(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えヒト血清アルブミンの粗抽出物を陽イオン交換クロマトグラフィーにて精製し、一次産物Ｉを得るステップ（１）と、
前記一次産物Ｉを陰イオン交換クロマトグラフィーにて精製し、二次産物ＩＩを得るステップ（２）と、
前記二次産物ＩＩに更に硫酸アンモニウムを加えて硫酸アンモニウムの濃度が０．１Ｍ〜１．０Ｍとなるようにした後、疎水性クロマトグラフィーにて精製し、精製された組換えヒト血清アルブミンを得るステップ（３）とを順に備え、
前記陽イオン交換クロマトグラフィーが、ＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  Ｓ（商標）、Ｃａｐｔｏ（登録商標）  ＭＭＣ、Ｎｕｖｉａ  Ｓ（商標）及びＭａｃｒｏＰｒｅｐ−ＣＭ（商標）からなる群より選択されるクロマトグラフィー担体を用いて行われ、
前記陰イオン交換クロマトグラフィーが、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）  ＦＦ、ＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  Ｑ（商標）及びＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）  ＦＦからなる群より選択されるクロマトグラフィー担体を用いて行われ、
前記疎水性クロマトグラフィーが、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）  ＨＰ、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）  ＦＦ、Ｍａｃｒｏ−ｐｒｅｐ  ｔ−ｂｕｔｙｌ（商標）及びＭａｃｒｏ−ｐｒｅｐ  ｍｅｔｈｙｌ（商標）からなる群より選択されるクロマトグラフィー担体を用いて行われる、
トランスジェニックイネの子実から組換えヒト血清アルブミンを分離及び精製する方法。
【請求項２】
前記ステップ（３）の疎水性クロマトグラフィーの前に、前記二次産物ＩＩをセラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにて精製するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記陽イオン交換クロマトグラフィーが、ＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  Ｓ（商標）またはＣａｐｔｏ（登録商標）  ＭＭＣを用いて行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記陰イオン交換クロマトグラフィーが、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）  ＦＦを用いて行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記疎水性クロマトグラフィーが、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）  ＨＰを用いて行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記セラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーが、Ｍａｃｒｏ−ｐｒｅｐセラミックヒドロキシアパタイトＩ型及びＩＩ型からなる群より選択されるクロマトグラフィー担体を用いて行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記組換えヒト血清アルブミンの粗抽出物が、
ｉ）組換えヒト血清アルブミンを含むトランスジェニックイネの子実を砕いたものを抽出用緩衝液と１：５の重量体積比（ｋｇ／ｌ）で混合し、５５〜６０℃にて１〜１．５時間抽出して混合物Ｉを得るステップであって、その内、抽出用緩衝液は、リン酸塩緩衝液１０〜３０ｍＭに、酢酸ナトリウム１０〜２０ｍＭと、硫酸アンモニウム１５〜３０ｍＭと、オクタン酸ナトリウム５〜２０ｍＭとを含み、そのｐＨが６．５〜８であるステップと、
ｉｉ）ステップｉ）で得られる混合物ＩのｐＨを４．０〜４．５に調整し、更に３〜１２時間沈降させて混合物ＩＩを得るステップと、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）で得られる混合物ＩＩを、ろ布式のプレートフレームフィルターで加圧ろ過し、その後、孔径が０．２０μｍ〜０．４５μｍのポリエーテルスルホン中空糸膜で精密ろ過した後、ろ液を集めて高濃度の組換えヒト血清アルブミンを含む粗抽出液を得るステップとを含む方法により製造される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記陽イオン交換クロマトグラフィーに使われる注入用緩衝液は、酢酸塩緩衝液で構成され、ｐＨが５．０未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記陽イオン交換クロマトグラフィーに使われる溶出用緩衝液は、酢酸塩緩衝液に塩化ナトリウムを含み、またはリン酸塩緩衝液に塩化ナトリウムを含み、ｐＨが５．０〜６．７である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記陽イオン交換クロマトグラフィーは、ＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  Ｓ（商標）を用いて行い、かつ酢酸塩緩衝液に０．２５Ｍ  塩化ナトリウムを含み、ｐＨが５．２である溶出用緩衝液が使われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
陽イオン交換クロマトグラフィーは、Ｎｕｖｉａ  Ｓ（商標）を用いて行い、かつ酢酸塩緩衝液に０．２５Ｍ  塩化ナトリウムを含み、ｐＨが５．０である溶出用緩衝液が使われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記陽イオン交換クロマトグラフィーは、Ｃａｐｔｏ（登録商標）  ＭＭＣを用いて行い、かつ非標的蛋白質の除去のため、酢酸塩緩衝液に１Ｍ  塩化ナトリウムを含み、ｐＨが４．７である洗浄用緩衝液が使われ、かつ組換えヒト血清アルブミンの溶出のため、リン酸塩緩衝液に１Ｍ  塩化ナトリウムを含み、ｐＨが６．７である溶出用緩衝液が使われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記陽イオン交換クロマトグラフィーは、ＭａｃｒｏＰｒｅｐ−ＣＭ（商標）を用いて行い、かつ非標的蛋白質の除去のため、酢酸塩緩衝液に１Ｍ  塩化ナトリウムを含み、ｐＨが４．７である洗浄用緩衝液が使われ、かつ組換えヒト血清アルブミンの溶出のため、リン酸塩緩衝液に０．１Ｍ  塩化ナトリウムを含み、ｐＨが６．５である溶出用緩衝液が使われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記陰イオン交換クロマトグラフィーは、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）  ＦＦを用いて行い、かつリン酸塩緩衝液に０．２５Ｍ  塩化ナトリウムを含み、ｐＨが６．０〜７．０である溶出用緩衝液が使われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記陰イオン交換クロマトグラフィーは、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）  ＦＦを用いて行い、かつ非標的蛋白質の除去のため、リン酸塩緩衝液に０．１Ｍ  塩化ナトリウムを含み、ｐＨが６．０〜７．０である洗浄用緩衝液が使われ、かつ組換えヒト血清アルブミンの溶出のため、リン酸塩緩衝液に０．２５Ｍ  塩化ナトリウムを含み、ｐＨが６．０〜７．０である溶出用緩衝液が使われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記疎水性クロマトグラフィーにおいて、精製すべき前記二次産物ＩＩには、更に濃度が０．１Ｍ〜１Ｍの硫酸アンモニウムを含ませる、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記疎水性クロマトグラフィーは、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）  ＨＰを用いて行い、かつ精製すべき前記二次産物ＩＩには、更に濃度が０．４Ｍの硫酸アンモニウムを含ませる、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記疎水性クロマトグラフィーは、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）  ＦＦを用いて行い、かつ精製すべき組換えヒト血清アルブミンを含む二次産物ＩＩには、更に濃度が０．１Ｍの硫酸アンモニウムを含ませる、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記疎水性クロマトグラフィーは、ＭａｃｒｏＰｒｅｐ−ｔ−  Ｂｕｔｙｌ（商標）を用いて行い、かつ精製すべき組換えヒト血清アルブミンを含む二次産物ＩＩには、更に濃度が０．６〜１．０Ｍの硫酸アンモニウムを含ませる、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記セラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、リン酸塩緩衝液で構成され、ｐＨ  が７．０〜７．５の溶出用緩衝液が使われる、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物工学分野に属するものであり、具体的にはトランスジェニックイネの子実から組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）を大規模に分離し精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト血清アルブミン（ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ，ＨＳＡ）は、５８５個のアミノ酸からなる一本鎖構造の非グリコシル化蛋白質であり、分子量が６６．５ｋＤであり、等電点が４．７〜４．９の範囲にあった。ヒト血漿中に最も多く含まれている蛋白質として、ヒト血清アルブミンは、血漿総蛋白質の６０％程度を占め、ヒト血液１リットル当たりに約４０ｇのＨＳＡが含まれている。ＨＳＡは血漿中のみならず、組織、体の分泌液、皮膚とリンパ腔にも存在する。正常な生理条件において、ＨＳＡは、血漿中でコロイド浸透圧の維持、栄養物質と傷口癒着の促進に寄与するとともに、キャリアー物質として、血液中で、例えば、ホルモンと言った多くの疎水性生体分子、生理活性物質、及び血液中の薬物と結合してその輸送に関与することが知られている。従って、ＨＳＡは、一つの重要な薬用蛋白質であり、臨床において主に失血、火傷、熱傷、形成外科手術及び脳損傷による低蛋白質血症、並びに肝硬変、腎性浮腫などの治療に用いられている。
