(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
共有結合的に固定化した酵素を含み、酵素活性を有する、乾燥した固体組成物であって、共有結合した巨大分子の形成体中に（ｉ）少なくとも１つの酵素と、（ｉｉ）少なくとも１つのポリマーと、（ｉｉｉ）少なくとも１つの架橋剤との反応生成物を含み、酵素が乾燥状態、周囲温度及び圧力で、少なくとも９０日間保存される場合、製造時の酵素活性と比較して９０％を超える酵素活性を保持し、
さらに活性炭を含み、並びに、
該酵素がタチナタマメに由来する粗ウレアーゼ、該ポリマーがポリ（エチレンイミン）、及び該架橋剤がエチレングリコールジグリシジルエーテルである、組成物。
【請求項２】
酵素が架橋剤及びポリマーと共有結合する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
共有結合した巨大分子の形成体中に固定化ウレアーゼと、少なくとも１つのポリマーと、少なくとも１つの架橋剤とを含む、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
吸着カートリッジ中に層として請求項１〜３のいずれか１に記載の組成物を含む、吸着カートリッジ。
【請求項５】
組成物に隣接したアルミナの存在を排除する、請求項４に記載の吸着カートリッジ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は共有結合した巨大分子の形成体（formation）（例えばポリマー、タンパク質、デンプン）における酵素の固定化に関する。酵素は共有結合的に固定化することができ、乾燥した場合に、安定した酵素活性を保持することができる。
【０００２】
本願は米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づき、２００８年９月３０日に出願された先行の米国仮特許出願第６１／１０１，３０２号（これはその全体が参照により本明細書中に援用される）の利益を主張する。
【背景技術】
【０００３】
酵素は本質的にタンパク質性（proteinaceous）であり、多くの様々な化学反応を調節する生体触媒として作用する。酵素は多くの分析用途、医学用途及び産業用途で使用される。例えば、酵素は腎不全による腎機能の喪失のための人工補綴を与える透析システムにおいて医学用途で利用される。酵素ウレアーゼは、血液透析及び腹膜透析システムにおいて尿素をアンモニアと二酸化炭素とに変換するのに使用される。酵素機能性の多くの用途では、特定の定位置で水性システムにおいて酵素を使用する必要がある。物理封入又は物理吸着、化学吸着、静電吸着、水素結合、共有結合、架橋、及びカプセル化又はマイクロカプセル化を含む多くの酵素固定化技法がこれを達成するのに利用されている。しかしながら、これらの技法では、乾燥した固体組成物として安定である乾燥した固体の酵素架橋生成物は生成されてはいない。一般的に多くの酵素で不安定であり、そのため温度及びｐＨの変化、加水分解、並びに化学修飾又は物理修飾を通して破壊される高感度な構造機能相関がこれらの取り組みをさらに複雑にしている。これらの破壊により通常、酵素の不活性化又は生体触媒能の低下が起こる。
【０００４】
ウレアーゼは腎臓透析システムで使用される酵素である。例えばウレアーゼは透析液中の尿素をアンモニアと重炭酸塩とに変換させる吸着透析に使用される。それからこれらの副生成物等を吸着材料、例えば活性炭及びイオン交換材料により取り除くことができ、それにより清浄な透析液を再生させることができる。このタイプの透析システムは水溶性の酵素の層に水を流すことを含むため、ウレアーゼの固定化は少なくとも以下の理由から重要である：（ｉ）固定化しなければ、酵素が流れる水に溶解し、システム全体に送られ、その所望の場所から効率的に洗い流されて、非常に短期間で腎臓透析システムが役に立たなくなる可能性があり；（ｉｉ）同時に、溶解した酵素が患者の体液への拡散により患者へと送り返され、その時点で患者中の任意の尿素が患者の体内でアンモニアへと変換される。
【０００５】
ウレアーゼのその活性に関する安定性、又は尿素の加水分解の触媒能は、共有結合的に固定化した、又は架橋したウレアーゼ材料の機能障害の原因であることが多い。この不安定性が保存期間を短くし、ほとんどの架橋ウレアーゼ材料の消費者製品における使用が実現不可能になる。架橋状態での酵素の安定性を改善させる試みには、凍結乾燥、液体バッファー中での保存、低温保存、又はこれらの方法全ての幾つかの組合せが含まれている。これらの方法はほとんど成功していないことに加えて、これらの方法それぞれに関連するコスト及び論理的複雑性により、多くの場合架橋ウレアーゼの利用（employment）は学術的施行にまで縮小される。
【０００６】
これまで架橋ウレアーゼ材料の安定性の維持にはコストが関わっていた。これに加えて、酵素源として精製ウレアーゼを使用するには法外な費用がかかり得る。架橋ウレアーゼを含む方法及び材料のほとんど全てが精製形態の酵素を利用する。これらの材料を用いて達成される限られた成功は別にして、ウレアーゼの精製に関連する費用が大規模な消費者製品の開発における主な障害をもたらす。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
安定して結合し、液相へと溶解又は置換することのない固定化酵素に対する必要性が存在する。高レベルの酵素活性を保有し、周囲条件下で長期間保存する場合、安定した活性を維持する固定化酵素に対するさらなる必要性が存在する。経済的に実現可能な供給源から生成することができる固定化酵素に対する別の必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の特徴は１つ又は複数の上述の不利点を回避する固定化酵素を提供することである。
【０００９】
本発明のさらなる特徴は共有結合した巨大分子の形成体中に共有結合的に固定化した酵素を含む組成物を提供することである。
【００１０】
本発明の別の特徴は乾燥及び保存することができ、かつ酵素活性を保持することができる、共有結合的に固定化した酵素を含む組成物を提供することである。
【００１１】
本発明のさらなる特徴は化合物（又は物質）をシステムから取り除くためにシステムで利用することができる固定化酵素を提供することである。
【００１２】
本発明の別の特徴は共有結合した巨大分子の形成体中に固定化酵素を含む、透析用の吸着カートリッジを提供することである。
【００１３】
本発明の別の特徴は酵素活性を保持する固定化酵素を製造する方法を提供することである。
【００１４】
本発明のさらなる特徴は共有結合する固定化酵素を製造する方法を提供することである。
【００１５】
本発明の別の特徴は粗（又は未処理（raw））非精製形態の酵素を利用することができる固定化酵素を製造する方法を提供することである。
【００１６】
本発明の付加的な特徴は以下の記載で一部説明され、この記載から一部明らかになり、又は本発明の実施により知ることができる。本発明の特徴は添付の特許請求の範囲で具体的に指摘された要素により実現及び到達することができる。
【００１７】
