(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＨＣクラスＩ分子に結合し、ＨＬＡ−Ｇ活性を有する結合体であって、該結合体は第２の部分に接続した第１の部分を含んでなり、前記第１の部分は、ＭＨＣクラスＩ分子に結合し、そして前記第２の部分は、ＨＬＡ−Ｇ活性を有し、ＭＨＣクラスＩ分子はA*1101、A*2402、C*0702、C*0102、A*3303、C*0801、C*0304、A*0201、B*4001、C*0401、B*5801、B*4601、B*5101、C*0302、B*3802、A*0207、B*1501及びA*0206から選択される対立遺伝子によりコードされる、前記結合体。
【請求項２】
前記第１の部分が、抗体又は抗体の断片を含む、請求項１に記載の結合体。
【請求項３】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項２に記載の結合体。
【請求項４】
前記抗体が、抗原結合性免疫グロブリンの断片である、請求項２又は３のいずれか１項に記載の結合体。
【請求項５】
前記モノクローナル抗体が、ハイブリドーマＢＢ７．２又はクローンＢ１１から誘導される、請求項２から４のいずれか１項に記載の結合体。
【請求項６】
前記第１の部分が、アプタマーを含む、請求項１に記載の結合体。
【請求項７】
前記第１の部分及び第２の部分が、リンカーによって接続されている、請求項１から６のいずれか１項に記載の結合体。
【請求項８】
前記リンカーが、ペプチドである、請求項７に記載の結合体。
【請求項９】
前記第２の部分が、ＨＬＡ−Ｇ又はその断片を含む、請求項１から８のいずれか１項に記載の結合体。
【請求項１０】
前記第２の部分が、配列番号：１又は２として与えたポリペプチド配列を含む、請求項９に記載の結合体。
【請求項１１】
前記第１の部分及び第２の部分が、共有又は非共有の結合相互作用によって接続している、請求項１から１０のいずれか１項に記載の結合体。
【請求項１２】
前記第１の部分及び第２の部分間の接続が、ビオチン及びストレプトアビジンによって仲介される結合相互作用による、請求項１１に記載の結合体。
【請求項１３】
前記第１の部分が、ビオチンに連結し、そして第２の部分がストレブトアビジンに連結している、請求項１２に記載の結合体。
【請求項１４】
抗−ＨＬＡ抗体の重鎖及び軽鎖の変動領域が、ストレプトアビジンに連結し、そしてＨＬＡ−Ｇの細胞外領域が、ビオチンに連結している、請求項１３に記載の結合体。
【請求項１５】
前記ＭＨＣクラスＩ分子がＨＬＡ−Ａ２遺伝子によってコードされる、請求項１に記載の結合体。
【請求項１６】
前記ＭＨＣクラスＩ分子がＨＬＡ−Ａ２遺伝子によってコードされ、前記第２の部分がＨＬＡ−Ｇ又はその断片を含む、請求項１に記載の結合体。
【請求項１７】
前記ＭＨＣクラスＩ分子がＨＬＡ−Ａ２遺伝子によってコードされ、前記第２の部分がＨＬＡ−Ｇ四量体である、請求項１に記載の結合体。
【請求項１８】
請求項１から１７のいずれか１項に記載の結合体を含む医薬組成物。
【請求項１９】
移植患者における移植片拒絶を防止するために使用される請求項１８に記載の医薬組成物であって、前記患者に移植手術の前、その最中及び／又はその後に投与される、前記組成物。
【請求項２０】
移植患者における移植片に対する耐性を誘発するために使用される請求項１８に記載の医薬組成物であって、前記患者に移植手術の前、その最中及び／又はその後に投与される、前記組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書中に引用される全ての文書は、参考文献としてその全てが援用される。
本発明は、免疫調節の分野に関する。特に、本発明は、患者における器官又は組織移植に対する免疫反応を抑制することが可能な治療的分子に関する。本発明は、更に患者における器官又は組織移植に対する耐性を誘発することにも関する。
【背景技術】
【０００２】
移植は、最も挑戦的で、そして複雑な医学の分野の一つであり、そして提供者から受容者の患者への組織又は器官の移動に関係する。これは、受容者の損傷した又は欠陥のあるな組織或いは器官を機能的なものと置換え、そして受容者の健康及び福利を有意に改良することができる可能性を提案する。
【０００３】
然しながら、遺伝子的に同一でない哺乳動物間の器官又は組織移植は、通常免疫学的拒絶から起こる臨床的合併症を伴う。免疫学的拒絶は、提供者の外来性（異質遺伝子）抗原に対する受容者の細胞仲介免疫系の感作によって起こる。特に、受容者の免疫系は、受容者の組織（移植片）の表面に提示される主要組織適合体（ＭＨＣ）分子と反応する。
【０００４】
ＭＨＣ分子は、全ての有顎脊椎動物の細胞の表面に発現し、そして細胞障害性Ｔ細胞に対する抗原を表示する原因である。ＭＨＣ分子をコードする遺伝子は、遺伝子構成及びゲノム配列は広く変化するが、脊椎動物のゲノムのＭＨＣ領域において見いだされる。
【０００５】
ヒトにおいて、これらの遺伝子は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子と呼ばれる。最も集中して研究されたＨＬＡ遺伝子は、九つのいわゆる古典的ＭＨＣ遺伝子：ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＰＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＡ、及びＨＬＡ−ＤＲＢ１である。ヒトにおいて、ＭＨＣは、三つの領域：クラスＩ、クラスＩＩ、及びクラスＩＩＩに分けられる。Ａ、Ｂ、及びＣ遺伝子はＭＨＣクラスＩに属し、一方六つのＤ遺伝子はクラスＩＩに属する。
【０００６】
特にヒトのＭＨＣ遺伝子の最も著しい特徴の一つは、その中に、そして特に九つの古典的遺伝子中に見出される驚異的な対立遺伝子の多様性である。ヒトにおいて、著しく多様な遺伝子座であるＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及びＨＬＡ−ＤＲＢ１は、それぞれおよそ２５０、５００、及び３００組の既知の対立遺伝子を有する。ＭＨＣ遺伝子は、ゲノム中で最も多形性である。免疫学的拒絶の原因であるものは、この多様性である。
【０００７】
集団中に提示される大きい対立遺伝子の変動は、同種移植片上及び受容者の身体に発現する全てのＨＬＡ分子間の完全なマッチが達成される可能性が殆どないことを意味する。異質遺伝子型の移植の提供者及び受容者間のＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩのミスマッチは、慢性の移植片拒絶の危険度を規定することにおいて、これはＭＨＣクラスＩ分子に対して特に真実であるが、重要な役割を演じる。例えば、移植に続いて、受容者による非自己のＭＨＣクラスＩ分子の認識は、免疫反応を引き起こし、これは、この細胞がアポトーシスの標的となることをもたらす。これは、最終的に同種移植片の免疫学的拒絶に導く。ＨＬＡクラスＩ分子のＡ、Ｂ及びＣが支配的であるが、クラスＩＩ分子のＨＬＡ−ＤＲが、特に固形の器官の移植片、例えば腎臓に対して特に重要であるように見受けられる。
【０００８】
免疫学的拒絶は、通常、移植の前及びその後の両方に受容者に免疫抑制剤を投与することによって緩和することができる。免疫抑制剤は、受容者の免疫系の活性を減少し、これによって提供者の組織又は器官を攻撃することを防止し、そして従ってより良好な移植片の保持を可能にする。然しながら、免疫抑制剤の投与は、患者が同種移植片に対する長期の耐性を産生することはもたらさず、そして従って殆どの患者は、その移植片の寿命（典型的には５−１０年）又は患者の人生の残りの間、免疫抑制治療を受けなければならない。
【０００９】
免疫抑制剤は、主としてその非特異性のために、多くの合併症を起こすことが知られている。例えば、公知の免疫抑制剤であるプレドニゾロンのようなコルチコステロイドに伴う全身性副作用は、挫創、線条（皮膚線条）、クッシング様顔貌（顔面の脂肪組織の蓄積）、体幹肥満、容易な挫傷、骨粗鬆症及び体重増加を含む。更に、免疫抑制治療を受けている患者は、日和見感染症に感受性であり、これは、未治療のまま放置すると、全身性感染及び死を急速にもたらし得る。
【００１０】
個々の患者に対する薬物投与計画を調整することは、免疫抑制治療に伴う副作用を管理することを援助することができるが、しかしこれは、困難で、そして費用のかかる過程である。
【００１１】
慣用的な免疫抑制治療に伴う制約を克服するための別の努力がなされている。例えば、これらの方法は、一過性キメラ現象、及び操作された細胞栄養芽層由来の血管内細胞の同時移植を含む。
【００１２】
一過性キメラ現象は、移植片受容者の両親又は同胞のような遺伝子的に関連する提供者からの骨髄の静脈内注入と一緒に移植される同種移植片を含む。然しながら、この方法は、潜在的な骨髄提供者が、受容者に対して密接に適合するＨＬＡハプロタイプを持つ者に制約されるために高度に制限される。この方法は、有意な罹患率を保有し、そして免疫抑制剤を受ける運命の患者の免疫適合性細胞の注入のために、移植片対宿主及び自己免疫性疾病をもたらすことができる。
【００１３】
操作された細胞栄養芽層由来の血管内細胞の同時移植は、更に局在的免疫抑制及び改良された移植片保持を提供するために使用されている。然しながら、この方法は、更に同種移植片に対する短期の耐性を提供するだけの制約に悩まされる。更に、保護効果は、血管の免疫性攻撃に制限される。免疫細胞が血管から組織に血管外遊出した場合、この方法は移植片に対して保護を提供しないものである。更にこの方法は、移植片の部位においてのみ局所的効果を有するものであり、そして流入領域リンパ節において起こるアロ感作に影響しないものである。移植片において局所的に起こるいずれもの感作は、血管の内部では起こらないものであるが、しかし血管外区画の移植片自体の微小環境において起こるものである。
【００１４】
従って、慣用的な免疫抑制治療に伴う不都合を克服し、そして好ましくは長期の同種移植片耐性を誘発する手段を提供する治療剤に対する必要性が当技術において存在する。
【発明の概要】
【００１５】
本発明人は、驚くべきことに妊娠中に母体の免疫系から胎児を保護する機構を、受容者の免疫系から提供者の移植片を保護するために活用することができることを見出した。
従って、本発明は、第２の部分に接続した第１の部分を含んでなる結合体（コンジュゲート）を提供し、ここにおいて第１の部分はＭＨＣに結合し、そして第２の部分はＨＬＡ−Ｇ活性を有する。
【００１６】
胎児の耐性の原因である機構の側面を適合することによって、本発明人は、治療分子（“Ｇ体”と呼ばれる）を製造し、これは、慣用的な免疫抑制治療に伴う不都合を克服し、そして改良された長期の移植片耐性の手段を提供する。従って本発明の結合体は、二つの機能性末端を有する単一の分子を創造するための二つの機能的に活性な部分の融合物である。一つは、移植された移植片中の提供者の細胞の異質遺伝子型のＨＬＡ分子に特異的に結合し、そして他方は、受容者の免疫細胞の表面の阻害性受容体と相互作用するためのＨＬＡ−Ｇ活性を示す。簡単には、本発明の結合体は、多数の機構：ｉ）移植片を、その細胞を被覆することによって免疫攻撃から保護し、従って本発明の第２の部分（ＨＬＡ−Ｇ活性を持つ）がＮＫ、ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞のような受容者のエフェクター細胞を阻害ことを可能にする；ｉｉ）移植片の同種異系抗原に対する感作を防止する；及びｉｉｉ）免疫寛容誘発性の提供者の異質遺伝子型ＤＣ又は移植片の同種異系抗原と共に付加された免疫寛容誘発性の受容者のＤＣを産生することによる長期の耐性の誘発によってその効果を仲介する。
【００１７】
同種移植片拒絶の最も普通の型は、Ｔ細胞が中心的役割を演じる細胞の免疫機構によって仲介される。免疫系の同一成分は、造血幹細胞移植における移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）及び有意な数の提供者のリンパ系組織を含有する器官移植、例えば肝臓移植のアロ反応性に関係する。Ｔ細胞の両方の主要な型、即ちＴＨ１型のＣＤ４ヘルパー細胞及びアロ反応性の細胞障害性ＣＤ８エフェクター細胞は、器官拒絶及びＧＶＤＨにおける細胞の免疫アロ反応性に寄与する。（Ｌｅ  Ｍｏｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ７３：１３７３−１３８１）。
【００１８】
アロ反応性免疫反応に対して二つの相、即ち感作及びエフェクター相がある。Ｔ細胞による非自己認識の初期の現象は、二つの重要な経路によって起こることができる。Ｔ細胞は、提供者の抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に提示される異質遺伝子型ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）分子を認識することができ、“直接的”非自己認識として知られる。対照的に、Ｔ細胞は、受容者のＡＰＣのＨＬＡ分子上に提示される提供者由来のペプチドを認識することができ、これは、“間接的”非自己認識と呼ばれる。認識の両方の経路は、アロ反応性免疫反応の感作及びエフェクター相において重要である。
【００１９】
同種移植片拒絶及びＧＶＤＨに関係する多数のＴ細胞感作並びにエフェクター機構が存在し、これらは、以下のように要約される。
同種感作中の細胞の移動
提供者の移植された組織は、常在性未熟樹状細胞（ＤＣ）を含有し、これは、移植過程そのものからの組織損傷によって開始される炎症シグナルに反応して活性化される。その後、“パッセンジャー”白血球（Ｈａｒｔ  ＆  Ｆａｂｒｅ（１９８１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５４：３４７−３６１）として知られるこれらのＤＣは、迅速に移植片から受容者の二次リンパ組織に遊走し、そして高いレベルのクラスＩ及びＩＩのＨＬＡ分子、並びに同時刺激性のＣＤ８０及びＣＤ８６のような成熟した（活性化した）ＤＣの特徴を獲得する（Ｌａｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９０）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７１：３０７−３１４）。二次リンパ組織において、これらのＤＣは、未処置のアロ反応性の提供者のＴ細胞を刺激する（直接的非自己認識）。受容者の未処置のＴ細胞は、血液及び二次リンパ組織間を常に循環する。これらが二次リンパ組織中の提供者のＡＰＣによって刺激された場合、これらは、エフェクターＴ細胞に分化し、これは、移植された移植片を含む末梢組織経由して循環する能力を獲得する。固形の血管新生化移植後の早い時期に、リンパ管の再確立に時間を要するために、受容者のＴ細胞の感作が、提供者の内皮細胞及びＤＣによって移植片自体内で起こることができる。
【００２０】
移植後、提供者のパッセンジャー白血球は、最終的に時間と共に枯渇し、従って直接的非自己認識の役割は減少する。然しながら、受容者のＡＰＣは、炎症性サイトカインに反応して移植片に遊走し、そして移植の部位でケモカインが放出される。これらの細胞が移植片を通過するとき、これらは損傷した組織からの残骸を貪食し、そして移植片によって放出される可溶性抗原を取り込む。これらの内部に取入れられた提供者由来の抗原は、受容者のＡＰＣによって加工され、そして二次リンパ組織中の未処置の受容体のＴ細胞に提示される（間接的非自己認識）（Ｂｅｎｉｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：３０５−３０８）。間接的経路は、移植片が持続する限り、提供者の抗原の提供のために使用可能であり、そしてその動態及び大きさは直接的経路より小さいものであることができるが、時間と共に減少しない。
【００２１】
移植片拒絶及びＧＶＨＤにおける直接的非自己認識
ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞の両方のＴ細胞受容体（ＴｃＲ）は、それぞれクラスＩＩ及びＩ変種の提供者のＡＰＣ上の異質遺伝子型ＨＬＡ分子と相互作用する。両方の種類のＴ細胞は、完全に活性化されるために提供者のＡＰＣからの同時刺激シグナルを必要とする。通常ＤＣである専門の提供者のＡＰＣは、二次リンパ組織中でこのようなシグナルを提供する。ＴＨ１型のＣＤ４Ｔ細胞は、細胞障害性のアロ反応性ＣＤ８Ｔ細胞の増殖、分化及び活性化を刺激するための“援助”を提供する。この援助は、サイトカイン、例えばＩＬ−２の分泌及びインターフェロン−ガンマによるＡＰＣの許可の形態をとり、そしてＣＤ４０リガンドによりＣＤ４０を架橋し、同様にＡＰＣが、細胞障害性ＣＤ８０エフェクターＴ細胞を更に活性化することができるようにし、これは次いで移植片を損傷することができる（図１）。然しながら、ＣＤ８Ｔ細胞は、同種移植片を拒絶することができ、そしてより遅い動態にもかかわらず、ＣＤ４ヘルパー細胞の非存在においてＧＶＨＤを誘発する（図２）。
【００２２】
間接的非自己認識
かなりの証拠が移植片拒絶におけるＣＤ４Ｔ細胞仲介の非自己認識の間接的経路を支持する（Ｊａｎｋｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．１６：４２９−４３９及びＦａｎｇｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１７５：１５２１−１５２９）。これは、ＣＤ４Ｔ細胞がＢ細胞に援助を提供することを可能にすることにより、クラス転換された同種異系抗体反応の産生において主要な役割を演じる。多くの研究が、間接的経路による同種異系抗原に反応するＴ細胞の前駆体の出現頻度が、臨床の拒絶と最良の相関を提供することを証明している。間接的非自己認識は、部分的に、同種異系抗体の重要性のために、そして部分的に、移植された移植片の天然の過程中の受容者のＡＰＣによる提供者のＡＰＣの最終的な置換のために、慢性的拒絶の主要な経路であると考えられる。
【００２３】
