(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａｂｌ遺伝子の多型を検出するためのプローブであって、下記P1の蛍光標識オリゴヌクレオチドからなることを特徴とする多型検出用プローブ。
（P1）配列番号９に示す塩基配列からなる、３’末端が蛍光色素で標識されている、オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、且つ標的配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少するかまたは増加する、請求項１記載のプローブ。
【請求項３】
前記蛍光標識オリゴヌクレオチドが、標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、標的配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少する、請求項２記載のプローブ。
【請求項４】
前記プローブが、融解曲線分析用のプローブである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項５】
ａｂｌ遺伝子における多型の検出方法であって、請求項１〜４のいずれか一項に記載のプローブを用いることを特徴とする方法。
【請求項６】
ａｂｌ遺伝子における多型の検出方法であって、下記工程（Ｉ）〜（IＶ）を含むことを
特徴とする方法。
（Ｉ）ＤＮＡを含有する試料に、請求項１〜４のいずれか一項に記載のプローブを添加して前記ＤＮＡに前記プローブをハイブリダイズさせる工程、
（ＩＩ）温度を変化させて前記ＤＮＡと前記プローブとのハイブリッド形成体を解離させ、ハイブリッド形成体の解離に基づくシグナルの変動を測定する工程、
（ＩＩＩ）前記シグナルの変動を解析してＴｍ値を決定する工程、および
（ＩＶ）前記Ｔｍ値から目的の多型の有無または多型を有する塩基配列の存在比を決定する工程。
【請求項７】
さらに、（Ｉ）の工程の前または（Ｉ）の工程と同時にDNAを増幅することを含む、請求
項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法によりａｂｌ遺伝子における多型を検出する工程、および多型の有無に基づいて抗白血病薬に対する耐性または抗白血病薬の薬効を判定する工程を含む、抗白血病薬に対する耐性または抗白血病薬の薬効の判定方法。
【請求項９】
ａｂｌ遺伝子における多型を検出するための試薬キットであって、請求項１〜４のいずれか一項に記載のプローブを含むキット。
【請求項１０】
さらに、ａｂｌ遺伝子の配列番号１に示す塩基配列におけるP1のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする配列を含む領域を増幅するためのプライマーを含む、請求項９に記載の試薬キット。                                                                 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、白血病に関連するａｂｌ遺伝子の多型を検出するためのプローブおよびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
白血病は、骨髄中の造血幹細胞がガン化することによって起こる疾患である。中でも慢性骨髄性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ：ＣＭＬ）は、９番目の染色体と２２番目の染色体との転座により形成されるｂｃｒ−ａｂｌ融合遺伝子が発症原因として知られており、その治療には、ＡＢＬキナーゼ阻害剤であるイマチニブ等が広く使用されている。しかしながら、このａｂｌ遺伝子（前記融合遺伝子におけるａｂｌ遺伝子を含む）に点突然変異が存在すると、イマチニブに対して耐性を発現するという問題があり、その場合、治療において、イマチニブ投与量の増加、他の治療薬への変更、骨髄移植等への切り替え等が必要になる。したがって、白血病、特にＣＭＬの治療においては、ａｂｌ遺伝子における点突然変異の有無を検出することが非常に重要となっている。
【０００３】
ａｂｌ遺伝子における点突然変異の検出方法としては、ａｂｌ遺伝子変異をRT-PCRで増幅してクローニングした後、シークエンス解析する方法（非特許文献１）、ａｂｌ遺伝子変異をPCR-RFLP法で検出する方法（非特許文献２）、ａｂｌ遺伝子変異をDHPLC法で検出
し、シークエンス解析する方法（非特許文献３）などが挙げられる。しかしながら、非特許文献１の方法は実験操作には専門知識やスキルが必要であり、自動化が困難である。また実験操作に手間がかかり、結果を得るまでに数日間を必要とする。非特許文献２の方法も操作が煩雑で結果を得るまでに1日程度を必要とする。また増幅産物が別の反応を汚染
する（コンタミネーションする）恐れがある。さらに自動化が困難である。非特許文献３の方法も操作が煩雑で自動化が困難である。またDHPLC法では変異タイプの区別が難しく
、シークエンス法などで別途変異タイプを検出する必要がある。
【０００４】
このような問題から、近年、遺伝子多型の検出方法として、融解曲線分析（Ｔｍ分析）を利用した検出が行われている（特許文献１，２）。これは、検出目的の遺伝子多型を含む検出対象配列に相補的なプローブを用いて、検出試料の標的一本鎖ＤＮＡと前記プローブとのハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成させ、このハイブリッド形成体に加熱処理を施して温度上昇に伴うハイブリッドの解離（融解）を吸光度等のシグナル測定により検出し、この検出結果に基づいてＴｍ値を決定することによって目的多型の有無を判断する方法である。Ｔｍ値は、ハイブリッド形成体の相同性が高い程高く、相同性が低い程低くなる。このため、目的多型を含む検出対象配列とそれに相補的なプローブとのハイブリッド形成体について予めＴｍ値（評価基準値）を求めておき、検出試料の標的一本鎖ＤＮＡと前記プローブとのＴｍ値（測定値）を測定し、測定値が評価基準値と同じであれば、マッチ、すなわち標的ＤＮＡに目的多型が存在すると判断でき、測定値が評価基準値より低ければ、ミスマッチ、すなわち標的ＤＮＡに目的多型が存在しないと判断できる。
【０００５】
