(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変アデノウイルスヘキソンタンパク質を含んでなるキャプシドを有するアデノウイルスであって、前記改変アデノウイルスヘキソンタンパク質が、該ヘキソンタンパク質の超可変領域１中に最低２５個のアミノ酸の欠失、および該ヘキソンタンパク質の超可変領域１に挿入された５ないし４５個のアミノ酸残基からなる外因性アミノ酸配列を含んでなるが、但し、該外因性アミノ酸配列がアデノウイルス配列以外であり、かつ、該外因性アミノ酸配列が免疫原のアミノ酸配列である、上記アデノウイルス。
【請求項２】
ヘキソンタンパク質が１個より多くの欠失を含んでなる、請求項１に記載のアデノウイルス。
【請求項３】
天然の超可変領域のＮ末端からの最低１アミノ酸およびＣ末端からの最低１アミノ酸が保持される、請求項２に記載のアデノウイルス。
【請求項４】
改変アデノウイルスヘキソンタンパク質が、その中に挿入された１個より多くの外因性分子を含んでなる、請求項２に記載のアデノウイルス。
【請求項５】
外因性アミノ酸配列が長さ２５アミノ酸残基を含んでなる、請求項１に記載のアデノウイルス。
【請求項６】
アデノウイルスがその中に挿入された１個より多くの外因性アミノ酸配列を含み、かつ、第二の外因性アミノ酸配列がターゲッティング配列を含んでなる、請求項１に記載のアデノウイルス。
【請求項７】
ターゲッティング配列が、細胞受容体のリガンドおよび抗体若しくはそのフラグメントのエピトープよりなる群から選択される、請求項６に記載のアデノウイルス。
【請求項８】
ターゲッティング配列が、二特異性抗体、抗ファイバーノブ（ａｎｔｉ−ｆｉｂｅｒ  ｋｎｏｂ）Ｆａｂおよび抗受容体抗体よりなる群から選択される、請求項６に記載のアデノウイルス。
【請求項９】
免疫原のアミノ酸配列がＴ細胞エピトープである、請求項１に記載のアデノウイルス。
【請求項１０】
Ｔ細胞エピトープが中和エピトープである、請求項９に記載のアデノウイルス。
【請求項１１】
免疫原がＨＩＶタンパク質からの抗原である、請求項１に記載のアデノウイルス。
【請求項１２】
免疫原のアミノ酸配列が、ｔａｔタンパク質若しくはエンベロープタンパク質から選択されるＨＩＶタンパク質からのものである、請求項１１に記載のアデノウイルス。
【請求項１３】
外因性アミノ酸配列が配列番号１２に示されるＥＱＥＬＬＥＬＤＫＷＡＳＬＷである、請求項１１に記載のアデノウイルス。
【請求項１４】
免疫原のアミノ酸配列が抗体エピトープである、請求項１に記載のアデノウイルス。
【請求項１５】
請求項１に記載のアデノウイルスであって、該アデノウイルスは、さらに、該キョプシド内にパッケージングされた核酸分子を含んでなり、該核酸配列はパッケージングおよび複製に必要な５’及び３’シスエレメント並びに宿主細胞中での発現を可能にする調節配列の制御下にある導入遺伝子を含む、アデノウイルス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は免疫原性処方で有用な改変アデノウイルスヘキソン（ｈｅｘｏｎ）タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
アデノウイルスは約３６キロベース（ｋｂ）のゲノムサイズをもつ二本鎖ＤＮＡウイルスであり、多様な標的組織における高度に効率的な遺伝子移入および大きい導入遺伝子容量を達成するその能力により、遺伝子移入の応用に広範に使用されている。慣習的に、アデノウイルスのＥ１遺伝子を欠失し、そして選択すべきプロモーター、目的の遺伝子のｃＤＮＡ配列およびポリＡシグナルよりなる導入遺伝子カセットで置き換えて、複製欠損組換えウイルスをもたらす。
【０００３】
アデノウイルスは、多数の他の少ないタンパク質すなわちＶＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＩＩＩａおよびＩＶａ２と一緒に、３種の主要なタンパク質すなわちヘキソン（ＩＩ）、ペントンベース（ｐｅｎｔｏｎ  ｂａｓｅ）（ＩＩＩ）およびノブをもつファイバー（ｋｎｏｂｂｅｄ  ｆｉｂｅｒ）（ＩＶ）よりなる正二十面体キャプシドを含む特徴的な形態を有する［非特許文献１］。該ウイルスゲノムは、末端タンパク質が５’端（末端逆位配列（ＩＴＲ）を有する）に共有結合された直鎖状二本鎖ＤＮＡである。該ウイルスＤＮＡは、高度に塩基性のタンパク質ＶＩＩ、およびμと命名された小型ペプチドと緊密に会合している。別のタンパク質ＶはこのＤＮＡ−タンパク質複合体でパッケージングされ、そしてタンパク質ＶＩを介して該キャプシドに構造的連結を提供する。該ウイルスはウイルスにコードされるプロテアーゼもまた含有し、これは成熟感染性ウイルスを生じるための構造タンパク質の数種のプロセシングに必要である。
【０００４】
遺伝子送達およびワクチン処方のためのアデノウイルスの使用が記述されている。組換えアデノウイルスは宿主細胞への分子の送達について記述されている。２種のチンパンジーアデノウイルスＣ１およびＣ６８（Ｐａｎ９）のゲノムを記述する特許文献１を参照されたい。また、チンパンジーアデノウイルスＳＡｄ２２／Ｐａｎ５、Ｐａｎ６、Ｐａｎ  ７ならびにサルアデノウイルスＳＶ１、ＳＶ２５およびＳＶ３９のゲノムから構築されるベクターを記述する特許文献２；ならびに、ハイブリッドアデノウイルスベクターおよびサルアデノウイルスＳＡ１８から構築されるベクターを記述する特許文献３もまた参照されたい。
【０００５】
アデノウイルスに対する多様な改変が以前に提案されている。こうした改変は、アデノウイルスファイバータンパク質への挿入［非特許文献２］；ターゲッティングのためのペントンタンパク質への挿入［非特許文献３］；ターゲッティングのためのアデノウイルスタンパク質ＩＸへの挿入［非特許文献４］、およびターゲッティング［非特許文献５；特許文献４］ならびに抗原エピトープの挿入のためのアデノウイルスヘキソンの改変を包含する。
【０００６】
より具体的には、ヒトアデノウイルス血清型２（ＨＡｄＶ−２）のヘキソンタンパク質への外来ペプチドの挿入がＣｒｏｍｐｔｏｎら［非特許文献６］により報告された。Ｒｏｂｅｒｔｓら［非特許文献７］により報告されたＨＡｄＶ−２の構造を参照して、該著者らは、ＨＡｄＶ−２ヘキソンの１７アミノ酸（２８１−２９７）を、ポリオウイルス決定子を内部に持つ１７アミノ酸のペプチドで置き換えた。この置換を行ったヘキソンの領域は、現在、βシート要素β７とβ８の間のＤＥ１ループと称されている［非特許文献８］。
【０００７】
Ｃｒｏｍｐｔｏｎら（１９９４）の研究は、ヒトアデノウイルス血清型５（ＨＡｄ−Ｖ５）（ＨＡｄＶ−２と同一の血清学的サブグループに属しかつそれに緊密に関係する）で、上に引用されるＶｉｇｎｅらにより再現された。より具体的には、Ｖｉｇｎｅらは、ＨＡｄＶ−５のヘキソンに、Ｃｒｏｍｐｔｏｎらにより使用されたものに同一の場所でペプチドを挿入した（ＨＡｄＶ−２ヘキソンのＨＡｄＶ−５ヘキソンとのタンパク質アライメントに基づく）。Ｖｉｇｎｅらは、１４個のＨＡｄＶ−５ヘキソン残基（２６９−２８１）をポリオウイルスペプチドならびにインテグリンターゲッティングリガンドで置き換えた。
【０００８】
アデノウイルスヘキソン超可変領域は、配列が血清型間でかなり異なる領域として記述されている（非特許文献９；非特許文献８）。
【０００９】
必要とされるものは、宿主細胞への分子の代替送達方法である。
【００１０】
【特許文献１】米国特許第６，０８３，７１６号
【特許文献２】国際特許公開第ＷＯ  ０２／３３６４５号
【特許文献３】国際特許公開第ＷＯ  ０４／１６６１４号
【特許文献４】Ｌａｔｔａ，Ｍａｒｔｉｎｅらによる米国特許出願第ＵＳ２００３１４３２０９号
【非特許文献１】Ｗ．Ｃ．Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．、８１：２５７３−２６０４（２０００年１１月）
【非特許文献２】Ｃｕｒｉｅｌ，Ｄ．Ｔ．、Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．、８８６：１５８−７１（１９９９）
【非特許文献３】Ｅｉｎｆｅｌｄ，Ｄ．Ａ．ら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７３：９１３０−６）（１９９９）
【非特許文献４】Ｄｍｉｔｒｉｅｖ，Ｉ．Ｐ．ら、（２００２）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７６：６８９３−９（２００２）
【非特許文献５】Ｖｉｇｎｅ，Ｅ．ら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７３：５１５６−６１（１９９９）
【非特許文献６】Ｃｒｏｍｐｔｏｎら、（１９９４）Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．７５：１３３−９（１９９４）
【非特許文献７】Ｒｏｂｅｒｔｓら、（１９８６）、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２３２：１１４８−５１
【非特許文献８】Ｒｕｘ  ＪＪら、（２００３）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７７：９５５３−６６
【非特許文献９】Ｃｒａｗｆｏｒｄ−ＭｉｋｓｚａとＳｃｈｎｕｒｒ  ＤＰ．Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  １５  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｈｅｘｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｔｈｅ  ｌｏｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｓｅｖｅｎ  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．１９９６  ７０：１８３６−４４
【発明の開示】
【００１１】
［発明の要約］
一局面において、本発明は、改変アデノウイルスヘキソンタンパク質を含んでなるキャプシドを有するアデノウイルスを提供する。該アデノウイルスは、アデノウイルスヘキソンタンパク質の少なくとも超可変領域１および／若しくは超可変領域４中の欠失、ならびに欠失（１個若しくは複数）の部位に挿入された外因性分子をもつヘキソンタンパク質を含んでなる改変キャプシドを有する。
【００１２】
別の局面において、本発明はアデノウイルスベクターの特異性の変更方法を提供する。本方法は、超可変領域（１個若しくは複数）中の欠失の最低１個に異種ターゲッティングアミノ酸配列が挿入された、本明細書に記述されるところの改変アデノウイルスヘキソンタンパク質をもつキャプシドを有するアデノウイルスを提供することを必要とする。
【００１３】
なお別の局面において、本発明は、本発明の改変アデノウイルスヘキソンタンパク質を含むキャプシドを有するアデノウイルスを被験体に提供する段階を含んでなる、アデノウイルスベクターにより送達される免疫原性分子に対する免疫応答の増強方法を提供し、前記アデノウイルスは、キャプシド中にパッケージングされた免疫原性分子をコードする核酸分子をさらに含有する。
【００１４】
なお別の局面において、本発明は、ヘキソンタンパク質の機能的に欠失された超可変領域中に外因性免疫原若しくは抗原を有する改変アデノウイルスヘキソンタンパク質を有するキャプシドを有するアデノウイルスを含んでなる免疫原性組成物を提供する。
【００１５】
なお別の局面において、本発明は、ヘキソンタンパク質の機能的に欠失された超可変領域１および／若しくは超可変領域４中に異種免疫原若しくは抗原を有する改変アデノウイルスヘキソンタンパク質を含んでなるキャプシドを有するアデノウイルスを含有する、自己プライミングする免疫原性組成物を提供する。こうしたアデノウイルスは、アデノウイルスにより保有される発現カセット中に第二の免疫原若しくは抗原をさらに含んでなる。
【００１６】
本発明の他の局面および利点は、本発明の以下の詳細な記述から容易に明らかとなろう。
【００１７】
［発明の詳細な記述］
本発明は改変アデノウイルスヘキソンタンパク質を提供する。こうした改変アデノウイルスヘキソンタンパク質は最低１個の超可変領域中に部分的若しくは完全な欠失を有する。該改変アデノウイルスヘキソンタンパク質は、その中に挿入された１個若しくはそれ以上の独立に選択される外因性分子を有し得る。一態様において、外因性分子は少なくとも超可変領域１若しくは超可変領域４の部位に挿入されるが、但し、該外因性分子はアデノウイルス由来でない。あるいは、改変アデノウイルスヘキソンタンパク質は、指定される欠失の領域にいかなる挿入断片も欠くことができる。
【００１８】
改変アデノウイルスヘキソンタンパク質を使用して、アデノウイルスキャプシドおよび／若しくは感染性アデノウイルス粒子を生成し得る。従って、本明細書で使用されるところの改変アデノウイルスキャプシドは、本明細書に記述されるところの改変アデノウイルスヘキソンタンパク質を含有するアデノウイルスキャプシドを指す。
【００１９】
一態様において、本発明の改変アデノウイルスキャプシドは空でありうる。すなわち、それはウイルスゲノムを欠きかつ／若しくは発現カセットを含有しない。こうした改変アデノウイルスキャプシドをタンパク質の形態での送達のため組成物中に処方し得る。あるいは、こうした改変アデノウイルスキャプシドは、宿主細胞中での発現のための適するベクターによる送達のため組成物中に処方し得る。
【００２０】
別の態様において、改変アデノウイルスキャプシドは、細胞への送達のため１種若しくはそれ以上の異種分子をその中にパッケージングさせている改変アデノウイルスキャプシドを有するアデノウイルス粒子の形態で製造する。別の方法で明記される場合を除き、本明細書で使用されるところの改変アデノウイルスベクターは、こうしたアデノウイルス粒子を指す。
【００２１】
超可変領域１（ＨＶＲ１）および超可変領域４（ＨＶＲ４）はヒトサブグループＣアデノウイルスで同定されている。これらの領域の構造は、アデノウイルスサブグループＣゲノムの他の超可変領域、すなわちＨＶＲ２、ＨＶＲ３、ＨＶＲ４、ＨＶＲ５、ＨＶＲ６およびＨＶＲ７の構造がそうであるように定義されていない。ヒトアデノウイルス血清型２のヘキソンタンパク質を便宜上配列番号１に再現する。ヒトアデノウイルス血清型５のヘキソンタンパク質を便宜上配列番号２に再現する。
【００２２】
理論により束縛されることを願わずに、発明者は、ヘキソンのこれらのＨＶＲ領域が多様なアデノウイルス間で長さおよび配列が大きく変動し、それにより多様な長さの多様な分子の挿入に対する寛容性を有する柔軟性の構築物を提供するため、本発明の改変アデノウイルスヘキソンタンパク質が有利であると考える。従って、本発明は、免疫応答の標的を定めかつ増強するのに有用な多様な異種分子の挿入を可能にする、高度に柔軟性の構築物を提供する。
【００２３】
「機能的」という用語は、天然の産物と同一レベルででは必ずしもないとは言えその天然の機能を遂行する産物（例えばタンパク質若しくはペプチド）を指す。「機能的」という用語は、ある産物をコードしかつそれから所望の産物が発現され得る遺伝子もまた指すことがある。「機能の欠失」は、その天然の機能を遂行する該産物の能力を破壊する欠失を指す。
【００２４】
本明細書で使用されるところの、ＨＶＲに関して本明細書に記述される欠失は、ヘキソンタンパク質中でＨＶＲを構成するアミノ酸配列の全部若しくは一部の除外を必要とし得る。例えば、４５アミノ酸のＨＶＲ（例えばＡｄ２若しくはＡｄ５のＨＶＲ１）について、１から４５アミノ酸までの欠失が行われていてもよく、例えば１から５まで、最低１０、最低２５、最低３０、最低３５若しくはそれ以上のアミノ酸の欠失が行われていてもよい。一態様において、天然の超可変領域のＮ末端からの最低１アミノ酸およびＣ末端からの最低１アミノ酸が保持される。
【００２５】
本明細および請求の範囲を通じて使用されるところの「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」という用語、ならびに他の変形物のなかでも「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでなること」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」および「含有すること」を包含するその変形物は、他の成分、要素、整数、段階などを包括する。「よりなる」若しくは「よりなること」という用語は、他の成分、要素、整数、段階などを除外する。
【００２６】