ＡＰＣに対して外来性である抗原（提供者由来のＨＬＡペプチドのような）は、通常ＣＤ４Ｔ細胞によって認識されるクラスＩＩのＨＬＡ分子上に提示される。対照的に、ＡＰＣに対して内在性の抗原、即ち細胞質ゾル中で生産されたタンパク質は、通常ＣＤ８Ｔ細胞によって認識されるクラスＩのＨＬＡ分子上に提示される（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ（１９９３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７７：１６４３−１６５０及びＮｅｅｆｊｅｓ  ＆  Ｐｌｏｅｇｈ（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １３：１７９−１８４））。専門のＡＰＣ、特にＤＣにおいて、外来性抗原は、更にＣＤ８Ｔ細胞による認識のためにクラスＩのＨＬＡ分子上に提示される（Ｂｅｖａｎ（１９７６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４３：１２８３−１２８８）及びＳｉｇａｌ  ＆  Ｒｏｃｋ（２０００）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２：１１４３−１１５０）。これは、交差提示として知られている。ＣＤ８Ｔ細胞による間接的非自己認識は、ＣＤ８Ｔ細胞によって認識されるクラスＩのＨＬＡ分子上の受容者のＤＣによる外来性抗原（提供者由来ＨＬＡペプチド）の提示を含み、これは、交差提示されたＣＤ８Ｔ細胞と呼ばれる（図３）。この経路は実験的に証明され、そして有効な細胞障害性のために共有されたクラスＩの対立遺伝子を必要とする。然しながら、クラスＩの共有がなくとも、交差提示されたＣＤ８Ｔ細胞は、血管再建された移植片を内張りする受容者の内皮細胞によって提示される提供者由来の同種異系抗原の認識、及び他の間接的エフェクター機構によって、同種移植片を拒絶することができる。
【００２４】
本発明による結合体は、先に記載した経路中の多数の点において移植片拒絶の機構を破壊することによって作用する。更に、この結合体は、アロ特異的Ｔ細胞の誘発による免疫反応を制御する最も重要な機構の一つを利用する。移植片上の細胞に特異的であるＭＨＣ分子に貪欲に結合するその能力によって、結合体は、この異質遺伝子型分子に富んだ微小環境において高い濃度を達成する。例えば、提供者がＨＬＡ−Ａ２陽性であり、そして受容者がそうでない場合の提供者−受容者の組合せにおいて、クラスＩのＨＬＡ分子（Ａ２のような）が、全ての有核細胞上に広範に発現するため、結合体は、提供者のＡＰＣの表面、並びに移植片の全ての柔細胞上のＨＬＡ−Ａ２に結合する。対照的に、これは、ＨＬＡ−Ａ２分子に欠けるものである受容者の細胞表面には結合しないものである。提供者のＡＰＣＳの表面上のＭＨＣ（この例ではＨＬＡ−Ａ２）に結合することによって、結合体は、外来ＭＨＣを遮蔽し、そして従って、この分子の直接的非自己認識に干渉し、従って直接経路によるＣＤ８Ｔ細胞の感作を防止する。Ａ２に特異的であるいずれもの直接的に感作されたＣＤ８Ｔ細胞は、その表面に結合した結合体のために、この移植片の柔組織の表面上の分子を認識することができず、これは、直接のＡ２−特異的細胞障害性を防止する。結合体により被覆された提供者のＡＰＣの表面上の他の異質遺伝子型ＨＬＡ分子の直接認識は、異質遺伝子型ＣＤ８Ｔ細胞の刺激ではなく阻害をもたらす。これは、相互作用がＴ細胞を阻害し、そして制御性Ｔ細胞を誘発することが実験的に示されているＨＬＡ−Ｇ陽性ＡＰＣを模倣するものであるため、結合体のＨＬＡ−Ｇ領域の阻害特性により達成されるものである（図４及び５）（ＬｅＭａｏｕｌｔ（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１：７６０４−７６０９）。
【００２５】
一つの側面において、本発明の結合体は、細胞表面上の阻害性白血球免疫グロブリン様受容体（ＬＩＬＲ）と相互作用するそのＨＬＡ−Ｇ活性により提供者のＡＰＣを阻害する（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ６４：２１５−２２５）。その後、これらの提供者のＡＰＣは、免疫寛容誘発性となり、そして提供者の異質遺伝子型ＨＬＡ分子に対して特異的である受容者の制御性Ｔ細胞、即ち、提供者特異的Ｔ細胞耐性を誘発する。この場合、異質遺伝子型の提供者のＨＬＡ分子は、受容者のＴ細胞に直接提示される（直接的非自己認識、図６）。結合体は、その官能性領域の両方により提供者のＡＰＣと相互作用する。ＨＬＡ−Ｇ／ＬＩＬＲ相互作用（上記を参照されたい）に加えて、結合体は、その抗−ＭＨＣ特性により提供者のＡＰＣに結合する（再びこの例においてはＨＬＡ−Ａ２）。これは、ＨＬＡ−Ａ２分子を少なくとも部分的に遮蔽する。いずれもの遮蔽されていない分子は、免疫寛容誘発性の提供者のＡＰＣによって提示され（ＨＬＡ−Ｇの結合のため）、これは、ＨＬＡ−Ａ２特異的耐性を誘発するものである。
【００２６】
ＨＬＡ−Ａ２に結合する能力は、更に本発明の結合体が、死んだ提供者の細胞（ＡＰＣ及び柔細胞の両方）、並びに提供者の組織から脱落したＨＬＡ−Ａ２を含有するいずれもの粒子状物質（細胞残骸）を被覆することを可能にする。これらの粒子が食作用性細胞によって清掃されるに従って、結合体のＨＬＡ−Ｇ活性は、これらの自然免疫細胞上の阻害性ＬＩＬＲと結合するものである。従って、ＨＬＡ−Ａ２及び他の異種遺伝子型の提供者の分子を含む提供者由来のペプチドは、加工され、そして免疫寛容誘発性であるものである結合体で調整された受容者のＡＰＣによって提示されるものである（間接的非自己認識、図７）。これらのＡＰＣは、提供者特異的な適応型制御性Ｔ細胞（Ｔｒ１）を誘発し、これは、移植片耐性を促進するものである（図８）。結合体の免疫グロブリン成分のＦｃ部分の好ましい非存在のために、移植片のＭＨＣとの結合は、自然免疫細胞上のＦｃ受容体を活性化する補体又は結合の活性化をもたらさないものである。従って、炎症性媒体は放出されないものである。同様な機構は、提供者の組織から放出される外来性ＭＨＣを含有する可溶性巨大分子成分の事例において操作されるものである。結合体は、このような分子と共に阻害性免疫結合体を形成し、従って免疫寛容誘発性同種異系抗原の提示を向上する。
【００２７】
結合体は、ＧＶＨＤの場合、同様な保護的機構を誘発する。
好ましくは、本発明の結合体の第１の部分は、抗体を含んでなる。好ましくは、抗体は、モノクローナル抗体である。好ましくは抗体は、抗原結合性免疫グロブリンの断片である。好ましくは、抗原結合性免疫グロブリン断片は、Ｆｃ部分を含まない。
【００２８】
結合体の第１の部分は、アプタマーを含んでいてもよい。
好ましくは結合体の第１に部分及び第２の部分は、リンカーによって接続されている。好ましくはリンカーはペプチドである。
【００２９】
好ましくは本発明の結合体の第２の部分は、ＨＬＡ−Ｇ又はその断片を含んでなる。好ましくは第２の部分は、配列番号：１又は配列番号：２として与えたポリペプチド配列であるか、或いはその断片又は変種を含んでなる。
【００３０】
本発明は、更に本発明の結合体を含んでなる医薬組成物を含む。
本発明は、更に本発明の結合体又は医薬組成物を、移植手術の前、最中及び／又は後に患者に投与することを含んでなる、移植患者における移植片拒絶を防止する方法を含む。
【００３１】
本発明は、更に本発明の結合体又は医薬組成物を、移植手術の前、最中及び／又は後に患者に投与することを含んでなる、移植患者における移植片に対する耐性を誘発する方法を含む。
【００３２】
従って、本発明の結合体は、二重の機能を有する。第一に、結合した後、第１の部分は、移植された組織又は器官上に見出される非自己のＭＨＣ分子を遮蔽し、そして宿主の細胞障害性Ｔ細胞によるその認識及び攻撃を防止する。第二に、第１の部分の結合は、移植された組織の細胞の表面の近くの第２の部分のＨＬＡ−Ｇ活性をもたらす。次いで分子のＨＬＡ−Ｇ活性は、移植された組織又は器官に対するＮＫ細胞活性を抑制する（Ｐａｚｍａｎｙ  ｅｔ  ａｌ（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ．２７４：７９２−７９５）。
【００３３】
移植された組織又は器官上に存在する非自己のＭＨＣ分子及び本発明の結合体によって結成された複合体が、宿主の免疫系（例えば樹状細胞）によって加工された場合、長期の移植片耐性が誘発される。本発明の結合体によって産生されるものである免疫寛容誘発性ＤＣ（提供者又は受容者から）は、Ｔ細胞のアネルギーを誘発し、アロ反応性Ｔ細胞を完全に削除し及び／又はアロ特異的制御性Ｔ細胞を産生することによって、長期の耐性を誘発し、そして維持することができる。先に詳細に記載したように、本発明人等は、移植片と相互作用するいずれもの宿主の樹状細胞が、ＨＬＡ−Ｇ活性に同時に暴露されるために、結合体が患者における移植片の長期の耐性に導くと信じる。これらの樹状細胞は、その後、ＭＨＣ分子及びＨＬＡ−Ｇ活性を含んでなる複合体を内部に取入れる。この複合体を獲得する過程において、樹状細胞の阻害性受容体は、ＨＬＡ−Ｇによって会合し、これらの細胞が抗体に対して免疫寛容誘発性になることを起こす（Ｈｏｒｕｚｓｋｏ  ｅｔ  ａｌ（２００１）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：３８５−３９４）。結果として、これらの樹状細胞がリンパ節に遊走し、そしてＴ細胞に遭遇する場合、これらの樹状細胞によって提示される移植片抗原に対する耐性がＴ細胞中に誘発される。
【００３４】
従って、本発明の結合体は、それによって移植された組織又は器官の局所的免疫抑制を、宿主の免疫系を全身的に抑制する必要性を伴わずに達成することができる機構を提供する。従って、患者は、慣用的な免疫抑制治療に伴う副作用に悩まされなくなる。
【００３５】
実施例６において、本出願人等は、Ｇ体の形態に組合された場合の、ＨＬＡ−Ｇ四量体及び抗−ＨＬＡ−Ａ２の相乗効果を示している。これは、新規な概念である。更に、免疫細胞によるＨＬＡ−Ａ２の発現は、ＨＬＡ−Ａ２陽性で行われた実験によって証明されているように、ＨＬＡ−Ａ２陰性の提供者と反対に、阻害効果が起こるために必須であるように見受けられる。従って、これらのデータは、ＨＬＡ−Ａ２以外の抗原に対する免疫反応が不当に損なわれるものではなく、そしてＧ体の効果が移植の設定におけるＨＬＡミスマッチに対して特異的なものであることを確認し、そして従って無差別な免疫抑制を起こす可能性がないものである概念を支持する。これらの結果におけるＨＬＡ−Ａ２に対する特異性は、本明細書中に記載される本発明の働きを裏付けている。
【００３６】
最後に、本出願人等は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）増殖に対するＧ体の阻害効果が、ＨＬＡ−Ａ２陰性のＰＢＭＣの増殖に対する有意な阻害効果がないために、外来性タンパク質のいずれもの仮想の一般的毒性によるものではないことを証明している。
【００３７】
更に、本発明の結合体が、長期の耐性を誘発することが可能であるために、移植された組織又は器官の寿命中、慣用的な経費のかかる、そして潜在的に有害な免疫抑制治療で患者を治療する必要がない。一度誘発された場合、これが同種異系抗原の持続した供給を確実にするものであり、従って免疫学的耐性を維持する機会を最大にするために、耐性は、移植片が受容者中に存在し続ける限り持続することができる。
【００３８】
第１の部分
先に記載したように、本発明の結合体の第１の部分は、移植片細胞の表面上に発現したＭＨＣ分子への結合体の結合及び局在化を標的とすることを具体的に意図する。従って第１の部分は、移植片に対して特異的なＭＨＣ分子に対する親和性を有し、そして受容者によって加工されたＭＨＣ分子に結合しないという意味において、そのＭＨＣ分子に対して特異的でなければならない。
【００３９】
例として、本出願人等は、ＨＬＡ−Ａ２陽性である提供者及びＨＬＡ−Ａ２陰性である受容者を挙げることができる。ＨＬＡ−Ａ２は、白色人種において非常に一般的である（４０−５０％）。従って、ＨＬＡ−Ａ２に対して特異性を持つ結合体（例えば抗−ＨＬＡ−Ａ２抗体）を使用する方法は、白色人種の場合の全ての移植の概略四分の一に対して適したものである。結合体の第１の部分は、この例においてＨＬＡ−Ａ２に対して完全に特異的であるように設計され、そして受容者のＨＬＡ分子に結合する可能性を回避するために、いずれもの密接に関連する分子と交差反応しない。当業者が理解するであろうように、提供者及び受容者間の他の異なったクラスＩのＨＬＡ分子は、本発明の結合体が受容者の細胞に結合しないことを確実にするために標的化されることができる。本発明は、提供者及び受容者間のＭＨＣの痕跡の不同性を利用して、提供者の移植片細胞が、特異的に標的化されることを確実にする。従って、多様な集団からの移植片を治療するために、それぞれの共通のＨＬＡ、例えばＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ｂ８、…等に対して特異的なそれぞれ一つの、ある範囲の本発明の結合体を必要とするものである。治療において、提供者及び受容者のそれぞれの特定の組合せに適した使用可能な範囲から、適した結合体が選択されるものである。可能性のある供給者／受容者の対の殆どは、このような結合体の小規模な組合せによって包含される。
【００４０】
本発明の結合体は、更に異種移植の状況においても使用される潜在性を有する。この場合、結合体の第１の部分は、提供者の種の独特のマーカーに対して特異的である。例えば、これがブタの移植片である場合、本発明の第１の部分は、ヒトＨＬＡ分子と交差反応しないブタのＨＭＣに特異的である抗体であることができる。
【００４１】
好ましくは、第１の部分は、１０−６Ｍより小さい、即ち１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ又は更に１０−１３Ｍより小さいＭＨＣ分子に対する結合親和性（Ｋｄ）を有する。好ましくは、第１の部分は、１０−９Ｍより小さい、即ち１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ又は１０−１３ＭのＭＨＣ分子に対する結合親和性（Ｋｄ）を有する。
【００４２】
第１の部分は、ＭＨＣ分子対して親和性を有する一つ又はそれより多い分子を含んでなることができる。
好ましくは第１の部分は、結合体をクラスＩＩのＨＬＡ分子に対して同様に特異的に製造することができない理由は不明であるが、ＭＨＣクラスＩ分子に対する親和性を持つ分子を含んでなる。ＨＬＡのクラスＩ分子Ａ、Ｂ及びＣが支配的であるが、クラスＩＩ分子、特にＨＬＡ−ＤＲは、特に固形の器官移植片、例えば腎臓に対して重要であるように見受けられる。従って、本発明は、他の共通のＨＬＡ；クラスＩ及びクラスＩＩの両方のミスマッチを標的とする概念を包含する。例えば、ＨＬＡ−ＤＲ又はＨＬＡ−Ｂ特異的Ｇ体結合体は、これらの分子が提供者及び受容者間でミスマッチである場合、有益な効果を有するものである。
【００４３】
ＭＨＣクラスＩ分子は、全ての有顎脊椎動物の細胞の表面上に発現し、そして細胞障害性Ｔ細胞に対する抗原を表示する原因である。ＭＨＣ分子をコードする遺伝子は、遺伝子構成及びゲノム配列は広く変化するが、脊椎動物のゲノムのＭＨＣ領域において見いだされる。
【００４４】
ヒトにおいて、これらの遺伝子は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子と呼ばれる。最も集中して研究されたＨＬＡ遺伝子は、九つのいわゆる古典的ＭＨＣ遺伝子：ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＰＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＡ、及びＨＬＡ−ＤＲＢ１である。ヒトにおいて、ＭＨＣは、三つの領域：クラスＩ、ＩＩ、及びＩＩＩに分けられる。Ａ、Ｂ、及びＣ遺伝子はＭＨＣクラスＩに属し、一方六つのＤ遺伝子はクラスＩＩに属する。
【００４５】
ＭＨＣクラスＩタンパク質分子は、二つのポリペプチド鎖：高度に重合性のα鎖（３個の領域：α１、α２及びα３を含んでなる）及び非共有的に結合したβ２−ミクログロブリンを含んでなるヘテロ二量体である。ヒトＭＨＣクラスＩタンパク質分子は、当技術において“ＨＬＡ分子”、又は“ＨＬＡタンパク質分子”と呼ばれることができる。
【００４６】
従って、用語“ＭＨＣクラスＩ分子”は、本明細書中で使用される場合、ヒト及び非ヒトを含む全ての哺乳動物のＭＨＣクラスＩ分子を含む。好ましくは、ＭＨＣクラスＩ分子は、ヒトＭＨＣクラスＩ分子（ＨＬＡタンパク質分子）である。
【００４７】
ＭＨＣクラスＩ分子は、細胞表面上の抗原を結合及び提示し、そして従って結合される抗原を伴い又は伴わずに存在する原因である。従って、用語ＭＨＣクラスＩ分子は、それ自体、又は抗原に結合した場合のいずれかのＭＨＣクラスＩ分子を指す。
【００４８】
ＭＨＣクラスＩ分子は、ＨＬＡ分子であることができる。好ましくはＨＬＡ分子は、ＨＬＡ−Ａ遺伝子の産物である。ＨＬＡ−Ａ遺伝子は、複対立性であり、そしてそれ自体は、コードされたタンパク質のα鎖の各種の差が、集団内に存在する。
【００４９】
好ましくは、本発明による第１の部分によって結合されたＨＬＡ分子は、ＨＬＡ−Ａ２遺伝子の産物である。
ＨＬＡ−Ａ２は、ＨＬＡ−Ａの‘Ａ’血清型群のＨＬＡ血清型であり、そしてＨＬＡ−Ａ０２０１、ＨＬＡ−Ａ０２０２、ＨＬＡ−Ａ０２０３、ＨＬＡ−Ａ０２０５、ＨＬＡ−Ａ０２０６、ＨＬＡ−Ａ０２０７及びＨＬＡ−Ａ０２１１遺伝子産物を含むＨＬＡ−Ａ０２対立遺伝子群によってコードされる。ＨＬＡ−Ａ２は、白色人種中で非常に一般的（４０−５０％）であり、そしてこれが提供者及び受容者の多くの組合せにおける使用に適しているものであるために、第１の部分に対する理想的な細胞標的を提供する。この方法は、白色人種の全ての移植の場合の殆ど四分の一に適しているものである。従って、用語“ＨＬＡ−Ａ２”によって、ＨＬＡ−Ａ２対立遺伝子群のいずれものメンバーが包含される。
【００５０】
本発明による結合体の第１の部分によって標的とされる一般的なクラスＩのＭＨＣ対立遺伝子の他の例は、当業者にとって明白であるものであり、そして例えばＨＬＡ−Ｂ８を含む。一般的なＭＨＣクラスＩ対立遺伝子（common MHC Class I alleles）を、以下の表１に示す。
【００５１】
【表１】
