(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面上のＨＡ−ＮＡ（血球凝集素およびノイラミニダーゼ）糖タンパク質の量が、直径１００ｎｍのビリオンに対して５５０個の糖タンパク質よりも多く、配列番号２のＰＢ１タンパク質をコードするＨ３Ｎ２インフルエンザウイルスのＰＢ１遺伝子と、インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスのＨＡおよびＮＡ遺伝子、または、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１もしくはＨ５Ｎ２サブタイプを有するウイルスから選択されるインフルエンザウイルスのＨＡおよびＮＡ遺伝子とを含む、改変されたインフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルス。
【請求項２】
インフルエンザウイルスのＨＡ−ＮＡワクチン糖タンパク質を生産する方法であって、ＨＡ−ＮＡワクチン糖タンパク質をコードするＨＡおよびＮＡ遺伝子を含む請求項１に記載の改変されたインフルエンザウイルスを卵または細胞において増幅する、方法。
【請求項３】
インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスの表面のＨＡ−ＮＡ糖タンパク質の量を増加させる方法であって、前記インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスにおける配列番号１のＰＢ１タンパク質をコードするＰＢ１遺伝子を、配列番号２のＰＢ１タンパク質をコードするＨ３Ｎ２インフルエンザウイルスのＰＢ１遺伝子で置換することを含み、前記インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスが、前記インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスのＨＡおよびＮＡ遺伝子を含む再集合体ウイルス、または、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１もしくはＨ５Ｎ２サブタイプを有するウイルスから選択されるインフルエンザウイルスのＨＡおよびＮＡ遺伝子を含む再集合体ウイルスである、方法。
【請求項４】
インフルエンザウイルスのＨＡ−ＮＡ糖タンパク質を含む一用量のワクチンの免疫原性を、生産される糖タンパク質のＮＡ／ＨＡ比を高めることによって増強する方法であって、前記糖タンパク質が、請求項１に記載の改変されたインフルエンザウイルスの、卵または細胞での増幅によって生産される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改変されたＰＢ１遺伝子を含む改変されたインフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルス、およびインフルエンザウイルスのワクチンシードの生産のための改変されたＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスの遺伝的背景を有する再集合体ウイルスを実装する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザウイルスにより引き起こされるインフルエンザは、毎年冬に温帯地域で集団発生を引き起こす、世界中で見られる一般的なウイルス性の呼吸器感染である。インフルエンザは今日も依然として、感染性疾患による死亡としては肺炎に次ぐ第二の原因である。ヒトにおける病態の原因となるインフルエンザウイルスはＡ型およびＢ型インフルエンザウイルスである。Ｂ型インフルエンザウイルスは系統の形態で循環するが、Ａ型インフルエンザウイルスは、血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）という２つの主要な表面糖タンパク質の抗原特性によってウイルスサブタイプに分けられる。インフルエンザウイルスはそれらの表面に３００〜７００の間の糖タンパク質を持ち、理論的ＮＡ／ＨＡ比は１対１０である。ヒトにおいて循環し、季節的流行を引き起こすウイルスは、Ａ（Ｈ１Ｎ１）型およびＡ（Ｈ３Ｎ２）型ウイルスである。インフルエンザウイルスの主要な保有宿主は動物保有宿主（鳥類およびブタ）であり、動物ウイルスが種の障壁を越えてヒトに感染し得る。高病原性鳥インフルエンザＡ（Ｈ５Ｎ１）型ウイルスおよびパンデミックＡ（Ｈ１Ｎ１）型ウイルスなどのウイルスは重大な公衆衛生問題を発生させる可能性がある。
【０００３】
現在のところ、予防接種が集団をインフルエンザウイルスから保護する唯一の有効な手段である。いわゆる季節性ワクチンは、循環している季節性Ａ（Ｈ１Ｎ１）型およびＡ（Ｈ３Ｎ２）型ウイルスおよびＢ型ウイルスに対する免疫を提供する。これは毎年ＷＨＯにより前年の原型株に基づいて定義される。宿主の免疫応答は主として体液性であり、ＨＡおよびＮＡタンパク質に対する中和抗体の合成を伴う。これらの２つのタンパク質の顕著な抗原ドリフトのために、特に、Ａ型ウイルスでは、ワクチンの組成は毎年見直さなければならない。
【０００４】
ワクチン生産の標準的な方法は、まず、Ａ／ＰＲ８／３４（Ｈ１Ｎ１）株との遺伝子再集合により、ＷＨＯによって決定された３つの原型株のそれぞれに関して卵でワクチンシードを得ることにある。ほとんどのワクチン生産者は、一般に、主として親Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルスに由来するこれらの再集合体ウイルスを使用する。従って、各ワクチンシードは、原型株と卵で最適な複製能を有するＡ／ＰＲ８／３４（Ｈ１Ｎ１）ウイルスとの間の遺伝子再集合から生じる。
【０００５】
