(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物及び／又は植物生育の場所に、有効量の枯草菌（Bacillus subtilis）ＱＳＴ７１３を適用する工程を含む、線虫防除方法。
【請求項２】
前記適用の前に、前記植物及び／又は前記植物生育の場所に処理が必要であることを確認する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記場所が土壌である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記枯草菌ＱＳＴ７１３を植物の植え付け前に、植物の植え付け時に、畝間に、または、植物の植え付け後に適用する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記枯草菌ＱＳＴ７１３を、土壌灌注処理の場合は１エーカー当たり２×１０１２〜６×１０１３ｃｆｕ、又は畝間処理の場合は１列１０００フィート当たり６×１０１０〜４×１０１２ｃｆｕの割合で適用する、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記割合が、１エーカー当たり１×１０１３〜６×１０１３ｃｆｕ、又は１列１０００フィート当たり７．５×１０１１〜４×１０１２ｃｆｕである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記枯草菌ＱＳＴ７１３を、植物の根と接触している土壌、又は植物の基部にある土壌に適用する、請求項３〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記枯草菌ＱＳＴ７１３を、１回適用として土壌１グラム当たり７×１０５〜１×１０７ｃｆｕの割合で適用する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記枯草菌ＱＳＴ７１３を、１回適用として土壌１グラム当たり１×１０６〜５×１０６ｃｆｕの割合で適用する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記枯草菌ＱＳＴ７１３を、複数回適用で土壌灌注処理の場合は適用ごとに１エーカー当たり２×１０１２〜６×１０１３ｃｆｕの割合で適用する、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記枯草菌ＱＳＴ７１３を、複数回適用で適用ごとに土壌１グラム当たり１×１０５〜３×１０６ｃｆｕの割合で適用する、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記枯草菌ＱＳＴ７１３を種子に適用する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１３】
第２の殺線虫剤を適用する工程をさらに含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記枯草菌ＱＳＴ７１３を、植物の植え付け時に前記第２の殺線虫剤と組み合わせて適用し、その後の適用では枯草菌ＱＳＴ７１３を単独で適用する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第２の殺線虫剤がオキサミルである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
枯草菌ＱＳＴ７１３と、生物学的殺線虫剤から選択される第２の殺線虫剤とを含む、線虫防除用組成物。
【請求項１７】
枯草菌ＱＳＴ７１３を含む、殺線虫剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
[0001]  本出願は、米国特許法第１１９条により以下の仮特許出願、すなわち２０１１年７月２５日出願の米国仮特許出願第６１／５１１，５０８号、２０１１年１１月４日出願の米国仮特許出願第６１／５５６，０１６号、及び２０１２年６月１９日出願の米国仮特許出願第６１／６６１，７６３号に基づく優先権を主張する。上記仮出願はそれぞれ、参照により全体を組み込むものとする。
【０００２】
（技術分野）
[0002]  本発明は植物寄生線虫の防除に関する。
【背景技術】
【０００３】
[0003]  植物寄生線虫は広範な作物に重大な損害を引き起こし、その結果、世界的作物収量の損失は年間５％〜１２％の範囲になると推定される。線虫による根の損傷は一般的であり、発育阻害の植物につながり、これは根系が小型化し、葉にミネラル欠乏の徴候を示して萎れやすい。線虫による損傷は、植物が多種多様な植物病理学的菌類及び細菌類に感染する素因ともなる。
【０００４】
[0004]  線虫と戦い、防除するために、農家は通常、化学的殺線虫剤を使用する。それは、臭化メチル及びクロロピクリンなどの気体及び液体燻蒸から、チオナジン及びオキサミルなどの有機リン酸塩及びカルバミン酸塩の適用にまで及ぶ。これらの化学的殺線虫剤の使用は数十年間続いている。標的線虫を防除する上で化学的殺線虫剤は効果的であるが、これらの方法には深刻な限界がある。１つの限界は、化学的殺線虫剤が既に根に侵入している線虫には作用できないことである。別の限界は、化学的殺線虫剤の生産及び使用に伴う危険性である。化学的殺線虫剤は毒性が強く、ヒトの中毒及び死につながることがある。その結果、複数の国が特定の農薬を制限し、時には禁止している。特に臭化メチルはオゾン層破壊効果により大部分の国で禁止されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
[0005]  これらの制限及び禁止により、実行可能な線虫解決策が不足している。本発明は、化学的農薬の使用に取って代わるか、その使用を低減する安全で効果的な手段を提供する。線虫が植物の根に侵入することを阻止することと、次にこの最初のバリアを何とか克服した線虫の成熟を防止することという双方の解決策を提供するという点でもユニークである。
【０００６】
[0006]  本発明は、植物寄生線虫を防除する方法及び組成物を提供する。本発明は、線虫を防除する方法であって、植物、植物の部分及び／又は植物の所在地に有効量の枯草菌ＱＳＴ７１３、枯草菌ＱＳＴ７１３の変異体及び／又は枯草菌ＱＳＴ７１３の代謝産物を適用することを含む方法を提供する。幾つかの実施形態では、枯草菌ＱＳＴ７１３は、枯草菌ＱＳＴ７１３、その代謝産物、及び任意選択で残留発酵培養液（residual fermentation broth）を含む発酵生成物として適用される。一実施形態では、発酵生成物は実質的に枯草菌ＱＳＴ７１３の細胞又は枯草菌ＱＳＴ７１３の変異体の細胞で構成される。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
[0007]  本発明の枯草菌系組成物は、ネコブセンチュウの卵を減少させ、ネコブセンチュウの植物侵入を低減し、及び／又は植物に侵入するネコブセンチュウの成熟を阻害する。幾つかの実施形態では、標的線虫（すなわち、防除される線虫）は病害を引き起こすネコブセンチュウである。特定の場合では、線虫はメロイドギネ種である。他の実施形態では、本発明の組成物の標的線虫はシストセンチュウである。特定の場合、標的線虫はヘテロデラ種である。他の実施形態では、標的線虫はグロボデラ種である。他の実施形態では、標的線虫は以下の種、すなわち、パラティレンクス種、プラティレンクス種、パラトリコドルス種、クリコネメラ種、ヘリコチレンクス種、メロイドギネ種、及びクリコネモイド種である。特定の場合、線虫はヘリコチレンクス・シュードロブスタス（Helicotylenchus pseudorobustus）（らせんＨＰ）又はヘリコチレンクス・ディゴニカス（Helicotylenchus digonicus）（らせんＨＤ）である。
