(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
外膜が取り除かれたウォートン・ジェリーを含む第一の膜、絨毛膜の層および羊膜の層を含む組織移植片であって、
ここで、前記ウォートン・ジェリーは、前記組織移植片がトンネリング処置での使用に適しているように、前記組織移植片の抗張力を増大させるために十分な量で与えられていることを特徴とする、
組織移植片。
【請求項２】
請求項１に記載の移植片であって、
前記移植片は、面を指定するために、絵、文字または記号でエンボス加工されていることを特徴とする、
移植片。
【請求項３】
請求項１に記載の移植片であって、
前記移植片は、使用前に実質的に乾燥していることを特徴とする、
移植片。
【請求項４】
請求項１に記載の移植片であって、
前記移植片は、使用前に水分を補給されていることを特徴とする、
移植片。
【請求項５】
請求項１に記載の移植片であって、
前記移植片は、自家血液の採取と分離の産物を用いるか、または胎児の豚の歯および血液濃縮物、精製された天然の生物活性剤、組み換え血小板由来の増殖因子および組み換え線維芽細胞増殖因子のような組み換え生物学的修飾因子、またはそれらの任意の組み合わせなどの異種移植片起源のいずれかの、血小板濃縮物由来の天然起源の増殖因子を含む水溶液で水分を補給されていることを特徴とする、
移植片。
【請求項６】
請求項１に記載の移植片であって、
前記移植片は、０．１〜２ｍｍの厚さであることを特徴とする、
移植片。
【請求項７】
請求項１に記載の移植片であって、
前記移植片は、約１ｍｍの厚さであることを特徴とする、
移植片。
【請求項８】
請求項１に記載の移植片であって、
前記移植片は、ラミニンおよびラミニン−５を含むことを特徴とする、
移植片。
【請求項９】
請求項１に記載の移植片であって、
前記移植片は、約１ｃｍ×１ｃｍ〜約２ｃｍ×４ｃｍのサイズであることを特徴とする、
移植片。
【請求項１０】
請求項１に記載の移植片であって、
前記移植片は、使用前に、期限切れの保存血由来の血小板濃厚液に浸漬されることを特徴とする、
移植片。
【請求項１１】
請求項１に記載の移植片であって、
前記移植片は、自家血液の採取と分離の産物；胎盤の同種移植片；骨髄穿刺液；精製された天然の生物活性剤、組み換え生物活性剤、またはそれらの任意の組み合わせの溶液のいずれかを用いて、血小板濃厚液由来の自然発生の増殖因子を含む生物活性剤とともに浸漬されることを特徴とする、
移植片。
【請求項１２】
請求項１に記載の移植片であって、
前記移植片は、
（１）外膜が取り除かれたウォートン・ジェリーを含む第一の膜；
（２）前記ウォートン・ジェリーに隣接する生物学的適合材料；
（３）絨毛膜；および
（４）羊膜、
ここで前記羊膜は、露出した基底膜および羊膜間質層を含み、
前記羊膜間質層は前記生物学的適合材料に隣接しており、
前記生物学的適合材料は、羊膜、絨毛膜、心膜の同種移植片、無細胞真皮の同種移植片、羊膜（すなわち、羊膜と絨毛膜の両方）、臍静脈、精製された１型コラーゲンの異種移植片、バイオセルロースポリマーまたはコポリマー、生体適合性合成ポリマーまたはコポリマーフィルム、精製された小腸粘膜下組織、膀胱無細胞マトリックス、死体筋膜、またはそれらの任意の組み合わせの多層を含む、
を含むことを特徴とする、
移植片。
【請求項１３】
請求項１に記載の移植片であって、
前記移植片は、１つまたは複数の骨移植片をさらに含むことを特徴とする、
移植片。
【請求項１４】
請求項１に記載の移植片であって、
創傷の血管新生を促進する、および、創傷治癒を促進するための方法に使用するためのものであり、
前記方法は、創傷部位を、請求項１に記載の移植片と接触させるステップを含むことを特徴とする、
移植片。
【請求項１５】
請求項１に記載の移植片であって、
歯肉上皮細胞の細胞遊走を促進する、および、歯肉上皮直接付着細胞の付着を促進するための方法に使用するためのものであり、
前記方法は、歯肉上皮細胞を、請求項１に記載の移植片と接触させるステップを含むことを特徴とする、
移植片。
【請求項１６】
請求項１に記載の移植片であって、
歯科の外科的処置と関連する創傷治癒を促進するための方法に使用するためのものであり、
前記歯科の外科的処置は、創傷を、請求項１に記載の移植片と接触させるステップを含むことを特徴とする、
移植片。
【請求項１７】
請求項１６に記載の移植片であって、
前記創傷は、口腔粘膜、または歯槽骨または歯の組織にあることを特徴とする、
移植片。
【請求項１８】
請求項１６に記載の移植片であって、
前記移植片は、縫合糸またはステープルを必要とせず、
ここで、前記移植片の少なくとも片側は、接着性であることを特徴とする、
移植片。
【請求項１９】
請求項１６に記載の移植片であって、
前記歯科の外科的処置は、歯肉退縮を治療または予防するため；垂直または水平の歯肉増大術のため；歯科インプラント周辺の治療または組織増大術のため；歯周の形成外科；小帯牽引の除去のため；乳頭組織の再生のため；口腔前庭形成術；組織再生誘導法；骨再生誘導法；摘出ソケットの移植；骨内骨欠損の治療のため；一次または二次の堤増大術のため；開窓術および骨欠損離開のため；洞の側部の窓を覆うため；シュナイダー膜内の裂傷を修復するため；口の痛みおよび／口腔病変を治療するため；または疾患または外傷性損傷により失われた組織を再生するため、
であることを特徴とする、
移植片。
【請求項２０】
請求項１に記載の移植片であって、
構造での不連続性と関連する創傷治癒を促進するための方法に使用するためのものであり、
前記方法は、前記不連続性を請求項１に記載の移植片で覆うステップを含むことを特徴とする、
移植片。
【請求項２１】
請求項２０に記載の移植片であって、
前記不連続性は、露出した根；切開；自家の骨または骨移植片代用品のいずれかの骨移植片で充填された骨欠損；摘出ソケット；骨内欠損；一次または二次の堤増大術での骨欠損；または開窓術および骨欠損離開であることを特徴とする、
移植片。
【請求項２２】
請求項２０に記載の移植片であって、
前記不連続性は、欠損に隣接する、および／または歯肉縁における、歯科の処置の間に作られる切開であって、
前記方法は、処置領域に直接近づくことができるように組織を持ち上げるステップ、および前記移植片を、露出した根面の上に、前記移植片中に存在する羊膜が歯の表面に面するように配置するステップを含むことを特徴とする、
移植片。
【請求項２３】
請求項２０に記載の移植片であって、
前記不連続性は、欠損に隣接する歯科の処置の間に作られる切開であって、
前記方法は、組織を持ち上げるステップ、および、前記移植片中に存在する羊膜が歯の表面に面するように、前記移植片を、前記組織の下部に滑り入れ、または、掘り入れ、露出した根の表面の上に配置するステップを含むことを特徴とする、
移植片。
【請求項２４】
請求項２０に記載の移植片であって、
前記不連続性は、欠損に対する歯肉縁根尖部に作られた切開であって、
前記方法は、歯肉組織を持ち上げるステップ、および、前記移植片中に存在する羊膜が歯の表面に面するように、前記移植片を、組織の下部に滑り入れ、または、侵入させ、露出した根の表面の上に配置するステップを含むことを特徴とする、
移植片。
【請求項２５】
請求項１に記載の移植片であって、
外科的処置後の脊椎の上または付近の瘢痕形成を予防するまたは低減させる方法に使用するためのものであり、
前記方法は、対象に、請求項１に記載の組織移植片を、対象の脊髄硬膜または脊椎付近の領域に直接適用するステップを含むことを特徴とする、
移植片。
【請求項２６】
請求項２５に記載の移植片であって、
前記外科的処置は、後処置を含むことを特徴とする、
移植片。
【請求項２７】
請求項２６に記載の移植片であって、
前記後処置は、椎弓切除術または椎間板切除術であることを特徴とする、
移植片。
【請求項２８】
請求項２６に記載の移植片であって、
前記後処置は、前方腰椎椎体間固定術（ＡＬＩＦ）または経椎間孔椎体間固定術（ＴＬＩＦ）であることを特徴とする、
移植片。
【請求項２９】
請求項２５に記載の移植片であって、
前記外科的処置は、前処置を含むことを特徴とする、
移植片。
【請求項３０】
請求項２５に記載の移植片であって、
前記移植片中に存在する羊膜は、露出した基底層を含むことを特徴とする、
移植片。
【請求項３１】
請求項１に記載の移植片であって、
対象での硬膜裂傷を治療するための方法に使用するためのものであり、
前記方法は、請求項１に記載の組織移植片を、硬膜裂傷に直接適用するステップを含むことを特徴とする、
移植片。
【請求項３２】
請求項３１に記載の移植片であって、
前記移植片中に存在する羊膜は、露出した基底層を含むことを特徴とする、
移植片。
【請求項３３】
請求項１に記載の移植片であって、
整形外科の適用と関連する創傷治癒を促進するための方法に使用するためのものであり、
前記方法は、創傷を、請求項１に記載の移植片と接触させるステップを含むことを特徴とする、
移植片。
【請求項３４】
請求項３３に記載の移植片であって、
前記移植片は、骨膜の修復に役立ち、破裂性／損傷性嚢を修復し、または骨修復中の空隙充填材料を固定して、腱修復に用いられることを特徴とする、
移植片。
【請求項３５】
請求項１に記載の移植片であって、
耳鼻咽喉科の適用と関連する創傷治癒を促進するための方法に使用するためのものであり、
前記方法は、創傷を、請求項１に記載の移植片と接触させるステップを含むことを特徴とする、
移植片。
【請求項３６】
請求項３５に記載の移植片であって、
前記耳鼻咽喉科の適用は、鼓室形成、アデノイド切除術による創傷、扁桃摘出による創傷、またはシュナイダー膜の修復であることを特徴とする、
移植片。
【請求項３７】
請求項１に記載の移植片であって、
対象の四肢に関する創傷治癒を促進するための方法に使用するためのものであり、
前記方法は、創傷を、請求項１に記載の移植片と接触させるステップを含むことを特徴とする、
移植片。
【請求項３８】
請求項３７に記載の移植片であって、
前記移植片は、小骨の固定のための抗−癒着バリア、金属めっきまたは金属製品が用いられる場合の抗−癒着バリアであり、または破裂性／損傷性嚢の修復を促進することを特徴とする、
移植片。
【請求項３９】
請求項１に記載の移植片であって、
眼科の適用と関連する創傷治癒を促進するための方法に使用するためのものであり、
前記方法は、創傷を、請求項１に記載の移植片と接触させるステップを含むことを特徴とする、
移植片。
【請求項４０】
請求項３９に記載の移植片であって、
前記移植片は、眼表面修復のためのオン−レイ移植片であることを特徴とする、
移植片。
【請求項４１】
請求項１に記載の移植片であって、
婦人科の適用と関連する創傷治癒を促進するための方法に使用するためのものであり、
前記方法は、創傷を、請求項１に記載の移植片と接触させるステップを含むことを特徴とする、
移植片。
【請求項４２】
請求項４１に記載の移植片であって、
前記移植片は、卵巣嚢胞の除去後の抗−癒着バリアであり、または膣壁びらんの修復に役立つことを特徴とする、
移植片。
【請求項４３】
請求項１に記載の移植片であって、
泌尿器科の適用と関連する創傷治癒を促進するための方法に使用するためのものであり、
前記方法は、創傷を、請求項１に記載の移植片と接触させるステップを含むことを特徴とする、
移植片。
【請求項４４】
請求項４３に記載の移植片であって、
前記移植片は、精管復元術の間の精管の閉鎖を促進する、または外傷により生じる精管の閉鎖を促進することを特徴とする、
移植片。
【請求項４５】
請求項１に記載の移植片であって、
全身の手術と関連する創傷治癒を促進するための方法に使用するためのものであり、
前記方法は、創傷を、請求項１に記載の移植片と接触させるステップを含むことを特徴とする、
移植片。
【請求項４６】
請求項４５に記載の移植片であって、
