアレン収量を有するものについてスクリーニングする、周知の方法によって得られ得る。参考文献８は、適切な温度で増殖させた場合にスクアレン蓄積を生じる、４−α−カルボキシステロール−Ｃ３−デヒドロゲナーゼ（ＥＲＧ２６）の温度感受性変異を有する変異酵母株を記載する。
【００２６】
しかし、通常、本発明は、遺伝的に操作した酵母を使用する。種々の方法は、出発株のスクアレン収量を増大させるために使用され得る。ステロール代謝は、例えば、スクアレン同化作用を増大させることによって、および／もしくはスクアレン異化作用（その分解および／もしくはその天然の、エルゴステロールへの変換が挙げられる）を低下させることによって、スクアレン収量を増大させるように操作され得る。スクアレン生合成に関与する遺伝子としては、メバロネートキナーゼ、ホスホメバロネートキナーゼ、ピロホスホメバロネートデカルボキシラーゼ、イソペンテニルピロホスフェートイソメラーゼ、ＨＭＧＲ（３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ）、およびスクアレンシンターゼが挙げられる。スクアレンをエルゴステロールへ変換するのに関与する遺伝子としては、スクアレンエポキシダーゼ（ＥＲＧｌ）、ラノステロールシンターゼ、Ｃ１４−ジメチラーゼ、ｄｌ４−レダクターゼ、Ｃ４−メチルオキシダーゼ、Ｃ４−デカルボキシラーゼ（ＥＲＧ２６）、３−ケトレダクターゼ、Ｃ２４−メチルトランスフェラーゼ、Ｃ８−イソメラーゼ、Ｃ５−デサチュラーゼ、ｄ２２−デサチュラーゼおよびｄ２４−レダクターゼが挙げられる。他の異化酵素としては、ＬＥＵ２（β−イソプロピルマレートデヒドロゲナーゼ）、オキシドスクアレンシクラーゼ、ザイモステロール−２４−メチルトランスフェラーゼおよびエルゴスタ−５，７，２４（２８）−トリエノール−２２−デヒドロゲナーゼが挙げられる。このような操作は、例えば、参考文献９において開示されている。
【００２７】
上記関連酵素についての活性レベルは、任意の適切な様式において、通常は、遺伝的操作によって、増大させられ得るかもしくは低下させられ得る。酵母は、標準的な方法（参考文献７および１０に記載されているものが挙げられる）によって遺伝的に操作され得る。遺伝子は、種々の方法において（例えば、プラスミド中、もしくは染色体組み込みによって）酵母の中へ導入され得る。遺伝子ノックアウト技術もまた、酵母については十分に確立されている。
【００２８】
酵素活性を増大させる方法としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ある株中に既に存在する酵素のコピー数を、例えば、１種以上のさらなる遺伝子を、通常はプラスミド上に付加することによって、増大させること；例えば、より強力なプロモーターとともに提供することによって、既に存在する酵素の発現レベルを増大させること（高度発現）；異種酵素（すなわち、ある株にこれまで存在していないもの）を付加すること；阻害因子もしくは抑制因子の発現を低下もしくは防止すること；ある株に既に存在する酵素の配列を修飾すること（例えば、安定性を高めるため、阻害をもたらすアミノ酸残基を除去するため、タンパク質輸送もしくは細胞位置を変化させるため）など。例えば、酵素の配列の短縮が、膜タンパク質から、サイトゾルタンパク質へとその酵素を変化させ、その結果、このことがスクアレン蓄積を引き起こし得ることは、公知である。
【００２９】
酵素活性を低下させる方法としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ある株に既に存在する酵素の欠失；例えば、より弱いプロモーターとともに提供することによって、既に存在する酵素の発現レベルを低下させること；阻害因子もしくは抑制因子の発現を増大させること；ある株に既に存在する酵素の配列を修飾すること（例えば、安定性を低下させるため、酵素活性を媒介するアミノ酸残基を修飾するため、機能的ドメインを欠失させるため、タンパク質輸送もしくは細胞位置を変化させるため）など。
【００３０】
過小発現（ｕｎｄｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）もしくは過剰発現のレベル、および増大した活性もしくは低下した活性のレベルは、関連する修飾を欠いている対応する野生型株と比較して表される。
【００３１】
