(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．ヒトＮＫＧ２Ａに特異的に結合すること；
ｂ．ＩｇＧ４サブタイプのヒトＦｃ領域、またはヒトＣＤ１６への結合を最小にするかまたは排除するように改変されているヒトＦｃ領域を含んでなること；
ｃ．ヒトＮＫＧ２ＣまたはヒトＮＫＧ２Ｅには特異的に結合しないこと；および
ｄ．ヒトＮＫ細胞上のＮＫＧ２Ａに結合する場合、細胞表面上にＨＬＡ−ＥまたはＱａ１ｂを有する標的ヒト細胞が前記ＮＫ細胞に接触したときに、前記ＮＫ細胞をして、前記標的ヒト細胞を溶解せしめること、
を特徴とする、全長のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであって、抗体が、ＮＫＧ２Ａへの結合について、ＣＮＣＭに受託番号Ｉ−３５４９の下に寄託されている細胞により生産される抗体と完全に競合することをさらに特徴とする、全長のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
非ヒト霊長類ＮＫＧ２Ａに結合することをさらに特徴とする、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
非ヒト霊長類ＮＫ細胞上のＮＫＧ２Ａへの結合時に、前記抗体は、細胞表面上にＨＬＡ−Ｅを有する標的非ヒト霊長類細胞が前記ＮＫ細胞に接触したときに、前記ＮＫ細胞をして、前記標的細胞を溶解せしめる、請求項２に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
配列番号２のアミノ酸配列の相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含んでなる、請求項１〜３のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
配列番号６のアミノ酸配列の相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含んでなる、請求項１〜４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
ヒト、キメラもしくはヒト化である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項７】
配列番号３を含んでなる核酸配列から産生される、請求項１〜６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項８】
配列番号７を含んでなる核酸配列から産生される、請求項１〜７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項９】
ａ．有効量の請求項１〜８のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント；および
ｂ．薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤、
を含んでなる医薬組成物。
【請求項１０】
前記組成物が医薬用途のために処方される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
化学療法化合物、ホルモン、血管新生インヒビター、またはアポトーシス誘導剤を含む癌の処置において使用される治療用薬剤；抗ウイルス化合物を含む感染性疾患を処置するために使用される治療用薬剤；自己免疫疾患、炎症性障害、および移植拒絶の処置のような他の免疫療法において使用される治療用薬剤；サイトカイン；サイトカインインヒビター；免疫調節剤；補助化合物；造血成長因子；活性化ＮＫ細胞受容体のアゴニストまたは抑制性ＮＫ細胞受容体のアンタゴニストから選択される第２の治療用薬剤をさらに含んでなる、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
ＮＫ細胞および標的細胞を含んでなる集団における前記標的細胞のＮＫ細胞媒介溶解を再構成するインビトロでの方法であって、前記ＮＫ細胞と請求項１〜８のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントとを接触させる工程を含んでなり、前記ＮＫ細胞が、その表面上のＮＫＧ２Ａによって特徴付けられ、そして前記標的細胞は、その表面上のＨＬＡ−ＥまたはＱａ１ｂの存在によって特徴付けられる、方法。
【請求項１３】
前記ＮＫ細胞がヒト細胞であり、前記標的細胞が、樹状細胞、癌細胞、ウイルス感染細胞から選択されるヒト細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
薬剤として使用するための請求項９に記載の組成物。
【請求項１５】
患者における自己免疫または炎症性障害を処置するための薬物の製造のための、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントの使用であって、該モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントが、請求項１〜８のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントである、使用。
【請求項１６】
免疫抑制薬、副腎皮質ステロイド、ＴＮＦインヒビター、ＮＣＲ刺激化合物、ＫＩＲ抑制性受容体のインヒビター、ＴＧＦ−β１のインヒビター、サイトカインインヒビター、造血成長因子、鎮痛剤、または抗炎症剤から選択される第２の治療用薬剤と組み合わせられ、前記第２の治療用薬剤が、個別の剤形もしくは組成物の一部のいずれかとして投与される、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記自己免疫または炎症性障害が、自己免疫性溶血性貧血、悪性貧血、結節性多発動脈炎、全身性エリテマトーデス、ウェゲナー肉芽腫症、自己免疫性肝炎、ベーチェット病、クローン病、原発性胆汁性肝硬変、強皮症、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、１型糖尿病、ぶどう膜炎、グレーブス病、甲状腺炎、心筋炎、リウマチ熱、強皮症、強直性脊椎炎、関節リウマチ、糸球体腎炎、サルコイドーシス、皮膚筋炎、重症筋無力症、多発性筋炎、ギラン・バレー症候群、多発性硬化症、円形脱毛症、天疱瘡／類天疱瘡、乾癬、および白斑よりなる群から選択される、請求項１５に記載の使用。
【請求項１８】
患者において癌を処置するための薬物の製造のための請求項９に記載の組成物の使用であって、前記癌が、その細胞表面上においてＨＬＡ−ＥまたはＱａ１ｂを発現する癌細胞の存在によって特徴付けられる、使用。
【請求項１９】
組成物が、抗癌剤または制吐剤から選択される第２の治療用薬剤と組み合わせられ、前記第２の治療用薬剤が、個別の剤形または前記組成物の一部のいずれかとして投与される、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
患者においてウイルス性疾患を処置するための薬物の製造のための請求項９に記載の組成物の使用であって、前記ウイルス性疾患が、その細胞表面上においてＨＬＡ−ＥまたはＱａ１ｂを発現するウイルス感染細胞の存在によって特徴付けられる、使用。
【請求項２１】
組成物が、抗ウイルス剤と組み合わせられ、前記抗ウイルス剤が、個別の剤形または前記組成物の一部のいずれかとして投与される、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
患者において抗原に対する忍容性を誘導するための薬物の製造のための請求項９に記載の組成物の使用であって、前記組成物が前記抗原と組み合わせて使用される、使用。
【請求項２３】
薬物が、自己免疫疾患またはアレルギーから選択される疾患を処置するために使用される、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
患者における造血細胞の移植を改善するための薬物の製造のための請求項９に記載の組成物の使用。
【請求項２５】
組成物が、抗癌剤、または造血成長因子から選択される第２の治療用薬剤と組み合わせられ、前記第２の治療用薬剤が、個別の剤形もしくは前記組成物の一部のいずれかとして投与される、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
患者が白血病を患っている、請求項２４または２５に記載の使用。
【請求項２７】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体；および検出マーカーを含んでなるコンジュゲート。
【請求項２８】
検出マーカーが、放射性同位元素、蛍光染料、ＮＫＧ２Ａに対する抗体以外での抗原−抗体対のメンバー、レクチン−炭水化物対のメンバー、アビジン、ビオチン、受容体−リガンド対のメンバー、または分子インプリントポリマー−プリント分子系のメンバーから選択される、請求項２７に記載のコンジュゲート。
【請求項２９】
ａ．請求項２７に記載のコンジュゲート；および
ｂ．ＮＫＧ２Ａ含有材料
を含んでなるキット。
【請求項３０】
抗体のＮＫＧ２Ａへの結合を検出する方法であって、以下の工程：
ａ．請求項２７に記載のコンジュゲートと、ＮＫＧ２Ａ含有材料とを接触させる工程；
ｂ．前記ＮＫＧ２Ａ含有材料に結合した検出マーカーの量を定量する工程；
ｃ．請求項２７に記載のコンジュゲートおよび前記抗体と、ＮＫＧ２Ａ含有材料とを接触させる工程；
ｄ．前記抗体の存在下で前記ＮＫＧ２Ａ含有材料に結合した検出マーカーの量を定量する工程；
ｅ．工程ｂにおいて定量される検出可能な材料の量と、工程ｄにおいて定量される量とを比較して、前記抗体が前記ＮＫＧ２Ａ含有材料に結合するかどうかを決定する工程
を含んでなる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＮＫ細胞表面受容体ＮＫＧ２Ａに対して指向されるモノクローナル抗体およびそのフラグメント、ならびにそのような抗体を産生させ、評価する方法に関する。モノクローナル抗体およびそのフラグメントは、免疫障害、特に、自己免疫障害、ならびにモジュレートされたＮＫ細胞機能を必要とする他の疾患を処置するのに有用である。一般的に、本方法は、処置しようとする障害の病因に寄与する樹状細胞または活性化されたＴ細胞のようなＨＬＡ−ＥまたはＱａ１ｂ発現細胞の溶解をもたらすＮＫ細胞上のＮＫＧ２Ａ受容体の刺激を防止するための抗体およびそのフラグメントの使用に関与する。
【背景技術】
【０００２】
自己免疫反応を誘発せずに有効な免疫監視機構を維持するには、エフェクターＴ細胞応答の正確な力価測定が必要である。自己免疫障害は、免疫系が自己抗原に対する免疫応答を展開する場合に生じる（例えば、非特許文献１を参照のこと）。自己免疫反応の誘発および維持に関与する機構は不明である一方、二次リンパ器官においてこれまで免疫学的に認められなかった抗原の出現が関与するようである。
【０００３】
樹状細胞は、免疫応答において重要な役割を果たす骨髄由来の抗原提示細胞（ＡＰＣ）である（例えば、非特許文献２を参照のこと）。ＤＣは、食作用、エンドサイトーシス、ならびに飲作用を介して、細菌、ウイルス、死にかかっている細胞、および多様な複雑な分子を内在化する。組み入れられたタンパク質はペプチドに分解され、次いで、ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ分子と共にＤＣ細胞表面上に提示される。ＭＨＣクラスＩ上に装填される抗原は、典型的に、内因性タンパク質から誘導され、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識される一方、ＭＨＣクラスＩＩに装填される抗原は、一般的に、外部タンパク質から誘導され、ＣＤ４＋Ｔ細胞によって認識される。抗原捕捉後、未熟ＤＣ細胞は成熟して、減少した食作用を示す成熟ＤＣを形成し、リンパ組織に移動し、増強されたＴ細胞刺激能を有する。
【０００４】
リンパ組織では、ＤＣは、生来の（naive）Ｔ細胞に抗原刺激を与えて、それらのクローン発現および分化を刺激し、また、Ｂ細胞、およびＮＫ細胞を含む自然免疫系の細胞とも相互作用することができる。活性化されたＮＫ細胞は、未成熟ＤＣ細胞を死滅させることができるが、成熟ＤＣ細胞を死滅させることができない。Ｔリンパ球の抗原輸送および一次感作は、主に抗原提示樹状細胞よって媒介されるため、樹状細胞による自己抗原の不適切な提示は、少なくとも部分的に自己免疫障害に寄与するようである。
【０００５】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、従来にない免疫に関与するリンパ球のサブ集団である。ＮＫ細胞は、腫瘍またはウイルス感染細胞のような所望されない細胞を排除することができる効率的な免疫監視機構を提供する。ＮＫ細胞活性は、活性化および抑制シグナルの両方に関与する複雑な機構によって調節される（例えば、非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７を参照のこと；その開示内容全体は参照により本明細書に援用される）。
【０００６】
ＮＫ細胞媒介認識およびＨＬＡクラスＩ欠損標的細胞の死滅に重要な役割を果たすいくつかの異なるＮＫ特異的受容体が同定されている。ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６およびＮＫｐ４４と称されるこれらの受容体は、Ｉｇスーパーファミリーのメンバーである。特異的なｍＡｂによって誘導されるそれらの架橋は、強力なＮＫ細胞活性化をもたらし、細胞内Ｃａ＋＋レベルの増加、細胞障害性の誘発およびリンフォカイン放出を生じる。重要なことに、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、および／またはＮＫｐ４４のｍＡｂ媒介活性化は、多くのタイプの標的細胞に対するＮＫ細胞障害性の活性化を生じる。これらの所見は、天然の細胞障害性におけるこれらの受容体の中心的役割の根拠を提供する。
【０００７】
ＮＫ細胞は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ特異的抑制性受容体によってネガティブに調節される（非特許文献８；非特許文献９）。これらの特異的受容体は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子またはＨＬＡの多型性決定基に結合し、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞溶解を阻害する。ヒトでは、キラーＩｇ様受容体（ＫＩＲ）と称される受容体のファミリーの所定のメンバーがＨＬＡクラスＩ対立遺伝子のグループを認識する（例えば、非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２を参照のこと；その開示内容全体は参照により本明細書に援用される）。
【０００８】
ＮＫ細胞上のもう１つの重要な抑制性受容体はＣＤ９４−ＮＫＧ２Ａであり、非古典的ＭＨＣクラス１分子ＨＬＡ−Ｅと相互作用する（例えば、非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１９；特許文献１を参照のこと；そのそれぞれの開示内容全体は参照により本明細書に援用される）。これらの受容体のいくつかは、Ｔ細胞抗原受容体依存性Ｔ細胞活性化の閾値をモジュレートする能力を有する。稀に抑制性受容体が存在しない場合、活性化アイソフォームはＴ細胞エフェクター機能を増大し、自己免疫病理に寄与し得る。ＮＫＧ２Ａのアミノ酸配列は、霊長類を含む哺乳動物の間でばらつきがある。例えば、ＮＫＧ２Ａタンパク質のヒトおよびアカゲザルバージョンは、リガンド結合ドメイン内で約８６％を含む９０％未満の同一性を共有する。
【０００９】
ＮＫＧ２Ａをモジュレートするため、本質的に、炎症の防止のための療法に対する努力は、非古典的ＭＨＣクラスＩ分子、ヒト受容体に対するＨＬＡ−Ｅおよびマウス受容体に対するＱａ−１ｂの研究に集中している。細胞表面発現のために、これらのＭＨＣ分子は、好ましくは、他のＭＨＣクラスＩ分子のシグナルペプチドから誘導されるペプチドに結合する。他のクラスＩＭＨＣ分子の発現は、ＨＬＡ−Ｅの発現を調節することができ、それによって、ＮＫ細胞は潜在的標的細胞におけるＭＨＣクラスＩ依存性抗原提示経路の状態をモニターすることが可能である。細胞表面ＨＬＡ−Ｅのレベルは、腫瘍およびウイルス感染細胞に対するＮＫ細胞の細胞障害性に極めて重要である。ＨＬＡ−Ｅ発現または機能をモジュレートするための治療ストラテジーは、一般的に、ＨＬＡ−ＩまたはＨＳＰ６０ペプチドを使用して、ＮＫ細胞が活性化されないような炎症の防止のための保護状態を誘導することに指向されている。
【００１０】
特許文献１は、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２ＣおよびＮＫＧ２Ｅに結合する抗体、３Ｓ９を開示している。３Ｓ９は、それらの受容体の架橋およびＮＫ細胞媒介溶解の同時阻害を生じるとされている。共有のＰＣＴ特許公開特許文献２は、ＮＫ型顆粒リンパ球増多症（ＮＫ−ＬＤＧＬ）を患う患者を処置するためのＮＫＧ２Ａを含むＮＫ受容体に特異的に結合する抗体の使用について開示している。そのような抗体はＮＫ細胞活性を阻害する。
【００１１】
モノクローナル抗体は、多様な疾患の診断および処置に非常に有用であることが証明されている。治療用モノクローナル抗体は、異なる機構を介して作用することができる。Ｒｉｔｕｘａｎのようないくつかの抗体は、病理学的細胞、例えば、腫瘍細胞の表面上に存在する抗原を認識し（Ｒｉｔｕｘａｎの場合、ＣＤ２０）、認識された細胞を破壊するように免疫系に指令することによって作用する。Ｂｅｘｘａｒ、Ｏｎｃｏｌｙｍ、またはＺｅｖａｌｉｎのような他の抗体は、放射性同位元素、化学療法剤、もしくは毒素に結合され、抗体によって結合された細胞の直接的死滅をもたらす。バシリキシマブおよびダクリズマブ（ＩＬ−２を阻止する）、ＩｇＥを阻止するオマリズマブ、ならびにエファルジマブ（ｅｆａｌｕｚｉｍａｂ）のようなさらに他のものも作用して、特定のタンパク質の活性を阻止する。抗体に基づく療法は当該分野において周知であり、例えば、非特許文献２０、非特許文献２１、非特許文献２２、非特許文献２３、非特許文献２４、非特許文献２５（そのそれぞれの開示内容全体は参照により本明細書に援用される）においてレビューされている。
【００１２】
抗体をヒトにおける治療アプリケーションに使用するか、または臨床治験に参加させ得る前に、それらは、非ヒト動物における前臨床研究を経て、それらの毒性、インビボでの効力、バイオアベイラビリティ、半減期ならびに他の多様な薬物動態学的および薬力学的パラメータのような多様なパラメータを評価しなければならない。そのようなアッセイは、典型的に、哺乳動物において行われ、好ましくは、ここで、それらは、生物学的活性を有し、即ち、ここで、ｍＡｂは、種において相同分子に反応し、従って、ここで、ヒトに対してもっとも大きな生理学的類似性を期待することができる。しかし、ヒトタンパク質に対して指向された抗体が標的タンパク質の非ヒト動物相同物に結合しない場合、非ヒト霊長類における研究は妨げられ得る。対照的に、交差反応が存在する場合、抗体のインビボでの効力を動物において試験することができるだけでなく、抗体の標的タンパク質への結合に関連する副作用、毒性、または動態学的特性のような他の問題もまた、研究することができる。容易に利用可能な霊長類の例として、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）、アカゲザル（Ｍａｃａｃｕｓ  ｍｕｌａｔｔａ）、アフリカミドリザル（Ｃｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓ  ａｅｔｈｉｏｐｓ）、マーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  ｊａｃｃｈｕｓ）、リスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ  ｓｃｉｕｒｅｕｓ）のような新世界ザルおよび旧世界ザル（すべて、「Ｃｅｎｔｒｅ  ｄｅ  Ｐｒｉｍａｔｏｌｏｇｉｅ」（ＣＤＰ：ＵＬＰ，Ｆｏｒｔ  Ｆｏｃｈ，６７２０７  Ｎｉｅｄｅｒｈａｕｓｂｅｒｇｅｎ、仏国）より入手可能）、ならびに「Ｓｔａｔｉｏｎ  ｄｅ  Ｐｒｉｍａｔｏｌｏｇｉｅ  ｄｕ  ＣＮＲＳ」、ＣＤ５６，１３７９０  Ｒｏｕｓｓｅｔ／Ａｒｃ、仏国）から入手可能なヒヒ（Ｐａｐｉｏ  ｈａｍａｄｒｙａｓ）が挙げられる。そのような事例は稀であり、一般的に、試験のための他の代替物が存在しないか、またはすべて試みられている場合にのみであるが、一般に、チンパンジー（Ｃｈｉｍａｎｚｅｅ）および類人猿もまた、候補医薬品を試験するために使用することができる。
【００１３】
抗体はそれらの標的の特定の３次元特徴に結合するため、標的タンパク質のアミノ酸配列における僅かな変化が結合を完全に廃止し得、１つの種由来のタンパク質に対して指向された所定の抗体がいくつかを共有するが完全な配列同一性は共有しない相同タンパク質にもまた結合するかどうかについては予測することができない。例えば、ヒトタンパク質に対して指向された抗体が、近縁種においてであっても相同物には結合しない多くの事例が記載されている。ヒトおよびアカゲザルＣＤ４タンパク質は、９４％近くもの同一性パーセントを共有するが、例えば、ヒトＣＤ４タンパク質に対するいくつかの抗体は、サル相同物に結合しない（例えば、非特許文献２６；非特許文献２７その開示内容全体が本明細書において参照により援用される）を参照のこと）。他の例として、ヒトＣＤ３（抗体開発のために広範に追及されている薬学的標的）に対するいくつかの抗体が挙げられ；もしそうでなければ、開発に適する特性を有する抗体、例えば、ＵＣＨＴ２は、サルＣＤ３タンパク質と交差反応しない。
【００１４】
多くの自己免疫障害の台頭および重症度、ならびに自己抗原に対する免疫応答を調整する際の成熟樹状細胞の役割を考慮すると、そのような障害の基礎となる樹状細胞の活性またはレベルをモジュレートする新規かつ効果的な治療法が当該分野において大いに必要とされる。さらに、免疫系による破壊からそれら自体を保護することが可能である異常細胞（例えば、所定の癌またはウイルス感染（ｉｎｆｒｅｃｔｅｄ）細胞）によって特徴付けられる障害に対する治療法の必要性が存在する。最後に、ＮＫＧ２Ａに対するモノクローナル抗体のヒトにおける治療能力の有効なインビボ試験システムを見出す必要性も存在する。本発明は、このようなおよび他の必要性に取り組む。
【特許文献１】米国特許公開第２００３／００９５９６５号明細書
【特許文献２】国際公開第２００５／１０５８４９号パンフレット
【非特許文献１】リューデビッヒ（Ｌｕｄｅｗｉｇ）ら（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ．１６９：４５−５４
【非特許文献２】オニール（Ｏ’Ｎｅｉｌｌ）ら（２００４年）Ｂｌｏｏｄ  １０４：２２３５−２２４６
【非特許文献３】モレッタ（Ｍｏｒｅｔｔａ）ら（２００１年）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９：１９７−２２３
【非特許文献４】モレッタ（Ｍｏｒｅｔｔａ）ら（２００３年）ＥＭＢＯ  Ｊ  ＥＰｕｂ  Ｄｅｃ  １８
【非特許文献５】ラベッチ（Ｒａｖｅｔｃｈ）ら（２０００年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０：８４−８９
【非特許文献６】ザンベロ（Ｚａｍｂｅｌｌｏ）ら（２００３年）Ｂｌｏｏｄ  １０２：１７９７−８０５
【非特許文献７】モレッタ（Ｍｏｒｅｔｔａ）ら（１９９７年）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：６９４−７０１
【非特許文献８】カリー（Ｋａｅｒｒｅ）ら、（１９８６年）Ｎａｔｕｒｅ  ３１９：６７５−８
【非特許文献９】エーレン（Ｏｅｈｌｅｎ）ら、（１９８９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：６６６−８
【非特許文献１０】ヤワタ（Ｙａｗａｔａ）ら（２００２年）Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２２：４６３−８２
【非特許文献１１】マーティン（Ｍａｒｔｉｎ）ら（２０００年）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．５１：２６８−８０
【非特許文献１２】ラニーア（Ｌａｎｉｅｒ）（１９９８年）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：３５９−９３
【非特許文献１３】ブラウド（Ｂｒａｕｄ）ら（１９９８年）Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：７９５−７９９
【非特許文献１４】リー（Ｌｅｅ）ら（１９９８年）ＰＮＡＳ  ９５：５１９９−５２０４
【非特許文献１５】バンス（Ｖａｎｃｅ）ら（２００２年）ＰＮＡＳ  ９９：８６８−８７３
【非特許文献１６】ブルックス（Ｂｒｏｏｋｓ）ら（１９９９年）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６２：３０５−３１３
【非特許文献１７】ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）らＪ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００３年）１７１：１３６９−７５
【非特許文献１８】ブルックス（Ｂｒｏｏｋｓ）ら（１９９７年）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８５：７９５−８００
【非特許文献１９】バン・ベネデン（Ｖａｎ  Ｂｅｎｅｄｅｎ）ら（２００１年）４３０２−４３１１
【非特許文献２０】ガット（Ｇａｔｔｏ）（２００４年）Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃ  Ａｇｅｎｔｓ４（５）：４１１−４
【非特許文献２１】カサデバル（Ｃａｓａｄｅｖａｌｌ）ら（２００４年）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２（９）：６９５−７０３
【非特許文献２２】ヒノダ（Ｈｉｎｏｄａ）ら（２００４年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．９５（８）：６２１−５
【非特許文献２３】オルシュウィスキー（Ｏｌｓｚｅｗｓｋｉ）ら（２００４年）Ｓｃｉ  ＳＴＫＥ．Ｊｕｌ０６（２４１）：ｐｅ３０
【非特許文献２４】コイフェル（Ｃｏｉｆｆｉｅｒ）（２００４年）Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｊ．補遺３：Ｓ１５４−８
【非特許文献２５】ローク（Ｒｏｑｕｅ）ら（２００４年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ．２０（３）：６３９−５４
【非特許文献２６】Ｇｅｎｂａｎｋ  ＩＤ  ＧＩ：１１６０１３および２０９８１６８０
【非特許文献２７】シャルマ（Ｓｈａｒｍａ）ら（２０００年）ＪＰＥＴ  ２９３：３３−４１，２０００
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、ＮＫＧ２Ａ受容体に対して指向されたモノクローナル抗体およびそのフラグメントを提供する。本発明のモノクローナル抗体およびそのフラグメントは、通常感受性の標的細胞を溶解するＮＫ細胞の能力を阻害してもよく（「ＮＫ細胞阻害抗体」）またはそれ以外の保護された標的細胞を溶解するＮＫ細胞の能力を再構成してもよい（「ＮＫ細胞活性化抗体」）。本発明のモノクローナル抗体およびそのフラグメントの機能は、Ｆｃ受容体に結合するそれらの能力に依存する。
【００１６】
Ｆｃγ受容体のようなＦｃ受容体は、白血球の表面上において発現される。これらの受容体は、免疫グロブリン（Ｉｇ）のＦｃ部分に結合し、例えば、Ｆｃγ受容体はＩｇＧのＦｃ部分に結合する。この結合は、抗体による抗原の認識と細胞に基づくエフェクター機構とを結び付けることによって免疫機能に寄与することに役立つ。異なる免疫グロブリンクラスは、免疫グロブリンＦｃ領域と免疫細胞上の特異的Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）との特異な相互作用を介して、異なるエフェクター機構を誘発する。活性化Ｆｃγ受容体には、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＣ、およびＦｃγＲＩＩＩＡが含まれる。ＦｃγＲＩＩＢは、抑制性Ｆｃγ受容体と考えられる。（レビューのために、例えば、ウフ（Ｗｏｏｆ）ら（２００４年）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４（２）：８９−９９、バウマン（Ｂａｕｍａｎｎ）ら（２００３年）Ａｒｃｈ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｈｅｒ  Ｅｘｐ  （Ｗａｒｓｚ）５１（６）：３９９−４０６；パン（Ｐａｎ）ら（２００３年）Ｃｈｉｎ  Ｍｅｄ  Ｊ（Ｅｎｇｌ）１１６（４）：４８７−９４；タカイ（Ｔａｋａｉ）ら（１９９４年）Ｃｅｌｌ７６：５１９−５２９；ラヴェチ（Ｒａｖｅｔｃｈ）ら（２００１年）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９：２７５−２９０（そのそれぞれの開示内容全体は参照により本明細書に援用される）を参照のこと）。
【００１７】
理論にとらわれずに述べると、本発明者らは、本発明の抗体およびフラグメントにＦｃ受容体結合領域が存在すると、Ｆｃ受容体を有する細胞の存在下で、ＮＫ細胞溶解の阻害が引き起こされると考えている。Ｆｃ受容体結合領域を欠くそれらの抗体およびフラグメントは、それらの細胞表面においてＨＬＡ−ＥまたはＱａ１ｂを有する標的細胞のＮＫ細胞溶解を再構築することが可能である。そのような標的細胞は、典型的に、ＨＬＡ−ＥまたはＱａ１ｂとＮＫＧ２Ａ受容体との相互作用を介するＮＫ細胞溶解に対して保護される。
【００１８】
本発明はまた、本発明の抗体およびフラグメントを含んでなる組成物、ならびに異なる疾患および障害を処置するためのそのような組成物を利用する治療方法を提供する。本発明は、ヒトＮＫＧ２Ａに対する抗体またはそのフラグメントの活性、毒性および適切な投与規則を評価ならびに特徴付けするために非ヒト霊長類を使用するための方法をさらに提供する。
【００１９】
従って、１つの態様では、本発明は：ａ）ＮＫＧ２Ａに特異的に結合すること；ｂ）Ｆｃ受容体には特異的に結合しないこと；およびｃ）ヒトＮＫ細胞上のＮＫＧ２Ａに結合する場合、前記ＮＫ細胞に、標的細胞表面にＨＬＡ−ＥまたはＱａ１ｂを有する標的ヒト細胞を溶解させることであって、前記標的細胞は前記ＮＫ細胞に接触すること、を特徴とするモノクローナル抗体またはそのフラグメントである活性化抗体を提供する。好ましくは、モノクローナル抗体またはフラグメントは、他のヒトＮＫＧ２受容体、具体的には、活性化受容体ＮＫＧ２ＣまたはＮＫＧ２Ｅに結合しない。本発明の抗体またはフラグメントがＺ１９９もしくはＺ２７０から選択される抗ＮＫＧ２モノクローナルと完全に競合することが、さらにより好適である。
【００２０】
１つの好適な実施態様では、モノクローナル抗体またはそのフラグメントは非ヒト霊長類ＮＫＧ２Ａに結合することが可能である。非ヒト霊長類ＮＫ細胞上のＮＫＧ２Ａに結合する際、モノクローナル抗体またはそのフラグメントは、標的細胞が前記ＮＫ細胞に接触する場合に前記標的細胞表面上にＨＬＡ−Ｅを有する標的非ヒト霊長類細胞の溶解を再構成する能力を有することが、さらにより好適である。
【００２１】
別の好適な実施態様では、モノクローナル抗体またはそのフラグメントは、Ｚ２７０の可変重鎖領域またはＺ２７０の可変軽鎖領域のアミノ酸配列を含んでなる。代替的に好適な実施態様では、モノクローナル抗体またはそのフラグメントは、Ｚ１９９の可変重鎖領域またはＺ１９９の可変軽鎖領域のアミノ酸配列を含んでなる。
【００２２】
なお別の好適な実施態様では、モノクローナル抗体またはそのフラグメントは、Ｆｃ受容体への結合を防止するように改変されているマウスもしくはヒトＩｇＧ１定常領域、またはヒトＩｇＧ４定常領域を含んでなる。
【００２３】
別の好適な実施態様では、抗体またはフラグメントはキメラもしくはヒト化されたものである。ｃｈ２７０ＶＫもしくはｃｈ２７０ＶＨを含んでなる抗体またはそのフラグメントが、より好適である。
【００２４】
別の実施態様では、そのフラグメントの抗体は、そのバイオアベイラビリティまたはインビボでの安定性を増強するように誘導体化される。別の実施態様では、抗体はＰＥＧで誘導体化される。
【００２５】
本発明の活性化抗体およびフラグメントは、ＮＫ細胞媒介溶解に対して通常耐性である所定の標的細胞の溶解を再構成するのに有用である。従って、別の実施態様では、本発明は、ＮＫ細胞および標的細胞を含んでなる集団における前記標的細胞のＮＫ細胞媒介溶解を再構成する方法であって、ここで、前記ＮＫ細胞は、その表面上のＮＫＧ２Ａによって特徴付けられ、そして前記標的細胞は、その表面上のＨＬＡ−ＥまたはＱａ１ｂの存在によって特徴付けられ、前記ＮＫ細胞と上記のモノクローナル抗体またはフラグメントとを接触させる工程を含んでなる方法を提供する。好ましくは、標的細胞はヒト細胞である。より好ましくは、標的細胞は、樹状細胞（「ＤＣ」）、癌細胞またはウイルス感染細胞である。最も好ましくは、標的は成熟樹状細胞（「ｍＤＣ」）である。
【００２６】
活性化抗体およびそのフラグメントは、薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤をさらに含んでなる組成物に処方されていてもよい。そのような組成物は、薬学的投与に適切であるように処方されていてもよい。医薬組成物は、場合により、処置する特定の疾患または病態に有用な第２の治療用薬剤を含んでもよい。そのようなすべての組成物もまた、本発明の一部である。
【００２７】
本発明の活性化抗体組成物を利用して、患者において、自己免疫（ａｔｕｏｉｍｍｕｎｅ）もしくは炎症性障害、または免疫応答を処置または防止してもよく；あるいは患者において、その表面上においてＨＬＡ−ＥまたはＱａ１ｂを発現する癌細胞の存在によって特徴付けられる癌、またはその表面上においてＨＬＡ−ＥまたはＱａ１ｂを発現するウイルス感染細胞の存在によって特徴付けられるウイルス性疾患を処置してもよい。これらの方法は、処置する特定の疾患または病態に有用な第２の治療用薬剤を患者に投与する工程をさらに含んでもよい。第２の治療用薬剤は、個別の剤形としてまたは前記組成物の一部としていずれで投与してもよい。
【００２８】
１つの実施態様では、本発明の活性化抗体またはフラグメントを含んでなる組成物ならびに該活性化抗体またはフラグメントを利用する方法における第２の治療用薬剤は、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、およびＮＫｐ４６のようなＮＫ細胞受容体の活性化を作動する化合物である。別の実施態様では、第２の治療用薬剤は、インヒビターＫＩＲ受容体のような抑制性ＮＫ細胞受容体のアンタゴニストである。別の実施態様では、第２の治療用薬剤はＴＧＦ−β１のアンタゴニストである。別の実施態様では、第２の治療用薬剤は、サイトカインインヒビター、造血成長因子、鎮痛剤、インスリン、抗炎症剤、および免疫抑制薬よりなる群から選択される。別の実施態様では、第２の治療用薬剤は、抗癌化合物または制吐剤である。別の実施態様では、第２の治療用薬剤は抗ウイルス化合物である。
