(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
セントラルメモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を有する移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）非誘導性抗第三者細胞を含む細胞の単離された集団を作製する方法であって、前記セントラルメモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型は、ＣＤ８＋／ＣＤ６２Ｌ＋／ＣＤ４５ＲＯ＋のシグナチャーを含み、前記細胞の単離された集団の少なくとも５０％が、前記シグナチャーを有し、前記細胞は寛容誘導細胞であり、かつ、移植後におけるリンパ節へのホーミングが可能であり、前記方法は、
（ａ）末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＧＶＨ反応性細胞の排除を可能にする条件のもと、ＩＬ−２１の存在下で第三者抗原（単数または複数）と接触させること、および
（ｂ）工程（ａ）から生じる前記細胞を、前記セントラルメモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を含む細胞の増殖を可能にする条件のもと、抗原非含有環境においてＩＬ−１５の存在下で培養し、それにより、前記細胞の単離された集団を作製すること
を含む、方法。
【請求項２】
非同系の細胞移植片または組織移植片が移植されている対象における疾患の根絶のために特定された医薬を製造するための、請求項１に記載の方法に従って作製された細胞の単離された集団の使用であって、
前記細胞が、（ｉ）前記対象および前記移植片の両方に関して非同系であるか、または、（ｉｉ）前記移植片に関して非同系であり、かつ、前記対象に関して同系であるか、のどちらかである、使用。
【請求項３】
前記細胞移植片または組織移植片は非自己由来であり、かつ、前記細胞の単離された集団は自己由来である、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記細胞移植片または組織移植片と、前記細胞の単離された集団とは、異なるドナーから得られる、請求項２に記載の使用。
【請求項５】
前記疾患は悪性腫瘍および任意選択的にＢ細胞悪性腫瘍を含む、請求項２に記載の使用。
【請求項６】
前記移植片は骨髄細胞および任意選択的に未成熟な造血細胞を含む、請求項２に記載の使用。
【請求項７】
前記未成熟な造血細胞は対象に関して非同系であり、かつ、前記細胞の単離された集団は対象に関して同系である、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記未成熟な造血細胞は非自己由来であり、かつ、前記細胞の単離された集団は自己由来である、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記未成熟な造血細胞が対象に関して非同系であるとき、前記細胞の単離された集団は、対象および移植片の両方に関して非同系である、請求項６に記載の使用。
【請求項１０】
前記未成熟な造血細胞と、前記細胞の単離された集団とは、異なるドナーから得られる、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記リンパ節は末梢リンパ節または腸間膜リンパ節を含む、請求項２に記載の使用。
【請求項１２】
前記移植片に関して非同系であり、かつ、対象に関して同系である前記細胞は、自己由来細胞を含む、請求項２に記載の使用。
【請求項１３】
未成熟な造血細胞を移植された対象における疾患の根絶のために特定された医薬を製造するための、請求項１に記載の方法に従って作製された細胞の単離された集団の治療効果的な量の使用であって、前記未成熟な造血細胞が前記対象に関して同系であるとき、前記細胞の単離された集団は、前記対象に関して同系であるように、または、前記対象に関して非同系であるように選択される、使用。
【請求項１４】
前記未成熟な造血細胞と、前記細胞の単離された集団は、自己由来であるか、または前記未成熟な造血細胞は自己由来であり、かつ、前記細胞の単離された集団は非自己由来である、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
未成熟な造血細胞を移植された対象における疾患の根絶のために特定された医薬を製造するための、請求項１に記載の方法に従って作製された細胞の単離された集団の治療効果的な量の使用であって、前記未成熟な造血細胞が前記対象に関して非同系であるとき、前記細胞の単離された集団は、前記対象に関して同系であるように、または、前記対象および前記未成熟な造血細胞の両方に関して非同系であるように選択される、使用。
【請求項１６】
前記未成熟な造血細胞は非自己由来であり、かつ、前記細胞の単離された集団は自己由来であるか、または前記未成熟な造血細胞と、前記細胞の単離された集団は、異なるドナーから得られる、請求項１５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、セントラルメモリーＴリンパ球表現型を含む移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）非誘導性抗第三者細胞に関連し、より具体的には、しかし、限定的ではなく、移植片対白血病／リンパ腫の処置のためのその使用に関連する。
【背景技術】
【０００２】
血液学的悪性腫瘍（例えば、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）など）の患者のための処置選択肢は多く、かつ、様々である。これらの現代の処置プロトコルは完全寛解（ＣＲ）を患者の相当割合でもたらしている。しかしながら、これらの患者の多くは究極的には再発しており、このことは、残存腫瘍細胞が、臨床的ＣＲを達成する患者に残っていることを意味する。この課題に対処するために、移植片対白血病／リンパ腫（ＧＶＬ）反応性を与えるドナーリンパ球注入（ＤＬＩ）が現在、開発中である。特に、進歩が、移植後のＤＬＩとの併用での同種骨髄移植（ＢＭＴ）の状況においてなされている［Ｇｒｉｇｇ  ＡおよびＲｉｔｃｈｉｅ  Ｄ、Ｂｉｏｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ（２００４）、１０：５７９〜５９０］。したがって、幹細胞移植片またはＤＬＩに存在するドナーのＣＤ８＋Ｔ細胞は、残存する悪性細胞を殺すことができるＧＶＬ効果の付加された利益を有することが明らかにされている［Ｈｏ  ＷＹ他、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．（２００２）、１１０：１４１５〜１４１７］。しかしながら、この利益が、移植関連死亡に悪影響を及ぼす移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）（これには、ＣＤ８  Ｔ細胞が関連する）によって相殺される。
【０００３】
本発明者らによって行われた以前の研究では、第三者刺激因子に対するマウスＣＤ８＋Ｔ細胞のエクスビボ刺激がＩＬ−２欠乏下では、Ｔ細胞枯渇化ＢＭＴ（ＴＤＢＭＴ）の生着を、ＧＶＨＤを生じさせることなく促進させることができる第三者の拘束されたＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）クローンの選択的成長をもたらすことが示されている［Ｂａｃｈａｒ−Ｌｕｓｔｉｇ  Ｅ．他、Ｂｌｏｏｄ（２００３）、１０２：１９４３〜１９５０；Ｒｅｉｃｈ−Ｚｅｌｉｇｅｒ  Ｓ．他、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２０００）、１３：５０７〜５１５］。近年、本発明者らは、セントラルメモリー表現型を有する活性化された抗第三者ＣＤ８＋細胞（Ｔｃｍ）が、ＢＭＴレシピエントにおけるＴｃｍ細胞の改善されたリンパ節ホーミング、それらの増殖能および長期に及ぶ持続に起因すると考えられるが、骨髄（ＢＭ）生着をさらに支援し、かつ、改善し得ることを明らかにした［Ｏｐｈｉｒ  Ｅ他、Ｂｌｏｏｄ（２０１０）、１１５：２０９５〜２１０４］。
【０００４】
さらに、本発明者らは、ヒトにおいて、抗第三者ＣＴＬが、同種反応性が激減されたにもかかわらず、Ｂ−ＣＬＬおよび種々のタイプの原発性リンパ腫の細胞の強力なインビトロ殺傷を示すことを示している［Ｌａｓｋ  Ａ他（２０１０年投稿）；Ａｒｄｉｔｔｉ  ＦＤ他、Ｂｌｏｏｄ（２００５）、１０５：３３６５〜３３７１］。ＧＶＬのこの独特な形態は、ＴＣＲ認識とは無関係であることが示され、これが、自己のＣＴＬによって、また、同種の抗第三者ＣＴＬによっての両方で媒介されることが見出された。さらに、抗第三者ＣＴＬによるＢ細胞悪性腫瘍のこのＴＣＲ非依存的殺傷は、ＩＣＡＭ１−ＬＦＡ１結合を介する迅速な接着、その後、ＣＴＬ上のＣＤ８と、腫瘍細胞上のＭＨＣクラスＩとの間における決定的な相互作用がなされたときのアポトーシスの遅い誘導を介して媒介されることが示された。そのうえ、この殺傷は、古典的なＣＴＬのデス分子、すなわち、ＦＡＳＬ、パーフォリン、ＴＮＦおよびＴｒａｉｌとは無関係であることが示された［Ｌａｓｋ  Ａ他、上掲］。
【０００５】
さらなる背景技術には、国際公開ＷＯ／２０１０／０４９９３５が含まれる。
【発明の概要】
【０００６】
本発明のいくつかの実施形態の一局面によれば、疾患をその必要性のある対象において処置する方法であって、（ａ）非同系の細胞移植片または組織移植片を前記対象に移植すること、および（ｂ）治療効果的な量の、セントラルメモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を有する移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）非誘導性抗第三者細胞を含む細胞の単離された集団を前記対象に投与し（ただし、前記細胞は寛容誘導細胞であり、かつ、移植後におけるリンパ節へのホーミングが可能であり、さらに、前記細胞は、（ｉ）前記対象および前記移植片の両方に関して非同系であるか、または、（ｉｉ）前記移植片に関して非同系であり、かつ、前記対象に関して同系であるか、のどちらかである）、それにより、前記対象を処置することを含む方法が提供される。
【０００７】
本発明のいくつかの実施形態の一局面によれば、セントラルメモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を有する移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）非誘導性抗第三者細胞を含む細胞の単離された集団（ただし、前記細胞は寛容誘導細胞であり、かつ、移植後におけるリンパ節へのホーミングが可能である）の、非同系の細胞移植片または組織移植片が移植されている対象における疾患の根絶のための補助処置としての使用であって、前記細胞が、（ｉ）前記対象および前記移植片の両方に関して非同系であるか、または、（ｉｉ）前記移植片に関して非同系であり、かつ、前記対象に関して同系であるか、のどちらかである、使用が提供される。
【０００８】
本発明のいくつかの実施形態の一局面によれば、セントラルメモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を有するＧＶＨＤ非誘導性抗第三者細胞を含む細胞の単離された集団が提供され、ただし、この場合、前記細胞は寛容誘導細胞であり、かつ、移植後におけるリンパ節へのホーミングが可能であり、さらに、前記細胞は、（ｉ）宿主対象および移植片の両方に関して非同系である（ただし、前記対象および前記移植片は非同系である）か、または、（ｉｉ）移植片に関して非同系であり、かつ、宿主対象に関して同系である（ただし、前記対象および前記移植片は非同系である）かのどちらかである。
【０００９】
本発明のいくつかの実施形態の一局面によれば、疾患をその必要性のある対象において処置する方法であって、（ａ）未成熟な造血細胞を前記対象に移植すること、および（ｂ）治療効果的な量の、セントラルメモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を有する移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）非誘導性抗第三者細胞を含む細胞の単離された集団を前記対象に投与すること（ただし、前記細胞は寛容誘導細胞であり、かつ、移植後におけるリンパ節へのホーミングが可能である）を含み、前記未成熟な造血細胞が前記対象に関して同系であるとき、前記細胞の単離された集団は、前記対象に関して同系であるように、または、前記対象に関して非同系であるように選択される、方法が提供される。
【００１０】
