(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）被験体の口腔組織の炎症を最低限に抑えるための抗炎症剤、及び
（ｉｉ）微生物及びそれらの断片を被験体の口腔組織から除去するための抗菌剤
から選択される作用物質を投与した被験体の口腔組織中のポルフィロモナス・ジンジバリスの存在に関連付けられる疾患若しくは状態を処置するために使用される、ポルフィロモナス・ジンジバリスに対して免疫応答を誘導する免疫原を含む薬剤。
【請求項２】
前記免疫原を、前記作用物質の１週間〜２週間後に投与する、請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
免疫原の投与前に作用物質を投与することにより被験体の口腔組織中のポルフィロモナス・ジンジバリスの存在に関連付けられる疾患又は状態を処置することにおける使用のためのキットであって、
（ｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスに対して免疫応答を誘導する免疫原を含む組成物と
（ｉｉ）被験体の口腔組織の炎症を最低限に抑えるための抗炎症剤、及び
微生物及びそれらの断片を被験体の口腔組織から除去するための抗菌剤
から選択される作用物質を含む組成物と、
（ｉ）および（ｉｉ）の使用に関する説明書
を含むキット。
【請求項４】
前記作用物質が抗炎症剤である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の薬剤又はキット。
【請求項５】
前記作用物質が抗菌剤である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の薬剤又はキット。
【請求項６】
前記抗菌剤が、フマル酸還元酵素の阻害剤である、請求項５に記載の薬剤又はキット。
【請求項７】
前記抗菌剤が、オキサンテル、モランテル又はチアベンダゾールから選択される、請求項５に記載の薬剤又はキット。
【請求項８】
前記免疫原が、ポルフィロモナス・ジンジバリス細胞、ポルフィロモナス・ジンジバリスに由来する断片、ポルフィロモナス・ジンジバリスに由来する代謝産物又はポルフィロモナス・ジンジバリス由来の組換えペプチド又はポリペプチドである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の薬剤又はキット。
【請求項９】
ポルフィロモナス・ジンジバリスに由来する前記組換えポルフィロモナス・ジンジバリスペプチド又はポリペプチドが、キメラタンパク質又は融合タンパク質である、請求項８に記載の薬剤又はキット。
【請求項１０】
前記キメラタンパク質又は融合タンパク質がＫＡＳ１−ＫｓＡ１及びＫＡＳ２−ＫＬＡ１から選択される請求項９に記載の薬剤又はキット。
【請求項１１】
前記免疫原及び前記作用物質のうちの少なくとも一方が全身投与される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の薬剤又はキット。
【請求項１２】
前記免疫原及び前記作用物質のうちの少なくとも一方が、口腔組織へ直接的に投与される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の薬剤又はキット。
【請求項１３】
前記免疫原及び前記作用物質のうちの少なくとも一方が、口腔粘膜へ直接的に投与される、請求項１２に記載の薬剤又はキット。
【請求項１４】
前記処置することが、歯科的処置をさらに含む請求項１〜１３のいずれか一項に記載の薬剤又はキット。
【請求項１５】
前記歯科的処置が、創面切除、歯石除去及び根面平滑化のうちの１つ又は複数を含む、請求項１４に記載の薬剤又はキット。
【請求項１６】
（ｉ）被験体の口腔組織の炎症を最低限に抑えるための抗炎症剤、及び
（ｉｉ）微生物及びそれらの断片を被験体の口腔組織から除去するための抗菌剤
から選択される作用物質を投与した被験体の口腔組織中のポルフィロモナス・ジンジバリスの存在に関連付けられる疾患若しくは状態の発生率又は重篤性を低減させるための組成物であって、ポルフィロモナス・ジンジバリスに対して免疫応答を誘導する免疫原を含む組成物。
【請求項１７】
前記免疫原を、前記作用物質の１週間〜２週間後に投与する、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記免疫原を、被験者の口腔組織が炎症を起こしていないときに投与する、請求項１６又は１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記免疫原はＴｈ２応答が優性な抗体応答を誘導する、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記被験者は前記組成物の投与前に歯科的処置を受けている、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記歯科的処置が、創面切除、歯石除去及び根面平滑化のうちの１つ又は複数を含む、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記疾患若しくは状態が、ポルフィロモナス・ジンジバリス感染に関連する、請求項１６〜２１のいずれか一項に記載の組成物。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験体における疾患若しくは状態（上記疾患若しくは状態は、被験体の口腔組織中の微生物病原体の存在に関連付けられる）の処置又は防止、具体的には（ただし、排他的ではない）ポルフィロモナス・ジンジバリス（P. gingivalis）関連の疾患若しくは状態の処置又は防止に関する。
【背景技術】
【０００２】
口は、主な感染部位の１つである。感染は、口腔組織の消耗性疾患を招き得る。また口腔組織の感染と、他の解剖学的区画における疾患又は状態との間に明らかな関連性が観察されている。
【０００３】
慢性歯周炎は、口腔組織の疾患の一例である。これは、歯槽骨の吸収及び最終的には歯を失うことにつながる歯の支持組織の炎症性疾患である。この疾患は、社会全体において公衆衛生上の主要な問題であり、成人の人口の最大１５％がこの疾患に罹患していると推定され、重篤な形態には５％〜６％が罹患している。
【０００４】
慢性歯周炎の発症及び進行は、歯肉縁下の歯垢中の特定のグラム陰性菌と関連付けられている。歯肉縁下の歯垢中のポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）が、疾患に強く関連付けられている。
【０００５】
処置（歯石除去及び根面平滑化）後の歯周炎患者の歯肉縁下の歯垢中のポルフィロモナス・ジンジバリスの残留性が、進行性の歯槽骨量減少に大いに関連付けられると報告されている。さらに、歯肉縁下の歯垢中のポルフィロモナス・ジンジバリス細胞数の増加は、付着喪失、歯周ポケットの深さ及びプロービング時の出血によって測定される場合の疾患重篤性と相関することが分かっている。
【０００６】
ポルフィロモナス・ジンジバリスによる口腔感染は、マウス、ラット及び非ヒト霊長類において歯周骨量減少を誘導することが分かっている。さらに、歯周病及びポルフィロモナス・ジンジバリス感染と、心血管疾患及び或る特定のがんとの関係性が増大している。
【０００７】
他の細菌、真菌、ウイルス及び原虫を含む他の多くの微生物病原体は、口腔組織の疾患に関連付けられており、これらの病原体の幾つかはまた、口腔組織の感染により他の解剖学的区画において疾患を引き起こす。前者の例としては、トレポネーマ・デンチコラ（T. denticola）及びタンネレラ・フォーサイシア（T. forsythia）が挙げられる。Ａ群ストレプトコッカス（Streptococcus）感染は、リウマチ熱及びリウマチ性心疾患の病原学的作用因子である。
【０００８】
問題の１つは、粘膜組織が慢性的に炎症しているか、又は粘膜組織の急性炎症が外科的介入又は他の歯科的介入から生じた状況において、所定の微生物病原体に対する強力な防御応答をどのようにして得るかどうかが不明瞭であることである。
【０００９】
本明細書における任意の従来技術に対する参考文献は、この従来技術がオーストラリアにおける共通の一般知識若しくは任意の他の法域の一部を形成するという、又はこの従来技術が当業者によって関連があるものと確認され、理解され、かつ見なされることを合理的に期待することができるという承認又は任意の形態の示唆ではなく、またそのように解釈されないものとする。
【発明の概要】
【００１０】
或る特定の実施の形態では、被験体における疾患若しくは状態（上記疾患若しくは状態は、被験体の口腔組織中の微生物病原体の存在に関連付けられるものである）の発生率又は重篤性を低減させる方法であって、
被験体を処置し、それにより実質的に全ての微生物又はそれらの断片を上記被験体の口腔組織から除去するためのコンディションを提供することと、その後、
上記被験体において抗体（上記抗体は、口腔組織中でのその存在が疾患又は状態と関連付けられる微生物病原体に対して上記被験体を防御するためのものである）を供給することと
を含み、それにより被験体における疾患若しくは状態の発生率又は重篤性を低減させる、被験体における疾患若しくは状態の発生率又は重篤性を低減させる方法が提供される。
【００１１】
一実施の形態では、抗体は、上記被験体へ免疫原（上記免疫原は、微生物病原体に対して上記被験体を防御するためのものである）を投与することによって、上記被験体中で供給される。
【００１２】
一実施の形態では、被験体におけるポルフィロモナス・ジンジバリス関連の疾患若しくは状態の発生率又は重篤性を低減させる方法であって、
被験体を処置し、それにより実質的に全ての微生物又はそれらの断片を上記被験体の口腔組織から除去することと、その後、
ポルフィロモナス・ジンジバリスに対する免疫応答を誘導するためのキメラタンパク質又は融合タンパク質（上記タンパク質は、第２のペプチドに直接的に又はリンカーを介して結合される第１のペプチドを含む）を上記被験体へ投与することであって、ここで、
（Ａ）上記第１のペプチドは、
（ｉ）配列番号１で示される配列と同じであるか、若しくはその配列と相同性である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉ）配列番号２で示される配列と同じであるか、若しくはその配列と相同性である配列の一部若しくは全て、
を含み、
（Ｂ）上記第２のペプチドは、
（ｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＬｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼのアドヘシンドメインの配列と同じであるか、若しくはその配列と相同性である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼのアドヘシンドメインの配列と同じであるか、若しくはその配列と相同性である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＨａｇＡアドヘシンドメインの配列と同じであるか、若しくはその配列と相同性である配列の一部若しくは全て
を含む、投与することと
を含み、それにより被験体における疾患若しくは状態の発生率又は重毒性を低減させる、被験体におけるポルフィロモナス・ジンジバリス関連の疾患若しくは状態の発生率又は重篤性を低減させる方法が提供される。
【００１３】
他の実施の形態では、
実質的に全ての微生物又はそれらの断片を上記被験者の口腔組織から除去するための抗菌剤と、
口腔組織中でのその存在が疾患又は状態と関連付けられる微生物病原体に対して、上記被験体を免疫感作するための免疫原と
を含む組成物又はキットが提供され、上記組成物又はキットは、上述の方法で使用するためのものである。
【００１４】
或る特定の実施の形態では、被験体における疾患若しくは状態（上記疾患若しくは状態は、被験体の口腔組織中の微生物病原体の存在に関連付けられるものである）の発生率又は重篤性を低減させる方法であって、
被験体の口腔組織に対して外科的処置を実施することと、その後、
上記被験体を処置し、それにより実質的に全ての微生物又はそれらの断片を上記被験体の口腔組織から除去するためのコンディションを提供することと、
上記被験体において抗体（上記抗体は、口腔組織中でのその存在が疾患又は状態と関連付けられる微生物病原体に対して上記被験体を防御するためのものである）を供給することと
を含み、それにより被験体における疾患若しくは状態の発生率又は重篤性を低減させる、被験体における疾患若しくは状態の発生率又は重篤性を低減させる方法が提供される。
【００１５】
一実施の形態では、上記外科的処置は歯科的処置である。歯科的処置の例としては、創面切除（debridement）、歯石除去（scaling）及び／又は根面平滑化（root planning）が挙げられる。
【００１６】
一実施の形態では、本発明は、被験体における疾患若しくは状態（上記疾患若しくは状態は、被験体の口腔組織中の微生物病原体の存在に関連付けられるものである）の発生率又は重篤性を低減させるための組成物を提供し、上記組成物は、本明細書中に記載されるような抗菌剤と本明細書中に記載されるような免疫原とを含む。
【００１７】
別の態様では、本発明は、被験体における疾患若しくは状態（上記疾患若しくは状態は、被験体の口腔組織中の微生物病原体の存在に関連付けられるものである）の発生率又は重篤性を低減させるための薬剤の調製における本発明の組成物の使用を提供する。疾患の非限定的な例としては、歯垢、歯肉炎、歯周炎、慢性歯周炎、齲蝕、骨量減少、歯槽骨量減少及び冠動脈疾患が挙げられる。
【００１８】
別の実施の形態では、本発明は、本明細書中に記載されるような抗菌剤の活性成分及び本明細書中に記載されるような免疫原からなる、歯周病（及び／又は処置に適するような本明細書中で同定される他の状態）の処置又は防止のための組成物を提供する。
【００１９】
別の実施の形態では、本発明は、被験体における疾患若しくは状態（上記疾患若しくは状態は、被験体の口腔組織中の微生物病原体の存在に関連付けられるものである）の発生率又は重篤性を低減させることにおける使用のための本明細書中に記載されるような抗菌剤と本明細書中に記載されるような免疫原とを含む組成物を提供する。
【００２０】
別の実施の形態では、本発明は、薬剤としての使用のための本明細書中に記載されるような組成物を提供する。
【００２１】
別の実施の形態では、本発明は、主成分として有効量の本発明の組成物を含む医薬組成物を提供する。
【００２２】
１つの実施の形態では、個体において口腔病原体に対する抗体応答を形成する又はＴｈ２応答を形成する方法であって、
口腔病原体に対する抗体応答又はＴｈ２応答が形成されるべき個体を供給する工程と、
前記個体を評価して、該個体が炎症性の口腔組織を有するかどうかを決定する工程と、
前記評価により前記個体が炎症性の口腔組織を有しないことが明らかになる状況において、該個体を口腔病原体で免疫感作し、それにより該個体において口腔病原体に対する抗体応答又はＴｈ２応答を形成する工程と
を含む、個体において口腔病原体に対する抗体応答を形成する又はＴｈ２応答を形成する方法が提供される。
【００２３】
１つの実施の形態では、炎症性の口腔組織を有する個体における口腔病原体に対する抗体応答の形成又はＴｈ２応答の形成に関する免疫感作計画において、抗炎症剤を該個体へ投与して、それにより口腔病原体に対する抗体応答又はＴｈ２応答の形成に関する該個体の免疫感作前に、該口腔組織の炎症を最低限に抑えるか、又は該口腔組織から炎症を除去する工程が提供される。
【００２４】
別の実施の形態では、口腔病原体に対する抗体応答を形成するように又はＴｈ２応答を形成するように炎症性の口腔組織を有する個体を、該病原体による免疫感作時に調整する方法であって、抗炎症剤を該個体へ投与して、それにより口腔病原体に対する抗体応答の形成又はＴｈ２応答の形成に関する病原体による該個体の免疫感作前に、該口腔組織の炎症を最低限に抑えるか、又は該口腔組織から炎症を除去する工程を含む、口腔病原体に対する抗体応答を形成するように又はＴｈ２応答を形成するように炎症性の口腔組織を有する個体を、該病原体による免疫感作時に調整する方法が提供される。
【００２５】
更なる実施の形態では、炎症性の口腔組織を有する個体において口腔病原体に対する抗体応答を形成する又はＴｈ２応答を形成する方法であって、
炎症性の口腔組織を有する個体を準備する工程と、
前記個体に対して処置を適用し、それにより前記口腔組織から炎症を除去する工程と、その後、
前記個体を口腔病原体で免疫感作し、それにより該個体において該病原体に対する抗体応答を形成する又はＴｈ２応答を形成する工程と
を含む、炎症性の口腔組織を有する個体において口腔病原体に対する抗体応答を形成する又はＴｈ２応答を形成する方法が提供される。
【００２６】
上記の実施の形態では、免疫感作が、口腔組織が炎症性ではない場合、又は炎症が亜臨床若しくは無症状である場合に提供されるものとする。
【００２７】
通常、免疫感作時に形成される免疫応答は主にＴｈ２応答であるが、該免疫応答は、Ｔｈ１応答の検出可能な構成成分を含有し得る。
【００２８】
通常、関連の炎症が慢性歯周炎、特にポルフィロモナス・ジンジバリス感染に関連する歯周炎である。
【００２９】
歯周炎がポルフィロモナス・ジンジバリス感染に関連付けられる場合、通常、免疫感作用の免疫原は、ポルフィロモナス・ジンジバリス細胞、それに由来する断片、代謝産物又は組換え産物、例えば本明細書中に記載されるキメラペプチド（特に、ＫＡＳ１−ＫｓＡ１、ＫＡＳ２−ＫＬＡ１）である。
【００３０】
通常、本明細書で規定されるような抗炎症剤又は抗菌剤は、抗炎症性化合物、抗生物質及び抗バイオフィルム剤の１つ若しくは複数を含むか、又はそれらからなり、それらの例は、本明細書中でより詳細に記載されている。
【００３１】
本明細書中で使用する場合、文脈上他の意味に解すべき場合を除いて、「含む」という用語及びこの用語の変化形（variations of the term, such as "comprising", "comprises" and "comprised"）は、更なる添加剤、構成成分、整数又は工程を排除するとは意図されない。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】組換えＫｇｐタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクマシーブルー染色を示す図である。レーン１＝ＫＡＳ２−ＫＬＡ１、レーン２＝ＫＬＡ１、レーン３＝ＫｓＡ１、レーン４＝ＫＡＳ１−ＫｓＡ１。分子量マーカーは、ｋＤａとして示される。
【図２】ＫＡＳ２ペプチド及びホルマリンで死滅させたポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０細胞の抗体認識を示す図である。（Ａ）ＫＡＳ２ペプチドを、ＥＬＩＳＡにおいてホルマリンで死滅させたポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０細胞（ＦＫ−Ｗ５０）、組換えタンパク質ＫＡＳ１−ＫｓＡ１、ＫＡＳ２−ＫＬＡ１、及び合成ＫＡＳ２−ＤＴ複合体及びＰＢＳに対して産生させた抗血清でプローブした。（Ｂ）ホルマリンで死滅させたポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０細胞を、ＥＬＩＳＡにおいてホルマリンで死滅させたポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０細胞（ＦＫ−Ｗ５０）、組換えタンパク質ＫＡＳ１−ＫｓＡ１、ＫＡＳ２−ＫＬＡ１、ＫＬＡ１及びＰＢＳに対して産生させた抗血清でプローブした。抗体応答は、得られたＥＬＩＳＡ力価ＯＤ４１５−２×バックグラウンドレベルとして表わされ、力価はそれぞれ、３つの値の平均値±標準偏差を表す。
【図３】組換えタンパク質及び組換えキメラタンパク質、ホルマリンで死滅させたポルフィロモナス・ジンジバリス及びアジュバントのみ（ＰＢＳ、ＩＦＡ）で免疫感作したマウス、又は非経口感染（非負荷）マウスの上顎臼歯のポルフィロモナス・ジンジバリス誘導性口蓋骨水平板（horizontal bone loss）減少を示す図である。この図では、ＫＡＳ２−ＫＬＡ１はＡＳ２−ＬＡ１と示され、ＫＬＡ１はＬＡ１と示され、ＫＡＳ１−ＫｓＡ１はＡＳ１−ｓＡ１と示され、ＫｓＡ１はｓＡ１と示される。骨量減少の測定は、セメントエナメル境（ＣＥＪ）から、左上顎及び右上顎の両方の各上顎臼歯の頬側の歯槽骨頂（ＡＢＣ）までの平方ミリメートル（ｍｍ２）で測定される面積の平均である。データは、レーベンの等分散性により測定されるように正規分布し、ｍｍ２での平均値（ｎ＝１２）として表わされ、一元配置分散分析及びダネットのＴ３検定を使用して解析した。＊は、群が対照（感染）群よりも有意に（Ｐ＜０．００１）に低い骨量減少を有することを示す。†は、群がＡＳ２−ＬＡ１群よりも有意に（Ｐ＜０．００１）に高い骨量減少を有することを示す。
【図４】歯周炎モデルにおける免疫感作したマウスの血清抗体サブクラス応答を示す図である。組換えタンパク質ＫｓＡ１、ＫＬＡ１、ＫＡＳ１−ＫｓＡ１及びＫＡＳ２−ＫＬＡ１並びにホルマリンで死滅させたポルフィロモナス・ジンジバリス株Ｗ５０で免疫感作したマウス由来の血清；Ａ（経口接種前）及びＢ（経口接種後）を、吸着抗原としてホルマリンで死滅させたポルフィロモナス・ジンジバリス株Ｗ５０を用いたＥＬＩＳＡで使用した。抗体応答ＩｇＧ（黒色棒グラフ）ＩｇＧ１（灰色棒グラフ）、ＩｇＧ２ａ（白色棒グラフ）、ＩｇＧ２ｂ（横縞棒グラフ）、ＩｇＧ３（斜め縞棒グラフ）は、得られたＥＬＩＳＡ力価（ｌｏｇ２）−バックグラウンドレベルとして表わされ、力価はそれぞれ、３つの値の平均±標準偏差を表す。
【図５】ＫＡＳ２ペプチド配列４３３〜４６８を表す重複ペプチドに対するペプチド特異的な抗体反応性のＰＥＰＳＣＡＮ分析を示す図である。（Ａ）ＫＡＳ１−ＫｓＡ１（白色棒グラフ）、ＫＡＳ２−ＫＬＡ１（黒色棒グラフ）の抗血清でプローブしたＫＡＳ２重複ペプチド（オフセット１、オーバーラップ７）。（Ｂ）ＫＡＳ２−ＤＴ複合体抗血清でプローブしたＫＡＳ２重複ペプチド（オフセット、オーバーラップ７）。棒グラフはそれぞれ、抗体反応性を示す（４１５ｎｍでの光学密度［ＯＤ］）。