前記移植片は、吻合の閉鎖を促進して、吻合のための抗−癒着バリアであり、またはヘルニア修復のための抗−癒着バリアであることを特徴とする、
移植片。
【請求項４７】
請求項１に記載の移植片であって、
口腔、鼻、喉、膣、または直腸中のヒト粘膜での創傷治癒を促進するための方法に使用するためのものであり、
前記方法は、創傷部位を、請求項１に記載の移植片と接触させるステップを含むことを特徴とする、
移植片。
【請求項４８】
請求項１に記載の移植片であって、
対象での創傷の治癒を促進するための方法に使用するためのものであり、
前記方法は、創傷に、請求項１に記載の移植片を適用するステップを含み、
ここで前記創傷は、脳硬膜中にあり、
小帯牽引の除去のため、失われた膝蓋骨組織の再生のため、洞腔中のシュナイダー膜または歯科インプラント周囲の軟組織の修復のための、歯周形成外科の（ｐｅｒｉｏｐｌａｓｔｉｃ）処置による創傷であることを特徴とする、
移植片。
【請求項４９】
請求項１に記載の移植片であって、
創傷の上または付近での瘢痕形成を予防または軽減するための方法に使用するためのものであり、
前記方法は、請求項１に記載の移植片を前記創傷に適用するステップを含むことを特徴とする、
移植片。
【請求項５０】
請求項４９に記載の移植片であって、
ここで創傷は、脊椎の手術、関節の修復、靭帯、腱、骨折、骨軟骨欠損、鼓膜修復、腹部の手術、眼の手術、慢性の創傷、糖尿病性潰瘍、火傷、血管の手術、鼻形成術、扁桃摘出、または顔の整形と関連することを特徴とする、
移植片。
【請求項５１】
請求項１に記載の移植片の使用であって、
癒着バリア、脊椎手術、関節の修復、靭帯、腱、骨折、骨軟骨欠損、鼓膜修復、腹部の手術、眼の手術、慢性の創傷、糖尿病性潰瘍、火傷、血管の手術、鼻形成術、扁桃摘出、または顔の整形としての医薬を製造するための、
使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年２月１４日出願の米国仮出願第６１／４４２，３４３号の優先権を主張するものである。この出願は、その教示の全てに関してその全体で本明細書中に参照により援用される。
【背景技術】
【０００２】
ヒト胎盤膜（例えば羊膜）は、１９００年代初期から、様々なタイプの再建的な外科的処置に使用されてきた。膜は、基質材料としての機能を果たし、より一般にはバイオ包帯またはパッチグラフトと呼ばれる。また、そのような膜は、眼の処置のために広く、そして、より最近では歯科の再生処置のために、潰瘍を治療して、および癒着バリアとして、用いられている。典型的に、手術に必要とされるまで、保存および保管のために、膜は凍結されるか、または乾燥されるかのいずれかである。
【０００３】
胎盤組織は、典型的に、選択的帝王切開後に回収される。胎盤は、臍帯と羊膜嚢からなる。羊膜嚢は、一般に羊膜と呼ばれ、２つの主な組織の層である羊膜と絨毛膜とを有する。羊膜組織は羊膜嚢の最内層であり、羊水に直接接する。羊膜嚢は羊水を含み、胎児の環境を保護する。組織学的評価は、羊膜の膜層は単一層の上皮細胞、薄い細網線維（基底膜）、厚い緻密層、および線維芽細胞層からなることを示す。羊膜の線維層（すなわち、基底膜）は、ＩＶ、Ｖ、およびＶＩＩ型コラーゲン、および、フィブロネクチンとラミニンを含む細胞接着の生物活性の因子を含む。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本明細書は、改良された物理的および生物学的特性を有する、胎盤由来の組織移植片を開示する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
要約
一態様では、組織移植片は、羊膜、絨毛膜、またはそれらの組み合わせで積層されたウォートン・ジェリー（Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓ  ｊｅｌｌｙ）を含む第一の膜を含む。移植片中のウォートン・ジェリーの存在は、羊膜由来の同種移植片、死体同種移植片、異種移植片、またはアロプラスト（ａｌｌｏｐｌａｓｔ）軟組織代用品の性能を高める。組織移植片を作成および使用するための方法もまた、本明細書中に開示される。本発明の効果は、一部分は以下の記載中で説明され、一部分は記載から明白であるか、下記態様の実行により習得され得る。前述の一般的な記載および以下の詳細な記載の両者は、単に例示的かつ説明的であり、限定ではないことが理解されるべきである。
【０００６】
援用されて本明細書の一部分を成す添付の図面は、下記の様々な態様を説明する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】本明細書に記載の組織移植片を作成するための方法の概略フローチャートである。
【図２】血管除去およびウォートン・ジェリーの単離を促進するための、臍帯における切開位置を示す。
【図３】本明細書に記載の組織移植片を作成するための例示的な乾燥用固定具の斜視図である。
【図４】歯肉退縮のための軟組織代用品としての、羊膜／ウォートン・ジェリー移植片の使用を示す。
【図５】部位保存のための、摘出部位におけるバリア膜としての、羊膜／ウォートン・ジェリー移植片の使用を示す。
【図６】歯肉退縮のための軟組織代用品としての、羊膜／絨毛膜／ウォートン・ジェリー移植片の使用を示す。
【図７】部位保存のための、摘出部位におけるバリア膜としての、羊膜／絨毛膜／ウォートン・ジェリー移植片の使用を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本項目および方法を開示および記載する前に、下記の態様は、特定の化合物、合成方法、または使用に限定されず、したがってもちろん、変更され得ることが理解されるべきである。また、本明細書で使用される専門用語は、単に特定の態様を説明する目的であり、限定されることを意図しないことが理解されるべきである。
【０００９】
本明細書において、以下の意味を有すると定義されるべきいくつかの用語に対して、参照が作成される：
本明細書および添付の請求項において用いられる単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに別段の指示をしない限り、複数形の指示対象を含むことを留意しなければならない。したがって、例えば、「生物活性剤（ａ  ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）」との言及は、２またはそれ以上のそのような生物活性剤（ａｇｅｎｔｓ）の混合物などを含む。
【００１０】
「随意的（ｏｐｔｉｏｎａｌ）」または「場合により（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）」は、続けて記述される事象または状況が生じ得るまたは生じ得ないこと、および、その記載はその事象または状況が生じる事例および生じない事例を含むことを意味する。例えば、語句「場合により清浄化するステップ」は、清浄化するステップが行われ得るか行われ得ないことを意味する。
【００１１】
用語「羊膜間質層」は、基底膜、緻密層、線維芽細胞層、および中間層からなる羊膜の部分として、本明細書中で定義される。
【００１２】
本明細書において用いられる用語「羊膜」は、中間組織層が損傷されていない（ｉｎｔａｃｔ）、または実質的に取り除かれた、羊膜を含む。
【００１３】
タイトルまたはサブタイトルは、読者の便宜のために本明細書中において用いられてよく、本発明の範囲に影響を及ぼす意図ではない。さらに、本明細書中で用いられるいくつかの用語は、以下にさらに具体的に定義される。
【００１４】
Ｉ．組織移植片およびそれを作成するための方法
本明細書は、組織移植片ならびにそれを作成および使用する方法を開示する。一般に、多層移植片は、羊膜、絨毛膜、またはそれらの組み合わせで積層されたウォートン・ジェリーの層からなる。
【００１５】
図１は、組織移植片として後に用いるための胎盤材料を摘出し、処理し、そして調製するためのステップの例示的な概略（１００）を示す。それぞれの個々のステップに関するさらに詳細の説明および議論を続ける。はじめに、選択的帝王切開（ステップ１１０）に続き、胎盤組織が、承諾する患者から採取される。材料は保存されて、適切な処理場、または検査（ｃｈｅｃｋ−ｉｎ）と評価のための施設に、従来の組織保存方法で運ばれる（ステップ１２０）。それから、全体の処理、操作、および、羊膜と絨毛膜組織層の分離が行われる（ステップ１３０）。基底膜を露出させるために、上皮層が羊膜から実質的に取り除かれた後（ステップ１３５）、それから、許容できる組織が除染される（ステップ１４０）。臍帯血管の構成要素からウォートン・ジェリーを分離して、羊膜を切り離して、臍帯の全体処理が行われる（ステップ１５０）。ウォートン・ジェリーを切断後、許容できる組織は除染される（ステップ１６０）。層化後、絨毛膜および／または羊膜で積層されたウォートン・ジェリーからなる移植片は、脱水されて（ステップ１７０）、小片に切断されて梱包される（ステップ１８０）。最後に、移植片は、放射線学的に最終的に電子ビームまたはγ線を用いて滅菌されて、適切な外科的処置における創傷ケアのために、外科医および他の医療専門家による使用のために、市場にリリースされる（ステップ１９０）。各ステップを以下に詳細に記載する。
【００１６】
最初の組織採取（ステップ１１０）
組織移植片を生産するために用いられる構成要素は、胎盤に由来する。胎盤の起源は変更することができる。一態様では、胎盤は、ヒトのような哺乳類に由来し、制限されないが、ウシ、ブタなどを含む他の動物をここで用いることができる。ヒトの場合、胎盤の回収は、帝王切開の出産中にそれが採取される病院で行われる。出産間近の母親を指すドナーは、移植が可能な最も安全な組織を提供するために設計された総合的なスクリーニングプロセスを自主的に受ける。スクリーニングプロセスは、好ましくは、ヒト免疫不全ウイルス１型および２型に対する抗体（抗−ＨＩＶ−１および抗−ＨＩＶ−２）、Ｂ型肝炎ウイルス  Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）に対する抗体（抗−ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルスに対する抗体（抗−ＨＣＶ）、ヒトＴ−リンパ向性ウイルスＩ型およびＩＩ型に対する抗体（抗−ＨＴＬＶ−Ｉ、抗−ＨＴＬＶ−ＩＩ）、ＣＭＶ、および梅毒に対する抗体、および、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）およびＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を検査する核酸に関して、従来の血清検査を用いて検査する。上記の検査リストは単に例示的であり、当業者により理解されるように、より多くの、より少ない、または異なる検査が、経時的にまたは移植片の使用目的に基づいて、所望され、または、必要とされてよい。
【００１７】
ドナーの情報およびスクリーニング検査結果の検討に基づいて、ドナーは、許容できるとみなされるか、または許容できないとみなされるかの、いずれかである。加えて、細菌、例えば、クロストリジウムまたは連鎖球菌の存在を判定するために、分娩時（ａｔ  ｔｈｅ  ｔｉｍｅ  ｏｆ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）に培養が行われる。ドナーの情報、スクリーニング検査、および分娩培養（ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｃｕｌｔｕｒｅ）が全て満たしている場合（すなわち、いかなるリスクも示さず、または許容できるレベルのリスクを示す）、ドナーは医長に承認されて、組織標本は、さらなる処理および評価に当初ふさわしいと指定される。