しかしながら、このようなＴｍ分析を用いた検出方法は、感度が低いという問題がある。これは、特に、白血病患者の血液細胞由来ＤＮＡについて点突然変異を検出する際に問題となっている（特許文献３）。すなわち、一人のＣＭＬ患者の血液であっても、その血液細胞にはａｂｌ遺伝子に点突然変異が発生しているもの（変異遺伝子）と発生していないもの（正常遺伝子）とが含まれており、両者の違いは、点突然変異すなわち一塩基の配列にすぎない。そうすると、点突然変異を検出するためのプローブは、点突然変異を含む変異配列（検出対象配列）にハイブリダイズ（マッチ）するが、さらに、点突然変異を含まない正常配列（非検出対象配列）にもハイブリダイズ（ミスマッチ）するという現象が起こってしまう。このような場合に、Ｔｍ分析によってシグナルの強度と温度との関係を示す融解曲線を作成すると、マッチしている変異配列に対する高温側のピークが、ミスマッチである正常配列に対する低温側のピークの存在によって検出し難くなるという問題がある。つまり、従来のプローブでは、変異を含む変異配列が存在する場合であっても、変異を含まない正常配列の存在によって、その検出が困難となり、検出感度の低下が生じてしまうという問題があった。
【０００６】
特許文献４には、Ｔｍ分析を用いた検出方法に使用するための、ａｂｌ遺伝子における点突然変異であるA758T(Y253F)、G756C(Q250E)、G763A(E255K) 、およびA758T(Y253F)を
検出するプローブが記載されている。また、特許文献５には、A730G(M244V)、G749A(G250E)、A943G(T315A)、C944T(T315I)、C951G(F317L)、T1052C(M351T)、A1064G(E355G)、T1075G(F359V)、およびA1187G(H396R)を検出するプローブが記載されている。しかしながら、T1076G (F359C)、T757C (Y253H)、A764T (E255V)、およびG895C/T (V299L)を検出するプ
ローブは、いずれの文献においても記載されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００１−２８６３００号公報
【特許文献２】特開２００２−１１９２９１号公報
【特許文献３】特表２００４−５３７９９２号公報
【特許文献４】国際公開２００８／０１８３０５号パンフレット
【特許文献５】特開２００８−１９９９６５号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】PNAS August 6, 2002 vol.99 no.16 10700-10705
【非特許文献２】Leukemia (2002) 16, 2190-2196
【非特許文献３】Clin Cancer Res 2006 ; 12(24) December 15, 2006
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ａｂｌ遺伝子における点突然変異のT1076G (F359C)、T757C (Y253H)、A764T(E255V)、およびG895C/T (V299L)を検出するのに有効な検出用プローブを特定し、ａｂｌ遺伝子における点突然変異のT1076G (F359C)、T757C (Y253H)、A764T (E255V)、およびG895C/T (V299L)を検出する方法、ならびにそのための試薬キットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、ａｂｌ遺伝子における点突然変異のT1076G (F359C)、T757C (Y253H)、A764T (E255V)、およびG895C/T (V299L)を含む特定の領域に基づいてプローブを設計し、該プローブを用いるＴｍ分析を行うことにより当該変異部位における多型を検出できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）ａｂｌ遺伝子の多型を検出するためのプローブであって、下記P1〜P9から選択される少なくとも１種の蛍光標識オリゴヌクレオチドからなることを特徴とする多型検出用プローブ。
（P1）配列番号１または２に示す塩基配列において塩基番号１２５〜１３３を含む１０〜５０塩基長の塩基配列に相補的な配列又はそれに相同な配列を有し、塩基番号１２５に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、オリゴヌクレオチド、
（P2）配列番号３または４に示す塩基配列において塩基番号１３５〜１４６を含む１２〜
５０塩基長の塩基配列に相補的な配列又はそれに相同な配列を有し、塩基番号１４６に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、オリゴヌクレオチド、
（P3）配列番号３または４に示す塩基配列において塩基番号１３５〜１４４を含む１０〜５０塩基長の塩基配列に相補的な配列又はそれに相同な配列を有し、塩基番号１４４に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、オリゴヌクレオチド、
（P3’）配列番号３または５に示す塩基配列において塩基番号１４２〜１４４を含む１０〜５０塩基長の塩基配列に相補的な配列又はそれに相同な配列を有し、塩基番号１４４に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、オリゴヌクレオチド、
（P4）配列番号３または４に示す塩基配列において塩基番号１３４〜１３５を含む１０〜５０塩基長の塩基配列に相補的な配列又はそれに相同な配列を有し、塩基番号１３４に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、オリゴヌクレオチド、
（P5）配列番号３または５に示す塩基配列において塩基番号１３８〜１４２を含む１０〜５０塩基長の塩基配列に相補的な配列又はそれに相同な配列を有し、塩基番号１３８に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、オリゴヌクレオチド、
（P6）配列番号３または５に示す塩基配列において塩基番号１４２〜１５３を含む１２〜５０塩基長の塩基配列に相補的な配列又はそれに相同な配列を有し、塩基番号１５３に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、オリゴヌクレオチド、
（P7）配列番号３または５に示す塩基配列において塩基番号１４２〜１５０を含む１０〜５０塩基長の塩基配列に相補的な配列又はそれに相同な配列を有し、塩基番号１５０に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、オリゴヌクレオチド、
（P8）配列番号６〜８に示す塩基配列において塩基番号１２６〜１３５を含む１０〜５０塩基長の塩基配列又はそれに相同な配列を有し、塩基番号１３５に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、オリゴヌクレオチド、
