(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
平均粒子径が１〜１５ｎｍの超常磁性金属酸化物を６０〜９５重量％含有するシリカ粒子の表面に、測定対象物質、測定対象物質の類似物質、又は、測定対象物質と特異的に結合する物質が固定化された磁性シリカ粒子を用いて試料中の測定対象物質を下記（１）、（２）及び（３）のうちいずれか一つの方法により測定することを特徴とする測定対象物質測定方法。
（１）前記磁性シリカ粒子が、測定対象物質と特異的に結合する物質（測定対象物質結合物質）をその表面に固定化しているものであって、前記測定対象物質を含む試料と、前記磁性シリカ粒子と、標識物質により標識された測定対象物質結合物質（標識測定対象物質結合物質）とを接触させて、前記磁性シリカ粒子上に前記測定対象物質結合物質と前記測定対象物質と前記標識測定対象物質結合物質との複合体（標識複合体）を形成させ、前記標識複合体を担持した磁性シリカ粒子をＢ／Ｆ分離して、前記標識複合体中の標識物質量を測定し、その結果に基づいて前記試料中の測定対象物質を測定する。
（２）前記磁性シリカ粒子が、測定対象物質又は測定対象物質の類似物質をその表面に固定化しているものであって、前記測定対象物質を含む試料と、標識物質により標識された測定対象物質と特異的に結合する物質（標識測定対象物質結合物質）と、前記磁性シリカ粒子とを接触させて、前記磁性シリカ粒子上に前記測定対象物質又は測定対象物質の類似物質と前記標識測定対象物質結合物質との複合体（標識複合体）を形成させ、前記標識複合体を担持した磁性シリカ粒子をＢ／Ｆ分離して、前記標識複合体中の標識物質量を測定し、その結果に基づいて試料中の測定対象物質を測定する。
（３）前記磁性シリカ粒子が、測定対象物質と特異的に結合する物質（測定対象物質結合物質）をその表面に固定化しているものであって、前記測定対象物質を含む試料と、標識物質により標識された測定対象物質又は測定対象物質の類似物質（標識測定対象物質又はその類似物質）と前記磁性シリカ粒子とを接触させて、前記磁性シリカ粒子上に前記測定対象物質結合物質と前記標識測定対象物質又はその類似物質との複合体（標識複合体）を形成させ、前記標識複合体を担持した磁性シリカ粒子をＢ／Ｆ分離して、前記標識複合体中の標識物質量を測定し、その結果に基づいて試料中の測定対象物質を測定する。
【請求項２】
前記Ｂ／Ｆ分離が、磁性シリカ粒子の磁性を利用してなされるものである、請求項１記載の測定方法。
【請求項３】
前記磁性シリカ粒子の平均粒子径が１〜５μｍである、請求項１又は２記載の測定方法。
【請求項４】
前記超常磁性金属酸化物が酸化鉄である請求項１〜３の何れか記載の測定方法。
【請求項５】
前記酸化鉄がマグネタイト、γ−ヘマタイト、マグネタイト−α−ヘマタイト中間酸化鉄及びγ−ヘマタイト−α−ヘマタイト中間酸化鉄からなる群から選ばれる少なくとも１種の酸化鉄である請求項４記載の測定方法。
【請求項６】
前記測定対象物質、前記測定対象物質の類似物質、又は、前記測定対象物質と特異的に結合する物質が固定化される前の前記磁性シリカ粒子の表面にグルタルアルデヒド、アルブミン、カルボジイミド、ストレプトアビジン、ビオチン及び官能基を有するアルキルアルコキシシランからなる群から選ばれる少なくとも１種の有機化合物を結合させてなる、請求項１〜５の何れか記載の測定方法。
【請求項７】
前記アルキルアルコキシシランが有する官能基が、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、メルカプト基及びグリシジルオキシ基からなる群から選ばれる少なくとも１種の官能基である、請求項６記載の測定方法。
【請求項８】
前記測定対象物質と特異的に結合する物質が、測定対象物質又は測定対象物質の類似物質に対する抗体、測定対象物質又は測定対象物質の類似物質が結合する抗原、或いは、測定対象物質又は測定対象物質の類似物質に結合するタンパク質である、請求項１〜７の何れか記載の測定方法。
【請求項９】
前記磁性シリカ粒子は、シリカのマトリックス中に前記超常磁性金属酸化物が分散されてなる請求項１〜８の何れか記載の測定方法。
【請求項１０】
平均粒子径が１〜１５ｎｍの超常磁性金属酸化物を６０〜９５重量％含有するシリカ粒子の表面に、測定対象物質、測定対象物質の類似物質、又は、測定対象物質と特異的に結合する物質が固定化された磁性シリカ粒子を含有することを特徴とする、請求項１〜９の何れか記載の測定方法用試薬。
【請求項１１】
前記磁性シリカ粒子の平均粒子径が１〜５μｍである請求項１０記載の試薬。
【請求項１２】
前記超常磁性金属酸化物が酸化鉄である請求項１０又は１１記載の試薬。
【請求項１３】
前記酸化鉄がマグネタイト、γ−ヘマタイト、マグネタイト−α−ヘマタイト中間酸化鉄及びγ−ヘマタイト−α−ヘマタイト中間酸化鉄からなる群から選ばれる少なくとも１種の酸化鉄である請求項１２記載の試薬。
【請求項１４】
測定対象物質、測定対象物質の類似物質、又は、測定対象物質と特異的に結合する物質が固定化される前の前記磁性シリカ粒子の表面にグルタルアルデヒド、アルブミン、カルボジイミド、ストレプトアビジン、ビオチン及び官能基を有するアルキルアルコキシシランからなる群から選ばれる少なくとも１種の有機化合物を結合させてなる請求項１０〜１３の何れか記載の試薬。
【請求項１５】
前記アルキルアルコキシシランが有する官能基が、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、メルカプト基及びグリシジルオキシ基からなる群から選ばれる少なくとも１種の官能基である請求項１４記載の試薬。
【請求項１６】
前記測定対象物質と特異的に結合する物質が、測定対象物質又は測定対象物質の類似物質に対する抗体、測定対象物質又は測定対象物質の類似物質が結合する抗原、或いは、測定対象物質又は測定対象物質の類似物質に結合するタンパク質である請求項１０〜１５の何れか記載の試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、磁性シリカ粒子を用いた測定対象物質測定方法及び該方法に用いられる試薬に関する。更に詳しくは、診断の補助、治療効果確認の補助、タンパク質精製時及び細胞分離時の精製度の確認等に用いる測定方法及び試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、生体物質を含有する試料、例えば生体サンプル中のタンパク質等を測定又は精製する方法としてタンパク質が結合し得る粒子表面に生体サンプル中のタンパク質等を結合させ、生体サンプル中の目的タンパク質等以外の不純物を除くために、粒子を洗浄しタンパク質等が結合した粒子を回収して、タンパク質の結合量を測定する方法やタンパク質解離溶液中に解離させて精製する方法が知られている。【０００３】
また、磁力によって容易に分離、回収が可能であることから、磁性を有する粒子が用いられており、例えば特許文献１には、酸化鉄からなる芯粒子の表面にシリカの被膜が形成されてなる磁性シリカ粒子が記載されている。しかし、この磁性粒子は、磁性体が強磁性であり、回収時の磁場を取り除いても強磁性により磁性体自身が一時的な磁場を示し粒子同士が自己会合し、洗浄性が悪い及び／又は次の操作（例えば、免疫反応）に悪影響を及ぼすという問題がある。【０００４】
更に、強磁性による磁性体自身の自己会合を解決する目的で、例えば、特許文献２には、磁性体に超常磁性である磁性体を用いた磁性シリカ粒子が開示されている。しかし、この磁性粒子は、粒子径が小さい場合は、磁性体の含有量が低く、磁力で粒子を回収する際に時間がかかり、粒子径が大きい場合は、比表面積が小さいために、結合するタンパク質等の量が少ないという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０００−２５６３８８号公報
【特許文献２】特開２０００−４０６０８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、測定対象物質、測定対象物質の類似物質、又は、測定対象物質と特異的に結合する物質を担持させる際の結合性に優れ、且つ、磁力による回収性及び磁力を除去した状態での分散性に優れ、短時間の洗浄工程でも免疫測定において優れた感度を出し得る磁性シリカ粒子を用いた測定対象物質測定方法、及び、該測定法用試薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意検討した結果、本発明に到達した。即ち本発明は、平均粒子径が１〜１５ｎｍの超常磁性金属酸化物を６０〜９５重量％含有するシリカ粒子の表面に、測定対象物質、測定対象物質の類似物質、又は、測定対象物質と特異的に結合する物質が固定化された磁性シリカ粒子を用いて試料中の測定対象物質を測定することを特徴とする測定対象物質測定方法、及び、平均粒子径が１〜１５ｎｍの超常磁性金属酸化物を６０〜９５重量％含有するシリカ粒子の表面に、測定対象物質、測定対象物質の類似物質、又は、測定対象物質と特異的に結合する物質が固定化された磁性シリカ粒子を含有することを特徴とする上記測定方法用の試薬である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の測定方法及び試薬においては、磁性シリカ粒子を磁気を用いて回収することにより簡便なＢ／Ｆ分離を可能とする。また、磁性シリカ粒子が超常磁性金属酸化物を含むものであるため、その磁気特性により集磁後の粒子の再分散性に優れ、その結果、短時間に高感度で測定対象物質を測定（検出）することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明における測定対象物質としては、通常この分野で測定されるものであれば特に限定はされず、例えば血清，血液，血漿，尿等の生体体液、リンパ液、血球、各種細胞類等の生体由来の試料中に含まれるタンパク質、脂質タンパク質、核酸、免疫グロブリン、血液凝固関連因子、抗体、酵素、ホルモン、癌マーカー、心疾患マーカー及び各種薬物等が代表的なものとして挙げられる。