一態様において、改変アデノウイルスはＨＶＲ１および／若しくはＨＶＲ４に欠失を含有するキャプシドを有する。別の態様において、改変アデノウイルスは、これらの領域の一方若しくは双方、およびまた別の選択されたＨＶＲ、例えばＨＶＲ２、ＨＶＲ３、ＨＶＲ５、ＨＶＲ６若しくはＨＶＲ７にも改変を含有するキャプシドを有する。
【００２７】
超可変領域１は、ＨＡｄＶ−２の残基の番号付け［配列番号１、Ｒ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ａ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−２  ｇｅｎｏｍｅ、ｐ．１−５１、Ｗ．Ｄｏｅｒｆｌｅｒ（編）Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ＤＮＡ．Ｍａｒｉｎｕｓ  Ｎｉｊｈｏｆｆ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、ボストン中］に基づくＨＡｄＶ−５［配列番号２］およびＨＡｄＶ−２［配列番号１］のヘキソンタンパク質の残基１３９ないし１６７若しくは残基１４７から１６２内に位置する。超可変領域４は、同一の番号付けスキームに基づき、ＨＡｄＶ−２のヘキソンタンパク質の残基２２２から２７１内に位置する。それら自身の番号付けに関する他のアデノウイルスのＨＶＲの位置を提供する例示的一アライメントについては例えば図３を参照されたい。こうし
たアライメントの製造は当該技術分野の熟練内に十分にある。
【００２８】
この情報を与えられれば、当業者は、ヒトサブグループＣアデノウイルス内の多様な血清型からのもの、若しくはサブグループＣアデノウイルス外の血清型からのものを包含する多様なアデノウイルス配列のヘキソン配列のアライメントを利用して、対応する超可変領域を容易に決定し得る。数種のアデノウイルスの配列およびそれらの超可変領域の位置の具体的に説明するアライメントについては、例えば、Ｃｒａｗｆｏｒｄ−ＭｉｋｓｚａとＳｃｈｎｕｒｒ、上に引用される、およびＲｕｘ，ＪＪら、（２００３）、上に引用されるを参照されたい。他の適するアデノウイルス配列は、記述された他のヒトおよびヒト以外の配列のなかから容易に選択しうる。
【００２９】
本明細書に記述されるところのアライメントは、インターネットのウェブサーバを通じてアクセス可能な「Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ」のような多様な公的に若しくは商業的に利用可能な多配列アライメントプログラムのいずれかを使用して実施する。あるいは、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩユーティリティーもまた使用される。上述されたプログラムに含有されるものを包含する、ヌクレオチド配列の同一性を評価するのに使用し得る当該技術分野で既知の多数のアルゴリズムもまた存在する。別の例として、ポリヌクレオチド配列は、ＧＣＧ
Ｖｅｒｓｉｏｎ６．１中のプログラムＦａｓｔａを使用して比較し得る。Ｆａｓｔａはクエリ配列と参照配列の間の最良のオーバーラップ領域のアライメントおよび配列の同一性パーセントを提供する。例えば、核酸配列間の配列の同一性パーセントは、ＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ６．１（引用することにより本明細書に組み込まれる）に提供されるところのそのデフォルトのパラメータ（６のｗｏｒｄ  ｓｉｚｅおよびスコアリングマトリックスについてのＮＯＰＡＭ係数）を用いてＦａｓｔａを使用して決定し得る。同様に、アミノ酸アライメントを実施するためのプログラムが利用可能である。一般に、これらのプログラムはデフォルトの設定で使用されるとは言え、当業者はこれらの設定を必要とされるように変更し得る。あるいは、当業者は、参照されるアルゴリズムおよびプログラムにより提供されるもののような同一性若しくはアライメントのレベルを少なくとも提供する別のアルゴリズム若しくはコンピュータプログラムを利用し得る。
【００３０】
適するアデノウイルスは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、米国バージニア州マナサス（ＡＴＣＣ）、多様な学術的および商業的供給源から入手可能であるか、または、所望の領域は、既知技術を使用して、文献に公表された若しくはデータベース（例えばＧｅｎＢａｎｋなど）から入手可能な配列を参照して合成しうる。適するアデノウイルスの例は、ヒトアデノウイルス血清型２［配列はＲ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ａ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−２  ｇｅｎｏｍｅ、ｐ．１−５１、Ｗ．Ｄｏｅｒｆｌｅｒ（編）Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ＤＮＡ．Ｍａｒｔｉｎｕｓ  Ｎｉｊｈｏｆｆ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、ボストン中に公表されている、３型、４型［ＨＡｄＶ−４ゲノムの配列はＳ．Ｊａｃｏｂｓら、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８５（２００４）、３３６１−３３６６に報告され、ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ受託番号ＡＹ４８７９４７に報告されている］、５型［配列はＲ．Ｋｉｎｌｏｃｋら、１９８４．Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｈｅｘｏｎ：ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｓｕｂｇｒｏｕｐ  Ｃ  ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ
２  ａｎｄ  ５．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：６４３１−６４３６に公表されている］、ＡＶ１およびＡＶ  ６［Ｐ．Ｐｒｉｎｇ−ＡｋｅｒｂｌｏｍとＴ．Ａｄｒｉａｎ、１９９３、Ｒｅｓ．Ｖｉｒｏｌ、１４４：１１７−１２１］、７、１２［配列はＪ．Ｓｐｒｅｎｇｅｌら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、６８：３７９−３８９（１９９４）に公表されている］、４０［配列は、Ｃ  Ｉ  Ｔｏｏｇｏｏｄら、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ、７０：３２０３−３２１４（１９８９）に公表されている］、ならびに、所望の細胞中で培養し得る現在同定されているヒトのタイプのいずれもさらに包含する［例えばＨｏｒｗｉｔｚ、”Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ”、ＶＩＲＯ
ＬＯＧＹ、第２版中ｐｐ．１６７９−１７２１（１９９０）を参照されたい］を制限なしに包含する。同様に、ヒト以外の霊長類（例えばチンパンジー、アカゲザル、マカクおよび他のサル種）若しくは他のヒト以外の哺乳動物を感染させることが既知かつ所望の細胞中で増殖するアデノウイルスを、本発明のベクター構築物で使用し得る。こうした血清型は、とりわけ、チンパンジーアデノウイルスＳＡｄ２２／Ｐａｎ５［ＶＲ−５９１］、ＳＡｄ２３／Ｐａｎ６［ＶＲ−５９２］、Ｓａｄ２４／Ｐａｎ７［ＶＲ−５９３］ならびにＳＡｄ２５／Ｃ６８［Ｐａｎ９、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ３９４１９６）および米国特許第６，０８３，７１６号］；ならびに、ＳＶ１［ＶＲ−１９５］；ＳＶ２５［ＳＶ−２０１］；ＳＶ３５；ＳＶ１５；ＳＶ−３４；ＳＶ−３６；ＳＶ−３７、およびヒヒアデノウイルス［ＶＲ−２７５］を制限なしに包含するサルアデノウイルスを制限なしに包含する。ＳＡｄ２２／Ｐａｎ５（Ｃ５ともまた命名される）、ＳＡｄ２３／Ｐａｎ６（Ｃ６ともまた命名される）、Ｓａｄ２４／Ｐａｎ７（Ｃ７ともまた命名される）、ＳＶ１、ＳＶ２５およびＳＶ３９の配列は記述されている［２００３年６月５日に公開された第ＷＯ
０３／０４６１２４号、第ＵＳ−２００５−００６９８６６−Ａ１号、２００５年３月３１日としてもまた公開されている］（引用することにより組込まれる）。ハイブリッドアデノウイルスベクター、およびサルアデノウイルスＳＡ１８から構築されたベクターを記述する国際特許公開第ＷＯ  ０４／１６６１４号明細書もまた参照されたい。ＳＡｄ２２／Ｐａｎ５［配列番号４］、ＳＡｄ２３／Ｐａｎ６［配列番号３］、ＳＡｄ２４／Ｐａｎ７［配列番号５］、ＳＶ１［配列番号１０］、ＳＶ２５［配列番号７］、ＳＶ３９［配列番号８］およびＳＡ１８［配列番号９］のヘキソンタンパク質の配列を本明細書に再現する。しかしながら、当業者は、他のアデノウイルス株由来の匹敵する領域を容易に選択しかつこれらの血清型の代わりに（若しくはそれらとともに）本発明で使用しうることを理解するであろう。
【００３１】
これらの技術を使用して、アデノウイルスサブグループＣのＨＶＲ１および／若しくはＨＶＲ４または他のＨＶＲに類似である他のアデノウイルス配列中の超可変領域もまた同定しうる。本発明の改変アデノウイルスヘキソンは、これらの改変に加え、他の超可変（ＨＶＲ）領域の１個若しくはそれ以上に対する改変を含有する。
【００３２】
一態様において、選択したＨＶＲで機能の欠失を行い、そしてその中に分子を挿入しない。これは、多様な理由から、例えば別のＨＶＲ若しくはキャプシド中の他の場所に大きな挿入断片を収容するために望ましいかもしれない。こうした機能的に欠失されたアデノウイルスヘキソンタンパク質は、アデノウイルス粒子を製造するため、ならびに他の用途に利用し得る。
【００３３】
別の態様において、改変アデノウイルスヘキソンタンパク質は、ＨＶＲ領域の欠失に挿入された外因性分子を含有する。こうした外因性分子は、改変アデノウイルスヘキソンタンパク質（またはウイルス粒子若しくは空の形態のそれを含有するキャプシド）の標的を変える、改変アデノウイルスキャプシドの免疫原性を変える、および／あるいは外因性アミノ酸配列若しくは免疫学的に交差反応性の分子に対する免疫応答を誘導するのに有用でありうる。
【００３４】
一態様において、アデノウイルスヘキソンタンパク質に挿入された外因性分子は、野生型アデノウイルスのアミノ酸配列、若しくはより具体的には工作されるべき野生型ウイルス成分タンパク質中の機能上同等な位置にその完全な配列が見出されない、長さ最低２、最低４、最低８、最低１０、最低１５、最低２０、最低２５若しくはそれ以上のアミノ酸残基のまたはより長い外因性アミノ酸配列である。ある態様において、外因性アミノ酸配列は、天然に存在しない、すなわち合成でまたは人工的に設計若しくは製造されたポリペプチドであるという意味で非天然でもまたありうる。ヘキソンタンパク質をコードする核酸分子の情況で、外因性分子は所望のアミノ酸配列をコードする核酸配列の形態にあり得
ることが理解されるであろう。
【００３５】
一態様において、外因性分子はターゲッティングに有用なアミノ酸配列である。本明細書で使用されるところの「ターゲッティング配列」は、改変アデノウイルスを指図するためのシグナルとして作用する特定のアミノ酸配列である。従って、一態様において、アデノウイルスキャプシドは、それが由来する天然の（野生型）ウイルスが結合しない所望の標的細胞に結合するように改変しうるか、または、それは、野生型ウイルスより制限された結合特異性を有するように、言い換えれば、野生型ウイルスが結合する標的細胞型のより広範な集団のなかから標的細胞の選択された１若しくは特定のサブセット若しくは型のみに結合するように、改変しうる。別の代替において、アデノウイルスは、その元の標的に結合する何らかの能力を保持し、そして付加的な標的が該外因性アミノ酸配列により提供される。ウイルスの向性が従って変えられる。これゆえに、「変えられた向性」により、改変ウイルスが、それが由来する野生型ウイルスのものに対し変えられたすなわち異なる標的細胞結合特異性を表すことを意味している。
【００３６】
有用な外因性分子の例は、例えば、正に荷電したアミノ酸（例えばリシン残基若しくはシステイン残基）、インターフェロンおよびインターロイキンのようなサイトカイン；リンホカイン；病原性生物体（ウイルス、細菌若しくは寄生生物）、好ましくはＨＩＶウイルス（ヒト免疫不全ウイルス）により認識される受容体のような膜受容体；第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子のような凝固因子；ジストロフィン；インスリン；ＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子）タンパク質のような細胞のイオンチャンネルに直接若しくは間接的に参画しているタンパク質；アンチセンスＲＮＡ、あるいは病原性生物体のゲノム中に存在する病原性遺伝子により産生されるタンパク質の活性を阻害することが可能なタンパク質、またはその発現が調節解除される細胞遺伝子の活性を阻害することが可能なタンパク質（若しくはそれらをコードする遺伝子）、例えば癌遺伝子；例えばα１−アンチトリプシン若しくはウイルスプロテアーゼ阻害剤のような酵素活性を阻害するタンパク質；例えば、標的配列への結合について天然のタンパク質と競合してそれによりＨＩＶの活性化を予防することが可能であるＨＩＶウイルスのｔａｔタンパク質のトランスドミナントバリアントのような、それらの生物学的機能を損なうように変異されている病原性タンパク質のバリアント；宿主細胞の免疫を増大させるための抗原エピトープ；主要組織適合複合体クラスＩおよびＩＩタンパク質、ならびにこれらの遺伝子の誘導因子であるタンパク質；抗体；免疫毒素をコードする遺伝子；毒素；成長因子若しくは成長ホルモン；細胞受容体およびそれらのリガンド；腫瘍抑制因子；限定されるものでないが癌遺伝子を挙げることができる心血管系疾患に関与するタンパク質；限定されるものでないが線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）および神経成長因子（ＮＧＦ）を挙げることができる成長因子；ｅ−ｎｏｓ、限定されるものでないがＲｂ（網膜芽腫）遺伝子を挙げることができる腫瘍抑制遺伝子；リポタンパク質リパーゼ；スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）；カタラーゼ；酸素およびフリーラジカルスカベンジャー；アポリポタンパク質；ならびにｐａｉ−１（プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１）；細胞性酵素、若しくは病原性生物体により産生されるもの；自殺遺伝子；ホルモン、Ｔ細胞受容体（エピトープ）、抗体エピトープ、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）、ならびに多様なタンパク質ライブラリーから同定されたリガンドを包含しうる。
【００３７】
一態様において、細胞表面受容体のリガンドが外因性分子である。適するリガンドの例は、例えば、抗体または抗体フラグメント若しくは誘導体、一本鎖抗体（ＳｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、およびＦｖフラグメントの相補性決定領域（ＣＤＲ）のような抗体の最小認識単位を包含する。こうしたアミノ酸配列は、抗体の抗原結合部位または抗原結合若しくは認識／領域（１個若しくはそれ以上）から得ることができるか若しくはそれらに由来することができ、そして、こうした抗体は天然でも若しくは合成でもよい。
【００３８】
別の態様において、ウイルスタンパク質が外因性分子である。例えば、ＨＳＶ−１  ＴＫ酵素は、（アシクロビル若しくはガンシクロビルのような）ある種のヌクレオシドアナログに対し、細胞のＴＫ酵素と比較してより大きい親和性を有する。
【００３９】
なお別の態様において、外因性分子は免疫原である。「免疫原性」分子は、細胞性免疫応答、抗体応答若しくは双方を誘導するものを包含しうる。病原体へのさらなる感染に対し保護的かつ／または疾患の症状若しくは他の状態に対し保護的である免疫応答を誘導するものを包含するワクチン分子。抗原は体液性（抗体）免疫応答を誘導することが可能である分子を指す。
【００４０】
典型的には、免疫原性分子は、特定のウイルス、生物体（例えば細菌、真菌、酵母）若しくは他の供給源（例えば腫瘍）、または交差反応性の生物体若しくは供給源に対する特異的免疫応答を誘導する。しかしながら、ある態様において、例えば免疫応答をブーストすることにより非特異的免疫調節応答を誘導する免疫原性分子を利用することが望ましいかもしれない。例えば、こうした分子は、それに対する免疫応答が望ましい分子の前に若しくはそれと一緒にそれが送達されるかどうかに依存して、ワクチン投与計画におけるプライム（ｐｒｉｍｅ）として若しくはアジュバントとして使用し得る。
