(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程
ａ）チオ硫酸サルファートランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を過剰発現する、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）の微生物又はコリネバクテリウム科（Corynebacteriaceae）の微生物を準備する工程、
ｂ）ａ）からの微生物を、チオ硫酸塩又はチオ硫酸塩と硫酸塩とからの混合物の群からの無機硫黄源を含む培地中で発酵させて、発酵ブロスを得る工程、及び
ｃ）ｂ）からの発酵ブロス中で硫黄含有アミノ酸を濃縮する工程、
を含む、Ｌ−メチオニン、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−ホモシステイン及びＬ−ホモシスチンの群から選択されている硫黄含有アミノ酸の発酵による製造方法。
【請求項２】
微生物が、チオ硫酸サルファートランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする１又は複数の遺伝子を過剰発現し、前記チオ硫酸サルファートランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは次のａ）〜ｄ）
ａ）ポリペプチドRdl2p, GlpE, PspE, YgaP, ThiI, YbbB, SseA, YnjE, YceA, YibN, NCgl0671, NCgl1369, NCgl2616, NCgl0053, NCgl0054, NCgl2678, NCgl2890からなるか又はこれを含むポリペプチド、哺乳類からのチオ硫酸サルファートランスフェラーゼ、
ｂ）配列番号２に示したアミノ酸配列からなるか又はこれを含むポリペプチド、
ｃ）ａ）又はｂ）のアミノ酸配列と９０％以上同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、ここで前記ポリペプチドはチオ硫酸サルファートランスフェラーゼ活性を示す、
ｄ）配列番号２に示したアミノ酸配列に対して１〜５個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加を含むアミノ酸配列を有するポリペプチド、ここで前記ポリペプチドはチオ硫酸サルファートランスフェラーゼ活性を示す、
から選択されている、請求項１記載の方法。
【請求項３】
チオ硫酸サルファートランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現を、次の群
ａ）本方法のために使用される微生物中で出発株に対して増強した発現を生じるプロモーターの制御下での遺伝子の発現、
ｂ）チオ硫酸サルファートランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子のコピー数を出発株に対して増加、
ｃ）本方法のために使用される微生物中で出発株に対して増強した翻訳を生じるリボソーム結合部位の使用下での遺伝子の発現の実施、
ｄ）本方法のために使用される微生物に関するコドン使用頻度（codon usage）の最適化による遺伝子発現の増強、
ｅ）遺伝子から転写されるｍＲＮＡ中のｍＲＮＡ二次構造の減少による遺伝子発現の増強、
ｆ）遺伝子から転写されるｍＲＮＡ中のＲＮＡ−ポリメラーゼ−ターミネーターの除去による遺伝子発現の増強、
ｇ）遺伝子から転写されるｍＲＮＡ中のｍＲＮＡ安定化配列の使用下での遺伝子発現の実施、
から選択した１又は複数の手段によって高める、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
チオ硫酸塩が、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、及びそれらの混合物の群から選択した塩である、請求項１から３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
硫酸塩が、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、及びそれらの混合物の群から選択した塩である、請求項１から３のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
発酵の間に、チオ硫酸塩の割合を、培地中及び発酵ブロス中の無機硫黄の全含有量に対して少なくとも５ｍｏｌ％に維持する、請求項１から５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
硫黄含有アミノ酸が、Ｌ−メチオニンである、請求項１から６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
微生物が、エシェリキア（Escherichia）属である、請求項１から７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
微生物の種が、大腸菌（Escherichia coli）である、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
微生物が、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属である、請求項１から７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
微生物の種が、コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
微生物が、
−出発株に比較して、アスパラギン酸キナーゼの高められた活性及び／又は発現、並びに調節タンパク質McbRの減弱又は欠失を有するコリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）、
−出発株に比較して、アスパラギン酸キナーゼの高められた活性及び／又は発現、並びに調節タンパク質MetJの減弱又は欠失を有する大腸菌（Escherichia coli）
から選択されていることを特徴とする請求項１から１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
−出発株に比較して、アスパラギン酸キナーゼの高められた活性及び／又は発現、並びに調節タンパク質McbRの減弱又は欠失を有するコリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）、
−出発株に比較して、アスパラギン酸キナーゼの高められた活性及び／又は発現、並びに調節タンパク質MetJの減弱又は欠失を有する大腸菌（Escherichia coli）
から選択され、Ｌ−メチオニンを排出又は生産する微生物において、
微生物がチオ硫酸サルファートランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を過剰発現する、微生物。
【請求項１４】
微生物が、チオ硫酸サルファートランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を過剰発現し、チオ硫酸サルファートランスフェラーゼ活性を有する前記ポリペプチドが請求項２に定義されている、請求項１３記載の微生物。
【請求項１５】
出発株が、大腸菌（Escherichia coli）MG1655、大腸菌（Escherichia coli）W3110、大腸菌（Escherichia coli）DH5α、大腸菌（Escherichia coli）DH10B、コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）ATCC13032、コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）R、コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）DSM20411（旧名称  ブレビバクテリウム・フラバム）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）DSM20412（旧名称  ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum））、コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）DSM1412（旧名称  ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum））、コリネバクテリウム・エフェシエンス（Corynebacterium efficiens）YS-314T(=DSM44549)、及びコリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）ATCC21608からなる群からの微生物から誘導されている、請求項１３または１４のいずれか１項記載の微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ−メチオニン、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−ホモシステイン及びＬ−ホモシスチンの群から選択されている硫黄含有アミノ酸の発酵による製造方法に関する。
【０００２】
硫黄含有アミノ酸は、大きな経済的重要性を有する。Ｌ−システインは、食品添加剤として、薬理学的作用物質（例えば、Ｎ−アセチルシステイン）のための出発材料として、そして、化粧品のために使用される。アミノ酸Ｌ−メチオニンは、動物飼料において重要な役割を果たす。Ｌ−メチオニンは、脊椎動物の代謝において、生合成によって製造できない必須アミノ酸である。そのため、動物飼育では、メチオニンが栄養と共に十分な量で摂取されることが確実にされなければならない。しかし、Ｌ−メチオニンは、典型的な飼料植物（例えば、ダイズ又は穀類）中で、特にブタ及び家禽用の典型的な飼料植物中で、しばしば、最適な動物栄養を保証するには余りに少ない量で存在するため、メチオニンを添加剤として動物飼料に混和することが好ましい。Ｄ−メチオニンは、脊椎動物によって、生物学的活性のあるＬ−メチオニンに移行されることができる。したがって、動物飼料には大抵は、Ｄ−メチオニン及びＬ−メチオニンからのラセミ体が添加される。Ｌ−ホモシステインは、動物によってトランスメチル化を介してＬ−メチオニンへ変換されることができ、したがってＬ−メチオニンを置き換えることができる。
【０００３】
先行技術では、メチオニンのようなアミノ酸は、化学合成によって製造される。この場合に、まずアクロレイン及びメチルメルカプタンが３−メチルチオプロピオンアルデヒドへと変換され、これは再度シアニド、アンモニア及び一酸化炭素によってヒダントインを生じる。ヒダントインは最終的に、ラセミ体（双方の立体異性体Ｄ−メチオニン又はＬ−メチオニンの等モル混合物）へと加水分解されることができる。この分子の生物学的活性形態は専らＬ体が示すため、飼料に含まれるＤ体は、代謝において、脱アミン化及びトランスアミン化によって初めて活性のあるＬ体へと移行されなければならない。
【０００４】
メチオニンとは対照的に、他の大抵の天然のタンパク質構成（proteinogen）アミノ酸は、主として、微生物による発酵によって製造される。この場合に、微生物が、天然アミノ酸合成のための相応する生合成経路を使用することが利用される。さらに、多くの発酵プロセスは、コスト的に好ましい出発材料、例えばグルコース及び無機塩を用いて極めて好ましい製造コストを達成し、そしてさらに、それぞれのアミノ酸の生物学的活性のあるＬ体を提供する。
【０００５】
しかし、アミノ酸の生合成経路は、野生型株中で厳しい代謝制御が課せられ、前記制御によって、アミノ酸は細胞の自家需要時にのみ製造されることが保証される。したがって、効率的な製造プロセスのための重要な前提条件は、野生型生物とは対照的に、劇的に増加した生産能力を所望のアミノ酸製造のために示す、適した微生物が提供可能であることである。
【０００６】
そのようなアミノ酸過剰生産微生物は、典型的な突然変異法／選択法によって及び／又は現代的な、狙いを定めた組み換え技術によって（"metabolic engineering"）作出されることができる。後者では、最初に、その変化、活性化又は不活性化によってアミノ酸過剰生産を引き起こす遺伝子又はアレルが同定される。次に、この遺伝子／アレルは、分子生物学的技術によって、微生物株へと導入されるか又は不活性化され、その結果、最適な過剰生産が達成される。しかし大抵は、複数の種々の処置の組み合わせによって初めて、本当に効率的な生産が生じる。
【０００７】
大腸菌（E. coli）及びＣ．グルタミクム（C. glutamicum）では、Ｌ−システインはＬ−セリンから生化学的に誘導される。Ｌ−セリンは、Ｏ−アセチルセリンとしてのセリン−アセチルトランスフェラーゼCysEによって活性化される。引き続き、Ｏ−アセチルセリン（チオール）−リアーゼは、スルフィドの形で還元した硫黄を移し、それによって、Ｌ−システインが発生する。Ｃ．グルタミクムとは対照的に、大腸菌は、２つの異なるＯ−アセチルセリン（チオール）−リアーゼを有し、ここで、ｏ−アセチルセリン（チオール）−リアーゼＢ（「CysM」）は、チオスルファートもｏ−アセチルセリンに移すことができる。それによって、Ｓ−スルホシステインが発生し、これは引き続き、今日まで特定されていないやり方でＬ−システイン及びスルフィド又はスルファートへと分解される（Kredich N.M. (1996) in Neidhardt FC et al . (Hrsg.) "Escherichia coli and Salmonella", 第２版、514-527頁）。
【０００８】