更に具体的には、例えばアルブミン，ヘモグロビン，ミオグロビン，トランスフェリン，プロテインＡ，Ｃ反応性蛋白質（ＣＲＰ）等のタンパク質、例えば高比重リポ蛋白質（ＨＤＬ），低比重リポ蛋白質（ＬＤＬ），超低比重リポ蛋白質等の脂質蛋白質、例えばデオキシリボ核酸（ＤＮＡ），リボ核酸（ＲＮＡ）等の核酸、例えばアルカリ性ホスファターゼ，アミラーゼ，酸性ホスファターゼ，γ−グルタミルトランスフェラーゼ（γ−ＧＴＰ），リパーゼ，クレアチンキナーゼ（ＣＫ），乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ），グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ），グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ），レニン，プロテインキナーゼ（ＰＫ），チロシンキナーゼ等の酵素、例えばＩｇＧ，ＩｇＭ，ＩｇＡ，ＩｇＤ，ＩｇＥ等の免疫グロブリン（或いはこれらの、例えばＦｃ部，Ｆａｂ部，Ｆ（ａｂ）２部等の断片）、例えばフィブリノーゲン，フィブリン分解産物（ＦＤＰ），プロトロンビン，トロンビン等の血液凝固関連因子、例えば抗ストレプトリジンＯ抗体，抗ヒトＢ型肝炎ウイルス表面抗原抗体（ＨＢｓ抗原），抗ヒトＣ型肝炎ウイルス抗体，抗リュウマチ因子等の抗体、例えば甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ），甲状腺ホルモン（ＦＴ３，ＦＴ４，Ｔ３，Ｔ４），副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ），ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）エストラジオール（Ｅ２）等のホルモン、例えばα−フェトプロテイン（ＡＦＰ），癌胎児性抗原（ＣＥＡ），ＣＡ１９−９，前立腺特異抗原（ＰＳＡ）等の癌マーカー、例えばトロポニンＴ（ＴｎＴ），ヒト脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体Ｎ端フラグメント（ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ）等の心疾患マーカー、例えば抗てんかん薬，抗生物質，テオフィリン等の薬物等が挙げられる。上記したものの中でも、抗体、ホルモン、癌マーカー、心疾患マーカー等が好ましい。
【００１０】
本発明における測定対象物質の類似物質（アナログ）は、測定対象物質と特異的に結合する物質（測定対象物質結合物質）が有する測定対象物質との結合部位と結合し得るもの、言い換えれば、測定対象物質が有する測定対象物質結合物質との結合部位を有するもの、更に言い換えれば、測定対象物質と測定対象物質結合物質との反応時に共存させると該反応と競合し得るものであれば何れでもよい。
【００１１】
本発明における測定対象物質と特異的に結合する物質（測定対象物質結合物質）としては、例えば「抗原」−「抗体」間反応、「糖鎖」−「タンパク質」間反応、「糖鎖」−「レクチン」間反応、「酵素」−「インヒビター」間反応、「タンパク質」−「ペプチド鎖」間反応、「染色体又はヌクレオチド鎖」−「ヌクレオチド鎖」間反応、又は、「ヌクレオチド鎖」−「タンパク質」間反応等の相互反応によって測定対象物質又はその類似物質と結合するもの等が挙げられ、上記各組合せに於いて何れか一方が測定対象物質又はその類似物質である場合、他の一方がこの測定対象物質結合物質である。例えば、測定対象物質又はその類似物質が「抗原」であるときは測定対象物質結合物質は「抗体」であり、測定対象物質又はその類似物質が「抗体」であるときは測定対象物質結合物質は「抗原」である（以下、その他の上記各組合せにおいても同様である）。
【００１２】
具体的には、例えばヌクレオチド鎖（オリゴヌクレオチド鎖、ポリヌクレオチド鎖）；染色体；ペプチド鎖（例えばＣ−ペプチド、アンジオテンシンＩ等）；タンパク質〔例えばプロカルシトニン、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）、免疫グロブリンＤ（ＩｇＤ）、β２−ミクログロブリン、アルブミン、これらの分解産物、フェリチン等の血清タンパク質〕；酵素〔例えばアミラーゼ（例えば膵型，唾液腺型，Ｘ型等）、アルカリホスファターゼ（例えば肝性，骨性，胎盤性，小腸性等）、酸性ホスファターゼ（例えばＰＡＰ等）、γ−グルタミルトランスファラーゼ（例えば腎性，膵性，肝性等）、リパーゼ（例えば膵型，胃型等）、クレアチンキナーゼ（例えばＣＫ−１，ＣＫ−２，ｍＣＫ等）、乳酸脱水素酵素（例えばＬＤＨ１〜ＬＤＨ５等）、グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（例えばＡＳＴｍ，ＡＳＴｓ等）、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（例えばＡＬＴｍ，ＡＬＴｓ等）、コリンエステラーゼ（例えばＣｈＥ１〜ＣｈＥ５等）、ロイシンアミノペプチダーゼ（例えばＣ−ＬＡＰ，ＡＡ，ＣＡＰ等）、レニン、プロテインキナーゼ、チロシンキナーゼ等〕及びこれら酵素のインヒビター，ホルモン（例えばＰＴＨ，ＴＳＨ，インシュリン，ＬＨ，ＦＳＨ，プロラクチン等）、レセプター（例えばエストロゲン，ＴＳＨ等に対するレセプター）；リガンド（例えばエストロゲン，ＴＳＨ等）；例えば細菌（例えば結核菌，肺炎球菌，ジフテリア菌，髄膜炎菌，淋菌，ブドウ球菌，レンサ球菌，腸内細菌，大腸菌，ヘリコバクター・ピロリ等）、ウイルス（例えばルベラウイルス，ヘルペスウイルス，肝炎ウイルス，ＡＴＬウイルス，ＡＩＤＳウイルス，インフルエンザウイルス，アデノウイルス，エンテロウイルス，ポリオウイルス，ＥＢウイルス，ＨＡＶ，ＨＢＶ，ＨＣＶ，ＨＩＶ，ＨＴＬＶ等）、真菌（例えばカンジダ，クリプトコッカス等）、スピロヘータ（例えばレプトスピラ，梅毒トレポネーマ等）、クラミジア、マイコプラズマ等の微生物；当該微生物に由来するタンパク質又はペプチド或いは糖鎖抗原；気管支喘息，アレルギー性鼻炎，アトピー性皮膚炎等のアレルギーの原因となる各種アレルゲン（例えばハウスダスト、例えばコナヒョウダニ，ヤケヒョウダニ等のダニ類、例えばスギ、ヒノキ、スズメノヒエ，ブタクサ，オオアワガエリ，ハルガヤ，ライムギ等の花粉、例えばネコ，イヌ，カニ等の動物、例えば米，卵白等の食物、真菌、昆虫、木材、薬剤、化学物質等に由来するアレルゲン等）；脂質（例えばリポタンパク質等）；プロテアーゼ（例えばトリプシン，プラスミン，セリンプロテアーゼ等）；腫瘍マーカータンパク抗原（例えばＰＳＡ，ＰＧＩ，ＰＧＩＩ等）；糖鎖抗原〔例えばＡＦＰ（例えばＬ１からＬ３等）、ｈＣＧ（ｈＣＧファミリー）、トランスフェリン、ＩｇＧ、サイログロブリン、Ｄｅｃａｙ−ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ−ｆａｃｔｏｒ（ＤＡＦ）、癌胎児性抗原（例えばＣＥＡ，ＮＣＡ，ＮＣＡ−２，ＮＦＡ等）、ＣＡ１９−９、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ、ＣＡ１２５、前立腺特異抗原、癌細胞が産生する特殊な糖鎖を有する腫瘍マーカー糖鎖抗原、ＡＢＯ糖��抗原等〕；糖鎖（例えばヒアルロン酸、β−グルカン、上記糖鎖抗原等が有する糖鎖等）；糖鎖に結合するタンパク質（例えばヒアルロン酸結合タンパク、βグルカン結合タンパク等）；リン脂質（例えばカルジオリピン等）；リポ多糖（例えばエンドトキシン等）；化学物質（例えばＴ３，Ｔ４，例えばトリブチルスズ，ノニルフェノール，４−オクチルフェノール，フタル酸ジ−ｎ−ブチル，フタル酸ジシクロヘキシル，ベンゾフェノン，オクタクロロスチレン，フタル酸ジ−２−エチルヘキシル等の環境ホルモン）；人体に投与・接種される各種薬剤及びこれらの代謝物；アプタマー；核酸結合性物質；およびこれらに対する抗体等が挙げられる。尚、本発明に於いて用いられる抗体には、パパインやペプシン等の蛋白質分解酵素、或いは化学的分解により生じるＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント等の分解産物も包含される。
【００１３】
上記の如き測定対象物質結合物質としては、「抗原」−「抗体」間反応或いは「糖鎖−タンパク質」間反応によって測定対象物質又はその類似物質と結合するものが好ましい。具体的には、測定対象物質又はその類似物質に対する抗体、測定対象物質又はその類似物質が結合する抗原、或いは、測定対象物質又はその類似物質に結合するタンパク質が好ましく、測定対象物質又はその類似物質に対する抗体、或いは測定対象物質又はその類似物質に結合するタンパク質が更に好ましい。
【００１４】
本発明における磁性シリカ粒子は、シリカのマトリックス中に平均粒子径が１〜１５ｎｍで超常磁性を有する金属酸化物を分散させたものである。
【００１５】
本発明における超常磁性金属酸化物の平均粒子径は、任意の２００個の超常磁性金属酸化物について走査型電子顕微鏡で観察して測定された粒子径の平均値である。
超常磁性金属酸化物の平均粒子径は、後述の超常磁性金属酸化物作製時の金属イオン濃度を調節することにより制御することができる。また、通常の分級等の方法によっても超常磁性金属酸化物の平均粒子径を所望の値にすることができる。
【００１６】
超常磁性とは、外部磁場の存在下で物質の個々の原子磁気モーメントが整列し誘発された一時的な磁場を示し、外部磁場を取り除くと、部分的な整列が損なわれ磁場を示さなくなることをいう。
【００１７】
平均粒子径が１〜１５ｎｍで超常磁性を示す超常磁性金属酸化物としては、鉄、コバルト、ニッケル及びこれらの合金等の酸化物が挙げられるが、磁界に対する感応性が優れていることから、酸化鉄が特に好ましい。超常磁性金属酸化物は、１種を単独で用いても２種以上を併用してもよい。
【００１８】
平均粒子径が１ｎｍ未満の場合は合成が困難であり、平均粒子径が１５ｎｍを超える場合は得られた磁性シリカ粒子の磁気特性が強磁性となり、実際の用途面において磁場を取り除いても磁性体自身が一時的な磁場を示し粒子同士が自己会合し、洗浄性が悪い及び／又は免疫反応等に悪影響を及ぼすという問題がある。
【００１９】
酸化鉄としては、公知の種々の酸化鉄を用いることができる。酸化鉄の内、特に化学的な安定性に優れることから、マグネタイト、γ−ヘマタイト、マグネタイト−α−ヘマタイト中間酸化鉄及びγ−ヘマタイト−α−ヘマタイト中間酸化鉄が好ましく、大きな飽和磁化を有し、外部磁場に対する感応性が優れていることから、マグネタイトが更に好ましい。
【００２０】
磁性シリカ粒子中の超常磁性金属酸化物の含有量の下限は、通常６０重量％、好ましくは６５重量％であり、上限は通常９５重量％、好ましくは８０重量％である。超常磁性金属酸化物の含有量が６０重量％未満の場合、得られた磁性シリカ粒子の磁性が十分でないため、実際の用途面における分離操作に時間がかかり、９５重量％を超えるものは合成が困難である。