ウイルス粒子は、一本鎖ＲＮＡから構成される８つの異なる遺伝子を含み、各遺伝子は１〜３個の特異的ウイルスタンパク質：ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＰ、ＮＳ１、ＮＳ２、ＰＢ１、ＰＢ１Ｆ２、ＰＢ１Ｎ４０、ＰＢ２およびＰＡをコードしている。その結果、長い選抜過程を経れば、ＰＲ８ウイルスの遺伝的背景に原型株のＨＡおよびＮＡをコードする遺伝子（「６＋２」組成）の少なくともセグメントを含むワクチン再集合体の獲得が可能となる。３つの原型株と親Ａ／ＰＲ／８／３４株の間の遺伝子再集合に由来するこの３ワクチン再集合体を次に卵で増幅させる。ＨＡおよびＮＡ抗原は、ワクチンの用量を生産するために、アジュバントを伴ってまたは伴わずに、尿膜系の産物から精製される。ワクチン用量を生産するためのこの工業的プロセスは長期間である（４〜６か月）。近年、ワクチン用量を得るための別の戦略が開発された。実際に、ワクチン再集合体を増幅するために細胞系統を使用すると、とりわけ、「卵（egg）」系（パンデミックを管理するには卵の品質が不十分）にもはや依存しないこと、尿膜生産法を用いる場合に決まって見られる表面抗原の変化を軽減すること、および非アレルゲン性とすることが可能となる。しかしながら、現在のところ、この工業的プロセスは現在のところ卵が果たすほどの機能を果たさないことから、この新しい生産方法を選択する製造者はほとんどない。
【０００６】
ワクチン用量生産時間を最小まで短縮するために、また、用量数の点で同等の収量を有するという目標で、「６＋２」組成を有するワクチン再集合体を迅速に得ることを可能とし、従って、全選抜工程を省いた逆遺伝学的技術の使用によってワクチンシードを得ることができる。逆遺伝学による組換えウイルスの生産は、ワクチンの需要に効果的に応じるための最も現実的な代替法を与える。逆遺伝学による組換えウイルスの生産は、次に、原型株との遺伝子再集合のプロセスによって用いられる場合に、卵または細胞におけるワクチン用量の生産のために至適化されたウイルス特徴を有するワクチン再集合体を生産することを可能とする「至適化」ＰＲ８ウイルスを生産するという可能性を拓く。
【０００７】
現在、パンデミック病原性ウイルスの出現に関して、インフルエンザ感染は、工業国だけで、１３０万〜２００万人の入院および２８０，０００〜６５０，０００人の死亡にのぼると見られている（ＷＨＯデータ）。
【０００８】
ワクチンの用量は、ＨＡ抗原の一定量によって定義される（１５μｇ／ウイルスサブタイプ／用量）。ワクチンロットをバリデートするためには、ＮＡ抗原の陽性検出が必要である。主要な経済的論点の１つは、ワクチン用量の製造コストを削減できるということである（１回の生産当たりの多用量化および／または同じ用量を生産するための時間の短縮）。
【０００９】
Ｗａｎｉｔｃｈａｎｇらには、再集合体（「５＋３」）Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルスのＰＢ１遺伝子がＳ−ＯＩＶウイルスのＰＢ１遺伝子に置換された場合の、Ｈ１Ｎ１（Ｓ−ＯＩＶ）ウイルスのＨＡ／ＮＡ糖タンパク質を発現する再集合体ウイルスの増殖の改善およびそのＮＡ活性の増強が記載されている。しかしながら、この増殖の改善およびＮＡ活性の増強は、Ｓ−ＯＩＶ  ＨＡ／ＮＡ糖タンパク質に特異的なものである。さらに、この増殖の改善およびＮＡ活性の増強は、Ｓ−ＯＩＶ  ＰＢ１遺伝子を含む再集合体（「７＋１」）Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルスでは検出されない。この文献には、Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルス表面のＨＡ−ＮＡ糖タンパク質の量を増加させる方法は記載されておらず、ウイルス表面のＨＡ−ＮＡ糖タンパク質の量が増加されている改変されたＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスも記載されていない。
【発明の開示】
【００１０】
本発明は、より多くの表面糖タンパク質を生産するウイルス株（ワクチン再集合体）およびＨＡ／ＮＡ表面糖タンパク質の生産を改善する方法に関する。本発明は特に、インフルエンザウイルスのワクチンシードを生産するために慣用されるＰＲ８ウイルスの改変からなる。この改変は、より多量の表面糖タンパク質（ＨＡおよびＮＡ）およびＮＡに好都合な異なるＨＡ／ＮＡ比を有するワクチン再集合体を得るためにＰＢ１タンパク質の特定のアミノ酸を改変することからなる。これらは抗インフルエンザワクチン用量の抗原を構成する。本発明は、Ａ型およびＢ型インフルエンザウイルスのワクチンシードを量的および質的に至適化することを可能とする。
【００１１】
本発明の利点の１つは、生産されたある量のＨＡに関して、ＮＡの過剰発現によりワクチン用量の免疫原性を高めることである。
【００１２】
もう１つの利点は、表面糖タンパク質の発現を増強することにより、卵または細胞において生産されるワクチンの用量数を増すことを可能とする系を取得することである。
【００１３】
発明の概要
本発明は、表面上のＨＡ−ＮＡ（血球凝集素およびノイラミニダーゼ）糖タンパク質の量が、直径１００ｎｍのビリオンに対して５５０糖タンパク質よりも多く、１８８（Ｋ→Ｅ）、２０５（Ｍ→Ｉ）、２１２（Ｌ→Ｖ）、２１６（Ｓ→Ｇ）、３９８（Ｅ→Ｄ）、４８６（Ｒ→Ｋ）、５６３（Ｉ→Ｒ）、５７６（Ｉ→Ｌ）、５８１（Ｅ→Ｄ）、５８４（Ｒ→Ｑ）、５８６（Ｋ→Ｒ）、６１７（Ｄ→Ｎ）、６２１（Ｑ→Ｒ）、６８２（Ｖ→Ｉ）および６９１（Ｒ→Ｋ）から選択される少なくとも２つの特異的アミノ酸改変を有するＰＢ１タンパク質をコードする配列番号１の変異型ＰＢ１遺伝子を含む、改変されたインフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスを目的とする。
【００１４】
好ましくは、本発明による改変されたウイルスは、少なくとも５６３（Ｉ→Ｒ）および６８２（Ｖ→Ｉ）の改変を有するＰＢ１タンパク質をコードする配列番号１の変異型ＰＢ１遺伝子を含む。
【００１５】
別の実施形態では、本発明によるＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスは、ＨＡ−ＮＡ表面糖タンパク質の量が直径１００ｎｍのビリオンに対して５５０糖タンパク質よりも多い別のＡ型インフルエンザウイルス株のＰＢ１遺伝子を含む。
【００１６】
好ましくは、本発明による改変されたインフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスは、配列番号２の配列を有するＨ３Ｎ２インフルエンザウイルスのＰＢ１遺伝子を含む。
【００１７】
有利には、本発明による改変されたインフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスは、別のインフルエンザウイルスのＨＡおよびＮＡ遺伝子を含む再集合体である。
【００１８】