【００１８】
上記の選定基準に見合うヒト胎盤は、好ましくは、滅菌輸送バッグ中の生理食塩水中に入れられ、そして処理場またはさらなる処理のための実験室への輸送のために、ウェットアイスの容器中に保存される。
【００１９】
スクリーニング検査と分娩培養からの結果の取得が完了する前に胎盤が採取される場合は、そのような組織はラベルされて検疫所に保管される。組織が操作および使用に安全であること示す必要なスクリーニング評価と分娩培養が満たされた後にのみ、胎盤は、さらなる処理に承認され、医長からの最終承認を得る。
【００２０】
材料の検査および評価（ステップ１２０）
処理センターまたは実験室への到着時に、輸送物は開封されて、滅菌輸送バッグ／容器が、なお密封されてかつ冷却されているか、適切なドナー書類が存在するか、そして書類上のドナー番号が、組織を含む滅菌輸送バッグ上の番号と一致するか、確認される。組織を含む滅菌輸送バッグはそれから、さらなる処理の準備が整うまで、冷蔵庫内で保管される。
【００２１】
羊膜嚢の全体組織の処理（ステップ１３０）
組織をさらに処理する準備が整ったら、胎盤組織をさらに処理するために必要な滅菌用品が制御環境中のステージングエリアに集められて、制御環境の中へ導入するために準備がされる。一態様では、胎盤は室温で処理される。制御環境が製造フードならば、滅菌用品は開封されて従来の滅菌技術を用いてフード内へ置かれる。制御環境がクリーンルームならば、滅菌用品は開封されて滅菌ドレープで覆われたカート上に置かれる。作業表面全体は、従来の滅菌技術を用いて、一枚の滅菌ドレープで覆われており、滅菌用品および処理装置は、同様に従来の滅菌技術を用いて、滅菌ドレープ上に置かれる。
【００２２】
処理装置は、従来かつ産業上認可された除染手順により除染されて、それから制御環境内に導入される。装置は、装置が組織標本に近接する可能性を最小限にするために戦略的に制御環境内に置かれ、さもなければ不注意に組織標本で汚染される。
【００２３】
つぎに、胎盤は滅菌輸送バッグから取り出されて、制御環境内の滅菌処理ボウルへと無菌的に移される。滅菌ボウルは、室温または室温付近の高張生理食塩水（例えば、１８％ＮａＣｌ）を含む。胎盤は、血塊を分離するのを助けるため、および、胎盤組織を室温に到達させるために、穏やかに揉まれて、それは、胎盤の構成要素がお互いから（例えば、羊膜および絨毛膜）、分離するのを促進する。周囲温度まで温められた後（例えば、約１０〜３０分後）、胎盤はそれから、滅菌処理ボウルから取り出されて、検査のために羊膜の膜層を下向きにして、処理トレイ上に平らに置かれる。
【００２４】
胎盤は、変色、破片または他の汚染、臭気、および損傷の兆候について調べられる。組織サイズも書き留める。この時点で、組織がさらなる処理にふさわしいかどうかについて決定がなされる。
【００２５】
つぎに、羊膜と絨毛膜が、注意深く分離される。一態様では、この処置に用いられる材料および装置は、処理トレイ、１８％生理食塩水、滅菌４×４スポンジ、および２つの滅菌ナルジェンジャー（Ｎａｌｇｅｎｅ  ｊａｒ）を含む。胎盤組織はそれから、羊膜が絨毛膜から分離されることができる領域（典型的には隅）を見つけるために精査される。羊膜は、絨毛膜上の薄い不透明の層として見られる。
【００２６】
線維芽細胞層は、１枚の滅菌ガーゼまたは綿棒で羊膜の両側にやさしく触れることで確認される。線維芽細胞層は、試験材料に張り付く。羊膜は、処理トレイの中に、基底膜層を下にして置かれる。また、先の尖っていない道具、細胞スクレーパー、または滅菌ガーゼを用いて、任意の残りの血液が取り除かれる。このステップは十分注意して行われるべきであり、また、羊膜を引き裂かないようにしなければならない。羊膜の清浄化は、いったん羊膜が外見上滑らかで乳白色になると完了する。
【００２７】
特定の態様では、線維芽細胞層を露出させるために、海綿層とも呼ばれる中間組織層は、羊膜から実質的に取り除かれる。取り除かれる中間組織層の量に関して、用語「実質的に取り除かれる」は、本明細書で、９０％より多い、９５％より多い、または９９％より多い中間組織層を羊膜から取り除くことを定義する。これは、羊膜から中間組織層を剥がすことにより行うことができる。あるいは、中間組織層は、ガーゼまたは他の適切なワイプで中間組織層を拭き取ることで、羊膜から取り除くことができる。結果として生じる羊膜は、続いて、下記の方法を用いて除染することができる。
【００２８】
羊膜からの上皮層の除去（ステップ１３５）
羊膜上に存在する上皮層は、羊膜の基底層を露出するために実質的に取り除かれる。上皮層を除去することの重要性を以下に記載する。取り除かれる上皮の量に関して、用語「実質的に取り除かれる」は、本明細書で、９０％より多い、９５％より多い、または９９％より多い上皮細胞を羊膜から取り除くことを定義する。羊膜層上に残っている上皮細胞の存在または不存在は、当技術分野で知られている技術を用いて評価することができる。例えば、上皮細胞層の除去後、処理ロットからの代表的な組織サンプルが、標準的な顕微鏡の検査スライド上に置かれる。組織サンプルはそれから、エオシンＹ染色を用いて染色されて、下記のように評価される。サンプルはそれからカバーされてスタンドに置かれる。いったん、染色するのに十分な時間が過ぎたら、拡大下で目視観測される。
【００２９】
上皮層は、当技術分野で知られている技術により取り除くことができる。例えば、上皮層は、細胞スクレーパーを用いて、羊膜から削り取ることができる。他の技術は、限定されないが、膜の凍結、細胞スクレーパーを用いた物理的除去、または上皮細胞を非イオン洗剤、陰イオン洗剤、およびヌクレアーゼに曝すことを含む。上皮が除去された組織はそれから、基底膜が傷つけられておらず損傷されていないことを確認するために検査される。このステップは、処理ステップの完了後かつ次のセクションに記載のように組織が脱水される前に行われる。例えば、代表的なサンプル移植片が、顕微鏡を用いた分析のために取り出される。組織サンプルは標準的なスライド上に置かれて、エオシンＹで染色されて、そして、顕微鏡下で観察される。上皮が存在すれば、玉石形の細胞として見られる。理論に束縛されるものではないが、ラミニンおよびラミニン−５は、主に、基底膜中に見られる；したがって、羊膜からの上皮細胞の除去は、基底膜を露出して、羊膜がラミニンおよびラミニン−５を放出する能力を著しく高める。これらの糖タンパク質は、本明細書に記載の移植片が細胞の付着、遊走、および組織化を仲介する能力に関して重要である。
【００３０】
本明細書に記載の方法、特にステップ１３０および１３５は、羊膜中の全ての細胞構成要素を除去はしない。この技術は、当技術分野で「脱細胞化」と呼ばれる。脱細胞化は、一般に、上皮細胞および線維芽細胞を含む羊膜に存在する、全ての細胞の物理的および／または化学的除去を含む。ステップ１３５は上皮細胞を除去するが、ステップ１３０で説明された中間層の除去後でさえ、羊膜中に存在する線維芽細胞層は、損傷されていない。線維芽細胞の除去は、創傷治癒において重要な役割を果たすタンパク質および増殖因子などの要素を組織移植片が放出する能力を低下させるため、これは重要な特質である。
【００３１】
化学的除染（ステップ１４０）
上記で単離された羊膜および絨毛膜は、下記の技術を用いて化学的に除染することができる。一態様では、羊膜および絨毛膜は室温で除染される。一態様では、ステップ１３０または１３５で生産される羊膜は、次のステップのために滅菌ナルジェンジャー中に置くことができる。一態様では、次の方法は、羊膜を清浄化するために用いることができる。ナルジェンジャーは無菌的に１８％の高張生理食塩水で満たされて密封される（または蓋で封がされる）。ジャーはそれから、ロッカープラットフォーム上に置かれて、３０〜９０分間撹拌されて、羊膜から汚染物質をさらに取り除く。ロッカープラットフォームが臨界的（ｃｒｉｔｉｃａｌ）環境（例えば、製造フード）内でなかった場合は、ナルジェンジャーは制御／滅菌環境へ戻されて開封される。滅菌鉗子を用いて、または無菌的に中身を静かに移して、羊膜は、１８％高張生理食塩水を含むナルジェンジャーからやさしく取り出されて、空のナルジェンジャー中に置かれる。羊膜を有する、この空のナルジェンジャーは、それから、無菌的に、予め混合された抗生物質溶液で満たされる。一態様では、予め混合された抗生物質溶液は、硫酸ストレプトマイシンおよび硫酸ゲンタマイシンのような抗生物質の混合物からなる。ポリミキシンＢ硫酸塩およびバシトラシンのような他の抗生物質、または、現在利用可能または将来利用可能である同様の抗生物質もまた、適切である。加えて、抗生物質溶液は、羊膜の温度を変化させないように、添加時に室温であることが好ましく、さもなければ羊膜を傷つける。羊膜および抗生物質を含む、このジャーまたは容器はそれから、密封され、または密閉されて、ロッカープラットフォーム上に置かれて、好ましくは６０〜９０分間、撹拌される。抗生物質溶液内での羊膜のそのような振動または撹拌は、組織から汚染物質および細菌をさらに取り除く。場合により、羊膜は、洗浄剤で洗浄することができる。一態様では、羊膜は、０．１〜１０％、０．１〜５％、０．１〜１％、または０．５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ洗浄液で洗浄することができる。
【００３２】
ロッカープラットフォームが臨界的環境（例えば、製造フード）内でなかった場合は、羊膜および抗生物質を含むジャーまたは容器はそれから、臨界的／滅菌環境へ戻されて開封される。滅菌鉗子を用いて、羊膜はジャーまたは容器からやさしく取り出されて、滅菌水または標準の生理食塩水（０．９％生理食塩水）を含む滅菌ボウル中に置かれる。羊膜は、少なくとも１０〜１５分間、滅菌水／標準生理食塩水中に、適所に浸される。羊膜は、組織からの抗生物質溶液および任意の他の汚染物質の除去を促進するために、わずかに撹拌されてよい。少なくとも１０〜１５分後に、羊膜は、脱水およびさらなる処理がされる状態になる。
【００３３】
絨毛膜の場合は、以下の例示的な方法を用いることができる。羊膜から絨毛膜を分離して線維層から凝固血液を除去した後、絨毛膜は１８％生理食塩水中で１５分〜６０分間、すすぎがされる。第一のすすぎのサイクルの間、１８％生理食塩水は、溶液温度がおよそ４８℃であるように、実験用加熱板またはインキュベーターを用いて滅菌容器中で加熱される。溶液が静かに移され、絨毛膜組織は滅菌容器内に置かれて、静かに移された生理食塩水が容器に注がれる。容器は密封されて、ロッカープレート上に置かれて、１５分〜６０分間撹拌される。１時間の撹拌浴の後に、絨毛膜組織は取り出されて、さらに１５分〜６０分のすすぎのサイクルのために、第二の加熱撹拌浴中に置かれた。場合により、絨毛膜組織は、羊膜の除染のために、上記のように洗浄剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ洗浄液）で洗浄することができる。容器は密封されて、１５分〜１２０分間、加熱せずに撹拌される。絨毛膜組織はつぎに、脱イオン水で（２５０ｍｌの脱イオン水×４回）、各すすぎで激しく動かして洗浄される。組織は取り出されて、１×ＰＢＳ  ｗ／ＥＤＴＡ溶液の容器中に置かれる。容器は密封されて、８時間制御された温度下で、１時間撹拌される。絨毛膜組織は取り出されて、滅菌水を用いてすすぎがされる。目視検査は、任意の残っている変色した線維状血液材料を絨毛膜組織から除去するために行われた。絨毛膜組織は、褐色変色の兆候がない乳白色の外観を有するはずである。
【００３４】
臍帯の全体処理（ステップ１５０）