本発明のいくつかの実施形態の一局面によれば、疾患をその必要性のある対象において処置する方法であって、（ａ）未成熟な造血細胞を前記対象に移植すること、および（ｂ）治療効果的な量の、セントラルメモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を有する移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）非誘導性抗第三者細胞を含む細胞の単離された集団を前記対象に投与すること（ただし、前記細胞は寛容誘導細胞であり、かつ、移植後におけるリンパ節へのホーミングが可能である）を含み、前記未成熟な造血細胞が前記対象に関して非同系であるとき、前記細胞の単離された集団は、前記対象に関して同系であるように、または、前記対象および前記未成熟な造血細胞の両方に関して非同系であるように選択される、方法が提供される。
【００１１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、非同系の細胞移植片または組織移植片は、ＨＬＡ同一ドナーおよびＨＬＡ非同一ドナーからなる群から選択されるドナーに由来する。
【００１２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、対象およびドナーはともにヒトである。
【００１３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、対象はヒト対象である。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞移植片または組織移植片は非自己由来であり、かつ、細胞の単離された集団は自己由来である。
【００１５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞移植片または組織移植片と、細胞の単離された集団とは、異なるドナーから得られる。
【００１６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、疾患は悪性腫瘍を含む。
【００１７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、悪性腫瘍はＢ細胞悪性腫瘍を含む。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、悪性腫瘍は白血病を含む。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、悪性腫瘍はリンパ腫を含む。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、移植片は骨髄細胞を含む。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、骨髄細胞は未成熟な造血細胞を含む。
【００２２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、未成熟な造血細胞は対象に関して非同系であり、かつ、細胞の単離された集団は対象に関して同系である。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、未成熟な造血細胞は非自己由来であり、かつ、細胞の単離された集団は自己由来である。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、未成熟な造血細胞が対象に関して非同系であるとき、細胞の単離された集団は、対象および移植片の両方に関して非同系である。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、未成熟な造血細胞と、細胞の単離された集団とは、異なるドナーから得られる。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、少なくとも１つの免疫抑制薬物を上記対象に投与することを含む。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、対象はさらに、工程（ａ）の前に、亜致死的、致死的または超致死量的な状態調節（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ）のもとで状態調節される。
【００２８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、工程（ａ）および工程（ｂ）が同時に行われる。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、工程（ｂ）が工程（ａ）の前に行われる。
【００３０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、工程（ｂ）が工程（ａ）の１日後に行われる。
【００３１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、セントラルメモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型はＣＤ８＋／ＣＤ６２Ｌ＋のシグナチャー（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）を含む。
【００３２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞の単離された集団の少なくとも５０％が上記シグナチャーを有する。
【００３３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、リンパ節は末梢リンパ節を含む。
【００３４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、リンパ節は腸間膜リンパ節を含む。
【００３５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、移植片に関して非同系であり、かつ、対象に関して同系である細胞は、自己由来細胞を含む。
【００３６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、移植片に関して非同系であり、かつ、宿主対象に関して同系である細胞は、自己由来である。
【００３７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、未成熟な造血細胞と、細胞の単離された集団とは自己由来である。
【００３８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、未成熟な造血細胞は自己由来であり、かつ、細胞の単離された集団は非自己由来である。
【００３９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、未成熟な造血細胞は非自己由来であり、かつ、細胞の単離された集団は自己由来である。
【００４０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、未成熟な造血細胞と、細胞の単離された集団とは、異なるドナーから得られる。
【００４１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、寛容誘導細胞であり、かつ、移植後におけるリンパ節へのホーミングが可能である、セントラルメモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を有する抗第三者細胞は、（ａ）末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＧＶＨ反応性細胞の排除を可能にする条件のもと、ＩＬ−２１の存在下または非存在下で第三者抗原（単数または複数）と接触させること、および（ｂ）工程（ａ）から生じる細胞を、セントラルメモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を含む細胞の増殖を可能にする条件のもと、抗原非含有環境においてＩＬ−１５の存在下で培養し、それにより、前記細胞の単離された集団を作製することによって作製される。
【００４２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＧＶＨ反応性細胞の排除を可能にする条件は、１日間〜５日間にわたって培養することを含む。
【００４３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＧＶＨ反応性細胞の排除を可能にする条件は、サイトカインが除かれた培養における１日〜５日を含む。
【００４４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、第三者抗原（単数または複数）は樹状細胞を含む。
【００４５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、第三者抗原（単数または複数）は、第三者細胞、細胞抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、タンパク質抽出物、精製タンパク質、および、自己の提示細胞、非自己の提示細胞によって提示されるか、あるいは、人工ビヒクルまたは人工抗原提示細胞の表面に提示される合成ペプチドからなる群から選択される。
【００４６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞の増殖を可能にする条件はさらに、ＩＬ−７を含む。
【００４７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＩＬ−１５の存在下で培養することが３日間〜３０日間にわたって行われる。
【００４８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＩＬ−１５の存在下で培養することが６日間〜３０日間にわたって行われる。
【００４９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＩＬ−１５の存在下で培養することが３日間〜２０日間にわたって行われる。
【００５０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞の増殖を可能にする条件は、３日間〜１０日間にわたって培養することを含む。
【００５１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞の増殖を可能にする条件は、３日間〜７日間にわたって培養することを含む。
【００５２】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および／または科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法および／または材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
本明細書では本発明のいくつかの実施形態を単に例示し添付の図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の実施形態を例示考察することだけを目的としていることを強調するものである。この点について、図面について行う説明によって、本発明の実施形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
【００５４】
【図１Ａ−１Ｈ】図１Ａ−１Ｈは、同系骨髄移植後における同系由来の抗第三者Ｔｃｍ細胞による腫瘍再発の阻害を示す。致死的放射線照射（８Ｇｙ）を受けたＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈ−２ｄ）に、３×１０６個の同系Ｔ細胞枯渇化骨髄（ＢＡＬＢ／ｃ−ＮＵＤＥ）（Ｈ−２ｄ）の移植片を、５×１０３個のＡ２０−ｌｕｃリンパ腫細胞の存在下または非存在下で、静脈内に与えた（０日目）。その後、マウスには、１日目に、示された数のＢＡＬＢ／ｃ由来の抗第三者Ｔｃｍ細胞による静脈内注射が行われたか、または行われなかった（これらはそれぞれ、白血病細胞＋Ｔｃｍとして示され（ｎ＝７）、または、白血病細胞のみにより示される（ｎ＝７））。図１Ａ〜図１Ｈは、バイオルミネセンス画像化（ＢＬＩ）によって１週間間隔で１４日目からモニターされた腫瘍成長を示す写真である。
【図１Ｉ】図１Ｉは、同系骨髄移植後における同系由来の抗第三者Ｔｃｍ細胞による腫瘍再発の阻害を示す。致死的放射線照射（８Ｇｙ）を受けたＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈ−２ｄ）に、３×１０６個の同系Ｔ細胞枯渇化骨髄（ＢＡＬＢ／ｃ−ＮＵＤＥ）（Ｈ−２ｄ）の移植片を、５×１０３個のＡ２０−ｌｕｃリンパ腫細胞の存在下または非存在下で、静脈内に与えた（０日目）。その後、マウスには、１日目に、示された数のＢＡＬＢ／ｃ由来の抗第三者Ｔｃｍ細胞による静脈内注射が行われたか、または行われなかった（これらはそれぞれ、白血病細胞＋Ｔｃｍとして示され（ｎ＝７）、または、白血病細胞のみにより示される（ｎ＝７））。図１Ｉは、異なる処置群から得られる動物の生存率を示すグラフである。ｘ軸は腫瘍細胞注射後の日数を示し、ｙ軸はレシピエントマウス生存の割合を示す。
【００５５】
