(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に記載のアミノ酸配列、あるいはこの配列中に１ないし１０個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列、又はこの配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ビオチン結合活性を示すタンパク質において、
以下のグループ：
１）配列番号２の３６番目のセリン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換；
２）配列番号２の８０番目のトリプトファン残基の親水性アミノ酸残基への置換；
３）配列番号２の１１６番目のアスパラギン酸残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換；
４）配列番号２の４６番目のプロリン残基のスレオニン、セリン若しくはチロシン残基への置換、及び、７８番目のスレオニン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換；
５）配列番号２の４６番目のプロリン残基のスレオニン、セリン若しくはチロシン残基への置換、及び、１１６番目のアスパラギン酸残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換：並びに
６）配列番号２の４６番目のプロリン残基のスレオニン、セリン若しくはチロシン残基への置換、７８番目のスレオニン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換、及び、１１６番目のアスパラギン酸残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換
から選択される置換を有することを特徴とし、ここで、水素結合を形成しないアミノ酸残基は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、又はプロリンであり、
以下の性質：
ｉ）ビオチンを用いた精製が可能である；
ｉｉ）配列番号２の記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の四量体構造を維持している；
ｉｉｉ）プロテアーゼに対し耐性を有する；及び
ｉｖ）大腸菌の可溶性画分において高い発現を示す
の全部を満たし、
以下のａ）−ｐ）
ａ）配列番号２の１４番目のアスパラギン残基は改変されていない、あるいはグルタミン又はアスパラギン酸に置換されている；
ｂ）配列番号２の１８番目のセリン残基は改変されていない、あるいはスレオニン又はチロシンに置換されている；
ｃ）配列番号２の３４番目のチロシン残基は改変されていない、あるいはセリン又はスレオニンに置換されている；
ｄ）配列番号２の３６番目のセリン残基は改変されていない、あるいはスレオニン又はチロシンに置換されている；
ｅ）配列番号２の４０番目のアスパラギン酸残基は改変されていない、あるいはアスパラギン以外の残基に置換されている；
ｆ）配列番号２の６９番目のトリプトファン残基は改変されていない；
ｇ）配列番号２の７６番目のセリン残基は改変されていない、あるいはスレオニン又はチロシンに置換されている；
ｈ）配列番号２の７８番目のスレオニン残基は改変されていない、あるいはセリン又はチロシンに置換されている；
ｉ）配列番号２の８０番目のトリプトファン残基は改変されていない；
ｊ）配列番号２の９６番目のトリプトファン残基は改変されていない；
ｋ）配列番号２の１０８番目のトリプトファン残基は改変されていない；
ｌ）配列番号２の１１６番目のアスパラギン酸残基は改変されていない、あるいはグルタミン酸又はアスパラギンに置換されている
ｍ）配列番号２の４６番目のプロリン残基は改変されていない；
ｎ）配列番号２の６６番目のアラニン残基は改変されていない；
ｏ）配列番号２の９７番目のロイシン残基は改変されていないか、イソロイシンに改変されている；及び
ｐ）配列番号２の１１３番目のバリン残基は改変されていない
の１ないし全ての条件を満たす、ただし、このうち、１）ないし６）で特定したアミノ酸残基は、１）ないし６）の各々で特定したように置換されている、
改変型ビオチン結合タンパク質。
【請求項２】
１−ａ）配列番号２の３６番目のセリン残基がアラニンに置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２  Ｓ３６Ａ）；
２−ａ）配列番号２の８０番目のトリプトファン残基がリジンに置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２  Ｗ８０Ｋ）；
３−ａ）配列番号２の１１６番目のアスパラギン酸残基がアラニンに置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２  Ｄ１１６Ａ）；
４−ａ）配列番号２の４６番目のプロリン残基がスレオニンに置換されており、そして、７８番目のスレオニン残基がアラニンに置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２  Ｐ４６Ｔ−Ｔ７８Ａ）；
５−ａ）配列番号２の４６番目のプロリン残基がスレオニンに置換されており、そして、１１６番目のアスパラギン酸残基がアラニンに置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２  Ｐ４６Ｔ−Ｄ１１６Ａ）；並びに
６−ａ）配列番号２の４６番目のプロリン残基がスレオニンに置換されており、７８番目のスレオニン残基がアラニンに置換されており、そして、１１６番目のアスパラギン酸残基がアラニンに置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２  Ｐ４６Ｔ−Ｔ７８Ａ―Ｄ１１６Ａ）
からなるグループから選択される、請求項１に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
【請求項３】
配列番号２に記載のアミノ酸配列、あるいはこの配列中に１ないし１０個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列、又はこの配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ビオチン結合活性を示すタンパク質において、
６）配列番号２の７８番目のスレオニン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換を有し、ここで、水素結合を形成しないアミノ酸残基は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、又はプロリンであり、
以下の性質：
ｉ）ビオチンを用いた精製が可能である；
ｉｉ）配列番号２の記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の四量体構造を維持している；
ｉｉｉ）プロテアーゼに対し耐性を有する；及び
ｖ）配列番号２の記載のアミノ酸配列からなるタンパク質よりも、高い耐熱性を有するの全部を満たし、
以下のａ）−ｏ）
ａ）配列番号２の１４番目のアスパラギン残基は改変されていない、あるいはグルタミン又はアスパラギン酸に置換されている；
ｂ）配列番号２の１８番目のセリン残基は改変されていない、あるいはスレオニン又はチロシンに置換されている；
ｃ）配列番号２の３４番目のチロシン残基は改変されていない、あるいはセリン又はスレオニンに置換されている；
ｄ）配列番号２の３６番目のセリン残基は改変されていない、あるいはスレオニン又はチロシンに置換されている；
ｅ）配列番号２の４０番目のアスパラギン酸残基は改変されていない、あるいはアスパラギン以外の残基に置換されている；
ｆ）配列番号２の６９番目のトリプトファン残基は改変されていない；
ｇ）配列番号２の７６番目のセリン残基は改変されていない、あるいはスレオニン又はチロシンに置換されている；
ｈ）配列番号２の８０番目のトリプトファン残基は改変されていない；
ｉ）配列番号２の９６番目のトリプトファン残基は改変されていない；
ｊ）配列番号２の１０８番目のトリプトファン残基は改変されていない；
ｋ）配列番号２の１１６番目のアスパラギン酸残基は改変されていない、あるいはグルタミン酸又はアスパラギンに置換されている
ｌ）配列番号２の４６番目のプロリン残基は改変されていない；
ｍ）配列番号２の６６番目のアラニン残基は改変されていない；
ｎ）配列番号２の９７番目のロイシン残基は改変されていないか、イソロイシンに改変されている；及び
ｏ）配列番号２の１１３番目のバリン残基は改変されていない
の１ないし全ての条件を満たす、
ことを特徴とする改変型ビオチン結合タンパク質。
【請求項４】
６−ａ）配列番号２の７８番目のスレオニン残基がアラニン残基へ置換されている、請求項３に記載の改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２  Ｔ７８Ａ）。
【請求項５】
配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質よりも、低いビオチン結合性を示す、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
【請求項６】
配列番号２に記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項に記載のタンパク質を固定化した担体。
【請求項８】
請求項１ないし６のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項９】
請求項８に記載の核酸を含むベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は改変型ビオチン結合タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
アビジンは卵白由来の塩基性糖タンパク質で、ビオチン（ビタミンＨ）と強く結合する。一方、ストレプトアビジンは放線菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｉｄｉｎｉｉ）由来のアビジン様タンパク質で、等電点は中性付近で糖鎖を含まない。両タンパク質とも、四量体を形成し、１つのサブユニット当たり１分子のビオチンと結合する。分子量は６０ｋＤａ程度である。アビジンとビオチン、あるいはストレプトアビジンとビオチンの親和性は非常に高く（Ｋｄ＝１０−１５〜−１４Ｍ）、生体二分子間の相互作用としては最も強い。そのため、アビジン／ストレプトアビジン−ビオチン相互作用は、生化学、分子生物学、あるいは医学の分野で広く応用されている。アビジンは、等電点が１０を越え、その高い塩基性、あるいは糖鎖の存在により、ＤＮＡやタンパク質等の生体分子に対する非特異的な結合が問題となる場合がある。
【０００３】
ビオチンの分子量は２４４と小さく、ｐＨ変化や熱にも安定であるため、物質の標識によく用いられている。ビオチン化の方法としては、化学的な修飾を施したビオチンを、タンパク質のアミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基等の各種の官能基に結合させる方法がある。このようなビオチン化試薬は市販されており、これらを利用してタンパク質や核酸等をビオチン化することができる。またタンパク質のビオチン化の方法の一つとして、生体内のビオチンリガーゼによってビオチン化される配列と、目的のタンパク質との融合タンパク質を、組換えタンパク質として発現させ、宿主細胞内の同酵素によって、融合タンパク質をビオチン化させる方法がある。このようなビオチン化配列として、例えばＢｉｏＥａｓｅ  Ｔａｇ（登録商標）があり、大腸菌やショウジョウバエ細胞、あるいは哺乳類細胞において、タンパク質をｉｎ ｖｉｖｏでビオチン化させた状態で発現させるシステムとして、市販されている。
【０００４】
アビジンまたはストレプトアビジンと、ビオチンとの結合は極めて強いため、その結合は不可逆的であり、一度結合すると殆ど解離させることが出来ない。この強い結合のため、従来のアビジン、ストレプトアビジンは、そのままでは、ビオチン化生体分子の精製のために必要な、例えばアフィニティクロマトグラフィー等の可逆的な結合を必要とする技術分野へ応用することが出来ない。
【０００５】
この問題への対策として、これまでにビオチン結合性を低下させたアビジンやストレプトアビジンが報告されている。例えば、ビオチンとの結合に寄与するチロシン残基をニトロ化したニトロ化アビジンやニトロ化ストレプトアビジンが開発された。これらは酸性〜中性（ｐＨが４〜７．５）の時にビオチンと強く結合し、アルカリ性（ｐＨが１０）の時に解離する。ニトロ化アビジン−アガロースはＣａｐｔＡｖｉｄｉｎ−アガロースとして市販されている。しかしニトロ化には手間がかかり、またその効率も一定ではない。
【０００６】
一方これまでに、遺伝子工学的にアビジンやストレプトアビジンに、部位特異的アミノ酸変異を導入することによって、ビオチンに対する親和性を下げた例が報告されている。ビオチンとの親和性を低下させる方法として、ビオチン結合ポケットを形成するアミノ酸のうち、ビオチンと直接相互作用するアミノ酸に変異導入する方法と、タンパク質のサブユニット同士の接点に関与するアミノ酸に変異導入する方法の２つがある。
【０００７】
アビジンの場合、ビオチンと水素結合するアミノ酸に変異を入れることで（Ｍａｒｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ.  ３６９：２４９−２５４；  Ｌａｉｔｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ. Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７８：４０１０−４０１４  ；  Ｌａｉｔｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ. Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６：８２１９−８２２４）、あるいはビオチンと疎水結合するアミノ酸に変異を入れることで（Ｌａｉｔｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ.  ４６１：５２−５８；  Ｌａｉｔｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７８：４０１０−４０１４）、ビオチンへの親和性を下げた組換えタンパク質が報告されている。
【０００８】
同様にストレプトアビジンの場合も、ビオチンと水素結合するアミノ酸に変異を入れた例（Ｑｕｒｅｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２７６：４６４２２−４６４２８；  Ｇａｂｒｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ９５：１３５２５−１３５３０；  Ｑｕｒｅｓｈｉ  ａｎｄ    Ｗｏｎｇ （２００２）Ｐｒoｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．  Ｐｕｒｉｆ．２５：４０９−４１５；  Ｗｕ  ａｎｄ    Ｗｏｎｇ（２００６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．４６：２６８−２７３；  Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｏｎｇ（２００５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２８０：２３２２５−２３２３１）や、ビオチンと疎水結合するアミノ酸に変異を入れた例（Ｃｈｉｌｋｏｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９２：１７５４−１７５８  ；  Ｌａｉｔｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ.  ４６１，５２−５８；  Ｓａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ９２：３１８０−３１８４，；  Ｓａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ９４：６１５３−６１５８）が知られている。
【０００９】
さらに、アビジンとストレプトアビジンにおいて、それらのタンパク質のサブユニット同士の接点に関与するアミノ酸に変異導入する方法で、単量体の変異タンパク質を作成し、ビオチンへの親和性を下げた例が報告されている（Ｌａｉｔｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７６：８２１９−８２２４、Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｏｎｇ（２００５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２８０：  ２３２２５−２３２３１）。アビジンやストレプトアビジンは、四量体を形成し、各サブユニットそれぞれに１つずつビオチン結合サイトを持つ。完全なビオチン結合ポケットを形成するには、隣接するサブユニットのアミノ酸残基（例えばタマビジン２の場合、１０８番目のトリプトファン（Ｗ１０８））の存在が重要である。従って、サブユニット間の結合は、ビオチンとの親和性にも大きな影響を与えるものと考えられている。
【００１０】
Ｗｕら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００５），２８０：２３２２５−２３２３１）によれば、ストレプトアビジンの場合、各サブユニットをＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄと名付けると、サブユニットＡにある５５番目のバリンは、サブユニットＢの５９番目のアルギニンに近い位置に存在する。サブユニットＡにある７６番目のスレオニンは、サブユニットＢ上の７６番目のスレオニンと５９番目のアラニンと非常に近い位置に配置している。サブユニットＢにある１０９番目のロイシンは、サブユニットＡ上の１２５番目のバリンと相互作用している。サブユニットＡにある１２５番目のバリンは、サブユニットＤ上の１０９番目のロイシン、１２０番目のトリプトファン、１２３番目のスレオニン、１２５番目のバリン、サブユニットＢ上の１０９番目のロイシン、サブユニットＣ上の１０７番目のグルタミンと広範囲に渡って相互作用をしている。従って、これらのアミノ酸を極性の高いアミノ酸、例えばアルギニン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、スレオニン等に置換することによって、サブユニット間に電荷的反発を発生させることや立体障害を生じさせることが期待できる。極性アミノ酸の中でもＨｙｄｒｏｐｈａｔｙ ｉｎｄｅｘが最も低いアルギニンはその効果が大きいと考えられる。
【００１１】
