(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞膜上に発現したClaudin6（CLDN6）に結合し、Claudin9（CLDN9）には実質的に結合しない、細胞障害活性を有するモノクローナル抗体であって、以下の(a)または(b)に記載のモノクローナル抗体：
(a)  配列番号４０に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号４１に記載のアミノ酸配列を有するCDR2、配列番号４２に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を有する重鎖可変領域および配列番号４３に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号４４に記載のアミノ酸配列を有するCDR2、配列番号４５に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を有する軽鎖可変領域を含む抗体
(b)  (a)に記載の抗体が認識するエピトープに対する結合が競合する抗体。
【請求項２】
ADCC活性を有する請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
CDC活性を有する請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
細胞障害性物質が結合していることを特徴とする請求項１〜３いずれかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
請求項１〜４いずれかに記載のモノクローナル抗体を含有する医薬組成物。
【請求項６】
細胞増殖抑制剤である請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
抗癌剤である請求項６に記載の医薬組成物。                                                                               
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に抗体医薬に関する。より詳細には、本発明は、抗CLDN6抗体およびこれを含む細胞増殖抑制剤および抗癌剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
Claudinファミリーは、タイトジャンクションを構成する分子量約23kDの4回膜貫通細胞膜タンパク質ファミリーで、ヒトおよびマウスにおいて24種類のメンバーが存在し、それぞれのClaudinは上皮細胞の種類ごとに非常にユニークな発現パターンを示すことが知られている（非特許文献１（Furuse  and  Tsukita,  TRENDS  in  Cell  Biology  2006,  16:181）;  非特許文献２（Wilcox,  et  al.,  Cell  2001,  104:  165）;  非特許文献３（Rahner,  et  al.,  GASTROENTEROLOGY  2001,  120:  411）;  非特許文献４（Morita,  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  1999,  96:  511））。上皮細胞シートにおいては、細胞間隙における物質の漏れ（拡散）を防ぐ機構が働いており、タイトジャンクションと呼ばれる細胞接着装置はその漏れを防ぐ機構において、まさに「バリア」としての中心的役割を果たしていることが明らかとなっている。【０００３】
Human  CLDN6トランスクリプトが癌で高発現していることは、非特許文献５（Hewitt,  et  al.,  BMC  Cancer  2006,  6:186）、或いは特許文献１（ＷＯ２００３／０８８８０８）などにより公知となっていた。また、癌におけるヒト及びマウスCLDN6の蛋白レベルでの発現については、非特許文献６（Osanai,  et  al.,  Cancer  Sci  2007,  98:  1557）及び非特許文献7（Azadeh  Arabzadeh,  et  al,  BMC  Cancer  2007,  7:  196）において、記載が認められる。非特許文献6においては、乳癌細胞株であるMCF7を用いたウエスタンブロット解析により示されている。本文献は、その論題にある通り、乳癌細胞株におけるhuman  CLDN6のエピジェネティックなサイレンシングが癌細胞の足場非依存的な増殖を促進している、と主張している。非特許文献６では、MCF7細胞株において、癌抑制遺伝子であるhuman  CLDN6がプロモーター領域の部分的なメチル化によって発現が低下し、その結果、アポトーシス感受性が減少し、コロニー形成能が落ち、癌細胞の浸潤能が上昇、メタロプロテアーゼ活性が上昇、癌細胞の移動（Migration）能が亢進し、癌の悪性化に寄与していると述べられている。【０００４】
ただし、非特許文献６において実施されているMCF7細胞のhuman  CLDN6に対するウエスタンブロットは、siRNAによるhuman  CLDN6のノックダウン系が動いているかどうかの確認実験の意味合いであり、材料である使用抗体や方法について記載されておらず、又、正常組織と比較し、乳癌細胞株MCF7においてhuman  CLDN6蛋白の発現量がどの程度変化しているかについて実験したものではない。非特許文献６の著者は、本文献の更に先行文献である非特許文献８（Quan  and  Lu,  Carcinogenesis  2003,  24:1593）を本文中にて引用し、非特許文献８の記載に基づき、更なる研究を実施したと述べている。この非特許文献８は、human  CLDN6は正常乳腺上皮細胞に比べ、乳癌細胞株BT-474及びMCF7ではmRNA発現が減少しているので、human  CLDN6は乳癌においては癌抑制遺伝子であると考察する内容である。すなわち、非特許文献６では、乳癌細胞株であるMCF7では正常乳腺よりもhuman  CLDN6蛋白の発現が減少しているものとして研究を遂行し、且つ、乳癌細胞株におけるhuman  CLDN6のエピジェネティックなサイレンシングが癌細胞の足場非依存的な増殖を促進しているとされている。【０００５】
また、非特許文献７は、DMBA/TPA投与マウス化学発癌腫瘍における、mouse  CLDN6蛋白を含む幾つかのmouse  Claudin蛋白の発現パターンの変化を免疫組織染色によって調べるに止まる文献であり、正常マウスにおいてもmouse  CLDN6が”suprabasal  compartment”において発現していると述べられている。【０００６】
なお、抗CLDN6抗体については、フローサイトメトリーのような方法によって細胞膜表面のhuman  CLDN6を認識できるような、即ち、細胞膜表面上にネイティブな形で存在するhuman  CLDN6を認識できるモノクローナル抗体の報告はされていない。【０００７】
［特許文献１]  ＷＯ２００３／０８８８０８
［非特許文献１]  Mikio  Furuse  and  Shoichiro  Tsukita:  Claudins  in  occluding  junctions  of  human  and  flies.  TRENDS  in  Cell  Biology  2006,  16:181
［非特許文献２]  Edward  R.  Wilcox,  Quianna  L.  Burton,  Sadaf  Naz,  Saima  Riazuddin,  Tenesha  N.  Smith,  Barbara  Ploplis,  Inna  Belyantseva,  Tamar  Ben-Yosef,  NikkiA.  Liburd,  Robert  J.  Morell,  Bechara  Kachar,  Doris  K.  Wu,  Andrew  J.  Griffith,  Sheikh  Riazuddin,  and  Thomas  B.  Friedman:  Mutations  in  the  Gene  Encoding  Tight  Junction  Claudin-14  Cause  Autosomal  Recessive  Deafness  DFNB29.  Cell  2001,  104:  165
［非特許文献３]  Christoph  Rahner,  Laura  L.  Mitic,  and  James  M.  Anderson:  Heterogeneity  in  Expression  and  Subcellular  Localization  of  Claudin  2,  3,  4,  and  5  in  the  Rat  Liver,  Pancreas,  and  Gut.  GASTROENTEROLOGY  2001,  120:  411
［非特許文献４]  Kazumasa  Morita,  Mikio  Furuse,  Kazushi  Fujimoto,  and  Shoichiro  Tsukita:  Claudin  multigene  family  encoding  four-transmembrane  domain  protein  components  of  tight  junction  strands.  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  1999,  96:  511
［非特許文献５]  Kyle  J  Hewitt,  Rachana  Agarwal  and  Patrice  J  Morin:  The  claudin  gene  family:  expression  in  normal  and  neoplastic  tissues.  BMC  Cancer  2006,  6:186
［非特許文献６]  Makoto  Osanai,  Masaki  Murata,  Hideki  Chiba,  Takashi  Kojima  and  Norimasa  Sawada:  Epigenetic  silencing  of  claudin-6  promotes  anchorage-independent  growth  of  breast  carcinoma  cells.  Cancer  Sci  2007,  98:  1557
［非特許文献７]  Azadeh  Arabzadeh,  Tammy-Claire  Troy  and  Kursad  Turksen:  Changes  in  the  distribution  pattern  of  Claudin  tight  junction  proteins  during  the  progression  of  mouse  skin  tumorigenesis.  BMC  Cancer  2007,  7:  196
［非特許文献８]  Chengshi  Quan  and  Shi-Jiang  Lu:  Identification  of  genes  preferentially  expressed  in  mammary  epithelial  cells  of  Copenhagen  rat  using  subtractive  hybridization  and  microarrays.  Carcinogenesis  2003,  24:1593
［非特許文献９]  Kohls  MD,  Lappi  DA:  Mab-ZAP:  A  tool  for  evaluating  antibody  efficacy  for  use  in  an  immunotoxin.  BioTechniques  2000,  28  (1):  162
［非特許文献１０]  Nimmerjahn  F,  Ravetch  JV.:  Divergent  immunoglobulin  G  subclass  activity  through  selective  Fc  receptor  binding.  Science.  2005,  310:  1510  
［非特許文献１１]  Nimmerjahn  F,  Ravetch  JV.:  Fcγ  Receptors:  Old  friends  and  new  family  members.  Immunity.  2006,  24:  19  
【発明の開示】
【０００８】
課題を解決するための手段
今回、本発明者らはhuman  CLDN6  mRNAが成体のあらゆる正常組織でその発現が認められないのに対して、腫瘍組織（肺腺癌、胃癌、卵巣癌）で発現亢進していることを見出した。
【０００９】
又、本発明者らは複数の癌細胞株においてhuman  CLDN6タンパク質が高発現しており、その蛋白発現はmRNAの発現解析結果と一致することを見出した。
【００１０】
さらに、本発明者らは細胞膜表面上にネイティブな形で存在するhuman  CLDN6を認識するモノクローナル抗体、及びhuman  CLDN6を高発現する癌細胞株に対してADCC、CDC活性による細胞障害活性を示すモノクローナル抗体、トキシンとのコンジュゲーションによりhuman  CLDN6高発現癌細胞株に対して細胞増殖抑制作用を有するモノクローナル抗体を作製することに成功した。
【００１１】
また、human  CLDN6は、正常組織での発現は認められず、human  CLDN6の腫瘍特異性が極めて高いことが明らかとなった。従って、抗CLDN6抗体は、human  CLDN6高発現腫瘍に対して高度に集積することが予想され、非常に有効な抗腫瘍剤となり得ることが見い出された。
【００１２】
すなわち本発明は、細胞膜上に発現したClaudin6（CLDN6）に結合する抗体を提供する。本発明はまた、細胞障害活性を有する抗CLDN6抗体を提供する。好ましくは、本発明の抗CLDN6抗体は、ADCC活性および／またはCDC活性を有する。また好ましい態様においては、本発明の抗CLDN6抗体には、細胞障害性物質が結合している。
【００１３】
別の観点においては、本発明は、以下の(a)〜(j)いずれかに記載の抗体：
(a)  配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有するCDR2、配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を有する重鎖可変領域を含む抗体（AB3-1重鎖）、
(b)  配列番号２７に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号２８に記載のアミノ酸配列を有するCDR2、配列番号２９に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を有する軽鎖可変領域を含む抗体（AB3-1軽鎖）、
(c)  (a)に記載の重鎖可変領域および(b)に記載の軽鎖可変領域を有する抗体（AB3-1）、
(d)  配列番号３０に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号３１に記載のアミノ酸配列を有するCDR2、配列番号３２に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を有する重鎖可変領域を含む抗体（AE1-16、AE49-11重鎖）、
(e)  配列番号３３に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号３４に記載のアミノ酸配列を有するCDR2、配列番号３５に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を有する軽鎖可変領域を含む抗体（AE1-16、AE49-11軽鎖）、
(f)  (d)に記載の重鎖可変領域および(e)に記載の軽鎖可変領域を有する抗体（AE1-16、AE49-11）、
(g)  配列番号４０に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号４１に記載のアミノ酸配列を有するCDR2、配列番号４２に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を有する重鎖可変領域を含む抗体（AE3-20重鎖）、
(h)  配列番号４３に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号４４に記載のアミノ酸配列を有するCDR2、配列番号４５に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を有する軽鎖可変領域を含む抗体（AE3-20軽鎖）、
(i)  (g)に記載の重鎖可変領域および(h)に記載の軽鎖可変領域を有する抗体（AE3-20）、
(j)  (a)〜(i)のいずれかに記載の抗体が認識するエピトープと同じエピトープを認識する抗体、
を提供する。
【００１４】
また別の観点においては、本発明は、抗CLDN6抗体を含有する医薬組成物を提供する。好ましくは、本発明の医薬組成物は、細胞増殖抑制剤である。また好ましくは、本発明の医薬組成物は抗癌剤である。また好ましくは、本発明の医薬組成物は、上述の本発明の抗体を含有する。
【００１５】
さらに別の観点においては、本発明は癌を診断する方法を提供し、この方法は、
(a)  被験者から採取された試料を提供する工程、
(b)  (a)の試料に含まれるCLDN6タンパク質を検出する工程、
を含む。好ましくは、CLDN6タンパク質は抗CLDN6抗体により検出される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図1は、正常組織でのhuman  CLDN6の発現プロファイルを示す。
【図２】図2は、肺癌でのhuman  CLDN6の発現プロファイルを示す。
【図３】図3は、胃癌でのhuman  CLDN6の発現プロファイルを示す。
【図４】図4は、卵巣癌でのhuman  CLDN6の発現プロファイルを示す。
【図５】図5は、抗CLDN6  ヤギポリクローナル抗体(Santa  Cruz  C-20  Code.sc-17669)によるウエスタンブロットを示す。
【図６】図6は、抗human  CLDN6抗体のhuman  CLDN6強制発現細胞、及び親株への結合性の測定（フローサイトメトリー解析）を示す。
【図７】図7は、抗human  CLDN6抗体の肺腺癌細胞株ABC-1、及び胃癌細胞株AGSへの結合性の測定（フローサイトメトリー解析）を示す。
【図８】図8は、肺腺癌細胞株ABC-1に対する抗human  CLDN6抗体のADCC活性を示す。
【図９】図9は、胃癌細胞株AGSに対する抗human  CLDN6抗体のADCC活性を示す。
【図１０】図10は、肺腺癌細胞株ABC-1に対する抗human  CLDN6抗体のCDC活性を示す。
【図１１】図11は、肺腺癌細胞株ABC-1に対するMab-ZAPを用いた抗human  CLDN6モノクローナル抗体の抗腫瘍効果を示す。