Ｌ−メチオニンは、リシン及びトレオニンと一緒にアスパラギン酸から誘導される。硫黄は、Ｌ−システインの形で（中間生成物としてのシスタチオニンを介して）トランス硫化によってＬ−メチオニンへ導入される（Ｃ．グルタミクム及び大腸菌中；大腸菌中では唯一の経路）。それと並行して、例えば、Ｃ．グルタミクムでは、直接的スルフヒドリル化の経路が存在し、ここでは、スルフィドはＬ−ホモシステインの形で同化される（B-J Hwang, H-J Yeom, Y Kim, H-S Lee, 2002, J Bacteriol., 184(5) : 1277-1286）。Ｌ−メチオニンのＣ１基は、Ｃ１代謝に由来し、かつ、メチオニン合成酵素ＭｅｔＥ及びＭｅｔＨからＬ−ホモシステインに移される（Review: Greene RC (1996) in Neidhardt FC et al . (Hrsg.) "E-scherichia coli and Salmonella", 第2版, 542-560頁）。Ｃ．グルタミクムでのＬ−メチオニン生合成は、Rueckert et al .で記載されている（Rueckert C, Puehler A, Kalinowski J, 2003, J Biotechnol., 104 ( 1-3 ) : 213-28）。Ｌ−メチオニンの発酵による生産のための株及び方法は、例えば、大腸菌（WO2006/001616 , W02009/ 043803）及びＣ．グルタミクム（WO2009/144270）に関して記載されている。
【０００９】
硫黄源としてのチオスルファートの使用は、硫黄含有アミノ酸の生産の際に（スルファートに対して）顕著により高い理論収率を可能にする（Kroemer JO, Wittmann C, Schroeder H, Heinzle E, Metab Eng., 2006, 8(4), pp. 353-369並びにWO2007/020295）。チオスルファートの利点は、次のように明らかにされる：スルファート（ＳＯ42-）では、硫黄原子は酸化段階＋６で存在する。同化のためには、酸化段階−２（スルフィド＝Ｓ2-）に還元されなくてはならない。スルファートからスルフィドへの還元のためには、細胞は２個のＡＴＰ及び４個のＮＡＤＰＨ（８個の電子）を消費しなければならない。チオスルファート中、中心硫黄原子は酸化段階＋５を有し、末端硫黄原子は酸化段階−１を有する（両方の硫黄原子の平均的な形式的酸化段階は＋２）。したがって、チオスルファートの両方の硫黄原子の還元には、８個の電子のみが必要であり、これに対して、２個のスルファートの還元では、１６個の電子が必要である。
【００１０】
大腸菌を用いたＬ−システインの生産のためのＳ供給源としてのチオスルファートの使用は、例えば、DE 10 2007 007 333及びWO2001/27307に記載されている。
【００１１】
WO2007/077041では、大腸菌でのＬ−メチオニン生産もまた、スルファートの代わりのチオスルファートの使用によって、著しく改善されることが示されている。
【００１２】
今日までは、チオスルファートの使用がＣ．グルタミクムでも、Ｌ−メチオニン生産の改善を生じることはまだなお実験的に示されていない。WO2007/020295(240頁)では、Ｃ．グルタミクムが硫黄源としてのＮａ−チオスルファートを用いて多くのバイオマスを形成することが示される。このことは、より少ないＡＴＰ及びＮＡＤＰＨ消費のための指標として評価された。チオスルファートを用いたＬ−メチオニン生産は、実際には検証されていない。
【００１３】
大腸菌では、チオスルファートは、スルファート−／チオスルファートトランスポーターCysPUWA-Sbpによって取り込まれる（Kredich N.M. (1996) 、Neidhardt FC et al . (Hrsg.) "Escherichia coli and Salmonella", 第２版、514-527頁）。CysP及びSbpは、２つの異なる原形質周辺（periplasmatische）結合タンパク質である。CysPはチオスルファートのための、そしてSbpはスルファートのための高い親和性を有する。CysAは、ＡＴＰ結合性成分を形成する。CysU及びCysWは、膜貫通成分である。WO2009/043803では、大腸菌でcysPUWAMオペロンの発現が増強され、それによって、Ｌ−メチオニン生産の改善が達成された。Ｃ．グルタミクムでは、チオスルファートの吸収に関して何も知られていない。推定上のスルファート吸収システムのノックアウト突然変異体CysZ (cg3112)は、なおＳ供給源としてのチオスルファートを用いて成長可能である（Rueckert C. et al. (2005), BMC Genomics., Vol. 6(121)）。したがって、CysZは、チオスルファート輸送を（単独で）担うものでない。
【００１４】
Ｏ−アセチルセリン（チオール）−リアーゼＢ（＝CysM, EC 2.5.1.47）は、大腸菌が、Ｌ−システイン及びＬ−メチオニンの合成のためのＳ供給源としてチオスルファートを利用することを可能にする。この酵素は、Ｓ−スルホシステイン（Ｒ−Ｓ−ＳＯ3）及びアセタートの、ｏ−アセチルセリン及びチオスルファートからの形成を触媒作用する。引き続き、Ｓ−スルホシステインは、今日まで特定されていないやり方で、Ｌ−システイン及びスルフィド又はスルファートへと分解される（Kredich N.M. (1996) in Neidhardt FC et al . (Hrsg.) "Escherichia coli and Salmonella", 第2版、514-527頁）。スルファートは、３つの工程において、ＡＴＰ−スルフリラーゼ（CysDN）、ＡＰＳ−キナーゼ（CysC）及びＰＡＰＳ−スルホトランスフェラーゼ（CysH）によってスルフィド（ＳＯ32-）へと還元される。引き続き、スルフィドは、ＮＡＤＰＨスルフィドレダクターゼによって更にスルフィド（Ｓ2-）へと還元され、これは、ｏ−アセチルセリン−（チオール）−リアーゼＡ（CysK）及びｏ−アセチルセリン−（チオール）−リアーゼＢ（CysM）によって第２のＬ−システイン分子の合成のために使用されることができる。
【００１５】
Ｃ．グルタミクムは、最少培地中でＳ供給源としてのチオスルファートを用いて成長できる（Rueckert C. et al . (2005), BMC Genomics., Vol. 6(121)）。但し、Ｃ．グルタミクムは、Ｏ−アセチルセリン（チオール）−リアーゼＢ（"CysM"）を有しない（Rueckert und Kalinowski (2008) in A. Burkovski (ed.) "Corynebacteria : Genomics and Molecular Biology", Caister Academic Press）。チオスルファートは、したがって、他のやり方で同化されなければならない。
【００１６】
本発明の課題は、硫黄含有アミノ酸、特にＬ−メチオニンのより高い過剰生産を可能にする方法及び微生物株を提供することである。
【００１７】
前記課題は、次の工程
ａ）それぞれの出発株に比較して高められたチオ硫酸サルファートランスフェラーゼ活性を有する腸内細菌科（Enterobacteriaceae）の微生物又はコリネバクテリウム科（Corynebacteriaceae）の微生物を準備する工程、
ｂ）ａ）からの微生物を、無機硫黄源としてのチオ硫酸塩又はチオ硫酸塩と硫酸塩とからの混合物を含む培地中で発酵させて、発酵ブロスを得る工程、及び
ｃ）ｂ）からの発酵ブロス中で硫黄含有アミノ酸を濃縮する工程、
を含む、Ｌ−メチオニン、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−ホモシステイン及びＬ−ホモシスチンの群から選択されている硫黄含有アミノ酸の発酵による製造方法によって解決される。
【００１８】
さらに、本発明は、次の工程
ａ）チオ硫酸サルファートランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を過剰発現する、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）の微生物又はコリネバクテリウム科（Corynebacteriaceae）の微生物を準備する工程、
ｂ）ａ）からの微生物を、無機硫黄源としてのチオ硫酸塩又はチオ硫酸塩と硫酸塩とからの混合物を含む培地中で発酵させて、発酵ブロスを得る工程、及び
ｃ）ｂ）からの発酵ブロス中で硫黄含有アミノ酸を濃縮する工程、
を含む、Ｌ−メチオニン、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−ホモシステイン及びＬ−ホモシスチンの群から選択されている硫黄含有アミノ酸の発酵による製造方法を提供する。
【００１９】
チオ硫酸サルファートランスフェラーゼは、「ロダネーゼ」（EC 2.8.1.1）とも称され、チオスルファートの還元された硫黄原子をシアニド（ＣＮ-）へと移す酵素である。
【００２０】
いくつかのチオ硫酸サルファートランスフェラーゼは、代わりの基質、例えばジヒドロリポアートにも還元された硫黄原子を移すことができる（Alexander K., Volini M, 1987, J. Biol. Chem., 262: 6595-6604）。データバンク「Clusters of Orthologous Groups of proteins" (COG)」では、カテゴリーCOG0607「ロダネーゼ関連スルファートランスフェラーゼ」においてその時点で１６８個のホモログのスルファートランスフェラーゼが全３つのライフドメイン中に見出される（Tatusov RL, Fedorova ND, Jackson JD, Jacobs AR, Kiryutin B, Koonin EV, Krylov DM, Mazumder R, Mekhedov SL, Nikolskaya AN, Rao BS, Smirnov S, Sverdlov AV, Vasudevan S, Wolf YI, Yin JJ, Natale DA, 2003, BMC Bioinformatics , 4:41; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/）。ロダネーゼは、１又は複数の特徴的なロダネーゼ類似ドメインを有する（"Rhodanese-like domain"; PFAM-Datenbank PF00581, http ://pfam.sanger.ac.uk/; Gliubich F, Gazerro M, Zanotti G, Delbono S, Bombieri G, Berni R , 1996, J Biol Chem., 271 (35) : 21054-61）。
【００２１】
サッカロミセス・セレビジエS288cからの遺伝子RDL2（Rhodanese-Like Protein）は、１４９個のアミノ酸長のタンパク質Rdl2pをコードする。これは、ロダネーゼ類似ドメインを有する（"Rhodanese-like domain", PFAM-Datenbank PF00581, http://pfam. sanger.ac.uk/）。Rdl2pが、チオ硫酸スルファートランスフェラーゼ（ロダネーゼ、EC 2.8.1.1）であることが実験的に示されている（Foster MW, Forrester MT, Stamler JS, 2009, Proc Natl Acad Sei USA, 106 (45) : 18948-53）。配列番号１は、遺伝子RDL2のＤＮＡ配列を示す。配列番号２は、RDL2によりコードされたタンパク質Rdl2pのアミノ酸配列を示す。
【００２２】
大腸菌は、十分に特定されたロダネーゼGlpE及びPspEの他に（Adams H, Teertstra W, Koster M, Tommassen J, 2002, FEBS Lett. 518:173-6）、７個の更なるパラロガス酵素であってロダネーゼ類似ドメインを有するものを有する（Cheng H, Donahue JL, Battle SE, Ray WK, Larson TJ, 2008, Open Microbiol J., 2:18-28）：
YgaPは、Ｎ末端のロダネーゼ類似ドメイン及び２つの膜貫通ドメインを有する。これは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏロダネーゼ活性を示す（Ahmed, F., 2003, Dissertation）、
YbbBは、ｔＲＮＡ−２−セレノウリジン合成酵素であり、かつ、Ｎ末端のロダネーゼ類似ドメインを有する（Wolfe MD, Ahmed F, Lacourciere GM, Lauhon CT, Stadtman TC, Larson TJ, 2004, J Biol Chem., 279 (3) : 1801-1809）、
ThiIは、チアミンの合成に必要であり、かつ、ｔＲＮＡ中の８位で、ウリジンを４−チオウリジンへと変換させる際に重要な役割を果たす（Palenchar PM, Buck CJ, Cheng H, Larson TJ, Mueller EG, 2000, J Biol Chem., 275 ( 12 ) : 8283-8286）、
SseAは、３−メルカプトピルバート：シアニドスルファートランスフェラーゼであり、これは好ましくはチオスルファートの代わりに３−メルカプトピルバートをシアニドに移す（Colnaghi R, Cassinelli G, Drummond M, Forlani F, Pagani S, 2001, FEBS Lett., 500 (3) : 153-156）。この酵素は、２つのロダネーゼ類似ドメインを有する、
ORF ynjEは、３つのロダネーゼ類似ドメインを有する推定上のサルファートランスフェラーゼをコードする（Haenzelmann P, Dahl JU, Kuper J, Urban A, Mueller-Theissen U, Leimkuehler S, Schindelin H., 2009, Protein Sei., 18 ( 12 ) : 2480-2491）、
ORF yibNは、Ｃ末端のロダネーゼ類似ドメインを有する推定上のサルファートランスフェラーゼをコードする、
ORF yceAは、ロダネーゼ類似ドメインを有する推定上のサルファートランスフェラーゼをコードする。