【０００３】
現在、臨床に使われているＨＳＡは、主にヒト由来の血漿から抽出、単離して製造されている。しかし、このような製造法には以下の欠点があった。一方では、血漿供給源に限界がる。即ち、限られた血液供給源によってはＨＳＡとその関連製剤の製造需要を満たすことができない。他方、血液自体が危険要因になる可能性があった。例えば肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）などの危険な感染性病原体が混入する恐れもあるので、血漿から抽出するＨＳＡの使用に大きな不安を抱える場合があった。そこで、代替法としてＤＮＡ組換え技術に基づくヒト血清アルブミン製造法の開発が強く求められている。
【０００４】
現代新しいＤＮＡ組換えと合成技術の進展に伴い、研究者らは組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）の製造と応用に強い関心を示している。今まで既に様々な発現系によってｒＨＳＡを大量製造する試みが行われてきた。例えば、大腸菌（Ｌａｔｔａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５：１３０９−１３１４，（１９８７））、枯草菌（Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｃ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：２９１７−２９２５，（１９８７））などの原核生物、酵母（ＷＯ００／４４７７２、ＥＰ０６８３２３３Ａ２、ＵＳ５６１２１９６）などの真核生物や培養動物細胞などを利用してｒＨＳＡを製造する技術が確立されているが、これらの方法は、その発現レベルが低く、または生産コストが高いことから産業規模の製造に適したものではない。
【０００５】
本発明者による中国特許出願２００５１００１９０８４号に、生物反応器としてイネ胚乳細胞を利用してｒＨＳＡを製造する方法が開示されており、当該方法に、イネ胚乳に特異的に発現するプロモーターとシグナルペプチドを利用してｒＨＳＡをイネ胚乳細胞の細胞内膜系に導入し、更にイネ胚乳の蛋白質小体に貯蔵することによってｒＨＳＡをイネに大量に蓄積させ、最終的には比較的高い発現レベルに到達させる工程が含まれている。この方法によって得られるｒＨＳＡの発現レベルは、少なくともイネの種籾（子実）の重量の０．３％以上であった。当該方法は、発現量が高く、コストが低いなどといった有利な点を示し、蛋白質医薬品の製造のための新しい手段の開発を可能にしている。
【０００６】
各発現系で製造されるｒＨＳＡは、市場投入の前に精製する必要がある。よって、精製手段が産物の品質及び製造コストに影響を与える可能性があった。また、通常、精製プロセスのコストは、製造コスト全体の８０〜９０％を占める。現時点において、イネの子実からｒＨＳＡを精製するプロセスが未だ確立されていない。このため、簡便で且つコスト効率の良い方法を開発してイネの子実からｒＨＳＡを精製することには、技術的な困難、または、経済的リスクが伴う。
【０００７】
酵母や植物の浮遊細胞からｒＨＳＡを抽出する技術が既に報告されており、例えば、中国特許出願ＣＮ１０１７６８２０６Ａにメタノール資化性酵母（Pichia pastoris）にて発現するｒＨＳＡの精製方法が開示されている。当該方法は、ｒＨＳＡの発酵培養液をセラミック膜でろ過した後、順次に陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーと弱陰イオン交換クロマトグラフィーを経て精製されたｒＨＳＡを取得する工程を含む。しかしながら、イネの子実由来の不純物は、酵母や植物の浮遊細胞由来の不純物とは大きく異なり、よって、これらの従来の技術をそのままイネの子実からのｒＨＳＡの精製に用いることができない。従って、イネからｒＨＳＡを精製する簡便かつ実効的な方法を開発することによって高収率、高純度でｒＨＳＡを製造し，将来において工業的生産を可能にすることが期待されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、トランスジェニックイネの子実から組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）を大規模に分離し、精製する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の上述した目的は、以下の技術的解決案により達成される。即ち、
トランスジェニックイネの子実から組換えヒト血清アルブミンを分離及び精製する方法であって、順に、
（１）組換えヒト血清アルブミンの粗抽出物を陽イオン交換クロマトグラフィーにて精製し、一次産物Ｉを得るステップと、
（２）一次産物Ｉを陰イオン交換クロマトグラフィーにて精製し、二次産物ＩＩを得るステップと、
（３）二次産物ＩＩを疎水性クロマトグラフィーにて精製し、精製された組換えヒト血清アルブミンを得るステップとを備える。
【００１０】
ステップ（１）において、陽イオン交換クロマトグラフィーは、ＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  Ｓ、Ｎｕｖｉａ  Ｓ、Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ及びＭａｃｒｏＰｒｅｐ−ＣＭからなる群より選択される強陽イオンクロマトグラフィー樹脂をクロマトグラフィー担体として行ってもよい。ＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  ＳまたはＣａｐｔｏ  ＭＭＣを用いて行うことが好ましい。
【００１１】
陽イオン交換クロマトグラフィーは、ｐＨ勾配による溶出またはＮａＣｌ濃度勾配による溶出を用いてもよく、ｐＨ勾配による溶出が好ましい。
【００１２】
一つの実施形態において、陽イオン交換クロマトグラフィーの溶出用緩衝液は、酢酸塩緩衝液に、０．２５Ｍ  塩化ナトリウムを含み、ｐＨが５．２であった。
【００１３】
ステップ（２）において、陰イオン交換クロマトグラフィーは、ＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  Ｑ、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ及びＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦからなる群より選択される強陰イオンクロマトグラフィー樹脂をクロマトグラフィー担体として行ってもよく、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦを用いて行うことが好ましい。
【００１４】
一つの実施形態において、陰イオン交換クロマトグラフィーの溶出用緩衝液は、リン酸塩緩衝液に、０．２Ｍ  塩化ナトリウムを含み、ｐＨが７．５であった。
【００１５】
ステップ（３）において、疎水性クロマトグラフィーは、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ、Ｍａｃｒｏ−ｐｒｅｐ  ｔ−ｂｕｔｙｌ及びＭａｃｒｏ−ｐｒｅｐ  ｍｅｔｈｙｌからなる群より選択されるクロマトグラフィー担体を用いて行ってもよい。Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰを用いて行うことが好ましい。
【００１６】
疎水性クロマトグラフィーによって得られる標的蛋白質を含む溶出物は、例えば、限外ろ過による濃縮、冷凍乾燥などの周知の技術で最終産物に加工することができる。
【００１７】
更に、前記方法において、前記ステップ（３）の疎水性クロマトグラフィーの前に、二次産物ＩＩをセラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにて精製するステップを含んでもよい。即ち、このような実施形態において、ステップ（３）として、標的蛋白質を含む二次産物についてセラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを行い、その後、ステップ（４）として、疎水性クロマトグラフィーを行って精製された標的蛋白質を得る。
【００１８】
セラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、Ｍａｃｒｏ−ｐｒｅｐセラミックヒドロキシアパタイトＩ型及びＭａｃｒｏ−ｐｒｅｐセラミックヒドロキシアパタイトＩＩ型からなる群より選択されるクロマトグラフィー担体を用いて行ってもよく、Ｍａｃｒｏ−ｐｒｅｐセラミックヒドロキシアパタイトＩ型を用いて行うことが好ましい。
【００１９】
一つの実施形態において、陽イオン交換クロマトグラフィーに使われる注入用緩衝液は、酢酸塩緩衝液から構成され（を含み）、そのｐＨが５．０未満であった。
【００２０】
陽イオン交換クロマトグラフィーに使われる標的蛋白質を溶出するための溶出用緩衝液は、酢酸塩緩衝液に塩化ナトリウムを含み、またはリン酸塩緩衝液に塩化ナトリウムを含み、ｐＨが５．０〜６．７であった。好ましくは、塩化ナトリウムの濃度が０．２５Ｍであり、溶出用緩衝液のｐＨが５．２であった。
【００２１】
一つの実施形態において、陽イオン交換クロマトグラフィーは、ＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  ＳまたはＣａｐｔｏ  ＭＭＣを用いて行い、ここで使われる溶出用緩衝液は、酢酸塩緩衝液に、０．２５Ｍ  塩化ナトリウムを含み、ｐＨが５．２または６．７であった。
【００２２】
一つの実施形態において、陽イオン交換クロマトグラフィーは、Ｎｕｖｉａ  Ｓをクロマトグラフィー担体として用い、その溶出用緩衝液は、酢酸塩緩衝液に、０．２５Ｍ  塩化ナトリウムを含み、ｐＨが５．０または５．２であった。