【０００８】
[0008]  幾つかの実施形態では、上記組成物を少なくとも１つの他の農薬、例えば殺菌剤、殺虫剤、殺線虫剤又は除草剤と混合する。一実施形態では、農薬は殺線虫剤である。特定の実施形態では、本発明の枯草菌系組成物を、市販品でもよい配合殺線虫剤とタンク混合する。他の実施形態では、複数の活性物質が１つの生成物を形成するように、枯草菌系組成物を活性成分（すなわち、菌、昆虫、線虫又は雑草に対して活性がある化合物）と混合し、その後に不活性物質が配合される。一実施形態では、他の殺線虫剤の活性成分はカルバメート又は有機リン酸塩である。別の実施形態では、それは生物学的殺線虫剤である。
【０００９】
[0009]  本発明は、枯草菌ＱＳＴ７１３又はその変異体、及び第２の線虫防除剤を含む組成物を提供する。幾つかの実施形態では、第２の線虫防除剤はカルバメート又は有機リン酸塩である。
【００１０】
[0010]  本発明はさらに、配合不活性物質又は他の配合成分、例えば多糖類（デンプン、マルトデキストリン、メチルセルロース、ホエータンパクなどのタンパク質、ペプチド、ガム）、糖類（乳糖、トレハロース、蔗糖）、脂質（レシチン、植物油、鉱物油）、塩（塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、クエン酸ナトリウム）、及びケイ酸塩（粘土、非晶質シリカ、ヒュームド／沈降シリカ、ケイ酸塩）などをさらに含む本発明の組成物のいずれかを提供する。組成物を土壌に適用するような幾つかの実施形態では、本発明の組成物は、土壌内への組成物の取り込みを促進する水又は鉱物、又は泥炭などの有機物質のような担体を含む。組成物を種子処理に、又は根の浸液として使用するような幾つかの実施形態では、担体は、種子又は根への組成物の付着を促進する結合剤又は固着剤である。組成物を種子処理剤として使用する別の実施形態では、配合成分は着色剤である。他の組成物では、配合成分は保存剤である。
【００１１】
[0011]  幾つかの実施形態では、植え付け前に、植物、植物部分、又は土壌などの植物の所在地に組成物を適用する。他の実施形態では、植え付け時に組成物を適用する。さらに他の実施形態では、植え付け後に組成物を適用する。
【００１２】
[0012]  特定の実施形態では、組成物を適用する前に、成長するために植物及び／又は植物の所在地が処理を必要とすることを確認することを含むステップがある。幾つかの実施形態では、確認は、植物成長のための場所が線虫侵襲の経済的閾値（economic threshold）を超えていることを判定することを含む。
【００１３】
[0013]  幾つかの実施形態では、本発明は、枯草菌ＱＳＴ７１３又はその変異体、及び殺線虫剤としてそれを使用するための指示書を含むキットを包含する。幾つかの実施形態では、これらの指示書は製品ラベルである。幾つかの実施形態では、指示書は枯草菌ＱＳＴ７１３又はその変異体を１エーカー当たり約２×１０１２ｃｆｕ〜約６×１０１３ｃｆｕの間の割合で使用するように使用者に指示する。幾つかの実施形態では、これらの指示書は、化学的殺線虫剤との組み合わせで枯草菌を殺線虫剤として使用するためのものである。特定の場合、指示書は、単独処理として使用する場合、製品ラベルで化学的殺線虫剤に推奨される割合よりも低い割合で化学的殺線虫剤を使用するように使用者に指示する。幾つかの他の実施形態では、指示書は、枯草菌ＱＳＴ７１３又はその変異体を、植物の根と接触している土壌に、植物の基部の土壌に、又は植物の基部の周囲で特定の距離以内（例えば植物の基部の周囲約５ｃｍ、約１０ｃｍ、約１５ｃｍ、約２０ｃｍ、約２５ｃｍ、約３０ｃｍ、約３５ｃｍ、約４０ｃｍ、約４５ｃｍ、約５０ｃｍ、約５５ｃｍ、約６０ｃｍ、約６５ｃｍ、約７０ｃｍ、約７５ｃｍ、約８０ｃｍ、約８５ｃｍ、約９０ｃｍ、約９５ｃｍ、約１００ｃｍ以上）の土壌に適用するように使用者に指示することができる。指示書は、枯草菌ＱＳＴ７１３又はその変異体を約１０日〜約１８日の間隔で、及び／又は適用ごとに土壌１グラムにつき約７×１０５ｃｆｕ〜約１×１０７ｃｆｕの割合で複数回適用するように使用者に指示することもできる。指示書はさらに、枯草菌ＱＳＴ７１３又はその変異体を植物の植え付け時に化学的殺線虫剤と組み合わせて使用し、その後の適用では枯草菌ＱＳＴ７１３又はその変異体を単独で使用するように使用者に指示することができる。一実施形態では、指示書は、枯草菌ＱＳＴ７１３又はその変異体を、１回適用として土壌１グラムにつき約７×１０５ｃｆｕ〜約１×１０７ｃｆｕの割合で適用するように使用者に指示する。別の実施形態では、指示書は、枯草菌ＱＳＴ７１３又はその変異体を、複数回適用として土壌１グラムにつき約１×１０５ｃｆｕ〜約３×１０６ｃｆｕの割合で適用するように指示する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】[0014]ネコブセンチュウが侵襲した根こぶ形成に及ぼすＱＳＴ７１３全培養液処理の効果を示す。本図及び他の図でＱＳＴ７１３全培養液をＡＱ７１３と呼ぶことに留意されたい。本図では未処理の対照を「ＵＴＣ」と呼ぶ。
【図２】[0015]様々な割合のＳＥＲＥＮＡＤＥ（登録商標）ＡＳＯでの処理がネコブセンチュウに侵襲された実生に及ぼす効果を示す。特に、結果は、根こぶ形成及び侵入の程度、及び線虫の発育に対する効果を示す。各処理（５．０％、２．５％及び１．０％のＳＥＲＥＮＡＤＥ  ＡＳＯ及びＵＴＣ）に対応する棒３本の各セットで、最初の棒はこぶ形成を、２番目の棒は線虫の侵入を、３番目は線虫の発育を表す。
【図３】[0016]未処理の植物（本図ではＵＴＣと呼ぶ）と比較してＡＱ７１３全培養液の様々なバッチで処理した植物１本当たりのネコブセンチュウの卵を表す。
【図４】[0017]単独で、又はＩＮＬＩＮＥ製品（１，３−ジクロロプロペン＋クロロピクリンの活性成分）と組み合わせてＳＥＲＥＮＡＤＥ  ＳＯＩＬ（登録商標）製品で処理した植物１本当たりのネコブセンチュウの卵を、未処理の植物（ＵＴＣと呼ぶ）及びＩＮＬＩＮＥ製品のみで処理した植物と比較して表す。表２で述べた様々な処理を、本図ではＴ１、Ｔ２、Ｔ３及びＴ４と呼ぶ。
【図５】[0018]ＡＱ７１３全培養液で処理し、１日、６日、９日及び１４日間隔（Ｔ１、Ｔ６、Ｔ９及びＴ１４）で線虫幼体で攻撃した植物根の１本ごとのネコブセンチュウの侵入（図５Ａ）、及び植物根の１本ごとのネコブセンチュウの発育（図５Ｂ）を示す。図５Ａでは、点線は未処理対照（「ＵＴＣ」）を表し、実線はＡＱ７１３での処理を表す。
【図６】[0019]０日目（Ｔ０）に植物をＡＱ７１３全培養液で灌注し、１週間、２週間又は３週間（Ｔ７、Ｔ１４又はＴ２１）に線虫で攻撃した後、植物根１本ごとにネコブセンチュウが産生した卵の合計を表す。未処理対照（ＵＴＣ）が、各接種日に設けた棒の各対の最初の棒である。各対の２番目の棒はＡＱ７１３で処理した結果を表す。
【図７】[0020]ＳＥＲＥＮＡＤＥ（登録商標）ＡＳＯ製品の１回又は複数回適用で処理した植物のこぶ等級（図７Ａ）、根１本当たりの卵の合計（図７Ｂ）及び新鮮な苗条の重量（図７Ｃ）を表す。
【図８】[0021]様々な用量のＳＥＲＥＮＡＤＥ（登録商標）ＡＳＯの１回適用で処理した植物の根１グラム当たりの卵の合計を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
[0022]  すべての出版物、特許及び特許出願は、本明細書の任意の図面及び補足を含め、個々の出版物又は特許出願が参照により特異的にかつ個々に組み込まれるものと示されている場合と同程度に参照により組み込むものとする。
【００１６】