【００４１】
適する免疫原は、例えば、Ｔ細胞エピトープ（例えばＣＤ４若しくはＣＤ８エピトープ）、抗体エピトープ、またはペプチド、ポリペプチド、酵素、あるいは細菌、真菌、酵母および／若しくはウイルス由来の他のフラグメントを包含する。免疫原の適する供給源は、とりわけ、本明細書に記述される免疫原性導入遺伝子の産物である。なお他の免疫原は当業者に容易に明らかであろう。
【００４２】
従って、一局面において、本発明は、１種若しくはそれ以上の外因性分子を含有するように改変された改変アデノウイルスヘキソンタンパク質を提供する。１種以上の外因性分子を利用する場合、該分子は同一であってもよい。別の態様において、外因性分子は異なってもよい。例えば、改変アデノウイルスヘキソンタンパク質は、天然のターゲッティングを改変する１領域中の外因性分子、および天然の中和エピトープを改変しかつ／若しくは免疫応答を誘導する別の領域中の外因性分子を含有しうる。別の例において、改変アデノウイルスヘキソンタンパク質は１種以上の型の外因性免疫原を含有しうる。独立に選択しうる適する外因性分子の多くの他の組合せが、当業者に明らかであろう。当業者に容易に明らかであろうとおり、ある種の分子はターゲッティング分子および免疫原双方として機能しうる。
【００４３】
こうした外因性分子（例えばアミノ酸配列）を製造しかつそれらをウイルス若しくはウイルス成分に導入するための技術は、当該技術分野で公知であり、そして文献に広範に記述されている。従って、例えば、分子生物学若しくは遺伝子工学技術が、本発明の改変ウイルス若しくはウイルス成分として発現されることが可能な遺伝子配列を製造若しくは構築するために容易に利用可能である。例えば、ウイルス成分タンパク質をコードする核酸分子若しくはヌクレオチド配列は、外因性アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を導入するように、例えば、アデノウイルスタンパク質の全部若しくは一部および外因性アミノ酸配列を含んでなる融合タンパク質をコードするように、改変しうる。
【００４４】
いかなるこうした付加的な若しくは外的なモチーフ若しくは機能も、「リンカー」配列によってウイルスに組み込まれることが便宜的若しくは必要でありうる。リンカー配列への結合を介するＤＮＡ若しくはアミノ酸配列の組み込みのためのこうした構築技術は、当該技術分野で既知であり、そしてタンパク質／遺伝子工学者の慣例の熟練内にある。
【００４５】
別の態様において、本発明は、所望の分子を保有する発現カセットを含有しうる感染性
アデノウイルス粒子の製造のために、外因性分子を含有する改変アデノウイルスキャプシドを利用する。適しては、発現カセットにより保有される分子は、産物若しくはそれと交差反応性の分子に対する免疫応答を誘導するのに有用な産物をコードする。
【００４６】
一例において、本態様は、改変アデノウイルスキャプシドが、発現カセットにより送達される分子のアジュバントとして機能することを可能にする。別の例において、本態様は、改変アデノウイルスキャプシドが、発現カセットにより送達される分子の自己プライミングする構築物として機能することを可能にする。
改変アデノウイルスベクター
一態様において、本発明は改変アデノウイルスキャプシドを含んでなる組成物を提供する。
【００４７】
本明細書で使用されるところの改変アデノウイルスキャプシドは、本明細書に記述されるとおり改変されたアデノウイルスヘキソンタンパク質を含有するアデノウイルスキャプシドを指す。加えて、改変アデノウイルスキャプシドは他の改変を含有しうる。こうした他の改変は、ヘキソンタンパク質、または他のキャプシドタンパク質、例えばファイバータンパク質若しくはペントン中の他の改変を包含しうる。例えば、改変アデノウイルスヘキソンは、米国特許第５，９２２，３１５号明細書（引用することにより組込まれる）に記述されるとおり変えられたヘキソンタンパク質をさらに含有しうる。本方法で、アデノウイルスヘキソンの最低１個のループ領域が、別のアデノウイルス血清型の最低１個のループ領域で変えられる。なお他の適する改変が記述されている［２００４年９月２日に公開された米国公開特許出願第２００４０１７１８０７号明細書。］あるいは、若しくは加えて、改変キャプシドは別の分子、例えば脂質、融合タンパク質と会合しうる。
【００４８】
一局面において、本発明の組成物は改変アデノウイルスベクターを包含する。別の方法で明記される場合を除き、本明細書で使用されるところの改変アデノウイルスベクターは、改変アデノウイルスキャプシドを有しかつ１種若しくはそれ以上の異種分子を細胞に送達する発現カセットを該キャプシド中にパッケージングしたアデノウイルス粒子を指す。アデノウイルス成分は、本明細書に記述されたかつ当業者に入手可能であるもののような多様な異なるアデノウイルスから得ることができるか若しくはそれらに由来し得る。アデノウイルスゲノムは双方の鎖にオープンリーディングフレームを含有するため、多くの場合、特定のオープンリーディングフレームと遺伝子領域の間の混同を回避するために多様な領域の５’および３’端に、本明細書で言及がなされる。従って、本明細書でアデノウイルスゲノムの「左」および「右」端に言及がなされる場合、この言及は、当該技術分野で慣習的であるところの図解の形式で描かれる場合に、およそ３６ｋｂのアデノウイルスゲノムの端に対してである［例えば、Ｈｏｒｗｉｔｚ、”Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ”、ＶＩＲＯＬＯＧＹ、第２版中ｐｐ．１６７９−１７２１（１９９０）を参照されたい］。従って、本明細書で使用されるところのアデノウイルスゲノムの「左末端」は、ゲノムが直鎖状の形態で図解で描かれる場合に該図の一番左端に位置するアデノウイルスゲノムの部分を指す。典型的には、左端は地図単位０で開始しかつ少なくとも５’末端逆位配列（ＩＴＲ）を包含するように右に伸長するゲノムの部分であることを指し、そして構造的遺伝子をコードするゲノムの内部領域を除外する。本明細書で使用されるところのアデノウイルスゲノムの「右末端」は、ゲノムが直鎖状の形態で図解で描かれる場合に該図の一番右端に位置するアデノウイルスゲノムの一部分を指す。典型的には、アデノウイルスゲノムの右端は、地図単位３６で終端しかつ少なくとも３’ＩＴＲを包含するように左に伸長するゲノムの一部分を指し、そして構造的遺伝子をコードするゲノムの内部領域を除外する。
【００４９】
「ミニ遺伝子」により、選択された異種遺伝子、ならびに宿主細胞での該遺伝子産物の翻訳、転写および／若しくは発現を駆動するのに必要な他の調節エレメントの組合せを意
味している。
【００５０】
典型的には、選択されたアデノウイルス遺伝子に対し天然の領域中に他のアデノウイルス配列を含有する核酸分子中にミニ遺伝子が配置されるようなアデノウイルスベクターを設計する。ミニ遺伝子は、所望の場合は既存の遺伝子領域の機能を混乱させるようにその領域に挿入しうる。あるいは、ミニ遺伝子は部分的に若しくは完全に欠失されたアデノウイルス遺伝子の部位に挿入しうる。例えば、ミニ遺伝子は、選択されうる他者のなかでも機能的Ｅ１欠失若しくは機能的Ｅ３欠失の部位のような部位に配置しうる。「機能的に欠失された」若しくは「機能の欠失」という用語は、遺伝子領域の十分な量が除去または例えば突然変異若しくは改変により別の方法で損傷されて、その結果該遺伝子領域が遺伝子発現の機能的産物を産生することがもはや可能でないことを意味している。所望の場合は該遺伝子領域全体を除去しうる。遺伝子破壊若しくは欠失の他の適する部位は、本出願の別の場所で論考する。
【００５１】
例えば、組換えウイルスの生成に有用な産生ベクターについて、該ベクターは、ミニ遺伝子、およびアデノウイルスゲノムの５’端若しくはアデノウイルスゲノムの３’端いずれか、またはアデノウイルスゲノムの５’および３’双方の端を含有しうる。アデノウイルスゲノムの５’端は、パッケージングおよび複製に必要な５’シスエレメント；すなわち５’末端逆位配列（ＩＴＲ）の配列（複製起点として機能する）および天然の５’パッケージングエンハンサードメイン（直鎖状Ａｄゲノムをパッケージングするのに必要な配列およびＥ１プロモーターのエンハンサーエレメントを含有する）を含有する。アデノウイルスゲノムの３’端は、パッケージングおよびキャプシド形成に必要な３’シスエレメント（ＩＴＲを包含する）を包含する。適しては、組換えアデノウイルスは５’および３’双方のアデノウイルスのシスエレメントを含有し、また、ミニ遺伝子は５’および３’のアデノウイルス配列の間に配置される。本発明のいかなるアデノウイルスベクターも、付加的なアデノウイルス配列もまた含有しうる。
【００５２】
本明細書に記述されるウイルス配列、ヘルパーウイルス（必要とされる場合）、および組換えウイルス粒子、ならびにベクターの構築で使用される他のベクター成分および配列は、上述されたとおり得られる。アデノウイルス配列のＤＮＡ配列を使用して、ベクターおよびこうしたベクターの製造に有用な細胞株を構築する。
【００５３】
配列の欠失、挿入および他の突然変異を包含する本発明のベクターを形成する核酸配列の改変は、標準的分子生物学技術を使用して生成することができ、そして本発明の範囲内にある。
【００５４】
導入遺伝子の選択、「ミニ遺伝子」のクローニングおよび構築、ならびにウイルスベクターへのその挿入に使用される方法は、本明細書に提供される教示を与えられれば、当該技術分野の熟練内にある。
【００５５】
１．導入遺伝子
導入遺伝子は、目的のポリペプチド、タンパク質若しくは他の産物をコードする導入遺伝子に隣接するベクター配列に対し異種の核酸配列である。核酸コーディング配列は、宿主細胞中での導入遺伝子の転写、翻訳および／若しくは発現を可能にする様式で調節成分に効果的に連結される。導入遺伝子配列の組成は、生じるベクターがもたらされることができる使用に依存することができる。例えば、１つの型の導入遺伝子配列は、発現に際して検出可能なシグナルを生じるレポーター配列を包含する。こうしたレポーター配列は、β−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、例えばＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８を包含する膜結
合型タンパク質、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質、およびそれらに対しそれらに向けられる高親和性抗体が存在するか若しくは慣習的手段により製造され得る当該技術分野で公知の他者、ならびにとりわけヘマグルチニン若しくはＭｙｃからの抗原標識ドメインに適切に融合された膜結合型タンパク質を含んでなる融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を制限なしに包含する。これらのコーディング配列は、それらの発現を駆動する調節エレメントと連合される場合に、酵素、Ｘ線撮影、比色、蛍光若しくは他の分光写真アッセイを包含する慣習的手段、蛍光活性化細胞分取アッセイ、ならびに酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および免疫組織化学を包含する免疫学的アッセイにより検出可能なシグナルを提供する。例えば、マーカー配列がＬａｃＺ遺伝子である場合、該シグナルを保有するベクターの存在は、β−ガラクトシダーゼ活性のアッセイにより検出される。
【００５６】
導入遺伝子がＧＦＰ若しくはルシフェラーゼである場合、該シグナルを保有するベクターはルミノメーターで色若しくは光産生により視覚的に測定しうる。しかしながら、望ましくは、導入遺伝子は、タンパク質、ペプチド、ＲＮＡ、酵素、若しくは触媒ＲＮＡのような生物学および医学で有用である産物をコードする非マーカー配列である。所望のＲＮＡ分子は、ｔＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、触媒ＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡを包含する。有用なＲＮＡ配列の一例は、処置される動物での標的とされる核酸配列の発現を消滅させる配列である。
【００５７】
導入遺伝子は、癌治療薬若しくはワクチンとして処置に、免疫応答の誘導に、および／または予防ワクチンの目的上使用しうる。本明細書で使用されるところの免疫応答の誘導は、ある分子（例えば遺伝子産物）に対するＴ細胞および／若しくは体液性免疫応答を誘導する該分子の能力を指す。本発明は複数の導入遺伝子を使用することをさらに包含する。ある状況では、１タンパク質の各サブユニットをコードするのに、または異なるペプチド若しくはタンパク質をコードするのに異なる導入遺伝子を使用しうる。これは、タンパク質サブユニットをコードするＤＮＡの大きさが大きい場合、例えば免疫グロブリン、血小板由来増殖因子若しくはジストロフィンタンパク質に望ましい。細胞が多サブユニットタンパク質を産生するためには、異なるサブユニットのそれぞれを含有する組換えウイルスに細胞を感染させる。あるいは、タンパク質の異なるサブユニットを同一の導入遺伝子によりコードしうる。この場合、単一遺伝子がサブユニットのそれぞれをコードするＤＮＡを包含し、各サブユニットのＤＮＡは配列内リボザイム進入部（ＩＲＥＳ）により分離される。これは、サブユニットのそれぞれをコードするＤＮＡの大きさが小さい、例えばサブユニットをコードするＤＮＡおよびＩＲＥＳの大きさの合計が５キロベース未満である場合に望ましい。ＩＲＥＳに対する一代替として、ＤＮＡは、翻訳後事象で自己切断する２Ａペプチドをコードする配列により分離しうる。例えば、Ｍ．Ｌ．Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、７８（Ｐｔ  １）：１３−２１（１９９７年１月）；Ｆｕｒｌｅｒ，Ｓ．ら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、８（１１）：８６４−８７３（２００１年６月）；Ｋｌｕｍｐ  Ｈ．ら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、８（１０）：８１１−８１７（２００１年５月）を参照されたい。この２ＡペプチドはＩＲＥＳより有意により小さく、空間が制限要因である使用にそれを良好に適するようにする。しかしながら、選択された導入遺伝子は、いかなる生物学的活性産物若しくは他の産物、例えば研究に所望の産物もコードしうる。
【００５８】
適する導入遺伝子は当業者により容易に選択されうる。導入遺伝子の選択は本発明の制限であると考えられない。
【００５９】
２．調節エレメント
ミニ遺伝子について上で同定された主要エレメントに加え、ベクターは、該プラスミドベクターでトランスフェクトしたか若しくは本発明により製造したウイルスに感染させた
細胞中でのその転写、翻訳および／若しくは発現を可能にする様式で該導入遺伝子に作動可能に連結されている、必要な慣習的調節領域もまた包含する。本明細書で使用されるところの「作動可能に連結されている」配列は、目的の遺伝子と連続する発現制御配列、およびトランスで若しくは離れて作用して目的の遺伝子を制御する発現制御配列の双方を包含する。
【００６０】
発現制御配列は、適切な転写開始、終止、プロモーターおよびエンハンサー配列；スプライシングおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナルのような効率的ＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を高める配列（すなわちコザックコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を高める配列；ならびに、所望の場合はコードされる産物の分泌を高める配列を包含する。天然、構成的、調節可能および／若しくは組織特異的であるプロモーターを包含する多数の発現制御配列が、当該技術分野で既知でありかつ利用されうる。
【００６１】
構成的プロモーターの例は、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（場合によってはＲＳＶエンハンサーを伴う）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（場合によってはＣＭＶエンハンサーを伴う）［例えばＢｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ、４１：５２１−５３０（１９８５）を参照されたい］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびＥＦ１αプロモーター［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］を制限なしに包含する。