別の有利な実施形態では、本発明による改変されたインフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスは、Ｈ３Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ１Ｎ２、Ｈ５Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ７、Ｈ９Ｎ２およびＨ３Ｎ１サブタイプを有するウイルスから選択されるインフルエンザウイルスのＨＡおよびＮＡ遺伝子を含む。
【００１９】
本発明のもう１つの目的は、ＨＡ−ＮＡワクチン糖タンパク質をコードするＨＡおよびＮＡ遺伝子を含む本発明による改変されたインフルエンザウイルスが卵または細胞において増幅される、インフルエンザウイルスのＨＡ−ＮＡワクチン糖タンパク質の生産方法である。
【００２０】
好ましくは、ＨＡ−ＮＡワクチン糖タンパク質は、Ｈ３Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ１Ｎ２、Ｈ５Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ７、Ｈ９Ｎ２およびＨ３Ｎ１サブタイプを有するウイルスの糖タンパク質から選択される。
【００２１】
本発明はまた、インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスの表面のＨＡ−ＮＡ糖タンパク質の量を増加させる方法であって、ＰＢ１遺伝子によりコードされているＰＢ１タンパク質に１８８（Ｋ→Ｅ）、２０５（Ｍ→Ｉ）、２１２（Ｌ→Ｖ）、２１６（Ｓ→Ｇ）、３９８（Ｅ→Ｄ）、４８６（Ｒ→Ｋ）、５６３（Ｉ→Ｒ）、５７６（Ｉ→Ｌ）、５８１（Ｅ→Ｄ）、５８４（Ｒ→Ｑ）、５８６（Ｋ→Ｒ）、６１７（Ｄ→Ｎ）、６２１（Ｑ→Ｒ）、６８２（Ｖ→Ｉ）および６９１（Ｒ→Ｋ）から選択される少なくとも２つの特異的アミノ酸改変を導入するための前記インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスの配列番号１のＰＢ１遺伝子の改変を含む方法に関する。
【００２２】
好ましくは、前記方法は、ＰＢ１遺伝子によりコードされているＰＢ１タンパク質に少なくとも２つの特異的アミノ酸改変５６３（Ｉ→Ｒ）および６８２（Ｖ→Ｉ）を導入するためのインフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスの配列番号１のＰＢ１遺伝子の改変を含む。
【００２３】
別の実施形態では、本発明による方法は、配列番号１のＰＢ１遺伝子を、ＨＡ−ＮＡ表面糖タンパク質の量が直径１００ｎｍのビリオンに対して５５０糖タンパク質よりも多い別のＡ型インフルエンザウイルス株のＰＢ１遺伝子で置換することを含む。
【００２４】
好ましくは、前記方法は、配列番号１のＰＢ１遺伝子を、配列番号２の配列を有するＨ３Ｎ２インフルエンザウイルスのＰＢ１遺伝子で置換することを含む。
【００２５】
有利には、Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルスは、別のインフルエンザウイルスのＨＡおよびＮＡ遺伝子を含む再集合体ウイルスである。
【００２６】
別の有利な実施形態では、Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルスは、Ｈ３Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ１Ｎ２、Ｈ５Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ７、Ｈ９Ｎ２およびＨ３Ｎ１サブタイプを有するウイルスから選択されるインフルエンザウイルスのＨＡおよびＮＡ遺伝子を含む再集合体ウイルスである。
【００２７】
本発明はまた、インフルエンザウイルスのＨＡ−ＮＡ糖タンパク質を含む一用量のワクチン（a dose of vaccine）の免疫原性を、生産される糖タンパク質のＮＡ／ＨＡ比を高めることによって増強する方法であって、前記糖タンパク質が本発明による改変されたインフルエンザウイルスの、卵または細胞での増幅によって生産される方法を目的とする。
【００２８】
配列リスト
配列番号１：インフルエンザＡ／ＰＲ８／８／３４  Ａ（Ｈ１Ｎ１）ウイルスのＰＢ１のタンパク質配列
配列番号２：インフルエンザモスクワ／１０／９９  Ａ（Ｈ３Ｎ２）ウイルスのＰＢ１のタンパク質配列
【００２９】
発明の具体的説明
本発明は、異なるインフルエンザウイルス株はそれらの表面に同じ量のＨＡおよびＮＡ糖タンパク質を持たないという予期しない知見に基づく。特に、受精鶏卵への注射によるウイルス増幅に関わる製造者により用いられているＡ／ＰＲ／８／３４親株の遺伝的背景を有するインフルエンザウイルスは、他のインフルエンザウイルス株よりも少ない量のＨＡおよびＮＡ糖タンパク質を発現することが分かった。この知見は、Ａ／ＰＲ／８／３４の遺伝的背景を有し、かつ、ＨＡおよびＮＡワクチン糖タンパク質を発現する再集合体ウイルスは抗インフルエンザワクチンの生産に従来から用いられていることから、大きな重要性を持つ。ワクチン用量は、ＨＡ抗原の１５μｇ／ウイルスサブタイプ／用量という一定量によって定義される。Ａ／ＰＲ／８／３４の遺伝的背景を有するインフルエンザウイルスにより生産される糖タンパク質の量を増加させることは、ワクチン用量の生産収量を改善し、これらのワクチン用量の製造コストを削減するという観点から主要な論点となる。
【００３０】
これらの結果を鑑みて、今般、予期しないことに、Ａ／ＰＲ／８／３４の遺伝的背景を有するウイルスにより生産されるＨＡ−ＮＡ糖タンパク質の量はこのウイルスのＰＢ１遺伝子の遺伝子改変によって増加させることができるということが見出された。よって、本発明は、Ａ／ＰＲ／８／３４の遺伝的背景を有し、かつ、原型株のＨＡ−ＮＡ糖タンパク質をより多量に生産する改変されたウイルス、ＨＡ−ＮＡワクチン糖タンパク質の生産収量を高める方法、およびＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスのより生産される糖タンパク質の量を増加させる方法に関する。本発明はまた、Ａ／ＰＲ／８／３４の遺伝的背景とともに、ＮＡに好都合な異なるＨＡ／ＮＡ比を有する改変されたウイルスに関する。
【００３１】