【００２９】
別の実施態様では、防止もしくは処置しようとする自己免疫または炎症性障害は、自己免疫性溶血性貧血、悪性貧血、結節性多発動脈炎、全身性エリテマトーデス、ウェゲナー肉芽腫症、アルツハイマー病、自己免疫性肝炎、ベーチェット病、クローン病、原発性胆汁性肝硬変（ｐｒｉｍａｒｙ  ｂｉｌａｒｙ  ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、強皮症、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、１型糖尿病、ぶどう膜炎、グレーブス病、甲状腺炎、１型糖尿病、心筋炎、リウマチ熱、強皮症、強直性脊椎炎、関節リウマチ、糸球体腎炎、サルコイドーシス、皮膚筋炎、重症筋無力症、多発性筋炎、ギラン・バレー症候群、多発性硬化症、円形脱毛症、天疱瘡／類天疱瘡、乾癬、および白斑よりなる群から選択される。
【００３０】
別の態様では、本発明は：ａ）ＮＫＧ２Ａに特異的に結合すること；ｂ）Ｆｃ受容体に特異的に結合すること；ｃ）ＮＫＧ２ＣもしくはＮＫＧ２Ｅには結合しないこと；ｄ）Ｚ２７０もしくはＺ１９９との完全な競合；ｅ）ＮＫ細胞感受性標的細胞のＮＫ細胞溶解を阻害することが可能であることによって特徴付けられる阻害モノクローナル抗体またはその阻害フラグメントを提供し、ここで、前記架橋モノクローナル抗体はＺ１９９ではない。１つの好適な実施態様では、阻害抗体は非ヒト霊長類ＮＫＧ２Ａに結合することをさらに特徴とする。
【００３１】
より好適な実施態様では、阻害抗体またはそのフラグメントは、Ｚ２７０の可変軽鎖領域またはＺ２７０の可変重鎖領域のアミノ酸配列を含んでなる。最も好適な実施態様の１つでは、抗体はＺ２７０である。
【００３２】
別の好適な実施態様では、阻害抗体またはフラグメントはキメラもしくはヒト化である。ｃｈ２７０ＶＫもしくはｃｈ２７０ＶＨを含んでなる阻害抗体またはその阻害フラグメントが、より好適である。別の最も好適な実施態様では、抗体はｃｈＺ２７０またはＺ２７０である。
【００３３】
別の実施態様では、本発明は、有効量の上記の阻害抗体もしくはその阻害フラグメント、またはＺ１９９；および薬学的に許容可能なキャリアもしくは賦形剤を含んでなる組成物を提供する。これらの阻害抗体組成物は、好ましくは、医薬用途のために処方される。
【００３４】
本発明の阻害抗体組成物は、場合により、他の細胞の所望されないＮＫ細胞媒介溶解、過剰反応のＮＫ細胞活性、または所望されないＮＫ細胞増殖によって特徴付けられる疾患または病態を処置するのに有用な第２の治療用薬剤（ｔｈｅｒａｐｕｅｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）を含んでなる。そのような第２の治療用薬剤（ｔｈｅｒａｐｕｅｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）は、例えば、サイトカイン、抗癌化合物（例えば、化学療法化合物（ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｕｅｔｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）、抗血管新生化合物（ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｅｎｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）、アポトーシス促進化合物、ホルモン剤、ＤＮＡ複製、有糸分裂および／もしくは染色体分離を妨害する化合物、またはポリヌクレオチド前駆体の合成および正確性を崩壊する薬剤）、補助化合物、抑制性ＮＫ細胞受容体を刺激することが可能な化合物（例えば、天然のリガンド、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ受容体の活性を刺激することができる抗体もしくは小分子、またはＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ３ＤＬ１、およびＫＩＲ３ＤＬ２のような抑制性ＫＩＲ受容体）、あるいは活性化ＮＫ細胞受容体（例えば、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、またはＮＫｐ４６）のインヒビターから選択され得る。
【００３５】
本発明の阻害抗体およびフラグメントは、細胞のＮＫ細胞媒介溶解を減少する方法において利用してもよい。あるいは、本発明の阻害抗体およびフラグメントは、細胞集団におけるＮＫ細胞の数を減少する方法において利用してもよい。これらの方法の両方とも、前記ＮＫ細胞と、インヒビターモノクローナル抗体またはフラグメントとを接触させる工程を含んでなる。
【００３６】
阻害抗体を含んでなる薬学的に適切な本発明の組成物は、他の細胞の所望されないＮＫ細胞媒介溶解、過剰反応のＮＫ細胞活性、もしくは所望されないＮＫ細胞増殖によって特徴付けられる病態または障害を患う患者を処置あるいは防止する方法において用いてもよく、前記方法は、前記組成物を患者に投与する工程を含んでなる。そのような１つの病態はＮＫ−ＬＤＧＬである。ＮＫ−ＬＤＧＬ（ＮＫ型顆粒リンパ球増多症；あるいはＮＫ−ＬＧＬと呼ばれる）は、ＮＫ細胞またはＮＫ様細胞、即ち、表面抗原発現（例えば、ＣＤ３−、ＣＤ５６＋、ＣＤ１６＋など；例えば、ラフラン（Ｌｏｕｇｈｒａｎ）（１９９３年）Ｂｌｏｏｄ８２：１を参照のこと）の特徴的組み合わせを示す大顆粒リンパ球のクローン発現によって引き起こされる増殖性障害のクラスを指す。
【００３７】
代替的実施態様では、本発明の阻害抗体を利用する方法のいずれも、第２の治療用薬剤を前記患者に投与するさらなる工程を含んでなり得る。本発明の阻害抗体組成物は、場合により、他の細胞の所望されないＮＫ細胞媒介溶解、過剰反応のＮＫ細胞活性、または所望されないＮＫ細胞増殖によって特徴付けられる疾患または病態を処置するのに有用な第２の治療用（ｔｈｅｒａｐｕｅｔｉｃ）薬剤を含んでなる。そのような薬剤の例は上記に記載されている。第２の治療用薬剤は、個別の剤形としてまたは阻害抗体またはフラグメント組成物の成分として投与され得る。
【００３８】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の抗体またはそのフラグメントのいずれか１つもしくはそれ以上を含んでなるキットを提供する。典型的に、キットはまた、本発明の方法に従う抗体を使用するための指示書を含んでなる。関連の実施態様では、キットは、個別の容器において、多様な疾患もしくは病態の処置または防止における活性化あるいは阻害抗体またはフラグメントのいずれかとの共同での使用のための上記のいずれかのような第２の治療用薬剤をさらに含んでなる。
【００３９】
別の態様に従えば、本発明は：ａ）前記抗体と、その表面上のＮＫＧ２Ａによって特徴付けられる非ヒト霊長類細胞、または非ヒト霊長類ＮＫＧ２Ａポリペプチドとを接触させる；およびｂ）前記細胞もしくはポリペプチドに結合するかまたはその活性に影響を及ぼす前記抗体の能力を評価する工程を含んでなる、ヒトＮＫＧ２Ａに対する抗体を評価する方法を提供する。関連の実施態様では、方法は活性化抗体を評価するために使用され；前記抗体は、非ヒト霊長類ＮＫ細胞および標的細胞を含んでなる細胞集団と接触され、ここで、前記ＮＫ細胞はその表面上のＮＫＧ２Ａによって特徴付けられ、そして前記標的細胞はその表面上のＨＬＡ−Ｅの存在によって特徴付けられ、そして前記評価工程は前記標的細胞が溶解されるかどうかを決定する。
【００４０】
別の実施態様では、本発明は、ヒトの疾患処置における使用に適切な抗体を産生させる方法を提供し、前記方法は次を含んでなる：ａ）ヒトＮＫＧ２Ａを含んでなる組成物で非ヒト哺乳動物を免疫する工程；ｂ）ＮＫＧ２Ａに結合するが、ＮＫＧ２ＣまたはＮＫＧ２Ｅに結合しないモノクローナル抗体を選択する工程；ｃ）前記抗体をヒトにおける使用に適切にする工程；ｄ）非ヒト霊長類に前記抗体を投与する工程；ならびにｅ）前記霊長類においてインビボでＮＫＧ２Ａに結合する前記抗体の能力および前記抗体に対する前記霊長類の忍容性を評価する工程。抗体が結合し、前記非ヒト霊長類に忍容される場合、それは、前記抗体がヒトの疾患処置における使用に適切であることを示す。好適な実施態様では、方法は、工程ｄの前にＦｃ受容体に結合しないように前記抗体を改変するさらなる工程を含んでなる。
【００４１】
本発明はまた、この方法によって産生される抗体も提供する。
【００４２】
なお別の実施態様では、ヒトＮＫＧ２Ａに対して指向された治療用抗体に適切な投与規則を同定する方法を提供し、前記方法は次を含んでなる：ａ）前記抗体の用量または回数が変更される一連の投与規則を使用して、前記抗体を非ヒト霊長類に投与する工程；ならびにｂ）前記非ヒト霊長類におけるＮＫＧ２Ａ発現細胞の活性および前記投与規則のそれぞれについての前記霊長類の忍容性を決定する工程。一旦、規則が前記霊長類に忍容され、ＮＫＧ２Ａ発現細胞の前記活性における検出可能なモジュレーションをもたらすことが決定されると、該投与規則はヒトにおける使用に適切であるとみなされる。
【００４３】
代替的実施態様に従えば、本発明は：ａ）抑制性または活性化抗体、およびｂ）細胞障害性薬剤を含んでなるコンジュゲートを提供する。得られるコンジュゲートは、ＮＫ細胞を死滅させるために使用される。従って、活性化抗体のみによって達成される該細胞の活性化とは対照的に、活性化抗体と細胞障害性薬剤とのコンジュゲーションにより、ＮＫ細胞を死滅させる分子が産生される。本発明の細胞毒素／抗体コンジュゲートは、組成物に処方して、本発明の阻害抗体に類似の様式における方法で使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】ＮＫ細胞対ＰＨＡ芽球の様々な比におけるＨＬＡ−Ｅ発現ＰＨＡ芽細胞のＮＫ細胞溶解に対する異なる３つの濃度のＺ２７０の効果を示す。
【図２】ＮＫ細胞対ＰＨＡ芽球の様々な比におけるＨＬＡ−Ｅ発現ＰＨＡ芽細胞のＮＫ細胞溶解に対する異なる３つの濃度のＺ１９９の効果を示す。
【図３】ＨＬＡ−Ｅ発現ＰＨＡ芽細胞のＮＫ細胞溶解に対するＺ２７０のＦ（ａｂ’）２フラグメントの効果を示す。
【図４】Ｚ２７０がカニクイザルＮＫ細胞に結合することを実証する、抗体Ｚ２７０ならびにＩｇＧ１および抗ＣＤ１６のカニクイザルＮＫ細胞への結合を示す。結合はまた、アカゲザルおよびヒヒについても示された。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
緒論
本発明は、それらの細胞表面上にＨＬＡ−ＥまたはＱａ１ｂを発現する細胞の存在によって特徴付けられる標的細胞のＮＫ細胞媒介溶解を活性化するＮＫＧ２Ａに対する新規の抗体、治療用途のために該抗体を産生させ、評価し、特徴付けるための方法；ならびに自己免疫または炎症性障害および樹状細胞のようなそれらの細胞表面上にＨＬＡ−ＥまたはＱａ１ｂを発現する細胞の存在によって特徴付けられる他の病態の処置のために該抗体を含んでなる組成物および該抗体を使用する方法を提供する。本発明は、部分的に、ＮＫＧ２Ａが多くのＮＫ細胞による成熟樹状細胞の溶解を阻害するための主因を有するという驚くべき発見に基づく。成熟樹状細胞は、ＮＫ細胞上に存在するＮＫＧ２Ａ受容体を介して作用し、樹状細胞の標的化を阻害する有意なレベルのＨＬＡ−Ｅを発現する。従って、以下の理論にとらわれずに述べると、ＮＫ細胞のＮＫＧ２Ａ媒介阻害を阻止することは、ＮＫ細胞による樹状細胞標的化の増加をもたらし、それによって、自己免疫または炎症性障害あるいは樹状細胞、特に、成熟樹状細胞の活性を減少することによって緩和もしくは治癒され得る実にあらゆる病態の有効な処置を提供すると考えられる。従って、本発明はまた、より一般的には、哺乳動物における樹状細胞、好ましくは、成熟樹状細胞の数を阻害または減少させる、ならびに一般的に、免疫応答、好ましくは、自己反応性免疫応答を減少させるような方法を提供する。
【００４６】
逆に言えば、本発明はまた、標的細胞のＮＫ細胞媒介溶解を阻害するＮＫＧ２Ａに対する新規の抗体、治療用途のための該抗体を産生させ、評価し、特徴付ける方法；ならびに自己免疫障害または移植拒絶の処置のための該抗体を含んでなる組成物および該抗体を使用する方法を提供する。
【００４７】
定義
本明細書において使用される以下の用語は、他で指定しない限り、それらに帰属する意味を有する。
【００４８】
明細書に記載の「ＮＫ」細胞は、従来にない免疫に関与するリンパ球のサブ集団を指す。ＮＫ細胞は、ＣＤ１６、ＣＤ５６、および／またはＣＤ５７を含む特異的表面抗原の発現、細胞表面におけるα／βまたはγ／δＴＣＲ複合体の不在、特定の細胞溶解性酵素の活性化により、「自己の」ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原を発現することができない細胞に結合して死滅させる能力、腫瘍細胞またはＮＫ活性化受容体に対するリガンドを発現する他の罹患した細胞を死滅させる能力、ならびに免疫応答を刺激または阻害するサイトカインと呼ばれるタンパク質分子を放出する能力のような所定の特徴ならびに生物学的特性によって同定することができる。当該分野において周知の方法を使用してＮＫ細胞を同定するために、これらの特徴および活性のいずれかを使用することができる。
【００４９】
樹状細胞は、骨髄において産生される異種集団の免疫細胞である（例えば、オニール（Ｏ’Ｎｅｉｌｌ）ら（２００４年）Ｂｌｏｏｄ  １０４：２２３５−２２４６、モハマデゼ（Ｍｏｈａｍａｄｚａｄｅｈ）ら（２００４年）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｂａｓｅｄ  Ｔｈｅｒ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ．２００４；２：１を参照のこと；その開示内容全体は参照により本明細書に援用される）。本明細書において言及されるとおり、ＤＣは、ＤＣ前駆体、未熟ＤＣ、および成熟ＤＣを含むことができる。ＤＣ前駆体および未熟ＤＣは、リネージネガティブ（ＣＤ３−  ＣＤ１４−  ＣＤ１９−  ＣＤ５６−）ＨＬＡ−ＤＲ＋単核細胞である。これらの細胞は、さらに２つの集団、骨髄由来ＤＣおよび形質細胞様ＤＣに分類することができる。骨髄由来ＤＣはＣＤ１１ｃ＋およびＣＤ１２３ｌｏｗであり、単球様外観を呈し、形質細胞様ＤＣは、形質細胞に類似の形態学的特徴を伴うＣＤ１１ｃ−およびＣＤ１２３ｈｉｇｈである。抗原捕捉後、ＤＣは、捕捉された抗原がペプチドにプロセシングされ、細胞表面上での提示のためにＭＨＣクラスＩまたはＩＩ上に装填される成熟のプロセスを経験する。成熟ＤＣは、より低い食細胞内への取り込みを示し、ベールと呼ばれる細胞質伸長を有し、リンパ組織へ移動し、ＣＤ８３およびＤＣ−ＬＡＭＰのような特徴的マーカーを発現する。ＴＬＲもまたＤＣにおいて発現され、異なるＤＣ型は異なるＴＬＲマーカーを発現する（例えば、オニール（Ｏ’Ｎｅｉｌｌ）ら（２００４年）を参照のこと）。
【００５０】
ＮＫＧ２Ａ（ＯＭＩＭ１６１５５５、その開示内容全体は参照により本明細書に援用される）は、ＮＫＧ２グループの転写物のグループである（ホーチンス（Ｈｏｕｃｈｉｎｓ）ら（１９９１年）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３；１０１７−１０２０）。ＮＫＧ２Ａは、いくつかの他と異なるスプライシングを示す２５ｋｂに及ぶ７つのエキソンによってコードされる。ＮＫＧ２ＡはＮＫ細胞の表面上において見出される抑制性受容体である。抑制性ＫＩＲ受容体のように、それは、その細胞質ドメインにおいてＩＴＩＭを所有する。本明細書において使用する「ＮＫＧ２Ａ」は、ＮＫＧ２Ａ遺伝子またはコードされるタンパク質の任意の変種、誘導体、もしくはアイソフォームを指す。また、野生型、全長ＮＫＧ２Ａと１つもしくはそれ以上の生物学的特性または機能を共有し、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸同一性を共有する任意の核酸あるいはタンパク質配列も包含する。ＮＫＧ２Ａはまた、本開示全般を通して「ＮＫＧ２Ａ受容体」とも称される。
【００５１】
ＮＫＧ２Ｃ（ＯＭＩＭ６０２８９１、その開示内容全体は参照により本明細書に援用される）およびＮＫＧ２Ｅ（ＯＭＩＭ６０２８９２、その開示内容全体は参照により本明細書に援用される）は、ＮＫＧ２グループの転写物の他の２つのメンバーである（ギレンケ（Ｇｉｌｅｎｋｅ）ら（１９９８年）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ４８：１６３−１７３）。ＮＫＧ２ＣおよびＮＫＧ２ＥはＮＫ細胞の表面上において見出される活性化受容体である。本明細書において使用する「ＮＫＧ２Ｃ」および「ＮＫＧ２Ｅ」は、ＮＫＧ２ＣもしくはＮＫＧ２Ｅ遺伝子あるいはそれぞれコードされるタンパク質の任意の変種、誘導体、またはアイソフォームを指す。また、野生型、全長ＮＫＧ２ＣまたはＮＫＧ２Ｅと１つもしくはそれ以上の生物学的特性または機能を共有し、開示される遺伝子またはコードされるタンパク質と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸同一性を共有する任意の核酸あるいはタンパク質配列も包含する。
【００５２】
ＣＤ９４（ＯＭＩＭ６０２８９４、その開示内容全体はそのすべてが参照により本明細書に援用される）。ＣＤ９４、ＮＫ細胞上において好適に発現される抗原（チャン（Ｃｈａｎｇ）ら（１９９５年）Ｅｕｒｏｐ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．２５：２４３３−２４３７）。ＣＤ９４は、ＮＫ細胞系統において０．８、１．８、および３．５ｋｂの３つの多数の転写物および５．５ｋｂの少数の転写物として発現され、１４７アミノ酸細胞外ドメインおよびＣ−型レクチンに特徴的ないくらかのモチーフを伴うタンパク質をコードする。ＣＤ９４のアミノ酸配列は、ＮＫＧ２ファミリーメンバーＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、およびＮＫＧ２Ｅのそれらに対して２７〜３２％同一である。細胞質ドメインの実際上の不在のため、ＣＤ９４は、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、およびＮＫＧ２Ｅとジスルフィド結合型ヘテロダイマーを形成する他の受容体との会合を必要とする（ラゼティック（Ｌａｚｅｔｉｃ）ら（１９９６年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１５７：４７４１−４７４５。本明細書において使用する「ＣＤ９４」は、ＣＤ９４遺伝子またはコードされるタンパク質の任意の変種、誘導体、もしくはアイソフォームを指す。また、野生型、全長ＣＤ９４と１つもしくはそれ以上の生物学的特性または機能を共有し、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸同一性を共有する任意の核酸あるいはタンパク質配列も包含する。
【００５３】
ＨＬＡ−Ｅ（ＯＭＩＭ１４３０１０、その開示内容全体は参照により本明細書に援用される）は、細胞表面上に発現され、他のＭＨＣクラスＩ分子のシグナル配列から誘導されるペプチドの結合によって調節される非古典的ＭＨＣ分子である。ＨＬＡ−Ｅは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞ならびにいくつかのＴ細胞に結合して、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ、およびＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃに特異的に結合するが、抑制性ＫＩＲ受容体には結合しない（例えば、ＯＭＩＭ６０４９３６（その開示内容全体は参照により本明細書に援用される）を参照のこと）（例えば、ブラウド（Ｂｒａｕｄ）ら（１９９８年）Ｎａｔｕｒｅ３９１：７９５−７９９（その開示内容全体は参照により本明細書に援用される）を参照のこと）。ＨＬＡ−Ｅの表面発現は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ＋ＮＫ細胞クローンによる溶解から標的細胞を保護するのに十分である。本明細書において使用する「ＨＬＡ−Ｅ」は、ＨＬＡ−Ｅ遺伝子またはコードされるタンパク質の任意の変種、誘導体、もしくはアイソフォームを指す。また、野生型、全長ＨＬＡ−Ｅと１つもしくはそれ以上の生物学的特性または機能を共有し、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸同一性を共有する任意の核酸あるいはタンパク質配列も包含する。
【００５４】
Ｑａ１ｂは、ＮＫＧ２Ａのための生理学的リガンドであるマウス細胞表面抗原である。本明細書において使用する「Ｑａ１ｂ」は、Ｑａ１ｂ遺伝子またはコードされるタンパク質の任意の変種、誘導体、もしくはアイソフォームを指す。また、野生型、全長Ｑａ１ｂと１つもしくはそれ以上の生物学的特性または機能を共有し、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸同一性を共有する任意の核酸あるいはタンパク質配列も包含する。
【００５５】
「自己免疫」障害は、自己と非自己もしくは他のものとを識別する能力の破壊のため、免疫系が自己の細胞または組織に対する反応を展開する任意の障害、病態、あるいは疾患を含む。自己免疫障害の例として、橋本病、悪性貧血、アジソン病、Ｉ型糖尿病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、ライター症候群、グレーブス病、多発性筋炎、ギラン・バレー、ウェゲナー肉芽腫症（Ｗｅｇｅｎｅｒ’ｓ  ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｏｓｕｓ）、結節性多発動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、側頭動脈炎、ベーチェット病（Ｂｅｃｈｅｔ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、チャーグ・ストラウス症候群、高安動脈炎などが挙げられる。「炎症性障害」は、消耗されない免疫応答によって特徴付けられる任意の障害を含む。自己免疫および炎症性障害は、免疫系の任意の成分に関与し得、身体の任意の細胞または組織型を標的化し得る。
【００５６】
ＮＫＧ２Ａ活性に関して、用語「阻害する」、「減少する」、「阻止する」、「ダウンモジュレートする」および「ダウンレギュレートする」は、細胞、好ましくは、ＮＫ細胞上のＮＫＧ２Ａ受容体の刺激もしくは発現を減速、減少、逆転、または任意の方法でネガティブに影響を及ぼす任意のプロセス、方法、あるいは化合物を指す。これらの用語は、リガンドの非存在下でアンタゴニストのように作用して、受容体の活性を減少するか、受容体の発現レベルを減少するか、ＮＫＧ２Ａによって誘発されるシグナル伝達もしくは遺伝子発現を阻止するか、またはＮＫＧ２Ａ活性化から生じる細胞の他の任意の活性を阻止するリガンドによってＮＫＧ２Ａの刺激を阻害する化合物を指し得る。好適な実施態様では、阻害化合物または方法は、リガンド、例えば、ＨＬＡ−Ｅによる受容体の結合を防止する。ＮＫＧ２Ａ受容体分子の数または上記の活性のいずれも、例えば、本出願において他に開示されているような任意の標準的な方法で測定することができる。
【００５７】
本明細書において使用する用語「抗体」は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を指す。重鎖の定常ドメインのタイプに依存して、抗体は、５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭのうちの１つに割り当てられる。これらのうちのいくらかは、さらに、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４などのようなサブクラスまたはイソタイプに分けられる。例示的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、四量体を含んでなる。各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一な対よりなり、各対は、１本の「軽」（約２５ｋＤａ）および１本の「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のＮ末端は、主に抗原認識を担う約１００〜１１０もしくはそれ以上のアミノ酸の可変領域を規定する。用語「可変軽鎖（ＶＬ）」および「可変重鎖（ＶＨ）」は、それぞれ、これらの軽および重鎖を指す。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ「α」、「δ」、「ε」、「γ」および「μ」と呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および３次元構造が周知である。ＩｇＧおよび／またはＩｇＭは生理学的状況において最も一般的な抗体であるため、およびそれらは実験施設において最も容易に作製されるため、それらは本発明において用いられる好適なクラスの抗体であり、ＩｇＧが特に好適である。
【００５８】
好ましくは、本発明の抗体はモノクローナル抗体である。ヒト化、キメラ、ヒト、またはそれ以外のヒトに適切な抗体が特に好適である。用語「抗体」はまた、本開示物に関して、そのような包含が重複を引き起こす場合（例えば、「抗体またはそのフラグメント」に対する具体的言及）を除いて、本明細書に記載の抗体のいずれかの任意のフラグメントまたは誘導体を含む。１つの好適な実施態様では、抗体は非枯渇化抗体であり、それらは、ＮＫ細胞に結合し、ＮＫＧ２Ａ刺激を阻害する（それらの細胞表面上にＨＬＡ−ＥまたはＱａ１ｂを有する細胞の溶解をもたらす）が、ＮＫＧ２Ａ発現細胞の死滅をもたらさないことを意味する。非枯渇化抗体または抗体フラグメントは、ＩｇＧ４抗体、Ｆｃ部分を欠く抗体フラグメント、あるいはそのＦｃテイルがＦｃ受容体による結合を減少もしくは排除するように改変されている他の任意の抗体のようなＦｃ受容体によって認識されないか、またはごく僅かにしか認識されないものである（例えば、国際公開第０３１０１４８５号パンフレット（その開示内容全体は参照により本明細書に援用される）を参照のこと）。
【００５９】
別の好適な実施態様では、抗体または抗体フラグメントはＦｃ受容体に結合する。そのような抗体およびフラグメントは、ＮＫＧ２Ａ分子の架橋を引き起こし、ＮＫ細胞活性の阻害、およびいくつかの場合、ＮＫ細胞死をもたらす。
【００６０】
用語「特異的に結合する」は、抗体が、好ましくは、競合結合アッセイにおいて、結合パートナー、例えば、ＮＫＧ２Ａに結合することができることを意味し、組換え形態のタンパク質、その中のエピトープ、または単離されたＮＫもしくは他の細胞の表面上に存在する生来のタンパク質のいずれか一方を使用して評価される。競合結合アッセイおよび特異的結合を決定するための他の方法については、以下においてさらに説明するものとし、当該分野において周知である。
【００６１】
「ヒトに適切な」抗体は、例えば、本明細書に記載の治療的方法において、ヒトにおいて安全に使用することができる任意の抗体、誘導体化された抗体、または抗体フラグメントを指す。ヒトに適切な抗体は、ヒト化、キメラ、または完全なヒト抗体、あるいは抗体の少なくとも一部が、ヒトから誘導されるか、もしくはそうでなければ、生来の非ヒト抗体が使用される場合に一般に惹起される免疫応答を回避するように改変される任意の抗体のすべてのタイプを含む。
【００６２】
本発明の目的のために、「ヒト化」抗体は、１つもしくはそれ以上のヒト免疫グロブリンの定常および可変フレームワークが、結合領域、例えば、動物免疫グロブリンのＣＤＲと融合されている抗体を指す。そのようなヒト化抗体は、結合領域が、非ヒト抗体に対する免疫反応を回避するように誘導される非ヒト抗体の結合特異性を維持するように設計される。
【００６３】
「キメラ抗体」は、（ａ）抗原結合部位（可変領域）が異なるもしくは改変されたクラス、エフェクター機能および／または種の定常領域、または新たな特性をキメラ抗体に付与する全く異なる分子、例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬物などに連結されるように、定常領域、またはその部分が改変、置き換え、または交換されるか；あるいは（ｂ）可変領域、またはその部分が、異なるもしくは改変された抗原特異性を有する可変領域で改変、置き換え、または交換される抗体分子である。
【００６４】
「ヒト」抗体は、抗原チャレンジに応答して特異的ヒト抗体を産生するように「操作」されているトランスジェニックマウスまたは他の動物から得られる抗体である（例えば、グリーン（Ｇｒｅｅｎ）ら（１９９４年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ７：１３；ロンベルグ（Ｌｏｎｂｅｒｇ）ら（１９９４年）Ｎａｔｕｒｅ３６８：８５６；テイラー（Ｔａｙｌｏｒ）ら（１９９４年）Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎ６：５７９（これらの教示内容全体は参照により本明細書に援用される）を参照のこと）。十分なヒト抗体はまた、遺伝子または染色体トランスフェクション方法、ならびにファージディスプレイ技術（これらのすべては当該分野において公知である）によっても構築することができる（例えば、マキャフェルティー（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ）ら（１９９０年）Ｎａｔｕｒｅ３４８：５５２−５５３を参照のこと）。ヒト抗体はまた、インビトロ活性化Ｂ細胞（例えば、米国特許第５，５６７，６１０号明細書および同第５，２２９，２７５号明細書（それらの全体が参照により援用される）を参照のこと）によって作製することができる。
【００６５】
本発明では、「活性な」または「活性化された」ＮＫ細胞は、生物学的に活性なＮＫ細胞、より詳細には、標的細胞を溶解する能力を有するＮＫ細胞を表す。例えば、「活性な」ＮＫ細胞は、ＮＫ活性化受容体−リガンドを発現し、「自己の」ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原（ＫＩＲ不適合細胞）を発現することができない細胞を死滅させることが可能である。そのような細胞は、本明細書において、「ＮＫ細胞感受性標的細胞」とも称される。再指向性死滅アッセイ（ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｋｉｌｌｉｎｇ  ａｓｓａｙ）における使用に適切であるそのような標的細胞の例には、Ｐ８１５およびＫ５６２細胞がある。しかし、任意の多くの細胞型を使用することができ、当該分野において周知である（例えば、シボリ（Ｓｉｖｏｒｉ）ら（１９９７年）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：１１２９−１１３６；バイタレ（Ｖｉｔａｌｅ）ら（１９９８年）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：２０６５−２０７２；ペッシノ（Ｐｅｓｓｉｎｏ）ら（１９９８年）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：９５３−９６０；ネリ（Ｎｅｒｉ）ら（２００１年）Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎ．８：１１３１−１１３５を参照のこと）。「活性な」または「活性化された」細胞はまた、遊離の細胞内カルシウムレベルの増加のサイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α・産生・のようなＮＫ活性に関連する分野において公知の他の任意の特性もしくは活性によっても同定することができる。本発明の目的のために、活性化されたＮＫ細胞は、理想的には、ＮＫＧ２Ａ受容体が刺激されず、ＮＣＲ、好ましくは、ＮＫｐ３０が刺激され、それによって、成熟樹状細胞に対する細胞の細胞障害性をもたらすＮＫ細胞を指す。
【００６６】
本明細書において使用する用語「ＮＫＧ２Ａ刺激」は、ＮＫＧ２Ａがその天然のリガンド（例えば、ＨＬＡ−ＥまたはＱａ１ｂ）またはその機能的フラグメントに結合する場合、ＮＫＧ２Ａ、例えば、ＮＫ細胞を有する細胞において生じるプロセスを指す。ＮＫＧ２Ａは抑制性受容体であるため、そのような結合はＮＫ細胞活性の阻害を引き起こすことができる。従って、「ＮＫＧ２Ａ刺激の阻害」は、ＮＫＧ２Ａのその天然のリガンドまたはその機能的フラグメントへの結合が減少されるかもしくは防止されるプロセスを指し、ここで、結合が生じるが、ＮＫ細胞活性の阻害は引き起こさない。
【００６７】
従って、ＮＫＧ２Ａに対する抗体に関して本明細書において使用する用語「活性化抗体」は、ＮＫ細胞上のＮＫＧ２Ａへの結合を介して、ＮＫＧ２Ａと標的細胞上のその天然のリガンド（例えば、ＨＬＡ−ＥもしくはＱａ１ｂ）との会合を防止するか、またはＨＬＡ−Ｅポジティブ標的によって通常媒介されるＮＫＧ２Ａ依存性シグナル伝達を防止し、それ故に、ＮＫＧ２Ａとリガンドとの会合によって引き起こされるＮＫ細胞による標的細胞の溶解の阻害を逆転する抗体を意味することが意図される。従って、活性化抗体はＮＫＧ２Ａ刺激の阻害を引き起こす。
【００６８】
ＮＫＧ２Ａに対する抗体に関して本明細書において使用する用語「阻害抗体」は、ＮＫ細胞上のＮＫＧ２Ａへの結合を介して、そうでなければ溶解される細胞を溶解するＮＫ細胞の能力の阻害を引き起こす抗体を意味することが意図される。本発明の阻害抗体は、典型的に、ＮＫ細胞においてＮＫＧ２Ａ分子の架橋を引き起こし、該ＮＫ細胞の阻害、そして時々死をもたらす。本発明のＮＫＧ２Ａに対する阻害抗体は、ＮＫＧ２Ａと、その天然のリガンドまたはその活性なフラグメントとの会合を防止し得るが、細胞を溶解するＮＫ細胞の能力は抗体によって阻害されているため、天然のリガンドを有する細胞の溶解は生じないことに留意すべきである。
【００６９】
用語「単離された」、「精製された」または「生物学的に純粋な」は、その生来の状態において見出されるように、通常、材料に伴う成分を実質的または本質的に含まない材料を指す。純度および均質度は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーのような分析化学技術を使用して、典型的に決定される。調製物に存在する優勢な種であるタンパク質が実質的に精製される。
【００７０】
本明細書において使用する用語「生物学的サンプル」として、生物学的液体（例えば、血清、リンパ、血液）、細胞サンプルまたは組織サンプル（例えば、骨髄）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は交換可能に使用され、アミノ酸残基の高分子を指す。該用語は、１つもしくはそれ以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的化学類似物であるアミノ酸高分子、ならびに天然に存在するアミノ酸高分子および天然に存在しないアミノ酸高分子に当てはまる。
【００７２】
例えば、細胞、または核酸、タンパク質、またはベクターに関して使用される場合の用語「組換え」は、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、異種核酸もしくはタンパク質の導入または生来の核酸またはタンパク質の改変によって改変されていること、あるいは、細胞が、そのようにして改変された細胞から誘導されることを示す。従って、例えば、組換え細胞は、該細胞の生来の（非組換え）形態内において見出されない遺伝子を発現するか、または他の点で異常に発現されるか、不十分に発現されるか、もしくは全く発現されない生来の遺伝子を発現する。