0005848254.tif 000002
【００５２】
結合体の第１の部分は、抗体を含むことができる。抗体は、いずれものアイソタイプであることができる（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ即ちα、γ又はμ重鎖）。抗体は、κ又はλ軽鎖を有することができる。ＩｇＧアイソタイプにおいて、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４サブクラスであることができる。用語“抗体”は、いずれもの適した天然の又は人工の免疫グロブリン或いはその誘導体を含む。一般的に、抗体は、特異的抗原結合活性を保有するＦｖ領域を含んでなるものである。これは、制約されるものではないが：全免疫グロブリン、抗原結合性免疫グロブリン断片（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２等）、一本鎖抗体（例えばｓｃＦｖ）、オリゴ体（ｏｌｉｇｏｂｏｄｉｅｓ）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ベニヤ化（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）抗体、等を含む。
【００５３】
本発明の結合体中に使用される抗体は、ポリクローナル又はモノクローナルであることができる。
本発明の結合体中に存在する抗体及び抗体成分が、Ｆｃ部分を含有しないことが好ましい。これは、移植片のＭＨＣへの結合が、自然免疫細胞上のＦｃ受容体を活性化する補体又は結合の活性化をもたらさないものであることを意味する。従って、炎症性介在物質は放出されない。
【００５４】
本発明の結合体中で使用される抗体は、いずれもの適した手段、例えば組換え発現、又は本発明のポリペプチドを、適当な動物（例えばウサギ、ハムスター、マウス又は他の齧歯類）に投与（例えば注入）することによって産生することができる。
【００５５】
ヒトの免疫系との適合性を増加するために、抗体をキメラ化又はヒト化することができる｛例えばＢｒｅｅｄｖｅｌｄ（２０００）Ｌａｎｃｅｔ  ３５５（９２０５）：７３５−７４０又はＧｏｒｍａｎ  ＆  Ｃｌａｒｋ（１９９０）Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：４５７−４６６｝か、或いは完全なヒトの抗体を使用することができる。ヒト化抗体は、ヒト中で本来の非ヒトモノクローナル抗体よりはるかに少なく免疫原性であるために、これらは、はるかに少ないアナフィラキシーの危険性を伴ってヒトの治療のために使用することができる。
【００５６】
ヒト化抗体は各種の方法によって達成することができ、例えば：（１）非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）を、場合により非ヒト抗体からの一つ又はそれより多いフレームワーク残基の所望による移動を伴って、ヒトのフレームワーク及び定常部に移植（“ヒト化”）すること；（２）全体の非ヒト変動領域を移植するが、しかしこれを表面残基の置換によってヒト様表面で“包み込む（cloaking）”こと（ベニヤ化：veneering）、が挙げられる。本明細書中に記載するように、ヒト化抗体は、“ヒト化”及び“ベニヤ化”抗体の両方を含むものである。（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５８０，Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳ．Ａ．，８１：６８５１−６８５５，Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＆  Ｏｉ（１９８８）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４４：６５−９２，Ｖｅｒｈｏｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６，Ｐａｄｌａｎ（１９９１）Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．２８：４８９−４９８，Ｐａｄｌａｎ（１９９４）Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１（３）：１６９−２１７及びＫｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．４（７）：７７３−８３）。ＣＤＲは、天然の免疫グロブリン結合部位のＦｖ領域の結合親和性及び特異性を一緒に定義するアミノ酸配列である（Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７．８７及びＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１））。
【００５７】
ヒト化された又は完全なヒトの抗体は、更にヒト免疫グロブリン座を含有するように操作された遺伝子導入動物を使用して産生することもできる。例えば、ＷＯ９８／２４８９３は、ヒトＩｇ座を有する遺伝子導入動物を開示し、ここにおいて、動物は、内在性重鎖及び軽鎖座の不活化のために、機能的内因的免疫グロブリンを産生しない。ＷＯ９１／１０７４１は、更に免疫原に免疫反応を開始することが可能な遺伝子導入非霊長類哺乳動物の宿主を開示し、ここにおいて、抗体は、霊長類の定常及び／又は変動領域を有し、そしてここにおいて、内因的免疫グロブリンをコードする座は置換されるか又は不活化される。ＷＯ９６／３０４９８は、全て又は一部の定常或いは変動領域を置換して、改変された抗体分子を形成するような哺乳動物の免疫グロブリン座を改変するためのＣｒｅ／Ｌｏｘ系の使用を開示している。ＷＯ９４／０２６０２は、不活化された内在的Ｉｇ座及び機能性ヒトＩｇ座を有する非ヒト哺乳動物宿主を開示している。米国特許第５，９３９，５９８号は、遺伝子導入マウスを製造する方法を開示し、ここにおいて、マウスは、内在的柔鎖を欠き、そして一つ又はそれより多い異種定常領域を含んでなる外来性免疫グロブリン座を発現する。
【００５８】
先に記載した遺伝子導入動物を使用して、免疫反応を、所望のＭＨＣクラスＩ分子中に産生することができ、そして抗体産生性細胞を動物から除去し、そしてヒトモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを産生するために使用することができる。免疫化プロトコル、アジュバント、等は当技術において公知であり、そして例えば、ＷＯ９６／３３７３５中に記載されているような遺伝子導入マウスの免疫化において使用される。モノクローナル抗体は、生物学的活性を阻害又は中和する能力或いは対応するポリペプチドの生理学的効果に対して試験することができる。
【００５９】
第１の部分が一つ又はそれより多い分子を含んでなる場合、これは、先に言及した異なったクラスの抗体を含んでなることができる。例えば、これは、Ｆｖ断片及びＦａｂ断片を含んでなることができ、これらの両方は、ＭＨＣクラスＩ分子に対する親和性を有する。Ｂ１１は、ファージ提示技術及び“軽鎖シャフリング”の方法を使用して産生されるＳｃＦｖ断片の例であり、これは、ヒトＨＬＡ−Ａ２に対して特異的である。この方法は、Ｗａｔｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＨＬＡ−Ａ２  ｕｓｉｎｇ  ｌｉｇｈｔ−ｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ：ａ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ＨＬＡ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｂｉｎｄｉｎｇ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ．２００４  Ａｐｒ；６３（４）：３４５−５４によって記載されている。本明細書中で使用される場合、Ｂ１１のＳｃＦｖは、上記の著者から得たＳｃＦｖ断片を含有するプラスミドから誘導され；配列を確認し、そして次いで改変して、本発明による結合体をコードする核酸分子を産生した。Ｂ１１に対するＣＤＲ配列は、Ｗａｔｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００（Ｔｈｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ＨＬＡ−Ａ２  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ａｎ  ｉｍｍｕｎｅ  Ｖ  ｇｅｎｅ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｙ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ．２０００  Ｍａｒ；５５（３）：２１９−２８）；及びＷａｔｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４（上記引用参照）によって刊行され、そして本発明による結合体中で使用するために適した配列の例が提供されている。
ＶＨ  
ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＶＳＣＡＡＳＧＶＴＬＳＤＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＡＦＩＲＮＤＧＳＤＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＫＴＶＳＬＱＭＳＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＮＧＥＳＧＰＬＤＹＷＹＦＤＬＷＧＲＧＴ
ＶＬ
ＤＶＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＹＤＮＬＰＰＴＦＧＧＧＴＫＬ
下線部分は、ＣＤＲである。
【００６０】
第１の部分は、同一クラスの抗体を含んでなることができる。例えば、第１の部分は、セリン及び／又はグリシンのようなリンカーペプチド或いは化学的リンカーによって一緒に連結された二つのｓｃＦｖを含んでなる二重特異性抗体であることができる。
【００６１】
本発明の結合体中で使用されるヒトＨＬＡ−Ａ２に対する抗体は、例えば、ハイブリドーマＢＢ７．２から誘導されることができる。ＢＢ７．２ハイブリドーマは、ＡＴＣＣ（米国培養細胞系統保存機関）から得ることができる。これを記載した本来の刊行物は、１９８１年のものであり（Ｐａｒｈａｍ  Ｐ，Ｂｒｏｄｓｋｙ  ＦＭ．Ｐａｒｔｉａｌ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｏｍｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ＢＢ７．２  Ａ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｗｉｔｈ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｆｏｒ  ＨＬＡ−Ａ２  ａｎｄ  ａ  ｖａｒｉａｎｔ  ｏｆ  ＨＬＡ−Ａ２８．Ｈｕｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８１  Ｄｅｃ；３（４）：２７７−９９）、そしてハイブリドーマは現在商業的に入手可能である。他の抗−ＨＬＡ−Ａ２ハイブリドーマが存在し、そして商業的に入手可能である。
【００６２】
第１の部分は、別の態様において、アプタマーを含んでなることができる。‘アプタマー’によって、本出願人等は、核酸配列であって、当該核酸配列及びこの配列が位置する環境に起因して、三次元の構造を形成するものを意味する。三次元構造は、部分的に、標的の分子（単数または複数）に対する特異性を有するアプタマーに結合特性を与える。本発明において、前記のアプタマーは、ＭＨＣ分子に対する結合特異性を示す。
【００６３】
アプタマーは、典型的にはオリゴヌクレオチドであり、これは、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド、或いは改変されたオリゴデオキシリボヌクレオチド又は改変されたオリゴリボヌクレオチドであることができる。アプタマーを確認するためのスクリーニング法は、米国特許第５２７０１６３号中に記載されている。用語“改変された”は、アプタマーの文脈において、共有的に改変された塩基及び／又は糖又は糖誘導体を持つヌクレオチドを指す。
【００６４】
第２の部分
先に記載したように、本発明の結合体の第２の部分は、ＨＬＡ−Ｇ活性を有することを意図している。ＨＬＡ−Ｇは、非古典的ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩｂ分子のメンバーである。ＨＬＡクラスＩｂ抗原のＨＬＡ−Ｅ、−Ｆ及び−Ｇは、クラスＩａ抗原と幾つかの特徴を共有するが、しかし更にある範囲の点でこれらと異なる。ＨＬＡクラスＩｂ抗原の機能の包括的な考察は、Ｈｖｉｉｄ  Ｔ．２００６（Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｕｐｄａｔｅ，Ｖｏｌ．１２，Ｎｏ．３  ｐｐ．２０９-２３２）中に見出すことができる。
【００６５】
ＨＬＡ−Ｇ分子は、これによって胎児が母親からの免疫学的に誘発される危害から保護される一つの側面を形成する。殆どの部分において二つの組織不適合性個体の交配産物である胎児は、本質的に同種移植片である。これは、５０％の父系遺伝子からなり、そして従って、これの外来性又は非自己としての認識のために、母系免疫系による破壊のために標的とされるべき父系抗原を産生する（Ｍｅｌｌｏｒ，２０００）。
【００６６】
父系組織又は器官の母系雰囲気への移植は、免疫系が抑制されない限り、免疫反応のカスケードを誘発し、母体からの移植の迅速な排除をもたらす。然しながら、圧倒的多数の妊娠において、胎児の同種移植片は拒絶されない。事実、母系の免疫系は、胎児に関して特異的に抑制されるが、しかし広い範囲の外部の病原体から母親を保護するために機能することがなお可能であるように見受けられる。
【００６７】
それによって胎児が母系免疫系によって許容される機構の本発明に関連する二つの側面は、栄養膜と呼ばれる胎盤の外部層の適応、及びＨＬＡ−Ｇと呼ばれる独特のＨＬＡ分子の存在である。
【００６８】
胎児由来である胎盤が、母系免疫系から胎児を隔離することが知られている。栄養膜と呼ばれる胎盤の最も外部の層は、母系免疫系に対するその耐性を支持するように見受けられる幾つかの適応を有する。一つの適応は、栄養膜細胞がその表面にＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩ分子を提示しないことである。明らかなように、ＭＨＣ分子が存在しない場合、これは非自己として認識されることができず、そして従ってＭＨＣクラスＩ分子を欠く細胞は、免疫系による破壊を回避する筈である。
【００６９】
然しながら、ＭＨＣクラスＩ分子を提示しない細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞による攻撃に脆弱である。ＮＫ細胞は、自然免疫系の主要成分を構成する細胞障害性リンパ球の一種である。これらは、ＭＨＣクラスＩ分子を発現しない細胞を特異的に認識し、そして殺戮することが可能である。
【００７０】
栄養膜の細胞が、ヒト白血球抗原−Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ）と呼ばれるＭＨＣ分子をその表面に発現し、そして提示することによってＮＫ細胞による攻撃から保護されることが考えられる（Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｕｐｄａｔｅ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｖａｕｖｅｒｔ  Ｆ．Ｈｖｉｉｄ（２００６））。ＨＬＡ−Ｇは、これらの細胞によってのみ発現される特殊化された抗原である（Ｈｕｎｔ，２０００ｂ）。これは、他のＨＬＡと比較した場合大きく減少した多形性を示し（Ｌｅ  Ｂｏｕｔｅｉｌｌｅｒ，２００３）、そしてそのキラー細胞免疫グロブリン様受容体により天然のキラー細胞を特異的に結合し、従ってその細胞障害性を遮断する（Ｆｕｒｍａｍ，２０００）。
【００７１】
更に、ＨＬＡ−Ｇの免疫調節性活性は、部分的に樹状細胞の阻害性受容体の会合及びＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞反応性の下方制御から得られると考えられる。
本発明に対して特に興味あるものは、両方とも受容体ＩＬＴ２及びＩＬＴ４並びにキラーＩｇ様受容体２ＤＬ４（ＫＩＲ２ＤＬ４受容体）との直接相互作用による、ＮＫ及びＴ細胞仲介の細胞溶解を阻害するＨＬＡ−Ｇの能力である（Ｎａｖａｒｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２９，２７７−２８３；Ｐｏｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６，５６７４−５６７９；Ｒａｊａｇｏｐａｌａｎ  ａｎｄ  Ｌｏｎｇ，１９９９，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８９，１０９３−１１００；Ｒｉｔｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３，１９３−２０１；Ｍｅｎｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １００，６３−７０）。
【００７２】