【００６２】
調節可能なプロモーターは、外因性に供給される化合物、温度のような環境因子、若しくは特定の生理学的状態の存在（例えば急性期、細胞の特定の分化状態）により、または複製する細胞のみで、遺伝子発現の調節を可能にし、かつ、誘導、活性化、抑制若しくは「遮断」され得る。調節可能なプロモーターおよび調節可能な系は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣｌｏｎｔｅｃｈおよびＡｒｉａｄを制限なしに包含する多様な商業的供給源から入手可能である。多くの他の系が記述されており、そして当業者により容易に選択され得る。例えば、誘導可能なプロモーターは、亜鉛で誘導可能なヒツジメタロチオニン（ＭＴ）プロモーターおよびデキサメサゾン（Ｄｅｘ）で誘導可能なマウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーターを包含する。他の調節可能な系は、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系［第ＷＯ  ９８／１００８８号］；エクダイソン昆虫プロモーター［Ｎｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：３３４６−３３５１（１９９６）］、テトラサイクリンで抑制可能な系［Ｇｏｓｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：５５４７−５５５１（１９９２）］、テトラサイクリンで誘導可能な系［Ｇｏｓｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６８：１７６６−１７６９（１９９５）、Ｈａｒｖｅｙら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、２：５１２−５１８（１９９８）もまた参照されたい］を包含する。他の系は、カストラジオール、ジフェノールムリスレロン（ｄｉｐｈｅｎｏｌ  ｍｕｒｉｓｌｅｒｏｎｅ）を使用するＦＫ５０６ダイマー、ＶＰ１６若しくはｐ６５、ＲＵ４８６で誘導可能な系［Ｗａｎｇら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１５：２３９−２４３（１９９７）およびＷａｎｇら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、４：４３２−４４１（１９９７）］ならびにラパマイシンで誘導可能な系［Ｍａｇａｒｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１００：２８６５−２８７２（１９９７）］を包含する。数種の調節可能なプロモーターの有効性は時間にわたり増大する。こうした場合に、複数のリプレッサーを直列に挿入すること（例えばＩＲＥＳによりＴｅｔＲに連結されたＴｅｔＲ）により、こうした系の有効性を高め得る。あるいは、所望の機能についてスクリーニングする前に最低３日待機し得る。この系の有効性を高めるための既知の手段により所望のタンパク質の発現を高め得る（例えばウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を使用して）。
【００６３】
別の態様において、導入遺伝子の天然のプロモーターを使用することができる。天然のプロモーターは、導入遺伝子の発現が天然の発現を模倣すべきであることが望ましい場合に好ましいかもしれない。天然のプロモーターは、導入遺伝子の発現を一時的に若しくは発達的に、または組織特異的様式で、あるいは特定の転写刺激に応答して調節しなければならない場合に使用しうる。さらなる一態様において、エンハンサーエレメント、ポリアデニル化部位若しくはコザックコンセンサス配列のような他の天然の発現調節領域もまた、天然の発現を模倣するのに使用しうる。
【００６４】
導入遺伝子の別の態様は、組織特異的プロモーターに作動可能に連結された導入遺伝子を包含する。例えば、骨格筋中での発現が望ましい場合は、筋中で活性のプロモーターを使用すべきである。これらは、骨格β−アクチン、ミオシン軽鎖２Ａ、ジストロフィン、筋クレアチンキナーゼをコードする遺伝子からのプロモーター、ならびに天然に存在するプロモーターより高い活性をもつ合成の筋プロモーターを包含する（Ｌｉら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１７：２４１−２４５（１９９９）を参照されたい）。組織特異的であるプロモーターの例は、とりわけ、肝（アルブミン、Ｍｉｙａｔａｋｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７１：５１２４−３２（１９９７）；Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Ｓａｎｄｉｇら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、３：１００２−９（１９９６）；α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ａｒｂｕｔｈｎｏｔら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、７：１５０３−１４（１９９６））、骨オステオカルシン（Ｓｔｅｉｎら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．、２４：１８５−９６（１９９７））；骨シアロタンパク質（Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｂｏｎｅ
Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．、１１：６５４−６４（１９９６））、リンパ球（ＣＤ２、Ｈａｎｓａｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６１：１０６３−８（１９９８）；免疫グロブリンＨ鎖；Ｔ細胞受容体鎖）、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（Ａｎｄｅｒｓｅｎら、Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．、１３：５０３−１５（１９９３））、神経細線維軽鎖遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：５６１１−５（１９９１））およびニューロン特異的ｖｇｆ遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉら、Ｎｅｕｒｏｎ、１５：３７３−８４（１９９５））のような神経型について既知である。
【００６５】
場合によっては、治療上有用な若しくは免疫原性の産物をコードする導入遺伝子を保有するベクターは選択可能なマーカーもまた包含しうるか、または、レポーター遺伝子はとりわけ、ジェネチシン、ハイグロマイシン若しくはピューリマイシン耐性をコードする配列を包含しうる。こうした選択可能なレポーター若しくはマーカー遺伝子（好ましくはウイルス粒子にパッケージングされるべきウイルスゲノム外に配置される）を使用して、アンピシリン耐性のような細菌細胞中のプラスミドの存在を知らせることができる。ベクターの他成分は複製起点を包含しうる。これらおよび他のプロモーターおよびベクター要素の選択は慣習的であり、そして多くのこうした配列が入手可能である［例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、およびその中に引用される参考文献を参照されたい］。これらのベクターは、当業者に既知の技術とともに本明細書に提供される技術および配列を使用して生成される。
【００６６】
こうした技術は、教科書［Ｓｍａｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー］に記述されるもののようなｃＤＮＡの慣習的クロ―ニング技術、アデノウイルスゲノムのオーバーラップオリゴヌクレオチド配列の使用、ポリメラーゼ連鎖反応、および所望のヌクレオチド配列を提供するいかなる適する方法も包含する。
【００６７】
改変アデノウイルス粒子の製造
少なくとも、発現カセットを保有する改変アデノウイルスベクターは、複製およびビリ
オンキャプシド形成に必要なアデノウイルスシスエレメントを含有し、それらのシスエレメントは異種遺伝子に隣接する。すなわち、該ベクターは、複製起点として機能するアデノウイルスのシスに作用する５’末端逆位配列（ＩＴＲ）の配列、天然の５’パッケージング／エンハンサードメイン（直鎖状Ａｄゲノムをパッケージングするのに必要な配列、およびＥ１プロモーターのエンハンサーエレメントを含有する）、異種分子、ならびに５’ＩＴＲ配列を含有する。例えば、米国特許第６，２０３，９７５号明細書（引用することにより本明細書に組込まれる）の「最小」ヒトＡｄベクターの製造について記述される技術は、組換えサルアデノウイルスに容易に適合し得るを、参照されたい。場合によっては、改変（例えば組換え）アデノウイルスは、上で定義された最小アデノウイルス配列以上を含有する。
【００６８】
一態様において、アデノウイルスは、Ｅ１ａ若しくはＥ１ｂ遺伝子が機能的に欠失され、そして場合によっては他の突然変異、例えば温度感受性突然変異若しくは他の遺伝子中の欠失を有している。他の態様において、組換えアデノウイルス中に無傷のＥ１ａおよび／若しくはＥ１ｂ領域を保持することが望ましい。こうした無傷のＥ１領域は、アデノウイルスゲノム中のその天然の位置に配置しても、若しくは天然のアデノウイルスゲノム中の（例えばＥ３領域の）欠失の部位に置いてもよい。
【００６９】
ヒト（若しくは他の哺乳動物）細胞への遺伝子の送達のための有用なアデノウイルスベクターの構築において、ある範囲のアデノウイルス核酸配列を該ベクターで使用し得る。例えば、アデノウイルス後初期遺伝子Ｅ３の全部若しくは一部分を、該組換えウイルスの一部を形成するアデノウイルス配列から除外してよい。Ｅ３の機能は組換えウイルス粒子の機能および産生に無関係であると考えられる。Ｅ４遺伝子の少なくともＯＲＦ６領域、およびより望ましくはこの領域の機能の冗長性によりＥ４領域全体の欠失を有する改変アデノウイルスベクターもまた構築しうる。本発明のなお別のベクターは、後初期遺伝子Ｅ２ａ中に欠失を含有する。欠失はアデノウイルスゲノムの後期遺伝子Ｌ１からＬ５のいずれでもまた行いうる。同様に、中期遺伝子ＩＸおよびＩＶａ２中の欠失がいくつかの目的上有用でありうる。他の欠失を他の構造的若しくは非構造的アデノウイルス遺伝子中で行いうる。上で論考された欠失は個別に使用しうる。すなわち、本発明での使用のためのアデノウイルス配列は単一領域のみに欠失を含有しうる。あるいは、それらの生物学的活性を破壊するのに効果的な遺伝子全体若しくはそれらの部分の欠失を、いかなる組合せでも使用しうる。例えば、例示的一ベクター中で、アデノウイルス配列は、Ｅ１遺伝子およびＥ４遺伝子、若しくはＥ１、Ｅ２ａおよびＥ３遺伝子、若しくはＥ１およびＥ３遺伝子、またはＥ３の欠失を伴う若しくは伴わないＥ１、Ｅ２ａおよびＥ４遺伝子、などの欠失を有しうる。上で論考された通り、こうした欠失は、所望の結果を達成するために温度感受性突然変異のような他の突然変異と組合せで使用しうる。
【００７０】
いずれかの必須のアデノウイルス配列（例えばＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂ、Ｅ４
ＯＲＦ６、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４およびＬ５）を欠くアデノウイルスベクターは、アデノウイルス粒子のウイルス感染性および増殖に必要とされる欠けているアデノウイルス遺伝子産物の存在下で培養しうる。これらのヘルパー機能は、１種若しくはそれ以上のヘルパー構築物（例えばプラスミド若しくはウイルス）またはパッケージング宿主細胞の存在下でアデノウイルスベクターを培養することにより提供しうる。例えば、１９９６年５月９日に公開されかつ引用することにより本明細書に組込まれる国際特許出願第ＷＯ９６／１３５９７号明細書に「最小」ヒトＡｄベクターの製造について記述された技術を参照されたい。
【００７１】
改変アデノウイルスが最小Ａｄ配列のみを含有するか、またはＥ１および／若しくはＥ３領域の機能的欠失のみを伴うＡｄゲノム全体を含有するかに関係なく、一態様において、該改変ウイルスはヒト若しくはサルアデノウイルス由来のキャプシドを含有する。ある
いは、他の態様において、シュードタイピングした（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｒ）アデノウイルスを本発明の方法で使用しうる。こうしたシュードタイピングしたアデノウイルスは、元のアデノウイルスキャプシドの供給源と異なる供給源アデノウイルスからのアデノウイルス配列を保有する核酸分子がパッケージングされたアデノウイルスキャプシドタンパク質を利用する。これらのアデノウイルスは、当業者に既知である方法を使用して製造しうる。
【００７２】
１．ヘルパーウイルス
従って、ミニ遺伝子を保有するのに使用されるウイルスベクターのアデノウイルス遺伝子内容物に依存して、ヘルパーアデノウイルス、若しくは複製しないウイルスフラグメントが、該ミニ遺伝子を含有する感染性組換えウイルス粒子を製造するのに必要な十分なサルアデノウイルス遺伝子配列を提供するのに必要でありうる。有用なヘルパーウイルスは、アデノウイルスベクター構築物中に存在せずかつ／若しくは該ベクターがトランスフェクトされるパッケージング細胞株により発現されない、選択されたアデノウイルス遺伝子配列を含有する。一態様において、ヘルパーウイルスは複製欠損であり、そして、上述された配列に加えて多様なアデノウイルス遺伝子を含有する。こうしたヘルパーウイルスは、望ましくはＥ１発現細胞株とともに使用する。
【００７３】
ヘルパーウイルスは、Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６４：１６９８５−１６９８７（１９８９）；Ｋ．Ｊ．ＦｉｓｈｅｒとＪ．Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２９９：４９（１９９４年４月１日）に記述されるところのポリカチオン複合物にもまた形成しうる。ヘルパーウイルスは場合によっては第二のレポーターミニ遺伝子を含有しうる。多数のこうしたレポーター遺伝子が当該技術分野に既知である。アデノウイルスベクター上の導入遺伝子と異なるヘルパーウイルス上のレポーター遺伝子の存在は、Ａｄベクターおよびヘルパーウイルス双方が独立にモニターされることを可能にする。この第二のレポーターは、精製に際しての生じる組換えウイルスとヘルパーウイルスの間の分離を可能にするのに使用する。
【００７４】
２．相補性細胞株
上述された遺伝子のいずれかが欠失された改変アデノウイルス（Ａｄ）を生成するため、ウイルスの複製および感染性に必須の場合は、欠失された遺伝子領域の機能を、ヘルパーウイルス若しくは細胞株、すなわち相補性若しくはパッケージング細胞株により組換えウイルスに供給しなければならない。多くの状況において、ヒトＥ１を発現する細胞株を、Ａｄベクターをトランス補完する（ｔｒａｎｓｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）のに使用し得る。これは、本発明のＡｄ配列と現在利用可能なパッケージング細胞中で見出されるヒトＡｄＥ１配列の間の多様性により、本ヒトＥ１含有細胞の使用が複製および産生過程の間の複製能力のあるアデノウイルスの生成を予防するために、とりわけ有利である。しかしながら、ある状況において、Ｅ１欠失アデノウイルスの生産に利用し得るＥ１遺伝子産物を発現する細胞株を利用することが望ましいであろう。こうした細胞株は記述されている。例えば米国特許第６，０８３，７１６号明細書を参照されたい。
【００７５】