【図１２】図12は、胃癌細胞株AGSに対するMab-ZAPを用いた抗human  CLDN6モノクローナル抗体の抗腫瘍効果を示す。
【図１３】図13は、ヤギ抗CLDN6ポリクローナル抗体（santa  cruz  sc-17669）による免疫染色結果を示す（A：肺腺癌腫瘍組織、B：肺腺癌非腫瘍組織）。
【図１４】図14は、PA-1皮下移植モデルにおけるAE49-11抗体の抗腫瘍活性の評価結果を示す。
【図１５】図15は、NUGC-3皮下移植モデルにおけるAE49-11抗体の抗腫瘍活性の評価結果を示す（細線：vehicle  iv、太線：低フコースAE49-11(50mg/kg,iv)）。
【００１７】
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２００８−００４４２３号の明細書に記載された内容を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
CLDN6
Claudin6(CLDN6)のアミノ酸配列およびこれをコードする遺伝子配列は、GenBank登録番号NP＿067018.1およびNM＿021195.3（配列番号：２２及び配列番号：２３）、またはGenBank登録番号NP＿067018.2およびNM＿021195.4（配列番号：４６及び配列番号：４７）に開示されている。【００１９】
本発明において、CLDN6タンパク質とは、全長タンパク質およびその断片の両方を含むことを意味する。断片とは、CLDN6タンパク質の任意の領域を含むポリペプチドであり、天然のCLDN6タンパク質の機能を有していなくてもよい。断片の例として、CLDN6タンパク質の細胞外領域を含む断片が挙げられる。【００２０】
抗CLDN6抗体
本発明の抗CLDN6抗体はCLDN6に結合する限り如何なる抗体でもよく、その由来（マウス、ラット、ヒト、等）、種類（モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体）および形状（改変抗体、低分子化抗体、修飾抗体、など）等は問われない。【００２１】
本発明で用いられる抗CLDN6抗体は特異的にCLDN6に結合することが好ましい。又、本発明で用いられる抗CLDN6抗体はモノクローナル抗体であることが好ましい。【００２２】
本発明における好ましい抗CLDN6抗体として、細胞膜上に発現したCLDN6に結合することができる抗体を挙げることができる。細胞膜上に発現したCLDN6は特に限定されないが、例えば、CLDN6を強制的に発現させた細胞（例えばBa/F3細胞など）やCLDN6を発現する癌細胞（例えば肺線癌細胞株ABC-1、胃癌細胞株AGSなど）の細胞膜上に発現したCLDN6が例として挙げられる。【００２３】
抗CLDN6抗体が細胞膜上に発現したCLDN6に結合するか否かはフローサイトメトリーなどの当業者に公知の方法により確認することが可能である。【００２４】
本発明の抗CLDN6抗体の好ましい他の態様として、細胞障害活性を有する抗体を挙げることができる。細胞障害活性を有する抗体は特に限定されないが、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（antibody-dependent  cell-mediated  cytotoxicity：ADCC）活性を有する抗体、補体依存性細胞傷害（complement-dependent  cytotoxicity：CDC）活性を有する抗体、細胞障害性物質が結合した抗体などを挙げることができる。【００２５】
本発明において、CDC活性とは補体系による細胞傷害活性を意味する。一方ADCC活性とは標的細胞の細胞表面抗原に特異的抗体が付着した際、そのFc部分にFcγ受容体保有細胞（免疫細胞等）がFcγ受容体を介して結合し、標的細胞に障害を与える活性を意味する。【００２６】
本発明において、抗体がADCC活性を有するか否か、又はCDC活性を有するか否かは公知の方法により測定することができる（例えば、Current  protocols  in  Immunology,  Chapter7.  Immunologic  studies  in  humans,  Editor,  John  E,  Coligan  et  al.,  John  Wiley  &  Sons,  Inc.,(1993)等）。【００２７】
具体的には、まず、エフェクター細胞、補体溶液、標的細胞の調製が実施される。
（１）エフェクター細胞の調製
CBA/Nマウスなどから脾臓を摘出し、RPMI1640培地（Invitrogen社製）中で脾臓細胞が分離される。10％ウシ胎児血清（FBS、HyClone社製）を含む同培地で洗浄後、細胞濃度を5×106/mlに調製することによって、エフェクター細胞が調製できる。【００２８】
（２）補体溶液の調製
Baby  Rabbit  Complement（CEDARLANE社製）を10％  FBS含有培地（Invitrogen社製）にて10倍希釈し、補体溶液が調製できる。【００２９】
（３）標的細胞の調製
CLDN6タンパク質を発現する細胞を0.2  ｍCiの51Cr-クロム酸ナトリウム（GEヘルスケアバイオサイエンス社製）とともに、10％  FBS含有DMEM培地中で37℃にて１時間培養することにより該標的細胞を放射性標識できる。CLDN6タンパク質を発現する細胞としては、CLDN6タンパク質をコードする遺伝子で形質転換された細胞、癌細胞（肺線癌細胞、胃癌細胞など）等を利用することができる。放射性標識後、細胞を10％  FBS含有RPMI1640培地にて３回洗浄し、細胞濃度を2×105/mlに調製することによって、該標的細胞が調製できる。【００３０】
ADCC活性、又はCDC活性は下記に述べる方法により測定できる。ADCC活性の測定の場合は、96ウェルＵ底プレート（Becton  Dickinson社製）に、標的細胞と、抗CLDN6抗体を50  μlずつ加え、氷上にて15分間反応させる。その後、エフェクター細胞100  μlを加え、炭酸ガスインキュベーター内で4時間培養する。抗体の終濃度は0または10μg/mlとする。培養後、100μlの上清を回収し、ガンマカウンター（COBRAII  AUTO-GAMMA、MODEL  D5005、Packard  Instrument  Company社製）で放射活性を測定する。細胞傷害活性（%）は得られた値を使用して(A-C)  /  (B-C)  x  100の計算式に基づいて計算できる。Aは各試料における放射活性（cpm）、Bは1％  NP-40（nacalai  tesque社製)を加えた試料における放射活性（cpm）、Cは標的細胞のみを含む試料の放射活性（cpm）を示す。【００３１】
一方、CDC活性の測定の場合は、96ウェル平底プレート（Becton  Dickinson社製）に、標的細胞と、抗CLDN6抗体を50  μlずつ加え、氷上にて15分間反応させる。その後、補体溶液100  μlを加え、炭酸ガスインキュベーター内で４時間培養する。抗体の終濃度は0または3  μg/mlとする。培養後、100  μlの上清を回収し、ガンマカウンターで放射活性を測定する。細胞傷害活性はADCC活性の測定と同様にして計算できる。【００３２】
細胞障害性物質が結合した抗CLDN6抗体は細胞内に取り込まれた場合、細胞障害性物質によって該抗体を取り込んだ細胞に細胞死を誘導することが可能である。従って、細胞障害性物質が結合した抗体は、さらにインターナライズ活性を有することが好ましい。本発明において「インターナライズ活性を有する抗体」とは、細胞表面上のCLDN6に結合した際に細胞内（細胞質内、小胞内、他の小器官内など）に輸送される抗体を意味する。【００３３】
抗体がインターナライズ活性を有するか否かは当業者に公知の方法を用いて確認することができ、例えば、標識物質を結合した抗CLDN6抗体をCLDN6を発現する細胞に接触させ該標識物質が細胞内に取り込まれたか否かを確認する方法、細胞障害性物質を結合した抗CLDN6抗体をCLDN6を発現する細胞に接触させ該CLDN6発現細胞に細胞死が誘導されたか否かを確認する方法、などにより確認することができる。より具体的には下記の実施例に記載の方法などにより抗体がインターナライズ活性を有するか否かを確認することが可能である。【００３４】
本発明で用いられる細胞障害性物質は細胞に細胞死を誘導できるものであれば如何なる物質でもよく、例えば、トキシン、放射性物質、化学療法剤などを挙げることができる。これらの本発明における細胞障害性物質は、生体内で活性な細胞障害性物質に変換されるプロドラッグを含む。プロドラッグの活性化は酵素的な変換であっても、非酵素的な変換であっても良い。【００３５】
本発明においてトキシンとは、微生物、動物又は植物由来の細胞毒性を示す種々のタンパク質やポリペプチド等を意味する。本発明で用いられるトキシンとしては、例えば、次のものを挙げることができる。ジフテリアトキシンＡ鎖(Diphtheria  toxin  A  Chain)(Langone  J.J.,et  al.,Methods  in  Enzymology,93,307-308,1983)、シュードモナスエクソトキシン(Pseudomonas  Exotoxin)(Nature  Medicine,2,350-353,1996)、リシン鎖(Ricin  A  Chain)(Fulton  R.J.,et  al.,J.Biol.Chem.,261,5314-5319,1986;Sivam  G.,et  al.,Cancer  Res.,47,3169-3173,1987;Cumber  A.J.et  al.,J.Immunol.Methods,135,15-24,1990;Wawrzynczak  E.J.,et  al.,Cancer  Res.,50,7519-7562,1990;Gheeite  V.,et  al.,J.Immunol.Methods,142,223-230,1991);無糖鎖リシンＡ鎖(Deglicosylated  Ricin  A  Chain)(Thorpe  P.E.,et  al.,Cancer  Res.,47,5924-5931,1987);アブリンＡ鎖(Abrin  A  Chain)(Wawrzynczak  E.J.,et  al.,Br.J.Cancer,66,361-366,1992;Wawrzynczak  E.J.,et  al.,Cancer  Res.,50,7519-7562,1990;Sivam  G.,et  al.,Cancer  Res.,47,3169-3173,1987;Thorpe  P.E.,et  al.,Cancer  Res.,47,5924-5931,1987);ゲロニン(Gelonin)(Sivam  G.,et  al.,Cancer  Res.,47,3169-3173,1987;Cumber  A.J.et  al.,J.Immunol.Methods,135,15-24,1990;WawrzynczakE.J.,et  al.,Cancer  Res.,50,7519-7562,1990;Bolognesi  A.,et  al.,Clin.exp.Immunol.,89,341-346,1992);ポークウイード抗ウィルス蛋白（PAP-s;Pokeweed  anti-viral  protein  fromseeds)(Bolognesi  A.,et  al.,Clin.exp.Immunol.,89,341-346,1992);ブリオジン(Briodin)(Bolognesi  A.,et  al.,Clin.exp.Immunol.,89,341-346,1992);サポリン(Saporin)(Bolognesi  A.,et  al.,Clin.exp.Immunol.,89,341-346,1992);モモルジン(Momordin)(Cumber  A.J.,et  al.,J.Immunol.Methods,135,15-24,1990;Wawrzynczak  E.J.,et  al.,Cancer  Res.,50,7519-7562,1990;Bolognesi  A.,et  al.,Clin.exp.Immunol.,89,341-346,1992);モモルコキン(Momorcochin)(Bolognesi  A.,et  al.,Clin.exp.Immunol.,89,341-346,1992);ジアンシン３２(Dianthin  32)(Bolognesi  A.,et  al.,Clin.exp.Immunol.,89,341-346,1992);ジアンシン３０(Dianthin  30)(Stirpe  F.,Barbieri  L.,FEBS  letter  195,1-8,1986);モデッシン(Modeccin)(Stirpe  F.,Barbieri  L.,FEBS  letter  195,1-8,1986);ビスカミン(Viscumin)(Stirpe  F.,Barbieri  L.,FEBS  letter  195,1-8,1986);ボルケシン(Volkesin)(Stirpe  F.,Barbieri  L.,FEBS  letter  195,1-8,1986);ドデカンドリン(Dodecandrin)(Stirpe  F.,Barbieri  L.,FEBS  letter  195,1-8,1986);トリチン(Tritin)(Stirpe  F.,Barbieri  L.,FEBS  letter  195,1-8,1986);ルフィン(Luffin)(Stirpe  F.,Barbieri  L.,FEBS  letter  195,1-8,1986);トリコキリン(Trichokirin)(Casellas  P.,et  al.,Eur.J.Biochem.176,581-588,1988;Bolognesi  A.,et  al.,Clin.exp.Immunol.,89,341-346,1992)。【００３６】
本発明において放射性物質とは、放射性同位体を含む物質のことをいう。放射性同位体は特に限定されず、如何なる放射性同位体を用いてもよいが、例えば、32P、14C、125I、3H、131I、186Re、188Reなどを用いることが可能である。【００３７】
本発明において化学療法剤とは、上記のトキシン、放射性物質以外の細胞障害活性を有する物質を意味し、サイカイン、抗腫瘍剤、酵素などが含まれる。本発明で用いられる化学療法剤は特に限定されないが、低分子量の化学療法剤が好ましい。分子量が小さい場合、抗体への結合の後も、抗体の機能に干渉する可能性が低いと考えられる。本発明において、低分子量の化学療法剤とは、通常１００〜２０００、好ましくは２００〜１０００の分子量を有する。本発明においては特に限定されないが、例えば、以下の化学療法剤を用いることができる。メルファラン（Melphalan)(Rowland  G.F.,et  al.,Nature  255,487-488,1975);シスプラチン(Cis-platinum)(Hurwitz  E.and  Haimovich  J.,Method  In  Enzymology  178,369-375,1986;Schechter  B.,et  al.,Int.J.Cancer  48,167-172,1991);カルボプラチン(Carboplatin)(Ota,Y.,et  al.,Asia-Oceania  J.Obstet.Gynaecol.19,449-457,1993);マイトマイシンＣ(Mitomycin  C)(Noguchi,A.,et  al.,Bioconjugate  Chem.3,132-137,1992);アドリアマイシン(Adriamycin(Doxorubicin))(Shih,L.B.,et  al.,Cancer  Res.51  4192-4198,1991;Zhu,Z.,et  al.,Cancer  Immunol.Immumother  40,257-267,1995;Trail,P.A.,et  al.,Science  261,212-215,1993;Zhu,Z.,et  al.,Cancer  Immunol.Immumother  40,257-267,1995;Kondo,Y.,et  al.,Jpn.J.Cancer  Res.86  1072-1079,1995;Zhu,Z.,et  al.,Cancer  Immunol.Immumother  40,257-267,1995;Zhu,Z.,et  al.,Cancer  Immunol.Immumother  40,257-267,1995);ダウノルビシン(Daunorubicin)(Dillman,R.O.,et  al.,Cancer  Res.48,6097-6102,1988;Hudecz,F.,et  al.,Bioconjugate  Chem.1,197-204,1990;Tukada  Y.et  al.,J.Natl.Cancer  Inst.75,721-729,1984);ブレオマイシン(Bleomycin)(Manabe,Y.,et  al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.115,1009-1014,1983);ネオカルチノスタチン(Neocarzinostatin)(Kitamura  K.,et  al.,Cancer  Immunol.Immumother  36,177-184,1993;Yamaguchi  T.,et  al.,Jpn.J.Cancer  Res.85,167-171,1994);メトトレキセート(Methotrexate)(Kralovec,J.,et  al.,Cancer  Immunol.Immumother  29,293-302,1989;Kulkarni,P.N.,et  al.,Cancer  Res.41,2700-2706,1981;Shin,L.B.,et  al.,Int.J.Cancer  41,832-839,1988;Gamett  M.C.,et  al.,Int.J.Cancer  31,661-670,1983);５−フルオロウリジン(5-Fluorouridine)(Shin,L.B.,Int.J.Cancer  46,1101-1106,1990);５−フルオロ−２′−デオキシウリジン(5-Fluoro-2'-deoxyuridine)(Goerlach  A.,et  al.,Bioconjugate  Chem.2,96-101,1991);シトシンアラビノシド(Cytosine  arabinoside)(Hurwitz  E.,et  al.,J.Med.Chem.28,137-140,1985);アミノプテリン(Aminopterin)(Kanellos  J.,et  al.,Immunol.Cell.Biol.65,483-493,1987);ビンクリスチン(Vincristine)(Johnson  J.R.,et  al.,Br.J.Cancer  42,17,1980);ビンデシン(Vindesine)(Johnson  J.R.,et  al.,Br.J.Cancer  44,472-475,1981);インターロイキン２（ＩＬ−２）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）、インターフェロン（ＩＮＦ）、カルボキシペプチダーゼ(Carboxypeptidase)、アルカリフォスファターゼ(Alkaline  Phosphatase)、ベータラクタマーゼ(β-lactamase)、シチジンデアミナーゼ(Cytidine  deaminase)。【００３８】
