(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップを含む、単離されたレポーターキナーゼの活性を検出するためのアッセイ。
（ｉ）単離されたレポーターキナーゼを、ＡＤＰ及び生物発光試薬を含むアッセイ混合物に添加するステップであり、前記レポーターキナーゼを同時にＡＤＰ及び生物発光試薬と接触させ、
前記レポーターキナーゼをＡＤＰと接触させる前に、前記アッセイ混合物は、前記レポーターキナーゼ以外のキナーゼを実質的に含まないステップ及び
（ii）前記アッセイ混合物からの光出力を検出するステップ
【請求項２】
レポーターキナーゼをＡＤＰと接触させる前には、アッセイ混合物が、ＡＴＰを実質的に含まない、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項３】
レポーターキナーゼをＡＤＰと接触させる前に、レポーターキナーゼ以外のキナーゼが、実質的に除去又は不活性化される、請求項１又は２に記載のアッセイ。
【請求項４】
レポーターキナーゼをＡＤＰと接触させる前に、ＡＴＰが、実質的に除去される、請求項１〜３のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項５】
レポーターキナーゼが、アデニル酸キナーゼ、好ましくは三量体又は単量体アデニル酸キナーゼである、請求項１〜４のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項６】
レポーターキナーゼが、耐熱性キナーゼである、請求項１〜５のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項７】
１５分未満、１０分未満、５分未満、２分未満、１分未満、又は３０秒未満で完了する、請求項１〜６のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項８】
以下のステップを含む、試料中の分析物の存在を決定するための方法。
（ｉ）前記試料中に前記分析物が存在する場合に、単離されたレポーターキナーゼと、前記分析物との間に複合体が形成されるように、前記分析物に特異的な結合剤に連結した前記レポーターキナーゼに前記試料を曝露するステップ、
（ii）複合体形成していないレポーターキナーゼから複合体形成したレポーターキナーゼを分離するステップ、並びに
（iii）請求項１〜７のいずれかに記載のアッセイを使用して、前記複合体形成したレポーターキナーゼの活性を測定するステップ
【請求項９】
以下のステップを含む、試料中の分析物の存在を決定するための方法。
（ｉ）単離されたレポーターキナーゼを含む固体支持体を提供するステップであり、前記レポーターキナーゼを、前記分析物に特異的な結合剤を含むリンカーを介して前記固体支持体に付着させるステップ、
（ii）前記固体支持体に前記試料を適用して、前記試料中に前記分析物が存在する場合、前記分析物が、前記レポーターキナーゼを前記固体支持体から置換するステップ、及び
（iii）請求項１〜７のいずれかに記載のアッセイを使用して、置換されたレポーターキナーゼの活性を測定するステップ
【請求項１０】
以下のステップを含む、試料中の分析物の存在を検出するための方法。
（ｉ）前記分析物に特異的な第１の結合剤が付着した固体支持体を提供するステップ、
（ii）前記試料中に存在する場合に前記分析物が前記第１の結合剤を介して前記固体支持体に付着されるように、前記固体支持体を前記試料に曝露するステップ、
（iii）前記分析物に特異的な第２の結合剤に連結した、単離されたレポーターキナーゼが、前記第２の結合剤と、既に結合している分析物との間の相互作用を介して前記固体支持体に付着するように、前記レポーターキナーゼに前記固体支持体を曝露するステップ、
（iv）ステップ（iii）において得られた混合物をフィルター膜に適用するステップであり、前記固体支持体が前記フィルター膜上に保持されるステップ、並びに
（ｖ）請求項１〜７のいずれかに記載のアッセイを使用して、保持されているレポーターキナーゼの活性を測定するステップ
【請求項１１】
以下のステップを含む、試料中の分析物の存在を検出するための方法。
（ｉ）前記分析物に特異的な第１の結合剤が付着した磁気固体支持体を提供するステップ、
（ii）前記試料中に存在する場合、前記分析物が前記第１の結合剤を介して前記固体支持体に結合するように、前記固体支持体を前記試料に曝露するステップ、
（iii）前記分析物に特異的な第２の結合剤に結合した、単離されたレポーターキナーゼが、前記第２の結合剤と、既に結合している分析物との間の相互作用を介して前記固体支持体に付着するように、前記レポーターキナーゼに前記固体支持体を曝露するステップ、
（iv）ステップ（iii）において得られた混合物を磁石に曝露するステップであり、前記固体支持体が磁石上に保持されるステップ、並びに
（ｖ）請求項１〜７のいずれかに記載のアッセイを使用して、保持されているレポーターキナーゼの活性を測定するステップ
【請求項１２】
固体支持体が、ラテックスビーズ及び磁気ビーズからなる群から選択される、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
以下のステップを含む、試料中の混入生物学的作用物質の量又は活性を低下させるための処理プロセスを検証する方法。
（ｉ）混入生物学的作用物質を含有する又は含有すると疑われる試料を提供するステップ、
（ii）規定量の単離されたレポーターキナーゼの存在下で前記試料を処理プロセスに供するステップであり、前記レポーターキナーゼ及び前記混入生物学的作用物質が両方とも前記処理プロセスに曝露されるステップ、
（iii）請求項１〜７のいずれかに記載のアッセイを使用して、前記レポーターキナーゼの残存活性を測定するステップ、及び
（iv）前記残存活性を所定のキナーゼ活性と比較するステップであり、前記所定のキナーゼ活性が、同じ条件下の前記混入生物学的作用物質の量又は活性の確認された低下に相当するステップ
【請求項１４】
１５分間未満、１０分間未満、５分間未満、又は２分間未満で完了する、請求項８〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
レポーターキナーゼの活性を測定する前に、試料が、ＡＴＰを実質的に除去するために及び／又はレポーターキナーゼ以外のキナーゼを実質的に除去する若しくは阻害するために処理される、請求項８〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
適したデータ記憶媒体上に、ステップ（ii）において得られた光出力データを記録するステップをさらに含む、請求項１〜７のいずれかに記載のアッセイ、又は請求項８〜１５のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レポーターキナーゼの活性を検出するための高速生物発光検出システム、特に、高速で、非常に感度のよい生物発光検出システムの分野に関する。レポーターキナーゼの活性を検出するための生物発光アッセイ、デバイス、及びキットもまた提供される。
【背景技術】
【０００２】
レポーター酵素としてのキナーゼの使用は、当技術分野において記載されてきた。例として、本発明者らは、試料中の分析物の存在を検出するための診断システム（国際公開第００／４６３５７号パンフレットを参照されたい）における及びさらに、汚染除去プロセスの有効性を検証するためのシステムにおける（国際公開第２００５／０９３０８５号パンフレットを参照されたい）レポーターキナーゼの使用を記載した。これらのレポーターキナーゼの活性は、光出力シグナルを生成するＡＴＰ生物発光システム（例えばルシフェリン−ルシフェラーゼ）を使用して、典型的に検出される。生成された光出力は、ルミノメーターを使用して測定され、さらに、これらの測定値は、キナーゼ活性の量と相互に関連している。
【０００３】
レポーターキナーゼシステムと関連する潜在的な問題は、出力シグナルを得るために必要とされる時間の長さである。今日までのところ、出力シグナルを得るのに必要とされる典型的な時間は、３０分間〜数時間の範囲である。したがって、当技術分野においてより迅速な及び／又は単純化されたレポーターシステムの必要性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第００／４６３５７号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００５／０９３０８５号パンフレット
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
１又は２以上の上述の問題は、本発明によって解決され、本発明は、第１の態様では、レポーターキナーゼの活性を検出するためのアッセイであって、
（ｉ）上述のレポーターキナーゼをアッセイ混合物に添加するステップであり、上述のレポーターキナーゼをＡＤＰと接触させ、ＡＤＰと接触させた後、５分以内に、上述のレポーターキナーゼを生物発光試薬と接触させ、
レポーターキナーゼをＡＤＰと接触させる前に、アッセイ混合物は、非レポーターキナーゼ（つまりレポーターキナーゼ以外のキナーゼ）を実質的に含まないステップ及び
（ii）アッセイ混合物からの光出力を検出するステップを含むアッセイを提供する。
【０００６】
本発明の一実施形態では、方法は、適したデータ記憶媒体上に、ステップ（ii）において得られた光出力データを記録するステップをさらに含む。
【０００７】
本発明の他の実施形態では、レポーターキナーゼをＡＤＰと接触させた後、２分以内、１分以内、３０秒以内、又は１０秒以内に、生物発光試薬と接触させる。他の実施形態では、レポーターキナーゼは、ＡＤＰ及び生物発光試薬と同時に接触させる。
【０００８】
したがって、レポーターキナーゼのＡＤＰとの接触と、生物発光試薬との接触との間に大幅なインキュベーション期間はない（又は非常に短いインキュベーション期間のみがある）。したがって、本発明は、「ワンステップ」生物発光検出プロセスを利用すると言うことができる。
【０００９】
上記の高速検出システムとは対照的に、従来のレポーターシステムは、典型的に「ツーステップ」検出プロセスを利用する。
【００１０】
【化１】
0006042066.tif 000002
【００１１】
【化２】
0006042066.tif 000003
【００１２】
第１のステップにおいて、レポーターキナーゼが、ＡＤＰ基質の供給源に曝露され、ＡＴＰの生成を可能にするのに十分な時間、インキュベートされる［１］。次いで、第２の個別のステップにおいて、ルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬が、レポーターキナーゼによって生成されたＡＴＰを光に変換するために添加される［２］。この「ツーステップ」生物発光アッセイは、正確なキナーゼ検出をもたらすことが示されてきた。しかしながら、その「ツーステップ」の性質（つまり、ＡＤＰの添加、インキュベーション、次いで生物発光試薬の個別の添加）は、扱いにくく、検出が、実験室環境においてではなく、「現場において」実行される場合に、遅いことが分かった。
【００１３】
今日までのところ、ステップ［２］の間に生成されたＡＭＰがステップ［１］の平衡を左側に動かし、それによって、ステップ［１］において生成されたＡＴＰのＡＤＰへの再変換を促進するので、２つの反応ステップ（上記に示される）は、共存できないと考えられてきた。システムの光シグナル出力がＡＴＰの存在に依存するので、これは、キナーゼ活性の検出をより困難にする。したがって、今日までのところ、ステップ［１］及び［２］は、時間的に（つまり、上記に記載されるインキュベーションステップを含むことによって）又は空間的に（つまり、反応が個別の区画において実行される）分離されてきた。
【００１４】
この定論に反して、本発明者らは、反応ステップ［１］及び［２］が、実際に、レポーターキナーゼの検出の感度に対するいかなる著しい悪影響をも伴わないで、同時に実行することができることを発見した。結果として生じる「ワンステップ」生物発光アッセイは、速度及び利便性の点から著しい利点を提供し、簡易迅速診断試験において特に有利であり、高速プロセス放出インジケーターとなる、つまり、実験室ではなく現場におけるキナーゼ活性の検出のためのものとなる。
【００１５】
さらに、検出の高感度及び正確性を確実にするために、本発明者らは、いかなるＡＤＰも添加する前に、レポーターキナーゼを含有する試料が、いかなる非レポーター（つまり混入）キナーゼ活性も及び／又はいかなる内在性ＡＴＰも実質的にないことを確実することが有利であることを発見した。上記の反応方式から明らかであろうが、これらの混入物のいずれの存在も、キナーゼ活性の検出の感度／正確性に著しく悪影響を及ぼし得る。例として、非レポーターキナーゼは、ＡＤＰをＡＴＰに変換し、したがって、誤った（又は増加した）光出力シグナルを生成するかもしれない。したがって、いかなる非レポーターキナーゼ及び／又はいかなる内在性ＡＴＰも除去する又は不活性化するために、レポーターキナーゼを含有する試料を処理することが有利であることが分かった。
【００１６】
本発明の一実施形態では、非レポーターキナーゼは、下記に記載される、１又は２以上の処理ステップを使用して除去される及び／又は不活性化される。この点に関して、本発明に従って不活性化される又は除去される好ましい非レポーターキナーゼは、哺乳動物、菌類、及び／又は植物のキナーゼ（例えば哺乳動物、菌類、又は植物のアデニル酸キナーゼ）である。これらの処理は、任意の回数（好ましくは１若しくは２以上、少なくとも２、又は少なくとも３）及び／又は任意の組合せにおいて使用してもよい。しかしながら、すべての場合において、処理は、レポーターキナーゼを実質的に無損傷（例えばキナーゼ活性の点から活性）のまま残す。いかなる１又は２以上の以下の処理ステップも、本発明の任意の態様に適用することができる。
【００１７】
一実施形態では、非レポーターキナーゼは、１〜３０分間の間、５０〜１２０℃の温度、例えば１０分間９０℃、３分間９０℃、１分間９０℃、３分間１２０℃、又は１分間１２０℃への曝露によって不活性化される。不活性化プロセスの温度及び継続期間は、レポーターキナーゼの活性を実質的に無損傷のまま残しながら、非レポーターキナーゼを変性させる。
【００１８】
さらなる実施形態では、非レポーターキナーゼは、化学的変性処理を使用して除去される／不活性化される。適した処理の例は、尿素（例えば２Ｍを超える濃度の尿素）若しくはグアニジン（例えば１Ｍを超える濃度のグアニジン）などのようなカオトロープへの曝露、界面活性剤（例えば０．５％を超えるＳＤＳ、サルコシル、若しくはｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）への曝露、フリーラジカル発生剤（例えば次亜塩素酸ナトリウム若しくは等価な試薬に由来する１０００ｐｐｍを超える活性塩素）への曝露、又は酸化処理への曝露を含む。
【００１９】
他の実施形態では、非レポーターキナーゼは、酵素変性処理を使用して除去される／不活性化される。適した酵素の例は、例えばPrionzyme（登録商標）、Properase（登録商標）、プロテイナーゼ−Ｋ、及びサーモリシンなどのような高度にプロセッシブなプロテアーゼを含む。
【００２０】
さらなる実施形態では、非レポーターキナーゼは、選択されるｐＨ（ｐＨ４未満の又は例えば５０ｍＭ  ＣＡＰＳ  ｐＨ１１などのような緩衝液を使用してｐＨ１１を超える）、選択される塩濃度（例えば２Ｍを超える硫酸アンモニウム）、ＥＤＴＡ、又はその組合せへの曝露によって除去される／不活性化される。
【００２１】
さらなる実施形態では、非レポーターキナーゼは、阻害剤の添加によって除去される／不活性化され、これは、非レポーターキナーゼを選択的に又は特異的に阻害する（つまり、阻害剤は、レポーターキナーゼの活性を実質的に無損傷のまま残しながら、非レポーターキナーゼを不活性化する）。適した阻害剤の例は、スタウロスポリン；バナデート（例えばオルトバナデート又はデカバナデート）；グリセロホスフェート；Ａｐ６Ａ（ジアデノシンヘキサホスフェート）、Ａｐ５Ａ（ジアデノシンペンタホスフェート）、Ａｐ４Ａ（ジアデノシンテトラホスフェート）、及び／又はＡｐ３Ａ（ジアデノシントリホスフェート）などのようなジアデノシンホスフェート；ビタミンＣ；ＡＭＰ−ＰＣＰ；ＡＭＰ−ＰＮＰ；ＡＭＰ−Ｓ；ＡＴＰ−γＳ；並びにＡｒａ−ＡＴＰを含む。非レポーターキナーゼの（例えば非レポーターアデニル酸キナーゼの）の競合的阻害剤が好ましい（例えばＡｐ４Ａ及び／又はＡｐ５Ａなどのようなジアデノシンホスフェート阻害剤）。一実施形態では、阻害剤は、哺乳動物及び菌類（例えば酵母）及び植物の非レポーターキナーゼを選択的に又は特異的に阻害する。他の実施形態では、阻害剤（例えばＡｐ５Ａ）は、哺乳動物、菌類（例えば酵母）の非レポーターキナーゼを選択的に又は特異的に阻害する。さらなる実施形態では、阻害剤（例えばＡｐ４Ａ及び／又はＡｐ６Ａ）は、哺乳動物の非レポーターキナーゼを選択的に又は特異的に阻害する。
【００２２】
阻害剤は、例えば異なる試料又はマトリックスについて経験的に決定され得る。例えば、一連の異なる阻害剤は、レポーターキナーゼ（例えばＳ．アシドカルダリウス（S.acidocaldarius）、Ｔ．マリティマ（T.maritima）、又はクラミジア・ニューモニエ（Chlamydia pneumonae）に由来するキナーゼ）及びウサギ筋肉アデニル酸キナーゼによって代表される哺乳動物組織由来キナーゼなどのような非レポーターキナーゼを区別するために、実験的に示されてきた（図４及び図７）。したがって、一実施形態では、Ａｐ４Ａ、Ａｐ５Ａ、及び／又はＡｐ６Ａなどのような１又は２以上の阻害剤の使用により、非レポーターキナーゼ（例えば、アデニル酸キナーゼなどのような内因性組織由来キナーゼ）の活性が実質的に低下し、利用される阻害剤濃度は、典型的に、低マイクロモルの範囲にあり、レポーターキナーゼに対して著しい影響を有していない。さらなる例として、Ａｐ５Ａは、レポーターキナーゼを、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）に由来する酵素によってここで代表される非レポーターキナーゼ（例えば菌類のアデニル酸キナーゼ）と区別する。これをもとに、阻害剤選択は、レポーターキナーゼ及び試料のバックグラウンド（つまり非レポーターキナーゼ）の両方の性質に基づくものであってもよい。
【００２３】
本発明の適したレポーターキナーゼ適用の例は、表１（下記）に示され、上述の適用において典型的に遭遇する非レポーターキナーゼの混入の例もまた示される。表１はまた、純粋に例として、本発明との関連において利用されてもよい阻害剤の選択をも列挙する（例えば試料調製緩衝液への添加によって）。
【００２４】
【表１】
0006042066.tif 000004
【００２５】
他の実施形態では、非レポーターキナーゼは、サイズに基づいてレポーターキナーゼから分離してもよい。例として、レポーターキナーゼを含有する試料は、濾過デバイス上に流すことができ、これは、サイズに基づいて非レポーターキナーゼ及びレポーターキナーゼを分離し、レポーターキナーゼは、適したフィルター上に保持されるが、非レポーターキナーゼは、通過する（例えば実施例１４及び図６を参照されたい）。これは、フィルターによって優先的に保持される粒子に又は小胞内にレポーターキナーゼを連結（coupling）することによって達成してもよい。いずれの場合も、フィルターへのレポーターキナーゼの付着は、レポーターキナーゼ活性の著しい損失をもたらさない。適したフィルターマトリックスは、ニトロセルロース、酢酸セルロース、又は濾紙を含む。フィルターマトリックスは、典型的に、利用される粒子状キャリアの性質に依存して、０．２μｍ〜２０μｍ以上などのような一連の孔径を利用する。
【００２６】
物理的なサイズもまた、ゲル濾過又はサイズ排除クロマトグラフィーを使用する、レポーターキナーゼからの非レポーターキナーゼの分離の基本として使用できる。一実施形態では、レポーターキナーゼは、非レポーターキナーゼよりも低い分子量を有する。他の実施形態では、レポーターキナーゼは、非レポーターキナーゼよりも高い分子量を有する。例として、レポーターキナーゼは、少なくとも４０〜８０ｋＤａの分子量を有していてもよいのに対して、非レポーターキナーゼは、３０ｋＤａ以下の分子量を有していてもよい。サイズ排除樹脂又は膜に流す場合、これは、非常に効率的な分離をもたらし、大きい方のタンパク質（例えばレポーターキナーゼ）は、マトリックスの空隙容量を又は空隙容量の近くを流れる（よって迅速に流出する）が、非レポーターキナーゼ（例えば、哺乳動物の組織キナーゼなどのような内在性キナーゼ）は、マトリックスの孔と相互作用し、よりゆっくり溶出する。適した「より高い分子量の」レポーターキナーゼは、古細菌の供給源から得られてもよく（例えば古細菌の供給源に由来する三量体アデニル酸キナーゼ酵素）、これは、２１〜２２ｋＤａの混入非レポーターキナーゼ（例えば、哺乳動物の組織キナーゼなどのような内因性キナーゼ）と比較して、サイズが６０ｋＤａの範囲にある。さらに、レポーターと非レポーターキナーゼとの間のサイズ差異は、レポーターキナーゼへのタンパク質又は抗体断片の添加によって（例えば一本鎖抗体可変領域（ｓｃＦｖ）、化学的コンジュゲーション又は遺伝的融合及び組換え発現によって）増強してもよい。例えば、一本鎖抗体可変領域（ｓｃＦｖ）に融合された三量体アデニル酸キナーゼは、約１２０ｋＤａのサイズを有する（３つのサブユニットのそれぞれに付着した約２０ｋＤａのｓｃＦｖのサイズに基づいて）。
【００２７】
さらなる実施形態では、レポーターキナーゼからの非レポーターキナーゼの分離は、表面電荷の使用によって達成することができる。一実施形態では、レポーターキナーゼの等電点は、非レポーターキナーゼよりも低くてもよい。他の実施形態では、レポーターキナーゼの等電点は、非レポーターキナーゼよりも高くてもよい。そのため、レポーターキナーゼは、適したｐＨでの、陽イオン交換マトリックス又は陰イオン交換マトリックスへのレポーターキナーゼ又は非レポーターキナーゼのいずれかの選択的な結合を用いて非レポーターキナーゼから分離することができる。レポーターキナーゼの等電点は、しばしば、高塩基性範囲にあり、例えば、Ｓ．アシドカルダリウスに由来するｔＡＫは、９．０３の予測ｐＩを有する（発明者らは、実際のｐＩがｐＨ１０を超えることを実証したが−表２を参照されたい）。対照的に、アッセイに干渉し得る大多数の非レポーターキナーゼは、典型的に、より低い等電点、例えばｐＨ７の範囲のｐＩを有する。そのため、レポーターキナーゼは、少なくとも８のｐＨで陽イオン交換樹脂、膜、若しくは他の固体マトリックスの使用によって、又はｐＨ１０を超えるｐＨで陰イオン交換樹脂、膜、若しくは他の固体マトリックスを使用して、レポーターキナーゼの選択的な結合を用いて非レポーターキナーゼから分離することができる。本発明のレポーターキナーゼの多くは、このｐＨ範囲の酵素活性を保持する。代替的には、非レポーターキナーゼは、それらを適したマトリックス、例えばｐＨ９までの陰イオン交換マトリックスに結合することによって選択的に除去することができる。
【００２８】
本発明の他の実施形態では、非レポーターキナーゼは、「疎水性捕捉」技術を使用して、レポーターキナーゼから分離することができる。レポーターキナーゼ（例えばスルホロブス科並びにアシディアヌス（acidianus）、メタロスファエラ（metallosphaera）、スティギオロブス（stygiolobus）、及びスルフリスファエラ（sulfurisphaera）などのような関連するスルフォロブス科に由来するもの）は、そのような表面が、他のタンパク質又は界面活性剤ベースの遮断剤を用いてあらかじめ処理される又はあらかじめコートされる（「遮断される」と呼ばれる）場合でさえ、様々な表面への非常に堅い結合を示す。対照的に、表面の「遮断」は、非レポーターキナーゼ（例えば哺乳動物、菌類、及び／又は植物の非レポーターキナーゼ）の結合を実質的に予防する。物理的結合特性のこの差異は、表面上への付着によって、混入非レポーターキナーゼからのレポーターキナーゼの有効な分離を可能にし、レポーターキナーゼの測定は、捕捉後にその表面上でなされる。例えば、一般に使用される遮断剤ウシ血清アルブミン（例えばＢＳＡ；中性緩衝液中３％ｗ／ｖ）又は脱脂乳（例えば中性緩衝液中５％ｗ／ｖ）のいずれかを用いてコートされたポリカーボネート表面のポリプロピレンの使用は、レポーターキナーゼではなく、非レポーターキナーゼ（例えば、哺乳動物組織キナーゼなどのような内在性キナーゼ）の結合を完全に予防するであろう。この点に関して、Ｓ．アシドカルダリウス、Ｓ．ソルファタリカス（S. solfataricus）、及び関連する属に由来するものなどのような三量体レポーターキナーゼは、これらの環境において特に付着する。
【００２９】
非レポーターキナーゼを除去／不活性化するための１又は２以上の上記の処理は、所望の効果を達成する又は増強するために組み合わせることができる。これは、１又は２以上の化学成分の相対濃度を、第２の成分の存在下において低下させてもよいことを意味してもよい。例えば、非レポーターキナーゼを不活性化するのに必要とされる尿素のレベルは、それだけで約２Ｍであってもよいが、それらが両方とも標的分子に対して影響を及ぼすので、０．５％のＳＤＳの存在下において１Ｍに低下させてもよい。
【００３０】
上記の処理のいくつかはまた、処置されている試料を浄化し、検出されることとなる分子へのさらなる到達をもたらすのに他の有益な効果を有していてもよい。この点に関して、本発明の好ましい適用は、生物学的試料における微生物感染の検出である。したがって、本出願は、感度のよい高速簡易迅速微生物アッセイを提供する。本発明は、特に、表１における「レポーターキナーゼ」の下に列挙される微生物の供給源などのような生物学的試料における細菌、ウイルス、及び／又は菌類の感染の高速検出に適する。さらなる微生物感染は、肝炎種、麻疹種、ノロウイルス種、レジオネラ種、クラミジア種、リステリア種、サルモネラ種、及びバークホルデリア種などのような、実施例において記載されるものを含む。本発明は、より一様な試料に関して及び凝集塊又は凝集物からの微生物抗原の放出においての両方で、糞便試料における微生物の検出を容易にする（例えば尿素及びＳＤＳの添加によって）。同様に、糞便試料への次亜塩素酸ナトリウムの添加により、試料を同時に滅菌し（感染の機会を最小限にし）、非レポーターキナーゼの活性を低下させてもよい。
【００３１】
非レポーターキナーゼを除去するためのステップの正確な順序／タイミングは、重大ではない、ただし、レポーターキナーゼがＡＤＰと接触する前にこれらのステップが実行されることを条件とする。したがって、それらは、試料調製段階において又はレポーターキナーゼがＡＤＰと接触する前にアッセイの間に実行することができる。一実施形態では、処理は、洗浄ステップの代わりとなる又はそれに加えて行われる。
【００３２】
【表２】
0006042066.tif 000005
【００３３】
上記に言及されるように、内在性ＡＴＰの存在は、本発明のアッセイの正確性感度に悪影響を及ぼすかもしれない。したがって、一実施形態では、ＡＤＰの添加前に存在するいかなるＡＴＰも、下記に記載される１又は２以上の処理ステップを使用して除去してもよい。これらの処理は、任意の回数（好ましくは１若しくは２以上、少なくとも２、又は少なくとも３）及び／又は任意の組合せにおいて使用してもよい。しかしながら、すべての場合において、処理は、レポーターキナーゼを実質的に無損傷のまま残す。処理ステップは、本発明の任意の態様に適用することができる。
【００３４】
一実施形態では、内因性ＡＴＰの除去は、ＡＴＰアーゼ（例えばアピラーゼ）を使用して達成される。ＡＴＰアーゼの存在が、レポーターキナーゼを使用して得られるシグナルに悪影響を与えることを回避するために、次いで、ＡＴＰアーゼは、ＡＤＰとの接触の前に除去されてもよい及び／又は不活性化してもよい。例として、ＡＴＰアーゼは、ＡＴＰを除去するために使用することができ、次いで、ＡＴＰアーゼは、上昇した温度の使用によってそれ自体破壊される。代替的には、ＡＴＰアーゼは、デバイス（本明細書において別記されるラテラルフローデバイス又は濾過デバイスなど）上に固定することができ、その結果、ＡＴＰがＡＴＰアーゼの上を流れると、ＡＴＰは不活性化される。上記のように、この不活性化ステップは、レポーターキナーゼがＡＤＰと接触する前に、行なわれなければならない。
【００３５】
さらなる実施形態では、内因性ＡＴＰは、物理的手段によって除去することができる。例として、濾過デバイスを使用することができ、これは、非レポーターキナーゼからのレポーターキナーゼの分離について上記に記載されるものに類似する方法で、サイズに基づいてＡＴＰを分離する。有利には、ＡＴＰ及び非レポーターキナーゼの両方の除去は、それらが両方ともレポーターキナーゼよりも非常に小さいので、後者がそれだけの場合でも又は抗体、構造物、若しくは他の診断試薬に付着されている場合でも、同時に達成することができる。
【００３６】
他の実施形態では、内在性ＡＴＰは、上記に記載される表面電荷に基づいて除去することができる。ｐＨ５．５でのＡＴＰの負電荷により、レポーターキナーゼではなく非レポーターキナーゼと一緒にそれが陰イオン交換樹脂に結合することを可能にする。これもまた、単一のステップで、シグナル生成レポーターキナーゼから混入ＡＴＰ及び混入非レポーターキナーゼを有効に分離する。
【００３７】
内在性ＡＴＰを除去するためのステップの正確な順序／タイミングは、重大ではない、ただし、レポーターキナーゼがＡＤＰと接触する前にこれらのステップが実行されることを条件とする。したがって、それらは、試料調製段階において又はレポーターキナーゼがＡＤＰと接触する前にアッセイの間に実行することができる。一実施形態では、処理は、洗浄ステップの代わり又はそれに加えて行う。
【００３８】
図３において示されるタイプのデータは、特定の試料のアッセイにおいて使用するためのバックグラウンド低減ステップ（つまり、非レポーターキナーゼ及び／又はＡＴＰの除去又は不活性化）のタイプ及び／又は数を決定する場合に役立つ（特に、感染がＡＴＰ又はレポーターキナーゼのバックグラウンドレベルに影響し得る場合、この情報は、いかなるアッセイタイプにおいてもこれらのステップの使用を妨げることはない）。
【００３９】
いかなる適したキナーゼ酵素も、本発明においてレポーターキナーゼとして使用してもよい。一実施形態では、レポーターキナーゼは、アデニル酸キナーゼ、酢酸キナーゼか、ピルビン酸キナーゼ、又はその組合せである。
【００４０】
本発明において使用されるレポーターキナーゼは、三量体又は単量体構造を有していてもよく、これらの三次構造は、例えば温度、ｐＨ、化学的変性剤、又はプロテアーゼなどのような条件へのキナーゼの安定性の改善と関連する。
【００４１】
一実施形態では、レポーターキナーゼは、非哺乳動物、非菌類、及び／又は非植物のキナーゼである。
【００４２】
一実施形態では、レポーターキナーゼは、微生物のキナーゼであり、適したキナーゼは、パイロコッカス・フリオススキナーゼ、Ｐ．アビシキナーゼ、Ｐ．フリオススキナーゼ、Ｐ．ホリコシイ（P. horikoshii）キナーゼ、Ｐ．オエシー（P. woesii）キナーゼなどのようなパイロコッカス種キナーゼ；スルホロブス・ソルファタリカスキナーゼ、Ｓ．アシドカルダリウスキナーゼ、Ｓ．シバタエ（S. shibatae）キナーゼなどのようなスルホロブス種キナーゼ；ロドサーマス・マリナス（Rhodothermus marinus）キナーゼなどのようなロドサーマス種キナーゼ；サーモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）キナーゼなどのようなサーモコッカス種キナーゼ；サーモトガ・マリティマキナーゼ、サーモトガ・ネアポリタナ（Thermatoga neapolitana）キナーゼなどのようなサーモトガ種キナーゼ；及びＭ．ルーバー（M. ruber）キナーゼなどのようなメタノコックス種キナーゼを含む。他の実施形態では、キナーゼは、Ａ．フルギダスキナーゼなどのようなアーケオグロブス種キナーゼ；Ａ．ペルニクスキナーゼなどのようなアエロピルム種キナーゼ；Ａ．ピロフィルス（A. pyrophilus）キナーゼなどのようなアクイフェックス種キナーゼ、Ａ．アシドカルダリウス（A. acidocaldarius）キナーゼなどのようなアリシクロバチルス・キナーゼ；Ｂ．カルドテナックス（B. caldotenax）ＢＴ１キナーゼ、バチルス種ＰＳ３キナーゼ、Ｂ．ステアロサーモフィラス（B. stearothermophilus）１１０５７キナーゼ、Ｂ．ステアロサーモフィラス１２００１キナーゼ、Ｂ．サーモカテニュラタスキナーゼ（B. thermocatenulatus）などのようなバチルス種キナーゼ；Ｃ．ステルココラリウム（C. stercocorarium）キナーゼなどのようなクロストリジウム種キナーゼ；Ｔ．エタノリカス（T. ethanolicus）キナーゼ、Ｔ．サーモスルフロゲネス（T. thermosulfurogenes）キナーゼ、Ｔ．セレレ（T. celere）キナーゼ、Ｔ．アクアティカス（T. aquaticus）ＹＴ１キナーゼ、Ｔ．カルドフィラス（T. caldophilus）ＧＫ２４キナーゼ、Ｔ．サーモフィラス（T. thermophilus）ＨＢ８キナーゼなどのようなサーモアナエロバクター種キナーゼである。好ましい実施形態では、キナーゼは、Ｔ．リトラリスキナーゼ、Ｔ．マリティマキナーゼ、又はＴ．ネアポリタナキナーゼである。
【００４３】
一実施形態では、レポーターキナーゼは、耐熱性である。高温に対して抵抗性であることと同様に、耐熱性キナーゼはまた、ある種の化学物質、例えばカオトロープへの曝露、フリーラジカル損傷、界面活性剤、極度のｐＨ、プロテアーゼへの曝露、タンパク質架橋、非透過性膜若しくは半透膜又はポリマー内の封入、又は表面上への不可逆性の固定などのような、ルーチン的にタンパク質を損傷する若しくは破壊する又はそれらを不活性にする他の生化学的及び物理的プロセスに対しても抵抗性であることが分かっている（例えば、それらの全体が参照によってこれによって組み込まれるDaniel RM, Cowan DA, Morgan HW, Curran MP, "A correlation between protein thermostability and resistance to proteolysis", Biochem J. 1982 207:641-4；Rees DC, Robertson AD, "Some thermodynamic implications for the thermostability of proteins", Protein Sci. 2001 10:1187-94；Burdette DS, Tchernajencko V V, Zeikus JG."Effect of thermal and chemical denaturants on Thermoanaerobacter ethanolicus secondary-alcohol dehydrogenase stability and activity", Enzyme Microb Technol. 2000 27:11-18；Scandurra R, Consalvi V, Chiaraluce R, Politi L, Engel PC., "Protein thermostability in extremophiles", Biochimie. 1998 Nov;80(11):933-41；及びLiao HH., "Thermostable mutants of kanamycin nucleotidyltransferase are also more stable to proteinase K, urea, detergents, and water-miscible organic solvents", Enzyme Microb Technol. 1993 Apr;15(4):286-92を参照されたい）。
【００４４】
他の実施形態では、レポーターキナーゼは、大腸菌キナーゼ、クロストリジウム・ディフィシルキナーゼ、バチルス・アントラシスキナーゼ、アシネトバクター・バウマンニキナーゼ、バークホルデリア・シュードマレイキナーゼ、クラミジア・トラコーマティスキナーゼ、クラミジア・ニューモニエキナーゼ、スタフィロコッカス・アウレウスキナーゼ、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumonia）キナーゼ、発疹チフスリケッチアキナーゼ、マイコバクテリウム・ツベルクローシスキナーゼ、サッカロマイセス・セレビシエキナーゼ、リーシュマニア・ドノバン（Leishmania donovanii）キナーゼ、トリパノソーマ・クルーズ（Trypanosoma cruzii）キナーゼ、シゲラ・フレックスネリ（Shigella flexneri）キナーゼ、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）キナーゼ、熱帯熱マラリア原虫キナーゼ、マイコバクテリウム・マリヌム（Mycobacterium marinum）キナーゼ、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）キナーゼ、フランシセラ・ツラレンシスキナーゼ、サルモネラ種キナーゼ、コクシエラ・ブルネッティ（Coxiella burnetii）キナーゼ、及び／又はブルセラ・アボルタス（Brucella abortus）キナーゼであってもよい。いくつかの実施形態では、これらの生物に由来するキナーゼは、非耐熱性であるが、異なる試料処理技術、抽出技術、又は分離技術の使用によって非レポーターキナーゼと識別することができる。これらのレポーターキナーゼの多くは、それからそれらが生じる生物の存在／不在、生存率、又は破壊を検出するためにそれらの活性を非レポーターキナーゼと識別するための方法と組み合わせて、高速アッセイにおいて使用してもよい。そのような方法は、患者試料、組織、又は細胞集団内の感染の存在及び異なる治療体制又は治療剤の有効性を評価するのに適している。
【００４５】
配列決定されており、本発明における使用に適した特異的なキナーゼの例は、配列番号１〜２５、３１〜３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、及び６１〜８４である。一実施形態では、本発明において使用されるキナーゼは、配列番号１〜２５、３１〜３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、及び６１〜８４に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％の同一性を有する。
【００４６】
適したレポーターキナーゼの他の例は、それらの全体が参照によってこれによって組み込まれる国際公開第００／４６３５７号パンフレット及び国際公開第２００５／０９３０８５号パンフレットにおいて見つけられる。
【００４７】
レポーターキナーゼの安定性は、当業者によく知られている様々な方法を使用して増加させてもよい。
【００４８】
例として、安定化剤（４Ｍの濃度までのソルビトール又は２Ｍまでの濃度のエチレングリコール、グリセロール、若しくはマンニトールなどのような他のポリオールなど）は、キナーゼの安定性を改善しうる。キシラン、トレハロース、ゼラチンなどのような他の添加剤もまた、個々に又は組み合わせて、さらなる安定化効果をもたらしうる。一連の二価金属イオン、特に、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、又はＭｎ２＋の添加もまた、キナーゼの安定性を改善しうる。
【００４９】
キナーゼの化学的修飾もまた、それらの安定性を改善するために使用することができる。グリオキシル酸による表面露出アミノ基の還元アルキル化（例えばMelik-Nubarov (1987) Biotech letts 9:725-730）、タンパク質表面への炭水化物の添加（例えばKlibanov (1979) Anal. Biochem. 93:1-25）、及びアミド化（例えばKlibanov (1983) Adv. Appl. Microbiol. 29:1-28）はすべて、キナーゼの安定性を増加させうる。化学的架橋剤の使用及び酵素固定のための様々なポリマー支持体の使用を含むさらなる方法もまた、酵素の安定性を増加させるための適切な方法である（Gupta (1991) Biotech. Appl. Biochem. 14:1-11において概説される）。
【００５０】
カゼイン若しくはアルブミンなどのような、約１０ｍｇ／ｍｌまでの適したキャリアタンパク質を含有する溶液中でのキナーゼの製剤又はグリシン、チロシン、トリプトファン、若しくはジペプチドなどのような遊離アミノ酸の製剤への添加は、プロテアーゼ処理に対するキナーゼの安定性を増加させうる。
【００５１】
酵素の遺伝的修飾は、熱安定性の著しい増加をもたらすことが示され、類推によって、そのような突然変異もまた、プロテアーゼ処理又は気相「滅菌」などのような他の条件に対する酵素の安定性を著しく増強するであろう。三量体（古細菌）ＡＫの決定された３Ｄ構造を用いて得られたキナーゼ酵素の耐熱性の比較（Vonrhein et al (1998) J. Mol. Biol. 282:167-179及びCriswell et al (2003) J. Mol. Biol.330:1087-1099）により、酵素の安定性に影響するアミノ酸が同定された。
【００５２】
安定性の改善を示すキナーゼの遺伝的に操作されたバリアントは、多くの方法で生成することができる。本質的に、これらは、三量体分子の中心的なコアパッキング領域の一部を形成すると考えられるアミノ酸の特異的な部位特異的突然変異誘発及び、分子全体が、続く一連の突然変異誘発及び改善された特性を有する分子の選択／スクリーニングにかけられるランダム「定向進化」法（random "directed evolution" method）を含む。特異的修正酵素は、配列番号１７〜１９において記載される（いくつかのバリアントはそれぞれの参照によって包含される）。概要を述べられたこれらの修飾は、構造上関連する分子の間で観察される差異に基づいて、おそらく酵素の耐熱性に影響するであろう領域を決定するためにコンセンサスベースのアプローチを使用するハイブリッドアプローチに基づく。これに続いて、最高の耐熱性と相互に関連するアミノ酸を組み込むために限定的な変更、又は耐熱性に不可欠であるとして決定された位置にすべての利用可能なアミノ酸を組み込むためにランダムな置換がなされる。
【００５３】
本発明の一実施形態では、レポーターキナーゼを固体支持体上に結合させてもよい。
【００５４】
適した固体支持体は、プラスチック（例えばポリカーボネート、ポリスチレン、若しくはポリプロピレン）表面、セラミック表面、ラテックス表面、磁気表面、鋼若しくは他の金属表面、フローマトリックス（本明細書において別記される）、フィルター膜、又は他のポリマー表面を含む。固体支持体は、例えばストリップ、ディップスティック、マイクロタイタープレート、ビーズの形態をとることができる。
【００５５】
固体支持体へのレポーターキナーゼの結合は、当技術分野において知られている種々様々の方法のいずれを使用して達成してもよい。
【００５６】
一実施形態では、レポーターキナーゼを、下記に概要を述べられるように、標準のタンパク質吸着法を介して固体支持体上に結合させる。
【００５７】
固体支持体上へのレポーターキナーゼの結合は、タンパク質を表面に連結するために通常使用される方法、例えば、約１時間、室温での、約ｐＨ９．６の０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液中でのタンパク質のインキュベーションによって達成してもよい。代替的には、タンパク質は、当業者らに知られている、広範囲の結合化学反応のいずれかを使用して表面にコバレントに付着させる。例えば、ＳＰＤＰ（Pierce chemicals社製；メーカーの説明書を使用）を用いて誘導体化され、架橋のための遊離スルフヒドリル基をもたらすためにＤＴＴを用いて還元されたアデニル酸キナーゼ融合タンパク質（例えばＳｕｐ３５への）を、マレイミド表面を有するポリスチレン支持体に共有結合させる。そのようなスルフヒドリル結合表面を有するプラスチック表面は、文献において十分に記載されている。本出願において記載されるレポーターキナーゼは、誘導体化及びそのような支持体への架橋に際してそれらの活性が保持される特性を有する。
【００５８】
その代わりに、ポリスチレン又はポリカーボネートの支持体上のアミン反応性表面が、タンパク質上の遊離アミン基を介してのキナーゼの直接的な切断不可能な架橋をもたらす単量体グルタルアルデヒドなどのような二官能性架橋剤と共に使用される。ＵＶ処理もまた、インジケーターを適した支持体に直接連結するために使用することができる。鋼表面は、キナーゼのコバレントな付着を媒介するために、プラスチック表面に類似する方法で処理することができる。
【００５９】
種々様々のタンパク質架橋試薬は、Pierce chemical company（Perbio）などのような会社から入手可能である。スルフヒドリル基、アミノ基、ヒドロキシル基、及びカルボキシル基に対して反応性の試薬は、タンパク質を連結するために設計されるが、それらは、プラスチック、他のポリマー、ガラス、及び金属などのような天然に反応性の固体支持体又はコートされた固体支持体にタンパク質を架橋するために同様に使用することができる。反応性の化学的性質はまた、炭水化物に酵素を架橋するのにも利用可能である。例えば、試薬ＢＭＰＨ（Ｎ−［β−マレイミドプロピオン酸］ヒドラジド・ＴＦＡ）、ＫＭＵＨ（Ｎ−［ｋ−マレイミドウンデカン酸］ヒドラジド）、及びＭＰＢＨ（４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジドハイドロクロライド）は、システイン残基の形態をした遊離スルフヒドリル又はスルフヒドリル反応性基を生成するように還元された化学的に誘導体化されたタンパク質を含有するインジケーターを炭水化物に架橋するために使用することができる。これは、複合糖質（例えば紙、セルロースベースの膜、ゲル、若しくは樹脂）である又は適切に反応性の表面を生成するために糖液を用いてコートする若しくは処理することができる固体支持体にとって特に重要であるかもしれない。