【図６】キメラＡＳ２−ＬＡ１は、ポルフィロモナス・ジンジバリス全細胞及びＲｇｐＡ−Ｋｇｐ複合体を認識する非近交系マウスにおける抗体応答を誘導することを示す図である。ＣＤ１非近交系マウスを、キメラＡＳ２−ＬＡ１（５０ｍｇ／マウス）で免疫感作して、収集した血清を、吸着抗原としてＡＳ２−ＬＡ１（Ａ）、ホルマリンで死滅させたポルフィロモナス・ジンジバリス株Ｗ５０（Ｂ）及びＲｇｐＡ−Ｋｇｐ複合体（Ｃ）を用いたＥＬＩＳＡで使用した。この図では、ＫＡＳ２−ＫＬＡ１はＡＳ２−ＬＡ１と示される。各抗原に対する各免疫グロブリンアイソタイプに関する力価が決定され、データは、得られたＥＬＩＳＡ力価（‘０００）−２×バックグラウンドレベルとして表わされ、力価はそれぞれ、３つの値の平均±標準偏差を表す。
【図７】Ｋｇｐプロテイナーゼのタンパク質モデルを示す図である。ＫＡＳ２［Ａｓｎ４３３〜Ｌｙｓ４６８］（Ａ）、ＫＡＳ４［Ａｓｐ３８８〜Ｖａｌ３９５］（Ｂ）、ＫＡＳ５［Ａｓｎ５１０〜Ａｓｐ５１６］（Ｃ）及びＫＡＳ６［Ｉｌｅ５７０〜Ｔｙｒ５８０］（Ｄ）。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
これより、本発明の或る特定の実施形態に関して、詳細に言及する。本発明が実施形態と併せて記載されるが、本発明はそれらの実施形態に限定されるべきではないことが理解されよう。対比して、本発明は、特許請求の範囲によって規定されるような本発明の範囲内に包含され得る全ての代替物、変更物及び均等物を包含すると意図される。
【００３４】
当業者は、本発明の実施において使用することができる本明細書に記載されるものに類似するか、又はそれらと同等の多くの方法及び材料を認識する。本発明は、記載される方法及び材料に限定されることはない。
【００３５】
本明細書中で開示及び規定される本発明は、明細書又は図面から言及されるか、又はそれらから明らかである個々の特徴の２つ以上の全ての代替的な組合せに及ぶことが理解されよう。これらの種々の組合せは全て、本発明の様々な代替的な態様を構成する。
【００３６】
本明細書中で使用する場合、文脈上他の意味に解すべき場合を除いて、「を含む」という用語及びこの用語の変化形（variations of the term, such as "comprising", "comprise" and "comprised"）は、更なる添加剤、構成成分、整数又は工程を排除するとは意図されない。
【００３７】
本発明者らは、感染に対する応答の改善、特に抗体応答の改善は、組織において養子免疫伝達を提供する前に、又は組織において免疫応答を誘起する際に、実質的に全ての炎症性刺激を口腔組織から除去することによって得ることができることを見出した。この知見は、本発明が口腔組織における疾患の防止及び／又は処置、並びに拡大解釈して微生物病原体による口腔組織の感染の結果として他の解剖学的区画に生じる疾患の防止及び／又は処置を提供する場合に特に有用である。
【００３８】
したがって、或る特定の実施形態では、被験体における疾患若しくは状態（上記疾患若しくは状態は、被験体の口腔組織中の微生物病原体の存在に関連付けられるものである）の発生率又は重篤性を低減させる方法が提供され、上記方法は、
被験体を処置し、それにより実質的に全ての微生物又はそれらの断片を上記被験体の口腔組織から除去するための条件を提供することと、その後、
上記被験体において抗体（上記抗体は、口腔組織中でのその存在が疾患又は状態と関連付けられる微生物病原体に対して上記被験体を防御するためのものである）を供給することと
を含み、それにより被験体における疾患若しくは状態の発生率又は重篤性を低減させる。
【００３９】
一実施形態では、抗体は、上記被験体へ免疫原（上記免疫原は、微生物病原体に対して上記被験体を防御するためのものである）を投与することによって、上記被験体中で供給される。
【００４０】
一実施形態では、被験体を処置して、それにより実質的に全ての微生物及びそれらの断片を上記被験体の口腔組織から除去するための条件を提供するための抗菌組成物及び免疫原は、相乗的に有効な量で供給される。
【００４１】
通常、本明細書中で言及される被験体は、動物、特に哺乳動物である。一実施形態では、哺乳動物はヒトである。或る特定の実施形態では、哺乳動物は、家畜又は飼育動物であり得る。家畜又は飼育動物の例としては、ウマ、ヤギ、ブタ及びウシ及びヒツジのような家畜類が挙げられる。或る特定の実施形態では、動物は、イヌ、ネコ、ウサギ又はモルモットのようなペットである。
【００４２】
１．定義
「実質的に全ての微生物及びそれらの断片を口腔組織から除去すること」という語句は、組織から炎症性刺激を激減させるのに十分な量の微生物又はそれらの断片若しくは代謝産物が組織から激減される状態を提供し、それにより上記組織における炎症の１つ又は複数の症状を、実質的に低減させるか、又は最低限に抑えることを指す。これは、具体的には関連する被験体が、慢性感染に起因する組織の慢性炎症を有する場合である。概して、組織の炎症を最低限に抑えることに焦点が向けられる。したがって、幾つかの微生物、それらの断片及び代謝産物は、関連する処置工程後に残存する可能性があることが理解されよう。
【００４３】
個体が炎症を起こした組織を有しない他の実施形態では、「実質的に全ての微生物及びそれらの断片を口腔組織から除去すること」という語句は、炎症を引き起こすであろう量への微生物、それらの断片及び代謝産物の蓄積を実質的に防止する状態を提供することを指す。これは、具体的には処置のための被験体が正常であるか、又はそうでなければ疾患若しくは状態に関して無症状である場合である。外科的介入又は歯科的介入が微生物を除去して、炎症を引き起こすであろう量の微生物の蓄積を実質的に防止する状態が提供されることを確実にすることが目的である場合にも、同様のことが当てはまる。炎症を引き起こし得る量の微生物の蓄積を防止することに焦点が置かれるようなこれらの実施形態では、幾つかの微生物、それらに由来する断片又は代謝産物が、関連する処置工程後に蓄積する場合があることが理解されよう。
【００４４】
「疾患又は状態の発生率を低減させること」という語句は概して、、被験体（正常な個体又無症状の個体である被験体、又は疾患若しくは状態の初期形態を有する被験体（subject））が疾患若しくは状態の完全活性形態へ進行する可能性を最低限に抑えることを指す。或る特定の実施形態では、この語句は、所定の被験体が疾患若しくは状態の完全活性形態へ進行するのを防止することを指す。
【００４５】
「疾患若しくは状態の重篤性を低減させること」という語句は概して、疾患若しくは状態の１つ又は複数の症状又は徴候を最低限に抑えることを指す。或る特定の実施形態では、この語句は、疾患若しくは状態を有する個体を処置することを指す。
【００４６】
「免疫原」は概して、抗原に対する免疫応答、好ましくは体液性応答又は抗体応答、例えばＴｈ２応答を誘起又は誘発することが可能である分子を指す。免疫原の例としては、ペプチド及び関連タンパク質が挙げられる。
【００４７】
「相乗的に有効な量」という語句は概して、それぞれが単独で使用される場合に組成物又は免疫原により達成され得る効果よりも大きい治療効果又は防止効果又は防御効果を提供する抗菌組成物及び免疫原の量を指す。一実施形態では、抗菌組成物及び免疫原の相乗的に有効な量は、上記組成物と免疫原との間の新規の実用的な相互関係を支持し、それにより上記免疫原の防御又は治療効果は、免疫原単独が炎症を起こした組織へ適用される場合に達成され得るよりもはるかに大きい。通常、微生物組成物及び免疫原の相乗的に有効な量は、免疫原が単独で使用される場合に実現され得るよりも高い力価及び／又は微生物病原体に対するより高い親和性抗体応答を提供する。
【００４８】
「治療上有効な量」という語句は概して、（ｉ）特定の疾患、状態若しくは障害を処置するか、（ｉｉ）特定の疾患、状態若しくは障害の１つ又は複数の症状を減衰させるか、改善させるか、若しくは排除するか、又は（ｉｉｉ）本明細書中に記載される特定の疾患、状態若しくは障害の１つ又は複数の症状の発症を遅延させる本発明の化合物の量を指す。
【００４９】
「処置する」又は「処置」という単語は、望ましくない生理学的変化又は障害を減速させる（低下させる）ことが目的である治療的処置である。本発明の目的では、有益な又は所望の臨床結果として、検出可能であるか又は検出不可能であるかに関係なく、症状の改善、疾患の程度の減少、疾患の状態の安定化（すなわち、悪化しないこと）、疾患進行の遅延又は減速、疾患状態の改善又は緩和、及び鎮静（部分的又は全体的に関係なく）が挙げられるが、これらに限定されない。「処置」はまた、処置を受けない場合に予測される生存と比較した場合に延命を意味し得る。処置は、必ずしも感染の完全なクリアランスをもたらすことができるとは限らないが、感染の合併症及び副作用、並びに感染の進行を低減させることができるか、又は最低限に抑えることができる。処置の成否は、個体の身体検査、細胞病理学的、血清学的なＤＮＡ又はｍＲＮＡの検出技法によってモニタリングすることができる。
【００５０】
「防止する」又は「防止」という単語は概して、所定の感染関連合併症を有しない個体を、その合併症へ進行することから守る若しくはその合併症へ進行するのを防ぐための予防的又は防止的手段を指す。防止が必要とされる個体は、感染を有する者を含む。
【００５１】
「薬学的に許容される」という語句は、物質又は組成物が、配合物を含む他の成分、及び／又はそれらで処置される哺乳動物と、化学的に及び／又は毒物学的に適合性でなくてはならないことを示す。
【００５２】
「添付文書」という用語は、治療用製品の市販パッケージに慣例的に含まれる、かかる治療用製品の使用に関する効能、用法、投与量、投薬、禁忌及び／又は警告に関する情報を含む説明書を指す。
【００５３】
Ｔｈ１応答は概して、インターフェロンガンマ及びＴＮＦのようなサイトカインを含む応答を指す。
【００５４】
Ｔｈ２応答は概して、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６、インターロイキン−１０、インターロイキン−１３等のようなサイトカインを含む応答を指す。
【００５５】
２．処置方法
本発明の方法は、上記疾患又は状態に関して無症状である被験体を含む広範囲の被験体に適用可能である。これらの個体は、口腔組織又は他の組織において疾患症状を有しなくてもよい。具体的には、これらの個体は、粘膜組織又は他の口腔組織の炎症を呈さなくてもよい。一実施形態では、これらの個体は、ランダムに選択した被験体のコホートとの関連で、口腔中の微生物病原体の正常な相対存在量を有し得る。
【００５６】
他の実施形態では、被験体では、口腔組織若しくは他の解剖学的区画の疾患又は状態の亜臨床的又は臨床的な症状が現れる。
【００５７】
上記疾患又は状態の症状は、上記被験体の口腔組織中が現れ得る。血液から損傷組織への血漿及び白血球の移動の増加を含む急性炎症の特質が存在し得る。発赤（赤み）、熱（熱の増加）、腫瘍（膨潤）、痛み（疼痛）及び機能喪失（機能消失）を含む歯肉の急性感染の臨床的徴候もまた存在し得る。慢性炎症は、白血球細胞（単球、マクロファージ、リンパ球、血漿細胞）浸潤を特徴とし得る。組織欠損及び骨量減少が観察され得る。炎症の例としては、口唇炎、歯肉炎、舌炎及び口内炎が挙げられる。
【００５８】
一実施形態では、被験体は、炎症を起こした粘膜組織又は他の口腔組織を有し得る。例えば、被験体は、口腔組織の急性炎症を呈し得る。これらの被験体の例としては、創面切除、歯石除去及び根面平滑化を含む歯科的手術又は口腔手術に付された被験体が挙げられる。
【００５９】
更なる実施形態では、被験体は、口腔組織の慢性炎症を呈し得る。一例では、被験体は歯槽骨への歯のコラーゲン接着の進行性減少に起因して歯肉炎、歯槽骨の吸収、及び最終的には歯を失うことを呈し得る。粘膜組織又は関連の口腔組織の他の病巣の可能性がある。
【００６０】
一実施形態では、疾患又は状態は、口腔組織の疾患又は状態である。慢性歯周炎は、特に重要な例である。他には、猩紅熱、アフタ性口内炎、化膿性肉芽腫、ジフテリア、結核、梅毒、放線菌症、カンジダ症、ヘルペス口内炎で見られるような口腔粘膜に対する損傷を特徴とする疾患及び状態が挙げられる。
【００６１】
疾患又は状態は、器官又は系（例えば、心血管系）のような口腔組織以外の組織の疾患又は状態であってもよいことが理解されよう。一実施形態では、疾患又は状態は、心血管疾患である。
【００６２】
本発明は、広範な微生物病原体、特に口腔の組織に感染するものに適用可能である。一実施形態では、病原体は、細菌、ウイルス及び真菌からなる群から選択される。
【００６３】
特に好ましい細菌は、ポルフィロモナス・ジンジバリス、トレポネーマ・デンチコラ（Treponema denticola）、タンネレラ・フォーサイシア（Tannerella forsythia）からなる群から選択される。
【００６４】
【表１】
0005977677.tif 000002
0005977677.tif 000003
【００６５】
一実施形態では、抗菌剤を形成する組成物が被験体を投与して、それにより実質的に全ての微生物又はそれらの断片を上記被験体の口腔組織から除去する。例を以下で更に論述する。
【００６６】
一実施形態では、例えば免疫原を被験体へ投与することによって被験体において抗体を供給することは、機械的な創面切除による感染部位の処置及び／又は本明細書中で規定されるような抗菌剤の１つ又は複数の適用の１週間〜２週間後に行われる。
【００６７】
微生物、それらの断片若しくは代謝産物のレベル又は存在は、微生物からタンパク質若しくはその断片を検出又は測定することによって決定することができる。
【００６８】
別の実施形態では、口腔組織における微生物、それらの断片若しくは代謝産物のレベル又は存在は、個体からサンプルを採取すること、及びサンプル中の所定のタンパク質の存在又は所定のタンパク質の発現のレベルを決定することによって決定することができる。タンパク質の存在又はレベルは、任意数のアッセイによって検出することができる。例としては、イムノアッセイ、クロマトグラフィ及び質量分析が挙げられる。特に好ましいイムノアッセイの一例はＦＡＣＳである。
【００６９】
サンプル中の標的タンパク質の存在を検出するのに使用することができる各種アッセイとしては、下記が挙げられる： 
【００７０】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）：この方法は、標的タンパク質、そのペプチド又は断片を含有するサンプル（例えば唾液又は口腔組織）のマイクロタイタープレートのウェルのような表面への固定化を含む。酵素に連結される標的タンパク質特異的抗体を適用して、標的タンパク質、そのペプチド又は断片と結合させる。次に、抗体の存在を検出して、抗体へ連結させた酵素を用いた比色反応によって定量化する。この方法で一般的に用いられる酵素としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼ及びアルカリホスファターゼが挙げられる。十分較正され、かつ線形の応答範囲内である場合、サンプル中に存在する標的タンパク質、そのペプチド又は断片の量は、生じる色の量に比例する。標的タンパク質、そのペプチド又は断片の標準は、定量的精度を改善するのに一般的に用いられる。
【００７１】
ウェスタンブロット法：この方法は、アクリルアミドゲルを用いた、標的タンパク質、そのペプチド又は断片と他のタンパク質との分離、続くタンパク質、それらのペプチド又は断片の膜（例えば、ナイロン又はＰＶＤＦ）への転写を含む。次に、標的タンパク質、そのペプチド又は断片の存在は、標的タンパク質、そのペプチド又は断片に特異的な抗体によって検出され、それらの抗体は、抗体結合試薬によって検出される。抗体結合試薬は、例えばプロテインＡ又は他の抗体であり得る。抗体結合試薬は、上述するように、放射性標識してもよく、又は酵素連結してもよい。検出は、オートラジオグラフィ、比色反応又は化学発光によるものであり得る。この方法は、標的タンパク質、そのペプチド又は断片の定量化、及び電気泳動中のアクリルアミドゲルにおける移動距離を示す膜上での相対位置によるその同一性の決定の両方を可能にする。
【００７２】
ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）：一様式では、この方法は、アガロースビーズのような沈殿可能な担体上に固定された特異的抗体及び放射標識された抗体結合タンパク質（例えば、Ｉ１２５で標識されたプロテインＡ）による所望の標的タンパク質、そのペプチド又は断片の沈殿を含む。沈殿したペレット中の計測数は標的タンパク質、そのペプチド又は断片の量に比例する。
【００７３】
ＲＩＡの別の様式では、標識された標的タンパク質、それらのペプチド又は断片、及び標識されていない抗体結合タンパク質が用いられる。未知量の標的タンパク質、そのペプチド又は断片を含有するサンプルを様々な量で添加する。標識された標的タンパク質、そのペプチド又は断片からの沈殿された計測数の減少が、添加したサンプル中の標的タンパク質、そのペプチド又は断片の量に比例する。
【００７４】
蛍光標示式細胞選別（ＦＡＣＳ）：この方法は、標的タンパク質、そのペプチド又は断片に特異的な抗体による細胞におけるｉｎ  ｓｉｔｕでの標的タンパク質、そのペプチド又は断片の検出を含む。標的タンパク質、そのペプチド又は断片に特異的な抗体は、フルオロフォアに連結される。検出は、各細胞から放出される光の波長を、細胞が光線を通過する際に読み取る細胞選別機を用いるものである。
【００７５】
免疫組織化学分析：この方法は、標的タンパク質、そのペプチド又は断片に特異的な抗体によって、固定化された細胞におけるｉｎ  ｓｉｔｕでの標的タンパク質、そのペプチド又は断片の検出を含む。標的タンパク質、そのペプチド又は断片に特異的な抗体は、酵素連結してもよく、又はフルオロフォアに連結してもよい。検出は、顕微鏡及び主観的評価又は自動評価によるものである。酵素結合した抗体を用いる場合、比色反応が必要とされ得る。免疫組織化学では、多くの場合、例えばヘキマトキシリン又はギムザ染色を使用して細胞核を対比染色することが続くことが理解されよう。
【００７６】
ｉｎ  ｓｉｔｕ活性アッセイ：この方法によれば、発色基質を、活性な酵素を含有する細胞上へ適用し、この酵素は、基質が光又は蛍光顕微鏡により視認される発色生成物を生成するように分解される反応を触媒する。
【００７７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性アッセイ：これらの方法では、特定の酵素の活性が、細胞から抽出されたタンパク質混合物中で測定される。活性は、比色方法を良好に使用して分光光度計で測定することができ、又は非変性アクリルアミドゲル（すなわち、活性ゲル）中で測定することができる。電気泳動後に、ゲルを、基質及び比色試薬を含有する溶液中に浸す。得られた染色バンドは、所定のタンパク質の酵素活性に対応する。十分較正され、かつ線形の応答範囲内である場合、サンプル中に存在する酵素の量は、生じる色の量に比例する。酵素標準物質は、定量的精度を改善するのに一般的に用いられる。
【００７８】
さらに、細菌ＤＮＡの量は、口腔組織中の微生物の存在又はレベルの指標として定量的ＰＣＲにより決定することができる。
【００７９】
ポリフィロモナス・ジンジバリス、トレポネーマ・デンチコラ、タンネレラ・フォーサイシア由来のタンパク質若しくはＤＮＡの存在又はレベルが決定されてもよく、実質的に全ての微生物又はその断片が被験体の口腔組織から除去されたことを示し得る。
【００８０】
抗菌剤及び／又は免疫原は、全身的に、又は口腔組織に直接、特に口腔粘膜に直接投与することができる。
【００８１】
一実施形態では、被験体の処置は、実質的に全ての微生物又はその断片を上記被験体の口腔組織から除去して、それにより被験体の口腔組織における炎症を最低限に抑える。別の実施形態では、被験体の処置は、実質的に全ての微生物又はその断片を上記被験体の口腔組織から除去して、それにより被験体の口腔組織の免疫応答を最低限に抑える。
【００８２】
免疫原は、実質的に全ての微生物及びその断片を上記被験体の口腔組織から除去するための上記被験体の処置後に上記被験者に投与することができる。
【００８３】
概して、本発明によれば、関連の口腔組織は、炎症を起こしていないか、又は仮に炎症が存在した場合にも、免疫感作時に無症状であるか、又は亜臨床である。
【００８４】
免疫感作後、被験体は、主として体液性応答であるＴｈ２応答の優性を示し、個体は、検出可能なレベルの防御抗体を有する。
【００８５】
３．組成物
或る特定の実施形態では、
実質的に全ての微生物及びその断片を上記被験体の口腔組織から除去するための抗菌剤と、
微生物病原体（口腔組織中でのその存在が疾患又は状態と関連付けられる）に対して上記被験体を免疫感作するための免疫原と
を含む組成物が提供され、上記組成物は、上述の方法で使用されることが可能である。
【００８６】
３．（ａ）抗菌剤
抗菌剤は、投与による効果が炎症性刺激を激減させることである任意の作用物質であり得る。単独で又は組み合わせて使用されるこれらの作用物質は、炎症、歯周病原体の再発、例えばバイオフィルム形成及び／又は歯周骨吸収の短期的な阻害に有用性がある。これらの作用物質は、単独で又は組み合わせて、例えば、歯周病原体に対するワクチン接種のための患者の免疫系を調製する外科的介入を受けることができる歯周部位で徐放性の歯周ゲル配合物において局所的に適用させることができる。
【００８７】
理論又は作用機序によって束縛されるものではないが、例えば歯周ゲル配合物における、感染した歯周部位の機械的創面切除及び洗浄の時点での本明細書中で規定されるような抗菌剤の適用は、免疫系を調製して、Ｔｈ２に偏った応答の発生を可能にするのを助けると考えられる。このＴｈ２に偏った応答は、防御抗体の産生及び歯周病原体の再発の防止及び疾患進行の防止をもたらす。
【００８８】