本発明において用いられる細胞障害性物質は一種類でもよいし、二種以上の細胞障害性物質を組み合わせて用いてもよい。【００３９】
抗CLDN6抗体と上記の細胞障害性物質との結合は共有結合または非共有結合等により行なうことができる。これら細胞障害性物質を結合した抗体の作製方法は公知である。【００４０】
抗CLDN6抗体と細胞障害性物質は、それら自身が有する連結基などを介して直接結合されてもよいし、また、リンカーや中間支持体などの他の物質を介して間接的に結合されてもよい。抗CLDN6抗体と細胞障害性物質が直接結合される場合の連結基は、例えばSH基を用いたジスルフィド結合が挙げられる。具体的には抗体のFc領域の分子内ジスルフィド結合を還元剤、例えばジチオトレイトール等にて還元し、細胞障害性物質内のジスルフィド結合を同様に還元して、両者をジスルフィド結合にて結合する。結合前に活性化促進剤、例えばエルマン試薬(Ellman's  reagent)にて抗体か細胞障害性物質のいずれか一方を活性化させ両者のジスルフィド結合形成を促進してもよい。抗CLDN6抗体と細胞障害性物質を直接結合するその他の方法としては、例えば、シッフ塩基を用いた方法、カルボジイミド法、活性エステル法（N-hydroxysucccinimide法）、混合アンヒドリド（Mixed  anhydride）を用いた方法、ジアゾ反応を用いた方法などを挙げることができる。【００４１】
抗CLDN6抗体と細胞障害性物質の結合は、他の物質を介して間接的に結合することも可能である。間接的に結合する為の他の物質は特に限定されず、例えば、アミノ基、カルボキシル基、メルカプト基等をいずれか１種類または２種類以上の組み合わせで２個以上有する化合物、ペプチドリンカー、抗CLDN6抗体への結合能を有する化合物などを挙げることができる。アミノ基、カルボキシル基、メルカプト基等をいずれか１種類または２種類以上の組み合わせで２個以上有する化合物の例としては、例えば、Ｎ−スクシニミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート(SPDP：N-Succinimidyl  3-(2-pyridylditio)propinate)(Wawrzynczak  E.J.,et  al.,Cancer  Res.,50,7519-7562,1990;Thorpe  P.E.,et  al.,Cancer  Res.,47,5924-5931,1987);スクシニミジル  ６−３−〔２−ピリジルジチオ〕プロピオンアミド）ヘキサノエート(LC-SPDP:Succinimidyl  6-3-〔2-pyridylditio〕propinamide)hexanoate)(Hermanson  G.T.,BIOCONJUGATE  Techniques,230-232,1996);スルホスクシニミジル  ６−３−〔２−ピリジルジチオ〕プロピオンアミド）ヘキサノエート(Sulfo-LC-SPDP:Sulfosuccinimidyl  6-3-〔2-pyridylditio〕propinamide)hexanoate)(Hermanson  G.T.,BIOCONJUGATE  Techniques,230-232,1996);Ｎ−スクシニミジル  ３−（２−ピリジルジチオ）ブチレート(SPDB：N-Succinimidyl  3-(2-pyridylditio)butyrate)(Wawrzynczak  E.J.,et  al.,Br.J.Cancer,66,361-366,1992);スクシニミジロキシカルボニル−α−（２−ピリジルジチオ）トルエン(SMPT：Succinimidyloxycarbonyl-α-(2-pyridylditio)toruene)(Thorpe  P.E.,etal.,Cancer  Res.,47,5924-5931,1987);スクシニミジル  ６−（α−メチル）−〔２−ピリジルジチオ〕トルアミド）ヘキサノエート(LC-SMPT:Succinimidyl  6-(α-methyl-〔2-pyridylditio〕toruamide)hexanoate)(Hermanson  G.T.,BIOCONJUGATE  Techniques,232-235,1996);スルホスクシニミジロル６−（α−メチル−〔２−ピリジルジチオ〕トルアミド）ヘキサノエート(Sulfo-LC-SMPT:Sulfosuccinimidyl  6-(α-methyl-〔2-pyridylditio〕toruamide)hexanoate)(Hermanson  G.T.,BIOCONJUGATE  Techniques,232-235,1996);スクシニミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート(SMPB：Succinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)butyrate)(Hermanson  G.T.,BIOCONJUGATE  Techniques,242-243,1996);スルホ−スクシニミジル  ４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート(Sulfo-SMPB:Sulfo-Succinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)butyrate)(Hermanson  G.T.,BIOCONJUGATE  Techniques,242-243,1996);ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ハイドロキシスクシニミドエステル(MBS  :m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide  ester)(Hermanson  G.T.,BIOCONJUGATE  Techniques,237-238,1996);ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ハイドロキシスルホスクシニミドエステル(Sulfo-MBS:m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysulfosuccinimide  ester)(Hermanson  G.T.,BIOCONJUGATE  Techniques,237-238,1996);Ｓ−アセチルメルカプトスクシニックアンヒドライド(SAMSA:S-Acetyl  mercaptosuccinic  anhydride)(Casellas  P.,et  al.,Eur.J.Biochem,176,581-588,1988);ジメチル  ３，３−ジチオビスプロリオニミデート(DTBP：Dimethyl  3,3'-ditiobisprorionimidate)(Casellas  P.,et  al.,Eur.J.Biochem,176,581-588,1988);２−イミノチオレーン(2-Iminotiolane)(Thorpe  P.E.,et  al.,Cancer  Res.,47,5924-5931,1987)などを挙げることができる。【００４２】
抗CLDN6抗体と細胞障害性物質との結合に用いられるその他の物質として、例えば、ペプチド、抗体、ポリＬ−グルタミン酸（ＰＧＡ）、カルボキシメチルデキストラン、デキストラン、アミノデキストラン、アビジン・ビオチン、シス・アコニット酸、グルタミン酸ジヒドラジド、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）等を挙げることができる。【００４３】
更に、タンパク質性の細胞障害性物質は、遺伝子工学的な手法によって抗体と結合することも可能である。具体的には、たとえば上記細胞障害性ペプチドをコードするDNAと抗CLDN6抗体をコードするDNAをインフレームで融合させて発現ベクター中に組み込んだ組換えベクターが構築できる。該ベクターを適切な宿主細胞に導入することにより得られる形質転換細胞を培養し、組み込んだDNAを発現させて、毒性ペプチドを結合した抗CLDN6抗体を融合タンパク質として得ることができる。抗体との融合タンパク質を得る場合、一般に、抗体のC末端側にタンパク質性の薬剤や毒素を配置される。抗体と、タンパク質性の薬剤や毒素の間には、ペプチドリンカーを介在させることもできる。【００４４】
本発明の抗CLDN6抗体の好ましい態様の一つとして、CLDN6に結合するが、CLDN9には実質的に結合しない抗体を挙げることができる。CLDN9はCLDN6との相同性が高く、CLDN6に最も近い分子であると考えられている。従って、CLDN6に結合するがCLDN9には実質的に結合しない抗体は、CLDN6への特異性が非常に高く、医薬品として有用であると考えられる。CLDN9のアミノ酸配列は公知であり、例えば、ヒトCLDN9のアミノ酸配列はGenBank登録番号NP＿066192.1（配列番号：４８）に記載されている。【００４５】
本発明においてCLDN6に結合するがCLDN9には実質的に結合しない抗体とは、CLDN6に対する結合活性と比較して、CLDN9に対する結合活性が通常、50%以下、好ましくは30%以下、さらに好ましくは10%以下である抗体のことをいう。【００４６】
又、本発明の抗CLDN6抗体の好ましい態様の一つとして、CLDN6に結合するがCLDN3には実質的に結合しない抗体を挙げることができる。CLDN3のアミノ酸配列は公知であり、例えば、ヒトCLDN3のアミノ酸配列はGenBank登録番号NP＿001297.1（配列番号：４９）に記載されている。本発明においてCLDN6に結合するが、CLDN3には実質的に結合しない抗体とは、CLDN6に対する結合活性と比較して、CLDN3に対する結合活性が通常、50%以下、好ましくは30%以下、さらに好ましくは10%以下である抗体のことをいう。【００４７】
又、本発明の抗CLDN6抗体の好ましい態様の一つとして、CLDN6に結合するがCLDN4には実質的に結合しない抗体を挙げることができる。CLDN4のアミノ酸配列は公知であり、例えば、ヒトCLDN4のアミノ酸配列はGenBank登録番号NP＿001296.1（配列番号：５０）に記載されている。本発明においてCLDN6に結合するが、CLDN4には実質的に結合しない抗体とは、CLDN6に対する結合活性と比較して、CLDN4に対する結合活性が通常、50%以下、好ましくは30%以下、さらに好ましくは10%以下である抗体のことをいう。【００４８】
又、本発明の抗CLDN6抗体の好ましい態様の一つとして、CLDN6に結合するがCLDN1には実質的に結合しない抗体を挙げることができる。CLDN1のアミノ酸配列を公知であり、例えば、ヒトCLDN1のアミノ酸配列はGenBank登録番号NP＿066924.1（配列番号：５１）に記載されている。本発明においてCLDN6に結合するが、CLDN1には実質的に結合しない抗体とは、CLDN6に対する結合活性と比較して、CLDN1に対する結合活性が通常、50%以下、好ましくは30%以下、さらに好ましくは10%以下である抗体のことをいう。【００４９】
本発明において好ましい抗CLDN6抗体の例として、ヒトCLDN6に結合するがヒトCLDN1およびヒトCLDN3には実質的に結合しない抗体、ヒトCLDN6に結合するがヒトCLDN1、ヒトCLDN3およびCLDN4には実質的に結合しない抗体、ヒトCLDN6に結合するが、ヒトCLDN1、ヒトCLDN3、ヒトCLDN4およびヒトCLDN9には実質的に結合しない抗体などを挙げることができる。【００５０】
本発明の抗CLDN6抗体の好ましい例として、例えば以下の(a)〜(j)いずれかに記載の抗体を挙げることができる。
(a)  配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有するCDR2、配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を有する重鎖可変領域を含む抗体（AB3-1重鎖）、
(b)  配列番号２７に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号２８に記載のアミノ酸配列を有するCDR2、配列番号２９に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を有する軽鎖可変領域を含む抗体（AB3-1軽鎖）、
(c)  (a)に記載の重鎖可変領域および(b)に記載の軽鎖可変領域を有する抗体（AB3-1）、
(d)  配列番号３０に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号３１に記載のアミノ酸配列を有するCDR2、配列番号３２に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を有する重鎖可変領域を含む抗体（AE1-16、AE49-11重鎖）、
(e)  配列番号３３に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号３４に記載のアミノ酸配列を有するCDR2、配列番号３５に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を有する軽鎖可変領域を含む抗体（AE1-16、AE49-11軽鎖）、
(f)  (d)に記載の重鎖可変領域および(e)に記載の軽鎖可変領域を有する抗体（AE1-16、AE49-11）、
(g)  配列番号４０に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号４１に記載のアミノ酸配列を有するCDR2、配列番号４２に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を有する重鎖可変領域を含む抗体（AE3-20重鎖）、
(h)  配列番号４３に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号４４に記載のアミノ酸配列を有するCDR2、配列番号４５に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を有する軽鎖可変領域を含む抗体（AE3-20軽鎖）、
(i)  (g)に記載の重鎖可変領域および(h)に記載の軽鎖可変領域を有する抗体（AE3-20）、
(j)  (a)〜(i)のいずれかに記載の抗体が認識するエピトープと同じエピトープを認識する抗体。【００５１】
被検抗体が、ある抗体が認識するエピトープと同じエピトープを認識すること、すなわちエピトープを共有することは、両者の同じエピトープに対する競合によって確認することができる。抗体間の競合は、交叉ブロッキングアッセイなどによって検出される。例えば競合ELISAアッセイは、好ましい交叉ブロッキングアッセイである。具体的には、交叉ブロッキングアッセイにおいては、マイクロタイタープレートのウェル上にコートしたCLDN6タンパク質を、候補の競合抗体の存在下、または非存在下でプレインキュベートした後に、本発明の抗CLDN6抗体が添加される。ウェル中のCLDN6タンパク質に結合した本発明の抗CLDN6抗体の量は、同じエピトープへの結合に対して競合する候補競合抗体（被検抗体）の結合能に間接的に相関している。すなわち同一エピトープに対する被検抗体の親和性が大きくなればなる程、本発明の抗CLDN6抗体のCLDN6タンパク質をコートしたウェルへの結合量は低下し、被検抗体のCLDN6タンパク質をコートしたウェルへの結合量は増加する。【００５２】
ウェルに結合した抗体量は、予め抗体を標識しておくことによって、容易に測定することができる。たとえば、ビオチン標識された抗体は、アビジンペルオキシダーゼコンジュゲートと適切な基質を使用することにより測定できる。ペルオキシダーゼなどの酵素標識を利用した交叉ブロッキングアッセイを、特に競合ELISAアッセイと言う。抗体は、検出あるいは測定が可能な他の標識物質で標識することができる。具体的には、放射標識あるいは蛍光標識などが公知である。【００５３】
更に被検抗体が本発明の抗CLDN6抗体と異なる種に由来する定常領域を有する場合には、ウェルに結合した抗体の量を、その抗体の定常領域を認識する標識抗体によって測定することもできる。あるいは同種由来の抗体であっても、クラスが相違する場合には、各クラスを識別する抗体によって、ウェルに結合した抗体の量を測定することができる。【００５４】
候補の競合抗体非存在下で実施されるコントロール試験において得られる結合活性と比較して、候補抗体が、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、さらに好ましくは少なくとも５０％、抗CLDN6抗体の結合をブロックできるならば、該候補競合抗体は本発明の抗CLDN6抗体と実質的に同じエピトープに結合するか、又は同じエピトープへの結合に対して競合する抗体である。【００５５】
さらに、本発明においては上述の(a)〜(j)の抗体と機能的に同等である限り、上述のCDR配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されていてもよい。本発明において、機能的に同等とはCLDN6への結合活性や細胞障害活性が同等であることを言う。本発明のおいて同等とは、上述の抗体と比較して、少なくとも50%、好ましくは70%、さらに好ましくは90%以上の活性を有することを言う。活性の上限は特に限定されず、上述の抗体より高い活性を有していてもよい。結合活性や細胞障害活性の測定は当業者に公知の方法で行うことが可能であり、例えば実施例に記載の方法により行うことが可能である。【００５６】
アミノ酸の置換、欠失、付加および／または挿入の為の当業者によく知られた方法としては、例えば、部位特異的変異誘発法（Hashimoto-Gotoh,T.et  al.(1995)Gene  152,271-275、Zoller,MJ,and  Smith,M.(1983)Methods  Enzymol.100,468-500、Kramer,W.et  al.(1984)Nucleic  Acids  Res.12,9441-9456、Kramer  W,and  Fritz  HJ(1987)Methods.Enzymol.154,350-367、Kunkel,TA(1985)Proc  Natl  Acad  Sci  USA.82,488-492、Kunkel(1988)Methods  Enzymol.85,2763-2766）などを挙げることができる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。このように、本発明の抗体のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が変異したアミノ酸配列を有し、該抗体と同等の活性を有する抗体もまた本発明の抗体に含まれる。このような変異体における、変異するアミノ酸数は、通常、１つのCDRに対して5アミノ酸以内であり、好ましくは４アミノ酸以内であり、さらに好ましくは３アミノ酸以内（例えば、１または２アミノ酸）であると考えられる。【００５７】