アビジンやストレプトアビジンなどのビオチン結合性タンパク質を、アフィニティクロマトグラフィー等の可逆的な結合を必要とする技術分野へ応用するためには、解離定数（ＫＤ）を１０−７ （Ｍ） 程度まで上昇させることが一つの目安となると考えられている。場合にもよるが一般に解離定数がこれ以上小さい場合、ビオチン結合能が強すぎて、所望のビオチン化物質を効率よく解離させることができず、また、解離定数がこれより大きい場合は、ビオチン結合能が弱すぎて所望のビオチン化物質を十分に結合させることができないからである（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｏｎｇ（２００６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ.  Ｐｕｒｉｆ.  ４６：２６８−２７）。
【００１２】
この点を考慮すると、上記のストレプトアビジン変異体において、水素結合部位一アミノ酸変異体は、いずれも解離定数が１０−１１  （Ｍ）程度と小さく、ビオチン結合能が強すぎるものであった。但し、このような変異体には、アミノ酸改変の結果、サブユニット相互作用にまで影響を及ぼすものが多くあり、これらはしばしば単量体となるが、単量体になった場合には１０−９  （Ｍ）程度の解離定数であった。また、上記のストレプトアビジン変異体において、水素結合部位を２箇所以上追加して改変させた場合、そのほとんどは単量体となり、その中にはビオチン結合能（解離定数）が１０−８  ないし１０−６  （Ｍ）程度になるものがあった（Ｑｕｒｅｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：４６４２２−４６４２８）。
【００１３】
解離定数が、１０−８  ないし１０−７  （Ｍ）の変異体は、アフィニティクロマトグラフィーなどの用途に適度なビオチン結合能を有している（Ｑｕｒｅｓｈｉ  ａｎｄ    Ｗｏｎｇ （２００２）Ｐｒoｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．  Ｐｕｒｉｆ．２５：４０９−４１５；  Ｗｕ  ａｎｄ    Ｗｏｎｇ（２００６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．４６：２６８−２７３）。しかし反面、このような単量体はプロテアーゼに非常に分解されやすいことが知られている（Ｌａｉｔｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７６：８２１９−８２２４、Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｏｎｇ（２００５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２８０：  ２３２２５−２３２３１）。アフィニティクロマトグラフィーでは様々な物質が混合した細胞粗抽出液を利用する場合が多いが、細胞粗抽出液中にはしばしばプロテアーゼが含まれており、単量体はこのような用途で使用するには問題があった。
【００１４】
また、単量体にすることによって、サブユニット間の結合で隠されていた疎水性領域が露出するため、タンパク質全体の可溶性が低下する可能性があり、また再凝集の原因にもなりうる。これまでアビジンをモデルに設計された単量体では（例えばプロメガ社のＳｏｆｔＬｉｎｋ  Ｓｏｆｔ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ａｖｉｄｉｎ  Ｒｅｓｉｎ）、これを担体に固定化させた際、単量体同士が会合して四量体を形成するため、結果としてビオチンとの親和性が高くなってしまう。このためビオチン標識物質を添加する前に、四量体がビオチンと強く結合する領域をビオチンで埋める処理が必要となる。この処理は手間がかかる上、前処理の程度によってビオチン標識物質の収量が大きく変わってくる虞がある。
【００１５】
上記のストレプトアビジン変異体において、水素結合部位のアミノ酸を２箇所以上改変しても四量体が維持されたものがまれにあった。しかし、例えこのような四量体であっても、改変によりサブユニット相互作用が弱まっており、担体に結合させた後に、ビオチン化物質と結合させ、その後、過剰ビオチンを加えてビオチン化物質を溶出させる場合、四量体を構成する単量体の多くが溶出してしまうという現象が見られた。
【００１６】
さらに、アビジンやストレプトアビジンのアミノ酸改変タンパク質はその多くが、大腸菌で可溶性発現させることができず、昆虫細胞や枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）で発現させなければならないため（Ｌａｉｔｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ.，  ４６１，  ５２−５８、Ｑｕｒｅｓｈｉ  ａｎｄ    Ｗｏｎｇ （２００２）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．  Ｐｕｒｉｆ．２５：４０９−４１５）、手間とコストが非常に問題となっていた。大腸菌で可溶性発現ができるのは一部の単量体ストレプトアビジンのみである（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｏｎｇ（２００６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ.  Ｐｕｒｉｆ.  ４６：２６８−２７３）。
【００１７】
以上述べたように、所望のビオチン化物質を十分に結合することができ、かつ、解離することができる程度のビオチン結合能を有し、大腸菌で可溶性高発現し、さらにプロテアーゼ耐性を有する、ビオチン結合性タンパク質はこれまで知られていなかった。
【００１８】
なお本発明者らは、食用キノコタモギタケ（Ｐｕｅｕｒｏｔｕｓ  ｃｏｎｕｃｏｐｉａｅ）から、新規なアビジン様ビオチン結合性タンパク質である、タマビジン１とタマビジン２を発見している（ＷＯ０２／０７２８１７）。タマビジン１及びタマビジン２は、大腸菌で大量に発現させることができ、特にタマビジン２はイミノビオチンカラムを用いた精製により容易に調製できた（ＷＯ０２／０７２８１７）。タマビジン１及びタマビジン２はビオチンと極めて強く結合し、特にタマビジン２に関しては、アビジンやストレプトアビジンとほぼ同レベルのビオチン結合活性を示した。またタマビジン２はアビジンやストレプトアビジンと比べて高い耐熱性を有し、さらにアビジンよりも非特異的な結合が少ないといった点で優れたビオチン結合性タンパク質であった。
【特許文献１】ＷＯ０２／０７２８１７
【特許文献２】特開平１０−２８５８９号公報
【非特許文献１】Ｍａｒｔｔｉｌａ ｅｔ  ａｌ． （２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ.  ３６９：２４９−２５４
【非特許文献２】Ｌａｉｔｉｎｅｎ ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７８：４０１０−４０１４
【非特許文献３】Ｌａｉｔｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６：８２１９−８２２４）
【非特許文献４】Ｌａｉｔｉｎｅｎ ｅｔ  ａｌ．（１９９９）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ.  ４６１：５２−５８
【非特許文献５】Ｑｕｒｅｓｈｉ ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６：４６４２２−４６４２８
【非特許文献６】Ｇａｂｒｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ． Ｓｃｉ.  ９５：１３５２５−１３５３０
【非特許文献７】Ｑｕｒｅｓｈｉ  ａｎｄ    Ｗｏｎｇ （２００２）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．  Ｐｕｒｉｆ．  ２５：４０９−４１５
【非特許文献８】Ｗｕ  ａｎｄ    Ｗｏｎｇ（２００６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．  Ｐｕｒｉｆ.  ４６：２６８−２７３
【非特許文献９】Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｏｎｇ（２００５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２８０：  ２３２２５−２３２３１
【非特許文献１０】Ｃｈｉｌｋｏｔｉ ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ.  ９２：１７５４−１７５８
【非特許文献１１】Ｓａｎｏ ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ９２：３１８０−３１８４
【非特許文献１２】Ｓａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．  ９４：６１５３−６１５８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明の解決すべき課題は、大腸菌で可溶性高発現が可能で、かつ、ビオチン固定化担体による精製が容易である、ビオチン結合性タンパク質を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者らは上記課題の解決のために、鋭意研究に努めた結果、所望のビオチン化物質と十分に結合することができ、かつ、解離することができる程度のビオチン結合能を有し、さらにプロテアーゼ耐性を有する、安定な改変型のビオチン結合性タンパク質を得ることに成功し、本発明を想到した。
【００２１】
具体的には、本発明は天然のタマビジン２（以下、本明細書において「ＴＭ２」と記載する場合がある）のアミノ酸配列（配列番号２）を改変することにより、上記性質を有する改変型のビオチン結合性タンパク質を得たものである。
【００２２】
本発明の好ましい態様
本発明は好ましくは以下の態様を含む。
［態様１］
配列番号２に記載のアミノ酸配列、あるいはこの配列中に１から複数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列、又はこの配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ビオチン結合活性を示すタンパク質において、
以下のグループ：
１）配列番号２の３６番目のセリン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換；
２）配列番号２の８０番目のトリプトファン残基の親水性アミノ酸残基への置換；
３）配列番号２の１１６番目のアスパラギン酸残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換；
４）配列番号２の４６番目のプロリン残基のスレオニン、セリン若しくはチロシン残基への置換、及び、７８番目のスレオニン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換；
５）配列番号２の４６番目のプロリン残基のスレオニン、セリン若しくはチロシン残基への置換、及び、１１６番目のアスパラギン酸残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換：並びに
６）配列番号２の４６番目のプロリン残基のスレオニン、セリン若しくはチロシン残基への置換、７８番目のスレオニン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換、及び、１１６番目のアスパラギン酸残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換
から選択される置換を有することを特徴とする、改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様２］
１−ａ）配列番号２の３６番目のセリン残基がアラニンに置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２  Ｓ３６Ａ）；
２−ａ）配列番号２の８０番目のトリプトファン残基がリジンに置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２  Ｗ８０Ｋ）；
３−ａ）配列番号２の１１６番目のアスパラギン酸残基がアラニンに置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２  Ｄ１１６Ａ）；
４−ａ）配列番号２の４６番目のプロリン残基がスレオニンに置換されており、そして、７８番目のスレオニン残基がアラニンに置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２  Ｐ４６Ｔ−Ｔ７８Ａ）；
５−ａ）配列番号２の４６番目のプロリン残基がスレオニンに置換されており、そして、１１６番目のアスパラギン酸残基がアラニンに置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２  Ｐ４６Ｔ−Ｄ１１６Ａ）；並びに
６−ａ）配列番号２の４６番目のプロリン残基がスレオニンに置換されており、７８番目のスレオニン残基がアラニンに置換されており、そして、１１６番目のアスパラギン酸残基がアラニンに置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２  Ｐ４６Ｔ−Ｔ７８Ａ―Ｄ１１６Ａ）
からなるグループから選択される、態様１に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様３］
以下の性質：
ｉ）ビオチンを用いた精製が可能である；
ｉｉ）配列番号２の記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の四量体構造を維持している；
ｉｉｉ）プロテアーゼに対し耐性を有する；及び
ｉｖ）大腸菌の可溶性画分において高い発現を示す
の１ないし全部を満たす、態様１又は２に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様４］
配列番号２に記載のアミノ酸配列、あるいはこの配列中に１から複数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列、又はこの配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ビオチン結合活性を示すタンパク質において、
６）配列番号２の７８番目のスレオニン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換を有することを特徴とする改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様５］
６−ａ）配列番号２の７８番目のスレオニン残基がアラニン残基へ置換されている、態様４に記載の改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２  Ｔ７８Ａ）。
［態様６］
以下の性質：
ｉ）ビオチンを用いた精製が可能である；
ｉｉ）配列番号２の記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の四量体構造を維持している；
ｉｉｉ）プロテアーゼに対し耐性を有する；及び
ｖ）配列番号２の記載のアミノ酸配列からなるタンパク質よりも、高い耐熱性を有する
の１ないし全部を満たす、態様４又は５に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様７］
配列番号２に記載のアミノ酸配列、あるいはこの配列中に１から複数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列、又はこの配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ビオチン結合活性を示すタンパク質において、
以下のグループ：
７）配列番号２の３６番目のセリン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換、及び、１１６番目のアスパラギン酸残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換；並びに
８）配列番号２の３６番目のセリン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換、７８番目のスレオニン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換、及び、１１６番目のアスパラギン酸残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換
から選択される置換を有することを特徴とする、改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様８］
７−ａ）配列番号２の３６番目のセリン残基がアラニンに置換されており、そして、１１６番目のアスパラギン酸残基がアラニンに置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２  Ｓ３６Ａ―Ｄ１１６Ａ）；並びに
８−ａ）配列番号２の３６番目のセリン残基がアラニンに置換されており、７８番目のスレオニン残基がアラニンに置換されており、そして、１１６番目のアスパラギン酸残基がアラニンに置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２  Ｓ３６Ａ−Ｔ７８Ａ―Ｄ１１６Ａ）
からなるグループから選択される、態様７に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様９］
以下の性質：
ｉ）ビオチンを用いた精製が可能である；
ｉｉｉ）プロテアーゼに対し耐性を有する；及び
ｖｉ）弱酸性条件下でビオチンと結合し、そして、中性条件下でビオチンと結合しない
の１ないし全部を満たす、態様７又は８に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様１０］
配列番号２に記載のアミノ酸配列、あるいはこの配列中に１から複数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列、又はこの配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ビオチン結合活性を示すタンパク質において、
９）配列番号２の７８番目のスレオニン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換、及び、１１６番目のアスパラギン酸残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換
を有することを特徴とする、改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様１１］
９−ａ）配列番号２の７８番目のスレオニン残基がアラニンに置換されており、そして、１１６番目のアスパラギン酸残基がアラニンに置換されている、態様１０に記載の改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２  Ｔ７８Ａ―Ｄ１１６Ａ）。
［態様１２］
以下の性質：
ｉ）ビオチンを用いた精製が可能である；
ｉｉ）配列番号２の記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の四量体構造を維持している；