【００２１】
超常磁性金属酸化物の製造方法は、特に限定されないが、Ｍａｓｓａｒｔにより報告されたものをベースとして水溶性鉄塩及びアンモニアを用いる共沈殿法（Ｒ．Ｍａｓｓａｒｔ，ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓ．Ｍａｇｎ．１９８１，１７，１２４７）、又は、水溶性鉄塩の水溶液中の酸化反応を用いた方法により合成することができる。
【００２２】
磁性シリカ粒子の平均粒子径は、好ましくは１〜５μｍ、更に好ましくは１〜３μｍである。平均粒子径が１μｍ未満の場合、分離回収の際に時間がかかる傾向にあり、５μｍを超えると、表面積が小さくなり、担持する物質（対象物質、測定対象物質の類似物質又は測定対象物質と特異的に結合する物質）の結合量が低く結合効率が低下する傾向にある。
【００２３】
本発明における磁性シリカ粒子の平均粒子径は、任意の２００個の磁性シリカ粒子について走査型電子顕微鏡（日本電子株式会社製「ＪＳＭ−７０００Ｆ」）で観察して測定された粒子径の平均値である。
磁性シリカ粒子の平均粒子径は、後述の水中油型エマルションを作製する際の混合条件（せん断力等）を調節して水中油型エマルションの粒子径を調整することにより制御することができる。また、磁性シリカ粒子製造時の水洗工程の条件変更又は通常の分級等の方法によっても平均粒子径を所望の値とすることができる。
【００２４】
本発明における磁性シリカ粒子の製造方法としては、例えば平均粒子径が１〜１５ｎｍの超常磁性金属酸化物粒子、前記超常磁性金属酸化物粒子１００重量％に対して３０〜５００重量％の（アルキル）アルコキシシラン及び分散剤を含有する分散液（Ａ１）、又は更に非水溶性有機溶媒を含有する分散液（Ａ２）と、水、水溶性有機溶媒、非イオン性界面活性剤及び（アルキル）アルコキシシランの加水分解用触媒を含有する溶液（Ｂ）とを混合して、水中油型エマルションを作製し、（アルキル）アルコキシシランの加水分解反応及び縮合反応を行い、超常磁性金属酸化物がシリカに包含された粒子を製造する方法が挙げられる。
（アルキル）アルコキシシランの加水分解反応及び縮合反応後、遠心分離及び磁石により固液分離し、水又はメタノールで洗浄して乾燥することにより磁性シリカ粒子が得られる。
上記及び以下において、（アルキル）アルコキシシランとは、アルキルアルコキシシラン又はアルコキシシランを意味する。
【００２５】
上記分散剤としては、分子内に１個以上のカルボキシル基を有する有機化合物、１個以上のスルホ基を有する有機化合物及び１個以上のカルボキシル基と１個以上のスルホ基を有する有機化合物等が挙げられる。具体的には、以下に例示する（ａ−１）〜（ａ−５）の有機化合物等が挙げられ、これらは１種を単独で用いても２種以上を併用してもよい。
【００２６】
（ａ−１）カルボキシル基を２個以上有する有機化合物：
炭素数２〜３０の脂肪族ポリカルボン酸（シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、プロパン−１，２，３−トリカルボン酸、クエン酸及びドデカン二酸等の飽和ポリカルボン酸並びにマレイン酸、フマール酸及びイタコン酸等の不飽和ポリカルボン酸等）、炭素数８〜３０の芳香族ポリカルボン酸（フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、トリメリット酸及びピロメリット酸等）及び炭素数５〜３０の脂環式ポリカルボン酸（シクロブテン−１，２−ジカルボン酸、シクロペンテン−１，２−ジカルボン酸、フラン−２，３−ジカルボン酸、ビシクロ［２，２，１］ヘプタ−２−エン−２，３−ジカルボン酸及びビシクロ［２，２，１］ヘプタ−２，５−ジエン−２，３−ジカルボン酸等）等。
【００２７】
（ａ−２）スルホ基を２個以上有する有機化合物：
炭素数１〜３０の脂肪族ポリスルホン酸（メチオン酸、１，１−エタンジスルホン酸、１，２−エタンジスルホン酸、１，１−プロパンジスルホン酸、１，３−プロパンジスルホン酸及びポリビニルスルホン酸等）、炭素数６〜３０の芳香族ポリスルホン酸（ｍ−ベンゼンジスルホン酸、１，４−ナフタレンスルホン酸、１，５−ナフタレンジスルホン酸、１，６−ナフタレンジスルホン酸、２，６−ナフタレンジスルホン酸、２，７−ナフタレンジスルホン酸及びスルホン化ポリスチレン等）、ビス（フルオロスルホニル）イミド及び炭素数２〜１０のビス（パーフルオロアルカンスルホニル）イミド［ビス（トリフルオロメタンスルホニル）イミド、ビス（ペンタフルオロエタンスルホニル）イミド、ビス（ノナフルオロブタンスルホニル）イミド、ペンタフルオロエタンスルホニルトリフルオロメタンスルホニルイミド、トリフルオロメタンスルホニルヘプタフルオロプロパンスルホニルイミド、ノナフルオロブタンスルホニルトリフルオロメタンスルホニルイミド等］等。
【００２８】
（ａ−３）カルボキシル基とスルホ基をそれぞれ１個以上有する有機化合物：
炭素数２〜３０のスルホカルボン酸（スルホ酢酸及びスルホコハク酸等）及び炭素数７〜３０のスルホ芳香族モノ又はポリカルボン酸（ｏ−、ｍ−又はｐ−スルホ安息香酸、２，４−ジスルホ安息香酸、３−スルホフタル酸、３，５−ジスルホフタル酸、４−スルホイソフタル酸、２−スルホテレフタル酸、２−メチル−４−スルホ安息香酸、２−メチル−３，５−ジスルホ安息香酸、４−プロピル−３−スルホ安息香酸、４−イソプロピル−３−スルホ安息香酸、２，４，６−トリメチル−３−スルホ安息香酸、２−メチル−５−スルホテレフタル酸、５−メチル−４−スルホイソフタル酸、５−スルホサリチル酸及び３−オキシ−４−スルホ安息香酸等）等。
【００２９】
（ａ−４）カルボキシル基を１個有する有機化合物：
炭素数１〜３０の脂肪族飽和モノカルボン酸（ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ベラルゴン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸及びベヘニン酸等）、炭素数３〜３０の脂肪族不飽和モノカルボン酸（アクリル酸、メタクリル酸、オレイン酸等）、炭素数３〜３０のヒドロキシ脂肪族モノカルボン酸（グリコール酸、乳酸及び酒石酸等）、炭素数４〜３０の脂環式モノカルボン酸（シクロプロパンカルボン酸、シクロペンタンカルボン酸及びシクロヘキサンカルボン酸等）、炭素数７〜３０の芳香族モノカルボン酸（安息香酸、ケイ皮酸及びナフトエ酸等）、炭素数７〜２０のヒドロキシ芳香族モノカルボン酸（サリチル酸及びマンデル酸等）及び炭素数２〜２０のパーフルオロカルボン酸（トリフルオロ酢酸、ウンデカフルオロヘキサン酸、トリデカフルオロヘプタン酸、パーフルオロオクタン酸、ペンタデカフルオロオクタン酸、ペプタデカフルオロノナン酸及びノナデカフルオロデカン酸等）等。
【００３０】
（ａ−５）スルホ基を１個有する有機化合物：
炭素数１〜３０の脂肪族モノスルホン酸（メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、プロパンスルホン酸、ブタンスルホン酸、ヘキサンスルホン酸、デカンスルホン酸、ウンデカンスルホン酸及びドデカンスルホン酸等）、炭素数６〜３０の芳香族モノスルホン酸（ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ｏ−トルエンスルホン酸、ｍ−トルエンスルホン酸、４−ドデシルベンゼンスルホン酸、４−オクチルベンゼンスルホン酸及びナフタレンスルホン酸等）及び炭素数１〜２０のパーフルオロアルカンスルホン酸（トリフルオロメタンスルホン酸等）等。
【００３１】
これらの内、（アルキル）アルコキシシランとの相溶性の観点から（ａ−４）の内の炭素数１０〜３０の有機化合物が好ましい。
【００３２】
分散剤の使用量は、超常磁性金属酸化物の重量を基準として、１００〜２，０００重量％、特に２５０〜１，０００重量％であることが好ましい。分散剤が１００重量％未満の場合、超常磁性金属酸化物が（アルキル）アルコキシシラン溶液に分散しにくい傾向にあり、２，０００重量％を超えると後の工程の水溶液への分散の際にエマルションが形成しにくい傾向にある。
【００３３】
使用する（アルキル）アルコキシシランとしては、下記一般式（１）で表される化合物が挙げられる。
Ｒ１（４−ｎ）Ｓｉ（ＯＲ２）ｎ            （１）
一般式（１）中、Ｒ１及びＲ２は、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、メルカプト基又はグリシジルオキシ基で置換されていてもよい炭素数１〜１０の１価の炭化水素基を表す。
【００３４】
炭素数１〜１０の炭化水素基としては、炭素数１〜１０の脂肪族炭化水素基（メチル基、エチル基、ｎ−又はｉｓｏ−プロピル基、ｎ−又はｉｓｏ−ブチル基、ｎ−又はｉｓｏ−ペンチル基及びビニル基等）、炭素数６〜１０の芳香族炭化水素基（フェニル基等）及び炭素数７〜１０の芳香脂肪族基（ベンジル基等）等が挙げられる。
【００３５】
一般式（１）におけるｎは１〜４の整数を表す。但し、ｎが１のアルキルアルコキシシランを用いる場合は、ｎが２〜４の（アルキル）アルコキシシランと併用する必要がある。反応後の粒子の強度及び粒子表面のシラノール基の量の観点からｎは４であることが好ましい。
【００３６】
一般式（１）で表される化合物の具体例としては、テトラメトキシシラン、テトラエトキシシラン、テトライソプロポキシシラン及びテトラブトキシシラン等のアルコキシシラン；メチルトリメトキシシラン及びメチルトリエトキシシラン等のアルキルアルコキシシラン；３−アミノプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、Ｎ−２（アミノエチル）３−アミノプロピルトリメトキシシラン及びＮ−２（アミノエチル）３−アミノプロピルトリエトキシシラン等のアミノ基で置換されたアルキル基を有するアルキルアルコキシシラン；７−カルボキシ−ヘプチルトリエトキシシラン及び５−カルボキシ−ペンチルトリエトキシシラン等のカルボキシル基で置換されたアルキル基を有するアルキルアルコキシシラン；３−ヒドロキシプロピルトリメトキシシラン及び３−ヒドロキシプロピルトリエトキシシラン等の水酸基で置換されたアルキル基を有するアルキルアルコキシシラン；３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン及び３−メルカプトプロピルトリエトキシシラン等のメルカプト基で置換されたアルキル基を有するアルキルアルコキシシラン；３−グリシジルオキシプロピルトリメトキシシラン及び３−グリシジルオキシプロピルトリエトキシシラン等のグリシジルオキシ基で置換されたアルキル基を有するアルキルアルコキシシラン等が挙げられる。