変異するアミノ酸残基においては、特に限定されないが、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質に基づいて、次のような分類が確立している。
疎水性アミノ酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、V）、
親水性アミノ酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T）、
脂肪族側鎖を有するアミノ酸（G、A、V、L、I、P）、
水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（S、T、Y）、
硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（C、M）、
カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（D、N、E、Q）、
塩基含有側鎖を有するアミノ酸（R、K、H）、
芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（H、F、Y、W）
（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。【００５８】
あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Mark,D.F.et  al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81,5662-5666、Zoller,M.J.and  Smith,M.,Nucleic  Acids  Research(1982)10,6487-6500、Wang,A.et  al.,Science  224,1431-1433、Dalbadie-McFarland,G.et  al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982)79,6409-6413）。すなわち、一般に、あるポリペプチドを構成するアミノ酸配列中、各群に分類されたアミノ酸は、相互に置換したときに、当該ポリペプチドの活性が維持される可能性が高いとされている。【００５９】
抗体の製造方法
本発明の抗CLDN6抗体は、公知の手段を用いて取得できる。本発明の抗CLDN6抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマにより産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主により産生されるもの等を含む。【００６０】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは公知技術を使用して、例えば、以下のようにして作製できる。まず、CLDN6タンパク質、CLDN6を発現する細胞またはCLDN6をコードする遺伝子を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫する。免疫動物から得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させて、ハイブリドーマを得る。更に、このハイブリドーマから、通常のスクリーニング法により、目的とする抗体を産生する細胞をスクリーニングすることによって抗CLDN6抗体を産生するハイブリドーマが選択できる。【００６１】
具体的には、モノクローナル抗体の作製は例えば以下に示すように行われる。まず、CLDN6遺伝子を発現することによって、抗体取得の感作抗原として使用されるCLDN6タンパク質が取得できる。ヒトCLDN6遺伝子の塩基配列は、GenBank登録番号NM＿021195.3（配列番号２３）やGenBank登録番号NM＿021195.4（配列番号４７）などに開示されている配列を用いることが可能である。すなわち、CLDN6をコードする遺伝子配列を公知の発現ベクターに挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中または培養上清中から目的のヒトCLDN6タンパク質が公知の方法で精製できる。また、精製した天然のCLDN6タンパク質も同様に使用できる。生成は通常のイオンクロマトグラフィやアフィニティクロマトグラフィなどの複数のクロマトグラフィを単数回又は複数回、組み合わせて又は単独で使用することにより生成することができる。また、CLDN6タンパク質の所望の部分ポリペプチドを異なるポリペプチドと融合した融合タンパク質を免疫原として利用することもできる。免疫原とする融合タンパク質を製造するために、例えば抗体のFc断片やペプチドタグ等を利用することができる。融合タンパク質を発現するベクターは所望の二種類又はそれ以上のポリペプチド断片をコードする遺伝子をインフレームで融合させ、当該融合遺伝子を前記の様に発現ベクターに挿入することにより作製することができる。融合タンパク質の作製方法はMolecular  Cloning  2nd  ed.  (Sambrook,J.  et  al.,  Molecular  Cloning  2nded.,  9.47-9.58,  Cold  Spring  Harbor  Lab.Press,  1989)に記載されている。【００６２】
このようにして精製されたCLDN6タンパク質を哺乳動物に対する免疫に使用する感作抗原として使用できる。CLDN6の部分ペプチドもまた感作抗原として使用できる。【００６３】
該感作抗原で免疫される哺乳動物は、特に限定されない。モノクローナル抗体を細胞融合法によって得るためには、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して免疫動物を選択するのが好ましい。一般的には、げっ歯類の動物が免疫動物として好ましい。具体的には、マウス、ラット、ハムスター、あるいはウサギを免疫動物とすることができる。その他、サル等を免疫動物とすることもできる。【００６４】
公知の方法にしたがって上記の動物が感作抗原により免疫できる。例えば、一般的方法として、感作抗原を腹腔内または皮下に注射することにより哺乳動物を免疫することができる。具体的には、該感作抗原が哺乳動物に4から21日毎に数回投与される。感作抗原は、PBS（Phosphate-Buffered  Saline）や生理食塩水等で適当な希釈倍率で希釈して免疫に使用される。更に、感作抗原をアジュバントとともに投与することができる。例えばフロイント完全アジュバントと混合し、乳化して、感作抗原とすることができる。また、感作抗原の免疫時には適当な担体が使用できる。特に分子量の小さい部分ペプチドが感作抗原として用いられる場合には、該感作抗原ペプチドをアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン等の担体タンパク質と結合させて免疫することが望ましい。【００６５】
このように哺乳動物が免疫され、血清中における所望の抗体量の上昇が確認された後に、哺乳動物から免疫細胞が採取され、細胞融合に付される。好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が使用できる。【００６６】
前記免疫細胞と融合される細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞が用いられる。ミエローマ細胞は、スクリーニングのための適当な選択マーカーを備えていることが好ましい。選択マーカーとは、特定の培養条件の下で生存できる（あるいはできない）形質を指す。選択マーカーには、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損（以下HGPRT欠損と省略する）、あるいはチミジンキナーゼ欠損（以下TK欠損と省略する）などが公知である。HGPRTやTKの欠損を有する細胞は、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン感受性（以下HAT感受性と省略する）を有する。HAT感受性の細胞はHAT選択培地中でDNA合成を行うことができず死滅するが、正常な細胞と融合すると正常細胞のサルベージ回路を利用してDNAの合成を継続することができるためHAT選択培地中でも増殖するようになる。【００６７】
HGPRT欠損やTK欠損の細胞は、それぞれ6チオグアニン、8アザグアニン（以下8AGと省略する）、あるいは5'ブロモデオキシウリジンを含む培地で選択することができる。正常な細胞はこれらのピリミジンアナログをDNA中に取り込んでしまうので死滅するが、これらの酵素を欠損した細胞は、これらのピリミジンアナログを取り込めないので選択培地の中で生存することができる。この他G418耐性と呼ばれる選択マーカーは、ネオマイシン耐性遺伝子によって2-デオキシストレプタミン系抗生物質（ゲンタマイシン類似体）に対する耐性を与える。細胞融合に好適な種々のミエローマ細胞が公知である。例えば、P3（P3x63Ag8.653）（J.  Immunol.（1979）123,  1548-1550）、P3x63Ag8U.1（Current  Topics  in  Microbiology  and  Immunology（1978）81,  1-7）、NS-1  （Kohler.  G.  and  Milstein,  C.  Eur.  J.  Immunol.（1976）6,  511-519）、MPC-11（Margulies.  D.H.  et  al.,  Cell（1976）8,  405-415）、SP2/0  （Shulman,  M.  et  al.,  Nature（1978）276,  269-270）、FO（de  St.  Groth,  S.  F.  etal.,  J.  Immunol.  Methods（1980）35,  1-21）、S194（Trowbridge,  I.  S.  J.  Exp.  Med.（1978）148,  313-323）、R210（Galfre,  G.  et  al.,  Nature（1979）277,  131-133）等のようなミエローマ細胞を利用することができる。【００６８】
前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法（Kohler.  G.  andMilstein,  C.、Methods  Enzymol.（1981）73,  3-46）等に準じて行なうことが可能である。【００６９】
より具体的には、例えば細胞融合促進剤の存在下で通常の栄養培養液中で、前記細胞融合が実施できる。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（PEG）、センダイウイルス（HVJ）等を使用することができる。更に融合効率を高めるために所望によりジメチルスルホキシド等の補助剤を加えることもできる。【００７０】
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定できる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を1から10倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なRPMI1640培養液、MEM培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液を利用することができる。さらに、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を培養液に添加することができる。【００７１】
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め37℃程度に加温したPEG溶液を混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。細胞融合法においては、例えば平均分子量1000から6000程度のPEGを、通常30から60％（w/v）の濃度で添加することができる。続いて、上記に挙げた適当な培養液を添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことにより、ハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等が除去される。【００７２】
このようにして得られたハイブリドーマは、細胞融合に用いられたミエローマが有する選択マーカーに応じた選択培養液を利用することによって選択することができる。例えばHGPRTやTKの欠損を有する細胞は、HAT培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択できる。すなわち、HAT感受性のミエローマ細胞を細胞融合に用いた場合、HAT培養液中で、正常細胞との細胞融合に成功した細胞を選択的に増殖させることができる。目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、上記HAT培養液を用いた培養が継続される。具体的には、一般に、数日から数週間の培養によって、目的とするハイブリドーマを選択することができる。ついで、通常の限界希釈法を実施することによって、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングが実施できる。あるいは、CLDN6を認識する抗体を国際公開WO03/104453に記載された方法によって作成することもできる。【００７３】
目的とする抗体のスクリーニングおよび単一クローニングは、公知の抗原抗体反応に基づくスクリーニング方法によって好適に実施できる。例えば、ポリスチレン等でできたビーズや市販の96ウェルのマイクロタイタープレート等の担体に抗原を結合させ、ハイブリドーマの培養上清と反応させる。次いで担体を洗浄した後に酵素で標識した二次抗体等を反応させる。もしも培養上清中に感作抗原と反応する目的とする抗体が含まれる場合、二次抗体はこの抗体を介して担体に結合する。最終的に担体に結合する二次抗体を検出することによって、目的とする抗体が培養上清中に存在しているかどうかが決定できる。抗原に対する結合能を有する所望の抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等によりクローニングすることが可能となる。この際、抗原としては免疫に用いたものを始め、実施的に同質なCLDN6タンパク質が好適に使用できる。たとえばCLDN6の細胞外ドメイン、あるいは当該領域を構成する部分アミノ酸配列からなるオリゴペプチドを、抗原として利用することができる。【００７４】
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫することによって上記ハイブリドーマを得る方法以外に、ヒトリンパ球を抗原感作して目的とする抗体を得ることもできる。具体的には、まずインビトロにおいてヒトリンパ球をCLDN6タンパク質で感作する。次いで免疫感作されたリンパ球を適当な融合パートナーと融合させる。融合パートナーには、たとえばヒト由来であって永久分裂能を有するミエローマ細胞を利用することができる（特公平1-59878号公報参照）。この方法によって得られる抗CLDN6抗体は、CLDN6タンパク質への結合活性を有するヒト抗体である。【００７５】
さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物に対して抗原となるCLDN6タンパク質を投与することによって、抗CLDN6ヒト抗体を得ることもできる。免疫動物の抗体産生細胞は、適当な融合パートナーとの細胞融合やエプスタインバーウイルスの感染などの処理によって不死化させることができる。このようにして得られた不死化細胞からCLDN6タンパク質に対するヒト抗体を単離することができる（国際公開WO  94/25585、WO93/12227、WO  92/03918、WO  94/02602参照）。更に不死化された細胞をクローニングすることにより、目的の反応特異性を有する抗体を産生する細胞をクローニングすることもできる。トランスジェニック動物を免疫動物とするときには、当該動物の免疫システムは、ヒトCLDN6を異物と認識する。したがって、ヒトCLDN6に対するヒト抗体を容易に得ることができる。このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することができる。また、該ハイブリドーマを液体窒素中で長期にわたって保存することもできる。【００７６】
又、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体のＶ領域を一本鎖抗体（scFv）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析することにより、抗原に結合するヒト抗体のV領域をコードするDNA配列が決定できる。抗原に結合するscFvのDNA配列を決定した後、当該V領域配列を所望のヒト抗体C領域の配列とインフレームで融合させた後に適当な発現ベクターに挿入することによって発現ベクターが作製できる。該発現ベクターを上記に挙げたような好適な発現細胞中に導入し、該ヒト抗体をコードする遺伝子を発現させることにより該ヒト抗体が取得できる。これらの方法は既に公知である（国際公開WO  92/01047,  WO  92/20791,  WO  93/06213,  WO  93/11236,  WO  93/19172,  WO  95/01438,  WO  95/15388）。【００７７】
当該ハイブリドーマを通常の方法に従い培養し、その培養上清から目的とするモノクローナル抗体を得ることができる。あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水からモノクローナル抗体を得ることもできる。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適している。【００７８】
組換え抗体
本発明の抗体は、抗体産生細胞からクローニングされた抗体遺伝子を利用して作成することができる組換え抗体であってもよい。クローニングした抗体遺伝子は、適当なベクターに組み込んで宿主に導入することによって、抗体を発現させることができる。抗体遺伝子の単離と、ベクターへの導入、そして宿主細胞の形質転換のための方法は既に確立されている（例えば、Vandamme,  A.  M.  et  al.,  Eur.J.  Biochem.（1990）192,  767-775参照）。【００７９】
たとえば、抗CLDN6抗体を産生するハイブリドーマ細胞から、抗CLDN6抗体の可変領域（V領域）をコードするcDNAを得ることができる。そのためには、通常、まずハイブリドーマから全RNAが抽出される。細胞からmRNAを抽出するための方法として、たとえば、グアニジン超遠心法（Chirgwin,  J.  M.  et  al.,  Biochemistry（1979）18,  5294-5299）、AGPC法（Chomczynski,  P.et  al.,  Anal.  Biochem.（1987）162,  156-159）などを用いることができる。【００８０】