[0023]  以下の説明は、本発明の理解に有用となり得る情報を含む。本明細書で提供される情報のいずれも、先行技術でも現在請求されている発明に関するものでもなく、特異的に又は明示的に参照される出版物のいずれも先行技術ではないことが認められる。
【００１７】
[0024]  ＳＥＲＥＮＡＤＥ（登録商標）製品（ＥＰＡ登録番号６９５９２−１２）は、枯草菌の独特の特許取得株（株ＱＳＴ７１３）、及び相乗的に作用して病原体を破壊し、優れた抗菌力を提供する多くの異なるリポペプチドを含有する。ＳＥＲＥＮＡＤＥ（登録商標）製品は、野菜、果物、堅果及び蔓作物などの植物を、火傷病、ボトリチス、酸腐れ、サビ病、菌核菌、ウドンコ病、細菌性斑点症及び白カビなどの病害から保護するために使用される。ＳＥＲＥＮＡＤＥ（登録商標）製品は、液体又は乾燥製剤として入手可能であり、茎葉及び／又は土壌処理として適用することができる。ＳＥＲＥＮＡＤＥ（登録商標）ＡＳＯ、ＳＥＲＥＮＡＤＥ（登録商標）ＭＡＸ、及びＳＥＲＥＮＡＤＥ  ＳＯＩＬ（登録商標）などのＳＥＲＥＮＡＤＥ（登録商標）製品のＥＰＡマスタラベルのコピーは、全米農薬情報検索システム（ＮＰＩＲＳ（登録商標））のＵＳＥＰＡ／ＯＰＰ農薬製品ラベルシステム（ＰＰＬＳ）により公的に入手可能である。
【００１８】
[0025]  ＳＥＲＥＮＡＤＥ（登録商標）ＡＳＯ（水性懸濁液・有機物質）は、活性成分としての乾燥ＱＳＴ７１３を１．３４％、他の成分を９８．６６％含有する。ＳＥＲＥＮＡＤＥ（登録商標）ＡＳＯは、最低１×１０９ｃｆｕ／ｇのＱＳＴ１３を含有するように配合され、ＱＳＴ７１３の最大量は３．３×１０１０ｃｆｕ／ｇになるように決定されている。ＳＥＲＥＮＡＤＥ（登録商標）ＡＳＯの代替商品名にはＳＥＲＥＮＡＤＥ  ＢＩＯＦＵＮＧＩＣＩＤＥ（登録商標）、ＳＥＲＥＮＡＤＥ  ＳＯＩＬ（登録商標）及びＳＥＲＥＮＡＤＥ（登録商標）ＧＡＲＤＥＮ  ＤＩＳＥＡＳＥがある。さらなる情報については、２０１０年１月４日付けのＳＥＲＥＮＡＤＥ（登録商標）の米国ＥＰＡマスタラベル及びＳＥＲＥＮＡＤＥ  ＳＯＩＬ（登録商標）を参照されたい。これらはそれぞれ、参照により全体を本明細書に組み込むものとする。
【００１９】
[0026]  ＳＥＲＥＮＡＤＥ（登録商標）ＭＡＸは、活性成分としてのＱＳＴ７１３を１４．６％、他の成分を８５．４％含有する。ＳＥＲＥＮＡＤＥ（登録商標）ＭＡＸは、最低７．３×１０９ｃｆｕ／ｇのＱＳＴ７１３を含有するように配合され、ＱＳＴ７１３の最大量は７．９×１０１０ｃｆｕ／ｇになるように決定されている。さらなる情報については、ＳＥＲＥＮＡＤＥ（登録商標）ＭＡＸの米国ＥＰＡマスタラベルを参照されたい。これは参照により全体を本明細書に組み込むものとする。
【００２０】
[0027]  枯草菌ＱＳＴ７１３、その変異体、その上澄み、及びそのリポペプチド代謝産物、及び植物の病原体及び昆虫を防除するためのこれらの使用方法が、米国特許第６，０６０，０５１号、第６，１０３，２２８号、第６，２９１，４２６号、第６，４１７，１６３号、及び第６，６３８，９１０号に詳細に記述され、これらはそれぞれ参照によりその教示全体を特異的に及び完全に本明細書に組み込むものとする。これらの米国特許では菌株をＡＱ７１３とし、これはＱＳＴ７１３と同義語である。枯草菌ＱＳＴ７１３は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の規定により、１９９７年５月７日に受け入れ番号Ｂ２１６６１でＮＲＲＬに寄託されている。本明細書でＱＳＴ７１３に言及する場合、それはすべてＮＲＲＬに受け入れ番号Ｂ２１６６１で寄託されているか、又はＳＥＲＥＮＡＤＥ（登録商標）製品の生産をシミュレートした状態でバイオリアクタ又は振盪フラスコ中で調製したＳＥＲＥＮＡＤＥ（登録商標）製品中に存在している状態の枯草菌ＱＳＴ７１３（ＡＱ７１３とも呼ぶ）を指す。
【００２１】
[0028]  以上で言及した特許は、線虫カエノラブディティス・エレガンスのＮ２種に対して枯草菌ＱＳＴ７１３全培養液の上澄みを試験したと述べている。このような試験は、上澄みには殺線虫剤の活性がないことを示した。
【００２２】
[0029]  上記特許に対応する米国特許出願第０９／０７４，８７０号を１９９８年に出願した時点で、ＱＳＴ７１３株は、古典的な生理学的、生化学的及び形態学的方法に基づいて枯草菌と呼ばれた。それ以来、バチルス種の分類法が、特に遺伝学及び配列決定テクノロジの進歩の見地から発展し、したがって種の命名法は、１９９８年に使用されていた方法ではなく主にＤＮＡ配列に基づいている。バチルス・アミロリクエファシエンスＦＺＢ４２、枯草菌１６８及びＱＳＴ７１３からのタンパク質配列を整合させると、バチルス・アミロリクエファシエンスＦＺＢ４２に見られるタンパク質のおよそ９５％がＱＳＴ７１３のタンパク質と８５％以上が同一である一方、枯草菌１６８中のタンパク質は３５％しかＱＳＴ７１３のタンパク質と８５％以上同一ではなかった。しかし、遺伝学に対する信頼性が向上しても、関係する科学文献及び法規文書にはなお分類上の曖昧性があり、この１５年間のバチルスの分類法に関する理解が進化中であることを反映している。例えば、ＦＺＢ４２と同様にＱＳＴ７１３と密接に関連する枯草菌株ＦＺＢ２４に基づく農薬製品は、環境保護局の文書では枯草菌変種アミロリクエファシエンスと分類される。このような命名法の複雑さにより、この特定のバチルス種は文書によって枯草菌、バチルス・アミロリクエファシエンス、及び枯草菌変種アミロリクエファシエンスと様々に呼ばれる。したがって、専ら配列の比較及び推論される分類法に基づき現在予測されるように、バチルス・アミロリクエファシエンスに変更するのではなくＱＳＴ７１３という枯草菌の命名を使用し続けてきた。
【００２３】
[0030]  「変異体」という用語は、ＱＳＴ７１３に由来する遺伝的変種を指す。一実施形態では、変異体は少なくとも親ＱＳＴ７１３株と同様に線虫を防除する。特定の場合、変異体はＱＳＴ７１３株の同定する特徴をすべて有する。別の実施形態では、変異体はＱＳＴ７１３株に対して約８５％より大きい、約９０％より大きい、約９５％より大きい、約９５％より大きい、約９８％より大きい、又は約９９％より大きい配列同一性を有する遺伝子配列を有する遺伝的変種である。変異体は、ＱＳＴ７１３細胞を化学物質又は照射で処理する、又はＱＳＴ７１３細胞の集団（ファージ抵抗性変異体など）から自然突然変異体を選択するか、又は当業者に周知の他の手段によって取得することができる。
【００２４】
[0031]  本発明の組成物は、米国特許第６，０６０，０５１号に記載された培地及び他の方法を使用するなど、当技術分野で周知の方法により枯草菌ＱＳＴ７１３又はその変異体を培養することにより獲得することができる。従来の大規模微生物培養プロセスには、液中発酵、固相発酵、又は液面培養がある。発酵の最後に向かって、養分が枯渇するにつれ、枯草菌細胞が増殖相から胞子形成相への移行を開始し、従って発酵の最終生成物は大部分が胞子、代謝産物及び残留発酵培地である。胞子形成は枯草菌の自然な生活サイクルの一部であり、通常は細胞が養分の制限に応答して開始する。発酵は、枯草菌の高レベルのコロニー形成単位を獲得し、胞子形成を促進するように構成される。発酵の結果である培地中の細菌細胞、胞子及び代謝産物は、直接使用するか、遠心分離、タンジェント流フィルトレーション、デプスフィルトレーションなどの従来の産業方法で濃縮することができる。発酵培養液及び培養液濃縮物の両方を、本明細書では「発酵生成物」と呼ぶ。本発明の組成物には発酵生成物が含まれる。幾つかの実施形態では、濃縮発酵培養液を、例えばダイアフィルトレーションプロセスにより洗浄し、残留発酵培養液及び代謝産物を除去する。
【００２５】