【図２Ａ−２Ｆ】図２Ａ−２Ｆは、同系骨髄移植後におけるＦ１由来の抗第三者ＣＤ８  Ｔ細胞による腫瘍再発の阻害を示す。致死的放射線照射（８Ｇｙ）を受けたＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈ−２ｄ）に、３×１０６個の同系Ｔ細胞枯渇化骨髄細胞（ＢＡＬＢ／ｃ−ＮＵＤＥ）（Ｈ−２ｄ）の移植片を、５×１０３個のＡ２０−ｌｕｃリンパ腫細胞の存在下または非存在下で、静脈内に与えた（０日目）。その後、マウスには、１日目に、２×１０７個のＦ１由来の抗第三者Ｔｃｍ細胞による静脈内注射（白血病細胞＋Ｔｃｍ、ｎ＝７）が行われたか、または行われなかった（白血病細胞のみ、ｎ＝５）。図２Ａ〜図２Ｆは、ＢＬＩによって１週間間隔で１４日目からモニターされた腫瘍成長を示す写真である。
【図２Ｇ】図２Ｇは、同系骨髄移植後におけるＦ１由来の抗第三者ＣＤ８  Ｔ細胞による腫瘍再発の阻害を示す。致死的放射線照射（８Ｇｙ）を受けたＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈ−２ｄ）に、３×１０６個の同系Ｔ細胞枯渇化骨髄細胞（ＢＡＬＢ／ｃ−ＮＵＤＥ）（Ｈ−２ｄ）の移植片を、５×１０３個のＡ２０−ｌｕｃリンパ腫細胞の存在下または非存在下で、静脈内に与えた（０日目）。その後、マウスには、１日目に、２×１０７個のＦ１由来の抗第三者Ｔｃｍ細胞による静脈内注射（白血病細胞＋Ｔｃｍ、ｎ＝７）が行われたか、または行われなかった（白血病細胞のみ、ｎ＝５）。図２Ｇは、異なる処置群から得られる動物の生存率を示すグラフである。ｘ軸は腫瘍細胞注射後の日数を示し、ｙ軸はレシピエントマウス生存の割合を示す。
【００５６】
【図３Ａ−３Ｈ】図３Ａ−３Ｈは、同種骨髄移植後における同種由来の抗第三者Ｔｃｍ細胞による腫瘍再発の阻害を示す。致死的放射線照射（８Ｇｙ）を受けたＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）マウスに、３×１０６個の同種Ｔ細胞枯渇化骨髄細胞（Ｃ５７ＢＬ／６−ＮＵＤＥ）（Ｈ−２ｂ）の移植片を、５×１０３個のＡ２０−ｌｕｃリンパ腫細胞の存在下または非存在下で、静脈内に与えた（０日目）。その後、マウスには、Ｃ５７ＢＬ／６由来細胞が（１日目に）静脈内注射された。図３Ａ〜図３Ｈは、ＢＬＩによって１週間間隔で１３日目からモニターされた腫瘍成長を示す写真である。
【図３Ｉ】図３Ｉは、同種骨髄移植後における同種由来の抗第三者Ｔｃｍ細胞による腫瘍再発の阻害を示す。致死的放射線照射（８Ｇｙ）を受けたＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）マウスに、３×１０６個の同種Ｔ細胞枯渇化骨髄細胞（Ｃ５７ＢＬ／６−ＮＵＤＥ）（Ｈ−２ｂ）の移植片を、５×１０３個のＡ２０−ｌｕｃリンパ腫細胞の存在下または非存在下で、静脈内に与えた（０日目）。その後、マウスには、Ｃ５７ＢＬ／６由来細胞が（１日目に）静脈内注射された。図３Ｉは、異なる処置群から得られる動物の生存率を示すグラフである。ｘ軸は腫瘍細胞注射後の日数を示し、ｙ軸はレシピエントマウス生存の割合を示す。
【００５７】
【図４Ａ−４Ｂ】図４Ａ−４Ｂは、本発明の抗第三者Ｔセントラルメモリー細胞の増殖および細胞表現型を示すグラフである。図４ＡはＴｃｍ細胞の増殖を培養の０日目から１２日目まで示し、図４Ｂは、Ａｌｌｏ−ＤＣに対する、同じ培養物を使用する細胞表現型を示す。
【００５８】
【図５】図５は、Ｂ細胞リンパ腫細胞株および形質細胞性白血病細胞株との２２時間の混合リンパ球反応（ＭＬＲ）の後におけるアポトーシス細胞のパーセントを示すグラフである。カルセインＡＭにより事前に標識されたＤａｕｄｉ細胞株、Ｈ．Ｍｙ２  Ｃ１Ｒ  ＨＬＡ  Ａ２  Ｋ６６Ａ変異体細胞株またはＬ３６３細胞株を、５倍過剰の抗第三者Ｔｃｍの存在下または非存在下で、２２時間インキュベーションした。アネキシンＶ＋細胞をＦＡＣＳによって求めた。データが五連の培養物の平均±ＳＤとして示される。＊＊＊ｐ＜０．００１の値は、Ｔｃｍの非存在下で培養されたサンプルと比較して、統計学的に有意な変化を示す。
【００５９】
【図６】図６は、Ｂ細胞リンパ腫ＥＢＶ−ＬＣＬ細胞株および形質細胞性白血病細胞株との２２時間の混合リンパ球反応（ＭＬＲ）の後における生細胞の数を示すグラフである。カルセインＡＭにより事前に標識されたＤａｕｄｉ細胞株、Ｈ．Ｍｙ２  Ｃ１Ｒ  ＨＬＡ  Ａ２  Ｋ６６Ａ変異体細胞株またはＬ３６３細胞株を、５倍過剰の抗第三者Ｔｃｍの存在下または非存在下で、２２時間インキュベーションした。カルセインＡＭ＋の生細胞の数をＦＡＣＳによって求めた。データが五連の培養物の平均±ＳＤとして示される。＊＊＊ｐ＜０．００１の値は、Ｔｃｍの非存在下で培養されたサンプルと比較して、統計学的に有意な変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、セントラルメモリーＴリンパ球表現型を含む移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）非誘導性抗第三者細胞に関連し、より具体的には、しかし、限定的ではなく、移植片対白血病／リンパ腫の処置のためのその使用に関連する。
【００６１】
本発明の原理および操作は、図面および付随する説明を参照してより良く理解されることができる。
【００６２】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明に示される細部、または、実施例によって例示される細部に必ずしも限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、あるいは、様々な方法で実施、または、実行される。また、本明細書中において用いられる表現法および用語法は説明のためであって、限定として見なされるべきでないことを理解しなければならない。
【００６３】
本発明を実施に移している間に、本発明者らは、抗第三者ＣＤ８＋  Ｔセントラルメモリー（Ｔｃｍ）細胞がインビボでの移植片対白血病／リンパ腫（ＧＶＬ）活性を含み、したがって、悪性の造血疾患（例えば、リンパ腫および白血病など）を処置するために使用され得ることを発見している。
【００６４】
本明細書中下記および下記の実施例の節において示されるように、本発明者らは、抗第三者ＣＤ８＋  Ｔｃｍ細胞のＧＶＬ反応性を、同種骨髄移植（ＢＭＴ）をリンパ腫患者において模擬するために特に設計されたインビボマウスモデルにおいて示している。最初に、本発明者らは、同種非反応性の由来するマウス抗第三者Ｔｃｍ細胞がヒト抗第三者ＣＴＬと同様に作用し、Ａ２０マウスリンパ腫細胞を直接に根絶することをインビトロにおいて確認した（下記の実施例の節の実施例１を参照のこと）。続いて、本発明者らは、Ｂ細胞リンパ腫についての微小残存病変（ｍｉｎｉｍａｌ  ｒｅｓｉｄｕａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ）マウスモデルを、ルシフェラーゼレポーター遺伝子がそのゲノムに安定的に組み込まれたＡ２０  Ｂ細胞リンパ腫細胞株（Ａ２０−ｌｕｃ）を利用して確立した。これらの細胞は、インビボでの腫瘍進行をバイオルミネセンス画像化（ＢＬＩ）によって高感度でモニタリングすることを可能にした。このモデルを使用して、本発明者らは、同系および同種の両方の第三者Ｔｃｍ細胞が同系の骨髄移植片と併せて投与されるとき、同系および同種の両方の第三者Ｔｃｍ細胞が、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を生じさせることなく、顕著なＧＶＬ反応性を示すことを発見した（それぞれ、下記の実施例の節の実施例２および実施例３）。さらに、本発明者らは、同種の抗第三者Ｔｃｍ細胞（ドナータイプ）を同種骨髄移植片と併せて投与するときには、ＧＶＨＤがない効果的なＧＶＬ効果を示した（下記の実施例の節の実施例４）。まとめると、これらの発見のすべてが、病的細胞を根絶するための、白血病／リンパ腫細胞に対する移植片としての抗第三者Ｔｃｍ細胞の使用を立証している。そのうえ、今回の結果は、レシピエントに関して、また、移植片ドナーに関して非同系であるドナーから得られる抗第三者Ｔｃｍ細胞（例えば、２つの異なるドナーから得られる抗第三者Ｔｃｍ細胞）が使用できることを明らかにする。
【００６５】
したがって、本発明の１つの局面によれば、疾患をその必要性のある対象において処置する方法であって、（ａ）細胞移植片または組織移植片を前記対象に移植すること、および（ｂ）治療効果的な量の、セントラルメモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を有する移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）非誘導性抗第三者細胞を含む細胞の単離された集団を前記対象に投与し（ただし、前記細胞は寛容誘導細胞であり、かつ、移植後におけるリンパ節へのホーミングが可能であり、さらに、前記細胞は、（ｉ）前記対象および前記移植片の両方に関して非同系であるか、または、（ｉｉ）前記移植片に関して非同系であり、かつ、前記対象に関して同系であるかのどちらかである）、それにより、前記対象を処置することを含む方法が提供される。
【００６６】
本明細書で使用される場合、用語「治療する／処置する」には、状態の進行を取り消すこと、実質的に阻害すること、遅くすること、または、逆向きにすること、状態の臨床的症状または審美的症状を実質的に改善すること、あるいは、状態の臨床的症状または審美的症状の出現を実質的に防止することが含まれる。
【００６７】
本明細書中で使用される場合、用語「対象」または用語「その必要性のある対象」は、細胞移植片または組織移植片を必要としている、任意の年齢の雄性または雌性の哺乳動物（好ましくは、ヒト）を示す。典型的には、対象は、細胞移植片または組織移植片の移植による処置を受け入れることができる障害、あるいは、病理学的または望まれない健康状態または状態または症候群、あるいは、物理的、形態学的または生理学的な異常のために、細胞移植片または組織移植片を必要としている（対象はまた、本明細書中ではレシピエントとして示される）。そのような障害の例が下記においてさらに示される。
【００６８】
本明細書中で使用される場合、表現「細胞移植片または組織移植片」は身体の細胞（例えば、１個だけの細胞または細胞群）または組織（例えば、充実組織または軟部組織、これらは全体または一部を移植することができる）を示す。本発明の教示に従って移植され得る例示的な組織には、リンパ系／造血系組織（例えば、リンパ節、パイエル板、胸腺または骨髄）が含まれるが、これらに限定されない。本発明の教示に従って移植され得る例示的な細胞には、造血幹細胞（例えば、未成熟な造血細胞）が含まれるが、これらに限定されない。
【００６９】
具体的な実施形態によれば、本発明の造血幹細胞はＣＤ３４＋である。
【００７０】
適用に依存して、上記方法は、対象と同系または非同系である細胞移植片または組織移植片を使用して行うことができる。
【００７１】
本明細書中で使用される場合、用語「同系（の）」は、本質的には当該対象と遺伝子的に同一である個体に由来する細胞または組織を示す。典型的には、本質的に完全に同系交配された哺乳動物、哺乳動物クローン、または、ホモ接合性双胎哺乳動物が同系である。
【００７２】
同系の細胞または組織の例には、当該対象に由来する細胞または組織（これらは「自己（由来）」としてこの技術分野では示される）、当該対象のクローン、あるいは、当該対象のホモ接合性双胎子が含まれる。
【００７３】
本明細書中で使用される場合、用語「非同系（の）」は、当該対象のリンパ球に関して同種または異種である個体に由来する細胞または組織（これらは「非自己（由来）」としてこの技術分野では示される）を示す。
【００７４】
本明細書中で使用される場合、用語「同種（の）」は、当該対象と同じ種であるが、当該対象とは実質的に非クローンであるドナーに由来する細胞または組織を示す。典型的には、同じ種の非近交系の非接合体（ｎｏｎ−ｚｙｇｏｔｉｃ）双胎哺乳動物は互いに同種である。同種ドナーは対象に関してＨＬＡ同一またはＨＬＡ非同一であってもよいことが理解される。
【００７５】
本明細書中で使用される場合、用語「異種（の）」は、当該対象のリンパ球の実質的割合の種に対して異なる種の抗原を実質的に発現する細胞または組織を示す。典型的には、異なる種の非近交系哺乳動物は互いに異種である。
【００７６】
本発明では、異種の細胞または組織が様々な種に由来すること、例えば、ウシ属の動物（例えば、ウシ）、ウマ科の動物（例えば、ウマ）、ブタ類（例えば、ブタ）、オビド類（ｏｖｉｄｓ）（例えば、ヤギ、ヒツジ）、ネコ属の動物（例えば、イエネコ（Ｆｅｌｉｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ））、イヌ科の動物（例えば、イヌ（Ｃａｎｉｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ））、齧歯類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、アレチネズミ、ハムスター）または霊長類（例えば、チンパンジー、アカゲザル、マカクザル、マーモセット）など（これらに限定されない）に由来することが想定される。
【００７７】
異種起源（例えば、ブタ起源）の細胞または組織が好ましくは、人畜共通感染症（例えば、ブタの内因性レトロウイルスなど）を有しないことが知られている供給源から得られる。同様に、ヒト由来の細胞または組織が好ましくは、実質的に病原体非含有の供給源から得られる。