抽出されたmRNAは、mRNA  Purification  Kit  （GEヘルスケアバイオサイエンス製）等を使用して精製することができる。あるいは、QuickPrep  mRNA  Purification  Kit  （GEヘルスケアバイオサイエンス製）などのように、細胞から直接全mRNAを抽出するためのキットも市販されている。このようなキットを用いて、ハイブリドーマから全mRNAを得ることもできる。得られたmRNAから逆転写酵素を用いて抗体V領域をコードするcDNAを合成することができる。cDNAは、AMV  Reverse  Transcriptase  First-strand  cDNA  Synthesis  Kit（生化学工業社製）等によって合成することができる。また、cDNAの合成および増幅のために、5'-Ampli  FINDER  RACE  Kit（Clontech製）およびPCRを用いた5'-RACE法（Frohman,  M.  A.  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA（1988）85,  8998-9002、Belyavsky,  A.et  al.,  Nucleic  Acids  Res.（1989）17,  2919-2932）を利用することができる。更にこうしたcDNAの合成の過程においてcDNAの両末端に後述する適切な制限酵素サイトが導入できる。【００８１】
得られたPCR産物から目的とするcDNA断片が精製され、次いでベクターDNAと連結される。このように組換えベクターが作製され、大腸菌等に導入されコロニーが選択された後に、該コロニーを形成した大腸菌から所望の組換えベクターが調製できる。そして、該組換えベクターが目的とするcDNAの塩基配列を有しているか否かについて、公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法等により確認できる。【００８２】
可変領域をコードする遺伝子を得るために、可変領域遺伝子増幅用のプライマーを使ったPCR法を利用することもできる。まず抽出されたmRNAを鋳型としてcDNAを合成し、cDNAライブラリーを得る。cDNAライブラリーの合成には市販のキットを用いるのが便利である。実際には、少数の細胞のみから得られるmRNAは極めて微量なので、それを直接精製すると収率が低い。したがって通常は、抗体遺伝子を含まないことが明らかなキャリアRNAを添加した後に精製される。あるいは一定量のRNAを抽出できる場合には、抗体産生細胞のRNAのみでも効率よく抽出することができる。たとえば１０以上、あるいは３０以上、好ましくは５０以上の抗体産生細胞からのRNA抽出には、キャリアRNAの添加は必要でない場合がある。【００８３】
得られたcDNAライブラリーを鋳型として、PCR法によって抗体遺伝子が増幅される。抗体遺伝子をPCR法によって増幅するためのプライマーが公知である。たとえば、論文(J.  Mol.  Biol.  (1991)  222,  581-597)などの開示に基づいて、ヒト抗体遺伝子増幅用のプライマーをデザインすることができる。これらのプライマーは、イムノグロブリンのサブクラスごとに異なる塩基配列となる。したがって、サブクラスが不明のcDNAライブラリーを鋳型とするときには、あらゆる可能性を考慮してPCR法を行う。【００８４】
具体的には、たとえばヒトIgGをコードする遺伝子の取得を目的とするときには、重鎖としてγ１〜γ５、軽鎖としてκ鎖とλ鎖をコードする遺伝子の増幅が可能なプライマーを利用することができる。IgGの可変領域遺伝子を増幅するためには、一般に3'側のプライマーにはヒンジ領域に相当する部分にアニールするプライマーが利用される。一方5'側のプライマーには、各サブクラスに応じたプライマーを用いることができる。【００８５】
重鎖と軽鎖の各サブクラスの遺伝子増幅用プライマーによるPCR産物は、それぞれ独立したライブラリーとする。こうして合成されたライブラリーを利用して、重鎖と軽鎖の組み合せからなるイムノグロブリンを再構成することができる。再構成されたイムノグロブリンの、CLDN6に対する結合活性を指標として、目的とする抗体をスクリーニングすることができる。【００８６】
結合活性を指標とする抗体のスクリーニング方法として、ファージベクターを利用したパニング法を用いることもできる。上記のように抗体遺伝子を重鎖と軽鎖のサブクラスのライブラリーとして取得した場合には、ファージベクターを利用したスクリーニング方法が有利である。重鎖と軽鎖の可変領域をコードする遺伝子は、適当なリンカー配列で連結することによってシングルチェインFv(scFv)とすることができる。scFvをコードする遺伝子をファージベクターに挿入すれば、scFvを表面に発現するファージを得ることができる。このファージを目的とする抗原と接触させて、抗原に結合したファージを回収すれば、目的の結合活性を有するscFvをコードするDNAを回収することができる。この操作を必要に応じて繰り返すことにより、目的とする結合活性を有するscFvを濃縮することができる。【００８７】
目的とする抗CLDN6抗体のV領域をコードするcDNAが得られた後に、該cDNAの両末端に挿入した制限酵素サイトを認識する制限酵素によって該cDNAが消化される。好ましい制限酵素は、抗体遺伝子を構成する塩基配列に出現する可能性が低い塩基配列を認識して消化する。更に１コピーの消化断片をベクターに正しい方向で挿入するためには、付着末端を与える制限酵素が好ましい。上記のように消化された抗CLDN6抗体のV領域をコードするcDNAを適当な発現ベクターに挿入することによって、抗体発現ベクターを得ることができる。このとき、抗体定常領域（C領域）をコードする遺伝子と、前記V領域をコードする遺伝子とをインフレームで融合させることによって、全長抗体を得ることができる。【００８８】
本発明の抗CLDN6抗体を製造するために、抗体遺伝子を発現制御領域による制御の下で発現するように発現ベクターに組み込むことができる。抗体を発現するための発現制御領域とは、例えば、エンハンサーやプロモーターを含む。次いで、この発現ベクターで適当な宿主細胞を形質転換することによって、抗CLDN6抗体をコードするDNAを発現する組換え細胞を得ることができる。【００８９】
抗体遺伝子の発現にあたり、抗体重鎖（H鎖）および軽鎖（L鎖）をコードするDNAは、それぞれ別の発現ベクターに組み込むことができる。H鎖とL鎖を組み込まれたベクターを、同じ宿主細胞に同時に形質転換(co-transfect)することによって、H鎖とL鎖を備えた抗体分子を発現させることができる。あるいはH鎖およびL鎖をコードするDNAを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換させてもよい（国際公開WO  94/11523参照）。【００９０】
抗体遺伝子を一旦単離し、適当な宿主に導入して抗体を作製するための宿主と発現ベクターの多くの組み合わせが公知である。これらの発現系は、いずれも本発明に応用することができる。真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、あるいは真菌細胞が使用できる。具体的には、本発明に利用することができる動物細胞としては、例えば、哺乳類細胞（CHO、COS、ミエローマ、BHK  （baby  hamster  kidney  ）、Hela、Veroなど）、両生類細胞（アフリカツメガエル卵母細胞など）、昆虫細胞（sf9、sf21、Tn5など）などを用いることが可能である。【００９１】
あるいは植物細胞としては、ニコティアナ・タバカム（Nicotiana  tabacum）などのニコティアナ（Nicotiana）属由来の細胞による抗体遺伝子の発現系が公知である。植物細胞の形質転換には、カルス培養した細胞を利用することができる。【００９２】
更に真菌細胞としては、酵母（サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces  serevisiae）などのサッカロミセス（Saccharomyces  ）属、メタノール資化酵母（Pichia  pastoris）などのPichia属）、糸状菌（アスペスギルス・ニガー（Aspergillus  niger）などのアスペルギルス（Aspergillus  ）属）などを用いることができる。【００９３】
あるいは原核細胞を利用した抗体遺伝子の発現系も公知である。たとえば、細菌細胞を用いる場合、大腸菌（E.  coli  ）、枯草菌などの細菌細胞を本発明に利用することができる。【００９４】
哺乳類細胞を用いる場合、常用される有用なプロモーター、発現させる抗体遺伝子、その３’側下流にポリＡシグナルを機能的に結合させた発現ベクターを構築することができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウイルス前期プロモーター／エンハンサー（human  cytomegalovirus  immediate  early  promoter/enhancer）を挙げることができる。【００９５】
また、その他に本発明の抗体の発現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、ウイルスプロモーター／エンハンサー、あるいはヒトエロンゲーションファクター1α（HEF1α）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサー等が挙げられる。プロモーター／エンハンサーを利用することができるウイルスとして、具体的には、レトロウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、シミアンウイルス40（SV40）等を示すことができる。【００９６】
SV40プロモーター／エンハンサーを使用する場合はMulliganらの方法（Nature（1979）277,  108）を利用することができる。また、HEF1αプロモーター／エンハンサーはMizushimaらの方法（Nucleic  Acids  Res.（1990）18,  5322）により、容易に目的とする遺伝子発現に利用することができる。【００９７】
大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列および発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて当該遺伝子が発現できる。プロモーターとしては、例えばlacZプロモーター、araBプロモーターを挙げることができる。lacZプロモーターを使用する場合はWardらの方法（Nature（1989）341,  544-546  ;  FASEBJ.（1992）6,2422-2427）を利用することができる。あるいはaraBプロモーターはBetterらの方法（Science（1988）240,  1041-1043）により、目的とする遺伝子の発現に利用することができる。【００９８】
抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列（Lei,  S.  P.  et  al.,  J.  Bacteriol.（1987）169,  4379）を使用すればよい。そして、ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、尿素のグアニジン塩酸塩の様なタンパク質変性剤を使用することによって所望の結合活性を有するように、抗体の構造が組み直される（refolded）。【００９９】
発現ベクターに挿入される複製起源としては、SV40、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス（BPV）等の由来のものを用いることができる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクター中に、選択マーカー挿入することができる。具体的には、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（APH）遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子等の選択マーカーを利用することができる。【０１００】
これらの発現ベクターを宿主細胞に導入し、形質転換された宿主細胞をインビトロまたはインビボで培養して目的とする抗体を産生させる。宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDMを使用することができ、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用することもできる。【０１０１】
前記のように発現、産生された抗体は、通常のタンパク質の精製で使用されている公知の方法を単独で使用することによって又は適宜組み合わせることによって精製できる。例えば、プロテインＡカラムなどのアフィニティーカラム、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Antibodies  A  Laboratory  Manual.  Ed  Harlow,  David  Lane,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory,  1988）。【０１０２】
また、組換え型抗体の産生には、上記宿主細胞に加えて、トランスジェニック動物を利用することもできる。すなわち目的とする抗体をコードする遺伝子を導入された動物から、当該抗体を得ることができる。例えば、抗体遺伝子は、乳汁中に固有に産生されるタンパク質をコードする遺伝子の内部にインフレームで挿入することによって融合遺伝子として構築できる。乳汁中に分泌されるタンパク質として、たとえば、ヤギβカゼインなどを利用することができる。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むＤＮＡ断片はヤギの胚へ注入され、該注入胚が雌のヤギへ導入される。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ（またはその子孫）が産生する乳汁からは、所望の抗体を乳汁タンパク質との融合タンパク質として取得できる。また、トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、ホルモンがトランスジェニックヤギに適宜使用できる（Ebert,  K.M.  et  al.,  Bio/Technology（1994）12,  699-702）。【０１０３】
糖鎖改変抗体
本発明の抗CLDN6抗体は糖鎖が改変された抗体であってもよい。抗体の糖鎖を改変することにより抗体の細胞傷害活性を増強できることが知られている。【０１０４】
糖鎖が改変された抗体の例としては、例えば、グリコシル化が修飾された抗体（WO99/54342など）、糖鎖に付加するフコースが欠損した抗体（WO00/61739、WO02/31140、WO2006/067847、WO2006/067913など）、バイセクティングGlcNAcを有する糖鎖を有する抗体（WO02/79255など）などを挙げることができる。【０１０５】
本発明の好ましい糖鎖改変抗体としてフコースが欠損した抗体を挙げることができる。抗体に結合する糖鎖には、抗体分子のアスパラギンの側鎖のＮ原子に結合するＮ−グリコシド結合糖鎖と、抗体分子のセリンまたはスレオニンの側鎖ヒドロキシル基に結合するＯ−グリコシル結合糖鎖があるが、本発明においてフコースの存否が問題となるのはＮ−グリコシド結合糖鎖である。【０１０６】
本発明においてフコースが欠損した抗体とは、組成物中の抗体のN−グリコシド結合糖鎖のうち、20％以上、好ましくは50％以上、より好ましくは70%以上、さらに好ましくは90％以上のN―グリコシド結合糖鎖においてフコースが欠損していることをいう。【０１０７】
フコースが欠損した抗体は当業者に公知の方法により作製することが可能であり、例えば、α-1,6コアーフコース（α-1,6core  fucose）を付加する能力を有しないかまたはその能力が低い宿主細胞中で抗体を発現させることにより製造することができる。フコースを付加する能力を有しないまたはその能力が低い宿主細胞は特に限定されないが、例えば、ラットミエローマYB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞（YB2/0細胞と略される）(ATCC  CRL  1662として保存されている)、FTVIIIノックアウトCHO細胞(WO  02/31140)、Lec13  細胞(WO03/035835)、フコーストランスポーター欠損細胞（WO2006/067847、WO2006/067913）などを挙げることができる。【０１０８】
糖鎖の解析は当業者に公知の方法で行うことができる。例えば、抗体にN-Glycosidase  F(Roche)等を作用させ、糖鎖を抗体から遊離させる。その後、セルロースカートリッジを用いた固相抽出(Shimizu  Y.  et  al.,  Carbohydrate  Research  332(2001),  381-388)による脱塩後に濃縮乾固し、2-アミノピリジンによる蛍光標識を行う(Kondo  A.  et  al.,  Agricultural  and  Biological  Chemistry  54:8(1990),  2169-2170)。得られたPA化糖鎖を、セルロースカートリッジを用いた固相抽出により脱試薬した後遠心濃縮し、精製PA化糖鎖とする。その後、ODSカラムによる逆相HPLC分析を行うことにより測定することが可能である。また、ＰＡ化糖鎖の調製を行った後、ODSカラムによる逆相HPLC分析およびアミンカラムによる順相HPLC分析を組み合わせた、二次元マッピングを実施することにより行うことも可能である。【０１０９】
キメラ抗体およびヒト化抗体
本発明の抗体の好ましい他の態様としてキメラ抗体またはヒト化抗体を挙げることができる。キメラ抗体は、互いに由来の異なる領域同士を連結した抗体を言う。一般にキメラ抗体は、ヒト以外の動物由来抗体のV領域とヒト抗体由来のC領域とから構成される。例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域と、ヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体は、マウス−ヒト異種キメラ抗体である。【０１１０】
これに対してヒト化抗体は、ヒト以外の動物由来抗体の相補性決定領域（CDR；complementarity  determining  region）と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域（FR；frameworkregion）およびヒト抗体由来のC領域とから構成される。ヒト化抗体はヒト体内における抗原性が低下しているため、本発明の治療剤の有効成分として有用である。ヒト化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称される。具体的には、ヒト以外の動物、たとえばマウス抗体のCDRをヒト抗体に移植したヒト化抗体などが公知である。ヒト化抗体を得るための一般的な遺伝子組換え手法も知られている。【０１１１】