【００６０】
それぞれのタイプの支持体について、結合を増強する及び／又は結合タンパク質を安定化する溶液中にレポーターキナーゼを処方することができる。そのような製剤は、１０％（ｗ／ｖ）までのスクロース、ソルビトール、マンニトール、セルロース、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含有する溶液を含む。さらに、キナーゼは、表面に適用されるゲルの一部又は適した支持体の内腔として製剤することができる。例として、アルギネート、寒天、又はポリアクリルアミドマトリックスを含む。
【００６１】
他の実施形態では、レポーターキナーゼを、分析物に特異的な結合剤を含むリンカーを介して固体支持体に付着させてもよい。この付着を達成するための適した方法の詳細は、本明細書の他のところに示される。
【００６２】
本発明の第１の態様において記載されるアッセイは、その全体が参照によってこれによって組み込まれる、出願人の以前の出願国際公開第００／４６３５７号パンフレットにおいて記載されるものなどのような、キナーゼベースの分析物検出アッセイにおいてキナーゼ活性を検出するのに特に適している。
【００６３】
したがって、本発明の第２の態様では、試料中の分析物の存在を決定するための方法であって、
（ｉ）分析物に特異的な結合剤に連結（coupled）したレポーターキナーゼに、試料を曝露し、レポーターキナーゼと、いかなるものでも、試料中に存在する分析物との間で複合体が形成されるステップ
（ii）複合体形成していないレポーターキナーゼから複合体形成したレポーターキナーゼを分離するステップ、並びに
（iii）本発明の第１の態様によるアッセイを使用して、複合体形成したレポーターキナーゼの活性を測定するステップを含む方法が提供される。
【００６４】
この方法において（及び本明細書において記載される他の方法において）使用される結合剤は、典型的に、調査中の分析物に特異的に結合する抗体（又はその断片）である。抗体は、特異的な抗体の同定及び単離のための従来の技術を使用して得られてもよく、したがって、アッセイは、それに対して抗体が産生され得る実質的にすべての分析物に対して適用される。代替的には、結合剤は、レクチン、成長因子、ＤＮＡ／ＲＮＡアプタマー、ファージ、又は調査中の分析物に特異的に結合する他の化学種からなる群から選択してもよい。第１及び第２の結合剤が含まれる場合、これらの結合剤は、同じであっても、異なっていてもよい。
【００６５】
レポーターキナーゼを、従来の技術によって、特異的結合剤に結合させてもよい。例えば、酵素を用いて免疫反応性生体分子を標識するための多数の方法がある（コンジュゲーション）。抗体、大多数の抗原、及び酵素はすべて、タンパク質であり、したがって、タンパク質の共有結合による架橋の一般的な方法は、イムノアッセイ試薬の産生に適応させることができる。抗体−酵素コンジュゲートの調製は、抗体の免疫学的特性及び酵素の触媒特性の両方の保持を確実にするために穏やかな条件を必要とする。一般的な方法は、グルタルアルデヒドカップリング、他のタンパク質分子上の遊離アミノ基とシッフ塩基連結を形成することができるジアルデヒドを生成するための糖タンパク質の過ヨウ素酸酸化の使用、及びヘテロ二官能性試薬、例えばスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）の使用を含む。
【００６６】
本発明の一実施形態では、上記の方法は、サンドイッチアッセイ（時に２抗体捕捉アッセイと呼ばれる）、抗原捕捉アッセイ、又は抗体捕捉アッセイなどのような「捕捉アッセイ」として実行される。抗体捕捉アッセイの例では、分析物は、最初に、例えば非特異的結合によって固体支持体に結合する。次いで、分析物は、分析物に特異的な結合剤（例えば抗体）に連結されたレポーターキナーゼに曝露される。したがって、分析物とレポーターキナーゼとの間で複合体が形成される。複合体形成していないいかなるレポーターキナーゼも、１又は２以上のルーチン的な洗浄ステップによって除去される。次いで、ＡＤＰ及びルシフェリン／ルシフェラーゼが、固体支持体に添加され、ここで、ＡＤＰはレポーターキナーゼ複合体によってＡＴＰに変換される。ルシフェリン／ルシフェラーゼは、ＡＴＰを光出力に変換し、これは、次いで、測定し、固体支持体上に存在する分析物の量に相互に関連させることができる。
【００６７】
一実施形態では、ステップ（iii）前の任意の時点で、試料は、非レポーターキナーゼ及び／又はＡＴＰを除去／不活性化するために処理される。この点に関して利用されてもよい適した処理は、本明細書において前に記載されている。
【００６８】
一実施形態では、本発明のこの態様において記載される方法は、１５分未満、１０分未満、５分未満、又は２分未満で完了する。
【００６９】
実施例１０は、口腔スワブ試料におけるＣ型肝炎の存在を検出するための本発明のこの態様による方法の使用を記載する。口腔スワブ試料は、患者の口から採取し、いかなる非レポーターキナーゼ（例えば、哺乳動物の組織キナーゼなどのような内因性キナーゼ）も除去するために１分間、９０℃でオーブン中で乾燥させる。次いで、スワブは、肝炎Ｃ抗原についての抗体に結合したレポーターキナーゼを含むコンジュゲートに曝露される。レポーターキナーゼコンジュゲートは、スワブ試料上に存在するいかなる肝炎Ｃ抗原とも複合体形成する。次いで、スワブは、複合体形成していないいかなるレポーターキナーゼコンジュゲートも除去するためにすすがれ、ＡＤＰ並びにルシフェリン及びルシフェラーゼを含有する試薬チューブの中に入れられる。試薬チューブは、携帯型のルミノメーターに移動され、光出力が測定される。次いで、光出力は、試料中に存在する分析物の量と相互に関連させることができる。
【００７０】
第３の態様では、本発明は、試料中の分析物の存在を決定するための方法であって、
（ｉ）レポーターキナーゼを含む固体支持体を提供するステップであり、レポーターキナーゼを、分析物に特異的な結合剤を含むリンカーを介して固体支持体に付着させるステップ、
（ii）固体支持体に試料を適用して、試料中に存在するいかなる分析物も、レポーターキナーゼを固体支持体から移動させるステップ、及び
（iii）本発明の第１の態様によるアッセイを使用して、移動されたレポーターキナーゼの活性を測定するステップを含む方法を提供する。
【００７１】
一実施形態では、本発明のこの態様において記載される方法は、１５分未満、１０分未満、５分未満、又は２分未満で完了する。
【００７２】
例として、細菌毒素を含有すると疑われる臨床試料が提供される。固体支持体もまた、提供され、これは、細菌毒素に特異的な結合剤（例えば抗体）によって固体支持体に連結されたレポーターキナーゼを含む。試料が固体支持体に適用されると、存在するいかなる細菌毒素も、固体支持体への抗体の結合に競合的に干渉し、それによって、レポーターキナーゼを固体支持体から移動させるであろう。次いで、移動されたレポーターキナーゼの量は、本発明の第１の態様によるアッセイを使用して、測定し、試料中に存在する細菌毒素の量と相互に関連させることができる。
【００７３】
実施例１３は、臨床試料中のノロウイルスの存在を検出するためのこの方法の使用を記載する。本実施例では、固体支持体は、ノロウイルスに対する抗体（つまり分析物に特異的な結合剤）を用いてコートされる。ＶＰ１ノロウイルスタンパク質（つまり分析物）にコンジュゲートされたレポーターキナーゼを含むレポーターキナーゼコンジュゲートが、形成される。ＶＰ１と抗体との間の相互作用によって、レポーターキナーゼを固体支持体に付着させる。次いで、臨床試料は、固体支持体に適用される。試料中に存在するいかなるノロウイルス（つまり分析物）も、レポーターキナーゼコンジュゲートを固体支持体から移動させる（displace）。次いで、この移動されたレポーターキナーゼの活性は、測定され、試料中に存在するノロウイルスの量と相互に関連される。
【００７４】
一実施形態では、固体支持体は、フローマトリックスである。用語「フローマトリックス」は、ニトロセルロース、ナイロン、レーヨン、セルロース、紙、ガラス繊維、シリカ、ゲルマトリックス、又は他の多孔性若しくは繊維性材料などのような材料を含む、それを通る液体の流動を可能にする任意の液体輸送固体材料を意味するように本明細書の全体にわたって使用される。一実施形態では、フローマトリックスは、実質的に平面で細長いストリップとして構成される。フローマトリックス材料は、必要とされるように、あらかじめ処理することができる又は修飾することができる。
【００７５】
レポーターキナーゼを固体支持体に付着するのに適した方法は、下記に記載される。結合剤は、本発明の第２の態様に関して上記に定義されるとおりである。
＊  分析物は、固体支持体の表面に直接結合させる。
レポーターキナーゼは、分析物に特異的な結合剤（例えば抗体）に連結され、それによって、表面上の分析物と結合する。試料中の抗体又は分析物の存在によって外されるまで、レポーターキナーゼは表面に付着したままである。
＊  分析物は、分析物に特異的な第１の結合剤を介して固体支持体に連結させる。
レポーターキナーゼは、分析物に特異的な第２の結合剤にコンジュゲートされ、それによって、表面上の分析物と結合する。試料中の抗体又は分析物の存在によって移動されるまで、レポーターキナーゼは表面に結合したままである（サンドイッチタイプの配置で）。
＊  分析物に特異的な結合剤は、固体支持体をコートするために使用される。
レポーターキナーゼは、標的分析物にコンジュゲートされ又は遺伝的に融合され、それによって、表面上の結合剤と結合する。レポーターキナーゼ−分析物コンジュゲートは、試験試料中の分析物又は抗体と競合することによって固体支持体から放出される。
【００７６】
そのため、レポーターキナーゼを、分析物に特異的な結合剤を含むリンカーによって固体支持体に間接的に付着させる。リンカーはまた、分析物（又はその断片）を含んでいてもよい。
【００７７】
一実施形態では、ステップ（iii）前の任意の時点で、試料は、非レポーターキナーゼ及び／又はＡＴＰを除去／不活性化するために処理される。適した処理は、本明細書において別記される。
【００７８】
第４の態様では、本発明は、試料中の分析物の存在を決定するための方法であって、
（ｉ）分析物に特異的な第１の結合剤が付着した固体支持体を提供するステップ、
（ii）試料中に存在するいかなる分析物も上述の第１の結合剤を介して固体支持体に付着するように、固体支持体を試料に曝露するステップ、
（iii）分析物に特異的な第２の結合剤に連結したレポーターキナーゼが、第２の結合剤と、既に結合している分析物との間の相互作用を介して固体支持体に付着するように、レポーターキナーゼに固体支持体を曝露するステップ、
（iv）ステップ（iii）において得られた混合物をフィルター膜に適用するステップであり、固体支持体がフィルター膜上に保持されるステップ、並びに
（ｖ）本発明の第１の態様によるアッセイを使用して、保持されているレポーターキナーゼの活性を測定するステップを含む方法を提供する。
【００７９】
一実施形態では、上記に記載される方法は、１５分未満、１０分未満、５分未満、又は２分未満に完了する。
【００８０】
一実施形態では、固体支持体は、ラテックス支持体又は磁気支持体、例えばラテックスビーズ又は磁気ビーズである。固体支持体が磁気を帯びたものである場合、ステップ（iv）は、固体支持体が磁石上に保持されるように、ステップ（iii）において得られた混合物を磁石に曝露するステップと交換してもよい。
【００８１】
実施例１４は、水試料中のレジオネラの存在を検出するためにこの方法の使用を記載する。レジオネラに特異的な抗体を固体支持体（ラテックスビーズ）に付着させる。次いで、ラテックスビーズは、（ｉ）試験される試料（可能性としてレジオネラを含有する）及び（ii）レジオネラに特異的な二次抗体に結合したレポーターキナーゼに曝露される。試料中に存在するいかなるレジオネラも、ラテックスビーズ上の抗体に結合する。続いて、レポーターキナーゼ抗体コンジュゲートは、既に結合しているレジオネラを介してラテックスビーズに結合する。したがって得られた混合物は、ラテックスビーズを保持するフィルター膜に適用される。混合物の他の成分（例えば非結合レポーターキナーゼコンジュゲート、ＡＴＰ、非レポーターキナーゼ（例えば、試験試料に対して内因性の哺乳動物の組織キナーゼ、植物及び／又は菌類のキナーゼなど）は、フィルター膜を通過する。次いで、フィルター膜上に保持されているレポーターキナーゼは、ＡＤＰ及び混合物ルシフェリン／ルシフェラーゼに曝露され、光出力は、ルミノメーターを使用して測定される。任意選択で、フィルター膜は、いかなる残存するＡＴＰ又は非レポーターキナーゼも除去するために、上記に記載される処理ステップのいずれかを使用して、処理することができる。
【００８２】
本発明の本態様における使用のための適したフィルター膜は、ニトロセルロース、酢酸セルロース、又は濾紙を含む。フィルターマトリックスは、典型的に、使用される任意の粒子状キャリアの性質に依存して、０．２μｍ〜２０μｍ以上の一連の孔径を利用する。
【００８３】
実施例１７は、食物試料中のサルモネラの存在を検出するためにこの方法の使用を記載する。磁気ビーズをラテックスビーズの代わりに固体支持体として使用し、ステップ（iii）において得られた混合物が、フィルター膜ではなく磁石に曝露されるという点を除いて、方法は、本質的に、上記に実施例１４について記載されるとおりである。
【００８４】
一実施形態では、ステップ（ｖ）前の任意の時点で、試料は、非レポーターキナーゼ及び／又はＡＴＰを除去する又は不活性化するために処理される。適した処理は、本明細書において別記される。
【００８５】
本発明の第１の態様において記載されるアッセイはまた、その全体が参照によってこれによって組み込まれる、出願人の以前の出願国際公開第２００５／０９３０８５号パンフレットにおいて記載されるものなどのような、キナーゼベースの生物学的インジケーターシステムにおいてキナーゼ活性を検出するのに適している。
【００８６】
典型的な生物学的インジケーターは、インジケーターストリップ又はディップスティックなどのような固体支持体上にレポーターキナーゼを吸着することによって調製される。次いで、インジケーターは、処理される試料（混入物を含有する）に含ませられ、インジケーターを加えた試料は、処理プロセスにかけられる。次いで、処理によるインジケーターキナーゼの活性の低下は、混入物の量又は活性の低下と相互に関連する。混入物において許容される低下と相互に関連することが知られている活性のレベルが決定される場合、処理はそのとき検証されたと見なされる。
【００８７】
これらのキナーゼベースのインジケーターの性能は、キナーゼを生物学的成分に共有結合で架橋することによって改善することができることもまた分かっており、生物学的成分は、混入物のミメティック／代用物である。これは、インジケーターが処理プロセスに対する混入物の反応をより正確に反映することを可能にし、これにより、次には、インジケーター正確性／感度の改善及び、したがって、よりわずかな「誤った」プロセス検証がもたらされる。
【００８８】
したがって、本発明の第５の態様では、試料中の混入生物学的作用物質の量又は活性を低下させるための処理プロセスを検証する方法であって、
（ｉ）混入生物学的作用物質を含有する又は含有すると疑われる試料を提供するステップ、
（ii）決定された量のレポーターキナーゼの存在下において試料を処理プロセスに供するステップであり、レポーターキナーゼ及び混入生物学的作用物質が両方とも処理プロセスに曝露されるステップ、
（iii）本発明の第１の態様によるアッセイを使用して、レポーターキナーゼの残存活性を測定するステップ、並びに
（iv）上述の残存活性を所定のキナーゼ活性と比較するステップであり、所定のキナーゼ活性が、同じ条件下で、混入生物学的作用物質の量又は活性の確認された低下に相当する、方法を提供する。
【００８９】
一実施形態では、ステップ（ｉ）〜（iv）は、１５分未満、１０分未満、５分未満、２分未満で完了する。
【００９０】
一実施形態では、ステップ（iii）前の任意の時点で、試料は、非レポーターキナーゼ及び／又はＡＴＰを除去／不活性化するために処理される。適した処理は、本明細書において別記される。
【００９１】
用語「処理」又は「処理プロセス」は、試料中の混入物の量又は活性を低下させるように設計される、いかなるプロセスも包含する。適した処理は、選択されたｐＨ、温度又は圧力、プロテアーゼ又は他の溶菌酵素に試料を曝露すること、界面活性剤、化学的滅菌剤、放射、フリーラジカル、又は気相滅菌剤に試料を曝露することのうちの１又は２以上を含む。一実施形態では、処理は、ＴＳＥなどのような感染性生物学的混入物の感染性活性（感染性としても知られている）を低下させるように設計される。用語「処理」又は「処理プロセス」はまた、湿り蒸気又は乾燥蒸気を用いる高温加圧滅菌、オゾン滅菌、Ｈ２Ｏ２滅菌、精製（rendering）、又は混入物を排除する若しくは不活性化するように設計された他の方法などのようなクリーニング及び不活性化プロセスをも包含する。本発明の一実施形態では、レポーターキナーゼ及び混入物の両方は、処理プロセスに直接曝露される、つまり、レポーターキナーゼ／混入物と処理プロセスとの間にシールもバリアもない。したがって、レポーターキナーゼ及び混入物は、両方とも、処理プロセスと直接接触しており、同じ処理条件にかけられる。
【００９２】
一実施形態では、混入生物学的作用物質は、細菌、ウイルス、胞子、毒素、プリオン、タンパク質、及びペプチドからなる群から選択される。さらなる実施形態では、レポーターキナーゼを、本発明の第１の態様に関して記載される方法のいずれかを使用して、固体支持体上に結合させる。
【００９３】
本発明の他の実施形態では、レポーターキナーゼを、生物学的成分に共有結合させる。
【００９４】
生物学的成分は、有利には、混入物のミメティック又は代用物であり、したがって、実質的に混入物と同じ方法で処理プロセスに反応する。一実施形態では、生物学的成分は、処理プロセスに供される試料中の混入物と同じであってもよいが、それと物理的に異なっていてもよく、例えば、本明細書において示される混入物及び生物学的成分のそれぞれについて、混入物がタンパク質である場合、生物学的成分もまた、タンパク質であり、混入物が血液タンパク質である場合、生物学的成分もまた、血液タンパク質であり、混入物がＤＮＡ分子である場合、生物学的成分もまた、ＤＮＡ分子であり、混入物がＲＮＡ分子である場合、生物学的成分もまた、ＲＮＡ分子である、などである。
【００９５】
本発明において使用することができる生物学的成分の例としては、タンパク質、核酸、炭水化物、及び脂質が挙げられる。
【００９６】
一実施形態では、生物学的成分は、血液タンパク質、細菌タンパク質、ウイルスタンパク質、菌類タンパク質、及び自己凝集タンパク質又はアミロイド形成タンパク質からなる群から選択されるタンパク質を含む。
【００９７】
さらなる実施形態では、血液タンパク質は、血液凝固タンパク質（例えばフィブリノーゲン、フィブリンペプチド、フィブリン、トランスグルタミナーゼ基質、トロンビン）、血清タンパク質（例えばアルブミン及びグロブリン）、血小板タンパク質、血液細胞糖タンパク質、並びにヘモグロビンからなる群から選択される。
【００９８】
他の実施形態では、細菌タンパク質は、細菌線毛タンパク質（例えば、大腸菌に由来するＣｇｓＡ及びサルモネラに由来するＡｇｆＡ）、細菌毒素タンパク質（例えばバチルス・アントラシス、コリネバクテリウム・ジフテリエ（Corynebacterium diphtheriae）、クロストリジウム・ボツリヌム（Clostridium botulinum）に由来する毒素）、細菌細胞表面タンパク質（例えばペプチドグリカン、リポ蛋白）、並びに細菌胞子タンパク質（例えば、グラム陽性細菌に由来し、クロストリジウム・タエニオスポラム（Clostridium taeniosporum）におけるリボン付属器（ribbon appendage）を形成するタンパク質、ｃｈａｐｌｉｎタンパク質、ｒｏｄｌｉｎタンパク質に類似する配列又は全体的な構造を有する）からなる群から選択される。
【００９９】
他の実施形態では、ウイルスタンパク質は、ウイルスエンベロープタンパク質、ウイルスカプシドタンパク質、及びウイルスコアタンパク質からなる群から選択される。好ましくは、ウイルスタンパク質は、バクテリオファージウイルス（例えばＭＳ２及びＰＰ７タンパク質）、ノーウォークウイルス（例えばカプシドタンパク質）、ロタウイルス（例えばＶＰ２、ＶＰ６、及びＶＰ７タンパク質）、コロナウイルス（例えばＳＡＲＳ  Ｓ、Ｅ、及びＭタンパク質）、ブルータングウイルス（例えばＶＰ２タンパク質）、ヒトパピローマウイルス（例えばウイルス主要構造タンパク質、Ｌ１）、Ｂ型肝炎（例えば小エンベロープタンパク質ＨＢｓＡｇ）、Ｃ型肝炎ウイルス（例えばコア、Ｅ１、及びＥ２タンパク質）、インフルエンザウイルス（例えばノイラミニダーゼ及び赤血球凝集素及びマトリックスタンパク質）、ポリオウイルス（例えばカプシドＶＰ０、１、及び３タンパク質）、ＨＩＶ（例えばＰｒ５５ｇａｇ、エンベロープタンパク質）、並びにデング熱Ｂウイルス（例えばエンベロープ（ｅ）及びプレメンブレン／メンブレン（ｐｒＭ／Ｍ，pre-membrane/membrane）に由来する。
【０１００】
さらなる実施形態では、菌類タンパク質は、ハイドロフォビンタンパク質（例えば、スエヒロタケ（Schizophyllum commune）に由来するＳＣ３、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）に由来するＲｏｄＡ／Ｂ、及び酵母に由来する等価なタンパク質）、菌類胞子タンパク質、菌糸タンパク質、マイコトキシン、並びに菌類プリオン（例えばＳｕｐ３５、Ｈｅｔ  Ｓ、ＵＲＥ  ２、Ｒｎｑ１、Ｎｅｗ１）からなる群から選択される。
【０１０１】
さらなる実施形態では、自己凝集タンパク質は、プリオン（例えばＰｒＰＳｃ及びＰｒＰｃ、Ｓｕｐ３５、Ｈｅｔ  Ｓ、Ｕｒｅ  ２、Ｒｎｑ１、Ｎｅｗ  １）、プリオンミメティックタンパク質、アミロイド線維、活性汚泥におけるフロック形成細菌及び線状菌に由来する細胞表面アドヘシン、ベータアミロイドタンパク質、タウタンパク質、ポリアデニン結合タンパク質、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｂ、肺サーファクタントタンパク質Ｃ、大腸菌に由来するＣｓｇＡタンパク質、サルモネラ種に由来するＡｇｆＡタンパク質、細菌線毛タンパク質、アポリポタンパク質（例えばアポリポタンパク質Ａ１）、菌類種に由来するハイドロフォビン（例えば、スエヒロタケに由来するＳＣ３、アスペルギルス・フミガーツスに由来するＲｏｄＡ／Ｂ）、ｃｈａｐｌｉｎ（例えば、ストレプトマイセス種に由来するＣｈｐ  Ａ〜Ｈ）、ｒｏｄｌｉｎ（例えば、ストレプトマイセス種に由来するＲｄ１Ａ及びＲｄ１Ｂ）、グラム陽性胞子殻タンパク質（例えばＰ２９ａ、Ｐ２９ｂ、ＧＰ８５、及びＳｐｏＶＭアナログ）、並びにフジツボセメント様タンパク質（barnacle cement-like protein）（シロスジフジツボ（Balanus albicostatus）に由来する１９ｋＤａタンパク質及びアカフジツボ（Megabalanus rosa）に由来する２０ｋＤａタンパク質及びシロスジフジツボに由来する新規な方解石依存性セメント様タンパク質（calcite-dependent cement-like protein））からなる群から選択される。
【０１０２】
さらなる実施形態では、核酸は、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子から選択される。好ましくは、核酸は、神経組織に由来する。
【０１０３】
さらなる実施形態では、炭水化物は、エキソポリサッカライド、リポ多糖（ＥＰＳ／ＬＰＳ、時にエンドトキシンとして知られている）（例えばレジオネラ、大腸菌、スタフィロコッカス種、ストレプトコッカス種、シュードモナス種、アシネトバクター種、カンピロバクター種、及びバチルス種に由来する）、ペプチドグリカン、植物、菌類、及び酵母の細胞壁成分（例えばキチン、リグニン、グルカン）、ムチン調製物、糖脂質（とりわけ脳由来糖脂質）、糖タンパク質（例えば細胞表面糖タンパク質、Ｅａｐ１ｐ）、胞子抽出物（例えばバチルス種、クロストリジウム種、及び他の胞子形成体に由来する）、酵母莢膜に由来する多糖、並びに無脊椎動物分泌物（例えば軟体動物ゲルに由来する）からなる群から選択される。
【０１０４】
他の実施形態では、脂質は、糖脂質（例えば脳由来糖脂質）、ガングリオシド（例えばＧＴ１ｂ、ＧＴ１ａなどのような神経細胞ガングリオシド及びＧＭ１などのようなより一般的な細胞起源のガングリオシド）、並びに植物油及び脂質からなる群から選択される。
【０１０５】
有利には、生物学的成分は、生物学的マトリックスの一部である。生物学的マトリックスは、処理されることとなる試料のミメティックであってもよい。一実施形態では、生物学的マトリックスは、タンパク質、脂質、核酸、及び炭水化物又はその断片若しくは誘導体からなる群から選択される１又は２以上の成分を含む。他の実施形態では、生物学的マトリックスは、タンパク質の混合物を含んでいてもよい。さらなる実施形態では、生物学的マトリックスは、血液、血清、アルブミン、粘液、卵、神経組織、食物、選別された動物材料、及び市販で入手可能な試験土壌からなる群から選択される１又は２以上の成分を含んでいてもよい。本発明のさらなる実施形態では、生物学的マトリックスは、フィブリノーゲン、トロンビン、第VIII因子、ＣａＣｌ２、並びに任意選択でアルブミン及び／又はヘモグロビンからなる群から選択される１又は２以上の成分を含む。生物学的成分に連結されたレポーターキナーゼの例は、配列番号３４〜３８、４０、４２、４８、５０、５２、５４、６１、６７、７２、及び７３において記載される。
【０１０６】
生物学的インジケーターは、レポーターキナーゼを適切な生物学的成分に共有結合することによって調製してもよい。当技術分野において知られている共有結合のいかなる適した方法も使用してもよい。一実施形態では、キナーゼは、生物学的成分に遺伝的に又は化学的に架橋される。
【０１０７】
化学的架橋は、酵素コンジュゲートの生成又は他の関連する目的のためのタンパク質の架橋に一般に使用される一連のホモ及びヘテロ二官能性試薬を使用して達成してもよい。例えば、生物学的成分としてフィブリンを含むインジケーターでは、フィブリン及びレポーターキナーゼは、第１級アミン基にＳＰＤＰ（Perbio社製）を添加して誘導体化してもよい。次いで、レポーターキナーゼは、反応性チオール基を生成するために還元することができ、次いで、これは、フィブリンと混合され、共有結合のフィブリン−キナーゼ連結がもたらされる。
【０１０８】
レポーターキナーゼはまた、メタ過ヨウ素酸を用いる標的炭水化物の処理の後に、ヘテロ二官能性作用物質を使用して炭水化物、脂質、又は他の複合糖質に化学的に架橋することもできる。
【０１０９】
代替的には、インジケーターは、融合タンパク質として調製してもよい。これは、適切な生物学的成分をコードする遺伝子に、適切なキナーゼをコードする合成遺伝子（例えばスルホロブス・アシドカルダリウス又はサーモトガ・ネアポリタナに由来するＡＫをコードする遺伝子）を融合することによって達成される。
【０１１０】
本発明の本態様による方法は、実施例１８〜２１において示される。
【０１１１】
本発明の第６の態様では、試料中のレポーターキナーゼの活性を検出するためのデバイスであって、
細長いフローマトリックスを含み、上述のフローマトリックスは、
（ｉ）試料受入ゾーン及び
（ii）ＡＤＰ及び生物発光試薬の混合物を含む、試料受入ゾーンの下流に位置する検出ゾーンを含み、
使用中に、試料は、試料受入ゾーンに適用され、フローマトリックスに沿って検出ゾーンに流される、デバイスが提供される。
【０１１２】
使用中に、試料は、デバイスの試料受入ゾーンに適用され、検出ゾーンに移動され、ここで、それは、ＡＤＰ及び生物発光試薬の混合物と接触する。ここで、試料中に存在するいかなるレポーターキナーゼも、ＡＤＰに対して作用して、ＡＴＰを生成し、これは、次には、生物発光試薬と反応して、光を産生する。検出ゾーンからの光出力は、ルミノメーター、好ましくは携帯型のルミノメーターを使用して容易に測定することができる。一実施形態では、デバイスの検出ゾーンは、切り離され、ルミノメーター中に配置される。次いで、産生された光の量は、レポーターキナーゼ活性の量と相互に関連させることができる。
【０１１３】
一実施形態では、デバイスは、その上に細長いフローマトリックスが置かれる裏打ちストリップを含む。裏打ちストリップ（backing strip）は、プラスチック接着性裏打ちカードなどのような任意の適した非吸収材料から作られてもよい。他の実施形態では、フローマトリックスは、上部積層物と底部積層物との間に部分的にはさまれている。上部積層物は、フローマトリックスの試料受入ゾーンへの到達をもたらす試料適用ウィンドウを含んでいてもよく、フローマトリックスの検出ゾーンへの到達をもたらす検出ウィンドウもまた含んでいてもよい。積層物は、任意の適した非吸収材料、例えば透明又は半透明接着性プラスチックフィルムから作られてもよい。
【０１１４】
一実施形態では、デバイスは、ラテラルフローデバイスである。ラテラルフローデバイス及びそれらの構築のための方法は、当技術分野においてよく知られており、標準の妊娠試験キットとして最もよく知られている。
【０１１５】
さらなる実施形態では、デバイスは、試料受入ゾーンと検出ゾーンとの間に位置するバックグラウンド低減ゾーンを含んでいてもよい。このゾーンは、試料が検出ゾーンに到着する前に、試料中に存在するかもしれないいかなる非レポーターキナーゼ及び／又はＡＴＰも除去／不活性化するように機能する。したがって、これらの混入物が、アッセイの感度又は正確性に干渉するのを予防する。
【０１１６】
一実施形態では、バックグラウンド低減除去ゾーンは、レポーターキナーゼを実質的に無影響のまま残しながら、非レポーターキナーゼを選択的に（又は特異的に）阻害する物質を含む。適した阻害剤は、本明細書において別記される。他の実施形態では、バックグラウンド低減ゾーンは、レポーターキナーゼを実質的に無影響のまま残しながら、非レポーターキナーゼを選択的に破壊するプロテアーゼを含む。適したプロテアーゼは、本明細書において別記される。さらなる実施形態では、バックグラウンド低減ゾーンは、本明細書において別記されるように、それらのサイズ、電荷、又は結合特性に基づいて非レポーターキナーゼを物理的に捕捉するように配置してもよい。したがって、捕捉された非レポーターキナーゼが、検出ゾーンに到着するのを予防する。
【０１１７】
他の実施形態では、バックグラウンド低減ゾーンは、固定されたＡＴＰアーゼ、例えばアピラーゼを含む。他の実施形態では、バックグラウンド低減ゾーンは、本明細書において別記されるように、そのサイズ又は電荷に基づいてＡＴＰを物理的に捕捉するように配置してもよい。したがって、捕捉されたＡＴＰが、検出ゾーンに到着するのを予防する。
【０１１８】
一実施形態では、デバイスの検出ゾーン中のＡＤＰは、高純度ＡＤＰであり、生物発光試薬は、ルシフェリン及びルシフェラーゼの混合物である。他の実施形態では、ＡＤＰ及びルシフェリン／ルシフェラーゼは、従来の固定方法を使用して検出ゾーン中に固定される。
【０１１９】
さらなる実施形態では、デバイスは、携帯式である。
【０１２０】
さらなる実施形態では、検出ゾーンは、検出の増強のために、レポーターキナーゼコンジュゲートを保持し、且つ濃縮する陽イオン性膜を含んでいてもよい。
【０１２１】
他の実施形態では、試料受入ゾーンは、これもまた検出ゾーンに移動し、デバイスを通しての試料の適切な流れを制御するように作用する適した色素を含んでいてもよい。この陽性内部標準はまた、明らかな視覚シグナルをもたらすために、色素を保持するのを支援するように、検出ゾーン内の陽イオン結合膜の使用を利用してもよい。
【０１２２】
本発明の第７の態様では、試料中の分析物の存在を検出するためのアッセイにおける使用のためのラテラルフローデバイスであって、
その上に細長いフローマトリックスを位置づける裏打ちストリップを含み、上述のフローマトリックスは、
（ｉ）分析物に特異的な結合剤を含むリンカーを介してフローマトリックスに付着したレポーターキナーゼを含む試料受入ゾーン及び
（ii）試料受入ゾーンの下流に位置する検出ゾーンを含み、
使用において、試料が試料受入ゾーンに適用され、試料中に存在するいかなる分析物も、レポーターキナーゼをフローマトリックスから外し、それによって、レポーターキナーゼを検出ゾーンに移動させる、ラテラルフローデバイスが提供される。
【０１２３】
使用中に、試料は、試料受入ゾーンに適用され、試料中に存在するいかなる分析物も、試料受入ゾーンに付着したレポーターキナーゼを置換する。置換されなかったいかなるレポーターキナーゼも、試料受入ゾーンに付着したまま残り、これは、分析物の存在について陰性の試料についての場合となる。したがって、外されたレポーターキナーゼのみが、検出ゾーンに進み、ここで、それは、検出され、試料中に存在する分析物の量と相互に関連させることができる。
【０１２４】
デバイスの裏打ちストリップは、プラスチック接着性裏打ちカードなどのような任意の適した非吸収材料から作られてもよい。一実施形態では、フローマトリックスは、上部積層物と底部積層物との間に少なくとも部分的にはさまれている。上部積層物は、フローマトリックスの試料受入ゾーンへの到達をもたらす試料適用ウィンドウを含んでいてもよく、フローマトリックスの検出ゾーンへの到達をもたらす検出ウィンドウもまた含んでいてもよい。積層物は、任意の適した非吸収材料、例えば透明又は半透明接着性プラスチックフィルムから作られてもよい。さらなる実施形態では、検出ゾーンは、ＡＤＰ及び生物発光試薬の混合物を含む。
【０１２５】
レポーターキナーゼは、分析物に特異的な結合剤を含むリンカーによってフローマトリックスに付着させる。フローマトリックスにレポーターキナーゼを付着するための結合剤及び方法は、本発明の第２の態様に関して記載されるとおりである。
【０１２６】
一実施形態では、デバイスは、試料受入ゾーンと検出ゾーンとの間に位置するバックグラウンド低減ゾーンをさらに含んでいてもよい。このゾーンは、試料が検出ゾーンに到着する前に、試料中に存在するかもしれないいかなる非レポーターキナーゼ及び／又はＡＴＰも除去／不活性化するように機能する。したがって、これらの混入物が、アッセイの感度又は正確性に干渉するのを予防する。
【０１２７】
一実施形態では、バックグラウンド低減除去ゾーンは、レポーターキナーゼを実質的に無影響のまま残しながら、非レポーターキナーゼを選択的に（又は特異的に）阻害する物質を含む。適した阻害剤は、本明細書において別記される。他の実施形態では、バックグラウンド低減除去ゾーンは、レポーターキナーゼを実質的に無影響のまま残しながら、非レポーターキナーゼを選択的に破壊するプロテアーゼを含む。適したプロテアーゼは、本明細書において別記される。さらなる実施形態では、バックグラウンド低減ゾーンは、本明細書において別記されるように、それらのサイズ、電荷、又は結合特性に基づいて非レポーターキナーゼを物理的に捕捉するように配置してもよい。したがって、捕捉された非レポーターキナーゼが、検出ゾーンに到着するのを予防する。
【０１２８】
他の実施形態では、バックグラウンド低減ゾーンは、固定されたＡＴＰアーゼ、例えばアピラーゼを含む。他の実施形態では、バックグラウンド低減ゾーンは、本明細書において別記されるように、そのサイズ又は電荷に基づいてＡＴＰを物理的に捕捉するように配置してもよい。したがって、捕捉されたＡＴＰが、検出ゾーンに到着するのを予防する。
【０１２９】
一実施形態では、デバイスの検出ゾーン中のＡＤＰは、高純度ＡＤＰであり、生物発光試薬は、ルシフェリン及びルシフェラーゼの混合物である。他の実施形態では、ＡＤＰ及びルシフェリン／ルシフェラーゼは、従来の固定方法を使用して検出ゾーン中に固定される。
【０１３０】
他の実施形態では、デバイスは、携帯式である。
【０１３１】
さらなる実施形態では、検出ゾーンは、検出の増強のために、レポーターキナーゼコンジュゲートを保持し、且つ濃縮する陽イオン性膜を含んでいてもよい。
【０１３２】
他の実施形態では、試料受入ゾーンは、これもまた検出ゾーンに移動し、デバイスを通しての試料の適切な流れを制御するように作用する適した色素を含んでいてもよい。この陽性内部標準はまた、明らかな視覚シグナルをもたらすために、色素を保持するのを支援するように、検出ゾーン内の陽イオン結合膜の使用を利用してもよい。
【０１３３】
第８の態様では、本発明は、試料中のレポーターキナーゼの活性を検出するための方法であって、本発明の第６の態様によるデバイスを使用して行なわれ、
（ｉ）デバイスの試料受入ゾーンに試料を適用するステップ、
（ii）試料がデバイスの検出ゾーンを流れることを可能にするステップ、及び
（iii）検出ゾーンからの光出力を検出するステップを含む方法を提供する。
【０１３４】
一実施形態では、ステップ（ｉ）の後に、方法は、本発明の第６の態様に関して記載されるバックグラウンド低減ゾーンを試料が流れることを可能にするステップをさらに含む。
【０１３５】
他の実施形態では、ステップ（iii）は、デバイスの検出ゾーンを切り離し、次いで、ルミノメーターの中に検出ゾーンを配置することによって実行される。
【０１３６】
さらなる実施形態では、方法は、適したデータ記憶媒体上に、得られた光出力データを記録するステップを含む。
【０１３７】
本発明の第９の態様では、本発明の第７の態様に関して記載されるデバイスを使用して、試料中の分析物の存在を検出するための方法であって、
（ｉ）デバイスの試料受入ゾーンに試料を適用するステップ、
（ii）試料受入ゾーンから外されたいかなるレポーターキナーゼも検出ゾーンに移動させるステップ、及び
（iii）検出ゾーンからの光出力を検出するステップを含む方法が提供される。
【０１３８】
一実施形態では、ステップ（ｉ）の後に、方法は、本発明の第７の態様に関して記載されるバックグラウンド低減ゾーンを試料が流れることを可能にするステップをさらに含む。
【０１３９】
他の実施形態では、ステップ（iii）は、デバイスの検出ゾーンを切り離し、検出ゾーンをＡＤＰ及び生物発光試薬に曝露し、検出ゾーンは、ＡＤＰに曝露された後に、５分以内（又は２分以内、１分以内、３０秒以内、若しくは１０秒以内）の間、生物発光試薬に曝露され、次いで、ルミノメーターの中に検出ゾーンを配置することによって実行される。一実施形態では、検出ゾーンは、ＡＤＰ及び生物発光試薬に同時に曝露される。
【０１４０】
さらなる実施形態では、方法は、適したデータ記憶媒体上に、得られた光出力データを記録するステップを含む。
【０１４１】
第１０の態様では、本発明は、本発明の第６又は第７の態様によるデバイス及びルミノメーターを含むキットを提供する。一実施形態では、ルミノメーターは、携帯型の（つまり携帯式の）ルミノメーターである。
【０１４２】
定義の部
用語「光出力」は、生物発光試薬とのＡＴＰの反応によって放射される光を意味する。この光出力は、標準のルミノメーターなどのような全く従来の技術を使用して検出することができる（例えばBerthold社製Orion  ９６ウェルマイクロプレートルミノメーター又は携帯型のルミノメーター）。
【０１４３】
用語「フローマトリックス」は、それを通る液体の流動を可能にする、任意の液体輸送固体材料を指し、ニトロセルロース、ナイロン、レーヨン、セルロース、紙、ガラス繊維、シリカ、ゲルマトリックス、又は他の多孔性若しくは繊維性材料などのような材料を含む。一実施形態では、フローマトリックスは、実質的に平面で細長いストリップとして構成される。フローマトリックス材料は、必要とされるように、あらかじめ処理することができる又は修飾することができる。
【０１４４】
用語「レポーターキナーゼ」は、哺乳動物、植物、及び／又は菌類のキナーゼではないキナーゼ酵素を指す。したがって、試験されることとなる生物学的試料との関連において、レポーターキナーゼは、健常な個人から採取された試料中に通常存在しない（任意の有意な程度まで）キナーゼである。言い換えれば、本発明のレポーターキナーゼは、健常な個人から採取される試料中に通常、（任意の有意な程度まで）固有ではない又は内在性ではないキナーゼである。レポーターキナーゼは、個別の（つまり外来性の）試薬として、例えば単離キナーゼとして試料に添加してもよい。レポーターキナーゼは、好ましくは耐熱性である。
【０１４５】
用語「非レポーターキナーゼ」は、上記に定義されるレポーターキナーゼではないキナーゼ酵素を指す。非レポーターキナーゼはまた、内在性キナーゼ、混入キナーゼ、又はバックグラウンドキナーゼと呼ばれてもよい。非レポーターキナーゼは、健常な個人から採取される試料中に典型的に存在する。非レポーターキナーゼ活性は、レポーターキナーゼと関連しない活性として定義することができる。多くの非レポーターキナーゼは、中温性の生物、つまり中程度の温度で最もよく成長する生物（例えば２５〜４０℃）に由来する。非レポーターキナーゼの例は、哺乳動物、植物、及び／又は菌類のキナーゼ、特に、臨床試料中に様々な量で見られる７つのヒトアデニル酸キナーゼアイソフォームの範囲のうちのいずれか、動物種若しくはそれらに由来する食物中の等価なタンパク質、又はヒト若しくは動物における一般的な共生生物に由来するキナーゼ（例えばアデニル酸キナーゼ）を含む。
【０１４６】
用語「耐熱性キナーゼ」は、熱への曝露の後に活性を保持する、つまり、高温に比較的影響を受けないキナーゼを指す。好ましい耐熱性キナーゼは、５０〜１２０℃の温度への曝露の後に少なくとも７０％の活性（又は８０％の活性、９０％の活性、９５％の活性、若しくは１００％の活性）を保持する。特に、好ましい耐熱性キナーゼは、３０分間の５０℃への曝露の後に又は３０分間の６０℃への曝露の後に又は３０分間の７０℃への曝露の後に又は２０分間の８０℃への曝露の後に又は３分間の９０℃への曝露の後に又は３分間の１２０℃への曝露の後に、少なくとも７０％の活性（又は８０％の活性、９０％の活性、９５％の活性、若しくは１００％の活性）を保持する。耐熱性キナーゼはまた、ある種の化学物質、例えばカオトロープへの曝露、フリーラジカル損傷、界面活性剤、極度のｐＨ、プロテアーゼへの曝露、タンパク質架橋、非透過性膜若しくは半透膜又はポリマー内の封入、又は表面上への不可逆性の固定などのような、ルーチン的にタンパク質を損傷する若しくは破壊する又はそれらを不活性にする一連の他の生化学的及び物理的プロセスに対して、非耐熱性キナーゼよりも抵抗性であってもよい。特定の実施形態では、耐熱性キナーゼは、１又は２以上の生化学的及び物理的プロセスへの曝露の後に少なくとも７０％の活性（又は８０％の活性、９０％の活性、９５％の活性、若しくは１００％の活性）を保持し得る。すべての場合において、この「保持されている活性」は、従来の試験を使用して容易に確認することができる。手短に言えば、キナーゼは、所与の時間、所与の処理条件下でＡＤＰと共にインキュベートされ、次いで、ルシフェリン／ルシフェラーゼ及びルミノメーターを使用して、ＡＴＰの生成を検出することによって、残存活性について分析される。これから、処理の後に保持されるキナーゼ活性の％は、決定することができる。
【０１４７】
用語「キナーゼ」及び「キナーゼ活性」は、本明細書の全体にわたって区別なく使用される。
【０１４８】
用語「試料」は、任意のアイテム、機器、表面、体液、又は材料を包含する。例として、臨床試料（全血、血清、唾液などのような口腔試料、膿、膣試料、糞便試料、嘔吐物など）、環境試料（水、土壌、空気試料など）、外科用機器及び医療機器、マイクロタイタープレート、ディップスティック、ラテラルフローデバイス、病院の衣服、寝具、大量の液体、選別された動物材料、医薬品、ワークベンチ、壁及び床、生物学的マトリックス、並びに生物学的インジケーターを含むが、これらに限定されない。
【０１４９】
用語「非レポーターキナーゼを実質的に含まない」、「非レポーターキナーゼがない」、「レポーターキナーゼ以外のキナーゼを実質的に含まない」、及び「レポーターキナーゼ以外のキナーゼがない」は、同義であると考えられ、非レポーターキナーゼのレベルが十分に低い又は不在であり、アッセイの感度又は正確性にいかなる有意な程度までも干渉しないことを意味するために本明細書の全体にわたって区別なく使用される。アッセイ読み取りに関して、非レポーターキナーゼの影響は、シグナル対ノイズ比に関して普通定義される。そのため、用語「実質的にない」はまた、非レポーターキナーゼが、アッセイの検出限界で、全キナーゼシグナルの１０％を超えて占めない（好ましくは５％又は２％を超えない）ことを意味するとして定義することができる。
【０１５０】
用語「ＡＴＰを実質的に含まない」及び「ＡＴＰがない」は、同義であると考えられ、内因性ＡＴＰのレベルが十分に低い又は不在であり、アッセイの感度又は正確性にいかなる有意な程度までも干渉しないことを意味するために本明細書の全体にわたって区別なく使用される。内因性ＡＴＰは、シグナル：ノイズに関してアッセイに対して影響を及ぼすかもしれず、したがって、「実質的にない」という用語は、いかなる内因性ＡＴＰも、アッセイの検出限界で、全シグナルの１０％を超えて占めない（好ましくは５％又は２％を超えない）ことを意味する。
【０１５１】
用語は、「同時に」は、同じ時間に、を意味する。本発明の第１の態様との関連において、一実施形態では、レポーターキナーゼは、ＡＤＰ及び生物発光試薬と同時に接触させられ、これは、ＡＤＰとのキナーゼの接触と、生物発光試薬とのキナーゼの接触との間に個別のインキュベーション期間がない（又は実質的にない）ことを意味する。
【０１５２】
用語「生物発光試薬」は、ＡＴＰと反応して、光を生成することができる任意の物質又は物質の混合物を指す。好ましい試薬は、ルシフェリン及びルシフェラーゼの混合物である。
【０１５３】