【００７８】
本発明の１つの実施形態によれば、対象およびドナーの両方がヒトである。
【００７９】
適用および利用可能な供給源に依存して、本発明の細胞移植片または組織移植片は、出生前の生物ドナー、出生後の生物ドナー、成体ドナーまたは死体ドナーから得ることができる。そのうえ、必要とされる適用に依存して、細胞または組織はナイーブであり得るか、または、遺伝子操作され得る。そのような決定は十分に当業者の能力の範囲内である。
【００８０】
この技術分野で知られているどの方法も、（例えば、移植用の）細胞または組織を得るために用いることができる。
【００８１】
細胞移植片または組織移植片を対象に移植することを、様々なパラメーターに依存して、例えば、細胞タイプまたは組織タイプ；レシピエントの疾患（例えば、臓器不全）のタイプ、段階または重篤度；対象に特異的な物理的パラメーターまたは生理学的パラメーター；および／あるいは、所望される治療結果などに依存して、数多くの様式で行うことができる。
【００８２】
本発明の細胞移植片または組織移植片を移植することを、適用に依存して、細胞移植片または組織移植片を様々な解剖学的場所のいずれか１つに移植することによって行うことができる。細胞移植片または組織移植片は同位置の解剖学的場所（移植片のための通常の解剖学的場所）に移植することができ、または、異所性の解剖学的場所（移植片のための変則的な解剖学的場所）に移植することができる。適用に依存して、細胞移植片または組織移植片は好都合には、腎被膜下に、あるいは、腎臓、精巣脂肪、皮下組織、網、門脈、肝臓、脾臓、骨、心臓腔、心臓、胸腔、肺、皮膚、膵臓および／または腹腔内空間の中に埋め込むことができる。
【００８３】
例えば、未成熟造血細胞移植を必要とする場合、例えば、同系ドナーまたは非同系ドナーの骨髄、動員された末梢血（例えば、白血球除去法によるもの）、胎児肝臓、卵黄嚢および／または臍帯血に由来し得る未成熟な自己の造血細胞、同種の造血細胞または異種の造血細胞（例えば、幹細胞）を、疾患に苦しむレシピエントに移植することができる。
【００８４】
本発明の１つの実施形態によれば、疾患は悪性疾患である。１つの具体的な実施形態によれば、悪性疾患は造血組織またはリンパ系組織の悪性腫瘍である。別の具体的な実施形態によれば、悪性疾患はＢ細胞悪性腫瘍である（すなわち、Ｂリンパ球を伴うＢ細胞悪性腫瘍である）。
【００８５】
そのような疾患には、白血病［例えば、急性リンパ性、急性リンパ芽球性、急性リンパ芽球性前Ｂ細胞性、急性リンパ芽球性Ｔ細胞白血病、急性巨核芽球性、単球性、急性骨髄性（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ）、急性骨髄性（ｍｙｅｌｏｉｄ）、好酸球を伴う急性骨髄性（ｍｙｅｌｏｉｄ）、Ｂ細胞性、好塩基球性、慢性骨髄性（ｍｙｅｌｏｉｄ）、慢性、Ｂ細胞性、好酸球性、フレンド、顆粒球性または骨髄球性、毛様細胞性、リンパ球性、巨核芽球性、単球性、単球マクロファージ性、骨髄芽球性、骨髄性（ｍｙｅｌｏｉｄ）、骨髄単球性、形質細胞性、前Ｂ細胞性、前骨髄芽球性、亜急性、Ｔ細胞性、リンパ系新生物性、骨髄性悪性腫瘍に対する素因、急性非リンパ球性白血病、Ｔ細胞性急性リンパ球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）およびＢ細胞性慢性リンパ球性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）］、リンパ腫［例えば、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞性、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病／リンパ腫、バーキットリンパ腫、Ｔ細胞性、皮膚Ｔ細胞性、前駆Ｔ細胞性白血病／リンパ腫、ろ胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、ＭＡＬＴリンパ腫、組織球性、リンパ芽球性、胸腺性および菌状育肉種］、移植片の移植に伴う疾患（例えば、移植片拒絶、慢性移植片拒絶、亜急性移植片拒絶、超急性移植片拒絶、急性移植片拒絶および移植片宿主病）、自己免疫疾患（例えば、１型糖尿病など）、重症複合免疫不全症候群（ＳＣＩＤ）（アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）を含む）、大理石病、再生不良性貧血、ゴーシュ病、サラセミア、および、他の先天的造血系異常または遺伝的に決定された造血系異常などが含まれるが、これらに限定されない。
【００８６】
本発明の同系または異系の造血細胞（例えば未成熟な造血細胞）は、細胞移植のためにこの技術分野で知られているいずれかの方法を使用して、例えば、細胞注入（例えば、Ｉ．Ｖ．）または、腹腔内経路を介する方法（これらに限定されない）などを使用してレシピエントに移植され得ることが理解されるであろう。
【００８７】
必要に応じてであるが、本発明の細胞移植片または組織移植片を、欠陥臓器を有する対象に移植するときには、最初、その機能不全臓器を対象から少なくとも部分的に除き、その結果、移植片の最適な発達、および、対象の解剖学的構造／生理機能とのその構造的／機能的な一体化を可能にするようにすることが好都合である場合がある。
【００８８】
細胞移植片または組織移植片を本発明の教示に従って対象に移植した後では、標準的な医療実務によれば、臓器の成長、機能性および免疫適合性をこの技術分野における様々な標準的技術のいずれか１つに従ってモニターすることが望ましい。例えば、細胞または組織の構造的発達をコンピューター断層撮影法または超音波造影によりモニターすることができ、一方で、非同系の細胞移植片または骨時移植片の生着を、例えば、キメラ現象試験によって［例えば、短いタンデム反復（ＳＴＲ）分析を使用するＰＣＲに基づく手順によって］モニターすることができる。
【００８９】
移植片タイプにかかわらず、移植片拒絶および移植片対宿主病を避けるために、また、何らかの残存腫瘍細胞をなくすために、本発明の方法では、抗第三者Ｔｃｍ細胞が用いられる。
【００９０】
したがって、本発明の１つの局面によれば、対象には、治療効果的な量の、セントラルメモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を有する移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）非誘導性抗第三者細胞を含む細胞の単離された集団が投与され、ただし、この場合、細胞は寛容誘導細胞であり、かつ、移植後におけるリンパ節へのホーミングが可能である。
【００９１】
表現「細胞の単離された集団」は、本明細書中で使用される場合、それらの天然の環境（例えば、ヒト身体）から単離されている細胞を示す。
【００９２】
用語「非ＧＶＨＤ」は、本明細書中で使用される場合、移植片対宿主誘導活性を実質的に有しないことを示す。したがって、本発明の細胞は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を著しく生じさせることがないように作製される。
【００９３】
表現「抗第三者細胞」は、本明細書中で使用される場合、第三者抗原（単数または複数）に対して（例えば、Ｔ細胞認識によって）向けられるリンパ球（例えば、Ｔリンパ球）を示す。
【００９４】
本明細書中で使用される場合、表現「第三者抗原（単数または複数）」は、下記で詳しく示されるように、ドナーまたはレシピエントのどちらにも存在しない可溶性または非可溶性（例えば、膜結合型）の抗原（単数または複数）を示す。
【００９５】
１つの実施形態によれば、本発明の第三者抗原（単数または複数）は、第三者細胞、細胞抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、タンパク質抽出物、精製タンパク質、および、自己の提示細胞、非自己の提示細胞によって提示されるか、あるいは、人工ビヒクルまたは人工抗原提示細胞の表面に提示される合成ペプチドからなる群から選択される。
【００９６】
例えば、第三者抗原は、第三者細胞、ウイルス（例えば、エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）など）の抗原、細菌の抗原（例えば、フラジェリンなど）が可能である。ウイルスまたは細菌の抗原を、それに感染した細胞（例えば、細胞株）によって、または、そうでない場合にはウイルス／細菌タンパク質を発現させるために作製される細胞（例えば、細胞株）によって提示させることができる。自己または非自己の抗原提示細胞を、それに融合または負荷された短い合成ペプチドを提示するために使用することができる。そのような短いペプチドは、ウイルス由来のペプチド、または、何らかの他の抗原を表すペプチドであり得る。
【００９７】
専用のソフトウエアを、ウイルス配列または他の配列を分析して、免疫原性の短いペプチド（すなわち、クラスＩのＭＨＣまたはクラスＩＩのＭＨＣの状況で提示可能なペプチド）を特定するために使用することができる。
【００９８】
第三者細胞は、（下記でさらに詳しく説明される）レシピエントに関して同種または異種のどちらも可能である。同種の第三者細胞の場合、そのような細胞は、そのような細胞に対して作製された抗第三者細胞が移植片またはレシピエント抗原に対する反応性を有しないように、ドナーのＨＬＡ抗原とは異なるが、レシピエントのＨＬＡ抗原との交差反応性がないＨＬＡ抗原を有する。
【００９９】
本発明の１つの実施形態によれば、同種または異種の第三者細胞は刺激性細胞であり、例えば、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）、脾臓またはリンパ節、サイトカイン動員されたＰＢＬ、インビトロ拡大された抗原提示樹状細胞（ＡＰＣ）、Ｂ細胞株、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、人工ＡＰＣ（例えば、ＨＬＡおよび／または共刺激分子によりトランスフェクションされたＫ５６２細胞株）など）から精製される細胞などであり、しかし、これらに限定されない。
【０１００】
１つの実施形態によれば、第三者抗原（単数または複数）は樹状細胞を含む。
【０１０１】
第三者抗原を、細胞表面、ウイルス表面または細菌表面に提示させることができ、あるいは、それらから得ることができ、かつ／または精製することができる。加えて、ウイルス抗原、細菌抗原または何らかの外来抗原を感染細胞の表面に呈示させることができ、あるいは、人工ビヒクル（例えば、リポソームまたは人工ＡＰＣ（例えば、第三者抗原（単数または複数）によりトランスフェクションされた線維芽細胞または白血病細胞株）など）の表面に呈示させることができる。
【０１０２】
加えて、第三者抗原は、例えば、様々な供給源から抽出または精製されるタンパク質が可能である。本発明による第三者抗原として役立ち得る精製タンパク質の一例がオボアルブミンである。他の様々な例が想定される。
【０１０３】
細胞、ウイルス、細菌、ウイルス感染細胞、細菌感染細胞、ウイルスペプチド提示細胞または細菌ペプチド提示細胞を第三者抗原として利用することが特に好都合である。これは、そのような第三者抗原は多様な一連の抗原決定基を含み、かつ、そのようなものとして、多様な集団の抗第三者細胞の形成を導き、そして、この抗第三者細胞がさらに、Ｔ細胞のより早い再構成において、そのような再構成が要求される場合に、例えば、致死的または亜致死的な放射線照射手順または化学療法手順の後で役立ち得るからである。
【０１０４】
さらに、抗第三者細胞が第三者抗原に対して向けられるとき、ＬＦＡ１−ＩＣＡＭ１結合によって媒介されるＴＣＲ非依存的な殺傷に起因する少なくとも何らかの移植片対疾患（例えば、ガン細胞）活性（例えば、移植片による対白血病活性など）を得ることが好都合である［Ａｒｄｉｔｔｉ他、Ｂｌｏｏｄ（２００５）、１０５（８）：３３６５〜７１。Ｅｐｕｂ：２００４年７月６日］。
【０１０５】
いくつかの実施形態によれば、本発明の抗第三者細胞はセントラルメモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を含む。
【０１０６】
表現「セントラルメモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型」は、本明細書中で使用される場合、リンパ節に戻るＴ細胞傷害性細胞のサブセットを示す。Ｔｃｍ表現型を有する細胞はヒトにおいては、典型的には、ＣＤ８＋／ＣＤ６２Ｌ＋／ＣＤ４５ＲＯ＋／Ｌ−セレクチン＋／ＣＤ４５ＲＡ−を発現する。より具体的な実施形態によれば、Ｔｃｍ表現型はＣＤ８＋／ＣＤ６２Ｌ＋のシグナチャーを含む。Ｔｃｍ細胞はこれらのシグナチャーマーカーのすべてを１個の細胞において発現し得るか、または、これらのシグナチャーマーカーの一部のみを１個の細胞において発現し得ることが理解されるであろう。
【０１０７】
少なくとも、細胞の単離された集団の少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％が、Ｔｃｍ細胞シグナチャーを有する細胞を含むことが理解されるであろう。
【０１０８】