【００７３】
用語「と競合する」は、特定のモノクローナル抗体（例えば、Ｚ１９９もしくはＺ２７０）について言及する場合、組換えＮＫＧ２Ａ分子または表面発現ＮＫＧ２Ａ分子のいずれかを使用する結合アッセイにおいて、試験する抗体またはそのフラグメントが、該参照モノクローナル抗体（例えば、Ｚ１９９もしくはＺ２７０）のＮＫＧ２Ａへの結合を（該参照モノクローナル抗体およびＮＫＧ２Ａを含んでなるが、試験抗体を欠くコントロールと比較して）減少することを意味する。例えば、抗体が、結合アッセイにおけるＺ２７０のヒトＮＫＧ２Ａ分子への結合を減少する場合、抗体はヒトＮＫＧ２Ａ分子への結合についてＺ２７０と「競合」する。
【００７４】
本明細書において使用する用語「と完全に競合する」は、試験抗体が、参照モノクローナルと実質的または本質的に同じエピトープに結合することを意味する。
【００７５】
本明細書において使用する「有効量」は、所望される結果を達成または促進するために必要もしくは十分である任意の量を指す。いくつかの場合、有効量は治療有効量である。治療有効量は、被験体において所望される生物学的応答を促進または達成するために必要もしくは十分な任意の量である。任意の特定のアプリケーションのための有効量は、処置する疾患または病態、投与する特定の薬剤、被験体のサイズ、または疾患または病態の重症度のような因子に依存して変動し得る。当業者は、過度の実験を必要とすることなく、特定の薬剤の有効量を経験的に決定することができる。
【００７６】
非ヒト霊長類という用語は、類人猿、新世界ザル、旧世界ザル、原猿類、Ｐｏｎｇｏ  ｐｙｇｍａｅｕｓ  ｐｙｇｍａｅｕｓ（ボルネオ・オランウータン）、Ｐｏｎｇｏ  ｐｙｇｍａｅｕｓ  ａｂｅｌｉｉ（スマトラ・オランウータン）、Ｇｏｒｉｌｌａ  ｇｏｒｉｌｌａ（ニシローランドゴリラ）、Ｐａｎ  ｐａｎｉｓｃｕｓ（ボノボ）、Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ（チンパンジー）、Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ  ｖｅｒｕｓ（チンパンジー）、Ｌｅｍｕｒ  ｆｕｌｖｕｓ（チャイロキツネザル）、Ｓａｇｕｉｎｕｓ  ｆｕｓｃｉｃｏｌｌｉｓ（シロクチタマリン）、Ｓａｇｕｉｎｕｓ  ｌａｂｉａｔｕｓ（アカハラタマリン）、Ｃａｌｌｉｃｅｂｕｓ  ｍｏｌｌｏｃｈ  ｐａｌｌｅｓｃｅｎｓ（パラグアイ・ティティ（ｐａｒａｇｕａｙａｎ  ｔｉｔｉ））、Ｓａｉｍｉｒｉ  ｓｃｉｕｒｅｕｓ（リスザル）、Ａｔｅｌｅｓ  ｇｅｏｆｆｒｏｙｉ（ジェフロイクモザル）、Ｌａｇｏｔｈｒｉｘ  ｌａｇｏｔｒｉｃｈａ（ウーリーモンキー）、Ｍａｃａｃａ  ａｒｃｔｏｉｄｅｓ（ベニガオザル）、Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル）、Ｍａｃａｃａ  ｆｕｓｃａｔａ（ニホンザル）、Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ（アカゲザル）、Ｍａｃａｃａ  ｎｅｍｅｓｔｒｉｎａ（ブタオザル）、Ｍａｃａｃａ  ｎｉｇｒａ（セレベスサル）、Ｅｒｙｔｈｒｏｃｅｂｕｓ  ｐａｔａｓ（パタスモンキー）、ヒヒ、マーモセット、オマキザル、カニクイザル、ホエザル、クモザル、マンドリル、オナガザル、パタスモンキー、コロブス、テナガザル、キツネザル、アイアイ、ロリス、ブッシュベビー、およびメガネザルを含む霊長目内の任意の哺乳動物を含む。好適な実施態様では、本発明において使用される非ヒト霊長類は、類人猿ではなく、例えば、チンパンジー、ゴリラ、オランウータン、またはテナガザル以外の非ヒト霊長類である。本発明の目的のために、非ヒト霊長類を使用して行われると言えるアッセイとして、抗体が霊長類に投与されるインビボアッセイ、例えば、霊長類から採取される細胞が抗体で処置され、霊長類に戻されるエクスビボアッセイ、および霊長類から採取される細胞、タンパク質、または組織に関与するインビトロアッセイを挙げることができる。
【００７７】
非ヒト霊長類のような哺乳動物が抗ＮＫＧ２Ａ抗体の投与規則を「忍容する」と言う場合、それは、副作用が重度でない限りそれらはなお存在し得るけれども、投与が致死性ではなく、動物において任意の重度の副作用を有さないこと、および一般的に、それらより、投与による治療便益性のほうが優ることを意味する。
【００７８】
ＮＫＧ２Ａに特異的に結合する化合物を入手すること
本発明は、免疫細胞、好ましくは、ＮＫ細胞上のＮＫＧ２Ａに結合する活性化および阻害抗体の両方、ならびにそれらの同定、産生、評価および使用に関与する。そのような抗体を同定する１つの方法は、ＮＫＧ２Ａに結合することが可能であるそれらを見出すことである。一旦、特異的に結合する抗体が同定されると、例えば、ＮＫ細胞上においてＮＫＧ２Ａを阻害または活性化するそれらの能力について、それらを試験することができる。しかし、そのような結合アッセイを行うことは、本発明の実施には決して必要ではないことが理解されよう。
【００７９】
抗体のＮＫＧ２Ａへの結合を評価するために、多様なアッセイのいずれかを使用することもできる。とりわけ、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロッティング、ＢＩＡＣＯＲＥ、および他の競合アッセイに基づくプロトコルは、使用に適切であり、当該分野において周知である。
【００８０】
例えば、試験抗体が標的タンパク質またはエピトープ（例えば、ＮＫＧ２Ａもしくはその一部）の存在下でインキュベートされ、結合抗体が洗浄除去され、例えば、放射性標識、質量分析のような物理的方法、または例えば、フローサイトメトリー分析（例えば、ＦＡＣＳｃａｎ）を使用して検出される直接もしくは間接的蛍光標識を使用して、結合抗体の存在が評価される、簡単な結合アッセイを使用することができる。そのような方法は、当業者に周知である。コントロール、非特異的抗体との間に認められる量を超える結合の任意の量は、抗体が特異的に標的に結合することを示す。
【００８１】
そのようなアッセイでは、標的細胞またはヒトＮＫＧ２Ａに結合する試験抗体の能力を、同じ標的に結合する（ネガティブ）コントロールタンパク質、例えば、構造的に関連のない抗原に対して惹起される抗体、または非Ｉｇペプチドもしくはタンパク質の能力と比較することができる。任意の適切なアッセイを使用して、コントロールタンパク質に対して２５％、５０％、１００％、２００％、１０００％もしくはそれ以上増加した親和性を伴って標的細胞またはＮＫＧ２Ａに結合する抗体あるいはフラグメントは、標的を「特異的に結合する」または「特異的に相互作用する」と言い、下記の治療方法における使用に好適である。
【００８２】
１つの実施態様では、ＮＫＧ２Ａ、例えば、３Ｓ９、２０ｄ５、Ｚ２７０もしくはＺ１９９、またはその誘導体に対する（ポジティブ）コントロール抗体の結合に影響を及ぼす試験抗体の能力が評価される。別に、ＮＫＧ２Ａ、例えば、ＨＬＡ−Ｅに対する天然のリガンドの結合に影響を及ぼす試験抗体の能力が評価される。３Ｓ９については、米国特許公開第２００３／００９５９６５号明細書（その開示内容は参照により本明細書に援用される）に記載されている。３Ｓ９は、ＮＫＧ２ＣおよびＮＫＧ２Ｅ、ならびにＮＫＧ２Ａに結合する。２０ｄ５は市販の抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５０５１８、米国）である。２０ｄ５はマウスＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２ＥおよびＮＫＧ２Ｃに結合する。Ｚ１９９は、市販の抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，製品番号ＩＭ２７５０、米国）である。Ｚ２７０については、本明細書において詳細に記載している。Ｚ２７０はヒトＮＫＧ２Ａに特異的に結合するが、ヒトＮＫＧ２ＣまたはＮＫＧ２Ｅには結合しない。
【００８３】
さらに、コントロール抗体（例えば、３Ｓ９、Ｚ２７０またはＺ１９９）および試験抗体が混合され（もしくは予め吸着される）、ＮＫＧ２Ａを含有するサンプルに適用される簡単な競合アッセイを用いてもよい。特定の実施態様では、阻害型ＮＫＧ２Ａ含有サンプルに適用する前のある期間にコントロール抗体と様々な量の試験抗体（例えば、１：１０または１：１００）とを予め混合し得る。他の実施態様では、コントロールおよび様々な量の試験抗体を、抗原／標的サンプルへの曝露中に簡単に混合することができる。（例えば、非結合抗体を排除するための分離または洗浄技術を使用することによって）結合抗体と遊離抗体および（例えば、種特異的もしくはアイソタイプ特異的第二抗体を使用することによって、検出可能な標識でコントロール抗体を特異的に標識することによって、または異なる化合物間を識別するための質量分析のような物理的方法を使用することによって）コントロール抗体と試験抗体とを識別することができる限り、試験抗体がコントロール抗体の抗原への結合を減少するかどうかを決定し、試験抗体がコントロールと実質的に同じエピトープを認識することを示すことが可能である。
【００８４】
上記の競合アッセイでは、完全に関連のない抗体の存在下で（標識される）コントロール抗体の結合は、コントロール高値である。コントロール低値は、標識された（ポジティブ）コントロール抗体（例えば、３Ｓ９、Ｚ２７０またはＺ１９９）を、正確に同じタイプ（例えば、３Ｓ９、Ｚ２７０またはＺ１９９）の非標識抗体と共にインキュベートすることによって得られ、ここで、競合が生じ、標識された抗体の結合を減少する。
【００８５】
試験アッセイでは、試験抗体の存在下における標識された抗体反応性の有意な抑制は、同じエピトープ（即ち、標識されたコントロール抗体と「交差反応する」もの）を認識する試験抗体を示す。約１：１０〜約１：１００の間のコントロール：試験抗体の任意の割合で、標識されたコントロールの抗原／標的への結合を、少なくとも５０％もしくはより好ましくは７０％だけ減少する任意の試験抗体または化合物は、コントロールと実質的に同じエピトープもしくは抗原決定基に結合する抗体または化合物とみなされる。好ましくは、そのような試験抗体または化合物は、コントロールの抗原／標的への結合を少なくとも９０％だけ減少する。それにもかかわらず、コントロール抗体もしくは化合物の結合を任意の測定可能な程度で減少する任意の化合物または抗体を、本発明において使用することができる。
【００８６】
問題のモノクローナル抗体と実質的に同じエピトープに結合する１つもしくはそれ以上の抗体の同定は、抗体の競合を評価することができる様々な免疫学的スクリーニングアッセイを使用して、容易に決定することができる。そのようなアッセイは当該分野において日常的である（例えば、米国特許第５，６６０，８２７号明細書（参照により本明細書に援用される）を参照のこと）。抗体が結合するエピトープを実際に決定するのに、いずれの方法においても、問題のモノクローナル抗体と同じかまたは実質的に同じエピトープに結合する抗体を同定する必要はないことが理解されよう。
【００８７】
１つの実施態様では、競合を、フローサイトメトリー試験によって評価することができる。例えば、ＮＫＧ２Ａ／ＣＤ９４受容体を有する細胞が、最初に、受容体に特異的に結合することが既知であるコントロール抗体（例えば、３Ｓ９、Ｚ２７０またはＺ１９９）と共に、次いで、例えば、蛍光色素またはビオチンで標識されている試験抗体と共にインキュベートされる。飽和量のコントロール抗体とのプレインキュベーションで得られる結合がコントロールとのプレインキュベーションを伴わない抗体によって得られる結合（蛍光の平均）の８０％、好ましくは、５０％、４０％もしくはそれ以下である場合、試験抗体はコントロールと競合すると言う。あるいは、飽和量の試験抗体と共にプレインキュベートした細胞上の（蛍光色素またはビオチンにより）標識されたコントロールにより得られる結合が、抗体とのプレインキュベーションを伴わずに得られる結合の８０％、好ましくは５０％、４０％、もしくはそれ以下である場合、試験抗体はコントロールと競合すると言う。
【００８８】
１つの好適な例では、試験抗体が予め吸着され、抗体結合のための基質、例えば、例えば、ＮＫＧ２Ａ／ＣＤ９４受容体、または例えば、３Ｓ９によって結合されることが公知であるそのエピトープ含有部分が固定化される表面に、飽和濃度で、適用される簡単な競合アッセイを用いることができる。表面は、好ましくは、ＢＩＡＣＯＲＥチップである。次いで、コントロール抗体（例えば、３Ｓ９、Ｚ２７０またはＺ１９９）を、基質飽和濃度で表面と接触させ、コントロール抗体の基質表面結合を測定する。コントロール抗体のこの結合を、試験抗体非存在下でのコントロール抗体の基質含有表面への結合と比較する。試験アッセイでは、試験抗体の存在下における基質含有表面の結合の有意な減少は、試験抗体が同じエピトープ（即ち、コントロール抗体と「交差反応する」もの）を認識することを示す。コントロール抗体の抗原含有基質への結合を、少なくとも３０％またはより好ましくは４０％だけ減少する任意の試験抗体は、コントロール抗体と実質的に同じエピトープまたは抗原決定基に結合する抗体とみなされる。好ましくは、そのような試験抗体は、コントロール抗体の基質への結合を少なくとも５０％だけ減少する。コントロールおよび試験抗体の順序は、逆転させることができ、即ち、コントロール抗体をまず表面に結合させ、その後に、試験抗体を表面に接触させることが理解されよう。予想されるとおり、第二抗体について認められる結合の減少（抗体が交差反応しているものとみなす）は、より大きな大きさになるため、好ましくは、まず、基質抗原に対してより高い親和性を有する抗体を、基質含有表面に結合させる。そのようなアッセイのさらなる例は、サウナル（Ｓａｕｎａｌ）ら、（１９９５年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ１８３：３３−４１（その開示内容は本明細書において参照により援用される）において提供される。
【００８９】
好ましくは、ＮＫＧ２Ａを認識する本発明に従うモノクローナル抗体は、自己免疫もしくは炎症性障害を伴う患者における実質的百分率のＮＫ細胞上に存在するエピトープと反応するが、他の細胞、即ち、ＮＫＧ２Ａを発現しない免疫または非免疫細胞とは有意には反応しない。従って、一旦、ＮＫ、好ましくは、ヒトＮＫ細胞のような細胞上のＮＫＧ２Ａを特異的に認識する抗体が同定されると、自己免疫または炎症性障害を伴う患者から採取されるＮＫ細胞に結合するその能力について、それを試験することができる。同様に、本方法は、例えば、ＮＫＧ２Ａの異なるエピトープまたはアイソフォームに対して指向される複数の抗体を使用して、ＮＫＧ２Ａの刺激を最大限に阻害するように設計された方法で、実践することができることが理解されよう。１つの実施態様では、ＮＫ細胞および樹状細胞が、抗体または化合物の投与前に患者から採取され、樹状細胞の溶解のＮＫＧ２Ａ媒介阻害を克服する試験抗体の能力が評価される。
【００９０】
他の抗原（例えば、他の種由来のＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、Ｆｃ受容体）への特異的結合または特異的結合の欠如を測定しなければならない本発明のそれらの実施態様では、上記に類似のアッセイを用いて、ＮＫＧ２Ａの代わりに適切な抗原を用い、結合がアッセイされる抗原に特異的であるコントロール抗体を用いてもよい。そのような抗原およびコントロール抗体は当該分野において周知であり、多くが市販されている。
【００９１】
ＮＫＧ２Ａ刺激を阻害する抗体の能力を評価すること
ＨＬＡ−ＥまたはＱａ１ｂによるＮＫＧ２Ａ／ＣＤ９４の刺激を阻害することが可能である本発明の活性化抗体の同定は、一般に、試験抗体の存在下でＮＫＧ２Ａ活性を評価するための細胞に基づくアッセイに関与する。いくつかの実施態様では、候補抗体が、最初に、上記のようなＮＫＧ２Ａに結合するそれらの能力に基づいて同定される。他の実施態様では、細胞に基づくスクリーニングが実施され、それらの結合親和性にかかわらず、ＮＫＧ２Ａ刺激を阻害することが可能な抗体が直接同定される。
【００９２】
１つの実施態様では、ＮＫＧ２Ａのモジュレーターが、米国特許公開第２００３／０１７１２８０号明細書；ブラウド（Ｂｒａｕｄ）ら（１９９８年）Ｎａｔｕｒｅ３９１：７９５−７９９；リー（Ｌｅｅ）ら（１９９８年）ＰＮＡＳ９５：５１９９−５２０４；バンス（Ｖａｎｃｅ）ら（２００２年）ＰＮＡＳ９９：８６８−８７３；ブルックス（Ｂｒｏｏｋｓ）ら（１９９９年）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ１６２：３０５−３１３；ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）らＪ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００３年）１７１：１３６９−７５；ブルックス（Ｂｒｏｏｋｓ）ら（１９９７年）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ１８５：７９５−８００；バン・ベネデン（Ｖａｎ  Ｂｅｎｅｄｅｎ）ら（２００１年）４３０２−４３１１；米国特許公開第２００３／００９５９６５号明細書（そのそれぞれの開示内容全体は参照により本明細書に援用される）に記載の方法またはアッセイを使用して同定される。
【００９３】
１つの実施態様では、本発明の活性化抗体は、リガンドによるＮＫＧ２Ａ受容体の刺激を阻害するそれらの能力について評価される。多数のアッセイ、分子、細胞に基づく、および動物に基づくモデルの両方を使用することができる。典型的な実施態様では、細胞、例えば、ＮＫＧ２Ａを発現するＮＫ細胞がＮＫＧ２Ａリガンド（またはリガンドを発現する細胞）、好ましくは、ＨＬＡ−Ｅに曝露され、受容体の刺激を崩壊する抗体の能力が評価される細胞に基づくアッセイが使用される。
【００９４】
遺伝子発現に基づく活性、細胞障害性に基づくアッセイ、および増殖アッセイを含むＮＫＧ２Ａ活性を評価する多くの細胞に基づくアッセイのいずれを使用することもできる。所定の実施態様では、インビトロアッセイは、細胞、例えば、自己免疫または炎症性障害を伴う患者から採取されるＮＫ細胞を使用するが、一般に、ＹＴＳまたはＮＫ−９２（ＡＴＣＣから入手可能）のようなＮＫ細胞系統を含む任意のＮＫＧ２Ａ発現細胞を使用することができる。例えば、発現される受容体の刺激が、例えば、シグナル伝達経路を活性化するか、増殖に影響を及ぼすか、もしくは細胞の細胞障害性を改変する検出可能な方法で細胞の活性または特性を改変する限り、細胞系統を、ＮＫＧ２Ａをコードする導入遺伝子でトランスフェクトし、本アッセイで使用することができる。そのようなアッセイでは、ＮＫＧ２Ａ、ＣＤ９４、またはＨＬＡ−Ｅの任意のアイソフォーム（例えば、ＯＭＩＭ参照番号１６１５５５、６０２８９４、および１４３０１０（その開示内容全体は参照により本明細書に援用される）を参照のこと）を、そのようなアッセイ（または本明細書に記載のＮＫＧ２Ａに関与する他の任意のアッセイもしくは方法）において使用することができることが理解されよう。
【００９５】
１つの好適な実施態様では、ＮＫＧ２Ａ発現細胞、例えば、ＮＫ細胞が、ＨＬＡ−ＥのようなＮＫＧ２Ａリガンド、またはＮＫＧ２Ａリガンドを発現する細胞、好ましくは、樹状細胞と共にインキュベートされ、ＮＫ細胞の阻害を阻止する試験化合物の能力が評価される細胞アッセイが使用される。そのようなアッセイでは、樹状細胞の溶解は、それ自体、ＮＫ細胞活性の反映として測定することができる。
【００９６】
１つの実施態様では、細胞系統は、自己免疫または炎症性障害を伴う患者由来のＮＫ細胞を使用して、確立される。多数の実施態様では、非ヒト細胞あるいは非ヒトＮＫＧ２Ａ／ＣＤ９４、例えば、ＮＫＧ２Ａ／ＣＤ９４を発現する非ヒト霊長類細胞、または適切なリガンド（例えば、マウスの場合、Ｑａ−１）の封入を伴うマウスもしくはヒトＮＫＧ２Ａ／ＣＤ９４のいずれかを発現するマウス細胞を使用するアッセイが使用される。
【００９７】
適切なリガンドへのＮＫＧ２Ａの結合は、ＮＫＧ２Ａを有する細胞において、多くの生理学的変化を引き起こす。これらは、遺伝子発現、細胞成長、細胞増殖、ｐＨ、細胞内セカンドメッセンジャー、例えば、Ｃａ２＋、ＩＰ３、ｃＧＭＰ、もしくはｃＡＭＰ、サイトカイン産生、または細胞障害活性のような活性の変化を含む。そのような変化は、本明細書において「ＮＫＧ２Ａ活性」と称される。ＮＫＧ２Ａリガンドの存在下におけるこれらの変化の任意の逆転を使用して、試験抗体の有用性を評価することができる。そのような逆転は、本明細書において「ＮＫＧ２Ａ活性の阻害」と称される。１つの実施態様では、ＮＫＧ２Ａ活性は、ＮＫＧ２Ａ応答性遺伝子またはタンパク質、例えば、ＳＨＰ−１もしくはＳＨＰ−２あるいはそれらの標的の発現または活性を検出することによって評価される（例えば、レ・デュリーン（Ｌｅ  Ｄｒｅａｎ）ら（１９９８年）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ２８：２６４−２７６、オーググリアロ（Ａｕｇｕｇｌｉａｒｏ）ら（２００３年）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ３３：１２３５−１４１を参照のこと；その開示内容全体は参照により本明細書に援用される）。
【００９８】
本明細書に記載のアッセイのいずれにおいても、細胞におけるＮＫＧ２Ａ活性の任意の検出可能な測定における５％、１０％、２０％、好ましくは、３０％、４０％、５０％、最も好ましくは６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、の減少もしくはそれ以上の減少は、試験抗体が本方法における使用の適切な候補であることを示す。
【００９９】
結合に加えて、ＮＫ細胞に、ＮＫＧ２Ａリガンドを有する標的細胞、例えば、樹状細胞、所定の癌細胞、あるいは所定のウイルス感染細胞の増殖もしくは活性化を阻害するか、または好ましくは、該細胞を死滅させる抗体または化合物の能力を評価することができる。１つの実施態様では、ＮＫＧ２Ａ受容体を発現するヒトＮＫ細胞が、ＮＫＧ２Ａリガンドを有する標的細胞と共にプレート、例えば、９６ウェルプレートに導入され、多様な量の試験抗体に曝露される。バイタル染料、即ち、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、カリフォルニア州）のような無傷（ｉｎｔａｃｔ）な細胞によって取り込まれる色素を添加し、洗浄して、過剰な染料を除去することにより、光学密度（抗体によって死滅した細胞が多いほど、光学密度が低い）によって、生存可能な細胞の数を測定することができる。（例えば、コノリー（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ）ら（２００１年）Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ２９８：２５−３３（その開示内容は、その全体が参照により本明細書に援用される）を参照のこと）。
【０１００】
最も好ましくは、本発明の活性化抗体は、Ｆｃ受容体の実質的な特異的結合を実証しない。そのような抗体は、Ｆｃ受容体に結合しないことが公知である多様な重鎖の定常領域を含んでなり得る。そのような１つの例は、ＩｇＧ４定常領域である。あるいは、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントのような定常領域を含まない抗体フラグメントを使用して、Ｆｃ受容体結合を回避することができる。Ｆｃ受容体結合は、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥアッセイにおいてＦｃ受容体タンパク質への抗体の結合を試験することを含む当該分野において既知の方法に従って、評価することができる。また、Ｆｃ部分がＦｃ受容体への結合を最小にするかまたは排除するように改変される他のいずれの抗体型を使用することもできる（例えば、国際公開第０３１０１４８５号パンフレット（その開示内容は参照により本明細書に援用される）を参照のこと）。Ｆｃ受容体結合を評価するためのアッセイ、例えば、細胞に基づくアッセイは当該分野において周知であり、例えば、国際公開第０３１０１４８５号パンフレットに記載されている。
【０１０１】
好ましくは、本発明の活性化モノクローナル抗体は、Ｆｃ領域、好ましくは、ＩｇＧ４もしくはＧ２サブタイプのＦｃ領域、またはＦｃ受容体への結合を減少するように改変されているＩｇＧ１もしくはＧ３サブタイプのＦｃ領域を含んでなる。最も好ましくはＧ４またはＧ２Ｆｃ領域は、Ｆｃ受容体への結合をさらに最小にするかもしくは完全に廃止するように改変される（例えば、アンガル（Ａｎｇａｌ）ら（１９９３年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ３０：１０５−１０８（その開示内容全体は参照により本明細書に援用される）を参照のこと）。
【０１０２】
ＩｇＧ４アイソタイプは、Ｆｃ結合活性を完全に欠くものではなく、Ｆｃγ（「Ｆｃｇ」）受容体への若干の結合を示す（ニューマン（Ｎｅｗｍａｎ）ら（２００１年）Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（９８（２）：１６４−１７４）。改変されていないＩｇＧ４モノクローナル抗体は、インビボで細胞枯渇を引き起こし得る（アイザックス（Ｉｓａａｃｓ）ら、（１９９６年）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０６，４２７）。Ｆｃｇ受容体への結合を主に担うことが報告されている配列は、ＬＬＧＧＰＳと規定されている（バートン（Ｂｕｒｔｏｎ）ら、（１９９２年）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５１：１）。重鎖ＣＨ２領域のＮ末端に配置されるこの配列（ＥＵ番号２３４−２３９）は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ３、およびマウスＩｇＧ２ａアイソタイプにおいて保存され、それらのすべてがＦｃｇ受容体に強度に結合する。ＩｇＧ４アイソタイプの野生型配列は、２３４位でフェニルアラニンを含有し、モチーフＦＬＧＧＰＳを付与する。マウスＩｇＧ２ｂアイソタイプはまた、Ｆｃｇ受容体の貧弱なバインダーであり、配列ＬＥＧＧＰＳを含有する。ニューマン（Ｎｅｗｍａｎ）ら（２００１年）は、マウスＩｇＧ２ｂと会合したグルタミン酸残基をヒト野生型ＩｇＧ４ＣＨ２ドメインに組み入れ、そのことによりＣＤＣおよびＡＤＣＣ活性をさらになお減少させ、インビトロでのＦｃｇＲＩおよびＦｃｇＲＩＩへの結合を事実上排除した配列ＦＥＧＧＰＳを付与した。グルタミン酸の導入に加えて、プロリンによるセリン２２８の置き換えにより、野生型ＩｇＧ４より安定な分子が生じた。ＩｇＧ４分子は、ヒンジ領域における鎖内ジスルフィド結合の不十分な形成を示す傾向がある。プロリンの導入は、ヒンジ部に剛性を提供し、より効率的な鎖内結合を促進し、２２８位のセリンの存在は、隣接するシステイン分子による鎖内ジスルフィド結合よりも好適な鎖内連結を促進し得るといわれた。そのような任意の改変およびその他により、容易に本発明の抗体になり得る。
【０１０３】
多くの場合、本発明の阻害抗体は、Ｆｃ受容体に結合する前者の能力のほとんどまたはすべてを廃止することによって、本発明の活性化抗体に変換され得る。
【０１０４】
ＮＫ細胞活性を阻害するＮＫＧ２Ａに対する抗体の能力を評価する
ＮＫＧ２Ａに結合し、ＮＫ細胞活性、特に、細胞のＮＫ細胞溶解を阻害することが可能である本発明の阻害抗体の同定は、細胞に基づくアッセイを使用してアッセイされる。典型的に、ＮＫ細胞のようなＮＫＧ２Ａを有する細胞は、多様な量の試験抗体の存在下で、ＲＭＡ、ＲＭＡのＴＡＰ−２誘導体、Ｐ８１５およびＫ５６２のようなＮＫ感受性細胞と接触される。試験抗体の存在下で死滅されるＮＫ感受性細胞の百分率が、抗体の非存在下での死滅と比較される。
【０１０５】
本発明の阻害抗体のための別のアッセイでは、ＮＫ細胞は、多様な量の試験抗体の存在下でインキュベートされ、抗体の非存在下でのＮＫ細胞死と比較して、抗体の直接的死滅作用が、ＮＫ細胞に対して影響を及ぼすことを決定する。ＮＫ細胞死滅はまた、ＮＫ感受性細胞の応答を含むアッセイにおいて決定され得る。
【０１０６】
本明細書に記載のいずれにおいても、５％、１０％、２０％、好ましくは、３０％、４０％、５０％、最も好ましくは、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％のＮＫ感受性細胞死滅の減少および／または５％、１０％、２０％、好ましくは、３０％、４０％、５０％、最も好ましくは、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％のＮＫ細胞死の増加は、試験抗体が本発明の阻害抗体であることを示す。
【０１０７】
霊長類種間のＮＫＧ２Ａの交差反応性
ヒトおよび非ヒト霊長類ＮＫＧ２Ａ間に交差反応性があることが観察されている。従って、受容体活性に対する抗ＮＫＧ２Ａ抗体の効果を評価するためのアッセイは、任意の霊長類由来のＮＫＧ２Ａポリペプチドを使用して行うことができる。例えば、そのようなアッセイは、インビトロで非ヒト霊長類ＮＫ細胞を使用することによって実施できるか、または抗体を非ヒト霊長類に投与することができ、そして、例えば、ＮＫ細胞活性における変更に反映されるＮＫＧ２Ａ活性をモジュレートするそれらの能力を測定することができる。
【０１０８】
抗体を産生させること
本発明の抗体は、様々な当該分野において公知の技術のいずれかによって産生させることができる。典型的に、それらは、Ｔ細胞またはＮＫ細胞または樹状細胞のような細胞の表面上の（または本明細書に記載のすべての実施態様のための、ＣＤ９４、もしくはＨＬＡ−Ｅのための）ＮＫＧ２Ａ受容体を含んでなる免疫原による非ヒト動物、好ましくは、マウスの免疫化によって産生される。受容体は、細胞全体または細胞膜、ＮＫＧ２Ａ（もしくはＣＤ９４など）の全長配列、または任意のＮＫＧ２Ａのフラグメントもしくは誘導体、典型的に免疫原性フラグメント、即ち、受容体を発現する細胞の表面上に曝露されるエピトープを含んでなるポリペプチドの一部を含んでもよい。ＮＫＧ２Ａの任意のアイソフォームまたはスプライシングフラグメントを使用することができる（例えば、ＯＭＩＭ１６１５５５を参照のこと；その開示内容は参照により本明細書に援用される）。そのようなフラグメントは、典型的に、成熟ポリペプチド配列の少なくとも７連続アミノ酸、さらにより好ましくは、その少なくとも１０連続アミノ酸を含有する。それらは、本質的に、受容体の細胞外ドメインから誘導される。好適な実施態様では、抗体を作製するために使用されるＮＫＧ２Ａ受容体はヒト受容体である。所定の実施態様では、例えば、ＣＤ９４と会合したヘテロダイマーで存在するＮＫＧ２Ａを使用して、抗体を作製することができる。
【０１０９】
最も好適な実施態様では、免疫原は、脂質膜、典型的に細胞表面の野生型ヒトＮＫＧ２Ａ受容体ポリペプチドを含んでなる。特定の実施態様では、免疫原は、無傷（ｉｎｔａｃｔ）なＮＫ細胞、特に、無傷なヒトＮＫ細胞、場合により処置または溶解された細胞を含んでなる。好適な実施態様では、免疫原は、自己免疫または炎症性障害を伴う患者から採取されるＮＫ細胞である。
【０１１０】
１つの実施態様では、抗体は、ＮＫＧ２Ａ、例えば、Ｚ１９９（デラ・キエーサ（Ｄｅｌｌａ  Ｃｈｉｅｓａ）ら、（２００３年）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３：１６５７−１６６６）、Ｚ２７０、３Ｓ９（例えば、米国特許公開第２００３／００９５９６５号明細書を参照のこと）、または２０Ｄ５（バンス（Ｖａｎｃｅ）ら、（１９９０年）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０（１２）：１８０１−１８１２）（その開示内容は参照により本明細書に援用される）を認識する１つもしくはそれ以上の既に存在するモノクローナル抗体から誘導される。所定のアプリケーションのために、細胞、好ましくは、自己免疫または炎症性障害を伴う患者由来のＮＫ細胞の存在に対してＮＫＧ２Ａの存在を決定するための診断用抗体としての使用のために、そのような抗体を、直接的または間接的に（即ち、標識された第二抗体で使用される）標識することができる。さらに、抗体を、本治療方法における使用のために本明細書に記載のようにヒトへの投与に適切にすることができる。
【０１１１】
本抗体は、全長の抗体または抗体フラグメントもしくは誘導体であり得る。抗体フラグメントの例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；二重特異性抗体；一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子；ただ１つの軽鎖可変ドメイン、または関連重鎖部分を伴わずに軽鎖可変ドメインの３つのＣＤＲを含有するそのフラグメントを含有する一本鎖ポリペプチド；ただ１つの重鎖可変領域、または関連軽鎖部分を伴わずに重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含有するそのフラグメントを含有する一本鎖ポリペプチド；および抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられる。そのようなフラグメントおよび誘導体ならびにそれらを調製する方法は、当該分野において周知である例えば、ペプシンを使用して、ヒンジ領域のジスルフィド結合より下流の抗体を消化して、Ｆ（ａｂ）’２（それ自体がジスルフィド結合によってＶＨ−ＣＨ１に結合される軽鎖であるＦａｂの二量体である）を生成させることができる。Ｆ（ａｂ）’２を、穏やかな条件下で還元して、ヒンジ領域のジスルフィド結合を切断し、それによって、Ｆ（ａｂ）’２二量体をＦａｂ’単量体に変換してもよい。Ｆａｂ’単量体は、本質的に、ヒンジ領域の部分を伴うＦａｂである（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ポール（Ｐａｕｌ）編、第３版、１９９３年）を参照のこと）。多様な抗体フラグメントが無傷（ｉｎｔａｃｔ）な抗体の消化によって規定される一方、当業者は、そのようなフラグメントを、化学的かまたは組換えＤＮＡ方法論を使用するかのいずれかによって、デノボで合成することができることを理解している。
【０１１２】
好適な実施態様では、活性化抗体は非枯渇化抗体であり、それらは、ＮＫ細胞に結合し、ＮＫＧ２Ａ刺激を阻害するが、ＮＫＧ２Ａ発現細胞の死滅をもたらさないことを意味する。ＮＫＧ２Ａ発現細胞を死滅させる能力は、抗体が細胞障害性ではなく、結合細胞を直接死滅させることを確実にするためのインビトロアッセイ、ならびに抗体が投与され、ＮＫＧ２Ａ発現細胞のレベルおよび活性が評価されるインビボアッセイを含む標準的な方法で評価することができる。特に好適な実施態様では、上記のように、Ｆｃ受容体によって認識されない（またはごく僅かにしか認識されない）抗体が使用される。従って、好適な抗体には、ＩｇＧ４、ＦａｂもしくはＦ（ａｂ’）２のようなフラグメント、またはＦｃ部分がＦｃ受容体による結合を減少または排除するように改変されている他の任意のＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭなどが含まれる（例えば、国際公開第０３１０１４８５号パンフレット（その開示内容全体は参照により本明細書に援用される）を参照のこと）。