本明細書中で具体化されると共に、広く記載されるように、本発明の目的に従って上で言及された特徴を達成するために、本発明は共有結合的に固定化した酵素を含み、酵素活性を有する組成物を提供する。組成物は酵素と、ポリマーと、架橋剤との反応生成物を含むことができる。組成物は共有結合した巨大分子の形成体を含むことができ、酵素は架橋剤及びポリマーと共有結合することができる。組成物は乾燥し、それから周囲温度及び圧力下で保存することができ、さらに酵素活性を維持することができる。このタイプの固定化は酵素が液相に溶解するのを防ぐことができる。またこのタイプの固定化は他の化学物質又は生化学物質により酵素がその固定化状態から置換するのを、及び／又は支持機能障害の結果である酵素の移動を防ぐことができる。
【００１８】
本発明は固定化酵素を製造する方法も提供する。該方法はポリマーと酵素との水性混合物を形成すること、架橋剤を該水性混合物に添加し、反応混合物を形成する、添加すること、及び共有結合した巨大分子の形成体において該反応混合物を架橋するのに十分な時間、該反応混合物を維持することを含むことができる。
【００１９】
本発明は化合物（又は物質）を該化合物（又は物質）を含有するシステムから取り除く方法も提供する。該方法は酵素活性を有する共有結合的に固定化した酵素を含む組成物で該システムを処理すること、及び該化合物（又は物質）を実質的に含まないシステムを回収することを含むことができる。該酵素が溶解し該システムへと漏出又は移動しないように、該酵素を固定化することができる。
【００２０】
このため本発明は吸着カートリッジ中に酵素活性を有する共有結合的に固定化した酵素を含む吸着カートリッジを提供する。
【００２１】
上述の概要及び以下の詳細な説明は両方とも例示的なものにすぎず、特許請求されるように本発明を限定するものではないことを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明による酵素固定化方法に関与する化学反応式（chemistry）を示す概略図である。図中英語は以下；Branched Poly:分岐ポリ（エチレンイミン）［ＢＰＥＩ］Ethylen Glycol Diglycidyl Ether: エチレングリコールジグリシジルエーテル［ＥＧＤＧＥ］Urease:ウレアーゼ
【図２】本発明による固定化酵素と比較した粗未固定化酵素（non-immobilized enzyme：固定化する前の酵素）におけるウレアーゼ活性の動態を示すグラフである。図中英語は以下；JMB Reaction Rate(mg%NH3/g min)ＪＢＭ反応速度（ＮＨ３（ｍｇ％）／ｇ／分）Urea Concentration(mg/dL):尿素濃度（ｍｇ／ｄＬ）Composite Reaction Rate(mg%NH3/g min):複合材料反応速度（ＮＨ３（ｍｇ％）／ｇ／分）Jack Bean Meal:タチナタマメ粉末Composite:複合材料
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は酵素活性を有する共有結合的に固定化した酵素を含む組成物に関する。組成物は共有結合した巨大分子の形成体中に酵素、ポリマー及び架橋剤を含むことができる。組成物は、例えば図１に示されるように酵素と、ポリマーと、架橋剤との反応生成物を含むことができる。図１に示されるように、酵素（例えばウレアーゼ）をポリマー（例えば分岐ポリ（エチレンイミン）及び架橋剤（例えばエチレングリコールジグリシジルエーテル）との巨大分子の形成体に共有結合的に固定化することができる。固定化酵素はポリマー及び／又は架橋剤と共有結合することができ、酵素活性を保持することができる。本発明では、２つ以上の酵素、及び／又は２つ以上のポリマー、及び／又は２つ以上の架橋剤を使用する又は存在させることができる。組成物の架橋密度はポリマー上の利用可能な官能基（例えばポリマー上の窒素原子）の％に対して１％〜５０％以上、例えば９％〜５０％であり得る。組成物（好ましくはヒドロゲルである）はその乾燥状態と比較して５０％〜２５０％の水膨潤率を有し得る。
【００２４】
本発明において、組成物は固体であってもよく、ここでは酵素は組成物全体に均一に存在することができる。したがって選択肢として、組成物を例えば製粉又は粉砕により粒子又は粉末状に形成してもよく、それぞれの粒子は、反応の一部であり、架橋剤（複数可）によりポリマーと架橋するために存在している酵素を有する。組成物が固体及び粒子形態であってもよいので、粒子は任意の大きさ及び形状、例えば以下に限定されないが、約１０ミクロン〜約１０ミリメートル、例えば約２０ミクロン〜１ミリメートル、又は２５ミクロン〜７５ミクロンの平均粒径を有し得る。粒子は剛体であり（rigid）及び／又は流動性を有するのが好ましい。粒子形状は均一、不規則、球状、板状（platelet）であり得るか、又は粒子は他の形状を有していてもよい。
【００２５】
固体の場合、組成物は固体組成物の重量を基としてほぼ２５ｗｔ％以下、１５ｗｔ％以下、１０ｗｔ％以下、５ｗｔ％以下、例えば０．１ｗｔ％〜１５ｗｔ％、１ｗｔ％〜１０ｗｔ％、５ｗｔ％〜１０ｗｔ％のような低い含水量又は含湿量を有し得る。
【００２６】
ポリマーはホモポリマー、コポリマー又はターポリマー等であり得る。ポリマーは例えばポリアミンを含み得る。ポリマーは１つ又は複数の以下の特質を有し得る：（ｉ）ポリマー柔軟性又は高いセグメント移動性（segmental mobility）、（ｉｉ）修飾及び架橋を容易にする、ポリマー上の高度な官能基密度、及び／又は（ｉｉｉ）ポリマーの水和。ポリマーは例えば、直鎖ポリ（エチレンイミン）、分岐ポリ（エチレンイミン）、直鎖若しくは分岐ポリ（プロピレンイミン）、ポリ（アリルアミン）、ポリ（ビニルピリジン）、ポリ（ビニルイミダゾール）、ポリ（ｌ−リジン）、又はそれらの任意の組合せを含み得る。
【００２７】
ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）は例えば上記の特質を全て有する。ＰＥＩは分岐形態（ＢＰＥＩ）又は直鎖形態（ＬＰＥＩ）で得ることができる。直鎖形態及び分岐形態の両方ともガラス転移温度を有し（ＬＰＥＩ  Ｔｇ＝−３５℃、ＢＰＥＩ  Ｔｇ＝−５０℃）、このことにより、室温以上でこれらのＰＥＩが高度なセグメント移動性を示すことが示される。
【００２８】
ＰＥＩポリマーはそれらの構造中に高度なアミンを有し、これによりポリマーが容易に修飾される。ＢＰＥＩはおおよそ同数の第１級アミン及び第３級アミンを含有し、これらはポリマーにおけるアミノ基の約半分を占め、アミノ基の総数の残りの半分は第２級アミンである。その一方で、ＬＰＥＩにおけるアミノ基はポリマー鎖のそれぞれの末端にある第１級アミンを除いてほとんどが第２級アミンだけである。様々な部分（moieties）、例えば酵素を第１級アミン基（ＢＰＥＩ）及び第２級アミン基（ＬＰＥＩ）を介してポリマーと容易に結合させることができる。これにより、酵素結合の程度を変え、架橋密度を制御することもできる。
【００２９】
ＰＥＩの付加的な魅力的特徴はＰＥＩが幾つかの酵素特性を高めることができるということである。ＰＥＩ自体は、酵素の感度及び安定性を増大させるだけでなく、溶液中及び凍結乾燥時の酵素の長期保存安定性を高めることができる。さらに、低ｐＨでプロトン化形態のＰＥＩはポリマー骨格上で静電的に反発する正電荷の結果として伸長状態で存在することができ、非常に水溶性であることが示されている。本明細書で使用することができる他のポリマーも同様にこれらの特質を１つ又は複数有し得る。