従って、用語“ＨＬＡ−Ｇ活性”は、ＮＫ及びＴ細胞仲介の細胞溶解を阻害する及び／又は樹状細胞を含む骨髄単球性細胞の機能を調節する能力を指す。ＨＬＡ−Ｇ活性を持つ分子は、ＨＬＡ−Ｇ、即ちＩＬＴ２、ＩＬＴ４及びＫＩＲ２ＤＬ４、又はこれらの選択物に対する少なくとも一つの受容体に結合する能力を有する。ＨＬＡ−Ｇは、主として骨髄免疫細胞（ＤＣ及び単球／マクロファージ）上に、そしてより少ない程度でリンパ球上に発現するＩＬＴ２及びＩＬＴ４に結合する。ＨＬＡ−Ｇは、更にＮＫ細胞上のＫＩＲ２ＤＬ４とも結合する。全てのこれらのＨＬＡ−Ｇの受容体は、これらがそのＨＬＡ−Ｇリガンドと会合した場合、これらを発現する細胞の機能を制御する阻害性受容体である。
【００７３】
第２の部分は、ＨＬＡ−Ｇ活性を有する一つ又はそれより多い分子を含んでなることができる。
ＨＬＡ−Ｇ活性を持つ分子は、ポリペプチドであることができる。同様に、分子は、ＨＬＡ−Ｇのための一つ又はそれより多い受容体、即ちＩＬＴ２、ＩＬＴ４及びＫＩＤ２ＤＬ４に結合するアプタマーであることができる。
【００７４】
第２の部分は、ＨＬＡ−Ｇポリペプチドを含んでなることができる。ＨＬＡ−Ｇは、重鎖及び軽鎖からなるヘテロ二量体である（ベータ２ミクログロブリン）。重鎖は、膜に固定されている。重鎖は、概略４５ｋＤａであり、そしてその遺伝子は、８個のエクソンを含有する。エクソン１は、リーダーペプチドをコードし、エクソン２及び３は、アルファ１及びアルファ２領域をコードし、これらの両方は、両方ともペプチドを結合し、そして提示することが可能であり、エクソン４は、アルファ３領域をコードし、エクソン５は、膜貫通領域をコードし、そしてエクソン６、７及び８は、細胞質側末端をコードする。
【００７５】
ＨＬＡ−Ｇポリペプチドは、四つの膜結合アイソフォーム、ＨＬＡ−Ｇ１からＧ４、及び三つの可溶性アイソフォーム、ＨＬＡ−Ｇ５からＧ７中に潜在的に存在する（Ｉｓｈｉｔａｎｉ  ａｎｄ  Ｇｅｒａｇｈｔｙ，１９９２；Ｆｕｊｉｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｋｉｒｓｚｅｎｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｈｖｉｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｐａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；ＬｅＭａｏｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。可溶性ＨＬＡ−Ｇアイソフォームは、ＨＬＡ−Ｇ転写物の選択的スプライシングによって産生される。ＨＬＡ−Ｇ分子の外部部分は、三つの部分：１、２及び３領域（エクソン２−４）からなる；領域１及び２は、ペプチド結合性間隙に寄与する。ＨＬＡ−Ｇの全長の膜タンパク質は、膜貫通領域によって細胞膜に固定されている（エクソン５）．
第２の部分は、先に記載したＨＬＡ−Ｇポリペプチドのいずれか一つを含んでなることができる。
【００７６】
第２の部分は、更に先に記載したＨＬＡクラスＩ抗原ポリペプチド断片の一つの断片を、断片がＨＬＡ−Ｇ活性を保有する限り、含んでなることができる。
好ましくは、第２の部分は、α１、α２、α３及びβ２ｍを含んでなるＨＬＡ−Ｇ分子の細胞外領域を含んでなる。第２の部分は、配列番号：１又は配列番号：２として与えた配列を有するポリペプチドを含んでなることができる。配列番号：１は、リーダーペプチドを持つ参照配列である。配列番号：２は、リーダーペプチドと共に、そして組換え結合体の合成のための切断された膜貫通／細胞質領域を伴う、実施例中で使用されるＨＬＡ−Ｇ配列である。第２の部分は、配列番号：１又は２として与えた配列に対してｐ％の配列相同性を有するポリペプチドを含んでなることができる。ｐのパーセント値は、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、９９．９又は１００であることができる。二つのアミノ酸配列間のパーセントの配列相同性への言及は、整列させた場合、アミノ酸が二つの配列を比較して同じであるパーセントを意味する。この整列及び相同性又は配列相同性のパーセントは、当技術において既知のソフトウェアプログラム、例えば“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”の第７．７．１８節に記載されているものを使用して決定することができる。好ましい整列は、１２のアフィンオープンペナルティー及び２のギャップエクステンションペナルティー、６２のＢＬＯＳＵＭマトリックスを伴うアフィンギャップ検索を使用するＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定される。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）中で教示されている。
【００７７】
ＨＬＡクラスＩｂ分子の、そして特にＨＬＡ−Ｇの非ヒトの形態は既知である。例えば、アカゲザル（Ｍａｃｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）及びサバンナヒヒ（Ｐａｐｉｏ  ａｎｕｂｉｓ）は、新規なクラスＩａ関連の座を保有する。この遺伝子は、制限された組織分布、ｍＲＮＡの選択的スプライシング、切断された細胞質領域、及び制約された多形性を含むＨＬＡ−Ｇのものに似た特徴を持つ糖タンパク質をコードする。従って、この分子は、ＨＬＡ−Ｇの機能的相同体であることができる（Ｈｕｎｔ  ａｎｄ  Ｌａｎｇａｔ，２００２  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ．６７（５）：１３６７−７４）。第２の部分は、ＨＬＡ−Ｇの非ヒト相同体を含んでなることができる。
【００７８】
“ＨＬＡ−Ｇ活性” を有する、即ち免疫細胞上の阻害性受容体に結合し、そしてその機能を調節することができる他の分子は、当業者にとって明白であるものである。これは、のコンビナトリアルライブラリーのスクリーニングによって確認されたアプタマー及び小分子さえも含む。
【００７９】
第２の部分は、ＨＬＡ−Ｇ活性を示すＨＬＡ−Ｇ以外のＨＬＡクラスＩｂ抗原のメンバー、例えばＨＬＡ−Ｅ又はＨＬＡ−Ｆを含んでなることができる。慣用的なクラスＩのＨＬＡ分子も、そのような結合の化学量論及び機能的意義、並びにこれがＨＬＡ−Ｇのそれと如何に比較されるか完全に明確になっていないが、更に幾つかのＨＬＡ−Ｇ受容体に結合することができる。
【００８０】
“ＨＬＡ−Ｇ活性”を有するように産生することができる分子のもう一つのクラスは、天然のリガンドの作用を模倣するＨＬＡ−Ｇの受容体に特異的な抗体、即ちＩＬＴ２、ＩＬＴ４、ＫＩＲ２ＤＬ４等に対するアゴニスト的抗体である。当然、細胞内部のシグナルを伝達することに対して伝導性である様式でこれらの受容体に結合することができるいずれもの分子に、“ＨＬＡ−Ｇ活性”を付与する。
【００８１】
リンカー及び他の成分
結合体の第１及び第２の部分は接続されている。この接続は、直接であることができ、又はこれはリンカーを経由することができる。両方の場合共、接続は第１及び第２の部分が互いに付着されていることを保つために働く。
【００８２】
標準的なタンパク質の架橋剤を本発明の結合体を産生するために使用することができる。これらは、当業者にとって親しいものであり、そしてタンパク質の側鎖を二つ又はそれより多いポリペプチドに架橋する化学反応を利用する方法を含む。例は、ジスルフィド、アミン−カルボキシル及びアミン−スルフィドリルリンカーである。次のウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｉｅｒｃｅｎｅｔ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｂｒｏｗｓｅ．ｃｆｍ？ｆｌｄＩＤ＝０２０３０６は、有用な全体像を提供する。
【００８３】
リンカーは、ペプチドであることができる。ペプチドリンカーの配列は、典型的には短いものである（例えば２０個又はそれより少ないアミノ酸、即ち２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個）。例は、ポリグリシンリンカー（即ちＧｌｙｎを含んでなり、ここにおいて、ｎ＝２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれより多い）、及びヒスチジン標識（即ちＨｉｓｎでここにおいて、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれより多い）を含んでなる。他の適したリンカーのアミノ酸配列は、当業者にとって明白であるものである。有用なリンカーは、ＧＳＧＧＧＧ又はＧＳＧＳＧＧＧＧである。（Ｇｌｙ）４テトラペプチドは、典型的なポリグリシンリンカーである。好ましくは、リンカーは、式（Ｇ４Ｓ）ｎを有するグリシン−セリンペプチドであり、ここにおいて、ｎは、１から１００迄のいずれもの数、即ち１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０又は１００である。
【００８４】
リンカーは、例えば米国特許第６，７５９５０９号）に記載されているような分枝鎖ペプチドリンカーであることができる。
リンカーは、例えば、化学的な架橋性分子であることができる。
【００８５】
結合体（コンジュゲート）
先に記載したように、本発明の結合体は、第２の部分に接続された第１の部分を含んでなる。第１及び第２の部分は、個々に産生し、そしてその後接続されて、結合体を形成することができ、又は第１及び第２の部分の両方を含んでなる一つの結合体分子を産生することができる。
【００８６】
本発明の結合体の好ましい態様は、ＨＬＡ−Ｇの細胞外領域に式（Ｇ４Ｓ）ｎを有するグリシン−セリンリンカーによって接続された抗−ＨＬＡ抗体の重鎖及び軽鎖の変動領域を含んでなるポリペプチドである。この好ましい分子の各種の形態の例は、配列番号：３及び４として提供される。断片、機能的等価物（例えば一つ又はそれより多い削除、置換、挿入又は付加を持つ変異体）及びこれらの分子の分解された形態、例えば配列番号：３又は４として与えた配列に対してｐ％の配列相同性を有するポリペプチドは、更に本発明の側面として含まれる。ｐのパーセント値は、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、９９．９又は１００であることができる。
【００８７】
本発明の好ましい態様において、結合体は、ヒューリン開裂を含有するものである。ヒューリン開裂部位は、例えば、第１の部分の二つの可変の抗体断片間に位置し、そしてタンパク質発現に伴う困難性を解決することができる。対処する基本的な問題は、化学量論のものである：ヘテロ二量体を一緒に形成するために一つより多いポリペプチドが必要な場合、二つのポリペプチド種が等濃度で小胞体中に存在しなければならない。従って、二つのポリペプチドが同一又は異なったベクター中の二つの異なった遺伝子上に発現する場合、二つの遺伝子の発現、そして従って翻訳及びタンパク質産生の速度は同等でないことがあり得る。これは、二つの成分ポリペプチドの一つの過剰をもたらし、これはタンパク質の産生に干渉するものである。他方、両方のポリペプチドが同一ベクター中の同一遺伝子上にコードされた場合、対象の二つのポリペプチド間のリンカーペプチドは、折畳み及び機能に干渉することができる。この問題を解決するために、タンパク質の技術者は、翻訳後に二つのポリペプチドを開裂するために、対象の二つのポリペプチド間の酵素的部位、例えばヒューリンをコードする解答に達している。これは、二つのペプチドを分離して、十分な折畳み及び機能を確実にするが、しかしこれは、これらの両方が全体のタンパク質の最適な産生のために等モルの量で存在する利益を提供する。従って、本発明の結合体は、この種の技術を組込むように設計される。
【００８８】
本発明による結合体の更なる好ましい形態は、共有的又は非共有的にのいずれかで連結されたものである。例えば、先に詳細に記述された移植片に特異的なＭＨＣ分子に対する親和性を保有する第１の部分のいずれかは、ＨＬＡ−Ｇ活性を保有する先に記載したいずれもの第２の部分に共有的又は非共有的に連結することができる。更に具体的には、移植片に対して特異的なＭＨＣ分子に向けられ抗体又は抗体の断片は、細胞外部分のようなＨＬＡ−Ｇ活性を保有する第２の部分に共有的又は非共有的に連結することができる。先に詳細に記述したように、このような抗体の断片は、抗−ＨＬＡ抗体の重鎖及び軽鎖の変動領域を含んでなることができる。好ましい形態は、ＨＬＡ−Ｇの細胞外領域に共有的又は非共有的にのいずれかで連結することができる。非共有的相互作用の例は、ビオチン又はストレプトアビジンのような結合パートナーの使用によるものである；他の例は、当業者にとって既知であるものである。
【００８９】
例えば、本発明の結合体の一つの好ましい形態は、ＨＬＡ−Ｇに非共有的に連結したＢＢ７．２又はＢ１１モノクローナル抗体を含むものである。結合体は、ストレプトアビジン連結抗体又は抗体断片を、ビオチニル化ＨＬＡ−Ｇと混合することによって形成することができる。抗体及びＨＬＡ−Ｇ分子の異なった比、例えば１：２０及び１：２間を使用することができる；１：１２又は１：４の両方のモル比を本明細書中で試験し、そして両方とも有効であることが見いだされた。
【００９０】
ポリペプチド
結合体の第１の部分及び／又は第２の部分は、ポリペプチドであることができる。更に、全体の結合体がポリペプチドであることができる。
【００９１】
ポリペプチドは、各種の形態（例えば、天然、融合、グリコシル化、非グリコシル化、ミリストイル化、非ミリストイル化、脂質付加、非脂質付加、単量体、多量体、粒子、変性、等）で調製することができる。
【００９２】
ポリペプチドは、検出可能な標識（例えば放射性又は蛍光標識、或いはビオチン標識）を含むことができる。
ポリペプチドは、多くの方法で、例えば化学的合成（少なくとも部分的に）、プロテアーゼを使用する長鎖ポリペプチドの消化、ＲＮＡからの翻訳、細胞培養物（例えば組換え発現から）からの精製によって、生物体自体（例えば組織からの単離）、細胞系供給源等から調製することができる。
【００９３】
用語“ポリペプチド”は、いずれもの長さのアミノ酸ポリマーを指す。ポリマーは、直鎖又は分枝鎖であることができ、これは、改変されたアミノ酸を含んでなることができ、そしてこれは、非アミノ酸によって中断されることができる。この用語は、更に天然に又は介入；例えばジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化、又は標識成分とのコンジュゲートのような、いずれもの他の操作或いは改変によって改変されたアミノ酸ポリマーを包含する。更に定義中に含まれるものは、例えば、一つ又はそれより多いアミノ酸の類似体（例えば、非天然のアミノ酸、等を含む）、並びに当技術において既知の他の改変を含有するポリペプチドである。ポリペプチドは、一本鎖又は会合鎖として存在することができる。
【００９４】
ポリペプチドは、天然に又は非天然にグリコシル化されることができる（即ちポリペプチドは、対応する天然に存在するポリペプチド中に見出されるグリコシル化パターンと異なったグリコシル化パターンを有する）。
【００９５】
ポリペプチドは、更にポリペプチドの精製、可溶化、クロマトグラフィー、画像化、酵素的又は化学的改変を補助するための更なる基を含んでなることができる。
ポリペプチドは、更により大きいポリペプチドの一部を形成することができる。例えば、ポリペプチドは、更なるｎ末端及び／又はｃ末端アミノ酸、例えばヒスチジンによって横に付加されることができるか、或いはＧＳＴに融合することができる。
【００９６】
一般的に、ポリペプチドは、天然に存在しない環境で提供され、即ちこれらは、その天然に存在する環境から分離される。
核酸
結合体がポリペプチドである場合、本発明は、本発明の結合体をコードする核酸を提供する。
【００９７】
本発明は、更に本発明の核酸に対するｎ％又はそれより多い配列相同性を持つヌクレオチド配列を含んでなる核酸を提供する。ｎのパーセント値は、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、９９．９又は１００であることができる。
【００９８】
本発明の核酸は、好ましくは単離された又は実質的に単離された形態で、即ち実質的に他の核酸を含まず（例えば天然に存在する核酸を含まず）、一般的に少なくとも約５０（重量）％の純度で、そして通常少なくとも約９０％の純度で提供される。
【００９９】
本発明の核酸は、各種の形態をとることができる。
本発明の核酸は、一本鎖又は二本鎖であることができる。他に規定又は要求しない限り、核酸を使用する本発明のいずれもの態様は、二本鎖の形態及び二本鎖の形態を構成する二本のそれぞれ相補的な一本鎖の形態の両方を使用することができる。
【０１００】
本発明の核酸は、環状又は分枝鎖であることができるが、しかし一般的に直鎖であるものである。
本発明の核酸は、固体の支持体（例えばビーズ、プレート、フィルター、フィルム、スライド、マイクロアレイ支持体、樹脂、等）に結合することができる。
【０１０１】
本発明のある態様に対して、核酸は、好ましくは少なくとも１００個のヌクレオチド（例えば１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３５０、４００、５００、７５０、１０００、１５００、２０００個又はそれより長いヌクレオチド）の長さである。
【０１０２】
本発明のある態様に対して、核酸は、好ましくは多くとも２０００個のヌクレオチド（例えば１９００、１５００、１０００、５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００個又はそれより短いヌクレオチド）の長さである。
【０１０３】
本発明の核酸は、検出可能な標識、例えば放射性又は蛍光標識、或いはビオチン標識を担持することができる。
本発明の核酸は、多くの方法で、例えば化学的合成（少なくとも部分的に）、ヌクレアーゼ（例えば制限酵素）を使用するより長い核酸の消化、より短い核酸の連結すること（例えばリガーゼ又はポリメラーゼを使用）によって、ゲノム又はｃＤＮＡライブラリーから調製することができる。
【０１０４】