（アルキル）アルコキシシランは、１種類を単独で用いても２種以上を併用してもよい。
【００３７】
（アルキル）アルコキシシランの使用量は、超常磁性金属酸化物１００重量％に対して、通常３０〜５００重量％、好ましくは４０〜２００重量％である。（アルキル）アルコキシシランが３０重量％未満の場合、超常磁性金属酸化物の表面が均一に被覆されにくくなり、５００重量％を超えると、超常磁性金属酸化物の含有率が小さくなり、磁力による回収時間が長くなる。
【００３８】
水の使用量は、超常磁性金属酸化物１００重量％に対して５００〜３，０００重量％であることが好ましく、特に８００〜２，０００重量％が好ましい。
【００３９】
非水溶性有機溶媒としては、２５℃における水への溶解度が０．１ｇ／水１００ｇ以下である、炭素数６〜１６の芳香族炭化水素溶剤（トルエン及びキシレン等）及び炭素数５〜１６脂肪族炭化水素溶剤（ｎ−ヘプタン、ｎ−ヘキサン、シクロヘキサン、ｎ−オクタン、デカン及びデカヒドロナフタレン等）等が挙げられる。これらは、１種類を単独で用いても２種以上を併用してもよい。
【００４０】
非水溶性有機溶媒の使用量は、超常磁性金属酸化物１００重量％に対して、２００〜１，０００重量％、特に２５０〜５００重量％が好ましい。有機溶媒の使用量が２００重量％未満であると超常磁性金属酸化物の分散性が悪くなる傾向にあり、１，０００重量％を超えると、磁性シリカ粒子の粒子径が不均一になる傾向にある。
【００４１】
水溶性有機溶媒としては、２５℃における水への溶解度が１００ｇ／水１００ｇ以上である、炭素数１〜３のアルコール（メタノール、エタノール及びｎ−又はｉｓｏ−プロパノール等）、炭素数２〜９のグリコール（エチレングリコール及びジエチレングリコール等）、アミド（Ｎ−メチルピロリドン等）、ケトン（アセトン等）、環状エーテル（テトラヒドロフラン及びテトラヒドロピラン等）、ラクトン（γ−ブチロラクトン等）、スルホキシド（ジメチルスルホキシド等）及びニトリル（アセトニトリル等）等が挙げられる。
これらの内、磁性シリカ粒子の粒子径の均一性の観点から、炭素数１〜４のアルコールが好ましい。
水溶性有機溶媒は、１種類を単独で用いても２種以上を併用してもよい。
【００４２】
水溶性有機溶媒の使用量は、水１００重量％に対して、１００〜５００重量％であることが好ましい。
【００４３】
非イオン性界面活性剤としては、高級アルコールアルキレンオキサイド（以下、ＡＯと略記）付加物；炭素数８〜２４の高級アルコール（デシルアルコール、ドデシルアルコール、ヤシ油アルキルアルコール、オクタデシルアルコール及びオレイルアルコール等）のエチレンオキサイド（以下、ＥＯと略記）１〜２０モル及び／又はプロピレンオキサイド（以下、ＰＯと略記）１〜２０モル付加物（ブロック付加物及び／又はランダム付加物を含む。以下同様）、炭素数６〜２４のアルキルを有するアルキルフェノールのＡＯ付加物；オクチル又はノニルフェノールのＥＯ１〜２０モル及び／又はＰＯ１〜２０モル付加物、ポリプロピレングリコールＥＯ付加物及びポリエチレングリコールＰＯ付加物；プルロニック型界面活性剤等、脂肪酸ＡＯ付加物；炭素数８〜２４の脂肪酸（デカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸及びヤシ油脂肪酸等）のＥＯ１〜２０モル及び／又はＰＯ１〜２０モル付加物等及び多価アルコール型非イオン性界面活性剤；炭素数３〜３６の２〜８価の多価アルコール（グリセリン、トリメチロールプロパン、ペンタエリスリトール、ソルビット及びソルビタン等）のＥＯ及び／又はＰＯ付加物；前記多価アルコールの脂肪酸エステル及びそのＥＯ付加物［ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０及びＴＷＥＥＮ（登録商標）８０等］；アルキルグルコシド（Ｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−ドデカノイルスクロース及びｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド等）；砂糖の脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド及びこれらのＡＯ付加物（ポリオキシエチレン脂肪酸アルカノールアミド等）；等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。これらは、１種類を単独で用いても２種以上を併用してもよい。
【００４４】
非イオン性界面活性剤の使用量は、超常磁性金属酸化物１００重量％に対して、１００〜１，０００重量％、特に３００〜５００重量％が好ましい。１００重量％未満又は１，０００重量％を超えると、エマルションが安定せず、生成する粒子の粒度分布が広くなる傾向がある。
【００４５】
非イオン性界面活性剤を含む水溶液の使用量は、超常磁性金属酸化物１００重量％に対して、１，０００〜１０，０００重量％、特に１，５００〜４，０００重量％が好ましい。１，０００重量％未満又は１０，０００重量％を超えると、エマルションが安定せず、生成する粒子の粒度分布が広くなる傾向がある。
【００４６】
（アルキル）アルコキシシランの加水分解用触媒としては、ルイス酸や塩酸等を用いることができ、具体的には、塩酸等の無機酸、酢酸等の有機酸、アンモニア等の無機塩基化合物、エタノールアミン等のアミン化合物を用いることができる。
加水分解用触媒の使用量は、（アルキル）アルコキシシランの重量に対して、０．０１〜１００重量％、特に０．２〜５０重量％が好ましい。
【００４７】
分散液（Ａ１）又は分散液（Ａ２）と、溶液（Ｂ）との混合方法は、特に限定されず、後述の設備を使用して一括混合することもできるが、磁性シリカ粒子の粒子径の均一性の観点から、溶液（Ｂ）を撹拌しながら分散液（Ａ１）又は分散液（Ａ２）を滴下する方法が好ましい。
【００４８】
分散液（Ａ１）又は分散液（Ａ２）と溶液（Ｂ）とを混合する際の設備としては、一般に乳化機、分散機として市販されているものであれば特に限定されず、例えば、ホモジナイザー（ＩＫＡ社製）、ポリトロン（キネマティカ社製）及びＴＫオートホモミキサー（特殊機化工業社製）等のバッチ式乳化機、エバラマイルダー（荏原製作所社製）、ＴＫフィルミックス、ＴＫパイプラインホモミキサー（特殊機化工業社製）、コロイドミル（神鋼パンテック社製）、クリアミックス（エムテクニック社製）、スラッシャー、トリゴナル湿式微粉砕機（三井三池化工機社製）、キャピトロン（ユーロテック社製）及びファインフローミル（太平洋機工社製）等の連続式乳化機、マイクロフルイダイザー（みずほ工業社製）、ナノマイザー（ナノマイザー社製）及びＡＰＶガウリン（ガウリン社製）等の高圧乳化機、膜乳化機（冷化工業社製）等の膜乳化機、バイブロミキサー（冷化工業社製）等の振動式乳化機、超音波ホモジナイザー（ブランソン社製）等の超音波乳化機等が挙げられ、粒子径の均一化の観点から、ＡＰＶガウリン、ホモジナイザー、ＴＫオートホモミキサー、エバラマイルダー、ＴＫフィルミックス、ＴＫパイプラインホモミキサー及びクリアミックスが好ましい。
【００４９】
（アルキル）アルコキシシランの加水分解反応及び縮合反応の温度は、２５〜１００℃であることが好ましく、更に好ましくは４５〜６０℃である。また、反応時間は、好ましくは０．５〜５時間、更に好ましくは１〜２時間である。
【００５０】
本発明における磁性シリカ粒子は、超常磁性金属酸化物がシリカに包含され、粒子表面に存在しないことから、多くの測定対象物質、測定対象物質の類似物質、又は測定対象物質と特異的に結合する物質をその表面に固定化することができる。
【００５１】
本発明における磁性シリカ粒子に、測定対象物質、測定対象物質の類似物質、又は、測定対象物質と特異的に結合する物質（以下、これらを総称して担持用物質と略記する場合がある）を固定化する方法としては、上述の磁性シリカ粒子に担持用物質を物理吸着させる方法が挙げられるが、より効率良く担持用物質を固定化させる観点から、グルタルアルデヒド、アルブミン、カルボジイミド、ストレプトアビジン、ビオチン及び官能基を有するアルキルアルコキシシランからなる群から選ばれる少なくとも１種の有機化合物を磁性シリカ粒子表面に結合させ、それらを介して担持用物質を磁性シリカ粒子に固定化させるのが好ましい。これらの有機化合物の内、特定の担持用物質を結合させる観点から、官能基を有するアルキルアルコキシシランが更に好ましい。
【００５２】
上記アルキルアルコキシシランが有する官能基としては、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、メルカプト基及びグリシジルオキシ基等が挙げられ、アルキルアルコキシシラン１分子中に異なる種類の官能基を有していてもよい。
【００５３】
磁性シリカ粒子の表面に官能基を有するアルキルアルコキシシランを結合させる方法としては、磁性シリカ粒子を作製する際の（アルキル）アルコキシシランとして、前述のアミノ基、カルボキシル基、水酸基、メルカプト基又はグリシジルオキシ基で置換されたアルキル基を有するアルキルアルコキシシランを使用する方法、又は、これらの置換基を有しない（アルキル）アルコキシシランを使用して磁性シリカ粒子を作製した後、磁性シリカ粒子をアミノ基、カルボキシル基、水酸基、メルカプト基又はグリシジルオキシ基で置換されたアルキル基を有するアルキルアルコキシシランで処理する方法等が挙げられる。
【００５４】
後者の方法の具体例としては、磁性シリカ粒子をその濃度が１〜５０重量％になるように溶媒に分散し、この分散液にアミノ基、カルボキシル基、水酸基、メルカプト基又はグリシジルオキシ基で置換されたアルキル基を有するアルキルアルコキシシランの溶液を添加して、１時間以上室温で加水分解反応及び縮合反応を行う方法が挙げられる。
【００５５】
この方法における溶媒は、用いるアルキルアルコキシシランの溶解性に応じて適宜選択され、水に可溶なアミノ基、カルボキシル基、水酸基又はメルカプト基で置換されたアルキル基を有するアルキルアルコキシシランを用いる場合は、水又は水−アルコールの混合溶媒等を用いることが好ましく、水に溶解しにくいグリシジルオキシ基で置換されたアルキル基を有するアルキルアルコキシシランを用いる場合、酢酸ブチル等を用いることが好ましい。