これに関連して、下記のものが抗菌剤であり得る：抗生物質、免疫抑制薬及び消毒薬。或る特定の実施形態では、上記抗菌剤は抗炎症剤であり得る。抗炎症剤としては、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）が挙げられる。ＮＳＡＩＤの例としては、シクロオキシゲナーゼを阻害する化合物が挙げられる。ＮＳＡＩＤの具体例としては、アスピリン、イブプロフェン及びナプロキセンが挙げられる。抗炎症剤の他の例としては、ＰＡＲ−２のアンタゴニストが挙げられ、これにはＰＡＲ−２と結合する抗体及び抗体断片、ＰＡＲ−２に結合し、かつその活性を阻害する他のポリペプチド、ＰＡＲ−２活性又は発現を阻害する他の化合物（ＰＡＲ−２コード核酸と相互作用する小有機化合物及び阻害性核酸を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。ＰＡＲ−２と結合すること及び／又はＰＡＲ−２を介したシグナル伝達から、内因性リガンドを阻止又は置換し得る例示的なアンタゴニストとしては、国際公開第２００４／００２４１８号及び国際公開第２００６／０２３８４４号に記載されるもの（例えば、アミノ酸配列ＬＩＧＫ又はＬＩＧＫＶを有するペプチド）が挙げられる。ＰＡＲ−２に結合して、かつ係留リガンドとして作用するＰＡＲ−２の領域のタンパク質分解性切断を防止するアンタゴニストは、国際公開第２００７／０９２６４０号に例示される。
【００８９】
ＰＡＲ−２の発現を阻害、低減又は阻止するアンタゴニストとしては、リボザイム、三重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）、ＲＮアーゼＰによる切断を促進する外部ガイド配列（ＥＧＳ）、ＰＡＲ−２をコードする核酸に特異的なペプチド核酸、アンチセンスＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ及びミクロＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない阻害性核酸が挙げられる。
【００９０】
ＰＡＲ−２は、正常な状況下でＰＡＲ−２を切断して、その活性化をもたらすプロテアーゼの活性を拮抗する「間接的アンタゴニスト」により間接的に阻害することができる。ＰＡＲ−２を切断することができるプロテアーゼとしては、ジンジパイン、トリプシン、トリプターゼ及び好中球プロテイナーゼ−３が挙げられる。本発明の方法で有用であるか、又は本発明の組成物で使用することができる間接的アンタゴニストの例としては、国際公開第９３／１４７７９号で開示されるトリプシン阻害剤及び国際公開第０２／４７７６２号で開示されるトリプターゼ阻害剤が挙げられる。
【００９１】
１つの特に好ましい実施形態では、抗菌剤は抗生物質である。例としては、以下の表Ｂで示されるようなマクロライド、テトラサイクリン、ペニシリン、フマル酸還元酵素阻害剤及び抗菌ペプチドからなる群から選択される抗生物質が挙げられる。
【００９２】
【表２】
0005977677.tif 000004
0005977677.tif 000005
【００９３】
一実施形態では、抗菌剤は、フマル酸還元酵酵素の阻害剤の１つ又は複数から選択される。適切な阻害剤としては、デクルシン、ベルチシピロン、ペシラミノール、ストレプトミセス種由来の５−アルケニル−３，３（２Ｈ）−フラノン、ナフレジン、メサコン酸、ロテノンを含むがこれらに限定されない天然生成物、並びにそれらの天然類縁体、半合成類縁体及び合成類縁体が挙げられる。別の態様では、阻害剤は、２−置換４，６−ジニトロフェノール、メルカプトピリジンＮ−オキシド、Ｌ−０９２２０１（Merck Sharpe and Dohme）、ニトロイミダゾール（例えば、フェキシンダゾール、メガゾール、ベンズニダゾール、ＭＫ−４３６、Ｌ−６３４５４９、ミソニダゾール）、又はベンズイミダゾール（例えば、アルベンダゾール、カムベンダゾール、メベンダゾール、オクスフェンダゾール、パレベンダゾール及びチアベンダゾール）、又はオキサンテル若しくはモランテルを含むがこれらに限定されない合成化合物であり得る。好ましい阻害剤は、オキサンテル、モランテル又はチアベンダゾールである。特に好ましい阻害剤はオキサンテルである。
【００９４】
阻害剤の選択は、阻害剤が臨床背景における使用に適しているかどうかを決定する臨床因子の数に依存することを当業者は理解されよう。
【００９５】
抗生物質は、微生物病原体にとって直接的に細胞障害性であり得る。他の実施形態では、抗生物質は間接的に細胞障害性であり、例えば、抗生物質は、微生物バイオフィルム生産又は幾つかの他の代謝の阻害剤であり得る。
【００９６】
一実施形態では、抗生物質は、抗菌ペプチドである。例を以下の表Ｃに示す。
【００９７】
【表３】
0005977677.tif 000006
【００９８】
１つの特に好ましい実施形態では、抗菌剤は、微生物バイオフィルム生産の阻害剤である。他の好ましい作用物質はフマル酸還元酵素阻害剤である。
【００９９】
或る特定の実施形態では、抗菌剤は抗体であり得る。抗体はポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であり得る。使用され得る例示的なモノクローナル抗体は、歯周病原体の分子（例えば、プロテアーゼ及びアドヘシン）又は炎症を抑えるための宿主指向性を有する［例えば、単独で又は組み合わせて、腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子（ｕ−ＰＡ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）及びＲＡＮＫリガンド（ＲＡＮＫＬ）に対する抗体］指向性を有する。好ましくは、抗体は、種々の病原体及び宿主炎症性媒介物質に対して誘導されるモノクローナル抗体の混合物である。ポリフィロモナス・ジンジバリスを標的とする使用するのに好ましいモノクローナル抗体は、Ｋｇｐプロテイナーゼ及びＲｇｐＡプロテイナーゼの活性部位に対して誘導されるもの、並びにＫｇｐプロテイナーゼ及びＲｇｐＡプロテイナーゼのＡ１アドヘシンにおける結合モチーフに対して誘導されるものである。
【０１００】
一実施形態では、抗菌剤は抗体疑似体である。抗体疑似体は、免疫グロブリンドメインの三次構造を有してもよく、又は有しなくてもよい（例えば、Dimitrov, 2009、ＭＡｂｓ  １  ２６〜２８）。抗体疑似体は、特定の分子に結合するための特異性を有し得る。抗体疑似体の一例は、アンチカリンとして知られるヒトリポカインに関連する分子のファミリーである（例えば、Skerra, 2007 Current Opinions in Biotechnology, 18 295-304）。好ましくは、アンチカリンは、ポリフィロモナス・ジンジバリスに由来するタンパク質に対して誘導されるか、又はポリフィロモナス・ジンジバリスに由来するタンパク質に特異的に結合する。好ましい実施形態では、アンチカリンは、Ｌｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼ又はＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼ（例えば、Ｋｇｐプロテイナーゼ及びＲｇｐＡプロテイナーゼ）の活性部位に対して誘導されるか、又は該活性部位に特異的に結合する。アンチカリンは、モノクローナル抗体の代わりに使用することができるが、約１８０アミノ酸のサイズ及び約２０ｋＤａの質量よりも８倍小さい。アンチカリンは、抗体よりも良好な組織透過性を有し、最大７０℃の温度で安定である。抗体と異なり、アンチカリンは、大腸菌のような細菌細胞中で大量に生産することができる。
【０１０１】
或る特定の実施形態では、抗菌剤はまた、細菌バイオフィルムの形成若しくは発達を阻害、低減又は防止することができる抗バイオフィルム剤であり得る。抗バイオフィルム剤は、バイオフィルム崩壊活性を有するものとし、バイオフィルム分散を引き起こすことができる。「バイオフィルム崩壊活性」は本明細書中では、バイオフィルムからの細菌の放出を引き起こす組成物又は作用物質の特性を説明するのに使用される。組成物又は作用物質はまた、バイオフィルム中での細菌の生存度を低減させ得るが、必ずしもそうとは限らない。バイオフィルムからの細菌の「放出」は、浮遊状態をとるバイオフィルムからの細菌の数を増加させること、それによりバイオフィルムからの細菌の殺菌剤への感受性を増加させることを含む。殺菌剤は、細菌の生存度を直接低減させる組成物、作用物質、化合物、ペプチド疑似体又はペプチドの特性を記載するのに使用される。
【０１０２】
したがって、理論又は作用機序によって束縛されるものではないが、バイオフィルム崩壊活性を示す組成物又は作用物質は、必ずしもバイオフィルム中での細菌の生存度を低減させるわけではなく、代わりに細菌細胞をバイオフィルムから放出させるか、又は放出されるよう誘導すると考えられる。或る特定の実施形態では、これらの組成物又は作用物質は、バイオフィルム中のより多くの細菌がプランクトン状態をとり得るか、又はとるように誘導し得る。他の実施形態では、組成物又は作用物質は、バイオフィルムの形成を阻害又は低減することができる。或る特定の実施形態では、組成物又は作用物質は、バイオフィルム成長を阻害又は低減することができる。他の実施形態では、本発明の抗菌剤は、被験体における疾患若しくは状態を開始又は促進する、バイオフィルムが示す任意の特徴を阻害又は低減することができる。或る特定の実施形態では、ペプチド又は組成物は、バイオフィルム中の細菌を死滅させずに、被験体における疾患若しくは状態を開始又は促進する、バイオフィルムが示す任意の特徴を阻害又は低減することができる。
【０１０３】
或る特定の実施形態では、抗菌組成物又は抗菌剤は、バイオフィルムの測定可能なパラメータを防止、阻害又は低減する能力を指す。バイオフィルムの測定可能なパラメータの非限定的な例は、バイオフィルムの総バイオマス、平均厚、表面対バイオボリューム（biovolume）比、粗度係数又は細菌組成及びそれらの生存度であり得る。
【０１０４】
３．（ｂ）免疫原
免疫原は、関連する微生物病原体に対する免疫応答、好ましくは防御抗体応答を誘起するように選択される。
【０１０５】
一実施形態では、免疫原は、ペプチド、例えば組換えペプチドの形態で供給される。
【０１０６】
ポルフィロモナス・ジンジバリス感染並びに関連の疾患及び状態に特に関連する一実施形態では、組換えペプチドは、ポルフィロモナス・ジンジバリスに対する免疫応答を誘導するためのキメラタンパク質又は融合タンパク質であってもよく、該タンパク質は、第２のペプチドに直接的に又はリンカーを介して結合される第１のペプチドを含み、
（Ａ）上記第１のペプチドは、
（ｉ）配列番号１で示される配列と同じであるか、若しくはその配列と相同性である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉ）配列番号２で示される配列と同じであるか、若しくはその配列と相同性である配列の一部若しくは全て、
を含み、
（Ｂ）上記第２のペプチドは、
（ｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＬｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼのアドヘシンドメインの配列と同じであるか、若しくはその配列と相同性である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼのアドヘシンドメインの配列と同じであるか、若しくはその配列と相同性である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＨａｇＡアドヘシンドメインの配列と同じであるか、若しくはその配列と相同性である配列の一部若しくは全て
を含む。
【０１０７】
本明細書中で使用する場合、「ペプチド」という用語は、最大約４０個のアミノ酸残基、好ましくは５個〜４０個のアミノ酸残基のアミノ酸配列を指すのに使用される。
【０１０８】
一実施形態では、ポリペプチドは、「第２のペプチド」の代わりに、又は換言すると「第２のペプチド」に代わって使用される。「ポリペプチド」という用語は、少なくとも約４０個のアミノ酸残基のアミノ酸配列を指すのに使用される。
【０１０９】
したがって、別の態様では、ポルフィロモナス・ジンジバリスに対する免疫応答を誘導するためのキメラタンパク質又は融合タンパク質であって、該タンパク質は、ポリペプチドに直接的に又はリンカーを介して結合されるペプチドを含み、ここで、
（Ａ）上記ペプチドは、
（ｉ）配列番号１で示される配列と同じであるか、若しくはその配列と相同性である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉ）配列番号２で示される配列と同じであるか、若しくはその配列と相同性である配列の一部若しくは全て、
を含み、
（Ｂ）上記ポリペプチドは、
（ｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＬｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼのアドヘシンドメインの配列と同じであるか、若しくはその配列と相同性である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼのアドヘシンドメインの配列と同じであるか、若しくはその配列と相同性である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＨａｇＡアドヘシンドメインの配列と同じであるか、若しくはその配列と相同性である配列の一部若しくは全て
を含む、
ポルフィロモナス・ジンジバリスに対する免疫応答を誘導するためのキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【０１１０】
別の態様では、本発明は、
（ｉ）配列番号６４〜配列番号６６のうちの１つで示される配列と同じであるか、又はその配列と相同性である配列、及び
（ｉｉ）配列番号６７又は配列番号６８で示される配列と同じであるか、又はその配列と相同性である配列
からなる群から選択されるポルフィロモナス・ジンジバリスに対する免疫応答を誘導するためのペプチドを提供する。
【０１１１】
ペプチドが配列番号６４〜配列番号６８の配列を有する本発明の態様では、ペプチドは、キメラタンパク質又は融合タンパク質の形態で供給されてもよく、そこでペプチドは、第２のペプチドに直接的に又はリンカーを介して結合される。ある実施形態では、キメラタンパク質又は融合タンパク質の第２のペプチドは、
（ｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＬｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼのアドヘシンドメインの配列と同じであるか、若しくはその配列と相同性である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼのアドヘシンドメインの配列と同じであるか、若しくはその配列と相同性である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＨａｇＡアドヘシンドメインの配列と同じであるか、若しくはその配列と相同性である配列の一部若しくは全て
を含む。
【０１１２】
上述の実施形態では、ポリペプチドは、第２のペプチドの代わりに、又は換言すると第２のペプチドに代わって使用される。したがって、別の態様では、被験体におけるポルフィロモナス・ジンジバリスに対する免疫応答を誘導するためのキメラタンパク質又は融合タンパク質であって、該タンパク質は、ポリペプチドに直接的に又はリンカーを介して結合されるペプチドを含み、ここで、
（Ａ）上記ペプチドは、
（ｉ）配列番号６４〜配列番号６６のうちの１つで示される配列と同じであるか、若しくはその配列と相同性である配列、又は
（ｉｉ）配列番号６７若しくは配列番号６８で示される配列と同じであるか、若しくはその配列と相同性である配列
を含み、
（Ｂ）上記ポリペプチドは、
（ｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＬｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼのアドヘシンドメインの配列と同じであるか、若しくはその配列と相同性である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼのアドヘシンドメインの配列と同じであるか、若しくはその配列と相同性である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＨａｇＡアドヘシンドメインの配列と同じであるか、若しくはその配列と相同性である配列の一部若しくは全て
を含む、被験体におけるポルフィロモナス・ジンジバリスに対する免疫応答を誘導するためのキメラタンパク質又は融合タンパク質が提供される。
【０１１３】
本明細書中で使用する場合、ペプチド又はポリペプチドの「相同体」に対する言及は、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（ここで、アルゴリズムのパラメータは、各々の参照配列の完全長にわたって各々の配列間で最大の適合を付与するように選択される）によって比較が実施される場合、第１の記載されるペプチド又はポリペプチドのアミノ酸配列に対して相同性を共有するか、若しくはそのアミノ酸配列に対して相同性であるか、又はそのアミノ酸配列と同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％、及び更に好ましくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するペプチド又はポリペプチドに対する言及である。配列同一性は、比較される２つの配列のアミノ酸間での正確な適合を指す。かかる相同体は、ポルフィロモナス・ジンジバリスのＬｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼ又はＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼの天然に存在する変異体又は単離体（isolate）に由来し得る。代替的には、かかる相同体は、ポルフィロモナス・ジンジバリスのＬｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼ又はＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼ由来のペプチド又はポリペプチドの「保存的置換」変異体であってもよく、ここで１つ又は複数のアミノ酸残基が、ペプチド又はポリペプチドの全体的な立体構造及び機能を変更させることなく変化しており、アミノ酸を、類似した特性を有するもので置換することを含むが、決してそれに限定されない。類似した特性を有するアミノ酸は当該技術分野で既知である。例えば、交換可能であり得る極性／親水性アミノ酸としては、アスパラギン、グルタミン、セリン、システイン、スレオニン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられ、交換可能であり得る非極性／疎水性アミノ酸としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンが挙げられ、交換可能であり得る酸性アミノ酸としては、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられ、交換可能であり得る塩基性アミノ酸としては、ヒスチジン、リシン及びアルギニンが挙げられる。好ましくは、かかる保存的置換変異体は、２０個未満、より好ましくは１５個未満、更に好ましくは１０個未満、最も好ましくは５個未満のアミノ酸の変化を有する。
【０１１４】
ペプチド結合の切断のための酵素における部位を規定するポルフィロモナス・ジンジバリストリプシン様酵素、特にＬｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼ（Ｋｇｐ）又はＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼ（ＲｇｐＡ）の領域は、本明細書の教示に従って、特に、Ｌｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼに関してポルフィロモナス・ジンジバリスで現れる場合に触媒部位の三次元立体構造を予測するプロセスを実証している、図７及び実施例９に関連して決定することができる。図１０はＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼ三次元立体構造のモデリングのための方法を提供する。
【０１１５】
或る特定の実施形態では、キメラタンパク質若しくは融合タンパク質、又はその第１のペプチド構成成分若しくは第２のペプチド構成成分は、ペプチド疑似体（peptidomimetic）から形成され得る。ペプチド疑似体は、所定のペプチドの１つ又は複数の特徴、例えば立体構造を模倣し、かつアミノ酸残基（その幾つかは、天然に存在しなくてもよい）からなる分子である。
【０１１６】
触媒部位の免疫原性領域を同定して、本発明者らは、体液性応答が惹起され得る様々なペプチド免疫原の配列を決定した。特に、触媒部位に隣接するか、又はそうでなければ触媒部位を規定する「６つの」領域を下記のとおりに規定した：ＫＡＳ１／ＲＡＳ１、ＫＡＳ２／ＲＡＳ２、ＫＡＳ３／ＲＡＳ３、ＫＡＳ４／ＲＡＳ４、ＫＡＳ５／ＲＡＳ５及びＫＡＳ６（表１を参照されたい）。この情報を用いて、本発明者らは、タンパク質配列データベースを調べて、触媒部位に隣接して、したがってポルフィロモナス・ジンジバリス上に見出される免疫原性エピトープを表す領域を形成するアミノ酸配列と相同性を共有するペプチドを決定することが可能であった。これらのペプチドの配列は、下記構造式によって同定される：
【０１１７】
【表４】