【００３０】
ポリマーは概して、いかなる分子量（Ｍｗ）又は数平均分子量（Ｍｎ）にも限定されない。ポリマーは例えば、約１キロダルトン（ｋＤａ）〜約１０００ｋＤａの範囲の平均Ｍｗ、及び約１ｋＤａ〜約１００ｋＤａの範囲のＭｎを有し得る。ＢＰＥＩ（Sigma-Aldrichから入手可能）は例えば、約１．３ｋＤａ、約２．０ｋＤａ、約２５ｋＤａ、又は約７５０ｋＤａの平均Ｍｗ（ＬＳによる）、及び約１．２ｋＤａ、約１．８ｋＤａ、約１０ｋＤａ、又は約６０ｋＤａのＭｎ（ＧＰＣによる）を有し得る。他の分子量及び数平均分子量が可能である。
【００３１】
ポリマーは、例えば以下に限定されないが、組成物の約１重量パーセント〜約９０重量パーセント、約５重量パーセント〜約７５重量パーセント、約１０重量パーセント〜約５０重量パーセント、又は約２５重量パーセント〜約３５重量パーセントの量で組成物中に存在し得る。
【００３２】
架橋剤は酵素及び／又はポリマーと共有結合を形成することができる二官能性試薬又は多官能性試薬を含み得る。架橋剤は例えば、１つ又は複数のエポキシ基、１つ又は複数のアクリレート基、１つ又は複数のハロゲン基、１つ又は複数のカルボキシル基、１つ又は複数のアルデヒド基、又はそれらの任意の組合せを含むことができる。好適な架橋剤の例はヘテロ二官能性ポリエチレングリコール、ホモ二官能性ポリエチレングリコール、又はそれらの組合せである。
【００３３】
架橋剤は柔軟性又はセグメント移動性を有し得る。柔軟性を有する架橋剤は酵素と共有結合するより良い機会を有し得ると同時に、酵素が基質に対する酵素活性部位を維持し、提示することを可能にする。架橋剤は例えば、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート、テトラ（エチレングリコール）ジアクリレート、ポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテル、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ジブロモへキサン、グルタルアルデヒド、エピクロロヒドリン、又はそれらの任意の組合せを含み得る。
【００３４】
架橋剤はポリマー及び／又は酵素の少なくとも一部と架橋する量で、例えば組成物の重量を基として約１ｗｔ％〜２０ｗｔ％存在し得る。
【００３５】
酵素は架橋剤及び／又はポリマーと共有結合することができる。いずれの酵素も本発明に使用することができる。好適な酵素の例としては、インベルターゼ、グルコシダーゼ、ラクターゼ、マルターゼ、アミラーゼ、ヒドロラーゼ、ウレアーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、イソメラーゼ、オキシダーゼ及びデヒドロゲナーゼが挙げられる。より具体的な例としては、グルコースオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、サルコシンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、クレアチナーゼ、クレアチニナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、又はそれらの任意の組合せが挙げられる。１つ又は複数の酵素の混合物も、共有結合した巨大分子の得られた形成体が２つ以上の酵素活性を有することができるように該方法で活用することができる。
【００３６】
本発明では、酵素を精製することなく、粗酵素材料又は未処理酵素材料を固定化することができ、またこの粗酵素材料又は未処理酵素材料を本発明の方法により固定化し、本発明の固定化酵素を形成することができ、ここでは該酵素は本明細書に記載のように架橋剤によりポリマーと架橋する。酵素は精製形態又は分画形態の酵素を含むことができるか、又は粗形態の酵素を含むことができる。粗形態の酵素はより経済的な方法及び組成物を提供することができる。例えば、酵素は天然源、例えばこれに限定されないがタチナタマメ（カナバリア・エンシホルミス（Canavalia ensiformis））に由来するウレアーゼを含み得る。ウレアーゼは他の天然源、例えばダイズ（グリシン・マックス（Glycine max））、他のマメ科植物及び植物、細菌（例えばバシラス・パステウリイ（Bacilluspasteurii））、又は酵母に由来していてもよい。精製形態のウレアーゼは例えば分画形態又は結晶化形態を含み得る（Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri）。粗酵素材料又は未処理酵素材料を使用する場合、この粗酵素材料又は未処理酵素材料はＳＵ／ｇで測定される酵素活性によって特徴付けることができる。例えば、粗酵素材料又は未処理酵素材料は、約１００ＳＵ／ｇ〜１０００ＳＵ／ｇ（例えば１００ＳＵ／ｇ〜５００ＳＵ／ｇ、１５０ＳＵ／ｇ〜３００ＳＵ／ｇ）の範囲の酵素活性を有するような酵素活性を有し得るか又は特徴とし得る。酵素材料が精製形態又は結晶化形態又は分画形態である場合、その純度は酵素活性によって特徴付けることができ、例えば２０００ＳＵ／ｇ〜６０００ＳＵ／ｇ以上、例えば２５００ＳＵ／ｇ〜５５００ＳＵ／ｇの範囲であり得る。本発明により、粗／未処理酵素材料、及び精製形態に関して本明細書で記載のように酵素安定性が達成されることは驚くべきことであった。
【００３７】
組成物は固定化酵素（ここで酵素が酵素活性を保持する）を含むことができる。固定化酵素は例えば、未固定化酵素と比較して約９０パーセント〜約１００パーセントの活性、又は少なくとも５０パーセント、少なくとも４０パーセント、少なくとも２５パーセント、又は少なくとも１０パーセント（例えば１０％〜９５％、１５％〜９０％、２０％〜８５％、２５％〜８０％、３０％〜７５％、３５％〜７０％、４０％〜６５％、４５％〜６０％）の酵素活性を保持することができる。酵素は組成物の約０．５重量パーセント〜約８０重量パーセント、約１０重量パーセント〜約７５重量パーセント、約２０重量パーセント〜約６０重量パーセント、又は約３０重量パーセント〜約５５重量パーセントの量で存在し得る。固定化ウレアーゼを含む組成物の酵素活性の例を図２に示す。
【００３８】
図２では、固定化ウレアーゼ（複合材料）の酵素活性及び組成物を作製するのに利用される粗ウレアーゼ（すなわち未固定化）（タチナタマメ粉末）の酵素活性を示す。固定化酵素組成物は同一の酵素動態を示し（すなわちＫｍ  ＪＢＭ＝複合材料）、粗ウレアーゼより早く飽和状態になることはない。図２は固定化ウレアーゼがその酵素活性の少なくとも約３０％〜４０％を保持することも示している。
【００３９】
組成物は共有結合した巨大分子の形成体中に少なくとも１つの酵素と、少なくとも１つのポリマーと、少なくとも１つの架橋剤との反応生成物を含むことができ、ここで反応生成物は架橋剤及びポリマーにおける１つ又は複数の官能基間の反応、並びに架橋剤及び酵素における１つ又は複数の官能基間の反応から得られる。また図１を参照すると、反応生成物は、例えば架橋剤（ＥＧＤＧＥ）の第１のエポキシ基とポリマー（ＢＰＥＩ）のアミン基との間、架橋剤の第２のエポキシ基と酵素（ウレアーゼ）のアミン基との間の反応から得ることができる。
【００４０】