【０１１３】
モノクローナルまたはポリクローナル抗体の調製については当該分野において周知であり、多数の利用可能な技術のいずれかを使用することができる（例えば、ケーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）、Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５−４９７（１９７５年）；コズボール（Ｋｏｚｂｏｒ）ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ４：７２（１９８３年）；コール（Ｃｏｌｅ）ら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９８５）の７７−９６頁を参照のこと）。一本鎖抗体の産生のための技術（米国特許第４，９４６，７７８号明細書）を適応して、所望されるポリペプチド、例えば、ＮＫＧ２Ａに対する抗体を産生させることができる。また、トランスジェニックマウス、または他の哺乳動物のような他の生物体を使用して、ヒト化、キメラ、または同様に修飾された抗体を発現させてもよい。あるいは、ファージディスプレイ技術を使用して、選択された抗原に特異的に結合する抗体およびヘテロメリックなＦａｂフラグメントを同定することができる（例えば、マキャフェルティー（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ）ら、Ｎａｔｕｒｅ３４８：５５２−５５４（１９９０年）；マークス（Ｍａｒｋｓ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：７７９−７８３（１９９２年）を参照のこと）。１つの実施態様では、方法は、ライブラリーまたはレパートリーから、ＮＫＧ２Ａ受容体と交差反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体を選択することを含んでなる。例えば、レパートリーは、場合により、任意の適切な構造（例えば、ファージ、細菌、合成複合体など）によってディスプレイされる抗体またはそのフラグメントの任意の（組換え）レパートリーであってもよい。
【０１１４】
当該分野において周知の任意の様式で、非ヒト哺乳動物を抗原で免疫する工程を行うことができる（例えば、Ｅ．ハーロー（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ）およびＤ．レーン（Ｄ．Ｌａｎｅ）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク州（１９８８）を参照のこと）。一般に、免疫原は、場合により完全フロイントアジュバントのようなアジュバントと共に、緩衝液に懸濁または溶解される。免疫原の量、緩衝液のタイプおよびアジュバントの量を決定するための方法は当該分野において周知であり、本発明に対する任意の方法において限定されない。
【０１１５】
同様に、抗体の産生を刺激するのに十分な免疫の場所および回数もまた、当該分野において周知である。典型的な免疫プロトコルでは、１日目に非ヒト動物に免疫原が腹腔内に注入され、１週間後に再度注入される。これに続いて、場合により、不完全フロイントアジュバントなどのアジュバントを伴って、約２０日目に抗原が再注入される。再注入は静脈内で実施され、数日間連続で反復され得る。これに続いて、静脈内または腹腔内のいずれかで、典型的にアジュバントを伴わずに、４０日目に追加注入が行われる。このプロトコルにより、約４０日後に、抗原特異的抗体産生Ｂ細胞が生じる。他のプロトコルもまた、それらが、免疫に使用される抗原に対する抗体を発現するＢ細胞の産生を生じる限り、利用することができる。
【０１１６】
別の実施態様では、非免疫非ヒト哺乳動物由来のリンパ球が単離され、インビトロで増殖され、次いで、細胞培養において免疫原に曝露される。次いで、リンパ球を回収し、下記の融合工程を行う。
【０１１７】
本発明の目的に好適であるモノクローナル抗体では、次の工程は、細胞、例えば、免疫された非ヒト哺乳動物由来のリンパ球、脾細胞、またはＢ細胞の単離、および抗体産生ハイブリドーマを形成するための該脾細胞、またはＢ細胞、またはリンパ球と不死化細胞との以後の融合である。従って、本明細書において使用される用語「免疫動物から抗体を調製すること」は、免疫動物からＢ細胞／脾細胞／リンパ球を入手すること、およびそれらの細胞を使用して、抗体を発現するハイブリドーマを産生させること、ならびに免疫動物の血清から直接抗体を入手することを含む。例えば、非ヒト哺乳動物からの脾臓細胞の単離は当該分野において周知であり、例えば、麻酔した非ヒト哺乳動物から脾臓を取り出し、それを小片に切断し、単一の細胞懸濁液が生成されるように、セルストレーナーのナイロンメッシュを介して、適切な緩衝液に脾包（ｓｐｌｅｎｉｃ  ｃａｐｓｕｌｅ）から脾臓細胞を圧搾することに関与する。細胞を洗浄し、遠心分離し、任意の赤血細胞を溶解する緩衝液に再懸濁する。溶液を再度遠心分離し、ペレット内に残留するリンパ球を最終的に新鮮緩衝液に再懸濁する。
【０１１８】
一旦、単離され、単一細胞懸濁液中に存在すると、抗体産生細胞を不死細胞株に融合させることができる。これは、典型的にはマウス骨髄腫細胞系統であるが、ハイブリドーマを作製するのに有用な他の多くの不死細胞系統が当該分野において公知である。好適なマウス骨髄腫株として、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州、米国より入手可能なＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、メリーランド州、米国より入手可能なＸ６３  Ａｇ８６５３およびＳＰ−２細胞が挙げられるが、これらに限定されない。融合は、ポリエチレングリコールなどを使用して行う。次いで、得られるハイブリドーマを、非融合親骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する１つもしくはそれ以上の物質を含有する選択培地で増殖させる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマのための培養培地は、典型的に、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含む（ＨＡＴ培地）（該物質はＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を妨害する）。
【０１１９】
ハイブリドーマは、マクロファージのフィーダー層上で増殖され得る。マクロファージは、脾臓細胞を単離するために使用される非ヒト哺乳動物の同腹仔由来であることが好ましく、典型的に、ハイブリドーマプレート化の数日前に、不完全フロイントアジュバントなどで刺激する。融合方法は、例えば、ゴーディング（Ｇｏｄｉｎｇ）「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ」、５９〜１０３頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６年）に記載されており、この開示内容は、本明細書において参照により援用される。
【０１２０】
コロニー形成および抗体産生に十分な時間、細胞を増殖させる。これは、通常、７〜１４日間の間である。次いで、ハイブリドーマコロニーを、所望される基質、例えば、ＮＫＧ２Ａを特異的に認識する抗体の産生についてアッセイする。アッセイは、典型的に発色ＥＬＩＳＡ型アッセイであるが、ハイブリドーマが増殖するウェルに適応することができるいずれのアッセイを用いてもよい。他のアッセイとしては、免疫沈降およびラジオイムノアッセイが挙げられる。所望の抗体産生にポジティブのウェルを試験して、１つもしくはそれ以上の異なるコロニーが存在するかどうかを決定する。１を超えるコロニー多存在する場合、細胞を再クローニングして、増殖させ、ただ単一の細胞が所望の抗体を産生するコロニーを生じていることを確実にする。明らかに単一のコロニーを伴うポジティブウェルを、典型的に再クローニングし、再アッセイし、ただ１つのモノクローナル抗体が検出され、産生されていることを確実にする。
【０１２１】
次いで、本発明のモノクローナル抗体を産生することが確認されるハイブリドーマを、ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０のような適切な培地において、より多量に培養する。あるいは、ハイブリドーマ細胞は、動物において腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。
【０１２２】
所望されるモノクローナル抗体を産生させるのに十分な増殖後、モノクローナル抗体（または腹水液）を含有する増殖培地を細胞から分別し、そこに存在するモノクローナル抗体を精製する。精製は、ゲル電気泳動、透析、タンパク質Ａもしくはタンパク質Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、またはアガロースもしくはＳｅｐｈａｒｏｓｅビーズのような固相支持体に連結された抗マウスＩｇを使用するクロマトグラフィーによって、典型的に達成される（すべて、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、出版番号１８−１０３７−４６、ＡＣ版（その開示内容は参照により本明細書に援用される）に記載されている）。結合抗体は、低ｐＨ緩衝液（グリシンまたはｐＨ３．０もしくはそれ未満の酢酸緩衝液）を使用し、抗体を含有する画分を直ちに中和することによって、タンパク質Ａ／タンパク質Ｇカラムから典型的に溶出される。これらの画分をプールし、透析し、必要であれば濃縮する。
【０１２３】
好適な実施態様では、ＮＫＧ２Ａ免疫原上に存在する決定基に結合する抗体をコードするＤＮＡをハイブリドーマから単離し、適切な宿主へのトランスフェクションのために適切な発現ベクターに配置する。次いで、宿主を、抗体の抗原認識部分を含んでなる抗体、その変異体、その活性なフラグメント、またはヒト化もしくはキメラ抗体の組換え産生のために使用する。好ましくは、本実施態様において使用されるＤＮＡは、自己免疫または炎症性障害を伴う患者から採取されるＮＫ細胞のようなＮＫ細胞上のＮＫＧ２Ａ受容体に存在する決定基を認識する抗体をコードする。
【０１２４】
本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、（例えば、マウス抗体の重および軽鎖をコードする遺伝に特異的に結合することが可能であるオリゴヌクレオチドを使用することによって）従来の手順を使用して、容易に単離され、配列決定され得る。一旦単離されたら、ＤＮＡを発現ベクターに配置することができ、次いで、それは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サル（ｓｉｍｉａｎ）ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または他では免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞のような宿主細胞にトランスフェクトされ、組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成が得られる。抗体をコードするＤＮＡの細菌における組換え発現は当該分野において周知である（例えば、スケラ（Ｓｋｅｒｒａ）ら、（１９９３年）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：２５６；およびプリュックサン（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ）、（１９９２年）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ．１３０：１５１を参照のこと）。抗体はまた、例えば、ウォード（Ｗａｒｄ）ら、（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ，３４１：５４４に開示されているような免疫グロブリンのコンビナトリアルライブラリーの選択によって、産生させてもよい。
【０１２５】
特定の実施態様では、抗体は、モノクローナル抗体Ｚ１９９またはＺ２７０のうちの１つと本質的に同じエピトープまたは抗原決定基に結合する。１つの好適な実施態様では、モノクローナル抗体は、Ｚ２７０のＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２部分を含んでなる。別の好適な実施態様に従えば、モノクローナル抗体は、Ｚ２７０の可変重鎖領域の３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１＝配列番号２のアミノ酸３１〜３５；ＣＤＲ２＝配列番号２のアミノ酸５０〜６６；ＣＤＲ３＝配列番号２のアミノ酸９９〜１０８）を含んでなる。Ｚ２７０の可変重鎖領域（Ｚ２７０ＶＨ；配列番号２）を含んでなるモノクローナル抗体がより好適である。Ｚ２７０の可変重鎖領域を含んでなり、ｃｈＺ２７０ＶＨ（配列番号３）を含んでなるヌクレオチド配列から転写および翻訳されるモノクローナル抗体がなおより好適である。別の好適な実施態様に従えば、モノクローナル抗体は、Ｚ２７０の可変軽鎖領域の３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１＝配列番号６のアミノ酸２４〜３４；ＣＤＲ２＝配列番号６のアミノ酸５０〜５６；ＣＤＲ３＝配列番号６のアミノ酸８９〜９５）を含んでなる。Ｚ２７０の可変軽鎖領域（配列番号６）を含んでなるモノクローナル抗体がより好適である。Ｚ２７０の可変軽鎖領域を含んでなり、ｃｈＺ２７０ＶＫ（配列番号７）を含んでなるヌクレオチド配列から転写および翻訳されるモノクローナル抗体がなおより好適である。なお別の好適な実施態様では、抗体はＺ２７０である。Ｚ２７０は、２００５年１２月２２日付、受託番号Ｉ−３５４９で、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｐａｓｔｅｕｒ，２５，Ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ，Ｆ−７５７２５Ｐａｒｉｓ、仏国に寄託した。
【０１２６】
ＮＫＧ２Ａに対する活性化および抑制性モノクローナル抗体の両方とも、それらを、ヒトにおける治療用途に適切にするように、一般的に改変される。例えば、それらを、ヒト化するか、キメラ化するか、または当該分野において周知の方法を使用して、ヒト抗体のライブラリーから選択してもよい。そのようなヒトに適切な抗体は、本発明の治療方法において直接使用することができるか、または本発明の方法における使用のために、下記のような細胞障害性抗体にさらに誘導体化することができる。
【０１２７】
１つの好適な実施態様では、本発明の抗体、例えば、Ｚ１９９またはＺ２７０と実質的に同じエピトープに結合する抗体を産生するハイブリドーマのＤＮＡは、発現ベクターへの挿入前に、例えば、相同非ヒト配列の代わりにヒト重および軽鎖定常ドメインのコーディング配列を置換することによって（例えば、モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）ら、（１９８４年）ＰＮＡＳ８１：６８５１）、または免疫グロブリンコーディング配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコーディング配列のすべてもしくは一部を共有結合させることによって、修飾することができる。該様式では、本来の抗体の結合特異性を有する「キメラ」または「ハイブリッド」抗体が調製される。典型的に、そのような非免疫グロブリンポリペプチドが、本発明の抗体の定常ドメインに対して置換される。
【０１２８】
好適な実施態様では、抗体は、ヒト重鎖定常領域に融合したＺ２７０の可変重鎖領域（配列番号２）を含んでなる。１つの好適な実施態様では、ヒト重鎖定常領域はＩｇＧ４定常領域である。別の好適な実施態様では、ヒト重鎖定常領域は、ＩｇＧ１定常領域、好ましくは、ヒトＩｇＧ１ｍ（−１、−２、−３）定常領域である。好ましくは、そのようなヒト重鎖定常領域含有抗体は、ｃｈＺ２７０ＶＨ（配列番号３）を含んでなるヌクレオチド配列から転写および翻訳される。
【０１２９】
別の好適な実施態様では、抗体は、ヒト軽鎖定常領域に融合したＺ２７０の可変軽鎖領域（配列番号６）を含んでなる。ヒトκ（ｋ３）軽鎖定常領域に融合したＺ２７０の可変軽鎖領域を含んでなる抗体がより好適である。好ましくは、そのようなヒト軽鎖定常領域含有抗体は、ｃｈＺ２７０ＶＫ（配列番号７）を含んでなるヌクレオチド配列から転写および翻訳される。
【０１３０】
ヒト軽鎖定常領域に融合した２７０ＶＫおよびヒト重鎖定常領域に融合した２７０ＶＫの両方を含んでなる抗体がなおより好適である。好ましくは、軽鎖定常領域はκ（ｋ３）定常領域であり、重鎖定常領域は、ＩｇＧ４またはＩｇＧ１ｍ（−１、−２、−３）から選択される。また、好ましくは、抗体のそれぞれの重および軽鎖は、それぞれ、ｃｈＺ２７０ＶＨ（配列番号３）を含んでなるヌクレオチド配列およびｃｈＺ２７０ＶＫ（配列番号７）を含んでなるヌクレオチドを含んでなるヌクレオチド配列から転写される。
【０１３１】
１つの特に好適な実施態様では、本発明の抗体はヒト化される。本発明の抗体の「ヒト化」形態は、マウスあるいは他の非ヒト免疫グロブリンから誘導される最小配列を含有する特異的キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖または（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、もしくは抗体の他の抗原結合配列のような）それらのフラグメントである。ほとんどの部分について、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であって、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、本来の抗体（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基によって置き換えられる一方、本来の抗体の所望される特異性、親和性、および能力は維持される。場合により、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基を、対応する非ヒト残基によって置き換えてもよい。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはインポートされたＣＤＲまたはフレームワーク配列のいずれにも見出されない残基を含んでなることができる。これらの修飾は、抗体の性能をさらに改質し、最適化するために作製される。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、および典型的に２つの可変ドメインの実質的にすべてを含んでなり、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが本来の抗体の該領域に対応し、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列の該領域である。より詳細については、ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２（１９８６年）；ライヒマン（Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ）ら、（１９８８年）Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３；フェルホエン（Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ）ら（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９：１５３４（１９８８年）；プレスタ（Ｐｒｅｓｔａ）（１９９２年）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２、５９３（それぞれはその全体が参照により本明細書に援用される）を参照のこと。
【０１３２】
ヒト化抗体を作製するのに使用すべきヒト可変ドメイン（軽鎖および重鎖の両方）の選択は、抗原性を減少させるのに極めて重要である。いわゆる「ベストフィット」方法に従えば、本発明の抗体の可変ドメインの配列を、公知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングされる。次いで、マウスの配列に最も近いヒト配列は、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク（ＦＲ）として許容される（シムズ（Ｓｉｍｓ）ら、（１９９３年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．，１５１：２２９６；チョチア（Ｃｈｏｔｈｉａ）およびレスク（Ｌｅｓｋ）（１９８７年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１））。別の方法は、軽または重鎖の特定の亜群のすべてのヒト抗体のコンセンサス配列由来の特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークを、いくらかの異なるヒト化抗体に使用することができる（カーター（Ｃａｒｔｅｒ）ら、（１９９２年）ＰＮＡＳ８９：４２８５；プレスタ（Ｐｒｅｓｔａ）ら、（１９９３年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５１：１９９３））。
【０１３３】
ヒト化される一方、ＮＫＧ２Ａ、好ましくは、ヒトおよび非ヒト霊長類ＮＫＧ２Ａに対する高い親和性、ならびに他の好適な生物学的特性を保持する抗体がさらに重要である。この目的を達成するために、好適な方法に従い、親配列の解析のプロセスならびに親およびヒト化配列の３次元モデルを使用する多様な概念上のヒト化産物によって、ヒト化抗体が調製される。３次元免疫グロブリンモデルは一般に利用可能であり、当業者に熟知されている。選択された候補免疫グロブリン配列の見込まれる３次元コンフォメーション構造を例示および示すコンピュータプログラムが利用可能である。これらの標示を調べることにより、候補免疫グロブリン配列の機能性における残基の可能な役割の解析、即ち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の解析を可能にする。この方法では、ＦＲ残基が選択され、標的抗原の増加した親和性などの所望される抗体の特徴が達成されるように、コンセンサスおよびインポート配列から合わせられる。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合への影響に、直接的および最も実質的に関与する。
【０１３４】
好適な実施例では、本発明は、実質的にヒトＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６）に結合しない少なくとも５、６、８、９、１０、１５または２０日の半減期を有するヒトまたはヒト化活性化抗ＮＫＧ２Ａ抗体を提供する。より好ましくは、活性化抗ＮＫＧ２Ａ抗体はヒト化抗体であり、ヒトＮＫＧ２Ａへの結合についてＺ１９９またはＺ２７０抗体と完全に競合する。本明細書に記載の方法に従う使用に適切な好適な抗体による例示の目的のために、Ｚ１９９またはＺ２７０抗体を使用して、ヒト化抗体を調製することができる。本発明に従う好適なヒト化抗体は、ヒトフレームワーク、非ヒト抗体由来の少なくとも１つのＣＤＲを含んでなり、ここで、存在する任意の定常領域はヒト免疫グロブリン定常領域に実質的に同一、例えば、少なくとも約６０〜９０％、好ましくは少なくとも９５％同一である。従って、おそらくＣＤＲを除くすべての部分のヒト化抗体は、１つもしくはそれ以上の生来のヒト抗体配列の対応する部分に実質的に同一である。いくつかの場合において、ヒト化抗体は、非ヒト抗体由来のＣＤＲに加えて、ヒトフレームワーク領域においてさらなる非ヒト残基を含む。
【０１３５】
ヒト化抗体の設計は、以下のとおりに行うことができる。アミノ酸が以下のカテゴリーに当てはまる場合、使用すべきヒト抗体（アクセプター抗体）のフレームワークアミノ酸は、ＣＤＲを提供する非ヒト抗体（ドナー抗体）由来のフレームワークアミノ酸によって置き換えられる：（ａ）アクセプター抗体のヒトフレームワーク領域におけるアミノ酸は、該位置でヒト抗体には普通でない一方、ドナー抗体において対応するアミノ酸は、該位置でヒト抗体に典型的であること；（ｂ）アミノ酸の位置は、ＣＤＲの１つのすぐ近くに隣接すること；または（ｃ）アミノ酸は、三次構造抗体モデルにおいてＣＤＲと相互作用することが可能であること（Ｃ．クイーン（Ｃ．Ｑｕｅｅｎ）らＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６，１００２９（１９８９年）、およびコ（Ｃｏ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８，２８６９（１９９１年）（その開示内容は本明細書において参照により援用される）を参照のこと）。
【０１３６】
ヒト化抗体の産生のさらなる詳細な説明については、クイーン（Ｑｕｅｅｎ）ら、（前掲）およびコ（Ｃｏ）ら、（前掲）ならびに米国特許第５，５８５，０８９号明細書；同第５，６９３，７６２号明細書、同第５，６９３，７６１号明細書、および同第５，５３０，１０１号明細書（その開示内容は本明細書において参照により援用される）を参照のこと。通常、ヒト化抗体におけるＣＤＲ領域は実質的に同一であり、より通常は、それらが誘導されたマウス抗体における対応するＣＤＲ領域に同一である。通常は所望されないが、得られるヒト化抗体の結合親和性にそれほど影響を及ぼすことなく、ＣＤＲ残基の１つもしくはそれ以上の保存的アミノ酸置換を作製することが時々可能である。時折、ＣＤＲ領域の置換は、結合親和性を増強することができる。上記で考察した特定のアミノ酸置換以外についても、ヒト化抗体のフレームワーク領域は、通常、実質的に同一であり、より通常は、それらが誘導されたヒト抗体のフレームワーク領域に同一である。もちろん、フレームワーク領域におけるアミノ酸の多くは、抗体の特異性または親和性に対してほとんどもしくは全く直接的寄与を生じない。従って、フレームワーク残基の多くの個々の保存的置換は、得られるヒト化抗体の特異性または親和性のそれほどの変化を伴わずに、忍容されうる。ヒト化抗体の抗原結合領域（非ヒト部分）は、ＮＫＧ２Ａに対する特異性を有するドナー抗体と称される非ヒト由来の抗体から誘導することができる。例えば、適切な抗原結合領域は、Ｚ１９９またはＺ２７０モノクローナル抗体から誘導することができる。他の供給源として、げっ歯類（例えば、マウスおよびラット）、ウサギ、ブタ、ヤギまたは非ヒト霊長類（例えば、サル）またはラクダ科の動物（例えば、ラクダおよびラマ）のような非ヒト供給源から得られるＮＫＧ２Ａ特異的（ブロッキング）抗体が挙げられる。さらに、Ｚ１９９またはＺ２７０抗体と同じもしくは類似のエピトープに結合する抗体のような他のポリクローナルまたはモノクローナル抗体を作製することができる（例えば、ケーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）ら、Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７（１９７５年）；ハーロー（Ｈａｒｌｏｗ）ら、１９８８年、抗体：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク州）；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２巻（補遺２７、１９９４年夏）、アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、編（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ニューヨーク州）、第１１章（１９９１年））。
【０１３７】
１つの実施態様では、ヒトならびに非ヒト霊長類ＮＫＧ２Ａに対する結合特異性を有するヒト化抗体は、非ヒト由来の少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる。例えば、ヒトならびに非ヒト霊長類ＮＫＧ２Ａに対する結合特異性を有するヒト化抗体は、重鎖および軽鎖を含んでなる。軽鎖は、ＮＫＧ２Ａおよびヒト由来の軽鎖から誘導されるＦＲに結合する非ヒト由来の抗体から誘導されるＣＤＲを含んでなることができる。例えば、軽鎖は、抗体がヒトおよび非ヒト霊長類ＮＫＧ２Ａに特異的に結合するようなＺ１９９もしくはＺ２７０抗体のいずれか１つのそれぞれのＣＤＲに類似または実質的に同じアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３を含んでなることができる。重鎖は、ＮＫＧ２Ａおよびヒト由来の重鎖から誘導されるＦＲに結合する非ヒト由来の抗体から誘導されるＣＤＲを含んでなることができる。例えば、重鎖は、下記のアミノ酸配列、あるいは抗体がヒトおよび非ヒト霊長類ＮＫＧ２Ａに特異的に結合するようなＺ１９９もしくはＺ２７０抗体のそれぞれのＣＤＲに類似または実質的に同じアミノ酸を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３を含んでなることができる。
【０１３８】
本発明の実施態様は、ヒトおよび非ヒト霊長類ＮＫＧ２Ａに特異的に結合し、Ｚ１９９またはＺ２７０抗体由来の３つの軽鎖ＣＤＲを含んでなるヒト化軽鎖およびヒト抗体軽鎖由来の軽鎖可変領域フレームワーク配列を含んでなるヒト化抗体である。本発明は、Ｚ１９９またはＺ２７０抗体由来の３つの重鎖ＣＤＲおよびヒト抗体重鎖由来の重鎖可変領域フレームワーク配列を含んでなるヒト化重鎖をさらに含んでなる。
【０１３９】
ヒト由来（ヒト部分）であるヒト化抗体または抗体鎖の部分は、任意の適切なヒト抗体または抗体鎖から誘導することができる。例えば、ヒト定常領域またはその一部は、存在するならば、対立遺伝子改変体を含むヒト抗体のκもしくはλ軽鎖、および／またはγ（例えば、γ１、γ２、γ３、γ４）、μ、α（例えば、α１、α２）、δもしくはε重鎖から誘導することができる。ＩｇＧ２ｂもしくはＩｇＧ４のような特定の定常領域、その変種または一部を選択して、エフェクター機能を整えることができる。後者の定常領域、またはその一部は、それらが実質的にＮＫ細胞上のＦｃγＩＩＩａ受容体（ＣＤ１６）に結合せず、従って、実質的に本発明の抗ＮＫＧ２Ａ抗体と結合するＮＫエフェクターのＡＤＣＣ媒介溶解を誘導しない点で特に好適である。例えば、「変種」とも称される変異型定常領域を、融合タンパク質に組み入れて、Ｆｃ受容体への結合および／または補体に結合する能力を最小にすることができる（例えば、ウィンター（Ｗｉｎｔｅｒ）ら、米国特許第５，６４８，２６０号明細書；モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）ら、国際公開第８９／０７１４２号パンフレット；モーガン（Ｍｏｒｇａｎ）ら、国際公開第９４／２９３５１号パンフレットを参照のこと）。さらに、天然のＦｃ領域と比較して、分裂促進応答を減少する変異型ＩｇＧ２Ｆｃドメインを作製することができる（例えば、ツォ（Ｔｓｏ）ら、米国特許第５，８３４，５９７号明細書（その教示内容はその全体が本明細書において参照により援用される）を参照のこと）。存在する場合、ヒトＦＲは、好ましくは、抗原結合領域ドナーの類似または等価領域に対する配列類似性を有するヒト抗体可変領域から誘導される。ヒト化抗体のヒト由来の部分に対するＦＲの他の供給源として、ヒト可変コンセンサス配列が挙げられる（ケトルボロウ，Ｃ．Ａ．（Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．）ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ４：７７３−７８３（１９９１年）；クイーン（Ｑｕｅｅｎ）ら、米国特許第５，５８５，０８９号明細書、同第５，６９３，７６２号明細書および同第５，６９３，７６１号明細書（そのすべての教示内容は、その全体が本明細書において参照により援用される）を参照のこと）。例えば、非ヒト部分を得るために使用される抗体または可変領域の配列は、カバット，Ｅ．Ａ．（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．）ら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｏｆｆｉｃｅ（１９９１年）に記載のヒト配列と比較することができる。好適な実施態様では、ヒト化抗体鎖のＦＲは、少なくとも約６０％の全長配列同一性、好ましくは少なくとも約８０％の全長配列同一性を有するヒト可変領域から誘導され、非ヒトドナー（例えば、Ｚ１９９またはＺ２７０抗体）の可変領域を伴う。
【０１４０】
２つの核酸またはポリペプチド（例えば、ヒト化抗体をコードするＤＮＡもしくはヒト化抗体のアミノ酸配列）に関する語句「実質的に同一な」は、以下の配列比較方法および／または目視検査を使用して測定した場合の最大対応するように比較および整列される場合、少なくとも約８０％、最も好ましくは、９０〜９５％もしくはそれ以上ヌクレオチドまたはアミノ酸残基同一性を有する２つもしくはそれ以上の配列またはサブ配列を指す。そのような「実質的に同一な」配列は、典型的に相同とみなされる。好ましくは、「実質的同一性」は、少なくとも約５０残基長である配列の領域にわたって、より好ましくは、少なくとも約１００残基の領域にわたって存在し、最も好ましくは、配列は、少なくとも約１５０残基にわたって、または比較しようとする２つの配列の全長にわたって実質的に同一である。下記のように、２つの任意の抗体配列は、カバット（Ｋａｂａｔ）における番号付けスキームを使用することによって、一方向でのみ整列することができる。従って、抗体については、同一性％は、唯一的かつ良好に規定される意味を有する。
【０１４１】
抗体の成熟重および軽鎖の可変領域由来のアミノ酸は、それぞれＨｘおよびＬｘを表し、ここで、ｘは、カバット（Ｋａｂａｔ）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ、メリーランド州、１９８７年および１９９１年）のスキームに従ってアミノ酸の位置を表す番号である。カバット（Ｋａｂａｔ）は、それぞれのサブグループについて抗体の多くのアミノ酸配列を列挙し、該サブグループにおけるそれぞれの残基位置について最も一般的に生じるアミノ酸を列挙している。カバット（Ｋａｂａｔ）では、列挙された配列において各アミノ酸に対する残基番号を割り当てるための方法を使用し、残基番号を割り当てるためのこの方法は、当該分野において標準的になっている。カバット（Ｋａｂａｔ）のスキームは、問題の抗体とカバット（Ｋａｂａｔ）におけるコンセンサス配列のうちの１つとを整列することによって、彼の概論には含まれない他の抗体にまで拡張可能である。カバット（Ｋａｂａｔ）の番号付けシステムの使用は、異なる抗体における等価な位置でのアミノ酸を容易に同定する。例えば、ヒト抗体のＬ５０位のアミノ酸は、マウス抗体のアミノ酸位置Ｌ５０に等価な位置を占有する。Ｎ末端からＣ末端にかけて、軽および重鎖可変領域の両方とも、交互に存在するフレームワークおよび（ＣＤＲ）「ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４」を含んでなる。各領域に対するアミノ酸の割り当ては、カバット（Ｋａｂａｔ）（１９８７年）および（１９９１年）、上掲ならびに／またはチョティア（Ｃｈｏｔｈｉａ）およびレスク（Ｌｅｓｋ）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７年）；チョティア（Ｃｈｏｔｈｉａ）ら、Ｎａｔｕｒｅ３４２：８７８−８８３（１９８９年）の規定に従う。