0005977677.tif 000007
【０１１８】
本発明者らは、これらのペプチドを含むキメラタンパク質が多数の利用性を有することを見出している。例えば、本明細書中に記載されるように、慢性歯周炎で観察されるような骨量減少の処置又は防止に関して非常に防御的である体液性応答を生じるものもある。ペプチドはまた、個体の血清中での特異性を検出又はモニタリングすることができる診断アッセイに使用することができ、それにより個体が感染されているか、又は感染されていないかどうか、感染しているならば、処置が必要とされるかどうか、又は提供される場合にはそれらが有効であったかどうかを示す。
【０１１９】
Ｌｙｓ又はＡｒｇのＣ末端に位置するペプチド結合の切断のための酵素における部位を規定するポルフィロモナス・ジンジバリストリプシン様酵素の領域は、Ｌｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼ又はＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼの完全配列を含まないことが理解されよう。
【０１２０】
本明細書中で使用する場合、「異種タンパク質」又は「キメラタンパク質又は融合タンパク質」という用語は、種々の供給源に由来するアミノ酸の機能性ユニット、ドメイン、配列又は領域で構成されるか、又は同じ供給源に由来して、ユニット、ドメイン、配列若しくは領域が由来するか、又は関連する分子中で観察されるものとは区別される機構を有するように構築されたタンパク質を指すのに使用される。本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質の一般的な特徴は、それらが、ペプチド結合の切断のための触媒部位を規定するポルフィロモナス・ジンジバリストリプシン様酵素の配列と同じであるか、又はそれと相同性を共有するアミノ酸配列を有する少なくとも１つのペプチドを含有することである。
【０１２１】
第１のペプチドがＫｇｐ［４３２〜４６８］領域由来のペプチドを含む好ましい実施形態では、第１のペプチドは、好ましくは（ｉ）ＶＳＦＡＮＹＴ及びＶＧＦＡＮＹＴから選択される配列、より好ましくはＧＶＳＦＡＮＹＴ、ＧＶＧＦＡＮＹＴ、ＶＳＦＡＮＹＴＡ及びＶＧＦＡＮＹＴＡから選択される配列を含むペプチド、又は（ｉｉ）ＥＴＡＷＡＤ、ＥＴＳＷＡＤ、ＴＡＷＡＤＰ及びＴＳＷＡＤＰから選択される配列、好ましくはＳＥＴＡＷＡＤ、ＳＥＴＳＷＡＤ、ＥＴＡＷＡＤＰ、ＥＴＳＷＡＤＰ、ＴＡＷＡＤＰＬ及びＴＳＷＡＤＰＬから選択される配列、より好ましくはＧＳＥＴＡＷＡＤ、ＧＳＥＴＳＷＡＤ、ＳＥＴＡＷＡＤＰ、ＳＥＴＳＷＡＤＰ、ＥＴＡＷＡＤＰＬ、ＥＴＳＷＡＤＰＬ、ＴＡＷＡＤＰＬＬ及びＴＳＷＡＤＰＬＬから選択される配列を含むペプチドである。より好ましくは、このペプチドは、第１表に示されるＫＡＳ１［４３２〜４５４］ペプチド、ＫＡＳ２［４３３〜４６８］ペプチド及びＫＡＳ３［４３６〜４５５］ペプチドから選択される。代替的には、第１のペプチドは、国際出願ＰＣＴ／ＡＵ９８／００３１１号（国際公開第９８／０４９１９２号）に開示されるＰＡＳ１（Ｋ４８）としても知られるＰＡＳ１Ｋ［４３２〜４５３］ペプチドであってもよい。これらのペプチドに対応する配列識別子を第３表に示す。
【０１２２】
同様に、第１のペプチドがＲｇｐＡ［４２６〜４６２］領域由来のペプチドを含む別の好ましい実施形態では、このペプチドは、第１表に示されるＲＡＳ１［４２６〜４４８］ペプチド、ＲＡＳ２［４２７〜４６２］ペプチド及びＲＡＳ３［４３０〜４４９］ペプチドから選択されるのが好ましい。代替的には、第１のペプチドは、国際出願ＰＣＴ／ＡＵ９８／００３１１号（国際公開第９８／０４９１９２号）に開示されるＰＡＳ１（Ｒ４５）としても知られるＰＡＳ１Ｒ［４２６〜４４６］ペプチドであってもよい。
【０１２３】
本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質では、第２のペプチドは、Ｌｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼ（Ｋｇｐ）又はＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼ（ＲｇｐＡ）又はＨａｇＡのようなポルフィロモナス・ジンジバリストリプシン様酵素のアドヘシンドメイン由来のペプチドであってもよい（第２表を参照されたい）。これらのドメインは場合によっては、ヘマグルチニンとしても知られる。Ｌｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼでは、好ましいドメインは、第２表で同定されるようなＫＡ１、ＫＡ２、ＫＡ３、ＫＡ４、ＫＡ５である。Ａｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼでは、好ましいドメインは、第２表で同定されるようなＲＡ１、ＲＡ２、ＲＡ３及びＲＡ４である。ＨａｇＡでは、好ましいドメインは、ＨａｇＡ１、ＨａｇＡ１＊及びＨａｇＡ１＊＊である。
【０１２４】
【表５】
0005977677.tif 000008
【０１２５】
キメラタンパク質又は融合タンパク質においてかかるペプチドとともに包含される場合に、ＫＡＳ１、ＫＡＳ２、ＫＡＳ３、ＫＡＳ４、ＫＡＳ５及びＫＡＳ６又はＲＡＳ１、ＲＡＳ２及びＲＡＳ３、ＲＡＳ４及びＲＡＳ５のような本発明のペプチドに対する体液性応答を改善することのほかに、アドヘシンドメインはまた、免疫原性エピトープを含有し、したがって防御免疫原性応答を誘発するための多重特異性が生じる。アドヘシンドメインの免疫原性エピトープが、本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質において供給される場合にポルフィロモナス・ジンジバリストリプシン様酵素のものと近い形態で保持されるという見解は、予測外である。
【０１２６】
本発明のこれらの実施形態では、キメラタンパク質又は融合タンパク質が、ポルフィロモナス・ジンジバリストリプシン様酵素の任意の１つ又は複数のアドヘシンドメインと一緒に、特にＬｙｓ-Ｘ−プロテイナーゼアドヘシンドメイン（ＫＡ１、ＫＡ２、ＫＡ３、ＫＡ４及びＫＡ５）又はＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼアドヘシンドメイン（ＲＡ１、ＲＡ２、ＲＡ３及びＲＡ４）又はＨａｇＡドメイン、ＨａｇＡ１、ＨａｇＡ１＊及びＨａｇＡ１＊＊の任意の１つ又は複数とともに、ＫＡＳ１／ＲＡＳ１、ＫＡＳ２／ＲＡＳ２、ＫＡＳ３／ＲＡＳ３、ＫＡＳ４／ＲＡＳ４、ＫＡＳ５／ＲＡＳ５及びＫＡＳ６／ＲＡＳ６から選択されるペプチドの任意の１つ又は複数を含有し得ることが理解されよう。
【０１２７】
また、アドヘシンドメインが、ポルフィロモナス・ジンジバリストリプシン様酵素で観察されるような完全ドメインである必要はないことが理解されよう。例えば、アドヘシンドメインは、かかるドメインの断片であってもよく、特に好ましい断片は、Ｌｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼＡ１ドメインのＫｓＡ１ドメイン断片及びＫＬＡ１ドメイン断片である（第２表を参照されたい）。ドメインがアドヘシンドメインの断片である場合、ドメインは一般的に、１つ又は複数のアドヘシンドメイン特異的エピトープを含有する。
【０１２８】
アドヘシン関連ペプチドに対応する配列識別子を第３表に示す。
【０１２９】
一実施形態では、第２のペプチド又はポリペプチドは、配列番号６９〜配列番号７９の１つ又は複数、又は配列番号８３〜配列番号８５の１つ又は複数で示される配列を含む。
【０１３０】
本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質は、Ｌｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼのＫｇｐ［４３２〜４６８］領域から選択される１つ又は複数の更なるペプチド、及び／又はＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼのＲｇｐＡ［４２６〜４６２］領域から選択される１つ又は複数の更なるペプチドを包含してもよい。
【０１３１】
本発明の好ましい実施形態では、キメラタンパク質又は融合タンパク質は、ＫＡＳ１、ＫＡＳ２、ＫＡＳ３、ＫＡＳ４、ＫＡＳ５及びＫＡＳ６の１つ若しくは複数、又はＫｓＡ１又はＫＬＡ１と一緒に、ＲＡＳ１、ＲＡＳ２、ＲＡＳ３、ＲＡＳ４及びＲＡＳ５の１つ若しくは複数を含む。
【０１３２】
したがって、或る特定の実施形態では。キメラタンパク質又は融合タンパク質は、少なくとも１つの更なるペプチドを含んでいてもよく、ここで上記更なるペプチドは、
（ｉ）配列番号１で示される配列と同じであるか、若しくはその配列に相同性である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉ）配列番号２で示される配列と同じであるか、若しくはその配列に相同性である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＬｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼのアドヘシンドメインの配列と同じであるか、若しくはその配列に相同性である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｖ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼのアドヘシンドメインの配列と同じであるか、若しくはその配列に相同性である配列の一部若しくは全て、又は
（ｖ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＨａｇＡアドヘシンドメインの配列と同じであるか、若しくはその配列に相同性である配列の一部若しくは全て
を含む。
【０１３３】
本明細書に記載されるようなキメラタンパク質又は融合タンパク質中に含まれ得るドメイン、ユニット、配列又は領域の他の例としては、Ｆｃ結合領域若しくはＦｃ受容体のような受容体若しくはリガンドに結合するためのドメイン、アルブミンのような半減期を改善するためのドメイン、又はキメラタンパク質若しくは融合タンパク質の発現若しくは精製を容易とするためのドメインが挙げられる。
【０１３４】
更に別の態様では、本発明は、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２５及び配列番号２６のうちの１つで示される配列を含むポルフィロモナス・ジンジバリスに対する免疫応答を誘導するためのペプチドを提供する。一実施形態では、ペプチドは、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２５及び配列番号２６のうちの１つに相同性である配列を有する。ペプチドは、５アミノ酸長〜４０アミノ酸長を有し得る。
【０１３５】
更に別の態様では、本発明は、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２５及び配列番号２６のうちの１つで示される配列を有するペプチドをコードする核酸を提供する。
【０１３６】
更に別の態様では、本発明は、ポルフィロモナス・ジンジバリスに対する免疫応答を誘導するためのキメラタンパク質又は融合タンパク質の製造のための配列番号１７、配列番号１８、配列番号２５及び配列番号２６のうちの１つで示される配列を有するペプチド又は配列番号１７、配列番号１８、配列番号２５及び配列番号２６のうちの１つで示される配列を有するペプチドをコードする核酸の使用を提供する。
【０１３７】
更に別の態様では、本発明は、ポルフィロモナス・ジンジバリスに対する免疫応答を誘導するための配列番号１７、配列番号１８、配列番号２５及び配列番号２６のうちの１つで示される配列を有するペプチド又は配列番号１７、配列番号１８、配列番号２５及び配列番号２６のうちの１つで示される配列を有するペプチドをコードする核酸の使用を提供する。一実施形態では、ペプチドは、
（ｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＬｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼのアドヘシンドメインの配列と同じであるか、若しくはその配列と相同性である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼのアドヘシンドメインの配列と同じであるか、若しくはその配列と相同性である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＨａｇＡアドヘシンドメインの配列と同じであるか、若しくはその配列と相同性である配列の一部若しくは全て
を含む、第２のペプチドと同時に又は第２のペプチドに続いて投与する。
【０１３８】
【表６】
0005977677.tif 000009
0005977677.tif 000010
0005977677.tif 000011
0005977677.tif 000012
0005977677.tif 000013
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0005977677.tif 000015
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0005977677.tif 000017
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0005977677.tif 000020
【０１３９】
本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質では、第１のペプチドのＣ末端残基は、アドヘシンドメインポリペプチドのＮ末端残基に共有結合され得るか、又は第１のペプチドのＮ末端残基は、アドヘシンドメインポリペプチドのＣ末端残基に共有結合され得る。この配置では、第１のペプチド及びアドヘシンドメインポリペプチドは、「直接的に連結される」か、又は「隣接している」と言われる。
【０１４０】
他の実施形態では、キメラタンパク質又は融合タンパク質は、第１のペプチドをアドヘシンドメインポリペプチドに連結するためのリンカーを含む。リンカーは、アミノ酸リンカー及び非アミノ酸リンカーの両方を含む、ペプチドをポリペプチドへ結合させることが可能な任意のリンカーであり得る。好ましくは、リンカーは非免疫原性である。適切なリンカーは、最大１５アミノ酸長であり得るが、５個未満のアミノ酸が好ましい。リンカーは、第１のペプチド及びアドヘシンドメインポリペプチドを、ポルフィロモナス・ジンジバリストリプシン様酵素で通常観察されるより密接した空間配置にさせるように機能し得る。代替的には、リンカーは、第１のペプチド及びアドヘシンドメインポリペプチドと間隔を空けてもよい。
【０１４１】
本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質は、組換え発現系（例えば組換えＤＮＡ技術）によって、又は化学合成（例えば固相ペプチド合成）によって生産することができる。これらの技法は当該技術分野で既知である。
【０１４２】
異種タンパク質又はキメラタンパク質は、それがキメラタンパク質又は融合タンパク質第１のペプチド構成成分又は第２のペプチド構成成分を単独で使用して得られるものを上回って得られる体液性応答を改善するため、特に好適である。
【０１４３】
本発明者らは、これらのペプチドを含むキメラタンパク質が多数の有用性を有することを見出している。例えば、本明細書中に記載されるように、慢性歯周炎で観察されるような骨量減少の処置又は防止に関して非常に防御的である体液性応答を生じるものもある。ペプチドはまた、それらが個体の血清中での特異性を検出又はモニタリングすることができる診断アッセイでも使用することができ、それにより個体が感染されているか、又は感染されていないかどうか、感染しているならば、処置が必要とされるかどうか、又は提供される場合にはそれらが有効であったかどうかを示す。
【０１４４】
一実施形態では、キメラタンパク質又は融合タンパク質は、防御免疫応答、通常そうでなければポルフィロモナス・ジンジバリス感染と関連付けられる結合組織損傷を少なくとも最低限に抑えるか、又は制限する応答を誘導する。一実施形態では、防御応答は、ポルフィロモナス・ジンジバリス誘導性の骨量減少を少なくとも最低限に抑えるか、又は制限する。ポルフィロモナス・ジンジバリス感染により媒介される骨量減少を測定するためのモデル系は本明細書で論述される。通常、防御免疫応答は、主として体液性応答である。或る特定の実施形態では、防御免疫応答はまた細胞性応答を誘導する。
【０１４５】
本発明はまた、上で広く記載されるようなキメラタンパク質又は融合タンパク質を含む組成物を提供する。通常、組成物は、抗原性又は免疫原性である。より具体的には、本発明は、任意にアジュバントと関連してキメラタンパク質又は融合タンパク質を含むポルフィロモナス・ジンジバリス感染に対する防御免疫応答又は治療的免疫応答を誘発するのに適した組成物を提供する。かかる組成物はまた、免疫応答を調節又は増強するための別の構成成分を含んでいてもよい。一実施形態では、組成物はワクチンの形態をとる。
【０１４６】
好ましい組成物は、歯周病原体ポルフィロモナス・ジンジバリス、トレポネーマ・デンチコラ及びタンネレラ・フォーサイシアに対する免疫応答を発生する免疫原を含む。免疫原は、弱毒化全細胞ワクチン、又は精製抗原ワクチン、又はより好ましくは組換え抗原ワクチンであってもよく、ここで、組成物は、３つの歯周病原体の１つ又は複数に対する抗原を含有する。ポルフィロモナス・ジンジバリス、トレポネーマ・デンチコラ及びタンネレラ・フォーサイシア感染に関連する免疫原を形成することが可能である適切なペプチドの他の例を表Ｄ〜表Ｆに示す。
【０１４７】
【表７】
0005977677.tif 000021
【０１４８】
【表８】
0005977677.tif 000022
0005977677.tif 000023
0005977677.tif 000024
0005977677.tif 000025
0005977677.tif 000026
【０１４９】
【表９】
0005977677.tif 000027
0005977677.tif 000028
0005977677.tif 000029
0005977677.tif 000030
0005977677.tif 000031
【０１５０】
様々なアジュバントが、ワクチン組成物と併用した使用に関して知られている。アジュバントは、免疫応答を調節することによって、またワクチン抗原が単独で投与された場合よりも少量のワクチン抗原又はより少ない用量を使用して、より持続的かつより高レベルの免疫性を獲得するのに役立つ。アジュバントの例としては、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、アジュバント６５（ラッカセイ油、マンニドモノオレエート及びモノステアリン酸アルミニウムを含有する）、油状物質エマルジョン、Ｒｉｂｉアジュバント、プルロニックポリオール、ポリアミン、アビリジン、Ｑｕｉｌ  Ａ、サポニン、ＭＰＬ、ＱＳ−２１、鉱物ゲル（例えば、アルミニウム塩及びカルシウム塩）、ナノ粒子（例えば、ヒドロキシアパタイト、リン酸カルシウム、アルミニウム塩）、糖オリゴマー及びポリマー（例えば、マンナン、キトサン）が挙げられる。他の例としては、水中油型エマルジョン（例えば、ＳＡＦ−１、ＳＡＦ−０、ＭＦ５９、Ｓｅｐｐｉｃ  ＩＳＡ７２０及び他の粒状物質アジュバント（例えば、ＩＳＣＯＭ（商標）及びＩＳＣＯＭマトリックス（商標）が挙げられる。アジュバントの他の例の広範ではあるが包括的ではないリストは、Cox and Coulter 1992［Wong WK（編） Animals parasite control utilising technology. Bocca Raton; CRC press、１９９２年；４９〜１１２中］に列挙される。アジュバントの他に、ワクチン組成物は、従来の薬学的に許容される担体、賦形剤、充填剤、緩衝剤又は希釈剤（適切である場合）を含んでいてもよい。アジュバントを含有するワクチン組成物の１つ又は複数の用量は、歯周炎を防止するために予防的に、又は既に存在する歯周炎を処置するために治療的に投与してもよい。一実施形態では、使用されるアジュバントは、Ｔｈ−２に偏った応答の産生を容易とするように選択される。例はＡｌｕｍである。
【０１５１】
好ましい組成物では、キメラタンパク質又は融合タンパク質は、粘膜アジュバントと併用されて、口腔、頬又は鼻の経路を介して投与される。粘膜アジュバントの例は、ナノ粒子、コレラ毒素及び熱不安定性大腸菌毒素、これらの毒素の無毒性Ｂサブユニット、毒性が低減されたこれらの毒素の遺伝子突然変異体である。
【０１５２】
経口的に／頬側的に／経鼻的に抗原タンパク質を送達するのに利用され得る他の方法としては、胃腸管又は他の粘膜表面からの微粒子の取込みを助長するために、及びタンパク質の分解を保護するためにマイクロカプセル化によって生分解性ポリマー（例えば、アクリレート又はポリエステル）の粒子又はナノ粒子（例えば、ヒドロキシアパタイト）中への若しくはその上へのタンパク質の組込み又は吸収が挙げられる。リポソーム、ＩＳＣＯＭ（商標）、ヒドロゲルは、粘膜免疫系への抗原タンパク質の送達のためのＬＴＢ、ＣＴＢ又はレクチンのようなターゲッティング分子の組込みにより更に増強され得る他の有望な方法の例である。抗原タンパク質及び粘膜アジュバント又は送達系の他に、ワクチン組成物は、従来の薬学的に許容される担体、賦形剤、充填剤、コーティング剤、分散媒、抗細菌剤又は抗真菌剤、及び緩衝剤又は希釈剤（適切である場合）を含んでいてもよい。
【０１５３】
皮内投与、筋内投与、腹腔内投与、静脈内投与、皮下投与、鼻内投与、舌下投与、頬側投与及び経口投与を含むがこれらに限定されない多くの方法が、被験体へのワクチン組成物の投与に関して知られている。これらの投与経路は、ワクチン接種に特に有用である。