[0032]  発酵培養液又は培養液濃縮物は、担体を追加した状態又は追加しない状態で、噴霧乾燥、凍結乾燥、箱形乾燥、流動層乾燥、ドラム乾燥、又は蒸発などの従来の乾燥プロセス又は方法を使用し、乾燥することができる。
【００２６】
[0033]  その結果の乾燥生成物は、微粉砕又は顆粒化などによってさらに処理し、特定の粒子サイズ又は物理的フォーマットを達成することができる。以下に記載する担体も乾燥後に追加することができる。
【００２７】
[0034]  本発明のバチルスの新規の変種及び菌株の発酵培養液の無細胞標本は、発酵培養液の抽出、遠心分離及び／又はフィルトレーションなどの当技術分野で知られている任意の手段で獲得することができる。いわゆる無細胞標本は細胞が全くないわけではなく、細胞を除去するために使用した技術（例えば遠心分離の速度）に応じてほとんど無細胞であるか、基本的に無細胞であることが当業者には認識される。その結果の無細胞標本は、乾燥し、及び／又は植物又は植物成長培地に適用する際に補助する成分を配合することができる。上記発酵培養液の濃縮法及び乾燥技術は、無細胞標本にも適用可能である。
【００２８】
[0035]  枯草菌の代謝産物は、米国特許第６，０６０，０５１号に記載された方法により入手することができる。本明細書で使用する「代謝産物」という用語は、半純粋及び純粋又は基本的に純粋な代謝産物を、又は枯草菌から分離されていない代謝産物を指すことがある。幾つかの実施形態では、発酵培養液の遠心分離によって無細胞標本を作成した後、代謝産物は、ＬＨ−２０、Ｇ１０、及びＧ１５及びＧ２５などのセファデックス樹脂のようなサイズ排除フィルトレーションによって精製することができ、これは、リポペプチドが８００ダルトンと１６００ダルトンの間であるので、約２０００ダルトン未満、約１５００ダルトン未満、約１０００ダルトン未満などのような分子量カットオフに基づいて代謝産物を様々なフラクションに分類する。
【００２９】
[0036]  上記発酵培養液の配合の濃縮法及び乾燥技術は、代謝産物にも適用可能である。
【００３０】
[0037]  本発明の組成物は、効力、安定性、及び有用性を改善する、及び／又は処理、包装及び最終用途の適用を容易にするために、細胞、無細胞標本又は代謝産物を含む組成物に添加した配合不活性物質を含むことができる。このような配合不活性物質及び成分は、担体、安定剤、養分、又は物理的改質剤を含むことができ、これは個々に、又は組み合わせて添加することができる。幾つかの実施形態では、担体は水、油、及び他の有機又は無機溶剤などの液体物質、及びミネラル、ポリマー、又は生物学的又は化学的合成により誘導されたポリマー錯体などの固体物質を含むことができる。幾つかの実施形態では、担体は、種子又は根などの植物部分への組成物の付着を容易にする結合剤又は接着剤である。例えば、Taylor, A.G.他の「Concepts and Technologies of Selected Seed Treatments」（Annu. Rev. Phytopathol, 28:321,339(1990)）を参照されたい。安定剤は固化防止剤、酸化防止剤、乾燥剤、保護剤又は保存剤を含むことができる。養分は炭素、窒素、及び糖、多糖、油、タンパク質、アミノ酸、脂肪酸及びリン酸塩などのリン源を含むことができる。物理的改質剤は充填剤、湿潤剤、増粘剤、ｐＨ調節剤、流動学的調節剤、分散剤、補助剤、界面活性剤、凍結防止剤又は着色剤を含むことができる。幾つかの実施形態では、細胞、無細胞標本又は発酵により生成された代謝産物を含む組成物は、希釈剤としての水がある状態、又は水がない状態で任意の他の配合標本なしで直接使用することができる。幾つかの実施形態では、配合不活性物質は、発酵培養液を濃縮した後、乾燥中及び／又は乾燥後に添加する。
【００３１】
[0038]  本発明の組成物は担体を含むことができ、これは、回収率、効力又は物理的特性を改善する、及び／又は包装及び適用を補助するために、リポペプチド含有発酵生成物、リポペプチドの無細胞標本、又はリポペプチドの精製、半精製又は粗抽出物を含む組成物に添加される不活性配合成分である。このような担体は個々に、又は組み合わせて添加することができる。
【００３２】
[0039]  本発明の組成物は、他の化学的及び非化学的添加剤、補助剤及び／又は処理剤と混合し、及び／又はそれと輪番で使用することができ、このような処理剤には化学的及び非化学的殺菌剤、殺虫剤、殺ダニ剤、殺線虫剤、肥料、養分、ミネラル、オーキシン、生育促進剤などが含まれるが、これらに限定されない。
【００３３】
[0040]  本発明の枯草菌系組成物と混合することができる殺線虫剤は、化学的又は生物学的殺線虫剤でよい。本明細書で使用する「化学的殺線虫剤」という用語は燻蒸剤を除き、「燻蒸剤」という用語は植え付け前に土壌に適用され、土壌を通して（土壌空気及び／又は土壌水中に）拡散し、臭化メチルなどの気体、クロロピクリンなどの揮発性液体、又はダゾメットなどの揮発性固体として適用することができる広範囲の農薬化学物質を包含する。
【００３４】
[0041]  幾つかの実施形態では、化学的又は生物学的殺線虫剤は市販されている配合製品であり、本発明の組成物とタンク混合され、及び／又はそれと輪番で使用される。他の実施形態では、化学的又は生物学的殺線虫剤の活性成分（不活性成分を除く）は、組成物が１つの配合製品を形成するように、（不活性物質を）配合する前に枯草菌ＱＳＴ７１３系組成物と混合する。
【００３５】
[0042]  このような混合又は輪番プログラムに使用する化学的殺線虫剤はカルバメート、オキシムカルバメート及び有機リン殺線虫剤である。カルバメート殺線虫剤にはベノミル、カルボフラン（ＦＵＲＡＤＡＮ（登録商標））、カルボスルファン及びクロエトカルブが含まれる。オキシムカルバメートにはアラニカルブ、アルジカルブ（ＴＥＭＩＫ（登録商標）、又はＡＶＩＣＴＡ（登録商標）の一部としてＳｙｎｇｅｎｔａからのＣｏｍｐｌｅｔｅ  Ｐａｋ種子処理）、アルドキシカルブ、（ＳＴＡＮＤＡＫ（登録商標））、オキサミル（ＶＹＤＡＴＥ（登録商標））、チオジカルブ（Ｂａｙｅｒ  ＣｒｏｐＳｃｉｅｎｃｅからのＡＥＲＩＳ（登録商標）種子適用システムの一部）及びティルペートが含まれる。有機リン殺線虫剤にはフェンスルホチオン（ＤＡＮＳＡＮＩＴ（登録商標））、エトプロップ（ＭＯＣＡＰ（登録商標））、ジアミダフォス、フェナミホス、ホスチエタン、ホスファミドン、カズサホス、クロルピリホス、ジクロフェンチオン、ジメトエート、ホスチアザート、ヘテロホス、イサミドホス、イサゾホス、ホレート、ホスホカルブ、テルブホス、チオナジン、トリアゾホス、イミシアホス、及びメカルホンが含まれる。各化合物の後に挿入された名称は、以上の化学物質各々の代表的な市販製剤である。このような混合に有用な他の化学的殺線虫剤にはスピロテトラマト（ＭＯＶＥＮＴＯ（登録商標））、ＭＯＮ３７４００殺線虫剤及びフィプロニルが含まれる。
【００３６】