用語「ＲＬＵ」は、相対的光単位を意味する。相対的光単位は、相対的であるが絶対的ではない測定値である。本明細書において示される図は、ルシフェラーゼ／ルシフェリン試薬の添加直後の２秒間、光測定の「フラッシュ（flash）」法を使用して、インジェクターシステムを有するBerthold社製Orion  ９６ウェルマイクロプレートルミノメーターを使用して取られた測定値に関する（技術的仕様３００〜６５０ｎｍの波長で放射された光を測定する光電子増倍管）。この結論を扱うために、メーカーは、ＲＬＵ「因子」についてのデータを生成し、これは、所与のルミノメーターによって生成されたデータが、較正された標準物質に標準化されることを可能にする。したがって、比較は、異なる機器の間でなすことができる。Berthold社製Orion  ９６ウェルマイクロプレートルミノメーターのＲＬＵ因子は、１である。したがって、本明細書において示されるＲＬＵ値は、標準に合わせられた／標準化されたＲＬＵ値と見なすことができる。
【０１５４】
絶対値に関して、ＲＬＵ値は、方法において記載される試薬を用いて上述の値を生ずるのに必要とされるＡＴＰの濃度と関連し得る。近似的換算として、また、ＲＬＵ値とＡＴＰ濃度との間の直線関係を考えれば、以下の値を使用することができる。
【０１５５】
【表３】
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【０１５６】
本出願において引用されるすべての参考文献は、それらの全体が参照によってこれによって組み込まれる。
配列番号
配列番号１  スルホロブス・ソルファタリカスに由来するアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号２  スルホロブス・アシドカルダリウスに由来するアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号３  スルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）に由来するアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号４  パイロコッカス・フリオススに由来するアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号５  パイロコッカス・ホリコシイに由来するアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号６  パイロコッカス・アビシに由来するアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号７  メタノコックス・サーモリソトロフィカス（Methanococcus thermolithotrophicus）に由来するアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号８  メタノコックス・ボルタエ（Methanococcus voltae）に由来するアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号９  メタノコックス・ジャナスキイ（Methanococcus jannaschii）に由来するアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号１０  メタノピュルス・カンドレリ（Methanopyrus kandleri）に由来するアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号１１  メタノトッリス・イグネアス（Methanotorris igneus）に由来するアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号１２  ピロバクルム・アエロフィルム（Pyrobaculum aerophilum）に由来するアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号１３  サーモトガ・マリティマに由来するアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号１４  アエロピルム・ペルニクスに由来するアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号１５  アーケオグロブス・フルギダスに由来するアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号１６  パイロコッカス・アビシに由来するアデニル酸キナーゼのタンパク質配列（単量体アデニル酸キナーゼ（ＡｄｋＥ，adenylate kinase））
配列番号１７  安定性の改善をもたらすように遺伝的に操作された、パイロコッカス・フリオススに由来するアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号１８  安定性の改善をもたらすように遺伝的に操作された、パイロコッカス・ホリコシイに由来するアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号１９  安定性の改善をもたらすように遺伝的に操作された、スルホロブス・アシドカルダリウスに由来するアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号２０  サーモトガ・マリティマに由来する酢酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号２１  パイロコッカス・ホリコシイに由来するピルビン酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号２２  スルホロブス・ソルファタリカスに由来するピルビン酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号２３  サーモトガ・マリティマに由来するピルビン酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号２４  パイロコッカス・フリオススに由来するピルビン酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号２５  メタノサルシーナ・サーモフィラ（Methanosarcina thermophila）に由来する酢酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号２６  スルホロブス・アシドカルダリウスに由来するアデニル酸キナーゼをコードするＤＮＡ配列
配列番号２７  コドン使用頻度が大腸菌における遺伝子の発現のために最適化された、スルホロブス・アシドカルダリウスに由来するアデニル酸キナーゼをコードするＤＮＡ配列
配列番号２８  サーモトガ・マリティマに由来するアデニル酸キナーゼをコードするＤＮＡ配列
配列番号２９  コドン使用頻度が大腸菌における遺伝子の発現のために最適化された、サーモトガ・マリティマに由来するアデニル酸キナーゼをコードするＤＮＡ配列
配列番号３０  コドン使用頻度が大腸菌における遺伝子の発現のために最適化された、アーケオグロブス・フルギダスに由来するアデニル酸キナーゼをコードするＤＮＡ配列
配列番号３１  コドン使用頻度が大腸菌における遺伝子の発現のために最適化された、スルホロブス・アシドカルダリウスに由来するアデニル酸キナーゼのタンパク質配列（配列番号２７）
配列番号３２  コドン使用頻度が大腸菌における遺伝子の発現のために最適化された、サーモトガ・マリティマに由来するアデニル酸キナーゼのタンパク質配列（配列番号２９）
配列番号３３  トランスグルタミナーゼ基質のタンパク質配列
配列番号３４  トランスグルタミナーゼ（第XIII因子）基質配列とＮ末端で融合された、スルホロブス・アシドカルダリウスに由来するアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号３５  トランスグルタミナーゼ（第XIII因子）基質配列とＣ末端で融合された、スルホロブス・アシドカルダリウスに由来するアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号３６  トランスグルタミナーゼ（第XIII因子）基質配列とＮ末端及びＣ末端で融合された、スルホロブス・アシドカルダリウスに由来するアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号３７  サーモトガ・マリティマに由来するアデニル酸キナーゼの５’末端に融合されたトランスグルタミナーゼ（第XIII因子）基質配列のＤＮＡ配列
配列番号３８  トランスグルタミナーゼ（第XIII因子）基質配列とＮ末端で融合された、サーモトガ・マリティマに由来するアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号３９  サーモトガ・マリティマに由来するアデニル酸キナーゼの３’末端に融合されたトランスグルタミナーゼ（第XIII因子）基質配列のＤＮＡ配列
配列番号４０  トランスグルタミナーゼ（第XIII因子）基質配列とＣ末端で融合された、サーモトガ・マリティマに由来するアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号４１  サーモトガ・マリティマに由来するアデニル酸キナーゼの５’末端及び３’末端の両方に融合されたトランスグルタミナーゼ（第XIII因子）基質配列のＤＮＡ配列
配列番号４２  トランスグルタミナーゼ（第XIII因子）基質配列とＮ末端及びＣ末端で融合された、サーモトガ・マリティマに由来するアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号４３  サッカロマイセス・セレビシエに由来する完全なＳｕｐ３５遺伝子構築物のＤＮＡ配列
配列番号４４  サッカロマイセス・セレビシエに由来する完全なＳｕｐ３５のタンパク質配列
配列番号４５  大腸菌における最適な発現のためのコドンバイアスのあるｓｕｐ３５Ｎ（Ｎ末端ドメイン）のＤＮＡ配列
配列番号４６  ｓｕｐ３５Ｎ（Ｎ末端ドメイン）のタンパク質配列
配列番号４７  サッカロマイセス・セレビシエに由来するＳｕｐ３５  Ｎ末端ドメインとＮ末端で融合された、スルホロブス・アシドカルダリウスに由来する、大腸菌コドンバイアスのあるアデニル酸キナーゼのＤＮＡ配列
配列番号４８  サッカロマイセス・セレビシエに由来するＳｕｐ３５  Ｎ末端ドメインとＮ末端で融合された、スルホロブス・アシドカルダリウスに由来するアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号４９  サッカロマイセス・セレビシエに由来するＳｕｐ３５  Ｎ末端ドメインとＣ末端で融合された、スルホロブス・アシドカルダリウスに由来する大腸菌コドンバイアスのあるアデニル酸キナーゼのＤＮＡ配列
配列番号５０  サッカロマイセス・セレビシエに由来するＳｕｐ３５  Ｎ末端ドメインとＣ末端で融合された、スルホロブス・アシドカルダリウスに由来するアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号５１  サーモトガ・マリティマに由来するアデニル酸キナーゼの５’末端で融合されたＳｕｐ３５ＮのＤＮＡ配列
配列番号５２  Ｓｕｐ３５ＮとＮ末端で融合された、サーモトガ・マリティマに由来するアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号５３  サーモトガ・マリティマに由来するアデニル酸キナーゼの３’末端で融合されたＳｕｐ３５ＮのＤＮＡ配列
配列番号５４  Ｓｕｐ３５ＮとＣ末端で融合された、サーモトガ・マリティマに由来するアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号５５  ｔＡＫ遺伝子との融合ペプチドとしての使用のための、凝集して、アミロイド線維を形成することができる短いＳｕｐ３５ペプチドをコードするＤＮＡ配列
配列番号５６  Ｓｕｐ３５由来アミロイドペプチド
配列番号５７  ノロウイルスカプシドタンパク質（５８ｋＤａ）をコードするＤＮＡ配列
配列番号５８  ノロウイルスカプシドタンパク質（５８ｋＤａ）のタンパク質配列
配列番号５９  大腸菌における発現のために最適化されたノロウイルスカプシドタンパク質（５８ｋＤａ）をコードする合成遺伝子についてのＤＮＡ配列
配列番号６０  サーモトガ・マリティマに由来するｔＡＫをコードする遺伝子の５’末端で融合された、大腸菌における発現のために最適化されたノロウイルスカプシドタンパク質（５８ｋＤａ）をコードする合成遺伝子についてのＤＮＡ配列
配列番号６１  サーモトガ・マリティマに由来するアデニル酸キナーゼのＮ末端で融合されたノロウイルスカプシドタンパク質（５８ｋＤａ）のタンパク質配列
配列番号６２  バクテリオファージＭＳ２コートタンパク質のタンパク質配列
配列番号６３  バクテリオファージＰＰ７コートタンパク質単量体のタンパク質配列
配列番号６４  バクテリオファージＰＰ７コートタンパク質二量体のタンパク質配列
配列番号６５  大腸菌ＣｓｇＡのタンパク質配列
配列番号６６  サルモネラＡｇｆＡのタンパク質配列
配列番号６７  大腸菌ＣｓｇＡのＮ末端に融合された、サーモトガ・マリティマに由来するアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号６８  フザリウム種に由来するハイドロフォビン３タンパク質のタンパク質配列
配列番号６９  フザリウム種に由来するハイドロフォビン５タンパク質のタンパク質配列
配列番号７０  シロスジフジツボに由来するセメント様タンパク質のタンパク質配列（１９Ｋ）
配列番号７１  アカフジツボに由来するセメント様タンパク質のタンパク質配列（２０ｋ）
配列番号７２  サーモトガ・マリティマに由来するｔＡＫとの、シロスジフジツボに由来するフジツボタンパク質の融合体；Ｎ末端融合体のタンパク質配列
配列番号７３  サーモトガ・マリティマに由来するｔＡＫとの、シロスジフジツボに由来するフジツボタンパク質の融合体；Ｃ末端融合体のタンパク質配列
配列番号７４  シロスジフジツボ方解石特異的吸着体のタンパク質配列
配列番号７５  フジツボセメントタンパク質に由来するペプチドのタンパク質配列
配列番号７６  フジツボセメントタンパク質に由来するペプチドのタンパク質配列
配列番号７７  フジツボセメントタンパク質に由来するペプチドのタンパク質配列
配列番号７８  大腸菌に由来するアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号７９  大腸菌に由来するピルビン酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号８０  大腸菌に由来する酢酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号８１  メタノコックス・ボルタエ（ＭＶＯ，Methanococcus voltae）に由来するアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号８２  メタノコックス・サーモリソトロフィカス（ＭＴＨ，Methanococcus thermolithotrophicus）に由来するアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号８３  バチルス・グロビスポラス（Bacillus globisporus）に由来するアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号８４  バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）に由来するアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列表
配列番号１
Met Lys Ile Gly Ile Val Thr Gly Ile Pro Gly Val Gly Lys Thr Thr Val Leu Ser Phe Ala Asp Lys Ile Leu Thr Glu Lys Gly Ile Ser Lys Ile Val Asn Tyr Gly Asp Tyr Met Leu Asn Thr Ala Leu Lys Glu Gly Tyr Val Lys Ser Arg Asp Glu Ile Arg Lys Leu Gln Ile Glu Lys Gln Arg Glu Leu Gln Ala Leu Ala Ala Arg Arg Ile Val Glu Asp Leu Ser Leu Leu Gly Asp Glu Gly Ile Gly Leu Ile Asp Thr His Ala Ile Arg Thr Pro Ala Gly Tyr Leu Pro Gly Leu Pro Arg His Val Ile Glu Val Leu Ser Pro Lys Val Ile Phe Leu Leu Glu Ala Asp Pro Lys Ile Ile Leu Glu Arg Gln Lys Arg Asp Ser Ser Arg Ala Arg Thr Asp Tyr Ser Asp Thr Ala Val Ile Asn Glu Val Ile Gln Phe Ala Arg Tyr Ser Ala Met Ala Ser Ala Val Leu Val Gly Ala Ser Val Lys Val Val Val Asn Gln Glu Gly Asp Pro Ser Ile Ala Ala Ser Glu Ile Ile Asn Ser Leu Met 
配列番号２
Met Lys Ile Gly Ile Val Thr Gly Ile Pro Gly Val Gly Lys Ser Thr Val Leu Ala Lys Val Lys Glu Ile Leu Asp Asn Gln Gly Ile Asn Asn Lys Ile Ile Asn Tyr Gly Asp Phe Met Leu Ala Thr Ala Leu Lys Leu Gly Tyr Ala Lys Asp Arg Asp Glu Met Arg Lys Leu Ser Val Glu Lys Gln Lys Lys Leu Gln Ile Asp Ala Ala Lys Gly Ile Ala Glu Glu Ala Arg Ala Gly Gly Glu Gly Tyr Leu Phe Ile Asp Thr His Ala Val Ile Arg Thr Pro Ser Gly Tyr Leu Pro Gly Leu Pro Ser Tyr Val Ile Thr Glu Ile Asn Pro Ser Val Ile Phe Leu Leu Glu Ala Asp Pro Lys Ile Ile Leu Ser Arg Gln Lys Arg Asp Thr Thr Arg Asn Arg Asn Asp Tyr Ser Asp Glu Ser Val Ile Leu Glu Thr Ile Asn Phe Ala Arg Tyr Ala Ala Thr Ala Ser Ala Val Leu Ala Gly Ser Thr Val Lys Val Ile Val Asn Val Glu Gly Asp Pro Ser Ile Ala Ala Asn Glu Ile Ile Arg Ser Met Lys 
配列番号３
Met Ser Lys Met Lys Ile Gly Ile Val Thr Gly Ile Pro Gly Val Gly Lys Thr Thr Val Leu Ser Lys Val Lys Glu Ile Leu Glu Glu Lys Lys Ile Asn Asn Lys Ile Val Asn Tyr Gly Asp Tyr Met Leu Met Thr Ala Met Lys Leu Gly Tyr Val Asn Asn Arg Asp Glu Met Arg Lys Leu Pro Val Glu Lys Gln Lys Gln Leu Gln Ile Glu Ala Ala Arg Gly Ile Ala Asn Glu Ala Lys Glu Gly Gly Asp Gly Leu Leu Phe Ile Asp Thr His Ala Val Ile Arg Thr Pro Ser Gly Tyr Leu Pro Gly Leu Pro Lys Tyr Val Ile Glu Glu Ile Asn Pro Arg Val Ile Phe Leu Leu Glu Ala Asp Pro Lys Val Ile Leu Asp Arg Gln Lys Arg Asp Thr Ser Arg Ser Arg Ser Asp Tyr Ser Asp Glu Arg Ile Ile Ser Glu Thr Ile Asn Phe Ala Arg Tyr Ala Ala Met Ala Ser Ala Val Leu Val Gly Ala Thr Val Lys Ile Val Ile Asn Val Glu Gly Asp Pro Ala Val Ala Ala Asn Glu Ile Ile Asn Ser Met Leu 
配列番号４
Met Pro Phe Val Val Ile Ile Thr Gly Ile Pro Gly Val Gly Lys Ser Thr Ile Thr Arg Leu Ala Leu Gln Arg Thr Lys Ala Lys Phe Arg Leu Ile Asn Phe Gly Asp Leu Met Phe Glu Glu Ala Val Lys Ala Gly Leu Val Lys His Arg Asp Glu Met Arg Lys Leu Pro Leu Lys Ile Gln Arg Glu Leu Gln Met Lys Ala Ala Lys Lys Ile Thr Glu Met Ala Lys Glu His Pro Ile Leu Val Asp Thr His Ala Thr Ile Lys Thr Pro His Gly Tyr Met Leu Gly Leu Pro Tyr Glu Val Val Lys Thr Leu Asn Pro Asn Phe Ile Val Ile Ile Glu Ala Thr Pro Ser Glu Ile Leu Gly Arg Arg Leu Arg Asp Leu Lys Arg Asp Arg Asp Val Glu Thr Glu Glu Gln Ile Gln Arg His Gln Asp Leu Asn Arg Ala Ala Ala Ile Ala Tyr Ala Met His Ser Asn Ala Leu Ile Lys Ile Ile Glu Asn His Glu Asp Lys Gly Leu Glu Glu Ala Val Asn Glu Leu Val Lys Ile Leu Asp Leu Ala Val Asn Glu Tyr Ala 
配列番号５
Met Pro Phe Val Val Ile Ile Thr Gly Ile Pro Gly Val Gly Lys Ser Thr Ile Thr Lys Leu Ala Leu Gln Arg Thr Arg Ala Lys Phe Lys Leu Ile Asn Phe Gly Asp Leu Met Phe Glu Glu Ala Leu Lys Leu Lys Leu Val Lys His Arg Asp Glu Met Arg Lys Leu Pro Leu Glu Val Gln Arg Glu Leu Gln Met Asn Ala Ala Lys Lys Ile Ala Glu Met Ala Lys Asn Tyr Pro Ile Leu Leu Asp Thr His Ala Thr Ile Lys Thr Pro His Gly Tyr Leu Leu Gly Leu Pro Tyr Glu Val Ile Lys Ile Leu Asn Pro Asn Phe Ile Val Ile Ile Glu Ala Thr Pro Ser Glu Ile Leu Gly Arg Arg Leu Arg Asp Leu Lys Arg Asp Arg Asp Val Glu Thr Glu Glu Gln Ile Gln Arg His Gln Asp Leu Asn Arg Ala Ala Ala Ile Thr Tyr Ala Met His Ser Asn Ala Leu Ile Lys Ile Ile Glu Asn His Glu Asp Lys Gly Leu Glu Glu Ala Val Asn Glu Leu Val Lys Ile Leu Asp Leu Ala Val Lys Glu Tyr Ala 
配列番号６
Met Ser Phe Val Val Ile Ile Thr Gly Ile Pro Gly Val Gly Lys Ser Thr Ile Thr Arg Leu Ala Leu Gln Arg Thr Lys Ala Lys Phe Lys Leu Ile Asn Phe Gly Asp Leu Met Phe Glu Glu Ala Val Lys Ala Gly Leu Val Asn His Arg Asp Glu Met Arg Lys Leu Pro Leu Glu Ile Gln Arg Asp Leu Gln Met Lys Val Ala Lys Lys Ile Ser Glu Met Ala Arg Gln Gln Pro Ile Leu Leu Asp Thr His Ala Thr Ile Lys Thr Pro His Gly Tyr Leu Leu Gly Leu Pro Tyr Glu Val Ile Lys Thr Leu Asn Pro Asn Phe Ile Val Ile Ile Glu Ala Thr Pro Ser Glu Ile Leu Gly Arg Arg Leu Arg Asp Leu Lys Arg Asp Arg Asp Val Glu Thr Glu Glu Gln Ile Gln Arg His Gln Asp Leu Asn Arg Ala Ala Ala Ile Ala Tyr Ala Met His Ser Asn Ala Leu Ile Lys Ile Ile Glu Asn His Glu Asp Lys Gly Leu Glu Glu Ala Val Asn Glu Leu Val Glu Ile Leu Asp Leu Ala Val Lys Glu Tyr Ala 
配列番号７
Met Lys Asn Lys Leu Val Val Val Thr Gly Val Pro Gly Val Gly Gly Thr Thr Ile Thr Gln Lys Ala Met Glu Lys Leu Ser Glu Glu Gly Ile Asn Tyr Lys Met Val Asn Phe Gly Thr Val Met Phe Glu Val Ala Gln Glu Glu Asn Leu Val Glu Asp Arg Asp Gln Met Arg Lys Leu Asp Pro Asp Thr Gln Lys Arg Ile Gln Lys Leu Ala Gly Arg Lys Ile Ala Glu Met Val Lys Glu Ser Pro Val Val Val Asp Thr His Ser Thr Ile Lys Thr Pro Lys Gly Tyr Leu Pro Gly Leu Pro Val Trp Val Leu Asn Glu Leu Asn Pro Asp Ile Ile Ile Val Val Glu Thr Ser Gly Asp Glu Ile Leu Ile Arg Arg Leu Asn Asp Glu Thr Arg Asn Arg Asp Leu Glu Thr Thr Ala Gly Ile Glu Glu His Gln Ile Met Asn Arg Ala Ala Ala Met Thr Tyr Gly Val Leu Thr Gly Ala Thr Val Lys Ile Ile Gln Asn Lys Asn Asn Leu Leu Asp Tyr Ala Val Glu Glu Leu Ile Ser Val Leu Arg 
配列番号８
Met Lys Asn Lys Val Val Val Val Thr Gly Val Pro Gly Val Gly Ser Thr Thr Ser Ser Gln Leu Ala Met Asp Asn Leu Arg Lys Glu Gly Val Asn Tyr Lys Met Val Ser Phe Gly Ser Val Met Phe Glu Val Ala Lys Glu Glu Asn Leu Val Ser Asp Arg Asp Gln Met Arg Lys Met Asp Pro Glu Thr Gln Lys Arg Ile Gln Lys Met Ala Gly Arg Lys Ile Ala Glu Met Ala Lys Glu Ser Pro Val Ala Val Asp Thr His Ser Thr Val Ser Thr Pro Lys Gly Tyr Leu Pro Gly Leu Pro Ser Trp Val Leu Asn Glu Leu Asn Pro Asp Leu Ile Ile Val Val Glu Thr Thr Gly Asp Glu Ile Leu Met Arg Arg Met Ser Asp Glu Thr Arg Val Arg Asp Leu Asp Thr Ala Ser Thr Ile Glu Gln His Gln Phe Met Asn Arg Cys Ala Ala Met Ser Tyr Gly Val Leu Thr Gly Ala Thr Val Lys Ile Val Gln Asn Arg Asn Gly Leu Leu Asp Gln Ala Val Glu Glu Leu Thr Asn Val Leu Arg 
配列番号９
Met Met Met Met Lys Asn Lys Val Val Val Ile Val Gly Val Pro Gly Val Gly Ser Thr Thr Val Thr Asn Lys Ala Ile Glu Glu Leu Lys Lys Glu Gly Ile Glu Tyr Lys Ile Val Asn Phe Gly Thr Val Met Phe Glu Ile Ala Lys Glu Glu Gly Leu Val Glu His Arg Asp Gln Leu Arg Lys Leu Pro Pro Glu Glu Gln Lys Arg Ile Gln Lys Leu Ala Gly Lys Lys Ile Ala Glu Met Ala Lys Glu Phe Asn Ile Val Val Asp Thr His Ser Thr Ile Lys Thr Pro Lys Gly Tyr Leu Pro Gly Leu Pro Ala Trp Val Leu Glu Glu Leu Asn Pro Asp Ile Ile Val Leu Val Glu Ala Glu Asn Asp Glu Ile Leu Met Arg Arg Leu Lys Asp Glu Thr Arg Gln Arg Asp Phe Glu Ser Thr Glu Asp Ile Gly Glu His Ile Phe Met Asn Arg Cys Ala Ala Met Thr Tyr Ala Val Leu Thr Gly Ala Thr Val Lys Ile Ile Lys Asn Arg Asp Phe Leu Leu Asp Lys Ala Val Gln Glu Leu Ile Glu Val Leu Lys
配列番号１０
Met Gly Tyr Val Ile Val Ala Thr Gly Val Pro Gly Val Gly Ala Thr Thr Val Thr Thr Glu Ala Val Lys Glu Leu Glu Gly Tyr Glu His Val Asn Tyr Gly Asp Val Met Leu Glu Ile Ala Lys Glu Glu Gly Leu Val Glu His Arg Asp Glu Ile Arg Lys Leu Pro Ala Glu Lys Gln Arg Glu Ile Gln Arg Leu Ala Ala Arg Arg Ile Ala Lys Met Ala Glu Glu Lys Glu Gly Ile Ile Val Asp Thr His Cys Thr Ile Lys Thr Pro Ala Gly Tyr Leu Pro Gly Leu Pro Ile Trp Val Leu Glu Glu Leu Gln Pro Asp Val Ile Val Leu Ile Glu Ala Asp Pro Asp Glu Ile Met Met Arg Arg Val Lys Asp Ser Glu Glu Arg Gln Arg Asp Tyr Asp Arg Ala His Glu Ile Glu Glu His Gln Lys Met Asn Arg Met Ala Ala Met Ala Tyr Ala Ala Leu Thr Gly Ala Thr Val Lys Ile Ile Glu Asn His Asp Asp Arg Leu Glu Glu Ala Val Arg Glu Phe Val Glu Thr Val Arg Ser Leu 
配列番号１１
Met Lys Asn Lys Val Val Val Val Thr Gly Val Pro Gly Val Gly Gly Thr Thr Leu Thr Gln Lys Thr Ile Glu Lys Leu Lys Glu Glu Gly Ile Glu Tyr Lys Met Val Asn Phe Gly Thr Val Met Phe Glu Val Ala Lys Glu Glu Gly Leu Val Glu Asp Arg Asp Gln Met Arg Lys Leu Asp Pro Asp Thr Gln Lys Arg Ile Gln Lys Leu Ala Gly Arg Lys Ile Ala Glu Met Ala Lys Glu Ser Asn Val Ile Val Asp Thr His Ser Thr Val Lys Thr Pro Lys Gly Tyr Leu Ala Gly Leu Pro Ile Trp Val Leu Glu Glu Leu Asn Pro Asp Ile Ile Val Ile Val Glu Thr Ser Ser Asp Glu Ile Leu Met Arg Arg Leu Gly Asp Ala Thr Arg Asn Arg Asp Ile Glu Leu Thr Ser Asp Ile Asp Glu His Gln Phe Met Asn Arg Cys Ala Ala Met Ala Tyr Gly Val Leu Thr Gly Ala Thr Val Lys Ile Ile Lys Asn Arg Asp Gly Leu Leu Asp Lys Ala Val Glu Glu Leu Ile Ser Val Leu Lys 
配列番号１２
Met Lys Ile Val Ile Val Ala Leu Pro Gly Ser Gly Lys Thr Thr Ile Leu Asn Phe Val Lys Gln Lys Leu Pro Asp Val Lys Ile Val Asn Tyr Gly Asp Val Met Leu Glu Ile Ala Lys Lys Arg Phe Gly Ile Gln His Arg Asp Glu Met Arg Lys Lys Ile Pro Val Asp Glu Tyr Arg Lys Val Gln Glu Glu Ala Ala Glu Tyr Ile Ala Ser Leu Thr Gly Asp Val Ile Ile Asp Thr His Ala Ser Ile Lys Ile Gly Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Leu Pro Asp Arg Ile Ile Ser Lys Leu Lys Pro Asp Val Ile Leu Leu Leu Glu Tyr Asp Pro Lys Val Ile Leu Glu Arg Arg Lys Lys Asp Pro Asp Arg Phe Arg Asp Leu Glu Ser Glu Glu Glu Ile Glu Met His Gln Gln Ala Asn Arg Tyr Tyr Ala Phe Ala Ala Ala Asn Ala Gly Glu Ser Thr Val His Val Leu Asn Phe Arg Gly Lys Pro Glu Ser Arg Pro Phe Glu His Ala Glu Val Ala Ala Glu Tyr Ile Val Asn Leu Ile Leu Arg Thr Arg Gln Lys Ser 
配列番号１３
Met Met Ala Tyr Leu Val Phe Leu Gly Pro Pro Gly Ala Gly Lys Gly Thr Tyr Ala Lys Arg Ile Gln Glu Lys Thr Gly Ile Pro His Ile Ser Thr Gly Asp Ile Phe Arg Asp Ile Val Lys Lys Glu Asn Asp Glu Leu Gly Lys Lys Ile Lys Glu Ile Met Glu Lys Gly Glu Leu Val Pro Asp Glu Leu Val Asn Glu Val Val Lys Arg Arg Leu Ser Glu Lys Asp Cys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Asp Gly Tyr Pro Arg Thr Val Ala Gln Ala Glu Phe Leu Asp Ser Phe Leu Glu Ser Gln Asn Lys Gln Leu Thr Ala Ala Val Leu Phe Asp Val Pro Glu Asp Val Val Val Gln Arg Leu Thr Ser Arg Arg Ile Cys Pro Lys Cys Gly Arg Ile Tyr Asn Met Ile Ser Leu Pro Pro Lys Glu Asp Glu Leu Cys Asp Asp Cys Lys Val Lys Leu Val Gln Arg Asp Asp Asp Lys Glu Glu Thr Val Arg His Arg Tyr Lys Val Tyr Leu Glu Lys Thr Gln Pro Val Ile Asp Tyr Tyr Gly Lys Lys Gly Ile Leu Lys Arg Val Asp Gly Thr Ile Gly Ile Asp Asn Val Val Ala Glu Val Leu Lys Ile Ile Gly Trp Ser Asp Lys 
配列番号１４
Met Lys Val Arg His Pro Phe Lys Val Val Val Val Thr Gly Val Pro Gly Val Gly Lys Thr Thr Val Ile Lys Glu Leu Gln Gly Leu Ala Glu Lys Glu Gly Val Lys Leu His Ile Val Asn Phe Gly Ser Phe Met Leu Asp Thr Ala Val Lys Leu Gly Leu Val Glu Asp Arg Asp Lys Ile Arg Thr Leu Pro Leu Arg Arg Gln Leu Glu Leu Gln Arg Glu Ala Ala Lys Arg Ile Val Ala Glu Ala Ser Lys Ala Leu Gly Gly Asp Gly Val Leu Ile Ile Asp Thr His Ala Leu Val Lys Thr Val Ala Gly Tyr Trp Pro Gly Leu Pro Lys His Val Leu Asp Glu Leu Lys Pro Asp Met Ile Ala Val Val Glu Ala Ser Pro Glu Glu Val Ala Ala Arg Gln Ala Arg Asp Thr Thr Arg Tyr Arg Val Asp Ile Gly Gly Val Glu Gly Val Lys Arg Leu Met Glu Asn Ala Arg Ala Ala Ser Ile Ala Ser Ala Ile Gln Tyr Ala Ser Thr Val Ala Ile Val Glu Asn Arg Glu Gly Glu Ala Ala Lys Ala Ala Glu Glu Leu Leu Arg Leu Ile Lys Asn Leu 
配列番号１５
Met Asn Leu Ile Phe Leu Gly Pro Pro Gly Ala Gly Lys Gly Thr Gln Ala Lys Arg Val Ser Glu Lys Tyr Gly Ile Pro Gln Ile Ser Thr Gly Asp Met Leu Arg Glu Ala Val Ala Lys Gly Thr Glu Leu Gly Lys Lys Ala Lys Glu Tyr Met Asp Lys Gly Glu Leu Val Pro Asp Glu Val Val Ile Gly Ile Val Lys Glu Arg Leu Gln Gln Pro Asp Cys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Asp Gly Phe Pro Arg Thr Leu Ala Gln Ala Glu Ala Leu Asp Glu Met Leu Lys Glu Leu Asn Lys Lys Ile Asp Ala Val Ile Asn Val Val Val Pro Glu Glu Glu Val Val Lys Arg Ile Thr Tyr Arg Arg Thr Cys Arg Asn Cys Gly Ala Val Tyr His Leu Ile Tyr Ala Pro Pro Lys Glu Asp Asn Lys Cys Asp Lys Cys Gly Gly Glu Leu Tyr Gln Arg Asp Asp Lys Glu Glu Thr Val Arg Glu Arg Tyr Arg Val Tyr Lys Gln Asn Thr Glu Pro Leu Ile Asp Tyr Tyr Arg Lys Lys Gly Ile Leu Tyr Asp Val Asp Gly Thr Lys Asp Ile Glu Gly Val Trp Lys Glu Ile Glu Ala Ile Leu Glu Lys Ile Lys Ser 
配列番号１６
Met Asn Ile Leu Ile Phe Gly Pro Pro Gly Ser Gly Lys Ser Thr Gln Ala Arg Arg Ile Thr Glu Arg Tyr Gly Leu Thr Tyr Ile Ala Ser Gly Asp Ile Ile Arg Ala Glu Ile Lys Ala Arg Thr Pro Leu Gly Ile Glu Met Glu Arg Tyr Leu Ser Arg Gly Asp Leu Ile Pro Asp Thr Ile Val Asn Thr Leu Ile Ile Ser Lys Leu Arg Arg Val Arg Glu Asn Phe Ile Met Asp Gly Tyr Pro Arg Thr Pro Glu Gln Val Ile Thr Leu Glu Asn Tyr Leu Tyr Asp His Gly Ile Lys Leu Asp Val Ala Ile Asp Ile Tyr Ile Thr Lys Glu Glu Ser Val Arg Arg Ile Ser Gly Arg Arg Ile Cys Ser Lys Cys Gly Ala Val Tyr His Val Glu Phe Asn Pro Pro Lys Val Pro Gly Lys Cys Asp Ile Cys Gly Gly Glu Leu Ile Gln Arg Pro Asp Asp Arg Pro Glu Ile Val Glu Lys Arg Tyr Asp Ile Tyr Ser Lys Asn Met Glu Pro Ile Ile Lys Phe Tyr Gln Lys Gln Gly Ile Tyr Val Arg Ile Asp Gly His Gly Ser Ile Asp Glu Val Trp Glu Arg Ile Arg Pro Leu Leu Asp Tyr Ile Tyr Asn Gln Glu Asn Arg Arg 
配列番号１７
Met Pro Phe Val Val Ile Ile Thr Gly Ile Pro Gly Val Gly Lys Ser Thr Ile Thr Arg Leu Ala Leu Gln Arg Thr Lys Ala Lys Phe Arg Leu Ile Asn Phe Gly Asp Leu Met Phe Glu Glu Ala Val Lys Ala Gly Leu Val Lys His Arg Asp Glu Met Arg Lys Leu Pro Leu Xaa Ile Gln Arg Glu Leu Gln Met Lys Ala Ala Lys Lys Ile Xaa Glu Met Ala Lys Glu His Pro Ile Leu Val Asp Thr His Ala Thr Ile Lys Thr Pro His Gly Tyr Xaa Leu Gly Leu Pro Tyr Glu Val Val Lys Thr Leu Asn Pro Asn Phe Ile Val Ile Ile Glu Ala Thr Pro Ser Glu Ile Leu Gly Arg Arg Leu Arg Asp Leu Lys Arg Asp Arg Asp Val Glu Thr Glu Glu Gln Ile Gln Arg His Gln Asp Leu Asn Arg Ala Ala Ala Ile Xaa Tyr Ala Met His Ser Asn Ala Leu Ile Lys Ile Ile Glu Asn His Glu Asp Lys Gly Leu Glu Glu Ala Val Asn Glu Leu Val Lys Ile Leu Asp Leu Ala Val Asn Glu Tyr Ala 