本発明は特に、改変されたＰＢ１遺伝子を含む改変されたＡ／ＰＲ／８／３４ウイルス、ならびに改変されたＰＢ１遺伝子と別のウイルス、特に、ＨＡ／ＮＡワクチン抗原を生産するための原型ウイルスのＨＡおよびＮＡ遺伝子とを含む改変された再集合体Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルスに関する。本発明はまた、本発明による改変されたウイルスまたは再集合体ウイルスの卵での増幅を含むＨＡ−ＮＡ糖タンパク質の生産方法に関する。最後に、本発明はまた、Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルスまたはＡ／ＰＲ／８／３４の遺伝的背景を有する再集合体ウイルスの表面のＨＡ−ＮＡ糖タンパク質の量を有意に増加させる方法も目的とする。これらの方法は、ＨＡ−ＮＡ糖タンパク質生産の収量を高めることを可能にする。
【００３２】
「インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルス」とは、Ａ／ＰＲ／８／３４株に関連するウイルスを意味する。Ａ／ＰＲ／８／３４株は、１９３４年にプエルトリコにおいて患者から採取されたインフルエンザウイルスを卵での生産に順応させることから得られたものである。Ａ／ＰＲ／８／３４株の種々のクローンが開発されており、当業者に周知である。Ａ／ＰＲ／８／３４株ならびにこの株に由来する種々のクローンはＡＴＣＣ寄託の対象となっている。それらは特にＡＴＣＣ寄託ＶＲ−９５およびＶＲ−１４６９である。このＡ／ＰＲ／８／３４株は、ワクチン生産のために卵で高増殖能を有する再集合体ウイルスを作製するための親株として使用されている。Ａ／ＰＲ／８／３４株の種々のクローンが製造者らにより使用されているが、これらのクローンは遺伝的に高い類似性を留め、ワクチン生産のための卵での高増殖能を特徴とする。Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルスの８つの遺伝子セグメントの配列がＧｅｎＢａｎｋから以下の番号（ＨＡ：ＦＪ８８８３４８．１、ＮＡ：ＣＹ０３８９０５．１、ＰＢ２：ＣＹ０４０１７７．１、ＰＡ：ＣＹ０３８９０８．１、ＮＳ：ＣＹ０４０１７４．１、ＰＢ１：ＣＹ０４０１７６．１、ＮＰ：ＣＹ０４０１７３．１およびＭ：ＣＹ０４０１７１．１）で入手可能である。
【００３３】
「改変されたインフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルス」とは、ＰＢ１遺伝子が改変されているＡ／ＰＲ／８／３４株関連のウイルスを意味する。
【００３４】
Ａ型インフルエンザウイルスは、８つの遺伝子、最も特にはＰＢ１、ＨＡおよびＮＡ遺伝子を含む。
【００３５】
「改変されたＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスの遺伝的背景を有する再集合体ウイルス」とは、改変されたＰＢ１遺伝子と、別のインフルエンザウイルス株のＨＡおよびＮＡ糖タンパク質をコードする遺伝子とを含む、改変されたＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスの６つの遺伝子を有する再集合体ウイルスを意味する。ＨＡおよびＮＡ糖タンパク質をコードする遺伝子は、一般に、抗原研究および遺伝的研究（ＷＨＯ関連の研究所による）をもとに大きなインフルエンザウイルス群を代表するものとして選択された野生型インフルエンザウイルス（または原型ウイルス）に由来する。これらの野生型インフルエンザウイルス（原型ウイルス）は臨床サンプルから直接増殖される。よって、毎年、ＷＨＯは特定の野生型インフルエンザウイルスから抗インフルエンザワクチンを作製することを推奨している。改変されたＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスの遺伝的背景を有する、対応する再集合体ウイルスは、鶏卵で極めてよく増殖し（Ａ／ＰＲ／８／３４株の特徴）、ワクチン生産のためのＨＡおよびＮＡ糖タンパク質を発現する。
【００３６】
「再集合体ウイルス」および「遺伝子再集合」とは、各親ウイルスの遺伝子を有するハイブリッドウイルスを得るための、２種または数種のインフルエンザウイルスの遺伝子が種々の組合せで見られる方法を意味する。この遺伝子再集合は自然界でも起こり得るし、あるいは実験室で得ることもできる。
【００３７】
本発明による改変されたインフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスは、改変されたＰＢ１（ポリメラーゼ塩基性タンパク質１）遺伝子を含む。Ａ型インフルエンザウイルスのＰＢ１遺伝子は当業者に周知である。Ａ／ＰＲ／８／３４  ＰＢ１遺伝子の配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋから番号ＣＹ０４０１７６．１、ＣＹ０３８９０９．１、ＣＹ０３８９０１．１、ＥＦ１９０９８０．１およびＥＦ１９０９７２．１として入手可能である。
【００３８】
インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスの種々のクローンのＰＢ１遺伝子は、ＰＢ１遺伝子の遺伝的浮動がたとえ小さくとも少数の配列分散を持ち得る。特定の実施形態では、インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスのＰＢ１遺伝子は、配列番号１のＰＢ１タンパク質をコードする。別の特定の実施形態では、インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスのＰＢ１遺伝子は、配列番号１のＰＢ１タンパク質、または配列番号１と少なくとも９８％、９９％もしくは９９．５％の同一性を有するこのタンパク質の変異体をコードする。
【００３９】
「改変されたＰＢ１遺伝子」とは、このセグメントによってコードされているタンパク質のアミノ酸配列に違いをもたらすその配列の改変を含むＰＢ１遺伝子を意味する。
【００４０】
ＰＢ１遺伝子は３つのタンパク質（ＰＢ１、ＰＢ１Ｆ２およびＰＢ１Ｎ４０）をコードし、ＰＢ１タンパク質は周知であり、ウイルスの複製／転写に中枢的役割を果たす（このタンパク質なしには複製は起こらない）。その他のタンパク質は補助的であるとされ、あまり理解されていない。ＰＢ１Ｆ２タンパク質はin vivoにおいて役割を果たすと思われるが、ＰＢ１Ｎ４０タンパク質の転写において推定される役割を記載している研究はただ１つに過ぎない。さらに、循環ウイルスのＰＢ１遺伝子セグメントはいずれもＰＢ１Ｆ２タンパク質をコードしていない。当業者は、このことからＰＢ１遺伝子の改変が、ＰＢ１、ＰＢ１Ｆ２および／またはＰＢ１Ｎ４０タンパク質の改変をもたらし得ると理解している。