ｉｉｉ）プロテアーゼに対し耐性を有する；
ｉｖ）大腸菌の可溶性画分において高い発現を示す；及び
ｖｉｉ）イミノビオチンで精製できない
の１ないし全部を満たす、態様１０又は１１のいずれか１項に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様１３］
配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質よりも、低いビオチン結合性を示す、態様１ないし１２のいずれか１項に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様１４］
以下のａ）−ｐ）
ａ）配列番号２の１４番目のアスパラギン残基は改変されていない、あるいはグルタミン又はアスパラギン酸に置換されている；
ｂ）配列番号２の１８番目のセリン残基は改変されていない、あるいはスレオニン又はチロシンに置換されている；
ｃ）配列番号２の３４番目のチロシン残基は改変されていない、あるいはセリン又はスレオニンに置換されている；
ｄ）配列番号２の３６番目のセリン残基は改変されていない、あるいはスレオニン又はチロシンに置換されている；
ｅ）配列番号２の４０番目のアスパラギン酸残基は改変されていない、あるいはアスパラギン以外の残基に置換されている；
ｆ）配列番号２の６９番目のトリプトファン残基は改変されていない；
ｇ）配列番号２の７６番目のセリン残基は改変されていない、あるいはスレオニン又はチロシンに置換されている；
ｈ）配列番号２の７８番目のスレオニン残基は改変されていない、あるいはセリン又はチロシンに置換されている；
ｉ）配列番号２の８０番目のトリプトファン残基は改変されていない；
ｊ）配列番号２の９６番目のトリプトファン残基は改変されていない；
ｋ）配列番号２の１０８番目のトリプトファン残基は改変されていない；
ｌ）配列番号２の１１６番目のアスパラギン酸残基は改変されていない、あるいはグルタミン酸又はアスパラギンに置換されている
ｍ）配列番号２の４６番目のプロリン残基は改変されていない；
ｎ）配列番号２の６６番目のアラニン残基は改変されていない；
ｏ）配列番号２の９７番目のロイシン残基は改変されていないか、イソロイシンに改変されている；及び
ｐ）配列番号２の１１３番目のバリン残基は改変されていない
の１ないし全ての条件を満たす、ただし、このうち、１）ないし９）で特定したアミノ酸残基は、１）ないし９）の各々で特定したように置換されている、
態様１ないし１３のいずれか１項に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様１５］
配列番号２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様１ないし１４のいずれか１項に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様１６］
態様１ないし１５のいずれか１項に記載のタンパク質を固定化した担体。
［態様１７］
態様１ないし１５のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする核酸。
［態様１８］
態様１７に記載の核酸を含むベクター。
［態様１９］
態様７の改変型ビオチン結合タンパク質を含む、生物学的試料中の物質を検出する系における非特異結合抑制剤。
【発明の概要】
【発明の効果】
【００２３】
本発明によって、大腸菌で可溶性高発現が可能であり、かつ、ビオチンとの結合及び解離を可能とする、適切な強度のビオチン結合活性を有する、改変型ＴＭ２が提供された。本発明の改変型ＴＭ２を例えば担体に固定化し、ビオチン化物質を精製するためのアフィニティクロマトグラフィー等に供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１Ａは、野生型タマビジン２（ＷＴ−ＴＭ２：左側）とＴＭ２  Ｓ３６Ａ（右側）の、図１ＢはＴＭ２  Ｔ７８Ａの、ならびに図１ＣはＴＭ２  Ｄ１１６Ａの、ビオチン−アガロースによる精製を示す写真である。各タンパク質をビオチン−アガロースに結合後、１０ｍＭのビオチンを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）を添加することにより、溶出を行った。各画分溶液に等量の２ｘＳＤＳ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒを添加後、９５℃で１０分処理しＳＤＳ−ＰＡＧＥに供与したのちクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色を行った。Ｓｕｐはカラムにかける前の可溶性画分であり、ＦＴはカラム通過（フロースルー）画分であり、Ｗは洗浄画分であり、Ｅｌｕは溶出画分である。
【図２】図２ＡはＴＭ２  Ｐ４６ＴＤ１１６Ａの、図２ＢはＴＭ２  Ｐ４６ＴＴ７８ＡＤ１１６Ａの、ならびに図２ＣはＴ７８ＡＤ１１６Ａの、ビオチン−アガロースによる精製を示す写真である。１０ｍＭのビオチンを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）を添加することにより、溶出を行った。さらに図２ＤはＴＭ２  Ｐ４６ＴＴ７８Ａの、イミノビオチン−アガロース、ならびにビオチン−アガロースによる精製を示す写真である。各画分溶液に等量の２ｘＳＤＳ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒを添加後、９５℃で１０分処理しＳＤＳ−ＰＡＧＥに供与したのちＣＢＢ染色を行った。Ｓｕｐはカラムにかける前の可溶性画分であり、ＦＴはカラム通過（フロースルー）画分であり、Ｗは洗浄画分であり、Ｅｌｕは溶出画分である。Ｍは分子量マーカーである。
【図３】図３Aは、ＴＭ２  Ｓ３６Ａ−Ｄ１１６Ａの、図３Bは、ＴＭ２  Ｓ３６Ａ−Ｔ７８Ａ−Ｄ１１６Ａの、ビオチン−アガロースによる精製を示す写真である。ｐＨ５、またはｐＨ６、あるいはｐＨ７で、ＴＭ２  Ｓ３６Ａ−Ｄ１１６Ａをビオチン−アガロースとを結合させ、ｐＨ５およびｐＨ６で結合させた時には５００ｍＭのＮａＣｌを含むｐＨ４のリン酸カリウム緩衝液で、ｐＨ７で結合させた時は５００ｍＭのＮａＣｌを含むｐＨ７のリン酸カリウム緩衝液で、それぞれ洗浄した。その後、ｐＨ５またはｐＨ６で結合させた時にはｐＨ７のリン酸カリウム緩衝液を１ｍＬ添加して、ｐＨ７で結合させた時には１０ｍＭのビオチンを含むｐＨ７．４のＰＢＳを１ｍＬ添加して、それぞれ溶出した。また、ｐＨ４またはｐＨ７のリン酸カリウム緩衝液、あるいはｐＨ１２の５０ｍＭ  ＣＡＰＳ緩衝液中で、ＴＭ２  Ｓ３６Ａ−Ｔ７８Ａ−Ｄ１１６Ａをビオチン−アガロースと結合させた後、洗浄し、ｐＨ７の１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液を１ｍＬ添加して溶出した。各画分溶液に等量の２ｘＳＤＳ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒを添加した後、９５℃で１０分処理し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供与したのちＣＢＢ染色を行った。
【図４】図４は、種々の改変型タマビジン２（ＴＭ２  Ｓ３６Ａ（図４Ａ）、ＴＭ２  Ｔ７８Ａ、ＴＭ２  Ｄ１１６Ａ、ＴＭ２  Ｔ７８Ａ−Ｄ１１６Ａ（以上図４Ｃ））、野生型のタマビジン２（ＷＴ−ＴＭ２、図４Ａ）、並びに対照としてＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ、図４Ｂ）のＰｒｏｔｅａｓｅ耐性を示す写真である。これらの改変型タマビジン２をＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫと３０℃、１５分間反応させた後、各反応溶液に５ｘＳＤＳ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒを添加した後、９５℃で１０分処理して反応を停止させた。サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供与し、ＣＢＢ染色を行った。
【図５】図５は、種々の改変型タマビジン２（ＴＭ２  Ｓ３６Ａ−Ｄ１１６Ａ（図５Ａ、Ｃ）、ＴＭ２  Ｔ７８Ａ、ＴＭ２  Ｐ４６Ｔ−Ｔ７８Ａ（以上図５Ａ）、ＴＭ２  Ｐ４６Ｔ−Ｄ１１６Ａ（図５Ｂ）、ＴＭ２  Ｓ３６Ａ−Ｔ７８Ａ−Ｄ１１６Ａ（図５Ｃ）、ＴＭ２  Ｗ８０Ｋ、ＴＭ２  Ｐ４６Ｔ−Ｔ７８Ａ−Ｄ１１６Ａ（以上図５Ｄ））のＰｒｏｔｅａｓｅ耐性を示す写真である。これらの改変型タマビジン２をＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫと３０℃、１５分間反応させた後、各反応溶液に５ｘＳＤＳ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒを添加した後、９５℃で１０分処理して反応を停止させた。なお、星印を付したＴＭ２  Ｔ７８Ａについては、１００℃で１０分処理して反応を停止させた。サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供与し、ＣＢＢ染色を行った。
【図６】図６は、ＴＭ２  Ｔ７８Ａの熱安定性を示す写真である。ＴＭ２  Ｔ７８Ａを、ビオチンの存在下、非存在下において所定の温度で、１ｘＳＤＳ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ中で２０分間熱処理をした後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供与し、ＣＢＢ染色を行った。
【図７】図７は、ＴＭ２  Ｓ３６Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅによる、ビオチン化ＢＳＡの精製を示す写真である。大腸菌（ＴＢ１）の菌体抽出液とビオチン化ＢＳＡ、あるいはビオチン化ＢＳＡのみのサンプルを、ＴＭ２  Ｓ３６Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅで精製した際の、精製前（ｔｏｔａｌ）、カラム通過（フロースルー）画分（ＦＴ）、洗浄画分（Ｗ）、溶出画分（Ｅｌｕ）の各溶液に、等量の２ｘＳＤＳ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒを添加した後、９５℃で１０分処理しＳＤＳ−ＰＡＧＥに供与した。ビオチン化ＢＳＡの存在は銀染色ＩＩキット（和光純薬社製）によって確認した。なお、溶出液には５ｍＭのビオチンを添加した。
【図８】図８ＡはＴＭ２  Ｄ１１６Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅによる、図８ＢはＴＭ２  Ｐ４６ＴＴ７８Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅによる、図８Ｃは、ＴＭ２  Ｐ４６ＴＤ１１６Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅによる、ビオチン化ＢＳＡの精製を示す写真である。ビオチン化ＢＳＡ、あるいは大腸菌抽出液とビオチン化ＢＳＡを、各担体でそれぞれ精製した際の、精製前（ｔｏｔａｌ）、カラム通過（フロースルー）画分（ＦＴ）、洗浄画分（Ｗ）、溶出画分（Ｅｌｕ）の各溶液に、等量の２ｘＳＤＳ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒを添加した後、９５℃で１０分処理しＳＤＳ−ＰＡＧＥに供与した。ビオチン化ＢＳＡの存在は銀染色ＩＩキット（和光純薬社製）によって確認した。なお、溶出液には５ｍＭのビオチンを添加した。
【図９】図９は、ビオチン化ＢＳＡのＴＭ２  Ｓ３６Ａ−Ｄ１１６Ａ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅへの結合の、ｐＨ依存性を示す写真である。ｐＨ５、ｐＨ６あるいはｐＨ７の１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液中でビオチン化ＢＳＡと結合させ、５００ｍＭのＮａＣｌを含むｐＨ４（上記ｐＨ５またはｐＨ６で結合させた場合）またはｐＨ７（上記ｐＨ７で結合させた場合）のリン酸カリウム緩衝液で洗浄した後、ｐＨ７のリン酸カリウム緩衝液を加えてビオチン化ＢＳＡを溶出した。精製前（ｔｏｔａｌ）、カラム通過（フロースルー）画分（ＦＴ）、洗浄画分（Ｗ）、溶出画分（Ｅｌｕ）の各溶液に、等量の２ｘＳＤＳ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒを添加し、９５℃で１０分処理した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供与した。さらに銀染色ＩＩキット（和光純薬社製）を用いてタンパク質を銀で染色した。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、本発明を実施するための好ましい形態について説明する。
タマビジン
タマビジンは、食用キノコである担子菌タモギタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｃｏｎｕｃｏｐｉａｅ）から発見された新規ビオチン結合タンパク質である（ＷＯ０２／０７２８１７）。当該文献には、
−タマビジン１とタマビジン２の相互のアミノ酸相同性は６５．５％で、ビオチンと強く結合する；
−タマビジン２は、大腸菌で可溶性画分に高発現する；そして
−タマビジン２を大腸菌で発現させた場合、４．５時間の培養で、５０ｍｌの培養当たり約１ｍｇの純度の高い精製組換えタンパク質が得られた。これはビオチン結合性タンパク質として知られているアビジンやストレプトアビジンと比較しても、非常に高い値である；
ことが記載されている。
【００２６】
本明細書における「タマビジン２」は、タマビジン２（ＴＭ２）又はそれらの変異体を意味する。本発明は、ＴＭ２又はその変異体の特定のアミノ酸残基を改変させることにより、ビオチンとの可逆的な反応を可能とする、改変型ＴＭ２を提供するものである。本明細書において「タマビジン２」、「ＴＭ２」と記載した場合には、特に言及しない限り野生型のＴＭ２及びその変異体を意味する。ただし、文意により、本発明の改変型ＴＭ２も含めてＴＭ２の野生型、変異型、本発明の改変型の総称として使用する場合もある。また、ＴＭ２はビオチン結合性を示すことから、本明細書においてＴＭ２を「ビオチン結合タンパク質」と呼称することがある。
【００２７】
具体的には、ＴＭ２（野生型）は典型的には、配列番号２のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質、又は、配列番号１の塩基配列を含んでなる核酸によってコードされるタンパク質、であってよい。あるいは、ＴＭ２は、配列番号２のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質、又は、配列番号１の塩基配列を含んでなる核酸によってコードされるタンパク質、の変異体であって、タマビジン２と同様のビオチン結合活性を有するタンパク質であってよい。ＴＭ２の変異体は、配列番号２のアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加を含むアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であってもよい。置換は、保存的置換であってもよく、これは、特定のアミノ酸残基を類似の物理化学的特徴を有する残基で置き換えることである。保存的置換の非限定的な例には、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＡｌａ相互の置換のような脂肪族基含有アミノ酸残基の間の置換、Ｌｙｓ及びＡｒｇ、Ｇｌｕ及びＡｓｐ、Ｇｌｎ及びＡｓｎ相互の置換のような極性残基の間での置換などが含まれる。
【００２８】
アミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加による変異体は、野生型タンパク質をコードするＤＮＡに、例えば周知技術である部位特異的変異誘発（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｖｏｌ．１０，  Ｎｏ．  ２０，  ｐ．６４８７−６５００，  １９８２参照、引用によりその全体を本明細書に援用する）を施すことにより作成することができる。本明細書において、「１又は複数のアミノ酸」とは、部位特異的変異誘発法により欠失、置換、挿入及び／又は付加できる程度のアミノ酸を意味する。また、本明細書において「１又は複数のアミノ酸」とは、場合により、１又は数個のアミノ酸を意味してもよい。
【００２９】
部位特異的変異誘発法は、例えば、所望の変異である特定の不一致の他は、変異を受けるべき一本鎖ファージＤＮＡに相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて次のように行うことができる。即ち、プライマーとして上記合成オリゴヌクレオチドを用いてファージに相補的な鎖を合成させ、得られた二重鎖ＤＮＡで宿主細胞を形質転換する。形質転換された細菌の培養物を寒天にプレーティングし、ファージを含有する単一細胞からプラークを形成させる。そうすると、理論的には５０％の新コロニーが一本鎖として変異を有するファージを含有し、残りの５０％が元の配列を有する。上記所望の変異を有するＤＮＡと完全に一致するものとはハイブリダイズするが、元の鎖を有するものとはハイブリダイズしない温度において、得られたプラークをキナーゼ処理により標識した合成プローブとハイブリダイズさせる。次に該プローブとハイブリダイズするプラークを拾い、培養してＤＮＡを回収する。
【００３０】
なお、生物活性ペプチドのアミノ酸配列にその活性を保持しつつ１または複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入及び／又は付加を施す方法としては、上記の部位特異的変異誘発の他にも、遺伝子を変異源で処理する方法、及び遺伝子を選択的に開裂し、次に選択されたヌクレオチドを除去、置換、挿入又は付加し、次いで連結する方法もある。限定されるものではないが、本発明におけるＴＭ２は、配列番号２において１ないしは１０個、好ましくは９個以下、７個以下、５個以下、３個以下、２個以下、より好ましくは１個以下のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ビオチン結合活性を有するタンパク質である。
【００３１】
ＴＭ２の変異体はさらに、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％以上、好ましくは８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上、より好ましくは９９．３％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であって、ＴＭ２と同様のビオチン結合活性を有するタンパク質であってもよい。
【００３２】