所望の場合は、本明細書に提供される配列を、選択された親細胞株中での発現のためのプロモーターの転写制御下に適する親供給源若しくはトランス相補性アデノウイルス供給源からのアデノウイルスＥ１遺伝子を少なくとも発現するパッケージング細胞若しくは細胞株を生成するのに利用しうる。調節可能若しくは構成的プロモーターを本目的上使用しうる。こうしたプロモーターの例は本明細の別の場所に詳細に記述する。親細胞は、いずれかの所望のＡｄＳＡｄ２２／Ｐａｎ５、Ｐａｎ６、Ｐａｎ７、ＳＶ１、ＳＶ２５若しくはＳＶ３９遺伝子を発現する新規細胞株の生成のため選択する。制限なしに、こうした親細胞株は、とりわけ、ＨｅＬａ［ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ  ２］、Ａ５４９［ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ  １８５］、ＨＥＫ  ２９３、ＫＢ［ＣＣＬ  １７］、Ｄｅｔｒｏｉｔ［例
えばＤｅｔｒｏｉｔ  ５１０、ＣＣＬ  ７２］およびＷＩ−３８［ＣＣＬ  ７５］細胞でありうる。これらの細胞株は全部、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｂｉｒｇｉｎｉａ  ２０１１０−２２０９から入手可能である。他の適する親細胞株を他の供給源から得てもよい。
【００７６】
こうしたＥ１発現細胞株はアデノウイルスＥ１欠失ベクターの生成に有用である。加えて、若しくは、あるいは、本発明は、１種若しくはそれ以上のサルアデノウイルス遺伝子産物、例えばＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａおよび／若しくはＥ４  ＯＲＦ６を発現し、組換えサルウイルスベクターの生成での使用のための本質的に同一手順を使用して構築し得る細胞株を提供する。こうした細胞株を利用して、それらの産物をコードする不可欠の遺伝子が欠失されたアデノウイルスベクターをトランス補完、若しくはヘルパー依存性ウイルス（例えばアデノ随伴ウイルス）のパッケージングに必要なヘルパー機能を提供し得る。本発明の宿主細胞の製造は選択されたＤＮＡ配列の集成のような技術を必要とする。この集成は慣習的技術を利用して達成しうる。こうした技術は、公知でありかつ上に引用されたＳａｍｂｒｏｏｋらに記述されるｃＤＮＡおよびゲノムクローニング、ポリメラーゼ連鎖反応と組合せたアデノウイルスゲノムのオーバーラップオリゴヌクレオチド配列の使用、合成法、ならびに所望のヌクレオチド配列を提供するいずれかの他の適する方法を包含する。
【００７７】
なお別の代替において、不可欠のアデノウイルス遺伝子産物は、アデノウイルスベクターおよび／若しくはヘルパーウイルスによりトランスに提供される。こうした一例において、適する宿主細胞は、原核生物（例えば細菌）細胞、ならびに昆虫細胞、酵母細胞および哺乳動物細胞を包含する真核生物細胞を包含するいずれの生物学的生物体からも選択しうる。とりわけ望ましい宿主細胞は、Ａ５４９、ＷＥＨＩ、３Ｔ３、１０Ｔ１／２、ＨＥＫ  ２９３細胞若しくはＰＥＲＣ６（その双方は機能的アデノウイルスＥ１を発現する）［Ｆａｌｌａｕｘ，ＦＪら、（１９９８）、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、９：１９０９−１９１７］、Ｓａｏｓ、Ｃ２Ｃ１２、Ｌ細胞、ＨＴ１０８０、ＨｅｐＧ２、ならびにヒト、サル、マウス、ラット、ウサギおよびハムスターを包含する哺乳動物由来の初代線維芽細胞、肝細胞および筋芽細胞のような細胞を制限なしに包含するいずれかの哺乳動物種のなかから選択する。細胞を提供する哺乳動物種の選択は本発明の制限でなく；また、哺乳動物細胞の型、すなわち線維芽細胞、肝細胞、腫瘍細胞などもそうでない。
【００７８】
３．ウイルス粒子の集成および細胞株のトランスフェクション
一般に、ミニ遺伝子を含んでなるベクターをトランスフェクションにより送達する場合、該ベクターは、約５μｇから約１００μｇまでのＤＮＡ、および好ましくは約１０ないし約５０μｇのＤＮＡの量で、約１×１０４細胞ないし約１×１０１３細胞、および好ましくは約１×１０５細胞に送達する。しかしながら、宿主細胞に対するベクターＤＮＡの相対量は、選択されたベクター、送達方法および選択された宿主細胞のような因子を考慮に入れて調節しうる。
【００７９】
ベクターは、裸のＤＮＡ、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、エピソーム、ウイルスなどを包含する、当該技術分野で既知若しくは上で開示されたいずれのベクターでもありうる。ベクターの宿主細胞への導入は、トランスフェクションおよび感染を包含する、当該技術分野で既知若しくは上で開示されたところのいずれの手段によっても達成しうる。アデノウイルス遺伝子の１種若しくはそれ以上は、宿主細胞のゲノム中に安定に組込まれても、エピソームとして安定に発現されても、若しくは一過性に発現されてもよい。遺伝子産物は全部、エピソーム上で一過性に発現されうるか、若しくは安定に組込まれうるか、または遺伝子産物の数種が安定に発現されうる一方で他者が一過性に発現される。さらに、アデノウイルス遺伝子のそれぞれのプロモーターは、構成的プロモー
ター、誘導可能なプロモーター若しくは天然のアデノウイルスプロモーターから独立に選択しうる。プロモーターは、生物体若しくは細胞の特定の生理学的状態により（すなわち分化状態により、または複製若しくは静止期細胞で）、あるいは例えば外因性に添加した因子により調節しうる。
【００８０】
宿主細胞への（プラスミド若しくはウイルスとしての）分子の導入もまた、当業者に既知かつ本明細を通じて論考されるところの技術を使用して達成しうる。好ましい態様において、標準的トランスフェクション技術、例えばＣａＰＯ４トランスフェクション若しくは電気穿孔法を使用する。
【００８１】
アデノウイルスの選択されたＤＮＡ配列（ならびに導入遺伝子および他のベクター要素）の多様な中間プラスミドへの集成、ならびに組換えウイルス粒子を製造するためのプラスミドおよびベクターの使用は、全部慣習的の技術を使用して達成される。こうした技術は、教科書［Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上に引用される］に記述されるもののようなｃＤＮＡの慣習的クローニング技術、アデノウイルスゲノムのオーバーラップオリゴヌクレオチド配列の使用、ポリメラーゼ連鎖反応、ならびに所望のヌクレオチド配列を提供するいずれかの適する方法を包含する。標準的トランスフェクションおよびコトランスフェクション技術、例えばＣａＰＯ４沈殿技術が使用される。使用される他の慣習的方法は、ウイルスゲノムの相同的組換え、アガーオーバーレイ中でのウイルスのプラーク形成（ｐｌａｑｕｉｎｇ）、シグナル生成の測定方法などを包含する。
【００８２】
例えば、所望のミニ遺伝子を含有するウイルスベクターの構築および集成後に、該ベクターをヘルパーウイルスの存在下にｉｎ  ｖｉｔｒｏでパッケージング細胞株にトランスフェクトする。相同的組換えがヘルパーおよびベクター配列の間で起こり、それはベクター中のアデノウイルス−導入遺伝子配列が複製かつビリオンキャプシドにパッケージングされることを可能にして、組換えウイルスベクター粒子をもたらす。こうしたウイルス粒子の本製造方法はトランスフェクションに基づく。しかしながら本発明はこうした方法に制限されない。
【００８３】
生じる組換え改変アデノウイルスは選択された導入遺伝子の選択された細胞への移入において有用である。
【００８４】
改変アデノウイルスベクターの使用
本発明の改変アデノウイルスベクターは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでのヒト若しくは家畜被験体（ヒト以外の霊長類、サル以外の霊長類および他の哺乳動物を包含する）への遺伝子移入に有用である。
【００８５】
一態様において、本明細書に記述される改変アデノウイルスベクターは、異種遺伝子によりコードされる産物の製造のための発現ベクターとしてｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用し得る。例えば、適する細胞株を該改変アデノウイルスに感染させ若しくはそれらでトランスフェクトし、そして慣習的様式で培養し、該改変アデノウイルスが遺伝子産物をプロモーターから発現することを可能にする。該遺伝子産物をその後、培養物からの既知の慣習的タンパク質単離および回収方法により、培地から回収しうる。
【００８６】
別の態様において、本発明の改変アデノウイルスベクターは、選択された導入遺伝子を選択された宿主細胞にｉｎ  ｖｉｖｏ若しくはｅｘ  ｖｉｖｏで送達し得る効率的な遺伝子移入ベヒクルを提供する。例えば、本発明の改変アデノウイルスベクターは、下述されるところの治療若しくは免疫原性分子の送達に利用し得る。一態様において、治療若しくはワクチン投与計画は、組換えアデノウイルスベクターの反復送達を必要とすることができる。こうした投与計画は、典型的に、ウイルスキャプシドが変えられている一連のウイ
ルスベクターの送達を必要とする。ウイルスキャプシドは、各その後の投与のため、または特定の１血清型のキャプシドの予め選択された数の投与（例えば１、２、３、４回若しくはそれ以上）後に、変化させうる。従って、一投与計画は、第一のキャプシドをもつＡｄの送達、第二のキャプシドをもつＡｄでの送達、および第三のキャプシドでの送達を必要としうる。他の態様において、本発明の改変Ａｄキャプシドを当業者に明らかであろうとおり単独で、１種の別のものと、若しくは他のＡｄ血清型ととともに使用する投与計画を選択しうる。場合によっては、こうした投与計画は、ヒト以外の霊長類のアデノウイルス、ヒトアデノウイルス、若しくは本明細書に記述されるような人工的（例えばキメラ）血清型のキャプシドをもつＡｄの投与を必要としうる。投与計画の各相は、単一Ａｄ血清型キャプシド、次いで別のＡｄ血清型キャプシドを用いる一連のものでの一連の注入（若しくは他の送達経路）の投与を必要としうる。あるいは、本発明の改変Ａｄベクターを、他のウイルス系、ウイルス以外の送達系、タンパク質、ペプチド、および他の生物学的活性分子を包含する他のアデノウイルスに媒介されない送達系を必要とする投与計画で利用しうる。
【００８７】
以下の節は、本発明の改変アデノウイルスキャプシド（例えばタンパク質の形態の）若しくは改変アデノウイルスベクターを介して送達しうる例示的分子に焦点を当てるであろう。
【００８８】
一態様において、本明細書に記述される改変Ａｄベクターは、公表された遺伝子治療方法に従ってヒトに投与される。選択された導入遺伝子を有する本発明のウイルスベクターは、好ましくは生物学的に適合性の溶液若しくは製薬学的に許容できる送達ベヒクルに懸濁して患者に投与しうる。適するベヒクルは滅菌生理的食塩水を包含する。製薬学的に許容できる担体であることが既知かつ当業者に公知の他の水性および非水性の等張無菌注入溶液ならびに水性および非水性の無菌懸濁液を、本目的上使用しうる。
【００８９】
改変アデノウイルスベクターは所望の生理学的効果を提供するのに十分な量で投与する。慣習的かつ製薬学的に許容できる投与経路は、限定されるものでないが、網膜への直接送達および他の眼内送達法、肝への直接送達、吸入、鼻内、静脈内、筋肉内、気管内、皮下、皮内、直腸、経口、眼内、内耳内、ならびに他の非経口投与経路を挙げることができる。投与経路は、所望の場合は組合せても、または導入遺伝子若しくは状態に依存して調節してもよい。投与経路は、処置されている状態の性質に主として依存することができる。
【００９０】
ウイルスベクターの投薬量は、治療されている状態、患者の齢、体重および健康状態のような因子に主として依存することができ、そして従って患者間で異なりうる。例えば、ウイルスベクターの治療上有効な成体ヒト若しくは家畜の投薬量は、一般に約１×１０６から１×１０１５粒子まで、約１×１０１１ないし１×１０１３粒子、若しくは約１×１０９ないし１×１０１２粒子ウイルスの濃度を含有する約１００μＬから約１００ｍＬまでの担体の範囲にある。投薬量は動物の大きさおよび投与経路に依存することができる。例えば、筋肉内注入のための適するヒト若しくは家畜の投薬量（約８０ｋｇの動物について）は、単一部位につき１ｍＬあたり約１×１０９ないし約５×１０１２粒子の範囲にある。場合によっては複数投与部位を送達しうる。別の例において、適するヒト若しくは家畜の投薬量は、経口製剤について約１×１０１１ないし約１×１０１５粒子の範囲にあることができる。当業者は、投与経路、および該組換えベクターを使用する治療若しくはワクチンの応用に依存してこれらの用量を調節しうる。導入遺伝子の発現のレベル、若しくは免疫原に関して循環抗体のレベルをモニターして、投薬量の投与頻度を決定し得る。投与の頻度のタイミングのなお他の決定方法は当業者に容易に明らかであろう。
【００９１】
１．治療分子
一局面において、改変アデノウイルスヘキソンタンパク質は、ターゲッティングを促進するため、および／若しくは本明細書に記述されるところの治療投与計画での使用のために、１種若しくはそれ以上の治療的導入遺伝子の挿入断片を含有し得る。別の局面において、本発明の改変アデノウイルスベクターは、１個若しくは治療的導入遺伝子をその中にパッケージングされて保有しうる。
【００９２】
導入遺伝子によりコードされる有用な治療的産物は、インスリン、グルカゴン、成長ホルモン（ＧＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体化ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポエチン、アンジオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦ  α）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン成長因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）、ＴＧＦ、アクチビン、インヒビンを包含するトランスフォーミング成長因子スーパーファミリーのいずれか１種、若しくは骨形成タンパク質（ＢＭＰ）ＢＭＰ１〜１５のいずれか、成長因子のヘレグルイン／ニューレグリン／ＡＲＩＡ／ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）ファミリーのいずれか１種、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィンＮＴ−３およびＮＴ−４／５、絨毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アグリン、セマフォリン／コラプシンのファミリーのいずれか１種、ネトリン−１およびネトリン−２、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、エフリン、ノギン、ソニックヘッジホッグならびにチロシンヒドロキシラーゼを制限なしに包含するホルモンならびに増殖および分化因子を包含する。
【００９３】
他の有用な導入遺伝子産物は、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン（ＩＬ）ＩＬ−１からＩＬ−２５（例えばＩL−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８を包含する）、単球化学遊走物質タンパク質、白血病阻害因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子、およびインターフェロン、ならびに幹細胞因子、ｆｌｋ−２／ｆｌｔ３リガンドのようなサイトカインおよびリンホカインを制限なしに包含する免疫系を調節するタンパク質を包含する。免疫系により産生される遺伝子産物もまた本発明で有用である。これらは、免疫グロブリンＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、一本鎖抗体、Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、一本鎖Ｔ細胞受容体、クラスＩおよびクラスＩＩ  ＭＨＣ分子、ならびに工作された免疫グロブリンおよびＭＨＣ分子を制限なしに包含する。有用な遺伝子産物は、補体調節タンパク質、膜補助因子タンパク質（ＭＣＰ）、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、ＣＲ１、ＣＦ２およびＣＤ５９のような補体調節タンパク質もまた包含する。なお他の有用な遺伝子産物は、ホルモン、成長因子、サイトカイン、リンホカイン、調節タンパク質および免疫系タンパク質の受容体のいずれか１種を包含する。本発明は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）受容体、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）受容体を包含するコレステロール調節のための受容体、例えばアポリポタンパク質（ａｐｏ）Ａおよびそのアイソフォーム（例えばＡｐｏＡＩ）、ａｐｏＥならびにＥ２、Ｅ３およびＥ４を包含するそのアイソフォーム）、ＳＲＢ１、ＡＢＣ１を包含する脂質の調節で有用なタンパク質、ならびにスカベンジャー受容体を包含する。本発明は、グルココルチコイド受容体およびエストロゲン受容体、ビタミンＤ受容体ならびに他の核受容体を包含するステロイドホルモン受容体スーパーファミリーのメンバーのような遺伝子産物もまた包含する。加えて、有用な遺伝子産物は、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍａｘ、ｍａｄ、血清応答因子（ＳＲＦ）、ＡＰ−１、ＡＰ２、ｍｙｂ、ＭｙｏＤおよびミオゲニン、ＥＴＳボックス含有タンパク質、ＴＦＥ３、Ｅ２Ｆ、ＡＴＦ１、ＡＴＦ２、ＡＴＦ３、ＡＴＦ４、ＺＦ５、ＮＦＡＴ、ＣＲＥＢ、ＨＮＦ−４、Ｃ／ＥＢＰ、ＳＰ１、ＣＣＡＡＴボックス結合タンパク質、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ−１）、ウィルムス腫