【０１４２】
結合および／または接着アッセイあるいは他の適切な方法はまた、必要な特異性を伴うヒト化抗体（例えば、ライブラリー由来）の同定および／または単離のための手順に使用することもできる（例えば、競合アッセイ）。
【０１４３】
本発明における使用のための非ヒトおよびヒト由来の抗体部分は、軽鎖、重鎖ならびに軽および重鎖の一部を含む。これらの抗体部分は、（例えば、一部のデノボ合成によって）抗体から入手もしくは誘導することができるか、あるいは所望される特性（例えば、ＮＫＧ２Ａに結合する、例えば、Ｚ１９９もしくはＺ２７０抗体との配列類似性）を有する抗体またはその鎖をコードする核酸を産生および発現させることができる。合成および／または組換え核酸を使用して、ヒトおよび非ヒト由来の所望される部分（例えば、抗原結合領域、ＣＤＲ、ＦＲ、Ｃ領域）を含んでなるヒト化抗体を産生させ、所望されるヒト化鎖をコードする遺伝子（例えば、ｃＤＮＡ）を調製することができる。鎖の一部を調製するために、１つもしくはそれ以上の終止コドンを所望される位置に導入することができる。例えば、ＰＣＲ変異誘発方法を使用して、新たに設計されるヒト化可変領域をコードする核酸配列を構築し、現存するＤＮＡ配列を変更することができる（例えば、カンマン，Ｍ．（Ｋａｍｍａｎ，Ｍ．）ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：５４０４（１９８９年）を参照のこと）。新規のＣＤＲをコードするＰＣＲプライマーは、同じ、または極めて類似のヒト可変領域に基づく先にヒト化された可変領域のＤＮＡテンプレートにハイブリダイズすることができる（サト，Ｋ．（Ｓａｔｏ，Ｋ．）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ５３：８５１−８５６（１９９３年））。テンプレートとして使用するための類似のＤＮＡ配列が入手できない場合、可変領域配列をコードする配列を含んでなる核酸を、合成オリゴヌクレオチドから構築することができる（例えば、コルビンガー，Ｆ．（Ｋｏｌｂｉｎｇｅｒ，Ｆ．）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ８：９７１−９８０（１９９３年）を参照のこと）。シグナルペプチドをコードする配列もまた、（例えば、合成において、ベクターへの挿入の際に）核酸に組み入れることができる。天然のシグナルペプチド配列が入手不能である場合、別の抗体由来のシグナルペプチド配列を使用することができる（例えば、ケトルボロウ，Ｃ．Ａ．（Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ４：７７３−７８３（１９９１年）を参照のこと）。これらの方法、本明細書に記載の方法または他の適切な方法を使用して、変種を容易に産生させることができる。１つの実施態様では、クローニングされた可変領域を変異誘発することができ、所望される特異性を伴う変種をコードする配列を選択することができる（例えば、ファージライブラリーから；例えば、クレベル（Ｋｒｅｂｂｅｒ）ら、米国特許第５，５１４，５４８号明細書；ホーゲングーム（Ｈｏｏｇｅｎｇｏｏｍ）ら、国際公開第９３／０６２１３号パンフレット、１９９３年４月１日公開）を参照のこと）。
【０１４４】
本発明はまた、本発明のヒト化抗体またはヒト化抗体軽もしくは重鎖をコードする配列を含んでなる単離されたおよび／または組換え（例えば、本質的に純粋なを含む）核酸に関する。
【０１４５】
ヒト抗体はまた、免疫化のために、ヒト抗体レパートリーを発現するように操作されている他のトランスジェニック動物を使用することのような他の多様な技術に従って、産生させてもよい。この技術では、ヒト重および軽鎖遺伝子座のエレメントが、内因性重および軽鎖遺伝子座の標的化された崩壊を伴うマウスまたは他の動物に導入される（例えば、ジャコボビッツ（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｚ）ら（１９９３年）Ｎａｔｕｒｅ３６２：２５５；グリーン（Ｇｒｅｅｎ）ら（１９９４年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．７：１３；ロンベルク（Ｌｏｎｂｅｒｇ）ら（１９９４年）Ｎａｔｕｒｅ３６８：８５６；テイラー（Ｔａｙｌｏｒ）ら（１９９４年）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎ．６：５７９（それらの開示内容全体が参照により本明細書に援用される）を参照のこと）。あるいは、遺伝子または染色体トランスフェクション方法によって、またはファージディスプレイ方法を使用する抗体レパートリーの選択を介して、ヒト抗体を構築することができる。この技術では、抗体可変ドメイン遺伝子は、糸状バクテリオファージの大または小コートタンパク質遺伝子のいずれかにインフレームでクローニングされ、ファージ粒子の表面上の機能的抗体フラグメントとしてディスプレイされる。糸状粒子は、一本鎖ＤＮＡコピーのファージゲノムを含有するため、抗体の機能的特性に基づく選択はまた、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択を生じる。この方法では、ファージは、Ｂ細胞のいくつかの特性を模倣する（例えば、ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）ら（１９９３年）Ｃｕｒｒ  Ｏｐ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ３：５５６４−５７１；マキャフェルティー（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ）ら（１９９０年）Ｎａｔｕｒｅ３４８：５５２−５５３（開示内容の全体が参照により本明細書に援用される）を参照のこと）。ヒト抗体はまた、インビトロ活性化Ｂ細胞（例えば、米国特許第５，５６７，６１０号明細書および同第５，２２９，２７５号明細書（それらの開示内容は、それらの全体が参照により援用される）を参照のこと）によって作製することができる。
【０１４６】
１つの実施態様では、免疫化のために、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｆｒｅｍｏｎｔ、カリフォルニア州）のような動物を使用して、「ヒト化」モノクローナル抗体が作製される。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅは、機能的ヒト免疫グロブリン遺伝子によって置き換えられるその免疫グロブリン遺伝子を有したマウス宿主である。従って、このマウスによりまたはこのマウスのＢ細胞から作製されたハイブリドーマにおいて産生される抗体は、すでにヒト化されている。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅは、米国特許第６，１６２，９６３号明細書において説明されており、該文献は本明細書においてその全体が参照により援用される。ＨｕＭＡｂ−ＭｏｕｓｅＴＭ（Ｍｅｄａｒｅｘ）を使用して、類似の方法を達成することができる。
【０１４７】
本発明の抗体はまた、それらが所望される生物学的活性を示す限り、重および／または軽鎖の部分が本来の抗体における相同する配列と同一かあるいは相同である一方、鎖の残りの部分は別の種から誘導されるかまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列に同一かあるいは相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、ならびにそのような抗体のフラグメントに誘導体化され得る（例えば、モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）ら、（１９８４年）ＰＮＡＳ８１：６８５１；米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照のこと）。
【０１４８】
別の実施態様では、本発明は、細胞障害性薬剤にコンジュゲートされた上記の抗体またはそのフラグメント（活性または抑制性であるかにかかわらず）を提供する。本明細書において使用する用語「細胞障害性薬剤」は、その細胞表面上のＮＫＧ２Ａ受容体を有する細胞を死滅させることが可能である分子である。本明細書において使用する用語「コンジュゲートされる」は、２つの薬剤が、共有結合および／または非共有結合を介してどちらも相互に結合されるか；あるいは直接もしくは連結部分を介して、相互に連接またはそうなければ接続されることを意味する。
【０１４９】
多数の毒性部分またはストラテジーのうちのいずれかを使用して、そのような細胞障害性抗体コンジュゲートを産生させることができる。所定の好適な実施態様では、抗体は、放射性同位元素または他の毒性化合物で直接誘導体化される。そのような場合、標識された単一特異性抗ＮＫＧ２Ａ抗体を、患者に注入することができ、ここで、次いで、それは、該標的抗原を発現する細胞、詳細には、ＮＫ細胞に結合し、死滅させることができ、非結合抗体は、簡単に身体から浄化される。「Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ」（ＡＥＳ）のような間接的ストラテジーを使用することもできる（例えば、米国特許第５，２５６，３９５号明細書；バーベット（Ｂａｒｂｅｔ）ら（１９９９年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ１４：１５３−１６６を参照のこと；それらの開示内容全体が参照により本明細書に援用される）。この特定のアプローチは、放射性標識ハプテンならびにＮＫ細胞受容体および放射性ハプテンの両方を認識する抗体の使用に関与する。この場合、抗体は、まず、患者に注入され、標的細胞に結合され、次いで、一旦、非結合型抗体が血流から浄化され、放射性標識ハプテンが投与される。ハプテンは過剰増殖性ＬＧＬ（例えば、ＮＫまたはＴ）細胞上の抗体−抗原複合体に結合し、それによって、それらを死滅させ、非結合型ハプテンは、身体から浄化される。
【０１５０】
細胞障害性または細胞抑制効果を伴う部分の任意のタイプは、本発明の細胞障害性コンジュゲートを形成させ、特異的ＮＫ受容体発現細胞を阻害または死滅させるために本抗体にコンジュゲートさせることができ、放射性同位元素、毒性タンパク質、毒性小分子、例えば、薬物、毒素、免疫調節物質、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、酵素、オリゴヌクレオチド、酵素インヒビター、治療用放射性核種、血管新生インヒビター、化学療法薬、ビンカアルカロイド類、アントラサイクリン系薬剤、エピドフィルロトキシン類（ｅｐｉｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎｓ）、タキサン系薬剤、代謝拮抗剤、アルキル化剤、抗生物質、ＣＯＸ−２インヒビター、ＳＮ−３８、有糸分裂阻害剤、抗血管新生およびアポトーシス誘導剤（ａｐｏｐｔｏｔｏｉｃ  ａｇｅｎｔ）、特に、ドキソルビシン、メトトレキサート、タキソール、ＣＰＴ−１１、カンプトテシン類（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａｎｓ）、ナイトロジェンマスタード、ゲムシタビン、アルキルスルホン酸、ニトロソ尿素類、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体、白金配位錯体、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素、リシン、アブリン、５−フルオロウリジン、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、ＤＮａｓｅＩ、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）エンテロトキシン−Ａ、ヨウシュヤマゴボウ（ｐｏｋｅｗｅｅｄ）抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉｎ）毒素、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素、およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）内毒素などを含む（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１９版、（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．１９９５年）；Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  （ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ，２００１年）；パスタン（Ｐａｓｔａｎ）ら（１９８６年）Ｃｅｌｌ４７：６４１；ゴールデンベルグ（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ）（１９９４年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ  ４４：４３；米国特許第６，０７７，４９９号明細書を参照のこと；それらの開示内容全体が参照により本明細書に援用される）。毒素は、動物、植物、真菌、もしくは微生物由来であり得るか、または化学合成によりデノボで作製され得ることが理解されよう。
【０１５１】
毒素または他の化合物は、任意の多くの利用可能な方法を使用して、直接的もしくは間接的に抗体に連結することができる。例えば、薬剤を、Ｎ−スクシニル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）のような架橋剤を使用するジスルフィド結合形成を介するか、または抗体のＦｃ領域における炭水化物部分を介して、還元型抗体成分のヒンジ領域に付着させることができる（例えば、ウー（Ｙｕ）ら（１９９４年）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ５６：２４４；ウォン（Ｗｏｎｇ）、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ１９９１年）；ウペスラシス（Ｕｐｅｓｌａｃｉｓ）ら、「Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、バーチ（Ｂｉｒｃｈ）ら（編）、１８７−２３０頁（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５年）；プライス（Ｐｒｉｃｅ）、「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ、リッター（Ｒｉｔｔｅｒ）ら（編）、６０−８４頁（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ１９９５年）、カテル（Ｃａｔｔｅｌ）ら（１９８９年）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｔｏｄａｙ７：５１−５８、デルプリノ（Ｄｅｌｐｒｉｎｏ）ら（１９９３年）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ８２：６９９−７０４；アルピッコ（Ａｒｐｉｃｃｏ）ら（１９９７年）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｒｎｉｓｔｒｙ８：３；ライスフィールド（Ｒｅｉｓｆｅｌｄ）ら（１９８９年）Ａｎｔｉｈｏｄｙ，Ｉｍｍｕｎｉｃｏｎ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｒｎ．２：２１７を参照のこと；それらのそれぞれの開示内容全体が参照により本明細書に援用される）。
【０１５２】
１つの好適な実施態様では、抗体は、Ｉ−１３１のような放射性同位元素で誘導体化される。多くの適切な放射性同位元素のいずれかを使用することができ、インジウム−１１１、ルテチウム−１７１、ビスマス−２１２、ビスマス−２１３、アスタチン−２１１、銅−６２、銅−６４、銅−６７、イットリウム−９０、ヨウ素−１２５、ヨウ素−１３１、リン−３２、リン−３３、スカンジウム−４７、銀−１１１、ガリウム−６７、プラセオジム−１４２、サマリウム−１５３、テルビウム−１６１、ジスプロシウム−１６６、ホルミウム−１６６、レニウム−１８６、レニウム−１８８、レニウム−１８９、鉛−２１２、ラジウム−２２３、アクチニウム−２２５、鉄−５９、セレン−７５、ヒ素−７７、ストロンチウム−８９、モリブデン−９９、ロジウム−１０５、パラジウム−１０９、プラセオジム−１４３、プロメチウム−１４９、エルビウム−１６９、イリジウム−１９４、金−１９８、金−１９９、および鉛−２１１を含むがこれらに限定されない。一般に、放射性核種は、好ましくは、オージェ放射体については、２０〜６，０００ｋｅＶの範囲、好ましくは、６０〜２００ｋｅＶの範囲で、β放射体については１００〜２，５００ｋｅＶ、およびα放射体については４，０００〜６，０００ｋｅＶの崩壊エネルギーを有する。α粒子の発生に伴って実質的に崩壊する放射性核種もまた好適である。
【０１５３】
本細胞障害性組成物における抗ＮＫＧ２Ａ抗体へのコンジュゲーションのための細胞障害性部分を選択する際に、該部分は、ヒト身体における心臓、腎臓、脳、肝臓、骨髄、結腸、乳、前立腺、甲状腺、胆嚢、肺、副腎、筋肉、神経線維、膵臓、皮膚、あるいは他の生命を維持する器官または組織から選択される１つもしくはそれ以上の組織のような生命を維持する正常な組織に対して有意なインビボでの副作用を発揮しないことを確実にすることが所望される。本明細書で使用する用語「有意な副作用」は、インビボで投与する場合、化学療法中に通常遭遇するような極僅かなもしくは臨床的に管理可能な副作用しか生じない抗体、リガンドまたは抗体コンジュゲートを指す。
【０１５４】
いくらか関連する実施態様では、本発明はまた、検出マーカーにコンジュゲートされる本発明の抗体を提供する。本明細書において使用する用語「検出マーカー」は、定量的もしくは定性的に観察または測定することができる任意の分子を指す。本発明のコンジュゲートされた抗体において有用な検出マーカーの例は、放射性同位元素、蛍光染料、または抗原／抗体（ＮＫＧ２Ａに対する抗体以外）、レクチン／炭水化物；アビジン／ビオチン；受容体／リガンド；もしくは分子インプリントポリマー／プリント分子系のいずれか１つのメンバーのような相補的結合対のメンバーである。
【０１５５】
本発明の抗体にコンジュゲートされる検出可能なマーカーを使用して、インビトロまたはインビボのいずれかで、ＮＫＧ２Ａに対する抗体の結合を検出してもよい。そのようなコンジュゲートもまた、競合型実験において、ＮＫＧ２Ａへの別の分子の結合を検出するために利用してもよい。インビボ設定では、本発明の検出マーカー（ｄｅｔｃｔａｂｌｅ  ｍａｒｋｅｒ）−抗体コンジュゲートを使用して、検出マーカーのエクスビボ検出（例えば、全身スキャンなどを介する）によってかまたは患者から得られる生物学的材料（例えば、血液、生検組織、他の体液、皮膚掻爬物など）における検出によって、本発明のＮＫＧ２Ａ抗体組成物による患者の処置の効力をモニターすることができる。多様な生物学的材料におけるマーカーの検出は、前記材料における治療用抗体の存在と相関関係がある。
【０１５６】
関連する実施態様では、本発明は、個別の容器において：検出マーカー−抗ＮＫＧ２Ａ抗体コンジュゲート；およびＮＫＧ２Ａ含有材料を含んでなるキットを提供する。ＮＫＧ２Ａ含有材料は、単離されたＮＫＧ２Ａ、本発明の抗ＮＫＧ２Ａ抗体が結合するエピトープを含んでなるＮＫＧ２Ａのフラグメント、またはその細胞表面上においてＮＫＧ２Ａを発現する細胞であってもよい。
【０１５７】
非ヒト霊長類における抗ヒトＮＫＧ２Ａ抗体の評価
好適な一連の実施態様では、本発明の抗ＮＫＧ２Ａ抗体の活性は、非ヒト霊長類においてインビボで評価される。そのような実施態様は、任意の極めて多様な理由によって行うことができる。ヒトＮＫＧ２Ａと非ヒト霊長類由来のＮＫＧ２Ａとの間の交差反応を考慮すると、および霊長類間の生理学的類似性を考慮すると、ヒトＮＫＧ２Ａを認識する抗体を非ヒト霊長類に投与することによって、ＮＫＧ２Ａを発現する細胞（例えば、ＮＫ細胞）の活性をモジュレートするその能力、生成される副作用、毒性、薬力学、薬物動態学、バイオアベイラビリティ、半減期、投与の至適用量もしくは回数、他の治療用薬剤との組み合わせを含む至適処方、あるいは抗体の効力、安全性、または至適投与を決定するために測定され得る他の任意の特性を含むが、これらに限定されない多くの態様について、抗体をインビボで評価することが可能である。候補治療用化合物をインビボで評価する方法については当該分野において周知であり、例えば、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、第１７版、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第２０版（その開示内容全体は参照により本明細書に援用される）に記載されている。
【０１５８】
類人猿、サル、および原猿類を含む任意の非ヒト霊長類を、本明細書に記載の方法に使用することができる。好適な霊長類として、アカゲザル（Ｍａｃａｃｕｓ  ｍｕｌａｔｔａ）、アフリカミドリザル（Ｃｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓ  ａｅｔｈｉｏｐｓ）、マーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  ｊａｃｃｈｕｓ）、リスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ  ｓｃｉｕｒｅｕｓ）、カニクイザル、およびヒヒ（Ｐａｐｉｏ  ｈａｍａｄｒｙａｓ）が挙げられる。別の好適な実施態様では、霊長類は類人猿ではなく、例えば、チンパンジー以外の霊長類である。非ヒト霊長類は、候補ヒト治療用薬剤のための安全性および効力アッセイにおいて一般に使用され、それらのケア、投与、生物学、および他の関連の特徴は当業者に周知である。１つの実施態様では、任意の非ヒト霊長類（またはアッセイにおける非ヒト霊長類由来の組織、細胞、もしくはタンパク質の使用）への任意の抗体の投与の前に、候補抗ヒトＮＫＧ２Ａ抗体と非ヒト霊長類由来のＮＫＧ２Ａとの交差反応が確認される。
【０１５９】
所定の実施態様では、非ヒト霊長類は、ＮＫＧ２Ａ調節化合物によって処置され得る疾患または病態のモデルとして役立つ。例えば、疾患または病態の徴候を処置もしくは緩和する抗体の能力を評価するために、例えば、自己免疫障害、アレルギー、癌、あるいは感染性疾患のモデルを使用することができる。本発明の実践のために決して制限するわけではないが、所定の非ヒト霊長類は、特定のタイプの疾患または病態を研究するのに特に有用である。例えば、マーモセットは、免疫および循環器系疾患の研究のためのモデル動物として役立っており、リスザルは感染性疾患の研究に、マカク（アカゲザルを含む）は特定の化合物の薬理学および毒物学の研究に、ヒヒは外科的研究、移植、および生体材料のモデルとして役立っている。
【０１６０】
１つの実施態様では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体を非ヒト霊長類に投与して、ＮＫＧ２Ａ活性への結合および／またはモジュレートにおける抗体の効力を評価する。そのような実施態様では、抗体を、任意の用量、回数、または処方で投与することができ、実際にそのような因子は、効力に及ぼすそれらの関連の影響を評価するために変動することができる。抗体の効力は、任意の極めて多様な方法で評価することができる。例えば、ＮＫＧ２ＡもしくはＮＫＧ２Ａ発現細胞への抗体のインビボ結合、細胞、例えば、ＮＫ細胞上のＮＫＧ２Ａの発現に対する抗体のインビボ効果、またはＮＫＧ２Ａの活性に対する抗体のインビボでの影響を評価することができ、例えば、ＮＫ細胞活性のための上記のアッセイのいずれかを使用して測定される。そのような実施態様では、抗体は典型的に、非ヒト霊長類に投与され、例えば、非ヒト霊長類から得られる生物学的サンプルに対して、その効果が検出される。あるいは、所定の方法をインビトロで行うことができ、ここで、例えば、非ヒト霊長類から得られるＮＫＧ２Ａ発現細胞に対する抗体の効果が調べられる。
【０１６１】
抗ヒトＮＫＧ２Ａ抗体の結合を評価するために、抗体は、直接的または間接的のいずれかで標識することができる。例えば、抗体は、投与前に放射性同位元素で標識することができ、投与後、異なる時間で得られる多様な生物学的サンプル（例えば、血液、多様な組織または器官、骨髄、脾臓、リンパ系成分などのような免疫に関連する組織）を調べることによって、動物内のその局在が評価される。１つの好適な実施態様では、ＰＢＬが得られ、例えば、蛍光標識第二抗体を使用して、例えば、ＦＡＣＳ解析によって結合抗体が検出されることで、ＮＫ細胞への抗体の結合が決定される。
【０１６２】
同様に、抗体を非ヒト霊長類に投与し、ＮＫＧ２Ａ活性に対するそれらの効果を評価することができる。例えば、ＮＫ細胞は、抗ＮＫＧ２Ａ抗体の投与の前後に得ることができ、ＮＫＧ２Ａの活性、発現、および／または２つ（もしくはそれ以上）の組の細胞の数を、任意の標準的な方法を使用して評価することができる。ＮＫＧ２Ａ刺激を阻止する（そしてそれによって、受容体を介するＮＫ細胞の阻害を阻止する）本発明の活性化抗体は、ＮＫ細胞活性を増加することが予想される。ＮＫＧ２Ａ受容体を架橋する本発明の阻害抗体は、ＮＫ細胞活性を減少し、生存中のＮＫ細胞の数を減少することが予想される。非ヒト霊長類において変更されたＮＫ細胞活性を引き起こす両方のタイプの抗体は、ヒトにおける障害を処置する際の使用に適切であるとみなされ、ここで、ＮＫ細胞活性の増加または減少が所望される。
【０１６３】
別の組の実施態様では、抗体の安全性ならびにそれらの多様な薬物動態学的および薬力学的特性を評価するために、抗ＮＫＧ２Ａ抗体が非ヒト霊長類に投与される。安全性は、任意の極めて広範な方法で評価することができる。例えば、抗体の全体毒性が、半数致死量（ＬＤ５０）を決定することによって評価することができ、これは、典型的に、キログラムあたりミリグラム（ｍｇ／ｋｇ）として表現され、ここで、値５０は、研究下の動物間の死亡百分率を指す。ＬＤ５０を決定することに加えて、心拍数、血圧などによって明示される挙動的、物理的、または生理学的変化を含む、投与に対する任意の検出可能な応答について動物をモニターすることによって、安全性もまた評価することができる。応答もまた、腎機能についてのクレアチンまたはＢＵＮ、肝機能などを決定するためのプロトロンビン、ビリルビン、アルブミン、または多様な酵素のような器官の機能を示すマーカーを調べるための血液および他の検査室に基づく試験に関与することができる（例えば、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、第１７版（参照により本明細書に援用される）を参照のこと）。
【０１６４】
抗体のインビボでの薬物動態学的および薬力学的評価のための方法は、標準的であり、当該分野において周知である（例えば、ヘイ（Ｈｅ）ら（１９９８年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：１０２９−１０３５；アルヤナキアナ（Ａｌｙａｎａｋｉａｎ）ら（２００３年）Ｖｏｘ  Ｓａｎｇｕｉｎｉｓ８４：１８８−１９２、シャルマ（Ｓｈａｒｍａ）ら（２０００年）ＪＰＥＴ２９３：３３−４１（その開示内容全体は参照により本明細書に援用される）を参照のこと）。そのようなアッセイは、典型的に、抗ＮＫＧ２Ａ抗体を非ヒト霊長類に投与すること、ならびに投与後、多様な時間で、抗体の（血漿および他の組織における）レベル、分布、結合、安定性、および他の特性を調べることに関与する。そのようなアッセイは、前臨床研究の極めて重要な構成分であり、抗体のインビボでの半減期、分布、バイオアベイラビリティなどを決定することによって、治療域ならびに、従って、投与された抗体によるＮＫ発現細胞の至適標的化を可能にする適切な投与規則（例えば、投与の回数および用量）を決定するのに役立つ。
【０１６５】
抗ＮＫＧ２Ａ抗体の効力、安全性、薬力学および薬物動態学の研究との共同で、多様な処方および投与規則についてもまた、体系的に試験して、抗ヒトＮＫＧ２Ａ抗体についての至適効力および安全性を得ることができる。例えば、治療域（高い確率の治療成功を有する抗体の血漿濃度の範囲）、ならびにＮＫＧ２Ａを標的化し、インビボでＮＫ細胞活性をモジュレートするのに至適に安全かつ有効である該規則および処方を決定することができる。例えば、所定の抗体を、１、２、３、４、５、もしくは６日間ごと、または１、２、３、もしくは４週間ごとなどに投与し、安全性、効力、動態学などのパラメータを調べることができる。同様に、ある時点で投与される抗体の用量を変動することができ、同じパラメータを調べるか、または投与の用量および回数の任意の組み合わせを試験することができる。さらに、異なる処方、例えば、異なる賦形剤、抗ＮＫＧ２Ａ抗体の異なる組み合わせ、またはＮＫＧ２Ａ抗体と他の治療用薬剤（処置する病態に依存する例えば、癌を処置するための化学療法剤）との異なる組み合わせを含む組成物を、非ヒト霊長類において試験することができる。また、異なる投与経路、例えば、静脈内、肺、局所などを比較することができる。投与パラメータを変動するそのような方法は、当業者に周知である。
【０１６６】
医薬組成物
本発明はまた、医薬組成物、例えば適切な賦形剤中の本発明の抗体（フラグメントを包含）およびその誘導体ならびに医薬状許容される担体を含有する医薬組成物を提供する。
【０１６７】
これらの組成物に使用され得る薬学的に許容可能なキャリアとして、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えば、リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩、または電解質、例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイダルシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースに基づく物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、蝋、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６８】
本発明の組成物は、経口的、非経口的、吸入スプレーにより、局所的、直腸内、経鼻的、頬側的、膣内に、あるいはインプラントされたリザーバを介して投与することができる。本明細書で使用する「非経口」は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑膜内、胸骨内、髄腔内、肝内、病巣内および頭蓋内注入または輸注技術を含む。ＲＡのような局在化された障害では、組成物は、しばしば、局所的、例えば、炎症関節に投与される。
【０１６９】
本発明の無菌注入可能な形態は、水性または油性懸濁液であり得る。これらの懸濁液は、適切な分散または湿潤剤および懸濁剤を使用して、当該分野において公知の技術に従って処方することができる。無菌注入可能な調製物はまた、非毒性の非経口的な許容可能な希釈剤もしくは溶媒における無菌注入可能な溶液または懸濁液（例えば、１，３−ブタンジオール中溶液として）であってもよい。なかでも、用いられ得る許容可能なビヒクルおよび溶媒は、水、リンゲル溶液および等張性塩化ナトリウム溶液である。さらに、無菌の不揮発性油は、溶媒または懸濁媒体として従来的に用いられる。この目的のために、合成モノ−またはジグリセリドを含む任意の低刺激不揮発性油を用いることができる。オレイン酸およびそのグリセリド誘導体のような脂肪酸は、注入可能物の調製に有用であり、それらは、特に、ポリオキシエチレン化バージョン（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ｖｅｒｓｉｏｎ）のオリーブ油またはヒマシ油のような天然の薬学的に許容可能な油である。これらの油溶液または懸濁液はまた、エマルジョンおよび懸濁液を含む薬学的許容可能な剤形の処方において一般に使用される長鎖アルコール希釈液または分散剤、例えば、カルボキシメチルセルロースまたは類似の分散剤を含有してもよい。薬学的に許容可能な固体、液体、または他の剤形の製造に一般に使用される他の一般に使用される界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ、Ｓｐａｎおよび他の乳化剤またはバイオアベイラビリティーの増強剤もまた、処方の目的のために使用することができる。
【０１７０】
本発明の組成物は、カプセル、錠剤、水性懸濁液または溶液を含むがこれらに限定されない任意の経口的な許容可能な剤形で経口的に投与することができる。経口使用のための錠剤の場合、一般に使用されるキャリアとして、乳糖およびトウモロコシデンプンが挙げられる。ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤もまた、典型的に添加される。カプセル形態の経口投与のための有用な希釈剤として、乳糖および乾燥トウモロコシデンプンが挙げられる。経口用途に水性懸濁液が必要な場合、有効成分は乳化および懸濁剤と組み合わせられる。所望であれば、所定の甘味、風味付け、または着色剤もまた添加することができる。
【０１７１】
あるいは、本発明の組成物は、直腸内投与のための坐剤の形態で投与することもできる。これらは、薬剤と、室温では固体であるが直腸温度では液体であり、従って、直腸内では融解して薬物を放出する適切な非刺激性賦形剤とを混合することによって調製することができる。そのような材料として、ココアバター、蜜蝋およびポリエチレングリコールが挙げられる。そのような組成物は、薬学的処方の分野において周知の技術に従って調製される。
【０１７２】
本発明の組成物は、特に、処置の標的が眼、皮膚、関節、もしくは下部腸管の疾患を含む局所適用によって用意にアクセス可能な領域または器官を含む場合、局所的に投与することができる。適切な局所処方は、これらの領域または器官のそれぞれについて容易に調製される。下部腸管のための局所適用は、直腸用坐剤処方（上記を参照のこと）または適切な浣腸処方で行うことができる。局所用経皮パッチも使用することができる。
【０１７３】
局所適用のために、組成物は、１つもしくはそれ以上のキャリアに懸濁または溶解された有効成分を含む適切な軟膏で処方してもよい。本発明の化合物の局所投与のためのキャリアとして、鉱油、流動ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックスおよび水が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、組成物は、１つもしくはそれ以上の薬学的に許容されたキャリアに懸濁または溶解された有効成分を含有する適切なローションまたはクリームにおいて処方することができる。適切なキャリアとして、鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベイト６０（ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ６０）、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７４】