【００２３】
コリネバクテリウム・グルタミカム中では、少なくとも７個のＯＲＦｓが仮想上のスルファートランスフェラーゼをコードする：
ORF thtR (=cg0803, NCgl0671)は、２つのロダネーゼ類似ドメイン及び３０１個のアミノ酸長を有する推定上のサルファートランスフェラーゼをコードする、
ORF sseA2 (=cg1613, NCgll369)は、２つのロダネーゼ類似ドメイン及び２８９個のアミノ酸長を有する推定上のサルファートランスフェラーゼをコードする、
ORF cg3000 (=NCg12616)は、１つのロダネーゼ類似ドメイン及び９６個のアミノ酸長を有する推定上のサルファートランスフェラーゼをコードする、
ORF cg0073 (=NCg10053)は、１つのロダネーゼ類似ドメイン及び９７個のアミノ酸長を有する推定上のサルファートランスフェラーゼをコードする、
ORF cg0074 (=NCg10054)は、１つのロダネーゼ類似ドメイン及び１９７個のアミノ酸長を有する推定上のサルファートランスフェラーゼをコードする、
ORF sseA1 (=cg3073, NCg12678)は、２つのロダネーゼ類似ドメイン及び２７４個のアミノ酸長を有する推定上のサルファートランスフェラーゼをコードする、
ORF cg3319 (=NCg12890)は、１つのロダネーゼ類似ドメイン及び３１２個のアミノ酸長を有する推定上のサルファートランスフェラーゼをコードする。
【００２４】
ウシ（Bos taurus）からのチオ硫酸サルファートランスフェラーゼは、２つのロダネーゼ類似ドメインを有し、かつ、十分に特定されている（Cannella C, Costa M, Pensa B, Ricci G, Pecci L, Cavallini D., 1981, Eur J Biochem., 119 ( 3 ) : 491-495）。
【００２５】
本方法の好ましい一実施態様において、微生物は、チオ硫酸サルファートランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする１又は複数の遺伝子を過剰発現し、ここで前記チオ硫酸サルファートランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、以下のａ）〜ｄ）から選択されている：
ａ）ポリペプチドRdl2p, GlpE, PspE, YgaP, ThiI, YbbB, SseA, YnjE, YceA, YibN, NCgl0671, NCgll369, NCgl2616, NCgl0053, NCgl0054, NCgl2678, NCgl2890からなるか又はこれを含むポリペプチド、哺乳類からのチオ硫酸サルファートランスフェラーゼ、例えばウシレバー（Bos taurus）からのチオ硫酸サルファートランスフェラーゼ、好ましくはRdl2p, GlpE, PspE、特に好ましくはRdl2p、
ｂ）配列番号２に示したアミノ酸配列からなるか又はこれを含むポリペプチド、
ｃ）ａ）又はｂ）のアミノ酸配列と７０％以上同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、ここで前記ポリペプチドはチオ硫酸サルファートランスフェラーゼ活性を示す、
ｄ）配列番号２に示したアミノ酸配列に対して１〜４５個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加を含むアミノ酸配列を有するポリペプチド、ここで前記ポリペプチドはチオ硫酸サルファートランスフェラーゼ活性を示す。
【００２６】
上述の通り、チオ硫酸サルファートランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、ａ）又はｂ）に挙げた酵素の変形をも含み、これはａ）又はｂ）に挙げた配列のアミノ酸配列と７０％以上同一であるアミノ酸配列を有し、ここで前記変形は、チオ硫酸サルファートランスフェラーゼ活性を有する。好ましい一実施態様において、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％前記アミノ酸配列と同一である、即ち、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％のアミノ酸位置が、前記したアミノ酸配列のものと同一である変形が含まれている。パーセンテージの同一性は、好ましくはアミノ酸又は核酸領域の全長にわたり算出される。多数のアルゴリズムを基礎とする一連のプログラムを当業者は配列比較のために利用する。この関連において、Needleman及びWunsch又はSmith及びWatermanのアルゴリズムは、特に信頼のある結果を生じる。配列のアラインメントのために、プログラムPileUp (J. Mol. Evolution., 25, SSI-360, 1987, Higgins et al . , CABIOS, 5 1989: 151-153)又はプログラムGap及びBestFit［Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48; 443-453 (1970))及びSmith and Waterman (Adv. Appl. Math. 2; 482-489 (1981))］が提供され、これはソフトウェアパケットGCG［Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madi-son, Wisconsin, USA 53711 (1991)］に属する。配列同一性のための上記パーセント値は、好ましくはプログラムGAPを用いて全配列領域にわたり算出される。
【００２７】
さらに、チオ硫酸サルファートランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、ａ）又はｂ）に挙げた酵素の断片をも含む。この断片は、上記活性を示す。チオ硫酸サルファートランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドの断片は、本特許出願の意味合いにおいて、好ましくは少なくとも３０個、少なくとも５０個又は少なくとも８０個の、前述のアミノ酸配列の１の相前後したアミノ酸残基を含む。
【００２８】
上述の通り、チオ硫酸サルファートランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号２に示したアミノ酸配列に関して１〜４５個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加を含むアミノ酸配列を有する、ａ）又はｂ）で挙げた酵素の変形も含み、ここで前記ポリペプチドはチオ硫酸サルファートランスフェラーゼ活性を示す。好ましい一実施態様において、前記アミノ酸配列は、配列番号２に示したアミノ酸配列に関して１〜４０個、更に好ましくは１〜３０個、更に好ましくは１〜２０個、好ましくは１〜１５個、さらにより好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加を含む。
【００２９】
更なる好ましい一方法において、ポリペプチドは、サッカロミセス・セレビジエS288cからの遺伝子RDL2の野生型配列に相応する、配列番号１のヌクレオチド配列を含む遺伝子によってコードされる。
【００３０】
さらに、ポリペプチドが、配列番号３のヌクレオチド配列を含む遺伝子によってコードされることが好ましい。コドン使用頻度は、ここでは大腸菌のものにわずかに適合されている。
【００３１】
更なる好ましい方法において、ポリペプチドは、配列番号４のヌクレオチド配列を含む遺伝子によってコードされる。コドン使用頻度は、ここでは、大腸菌のものに強力に適合されている。
【００３２】
さらに好ましくは、前記ポリペプチドは、配列番号５のヌクレオチド配列を含む遺伝子によってコードされる。コドン使用頻度は、ここでは、完全に大腸菌のものに適合されている。
【００３３】
本発明の実施の際には、好ましくは、チオ硫酸スルファートランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現は、１又は複数の以下の措置によって高められる：
ａ）本方法のために使用される微生物中で出発株に対して増強した発現を生じるプロモーターの制御下での遺伝子の発現。この場合に、例えば大腸菌のgapA遺伝子の構成的ＧＡＰＤＨプロモーターが、又は、誘導可能なlac-, tac-, trc-, lambda-, ara-又はtet-プロモーターが使用される（Review: Makrides SC. Micro-biol Rev. 1996 Sep; 60(3) : 512-38）
ｂ）チオ硫酸サルファートランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子のコピー数を出発株に対して高める。このことは、例えば、高められたコピー数でプラスミド中へ遺伝子を挿入することによって、又は、より多くのコピーで微生物の染色体中へ遺伝子を組み込むことによって、達成されることができる（Baneyx F, 1999, Curr. Opin. Bio- technol . 10, 411-421）
ｃ）本方法のために使用される微生物中で出発株に対して増強した翻訳を生じるリボソーム結合部位の使用下で遺伝子の発現が行われる（Makrides SC. Microbiol Rev. 1996 Sep; 60 ( 3 ) : 512-38）
ｄ）本方法のために使用される微生物に関する遺伝子のコドン使用頻度（codon usage）の最適化によって遺伝子発現を増強する（Welch, Villalobos, Gustafsson and Minshull, J R Soc Interface, 2009, 6:467-76頁）。遺伝子のコドン使用頻度を生物に適合するための尺度として、例えば、"Codon Adaptation Index" (CAI)が適する（Sharp PM, Li WH, 1987, Nucleic Acids Res., 15(3) : 1281-95）
ｅ）遺伝子から転写されるｍＲＮＡ中のｍＲＮＡ二次構造の減少によって遺伝子発現を増強する（Kudla G, Murray AW, Tollervey D, Plotkin JB., Science, 2009 Apr 10 ; 324 ( 5924 ) : 255-8 ; Welch, Villalobos, Gustafsson and Minshull, J R Soc Interface, 2009, 6.467-76頁）
ｆ）遺伝子から転写されるｍＲＮＡ中のＲＮＡ−ポリメラーゼ−ターミネーターの除去によって遺伝子発現を増強する（Welch, Villalobos, Gustafsson and Minshull, J R Soc Interface, 2009, 6: 467-76頁）
ｇ）遺伝子から転写されるｍＲＮＡ中のｍＲＮＡ安定化配列の使用下で遺伝子発現を実施する（Carrier TA, Keasling JD, Biotechnol Prog., 1997, Nov-Dec; 13 (6) : 699-708）。例として、配列ARNmstl7が、大腸菌の遺伝子metFのｍＲＮＡの安定化のために挙げられることができる（WO2009/043803）。
【００３４】
本発明の方法の更なる一実施態様において、チオ硫酸塩が、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩及びその混合物の群から選択した塩、好ましくはアンモニウム塩であることが好ましい。
【００３５】
さらに、硫酸塩が、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩（及び混合物）の群から選択した塩、好ましくはアンモニウム塩であることが好ましい。
【００３６】
好ましくは、培地又は発酵ブロス中のチオ硫酸塩の濃度は、０．０５ｇ／ｋｇ〜１００ｇ／ｋｇ、好ましくは０．１ｇ／ｋｇ〜２０ｇ／ｋｇ、特に好ましくは０．２ｇ／ｋｇ〜１２ｇ／ｋｇである。
【００３７】
好ましい一方法において、培地又は発酵ブロス中のチオ硫酸塩の濃度は、発酵の間に、少なくとも０．０５ｇ／ｋｇ〜１００ｇ／ｋｇ、好ましくは０．１ｇ／ｋｇ〜２０ｇ／ｋｇ、特に好ましくは０．２ｇ／ｋｇ〜１２ｇ／ｋｇに維持される。
【００３８】
更なる好ましい一方法において、発酵の間に、チオ硫酸塩の割合は、培地中及び発酵ブロス中の無機硫黄の全含有量に対して少なくとも５ｍｏｌ％に維持される。
【００３９】
本発明の方法は、バッチ法、流加培養法、繰り返し流加培養法及び連続法として構成されていてよい。
【００４０】
さらに、硫黄含有アミノ酸は、発酵ブロスから固形生成物として又は液状生成物中に溶解して獲得されてよい。
【００４１】
本発明の好ましい方法において、生産すべき硫黄含有アミノ酸は、Ｌ−メチオニンである。
【００４２】
さらに好ましくは、微生物は、エシェリキア属、特に好ましくは大腸菌種である。
【００４３】
代わりの方法において、微生物は、コリネバクテリウム属、特に好ましくはコリネバクテリウム・グルタミカム種である。
【００４４】
本発明の特に好ましい方法において、微生物は次のものから選択されている：
−出発株に比較して、アスパラギン酸キナーゼの高められた活性及び／又は発現及び調節タンパク質McbRの減弱又は欠失を有するコリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）、
−出発株に比較して、アスパラギン酸キナーゼの高められた活性及び／又は発現及び調節タンパク質MetJの減弱又は欠失を有する大腸菌（Escherichia coli）。
【００４５】
本発明はさらに、
−出発株に比較して、アスパラギン酸キナーゼの高められた活性及び／又は発現及び調節タンパク質McbRの減弱又は欠失を有するコリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）、