メスまたはハサミを用いて、臍帯が絨毛ディスク（ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ  ｄｉｓｋ）から切り離される。いったん静脈と動脈が確認されたら、図２に示すように、臍帯は、静脈または動脈の一つを縦に下へと切断される。いったん臍帯が切断されたら、ウォートン・ジェリーから静脈および動脈壁を切断するために外科用ハサミおよび鉗子を用いることができる。次に、羊膜を切断することにより、羊膜の外層がウォートン・ジェリーから取り除かれる。ここで、臍帯の外膜は、ウォートン・ジェリーが唯一残る構成要素であるようにして取り除かれる。このように、本明細書において用いられるウォートン・ジェリーは、臍帯外膜および臍帯血管を含まない。ウォートン・ジェリーは、小片に切断することができる。一態様では、小片は、およそ１〜４ｃｍ×１０〜３０ｃｍでおよその厚さが１．２５ｃｍである；しかしながら、適用に応じて、他の厚さが可能である。
【００３５】
化学的除染（ステップ１６０）
ウォートン・ジェリーは、滅菌ナルジェンジャーに移される。次に、室温の１８％高張生理食塩水が、組織をすすぐために加えられて、ジャーが密封される。ジャーは３０〜６０分間撹拌される。インキュベーション後、ジャーは除染されて、そして滅菌領域へ戻される。組織は清潔な滅菌ナルジェンジャーに移されて、そして１８％ＮａＣｌで予熱（約４８℃）される。容器は密封されて、そしてロッカープレート上に置かれて、６０〜９０分間撹拌される。
【００３６】
すすぎ後、ジャーは除染されて、そして滅菌領域に戻される。組織が取り出されて、そして抗生物質溶液中に置かれる。容器は密封されて、ロッカープラットフォーム上で６０〜９０分間撹拌される。インキュベーションに続いて、ジャーは、１〜１０℃で２４時間まで冷蔵されてよい。
【００３７】
ウォートン・ジェリーは次に、およそ２００ｍＬの滅菌水を含む滅菌ボウルへ移される。組織は１〜２分間すすがれて、そして、およそ３００ｍｌの滅菌水を含む滅菌ナルジェンジャーへ移される。ジャーは密封されて、そして３０〜６０分間、ロッカー上に置かれる。インキュベーション後、ジャーは滅菌領域へ戻される。ウォートン・ジェリーは、褐色変色の兆候がない乳白色の外観を有するはずである。
【００３８】
組織移植片の調製および脱水（ステップ１７０）
本明細書に記載の組織移植片は、羊膜および／または絨毛膜で積層されたウォートン・ジェリーからなる。組織移植片は、ウォートン・ジェリーに積層された、複数の（すなわち、２より多い）羊膜および絨毛膜からなり得る。例えば、移植片は、羊膜と絨毛膜が交互に重なった層を有するウォートン・ジェリーからなり得る。別の態様では、移植片は、お互いに積層された複数の羊膜層およびお互いに積層された複数の絨毛膜層を有するウォートン・ジェリーからなり得る。
【００３９】
移植片中に存在する層の実際の数は、手術の必要性および組織移植片を用いるように意図される処置に依存する。例えば、根の被覆処置のような歯の再生処置において、または組織再生誘導法での使用において、移植片の厚さは、約０．５ｍｍ〜２ｍｍの範囲であり得る。一態様では、ウォートン・ジェリーと羊膜との間に挿入される膜の数は、１、２、５およびまたは１０であり得、層の最終的な数は用いられる移植片のタイプおよび期待される使用適応に依存する。
【００４０】
一態様では、移植片は、（１）ウォートン・ジェリーの第一の膜；（２）絨毛膜、ここで前記絨毛膜は絨毛膜間質層を含み、前記絨毛膜間質層はウォートン・ジェリーに隣接しており；および（３）羊膜、ここで前記羊膜は、露出した基底膜と羊膜間質層を有し、前記羊膜間質層は絨毛膜に隣接している、を含む。別の態様では、移植片は、（１）ウォートン・ジェリーの第一の膜；および（２）羊膜、ここで前記羊膜は、露出した基底膜および羊膜間質層を有し、前記羊膜間質層はウォートン・ジェリーに隣接している、を含む。
【００４１】
別の態様では、本明細書に記載の移植片は、羊膜の外層が取り除かれておおよその長さ、幅および厚さに切断されているウォートン・ジェリーと、基底膜およびウォートン・ジェリーと羊膜との間に挟まれている別の生分解性の生物学的適合材料を露出させるために上皮層が実質的に取り除かれている羊膜の層とからなり得える。そのような材料の例は、限定されないが、心膜の同種移植片、無細胞真皮の同種移植片、羊膜（すなわち、羊膜と絨毛膜の両方）、臍静脈、精製された１型コラーゲン異種移植片、バイオセルロースポリマーまたはコポリマー、生体適合性合成ポリマーまたはコポリマーフィルム、精製された小腸粘膜下組織、膀胱無細胞マトリックス、死体筋膜、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【００４２】
一態様では、組織移植片は、化学的脱水に続く凍結乾燥により脱水される。一態様では、化学的脱水ステップは、組織に存在する残りの水を、実質的に（すなわち、９０％より多く、９５％より多く、または９９％より多く）、または完全に除去する（すなわち、組織を脱水する）ために、ウォートン・ジェリー、羊膜、およびまたは絨毛膜を、極性有機溶媒と十分な時間および量で接触させることにより行われる。溶媒はプロトン性または非プロトン性であってよい。本明細書で有用な極性有機溶媒の例は、限定されないが、アルコール類、ケトン類、エーテル類、アルデヒド類、またはそれらの任意の組み合わせを含む。具体的な非限定の例は、ＤＭＳＯ、アセトン、テトラヒドロフラン、エタノール、イソプロパノール、またはそれらの任意の組み合わせを含む。一態様では、胎盤組織は、室温で極性有機溶媒に接触させられる。さらなるステップは必要なく、組織は下記のようにして、直接に凍結乾燥することができる。
【００４３】
化学的脱水後、任意の残りの水と極性有機溶媒を除去するために、組織移植片は凍結乾燥される。一態様では、凍結乾燥の前に、羊膜および／または絨毛膜を有するウォートン・ジェリーを、適切な乾燥用固定具上に置くことができる。例えば、１片または複数片のウォートン・ジェリーを、ゲル側が乾燥用固定具の表面に隣接する適切な乾燥用固定具の上に置くことができる。次に、絨毛膜が、間質側を下にしてウォートン・ジェリーの上部に置かれて、続いて、絨毛膜の上部に羊膜間質側を下にして、羊膜の露出した基底膜が上を向くようにして置かれる。別の態様では、羊膜を、露出した基底膜が下を向くようにして乾燥用固定具の表面上に置き、それから、間質側を上にして絨毛膜を羊膜の上部に置き、続いて、絨毛膜の上部にウォートン・ジェリーの小片を置くことができる。別の態様では、羊膜を、露出した基底膜が上を向くようにして乾燥用固定具の表面上に置き、それから絨毛膜を羊膜の上部に置き、続いてウォートン・ジェリーの小片を置くことができる。
【００４４】
乾燥用固定具は、好ましくは、胎盤組織を平たい形状で広げて置いて完全に受け入れるのに十分大きいサイズである。一態様では、乾燥用固定具は、デュポンが発明して販売するアセタール樹脂工学プラスチックのブランド名であるテフロンまたはデルリン製であり、そしてそれはまた、ジョージア州マリエッタのＷｅｒｎｅｒ  Ｍａｃｈｉｎｅ，  Ｉｎｃ．から市販されている。熱耐性および切断耐性であり湿組織を受け入れるのに適切な形状に形成することが可能な任意の他の適切な材料もまた、乾燥用固定具に用いることができる。
【００４５】
一態様では、図３に示されるのと同様に、乾燥用固定具５００の受容面は、切断後の組織の所望の外輪郭であって、組織が用いられる適用可能な外科的処置に要求されるサイズと形である、製品スペース（ｐｒｏｄｕｃｔ  ｓｐａｃｅ）５１０を規定する溝５０５を有する。例えば、乾燥用固定具は、溝が格子配置であるようにして配列させることができる。一つの乾燥用固定具上の格子は、同一の均一なサイズであってよく、または異なる外科的適用のために設計された多様のサイズを含んでよい。それでもなお、当業者によって理解されるように、任意のサイズおよび形の配列を、乾燥用固定具に用いることができる。別の実施態様では、積空間を規定する溝を有する代わりに、乾燥用固定具は、隆起した突起部または刃を有する。
【００４６】
溝または突起部の間の「空の」空間の中に、乾燥用固定具は、テキスト、ロゴ、名前、または同様のデザイン５２０の形状にわずかに隆起した、または、ギザギザした、表面模様（ｔｅｘｔｕｒｅ）を含み得る。この表面模様付けされた（ｔｅｘｔｕｒｅｄ）テキスト、ロゴ、名前、またはデザインは、カスタマイズされ得る。乾燥されると、基本的に組織自身の中にラベルをもたらしながら、組織は隆起した表面模様の周りに、またはギザギザした表面模様の中に、それ自身を形作る。好ましくは、乾燥および切断後に、乾燥組織のエンドユーザー（典型的には臨床医）が乾燥組織の基底側から間質側を区別することができるように、表面模様／ラベルは、組織移植片上に一方向にのみ読まれる、または見られることができる。これが望まれる理由は、外科的処置の間、羊膜基底側を下にして、または同種移植片を受ける患者の天然組織に隣接して、同種移植片を所定の位置に置くことが望ましいからである。図３は、乾燥用固定具５００の空の空間５１０の中に含まれ得る様々なマーク、ロゴ、およびテキスト５２０を示す。典型的に、一つの乾燥用固定具は、全ての空の空間の中に同一のデザインまたはテキストを含む；しかしながら、図３は、説明の目的のために、それぞれの移植片をエンボス加工するためのそのような乾燥用固定具上に含まれ得る広く様々なデザインを示す。
【００４７】
いったん絨毛膜および／または羊膜を有するウォートン・ジェリーからなる組織移植片が乾燥用固定具上に置かれると、乾燥用固定具は凍結乾燥機内に置かれる。組織移植片を脱水するための凍結乾燥機の使用は、加熱脱水のような他の技術に比べて、より効率的かつ完璧であり得る。一般に、胎盤組織移植片中の氷晶形成は、組織移植片中の細胞外マトリックスを傷つけ得るので避けることが望ましい。凍結乾燥前に胎盤組織を化学的に脱水することで、この問題は回避することができる。
【００４８】
別の態様では、脱水ステップは、組織移植片を温めるステップを含む。一態様では、羊膜および／または絨毛膜を有するウォートン・ジェリーは、適切な上述の乾燥用固定具上に置かれて、そして、乾燥用固定具は滅菌Ｔｙｖｅｘ（または同様の、通気性があり熱耐性で密封可能な材料）の脱水バッグ中に置かれて、密封される。通気性のある脱水バッグは、組織の乾燥が早すぎるのを防止する。複数の乾燥用固定具が同時に処理される場合は、それぞれの乾燥用固定具は、それ自身のＴｙｖｅｘバッグ中に置かれるか、または、複数の乾燥フレームをそれ上に保持するように設計された適切な取付フレーム中に置かれてそれからフレーム全体がより大きい一つの滅菌Ｔｙｖｅｘ脱水バッグ内に置かれて密封されるかの、いずれかである。
【００４９】
１つまたは複数の乾燥用固定具を含むＴｙｖｅｘ脱水バッグはそれから、およそ３５〜５０℃に予熱された非真空のオーブンまたはインキュベーター内に置かれる。Ｔｙｖｅｘバッグは、３０〜１２０分間、オーブン中にそのままにされる。一態様では、加熱ステップは、組織移植片を過乾燥または燃焼はさせないが組織を十分に乾燥させるために、およそ４５℃の温度で４５分で行うことができる。任意の具体的なオーブンに関する具体的な温度および時間は、高度、オーブンの大きさ、オーブン温度の精度、乾燥用固定具に用いられる材料、同時に乾燥される乾燥用固定具の数、一つまたは複数の、乾燥用固定具のフレームが同時に乾燥されるのかどうか、などを含む他の因子に基づいて計算および調節される必要がある。
【００５０】
特定の態様では、組織移植片は、最後の切断および梱包（ステップ１８０）を除いて、物理的に変更されない。完了すると、処理された組織移植片は白っぽい着色を有する半透明の見た目を有する。組織移植片は柔らかくて、それが乾燥して水分を補給されていない状態での曲げ加工およびサイズ化に耐える。本明細書に記載の組織移植片は、長時間、室温で保管され得る。
【００５１】
切断および梱包（ステップ１８０）