【００５６】
アミノ基、カルボキシル基、水酸基、メルカプト基又はグリシジルオキシ基で置換されたアルキル基を有するアルキルアルコキシシランの使用量は、処理前の磁性シリカ粒子に対して０．１〜５重量％であることが好ましい。０．１重量％未満であると、導入される官能基数が充分でない場合があり、５重量％を超えると、粒子表面の官能基量を更に増加させる効果が少なくなる傾向にある。
【００５７】
グルタルアルデヒド、アルブミン、カルボジイミド、ストレプトアビジン又はビオチンを磁性シリカ粒子の表面に結合させる方法は特に限定されないが、例えば、以下のようにして結合させることができる。
アルデヒド基を有するグルタルアルデヒド及びカルボキシル基を有するビオチンは、アミノ基を有するアルキルアルコキシシランが表面に結合した磁性シリカ粒子と反応させることで、磁性シリカ粒子の表面に結合させることができる。また、アミノ基を有するアルブミン及びストレプトアビジン並びにカルボジイミド基を有するカルボジイミドは、カルボキシル基を有するアルキルアルコキシシランが表面に結合した磁性シリカ粒子と反応させることで、磁性シリカ粒子の表面に結合させることができる。
【００５８】
本発明の測定対象物質測定方法は、上記本発明における磁性シリカ粒子を用いて行われる以外はこの分野で通常行われる、文献［例えば、酵素免疫測定法第２版（石川栄治ら編集、医学書院）１９８２年］記載のサンドイッチ法、競合法及び特開平６−１３００６３号公報記載の測定法に準じて行えばよい。
【００５９】
サンドイッチ法は、例えば、測定対象物質を含む試料と、測定対象物質と特異的に結合する物質（測定対象物質結合物質）を表面に固定化した磁性シリカ粒子と、標識物質により標識された測定対象物質結合物質（標識測定対象物質結合物質）とを接触させて、磁性シリカ粒子上に測定対象物質結合物質と測定対象物質と標識測定対象物質結合物質との複合体（標識複合体）を形成させ、該標識複合体を担持した磁性シリカ粒子をＢ／Ｆ分離して、標識複合体中の標識物質量を測定し、その結果に基づいて試料中の測定対象物質を測定することによりなされる。
【００６０】
具体的には例えば、測定対象物質を含む試料と測定対象物質結合物質を表面に固定化した磁性シリカ粒子とを接触させて、磁性シリカ粒子表面に測定対象物質結合物質と測定対象物質との複合体を形成させ、更に該複合体に、標識測定対象物質結合物質を接触させて、磁性シリカ粒子に担持された測定対象物質結合物質と測定対象物質と標識測定対象物質結合物質との複合体（標識複合体）を形成させ、該標識複合体を担持した磁性シリカ粒子をＢ／Ｆ分離して、標識複合体中の標識物質量を測定し、その結果に基づいて試料中の測定対象物質を測定すればよい。該方法に於いては、測定対象物質と測定対象物質結合物質が固定化された磁性シリカ粒子とを反応させた後、標識測定対象物質結合物質を反応させているが、標識測定対象物質結合物質と測定対象物質とを反応させた後に測定対象物質結合物質が固定化された磁性シリカ粒子とを反応させても、これら３つを同時に反応させても構わない。
【００６１】
上記サンドイッチ法におけるＢ／Ｆ分離とは、上記標識複合体と、標識複合体の形成に関与しなかった標識測定対象物質結合物質との分離を意味し、具体的には、磁性シリカ粒子に担持された測定対象物質結合物質、磁性シリカ粒子に担持された測定対象物質結合物質と測定対象物質との複合体、及び、上記の標識複合体と、他の成分（試料中の測定対象物質以外の成分、標識複合体の形成に関与しなかった標識測定対象物質結合物質等）との分離を意味する。
また、Ｂ／Ｆ分離工程は標識複合体の形成後には必須の工程であるが、磁性シリカ粒子表面に測定対象物質結合物質と測定対象物質との複合体を形成させた後においても実施することができる。
【００６２】
競合法の一態様としては、測定対象物質を含む試料、標識物質により標識された測定対象物質と特異的に結合する物質（標識測定対象物質結合物質）、及び、測定対象物質又は測定対象物質の類似物質をその表面に固定化している磁性シリカ粒子とを接触させて、磁性シリカ粒子上に測定対象物質又はその類似物質と標識測定対象物質結合物質との複合体（標識複合体）を形成させ、該標識複合体を担持した磁性シリカ粒子をＢ／Ｆ分離して、標識複合体中の標識物質量を測定し、その結果に基づいて試料中の測定対象物質を測定することによりなされる。
【００６３】
具体的には例えば、測定対象物質を含む試料と、標識測定対象物質結合物質と、測定対象物質又はその類似物質を担持した磁性シリカ粒子とを接触させて、標識測定対象物質結合物質に、試料中の測定対象物質と磁性シリカ粒子上の測定対象物質又はその類似物質と競合反応させて、磁性シリカ粒子上に測定対象物質又はその類似物質と標識測定対象物質結合物質との複合体（標識複合体）を形成させ、該標識複合体を担持した磁性シリカ粒子をＢ／Ｆ分離して、標識複合体中の標識物質量を測定し、その結果に基づいて試料中の測定対象物質を測定すればよい。該方法に於いては、測定対象物質、標識測定対象物質結合物質、及び測定対象物質又はその類似物質を担持した磁性シリカ粒子を同時に競合反応させているが、測定対象物質と測定対象物質又はその類似物質を担持した磁性シリカ粒子とを接触させた後に、標識測定対象物質結合物質を加えて競合反応させても、測定対象物質と標識測定対象物質結合物質を接触させた後に、測定対象物質又はその類似物質を担持した磁性シリカ粒子を加えて競合反応させてもよい。
【００６４】
上記競合法におけるＢ／Ｆ分離とは、上記標識複合体と、標識複合体の形成に関与しなかった他の成分（標識測定対象物質結合物質、及び、標識測定対象物質結合物質と測定対象物質の複合体）との分離を意味し、具体的には、測定対象物質又はその類似物質を担持した磁性シリカ粒子、及び、測定対象物質又はその類似物質を担持した磁性シリカ粒子と標識測定対象物質結合物質との複合体（標識複合体）と、他の成分（試料中の測定対象物質以外の成分、標識測定対象物質結合物質、測定対象物質の複合体等）との分離を意味する。
【００６５】
また、競合法の別の態様としては、測定対象物質を含む試料と、標識物質により標識された測定対象物質又はその類似物質（標識測定対象物質又はその類似物質）と、測定対象物質結合物質を担持した磁性シリカ粒子とを接触させて、磁性シリカ粒子上に測定対象物質結合物質と標識測定対象物質又はその類似物質との複合体（標識複合体）を形成させ、該標識複合体を担持した磁性シリカ粒子をＢ／Ｆ分離して、標識複合体中の標識物質量を測定し、その結果に基づいて試料中の測定対象物質を測定することによりなされる。
【００６６】
具体的には例えば、測定対象物質を含む試料と、標識測定対象物質又はその類似物質と、測定対象物質結合物質を担持させた磁性シリカ粒子とを接触させて、磁性シリカ粒子上の測定対象物質結合物質に、試料中の測定対象物質と標識測定対象物質又はその類似物質とを競合反応させて、磁性シリカ粒子上に測定対象物質結合物質と標識測定対象物質又はその類似物質との複合体（標識複合体）とを形成させ、該標識複合体を担持した磁性シリカ粒子をＢ／Ｆ分離して、標識複合体中の標識物質量を測定し、その結果に基づいて試料中の測定対象物質を測定すればよい。該競合法に於いては、測定対象物質、標識測定対象物質又はその類似物質、及び、測定対象物質結合物質を担持させた磁性シリカ粒子を同時に競合反応させているが、測定対象物質と測定対象物質結合物質を担持させた磁性シリカ粒子とを接触させた後に、標識測定対象物質又はその類似物質を加えて競合反応させても、標識測定対象物質又はその類似物質と測定対象物質結合物質を担持させた磁性シリカ粒子とを接触させた後に、測定対象物質を加えて競合反応させてもよい。
【００６７】
上記競合法におけるＢ／Ｆ分離とは、上記標識複合体と、標識複合体の形成に関与しなかった他の成分（標識測定対象物質又はその類似物質）との分離を意味し、具体的には、測定対象物質結合物質を担持させた磁性シリカ粒子、測定対象物質結合物質を担持させた磁性シリカ粒子と測定対象物質との複合体、及び、測定対象物質結合物質を担持させた磁性シリカ粒子と標識測定対象物質又はその類似物質との複合体と、他の成分（試料中の測定対象物質以外の成分、標識複合体の形成に関与しなかった標識測定対象物質又はその類似物質等）との分離を意味する。
【００６８】
また、測定対象物質が酵素の場合には、上記サンドイッチ法及び競合法以外の酵素活性方法を用いる方法、例えば、測定対象物質を含む試料と、測定対象物質結合物質（例えば、抗体等の酵素と結合し得る物質）を担持させた磁性シリカ粒子を表面に固定化した磁性シリカ粒子とを接触させて、磁性シリカ粒子上に酵素と測定対象物質結合物質との複合体を形成させ、複合体を担持した磁性シリカ粒子をＢ／Ｆ分離した後、酵素の種類に応じた基質、又は酵素の種類に応じた基質及び発色剤、要すれば更に共役酵素を添加し、その基質の変化又は発色剤の発色結果に基づいて試料中の酵素量を測定する方法により、測定してもよい。尚、基質、発色剤、共役酵素は、公知のものを用いればよく、例えば酵素がペルオキシダーゼの場合には、過酸化水素とルミノール発光試薬等を用いればよい。これらの使用量も通常この分野で用いられる範囲であればよい。上記方法におけるＢ／Ｆ分離とは、測定対象物質と測定対象物質結合物質を担持させた磁性シリカ粒子との複合体と、その他の成分（試料中の測定対象物質以外の成分等）との分離を意味する。
【００６９】
本発明の測定対象物質測定方法において、試料、磁性シリカ粒子、標識された測定対象物質結合物質、標識測定対象物質又はその類似物質等を接触させる方法としては、通常なされる撹拌、混合等の処理により、磁性シリカ粒子が分散されればよい。反応時間は、測定対象物質、用いられる測定対象物質結合物質、サンドイッチ法、競合法等の違いに応じて適宜設定されればよいが、通常１〜１０分、好ましくは１〜５分である。
【００７０】
本発明の測定対象物質測定方法におけるＢ／Ｆ分離は、例えば、磁性シリカ粒子の磁性を利用し、反応槽の外側等から磁石等により磁性シリカ粒子を集めて、反応液を排出し、洗浄液を加えた後、磁石を取り除き、磁性シリカ粒子を混合して分散させ、洗浄することによりなされる。上記操作を１〜３回繰り返してもよい。洗浄液としては、通常この分野で用いられるものであれば特に限定はされない。
【００７１】