−出発株に比較して、アスパラギン酸キナーゼの高められた活性及び／又は発現及び調節タンパク質MetJの減弱又は欠失を有する大腸菌（Escherichia coli）から選択されている微生物を提供し、ここで前記微生物はＬ−メチオニンを排出又は生産し、それぞれの出発株に比較して高められたチオ硫酸サルファートランスフェラーゼ活性を有する。
【００４６】
さらに、本発明は、
−出発株に比較して、アスパラギン酸キナーゼの高められた活性及び／又は発現及び調節タンパク質McbRの減弱又は欠失を有するコリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）、
−出発株に比較して、アスパラギン酸キナーゼの高められた活性及び／又は発現及び調節タンパク質MetJの減弱又は欠失を有する大腸菌（Escherichia coli）から選択されている微生物であって、
Ｌ−メチオニンを排出又は生産し、
チオ硫酸サルファートランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を過剰発現する微生物を提供する。
【００４７】
Ｌ−メチオニンを排出又は生産するＣ．グルタミクム株は、好ましくは、アスパラギン酸キナーゼ（EC 2.7.2.4）の増強した酵素活性を示し、ここでフィードバック耐性アレルが好ましい。コリネバクテリウムでは、このアスパラギン酸キナーゼは遺伝子lysCによってコードされる。さらに、（遺伝子mcbRによってコードされる）調節タンパク質McbRの減弱又は欠失によって硫黄利用の増加が行われる。McbRは、Ｃ．グルタミクム中の全硫黄利用カスケードのリプレッサーである（Rey DA, Nentwich SS, Koch DJ, Rueckert C, Puehler A, Tauch A, Kalinowski J., Mol Microbiol . , 2005, 56 ( 4 ) : 871-887）。
【００４８】
Ｌ−メチオニンを排出又は生産する大腸菌株は、好ましくはアスパラギン酸キナーゼ（EC 2.7.2.4）の増強した酵素活性を示し、ここでフィードバック耐性アレルが好ましい。大腸菌中では、３つの異なるアスパラギン酸キナーゼが存在し、これは遺伝子thrA, metL又はlysCによってコードされる。さらに、遺伝子metJによってコードされる調節タンパク質MetJの減弱又は欠失によって、Ｌ−メチオニン生合成の増加が起こる。MetJは、大腸菌中のＬ−メチオニン生合成の主要リプレッサーである。
【００４９】
さらに好ましくは、微生物は、チオ硫酸サルファートランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする１又は複数の遺伝子を過剰発現し、ここで前記チオ硫酸サルファートランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、以下のａ）〜ｄ）から選択されている：
ａ）ポリペプチドRdl2p, GlpE, PspE, YgaP, ThiI, YbbB, SseA, YnjE, YceA, YibN, NCgl0671, NCgll369, NCgl2616, NCgl0053, NCgl0054, NCgl2678, NCgl2890からなるか又はこれを含むポリペプチド、哺乳類からのチオ硫酸サルファートランスフェラーゼ、例えばウシレバー（Bos taurus）からのチオ硫酸サルファートランスフェラーゼ、好ましくはRdl2p, GlpE, PspE、特に好ましくはRdl2p、
ｂ）配列番号２に示したアミノ酸配列からなるか又はこれを含むポリペプチド、
ｃ）ａ）又はｂ）のアミノ酸配列と７０％以上同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、ここで前記ポリペプチドはチオ硫酸サルファートランスフェラーゼ活性を示す、
ｄ）配列番号２に示したアミノ酸配列に対して１〜４５個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加を含むアミノ酸配列を有するポリペプチド、ここで前記ポリペプチドはチオ硫酸サルファートランスフェラーゼ活性を示す。
【００５０】
更に、微生物の出発株が、好ましくは、大腸菌（Escherichia coli）MG1655、大腸菌（Escherichia coli）W3110、大腸菌（Escherichia coli）DH5α、大腸菌（Escherichia coli）DH10B、大腸菌（Escherichia coli）BW2952、大腸菌（Escherichia coli）REL606、コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）ATCC13032、コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）R、コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）DSM20411（旧名称  ブレビバクテリウム・フラバム）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）DSM20412（旧名称  ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）DSM1412（旧名称  ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum））、コリネバクテリウム・エフェシエンス（Corynebacterium efficiens）YS-314T(=DSM44549)、コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）ATCC21608、コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）DSM17322からなる群から誘導されている。
【００５１】
更なるＬ−メチオニン排出又は生産株は、例えば、生産プラスミドpME101-thrA*l-cysE-Pgap-metA*llを含む大腸菌生産株MG1655 ΔmetJ Ptrc-metH Ptrc-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHPである(WO2009/043803)。
【００５２】
大腸菌生産株MG1655ΔmetJ Ptrc-metH Ptrc-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHPのクローニングは、特許出願WO2009/043803に記載されている。この株は、野生型大腸菌株K12 MG1655に基づく。この株のゲノム中には、以下の変更が導入されている：
・Ｌ−メチオニン生合成のリプレッサーのための遺伝子metJが欠失されている、
・遺伝子metH（コバラミン依存性メチオニン合成酵素をコード）の上流に、強力なtrcプロモーターが挿入されている、
・遺伝子metF（５，１０−メチレンテトラヒドロホラートレダクターゼ（5,10- Methylentetrahydrofolat-Reduktase）をコード）の上流に、強力なtrcプロモーターが挿入されている、
・オペロンcysPUWAMの上流に、強力なtrcFプロモーターが挿入されている。cysPUWAはスルファート／チオスルファート吸収トランスポーターをコードする。cysMはシステイン合成酵素Ｂをコードする、
・オペロンcysJIHの上流に、強力なtrcFプロモーターが挿入されている。cysJIはスルフィドレダクターゼをコードし、cysHは３′−ホスホ−アデニルイルスルファート−レダクターゼをコードする、
・オペロンgcvTHPの上流に、強力なtrc09プロモーターが挿入されている。gcvT、gcvH及びgcv Pはグリシン−切断−システムの３つの要素をコードする。
【００５３】
大腸菌生産プラスミドpMElOl-thrA* 1-cysE-Pgap-metA* 11のクローニングは、特許出願WO2007/077041に記載されている。これは、ベクターpCL1920を基礎とする低コピー数のプラスミド（low copy plasmid）である（Lerner, C.G. and Inouye, M., Nucl . Acids Res. (1990) 18:4631 [PMID: 2201955]）。空プラスミドpMElOlはlacIq遺伝子を有し、これは、lac-リプレッサーの強力発現したアレルをコードする。Lacリプレッサーによって下流の複製可能な強力なtrcプロモーターを、遺伝子thrA*lがクローニングする。これは大腸菌からのアスパラギン酸キナーゼ／ホモセリンデヒドロゲナーゼThrAのフィードバック耐性変形をコードする。同じ配向において、その後ろに、遺伝子cysEが、その天然プロモーターと一緒に存在する。これは大腸菌からのセリン−アセチルトランスフェラーゼをコードする。cysEの下流には、大腸菌からの強力gapAプロモーターが続き、前記プロモーターは遺伝子metA*11の発現を制御する。metA*11は、大腸菌からのホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼのフィードバック耐性変形をコードする。
【００５４】
更なるＬ−メチオニン排出又は生産微生物の例として以下株を挙げることができる：
−Ｃ．グルタミクムM1179 (=DSM17322) (WO2007/011939)
−大腸菌TF4076BJF metA#10 + metYX(Lm)（W02008/127240 ; 46頁）
−大腸菌W3110ΔJ/pKP451（EP 1 445 310 B1  ７頁、実施例４）
−大腸菌WΔthrBCΔmetJmetK32 pMWPthrmetA4Δ5Δ9（Yoshihiro Usuda and Osamu Kurahashi, 2005, Applied and Environmental Microbiology, Vol.71, No.6, p. 3228-3234）
−W3110/pHC34（WO01/27307  １３頁、実施例３）。
【００５５】
種々の適した微生物の更なる例は、Gomes et al .で記載されている（Enzyme and Microbial Technology 37 (2005), 3-18）。
【００５６】
更なる好ましい一実施態様において、Ｌ−メチオニン生産細菌は、次の群から選択される１又は複数の特徴を有する：
１）チオスルファート−／スルファート−トランスポートシステムCysPUWA (EC 3.6.3.25)の１又は複数の要素をコードする過剰発現したポリヌクレオチド、
２）３′−ホスホアデノシン−５′−ホスホスルファートレダクターゼCysH (EC 1.8.4.8)をコードする過剰発現したポリヌクレオチド、
３）スルフィドレダクターゼCysJI (EC 1.8.1.2)の１又は複数の要素をコードする過剰発現したポリヌクレオチド、
４）システイン合成酵素A CysK (EC 2.5.1.47)をコードする過剰発現したポリヌクレオチド、
５）システイン合成酵素B CysM (EC 2.5.1.47)をコードする過剰発現したポリヌクレオチド、
６）アセチルトランスフェラーゼCysE (EC 2.3.1.30)をコードする過剰発現したポリヌクレオチド、
７）グリシン切断システムGcvTHP- Lpd (EC 2.1.2.10, EC 1.4.4.2, EC 1.8.1.4)の１又は複数の要素をコードする過剰発現したポリヌクレオチド、
８）リポイル合成酵素LipA (EC 2.8.1.8)をコードする過剰発現したポリヌクレオチド、
９）リポイル−タンパク質−リガーゼLipB (EC 2.3.1.181)をコードする過剰発現したポリヌクレオチド、
１０）ホスホグリセラートデヒドロゲナーゼSerA (EC 1.1.1.95)をコードする過剰発現したポリヌクレオチド、
１１）３−ホスホセリンホスファターゼSerB (EC 3.1.3.3)をコードする過剰発現したポリヌクレオチド、
１２）３−ホスホセリン／ホスホヒドロキシトレオニンアミノトランスフェラーゼSerC (EC 2.6.1.52)をコードする過剰発現したポリヌクレオチド、
１３）セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼGlyA (EC 2.1.2.1)をコードする過剰発現したポリヌクレオチド、
１４）アスパルトキナーゼＩ及びホモセリンデヒドロゲナーゼI ThrA (EC 2.7.2.4, EC 1.1.1.3)をコードする過剰発現したポリヌクレオチド、
１５）アスパルタートキナーゼLysC (EC 2.7.2.4)をコードする過剰発現したポリヌクレオチド、
１６）ホモセリン−デヒドロゲナーゼHom (EC 1.1.1.3)をコードする過剰発現したポリヌクレオチド、
１７）ホモセリン−Ｏ−アセチルトランスフェラーゼMetX (EC 2.3.1.31)をコードする過剰発現したポリヌクレオチド、
１８）ホモセリン−Ｏ−スクシニルトランスフェラーゼMetA (EC 2.3.1.46)をコードする過剰発現したポリヌクレオチド、
１９）シスタチオニンガンマ−合成酵素MetB (EC 2.5.1.48)をコードする過剰発現したポリヌクレオチド、
２０）β−Ｃ−Ｓ−リアーゼAecD（EC 4.4.1.8、β−リアーゼとも称される）をコードする過剰発現したポリヌクレオチド、
２１）シスタチオニン  β−リアーゼMetC（EC 4.4.1.8）をコードする過剰発現したポリヌクレオチド、
２２）Ｂ１２独立性ホモシステインＳ−メチルトランスフェラーゼMetE (EC 2.1.1.14)をコードする過剰発現したポリヌクレオチド、
２３）Ｂ１２依存性ホモシステインＳ−メチルトランスフェラーゼMetH (EC 2.1.1.13)をコードする過剰発現したポリヌクレオチド、
２４）メチレンテトラヒドロホラートレダクターゼ(EC 1.5.1.20)をコードする過剰発現したポリヌクレオチド、
２５）コリネバクテリウム・グルタミクムからのＬ−メチオニンエキスポーターBrnFEの１又は複数の要素をコードする過剰発現したポリヌクレオチド、