眼科用途のために、組成物を、等張性、ｐＨ調整した滅菌食塩水中の微粉化懸濁液、または好ましくは、等張性、ｐＨ調整した食塩水中の溶液として、塩化ベンジルアルコニウムのような保存剤を伴うもしくは伴わずに、処方してもよい。あるいは、眼科用途として、組成物を、ワセリンのような軟膏において処方してもよい。
【０１７５】
本発明の処方物はまた、経鼻エアゾルまたは吸入によって投与してもよい。そのような組成物は、薬学的処方の分野に周知の技術に従って調製され、ベンジルアルコールもしくは他の適切な保存剤、バイオアベイラビリティーを増強するための吸収促進剤、フルオロカーボン、および／または他の従来の可溶化もしくは分散剤を用いる食塩水中の溶液として調製してもよい。
【０１７６】
１つの実施態様では、本発明の抗体または治療用化合物は、単独かまたは患者または動物に対して標的化された送達のための別の物質と共に、リポソーム（抗体の場合、「免疫リポソーム」）に組み入れられ得る。そのような他の物質として、遺伝子治療のための遺伝子の送達のためかまたはＮＫ細胞を活性化するもしくは成熟樹状細胞を阻害するためのアンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉもしくはｓｉＲＮＡの送達のための核酸、あるいは他の手段を介するＮＫ細胞の活性化（もしくは樹状細胞の阻害）のための毒物または薬物、あるいは本発明の目的に有用であり得る本明細書に記載の他の任意の薬剤を挙げることができる。
【０１７７】
別の実施態様では、本発明の抗体または他の化合物は、バイオアベイラビリティ、インビボでの半減期などを改善するために改変することができる。例えば、任意の数の形態のポリエチレングリコールおよび当該分野において公知の付着方法（例えば、リー（Ｌｅｅ）ら（２００３年）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．１４（３）：５４６−５３；ハリス（Ｈａｒｒｉｓ）ら（２００３年）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２（３）：２１４−２１；デケルト（Ｄｅｃｋｅｒｔ）ら（２０００年）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．８７（３）：３８２−９０を参照のこと）を使用して、抗体および他の化合物をペグ化することができる。
【０１７８】
投与の用量および回数を決定すること
上記のように、本発明の重要な部分は、投与の安全かつ有効な用量および回数を決定するために、非ヒト霊長類において抗ＮＫＧ２Ａ抗体を試験することである。投与規則の適切な開始は、既に開発されている他の治療用モノクローナル抗体による経験を調べることによって、決定することができる。いくらかのモノクローナル抗体は、Ｒｉｔｕｘａｎ（リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ））、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（トラツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ））またはＸｏｌａｉｒ（オマリズマブ（Ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ））、Ｂｅｘｘａｒ（トシツモマブ）、Ｃａｍｐａｔｈ（アレムツズマブ）、Ｚｅｖａｌｉｎ、Ｏｎｃｏｌｙｍならびに類似の投与規則（即ち、処方および／または用量および／または投与プロトコル）が本発明の抗体と共に使用され得るような臨床的状況において効率的であることが示されている。投与のためのスケジュールおよび用量は、例えば、製造者の指示書を使用して、これらの製品のための既知の方法に従って決定することができる。例えば、モノクローナル抗体は、１００ｍｇ（１０ｍＬ）または５００ｍｇ（５０ｍＬ）の単回使用のバイアルのいずれかにおいて１０ｍｇ／ｍＬの濃度で供給することができる。生成物は、９．０ｍｇ／ｍＬ塩化ナトリウム、７．３５ｍｇ／ｍＬクエン酸ナトリウム二水和物、０．７ｍｇ／ｍＬポリソルベイト（ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０）、および注射用滅菌水において、靜注投与のために処方される。ｐＨは６．５に調整される。本発明の抗体のための例示的に適切な用量範囲は、約１０ｍｇ／ｍ２〜５００ｍｇ／ｍ２であり得る。しかし、これらのスケジュールは例示的であること、ならびに至適スケジュールおよび規則は、臨床治験において決定されなければならない抗体の親和性および抗ＮＫＧ２Ａ活性を考慮して適応することができることが理解されよう。２４時間、４８時間、７２時間または１週間もしくは１箇月間、細胞を飽和するＮＫＧ２Ａへの抗体の注入の量およびスケジュールは、抗体の親和性およびその薬物動態パラメータを考慮して決定される。
【０１７９】
しかし、これらのスケジュールは例示的であること、ならびに至適スケジュールおよび規則は、臨床治験または前臨床治験において決定されなければならない抗体の親和性および抗ＮＫＧ２Ａ活性を考慮して適応することができることが理解されよう。２４時間、４８時間、７２時間または１週間もしくは１箇月間、細胞を飽和するＮＫＧ２Ａへの抗体の注入の量およびスケジュールは、抗体の親和性およびその薬物動態パラメータを考慮して決定される。
【０１８０】
本方法において患者または非ヒト霊長類に投与される用量は、経時的に被験体において有益な応答を生じるのに十分であるべきである。用量は、用いられる特定のモジュレーターの効力および被験体の病態、ならびに体重または処置しようとする領域の面積によって決定される。用量のサイズはまた、特定の被験体における投与に伴い得る任意の有害な副作用の存在、性質、および程度によって決定される。特定の患者において投与しようとする化合物の有効量を決定する際に、医師は、化合物の循環血漿レベル、化合物毒性、および抗化合物抗体の産生を評価し得る。一般に、化合物の等価用量は、典型的な被験体について、約１ｎｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇである。投与は、単回または分割用量を介して達成することができる。
【０１８１】
ヒトおよび非ヒト霊長類ＮＫＧ２Ａ受容体の両方に結合する本発明の抗体は、投与の用量および回数を決定する際に有利に使用することができる。抗ＮＫＧ２Ａ抗体による治療のための至適治療域の選択は、非ヒト霊長類への抗体の投与に基づいて行うことができる。短期間（２４時間共培養）におけるＮＫ細胞活性化は、骨髄細胞（ＢＭＣ）毒性を回避することが示唆されている一方、より長期間（骨髄細胞と活性化されたＮＫ細胞との４８時間共培養）は、造血再構成（ｈｅｍａｔｏｐｉｏｅｔｉｃ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）に有害な影響を及ぼすことが示されている（コウ（Ｋｏｈ）ら（２００２年）Ｂｉｏｌ．Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．８：１７−２５）。しかし、より長期間（例えば、２４時間または４８時間さえよりも長い）にわたる個体におけるＮＫ細胞のＮＫ細胞活性化抗ＮＫＧ２Ａ抗体への曝露を可能にする投与規則を用いることは貴重である。理論にとらわれないことを所望するならば、抗ＮＫＧ２Ａ抗体が２４時間または４８時間を超えて存在するような規則は、標的（例えば、癌、感染、炎症）細胞に対する治療効果のために個体において、抗ＮＫＧ２Ａ抗体が十分な量のＮＫ細胞に接触し、該細胞を活性化することを可能にする。従って、本発明者らは、個体を抗ＮＫＧ２Ａ抗体で処置する方法であって、前記個体を抗ＮＫＧ２Ａ抗体に、２４時間、より好ましくは、４８時間を超える期間、曝露させることを含んでなる上記方法を提供する。最も好ましくは、本発明は、２４時間、または４８時間を超える、あるいはより好ましくは、少なくとも５、６、７、１０、１４もしくは２０日間の血漿中半減期を有する抗ＮＫＧ２Ａ抗体を前記個体に投与することを含んでなる。最も好ましくは、本発明は、Ｆｃ部分、好ましくは、Ｇ２またはＧ４タイプのＦｃ部分を含んでなる抗ＮＫＧ２Ａ抗体を前記個体に投与することを含んでなる。本明細書においてさらに考察されるように、ＮＫＧ２Ａ機能を阻止する任意の適切な抗体、例えば、Ｚ１９９またはＺ２７０の結合特異性を有する抗体を使用することができる。好適な実施態様では、抗体は、２回目もしくはそれより後の投与で投与され、抗体は、キメラ、ＣＤＲグラフト化、ヒトまたはヒト化抗体である。
【０１８２】
本発明は、ヒトＮＫＧ２Ａに対して指向される治療用抗体のための適切な投与規則を同定する方法を提供し、該方法は、投与規則、好ましくは、抗体の用量または回数が変動される一連の規則を使用して、抗体を非ヒト霊長類に投与すること、ならびに非ヒト霊長類におけるＮＫＧ２Ａ発現細胞の活性および特に、投与規則のための霊長類の骨髄細胞（ＢＭＣ）および／または造血細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｅｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ）、特に、骨髄細胞再構成に対する治療の効果を決定することを含んでなる。好ましくは、方法は、抗ＮＫＧ２Ａ抗体投与後の骨髄再構成を評価することをさらに含んでなり、一般的に、骨髄再構成が、例えば、抗ＮＫＧ２Ａ療法前に観察されるレベルに接近するレベルまたは予め決定された最小レベルにまで正常化するのに要する日数を決定することに関与する。次いで、骨髄再構成を正常化させることを可能にする投与規則を選択または同定することが可能である。
【０１８３】
本発明は、非ヒト霊長類におけるＮＫＧ２Ａ発現細胞の活性を決定することおよび／またはＮＫＧ２Ａ発現細胞の活性において検出可能なモジュレーションをもたらす投与規則を同定もしくは選択することをさらに含んでなることができる。
【０１８４】
前記投与規則は、例えば、個体のＮＫ細胞を活性化する抗ＮＫＧ２Ａ抗体への曝露の期間、および抗体投与の回数について、表され得る。そのようなパラメータに基づいて、投与回数および用量は、例えば、抗体の血漿中半減期、親和性、バイオアベイラビリティ（またはピーク血清濃度までの時間）などを考慮し、使用される特定の抗体に依存して、適応することができる。
【０１８５】
規則が、霊長類による骨髄再構成の部分的もしくは完全な回復または正常化を可能にし、ＮＫＧ２Ａ発現細胞の活性における検出可能なモジュレーションをもたらすという決定は、投与規則がヒトにおける使用に適切であることを示す。
【０１８６】
内因性ヒト免疫グロブリンの異化速度については、良好に特徴付けされている。ＩｇＧの半減期は、アイソタイプに従ってばらつきがあり、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４では３週間まで、およびＩｇＧ３では約１週間である。薬物動態学が抗原結合性または免疫原性によって変更されない限り、無傷（ｉｎｔａｃｔ）なヒトＩｇＧモノクローナル抗体は内因性ＩｇＧに匹敵する薬物動態学を示す。先に考察したように、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４アイソタイプの非常に長い半減期は、ＦｃＲｎによる異化保護が原因である。ＦｃＲｎは、肝細胞、内皮細胞、および網内系（ＲＥＳ）の食細胞上で発現される。ＩｇＧがエンドサイトーシスを受ける場合、エンドソームの低いｐＨは、ＩｇＧＦｃドメインのＦｃＲｎへの結合を促進し、これは、ＩｇＧを細胞表面へリサイクルし、リソソーム分解からＩｇＧをサルベージする。他のＩｇＧアイソタイプと比較してＩｇＧ３の短い半減期は、ＦｃＲｎ結合ドメインにおける単一のアミノ酸の差異（４３５位のヒスチジンの代わりにアルギニン）が原因である。
【０１８７】
無傷（ｉｎｔａｃｔ）なマウスＩｇＧ１およびＩｇＧ２抗体の排除は、対応するヒトアイソタイプよりかなり速い。マウス抗体の半減期は、ヒトにおいて１２〜４８時間の範囲である。ヒトにおけるマウス抗体の短い半減期は、マウスＦｃドメインのヒトＦｃＲｎへの低い親和性結合が原因である。ヒトＦｃＲｎは、ヒト、ウサギ、およびモルモットＩｇＧに結合するが、ラット、ウシ、ヒツジ、またはマウスＩｇＧに有意には結合せず；マウスＦｃＲｎは、これらのすべての種由来のＩｇＧに結合する。Ｆ（ａ’）２、Ｆａｂ、およびｓｃＦＶを含む抗体フラグメントは、Ｆｃドメインを欠き、ＦｃＲｎには結合しない。従って、これらのフラグメントの半減期は無傷（ｉｎｔａｃｔ）なＩｇＧよりも実質的に短く、半減期は、主にそれらの分子量によって決定される。より低い分子量のＦａｂおよびｓｃＦｖフラグメントは、腎クリアランスに供されて、排泄が加速される。報告された半減期は、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントでは１１〜２７時間の範囲であり、Ｆａｂフラグメントでは０．５〜２１時間の範囲である。一価および多価ｓｃＦｖ構築物の半減期は、数分〜数時間の範囲であり得る。
【０１８８】
抗原結合性は、抗体の薬物動態学に有意に影響を及ぼし得る。抗体が内在化された細胞膜抗原に結合するか、または分泌型抗原によって形成される免疫複合体が循環から効率的に排除される場合、抗原は、抗体クリアランスのための「シンク（ｓｉｎｋ）」として作用し得る。抗原シンクは、用量依存的薬物動態学を生じる。用量レベルが抗原プールを飽和するのに不十分である場合、抗原媒介クリアランスが優勢であり、抗体半減期は内因性ＩｇＧの半減期より短く；抗原を飽和する用量レベルでは、ＲＥＳ媒介クリアランスが優勢であり、半減期は内因性ＩｇＧに類似する。
【０１８９】
本発明の好適な実施態様は、抗ＮＫＧ２Ａ抗体が１回目の投与で投与される投与規則について記載している。抗ＮＫＧ２Ａ抗体の１回目の投与は、ＮＫ細胞を活性化し、間接的に、活性化ＮＫ細胞によって、個体における骨髄細胞再構成を阻害し得る。抗ＮＫＧ２Ａ抗体の２回目の投与は、骨髄細胞再構成回復の薬力学的プロファイルに一致して投与され、例えば、個体の骨髄細胞再構成の速度が少なくとも部分的に回復していることが予想される時に投与されるべきである。従って、ヒトおよび非ヒト霊長類において受容体を交差反応する抗ＮＫＧ２Ａ抗体を使用することによって、本発明者らは、骨髄再構成が影響を受けないことが報告されている２４時間を超える期間の間、ＮＫ細胞を抗ＮＫＧ２Ａ抗体に接触させる方法を提供する。
【０１９０】
好適な実施態様では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体の２回目の投与は、初回投与の少なくとも６、７、８、９または１０日後、好ましくは、初回投与の少なくとも１４、１５、１６、または２０日後に投与される。最も好ましくは、抗ＮＫＧ２Ａ抗体の２回目の投与は、被験体における抗ＮＫＧ２Ａ抗体血漿濃度が、初期（投与時）濃度の半分に到達することが見積もられる時間（日）の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０日後または少なくとも１４、１５、１６、もしくは２０日後、好ましくは、抗ＮＫＧ２Ａ抗体の少なくとも１つの血漿中半減期の期間の少なくとも６〜１０日後または少なくとも１５〜２０日後に投与される。あるいは、方法は、抗ＮＫＧ２Ａ抗体のピーク血清濃度について表され得、ここで、抗ＮＫＧ２Ａ抗体の２回目の投与は、被験体における抗ＮＫＧ２Ａ抗体血漿濃度が個体のピーク血清濃度の半分に到達することが見積もられる時間（日）の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０日後または少なくとも１４、１５、１６、もしくは２０日後に投与される。
【０１９１】
さらなる実施態様では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体の２回目の投与は、被験体における抗ＮＫＧ２Ａ抗体血漿濃度が、検出不能な濃度に到達することが見積もられる時間（日）の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０日後または少なくとも１４、１５、１６、もしくは２０日後、好ましくは、抗ＮＫＧ２Ａ抗体の少なくとも２、３、４またはそれ以上の血漿中半減期の期間の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０日後または少なくとも１４、１５、１６、もしくは２０日後に投与される。
【０１９２】
好適な実施態様では、投与規則は、Ｇ２ｂ、好ましくは、Ｇ４サブタイプのＦｃ領域を含んでなる抗体（それぞれＩｇＧ２ｂまたはＩｇＧ４）について記載される。好ましくは、前記抗体は、約５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１８、２０、２１日間、または好ましくは、約１０〜１５日間、１５〜２１日間の血漿中半減期を有する。好ましくは、抗体は、ＮＫ細胞上のＦｃ受容体（ＣＤ１６）に実質的に結合しないＦｃ領域を含んでなる。前記抗体は、好ましくは、１回目の投与、ならびに２回目および／またはその後の投与で投与され、ここで、２回目および／またはその後の投与は、抗体がその初期濃度の半分に到達することが見積もられる少なくとも６、７、８、９、１０、１４、１５、１６、もしくは２０日後に投与される。前記２回目および／またはその後の投与は、投与後の日数の絶対数、例えば、好ましくは、初回投与の少なくとも６、７、８、９もしくは１０日後、好ましくは、１回目の投与の少なくとも１４、１５、１６、２０、２１、２４、２８、３０もしくは３５日後で表され得る。前記抗体は、天然に存在するＦｃ部分、好ましくは、天然に存在するヒトＦｃ部分を含んでなる抗体であってもよく、またはより好ましくは、抗体の血漿中半減期を増加するおよび／またはＦｃ受容体への結合を改変する、例えば、Ｆｃｎ受容体への結合を増加して、血漿中半減期を増加するか、もしくはＦｃγＩＩＩａへの結合を減少して、ＮＫ細胞に対する望ましくない毒性（ＡＤＣＣ）を減少する１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換のような改変を含有してもよい。そのような改変は、当該分野において周知の方法に従って行うことができ、その改変のいくらかは、本明細書においてさらに記載されている。
【０１９３】
なお別の好適な実施態様では、投与規則は、抗体フラグメント、好ましくは、例えば、約５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１８、２０、２１日間の血漿中半減期を有するように本明細書に記載のようなポリエチレングリコールで改変されたＦ（ａｂ’）２フラグメントについて記載される。前記抗体は、好ましくは、１回目の投与、ならびに２回目および／またはその後の投与で投与され、ここで、２回目および／またはその後の投与は、抗体がその初期濃度の半分に到達することが見積もられる少なくとも６、７、８、９、１０、１４、１５、１６、もしくは２０日後に投与される。前記２回目および／またはその後の投与は、投与後の日数の絶対数で表され得、例えば、好ましくは、初回投与の少なくとも６、７、８、９もしくは１０日後、好ましくは、１回目の投与の少なくとも１４、１５、１６、２０、２１、２４、２８、３０もしくは３５日後である。
【０１９４】
薬学的組み合わせ
本発明の別の重要な実施態様に従えば、抗ＮＫＧ２Ａ抗体および／または他の化合物は、抗体もしくは化合物が投与されている特定の治療目的のために通常利用される薬剤を含む１つもしくはそれ以上のさらなる治療用薬剤と共に処方されてもよい。さらなる治療剤は、通常、処置する特定の疾患または病態のための単剤治療における該薬剤に典型的に使用される用量で投与される。そのような治療用薬剤として、癌の処置において使用される治療用薬剤（化学療法化合物、ホルモン、血管新生インヒビター、アポトーシス誘導剤（ａｐｏｐｔｉｏｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）などを含む「抗癌化合物」）；感染性疾患を処置するために使用される治療用薬剤（抗ウイルス化合物を含む）；自己免疫疾患、炎症性障害、および免疫拒絶の処置のような他の免疫療法において使用される治療用薬剤；サイトカイン；免疫調節剤；補助化合物；または他の抗体ならびに活性化および抑制性ＮＫ細胞受容体の両方に対する他の抗体のフラグメントが挙げられる。他で具体的に述べない限り、下記の組み合わせの組成物の組は、本発明の活性化抗体、阻害抗体または細胞毒素−抗体コンジュゲートのいずれかを含んでなることができる。
【０１９５】
癌の処置のための治療用薬剤として、化学療法剤（ＤＮＡ複製、有糸分裂および染色体分離（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｓｅｇｒｅａｇａｔｉｏｎ）を妨害する薬剤、ならびにポリヌクレオチド前駆体の合成および正確性を崩壊する薬剤を含む）、ホルモン療法剤、抗血管新生剤、ならびにアポトーシスを誘導する薬剤が挙げられる。
【０１９６】
例示的に考えられる化学療法剤として、アルキル化剤、代謝拮抗剤、細胞障害性抗生物質、ビンカアルカロイド、例えば、アドリアマイシン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、カルミノマイシン、ダウノマイシン、ドキソルビシン、タモキシフェン、タキソール、タキソテール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、エトポシド（ＶＰ−１６）、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、シトシンアラビノシド、シクロホスファミド、チオテパ、メトトレキサート、カンプトテシン、アクチノマイシンＤ、マイトマイシンＣ、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、アミノプテリン、コンブレタスタチン（系薬剤）、ならびにそれらの誘導体およびプロドラックが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９７】
ホルモン剤としては、例えば、ＬＨＲＨアゴニスト、例えば、リュープロレリン、ゴセレリン、トリプトレリン、およびブセレリン；抗エストロゲン、例えば、タモキシフェンおよびトレミフェン；抗アンドロゲン例えば、フルタミド、ニルタミド、シプロテロンおよびビカルタミド；アロマターゼ阻害剤例えば、アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾールおよびファドロゾール；ならびにプロゲスターゲン例えば、メドロキシ、クロルマジノンおよびメゲストロールが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９８】
併用治療のための化学療法剤が米国特許第６，５２４，５８３号明細書の表Ｃに列挙されており、薬剤および適応に関する開示内容は、具体的に、本明細書において参照により援用される。列挙されたそれぞれの薬剤は例示的であり、限定的ではない。当業者は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」第１５版、第３３章、特に６２４〜６５２頁を参照のこと。用量の変動は、処置する病態に依存して生じる可能性がある。処置を施行する医師は、個々の被験体に対する適切な用量を決定することが可能である。
【０１９９】
抗血管新生剤の例として、それぞれＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ受容体に対して指向される中和抗体、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ＲＮＡアプタマーおよびリボザイムが挙げられる（米国特許第６，５２４，５８３号明細書、その開示内容は本明細書において参照により援用される）。国際公開第９８／１６５５１号パンフレット（具体的に本明細書において参照により援用される）に記載されているように、拮抗特性を伴うＶＥＧＦの変異体もまた用いることができる。併用治療に関して有用であるさらなる例示的抗血管新生剤が米国特許第６，５２４，５８３号明細書の表Ｄに列挙されており、薬剤および適応に関する開示内容は、具体的に、本明細書において参照により援用される。
【０２００】
例示的アポトーシス誘導剤として、ｂｃｒ−ａｂｌ、ｂｃｌ−２（ｂｃｌ−１、ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１とは異なる；（ＧｅｎＢａｎｋ）寄託番号Ｍ１４７４５、Ｘ０６４８７；米国特許第５，６５０，４９１号明細書；および同第５，５３９，０９４号明細書；それぞれ、本明細書において参照により援用される）ならびにＢｃｌ−ｘ１、Ｍｃｌ−１、Ｂａｋ、Ａ１、およびＡ２０を含むファミリーメンバーが挙げられるが、これらに限定されない。ｂｃｌ−２の過剰発現はＴ細胞リンパ腫においてはじめて発見された。癌遺伝子ｂｃｌ−２は、Ｂａｘ、アポトーシス経路におけるタンパク質に結合し、不活化することによって、機能する。ｂｃｌ−２機能を阻害すると、Ｂａｘの不活化が防止され、アポトーシス経路を促進させることが可能である。例えば、アンチセンスヌクレオチド配列、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡまたは小分子の化学化合物を使用するこのクラスの発癌遺伝子の阻害が、アポトーシスの増強を生じさせるための本発明での使用のために考慮される（米国特許第５，６５０，４９１号明細書；同第５，５３９，０９４号明細書；および同第５，５８３，０３４号明細書；それぞれは本明細書において参照により援用される）。
【０２０１】
本発明の分子と組み合わせて使用することができる有用な抗ウイルス剤として、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター、非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビターおよびヌクレオシド類似体が挙げられるが、これらに限定されない。抗ウイルス剤の例として、ジドブジン、アシクロビル、ガングシクロビル、ビダラビン、イドクスウリジン、トリフルリジン、およびリバビリン、ならびにフォスカルネット、アマンタジン、リマンタジン、サキナビル、インディナビル、アンプレナビル、ロピナビル、リトナビル、α−インターフェロン、アデフォビル、クレバジン、エンテカビル、およびプレコナリルが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０２】
自己免疫または炎症性障害については、とりわけ、免疫抑制薬、例えば、アザチオプリン（例えば、Ｉｍｕｒａｎ）、クロラムブシル（例えば、Ｌｅｕｋｅｒａｎ）、シクロホスファミド（例えば、Ｃｙｔｏｘａｎ）、シクロスポリン（例えば、Ｓａｎｄｉｍｍｕｎｅ、Ｎｅｏｒａｌ）、メトトレキサート（例えば、Ｒｈｅｕｍａｔｒｅｘ）、副腎皮質ステロイド、プレドニゾン（例えば、Ｄｅｌｔａｓｏｎｅ、Ｍｅｔｉｃｏｒｔｅｎ）、エタネルセプト（例えば、Ｅｎｂｒｅｌ）、インフリキシマブ（例えば、Ｒｅｍｉｃａｄｅ）、ＴＮＦのインヒビター、ＦＫ−５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸モフェチル、レフルノミド、抗リンパ球グロブリン、デオキシスパガリンまたはＯＫＴを含む１つもしくはそれ以上のタイプの自己免疫または炎症性障害、あるいは自己免疫もしくは炎症性障害の任意の徴候または特徴に有効であることが既知の他の任意の化合物。
【０２０３】
免疫調節化合物の好適な例はサイトカインを含む。他の例として、効果、好ましくは、ＮＫ細胞活性の活性化もしくは増強の、あるいはＮＫ細胞の増殖を誘導または支持する効果を有する化合物が挙げられる。免疫調節性化合物の例として、ＮＯＤおよびＰＫＲ受容体のリガンド、ＴＬＲ３（ｄｓＲＮＡ、ポリＩ：ＣおよびポリＡ：Ｕ）、ＴＬＲ４（ＡＮＡ３８０、イサトリビン（ｉｓａｔｏｒｉｂｉｎｅ）、ＬＰＳおよびＭＰＬのような模倣物）、ＴＬＲ７（オリゴヌクレオチド、ｓｓＲＮＡ）、ＴＬＲ９（ＣｐＧｓのようなオリゴヌクレオチド）のアゴニストのようなＴＬＲ（Ｔｏｌｌ様受容体）のアゴニスト（それらの多くの例が、アキラ（Ａｋｉｒａ）およびタケダ（Ｔａｋｅｄａ）（（２００４年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ４：４９９）に記載されている）ならびにＮＫ細胞上の抑制性受容体を阻止する（例えば、ＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ２／３活性を阻害する）かまたはＮＫ細胞活性化受容体にアゴニストとして作用する（例えば、ＮＣＲ受容体ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４またはＮＫ０４６を架橋する抗体）抗体が挙げられるが、これらに限定されない。本発明に従う組み合わされたアプローチにおいて多様なサイトカインが用いられ得る。本発明によって考慮される組み合わせにおいて有用なサイトカインの例として、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＴＧＦ−β、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＬＡＦ、ＴＣＧＦ、ＢＣＧＦ、ＴＲＦ、ＢＡＦ、ＢＤＧ、ＭＰ、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＴＭＦ、ＰＤＧＦ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、またはＩＦＮ−γが挙げられる。本発明の併用処置または組成物において使用されるサイトカインは、患者の状態およびサイトカインの相対的毒性のような臨床適応に一致する標準的な規則に従って、投与される。
【０２０４】
補助化合物はとしては、その例として、制吐剤、例えば、セロトニン拮抗薬および治療薬、例えば、フェノチアジン系薬剤、置換ベンズアミド系薬剤、抗ヒスタミン系薬剤、ブチロフェノン系薬剤、副腎皮質ステロイド、ベンゾジアゼピン系薬剤およびカンナビノイド系薬剤；ビスホスホネート系薬剤、例えば、ゾレドロン酸およびパミドロン酸；ならびに造血成長因子、例えば、エリスロポエチンおよびＧ−ＣＳＦ、例えば、フィルグラスチム、レノグラスチムおよびダルベポエチンを挙げることができる。
【０２０５】
本発明の活性化抗ＮＫＧ２Ａ抗体とともに処方され得る他の治療用薬剤は、ＮＫ細胞を活性化することができる他の化合物を含む。例えば、ＮＣＲ、例えば、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、およびＮＫｐ４６を刺激する化合物を使用することができ（例えば、ＰＣＴ国際公開第０１／３６６３０号パンフレット、バイタレ（Ｖｉｔａｌｅ）ら（１９９８年）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：２０６５−２０７２、シボリ（Ｓｉｖｏｒｉ）ら（１９９７年）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：１１２９−１１３６；ペッシノ（Ｐｅｓｓｉｎｏ）ら（１９９８年）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：９５３−９６０；ペッシノ（Ｐｅｓｓｉｎｏ）ら（１９９８年）Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１８８：９５３−９６０を参照のこと；その開示内容全体は参照により本明細書に援用される）、ＫＩＲ抑制性受容体のインヒビターが可能であることと同様である（例えば、ヤワタ（Ｙａｗａｔａ）ら（２００２年）Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ２２：４６３−８２；マーティン（Ｍａｒｔｉｎ）ら（２０００年）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．５１：２６８−８０；ラニーア（Ｌａｎｉｅｒ）（１９９８年）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：３５９−９３を参照のこと；その開示内容全体は参照により本明細書に援用される）。好ましくは、ＮＫｐ３０のアクチベーター、例えば、天然のリガンドまたは活性化抗体が使用される。１つの実施態様では、ＴＧＦ−β１はＮＫｐ３０をダウンレギュレートすることができるため、ＴＧＦ−β１のインヒビターが使用される（例えば、カストリコニ（Ｃａｓｔｒｉｃｏｎｉ）ら（２００４年）Ｃ．Ｒ．Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ３２７：５３３−５３７を参照のこと（その開示内容全体は、そのすべてが本明細書に援用される））。
【０２０６】
本発明の阻害抗ＮＫＧ２Ａ抗体と共に処方することができる治療用化合物は、ＮＫ細胞を阻害することができる化合物である。そのような化合物として、ＮＣＲ、例えば、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、およびＮＫｐ４６のインヒビター、活性化ＮＫＧ２受容体（例えば、ＮＫＧ２Ｃ）のインヒビター；抑制性ＫＩＲ受容体のアクチベーター、または抑制性Ｌｙ４９受容体のアクチベーターが挙げられる。
【０２０７】
本発明の活性化抗体はまた、忍容性が所望される抗原と共に処方され得る。本発明の活性化抗体によって引き起こされる樹状細胞の増強された死滅は、その時に免疫系に提示される抗原の局在化を引き起こすと考えられる。そのような組成物は、自己免疫疾患、ならびにアレルギーを処置するのに有用である。本発明の活性化抗体と共に処方され得る抗原の例として、ミエリン塩基性タンパク質（ｍｙｌｅｉｎ  ｂａｓｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ブタクサならびに他の花粉および植物アレルゲン、ペットアレルギーの原因アレルゲン、（ピーナッツおよび他のナッツアレルゲン、乳製品アレルゲン、ゴマおよび他の種子アレルゲンのような）食物アレルギーの原因アレルゲンまたは昆虫アレルゲンが挙げられる。
【０２０８】
動物およびヒトの用量の相互関係（体表面積の平方メートルあたりのミリグラムに基づく）については、フレイレイヒ（Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈ）ら、（１９６６年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｒｅｐ５０：２１９に記載されている。体表面積は、患者の身長および体重から概算しよもよい。例えば、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｔａｂｌｅｓ，Ｇｅｉｇｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ａｒｄｌｅｙ、ニューヨーク州、１９７０，５３７を参照のこと。本発明の有効量の化合物は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは、０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲；または範囲の下限が０．００１ｍｇ／ｋｇ〜９００ｍｇ／ｋｇの間の任意の量であり、範囲の上限が０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇの間の任意の量である任意の範囲（例えば、０．００５ｍｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ）であり得る。有効用量はまた、当業者により認識されているように、治療する疾患、投与経路、賦形剤の使用、および他の薬剤の使用のような他の治療処置との併用の可能性に依存して変動する。