【０１５４】
更なる態様では、本発明は、少なくとも１つの調節要素に任意に操作可能に連結される、上で広く記載されるキメラタンパク質又は融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。一実施形態では、核酸は、単離形態又は実質的に精製された形態で提供される。
【０１５５】
核酸分子は、例えば、原核宿主細胞又は真核宿主細胞への発現ベクターの挿入によって組換えタンパク質としてのキメラタンパク質の生産に適した発現ベクターへ挿入され得る。組換えタンパク質の首尾よい発現は、発現ベクターが、発現に使用される特定の宿主細胞系と適合性でありかつ該特定の宿主細胞系により認識される転写及び翻訳のための必須調節要素を含有することを要する。様々な宿主細胞系を利用して、組換えタンパク質を発現させてもよく、それらとしては、バクテリオファージベクター、プラスミドベクター又はコスミドＤＮＡで形質転換された細菌、酵母ベクターを含有する酵母、真菌ベクターを含有する真菌、ウイルス（例えば、バキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞株、及びプラスミド若しくはウイルス発現ベクターでトランスフェクトさせたか、又は組換えウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス等）で感染させた哺乳動物細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５６】
分子生物学の技術分野で既知の方法を使用して、様々なプロモーター及びエンハンサ−を発現ベクターへ組み込ませて、組換えタンパク質の発現を増大させることができる。但し、アミノ酸配列の発現の増大が、使用される特定の宿主細胞系と適合性である（例えば、特定の宿主細胞系に対して無毒性である）。
【０１５７】
プロモーターの選択は、使用される発現系に依存する。プロモーターは、強度、すなわち転写を容易にする能力が様々である。概して、高レベルのコーティングヌクレオチド配列の転写及び組換えタンパク質への発現を得るために、強力なプロモーターを使用することが望ましい。例えば、大腸菌を含む宿主細胞系で高レベルの転写が観察された技術分野で既知の細菌、ファージ又はプラスミドプロモーターとしては、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、リボソームＲＮＡプロモーター、ＰＲプロモーター及びＰＬプロモーター、ｌａｃＵＶ５、ｏｍｐＦ、ｂｌａ、ｌｐｐ等が挙げられ、アミノ酸配列をコードする挿入されたヌクレオチド配列の転写を提供するのに使用され得る。
【０１５８】
効率的な転写又は翻訳のための他の制御要素としては、エンハンサ及び調節性シグナルが挙げられる。エンハンサ配列は、近くのコードヌクレオチド配列に関してそれらの位置及び方向に比較的非依存性の様式で転写効率を増大させると考えられるＤＮＡ要素である。したがって、使用される宿主細胞発現ベクター系に応じて、エンハンサは、転写効率を増大させるために挿入されたコード配列から上流又は下流のいずれかに配置してもよい。転写開始シグナル又は翻訳開始シグナルのような他の調節性部位は、コード配列の発現を調節するのに使用することができる。
【０１５９】
別の実施形態では、ベクターは、ウイルス又は細菌のワクチンベクターであってもよく、組換えウイルスワクチン、組換え細菌ワクチン、組換え弱毒化細菌ワクチン、又は不活性化された組換えウイルスワクチンを提供するのに使用され得る。ワクシニアウイルスは、当該技術分野における、他の生物に由来するワクチン抗原を発現するように操作される感染ウイルスの最も良く知られている例である。弱毒化されているか、又はそうでなくともそれ自体では疾患を引き起こさないように処理される組換え生ワクシニアウイルスは、宿主を免疫感作するのに使用される。宿主内での組換えウイルスの続く複製は、ワクチン抗原による免疫系の連続的な刺激を提供し、それによって長期にわたる免疫性を提供する。
【０１６０】
他の生ワクチンベクターとしては、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、及び好ましくはポックスウイルス（例えばワクシニア）［Paoletti及びPanicali、米国特許第４，６０３，１１２号］及び弱毒化されたサルモネラ（Salmonella）株［Stocker他、米国特許第５，２１０，０３５号、同第４，８３７，１５１号及び同第４，７３５，８０１号、並びにCurtiss他、１９８８年、Vaccine 6:155-160］が挙げられる。生ワクチンは、それらが実質的に長期にわたる免疫性を付与することができる免疫系を絶えず刺激するため、特に好適である。免疫応答が、続くポルフィロモナス・ジンジバリス感染に対して防御的である場合、生ワクチン自体は、ポルフィロモナス・ジンジバリスに対する予防ワクチンにおいて使用され得る。特に、生ワクチンは、口腔の共生者である細菌に基づき得る。この細菌は、組換えキメラタンパク質を保有するベクターで形質転換することができ、続いて口腔、特に口腔粘膜にコロニー形成するのに使用され得る。口腔粘膜中でコロニー形成すると、組換えタンパク質の発現は、粘膜関連リンパ系組織を刺激して、中和抗体を産生させる。この実施形態を更に説明するために、当該技術分野で既知の分子生物学的技法を使用して、本発明のキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、エピトープの発現を可能にするが、ワクシニアウイルスベクターの成長又は複製に悪影響を及ぼさない部位で、ワクシニアウイルスゲノムＤＮＡへ挿入してもよい。結果として得られる組換えウイルスは、ワクチン配合物における免疫原として使用され得る。同じ方法が、不活性化された組換えウイルスワクチン配合物を構築するのに使用され得るが、但し、組換えウイルスが、例えば当該技術分野でで既知の化学的手段によって、免疫原としての使用前に、及び発現される免疫原の免疫原性に実質的に影響を及ぼさずに、不活性化される場合を除く。不活性化された組換えワクチンは、ワクチン抗原に対する免疫学的応答を増強するために適切なアジュバントとともに配合してもよい。
【０１６１】
本発明はまた、ワクチン配合物としての直接的に本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子の使用を提供する。１つ又は複数の調節性要素に操作可能に連結されるキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、ポルフィロモナス・ジンジバリスの病原性株に対して個体をワクチン接種するのに直接導入することができる（「直接的な遺伝子移入」）。血管内皮細胞並びに主要臓器の組織のようなワクチン接種される個体の細胞による遺伝子材料の発現をもたらすワクチン接種される個体への直接的な遺伝子移入は、例えば発現プラスミド：カチオン性リポソーム複合体を静脈内に注射することによる当該技術分野での技法によって実証されている［Zhu他、１９９３年、Science 261:209-211］。ベクターＤＮＡを標的細胞へ送達する他の有効的な方法が当該技術分野で知られている。一例では、ウイルス遺伝子を含有する精製組換えプラスミドＤＮＡを使用して、防御免疫応答を誘導するようにワクチンを接種してきた（非経口的にであるか、粘膜的にであるか、又は遺伝子銃免疫感作によるかにかかわらず）［Fynan他、１９９３年、Proc Natl Acad Sci USA 90:11478-11482］。別の例では、個体から取り出した細胞は、当該技術分野で既知の標準的な手順によりトランスフェクト又は電気穿孔することができ、組換えベクターＤＮＡの標的細胞への導入をもたらす。次に、組換えベクターＤＮＡを含有する細胞は、例えばベクター中で発現される選択マーカーを用いて、当該技術分野で既知の方法を使用することに関して選択してもよく、続いて選択された細胞は、個体へ再導入して、組換えタンパク質を発現させてもよい。
【０１６２】
他の実施形態では、上述するような抗菌剤及び免疫原を含む医薬組成物が提供される。組成物は更に、希釈剤、賦形剤若しくは担体、又は口腔感染に関連した状態又は疾患の処置のための化学療法剤を含んでいてもよく、経口投与に適合され得る。本発明の組成物を、例えばウォームガムベースで攪拌すること又はガムベースの外面をコーティングすることにより、ロゼンジに又はチューイングガム若しくは他の製品に組み込むこともできる。ガムベースの例は、望ましくは従来の可塑剤若しくは柔軟剤、糖類、又はグルコース、ソルビトール等の他の甘味料を用いた、ジェルトン、ゴム乳液、ビニライト樹脂等である。
【０１６３】
上述の医薬組成物を含有する本発明の口腔組成物が調製されて、練り歯磨き、歯磨き粉及び液体歯磨剤を含む歯磨剤、洗口剤、トローチ、チューインガム、歯科用ペースト、歯肉マッサージクリーム、うがい用タブレット、乳製品並びに他の食品のような口に適用可能な様々な形態で使用され得る。本発明による口腔組成物は更に、特定の口腔組成物のタイプ及び形態に応じて更なる既知の成分を含んでいてもよい。
【０１６４】
本発明の或る特定の好ましい形態において、経口組成物は性質として実質的に液体のもの、例えば洗口液又はリンス剤であり得る。このような調製物において、ビヒクルは通常望ましくは以下に記載のような保湿剤を含む水−アルコール混合物である。一般的に、水対アルコールの重量比は約１：１〜約２０：１の範囲である。この種の調製物における水−アルコール混合物の総量は通常、調製物の約７０重量％〜約９９．９重量％の範囲である。アルコールは通常エタノール又はイソプロパノールである。エタノールが好ましい。
【０１６５】
本発明のこのような液体及び他の調製物のｐＨは概して約５〜約９、通常約５．０〜７．０の範囲である。ｐＨを酸（例えばクエン酸又は安息香酸）若しくは塩基（例えば水酸化ナトリウム）で制御することができるか、又は（例えばクエン酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、炭酸ナトリウム又は重炭酸ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム等を用いて）緩衝させることができる。
【０１６６】
本発明の他の望ましい形態において、医薬組成物は性質として実質的に固体又はペースト状のもの、例えば歯磨き粉、歯垢検出剤（dental tablet）又は歯磨きペースト（歯科用クリーム）又はジェル歯磨き剤であり得る。このような固体又はペースト状の経口調製物のビヒクルは一般的に歯科的に許容される研磨材料を含有する。
【０１６７】
歯磨きペーストにおいて、液体ビヒクルは通常、調製物の約１０重量％〜約８０重量％の範囲の量で水及び保湿剤を含み得る。好適な保湿剤／担体としてグリセリン、プロピレングリコール、ソルビトール及びポリプロピレングリコールが例示される。水、グリセリン及びソルビトールの液体混合物も有益である。屈折率が考慮すべき重要なものである透明なジェルにおいて、約２．５％（ｗ／ｗ）〜３０％（ｗ／ｗ）の水、０％（ｗ／ｗ）〜約７０％（ｗ／ｗ）のグリセリン、及び約２０％（ｗ／ｗ）〜８０％（ｗ／ｗ）のソルビトールを用いるのが好ましい。
【０１６８】
歯磨きペースト、クリーム及びジェルは通常、約０．１％（ｗ／ｗ）〜約１０％（ｗ／ｗ）、好ましくは約０．５％（ｗ／ｗ）〜約５％（ｗ／ｗ）の割合で天然型又は合成型の増粘剤又はゲル化剤を含有する。好適な増粘剤は合成ヘクトライト、例えばLaporte Industries Limitedから市販されているＬａｐｏｎｉｔｅ（例えばＣＰ、ＳＰ  ２００２、Ｄ）として利用可能な合成コロイドマグネシウムアルカリ金属シリケート複合体粘土である。Ｌａｐｏｎｉｔｅ  Ｄはおよそ５８．００重量％  ＳｉＯ２、２５．４０重量％  ＭｇＯ、３．０５重量％  Ｎａ２Ｏ、０．９８重量％  Ｌｉ２Ｏ、並びに幾らかの水及び微量金属である。その真の比重は２．５３であり、湿度８％で１．０ｇ／ｍｌの見掛けのかさ密度を有する。
【０１６９】
他の好適な増粘剤には、アイリッシュモス、イオタカラギーナン、トラガカントゴム、デンプン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシエチルプロピルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース（例えばＮａｔｒｏｓｏｌとして利用可能）、カルボキシメチルセルロースナトリウム及び微砕Ｓｙｌｏｉｄ（例えば２４４）等のコロイドシリカが含まれる。可溶化剤には、例えば、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール及びヘキシレングリコール等の湿潤ポリオール、メチルセロソルブ及びエチルセロソルブ等のセロソルブ、オリーブ油、ヒマシ油及びワセリン等の直鎖に少なくとも約１２個の炭素を含有する植物油及びワックス、並びに酢酸アミル、酢酸エチル及び安息香酸ベンジル等のエステルも含まれ得る。
【０１７０】
従来どおり経口調製物は通常、好適なラベル付きパッケージで販売されているか、又はそうでなくとも流通していると理解される。このため、マウスリンスのボトルはそれを実質的にマウスリンス又は洗口液として記載し、その使用に関して説明しているラベルを有しており、歯磨きペースト、クリーム又はジェルは通常、それを実質的に歯磨きペースト、ジェル又は歯科クリームとして記載しているラベルを有する、押し出しチューブ（典型的にはアルミニウム、裏打ちされた鉛、又はプラスチック製の）、又は内容物を定量的に取り出す（metering out）他の搾り出し式ディスペンサー、ポンプ式ディスペンサー若しくは加圧式ディスペンサー中にある。
【０１７１】
予防作用の増大を達成するために、口腔全体への活性剤の徹底的かつ完全な分散を達成するのを助けるために、及び本組成物を化粧品としてより許容可能にするために有機界面活性剤を本発明の組成物に使用してもよい。有機界面活性材料は自然状態でアニオン性、非イオン性又は両性であるのが好ましく、活性剤と相互作用しないのが好ましい。組成物に洗浄性及び発泡性を与える洗浄材料を界面活性剤として利用するのが好ましい。アニオン性界面活性剤の好適な例は、高級脂肪酸モノグリセリドモノスルフェートの水溶性塩、例えば硬化ヤシ油脂肪酸のモノ硫酸モノグリセリドのナトリウム塩、高級アルキル硫酸塩、例えばラウリル硫酸ナトリウム、アルキルアリールスルホネート、例えばドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、高級アルキルスルホ酢酸塩、１，２−ジヒドロキシプロパンスルホネートの高級脂肪酸エステル、及び低級脂肪族アミノカルボン酸化合物の実質的に飽和した高級脂肪族アシルアミド、例えば脂肪酸、アルキルラジカル又はアシルラジカルに１２個〜１６個の炭素を有するもの等である。最後に言及されたアミドの例は、Ｎ−ラウロイルサルコシン、並びにセッケン又は同様の高級脂肪酸材料を実質的に含まないとされるＮ−ラウロイルサルコシン、Ｎ−ミリストイルサルコシン又はＮ−パルミトイルサルコシンのナトリウム塩、カリウム塩及びエタノールアミン塩である。使用に好適な水溶性の非イオン性界面活性剤の例は、エチレンオキシドと疎水性の長鎖（例えば約１２個〜２０個の炭素原子の脂肪族鎖）を有し、エチレンオキシドと反応性を有する様々な反応性水素含有化合物との縮合生成物であり、該縮合生成物（「エトキサマー（ethoxamers）」）は親水性ポリオキシエチレン部分を含有し、例えばポリ（エチレンオキシド）と脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪アミド、多価アルコール（例えばモノステアリン酸ソルビタン）及びポリプロピレンオキシド（例えばプルロニック材料）との縮合生成物等である。
【０１７２】
界面活性剤は通常、約０．１重量％〜５重量％の量で存在する。界面活性剤が本発明の活性剤の溶解を助け、それにより必要となる可溶化保湿剤の量を減らすことができることは注目に値する。
【０１７３】
増白剤、保存料、シリコーン、クロロフィル化合物及び／又は尿素、リン酸二アンモニウム等のアンモニア化材料、並びにそれらの混合物等の様々な他の材料を本発明の経口調製物に組み込んでもよい。これらのアジュバントは存在する場合、所望の特性及び特質に実質的に悪影響を及ぼすことのない量で調製物に組み込まれる。
【０１７４】
任意の好適な芳香材料又は甘味材料を利用してもよい。好適な芳香成分の例は芳香油、例えばスペアミント、ペパーミント、ウィンターグリーン、サッサフラス、チョウジ、セージ、ユーカリ、マジョラム、シナモン、レモン及びオレンジの油、並びにサリチル酸メチルである。好適な甘味剤には、スクロース、ラクトース、マルトース、ソルビトール、キシリトール、シクラミン酸ナトリウム、ペリラルチン、ＡＭＰ（アスパルチルフェニルアラニンメチルエステル）、サッカリン等が含まれる。好適には芳香剤及び甘味剤は各々又は両方とも、調製物の約０．１％〜５％以上を構成し得る。
【０１７５】
経口使用を目的とする組成物を医薬組成物の製造に関して当該技術分野で既知の任意の方法に従って調製することができ、このような組成物は薬学的に有効な（elegant）口当たりのよい調製物を提供するために、甘味剤、芳香剤、着色剤及び保存剤からなる群から選択される作用物質を１つ又は複数含有していてもよい。錠剤は錠剤の製造に好適な非毒性の薬学的に許容される賦形剤と混合された活性成分を含有する。これらの賦形剤は例えば不活性希釈剤、例えば炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム又はリン酸ナトリウム；造粒剤及び崩壊剤、例えばコーンスターチ又はアルギン酸；結合剤、例えばデンプン、ゼラチン又はアカシア、並びに平滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はタルクであり得る。錠剤はコーティングされていなくてもよく、又は錠剤を胃腸管又は歯周ポケットでの崩壊及び吸収を遅らせ、それによりより長期にわたり作用が持続するように既知の技法でコーティングしてもよい。例えば、モノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリル等の遅延材料を利用してもよい。
【０１７６】
経口使用のための製剤を硬ゼラチンカプセル（その中で活性成分は不活性固体希釈剤、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウム又はカオリンと混合される）として、又は軟ゼラチンカプセル（その中で活性成分は水又は油媒体、例えば落花生油、液体パラフィン若しくはオリーブ油と混合される）として提示してもよい。
【０１７７】
水性懸濁液は水性懸濁液の製造に好適な賦形剤と混合された活性材料を含有する。このような賦形剤は懸濁化剤、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム及びアカシアゴムである。分散剤又は湿潤剤は天然のホスファチド、例えばレシチン、又はアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物、例えばステアリン酸ポリオキシエチレン、又はエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール、又はエチレンオキシドと脂肪酸及びヘキシトールに由来する部分エステルとの縮合生成物、例えばモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール、又はエチレンオキシドと脂肪酸及び無水ヘキシトールに由来する部分エステルとの縮合生成物、例えばモノオレイン酸ポリエチレンソルビタンであり得る。
【０１７８】
水性懸濁液は１つ又は複数の保存料又は抗菌剤、例えばベンゾエート、例えばエチルｐ−ヒドロキシベンゾエート又はｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエート（別の例はグルコン酸クロルヘキシジンである）１つ又は複数の着色剤、１つ又は複数の芳香剤、及び１つ又は複数の甘味剤、例えばスクロース又はサッカリンを含有していてもよい。
【０１７９】
油性懸濁液を、植物油、例えば落花生油、オリーブ油、ゴマ油若しくはヤシ油、又は液体パラフィン等の鉱油中に活性成分を懸濁することにより配合してもよい。油性懸濁液は増粘剤、例えば蜜蝋、固形パラフィン又はセチルアルコールを含有していてもよい。上記で記載されるもののような甘味剤、及び芳香剤を口当たりのよい経口調製物を提供するために添加してもよい。これらの組成物をアスコルビン酸等の抗酸化剤の添加により保存してもよい。
【０１８０】
４．キット
或る特定の実施形態では、
実質的に全ての微生物又はそれらの断片を下記被験体の口腔組織から除去するための抗菌剤、
微生物病原体（口腔組織におけるその存在が、疾患又は状態に関連付けられる）に対して上記被験体を免疫感作するための免疫原
を含むキットが提供され、上記キットは、上述の方法での使用に適合している。
【０１８１】
キットは、
抗菌剤及び免疫原のうちの１つ又は複数の形態で治療用組成物を保持する容器、
使用に関する説明書を伴うラベル又はパッケージ挿入物
を含んでいてもよい。
【０１８２】
或る特定の実施形態では、本明細書中で記載される方法又は使用で使用される場合のキットが提供される。
【０１８３】
或る特定の実施形態では、キットは、疾患又は状態の治療のための１つ又は複数の更なる活性成分又は有効成分を含有していてもよい。
【０１８４】
キットは、容器、及び容器上のラベル若しくはパッケージ挿入物又は容器に関連付けられるラベル若しくはパッケージ挿入物を含んでいてもよい。適切な容器としては、例えば、瓶、バイアル、シリンジ、ブリスター・パック等が挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチックのような各種材料から形成され得る。容器は、状態を処置するのに有効である治療用組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有してもよい（例えば、容器は、皮下注射針により貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであり得る）。ラベル又はパッケージ挿入物は、治療用組成物が選んだ状態を処置するのに使用されることを示す。一実施形態では、ラベル又はパッケージ挿入物は、使用に関する説明書を含み、治療用組成物が、所定の疾患又は状態の治療に使用され得ることを示す。