いったん移植片が十分に脱水されたら、組織移植片はそれから、特定の商品サイズに切断される準備がされて、保管、最終的な滅菌および後の外科的使用のために、適切に梱包される。一態様では、脱水された組織を含むＴｙｖｅｋバッグは、滅菌／制御環境中に戻して置かれる。生産されるべき移植片の数は、乾燥用固定具（単数または複数）上の組織のサイズおよび形状に基づいて見積もられる。それからまた、それぞれの組織移植片に対して一つの、適切な数のポーチが、滅菌／制御環境の中に導入される。乾燥用固定具（単数または複数）はそれから、Ｔｙｖｅｋバッグから取り出される。
【００５２】
乾燥用固定具が溝を有する場合は、以下の例示的な方法を、商品サイズに組織移植片を切断するために用いることができる。乾燥用固定具が格子状に構成される場合は、＃２０または同様のストレートまたはローリング刃を、それぞれの溝のラインに沿って平行に切断するために用いる。次に、垂直方向の全ラインが切断される。あるいは、乾燥用固定具が隆起した縁または刃を有する場合は、以下の方法を、組織移植片を商品サイズに切断するために用いることができる。滅菌ローラーを、乾燥用固定具を横切って転がるために用いる。脱水された組織移植片が、乾燥用固定具の全ての隆起した刃または縁に沿って切断されるように、十分な圧力が付与されるべきである。
【００５３】
切断後、それぞれの組織移植片は、それぞれの「インナー」ポーチに置かれる。好ましくは透明側と不透明側を有するインナーポーチは、透明側を上に向けるべきである。組織移植片は、テキスト、ロゴ、名前、または同様のデザインの形状での表面模様がインナーポーチの透明側を介して外に向いてインナーポーチの外側に見えるように、「インナー」ポーチの中に置かれる。この方法は、それぞれの別個の組織移植片に関して繰り返される。
【００５４】
それぞれの組織移植片はそれから、裂け目または穴がないか、商品サイズ（切断物として）が、規定の長さおよび幅サイズのおよそ（＋または−）１ミリメーター以内で、かつ、その特定の移植片に関しておよそ（＋または−）２５０ミクロン以内の厚さであるか、組織移植片の著しい染みまたは変色がないか、および表面模様付けされたロゴまたはワードが、「インナー」ポーチを介して読めて、そして見えるかどうかを、確認するための最終的な検査がされる。
【００５５】
可能な限り、酸素は、密封される前にインナーポーチから取り除かれる。インナーポーチは、任意の適切な方法で密封することができる；しかしながら、加熱密封が効果的であることが示されている。一態様では、梱包後、商品は、１７．５ｋＧｙの標的線量でのγ線または電子ビーム滅菌を用いた放射線により、最終的に滅菌される。次に、それぞれのインナーポーチは、さらなる保護、保管および輸送のために、「アウター」ポーチの中に、別々に梱包される。
【００５６】
上述のステップのいずれも、不要な細胞を殺すため、組織移植片を除染するために、またはさもなければ組織移植片を保存するために、組織移植片を凍結させるステップを含まないことを留意すべきである。本明細書に記載の、脱水された組織移植片は、冷蔵または冷凍の必要なく室温または周囲温度で保管および輸送されるように作られる。
【００５７】
商品のリリース（ステップ１９０）
組織移植片がエンドユーザーに輸送およびリリースする準備ができる前に、品質保証部および医長によって、製造、回収およびドナーの適格性に関する全ての証拠書類が見直されて許容できると見なされる。
【００５８】
適切なラベリングおよび生産加工流通過程の管理（ｃｈａｉｎ  ｏｆ  ｃｕｓｔｏｄｙ）が、承認された業界標準及び慣習に従って、上記の方法の全てを通して監視される。適切なクリーンルームおよび滅菌作業条件が、可能な限り、上記の方法を通してずっと、維持および使用される。
【００５９】
ＩＩ．組織移植片の適用
本明細書に記載の組織移植片は、非常に多くの医療用途がある。一態様では、組織移植片は、羊膜の外層が取り除かれておおよその長さ、幅および厚さに切断されているウォートン・ジェリー、絨毛膜の層、および上皮層が実質的に取り除かれている羊膜の層からなる。上皮層を除去することにより、宿主由来の細胞は、羊膜の基底膜の上部および中にある細胞−癒着タンパク質と、より容易に相互作用することができる。羊膜のラミニン構造は、例えば口腔粘膜組織のような天然ヒト組織のそれとほぼ同一である。これは、基底膜の上部にわたって見られるラミニンおよびラミニン−５を含む。なお、絨毛膜は、組織のあらゆるところに高レベルのラミニンおよびラミニン−５を含む。
【００６０】
一態様では、歯肉退縮の治療において、移植片は、露出した根面上に羊膜側が直接置かれるようにして置かれる。上記のように、羊膜および絨毛膜に見られる高濃度のラミニン−５は、歯肉上皮直接付着細胞の、根の表面への付着を促進する。別の態様では、骨再生誘導法（ｇｕｉｄｅｄ  ｂｏｎｅ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）の処置で用いられる場合、移植片は、羊膜側が外側に向くようにして置かれる。羊膜および絨毛膜に見られる高濃度のラミニンおよびラミニン−５は、最初の閉鎖が得られない場合、または、膜を口腔環境に暴露する離開において、上皮形成および創傷閉鎖を促進する。
【００６１】
ウォートン・ジェリーの存在は、移植片の厚さを大いに増大させて、それは「トンネリング（ｔｕｎｎｅｌｉｎｇ）」と呼ばれる外科技術に有用な、大きな抗張力をもたらす。ここで、歯肉退縮の治療において、縫合糸が移植片を通されて、歯肉組織の下に引っ張られて、そして露出した根面および近位骨の上に置かれる。このように、本明細書に記載の移植片は、縫合糸を用いて移植片を所定の位置に固定することが好ましい適用に有用である。増加した厚さは、歯肉組織の高さおよびまたは幅を増大させることを目的とする増大処置のために、歯科インプラント周辺での使用のために、または移植片の厚さが「垂直切開（ｖｅｒｔｉｃａｌ  ｉｎｃｉｓｉｏｎｓ）」「エンベロープフラップ（ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｆｌａｐ）」「ポーチ技術（ｐｏｕｃｈ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）」または「スライディングペディセル（ｓｌｉｄｉｎｇ  ｐｅｄｉｃｅｌ）（単数または複数）」のような外科的技術を用いた、より高レベルの根被覆と関連する進行性歯肉退縮欠損の治療において、そのような移植片をさらにふさわしくする。
【００６２】
別の態様では、骨再生誘導法および組織再生誘導法の処置において、移植片は、骨代用品、自家の骨または両方の組み合わせのいずれかの骨移植片の上に、近位壁（例えば、骨、歯、または、チタンメッシュのような剛性膜）に置かれて密着されることができて、保護領域への歯肉上皮細胞の根尖移動を防止する。本態様では、移植片は、縫合糸の使用を必要としない。加えて、移植片は口腔環境に曝されたままにされ得て、移植された骨欠損を被覆するほどの歯肉組織を放出する必要を減らし、移植片の露出領域はその後に、手術に続いて角質化組織で被覆される。さらに、移植片が最初に置かれて、それから骨欠損が移植片材料で充填されて、そしてそれから折り重ねられて移植領域の上を覆うという方法で、移植片を用いることができる。本明細書に記載の移植片は、炎症を誘導しない。炎症がないことは、手術後の患者の痛み、最初の閉鎖が得られるときの移植片の離開、および元の骨の寸法をより良く保存させる、下部の天然の骨および移植片の上での破骨細胞の再吸収、および本明細書に記載の移植片の再吸収と関連する自然な炎症過程を軽減させる。ウォートン・ジェリー中の原線維の間の広大な空間、および、天然または人工のいずれかの生物学的流体を吸収する能力は、垂直およびまたは水平の骨増大術でチタンメッシュの上に置いてインプラント周辺の歯肉組織を厚くさせて歯肉退縮の治療における移植片の有効性を増加させながら移植片の壊死の危険性を減少させることにより血管新生率を自然に促進すること、骨再生誘導法、および、覆っている歯肉組織を厚くさせることが目的である歯槽骨欠損に関する外科的処置によく適している。
【００６３】
理論に束縛されるものではないが、おおよその長さ、幅、および厚さに切断されたウォートン・ジェリー、絨毛膜の層、および基底膜を露出するために上皮層が実質的に取り除かれている羊膜の層からなる移植片は、細胞の接着と遊走を促進するそれらの優れた能力、細胞増殖と遺伝子発現の調節、分化形質の維持および神経突起伸長の刺激のため、再生処置での使用に大変適切であり得た。血管新生を高めることができるそれらの能力および、それらの本来備わっている長所と使いやすさは、口腔内、鼻内、喉内、膣内、および直腸内に存在するヒト粘膜に関する外科的適用において移植片を効果的にする。
【００６４】
本明細書に記載の移植片は、生物活性剤に浸すことができる。本明細書で有用な生物活性剤の例は、限定されないが、自家血液の採取と分離を用いた産物または全目的に関してその全体で本明細書中に参照により援用される米国特許出願公開第２０１０／０２２２２５３号で概説された方法に従った期限切れの血液バンク由来の血小板濃縮物のいずれかの、血小板濃縮物由来の天然起源の増殖因子からなる溶液を含む。生物活性剤の他の例は、骨髄穿刺液；胎盤の同種移植片；濃縮ヒト胎盤臍帯血幹細胞、濃縮羊水幹細胞またはバイオリアクター中で増殖された幹細胞由来の幹細胞；適切な緩衝液中の精製された生物活性剤；または抗生物質を含む。ここで、組織移植片の１つまたは複数の移植片層は、組織中に組み込まれた生物活性剤を有することができる。生物活性剤を有する湿組織移植片を創傷に対して適用する際、生物活性剤は時間をかけて創傷に届けられる。
【００６５】
組織移植片は、取扱いしやすくて壊れにくい。したがって、本明細書に記載の移植片を使用する場合、縫合糸の使用を必要としない。しかしながら、組織移植片は、縫合糸を保持するような、またはそれが用いられる適応の必要に基づいた再吸収の比速度（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒａｔｅ）をもたらすような方法に設計されてよい。
【００６６】
本明細書に記載の組織移植片は多くの適用があり、様々な処置において用いることができる。例えば、組織移植片は、以下の、歯肉退縮欠損の処置、付着した歯肉組織の量を増加させる垂直および水平の歯肉増大術、小帯牽引の除去、歯科インプラント周辺の組織増大、乳頭再建、および口腔前庭形成術を含む歯の再生処置において、移植された骨内欠損の上の組織再生誘導法において、移植された摘出ソケットの上での骨再生誘導法、一次および二次の下顎および上顎堤増大術、および開窓術と欠損離開において、および、シュナイダー膜中の裂傷の上に置いて洞の側部の窓を被覆するために用いられる洞挙上術（ｓｉｎｕｓ  ｅｌｅｖａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）において、用いることができる。口腔粘膜組織に関する適用では、口の痛み、口腔病変の治療、および、疾患または外傷性損傷により失われた、より大量の粘膜組織の置換を含む。
【００６７】
また、組織移植片は、組織が耳内、鼻内、および喉内の粘膜からなる再建的な処置、婦人科、および直腸および肛門に関する外科的処置において用いることができる。
【００６８】
本明細書に記載の組織移植片は、１つまたは複数の骨移植片および／または再生物質を含み得る。骨移植片は、骨組織中の欠損または欠乏を修復するために用いられる組織または材料である。骨移植片は、一般に、４つのカテゴリーに分類される：患者由来の自家移植片、および同種移植片、異種移植およびアロプラスト。骨移植片は、一般的に、１つまたは複数の以下の特性を有する：（１）骨形成性の可能性−生細胞の存在；（２）骨誘導性−細胞を引き寄せて、骨形成を誘導して、およびまたは細胞遊走を加速する、非コラーゲン性タンパク質を含む、；および（３）骨伝導性−細胞遊走のための足場の役目を果たしてリン酸カルシウムを提供する。
【００６９】