瘍タンパク質、ＥＴＳ結合タンパク質、ＳＴＡＴ、ＧＡＴＡボックス結合タンパク質、例えばＧＡＴＡ−３、ならびに翼状らせんタンパク質のフォークヘッドファミリーのような転写因子を包含する。
【００９４】
他の有用な遺伝子産物は、カルバモイル合成酵素Ｉ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノコハク酸合成酵素、アルギノコハク酸リアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセト酢酸加水分解酵素、フェニルアラニン水酸化酵素、α−１アンチトリプシン、グルコース−６−ホスファターゼ、ポルフォビリノーゲン脱アミノ酵素、シスタチオンβ−合成酵素、分枝状鎖ケト酸脱炭酸酵素、アルブミン、イソバレリル−ｃｏＡ脱水素酵素、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、グルタリルＣｏＡ脱水素酵素、インスリン、β−グルコシダーゼ、ピルビン酸カルボキシレート、肝ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシン脱炭酸酵素、Ｈ−プロテイン、Ｔ−プロテイン、嚢胞性線維症膜貫通調節因子（ＣＦＴＲ）配列、およびジストロフィンｃＤＮＡ配列を包含する。他の有用な遺伝子産物は、血友病Ａの処置に有用な（例えば、第ＶＩＩＩ因子、ならびに、場合によっては結合により作動可能に連結されたヘテロ二量体のＬ鎖およびＨ鎖を包含するそのバリアント）、ならびにＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子、米国特許第６，２００，５６０号および同第６，２２１，３４９号明細書を参照されたい］、ならびに血友病Ｂの処置に有用な（例えば第ＩＸ因子）ものを包含する。
【００９５】
なお他の有用な遺伝子産物は、挿入、欠失若しくはアミノ酸置換を含有する天然に存在しないアミノ酸配列を有するキメラ若しくはハイブリッドポリペプチドのような天然に存在しないポリペプチドを包含する。例えば、一本鎖の工作された免疫グロブリンはある種の免疫無防備状態の患者で有用であり得る。他の型の天然に存在しない遺伝子配列は、アンチセンス分子、および標的の過剰発現を低下させるのに使用し得るリボザイムのような触媒核酸を包含する。
【００９６】
遺伝子の発現の低下および／若しくは調節は、癌および乾癬がそうであるところの過剰増殖する細胞を特徴とする過剰増殖状態の処置にとりわけ望ましい。標的ポリペプチドは、正常細胞に比較して過剰増殖細胞中で独占的に若しくはより高レベルで産生されるポリペプチドを包含する。標的抗原は、ｍｙｂ、ｍｙｃ、ｆｙｎのような癌遺伝子、ならびに転位遺伝子ｂｃｒ／ａｂｌ、ｒａｓ、ｓｒｃ、Ｐ５３、ｎｅｕ、ｔｒｋおよびＥＧＲＦによりコードされるポリペプチドを包含する。標的抗原としての癌遺伝子産物に加え、抗癌処置および保護的処方の標的ポリペプチドは、Ｂ細胞リンパ腫により作成される抗体の可変領域およびＴ細胞リンパ腫のＴ細胞受容体の可変領域を包含し、それらは、いくつかの態様において自己免疫疾患の標的抗原としてもまた使用される。モノクローナル抗体１７−１Ａにより認識されるポリペプチドおよび葉酸結合ポリペプチドを包含する、腫瘍細胞中でより高レベルで見出されるポリペプチドのような他の腫瘍関連ポリペプチドを、標的ポリペプチドとして使用し得る。
【００９７】
他の適する治療的ポリペプチドおよびタンパク質は、細胞受容体、および自己に向けられた抗体を産生する細胞を包含する、自己免疫と関連する標的に対する、広範囲の保護免疫応答を与えることにより自己免疫疾患および障害に苦しめられている個体を処置するのに有用でありうるものを包含する。Ｔ細胞媒介性自己免疫疾患は、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、インスリン依存型糖尿病（ＩＤＤＭ）、自己免疫性甲状腺炎、反応性関節炎、強直性脊椎炎、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、乾癬、脈管炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、クローン病および潰瘍性大腸炎を包含する。これらの疾患のそれぞれは、内因性抗原に結合しかつ自己免疫疾患に関連する炎症カスケードを開始するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を特徴とする。
【００９８】
本発明の改変アデノウイルスベクターは、例えば同一の導入遺伝子の再送達を必要とす
る投与計画で、若しくは他の導入遺伝子の送達を必要とする組合せ投与計画で、導入遺伝子の複数のアデノウイルス媒介性送達が望ましい治療的投与計画にとりわけ良好に適する。こうした投与計画は、改変アデノウイルスベクターの投与、次いで同一血清型のアデノウイルスからのベクターでの再投与を必要としうる。とりわけ望ましい投与計画は、第一の投与で送達されるウイルスベクターの血清型がその後の投与の１種若しくはそれ以上で利用されるウイルスベクターの血清型と異なる、本発明の改変アデノウイルスベクターの投与を必要とする。例えば、一治療的投与計画は、改変アデノウイルスの投与、および同一若しくは異なる血清型の１種若しくはそれ以上の改変アデノウイルスでの反復投与を必要とする。別の例において、一治療的投与計画は、アデノウイルスベクターの投与、次いで第一の送達されるアデノウイルスベクターの血清型と異なる本発明の改変アデノウイルスベクターでの反復投与、および場合によっては前の投与段階のベクターの血清型と同一であるか若しくは好ましくは異なる別のベクターでのさらなる投与を必要とする。これらの投与計画は、本発明のキメラ血清型を使用して構築されるアデノウイルスベクターの送達に制限されない。むしろ、これらの投与計画は、本発明のキメラベクターの１種若しくはそれ以上と組合せの人工的な、ヒト、若しくはヒト以外の霊長類または他の哺乳動物起源のものでありうる他のアデノウイルス血清型（改変されていようがそうでなかろうが）のベクターを容易に利用し得る。こうした血清型の例は本文書の別の場所で論考されている。さらに、これらの治療的投与計画は、アデノウイルス以外のベクター、ウイルス以外のベクター、および／若しくは多様な他の治療上有用な化合物若しくは分子と組合せの、本発明の改変アデノウイルスベクターの同時若しくは連続いずれかの送達を必要としうる。本発明はこれらの治療的投与計画に制限されず、多様なそれらは当業者に容易に明らかであろう。
【００９９】
２．免疫原性導入遺伝子の送達
以前に記述されたとおり、改変アデノウイルスヘキソンタンパク質それ自身は、選択された免疫原に対する免疫応答を誘導する選択されたペプチド、ポリペプチド若しくはタンパク質を含有するように改変しうる。こうした改変アデノウイルスヘキソンタンパク質それ自身を、ターゲッティングに、アジュバントとして、および／若しくは特異的免疫応答を誘導するのにそれ自身が有用であるアデノウイルスキャプシドを生成するのに使用しうる。さらなる一態様において、こうした改変アデノウイルスキャプシドを、適する発現カセット若しくはミニ遺伝子がパッケージングされているウイルス粒子の生成で使用する。
【０１００】
従って、一態様において、本発明の改変アデノウイルスベクターはさらに、選択された免疫原に対する免疫応答を誘導するペプチド、ポリペプチド若しくはタンパク質をコードする導入遺伝子を、改変アデノウイルスキャプシド内にパッケージングされて含有する。本発明のこうした改変アデノウイルスは、自己プライミング効果、アジュバント効果を提供することができ、かつ／または、該ベクターにより発現される挿入される異種タンパク質（１種若しくは複数）に対する細胞溶解性Ｔ細胞および／若しくは抗体の誘導で高度に有効でありうる。
【０１０１】
本発明のアデノウイルスは免疫原性組成物としてもまた使用しうる。該組換えアデノウイルスは、免疫応答の誘導に決定的に重要かつ病原体の蔓延を制限することが可能な抗原（１種若しくは複数）が同定されかつそのｃＤＮＡが入手可能であるいかなる病原体に対する予防的若しくは治療的ワクチンとしても使用し得る。
【０１０２】
こうしたワクチン（若しくは他の免疫原性）組成物は、上述されたところの適する送達ベヒクル中で処方される。一般に、免疫原性組成物の用量は治療組成物について上で定義された範囲にある。選択された遺伝子の免疫のレベルをモニターしてブースターの必要性（あれば）を決定し得る。血清中の抗体力価の評価後に、至適のブースター免疫化が望ましいかもしれない。
【０１０３】
場合によっては、本発明のワクチン組成物は、例えばアジュバント、安定剤、ｐＨ調節剤、保存剤などを包含する他の成分を含有するように処方しうる。こうした成分はワクチンの技術分野の当業者に公知である。適するアジュバントの例は、リポソーム、アルム、モノホスホリルリピドＡ、およびサイトカイン、インターロイキン、ケモカイン、リガンドのようないずれかの生物学的活性因子、ならびに至適にはそれらの組合せを制限なしに包含する。これらの生物学的活性因子のあるものは、例えばプラスミド若しくはウイルスベクターを介してｉｎ  ｖｉｖｏで発現させ得る。例えば、こうしたアジュバントは、抗原のみをコードするＤＮＡワクチンでのプライミングに際して生成される免疫応答と比較して抗原特異的な免疫応答を高めるために、抗原をコードするプライミングＤＮＡワクチンとともに投与し得る。
【０１０４】
該アデノウイルスは、「免疫原性量」、すなわち所望の細胞をトランスフェクトしかつ免疫応答を誘導するために選択された遺伝子の十分なレベルの発現を提供するための投与経路で有効であるアデノウイルスの量で投与する。保護免疫を提供する場合、アデノウイルスは、感染および／若しくは再発性疾患の予防において有用なワクチン組成物であると考えられる。
【０１０５】
例えば、免疫原は多様なウイルス科から選択しうる。それに対する免疫応答が望ましいとみられる所望のウイルス科の例は、一般的な風邪の症例の約５０％の原因であるライノウイルス属；ポリオウイルス、コックサッキーウイルス、エコーウイルス、およびＡ型肝炎ウイルスのようなヒトエンテロウイルスを包含するエンテロウイルス属；ならびに主としてヒト以外の動物での口蹄疫の原因であるアプトウイルス属を包含するピコルナウイルス科を包含する。ウイルスのピコルナウイルス科内で、標的抗原はＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４およびＶＰＧを包含する。他のウイルス科は、流行性胃腸炎の重要な原因病原体であるノーウォーク群のウイルスを包含するカルシウイルス（ｃａｌｃｉｖｉｒｕｓ）科を包含する。ヒトおよびヒト以外の動物で免疫応答を誘導するための抗原の標的設定における使用に望ましいなお別のウイルス科は、シンドビスウイルス、ロスリバーウイルス、ならびにベネズエラ、東部および西部ウマ脳炎ウイルスを包含するアルファウイルス属、ならびに風疹ウイルスを包含するルビウイルス属を包含するトガウイルス科である。フラビウイルス科は、デング熱、黄熱病、日本脳炎、セントルイス脳炎およびダニ媒介脳炎ウイルスを包含する。他の標的抗原は、Ｃ型肝炎、または感染性気管支炎ウイルス（家禽）、ブタ伝染性胃腸ウイルス（ブタ）、ブタヘマグルチナチン（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎ）脳脊髄炎ウイルス（ブタ）、ネコ感染性腹膜炎ウイルス（ネコ）、ネコ腸コロナウイルス（ネコ）、イヌコロナウイルス（イヌ）のような多数のヒト以外のウイルス、ならびに、一般的な風邪および／または非Ａ、ＢすなわちＣ型肝炎を引き起こすことがあるヒト呼吸器コロナウイルスを包含するコロナウイルス科から生成しうる。加えて、ヒトコロナウイルスは重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）の推定の原因病原体を包含する。コロナウイルス科内で、標的抗原は、Ｅ１（Ｍすなわちマトリックスタンパク質ともまた呼ばれる）、Ｅ２（Ｓすなわちスパイクタンパク質ともまた呼ばれる）、Ｅ３（ＨＥすなわちヘマグルチン−エルテロース（ｅｌｔｅｒｏｓｅ）ともまた呼ばれる）糖タンパク質（全部のコロナウイルスに存在するわけではない）若しくはＮ（ヌクレオキャプシド）を包含する。なお他の抗原は、ベシクロウイルス（例えば水疱性口内炎ウイルス）および一般的なリッサウイルス（例えば狂犬病）属を包含するラブドウイルス科を標的としうる。ラブドウイルス科内で、適する抗原はＧタンパク質若しくはＮタンパク質に由来しうる。マルブルクおよびエボラウイルスのような出血性熱ウイルスを包含するフィロウイルス科が抗原の適する供給源となりうる。パラミクソウイルス科は、パラインフルエンザウイルス１型、パラインフルエンザウイルス３型、ウシパラインフルエンザウイルス３型、ルブラウイルス（流行性耳下腺炎ウイルス）、パラインフルエンザウイルス２型、パラインフルエンザウイルス４型、ニューカッスル病ウイルス（ニワトリ）、牛疫、麻疹およびイヌジ
ステンパーを包含するモルビリウイルス、ならびにＲＳウイルスを包含するニューモウイルスを包含する。インフルエンザウイルスはオルトミクソウイルス科内で分類され、そして抗原の適する供給源である（例えばＨＡタンパク質、Ｎ１タンパク質）。ブニヤウイルス科は、ブニヤウイルス（カリフォルニア脳炎、ラクロス）、フレボウイルス（リフトバレー熱）、ハンタウイルス（プーマラ（ｐｕｒｅｍａｌａ）はヘマハギン（ｈｅｍａｈａｇｉｎ）熱ウイルスである）、ナイロウイルス（ナイロビ羊病）、および多様な割り当てられていないブンガウイルス（ｂｕｎｇａｖｉｒｕｓ）属を包含する。アレナウイルス科はＬＣＭおよびラッサ熱ウイルスに対する抗原の供給源を提供する。レオウイルス科は、レオウイルス、ロタウイルス（小児で急性胃腸炎を引き起こす）、オルビウイルスおよびカルチウイルス（ｃｕｌｔｉｖｉｒｕｓ）属（コロラドダニ熱）、レボンボ（ヒト）、ウマ脳症、ブルータングを包含する。レトロウイルス科は、ネコ白血病ウイルス、ＨＴＬＶＩおよびＨＴＬＶＩＩ、レンチウイルス亜科の（ｌｅｎｔｉｖｉｒｉｎａｌ）（ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ感染性貧血ウイルスおよびスプマウイルス亜科の（ｓｐｕｍａｖｉｒｉｎａｌ）を包含する）のようなヒトおよび家畜の疾患を包含するオンコリウイルス（ｏｎｃｏｒｉｖｉｒｉｎａｌ）亜科を包含する。レンチウイルスのなかで多くの適する抗原が記述され、そして容易に選択し得る。
【０１０６】
適するＨＩＶおよびＳＩＶ抗原の例は、ｇａｇ、ｐｏｌ、Ｖｉｆ、Ｖｐｘ、ＶＰＲ、Ｅｎｖ、Ｔａｔ、ＮｅｆおよびＲｅｖタンパク質、ならびにそれらの多様なフラグメントを制限なしに包含する。例えば、Ｅｎｖタンパク質の適するフラグメントは、ｇｐ１２０、ｇｐ１６０、ｇｐ４１のようなそのサブユニット、若しくは例えば長さ最低約８アミノ酸のそれらのより小さいフラグメントのいずれも包含しうる。同様にｔａｔタンパク質のフラグメントを選択しうる。［米国特許第５，８９１，９９４号および同第６，１９３，９８１号明細書を参照されたい。］Ｄ．Ｈ．Ｂａｒｏｕｃｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７５（５）：２４６２−２４６７（２００１年３月）、およびＲ．Ｒ．Ａｍａｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９２：６９−７４（２００１年４月６日）に記述されるＨＩＶおよびＳＩＶタンパク質もまた参照されたい。別の例において、ＨＩＶおよび／若しくはＳＩＶ免疫原性タンパク質若しくはペプチドを使用して、融合タンパク質若しくは他の免疫原性分子を形成しうる。例えば、２００１年８月２日に公開された第ＷＯ  ０１／５４７１９号、および１９９９年４月８日に公開された同第ＷＯ  ９９／１６８８４号明細書に記述されたＨＩＶ−１  Ｔａｔおよび／若しくはＮｅｆ融合タンパク質、ならびに免疫化処方を参照されたい。本発明は、本明細書に記述されるＨＩＶおよび／若しくはＳＩＶ免疫原性タンパク質若しくはペプチドに制限されない。加えて、これらのタンパク質に対する多様な改変が記述されているか、若しくは当業者により容易になされ得る。例えば米国特許第５，９７２，５９６号明細書に記述される改変ｇａｇタンパク質を参照されたい。さらに、いずれの所望のＨＩＶおよび／若しくはＳＩＶ免疫原も単独若しくは組合せで送達しうる。こうした組合せは単一ベクター若しくは複数のベクターからの発現を包含しうる。場合によっては、別の組合せは、タンパク質の形態の免疫原の１種若しくはそれ以上の送達を伴う、１種若しくはそれ以上の発現された免疫原の送達を必要としうる。こうした組合せを下により詳細に論考する。