配列番号１８
Met Pro Phe Val Val Ile Ile Thr Gly Ile Pro Gly Val Gly Lys Ser Thr Ile Thr Lys Leu Ala Leu Gln Arg Thr Arg Ala Lys Phe Lys Leu Ile Asn Phe Gly Asp Leu Met Phe Glu Glu Ala Leu Lys Leu Xaa Leu Val Lys His Arg Asp Glu Met Arg Lys Leu Pro Leu Glu Val Gln Arg Glu Leu Gln Met Asn Ala Ala Lys Lys Ile Ala Glu Met Ala Lys Asn Tyr Pro Ile Leu Leu Asp Thr His Ala Thr Ile Lys Thr Pro His Gly Tyr Leu Leu Gly Leu Pro Tyr Glu Val Ile Lys Ile Leu Asn Pro Asn Phe Ile Val Ile Ile Glu Ala Thr Pro Ser Glu Ile Leu Gly Arg Arg Leu Arg Asp Leu Lys Arg Asp Arg Asp Val Glu Thr Glu Glu Gln Ile Gln Arg His Gln Asp Leu Asn Arg Ala Ala Ala Ile Xaa Tyr Ala Met His Ser Asn Ala Leu Ile Lys Ile Ile Glu Asn His Glu Asp Lys Gly Leu Glu Glu Ala Val Asn Glu Leu Val Lys Ile Leu Asp Leu Ala Val Lys Glu Tyr Ala 
配列番号１９
Met Lys Ile Gly Ile Val Thr Gly Ile Pro Gly Val Gly Lys Ser Thr Val Leu Ala Lys Val Lys Glu Ile Leu Asp Asn Gln Gly Ile Asn Asn Lys Ile Ile Asn Tyr Gly Asp Phe Met Leu Ala Thr Ala Leu Lys Leu Gly Tyr Ala Lys Asp Arg Asp Glu Met Arg Lys Leu Ser Val Glu Lys Gln Lys Lys Leu Gln Ile Asp Ala Ala Lys Gly Ile Ala Glu Glu Ala Arg Ala Gly Gly Glu Gly Tyr Leu Phe Ile Asp Thr His Ala Val Ile Arg Thr Pro Ser Gly Tyr Xaa Pro Gly Leu Pro Ser Tyr Val Ile Thr Glu Ile Asn Pro Ser Val Ile Phe Leu Leu Glu Ala Asp Pro Lys Ile Ile Leu Ser Arg Gln Lys Arg Asp Thr Thr Arg Asn Arg Asn Asp Tyr Ser Asp Glu Ser Val Ile Leu Glu Thr Ile Asn Phe Ala Arg Tyr Ala Ala Thr Ala Ser Ala Val Leu Ala Gly Ser Thr Val Lys Val Ile Val Asn Val Glu Gly Asp Pro Ser Ile Ala Ala Asn Glu Ile Ile Arg Ser Met Lys 
配列番号２０
Met Arg Val Leu Val Ile Asn Ser Gly Ser Ser Ser Ile Lys Tyr Gln Leu Ile Glu Met Glu Gly Glu Lys Val Leu Cys Lys Gly Ile Ala Glu Arg Ile Gly Ile Glu Gly Ser Arg Leu Val His Arg Val Gly Asp Glu Lys His Val Ile Glu Arg Glu Leu Pro Asp His Glu Glu Ala Leu Lys Leu Ile Leu Asn Thr Leu Val Asp Glu Lys Leu Gly Val Ile Lys Asp Leu Lys Glu Ile Asp Ala Val Gly His Arg Val Val His Gly Gly Glu Arg Phe Lys Glu Ser Val Leu Val Asp Glu Glu Val Leu Lys Ala Ile Glu Glu Val Ser Pro Leu Ala Pro Leu His Asn Pro Ala Asn Leu Met Gly Ile Lys Ala Ala Met Lys Leu Leu Pro Gly Val Pro Asn Val Ala Val Phe Asp Thr Ala Phe His Gln Thr Ile Pro Gln Lys Ala Tyr Leu Tyr Ala Ile Pro Tyr Glu Tyr Tyr Glu Lys Tyr Lys Ile Arg Arg Tyr Gly Phe His Gly Thr Ser His Arg Tyr Val Ser Lys Arg Ala Ala Glu Ile Leu Gly Lys Lys Leu Glu Glu Leu Lys Ile Ile Thr Cys His Ile Gly Asn Gly Ala Ser Val Ala Ala Val Lys Tyr Gly Lys Cys Val Asp Thr Ser Met Gly Phe Thr Pro Leu Glu Gly Leu Val Met Gly Thr Arg Ser Gly Asp Leu Asp Pro Ala Ile Pro Phe Phe Ile Met Glu Lys Glu Gly Ile Ser Pro Gln Glu Met Tyr Asp Ile Leu Asn Lys Lys Ser Gly Val Tyr Gly Leu Ser Lys Gly Phe Ser Ser Asp Met Arg Asp Ile Glu Glu Ala Ala Leu Lys Gly Asp Glu Trp Cys Lys Leu Val Leu Glu Ile Tyr Asp Tyr Arg Ile Ala Lys Tyr Ile Gly Ala Tyr Ala Ala Ala Met Asn Gly Val Asp Ala Ile Val Phe Thr Ala Gly Val Gly Glu Asn Ser Pro Ile Thr Arg Glu Asp Val Cys Ser Tyr Leu Glu Phe Leu Gly Val Lys Leu Asp Lys Gln Lys Asn Glu Glu Thr Ile Arg Gly Lys Glu Gly Ile Ile Ser Thr Pro Asp Ser Arg Val Lys Val Leu Val Val Pro Thr Asn Glu Glu Leu Met Ile Ala Arg Asp Thr Lys Glu Ile Val Glu Lys Ile Gly Arg 
配列番号２１
Met Arg Arg Met Lys Leu Pro Ser His Lys Thr Lys Ile Val Ala Thr Ile Gly Pro Ala Thr Asn Ser Lys Lys Met Ile Lys Lys Leu Ile Glu Ala Gly Met Asn Val Ala Arg Ile Asn Phe Ser His Gly Thr Phe Glu Glu His Ala Lys Ile Ile Glu Met Val Arg Glu Gln Ser Gln Lys Leu Asp Arg Arg Val Ala Ile Leu Ala Asp Leu Pro Gly Leu Lys Ile Arg Val Gly Glu Ile Lys Gly Gly Tyr Val Glu Leu Glu Arg Gly Glu Lys Val Thr Leu Thr Thr Lys Asp Ile Glu Gly Asp Glu Thr Thr Ile Pro Val Glu Tyr Lys Asp Phe Pro Lys Leu Val Ser Lys Gly Asp Val Ile Tyr Leu Ser Asp Gly Tyr Ile Val Leu Arg Val Glu Asp Val Lys Glu Asn Glu Val Glu Ala Val Val Ile Ser Gly Gly Lys Leu Phe Ser Arg Lys Gly Ile Asn Ile Pro Lys Ala Tyr Leu Pro Val Glu Ala Ile Thr Pro Arg Asp Ile Glu Ile Met Lys Phe Ala Ile Glu His Gly Val Asp Ala Ile Gly Leu Ser Phe Val Gly Asn Val Tyr Asp Val Leu Lys Ala Lys Ser Phe Leu Glu Arg Asn Gly Ala Gly Asp Thr Phe Val Ile Ala Lys Ile Glu Arg Pro Asp Ala Val Arg Asn Phe Asn Glu Ile Leu Asn Ala Ala Asp Gly Ile Met Ile Ala Arg Gly Asp Leu Gly Val Glu Met Pro Ile Glu Gln Leu Pro Ile Leu Gln Lys Arg Leu Ile Arg Lys Ala Asn Met Glu Gly Lys Pro Val Ile Thr Ala Thr Gln Met Leu Val Ser Met Thr Met Glu Lys Val Pro Thr Arg Ala Glu Val Thr Asp Val Ala Asn Ala Ile Leu Asp Gly Thr Asp Ala Val Met Leu Ser Glu Glu Thr Ala Val Gly Lys Phe Pro Ile Glu Ala Val Glu Met Met Ala Arg Ile Ala Lys Val Thr Glu Glu Tyr Arg Glu Ser Phe Gly Ile Thr Arg Met Arg Glu Phe Leu Glu Gly Thr Lys Arg Gly Thr Ile Lys Glu Ala Ile Thr Arg Ser Ile Ile Asp Ala Ile Cys Thr Ile Gly Ile Lys Phe Ile Leu Thr Pro Thr Lys Thr Gly Arg Thr Ala Arg Leu Ile Ser Arg Phe Lys Pro Lys Gln Trp Ile Leu Ala Phe Ser Thr Arg Glu Lys Val Cys Asn Asn Leu Met Phe Ser Tyr Gly Val Tyr Pro Phe Cys Met Glu Glu Gly Phe Asn Glu Asn Asp Ile Val Arg Leu Ile Lys Gly Leu Gly Leu Val Gly Ser Asp Asp Ile Val Leu Met Thr Glu Gly Lys Pro Ile Glu Lys Thr Val Gly Thr Asn Ser Ile Lys Ile Phe Gln Ile Ala 
配列番号２２
Met Arg Lys Thr Lys Ile Val Ala Thr Leu Gly Pro Ser Ser Glu Glu Lys Val Lys Glu Leu Ala Glu Tyr Val Asp Val Phe Arg Ile Asn Phe Ala His Gly Asp Glu Thr Ser His Arg Lys Tyr Phe Asp Leu Ile Arg Thr Tyr Ala Pro Glu Ser Ser Ile Ile Val Asp Leu Pro Gly Pro Lys Leu Arg Leu Gly Glu Leu Lys Glu Pro Ile Glu Val Lys Lys Gly Asp Lys Ile Val Phe Ser Gln Lys Asp Gly Ile Pro Val Asp Asp Glu Leu Phe Tyr Ser Ala Val Lys Glu Asn Ser Asp Ile Leu Ile Ala Asp Gly Thr Ile Arg Val Arg Val Lys Ser Lys Ala Lys Asp Arg Val Glu Gly Thr Val Ile Glu Gly Gly Ile Leu Leu Ser Arg Lys Gly Ile Asn Ile Pro Asn Val Asn Leu Lys Ser Gly Ile Thr Asp Asn Asp Leu Lys Leu Leu Lys Arg Ala Leu Asp Leu Gly Ala Asp Tyr Ile Gly Leu Ser Phe Val Ile Ser Glu Asn Asp Val Lys Lys Val Lys Glu Phe Val Gly Asp Glu Ala Trp Val Ile Ala Lys Ile Glu Lys Ser Glu Ala Leu Lys Asn Leu Thr Asn Ile Val Asn Glu Ser Asp Gly Ile Met Val Ala Arg Gly Asp Leu Gly Val Glu Thr Gly Leu Glu Asn Leu Pro Leu Ile Gln Arg Arg Ile Val Arg Thr Ser Arg Val Phe Gly Lys Pro Val Ile Leu Ala Thr Gln Val Leu Thr Ser Met Ile Asn Ser Pro Ile Pro Thr Arg Ala Glu Ile Ile Asp Ile Ser Asn Ser Ile Met Gln Gly Val Asp Ser Ile Met Leu Ser Asp Glu Thr Ala Ile Gly Asn Tyr Pro Val Glu Ser Val Arg Thr Leu His Asn Ile Ile Ser Asn Val Glu Lys Ser Val Lys His Arg Pro Ile Gly Pro Leu Asn Ser Glu Ser Asp Ala Ile Ala Leu Ala Ala Val Asn Ala Ser Lys Val Ser Lys Ala Asp Val Ile Val Val Tyr Ser Arg Ser Gly Asn Ser Ile Leu Arg Val Ser Arg Leu Arg Pro Glu Arg Asn Ile Ile Gly Val Ser Pro Asp Pro Arg Leu Ala Lys Lys Phe Lys Leu Cys Tyr Gly Val Ile Pro Ile Ser Ile Asn Lys Lys Met Gln Ser Ile Asp Glu Ile Ile Asp Val Ser Ala Lys Leu Met Gln Glu Lys Ile Lys Asp Leu Lys Phe Lys Lys Ile Val Ile Val Gly Gly Asp Pro Lys Gln Glu Ala Gly Lys Thr Asn Phe Val Ile Val Lys Thr Leu Glu Gln Gln Lys Lys 
配列番号２３
Met Arg Ser Thr Lys Ile Val Cys Thr Val Gly Pro Arg Thr Asp Ser Tyr Glu Met Ile Glu Lys Met Ile Asp Leu Gly Val Asn Val Phe Arg Ile Asn Thr Ser His Gly Asp Trp Asn Glu Gln Glu Gln Lys Ile Leu Lys Ile Lys Asp Leu Arg Glu Lys Lys Lys Lys Pro Val Ala Ile Leu Ile Asp Leu Ala Gly Pro Lys Ile Arg Thr Gly Tyr Leu Glu Lys Glu Phe Val Glu Leu Lys Glu Gly Gln Ile Phe Thr Leu Thr Thr Lys Glu Ile Leu Gly Asn Glu His Ile Val Ser Val Asn Leu Ser Ser Leu Pro Lys Asp Val Lys Lys Gly Asp Thr Ile Leu Leu Ser Asp Gly Glu Ile Val Leu Glu Val Ile Glu Thr Thr Asp Thr Glu Val Lys Thr Val Val Lys Val Gly Gly Lys Ile Thr His Arg Arg Gly Val Asn Val Pro Thr Ala Asp Leu Ser Val Glu Ser Ile Thr Asp Arg Asp Arg Glu Phe Ile Lys Leu Gly Thr Leu His Asp Val Glu Phe Phe Ala Leu Ser Phe Val Arg Lys Pro Glu Asp Val Leu Lys Ala Lys Glu Glu Ile Arg Lys His Gly Lys Glu Ile Pro Val Ile Ser Lys Ile Glu Thr Lys Lys Ala Leu Glu Arg Leu Glu Glu Ile Ile Lys Val Ser Asp Gly Ile Met Val Ala Arg Gly Asp Leu Gly Val Glu Ile Pro Ile Glu Glu Val Pro Ile Val Gln Lys Glu Ile Ile Lys Leu Ser Lys Tyr Tyr Ser Lys Pro Val Ile Val Ala Thr Gln Ile Leu Glu Ser Met Ile Glu Asn Pro Phe Pro Thr Arg Ala Glu Val Thr Asp Ile Ala Asn Ala Ile Phe Asp Gly Ala Asp Ala Leu Leu Leu Thr Ala Glu Thr Ala Val Gly Lys His Pro Leu Glu Ala Ile Lys Val Leu Ser Lys Val Ala Lys Glu Ala Glu Lys Lys Leu Glu Phe Phe Arg Thr Ile Glu Tyr Asp Thr Ser Asp Ile Ser Glu Ala Ile Ser His Ala Cys Trp Gln Leu Ser Glu Ser Leu Asn Ala Lys Leu Ile Ile Thr Pro Thr Ile Ser Gly Ser Thr Ala Val Arg Val Ser Lys Tyr Asn Val Ser Gln Pro Ile Val Ala Leu Thr Pro Glu Glu Lys Thr Tyr Tyr Arg Leu Ser Leu Val Arg Lys Val Ile Pro Val Leu Ala Glu Lys Cys Ser Gln Glu Leu Glu Phe Ile Glu Lys Gly Leu Lys Lys Val Glu Glu Met Gly Leu Ala Glu Lys Gly Asp Leu Val Val Leu Thr Ser Gly Val Pro Gly Lys Val Gly Thr Thr Asn Thr Ile Arg Val Leu Lys Val Asp 
配列番号２４
Met Arg Arg Val Lys Leu Pro Ser His Lys Thr Lys Ile Val Ala Thr Ile Gly Pro Ala Thr Asn Ser Arg Lys Met Ile Lys Gln Leu Ile Lys Ala Gly Met Asn Val Ala Arg Ile Asn Phe Ser His Gly Ser Phe Glu Glu His Ala Arg Val Ile Glu Ile Ile Arg Glu Glu Ala Gln Lys Leu Asp Arg Arg Val Ala Ile Leu Ala Asp Leu Pro Gly Leu Lys Ile Arg Val Gly Glu Ile Lys Gly Gly Tyr Val Glu Leu Lys Arg Gly Glu Lys Val Ile Leu Thr Thr Lys Asp Val Glu Gly Asp Glu Thr Thr Ile Pro Val Asp Tyr Lys Gly Phe Pro Asn Leu Val Ser Lys Gly Asp Ile Ile Tyr Leu Asn Asp Gly Tyr Ile Val Leu Lys Val Glu Asn Val Arg Glu Asn Glu Val Glu Ala Val Val Leu Ser Gly Gly Lys Leu Phe Ser Arg Lys Gly Val Asn Ile Pro Lys Ala Tyr Leu Pro Val Glu Ala Ile Thr Pro Lys Asp Phe Glu Ile Met Lys Phe Ala Ile Glu His Gly Val Asp Ala Ile Gly Leu Ser Phe Val Gly Ser Val Tyr Asp Val Leu Lys Ala Lys Ser Phe Leu Glu Lys Asn Asn Ala Glu Asp Val Phe Val Ile Ala Lys Ile Glu Arg Pro Asp Ala Val Arg Asn Phe Asp Glu Ile Leu Asn Ala Ala Asp Gly Ile Met Ile Ala Arg Gly Asp Leu Gly Val Glu Met Pro Ile Glu Gln Leu Pro Ile Leu Gln Lys Lys Leu Ile Arg Lys Ala Asn Met Glu Gly Lys Pro Val Ile Thr Ala Thr Gln Met Leu Val Ser Met Thr Thr Glu Lys Val Pro Thr Arg Ala Glu Val Thr Asp Val Ala Asn Ala Ile Leu Asp Gly Thr Asp Ala Val Met Leu Ser Glu Glu Thr Ala Ile Gly Lys Phe Pro Ile Glu Thr Val Glu Met Met Gly Lys Ile Ala Lys Val Thr Glu Glu Tyr Arg Glu Ser Phe Gly Leu Ser Arg Ile Arg Glu Phe Met Glu Ile Lys Lys Gly Thr Ile Lys Glu Ala Ile Thr Arg Ser Ile Ile Asp Ala Ile Cys Thr Ile Asp Ile Lys Phe Ile Leu Thr Pro Thr Arg Thr Gly Arg Thr Ala Arg Leu Ile Ser Arg Phe Lys Pro Lys Gln Trp Ile Leu Ala Phe Ser Thr Asn Glu Arg Val Cys Asn Asn Leu Met Phe Ser Tyr Gly Val Tyr Pro Phe Cys Leu Glu Glu Gly Phe Asp Glu Asn Asp Ile Val Arg Leu Ile Lys Gly Leu Gly Leu Val Glu Ser Asp Asp Met Val Leu Met Thr Glu Gly Lys Pro Ile Glu Lys Thr Val Gly Thr Asn Ser Ile Lys Ile Phe Gln Ile Ala 
配列番号２５
Met Lys Val Leu Val Ile Asn Ala Gly Ser Ser Ser Leu Lys Tyr Gln Leu Ile Asp Met Thr Asn Glu Ser Ala Leu Ala Val Gly Leu Cys Glu Arg Ile Gly Ile Asp Asn Ser Ile Ile Thr Gln Lys Lys Phe Asp Gly Lys Lys Leu Glu Lys Leu Thr Asp Leu Pro Thr His Lys Asp Ala Leu Glu Glu Val Val Lys Ala Leu Thr Asp Asp Glu Phe Gly Val Ile Lys Asp Met Gly Glu Ile Asn Ala Val Gly His Arg Val Val His Gly Gly Glu Lys Phe Thr Thr Ser Ala Leu Tyr Asp Glu Gly Val Glu Lys Ala Ile Lys Asp Cys Phe Glu Leu Ala Pro Leu His Asn Pro Pro Asn Met Met Gly Ile Ser Ala Cys Ala Glu Ile Met Pro Gly Thr Pro Met Val Ile Val Phe Asp Thr Ala Phe His Gln Thr Met Pro Pro Tyr Ala Tyr Met Tyr Ala Leu Pro Tyr Asp Leu Tyr Glu Lys His Gly Val Arg Lys Tyr Gly Phe His Gly Thr Ser His Lys Tyr Val Ala Glu Arg Ala Ala Leu Met Leu Gly Lys Pro Ala Glu Glu Thr Lys Ile Ile Thr Cys His Leu Gly Asn Gly Ser Ser Ile Thr Ala Val Glu Gly Gly Lys Ser Val Glu Thr Ser Met Gly Phe Thr Pro Leu Glu Gly Leu Ala Met Gly Thr Arg Cys Gly Ser Ile Asp Pro Ala Ile Val Pro Phe Leu Met Glu Lys Glu Gly Leu Thr Thr Arg Glu Ile Asp Thr Leu Met Asn Lys Lys Ser Gly Val Leu Gly Val Ser Gly Leu Ser Asn Asp Phe Arg Asp Leu Asp Glu Ala Ala Ser Lys Gly Asn Arg Lys Ala Glu Leu Ala Leu Glu Ile Phe Ala Tyr Lys Val Lys Lys Phe Ile Gly Glu Tyr Ser Ala Val Leu Asn Gly Ala Asp Ala Val Val Phe Thr Ala Gly Ile Gly Glu Asn Ser Ala Ser Ile Arg Lys Arg Ile Leu Thr Gly Leu Asp Gly Ile Gly Ile Lys Ile Asp Asp Glu Lys Asn Lys Ile Arg Gly Gln Glu Ile Asp Ile Ser Thr Pro Asp Ala Lys Val Arg Val Phe Val Ile Pro Thr Asn Glu Glu Leu Ala Ile Ala Arg Glu Thr Lys Glu Ile Val Glu Thr Glu Val Lys Leu Arg Ser Ser Ile Pro Val 
配列番号２６
atgaagattg gtattgtaac tggaattcct ggtgtaggga aaagtactgt cttggctaaa gttaaagaga tattggataa tcaaggtata aataacaaga tcataaatta tggagatttt atgttagcaa cagcattaaa attaggctat gctaaagata gagacgaaat gagaaaatta tctgtagaaa agcagaagaa attgcagatt gatgcggcta aaggtatagc tgaagaggca agagcaggtg gagaaggata tctgttcata gatacgcatg ctgtgatacg tacaccctct ggatatttac ctggtttacc gtcatatgta attacagaaa taaatccgtc tgttatcttt ttactggaag ctgatcctaa gataatatta tcaaggcaaa agagagatac aacaaggaat agaaatgatt atagtgacga atcagttata ttagaaacca taaacttcgc tagatatgca gctactgctt ctgcagtatt agccggttct actgttaagg taattgtaaa cgtggaagga gatcctagta tagcagctaa tgagataata aggtctatga agtaa 
配列番号２７
atgaaaatcg gtatcgttac cggtatcccg ggtgttggta aatctaccgt tctggctaaa gttaaagaaa tcctggacaa ccagggtatc aacaacaaaa tcatcaacta cggtgacttc atgctggcta ccgctctgaa actgggttac gctaaagacc gtgacgaaat gcgtaaactg tctgttgaaa aacagaaaaa actgcagatc gacgctgcta aaggtatcgc tgaagaagct cgtgctggtg gtgaaggtta cctgttcatc gacacccacg ctgttatccg taccccgtct ggttacctgc cgggtctgcc gtcttacgtt atcaccgaaa tcaacccgtc tgttatcttc ctgctggaag ctgacccgaa aatcatcctg tctcgtcaga aacgtgacac cacccgtaac cgtaacgact actctgacga atctgttatc ctggaaacca tcaacttcgc tcgttacgct gctaccgctt ctgctgttct ggctggttct accgttaaag ttatcgttaa cgttgaaggt gacccgtcta tcgctgctaa cgaaatcatc cgttctatga aatag 
配列番号２８
atgatggcgt accttgtctt tctaggacct ccaggtgcag gaaaaggaac ctacgcaaag agattgcagg aaataacggg gattcctcat atatccaccg gtgacatttt cagggacatt gtaaaaaaag agaacgacga gcttgggaaa aagataaaag agatcatgga aaggggagaa ctcgttccgg acgaactcgt gaacgaggtt gtgaaaagaa gactctcaga aaaagattgt gaaagaggat tcatactgga cggctatcca agaaccgttg ctcaggcgga attcctcgac ggctttttga aaactcaaaa caaagagctc acggctgctg tactctttga agttcctgag gaagtggtcg ttcagaggct cacggccaga aggatctgcc cgaaatgtgg aagaatttac aatttgattt cgctccctcc aaaagaagac gaactgtgcg atgattgtaa agtgaagctc gttcagagag aagacgacaa agaagaaaca gtgagacaca gatacaaggt ttatctcgaa aagacacagc cagtgattga ttactacgat aaaaagggca ttctcaaacg agtggatggt accataggaa tagacaacgt gatcgctgaa gtgttaaaga taatagggtg gagtgataaa tga 
配列番号２９
atgatggcct atctggtttt tcttggtcca ccgggggcag gcaaaggtac atatgcgaaa cgtttacagg aaatcaccgg catcccgcac attagcacgg gcgacatttt tcgtgatatt gtcaaaaagg aaaatgacga attaggtaag aaaattaaag aaattatgga gcgcggcgag ttggtgccgg acgaactggt gaatgaagtt gtcaaacgtc ggctgtctga aaaggattgc gaacgtggct ttattttgga cggttacccg cgtacagtag ctcaggcaga gtttctcgac ggcttcctga agactcagaa taaggagtta acggctgcgg tcctgttcga ggtgcctgaa gaggtggtcg ttcagcgtct gaccgcgcgg cgtatctgcc cgaagtgtgg tcgtatttac aacctgattt cacttcctcc aaaagaagat gaactgtgtg atgactgcaa agtaaaactg gtgcaacgcg aagatgataa agaggaaact gtgcgccatc gctacaaagt atatctggaa aaaacccaac cggttatcga ttattatgat aaaaaaggca ttttgaaacg cgttgatggg accatcggca tcgataacgt gattgccgaa gttctcaaaa tcattgggtg gagtgataaa 
配列番号３０
atgaacctga ttttcctggg tccgcctggg gcaggcaaag gcacccaggc gaaacgtgtg tctgaaaagt acggtatccc gcagattagt accggcgata tgctgcgtga agcggttgct aagggtacgg aactggggaa aaaggcgaaa gaatatatgg acaaagggga acttgttccg gatgaagtag ttattggaat cgtgaaagaa cgcctccagc aaccggattg tgagaagggc tttattctgg acggttttcc gcgtacgtta gcacaagccg aagctctgga cgaaatgtta aaagaattga ataagaaaat tgacgccgta atcaacgtgg tcgtaccgga agaggaagtt gtcaagcgta ttacctatcg tcgcacttgc cgcaattgcg gcgccgtgta ccatctcatt tatgcacctc caaaagagga taataaatgt gataaatgcg gcggtgagct ttatcagcgt gatgacgata aagaagagac agtccgcgag cgttaccgtg tgtataaaca gaacacagag ccattgatcg attattaccg taaaaaggga atcctgtatg atgtggatgg tactaaagac atcgaaggag tttggaaaga aattgaggcg attctggaaa aaattaaaag c 
配列番号３１
Met Lys Ile Gly Ile Val Thr Gly Ile Pro Gly Val Gly Lys Ser Thr Val Leu Ala Lys Val Lys Glu Ile Leu Asp Asn Gln Gly Ile Asn Asn Lys Ile Ile Asn Tyr Gly Asp Phe Met Leu Ala Thr Ala Leu Lys Leu Gly Tyr Ala Lys Asp Arg Asp Glu Met Arg Lys Leu Ser Val Glu Lys Gln Lys Lys Leu Gln Ile Asp Ala Ala Lys Gly Ile Ala Glu Glu Ala Arg Ala Gly Gly Glu Gly Tyr Leu Phe Ile Asp Thr His Ala Val Ile Arg Thr Pro Ser Gly Tyr Leu Pro Gly Leu Pro Ser Tyr Val Ile Thr Glu Ile Asn Pro Ser Val Ile Phe Leu Leu Glu Ala Asp Pro Lys Ile Ile Leu Ser Arg Gln Lys Arg Asp Thr Thr Arg Asn Arg Asn Asp Tyr Ser Asp Glu Ser Val Ile Leu Glu Thr Ile Asn Phe Ala Arg Tyr Ala Ala Thr Ala Ser Ala Val Leu Ala Gly Ser Thr Val Lys Val Ile Val Asn Val Glu Gly Asp Pro Ser Ile Ala Ala Asn Glu Ile Ile Arg Ser Met Lys 
配列番号３２
Met Met Ala Tyr Leu Val Phe Leu Gly Pro Pro Gly Ala Gly Lys Gly Thr Tyr Ala Lys Arg Leu Gln Glu Ile Thr Gly Ile Pro His Ile Ser Thr Gly Asp Ile Phe Arg Asp Ile Val Lys Lys Glu Asn Asp Glu Leu Gly Lys Lys Ile Lys Glu Ile Met Glu Arg Gly Glu Leu Val Pro Asp Glu Leu Val Asn Glu Val Val Lys Arg Arg Leu Ser Glu Lys Asp Cys Glu Arg Gly Phe Ile Leu Asp Gly Tyr Pro Arg Thr Val Ala Gln Ala Glu Phe Leu Asp Gly Phe Leu Lys Thr Gln Asn Lys Glu Leu Thr Ala Ala Val Leu Phe Glu Val Pro Glu Glu Val Val Val Gln Arg Leu Thr Ala Arg Arg Ile Cys Pro Lys Cys Gly Arg Ile Tyr Asn Leu Ile Ser Leu Pro Pro Lys Glu Asp Glu Leu Cys Asp Asp Cys Lys Val Lys Leu Val Gln Arg Glu Asp Asp Lys Glu Glu Thr Val Arg His Arg Tyr Lys Val Tyr Leu Glu Lys Thr Gln Pro Val Ile Asp Tyr Tyr Asp Lys Lys Gly Ile Leu Lys Arg Val Asp Gly Thr Ile Gly Ile Asp Asn Val Ile Ala Glu Val Leu Lys Ile Ile Gly Trp Ser Asp Lys 
配列番号３３
Met Asn Gln Glu Gln Val Ser Pro Leu Gly Gly 
配列番号３４
Met Asn Gln Glu Gln Val Ser Pro Leu Gly Gly Lys Ile Gly Ile Val Thr Gly Ile Pro Gly Val Gly Lys Ser Thr Val Leu Ala Lys Val Lys Glu Ile Leu Asp Asn Gln Gly Ile Asn Asn Lys Ile Ile Asn Tyr Gly Asp Phe Met Leu Ala Thr Ala Leu Lys Leu Gly Tyr Ala Lys Asp Arg Asp Glu Met Arg Lys Leu Ser Val Glu Lys Gln Lys Lys Leu Gln Ile Asp Ala Ala Lys Gly Ile Ala Glu Glu Ala Arg Ala Gly Gly Glu Gly Tyr Leu Phe Ile Asp Thr His Ala Val Ile Arg Thr Pro Ser Gly Tyr Leu Pro Gly Leu Pro Ser Tyr Val Ile Thr Glu Ile Asn Pro Ser Val Ile Phe Leu Leu Glu Ala Asp Pro Lys Ile Ile Leu Ser Arg Gln Lys Arg Asp Thr Thr Arg Asn Arg Asn Asp Tyr Ser Asp Glu Ser Val Ile Leu Glu Thr Ile Asn Phe Ala Arg Tyr Ala Ala Thr Ala Ser Ala Val Leu Ala Gly Ser Thr Val Lys Val Ile Val Asn Val Glu Gly Asp Pro Ser Ile Ala Ala Asn Glu Ile Ile Arg Ser Met Lys 
配列番号３５
Met Lys Ile Gly Ile Val Thr Gly Ile Pro Gly Val Gly Lys Ser Thr Val Leu Ala Lys Val Lys Glu Ile Leu Asp Asn Gln Gly Ile Asn Asn Lys Ile Ile Asn Tyr Gly Asp Phe Met Leu Ala Thr Ala Leu Lys Leu Gly Tyr Ala Lys Asp Arg Asp Glu Met Arg Lys Leu Ser Val Glu Lys Gln Lys Lys Leu Gln Ile Asp Ala Ala Lys Gly Ile Ala Glu Glu Ala Arg Ala Gly Gly Glu Gly Tyr Leu Phe Ile Asp Thr His Ala Val Ile Arg Thr Pro Ser Gly Tyr Leu Pro Gly Leu Pro Ser Tyr Val Ile Thr Glu Ile Asn Pro Ser Val Ile Phe Leu Leu Glu Ala Asp Pro Lys Ile Ile Leu Ser Arg Gln Lys Arg Asp Thr Thr Arg Asn Arg Asn Asp Tyr Ser Asp Glu Ser Val Ile Leu Glu Thr Ile Asn Phe Ala Arg Tyr Ala Ala Thr Ala Ser Ala Val Leu Ala Gly Ser Thr Val Lys Val Ile Val Asn Val Glu Gly Asp Pro Ser Ile Ala Ala Asn Glu Ile Ile Arg Ser Met Lys Gly Gly Asn Gln Glu Gln Val Ser Pro Leu 
配列番号３６
Met Asn Gln Glu Gln Val Ser Pro Leu Gly Gly Lys Ile Gly Ile Val Thr Gly Ile Pro Gly Val Gly Lys Ser Thr Val Leu Ala Lys Val Lys Glu Ile Leu Asp Asn Gln Gly Ile Asn Asn Lys Ile Ile Asn Tyr Gly Asp Phe Met Leu Ala Thr Ala Leu Lys Leu Gly Tyr Ala Lys Asp Arg Asp Glu Met Arg Lys Leu Ser Val Glu Lys Gln Lys Lys Leu Gln Ile Asp Ala Ala Lys Gly Ile Ala Glu Glu Ala Arg Ala Gly Gly Glu Gly Tyr Leu Phe Ile Asp Thr His Ala Val Ile Arg Thr Pro Ser Gly Tyr Leu Pro Gly Leu Pro Ser Tyr Val Ile Thr Glu Ile Asn Pro Ser Val Ile Phe Leu Leu Glu Ala Asp Pro Lys Ile Ile Leu Ser Arg Gln Lys Arg Asp Thr Thr Arg Asn Arg Asn Asp Tyr Ser Asp Glu Ser Val Ile Leu Glu Thr Ile Asn Phe Ala Arg Tyr Ala Ala Thr Ala Ser Ala Val Leu Ala Gly Ser Thr Val Lys Val Ile Val Asn Val Glu Gly Asp Pro Ser Ile Ala Ala Asn Glu Ile Ile Arg Ser Met Lys Gly Gly Asn Gln Glu Gln Val Ser Pro Leu 
配列番号３７