腸骨稜、肋骨、顎、または、上顎結節または摘出部位由来の口腔内海綿骨から採取される骨自家移植片は、骨形成性、骨誘導性、および骨伝導性の特性を有する。同種移植片の材料は、ヒト死体由来の組織を指し、そして、腸骨海綿骨および髄質、凍結乾燥された皮質骨および海綿骨、および脱塩されて凍結乾燥された皮質骨および海綿骨を含む。死体同種移植片は、骨伝導および骨誘導の特性を有する。異種移植片は、非−ヒト種由来である。これらの移植片材料は、全体として骨伝導の特性のみを有し、または、不活性で吸収性のヒドロキシアパタイト足場を残して、ほとんどのタンパク性物質が取り除かれている。アロプラストは合成的に製造されて、非多孔質性ヒドロキシアパタイト、多孔質性ヒドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、生体活性ガラス、フルオロアパタイト、炭酸アパタイト、硫酸カルシウム、炭酸カルシウム、およびそれらの組み合わせを含み、そして、異なる度合いの骨伝導特性を与える。
【００７０】
他の態様では、本明細書に記載の移植片は、外傷による移植骨欠損の処置、外科的に作られた骨欠損（例えば、穿頭孔およびトレフィン欠損（ｔｒｅｐｈｉｎｅ  ｄｅｆｅｃｔ）、頬骨欠損、および眼窩欠損）を含む頭蓋顔面手術において、および、開放骨折および閉鎖骨折、区域性欠損、骨軟骨欠損、脊椎固定、および他の非耐力（ｎｏｎ−ｌｏａｄ  ｂｅａｒｉｎｇ）の再生処置での整形外科手術において、メッシュまたは多孔質性デバイスの周りを包むことができる。
【００７１】
他の態様では、本発明に記載の移植片は、整形外科の適用（すなわち、スポーツ医学）で用いることができる。スポーツ医学は、活発な人およびスポーツ選手において、外傷に起因する関節中または関節周辺の様々な軟組織損傷、または運動の繰り返しによりもたらされる慢性状態の修復および再建を含む。例えば、スポーツ医学は、制限されないが、肩、肘、足、足首、手および手首と関連する、様々な異なる損傷の治療を含む。
【００７２】
損傷の主なタイプは、腱および靭帯の捻挫および様々な関節におけるヘルニアを含み、最も一般的には、膝のＡＣＬおよび肩の回旋腱板である。腱と靭帯でない処置は、裂けた膝半月板の修復および治療されないままにしておくと関節の変形性関節症をもたらし得る膝軟骨の修復を含む。また、非外科的選択肢は、炎症を起こした腱（例えば「テニス肘」）への抗−炎症性薬剤の注入、関節への潤滑剤の注入（例えばヒアルロン酸を膝へ）、ならびに理学療法およびブレーシング（ｂｒａｃｉｎｇ）を含む。
【００７３】
一態様では、本明細書に記載の組織移植片は、治癒している腱上での瘢痕形成を防ぐために、腱修復を包むために用いることができる。また、それらは、修復がうまく進行するための、保護的な閉鎖環境を提供することができる。組織移植片は、同種移植片を購入する必要性に代替するため、または、腱または靭帯の移行をするために、既製の（ｏｆｆ−ｔｈｅ−ｓｈｅｌｆ）腱および靭帯として用いることができる。
【００７４】
他の態様では、本明細書に記載の組織移植片は、回旋腱板の補強で用いることができる。いくつかの回旋腱板の裂傷は、生存可能な天然組織の欠如のため、修復を助ける補強マトリックスを必要とするほどに大きい。本明細書に記載の組織移植片は、修復を補強するためのマトリックスとして用いることができる。一態様では、本明細書に記載の組織移植片は、膝軟骨を修復するために用いることができる。例えば、組織移植片は、細胞培養された軟骨細胞または軟骨欠損の内側の他のプロ軟骨再生マトリックスを保持するためのバリアとして用いることができる。この態様では、組織移植片は、欠損を閉鎖してマトリックスを所定の位置に維持するためのフラップとして使用される。
【００７５】
一態様では、組織移植片は、末梢神経を修復するために用いることができる。組織移植片は、治癒している神経の上に瘢痕が形成するのを防ぐために、神経修復上を包むものとして用いることができる。また、組織移植片は、修復がうまく進行するための、保護的な閉鎖環境を提供することができる。他の態様では、組織移植片は、神経末端が再接近し得ない保護的環境中に神経が伸びるのを導くための神経再生チューブ中に製造することができる。ここで、末端が他の軟組織に妨害されることなく自由に接することができる場合、神経は一定の距離次第で再度結合することができる。別の態様では、組織移植片は、前立腺切除術の処置後に神経束を束ねるために用いることができる。これらの神経は、勃起機能および排泄抑制能力を司る。組織移植片は、瘢痕および場合により神経を損傷することからそれらを守るために、神経上に置くことができる。
【００７６】
他の態様では、本明細書に記載の組織移植片は、骨膜の修復での補助；破裂性／損傷性嚢の修復の補助；骨修復中の空隙充填材料の固定の補助；のような他の整形外科の適用において、または対象の四肢に関する適用（例えば、小骨の固定のための抗−癒着バリア、金属めっきまたは金属製品が用いられる場合の抗−癒着バリア、または、破裂性／損傷性嚢の修復の補助）において、用いることができる。
【００７７】
一態様では、本明細書に記載の移植片は、創傷治癒を高める、または改善するのに有用である。日常ベースで医師を訪れる創傷のタイプはさまざまである。急性の創傷は、外科的処置、外傷および火傷に起因する。慢性の創傷は、他の点では健康な人において、治癒に比べて閉じるのが遅い創傷である。患者を悩ませる慢性の創傷のタイプの例は、糖尿病性足部潰瘍、静脈性下腿潰瘍、圧迫潰瘍、動脈性潰瘍、および感染する手術創傷を含む。
【００７８】
外傷性創傷を治療する時の医師の目標は、最小限の瘢痕および感染で、創傷の領域における自然な機能を患者が保持するようにしながら創傷を治療することである。創傷が感染する場合、手足または生活の喪失を導き得る。ほとんどは、何事もなく医師はこれらの患者を治療する。しかしながら、慢性の創傷を扱う医師は、手足または生活の喪失を導き得る感染リスクを最小限化するために、できるだけ素早く創傷を閉じることを主に心掛ける。慢性の創傷は、治癒カスケードを悪化または遅らせる共存症を有する患者での創傷である。一態様では、本明細書に記載の組織片は、炎症を軽減して治癒を高めるのを助けるために、必須の創傷治癒因子、細胞外マトリックスタンパク質および炎症性メディエータを運搬して瘢痕組織形成を軽減する、組織再生テンプレートとして機能することができる。
【００７９】
別の態様では、本明細書に記載の組織移植片は、手術後に起こる脊椎および周辺領域への合併症を対処する、または軽減するのに有用である。急性および慢性の脊椎損傷および脊椎痛は、脊柱における外傷および／または退行性変化に起因し得る。退行性の患者に関しては、通常、患者の症状および病状に応じた可能な手術が施される。保存療法が失敗した場合の最初の外科的選択肢は、椎弓切除術またはマイクロ椎間板切除術（ｍｉｃｒｏ−ｄｉｓｃｅｃｔｏｍｙ）である。これらの低侵襲的処置は、痛みの発生または脊柱管狭窄を緩和することを目的とする。疾患が進行する場合、制限されないが、脊椎固定を含む他の手術が必要となり得る。脊椎固定は、前方（腹部を通って前から）、後方（背中から）、または側部（脇を通って）で、様々な方法を通して達成されてよい。それぞれの方法は、利点と欠点がある。目標は典型的に、椎間板を取り除き、板の高さを元に戻して、動きおよびさらなる劣化を制限するために２つの脊椎骨を一緒に固定させる（ｆｕｓｅ）ことである。外科医および患者の外科的選択肢には、椎間板を人口板で置き換えることもある。脊椎外傷は典型的に、脊椎レベル（ｓｐｉｎｅ  ｌｅｖｅｌｓ）を固定する（ｆｕｓｉｎｇ）ことにより治療され、または、椎骨が破砕している場合は、外科医は椎体切除術（ｃｏｒｐｅｃｔｏｍｙ）をして、影響を受けたレベルにわたって固定することを選択し得る。 
【００８０】
一態様では、本明細書に記載の組織移植片は、脊椎上または脊椎付近の瘢痕形成を予防または軽減し、および硬膜裂傷をシーリングするのに有用である。手術後の脊椎上または脊椎付近の瘢痕形成は非常に衰弱性（ｄｅｂｉｌｉｔａｔｉｎｇ）であり得て、そして場合により、上記の症状を対処するための手術をその後に必要とする。また、用語「抗−癒着」は、当技術分野において、脊椎上または脊椎付近の瘢痕組織の予防を指すためにも用いられる。他の態様では、本明細書に記載の組織移植片は、移植片が周囲の手術部位由来の手術後の外傷から脊髄硬膜を保護する、保護バリアとして用いることができる。例えば、移植片は、椎骨などの、切れたばかりの骨による鋭いエッジによって引き起こされる、脊髄硬膜への損傷を防ぐことができる。他の態様では、組織移植片は、前方腰椎椎体間固定術（ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｌｕｍｂａｒ  ｉｎｔｅｒｂｏｄｙ  ｆｕｓｉｏｎ）、後方腰椎椎体間固定術（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｌｕｍｂａｒ  ｉｎｔｅｒｂｏｄｙ  ｆｕｓｉｏｎ）、経椎間孔腰椎椎体間固定術（ｔｒａｎｓ−ｌｕｍｂａｒ  ｉｎｔｅｒｂｏｄｙ  ｆｕｓｉｏｎ）、前方頸部椎間板切除術および固定術（ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｄｉｓｃｅｃｔｏｍｙ  ａｎｄ  ｆｕｓｉｏｎ）、マイクロ椎間板切除術、脊髄硬膜修復のため、および脳脊髄液漏（ＣＳＦ  ｌｅａｋａｇｅ）を防ぐための硬膜シーラントとして、用いることができる。
【００８１】
外科的処置に応じて、組織移植片は、脊髄硬膜、神経根を含む脊椎の周辺領域、またはそれらの組み合わせに、直接適用することができる。椎骨の独特な構造のために、組織移植片は、対象における適切な位置に配置して付けることができるようにして、任意の形状または寸法に切断することができる。例えば、組織移植片が、両側の被覆に用いられる場合、長方形型の膜は、組織移植片を、後方脊椎突起（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｓｐｉｎａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓ）周辺に合わせさせて、横の動きを最小限にする。横の動きを最小限にすることに加えて、組織移植片はまた、影響を受けた領域への露出のために骨髄層が取り除かれている、近位および遠位のバリアカバレッジを与えることができる。一態様では、適切な配置を確実にするために、移植片は、対象での移植片の適切な配置を確実にするために、移植片の露出した基底膜上をエンボス加工することができる。特に、適切な移植片の配置は、移植片の基底膜が脊髄硬膜または周辺領域に直接接触することを確実にする。例えば、適切な膜の配置および方向は、後方または前方アプローチが使用される脊椎の適用において材料を適用する場合に重要である。
【００８２】
組織片は、脊椎と関連する様々な外科的処置に起因し得る瘢痕形成を予防または軽減するのに有用である。組織片は首、背中、または腰における任意の処置後に用いることができる。適用に応じて、羊膜の上皮は実質的に取り除かれてよい。例えば、椎弓切除術または椎間板切除術などの後処置では、上皮層は実質的に取り除かれる。上皮細胞層の除去は、羊膜の基底膜層を露出させて、細胞シグナル特性を増大させる。この上方制御の応答は、細胞の遊走および抗−炎症性タンパク質の発現を高めて、線維症を阻害する。脊髄硬膜は、後処置に続き典型的に保護されないままである。このように、本明細書に記載の移植片は、これらの処置において、満たされていない要求をもたらす。
【００８３】