【００４１】
改変されたＰＢ１遺伝子を含むＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスは、Ａ／ＰＲ／８／３４ＰＢ１遺伝子の突然変異誘発、特に、ＰＢ１遺伝子の配列に突然変異を導入するか、またはＡ／ＰＲ／８／３４のＰＢ１遺伝子を別のインフルエンザウイルス株のＰＢ１遺伝子で置換することによって得られる。
【００４２】
「ＨＡ−ＮＡ糖タンパク質」とは、血球凝集素（ＨＡ）糖タンパク質およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）糖タンパク質を意味する。これらは、中和抗体の生産を誘導し得るインフルエンザＡウイルス表面の特異的抗原タンパク質である。Ａ型インフルエンザウイルスは、血球凝集素およびノイラミニダーゼの組合せ（１６のサブタイプのＨＡと９つのサブタイプのＮＡ）に応じて再分類される。
【００４３】
それらのＰＢ１遺伝子の改変により、改変されたインフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスおよび本発明の改変されたＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスの遺伝的背景を含む再集合体インフルエンザワクチンウイルスは、改変されたＰＢ１遺伝子を含まないＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスの表面に通常存在するＨＡ−ＮＡ糖タンパク質の量よりも増大された量のＨＡ−ＮＡ糖タンパク質をそれらの表面に有する。
【００４４】
好ましくは、改変されたＰＢ１遺伝子を含むＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスの表面のＨＡ−ＮＡ糖タンパク質の量は、直径１００ｎｍのビリオンに対して５５０、６００、より好適には６５０より多い糖タンパク質を有する。表面糖タンパク質（ＨＡ＋ＮＡ）の量は、糖タンパク質スパイク間の距離を測定した後に、直径１００ｎｍのウイルスの表面積と相関させることによって決定される。４つの糖タンパク質スパイク間の距離は、低温電子顕微鏡によって測定される。
【００４５】
好ましい実施形態では、Ａ／ＰＲ／８／３４株のＰＢ１遺伝子は、ＰＢ１タンパク質に特定のアミノ酸改変をもたらす改変を有する。好ましくは、ＰＢ１遺伝子の改変は、Ａ／ＰＲ／３／８４株ＰＢ１タンパク質の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５アミノ酸の特定の改変を伴う。より好適には、ＰＢ１遺伝子の改変は、Ａ／ＰＲ／３／８４株ＰＢ１タンパク質の少なくとも２個のアミノ酸の特異的改変を伴う。
【００４６】
好ましくは、改変されたＰＢ１遺伝子は、１８８（Ｋ→Ｅ）、２０５（Ｍ→Ｉ）、２１２（Ｌ→Ｖ）、２１６（Ｓ→Ｇ）、３９８（Ｅ→Ｄ）、４８６（Ｒ→Ｋ）、５６３（Ｉ→Ｒ）、５７６（Ｉ→Ｌ）、５８１（Ｅ→Ｄ）、５８４（Ｒ→Ｑ）、５８６（Ｋ→Ｒ）、６１７（Ｄ→Ｎ）、６２１（Ｑ→Ｒ）、６８２（Ｖ→Ｉ）および６９１（Ｒ→Ｋ）から選択される少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５の改変を含むＰＢ１タンパク質をコードする。
【００４７】
本発明の有利な一実施形態では、改変されたＰＢ１遺伝子は、少なくとも１８８（Ｋ→Ｅ）、２０５（Ｍ→Ｉ）、２１２（Ｌ→Ｖ）、２１６（Ｓ→Ｇ）、３９８（Ｅ→Ｄ）、４８６（Ｒ→Ｋ）、５６３（Ｉ→Ｒ）、５７６（Ｉ→Ｌ）、５８１（Ｅ→Ｄ）、５８４（Ｒ→Ｑ）、５８６（Ｋ→Ｒ）、６１７（Ｄ→Ｎ）、６２１（Ｑ→Ｒ）、６８２（Ｖ→Ｉ）および６９１（Ｒ→Ｋ）の改変を有するＰＢ１タンパク質をコードする。
【００４８】
より好適には、改変されたＰＢ１遺伝子は、１８８（Ｋ→Ｅ）、２０５（Ｍ→Ｉ）、２１２（Ｌ→Ｖ）、２１６（Ｓ→Ｇ）、３９８（Ｅ→Ｄ）、４８６（Ｒ→Ｋ）、５６３（Ｉ→Ｒ）、５７６（Ｉ→Ｌ）、５８１（Ｅ→Ｄ）、５８４（Ｒ→Ｑ）、５８６（Ｋ→Ｒ）、６１７（Ｄ→Ｎ）、６２１（Ｑ→Ｒ）、６８２（Ｖ→Ｉ）および６９１（Ｒ→Ｋ）から選択される少なくとも２つの改変を有するＰＢ１タンパク質をコードする。
【００４９】
有利には、改変されたＰＢ１遺伝子は、少なくとも５６３（Ｉ→Ｒ）および６８２（Ｖ→Ｉ）の改変を有するタンパク質をコードする。
【００５０】
他の実施形態では、Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルスのＰＢ１遺伝子は、ＨＡ−ＮＡ表面糖タンパク質の量が直径１００ｎｍのビリオンに対して５５０、６００または６５０糖タンパク質よりも多い別のインフルエンザウイルス株のＰＢ１遺伝子で置換されている。
【００５１】
有利な実施形態では、Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルスのＰＢ１遺伝子は、配列番号２のＰＢ１タンパク質をコードする遺伝子で置換されている。
【００５２】
本発明はまた、本発明による改変されたインフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスの遺伝的背景を有し、かつ、別のインフルエンザウイルスのＨＡおよびＮＡ遺伝子を含む再集合体インフルエンザウイルスにも関する。よって、これらの再集合体ウイルスは一般に改変されたＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスの６つの遺伝子（改変されたＰＢ１遺伝子を含む）と、別のインフルエンザウイルス株の２つの遺伝子（これらの遺伝子はＨＡおよびＮＡ糖タンパク質をコードする）を担持する。本発明の再集合体ウイルスは、それらの表面でより多くのＨＡおよびＮＡ糖タンパク質を生産するとともに、Ａ／ＰＲ／８／３４株ウイルスと同様に卵で極めてよく増殖する。よって、同じ再集合体ウイルス生産量では、より多用量のワクチンを生産することができる。
【００５３】