組成物はヒドロゲルであってもよい。本発明の目的のために、ヒドロゲルは不水溶性であり、かつ水中で膨潤性であるポリマー鎖のネットワークとして規定することができる。ヒドロゲルは相当量の水を含有することができる、例えばヒドロゲルの重量を基として９９ｗｔ％を超える水を含有することができる。
【００４１】
組成物は乾燥することができる。組成物は例えば、組成物の重量を基として約０ｗｔ％〜約２５ｗｔ％、１５ｗｔ％未満、１０ｗｔ％未満、又は約０ｗｔ％〜１５ｗｔ％、０．０１ｗｔ％〜５ｗｔ％、０．１ｗｔ％〜１ｗｔ％、０．５ｗｔ％〜１０ｗｔ％、２ｗｔ％〜８ｗｔ％、又は５ｗｔ％〜１０ｗｔ％の含水量（又は含湿量）まで乾燥することができる。固定化酵素は乾燥した場合に酵素活性を保持することができ、乾燥状態で保存した場合に、この活性を維持することができる。組成物を例えば、周囲温度及び圧力（例えば２５℃、１ａｔｍ）で少なくとも１週間、少なくとも３０日間、少なくとも６０日間、少なくとも９０日間、又は少なくとも６ヶ月間以上保存した場合に、０日目（形成時）の初期酵素活性と比較して、１０パーセント超、２５パーセント超、５０パーセント超、８０パーセント超、９０パーセント超、又は約１００パーセントの酵素活性を保持することができる。
【００４２】
組成物は粒子等の形態で添加物をさらに含むことができる。添加物は例えばポリマー／酵素／架橋剤の組成物を吸着することができる材料を含み得る。例えば組成物は任意で活性炭粒子を含み得る。活性炭粒子の添加により例えば、巨大分子組成物の密集度及び／又は剛性を変更することができる。炭素粒子がより多く存在すれば、組成物がより高密度かつ剛体になる。活性炭は例えばポリマーを吸着することにより、共有結合した巨大分子の形成体を吸着することができる。活性炭は例えば、約１ミクロン〜約１００ミクロン、約５ミクロン〜約８０ミクロン、又は約１０ミクロン〜約５０ミクロンの平均粒径を有し得る。活性炭又は他の充填材料又は吸着材料は例えば、組成物の重量を基として約０重量パーセント〜約５０重量パーセント、約１重量パーセント〜約３０重量パーセント、約５重量パーセント〜約４０重量パーセント、又は約１０重量パーセント〜約３０重量パーセントの量で組成物中に存在し得る。
【００４３】
組成物は粒子等の形態でイオン交換添加物、例えばアニオン交換粒子及び／又はカチオン交換粒子をさらに含むことができる。組成物は例えばリン酸ジルコニウム粒子及び／又は酸化ジルコニウム粒子を含むことができる。イオン交換粒子は例えば、組成物の重量を基として約０重量パーセント〜約５０重量パーセント、約１重量パーセント〜約３０重量パーセント、約５重量パーセント〜約４０重量パーセント、又は約１０重量パーセント〜約３０重量パーセントの量で組成物中に存在し得る。例えば固定化ウレアーゼと組合せたイオン交換材料は腎臓透析システムにおける使用のための組成物を提供することができる。透析液に存在するアニオン及び／又はカチオン、例えばＮＨ４＋、Ｃａ＋及び／又はＰ−をイオン交換粒子により吸着し、透析液から取り除くことができる。
【００４４】
本発明はさらに、共有結合した巨大分子の形成体において固定化酵素を製造する方法であって、該酵素が酵素活性を有し、これまでに開示されたように長期間（例えば少なくとも３０日間）活性を保持することができる、方法に関する。該方法は任意に制御量の架橋密度で酵素とポリマー及び／又は架橋剤とを共有結合させることができる。
【００４５】
固定化酵素を製造する方法は、少なくとも１つのポリマーと少なくとも１つの酵素との水性混合物を形成すること、及び少なくとも１つの架橋剤（複数可）を水性混合物に添加して、反応混合物を形成する、添加すること、及び共有結合した巨大分子の形成体に酵素を固定化させるように反応混合物を維持することを含むことができる。該方法は初めにポリマーを水溶液中に溶解すること、次に酵素を水溶液に添加すること、その後架橋剤を添加して、反応混合物を形成する、添加することを含むことができる。任意の他の添加順序を使用することができる。
【００４６】
反応混合物において、架橋剤はポリマー及び／又は酵素と反応する官能基を１つ又は複数含むことができる。本発明の目的のために、「官能基」という用語には共有結合的及び／又は非共有結合的な相互作用が起こり得る化学構造が全て含まれる。１つ又は複数の官能基は例えば、エポキシド、アクリレート、ハロゲン化物、カルボキシル、アルデヒド又はそれらの任意の組合せを含み得る。図１で例示的に示されるように、架橋剤（ＥＧＤＧＥ）の第１のエポキシ基はポリマー（ＢＰＥＩ）のアミン基と反応することができ、架橋剤の第２のエポキシ基は酵素（ウレアーゼ）のアミン基と反応することができる。エポキシ基は例えばリジンに存在する第１級アミン、及び／又は例えばグルタミン、アルギニン、アスパラギン及び／又はヒスチジンに存在する第２級アミン又は第３級アミンと反応することができる。エポキシドは例えば、求核剤の影響を受けやすいことがあり、エポキシ基が反応することができる他の候補物質には例えば、チオール基及びカルボキシル基が含まれる。
【００４７】
また図１を参照すると、固定化酵素、例えば固定化ウレアーゼを製造する方法が示される。図１の反応図によって示されるように、分岐ポリ（エチレンイミン）ポリマー（ＢＰＥＩ）と、エチレングリコールジグリシジルエーテル（ＥＧＤＧＥ）と、ウレアーゼとを含む混合物を反応させ、共有結合した巨大分子の形成体を生成させる。反応１では、２つの化学的に活性のある基はＢＰＥＩのアミノ基（孤立電子対によりアミノ基が求核剤となる）、及びＥＧＤＧＥのエポキシ基であり得る。求核アミンは第１のエポキシ基の少なくともヒンダード炭素原子を攻撃する。反応２では、第２のエポキシ基はこの反応系において他の利用可能なアミン基と反応する。酵素によって供給される他の官能基に加えて、これらの一部はウレアーゼ由来のリジン残基のアミン基であり得る。
【００４８】
これらの２つの反応の順番を入れ替えてもよい。言い換えれば、エポキシ基を初めに酵素由来のアミンと、その後でポリマーと反応させることができる。さらに、架橋は酵素分子間又はＢＰＥＩ鎖間で起こってもよい。したがって架橋剤を添加する前に任意で十分混合された均質溶液が達成されていてもよい。
【００４９】
ポリマーの選択に応じて、場合によってはポリマーは水に易溶性でなくてもよい。酸、例えば塩酸（ＨＣｌ）を水溶液に添加すること、及び／又は熱を加えることによってポリマーを水により可溶性にすることができる。ポリマーが溶解したら、酵素を添加することができる。酵素を安定化させることができる静電複合体をポリマーと酵素との間で形成することができる。必要に応じて、酵素を添加する前に水溶液を略室温まで冷却することができる。酵素をより高い温度若しくはより低い温度、又は酵素が活性を保つ任意の温度範囲、例えば約２０℃〜約５０℃の温度範囲で添加することができる。酵素をポリマー溶液に添加し、例えばマグネティックスターラを使用して混ぜることができる。ポリマーと酵素溶液とを混合すると、溶液は粘性になり、より強力な混合技法及び／又は手動による混合が必要になる場合がある。
【００５０】
１つの選択肢として、ポリマーと酵素との均質ブレンドが得られた後に、架橋剤を添加してもよい。ポリマーと酵素とを混ぜる前、混ぜている間、及び／又は混ぜた後に架橋剤を添加してもよい。この混合物を例えば激しい混合（vigorous mixing）により混ぜ合わせ、反応混合物を形成することができる。それから反応混合物を表面、例えばノンスティック（non-stick：非粘性）表面上に注ぎ、硬化させる（cure）ことができる。反応混合物は酵素が活性を維持する任意の温度範囲、例えば約２０℃〜約５０℃の温度範囲、又は周囲温度（例えば２５℃）で硬化し得る。硬化時間は例えば１時間未満〜約２４時間、又は約２時間〜４時間の範囲であり得る。混合物が硬化したら、例えばブレンダーを使用して材料をより小さい粒子に粉砕することができる。