[0043]  このような混合及び輪番プログラムに使用する生物学的殺線虫剤には、キチン質と尿の混合物、堆肥抽出物及び茶（曝気及び非曝気の両方）と、真菌ミロセシウム・ベルカリア及び／又はその代謝産物（ＤＩＴＥＲＡ（登録商標）として市販されている）を含む組成物と、真菌ペシロミセス・リラシヌス（例えばＭＥＬＯＣＯＮ（登録商標）又はＢＩＯＡＣＴとして市販されている）を含む組成物と、P. usgaeを含む細菌パスツリア（例えばＥＣＯＮＥＭ（登録商標）として販売されている）を含む組成物と、バチルス・フィルムス（１９９５年５月２９日にフランスのパスツール研究所の国立微生物培養物コレクションにＣＮＭＣ  Ｉ−１５８２として寄託され、例えばＶＯＴＩＶＯ（登録商標）として販売されている菌株を含む）、枯草菌、バチルス・アミロリクエファシエンス、バチルス・プミルス（１９９９年１月１４日にＢ−３００８７としてＮＲＲＬに寄託された菌株及びその変異体を含む）、及びバチルス・セレウスを含むバチルス種からの細菌を含む組成物と、ストレプトミセス・リディカス（ＡＣＴＩＮＯＶＡＴＥ（登録商標）として販売されている）などの殺殺虫剤ストレプトミセス種を含む組成物とが含まれる。生物学的殺線虫剤には、ニーム植物（該植物からの種子又は油を含む）又はニーム種子の２次代謝産物であるアジディラクチンをベースにした生成物、ゴマ油系生成物（ＤＲＡＧＯＮＦＩＲＥ（登録商標）など）カルバクロール、及び植物抽出物（チリのキラヤ・サポナリア木から得たＮＥＭＡ−Ｑ（登録商標）など）をベースにした生成物のような植物系殺線虫剤も含まれる。生物学的殺線虫剤には、アバメクチン（アバメクチンＢ１ａとＢ１ｂの組み合わせで構成される）及びアベルメクチンＢ２ａを含むストレプトミセス・アベルメンティリスによって生成されるメクチン、及び元々はエルウィニア・アミロボーラで確認され、ハルピンＥＡ及びハルピンαβを含むハルピンタンパク質など、細菌によって生成された分離化合物も含まれる。
【００３７】
[0044]  本発明の組成物は、メロイドギネ種、ヘテロデラ種、グロボデラ種、プラティレンクス種、及びクリコネメラ種を含む、例えばネコブセンチュウ、シストセンチュウ、ネグサレセンチュウ及びワセンチュウなどの植物寄生線虫の防除に有用である。組成物は、チレンクルス・セミペネトランス、トリコドラス種、ロンギドルス種、ロチレンクルス種、キシフィネマ種、ベロノライムス種（Ｂ．ロンギカウダタスなど）、クリコネモイデス種、チレンコリンカス種、ホプロライムス種、ロチレンクス種、ヘリコチレンクス種（ヘリコチレンクス・シュードロブスタス（らせんＨＰ）及びヘリコチレンクス・ディゴニクス（らせんＨＤ）など）、ラドホルス種（Ｒ．シトロフィリス及びＲ．シミリスなど）、ジチレンクス種、パラトリコドルス種、及び他の植物寄生線虫の防除にも有用である。幾つかの実施形態では、標的はヘテロデラ・グリシネス（ダイズシストセンチュウ）、ヘテロデラ・シャクティイ（ビーツシストセンチュウ）、ヘテロデラ・アベナエ（シリアルシストセンチュウ）、メロイジギネ・インコグニタ（ワタ（又は南）ネコブセンチュウ）、グロボデラ・ロストチエンシス及びグロボデラパリダ（ジャガイモシストセンチュウ）などのシストセンチュウである。他の実施形態では、標的はＭ．インコグニタ（ワタネコブセンチュウ）、Ｍ．ジャバニカ（ジャワネコブセンチュウ）、Ｍ．ハプラ（北ネコブセンチュウ）、及びＭ．アレナリア（ラッカセイネコブセンチュウ）などのネコブセンチュウである。
【００３８】
[0045]  本明細書で使用する「防除」という用語は、死滅させる、数を減少させる、及び／又は成長、栄養補給又は正常な生理学的発育、例えばネコブセンチュウの場合は根に侵入して根中で発育する能力を低下させることを意味する。有効量は、線虫の増殖、栄養補給、根への侵入、根中での成熟、及び／又は正常な線虫の全体的生理学的発育、及び／又はこぶ又は根及び／又は植物の生育低下などの線虫感染に由来する植物宿主の徴候を顕著に低下させることが可能な量である。幾つかの実施形態では、徴候及び／又は線虫は少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％低下する。
【００３９】
[0046]  本発明の組成物は、種子、農産物、及び造園のために成長させるものなど、多種多様な農業及び／又は園芸作物の処理に使用される。本発明の組成物を使用して処理することができる代表的な植物には球根野菜、穀物、柑橘類（グレープフルーツ、レモン、及びオレンジなど）、ワタ及び他の繊維作物、ウリ科、結実野菜、葉物野菜（セロリ、タマチシャ及びチリメンチシャ、及びほうれん草など）、豆果、脂肪種子作物、落花生、仁果（リンゴ及びナシなど）、堅果（アーモンド、ペカン、及びクルミなど）、根菜、塊茎野菜、球茎野菜、タバコ、苺及び他のベリー類、アブラナ属（ブロッコリ及びキャベツなど）、ブドウ、パイナップル、及び顕花植物、花壇用花卉、及び観賞植物（シダ及びギボウシなど）が含まれるが、これらに限定されない。本発明の組成物はバナナ及びコーヒーなどのプランテーション作物など、及び森林、公園又は造園地に存在するような多年生植物の処理にも使用される。
【００４０】
[0047]  本明細書に記載する組成物は、植物寄生線虫を防除するために、植物、種子、根、根茎、球茎、球根、又は塊茎などの植物部分、及び／又は土壌などの植物又は植物部分が成長する場所に適用される。本発明の組成物は、葉面散布として、種子／根／塊茎／根茎／球根／球茎処理として、及び／又は土壌処理として適用することができる。種子／根／塊茎／根茎／球根／球茎は、植え付け前、植え付け中、又は植え付け後に処理することができる。
【００４１】
[0048]  本明細書に記載する組成物は、線虫を防除し、それにより作物収量を増加させるために、植物、種子、根茎、球茎又は塊茎などの植物部分、及び／又は土壌などの植物又は植物部分が生育する場所にも適用される。幾つかの実施形態では、作物収量は少なくとも約５％、他の実施形態では少なくとも約１０％、さらに他の実施形態では少なくとも約１５％、さらに他の実施形態では少なくとも約２０増加する。
【００４２】
[0049]  種子処理として使用される場合、本発明の組成物は、種子のサイズに応じて種子１個当たり約１×１０２〜約１×１０９ｃｆｕの割合で適用される。幾つかの実施形態では、適用の割合は種子１個当たり約１×１０３〜約１×１０８ｃｆｕ、又は種子１個当たり約１×１０４〜約１×１０７ｃｆｕである。
【００４３】
[0050]  本発明の組成物は、植物の根系ごとに約１×１０３〜約１×１０８ｃｆｕの割合で根浸液として適用することもできる。
【００４４】
[0051]  土壌処理として使用する場合、本発明の組成物は、土壌表面灌注、シャンクイン、注入及び／又は畝間適用として、又は灌漑用水との混合によって適用することができる。灌注土壌処理は植え付け時、種まき中又は種まき後、又は移植後及び植物が成長する任意の段階で適用することができ、その適用量は１エーカー当たり約４×１０７〜約８×１０１４ｃｆｕ、又は１エーカー当たり約４×１０９〜約８×１０１３ｃｆｕ、又は１エーカー当たり約４×１０１１〜約８×１０１２ｃｆｕ、又は１エーカー当たり約２×１０１２〜約６×１０１３ｃｆｕ、又は１エーカー当たり約２×１０１２〜約３×１０１３ｃｆｕである。幾つかの実施形態では、適用量は１エーカー当たり約１×１０１２〜約６×１０１２ｃｆｕ、又は１エーカー当たり約１×１０１３〜約６×１０１３ｃｆｕである。植え付け時に適用される畝間処理の適用量は、１列１０００フィート（３０４．８ｍ）当たり約２．５×１０１０〜約５×１０１１ｃｆｕである。幾つかの実施形態では、適用量は１列１０００フィート（３０４．８ｍ）当たり約６×１０１０〜約３×１０１２ｃｆｕ、又は１列１０００フィート（３０４．８ｍ）当たり約６×１０１０〜約４×１０１１ｃｆｕ、又は１列１０００フィート（３０４．８ｍ）当たり約６×１０１１〜約３×１０１２ｃｆｕ、又は１列１０００フィート（３０４．８ｍ）当たり約６×１０１１〜約４×１０１２ｃｆｕである。全面処理及び他のそれほど一般的ではない土壌処理に対する割合の調節方法は、当業者には理解される。
【００４５】