【００２３】
一つの実施形態において、陽イオン交換クロマトグラフィーは、Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣをクロマトグラフィー担体として用い、不純物の除去に用いられる洗浄用緩衝液は、酢酸塩緩衝液に、１Ｍ  塩化ナトリウムを含み、ｐＨが４．７である。標的蛋白質の溶出に用いられる溶出用緩衝液は、リン酸塩緩衝液に、１Ｍ  塩化ナトリウムを含み、ｐＨが６．７であった。
【００２４】
一つの実施形態において、陽イオン交換クロマトグラフィーは、ＭａｃｒｏＰｒｅｐ−ＣＭをクロマトグラフィー担体として用い、不純物の除去に用いられる洗浄用緩衝液は、酢酸塩緩衝液に、１Ｍ  塩化ナトリウムを含み、ｐＨが４．７である。標的蛋白質の溶出に用いられる溶出用緩衝液は、リン酸塩緩衝液に、０．１Ｍ  塩化ナトリウムを含み、ｐＨが６．５であった。
【００２５】
一つの実施形態において、陰イオン交換クロマトグラフィーは、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦをクロマトグラフィー担体として用い、ここで使われる溶出用緩衝液は、リン酸塩緩衝液に、０．２５Ｍ  塩化ナトリウムを含み、ｐＨが６．０〜７．０であった。
【００２６】
一つの実施形態において、陰イオン交換クロマトグラフィーは、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦをクロマトグラフィー担体として用い、不純物の除去に用いられる洗浄用緩衝液は、リン酸塩緩衝液に、０．１Ｍ  塩化ナトリウムを含み、ｐＨが６．０〜７．０である。標的蛋白質の溶出に用いられる溶出用緩衝液は、リン酸塩緩衝液に、０．２５Ｍ  塩化ナトリウムを含み、ｐＨが６．０〜７．０であった。
【００２７】
一つの実施形態において、疎水性クロマトグラフィーにて精製すべきｒＨＳＡ含有画分に、更に硫酸アンモニウムを含んでもよく、硫酸アンモニウムの濃度が０．１Ｍ〜１Ｍの範囲にあってもよい。
【００２８】
一つの実施形態において、疎水性クロマトグラフィーは、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰをクロマトグラフィー担体として用いて行い、精製すべきｒＨＳＡ含有画分に含まれる硫酸アンモニウムの濃度が０．４Ｍであった。
【００２９】
一つの実施形態において、疎水性クロマトグラフィーは、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦをクロマトグラフィー担体として用いて行い、精製すべきｒＨＳＡ含有画分に含まれる硫酸アンモニウムの濃度が０．１Ｍであった。
【００３０】
一つの実施形態において、疎水性クロマトグラフィーは、ＭａｃｒｏＰｒｅｐ−ｔ−Ｂｕｔｙｌをクロマトグラフィー担体として用いて行い、精製すべきｒＨＳＡ含有画分に含まれる硫酸アンモニウムの濃度が０．６〜１．０Ｍであった。
【００３１】
一つの実施形態において、Ｍａｃｒｏ−ｐｒｅｐセラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにおいて、標的蛋白質の溶出に用いられる溶出用緩衝液は、リン酸塩緩衝液から構成され（を含み）、ｐＨが７．０〜７．５であった。
【００３２】
本発明に係わる前記ｒＨＳＡは、本出願の出願人によって提出された中国特許出願２００５１００１９０８４．４号に開示されている方法に従い、イネ胚乳細胞を生物反応器として用いて製造することができる。トランスジェニックイネに発現するｒＨＳＡは、本出願の出願人によって提出された中国特許出願２０１０１０５９７５４４．２号に開示されている方法に従って抽出することができ、好ましくは、当該方法に、
（ｉ）粉砕済みのｒＨＳＡ含有トランスジェニックイネを抽出用緩衝液と、１：５の重量体積比（ｋｇ／ｌ）で混合し、５５〜６０℃にて１〜１．５時間抽出を行って混合物Ｉを得るステップであって、抽出用緩衝液は、リン酸塩緩衝液１０〜３０ｍＭに、酢酸ナトリウム１０〜２０ｍＭと、硫酸アンモニウム１５〜３０ｍＭと、オクタン酸ナトリウム５〜２０ｍＭとを含み、そのｐＨが６．５〜８であるステップと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）で得られる混合物ＩのｐＨを４．０〜４．５に調整し、更に３〜１２時間かけて沈降させて混合物ＩＩを得るステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）で得られる混合物ＩＩをろ過して澱粉や非標的蛋白質を取り除いた後、ろ液を回収して高濃度のｒＨＳＡを含む粗抽出液を得るステップとを含む。
【００３３】
一つの実施形態において、前記ろ過に、ろ布式のプレートフレームフィルターを用いて加圧ろ過し、その後、ポリエーテルスルホン中空糸膜にて精密ろ過するステップが含まれる。前記中空糸膜は、孔径が０．２０μｍ〜０．４５μｍであり、０．２２μｍのものが好ましい。
【発明の効果】
【００３４】
本発明により提供される技術的解決案は、以下の利点があった。
【００３５】
１）イネに色素と多糖類の物質が比較的高い含有量で含有されていることに対して、本発明において、第１の精製ステップとして陽イオン交換クロマトグラフィーを行い、ｒＨＳＡを捕集または結合するために許容注入量を有効に高め、クロマトグラフィーの精製効率を高めている。これに対し、第１の精製ステップとして陰イオン交換クロマトグラフィーを用いると、ｒＨＳＡを捕集するための許容注入量が理論値の２０％程度にしかならない。また、ＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  ＳとＣａｐｔｏ−ＭＭＣは、いずれも水酸化ナトリウムに対して極めて高い安定性と長い寿命を有するので、クロマトグラフィー担体の耐用期限が延長されるとともに、本発明の洗浄作業を容易にできるようにし、最終的に目的産物のコストを削減できる。
【００３６】
２）本発明において、第２の精製ステップとして陰イオン交換クロマトグラフィーを行っている。溶出条件を最適化した結果、イネの子実に含まれる８０％以上の非標的蛋白質を除去することができ、結果として、非標的蛋白質を有効に取り除いた上でｒＨＳＡを回収することができた。また、イネの子実に含まれる色素と多糖類の物質が、第１の精製ステップにおいて陽イオン交換クロマトグラフィーを行うことにより既に取り除かれているため、陰イオン交換クロマトグラフィーの許容注入量及び精製効率への影響が取り除かれる。
【００３７】
３）本発明において、第３の精製ステップとしてＭａｃｒｏ−ｐｒｅｐセラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを行い、二量体以上の多量体を取り除く。ｒＨＳＡを注射用の薬剤にする場合、過剰量の二量体以上の多量体によってアレルギーを引き起こす恐れがあった。そこで、このステップで純度を著しく向上させ、臨床応用における純度の高さに対する要求またはそれ以上の要求に応えられるようにする。
【００３８】
４）本発明において、仕上げの精製ステップとして疎水性クロマトグラフィーを行う。以上のように、三段階に分けてクロマトグラフィーを行うことにより、目的とする産物のＨＰＬＣ純度を９９．０％以上にすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】一次精製として異なるクロマトグラフィー担体を用いて陽イオン交換クロマトグラフィーを行い、得られた画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ写真であった。その内、ＡがＵＮＯ  ｓｐｈｅｒｅ  Ｓ担体であり、ＢがＮｕｖｉａ  Ｓ担体であり、ＣがＣａｐｔｏ  ＭＭＣ担体であり、ＤがＭａｃｒｏＰｒｅｐ−ＣＭ担体であった。
【図２】ｒＨＳＡ抽出液の許容注入量（体積）に対する、Ｎｕｖｉａ  Ｓ担体とＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  Ｓ担体の間の、異なる流速（３００ｃｍ／ｈ、６００ｃｍ／ｈ）における比較結果を示す図であった。
【図３】一次精製として異なるクロマトグラフィー担体を用いて陰イオン交換クロマトグラフィーを行うことによって得られる画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ写真であった。その内、ＡがＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  Ｑ担体であり、ＢがＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ担体であった。
【図４】透析前後における、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ担体のに対するｒＨＳＡ抽出液の許容注入量及びｒＨＳＡ抽出液における透析前後の多糖類の含有量を示す図であった。
【図５】二次精製として異なるクロマトグラフィー担体を用いて陰イオン交換クロマトグラフィーを行うことによって得られる画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ写真であった。その内、ＡがＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ担体であり、ＢがＤＥＡＥ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ担体であった。
【図６】三次（仕上げ）精製として異なるクロマトグラフィー担体を用いて疎水性クロマトグラフィーを行うことによって得られる画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ写真であった。その内、ＡがＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ担体であり、ＢがＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ担体であり、ＣがＭａｃｒｏ  Ｐｒｅｐ−ｔ−Ｂｕｔｙｌ担体であった。
【図７】ｒＨＳＡを含む粗抽出液に対し順に陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、及び疎水性クロマトグラフィーを行って得られる溶出画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ写真であった。その内、クロマトグラフィー担体として、それぞれＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  Ｓ（Ａ）、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｂ）とＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（Ｃ）が使われている。