他の態様では、上皮細胞層は取り除かれない。例えば、前方腰椎椎体間固定術（ＡＬＩＦ）や経椎間孔椎体間固定術（Ｔｒａｎｓｆｏｒａｍｉｎａｌ  Ｉｎｔｅｒｂｏｄｙ  Ｆｕｓｉｏｎ）（ＴＬＩＦ）のような前処置または改良された前処置では、羊膜の上皮層は取り除かれず、損傷されていない。これらの態様では、組織片は、腹膜、より大きな血管、および腹部の筋肉組織からの隔離を維持することにより脊椎の手術部位にさらなる保護を与える。膜は、癒着および瘢痕に対する、減少した摩擦解剖学的バリア（ｆｒｉｃｔｉｏｎ  ａｎａｔｏｍｉｃａｌ  ｂａｒｒｉｅｒ）としての役割を果たす。例えば、組織片は、瘢痕組織が大きな血管を脊椎に結合させるのを防ぐことができる。これは、脊椎の手術後での一般的な問題であり、これを対処するための第二の外科的処置が必要である。
【００８４】
別の態様では、組織移植片は、女性の受胎能に関与し得る疾患の治療、生殖器系に起因する痛みまたは生殖器系におけるガンに関する産婦人科（ＯＢ／ＧＹＮ）の外科的処置に用いることができる。これらの処置は、子宮筋腫の除去（筋腫切除術）、卵巣嚢胞の除去、卵管結紮、子宮内膜症の治療、いくつかのガン性または非ガン性腫瘍の除去、および膣スリング（ｖａｇｉｎａｌ  ｓｌｉｎｇｓ）を含む。これらの処置は、経膣の、腹部の、または腹腔鏡の手法により達成されてよい。
【００８５】
組織移植片は、外科的処置後の生殖器系における瘢痕組織の量を軽減するためのパッチとして用いることができる。瘢痕組織は、線維組織の別形態であり、そしてまた、受胎能の問題に寄与し得る。卵巣上または卵管中の瘢痕の量を最小限に抑える能力は、手術後の受胎能および痛みさえにも役立ち得る。別の態様では、組織移植片は、重症の子宮内膜症の治療後に子宮壁を補強するために、および、患者の妊娠する能力を高めるために、用いることができる。さらなる態様では、組織移植片は、卵巣嚢胞の除去後の抗−癒着バリア、または膣壁びらんの修復の補助として用いることができる。
【００８６】
他の態様では、組織移植片は心臓適用に用いることができる。狭心症は心筋の虚血（血液の不足、したがって、酸素供給の欠乏）による、一般に冠動脈（心臓の血管）の閉塞または攣縮による、重度の胸部痛である。狭心症の主な原因である冠動脈疾患は、心臓の動脈のアテローム性動脈硬化に起因する。アテローム硬化性の血塊を除去するための様々な開放性の心臓および血管の外科処置は、血管の修復、再建および閉鎖、および外科的欠損を閉鎖させてパッチするための再生組織パッチの補助を必要とする。また、心臓バイパス移植片および心臓欠陥の再建（心臓切開の外科的処置の一環として）は、パッチまたは移植片から、軟組織の弱さに対する支え（ｂｕｔｔｒｅｓｓ）、適切な組織の欠損がある場合は組織置換、および心臓それ自身への癒着を軽減する可能性も与えるという、恩恵を受けることができる。本明細書に記載の組織移植片は、頸動脈修復、冠動脈バイパス移植術、先天性心疾患、心臓弁修復、および血管修復（すなわち末梢血管）などの手術および合併症に起因する血管および心臓の欠陥の修復を助けるためのパッチとして、用いることができる。
【００８７】
本明細書に記載の組織移植片は、全身の外科処置で用いることができる。例えば、全身の外科的処置は、腹腔に関する処置を含む。これらは、腸、胃、大腸、肝臓、胆嚢、虫垂、胆管および甲状腺を含む。処置は、ヘルニア、ポリープ切除、ガン除去、結腸クローン病および潰瘍性大腸炎の外科的処置を含んでよい。これらの処置は、開腹または腹腔鏡下で行われてよい。他の態様では、組織移植片は、吻合の閉鎖、吻合のための抗−癒着バリア、またはヘルニア修復のための抗−癒着バリアを促進するために用いることができる。
【００８８】
他の態様では、組織移植片は耳鼻咽喉科（ＥＮＴ）処置で用いることができる。鼓室形成は、鼓膜（ｅａｒｄｒｕｍ）（鼓膜（ｔｙｍｐａｎｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ））および／または中耳の小骨の再建のために行われる。穿孔された鼓膜の治療のための、様々な選択肢が存在する。穿孔が最近の外傷による場合は、耳、鼻および喉の多くの専門家は、自然に治癒するかどうか観察して見ることを選択するだろう。これが生じないか、または、頻回の再度の穿孔が同一エリアに生じる場合は、手術が検討され得る。鼓室形成は、外耳道を通して、または耳の後ろの切開により行うことができる。ここで、外科医は、耳周辺の皮膚の下の組織から移植片を摘出して、そして、鼓膜を再構築するためにそれを用いる。本明細書に記載の組織移植片は、患者自身の組織の摘出と関連するさらなる外傷を防ぐために用いることができ、そして手術時間を短縮する。他の態様では、組織移植片は、アデノイド切除後の創傷被覆、扁桃摘出後の創傷被覆、またはシュナイダー膜（Ｓｎｉｄｅｒｉａｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）の促進修復として用いることができる。
【００８９】
他の態様では、本明細書に記載の組織移植片は、形成外科処置で用いることができる。瘢痕形成術（ｓｃａｒ  ｒｅｖｉｓｉｏｎ）は、瘢痕の見た目を改善または軽減するための手術である。それはまた、機能を回復させ、および、損傷、創傷、または以前の手術に起因する皮膚変化（美観を損なうこと）をなおす。瘢痕組織は、損傷または手術後の皮膚治癒として形成する。瘢痕の量は、創傷の大きさ、深さ、および部位；人の年齢；遺伝；および皮膚の色（色素沈着）を含む皮膚特性により決定され得る。手術は、瘢痕の切除および欠損の注意深い閉鎖を含む。一態様では、本明細書に記載の組織移植片は、瘢痕の治癒および予防；および軟組織の縁の丁寧な近似（ｃａｒｅｆｕｌ  ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｆｔ−ｔｉｓｓｕｅ  ｅｄｇｅｓ）が達成不可能であって瘢痕組織が生じ得るケロイドまたはガンの修復（ｒｅｖｉｓｉｏｎ）／除去に役立つパッチとして用いることができる。さらに、組織移植片の抗炎症性特性は、その上、治癒を高めることができる。
【００９０】
他の態様では、組織移植片は、眼科の適用（例えば、眼表面修復のオン−レイ（ｏｎ−ｌａｙ）移植片）または泌尿器科の適用（例えば、精管復元術の間の精管の閉鎖を促進する、または外傷により生じる精管の閉鎖を促進する）において用いることができる。
【００９１】
一態様では、組織移植片は、脳硬膜の修復および置換、小帯牽引の除去、失われた膝蓋骨組織の再生、空洞中のシュナイダー膜、歯科インプラント周辺の軟組織の修復、口腔前庭形成術、および組織再生誘導法において用いることができる。
【００９２】
移植片の適用に応じて、移植片は、自家血液の採取と分離を用いた産物または期限切れの血液バンク由来の血小板濃縮物のいずれかの、血小板濃縮物由来の天然起源の増殖因子；骨髄穿刺液；濃縮ヒト胎盤臍帯血幹細胞、濃縮羊水幹細胞、またはバイオリアクター中で増殖された幹細胞由来の幹細胞；または抗生物質からなる溶液のような生物活性剤に浸すことができる。ここで、組織移植片の１つまたは複数の膜層は、生物活性剤を吸収する。生物活性剤を有する湿組織移植片を創傷に対して適用する際、生物活性剤は時間をかけて創傷に届けられる。
【００９３】
本明細書に記載の組織移植片は対象の組織に直接適用することができるが、それらはまた、続けて対象に適用することのできる創傷被覆材（ｗｏｕｎｄ  ｄｒｅｓｓｉｎｇ）に適用することができる。例えば、創傷被覆材は、ガーゼ、絆創膏またはラップ、または対象へ直接適用することのできる組織移植片を含むことができる、または付けることができる任意の他の適切な物であり得る。
【実施例】
【００９４】
以下の実施例は、本明細書に記載されてクレームされた化合物、組成物、および方法がどのように作られて評価されるかについて完全な開示と説明を当業者に提供するために提示され、そして、単なる例示を意図し、発明者らが彼らの発明と見なす範囲を限定することを意図しない。数字（例えば、量、温度など）に関して正確さを保証する努力はしているが、いくつかのエラーおよび偏差は説明されるべきである。別段の指示がない限り、部は重量部であり、温度は℃または大気温度であり、および圧力は大気圧またはそれ付近である。構成要素の濃度、所望の溶媒、溶媒混合物、温度、圧力、および記載の方法により得られる産物の純度および収量を最適化するために用いることのできる他の反応の範囲および条件など、反応条件の多くのバリエーションおよび組み合わせがある。合理的で型通りの実験のみが、そのような方法の条件を最適化するために必要とされる。
【００９５】
一態様では、以下の方法は、本明細書に記載の組織移植片を作成するために用いられる：
（ａ）対象から胎盤を得るステップ、ここで胎盤は羊膜嚢および臍帯を含む；
（ｂ）羊膜嚢を、羊膜および絨毛膜組織の層に分離するステップ、ここで羊膜は基底膜に隣接する上皮細胞を含む；
（ｄ）羊膜の基底膜を露出させるために、実質的に全ての上皮細胞を除去するステップ；
（ｅ）臍帯の血管の構成要素からウォートン・ジェリーを分離するステップ
（ｆ）ウォートン・ジェリーから羊膜の外層を切り離すステップ；
（ｇ）予め決められた長さ、幅および厚さに、ウォートン・ジェリーを切断するステップ；
（ｈ）乾燥用固定具の表面の上に、ウォートン・ジェリーを載せるステップ；
（ｉ）ウォートン・ジェリーの上部に絨毛膜を重ねるステップ
（ｊ）絨毛膜の上部に羊膜を重ねるステップ；
（ｊ）乾燥用固定具の上に重ねられた組織移植片を脱水するステップ；および
（ｋ）脱水された羊膜−絨毛膜−ウォートン・ジェリーの小片を、周囲の絨毛膜および羊膜から切断するステップ
【００９６】
ウォートン・ジェリーの調製
ａ．材料および装置
以下の品々は、滅菌されて、適切な場合には、または滅菌のものが購入されて、および胎盤を処理するために用いられた：ステンレススチールボウル、ドレープ、３２オンスのボウル、処理トレイ、クリーニングキット（定規、ハサミ、鉗子および小さい曲がった鉗子）、トランスファーキット（ハサミおよび鉗子）、ロッカー（Ｂａｒｎｓｔｅａｄ  Ｌａｂ  Ｌｉｎｅ、Ｍｏｄｅｌ  ２３１４）、抗生物質溶液（０．２％硫酸ストレプトマイシンおよび０．０１５％硫酸ゲンタマイシン）、水、１８％ＮａＣｌ、４×４ｃｍガーゼ、ナルジェンジャー、Ｉｓｏｓｏｒｂ、定規、および蚊バサミ（ｍｏｓｑｕｉｔｏ  ｓｃｉｓｓｏｒｓ）。処理の最初に古さが２１日未満のヒト胎盤は、地元の病院から得られた。全ての溶液、使い捨て用品、生物学的安全キャビネット中で用いられる器具および容器は滅菌された。
【００９７】
ｂ．方法
滅菌領域は、消毒された生物学的安全キャビネット中に用意された。２つのドレープが、作業トレイとボウルの底部を覆うために置かれて、クリーニングキット、ガーゼ、蚊バサミおよびナルジェンジャーが、作業トレイへ無菌的に移された。胎盤は、回収輸送容器から取り出されて、無菌的にステンレススチールボウル中に置かれて、そしてボウルは領域へ移された。高張生理食塩水（１８％ＮａＣｌ）がボウルおよびナルジェン容器の中へ注がれた。
【００９８】
組織は、任意の変色、破片、容認できない臭気および損傷の兆候について評価された。情報は記録されて、任意の損傷が図に示された。組織が容認可能なものであった場合、操作者は、さらに進めた。
【００９９】
臍帯から始まって、羊膜から絨毛膜を分離するために、羊膜は絨毛ディスクからやさしく持ち上げられた。羊膜の大部分は注意深く取り除かれて、残っている羊膜および絨毛膜はディスクから切断された。無関係で不規則な縁は切り取られて、血塊はガーゼを用いて取り除かれた。羊膜および絨毛膜はお互いに分離された。羊膜および絨毛膜は続いて、残っている血塊を和らげるために、１８％高張生理食塩水中で１０分間すすぎがされた。
【０１００】
臍帯は絨毛ディスクから切り離された。静脈および動脈は、臍帯の末端に位置した。臍帯は、図２に示すように臍帯の縦軸に沿って血管の間を、血管の一つを通って外膜へと切断された。蚊バサミは、目に見える任意の静脈および動脈壁を切り取るために用いられた。
【０１０１】