用語“核酸”は、一般的な意味で、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、及び／又はこれらの類似体を含有するいずれもの長さのヌクレオチドの重合形態を含む。これは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ複合型を含む。これは、更に改変された骨格（例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）又はホスホロチオエート）又は改変された塩基を含有するもののようなＤＮＡ又はＲＮＡ類似体を含む。用語“核酸”は、具体的に示さない限り、核酸の長さ又は構造に制約されることを意図していなく、そして次のもの：遺伝子又は遺伝子断片、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換え核酸、分枝鎖核酸、プラスミド、ベクター、いずれもの供給源からのＤＮＡ、いずれもの供給源からのＲＮＡ、プローブ、及びプライマーは、核酸の非制約的例である。本発明の核酸がＲＮＡの形態をとる場合、これは、５’キャップを有することができる。
【０１０５】
核酸がＤＮＡである場合、ＲＮＡ配列中の“Ｕ”が、ＤＮＡ中で“Ｔ”によって置換されるものであることは認識されるであろう。同様に、核酸がＲＮＡである場合、ＤＮＡ配列中の“Ｔ”が、ＲＮＡ中で“Ｕ”によって置換されるものであることは認識されるであろう。
【０１０６】
用語“補体”又は“相補的”が核酸に関して使用される場合、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対を指す。従って、Ｃの補体はＧであり、Ｇの補体はＣであり、Ａの補体はＴ（又はＵ）であり、そしてＴ（又はＵ）の補体はＡである。Ｉ（プリンイノシン）のような塩基を、例えばピリミジン（Ｃ又はＴ）を補完するために使用することも更に可能である。この用語は、更に方向−５’ＡＣＡＧＴ−３’の補体は、５’ＴＧＴＣＡ−３’ではなく  ５’ＡＣＴＧＴ−３’であることを意味する。
【０１０７】
本発明の核酸は、例えば：ポリペプチドを産生するために；又は核酸の更なるコピーを産生するために使用することができる。
二つの核酸配列間の配列相同性のパーセントに対する言及は、整列させた場合、二つの配列の比較において塩基が同一であるパーセントを意味する。この整列及び相同性又は配列相同性のパーセントは、当技術において既知のソフトウェアプログラム、例えば “Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”の第 ７．７．１８節中に記載されたものを使用して決定することができる。好ましい整列プログラムは、ＧＣＧ  Ｇａｐ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｓｕｉｔｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．１）であり、好ましくはデフォルトのパラメーターを使用し、これは、次のとおり：オープンギャップ＝３；エクステンドギャップ＝１である。
【０１０８】
核酸がポリペプチドを“コードする”と記述された場合、これは、必ずしもポリヌクレオチドが翻訳されること意味するものではなく、しかしこれは、ポリペプチドのアミノ酸をコードする一連のコドンを含むものである。
【０１０９】
ベクター
本発明の核酸は、ベクターの一部、即ち一つ又はそれより多い細胞型の形質導入／形質移入のために設計された核酸構築物の一部であることができる。ベクターは、例えば、挿入されたヌクレオチドの単離、伝播及び複製のために設計された“クローニングベクター”、宿主細胞中のヌクレオチド配列の発現のために設計された“発現ベクター”、組み換えウイルス又はウイルス様粒子の産生をもたらすように設計された“ウイルスベクター”、或いは一つより多い種類のベクターの特質を含んでなる“シャトルベクター”であることができる。
【０１１０】
本発明のベクターは、好ましくは自己複製エピソーム又はプラスミドのような染色体外ベクターである。
本発明のベクターは、好ましくは複製起点を含んでなる。複製起点が原核生物において産生であるが、しかし真核生物中でそうではないことが好ましい。
【０１１１】
本発明のベクターは、多数のクローニング部位を含んでなることができる。
宿主細胞
“宿主細胞”は、外来性核酸の受容者であることができるか、又はそうである個々の細胞又は細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一の宿主細胞の子孫を含み、そして子孫は、天然の、偶発的、又は計画的変異及び／又は変化のために、必ずしも本来の親細胞と完全に同一である（多形性又は全ＤＮＡ補体において）ことはできない。宿主細胞は、本発明の核酸でｉｎ  ｖｉｖｏ、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで形質移入されたか、或いは感染された細胞を含む。
【０１１２】
本発明の好ましい態様において、結合体の第１及び第２の部分は、いずれものリンカー領域、開裂部位、又は含むことができる標識と共に、直接のインフレーム翻訳タンパク質として発現する。
【０１１３】
本発明のもう一つの態様において、本発明の第１及び第２の部分は、別個の成分として産生され、次いで生物学的又は化学的技術を使用して一緒に結合することができる。いずれもの開裂部位又は含むことができる標識は、第１又は第２の部分のいずれかと共にインフレーム翻訳の融合体として発現することができるか、或いは生物学的又は化学的技術を使用して結合体に結合することができる。
【０１１４】
医薬組成物
本発明は、本発明の結合体又は核酸を含んでなる医薬組成物を提供する。
本発明によって包含される医薬組成物は、活性成分として、本明細書中に開示される本発明の結合体又は核酸を治療的に有効な量で含む。“有効な量”は、臨床的結果を含む利益のある又は所望の結果をもたらすために十分な量である。有効な量は、一回又はそれより多い投与で投与することができる。本発明の目的のために、有効な量は、移植片拒絶の症状及び／又は進行を緩和、寛解、安定、逆転、減速又は遅延するために十分である量である。更に、有効な量は、移植片に対する耐性を誘発するために十分である量である。
【０１１５】
組成物は、移植片拒絶を治療及び／又は予防、並びに移植片に対する耐性を誘発するために使用することができる。更に、医薬組成物は、免疫抑制の慣用的方法と組合せて使用することができる。
【０１１６】
用語“治療”、“治療すること”、“治療する”等は、一般的に所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを指すために、本明細書中で使用される。効果は、移植片拒絶又はその症状を完全に又は部分的に予防することに関して予防的であることができ、及び／又は移植片拒絶及び／又は移植片拒絶に起因し得る不都合な影響を部分的に又は完全に安定化する或いは治癒することに関して治療的であることができる。
【０１１７】
用語“治療的に有効な量”は、本明細書中で使用される場合、所望の疾病又は症状を治療、寛解、又は予防する、或いは検出可能な治療的又は予防的効果を示すための治療剤の量を指す。効果は、例えば、化学マーカー又は抗原のレベルによって検出することができる。治療効果は、更に物理的症状の減少を含む。患者に対する実際の有効な量は、患者の大きさ及び健康状態、症状の性質及び程度、並びに投与のために選択される治療剤又は治療剤の組合せに依存するものである。与えられた状況のために有効な量は、所定の実験によって決定され、そして臨床医の判断内である。本発明の目的のために、有効な投与量は、これが投与される個体において、一般的に約０．０１ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ、又は約０．０１ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇ、或いは約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの本発明の組成物であるものである。
【０１１８】
医薬組成物は、更に医薬的に受容可能な担体を含有することができる。用語“医薬的に受容可能な担体”は、抗体又はポリペプチド、遺伝子、及び他の治療剤のような治療剤の投与のための担体を指す。この用語は、それ自体が組成物を受ける個体に有害な抗体の産生を誘発しない、そして不当な毒性を伴わず投与することができるいずれもの医薬的担体を指す。適した担体は、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合性アミノ酸、アミノ酸コポリマー、及び不活化ウイルス粒子のような大きいゆっくりと代謝される巨大分子であることができる。このような担体は、当業者にとって公知である。治療組成物中の医薬的に受容可能な担体は、水、生理食塩水、グリセロール及びエタノールのような液体を含むことができる。湿潤化又は乳化剤、ｐＨ緩衝性物質、等のような補助的物質も、更にこのようなベヒクル中に存在することができる。典型的には、治療組成物は、液体溶液又は懸濁液のいずれかとして注射用に調製される；注射に先立つ液体ベヒクル中の溶液又は懸濁液のために適した固体の形態も、更に調製することができる。リポソームは、医薬的に受容可能な担体の定義に含まれる。医薬的に受容可能な塩、例えば塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、等のような無機酸の塩；及び酢酸、プロピオン酸、マロン酸、安息香酸、等のような有機酸の塩も、更に医薬組成物中に存在することができる。医薬的に受容可能な賦形剤の徹底的な議論は、参考文献中で入手可能である。
【０１１９】
組成物は、好ましくは滅菌であり及び／又は発熱物質を含まない。これは、典型的にはｐＨ約７に緩衝されている。
処方後、本発明によって意図される組成物は、（１）患者に直接投与する；又は（２）ｅｘ  ｖｉｖｏで移植片に供給することができる。例えば、移植片が受容者に外科手術的に植込まれる前に、これを本発明の医薬組成物で処理することができる。これは、移植片を、本発明の組成物を含有する溶液で洗浄するか、又はそれに浸漬することによって達成することができる。このような洗浄又は浸漬工程は、移植片を、所定の時間、適当な条件下で本発明の医薬組成物中に浸すか、又はそれで被覆することを含むことができる。適した浸漬時間の例は、好ましくは４℃で、１、２、３、４、５、６時間又はそれより多い時間を含む。本発明による結合体は、造血幹細胞を収集又は保存するために、移植前に使用される種類の既知の溶液に組込むことができる。
【０１２０】
移植片は、使用前に体温まで温めることができる。
一つの例において、本発明による医薬組成物は、局所製剤に組込むことができる。このような可能性は、皮膚がしばしば感染される標的器官の一つであるため、移植片対宿主病（graft-versus-host disease：ＧＶＨＤ）の皮膚を“塗付する”ために十分に適しているものである。火傷部位に特異的な製剤は、炎症を軽減し、そして火傷部位を異質遺伝子型皮膚移植片に対して準備するために使用することができる。
【０１２１】
同様に、組成物の製剤は、例えばＧＶＨＤの肝臓又は大腸を標的とするために使用される静脈内カテーテルにより与えられた位置に高濃度で投与するために設計することができる。
【０１２２】
組成物の直接供給は、一般的に非経口、例えば皮下、腹腔内、静脈内又は筋肉内的に、病巣内  腫瘍内又は組織の間質内空間への注射によって達成されるものである。他の投与の様式は、経口及び肺への投与、座薬、及び経皮適用、針、及び遺伝子銃又は皮下噴霧器を含む。投与治療は、一回投与計画又は多数回投与であることができる。
【０１２３】
本発明の医薬組成物の投与量及び投与の手段は、治療組成物の具体的性質、患者の症状、年齢、及び体重、移植片拒絶の程度、並びに他の関係する因子に基づいて決定される。
本発明による結合体の適した形態をコードする核酸による遺伝子療法は、安全な供給のためのもう一つの可能性である。遺伝子療法は、移植前の移植片自体に（固形の血管新生化移植片に対して）、幹細胞移植の場合の懸濁液中の細胞に、或いは移植前又は後の提供者にのいずれかに適用することができる。遺伝子療法のために使用されるベクターの改変は、外来性に投与される薬物による遺伝子の発現を制御するために使用することができる。遺伝子療法の適用は、ベクターＤＮＡの筋肉内注射又は遺伝子銃（微粒子銃）のようなデバイスの使用のいずれかによることができる。
【０１２４】
治療の方法
本発明は、患者に本発明の結合体又は医薬組成物を投与することを含んでなる、患者の移植片拒絶を予防する方法を含む。先に詳細に記載したように、受容者の患者として適しているために、患者は、本発明の結合体によって認識されるものとは異なっているＭＨＣクラスＩ対立遺伝子を有していなければならない。従って、ＭＨＣクラスＩに対する特異性を持つ結合体の入手の可能性は、本発明を多数の人種間で使用することができる範囲に対する唯一の制限を提起する。この制限が潜在的な提供者の予備要員に対してのみ提起されるが、しかし受容者にはこれがない、即ち誰でも受容者であることができるが、しかし本発明による結合体によって認識される組織型を保有するもののみが提供者になることができるという考えを記述することは価値のあることである。これは、本発明による結合体が全ての一般的な組織型を包含することができるため、実質的困難性を提起しない。従って、然しながら、本発明による方法は、提供者及び受容者の片方又は両方のＭＨＣ対立遺伝子（ＭＨＣクラスＩ対立遺伝子のような）を、試験する工程を組込むことができる。
【０１２５】
本発明は、更に患者に本発明の結合体又は医薬組成物を投与することを含んでなる、患者に移植片に対する耐性を誘発する方法を含む。
結合体又は医薬組成物は、患者に、彼らが移植手術を受ける前、移植手術の最中、及び／又は移植手術が完了した後に投与することができる。
【０１２６】
本発明は、更に先に記載した治療の方法における結合体及び／又は医薬品の使用を提供する。
本発明の方法で治療される患者は、移植片の移植を受けるものであるか、又は移植手術に対して準備されるものである。患者は、動物、好ましくは哺乳動物、そして更に好ましくはヒトであるものである。
【０１２７】
普通の移植片は、肝臓、腎臓、膵臓、角膜、心臓、骨髄、皮膚及び幹細胞である。幹細胞移植は、疾病及び欠損症の場合の細胞及び組織の機能を回復する実行可能な方法として、信頼性を得つつある。他の例は、当業者にとって既知であるものである。
【０１２８】
耐性は、誘発された後、これが同種異系抗原の持続した供給を確実にし、従って免疫学的耐性を維持する機会を最大にすることを確実にするものであるために、移植片が受容者中に存在し続ける限り持続することができる。従って、この状況は、正のフィードバックループを提供し、これによって耐性は、同種異系抗体の継続した供給による更なる耐性に導く移植片の統合性の保存に導く。長期的には、本発明による結合体の中止は、免疫学的耐性が自己持続性になった場合、考慮することができる。当然に、もしも、非免疫学的原因によって、移植片が損傷され、炎症をもたらし、そしてアロ反応性過程を再発する恐れがあるかもしれない場合、このサイクルは中断することができる。この場合、移植片を保護するために、治療の再開を必要とすることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１】ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞の直接的アロ感作の略図である。
【図２】ＣＤ４非依存性ＣＤ８の直接的アロ感作の略図である。
【図３】ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞の間接的アロ感作の略図である。
【図４】結合体による、ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞の直接的アロ感作の阻害の略図である。
【図５】結合体による、ＣＤ４非依存性ＣＤ８直接的アロ感作の阻害の略図である。
【図６】結合体による、直接的アロ認識による制御性Ｔ細胞の誘導の阻害の略図である。
【図７】結合体による、ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞の間接的アロ感作の阻害の略図である。
【図８】結合体による、間接的アロ認識による制御性Ｔ細胞の誘導の阻害の略図である。
【図９】結合体Ａの略図である。α１、α２、α３及びβ２ｍは、ＨＬＡ−Ｇ分子の細胞外領域である。ＶＬＡ及びＶＨＡは、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖の変動領域である。
【図１０】結合体Ｂの略図である；α１、α２、α３及びβ２ｍは、ＨＬＡ−Ｇ分子の細胞外領域である。ＶＬＡ及びＶＨＡは、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖の変動領域である。
【図１１】一過性形質転換の対照である。
【図１２】ＣＯＳ７細胞上清中の結合体Ｂを示すウェスタンブロットである。レーン１＝ベクターのみの形質移入体；レーン２＝ＨＬＡ−Ｇ／β２ｍ形質移入体；レーン３＝結合体Ｂの形質移入体である。
【図１３】結合体Ｃの存在及び非存在中の混合リンパ球の反応である。応答細胞は、ＨＬＡ−Ａ２陰性であり、刺激細胞はＨＬＡ−Ａ２陽性である。
【図１４】ＨＬＡ−Ａ２に結合する結合体Ｂを示す免疫沈降からのウェスタンブロットである。レーン１＝補充された結合体Ｂと共にインキュベートされたＳＡビーズ；レーン２＝結合体Ｂと共にインキュベートされたＳＡビーズ＋ｂＨＬＡ−Ａ２；レーン＝ＳＡビーズ＋ｂＨＬＡ−Ａ２単独である。ウェスタンブロットの検出抗体は、４Ｈ８４（抗−ＨＬＡ−Ｇ）である。
【図１５】ＨＬＡ−Ａ２に対する、結合体Ａではなく、結合体Ｂの結合を示す免疫沈降からのウェスタンブロットである。レーン１＝ＳＡビーズ／ＢＢ７．２；レーン２＝ＳＡビーズ／ｂＨＬＡ−Ａ２／ＢＢ７．２；レーン３＝ＳＡビーズ／補充された結合体Ｂ；レーン４＝ＳＡビーズ／ｂＨＬＡ−Ａ２／補充された結合体Ｂ；レーン５＝ＳＡビーズ／ｂＨＬＡ−Ａ２；レーン６＝ＳＡビーズ／ｂＨＬＡ−Ａ２／補充された結合体Ｂ；レーン７＝ＨＬＡ−Ｇ／補充されたβ２ｍ；レーン８＝補充された結合体Ｂである。ウェスタンブロットの検出抗体は、４Ｈ８４（抗−ＨＬＡ−Ｇ）である。