【図８】本発明の一つの実施形態に係る精製済みのｒＨＳＡ産物のＨＰＬＣクロマトグラム（ＨＰＬＣ−ＳＥＣ）であった。
【図９】Ｍａｃｒｏ−ｐｒｅｐセラミックヒドロキシアパタイトＩ型の担体を用いてセラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを行うことによって得られる溶出画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ写真であった。
【図１０】本発明の他の一つの実施形態に係わる精製済みのｒＨＳＡ産物のＨＰＬＣクロマトグラムであった。
【図１１】順にＭａｃｒｏ−ｐｒｅｐセラミックヒドロキシアパタイトＩＩ型の担体を用いてセラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、及びＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ担体を用いて疎水性クロマトグラフィーを行うことによって得られる溶出画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ写真であった。
【図１２】本発明の他の一つの実施形態に係わる精製済みのｒＨＳＡ産物のＨＰＬＣクロマトグラムであった。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
以下、本発明の特徴と利点をより容易に理解できるように実施例を挙げて説明する。これらの実施例は本発明を説明するものであり、本発明の範囲はこれらの実施例によって何ら制限されるものではない。
【００４１】
陽イオン交換クロマトグラフィーにおけるクロマトグラフィー担体と溶出条件の選定
本発明において、クロマトグラフィー担体をＢｉｏ−Ｒａｄ社製のＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  Ｓ、Ｎｕｖｉａ  Ｓ、Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣなどを含む高い作業流速（working flow rate）を有する陽イオン交換樹脂とした。
【００４２】
実験より分かるように、Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ、Ｎｕｖｉａ  ＳとＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  Ｓは、何れもｒＨＳＡの精製に利用可能であった。その内、Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣによる蛋白質の精製効果が最もよく、その次にＮｕｖｉａ  ＳとＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  Ｓであった。Ｎｕｖｉａ  ＳとＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  Ｓは、蛋白質精製において両者の効果に明らかな区別がないと確認できる。しかし、同じ作業流速の場合においてＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  Ｓの許容注入量がＣａｐｔｏ  ＭＭＣの１．５倍である。また、ＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  Ｓの作業流速は、Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣと同じであった。なお、ＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  Ｓは、高濃度の水酸化ナトリウム中においても極めて優れた安定性を示しており、Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣと比べて洗浄プロセスが簡便で、使用寿命が長く、コストが低いといった利点があった。
【００４３】
Ｎｕｖｉａ  ＳとＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  Ｓは、類似した性質を有しているが、リガンドの伸長長さと基質粒子の大きさに区別があった。両者各自の最適の作業流速において、Ｎｕｖｉａ  Ｓの許容注入量がＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  Ｓの１．４倍になっているが、Ｎｕｖｉａ  Ｓの作業流速は、ＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  Ｓの約半分であった。代わりに、同じ流速の場合、ＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  Ｓの許容注入量がＮｕｖｉａ  Ｓより大きく、また、両者の精製能力は同等のレベルにあった。
【００４４】
各要素を纏めて見ると、陽イオン交換クロマトグラフィーのクロマトグラフィー担体としてＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  Ｓを使うのが好ましい。
【００４５】
ｒＨＳＡが担体に完全に吸着できるように、ｒＨＳＡを含む抽出液を比較的低いｐＨ値（ｐＨ＝４．４）でＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  Ｓを充填したカラムに添加し、その後、それぞれｐＨ勾配を有する溶出用緩衝液とＮａＣｌ勾配を有する溶出用緩衝液で溶出させて基本的な溶出条件を調べる。
【００４６】
結果から示されるように、ｐＨ勾配による溶出の際において、ＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  Ｓカラムに吸着されたｒＨＳＡは、溶出用緩衝液のｐＨが５．５を超える場合において僅かながらも脱着する傾向を示しため、注入用緩衝液のｐＨを５．５以下にする必要があることが示唆された。また、溶出用緩衝液のｐＨを５．６８にする場合、ｒＨＳＡは、カラムから完全に脱着する。このことから、ｒＨＳＡがＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  ＳクロマトグラフィーカラムでのｐＨ勾配による溶出に対して非常に敏感であることが分かる。
【００４７】
ＮａＣｌ濃度勾配による溶出で、標的蛋白質ｒＨＳＡは、３５％から６０％までの１Ｍ  塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）濃度勾配において脱着の傾向を示し、従って、ｒＨＳＡがＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  ＳクロマトグラフィーカラムでのＮａＣｌ濃度勾配による溶出に敏感に反応しないことが確認された。これらの結果から、ｐＨ勾配とＮａＣｌ勾配が何れもｒＨＳＡの溶出に利用できることが証明された。また、ｐＨ勾配の場合、より敏感に且つより少量の溶出用緩衝液を使ってｒＨＳＡを溶出することができる。一方、ＮａＣｌ勾配によってｒＨＳＡを溶出し難く、必要とされるＮａＣｌの濃度が高く、且つ大量の溶出用緩衝液を使用する必要があった。
【００４８】
精製効果と回収率を総合的に考慮すると、好ましい溶出用緩衝液として、０．２５Ｍ  ＮａＣｌのリン酸塩緩衝液（ｐＨ  ５．２）が挙げられる。
【００４９】
陰イオン交換クロマトグラフィーにおけるクロマトグラフィー担体と溶出条件の選定
陽イオン交換樹脂と同様に、陰イオン交換樹脂もｒＨＳＡの精製に用いることができる。本発明において、クロマトグラフィー担体をＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  Ｑ、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ及びＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦなどを含む、高い流速と高い許容注入量を有する陰イオン交換樹脂とした。
【００５０】
実験より分かるように、ＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  Ｑ、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ及びＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦは、何れもｒＨＳＡの精製に用いることができる。ＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  ＱはＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦと比べて流速が大きいが、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦはＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  Ｑと比べて  精製効率が優れている。また、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦは、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦと類似した精製効率を示しているが、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦと比べて流速が低い。
【００５１】
上述から分かるように、陽イオン交換クロマトグラフィーにおけるクロマトグラフィー担体として、ＵＮＯ−ｓｐｈｅｒｅ  Ｓは、精製性能においてＣａｐｔｏ  ＭＭＣと比べてやや劣っている。しかし、実験により証明されたように、このような不利な影響は、全体の精製効率を改善することによって受けないようにすることが出来る。また、ＵＮＯ−ｓｐｈｅｒｅ  Ｓは、後の陰イオン交換クロマトグラフィーに不利な影響を与えない。一つの好ましい実施形態において、陰イオン交換クロマトグラフィーのクロマトグラフィー担体としてＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦを用いるのが好ましく、標的蛋白質の溶出に用いる溶出用緩衝液は、リン酸塩緩衝液に０．２Ｍ  ＮａＣｌを含み、ｐＨが６．８であった。