【００５１】
共有結合した巨大分子の形成体中に固定化酵素を含む粉砕粒子を乾燥することができる。粉砕粒子を例えば周囲圧力（例えば１ａｔｍ）、又は真空下で乾燥することができる。粉砕粒子を真空オーブンで、例えば約−５インチＨｇ〜約−２７インチＨｇ、又は約−２５インチＨｇの真空圧力で乾燥することができる。粒子は例えば約１％〜約２５％、例えば約１０％の相対湿度を有するデシケーターでも乾燥することができる。さらなる例としては、固体の場合、本発明の組成物における固定化酵素は、材料を乾燥するために例えば粉砕粒子の形態の本発明の固定化酵素組成物固体をカラムに入れ、ポンプによりアルゴン又は他の不活性ガスをカラムに通すことにより乾燥することができる。これは１時間〜１２時間以上起こり得る。この特定の手順又は同様の手順を、粉砕粒子の含湿量又は含水量が組成物の重量を基として１５ｗｔ％以下になるまで行うことができる。この初期乾燥は固体が形成された直後、又は材料が形成されて１時間又は５時間以内に行われるのが好ましく、これにより含湿量又は含水量が１５ｗｔ％以下まで低減する。不活性ガスと共にカラムを使用した後、他の乾燥技法、例えば真空オーブン、デシケーター等を、含湿量又は含水量をさらに低減するのに使用することができる。上述のように、本発明の固体組成物の乾燥は固体組成物の調製の数時間以内に行われるのが好ましく、これにより１５ｗｔ％以下の含湿量が達成される。そうすることにより、より高い開始酵素活性を達成することができる。架橋剤を共有結合した巨大分子の形成体において所望の程度の架橋が得られる任意の量で水性混合物に添加することができる。幾つかの製剤において、過度の架橋は酵素の活性及び／又は安定性に影響を与える可能性がある。高度な架橋により、例えば酵素活性が低減した及び／又は安定性が低下した固定化酵素が生成される可能性がある。架橋剤は例えば約０．５パーセント〜約５０パーセント、約５パーセント〜約３０パーセント、約１０パーセント〜約２０パーセント、約４０パーセント、約４０パーセント未満、約２０パーセント又は約１０パーセントの架橋密度を得る量で添加することができる。
【００５２】
これまでに述べたように、該方法はさらに付加的な添加物、例えば粒子を混合物に混ぜることを含んでいてもよい。付加的な添加物は例えばポリマー／酵素／架橋剤の組成物を吸着することができる材料を含むことができる。例えば、活性炭を混合物に添加し、混ぜて、均質な混合物を提供することができる。活性炭粒子の添加により例えば、巨大分子組成物の密集度及び／又は剛性を変更することができる。イオン交換材料、例えばリン酸ジルコニウム及び／又は酸化ジルコニウムを混合物に添加することができる。
【００５３】
該方法は共有結合した巨大分子の形成体において固定化酵素を調製すること、巨大分子を乾燥すること、及び固定化酵素を保存することを含んでいてもよい。固定化酵素を乾燥状態、周囲温度及び圧力（例えば２５℃、１ａｔｍ）で保存し、さらに酵素活性を保持することができる。調製日の活性と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％の酵素活性を保つように、固定化酵素は少なくとも３０日間、例えば２ヶ月間〜６ヶ月間、酵素活性を保持することができる。表１は本発明の方法によって調製され、実施例１において詳述され、かつ周囲温度及び圧力で保存された固定化ウレアーゼ組成物で測定されたウレアーゼ活性の結果を示す。
【００５４】
表１に示すように、調製初日（０日目）、及びその後１日ごとに数日、ウレアーゼ活性を測定した。データにより示されるように、活性は完全に安定性を保っており、８２日目であっても０日目で測定された酵素活性と少なくとも同程度の酵素活性を保持していた。
【００５５】
表１  ウレアーゼ活性     
調製後の日数      材料の活性（ＳＵ／ｇ）        
０                ３０．３９        
１                ２７．２８        
２                ３２．１７        
５                ３２．７１        
６                ３２．１９        
８                ３３．３７        
１２              ３２．８８        
１５              ２９．１        
２０              ３１．３８        
２９              ４１．３３        
３６              ２９．０５        
５１              ３９．０７        
６８              ３０．０６        
８２              ３４．８１        
１０３            ３６．０８        
１２６            ３９．２７        
１５９            ３２．７        
２９４            ４８．１        
３９４            ３７        
４６０            ４０   
【００５６】
本発明の方法において、好ましくはポリマー及び酵素が単一の相、例えば水相で架橋され、ここで酵素（例えばウレアーゼ）は水相に溶解することができ、ポリマーは同じ水相において反応する。ポリマーは水溶性であり得る。
【００５７】
本発明はさらに、本明細書で記載のように本発明の固定化酵素を利用して、化合物（又は物質）を化合物（又は物質）を含有するシステムから取り除く方法に関する。該方法は共有結合的に固定化した酵素を含み、酵素活性を有する組成物でシステムを処理することを含み得る。組成物は共有結合した巨大分子の形成体における酵素と、ポリマーと、架橋剤との反応生成物であり得る。システムは例えば透析システムを含んでいてもよく、化合物（又は物質）は例えば尿素を含んでいてもよく、酵素は例えばウレアーゼを含んでいてもよい。該方法はさらに、システムを例えば１つ又は複数のイオン交換材料で処理することを含み得る。
【００５８】
吸着カートリッジは吸着カートリッジ中に本明細書に記載の組成物を含んでいてもよい。組成物は例えば、共有結合的に固定化した酵素を含み、酵素活性を有していてもよい。組成物は共有結合した巨大分子の形成体中に酵素と、ポリマーと、架橋剤との反応生成物を含んでいてもよい。吸着カートリッジは１つ又は複数の層、例えば２つの層を含んでいてもよく、少なくとも１つの層は本発明の組成物を含むことができる。組成物は例えば固定化ウレアーゼを含むことができる。組成物はさらに、形成体中に活性炭及び／又は他の添加物を含むことができる。
【００５９】
本発明は本発明の組成物を使用することにより、本発明による酵素の固定化が効果的であり、本明細書で論考されるように架橋によって達成されるので、透析（例えば吸着）カートリッジの酵素層上にアルミナ層又は同様の層を有する必要性を回避することができる。このため、本発明の一態様には、本発明の組成物を（例えば層として）含み、酵素含有セクション又は層に隣接したアルミナ層又は同様の層を含まない（又は必要としない）透析カートリッジ又は吸着カートリッジが含まれる。