[0052]  本発明の組成物は、植え付け前又は種子の発芽前に土壌に導入することができる。本発明の組成物は、植物の根に接触している土壌、植物の基部にある土壌、又は植物基部の周囲の（例えば植物基部の周囲又は下に約５ｃｍ、約１０ｃｍ、約１５ｃｍ、約２０ｃｍ、約２５ｃｍ、約３０ｃｍ、約３５ｃｍ、約４０ｃｍ、約４５ｃｍ、約５０ｃｍ、約５５ｃｍ、約６０ｃｍ、約６５ｃｍ、約７０ｃｍ、約７５ｃｍ、約８０ｃｍ、約８５ｃｍ、約９０ｃｍ、約９５ｃｍ、約１００ｃｍ、又はそれ以上の距離以内の）土壌に導入することもできる。組成物は、点滴灌漑、スプリンクラー、土壌注入又は土壌灌注を含むが、これらに限定されない様々な技術を使用して適用することができる。組成物は、異なる植物の所在地に移植する前に、プラグトレイ内の土壌及び／又は植物に、又は実生にも適用することができる。土壌灌注処理を含め、植物の根に接触している土壌、植物基部、又は植物基部の周囲で特定の距離以内の土壌に適用する場合、組成物は１回適用として、又は複数回適用として適用することができる。組成物は、灌注処理については上記の割合で、又は土壌１グラム当たり約１×１０５〜約１×１０８ｃｆｕ、土壌１グラム当たり１×１０５〜約１×１０７ｃｆｕ、土壌１グラム当たり１×１０５〜約１×１０６ｃｆｕ、土壌１グラム当たり７×１０５〜約１×１０７ｃｆｕ、土壌１グラム当たり１×１０６〜約５×１０６ｃｆｕ、又は土壌１グラム当たり１×１０５〜約３×１０６ｃｆｕの割合で適用することができる。一実施形態では、本発明の組成物を１回適用として土壌１グラム当たり約７×１０５〜約１×１０７ｃｆｕの割合で適用する。別の実施形態では、本発明の組成物を１回適用として土壌１グラム当たり約１×１０６〜約５×１０６ｃｆｕの割合で適用する。他の実施形態では、本発明の組成物を複数回適用として土壌１グラム当たり約１×１０５〜約３×１０６ｃｆｕの割合で適用する。
【００４６】
[0053]  本発明の組成物を複数回適用として適用する場合、これらの適用は約１日間〜約２８日間、約１日間〜約２１日間、約１日間〜約１４日間、約７日間〜約２８日間、約７日間〜約２１日間、約７日間〜約１４日間、又は約１０日間〜約１８日間の間隔で実行することができる。
【００４７】
[0054]  本発明の枯草菌系組成物は、独立して、又は化学的及び生物学的殺線虫剤など、１つ又は複数の他の殺線虫剤と組み合わせて適用することができる。幾つかの実施形態では、枯草菌ＱＳＴ７１３は少なくとも１つの他の殺線虫剤と同時配合し、同時配合した生成物を植物又は植物の所在地に適用する。幾つかの他の実施形態では、枯草菌系組成物を市販されている化学的又は生物学的殺線虫剤の製剤とタンク混合し、植物及び植物の所在地に適用する。他の実施形態では、市販されている化学的又は生物学的殺線虫剤の製剤の直前又は直後に、本発明の枯草菌系組成物を植物及び／又は植物の所在地に適用する。他の実施形態では、市販されている化学的又は生物学的殺線虫剤の製剤と輪番で、本発明の枯草菌系組成物を植物及び／又は植物の所在地に適用する。殺線虫剤を何回か適用する輪番プログラムでは、本発明の組成物を単独で、又は他の殺線虫剤と組み合わせて適用することができる。１つの場合、枯草菌系組成物を種子処理として、或いは畝間又は灌注処理として、以下でさらに詳細に検討するように適用する。
【００４８】
[0055]  出願人はいかなる特定の理論にも束縛されることを望まないが、枯草菌ＱＳＴ７１３は処理した植物の誘導全身抵抗性（ＩＳＲ）によって線虫を防除すると考えられる。ＩＳＲの説明については、Bakker, P.A.H.M.の「Induced Systemic Resistance by Fluorescent Pseudomonas spp.」（Phytophathology 97(2): 239-243(2007)）を参照されたい。ＩＳＲは、枯草菌ＱＳＴ７１３で処理した時間からその後に線虫が植物を攻撃するまでの間の特定の誘導期の後にのみ効力を生じることができる。幾つかの実施形態では、植え付け時に枯草菌系組成物を第２の殺線虫剤と組み合わせて適用し、その後の適用時に枯草菌系組成物を単独で、又は別の殺線虫剤と組み合わせて適用する。第２の殺線虫剤を用いた初期処理が、枯草菌系組成物がＩＳＲをトリガするまでの誘導期中に植物を保護することができる。上記実施形態の幾つかの場合、市販されている第２の化学的又は生物学的殺線虫剤の製剤を、単独の殺線虫剤処理として使用するためのラベルの推奨値より低い割合で適用する。一実施形態では、植え付け時に枯草菌ＱＳＴ７１３をオキサミル（ＶＹＤＡＴＥ（登録商標））とともに適用し、その後の適用では枯草菌ＱＳＴ７１３を単独で適用する。
【００４９】
[0056]  他の実施形態では、燻蒸剤を適用した後、本発明のバチルス系組成物を植物及び／又は植物の所在地に適用する。燻蒸剤はシャンク注入によって、通常は地下最低８インチ（２０．３２ｃｍ）で適用することができる。燻蒸剤の液体製剤は、表面ドリップ化学溶液灌水法で適用し、燻蒸剤を地下８インチ（２０．３２ｃｍ）以上の深さで適用することもできる。処理された土層は、燻蒸剤を土壌中に数日間保持するためにビニール防水シートで覆う。これは植え付け前に実行され、植え付ける前に空気を逃がしておく。本明細書に記載するバチルス系組成物は、このように空気を逃がした期間の後、植え付け前、植え付け時又は植え付け後に適用される。幾つかの場合、燻蒸剤は製品ラベル上で推奨される割合より低い割合で適用される。
【００５０】
[0057]  化学的及び生物学的殺線虫剤について以上で説明した。燻蒸型殺線虫剤には、クロロピクリン（ＣＨＬＯＲ−Ｏ−ＰＩＣ）などのハロゲン化炭化水素；臭化メチル（ＭＥＴＨ−Ｏ−ＧＡＳ）及びその組み合わせ（ＢＲＯＭ−Ｏ−ＧＡＳ及びＴＥＲＲ−Ｏ−ＧＡＳなど）；１，３−ジクロロプロペン（ＴＥＬＯＮＥ  ＩＩ、ＴＥＬＯＮＥ  ＥＣ、ＣＵＲＦＥＷ）及び１，３−ジクロロプロペンとクロロピクリンとの組み合わせ（ＴＥＬＯＮＥ  Ｃ−１７、ＴＥＬＯＮＥ  Ｃ−３５、及びＩＮＬＩＮＥ）；ヨウ化メチル（ＭＩＤＡＳ）；ナトリウムメチルジチオカルバメート（ＶＡＰＡＭ、ＳＯＩＬＰＲＥＰ、ＭＥＴＡＭ−ＳＯＤＩＵＭ）などのメチルイソシアネート遊離促進物質；１，３−ジクロロプロペンとメチルイソチオシアネートの組み合わせ（ＶＯＲＬＥＸ）；及びテトラチオ炭酸ナトリウム（ＥＮＺＯＮＥ）などの二硫化炭素遊離促進物質；及び二硫化ジメチル又はＤＭＤＳ（ＰＡＬＡＤＩＮＯ）が含まれる。以上の燻蒸剤それぞれの市販製剤の例は、化学名の後のカッコ内で提供されている。
【００５１】
[0058]  本発明の組成物は、総合的害虫駆除（「ＩＰＭ」）プログラムの一部として適用することもできる。このようなプログラムは様々な出版物、特に大学の連携公開講座で説明されている。線虫については、このようなプログラムは、標的線虫の宿主となり得ない作物との輪作、栽培及び耕作の実践、及び移植の使用を含む。例えば、バチルス系組成物は、生育期の後にカラシ又は他の線虫抑制作物と一緒に適用することができる。
【００５２】
[0059]  幾つかの実施形態では、植物、植物の部分又は植物の所在地へと本発明の組成物を適用する前に処理を必要とする場所を確認する。このような確認は、萎黄病、発育阻害、ネクローシス、又は萎れる（すなわち、栄養が欠乏しているように見える）ような植物を目で見た確認を、通常は線虫問題の履歴に関する知識、植物のサンプリング及び／又は土壌のサンプリングと組み合わせて実行することができる。植物サンプリングは、生育期中に、又は最終収穫の直後に実行することができる。植物を土壌から取り出し、その根を検査して、用地内の線虫問題の性質及び程度を決定する。ネコブセンチュウの場合、根こぶの重症度は、こぶがある根系の割合を測定することによって決定する。ネコブセンチュウによって引き起こされたこぶは、こぶは根から容易に分離されないので、窒素を固定する土壌細菌の根こぶから区別することができる。ネコブセンチュウの土壌生物個体群レベルは根こぶの重症度とともに上昇する。幾つかの場合、いかなるレベルの根こぶでも検出された場合、それは感染しやすい作物の植え付けに、特にサンプリング区域又はその付近でネコブセンチュウの問題があることを示唆する。シストセンチュウは、植物のサンプリング及びシストを探す根の精査によっても確認することができる。