【図１６】結合体Ｂ及びＨＬＡ−Ｇ／β２マイクログロブリン（図８Ｂに示す）に対する抗ＨＬＡ−Ｇモノクローナル抗体（図８Ａに示す）の結合を示す免疫沈降からのウェスタンブロットである。図１６Ａにおいて、レーン１＝タンパク質Ｇ単独；レーン２＝タンパク質Ｇ＋ＭＥＭ−Ｇ９ｍＡｂ；レーン３＝タンパク質Ｇ＋補充された結合体Ｂと共にインキュベートされたＭＥＭ−９；レーン４＝タンパク質Ｇ＋８７Ｇ−ＰＥｍＡｂ；レーン５＝タンパク質Ｇ＋補充された結合体Ｂと共にインキュベートされた８７Ｇ−ＰＥ；レーン６＝タンパク質Ｇ＋４Ｈ８４ｍＡｂ；レーン７＝タンパク質Ｇ＋補充された結合体Ｂと共にインキュベートされた４Ｈ８４である。検出抗体：４Ｈ８４（抗ＨＬＡ−Ｇ）。レーン７の円で囲んだバンドは、結合体Ｂに結合している４Ｈ８４を示す。図１６Ｂにおいて、レーン１＝タンパク質Ｇ＋ＭＥＭ−Ｇ９；レーン２＝タンパク質Ｇ＋ＨＬＡ−Ｇと共にインキュベートされたＭＥＭ−Ｇ９＋補充されたβ２ｍ；レーン３＝タンパク質Ｇ＋８７Ｇ−ＰＥ；レーン４＝タンパク質Ｇ＋ＨＬＡ−Ｇと共にインキュベートされた８７Ｇ−ＰＥ＋補充されたβ２ｍ；レーン５＝タンパク質Ｇ＋４Ｈ８４；レーン６＝タンパク質Ｇ＋ＨＬＡ−Ｇと共にインキュベートされた４Ｈ８４＋補充されたβ２ｍ；レーン７＝タンパク質Ｇ／Ｗ６／３２；レーン８＝タンパク質Ｇ＋ＨＬＡ−Ｇと共にインキュベートされたＷ６／３２＋補充されたβ２ｍである。検出抗体：４Ｈ８４。レーン２、４及び８の円で囲んだバンドは、結合を示す。レーン６も更に結合を示すように見受けられるが、然しながらこれは、同様な分子量の非特異的バンドによって僅かに明瞭でなくなっている。
【図１７】ＨＬＡ−Ａ２陽性のリンパ球に結合している結合体ＣのＦＡＣＳ分析である。
【図１８】ＨＬＡ−Ａ２陰性の単球に結合している（ＩＬＴ４に結合）結合体ＣのＦＡＣＳ分析である。
【図１９】ＨＬＡ−Ａ２陰性のリンパ球に結合していない結合体ＣのＦＡＣＳ分析である。
【図２０】別個のプラスミド上に同時形質移入されたβ２ｍを伴う、抗−ＨＬＡ−Ａ２のＳｃＦｖ断片に連結したＨＬＡ−Ｇ重鎖からなるＯＲＩＧＢｖ２及びＢ１１ＧＢｖ２構築物の略図である。
【図２１】ストレプトアビジンビーズに結合したビオチニル化ＨＬＡ−Ａ２を使用した免疫沈降を示すウェスタンブロットである。一次検出抗体は４Ｈ８４（非立体構造的抗−ＨＬＡ−Ｇ）である。ＯＲＩＧＢｖ２（６２ｋＤａの予想分子量）のかすかな結合及びＢ１１ＧＢｖ１（７３ｋＤａの予想分子量）及びＢ１１ＧＢｖ２（６０ｋＤａの予想分子量）のより強い結合が見られる。
【図２２】タンパク質Ｇビーズに結合した抗−ＨＬＡ−Ｇ（８７Ｇ）を使用した免疫沈降のウェスタンブロットを示す。一次検出抗体は、４Ｈ８４（非立体構造的抗−ＨＬＡ−Ｇ）である。Ｂ１１ＧＢｖ１（７３ｋＤａの予想分子量）のかすかな結合並びにＯＲＩＧＢｖ２及びＢ１１ＧＢｖ２／β２ｍ（それぞれ６２及び６０ｋＤａの予想分子量）のより強い結合が箱の領域で見られる。
【図２３】Ｇ体は、ＨＬＡ−Ａ２陽性のＣＤ３／ＣＤ２８仲介の増殖を容量依存的に阻害するが、しかしＨＬＡ−Ａ２陰性ＰＢＭＣのそれはない。ＰＢＭＣ（１×１０５）を、抗−ＣＤ３／抗−ＣＤ２８の１ビーズ対５細胞の比で被覆されたビーズで、非存在又は増加する投与量のＧ体の更なる存在中で活性化した。増殖を［３Ｈ］−ＴｄＲの組込みによって評価した。（Ａ）ＨＬＡ−Ａ２陽性の提供者Ｃ、増殖を３日目（Ａ１）及び７日目（Ａ２）に測定した。（Ｂ）ＨＬＡ−Ａ２陽性の提供者Ｊ、増殖を３日目に測定した。（Ｃ）ＨＬＡ−Ａ２陰性の提供者Ｋ、増殖を７日目に測定した。＄は、使用された対照である：５ｕｇ／ｍｌのＧ体中に存在するものと同等の最高の濃度で試験された抗−ＨＬＡ−Ａ２及びＨＬＡ−Ｇ−四量体である。
【図２４】Ｇ体は、ＨＬＡ−Ａ２陽性のスーパー抗原（ＳＥＢ）仲介の増殖を容量依存的に阻害するが、しかしＨＬＡ−Ａ２陰性のＰＢＭＣのそれはない。ＰＢＭＣ（１×１０５）を、示さない限り１ｎｇ／ｍｌのＳＥＢで、Ｇ体の非存在又は増加する投与量の更なる存在中で活性化した。増殖を［３Ｈ］−ＴｄＲの組込みによって評価した。（Ａ）ＨＬＡ−Ａ２陽性の提供者Ｊ、増殖を３日目（Ａ１）及び７日目（Ａ２）に測定した。（Ｂ）ＨＬＡ−Ａ２陽性の提供者Ｃ、増殖を３日目に測定した。（Ｃ）ＨＬＡ−Ａ２陰性の提供者Ｋ、増殖を３日目に測定した。＄は、使用された対照である：５ｕｇ／ｍｌのＧ体中に存在するものと同等の最高の濃度で試験された抗−ＨＬＡ−Ａ２、抗−ＨＬＡ−Ａ２及びＨＬＡ−Ｇ−四量体に対するアイソタイプの対照である。
【発明を実施するための形態】
【０１３０】
本発明は、ここに、実施例に対する特別な言及により詳細に記載されるものである。これらの実施例が、制約することを意図することは全くないことは認識されるものである。
【実施例１】
【０１３１】
［実施例１−ペプチドの産生］
ＢＢ７．２ハイブリドーマの配列決定
全ＲＮＡを、ＢＢ７．２ハイブリドーマのペレットからＦｕｓｉｏｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｌｔｄ．のインハウスの全ＲＮＡ抽出プロトコルを使用して抽出した。抽出したｍＲＮＡを逆転写して、オリゴ（ｄＴ）プライマーを使用してｃＤＮＡを産生した。このｃＤＮＡを、モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬ領域に隣接するオリゴヌクレオチドプライマーを使用するＰＣＲ反応のためのテンプレートとして使用した。
【０１３２】
ＰＣＲで増幅されたＶＨ及びＶＬのＤＮＡ産物を、ｐＣＲ２．１配列決定ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローン化し、そしてＴＯＰ１０のＥ．ｃｏｌｉ細胞中に形質転換した。陽性に形質転換されたコロニーを単離し、そしてＦｕｓｉｏｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｌｔｄ．によって配列決定した。
【０１３３】
ＢＢ７．２ハイブリドーマＳｃＦｖを含んでなる結合体Ａ
ＨＬＡ−Ｇ、β２−マイクログロブリン及びＢＢ７．２のＳｃＦｖ部分を含んでなるポリペプチド結合体（結合体Ａと表示）を、二つのポリペプチド鎖として産生した。一番目は、ＢＢ７．２のＶＨ領域に融合したＨＬＡ−Ｇを含んでなり、そして二番目は、β２−マイクログロブリンに融合したＢＢ７．２のＶＬ領域を含んでなる。それぞれのポリペプチド鎖のそれぞれの断片は、（Ｇ４Ｓ）１−３リンカーで連結されていた。二つのポリペプチドをヒューリン開裂部位リンカーで連結し、そしてｃ−ｍｙｃ及び６×標識を組込んで、精製及び検出を可能にした。各種の制限酵素開裂部位を合成遺伝子中に組込んで、各種の成分の除去及び／又は置換を可能にし、そして将来の改変を可能にした（図９）。
【０１３４】
それらの合成後、構築物を、ＧｅｎｓｃｒｉｐｔによってｐｃＤＮＡ３．１発現ベクター中にクローン化した。次いで形質転換適合性Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を、構築物を含有するｐｃＤＮＡ３．１ベクターで形質転換し、そして陽性の形質転換体を抗生物質耐性の獲得によって確認した。プラスミドＤＮＡを大量調製（ｍａｘｉｐｒｅｐａｒｅｔｉｏｎ）によって得た。
【０１３５】
Ｂ１１ＳｃＦｖを含んでなる結合体Ｂ
二番目の結合体（結合体Ｂと表示）を、ＢＢ７．２から誘導されたＳｃＦｖ配列を、公表されたＢ１１配列（図１０）で置換することによって、結合体Ａから産生した。
【０１３６】
Ｂ１１ＳｃＦｖのクローンを、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＵＫのＤｒ．Ｗａｔｋｉｎｓ及びＤｒ．Ｏｕｗｅｈａｎｄからの親切な贈り物として得た。公表された配列の検証後、クローンをＴＯＰ１０細胞中に形質転換し、続いてプラスミドのＤＮＡを抽出した。プラスミドＤＮＡを、Ｍ１３Ｆ、Ｍ１３Ｒ及び特別調製の“ＡＧＧＣＧＡＧＴＣＡＧＧＡＣＡＴＴＡＧＣ”プライマーを使用して、Ｇｅｎｅｓｅｒｖｉｃｅによって配列決定した。配列の検証を、公表された配列との比較によって行った。
【０１３７】
特別調製の（custom）Ｂ１１ＳｃＦｖ挿入配列の設計及び合成
特別調製のＢ１１ＳｃＦｖ配列は、５’及び３’末端に接続された（Ｇ４Ｓ）３リンカーを伴う検証されたＢ１１ＳｃＦｖ配列を含んでなる。（Ｇ４Ｓ）３リンカーは、更に二つの変動領域間に組込まれる。ＢｓｐＥＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素開裂部位を、５’及び３’末端に組込んで、特別調製のＢ１１ＳｃＦｖ配列の、結合体Ａ構築物のＢＢ７．２ＳｃＦｖ配列の場所へのクローン化を可能にする。結合体Ｂは、ｃ−ｍｙｃ標識又はヒューリン開裂部位を含んでいなかった。
【０１３８】
この特別調製の配列をＧｅｎＳｃｒｉｐｔに提示し、ここでコドンをＣＯＳ７細胞中の発現のために最適化された。特別調製のＢ１１ＳｃＦｖポリヌクレオチドを合成し、そして前のｐＵＣ５７ベクター中にクローン化した。
【０１３９】
特別調製のＢ１１ＳｃＦｖ配列の構築物Ａ中のクローン化
Ｂ１１のｐＵＣ５７ベクターを、ＴＯＰ１０細胞中に形質転換し、続いてプラスミドを少量調製（ｍｉｎｉｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）にかけた。結合体Ａ及び特別調製のＢ１１のｐＵＣ５７プラスミドを、ＢｓｐＥＩ及びＢａｍＨＩと共に６０分間３７℃で消化した。消化産物を、０．８％アガロースゲル上で分離した。消化された結合体Ａの断片（ＢＢ７．２ＳｃＦｖを含まない）及び特別調製のＢ１１ＳｃＦｖ配列をゲル抽出によって得て、次いで連結した。次いでＴＯＰ１０細胞を連結産物と形質転換してから、プラスミドＤＮＡの少量調製を行った。
【０１４０】
プラスミドＤＮＡの少量調製物を、Ｇｅｎｅｓｅｒｖｉｃｅによって配列決定した。Ｔ７Ｆ、ｂＧＨＲ及び“ＡＴＧＧＡＡＣＣＴＴＣＣＡＧＡＡＧＴＧＧ”プライマーを使用した、配列分析は、特別調製Ｂ１１ＳｃＦｖ配列が、結合体ＡのＢＢ７．２を正しく置換したことを確認した。
【０１４１】
配列の確認後、形質転換されたＴＯＰ１０細胞を使用して、少量調製を行った。
ヒューリン開裂を向上するための結合体Ａとの同時形質転換のためのヒューリンのクローン化
ヒューリンｃＤＮＡ挿入物を伴うｐＲｃ／ＣＭＶプラスミドを、共同研究者から得た。このプラスミドをＴＯＰ１０細胞中に形質転換し、そして大量調製からの産物を産生した。
【０１４２】
ビオチン−ストレプトアビジン連結ポリペプチドを含んでなる結合体Ｃ
ＨＬＡ−Ｇに連結したＢＢ７．２モノクローナル抗体を含む、化学的に連結した結合体（結合体Ｃと表示）を産生した。結合体を、ストレプトアビジンに連結されたＢＢ７．２ｍＡｂをビオチニル化されたＨＬＡ−Ｇと１：１２又は１：４のいずれかのモル比で混合し、続いて室温で３０分間インキュベートすることによって形成した。
【０１４３】
ＢＢ７．２モノクローナル抗体のストレプトアビジンへの結合
ＥＺ−Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｌｉｎｋのキットからの専売試薬の添加後、ＰＢＳ中の１００μｇ又は３００μｇの精製されたＢＢ７．２ｍＡｂを、１００μｇのストレプトアビジン中に概略１：３又は１：１のモル比で加えた。この混合物を３時間インキュベーとし、次いで反応を専売のクエンチ用試薬を使用し停止した。
【０１４４】
ＨＬＡ−Ｇのビオチニル化
ビオチニル化ＨＬＡ−Ｇを、Ｆｒａｎｋ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒから購入した。
【実施例２】
【０１４５】
［実施例２−対照の産生］
形質転換対照の産生
高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）配列を、ｐｃＤＮＡ３．１中にクローン化し、次いでＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ制限酵素を使用する消化によって抽出した。ｐｃＤＮＡ３．１を、更にＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩで消化した。アガロースゲル電気泳動及びゲル抽出による分離後、ＥＧＦＰ配列及び直線化されたｐｃＤＮＡ３．１ベクターを、Ｔ４のＤＮＡリガーゼを使用して一緒に連結した。次いでＴＯＰ１０細胞を、このベクターと共に形質転換した。ＥＧＦＰの配列を、Ｇｅｎｅｓｅｒｖｉｃｅにおいて行った配列分析によって確認した。次いでプラスミドの大量調製を行った。
【０１４６】
実験対照の産生
全長のＨＬＡ−Ｇ、可溶性ＨＬＡ−Ｇ又はβ２−マイクログロブリン配列を、実験対照として使用するためにｐｃＤＮＡ３．１中にクローン化した。
【０１４７】
全長のＨＬＡ−ＧのｃＤＮＡを、ＪＥＧ３細胞から抽出した逆転写されたＲＮＡから誘導した。プライマーを、ｐｃＤＮＡ３．１方向性ＴＯＰＯクローニング系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に製造業者の説明書によって使用するために設計した。ＴＯＰ１０細胞を、ＨＬＡ−Ｇの全長のｃＤＮＡ配列を含有するベクターと共に形質転換した。全長のＨＬＡ−ＧのｃＤＮＡ配列を、配列分析によって確認し、続いてベクターを大量調製にかけた。
【０１４８】
可溶性ＨＬＡ−Ｇを、結合体ＡプラスミドからのＰＣＲによってクローン化した。ＰＣＲプライマーは、可溶性ＨＬＡ−ＧのｐｃＤＮＡ３．１へのクローン化を容易にするために、ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ制限部位を組込んだ。可溶性ＨＬＡ−Ｇを、ｐｃＤＮＡ３．１中にクローン化するために、ＰＣＲ産物及びｐｃＤＮＡ３．１ベクターをＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩで消化した。ＰＣＲ産物を、Ｑｉａｇｅｎ  Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットを使用して精製し、そして消化されたｐｃＤＮＡ３．１をゲル抽出し、続いてアガロースゲル電気泳動によって分離した。
【０１４９】
ベクター及び挿入物を連結し、そしてＴＯＰ１０を形質転換するために使用してから、ＤＮＡ配列検証及び大量調製にかけた。
β２マイクログロブリンを、ＡＴＣＣから得た‘β２Ｍ  ＭＧＣ’からのＰＣＲによってクローン化した。プライマーを、いずれかの末端のＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ制限酵素部位と共に設計して、可溶性ＨＬＡ−Ｇクローンのために使用したもののような戦略を使用して、ｐｃＤＮＡ３．１へのクローン化を容易にした。
【実施例３】
【０１５０】
［実施例３−形質移入実験］
一過性形質移入
ＣＯＳ７細胞の一過性形質移入を、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔを、そしてその後Ａｔｔｒａｃｔｅｎｅ試薬（無血清媒地と共に使用するために購入）を使用して行った。
【０１５１】
ＣＯＳ７形質移入対照
ＣＯＳ７細胞を、ＥＧＦＰ構築物と共に一過性で形質移入して、形質移入系が働くか否かを試験した。形質移入の４８から７２時間後、ＣＯＳ７細胞を、トリプシン化によって回収した。次いで細胞を、フローサイトメトリ−法によって分析し、これは、４０−５０％のＣＯＳ７細胞がＥＧＦＰを発現していることを明らかにした（図１１）。
【０１５２】
ＣＯＳ７細胞を、更に結合体Ａ又はＨＬＡ−Ｇ／β２−マイクログロブリンと共に形質移入し、或いは更にヒューリンを伴う結合体Ａと共に同時形質移入して、ヒューリン開裂部位の開裂を昂進した。これらの三つの実験からの上清を、下流の適用において使用するために、形質移入の７２時間後に収集した。
【０１５３】
ＩＬＴ２及びＩＬＴ４プラスミドによるＫ５６２細胞の安定な形質移入
ＩＬＴ２及びＩＬＴ４プラスミドを、Ａｔｔｒａｃｔｅｎｅ形質移入試薬と混合し、そしてＫ５６２細胞と共に４８時間インキュベーとしてから、Ｇ４１８を８００μｇ／ｍｌ含有する完全培地に移して、形質移入されたＫ５６２細胞の選択を可能にした。細胞を、選択性培地中に２から３週間維持して、形質移入されていない細胞の非存在を確実にした。
【０１５４】
形質転換されたＫ５６２細胞中の発現レベルの決定
次いでＩＬＴ２及びＩＬＴ４で形質転換されたＫ５６２細胞を、それぞれ抗−ＩＬＴ２及び抗−ＩＬＴ４ｍＡｂで染色して、発現レベルを決定した。高度に発現したクローンを、その後、ＢＤ  ＦＡＣＳ  ＡＲＩＡ細胞選別装置を使用して選別してから、限界希釈クローニングした。
【０１５５】
高度に発現したクローンを、数日間培養して、その数を増加してから、限界希釈クローン化を行った。細胞を数え、そして濃度をｍｌ当たり２．５細胞に調節した。次いで２００μｌの細胞を、９６ウェルの平底プレート中で２から３週間、コロニーが形成されるまでインキュベートした。次いでこれらの単一クローンのコロニーを更に拡大し、そしてＩＬＴ２及びＩＬＴ４の発現のためにスクリーニングして、最高の細胞の発現のために更に富化した。
【０１５６】
ＣＯＳ７細胞中のタンパク質の発現を確認するためのウェスタンブロット
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、それに続く抗−ＨＬＡ−ＧｍＡｂ（４Ｈ８４）によるウェスタンブロットを行って、形質転換されたＣＯＳ７細胞の上清中の結合体Ａ及び結合体Ｂ並びにＨＬＡ−Ｇの存在を検出した。この分析は、適当な分子量のタンパク質の存在を明らかにした（図１２）。
【０１５７】
抗−Ｃ−ｍｙｃ、抗−Ｈｉｓ及び抗−β２ミクログロブリン抗体によるウェスタンブロットは、膜上のタンパク質の再折りたたみのために、可能な明確な結合を示すことに失敗した。
【実施例４】
【０１５８】
［実施例４−混合リンパ球反応］
細胞仲介の障害性
細胞仲介の細胞障害性を分析するために、ＰＢＭＣ及びＣ０７３を、１０：１の比で７日間インキュベートした。７日後、ＰＢＭＣを洗浄し、そして数えた。新しいＣ０７３細胞を、カルボキシフルオレセンスクシンイミドエステル（ＣＦＳＥ）で塗布し、そして感作されたＰＢＭＣを、塗付されたＣ０７３細胞に各種の比で加えた。フローサイトメトリ−分析は、標的細胞の約７０−８０％の溶解を示した。