具体的には、マウスの抗体のCDRをヒトのFRに移植するための方法として、たとえばOverlap  Extension  PCRが公知である。Overlap  Extension  PCRにおいては、ヒト抗体のFRを合成するためのプライマーに、移植すべきマウス抗体のCDRをコードする塩基配列が付加される。プライマーは４つのFRのそれぞれについて用意される。一般に、マウスCDRのヒトFRへの移植においては、マウスのFRと相同性の高いヒトFRを選択するのが、CDRの機能の維持において遊離であるとされている。すなわち、一般に、移植すべきマウスCDRに隣接しているFRのアミノ酸配列と相同性の高いアミノ酸配列からなるヒトFRを利用するのが好ましい。【０１１２】
また連結される塩基配列は、互いにインフレームで接続されるようにデザインされる。それぞれのプライマーによってヒトFRが個別に合成される。その結果、各FRにマウスCDRをコードするDNAが付加された産物が得られる。各産物のマウスCDRをコードする塩基配列は、互いにオーバーラップするようにデザインされている。続いて、ヒト抗体遺伝子を鋳型として合成された産物のオーバーラップしたCDR部分を互いにアニールさせて相補鎖合成反応が行われる。この反応によって、ヒトFRがマウスCDRの配列を介して連結される。【０１１３】
最終的に３つのCDRと４つのFRが連結されたV領域遺伝子は、その5’末端と3'末端にアニールし適当な制限酵素認識配列を付加されたプライマーによってその全長が増幅される。上記のように得られたDNAとヒト抗体C領域をコードするDNAとをインフレームで融合するように発現ベクター中に挿入することによって、ヒト型抗体発現用ベクターが作成できる。該組込みベクターを宿主に導入して組換え細胞を樹立した後に、該組換え細胞を培養し、該ヒト化抗体をコードするDNAを発現させることによって、該ヒト化抗体が該培養細胞の培養物中に産生される（欧州特許公開EP  239400  、国際公開WO  96/02576参照）。【０１１４】
上述のように作製されたヒト化抗体の抗原への結合活性を定性的又は定量的に測定し、評価することによって、CDRを介して連結されたときに該CDRが良好な抗原結合部位を形成するようなヒト抗体のFRが好適に選択できる。必要に応じ、再構成ヒト抗体のCDRが適切な抗原結合部位を形成するようにFRのアミノ酸残基を置換することもできる。たとえば、マウスCDRのヒトFRへの移植に用いたPCR法を応用して、FRにアミノ酸配列の変異を導入することができる。具体的には、FRにアニーリングするプライマーに部分的な塩基配列の変異を導入することができる。このようなプライマーによって合成されたFRには、塩基配列の変異が導入される。アミノ酸を置換した変異型抗体の抗原への結合活性を上記の方法で測定し評価することによって所望の性質を有する変異FR配列が選択できる（Sato,  K.et  al.,  Cancer  Res,  1993,  53,  851-856）。【０１１５】
ヒト化抗体のC領域には、ヒト抗体のものが使用され、例えばH鎖では、Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cμ、Cδ、Cα1、Cα2、Cε等を、L鎖ではCκ、Cλ等を使用することができる。また、抗体またはその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体C領域を修飾してもよい。ヒト化の際に用いられるヒト抗体は、IgG、IgM、IgA、IgE、IgDなど如何なるアイソタイプのヒト抗体でもよいが、本発明においてはIgGを用いることが好ましい。IgGとしては、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4などを用いることが可能である。【０１１６】
なお、ヒト化抗体を作製した後に、可変領域（例えば、CDR、FR）や定常領域中のアミノ酸を他のアミノ酸で置換、欠失、付加および／または挿入等してもよく、本発明のヒト化抗体には、そのようなアミノ酸置換等されたヒト化抗体も含まれる。【０１１７】
二価抗体、低分子化抗体、修飾抗体
本発明の抗CLDN6抗体には、CLDN6タンパク質に結合する限り、IgGに代表される二価抗体だけでなく、一価抗体、若しくはIgMに代表される多価抗体も含まれる。本発明の多価抗体には、全て同じ抗原結合部位を有する多価抗体、または、一部もしくは全て異なる抗原結合部位を有する多価抗体が含まれる。【０１１８】
又、本発明の抗体は、抗体の全長分子に限られず、CLDN6タンパク質に結合する限り、低分子化抗体またはその修飾物であってもよい。【０１１９】
低分子化抗体は、全長抗体(whole  antibody、例えばwhole  IgG等)の一部分が欠損している抗体断片を含む。CLDN6抗原への結合能を有する限り、抗体分子の部分的な欠損は許容される。本発明における抗体断片は、重鎖可変領域（VH）および軽鎖可変領域（VL）のいずれか、または両方を含んでいることが好ましい。VHまたはVLのアミノ酸配列は、置換、欠失、付加および／又は挿入を含むことができる。さらにCLDN6抗原への結合能を有する限り、VHおよびVLのいずれか、または両方の一部を欠損させることもできる。又、可変領域はキメラ化やヒト化されていてもよい。抗体断片の具体例としては、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fvなどを挙げることができる。また、低分子化抗体の具体例としては、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv（single  chain  Fv）、ダイアボディー（Diabody）、sc(Fv)2（single  chain  (Fv)2）などを挙げることができる。これら抗体の多量体（例えば、ダイマー、トリマー、テトラマー、ポリマー）も、本発明の低分子化抗体に含まれる。【０１２０】
抗体の断片は、抗体を酵素で処理して抗体断片を生成させることによって得ることができる。抗体断片を生成する酵素として、例えばパパイン、ペプシン、あるいはプラスミンなどが公知である。あるいは、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させることができる（例えば、Co,  M.S.et  al.,  J.  Immunol.（1994）152,  2968-2976、Better,  M.  &  Horwitz,  A.  H.  Methods  in  Enzymology（1989）178,  476-496、Plueckthun,  A.  &  Skerra,  A.  Methods  in  Enzymology（1989）178,  476-496、Lamoyi,  E.,  Methods  in  Enzymology（1989）121,  652-663、Rousseaux,  J.  et  al.,  Methods  in  Enzymology（1989）121,  663-669、Bird,  R.  E.  et  al.,  TIBTECH（1991）9,  132-137参照）。【０１２１】
ダイアボディーは、遺伝子融合により構築された二価(bivalent)の抗体断片を指す(Holliger  P  et  al.,  Proc.Natl.Acad.Sci.USA  90:  6444-6448  (1993)、EP404,097号、WO93/11161号等)。ダイアボディーは、2本のポリペプチド鎖から構成されるダイマーである。通常、ダイマーを構成するポリペプチド鎖は、各々、同じ鎖中でVLおよびVHがリンカーにより結合されている。ダイアボディーにおけるリンカーは、一般に、VLとVHが互いに結合できない位に短い。具体的には、リンカーを構成するアミノ酸残基は、例えば、5残基程度である。そのため、同一ポリペプチド鎖上にコードされるVLとVHとは、単鎖可変領域フラグメントを形成できず、別の単鎖可変領域フラグメントと二量体を形成する。その結果、ダイアボディーは2つの抗原結合部位を有することとなる。【０１２２】
scFvは、抗体のH鎖V領域とL鎖V領域とを連結することにより得られる。scFvにおいて、H鎖V領域とL鎖V領域は、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して連結される(Huston,  J.  S.  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A,  1988,  85,  5879-5883.)。scFvにおけるH鎖V領域およびL鎖V領域は、本明細書に抗体として記載されたもののいずれの抗体由来であってもよい。Ｖ領域を連結するペプチドリンカーには、特に制限はない。例えば３から２５残基程度からなる任意の一本鎖ペプチドをリンカーとして用いることができる。【０１２３】
sc(Fv)2は、2つのVHおよび2つのVLをリンカー等で結合して一本鎖にした低分子化抗体である（Hudson  et  al、J  Immunol.  Methods  1999；231：177-189）。sc(Fv)2は、例えば、scFvをリンカーで結ぶことによって作製できる。【０１２４】
さらに、本発明の抗体は、ポリエチレングリコール（PEG）などの各種分子と結合させた抗体修飾物として使用することもできる。このような抗体修飾物は、本発明の抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。【０１２５】
さらに、本発明の抗体は二重特異性抗体（bispecific  antibody）であってもよい。二重特異性抗体とは、異なるエピトープを認識する可変領域を同一の抗体分子内に有する抗体をいうが、当該エピトープは異なる分子中に存在していてもよいし、同一の分子中に存在していてもよい。すなわち本発明において、二重特異性抗体はCLDN6タンパク質上の異なるエピトープを認識する抗原結合部位を有することができる。このような二重特異性抗体は、１分子のCLDN6に対して２分子の抗体分子が結合できる。その結果、より強力な細胞障害作用を期待できる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体も包含される。【０１２６】
また本発明においては、CLDN6以外の抗原を認識する二重特異性抗体を組み合わせることもできる。たとえば、CLDN6と同様に標的とする癌細胞の細胞表面に特異的に発現する抗原であって、CLDN6とは異なる抗原を認識するような二重特異性抗体を組み合わせることができる。【０１２７】
二重特異性抗体を製造するための方法は公知である。たとえば、認識抗原が異なる２種類の抗体を結合させて、二重特異性抗体を作製することができる。結合させる抗体は、それぞれがH鎖とL鎖を有する１／２分子であっても良いし、H鎖のみからなる１／４分子であっても良い。あるいは、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて、二重特異性抗体産生融合細胞を作製することもできる。さらに、遺伝子工学的手法により二重特異性抗体が作製できる。【０１２８】
医薬組成物
本発明は上述の抗CLDN6抗体を有効成分として含有する医薬組成物を提供する。又、本発明は上述の抗CLDN6抗体を有効成分として含有する抗癌剤に関する。本発明の抗癌剤は、癌を罹患している対象または再発する可能性がある対象に投与されることが好ましい。【０１２９】
また、本発明において、抗CLDN6抗体を有効成分として含有する抗癌剤は、抗CLDN6抗体を対象に投与する工程を含む癌を予防または治療する方法、または、抗癌剤の製造における抗CLDN6抗体の使用と表現することもできる。【０１３０】
本発明の抗癌剤により治療される癌の種類は特に限定されないが、通常、CLDN6タンパク質が発現する癌であり、好ましくは肺線癌、胃癌または卵巣癌である。又、特に限定されないが、本発明の抗癌剤により治療される癌は、好ましくはCLDN6タンパク質が高発現している癌である。【０１３１】
本発明において、「抗CLDN6抗体を有効成分として含有する」とは、抗CLDN6抗体を主要な活性成分として含むという意味であり、モノクローナル抗体の含有率を制限するものではない。【０１３２】
更に本発明における医薬組成物、細胞増殖抑制剤あるいは抗癌剤には、必要に応じて複数種類の抗体を配合することができる。たとえば、複数の抗CLDN6抗体のカクテルとすることによって、CLDN6発現細胞に対する細胞傷害作用を強化できる可能性がある。あるいは、抗CLDN6抗体に加えて、他の腫瘍関連抗原を認識する抗体を配合することにより、治療効果を高めることもできる。【０１３３】
本発明の医薬組成物、細胞増殖抑制剤あるいは抗癌剤は、経口、非経口投与のいずれかによって患者に投与することができる。好ましくは非経口投与である。係る投与方法としては具体的には、注射投与、経鼻投与、経肺投与、経皮投与などが挙げられる。注射投与の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などによって本発明の医薬組成物が全身または局部的に投与できる。また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。投与量としては、例えば、一回の投与につき体重1  kgあたり0.0001mgから1000mgの範囲で投与量が選択できる。あるいは、例えば、患者あたり0.001から100000mg/bodyの範囲で投与量が選択できる。しかしながら、本発明の医薬組成物はこれらの投与量に制限されるものではない。【０１３４】
本発明の医薬組成物は、常法に従って製剤化することができ（例えば、Remington's  Pharmaceutical  Science,  latest  edition,  Mark  Publishing  Company,  Easton,  U.S.A）、医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。例えば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられる。更にこれらに制限されず、その他常用の担体が適宜使用できる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を担体として挙げることができる。【０１３５】
また、本発明は、CLDN6発現細胞と抗CLDN6抗体とを接触させることによりCLDN6発現細胞に傷害を引き起こす方法又は細胞の増殖を抑制する方法を提供する。抗CLDN6抗体は上述したとおりである。抗CLDN6抗体が結合する細胞はCLDN6が発現している細胞であれば特に限定されない。本発明における好ましいCLDN6発現細胞は癌細胞である。好ましい癌細胞としては肺線癌細胞、胃癌細胞、卵巣癌細胞などを挙げることができる。【０１３６】
本発明において「接触」は、インビトロで行われてもよいし、インビボで行われてもよい。例えば、試験管内で培養しているCLDN6発現細胞の培養液に抗体を添加することにより行われる。この場合において、添加される抗体の形状としては、溶液又は凍結乾燥等により得られる固体等の形状が適宜使用できる。水溶液として添加される場合にあっては純粋に抗体のみを含有する水溶液であってもよいし、例えば上記記載の界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等を含む溶液であってもよい。添加する濃度は特に限定されないが、培養液中の最終濃度として、好ましくは1  pg/mlから1  g/mlの範囲であり、より好ましくは1  ng/mlから1  mg/mlであり、更に好ましくは1  μg/mlから1  mg/mlが好適に使用されうる。【０１３７】
また本発明において「接触」は更に、別の態様では、CLDN6発現細胞を体内に移植した非ヒト動物や内在的にCLDN6を発現する癌細胞を有する動物に投与することによっても行われる。投与方法は経口、非経口投与のいずれかによって実施できる。特に好ましくは非経口投与による投与方法であり、係る投与方法としては具体的には、注射投与、経鼻投与、経肺投与、経皮投与などが挙げられる。注射投与の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などによって本発明の医薬組成物細胞増殖阻害剤および抗癌剤が全身または局部的に投与できる。また、被験動物の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。水溶液として投与される場合にあっては純粋に抗体のみを含有する水溶液であってもよいし、例えば上記記載の界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等を含む溶液であってもよい。投与量としては、例えば、一回の投与につき体重1  kgあたり0.0001mgから1000mgの範囲で投与量が選択できる。あるいは、例えば、患者あたり0.001から100000mg/bodyの範囲で投与量が選択できる。しかしながら、本発明の抗体投与量はこれらの投与量に制限されるものではない。【０１３８】
診断方法
本発明はさらに抗CLDN6抗体を用いた癌の診断方法を提供する。本発明の方法により診断される癌はCLDN6を発現している限り特に限定されないが、肺線癌、胃癌または卵巣癌が好ましい。【０１３９】
本発明の診断方法はインビトロで行われてもよいしインビボで行われてもよいが、インビトロで行われることが好ましい。【０１４０】
本発明の抗CLDN6抗体を用いた癌の診断方法は、例えば、以下の工程を含む方法である。
(a)  被験者から採取された試料を提供する工程、
(b)  (a)の試料に含まれるCLDN6タンパク質を検出する工程。【０１４１】
本発明において検出とは、定量的または定性的な検出を含む。定性的な検出には例えば、CLDN6タンパク質が存在するか否かの測定、CLDN6タンパク質が一定の量以上存在するか否かの測定、CLDN6タンパク質の量を他の試料（例えば、コントロール試料など）と比較する測定などが含まれる。定量的な検出には例えば、CLDN6タンパク質の濃度の測定、CLDN6タンパク質の量の測定などが含まれる。【０１４２】
本発明における被検試料は、CLDN6タンパク質が含まれる可能性のある試料であれば特に制限されない。具体的には、哺乳類などの生物の体から採取された試料が好ましい。さらに好ましい試料は、ヒトから採取された試料である。被検試料の具体的な例としては、例えば、血液、間質液、血漿、血管外液、脳脊髄液、滑液、胸膜液、血清、リンパ液、唾液、尿、組織などが例示できる。好ましい試料は、生物の体から採取された組織若しくは細胞が固定化された標本又は細胞の培養液などの被検試料から得られる試料である。【０１４３】
CLDN6タンパク質の検出は当業者に公知の方法により行うことが可能であり、例えば、ラジオイムノアッセイ（RIA）、エンザイムイムノアッセイ（EIA）、蛍光イムノアッセイ（FIA）、発光イムノアッセイ（LIA）、免疫沈降法（IP）、免疫比濁法（TIA）、ウエスタンブロット（WB）、免疫組織化学（IHC）法、免疫拡散法（SRID）などにより行うことが可能である。【０１４４】
本発明において、CLDN6タンパク質が検出された場合（例えば、コントロール試料と比較して被検試料に含まれるCLDN6タンパク質が多い場合、被検試料に含まれるCLDN6タンパク質が一定量を超える場合、など）に癌である、又は癌の可能性が高いと判断される。
【実施例】