好ましくは、ＨＡおよびＮＡ糖タンパク質をコードする遺伝子はＡ型ウイルス、有利には、野生型インフルエンザウイルス（原型ウイルス）に由来する。有利には、ＨＡおよびＮＡ糖タンパク質をコードする遺伝子は、ウイルスサブタイプに関わらずに循環ヒトまたは動物インフルエンザウイルスに由来する。好ましい実施形態では、ＨＡおよびＮＡ糖タンパク質をコードする遺伝子は、Ｈ３Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ１Ｎ２、Ｈ５Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ７、Ｈ９Ｎ２およびＨ３Ｎ１サブタイプを有するウイルスから選択されるインフルエンザウイルスに由来する。
【００５４】
特定の実施形態では、本発明は、Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルスの５つの遺伝子と１以上の他のインフルエンザウイルス株のＰＢ１、ＨＡおよびＮＡ遺伝子とを含む再集合体インフルエンザウイルスに関する。好ましくは、Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルスのＰＢ１遺伝子は、ＨＡ−ＮＡ表面糖タンパク質の量が直径１００ｎｍのビリオンに対して５５０、６００または６５０糖タンパク質よりも多い別のインフルエンザウイルス株のＰＢ１遺伝子で置換されている。有利には、Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルスのＰＢ１遺伝子は、配列番号２のＰＢ１タンパク質をコードする遺伝子で置換されている。
【００５５】
本発明はまた、改変されたＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスおよび改変されたＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスの遺伝的背景を有する再集合体ウイルスを実装する、ＨＡ−ＮＡ糖タンパク質の生産のための方法に関する。
【００５６】
本発明による改変されたＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスおよび改変されたＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスを用いて得られた再集合体ウイルスは、受精鶏卵または細胞における増幅によるワクチンシードの生産に特に適している。
【００５７】
Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルスの遺伝的背景（改変されたＰＢ１遺伝子を含む６つのＡ／ＰＲ／８／３４遺伝子）と野生型ウイルス（または原型ウイルス）のＨＡおよびＮＡ遺伝子とを有する再集合体ウイルスは、ＨＡ−ＮＡワクチン糖タンパク質の生産に特に適している。この再集合体ウイルスは、標準的技術に従って受精鶏卵または細胞で増幅される。
【００５８】
有利な実施形態では、本発明は、本発明による改変されたインフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスの遺伝的背景を有し、かつ、前記ＨＡ−ＮＡワクチン糖タンパク質をコードするＨＡおよびＮＡ遺伝子を含む再集合体ウイルスが卵または細胞で増幅される、インフルエンザウイルスのＨＡ−ＮＡワクチン糖タンパク質の生産方法に関する。
【００５９】
好ましくは、ＨＡ−ＮＡワクチン糖タンパク質は、Ａ型インフルエンザウイルスのＨＡ−ＮＡ糖タンパク質から、より詳しくは、ウイルスサブタイプに関わらずに循環ヒトまたは動物インフルエンザのＨＡ−ＮＡ糖タンパク質から選択される。好ましい実施形態では、ＨＡおよびＮＡワクチン糖タンパク質は、Ｈ３Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ１Ｎ２、Ｈ５Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ７、Ｈ９Ｎ２およびＨ３Ｎ１サブタイプから選択される。
【００６０】
本発明はまた、これらの方法によって得られるＨＡ−ＮＡ糖タンパク質にも関する。
【００６１】
本発明はまた、インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスまたはこのウイルスのＰＢ１遺伝子の改変を含む再集合体Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルスの表面のＨＡ−ＮＡ糖タンパク質の量を増加させる方法に関する。
【００６２】
ＰＢ１遺伝子のこれらの改変は上記されている。
【００６３】
ＨＡ−ＮＡ糖タンパク質量の増加は、改変されたＰＢ１遺伝子を含まないＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスまたは再集合体Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルスの表面に存在する糖タンパク質の量に対して測定される。
【００６４】
有利な実施形態では、この増加により、ＨＡ−ＮＡ表面糖タンパク質の量が直径１００ｎｍのビリオンに対して５５０、６００または６５０糖タンパク質よりも多いＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスまたは再集合体Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルスを得ることが可能となる。
【００６５】
好ましくは、この改変は、前記ＰＢ１遺伝子によりコードされるＰＢ１タンパク質に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５の特異的アミノ酸改変を導入するための前記インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスまたは前記再集合体インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスのＰＢ１遺伝子の改変を含む。
【００６６】
より好適には、この改変は、前記ＰＢ１遺伝子によりコードされるＰＢ１タンパク質に１８８（Ｋ→Ｅ）、２０５（Ｍ→Ｉ）、２１２（Ｌ→Ｖ）、２１６（Ｓ→Ｇ）、３９８（Ｅ→Ｄ）、４８６（Ｒ→Ｋ）、５６３（Ｉ→Ｒ）、５７６（Ｉ→Ｌ）、５８１（Ｅ→Ｄ）、５８４（Ｒ→Ｑ）、５８６（Ｋ→Ｒ）、６１７（Ｄ→Ｎ）、６２１（Ｑ→Ｒ）、６８２（Ｖ→Ｉ）および６９１（Ｒ→Ｋ）から選択される少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５の特異的アミノ酸改変を導入するための前記インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスまたは前記再集合体インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスのＰＢ１遺伝子の改変を含む。