測定対象物質結合物質、測定対象物質又はその類似物質等を標識するために用いられる標識物質としては、例えば酵素免疫測定法（ＥＩＡ）に於いて用いられるアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ルシフェラーゼ、チロシナーゼ、酸性ホスファターゼ等の酵素類、例えば放射免疫測定法（ＲＩＡ）に於いて用いられる99mＴｃ、131Ｉ、125Ｉ、14Ｃ、3Ｈ、32Ｐ等の放射性同位元素、例えば蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）に於いて用いられるフルオレセイン、ダンシル、フルオレスカミン、クマリン、ナフチルアミン或いはこれらの誘導体、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光性物質、例えばルシフェリン、イソルミノール、ルミノール、ビス（２，４，６−トリフロロフェニル）オキザレート等の発光性物質、例えばフェノール、ナフトール、アントラセン或いはこれらの誘導体等の紫外部に吸収を有する物質、例えば４−アミノ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル、３−アミノ−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル、２，６−ジ−ｔ−ブチル−α−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−オキソ−２，５−シクロヘキサジエン−１−イリデン）−ｐ−トリオキシル等のオキシル基を有する化合物に代表されるスピンラベル化剤としての性質を有する物質等が挙げられる。
これらの内、感度等の観点から、酵素、蛍光性物質が好ましく、更に好ましいのはアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ及びグルコースオキシダーゼであり、特に好ましいのはペルオキシダーゼである。
【００７２】
上記した如き標識物質を測定対象物質結合物質、測定対象物質又はその類似物質等に結合させるには、通常この分野で用いられる方法、例えば自体公知のＥＩＡ、ＲＩＡ或いはＦＩＡ等に於いて一般に行われている自体公知の標識方法［例えば、医化学実験講座、第８巻、山村雄一監修、第１版、中山書店、１９７１；図説  蛍光抗体、川生明著、第１版、（株）ソフトサイエンス社、１９８３；酵素免疫測定法、石川栄治、河合忠、室井潔編、第２版、医学書院、１９８２等に記載のグルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸法、マレイミド法又はピリジルジスルフィド法等］等を利用すればよい。
【００７３】
標識物質の使用量は、用いる標識物質の種類により異なるため一概には言えないが、例えばペルオキシダーゼを標識物質として使用する場合には、測定対象物質結合物質と標識物質とを、例えば通常１：１〜２０のモル比、好ましくは１：１〜１０のモル比、更に好ましくは１：１〜２のモル比となるように、例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等の通常この分野で用いられている緩衝液中に含有させて用いればよい。尚、当該緩衝液としては、通常この分野で用いられている、例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等が挙げられ、そのｐＨは、抗原抗体反応を抑制しない範囲であればよく、通常５〜９である。また、このような緩衝液中には、目的の抗原抗体反応を阻害しないものであれば、例えばアルブミン、グロブリン、水溶性ゼラチン、ポリエチレングリコール等の安定化剤、界面活性剤、糖類等を含有させておいてもよい。
【００７４】
標識物質又はその活性の測定方法としては、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）及び化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ及びＣＬＥＩＡ）が挙げられ、短時間での免疫測定における感度の観点から好ましいのはＥＩＡ、ＣＬＩＡ及びＣＬＥＩＡであり、更に好ましいのはＣＬＥＩＡである。
【００７５】
本願発明の測定方法は、例えばサンドイッチ法でＡＦＰを測定する場合、以下のようにして行えばよい。
【００７６】
即ち、例えばＡＦＰを含む試料１０〜２５μＬと例えば本発明における磁性シリカ粒子に抗ＡＦＰ抗体を担持させたものを０．１〜１ｍｇ／ｍＬ含むリン酸緩衝液等の緩衝液（磁性シリカ粒子を含有する試薬）４０〜５０μＬとを反応槽に添加し、該反応溶液を攪拌し、磁性シリカ粒子を分散させて、磁性シリカ粒子上に担持されている抗ＡＦＰ抗体とＡＦＰとを接触、反応させ、複合体を形成させる。次いで、例えば反応槽の外側から磁石等により磁性シリカ粒子を集め、反応液を排出し、生理食塩水等の洗浄液を添加する。その後、磁石を取り除き、該磁性シリカ粒子を分散させて洗浄する。この操作は、１〜３回繰り返してもよい。尚、この洗浄操作は、試料又は磁性シリカ粒子を含有する試薬を残したまま、西洋ワサビ由来等ペルオキシダーゼ（以下ＰＯＤと略記）標識された抗ＡＦＰ抗体（以下標識試薬と略記）を添加して反応させる場合には、この洗浄操作を省略しても構わない。その後、例えば標識試薬を加え、該反応溶液を攪拌し、磁性シリカ粒子を分散させて、ＰＯＤ標識された抗ＡＦＰ抗体と上記複合体とを反応結合させる。次いで、上記の洗浄と同様にして生理食塩水等の洗浄液を加えて分散させて洗浄を行う。最後に例えばルミノール及び過酸化水素を加え、化学発光計にて１秒間の化学発光積算量を測定し、該測定値を基に試料中のＡＦＰ量を算出する。尚、この場合には予め規定のＡＦＰ含有溶液を試料として上記と同様の操作により作られたＡＦＰ量と１秒間の化学発光積算量との関係を示す検量線等を用いることで容易に試料中のＡＦＰ量を算出し得る。
【００７７】
本発明の試薬は、上記本発明における磁性シリカ粒子を含んでなるものであり、上記測定方法に用いられるものである。具体的には、例えば、本発明における磁性シリカ粒子を含む緩衝液等が挙げられ、該緩衝液としては、免疫測定等に通常用いられる緩衝液が好ましく挙げられ、例えば１，４−ピペラジンジエタンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液、ＭＯＰＳ［３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸］／水酸化ナトリウム緩衝液、トリエタノールアミン／塩酸緩衝液及びＰＢＳ（リン酸緩衝液）等が挙げられる。
これらの緩衝液中の緩衝剤の濃度は、１〜５００ｍＭが好ましく、更に好ましくは５〜３００ｍＭ、特に好ましくは１０〜２００ｍＭである。
上記及び以下において、ｍＭは２５℃での濃度（ミリモル／リットル）を表す。
磁性シリカ粒子の量は、特に限定されず、用いられる測定対象物質結合物質又は測定対象物質の類似物質の種類、測定対象物質の種類等により適宜選択できる。
本発明の試薬は、本発明における磁性シリカ粒子が緩衝液に分散された形態であることが好ましい。
【００７８】
本発明の試薬は、本発明における磁性シリカ粒子を含有する試薬以外に、標識物質により標識された測定対象物質と特異的に結合する物質、或いは、標識物質により標識された、測定対象物質又はその類似物質を含有する試薬（以下、標識試薬と略記する場合がある）を含んでいてもよい。該標識物質は、上記本発明の測定方法の項で記載したものと同じものが挙げられ、好ましいものも同じである。
【００７９】
標識試薬には、標識物質により標識された測定対象物質と特異的に結合する物質、或いは、標識物質により標識された、測定対象物質又はその類似物質以外に緩衝液等を含むことができる。標識試薬に使用される緩衝液としては、免疫測定に通常用いられる緩衝液が好ましく、例えば、上述の磁性シリカ粒子を含む試薬に使用される緩衝液と同様のものが挙げられ、緩衝液中の緩衝剤の濃度も上述の磁性シリカ粒子を含む試薬に使用される場合と同様である。
【００８０】
本発明の試薬は、本発明における磁性シリカ粒子を含有する試薬、及び、標識試薬以外に、化学発光試薬を含んでいてもよく、該化学発光試薬は、上記の標識物質に基づき選択され、例えば、標識物質がＰＯＤである場合、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物及び化学発光増強剤を必須構成成分としてなる化学発光試薬第１液と、酸化剤及び水を必須構成成分としてなる化学発光試薬第２液とを含んでなる。
【００８１】
２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物としては、例えば、特開平２−２９１２９９号公報、特開平１０−３１９０１５号公報及び特開２０００−２７９１９６号公報等に記載の公知の２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物及びこれらの混合物等が使用できる。
これらの内、ルミノール、イソルミノール、Ｎ−アミノヘキシル−Ｎ−エチルイソルミノール（ＡＨＥＩ）、Ｎ−アミノブチル−Ｎ−エチルイソルミノール（ＡＢＥＩ）及びこれらの金属塩（アルカリ金属塩等）が好ましく、更に好ましいのはルミノール及びその金属塩、特に好ましいのはルミノールのナトリウム塩である。
【００８２】
化学発光試薬における２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物の含有量は、その種類及び適用する測定方法や測定条件等によって適宜設定されるが、化学発光増強効果及び保存安定性等の観点から、０．５〜８０ｍＭが好ましく、更に好ましくは１．８〜４０ｍＭ、特に好ましくは３．５〜２１ｍＭである。
【００８３】
化学発光増強剤としては、例えば、特表昭５９−５００２５２号公報、特開昭５９−１７１８３９号公報及び特開平２−２９１２９９号公報等に記載の公知の化学発光増強剤及びこれらの混合物等が使用できる。
これらの内、化学発光増強効果等の観点から、フェノールが好ましく、更に好ましいのはＰ−ヨードフェノール、４−（シアノメチルチオ）フェノール及び４−シアノメチルチオ−２−クロロフェノール、特に好ましいのは４−（シアノメチルチオ）フェノールである。
【００８４】
化学発光試薬における化学発光増強剤の含有量は、その種類及び適用する測定方法や測定条件等によって適宜設定されるが、化学発光増強効果及び保存安定性等の観点から、０．１〜１５ｍＭが好ましく、更に好ましくは０．３〜７．０ｍＭ、特に好ましくは０．６〜３．４ｍＭである。