【０１４５】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。【０１４６】
[実施例1]    Human  Exon  1.0  ST  Arrayによるhuman  CLDN6  mRNA発現解析
human  CLDN6  mRNAの臨床癌、癌細胞株、各種正常臓器における発現分布について明らかにするために、元来はスプライスバリアント解析を行うために開発されたHuman  Exon  1.0  ST  Array  (Affymetrix社)  を用いた発現解析を実施した。Human  Exon  1.0  ST  Arrayによって発現解析を実施する利点は、基本的に一遺伝子につき3’側に一つのプローブセットしかなかったこれまでのAffymetrix社の発現アレイと比較して、Human  Exon  1.0  ST  Arrayでは遺伝子のエクソン毎に少なくとも一つのプローブセットが設定されているので、本アレイを用いて遺伝子毎の発現解析を行った場合、一遺伝子について複数のプローブセットの発現データを得ることができることになり、遺伝子毎の発現データの信頼性が上がると言える。【０１４７】
今回の発現解析においては、22例の肺腺癌摘出組織の腫瘍部、2例の肺腺癌摘出組織の正常部、13例の胃癌摘出組織の腫瘍部、20例の卵巣癌摘出組織の腫瘍部、19種類の肺腺癌細胞株、4種類の小細胞肺癌細胞株、10種類の胃癌細胞株、20種類の卵巣癌細胞株、及び65種類の正常組織（Clontech社、Ambion社、STRATAGENE社、Cell  APPLICATIONS社、Panomics社、CHEMICON社、BioChain  Institute社から購入）由来のtotal  RNAを使用した。【０１４８】
全ての臨床癌摘出組織（インフォームドコンセント取得済み）の腫瘍部、正常部、及び癌細胞株（ATCC、JCRB、理研  BIOSOURCE  CENTER  CELL  BANKから購入）については、Trizol  (Invitrogen)を用いて製品添付の方法に従ってtotal  RNA抽出を実施した。上述のtotal  RNA  1μgを用い、GeneChip  Whole  Transcript  (WT)  Sense  Target  Labeling  Assay  Manual  (Affymetrix)に準じて遺伝子発現解析実験を実施、Human  Exon  1.0  ST  Array  Dataの数値化は、Affymetrix社提供のExACT  (Exon  Array  Computational  Tool)ソフトウェアを用いて実施した。【０１４９】
Human  CLDN6に対するHuman  Exon  1.0  ST  Arrayのコアプローブセットは3つ存在し、そのプローブセットIDは、3677351、3677352、3677353である。その3つのプローブセット  IDの正常組織の発現データを図1に、肺腺癌細胞株、小細胞肺癌細胞株、肺腺癌摘出組織の腫瘍部の発現データを図2に、胃癌細胞株、胃癌摘出組織の腫瘍部の発現データを図3に、卵巣癌細胞株、卵巣癌摘出組織の腫瘍部の発現データを図4にそれぞれ示す。【０１５０】
図1〜4から分る通り、human  CLDN6トランスクリプトの正常組織での発現は、胎児肺を除いて皆無であり（今回調べた成体の正常組織での発現は、腫瘍組織と比較して無視できるほど少ない）、頻度は低いものの、肺癌、胃癌、卵巣癌での高発現が観察された。本結果は、human  CLDN6を標的とした抗腫瘍剤が、正常組織での副作用を全く心配すること無く、薬剤の薬効と副作用の大きな乖離を期待させる。【０１５１】
[実施例2]    癌細胞株におけるhuman  CLDN6タンパク質の発現解析
癌細胞株におけるhuman  CLDN6タンパク質の発現解析は、細胞株ライセートに対するウエスタンブロット法を用いて実施した。【０１５２】
Human  Exon  1.0  ST  Array、及びHuman  Genome  U133  Set  Arrayによるhuman  CLDN6  mRNA発現解析の結果から、human  CLDN6  mRNA高発現の細胞株として、肺腺癌細胞株ABC-1、胃癌細胞株AGSの2株を、human  CLDN6  mRNAを発現していない細胞株として、肺腺癌細胞株NCI-H2347、肺小細胞肺癌細胞株NCI-H209、肺小細胞肺癌細胞株NCI-H1672、肺小細胞肺癌細胞株NCI-H1184の4株を実験に使用した。ABC-1はJCRB  Cell  Bankから、AGS、NCI-H2347、NCI-H209、NCI-H1672、NCI-H1184はATCCから購入し使用した。【０１５３】
1mM  EDTA  /PBS(-)にて細胞をディッシュから剥がし、1  x  106個の細胞に対して、50uLのNP40  Lysis  Buffer  [0.5%  Nonidet  P40  (v/v),  50mM  Tris-HCl  (pH  7.5),  150mM  NaCl,5mM  EDTA,  1  tablet  /10mL  Complete  mini  EDTA  free  (Roche  04  693  159  001),  100ug/mL  p-APMSF  (p-Amidinophenyl)-methanesulfonyl  Fluoride  Hydrochloride  (Wako  014-10391)]を添加し、細胞をピペッティングにより溶解後、氷上に30分静置し、４℃で15000rpmで30分遠心した上清を細胞株ライセートとした。【０１５４】
上述のようにして作製したライセートを2x  sample  buffer  (SIGMA  S3401-IVL)で1:1とした後、室温にて15分インキュベートし、10uL  (1  x  105分の細胞ライセート)をウエスタンブロットに供した。ウエスタンブロットにおいては、ポリアクリルアミドは15-25%  のものを使用し、1次抗体は、human  CLDN6のC末ペプチドに対するポリクローナル抗体である抗claudin-6  ヤギポリクローナル抗体(C-20)  (SantaCruz  Code.  sc-17669  Lot.  H2605)を200分の1希釈して使用し、2次抗体はブタ抗ヤギIg’s  HRP  コンジュゲート(BIOSOURCE  Code.ACI3404  Lot.4101)を20000分の1希釈して使用した。発色はECL  Plus  Western  Blotting  Detection  System  (GE  Healthcare  Code.RPN2132)を用い、Hyperfilm  ECL  (GE  Healthcare  Code.28-9068-36)に発色させたメンブレンを感光させた。【０１５５】
図5に示すとおり、[実施例  1]において示したトランスクリプトーム解析結果と良く相関した蛋白発現結果であった。この結果から推論すると、human  CLDN6蛋白発現はhuman  CLDN6  mRNA発現と極めて一致していると結論付けることができ、[実施例1]で示したExon  Arrayによるトランスクリプトーム解析結果が蛋白発現解析結果とほぼ一致していると言える。このことから、human  CLDN6タンパク質が成体の正常組織での発現がほとんどなく、腫瘍において発現上昇していることを初めて示したものである、と言える。【０１５６】
[実施例3]    癌細胞膜表面上のhuman  CLDN6を認識する抗体の作製とその抗体の抗腫瘍活性の測定
実施例1、2において示した通り、human  CLDN6蛋白の発現とmRNAの発現は良く相関しており、また、成体の正常組織でのhuman  CLDN6  mRNAの発現は腫瘍組織と比較してかなり少ないか、ほぼ無いことが明らかとなった。従って、成体の正常組織でのhuman  CLDN6蛋白の発現も腫瘍組織と比較して、ほぼ無いものと推測された。このことは、癌細胞表面上に発現するhuman  CLDN6タンパク質を認識する抗体は、極めて腫瘍特異性の高い抗体であることを意味している。そのような抗体を抗腫瘍剤として使用する場合、薬効と副作用の極めて大きな乖離を期待することができ、抗腫瘍剤の標的としてhuman  CLDN6が極めて高いポテンシャルを有していることを意味している。【０１５７】
そこで、実際に癌細胞膜表面上のhuman  CLDN6を認識する抗体を作製し、それらの抗体の抗腫瘍効果について評価した。【０１５８】
3-1.  human  CLDN6  cDNAのクローニング
Human  CLDN6に対する抗体を作製するにあたり、human  CLDN6  (Refseq  Accession  No.  NM＿021195.3)  cDNAのオープンリーディングフレームを含む配列のクローニングを実施した。Human  CLDN6のcDNAは、Marathon-Ready  cDNA  Fetal  Lung  (Clontech社  Code.639333)をテンプレートとして、配列番号1、及び配列番号2で表されるプライマーを用いてクローニングした。詳細には、KOD  plus  DNA  polymerase  (TOYOBO社)を用いて、5μL  の10  x  KOD  Buffer,  5uLの2mM  dNTPs,  3uLの25mM  MgSO4,  1.5uLの10μM  配列番号1  のプライマー,  1.5uLの10μMの配列番号2  のプライマー,  2uLのTemplate  fetal  lung  cDNA,  1uLのKOD  plus  DNA  polymerase,  31uLのヌクレアーゼフリー水を含む溶液を調製し、94℃  2min、{94℃  15秒、58℃  30秒、68℃  1分}  x30サイクルでPCR増幅を行った。次に、本増幅産物をテンプレートとして、配列番号3、及び配列番号4で表されるプライマーを用い、同酵素でもって、同上の組成で、94℃  2min、{94℃  15秒、58℃  30秒、68℃  1分}  x20サイクルで更に再増幅した。増幅断片をHindIII、NheIで消化し、pMCN-flag  ベクターのHind  III、Nhe  Iサイトにクローニングした。【０１５９】
3-2.  human  CLDN6発現CHO  (DG44)、及びhuman  CLDN6発現Ba/F3細胞の作製
human  CLDN6発現CHO細胞（DG44  、Invitrogen社より購入）、及びhuman  CLDN6発現Ba/F3細胞作製のための哺乳動物での発現ベクターとしてはpCOS2ベクターを用いた。pCOS2ベクターは、ベクター上に目的遺伝子の発現誘導のためのプロモーターとして、EF1α  プロモーター−エンハンサー配列が組み込まれており、本プロモーター−エンハンサー下に目的遺伝子cDNA配列を挿入することにより、ベクター導入細胞において、目的遺伝子の発現を誘導することができる。また、本ベクターには、ネオマイシン耐性遺伝子が組み込まれているので、ベクター導入細胞をネオマイシンで選抜することが可能である。【０１６０】
配列番号5で表されるプライマー（EcoRI認識配列-Kozak配列-human  CLDN6  (Refseq  Accession  No.  NM＿021195.3)  オープンリーディングフレームの5’末端配列）と、配列番号6で表されるプライマー（Not  I認識配列-human  CLDN6  オープンリーディングフレームの3’末端配列）を用いて、[実施例3-1.]にて記載したhuman  CLDN6  cDNAをクローニングしたプラスミドをテンプレートとしてPCRを行った。PCR  増幅産物をTOPO  TA  Cloning(Invitrogen社)を用いて、pCR  2.1-TOPOベクターにクローニングした。本ベクターをEcoRI、NotI消化して得られるhuman  CLDN6断片をpCOS2ベクターのEcoRI、NotIサイトに組み込むことによって、human  CLDN6  /  pCOS2発現ベクターを構築した。【０１６１】
Human  CLDN6  /  pCOS2をPvuI消化したものをエレクトロポレーション法（BIO-RAD社  GenePulser  IIを使用）により、CHO  (DG44)  細胞、及びBa/F3細胞に導入した。500ug/mL  Geneticinにより導入細胞株を選抜して、human  CLDN6定常発現CHO  (DG44)、及びhuman  CLDN6定常発現Ba/F3細胞を樹立した。【０１６２】
また、本human  CLDN6  /  pCOS2ベクターは、以下に記載したDNA免疫にも使用した。【０１６３】
3-3.  抗human  CLDN6抗体の作製
抗human  CLDN6抗体の作製にあたり、マウスへの免疫はHelios  Gene  Gun  (BIO-RAD社)によるDNA免疫とhuman  CLDN6強制発現Ba/F3細胞の細胞免疫の組み合わせで実施し、モノクローナル抗体のスクリーニングは、human  CLDN6発現CHO(DG44)細胞を用いたフローサイトメトリーで実施した。【０１６４】
免疫に用いたマウスは、日本チャールス・リバー株式会社より、系統名BALB/cAnNCrlCrlj、及び系統名MRL/MpJ-Tnfrsf6<lpr>/Crlj  Genotype:lpr/lprを購入し、使用した。GeneGunによるDNA免疫に際しては、[実施例3-2.]にて記述したhuman  CLDN6  /  pCOS2ベクターを用いて、BIO-RAD社の「HELIOS  GENE  GUN簡易操作マニュアル  ver.2.1」に従い、プラスミドDNAの金粒子へのコーティング、マウスへの免疫を実施した。DNA免疫スケジュールは、1匹のマウスに対し、２発  /  回、1週間に１〜３回、合計８回〜１７回程度実施した。定期的にマウス血清中の抗体価の測定をhuman  CLDN6強制発現細胞株を用いたフローサイトメトリーで実施した。DNA免疫による抗体価の上昇が確認されたら、human  CLDN6強制発現Ba/F3細胞株の細胞免疫を尾静脈より実施、最終の細胞免疫の２〜３日後に、脾臓細胞を摘出し、マウスミエローマ細胞株P3X63Ag8U.1（P3U1、ATCCより購入）との細胞融合法により、抗体産生不死化ハイブリドーマを作製した。マウスの脾臓細胞とマウスミエローマ細胞株P3X63Ag8U.1との細胞融合に際しては、脾臓細胞2〜4に対し、P3X63Ag8U.1細胞1の割合で両細胞を混合し、その混合細胞に対し、PEG1500（Roche  Diagnostics社）をゆっくりと慎重に添加後、RPMI1640培地でPEG1500を希釈、遠心操作によりPEG1500を除去した。次に、HAT培地（10%  Fetal  Bovine  Serum  (Roche  Diagnostics社),  1x  Penicillin-Streptomycin  (Invitrogen社),  1x  HAT  media  supplement  (Sigma社),  0.5x  BM-Condimed  H1  Hybridoma  Cloning  Supplement  (Roche  Diagnostics社)を含むRPMI1640  (Invitrogen社)培地）に懸濁し、96ウェルプレート、10〜30枚に融合細胞を播種した。37℃,  CO2  インキュベーターにて７日〜１０日培養後、ハイブリドーマ培養上清を用いて、スクリーニングを実施した。スクリーニングは、human  CLDN6強制発現CHO細胞に対する抗体の結合活性をフローサイトメーター（ベクトン・ディッキンソン社）で測定することによって実施した。陽性ウェルについては、複数のハイブリドーマが存在している可能性があるため、限界希釈法によりハイブリドーマのモノクローン化を行った。モノクローン化の後、human  CLDN6強制発現CHO細胞、及びhuman  CLDN6強制発現Ba/F3細胞への結合活性の強い抗体を産生しているハイブリドーマクローンを選択し、これをもって細胞膜表面上のhuman  CLDN6を認識する抗体産生ハイブリドーマの樹立とした。【０１６５】
これらのうち、特に、フローサイトメトリーにおいてhuman  CLDN6強制発現細胞株に対する結合活性が強く、且つアイソタイピングの結果IgG  タイプであった抗体を産生するハイブリドーマ18種類を選択し、FBSの代わりにUltra  Low  IgG  FBS  (Invitrogen社)を含むHAT培地にて培養し、その培養上清からHiTrap  ProteinG  HP  1mLカラム（GE  Healthcare社）で抗体を精製した。抗体の精製度は、SDS-PAGE、CBB染色により十分なレベルであることを確認した。なお、抗体のアイソタイピングは、IsoStrip  (Roche社)  を用いて実施した。精製した抗体の濃度測定は、Dc  Protein  Assay  Kit  I  (BIO-RAD社)  を用いて、添付のウシγグロブリンをスタンダードとして用いて実施し、抗体濃度はウシγグロブリン濃度に換算して表した。上述の抗体精製、アイソタイピング、蛋白定量については、何れも添付の製品マニュアルに従って実施した。【０１６６】
3-4.  抗human  CLDN6モノクローナル抗体のhuman  CLDN6  強制発現Ba/F3細胞表面上のhuman  CLDN6への結合活性の測定
[実施例  3-3]において記載した、精製抗human  CLDN6モノクローナル抗体18種類のhCLDN6強制発現Ba/F3細胞、及び親株であるBa/F3への結合性について、抗体濃度を振ってフローサイトメトリーによって評価した。【０１６７】
FACS  buffer  (0.5%  BSA,  1x  PBS(-),  0.1%  NaN3)に懸濁した1  x  105個の細胞を96ウェルU底プレート(FALCON  353910)に分注し、最終濃度が10,  2,  0.4,  0.08,  0  μg/mLとなるようにそれぞれの抗体を添加、混和後、4℃で1時間インキュベートした。遠心操作と反応液のアスピレーティングによる除去、及び200uL/ウェルのFACS  bufferの添加による細胞の洗浄後、2次抗体としてFITC標識Goat  F(ab’)2  Fragment  Anti-mouse  IgG(Fcγ)  (BECKMAN  COULTER)をFACS  bufferにて100倍希釈して細胞に添加した。4℃、30分のインキュベーション後、同上のFACS  bufferによる細胞の洗浄を行い、10μg/mLの濃度でヨウ化プロピジウム(SIGMA)を含むFACS  buffer  100uLに懸濁し、フローサイトメトリーに供した。【０１６８】
フローサイトメトリーは、X軸：前方散乱光（forward  scatter）、Y軸：側方散乱光（side  scatter）のドットプロット、及びX軸：前方散乱光（forward  scatter）、Y軸：Propidium  Iodideの蛍光(FL-3)のドットプロットにて生細胞集団にゲートを設定した。【０１６９】
図6に示す通り、本発明の抗体は親株であるBa/F3細胞には結合せず、human  CLDN6強制発現Ba/F3細胞に強く結合する、human  CLDN6特異的抗体である。【０１７０】
3-5.  抗human  CLDN6抗体の癌細胞膜表面上のhuman  CLDN6に対する結合活性の測定