２つのアミノ酸配列の同一性％は、視覚的検査および数学的計算によって決定してもよい。あるいは、２つのタンパク質配列の同一性パーセントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，  Ｓ．  Ｂ．  及びＷｕｎｓｃｈ，  Ｃ．  Ｄ．  （Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ４８：  ４４３−４５３，  １９７０）のアルゴリズムに基づき、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラムを用い配列情報を比較することにより、決定してもよい。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，  Ｓ．  及びＨｅｎｉｋｏｆｆ，  Ｊ．  Ｇ．  （Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８９：  １０９１５−１０９１９，  １９９２）に記載されるような、スコアリング・マトリックス、ｂｌｏｓｕｍ６２；（２）１２のギャップ加重；（３）４のギャップ長加重；及び（４）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。
【００３３】
当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、用いてもよい。同一性のパーセントは、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓ．，  ２５，  ｐ．３３８９−３４０２，  １９９７）に記載されているＢＬＡＳＴプログラムを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。当該プログラムは、インターネット上でＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）、あるいはＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のウェブサイトから利用することが可能である。ＢＬＡＳＴプログラムによる同一性検索の各種条件（パラメーター）は同サイトに詳しく記載されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。又は、２つのアミノ酸配列の同一性％は、遺伝情報処理ソフトウエアＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ．７（ゼネティックス製）などのプログラム、又は、ＦＡＳＴＡアルゴリズムなどを用いて決定してもよい。その際、検索はデフォルト値を用いてよい。
【００３４】
２つの核酸配列の同一性％は、視覚的検査と数学的計算により決定可能であるか、またはより好ましくは、この比較はコンピュータ・プログラムを使用して配列情報を比較することによってなされる。代表的な、好ましいコンピュータ・プログラムは、遺伝学コンピュータ・グループ（ＧＣＧ；ウィスコンシン州マディソン）のウィスコンシン・パッケージ、バージョン１０．０プログラム「ＧＡＰ」である（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８４，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １２：  ３８７）。この「ＧＡＰ」プログラムの使用により、２つの核酸配列の比較の他に、２つのアミノ酸配列の比較、核酸配列とアミノ酸配列との比較を行うことができる。ここで、「ＧＡＰ」プログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドについての（同一物について１、及び非同一物について０の値を含む）一元（ｕｎａｒｙ）比較マトリックスのＧＣＧ実行と、Ｓｃｈｗａｒｔｚ及びＤａｙｈｏｆｆ監修「ポリペプチドの配列および構造のアトラス（Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）」国立バイオ医学研究財団、３５３−３５８頁、１９７９により記載されるような、ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １４：  ６７４５，  １９８６の加重アミノ酸比較マトリックス；又は他の比較可能な比較マトリックス；（２）アミノ酸の各ギャップについて３０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の１のペナルティ；又はヌクレオチド配列の各ギャップについて５０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の３のペナルティ；（３）エンドギャップへのノーペナルティ：及び（４）長いギャップへは最大ペナルティなし、が含まれる。当業者により使用される他の配列比較プログラムでは、例えば、米国国立医学ライブラリーのウェブサイト：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.htmlにより使用が利用可能なＢＬＡＳＴＮプログラム、バージョン２．２．７、またはＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムが使用可能である。ＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０についての標準的なデフォルトパラメーターの設定は、以下のインターネットサイト：http://blast.wustl.eduに記載されている。さらに、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸スコア付けマトリックスを使用し、使用可能である選択パラメーターは以下の通りである：（Ａ）低い組成複雑性を有するクエリー配列のセグメント（ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎのＳＥＧプログラム（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １９９３）により決定される；ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎ，  １９９６「配列データベースにおける組成編重領域の解析（Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌｌｙ  ｂｉａｓｅｄ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａｂａｓｅｓ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  ２６６：  ５４４−７１も参照されたい）、又は、短周期性の内部リピートからなるセグメント（ＣｌａｖｅｒｉｅおよびＳｔａｔｅｓ（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １９９３）のＸＮＵプログラムにより決定される）をマスクするためのフ���ルターを含むこと、及び（Ｂ）データベース配列に対する適合を報告するための統計学的有意性の閾値、またはＥ−スコア（ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，  １９９０）の統計学的モデルにしたがって、単に偶然により見出される適合の期待確率；ある適合に起因する統計学的有意差がＥ−スコア閾値より大きい場合、この適合は報告されない）；好ましいＥ−スコア閾値の数値は０．５であるか、または好ましさが増える順に、０．２５、０．１、０．０５、０．０１、０．００１、０．０００１、１ｅ−５、１ｅ−１０、１ｅ−１５、１ｅ−２０、１ｅ−２５、１ｅ−３０、１ｅ−４０、１ｅ−５０、１ｅ−７５、または１ｅ−１００である。
【００３５】
ＴＭ２の変異体はまた、配列番号１の塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含んでなる核酸によってコードされるタンパク質であって、ＴＭ２と同様の結合活性を有するタンパク質であってもよい。
【００３６】
ここで、「ストリンジェントな条件下」とは、中程度または高程度にストリンジェントな条件においてハイブリダイズすることを意味する。具体的には、中程度にストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、一般の技術を有する当業者によって、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版，第６章，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００１に示され、例えば５×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４２℃での、約５０％ホルムアミド、２×ないし６×ＳＳＣ、好ましくは５×ないし６×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ（または約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、スターク溶液などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、及び例えば、約５０℃ないし６８℃、０．１×、ないし、６×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。好ましくは中程度にストリンジェントな条件は、約５０℃、６×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳのハイブリダイゼーション条件（及び洗浄条件）を含む。高ストリンジェントな条件もまた、例えばＤＮＡの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することが可能である。
【００３７】
一般に、こうした条件は、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度及び／又は低い塩濃度でのハイブリダイゼーション（例えば、０．５％程度のＳＤＳを含み、約６５℃、６×ＳＳＣないし０．２×ＳＳＣ、好ましくは６×ＳＳＣ、より好ましくは２×ＳＳＣ、より好ましくは０．２×ＳＳＣ、あるいは０．１×ＳＳＣのハイブリダイゼーション）及び／又は洗浄を含み、例えば上記のようなハイブリダイゼーション条件、及びおよそ６５℃、ないし６８℃、０．２×ないし０．１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄を伴うと定義される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の緩衝液では、ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）にＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、および１．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）を代用することが可能であり、洗浄はハイブリダイゼーションが完了した後で１５分間ないし１時間程度行う。
【００３８】
また、プローブに放射性物質を使用しない市販のハイブリダイゼーションキットを使用することもできる。具体的には、ＥＣＬ  ｄｉｒｅｃｔ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ＆  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を使用したハイブリダイゼーション等が挙げられる。ストリンジェントなハイブリダイゼーションとしては、例えば、キット中のｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒにＢｌｏｃｋｉｎｇ試薬を５％（ｗ／ｖ）、ＮａＣｌを０．５Ｍになるように加え、４２℃で４時間行い、洗浄は、０．４％  ＳＤＳ、０．５ｘＳＳＣ中で、５５℃で２０分を２回、２ｘＳＳＣ中で室温、５分を一回行う、という条件が挙げられる。
【００３９】
ＴＭ２の変異体のビオチン結合活性は、公知の手法のいずれかにより測定することが可能である。例えば、Ｋａｄａら（Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ．，  １４２７：  ３３−４３  （１９９９））に記載されるように蛍光ビオチンを用いる方法により測定してもよい。この方法は、ビオチン結合タンパク質のビオチン結合サイトに蛍光ビオチンが結合すると、蛍光ビオチンの蛍光強度が消失する性質を利用したアッセイ系である。あるいは、表面プラズモン共鳴を原理としたバイオセンサーなど、タンパク質とビオチンの結合を測定することが可能なセンサーを用いて、変異体タンパク質のビオチン結合活性を評価することもできる。
【００４０】
本発明の改変タマビジンにおいて、改変しないことが望ましいアミノ酸残基については後述する。
本発明の改変タマビジン（Ｉ型）
本発明の改変型ＴＭ２は１態様として、
配列番号２に記載のアミノ酸配列、あるいはこの配列中に１から複数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列、又はこの配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ビオチン結合活性を示すタンパク質（ＴＭ２あるいはＴＭ２（変異体））において、
以下のグループ：
１）配列番号２の３６番目のセリン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換；
２）配列番号２の８０番目のトリプトファン残基の親水性アミノ酸残基への置換；
３）配列番号２の１１６番目のアスパラギン酸残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換；
４）配列番号２の４６番目のプロリン残基のスレオニン、セリン若しくはチロシン残基への置換、及び、７８番目のスレオニン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換
５）配列番号２の４６番目のプロリン残基のスレオニン、セリン若しくはチロシン残基への置換、及び、１１６番目のアスパラギン酸残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換；
：並びに
６）配列番号２の４６番目のプロリン残基のスレオニン、セリン若しくはチロシン残基への置換、７８番目のスレオニン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換、及び、１１６番目のアスパラギン酸残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換
から選択される置換を有することを特徴とする。
【００４１】
本明細書において「タマビジン２（ＴＭ２）」とは、上記で既に定義した通りである。
本明細書において「水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換」とは、ビオチンと水素結合を形成しないと考えられるアミノ酸残基へ置換することを意味する。限定されるわけではないが、具体的な例としては、非極性すなわち疎水性のR基をもつアミノ酸であるアラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、トリプトファン（Ｗ）、フェニルアラニン（Ｆ）、及びプロリン（Ｐ）などへの、これら以外のアミノ酸残基からの置換を挙げることができる。本明細書中の実施例では、下記の改変型ＴＭ２においてセリン、スレオニン又はアスパラギン酸から、アラニン（Ａ）へ置換した改変体が記載されている。
【００４２】
本明細書において「親水性アミノ酸残基への置換」とは、本技術分野で一般的に親水性であると考えられているアミノ酸残基への置換を意味する。限定されるわけではないが、具体的な例としては、極性アミノ酸が挙げられ、その中でも生理的pHで正の電荷をもつR基を有するリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、及びヒスチジン（Ｈ）、生理的pHで負の電荷をもつR基を有するアスパラギン酸（Ｄ）やグルタミン酸（Ｅ）などへの置換を挙げることができ、下記の改変型ＴＭ２においてはトリプトファンをリジン（Ｋ）へ置換したものを述べる。
【００４３】
このような改変型ＴＭ２は好ましくは、
１−ａ）配列番号２の３６番目のセリン残基がアラニンに置換されている改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２  Ｓ３６Ａ）、
２−ａ）配列番号２の８０番目のトリプトファン残基がリジンに置換されている改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２  Ｗ８０Ｋ）、
３−ａ）配列番号２の１１６番目のアスパラギン酸残基がアラニンに置換されている改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２  Ｄ１１６Ａ）、
４−ａ）配列番号２の４６番目のプロリン残基がスレオニンに置換されており、そして、７８番目のスレオニン残基がアラニンに置換されている改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２  Ｐ４６Ｔ−Ｔ７８Ａ）、
５−ａ）配列番号２の４６番目のプロリン残基がスレオニンに置換されており、そして、１１６番目のアスパラギン酸残基がアラニンに置換されている改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２  Ｐ４６Ｔ−Ｄ１１６Ａ）、並びに、
６−ａ）配列番号２の４６番目のプロリン残基がスレオニンに置換されており、７８番目のスレオニン残基がアラニンに置換されており、そして、１１６番目のアスパラギン酸残基がアラニンに置換されている改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２  Ｐ４６Ｔ−Ｔ７８Ａ―Ｄ１１６Ａ）、である。
【００４４】
そのような改変型ＴＭ２は、好ましくは、以下の性質；
ｉ）ビオチンを用いた精製が可能である、
ｉｉ）配列番号２の記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の四量体構造を維持している、
ｉｉｉ）プロテアーゼに対し耐性を有する、
ｉｖ）大腸菌の可溶性画分において高い発現を示す、
の１ないし全部を示す。
【００４５】
本明細書において「ビオチンを用いた精製が可能」とは、対象とするタンパク質が適度なビオチン結合能を有することによりビオチンとの結合及び解離が可能であるために、ビオチンとのアフィニティを利用して、対象タンパク質自体、および／または、対象タンパク質を結合した担体（カラム等）を用いた、ビオチン化物質（例えばビオチン化タンパク質等）の精製が可能であることを意味する。従って、改変型ＴＭ２は、野生型ＴＭ２に比べて、ビオチン結合能が小さい低親和性タマビジンである。
【００４６】
本明細書において「四量体構造を維持している」とは、天然のＴＭ２が有する四量体のサブユニット構造を実質的に維持していることを意味する。具体的には、野生型のＴＭ２と同程度の分子量を有する状態を意味する。例えば、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（Ｆａｓｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＦＰＬＣ））によって、改変型ＴＭ２の分子量を測定し、ＴＭ２の分子量と比較することによって確認できる。