【００５３】
[0060]  土壌のサンプリングは、土壌又は根の特定の体積に寄生する線虫及び／又は線虫の卵の数を決定する手段を提供する。土壌サンプリングは、問題が最初に疑われた時、最終収穫時、又は新しい作物を植え付ける前の任意の時、例えば以前の作物の廃棄前に実施することができる。大学の連携公開講座プログラムは、フロリダ大学、オレゴン州立大学及びネブラスカ−リンカーン大学などの土壌サンプリングサービスを提供する。また、このようなプログラムはサンプリングの採集方法のガイドラインを提供する。例えば、収穫後の予測サンプリングの１つの方法で、サンプルは（作物の価値に応じて、作物の価値が高いほどサンプリングするエーカー数を少なくして）５又は１０エーカーにわたる１０〜２０の用地から深さ６〜１０インチ（１５．２４〜２５．４ｃｍ）の深さの土壌で規則的なジグザグのパターンにして採集する。定着した植物を試験する方法では、症状があるが枯れたり枯れそうになったりしていない、すなわち、分解していない疑わしい植物から、６〜１０インチ（１５．２４〜２５．４ｃｍ）の深さの土壌で根及び土壌のサンプルを取り出す。
【００５４】
[0061]  幾つかの実施形態では、確認は、線虫侵襲の経済的閾値、すなわち、処理しない場合に予想される経済的損失が処理の費用を超える点に到達しているか否かを決定することを含む。経済的閾値は、作物、地勢、気候、植え付けの時、土壌のタイプ、及び／又は土壌温度に応じて変化する。この主題に関しては多数の論文が発表されており、様々な地域の大学の連携公開講座プログラムからガイドラインが入手可能である。例えばRobb, J.G.他の「Factors Affecting the Economic Threshold for Heterodera schachtii Control in Sugar Beet」（Economics of Nematode Control January-June 1992）、Hafez, Saad L.の「Management of Sugar Beet Nematode」（University of Idaho Current Information Series (CIS) 1071 (1998)）、及び「UCIPM Pest Management Guidelines: Tomato」（UC ANR Publication 3470 Nematodes A. Ploeg, Nematology, UC Riverside (January 2008)）を参照されたい。特定の季節に特定の作物の経済的閾値を決定することについては、十分に当業者の技能の範囲に入る。
【００５５】
[0062]  幾つかの実施形態では、土壌サンプリングは、線虫侵襲により収量が侵襲していない土壌の標準値の約８０％、約９０％、又は約９５％になることを明らかにする。
【００５６】
[0063]  幾つかの実施形態では、土壌サンプル１キログラム当たりの根こぶ幼体（root knot juveniles）の経済的閾値は、少なくとも約２５０、少なくとも約３００、少なくとも約５００、少なくとも約７５０、少なくとも約１０００、少なくとも約２０００、少なくとも約３０００、少なくとも約４０００、少なくとも約５０００、又は少なくとも約６０００である。
【００５７】
[0064]  幾つかの実施形態では、土壌１ｃｍ３当たりのシストセンチュウの卵及び幼生の経済的閾値は少なくとも約０．５、少なくとも約１、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４である。上記のＨａｆｅｚ（１９９８）によると、１個のシストは５００個の生存卵及び幼生と概算することができる。
【００５８】
[0065]  以下の実施例は純粋に例証のためにあり、本発明を限定する目的はない。
【００５９】
実施例
実施例１
メロイドギネ・ジャバニカ（Meloidogyne javanica）に対する枯草菌ＱＳＴ７１３の活性
[0066]  キュウリの種子変種サルタン（Sultan）で調査を実施し、ネコブセンチュウであるメロイドギネ・ジャバニカに対するＱＳＴ７１３の活性を判定した。２０ｇの砂及び出芽していない種子１個を入れた５０ｍＬの遠心管を、様々な割合のＱＳＴ７１３の全培養液又は市販されているＳＥＲＥＮＡＤＥ（登録商標）ＡＳＯ製品で処理した。全培養液とＳＥＲＥＮＡＤＥ（登録商標）ＡＳＯ製品とは、製品の方がコロニー形成単位（ｃｆｕ）及び代謝産物に関して濃度がはるかに高く、製品が全培養液より少なくとも１ｌｏｇ大きいｃｆｕを有する点で異なる。また、製品は特に保存剤が配合されており、したがって製品は全培養液より酸性が高い。ＱＳＴ７１３の全培養液培養物を得るために、ルリア培養液（Luria Broth；ＬＢ）を入れた種子フラスコにＱＳＴ７１３を接種し、３０℃で一晩増殖させた。翌日、各種子フラスコのアリコートを、１Ｌの振盪フラスコに入れた２００ｍＬのダイズ系培地に接種し、胞子形成まで増殖させた。簡潔に言うと、振盪フラスコ培養物を３０℃〜３２℃の間の温度に維持し、振盪装置を２００〜２２０ｒｐｍに設定した。細胞の増殖及び代謝産物の産生が停止したインキュベート後およそ３日で、培養液を採取した。処理した種子は、温室内で発芽し、生育できるようにした。処理後４〜５日（ＤＡＴ）で、第二段階幼体ネコブセンチュウ１００個を接種した。１０ＤＡＴで、実生に０〜４のスケールで根こぶ形成率の得点をつけ、それを表１に示す。
【００６０】
[0067]  次に、線虫の侵入及び発育を観察するために根を酸フクシンで染色し、ライカ解剖顕微鏡で観察した。線虫の侵入に関しては、各根中の線虫幼体総数をカウントした。線虫の発育については、後期第二段階幼体（Ｊ２）及び第三段階幼体（Ｊ３）を含む肥満幼体総数をカウントした。根への線虫の侵入及び侵入後の線虫の発育は、表１で詳述するように得点をつけた。使用した技術の詳細については、C.O. Omwega他の「A Nondestructive Technique for Screening Bean Germ Plasm for Resistance to Meloidogyne incognita」（Plant Disease (1988) 72(11):970-972)）を参照されたい。
【００６１】
[0068]  表１．細菌全培養液の線虫拮抗作用の評定方式。こぶ形成指数は、根こぶ形成の割合に基づいている。侵入尺度は、未処理対照（ＵＴＣ）中の幼若線虫の数に対する幼若線虫の平均総数として計算した。発育尺度は、根の中にいる肥満幼若線虫（後期Ｊ２段階／Ｊ３段階）の総数を反映している。
【表１】
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【００６２】
[0069]  図１は、ＱＳＴ７１３全培養液を適用すると根こぶ形成が減少することを示す。図２は、様々な割合のＳＥＲＥＮＡＤＥ（登録商標）ＡＳＯを適用すると、未処理対照と比較して、こぶ形成、侵入及び発育が低下することを示す。データは上記評定システムに基づいているので、常に用量反応を観察することが可能だとは限らないことに留意されたい。
【００６３】
実施例２
トマトのネコブセンチュウ卵を防除するＡＱ７１３の有効性