２６）大腸菌からのバリンエキスポーターYgaZH(b2682, b2683)の１又は複数の要素をコードする過剰発現したポリヌクレオチド、
２７）大腸菌からの推定トランスポーターYjeH (b4141)をコードする過剰発現したポリヌクレオチド、
２８）ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼPntAB (EC 1.6.1.2)の１又は複数の要素をコードする過剰発現したポリヌクレオチド、
２９）Ｏ−スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼMetz (EC 2.5.1.48)をコードする過剰発現したポリヌクレオチド、
３０）ホスホエノールピルバートカルボキシラーゼPyc (EC 4.1.1.31)をコードする過剰発現したポリヌクレオチド。
【００５７】
好ましい特徴は、ここでは、次の群からの１又は複数のものである：
１）チオスルファート−／スルファート−トランスポートシステムCysPUWA (EC 3.6.3.25)の１又は複数の要素をコードする過剰発現したポリヌクレオチド、
２）３′−ホスホアデノシン−５′−ホスホスルファートレダクターゼCysH (EC 1.8.4.8)をコードする過剰発現したポリヌクレオチド、
３）スルフィドレダクターゼCysJI (EC 1.8.1.2)の１又は複数の要素をコードする過剰したポリヌクレオチド、
４）システイン合成酵素A CysK (EC 2.5.1.47)をコードする過剰したポリヌクレオチド、
５）システイン合成酵素B CysM (EC 2.5.1.47)をコードする過剰発現したポリヌクレオチド、
６）セリンＡ−セチルトランスフェラーゼCysE (EC 2.3.1.30)をコードする過剰発現したポリヌクレオチド、
７）グリシン切断システムGcvTHP- Lpd (EC 2.1.2.10, EC 1.4.4.2, EC 1.8.1.4)の１又は複数の要素をコードする過剰発現したポリヌクレオチド、
８）リポイル合成酵素LipA (EC 2.8.1.8)をコードする過剰発現したポリヌクレオチド、
９）リポイル−タンパク質リガーゼLipB (EC 2.3.1.181)をコードする過剰発現したポリヌクレオチド、
１０）ホスホグリセラートデヒドロゲナーゼSerA (EC 1.1.1.95)をコードする過剰発現したポリヌクレオチド、
１１）３−ホスホセリンホスファターゼSerB (EC 3.1.3.3)をコードする過剰発現したポリヌクレオチド、
１２）３−ホスホセリン／ホスホヒドロキシトレオニンアミノトランスフェラーゼSerC (EC 2.6.1.52)をコードする過剰発現したポリヌクレオチド、
１３）セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼGlyA (EC 2.1.2.1)をコードする過剰発現したポリヌクレオチド、
１４）アスパルトキナーゼＩ及びホモセリンデヒドロゲナーゼI ThrA (EC 2.7.2.4, EC 1.1.1.3)をコードする過剰発現したポリヌクレオチド、
１５）アスパルタートキナーゼLysC (EC 2.7.2.4)をコードする過剰発現したポリヌクレオチド、
１６）ホモセリン−デヒドロゲナーゼHom (EC 1.1.1.3)をコードする過剰発現したポリヌクレオチド、
１７）ホモセリン−アセチルトランスフェラーゼMetX (EC 2.3.1.31)をコードする過剰発現したポリヌクレオチド、
１８）ホモセリン−Ｏ−トランススクシニラーゼMetA (EC 2.3.1.46)をコードする過剰発現したポリヌクレオチド、
１９）シスタチオニンγ−合成酵素MetB (EC 2.5.1.48)をコードする過剰発現したポリヌクレオチド、
２０）β−Ｃ−Ｓ−リアーゼAecD (EC 4.4.1.8、β−リアーゼとも称される)をコードする過剰発現したポリヌクレオチド、
２１）シスタチオニンβ−リアーゼMetC (EC 4.4.1.8)をコードする過剰発現したポリヌクレオチド、
２２）Ｂ１２独立性ホモシステインＳ−メチルトランスフェラーゼMetE (EC 2.1.1.14)をコードする過剰発現したポリヌクレオチド、
２３）Ｂ１２依存性ホモシステインＳ−メチルトランスフェラーゼMetH (EC 2.1.1.13)をコードする過剰発現したポリヌクレオチド、
２４）メチレンテトラヒドロホラートレダクターゼMetF (EC 1.5.1.20)をコードする過剰発現したポリヌクレオチド。
【００５８】
特にとりわけ好ましい特徴は、ここでは、次の群から選択されている：
１）アスパルトキナーゼＩ及びホモセリンデヒドロゲナーゼI ThrA (EC 2.7.2.4, EC 1.1.1.3)をコードする過剰発現したポリヌクレオチド、
２）アスパルタートキナーゼLysC (EC 2.7.2.4)をコードする過剰発現したポリヌクレオチド、
３）ホモセリン−デヒドロゲナーゼHom (EC 1.1.1.3)をコードする過剰発現したポリヌクレオチド、
４）ホモセリン−アセチルトランスフェラーゼMetX (EC 2.3.1.31)をコードする過剰発現したポリヌクレオチド、
５）ホモセリン−Ｏ−トランススクシニラーゼMetA (EC 2.3.1.46)をコードする過剰発現したポリヌクレオチド、
６）シスタチオニンγ−合成酵素MetB (EC 2.5.1.48)をコードする過剰発現したポリヌクレオチド、
７）β−Ｃ−Ｓ−リアーゼAecD (EC 4.4.1.8、β−リアーゼとも称される)をコードする過剰発現したポリヌクレオチド、
８）シスタチオニンβ−リアーゼMetC (EC 4.4.1.8)をコードする過剰発現したポリヌクレオチド、
９）Ｂ１２独立性ホモシステインＳ−メチルトランスフェラーゼMetE (EC 2.1.1.14)をコードする過剰発現したポリヌクレオチド、
１０）Ｂ１２依存性ホモシステインＳ−メチルトランスフェラーゼMetH (EC 2.1.1.13)をコードする過剰発現したポリヌクレオチド、
１１）メチレンテトラヒドロホラートレダクターゼMetF (EC 1.5.1.20)をコードする過剰発現したポリヌクレオチド。
【００５９】
Ｃ．グルタミクム中のＬ−メチオニン生産の改善には、場合によって、次の群から選択した１又は複数の遺伝子を減弱することが適切である：
ａ）グルコース−６−ホスファート−イソメラーゼ(Pgi, EC Nr. 5.3.1.9)をコードする遺伝子pgi、
ｂ）ホモセリンキナーゼ(ThrB, EC Nr. 2.7.1.39)をコードする遺伝子thrB、
ｃ）Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素(MetK, EC Nr 2.5.1.6)をコードする遺伝子metK、
ｄ）ジヒドロジピコリナート合成酵素(DapA, EC Nr. 4.2.1.52)をコードする遺伝子dapA、
ｅ）ホスホエノールピルバラートカルボキシキナーゼ(Pck, EC Nr. 4.1.1.49)をコードする遺伝子pck、
ｆ）シスタチオニン−γ−リアーゼ(Cg3086, EC Nr. 4.4.1.1)をコードする遺伝子cg3086、
ｇ）シスタチオニン−β−合成酵素(Cg2344, EC Nr. 4.2.1.22)をコードする遺伝子cg2344、
ｈ）調節タンパク質Cg3031をコードする遺伝子cg3031、
ｉ）Ｌ−メチオニン生合成の転写調節因子(McbR)をコードする遺伝子mcbR、
ｊ）Ｌ−メチオニントランスポーター(MetQNI)のサブユニットをコードする遺伝子metQ、
ｋ）Ｌ−メチオニントランスポーター(MetQNI)のサブユニットをコードする遺伝子metN、
ｌ）Ｌ−メチオニントランスポーター(MetQNI)のサブユニットをコードする遺伝子metl、
ｍ）Ｌ−メチオニントランスポーター(MetP)をコードする遺伝子metP。
【００６０】
大腸菌中のＬ−メチオニン生産の改善には、場合によって、次の群から選択した１又は複数の遺伝子を減弱することが適切である：
ａ）Ｌ−メチオニン生合成の転写調節因子(MetJ)をコードする遺伝子metJ (b3938, ECK3930)、
ｂ）グルコース−６−ホスファート−イソメラーゼ(Pgi, EC Nr. 5.3.1.9)をコードする遺伝子pgi (b4025, ECK4017)、
ｃ）ホモセリンキナーゼ(ThrB, EC 2.7.1.39)をコードする遺伝子thrB (b0003, ECK0003)、
ｄ）Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素(MetK, EC Nr. 2.5.1.6)をコードする遺伝子metK (b2942, ECK2937)、
ｅ）ジヒドロジピコリナート合成酵素(DapA, EC Nr. 4.2.1.52)をコードする遺伝子dapA (b2478, ECK2474)、
ｆ）ホスホエノールピルバートカルボキシキナーゼ(Pck, EC Nr. 4.1.1.49)をコードする遺伝子pck (b3403, ECK3390)、
ｇ）ホルミルテトラヒドロホラートヒドロラーゼ(PurU, EC Nr. 3.5.1.10)をコードする遺伝子purU (bl232, ECK1227)、
ｈ）ピルバートキナーゼＩＩ(PykA, EC Nr. 2.7.1.40)をコードする遺伝子pykA (bl854, ECK1855)、
ｉ）ピルバートキナーゼＩ(PykF, EC 2.7.1.40)をコードする遺伝子pykF (bl676, ECK1672)、
ｊ）Ｌ−メチオニントランスポーター(MetQNI)のサブユニットをコードする遺伝子metQ(b0197, ECK0197)、
ｋ）Ｌ−メチオニントランスポーター(MetQNI)のサブユニットをコードする遺伝子metI(b0198, ECK0198)、
ｌ）Ｌ−メチオニントランスポーター(MetQNI)のサブユニットをコードする遺伝子metN (b0199, ECK0199)、
ｍ）デオキシシチジン５′−トリホスファートデアミナーゼ(Dcd, EC Nr. 3.5.4.13)をコードする遺伝子dcd (b2065, ECK2059)、
ｎ）推定Ｎ−アシルトランスフェラーゼ(YncA, Metabolie Explorer WO2010/020681)をコードする遺伝子yncA (bl448, ECK1442)、
ｏ）調節性sRNA FnrSをコードする遺伝子fnrS (b4699, ECK4511)。
【００６１】
発明の詳細な説明
本発明は、Ｌ−メチオニン、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−ホモシステイン及びＬ−ホモシスチンの群から選択されている硫黄含有アミノ酸の発酵による製造方法に関する。本方法は、チオ硫酸サルファートランスフェラーゼの酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を過剰発現する、腸内細菌科の微生物又はコリネバクテリウム科の微生物を用いて実施される。
【００６２】
ここでは、「遺伝子」との概念は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の断片を意味し、前記断片は、まずリボ核酸（ＲＮＡ）の製造（転写）のための情報を、そして、前記リボ核酸はタンパク質（ポリペプチド）（ここでは、チオ硫酸サルファートランスフェラーゼの活性を有するポリペプチド）の製造（翻訳）のための情報、を含む。遺伝子又はポリヌクレオチドが、タンパク質製造のための情報を含むとの事実を、遺伝子又はＲＮＡによるタンパク質又はポリペプチドのコーディング（coding）とも呼ぶ。内在遺伝子又はポリヌクレオチドとは、種の集団中に存在するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、遺伝子又はアレル或いはそのポリヌクレオチドが理解される。「遺伝子」及び「ＯＲＦ」（オープンリーディングフレーム）との概念は、本発明では同義に使用される。
【００６３】
「ポリヌクレオチド」との概念は、一般に、ポリリボヌクレオチド及びポリデオキシリボヌクレオチドを指し、ここでは改変されていないＲＮＡ又はＤＮＡ又は改変されたＲＮＡ又はＤＮＡであってよい。
【００６４】
「ポリペプチド」との概念は、２又はそれより多いペプチド結合を介して結合したアミノ酸を含むペプチド又はタンパク質を指す。ポリペプチド及びタンパク質との概念は同義に使用される。タンパク質は、全細胞の基本構成要素に属する。タンパク質は細胞に構造を付与するのみでなく、物質を輸送し、化学反応を触媒作用し、そしてシグナル物質を認識する分子「機械」、である。
【００６５】
「タンパク質構成アミノ酸（proteinogenen Aminosaeure）」とは、天然タンパク質中で、即ち、微生物、植物、動物及びヒトのタンパク質中で発生するアミノ酸が理解される。それには、特に、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−セリン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−システイン、Ｌ−バリン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−チロシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−リシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−プロリン及びＬ−アルギニン並びにセレンシステインの群から選択されたＬ−アミノ酸が属する。この場合に、タンパク質構成アミノ酸は常にα−アミノ酸である。アミノ酸グリシンを除き、全てのタンパク質構成アミノ酸に関して、α−炭素原子は非対称である（分子はキラルである）。前記アミノ酸各々のうち２つのエナンチオマーが存在する。この場合に、双方のエナンチオマーのうち１つだけが、タンパク質を構成し、即ち、Ｌ−アミノ酸である。タンパク質の増成に必要な装置−リボソーム、ｔＲＮＡ、アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素（これはｔＲＮＡにアミノ酸を負荷させる）その他−は、それ自体でキラルでもあり、そして、Ｌ−変形のみ認識できる。