【００５２】
陰イオン交換クロマトグラフィーと陽イオン交換クロマトグラフィーの実施順番の確定
陰イオン交換クロマトグラフィーと陽イオン交換クロマトグラフィーは、何れもｒＨＳＡの一次精製に用いることができるが、実験から分かるように、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ陰イオン交換樹脂を一次精製ステップに用いた時は、その許容注入量が理論上の許容量より遥かに低い。これはイネの子実に大量に存在する可溶性多糖類と核酸の関与によるものと考えられる。その理由して、可溶性多糖類と核酸は負電荷を持っており、よって、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦに結合してその許容注入量を低下させることが考えられる。実験により証明されたように、透析によってｒＨＳＡ抽出液に含まれる可溶性多糖類の含有量を減らすことが出来るため、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦの許容注入量を高めることができる。
【００５３】
その一方、ＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  Ｓ、Ｎｕｖｉａ  ＳとＣａｐｔｏ  ＭＭＣなどの陽イオン交換クロマトグラフィー担体は、可溶性多糖類及び核酸と結合できず、よって、許容注入量の低下を回避することができる。このことから、本発明において、一次精製に陽イオン交換クロマトグラフィーを用い、二次精製に陰イオン交換クロマトグラフィーを用いることとした。
【００５４】
疎水性クロマトグラフィーにおけるクロマトグラフィー担体の選定
本発明において、幾つかの疎水性クロマトグラフィー担体を当該精製ステップに用いた。疎水性クロマトグラフィー担体として、例えば、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ＬＳ）、Ｍａｃｒｏ−ｐｒｅｐ  ｔ−ｂｕｔｙｌ及びＭａｃｒｏ−ｐｒｅｐ  ｍｅｔｈｙｌが挙げられ、これらは類似した性質を持っている。
【００５５】
Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰは、強い疎水性と優れた精製性能を持っている。粗抽出液からほぼ全ての非標的蛋白質とその他の不純物を除去する性能は、精製効率の向上に鍵となっているが、当該クロマトグラフィー担体は、粒子のサイズが比較的小さく、流速が低く、作業方式が特別であることから、その応用においてやや利便性が低い。
【００５６】
Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰと比較して、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ＬＳ）は、同じリガンドと基質を有しているが、球状基質の粒径とリガンドの密度が異なっている。Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ＬＳ）の基質の平均粒径は、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰと比べて３倍大きく、よって、前者は大きい作業流速を有する。このためｒＨＳＡの生産に用いる際に製造時間を短縮することができる。ＭａｃｒｏＰｒｅｐ−Ｂｕｔｙｌは、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦとＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰより疎水性が弱く、Ｍａｃｒｏ−ｐｒｅｐ  ｍｅｔｈｙｌは、疎水性においてＭａｃｒｏＰｒｅｐ−ｂｕｔｙｌより弱い。
【００５７】
Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦは、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰと同様の作業方式で浸透液（transmission fluid）を集めるほうがよい。添加サンプルの塩濃度を選定する際、２５ｍＭ  ＰＢ＋０．５Ｍ  （ＮＨ４）２ＳＯ４  、ｐＨ  ６．８の平衡用緩衝液を用いて添加してから１００％の水で溶出する場合、５０％を超えるｒＨＳＡがカラムに保持されていることが確認できる。結果として平衡用緩衝液の塩濃度を低くする必要がある。
【００５８】
ＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  ＳとＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラムにてろ過した後のサンプルに硫酸アンモニウムを加え、硫酸アンモニウムの濃度をそれぞれ０．２Ｍと０．１Ｍとなるように調整した後、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ＬＳ）カラムに添加する。浸透液（transmission fluid）と、純水による溶出液を集めてＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を行う。結果より示されるように、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ＬＳ）は、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰと比べてより強い疎水性を示し、且つ添加サンプルにおける硫酸アンモニウムの濃度が０．１Ｍと低くなっている場合においてもなおサンプル中の非標的蛋白質に対する良好な除去効果を有している。また、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ＬＳ）により得られる産物の純度は９３．５％に達している。一方で、約３０％のｒＨＳＡがＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ＬＳ）カラムに保持されて失われる。硫酸アンモニウムの代わりに塩化ナトリウムを用いて上記実験を行う場合、同様の結果となる。カラムに保持されることによるｒＨＳＡのロスが一定程度で低減されるが、産物のＨＰＬＣ純度は依然として約９３％であった。
【００５９】
ＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  ＳとＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラムにてろ過した後のサンプルに硫酸アンモニウムを加え、硫酸アンモニウムの濃度をそれぞれ１Ｍ、０．８Ｍまたは０．６Ｍとなるように調整した後、Ｍａｃｒｏ−ｐｒｅｐ  ｔ−ｂｕｔｙｌとＭａｃｒｏ−ｐｒｅｐ  ｍｅｔｈｙｌカラムに添加する。浸透液（transmission fluid）と、純水による溶出物とを集めてＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を行う。結果より示されるように、Ｍａｃｒｏ−ｐｒｅｐ  ｔ−ｂｕｔｙｌとＭａｃｒｏ−ｐｒｅｐ  ｍｅｔｈｙｌは、何れも疎水性が弱い。更に両者のｒＨＳＡに対する精製特性もも良好ではなく、得られるｒＨＳＡのＨＰＬＣ純度は９０％であった。
【００６０】
Ｍａｃｒｏ−ｐｒｅｐセラミックヒドロキシアパタイトＩ型またはＩＩ型を選定するために、Ｂｉｏ  Ｒａｄ社製の二つのＭａｃｒｏ−ｐｒｅｐセラミックヒドロキシアパタイトについて比較を行った。比較の結果から、Ｍａｃｒｏ−ｐｒｅｐセラミックヒドロキシアパタイトＩ型がＩＩ型より適しているのが確認された。Ｍａｃｒｏ−ｐｒｅｐセラミックヒドロキシアパタイトＩ型を用いてクロマトグラフィーを行うと、モノマーの含有量を９８．９９８％にまで引き上げることができる。
【００６１】
上述したことから、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰと比べて高流速で作業できる点で他のクロマトグラフィー担体が優れていることには間違いないが、他のクロマトグラフィー担体からは、何れもＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰに匹敵する精製効率を得られない。Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰは、精製速度が比較的低いが、９８％より大きい純度を有する標的蛋白質を確保できる。従って、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰを疎水性クロマトグラフィー担体として用いることが好適であった。
【実施例】
【００６２】
材料と装置
ろ布式のプレートフレーム加圧ろ過器は、型番がＸＭＳ４／５００−ＵＢであり、メーカーが上海天立加圧ろ過器技術有限公司（中国）である。０．２０μｍの中空糸セルロースカラムは、湖州科濾膜技術有限公司（中国）により購入する。
【００６３】
ＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  Ｓ、Ｎｕｖｉａ  Ｓ、Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ、ＭａｃｒｏＰｒｅｐ−ＣＭ、ＭａｃｒｏＰｒｅｐ−ｍｅｔｈｙｌ及びＭａｃｒｏＰｒｅｐ−Ｂｕｔｙｌの各担体は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社（米国）により購入する。
Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ及びＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦの各担体は、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（米国）により購入する。
Ｃ１０／１０とＸＫ１６／２０の各クロマトグラフィーカラムは、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（米国）により購入する。