【０１５９】
結合体Ｃの存在下での増殖反応の評価
マイトマイシン−Ｃで処理されたＨＬＡ−Ａ２陰性の応答体及びＨＬＡ−Ａ２陽性の刺激体細胞による混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を、増殖反応に対する結合体Ｃの効果を評価するために使用した（図１３）。応答体及び刺激体集団を、１：１の比で、更にＲＰＭＩ培地、１０％の熱不活化胎児（ウシ）仔ウシ血清（ＦＣＳ）、ペニシリン及びストレプトマイシンを含有する９６ウェルのＵ底プレートのウェル当たり１０５細胞でインキュベートした。
【０１６０】
マイトマイシン−Ｃの処理は、細胞を、完全培地中に、２×１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁すること及びマイトマイシン−Ｃの２５ｕｇ／ｍｌの濃度における添加を含んでいた。細胞を、１時間３７℃でインキュベートし、そして次いで完全培地で３回洗浄してから、使用した。
【０１６１】
結合体Ｃを、最高及び最低の濃度間の１０倍の差を持つ４種の異なった濃度（Ｃ１＝２．２μｇ／ｍｌ、Ｃ２＝１．１μｇ／ｍｌ、Ｃ３＝０．５５μｇ／ｍｌ、Ｃ４＝０．２２μｇ／ｍｌ）で加えた。細胞を７日間インキュベートし、そして回収の１８時間前に３Ｈチミジンでパルス標識し、この時点でベータカウンターを使用して放射能を測定した。
【０１６２】
最初の実験は、結合体Ｃの添加は、対照と比較して向上した増殖をもたらすことを示した。その後、内毒素レベルを、Ｌｏｎｚａ  ＬＡＬキットを使用して測定した（ビオチニル化ＨＬＡ−Ｇの供給源が細菌性であったため）。内毒素のレベルは、キットの検出上限を超えていることが見いだされた。
【０１６３】
その後、内毒素レベルを、Ｎｏｒｔｅｋ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ除去キットを使用して激減させ、その後、内毒素レベルを再度測定し、そして有意に低いことが見いだされた（実験に使用した濃度において＜０．１ＥＵ／ｍｌ）。
【０１６４】
ＨＬＡ−Ａ２のアロ増殖反応に対する結合体Ｃの影響を試験するために、ＭＬＲを、ＨＬＡ−Ａ２陰性の提供者（応答体として使用）及びＨＬＡ−Ａ２陽性の提供者（刺激体として使用）からのＰＢＭＣを使用して、結合体Ｃの存在及び非存在下で行った。結合体Ｃの添加は、アロ増殖反応の減少をもたらした。
【０１６５】
結合体Ｃを使用してこのＭＬＲを繰返すことは、それが内毒素が浄化された内毒素の場合、７日目の３Ｈ−チミジン取込みによって測定されるアロ増殖反応の減少に導いた。
ＨＬＡ−Ａ２陽性のＥＢＶで形質転換されたＢ−ＬＣＬ細胞系（Ｃ０７３）を、ＭＬＲ実験及び細胞仲介の細胞障害性実験に使用した。
【０１６６】
ＭＬＲにおいて、１０５のＰＢＭＣを、９６ウェルのＵ底プレート中のウェルに加え、そしてＣ０７３細胞（マイトマイシン−Ｃで処理）と共に、１：１、１：３、１：１０及び１：３０のＰＢＭＣ：Ｃ０７３でインキュベートした。７日目における良好な増殖反応を、３Ｈ−チミジン取込みを使用して測定した。
【実施例５】
【０１６７】
［実施例５−結合研究］
ストレプトアビジンアガロースビーズにカップリングしたＨＬＡ−Ａ２を使用する免疫沈降（ＩＰ）実験は、ＨＬＡ−Ａ２に対する結合体Ａ構築物の結合を示さなかった。対照的に、結合体Ｃは、ＨＬＡ−Ａ２に対する結合を確かに示した（図１４）。
【０１６８】
免疫沈降研究のためのプロトコル
３０μｌのストレプトアビジンアガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を、１ｍｌのＰＢＳで洗浄した。洗浄後、ストレプトアビジンアガロースビーズを、２５０μｌのＰＢＳ中の１μｇのビオチニル化ＨＬＡ−Ａ２（Ｆｒａｎｋ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｒｅから購入）と共に１時間インキュベートして、ビオチニル化ＨＬＡ−Ａ２のビーズへの結合を可能にした。次いでビーズを、結合体Ａ又は結合体Ｂで形質移入された細胞からの２５０μｌの上清と共に３時間インキュベーとした。次いでビーズを１ｍｌのＰＢＳで３回洗浄してから、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット分析により分離した。
【０１６９】
ウェスタンブロット分析は、抗−ＨＬＡ−Ｇ（４Ｈ８４）を検出抗体として使用し、そしてこれは、ＨＬＡ−Ａ２ビーズが結合体Ｂをプルダウンしたが、結合体Ａはそうではないことを示した（図１５）。
【０１７０】
ＨＬＡ−Ｇ／β２マイクログロブリン又は結合体Ｂの立体構造を分析するための各種の抗−ＨＬＡ−ＧｍＡｂを使用するＩＰ実験
３０μｌのタンパク質Ｇセファロースビーズを、１ｍｌのＰＢＳで一回洗浄し、次いで２５０μｌ中の１μｇのｍＡｂと共に１時間インキュベーとして、結合させた。ｍＡｂは、立体構造のｍＡｂ、８７Ｇ、ＭＥＭ−Ｇ９及びＷ６／３２並びに非立体構造のｍＡｂ４Ｈ８４を含んでいた。カップリングしたビーズを、ＰＢＳで二回洗浄し、次いで２５０μｌのＰＢＳ、或いはＨＬＡ−Ｇ／β２マイクログロブリン又はＣＯＳ７細胞と同時形質移入された結合体Ｂから得た上清のいずれかと共に３時間インキュベートした。次いでビーズを１ｍｌのＰＢＳで３回洗浄してから、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットによって分離した。
【０１７１】
ウェスタンブロット分析は、立体構造の抗体は、ＨＬＡ−Ｇ／β２Ｍをプルダウンすることが可能であったが、結合体Ｂはそうではないことを明らかにし、ＨＬＡ−Ｇ部分に伴う折りたたみの問題があり得ることを示唆した（図１６）。従って、本出願人等は、最初の例中の分子のβ２Ｍ部分を含まないＧ体（本来の及びＢ１１変種）を、再クローン化した。
【０１７２】
ＦＡＣＳ分析
ＦＡＣＳ分析を、ＰＢＭＣを結合体Ｃと共に１時間氷上でインキュベートすることによって行った。次いで細胞を、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ／０．１％アジドで二回洗浄した。二番目の抗体（ＧＡＭ  ＦＩＴＣ）を加え、そして細胞を１時間氷上でインキュベートした。２回の更なる洗浄後、細胞を、５００μｌのＢＤ  ＣｅｌｌＦｉｘ中に固定してから、流動ＦＡＣＳ分析にかけた。
【０１７３】
ＦＡＣＳ分析は、結合体Ｃが、ＨＬＡ−Ａ２陽性のリンパ球（図１７）及びＨＬＡ−Ａ２陰性の単球（図１８）に結合することが可能であるが、しかしＨＬＡ−Ａ２陰性のリンパ球には結合しない（図１９）ことを、検出抗体としてヤギ−抗−マウスＩｇを用いて、明らかにした。
【０１７４】
〔実施例５ａ−β２Ｍ断片を含まない本来のＧ体（ＯＲＩＧＢｖ１）及びＢ１１−Ｇ体（Ｂ１１ＧＢｖ１）の再クローン化並びにその後の結合研究〕
ＯＲＩＧＢｖ１及びＢ１１ＧＢｖ１を、β２ｍ断片を含まずに再クローン化して、これが、分子のＨＬＡ−Ｇ部分が正しく折りたたまれることを可能にするか否かを決定した。
【０１７５】
β２ｍ断片（及び６×Ｈｉｓ標識）を含まない組換えＧ体の更なるバージョン“バージョン２”を、ＰＣＲクローン化によって産生した（図２０）。ＯＲＩＧＢｖ１及びＢ１１ＧＢｖ１を、ＰＣＲクローン化のテンプレートとして使用した。新しい構築物を、５’Ｎｈｅｌ及び３’ＢａｍＨＩ制限酵素部位（下線部）を伴って設計して、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターへのクローン化を可能にした。ＯＲＩＧＢｖ２クローン化のために使用したプライマーは、５’−ＣＴＧＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＧＴＣ及びＡＴＡＧＧＡＴＣＣＴＣＡＣＧＧＧＧＧＴＧＴＣＧＴＡＣＧＧＧＣＴＧ−３’であり；一方Ｂ１１ＧＢｖ２クローン化のために使用したプライマーは、５’−ＣＴＧＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＧＴＣ及びＡＴＡＧＧＡＴＣＣＴＣＡＣＣＣＧＡＧＣＡＣＴＧＴＣＡＧＣＴＴＧＧ−３’であった。
【０１７６】
ＰＣＲ産物を、０．８％のアガロースゲルにかけ、そして予測された大きさに対応するバンドをゲルから抽出し、そしてＮｈｅｌ及びＢａｍＨＩ制限酵素とインキュベートしてから、Ｑｉａｇｅｎ  ＰＲＣ産物精製キットで精製した。
【０１７７】
ｐｃＤＮＡ３．１（＋）プラスミドを、更にＮｈｅｌ及びＢａｍＨＩ制限酵素と共にインキュベートしてから、０．８％のアガロースゲルにかけた。対応する直線化プラスミドをゲルから抽出した。直線化されたベクター及びＲＥで消化された挿入物を連結し、そしてＴＯＰ１０細胞中に形質転換した。
【０１７８】
ＤＮＡの配列決定は、ＯＲＩＧＢｖ１及びＢ１１ＧＢｖ１プラスミドが、意図する配列を有していたことを確認した。使用した配列決定プライマーは、Ｔ７Ｆ及びｂＧＨＲ系統であった。
【０１７９】
ＯＲＩＧＢｖ１及びＢ１１ＧＢｖ１の結合特性
免疫沈降実験は、Ｂ１１ＧＢｖ２のＨＬＡ−Ａ２への結合を確認した（図２１）。興味あることに、ＯＲＩＧＢｖ２も、更にＨＬＡ−Ａ２に対する弱い結合を示した。
【０１８０】
更に、ＯＲＩＧＢｖ２及びＢ１１ＧＢｖ２の両方は、立体構造のモノクローナル抗体８７Ｇ及びＭＥＭ−Ｇ／９に対する大きい結合を示した。図２２は、８７Ｇに対する結合を示し、そしてパターンがＭＥＭ−Ｇ／９と同じであることを示した。
【０１８１】
要約として、Ｂ１１ＧＢｖ２は、ＨＬＡ−Ａ２に対する結合を示し、そして正しい立体構造状態を有するＨＬＡ−Ｇ部分を有していた。ＯＲＩＧＢｖ２は、正しい立体構造状態のＨＬＡ−Ｇ部分を有し、そして恐らくＨＬＡ−Ａ２に対する結合の程度も同様に有していた。
【実施例６】
【０１８２】
［実施例６−ＰＢＭＣ中の増殖反応に対するＧ体（実施例１で定義された結合体Ｃ）の効果］
免疫細胞機能に対するＧ体の効果に対処し、そしてＴ細胞の増殖に対するＧ体の役割を試験するために二つの異なった方法を使用した。
【０１８３】
試薬
使用した組織培養培地は、１０％ＦＣＳ（５６℃で３０分間熱不活性化、Ｓｉｇｍａ）  １００Ｕ／ｍｌのペニシリン（Ｓｉｇｍａ）及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）並びに２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ）で補充されたＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）であった。Ｔ細胞の活性化を、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｔ−ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、１：５のビーズ：細胞比で、又はスーパー抗原Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓエンテロトキシンＢ（ＳＥＢ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で、１ｎｇ／ｍｌの最終濃度で使用して誘導した。
【０１８４】
ＰＭＢＣ中の増殖反応の誘導及び測定
ＰＢＭＣを、バフィーコート（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｌｏｎｄｏｎ）から、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ｎｙｃｏｍｅｄ）の密度勾配遠心によって単離し、フローサイトメトリ−法（以下を参照されたい）によってＨＬＡ−Ａ２発現のために分類し、そして液体窒素中で９０％のＦＣＳ／１０％のＤＭＳＯ中で更なる使用まで保存した。
【０１８５】
ＰＢＭＣ（１×１０５細胞／２５０μｌ）を、９６ウェルの丸底プレート中で、増加した投与量の結合したＧ体（抗−ＨＬＡ−Ａ２ｍＡｂ当量として計算、０．１−２．５μｇ／ｍｌの範囲）と共に培養した。並行して、次の対照：抗−ＨＬＡ−Ａ２（２．５μｇ／ｍｌ、ＩｇＧ２ｂ、クローンＢＢ７．２、インハウスで増殖）、ＩｇＧ２ｂ（２．５μｇ／ｍｌ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＨＬＡ−Ｇ四量体（２．５μｇ／ｍｌ、ｍＡｂ当量）も、幾つかの実験において試験した。ＰＢＭＣを、ＳＥＢ又は抗−ＣＤ３／抗−ＣＤ２８被覆ビーズのいずれかで活性化した。増殖反応を、［３Ｈ］−ＴｄＲ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の組込みを、３及び／又は７日間の培養の最後の１６時間中に３７ＫＢｑ／ウェルでパルス標識した後、液体シンチレーション分光分析によって測定することによって評価した。
【０１８６】
フローサイトメトリ−法によるＰＢＭＣに対するＨＬＡ−Ａ２発現の評価
ＰＢＭＣを洗浄し、再懸濁し、そして氷上で３０分間１％のＢＳＡ及び０．０５％のＮａＮ３を含有するＰＢＳ中で染色した。細胞を、ＦＩＴＣ結合のマウス抗−ヒトＨＬＡ−Ａ２ｍＡｂ（ＩｇＧ２ｂ、１μｇ／ｌ×１０６細胞、インハウスで増殖及び結合したクローンＢＢ７．２）又はアイソタイプ適応化ＦＩＴＣ結合の対照ｍＡｂ（ＭＢＬ）で染色した。データを、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒのフローサイトメトリ−器で獲得し、そしてＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒソフトウェアを使用して解析した。
【０１８７】
統計解析
データを、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定を伴うＡＮＯＶＡを使用するＳＰＳＳソフトウェアで統計的に解析した。＜０．０５のＰ値を、有意性のレベルと考えた。
【０１８８】
【表２】
0005848254.tif 000003
【０１８９】
Ｇ体はＣＤ３／ＣＤ２８誘導性のＰＢＭＣ増殖を用量依存的に阻害する
Ｇ体が、ＰＢＭＣの増殖を調節することができるという疑問に対処するために、細胞を、ＨＬＡ−Ａ２陽性又はＨＬＡ−Ａ２陰性の提供者の末梢血から単離した（データは示されていない）。その後、ＰＢＭＣを、抗−ＣＤ３／抗−ＣＤ２８抗体で被覆されたビーズで増加したＧ体の投与量の非存在又は存在中で多クローン的に活性化した。増殖を、培養の３及び７日目に評価した。ＨＬＡ−Ａ２陽性の提供者（提供者Ｃ）からのＰＢＭＣを使用して、本出願人等は、試験した最高のＧ体投与量における［３Ｈ］−ＴｄＲの組込みにおける有意な７０％の減少に達する増殖の用量依存性阻害を観察した（図２３Ａ、表２）。その後、本出願人等は、更にＨＬＡ−Ａ２陽性の提供者を試験し、そして（例えば提供者Ｊで）増殖の５０％の有意な減少が、活性化後３日目にすでに見られることを観察した（図２３Ｂ、表２）。これらのデータは、異なった提供者が、Ｇ体の阻害効果に異なった動態で反応することを示す。更に、ＨＬＡ−Ａ２（抗−ＨＬＡ−Ａ２により）又はＬＩＬＲ（ＨＬＡ−Ｇ四量体により）を標的とすることが、免疫抑制をもたらすことができることは報告されているが、本出願人等の実験において、抗−ＨＬＡ−Ａ２及びＨＬＡ−Ｇを、Ｇ体の形態で組合せた場合、相乗的阻害効果が存在することを見るのは印象的である。これは、ＰＢＭＣ増殖に対して個々の成分（即ち抗−ＨＬＡ−Ａ２又はＨＬＡ−Ｇ四量体、図２３Ｂ）による僅かな又は少しの阻害効果があった場合でさえ、Ｇ体が強力な阻害効果をなお示すために、特に実際的な重要性を有する。
【０１９０】
然しながら、興味あることに、ＨＬＡ−Ａ２陰性のＰＢＭＣは、Ｇ体によって影響されない（図２３Ｃ、表２）。ＨＬＡ−Ａ２の発現は、先に記載した実験によって示されるように、阻害効果が起こるために必須であるように見受けられる。
【０１９１】
Ｇ体はスーパー抗原誘導のＰＢＭＣ増殖の強力な阻害剤である
ＡＰＣ−Ｔ細胞の相互作用中のＧ体の効果を評価するために、ＰＢＭＣを、ＭＨＣ  ＩＩ／ＴＣＲクロスリンカー、スーパー抗原ＳＥＢで、増加する投与量のＧ体の存在中でオリゴクローナルに活性化した。最初、本出願人等は、３種の異なった投与量のＳＥＢで活性化した培養物中のＧ体の効果を試験した。活性化後３日目に、本出願人等は、７０％までの増殖の有意な減少を観察し、これは、ＳＥＢを１ｎｇ／ｍｌの低い投与量で使用した場合に最も明白であった（図２４Ａ１）。この効果は、１０ｎｇ／ｍｌのＳＥＢで活性化後７日目に更に明白となり、一方１００ｎｇ／ｍｌのＳＥＢでは、いずれかの時点においても有意性に達しなかった（図２４Ａ２）。
【０１９２】
再び、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズによる実験において観察したように、本出願人等は、その個々の成分の等モル濃度と比較した場合、より強力なＧ体の効果を観察した（図２４Ａ及び２４Ｂ）。
【０１９３】
最後に、ＨＬＡ−Ａ２陰性のＰＢＭＣは、Ｇ体によって影響されず（図２４Ｃ、表２）、そして従って、ＨＬＡ−Ａ２の発現は、阻害効果のために不可欠であるように見受けられる。
【０１９４】
本出願人等は、ＨＬＡ−Ｇ四量体及び抗−ＨＬＡ−Ａ２をＧ体の形態に組合せたときの相乗効果を示した。これは新規な概念であり、そして本発明の概念を支持する。
更に、ＨＬＡ−Ａ２陰性に対するＨＬＡ−Ａ２陽性の提供者で行われた実験によって示されたように、免疫細胞によるＨＬＡ−Ａ２の発現が阻害効果が起こるための前提条件であるように見受けられる。従って、これらのデータは、ＨＬＡ−Ａ２以外の抗原に対する免疫反応が不当に損なわれるものではないという概念を支持し、そしてＧ体の効果が移植の設定におけるＨＬＡミスマッチに対して特異的であり、それゆえに、無差別な免疫抑制を起こす可能性がないものであることを確認する。これらの結果におけるＨＬＡ−Ａ２に対する特異性は、更に本明細書中に記載される本発明の作用を支持している。
【０１９５】
最後に、本出願人等のデータは、ＨＬＡ−Ａ２陰性のＰＢＭＣの増殖に対する有意な阻害効果がないことから、ＰＢＭＣの増殖に対するＧ体の阻害効果が外来性タンパク質の何らかの仮想の一般的毒性によるものではないことを証明している。