酵母における適切な遺伝的操作には既にいくつかの報告がある。例えば、参考文献１１は、ＨＭＧＲの高度発現と、ザイモステロール−２４−メチルトランスフェラーゼおよび／もしくはエルゴスタ−５，７，２４（２８）−トリエノール−２２−デヒドロゲナーゼの低下した発現とに起因して、増大したスクアレン蓄積を有する酵母を開示している。参考文献１２は、その膜結合領域を欠き、従って、サイトゾル酵素を提供し、スクアレン蓄積を示す、短縮型ＨＭＧＲ（ＨＭＧｌアイソザイム）を発現する酵母を開示している。スクアレンエポキシダーゼの妨害は、スクアレンの蓄積を引き起こす［１３］。参考文献１４は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼを阻害し、ＨＭＧＲを高度に発現させるために、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａを修飾して、その結果、上記株が、安価な炭素源（例えば、チーズホエイもしくはサトウキビ）を使用して、２％  ｃｄｗでスクアレンを生産したことを開示している。オキシドスクアレンシクラーゼ（ＥＲＧ７）の変異はまた、スクアレン蓄積を引き起こし得る［８］。コレステロールの添加なしでは３−ケトステロール上で増殖できないエルゴステロール栄養要求株は、スクアレンを蓄積することが分かった［１５］。ヘム合成が損なわれた酵母株は、スクアレンを蓄積し得る［１６］。
【００３２】
これらアプローチの組み合わせが使用され得る（例えば、スクアレンエポキシダーゼのノックアウトと組み合わせた、サイトゾルの短縮型ＨＭＧＲの発現）。
【００３３】
短縮型ＨＭＧＲを発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株（例えば、参考文献１２に記載されているもの）は、好ましい。理想的には、構成性プロモーター（例えば、ＡＤＨｌプロモーター）の制御下での可溶性の非膜結合型形態のＨＭＧｌの発現は、高レベルのスクアレン蓄積（４０×野生型）をもたらす。上記短縮型タンパク質は、ＨＭＧ１ｐのスペーサー領域およびＣ末端触媒ドメインの一部を含み得るが、そのＮ末端膜貫通領域を欠いている。ある株は、上記遺伝子の１つ以上のコピーを発現し得る。
【００３４】
酵母（天然、変異もしくは操作された）は、スクアレンの収量を増大させる因子の存在下で増殖させられ得る。例えば、アリルアミン抗真菌剤（例えば、テルビナフィン、ナフチフィン）は、スクアレンエポキシダーゼを阻害し得、エルゴステロール欠乏および細胞内スクアレンの蓄積を生じる［１７］。スクアレンエポキシダーゼインヒビターが致死レベル未満で含まれるか、または耐性株などで使用される場合、培養物の上記スクアレン収量は、増大し得る。約１００倍というスクアレン収量の増大は、テルビナフィンの存在下で参考文献１８において認められた。種々のＣａｎｄｉｄａ種におけるスクアレンエポキシダーゼは、約１０倍までテルビナフィンに対する感受性が異なるので、因子の濃度は、目的の任意の酵母について最適化されなければならないかもしれない。スクアレン蓄積を引き起こし得る他の抗真菌剤としては、ボリコナゾール［１９］、６−アミノ−２−ｎ−ペンチルチオベンゾチアゾール［２０］、およびチオカルバメート抗真菌剤（例えば、トルナフテートおよびトルシクラート）［２１］が挙げられるが、これらに限定されない。チアミンの存在下での増殖はまた、スクアレン収量を増大させ得る［２２］。
【００３５】
適切な酵母としては、スクアレンを生産するかもしくはスクアレンを生産するように操作され得る任意の酵母が挙げられる。適切な酵母の例としては、以下の属：
【００３６】
【化１】
0005930766.tif 000002
に由来する種が挙げられる。本発明に有用な属は、Ｓａｃｃｌｉａｒｏｍｙｃｅｓ、およびＴｏｒｕｌａｓｐｏｒａである。本発明での使用に好ましい種は、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉであり、最も好ましいのは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。
【００３７】
スクアレンを生産するための酵母発酵は、大スケールで行われ得、このことは、ほぼ無限の量のスクアレンをもたらし、従って、生産されるスクアレンの単位コストを下げる。上記酵母は、任意の公知の培養系もしくは発酵系を使用して増殖させられ得る。本発明の使用に適切な酵母発酵系としては、バッチ発酵系および連続発酵系が挙げられる。２段階培養系が使用され得る。上記酵母は、（少なくとも部分的に）嫌気相へ変化させて、スクアレン生産を増大させる前に、バイオマスを増大させる好気条件下で増殖させられ得る。２段階培養系は、スクアレン蓄積が増殖相から分離されるのを可能にする。嫌気条件下での酵母の培養は、スクアレン生産を増大させるために使用され得［２３−２５］、炭素源はまた、影響力を有し得る。
【００３８】
酵母は、制御された培地で増殖させられ得るので、培養物は、疾患原因因子、環境毒素および他の汚染物質が確実にない状態であり得る。酵母を増殖させるために適した培地は、酵母種および発酵系に依存する。適切な培地としては、補充物質ありもしくはなしの富栄養（ｒｉｃｈ）培地もしくは最小培地が挙げられる。例えば、上記酵母は、ＭＭ、ＥＭＭ、ＹＰＤ、ＹＰＤＳ、ＹＰＧ、ＹＰＧＳ、ＹＴ、ＹＡＰＤ、ＹＥＰＤ、ＹＰＬ、ＹＥＰ、ＹＮＢＤおよびＳＤ中で増殖させられ得る。いかなる動物由来産物（例えば、ホエイ）をも含まない培地が、理想的である。動物（特に、ウシ）物質が細胞培養の間に使用される場合、それらは、伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）を含まず、特に、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）を含まない供給源から得られるべきである。