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  １５／２００クロマトグラフィーカラムは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社（米国）により購入する。
【００６４】
［実施例１］トランスジェニックイネからのｒＨＳＡの抽出
本発明の発明者による中国特許出願２００５１００１９０８４号に開示された方法に従い、トランスジェニックイネが作製された。水稲栽培されたトランスジェニックイネの外皮を除去して半精米を得、その後、粒度が８０〜１００メッシュの米粉となるように砕いた。砕いた米粉を抽出用緩衝液と１：５（重量／体積、ｋｇ／Ｌ）の割合で混合し、６０℃にて１．５時間抽出した。抽出用緩衝液は、リン酸塩緩衝液２５ｍＭに、酢酸ナトリウム２０ｍＭと、硫酸アンモニウム１０ｍＭと、オクタン酸ナトリウム１０ｍＭとを含み、ｐＨが７．５であった。上記のようにして得られた混合物を酢酸でｐＨ  ４．５に調整し、更に少なくとも３時間置いて非標的蛋白質を沈降させた。その後、得られた混合物を、順に（ろ布式の）プレートフレーム加圧ろ過器で加圧ろ過してから孔径が０．２２μｍの中空糸セルロースカラムで精密ろ過し、透明なｒＨＳＡ抽出液を得た。ｒＨＳＡの濃度は、約０．６６ｍｇ／ｍｌであった。
【００６５】
［実施例２］陽イオン交換クロマトグラフィーによる一次精製
（１）ＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  Ｓクロマトグラフィー担体を用いる陽イオン交換クロマトグラフィー
ＸＫ１６／１００カラムに約８．７ｍｌのＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  Ｓを充填し、流出液のｐＨ値が安定するまで２００ｍｌの平衡用緩衝液（無水酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、酢酸を加えてｐＨが４．５となるように調整したもの）を使って３００ｃｍ／ｈ（ｃｍ／時）の流速で平衡化した。実施例１で得られたｒＨＳＡ抽出液サンプル２５０ｍｌを、６００ｃｍ／ｈの流速でカラムに注入した。サンプルの導電率が６．１ｍＳ／ｃｍであり、ｐＨが４．５３であった。サンプルを添加した後、溶出用緩衝液（酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、酢酸、ｐＨ５．２、塩化ナトリウム１４．６１ｇ／Ｌ）を使って３００ｃｍ／ｈの流速でサンプルを溶出した。溶出液を集めてＳＤＳ−ＰＡＧＥで観察し、ｒＨＳＡを含む画分を得た。電気泳動図は、図１Ａに示した。
【００６６】
（２）Ｎｕｖｉａ  Ｓクロマトグラフィー担体を用いる陽イオン交換クロマトグラフィー
ＸＫ１６／１００カラムに約９．３ｍｌのＮｕｖｉａ  Ｓ担体を充填し、流出液のｐＨ値が安定するまで２００ｍｌの平衡用緩衝液（無水酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、酢酸を加えてｐＨが４．５となるように調整したもの）を使って３００ｃｍ／ｈの流速で平衡化した。実施例１で得られたｒＨＳＡ抽出液サンプル２５０ｍｌを、３００ｃｍ／ｈの流速でカラムに注入した。サンプルの導電率が６．３ｍＳ／ｃｍであり、ｐＨが４．５６であった。サンプルを添加した後、溶出用緩衝液（酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、酢酸、ｐＨ５．０、塩化ナトリウム１４．６１ｇ／Ｌ）を使って３００ｃｍ／ｈの流速でサンプルを溶出した。溶出液を集めてＳＤＳ−ＰＡＧＥで観察し、ｒＨＳＡを含む画分を得た。電気泳動図は、図１Ｂに示した。
【００６７】
（３）Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣクロマトグラフィー担体を用いる陽イオン交換クロマトグラフィー
ＸＫ１６／１００カラムに約１５．１ｍｌのＣａｐｔｏ  ＭＭＣ担体を充填し、流出液のｐＨ値が４．５で安定するまで２００ｍｌの平衡用緩衝液（無水酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、酢酸を加えてｐＨが４．５となるように調整したもの）を使って３００ｃｍ／ｈの流速で平衡化した。実施例１で得られたｒＨＳＡ抽出液サンプル２５０ｍｌを、６００ｃｍ／ｈの流速でカラムに注入した。サンプルの導電率が６．３ｍＳ／ｃｍであり、ｐＨが４．５６であった。サンプルを添加した後、溶出用緩衝液（酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、酢酸、ｐＨ４．７、塩化ナトリウム５８．４４ｇ／Ｌ）を使って３００ｃｍ／ｈの流速で不純物を除去し、その後、溶出用緩衝液（リン酸二水素ナトリウム０．３ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム３．５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５８．４４ｇ／Ｌ、ｐＨ  ６．７）でサンプルを溶出してｒＨＳＡを含む画分を得た。電気泳動図は、図１Ｃに示した。
【００６８】
（４）ＭａｃｒｏＰｒｅｐ−ＣＭクロマトグラフィー担体を用いる陽イオン交換クロマトグラフィー
ＸＫ１６／１００カラムに約１０ｍｌのＭａｃｒｏＰｒｅｐ−ＣＭ担体を充填し、流出液のｐＨ値が４．５で安定するまで３００ｍｌの平衡用緩衝液（無水酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、酢酸を加えてｐＨが４．５となるように調整したもの）を使って２００ｃｍ／ｈの流速で平衡化した。２５０ｍｌの実施例１で得られたｒＨＳＡ抽出液サンプルを、３００ｃｍ／ｈの流速でカラムに注入した。サンプルの導電率が６．３ｍＳ／ｃｍであり、ｐＨが４．５６であった。サンプルを添加した後、洗浄用緩衝液（酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、酢酸、ｐＨ  ４．７、塩化ナトリウム５８．４４ｇ／Ｌ）を使って２００ｃｍ／ｈの流速で不純物を除去し、その後、溶出用緩衝液（リン酸二水素ナトリウム０．３ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム３．５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５．８４ｇ／Ｌ、ｐＨ  ６．５）でサンプルを溶出してｒＨＳＡを含む画分を得た。電気泳動図は、図１Ｄに示した。
【００６９】
（５）Ｎｕｖｉａ  Ｓ担体とＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  Ｓ担体の許容注入量の比較
ＸＫ１６／１００カラムに、それぞれ約５ｍｌのＮｕｖｉａ  ＳとＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  Ｓ担体を充填し、流出液のｐＨ値が４．５となるまで２００ｍｌの平衡用緩衝液（無水酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、酢酸を加えてｐＨが４．５となるように調整したもの）を使って３００ｃｍ／ｈの流速で平衡化した。実施例１で得られたｒＨＳＡ抽出液サンプルを、３００ｃｍ／ｈの流速でＮｕｖｉａ  ＳカラムとＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  Ｓカラムにそれぞれ添加した。サンプル添加過程におけるＵＶ２８０の吸収値を記録し、当該吸収値が水平域を１０％分超えるまで記録を続けた。サンプルの添加体積をそれぞれ記録し、３００ｃｍ／ｈの流速における１ミリリットル当たりのＮｕｖｉａ  ＳまたはＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  Ｓの実際の許容注入量を算出した。
【００７０】
なお、流出液のｐＨ値が４．５となるまで平衡用緩衝液（無水酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、酢酸を加えてｐＨが４．５となるように調整したもの）を使って３００ｃｍ／ｈの流速でＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  Ｓカラムを平衡化した。実施例１で得られたｒＨＳＡ抽出液のサンプルを６００ｃｍ／ｈの流速でＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  Ｓカラムに添加し、サンプル添加過程におけるＵＶ２８０の吸収値を計測し、当該吸収値が水平域を１０％分超えるまで計測を続けた。サンプルの添加体積を計測し、６００ｃｍ／ｈの流速においての１ミリリットル当たりのＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  Ｓの実際注入量を算出した。許容注入量の比較結果は、図２に示した。
【００７１】
［実施例３］陰イオン交換クロマトグラフィーによる一次精製
（１）ＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  Ｑ担体を用いる陰イオン交換クロマトグラフィー
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  １５／２００カラムに約１０ｍｌのＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  Ｑ担体を充填し、流出液のｐＨ値が７．５となるまで２００ｍｌの平衡用緩衝液（リン酸二水素ナトリウム０．３ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム３．５ｇ／Ｌに、水酸化ナトリウムまたは塩酸を加えてｐＨ７．５に調整したもの）を使って流速３００ｃｍ／ｈでカラムを平衡化した。実施例１で得られたｒＨＳＡの抽出液サンプル２５０ｍｌをｐＨ７．５に調整し、且つ当該緩衝液で導電率が１０．０ｍＳ以下となるように希釈した後、３００ｃｍ／ｈの流速でＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  Ｑカラムに添加した。当該サンプルを洗浄用緩衝液（リン酸二水素ナトリウム０．３ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム３．５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１１．６８ｇ／Ｌ）で洗浄して不純物を除去した後、溶出用緩衝液（リン酸二水素ナトリウム０．３ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム３．５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム２３．３６ｇ／Ｌ）で溶出し、ｒＨＳＡ含有画分を集めた。電気泳動図は、図３Ａに示した。