【００６０】
本発明の組成物を任意の酵素又は固定化酵素の代わりに使用することができる。本発明の組成物を、米国特許第６，６２７，１６４号、同第６，８７８，２８３号、同第７，０３３，４９８号又は公開済みの米国特許出願第２００６／０１４０８４０号（本明細書中で参照により援用される）に記載された吸着カートリッジにおいて酵素層（例えばウレアーゼ）として使用することができる。
【００６１】
組成物を透析カートリッジ又はデバイスにおける構成要素として使用することができる。透析カートリッジは本発明の組成物を含有するカートリッジであってもよく、ここで組成物は少なくとも１つの層として存在し、透析カートリッジはさらに吸着材料の他の層（複数可）を少なくとも１つ含むことができる。
【００６２】
本発明の組成物を酵素（例えばウレアーゼ）を使用する任意の用途で使用することができ、ウレアーゼ若しくは酵素層として、又は公開済みの米国特許出願第２００２−０１１２６０９号及び米国特許第６，８７８，２８３号に記載のカートリッジ、並びにSorbのＲＥＤＹカートリッジ（例えば"Sorbent DialysisPrimer,"（COBERenal Care, Inc. Sep. 4, 1993 edition）、及び"Rx Guide to Custom Dialysis,"（COBE Renal Care, Inc. Revision E,Sep., 1993）を参照されたい）（全てその全体が参照により本明細書中に援用される）のような吸着カートリッジにおける付加的なウレアーゼ若しくは酵素層として使用することができる。これらの公開済みの文献／出願においてウレアーゼ等の酵素を使用する実施形態は全て本願の実施形態であり、ここでは本発明の組成物が使用される。例示的な目的にすぎないが、管状ハウジング又はカートリッジ内の様々なフィルタ媒体（filter media）セクションを本発明の組成物と共に使用することができる。ハウジング又はカートリッジは粒状活性炭セクション、固定化酵素セクション、任意で粉末アルミナ（Ａｌ２Ｏ３）セクション、リン酸ジルコニウム、及び／又は酢酸塩形態の含水酸化ジルコニウムと炭酸ジルコニウムナトリウムとの混合物又は炭酸ジルコニウムナトリウム単独を含むセクションのような吸着材料を含むことができる。透析カートリッジは１つ又は複数の層又は帯（zones）として本発明の組成物を含有するカートリッジであってもよく、ここで透析カートリッジは、第１の末端から始まり、第２の末端で終わる配置を含む複数のフィルタ媒体セクション（又は層）、活性炭セクション、固定化酵素セクション、任意で粉末アルミナセクション、リン酸ジルコニウムセクション、及び炭酸ジルコニウムナトリウム又は酢酸塩形態の含水酸化ジルコニウムと炭酸ジルコニウムナトリウムとの混合物のセクションを有する。血液透析のために、透析液用の基材として高度に精製させた水を使用する場合を除いて、水道水から塩素を取り除くのに適合させたフィルタ媒体が好ましい。フィルタ媒体は活性炭であり得る。重金属、酸化剤及びクロラミンに結合させるフィルタ媒体として活性炭を使用することができる。酵素変換により尿素を炭酸アンモニウムへと変換させるのに、ウレアーゼ等の固定化酵素をフィルタ媒体中に使用することができる。アルミナ（Ａｌ２Ｏ３）、活性炭、アニオン交換樹脂及び／又は珪藻土を吸着材として使用することができる。酵素を使用する場合、塩素が酵素を不活性化する可能性があるため、固定化酵素フィルタ媒体の前に塩素を取り除くために活性炭を使用することができる。水道水中のアンモニア、カルシウム、マグネシウム、カリウム及び他のカチオン、並びに毒性のある微量金属に結合させるのに、カチオン交換材料を使用することができる。これらのフィルタ媒体の別の機能は尿素加水分解により炭酸塩を重炭酸塩へと変換させることであり得る。このようなカチオン交換材料には、リン酸ジルコニウム、リン酸チタン又はゼオライトが含まれ得る。アニオン交換フィルタ媒体はリン酸塩、フッ化物及び他の重金属に結合する。アニオン交換フィルタ媒体の副生成物には酢酸塩、及び患者の血液の代謝性アシドーシスも補正する重炭酸塩が含まれ得る。このようなフィルタ媒体に��、酢酸塩形態の含水酸化ジルコニウム、含水シリカ、酸化第二スズ、酸化チタン、アンチモン酸、含水酸化タングステン又は炭酸ジルコニウムナトリウムが含まれ得る。
【００６３】
本発明の性質を説明するのに以下の実施例が与えられる。しかしながら本発明はこれらの実施例に記載される特定の条件又は詳述に限定されないことを理解されたい。
【実施例】
【００６４】
本実施例において、ウレアーゼ活性を以下の試薬／手順に従って測定する：
試薬
硫酸アンモニアストック溶液（２０００ｍｇ％  ＮＨ３−Ｎ）：Ｈ２Ｏに９４．３４グラムの（ＮＨ４）２ＳＯ４を溶解する。濃Ｈ２ＳＯ４を１滴添加する。Ｈ２Ｏで１リットルにする。
フェノール試薬：Ｈ２Ｏに５０グラムのフェノールと０．２５グラムのニトロプルシドナトリウム（ニトロフェリシアン化ナトリウム）とを溶解し、Ｈ２Ｏで１リットルにする。
次亜塩素酸試薬：約５００ｍｌのＨ２Ｏに２５グラムのＮａＯＨを溶解する。２０ｍｌの１０％次亜塩素酸ナトリウム漂白剤を添加し、Ｈ２Ｏで１リットルにする。
ＮＨ３−Ｎスタンダード（１０ｍｇ％、１５ｍｇ％及び２０ｍｇ％）：０．５ｍｌ、０．７５ｍｌ及び１ｍｌの硫酸アンモニアストック溶液（２０００ｍｇ％）をそれぞれ１００ｍｌ容のメスフラスコにピペッティングし、Ｈ２Ｏで一定容量にする。
手順
スダンダード、試料及びブランクを全て三連で行う。
１ｍｌのフェノール試薬を全ての試験管に加える。
２０ｕｌのＨ２Ｏをブランクとしてそれぞれの試験管に加える。
２０ｕｌのスタンダートをそれぞれの試験管に加える。
混合する。
１ｍｌの次亜塩素酸試薬を添加し、ボルテックスする。
室温で２０分間静置する。
８ｍｌのＨ２Ｏを添加し、３回ボルテックスする。
参照キュベットにおいてブランクを使用して６３５ｎｍで吸光度を読み取る（規定通り）。
試料の吸光度をスタンダードの吸光度と比較することにより、試料中のＮＨ３−Ｎ（ｍｇ％）を算出する。
【００６５】
実施例１：架橋密度が１０％であるＢＰＥＩ／ＥＧＤＧＥ／ウレアーゼ／炭素の組成物の調製（バッチ１５）。
酸を撹拌中のポリマーに非常にゆっくりと（液滴で）添加することにより、１０ｇのＢＰＥＩを２５ｍＬの５Ｍ  ＨＣｌ中に溶解した。これには約３０分〜４５分かかった。全ての酸を添加したら、ポリマー溶液を室温に冷却されるまで撹拌した。これには約１０分かかった。
【００６６】
１５ｇのタチナタマメ（ＪＢＭ）を５ｇの活性炭粉末と混ぜ合わせた。それからこのブレンドを冷却したポリマー溶液に添加し、撹拌した。或る特定の時点において、マグネティックスターラは撹拌させるのに十分な強さではなかった。そのため混合物を泡だて器としてスパチュラを用いて激しく撹拌した。
【００６７】
均質になったら、１．７５ｍＬのＥＧＤＧＥ（TCI America, Polysciences, SPI Supplies）を添加した。この架橋剤に関する一般名称はＱｕｅｔｏｌ  ６５１である。スパチュラを用いて、再び混合物を激しく混合した。
【００６８】