atgaatcaag aacaagtcag cccgctgggc ggcatcatcg cctatctggt ttttcttggt ccaccggggg caggcaaagg tacctatgcg aaacgtttac aggaaatcac cggcatcccg cacattagca cgggcgacat ttttcgtgat attgtcaaaa aggaaaatga cgaattaggt aagaaaatta aagaaattat ggagcgcggc gagttggtgc cggacgaact ggtgaatgaa gttgtcaaac gtcggctgtc tgaaaaggat tgcgaacgtg gctttatttt ggacggttac ccgcgtacag tagctcaggc agagtttctc gacggcttcc tgaagactca gaataaggag ttaacggctg cggtcctgtt cgaggtgcct gaagaggtgg tcgttcagcg tctgaccgcg cggcgtatct gcccgaagtg tggtcgtatt tacaacctga tttcacttcc tccaaaagaa gatgaactgt gtgatgactg caaagtaaaa ctggtgcaac gcgaagatga taaagaggaa actgtgcgcc atcgctacaa agtatatctg gaaaaaaccc aaccggttat cgattattat gataaaaaag gcattttgaa acgcgttgat gggaccatcg gcatcgataa cgtgattgcc gaagttctca aaatcattgg gtggagtgat aaataggtcg acgc 
配列番号３８
Met Asn Gln Glu Gln Val Ser Pro Leu Gly Gly Ile Ile Ala Tyr Leu Val Phe Leu Gly Pro Pro Gly Ala Gly Lys Gly Thr Tyr Ala Lys Arg Leu Gln Glu Ile Thr Gly Ile Pro His Ile Ser Thr Gly Asp Ile Phe Arg Asp Ile Val Lys Lys Glu Asn Asp Glu Leu Gly Lys Lys Ile Lys Glu Ile Met Glu Arg Gly Glu Leu Val Pro Asp Glu Leu Val Asn Glu Val Val Lys Arg Arg Leu Ser Glu Lys Asp Cys Glu Arg Gly Phe Ile Leu Asp Gly Tyr Pro Arg Thr Val Ala Gln Ala Glu Phe Leu Asp Gly Phe Leu Lys Thr Gln Asn Lys Glu Leu Thr Ala Ala Val Leu Phe Glu Val Pro Glu Glu Val Val Val Gln Arg Leu Thr Ala Arg Arg Ile Cys Pro Lys Cys Gly Arg Ile Tyr Asn Leu Ile Ser Leu Pro Pro Lys Glu Asp Glu Leu Cys Asp Asp Cys Lys Val Lys Leu Val Gln Arg Glu Asp Asp Lys Glu Glu Thr Val Arg His Arg Tyr Lys Val Tyr Leu Glu Lys Thr Gln Pro Val Ile Asp Tyr Tyr Asp Lys Lys Gly Ile Leu Lys Arg Val Asp Gly Thr Ile Gly Ile Asp Asn Val Ile Ala Glu Val Leu Lys Ile Ile Gly Trp Ser Asp Lys 
配列番号３９
atgatggcct atctggtttt tcttggtcca ccgggggcag gcaaaggtac ctatgcgaaa cgtttacagg aaatcaccgg catcccgcac attagcacgg gcgacatttt tcgtgatatt gtcaaaaagg aaaatgacga attaggtaag aaaattaaag aaattatgga gcgcggcgag ttggtgccgg acgaactggt gaatgaagtt gtcaaacgtc ggctgtctga aaaggattgc gaacgtggct ttattttgga cggttacccg cgtacagtag ctcaggcaga gtttctcgac ggcttcctga agactcagaa taaggagtta acggctgcgg tcctgttcga ggtgcctgaa gaggtggtcg ttcagcgtct gaccgcgcgg cgtatctgcc cgaagtgtgg tcgtatttac aacctgattt cacttcctcc aaaagaagat gaactgtgtg atgactgcaa agtaaaactg gtgcaacgcg aagatgataa agaggaaact gtgcgccatc gctacaaagt atatctggaa aaaacccaac cggttatcga ttattatgat aaaaaaggca ttttgaaacg cgttgatggg accatcggca tcgataacgt gattgccgaa gttctcaaaa tcattgggtg gagtgataaa ctgggcggca atcaagaaca agtcagcccg ctgtaa 
配列番号４０
Met Met Ala Tyr Leu Val Phe Leu Gly Pro Pro Gly Ala Gly Lys Gly Thr Tyr Ala Lys Arg Leu Gln Glu Ile Thr Gly Ile Pro His Ile Ser Thr Gly Asp Ile Phe Arg Asp Ile Val Lys Lys Glu Asn Asp Glu Leu Gly Lys Lys Ile Lys Glu Ile Met Glu Arg Gly Glu Leu Val Pro Asp Glu Leu Val Asn Glu Val Val Lys Arg Arg Leu Ser Glu Lys Asp Cys Glu Arg Gly Phe Ile Leu Asp Gly Tyr Pro Arg Thr Val Ala Gln Ala Glu Phe Leu Asp Gly Phe Leu Lys Thr Gln Asn Lys Glu Leu Thr Ala Ala Val Leu Phe Glu Val Pro Glu Glu Val Val Val Gln Arg Leu Thr Ala Arg Arg Ile Cys Pro Lys Cys Gly Arg Ile Tyr Asn Leu Ile Ser Leu Pro Pro Lys Glu Asp Glu Leu Cys Asp Asp Cys Lys Val Lys Leu Val Gln Arg Glu Asp Asp Lys Glu Glu Thr Val Arg His Arg Tyr Lys Val Tyr Leu Glu Lys Thr Gln Pro Val Ile Asp Tyr Tyr Asp Lys Lys Gly Ile Leu Lys Arg Val Asp Gly Thr Ile Gly Ile Asp Asn Val Ile Ala Glu Val Leu Lys Ile Ile Gly Trp Ser Asp Lys Leu Gly Gly Asn Gln Glu Gln Val Ser Pro Leu 
配列番号４１
atgaatcaag aacaagtcag cccgctgggc ggcatcatcg cctatctggt ttttcttggt ccaccggggg caggcaaagg tacctatgcg aaacgtttac aggaaatcac cggcatcccg cacattagca cgggcgacat ttttcgtgat attgtcaaaa aggaaaatga cgaattaggt aagaaaatta aagaaattat ggagcgcggc gagttggtgc cggacgaact ggtgaatgaa gttgtcaaac gtcggctgtc tgaaaaggat tgcgaacgtg gctttatttt ggacggttac ccgcgtacag tagctcaggc agagtttctc gacggcttcc tgaagactca gaataaggag ttaacggctg cggtcctgtt cgaggtgcct gaagaggtgg tcgttcagcg tctgaccgcg cggcgtatct gcccgaagtg tggtcgtatt tacaacctga tttcacttcc tccaaaagaa gatgaactgt gtgatgactg caaagtaaaa ctggtgcaac gcgaagatga taaagaggaa actgtgcgcc atcgctacaa agtatatctg gaaaaaaccc aaccggttat cgattattat gataaaaaag gcattttgaa acgcgttgat gggaccatcg gcatcgataa cgtgattgcc gaagttctca aaatcattgg gtggagtgat aaactgggcg gcaatcaaga acaagtcagc ccgctgtaa 
配列番号４２
Met Asn Gln Glu Gln Val Ser Pro Leu Gly Gly Ile Ile Ala Tyr Leu Val Phe Leu Gly Pro Pro Gly Ala Gly Lys Gly Thr Tyr Ala Lys Arg Leu Gln Glu Ile Thr Gly Ile Pro His Ile Ser Thr Gly Asp Ile Phe Arg Asp Ile Val Lys Lys Glu Asn Asp Glu Leu Gly Lys Lys Ile Lys Glu Ile Met Glu Arg Gly Glu Leu Val Pro Asp Glu Leu Val Asn Glu Val Val Lys Arg Arg Leu Ser Glu Lys Asp Cys Glu Arg Gly Phe Ile Leu Asp Gly Tyr Pro Arg Thr Val Ala Gln Ala Glu Phe Leu Asp Gly Phe Leu Lys Thr Gln Asn Lys Glu Leu Thr Ala Ala Val Leu Phe Glu Val Pro Glu Glu Val Val Val Gln Arg Leu Thr Ala Arg Arg Ile Cys Pro Lys Cys Gly Arg Ile Tyr Asn Leu Ile Ser Leu Pro Pro Lys Glu Asp Glu Leu Cys Asp Asp Cys Lys Val Lys Leu Val Gln Arg Glu Asp Asp Lys Glu Glu Thr Val Arg His Arg Tyr Lys Val Tyr Leu Glu Lys Thr Gln Pro Val Ile Asp Tyr Tyr Asp Lys Lys Gly Ile Leu Lys Arg Val Asp Gly Thr Ile Gly Ile Asp Asn Val Ile Ala Glu Val Leu Lys Ile Ile Gly Trp Ser Asp Lys Leu Gly Gly Asn Gln Glu Gln Val Ser Pro Leu 
配列番号４３
gattcaaacc aaggcaacaa tcagcaaaac taccagcaat acagccagaa cggtaaccaa caacaaggta acaacagata ccaaggttat caagcttaca atgctcaagc ccaacctggg ggtgggtact accaaaatta ccaaggttat tctgggtacc aacaaggtgg ctatcaacag tacaatcccg acgccggtta ccagcaacag tataatcctc aaggaggcta tcaacagtac aatcctcaag gcggttatca gcaccaattc aatccacaag gtggccgtgg aaattacaaa aacttcaact acaataacaa tttgcaagga tatcaagctg gtttccaacc acagtctcaa ggtatgtctt tgaacgactt tcaaaagcaa caaaagcagg ccgctcccaa accaaagaag actttgaagc ttgtctccag ttcctgtatc aagttggcca atgctaccaa gaaggttgac acaaaacctg ccgaatctga taagaaagag gaagagaagt ctgctgaaac caaagaacca actaaagagc caacaaaggt cgaagaacca gttaaaaagg aggagaaacc agtccagact gaagaaaaga cggaggaaaa atcggaactt ccaaaggtag aagaccttaa aatctctgaa tcaacacata ataccaacaa tgccaatgtt accagtgctg atgccttgat caaggaacag gaagaagaag tggatgacga agttgttaac gatatgtttg gtggtaaaga tcacgtttct ttaattttca tgggtcatgt tgatgccggt aaatctacta tgggtggtaa tctactatac ttgactggct ctgtggataa gagaactatt gagaaatatg aaagagaagc caaggatgca ggcagacaag gttggtactt gtcatgggtc atggatacca acaaagaaga aagaaatgat ggtaagacta tcgaagttgg taaggcctac tttgaaactg aaaaaaggcg ttataccata ttggatgctc ctggtcataa aatgtacgtt tccgagatga tcggtggtgc ttctcaagct gatgttggtg ttttggtcat ttccgccaga aagggtgagt acgaaaccgg ttttgagaga ggtggtcaaa ctcgtgaaca cgccctattg gccaagaccc aaggtgttaa taagatggtt gtcgtcgtaa ataagatgga tgacccaacc gttaactggt ctaaggaacg ttacgaccaa tgtgtgagta atgtcagcaa tttcttga 
配列番号４４
Asp Ser Asn Gln Gly Asn Asn Gln Gln Asn Tyr Gln Gln Tyr Ser Gln Asn Gly Asn Gln Gln Gln Gly Asn Asn Arg Tyr Gln Gly Tyr Gln Ala Tyr Asn Ala Gln Ala Gln Pro Gly Gly Gly Tyr Tyr Gln Asn Tyr Gln Gly Tyr Ser Gly Tyr Gln Gln Gly Gly Tyr Gln Gln Tyr Asn Pro Asp Ala Gly Tyr Gln Gln Gln Tyr Asn Pro Gln Gly Gly Tyr Gln Gln Tyr Asn Pro Gln Gly Gly Tyr Gln His Gln Phe Asn Pro Gln Gly Gly Arg Gly Asn Tyr Lys Asn Phe Asn Tyr Asn Asn Asn Leu Gln Gly Tyr Gln Ala Gly Phe Gln Pro Gln Ser Gln Gly Met Ser Leu Asn Asp Phe Gln Lys Gln Gln Lys Gln Ala Ala Pro Lys Pro Lys Lys Thr Leu Lys Leu Val Ser Ser Ser Cys Ile Lys Leu Ala Asn Ala Thr Lys Lys Val Asp Thr Lys Pro Ala Glu Ser Asp Lys Lys Glu Glu Glu Lys Ser Ala Glu Thr Lys Glu Pro Thr Lys Glu Pro Thr Lys Val Glu Glu Pro Val Lys Lys Glu Glu Lys Pro Val Gln Thr Glu Glu Lys Thr Glu Glu Lys Ser Glu Leu Pro Lys Val Glu Asp Leu Lys Ile Ser Glu Ser Thr His Asn Thr Asn Asn Ala Asn Val Thr Ser Ala Asp Ala Leu Ile Lys Glu Gln Glu Glu Glu Val Asp Asp Glu Val Val Asn Asp Met Phe Gly Gly Lys Asp His Val Ser Leu Ile Phe Met Gly His Val Asp Ala Gly Lys Ser Thr Met Gly Gly Asn Leu Leu Tyr Leu Thr Gly Ser Val Asp Lys Arg Thr Ile Glu Lys Tyr Glu Arg Glu Ala Lys Asp Ala Gly Arg Gln Gly Trp Tyr Leu Ser Trp Val Met Asp Thr Asn Lys Glu Glu Arg Asn Asp Gly Lys Thr Ile Glu Val Gly Lys Ala Tyr Phe Glu Thr Glu Lys Arg Arg Tyr Thr Ile Leu Asp Ala Pro Gly His Lys Met Tyr Val Ser Glu Met Ile Gly Gly Ala Ser Gln Ala Asp Val Gly Val Leu Val Ile Ser Ala Arg Lys Gly Glu Tyr Glu Thr Gly Phe Glu Arg Gly Gly Gln Thr Arg Glu His Ala Leu Leu Ala Lys Thr Gln Gly Val Asn Lys Met Val Val Val Val Asn Lys Met Asp Asp Pro Thr Val Asn Trp Ser Lys Glu Arg Tyr Asp Gln Cys Val Ser Asn Val Ser Asn Phe Leu 
配列番号４５
atggactcta accagggtaa caaccagcag aactaccagc agtactctca gaacggtaac cagcagcagg gtaacaaccg ttaccagggt taccaggctt acaacgctca ggctcagccg ggtggtggtt actaccagaa ctaccagggt tactccggat atcaacaggg tggttaccaa caatataatc cagacgctgg ttaccagcag cagtacaacc cgcagggtgg ttaccagcag tacaacccgc aaggcggata tcaacaccag ttcaatccgc agggtggtcg tggtaactac aaaaacttca actacaacaa caacctgcag ggttaccagg ctggttaa 
配列番号４６
Met Asp Ser Asn Gln Gly Asn Asn Gln Gln Asn Tyr Gln Gln Tyr Ser Gln Asn Gly Asn Gln Gln Gln Gly Asn Asn Arg Tyr Gln Gly Tyr Gln Ala Tyr Asn Ala Gln Ala Gln Pro Gly Gly Gly Tyr Tyr Gln Asn Tyr Gln Gly Tyr Ser Gly Tyr Gln Gln Gly Gly Tyr Gln Gln Tyr Asn Pro Asp Ala Gly Tyr Gln Gln Gln Tyr Asn Pro Gln Gly Gly Tyr Gln Gln Tyr Asn Pro Gln Gly Gly Tyr Gln His Gln Phe Asn Pro Gln Gly Gly Arg Gly Asn Tyr Lys Asn Phe Asn Tyr Asn Asn Asn Leu Gln Gly Tyr Gln Ala Gly 
配列番号４７
atggactcta accagggtaa caaccagcag aactaccagc agtactctca gaacggtaac cagcagcagg gtaacaaccg ttaccagggt taccaggctt acaacgctca ggctcagccg ggtggtggtt actaccagaa ctaccagggt tactccggtt atcagcaagg tggctaccaa caatataatc cagacgctgg ctatcaacag caatataatc ctcagggtgg ttaccagcag tacaacccgc aaggcggtta tcaacaccag ttcaatccgc agggtggtcg tggtaactac aaaaacttca actacaacaa caacctgcag ggttaccagg ctggaattat gaagatcggc attgtgaccg gcattccggg cgttggcaaa agcaccgttc tggcaaaggt gaaggagatc ctggacaacc agggcattaa taacaaaatt attaattatg gtgattttat gctggcgacc gcgctgaagc tgggctacgc aaaagatcgt gacgaaatgc gcaaactgag cgtggaaaaa cagaagaagc tgcagattga tgcggcgaag ggcattgcgg aagaggcacg cgcgggcggc gaaggctacc tgtttatcga tacccatgcg gtgatccgca ccccgagcgg ttatctgccg ggcctgccgt cttacgtgat tacggaaatc aacccgagcg ttatttttct gctggaggca gatccgaaga ttattctgag ccgccagaag cgcgatacca cccgcaaccg caacgattat agcgacgaaa gcgttatcct ggagaccatc aactttgcgc gctatgcggc aaccgcgagc gcggttctgg caggctctac cgttaaagtg atcgtgaacg tggagggtga tccaagcatc gcggcgaacg aaatcattcg cagcatgaaa taagtcgacg c 
配列番号４８
Met Asp Ser Asn Gln Gly Asn Asn Gln Gln Asn Tyr Gln Gln Tyr Ser Gln Asn Gly Asn Gln Gln Gln Gly Asn Asn Arg Tyr Gln Gly Tyr Gln Ala Tyr Asn Ala Gln Ala Gln Pro Gly Gly Gly Tyr Tyr Gln Asn Tyr Gln Gly Tyr Ser Gly Tyr Gln Gln Gly Gly Tyr Gln Gln Tyr Asn Pro Asp Ala Gly Tyr Gln Gln Gln Tyr Asn Pro Gln Gly Gly Tyr Gln Gln Tyr Asn Pro Gln Gly Gly Tyr Gln His Gln Phe Asn Pro Gln Gly Gly Arg Gly Asn Tyr Lys Asn Phe Asn Tyr Asn Asn Asn Leu Gln Gly Tyr Gln Ala Gly Ile Met Lys Ile Gly Ile Val Thr Gly Ile Pro Gly Val Gly Lys Ser Thr Val Leu Ala Lys Val Lys Glu Ile Leu Asp Asn Gln Gly Ile Asn Asn Lys Ile Ile Asn Tyr Gly Asp Phe Met Leu Ala Thr Ala Leu Lys Leu Gly Tyr Ala Lys Asp Arg Asp Glu Met Arg Lys Leu Ser Val Glu Lys Gln Lys Lys Leu Gln Ile Asp Ala Ala Lys Gly Ile Ala Glu Glu Ala Arg Ala Gly Gly Glu Gly Tyr Leu Phe Ile Asp Thr His Ala Val Ile Arg Thr Pro Ser Gly Tyr Leu Pro Gly Leu Pro Ser Tyr Val Ile Thr Glu Ile Asn Pro Ser Val Ile Phe Leu Leu Glu Ala Asp Pro Lys Ile Ile Leu Ser Arg Gln Lys Arg Asp Thr Thr Arg Asn Arg Asn Asp Tyr Ser Asp Glu Ser Val Ile Leu Glu Thr Ile Asn Phe Ala Arg Tyr Ala Ala Thr Ala Ser Ala Val Leu Ala Gly Ser Thr Val Lys Val Ile Val Asn Val Glu Gly Asp Pro Ser Ile Ala Ala Asn Glu Ile Ile Arg Ser Met Lys 
配列番号４９
atgaagatcg gcattgtgac cggcattccg ggcgttggca aaagcaccgt tctggcaaag gtgaaggaga tcctggacaa ccagggcatt aataacaaaa ttattaatta tggtgatttt atgctggcga ccgcgctgaa gctgggctac gcaaaagatc gtgacgaaat gcgcaaactg agcgtggaaa aacagaagaa gctgcagatt gatgcggcga agggcattgc ggaagaggca cgcgcgggcg gcgaaggcta cctgtttatc gatacccatg cggtgatccg caccccgagc ggttatctgc cgggcctgcc gtcttacgtg attacggaaa tcaacccgag cgttattttt ctgctggagg cagatccgaa gattattctg agccgccaga agcgcgatac cacccgcaac cgcaacgatt atagcgacga aagcgttatc ctggagacca tcaactttgc gcgctatgcg gcaaccgcga gcgcggttct ggcaggctct accgttaaag tgatcgtgaa cgtggagggt gatccaagca tcgcggcgaa cgaaatcatt cgcagcatga aacagtcgag tatggactct aaccagggta acaaccagca gaactaccag cagtactctc agaacggtaa ccagcagcag ggtaacaacc gttaccaggg ttaccaggct tacaacgctc aggctcagcc gggtggtggt tactaccaga actaccaggg ttactccggt tatcagcaag gtggctacca acaatataat ccagacgctg gctatcaaca gcaatataat cctcagggtg gttaccagca gtacaacccg caaggcggtt atcaacacca gttcaatccg cagggtggtc gtggtaacta caaaaacttc aactacaaca acaacctgca gggttaccag gctggttaag tcgacgc 
配列番号５０
Met Lys Ile Gly Ile Val Thr Gly Ile Pro Gly Val Gly Lys Ser Thr Val Leu Ala Lys Val Lys Glu Ile Leu Asp Asn Gln Gly Ile Asn Asn Lys Ile Ile Asn Tyr Gly Asp Phe Met Leu Ala Thr Ala Leu Lys Leu Gly Tyr Ala Lys Asp Arg Asp Glu Met Arg Lys Leu Ser Val Glu Lys Gln Lys Lys Leu Gln Ile Asp Ala Ala Lys Gly Ile Ala Glu Glu Ala Arg Ala Gly Gly Glu Gly Tyr Leu Phe Ile Asp Thr His Ala Val Ile Arg Thr Pro Ser Gly Tyr Leu Pro Gly Leu Pro Ser Tyr Val Ile Thr Glu Ile Asn Pro Ser Val Ile Phe Leu Leu Glu Ala Asp Pro Lys Ile Ile Leu Ser Arg Gln Lys Arg Asp Thr Thr Arg Asn Arg Asn Asp Tyr Ser Asp Glu Ser Val Ile Leu Glu Thr Ile Asn Phe Ala Arg Tyr Ala Ala Thr Ala Ser Ala Val Leu Ala Gly Ser Thr Val Lys Val Ile Val Asn Val Glu Gly Asp Pro Ser Ile Ala Ala Asn Glu Ile Ile Arg Ser Met Lys Gln Ser Ser Met Asp Ser Asn Gln Gly Asn Asn Gln Gln Asn Tyr Gln Gln Tyr Ser Gln Asn Gly Asn Gln Gln Gln Gly Asn Asn Arg Tyr Gln Gly Tyr Gln Ala Tyr Asn Ala Gln Ala Gln Pro Gly Gly Gly Tyr Tyr Gln Asn Tyr Gln Gly Tyr Ser Gly Tyr Gln Gln Gly Gly Tyr Gln Gln Tyr Asn Pro Asp Ala Gly Tyr Gln Gln Gln Tyr Asn Pro Gln Gly Gly Tyr Gln Gln Tyr Asn Pro Gln Gly Gly Tyr Gln His Gln Phe Asn Pro Gln Gly Gly Arg Gly Asn Tyr Lys Asn Phe Asn Tyr Asn Asn Asn Leu Gln Gly Tyr Gln Ala Gly 
配列番号５１
atggactcta accagggtaa caaccagcag aactaccagc agtactctca gaacggtaac cagcagcagg gtaacaaccg ttaccagggt taccaggctt acaacgctca ggctcagccg ggtggtggtt actaccagaa ctaccagggt tactccggtt atcagcaagg tggctaccaa caatataatc cagacgctgg ctatcaacag caatataatc ctcagggtgg ttaccagcag tacaacccgc aaggcggtta tcaacaccag ttcaatccgc agggtggtcg tggtaactac aaaaacttca actacaacaa caacctgcag ggttaccagg ctggaattat gatggcctat ctggtttttc ttggtccacc gggggcaggc aaaggtacct atgcgaaacg tttacaggaa atcaccggca tcccgcacat tagcacgggc gacatttttc gtgatattgt caaaaaggaa aatgacgaat taggtaagaa aattaaagaa attatggagc gcggcgagtt ggtgccggac gaactggtga atgaagttgt caaacgtcgg ctgtctgaaa aggattgcga acgtggcttt attttggacg gttacccgcg tacagtagct caggcagagt ttctcgacgg cttcctgaag actcagaata aggagttaac ggctgcggtc ctgttcgagg tgcctgaaga ggtggtcgtt cagcgtctga ccgcgcggcg tatctgcccg aagtgtggtc gtatttacaa cctgatttca cttcctccaa aagaagatga actgtgtgat gactgcaaag taaaactggt gcaacgcgaa gatgataaag aggaaactgt gcgccatcgc tacaaagtat atctggaaaa aacccaaccg gttatcgatt attatgataa aaaaggcatt ttgaaacgcg ttgatgggac catcggcatc gataacgtga ttgccgaagt tctcaaaatc attgggtgga gtgataaata g 
配列番号５２
Met Asp Ser Asn Gln Gly Asn Asn Gln Gln Asn Tyr Gln Gln Tyr Ser Gln Asn Gly Asn Gln Gln Gln Gly Asn Asn Arg Tyr Gln Gly Tyr Gln Ala Tyr Asn Ala Gln Ala Gln Pro Gly Gly Gly Tyr Tyr Gln Asn Tyr Gln Gly Tyr Ser Gly Tyr Gln Gln Gly Gly Tyr Gln Gln Tyr Asn Pro Asp Ala Gly Tyr Gln Gln Gln Tyr Asn Pro Gln Gly Gly Tyr Gln Gln Tyr Asn Pro Gln Gly Gly Tyr Gln His Gln Phe Asn Pro Gln Gly Gly Arg Gly Asn Tyr Lys Asn Phe Asn Tyr Asn Asn Asn Leu Gln Gly Tyr Gln Ala Gly Ile Met Met Ala Tyr Leu Val Phe Leu Gly Pro Pro Gly Ala Gly Lys Gly Thr Tyr Ala Lys Arg Leu Gln Glu Ile Thr Gly Ile Pro His Ile Ser Thr Gly Asp Ile Phe Arg Asp Ile Val Lys Lys Glu Asn Asp Glu Leu Gly Lys Lys Ile Lys Glu Ile Met Glu Arg Gly Glu Leu Val Pro Asp Glu Leu Val Asn Glu Val Val Lys Arg Arg Leu Ser Glu Lys Asp Cys Glu Arg Gly Phe Ile Leu Asp Gly Tyr Pro Arg Thr Val Ala Gln Ala Glu Phe Leu Asp Gly Phe Leu Lys Thr Gln Asn Lys Glu Leu Thr Ala Ala Val Leu Phe Glu Val Pro Glu Glu Val Val Val Gln Arg Leu Thr Ala Arg Arg Ile Cys Pro Lys Cys Gly Arg Ile Tyr Asn Leu Ile Ser Leu Pro Pro Lys Glu Asp Glu Leu Cys Asp Asp Cys Lys Val Lys Leu Val Gln Arg Glu Asp Asp Lys Glu Glu Thr Val Arg His Arg Tyr Lys Val Tyr Leu Glu Lys Thr Gln Pro Val Ile Asp Tyr Tyr Asp Lys Lys Gly Ile Leu Lys Arg Val Asp Gly Thr Ile Gly Ile Asp Asn Val Ile Ala Glu Val Leu Lys Ile Ile Gly Trp Ser Asp Lys 
配列番号５３
Ala Thr Gly Ala Thr Gly Gly Cys Cys Thr Ala Thr Cys Thr Gly Gly Thr Thr Thr Thr Thr Cys Thr Thr Gly Gly Thr Cys Cys Ala Cys Cys Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Gly Gly Cys Ala Ala Ala Gly Gly Thr Ala Cys Cys Thr Ala Thr Gly Cys Gly Ala Ala Ala Cys Gly Thr Thr Thr Ala Cys Ala Gly Gly Ala Ala Ala Thr Cys Ala Cys Cys Gly Gly Cys Ala Thr Cys Cys Cys Gly Cys Ala Cys Ala Thr Thr Ala Gly Cys Ala Cys Gly Gly Gly Cys Gly Ala Cys Ala Thr Thr Thr Thr Thr Cys Gly Thr Gly Ala Thr Ala Thr Thr Gly Thr Cys Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Ala Ala Ala Thr Gly Ala Cys Gly Ala Ala Thr Thr Ala Gly Gly Thr Ala Ala Gly Ala Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ala Ala Gly Ala Ala Ala Thr Thr Ala Thr Gly Gly Ala Gly Cys Gly Cys Gly Gly Cys Gly Ala Gly Thr Thr Gly Gly Thr Gly Cys Cys Gly Gly Ala Cys Gly Ala Ala Cys Thr Gly Gly Thr Gly Ala Ala Thr Gly Ala Ala Gly Thr Thr Gly Thr Cys Ala Ala Ala Cys Gly Thr Cys Gly Gly Cys Thr Gly Thr Cys Thr Gly Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Thr Thr Gly Cys Gly Ala Ala Cys Gly Thr Gly Gly Cys Thr Thr Thr Ala Thr Thr Thr Thr Gly Gly Ala Cys Gly Gly Thr Thr Ala Cys Cys Cys Gly Cys Gly Thr Ala Cys Ala Gly Thr Ala Gly Cys Thr Cys Ala Gly Gly Cys Ala Gly Ala Gly Thr Thr Thr Cys Thr Cys Gly Ala Cys Gly Gly Cys Thr Thr Cys Cys Thr Gly Ala Ala Gly Ala Cys Thr Cys Ala Gly Ala Ala Thr Ala Ala Gly Gly Ala Gly Thr Thr Ala Ala Cys Gly Gly Cys Thr Gly Cys Gly Gly Thr Cys Cys Thr Gly Thr Thr Cys Gly Ala Gly Gly Thr Gly Cys Cys Thr Gly Ala Ala Gly Ala Gly Gly Thr Gly Gly Thr Cys Gly Thr Thr Cys Ala Gly Cys Gly Thr Cys Thr Gly Ala Cys Cys Gly Cys Gly Cys Gly Gly Cys Gly Thr Ala Thr Cys Thr Gly Cys Cys Cys Gly Ala Ala Gly Thr Gly Thr Gly Gly Thr Cys Gly Thr Ala Thr Thr Thr Ala Cys Ala Ala Cys Cys Thr Gly Ala Thr Thr Thr Cys Ala Cys Thr Thr Cys Cys Thr Cys Cys Ala Ala Ala Ala Gly Ala Ala Gly Ala Thr Gly Ala Ala Cys Thr Gly Thr Gly Thr Gly Ala Thr Gly Ala Cys Thr Gly Cys Ala Ala Ala Gly Thr Ala Ala Ala Ala Cys Thr Gly Gly Thr Gly Cys Ala Ala Cys Gly Cys Gly Ala Ala Gly Ala Thr Gly Ala Thr Ala Ala Ala Gly Ala Gly Gly Ala Ala Ala Cys Thr Gly Thr Gly Cys Gly Cys Cys Ala Thr Cys Gly Cys Thr Ala Cys Ala Ala Ala Gly Thr Ala Thr Ala Thr Cys Thr Gly Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Cys Cys Cys Ala Ala Cys Cys Gly Gly Thr Thr Ala Thr Cys Gly Ala Thr Thr Ala Thr Thr Ala Thr Gly Ala Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Cys Ala Thr Thr Thr Thr Gly Ala Ala Ala Cys Gly Cys Gly Thr Thr Gly Ala Thr Gly Gly Gly Ala Cys Cys Ala Thr Cys Gly Gly Cys Ala Thr Cys Gly Ala Thr Ala Ala Cys Gly Thr Gly Ala Thr Thr Gly Cys Cys Gly Ala Ala Gly Thr Thr Cys Thr Cys Ala Ala Ala Ala Thr Cys Ala Thr Thr Gly Gly Gly Thr Gly Gly Ala Gly Thr Gly Ala Thr Ala Ala Ala Cys Thr Gly Thr Cys Gly Ala Gly Thr Ala Thr Gly Gly Ala Cys Thr Cys Thr Ala Ala Cys Cys Ala Gly Gly Gly Thr Ala Ala Cys Ala Ala Cys Cys Ala Gly Cys Ala Gly Ala Ala Cys Thr Ala Cys Cys Ala Gly Cys Ala Gly Thr Ala Cys Thr Cys Thr Cys Ala Gly Ala Ala Cys Gly Gly Thr Ala Ala Cys Cys Ala Gly Cys Ala Gly Cys Ala Gly Gly Gly Thr Ala Ala Cys Ala Ala Cys Cys Gly Thr Thr Ala Cys Cys Ala Gly Gly Gly Thr Thr Ala Cys Cys Ala Gly Gly Cys Thr Thr Ala Cys Ala Ala Cys Gly Cys Thr Cys Ala Gly Gly Cys Thr Cys Ala Gly Cys Cys Gly Gly Gly Thr Gly Gly Thr Gly Gly Thr Thr Ala Cys Thr Ala Cys Cys Ala Gly Ala Ala Cys Thr Ala Cys Cys Ala Gly Gly Gly Thr Thr Ala Cys Thr Cys Cys Gly Gly Thr Thr Ala Thr Cys Ala Gly Cys Ala Ala Gly Gly Thr Gly Gly Cys Thr Ala Cys Cys Ala Ala Cys Ala Ala Thr Ala Thr Ala Ala Thr Cys Cys Ala Gly Ala Cys Gly Cys Thr Gly Gly Cys Thr Ala Thr Cys Ala Ala Cys Ala Gly Cys Ala Ala Thr Ala Thr Ala Ala Thr Cys Cys Thr Cys Ala Gly Gly Gly Thr Gly Gly Thr Thr Ala Cys Cys Ala Gly Cys Ala Gly Thr Ala Cys Ala Ala Cys Cys Cys Gly Cys Ala Ala Gly Gly Cys Gly Gly Thr Thr Ala Thr Cys Ala Ala Cys Ala Cys Cys Ala Gly Thr Thr Cys Ala Ala Thr Cys Cys Gly Cys Ala Gly Gly Gly Thr Gly Gly Thr Cys Gly Thr Gly Gly Thr Ala Ala Cys Thr Ala Cys Ala Ala Ala Ala Ala Cys Thr Thr Cys Ala Ala Cys Thr Ala Cys Ala Ala Cys Ala Ala Cys Ala Ala Cys Cys Thr Gly Cys Ala Gly Gly Gly Thr Thr Ala Cys Cys Ala Gly Gly Cys Thr Gly Gly Thr Thr Ala Ala Gly Thr Cys Gly Ala Cys Gly Cys 
配列番号５４