（P9）配列番号６〜８に示す塩基配列において塩基番号１２６〜１２９を含む１０〜５０塩基長の塩基配列又はそれに相同な配列を有し、塩基番号１２９に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、オリゴヌクレオチド。
（２）P1のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号１２５に対応する塩基を３’末端から数えて１〜３番目の位置に有し、
P2のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号１４６に対応する塩基を５’末端から数えて１〜３番目の位置に有し、
P3およびP3'のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号１４４に対応する
塩基を５’末端から数えて１〜３番目の位置に有し、
P4のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号１３４に対応する塩基を３’末端から数えて１〜３番目の位置に有し、
P5のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号１３８に対応する塩基を３’末端から数えて１〜３番目の位置に有し、
P6のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号１５３に対応する塩基を５’末端から数えて１〜３番目の位置に有し、
P7のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号１５０に対応する塩基を５’末端から数えて１〜３番目の位置に有し、
P8のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号１３５に対応する塩基を３’末端から数えて１〜３番目の位置に有し、
P9のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号１２９に対応する塩基を３’末端から数えて１〜３番目の位置に有する、（１）記載のプローブ。
（３）P1のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号１２５に対応する塩基を３’末端に有し、
P2のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号１４６に対応する塩基を５’末端に有し、
P3およびP3'のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号１４４に対応する
塩基を５’末端に有し、
P4のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号１３４に対応する塩基を３’末端に有し、
P5のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号１３８に対応する塩基を３’末端に有し、
P6のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号１５３に対応する塩基を５’末端に有し、
P7のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号１５０に対応する塩基を５’末端に有し、
P8のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号１３５に対応する塩基を３’末端に有し、
P9のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号１２９に対応する塩基を３’末端に有する、（１）記載のプローブ。
（４）前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、且つ標的配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少するかまたは増加する、（１）〜（３）のいずれかに記載のプローブ。
（５）前記蛍光標識オリゴヌクレオチドが、標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、標的配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少する、（４）記載のプローブ。
（６）P1、P3、P3'、P4、P5、P7、P8、P9のオリゴヌクレオチドの塩基長が１０〜３０
であり、P2およびP6のオリゴヌクレオチドの塩基長が１２〜３０である、（１）〜（５）のいずれかに記載のプローブ。
（７）前記プローブが、融解曲線分析用のプローブである、（１）〜（６）のいずれかに記載のプローブ。
（８）ａｂｌ遺伝子における多型の検出方法であって、（１）〜（７）のいずれかに記載のプローブを用いることを特徴とする方法。
（９）ａｂｌ遺伝子における多型の検出方法であって、下記工程（Ｉ）〜（Ｖ）を含むことを特徴とする方法。
（Ｉ）ＤＮＡを含有する試料に、（１）〜（７）のいずれかに記載のプローブを添加して前記ＤＮＡに前記プローブをハイブリダイズさせる工程、
（ＩＩ）温度を変化させて前記ＤＮＡと前記プローブとのハイブリッド形成体を解離させ、ハイブリッド形成体の解離に基づくシグナルの変動を測定する工程、
（ＩＩＩ）前記シグナルの変動を解析してＴｍ値を決定する工程、および
（ＩＶ）前記Ｔｍ値から目的の多型の有無または多型を有する塩基配列の存在比を決定する工程。
（１０）さらに、（Ｉ）の工程の前または（Ｉ）の工程と同時にDNAを増幅することを
含む、（９）に記載の方法。
（１１）（８）〜（１０）のいずれかに記載の方法によりａｂｌ遺伝子における多型を検出する工程、および多型の有無に基づいて抗白血病薬に対する耐性または抗白血病薬の薬効を判定する工程を含む、抗白血病薬に対する耐性または抗白血病薬の薬効の判定方法。
（１２）ａｂｌ遺伝子における多型を検出するための試薬キットであって、（１）〜（７）のいずれかに記載のプローブを含むキット。
（１３）さらに、ａｂｌ遺伝子の配列番号１に示す塩基配列におけるP1のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする配列を含む領域、配列番号３に示す塩基配列におけるP2、P3、P3’、P4、P5、P6、もしくはP7のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする配列を含む領域、または配列番号６に示す塩基配列におけるP8もしくはP9のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする配列を含む領域を増幅するためのプライマーを含む、（１２）に記載の試薬キット。