【００６６】
「遺伝子発現」（略して「発現」）との概念は、一般に、遺伝情報をフェノタイプに表出させることを指す。より狭い意味合いでは、遺伝子発現は、ＲＮＡへの遺伝子の転写、酵素活性を有してよいポリペプチドへのＲＮＡの続く翻訳を指す。
【００６７】
「過剰発現」との概念は、一般に、出発株（親株）又は野生型株に比較した、リボ核酸、タンパク質又は酵素の細胞内濃度又は活性の向上が理解される。本発明では、チオ硫酸サルファートランスフェラーゼ遺伝子又はチオ硫酸サルファートランスフェラーゼ−ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが過剰発現される。
【００６８】
「出発株」（親株）とは、１又は複数のアミノ酸、ペプチド又はタンパク質の生産性を高めるための処置、又は、１又は複数の酵素活性を高めるための処置（例えば、過剰発現を生じる処置）が実施される微生物が理解される。出発株は、野生型株であってもよいが、既に事前に変化させた株であってもよい（例えば、生産株）。
【００６９】
細胞の「野生型」とは、好ましくは、そのゲノムが進化によって天然に発生した状態にある細胞を指す。この概念は、細胞全体に対しても個々の遺伝子に対しても使用される。したがって、特に、「野生型」との概念には、その遺伝子配列が少なくとも部分的に組み換え方法を用いてヒトによって変更されている細胞又は遺伝子は属さない。
【００７０】
本発明の意味合いにおいて得られる突然変異体は、使用される出発株又は親株に比較して、発酵プロセスにおいて所望のアミノ酸の高められた排出又は生産を示す。この場合に、アミノ酸は周囲媒体へと放出されるか又は細胞内に貯蔵される（蓄積）。
【００７１】
「増強」又は「高められた活性」との概念は、この関連において、相応するＤＮＡによりコードされる微生物中の１又は複数の酵素の細胞内酵素活性の向上を記載する。
【００７２】
基本的に、酵素活性の増加は、例えば、酵素をコードする１又は複数の遺伝子配列のコピー数を高めること、強力プロモーターを使用すること、又は、増加した活性を有する相応する酵素をコードする遺伝子若しくはアレルを利用すること、及び、場合によってこれら処置を組み合わせること、によって達成される。本発明に応じて遺伝子工学によって変更させた細胞は、例えば、形質転換、形質導入、コンジュゲーション又は前記方法とベクターとの組み合わせによって作製され、前記ベクターは、所望の遺伝子、前記遺伝子のアレル又はその部分及び前記遺伝子発現を可能にするベクターを含む。非相同性発現は、特に、細胞染色体への遺伝子又はアレルの組み込み、又は、染色体外複製ベクターによって達成される。
【００７３】
DE-A-100 31 999は、細胞中の酵素活性を高めるための手段に関する概要を、ピルビン酸カルボキシラーゼを例にとって与えており、この文献は参照として導入され、そして、細胞中の酵素活性を高めるための手段に関するその開示内容は、本発明の開示の一部を形成する。
【００７４】
酵素活性の向上は、例えば、相応するポリヌクレオチドのコピー数を染色体で又は染色体外で少なくとも１コピー高めることによって達成される。
【００７５】
コピー数を高めるための広く知られた方法は、相応するポリヌクレオチドをベクター、好ましくはプラスミド中に取り入れ、これが細菌によって複製されることにある。
【００７６】
腸内細菌科のための適したプラスミドベクターは、例えば、pACYC184から誘導されたクローニングベクター(Bartolome et al . ; Gene 102: 75-78 (1991)), pTrc99A (Amann et al.; Gene 69: 301-315 (1988))又はpSC1Ol誘導体(Vocke und Bastia; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80(21) : 6557-6561 (1983))である。さらに、特に適しているのは、pCL1920から誘導されたプラスミド(Lerner, C.G. and Inouye, M., Nucl . Acids Res. (1990) 18:4631 [PMID: 2201955])である。「Bacterial Artificial Chromosomes(BAC)」から誘導されたプラスミドベクター、例えばpCC1BAC (EPICENTRE Biotechnologies , Madison, U.S.A.)は、同様に、大腸菌中の相応するポリヌクレオチドのコピー数を高めるのに適している。
【００７７】
Ｃ．グルタミクムのための適したプラスミドベクターは、例えば、pZl (Menkel et al . , Applied and Environmental Microbiology 64: 549-554 (1989))、pEKExl (Eikmanns et al . , Gene 107: 69-74 (1991))又はpHS2-l (Sonnen et al . , Gene 107: 69-74 (1991))である。これは、クリプティックプラスミドpHM1519, pBLl又はpGAlに基づく。他のプラスミドベクター、例えば、pCG4 (US 4, 489, 160)又はpNG2 (Serwold-Davis et al . , FEMS Microbiology Letters 66: 119-124 (1990))又はpAGl (US 5,158,891)に基づくものは、同じように使用されてよい。Ｃ．グルタミクム中のプラスミドとの主題に関する概要文献は、Tauch et al. (Journal of Biotechnology 104, 27-40 (2003))で見出される。
【００７８】
さらに、ベクターとして、トランスポゾン、挿入エレメント（IS-Elemente）又はファージが使用できる。そのような遺伝子システムは、例えば特許公報US 4,822,738, US 5,804,414及びUS 5,804414に記載されている。同様に、WO 92/02627に記載のＩＳエレメント  ISaBl又はプラスミドpXZ10142のトランスポゾンTn 45（"Handbook of Corynebacterium glutamicum" (編者: L. Eggeling及び M. Bott)に引用）は、使用されることができる。
【００７９】
過剰発現を達成するための他の広く知られた方法は、染色体遺伝子増幅方法である。この方法では、興味をもたれるポリヌクレオチドの少なくとも１の追加コピーが、細菌の染色体中へと導入される。そのような増幅方法は、例えばWO 03/014330又はWO 03/040373に記載されている。
【００８０】
過剰発現の達成のための更なる方法は、相応する遺伝子又はアレルをプロモーター又は発現カセットと機能的に連結することにある（operably linked）。Ｃ．グルタミクムのための適したプロモーターは、例えば、Patek et alによる概要文献(Journal of Biotechnology 104(1-3), 311-323 (2003))の図１に記載されている。同様に、Vasicova et al (Journal of Bacteriology 181, 6188-6191 (1999))によって記載されるdapA-プロモーターの変形、例えばプロモーターA25が使用できる。さらに、Ｃ．グルタミクムのgapプロモーター(EP 06007373)が使用できる。
【００８１】
大腸菌に関しては、例えばAmann et al . (Gene 69(2), 301-315 (1988))及びAmann及びBrosius (Gene 40(2-3), 183-190 (1985))によって記載のプロモーターT3, T7, SP6, M13, lac, tac及びtrcが知られており、これは部分的にＣ．グルタミクムのためにも使用できる。そのようなプロモーターは、例えば、問題となる遺伝子の上流に、典型的には開始コドンから約１〜５００核酸塩基間隔をあけて導入されることができる。US 5,939,307では、発現カセット又はプロモーター、例えばtacプロモーター、trpプロモーター、lppプロモーター又はPLプロモーター及びファージλのPRプロモーターを、例えば、染色体トレオニンオペロンの上流に導入することによって、発現向上が達成できたことが記載されている。同様にして、ギアボックスプロモーター又はnarプロモーターを使用するファージT7プロモーターが使用できる。そのような発現カセット又はプロモーターは、EP 0 593 792に記載のように、プラスミド結合遺伝子を過剰発現するために使用することもできる。lacIQアレルの使用によって、再度、プラスミド結合遺伝子の発現が制御される（Glascock及びWeickert, Gene 223, 221-231 (1998)）。プロモーターの活性を、１又は複数のヌクレオチド交換による、１又は複数の挿入及び／又は１又は複数の欠失による、その配列の改変によって高めることがさらに可能である。
【００８２】
過剰発現の処置によって、相応するポリペプチドの活性又は濃度は、一般に、過剰発現を生じる処置前の相応する出発株（野生型又は出発微生物）中のポリペプチドの活性又は濃度に対して、少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％又は５００％、最大１０００％又は２０００％まで、高められる。
【００８３】
チオ硫酸サルファートランスフェラーゼの酵素活性の測定方法は、例えば、Cheng H, Donahue JL, Battie SE, Ray WK, Larson TJ, 2008, Open Microbiol J., 2:18-28 及びAlexander K., Volini M, 1987, J. Biol. Chem., 262: 6595-6604に記載されている。
【００８４】
前述の酵素又は遺伝子の発現は、一次元及び二次元のタンパク質ゲル分離及び相応する評価ソフトウェアを用いた引き続くタンパク質濃度光学的同定を用いて、ゲル中で検出可能である。酵素活性の向上が、相応する遺伝子の発現の向上にのみ基づく場合には、酵素活性の向上の定量化は簡単に、野生型と遺伝子工学によって変化させた細胞との間での一次元又は二次元タンパク質分離の比較によって決定されることができる。細菌でのタンパク質ゲルの慣用の調製方法及びタンパク質の同定方法は、Hermann et al . (Electrophoresis , 22: 1712.23 (2001)によって記載の方法である。タンパク質濃度は、同様に、検出するタンパク質に特異的な抗体を用いたウェスタンブロットハイブリダイゼーション(Sambrook et al . , Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. USA, 1989 )及び濃度測定のための相応するソフトウェアを用いた引き続く光学的評価(Lohaus及びMeyer (1989) Biospektrum, 5: 32-39; Lottspeich (1999), Angewandte Chemie 111: 2630-2647)によって、分析されることができる。ＤＮＡ結合タンパク質の活性は、ＤＮＡバンドシフトアッセイ（ゲルシフト（Gelretardation）とも称される）を用いて測定されることができる(Wilson et al . (2001) Journal of Bacteriology, 183: 2151-2155)。他の遺伝子の発現に対するＤＮＡ結合タンパク質の作用は、レポーター遺伝子アッセイの様々な十分に記載の方法によって検出されることができる（Sambrook et al . , Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. USA, 1989）。細胞内酵素活性は、様々な記載の方法(Donahue et al . (2000) Journal of Bacteriology 182 (19) : 5624-5627; Ray et al . (2000) Journal of Bacteriology 182 (8) : 2277-2284; Freed-berg et al . (1973) Journal of Bacteriology 115 (3) : 816-823)によって測定されることができる。以下の記載において、所定の酵素の活性測定のための具体的方法が挙げられていない場合には、この測定は、酵素活性の増加の測定及び酵素活性の減少の測定を、好ましくはHermann et al . , Electophoresis , 22: 1712-23 (2001), Lohaus et al . , Biospektrum 5 32-39 (1998) , Lottspeich, Angewandte Chemie 111: 2630-2647 (1999)及びWilson et al . , Journal of Bacteriology 183: 2151-2155 (2001)に記載の方法を用いて行う。
【００８５】
酵素活性の増加が、内在性遺伝子の突然変異によって実現される場合には、この種の突然変異は、典型的な方法、例えばＵＶ照射又は突然変異誘発性化学薬品により狙いを定めないで生じさせてもよいし、又は、遺伝子工学的手法、例えば（１又は複数の）欠失、（１又は複数の）挿入及び／又は（１又は複数の）ヌクレオチド交換により狙いを定めて生じさせられてもよい。この突然変異によって、遺伝子工学的に変更した細胞が得られる。酵素の特に好ましい突然変異体は、特に、もはやフィードバック阻害可能でないか、又は、少なくとも野生型酵素に比較してフィードバック阻害が少ない酵素である。
【００８６】