Met Met Ala Tyr Leu Val Phe Leu Gly Pro Pro Gly Ala Gly Lys Gly Thr Tyr Ala Lys Arg Leu Gln Glu Ile Thr Gly Ile Pro His Ile Ser Thr Gly Asp Ile Phe Arg Asp Ile Val Lys Lys Glu Asn Asp Glu Leu Gly Lys Lys Ile Lys Glu Ile Met Glu Arg Gly Glu Leu Val Pro Asp Glu Leu Val Asn Glu Val Val Lys Arg Arg Leu Ser Glu Lys Asp Cys Glu Arg Gly Phe Ile Leu Asp Gly Tyr Pro Arg Thr Val Ala Gln Ala Glu Phe Leu Asp Gly Phe Leu Lys Thr Gln Asn Lys Glu Leu Thr Ala Ala Val Leu Phe Glu Val Pro Glu Glu Val Val Val Gln Arg Leu Thr Ala Arg Arg Ile Cys Pro Lys Cys Gly Arg Ile Tyr Asn Leu Ile Ser Leu Pro Pro Lys Glu Asp Glu Leu Cys Asp Asp Cys Lys Val Lys Leu Val Gln Arg Glu Asp Asp Lys Glu Glu Thr Val Arg His Arg Tyr Lys Val Tyr Leu Glu Lys Thr Gln Pro Val Ile Asp Tyr Tyr Asp Lys Lys Gly Ile Leu Lys Arg Val Asp Gly Thr Ile Gly Ile Asp Asn Val Ile Ala Glu Val Leu Lys Ile Ile Gly Trp Ser Asp Lys Leu Ser Ser Met Asp Ser Asn Gln Gly Asn Asn Gln Gln Asn Tyr Gln Gln Tyr Ser Gln Asn Gly Asn Gln Gln Gln Gly Asn Asn Arg Tyr Gln Gly Tyr Gln Ala Tyr Asn Ala Gln Ala Gln Pro Gly Gly Gly Tyr Tyr Gln Asn Tyr Gln Gly Tyr Ser Gly Tyr Gln Gln Gly Gly Tyr Gln Gln Tyr Asn Pro Asp Ala Gly Tyr Gln Gln Gln Tyr Asn Pro Gln Gly Gly Tyr Gln Gln Tyr Asn Pro Gln Gly Gly Tyr Gln His Gln Phe Asn Pro Gln Gly Gly Arg Gly Asn Tyr Lys Asn Phe Asn Tyr Asn Asn Asn Leu Gln Gly Tyr Gln Ala Gly 
配列番号５５
ggtaacaacc agcagaacta c 
配列番号５６
Gly Asn Asn Gln Gln Asn Tyr 
配列番号５７
atgatgatgg cgtctaagga cgctacatca agcgtggatg gcgctagtgg cgctggtcag ttggtaccgg aggttaatgc ttctgaccct cttgcaatgg atcctgtagc aggttcttcg acagcagtcg cgactgctgg acaagttaat cctattgatc cctggataat taataatttt gtgcaagccc cccaaggtga atttactatt tccccaaata atacccccgg tgatgttttg tttgatttga gtttgggtcc ccatcttaat cctttcttgc tccatctatc acaaatgtat aatggttggg ttggtaacat gagagtcagg attatgctag ctggtaatgc ctttactgcg gggaagataa tagtttcctg cataccccct ggttttggtt cacataatct tactatagca caagcaactc tctttccaca tgtgattgct gatgttagga ctctagaccc cattgaggtg cctttggaag atgttaggaa tgttctcttt cataataatg atagaaatca acaaaccatg cgccttgtgt gcatgctgta cacccccctc cgcactggtg gtggtactgg tgattctttt gtagttgcag ggcgagttat gacttgcccc agtcctgatt ttaatttctt gtttttagtc cctcctacgg tggagcagaa aaccaggccc ttcacactcc caaatctgcc attgagttct ctgtctaact cacgtgcccc tctcccaatc agtagtatgg gcatttcccc agacaatgtc cagagtgtgc agttccaaaa tggtcggtgt actctggatg gccgcctggt tggcaccacc ccagtttcat tgtcacatgt tgccaagata agagggacct ccaatggcac tgtaatcaac cttactgaat tggatggcac accctttcac ccttttgagg gccctgcccc cattgggttt ccagacctcg gtggttgtga ttggcatatc aatatgacac agtttggcca ttctagccag acccagtatg atgtagacac cacccctgac acttttgtcc cccatcttgg ttcaattcag gcaaatggca ttggcagtgg taattatgtt ggtgttctta gctggatttc ccccccatca cacccgtctg gctcccaagt tgacctttgg aagatcccca attatgggtc aagtattacg gaggcaacac atctagcccc ttctgtatac ccccctggtt tcggagaggt attggtcttt ttcatgtcaa aaatgccagg tcctggtgct tataatttgc cctgtctatt accacaagag tacatttcac atcttgctag tgaacaagcc cctactgtag gtgaggctgc cctgctccac tatgttgacc ctgataccgg tcggaatctt ggggaattca aagcataccc tgatggtttc ctcacttgtg tccccaatgg ggctagctcg ggtccacaac agctgccgat caatggggtc tttgtctttg tttcatgggt gtccagattt tatcaattaa agcctgtggg aactgccagc tcggcaagag gtaggcttgg tctgcgccga taa 
配列番号５８
Met Met Met Ala Ser Lys Asp Ala Thr Ser Ser Val Asp Gly Ala Ser Gly Ala Gly Gln Leu Val Pro Glu Val Asn Ala Ser Asp Pro Leu Ala Met Asp Pro Val Ala Gly Ser Ser Thr Ala Val Ala Thr Ala Gly Gln Val Asn Pro Ile Asp Pro Trp Ile Ile Asn Asn Phe Val Gln Ala Pro Gln Gly Glu Phe Thr Ile Ser Pro Asn Asn Thr Pro Gly Asp Val Leu Phe Asp Leu Ser Leu Gly Pro His Leu Asn Pro Phe Leu Leu His Leu Ser Gln Met Tyr Asn Gly Trp Val Gly Asn Met Arg Val Arg Ile Met Leu Ala Gly Asn Ala Phe Thr Ala Gly Lys Ile Ile Val Ser Cys Ile Pro Pro Gly Phe Gly Ser His Asn Leu Thr Ile Ala Gln Ala Thr Leu Phe Pro His Val Ile Ala Asp Val Arg Thr Leu Asp Pro Ile Glu Val Pro Leu Glu Asp Val Arg Asn Val Leu Phe His Asn Asn Asp Arg Asn Gln Gln Thr Met Arg Leu Val Cys Met Leu Tyr Thr Pro Leu Arg Thr Gly Gly Gly Thr Gly Asp Ser Phe Val Val Ala Gly Arg Val Met Thr Cys Pro Ser Pro Asp Phe Asn Phe Leu Phe Leu Val Pro Pro Thr Val Glu Gln Lys Thr Arg Pro Phe Thr Leu Pro Asn Leu Pro Leu Ser Ser Leu Ser Asn Ser Arg Ala Pro Leu Pro Ile Ser Ser Met Gly Ile Ser Pro Asp Asn Val Gln Ser Val Gln Phe Gln Asn Gly Arg Cys Thr Leu Asp Gly Arg Leu Val Gly Thr Thr Pro Val Ser Leu Ser His Val Ala Lys Ile Arg Gly Thr Ser Asn Gly Thr Val Ile Asn Leu Thr Glu Leu Asp Gly Thr Pro Phe His Pro Phe Glu Gly Pro Ala Pro Ile Gly Phe Pro Asp Leu Gly Gly Cys Asp Trp His Ile Asn Met Thr Gln Phe Gly His Ser Ser Gln Thr Gln Tyr Asp Val Asp Thr Thr Pro Asp Thr Phe Val Pro His Leu Gly Ser Ile Gln Ala Asn Gly Ile Gly Ser Gly Asn Tyr Val Gly Val Leu Ser Trp Ile Ser Pro Pro Ser His Pro Ser Gly Ser Gln Val Asp Leu Trp Lys Ile Pro Asn Tyr Gly Ser Ser Ile Thr Glu Ala Thr His Leu Ala Pro Ser Val Tyr Pro Pro Gly Phe Gly Glu Val Leu Val Phe Phe Met Ser Lys Met Pro Gly Pro Gly Ala Tyr Asn Leu Pro Cys Leu Leu Pro Gln Glu Tyr Ile Ser His Leu Ala Ser Glu Gln Ala Pro Thr Val Gly Glu Ala Ala Leu Leu His Tyr Val Asp Pro Asp Thr Gly Arg Asn Leu Gly Glu Phe Lys Ala Tyr Pro Asp Gly Phe Leu Thr Cys Val Pro Asn Gly Ala Ser Ser Gly Pro Gln Gln Leu Pro Ile Asn Gly Val Phe Val Phe Val Ser Trp Val Ser Arg Phe Tyr Gln Leu Lys Pro Val Gly Thr Ala Ser Ser Ala Arg Gly Arg Leu Gly Leu Arg Arg 
配列番号５９
atgatgatgg cttctaaaga cgctacctct tctgttgacg gtgcttctgg tgctggtcag ctggttccgg aagttaacgc ttctgacccg ctggctatgg acccggttgc tggttcttct accgctgttg ctaccgctgg tcaggttaac ccgatcgacc cgtggatcat caacaacttc gttcaggctc cgcagggtga attcaccatc tctccgaaca acaccccggg tgacgttctg ttcgacctgt ctctgggtcc gcacctgaac ccgttcctgc tgcacctgtc tcagatgtac aacggttggg ttggtaacat gcgtgttcgt atcatgctgg ctggtaacgc tttcaccgct ggtaaaatca tcgtttcttg catcccgccg ggtttcggtt ctcacaacct gaccatcgct caggctaccc tgttcccgca cgttatcgct gacgttcgta ccctggaccc gatcgaagtt ccgctggaag acgttcgtaa cgttctgttc cacaacaacg accgtaacca gcagaccatg cgtctggttt gcatgctgta caccccgctg cgtaccggtg gtggtaccgg tgactctttc gttgttgctg gtcgtgttat gacctgcccg tctccggact tcaacttcct gttcctggtt ccgccgaccg ttgaacagaa aacccgtccg ttcaccctgc cgaacctgcc gctgtcttct ctgtctaact ctcgtgctcc gctgccgatc tcttctatgg gtatctctcc ggacaacgtt cagtctgttc agttccagaa cggtcgttgc accctggacg gtcgtctggt tggtaccacc ccggtttctc tgtctcacgt tgctaaaatc cgtggtacct ctaacggtac cgttatcaac ctgaccgaac tggacggtac cccgttccac ccgttcgaag gtccggctcc gatcggtttc ccggacctgg gtggttgcga ctggcacatc aacatgaccc agttcggtca ctcttctcag acccagtacg acgttgacac caccccggac accttcgttc cgcacctggg ttctatccag gctaacggta tcggttctgg taactacgtt ggtgttctgt cttggatctc tccgccgtct cacccgtctg gttctcaggt tgacctgtgg aaaatcccga actacggttc ttctatcacc gaagctaccc acctggctcc gtctgtttac ccgccgggtt tcggtgaagt tctggttttc ttcatgtcta aaatgccggg tccgggtgct tacaacctgc cgtgcctgct gccgcaggaa tacatctctc acctggcttc tgaacaggct ccgaccgttg gtgaagctgc tctgctgcac tacgttgacc cggacaccgg tcgtaacctg ggtgaattca aagcttaccc ggacggtttc ctgacctgcg ttccgaacgg tgcttcttct ggtccgcagc agctgccgat caacggtgtt ttcgttttcg tttcttgggt ttctcgtttc taccagctga aaccggttgg taccgcttct tctgctcgtg gtcgtctggg tctgcgtcgt tag 
配列番号６０
atgatgatgg cttctaaaga cgctacctct tctgttgacg gtgcttctgg tgctggtcag ctggttccgg aagttaacgc ttctgacccg ctggctatgg acccggttgc tggttcttct accgctgttg ctaccgctgg tcaggttaac ccgatcgacc cgtggatcat caacaacttc gttcaggctc cgcagggtga attcaccatc tctccgaaca acaccccggg tgacgttctg ttcgacctgt ctctgggtcc gcacctgaac ccgttcctgc tgcacctgtc tcagatgtac aacggttggg ttggtaacat gcgtgttcgt atcatgctgg ctggtaacgc tttcaccgct ggtaaaatca tcgtttcttg catcccgccg ggtttcggtt ctcacaacct gaccatcgct caggctaccc tgttcccgca cgttatcgct gacgttcgta ccctggaccc gatcgaagtt ccgctggaag acgttcgtaa cgttctgttc cacaacaacg accgtaacca gcagaccatg cgtctggttt gcatgctgta caccccgctg cgtaccggtg gtggtaccgg tgactctttc gttgttgctg gtcgtgttat gacctgcccg tctccggact tcaacttcct gttcctggtt ccgccgaccg ttgaacagaa aacccgtccg ttcaccctgc cgaacctgcc gctgtcttct ctgtctaact ctcgtgctcc gctgccgatc tcttctatgg gtatctctcc ggacaacgtt cagtctgttc agttccagaa cggtcgttgc accctggacg gtcgtctggt tggtaccacc ccggtttctc tgtctcacgt tgctaaaatc cgtggtacct ctaacggtac cgttatcaac ctgaccgaac tggacggtac cccgttccac ccgttcgaag gtccggctcc gatcggtttc ccggacctgg gtggttgcga ctggcacatc aacatgaccc agttcggtca ctcttctcag acccagtacg acgttgacac caccccggac accttcgttc cgcacctggg ttctatccag gctaacggta tcggttctgg taactacgtt ggtgttctgt cttggatctc tccgccgtct cacccgtctg gttctcaggt tgacctgtgg aaaatcccga actacggttc ttctatcacc gaagctaccc acctggctcc gtctgtttac ccgccgggtt tcggtgaagt tctggttttc ttcatgtcta aaatgccggg tccgggtgct tacaacctgc cgtgcctgct gccgcaggaa tacatctctc acctggcttc tgaacaggct ccgaccgttg gtgaagctgc tctgctgcac tacgttgacc cggacaccgg tcgtaacctg ggtgaattca aagcttaccc ggacggtttc ctgacctgcg ttccgaacgg tgcttcttct ggtccgcagc agctgccgat caacggtgtt ttcgttttcg tttcttgggt ttctcgtttc taccagctga aaccggttgg taccgcttct tctgctcgtg gtcgtctggg tctgcgtcgt atgatggcct atctggtttt tcttggtcca ccgggggcag gcaaaggtac ctatgcgaaa cgtttacagg aaatcaccgg catcccgcac attagcacgg gcgacatttt tcgtgatatt gtcaaaaagg aaaatgacga attaggtaag aaaattaaag aaattatgga gcgcggcgag ttggtgccgg acgaactggt gaatgaagtt gtcaaacgtc ggctgtctga aaaggattgc gaacgtggct ttattttgga cggttacccg cgtacagtag ctcaggcaga gtttctcgac ggcttcctga agactcagaa taaggagtta acggctgcgg tcctgttcga ggtgcctgaa gaggtggtcg ttcagcgtct gaccgcgcgg cgtatctgcc cgaagtgtgg tcgtatttac aacctgattt cacttcctcc aaaagaagat gaactgtgtg atgactgcaa agtaaaactg gtgcaacgcg aagatgataa agaggaaact gtgcgccatc gctacaaagt atatctggaa aaaacccaac cggttatcga ttattatgat aaaaaaggca ttttgaaacg cgttgatggg accatcggca tcgataacgt gattgccgaa gttctcaaaa tcattgggtg gagtgataaa 
配列番号６１
Met Met Met Ala Ser Lys Asp Ala Thr Ser Ser Val Asp Gly Ala Ser Gly Ala Gly Gln Leu Val Pro Glu Val Asn Ala Ser Asp Pro Leu Ala Met Asp Pro Val Ala Gly Ser Ser Thr Ala Val Ala Thr Ala Gly Gln Val Asn Pro Ile Asp Pro Trp Ile Ile Asn Asn Phe Val Gln Ala Pro Gln Gly Glu Phe Thr Ile Ser Pro Asn Asn Thr Pro Gly Asp Val Leu Phe Asp Leu Ser Leu Gly Pro His Leu Asn Pro Phe Leu Leu His Leu Ser Gln Met Tyr Asn Gly Trp Val Gly Asn Met Arg Val Arg Ile Met Leu Ala Gly Asn Ala Phe Thr Ala Gly Lys Ile Ile Val Ser Cys Ile Pro Pro Gly Phe Gly Ser His Asn Leu Thr Ile Ala Gln Ala Thr Leu Phe Pro His Val Ile Ala Asp Val Arg Thr Leu Asp Pro Ile Glu Val Pro Leu Glu Asp Val Arg Asn Val Leu Phe His Asn Asn Asp Arg Asn Gln Gln Thr Met Arg Leu Val Cys Met Leu Tyr Thr Pro Leu Arg Thr Gly Gly Gly Thr Gly Asp Ser Phe Val Val Ala Gly Arg Val Met Thr Cys Pro Ser Pro Asp Phe Asn Phe Leu Phe Leu Val Pro Pro Thr Val Glu Gln Lys Thr Arg Pro Phe Thr Leu Pro Asn Leu Pro Leu Ser Ser Leu Ser Asn Ser Arg Ala Pro Leu Pro Ile Ser Ser Met Gly Ile Ser Pro Asp Asn Val Gln Ser Val Gln Phe Gln Asn Gly Arg Cys Thr Leu Asp Gly Arg Leu Val Gly Thr Thr Pro Val Ser Leu Ser His Val Ala Lys Ile Arg Gly Thr Ser Asn Gly Thr Val Ile Asn Leu Thr Glu Leu Asp Gly Thr Pro Phe His Pro Phe Glu Gly Pro Ala Pro Ile Gly Phe Pro Asp Leu Gly Gly Cys Asp Trp His Ile Asn Met Thr Gln Phe Gly His Ser Ser Gln Thr Gln Tyr Asp Val Asp Thr Thr Pro Asp Thr Phe Val Pro His Leu Gly Ser Ile Gln Ala Asn Gly Ile Gly Ser Gly Asn Tyr Val Gly Val Leu Ser Trp Ile Ser Pro Pro Ser His Pro Ser Gly Ser Gln Val Asp Leu Trp Lys Ile Pro Asn Tyr Gly Ser Ser Ile Thr Glu Ala Thr His Leu Ala Pro Ser Val Tyr Pro Pro Gly Phe Gly Glu Val Leu Val Phe Phe Met Ser Lys Met Pro Gly Pro Gly Ala Tyr Asn Leu Pro Cys Leu Leu Pro Gln Glu Tyr Ile Ser His Leu Ala Ser Glu Gln Ala Pro Thr Val Gly Glu Ala Ala Leu Leu His Tyr Val Asp Pro Asp Thr Gly Arg Asn Leu Gly Glu Phe Lys Ala Tyr Pro Asp Gly Phe Leu Thr Cys Val Pro Asn Gly Ala Ser Ser Gly Pro Gln Gln Leu Pro Ile Asn Gly Val Phe Val Phe Val Ser Trp Val Ser Arg Phe Tyr Gln Leu Lys Pro Val Gly Thr Ala Ser Ser Ala Arg Gly Arg Leu Gly Leu Arg Arg Met Met Ala Tyr Leu Val Phe Leu Gly Pro Pro Gly Ala Gly Lys Gly Thr Tyr Ala Lys Arg Leu Gln Glu Ile Thr Gly Ile Pro His Ile Ser Thr Gly Asp Ile Phe Arg Asp Ile Val Lys Lys Glu Asn Asp Glu Leu Gly Lys Lys Ile Lys Glu Ile Met Glu Arg Gly Glu Leu Val Pro Asp Glu Leu Val Asn Glu Val Val Lys Arg Arg Leu Ser Glu Lys Asp Cys Glu Arg Gly Phe Ile Leu Asp Gly Tyr Pro Arg Thr Val Ala Gln Ala Glu Phe Leu Asp Gly Phe Leu Lys Thr Gln Asn Lys Glu Leu Thr Ala Ala Val Leu Phe Glu Val Pro Glu Glu Val Val Val Gln Arg Leu Thr Ala Arg Arg Ile Cys Pro Lys Cys Gly Arg Ile Tyr Asn Leu Ile Ser Leu Pro Pro Lys Glu Asp Glu Leu Cys Asp Asp Cys Lys Val Lys Leu Val Gln Arg Glu Asp Asp Lys Glu Glu Thr Val Arg His Arg Tyr Lys Val Tyr Leu Glu Lys Thr Gln Pro Val Ile Asp Tyr Tyr Asp Lys Lys Gly Ile Leu Lys Arg Val Asp Gly Thr Ile Gly Ile Asp Asn Val Ile Ala Glu Val Leu Lys Ile Ile Gly Trp Ser Asp Lys 
配列番号６２
Met Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu Val Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu Leu Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly Ile Tyr 
配列番号６３
Ser Lys Thr Ile Val Leu Ser Val Gly Glu Ala Thr Arg Thr Leu Thr Glu Ile Gln Ser Thr Ala Asp Arg Gln Ile Phe Glu Glu Lys Val Gly Pro Leu Val Gly Arg Leu Arg Leu Thr Ala Ser Leu Arg Gln Asn Gly Ala Lys Thr Ala Tyr Arg Val Asn Leu Lys Leu Asp Gln Ala Asp Val Val Asp Cys Ser Thr Ser Val Cys Gly Glu Leu Pro Lys Val Arg Tyr Thr Gln Val Trp Ser His Asp Val Thr Ile Val Ala Asn Ser Thr Glu Ala Ser Arg Lys Ser Leu Tyr Asp Leu Thr Lys Ser Leu Val Val Gln Ala Thr Ser Glu Asp Leu Val Val Asn Leu Val Pro Leu Gly Arg 
配列番号６４
Met Ser Lys Thr Ile Val Leu Ser Val Gly Glu Ala Thr Arg Thr Leu Thr Glu Ile Gln Ser Thr Ala Asp Arg Gln Ile Phe Glu Glu Lys Val Gly Pro Leu Val Gly Arg Leu Arg Leu Thr Ala Ser Leu Arg Gln Asn Gly Ala Lys Thr Ala Tyr Arg Val Asn Leu Lys Leu Asp Gln Ala Asp Val Val Asp Ser Gly Leu Pro Lys Val Arg Tyr Thr Gln Val Trp Ser His Asp Val Thr Ile Val Ala Asn Ser Thr Glu Ala Ser Arg Lys Ser Leu Tyr Asp Leu Thr Lys Ser Leu Val Ala Thr Ser Gln Val Glu Asp Leu Val Val Asn Leu Val Pro Leu Gly Arg Tyr Gly Ser Lys Thr Ile Val Leu Ser Val Gly Glu Ala Thr Arg Thr Leu Thr Glu Ile Gln Ser Thr Ala Asp Arg Gln Ile Phe Glu Glu Lys Val Gly Pro Leu Val Gly Arg Leu Arg Leu Thr Ala Ser Leu Arg Gln Asn Gly Ala Lys Thr Ala Tyr Arg Val Asn Leu Lys Leu Asp Gln Ala Asp Val Val Asp Ser Gly Leu Pro Lys Val Arg Tyr Thr Gln Val Trp Ser His Asp Val Thr Ile Val Ala Asn Ser Thr Glu Ala Ser Arg Lys Ser Leu Tyr Asp Leu Thr Lys Ser Leu Val Ala Thr Ser Gln Val Glu Asp Leu Val Val Asn Leu Val Pro Leu Gly Arg 
配列番号６５
Met Lys Leu Leu Lys Val Ala Ala Ile Ala Ala Ile Val Phe Ser Gly Ser Ala Leu Ala Gly Val Val Pro Gln Tyr Gly Gly Gly Gly Asn His Gly Gly Gly Gly Asn Asn Ser Gly Pro Asn Ser Glu Leu Asn Ile Tyr Gln Tyr Gly Gly Gly Asn Ser Ala Leu Ala Leu Gln Thr Asp Ala Arg Asn Ser Asp Leu Thr Ile Thr Gln His Gly Gly Gly Asn Gly Ala Asp Val Gly Gln Gly Ser Asp Asp Ser Ser Ile Asp Leu Thr Gln Arg Gly Phe Gly Asn Ser Ala Thr Leu Asp Gln Trp Asn Gly Lys Asn Ser Glu Met Thr Val Lys Gln Phe Gly Gly Gly Asn Gly Ala Ala Val Asp Gln Thr Ala Ser Asn Ser Ser Val Asn Val Thr Gln Val Gly Phe Gly Asn Asn Ala Thr Ala His Gln Tyr 
配列番号６６
Met Lys Leu Leu Lys Val Ala Ala Phe Ala Ala Ile Val Val Ser Gly Ser Ala Leu Ala Gly Val Val Pro Gln Trp Gly Gly Gly Gly Asn His Asn Gly Gly Gly Asn Ser Ser Gly Pro Asp Ser Thr Leu Ser Ile Tyr Gln Tyr Gly Ser Ala Asn Ala Ala Leu Ala Leu Gln Ser Asp Ala Arg Lys Ser Glu Thr Thr Ile Thr Gln Ser Gly Tyr Gly Asn Gly Ala Asp Val Gly Gln Gly Ala Asp Asn Ser Thr Ile Glu Leu Thr Gln Asn Gly Phe Arg Asn Asn Ala Thr Ile Asp Gln Trp Asn Ala Lys Asn Ser Asp Ile Thr Val Gly Gln Tyr Gly Gly Asn Asn Ala Ala Leu Val Asn Gln Thr Ala Ser Asp Ser Ser Val Met Val Arg Gln Val Gly Phe Gly Asn Asn Ala Thr Ala Asn Gln Tyr 
配列番号６７
Met Met Ala Tyr Leu Val Phe Leu Gly Pro Pro Gly Ala Gly Lys Gly Thr Tyr Ala Lys Arg Ile Gln Glu Lys Thr Gly Ile Pro His Ile Ser Thr Gly Asp Ile Phe Arg Asp Ile Val Lys Lys Glu Asn Asp Glu Leu Gly Lys Lys Ile Lys Glu Ile Met Glu Lys Gly Glu Leu Val Pro Asp Glu Leu Val Asn Glu Val Val Lys Arg Arg Leu Ser Glu Lys Asp Cys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Asp Gly Tyr Pro Arg Thr Val Ala Gln Ala Glu Phe Leu Asp Ser Phe Leu Glu Ser Gln Asn Lys Gln Leu Thr Ala Ala Val Leu Phe Asp Val Pro Glu Asp Val Val Val Gln Arg Leu Thr Ser Arg Arg Ile Cys Pro Lys Cys Gly Arg Ile Tyr Asn Met Ile Ser Leu Pro Pro Lys Glu Asp Glu Leu Cys Asp Asp Cys Lys Val Lys Leu Val Gln Arg Asp Asp Asp Lys Glu Glu Thr Val Arg His Arg Tyr Lys Val Tyr Leu Glu Lys Thr Gln Pro Val Ile Asp Tyr Tyr Gly Lys Lys Gly Ile Leu Lys Arg Val Asp Gly Thr Ile Gly Ile Asp Asn Val Val Ala Glu Val Leu Lys Ile Ile Gly Trp Ser Asp Lys Gly Ser Gly Val Val Pro Gln Tyr Gly Gly Gly Gly Asn His Gly Gly Gly Gly Asn Asn Ser Gly Pro Asn Ser Glu Leu Asn Ile Tyr Gln Tyr Gly Gly Gly Asn Ser Ala Leu Ala Leu Gln Thr Asp Ala Arg Asn Ser Asp Leu Thr Ile Thr Gln His Gly Gly Gly Asn Gly Ala Asp Val Gly Gln Gly Ser Asp Asp Ser Ser Ile Asp Leu Thr Gln Arg Gly Phe Gly Asn Ser Ala Thr Leu Asp Gln Trp Asn Gly Lys Asn Ser Glu Met Thr Val Lys Gln Phe Gly Gly Gly Asn Gly Ala Ala Val Asp Gln Thr Ala Ser Asn Ser Ser Val Asn Val Thr Gln Val Gly Phe Gly Asn Asn Ala Thr Ala His Gln Tyr 
配列番号６８
Met Gln Phe Ser Thr Leu Thr Thr Val Phe Ala Leu Val Ala Ala Ala Val Ala Ala Pro His Gly Ser Ser Gly Gly Asn Asn Pro Val Cys Ser Ala Gln Asn Asn Gln Val Cys Cys Asn Gly Leu Leu Ser Cys Ala Val Gln Val Leu Gly Ser Asn Cys Asn Gly Asn Ala Tyr Cys Cys Asn Thr Glu Ala Pro Thr Gly Thr Leu Ile Asn Val Ala Leu Leu Asn Cys Val Lys Leu Leu 
配列番号６９
Met Lys Phe Ser Leu Ala Ala Val Ala Leu Leu Gly Ala Val Val Ser Ala Leu Pro Ala Asn Glu Lys Arg Gln Ala Tyr Ile Pro Cys Ser Gly Leu Tyr Gly Thr Ser Gln Cys Cys Ala Thr Asp Val Leu Gly Val Ala Asp Leu Asp Cys Gly Asn Pro Pro Ser Ser Pro Thr Asp Ala Asp Asn Phe Ser Ala Val Cys Ala Glu Ile Gly Gln Arg Ala Arg Cys Cys Val Leu Pro Ile Leu Asp Gln Gly Ile Leu Cys Asn Thr Pro Thr Gly Val Gln Asp 
配列番号７０
Val Pro Pro Pro Cys Asp Leu Ser Ile Lys Ser Lys Leu Lys Gln Val Gly Ala Thr Ala Gly Asn Ala Ala Val Thr Thr Thr Gly Thr Thr Ser Gly Ser Gly Val Val Lys Cys Val Val Arg Thr Pro Thr Ser Val Glu Lys Lys Ala Ala Val Gly Asn Thr Gly Leu Ser Ala Val Ser Ala Ser Ala Ala Asn Gly Phe Phe Lys Asn Leu Gly Lys Ala Thr Thr Glu Val Lys Thr Thr Lys Asp Gly Thr Lys Val Lys Thr Lys Thr Ala Gly Lys Gly Lys Thr Gly Gly Thr Ala Thr Thr Ile Gln Ile Ala Asp Ala Asn Gly Gly Val Ser Glu Lys Ser Leu Lys Leu Asp Leu Leu Thr Asp Gly Leu Lys Phe Val Lys Val Thr Glu Lys Lys Gln Gly Thr Ala Thr Ser Ser Ser Gly His Lys Ala Ser Gly Val Gly His Ser Val Phe Lys Val Leu Asn Glu Ala Glu Thr Glu Leu Glu Leu Lys Gly Leu 
配列番号７１
Met Lys Trp Phe Leu Phe Leu Leu Thr Thr Ala Val Leu Ala Ala Val Val Ser Ala His Glu Glu Asp Gly Val Cys Asn Ser Asn Ala Pro Cys Tyr His Cys Asp Ala Asn Gly Glu Asn Cys Ser Cys Asn Cys Glu Leu Phe Asp Cys Glu Ala Lys Lys Pro Asp Gly Ser Tyr Ala His Pro Cys Arg Arg Cys Asp Ala Asn Asn Ile Cys Lys Cys Ser Cys Thr Ala Ile Pro Cys Asn Glu Asp His Pro Cys His His Cys His Glu Glu Asp Asp Gly Asp Thr His Cys His Cys Ser Cys Glu His Ser His Asp His His Asp Asp Asp Thr His Gly Glu Cys Thr Lys Lys Ala Pro Cys Trp Arg Cys Glu Tyr Asn Ala Asp Leu Lys His Asp Val Cys Gly Cys Glu Cys Ser Lys Leu Pro Cys Asn Asp Glu His Pro Cys Tyr Arg Lys Glu Gly Gly Val Val Ser Cys Asp Cys Lys Thr Ile Thr Cys Asn Glu Asp His Pro Cys Tyr His Ser Tyr Glu Glu Asp Gly Val Thr Lys Ser Asp Cys Asp Cys Glu His Ser Pro Gly Pro Ser Glu 
配列番号７２
Met Arg Val Leu Val Ile Asn Ser Gly Ser Ser Ser Ile Lys Tyr Gln Leu Ile Glu Met Glu Gly Glu Lys Val Leu Cys Lys Gly Ile Ala Glu Arg Ile Gly Ile Glu Gly Ser Arg Leu Val His Arg Val Gly Asp Glu Lys His Val Ile Glu Arg Glu Leu Pro Asp His Glu Glu Ala Leu Lys Leu Ile Leu Asn Thr Leu Val Asp Glu Lys Leu Gly Val Ile Lys Asp Leu Lys Glu Ile Asp Ala Val Gly His Arg Val Val His Gly Gly Glu Arg Phe Lys Glu Ser Val Leu Val Asp Glu Glu Val Leu Lys Ala Ile Glu Glu Val Ser Pro Leu Ala Pro Leu His Asn Pro Ala Asn Leu Met Gly Ile Lys Ala Ala Met Lys Leu Leu Pro Gly Val Pro Asn Val Ala Val Phe Asp Thr Ala Phe His Gln Thr Ile Pro Gln Lys Ala Tyr Leu Tyr Ala Ile Pro Tyr Glu Tyr Tyr Glu Lys Tyr Lys Ile Arg Arg Tyr Gly Phe His Gly Thr Ser His Arg Tyr Val Ser Lys Arg Ala Ala Glu Ile Leu Gly Lys Lys Leu Glu Glu Leu Lys Ile Ile Thr Cys His Ile Gly Asn Gly Ala Ser Val Ala Ala Val Lys Tyr Gly Lys Cys Val Asp Thr Ser Met Gly Phe Thr Pro Leu Glu Gly Leu Val Met Gly Thr Arg Ser Gly Asp Leu Asp Pro Ala Ile Pro Phe Phe Ile Met Glu Lys Glu Gly Ile Ser Pro Gln Glu Met Tyr Asp Ile Leu Asn Lys Lys Ser Gly Val Tyr Gly Leu Ser Lys Gly Phe Ser Ser Asp Met Arg Asp Ile Glu Glu Ala Ala Leu Lys Gly Asp Glu Trp Cys Lys Leu Val Leu Glu Ile Tyr Asp Tyr Arg Ile Ala Lys Tyr Ile Gly Ala Tyr Ala Ala Ala Met Asn Gly Val Asp Ala Ile Val Phe Thr Ala Gly Val Gly Glu Asn Ser Pro Ile Thr Arg Glu Asp Val Cys Ser Tyr Leu Glu Phe Leu Gly Val Lys Leu Asp Lys Gln Lys Asn Glu Glu Thr Ile Arg Gly Lys Glu Gly Ile Ile Ser Thr Pro Asp Ser Arg Val Lys Val Leu Val Val Pro Thr Asn Glu Glu Leu Met Ile Ala Arg Asp Thr Lys Glu Ile Val Glu Lys Ile Gly Arg Val Pro Pro Pro Cys Asp Leu Ser Ile Lys Ser Lys Leu Lys Gln Val Gly Ala Thr Ala Gly Asn Ala Ala Val Thr Thr Thr Gly Thr Thr Ser Gly Ser Gly Val Val Lys Cys Val Val Arg Thr Pro Thr Ser Val Glu Lys Lys Ala Ala Val Gly Asn Thr Gly Leu Ser Ala Val Ser Ala Ser Ala Ala Asn Gly Phe Phe Lys Asn Leu Gly Lys Ala Thr Thr Glu Val Lys Thr Thr Lys Asp Gly Thr Lys Val Lys Thr Lys Thr Ala Gly Lys Gly Lys Thr Gly Gly Thr Ala Thr Thr Ile Gln Ile Ala Asp Ala Asn Gly Gly Val Ser Glu Lys Ser Leu Lys Leu Asp Leu Leu Thr Asp Gly Leu Lys Phe Val Lys Val Thr Glu Lys Lys Gln Gly Thr Ala Thr Ser Ser Ser Gly His Lys Ala Ser Gly Val Gly His Ser Val Phe Lys Val Leu Asn Glu Ala Glu Thr Glu Leu Glu Leu Lys Gly Leu 