【０１８５】
キットは、（ａ）治療用組成物、及び（ｂ）第２の活性成分又は有効成分を中に含有する第２の容器を含んでいてもよい。本発明のこの実施形態におけるキットは更に、その活性成分及び他の活性成分が所定の感染から生じる障害を処置するか、又は合併症を防止するのに使用することができることを示すパッケージ挿入物を含んでいてもよい。代替的には、又はさらには、キットは、薬学的に許容される緩衝剤、例えば注射用の静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル溶液及びデキストロース溶液を含む第２の（又は第３の）容器を更に含んでいてもよい。キットは更に、他の緩衝剤、希釈剤、フィルタ、針及びシリンジを含む商業的及び使用者の観点から望ましい他の材料を含んでいてもよい。
【０１８６】
本発明は、本発明の限定のためでなく例示のために記載される下記実施例によって更に説明される。
【実施例】
【０１８７】
実施例１：
方法及び材料
細菌株及び成長条件。ポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０の凍結乾燥させた培養液を、５μｇ／ｍｌのヘミン、０．５μｇ／ｍｌのシステイン（ＨＢ寒天、継代回数１０未満）を補充した溶解ウマ血液寒天板上で３７℃で嫌気的に成長させた。３日〜４日後、コロニーを使用して、５μｇ／ｍｌのヘミン、０．５μｇ／ｍｌのシステインを含有するブレイン・ハートインフュージョン培地に接種した（１）。バッチ培養液を、ＭＫ３嫌気性ワークステーション（Don Whitley Scientific Ltd.、オーストラリア、アデレード）中で嫌気的に成長させた。細胞を遠心分離（７５００ｇ、３０分、４℃）により指数成長期中に収集して、嫌気性ワークステーション中でＰＧ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２及び５ｍＭ  システイン−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）で２回洗浄した。バッチ培養液の成長は、分光光度計（モデル２９５Ｅ、Perkin-Elmer）を使用して６５０ｎｍでモニタリングした。培養液純度は、グラム染色、顕微鏡検査によって、及びSlots（２）に従う各種生化学試験を使用して日常どおりに検査した。
【０１８８】
アドヘシン配列及びＫｇｐプロテイナーゼ配列のＮ末端付加を有するアドヘシン配列を含有するｐＥＴ２８構築物の構築。活性部位（ＡＳ）ドメイン及びＫｇｐＡ１アドヘシン（Ａ１）ドメインのペプチド及びキメラペプチドを表すＫｇｐ残基を、ｐＥＴ発現ベクター（Novagen）を使用してヘキサ−Ｈｉｓタグを有する組換え（ｒ）タンパク質として大腸菌で過剰発現させた。発現させたｒタンパク質は、ｒＫＡＳ２及びｒＫＬＡ１であり、ｒ−キメラタンパク質は、ｒＫＡＳ２−ＫＬＡ１、ｒＫＡＳ１−ＫｓＡ１及びｒＫＡＳ４−ＫＡＳ３−ＫＡＳ５−ＫＡＳ６−ＫＬＡ１（マルチＫＡＳ−ＫＬＡ１とも称される）であった。様々なＡ１ドメイン及びＡＳドメインを表すアミノ酸配列を第１表及び第２表に記載する。
【０１８９】
ｋｇｐ遺伝子の様々なＫＡＳドメイン及びＫＡ１ドメインを、ｐＮＳ１（ｐＵＣ１８中の３．５ｋｂのＢａｍＨＩ  ｌｙｓ断片）又はポルフィロモナス・ジンジバリスゲノムＤＮＡから、それぞれ第４表に列挙されるプライマー、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Invitrogen）及びＰＣ−９６０サーマルサイクラー（Corbett Research Technologies）を使用して増幅させた。プライマー対ＫＡＳ２−ＦＯＲ及びＫＡＳ２−ＲＥＶ、並びにＫＬＡ１−ＦＯＲ及びＫＬＡ１−ＲＥＶを使用して、下記反応条件：９４℃で３分、続いて９４℃で４５秒（変性）、６２℃で４０秒（アニーリング）及び７２℃で２０秒（伸長）を２８サイクル、続く７２℃で５分の最終サイクルを使用して、それぞれＫＡＳ２及びＫＬＡ１をコードするＰＣＲ断片を生成した。
【０１９０】
ＫＡＳ２−ＫＬＡ１キメラＰＣＲ産物は、下記のとおりに重複伸長による遺伝子スプライシング（ＳＯＥｉｎｇ）によって産生された：ＰＣＲ産物は、上述の条件を使用してプライマー対ＫＡＳ２−ＦＯＲ及びＫＡＳ２−ＫＬＡ１−キメラ−ＲＥＶ、並びにＫＡＳ２−ＫＬＡ１−キメラ−ＦＯＲ及びＫＬＡ１−ＲＥＶを使用して産生された。次に、ＰＣＲ産物をアニーリングさせて、最終ＰＣＲは、プライマーＫＡＳ２−ＦＯＲ及びＫＬＡ１−ＲＥＶを用いて実施した（９４℃で２分、続いて９４℃で３０秒、５０℃で３０秒及び７２℃で４０秒を２８サイクル、続く７２℃で５分の最終サイクル）。
【０１９１】
ＫＡＳ１−ＫｓＡ１  ＰＣＲ産物の調製に関して、２つの逐次（successive）ＰＣＲを、順次ＫＡＳ１−ＫｓＡ１−ＦＯＲプライマー１及び２のそれぞれとともにＫＡＳ１−ＫｓＡ１−ＲＥＶプライマーを使用して行って（反応条件：９４℃で２分、続いて９４℃で１５秒、６３℃で３０秒及び７２℃で２分を３５サイクル）、ＫＡＳ１−ＫｓＡ１  ＰＣＲ産物を産生した。ＫＡＳ１−ＫｓＡ１−ＦＯＲ１及びＫＡＳ１−ＫｓＡ１−ＦＯＲ２プライマーは、これまでのＰＣＲ産物の５’と重複する３’伸長を含有する。
【０１９２】
マルチＫＡＳ−ＫＬＡ１  ＰＣＲ断片の調製に関して、４つの逐次ＰＣＲを、順次マルチ−ＦＯＲプライマー１、２、３及び４のそれぞれとともにマルチ−ＲＥＶプライマーを使用して行って（反応条件は、９５℃で２分、続いて９５℃で２０秒、６８℃で１．５分を３５サイクルとした）、マルチＫＡＳ−ＫＬＡ１  ＰＣＲ産物を産生した。各マルチ−ＦＯＲプライマーは、これまでのＰＣＲ産物の５’と重複する３’伸長を含有する。
【０１９３】
ＫＡＳ２、ＫＬＡ１、ＫＡＳ２−ＫＬＡ１、ＫＡＳ１−ＫｓＡ１及びマルチＫＡＳ−ＫＬＡ１をコードするＰＣＲ断片は全て、製造業者のプロトコルに従って、ＰＣＲ精製カラム（Qiagen）を使用して精製し、ＴＡクローニングベクターであるｐＧｅｍ−Ｔ  Ｅａｓｙ（Promega）へ連結して、大腸菌ＪＭ１０９へ形質転換した。精製した組換えｐＧｅｍＴ−Ｅａｓｙ構築物をＮｃｏＩ及びＸｈｏＩで消化して、ＮｃｏＩ／ＸｈｏＩで消化させたｐＥＴ２８ｂ（Novagen）に定方向にクローニングして、非発現宿主である大腸菌ＪＭ１０９［ＤＨ５α］へ形質転換した。組換えｐＥＴ２８構築物は、製造業者の説明書に従って、精製して、大腸菌発現宿主であるＢＬ２１（ＤＥ３）［ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）］（Novagen）へ形質転換して、５０μｇのカナマイシンを含有するＬＢ上で選択した。各挿入片の完全性は、ＤＮＡ配列分析により確認した。
【０１９４】
オリゴヌクレオチドプライマー（第４表）は、制限酵素部位、停止コドン及びヘキサ−Ｈｉｓタグ（必要であれば）を組み込むように設計されている。ｒＫＡＳ２、ｒＫＬＡ１及びｒＫＡＳ２−ＫＬＡ１に使用されるプライマーは、ｒ−タンパク質中における３つ以下の（no more than）アミノ酸にヘキサ−Ｈｉｓタグを付加したものに対する外来性コード配列の包含を制限するように設計された。ｒＫＡＳ１及びｒＫＬＡ１は、それぞれＮ末端及びＣ末端にヘキサ−Ｈｉｓタグを含有するように設計されて、その結果、それらはＮ末端及びＣ末端の両方でヘキサ−ｈｉｓタグを有するｒＫＡＳ２−ＫＬＡ１と直接比較することができる。ｒＫＡＳ１−ＫｓＡ１及びｒマルチＫＡＳ−ＫＬＡ１では、ＨｉｓタグはＣ末端に見出される。
【０１９５】
【表１０】
0005977677.tif 000032
0005977677.tif 000033
【０１９６】
組換えタンパク質の発現及び精製。組換えタンパク質は、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシダーゼ（ＩＰＴＧ）による誘導によってｐＥＴ２８：：ＫＬＡ１（ＫＡＳ２、ＫＡＳ２−ＬＡ１、ＫＡＳ１−ＳＡ１、マルチＫＡＳ−ＫＬＡ１）構築物から発現させた。組換えタンパク質は全て、６−Ｈｉｓ  Ｔａｇ融合タンパク質として産生されて、変性条件下でＮＩ−ＮＴＡ精製系（Invitrogen）で精製した。簡潔に述べると、大腸菌（ＤＥ３）単一コロニー形質転換体を使用して、オービタルシェーカー上で一晩、３７℃で５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する２０ｍＬのルリア・ベルターニ（ＬＢ）ブロスに接種した。続いて、この接種材料を使用して、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ  １Ｌに接種した。この培養液のＯＤ６００は、２００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で２時間、０．１ｍＭでイソプロピルＩＰＴＧによりタンパク質発現を誘導する前に０．５〜０．７（対数期中期）に到達させた。細胞を収集して（７５００ｇ）、変性結合緩衝液（８Ｍ尿素、２０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）及び５００ｍＭ  ＮａＣｌ）中に再懸濁して、Bransonのソニファー２５０細胞破壊器（Branson Ultronics Corporation、コネティカット州ダンベリー）を使用して、設定３でマイクロチップを用いて、３０秒間隔で３×１５秒のバーストの間、氷上で超音波処理して、続いて３９０００ｇで４℃で３０分間遠心分離した。組換えタンパク質は、予め平衡化させたＮｉ−ＮＴＡアガロースカラム上へ負荷すること、続いて変性洗浄緩衝液（８Ｍ  尿素、２０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）及び５００ｍＭ  ＮａＣl）で洗浄することによって上清から精製して、未結合のタンパク質を溶出させた。続いて、カラムを１０倍量の結合緩衝液Ｂを使用して洗浄して、組換えタンパク質は、変性溶出緩衝液（８Ｍ  尿素、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）、５００ｍＭ  ＮａＣｌ及び０．５Ｍ  イミダゾール）で溶出させた。精製したタンパク質は、２Ｍ  尿素−ＰＢＳに対して透析して、−８０℃で保管した。
【０１９７】
組換えタンパク質サンプルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析して、ＰｒｏｔＰａｒａｍオンライン（http://au.expasy.org/tools/protparam.html）を使用して、それらの分子質量を決定した。全てのサンプルのタンパク質濃度は、標準物質としてＢＳＡを使用してBio-Radタンパク質アッセイによって決定した。
【０１９８】
免疫感作及びマウス歯周炎モデル。マウス歯周炎実験を過去に記載される（３）とおりに実施して、メルボルン大学動物実験倫理委員会（University of Melbourne Ethics Committee for Animal Experimentation）により承認された。ミクロアイソレータ中に収容した６週齢〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たりマウス１２匹）を、５０μｇの組換えタンパク質又はＲｇｐＡ−Ｋｇｐ複合体のうちの１つ、ポルフィロモナス・ジンジバリス株Ｗ５０の２×１０９個のホルマリンで死滅させた細胞又はＰＢＳをのいずれかで皮下的に免疫感作した（皮下１００μＬ）。抗原はそれぞれ、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中で乳化させた。３０日後、マウスを抗原（皮下注射、ＩＦＡ中に乳化）で追加免疫して、続いて、１２日後に眼球後神経叢から出血させた。４日後、第２の免疫感作マウスに、脱イオン水中で１ｍｇ／ｍｌでのカナマイシン（Sigma-Aldrich、オーストラリア、ニューサウスウェールズ）を７日間自由に与えた。抗生物質処置の３日後（出血の２日後）、マウスに、２％（ｗｔ／ｖｏｌ）カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ；Sigma-Aldrich、オーストラリア、ニューサウスウェールズ）を含有するＰＧ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２及び５ｍＭ  システイン−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）中の１×１０１０個の生存可能なポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０（２５μｌ）で、２日空けて４回、経口接種して、対照群は、２％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＣＭＣのみを含有するＰＧ緩衝液で偽感染させた。接種材料は、嫌気性チャンバ中で調製され、続いて、即座に上顎臼歯の歯肉縁へ適用させた。２週後、マウスに、２％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＣＭＣを含有するＰＧ緩衝液中の生存可能なポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０（２５μｌ）１×１０１０個の細胞を更に４回（２日空けて）投与した。各接種材料中の生存可能細菌の数は、血液寒天上での列挙により確認した。マウスに、軟らかい粉末食（Barastock、オーストラリア）を与え、寝具類への接近を防ぐために、隆起した金網の底部に適合させたケージ中に収容した。最終投与の４週後に、マウスを眼球後神経叢から出血させて、屠殺し、上顎骨を取り出して半分に切断し、一方（右側）を歯槽骨量減少測定に使用し、他方（左側）をリアルタイムＰＣＲに使用した。
【０１９９】
右半分の上顎骨を脱イオン水中で煮沸し（１分）、機械的に切り落とし、２％（ｗｔ／ｖｏｌ）水酸化カリウム中に浸漬させた（１６時間、２５℃）。続いて、上顎骨の半分を洗浄して（脱イオン水で２回）、３％（ｗｔ／ｖｏｌ）過酸化水素中に浸漬させた（６時間、２５℃）。上顎骨の半分を洗浄した（脱イオン水で２回）後、それらを０．１％（ｗｔ／ｖｏｌ）メチレンブルー水で染色して、各上顎骨の半分の頬側デジタル画像を、ＯＬＹＳＩＡ  ＢｉｏＲｅｐｏｒｔソフトウェアバージョン３．２（Olympus Australia Pty Ltd.、ニューサウスウェールズ、オーストラリア）を使用して解剖顕微鏡上に取り付けたオリンパスＤＰ１２デジタルカメラにより取り込み、水平骨量減少を評価した。水平骨量減少は、頂高の低減をもたらす歯槽骨頂（ＡＢＣ）に垂直な水平面で見られる減少である。各上顎骨の半分を、各歯の画像の臼歯の頬側咬頭及び舌側咬頭が重ね合わさるように整列させて、画像を枠中のマイクロメートルのスケールで取り込み、その結果、測定は、各画像に関して標準化することができた。各臼歯に関してセメント・エナメル接合部からＡＢＣまでの面積を、ＯｌＹＳＩＡ  ＢｉｏＲｅｐｏｒｔソフトウェアバージョン３．２画像化ソフトウェアを使用して測定した。骨量減少測定は、無作為化かつ盲検プロトコルを使用して一人の実験者により２回決定された。
【０２００】
ＥＬＩＳＡによるサブクラス抗体の決定。マウス血清のサブクラス抗体応答を決定するために、０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）Ｔｗｅｅｎ２０を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（０．０１Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）（ｐＨ７．０）（ＰＢＳＴ）中のホルマリンで死滅させたポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０の５μｇ／ｍｌ溶液を使用して、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を三連で実施して、平底ポリビニルマイクロタイタープレート（Dynatech Laboratories、バージニア州マクリーン）のウェルをコーティングした。コーティング溶液の除去後、２％（ｗｔ／ｖｏｌ）脱脂粉乳を含有するＰＢＳＴをウェルに添加して、室温で１時間コーティングされていないプラスチックをブロッキングした。ウェルをＰＢＳＴで４回洗浄した後、０．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）脱脂粉乳を含有するＰＢＳＴ（ＳＫ−ＰＢＳＴ）中のマウス血清の段階希釈物を各ウェルへ添加して、室温で１６時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳＴで６回洗浄した後、マウスＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ又はＩｇＧ３（Sigma、オーストラリア、ニューサウスウェールズ）に対するヤギＩｇＧの１／２０００希釈物がＳＫ−ＰＢＳＴ中で添加されて、室温で２時間結合させた。プレートをＰＢＳＴ中で６回洗浄して、ＳＫ−ＰＢＳＴ中のホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ウサギ抗ヤギ免疫グロブリン（Sigma、オーストラリア、ニューサウスウェールズ）の１／５０００希釈物を各ウェルへ添加して、室温で１時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳＴで６回洗浄した後、結合抗体は、１００μｌのＡＢＴＳ基質［０．００５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）過酸化水素を含有する８０ｍＭ  クエン酸中の０．９ｍＭ  ２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズ−チアゾリン−６）スルホン酸、ｐＨ４．０］を各ウェルへ添加することにより検出した。４１５ｎｍでの光学密度は、マイクロプレ−トリーダー（Bio-Radマイクロプレートリーダー、モデル４５０）を使用して測定した。
【０２０１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動及びウェスタンブロッティング。組換えタンパク質（１０μｇ）を、ＸＣｅｌｌ  ｓｕｒｅｌｏｃｋ  ミニセル電気泳動システムを使用して分析した。組換えタンパク質は、２０μｌの還元サンプル緩衝液（１０％［ｗｔ／ｖｏｌ］ＳＤＳ、０．０５％［ｗｔ／ｖｏｌ］ブロモフェノールブルー、２５％［ｖｏｌ／ｖｏｌ］グリセロール及び０．０５％［ｖｏｌ／ｖｏｌ］２−メルカプトエタノール）中で混合した。ｐＨは、１．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌでｐＨ８．０へ調節して、次に溶液を１００℃で５分間加熱した。組換えタンパク質（１０μｇ／レーン）をＮｏｖｅｘ  １２％（ｗｔ／ｖｏｌ）Ｔｒｉｓ−グリシンプレキャストミニゲル上へ負荷して、３０ｍＡ〜５０ｍＡの電流及び１２５Ｖの電位差を用いて、Ｎｏｖｅｘ電気泳動システム（Novex、カリフォルニア州、サンディエゴ）を使用して電気泳動を行った。タンパク質は、０．２５％（ｗ／ｖ）クマジーブルーＲ２５０を使用して可視化した。
【０２０２】
Ｋｇｐプロテイナーゼ活性部位ペプチド（ＫＡＳ−２）配列のエピトープ分析。Ｌｙｓ特異的プロテイナーゼ活性部位ペプチドＫＡＳ２に関する抗体結合部位（４３３〜４６８、配列番号２８）は、Ｆｍｏｃ化学に関する標準的な固相ペプチド合成プロトコルを使用してマルチピンペプチド合成システム（Chiron Technologies、オーストラリア、メルボルン）上でＮ末端がビオチン化された重複した８残基ペプチド（１個の残基によるオフセット、７個の残基による重複）を合成することによって決定した。０．１Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中のビオチン化されたペプチド（５μｇ／ｍＬ）は、ストレプトアビジンでコーティングされたプレートへ、４℃で一晩結合させた（Nunc、オーストラリア、ニューサウスウェールズ）。ウェルをＰＢＳＴで４回洗浄した後、プレートに結合されたペプチドのエピトープマッピングを、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含有する０．１Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の１％（ｗ／ｖ）無脂粉乳（ＳＫ−ＰＢＳＴ）中の１：１０００希釈でのマウス血清を使用して、Chiron Technologiesによる指示書に従ってＥＬＩＳＡによって実施した。ウェルをＰＢＳＴで６回洗浄した後、マウスＩｇＧに対するヤギＩｇＧ（Sigma、オーストラリア、ニューサウスウェールズ）の１／２０００希釈物をＳＫ−ＰＢＳＴ中に添加して、室温で２時間結合させた。プレートをＰＢＳＴ中で６回洗浄した、ＳＫ−ＰＢＳＴ中のホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ウサギ抗ヤギ免疫グロブリン（Sigma、オーストラリア、ニューサウスウェールズ）の１／５０００希釈物を各ウェルに添加して、室温で１時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳＴで６回洗浄した後、結合抗体は、１００μｌのＡＢＴＳ基質［０．００５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）過酸化水素を含有する８０ｍＭ  クエン酸中の０．９ｍＭ  ２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズ−チアゾリン−６）スルホン酸、ｐＨ４．０］を各ウェルへ添加することにより検出した。４１５ｎｍでの光学密度は、マイクロプレ−トリーダー（Bio-Radマイクロプレートリーダー、モデル４５０）を使用して測定した。