【００３９】
培養条件の制御に起因して、本発明に従って酵母から精製されたスクアレンは、病原体、病原体の代謝産物、毒素、および他の有害な物質による汚染がなく、もともとＴＳＥ原因因子を含まない（このような因子は、酵母においては見いだされていない）。酵母からスクアレンを単離するための方法は、当該分野で公知であり、クロマトグラフィー、液体−液体溶媒抽出、臨界未満ガス抽出［２６］、および超臨界流体抽出（必要に応じて、凍結乾燥が先に行われる）（例えば、ＣＯ２を用いる）、クロロホルム−メタノール溶媒抽出［５，２３，２７］のような方法が挙げられる。理想的には、上記精製スクアレンは、９７％より純粋（重量で）であり、より好ましくは、９８％より高い、９９％、９９．５％、９９．９％、９９．９９％、さらには１００％純粋である。理想的には、上記精製スクアレンは、スクアレン１ｇあたり６１５３ｐｇ未満のＰＣＢ／ダイオキシン（毒性等量（ＴＥＱ）として測定される）を含む。ＴＥＱは、ＰＣＢ／ダイオキシンの混合物の毒性が、単一の数字として表されることを可能にする。各ＰＣＢ（ポリ塩化ビフェニル）の毒性は、２，３，７，８−ＴＣＤＤダイオキシン（基準値１を有する）の毒性の比（毒性等価係数，ＴＥＦ；ＷＨＯ  ２００５）として表される。混合物の総ＴＥＱを計算するために、各ＰＣＢの質量には、そのＴＥＦが乗算され、そして、上記ＴＥＱは、これら値の合計である。例えば、上記スクアレンは、５０００ｐｇ／ｇ未満、４０００ｐｇ／ｇ、３０００ｐｇ／ｇ、２０００ｐｇ／ｇ、１０００ｐｇ／ｇ、５００ｐｇ／ｇ、１００ｐｇ／ｇ、５０ｐｇ／ｇ（ＴＥＱ）のダイオキシン／ＰＣＢレベルを有し得る。
【００４０】
いったん上記スクアレンが、上記酵母から精製されたら、上記スクアレンは、下流の産物（例えば、医薬、水中油型エマルジョンアジュバントなど）の調製のために使用され得る。
【００４１】
（水中油型エマルジョン）
水中油型エマルジョンは、ワクチンを補助することにおいて使用するために特に適切であることが見いだされた。本発明に従って調製されるエマルジョンは、水性成分に加えて、スクアレンおよび少なくとも１種の界面活性剤を含む。上記エマルジョンは、さらなる油を含み得る。理想的には、上記油および界面活性剤は、生分解性（代謝可能）かつ生体適合性である。
【００４２】
スクアレンおよびトコフェロールの油組み合わせが、使用され得る。組成物がロコフェロールを含む場合、αトコフェロール、βトコフェロール、γトコフェロール、δトコフェロール、εトコフェロール、もしくはξトコフェロールのうちのいずれかが使用され得るが、α−トコフェロールが、好ましい。上記トコフェロールは、いくつかの形態（例えば、種々の塩および／もしくはアイソマー）をとり得る。塩としては、有機性塩（例えば、コハク酸塩、酢酸塩、ニコチン酸塩など）が挙げられる。Ｄ−α−トコフェロールおよびＤＬ−α−トコフェロールが、ともに使用され得る。好ましいα−トコフェロールは、ＤＬ−α−トコフェロールである。
【００４３】
２〜２０％（容積で）の範囲の油含有量が代表的である。
【００４４】
上記エマルジョン中の油滴は、一般に、５μｍ直径未満であり、さらにサブミクロン直径を有し得る。これら小さなサイズは、都合のよいことに、安定なエマルジョンを提供するためにマイクロフルイダイザーで達成される。２２０ｎｍ未満のサイズを有する液滴が好ましい。なぜなら、それらは、濾過滅菌に供され得るからである。
【００４５】
界面活性剤は、それらの「ＨＬＢ」（親水性／親油性バランス）によって分類され得る。本発明の好ましい界面活性剤は、少なくとも１０、好ましくは、少なくとも１５、およびより好ましくは、少なくとも１６のＨＬＢを有する。本発明は、界面活性剤とともに使用され得る。これら界面活性剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般にＴｗｅｅｎといわれる）、特に、ポリソルベート２０およびポリソルベート８０；ＤＯＷＦＡＸＴＭ  商用名の下で販売される、エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）、および／もしくはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー（例えば、直鎖状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマー）；オクトキシノール（これは、反復エトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の数が変動し得る）（オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、もしくはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が特に重要である）；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；リン脂質、例えば、ホスファチジルコリン（レシチン）；ノニルフェノールエトキシレート（例えば、ＴｅｒｇｉｔｏｌＴＭ  