なお、上記においてａｂｌ遺伝子の多型は同遺伝子の近傍領域の多型をも含む。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のプローブによれば、検出目的の変異を有するａｂｌ遺伝子（ｂｃｒ−ａｂｌ融合遺伝子におけるａｂｌ遺伝子を含む。以下同様。）（変異遺伝子）と変異が発生していないａｂｌ遺伝子（正常遺伝子）とが共存している場合でも、前記目的の変異が発生した検出対象配列を検出できる。Ｔｍ分析においては、プローブが一塩基のみ異なる変異遺伝子と正常遺伝子の双方にハイブリダイズすると、融解曲線において両者のシグナルが重なり、変異遺伝子の存在を検出することが非常に困難である。これに対して、本発明のプローブによれば、変異遺伝子と正常遺伝子の双方にハイブリダイズするものの、融解曲線において、両者のシグナルを十分に分離できる。このため、本発明によれば、従来よりも優れた感度で、変異遺伝子を検出することができる。
本発明のプローブをPCRなどの遺伝子増幅系中に添加しておけば、遺伝子増幅反応終了
後、Ｔｍ分析を行うだけで、高感度で複数の遺伝子変異型のタイピングが可能となる。さらに、全血や口腔粘膜懸濁液などを直接検査することが可能であるため、手間やコストを低減することができる。
本発明のプローブは、特異性が高く、検出感度が高い。
本発明の方法を用いることにより、PCRを行う場合であっても、増幅産物を取り出す必
要がないため、コンタミネーションの危険性がほぼ無い。また、本発明の方法は、手順が簡単なので自動化が容易である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】（Ａ）核酸混合物の融解曲線、及び（Ｂ）微分融解曲線の一例を示す図である。
【図２】検量線の一例を示す図である。
【図３Ａ】実施例1のT1076G (F359C)を含むプラスミド（変異含有率２．５％）についての配列番号９（３’末端標識）のプローブを用いたTm分析における単位時間当たりのＴＡＭＲＡの蛍光強度の変化量（d蛍光強度増加量/t）の変化を示す。縦軸は、単位時間当たりの蛍光強度の変化量（d蛍光強度増加量/t）、横軸は温度（℃）である。
【図３Ｂ】比較例1のT1076G (F359C)を含むプラスミド（変異含有率２．５％）についての配列番号９（５’末端標識）のプローブを用いたTm分析における単位時間当たりのＴＡＭＲＡの蛍光強度の変化量（d蛍光強度増加量/t）の変化を示す。縦軸は、単位時間当たりの蛍光強度の変化量（d蛍光強度増加量/t）、横軸は温度（℃）である。
【図４Ａ】実施例２−１のT757C (Y253H) を含むプラスミド（変異含有率０％（I）、１０％（II）、２０％（III））についての配列番号１０のプローブを用いたTm分析における単位時間当たりのＴＡＭＲＡの蛍光強度の変化量（d蛍光強度増加量/t）の変化を示す。縦軸は、単位時間当たりの蛍光強度の変化量（d蛍光強度増加量/t）、横軸は温度（℃）である。
【図４Ｂ】実施例２−２のT757C (Y253H) を含むプラスミド（変異含有率１０％）についての配列番号１１のプローブを用いたTm分析における単位時間当たりのＴＡＭＲＡの蛍光強度の変化量（d蛍光強度増加量/t）の変化を示す。縦軸は、単位時間当たりの蛍光強度の変化量（d蛍光強度増加量/t）、横軸は温度（℃）である。
【図４Ｃ】実施例２−３のT757C (Y253H) を含むプラスミド（変異含有率１０％）についての配列番号１２のプローブを用いたTm分析における単位時間当たりのＴＡＭＲＡの蛍光強度の変化量（d蛍光強度増加量/t）の変化を示す。縦軸は、単位時間当たりの蛍光強度の変化量（d蛍光強度増加量/t）、横軸は温度（℃）である。
【図５Ａ】実施例３−１のA764T (E255V) を含むプローブの相補鎖（変異含有率１０％）についての配列番号１３のプローブを用いたTm分析における単位時間当たりのＴＡＭＲＡの蛍光強度の変化量（d蛍光強度増加量/t）の変化を示す。縦軸は、単位時間当たりの蛍光強度の変化量（d蛍光強度増加量/t）、横軸は温度（℃）である。
【図５Ｂ】実施例３−２のA764T (E255V) を含むプローブの相補鎖（変異含有率１０％）についての配列番号１４のプローブを用いたTm分析における単位時間当たりのＴＡＭＲＡの蛍光強度の変化量（d蛍光強度増加量/t）の変化を示す。縦軸は、単位時間当たりの蛍光強度の変化量（d蛍光強度増加量/t）、横軸は温度（℃）である。
【図５Ｃ】実施例３−３のA764T (E255V) を含むプローブの相補鎖（変異含有率１０％）についての配列番号１５のプローブを用いたTm分析における単位時間当たりのＴＡＭＲＡの蛍光強度の変化量（d蛍光強度増加量/t）の変化を示す。縦軸は、単位時間当たりの蛍光強度の変化量（d蛍光強度増加量/t）、横軸は温度（℃）である。
【図５Ｄ】実施例３−４のA764T (E255V) を含むプローブの相補鎖（変異含有率１０％）についての配列番号１６のプローブを用いたTm分析における単位時間当たりのＴＡＭＲＡの蛍光強度の変化量（d蛍光強度増加量/t）の変化を示す。縦軸は、単位時間当たりの蛍光強度の変化量（d蛍光強度増加量/t）、横軸は温度（℃）である。
【図６Ａ】実施例４−１のG895C (V299L) を含むプラスミド（変異含有率５％）についての配列番号１７のプローブを用いたTm分析における単位時間当たりのＢＯＤＩＰＹ  ＦＬの蛍光強度の変化量（d蛍光強度増加量/t）の変化を示す。縦軸は、単位時間当たりの蛍光強度の変化量（d蛍光強度増加量/t）、横軸は温度（℃）である。
【図６Ｂ】実施例４−２のG895C (V299L) を含むプラスミド（変異含有率５％）についての配列番号１８のプローブを用いたTm分析における単位時間当たりのＢＯＤＩＰＹ  ＦＬの蛍光強度の変化量（d蛍光強度増加量/t）の変化を示す。縦軸は、単位時間当たりの蛍光強度の変化量（d蛍光強度増加量/t）、横軸は温度（℃）である。
【図６Ｃ】実施例４−３のG895T (V299L) を含むプラスミド（変異含有率５％）についての配列番号１９のプローブを用いたTm分析における単位時間当たりのＴＡＭＲＡの蛍光強度の変化量（d蛍光強度増加量/t）の変化を示す。縦軸は、単位時間当たりの蛍光強度の変化量（d蛍光強度増加量/t）、横軸は温度（℃）である。
【図６Ｄ】実施例４−４のG895T (V299L) を含むプラスミド（変異含有率５％）についての配列番号２０のプローブを用いたTm分析における単位時間当たりのＴＡＭＲＡの蛍光強度の変化量（d蛍光強度増加量/t）の変化を示す。縦軸は、単位時間当たりの蛍光強度の変化量（d蛍光強度増加量/t）、横軸は温度（℃）である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明において、以下、検出目的の変異を有するａｂｌ遺伝子を「変異遺伝子」、検出目的の変異を有する配列を「変異配列」、検出目的の変異が発生していないａｂｌ遺伝子を「正常遺伝子」、検出目的の変異が発生していない配列を「正常配列」、変異の有無を検出する試料中のＤＮＡを「標的ＤＮＡ」ともいう。