酵素活性の向上が酵素発現の向上によって実現される場合には、例えば、相応する遺伝子のコピー数を高めるか又はプロモーター領域及び調節領域又はリボソーム結合部位（構造遺伝子の上流にある）を突然変異させる。同様に、構造遺伝子の上流に組み込まれる発現カセットが作用する。誘導可能なプロモーターによって、更に、発現を任意の各時間点で増加させることが可能である。しかし、さらに、酵素遺伝子には、調節配列として、いわゆる「エンハンサー」が配置されていてもよく、これはＲＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡの間の改善された相互作用を介して同様に高められた遺伝子発現をひきおこす。ｍＲＮＡの寿命を延長するための処置によって、同様に発現は改善される。さらに、酵素タンパク質の分解の防止によって、同様に酵素活性は増強される。遺伝子又は遺伝子コンストラクトは、この場合に、種々のコピー数を有してプラスミド中に存在するか、又は染色体中に組み込まれ、かつ増幅されている。代わりに、更に、当該遺伝子の過剰発現が、培地組成の変更及び培養実施によって達成されることができる。そのための指示は、当業者は特にMartin et al . (Bio/Technology 5, 137-146 (1987))、Guerrero et al . (Gene 138, 35-41 (1994))、Tsuchiya及びMorinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988))、Eikmanns et al . (Gene 102, 93-98 (1991)), EP-A-0 472 869中、US 4,601,893中、Schwarzer及びPuehlerに(Bio/Technology 9, 84-87 (1991)、Reinscheid et al (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994))中、LaBarre et al . (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993))で、WO-A-96/15246で、Malumbres et al . (Gene 134, 15-24 (1993) に、JP-A-10-229891中、Jensen及びHammer(Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)) に、及び遺伝子学及び分子生物学の既知の教科書に見出す。前述の処置は、突然変異と同様に、遺伝子工学によって変化させた細胞を生じる。
【００８７】
さらに、遺伝子増幅方法を染色体中への組み込みによって適用することができるプラスミドベクターも適し、これは例えばReinscheid et al . (Applied and Environmental Microbiology 60: 126-132 (1994))によってhom-thrB-オペロンの重複又は増幅のために記載されている。この方法では、完全遺伝子がプラスミドベクター中にクローニングされ、これは宿主（典型的には大腸菌）中で複製されることができるが、しかし、コリネバクテリウム・グルタミカム中では複製されることができない。ベクターとして、例えばpSUP301 (Simon et al . , Bio/Technology 1: 784-791 (1983)), pK18mob又はpK19mob (Schaefer et al . , Gene 145: 69-73 (1994)), pGEM-T (Promega Corporation, Madison, Wisconsin, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman, Journal of Biological Chemistry 269: 32678-84 (1994)), pCR-BluntII-TOPO (Invitrogen, Groningen, オランダ), pEMl (Schrumpf et al . , Journal of Bacteriology 173: 4510-4516))又はpBGS8 (Spratt et al . , Gene 41: 337-342 (1986))が考慮される。増幅すべき遺伝子を含むプラスミドベクターは、引き続き、コンジュゲーション又は形質転換によって、所望のコリネバクテリウム・グルタミカム株中へと移される。コンジュゲーション方法は、例えばSchaefer et al . , Applied and Environmental Microbiology 60: 756-759 (1994)で記載される。形質転換方法は、例えばThierbach et al . , Applied Microbiology and Biotechnology 29: 356-362 (1988), Dunican及びShivnan, Bio/Technology 7: 1067-1070 (1989) 及びTauch et al., FEMS Microbiology Letters 123: 343-347 (1994)で記載される。「cross-over」結果を用いた相同組み換え後に、発生する株は、当該遺伝子の少なくとも２個のコピーを含む。大腸菌のための類似方法は、例えばLink, A.J., Phillips, D. and Church, G.M. (1997), J. Bacteriology 179: 6228-6237で記載されている。
【００８８】
染色体中のＤＮＡの挿入又は欠失には、リコンビナーゼ媒介方法も使用でき、これは例えばDatsenko KA, Wanner BL . , 2000, Proc Natl Acad Sei USA., 97 ( 12 ) : 6640-5によって記載されている。
【００８９】
以上の及び以下の説明で使用する表現「その野生型又は出発株に対して増加した酵素活性」とは、好ましくは常に、少なくとも２倍、特に好ましくは少なくとも１０倍、さらに好ましくは少なくとも１００倍、さらにより好ましくは少なくとも１０００倍、最も好ましくは少なくとも１００００倍増加した、そのつどの酵素の活性を理解することができる。さらに、「その野生型又は出発株に対して増加した酵素活性」を有する本発明の細胞は、特に、その野生型又は出発株が酵素活性を有しないか又は少なくとも検出可能な酵素活性を有しなくて、酵素活性向上後に初めて、例えば過剰発現によって、検出可能な酵素活性を示す細胞も含む。この関連において、「過剰発現」又は以下の説明で使用した表現「発現の向上」との概念は、出発細胞、例えば野生型細胞が、発現を示さないか又は少なくとも検出可能な発現を示さず、組み換え方法後に初めて検出可能な酵素発現が誘発される、という場合も含む。
【００９０】
本発明の処置によって得られる単離された細菌は、使用される出発株又は親株に比較して、発酵プロセスにおいて所望のアミノ酸の高められた排出又は生産を示す。
【００９１】
単離された細菌とは、本発明による、出発株に対して高められたチオ硫酸サルファートランスフェラーゼ活性を示す、単離されたか又は作製された突然変異体及び組み換え細菌、特に、腸内細菌科又はコリネバクテリウム科の細菌を理解することができる。
【００９２】
生成物濃度（体積あたりの生成物）、生成物収率（消費した炭素源あたりの形成された生成物）及び生成物形成（体積及び時間あたりの形成された生成物）又は他のプロセスパラメーター及びその組み合わせの群から選択される１又は複数のパラメーターに関する単離された細菌又はその使用下での発酵プロセスの能力は、出発株又は親株又はその使用下での発酵プロセスに対して少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも１．５％又は少なくとも２％改善される。
【００９３】
本発明の方法では、細菌は連続的に−例えばPCT/EP2004/008882に記載のように−又は不連続的にバッチ方法（batch cultivation）又はフェドバッチ方法（供給方法、fed batch）又は繰り返した流加バッチ方法（繰り返し供給方法）において、Ｌ−アミノ酸生産の目的で培養されることができる。既知の培養方法に関する一般的要約は、Chmielによる教科書(Bioprozesstechnik 1. Einfuehrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))又はStorhasによる教科書(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994))から提供可能である。
【００９４】
使用されるべき培養培地又は発酵培地は、適切に、そのつどの株の要求を満たさなければならない。種々の微生物の培養培地の記載は、ハンドブックAmerican Society for Bacteriologyの"Manual of Methods for General Bacteriology" (Washington D.C., USA, 1981)に含まれている。培養培地及び発酵培地又は培地の概念は、相互に交換可能である。
【００９５】
炭素源として、糖及び炭水化物、例えばグルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、サトウダイコン又はサトウキビ製造からのサッカロース含有溶液、デンプン、デンプン加水分解物及びセルロース、油脂、例えばダイズ油、ヒマワリ油、ピーナッツ油及びヤシ脂、脂肪酸、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸、アルコール、例えばグリセリン、メタノール及びエタノール及び有機酸、例えば酢酸が使用できる。前記物質は、単独で又は混合して使用できる。
【００９６】
窒素源として、有機窒素含有化合物、例えばペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカー、ダイズ粉及び尿素又は無機化合物、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムが使用できる。窒素源は、単独で又は混合して使用できる。
【００９７】
リン源として、リン酸、リン酸二水素カリウム又はリン酸水素二カリウム又は相応するナトリウム含有塩が使用できる。
【００９８】
硫黄源として、本発明によれば、ジチオ硫酸の塩（チオ硫酸塩）が使用され、これは場合によって、他の硫黄源、例えば硫酸塩、亜硫酸塩又は亜ジチオン酸塩と一緒に使用される。
【００９９】
さらに、培養培地は、塩、例えば塩化物塩、金属（例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム及び鉄を含む）塩、例えば硫酸マグネシウム又は硫酸鉄を含まなくてはならず、これは成長のために必要である。最後に、必須成長物質、例えばアミノ酸、例えばホモセリン及びビタミン、例えばチアミン、ビオチン又はパントテン酸を、前述の物質に追加して使用できる。
【０１００】
培養培地には、その上、それぞれのアミノ酸の適した前駆物質が添加されていてよい。
【０１０１】
前述の使用物質は、培地に１個のバッチの形で添加されるか、又は、好適に培養の間に供給されてよい。
【０１０２】
培地のｐＨ制御には、塩基性化合物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア又はアンモニア水又は酸性化合物、例えばリン酸又は硫酸が好適に使用される。ｐＨは、一般に、６．０〜９．０、好ましくは６．５〜８の値に調節される。泡発生の制御のために、消泡剤、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルが使用できる。プラスミドの安定性の維持のために、培地には適した選択的作用物質、例えば抗生物質が添加されることができる。好気条件を維持するには、酸素又は酸素含有ガス混合物、例えば空気が培地中に導入される。過酸化水素で濃縮されている液体の使用は、同様に可能である。場合によって、発酵は過圧で、例えば０．０３〜０．２ＭＰａの圧力で行われる。培地の温度は、通常は２０℃〜４５℃、好ましくは２５℃〜４０℃にある。バッチ方法では、培養は、所望のアミノ酸の最大値が形成される限り続行される。この目的は、通常は１０時間〜１６０時間の間に達成される。連続的方法では、より長期の培養期間が可能である。
【０１０３】
適した発酵培地は、特にUS 6,221,636、US 5,840,551、US 5,770,409、US 5,605,818、US 5,275,940 及びUS 4,224,409に記載されている。
【０１０４】
Ｌ−アミノ酸の測定方法は、先行技術から知られている。分析は、例えばSpackman et al . (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190)が記載のように、イオン交換クロマトグラフィと引き続くニンヒドリン誘導体化を用いて行われてよく、又は、逆相ＨＰＬＣによって行われてよく、これはLindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174)が記載のとおりである。
【０１０５】
このようにして製造した発酵ブロスは、引き続き、固体又は液体の生成物へと加工される。
【０１０６】
発酵ブロスとは、微生物が所定の時間にわたり所定の温度で培養された発酵培地が理解される。発酵培地又は発酵の間に使用される培地は、微生物の増殖及び所望のアミノ酸の形成を確実にする全ての物質又は成分を含む。
【０１０７】
発酵の終了時に、発生する発酵ブロスは、相応して、ａ）微生物細胞の培養の結果として発生する微生物バイオマス、ｂ）発酵の進行中に形成される所望のアミノ酸、ｃ）発酵の進行中に形成される有機的副生成物及びｄ）使用した１又は複数の発酵培地の又は使用物質、例えばビタミン、例えばビオチン、アミノ酸、例えばホモセリン又は塩、例えば硫酸マグネシウムの、発酵によって消費されない成分、を含む。
【０１０８】
有機的副生成物には、発酵の際に使用される微生物によって場合によってそのつどの所望のＬ−アミノ酸の他に生成され、かつ場合によって排出される物質が属する。それには、所望のアミノ酸に比較して３０％、２０％又は１０％未満を構成するＬ−アミノ酸が属する。それには、さらに、１〜３個のカルボキシル基を有する有機酸、例えば酢酸、乳酸、クエン酸、リンゴ酸又はフマル酸が属する。最終的に、それには、糖、例えばトレハロースも属する。