【００４７】
本明細書において「プロテアーゼに対し耐性を有する」とは、プロテアーゼ処理によってタンパク質が酵素分解されない、又は実質的に分解されないことを意味する。プロテアーゼ処理は、例えば、３０℃で１５分間、プロテイナーゼＫによる処理を施す。「酵素分解されない」とは、野生型のＴＭ２と同様に、酵素処理後にＳＤＳ−ＰＡＧＥを行っても当該タンパク質の四量体、二量体および／または単量体のバンドが明瞭に検出できることを意味する。すなわち、プロテアーゼに対し耐性を持たないタンパク質は、プロテアーゼ処理により小分子にまで分解されてしまい、プロテアーゼ処理後のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、四量体、二量体、および単量体のバンドは検出できないが、プロテアーゼに対し耐性を有するタンパク質の場合はプロテアーゼ処理によっても完全に分解されてしまうことなく、四量体構造を維持する。そしてＳＤＳ-ＰＡＧＥにおいて、四量体および／または四量体が解離した二量体や単量体のバンドとして検出される。
【００４８】
本明細書において「大腸菌の可溶性画分において高い発現を示す」とは、所望の遺伝子を発現ベクターに組み込み、大腸菌に導入後、適当な培地中で適当な温度ならびに発現誘導条件下でタンパク質を発現させた場合に、その組換えタンパク質が大腸菌中において、菌体破砕後の可溶性画分に、確認可能な程度十分に、好ましくは野生型のＴＭ２とほぼ同程度、またはそれ以上に産生されることを意味する。限定されるわけではないが、培養液１Ｌ当たり、１ｍｇ以上、好ましくは５ｍｇ以上、１０ｍｇ以上、１５ｍｇ以上、特に好ましくは２０ｍｇ以上発現することを意味する。
【００４９】
「ＴＭ２  Ｓ３６Ａ」及び「ＴＭ２  Ｄ１１６Ａ」はＴＭ２においてビオチンと水素結合すると考えられる部位を改変したものであり、大腸菌の可溶性画分において高発現するものである。また、これらの改変体ＴＭ２は四量体の構造を維持しており、プロテアーゼに対し高い耐性を有している。さらにこれらの改変型ＴＭ２のビオチン結合能は、１アミノ酸改変体であるにもかかわらず、それとビオチンとの結合能は、ビオチンと可逆的反応を起こさせるのに十分な程度に低下しており、ビオチン化タンパク質を非常に効率的に精製することができる。その上、イミノビオチンカラムを利用した場合であっても、これらの改変体ＴＭ２を非常に効率的に精製することができる。従って、「ＴＭ２  Ｓ３６Ａ」及び「ＴＭ２  Ｄ１１６Ａ」は、これまでの低結合能ビオチン結合性タンパク質の問題点を解決することができる、非常に優れたビオチン可逆的結合性タンパク質である。
【００５０】
「ＴＭ２  Ｗ８０Ｋ」は、ＴＭ２においてビオチンと疎水結合すると考えられる部位を改変したものであり、野生型ＴＭ２（配列番号２）の８０番目のトリプトファンをリジンに改変したものである。ＴＭ２  Ｗ８０Ｋは、大腸菌の可溶性画分において高発現するものである。また、四量体の構造を維持しており、プロテアーゼに対し高い耐性を有している。さらにこれらの変異体のビオチン結合能は、１アミノ酸改変体であるにもかかわらず、ビオチンと可逆的反応を起こさせるのに十分な程度に低下しており、酢酸を用いると、ビオチン化タンパク質を非常に効率的に精製することができる。その上、イミノビオチンカラムを利用した場合であっても、非常に効率的に精製することができる。従ってＷ８０Ｋは、これまでの低結合能ビオチン結合性タンパク質の問題点を解決した、非常に優れた、ビオチン可逆的に結合する性質を有するタンパク質である。
【００５１】
「ＴＭ２  Ｐ４６Ｔ−Ｔ７８Ａ」と「ＴＭ２  Ｐ４６Ｔ−Ｄ１１６Ａ」は、タマビジンのサブユニット間の結合に関与すると考えられる部位、かつ、ビオチンと水素結合すると考えられる部位を改変したものである。ＴＭ２とストレプトアビジンとのアミノ酸の相同性（両者のアミノ酸相同性は全体で４８％である）を利用して検討したところ、ストレプトアビジンにおける５５番目のバリン（Ｖａｌ）、７６番目のスレオニン（Ｔｈｒ）、１０９番目のロイシン（Ｌｅｕ）、ならびに１２５番目のバリン（Ｖａｌ）が、それぞれＴＭ２における、４６番目のプロリン（Ｐｒｏ）、６６番目のアラニン（Ａｌａ）、９７番目のロイシン（Ｌｅｕ）、１１３番目のバリン（Ｖａｌ）であると考えられた。すなわち、ＴＭ２においてそれらのアミノ酸は、サブユニット結合部位に存在すると考えられた。そしてそれらのアミノ酸に実際に変異を入れ、ビオチン結合活性を測定すると、ビオチンと可逆的に結合するが、およそ半数の改変体は二量体や単量体の混合物となる。
【００５２】
ところで、ＴＭ２のサブユニット間結合に関与すると考えられる４６番目のプロリンをスレオニンに改変した「ＴＭ２  Ｐ４６Ｔ」は、サブユニット間結合を弱めることを意図した変異体であるが、四量体を維持している。そして、ビオチン結合能は予想に反して非常に高く、過剰量のビオチンを加えてもビオチン化物質を溶出させることができない。しかし、このＴＭ２  Ｐ４６Ｔの、ビオチンと水素結合すると考えられる部位である、７８番目のスレオニン又は１１６番目のアスパラギン酸をアラニンに改変した変異体は、ビオチン結合能が適度な水準に変化し、ビオチン化物質を十分に精製することができる。
【００５３】
さらに、これらの変異をすべて組み合わせた「ＴＭ２  Ｐ４６Ｔ−Ｔ７８Ａ−Ｄ１１６Ａ」も、ビオチン化物質を十分に精製することができる。
また、これらの変異体は四量体を維持しており、プロテアーゼ耐性を有している。なお、このように水素結合の変異とサブユニット間結合の変異を組み合わせることにより、適切なビオチン結合能を持たせることに成功したビオチン結合性タンパク質は、これまでに例がない。
【００５４】
本発明の改変タマビジン（ＩＩ型）
また本発明の改変型ＴＭ２は１態様として、
配列番号２に記載のアミノ酸配列、あるいはこの配列中に１から複数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列、又はこの配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ビオチン結合活性を示すタンパク質（ＴＭ２あるいはＴＭ２（変異体））において、
６）配列番号２の７８番目のスレオニン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換
を有することを特徴とする。
【００５５】
このような改変型ＴＭ２は好ましくは、
６−ａ）配列番号２の７８番目のスレオニン残基がアラニン残基へ置換されている改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２  Ｔ７８Ａ）である。
【００５６】
本明細書において「タマビジン２（ＴＭ２）」とは、上記で既に定義した通りである。
本明細書において「水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換」とは、上記で既に定義した通りである。
【００５７】
このような改変型ＴＭ２は、好ましくは、以下の性質；
ｉ）ビオチンを用いた精製が可能である、
ｉｉ）配列番号２の記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の四量体構造を維持している、
ｉｉｉ）プロテアーゼに対し耐性を有する、
ｖ）配列番号２の記載のアミノ酸配列からなるタンパク質よりも、高い耐熱性を有する、  
の１ないし全部を示す。
【００５８】
本明細書において「ビオチンを用いた精製が可能」、「四量体構造を維持している」及び「プロテアーゼに対し耐性を有する」は、上記で既に定義した通りである。
本明細書において「高い耐熱性を有する」とは、野生型と同程度あるいはそれ以上の耐熱性を有することを意味する。非限定的に、例えば、ＳＤＳ存在下で２０分間加熱処理を行った際のＴｒ値（単量体と四量体の量比が１：１となる温度）が天然のＴＭ２と比較して、ビオチン非存在下で、好ましくは同程度、より好ましくは５℃以上、さらに好ましくは１０℃以上高いことを意味する。
【００５９】
「ＴＭ２  Ｔ７８Ａ」は、大腸菌可溶性画分からのイミノビオチン−アガロースによる回収率は低いが、ビオチン−アガロースによる回収率は高く（９５％程度）、四量体を維持しプロテアーゼ耐性を有している。加えてＴＭ２  Ｔ７８Ａは、ＴＭ２  Ｓ３６ＡやＴＭ２  Ｄ１１６Ａと同様に１アミノ酸変異体であるにもかかわらず、ビオチン結合能が適度に低下しており、ビオチン化タンパク質を精製することができる（回収率は４０％〜５０％程度）。さらにＴＭ２  Ｔ７８Ａは、ビオチン非存在下でのＴｒ値が８８℃であり、ＴＭ２のＴｒ値（７８℃）より１０℃も高く、またビオチン結合時のＴｒ値も１００℃以上であり、熱安定性が非常に高いタンパク質である。
【００６０】
本発明の改変タマビジン（ＩＩＩ型）
また本発明の改変型ＴＭ２は１態様として、
配列番号２に記載のアミノ酸配列、あるいはこの配列中に１から複数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列、又はこの配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ビオチン結合活性を示すタンパク質（ＴＭ２あるいはＴＭ２（変異体））において、
以下のグループ：
７）配列番号２の３６番目のセリン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換、及び、１１６番目のアスパラギン酸残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換；並びに
８）配列番号２の３６番目のセリン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換、７８番目のスレオニン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換、及び、１１６番目のアスパラギン酸残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換
から選択される置換を有することを特徴とする。
【００６１】
本明細書において「タマビジン２（ＴＭ２）」とは、上記で既に定義した通りである。
本明細書において「水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換」とは、上記で既に定義した通りである。
【００６２】
このような改変型ＴＭ２は好ましくは、
７−ａ）配列番号２の３６番目のセリン残基がアラニンに置換されており、そして、１１６番目のアスパラギン酸残基がアラニンに置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２  Ｓ３６Ａ―Ｄ１１６Ａ）；並びに
８−ａ）配列番号２の３６番目のセリン残基がアラニンに置換されており、７８番目のスレオニン残基がアラニンに置換されており、そして、１１６番目のアスパラギン酸残基がアラニンに置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２  Ｓ３６Ａ−Ｔ７８Ａ―Ｄ１１６Ａ）
からなるグループから選択される。
【００６３】
このような改変型ＴＭ２は、以下の性質；
ｉ）ビオチンを用いた精製が可能である；
ｉｉｉ）プロテアーゼに対し耐性を有する、
ｖｉ）弱酸性条件下でビオチンと結合し、そして、中性条件下でビオチンと結合しない、
の１ないし全部を示す。
【００６４】
本明細書において「ビオチンを用いた精製が可能である」及び「プロテアーゼに対し耐性を有する」とは、上記で既に定義した通りである。
本態様の改変型タマビジンは、特殊なｐＨ依存性を示す。本明細書において「弱酸性」とは、ｐＨ４からｐＨ６の範囲内の水素イオン指数を意味する。「中性」とは、ｐＨ７からｐＨ８の範囲内の水素イオン指数を意味する。
【００６５】
「ＴＭ２  Ｓ３６Ａ−Ｄ１１６Ａ」は、大腸菌可溶性画分からの回収率は９５％、精製度９５％（ｐＨ４で結合、ｐＨ７で解離させた場合）、四量体を維持しプロテアーゼ耐性を有している。そして、ビオチン結合に関して極めて特異的なｐＨ依存性を有する。これまで、中性付近（ｐＨ７付近）でビオチンと結合しないビオチン結合タンパク質は知られていない。この「ＴＭ２  Ｓ３６Ａ−Ｄ１１６Ａ」は、弱酸性条件（ｐＨ４〜６程度）においてビオチンと非常に効率よく結合するのに対し、中性条件及びアルカリ条件（ｐＨ７、ｐＨ１２）ではビオチンと全く結合しないという、これまでのビオチン結合性タンパク質とは全く異なる特徴を有している。従ってこの改変体を用いれば、対象物質を強アルカリ性条件に曝して変性させてしまうことなく、穏和な条件で精製することができる。
【００６６】
本明細書において「アルカリ条件」とは、ｐＨ９からｐＨ１３の範囲内の水素イオン指数を意味する。
「ＴＭ２  Ｓ３６Ａ−Ｔ７８Ａ−Ｄ１１６Ａ」は、大腸菌の可溶性画分において高発現するものである。また二量体の構造を維持しており、プロテアーゼに対し高い耐性を有している。「ＴＭ２  Ｓ３６Ａ−Ｔ７８Ａ−Ｄ１１６Ａ」は、「ＴＭ２  Ｓ３６Ａ−Ｄ１１６Ａ」と同様に、弱酸性条件（ｐＨ４〜６程度）においてビオチンと効率よく結合するのに対し、中性条件（ｐＨ７）ではビオチンと全く結合しないという、これまでのビオチン結合性タンパク質とは全く異なる特徴を有している。ただし、アルカリ条件下では、「ＴＭ２  Ｓ３６Ａ−Ｄ１１６Ａ」と異なり、弱酸性条件と同様にビオチンと効率良く結合した。
【００６７】
「ＴＭ２  Ｓ３６Ａ−Ｔ７８Ａ−Ｄ１１６Ａ」はまた、イミノビオチンに全く結合せず、イミノビオチンで精製できないという特徴も有する。この点は、後述するＩＶ型と性質ｖｉｉ）が共通する。「イミノビオチンで精製できない」の意義はＩＶ型の説明において詳述する。
【００６８】
当該改変体は、例えば系のｐＨを変化させることにより、当該改変体とビオチンとの結合を制御することを特徴とした分子スイッチなどの用途に用いることができる。
また本発明は、当該改変体を含む、生物学的試料中の物質を検出する系における非特異結合抑制剤を提供する。また本発明は、当該改変体を、生物学的試料中の物質を検出する系において、非特異的結合抑制剤として使用する方法も提供する。
【００６９】
当該改変体は生物学的試料、例えばヒトや動物の血清等を被験試料としたイムノアッセイや核酸ハイブリダイゼーションにおける、非特異結合の抑制剤として用いることができる。これまでに非特異結合を除去するために、ビオチン結合能を低下させたアビジン、ストレプトアビジンが提案されているが（特開平１０−２８５８９号公報)、これらは完全に不活性化されていないため、（ストレプト）アビジン固相化担体に結合したビオチン化物質が脱離する可能性があった。
【００７０】
なお本発明における生物学的試料としては、検出対象となる物質が含まれうるものであれば特段限定されない。生物から採取された細胞、組織又はその破片等を含む試料、例えば体液、さらに好ましくは、血液、血清、脳脊髄液、唾液、咽頭拭い液、汗、尿、涙、リンパ液、精液、腹水及び母乳などである。
【００７１】
これらの体液は、必要に応じ希釈して用いる。希釈率は通常２倍ないし１００００倍程度、好ましくは１００倍ないし１０００倍程度であるが、これに限定されない。希釈するための溶液は任意の緩衝液が使用されうるが、適当なブロッキング剤を含んでも良い。
【００７２】
本発明の被検物質としては、生物学的試料中の検出又は測定が望まれる物質であれば特段の制限はないが、抗体や抗原などのタンパク質やその断片、ペプチド、核酸、ホルモン、糖質、糖脂質、あるいは生物学的試料中に含まれる細菌やウイルスなどを好ましく挙げることができる。
【００７３】
ここで当該改変体を用いれば、例えばタマビジンを固相化した担体に、ビオチン化抗原またはビオチン化抗体を結合させ、血清中の抗体や抗原を検出する系において、当該改変体を含む溶液で血清を希釈する、または当該改変体を含む溶液で担体のブロッキング操作を行うことにより、血清中成分との非特異結合を低減させることができる。当該改変体は中性付近でビオチンと結合しないので、イムノアッセイの反応を中性付近で行うことで、ビオチン化抗原またはビオチン化抗体を固相面から脱離させることなく、非特異結合を低減させることができる。
【００７４】
本発明の改変タマビジン（ＩＶ型）
また本発明の改変型ＴＭ２は１態様として、
配列番号２に記載のアミノ酸配列、あるいはこの配列中に１から複数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列、又はこの配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ビオチン結合活性を示すタンパク質（ＴＭ２あるいはＴＭ２（変異体））において、
９）配列番号２の７８番目のスレオニン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換、及び、１１６番目のアスパラギン酸残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換
を有することを特徴とする。
【００７５】
本明細書において「タマビジン２（ＴＭ２）」とは、上記で既に定義した通りである。
本明細書において「水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換」とは、上記で既に定義した通りである。
【００７６】
このような改変型ＴＭ２は好ましくは、
９−ａ）配列番号２の７８番目のスレオニン残基がアラニンに置換されており、そして、１１６番目のアスパラギン酸残基がアラニンに置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２  Ｔ７８Ａ―Ｄ１１６Ａ）である。
【００７７】
このような改変型ＴＭ２は、以下の性質；
ｉ）ビオチンを用いた精製が可能である、
ｉｉ）配列番号２の記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の四量体構造を維持している、
ｉｉｉ）プロテアーゼに対し耐性を有する、
ｉｖ）大腸菌の可溶性画分において高い発現を示す、
ｖｉｉ）イミノビオチンで精製できない
の１ないし全部を示す。
【００７８】
本明細書において「ビオチンを用いた精製が可能である」、「四量体構造を維持している」、「プロテアーゼ耐性を有する」及び「大腸菌の可溶性画分において高い発現を示す」とは、上記で既に定義した通りである。
【００７９】
本明細書において「イミノビオチンで精製できない」とは、目的タンパク質がイミノビオチンと結合しないか、あるいはイミノビオチンと結合した目的タンパク質を溶出することができないために、イミノビオチンを用いた精製が不可能であることを意味する。
【００８０】
「ＴＭ２  Ｔ７８Ａ−Ｄ１１６Ａ」は、大腸菌の可溶性画分において高発現するものである。また四量体の構造を維持しており、プロテアーゼに対し高い耐性を有している。この改変体は、イミノビオチンでは全く精製できないが、ビオチンでは極めてよく精製できる、というこれまでに全く知られていない特異な性質を有している。
【００８１】
当該改変体は、例えば以下のような用途に用いることが出来る。例えばある細胞を、その細胞の表層に存在する抗原を目印に特異的に標識したい場合、まず、これらの改変体を検体に注射し、検体の血液中の内生ビオチンと結合させる。続いて、その抗原に対する特異的抗体をイミノビオチン化し、検体に導入し、当該細胞をイミノビオチンでラベルする。最後に、放射性同位元素ラベルあるいは蛍光ラベルしたアビジンやストレプトアビジン、あるいはタマビジンのようなビオチンと強く結合するタンパク質を検体に注入することで、細胞を特異的に標識することが出来る。この系では予めこれらの改変体で内生のビオチンレベルを低下させているので、バックグラウンドが低く、かつこれらの改変体は、ビオチンには結合するがイミノビオチンには結合しないので、当該細胞には結合しない。通常、ビオチン結合タンパク質はイミノビオチンとビオチンの両方に結合するので、これらの改変体を使用しなければ上記の系は成立しない。