【００６７】
有利には、この改変は、前記ＰＢ１遺伝子によりコードされるＰＢ１タンパク質に少なくとも特定のアミノ酸改変１８８（Ｋ→Ｅ）、２０５（Ｍ→Ｉ）、２１２（Ｌ→Ｖ）、２１６（Ｓ→Ｇ）、３９８（Ｅ→Ｄ）、４８６（Ｒ→Ｋ）、５６３（Ｉ→Ｒ）、５７６（Ｉ→Ｌ）、５８１（Ｅ→Ｄ）、５８４（Ｒ→Ｑ）、５８６（Ｋ→Ｒ）、６１７（Ｄ→Ｎ）、６２１（Ｑ→Ｒ）、６８２（Ｖ→Ｉ）および６９１（Ｒ→Ｋ）を導入するための前記インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスまたは前記再集合体インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスのＰＢ１遺伝子の改変を含む。
【００６８】
有利には、この改変は、前記ＰＢ１遺伝子によりコードされるＰＢ１タンパク質に１８８（Ｋ→Ｅ）、２０５（Ｍ→Ｉ）、２１２（Ｌ→Ｖ）、２１６（Ｓ→Ｇ）、３９８（Ｅ→Ｄ）、４８６（Ｒ→Ｋ）、５６３（Ｉ→Ｒ）、５７６（Ｉ→Ｌ）、５８１（Ｅ→Ｄ）、５８４（Ｒ→Ｑ）、５８６（Ｋ→Ｒ）、６１７（Ｄ→Ｎ）、６２１（Ｑ→Ｒ）、６８２（Ｖ→Ｉ）および６９１（Ｒ→Ｋ）から選択される少なくとも２つの特異的アミノ酸改変に導入するための前記インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスまたは前記再集合体インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスのＰＢ１遺伝子の改変を含む。
【００６９】
より有利には、この改変は、前記ＰＢ１遺伝子によりコードされるＰＢ１タンパク質に少なくとも２つの特異的アミノ酸改変５６３（Ｉ→Ｒ）および６８２（Ｖ→Ｉ）を導入するための前記インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスまたは前記再集合体インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスのＰＢ１遺伝子の改変を含む。
【００７０】
他の実施形態では、前記インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスまたは前記再集合体インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスのＰＢ１遺伝子の改変は、インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスのＰＢ１遺伝子を、ＨＡ−ＮＡ表面糖タンパク質の量が直径１００ｎｍのビリオンに対して５５０、６００または６５０糖タンパク質よりも多い別のインフルエンザウイルスのＰＢ１遺伝子で置換することを含む。
【００７１】
好ましくは、前記インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスまたは前記再集合体インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスのＰＢ１遺伝子の改変は、インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスのＰＢ１遺伝子を配列番号２のＰＢ１遺伝子で置換することを含む。
【００７２】
本発明はまた、Ａ／ＰＲ／８／３４の遺伝的背景を有する再集合体ワクチンウイルスの卵または細胞における増幅による、インフルエンザウイルスのＨＡ−ＮＡワクチン糖タンパク質の生産収量を高める方法であって、前記再集合体ウイルスの表面のＨＡ−ＮＡ糖タンパク質の量がＡ／ＰＲ／８／３４のＰＢ１遺伝子の改変により増加される方法に関する。
【００７３】
本発明はまた、本発明による改変されたＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスの６つの遺伝子が原型インフルエンザウイルス（野生型ウイルス）のＨＡおよびＮＡワクチン糖タンパク質をコードする２つの遺伝子と組み合わされた、ＨＡ−ＮＡワクチン糖タンパク質の生産のための再集合体ワクチンウイルスを作製する方法に関する。
【００７４】
本発明の利点の１つは、生産される一定量のＨＡに対してＮＡを過剰発現させることによりワクチン用量の免疫原性が増加することである。
【００７５】
よって、本発明はまた、インフルエンザウイルスのＨＡ−ＮＡ糖タンパク質を含む一用量のワクチンの免疫原性を、生産される糖タンパク質のＮＡ／ＨＡ比を高めることによって増強する方法であって、糖タンパク質が本発明による改変されたＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスの遺伝的背景を有する再集合体ウイルスの卵または細胞における増幅により生産される方法に関する。
【実施例】
【００７６】
実施例１：逆遺伝学による組換えウイルスの生産
本発明者らは、本発明者らの研究室で開発されたプロトコールに従い、逆遺伝学によって９種類の組換えウイルスを作製した。これらの組換えウイルスのゲノム組成は次の通りである（表１）。
−ウイルスＨ３Ｎ２  Ａ／モスクワ／１０／９９（ＭＯ）
−ウイルスＨ１Ｎ１  Ａ／ＰＲ／８／３４（ＰＲ８）
−ウイルスＡ：ＰＲ８ウイルスの遺伝的背景にＭＯのＨＡおよびＮＡ遺伝子のセグメントを含む「クラシック」ＰＲ８ワクチン再集合体
−ウイルスＢ：ＰＲ８ウイルスの遺伝的背景にＭＯのＨＡ、ＮＡおよびＰＢ１遺伝子のセグメントを含むＰＲ８ワクチン再集合体
−ウイルスＣ：ＭＯのＰＢ１遺伝子のセグメントを含むＰＲ８
−ウイルスＤ：鳥インフルエンザＨ５Ｎ２  Ａ／フィンチ／イングランド／２０５１／９１（ウイルスＦＩ）のＨＡおよびＮＡ遺伝子のセグメントを含む「クラシック」ＰＲ８ワクチン再集合体
−ウイルスＥ：ＰＲ８ウイルスの遺伝的背景にＦＩのＨＡおよびＮＡ遺伝子のセグメントとＭＯのＰＢ１遺伝子のセグメントとを含むＰＲ８ワクチン再集合体
−ウイルスＦ：ヒトＨ３Ｎ２ウイルスＡ／カルフォルニア／１０／０４（ウイルスＣＡＬ）のＨＡおよびＮＡ遺伝子のセグメントを含む「クラシック」ＰＲ８ワクチン再集合体