それから混合物をノンスティック表面（すなわちプラスチックのバケット蓋）の上に注ぎ、周囲条件でおよそ３時間硬化させた。それから組成物をブレンダーに入れ、小さい粒子へと粉砕した。
【００６９】
それから粒子を２５℃に保った真空オーブンに入れ、−２５インチＨｇ（真空）で２４時間乾燥した。それから粒子を真空オーブンから取り出し、相対湿度が約１０％であるデシケーターにさらに２４時間置き、完全に乾燥させた。
【００７０】
乾燥重量は３２ｇ〜３４ｇであった。重量が高くなったら、さらに乾燥させるために、材料をデシケーターに戻した。
【００７１】
架橋密度を算出すると、およそ１０％であった。バッチ１５のウレアーゼ活性を上記及び実施例４で詳述される手順によって測定した。
【００７２】
結果：
【００７３】
表２
スタンダード    １        ２            ３            平均          標準偏差  
１０      ０．３１７    ０．３１２    ０．３１８    ０．３１６      ０．００３５１５      ０．４７９    ０．４８９    ０．４８５    ０．４８４      ０．００７０２０      ０．６６１    ０．６３３    ０．６５８    ０．６５１      ０．０１９８
【００７４】
表３  
スタンダード  １          ２          ３          平均          標準偏差  
バッチ１５    １．０５２  １．０４３  １．０３６  １．０４４    ０．００８０   
【００７５】
バッチ１５試料におけるＮＨ３（ｍｇ％）：３０．３９
材料の活性：３０．３９ＳＵ／ｇ
６３５ｎｍでの吸光度。
【００７６】
実施例２：架橋密度が２０％であるＢＰＥＩ／ＥＧＤＧＥ／ウレアーゼ／炭素の組成物の調製（バッチ１３）。
３．５ｍＬのＥＧＤＧＥを使用する以外は実施例１のバッチ調製に従った。架橋密度を算出すると、およそ２０％であった。
【００７７】
表４       
スタンダード    １      ２            ３            平均          標準偏差  
１０      ０．３２７    ０．３２１    ０．３２２    ０．３２３    ０．００４２  １５      ０．４８９    ０．４９１    ０．４９５    ０．４９２    ０．００１４  ２０      ０．６６      ０．６６６    ０．６６１    ０．６６２    ０．００４２  
【００７８】
表５       
スタンダード  １          ２            ３            平均          標準偏差  
バッチ１３    １．５４８  １．５８４    １．５６３    １．５６５    ０．０１８０
【００７９】
バッチ１３試料におけるＮＨ３（ｍｇ％）：４６．８８
材料の活性：２３．４４ＳＵ／ｇ
６３５ｎｍでの吸光度。
【００８０】
実施例３：架橋密度が４０％であるＢＰＥＩ／ＥＧＤＧＥ／ウレアーゼ／炭素の組成物の調製（バッチ１１）。
７ｍＬのＥＧＤＧＥを使用する以外は実施例１のバッチ調製に従った。架橋密度を算出すると、およそ４０％であった。
【００８１】
表６        
スタンダード    １          ２            ３            平均          標準偏差  
１０          ０．３１４    ０．３０６    ０．３１２    ０．３１    ０．００５７１５          ０．４９１    ０．４９２    ０．４９４    ０．４９２  ０．０００７２０          ０．６３２    ０．６７１    ０．６７６    ０．６５２  ０．０２７６
【００８２】
表７       
スタンダード    １        ２            ３            平均          標準偏差  
バッチ１１    ０．４６９  ０．４６２    ０．４６８    ０．４６６    ０．００３８
【００８３】
バッチ１３試料におけるＮＨ３（ｍｇ％）：１４．５１
材料の活性：７．２５ＳＵ／ｇ
６３５ｎｍでの吸光度。
【００８４】
実施例４：ウレアーゼ活性を測定するためのプロトコル。
２．０ｇのＢＰＥＩ／ＥＧＤＧＥ／ウレアーゼ／炭素の組成物を撹拌バーの入った１００ｍＬ容のメスフラスコに秤量した。１０ｍＬの酢酸ナトリウム／塩化ナトリウムバブラー（bubber）溶液をフラスコに加えて、撹拌を始めた。
【００８５】
１５ｍＬのリン酸尿素溶液をフラスコに加えた。ちょうど５分後、１５ｍＬの１．０Ｍ  ＨＣｌをフラスコに加え、反応を止めた。撹拌バーを取り出し、フラスコを脱イオン水で一定容量まで満たした。撹拌バーを交換し、内容物を十分に混合した。
【００８６】
０．４５ミクロン径のシリンジフィルターを、プランジャーを取り外した３ｍｌ容のシリンジに取り付けた。シリンジをフラスコからの溶液で満たした。シリンジにプランジャーを付け替え、フィルターを通して液体を押し出し、無菌（clean）容器に回収した。濾過溶液からの２０ｕＬアリコートを、溶液中のＮＨ４＋含有量を試験するのに使用した。
【００８７】
実施例５：アルブミン溶液中のウレアーゼ漏出の測定。
ウレアーゼ−ストリップ溶液を、ｐＨ７．０でウシアルブミンを３００ｍＬのリン酸緩衝溶液に添加することにより調製した。アルブミンを最終濃度が１５０ｍｇ％になるように添加した。
【００８８】
２．０ｇのＢＰＥＩ／ＥＧＤＧＥ／ウレアーゼ／炭素の組成物を１００ｍＬ容のメスフラスコに秤量することにより溶液Ａを調製した。それからフラスコをウレアーゼ−ストリップ溶液で一定容量まで満たし、２０分間撹拌した。１０ｍＬアリコートを取り、新たな１００ｍＬ容のフラスコに加えた。
【００８９】
５ｍＬのリン酸尿素を添加し、ちょうど５分間溶液を撹拌することにより１０ｍＬの溶液Ａを含有する新たなフラスコ中で溶液Ｂを調製した。それから、１０ｍＬの１Ｍ  ＨＣｌを添加し、反応を止めた。撹拌バーを取り出し、フラスコをｄＨ２Ｏで一定容量まで満たした。
【００９０】
ＮＨ４＋含有量を上記のように測定した。
算出：
溶液Ｂの活性＝ＮＨ４＋（ｍｇ％）／１００ｍＬ
溶液Ａの活性＝（溶液Ｂの活性）×１０ｍＬ／２．０ｇの材料
ウレアーゼの漏出＝（溶液Ａの活性）／１００ｍＬ
結果：
漏出＝０．００１４８ＳＵ／ｇ／ｍＬ
【００９１】
実施例６：アルブミン溶液中のウレアーゼ活性の測定。
ウレアーゼストリップ溶液（リン酸緩衝液＋１５０ｍｇ％のアルブミン）中に１．５ｇの尿素を溶解することによりリン酸尿素溶液を調製した。
【００９２】
２．０ｇのＢＰＥＩ／ＥＧＤＧＥ／ウレアーゼ／炭素の組成物を１００ｍｌ容のメスフラスコに秤量した。１５ｍｌのリン酸尿素溶液を添加し、撹拌した。ちょうど５分後、１５ｍＬのＨＣｌを添加し、反応を止めた。撹拌バーを取り出し、フラスコをｄＨ２Ｏで一定容量まで満たした。２０ｕＬアリコートを、ＮＨ４＋（ｍｇ％）を試験するのに使用した。
【００９３】
表８    
スタンダード    １          ２            ３            平均          標準偏差  
１０          ０．３０５    ０．３０８  ０．３０１    ０．３０５    ０．００２１１５          ０．４７７    ０．４６８  ０．４７２    ０．４７２    ０．００６４２０          ０．６３７    ０．６２７  ０．６３３    ０．６３２    ０．００７０