【００８２】
本発明の不活性型の改変タマビジン
本発明は、以下のタンパク質を含む。すなわち、
配列番号２に記載のアミノ酸配列、あるいはこの配列中に１から複数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列、又はこの配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ビオチン結合活性を示さないタンパク質（ＴＭ２あるいはＴＭ２（変異体））において、
１０−ａ）配列番号２の６６番目のアラニン残基がアルギニンに置換されており、そして、１１３番目のバリン残基がアルギニンに置換されている、タマビジン改変タンパク質（ＴＭ２  Ａ６６Ｒ―Ｖ１１３Ｒ）；並びに
１１−ａ）配列番号２の４６番目のプロリン残基がスレオニンに置換されており、６６番目のアラニン残基がアルギニンに置換されており、９７番目のロイシン残基がスレオニンに置換されており、そして、１１３番目のバリン残基がアルギニンに置換されている、タマビジン改変タンパク質（ＴＭ２  Ｐ４６Ｔ―Ａ６６Ｒ―Ｌ９７Ｔ―Ｖ１１３Ｒ）
であることを特徴とする。
【００８３】
本明細書において「タマビジン２（ＴＭ２）」とは、上記で既に定義した通りである。
このようなタマビジン改変タンパク質は、以下の性質；
ｉ）ビオチンへの結合活性が失われている、
ｉｉ）大腸菌の可溶性画分において高い発現を示す、
の全てを示す。
【００８４】
本明細書において、「ビオチンへの結合活性が失われている」とは、元のタンパク質のビオチン結合活性が変異により失われ、改変されたタンパク質がビオチン結合活性を実質的に有しないことを意味する。
【００８５】
本明細書において、「大腸菌の可溶性画分において高い発現を示す」とは、上記で既に定義した通りである。
「ＴＭ２  Ａ６６Ｒ―Ｖ１１３Ｒ」と「ＴＭ２  Ｐ４６Ｔ―Ａ６６Ｒ―Ｌ９７Ｔ―Ｖ１１３Ｒ」は、タマビジンのサブユニット間の結合に関与すると考えられる部位を改変したものである。ＴＭ２とストレプトアビジンとのアミノ酸の相同性（両者のアミノ酸相同性は全体で４８％である）を利用して検討したところ、ストレプトアビジンにおける５５番目のバリン（Ｖａｌ）、７６番目のスレオニン（Ｔｈｒ）、１０９番目のロイシン（Ｌｅｕ）、ならびに１２５番目のバリン（Ｖａｌ）が、それぞれＴＭ２における、４６番目のプロリン（Ｐｒｏ）、６６番目のアラニン（Ａｌａ）、９７番目のロイシン（Ｌｅｕ）、１１３番目のバリン（Ｖａｌ）であると考えられた。すなわち、ＴＭ２においてそれらのアミノ酸は、サブユニット結合部位に存在すると考えられた。そしてそれらのアミノ酸に実際に変異を入れ、ビオチン結合活性を測定すると、ビオチン結合活性はほぼ完全に失われていた（表２）。
【００８６】
当該不活性型の改変タンパク質は、生物学的試料中の物質を検出する系における、非特異結合抑制剤として使用することができる。よって本発明は、当該不活性型の改変タンパク質を含む、生物学的試料中の物質を検出する系における非特異結合抑制剤を提供する。また本発明は、当該不活性型の改変タンパク質を、生物学的試料中の物質を検出する系において、非特異的結合抑制剤として使用する方法も提供する。
【００８７】
これまでに非特異結合を除去するために、ビオチン結合能を低下させたアビジン、ストレプトアビジンが提案されているが（特開平１０−２８５８９号公報)、これらは完全に不活性化されていないため、（ストレプト）アビジン固相化担体に結合したビオチン化物質が脱離する可能性があった。
【００８８】
ここで当該不活性型の改変タンパク質を用いれば、例えばタマビジンを固相化した担体に、ビオチン化抗原またはビオチン化抗体を結合させ、血清中の抗体や抗原を検出する系において、当該不活性型の改変タンパク質を含む溶液で血清を希釈する、または当該不活性型の改変タンパク質を含む溶液でブロッキング操作を行うことで非特異結合を低減することができる。当該不活性型の改変タンパク質はビオチンへの結合活性が失われているので、ビオチン化抗原またはビオチン化抗体を固相面から脱離させることなく、非特異結合を低減させることができる。また当該不活性型の改変タンパク質は、大腸菌の可溶性画分において高い発現を示すので、容易に製造することが可能である。
【００８９】
アミノ酸の改変方法
ＴＭ２のアミノ酸を改変して、本発明の改変型ＴＭ２を得るための方法は、公知のアミノ酸配列に変異を施す方法を使用でき、特に限定されない。好ましくは本発明の改変タンパク質をコードする核酸の塩基配列に修飾を施し改変する。
【００９０】
例えば、アミノ酸配列の特定の位置のアミノ酸を改変するには、例えばＰＣＲを利用した方法が挙げられる（Ｈｉｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ  （１９８８）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １６：７３５１−７３６７，  Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ｇｅｎｅ  ７７：５１−５９）。すなわち、標的変異のミスマッチコドンを含むプライマーを利用してＰＣＲを行ない、目的の改変体をコードするＤＮＡを作成しこれを発現させることにより、目的の改変体を得ることができる。
【００９１】
また、アミノ酸の欠失、置換、挿入及び／又は付加による改変体は、野生型タンパク質をコードするＤＮＡに、前述の周知技術である部位特異的変異誘発を施すなどの方法により作成することができる。
【００９２】
本発明の改変型ＴＭ２において改変されないことが望ましいアミノ酸残基
本発明の改変型ＴＭ２におけるアミノ酸残基の改変は、改変型ＴＭ２が適切なビオチン親和性を有することにより精製が可能となるような改変である。ところで、ビオチン結合タンパク質の一つであるストレプトアビジンのビオチンポケットについては既に解明が進んでいる。このストレプトアビジンとＴＭ２のアミノ酸配列のホモロジーは５０％程度に過ぎないが、発明者らは、ＴＭ２のビオチンポケットについての知見を得るべく、ＴＭ２とストレプトアビジンのアミノ酸配列を並列させて比較した。
【００９３】
すると、ストレプトアビジンのビオチンポケットを形成するアミノ酸の中で、ビオチンと直接相互作用する残基Ｎ２３、Ｓ２７、Ｙ４３、Ｓ４５、Ｎ４９、Ｗ７９、Ｓ８８、Ｔ９０、Ｗ９２、Ｗ１０８、Ｗ１２０、Ｄ１２８（Ｗｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：  ８５−８８）は、ＴＭ２では各々、Ｎ１４、Ｓ１８、Ｙ３４、Ｓ３６、Ｄ４０、Ｗ６９、Ｓ７６、Ｔ７８、Ｗ８０、Ｗ９６、Ｗ１０８、Ｄ１１６に該当し、非常によく保存されていることが見出された。ＴＭ２とストレプトアビジンのビオチン結合ポケットは非常に似た構造を有し、これらのアミノ酸残基はビオチン結合に大きく関与していると考えられる。
【００９４】
唯一、ストレプトアビジンの４９番目のＮ（アスパラギン）は、ＴＭ２においては４０番目のＤ（アスパラギン酸）になっており、例外であった。なお４０番目のアスパラギン酸に関しては、これをストレプトアビジンと同様にアスパラギンに改変したＴＭ２  Ｄ４０Ｎ  ＴＭ２において、ビオチン結合能が高くなるという知見を本発明者らは得ている。よって４０番目のアスパラギン酸をアスパラギンに置換した改変体はビオチン結合能が強すぎるので、上記のＴＭ２  Ｄ４０Ｎ  ＴＭ２を本発明に使用することは好ましくない。
【００９５】
特に４つのトリプトファン残基（Ｗ６９、Ｗ８０、Ｗ９６、Ｗ１０８）はビオチンポケットの構造に重要な役割を果たしていると考えられるため、これまでの改変体に関する記載で特定された置換を行う場合を除き、改変されないことが望ましい。あるいは、これらを改変する場合にはビオチンとの結合を維持できるよう、性質あるいは構造が類似したアミノ酸に改変することが望ましく、例えばフェニルアラニン（Ｆ）へ改変することが望ましい。
【００９６】
一方、ビオチンとの結合に関与すると考えられるその他のアミノ酸、すなわち、ＴＭ２においては、ビオチンと直接相互作用すると考えられるアミノ酸残基（Ｎ１４、Ｓ１８、Ｙ３４、Ｓ３６、Ｓ７６、Ｔ７８、Ｄ１１６）についても、これまでの記載で特定された置換を行う場合を除き、改変されないことが望ましい。あるいは、これらを改変する場合にはビオチンとの結合を維持できるよう、性質あるいは構造が類似したアミノ酸に改変することが望ましく、例えばアスパラギン（Ｎ１４）の場合は、グルタミン（Ｑ）やアスパラギン酸（Ｄ）へ、好ましくはグルタミンへ、アスパラギン酸（Ｄ４０）の場合は、アスパラギン（Ｎ）以外へ、セリン（Ｓ１８、Ｓ３６、Ｓ７６）の場合は、スレオニン（Ｔ）あるいはチロシン（Ｙ）へ、好ましくはスレオニンへ、チロシン（Ｙ３４）の場合は、セリン（Ｓ）あるいはスレオニン（Ｔ）へ、好ましくはスレオニンへ、スレオニン（Ｔ７８）の場合は、セリン（Ｓ）やチロシン（Ｙ）へ、好ましくはセリンへ、アスパラギン酸（Ｄ１１６）の場合は、グルタミン酸（Ｅ）やアスパラギン（Ｎ）へ、好ましくはグルタミン酸へ、それぞれ改変することが望ましい。
【００９７】
加えてＰ４６、Ａ６６、Ｌ９７、Ｖ１１３もサブユニット結合部位であるために、これらの残基についても、これまでの記載で特定された置換を行う場合を除き、改変されないことが望ましい。これらを改変する場合にはビオチンとの結合を維持できるよう、性質あるいは構造が類似したアミノ酸に改変することが望ましく、例えばロイシン（Ｌ９７）の場合は、イソロイシンへ改変することが望ましい。
【００９８】
ただし、いずれも、上記１）−９）で特定したアミノ酸残基は、１）ないし９）の各々で特定したように置換されている。
改変型ＴＭ２タンパク質をコードする核酸
本発明は、本発明の改変型ＴＭ２タンパク質をコードする核酸を提供する。このような核酸の塩基配列は、ＴＭ２の塩基配列（配列番号１）を、改変型ＴＭ２タンパク質の改変アミノ酸をコードする塩基配列に改変したものである。改変される塩基配列は、改変後のアミノ酸をコードする塩基配列であれば限定されない。例えば、配列番号１の塩基配列からなる核酸（以下、「ＴＭ２遺伝子」）、またはそれらの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ビオチンとの結合及び解離を可能とする、適切なビオチン結合活性を有するタンパク質をコードする核酸であって、本発明の改変を施すために塩基配列を改変させたものを含む。
【００９９】
本発明の核酸は、好ましくは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８及び２０のいずれかのアミノ酸配列をコードする。本発明の核酸は、より好ましくは配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９のいずれかの核酸配列からなる。
【０１００】
本発明の核酸を含むベクター
また、本発明は、改変型ＴＭ２タンパク質をコードする核酸を含むベクターを提供する。好ましくは、改変型ＴＭ２タンパク質を発現するための発現ベクターである。
【０１０１】
本発明の改変型ＴＭ２のタンパク質をコードする核酸は、上記「改変型ＴＭ２タンパク質をコードする核酸」に記載された通りであり、特に限定されない。改変型ＴＭ２タンパク質をコードする核酸の上流には所望の宿主で機能するプロモーターが、またその下流にはターミネーターが配置されていることが望ましい。
【０１０２】
本発明のベクターは、好ましくは発現ベクターである。発現ベクターは、上記のような発現ユニット（プロモーター＋改変型ＴＭ２コード領域＋ターミネーター）の他に、所望の宿主で複製できるためのユニット、例えば複製開始点を有し、また所望の宿主細胞を選抜するための、薬剤抵抗性マーカー遺伝子を有してもよい。宿主は特に限定されないが、好ましくは大腸菌である。また、本発現ベクターに、例えば、大腸菌におけるラクトースリプレッサー系のような適当な発現制御系を組み込んでもよい。
【０１０３】
改変型ＴＭ２を固定化した担体
本発明は、本発明の改変型ＴＭ２タンパク質を固定化した担体を提供する。
担体を構成する材料は公知のものを使用可能である。例えば、セルロース、テフロン、ニトロセルロース、アガロース、高架橋アガロース、デキストラン、キトサン、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリプロピレン、ナイロン、ポリジビニリデンジフルオライド、ラテックス、シリカ、ガラス、ガラス繊維、金、白金、銀、銅、鉄、ステンレススチール、フェライト、シリコンウエハ、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリ乳酸、樹脂、多糖類、タンパク（アルブミン等）、炭素又はそれらの組合せ、などを含むがこれらに限定されない。また、一定の強度を有し、組成が安定し、かつ非特異結合が少ないものが好ましい。
【０１０４】
固体担体の形状は、ビーズ、磁性ビーズ、薄膜、微細管、フィルター、プレート、マイクロプレート、カーボンナノチューブ、センサーチップなどを含むがこれらに限定されない。薄膜やプレートなどの平坦な固体担体は、当該技術分野で知られているように、ピット、溝、フィルター底部などを設けてもよい。
【０１０５】
発明の一態様において、ビーズは、約２５ｎｍ〜約１ｍｍの範囲の球体直径を有しうる。好ましい態様では、ビーズは約５０ｎｍ〜約１０μｍの範囲の直径を有する。ビーズのサイズは特定の適用に応じて選択されうる。
【０１０６】
タンパク質の担体への結合は特に限定されず、タンパク質を担体に結合させるための公知の方法を使用することが可能である。具体的な結合方法は、担体の種類等によって、当業者が適宜選択可能である。
【実施例】
【０１０７】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
【０１０８】
実施例１  低親和性（Ｌｏｗ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ）タマビジン２（ＬＡＴＭ２）の構築と分析
１−１．低親和性タマビジン２（以下ＬＡＴＭ２）の設計
本発明者らは、ストレプトアビジンの結晶構造の知見を踏まえ、ストレプトアビジンとＴＭ２のアミノ酸配列との比較検討を行い、ＴＭ２においてビオチンと相互作用するアミノ酸残基を推定し、それらのアミノ酸の配置はストレプトアビジンがビオチンと相互作用するアミノ酸のそれと似ているという知見を得た。これにより、ＴＭ２のアミノ酸配列の６９番目、８０番目、９６番目、１０８番目のトリプトファンが、ビオチンと疎水結合するアミノ酸であると推定し、さらにＴＭ２のアミノ酸配列の１４番目のアスパラギン、１８番目のセリン、３４番目のチロシン、３６番目のセリン、７６番目のセリン、７８番目のスレオニン、および、１１６番目のアスパラギン酸が、ビオチンと水素結合するアミノ酸であると推定した。また、検討の結果、４６番目のプロリン、６６番目のアラニン、９７番目のロイシン、１１３番目のバリンがＴＭ２においてサブユニット間の結合に重要であると考えられた。
【０１０９】
以上の知見を踏まえ、ＴＭ２とビオチンとの親和性を低下させることを目的に、ＴＭ２中にアミノ酸変異を導入した。まず、ビオチンとの疎水結合に重要な役割を果たしていると考えられるトリプトファン（６９番目、８０番目、９６番目、１０８番目のトリプトファン）、水素結合に関与すると考えられるアミノ酸（１４番目のアスパラギン、１８番目のセリン、３４番目のチロシン、３６番目のセリン、１１６番目のアスパラギン酸、７６番目のセリン、７８番目のスレオニン）に変異導入を行った。さらには、サブユニット間の結合に重要であると考えられるアミノ酸残基（４６番目のプロリン、６６番目のアラニン、９７番目のロイシン、１１３番目のバリン）についても変異導入を行った。
【０１１０】
即ち、ＬＡＴＭ２を構築するために以下の３０個のＴＭ２改変体を構築した。
（１）１０８番目のトリプトファンをリジンに置換したＴＭ２（以下、「ＴＭ２  Ｗ１０８Ｋ」）；
（２）６９番目のトリプトファンをリジンに置換したＴＭ２（以下、「ＴＭ２  Ｗ６９Ｋ」）；
（３）８０番目のトリプトファンをリジンに置換したＴＭ２（以下、「ＴＭ２  Ｗ８０Ｋ」、塩基配列は配列番号３に記載、アミノ酸配列は配列番号４に記載）；
（４）３６番目のセリンをアラニンに変異したＴＭ２（以下、「ＴＭ２  Ｓ３６Ａ」、塩基配列は配列番号５に記載、アミノ酸配列は配列番号６に記載）；
（５）３６番目のセリンからアラニンへの置換と７８番目のスレオニンからアラニンへの置換と１１６番目のアスパラギン酸からアラニンへの置換を持つＴＭ２（以下、「ＴＭ２  Ｓ３６Ａ−Ｔ７８Ａ−Ｄ１１６Ａ」、塩基配列は配列番号７に記載、アミノ酸配列は配列番号８に記載）；
（６）１４番目のアスパラギンをアラニンに変異したＴＭ２（以下、「ＴＭ２  Ｎ１４Ａ」）；
（７）７８番目のスレオニンをアラニンに変異したＴＭ２（以下、「ＴＭ２  Ｔ７８Ａ」、塩基配列は配列番号９に記載、アミノ酸配列は配列番号１０に記載）；
（８）１１６番目のアスパラギン酸をアラニンに変異したＴＭ２（以下、「ＴＭ２  Ｄ１１６Ａ」、塩基配列は配列番号１１に記載、アミノ酸配列は配列番号１２に記載）；
（９）６６番目のアラニンをアルギニンに変異したＴＭ２（以下、「ＴＭ２  Ａ６６Ｒ」）；
（１０）４６番目のプロリンからスレオニンへの置換と６６番目のアラニンからアルギニンへの置換をもつＴＭ２（以下、「ＴＭ２  Ｐ４６Ｔ−Ａ６６Ｒ」）； 
（１１）１１３番目のバリンをアルギニンに変異したＴＭ２（以下、「ＴＭ２  Ｖ１１３Ｒ」）；
（１２）４６番目のプロリンからスレオニンへの置換と１１３番目のバリンからアルギニンへの置換を持つＴＭ２（以下、「ＴＭ２  Ｐ４６Ｔ−Ｖ１１３Ｒ」）。
【０１１１】
（１３）４６番目のプロリンからスレオニンへの置換と７８番目のスレオニンからアラニンへの置換を持つＴＭ２（以下、「ＴＭ２  Ｐ４６Ｔ−Ｔ７８Ａ」、塩基配列は配列番号１３に記載、アミノ酸配列は配列番号１４に記載）。
【０１１２】
（１４）４６番目のプロリンからスレオニンへの置換と１１６番目のアスパラギン酸からアラニンへの置換を持つＴＭ２（以下、「ＴＭ２  Ｐ４６Ｔ−Ｄ１１６Ａ」、塩基配列は配列番号１５に記載、アミノ酸配列は配列番号１６に記載）。
【０１１３】
（１５）４６番目のプロリンからスレオニンへの置換と７８番目のスレオニンからアラニンへの置換と１１６番目のアスパラギン酸からアラニンへの変異を持つＴＭ２（以下、「ＴＭ２  Ｐ４６Ｔ−Ｔ７８Ａ−Ｄ１１６Ａ」、塩基配列は配列番号１７に記載、アミノ酸配列は配列番号１８に記載）。
【０１１４】
（１６）４６番目のプロリンからスレオニンへの置換と６６番目のアラニンからアルギニンへの置換と９７番目のロイシンからスレオニンへの変異を持つＴＭ２（以下、「ＴＭ２  Ｐ４６Ｔ−Ａ６６Ｒ−Ｌ９７Ｔ」）。
【０１１５】
（１７）１０８番目のトリプトファンからグルタミン酸への変異を持つＴＭ２（以下、「ＴＭ２  Ｗ１０８Ｅ」）。
（１８）１０８番目のトリプトファンからアルギニンへの変異を持つＴＭ２（以下、「ＴＭ２  Ｗ１０８Ｒ」）。
【０１１６】
（１９）９６番目のトリプトファンからリジンへの変異を持つＴＭ２（以下、「ＴＭ２  Ｗ９６Ｋ」）。
（２０）３６番目のセリンからアラニンへの置換と１１６番目のアスパラギン酸からアラニンへの置換を持つＴＭ２（以下、「ＴＭ２  Ｓ３６Ａ−Ｄ１１６Ａ」、塩基配列は配列番号１９に記載、アミノ酸配列は配列番号２０に記載）。
【０１１７】
（２１）１８番目のセリンからアラニンへの変異を持つＴＭ２（以下、「ＴＭ２  Ｓ１８Ａ」）。