【０２０９】
さらなる治療用薬剤を含んでなる医薬組成物では、さらなる治療用薬剤の有効量は、単に該さらなる薬剤を使用する単剤療法規則において通常利用される用量の約２０％〜１００％の間である。好ましくは、有効量は、通常の単剤療法用量の約７０％〜１００％の間である。これらのさらなる治療用薬剤の通常の単剤療法用量（ｍｏｎｏｔｈｅｒａｐｕｅｔｉｃ  ｄｏｓａｇｅ）は、当該分野において周知である。例えば、ウェルズ（Ｗｅｌｌｓ）ら、編、Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、第２版、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅ，Ｓｔａｍｆｏｒｄ，Ｃｏｎｎ．（２０００年）；ＰＤＲ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ，Ｔａｒａｓｃｏｎ  Ｐｏｃｋｅｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ  ２０００、上製版、Ｔａｒａｓｃｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｌｏｍａ  Ｌｉｎｄａ、カリフォルニア州（２０００年）（それぞれの文献は、その全体が本明細書において参照により援用される）を参照のこと。
【０２１０】
上記で列挙したさらなる治療用薬剤のいくつかは、本発明の化合物と相乗的に作用することが予想される。これが生じる場合、それは、さらなる治療用薬剤および／または本発明の化合物の有効用量を、単剤療法において必要とされる用量から減少することが可能である。これは、さらなる治療用薬剤または本発明の化合物のいずれかの毒性副作用を最小にする、効力における相乗的改善、投与もしくは使用の改善された簡易性および／または化合物調製もしくは処方の費用全体の減少の利点を有する。
【０２１１】
上記の所定の治療用薬剤は、上記で開示された２つもしくはそれ以上のカテゴリーに当てはまることが、当業者に認識されるであろう。本発明の目的のために、そのような治療用薬剤は、療法の該カテゴリーのそれぞれのメンバーであるとみなされるべきであり、ある特定されたカテゴリーにある任意の治療用薬剤の特徴付けは、別の特定されたカテゴリー内にも属するとみなすことを妨げない。
【０２１２】
なお別の実施態様では、本発明は、本発明の抗体および上記の薬剤またはアレルゲンのいずれかから選択される第２の治療用薬剤もしくはアレルゲンを含んでなる物質の組成物を提供し、ここで、抗体および第２の薬剤は、個別の剤形であるが、相互に会合しない。本明細書において使用する用語「相互に会合する」は、個別の剤形が同じ規則の部分として販売および投与されることを意図することが容易に明らかであるように、個別の剤形が、一緒に、またはそうでなければ、相互に付着されて包装されることを意味する。薬剤および抗体は、好ましくは、ブリスターパックもしくは他のマルチチャンバ包装、または（例えば、２つの容器間の引っ掻き線上で破開することによって）使用者によって分離することができる（ホイルポーチなどのような）接続され、個別に密封された容器において一緒に包装される。
【０２１３】
なお別の実施態様では、本発明は、個別の容器において、ａ）本発明の抗体；およびｂ）第２の治療用薬剤またはアレルゲンを含んでなるキットを提供する。また、上記の治療用薬剤またはアレルゲンのいずれもそのようなキット中に存在してよい。
【０２１４】
抗ＮＫＧ２Ａ抗体および組成物の治療用途
本発明の活性化抗体は、ＮＫ細胞が標的細胞に接触する場合、ＮＫ細胞を、それらの細胞表面上にＨＬＡ−ＥまたはＱａ１ｂを有する標的細胞を溶解することが可能であるようにする。従って、１つの実施態様に従えば、本発明は、ＮＫ細胞および標的細胞を含んでなる集団における前記標的細胞のＮＫ細胞媒介溶解を再構成する方法であって、ここで、前記ＮＫ細胞は、その表面上のＮＫＧ２Ａによって特徴付けられ、そして前記標的細胞は、その表面上のＨＬＡ−ＥまたはＱａ１ｂの存在によって特徴付けられ、前記ＮＫ細胞と上記の活性化モノクローナル抗体またはそのフラグメントとを接触させる工程を含んでなる、上記方法を提供する。
【０２１５】
この活性は、それらの細胞表面上にＨＬＡ−ＥまたはＱａ１ｂを発現する有害な細胞によって特徴付けられる病態および障害の処置において、特に有用である。そのような１つの細胞型は樹状細胞、好ましくは、成熟樹状細胞である。従って、本発明は、自己免疫または炎症性障害あるいは少なくとも部分的に、過度の樹状細胞、もしくは過剰反応の樹状細胞活性によって引き起こされる他の任意の障害を処置する方法を提供する。そのような障害を処置する方法は、活性化抗体を含んでなる本発明の非細胞障害性組成物を患者に投与する工程を含んでなる、
【０２１６】
本方法を使用して処置可能な例示的自己免疫障害として、とりわけ、溶血性貧血、悪性貧血、結節性多発動脈炎、全身性エリテマトーデス、ウェゲナー肉芽腫症、自己免疫性肝炎、ベーチェット病、クローン病、原発性胆汁性肝硬変（ｐｒｉｍａｒｙ  ｂｉｌａｒｙ  ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、強皮症、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、１型糖尿病、ぶどう膜炎、グレーブス病、アルツハイマー病、甲状腺炎、心筋炎、リウマチ熱、強皮症、強直性脊椎炎、関節リウマチ、糸球体腎炎、サルコイドーシス、皮膚筋炎、重症筋無力症、多発性筋炎、ギラン・バレー症候群、多発性硬化症、円形脱毛症、天疱瘡／類天疱瘡、水疱性類天疱瘡、橋本病、乾癬、および白斑が挙げられる。
【０２１７】
これらの方法で処置することができる炎症性障害の例として、副腎炎、肺胞炎、胆嚢胆管炎、虫垂炎、亀頭炎、眼瞼炎、気管支炎、滑液胞炎、心臓炎、蜂窩織炎、子宮頚炎、胆嚢炎、声帯炎、蝸牛炎（ｃｏｃｈｌｉｔｉｓ）、潰瘍性大腸炎、結膜炎、膀胱炎、皮膚炎、憩室炎、脳炎、心内膜炎、食道炎、耳管炎、結合組織炎、毛包炎、胃炎、胃腸炎、歯肉炎、舌炎、肝脾炎、角膜炎、内耳炎、喉頭炎、リンパ管炎、乳房炎、中耳炎、髄膜炎、子宮炎、粘膜炎（ｍｕｃｉｔｉｓ）、心筋炎、筋炎（ｍｙｏｓｉｔｉｔｉｓ）、鼓膜炎、腎炎、神経炎、精巣炎、離断性骨軟骨炎、耳炎、心膜炎、腱鞘炎（ｐｅｒｉｔｅｎｄｏｎｉｔｉｓ）、腹膜炎、咽頭炎、静脈炎、急性灰白髄炎、前立腺炎、歯髄炎、網膜炎、鼻炎、卵管炎、強膜炎、強膜脈絡膜炎（ｓｅｌｅｒｏｃｈｏｒｏｉｄｉｔｉｓ）、陰嚢炎、副鼻腔炎、脊椎炎、脂肪組織炎、口内炎、滑膜炎、耳管炎、腱炎、扁桃腺炎、尿道炎、および膣炎が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１８】
また、樹状細胞のアロ反応性ＮＫ細胞死滅は、骨髄移植における造血細胞の生着を改善したことも示されている（Ｌ．ルッジェーリ（Ｌ．Ｒｕｇｇｅｒｉ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２，２９５：２０９７−２１００）。従って、別の実施態様では、本発明は、患者における造血細胞の生着を改善する方法であって、活性化抗体を含んでなる本発明の組成物を前記患者に投与する工程を含んでなる上記方法を提供する。移植の改善は、移植片対宿主病の発症率または重症度の減少、移植片の生存の延長、または移植によって処置されている疾患（例えば、造血器癌）の徴候の減少もしくは排除により、明らかである。この方法は、好ましくは、白血病の処置において使用される。
【０２１９】
癌細胞はまた、それらの表面上のＨＬＡ−Ｅの存在を介する死滅を回避することが示されている。ＨＬＡ−Ｅは、外科的に取り出された神経膠芽腫標本、神経膠腫細胞系統および神経膠芽腫細胞培養（Ｊ．ウィチフセン（Ｊ．Ｗｉｓｃｈｈｕｓｅｎ）ら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ  Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ．２００５年；６４（６）：５２３−８）；ならびに白血病由来細胞系統、黒色腫、黒色腫由来細胞系統および頚部腫瘍（Ｒマリン（Ｒ  Ｍａｒｉｎ）ら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．２００３年、５４（１１）：７６７−７５）において検出されている。従って、別の実施態様では、本発明は、癌を患う患者を処置する方法であって、ここで、前記癌は、ＨＬＡ−Ｅを発現する細胞によって特徴付けられ、活性化抗体を含んでなる本発明の組成物を前記患者に投与する工程を含んでなる上記方法を提供する。
【０２２０】
この方法に従って処置され得る癌の例として、膀胱、乳、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、前立腺、膵臓、胃、頚部、甲状腺および扁平上皮癌を含む皮膚の癌種を含む癌腫；白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、有毛細胞リンパ腫およびバーキットリンパ腫を含むリンパ球系統の造血器腫瘍；急性および慢性骨髄性白血病および前骨髄球性白血病を含む骨髄系統の造血器腫瘍；線維肉腫および横紋筋肉腫を含む間葉起源の腫瘍；黒色腫、精上皮腫、奇形癌種、神経芽細胞腫および神経膠腫を含む他の腫瘍；星細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、および神経鞘腫を含む中枢および末梢神経系の腫瘍；線維肉腫、横紋筋肉腫（ｒｈａｂｄｏｍｙｏｓｃａｒｏｍａ）、および骨肉腫を含む間葉起源の腫瘍；ならびに黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、精上皮腫、甲状腺濾胞癌および奇形癌種を含む他の腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２１】
本発明に従って処置することができる好適な癌として、神経膠腫、神経膠芽腫、白血病、黒色腫、および頚部腫瘍が挙げられる。
【０２２２】
ウイルス感染細胞はまた、ＮＫ細胞死滅を回避する機構として、ＨＬＡ−Ｅ発現を使用する。ＨＬＡ−Ｅ発現は、Ｃ型肝炎ウイルス感染細胞（Ｊ．マッターマン（Ｊ．Ｍａｔｔｅｒｍａｎｎ）ら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．２００５年；１６６：４４３−４５３）；およびサイトメガロウイルス感染細胞（Ｃ．セルボニ（Ｃ．Ｃｅｒｂｏｎｉ）ら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１年；３１（１０）：２９２６−３５）と関連している。従って、別の実施態様では、本発明は、ウイルス感染を患う患者を処置する方法であって、ここで、前記ウイルス感染は、ＨＬＡ−Ｅを発現するウイルス感染細胞によって特徴付けられ、活性化抗体を含んでなる本発明の組成物を前記患者に投与する工程を含んでなる上記方法を提供する。
【０２２３】
この方法によって処置され得るウイルス感染の例として、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ＨＩＶ−１（また、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶもしくはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ、またはＨＩＶ−ＩＩＩとも称される；およびＨＩＶ−ＬＰのような他の単離体）のようなヒト免疫不全ウイルス）；ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；カルシウイルス科（Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、胃腸炎を引き起こす株）；トガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、デングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、コロナウイルス（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｅｓ））；ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、エボラウイルス）；パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器多核体ウイルス）；オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、インフルエンザウイルス）またはトリインフルエンザウイルス（例えば、Ｈ５Ｎ１もしくは関連ウイルス）；ブニヤウイルス（Ｂｕｎｇａｖｉｒｉｄａｅ）科（例えば、ハンタウイルス、ブニヤウイルス（ｂｕｎｇａ  ｖｉｒｕｓｅｓ）、フレボウイルスおよびナイロウイルス（Ｎａｉｒｏ  ｖｉｒｕｓｅｓ））；アレナウイルス科（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）（出血熱ウイルス）；レオウイルス科（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、レオウイルス（Ｒｅｏｖｉｒｕｓｅｓ）、オルビウイルス（ｏｒｂｉｖｉｕｒｓｅｓ）およびロタウイルス）；ビルナウイルス科（Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）；ヘパドナウイルス科（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）（Ｂ型肝炎ウイルス）；パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）（パルボウイルス）；パポーバウイルス科（Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ）（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；アデノウイルス科（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）（ほとんどのアデノウイルス）；ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１および２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ））；ポックスウイルス科（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）（天然痘ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；イリドウイルス科（Ｉｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、アフリカ豚コレラウイルス）；ならびに未分類のウイルス（例えば、海綿状脳症の原因因子、デルタ肝炎の因子（Ｂ型肝炎ウイルスの欠損サテライト（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｓａｔｅｌｌｉｔｅ）と思われる）、非Ａ非Ｂ型肝炎の因子（クラス１＝内部伝染；クラス２＝非経口的伝染（即ち、Ｃ型肝炎）；ノーウォーク（Ｎｏｒｗａｌｋ）および関連ウイルス、およびアストロウイルス）のウイルスによって引き起こされる感染が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２４】
最も好ましくは、処置しようとするウイルス感染は、Ｃ型肝炎ウイルス感染またはサイトメガロウイルス感染から選択される。
【０２２５】
また、本発明の活性化抗体を使用して、抗原に対する忍容性を誘導することもできる。従って、別の実施態様に従えば、本発明は、患者において抗原に対する忍容性を誘導する方法であって、活性化抗体；を含んでなる本発明の組成物を前記患者に投与する工程；および忍容性が所望される抗原を前記患者に投与する工程を含んでなる、上記方法を提供する。方法は、好ましくは、アレルギーを処置するために使用され、ここで、抗原はアレルゲンである。抗原の選択は、本発明の活性化抗体および抗原を含んでなる組み合わせ組成物のための上記のものから作製することができる。
【０２２６】
本発明の阻害抗体または細胞毒素−抗体コンジュゲートを含んでなる組成物は、ＮＫ細胞を死滅させるか、ＮＫ細胞の活性を減少するか、ＮＫ細胞の増殖を減少するか、ＮＫ細胞溶解に対して感受性な細胞の溶解を防止するかまたは集団におけるＮＫ細胞の数を減少するのに有用である。１つの実施態様に従えば、本発明は、ＮＫ細胞の活性を減少するか、ＮＫ細胞の増殖を減少するか、ＮＫ細胞溶解に対して感受性な細胞の溶解を防止するか、または集団におけるＮＫ細胞の数を減少する方法であって、ＮＫ細胞と、阻害抗体または細胞毒素−抗体コンジュゲートを含んでなる本発明の組成物とを接触させる工程を含んでなる上記方法を提供する。これらの方法は、ＮＫ過剰反応および／または過剰増殖によって特徴付けられる疾患において、特に有用である。
【０２２７】
例えば、共有のＰＣＴ公開国際公開第２００５／１０５８４９号パンフレットは、ＮＫ型ＬＤＧＬの処置のための多様なＮＫ細胞受容体に対する抗体の使用について概説している。ＰＣＴ公開国際公開第２００５／１１５５１７号パンフレットは、ＮＫ細胞過剰反応が膵島自己免疫の存在、促進、および／または亢進に関連し、従って、Ｉ型糖尿病において役割を果たすことを公開している。従って、１つの実施態様に従えば、本発明は、ＮＫ細胞過剰反応またはＮＫ細胞過剰増殖によって特徴付けられる病態を患う患者を処置する方法であって、阻害抗体または細胞毒素−抗体コンジュゲートを含んでなる本発明の組成物を前記患者に投与する工程を含んでなる上記方法を提供する。好適な実施態様では、病態は、ＮＫ型ＬＤＧＬまたはＩ型糖尿病から選択される。
【０２２８】
上記の治療方法のいずれも、処置する病態に適切な第２の治療用薬剤を患者に投与するさらなる工程を含んでなり得る。患者に投与され得る第２の治療用薬剤のタイプの例として、サイトカイン、サイトカインインヒビター、造血成長因子、インスリン、抗炎症剤、免疫抑制薬、抗癌化合物（例えば、化学療法化合物（ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｕｅｔｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）、抗血管新生化合物（ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｅｎｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）、アポトーシス促進化合物、ホルモン剤、ＤＮＡ複製、有糸分裂および／もしくは染色体分離を妨害する化合物、またはポリヌクレオチド前駆体の合成および正確性を崩壊する薬剤）、補助化合物（例えば、鎮痛剤もしくは制吐剤）、活性化ＮＫ細胞受容体を作動する化合物、（例えば、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、およびＮＫｐ４６）、抑制性ＮＫ細胞受容体のアンタゴニスト、（例えば、インヒビターＫＩＲ受容体）、ＴＧＦ−β１のアンタゴニスト、抑制性ＮＫ細胞受容体を刺激することが可能な化合物、（例えば、天然のリガンド、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ受容体の活性を刺激することができる抗体もしくは小分子、またはＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ３ＤＬ１、およびＫＩＲ３ＤＬ２のような抑制性ＫＩＲ受容体）、あるいは活性化ＮＫ細胞受容体のインヒビター、（例えば、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、もしくはＮＫｐ４６）が挙げられる。
【０２２９】
上記のクラスの化合物の具体的な例については、薬学的組み合わせに関するセクションに記載されており、任意のそのような特定の化合物、ならびに任意のこれらのクラスの治療用薬剤（ｔｈｅｒａｐｕｅｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）の他のメンバーを、本発明の方法で患者に投与してもよい。使用するための治療用薬剤の選択は、医学分野の当業者によって容易に行われ、処置または防止する病態の性質、病態の重症度、処置される患者の全般的健康状態、および処置する医師の判断に依存する。
【０２３０】
第２の治療用薬剤は、本発明（ｉｎｖｅｎｔｉｏｎｏｒ）の抗ＮＫＧ２Ａ組成物と同時、前、または後に投与してもよい。同時に投与する場合、第２の治療用薬剤は、個別に処方された組成物（即ち、複数の剤形）か、または抗体含有組成物の一部のいずれかとして投与し得る。
【０２３１】
いくつかの実施態様では、本発明のＮＫＧ２Ａ抗体組成物の投与の前に、ＮＫ細胞上のＮＫＧ２Ａ、およびおそらく他のタンパク質の発現が評価され、ならびに／あるいは樹状細胞（好ましくは、成熟樹状細胞）の活性もしくは数および／または細胞上のＮＫＧ２Ａリガンド（例えば、ＨＬＡ−ＥもしくはＱａ１ｂ）の存在が測定される。これは、ＮＫまたは患者由来の樹状細胞のサンプルを入手し、ＮＫ細胞について、例えば、イムノアッセイを使用して試験して、細胞上のＫＩＲ受容体、他のＮＫＧ２受容体、またはＮＣＲ（例えば、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６）のようなマーカーの相対的台頭を決定することによって、達成することができる。また、他の方法を使用して、ＲＮＡに基づく方法、例えば、ＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンブロッティングのように、これらのタンパク質の発現を検出することができる。患者においてＮＫＧ２Ａを発現するＮＫ細胞の検出は、本方法が患者を処置する際の使用に良好に適することを示す。
【０２３２】
処置は、複数ラウンドの抗体に関連するものであってもよい。例えば、初回ラウンドの投与後、ＮＫＧ２Ａ発現ＮＫ細胞、ならびに／あるいは樹状細胞、またはそれらの表面上にＮＫＧ２ＡもしくはＨＬＡ−Ｅ、またはＱａ１ｂを発現する他の細胞のレベルおよび／または活性を再測定することができ、適切であれば、さらなるラウンドの投与を実施することができる。この方法では、複数ラウンドの受容体／細胞／リガンド検出および抗体組成物投与を、例えば、障害が抑制されるまで実施することができる。
【０２３３】
また、本方法を使用して、１を超える抗体を産生および／または使用することができることが理解されよう。例えば、ＮＫＧ２Ａの異なるエピトープ、ＮＫＧ２Ａ、ＣＤ９４、もしくはＨＬＡ−Ｅの異なる組み合わせ、または任意の個体において存在し得る３つのタンパク質のいずれかの異なるアイソフォームに対して指向される抗体の組み合わせを、一般的にまたは（例えば、適切な処置規則を決定するための患者におけるＮＫＧ２Ａ発現細胞の分析に従って）任意の個々の患者のいずれかにおけるＮＫＧ２Ａ刺激の阻害またはＮＫ細胞化成の阻害の理想のレベルを入手するのに適切であるように、使用することができる。
【０２３４】
特定の治療アプローチが、患者の病態自体に有害であることが知られておらず、ＮＫＧ２Ａ抗体処置を有意に妨げない限り、その本発明との組み合わせが考慮される。
【０２３５】
本発明はまた、手術などの古典的アプローチと組み合わせて使用してもよい。１つもしくはそれ以上の第２の治療用薬剤またはアプローチを本治療と組み合わせて使用する場合、組み合わされた結果が、各処置を個別に行う場合に観察される効果の相加である必要はない。少なくとも相加的効果が一般的に所望されるが、本発明の抗体組成物が、ＮＫ細胞を阻害または活性化するのに有効性を保持する限り、本発明の方法は、第２の治療用薬剤または他のアプローチの使用をさらに含んでなり得る。また、組み合わされた処置が相乗効果を示すことを求める特定の要件は存在しないが、このことは間違いなく可能であり、有利である。ＮＫＧ２Ａ抗体に基づく処置は、例えば、数分〜数週間および数箇月の範囲の間隔だけ他の処置より先行するか、または後に続き得る。１回を超える本発明の抗ＮＫＧ２Ａ組成物の投与を利用することもまた、想定される。第２の治療用薬剤または他のアプローチは、数日おきもしくは数週間おきに本発明のＮＫＧ２Ａ抗体組成物と交換可能に投与してもよく；あるいは抗ＮＫＧ２Ａ処置のサイクルが与えられた後、他の薬剤療法またはアプローチのサイクルが続いてもよい。いずれにしても、第２の治療用薬剤を患者に投与するさらなる工程を含んでなる方法で必要なのは、投与時間にかかわらず、治療上有益な効果を発揮するのに有効な組み合わされた量で第２の治療用薬剤および本発明の抗体の両方を送達することだけである。
【０２３６】
抗体および組成物を患者に投与する本方法はまた、動物を試験するか、またはヒト疾患の動物モデルにおける本明細書に記載の方法または組成物のいずれかの有効性を試験するために使用することができることが理解されよう。従って、本明細書において使用する用語「患者」は、任意の温血動物、好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、霊長類、最も好ましくは、ヒトを意味する。
【０２３７】
本発明のさらなる態様および利点を、以下の実施例のセクションで開示するが、これは例示的であり、本出願の範囲を制限するものではないとみなすべきである。
【実施例】
【０２３８】
実施例１．自家移植ｉＤＣの死滅は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ＋ＫＩＲ−ＮＫ細胞のサブセットによって媒介される
外因性ＩＬ−２の存在下で培養されたポリクローナルＮＫ細胞は、ｉＤＣに対して強力な細胞溶解活性を呈することは先に示されていた。従って、本研究では、ドナーＡＭ、ＡＣおよびＤＢから単離されたポリクローナルＮＫ細胞集団が、自家移植および同種異系ｉＤＣの両方を効率的に死滅させた。しかし、自家移植ｉＤＣに対する細胞溶解活性は、適切な抗ＨＬＡクラスＩｍＡｂの存在下で増加され得る。
【０２３９】
これらのデータは、ＤＣ上の自己ＨＬＡクラスＩとＮＫ細胞上の抑制性受容体との間に生じる阻害相互作用の崩壊の結果であり得る。これらの結果に基づいて、本発明者らは、全ＮＫ細胞プールの機能のみがｉＤＣに対する自発的細胞障害性を示す一方、それらの受容体とＨＬＡクラスＩ分子との間の有効な阻害相互作用のため、他のＮＫ細胞は示さないという仮定を立てた。この可能性について分析するために、ドナーＡＭ、ＡＣおよびＤＢから単離されたＮＫ細胞クローンのパネルを、自家移植（および同種異系）ｉＤＣに対する細胞溶解活性について評価した。本発明者らの仮定と一致して、ＮＫ細胞クローンの機能のみが自家移植ｉＤＣを溶解した。他のクローンは、ほとんどもしくは全く細胞障害性を示さなかった。さらに、細胞性溶解クローンの百分率は、標的細胞が同種異系ｉＤＣによって提示された場合、僅かに増加した（下記を参照のこと）。
【０２４０】
所定のＮＫ細胞クローンがｉＤＣを溶解できないことが、それらの抑制性ＮＫＲとＨＬＡクラスＩ分子との相互作用に反映するかどうかを確認するために、これらのクローンを、抗ＨＬＡクラスＩｍＡｂの非存在または存在下（即ち、阻害相互作用を崩壊する条件下）のいずれかで自家移植ｉＤＣを溶解する能力について分析した。これらの実験の結果に基づいて、ＮＫ細胞クローンを３つの異なる機能カテゴリーに分け、さらに、キラーＩｇ様受容体（ＫＩＲ）２ＤＬ、ＫＩＲ３ＤＬ１およびＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを含むＨＬＡクラスＩ特異的抑制性受容体（即ち、ヒトにおける主要なＭＨＣクラスＩ特異的抑制性受容体）の発現について分析した。
【０２４１】
ＮＫクローンの第１のグループ（グループＡ）は、ｉＤＣに対する自発的細胞溶解活性によって特徴付けられた。それらの細胞溶解性活性の大きさは、抗ＨＬＡクラスＩｍＡｂの存在下では、増加し得なかったか、またはごく最小限にしか増加し得なかった。これらのクローンは、それらがＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを発現したが、自己ＨＬＡクラスＩ対立遺伝子を反応するＫＩＲ２ＤＬおよびＫＩＲ３ＤＬ１を欠如したため、抑制性受容体の発現について、むしろ同種である。ＮＫ細胞クローンの第２のグループ（グループＢ）もまた、自発的にｉＤＣを死滅させる能力について特徴付けられた。しかし、グループＡのクローンと異なり、それらの細胞障害性は、抗ＨＬＡクラスＩｍＡｂの存在下で増加した。このことは、ＮＫ細胞媒介細胞溶解を制限するが、廃止しない阻害相互作用の存在を示唆するものであった。このグループはまた、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ＋クローンからなり、自己ＨＬＡクラスＩ対立遺伝子と反応性のＫＩＲを欠如した。意外にも、グループＢのＮＫクローンの細胞溶解性活性はまた、抗ＣＤ９４ｍＡｂの存在下で増加され得、従って、細胞障害性の（部分的）阻害が実際にＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａによって媒介されたことが示された。
【０２４２】
第３のグループ（グループＣ）に属するＮＫクローンは、自家移植ｉＤＣに対する細胞障害性を示さなかった。しかし、抗ＨＬＡクラスＩｍＡｂの存在下で、ｉＤＣは効率的に溶解され、強力な阻害相互作用の存在が示唆された。これらのＮＫクローンは、抑制性受容体の発現に関してより異種であった。意外にも、自己ＨＬＡクラスＩ対立遺伝子に特異的なＫＩＲ２ＤＬまたはＫＩＲ３ＤＬ１を発現する事実上すべてのＮＫクローンは、このグループに含まれた。さらに、これらのうちのいくつかのクローンは、単一のＫＩＲの発現によって特徴付けられた一方、他は、異なる特異性を伴う複数のＫＩＲを発現した。ｉＤＣに対する細胞溶解活性の再構成は、抗ＨＬＡクラスＩｍＡｂによってだけでなく、抗ＫＩＲｍＡｂによっても得ることができた（下記を参照のこと）。
【０２４３】
最終的に、少数の画分のグループＣのＮＫ細胞クローンがＫＩＲ−ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ＋であった。それらの細胞障害性は、ＣＤ９４のｍＡｂ媒介阻止または抗ＨＬＡクラスＩｍＡｂによって再構成され得る。これらのデータは：（ａ）すべてのＮＫ細胞が自家移植ｉＤＣを死滅させることが可能というわけではない（但し、すべてのＮＫ細胞は、抗ＨＬＡクラスＩｍＡｂの存在下でｉＤＣを溶解し得る）こと；（ｂ）ｉＤＣに対する自発的細胞溶解活性を示すクローンは、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ＋ＫＩＲ−表面表現型によって特徴付けられるＮＫサブセット（グループＡおよびＢ）に制限されること；（ｃ）自己ＨＬＡクラスＩ対立遺伝子に特異的であるＫＩＲ２ＤＬまたはＫＩＲ３ＤＬ１を発現するクローンは、自家移植ｉＤＣを死滅させない（グループＣ）ことを示す。
【０２４４】
いくつかのＮＫクローンは、自己反応性ＫＩＲおよびＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａの両方を発現した。すべての場合において、それらはグループＣに託され、それらの細胞溶解活性は、抗ＨＬＡクラスＩおよび抗ＫＩＲｍＡｂの両方によって再構成され得る一方、抗ＣＤ９４ｍＡｂはほとんどまたは全く効果を有さなかった。最終的に、ｉＤＣが同種異系（ＫＩＲミスマッチ）個体から誘導された実験のみにおいてＫＩＲ＋ＮＫＧ２Ａ−クローンがｉＤＣに対する細胞溶解活性を示すことが見出されたことを述べる価値がある。この場合、発現されたＫＩＲは、同種異系ＤＣ上のＨＬＡクラスＩ対立遺伝子を認識することができないため、ＫＩＲ＋ＮＫＧ２Ａ−細胞は、アロ反応性を示す。代表的なＮＫクローンＡＭ４（ＫＩＲ３ＤＬ１＋）は、自家移植ｉＤＣ（ＢＷ４＋ＢＷ６−）を死滅させることができなかった一方、それは、同種異系ＫＩＲミスマッチ（ＢＷ４−ＢＷ６＋）ｉＤＣを溶解した。自家移植ｉＤＣの死滅は、抗ＨＬＡクラスＩｍＡｂの存在下で再構成され得る一方、同種異系ｉＤＣの死滅は、有意に改変されなかった。
【０２４５】
自家移植と同種異系ＫＩＲミスマッチｉＤＣとの間を区別するＫＩＲの能力を示す別の例は、ＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ２を同時発現するクローンＤＢ３によって提供される。このクローンは、そのＫＩＲ表現型に基づいて、すべての異なるＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子（グループ１およびグループ２の両方）を認識すべきであるため、「非アロ反応性」として規定することができる。実際に、このクローンは、自家移植または同種異系ｉＤＣを死滅させなかった一方、両方の標的の溶解は、抗ＨＬＡクラスＩｍＡｂによって効率的に再構成され得る。さらに、溶解の再構成が、自家移植（ＣＷ１／ＣＷ３）ｉＤＣに対する抗ＫＩＲ２ＤＬ２ｍＡｂおよび同種異系（ＣＷ２／ＣＷ４）ｉＤＣに対する抗ＫＩＲ２ＤＬ１ｍＡｂによって得られた。最終的に、予想されるように、ＮＫＧ２Ａ＋ＫＩＲ−クローンの場合、自家移植または同種異系ｉＤＣを死滅させる能力において、実質的に異なる差異は認められなかった。
【０２４６】
実施例２−ｉＤＣのＮＫ媒介細胞障害性に対する感受性は、ＨＬＡ−ＥクラスＩ分子のダウンモジュレーションに反映する
先の研究は、ｉＤＣおよびｍＤＣが、ＨＬＡクラスＩ表面発現に関して顕著な差異を示すことを実証した。従って、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、ＣおよびＥ分子の単一形態の決定基に特異的なｍＡｂの使用によって、成熟を経験しているＤＣは、細胞表面でそれらのＨＬＡクラスＩ発現を著しくアップレギュレートすることが示されている。さらに、ＨＬＡクラスＩのアップレギュレーションは、ｍＤＣがＮＫ細胞媒介溶解に対して耐性になる極めて重要な機構を提示した。
【０２４７】
異なる段階のＤＣ成熟を代表する細胞上の多様なＨＬＡクラスＩ分子の発現を直接評価するために、本発明者らは、単球上のＨＬＡ−Ａ、Ｂ、ＣおよびＥ、同じ個体から誘導されるｉＤＣおよびｍＤＣの発現を比較分析した。すべてのＨＬＡクラスＩ分子は、ｉＤＣと比較して、ｍＤＣにおいて高度にアップレギュレートされた。意外にも、それらは、単球（即ち、ｉＤＣの前駆体）と比較して、ｉＤＣにおいて明らかにダウンレギュレートされた。従って、単球由来のｉＤＣの作製は、新規表面分子（例えば、ＣＤ１ａ）および機能的特性の獲得（またはアップレギュレーション）だけではなく、ＣＤ１４、ならびにＨＬＡ−Ａ、Ｂ、ＣおよびＥ分子を含む多様な分子の発現の消失（またはダウンレギュレーション）をもたらすようである。このことは、ＨＬＡクラスＩダウンレギュレーションの程度が、ｉＤＣが、特定のサブセットのＮＫ細胞（ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ＋ＫＩＲ−）によって媒介される溶解に感受性になることを可能にするレベルに同調されることを示唆するものであろう。