[0070]  ネコブセンチュウの卵に対するＱＳＴ７１３の有効性を試験するために、トマト種子で別の実験を実施した。ＡＱ７１３−バッチ１は、実施例１で述べたように調製した全培養液培養物であった。ＡＱ７１３−バッチ２及びＡＱ７１３−バッチ３をバイオリアクタ内で調製した。簡潔に言うと、保存培養物のバイアルを解凍し、ディフコ栄養培養液（Difco Nutrient Broth）の滅菌フラスコに移した。次に、フラスコ培養物を２８℃〜３２℃の間の温度、２００〜２２０ｒｐｍの回転速度の回転振盪装置でインキュベートし、細胞の増殖を促進して、高密度細胞を獲得し、次に１２Ｌのダイズ系増殖培地を２０Ｌのバイオリアクタに加えた。バイオリアクタは、３０℃〜３２℃の間の温度設定、５００〜１０００ｒｐｍの攪拌設定、６〜８の間に緩衝したｐＨ、及び０．５〜１．０ＶＶＭの曝気に設定した。細胞の増殖及び代謝産物の産生が停止したインキュベート後およそ３日で、培養物培養液を採取した。３週間のトマトの苗を灌注によってＱＳＴ７１３で処理した。次に、植木鉢を温室内で１０日間保管してから、植木鉢１個当たり５０００個のネコブセンチュウ（「ＲＫＮ」）の卵を接種した。線虫接種から４２日後に苗を採取した。Hussey RS、Barker KRの「A Comparison of Methods of Collecting Inocula of Meloidogyne spp., Including a New Technique」（Plant Disease Reporter, 1973; 57:1025-1028）で詳述されているように、１％のＮａＯＣｌ溶液を使用してトマトの苗の根から卵を採集した。ＡＱ７１３は、苗１本当たりに観察されたネコブセンチュウ卵の数を減少させた。データは、採点システムではなく卵を直接カウントした結果を表す。未処理サンプル（ＵＴＣ）と比較した結果を図３に示す。
【００６４】
実施例３
様々な線虫に対するＳＥＲＥＮＡＤＥ  ＳＯＩＬ（登録商標）製品の有効性
[0071]  「埋土バッグ」調査を実施して、イチゴ畑で様々なタイプの線虫に対するＳＥＲＥＮＡＤＥ  ＳＯＩＬ（登録商標）製品の有効性を判定した。埋土バッグは、土壌処理、特に燻蒸剤の有効性を評価するために一般的に使用されている。既知の濃度の線虫を入れた土壌サンプルをナイロンの網バッグに入れ、イチゴ苗床の約６〜８インチ（１５．２４〜２０．３２ｃｍ）の深さに埋土した。様々な処理を表２に示すように適用した。ＩＮＬＩＮＥ製品をＳＥＲＥＮＡＤＥ  ＳＯＩＬ（登録商標）製品と組み合わせて、陽性対照として使用した。
【表２】
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【００６５】
[0072]  処理Ｂの後、２０１０年１２月８日にバッグを採集し、線虫（成虫及び幼虫）をカウントした。結果を以下に示す。
【表３】
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【００６６】
[0073]  同じ文字が後に付く平均値は、Ｐ＝０．０５で有意に差がない（スチューデント・ニューマン・キュール）。
【００６７】
[0074]  以上で示した最後の適用の数週間後、幾つかの苗をプロットから取り出し、実施例２で述べたように根のネコブセンチュウを分析した。図４は、処理が根１本当たりのネコブセンチュウの卵を減少させたことを示す。
【００６８】
[0075]  その後の実験で、ＳＥＲＥＮＡＤＥ  ＳＯＩＬ（登録商標）製品が、未処理対照と比較した場合に、ジャガイモの苗でパラトリコドルス種及びパラティレンクス種の防除に効果的であることが示された。ＳＥＲＥＮＡＤＥ  ＳＯＩＬ（登録商標）製品は、未処理対照と比較した場合に、イチゴの苗でヘリコチレンクス・シュードロブスタス（らせんＨＰ）、ヘリコティレンクス・ジゴニクス（らせんＨＤ）及びクリコネメラ種に対する活性、トマトの苗でクリコネモイデス種に対する活性、ジャガイモでパラティレンクス種に対する活性も示した。
【００６９】
実施例４
枯草菌ＱＳＴ７１３での処理の誘導期及びメロイドギネ・ジャバニカに対する有効性
[0076]  キュウリの苗を使用した以下の実験に、実施例１で上述した実験技術を使用した。簡潔に言うと、ＡＱ７１３の培養液培養物を調製し、それを使用して０日目（Ｔ０）にキュウリ種子（種子１ｇ当たり１０５ｃｆｕ）を処理した。キュウリの苗は、１日、６日、９日、及び１４日の間隔（Ｔ１、Ｔ６、Ｔ９及びＴ１４）をあけて線虫幼体に攻撃させた。幼体線虫の接種後日数（Days post-innoculation；ＤＰＩ）１４日にて、各時点を採取した。根に侵入したメロイドギネ・ジャバニカのネコブセンチュウ（ＲＫＮ）の数（図５Ａ参照）、さらに発育した幼体の数（図５Ｂ参照）を数量化した。各データ点は、キュウリ苗６本の線虫の平均数を表す。キュウリ苗でＡＱ７１３の処理から線虫の攻撃までの間に６日間を超えるラグタイムがあったとき、未処理対照（ＵＴＣ）と比較して、ＡＱ７１３はＲＫＮの侵入及び発育の防除に効果的であった。
【００７０】
[0077]  処理と線虫攻撃の間に何らかの誘導期がある場合にＡＱ７１３が良好に作用するという観察結果を確認するために、４週間のトマト実生を０日目（Ｔ０）にＡＱ７１３全培養液（砂１ｇ当たり１０５ｃｆｕ）で灌注し、実施例２で述べたように１週間、２週間、又は３週間（Ｔ７、Ｔ１４又はＴ２１）後に植木鉢１個当たり１０００個のＲＫＮ幼体で攻撃させた。４２ＤＰＩで各時点を採取し、根１本当たりの卵の総数をカウントした。各データ点は、トマトの苗５本の卵の平均数を表す。トマトの苗のＲＫＮの卵数を未処理対照（ＵＴＣ）より減少させる効力のために、ＡＱ７１３の処理とその後の線虫攻撃との間に必要なラグタイムは、この実験では約１４日以上であった（図６参照）。
【００７１】
実施例５
１回適用と比較したＳＥＲＥＮＡＤＥ（登録商標）ＡＳＯの複数回適用
[0078]  表３に詳述するように複数回適用で処理するために、約８インチ（２０．３２ｃｍ）の直径を有する植木鉢に移植した時点、及びその後は２週間に１回（すなわち、２週間おきに）、トマトの苗にＳＥＲＥＮＡＤＥ（登録商標）ＡＳＯ製品を適用した。ＳＥＲＥＮＡＤＥ（登録商標）ＡＳＯ製品は、苗の基部から約２〜３インチ（５．０８〜７．６２ｃｍ）以内で苗の基部の周囲の土壌に適用した。用量の６クォート／エーカーは、土壌（すなわち、苗の基部から２〜３インチ（５．０８〜７．６２ｃｍ）以内の土壌）１ｇ当たり１×１０５ｃｆｕとほぼ同等である。次に、植木鉢を温室内に１０日間おき、植木鉢ごとに１０００個のネコブセンチュウＪ２幼虫を接種した。苗は線虫接種の４２日後に採取し、実施例１及び２で述べたようにこぶの等級をつけ（図７Ａ参照）、卵の総数をカウントした（図７Ｂ参照）。新しい苗条も計量して、苗の生育に対する処理の効果を確認した（図７Ｃ参照）。全データ点は、測定４回の平均値を表す。ＳＥＲＥＮＡＤＥ（登録商標）ＡＳＯ製品の複数回適用は、１回適用と比較して、全体的に線虫防除及び対応する苗の生育を向上させた。
【表４】
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【００７２】
実施例６
移植時に様々な用量で１回適用したＳＥＲＥＮＡＤＥ（登録商標）ＡＳＯ
[0079]  ＳＥＲＥＮＡＤＥ（登録商標）ＡＳＯ製品を、表４で詳述するように移植時に様々な用量で植木鉢のトマト苗に適用した。
【表５】
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【００７３】
[0080]  上述したように、６クォート／エーカーという用量は土壌１ｇ当たり１×１０５ｃｆｕとほぼ同等である。次に、苗を温室内に１０日間おき、植木鉢ごとに３０００個のネコブセンチュウの卵を摂取した。苗は線虫接種の７週後に採取し、卵の合計をカウントした（図８参照）。全データ点は測定４回の平均値を表す。一般的に、割合が４クォート／エーカーより高くなると、線虫卵産生の防除が向上し、４０クォート／エーカーで処理すると、未処理の苗群と比較して約７０％の防除となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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