【０２０３】
統計学的解析。骨量減少データは、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）及びダネットＴ３検定（ウィンドウズ（登録商標）用ＳＰＳＳ、バージョン１２）を使用して統計学的に解析した。ＩｇＡ、ＩｇＭ及びＩｇＧのサブクラス抗体力価は、ＳＰＳＳソフトウェア（ウィンドウズ（登録商標）用ＳＰＳＳ、バージョン１２）を使用してスチューデントｔ検定を使用して統計学的に解析した。
【０２０４】
実施例２
組換えタンパク質（ＫｓＡ１、ＫＬＡ１、ＫＡＳ１−ＫｓＡ１及びＫＡＳ２−ＫＬＡ１）の特性化及び精製。ＫｇＰアドヘシンＡ１ドメイン断片及びキメラＫｇｐプロテイナーゼ及びＫｇｐアドヘシンＡ１ドメイン断片の、ポルフィロモナス・ジンジバリス感染を防御する能力を特性化するために、本発明者らは、組換えタンパク質：ＫｓＡ１、ＫＬＡ１、ＫＡＳ１−ＫｓＡ１及びＫＡＳ２−ＫＬＡ１を発現させて、精製した。組換えタンパク質（ＫｓＡ１及びＫＬＡ１）及び組換えキメラタンパク質（ＫＡＳ１−ＫｓＡ１及びＫＡＳ２−ＫＬＡ１）は、ニッケルキレートアフィニティクロマトグラフィを使用して封入体（inclusion bodies）から精製して、精製したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（図１）。精製した組換えタンパク質はそれぞれ、ＫＡＳ２−ＫＬＡ１、ＫＬＡ１、ＫｓＡ１及びＫＡＳ１−ＫｓＡ１に相当する４０ｋＤａ、３６ｋＤａ、３１ｋＤａ及び３２ｋＤａの分子量を有する１つの主要タンパク質バンドからなるものであり、これらの分子量は、ＰｒｏｔＰａｒａｍを使用したＨｉｓ−タグ組換えタンパク質の算出した分子質量に相当した。組換えタンパク質の免疫原性を特性化するために、ＫｓＡ１、ＫＬＡ１、ＫＡＳ１−ＫｓＡ１及びＫＡＳ２−ＫＬＡ１を使用して、マウスを免疫感作して、血清を使用して、ＫＡＳ２ペプチドでコーティングされたプレート及びホルマリンで死滅させたポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０細胞でコーティングされたプレートをプロービングした（図２）。組換えキメラタンパク質ＫＡＳ１−ＫｓＡ１及びＫＡＳ２−ＫＬＡ１抗血清は、ＫＡＳ２特異的抗血清（ＫＡＳ２−ジフテリア毒素複合体）並びにホルマリンで死滅させたポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０細胞（図２Ｂ）と類似したレベルでＫＡＳ２ペプチドを認識することが見出された（図２Ａ）。しかしながら、組換えタンパク質ＫＬＡ１に対する抗血清のみが、死滅させたポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０細胞を認識した（図２Ｂ）。
【０２０５】
実施例３
マウス歯周炎モデルにおけるポルフィロモナス・ジンジバリス誘導性の歯槽骨量減少に対する組換えタンパク質（ＫｓＡ１、ＫＬＡ１、ＫＡＳ１−ＫｓＡ１及びＫＡＳ２−ＫＬＡ１）による免疫感作の影響。組換えタンパク質ＫｓＡ１、ＫＬＡ１、ＫＡＳ１−ＫｓＡ１及びＫＡＳ２−ＫＬＡ１、ホルマリンで死滅させたポルフィロモナス・ジンジバリス株Ｗ５０及びＲｇｐＡ−Ｋｇｐ複合体を使用して、Baker他（４）により報告されるものに基づく歯周骨量減少の改変マウスモデルを使用したポルフィロモナス・ジンジバリス誘導性の歯槽骨量減少に対して誘導される防御を決定及び比較した。マウスを、組換えタンパク質ＫｓＡ１、ＫＬＡ１、ＫＡＳ１−ＫｓＡ１若しくはＫＡＳ２−ＫＬＡ１、ＲｇｐＡ−Ｋｇｐ複合体又はホルマリンで死滅させたポルフィロモナス・ジンジバリス株Ｗ５０（ＦＫ−Ｗ５０）細胞又はＰＢＳアジュバントのみのいずれかで免疫感作して（０日目及び３０日目）、続いて生存可能なポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０で経口的に負荷した。組換え抗原、ＲｇｐＡ−Ｋｇｐ複合体及びＦＫ−Ｗ５０細胞の全てによる免疫感作は、これらの動物がＰＢＳで免疫感作した群に比較して有意に（ｐ＜０．００１）低い骨量減少を示したため、ポルフィロモナス・ジンジバリス誘導性の歯槽骨量減少に対してＢＡＬＢ／ｃマウスを防御した（図３）。しかしながら、ＫＡＳ２−ＫＬＡ１で免疫感作したマウスは、ＫＬＡ１（ｐ＜０．０１）、ＫｓＡ１（ｐ＜０．００１）、ＲｇｐＡ−Ｋｇｐ複合体（ｐ＜０．００１）、ＦＫ−Ｗ５０細胞（ｐ＜０．００１）及び非負荷マウス（ｐ＜０．００１）で免疫感作したマウスよりも有意に低い骨量減少を示した。ＫＡＳ２−ＫＬＡ１で免疫感作したマウスとＫＡＳ１−ＫｓＡ１で免疫感作したマウスとの間では骨量減少に有意差はなかった。さらに、ＫＡＳ１−ＫｓＡ１で免疫感作したマウスは、非負荷マウス（ｐ＜０．０１）及びＲｇｐＡ−Ｋｇｐ複合体で免疫感作したマウス（ｐ＜０．０５）よりも有意に低い骨量減少を示したが、ＫｓＡ１、ＫＬＡ１及びＦＫ−Ｗ５０で免疫感作したマウスとは有意に異ならなかった。ＫｓＡ１で免疫感作したマウスと、ＫＬＡ１で免疫感作したマウスと、ＲｇｐＡ−Ｋｇｐ複合体で免疫感作したマウスと、ＦＫ−Ｗ５０で免疫感作したマウスとの間では骨量減少に有意差はなかった。
【０２０６】
実施例４
マウス歯周炎モデルにおける組換えタンパク質（ＫｓＡ１、ＫＬＡ１、ＫＡＳ１−ＫｓＡ１及びＫＡＳ２−ＫＬＡ１）による免疫感作により誘導される抗体サブクラス応答。生存可能なポルフィロモナス・ジンジバリス細胞による経口接種負荷の前及び後に、マウスを出血させて、遠心分離により血清を収集した。図４は、マウス歯周炎モデルにおける各免疫原（ＫｓＡ１、ＫＬＡ１、ＫＡＳ１−ＫｓＡ１若しくはＫＡＳ２−ＫＬＡ１、又はホルマリンで死滅させたポルフィロモナス・ジンジバリス株Ｗ５０（ＦＫ−Ｗ５０）細胞）に関するホルマリンで死滅させたポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０細胞に対する抗体サブクラス反応性を示す。防御免疫原は全て、ＦＫ−Ｗ５０に対して高いＩｇＧ抗体力価を誘導した。さらに、各防御免疫原が誘導する主要な抗体サブクラスは、ＩｇＧ１であり、ＦＫ−Ｗ５０特異的抗体であるＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ３の免疫反応性はごく弱いものであった（図４）。経口接種前（図４Ａ）及び経口接種後（図４Ｂ）の両方の各免疫原により誘導される主要な抗体サブクラスはＩｇＧ１であった。
【０２０７】
実施例５
ＫＡＳ２（４３３〜４６８）のエピトープマッピング。ＫＡＳ２（４３３〜４６８）に関する重複しているビオチン化された８残基ペプチド（１個はオフセット、７個はオーバーラップ）を合成して、ストレプトアビジンでコーティングされたプレートをコーティングするのに使用した。次に、抗体結合エピトープを、ＫＡＳ１−ＫｓＡ１、ＫＡＳ２−ＫＬＡ１及びＫＡＳ２−ジフテリア毒素複合体で免疫感作したマウス由来の抗血清を使用して同定した（図５）。バックグラウンドを上回る光学密度（４１５ｎｍ）の２倍増加を、陽性抗体応答とみなした（閾値ＯＤ）。抗血清は、配列番号２８に由来する以下のペプチド配列を認識した。すなわち、ＫＡＳ１−ＫｓＡ１は、ペプチド４３５〜４４２、４３６〜４４３、４４５〜４５２、４４６〜４５３及び４４７〜４５４を認識した（閾値ＯＤ＝０．０７、図５Ａ）のに対して、ＫＡＳ２−ＫＬＡ１は、ペプチド４３５〜４４２、４４７〜４５４及び４４８〜４５５を認識した（閾値ＩＤ＝０．０７、図５Ａ）。このことは、多数の最小エピトープ、すなわちペプチド４３６〜４４２（ＶＳＦＡＮＹＴ及びその変異体ＶＧＦＡＮＹＴ）、ペプチド４４７〜４５２（ＥＴＡＷＡＤ及びその変異体ＥＴＳＷＡＤ）及びペプチド４４８〜４５３（ＴＡＷＡＤＰ及びその変異体ＴＳＷＡＤＰ）の認識を示唆する。ペプチド４３６〜４４２エピトープを含むペプチドとしては、ＧＶＳＦＡＮＹＴ、ＧＶＧＦＡＮＹＴ、ＶＳＦＡＮＹＴＡ及びＶＧＦＡＮＹＴＡが挙げられる。ペプチド４４７〜４５２エピトープ及び／又はペプチド４４８〜４５３エピトープを含むペプチドとしては、ＳＥＴＡＷＡＤ、ＳＥＴＳＷＡＤ、ＥＴＡＷＡＤＰ、ＥＴＳＷＡＤＰ、ＴＡＷＡＤＰＬ及びＴＳＷＡＤＰＬ、より詳細にはＧＳＥＴＡＷＡＤ、ＧＳＥＴＳＷＡＤ、ＳＥＴＡＷＡＤＰ、ＳＥＴＳＷＡＤＰ、ＥＴＡＷＡＤＰＬ、ＥＴＳＷＡＤＰＬ、ＴＡＷＡＤＰＬＬ及びＴＳＷＡＤＰＬＬが挙げられる。
【０２０８】
実施例６
タンパク質への結合のためのＫＡＳペプチド及びＲＡＳペプチドの合成
ペプチドは、手動的に又はＣＥＭマイクロ波ペプチド合成器を使用して合成した。Ｆｍｏｃ化学に関する標準的な固相ペプチド合成プロトコルを全体にわたって使用した。ペプチドは、Ｒｉｎｋリンカー由来のＡＭ−ｓｕｒｅ樹脂（AAPPTEC、米国、ケンタッキー州）を使用してカルボキシアミド形態として構築した。カップリングは、４当量のＦｍｏｃアミノ酸及び６当量のＤＩＰＥＡを使用して、ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ活性化により遂行された。Ｆｍｏｃ基は、１Ｍ  ＨＯＢｔ／ＤＭＦ中の２０％ピペリジンにより除去された。
【０２０９】
ＫＡＳペプチド又はＲＡＳペプチドを保有する樹脂をＤＭＦ中に膨潤させて、続いてＮ末端のＦｍｏｃ基を、２％ｖ／ｖピペリジンを含有するＤＭＦ中の２％ｖ／ｖ  ＤＢＵによって除去した。次に、Ｎ末端アミノ基を、５当量のＳＡＭＡ−ＯＰｆｐ及び５当量のＨＯＢｔを使用してＳ−アセチルメルカプト酢酸（ＳＡＭＡ）基で誘導体化した。反応は、トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳＡ）試験によってモニタリングした。陰性ＴＮＢＳＡ試験が戻った際に、樹脂を洗浄した（５×ＤＭＦ、３×ＤＣＭ及び３×ジエチルエーテル）。次に、樹脂を真空下で乾燥させた。樹脂支持体からのペプチドの切断は、ＴＦＡ：フェノール：ＴＩＰＳ：ＥＤＴ：水（９２：２：２：２：２）切断カクテルを使用して、ペプチドのアルギニン含有量に応じて２．５時間又は４時間実施した。切断後、樹脂を濾過により除去して、濾液を窒素流下でおよそ１ｍＬまで濃縮した。ペプチド生成物を冷エーテル中で沈殿させた後、それらを遠心分離して、３回洗浄した。ペプチド沈殿物を０．１％ｖ／ｖＴＦＡを含有する水５ｍＬ〜１０ｍＬ中に溶解させて、不溶性残基を遠心分離により除去した。ペプチドは、ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。
【０２１０】
多数の様々な化学部分を、タンパク質への結合に関してペプチドを誘導体化するのに使用することができ、これらは、ハロゲン化物（ブロモ、クロロ及びヨード）、マレイミド、スクシンイミジル、ヒドラジニル、オキシム、チオールのような反応性基を導入して、次に、ＫｇｐＡ１のようなタンパク質へ、その自然システイン残基を通じて、誘導体化されたペプチドを結合させるのに使用されるか、又は次に化学的連結を、ペプチド−タンパク質複合体を形成するように進行させる相補的な反応性基で誘導化されている。
【０２１１】
ＫＡ１へのＳＡＭＡ−ペプチドの結合。リン酸緩衝生理食塩水（０．１Ｍ  リン酸ナトリウム、０．９％のＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中に１０ｍｇ／ｍＬの組換えＫＡ１又はＲｇｐＡ−Ｋｇｐ複合体の他のアドヘシンドメインを含有する溶液に、０．１ｍＬのＤＭＦ中のｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）の１％ｗ／ｖ溶液を添加した。３０分後、未反応のＭＢＳを除去して、ＭＢＳ修飾ＫＡ１を、結合緩衝液（０．１Ｍ  リン酸ナトリウム、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ６．０）で平衡化したＰＤ１０カラム（Pharmacia、オーストラリア、ニュースサウスウェールズ州）を使用してゲル濾過により収集した。精製したＳＡＭＡ−ペプチド（１．３μモル）を、６Ｍ  グアニジンＨＣｌを含有する０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ６．０）２００μＬ中に溶解させて、８００μＬのＭｉｌｌｉＱ水で希釈して、ＭｉｌｌｉＱ水中に溶解した２５μＬの２Ｍ  ＮＨ２ＯＨ（４０当量）の添加によりｉｎ  ｓｉｔｕで脱保護した。収集したＭＢＳ−ＫＡ１を、脱保護したＳＡＭＡ−ペプチドと即座に反応させて、室温で１時間攪拌した。ペプチド−ＫＡ１複合体は、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で平衡化させたＰＤ１０カラムを使用してゲル濾過により未反応ペプチドと分離させて、凍結乾燥させた。反応は、エルマン試験を使用してモニタリングした。
【０２１２】
実施例７
抗体の調製。組換えタンパク質に対するポリクローナル抗血清は、タンパク質で皮下的に免疫感作することによってマウス中で産生される。マウスは、０日目に不完全フロイントアジュバント中の２５μｇのタンパク質で、３０日目に不完全フロイントアジュバント中の２５μｇのタンパク質で免疫感作する。免疫感作は、標準的な手順を使用して実行する。タンパク質に対して高い力価を有するポリクローナル抗血清が得られる。望ましい場合は、組換えタンパク質に対して特異的に導かれるモノクローナル抗体は、標準的な手順を使用して得られる。
【０２１３】
実施例８
抗体の生成のための免疫感作。６週齢〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス又はＣＤ１（スイス非近交系マウス）（１群当たりマウス１０匹）を、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中に乳化させた５０μｇのＫＡＳ２−ＬＡ１キメラ及び抗原のいずれかで皮下的に免疫感作した（皮下、１００μＬ）。３０日後、マウスを抗原（皮下注射、ＩＦＡ中に乳化）で追加免疫して、１２日後に、マウスを死滅させて、心臓（cardiac）を出血させて、血清を収集した。
【０２１４】
ＥＬＩＳＡによるサブクラス抗体の決定。マウス血清のサブクラス抗体応答を決定するために、０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（０．０１Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）（ｐＨ７．０）（ＰＢＳＴ）中のＫＡＳ２−ＬＡ１キメラ又はホルマリンで死滅させたポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０又はＲｇｐ−Ｋｇｐ複合体の５μｇ／ｍｌの溶液を使用して、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を三連で実施して、平底のポリビニルマイクロタイタープレート（Dynatech Laboratories、バージニア州、マクリーン）のウェルをコーティングした。コーティング溶液の除去後、２％（ｗｔ／ｖｏｌ）脱脂粉乳を含有するＰＢＳＴをウェルに添加して、コーティングされていないプラスチックを室温で１時間ブロックした。ウェルをＰＢＳＴで４回洗浄した後、０．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）脱脂粉乳を含有するＰＢＳＴ（ＳＫ−ＰＢＳＴ）中のマウス血清の段階希釈物を各ウェルへ添加して、室温で１６時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳＴで６回洗浄した後、マウスＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ又はＩｇＧ３に対するヤギＩｇＧ（Sigma、オーストラリア、ニューサウスウェールズ州）の２０００倍希釈物をＳＫ−ＰＢＳＴ中に添加して、室温で２時間結合させた。プレートをＰＢＳＴで６回洗浄して、ＳＫ−ＰＢＳＴ中のホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ウサギ抗ヤギ免疫グロブリン（Sigma、オーストラリア、ニューサウスウェールズ州）の５０００倍希釈物を各ウェルへ添加して、室温で１時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳＴで６回洗浄した後、結合抗体は、ＡＢＴＳ基質［０．００５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）過酸化水素を含有する８０ｍＭ  クエン酸中の０．９ｍＭ  ２．２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズ−チアゾリン−６）スルホン酸、ｐＨ４．０］を各ウェルへ添加することにより検出した。４１５ｎｍでの光学密度は、マイクロプレートリーダー（Bio-Radのマイクロプレートリーダー、モデル４５０）を使用して測定した。
【０２１５】
非近交系（ＣＤ１、スイス）マウスにおける組換えタンパク質ＫＡＳ２−ＫＬＡ１による免疫感作より誘導される抗体サブクラス応答。ＣＤ１（スイス）マウスをＫＡＳ２−ＬＡ１キメラで免疫感作させて、出血させて、遠心分離により血清を収集した。図６は、ＫＡＳ２−ＬＡ１キメラ、ホルマリンで死滅させたポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０細胞及びＲｇｐＡ−Ｋｇｐ複合体に対する抗体サブクラス反応性を示す。ＫＡＳ２−ＬＡ１キメラは、ＫＡＳ２−ＬＡ１キメラを認識する優勢ＩｇＧ１抗体応答を有する強力なＩｇＧ抗体を誘導し、かつＦＫ  ポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０細胞及びＲｇｐＡ−Ｋｇｐ複合体と強力に交差反応した（図６）。さらに、ＫＡＳ２−ＬＡ１キメラは、弱い免疫反応性だけを有するＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ３の抗原特異的な抗体を誘導した（図６）。
【０２１６】
実施例９
Ｋｇｐ構造モデルの開発及び活性部位表面に接近可能な配列の同定
本発明者らの研究により、Ｋｇｐプロテイナーゼ活性部位ペプチドが非常に免疫原性であり、ポルフィロモナス・ジンジバリス誘導性の骨量減少に対する高レベルの防御を誘導することが示された。ワクチン候補物として更なるプロテイナーゼ活性部位ペプチドを同定する試みでは、Ｓｙｂｙｌ７．３内のＯｒｃｈｅｓｔｒａｒプログラム一式を使用して、Ｋｇｐの触媒ドメインのモデルが開発された（図７）。モデルは、ポルフィロモナス・ジンジバリス由来のＲｇｐＢプロテイナーゼのＰＤＢ構造１ｃｒｖに基づくものであり、タンパク質は、２３．５８％のペアワイズ同一性を有し、Ｚスコアは２５．０９である（高信頼度モデル）。Ｍｅｔａ−ＰＰｉｓｐタンパク質相互作用サーバは、Ｋｇｐに関する２つのタンパク質間相互作用表面を予測する：基質結合表面（ＲｇｐＢに見られるような）及びＫｇｐに特有の第２の表面。ＲｇｐＢモデルとＫｇｐモデルとの間の主な差は、第２の相互作用表面を構成するループ、及び第２の相互作用表面内に収まるＫｇｐではモデリングすることができない１９残基ギャップ（Ｖａｌ５２６〜Ｐｈｅ５４５）に存在する。図７は、Ｋｇｐのプロテイナーゼ活性部位周辺の表面に接近可能な配列を示すより厚みのあるリボンを用いたＫｇｐモデルを示し、表面に接近可能な配列は、Ａｓｐ３３８〜Ｇｌｎ３９４、Ｌｅｕ４２１〜Ａｌａ４２３、Ａｌａ４５１を有するＡｌａ４４３〜Ｇｌｕ４４７、Ａｓｎ５１０〜Ｔｒｐ５１３及びＴｙｒ５８０を有するＩｌｅ５７０〜Ｇｌｙ５７７であることが見出された。モデル（図６）から、ＫＡＳ２（Ａ）とともに、３つの他の配列ＫＡＳ４（Ａｓｐ３８８〜Ｖａｌ３９５）（Ｂ）、ＫＡＳ５（Ａｓｎ５１０〜Ａｓｐ５１６）（Ｃ）及びＫＡＳ６（Ｉｌｅ５７０〜Ｔｙｒ５８０）（Ｄ）が優性であり、ワクチン標的であるのに十分な長さを有することが明らかである。したがって、配列中にこれらのペプチドそれぞれを有する組換えキメラタンパク質を生産し、ＫＬＡ１のＮ末端上へ結合させて、マルチＫＡＳ−ＫＬＡ１を生産することができ、これを使用して免疫応答を誘導して、したがってポルフィロモナス・ジンジバリス関連の疾患又は状態に対して防御することができる。
【０２１７】
実施例１０
触媒部位に隣接する免疫原性領域を同定するためのＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼをモデリングするプロセス。
【０２１８】
Ａｒｇ−Ｘプロテイナーゼの三次元構造は、Eichinger, A、Beisel HG、Jacob U、Huber R、Medrano FJ、Banbula A、Potempa J、Travis J、Bode W.「ジンジパインＲの結晶構造：カスパーゼ様フォールドを有するＡｒｇ特異的な細菌システインプロテイナーゼ（Crystal structure of gingipain R: an Arg-specific bacterial cysteine proteinase with caspase-like fold）」．EMBO J. 1999 Oct 15; 18(20):5453-62の方法に従って決定した。
【０２１９】
実施例１１
以下は抗体を含有する歯磨きペースト配合物の一例である。
成分                                                                ％（ｗ／ｗ）
リン酸二カルシウム二水和物                                          ５０．０