【００７２】
（２）Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ担体を用いる陰イオン交換クロマトグラフィー
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  １５／２００カラムに約１０ｍｌのＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ担体を充填し、流出液のｐＨ値が７．０となるまで２００ｍｌの平衡用緩衝液（リン酸二水素ナトリウム０．３ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム３．５ｇ／Ｌに、水酸化ナトリウムまたは塩酸を加えてｐＨ７．０に調整したもの）を使って流速３００ｃｍ／ｈでカラムを平衡化した。実施例１で得られたｒＨＳＡの抽出液サンプル２５０ｍｌをｐＨ６．８に調整し、且つ当該緩衝液で導電率が１０．０ｍＳ以下となるように希釈した後、３００ｃｍ／ｈの流速でＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラムに添加した。当該サンプルを溶出用緩衝液（リン酸二水素ナトリウム０．３ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム３．５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５．８４ｇ／Ｌ）で溶出し、ｒＨＳＡ含有画分を集めた。電気泳動図は、図３Ｂに示した。
【００７３】
（３）Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦの実際注入量の測定
１０／１００カラムに約５ｍｌのＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ担体を充填し、流出液のｐＨ値が７．０に安定するまで２００ｍｌの平衡用緩衝液（リン酸二水素ナトリウム０．３ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム３．５ｇ／Ｌに、水酸化ナトリウムまたは塩酸を加えてｐＨが７．０となるように調整したもの）を使って流速３００ｃｍ／ｈでカラムを平衡化した。実施例１で得られたｒＨＳＡの抽出液サンプル２５０ｍｌをｐＨ７．５に調整し、当該緩衝液で導電率が１０．０ｍＳ以下に、かつ総体積が１０００ｍｌになるまで希釈した。得られたサンプルを３００ｃｍ／ｈの流速でＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラムに添加した。サンプル添加過程におけるＵＶ２８０の吸収値を計測し、当該吸収値が水平域を１０％分超えるまで計測を続けた。サンプルの添加体積を記録し、３００ｃｍ／ｈの流速におけるＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ１ミリリットル当たりの実際の許容注入量を算出した。その後、樹脂を再生した。
【００７４】
実施例１で得られたｒＨＳＡの抽出液のサンプルをｐＨ７．０に調整し、且つ当該緩衝液で導電率が１０．０ｍＳ以下となるように希釈した後、ＧＥ  ３０ＫＤメンブレンカセットで４００ｍｌに濃縮した。硫酸‐フェノール法を用いて透析前後の多糖類含有量を測定した後、当該サンプルを平衡化済みのＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラムに添加した。サンプル添加過程におけるＵＶ２８０の吸収値を計測し、当該吸収値が水平域を１０％分超えるまで記録を続けた。サンプルの添加体積を計測し、３００ｃｍ／ｈの流速においての１ミリリットル当たりのＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦの実際の許容注入量を算出した。許容注入量の変化と多糖類含有量の変化は、図４に示した。
【００７５】
［実施例４］陰イオン交換クロマトグラフィーによる二次精製
実施例２で得られたｒＨＳＡ含有画分を均一に２等分し、以下の実験に用いた。
【００７６】
（１）Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ担体を用いる陰イオン交換クロマトグラフィー
１５／２００カラムに約７ｍｌのＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ担体を充填し、流出液のｐＨ値が７．０となるまで２００ｍｌの平衡用緩衝液（リン酸二水素ナトリウム０．３ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム３．５ｇ／Ｌに、水酸化ナトリウムまたは塩酸を加えてｐＨが７．０となるように調整したもの）を使って流速３００ｃｍ／ｈでカラムを平衡化した。上記画分の一方をｐＨが７．０になるように調整し、且つ当該緩衝液で導電率が１０．０ｍＳ以下となるように希釈した。当該サンプルを３００ｃｍ／ｈの流速でＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラムに添加した後、溶出用緩衝液（リン酸二水素ナトリウム０．３ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム３．５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１１．６８ｇ／Ｌ）で溶出し、ｒＨＳＡ含有画分を集めた。電気泳動図は、図５Ａに示した。
【００７７】
（２）ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ担体を用いる陰イオン交換クロマトグラフィー
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  １５／２００カラムに約８ｍｌのＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ担体を充填し、流出液のｐＨ値が７．０となるまで２００ｍｌの平衡用緩衝液（リン酸二水素ナトリウム０．３ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム３．５ｇ／Ｌに、水酸化ナトリウムまたは塩酸を加えてｐＨが７．０となるように調整したもの）を使って流速３００ｃｍ／ｈでカラムを平衡化した。上記画分の他の一方をｐＨが７．５になるように調整し、且つ当該緩衝液で導電率が１０．０ｍＳ以下となるように希釈した。当該サンプルを３００ｃｍ／ｈの流速でＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラムに添加した後、溶出用緩衝液（リン酸二水素ナトリウム０．３ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム３．５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１１．６８ｇ／Ｌ）で溶出し、ｒＨＳＡ含有画分を集めた。電気泳動図は、図５Ｂに示した。
【００７８】
［実施例５］疎水性クロマトグラフィーによる三次（仕上げ）精製
（１）Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ担体を用いる疎水性クロマトグラフィー
ＸＫ１６／１００カラムに約８ｍｌのＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ充填し、２００ｍｌの平衡用緩衝液（無水酢酸ナトリウム２．３２ｇ／Ｌ、リン酸二水素ナトリウム２．８１ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム６６ｇ／Ｌ）を使って流速１００ｃｍ／ｈでカラムを平衡化した。実施例４（Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ）で得られたｒＨＳＡ含有画分２０ｍｌに硫酸アンモニウム（０．４Ｍ）を加え、導電率が８０．０ｍＳとなるようにした。その後、当該サンプルを１００ｃｍ／ｈの流速でカラムに添加した。浸透液を集めてｒＨＳＡ含有画分を得た。電気泳動図は、図６Ａに示した。
【００７９】
（２）Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ担体を用いる疎水性クロマトグラフィー
ＸＫ１６／１００カラムに約１０ｍｌのＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦを充填し、２００ｍｌの平衡用緩衝液（無水酢酸ナトリウム２．３２ｇ／Ｌ、リン酸二水素ナトリウム２．８１ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム１３．２ｇ／Ｌ）を使って流速１５０ｃｍ／ｈでカラムを平衡化した。実施例４（Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ）で得られたｒＨＳＡ含有画分２０ｍｌに硫酸アンモニウム（０．１Ｍ）を加え、導電率が８０．０ｍＳとなるようにした。その後、当該サンプルを１５０ｃｍ／ｈの流速でカラムに添加した。浸透液を集めてｒＨＳＡ含有画分を得た。電気泳動図は、図６Ｂに示した。
【００８０】
（３）ＭａｃｒｏＰｒｅｐ−ｔ−ｂｕｔｙｌ担体を用いる疎水性クロマトグラフィー
１５／２００カラムに約６ｍｌのＭａｃｒｏＰｒｅｐ−ｔ−ｂｕｔｙｌ担体を充填し、２００ｍｌの平衡用緩衝液（無水酢酸ナトリウム２．３２ｇ／Ｌ、リン酸二水素ナトリウム２．８１ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム１３．２ｇ／Ｌ）を使って流速１５０ｃｍ／ｈでカラムを平衡化した。実施例３（Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ）で得られたｒＨＳＡ含有画分２０ｍｌに硫酸アンモニウム（それぞれ１．０  Ｍ、０．８  Ｍ、０．６Ｍ）を加え、導電率がそれぞれ１３０．０  ｍＳ、９０．０  ｍＳ、７０．０  ｍＳとなるようにした。その後、当該サンプルを１５０ｃｍ／ｈの流速でカラムに添加した。浸透液を集めてｒＨＳＡ含有画分を得た。電気泳動図は、図６Ｃに示した。