【００９４】
表９       
スタンダード    １            ２            ３            平均          標準偏差
バッチ１３    １．５４８    １．５８４    １．５６３    １．５６５  ０．０１８１
【００９５】
結果：
バッチ１３試料におけるＮＨ３（ｍｇ％）：１４．５１
材料の活性：７．２５ＳＵ／ｇ
【００９６】
実施例７：
これらの一連の実施例において、実施例１を言及された量の各構成要素を除いて本質的に繰り返し、さらに使用するウレアーゼはSigma-Aldrichから入手し、約２７００ＳＵ／ｇ〜５４００ＳＵ／ｇの酵素活性を有することを特徴とし得る精製形態であった。共有結合した巨大分子の形成体中に少なくとも１つの酵素と、少なくとも１つのポリマーと、少なくとも１つの架橋剤とを有する組成物の効果を測定するために、この反応で使用する架橋剤の量、及び／又はアミン含有ポリマー、及び／又は含水量を変えた。以下の結果で分かるように、精製形態のウレアーゼは、調製後何日も経った後でも依然として優れた酵素安定性を維持していた。精製ウレアーゼが粗ウレアーゼよりもかなり安定性が低いと考えられ、反応又は修飾、例えば架橋の際に失活しやすい可能性があるので、このことは精製酵素、例えば精製ウレアーゼを使用する場合に特に重要である。これらの実験で、酵素活性は５日超、１０日超、１５日超、３０日超、４５日超等の期間にわたり得ることができ、かつ安定であり得ることが分かった。結果を以下で要約する。
【００９７】
実験Ａ：
試薬：１０ｇのＢＰＥＩ、２５ｍｌの５Ｎ  ＨＣｌ、０．１ｇのウレアーゼ、５滴のＤＩ  Ｈ２Ｏ、１．７５ｍｌのＥＧＤＧＥ
結果：
【００９８】
表１０       
調製後の日数              材料の活性（ＳＵ／ｇ）        
１                        ３．４        
９                        ３        
１６                      ２．２        
２２                      ４．７        
２９                      ４．７        
３７                      ３．４        
５７                      ２．７   
【００９９】
実験Ｂ：
試薬：１０ｇのＢＰＥＩ、２５ｍｌの５Ｎ  ＨＣｌ、０．３ｇのウレアーゼ、１２ｍｌのＤＩ  Ｈ２Ｏ、１．７５ｍｌのＥＧＤＧＥ
結果：
【０１００】
表１１       
調製後の日数              材料の活性（ＳＵ／ｇ）        
１                        ６．３        
７                        ７．２        
１４                      ６．９        
２２                      ７．４        
４２                      ５．６   
【０１０１】
実験Ｃ：
試薬：１０ｇのＢＰＥＩ、２５ｍｌの５Ｎ  ＨＣｌ、０．３ｇのウレアーゼ、７．５ｍｌのＤＩ  Ｈ２Ｏ、１．７５ｍｌのＥＧＤＧＥ
結果：
【０１０２】
表１２       
調製後の日数              材料の活性（ＳＵ／ｇ）        
１                        ７．２        
５                        ７．５        
８                        ９．３        
２８                      ６．９   
【０１０３】
実験Ｄ：
試薬：１０ｇのＢＰＥＩ、２５ｍｌの５Ｎ  ＨＣｌ、０．３ｇのウレアーゼ、４．０ｍｌのＤＩ  Ｈ２Ｏ、１．７５ｍｌのＥＧＤＧＥ
結果：
【０１０４】
表１３      
調製後の日数              材料の活性（ＳＵ／ｇ）        
１                        ４．５        
２                        ５．１        
２２                      ２．９   
【０１０５】
実験Ｅ：
試薬：８ｇのＢＰＥＩ、２０ｍｌの５Ｎ  ＨＣｌ、０．３ｇのウレアーゼ、６．０ｍｌのＤＩ  Ｈ２Ｏ、１．４０ｍｌのＥＧＤＧＥ
結果：
【０１０６】
表１４       
調製後の日数              材料の活性（ＳＵ／ｇ）        
１                        １３．６        
２                        １４        
７                        １２．４        
３０                      ２５．３        
４７                      １３．３   
【０１０７】
実験Ｆ：
試薬：８ｇのＢＰＥＩ、２０ｍｌの５Ｎ  ＨＣｌ、０．３ｇのウレアーゼ、３．０ｍｌのＤＩ  Ｈ２Ｏ、１．４０ｍｌのＥＧＤＧＥ
結果：
【０１０８】
表１５       
調製後の日数              材料の活性（ＳＵ／ｇ）        
２                        １３．４        
２５                      １９．５        
４２                      １２．９   
【０１０９】
実験Ｇ：
試薬：６ｇのＢＰＥＩ、１５ｍｌの５Ｎ  ＨＣｌ、０．３ｇのウレアーゼ、４．０ｍｌのＤＩ  Ｈ２Ｏ、１．０５ｍｌのＥＧＤＧＥ
結果：
【０１１０】
表１６                 
調製後の日数              材料の活性（ＳＵ／ｇ）        
５                        １９．７        
１１                      １６．３   
【０１１１】
出願人らは本開示において全ての言及された参考文献の全内容を具体的に援用している。さらに量、濃度、又は他の値若しくはパラメータが範囲、好ましい範囲、又は好ましい上限値及び好ましい下限値の列挙のいずれかで与えられる場合、これは、範囲が別々に開示されているかどうかにかかわらず、任意の上限範囲又は好ましい値と任意の下限範囲又は好ましい値との任意の組合せから成る全ての範囲を具体的に開示していると理解されたい。数値範囲が本明細書で言及される場合、特に指定のない限り、この範囲はその端点と、その範囲内の全ての整数及び分数とを含むように意図される。本発明の範囲は範囲を規定する場合に言及される特定の値に限定されるようには意図されない。
【０１１２】
本発明の他の実施形態は、本明細書及び本明細書で開示の本発明の実施を考慮すれば当業者にとって明らかであろう。本明細書及び本実施例は例示目的にすぎないものと考えられ、本発明の実際の範囲及び精神は以下の特許請求の範囲及びその均等物によって示されることが意図される。
【図１】
0005848128.tif 000002
【図２】
0005848128.tif 000003