述べられたように、Ｔｃｍ細胞は典型的には、移植後、リンパ節に戻る。いくつかの実施形態によれば、本発明の抗第三者Ｔｃｍ細胞は、移植後、リンパ節のいずれかに戻ることができ、例えば、末梢リンパ節および腸間膜リンパ節のようなリンパ節に戻ることができる。これらの細胞のホーミング性により、これらの細胞はその寛容効果を迅速かつ効率的な様式で発揮することができる。
【０１０９】
したがって、本発明の抗第三者Ｔｃｍ細胞は寛容誘導細胞である。
【０１１０】
表現「寛容誘導細胞」は、本明細書中で使用される場合、レシピエントの細胞（例えば、レシピエントのＴ細胞）と接触したとき、その低下した応答性を誘発する細胞を示す。寛容誘導細胞には、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００１／０４９２４３および同第ＷＯ２００２／１０２９７１において以前に記載されたように、ｖｅｔｏ細胞（すなわち、宿主Ｔ細胞と接触したときに宿主Ｔ細胞のアポトーシスを引き起こすＴ細胞）が含まれる。
【０１１１】
寛容誘導細胞の使用は、移植片拒絶を排除し、かつ、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を克服することが求められている状況において、例えば、同種または異種の細胞または組織の移植などにおいて特に有益である。
【０１１２】
いくつかの実施形態によれば、本発明のＴｃｍ細胞はナイーブ細胞（例えば、遺伝子非改変）または遺伝子改変細胞（例えば、特定の遺伝子、マーカーもしくはペプチドを発現させるために、または発現させないために、あるいは、特定のサイトカインを分泌させるために、または分泌させないために遺伝子操作されている細胞）である場合がある。この技術分野で知られている方法はどれも、細胞を、例えば、関連遺伝子（単数または複数）の不活性化、または、ポリペプチド発現を妨害するアンチセンスＲＮＡの挿入によって遺伝子操作することにおいて実行することができる（例えば、国際公開ＷＯ／２０００／０３９２９４を参照のこと。これは本明細書により参照によって組み込まれる）。
【０１１３】
（移植片対宿主（ＧＶＨ）活性がない）抗第三者の同種非反応性細胞を作製するために使用される方法はどれも、本発明の教示に従って使用することができる。
【０１１４】
本発明の抗第三者Ｔｃｍ細胞は典型的には、最初、同系または非同系の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、サイトカインが除かれた培養（すなわち、サイトカインの添加が行われない培養）において第三者抗原（単数または複数）（例えば、上記で記載されるものなど）と接触させることによって作製される。この工程は典型的には、約１２時間〜７２時間、２４時間〜４８時間、１日間〜１０日間、１日間〜７日間、１日間〜５日間、２日間〜３日間または２日間にわたって行われ、ＧＶＨ反応性細胞（例えば、Ｔ細胞）の排除を可能にする。代替において、抗第三者Ｔｃｍ細胞は、他の場合にはサイトカイン非含有の培養にＩＬ−２１（０．００１ｎｇ／ｍｌ〜３０００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、または、１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ）を補充することによって、移植片対宿主（ＧＶＨ）活性がなく作製することができる。この工程は典型的には、約１２時間〜７２時間、２４時間〜４８時間、１日間〜１０日間、１日間〜７日間、１日間〜５日間、２日間〜３日間または３日間にわたって行われる。
【０１１５】
次に、抗第三者細胞は、ＩＬ−１５（０．０５ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌ、０．００１ｎｇ／ｍｌ〜３０００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、または、１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で培養される。具体的な実施形態によれば、濃度は、抗原非含有の環境において、約３日〜３０日、６日〜３０日、３日〜２０日、１０日〜２０日、３日〜１５日、５日〜１５日、７日〜１５日、７日〜１４日、３日〜１０日、３日〜７日、または、１４日の期間にわたって５ｎｇ／ｍｌである。培養はさらに、さらなるサイトカインの存在下で、例えば、ＩＬ−７（０．０５ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌ、０．００１ｎｇ／ｍｌ〜３０００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、または、１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ）などの存在下で行うことができる。具体的な実施形態によれば、濃度は５ｎｇ／ｍｌおよび／またはＩＬ−２１（０．００１ｎｇ／ｍｌ〜３０００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、または、２０ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ）である。具体的な実施形態によれば、濃度は３０ｎｇ／ｍｌである。このプロセスは、セントラルメモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を含み、かつ、ＧＶＨＤ活性が除かれる抗第三者細胞の増殖を可能にする。
【０１１６】
ＣＤ８＋Ｔ細胞の選択を可能にするさらなる工程が、細胞をＩＬ−１５の存在下で培養する前に、例えば、ＭＡＣＳビーズの使用などによって行われ得ることが理解されるであろう。そのような工程は、培養物内のＣＤ８＋細胞の純度を増大させるために（すなわち、細胞培養物内の他のリンパ球（例えば、Ｔ  ＣＤ４＋細胞）を排除するために）、または、ＣＤ８＋Ｔ細胞の数を増大させるために有益であり得る。したがって、ＣＤ８＋細胞の単離を、第三者抗原（単数または複数）との培養の前において、または、第三者抗原（単数または複数）との培養の後で、かつ、ＣＤ１５との培養の前において行うことができる。
【０１１７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、同系のＰＢＭＣ（例えば、対象から得られるＰＢＭＣ）を本発明の教示に従って使用することができる（すなわち、同系のＴｃｍ細胞が処置のために有益であり得る状況において使用することができる）。同様に、非同系のＰＢＭＣ（例えば、対象に関して同種または異種のＰＢＭＣ）を本発明の教示に従って使用することができる。ＰＢＭＣの供給源が、細胞の意図された使用に関して決定されるであろう（本明細書中下記のさらなる詳細を参照のこと）。また、ＰＢＭＣの供給源は、とりわけ、本明細書中に提供される詳細な開示に照らして、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１１８】
下記の実施例の節において詳しく記載されるように、本発明者らは、抗第三者Ｔｃｍ細胞が、細胞移植片または組織移植片（例えば、骨髄細胞）と同じ起源であってもよいことを示している。具体的には、それらはともに、同系ドナー（例えば、対象）に由来することができ（実施例２および図１Ａ〜図１Ｉを参照のこと）、または、それらはともに、非同系ドナー（例えば、同種の対象）に由来することができる（実施例４および図３Ａ〜図３Ｉを参照のこと）。逆に、抗第三者Ｔｃｍ細胞を、細胞移植片または組織移植片と比較して、異なる起源から得ることができる（例えば、骨髄細胞を対象から得ることができ、抗第三者細胞を同種ドナーから得ることができる。実施例３および図２〜図２Ｇ）。
【０１１９】
したがって、本発明の１つの実施形態によれば、抗第三者Ｔｃｍ細胞は対象および移植片の両方に関して非同系（例えば、同種または異種）であってもよい。
【０１２０】
本明細書中で使用される場合、表現「対象および移植片の両方に関して非同系」は、本発明の抗第三者Ｔｃｍ細胞に関するとき、抗第三者Ｔｃｍ細胞を、どのような組み合わせでも、対象に関して同種または異種であり、かつ、移植片に関して同種または異種であると見なす。したがって、抗第三者Ｔｃｍ細胞を、対象とは異なる起源から、また、移植片ドナーとは異なる起源から得ることができる。
【０１２１】
１つの具体的な実施形態によれば、抗第三者Ｔｃｍ細胞は対象および移植片の両方に関して非同系である（例えば、第２のドナーから得られる）。
【０１２２】
別の実施形態によれば、抗第三者Ｔｃｍ細胞は対象のみに関して非同系であり得る。別の実施形態によれば、抗第三者Ｔｃｍ細胞は、細胞移植片または組織移植片のみに関して非同系であり得る。
【０１２３】
１つの実施形態によれば、抗第三者Ｔｃｍ細胞は移植片に関して非同系であり、かつ、対象に関して同系である（例えば、移植片が非自己起源のものである状況では自己起源である）。
【０１２４】
１つの具体的な実施形態によれば、移植片が、対象に関して非同系である未成熟な造血細胞を含むとき（例えば、非自己由来であるとき）、細胞の単離された集団は対象に関して同系である（例えば、自己由来である）。
【０１２５】
本明細書中で使用される場合、用語「未成熟な造血細胞」は、単数または複数のタイプの完全に分化した造血細胞に分化することができる、任意のタイプの、完全に分化していない細胞を示す。未成熟な造血細胞には、限定されないが、「始原体細胞」、「前駆体細胞」、「幹細胞」、「多能性細胞」および「多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）細胞」などとしてこの技術分野で示される様々なタイプの細胞が含まれる。
【０１２６】
好ましくは、未成熟な造血細胞は造血幹細胞である。
【０１２７】
好ましくは、未成熟な造血細胞がヒトに由来する場合、未成熟な造血細胞はＣＤ３４＋の細胞であり、例えば、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋の細胞などである。
【０１２８】
未成熟な造血細胞を含む本発明の移植片のタイプには、全骨髄細胞の移植片（Ｔ細胞が枯渇化された移植片またはＴ細胞が枯渇化されていない移植片）、骨髄吸引物から得られる未成熟な造血細胞の移植片、末梢血由来の未成熟な造血細胞の移植片、および、臍帯血由来の未成熟な造血細胞の移植片が含まれる。そのような移植片を得る様々な方法が本明細書中下記に記載される。
【０１２９】
ヒト末梢血由来の造血幹細胞を含む移植片を、標準的な方法に従って、例えば、ＣＤ３４＋細胞をドナーのサイトカイン処置によって末梢血中に動員し、動員されたＣＤ３４＋細胞を白血球除去により集めることによって得ることができる。十分な指針が、骨髄または血液からの骨髄由来幹細胞の単離を実施するためにこの技術分野の文献において提供される（例えば、Ａｒａｉ  Ｓ．、Ｋｌｉｎｇｅｍａｎｎ  ＨＧ．、２００３、Ａｒｃｈ  Ｍｅｄ  Ｒｅｓ．、３４：５４５〜５３；Ｒｅｐｋａ  Ｔ．およびＷｅｉｓｄｏｒｆ  Ｄ．、１９９８、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．、１０：１１２〜７；Ｊａｎｓｓｅｎ  ＷＥ．他、１９９４、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｏｎｔｒｏｌ、１：２２５〜２３０；Ａｔｋｉｎｓｏｎ  Ｋ．、１９９９、Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｐａｔｈｏｌ．、９２：１０７〜３６を参照されたい）。
【０１３０】
ヒト臍帯血由来造血幹細胞の移植片を標準的な方法に従って得ることができる（例えば、Ｑｕｉｌｌｅｎ  Ｋ、Ｂｅｒｋｍａｎ  ＥＭ．、１９９６、Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ、５：１５３〜５を参照されたい）。
【０１３１】
本発明の造血幹細胞の移植片はまた、肝臓組織または卵黄嚢に由来することができる。
【０１３２】
必要数の造血幹細胞を初代造血幹細胞のエクスビボ拡大によって提供することができる（これは、Ｅｍｅｒｓｏｎ、１９９６、Ｂｌｏｏｄ、８７：３０８２に総説され、より詳しくは、Ｐｅｔｚｅｒ他、１９９６、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．、３：１４７０；Ｚｕｎｄｓｔｒａ他、１９９４、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１２：９０９；および国際公開ＷＯ９５／１１６９２に記載される）。別の具体的な実施形態によれば、移植片が、対象に関して非同系である未成熟な造血細胞を含むとき（例えば、非自己由来であるとき）、細胞の単離された集団は、対象と、移植片との両方に関して非同系である（例えば、未成熟な造血細胞と、細胞の単離された集団とが、異なるドナーから得られる）。
【０１３３】