−ウイルスＧ：ＰＲ８ウイルスの遺伝的背景にＣＡＬのＨＡおよびＮＡ遺伝子のセグメントとＭＯのＰＢ１遺伝子のセグメントを含むＰＲ８ワクチン再集合体
【００７７】
in vitroにおける組換えウイルスの生産は、それぞれ遺伝子のセグメントを含む８つのプラスミドを有する２９３Ｔ細胞のトランスフェクションに基づく。ウイルスの生産は、本研究室にてその独自の分子ツールおよび細胞ツールを用いて行った。９種類の組換えウイルスで得られた生産収量は細胞においては同等であり、組換えウイルスの通常の生産に適合する。
【００７８】
【表１】
0005889890.tif 000002
【００７９】
実施例２：低温電子顕微鏡による組換えウイルスの表面のＨＡ−ＮＡ糖タンパク質密度の比較分析（表２）
逆遺伝学により作製された種々のウイルスを増幅し、スクロースクッション上で精製する。格子上に付着させた精製ウイルスを超低温で冷凍し、低温電子顕微鏡で観察する。
【００８０】
表面糖タンパク質（ＧＰ）の密度を、４つの糖タンパク質スパイク間の距離を測定することによって決定し（ＩｍａｇｅＪ画像解析ソフトウエア）、下式：４πＲ２（Ｒ＝５０ｎｍ）に従って、直径１００ｎｍのウイルスの表面に相関させることによって決定する。
【００８１】
結果：
ウイルスＰＲ８：直径１００ｎｍのウイルスの表面に５００ＧＰ。
ウイルスＭＯ：直径１００ｎｍのウイルスの表面に６８９ＧＰ。
ウイルスＡ：直径１００ｎｍのウイルスの表面に５００ＧＰ。
ウイルスＢ：直径１００ｎｍのウイルスの表面に７００ＧＰ。
ウイルスＣ：直径１００ｎｍのウイルスの表面に５９８ＧＰ。
ウイルスＤ：直径１００ｎｍのウイルスの表面に４９８ＧＰ。
ウイルスＥ：直径１００ｎｍのウイルスの表面に６４０ＧＰ。
ウイルスＦ：直径１００ｎｍのウイルスの表面に５０２ＧＰ。
ウイルスＧ：直径１００ｎｍのウイルスの表面に７０３ＧＰ。
【００８２】
【表２】
0005889890.tif 000003
【００８３】
−組換えＰＲ８  Ｈ１Ｎ１ウイルスと組換えＭＯ  Ｈ３Ｎ２ウイルスの間には糖タンパク質量に関して有意差がある（Ｈ３Ｎ２ウイルスでは＋３５％）。
−クラシックワクチン組成物に相当する組換えウイルスＡは、ＰＲ８ウイルスと同等のＧＰ量を有する。
−組換えウイルスＢ（ＭＯ  ＰＢ１遺伝子を含む）はその表面に、ＭＯウイルスで見られるものと同一のＧＰ量を有する。
−ＰＢ１遺伝子は、直径１００ｎｍのビリオンに対して７００ＧＰに相当するＧＰ量を含む組換えワクチンウイルスを得ることを可能とする。
−組換えウイルスＣはその表面に、ウイルスＰＲ８で見られるものよりも多い量のＧＰを有する（２０％）。
−ＭＯ  ＰＢ１遺伝子のセグメントによるＧＰ量の増加が、表面にＣＡＬ株のＨ３Ｎ２  ＧＰを有する組換えウイルスＦおよびＧで見られた。
−ＭＯ  ＰＢ１遺伝子のセグメントのより媒介されるＧＰ量の増加が、ＦＩ  Ｈ５Ｎ２ウイルスの鳥類ＧＰを有する再集合体ワクチンウイルス（ウイルスＤおよびＥ）で見られた。
【００８４】
実施例３：組換えウイルスのノイラミニダーゼ（ＮＡ）活性の決定および比較（表２）
ＮＡ活性は、本研究室によって開発された実験プロトコール(Ferraris et al. Vaccine 2006)を用いて決定した。ＮＡ活性は所定量のウイルスに対して決定されるので（ＲＦＵは１０Ｅ５ウイルスを表す）、見られた変動はウイルス表面のＮＡタンパク質の量を反映する（同一のＮＡに関する）。
【００８５】
ＮＡ  ＲＦＵ活性の変動（ヒトＮ２ノイラミニダーゼを含むウイルスに関する）を下記に示す。
ＭＯ：１０Ｅ５のウイルスで２９３４０ＲＦＵ
ウイルスＡ：１０Ｅ５のウイルスで１４６００ＲＦＵ
ウイルスＢ：１０Ｅ５のウイルスで５８０００ＲＦＵ
ウイルスＦ：１０Ｅ５のウイルスで１３８９７ＲＦＵ
ウイルスＧ：１０Ｅ５のウイルスで６３４７０ＲＦＵ
【００８６】
クラシック再集合体ワクチンウイルスである組換えウイルスＡおよびＦに対して組換えウイルスＢおよびＧでＮＡ量の増加が見られる。
【００８７】
ＮＡ  ＲＦＵ活性の変動（鳥類Ｎ２ノイラミニダーゼを含むウイルスに関する）を下記に示す。
ウイルスＤ：１０Ｅ５のウイルスで８４５０ＲＦＵ
ウイルスＥ：１０Ｅ５のウイルスで３６５４２ＲＦＵ
【００８８】
クラシック再集合体ワクチンウイルスである組換えウイルスＤに対して組換えウイルスＥ（ＭＯ  ＰＢ１遺伝子のセグメント）でＮＡ量の増加が見られる。
【００８９】
ＮＡ  ＲＦＵ活性の変動（Ｎ１ノイラミニダーゼを含むウイルスに関する）を下記に示す。
ウイルスＰＲ８：１０Ｅ５のウイルスで１４２３４ＲＦＵ
ウイルスＣ：１０Ｅ５のウイルスで６３５４０ＲＦＵ
【００９０】
ウイルスＰＲ８に対して組換えウイルスＣ（ＭＯ  ＰＢ１遺伝子のセグメント）でＮＡ量の増加が見られる。
【００９１】
結果として、ＭＯウイルスのＰＢ１遺伝子を含むクラシック再集合体ワクチンウイルスは、クラシックワクチン再集合体で測定されたものよりも大きいＮＡ酵素活性を有する。
【００９２】
ＭＯウイルスＰＢ１遺伝子をクラシック再集合体ワクチンウイルスの遺伝的背景に導入すると、
・ウイルス表面のＧＰ数の増加（＋２０％〜＋３５％）、
・ウイルス表面のＮＡ数の増加（ＮＡ活性の増加）
が可能となる。
【００９３】
実施例４：ＰＲ８  Ｈ１Ｎ１ウイルスとＭＯ  Ｈ３Ｎ２ウイルスの間のアミノ酸配列比較による、上記特性を担う特定のＨ３Ｎ２  ＰＢ１配列の決定
ＰＢ１タンパク質のタンパク質配列のアライメントは、ＰＲ８とＭＯの間の３０アミノ酸の違いを示す。
【００９４】
ＭＯ  ＰＢ１タンパク質のタンパク質配列を得るためのＰＲ８  ＰＢ１タンパク質のタンパク質配列の改変を可能とする指定突然変異誘発の戦略は、本特許出願の対象である突然変異のリストを実証することを可能とした。
【００９５】
突然変異のリスト：１８８（Ｋ→Ｅ）、２０５（Ｍ→Ｉ）、２１２（Ｌ→Ｖ）、２１６（Ｓ→Ｇ）、３９８（Ｅ→Ｄ）、４８６（Ｒ→Ｋ）、５６３（Ｉ→Ｒ）、５７６（Ｉ→Ｌ）、５８１（Ｅ→Ｄ）、５８４（Ｒ→Ｑ）、５８６（Ｋ→Ｒ）、６１７（Ｄ→Ｎ）、６２１（Ｑ→Ｒ）、６８２（Ｖ→Ｉ）および６９１（Ｒ→Ｋ）。
【００９６】
さらに精密化した実験戦略によれば、記載の生物学的プロセスに関与する２つの突然変異を同定することが可能であった。突然変異Ｉ５６３ＲおよびＶ６８２ＩをＰＲ８（ウイルスＡ）ＰＢ１タンパク質に導入すると、ウイルスＢで見られるものと同様の表現型（ＧＰおよびＮＡ活性の量）を得ることが可能となる。
【００９７】
参照文献
0005889890.tif 000004
【配列表】
0005889890000001.app