【００８５】
化学発光試薬第１液には、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物及び化学発光増強剤以外に、緩衝液及び／又はキレート剤等を含むことができる。
【００８６】
緩衝液としては、例えば、特開平１０−３１９０１５号公報及び特開２００３−２７９４８９号公報等に記載の公知の緩衝液等が使用できる。
これらの内、化学発光増強効果及び保存安定性等の観点から、３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液、２−ヒドロキシ−３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸・１水和物／水酸化ナトリウム緩衝液及びピペラジニル−１，４−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパンスルホン酸）・２水和物／水酸化ナトリウム緩衝液が好ましく、更に好ましいのは３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液及び２−ヒドロキシ−３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸・１水和物／水酸化ナトリウム緩衝液、特に好ましいのは３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液である。
これらの緩衝液における緩衝剤の含有量は、化学発光増強効果及び保存安定性等の観点から、１〜５００ｍＭが好ましく、更に好ましくは５〜３００ｍＭ、特に好ましくは１０〜２００ｍＭである。
【００８７】
キレート剤としては、例えば、特開平９−７５０９９号公報及び特開２００３−２７９４８９号公報等に記載の公知のキレート剤等が使用できる。
これらの内、化学発光増強効果及び保存安定性等の観点から、４配位キレート剤が好ましく、更に好ましいのはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及びその塩（エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸三ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸二カリウム及びエチレンジアミン四酢酸三カリウム等）並びにトランス−１，２ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、特に好ましいのはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及びその塩である。
【００８８】
キレート剤を含有する場合、その含有量は化学発光増強効果及び保存安定性の観点から、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物の重量に基づいて、０．００１〜４重量％が好ましく、更に好ましくは０．０１〜２重量％、特に好ましくは０．０５〜１重量％である。
【００８９】
化学発光試薬第１液は、液体であることが好ましく、また、酵素の蛍光強度の観点からはアルカリ性であることが好ましい。第１液のｐＨは、７〜１１が好ましく、更に好ましくは８〜１０である。尚、ｐＨは、ＪＩＳ  Ｋ０４００−１２−１０：２０００に準拠して測定される（測定温度２５℃）。
【００９０】
化学発光試薬第１液は、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物、化学発光増強剤並びに必要により緩衝液及び／又はキレート剤を均一混合することにより容易に得ることができる。
【００９１】
化学発光試薬第２液が含有する酸化剤としては、例えば、特開平８−２６１９４３号公報及び特開２０００−２７９１９６号公報等に記載の公知の酸化剤等［無機の過酸化物（過酸化水素、過ホウ酸ナトリウム及び過ホウ酸カリウム等）、有機過酸化物（過酸化ジアルキル及び過酸化アシル等）、ペルオクソ酸化合物（ペルオクソ硫酸及びペルオクソリン酸等）等］の水溶液が挙げられる。
これらの内、保存安定性等の観点から、過酸化水素水溶液、過ホウ酸ナトリウム水溶液及び過ホウ酸カリウム水溶液が好ましく、更に好ましいのは過酸化水素水溶液である。
【００９２】
化学発光試薬第２液における酸化剤の濃度は、その種類及び適用する測定方法や測定条件等によって適宜設定されるが、化学発光増強効果等の観点から、０．５〜４０ｍＭが好ましく、更に好ましくは１〜２０ｍＭ、特に好ましくは２．５〜１０ｍＭである。
【００９３】
化学発光試薬第２液が含有する水としては、蒸留水、逆浸透水及び脱イオン水等が挙げられる。これらの内、化学発光増強効果及び保存安定性等の観点から、蒸留水及び脱イオン水が好ましく、更に好ましいのは脱イオン水である。
【００９４】
化学発光試薬第２液は、酸化剤及び水以外にキレート剤等を含むことができる。
キレート剤としては、上述の第１液に含むことができるキレート剤として例示したものと同様のものが挙げられ、好ましいものも同様である。
キレート剤を含有する場合、その含有量は、化学発光増強効果及び保存安定性の観点から、酸化剤の重量に基づいて、０．２〜１００重量％が好ましく、更に好ましくは０．５〜２０重量％、特に好ましくは１〜１０重量％である。
化学発光試薬第２液は、酸化剤、水及び必要によりキレート剤を均一混合することにより容易に得られる。
【実施例】
【００９５】
以下、実施例により本発明を更に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。以下、特に定めない限り、％は重量％、部は重量部を示す。【００９６】
製造例１
反応容器に塩化鉄（ＩＩＩ）６水和物２．７部、塩化鉄（ＩＩ）４水和物１．０部及び水３７５部を仕込んで溶解させて５０℃に昇温し、攪拌下温度を５０〜５５℃に保持しながら、２５％アンモニア水３．８部と水１００部を混合した溶液を１時間かけて滴下し、滴下後１時間攪拌し、オレイン酸１０．５部加え、２時間攪拌を継続した。室温に冷却後、デカンテーションにより固液分離して得られたオレイン酸が吸着したマグネタイト粒子を水５０部で洗浄する操作を３回行った。得られたオレイン酸が吸着したマグネタイト粒子を容器に仕込み、デカン５．７部及びテトラエトキシシラン２．２部を加えて混合し、分散液（Ａ２−１）を調製した。
反応容器に２５％アンモニア水溶液３９．０部、イソプロパノール５５．４部、ソルビタンモノオレエート２．９部（三洋化成工業社製「イオネットＳ−８０」）及びポリオキシエチレン（付加モル数２０モル）アルキル（Ｃ１６〜１８）エーテル（三洋化成工業社製「エマルミン２００」）２．０部を加えてクリアミックス（エムテクニック社製）を用いて混合し、５０℃に昇温後、クリアミックスの回転数６，０００ｒｐｍで攪拌しながら、上記分散液（Ａ２−１）を１時間かけて滴下後、５０℃で１時間反応させた。反応後、２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して微粒子の存在する上清を除いた。得られた固相に水５０部を加えて粒子を分散させて１，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離後、微粒子の存在する上清を除く操作を１０回行った。続いて、得られた固相に水５０部を加えて粒子を分散させて５００ｒｐｍで５分間遠心分離することにより、大きな粒子径の粒子を沈降させて目的とする粒子径を有する粒子を含有する上清（１）を回収した。残った固相に水５０部を加えて５００ｒｐｍで５分間遠心分離後、上清（２）を回収する操作を２回行い、固相中に存在する目的とする粒子径を有する粒子を回収した。次に、上清（１）及び（２）について、磁石を用いて粒子を集磁し、集磁された粒子を８０℃で８時間乾燥させて磁性シリカ粒子（Ｓ１）を得た。【００９７】
製造例２
乳化の際のクリアミックスの回転数を６，０００ｒｐｍから７，５００ｒｐｍに代えた以外は、製造例１と同様にして磁性シリカ粒子（Ｓ２）を得た。【００９８】
製造例３
テトラエトキシシランの仕込量を２．２部から０．５部に代えた以外は、製造例１と同様にして磁性シリカ粒子（Ｓ３）を得た。【００９９】
製造例４
乳化の際のクリアミックスの回転数を６，０００ｒｐｍから７，５００ｒｐｍに代えた以外は、製造例３と同様にして磁性シリカ粒子（Ｓ４）を得た。【０１００】
製造例５
マグネタイト粒子作製時における２５％アンモニア水３．８部と混合する水の量を１００部から３３．８部に代えた以外は、製造例１と同様にして磁性シリカ粒子（Ｓ５）を得た。【０１０１】
製造例６
乳化の際のクリアミックスの回転数を６，０００ｒｐｍから７，５００ｒｐｍに代えた以外は、製造例５と同様にして磁性シリカ粒子（Ｓ６）を得た。【０１０２】
製造例７
テトラエトキシシランの仕込量を２．２部から０．５部に代えた以外は、製造例５と同様にして磁性シリカ粒子（Ｓ７）を得た。【０１０３】
製造例８
乳化の際のクリアミックスの回転数を６，０００ｒｐｍから７，５００ｒｐｍに代えた以外は、製造例７と同様にして磁性シリカ粒子（Ｓ８）を得た。【０１０４】
製造例９
マグネタイト粒子作製時における２５％アンモニア水３．８部と混合する水の量を１００部から５５部に代え、テトラエトキシシランの仕込量を２．２部から１．２部に代えた以外は、製造例２と同様にして磁性シリカ粒子（Ｓ９）を得た。【０１０５】
比較製造例１
テトラエトキシシランの仕込量を０．５部から８．０部に代えた以外は、製造例４と同様にして磁性シリカ粒子（Ｈ１）を得た。【０１０６】
比較製造例２
テトラエトキシシランの仕込量を１．２部から１２．５部に代えた以外は、製造例９と同様にして磁性シリカ粒子（Ｈ２）を得た。【０１０７】
比較製造例３
テトラエトキシシランの仕込量を１．２部から８．０部に代え、乳化の際のクリアミックスの回転数を７，５００ｒｐｍから６，０００ｒｐｍに代えた以外は、製造例９と同様にして磁性シリカ粒子（Ｈ３）を得た。【０１０８】
比較製造例４
１００部の硫酸第一鉄を１，０００部の水に溶解し、攪拌下、水５００部に水酸化ナトリウム２８．８部を溶解した水溶液を１時間かけて滴下後、攪拌しながら、８５℃まで昇温して空気を懸濁液に吹き込み８時間酸化し、遠心分離することにより得られたマグネタイト粒子２．２部をデカン５．７部及びテトラエトキシシラン２．２部と混合して分散液（Ｒ−１）を得た。分散液（Ａ２−１）を分散液（Ｒ−１）に代えた以外は、製造例２と同様にして磁性シリカ粒子（Ｈ４）を得た。【０１０９】