本発明において検出する多型としては、例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）等が挙げられる。
また、本明細書において、T1076G (F359C)とはａｂｌ遺伝子の１０７６番目の塩基におけるＴ（野生型）からＧ（変異型）への変異を表し、カッコ内は塩基の変異に伴い３５９番目のアミノ酸がＦからＣに変化することを意味する。その他の変異の表記についても同様である。
なお、ａｂｌ遺伝子の塩基配列はNational Center for Biotechnology Information
（ＮＣＢＩ）アクセッションＮｏ．ＮＧ_０１２０３４に登録されている。下記に示す配
列番号１，３，６の配列はいずれもこれらの配列に含まれている。
以下に、本発明のプローブについて説明する。
【００１５】
＜プローブ＞
本発明のプローブは、前述のように、ａｂｌ遺伝子の多型を検出するためのプローブであって、前記Ｐ１〜Ｐ９からなる群から選択された少なくとも一つのオリゴヌクレオチドからなることを特徴とする。
【００１６】
（Ｐ１）配列番号１または２に示す塩基配列において塩基番号１２５〜１３３を含む１０〜５０塩基長の塩基配列に相補的な配列又はそれに相同な配列を有し、塩基番号１２５に
対応する塩基がシトシンであり蛍光標識されている、オリゴヌクレオチド
ここで、「塩基番号１２５に対応する塩基」とは、前記相補配列又は相同配列において、配列番号１および２の塩基番号１２５のｇ（グアニン）に対応する相補塩基ｃ（シトシン）を意味する。P1のプローブにおいては、このｃが３’末端から数えて1〜3番目の位置に存在することが好ましく、このｃが３’末端に存在することがより好ましい。
Ｐ１のオリゴヌクレオチドからなるプローブは、配列番号１の塩基配列における１３３番目の塩基の多型を検出するためのプローブである。この塩基はT1076G変異の塩基に該当し、野生型であればＴ，変異型であればＧである。T1076を含む領域の配列を配列番号１
（野生型：１３３番目がＴ）および２（変異型：１３３番目がＧ）に示す。
当該多型を検出するためのプローブの長さは、好ましくは１０〜３０塩基長、より好ましくは１５〜２５塩基長である。
なお、Ｐ１のオリゴヌクレオチドからなるプローブは、配列番号１に示す塩基配列において塩基番号１２５〜１３３を含む１０〜５０塩基長の塩基配列に相補的な配列又はそれに相同な配列を有し、塩基番号１２５に対応する塩基がシトシンであり蛍光標識されている、野生型検出用オリゴヌクレオチドと、配列番号２に示す塩基配列において塩基番号１２５〜１３３を含む１０〜５０塩基長の塩基配列に相補的な配列又はそれに相同な配列を有し、塩基番号１２５に対応する塩基がシトシンであり蛍光標識されている、変異型検出用オリゴヌクレオチドのいずれか一方でもよいし、両方でもよい。
好ましくは、変異型検出用の下記配列番号９の塩基配列を有するプローブが挙げられる。
５’−ｃｃｔｇｔｇｇａｔｇＣａｇｔｔｔｔｔｃ＊−３’（配列番号９）
ここで、ｃ＊は３’側に蛍光標識されたｃを示す（以下同様）。
なお、これに対応する野生型検出用プローブは大文字のＣがＡである。
【００１７】
（Ｐ２）配列番号３または４に示す塩基配列において塩基番号１３５〜１４６を含む１２〜５０塩基長の塩基配列に相補的な配列又はそれに相同な配列を有し、塩基番号１４６に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、オリゴヌクレオチド
ここで、「塩基番号１４６に対応する塩基」とは、前記相補配列又は相同配列において、配列番号３および４の塩基番号１４６のｇに対応する相補塩基ｃを意味する。P2のプローブにおいては、このｃが５’末端から数えて1〜3番目の位置に存在することが好ましく、このｃが５’末端に存在することがより好ましい。
Ｐ２のオリゴヌクレオチドからなるプローブは、配列番号３の塩基配列における１３５番目の塩基の多型を検出するためのプローブである。この塩基はT757C変異の塩基に該当
し、野生型であればＴ，変異型であればＣである。T757Cを含む領域の配列を配列番号３
（野生型：１３５番目がＴ）および４（変異型：１３５番目がＣ）に示す。
当該多型を検出するためのプローブの長さは、好ましくは１２〜３０塩基長、より好ましくは１５〜３０塩基長であり、さらに好ましくは１５〜２５塩基長である。
なお、Ｐ２のオリゴヌクレオチドからなるプローブは、配列番号３に示す塩基配列において塩基番号１３５〜１４６を含むで終わる１２〜５０塩基長の塩基配列に相補的な配列又はそれに相同な配列を有し、塩基番号１４６に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、野生型検出用オリゴヌクレオチドと、配列番号４に示す塩基配列において塩基番号１３５〜１４６を含む１２〜５０塩基長の塩基配列に相補的な配列又はそれに相同な配列を有し、塩基番号１４６に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、変異型検出用オリゴヌクレオチドのいずれか一方でもよいし、両方でもよい。
好ましくは、変異型検出用の下記配列番号１０の塩基配列を有するプローブが挙げられる（大文字が変異塩基を示す、以下同じ）。
５’−＊ｃａｃｃｔｃｃｃｃｇｔＧｃｔｇ−３’（配列番号１０）
ここで、＊ｃは５’側に蛍光標識されたｃを示す（以下同様）。
なお、これに対応する野生型検出用プローブは大文字のＧがＡである。
【００１８】
（Ｐ３）配列番号３または４に示す塩基配列において塩基番号１３５〜１４４を含む１０〜５０塩基長の塩基配列に相補的な配列又はそれに相同な配列を有し、塩基番号１４４に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、オリゴヌクレオチド
ここで、「塩基番号１４４に対応する塩基」とは、前記相補配列又は相同配列において、配列番号３および４の塩基番号１４４のｇに対応する相補塩基ｃを意味する。P3のプローブにおいては、このｃが５’末端から数えて1〜3番目の位置に存在することが好ましく、このｃが５’末端に存在することがより好ましい。
Ｐ３のオリゴヌクレオチドからなるプローブは、配列番号３の塩基配列における１３５番目の塩基の多型を検出するためのプローブである。
当該多型を検出するためのプローブの長さは、好ましくは１０〜３０塩基長、より好ましくは１５〜２５塩基長である。