【０２４８】
この方針に沿って、ＫＩＲ＋ＮＫ細胞はｉＤＣを死滅させることができないため、ｉＤＣによって発現されるＨＬＡ−ＢまたはＨＬＡＣ分子の量は、ＫＩＲ交差反応および抑制性シグナルの送達を生じるのに十分であることが考えられる。一方、ＨＬＡ−Ｅのダウンレギュレーションは、ＫＩＲ−ＮＫＧ２Ａ＋ＮＫ細胞がｉＤＣを死滅させる機能を可能にするのに十分である。実際、（ＨＬＡ−Ｅ特異的３Ｄ１２ｍＡｂによって検出されるように）ＨＬＡ−Ｅは、ｉＤＣにおいてほとんど検出することができない一方、それは、ｍＤＣ上において部分的にのみ再発現されることが認められ得る。しかし、すべての場合において、ｍＤＣにおけるＨＬＡ−Ｅ発現は、単球または同じ個体から誘導されるＰＢＬと比較してより低かった。驚くべきことに、ＨＬＡ−Ａ、ＢおよびＣ分子は、ＰＨＡ芽球によるよりもｍＤＣにより高いレベルで発現されるが、ＨＬＡ−Ｅの表面発現は、ＰＨＡ芽球におけるよりもｍＤＣにおける方が一貫して低かった。これに関して、先の研究は、エフェクターＮＫ細胞のＫＩＲ／ＮＫＧ２Ａ表現型とは独立して、自家移植ＰＨＡ芽球が、ＮＫ溶解に高度に耐性であるという明らかな証拠を提供した。
【０２４９】
実施例３−ＮＫクローンの小画分は、ｍＤＣの死滅を媒介することができる
ポリクローナルＮＫ細胞がｍＤＣを効率的に死滅させないという先の報告に一致して、本発明者らは、ｉＤＣを溶解するほとんどのＮＫ細胞クローンがｍＤＣを死滅させなかったことを示す。しかし、興味深いことに、ｍＤＣは、グループＡに属するＮＫクローンのより少数の画分（即ち、抗ＨＬＡクラスＩｍＡｂによって増加され得ない自発的抗ｉＤＣ細胞溶解活性を示すもの）によって溶解された。自家移植ｍＤＣの溶解はｉＤＣのそれと比較して低く、抗ＨＬＡクラスＩｍＡｂの存在下で増加することができた。このことは、ｉＤＣと比較してｍＤＣにおけるＨＬＡＥのより高い発現が、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを介するより効率的なシグナル伝達を生じることを示唆する（これはまた、それらの溶解を増加する抗ＣＤ９４ｍＡｂの能力によっても示唆される）。グループＢのＮＫクローン（即ち、ｉＤＣを死滅させることが可能であり、その溶解は抗ＨＬＡクラスＩｍＡｂによって増加される）に関して、それらは、ｍＤＣに対する溶解活性を示さなかったが；しかし、細胞溶解活性は、抗ＨＬＡクラスＩまたは抗ＣＤ９４ｍＡｂの存在下で示され得た。最後に、ｉＤＣを死滅させることができないグループＣに属するクローン（ほとんどの場合、ＫＩＲ＋）はまた、ｍＤＣを死滅させることもできなかった。ｍＤＣに対する細胞障害性は、ＨＬＡクラスＩとＫＩＲとの間の相互作用のｍＡｂ媒介崩壊においてのみ検出され得た。
【０２５０】
実施例４−ＤＣを死滅させる能力におけるＫＩＲ−ＮＫＧ２Ａ＋ＮＫ細胞の異種性
上記で例示されるように、グループＡおよびＢに属するＮＫ細胞クローンが、同種ＫＩＲ−ＮＫＧ２Ａ＋表面表現型によって特徴付けられる一方、グループＣは、ＫＩＲ＋ＮＫＧ２Ａ−またはＫＩＲ−ＮＫＧ２Ａ＋クローン（またはより低い頻度で、ＫＩＲ＋ＮＫＧ２Ａ＋クローン）のいずれかを含む。ＫＩＲを介するネガティブなシグナル伝達が、ＮＫＧ２Ａを介するものより効率的であると想定すると、（それらのシグナル伝達能における本質的差異またはＤＣ上における特異的ＨＬＡクラスＩリガンドの異なる利用可能性のいずれかのため）、何故、ＫＩＲ−ＮＫＧ２Ａ＋細胞がＮＫクローンのすべての３つのグループにおいて検出可能であるかを明らかにすべきである。所定のＮＫ細胞クローンの細胞溶解活性は、抑制性（ＫＩＲ、ＮＫＧ２Ａ）と誘発性（ＮＣＲ、ＮＫＧ２Ｄ）受容体との間の均衡の結果であるため、本発明者らは、異なるグループのＮＫクローンにおけるこれらの分子の発現のレベルについて分析した。特に、本発明者らは、ＮＫＧ２ＡおよびＮＫｐ３０の発現（即ち、ｉＤＣおよびｍＤＣのＮＫ細胞媒介溶解の誘導において優勢な役割を果たす誘導性ＮＣＲ）に注目した。
【０２５１】
最初に、グループＡ、ＢおよびＣに属するＮＫＧ２Ａ＋ＫＩＲ−クローンを、ＮＫＧ２Ａ表面発現のレベルについて評価した。グループＣに属するＮＫクローンは、グループＡおよびＢと比較して、極めて高いレベルのＮＫＧ２Ａを発現した。さらに、グループＡクローンは、グループＢクローンと比較して、ＮＫＧ２Ａのより低い発現によって特徴付けられた。これらのデータは、ＮＫＧ２Ａ発現のレベルとｉＤＣ（およびｍＤＣ）を死滅させる能力との間の負の相関関係の存在を示唆する。ｉＤＣにおいて発現される低い量のＨＬＡ−Ｅ分子は、高いまたは低いレベルのＮＫＧ２Ａを発現するＮＫ細胞によって、特異に感知され得る一方、（高いレベルのＨＬＡ−Ｅを発現する）ｍＤＣは、極めて低いＮＫＧ２Ａ表面密度によって特徴付けられるＮＫクローンによってのみ溶解に感受性である。ＮＫｐ３０の発現に関して、これは、分析したほとんどのＮＫＧ２Ａ＋クローンにおいて比較可能であった。これらのデータに一致して、抗ＨＬＡクラスＩｍＡｂの存在下（即ち、阻害相互作用の非存在下）でｉＤＣを死滅させるそれらの能力は、有意差を示さなかった。
【０２５２】
考察．異種性は、細胞溶解応答の大きさにおいて、ＮＫＧ２Ａ＋ＫＩＲ−細胞の間でさえも存在する。これは、ＮＫＧ２Ａの表面密度と負の相関関係を示すようである。従って、低いレベルのＮＫＧ２Ａを発現するＮＫクローン（グループＡ）は、ｉＤＣおよびｍＤＣの両方を溶解する一方、より高いレベルのＮＫＧ２Ａを発現するクローンは、ｉＤＣのみを死滅させるか、または若干の場合（ＮＫＧ２Ａブライト）において、ｉＤＣおよびｍＤＣの両方を死滅させることができなかった。
【０２５３】
明らかに、本発明者らはまた、ＨＬＡ−Ｅの表面発現が単球と比較してｉＤＣにおいて鋭敏に減少する一方、それは、ｍＤＣにおいて部分的に回復することを示す。対照的に、ｉＤＣにおいて減少した細胞表面レベルのＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃはなお、ＫＩＲ３ＤＬ１またはＫＩＲ２ＤＬに効率的に従事するのに十分である。
【０２５４】
予想外の所見は、自家移植ｍＤＣを死滅させることが可能であるグループＡに属するＮＫ細胞クローンの小さなサブセット（５〜１０％）の同定であった。これらのＮＫクローンは、自己反応性ＫＩＲを発現せず、低レベルのＮＫＧ２Ａによって特徴付けられた。これにより、これらのＮＫ細胞は、より高いレベルのＮＫＧ２Ａを発現するＮＫ細胞と比較して、標的細胞上におけるＨＬＡ−Ｅのダウンレギュレーションを容易に感知することが可能である。従って、抗ＨＬＡクラスＩｍＡｂの存在下では、ｉＤＣに対するＮＫＧ２ＡｌｏｗＮＫ細胞の細胞溶解活性の増加は認められなかった。一方、（より高いレベルのＨＬＡ−Ｅを発現する）ｍＤＣの場合、抗ＨＬＡクラスＩｍＡｂの添加により、細胞溶解活性の増加が生じ、これにより、十分なレベルの受容体−リガンド相互作用が提供されれば、グループＡクローンによって発現されるＮＫＧ２Ａ分子が溶解を阻害できることが示された。ｍＤＣでは、いくつかの程度の異種が、ＨＬＡ−ＥのおよびおそらくＮＫｐ３０のリガンドの発現において存在し得ることが考えられる。異なる量のＨＬＡ−Ｅを発現する細胞間を区別するＮＫ細胞の画分の能力が付与されれば、ｍＤＣ間のいくつかのみＮＫ細胞のこの特定のサブセットに耐性を与えるのに十分なＨＬＡ−Ｅの表面密度を発現し得ることが可能である。
【０２５５】
実施例５−Ｚ２７０抗ＮＫＧ２ＡｍＡｂは成熟樹状細胞に対するＮＫ細胞株の溶解活性を増加する
Ｚ２７０は、ＮＫＧ２Ａに対するマウスＩｇＧ１モノクローナル抗体である。Ｚ２７０のアミノ酸配列は配列番号に記載されている。Ｚ２７０はマウス抗体であるため、それはヒトＦｃ受容体に結合せず、従って、ヒト細胞系またはマウスＦｃ受容体を有する細胞を欠く任意の系において本発明の活性化抗体として作用する。対照的に、マウス（ｍｏｕｎｓｅ）Ｆｃ受容体を有する細胞を含んでなる系では、そのＩｇＧ１定常領域がそのようなＦｃ受容体に結合するという事実のため、Ｚ２７０は本発明の阻害抗体である。
【０２５６】
ＮＫＧ２Ａおよび未成熟樹状細胞を発現するヒトＮＫ細胞クローン（形質細胞様樹状細胞または骨髄系樹状細胞）を、標準的な方法を使用して作製した。得られるヒトＮＫ細胞クローンＢＨ３、ＢＨ１８およびＢＨ３４の溶解活性を、自家移植未成熟樹状細胞上において試験した。ｉＤＣに対するこれらのクローンのそれぞれの溶解活性は、ＣＤ９４（ＩｇＭ）およびＮＫＧ２Ａ（Ｚ２７０、ＩｇＧ１）に対するモノクローナル抗体の非存在または存在下で平行に試験した。比較のため、抗ＨＬＡクラスＩ抗体およびコントロールＩｇＧ１（抗２Ｂ４抗体）の存在下での溶解活性についても試験した。
【０２５７】
以下の表１に示されるように、ＮＫクローンは、抗体の非存在下またはコントロール抗体抗２Ｂ４ｍＡｂの存在下でｉＤＣの溶解をほとんど示さなかった。しかし、自家移植ｉＤＣの死滅は、抗ＣＤ９４、抗ＮＫＧ２ＡｍＡｂＺ２７０または抗ＨＬＡクラスＩｍＡｂのいずれかの存在下で再構成され得る。この結果は、ＮＫＧ２Ａ機能の妨害により、ｉＤＣのＮＫ細胞溶解が再構成されることを実証する。また、モノクローナルＺ２７０のＮＫＧ２Ａ結合領域は、ＮＫＧ２Ａの抑制機能を阻止することが可能であることを実証する。
【０２５８】
【表１】
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【０２５９】
実施例６−抗ＮＫＧ２Ａ抗体を使用する自家移植標的細胞溶解の再構成
抗体の非存在下またはｍＡｂＺ１９９、もしくはｍＡｂＺ２７０の存在下で、ＨＬＡ−Ｅを発現する自家移植ＰＨＡ芽球標的細胞に対するヒトＮＫバルク細胞の細胞溶解活性について試験した。細胞溶解活性を、標準的な４時間の５１Ｃｒ遊離アッセイによって評価した。すべての標的は、マイクロ滴定プレートのウェルあたり３０００個の細胞で使用した。ＮＫ細胞の数を変動させて、図１に示されるように、０．０１〜１００の間のエフェクター／標的比を生成した。
【０２６０】
抗体の非存在下では、ＮＫ細胞は、ＨＬＡ−Ｅを発現する標的細胞に対する細胞溶解活性をほとんど示さなかった。しかし、抗ＮＫＧ２Ａ抗体（ｍＩｇＧ１定常領域を有する）Ｚ２７０または（ｍＩｇＧ２ｂ定常領域を有する）Ｚ１９９の存在下で、ＮＫクローンは、それらのＨＬＡ−Ｅリガンドを認識することができなくなり、ＰＨＡ芽球標的に対して強力な細胞溶解活性を示した。Ｚ２７０はマウスＩｇＧ１定常領域を有し、Ｚ１９９はマウスＩｇＧ２ｂ定常領域を有する。それらのいずれの抗体もヒトＦｃ受容体に有意に結合することができない。
【０２６１】
同様に、ＨＬＡ−Ｅポジティブ自家移植ＰＨＡ芽球細胞のＮＫバルク細胞死滅の阻害は、Ｚ２７０Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（図２）、抗ＫＩＲｍＡｂＤＦ２００もしくはＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ２、３を介するシグナル伝達を阻止するｐａｎ２Ｄの使用、または抗体Ｗ６／３２によって、効率的に逆転され得る。また、試験した条件（Ｅ／Ｔ比＝１、５０μｇ／ｍｌ  ｍＡｂ）下では、ＰＨＡ芽球細胞は、ＮＫバルク細胞によって死滅されなかったが、しかし、この阻害は、Ｚ２７０ｍＡｂまたはＺ２７０Ｆａｂフラグメントのいずれかの使用によって、逆転され得た。
【０２６２】
実施例７−材料および方法
ｍＡｂ．この研究では、本発明者らの研究室で生成された以下のｍＡｂを使用した：ＪＴ３Ａ（ＩｇＧ２ａ、抗ＣＤ３）、ＡＺ２０およびＦ２５２（それぞれＩｇＧ１およびＩｇＭ、抗ＮＫｐ３０）、ｃ１２７（ＩｇＧ１、抗ＣＤ１６）、ｃ２１８（ＩｇＧ１、抗ＣＤ５６）、ＥＢ６ｂ（ＩｇＧ１、抗ＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＳ１）、ＧＬ１８３（ＩｇＧ１、抗ＫＩＲ２ＤＬ２  ＫＩＲ２ＤＬ３およびＫＩＲ２ＤＳ２）、ＦＥＳ１７２（ＩｇＧ２ａ、抗ＫＩＲ２ＤＳ４）、Ｚ２７（ＩｇＧ１、抗ＫＩＲ３ＤＬ１）、ＸＡ１８５（ＩｇＧ１、抗ＣＤ９４）、Ｚ１９９、Ｚ２７０（ＩｇＧ２ｂ、抗ＮＫＧ２Ａ）、Ａ６−１３６（ＩｇＭ、抗ＨＬＡクラスＩ）、１３１（ＩｇＧ１、Ａ３、Ａ１１およびＡ２４を含む抗ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子）ならびにＥ５９／５３（ＩｇＧ２ａ、抗ＨＬＡ−Ａ）［シッコネ（Ｃｉｃｃｏｎｅ）ら、（１９９０年）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ８７：９７９４−９７９７；ペンデ（Ｐｅｎｄｅ）ら、（１９９８年）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：２３８４−２３９４］。ｍＡｂＦ４／３２６（ＩｇＧ、抗ＨＬＡ−Ｃ）［マーシュ（Ｍａｒｓｈ）ら、（１９９０年）Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ３６：１８０−１８６］、１１６−５−２８（ＩｇＧ２ａ、抗ＨＬＡ−Ｂｗ４対立遺伝子）および１２６−３９（ＩｇＧ３、抗ＨＬＡ−Ｂｗ６対立遺伝子）は、Ｋ．ゲルストルプ（Ｋ．Ｇｅｌｓｔｈｏｒｐｅ）博士（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ，ＧＢ）（ＸＩＩ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＨＬＡ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ）より贈呈され、３Ｄ１２（ＩｇＧ１、抗ＨＬＡ−Ｅ）［リー（Ｌｅｅ）ら（１９９８年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：４９５１−４９６０］は、ダニエル・ゲラフティ（Ｄａｎｉｅｌ  Ｇｅｒａｇｈｔｙ）博士（Ｆｒｅｄ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓｅａｔｔｌｅ、ワシントン州）より贈呈された。
【０２６３】
抗ＣＤ１ａ（ＩｇＧ１−ＰＥ）、抗ＣＤ１４（ＩｇＧ２ａ）、抗ＣＤ８３（ＩｇＧ２ｂ）および抗ＣＤ８６（ＩｇＧ２ｂ−ＰＥ）は、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ（Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ、仏国）から購入した。Ｄ１．１２（ＩｇＧ２ａ、抗ＨＬＡ−ＤＲ）ｍＡｂは、Ｒ．Ｓ．アコラ（Ｒ．Ｓ．Ａｃｃｏｌｌａ）博士（Ｐａｖｉａ、伊国）より提供された。ＨＰ２．６（ＩｇＧ２ａ、抗ＣＤ４）ｍＡｂは、Ｐ．サンチェス−マドリード（Ｐ．Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｍａｄｒｉｄ）博士（Ｍａｄｒｉｄ、西国）より提供された。
【０２６４】
ポリクローナルまたはクローナルＮＫ細胞集団の作製ＰＢＬを得るために、ＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ勾配上で単離し、プラスチック付着細胞から枯渇させた。富化されたＮＫ細胞を、ＰＢＬを抗ＣＤ３（ＪＴ３Ａ）、抗ＣＤ４（ＨＰ２．６）および抗ＨＬＡ−ＤＲ（Ｄ１．１２）ｍＡｂと共にインキュベート（４℃で３０分間）し、続いて、ヤギ抗体マウス被覆Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ，Ｏｓｌｏ、諾国）と共にインキュベート（４℃で３０分間）し、免疫磁気枯渇により単離した。ＣＤ３−ＣＤ４−ＨＬＡ−ＤＲ−細胞を、１００Ｕ／ｍｌ  ｒＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ，Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、カリフォルニア州）および１．５ｎｇ／ｍｌ  ＰＨＡ（Ｇｉｂｃｏ  Ｌｔｄ，Ｐａｉｓｌｅｙ、英国）の存在下、照射処理されたフィーダー細胞上で培養し、ポリクローナルＮＫ細胞集団を入手したか、または先に記載のように、限界希釈後、ＮＫ細胞クローンを入手した。
【０２６５】
ＤＣの作製。  ＰＢＭＣを健康なドナーから誘導し、プラスチック付着細胞を、ＩＬ−４およびＧＭＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｌｏｎｄｏｎ、英国）の存在下、それぞれ２０ｎｇ／ｍｌおよび５０ｎｇ／ｍｌの最終濃度で培養した。６日間の培養後、細胞は、ｉＤＣに対応するＣＤ１４−ＣＤ１ａ＋ＣＤ８３−表現型によって特徴付けられた。ＣＤ１４−ＣＤ１ａ＋ＣＤ８３＋ＣＤ８６＋ｍＤＣを作製するために、ｉＤＣを、２日間、ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミシガン州）により、１μｇ／ｍｌの最終濃度で刺激した。
【０２６６】
フローサイトフルオロメトリー分析および細胞溶解活性１または２色サイトフルオロメトリー分析（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、カリフォルニア州）では、細胞を、適切なｍＡｂ、続いて、ＰＥ−またはＦＩＴＣコンジュゲートアイソタイプ特異的ヤギ抗マウス第２試薬（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ）で染色した。ポリクローナルおよびクローナルＮＫ細胞集団を、自家移植または異種ＤＣのいずれかに対する４時間の［５１Ｃｒ］遊離アッセイにおいて細胞溶解活性について試験した。マスキング実験のために、添加された多様なｍＡｂの濃度は１０μｇ／ｍｌであった。Ｅ／Ｔ比をテキストで示す。
【０２６７】
実施例８−Ｚ２７０重および軽鎖可変領域の特徴付け
マウスハイブリドーマ株、Ｚ２７０の凍結細胞ペレットを融解し、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｄｉキット（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号７５１４２）を使用して処理し、７１μｇの全ＲＮＡを単離した。約５マイクログラムのＺ２７０ＲＮＡを逆転写に供し、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  １ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号２７−９２６１−０１）を使用して、Ｚ２７０ｃＤＮＡを生成した。免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）ｃＤＮＡを、どのプライマー対がＰＣＲに最も安定であるかを決定するために、定常領域プライマーと組み合わされた異なる多くのＩｇＨプライマーを使用して、ＰＣＲによって増幅した。同様に、免疫グロブリンκ鎖可変領域（ＶＫ）を、κ定常領域プライマーと組み合わされた複数のＩｇＫを使用して、増幅した。
【０２６８】
重および軽鎖可変領域のそれぞれについての適切なプライマーを同定し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＰＯ１０細菌への形質転換、増幅および配列決定（ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）ターミネーターｖ３．０Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＡＢＩ）を使用する）のために、ｐＣＲ２．１（登録商標）−ＴＯＰＯベクター（登録商標）に個別に連結した。重鎖可変領域（Ｚ２７０  ＶＨ）および対応するアミノ酸配列のＤＮＡ配列は、それぞれ、配列番号１および配列番号２に記載されている。軽鎖可変領域（Ｚ２７０  ＶＫ）および対応するアミノ酸配列のＤＮＡ配列は、それぞれ、配列番号３および配列番号４に記載されている。
【０２６９】
Ｚ２７０ＶＫの特徴付けは、適切なプライマーおよびＰＣＲ、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位、Ｋｏｚａｋ翻訳開始部位および５’末端でのＫ２Ａ／ＲＦＴ２κリーダー配列およびスプライスドナー部位およびＺ２７０ＶＫＤＮＡ配列の３’末端でのＢａｍＨＩ制限部位を介する導入を要した。得られるＰＣＲ産物を、Ｚ２７０軽鎖の可変領域を含有する全長キメラ軽鎖をコードするように、ヒトκ軽鎖の定常領域をコードするベクターにクローニングした。得られるｃｈＺ２７０ＶＫおよび対応するアミノ酸配列のＤＮＡ配列は、それぞれ、配列番号５および配列番号６に記載されている。
【０２７０】
Ｚ２７０ＶＨの特徴付けは、適切なプライマーおよびＰＣＲ、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位、Ｋｏｚａｋ翻訳開始部位および５’末端でのＡ００３リーダー配列およびＺ２７０ＶＨのＤＮＡ配列の３’末端での天然のＡｐａＩ制限部位を含むγ１Ｃ領域の５’末端を介する導入を要した。得られるＰＣＲ産物を、Ｚ２７０重鎖の可変領域を含有する全長キメラＩｇＧ１重鎖をコードするように、ヒトＩｇＧ１重鎖の定常領域をコードするベクターにクローニングした。得られるｃｈＺ２７０ＶＨおよび対応するアミノ酸配列のＤＮＡ配列は、それぞれ、配列番号７および配列番号８に記載されている。
【０２７１】
得られる重および軽鎖含有プラスミドを、ＣＯＳ７細胞に同時にエレクトロポレートし、Ｚ２７０の得られるヒトＩｇＧ１κキメラ化（ｃｈｉｍｅｒｓａｔｉｏｎ）構築物を発現させた。
【０２７２】
実施例９−新規ｍＡｂの作製
５週齢のＢａｌｂＣマウスＮＫクローンＳＡ２６０（ＣＤ９４ｂｒｉｇｈｔ）を免疫することによって、ｍＡｂを作製した。異なる細胞融合後、最初に、ｍＡｂ  Ｚ１９９およびＺ２７０を、（モレッタ（Ｍｏｒｅｔｔａ）ら、（１９９４年）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：５４５に記載のように選択した。ＣＤ９４分子の分布についての休止または活性されたＮＫ細胞集団の分析を、モレッタ（Ｍｏｒｅｔｔａ）ら（１９９４年）に記載のように１または２色蛍光フローサイトメトリー分析を使用して実施した。
【０２７３】
ポジティブなモノクローナル抗体を、ＮＫクローンによる溶解を再構成するそれらの能力についてさらにスクリーニングした。ＮＫクローンの細胞溶解活性を、エフェクターＮＫ細胞を、多様なＨＬＡクラスＩ遺伝子をトランスフェクトされたもしくはトランスフェクトされていないＰ８１５マウス細胞系統またはＣ１Ｒヒト細胞系統に対して試験する標準的な４時間の５１Ｃｒ遊離アッセイにより評価した。これらの研究において使用される他の標的細胞は、シボリ（Ｓｉｖｏｒｉ）ら（１９９６年）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：２４８７−２４９２に記載のように、多様なＨＬＡクラスでトランスフェクトされていないまたはトランスフェクトされたヒトＨＬＡ−クラスＩ−ＬＣＬ７２１．２２１細胞系統によって示された。
【０２７４】
実施例１０−ＰＢＬの精製ならびにポリクローナルおよびクローナルＮＫ細胞系統の作製
ＰＢＬを、Ｆｉｃｏｌｌ  Ｈｙｐａｑｕｅ勾配およびプラスチック付着細胞の枯渇によって、健康なドナーから得る。富化されたＮＫ細胞を得るために、ＰＢＬを、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４および抗ＨＬＡ−ＤＲｍＡｂ（４℃で３０分間）、続いて、ヤギ抗マウス磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ）（４℃で３０分間）と共にインキュベートし、当該分野において既知の方法（ペンデ（Ｐｅｎｄｅ）ら、１９９９年）によって免疫磁気選択を行う。ＣＤ３−、ＣＤ４−、ＤＲ−細胞を、刺激したフィーダー細胞、１００Ｕ／ｍｌインターロイキン２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ、Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）および１．５ｎｇ／ｍｌ  ＰｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎＡ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）上で培養し、ポリクローンＮＫ細胞集団を得る。ＮＫ細胞を限界希釈によりクローニングし、ＮＫ細胞のクローンを細胞表面受容体の発現についてのフローサイトメトリーによって特徴付ける。
【０２７５】
実施例１１−抗ＮＫＧ２ａ  ｍＡｂに結合する受容体の個々の発現を同定するためのサル由来の全血の染色
材料
サル血液：アカゲザルおよびカニクイザルの血液は、Ｃｅｎｔｒｅ  ｄｅ  Ｐｒｉｍａｔｏｌｏｇｉｅ，ＵＬＰ，Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇで購入した。ヒヒのサル血液は、Ｃｅｎｔｒｅ  ｄｅ  Ｐｒｉｍａｔｏｌｏｇｉｅ，ＣＮＲＳ，Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｒｏｕｓｓｅｔで購入した。サル血液は、ＥＤＴＡまたはクエン酸ナトリウムを含有する「ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ」管で回収した。血液を、回収後２４時間以内に処理し、室温で保持した。
【０２７６】
抗体：ＦＩＴＣ−ＣＤ３、−ＣＤ４、−ＣＤ１４、−ＣＤ２０、およびＣｙＣｒ−ＣＤ４５は、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ由来であり、ＰＣ７−ＣＤ１６はＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒから入手した；これらのすべてのクローンはサルＰＢＭＣと交差反応する。ＰＥ−ＧａＭ（ヤギＦ（ａｂ’）２フラグメント抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＰＥ）、およびＯｐｔｉＬｙｓｅ（登録商標）ＣはＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒから購入した。抗ＮＫＧ２ａ  ｍＡｂ（クローンＺ２７０、マウスＩｇＧ１）を１μｇ／ｍｌで使用した。
【０２７７】
他の試薬：ＰＢＳ（１×）はＧｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎより；マウス血清はＪａｎｖｉｅｒ由来のＮＭＲＩマウスより；ホルムアルデヒド３７％はＳｉｇｍａより入手した。
【０２７８】
方法：
細胞染色は、以下のプロトコルにしたがって行った：
・１００μｌの血液＋１０μｌの１０×精製されたｍＡｂ
・撹拌しながら３０分間ＲＴでインキュベートする
・３ｍｌのＰＢＳで洗浄する（１４００ＲＰＭ、１０分間、ＲＴ）
・１００μｌのＰＥ−ＧａＭまたはＰＥ−ＧａＨを添加して、１：２００最終とし、ボルテックス撹拌する
・撹拌しながら３０分間ＲＴでインキュベートする
・３ｍｌのＰＢＳで洗浄する（１４００ＲＰＭ、１０分間、ＲＴ）
・５０μｌの２０％マウス血清を添加し、ボルテックス撹拌し、１０分間インキュベートする
・３０μｌ〜６０μｌのＦＩＴＣ−ＣＤ３、（−ＣＤ４、−ＣＤ１４、−ＣＤ２０）、ＰＣ７−ＣＤ１６、ＣｙＣｒ−ＣＤ４５混合物または１０μｌのそれぞれの対応するアイソタイプコントロールを添加する
・撹拌しながら３０分間ＲＴでインキュベートする
・５００μｌのＯｐｔｉＬｙｓｅ（登録商標）Ｃを添加し、ボルテックス撹拌し、１０分間インキュベートする
・５００μｌのＰＢＳを添加し、ボルテックス撹拌し、１０分間インキュベートする
・３ｍｌのＰＢＳで洗浄する（１４００ＲＰＭ、１０分間、ＲＴ）
・細胞ペレットを３００μｌのＰＢＳ＋０．２％ホルムアルデヒドに再懸濁する
【０２７９】
フローサイトメトリーは、以下のプロトコルに従って行った：
・サンプルをＸＬ／ＭＣＬサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）上に通過させるＥＸＰＯＴＭ３２  ｖ１．２ソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）により獲得および分析を実施した。
・分析は、それらのＦＳＣおよびＳＳＣ特徴によって同定されるリンパ球を中心に行った
・Ｔ細胞またはＮＫ細胞コンパートメントの分析：
Ｔ細胞＝ＣＤ３＋リンパ球は、Ｌｙにゲート設定された抗ＣＤ３染色ヒストグラムのポジティブ細胞として定義される
ＮＫ細胞＝ＣＤ３−ＣＤ５６＋リンパ球は、ＣＤ３／ＣＤ５６ドットプロットにおけるＣＤ３−ＣＤ５６＋ゲートに対応する（４分円の左上部分）。
【０２８０】
結果
アカゲザル、カニクイザルおよびヒヒに対するＮＫＧ２Ａモノクローナル抗体Ｚ２７０の結合を評価した。カニクイザルバルクＮＫ細胞（１６日目、３００μｍｌを、３０分間、４℃でｍＡｂ（１μｇ／ｍｌ）インキュベートし、洗浄し、２０分間、４℃でＰＥ−ＧａＭで標識した。図１は、Ｚ２７０がカニクイザルＮＫ細胞に結合することを実証する、カニクイザルＮＫ細胞への結合、ならびにＩｇＧ１および抗ＣＤ１６結合を示す。Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ（アカゲザル）ＮＫ細胞（全血由来）を、ｍＡｂと共にインキュベートし、洗浄し、ＰＥ−ＧａＭで標識した。表２に示される結果は、アカゲザルＮＫ細胞へのクローンＺ２７０の結合を実証する。最終的に、ヒヒＮＫ細胞（全血由来）を、ｍＡｂと共にインキュベートし、洗浄し、ＰＥ−ＧａＭで標識した。表３に示される結果は、ヒヒＮＫ細胞へのクローンＺ２７０の結合を実証する。
【０２８１】
実施例１２：抗ＮＫＧ２ａ  ｍＡｂに結合する受容体の個々の発現を同定するためのサル由来の全血の染色
材料
アカゲザルおよびカニクイザル由来のサル血液を、ＥＤＴＡまたはクエン酸ナトリウムを含有するチューブに回収した。抗体：ＦＩＴＣ−ＣＤ３、−ＣＤ４、−ＣＤ１４、−ＣＤ２０、およびＣｙＣｒ−ＣＤ４５は、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ由来であり、ＰＣ７−ＣＤ１６はＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒから入手した；これらのすべてのクローンはサルＰＢＭＣと交差反応する。ＰＥ−ＧａＭ（ヤギＦ（ａｂ’）２フラグメント抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＰＥ）、およびＯｐｔｉＬｙｓｅ（登録商標）ＣはＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒから購入した。他の試薬：ＰＢＳ（１×）はＧｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから；Ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ３７％はＳｉｇｍａから入手した。
【０２８２】
方法：
細胞染色は、以下のプロトコルにしたがって行った：
１００μｌ全血（ＥＤＴＡ）＋１１μｌ  ｍＡｂ溶液、Ｚ２７０もしくはＺ１９９（１０μｇ／ｍｌ）またはアイソタイプコントロールを、３０分間、ＲＴでインキュベートした。
・ＰＢＳで洗浄し、１００μｌのＰＥ−またはＦＩＴＣ  ＧａＭ（１／２００最終）を添加し、３０分間、ＲＴで放置する
・ＰＢＳで洗浄し、５０μｌのマウス血清２０％を添加し、６０μｌ含有ＦＩＴＣ−抗ＣＤ３、−ＣＤ４、−ＣＤ１４、−ＣＤ２０、ＣｙＣｒ−ＣＤ４５、ＰＣ７−ＣＤ１６を添加し、３０分間ＲＴで放置視する
・５００μｌのｏｐｔｉｌｙｓｅＣを添加し、１０分間ＲＴで放置する
・５００μｌのＰＢＳを添加し、１０分間、ＲＴで放置する
・ＰＢＳおよび０．２％ホルムアルデヒドで洗浄する
・ＣＤ４５ｂｒｉｇｈｔ小細胞（ＣＤ４５／ＳＳＣ）、次いで、ＣＤ１６＋ＣＤ３−ＣＤ４−ＣＤ１４−ＣＤ２０−細胞を中心に分析を行う
【０２８３】
結果
ＮＫＧ２Ａモノクローナル抗体Ｚ２７０ならびにＺ２９９のアカゲザルＮＫ細胞およびカニクイザルＮＫ細胞への結合を評価および比較した。カニクイザルバルクＮＫ細胞（１６日目、３００μｌを、３０分間、４℃でｍＡｂ（１μｇ／ｍｌ）インキュベートし、洗浄し、２０分間、４℃でＰＥ−ＧａＭで標識した。図４は、Ｚ１９９およびＺ２７０の両方がカニクイザルＮＫ細胞に結合することを実証する、Ｚ１９９およびＺ２７０の両方のカニクイザルＮＫ細胞への結合、ならびにＩｇＧ１および抗ＣＤ１６結合を示す。Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ（アカゲザル）ＮＫ細胞（全血由来）を、ｍＡｂと共にインキュベートし、洗浄し、ＰＥ−ＧａＭで標識した。表５に示される結果は、アカゲザルＮＫ細胞へのＺ１９９およびＺ２７０の両方の結合を実証する。
【０２８４】
（ビアッソニ（Ｂｉａｓｓｏｎｉ）ら、（２００５年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７４：５６９５−５７０５、図５および６を参照のこと）Ｚ１９９は、ＮＫＧ２Ａに加えて、カニクイザルＮＫＧ２Ｃにも結合すること、さらに、このｍＡｂは、再指向された死滅アッセイにおいてＰ８１５標的細胞の増加を生じることがさらに観察されている。溶解における後者の増加はヒトＮＫ細胞では逆に観察され、インヒビター受容体ＮＫＧ２Ａについて予想されるものに相反する。従って、理論にとらわれないことを所望するならば、本発明者らは、Ｚ１９９が、カニクイザルにおいて活性化受容体ＮＫＧ２Ｃを介して作用することを提唱する。Ｚ２７０はまた、カニクイザル細胞に結合し、再指向された死滅アッセイにおけるＰ８１５標的細胞の溶解の増加の増加を生じ、Ｚ２７０もまた、カニクイザルにおいてＮＫＧ２Ｃを認識することが示唆される。
【０２８５】
しかし、同じ種（例えば、カニクイザル）における２つのｍＡｂの結合のレベルは、染色された細胞の百分率および蛍光の強度の両方において非常に異なる。このことは、２つの抗体が別々にＮＫＧ２Ａエピトープに結合することを意味する。
【０２８６】
【表２】
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【０２８７】
【表３】
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【０２８８】
【表４】
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【０２８９】
【表５】
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【０２９０】
本明細書において引用されたすべての刊行物および特許出願は、それぞれ個々の刊行物または特許出願が、あたかも具体的かつ個別に参照により組み入れられて示されているが如く、それらの全体が、参照により、本明細書に援用される。
【０２９１】
上述の発明は、例えば、理解を明確にする目的で、例示および例の方法でいくらか詳細に説明してきたが、当業者であれば、本発明の教示内容に照らし合わせて、添付の特許請求の範囲の趣旨または範囲から逸脱することなく、それに所定の変更および改変を加えられ得ることが、容易に明らかとなろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
0006054129.tif 000009
【図４】
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【配列表】
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