ＮＰシリーズ）；ラウリル、セチル、ステアリルおよびオレイルアルコールに由来するポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として公知）、例えば、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ  ３０）；およびソルビタンエステル（一般に、ＳＰＡＮとして公知）、例えば、ソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ  ８５）およびソルビタンモノラウレート。非イオン性界面活性剤が好ましい。上記エマルジョン中に含めるための最も好ましい界面活性剤は、ポリソルベート  ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート；Ｔｗｅｅｎ  ８０）である。
【００４６】
界面活性剤の混合物が、使用され得る（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ８０／Ｓｐａｎ  ８５混合物）。ポリオキシエチレンソルビタンエステルおよびオクトキシノールの組み合わせもまた、適切である。別の有用な組み合わせは、ラウレス（ｌａｕｒｅｔｈ）９とポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／もしくはオクトキシノールを含む。
【００４７】
好ましい量の界面活性剤（重量％）は、以下である：ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ８０）  ０．０１〜２％；オクチルフェノキシポリオキシエタノールもしくはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、もしくは他のＴｒｉｔｏｎシリーズの界面活性剤）  ０．００１〜０．１％；ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ラウレス  ９）  ０．１〜２０％。
【００４８】
ポリソルベート  ８０界面活性剤を含むスクアレン含有水中油型エマルジョンが、好ましい。本発明に従って精製されたスクアレンを使用して作製され得る特定の水中油型エマルジョンアジュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４９】
・スクアレン、ポリソルベート  ８０、およびソルビタントリオレエートのサブミクロンエマルジョン。上記エマルジョンの容積での組成は、約５％  スクアレン、約０．５％
ポリソルベート  ８０および約０．５％  Ｓｐａｎ  ８５であり得る。重量の観点では、これら比率は、４．３％  スクアレン、０．５％  ポリソルベート  ８０および０．４８％  Ｓｐａｎ  ８５になる。このアジュバントは、参考文献３１の第１０章および参考文献３２の第１２章に詳細に記載されるように、「ＭＦ５９」として公知である［２８−３０］。上記ＭＦ５９エマルジョンは、有利なことには、クエン酸イオン（例えば、１０ｍＭ  クエン酸ナトリウム緩衝液）を含む。
【００５０】
・スクアレン、トコフェロール、およびポリソルベート  ８０のサブミクロンエマルジョン。これらエマルジョンは、２〜１０％  スクアレン、２〜１０％  トコフェロールおよび０．３〜３％  ポリソルベート  ８０を有し得、スクアレン：トコフェロールの重量比は、より安定なエマルジョンを提供し得るので、好ましくは、≦１（例えば、０．９０）である。スクアレンおよびポリソルベート  ８０は、約５：２の容積比もしくは約１１：５の重量比で存在し得る。１つのこのようなエマルジョンは、ＰＢＳ中にＴｗｅｅｎ  ８０を溶解して、２％溶液をもたらし、次いで、９０ｍｌのこの溶液と、（５ｇのＤＬ−α−トコフェロールおよび５ｍｌのスクアレン）の混合物とを混合し、次いで、上記混合物をマイクロフルイダイズ（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓｅ）することによって、作製され得る。得られたエマルジョンは、サブミクロン油滴（例えば、平均直径１００〜２５０ｎｍの間、好ましくは、約１８０ｎｍ）を有する。上記エマルジョンはまた、３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３ｄ−ＭＰＬ）を含み得る。このタイプの別の有用なエマルジョンは、１ヒト用量あたり、０．５〜１０ｍｇ  スクアレン、０．５〜１１ｍｇ
トコフェロール、および０．１〜４ｍｇ  ポリソルベート  ８０を含み得る［３３］。
【００５１】