比較製造例５
テトラエトキシシランの仕込量を２．２部から１２．５部に代えた以外は、比較製造例４と同様にして磁性シリカ粒子（Ｈ５）を得た。【０１１０】
比較製造例６
平均粒子径５０ｎｍのマグネタイト粒子（シグマ  アルドリッチ  ジャパン社製)２．２部をデカン５．７部及びテトラエトキシシラン２．２部と混合して分散液（Ｒ−２）を得た。分散液（Ａ２−１）を分散液（Ｒ−２）に代える以外は、製造例１と同様にして磁性シリカ粒子（Ｈ６）を得た。【０１１１】
実施例１
以下の操作により、磁性シリカ粒子を含有する試薬（抗ＡＦＰ抗体結合磁性シリカ粒子試薬）、標識試薬（ＰＯＤ標識抗ＡＦＰ抗体試薬）、化学発光試薬第１液及び化学発光試薬第２液から構成される本発明の試薬を得た。
磁性シリカ粒子を含有する試薬の作製：
１重量％γ−アミノプロピルトリエトキシシラン含有アセトン溶液４０ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に製造例１で作製した磁性シリカ粒子（Ｓ１）４０ｍｇを加え、２５℃で１時間反応させ、ネオジウム磁石で磁性シリカ粒子を集磁後、液をアスピレーターで吸引除去した。次いで脱イオン水４０ｍＬを加えて蓋をし、ポリスチレン瓶をゆっくりと２回倒置攪拌した後、ネオジウム磁石で磁性シリカ粒子を集磁後、液をアスピレーターで吸引除去して磁性シリカ粒子を洗浄した。この洗浄操作を３回行った。次いで、この洗浄後の磁性シリカ粒子を２重量％グルタルアルデヒド含有水溶液４０ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に加え、２５℃で１時間反応させた。そして、脱イオン水４０ｍＬを加えて蓋をし、ポリスチレン瓶をゆっくりと２回倒置攪拌したのち、ネオジウム磁石で磁性シリカ粒子を集磁後、液をアスピレーターで吸引除去して磁性シリカ粒子を洗浄した。この洗浄操作を３回行った。更にこの洗浄後の磁性シリカ粒子を抗ＡＦＰモノクローナル抗体（ダコジャパン社より購入）を２０μｇ／ｍＬの濃度で含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．７）４０ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に加え、２５℃で１時間反応させた。反応後、ネオジウム磁石で磁性シリカ粒子を集磁後、抗ＡＦＰ抗体含有リン酸緩衝液を除去し、抗ＡＦＰ抗体結合磁性シリカ粒子を作製した。これを１％の牛血清アルブミン含有の０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で、抗ＡＦＰ抗体結合磁性シリカ粒子濃度として０．５ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈し、磁性シリカ粒子を含有する試薬を調製し、冷蔵（２〜１０℃）で保存した。【０１１２】
標識試薬の作製：
抗ＡＦＰポリクローナル抗体（ダコジャパン社より購入）、西洋ワサビ由来ＰＯＤ（東洋紡社製）を用い、文献（エス・ヨシタケ、エム・イマガワ、イー・イシカワ、エトール；ジェイ．バイオケム，Ｖｏｌ．９２，１９８２，１４１３−１４２４）に記載の方法でＰＯＤ標識抗ＡＦＰ抗体を調製した。これを１％の牛血清アルブミン含有の０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で、ＰＯＤ標識抗ＡＦＰ抗体濃度として２００ｎＭの濃度に希釈し、標識試薬を調製し、冷蔵（２〜１０℃）で保存した。【０１１３】
化学発光試薬第１液の調製：
ルミノールのナトリウム塩［シグマ  アルドリッチ  ジャパン社製］０．７ｇ及び４−（シアノメチルチオ）フェノール０．１ｇを１，０００ｍＬメスフラスコに仕込んだ。３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．６）を溶液の容量が１，０００ｍＬになるように仕込み、２５℃で均一混合して化学発光試薬第１液を調製した。測定に用いるまで冷蔵（２〜１０℃）保存した。【０１１４】
化学発光試薬第２液の調製：
過酸化水素［和光純薬工業社製、試薬特級、濃度３０重量％］６．６ｇを１，０００ｍＬメスフラスコに仕込んだ。脱イオン水を溶液の容量が１，０００ｍＬになるように仕込み、２５℃で均一混合して化学発光試薬第２液を調製した。測定に用いるまで冷蔵（２〜１０℃）保存した。【０１１５】
実施例２〜９及び比較例１〜６
磁性シリカ粒子（Ｓ１）を磁性シリカ粒子（Ｓ２）〜（Ｓ９）又は（Ｈ１）〜（Ｈ６）に代える以外は実施例１と同様にして、本発明の又は比較用の磁性シリカ粒子を含有する試薬、標識試薬、化学発光試薬第１液及び化学発光試薬第２液から構成される本発明の試薬を得た。【０１１６】
得られた試薬を用いて、以下の方法により短時間での免疫測定における洗浄性及び感度を評価した結果を表１に示す。また、使用した磁性シリカ粒子（Ｓ１）〜（Ｓ９）及び（Ｈ１）〜（Ｈ６）について、以下に示す方法で超常磁性金属酸化物の平均粒子径、磁性シリカ粒子の平均粒子径、超常磁性金属酸化物の含有量を測定し、集磁性、再分散性及び再凝集性を評価した結果を併せて表１に示す。【０１１７】
＜本発明の試薬を用いた短時間での免疫測定における洗浄性及び感度の評価方法＞
磁性シリカ粒子を含有する試薬０．０２５ｍＬと１重量％の牛血清アルブミンを含有したリン酸緩衝液で調製したＡＦＰ濃度が２ｎｇ／ｍＬの標準ＡＦＰ液０．０２５ｍＬを試験管に入れて混合し、試験管中で３７℃で３分間反応させ、抗ＡＦＰ抗体結合磁性シリカ粒子／ＡＦＰ複合体を形成させた。反応後、試験管の外側からネオジウム磁石で磁性シリカ粒子を１０秒間集め、試験管中の液をアスピレーターで除き、ネオジウム磁石を側面から十分に離し、生理食塩水０．５ｍＬを加えて磁性シリカ粒子を分散させて集磁後、アスピレーターで液を除く洗浄操作を３回行った。【０１１８】
続いて、標識試薬０．０２５ｍＬを試験管に注入し、試験管中で３７℃で３分間反応させ、抗ＡＦＰ抗体結合磁性シリカ粒子／ＡＦＰ／ＰＯＤ標識抗ＡＦＰ抗体複合体を形成させた。反応後、試験管の外側からネオジウム磁石で磁性シリカ粒子を１０秒間集め、試験管中の液をアスピレーターで除き、ネオジウム磁石を側面から十分に離し、生理食塩水０．５ｍＬを加えて磁性シリカ粒子を分散させて集磁後、アスピレーターで液を除く洗浄操作を２回行った。
最後に、化学発光試薬第１液０．０７ｍＬと化学発光試薬第２液０．０７ｍＬとを同時に加え、３７℃で４３秒間発光反応させ、化学発光試薬を添加後４３〜４５秒の平均発光量を発光検出器［Ｌｕｍａｔ  ＬＢ９５０７（ベルトールドジャパン社製）］で測定した。尚、ＡＦＰ濃度が２ｎｇ／ｍＬの標準ＡＦＰ液の代わりにＡＦＰ濃度が０ｎｇ／ｍＬの標準ＡＦＰ液を使用して上記と同様の操作を行いバックグラウンドとして用いた。【０１１９】
洗浄性については、ＡＦＰ濃度が０ｎｇ／ｍＬの標準溶液を用いて免疫測定を行った場合の平均発光量から以下の基準で判定した。
○：１０，０００ｃｐｓ未満
△：１０，０００ｃｐｓ以上かつ３０，０００ｃｐｓ未満
×：３０，０００ｃｐｓ以上
感度については、ＡＦＰ濃度が０ｎｇ／ｍＬと２ｎｇ／ｍＬの標準溶液を用いた免疫測定を行った場合の発光量の差から以下の基準で判定した。
○：２５，０００ｃｐｓ以上
△：１０，０００ｃｐｓ以上かつ２５，０００ｃｐｓ未満
×：１０，０００ｃｐｓ未満【０１２０】
＜超常磁性金属酸化物の平均粒子径の測定方法＞
任意の２００個の超常磁性金属酸化物について、走査型電子顕微鏡で観察して粒子径を測定し、その平均値を平均粒子径とした。
＜磁性シリカ粒子の平均粒子径の測定方法＞
任意の２００個の磁性シリカ粒子について、走査型電子顕微鏡で観察して粒子径を測定し、その平均値を平均粒子径とした。
＜磁性シリカ粒子中の超常磁性金属酸化物の含有量の測定方法＞
任意の２０個の磁性シリカ粒子について、走査型電子顕微鏡で観察し、エネルギー分散型Ｘ線分光装置により超常磁性金属酸化物の含有量を測定してその平均値を含有量とした。【０１２１】
＜磁性シリカ粒子の集磁性の評価方法＞
１．０ｍｇの磁性粒子シリカ粒子を２ｍＬのイオン交換水に分散させ、口内径×胴径×全高＝φ１０．３ｍｍ×φ１２．０ｍｍ×３５ｍｍのガラス容器に入れ、１ｃｍ×１ｃｍ×１ｃｍのネオジウム磁石を側面につけ、初期吸光度が２０％となるまでの時間を測定し、以下の基準で判定した。
○：１５秒未満
△：１５秒以上かつ３０秒未満
×：３０秒以上【０１２２】
＜磁性シリカ粒子の再分散性の評価方法＞
１．０ｍｇの磁性粒子シリカ粒子を２ｍＬのイオン交換水に分散させ、口内径×胴径×全高＝φ１０．３ｍｍ×φ１２．０ｍｍ×３５ｍｍのガラス容器に入れ、１ｃｍ×１ｃｍ×１ｃｍのネオジウム磁石を側面につけて、磁性シリカ粒子を完全に集磁し、上清を除去し、ネオジウム磁石を側面から十分に離し、２ｍＬのイオン交換水を磁性シリカ粒子に噴きつけながら加え、３回のピペッティングにより混合した後、１０秒以内に顕微鏡で観察し、視野内の全粒子数に対する凝集した粒子数の割合を算出して以下の基準で再分散性を判定した。
○：凝集粒子が５％未満
△：凝集粒子が５％以上かつ２０％未満
×：凝集粒子が２０％以上【０１２３】
＜磁性シリカ粒子の再凝集性の評価方法＞
３回のピペッティングによる混合後、顕微鏡で観察するまでの時間を１０秒以内から５分に代える以外は上記再分散性の評価方法と同様にして、視野内の全粒子数に対する凝集した粒子数の割合を算出して以下の基準で判定した。
○：凝集粒子が５％未満
△：凝集粒子が５％以上かつ２０％未満
×：凝集粒子が２０％以上【０１２４】
【表１】
0005977743.tif 000002
【産業上の利用可能性】
【０１２５】
本発明の磁性シリカ粒子を用いた測定対象物質測定方法は、磁性シリカ粒子の磁気特性及び集磁後の粒子の再分散性が優れることから、簡便且つ短時間に高感度で測定対象物質を測定することができるため、放射免疫測定法、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法及び化学発光免疫測定法等の臨床検査に幅広く適用できる。また、本発明の試薬は、上記測定方法に用いるのに適したものであり、同様に、放射免疫測定法、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法及び化学発光免疫測定法等の臨床検査薬として用いることができる。