【０１０７】
パボーバウイルス科は、ポリオーマウイルス亜科（ＢＫＵおよびＪＣＵウイルス）ならびにパピローマウイルス亜科（癌若しくは乳頭腫の悪性進行と関連する）を包含する。アデノウイルス科は呼吸器疾患および／若しくは腸炎を引き起こすウイルス（ＥＸ、ＡＤ７、ＡＲＤ、Ｏ．Ｂ．）を包含する。パルボウイルスはネコパルボウイルス科（ネコ腸炎）、ネコ汎白血球減少症ウイルス、イヌパルボウイルスおよびブタパルボウイルスを包含する。ヘルペスウイルス科は、シンプレックスウイルス（ＨＳＶＩ、ＨＳＶＩＩ）、ワリセロウイルス（ｖａｒｉｃｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）（偽性狂犬病、帯状疱疹）属を包含するアルファヘルペスウイルス亜科、およびサイトメガロウイルス属（ＨＣＭＶ、ムロメガロウ
イルス）を包含するベータヘルペスウイルス亜科、ならびに、リンホクリプトウイルス属、ＥＢＶ（バーキットリンパ腫）、感染性鼻気管炎、マレック病ウイルスおよびラジノウイルスを包含するガンマヘルペスウイルス亜科を包含する。ポックスウイルス科は、オルトポックスウイルス（大疱瘡（天然痘）およびワクシニア（牛痘））、パラポックスウイルス、アビポックスウイルス、カプリポックスウイルス、レポリポックスウイルス、スイポックスウイルス属を包含するチョルドポックスウイルス亜科、ならびにエントモポックスウイルス亜科を包含する。ヘパドナウイルス科はＢ型肝炎ウイルスを包含する。抗原の適する供給源となりうる１種の分類されないウイルスはＤ型肝炎ウイルスである。なお他のウイルス供給源は、トリ伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスおよびブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルスを包含しうる。アルファウイルス科はウマ動脈炎ウイルスおよび多様な脳炎ウイルスを包含する。
【０１０８】
本発明のウイルスは、ヒトおよびヒト以外の脊椎動物を感染させる細菌、真菌、寄生性微生物若しくは多細胞寄生生物を包含する他の病原体に対しヒト若しくはヒト以外の動物を免疫するのに有用であるか、または癌細胞若しくは腫瘍細胞からである免疫原もまた保有しうる。細菌性病原体の例は病原性グラム陽性球菌を包含するは肺炎球菌；ブドウ球菌；ならびに連鎖球菌を包含する。病原性グラム陰性球菌は髄膜炎菌；淋菌を包含する。病原性の腸グラム陰性桿菌は、腸内細菌科；シュードモナス菌、アシネトバクテリア（ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｉａ）およびエイケネラ（ｅｉｋｅｎｅｌｌａ）；類鼻疽；サルモネラ（ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）；シゲラ（ｓｈｉｇｅｌｌａ）；ヘモフィルス（ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）；モラクセラ（ｍｏｒａｘｅｌｌａ）；軟性下疳菌（Ｈ．ｄｕｃｒｅｙｉ）（軟性下疳を引き起こす）；ブルセラ（ｂｒｕｃｅｌｌａ）；野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）（野兎病を引き起こす）；エルジニア（ｙｅｒｓｉｎｉａ）（パスツレラ菌）；ストレプトバチルス  モニリフォルミス（ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）およびらせん菌を包含し；グラム陽性桿菌はリステリア菌（ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）；豚丹毒菌（ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）；ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）（ジフテリア）；コレラ；炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）（炭疽）；ドノヴァン症（鼠径部肉芽腫）；およびバルトネラ症を包含する。病原性嫌気性細菌により引き起こされる疾患は、破傷風；ボツリヌス中毒；他のクロストリジウム属；結核；らい；および他のミコバクテリウムを包含する。病原性のスピロヘータ疾患は梅毒；トレポネーマ症；イチゴ腫、ピンタおよび風土病性梅毒；ならびにレプトスピラ症を包含する。より高病原性の細菌および病原性真菌により引き起こされる他の感染症は、アクチノミセス症；ノカルジア症；クリプトコックス症、ブラストミセス症、ヒストプラスマ症およびコクシジオイデス真菌症；カンジダ症、アスペルギルス症およびムコール症；スポロトリクス症；パラコクシジオイドミコーシス、ペトリエリジオシス（ｐｅｔｒｉｅｌｌｉｄｉｏｓｉｓ）、トルロプシス症、菌腫およびクロモミコーシス；ならびに皮膚糸状菌症を包含する。リケッチア感染症は、発疹チフス、ロッキー山熱、Ｑ熱およびリケッチア痘を包含する。マイコプラスマおよびクラミジア感染症の例は：マイコプラスマ肺炎；性病性リンパ肉芽腫；オウム病；および周産期クラミジア感染症を包含する。病原性真核生物は病原性原生動物および蠕虫を包含し、また、それらにより生じられる感染症は：アメーバ症；マラリア；リーシュマニア症；トリパノソーマ症；トキソプラスマ症；ニューモシスチス  カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ）；トリカンス（Ｔｒｉｃｈａｎｓ）；トキソプラスマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）；バベシア症；ジアルジア症；旋毛虫症；フィラリア症；住血吸虫症；線虫；吸虫（ｔｒｅｍａｔｏｄｅｓ）すなわち吸虫（ｆｌｕｋｅｓ）；および条虫（ｃｅｓｔｏｄｅ）（条虫（ｔａｐｅｗｏｒｍ））感染症を包含する。これらの生物体および／若しくはそれらにより産生される毒素の多くは、疾病対策センター（Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ
Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）［（ＣＤＣ）、米国保健福祉省の部門］により生物学的攻撃での使用に関する潜在性を有する剤と同定された。例えば、これらの生物学的剤
のいくつかは、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）（炭疽）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）およびその毒素（ボツリヌス中毒）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）（ペスト）、大疱瘡（天然痘）、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）（野兎病）、ならびにウイルス性出血熱［フィロウイルス（例えばエボラ、マルブルク］、ならびにアレナウイルス［例えばラッサ、マチュポ］）（それらの全部は現在カテゴリーＡの病原体に分類されている）；コクシエラ  ブルネティ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｔｉ）（Ｑ熱）；ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）スピーシーズ（ブルセラ症）、バークホルデリア  マレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ）（鼻疽）、バークホルデリア  シュードマレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）（類鼻疽）、トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）およびその毒素（リシン毒素）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）およびその毒素（ε毒素）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）スピーシーズおよびそれらの毒素（エンテロトキシンＢ）、オウム病クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）（オウム病）、水の安全性に対する脅威（例えばコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、クリトスポリジウム  パルブム（Ｃｒｙｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ））、発疹チフス（発疹チフスリケッチア（Ｒｉｃｈｅｔｔｓｉａ  ｐｏｗａｚｅｋｋｉ））、ならびにウイルス性脳炎（アルファウイルス、例えばベネズエラウマ脳炎；東部ウマ脳炎；西部ウマ脳炎）（それらの全部は現在カテゴリーＢの剤として分類されている）；ならびにニパンウイルスおよびハンタウイルス（現在カテゴリーＣの病原体として分類されている）を包含する。加えて、そのように分類されるか若しくは異なって分類される他の生物体が、将来同定かつ／若しくはこうした目的上使用されうる。本明細書に記述されるウイルスベクターおよび他の構築物が、これらの生物学的剤への感染若しくはそれらとの他の有害反応を予防かつ／若しくは処置することができるこれらの生物体、ウイルスからの抗原、それらの毒素若しくは他の副生成物を送達するのに有用であることが容易に理解されるであろう。
【０１０９】
Ｔ細胞の可変領域に対する免疫原を送達するための本発明のベクターの投与は、それらのＴ細胞を排除するための細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）を包含する免疫応答を導き出す。関節リウマチ（ＲＡ）において、該疾患に関与するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の数個の特異的可変領域が特徴づけられている。これらのＴＣＲはＶ−３、Ｖ−１４、Ｖ−１７およびＶα−１７を包含する。従って、これらのポリペプチドの最低１種をコードする核酸配列の送達は、ＲＡに関与するＴ細胞を標的とすることができる免疫応答を導き出すことができる。多発性硬化症（ＭＳ）において、該疾患に関与するＴＣＲの数個の特異的可変領域が特徴づけられている。これらのＴＣＲはＶ−７およびＶα−１０を包含する。従って、これらのポリペプチドの最低１種をコードする核酸配列の送達は、ＭＳに関与するＴ細胞を標的とすることができる免疫応答を導き出すことができる。強皮症において、該疾患に関与するＴＣＲの数個の特異的可変領域が特徴づけられている。これらのＴＣＲはＶ−６、Ｖ−８、Ｖ−１４およびＶα−１６、Ｖα−３Ｃ、Ｖα−７、Ｖα−１４、Ｖα−１５、Ｖα−１６、Ｖα−２８ならびにＶα−１２を包含する。従って、これらのポリペプチドの最低１種をコードするキメラアデノウイルスの送達は、強皮症に関与するＴ細胞を標的とすることができる免疫応答を導き出すことができる。
【０１１０】
３．送達方法
選択された遺伝子の治療レベル若しくは免疫のレベルをモニターして、ブースターの必要性（あれば）を決定し得る。血清中のＣＤ８＋  Ｔ細胞応答、若しくは場合によっては抗体力価の評価後に、任意のブースター免疫化が望ましいことがある。場合によっては、本発明のアデノウイルスベクターは、単回投与で、または多様な組合せ投与計画で、例えば他の有効成分を必要とする投与計画若しくは治療クールとともに、またはプライム−ブースト（ｐｒｉｍｅ−ｂｏｏｓｔ）投与計画で送達しうる。多様なこうした投与計画が当
該技術分野で記述されており、そして容易に選択しうる。例えば、プライム−ブースト投与計画は、タンパク質、若しくはこうした抗原をコードする配列を保有する組換えウイルスのような伝統的抗原を含む第二の若しくはさらなるブースターの投与に対し免疫系をプライミングするための、ＤＮＡ（例えばプラスミド）に基づくベクターの投与を必要としうる。例えば、２０００年３月２日に公開された国際特許公開第ＷＯ  ００／１１１４０号明細書（引用することにより組込まれる）を参照されたい。あるいは、免疫化投与計画は、抗原を保有するベクター（ウイルス若しくはＤＮＡいずれかに基づく）若しくはタンパク質に対する免疫応答をブーストするための本発明の改変アデノウイルスベクターの投与を必要としうる。なお別の代替において、免疫化投与計画は、タンパク質の投与、次いで抗原をコードするベクターを含むブースターを必要とする。
【０１１１】
一態様において、本発明は、本発明の改変アデノウイルスベクターの送達を必要とする投与計画での、選択された抗原に対する免疫応答のプライミングおよびブースト方法を提供する。こうした投与計画は、選択された免疫原を保有するプラスミドＤＮＡベクターの送達、ならびに／またはプライムおよび／若しくはブーストベヒクルからの多タンパク質の発現を必要としうる。例えば、ＨＩＶおよびＳＩＶに対する免疫応答を生成するのに有用なタンパク質サブユニットの発現のための多タンパク質投与計画を記述するＲ．Ｒ．Ａｍａｒａ、Ｓｃｉｃｅｎｃｅ、２９２：６９−７４（２００１年４月６日）を参照されたい。例えば、プライムは、単一転写物若しくは複数の転写物からＧａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｉｆ、ＶＰＸおよびＶｐｒならびにＥｎｖ、ＴａｔおよびＲｅｖを送達しうる。あるいは、ＳＩＳのＧａｇ、ＰｏｌおよびＨＩＶ−１  Ｅｎｖは単一構築物で送達される。なお他の投与計画は、国際特許公開第ＷＯ  ９９／１６８８４号および同第ＷＯ  ０１／５４７１９号明細書に記述されている。
【０１１２】
しかしながら、プライム−ブースト投与計画は、ＨＩＶに対する免疫化若しくはこれらの抗原の送達に制限されない。例えば、プライミングは、第一のベクターを用いて送達すること、次いで第二のベクター、若しくはタンパク質の形態の抗原それ自身を含有する組成物でブーストすることを必要としうる。一例において、プライム−ブースト投与計画は、抗原が由来するウイルス、細菌若しくは他の生物体に対する保護免疫応答を提供し得る。別の望ましい態様において、プライム−ブースト投与計画は、それに対する治療が投与されている状態の存在の検出のための慣習的アッセイを使用して測定し得る治療効果を提供する。
【０１１３】
プライミング組成物は、身体の多様な部位で、用量依存性の様式（所望の免疫応答が標的とされている抗原に依存する）で投与しうる。本発明は、注入（１個若しくは複数）の量若しくは部位、または製薬学的担体に制限されない。むしろ、該投与計画は、そのそれぞれが毎時、毎日、毎週若しくは毎月または毎年投与される単一用量若しくは投薬量を包含しうるプライミングおよび／若しくはブースト（ｂｏｏｓｔｉｎｇ）段階を必要としうる。一例として、哺乳動物は、担体中約１０μｇないし約５０μｇの間のプラスミドを含有する１若しくは２用量を受領しうる。ＤＮＡ組成物の所望の量は、約１μｇないし約１０，０００μｇの間のＤＮＡベクターの範囲にわたる。投薬量は被験体の体重１ｋｇあたり約１μｇから１０００μｇのＤＮＡまで変動しうる。送達の量若しくは部位は、望ましくは哺乳動物の同一性および状態に基づき選択する。
【０１１４】
哺乳動物への抗原の送達に適するベクターの投薬量単位は本明細書に記述されている。ベクターは、等張の生理的食塩水；等張塩溶液、若しくはこうした投与の当業者に明らかであろう他の製剤のような製薬学的に若しくは生理学的に許容できる担体に懸濁若しくは溶解されることにより、投与のため調製する。適切な担体は当業者に明白であることができ、そして投与経路に大きな部分依存するであろう。本発明の組成物は、生物分解性の生物適合性ポリマーを使用する徐放製剤中で上述された経路に従って、若しくはミセル、ゲ