本発明の別の実施形態の一局面によれば、疾患をその必要性のある対象において処置する方法であって、（ａ）未成熟な造血細胞を前記対象に移植すること、および（ｂ）治療効果的な量の、セントラルメモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を有する移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）非誘導性抗第三者細胞を含む細胞の単離された集団を前記対象に投与すること（ただし、前記細胞は寛容誘導細胞であり、かつ、移植後におけるリンパ節へのホーミングが可能である）を含み、前記未成熟な造血細胞が前記対象に関して同系であるとき、前記細胞の単離された集団は、前記対象に関して同系であるように、または、前記対象に関して非同系であるように選択される、方法が提供される。
【０１３４】
１つの具体的な実施形態によれば、未成熟な造血細胞と、細胞の単離された集団との両方が自己由来である（例えば、対象から得られる）。
【０１３５】
別の具体的な実施形態によれば、未成熟な造血細胞が自己由来であり（例えば、対象から得られ）、細胞の単離された集団が非自己由来である（例えば、ドナーから得られる）。
【０１３６】
本発明の別の実施形態の一局面によれば、疾患をその必要性のある対象において処置する方法であって、（ａ）未成熟な造血細胞を前記対象に移植すること、および（ｂ）治療効果的な量の、セントラルメモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を有する移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）非誘導性抗第三者細胞を含む細胞の単離された集団を前記対象に投与すること（ただし、前記細胞は寛容誘導細胞であり、かつ、移植後におけるリンパ節へのホーミングが可能である）を含み、前記未成熟な造血細胞が前記対象に関して非同系であるとき、前記細胞の単離された集団は、前記対象に関して同系であるように、または、前記対象および前記未成熟な造血細胞の両方に関して非同系であるように選択される、方法が提供される。
【０１３７】
１つの具体的な実施形態によれば、未成熟な造血細胞が非自己由来であり（例えば、ドナーから得られ）、細胞の単離された集団が自己由来である（例えば、対象から得られる）。
【０１３８】
別の実施形態によれば、未成熟な造血細胞が対象に関して非同系であるとき（例えば、非自己由来であるとき）、抗第三者Ｔｃｍ細胞は対象および移植片の両方に関して非同系である（例えば、２つの異なるドナーから得られる）。
【０１３９】
１つの具体的な実施形態によれば、未成熟な造血細胞と、細胞の単離された集団とが、異なるドナーから得られる。
【０１４０】
本発明の追加の局面によれば、セントラルメモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を有する移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）非誘導性抗第三者細胞を含む細胞の単離された集団が提供され、ただし、前記細胞は寛容誘導細胞であり、かつ、移植後におけるリンパ節へのホーミングが可能であり、さらに前記細胞は、対象および細胞移植片もしくは組織移植片の両方に対して非同系であり、前記細胞は、（ｉ）前記宿主対象および前記移植片の両方に関して非同系であるか、または、（ｉｉ）前記移植片に関して非同系であり、かつ、前記宿主対象に関して同系であるかのどちらかである。
【０１４１】
１つの実施形態によれば、移植片に関して非同系であり、かつ、宿主対象に関して同系である細胞は自己由来である。
【０１４２】
したがって、本発明では、どのような抗第三者Ｔｃｍ細胞であれ、疾患（例えば、白血病またはリンパ腫）の根絶をもたらすことになり、また、寛容原性かつ非ＧＶＨＤ性であることによって細胞移植片または組織移植片（例えば、自己由来または非自己由来の骨髄細胞）の生着を同時に高めることになる抗第三者Ｔｃｍ細胞（例えば、対象および移植片の両方に関して非同系である抗第三者Ｔｃｍ細胞、または、移植片に関して非同系であり、かつ、対象に関して同系である抗第三者Ｔｃｍ細胞）の対象への投与が意図される。
【０１４３】
抗第三者細胞が、（例えば、補助治療として）細胞移植片または組織移植片と同時に投与され得ること、あるいは、（例えば、残存ガン細胞を移植前に根絶するために、また、移植片拒絶および移植片対宿主病を排除するために）細胞移植片または組織移植片の移植に先立って投与され得ること、あるいは、（例えば、残存ガン細胞を移植後に根絶するために、また、移植片拒絶および移植片対宿主病を排除するために）細胞移植片または組織移植片の移植の後で投与され得ることが理解されるであろう。
【０１４４】
抗第三者細胞が移植後の任意の時間で投与され得ることが理解されるであろう。典型的には、抗第三者Ｔｃｍ細胞は、移植後の０日目、１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、７日目、８日目または１０日目に投与される。しかしながら、抗第三者Ｔｃｍ細胞は、移植後の長期間にわたって、例えば、移植後の２週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１８ヶ月または２４ヶ月のような移植後の長期間にわたって投与される場合がある。
【０１４５】
抗第三者Ｔｃｍ細胞は、細胞移植のためにこの技術分野で知られているどのような方法によってでも、例えば、限定されないが、細胞注入（例えば、Ｉ．Ｖ．）などにより、または、腹腔内経路により投与することができる。
【０１４６】
理論にとらわれないが、治療効果的な量は、ＧＶＨＤを誘導することなく、寛容化、抗腫瘍効果および／または免疫再構成のために効率的な抗第三者Ｔｃｍ細胞の量である。本発明のＴｃｍ細胞は移植後にリンパ節に戻るので、（以前に使用された細胞の用量（例えば、国際公開ＷＯ２００１／０４９２４３を参照のこと）と比較して）より少ない量の細胞が、細胞の有益な効果（例えば、寛容化、抗腫瘍効果および／または免疫再構成）を達成するために必要とされるかもしれない。より低いレベルの免疫抑制薬物が本発明のＴｃｍ細胞との併用で必要とされるかもしれないこと（例えば、治療プロトコルからのラパマイシンの除外など）が理解されるであろう。
【０１４７】
治療効果的な量を決定することは、とりわけ、本明細書中に提供される詳細な開示に照らして、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１４８】
本発明の方法において使用されるどのような調製物についても、治療効果的な量または用量を、最初はインビトロアッセイおよび細胞培養アッセイから推定することができる。例えば、用量を、所望される濃度または力価を達成するために動物モデルにおいて定めることができる。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。
【０１４９】
例えば、組織移植片の場合には、レシピエントに注入される抗第三者Ｔｃｍ細胞の数は１×１０４個／Ｋｇ体重よりも多くなければならない。レシピエントに注入される抗第三者Ｔｃｍ細胞の数は典型的には、１×１０４個／Ｋｇ体重〜１×１０９個／Ｋｇ体重の範囲でなければならない。
【０１５０】
細胞移植片または組織移植片の生着を促進させるために、方法はさらに、好都合には、対象を、細胞移植片または組織移植片の移植の前に、あるいは、細胞移植片または組織移植片の移植と同時に、あるいは、細胞移植片または組織移植片の移植の後で免疫抑制療法により状態調節することを含むことができる。
【０１５１】
したがって、本発明の１つの実施形態によれば、対象は、細胞移植片または組織移植片の移植の前に、亜致死的、致死的または超致死量的な条件のもとで状態調節される。
【０１５２】
例えば、対象を、骨髄機能破壊的（ｍｙｅｌｏａｂｌａｔｉｖｅ）または骨髄機能非破壊的な状態調節により処置することができる。状態調節のタイプは当業者によって決定することができ、状態調節のタイプでは、対象の年齢および疾患重篤度が考慮に入れられる。したがって、例えば、高齢の対象（例えば、４０歳を超える対象）は穏和な免疫抑制療法により処置することができる。
【０１５３】
好適なタイプの免疫抑制療法の例には、免疫抑制薬物、寛容誘導細胞集団（本明細書中上記で詳しく記載されるようなもの）および／または免疫抑制放射線照射を施すことが含まれる。
【０１５４】
移植のための好適な免疫抑制療法を選択し、施すための十分な指針がこの技術分野の文献において提供される（例えば、下記を参照されたい：Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ  ＣＨ．およびＲｏｗｌａｎｄｓ  ＤＴ  Ｊｒ．、１９９２、ＪＡＭＡ．、２６８、２９５２；Ｈｉｇｉｎｓ  ＲＭ．他、１９９６、Ｌａｎｃｅｔ、３４８、１２０８；Ｓｕｔｈａｎｔｈｉｒａｎ  Ｍ．およびＳｔｒｏｍ  ＴＢ．、１９９６、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．、３３１、３６５；Ｍｉｄｔｈｕｎ  ＤＥ．他、１９９７、Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒｏｃ．、７２、１７５；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＶＡ．他、１９９４、Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ．、９７、１４；Ｈａｎｔｏ  ＤＷ．、１９９５、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｅｄ．、４６、３８１；Ｓｅｎｄｅｒｏｗｉｃｚ  ＡＭ．他、１９９７、Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ．、１２６、８８２；Ｖｉｎｃｅｎｔｉ  Ｆ．他、１９９８、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．、３３８、１６１；Ｄａｎｔａｌ  Ｊ．他、１９９８、Ｌａｎｃｅｔ、３５１、６２３）。
【０１５５】
好ましくは、免疫抑制療法は、少なくとも１つの免疫抑制剤を対象に投与することからなる。
【０１５６】
免疫抑制剤の例には、メトトレキサート、シクロホスファミド、シクロスポリン、シクロスポリンＡ、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン（スルファサラゾピリン）、金塩、Ｄ−ペニシラミン、レフルノミド、アザチオプリン、アナキンラ、インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ）、エタネルセプト、ＴＮＦ．アルファ．遮断剤、炎症性サイトカインを標的とする生物学的薬剤、および、非ステロイド系抗炎症性薬物（ＮＳＡＩＤ）が含まれるが、これらに限定されない。ＮＳＡＩＤの例には、アセチルサリチル酸、サリチル酸コリンマグネシウム、ジフルニサル、サリチル酸マグネシウム、サルサラート、サリチル酸ナトリウム、ジクロフェナク、エトドラク、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラク、メクロフェナマート、ナプロキセン、ナブメトン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スリンダク、トルメチン、アセトアミノフェン、イブプロフェン、Ｃｏｘ−２阻害剤、トラマドール、ラパマイシン（シロリムス）およびラパマイシンアナログ（例えば、ＣＣＩ−７７９、ＲＡＤ００１、ＡＰ２３５７３）が含まれるが、これらに限定されない。これらの薬剤は個々に投与することができ、または、組み合わせて投与することができる。
【０１５７】
本明細書中で使用される用語「約」は、±１０％を示す。
【０１５８】
用語「含む／備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、およびそれらの同根語は、「含むが、それらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」ことを意味する。
【０１５９】
用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、「含み、それらに限定される（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」ことを意味する。
【０１６０】
表現「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、さらなる成分、工程および／または部分が、主張される組成物、方法または構造の基本的かつ新規な特徴を実質的に変化させない場合にだけ、組成物、方法または構造がさらなる成分、工程および／または部分を含み得ることを意味する。
【０１６１】
本明細書中で使用される場合、単数形態（「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」）は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の参照物を包含する。例えば、用語「化合物（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または用語「少なくとも１つの化合物」は、その混合物を含めて、複数の化合物を包含し得る。
【０１６２】