配列番号７３
Val Pro Pro Pro Cys Asp Leu Ser Ile Lys Ser Lys Leu Lys Gln Val Gly Ala Thr Ala Gly Asn Ala Ala Val Thr Thr Thr Gly Thr Thr Ser Gly Ser Gly Val Val Lys Cys Val Val Arg Thr Pro Thr Ser Val Glu Lys Lys Ala Ala Val Gly Asn Thr Gly Leu Ser Ala Val Ser Ala Ser Ala Ala Asn Gly Phe Phe Lys Asn Leu Gly Lys Ala Thr Thr Glu Val Lys Thr Thr Lys Asp Gly Thr Lys Val Lys Thr Lys Thr Ala Gly Lys Gly Lys Thr Gly Gly Thr Ala Thr Thr Ile Gln Ile Ala Asp Ala Asn Gly Gly Val Ser Glu Lys Ser Leu Lys Leu Asp Leu Leu Thr Asp Gly Leu Lys Phe Val Lys Val Thr Glu Lys Lys Gln Gly Thr Ala Thr Ser Ser Ser Gly His Lys Ala Ser Gly Val Gly His Ser Val Phe Lys Val Leu Glu Ala Glu Thr Glu Leu Glu Leu Lys Gly Leu Met Arg Val Leu Val Ile Asn Ser Gly Ser Ser Ser Ile Lys Tyr Gln Leu Ile Glu Met Glu Gly Glu Lys Val Leu Cys Lys Gly Ile Ala Glu Arg Ile Gly Ile Glu Gly Ser Arg Leu Val His Arg Val Gly Asp Glu Lys His Val Ile Glu Arg Glu Leu Pro Asp His Glu Glu Ala Leu Lys Leu Ile Leu Asn Thr Leu Val Asp Glu Lys Leu Gly Val Ile Lys Asp Leu Lys Glu Ile Asp Ala Val Gly His Arg Val Val His Gly Gly Glu Arg Phe Lys Glu Ser Val Leu Val Asp Glu Glu Val Leu Lys Ala Ile Glu Glu Val Ser Pro Leu Ala Pro Leu His Asn Pro Ala Asn Leu Met Gly Ile Lys Ala Ala Met Lys Leu Leu Pro Gly Val Pro Asn Val Ala Val Phe Asp Thr Ala Phe His Gln Thr Ile Pro Gln Lys Ala Tyr Leu Tyr Ala Ile Pro Tyr Glu Tyr Tyr Glu Lys Tyr Lys Ile Arg Arg Tyr Gly Phe His Gly Thr Ser His Arg Tyr Val Ser Lys Arg Ala Ala Glu Ile Leu Gly Lys Lys Leu Glu Glu Leu Lys Ile Ile Thr Cys His Ile Gly Asn Gly Ala Ser Val Ala Ala Val Lys Tyr Gly Lys Cys Val Asp Thr Ser Met Gly Phe Thr Pro Leu Glu Gly Leu Val Met Gly Thr Arg Ser Gly Asp Leu Asp Pro Ala Ile Pro Phe Phe Ile Met Glu Lys Glu Gly Ile Ser Pro Gln Glu Met Tyr Asp Ile Leu Asn Lys Lys Ser Gly Val Tyr Gly Leu Ser Lys Gly Phe Ser Ser Asp Met Arg Asp Ile Glu Glu Ala Ala Leu Lys Gly Asp Glu Trp Cys Lys Leu Val Leu Glu Ile Tyr Asp Tyr Arg Ile Ala Lys Tyr Ile Gly Ala Tyr Ala Ala Ala Met Asn Gly Val Asp Ala Ile Val Phe Thr Ala Gly Val Gly Glu Asn Ser Pro Ile Thr Arg Glu Asp Val Cys Ser Tyr Leu Glu Phe Leu Gly Val Lys Leu Asp Lys Gln Lys Asn Glu Glu Thr Ile Arg Gly Lys Glu Gly Ile Ile Ser Thr Pro Asp Ser Arg Val Lys Val Leu Val Val Pro Thr Asn Glu Glu Leu Met Ile Ala Arg Asp Thr Lys Glu Ile Val Glu Lys Ile Gly Arg 
配列番号７４
Met Lys Tyr Thr Leu Ala Leu Leu Phe Leu Thr Ala Ile Ile Ala Thr Phe Val Ala Ala His Lys His His Asp His Gly Lys Ser Cys Ser Lys Ser His Pro Cys Tyr His Cys His Thr Asp Cys Glu Cys Asn His His His Asp Asp Cys Asn Arg Ser His Arg Cys Trp His Lys Val His Gly Val Val Ser Gly Asn Cys Asn Cys Asn Leu Leu Thr Pro Cys Asn Gln Lys His Pro Cys Trp Arg Arg His Gly Lys Lys His Gly Leu His Arg Lys Phe His Gly Asn Ala Cys Asn Cys Asp Arg Leu Val Cys Asn Ala Lys His Pro Cys Trp His Lys His Cys Asp Cys Phe Cys
配列番号７５
Ser Lys Leu Pro Cys Asn Asp Glu His Pro Cys Tyr Arg LysGlu Gly Gly Val Val Ser Cys Asp Cys Lys 
配列番号７６
Ser Lys Leu Pro Ser Asn Asp Glu His Pro Ser Tyr Arg Lys Glu Gly Gly Val Val Ser Ser Asp Ser Lys 
配列番号７７
Lys Thr Ile Thr Cys Asn Glu Asp His Pro Cys Tyr His Ser Tyr Glu Glu Asp Gly Val Thr Lys Ser Asp Cys Asp Cys Glu 
配列番号７８
Met Arg Ile Ile Leu Leu Gly Ala Pro Gly Ala Gly Lys Gly Thr Gln Ala Gln Phe Ile Met Glu Lys Tyr Gly Ile Pro Gln Ile Ser Thr Gly Asp Met Leu Arg Ala Ala Val Lys Ser Gly Ser Glu Leu Gly Lys Gln Ala Lys Asp Ile Met Asp Ala Gly Lys Leu Val Thr Asp Glu Leu Val Ile Ala Leu Val Lys Glu Arg Ile Ala Gln Glu Asp Cys Arg Asn Gly Phe Leu Leu Asp Gly Phe Pro Arg Thr Ile Pro Gln Ala Asp Ala Met Lys Glu Ala Gly Ile Asn Val Asp Tyr Val Leu Glu Phe Asp Val Pro Asp Glu Leu Ile Val Asp Arg Ile Val Gly Arg Arg Val His Ala Pro Ser Gly Arg Val Tyr His Val Lys Phe Asn Pro Pro Lys Val Glu Gly Lys Asp Asp Val Thr Gly Glu Glu Leu Thr Thr Arg Lys Asp Asp Gln Glu Glu Thr Val Arg Lys Arg Leu Val Glu Tyr His Gln Met Thr Ala Pro Leu Ile Gly Tyr Tyr Ser Lys Glu Ala Glu Ala Gly Asn Thr Lys Tyr Ala Lys Val Asp Gly Thr Lys Pro Val Ala Glu Val Arg Ala Asp Leu Glu Lys Ile Leu Gly 
配列番号７９
Met Lys Lys Thr Lys Ile Val Cys Thr Ile Gly Pro Lys Thr Glu Ser Glu Glu Met Leu Ala Lys Met Leu Asp Ala Gly Met Asn Val Met Arg Leu Asn Phe Ser His Gly Asp Tyr Ala Glu His Gly Gln Arg Ile Gln Asn Leu Arg Asn Val Met Ser Lys Thr Gly Lys Thr Ala Ala Ile Leu Leu Asp Thr Lys Gly Pro Glu Ile Arg Thr Met Lys Leu Glu Gly Gly Asn Asp Val Ser Leu Lys Ala Gly Gln Thr Phe Thr Phe Thr Thr Asp Lys Ser Val Ile Gly Asn Ser Glu Met Val Ala Val Thr Tyr Glu Gly Phe Thr Thr Asp Leu Ser Val Gly Asn Thr Val Leu Val Asp Asp Gly Leu Ile Gly Met Glu Val Thr Ala Ile Glu Gly Asn Lys Val Ile Cys Lys Val Leu Asn Asn Gly Asp Leu Gly Glu Asn Lys Gly Val Asn Leu Pro Gly Val Ser Ile Ala Leu Pro Ala Leu Ala Glu Lys Asp Lys Gln Asp Leu Ile Phe Gly Cys Glu Gln Gly Val Asp Phe Val Ala Ala Ser Phe Ile Arg Lys Arg Ser Asp Val Ile Glu Ile Arg Glu His Leu Lys Ala His Gly Gly Glu Asn Ile His Ile Ile Ser Lys Ile Glu Asn Gln Glu Gly Leu Asn Asn Phe Asp Glu Ile Leu Glu Ala Ser Asp Gly Ile Met Val Ala Arg Gly Asp Leu Gly Val Glu Ile Pro Val Glu Glu Val Ile Phe Ala Gln Lys Met Met Ile Glu Lys Cys Ile Arg Ala Arg Lys Val Val Ile Thr Ala Thr Gln Met Leu Asp Ser Met Ile Lys Asn Pro Arg Pro Thr Arg Ala Glu Ala Gly Asp Val Ala Asn Ala Ile Leu Asp Gly Thr Asp Ala Val Met Leu Ser Gly Glu Ser Ala Lys Gly Lys Tyr Pro Leu Glu Ala Val Ser Ile Met Ala Thr Ile Cys Glu Arg Thr Asp Arg Val Met Asn Ser Arg Leu Glu Phe Asn Asn Asp Asn Arg Lys Leu Arg Ile Thr Glu Ala Val Cys Arg Gly Ala Val Glu Thr Ala Glu Lys Leu Asp Ala Pro Leu Ile Val Val Ala Thr Gln Gly Gly Lys Ser Ala Arg Ala Val Arg Lys Tyr Phe Pro Asp Ala Thr Ile Leu Ala Leu Thr Thr Asn Glu Lys Thr Ala His Gln Leu Val Leu Ser Lys Gly Val Val Pro Gln Leu Val Lys Glu Ile Thr Ser Thr Asp Asp Phe Tyr Arg Leu Gly Lys Glu Leu Ala Leu Gln Ser Gly Leu Ala His Lys Gly Asp Val Val Val Met Val Ser Gly Ala Leu Val Pro Ser Gly Thr Thr Asn Thr Ala Ser Val His Val Leu 
配列番号８０
Met Ser Ser Lys Leu Val Leu Val Leu Asn Cys Gly Ser Ser Ser Leu Lys Phe Ala Ile Ile Asp Ala Val Asn Gly Glu Glu Tyr Leu Ser Gly Leu Ala Glu Cys Phe His Leu Pro Glu Ala Arg Ile Lys Trp Lys Met Asp Gly Asn Lys Gln Glu Ala Ala Leu Gly Ala Gly Ala Ala His Ser Glu Ala Leu Asn Phe Ile Val Asn Thr Ile Leu Ala Gln Lys Pro Glu Leu Ser Ala Gln Leu Thr Ala Ile Gly His Arg Ile Val His Gly Gly Glu Lys Tyr Thr Ser Ser Val Val Ile Asp Glu Ser Val Ile Gln Gly Ile Lys Asp Ala Ala Ser Phe Ala Pro Leu His Asn Pro Ala His Leu Ile Gly Ile Glu Glu Ala Leu Lys Ser Phe Pro Gln Leu Lys Asp Lys Asn Val Ala Val Phe Asp Thr Ala Phe His Gln Thr Met Pro Glu Glu Ser Tyr Leu Tyr Ala Leu Pro Tyr Asn Leu Tyr Lys Glu His Gly Ile Arg Arg Tyr Gly Ala His Gly Thr Ser His Phe Tyr Val Thr Gln Glu Ala Ala Lys Met Leu Asn Lys Pro Val Glu Glu Leu Asn Ile Ile Thr Cys His Leu Gly Asn Gly Gly Ser Val Ser Ala Ile Arg Asn Gly Lys Cys Val Asp Thr Ser Met Gly Leu Thr Pro Leu Glu Gly Leu Val Met Gly Thr Arg Ser Gly Asp Ile Asp Pro Ala Ile Ile Phe His Leu His Asp Thr Leu Gly Met Ser Val Asp Ala Ile Asn Lys Leu Leu Thr Lys Glu Ser Gly Leu Leu Gly Leu Thr Glu Val Thr Ser Asp Cys Arg Tyr Val Glu Asp Asn Tyr Ala Thr Lys Glu Asp Ala Lys Arg Ala Met Asp Val Tyr Cys His Arg Leu Ala Lys Tyr Ile Gly Ala Tyr Thr Ala Leu Met Asp Gly Arg Leu Asp Ala Val Val Phe Thr Gly Gly Ile Gly Glu Asn Ala Ala Met Val Arg Glu Leu Ser Leu Gly Lys Leu Gly Val Leu Gly Phe Glu Val Asp His Glu Arg Asn Leu Ala Ala Arg Phe Gly Lys Ser Gly Phe Ile Asn Lys Glu Gly Thr Arg Pro Ala Val Val Ile Pro Thr Asn Glu Glu Leu Val Ile Ala Gln Asp Ala Ser Arg Leu Thr Ala
配列番号８１
Met Lys Asn Lys Val Val Val Val Thr Gly Val Pro Gly Val Gly Ser Thr Thr Ser Ser Gln Leu Ala Met Asp Asn Leu Arg Lys Glu Gly Val Asn Tyr Lys Met Val Ser Phe Gly Ser Val Met Phe Glu Val Ala Lys Glu Glu Asn Leu Val Ser Asp Arg Asp Gln Met Arg Lys Met Asp Pro Glu Thr Gln Lys Arg Ile Gln Lys Met Ala Gly Arg Lys Ile Ala Glu Met Ala Lys Glu Ser Pro Val Ala Val Asp Thr His Ser Thr Val Ser Thr Pro Lys Gly Tyr Leu Pro Gly Leu Pro Ser Trp Val Leu Asn Glu Leu Asn Pro Asp Leu Ile Ile Val Val Glu Thr Thr Gly Asp Glu Ile Leu Met Arg Arg Met Ser Asp Glu Thr Arg Val Arg Asp Leu Asp Thr Ala Ser Thr Ile Glu Gln His Gln Phe Met Asn Arg Cys Ala Ala Met Ser Tyr Gly Val Leu Thr Gly Ala Thr Val Lys Ile Val Gln Asn Arg Asn Gly Leu Leu Asp Gln Ala Val Glu Glu Leu Thr Asn Val Leu Arg 
配列番号８２
Met Lys Asn Lys Leu Val Val Val Thr Gly Val Pro Gly Val Gly Gly Thr Thr Ile Thr Gln Lys Ala Met Glu Lys Leu Ser Glu Glu Gly Ile Asn Tyr Lys Met Val Asn Phe Gly Thr Val Met Phe Glu Val Ala Gln Glu Glu Asn Leu Val Glu Asp Arg Asp Gln Met Arg Lys Leu Asp Pro Asp Thr Gln Lys Arg Ile Gln Lys Leu Ala Gly Arg Lys Ile Ala Glu Met Val Lys Glu Ser Pro Val Val Val Asp Thr His Ser Thr Ile Lys Thr Pro Lys Gly Tyr Leu Pro Gly Leu Pro Val Trp Val Leu Asn Glu Leu Asn Pro Asp Ile Ile Ile Val Val Glu Thr Ser Gly Asp Glu Ile Leu Ile Arg Arg Leu Asn Asp Glu Thr Arg Asn Arg Asp Leu Glu Thr Thr Ala Gly Ile Glu Glu His Gln Ile Met Asn Arg Ala Ala Ala Met Thr Tyr Gly Val Leu Thr Gly Ala Thr Val Lys Ile Ile Gln Asn Lys Asn Asn Leu Leu Asp Tyr Ala Val Glu Glu Leu Ile Ser Val Leu Arg 
配列番号８３
Met Asn Ile Val Leu Met Gly Leu Pro Gly Ala Gly Lys Gly Thr Gln Ala Asp Arg Ile Val Glu Lys Tyr Gly Thr Pro His Ile Ser Thr Gly Asp Met Phe Arg Ala Ala Ile Gln Glu Gly Thr Glu Leu Gly Val Lys Ala Lys Ser Phe Met Asp Gln Gly Ala Leu Val Pro Asp Glu Val Thr Ile Gly Ile Val Arg Glu Arg Leu Ser Lys Ser Asp Cys Asp Asn Gly Phe Leu Leu Asp Gly Phe Pro Arg Thr Val Pro Gln Ala Glu Ala Leu Asp Gln Leu Leu Ala Asp Met Gly Arg Lys Ile Glu His Val Leu Asn Ile Gln Val Glu Lys Glu Glu Leu Ile Ala Arg Leu Thr Gly Arg Arg Ile Cys Lys Val Cys Gly Thr Ser Tyr His Leu Leu Phe Asn Pro Pro Gln Val Glu Gly Lys Cys Asp Lys Asp Gly Gly Glu Leu Tyr Gln Arg Ala Asp Asp Asn Pro Asp Thr Val Thr Asn Arg Leu Glu Val Asn Met Asn Gln Thr Ala Pro Leu Leu Ala Phe Tyr Asp Ser Lys Glu Val Leu Val Asn Ile Asn Gly Gln Lys Asp Ile Lys Asp Val Phe Lys Asp Leu Asp Val Ile Leu Gln Gly Asn Gly Gln 
配列番号８４
Met Asn Leu Val Leu Met Gly Leu Pro Gly Ala Gly Lys Gly Thr Gln Gly Glu Arg Ile Val Glu Asp Tyr Gly Ile Pro His Ile Ser Thr Gly Asp Met Phe Arg Ala Ala Met Lys Glu Glu Thr Pro Leu Gly Leu Glu Ala Lys Ser Tyr Ile Asp Lys Gly Glu Leu Val Pro Asp Glu Val Thr Ile Gly Ile Val Lys Glu Arg Leu Gly Lys Asp Asp Cys Glu Arg Gly Phe Leu Leu Asp Gly Phe Pro Arg Thr Val Ala Gln Ala Glu Ala Leu Glu Glu Ile Leu Glu Glu Tyr Gly Lys Pro Ile Asp Tyr Val Ile Asn Ile Glu Val Asp Lys Asp Val Leu Met Glu Arg Leu Thr Gly Arg Arg Ile Cys Ser Val Cys Gly Thr Thr Tyr His Leu Val Phe Asn Pro Pro Lys Thr Pro Gly Ile Cys Asp Lys Asp Gly Gly Glu Leu Tyr Gln Arg Ala Asp Asp Asn Glu Glu Thr Val Ser Lys Arg Leu Glu Val Asn Met Lys Gln Thr Gln Pro Leu Leu Asp Phe Tyr Ser Glu Lys Gly Tyr Leu Ala Asn Val Asn Gly Gln Gln Asp Ile Gln Asp Val Tyr Ala Asp Val Lys Asp Leu Leu Gly Gly Leu Lys Lys 
【０１５７】
本発明は、ここで、以下の実施例において特定の実施形態で及び添付の図面に関して記載する。
【図面の簡単な説明】
【０１５８】
【図１Ａ】７０℃（Ａ）、８０℃（Ｂ）、及び９０℃（Ｃ）での処理の後のアデニル酸キナーゼ（ＡＫ）酵素の活性を示す図である。
【図１Ｂ】７０℃（Ａ）、８０℃（Ｂ）、及び９０℃（Ｃ）での処理の後のアデニル酸キナーゼ（ＡＫ）酵素の活性を示す図である。
【図１Ｃ】７０℃（Ａ）、８０℃（Ｂ）、及び９０℃（Ｃ）での処理の後のアデニル酸キナーゼ（ＡＫ）酵素の活性を示す図である。
【図２】大腸菌において組換え発現された一連のＡＫ酵素の安定性を示す図である。ＡＫ酵素をコードする遺伝子は、実施例３において記載されるように、クローニングされ、発現された。すべての遺伝子は、先に記載されるように、pET3aから発現されたＳ．アシドカルダリウスクローンＩを除いてベクターpET28aから発現された。発現レベルは、それぞれのクローンについて類似していたが、一部のパイロコッカス・フリオスス（Ｐ．ｆｕ）酵素は、不溶性画分中にあり、これは、おそらく、アッセイされているこの酵素の量を低下させたであろう。組換え酵素の安定性は、１ｍｇ／ｍｌ全細胞タンパク質からの１０倍段階希釈液で、粗製大腸菌溶解物中での３０分間の８０℃でのインキュベーションの後に測定された（カラム１２が１ｆｇ／ｍｌ全タンパク質と等価となる）。サーモトガ・マリティマ及びアーケオグロブス・フルギダスに由来する酵素は、試験された他の酵素よりも著しく優れた安定性を示したが、残りの酵素（スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓ．ｓｏ  Ｐ２）、アエロピルム・ペルニクス、及びＰ．ｆｕ）は、前のアッセイの基本として使用されたＳ．アシドカルダリウス酵素（データはＳ．ａｃ  Ｉと標識）に類似する活性を示した。
【図３Ａ】臨床診断に適切な様々な試料における非レポーターアデニル酸キナーゼ活性（図３Ａ）及びＡＴＰ（図３Ｂ）の相対的なレベルを示す図である。健常なドナーに由来する試料は、非レポーターアデニル酸キナーゼによって生成された（基質としてのＡＤＰの添加の後；図３Ａ）又は試料中に天然に存在する（図３Ｂ）ＡＴＰのレベルについて評価された。この情報は、特定の試料についてのアッセイにおいて、どのバックグラウンド低減ステップを含ませる必要があるかを決定するのを援助するために使用することができるが、特に、感染がＡＴＰ又はレポーターキナーゼのバックグラウンドレベルに影響し得る場合、この情報は、いかなるアッセイタイプにおいてもそれらの使用を妨げることはない。試料は、ヒツジに由来する全血及び血清、マウス脳ホモジネート（ＭＢＨ，mouse brain homogenate；組織生検試料の代表）、雌ウシの乳、並びにクエン酸（「ｃａ」）による方法又はスワブデバイス（「ｒ」）を使用して収集された２つの唾液試料（１及び２）である。生のアッセイから生成された相対的な光単位は、標準曲線に基づいてＡＴＰ単位に変換される。
【図３Ｂ】臨床診断に適切な様々な試料における非レポーターアデニル酸キナーゼ活性（図３Ａ）及びＡＴＰ（図３Ｂ）の相対的なレベルを示す図である。健常なドナーに由来する試料は、非レポーターアデニル酸キナーゼによって生成された（基質としてのＡＤＰの添加の後；図３Ａ）又は試料中に天然に存在する（図３Ｂ）ＡＴＰのレベルについて評価された。この情報は、特定の試料についてのアッセイにおいて、どのバックグラウンド低減ステップを含ませる必要があるかを決定するのを援助するために使用することができるが、特に、感染がＡＴＰ又はレポーターキナーゼのバックグラウンドレベルに影響し得る場合、この情報は、いかなるアッセイタイプにおいてもそれらの使用を妨げることはない。試料は、ヒツジに由来する全血及び血清、マウス脳ホモジネート（ＭＢＨ，mouse brain homogenate；組織生検試料の代表）、雌ウシの乳、並びにクエン酸（「ｃａ」）による方法又はスワブデバイス（「ｒ」）を使用して収集された２つの唾液試料（１及び２）である。生のアッセイから生成された相対的な光単位は、標準曲線に基づいてＡＴＰ単位に変換される。
【図４Ａ】Ａｐ５ａ（ジアデノシンペンタホスフェートペンタナトリウム塩）を使用するレポーターキナーゼ及び非レポーター（内在性）組織キナーゼの特異な阻害（図４Ａ）並びにルシフェラーゼに対するＡｐ５ａの効果（図４Ｂ）を示す図である。Ｓ．アシドカルダリウス又はＴ．マリティマに由来するレポーターアデニル酸キナーゼは、先に記載されるように精製された。ウサギミオキナーゼ（筋肉アデニル酸キナーゼ）は、Ｓｉｇｍａから得られた。１００ｎｇのそれぞれの酵素は、５分間、反応緩衝液（１５ｍＭ  ＭｇＡｃ、１０ｍＭ  ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ７．７５）中で、示される濃度の阻害剤と共にインキュベートされた。ＡＤＰは、７０μＭの最終濃度まで添加され、反応液は、ルシフェリン及びルシフェラーゼの添加の前にインキュベートされた。ルシフェラーゼ／ルシフェリンを用いる検出の後に生成されたＲＬＵは、標準曲線を使用して等価なＡＴＰ単位に変換された、また、結果は、図４Ａに示される。ＩＣ５０（酵素の活性を５０％低下させる阻害剤の濃度）は、計算され、１０．４μＭ（Ｓａｃ）、４．３μＭ（Ｔｍａ）、及び０．０６μＭ（ウサギミオキナーゼ）の値を示す。Ａｐ５Ａの存在は、ルシフェラーゼの活性に対して有害な効果を有していない（図４Ｂを参照されたい）。
【図４Ｂ】Ａｐ５ａ（ジアデノシンペンタホスフェートペンタナトリウム塩）を使用するレポーターキナーゼ及び非レポーター（内在性）組織キナーゼの特異な阻害（図４Ａ）並びにルシフェラーゼに対するＡｐ５ａの効果（図４Ｂ）を示す図である。Ｓ．アシドカルダリウス又はＴ．マリティマに由来するレポーターアデニル酸キナーゼは、先に記載されるように精製された。ウサギミオキナーゼ（筋肉アデニル酸キナーゼ）は、Ｓｉｇｍａから得られた。１００ｎｇのそれぞれの酵素は、５分間、反応緩衝液（１５ｍＭ  ＭｇＡｃ、１０ｍＭ  ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ７．７５）中で、示される濃度の阻害剤と共にインキュベートされた。ＡＤＰは、７０μＭの最終濃度まで添加され、反応液は、ルシフェリン及びルシフェラーゼの添加の前にインキュベートされた。ルシフェラーゼ／ルシフェリンを用いる検出の後に生成されたＲＬＵは、標準曲線を使用して等価なＡＴＰ単位に変換された、また、結果は、図４Ａに示される。ＩＣ５０（酵素の活性を５０％低下させる阻害剤の濃度）は、計算され、１０．４μＭ（Ｓａｃ）、４．３μＭ（Ｔｍａ）、及び０．０６μＭ（ウサギミオキナーゼ）の値を示す。Ａｐ５Ａの存在は、ルシフェラーゼの活性に対して有害な効果を有していない（図４Ｂを参照されたい）。
【図５】試料中の分析物の検出のためのラテラルフローデバイスの構成を示す図である。
【図６】試料中の分析物の検出のための濾過デバイスの構成を示す図である。
【図７Ａ】哺乳動物の組織若しくは試料に由来するバックグラウンド活性及び／又は他の供給源（例えば酵母混入）に由来するバックグラウンドに対するさらなる阻害剤の効果を示す図である。実験は、本質的に図４について記載されるように実行された。ルシフェラーゼの活性に対する悪影響は、検査された阻害剤のいずれについても観察されなかった（結果は示さず）。酵母アデニル酸キナーゼは、Ｓｉｇｍａから得られた。図７Ａ；Ａｐ６Ａによるアデニル酸キナーゼの阻害の比較、ＭＡＫ＝ウサギ筋肉ＡＫ（ミオキナーゼ）；ＹＡＫ＝酵母ＡＫ；ＳＡＣ＝Ｓ．アシドカルダリウスＡＫ；ＴＭＡ＝Ｔ．マリティマＡＫ。図７Ｂ；哺乳動物細胞（ＭＡＫ）又は酵母（ＹＡＫ）に由来する混入バックグラウンドアデニル酸キナーゼの阻害についてのＡｐ５Ａ及びＡｐ６Ａの比較。ＡＰ４Ａ（示さず）及びＡｐ６Ａは、いずれも非レポーター哺乳動物組織アデニル酸キナーゼの代表的な例と比較される場合、単量体（細菌）レポーターアデニル酸キナーゼ（サーモトガ・マリティマに由来）の例及びスルホロブス・アシドカルダリウスに由来する三量体（古細菌）アデニル酸キナーゼの例を区別するのに、Ａｐ５Ａに類似するプロファイルを示す（図７Ａ）。Ａｐ４Ａ（示さず）及びＡｐ６Ａは、アッセイが、細菌及び古細菌の酵素並びに菌類起源の酵素（ここでは、サッカロマイセス・セレビシエに由来するＡＫによって代表される）を識別することを可能にしない（図７Ｂ）。この場合、Ａｐ５Ａは、なお、レポーターアデニル酸キナーゼを酵母酵素と識別するために使用することができる。
【図７Ｂ】哺乳動物の組織若しくは試料に由来するバックグラウンド活性及び／又は他の供給源（例えば酵母混入）に由来するバックグラウンドに対するさらなる阻害剤の効果を示す図である。実験は、本質的に図４について記載されるように実行された。ルシフェラーゼの活性に対する悪影響は、検査された阻害剤のいずれについても観察されなかった（結果は示さず）。酵母アデニル酸キナーゼは、Ｓｉｇｍａから得られた。図７Ａ；Ａｐ６Ａによるアデニル酸キナーゼの阻害の比較、ＭＡＫ＝ウサギ筋肉ＡＫ（ミオキナーゼ）；ＹＡＫ＝酵母ＡＫ；ＳＡＣ＝Ｓ．アシドカルダリウスＡＫ；ＴＭＡ＝Ｔ．マリティマＡＫ。図７Ｂ；哺乳動物細胞（ＭＡＫ）又は酵母（ＹＡＫ）に由来する混入バックグラウンドアデニル酸キナーゼの阻害についてのＡｐ５Ａ及びＡｐ６Ａの比較。ＡＰ４Ａ（示さず）及びＡｐ６Ａは、いずれも非レポーター哺乳動物組織アデニル酸キナーゼの代表的な例と比較される場合、単量体（細菌）レポーターアデニル酸キナーゼ（サーモトガ・マリティマに由来）の例及びスルホロブス・アシドカルダリウスに由来する三量体（古細菌）アデニル酸キナーゼの例を区別するのに、Ａｐ５Ａに類似するプロファイルを示す（図７Ａ）。Ａｐ４Ａ（示さず）及びＡｐ６Ａは、アッセイが、細菌及び古細菌の酵素並びに菌類起源の酵素（ここでは、サッカロマイセス・セレビシエに由来するＡＫによって代表される）を識別することを可能にしない（図７Ｂ）。この場合、Ａｐ５Ａは、なお、レポーターアデニル酸キナーゼを酵母酵素と識別するために使用することができる。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【０１５９】
天然アデニル酸キナーゼ酵素の精製
バイオマスは、２４の種々の微生物（表３）から産生した。
【０１６０】
古細菌の８つのメンバーを、１６の種々の好気性細菌及び嫌気性細菌と共に代表とした。これらの生物のそれぞれに由来するＡＫは、選択吸収及びCibacron Blue 3A（Blue Sepharose）からの脱離を使用して親和性クロマトグラフィーによって精製した。酵素はすべて、ゲル濾過（Superdex G200）によってさらに特徴づけ、且つ精製した。これは、主要なＡＫ画分の同定及び分子量の推定を可能にした。
【０１６１】
【表４】
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【実施例２】
【０１６２】
天然アデニル酸キナーゼの安定性の分析
生物に由来するバイオマスから単離したアデニル酸キナーゼの７０、８０、及び９０℃での安定性を評価し、結果を図１に示した。
【０１６３】
アデニル酸キナーゼは、選択吸収及びCibacron Blue 3A（Blue Sepharose）からの脱離を使用して親和性クロマトグラフィーによってバイオマスから単離した。カラムから溶出した試料は、１：１００００に希釈し、次いで、それぞれの１０μｌを、マイクロタイターウェルに添加した。２．５μｌのアピラーゼは、溶出緩衝液から、存在するＡＴＰを破壊するためにそれぞれのウェルに添加し、３０分間、３７℃でインキュベートした。アピラーゼは、２０分間、６５℃での熱処理によって不活性化した。
【０１６４】
ＡＤＰ基質は、添加し、３０分間、７０（パネルＡ）、８０（パネルＢ）、又は９０℃（パネルＣ）でインキュベートし、１０μｌのＤ−ルシフェリン−ルシフェラーゼ試薬の添加の前に２５℃まで冷却した。産生されたＡＴＰは、プレートルミノメーター上でＲＬＵとして測定した。
【実施例３】
【０１６５】
組換えアデニル酸キナーゼの発現及び精製
代表的なＡＫを発現するクローンを生じさせ、古細菌スルホロブス・アシドカルダリウス及び細菌バチルス・ステアロサーモフィラスに由来する組換えＡＫを産生した。プラスミドは、大腸菌の中に形質転換し、細胞抽出物は、ＡＫの期待される分子量に対応する電気泳動上のタンパク質バンドを含有することが示された。ＡＫ活性は、適切な温度でのインキュベーションの後に測定した（スルホロブス・アシドカルダリウスＡＫについては８０℃及びバチルス・ステアロサーモフィラスＡＫについては６０℃）。
【０１６６】
両方のＡＫについての精製法は、確立し、大腸菌に由来するタンパク質を不活性化し、且つ凝集させるための、８０℃での２０分間のインキュベーションの最初の熱処理、その後に続く親和性クロマトグラフィー及びゲル濾過を含んだ。親和性クロマトグラフィーは、Blue Sepharoseへの酵素の吸着、その後に続く低濃度のＡＫ補助因子（ＡＭＰ＋ＡＴＰ及びマグネシウムイオン）を用いる特異的な溶出を含んだ。溶出緩衝液中のＡＴＰ及びＡＭＰ（Sigma社製）は、続く熱処理によって容易に不活性化される中温菌アピラーゼとのインキュベーションによって分解した。ゲル濾過クロマトグラフィーは、調製グレードSuperdexカラムを利用して、大量の両方の酵素を調製することを可能にするためにスケールアップした。
【０１６７】
プライマーは、候補天然酵素のスクリーニングの間に同定された生物に由来するＡＫ遺伝子のＰＣＲ増幅のために設計した。
【０１６８】
微生物は、個々に決定した成長条件を使用して成長させ、ゲノムＤＮＡを単離し、それぞれの生物に由来するアデニル酸キナーゼ遺伝子のＰＣＲ増幅のために鋳型として使用した。生物、サーモトガ・マリティマ、アエロピルム・ペルニクス、スルホロブス・アシドカルダリウス、及びスルホロブス・ソルファタリカスに由来するＰＣＲ増幅した、アデニル酸キナーゼ遺伝子は、ベクター、pET28aの中にサブクローニングし、まれなｔＲＮＡを発現するコドン増強（codon enhanced）大腸菌株の中に形質転換した（Zdanovsky et al, 2000）。この大腸菌株は、ＡＴリッチ遺伝子の発現レベルを増強するのに適している。
【０１６９】
形質転換の成功は、ミニ発現研究によって評価し、結果は、ＩＰＴＧを用いる誘発前後に培養上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥはまた、試料中に存在する熱不安定タンパク質を除去するためにＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に流す前に２０分間、８０℃まで試料を加熱することからなる熱処理ステップを含めた後に上清を分析するためにも使用した。
【実施例４】
【０１７０】
組換えアデニル酸キナーゼの安定性の分析
組換えｔＡＫ酵素の安定性は、粗製大腸菌細胞溶解物中で評価した。
【０１７１】
細胞は、本質的に実施例３において記載されるように成長させ、超音波処理によって溶解した。粗抽出液のＡＫ活性は、３０分間、８０℃での熱処理、その後に続く１０倍段階希釈の前後に決定した。
【０１７２】
結果（図２を参照されたい）は、種々様々の組換え酵素が本発明の方法における使用に適していることを実証する。特に好ましいＡＫは、Ｔ．マリティマ、Ａ．フルギダス、及びＳ．ソルファタリカスに由来するものである。必要とされる場合、そのような酵素は、おそらく、さらなる感度をもたらすために、生物発光アッセイについてより優れたダイナミックレンジをもたらすであろう。
【実施例５】
【０１７３】
安定性を改善するためのアデニル酸キナーゼの遺伝的修飾
部位特異的突然変異体は、当業者らに知られている標準の方法を使用して、実施例６〜８及び配列番号１７〜１９においてそれぞれ示されるように、Ｐ．フリオスス、Ｐ．ホリコシイ、及びＳ．アシドカルダリウスに由来するＡＫ遺伝子において構築した。
【０１７４】
それぞれの遺伝子において同定された特異的な変化に加えて、Ｓ．アシドカルダリウス配列において下線を引いた領域は、古細菌アデニル酸キナーゼ三量体構造のコアパッキング領域を形成する。よって、この領域のパッキングを妨害するアミノ酸置換は、おそらく、酵素の熱及び物理的安定性を減少させる際に主要な効果を有するであろう。反対に、コアパッキングを改善するアミノ酸置換、特に大きな側鎖を有する疎水性残基は、熱又は他のプロセスに対して酵素を安定化するかもしれない。したがって、既に記載されている特異的な突然変異に加えて、多くの「選択的な」アプローチを、これらの領域中の関連する遺伝子配列の局所的な遺伝子シャッフリング（本質的に、Stemmer (1994) Nature 370:389-391及びCrameri et al (1996) Nature Biotech. 14:315-319において記載される）及び縮重オリゴヌクレオチド又は修飾ヌクレオチドミックスを使用する、ランダムなＰＣＲベースの突然変異誘発（例えばVartanian et al (1996) Nucleic Acid Res.24:2627-2633）と共に使用した。多くのこれらの修飾は、大腸菌中での組換え発現及び高温での溶解細胞のアデニル酸キナーゼ活性の高速アッセイによって評価した場合、安定性の改変を示す。
【実施例６】
【０１７５】
安定性の改善をもたらすために遺伝的に操作した、パイロコッカス・フリオススに由来するアデニル酸キナーゼ（配列番号１７）
MPFVVIITGI PGVGKSTITR LALQRTKAKF RLINFGDLMF EEAVKAGLVK HRDEMRKLPL (KからE) IQRELQMKA AKKI (TからA) EMAKE HPILVDTHAT IKTPHGY (MからL) LG LPYEVVKTLN PNFIVIIEAT PSEILGRRLR DLKRDRDVET EEQIQRHQDL NRAAAIAYAM HSNALIKIIE NHEDKGLEEA VNELVKILDL AVNEYA
【０１７６】
１若しくは２以上又はすべての示される部位での突然変異は、酵素の安定性を修飾する。強調した３つの明示した変化に加えて、他の小さな疎水性残基（Ｉ、Ｌなど）又はより大きな疎水性残基（Ｆなど）への１５７位でのアラニンの修飾は、組換えタンパク質の安定性を増加させる。よって、これらの部位での修飾の組合せを通して可能な３５のバリアントがある。Ｔ（Ｐ．ホリコシイのＡｄｋＡにおける等価な位置に観察される）、Ｓ  Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｒなどのような極性残基へのアミノ酸１５７の修飾は、安定性の減少をもたらす。
【実施例７】
【０１７７】
安定性の改善をもたらすために遺伝的に操作されたパイロコッカス・ホリコシイに由来するアデニル酸キナーゼ（配列番号１８）
太字で示し且つ下線を引いた残基のいずれか又は両方の修飾は、酵素の安定性を増加させた（３つのバリアントが可能である）。
MPFVVIITGI PGVGKSTITK LALQRTRAKF KLINFGDLMF EEALKLGLVK HRDEMRKLPL EVQRELQMNA AKKIAEMAKN YPILLDTHAT IKTPHGYLLG LPYEVIKILN PNFIVIIEAT PSEILGRRLR DLKRDRDVET EEQIQRHQDL NRAAAIAYAM HSNALIKIIE NHEDKGLEEA VNELVKILDL AVKEYA
【実施例８】
【０１７８】
安定性の改善をもたらすために遺伝的に操作されたスルホロブス・アシドカルダリウスに由来するアデニル酸キナーゼ（配列番号１９）
下線を引いて示された残基の修飾は、酵素の安定性を増加させることができる。
MKIGIVTGIP GVGKSTVLAK VKEILDNQGI NNKIINYGDF MLATALKLGY AKDRDEMRKL SVEKQKKLQI DAAKGIAEEA RAGGEGYLFI DTHAVIRTPS GY (AからM) PGLPSYV ITEINPSVIF LLEADPKIIL SRQKRDTTRN RNDYSDESVI LETINFARYA ATASAVLAGS TVKVIVNVEG DPSIAANEII RSMK