ウォートン・ジェリーは、１８％ＮａＣｌで満たされたナルジェンジャーの中に、室温で置かれて、無菌的に蓋で覆われて密封されて、フードから取り出されて、ラベルがされて、ロッカープラットフォームへ移されて、そして周囲温度で６０分間撹拌された。インキュベーションの間、フードは清潔にされて、滅菌作業領域に以下の材料が準備された：予熱された１８％ＮａＣｌで満たされたナルジェンジャー、１枚の滅菌ドレープおよび１つのトランスファーキット。
【０１０２】
６０分の最後に、ウォートン・ジェリーを含むナルジェンジャーは消毒されて、作業領域へ無菌的に戻された。ウォートン・ジェリーは、ジャーから鉗子で無菌的に取り出されて、そしてドレープ上に置かれた。臍帯を厚さ１．２５ｍｍ未満に切断しないようにして、任意の目に見える静脈および動脈壁が蚊バサミで切り離された。清潔なナルジェン容器が、５００ｍｌの温かい（４８℃）１８％ＮａＣｌで満たされた。ウォートン・ジェリーは、新鮮で温かい１８％ＮａＣｌを含む清潔なナルジェンジャーへ移されて、そして蓋がきつく締められた。ジャーはロッカープラットフォームの上に置かれて、７０分間撹拌された。インキュベーションの間、フード中の使用済みの使い捨て用品は捨てられて、領域は消毒された。インキュベーション時間に続いて、ナルジェンジャーはシェーカーから取り出されて、ナルジェンジャーの外側は消毒されて、そしてフードへ戻された。
【０１０３】
除染ステップが次に行われた。ウォートン・ジェリーは、予め混合された抗生物質（０．２％硫酸ストレプトマイシンおよび０．０１５％硫酸ゲンタマイシン）で満たされたナルジェンジャーの中に置かれて、無菌的に蓋で覆われて、フードから取り出されて、ラベルされて、ロッカープラットフォームへ移されて、そして、周囲温度で６０分間撹拌された。ナルジェンジャーは１〜１０℃に１６時間置かれた。
【０１０４】
フードは消毒されて、そして滅菌作業領域は以下の材料を含むことが確認された：作業トレイ、滅菌水で満たされたナルジェンジャー、１枚の滅菌ドレープ、滅菌水を含む滅菌ボウルおよび１つのトランスファーキット。組織を含むジャーが開けられて、そして臍帯が抗生物質溶液から鉗子で取り出されて、そして、滅菌水のボウル中に置かれた。ウォートン・ジェリーは、ボウルの中で、水で１〜２分間すすぎがされて、そして滅菌水の入ったナルジェンへ移された。蓋が、ナルジェンの上できつく締められた。ナルジェンはフードから取り出されて、そしてロッカープラットフォームの上に６０分間置かれた。フードは清潔にされて消毒された。フードの中の作業領域は、以下を含んで準備された：滅菌水で満たされた滅菌ボウル、脱水キット（ハサミ、鉗子および小さい曲がった鉗子）、蚊バサミ、定規、乾燥ボード、乾燥ラックおよびクランプ。インキュベーション後、組織を含むナルジェンジャーの外側が消毒されて、そしてフードへ戻された。
【０１０５】
組織がジャーから無菌的に取り出されて、滅菌ボウルへ移された。所望の厚さが得られたことを確認するために、組織の厚さが測定された（１．２５ｍｍ  ＋／−０．２５ｍｍ）。
【０１０６】
羊膜の調製
ａ．材料および装置
以下の品々は、滅菌されて、適切な場合には、または滅菌のものが購入されて、および胎盤を処理するために用いられた：ステンレススチールボウル、ドレープ、３２オンスのボウル、処理トレイ、クリーニングキット（定規、ハサミ、鉗子および小さい曲がった鉗子）、トランスファーキット（ハサミおよび鉗子）、ロッカー（Ｂａｒｎｓｔｅａｄ  Ｌａｂ  Ｌｉｎｅ、Ｍｏｄｅｌ  ２３１４）、抗生物質（０．２％ストレプトマイシンおよび０．０１５％ゲンタマイシン）、水、１８％ＮａＣｌ、４×４ｃｍガーゼ、ナルジェンジャー、Ｉｓｏｓｏｒｂ、定規、蚊バサミ。処理の最初に古さが２１日未満のヒト胎盤は、地元の病院から得られた。全ての溶液、使い捨て用品、生物学的安全キャビネット中で用いられる器具および容器は滅菌された。
【０１０７】
ｂ．方法
滅菌領域は、消毒された生物学的安全キャビネット中に用意された。２つのドレープが、作業トレイとボウルの底部を覆うために置かれて、クリーニングキット、ガーゼ、蚊バサミおよびナルジェンジャーが、作業トレイへ無菌的に移された。胎盤は、回収輸送容器から取り出されて、ステンレススチールボウル中に置かれて、そしてボウルは領域へ移された。高張生理食塩水（１８％ＮａＣｌ）がボウルおよびナルジェン容器の中へ注がれた。
【０１０８】
胎盤は、任意の変色、破片、容認できない臭気および損傷の兆候について評価された。羊膜の長さおよび幅のおおまかな測定が行われた（羊膜：３０ｃｍ×４０ｃｍ）。情報は記録されて、任意の損傷が図に示された。組織が容認可能なものであった場合、操作者は、さらに進めた。
【０１０９】
臍帯から始まって、羊膜から絨毛膜を分離するために、羊膜は絨毛ディスクからやさしく持ち上げられた。羊膜の大部分は、鈍的切開（ｂｌｕｎｔ  ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）により絨毛膜から注意深く分離されて、そして残っている羊膜および絨毛膜はディスクから切断された。無関係で不規則な縁は切り取られて、血塊はガーゼを用いて取り除かれた。羊膜は、上皮側を上にしてトレイの上に置かれて、そして、細胞スクレーパーで羊膜を優しくこすることによって、細胞の上皮層が取り除かれた。羊膜は、残っている血塊を和らげるために、ボウル中の１８％高張生理食塩水中で１０分間すすぎがされた。
【０１１０】
組織は、生理食塩水を含むナルジェン容器に移されて、蓋が閉められて、そしてナルジェンはロッカー上で６０分間撹拌された。ナルジェン容器は、生物学的安全キャビネット中の清潔な滅菌領域に戻されて、そして容器が開けられた。羊膜は、抗生物質溶液を含むナルジェン容器へ移されて、蓋が閉められて、そして容器はロッカー上で９０分間撹拌された。インキュベーションに続いて、羊膜は１〜１０℃で１８時間２５分、冷蔵された。
【０１１１】
組織は、滅菌水を含むナルジェンへ移されて、蓋が閉められて、そして組織は、ロッカー上で６０分間撹拌された。インキュベーションに続いて、組織は移植片の調製の準備が整った。
【０１１２】
絨毛膜の調製
羊膜および絨毛膜が分離されて血塊が取り除かれた後に、絨毛膜は、１８％生理食塩水の最初のすすぎの中に、３０〜６０分間置かれた。最初のすすぎの終了時に、絨毛膜は新しい滅菌容器の中に置かれて、そして、４８℃に温められた１８％生理食塩水が容器に静かに移された。容器は密封された。容器はロッカープレートの上に置かれて、そして６０〜９０分間撹拌された。６０〜９０分後、撹拌が終了して、絨毛膜は取り除かれて、新しい別の滅菌容器の中に置かれた。４８℃に温められた１８％生理食塩水が容器の中に静かに移された。このステップは随意的であり、そして、このステップはさらなる清浄化を提供するので、残りの血液がまだなお組織上に見える場合に用いることができる。２回目の６０〜９０分の撹拌サイクルの終了時に、絨毛膜は取り除かれて、抗生物質溶液中に置かれて、そして６０〜９０分間撹拌された。抗生物質の撹拌に続いて、組織処理を中断して組織を１〜１０℃で２４時間以下の間保持することができる。その後に、処理は適宜再開される。いったん抗生物質の洗浄が終わったら、絨毛膜は取り除かれて、滅菌水の中に置かれて、そして３０〜６０分間撹拌された。
【０１１３】
羊膜−絨毛膜−ウォートン・ジェリー移植片の調製
滅菌領域が生物学的安全キャビネットの中に用意されて、そして滅菌の非反転エンボス加工の乾燥ボードが領域内に置かれた。ウォートン・ジェリーは、ゲル側を下向きに乾燥用固定具に直接接触して置かれた。それから、単層の絨毛膜が、ウォートン・ジェリーの上部に、間質側を下向きに（ｄｏｎｅ）横たえて置かれた。気泡が取り除かれた。それから、単層の羊膜が、絨毛膜の上部に、間質層を下向きに置かれた。気泡が取り除かれた。乾燥ラックは羊膜−絨毛膜−ウォートン・ジェリー移植片の上部に置かれて、そして乾燥ラックと乾燥ボードは一緒に固定された。それから、固定された装置は、４５℃に設定されて予め滅菌された乾燥オーブンの中に置かれて、完全に乾燥するまで（２１時間）インキュベートされた。
【０１１４】
個々の羊膜−絨毛膜−ウォートン・ジェリー移植片の調製
フードは消毒されて、滅菌作業（ｓｔｅｒｉｌｅ  ｗｏｒｋ）は以下の材料を含んで用意された：滅菌ドレープ、切断ボード、切断キット（２つの定規、ハサミ、鉗子、小さい曲がった鉗子、ナイフホルダー、針ホルダー、およびマイクロヘラ（ｍｉｃｒｏ  ｓｐａｔｕｌａ））、メスの刃、およびインナーホイルポーチ（ｉｎｎｅｒ  ｆｏｉｌ  ｐｏｕｃｈｅｓ）。組織は、乾燥用固定具から取り除かれて、無菌的に作業領域内へ移された。１つの定規とメスが、移植片を所望のサイズ（１．０×１．３ｃｍ、１．０×２．５ｃｍ、１．０×３．５ｃｍ）に切断するために用いられた。それぞれの移植片は、エンボスが左から右へ読まれるように、それ自身のインナーホイルポーチの中に置かれた。いったん全ての移植片が切断されてポーチの中に置かれたら、インナーポーチは密封されて、組織識別番号でラベルされた。
【０１１５】
インビボでの試験
ａ．羊膜／ウォートン・ジェリー移植片
軟組織移植片−歯肉退縮
図４Ａは、歯８番の２ｍｍの欠損、および、歯８番の１ｍｍの欠損を示す。歯石除去（ｓｃａｌｉｎｇ）および根面平滑化の後、根面は、テトラサイクリンを用いて無毒化されて、そしてエムドゲイン（Ｅｍｄｏｇａｉｎ）が根面に適用された。羊膜／ウォートン・ジェリー移植片はそれから、欠損および近位骨（図４Ｂ）の上に置かれた。移植片を所定の位置に固定するために縫合糸は用いられなかった。フラップは移植片を十分に覆って進められた。９週目で、１００％の根被覆、および組織の厚さのいくらかの増大（図４Ｃ）。
【０１１６】
バリア膜−部位保存
歯３１番が、傷つけないように抜かれた。摘出部位は、凍結乾燥された骨同種移植片で移植されて、羊膜／ウォートン・ジェリー移植片で覆われた。最初の閉鎖は得られなかった。処置後１０日目に、手術部位上の歯肉組織、および、膜の露出部分を覆う肉芽組織の内側への移行が見られた（図５Ｃ）。２．５箇月目には、部位は角質化した組織で完全に覆われて（図５Ｄ）、そして、優れた新しい骨形成があった（図５Ｅ）。図５Ｆは、インプラントがうまく配置されたことを示す。
【０１１７】
ｂ．羊膜／絨毛膜／ウォートン・ジェリー移植片
軟組織代用品−歯肉退縮
図６Ａは、歯３番の２ｍｍの欠損、歯４番の３ｍｍの欠損、歯２９番の２ｍｍの欠損、および歯３０番の３ｍｍの欠損を示す。下顎における欠損は結合組織移植片（ＣＴＧ）で処置されて、上顎における欠損は羊膜／絨毛膜／ウォートン・ジェリー移植片で処置された。ＣＴＧと移植片の両方は所定の位置に縫合されて、表面を覆うフラップで完全に覆われた。２週目には、全ての処置された部位は、最小限の炎症および優れた治癒を示した（図６Ｂ）。３箇月目には、全ての処置された部位は、１００％の根被覆、組織の厚さの増大、および優れた美的成果を有した（図６Ｃ）。
【０１１８】
バリア膜−部位保存
歯１４番が、傷つけないように抜かれた（図７Ａ）。摘出部位は、凍結乾燥された骨同種移植片で移植されて、羊膜／ウォートン・ジェリー移植片で覆われた（図７Ｂ）。最初の閉鎖は得られなかった。処置後２週目に、歯肉組織および膜の露出部分を覆う肉芽組織の内側への移行が見られた（図７Ｃ）。４週目には、露出移植片の完全な被覆が見られた（図７Ｄ）。８週目には、歯肉組織のほとんど完全な角質化が見られた（図７Ｅ）。組織が、羊膜／ウォートン・ジェリー移植片に比べて、より厚いことに留意されたい。
【０１１９】
様々な改良および変更を、本明細書に記載の化合物、組成物および方法に対して行うことができる。本明細書に記載の化合物、組成物および方法の他の態様は、明細書の検討、および、本明細書に開示された化合物、組成物および方法の実践から明らかであろう。明細書および実施例は例示的であると考えられることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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