グリセロール                                                        ２０．０
カルボキシメチルセルロースナトリウム                                １．０
ラウリル硫酸ナトリウム                                              １．５
ナトリウムラウロイルサルコニセート                                  ０．５
香料                                                                １．０
サッカリンナトリウム                                                ０．１
グルコン酸クロルヘキシジン                                          ０．０１
デキストラナーゼ                                                    ０．０１
特異的抗体を含有するヤギ血清                                        ０．２
水                                                                  残り
【０２２０】
実施例１２
以下は歯磨きペースト配合物の一例である。
成分                                                                ％（ｗ／ｗ）
リン酸二カルシウム二水和物                                          ５０．０
ソルビトール                                                        １０．０
グリセロール                                                        １０．０
カルボキシメチルセルロースナトリウム                                １．０
ラウリル硫酸ナトリウム                                              １．５
ナトリウムラウロイルサルコニセート                                  ０．５
香料                                                                １．０
サッカリンナトリウム                                                ０．１
モノフルオロリン酸ナトリウム                                        ０．３
グルコン酸クロルヘキシジン                                          ０．０１
デキストラナーゼ                                                    ０．０１
特異的抗体を含有するウシ血清                                        ０．２
水                                                                  残り
【０２２１】
実施例１３
以下は歯磨きペースト配合物の一例である。
成分                                                                ％（ｗ／ｗ）
リン酸二カルシウム二水和物                                          ５０．０
ソルビトール                                                        １０．０
グリセロール                                                        １０．０
カルボキシメチルセルロースナトリウム                                １．０
ラウロイルジエタノールアミド                                        １．０
スクロースモノラウレート                                            ２．０
香料                                                                １．０
サッカリンナトリウム                                                ０．１
モノフルオロリン酸ナトリウム                                        ０．３
グルコン酸クロルヘキシジン                                          ０．０１
デキストラナーゼ                                                    ０．０１
特異的抗体を含有するウシ血清                                        ０．１
水                                                                  残り
【０２２２】
実施例１４
以下は歯磨きペースト配合物の一例である。
成分                                                                ％（ｗ／ｗ）
ソルビトール                                                        ２２．０
アイリッシュモス                                                    １．０
水酸化ナトリウム（５０％）                                          １．０
Ｇａｎｔｒｅｚ                                                      １９．０
水（脱イオン水）                                                    ２．６９
モノフルオロリン酸ナトリウム                                        ０．７６
サッカリンナトリウム                                                ０．３
ピロホスフェート                                                    ２．０
アルミナ水和物                                                      ４８．０
香料オイル                                                          ０．９５
マウスモノクローナル抗体                                            ０．３
ラウリル硫酸ナトリウム                                              ２．００
【０２２３】
実施例１５
以下は液体歯磨きペースト配合物の一例である。
成分                                                                ％（ｗ／ｗ）
ポリアクリル酸ナトリウム                                            ５０．０
ソルビトール                                                        １０．０
グリセロール                                                        ２０．０
香料                                                                １．０
サッカリンナトリウム                                                ０．１
モノフルオロリン酸ナトリウム                                        ０．３
グルコン酸クロルヘキシジン                                          ０．０１
エタノール                                                          ３．０
特異的抗体を含有するウマＩｇ                                        ０．２
リノール酸                                                          ０．０５
水                                                                  残り
【０２２４】
実施例１６
以下は洗口液配合物の一例である。
成分                                                                ％（ｗ／ｗ）
エタノール                                                          ２０．０
香料                                                                １．０
サッカリンナトリウム                                                ０．１
モノフルオロリン酸ナトリウム                                        ０．３
グルコン酸クロルヘキシジン                                          ０．０１
ラウロイルジエタノールアミド                                        ０．３
特異的抗体を含有するウサギＩｇ                                      ０．２
水                                                                  残り
【０２２５】
実施例１７
以下は洗口液配合物の一例である。
成分                                                                ％（ｗ／ｗ）
Ｇａｎｔｒｅｚ  Ｓ−９７                                            ２．５
グリセリン                                                          １０．０
香料オイル                                                          ０．４
モノフルオロリン酸ナトリウム                                        ０．０５
グルコン酸クロルヘキシジン                                          ０．０１
ラウロイルジエタノールアミド                                        ０．２
マウスモノクローナル抗体                                            ０．３
水                                                                  残り
【０２２６】
実施例１８
以下はロゼンジ配合物の一例である。
成分                                                                ％（ｗ／ｗ）
糖                                                                  ７５〜８０
トウモロコシシロップ                                                １〜２０
香料オイル                                                          １〜２
ＮａＦ                                                              ０．０１〜０．０５
マウスモノクローナル抗体                                            ０．３
ステアリン酸Ｍｇ                                                    １〜５
水                                                                  残り
【０２２７】
実施例１９
以下は歯肉マッサージクリーム配合物の一例である。
成分                                                                ％（ｗ／ｗ）
ホワイトワセリン                                                    ８．０
プロピレングリコール                                                ４．０
ステアリルアルコール                                                ８．０
ポリエチレングリコール４０００                                      ２５．０
ポリエチレングリコール４００                                        ３７．０
モノステアリン酸スクロース                                          ０．５
グルコン酸クロルヘキシジン                                          ０．１
マウスモノクローナル抗体                                            ０．３
水                                                                  残り
【０２２８】
実施例２０
以下はチューイングガム配合物の一例である。
成分                                                                ％（ｗ／ｗ）
ガム基剤                                                            ３０．０
炭酸カルシウム                                                      ２．０
結晶性ソルビトール                                                  ５３．０
グリセリン                                                          ０．５
香料オイル                                                          ０．１
マウスモノクローナル抗体                                            ０．３
水                                                                  残り
【０２２９】
実施例２１
以下は医薬配合物の一例である。
成分                                                                ％（ｗ／ｗ）
ヒト化特異的モノクローナル抗体                                        １０
無菌リン酸緩衡生理食塩水                                              ９０
【０２３０】
実施例２２
以下は歯周ジェル配合物の一例である。
成分                                                                ％（ｗ／ｗ）
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７                                          ２０．０
ステアリルアルコール                                                ８．０
特異的抗体                                                          ３．０
コロイド二酸化ケイ素（Ａｅｒｏｓｉｌ  ２００）                      １．０
グルコン酸クロルヘキシジン                                          ０．１
水                                                                  残り
【０２３１】
実施例２３
以下は歯周ジェル配合物の一例である。
成分                                                                ％（ｗ／ｗ）
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７                                        ２０．０
ステアリルアルコール                                                ８．０
特異的抗体                                                          ３．０
コロイド二酸化ケイ素（Ａｅｒｏｓｉｌ  ２００）                      １．０
パモ酸オキサンテル                                                  ０．１
水                                                                  残り
【０２３２】
本発明は本明細書中で詳細に説明しているが、実施例は単に例示目的にすぎないと理解すべきである。分子生物学、歯の診断及び関連の関連分野の当業者にとって明らかな本発明の実施形態の他の変更形態が本発明の範囲内であることが意図される。
【０２３３】
本明細書で開示及び規定される本発明は、明細書若しくは図面で言及される又は明細書若しくは図面から明らかな２つ以上の個々の特徴の全ての代替的な組合せにまで及ぶことが理解される。これらの様々な組合せは全て本発明の様々な代替的な態様を構成する。
【０２３４】
【表１１】
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【０２３５】
本明細書で開示及び規定される本発明は、明細書若しくは図面で言及される又は明細書若しくは図面から明らかな２つ以上の個々の特徴の全ての代替的な組合せにまで及ぶことが理解される。これらの様々な組合せは全て本発明の様々な代替的な態様を構成する。
【配列表フリーテキスト】
【０２３６】
配列番号１：ＸはＧにもＳにもなり得る
ＸはＳにもＡにもなり得る
ＸはＳにもＬにもなり得る
ＸはＬにもＶにもなり得る
ＸはＡにもＴにもなり得る
ＸはＴにもＳにもなり得る
ＸはＶにもＬにもなり得る
ＸはＤにもＮにもなり得る
配列番号２：ＸはＶにもＡにもなり得る
配列番号２７：ＸはＧにもＳにもなり得る
ＸはＳにもＡにもなり得る
ＸはＳにもＬにもなり得る
配列番号２８：ＸはＧにもＳにもなり得る
ＸはＳにもＡにもなり得る
ＸはＳにもＬにもなり得る
ＸはＬにもＶにもなり得る
ＸはＡにもＴにもなり得る
ＸはＴにもＳにもなり得る
ＸはＶにもＬにもなり得る
ＸはＤにもＮにもなり得る
配列番号２９：ＸはＧにもＳにもなり得る
ＸはＳにもＡにもなり得る
ＸはＳにもＬにもなり得る
ＸはＬにもＶにもなり得る
配列番号３１：ＸはＶにもＡにもなり得る
配列番号３２：ＸはＶにもＡにもなり得る
配列番号３３：ＸはＶにもＡにもなり得る
配列番号６４：ＸはＳにもＹにもなり得る
ＸはＹにもＳにもなり得る
ＸはＰにもＳにもなり得る
ＸはＫにもＱにもなり得る
ＸはＩにもＶにもなり得る
配列番号６６：ＸはＶにもＩにもなり得る
配列番号６８：ＸはＮにもＤにもなり得る
ＸはＳにもＹにもなり得る
ＸはＳにもＰにもなり得る
配列番号７９：ＸはＮＰにもＮＰＮＰにもＮＰＮＰＮＰにもＮＰＮＰＮＰＮＰにもＮＰＮＰＮＰＮＰＮＰにもＮＰＮＰＮＰＮＰＮＰＮＰにもなり得る
【図１】
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【図２】
0005977677.tif 000036
【図３】
0005977677.tif 000037
【図４】
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【図５】
0005977677.tif 000039
【図６】
0005977677.tif 000040
【図７】
0005977677.tif 000041
【配列表】
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