【００８１】
［実施例６］ｒＨＳＡ含有抽出液からのｒＨＳＡの分離及び精製
ステップ（１）：ＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  Ｓを用いる陽イオン交換クロマトグラフィーによる一次精製
ＸＫ１６／２０カラムに約１２ｍｌのＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  Ｓ担体を充填し、５００ｍｌの平衡用緩衝液（無水酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、酢酸、ｐＨ４．５）を使って流速３００ｃｍ／ｈでカラムを平衡化した。実施例１で得られたｒＨＳＡ含有抽出液のサンプル３００ｍｌを６００ｃｍ／ｈの流速でカラムに添加した。サンプルの導電率が６．５ｍＳ／ｃｍであり、ｐＨが４．５であった。サンプルを添加した後、溶出用緩衝液（酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、酢酸、ｐＨ５．０、塩化ナトリウム１４．６１ｇ／Ｌ）を使って２００ｃｍ／ｈの流速でサンプルを溶出した。溶出液を集めてＳＤＳ−ＰＡＧＥで観察を行い、ｒＨＳＡ含有画分を得た。電気泳動図は、図７Ａに示した。
【００８２】
ステップ（２）：Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦを用いる陰イオン交換クロマトグラフィーによる二次精製
ＸＫ１６／１００カラムに約１３ｍｌのＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ担体を充填し、４００ｍｌの平衡用緩衝液（無水酢酸ナトリウム６．５１ｇ／Ｌ、リン酸二水素ナトリウム０．７２ｇ／Ｌ、ｐＨ  ６．８）を使って流速３００ｃｍ／ｈでカラムを平衡化した。上記ステップで得られたｒＨＳＡ含有画分を約２００ｍｌに希釈し、導電率が１０．０ｍＳ未満となるようにした後、３００ｃｍ／ｈの流速でカラムに添加した。サンプルの導電率が８．３ｍＳ／ｃｍであり、ｐＨが６．８であった。サンプルを添加した後、溶出用緩衝液（リン酸水素二ナトリウム６．５１ｇ／Ｌ、リン酸二水素ナトリウム０．７２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１１．６９ｇ／Ｌ）を使って１００ｃｍ／ｈの流速でサンプルを溶出した。溶出液を集めてＳＤＳ−ＰＡＧＥで観察を行い、ｒＨＳＡ含有画分を集めた。電気泳動図は、図７Ｂに示した。
【００８３】
ステップ（３）：Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰを用いる疎水性クロマトグラフィーによる三次（仕上げ）精製
ＸＫ１６／１００カラムに約１２ｍｌのＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰを充填し、２００ｍｌの平衡用緩衝液（無水酢酸ナトリウム２．３２ｇ／Ｌ、リン酸二水素ナトリウム２．８１ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム６６ｇ／Ｌ）を使って流速１００ｃｍ／ｈでカラムを平衡化した。上記ステップで得られた２０ｍｌのｒＨＳＡ含有画分に硫酸アンモニウムを加え、導電率が９０．０ｍＳとなるようにした。その後、サンプルを１００ｃｍ／ｈの流速でカラムに添加した。浸透液を集めてｒＨＳＡ含有画分を得た。電気泳動図は、図７Ｃに示した。精製されたｒＨＳＡ産物のＨＰＬＣクロマトグラムは、図８に示した。ＨＰＬＣ解析により、ｒＨＳＡが（モノマーに、二量体と多量体を合わせて）９９％を超える純度を有することが確認できる。
【００８４】
［実施例７］ｒＨＳＡ含有抽出液からのｒＨＳＡの精製
本実施例において、４ステップを有する精製法にてｒＨＳＡを分離、精製するため、実施例１で得られたｒＨＳＡの粗抽出液を、それぞれＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  Ｓ、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ、Ｍａｃｒｏ−ｐｒｅｐセラミックヒドロキシアパタイトＩ型及びＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰをクロマトグラフィー担体とする陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、セラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー及び疎水性クロマトグラフィーで順に処理した。陽イオン交換クロマトグラフィーと陰イオン交換クロマトグラフィーは、実施例６と同様に行われる。
【００８５】
ＣＨＴカラムに約１５ｍｌのＭａｃｒｏ−ｐｒｅｐセラミックヒドロキシアパタイトＩ型の担体を充填し、２００ｍｌの平衡用緩衝液（２０ｍＭ  リン酸ナトリウム＋５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）を使って流速１００ｃｍ／ｈでカラムを平衡化した。陰イオン交換クロマトグラフィーから得るｒＨＳＡ含有画分を、そのまま流速１００ｃｍ／ｈでカラムに添加した。サンプルの導電率が２６ｍＳ／ｃｍであり、ｐＨが７．４〜７．６であった。サンプルを添加した後、溶出用緩衝液（５００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５）でサンプルを溶出し、浸透液を集めてｒＨＳＡ含有画分を得た。ｒＨＳＡの精製容量が３０ｍｇ／ｇ  ＣＨＴ  Ｉであったと推定され、ｒＨＳＡの回収率が８０％以上に達した。最後に、ＣＨＴセラミックヒドロキシアパタイトカラムを、カラム容積の３〜５倍量の緩衝液（５００ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）で再生した。必要に応じてカラムを１〜２Ｎ  ＮａＯＨで殺菌し、０．１Ｎ  ＮａＯＨに保存した。電気泳動図は、図９に示した。
【００８６】
その後、上記で得られたｒＨＳＡ含有画分を実施例６と同様の方法を用いて疎水性クロマトグラフィーで処理した。浸透液を集めてｒＨＳＡ含有画分を得た。精製されたｒＨＳＡ産物のＨＰＬＣクロマトグラムは、図１０に示した。ＨＰＬＣ解析により、ｒＨＳＡが約９９％（モノマーのみ）の純度を有することが確認できる。
【００８７】
［実施例８］ｒＨＳＡ含有抽出液からのｒＨＳＡの精製
本実施例において、セラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーとしてＭａｃｒｏ−ｐｒｅｐセラミックヒドロキシアパタイトＩＩ型のクロマトグラフィー担体を用いる以外、実施例７と同様の方法で精製を行った。
【００８８】
ＣＨＴカラムに約１５ｍｌのＭａｃｒｏ−ｐｒｅｐセラミックヒドロキシアパタイトＩＩ型のクロマトグラフィー担体を充填し、２００ｍｌの平衡用緩衝液（２０ｍＭ  リン酸ナトリウム＋５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）を使って流速１００ｃｍ／ｈでカラムを平行化した。その後、陰イオン交換クロマトグラフィーから得るｒＨＳＡ含有画分を、そのまま流速１００ｃｍ／ｈでカラムに添加した。サンプルの導電率が２６ｍＳ／ｃｍであり、ｐＨが７．４〜７．６であった。サンプルを添加した後、溶出用緩衝液（５００ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）でサンプルを溶出し、浸透液を集めてｒＨＳＡ含有画分を得た。ｒＨＳＡの精製量が≦２５ｍｇ／ｇ  ＣＨＴ  ＩＩであったと推定され，ｒＨＳＡの回収率は８５％以上に達した。最後に、ＣＨＴカラムをカラム容積の３〜５倍量の緩衝液（５００ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）で再生した。必要に応じてカラムを１〜２Ｎ  ＮａＯＨで殺菌し、０．１Ｎ  ＮａＯＨに保存した。
【００８９】
その後、実施例７と同様の方法に従い、上記ステップで得られたｒＨＳＡ含有画分を疎水性クロマトグラフィーで処理した。浸透液を集めてｒＨＳＡ含有画分を得た。電気泳動図は、図１１に示した。精製されたｒＨＳＡ産物のＨＰＬＣクロマトグラムは、図１２に示した。ＨＰＬＣ解析により、ｒＨＳＡが約９９％（モノマーのみ）の純度を有することが確認できる。
【００９０】
実施例６〜８の結果から示されるように、セラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、ｒＨＳＡ最終産物におけるモノマーの含有量を有効に高めることができ、その純度が約９９％に達した。なお、セラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰを用いる精製ステップで使われる方式と同様の通過方式を用いてｒＨＳＡを更に精製し、且つ同じ溶出液を、塩濃度とｐＨ値を調整しなくとも適用できるので、その操作が簡便である。セラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いることで、上記精製されたｒＨＳＡは、臨床応用の要求水準を満たすことができる。
【符号の説明】
【００９１】
Ｓ  添加サンプル
ＦＴ  浸透液（通過画分、flow through、transmission fluid）
Ｅｌｕ  ｒＨＳＡを含む溶出液
Ｅｌｕ１  非標的蛋白質の溶出液
Ｅｌｕ２  ｒＨＳＡの溶出液
ＣＩＰ  定置洗浄画分
【図１】
0005948343.tif 000002
【図２】
0005948343.tif 000003
【図３】
0005948343.tif 000004
【図４】
0005948343.tif 000005
【図５】
0005948343.tif 000006
【図６】
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【図７】
0005948343.tif 000008
【図８】
0005948343.tif 000009
【図９】
0005948343.tif 000010
【図１０】
0005948343.tif 000011
【図１１】
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【図１２】
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