【０１０９】
産業上の目的のため適した典型的発酵ブロスは、４０ｇ／ｋｇ〜１８０ｇ／ｋｇ又は５０ｇ／ｋｇ〜１５０ｇ／ｋｇのアミノ酸含有量を有する。バイオマス（乾燥したバイオマスとして）の含有量は、一般に、２０〜５０ｇ／ｋｇである。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】図１は、"pMA-RDL2"プラスミド（配列番号８）を示す図である。
【０１１１】
実施例：
実施例１：遺伝子RDL2の合成及びクローニング
Ｓ．セレビシエからのORFs RDL2（配列番号１）の発現のために、ヌクレオチド配列（GENEART AG; Regensburg, ドイツ国）をde novo合成し、これは上流配列（"upstream"、配列番号６）、ORF RDL2配列（"RDL2"、配列番号１）並びに下流配列（"downstream"、配列番号７）からなる。上流配列は、制限酵素PacI及びFseIのための認識部位並びにリボソーム結合部位を含む。下流配列は、第２の停止コドンTAAを含み、その後に、大腸菌MG1655からのrnpB遺伝子のT1ターミネーターが続く。その後ろには、制限酵素PmeI及びSbfIのための認識配列が続く。合成後に、SacI及びKpnIでヌクレオチド配列を切断し、そして、同様にSacI及びKpnIで切断したプラスミドpMA (ampR)へとクローニングした。生じるプラスミドを、"pMA-RDL2"（配列番号８、図１）と呼ぶ。
【０１１２】
ORF RDL2によってコードされるタンパク質Rdl2p（配列"RDL2p"、配列番号２）のアミノ酸配列から出発して、３つの異なるＤＮＡ配列を作製し、これは野生型アミノ酸配列を有するRdl2pタンパク質をコードする。この配列を、"RDL2a"（配列番号３）、"RDL2b"（配列番号４）及び"RDL2c"（配列番号５）と呼んだ。これら３つの配列をそのつど、上記した上流及び下流配列と一緒にde novo合成し、そして、上記のようにプラスミドpMA(GENEART AG; Regensburg, ドイツ国)中へクローニングした。生じるプラスミドを、pMA-RDL2a、pMA-RDL2b及びpMA-RDL2cと呼んだ。前述の変法は、本方法のために使用される微生物のコドン使用頻度（codon usage）の最適化の点で異なる。そして、コドン使用頻度に関する適合のための値は次のとおりである：
RDL2 :コドン使用頻度は適合させていない（"codon adaptation index" CAI=0,27）。
RDL2a:コドン使用頻度は大腸菌に軽く適合させてある（CAI=0,38）
RDL2b:コドン使用頻度は大腸菌に強く適合させてある（CAI=0,72）
RDL2c: コドン使用頻度は完全に大腸菌に適合させてある（CAI=1）。
【０１１３】
実施例２：プラスミドpMElOl-thrA*l-cysE-Pgap-metA*llへのORFs RDL2 , RDL2a, RDL2b並びにRDL2cのクローニング
大腸菌への発現のために、RDL2タンパク質をコードする４つの遺伝子変形をそのつど大腸菌生産プラスミドpMElOl-thrA*1- cysE-Pgap-metA* 11 (WO2007/ 077041)へとmetA*llの下流にクローニングした。
【０１１４】
そのために、遺伝子を、それぞれプライマーRDL2-t4-f（配列番号１１）及びRDL2-r（配列番号１２）を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の適用下で、Phusion DNAポリメラーゼ(Finnzymes Oy, Espoo, フィンランド)を用いて増幅した。テンプレートとして、実施例１からのプラスミドpMA-RDL2, pMA-RDL2a, pMA-RDL2b及びpMA-RDL2cを使用した：
0006053691.tif 000002
【０１１５】
804 bpサイズのＰＣＲ産物及びプラスミドpMElOl-thrA* 1- cysE-PgapA-metA* 11を、制限酵素SalI及びSbfIを用いて分解し、ライゲーションし、大腸菌株DH5α中に形質転換した。プラスミドを有する細胞を、培養によって、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを有するLB寒天上で、選択した。成功したクローニングを、プラスミドＤＮＡ単離後に、制限酵素AgeIを用いた制御切断（Kontrollspaltung）によって検出した。最後に、クローニングしたＤＮＡ断片を、以下プライマーを用いて配列決定した：
0006053691.tif 000003
【０１１６】
発生したプラスミドを、pME-RDL2, pME-RDL2a, pME-RDL2b及びpME-RDL2cと呼んだ。
【０１１７】
実施例３：大腸菌MG1655ΔmetJ Ptrcr-metH Ptrc-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHPの形質転換
Ｌ−メチオニン生産大腸菌株MG1655ΔmetJ metA*ll Ptrc-metH Ptrc-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH（以下、DM2219と呼ぶ）を、特許公報WO 2009/043803 A2に記載する。
【０１１８】
この株をそれぞれプラスミドpME-RDL2, pME-RDL2a, pME-RDL2b及びpME-RDL2cで並びにプラスミドpMElOl- thrA* 1- cysE-PgapA-metA* 11 (WO2009/043803 A2 )で形質転換し、そして、プラスミドを有する細胞を５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを有するLB寒天上で選択した。形質転換体を１％のグルコース及び５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを有する各々１０ｍｌのＬＢ液体培地中に移して接種し（ueberimpfen）、１６時間３７℃で培養した。引き続き、グリセリンを最終濃度１０％で添加し、培養物を−７０℃で凍結させた。
【０１１９】
実施例４：大腸菌Ｌ−メチオニン生産株の評価
大腸菌Ｌ−メチオニン生産株の性能を、１００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中での生産試験によって評価した。予備培養物として、そのつど１０ｍｌの予備培養培地（２．５ｇ／ｌのグルコース及び９０％の最小培地ＰＣ１を有する１０％ＬＢ培地）を、１００μｌの細胞培養物で接種し、１０時間３７℃で培養した。そして、引き続き各１０ｍｌのＰＣ１最少培地（表１）をＯＤ６００ｎｍ  ０．２（Eppendorf Bio-Photometer; Eppendorf AG, Hamburg, ドイツ国）に接種し、２４時間３７℃で培養した。細胞外Ｌ−メチオニン濃度を、アミノ酸分析機（Sykam GmbH, Eresing, ドイツ国）を用いてイオン交換クロマトグラフィ及びニンヒドリン検出を用いたポストカラム誘導体化によって決定した。細胞外グルコース濃度を、YSI 2700 Select Glucose Analyzer (YSI Life Sciences, Yellow Springs, Ohio, USA)を用いて決定した。このデータは、ORF RDL2, RDL2a, RDL2b又はRDL2cの発現が、Ｌ−メチオニン濃度を顕著に高めることを示す（表２）。
【０１２０】
表１：最小培地ＰＣ１
【表１】
0006053691.tif 000004
【０１２１】
表２：種々のプラスミドを有する大腸菌DM2219株の発酵ブロス中のＬ−メチオニン濃度
【表２】
0006053691.tif 000005
【０１２２】
実施例５：ORFs RDL2 , RDL2a, RDL2b並びにRDL2cのプラスミドpEC-XT99Aへのクローニング
ORFs RDL2, RDL2a, RDL2b並びにRDL2cのＣ．グルタミクム中の発現のためのベースベクターとして、大腸菌−Ｃ．グルタミクム−シャトル−発現プラスミドpEC-XT99A(EP1085094B1)を使用した。実施例１からのプラスミドpMA-RDL2 , pMA-RDL2a, pMA-RDL2b及びpMA-RDL2cを、それぞれ制限酵素StuI及びNaeIを用いて切断し、０．８％のアガロースゲル中で分離した。638 bpのサイズのＤＮＡ断片を、ゲルから切り出し、ＤＮＡを抽出した（QIAquick Gel Extraction Kit, QIAGEN, Hilden,ドイツ国）。発現プラスミドpEC-XT99Aを、制限酵素Ecll36IIで切断した。引き続き、そのつど638 bpのサイズのＤＮＡ断片をReady-To-Go Ligation Kit (Amersham GE Healthcare Europe GmbH, Freiburg, ドイツ国)の使用下でライゲーションした。大腸菌株DH5 (Invitrogen GmbH; Darmstadt; ドイツ国)を、ライゲーションバッチを用いて形質転換し、プラスミドを有する細胞を５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを有するLB寒天上で選択した。
【０１２３】
プラスミドDNAの単離後に、成功したクローニングを、制限酵素PmeI及びSacIIを用いた制御切断によって検出した。最後に、このプラスミドを、以下プライマーを用いて配列決定した：
0006053691.tif 000006
【０１２４】
プラスミド固有のtrcプロモーター及びRDL2をコードするORFsが等しく配向している（orientieren）プラスミドコンストラクトを、次のように呼んだ：pEC-RDL2, pEC-RDL2a, pEC-RDL2b及びpEC-RDL2c。
【０１２５】
実施例６：Ｃ．グルタミクムM1179の形質転換
コリネバクテリウム・グルタミカム株M1179は、エチオニン耐性Ｌ−メチオニン生産株である（WO2007/011939）。これは、Deutschen Sammlung fuer Mikroorganismen und Zellkulturen（DSMZ, Braunschweig,ドイツ国）で、２００５年５月１８日に、ブダペスト協定に一致して、DSM17322として寄託されている。
【０１２６】
プラスミドpEC-RDL2, pEC-RDL2a, pEC-RDL2b, pEC-RDL2c又はpEC-XT99Aを、Tauch et al. (1994, FEMS Microbiological Letters, 123: 343-347)による電気穿孔条件によって、M1179株中に電気穿孔した。
【０１２７】
プラスミドを有する細胞の選択を、５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを有するLB寒天上で行った。形質転換体のプラスミドを単離し（Peters-Wendisch et al . , 1998, Microbiology 144, 915-927）、制限切断及びゲル電気泳動によって検証した。そうして発生した株を、M1179/pEC-RDL2, M1179/pEC-RDL2a, M1179/pEC-RDL2b, M1179/pEC-RDL2c及びM1179/pEC-XT99Aと呼ぶ。
【０１２８】
実施例７：Ｃ．グルタミクムＬ−メチオニン生産株の評価
製造したＣ．グルタミクム株M1179/pEC-RDL2, M1179/pEC-RDL2a, M1179/pEC-RDL2b, M1179/pEC-RDL2c及びM1179/pEC-XT99Aを、Ｌ−メチオニン生産に適した栄養培地中で培養し、そして、Ｌ−メチオニン含有量を培養上清中で決定した。
【０１２９】
そのために、株をまず寒天プレート（カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を有する脳−心臓−寒天）上に塗り、２４時間３３℃でインキュベーションした。この寒天プレート培養物から細胞を５ｍｇ／ｌのテトラサイクリンを有する各１０ｍｌ培地HH （脳−心臓ブイヨン、Merck, Darmstadt,ドイツ国）中に移して接種し、２４時間１００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中で３３℃で２４０ｒｐｍで振盪させた。そして、引き続き各１０ｍｌのPM培地（表３）を、ＯＤ６６０ｎｍ  ０．１（Genios, Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, ドイツ国）に接種し、２４時間３３℃でじゃま板を備えた１００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中で培養した。
【０１３０】
表３：PM培地
【表３】
0006053691.tif 000007
【０１３１】
２４時間後に、ＯＤを６６０ｎｍで決定し（Genios, Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, ドイツ国）、形成されたＬ−メチオニン濃度を測定した。Ｌ−メチオニンを、アミノ酸分析機（Sykam GmbH, Eresing,ドイツ国）を用いてイオン交換クロマトグラフィ及びニンヒドリン検出を用いたポストカラム誘導体化によって決定した。表４は、培養物の光学密度及びＬ−メチオニン濃度を示す。ORF RDL2, RDL2a, RDL2b又はRDL2cの発現は、Ｌ−メチオニン濃度の顕著な増加を結果として有した。
【０１３２】
表４：種々のプラスミドを有するＣ．グルタミクムM1179株の発酵ブロス中のメチオニン濃度
【表４】
0006053691.tif 000008
【図１】
0006053691.tif 000009
【配列表】
0006053691000001.app