ルおよびリポソームを使用するその場での送達により、哺乳動物に投与しうる。場合によっては、本発明のプライミング段階は、本明細書で定義されるような、プライミング組成物、適する量のアジュバントとともに投与することもまた包含する。
【０１１５】
好ましくは、ブースト組成物（ｂｏｏｓｔｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）は、哺乳動物被験体にプライミング組成物を投与した約２ないし約２７週後に投与する。ブースト組成物の投与は、プライミングＤＮＡワクチンにより投与されると同一の抗原を含有する若しくは送達することが可能なブースト組成物の有効量を使用して達成される。ブースト組成物は、同一ウイルス供給源（例えば本発明のアデノウイルス配列）若しくは別の供給源由来の組換えウイルスベクターから構成しうる。あるいは、「ブースト組成物」は、プライミングＤＮＡワクチンでコードされると同一の抗原を、しかしタンパク質若しくはペプチドの形態で含有する組成物であり得、その組成物は宿主中で免疫応答を誘導する。別の態様において、ブースト組成物は、哺乳動物細胞中でその発現を指図する制御配列の制御下に該抗原をコードするＤＮＡ配列、例えば公知の細菌若しくはウイルスベクターのようなベクターを含有する。ブースト組成物の主要件は、該組成物の抗原が、プライミング組成物によりコードされるものと同一の抗原若しくは交差反応性抗原であることである。
【０１１６】
別の態様において、本発明の改変アデノウイルスベクターは、多様な他の免疫化および治療的投与計画での使用にもまた良好に適する。こうした投与計画は、異なる血清型キャプシドのＡｄベクターと同時に若しくは連続して本発明のアデノウイルスベクターの送達を必要としうる（本発明のアデノウイルスベクターがＡｄ以外のベクターと同時に若しくは連続して送達される投与計画、本発明のアデノウイルスベクターがタンパク質、ペプチド、および／または他の生物学的に有用な治療若しくは免疫原性化合物と同時に若しくは連続して送達される投与計画）。こうした用途は当業者に容易に明らかであろう。
【０１１７】
従って、本発明は、本発明の改変アデノウイルスヘキソンタンパク質を含んでなる多様な処置およびワクチン投与計画での使用のための免疫原性組成物を提供する。一態様において、改変アデノウイルスヘキソンは、空の改変アデノウイルスキャプシド（すなわち標的細胞のための送達のためのいかなるミニ遺伝子もその中にパッケージングしていない改変アデノウイルスヘキソンを含有するアデノウイルスキャプシド）の形態で被験体に送達しうる。別の態様において、標的細胞中でこのヘキソンを発現するベクターを利用しうる。なお別の態様において、ミニ遺伝子を保有する改変アデノウイルス粒子を被験体に送達する。
【０１１８】
こうした改変アデノウイルス粒子は、その改変キャプシド中にターゲッティング配列を含有しうる。しかしながら、こうした改変アデノウイルス粒子は、自己プライミングする免疫原性組成物の基礎を形成しうる。こうした自己プライミングする組成物は、アデノウイルスキャプシド中の外因性アミノ酸配列が免疫原である場合に製造することができ、そして、該キャプシドは免疫原をコードする核酸配列もまたその中にパッケージングしている。本明細書に記述されるところのキャプシドタンパク質中の免疫原、およびキャプシド内にパッケージングされた分子内に含有される免疫原は同一であることができ、同一のウイルス若しくは生物体に対する免疫応答を誘導しうる。別の態様において、本発明の自己プライミングするアデノウイルス粒子は、非特異的免疫応答を誘導する免疫原をそのキャプシドに含有することができ、かつ、選択された細胞型、分子若しくは生物体に対する特異的若しくは交差反応性免疫応答を誘導する前記第二の免疫原をその中にパッケージングしていることができる。
【実施例】
【０１１９】
以下の実施例は具体的に説明し、そして本発明をそれらの具体的に説明される態様に制限することを意図していない。
【０１２０】
発明者は、ヘキソン（上に引用されるＲｕｘら、（２００３）により定義されるところのＨＶＲ１領域の２５アミノ酸の欠失（ＡＬＥＩＮＬＥＥＥＤＤＤＮＥＤＥＶＤＥＱＡＥＱＱＫ、配列番号１１）を含有する生存可能なアデノウイルス変異体を生成し得ることを示した。
【０１２１】
発明者は、所望のペプチド配列（本実施例において、ＨＩＶ中和エピトープを内部に持つことが報告されたＨＩＶエンベロープタンパク質の区分に対応するペプチド配列ＥＱＥＬＬＥＬＤＫＷＡＳＬＷ、配列番号１２）をコードする外因性ＤＮＡセグメントを、該欠失の代わりに挿入し得ることをさらに示す。
【０１２２】
実施例１：ＨＡｄＶ−５ヘキソンの挿入変異
それが外来ペプチド配列をコードするようにヘキソンのＤＮＡ配列を変異させるために着手されたクローニング段階は、後に続くとおりであった。
【０１２３】
ヘキソンコーディング領域を内部に持つＨＡｄＶ−５ゲノムからのＡｓｃＩフラグメントを、プラスミドｐＮＥＢ１９３（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから購入した）にサブクローニングして、ｐＮＥＢＡｓｃを創製した（図１を参照されたい）。
【０１２４】
ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）突然変異誘発を該ヘキソンで実施して、挿入部位に新たなＳｐｅＩ部位を創製した。ＳｐｅＩ部位を創製するためのＰＣＲ突然変異誘発の詳細は、後に続くとおりである。
【０１２５】
反応１および２のＰＣＲ鋳型はｐＮＥＢＡｓｃ（プラスミドｐＮＥＢ１９３にクローン化したヘキソン領域を含有するＡｄ５  ＡｓｃＩフラグメント）である。反応１および２の産物を合わせ、そして反応３の鋳型として使用した。ＰＣＲ酵素はＴｇｏポリメラーゼであった。全３反応の循環は後に続くとおりであった。すなわち、９４°−３０秒、４５°−６０秒、７２°−６０秒、４０回。
【０１２６】
反応１のため、プライマー「５ｈｅｘ１」（ＧＡＣＣＧＣＣＧＴＴＧＴＴＧＴＡＡＣＣＣ、配列番号１３）および「ｌｔ  ｒｅｖ」（ＧＴＴＧＴＣＡＴＣＧＴＣＣＡＣＴＡＧＴＣＣＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴＡＧＧＴＴＴＡＴＴＴＣＡＡＧ、配列番号１４）を使用して、７１３ｂｐのフラグメントを増幅した。
【０１２７】
反応２のため、プライマー「ｒｔ  ｆｗｄ」（ＧＧＡＣＴＡＧＴＧＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡＣＧＡＡＧＡＣＧＡ、配列番号１５）および「ｒｔ  ｒｅｖ」（ＡＴＧＧＴＴＴＣＡＴＴＧＧＧＧＴＡＧＴＣ、配列番号１６）を使用して、２５９ｂｐのフラグメントを増幅した。
【０１２８】
反応３のため、反応１および反応２から生じるフラグメントを、プライマー「５ｈｅｘ１」および「ｒｔ  ｒｅｖ」を使用して一緒に縫い合わせて（ｓｅｗｎ）、９５１ｂｐの産物をもたらした。縫い合わせた９５１ｂｐの産物をＢｌｐＩで切断し；生じる５１８ｂｐのフラグメントを使用してｐＮＥＢＡｓｃの天然のＢｌｐＩフラグメントを置き換えて、ｐＮＥＢＡｓｃＳｐｅを生じた。これは、ヘキソンアミノ酸配列中のＥＥＥとＤＤＤの間（ａａ＃１４９と１５０の間）にＳｐｅＩ部位を含有するＧＧＡＣＴＡＧＴＧ［配列番号１５のｎｔ  １−９］（アミノ酸ＧＬＶをコードする）を挿入する。］
【０１２９】
所望のペプチド配列をコードする合成ＤＮＡフラグメントを該ＳｐｅＩ部位に挿入した。該手順の詳細は後に続くとおりであった。
【０１３０】
オリゴマー「ＣＤ４  ｔｏｐ」（ＣＴＡＧＧＣＴＧＣＴＡＣＧＧＣＧＴＧＡＧＣＧＣＣ
ＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＧＧ、配列番号１８）および「ＣＤ４  ｂｏｔ」（ＣＴＡＧＣＣＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＧＧＣＧＣＴＣＡＣＧＣＣＧＴＡＧＣＡＧＣ、配列番号１９）を一緒にアニーリングした後、ＳＡＲＳコロナウイルスのスパイクタンパク質からのＢａｌｂ／ｃマウスＣＤ４エピトープをｐＮＥＢＡｓｃＳｐｅのＳｐｅＩ部位に挿入して、ｐＮＥＢＡｓｃＳｐｅ−ｓｐｉｋｅＣＤ４を生じた。これは、ＧＬＧＣＹＧＶＳＡＴＫＬＧＬＶ（配列番号２０）をヘキソンのＥＥＥとＤＤＤの間（ａａ＃１４９と１５０の間）に置く。
【０１３１】
ＳＡＲＳコロナウイルスのスパイクタンパク質からのＢａｌｂ／ｃマウスＣＤ８エピトープを挿入するため、オリゴマー「ＣＤ８  ｔｏｐ」（ＣＴＡＧＧＧＡＣＣＡＧＣＡＣＣＧＧＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＴＡＣＣＧＣＴＡＣＣＴＧＣＧＣＣＡＣＧＧＣＡＡＧＣＴＧＣＧＣＣＣＣＧＧＧ、配列番号２１）および「ＣＤ８  ｂｏｔ」（ＣＴＡＧＣＣＣＧＧＧＧＣＧＣＡＧＣＴＴＧＣＣＧＴＧＧＣＧＣＡＧＧＴＡＧＣＧＧＴＡＣＴＴＧＴＡＧＴＴＧＴＡＧＴＴＧＣＣＧＧＴＧＣＴＧＧＴＣＣ、配列番号２２）を一緒にアニーリングし、そしてｐＮＥＢＡｓｃＳｐｅのＳｐｅＩ部位に挿入して、ｐＮＥＢＡｓｃＳｐｅ−ｓｐｉｋｅＣＤ８を生じた。これは、アミノ酸配列ＧＬＧＴＳＴＧＮＹＮＹＫＹＲＹＬＲＨＧＫＬＲＰＧＬＶ（配列番号２３）をヘキソンのＥＥＥとＤＤＤの間（ａａ＃１４９と１５０の間）に置く。
【０１３２】
Ｅ１およびＥ３欠失ＨＡｄＶ−５ベクターの天然のヘキソンを含有するプラスミド分子クローン（ｐＳＲＡｄ５ｅＧＦＰ）を、挿入された外来配列とともにヘキソンを含有するもので置き換えて、変異させたヘキソンを内部に持つ新たなプラスミド分子クローン（それぞれｐＨ５ｓＣＤ４およびｐＨ５ｓＣＤ８）を創製した。
【０１３３】
ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）突然変異誘発を該ヘキソンで実施して、挿入部位に新たなＢｓｐＥＩ制限酵素部位を創製した。ＢｓｐＥＩ部位を創製するＰＣＲ突然変異誘発の詳細は後に続くとおりであった。
【０１３４】
ｐＮＥＢＡｓｃ（プラスミドｐＮＥＢ１９３にクローン化したヘキソン領域を含有するＡｄ５  ＡｓｃＩフラグメント）が反応１および２の鋳型であった。反応１および２の産物を合わせ、そして反応３の鋳型として使用した。
【０１３５】
ＮＥＢから購入しかつ製造元の説明書に従って使用したＰｈｕｓｉｏｎＴＭハイフィデリティ（ｈｉｇｈ−ｆｉｄｅｌｉｔｙ）ＰＣＲキット。全３反応の循環は：９８°―５秒、５５°−１５秒、７２°−６０秒、２５回であった。
【０１３６】
反応１のため、プライマー「５ｈｅｘ１」（ＧＡＣＣＧＣＣＧＴＴＧＴＴＧＴＡＡＣＣＣ、配列番号２４）およびＢｓｐＳＯＥｒｅｖ（ＣＧＴＧＡＧＴＴＣＣＧＧＡＡＧＴＡＧＣＡＧＣＴＴＣＡＴＣＣＣＡＴＴＣＧ、配列番号２５）を使用して６７８ｂｐのフラグメントを増幅した。反応２のため、プライマーＢｓｐＳＯＥｆｗｄ（ＴＧＣＴＡＣＴＴＣＣＧＧＡＡＣＴＣＡＣＧＴＡＴＴＴＧＧＧＣＡＧＧＣＧ、配列番号２６）および５ｈｅｘ４（ＧＧＡＡＧＡＡＧＧＴＧＧＣＧＴＡＡＡＧＧ、配列番号２７）を使用して、１３７９ｂｐのフラグメントを増幅した。
【０１３７】
反応３のため、反応１および反応２から生じるフラグメントを、プライマー５ｈｅｘ１および５ｈｅｘ４を使用して一緒に縫い合わせ、そして２０３７ｂｐの産物をＲｓｒＩＩ＋ＡｖｒＩＩで切断し；生じる１９０８ｂｐのフラグメントをｐＮＥＢＡｓｃ／ＲｓｒＩＩ＋ＡｖｒＩＩに連結して、ｐＮＥＢＡｓｃＢｓｐＥＩを生じた。これは、ＡＬＥＩＮＬＥＥＥＤＤＤＮＥＤＥＶＤＥＱＡＥＱＱＫ［配列番号１１］をコードする７５ｂｐを欠失し、そしてヘキソン配列中にＢｓｐＥＩ部位を含有するＴＣＣＧＧＡ（ＳＧをコードする配列番号２７のｎｔ  ７１−３）を挿入する。
【０１３８】
所望のペプチド配列をコードする合成ＤＮＡフラグメントをＢｓｐｅＩ部位に挿入した。該手順の詳細は後に続くとおりであった。ＨＩＶ  ２Ｆ５エピトープ領域をｐＮＥＢＡｓｃＢｓｐＥＩに挿入するため、オリゴマー「２Ｆ５  ｔｏｐ」（ＣＣＧＧＣＧＡＧＣＡＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＡＣＡＡＧＴＧＧＧＣＣＡＧＣＣＴＧＴＧＧＴ、配列番号２８）および「２Ｆ５  ｂｏｔ」（ＣＣＧＧＡＣＣＡＣＡＧＧＣＴＧＧＣＣＣＡＣＴＴＧＴＣＣＡＧＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＣＣＴＧＣＴＣＧ、配列番号１７）をアニーリングし、そしてＢｓｐＥＩ部位に挿入して、プラスミドｐＮＥＢＡｓｃ  ２Ｆ５を生じた。これは、アミノ酸配列ＡＬＥＩＮＬＥＥＥＤＤＤＮＥＤＥＶＤＥＱＡＥＱＱＫ（配列番号１１）を、上で実施した２５アミノ酸欠失の代わりに置く。
【０１３９】
Ｅ１およびＥ３欠失ＨＡｄＶ−５ベクターの天然のヘキソンを含有するプラスミド分子クローン（ｐＳＲＡｄ５ｅＧＦＰ）を、欠失若しくは挿入された外来配列を伴うヘキソンを含有するもので置き換えて、変異させたヘキソンを内部に持つ新たなプラスミド分子クローン（それぞれｐＨ５ｈｅｘＢｓｐｅＩおよびｐＨ５  ２Ｆ５）を創製した。
【０１４０】
感染性組換えＨＡｄＶ−５ベクターを、変異させたヘキソンを内部に持つ該新たなプラスミド分子クローン（ＰａｃＩで直鎖状にした）をＨＥＫ  ２９３細胞にトランスフェクトすることにより、変異させたヘキソンを伴い生成させた。
【０１４１】
改変ヘキソンタンパク質を含有するこの新たなＨＡｄＶ−５ベクターを、本明細書に記述されるところの多様な応用で使用しうる。
【０１４２】
本明細に引用される全刊行物は引用することにより本明細書に組込まれる。本発明はとりわけ好ましい態様に関して記述した一方、本発明の技術思想から離れることなく改変を行い得ることが認識されるであろう。こうした改変は、付随する請求の範囲の範囲内にあることを意図している。
【図面の簡単な説明】
【０１４３】
【図１】ヘキソンコーディング領域を内部に持つヒトアデノウイルス５型ゲノム（ＨＡｄＶ−５）のプラスミドｐＮＥＢ１９３（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから購入した）へのサブクローニングから生じるプラスミドｐＮＥＢＡｓｃの地図である。
【図２Ａ】天然のアデノウイルスヘキソンおよび緑色蛍光タンパク質マーカー遺伝子を含有するＥ１およびＥ３欠失ＨＡｄＶ−５ベクターの分子クローンである、プラスミド（ｐ）ＳＲＡｄ５ｅＧＦＰの地図である。
【図２Ｂ】ＨＡｄＶ−５バックボーン、およびＳＡＲＳコロナウイルスのスパイクタンパク質からのＣＤ４エピトープを含有する変異させたヘキソンを含有するプラスミド分子クローンである、ｐＨ５ｓＣＤ４ｅＧＦＰの地図である。
【図２Ｃ】Ｅ１、Ｅ３欠失ＨＡｄＶ−５ゲノム、およびＳＡＲＳコロナウイルスのスパイクタンパク質からのＣＤ８エピトープを含有する変異させたヘキソンを含有するプラスミド分子クローンである、ｐＨ５ｓＣＤ８ｅＧＦＰの地図である。
【図２Ｄ】Ｅ１、Ｅ３欠失ＨＡｄＶ−５ゲノム、およびＨＩＶ  ２Ｆ５エピトープ領域を含有する変異させたヘキソンを含有するプラスミド分子クローンである、ｐＨ５−２Ｆ５ｅＧＦＰの地図である。
【図２Ｅ】Ｅ１、Ｅ３欠失ＨＡｄＶ−５ゲノム、および挿入断片を含有しない変異させたヘキソンを含有するプラスミド分子クローンである、ｐＨ５−ｈｅｘＢｓｐｅＥＩの地図である。
【図３】サルアデノウイルスＳＡｄＶ−２３（旧命名法の下でＰａｎ６若しくはＣ６）；ＳａｄＶ−２２（旧命名法の下でＳＡｄ２２／Ｐａｎ５若しくはＣ５）；ＳＡｄＶ−２４（旧命名法の下でＰａｎ７若しくはＣ７）；およびＳＡｄＶ−２５（旧命名法の下でＣ６８）の超可変領域（ＨＶＲ）１、２、３、４、５、６および７を含有するアデノウイルスヘキソンタンパク質の部分のアライメントである。ＨＶＲの位置をこれらの配列について示し、配列のそれぞれに関する番号付けを示す。ＳＡｄＶ−２３について、該フラグメントは配列番号３のアミノ酸１３１ないし４９５であり；ＳＡｄＶ−２２について、該フラグメントは配列番号４のアミノ酸１３１ないし４８６であり；ＳＡｄ２４について、該フラグメントは配列番号５のアミノ酸１３１ないし４８５であり；ＳＡｄ２５について、該フラグメントは配列番号６のアミノ酸１３１ないし４８６であり；ｈＡｄ５について、該フラグメントは配列番号２のアミノ酸１３１ないし５０９である。
【図１】
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【図２Ａ】
0005889514.tif 000003
【図２Ｂ】
0005889514.tif 000004
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
0005889514.tif 000006
【図２Ｅ】
0005889514.tif 000007
【図３】
0005889514.tif 000008
【配列表】
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