なお、Ｐ３のオリゴヌクレオチドからなるプローブは、配列番号３に示す塩基配列において塩基番号１３５〜１４４を含む１０〜５０塩基長の塩基配列に相補的な配列又はそれに相同な配列を有し、塩基番号１４４に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、野生型検出用オリゴヌクレオチドと、配列番号４に示す塩基配列において塩基番号１３５〜１４４を含む１０〜５０塩基長の塩基配列に相補的な配列又はそれに相同な配列を有し、塩基番号１４４に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、変異型検出用オリゴヌクレオチドのいずれか一方でもよいし、両方でもよい。
好ましくは、変異型検出用の下記配列番号１１の塩基配列を有するプローブが挙げられる。
５’−＊ｃｃｔｃｃｃｃｇｔＧｃｔｇｇｃ−３’（配列番号１１）
なお、これに対応する野生型検出用プローブは大文字のＧがＡである。
【００１９】
（Ｐ３’）配列番号３または５に示す塩基配列において塩基番号１４２〜１４４を含む１０〜５０塩基長の塩基配列に相補的な配列又はそれに相同な配列を有し、塩基番号１４４に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、オリゴヌクレオチド
ここで、「塩基番号１４４に対応する塩基」とは、前記相補配列又は相同配列において、配列番号３および５の塩基番号１４４のｇに対応する相補塩基ｃを意味する。P3'のプ
ローブにおいては、このｃが５’末端から数えて1〜3番目の位置に存在することが好ましく、このｃが５’末端に存在することがより好ましい。
Ｐ３’のオリゴヌクレオチドからなるプローブは、配列番号３の塩基配列における１４２番目の塩基の多型を検出するためのプローブである。この塩基はA764T変異の塩基に該
当し、野生型であればＡ，変異型であればＴである。A764Tを含む領域の配列を配列番号
３（野生型：１４２番目がＡ）および５（変異型：１４２番目がＴ）に示す。
当該多型を検出するためのプローブは、好ましくは１０〜３０塩基長、より好ましくは１５〜２５塩基長であり、配列番号３に示す塩基配列において塩基番号１４２〜１４４を含む１０〜５０塩基長の塩基配列に相補的な配列又はそれに相同な配列を有し、塩基番号１４４に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、野生型検出用オリゴヌクレオチドと、配列番号５に示す塩基配列において塩基番号１４２〜１４４を含む１０〜５０塩基長の塩基配列に相補的な配列又はそれに相同な配列を有し、塩基番号１４４に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、変異型検出用オリゴヌクレオチドのいずれか一方でもよいし、両方でもよい。
好ましくは、変異型検出用の下記配列番号１６の塩基配列を有するプローブが挙げられる。
５’−＊ｃｃＡｃｃｃｃｇｔａｃｔｇｇｃｃ−３’（配列番号１６）
なお、これに対応する野生型検出用プローブは大文字のＡがＴである。
【００２０】
（Ｐ４）配列番号３または４に示す塩基配列において塩基番号１３４〜１３５を含む１０〜５０塩基長の塩基配列に相補的な配列又はそれに相同な配列を有し、塩基番号１３４に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、オリゴヌクレオチド
ここで、「塩基番号１３４に対応する塩基」とは、前記相補配列又は相同配列において、配列番号３および４の塩基番号１３４のｇに対応する相補塩基ｃを意味する。P4のプローブにおいては、このｃが３’末端から数えて1〜3番目の位置に存在することが好ましく、このｃが３’末端に存在することがより好ましい。
Ｐ４のオリゴヌクレオチドからなるプローブは、配列番号３の塩基配列における１３５番目の塩基の多型を検出するためのプローブである。
当該多型を検出するためのプローブの長さは、好ましくは１０〜３０塩基長、より好ましくは１５〜２５塩基長である。
なお、Ｐ４のオリゴヌクレオチドからなるプローブは、配列番号３に示す塩基配列において塩基番号１３４〜１３５を含む１０〜５０塩基長の塩基配列に相補的な配列又はそれに相同な配列を有し、塩基番号１３４に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、野生型検出用オリゴヌクレオチドと、配列番号４に示す塩基配列において塩基番号１３４〜１３５を含む１０〜５０塩基長の塩基配列に相補的な配列又はそれに相同な配列を有し、塩基番号１３４に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、変異型検出用オリゴヌクレオチドのいずれか一方でもよいし、両方でもよい。
好ましくは、変異型検出用の下記配列番号１２の塩基配列を有するプローブが挙げられる。
５’−ｇｔａｃａｃｃｔｃｃｃｃｇｔＧｃ＊−３’（配列番号１２）
なお、これに対応する野生型検出用プローブは大文字のＧがＡである。
【００２１】
（Ｐ５）配列番号３または５に示す塩基配列において塩基番号１３８〜１４２を含む１０〜５０塩基長の塩基配列に相補的な配列又はそれに相同な配列を有し、塩基番号１３８に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、オリゴヌクレオチド
ここで、「塩基番号１３８に対応する塩基」とは、前記相補配列又は相同配列において、配列番号３および５の塩基番号１３８のｇに対応する相補塩基ｃを意味する。P5のプローブにおいては、このｃが３’末端から数えて1〜3番目の位置に存在することが好ましく、このｃが３’末端に存在することがより好ましい。
Ｐ５のオリゴヌクレオチドからなるプローブは、配列番号３の塩基配列における１４２番目の塩基の多型を検出するためのプローブである。
当該多型を検出するためのプローブの長さは、好ましくは１０〜３０塩基長、より好ましくは１５〜２５塩基長である。
なお、Ｐ５のオリゴヌクレオチドからなるプローブは、配列番号３に示す塩基配列において塩基番号１３８〜１４２を含む１０〜５０塩基長の塩基配列に相補的な配列又はそれに相同な配列を有し、塩基番号１３８に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、野生型検出用オリゴヌクレオチドと、配列番号５に示す塩基配列において塩基番号１３８〜１４２を含む１０〜５０塩基長の塩基配列に相補的な配列又はそれに相同な配列を有し、塩基番号１３８に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、変異型検出用オリゴヌクレオチドのいずれか一方でもよいし、両方でもよい。
好ましくは、変異型検出用の下記配列番号１３の塩基配列を有するプローブが挙げられる。
５’−ｃｃｔｃｇｔａｃａｃｃＡｃｃｃｃ＊−３’（配列番号１３）
なお、これに対応する野生型検出用プローブは大文字のＡがＴである。
【００２２】