human  CLDN6のC末細胞内ペプチド配列を認識するポリクローナル抗体は知られているが、癌細胞膜表面上のネイティブな形をとっているhuman  CLDN6の細胞外部分を認識する抗体は未だ存在しなかった。そこで、[実施例3-3]において作製した本発明の抗human  CLDN6モノクローナル抗体を用いて、これらの抗体がhuman  CLDN6  強制発現細胞株の細胞ライセートだけでなく、実際の癌細胞膜表面上のhuman  CLDN6をも認識するか否かについてフローサイトメトリーを用いて評価した。【０１７１】
Human  CLDN6陽性癌細胞株としては、[実施例1]、[実施例2]の遺伝子及び蛋白発現解析結果に基づいて、肺腺癌細胞株ABC-1、及び胃癌細胞株AGSを用いた。【０１７２】
FACS  buffer  (0.5%  BSA,  1x  PBS(-),  0.1%  NaN3)に懸濁した1  x  105個のそれぞれの細胞を96ウェルU底プレート(FALCON  353910)に分注し、最終濃度が10,  1,  0  μg/mLとなるようにそれぞれの抗体を添加、混和後、4℃で1時間インキュベートした。遠心操作と反応液のアスピレーティングによる除去、及び200uL/ウェルのFACS  bufferの添加による細胞の洗浄後、2次抗体としてFITC標識ヤギ  F(ab’)2  フラグメント抗マウスIgG(Fcγ)  (BECKMAN  COULTER社)をFACS  bufferにて100倍希釈して細胞に添加した。4℃、1hのインキュベーション後、同上のFACS  bufferによる細胞の洗浄を行い、FACS  buffer  120uLに懸濁し、フローサイトメトリーに供した。【０１７３】
フローサイトメトリーは、X軸：前方散乱光（forward  scatter）、Y軸：側方散乱光（side  scatter）のドットプロットにて生細胞集団にゲートを設定した。【０１７４】
図7に示す通り、[実施例3-3]で作製した抗体は、抗体により程度の差はあるが、18種類とも濃度依存的にhuman  CLDN6発現癌細胞株であるABC-1、及びAGS細胞に結合した。【０１７５】
3-6.  抗human  CLDN6抗体のAntibody-Dependent  Cellular  Cytotoxicity  (ADCC)活性の測定
本発明の抗human  CLDN6モノクローナル抗体の肺腺癌細胞株ABC-1および胃癌細胞株AGSに対するADCC活性をクロム放出法で調べた。ABC-1またはAGSを96ウェルプレートに播種し付着させた後、クロム51を添加して培養を数時間続けた。培養液を除去、培養液で細胞を洗浄したのちに新しい培養液を添加した。続いて抗体を添加し、各ウェルにターゲット細胞に比べて約5倍量のエフェクター細胞(NK-92  (ATCC,  CRL-2407)にマウスFc-ガンマ受容体3(NM＿010188)の細胞外領域およびヒトガンマ鎖(NM＿004106)の膜貫通領域と細胞内領域を含むキメラタンパク質を強制発現させた組換え細胞(特願2007-20155))を添加し、プレートを5%  CO2インキュベーター中で37℃にて4時間静置した。静置後プレートを遠心し、各ウェルより一定量の上清を回収してガンマカウンターWallac  1480を用いて放射活性を測定し、以下の式を用いて特異的クロム遊離率(%)を求めた。
特異的クロム遊離率(%)  =  (A-C)×100/(B-C)
ここで、Aは各ウェルにおける放射活性、Bは終濃度1%  Nonidet  P-40で細胞溶解して培地へ放出される放射活性平均値、Cは培地のみ添加した場合における放射活性平均値である。【０１７６】
その結果、図8、図9に示したように、試験に用いた本発明の抗human  CLDN6モノクローナル抗体のうち、特に、AB3-1、AE1-16、AE49-11、AE3-20、AC2-40は、ABC-1、及びAGSに対して非常に強いADCC活性を誘導した。本結果は、human  CLDN6を標的とした腫瘍に対する抗体治療が非常に有用であることを示す結果である。【０１７７】
3-7.  抗  human  CLDN6抗体のComplement-Dependent  Cytotoxicity  (CDC)活性の測定
抗human  CLDN6モノクローナル抗体の肺腺癌細胞株ABC-1に対するCDC活性をクロム放出法で調べた。ABC-1を96ウェルプレートに播種し付着させた後、Chromium-51を添加して培養を数時間続けた。培養液を除去、培養液で細胞を洗浄したのちに新しい培養液を添加した。続いて本発明の抗human  CLDN6モノクローナル抗体（AB3-1、AC2-40、AD12-47、AE1-16、AE2-4、AE3-20、AE49-11）およびコントロールマウスIgG1抗体(Cat.  No.  553453、BD  Biosciences  Pharmingen)を終濃度10μg/mLになるように添加した。続いて幼令ウサギ補体(Cat.  No.  CL3441、Cederlane)を終濃度25%、5%、または1%になるように添加した。プレートを5%  CO2インキュベーター中で37℃にて1.5時間静置した。静置後プレートを遠心し、各ウェルより一定量の上清を回収してガンマカウンターWallac  1480を用いて放射活性を測定し、3-6.と同様に特異的クロム遊離率(%)を求めた。【０１７８】
その結果、図10に示すように、試験に用いた本発明の抗human  CLDN6モノクローナル抗体のうち特に、AE1-16、AE3-20、AE49-11は強いCDC活性を誘導した。一方対照として用いたマウスIgG1抗体はCDC活性を示さなかった。【０１７９】
3-8.  Mab-ZAPを用いた抗human  CLDN6抗体の抗腫瘍効果の評価
Human  CLDN6を標的としたイムノトキシンが抗腫瘍活性を示すことができるかについて、Mab-ZAP  (Advanced  Targeting  Systems社)  を用いて評価した。Mab-ZAPはヤギ抗マウスIgGのサポリン（saporin）標識体である。サポリンはリボソームにおけるタンパク質合成阻害を作用機作とするタンパク質性の毒素である。全ての抗体がイムノトキシンを作製するのに適している訳ではなく、イムノトキシンとして薬効の強い抗体もあればそうでないものもあることが知られている（非特許文献９；Kohls  and  Lappi,  BioTechniques  2000,  28  (1):  162）。そこで、今回取得した抗human  CLDN6結合抗体18種類のイムノトキシンとしてのポテンシャルについて、Mab-ZAPを用いて評価した。【０１８０】
標的癌細胞株としては、肺腺癌細胞株ABC-1、及び胃癌細胞株AGSを用いた。ABC-1については、第０日において96ウェルプレートに5  x  103  細胞/  100μL  /  ウェルで播種し、第１日において各種抗  human  CLDN6  モノクローナル抗体を、最終濃度が100ng  /  200μL培地  /  ウェル、或いは0ng  /  200μL培地  /  ウェルとなるように添加し、続いて、Mab-ZAPを最終濃度が100ng  /  200μL培地  /  ウェルとなるように添加して、37℃  CO2インキュベーターにて培養した。第９日において生細胞測定試薬SF  (ナカライテスク)を  20μL  /ウェルで添加し、30分間、37℃  CO2インキュベーターにて培養した後、450nm-  650nmの吸光度を測定した。AGSについては、第０日において96  ウェルプレートに1  x  103  細胞/  100μL  /  ウェルで播種し、第１日において各種抗  human  CLDN6  モノクローナル抗体を、最終濃度が100ng  /  200μL培地  /  ウェル、或いは0ng  /  200μL培地  /  ウェルとなるように添加し、続いて、Mab-ZAPを最終濃度が100ng  /  200μL培地  /  ウェルとなるように添加して、37℃  CO2インキュベーターにて培養した。第７日において生細胞測定試薬SF  (ナカライテスク社)を  20μL  /ウェルで添加し、30分間、37℃  CO2インキュベーターにて培養した後、450nm-  650nmの吸光度を測定した。【０１８１】
ABC-1およびAGSについての結果をそれぞれ図11および図12に示す。Mab-ZAP単独、或いは抗体単独では何れも抗腫瘍効果は観察されないのに対し、AE1-16抗体、或いはAE49-11抗体とMab-ZAPとの共存在下において、ABC-1およびAGSに対して非常に強い抗腫瘍効果が観察された。【０１８２】
以上の結果から、human  CLDN6を標的としたイムノトキシンは抗腫瘍剤として非常に有用であることが示された。【０１８３】
[実施例4]    抗human  CLDN6抗体の可変領域遺伝子配列の決定
以上の結果から、今回取得した抗human  CLDN6抗体のうち、ADCC、CDC、及びMab-ZAP共存在下によるイムノトキシンとしての抗腫瘍活性の強かった抗体3種類（AB3-1、AE1-16、AE49-11、AE3-20）を選択し、抗体の可変領域の核酸配列、及びアミノ酸配列を決定した。それぞれの抗体を産生するハイブリドーマを培養し、1  x  106  個の細胞からRNeasy  (QIAGEN社)を用いてtotal  RNAを精製した。精製したtotal  RNA  1μgを使用し、SMART  RACE  cDNA  Amplification  Kit  (Clontech社)とマウスIgG1定常領域配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドMHC-IgG1（配列番号7）またはマウスIgG2b定常領域配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドMHC-IgG2b（配列番号8）またはマウスκ鎖定常領域塩基配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドmCKappaR（配列番号9）を用い、3種類の抗体のH鎖、L鎖cDNAの定常領域の上述のオリゴヌクレオチド配列に相当する位置から5’  -  cDNA末端までの配列をPCR増幅した。増幅断片をpTA2ベクター（TOYOBO）にクローニングし、cDNA配列を決定した。AB3-1のH鎖可変領域の塩基配列を配列番号10、アミノ酸配列を配列番号11、L鎖可変領域の塩基配列を配列番号12、アミノ酸配列を配列番号13に示す。AE1-16のH鎖可変領域の塩基配列を配列番号14、アミノ酸配列を配列番号15、L鎖可変領域の塩基配列を配列番号16、アミノ酸配列を配列番号17に示す。AE49-11のH鎖可変領域の塩基配列を配列番号18、アミノ酸配列を配列番号19、L鎖可変領域の塩基配列を配列番号20、アミノ酸配列を配列番号21に示す。AE3-20のH鎖可変領域の塩基配列を配列番号36、アミノ酸配列を配列番号37、L鎖可変領域の塩基配列を配列番号38、アミノ酸配列を配列番号39に示す。【０１８４】
また、これらの可変領域のCDRのアミノ酸配列を下記の表に示す。
【表１】
0005848863.tif 000002
【０１８５】
[実施例  5]    抗human  CLDN6モノクローナル抗体のhuman  CLDN1、CLDN3、CLDN4、CLDN9分子に対する結合性評価
[実施例4]において、可変領域アミノ酸配列を決定した抗human  CLDN6モノクローナル抗体4種類（AB3-1、AE1-16、AE49-11、AE3-20）の  human  CLDN1、CLDN3、CLDN4、CLDN9分子に対する結合性について、各分子の強制発現Ba/F3細胞株を作製し、抗体濃度を振ってフローサイトメトリーによって評価した。【０１８６】
FACS  buffer  (0.5%  BSA,  1x  PBS(-),  0.1%  NaN3)に懸濁した1  x  105個の細胞を96ウェルU底プレート(FALCON  353910)に分注し、最終濃度が10,  2,  0.4,  0.08,  0  μg/mLとなるようにそれぞれの抗体を添加、混和後、4℃で1時間インキュベートした。遠心操作と反応液のアスピレーティングによる除去、及び200uL/ウェルのFACS  bufferの添加による細胞の洗浄後、2次抗体としてFITC標識Goat  F(ab’)2  Fragment  Anti-mouse  IgG(Fcγ)  (BECKMAN  COULTER)をFACS  bufferにて100倍希釈して細胞に添加した。4℃、30分のインキュベーション後、同上のFACS  bufferによる細胞の洗浄を行い、10μg/mLの濃度でヨウ化プロピジウム(SIGMA)を含むFACS  buffer  100uLに懸濁し、フローサイトメトリーに供した。【０１８７】
フローサイトメトリーは、X軸：前方散乱光（forward  scatter）、Y軸：側方散乱光（side  scatter）のドットプロット、及びX軸：前方散乱光（forward  scatter）、Y軸：Propidium  Iodideの蛍光(FL-3)のドットプロットにて生細胞集団にゲートを設定した。【０１８８】
表２に示す通り、本発明の抗体であるAE3-20はhuman  CLDN6にほぼ特異的に結合する抗体であり、AE1-16およびAE49-11はhuman  CLDN9に中程度、human  CLDN4に弱く交差する抗体であり、AB3-1はhuman  CLDN9に交差する抗体であった。【０１８９】
【表２】
0005848863.tif 000003
【０１９０】
[実施例6]    免疫組織染色による肺腺癌組織でのCLDN6の検出
肺腺癌組織におけるCLDN6タンパク質発現、癌細胞膜上への局在を免疫組織染色で確認した。免疫組織染色においては、肺腺癌臨床組織から抽出した全RNAを用いて、Real  Time  PCRによるCLDN6転写産物の定量をまず実施し、CLDN6転写産物が高発現の症例を用いた。凍結切片は4%  PFA固定後、一般的なLSAB法にて、Ventana  HX  Discovery  System  (Ventana  Medical  Systems社)を用いて免疫組織染色を行った。免疫組織染色における1次抗体は、ヤギ抗CLDN6ポリクローナル抗体（Santa  Cruz社Code.No.  sc-17669  Lot.  H2605）を12.5μg/mLとして使用した。結果、肺腺癌の腫瘍組織において、細胞膜および細胞質内に陽性反応が認められた。一方、非腫瘍組織においては、マクロファージ、2型肺胞上皮および細気管支上皮に陽性反応が認められたが、いずれも染色強度は軽微であり、腫瘍組織で認められた細胞膜への陽性反応は認められなかった。肺腫瘍組織における細胞膜の染色強度は、正常肺組織よりも高かった。ヒト腫瘍組織の細胞膜におけるタンパク質レベルでの発現検出は、本発明によって初めて示された。【０１９１】
[実施例7]    抗CLDN6抗体の抗腫瘍活性の評価
AE49-11抗体の抗腫瘍活性の評価
AE49-11抗体のサブクラスはIgG2bであるが、先行研究において、IgG2aの方がADCC活性が強いとの報告（非特許文献[10]、[11]）があったことから、薬効増強を意図して、抗体のFc領域をIgG2aに変換したAE49-11抗体（「AE49-11/mIgG2a」と命名、H鎖アミノ酸配列（配列番号[52]）、L鎖アミノ酸配列（配列番号[53]）を発現するベクターを構築し、CHO-DG44細胞にて発現、精製した。本AE49-11/mIgG2a抗体の結合活性が元のIgG2b抗体とほぼ同等であることは、フローサイトメトリーにて確認し、本抗体を用いて、in  vivo抗腫瘍実験を以下の通り実施した。【０１９２】
（１）PA-1皮下移植モデル
PA-1細胞をHanks’  Balanced  Salt  Solution  (HBSS)にて5  x  107  cell/mlに調製し、前日に抗アシアロGM1抗体100  μl  (和光純薬社、1バイアルを1  mlの注射用蒸留水で溶解後、4  mlの生理的食塩水を添加)を腹腔内投与したSCIDマウス(メス、9週齢、日本チャールス・リバー社)の腹部皮下へ200  μl移植した。移植後23日目よりAE49-11/mIgG2a抗体を週1回、4週間、尾静脈より投与した。抗体は生理食塩液にて5  mg/mlに調製し50  mg/kgにて投与した。陰性対照として生理食塩液  (vehicle)を同様に投与した。1群5匹にて試験を行った。抗腫瘍活性は腫瘍体積で評価した。腫瘍体積  (mm3)、腫瘍体積変化量、及び腫瘍増殖抑制効果(%)は以下のように算出した。
腫瘍体積  (mm3)  =  腫瘍長径  ×  腫瘍短径  ×  腫瘍短径  ×  1/2
腫瘍体積変化量  (mm3)  =  測定時の腫瘍体積  -  投与開始時の腫瘍体積
腫瘍増殖抑制率  (%)=  {1-（薬剤投与群の腫瘍体積変化量の平均値  /
vehicle投与群の腫瘍体積変化量の平均値）}  ×  100【０１９３】
試験の結果、AE49-11/mIgG2a抗体は50  mg/kg投与群でvehicle投与群に対して腫瘍増殖を抑制する傾向を示した。投与開始1,  2,  3,  4週間後の腫瘍増殖抑制率は49.5%,  31.1%,  29.9%,  17.9%であり、投与開始早期での腫瘍増殖抑制効果が強い傾向が観察された。【０１９４】
（２）NUGC-3皮下移植モデル
引き続いて、NUGC-3皮下移植モデルでの薬効を検討した。本モデルにおける薬効試験を行うにあたっては、フコーストランスポーターをノックアウトしたCHO-DXB11S細胞でAE49-11/mIgG2a抗体を発現、精製した抗体（低フコース型AE49-11/mIgG2a抗体）を用いて薬効試験を行った。【０１９５】
NUGC-3細胞をHanks’  Balanced  Salt  Solution  (HBSS)にて5  x  107  cell/mlに調製し、SCIDマウス(メス、12週齢、日本チャールス・リバー社)の腹部皮下へ200  μl移植した。移植後11日目に腫瘍体積と体重で2群に群分けし、移植後11日目、17日目、24日目に各群に低フコース型AE49-11/mIgG2a抗体とvehicleを尾静脈より投与した。抗体はvehicleにて5  mg/mlに調製し50  mg/kgにて投与した。Vehicleは、100  mM  Glycine  (pH2.7)とその10分の1量の1  M  Tris-HCl  (pH9.0)の混合溶液を、elution  bufferをD-PBS  (-)として、PD-10カラムにてbuffer置換したものを0.22  μm  filter滅菌して使用した。【０１９６】
1群8匹にて試験を行った。抗腫瘍活性は延命効果で評価した。
試験の結果、低フコース型AE49-11/mIgG2a抗体はvehicle投与群に対して延命効果を有することが示された。
以上から抗CLDN6抗体がヒト臨床において抗腫瘍活性を示す可能性が示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０１９７】
本発明の抗CLDN6抗体は、抗体医薬、とくに細胞増殖抑制剤および抗癌剤として有用である。【０１９８】
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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