（２２）７８番目のスレオニンからアラニンへの置換と１１６番目のアスパラギン酸からアラニンへの置換を持つＴＭ２（以下、「ＴＭ２  Ｔ７８Ａ−Ｄ１１６Ａ」、塩基配列は配列番号２１に記載、アミノ酸配列は配列番号２２に記載）。
【０１１８】
（２３）３４番目のチロシンからアラニンへの変異を持つＴＭ２（以下、「ＴＭ２  Ｙ３４Ａ」）。
（２４）４６番目のプロリンからスレオニンへの変異を持つＴＭ２（以下、「ＴＭ２  Ｐ４６Ｔ」）。
【０１１９】
（２５）４６番目のプロリンからスレオニンへの置換と９７番目のロイシンからスレオニンへの置換を持つＴＭ２（以下、「ＴＭ２  Ｐ４６Ｔ−Ｌ９７Ｔ」）。
（２６）４６番目のプロリンからスレオニンへの置換と６６番目のアラニンからアルギニンへの置換と９７番目のロイシンからスレオニンへの変異と１１３番目のバリンからアルギニンへの置換を持つＴＭ２（以下、「ＴＭ２  Ｐ４６Ｔ−Ａ６６Ｒ−Ｌ９７Ｔ−Ｖ１１３Ｒ」）。（塩基配列は配列番号２３に記載、アミノ酸配列は配列番号２４に記載）
（２７）６６番目のアラニンからアルギニンへの置換と１１３番目のバリンからアルギニンへの置換を持つＴＭ２（以下、「ＴＭ２  Ａ６６Ｒ−Ｖ１１３Ｒ」）。（塩基配列は配列番号２５に記載、アミノ酸配列は配列番号２６に記載）
（２８）６６番目のアラニンからアルギニンへの置換と９７番目のロイシンからスレオニンへの置換と１１３番目のバリンからアラギニンへの置換を持つＴＭ２（以下、「ＴＭ２  Ａ６６Ｒ−Ｌ９７Ｔ−Ｖ１１３Ｒ」）。
【０１２０】
（２９）９７番目のロイシンからスレオニンへの変異を持つＴＭ２（以下、「ＴＭ２  Ｌ９７Ｔ」）。
（３０）９７番目のロイシンからスレオニンへの変異と１１３番目のバリンからアルギニンへの置換を持つＴＭ２（以下、「ＴＭ２  Ｌ９７Ｔ−Ｖ１１３Ｒ」）。
【０１２１】
まず、ＬＡＴＭ２を構築するための変異導入を行うのに使用するＰＣＲ用プライマーを設計した。ＴＭ２遺伝子の５’部分の領域の配列と、その上流に制限酵素ＰｃｉＩ切断部位（ＡＣＡＴＧＴ）を配置した配列からなるプライマーＴｍ２  ５’ Ｐｃｉ、ＴＭ２遺伝子の３’部分の領域と、その下流に制限酵素ＢａｍＨＩ切断部位（ＧＧＡＴＣＣ）を配置した配列からなるプライマーＴｍ２ ３’Ｂａｍを設計した。各改変タマビジン２についてのミスマッチコドンを含む一連のセンスプライマー、およびアンチセンスプライマーを、それぞれ表１に示す。なお表１において制限酵素認識部位を下線で示し、変異導入部位を点線で示した。
【０１２２】
［表１］  低親和性タマビジン構築用プライマー
【０１２３】
【表１】
0005848501.tif 000002
【０１２４】
１−２  ＰＣＲによる遺伝子増幅
ＬＡＴＭ２遺伝子を構築するために、２段階のＰＣＲを行った。１段階目のＰＣＲは、ＴＭ２遺伝子がベクターｐＴｒｃ９９Ａに組み込まれたプラスミドを鋳型にして、プライマーＴｍ２ＮｔｅｒｍＰｃｉと各改変体のミスマッチコドンを含むアンチセンスプライマー（ＴＭ２−Ｓ３６Ａ−Ｒｖ、ＴＭ２−Ｎ１４Ａ−Ｒｖ、ＴＭ２−Ｔ７８Ａ−Ｒｖ、ＴＭ２−Ｄ１１６Ａ−Ｒｖ、ＴＭ２−Ｗ１０８Ｋ−Ｒｖ、ＴＭ２−Ｗ１０８Ｅ−Ｒｖ、ＴＭ２−Ｗ１０８Ｒ−Ｒｖ、ＴＭ２−Ｗ９６Ｋ−Ｒｖ、ＴＭ２−Ｓ１８Ａ−Ｒｖ、ＴＭ２−Ｙ３４Ａ−Ｒｖ、ＴＭ２−Ｗ６９Ｋ−Ｒｖ、ＴＭ２−Ｗ８０Ｋ−Ｒｖ、ＴＭ２−Ｐ４６Ｔ−Ｒｖ、ＴＭ２−Ｖ１１３Ｒ−Ｒｖ、ＴＭ２−Ｌ９７Ｔ−Ｒｖ）のそれぞれを用いて変異遺伝子の５’部分の増幅を行った。更にミスマッチコドンを含むセンスプライマー(ＴＭ２−Ｓ３６Ａ−Ｆｗ、ＴＭ２−Ｎ１４Ａ−Ｆｗ、ＴＭ２−Ｔ７８Ａ−Ｆｗ、ＴＭ２−Ｄ１１６Ａ−Ｆｗ、ＴＭ２−Ｗ１０８Ｋ−Ｆｗ、ＴＭ２−Ｗ１０８Ｅ−Ｆｗ、ＴＭ２−Ｗ１０８Ｒ−Ｆｗ、ＴＭ２−Ｗ９６Ｋ−Ｆｗ、ＴＭ２−Ｓ１８Ａ−Ｆｗ、ＴＭ２−Ｙ３４Ａ−Ｆｗ、ＴＭ２−Ｗ６９Ｋ−Ｆｗ、ＴＭ２−Ｗ８０Ｋ−Ｆｗ、ＴＭ２−Ｐ４６Ｔ−Ｆｗ、ＴＭ２−Ｖ１１３Ｒ−Ｆｗ、ＴＭ２−Ｌ９７Ｔ−Ｆｗ)のそれぞれとＴｍ２ＣｔｅｒｍＢａｍを用いて変異遺伝子の３’部分の増幅を行った。
【０１２５】
ＰＣＲ反応条件は以下のとおりである。５０μＬの反応液中に鋳型ＤＮＡを５００ｎｇ、１０×Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｔａｋａｒａ社）を５μＬ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰを４μＬ、プライマーを各２５ｐｍｏｌｅｓ、５Ｕ／μＬ  Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社製）を０．５μＬ添加し、プログラムテンプコントロールシステムＰＣ−７００（ＡＳＴＥＫ）を用いて、９６℃３分を１回、９６℃１分、５５℃１分、７２℃２分を１０回、７２℃６分を１回のサイクルで加熱を行った。その結果、遺伝子の５’部分、および３’部分において、いずれも設計通りのサイズのＰＣＲ産物が得られた。
【０１２６】
これらのＰＣＲ産物を、低融点アガロース（ＳｅａＰｌａｑｕｅＧＴＧ、ＣＡＭＢＲＥＸ社）を用いてＴＡＥ緩衝液中でアガロース電気泳動を行った。各ＤＮＡ断片をゲルごと切り出し、ゲルと等量の２００  ｍＭ  ＮａＣｌを加え、７０℃で１０分間処理し、ゲルを融解した。このサンプルについて、フェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出、クロロホルム抽出を各１回行い、エタノール沈殿によって遺伝子の５’部分と３’部分のＤＮＡ断片を回収した。それぞれの各変異遺伝子の５’部分と３’部分の両ＤＮＡ断片を鋳型にして、プライマーＴｍ２ＮｔｅｒｍＰｃｉとＴｍ２ＣｔｅｒｍＢａｍを用いて、２段階目のＰＣＲを行った。反応条件は１段階目と同様とした。その結果、いずれのクローンにおいても約４３０ｂｐのＰＣＲ産物が得られた。
【０１２７】
１−３）  遺伝子クローニング
ＰＣＲによって得られたＬＡＴＭ２遺伝子断片をベクターｐＣＲ４  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングした。ライゲーション反応はベクターキット添付の説明書きに従った。大腸菌ＴＢ１にエレクトロポレーション法を用いてＤＮＡを導入し、常法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  １９８９，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）に従ってプラスミドＤＮＡを抽出した。インサートが確認されたクローンに関して、Ｍ１３プライマー（Ｔａｋａｒａ社）を用いて、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ蛍光シークエンサー（Ｍｏｄｅｌ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ，  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）で、ＰＣＲ産物の塩基配列をその両端から決定し、対象塩基に目的とする変異が導入されていることを確認した。
【０１２８】
塩基配列を確認した後、上記プラスミドを制限酵素ＰｃｉＩとＢａｍＨＩで二重消化し、前述の方法でゲル精製を行い、ＤＮＡ断片を回収した。この断片を、あらかじめＮｃｏＩとＢａｍＨＩで消化しておいた大腸菌発現用ベクターｐＴｒｃ９９Ａに、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いてライゲーションした。ライゲーション産物を大腸菌ＴＢ１に形質転換し、常法に従いプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素分析を行い、挿入遺伝子の有無を確認した。こうして、ＬＡＴＭ２タンパク発現用のベクターである、ＴＭ２  Ｗ１０８Ｋ／ｐＴｒｃ９９Ａ、ＴＭ２  Ｗ１０８Ｅ／ｐＴｒｃ９９Ａ、ＴＭ２  Ｗ１０８Ｒ／ｐＴｒｃ９９Ａ、ＴＭ２  Ｗ６９Ｋ／ｐＴｒｃ９９Ａ、ＴＭ２  Ｗ８０Ｋ／ｐＴｒｃ９９Ａ、ＴＭ２  Ｗ９６Ｋ／ｐＴｒｃ９９Ａ、ＴＭ２  Ｓ１８Ａ／ｐＴｒｃ９９Ａ、ＴＭ２  Ｙ３４Ａ／ｐＴｒｃ９９Ａ、ＴＭ２  Ｓ３６Ａ／ｐＴｒｃ９９Ａ、ＴＭ２  Ｎ１４Ａ／ｐＴｒｃ９９Ａ、ＴＭ２  Ｔ７８Ａ／ｐＴｒｃ９９Ａ、ＴＭ２  Ｄ１１６Ａ／ｐＴｒｃ９９Ａ、ＴＭ２  Ａ６６Ｒ／ｐＴｒｃ９９Ａ、ＴＭ２  Ｐ４６Ｔ／ｐＴｒｃ９９Ａ、ＴＭ２  Ｌ９７Ｔ／ｐＴｒｃ９９Ａ、ＴＭ２  Ｖ１１３Ｒ／ｐＴｒｃ９９Ａを完成させた。
【０１２９】
さらに、２箇所のアミノ酸変異を有するＬＡＴＭ２、および３箇所のアミノ酸変異を有するＬＡＴＭ２については、点変異を有するＬＡＴＭ２をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターを鋳型とし、各改変体についてのミスマッチコドンを含むプライマーを用いて上記に記載した方法で構築した。これにより、ＴＭ２  Ｓ３６ＡＤ１１６Ａ／ｐＴｒｃ９９Ａ、ＴＭ２  Ｓ３６ＡＤＴ７８ＡＤ１１６Ａ／ｐＴｒｃ９９Ａ、ＴＭ２  Ｔ７８ＡＤ１１６Ａ／ｐＴｒｃ９９Ａ、ＴＭ２  Ｐ４６ＴＬ９７Ｔ／ｐＴｒｃ９９Ａ、ＴＭ２  Ｐ４６ＴＡ６６ＲＬ９７Ｔ／ｐＴｒｃ９９Ａ、ＴＭ２  Ｐ４６ＴＡ６６ＲＬ９７ＴＶ１１３Ｒ／ｐＴｒｃ９９Ａ、ＴＭ２  Ａ６６ＲＬ９７Ｔ／ｐＴｒｃ９９Ａ、ＴＭ２  Ｐ４６ＴＡ６６Ｒ／ｐＴｒｃ９９Ａ、ＴＭ２  Ｌ９７ＴＶ１１３Ｒ／ｐＴｒｃ９９Ａ、ＴＭ２  Ａ６６ＲＶ１１３Ｒ／ｐＴｒｃ９９Ａ、ＴＭ２  Ａ６６ＲＬ９７ＴＶ１１３Ｒ／ｐＴｒｃ９９Ａ、ＴＭ２  Ｐ４６ＴＶ１１３Ｒ／ｐＴｒｃ９９Ａ、ＴＭ２  Ｐ４６ＴＴ７８Ａ／ｐＴｒｃ９９Ａ、ＴＭ２  Ｐ４６ＴＤ１１６Ａ／ｐＴｒｃ９９Ａ、Ｐ４６ＴＴ７８ＡＤ１１６Ａ／ｐＴｒｃ９９Ａを完成させた。
【０１３０】
１−４）  ＬＡＴＭ２の大腸菌発現
各ＬＡＴＭ２／ｐＴｒｃ９９Ａにより形質転換した大腸菌ＢＬ２１を、抗生物質アンピシリン（最終濃度１００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地６ｍＬに接種し、ＯＤ６００における吸光度が０．５に達するまで２５℃で振とう培養した。その後、１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加し、さらに２５℃で一晩振とう培養した。培養液１ｍＬから遠心にて大腸菌を集菌し、１００ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７）１５００μＬ中に懸濁後、菌体を超音波により破砕した。破砕液を遠心（１５０００ｒｐｍ）し、その上清を可溶性画分とした。
【０１３１】
この可溶性画分についてウエスタンブロッティング解析を行った。可溶性画分と２×ＳＤＳ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ（１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ６．８，  １０％  ２−メルカプトエタノール、  ４％  ＳＤＳ、  １０％  スクロース、０．０１％ＢＰＢ）を等量ずつ混和し、９５℃で１０分間加熱したものをＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で展開し、ウエスタンブロッティング解析に用いた。１次抗体としてウサギ抗ＴＭ２抗体（ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３２６２６０）を用いた。さらに、２次抗体としてアルカリフォスファターゼ標識抗ウサギ  ＩｇＧ抗体（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いた。ウエスタンブロッティング解析の結果、ＬＡＴＭ２／ｐＴｒｃ９９Ａで形質転換した大腸菌いずれにおいても、ＬＡＴＭ２遺伝子を挿入していないベクターｐＴｒｃ９９Ａで形質転換した大腸菌にはない、１５．５ｋＤａ付近のバンドが検出された。これらのバンドのサイズは、ＴＭ２のアミノ酸配列から予測される単量体の分子量１５．５ｋＤａと一致した。
【０１３２】
また、培養液１Ｌ当たりの可溶性ＬＡＴＭ２タンパクの発現量は、いずれもＷＴ−ＴＭ２と同程度で約２０ｍｇであった。ただし、ＴＭ２  Ｗ１０８Ｒ、ＴＭ２  Ｗ９６Ｋ、ＴＭ２  Ｓ１８Ａ、ＴＭ２  Ｙ３４Ａについては発現がほとんど見られなかったため、以後の検討は行っていない。
【０１３３】
１−５）  ＬＡＴＭ２の精製
ＬＡＴＭ２の精製は、Ｈｏｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）の方法に従い、２−イミノビオチン−アガロース（Ｓｉｇｍａ社製）を充填したカラムを用いて行った。各ＬＡＴＭ２で形質転換した大腸菌について、大腸菌培養液２５ｍＬに、最終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加して発現誘導した。菌体を遠心分離により集菌し、５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  ＣＡＰＳ（ｐＨ１２）１．５ｍＬで懸濁し、超音波破砕後の遠心上清に、２−イミノビオチン−アガロース  ５００μＬを添加した後、カラムに充填した。５００ｍＭ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  ＣＡＰＳ（ｐＨ１２）でカラムをよく洗浄した後、５０ｍＭ  ＮＨ４ＯＡＣ（ｐＨ４）で溶出した。
【０１３４】
また、ビオチン−アガロース（Ｓｉｇｍａ社製）による精製は以下の方法で行った。ＬＡＴＭ２の各々の大腸菌培養液２５ｍＬに発現誘導をかけ、１００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１．５ｍＬで菌体を懸濁し、超音波破砕後の上清にビオチン−アガロース  ４００μＬを添加した後１時間転倒混和した。その後アガロースをカラムに充填し、５００ｍＭ  ＮａＣｌを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）でカラムをよく洗浄した後、１０ｍＭ  ビオチンを含むＰＢＳ１ｍＬで溶出した。
【０１３５】
ただし、ＴＭ２  Ｓ３６Ａ−Ｔ７８Ａ−Ｄ１１６Ａについては５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  ＣＡＰＳ（ｐＨ１２）  １．５ｍＬで懸濁し、超音波破砕後の上清にビオチン−アガロース  ４００μＬを添加した。１時間転倒混和後、５００ｍＭ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  ＣＡＰＳ（ｐＨ１２）でカラムをよく洗浄し、１０ｍＭ  ビオチンを含むＰＢＳ１ｍＬ（ｐＨ７．４）で溶出した。
【０１３６】
また、ＴＭ２  Ｓ３６Ａ−Ｄ１１６Ａにおいては１００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ４．０）１．５ｍＬで懸濁し、超音波破砕後の上清にビオチン−アガロース  ４００μＬを添加した。洗浄は５００ｍＭ  ＮａＣｌを含む１００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ４）を用い、１０ｍＭ  ビオチンを含むＰＢＳ１ｍｌ（ｐＨ７）で溶出した。過剰量のビオチンで溶出したＬＡＴＭ２に結合しているビオチンは、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液で一晩透析することで除去した。
【０１３７】
２−イミノビオチン−アガロースとビオチン−アガロースにおける回収率と精製度の結果を表２に示す。なお、表２において回収率は、精製後のＬＡＴＭ２タンパク質の量を精製前のＬＡＴＭ２タンパク質の量で割ったものに１００を乗じて％で表した。また、精製度は、精製画分中の総タンパク質の量に占めるＬＡＴＭ２タンパク質の量の割合に１００を乗じて％で表した。ビオチン−アガロースによる精製における回収率および精製度については、ｐＨ７で結合し過剰ビオチンで溶出させたときの結果として示した。
【０１３８】
［表２］  ＬＡＴＭ２の回収率及び精製度
【０１３９】
【表２−１】
0005848501.tif 000003
【０１４０】
【表２−２】
0005848501.tif 000004
【０１４１】
２―イミノビオチン−アガロースを用いた精製において、各種ＬＡＴＭ２のうち、ＴＭ２  Ｐ４６Ｔ、ＴＭ２  Ｓ３６Ａ、ＴＭ２  Ｄ１１６Ａ、ＴＭ２  Ｐ４６Ｔ−Ｔ７８Ａ、ＴＭ２  Ｐ４６Ｔ−Ｄ１１６Ａ、ＴＭ２  Ｐ４６Ｔ−Ｔ７８Ａ−Ｄ１１６Ａ、ＴＭ２  Ｗ８０Ｋ、及びＴＭ２  Ｐ４６Ｔ−Ｌ９７Ｔについては、回収率についても、精製度についても、野生型ＴＭ２（ＷＴ−ＴＭ２：回収率９５％、精製度９５％）と同程度に精製することが可能であった。
【０１４２】
また、ＴＭ２  Ｗ１０８Ｋ、ＴＭ２  Ｎ１４Ａ、ＴＭ２  Ｔ７８Ａ、ＴＭ２  Ｗ１０８Ｅ、及びＴＭ２  Ｗ６９Ｋについては、２−イミノビオチン−アガロースを用いた精製において、回収率はＷＴより劣るものの、精製は可能であった。
【０１４３】
一方、ＴＭ２  Ｓ３６Ａ−Ｔ７８Ａ−Ｄ１１６Ａ、ＴＭ２  Ｓ３６Ａ−Ｄ１１６Ａ、ＴＭ２  Ａ６６Ｒ、ＴＭ２  Ｐ４６Ｔ−Ａ６６Ｒ、ＴＭ２  Ｔ７８Ａ−Ｄ１１６Ａ、ＴＭ２  Ｐ４６Ｔ−Ａ６６Ｒ−Ｌ９７Ｔ、ＴＭ２  Ａ６６Ｒ−Ｌ９７Ｔ、ＴＭ２  Ａ６６Ｒ−Ｌ９７Ｔ−Ｖ１１３Ｒ、ＴＭ２  Ｌ９７Ｔ−Ｖ１１３Ｒ、ＴＭ２  Ｖ１１３Ｒ、及びＴＭ２  Ｐ４６Ｔ−Ｖ１１３Ｒについては、２−イミノビオチン−アガロース（Ｓｉｇｍａ社製）に結合せず、それを用いて精製することはできなかった。しかしこれらのＬＡＴＭ２は全て、ビオチン−アガロース（Ｓｉｇｍａ社製）には結合し、精製することができた。
【０１４４】
一方、ＴＭ２  Ｐ４６Ｔ−Ａ６６Ｒ−Ｌ９７Ｔ−Ｖ１１３Ｒ及びＴＭ２  Ａ６６Ｒ−Ｖ１１３Ｒは、２−イミノビオチン−アガロースにも、ビオチン−アガロースにも結合しなかった。また、ＴＭ２  Ｐ４６Ｔ及びＴＭ２  Ｌ９７Ｔについてはビオチン−アガロースには結合したが、ＷＴ−ＴＭ２と同様に、過剰ビオチンによる溶出はできなかった。これはビオチンとの結合が極めて強いためと考えられた。
【０１４５】
ＷＴ−ＴＭ２とＴＭ２  Ｓ３６Ａをビオチン−アガロースで精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した結果を図１Ａに示す。ＷＴ−ＴＭ２は、図１Ａにおいてフロースルー（ＦＴ）にそのバンドが見られないことから判るように、ビオチン−アガロースに効率よく吸着される。しかしビオチンとのアフィニティが非常に高いため過剰ビオチンによる溶出は不可能であり、溶出液（Ｅｌｕ）にはＷＴ−ＴＭ２は認められなかった。
【０１４６】
一方、同じくＦＴにＴＭ２  Ｓ３６Ａのバンドが見られないことから判るように、ＴＭ２  Ｓ３６Ａは同様にビオチン−アガロースに効率よく吸着されるものの、過剰のビオチンを添加することで溶出され、ＥｌｕにＴＭ２  Ｓ３６Ａのバンドが検出される。このビオチン結合の可逆性はＴＭ２に変異を組み込むことによって、ビオチンとのアフィニティが低下したことによりもたらされたものであると考えられた。他のＬＡＴＭ２、すなわち、ＴＭ２  Ｗ１０８Ｋ、ＴＭ２  Ｗ１０８Ｅ、ＴＭ２  Ｔ７８Ａ（図１Ｂ）、ＴＭ２  Ｄ１１６Ａ（図１Ｃ）、ＴＭ２  Ｐ４６Ｔ−Ｄ１１６Ａ（図２Ａ）、ＴＭ２  Ｐ４６Ｔ−Ｔ７８Ａ−Ｄ１１６Ａ（図２Ｂ）、ＴＭ２  Ｔ７８Ａ−Ｄ１１６Ａ（図２Ｃ）、ＴＭ２  Ｐ４６Ｔ−Ｔ７８Ａ（図２Ｄ）についても、同様の実験結果が得られた。
【０１４７】