本開示を通して、本発明の様々な態様が範囲形式で提示され得る。範囲形式での記載は単に便宜上および簡潔化のためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈すべきでないことを理解しなければならない。従って、範囲の記載は、具体的に開示された可能なすべての部分範囲、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値を有すると見なさなければならない。例えば、１〜６などの範囲の記載は、具体的に開示された部分範囲（例えば、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６など）、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値（例えば、１、２、３、４、５および６）を有すると見なさなければならない。このことは、範囲の広さにかかわらず、適用される。
【０１６３】
数値範囲が本明細書中で示される場合には常に、示された範囲に含まれる任意の言及された数字（分数または整数）を含むことが意味される。第１の示された数字および第２の示された数字「の範囲である／の間の範囲」という表現、および、第１の示された数字「から」第２の示された数「まで及ぶ／までの範囲」という表現は、交換可能に使用され、第１の示された数字と、第２の示された数字と、その間のすべての分数および整数とを含むことが意味される。
【０１６４】
本明細書中で使用される用語「方法（ｍｅｔｈｏｄ）」は、所与の課題を達成するための様式、手段、技術および手順を示し、これには、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者に知られているそのような様式、手段、技術および手順、または、知られている様式、手段、技術および手順から、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者によって容易に開発されるそのような様式、手段、技術および手順が含まれるが、それらに限定されない。
【０１６５】
明確にするため別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴が、単一の実施形態に組み合わせて提供されることもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施形態で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで、あるいは本発明の他の記載される実施形態において好適なように提供することもできる。種々の実施形態の文脈において記載される特定の特徴は、その実施形態がそれらの要素なしに動作不能である場合を除いては、それらの実施形態の不可欠な特徴であると見なされるべきではない。
【０１６６】
本明細書中上記に描かれるような、および、下記の請求項の節において特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、実験的裏付けが下記の実施例において見出される。
【実施例】
【０１６７】
次に下記の実施例が参照されるが、下記の実施例は、上記の説明と一緒に、本発明のいくつかの実施形態を非限定様式で例示する。
【０１６８】
一般に、本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学および組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技術は文献に詳細に説明されている。例えば以下の諸文献を参照されたい：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、米国メリーランド州バルチモア（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、米国ニューヨーク（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク（１９９８）；米国特許の第４６６６８２８号、同第４６８３２０２号、同第４８０１５３１号、同第５１９２６５９号および同第５２７２０５７号に記載される方法；「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら編「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、米国ニューヨーク（１９８０）；利用可能な免疫アッセイ法は、特許と科学文献に広範囲にわたって記載されており、例えば：米国特許の第３７９１９３２号、同第３８３９１５３号、同第３８５０７５２号、同第３８５０５７８号、同第３８５３９８７号、同第３８６７５１７号、同第３８７９２６２号、同第３９０１６５４号、同第３９３５０７４号、同第３９８４５３３号、同第３９９６３４５号、同第４０３４０７４号、同第４０９８８７６号、同第４８７９２１９号、同第５０１１７７１号および同第５２８１５２１号；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌ���ｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．（１９８４）および「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；これらの文献の全ては、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである。その他の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。それらの文献に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。それらの文献に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【０１６９】
一般的な材料および実験手順
動物
メスの６週齢〜１２週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス、ＣＢ６（Ｆ１）マウス、ＦＶＢマウス、Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＢＡＬＢ／ｃ−ＮＵＤＥマウスを、Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得た。Ｂ６−ＮＵＤＥマウスの子孫が、Ｗｅｉｚｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｎｔｅｒにおいて交配された。すべてのマウスが小ケージで保たれ（各ケージにおいて５匹の動物）、無菌の餌および酸性水が与えられた。すべての研究が、Ｗｅｉｚｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅの施設内実験動物委員会によって承認された。
【０１７０】
細胞
Ａ２０マウスリンパ腫細胞株、すなわち、ＢＡＬｂ／ｃ（Ｈ−２ｄ）由来のＢ細胞リンパ腫／白血病株（これは以前に記載された［Ｋｉｍ  ＫＪ他、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７９）、１２２：５４９〜５５４］）と、Ａ２０の安定トランスフェクタント、すなわち、Ａ２０ｙｆｐ／ｌｕｃ＋（これは以前に記載された［Ｅｄｉｎｇｅｒ  Ｍ他、Ｂｌｏｏｄ（２００３）、１０１：６４０〜６４８］）とをともに、５％のＦＣＳ、２ｍＭのグルタミン、非必須アミノ酸、抗生物質および５０μＭの２−メルカプトエタノールが補充されるＲＰＭＩ１６４０培地で維持した。
【０１７１】
宿主非反応性抗第三者Ｔｃｍの調製
抗第三者Ｔｃｍを以前の記載［Ｏｐｈｉｒ  Ｅ．他、Ｂｌｏｏｄ（２０１０）、１１５：２０９５〜２１０４］のように調製した。簡単に記載すると、ドナーマウスの脾臓細胞を、放射線照射された第三者脾臓細胞に対して、サイトカイン欠如のもとで６０時間培養した。続いて、ＣＤ８＋細胞を、磁石粒子（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用して陽性選択し、Ａｇ非含有環境で培養した。ｒｈＩＬ−１５（２０ｎｇ／ｍＬ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を１日おきに加えた。精製された集団を培養終了時（１６日目）に得るために、Ｔｃｍ細胞を磁気活性化細胞分取［ＭＡＣＳ、Ｍｉｌｔｅｎｙ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ］によってＣＤ６２Ｌ発現について陽性選択した。
【０１７２】
フローサイトメトリー分析
蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）分析を、改変されたＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳｃａｎを使用して行った。細胞をＣＤ８に対して特異的な各種標識抗体により染色した−フィコエリトリン（ＰＥ）／フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）／アロフィコシアニン（ＡＰＣ）（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、カルセインＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，ＩＮＣ．、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、米国）。アネキシンＶ染色および７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ）染色を製造者の説明書（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に従って行った。
【０１７３】
ＭＬＲ培養および細胞毒性アッセイ
抗第三者Ｔｃｍ細胞およびリンパ腫細胞をＦｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離によって得て、リンパ腫細胞を製造者の説明書に従って０．１５μｇ／ｍｌのカルセインＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，ＩＮＣ．、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、米国）により標識し、要求された培地において１×１０６細胞／ｍｌの濃度にした。３×１０５個のリンパ腫細胞を２４ウエルプレートのための示された比率および時間間隔に従って抗第三者ＣＴＬとインキュベーションした。細胞を回収し、表面マーカー（例えば、アネキシン−Ｖ（ＢＤ）など）を使用して、また、カルセインＡＭ染色のリンパ腫細胞の数をＦＡＣＳにより測定することによって生存について分析した。
【０１７４】
アネキシンＶ染色によるアポトーシスの検出
アネキシンＶ  ＡＰＣを使用して、アポトーシス細胞を検出した。インビトロ培養物からのサンプルを、異なる蛍光団により標識される選択されたモノクローナル抗体の混合物と４℃で２０分間インキュベーションした。結合していないフリーの抗体を、アネキシンＶ結合緩衝液を使用して洗い流した後、サンプルに５μｌのアネキシンＶ−ＡＰＣ（ＢＤ）を加えた。その後、細胞を暗所において室温で１５分間インキュベーションし、アネキシンＶ結合緩衝液により洗浄した。サンプルを、アネキシンＶにより陽性染色される生細胞についてＦＡＣＳによって分析した。
【０１７５】
微小残存病変インビボモデル
１２週齢のＢＡＬＢ／ｃのメスのレシピエントマウスをＧａｍｍａビーム１５０−Ａの６０Ｃｏ線源（Ａｔｏｍｉｃ  Ｅｎｅｒｇｙ  ｏｆ  Ｃａｎａｄａ、Ｋａｎａｔａ、ＯＮ、カナダ）からの８Ｇｙの全身照射（ＴＢＩ）の単回線量にさらした（１日前）。翌日（０日目）、レシピエントマウスに、マウスあたり５×１０３個のＡ２０ｌｕｃリンパ腫細胞が加えられる、ＢＡＬｂ／ｃ−Ｎｕｄｅマウス（同系）から得られる３×１０６個のＴ細胞枯渇化骨髄、または、Ｂ６−Ｎｕｄｅマウスから得られる３×１０６個のＴ細胞枯渇化骨髄を静脈内に注入した。その翌日（１日目）、マウスは１０×１０６個のＢＡＬＢ／ｃ由来の抗第三者Ｔｃｍ（同系）または５×１０６個のＣ５７ＢＬ／６由来の抗第三者Ｔｃｍ（同種）を静脈内に受けたか、あるいは受けなかった。腫瘍局在化、Ａ２０細胞の移動パターンおよび抗第三者ＣＴＬの抗リンパ腫反応性を、インビボ画像化システムを使用して調べた。
【０１７６】
インビボ画像化
マウスをケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ、腹腔内（ｉ．ｐ））（Ｋｅｐｒｏ  Ｈｏｌａｎｄ、オランダ）およびキシラジン（Ｋｅｐｒｏ  Ｈｏｌａｎｄ、オランダ）（２０ｍｇ／Ｋｇ  ｉ．ｐ）により麻酔し、Ｄルシフェリンの水溶液（１５０ｍｇ／Ｋｇ  ｉ．ｐ）（カタログ番号：ＸＲ−１００１、ＰＢＳにおける３０ｍｇ／ｍｌ；Ｘｅｎｏｇｅｎ）を画像化の１０分前に注射した。動物を、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（Ｗｅｉｚｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）において、Ｐｉｘｅｌｆｌｙ  ＱＥ（ＰＣＯ，Ｋ、ドイツ）電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラとつながれたインビボ画像化システム（ＩＶＩＳ（登録商標）１００、Ｘｅｎｏｇｅｎ）の遮光チャンバーに入れた。グレースケールの身体表面参照画像（デジタル写真）を、強照明下、１０秒間の暴露の後で得た。画像データの処理および分析を、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ２．５ソフトウエアを使用して行った。マウスを１４日目から１週間間隔で腫瘍成長についてモニターした。
【０１７７】
統計学的分析
生存データの分析を、カプラン・マイヤー曲線（ログランク検定）を使用して行った。平均の比較を、スチューデントｔ検定を使用して行った。
【０１７８】
実施例１
マウスモデルの確立
適切なマウスモデルを確立するために、本発明者らは最初に、（Ｂ６×ＢＡＬＢ／Ｃ）Ｆ１に由来する抗第三者Ｔｃｍ細胞がＢＡＬＢ／ｃ起源のＡ２０リンパ腫細胞のＴＣＲ非依存的殺傷を示すことを確認した（Ｔｃｍ非存在下でインキュベーションされたＡ２０との比較で４回の実験において３４．８±１２．１％、５：１のＴｃｍ／リンパ腫細胞比、ｐ＜０．０５）。そのうえ、Ｔｃｍ細胞との１６時間のインキュベーションの後において、Ａ２０細胞のアネキシンＶ染色が、基底的染色レベルと比較して有意に高まった（３回の実験においてそれぞれ、１４．８±４．５％および５．２±２．２％、ｐ＜０．０５）。このことから、ヒトリンパ腫細胞の殺傷について以前に記載される機構［Ｌａｓｋ  Ａ他（２０１０年投稿）；Ａｒｄｉｔｔｉ  ＦＤ他、Ｂｌｏｏｄ（２００５）、１０５：３３６５〜３３７１］と類似する、アポトーシスに基づく機構が示唆される。
【０１７９】
実施例２
同系の骨髄移植片およびＴｃｍ細胞による処置プロトコル
ルシフェラーゼを発現するＡ２０細胞を使用して、本発明者らは、悪性細胞の運命をインビボで追跡することができ、また、同系または同種のどちらかの骨髄移植（ＢＭＴ、下記）に対する加えられたドナー抗第三者Ｔｃｍの抗リンパ腫効果を、微小残存病変を模擬するモデルにおいて研究することができた。同系モデルにおいて、３×１０６個のＮｕｄｅ  ＢＡＬＢ／ｃ  ＢＭ細胞を、致死的放射線照射を受けたＢＡＬＢ／ｃマウスに、５０００個のＡ２０細胞と一緒に移植した。翌日、同系Ｔｃｍを注入した。図１Ａ〜図１Ｄにおいて認められ得るように、非処置マウスのどれもが骨髄移植（ＢＭＴ）後１００日で生存していなかった（０／７）（２３日のメジアン生存）。しかしながら、１×１０７個または２×１０７個の同系Ｔｃｍ細胞の投与は、有意に低下した腫瘍負荷量をもたらし（図１Ｅ〜図１Ｈ）、また、ＢＭＴ後１００日でのマウスの２８％（２／７、Ｐ＜０．０００１）およびマウスの４０％（２／５、Ｐ＜０．００２）の改善された全生存を４９日および８０日のメジアン生存とともにそれぞれもたらした（図１Ｉ）。
【０１８０】
実施例３
同系骨髄移植片および同種Ｔｃｍ細胞による処置プロトコル
本発明者らの実験室で行われたより初期の研究［Ｏｐｈｉｒ  Ｅ．他、Ｂｌｏｏｄ（２０１０）、１１５：２０９５〜２１０４］では、抗第三者Ｔｃｍ細胞には、部分的に一致したドナーを使用するときでさえ、寛容化活性（これはＢＭＴ後の長期持続につながる）があることが示された。したがって、本発明者らは、以前に投与された同系Ｔｃｍ細胞に取って代わる２×１０７個のＦ１（ＣＢ６）由来Ｔｃｍ細胞の抗リンパ腫効果を上記の同系ＢＭＴモデルにおいて調べた。これらのＦ１由来Ｔｃｍ細胞は、ＭＨＣ不一致のために拒絶されることが予想されたが、移植後２ヶ月でさえ存在し続けており、拒絶されなかった（データは示されず）。それらの長期持続はおそらくは、上記で記載されるそれらの寛容化活性の結果であった。これらのＦ１由来Ｔｃｍ細胞の著しい臨床効果が、非処置群における０％のマウス生存（０／５、図２Ａ〜図２Ｃおよび図２Ｇ）との比較で、５７．１％のマウスの改善された全生存（４／７、図２Ｄ〜図２Ｇ）によって明らかにされた。したがって、これらの結果は、抗第三者Ｔｃｍ細胞が、同種ドナーに由来する場合、単独または骨髄細胞との組み合わせのどちらにおいても、抗Ｂ細胞悪性細胞治療として使用され得ることを決定的に明らかにしている。
【０１８１】
実施例４
同種骨髄移植片および同種Ｔｃｍ細胞による処置プロトコル
同種状況で調べられたとき、腫瘍根絶のさらなる改善が示された。この効果はおそらくは、新しく発見されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）非依存的な細胞殺傷を上回るさらなる移植片対白血病／リンパ腫（ＧＶＬ）効果をもたらした残存する同種反応性のためであった。重要なことに、この付加的効果が、ＧＶＨＤを生じさせることなく達成された。この同種モデルにおいて、３×１０６個の同種Ｎｕｄｅ  Ｂ６  ＢＭ細胞を、致死的放射線照射を受けたＢＡＬＢ／ｃマウスに、５０００個のＡ２０細胞と一緒に移植した。翌日、マウスをドナー型Ｔｃｍにより処置した。（上記の実施例２および実施例３において記載される）同系モデルにおける結果と同様に、非処置マウスのどれもがＢＭＴ後１００日で生存しておらず（０／８、２３日のメジアン生存、図３Ａ〜図３Ｄおよび図３Ｉ）、一方で、５×１０６個のドナー型Ｔｃｍ細胞の投与は、ＢＭＴ後１００日での１００％（７／７）の顕著な全生存をもたらした（図３Ｅ〜図３Ｉ）。同種Ｔｃｍ細胞は、同系Ｔｃｍ細胞と比較して、高まったＧＶＬ活性を示したが、この効果には、ＧＶＨＤの症状発現が何ら伴っていなかった。したがって、以前に記載されたように、同種の抗第三者Ｔｃｍ細胞を受けるマウスの体重および全体的外観は、Ｎｕｄｅ  ＢＭだけの移植片により放射線保護されたコントロール群におけるマウスのものと同じであった。
【０１８２】
まとめると、本発明者らは、インビボ画像化によって、マウスの抗第三者ＴｃｍのＧＶＬ反応性を初めて明らかにした。これらの結果は、抗第三者Ｔｃｍ細胞が、両方のＢＭ生着を促すことによって、また、同時に、ＧＶＬ反応性を、ＧＶＨＤを生じさせることなく誘導することによって「二重の支持効果」をもたらし得ることを示唆する。そのような細胞治療は、Ｂ−ＣＬＬおよび他のＢ細胞悪性腫瘍を有する高齢患者で、攻撃的な状態調節に耐えられないかもしれない高齢患者については特に、非常に魅力的であり、また、潜在的には、抗ガン細胞治療として使用されるために、「棚から取り出される」容易に利用可能な製造物に開発されることが可能である。
【０１８３】
実施例５
抗第三者Ｔセントラルメモリー細胞の作製
材料および実験手順
ナイーブＣＤ８＋  Ｔ細胞の濃縮
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、健康なドナーから得られる軟膜のＦｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離によって得た。その後、ドナーのＰＢＭＣを１０％ＤＭＳＯの凍結用溶液に移し、液体窒素中で凍結保存した。
【０１８４】
２日前：ドナーの凍結ＰＢＭＣを３７℃の水浴で急速解凍し、暖かい解凍用培地（１０％ヒト血清と、細胞を染色することの結果としての細胞凝集塊の形成を避けるためにＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼが補充されるＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ培地とが補充されるＣｅｌｌｇｒｏ  ＤＣ）に移した。解凍されたドナーＰＢＭＣを暖かい解凍用培地により２回洗浄した。接着性細胞を枯渇化するために、ドナーＰＢＭＣをその後、培養培地（５％ヒト血清およびＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐおよび１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７が補充されるＣｅｌｌｇｒｏ  ＤＣ）に再懸濁し、３７℃での一晩のインキュベーションのための特別に被覆された６ウエルプレートに置床した。
【０１８５】
１日前：非接着性細胞を取り出した（このプロセスは、接着した単球を除くことによって、所望されるＴ細胞の濃度を増大させ、加えて、解凍された細胞が、磁気濃縮プロセスに供される前に解凍プロセスから回復することを可能にした）。
【０１８６】
０日目：損なわれていないＣＤ８＋Ｔ細胞を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉから得られるＣＤ８単離キットを製造者のプロトコルに従って使用して単離した。その後、ナイーブ表現型を有するＣＤ８  Ｔ細胞を、活性化マーカーＣＤ４５ＲＯを発現する細胞を、ＣＤ４５ＲＯ磁石ビーズを使用して枯渇化することによって総ＣＤ８集団から得た。
【０１８７】
単球由来樹状細胞（ＤＣ）の作製
単球由来ＤＣを同種の凍結保存ＰＢＭＣから作製した。単球をプラスチック接着によってＰＢＭＣから濃縮し、３日間にわたってＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４において培養した。成熟化をＬＰＳおよびＩＦＮ−γの添加により培養の最後の２４時間にわたって誘導した。
【０１８８】
抗第三者Ｔｃｍ細胞（単球由来ＤＣを標的とするナイーブＣＤ８  Ｔ細胞）の作製
ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＩＬ−２１が補充される培養培地（５％ヒト血清およびＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐが補充されるＣｅｌｌｇｒｏ  ＤＣ）において３日間、１：０．２５の比率で、放射線照射（３０ｇｙ）の単球由来ＤＣにより活性化した。その後、ＣＤ８＋Ｔ細胞はさらなる活性化を何ら受けず、１２日目まで、ＩＬ−７およびＩＬ−１５とともに成長させられた。
【０１８９】
結果
培養の１１日目に、細胞組成および細胞表現型を、ＦＡＣＳ分析を使用して評価し、細胞数をトリパンブルー排除によって求めた。結果は、細胞組成（リンホゲート（Ｌｙｍｐｈｏｇａｔｅ）から、データは示されず）が主に、９４．６％のＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ８＋）から構成され、１．２％のＣＤ５６＋ＮＫ細胞（ＣＤ３−ＣＤ５６＋）および１．１％のＮＫ  Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ５６＋）の微量物を伴うことを示した。さらに、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、主として７６％のＴｃｍ細胞、９％のナイーブ細胞、８．５％のＴｅｆｆ／Ｔｅｍ、および、６．５％のＴｅｍｒａから構成された。
【０１９０】
実施例６
Ｔｃｍの移植片対白血病（ＧＶＬ）アッセイ
材料および実験手順
ＧＶＬアッセイ
Ｂ細胞株を、製造者の説明書に従って、０．１５μｇ／ｍｌのカルセインＡＭ（細胞死のときに放出される生体染色色素）により標識した。次に、０．３×１０６個のカルセイン標識された細胞株を、１．５×１０６個の抗第三者Ｔｃｍの存在下または非存在下で、２４ウエルプレートにおいて２２時間インキュベーションした。外因性サイトカインをＭＬＲに加えなかった。２２時間後、細胞を回収し、生存するカルセイン染色細胞の数をＦＡＣＳにより測定することによって生存について分析した。
【０１９１】
細胞の絶対値を得るために、サンプルを一定の体積で懸濁し、それぞれのサンプルについてのフローサイトメトリーのカウント数を一定の所定の期間中に得て、一定体積および一定数の投入細胞により得られるフローサイトメトリーのカウント数と比較した。
【０１９２】
アポトーシスの検出
アネキシンＶ染色によるアポトーシスの検出のために、サンプルを５μｌのアネキシンＶ−ＡＰＣ（ＢＤ）と室温で１０分間インキュベーションした。続いて、結合していないアネキシンＶを洗い流し、サンプルをＦＡＣＳによって分析した。
【０１９３】
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。
【０１９４】
本明細書で挙げた刊行物、特許および特許出願はすべて、個々の刊行物、特許および特許出願が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。節の見出しが使用されている程度まで、それらは必ずしも限定であると解釈されるべきではない。
【図１Ａ−１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図２Ａ−２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図３Ａ−３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図４Ａ−４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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