（Ｐ６）配列番号３または５に示す塩基配列において塩基番号１４２〜１５３を含む１２〜５０塩基長の塩基配列に相補的な配列又はそれに相同な配列を有し、塩基番号１５３に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、オリゴヌクレオチド
ここで、「塩基番号１５３に対応する塩基」とは、前記相補配列又は相同配列において、配列番号３および５の塩基番号１５３のｇに対応する相補塩基ｃを意味する。P6のプローブにおいては、このｃが５’末端から数えて1〜3番目の位置に存在することが好ましく、このｃが５’末端に存在することがより好ましい。
Ｐ６のオリゴヌクレオチドからなるプローブは、配列番号３の塩基配列における１４２番目の塩基の多型を検出するためのプローブである。
当該多型を検出するためのプローブの長さは、好ましくは１２〜３０塩基長、より好ましくは１５〜３０塩基長であり、さらに好ましくは１５〜２５塩基長である。
なお、Ｐ６のオリゴヌクレオチドからなるプローブは、配列番号３に示す塩基配列において塩基番号１４２〜１５３を含む１２〜５０塩基長の塩基配列に相補的な配列又はそれに相同な配列を有し、塩基番号１５３に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、野生型検出用オリゴヌクレオチドと、配列番号５に示す塩基配列において塩基番号１４２〜１５３を含む１２〜５０塩基長の塩基配列に相補的な配列又はそれに相同な配列を有し、塩基番号１５３に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、変異型検出用オリゴヌクレオチドのいずれか一方でもよいし、両方でもよい。
好ましくは、変異型検出用の下記配列番号１４の塩基配列を有するプローブが挙げられる。
５’−＊ｃｃｔｃｇｔａｃａｃｃＡｃｃｃｃ−３’（配列番号１４）
なお、これに対応する野生型検出用プローブは大文字のＡがＴである。
【００２３】
（Ｐ７）配列番号３または５に示す塩基配列において塩基番号１４２〜１５０を含む１０〜５０塩基長の塩基配列に相補的な配列又はそれに相同な配列を有し、塩基番号１５０に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、オリゴヌクレオチド
ここで、「塩基番号１５０に対応する塩基」とは、前記相補配列又は相同配列において、配列番号３および５の塩基番号１５０のｇに対応する相補塩基ｃを意味する。P7のプローブにおいては、このｃが５’末端から数えて1〜3番目の位置に存在することが好ましく、このｃが５’末端に存在することがより好ましい。
Ｐ７のオリゴヌクレオチドからなるプローブは、配列番号３の塩基配列における１４２番目の塩基の多型を検出するためのプローブである。
当該多型を検出するためのプローブの長さは、好ましくは１０〜３０塩基長、より好ましくは１５〜２５塩基長である。
なお、Ｐ７のオリゴヌクレオチドからなるプローブは、配列番号３に示す塩基配列において塩基番号１４２〜１５０を含む１０〜５０塩基長の塩基配列に相補的な配列又はそれに相同な配列を有し、塩基番号１５０に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、野生型検出用オリゴヌクレオチドと、配列番号５に示す塩基配列において塩基番号１４２〜１５０を含む１０〜５０塩基長の塩基配列に相補的な配列又はそれに相同な配列を有し、塩基番号１５０に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、変異型検出用オリゴヌクレオチドのいずれか一方でもよいし、両方でもよい。
好ましくは、変異型検出用の下記配列番号１５の塩基配列を有するプローブが挙げられる。
５’−＊ｃｇｔａｃａｃｃＡｃｃｃｃｇｔａ−３’（配列番号１５）
なお、これに対応する野生型検出用プローブは大文字のＡがＴである。
【００２４】
（Ｐ８）配列番号６〜８に示す塩基配列において塩基番号１２６〜１３５を含む１０〜５０塩基長の塩基配列又はそれに相同な配列を有し、塩基番号１３５に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、オリゴヌクレオチド
ここで、「塩基番号１３５に対応する塩基」とは、前記配列において、配列番号６〜８の塩基番号１３５のｃを意味する。P8のプローブにおいては、このｃが３’末端から数えて1〜3番目の位置に存在することが好ましく、このｃが３’末端に存在することがより好ましい。
Ｐ８のオリゴヌクレオチドからなるプローブは、配列番号６の塩基配列における１２６番目の塩基の多型を検出するためのプローブである。この塩基はG895C/T変異の塩基に該
当し、野生型であればＧ，変異型であればＣまたはＴである。G895C を含む領域の配列を配列番号６（野生型：１２６番目がＧ）、配列番号７（変異型：１２６番目がＣ）および
８（変異型：１２６番目がＴ）に示す。
当該多型を検出するためのプローブの長さは、好ましくは１０〜３０塩基長、より好ましくは１５〜２５塩基長である。
なお、Ｐ８のオリゴヌクレオチドからなるプローブは、配列番号６に示す塩基配列において塩基番号１２６〜１３５を含む１０〜５０塩基長の塩基配列又はそれに相同な配列を有し、塩基番号１３５に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、野生型検出用オリゴヌクレオチドと、配列番号７に示す塩基配列において塩基番号１２６〜１３５を含む１０〜５０塩基長の塩基配列又はそれに相同な配列を有し、塩基番号１３５に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、変異型検出用オリゴヌクレオチドと、配列番号８に示す塩基配列において塩基番号１２６〜１３５を含む１０〜５０塩基長の塩基配列又はそれに相同な配列を有し、塩基番号１３５に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、変異型検出用オリゴヌクレオチドのいずれか一つでもよいし、２または３つでもよい。
好ましくは、変異型検出用の下記配列番号１７または１９の塩基配列を有するプローブが挙げられる。
５’−ｃｃｔｇＣｔｇｃａｇｃｔｃｃ＊−３’（配列番号１７）
５’−ａａｃｃｔｇＴｔｇｃａｇｃｔｃｃ＊−３’（配列番号１９）
なお、これらに対応する野生型検出用プローブは大文字のＣまたはＴがＧである。
【００２５】
（Ｐ９）配列番号６〜８に示す塩基配列において塩基番号１２６〜１２９を含む１０〜５０塩基長の塩基配列又はそれに相同な配列を有し、塩基番号１２９に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、オリゴヌクレオチド
ここで、「塩基番号１２９に対応する塩基」とは、前記配列において、配列番号６〜８の塩基番号１２９のｃを意味する。P9のプローブにおいては、このｃが３’末端から数えて1〜3番目の位置に存在することが好ましく、このｃが３’末端に存在することがより好ましい。