１−６）  ＴＭ２  Ｓ３６Ａ−Ｄ１１６Ａ、ＴＭ２  Ｓ３６Ａ−Ｔ７８Ａ−Ｄ１１６Ａのビオチン−アガロース結合における特異的ｐＨ依存性
ＴＭ２  Ｓ３６Ａ−Ｄ１１６ＡおよびＴＭ２  Ｓ３６Ａ−Ｔ７８Ａ−Ｄ１１６Ａは、ビオチン−アガロース（Ｓｉｇｍａ社製）への結合において他のＬＡＴＭ２に見られないｐＨ依存性を示した。
【０１４８】
ＴＭ２  Ｓ３６Ａ−Ｄ１１６Ａの大腸菌培養液２５ｍＬを、１ｍＭ  ＩＰＴＧで発現誘導した菌体を、１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１．５ｍＬあるいは５０ｍＭのＣＡＰＳ（ｐＨ１２．０）  １．５ｍＬで懸濁し、超音波破砕を行った。その後遠心分離を行い、遠心後の上清にビオチン−アガロース  ４００μＬを加えたところ、ビオチン−アガロースに全く結合しなかった。しかしながら、ｐＨ４.０、ｐＨ５．０、またはｐＨ６．０の１００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液でタンパク質を抽出すると、効率よくビオチン−アガロースへ結合した。さらに、反応液のｐＨをｐＨ７．０あるいはｐＨ１２．０に上げるとＴＭ２  Ｓ３６Ａ−Ｄ１１６Ａは担体から解離し、９５％の効率で回収できた。すなわち、図３Ａにおいて、ｐＨ５とｐＨ６のリン酸カリウム緩衝液で結合させ、ｐＨ７のリン酸カリウム緩衝液で溶出させた実験系ではＴＭ２  Ｓ３６Ａ−Ｄ１１６Ａのバンドが溶出画分に単一バンドとして認められた。一方ｐＨ７のリン酸カリウム緩衝液中では、ＴＭ２  Ｓ３６Ａ−Ｄ１１６Ａは、ビオチン−アガロースには結合せず、フロースルー画分に認められた。
【０１４９】
ＴＭ２  Ｓ３６Ａ−Ｔ７８Ａ−Ｄ１１６ＡについてもｐＨ依存性について実験を行った。ｐＨ４．０あるいはｐＨ１２．０の緩衝液を用いて懸濁し、超音波破砕し、遠心後の上清にビオチン−アガロースを添加したところ、ビオチン−アガロースへの結合を示した。一方、ＴＭ２  Ｓ３６Ａ−Ｄ１１６Ａと同様に、ｐＨ７．０ではビオチン−アガロースには全く結合しなかった。この性質を利用して、ｐＨ４．０でビオチン−アガロースに結合させ、ｐＨ７．０で溶出させることで、高純度のＴＭ２  Ｓ３６Ａ−Ｔ７８Ａ−Ｄ１１６Ａを得ることが出来た（図３Ｂ）。
【０１５０】
１−７）  ＬＡＴＭ２のサブユニット会合状態
ＬＡＴＭ２のサブユニット会合状態を分析するために、各種ＬＡＴＭ２の分子量をＦＰＬＣにより測定した。カラムはＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００ＨＲ(ＧＥヘルスケア社製)を用いた。分子量測定マーカーとしてＧｅｌ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＬＭＷ（ＧＥヘルスケア社製）を用いた。緩衝液は、５００ｍＭＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸カリウムを用いた。
【０１５１】
対照のＷＴ−ＴＭ２をインジェクションすることにより、四量体が溶出するピークの位置は４４〜４７ｍｌであると規定された。さらに分子量測定マーカーをロードした結果より、単量体が溶出するピークの位置は６３〜６６ｍｌ付近であり、二量体が溶出するピークの位置は５１〜５４ｍｌ付近であると規定された。
【０１５２】
各種ＬＡＴＭ２を分析した結果を表３に示す。
［表３］  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００ＨＲにおけるサブユニットの会合度の分析
【０１５３】
【表３】
0005848501.tif 000005
【０１５４】
ほとんどのＬＡＴＭ２がＷＴ−ＴＭ２と同様に四量体にあたるピークを示し、四量体を維持していることが明らかとなった。しかし、ＴＭ２  Ａ６６Ｒは一部が単量体となっており（全体の約３０％が単量体）、これにさらに４６番目のプロリンからスレオニンへの変異を加えたＴＭ２  Ｐ４６Ｔ−Ａ６６Ｒは、そのほとんどが単量体化していた（全体の約７５％）。また、ＴＭ２  Ｐ４６Ｔ−Ａ６６Ｒ−Ｌ９７Ｔ、ＴＭ２  Ａ６６Ｒ−Ｌ９７Ｔはそれぞれ７２．８％、９０％が単量体化していた。
【０１５５】
一方、ＴＭ２  Ｓ３６Ａ、ＴＭ２  Ｔ７８Ａ，ＴＭ２  Ｄ１１６Ａは四量体を維持していたが、ＴＭ２  Ｓ３６Ａ−Ｔ７８Ａ−Ｄ１１６Ａは二量体として存在していた。さらにＴＭ２  Ｗ１０８Ｋは１００％四量体で存在するが、ＴＭ２  Ｗ１０８Ｅは四量体と二量体が混在しており、その存在比はそれぞれ３３％と６７％であった。
【０１５６】
１−８）ＬＡＴＭ２のプロテアーゼ耐性
ビオチン−アガロースにより精製した１０μＭのＬＡＴＭ２（ＴＭ２  Ｓ３６Ａ、ＴＭ２  Ｄ１１６Ａ、ＴＭ２  Ｔ７８Ａ、ＴＭ２  W８０K、ＴＭ２  Ｔ７８Ａ−Ｄ１１６Ａ、ＴＭ２  Ｐ４６Ｔ−Ｔ７８Ａ、ＴＭ２  Ｐ４６Ｔ−Ｄ１１６Ａ、ＴＭ２  Ｓ３６Ａ−Ｄ１１６Ａ、ＴＭ２  Ｓ３６Ａ−Ｔ７８Ａ−Ｄ１１６Ａ、ＴＭ２  P４６T−Ｔ７８Ａ−Ｄ１１６Ａ）を、５μＭ  ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫと５ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中で３０℃、１５分間反応させた。この際、一部のサンプルには最終濃度１ｍＭになるようにビオチンを添加した。その後、ＳＤＳサンプルバッファーを添加し、９５℃で１０分間熱処理することで反応を停止させた。得られたサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供与しＣＢＢ染色を行った。対照として、１０μＭの野生型ＴＭ２と、１６μＭのＢＳＡを同条件で反応させた。結果を図４、図５に示す。
【０１５７】
その結果、ＢＳＡはビオチンの有無に関らずＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ存在下では完全に分解された（図４Ｂ）。しかしながら、野生型（ＷＴ）ＴＭ２（図４Ａ）とＴＭ２−Ｓ３６Ａ（図４Ａ）、ＴＭ２  Ｄ１１６Ａ（図４Ｃ）、ＴＭ２  Ｔ７８Ａ（図４Ｃ、図５Ａ）、ＴＭ２  Ｔ７８Ａ−Ｄ１１６Ａ（図４Ｃ）、ＴＭ２  Ｐ４６Ｔ−Ｔ７８Ａ（図５Ａ）、ＴＭ２  Ｐ４６Ｔ−Ｄ１１６Ａ（図５Ｂ）、ＴＭ２  Ｓ３６Ａ−Ｔ７８Ａ−Ｄ１１６Ａ（図５Ｃ）、ＴＭ２  Ｐ４６Ｔ−Ｔ７８Ａ−Ｄ１１６Ａ（図５Ｄ）、ＴＭ２  Ｗ８０Ｋ（図５Ｄ）はビオチンの有無に関らずＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫが存在しても殆ど分解されず、モノマー以上の分子量を維持していた。このことからＬＡＴＭ２はタンパク質分解酵素に対して安定であることが示された。
【０１５８】
なお、ＴＭ２  Ｓ３６Ａ−Ｄ１１６Ａは、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫの存在下でおよそ半分程度が分解して低分子量化したものの、モノマーのバンドが明瞭に見られ、当該酵素に対して耐性を有していることが示された。（図５Ａ、Ｃ）。
【０１５９】
１−９）ＬＡＴＭ２の耐熱性
ＬＡ−ＴＭ２の耐熱性を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって調査した。各タンパク質をＳＤＳサンプルバッファー中で、ビオチンの存在下及び非存在下で所定の温度で２０分間熱処理した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ染色を行った。採用した加熱温度はビオチン無しの実験系では８０℃、８２℃、８４℃、８６℃、８８℃、９０℃、９２℃、及び９４℃であり、ビオチンを添加した実験系では８６℃、８８℃、９０℃、９２℃、９４℃、９６℃、９８℃、及び１００℃であった。
【０１６０】
その結果を図６に示す。図６において左側がビオチン無しの実験系であり、右側がビオチン有りの実験系である。図６に示すようにＴＭ２  Ｔ７８Ａにおいて、ビオチン非存在下でのＴｒ値（単量体と四量体の量比が１：１になる温度）は８８℃であり、野生型ＴＭ２のＴｒ値（７８℃）を１０℃も上回った。またビオチン存在下ではサブユニット会合力が増すためにＷＴ−ＴＭ２およびＴＭ２  Ｔ７８Ａの四量体構造が安定し耐熱性が向上すると考えられる。実際、図６に示すように、ＴＭ２  Ｔ７８Ａのビオチン存在下でのＴｒ値は１００℃以上であった。以上のことからＴＭ２  Ｔ７８Ａにおいて、熱安定性が明らかに向上していることが判った。
【０１６１】
実施例２  ＬＡＴＭ２によるビオチン化タンパク質の精製
上記の様にして調製したＬＡＴＭ２を用いてビオチン化タンパク質を効率よく精製できるか否かを、ＬＡＴＭ２を固定化した担体を作製することにより確認した。
【０１６２】
２−１）ＬＡＴＭ２−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅの作製
ＬＡＴＭ２によってビオチン化タンパク質を効率よく精製することが可能であるか否かを調べるために、ＴＭ２  Ｓ３６ＡをＳｈｅｐａｒｏｓｅに固定化したＴＭ２−Ｓ３６Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを作製した。
【０１６３】
まず、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＨＰ（ＧＥヘルスケア社製）に詰められた樹脂を取り出し、イソプロパノールに再懸濁した。遠心(３０００ｒｐｍ)によってイソプロパノールを除去し、冷やしておいた１ｍＭ  ＨＣｌ  １０ｍＬを添加して活性化した。つぎに、遠心（３０００ｒｐｍ）後、上清を除去することで、ＨＣｌを除去した後、冷やしておいたＭｉｌｌｉ−Ｑ水１０ｍｌを添加した。
【０１６４】
遠心（３０００ｒｐｍ）によってＭｉｌｌｉ−Ｑ水を除去したのち、１．３ｍｇ／ｍＬのＴＭ２  Ｓ３６Ａを０．９ｍｌ添加し、室温で３時間転倒混和した。遠心（３０００ｒｐｍ）によって上清を除去後、５０ｍＭＴｒｉｓ／ＰＢＳ（ｐＨ８．０）を５ｍｌ添加し、さらに室温で２時間転倒混和した。転倒混和後のＳｅｐｈａｒｏｓｅから遠心（３０００ｒｐｍ）によって上清を除去した後、ブロッキング剤として５ｍｌの０．５％ＢＳＡ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を添加し、さらに３０分転倒混和した。最後にＰＢＳ（ｐＨ７．４）５ｍＬで洗浄し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に再懸濁した。なお担体へのＴＭ２  Ｓ３６Ａの結合量は、上清に残存するＴＭ２  Ｓ３６Ａの量を測定し、その値を担体に添加前のタンパク質の量から差し引くことで算出した。その結果、添加したタンパク質の８６％に相当する１．０１ｍｇのＴＭ２  Ｓ３６Ａが担体に結合していた。
【０１６５】
同様のビオチン可逆結合性を示す他のＬＡＴＭ２（ＴＭ２  Ｐ４６Ｔ−Ｔ７８Ａ、ＴＭ２  Ｐ４６Ｔ−Ｄ１１６Ａ、ＴＭ２  Ｄ１１６Ａ）についても担体への結合量を検討したところ、ＴＭ２  Ｐ４６Ｔ−Ｔ７８Ａは０．８５３ｍｇ添加し２５%の０．２１ｍｇが、ＴＭ２  Ｐ４６Ｔ−Ｄ１１６Ａは０．７６１ｍｇ添加し９３％の０．７０９ｍｇが、ＴＭ２  Ｄ１１６Ａは１．１６ｍｇ添加し８７％の１．０１ｍｇが結合していた。
【０１６６】
２−２）ビオチン化ＢＳＡの精製
作製したＴＭ２−Ｓ３６Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いてビオチン化タンパク質の精製を試みた。精製するビオチン化タンパク質としてＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）ＮＨＳ−ビオチン（リンカー長１３．５オングストローム、ＰＩＥＲＣＥ社製）でビオチン化したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（以下ビオチン化ＢＳＡ）を用いた。
【０１６７】
本発明の改変型低親和性タマビジンを用いたビオチン化ＢＳＡの精製実験を行った。０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＴＭ２−Ｓ３６Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ７５μＬに、１．６６μｇ  ビオチン化ＢＳＡ、ならびに大腸菌ＴＢ１菌体抽出液を３００μＬ添加した。菌体抽出液は、大腸菌ＴＢ１の菌体を０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で懸濁後、超音波により破砕し遠心により上清を回収したものを用いた。１．５時間転倒混和を行った後、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で三回洗浄し、５ｍＭのビオチンを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）３００μＬによって溶出した。なお対照として菌体抽出液の代わりに１．６６μｇのビオチン−ＢＳＡを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）３００μＬを用いた。その結果を図７に示す。図７において、左側がビオチン化ＢＳＡと菌体抽出液をＴＭ２−Ｓ３６Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに添加した実験系、右側がビオチン化ＢＳＡのみをＴＭ２−Ｓ３６Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに添加した実験系である。
【０１６８】
図７に示すように、精製前（ｔｏｔａｌ）のサンプルに存在したビオチン化ＢＳＡは、フロースルー（ＦＴ）の画分と洗浄液（Ｗ）においては殆ど検出されなかったが、溶出液（Ｅｌｕ）においては検出された。すなわち、ＴＭ２−Ｓ３６Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いると、菌体抽出液中の様々なタンパク質から、ビオチン化ＢＳＡを特異的に結合し、精製できることが明らかとなった。ビオチン化ＢＳＡの回収率は８０％、精製度は９５％であった。なお、溶出画分にＴＭ２−Ｓ３６Ａと思われるバンドは殆ど検出されなかった。
【０１６９】
同様の結果がＴＭ２  Ｄ１１６Ａ、ＴＭ２  Ｐ４６Ｔ−Ｔ７８Ａ、ＴＭ２  Ｐ４６Ｔ−Ｄ１１６ＡをＳｅｐｈａｒｏｓｅに固定化したＴＭ２−Ｄ１１６Ａ−Ｓｅｐａｈａｒｏｓｅ（図８Ａ）、ＴＭ２−Ｐ４６Ｔ−Ｔ７８Ａ−Ｓｅｐａｈａｒｏｓｅ（図８Ｂ）、ＴＭ２−Ｐ４６Ｔ−Ｄ１１６Ａ−Ｓｅｐａｈａｒｏｓｅ（図８Ｃ）、においても得られた。即ち、これらの担体にビオチン化ＢＳＡを上記と同様に、効率よく結合させ、効率よく回収することが出来た。図８Ａ、Ｂにビオチン化ＢＳＡを、ＴＭ２−Ｄ１１６Ａ−ＳｅｐａｈａｒｏｓｅもしくはＴＭ２−Ｐ４６Ｔ−Ｔ７８Ａ−Ｓｅｐａｈａｒｏｓｅに結合させ、６０％の回収率、精製度９５％でビオチン化ＢＳＡを回収する例を記載した。さらに図８Ｃにはビオチン化ＢＳＡ、もしくはビオチン化ＢＳＡに大腸菌の菌体抽出液を混和したものから、ＴＭ２−Ｐ４６Ｔ−Ｄ１１６Ａ−Ｓｅｐａｈａｒｏｓｅを用いて８０％の回収率、９５％の精製度でビオチン化ＢＳＡを精製する例を記載した。
【０１７０】
また、ＴＭ２  Ｓ３６Ａよりもビオチン親和性が低下していると思われるＬＡＴＭ２（ＴＭ２  Ｗ８０Ｋ、ＴＭ２  Ｔ７８Ａ−Ｄ１１６Ａ、ＴＭ２  Ｐ４６Ｔ−Ｔ７８Ａ−Ｄ１１６Ａ）をＳｅｐｈａｒｏｓｅに固定化したものについても、大腸菌粗抽出液からのビオチン化タンパク質（ＢＳＡ）の精製を検討した。その結果、ＴＭ２−Ｓ３６Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに比べ、精製効率が若干低下していたが、ビオチン化タンパク質を精製することができた。その回収率および精製度は、ＴＭ２−Ｗ８０Ｋ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅが回収率２５％、精製度８０％、ＴＭ２−Ｔ７８Ａ−Ｄ１１６Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅが回収率６０％、精製度８５％、ＴＭ２  Ｐ４６Ｔ−Ｔ７８Ａ−Ｄ１１６Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅが回収率６０％、精製度８０％であった。
【０１７１】
２−３）  ＴＭ２  Ｓ３６Ａ−Ｄ１１６Ａのビオチンへの結合におけるｐＨ依存性
ＴＭ２  Ｓ３６Ａ−Ｄ１１６Ａは、先の1−６）で述べたように、ビオチン−アガロース（Ｓｉｇｍａ社製）への結合において、特異的なｐＨ依存性を示した。そこでＴＭ２  Ｓ３６Ａ−Ｄ１１６Ａを共有結合でｓｅｐｈａｒｏｓｅに結合させたＳ３６Ａ−Ｄ１１６Ａ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅを作製し、ビオチン化タンパク質を精製する際のｐＨ依存性を検討した。
【０１７２】
上記の２−１）と同様にしてＳ３６Ａ−Ｄ１１６Ａ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅを作製した。作製したＳ３６Ａ−Ｄ１１６Ａ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅに、ｐＨ５、ｐＨ６、あるいはｐＨ７の１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液中で、ビオチン化ＢＳＡを結合させた。５００ｍＭ  ＮａＣｌを含むｐＨ４またはｐＨ７のリン酸カリウム緩衝液でよく洗浄した後、ｐＨ７のリン酸カリウム緩衝液を加えてビオチン化ＢＳＡを溶出した。各フラクション溶液に等量の２ｘＳＤＳ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒを添加し、９５℃で１０分処理した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供与し、さらに銀染色ＩＩキット（和光純薬社製）を用いてタンパク質を銀染色した。
【０１７３】
ｐＨ５、ｐＨ６、あるいはｐＨ７で結合させた場合の、精製前（ｔｏｔａｌ）、フロースルー画分（ＦＴ）、洗浄液（Ｗ）、溶出液（Ｅｌｕ）の各サンプルにおける、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図９に示す。図９に示されるようにｐＨ５とｐＨ６においては、溶出液中にビオチン化ＢＳＡのバンドが認められた。従ってＳ３６Ａ−Ｄ１１６Ａ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅは、ｐＨ５あるいはｐＨ６においてはビオチン化タンパク質を結合し、ｐＨ７においてこれを解離させるという特徴的なｐＨ依存性を示した。一方ｐＨ７では、ビオチン化ＢＳＡはＳ３６Ａ−Ｄ１１６Ａ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅに結合しなかった。
【０１７４】
この結果から、ＴＭ２  Ｓ３６Ａ−Ｄ１１６Ａ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いると、極めて穏和なｐＨ条件下（例えばｐＨ５で結合、ｐＨ７で溶出）でビオチン化タンパク質の精製が可能であることが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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