【実施例９】
【０１７９】
酢酸キナーゼ及びピルビン酸キナーゼの発現
実施例３の方法に従って、発明者らは、酢酸キナーゼ及びピルビン酸キナーゼを発現した。
配列番号２０−サーモトガ・マリティマに由来する酢酸キナーゼ
配列番号２１−パイロコッカス・ホリコシイに由来するピルビン酸キナーゼ
配列番号２２−スルホロブス・ソルファタリカスに由来するピルビン酸キナーゼ
配列番号２３−サーモトガ・マリティマに由来するピルビン酸キナーゼ
配列番号２４−パイロコッカス・フリオススに由来するピルビン酸キナーゼ
配列番号２５−メタノサルシーナ・サーモフィラに由来する酢酸キナーゼ
配列番号７８−大腸菌に由来するアデニル酸キナーゼ
配列番号７９−大腸菌に由来するピルビン酸キナーゼ
配列番号８０−大腸菌に由来する酢酸キナーゼ
配列番号８１−メタノコックス・ボルタエ（ＭＶＯ）に由来するアデニル酸キナーゼ
配列番号８２−メタノコックス・サーモリソトロフィカス（ＭＴＨ）に由来するアデニル酸キナーゼ
配列番号８３−バチルス・グロビスポラスに由来するアデニル酸キナーゼ
配列番号８４−バチルス・スブチリスに由来するアデニル酸キナーゼ
【実施例１０】
【０１８０】
口腔体液試料中のＣ型肝炎の検出
抗体は、標準の方法を使用して、構造タンパク質（例えばＥ１及びＥ２）又は非構造的タンパク質（例えばＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂ）のいずれかに由来するＣ型肝炎表面抗原に対して産生した。手短に言えば、タンパク質は、大腸菌中で組換えタンパク質として発現させる又は短い免疫原性ペプチドとして合成する。短いペプチドは、ＨＬＡなどのような適したキャリアにコンジュゲートし、約１００μｇ／ｍｌの濃度でウサギ又はモルモットに筋肉内注射した。フロイント完全アジュバントは、免疫化の第１の段階で使用し、不完全アジュバントは続いて使用する。
【０１８１】
ポリクローナル血清は、３か月の時間経過にわたる３回の毎月の抗原投与の後に収集する。ＩｇＧは血液から精製し、標準の結合化学反応を使用して、Ｔｍａ  ｔＡＫにコンジュゲートする。手短に言えば、抗体は、３ＳＰＤＰ対１Ｔｍａ  ｔＡＫのモル比でＳＰＤＰ（Pierce Chemical company社製）を使用して誘導体化する。Ｔｍａ中の遊離スルフヒドリルは、ＤＴＴを用いる限定的な処理によって放出し、タンパク質は、誘導体化された抗体と反応する。次いで、抗体−ｔＡＫコンジュゲートは、ゲル濾過クロマトグラフィーを使用して分離する。
【０１８２】
口腔歯肉滲出液試料は、適したスワブデバイスを使用して収集する。デバイスは、乾燥器中９０℃で１分間、加熱し、次いで、抗ＨＣＶポリクローナル抗体−ｔＡＫコンジュゲートを含有する１ｍｌの溶液と混合する。次いで、スワブは、いかなる非結合コンジュゲートも除去するために冷水中ですすぎ、Ｍｇ−ＡＤＰ、ルシフェリン、及びルシフェラーゼを含む試薬ミックスを含有する試薬チューブの中に入れる。スワブは、２分間インキュベートし、次いで、全試薬チューブは、携帯型の衛生モニターの中に入れ、読み取り値を直ちに測定する。
【実施例１１】
【０１８３】
例えば、麻疹ワクチンを用いる免疫の後の又は感染性麻疹ウイルスへの曝露の後の初期の段階での血清又は全血の試料中の免疫状態の検出
麻疹糖タンパク質の断片、他の麻疹ウイルス表面成分、又は熱不活性化麻疹ウイルスは、ディップスティックなどのような固体支持体をコートするために使用する。いかなる非レポーターキナーゼも不活性化するための２Ｍまでの尿素を含む、ＰＢＳを用いて１：２に希釈した全血の試料を、ディップスティックに適用し、麻疹成分に抗体を結合させる（結合ステップ１；３０℃で５分間）。この段階の間にいかなるＡＴＰも不活性化するために、アピラーゼを血液試料に添加する。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．４）を用いて簡単にすすいだ後に、ディップスティックを、ｔＡＫにコンジュゲートされた抗ヒトＩｇＧを含有する溶液中に浸し、インキュベートする（結合ステップ２；３０℃で５分間）。さらに、ディップスティックを簡単にすすぎ、次いで、試薬チューブ内に配置する。ルシフェリン／ルシフェラーゼ及びＡＤＰを同時に添加し、反応を、５分後に、携帯型のルミノメーターを使用して測定した。
【実施例１２】
【０１８４】
糞便試料中のノロウイルスの検出のための試料調製
ノロウイルスは、臨床診断のために下痢試料（つまり糞便試料）中でルーチン的に測定される。
【０１８５】
混入キナーゼ活性のレベルを低下させるために、糞便試料は、混入キナーゼを不活性化するように設計した緩衝液を用いて１：２〜１：４に希釈する。この緩衝液は、１又は２以上の以下の成分を含む。
２Ｍ尿素；２Ｍグアニジン；１％ＳＤＳ；１％デオキシコレート；１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００
【０１８６】
上記の成分の添加もまた、次の実施例において記載される抗体コンジュゲートによる、ノロウイルス抗原をより容易に検出可能にし、アッセイシグナルを増加させ、アッセイノイズを低下させる。任意選択で、アピラーゼもまた、存在するかもしれないいかなるＡＴＰも破壊するために試料に添加してもよい。
【０１８７】
同じタイプの添加剤もまた、嘔吐物、ノロウイルスについて試験するのに有用であろうが、今日までのところ、分析に適していない試料中のノロウイルスの検出のための試料処置成分として使用することができる。
【実施例１３】
【０１８８】
糞便試料中のノロウイルス及び／又はＣ−ディフィシル毒素の検出のためのラテラルフローアッセイ
レポーターキナーゼコンジュゲートは、Ｐ．アビシに由来するアデニル酸キナーゼの、ノロウイルスＶＰ１タンパク質又はその断片（例えばＰ−ドメイン（アミノ酸３６２と７０３の間に位置する）、Ｐ２ドメイン（アミノ酸４１４〜５８９）、又はＰ１ドメインのサブ断片（アミノ酸３６２〜４１３若しくは５９０〜７０３）へのコンジュゲートによって調製する。ノロウイルス内の位置は、Chen R, Neill JD, Estes MK, Prasad BV. X-ray structure of a native calicivirus: structural insights into antigenic diversity and host specificity. Proc Natl Acad Sci U S A. (2006) 103 p8048-53において記載されるナンバリングに対応する。
【０１８９】
ラテラルフローデバイスは、本質的に図５において示されるように調製する。試料受入ゾーンは、１又は２以上の抗ノロウイルス抗体を用いてコートする（臨床分離株の抗原性的に種々の範囲の検出をもたらすために）。次いで、レポーターキナーゼコンジュゲート（上記に記載される）は、抗体を介して試料受入ゾーンに結合する。
【０１９０】
臨床糞便試料は、上記の実施例１２において概要を述べるように、処置し、デバイスの試料受入ゾーンに適用する。ノロウイルスの存在下において、レポーターキナーゼコンジュゲートは外れ、バックグラウンド低減ゾーンを介して検出ゾーンに移動する。バックグラウンド低減ゾーンは、もとの試料内に含有されていたいかなるＡＴＰも保持する陰イオン交換膜を含む。中性ｐＨの緩衝液（ＰＢＳなど）を使用することによって、ＡＴＰは、陰イオン交換膜上に保持されるが、レポーターキナーゼコンジュゲートは、等電点未満のままであり、したがって陽イオン性であるので、通過する。非レポーターキナーゼは、試料調製段階において先に除去されている（実施例１２を参照されたい）。
【０１９１】
次いで、ラテラルフローデバイスは、２つに切り離し、次いで、検出ゾーンを、ＡＤＰ、ルシフェリン、及びルシフェラーゼを含有する試薬チューブの中に配置する。もとの試料中のノロウイルスの存在は、２〜５分間のアッセイ時間で光出力の測定によって決定する。
【０１９２】
同様に、ラテラルフローデバイスは、試料中のＣ．ディフィシル毒素Ａ又は毒素Ｂの存在を検出するために提供してもよい。これらの標的に対する抗体は、文献において十分に記載されており、上記に記載されるようにレポーターアデニル酸キナーゼ（複数可）にコンジュゲートすることができる。糞便試料は、実施例１２におけるように処置し、ラテラルフローアッセイは、記載されるように実行する。
【０１９３】
任意選択で、デバイスは、試料中のＣ．ディフィシル毒素（複数可）又はノロウイルスの存在を検出するために提供され、臨床試料の特異な診断が実行されることを可能にしてもよい。試料は、実施例１２において記載されるように処置し、同じ反応液中でノロウイルス及びＣ．ディフィシル毒素（複数可）の両方についての診断試薬と混合する。試料は、２つの標的のうちの１つのみを捕捉するために組み立てた２つの個別のラテラルフローデバイス上に又は優先的に、２つの捕捉ウィンドウを有する単一のデバイス上に流してもよい。次いで、これらの２つのデバイス又は２つのウィンドウは、１又は２以上の標的種の存在を決定するために個別にアッセイする。
【実施例１４】
【０１９４】
水試料中のレジオネラの検出
アッセイは、図６において記載されるデバイスを使用して実行する。
【０１９５】
冷却塔からの水試料は、ルーチン的なメンテナンスの時点でサンプリングする。典型的に、抗レジオネラ抗体（抗体Ａ；又はその断片）を用いてコートされたラテックスビーズ及び第２の抗レジオネラ抗体（抗体Ｂ）に化学的にコンジュゲートされたＡ．フルギダスに由来するレポーターキナーゼを既に含有しているシリンジに５０ｍｌの水を、添加する。任意選択で、抗体Ａ及びＢは、同じ抗体であってもよい、ただし、レジオネラの表面上に多数の結合部位があることを条件とする。好ましくは、それらは、レジオネラの異なるエピトープを認識する異なる抗体である。レジオネラが水試料中に存在する場合、それは、抗体Ａを介してラテックスビーズに結合するようになる。レポーターキナーゼは、既に結合しているレジオネラとの抗体Ｂの相互作用を介してラテックスビーズに結合する。
【０１９６】
シリンジは、手によって又は任意選択で適した自動振盪機内で５分間継続的に振盪する。シリンジは、水、非レポーターキナーゼ、ＡＴＰ、複合体形成していないレポーターキナーゼコンジュゲート、及び複合体形成していないあらゆる微生物の自由な通過を可能にするように設計されたフィルターを含有するがラテックスビーズに結合したいかなるものでも保持するであろう濾過デバイスに、適用する。したがって、ラテックスビーズに結合したレポーターキナーゼもフィルター上に保持されるであろう。
【０１９７】
フィルターは、フィルターケースから取り出し、試薬チューブの中に移動する。レジオネラの存在は、ＡＤＰ、ルシフェリン、及びルシフェラーゼの添加並びに携帯式のルミノメーターを使用する光出力の測定よって評価する。
【実施例１５】
【０１９８】
スワブ試料中のクラミジアの検出
スワブデバイスは、試験個人に由来する膣試料を収集するために使用する。スワブは、組織を破壊するのを援助するための１Ｍ尿素及びいかなる非レポーターキナーゼの活性も遮断する２μＭ  Ａｐ５Ａ最終濃度を含有する試薬チューブ中に配置する。Ａｐ５Ａの存在は、ルシフェラーゼの活性に対して有害な効果を有しておらず（図４Ｂを参照されたい）、よって、それが最終反応液中に存在しても、それは、検出限界に悪影響を及ぼさない。
【０１９９】
レポーターキナーゼコンジュゲートは、クラミジア抗原にＳ．ソルファタリカスに由来するアデニル酸キナーゼをコンジュゲートすることによって調製する。適したクラミジア抗原は、クラミジアの表面上に多数存在する主要な外部膜タンパク質（ＭｏＭＰ，major outer membrane protein）である。一連の多形膜タンパク質もまた記載されており、特異的で感度のよい検出に適した標的抗原となりうる。抗体は、このタンパク質又は従来のプロトコールに従ってそれから誘導されるペプチドに対して生成することができる。
【０２００】
ラテラルフローデバイスは、図５において記載されるように調製する。デバイスの試料受入ゾーンは、クラミジア抗原に対する抗体を用いてコートする。次いで、レポーターキナーゼコンジュゲートは、デバイスの試料受入ゾーン上に適用し、コンジュゲートの抗原とコートした抗体との間の相互作用を介してそれに結合するようになる。
【０２０１】
次いで、少量の試料を、デバイスの試料受入ゾーン上に配置する。試料中に存在するいかなるクラミジア抗原も、試料受入ゾーンからレポーターキナーゼコンジュゲートを外し、それを測定することができる検出ゾーンへのレポーターキナーゼコンジュゲートの流れを可能にする。次いで、デバイスは、試薬チューブ中に、且つＡＤＰ及びルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬と共に配置する。光出力シグナルは、５分以内に測定する。
【０２０２】
代替抗原として、クラミジアに由来する細菌性脂質多糖体に対して産生された抗体を利用し、レポーターキナーゼにコンジュゲートしてもよい。この多価標的は、他の標的よりも優れた感度及び特異性をもたらしてもよい。任意選択で、２つ以上の標的抗原は、検出されたシグナルを増幅するために組み合わせられてもよい。
【実施例１６】
【０２０３】
食物試料中のリステリアの検出
リステリアを含有することが疑われる食物試料は、試料成分をプレートに非特異的に結合し、それへのさらなる非特異的結合を予防するためにプレートを処理し、且つ洗浄することによってマイクロタイタープレート上に固定する。
【０２０４】
レポーターキナーゼコンジュゲートは、リステリアに特異的な抗体を、Ｓ．ソルファタリカスに由来するピルビン酸キナーゼにコンジュゲートすることによって調製する。
【０２０５】
レポーターキナーゼコンジュゲートは、プレートに適用し、さらなる洗浄／回収前に結合させる。プレートは、ここで、存在するいかなる非レポーターＡＫも変性させ、微生物内に閉じ込められているかもしれないいかなるＡＴＰも放出するために細胞抽出緩衝液中で約１分間、約９０℃まで加熱する（サーマルサイクラー中で）。次いで、プレートは、３７℃まで冷却し、アピラーゼなどのような熱不安定性ＡＴＰアーゼを添加する。プレートは、バックグラウンドＡＴＰを除去するために約５分間インキュベートし、次いで、熱不安定性ＡＴＰアーゼを変性させるために温度を約９０℃まで上げる。
【０２０６】
次に、ＡＤＰ並びにルシフェリン及びルシフェラーゼ混合物の混合物を、プレートに同時に添加する。キナーゼは、ＡＤＰに対して作用して、ＡＴＰを生成し、これは、ルシフェリン／ルシフェラーゼと続いて反応して、光を産生する。光出力は、携帯型のルミノメーターを使用して測定し、存在する微生物の濃度に対して正比例する。
【実施例１７】
【０２０７】
食物試料中のサルモネラの検出
固相は、モルモットにおいて産生された第１の抗サルモネラポリクローナル抗体を用いて磁気ビーズをコートすることによって調製する。
【０２０８】
レポーターキナーゼコンジュゲートは、Ｔ．マリティマに由来するアデニル酸キナーゼを、モルモットにおいて産生された第２の抗サルモネラポリクローナル抗体にコンジュゲートすることによって調製する。
【０２０９】
試験する食物試料は、１Ｍ尿素及び２μＭ  Ａｐ５Ａを含有する緩衝液中に分散させ、磁気ビーズ及びレポーターキナーゼコンジュゲートの存在下において５分間混合する。この混合は、室温又は高温で実行することができる。サルモネラが食物試料中に存在する場合、それは、磁気ビーズ上の第１の抗サルモネラ抗体に結合するであろう。次には、レポーターキナーゼコンジュゲートは、第２の抗サルモネラ抗体と、既に結合しているサルモネラとの間の相互作用を介して磁気ビーズに結合するであろう。
【０２１０】
次いで、磁気ビーズは、強い磁石への引力によって収集し、中性緩衝液を用いて洗浄する。結合したビーズを有する磁石は、試薬チューブに移動し、ＡＤＰ、ルシフェリン、及びルシフェラーゼを同時に添加する。光出力シグナルは、５分間以内で、好ましくは携帯型のルミノメーター中で読み取る。
【実施例１８】
【０２１１】
大量の液体を滅菌するためのプロセスの検証
インジケーター１の調製
第１のインジケーターは、スルホロブス・ソルファタリカスに由来する０．１ｍｇのピルビン酸キナーゼをポリスチレンストリップに共有結合することによって調製する。
【０２１２】
インジケーター２の調製
第２のインジケーターは、Ａ．フルギダスに由来する０．１ｍｇのアデニル酸キナーゼを透析チューブなどのような半透膜の内面に結合することによって調製する。Ａ．フルギダスキナーゼは、ＢＭＰＨ（Pierce社製）と反応することができる、天然に存在する反応性システイン残基（つまり、天然酵素内でジスルフィド結合していない）を含有する。適した酸化剤を用いるヴィスキング管材料の処理によって例えば生成されるように、これにより、酸化炭水化物と反応することができる基が生成される。酵素を膜表面と反応させ、共有結合インジケーターを生成する。
【０２１３】
検証
次いで、インジケーターを大量の液体内に結合し、滅菌プロセス（加圧滅菌、酸化ガスの通過、又は他の化学的滅菌などのような）を実行する。
【０２１４】
インジケーターは、プロセスの完了と同時に大量の液体から取り出し、キナーゼの残存活性を測定する。測定を達成するために、インジケーターは、最初に、２分間、１０μｇ／ｍｌの濃度で、アピラーゼの存在下においてインキュベートする。アピラーゼは、５μＭの濃度のＡｐ５ａの添加によって不活性化することができる。次いで、２つのインジケーターは、ＡＤＰ、ルシフェリン、及びルシフェラーゼを含有する組み合わせた試薬の添加によって独立して読み取ることができる。測定は、衛生モニターなどのような携帯型のルミノメーターを使用して５分間以内でなされる。
【０２１５】
本実施例において、存在するかもしれないいかなる非レポーターキナーゼも、処理条件によって破壊され、そのため、特異的なキナーゼ低減ステップは必要とされない。次いで、残存活性は、決定した閾値と比較する。
【実施例１９】
【０２１６】
生物学的界面活性剤を使用する布地洗浄サイクルの性能の検証
インジケーター１の調製
第１のインジケーターは、ジスルフィド結合形成に基づく方法を使用して、柔軟なポリスチレン棒の上に、Ｓ．ソルファタリカスに由来するアデニル酸キナーゼを架橋することによって調製する。この方法では、アデニル酸キナーゼは、１〜３のＳＰＤＰ：タンパク質の比で、スルホスクシンイミジル６−（３’−［２−ピリジルジチオ］−プロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＰＤＰ，Sulfosuccinimidyl 6-(3’-[2-pyridyldithio]-propionamido)hexanoate；Pierce chemical company社製、ＵＫ）などのようなヘテロ二官能性作用物質を用いて誘導体化する。次いで、誘導体化したキナーゼは、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）又は２−メルカプトエタンスルホン酸）（ＭＥＳＮＡ，2-mercapto ethane sulfonic acid）などのような還元剤との反応によって還元し、還元剤は、透析によって除去し、キナーゼは、マレイミド誘導体化ポリスチレン表面と反応させる。典型的に、０．１ｍｇのキナーゼがインジケーター上に存在する。
【０２１７】
インジケーター２の調製
第２のインジケーターは、高タンパク質結合ポリスチレンストリップ上へのＳ．アシドカルダリウスに由来するアデニル酸キナーゼの非特異的付着によって調製する。キナーゼは、任意選択で、０．１〜２％ｗ／ｖの安定化剤ソルビトールを含有する重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中０．５〜２ｍｇ／ｍｌの濃度で調製する。次いで、結合緩衝液中のキナーゼは、２２℃、１〜２時間の期間（一晩４℃で）、高タンパク質結合ポリスチレンストリップと共にインキュベートする。残りのキナーゼは、リン酸緩衝生理食塩水中で洗浄することによって除去する。典型的に、０．１ｍｇのキナーゼがインジケーター上に存在する。
【０２１８】
洗浄サイクルの検証
洗浄機に、洗浄するアイテムを載せ、インジケーターを、洗浄機の内側の適したホルダー内に定着させる（その回収を容易にするために）。次いで、洗浄サイクルを実行する。サイクルの完了時に、インジケーターを取り出し、キナーゼの残存活性を評価する。本実施例では、洗浄プロセスは、いかなる非レポーターキナーゼも及びいかなる残りのＡＴＰも両方とも除去し及び／又は不活性化し、よって、どちらもアッセイに干渉しない。レポーターキナーゼの存在は、ＡＤＰの添加、その後に続く１分間以内のルシフェリン及びルシフェラーゼの添加によって決定する。
【０２１９】
残りのキナーゼ活性の測定値があらかじめ決定される閾値レベルと等しい又はそれ未満である場合、洗浄物は、さらなる処理のためにきれいにする。
【実施例２０】
【０２２０】
フィブリンベースのインジケーターデバイスの調製
フィブリンに架橋するためのｔＡＫ融合体の調製
トランスグルタミナーゼ基質配列（MNQEQVSPLGG−配列番号３３）を、コドン最適化遺伝子クローンによってコードされるＳ．アシドカルダリウスに由来するアデニル酸キナーゼのＮ末端、Ｃ末端、又はＮ末端及びＣ末端の両方に添加する。この構築物は、社内の発現ベクター（pMTL 1015；国際公開第２００５／１２３７６４号パンフレットにおいて記載される）の中にＮdeI-SalI断片として移動する。発現構築物は、ＤＮＡ塩基配列決定法によって確認し、続く発現のために発現宿主ＢＬ２１又はＲＶ３０８の中に移動する。
【０２２１】
同様に、サーモトガ・マリティマに由来する再合成ｔＡＫ遺伝子（配列番号２９）を、上記に同定される３つの方向づけでトランスグルタミナーゼ配列に融合する。発現系のクローニング及び調製もまた、上記に記載されるとおりとする。
【０２２２】
融合体構築物はまた、続く精製のためのアフィニティータグの添加と共に他の発現ベクター−宿主の組合せで発現することができる。この関連において特に有用なのは、融合タンパク質のＮ末端又はＣ末端上に６−ヒスチジンタグ、精製及び検出を援助するが、融合タンパク質の固有の特性に干渉しない修飾を添加する発現ベクターである。このタイプの修飾のためのベクターは、pETシリーズベクター（Novagen社製／Merck）及びpQEシリーズベクター（Qiagen社製）を含む。
【０２２３】
インジケーターデバイスの材料を生成するために、発現株は、本質的に静置培養条件下で、８リットル発酵槽中で最初に成長させる。手短に言えば、株は、シードストックとして調製し、続いて、８リットルの成長培地（さらなるグルコースを含有する修飾テリフィックブロス）の中に希釈する。培養物が、それらが定常条件（典型的にＯＤ＝５のあたり）に入っていることを実証する光学密度（６００ｎｍでのＯＤ）に達するまで、培養物は、標準の発酵条件下で成長させる。次いで、発酵槽は、継続的な遠心分離によって材料を採取する前に、１２時間までの間、最小限の通気条件下で保持する。
【０２２４】
ｔＡＫ融合体の精製
次いで、採取した材料は、以下のプロトコールに従って精製する。
緩衝液Ａ：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；９００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５
洗浄緩衝液：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；２００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５
緩衝液Ｂ：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；２００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５
１０ｍＭ  ＡＴＰ；１０ｍＭ  ＡＭＰ；１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
ＭｇＡｃ緩衝液：１５ｍＭ  ＭｇＡｃ（１Ｍ  Fluka BioChemika社製）、ｐＨ６．８
１．凍結細胞ペーストを量り（１０ｇ）、３×（３０ｍｌ）容量の緩衝液Ａ、ｐＨ７．５中に再懸濁する。
２．３０秒間オン／３０秒間オフの２５サイクルを使用して、氷上で超音波処理する（約１２，０００ｋｈｚ）。１ｍｌの試料を採取する。
３．超音波処理した細胞溶液を、４度で３０分間、６，０００ｒｐｍで遠心分離する。上清を注意深く流し、１ｍｌの試料を採取する。
４．上清を２０分間ウォーターバス中で８０℃で熱処理する。１ｍｌの試料を採取する。（このステップは、融合タンパク質の熱安定性に依存する任意選択のステップである）。
５．熱処理した溶液を、４度で３０分間、６０００ｒｐｍで遠心分離する。上清を流し、１ｍｌの試料を採取する。
６．カラム上に装填する前に０．２μｍの低結合フィルターを用いて試料を濾過する。
７．５カラム体積（ＣＶ，Column Volume）の緩衝液Ａを用いてBlue Sepharose Fast Flowカラムを平衡化する。
８．試料を装填する。０．２ｍｌ／分で洗浄緩衝液を用いてカラムを一晩洗浄する。
９．１ｍｌ／分の流速で１００％緩衝液Ｂを用いてタンパク質を溶出し、２．５ｍｌ画分中の産物を収集する。
１０．一度すべてのタンパク質が溶出したら、５ＣＶで５ｍｌ／分で１００％緩衝液Ｂを用いてカラムを洗浄する。
１１．５ＣＶの緩衝液Ａを用いてカラムを再平衡化する。
１２．４℃での保管のために５ＣＶの２０％エタノールを用いてカラムをすすぐ。
【０２２５】
任意選択で、さらなるタンパク質精製法が、高純度産物を得るために適用される。SP-Sepharose Fast Flow又はQ-Sepharose Fast Flow樹脂上のイオン交換クロマトグラフィーは、特に有効である。
【０２２６】
次いで、試料は、ピークアデニル酸キナーゼ活性を含有する画分を同定するために標準のアッセイ形式を使用して分析する。これは、標準の技術を使用し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって確認する。手短に言えば、アッセイ方法は、以下のプロトコールを使用して実行する。
１．Ｍｇ  Ａｃ緩衝液中で精製ｔＡＫ融合体を１：１０００及び１：１０，０００に希釈する。ウェル当たり１００μｌを添加する。
２．アピラーゼを用いて処理し（１ｍｌ当たり２．５ユニットのストック濃度で５０μｌ／ウェル；ジャガイモに由来するSigma社製グレードVIアピラーゼ）、ＡＴＰを除去するために振盪しながら３０℃で３０分間インキュベートする。
３．アピラーゼを変性させるために１０分間７０℃でプレートをインキュベートする。
４．５０μｌ／ウェルのＡＤＰを添加し（ＭｇＡｃ緩衝液中２７５μＭ  ＡＤＰ）、密封する。２０分間７０℃でインキュベートする。
５．プレートを取り出し、２０分間室温まで冷却させ、２０分間室温までルシフェラーゼ／ルシフェリン（Ｌ／Ｌ）試薬を温める。
６．プレート当たり１又は２つの空のウェルに２００μｌ  ＡＴＰ標準物質を添加する。
７．ルミノメーター上にインジェクターを組み立て、Ｌ／Ｌ試薬（ＡＴＰ試薬、Biotherma社製）をそれらに注入する。３０μｌ  Ｌ／Ｌ試薬／ウェルを注射する。
８．ルミノメーターを使用して生成された光を直ちに読み取る。
【０２２７】
次いで、ピークキナーゼ活性を有する画分は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ  ｐＨ７．４）に対して大規模に透析し、必要となるまで保管する。任意選択で、融合体は、フィブリン膜内の酵素活性を組み込むためのさらなる手段を提供するために、ｔＡＫと完全長フィブリノーゲン分子との間で調製することができる。
【０２２８】
固体支持体上へのｔＡＫ融合体の沈着
ｔＡＫ−フィブリン融合体は、ＰＢＳ又は重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中で約２００μｇ／ｍｌまで希釈し、３１６Ｌグレードステンレス鋼、プラスチック、ガラス、又は織物の固体支持体に適用する。タンパク質は、室温で２時間まで又は一晩４℃で表面に付着させる。
【０２２９】
任意選択で、さらなるキャリア分子、例えば、１％ｗ／ｖまでの濃度のスクロース、１ｍｇ／ｍｌまでのアルブミン、０．５％ｗ／ｖまでのブタムチンは、この段階で添加する。そのようなキャリアの添加は、あるタイプのインジケーターに特に重要であるかもしれないが、キャリアの存在は、次の段階において適用されるフィブリン膜への続く相互作用及び架橋に干渉するべきでない。
【０２３０】
フィブリン含有土壌のオーバーレイ及びフィブリン−ｔＡＫ融合体への架橋
フィブリノーゲンを含有する溶液は、フィブリン含有試験土壌（生物学的マトリックス）へのインジケーターの架橋を達成するために添加する。
【０２３１】
３ｍｇ／ｍｌまでのフィブリノーゲン（第XIII因子を含有する）、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、及びトロンビン（１ｍｌ当たり５ＮＩＨユニットまで）を含有する溶液を新たに混合し、固体支持体のコートした表面に添加する。反応は、必要とされる架橋レベルに依存して、３０分間までの間、室温で進行させる。任意選択で、アルブミン（８０ｍｇ／ｍｌまで）及びヘモグロビン（８０ｍｇ／ｍｌまで）は、血液様の土壌のクリーニングのためのより困難でより現実的な課題を提供するために、この段階で添加する。架橋の後に、残液を除去し、インジケーターデバイスを乾燥させる。
【０２３２】
任意選択で、ｔＡＫ−フィブリンペプチド融合体は、固体支持体表面へのその添加の前に、フィブリン含有試験土壌溶液（生物学的マトリックス）に添加する。マトリックスへのフィブリンペプチドの架橋は、より多くの第XIII因子を添加する及び／又は反応の期間を拡張することによって増加させることができる。架橋はまた、フィブリンペプチドが分子の両端に添加されたｔＡＫ融合タンパク質の使用によって増強することができる。任意選択で、フィブリノーゲン−ｔＡＫ融合体は、インジケーターの架橋をさらに提供するために、この溶液に直接添加することができる。
【０２３３】
フィブリン又はフィブリノーゲンへのｔＡＫの共有結合の化学的架橋
ｔＡＫは、当業者らによく知られている広範囲の方法によってフィブリン、フィブリンペプチド、又はフィブリノーゲンに化学的に結合させてもよい。例えば、フィブリノーゲン又はフィブリンについての精製タンパク質調製物は、民間の供給源（例えばSigma）から得られる。Ｓ．アシドカルダリウスに由来するｔＡＫは、上記に記載されるように調製する。ｔＡＫは、メーカーの指示に従って、アミド反応性試薬ＳＰＤＰ（ＳＰＤＰ，N-Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)-propionate（Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート）；Pierce chemical company社製）を使用して誘導体化する。フィブリン又はフィブリノーゲンもまた、同じプロトコールを使用して誘導体化する。誘導体化ｔＡＫは、反応性スルフヒドリル基を得るためにメルカプトエタノールとの反応によって還元する。次いで、これは、ＳＰＤＰ誘導体化フィブリンと混合し、２つの分子の間で共有結合の形成を引き起こす。反応パートナーの濃度は、経験的にメーカーのＳＰＤＰについての指示内のガイドラインに従って決定するべきである。化学的に連結されたｔＡＫ−フィブリン又はフィブリノーゲンは、区別なく又は融合タンパク質に加えて使用することができる。
【０２３４】
フィブリン−ｔＡＫインジケーターの使用
洗浄機消毒器中での使用
インジケーターは、上記に記載されるように調製する。好ましくは、固体支持体は、長方形のステンレス鋼ストリップ５５ｍｍ×５ｍｍ×０．７５ｍｍであり、一方の又は両方の表面上をコートしてもよい。１つ又は好ましくはいくつかのインジケーターストリップは、洗浄機消毒器のチャンバー内に位置する。最適には、これらは、洗浄プロセスが有効であるという最も高度の確実性を提供するために、きれいにすることが最も困難であるかもしれない部位に位置してもよい。代替的には、それらは、多数のスプレーアーム（つまり、ここで、これらは互いに独立していてもよい）の機能をモニターするために位置してもよい。インジケーターストリップは、それらが洗浄処理の間に動かないことを確実にするために棚又は洗浄機消毒器チャンバーの他の下部構造に留める。代用のデバイスの方向づけは、例えば、コートされた表面が、散水の方向に対して直角となるようにそれらを位置づけることによって、洗浄プロセスの効能に関するさらなる情報を提供するために修正することができる。
【０２３５】
機器洗浄物を添加し、標準の実行サイクルを実行する。実行の終わりに、デバイスをチャンバーから取り出し、機器の取り出し及びあらゆる続く処理の前に、下記に概要を述べられるように、残りのｔＡＫ融合体の存在を評価する。任意選択で、デバイスは、注意深く決定したポイントでプロセスを中断することによって又は実行の間にインジケーターを取り外す方法を提供する機械を使用することによって洗浄プロセスの間に取り出すことができる。
【０２３６】
内視鏡試験手順における使用
内視鏡再処理システムをモニターするためのインジケーターデバイスは、上記に概要が述べられたものに本質的に類似する。類似するサイズのインジケーター表面、内視鏡内のステンレス鋼成分、ＰＴＦＥ管材料、又は他の適切な材料のいずれかの代表を、管状チャンバー内に配置する。これは、内視鏡の前方端又はより好ましくは、患者組織と接触する末端への、適したねじ、押込み、又は差込みによる取付けを介して結合する。これは、内視鏡再処理ユニット内に配置し、内視鏡管材料及びインジケーターデバイスの末端は、ユニット中のポートに結合する。プロセスは、標準で実行し、インジケーターデバイスは、今後の処理又は内視鏡を使用に戻す前に、分析のために実行の終わりに取り出す。
【０２３７】
クリーニング性能を評価するための手段
インジケーターデバイスは、試験プロセスの終わりに取り出す。次いで、インジケーターストリップは、ＡＤＰ、ルシフェリン、及びルシフェラーゼを同時に添加する試薬チューブの中に配置し、シグナルは、２分間で、携帯型のルミノメーター上で読み取る。
【実施例２１】
【０２３８】
ｔＡＫ−Ｓｕｐ３５融合体の調製
Ｓ．アシドカルダリウス又はＴ．マリティマに由来するアデニル酸キナーゼのＮ末端若しくはＣ末端又は両端に融合されたサッカロミセス−セレビジエに由来するＳｕｐ３５のＮ末端ドメインを含有するクローンは、標準のＤＮＡ操作技術によって生成する。クローンはすべて、pMTL1015発現ベクターの中にNdeI−SalI断片として移動し、それらの配列を確認する。発現構築物は、ＢＬ２１又はＲＶ３０８発現株を形質転換するために使用し、材料は、大規模発酵条件においてであるが、最小限の通気で成長させた。
【０２３９】
ｔＡＫ−Ｓｕｐ３５融合体の発現及び精製は、熱変性ステップ（ステップ４）の使用が精製プロトコールの一部ではないことを除いて、本質的に実施例２０において記載されるフィブリン−ペプチド融合体と同じである。手短に言えば、発酵槽に由来する細胞ペーストは、緩衝液Ａ中で再懸濁し、超音波処理によって溶解する。細胞細片は、取り出し（熱処理は、これらのタイプの融合体に典型的に使用されない）、上清は、実施例２０において概要を述べられるようにカラム精製に使用する。
【０２４０】
ある種の成長条件下で、融合タンパク質は、不溶性であるかもしれず、細胞内の封入体として明らかである。この場合、細胞ペレットは、調製し、同じ方法で溶解するが、封入体を含有する、結果として生じる不溶性画分は、遠心分離によって収集する。この物質は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００（５％の濃度まで）を含有する緩衝液（例えばＰＢＳ）中で洗浄する。それぞれの洗浄の後に、融合タンパク質を含有するペレットは、遠心分離によって分離する。５回の洗浄の後に、封入体は、８Ｍ尿素を含有するＰＢＳ中で再可溶化し、３０分間までの間、穏やかに撹拌した。あらゆる残りの不溶性材料は、遠心分離によって除去する。尿素可溶性材料は、５×１０容量までのＰＢＳに対して透析して、尿素を除去し、融合タンパク質をリフォールディングさせる。任意選択で、尿素は、精製に使用される１００容量の急速に撹拌したＰＢＳ又は緩衝液Ａの中に、尿素可溶性調製物を細いゲージ針を通して噴霧することによって、より急速に除去してもよい。材料は、続く処理前に３０分間までの間、撹拌しながら室温に置く。
【０２４１】
融合体の続く精製は、本質的に実施例２０において記載されるように実行する。溶解細胞又は可溶化し、リフォールディングした封入体に由来する上清は、あらかじめ平衡化したBlue Sepharose Fast Flowカラム上に装填する。緩衝液Ａ、続いて洗浄緩衝液中での大規模な洗浄の後に、タンパク質は、緩衝液Ｂを使用して溶出する。ピーク画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析及び酵素アッセイによって決定する。次いで、画分は、プールし、ＰＢＳの中に透析する。
【０２４２】
アミロイド形態へのｔＡＫ−Ｓｕｐ３５の変換
集合して、原線維になる場合のＳｕｐ３５−ｔＡＫ融合体は、汚染除去プロセスの効能を評価するための重要な分子であるプリオンなどのようなアミロイドタンパク質のより好適な代表となる。
【０２４３】
Ｓｕｐ３５−ｔＡＫ融合体のアミロイド形態は、精製可溶性タンパク質をリフォールディングする又は尿素再可溶化封入体調製物の透析に使用する条件を修飾することによって生成する。第１の場合では、立体構造の変化は、ｐＨ４のあたりの条件に対する融合タンパク質の曝露によって誘発する（例えば、任意選択で１ＭまでのＮａＣｌを含有する、ｐＨ７．４の適切に緩衝した溶液の中への透析によって）。後者の場合では、８Ｍ尿素／ＰＢＳ中で再可溶化した融合タンパク質は、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中２Ｍ尿素、３００ｍＭ  ＮａＣｌに対して室温で６〜１２時間透析する。代替的には、原線維化は、類似するインキュベーション条件下で２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０  １０ｍＭ  ＥＤＴＡに対する透析によって誘発することができる。任意選択で、融合タンパク質は、正常なＳｕｐ３５を含有する原線維の中に組み込んでもよい。これは、１：１〜１：１０の融合体：Ｓｕｐ３５の比で、同じ方法で発現した融合されていないＳｕｐ３５と融合体を混合することによって達成する。
【０２４４】
固体支持体上へのｔＡＫ−Ｓｕｐ３５融合体の沈着
固体支持体上への原線維の沈着は、高レベルのＮａＣｌの存在下において適した緩衝液（例えばＰＢＳ  ｐＨ７．４重炭酸緩衝液ｐＨ９．６）中での単純なタンパク質吸着によって達成する。荷電した又はあらかじめコートした表面（例えばポリ−Ｌ−リシンを用いてコートしたプラスチック）の使用は、より有効に融合タンパク質に結合することができる表面を提供するのに有用である。任意選択で、原線維は、スクロース（１％まで）、ブタムチン（０．５％まで）、又はアルブミン（１ｍｇ／ｍｌまで）などのような適したキャリア中で沈着させてもよい。
【０２４５】
試験土壌のオーバーレイ
次いで、試験土壌（生物学的マトリックス）は、上記に記載される表面上に付着させたアミロイド調製物上にオーバーレイする。
【０２４６】
アミロイドインジケーターが埋め込まれる適した生物学的マトリックスは、例えばアルブミンあり又はなしの０．５％ムチン、市販の試験土壌（Browneによって製造されるものなど）又は国内標準委員会及び国際標準委員会による指針書の号において同定される試験土壌のいずれか１つ（例えばＨＴＭ  ０１／０１（ＵＫ）において詳述されるエディンバラ土壌）を含む。
【０２４７】
試験土壌内のアミロイド線維の集合
アミロイドが、複合体マトリックス中で自己集合する能力を考慮すれば、アミロイド−ｔＡＫ融合体は、原線維形成及び続く表面上への沈着前に、土壌組成物と混合することが可能である。これは、アミロイド線維を、他の土壌組成物と混合し、相互キレート化して、表面から除去するのがより難しいかもしれない異なるタイプのマトリックスを提供してもよいという、インジケーターに対するさらなる選択肢を提供する。
【０２４８】
洗浄プロセスにおいて表面からプリオン除去を評価するためのｔＡＫ−Ｓｕｐ３５インジケーターの使用
上記に記載されるインジケーターは、原線維として調製し、０．５％ムチンの存在下において鋼表面上に乾燥させる。インジケーターは、洗浄機消毒器のチャンバー内のあらかじめ決定した位置に配置する。機器洗浄物を添加する。プロセスは、メーカーの指示に従って、スタートし、いかなるプロセス記録も完了する。プロセスの終わりに且ついかなる機器も機械から取る前に、インジケーターデバイスは、実施例２０において記載されるように取り出し、評価する。
【０２４９】
プロテアーゼベースのプロセスにおいてプリオン不活性化を評価するためのｔＡＫ−Ｓｕｐ３５インジケーターの使用
上記に記載されるインジケーターは、遊離Ｓｕｐ３５：Ｓｕｐ３５−ｔＡＫ（５：１を超える）の高い比で原線維として調製し、エディンバラ土壌の存在下において固体支持体ストリップ上に沈着させた。インジケーターデバイスは、新たに作製したPrionzyme（商標）（Genencor International社製）プリオン不活性化処理（６０℃、ｐＨ１２）を含有する予浸バスの中に入れる。インジケーターストリップは、インジケーターの末端が液体の容積内となるようにバスの側面に留める。機器は、必要とされるように添加し、３０分間処置する。インジケーターデバイスは機器の取り出し前にプロセスの終わりにバスから取り出し、実施例２０において記載されるように評価する。
【０２５０】
プリオンの破壊を目的とする酸化プロセスのためのｔＡＫ−Ｓｕｐ３５インジケーターの使用
上記に記載されるインジケーターは、Ｓｕｐ３５−ｔＡＫのみを使用して、原線維として調製し、ステンレス鋼表面上に沈着させた（任意選択で０．１％ｗ／ｖスクロースの存在下において）。インジケーターは、機器が処置のために準備されるGenesis（商標）容器の蓋の内側に結合し、蓋を閉じる。容器は、酸化障害に適したプロセッサーの洗浄物チャンバーの中に入れ（例えば１２５Ｌオゾン滅菌器；ＴＳＯ３又はFichet et al 2004; Lancetによる公開論文において記載されるものなどのような気相過酸化水素技術）、プロセスは、メーカーの指示に従って実行する。プロセスの終わりに、Genesis容器は、チャンバーから取り出し、インジケーターデバイスは、実施例２０において記載されるように取り出し、処置する。
【実施例２２】
【０２５１】
感染による試料中のレポーターキナーゼの検出；患者試料中での感染の高速アッセイのための使用
絶対細胞内病原体バークホルデリア・シュードマレイに由来する感染が疑われる患者が、クリニックに来た。血液試料を取り出し、１Ｍ尿素及び５μＭ  Ａｐ４Ａを含有する緩衝液中に分散させた。試料は、ＡＤＰ及びルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬の添加によってアッセイし、２分間インキュベートし、光出力は、携帯型のルミノメーターにおいて測定した。生成されたシグナルは、血液試料内のＢ．シュードマレイの量に正比例する。
【０２５２】
感染による試料中のレポーターキナーゼの検出；細胞モデルにおける感染の高速アッセイのための使用
細胞内細菌性病原体に関する研究は、哺乳動物細胞培養系においてそれらを成長させる必要性により複雑になる。生細胞の測定は、哺乳動物の宿主細胞の中への続く培養又は再感染を必要とし、これらの両方は、非常に時間を浪費する方法である。本発明によって提供されるものなどのような高速アッセイは、実験の結果をリアルタイムで決定するために使用することができる情報の提供において非常に貴重である。
【０２５３】
Ｂ．シュードマレイの適した分離株は、細胞内細菌の成長を支援することができる許容細胞培養モデルと共にインキュベートした。培養は、感染を確立するために適切な長さの時間、成長させた。
【０２５４】
細胞は、遠心分離によって単離し、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５μＭ  Ａｐ４Ａを含有する緩衝液中への再懸濁によって溶解した。ＡＤＰ、ルシフェリン、及びルシフェラーゼを含有する検出試薬は、添加し、５分間インキュベートした。光出力は、９６ウェルプレートルミノメーターにおいて読み取った。生成されたシグナルの量は、細胞培養内の生存可能なＢ．シュードマレイ細胞の数に比例する。任意選択で、この高速アッセイ方法は、細胞培養内の生細胞の数を低下させるワクチン又は薬剤の効果を測定するために拡張することができる。
【０２５５】
例えば、プロトタイプＢ．シュードマレイワクチンを用いて免疫した患者において産生された抗体は、許容細胞培養物への添加前に生物と混合される。
【０２５６】
中和されていない微生物の取込みを可能にするのに十分なインキュベーション期間の後に、細胞は、洗浄し、感染を確立するのに十分な期間、インキュベートする。次いで、細胞は、洗浄し、阻害剤の存在下において、再び、上記に記載されるように溶解する。ＡＤＰ、ルシフェリン、及びルシフェラーゼの同時の添加によって測定されるシグナルは、中和されていない微生物の数に比例し、ワクチン及び／又はワクチン注射した個人において生成される免疫反応の有効性の基準を与える。そのような方法は、ハイスループットスクリーニングに適している。
【０２５７】
さらなる実施例では、感染細胞培養物は、上記に記載されるように組み立てられる。感染を確立した後、抗生物質は、宿主細胞内の細菌を死滅させる明確な目的で、感染培養物を処理するために使用する。抗生物質を適用した後、培養物は、抗生物質がその効果を有するようになるのに十分な時間、インキュベートする。細胞は、上記に記載されるように阻害剤の存在下において溶解し、生細胞の数は、ＡＤＰ、ルシフェリン、及びルシフェラーゼの添加により、レポーターキナーゼの測定によって定量する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【配列表】
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