・スクアレン、トコフェロール、およびＴｒｉｔｏｎ界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）のエマルジョン。上記エマルジョンはまた、３ｄ−ＭＰＬ（以下を参照のこと）を含み得る。上記エマルジョンは、リン酸緩衝液を含み得る。
【００５２】
・スクアレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン性界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレン（１２）セトステアリルエーテル）および疎水性非イオン性界面活性剤（例えば、ソルビタンエステルもしくはマンニドエステル（例えば、ソルビタンモノオレエートもしくは「Ｓｐａｎ  ８０」））を含むエマルジョン。上記エマルジョンは、好ましくは、熱可逆性であり、そして／または２００ｎｍ未満のサイズを有する少なくとも（容積で）９０％の油滴を有する［３４］。上記エマルジョンはまた、アルジトール；凍結防止剤（例えば、糖（例えば、ドデシルマルトシドおよび／もしくはスクロース））；および／もしくはアルキルポリグリコシドのうちの１種以上を含み得る。上記エマルジョンは、ＴＬＲ４アゴニストを含み得る［３５］。このようなエマルジョンは、凍結乾燥され得る。
【００５３】
・スクアレン、ポロキサマー  １０５およびＡｂｉｌ−Ｃａｒｅのエマルジョン［３６］。アジュバント付加したワクチン中のこれら成分の最終濃度（重量）は、５％  スクアレン、４％  ポロキサマー  １０５（プロニックポリオール）および２％  Ａｂｉｌ−Ｃａｒｅ  ８５（Ｂｉｓ−ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６  ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６  ジメチコン；トリカプリルグリセリル／トリカプリン酸グリセリル）である。
【００５４】
上記エマルジョンは、別個の抗原含有成分と、即座に、送達時に、もしくはワクチン製造の間に混合され得る。これら２つの成分が液体である場合、混合のための上記２つの液体の容積比は、変動し得る（例えば、５：１〜１：５の間）が、一般に、約１：１である。
【００５５】
従って、本発明のプロセスは、上記エマルジョンと免疫原とを合わせるさらなる工程を包含し得る。上記プロセスは、上記エマルジョンもしくは上記エマルジョン／免疫原ミックスをパッケージするさらなる工程を包含し得る。本発明に従って生産されるエマルジョンは、キット内の第１の容器にパッケージされ得、ここで上記キットは、免疫原を含む第２の容器を含む。上記２つの容器の内容物は、混合され得、次いで、被験体（例えば、ヒト）に投与され得るか、もしくは別個に共投与され（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ）得る。
【００５６】
（一般）
用語「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む、包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘを「含む」組成物は、もっぱらＸからなってもよいし、いくつかのさらなるものを含み得る（例えば、Ｘ＋Ｙ）。
【００５７】
数値ｘに関して用語「約」とは、任意であり、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【実施例】
【００５８】
（発明を実施するための形態）
種々の変異酵母株を、遺伝的操作技術によって調製する。上記変異株は、スクアレン代謝に関与する酵素を過剰発現するか過小発現するかのいずれかである。１つのこのような酵母は、参考文献１１に開示されるＡＴＣ１５５１株（これは、最大１６％までのｃｄｗで、適切な増殖条件下でスクアレンを生産し得る）である。
【００５９】
培養後に、上記培養細胞を集め、ガラスビーズミルを使用して粉砕する。スクアレンを、（２：１）  クロロホルム−メタノール溶媒抽出によって、または収量を改善するために、凍結乾燥および次いで超臨界二酸化炭素抽出を使用して参考文献５において開示される方法によって、上記溶解物から精製する。得られたスクアレンは、高度に純粋である（＞９５％）。
【００６０】
上記精製スクアレンを、Ｔｗｅｅｎ  ８０およびＳｐａｎ  ８５界面活性剤の混合物と、およびクエン酸緩衝液と合わせて、５％  スクアレン、０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ８０および０．５％  Ｓｐａｎ  ８５（容積で）を有する混合物を調製する。この混合物をマイクロフルイダイズし、５００ｎｍ未満の平均液滴サイズを有するエマルジョンを調製する。このエマルジョンは、「ＭＦ５９」として公知であり、ワクチンアジュバントとして使用し得る。
【００６１】
本発明は、例示のみを目的として記載されており、改変が行われ得ると同時に、それが本発明の範囲および趣旨内にあり得ることが理解される。
【００６２】
（参考文献）
【００６３】
【化２】
0005930766.tif 000003