【実施例７】
【０１９６】
［実施例７−更なる実験の提案］
免疫反応に対する結合体の効果を更に評価するために更なる実験を行うことができる。
提案１
本発明人等は、ＰＢＭＣナチュラルキラー細胞の細胞障害性実験における標的としてのＣＦＳＥで塗付されたＫ５６２細胞を使用する実験を提案する。
【０１９７】
提案２
抗原提示細胞としてのＨＬＡ−Ａ２の供給源でパルス標識された単球由来の樹状細胞及び応答体細胞集団としての自己ＰＢＭＣを使用する間接感作に対する結合体の効果を試験する実験を、更に提案する。
【０１９８】
提案３
本発明人等は、熱ショック処理されたＫ５６２−ＨＬＡ−Ａ２形質移入体でパルス標識された単球由来の樹状細胞を、自己ＰＢＭＣを７日間感作し、そして次いで結合体の添加が、感作段階で付加された場合に効果を有するか否かを試験するために使用することを提案する。次いで感作されたＰＢＭＣは、その増殖性及びＨＬＡ−Ａ２に対する細胞障害性反応に対して試験されるものである。
【０１９９】
提案４
この作業の発展は、クラスＩ及びクラスＩＩの両方の他の一般的なＨＬＡミスマッチを標的とするものである。例えば、ＨＬＡ−ＤＲ又はＨＬＡ−Ｂ−特異的Ｇ体は、これらの分子が提供者及び受容者間でミスマッチである場合、有益な効果を有することができる。
【実施例８】
【０２００】
実施例８−材料及び方法
ＨＬＡ−Ａ２４及びＨＬＡ−Ｂ８ｐｃＤＮＡ３．１クローンの調達
ＨＬＡ−Ａ２４及びＨＬＡ−Ｂ８ｐｃＤＮＡ３．１プラスミドを、それぞれの対立遺伝子に対して同型結合のＥＢＶで形質導入されたＢ−ＬＣＬ系から誘導されたｃＤＮＡからクローン化した後、共同研究者から得た。Ｅ．ｃｏｌｉを、これらのプラスミドで形質転換し、続いてプラスミドを少量調製にかけた。
【０２０１】
リガンド結合実験において使用するためのＩＬＴ２、ＩＬＴ４のクローン化
ＩＬＴ２及びＩＬＴ４受容体を、ヒト末梢血単核球から抽出されたｐｃＤＮＡからＰＣＲによってクローン化した。ネステドプライマーによる２段のＰＣＲを、ＰＣＲ産物のいずれかの末端でＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩ制限部位に組込むために使用した。次いでＰＣＲ産物を、可溶性ＨＬＡ−Ｇのために記載したものと同じ方法を使用して、しかしＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩ制限酵素を使用したことを除きｐｃＤＮＡ３．１中に挿入した。
【０２０２】
細胞系の購入及び維持
ＣＯＳ７、ＫＧ１、２９３Ｔ、ＢＢ７．２細胞系を、ＡＴＣＣから購入した。
Ｋ５６２、ＪＥＧ３、ＣＯ７３細胞系を、ＨＰＡ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓから購入した。
【０２０３】
Ｗ６／３２、ＺＭ３．８、４２Ｄ１、Ｕ９３７を、共同研究者から得た。
基本培地
非必須アミノ酸及びＦＣＳを加えていないＶＰＳＦＭ（無血清培地）で更に補充したイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）は別として、全ての細胞系のための基本培地を、１０％のＦＣＳ、Ｌ−グルタミン及びペニシリン／ストレプトマイシンで補充した。
【０２０４】
ＣＯＳ７細胞
これらの接着細胞を、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に維持してから、無血清培地培養のためのＶＰＳＦＭに適応させた。これらの細胞を、トリプシン（これは無血清培地に変更した後ＴｒｙｐＬＥに変更された）で剥離してから、週２回分割した。
【０２０５】
２９３Ｔ及びＪＥＧ３
これらの接着性細胞を、ＤＭＥＭ中で維持した。これらを、週２回トリプシンによる剥離後分割した。
【０２０６】
ＫＧ１
これらの懸濁細胞を、Ｉｓｃｏｖｅの改良ＤＭＥＭ中で維持し、そして週２回分割した。
Ｋ５６２、Ｕ９３７及びＣ０７３
これらの懸濁細胞を、全てＲＰＭＩ中で維持し、そして週２回分割した。
【０２０７】
形質移入された細胞系
Ｋ５６２−ＨＬＡ−Ａ２、Ｋ５６２−ＩＬＴ２及びＫ５６２−ＩＬＴ４細胞系を、７００μｇ／ｍｌのＧ４１８（ＨＬＡ−Ａ２）又は８００μｇ／ｍｌの（ＩＬＴ２及びＩＬＴ４）で補充されたＲＰＭＩ中で維持して、細胞上の選択圧を維持した。細胞系を週２回分割した。
【０２０８】
ハイブリドーマ及びモノクローナル抗体の抽出
全てのハイブリドーマを、ＤＭＥＭ中で増殖し、そして週２回分割した。
ハイブリドーマを、７日間増殖させてから、上清からｍＡｂを回収した。ｍＡｂを、タンパク質−Ｇカラムを抗体結合のために使用する、ＭＡｂＴｒａｐキット（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して単離し、その後溶出した。
【０２０９】
競合Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換
競合Ｅ．ｃｏｌｉ（ＴＯＰ１０；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ又はＮＥＢ１０ｂｅｔａ；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を、製造業者の説明書によりプラスミドＤＮＡで形質転換した。Ｅ．ｃｏｌｉを、氷上で解凍し、プラスミドＤＮＡと３０分間インキュベートし、４２℃で３０秒間熱ショック処理し、次いで氷上で更に２から５分間インキュベートした。次いで２５０μｌ又は９５０μｌのＳＯＣ培地（それぞれＴＯＰ１０及びＮＥＢ１０ベータに対して）を、Ｅ．ｃｏｌｉに加え、続いて３７℃の振盪インキュベーター中で６０分間インキュベートした。その後、２０μｌ及び２００μｌの混合物を、選択的ＬＢアガールプレート上に置き、そして３７℃で一晩インキュベートした。
【０２１０】
グリセロールストック
対数増殖中の細胞を含有するＬＢブロス８００μｌを、２００μｌの滅菌グリセロールに加えることによって全てのクローンのグリセロールストックを製造した。グリセロール原液を、−８０℃で保存した。
【０２１１】
末梢血単核球の分離
ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐを使用することによって全血又はバフィーコートから分離した。ＰＢＳで１：１に希釈された全血を、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ上に層にし、そして８００Ｇで２０分間遠心した。次いでＰＢＭＣ層を回収し、そしてハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）で洗浄してから、実験に使用するか、又は保存のため冷凍した。
【０２１２】
ＤＮＡの少量調製
ＤＮＡ少量調製物を、形質転換されたＴＯＰ１０又はＮＥＢ１０ベータＥ．ｃｏｌｉを、選択培地（カルベニシリン１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢアガールプレート上にプレート接種又は線条接種し、そして３７℃で一晩インキュベートすることによって得た。次いで単一コロニーを、カルベニシリンを含有する６ｍｌのＬＢブロス中でインキュベートし、そして３７℃で一晩振盪インキュベーター中でインキュベートした。次いで４ｍｌのＬＢ培養物を遠心し、そしてプラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  Ｑｉａｐｒｅｐ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを使用してペレットから抽出した。ＤＮＡをｄＨ２Ｏ中に溶出し、濃度をＮａｎｏｄｒｏｐ  ＮＤ−１０００分光光度計を使用して測定し、続いて−２０℃で保存した。
【０２１３】
ＤＮＡの中量（midi）調製／大量(maxi)調製
ＤＮＡの中量調製物／大量調製物を、形質転換されたＴＯＰ１０又はＮＥＢ１０ベータＥ．ｃｏｌｉを、選択培地（カルベニシリン１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢアガールプレート上にプレート接種又は線状接種し、そして３７℃で一晩インキュベートすることによって得た。単一コロニーを、カルベニシリンを含有する５ｍｌのＬＢブロス中に加え、そして３７℃で８時間振盪インキュベーター中でインキュベートした。次いで１又は５ｍｌのＬＢ培養物を、５０又は２５０ｍｌ（それぞれ中量及び大量調製物に対して）のカルベニシリンを含有するＬＢブロスに加え、そして３７℃で振盪インキュベーター中で一晩インキュベートした。ＬＢブロスを遠心し、そしてプラスミドＤＮＡを、Ｓｉｇｍａ  ＧｅｎＥｌｕｔｅ  ＨＰ  Ｍｉｄｉｐｒｅｐ又はＭａｘｉｐｒｅｐキットを使用して得られたペレットから抽出した。ＤＮＡをｄＨ２Ｏ中に溶出し、濃度をＮａｎｏｄｒｏｐ  ＮＤ−１０００分光光度計を使用して測定し、続いて−２０℃で保存した。
【０２１４】
機能実験
全ての機能実験を、１０％の熱不活化ＦＣＳ及びペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ培地中で行った。
【０２１５】
細胞系の形質移入
一過性及び安定な形質移入を、ＱｉａｇｅｎからのＳｕｐｅｒｆｅｃｔ又はＡｔｔｒａｃｔｅｎｅ形質移入試薬のいずれかを使用して製造業者の説明書によって行った：細胞を、形質移入の２４時間前又は直前のいずれかに播種した。プラスミドＤＮＡ及び形質移入試薬を培地中で混合し、そして１０から１５分間室温でインキュベートした。次いでこの混合物を形質移入される細胞に加えた。Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ試薬を使用する場合、細胞のための培地を、２−３時間のインキュベーション後に交換した。
【０２１６】
フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）実験
流動細胞計測実験を、Ｂｅｃｋｍａｎｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｙｔｏｍｉｃｓ  ＦＣ５００流動細胞計測器（フローサイトメーター）を使用して行った。
【０２１７】
ＣＦＳＥによる塗付（ペインティング）
細胞障害性実験において使用される標的細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、そしてＰＢＳ中に１−２×１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。次いでカルボキシフルオレセンスクシンイミドエステル（ＣＦＳＥ）を、２５０ｎＭのＣＦＳＥの最終濃度で細胞に加え、続いて暗所で５分間インキュベートした。次いで細胞を完全培地で３回洗浄して、いずれもの未結合のＣＦＳＥを中和してから、使用した。
【０２１８】
細胞仲介の細胞障害性実験
ＣＦＳＥを塗布された標的細胞を、塗布されていないエフェクター細胞と共に１：６、１：１２、１：２５及び１：５０の比で、９６ウェルのＵ底プレート中でインキュベートした。次いでプレートを２５０Ｇで４分間遠心し、続いて３７℃で４時間インキュベーとした。次いで７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）を、１０μｇ／ｍｌ迄の濃度で細胞に加え、続いて暗所で１０から１５分間インキュベートした。次いで細胞をＦＡＣＳ試験管に移し、続いてＦＡＣＳ分析にかけた。
【０２１９】
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列決定を、ＧｅｎｅｓｅｒｖｉｃｅによるＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７３０  ＤＮＡ分析器を使用して行った。標準的な配列決定プライマー又は特別注文で設計されたプライマーが、折に触れ会社によって提供された。
【０２２０】
ＤＮＡのアガロースゲル電気泳動
ＤＮＡ電気泳動において使用するためのアガロースゲルを、アガロースを、０．５ＸのＴｒｉｓホウ酸−ＥＤＴＡ緩衝液中に溶解することによって形成した。０．５ＸのＴｒｉｓホウ酸−ＥＤＴＡ緩衝液を、更に電気泳動実行緩衝液として使用した。
【０２２１】
ＤＮＡゲル抽出
アガロースゲルからの全てのＤＮＡ抽出を、Ｑｉａｇｅｎ  Ｑｉａｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットを使用して、製造業者の説明書によって行い、そしてＤＮＡをｄＨ２Ｏで溶出した。
【０２２２】
ＤＮＡ連結
全てのＤＮＡ連結を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して行った。連結反応物を、一晩１６℃でインキュベートした。
【０２２３】
ＲＮＡ抽出
ＰＢＭＣ又は細胞系のいずれかからの全ＲＮＡ抽出を、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮＥａｓｙ  Ｍｉｎｉ抽出キットを使用して行った。
【０２２４】
逆転写
ｍＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写を、Ｑｉａｇｅｎ  Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ逆転写試薬を使用して行った。テンプレートＲＮＡを、Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ、ｄＮＴＰ、固着されたオリゴ−ｄＴプライマー及びＲＮアーゼ阻害剤と共に、製造業者の説明書によって３７℃で６０分間インキュベートした。反応産物を、その後ＰＣＲ反応に使用するか、又は−２０℃で保存した。
【０２２５】
ポリメラーゼ連鎖反応
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、Ｐｗｏポリメラーゼキット（Ｒｏｃｈｅ）又はＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼキット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）のいずれかを使用して行い、これらの両方は、高忠実度のために設計されていた。専売緩衝液及び試薬は、キットと共に供給され、そしてその使用のための製造業者の勧告に従った。
【０２２６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ実験を、非連続的ポリアクリルアミドゲルを伴うＬａｅｍｍｌｉ緩衝系を使用して行い、そしてＴｒｉｓグリシン−ＳＤＳ緩衝液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ実験のために使用した。ゲルを、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｍｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅａｎゲル注入成形スタンドを使用して注入成形した。試料を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｍｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅａｎ  Ｔｅｔｒａ細胞を使用して実行した。Ｌａｅｍｍｌｉ還元緩衝液を試料に加え、次いで９５−１００℃でインキュベートしてから、電気泳動のためにゲルに付加した。
【０２２７】
ウェスタンブロット
タンパク質を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  ＳＤ  Ｓｅｍｉ−Ｄｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｃｅｌｌを使用して、Ｂｊｅｒｒｕｍ及びＳｃｈａｆｅｒ−Ｎｉｅｌｓｅｎ移送緩衝液（４８ｍＭのＴｒｉｓ．３９ｍＭのグリシン、２０％のメタノール）の存在中で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからＰＶＤＦ膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐ，ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に移した。使用した移送時間は、製造業者の勧告によった。
【０２２８】
次いで膜をＴＢＳ−Ｔ（Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水−Ｔｗｅｅｎ）緩衝液中で、５％の脱脂粉乳と共に６０分間インキュベートした。次いで膜を洗浄し、続いてＴＢＳ−Ｔ／２．５％ＢＳＡ中の一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。次いで膜を、ＴＢＳ−Ｔで２回洗浄し、そしてＴＢＳ−Ｔ中の二次抗体（ヤギ抗−マウスＨＲＰ）と共に６０分間室温でインキュベートした。次いで膜を、更に３回洗浄した。
【０２２９】
次いでＥＣＬ試薬（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を、膜がオートラジオグラフィーフィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＥＣＬ，  ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に暴露される１分前に膜に加えた。暴露時間は、最良の品質の画像を得るために２から６０分間の範囲であり、そしてフィルムは自動フィルム処理装置で現像した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６（Ａ）】
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【図１６（Ｂ）】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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