Ｐ９のオリゴヌクレオチドからなるプローブは、配列番号６の塩基配列における１２６番目の塩基の多型を検出するためのプローブである。
当該多型を検出するためのプローブの長さは、好ましくは１０〜３０塩基長、より好ましくは１５〜２５塩基長である。
なお、Ｐ９のオリゴヌクレオチドからなるプローブは、配列番号６に示す塩基配列において塩基番号１２６〜１２９を含む１０〜５０塩基長の塩基配列又はそれに相同な配列を有し、塩基番号１２９に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、野生型検出用オリゴヌクレオチドと、配列番号７に示す塩基配列において塩基番号１２６〜１２９を含む１０〜５０塩基長の塩基配列又はそれに相同な配列を有し、塩基番号１２９に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、変異型検出用オリゴヌクレオチドと、配列番号８に示す塩基配列において塩基番号１２６〜１２９を含む１０〜５０塩基長の塩基配列又はそれに相同な配列を有し、塩基番号１２９に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、変異型検出用オリゴヌクレオチドのいずれか一つでもよいし、２または３つでもよい。
好ましくは、変異型検出用の下記配列番号１８または２０の塩基配列を有するプローブが挙げられる。
５’−ａｃｃｃｔａａｃｃｔｇＣｔｇｃ＊−３’（配列番号１８）
５’−  ｔｃａａａｃａｃｃｃｔａａｃｃｔｇＴｔｇｃ＊−３’（配列番号２０）
なお、これらに対応する野生型検出用プローブは大文字のＣまたはＴがＧである。
【００２６】
本願における「相同」とは、特定の塩基配列において、塩基配列の相補鎖または当該塩基配列に８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有する配列を有している塩基配列をさす。
本発明のプローブは、標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、且つ標的配
列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少（消光）するかまたは増加する蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブであることが好ましい。その中でも標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、且つ標的配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少する蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブであることがより好ましい。このような蛍光消光現象（Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ）を利用したプローブとしては、一般的
に、グアニン消光プローブと呼ばれており、いわゆるＱＰｒｏｂｅ（登録商標）として知られている。中でも、オリゴヌクレオチドを３'末端もしくは５'末端がＣとなるように設計し、その末端のＣが、Ｇに近づくと発光が弱くなるように蛍光色素で標識化されたプローブが好ましい。
なお、本明細書において、「５’末端から数えて１〜３番目」という場合は、５’末端を１番目として数え、「３’末端から数えて１〜３番目」という場合は、３’末端を１番目として数える。
【００２７】
前記蛍光色素は、制限されないが、例えば、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等が挙げられ、市販の蛍光色素としては、例えば、ＢＯＤＩＰＹ 
ＦＬ（商標名、モレキュラー・プローブ社製）、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ（商品名、アマシャムファルマシア社製）、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ（商品名、ミリポア社製）、ＦＡＭ（ＡＢＩ社製）、Ｃｙ３およびＣｙ５（アマシャムファルマシア社製）、ＴＡＲＭＡ(モレ
キュラープローブ社製)等が挙げられる。プローブの検出条件は、特に制限されず、使用
する蛍光色素により適宜決定できるが、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅは、検出波長
４４５〜４８０ｎｍ、ＴＡＭＲＡは、検出波長５８５〜７００ｎｍ）、ＢＯＤＩＰＹ Ｆ
Ｌは、検出波長５２０〜５５５ｎｍで検出できる。このようなプローブを使用すれば、シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。
【００２８】
また、本発明のプローブは、例えば、３'末端にリン酸基が付加されてもよい。後述す
るように、変異の有無を検出するＤＮＡ（標的ＤＮＡ）は、ＰＣＲ等の遺伝子増幅法によって調製することができ、この際、本発明のプローブを遺伝子増幅反応の反応液中に共存させることができる。このような場合に、プローブの３'末端にリン酸基を付加させてお
けば、プローブ自体が遺伝子増幅反応によって伸長することを十分に防止できる。また、３'末端に前述のような標識化物質を付加することによっても、同様の効果が得られる。
【００２９】
上記塩基配列を有し、５’末端または３’末端のCが蛍光色素で標識されたプローブの
具体例を以下の表１に示す（大文字の塩基は変異点を示し、Pはリン酸基を示す）。ただ
し、本発明のプローブは以下のものに限定されない。
【表１】
0005940771.tif 000002
【００３０】
本発明のプローブは、ａｂｌ遺伝子の多型の検出に使用することができる。検出方法は、何ら制限されず、検出対象配列とプローブとのハイブリダイズを利用する方法であればよい。本発明のプローブを適用する方法の一例として、Ｔｍ分析を利用した多型の検出方法について、以下に説明する。
【００３１】
＜多型検出方法＞
本発明の多型検出方法は、前述のように、ａｂｌ遺伝子における多型の検出方法であって、下記工程（Ｉ）〜（ＩＶ）を含むことを特徴とする。なお、本発明の多型検出方法は、本発明のプローブを使用することが特徴であって、その他の構成や条件等は、以下の記載に制限されない。
（Ｉ）ＤＮＡを含有する試料に、本発明のプローブを添加し、前記ＤＮＡに前記プローブをハイブリダイズさせる工程
（ＩＩ）前記ＤＮＡと前記プローブとのハイブリッド形成体について、温度変化に伴うシグナルの変動を測定する工程
（ＩＩＩ）前記シグナルの変動を解析してＴｍ値を決定する工程
（ＩＶ）前記Ｔｍ値から目的多型の有無または多型を有する塩基配列の存在比を決定する工程
なお、（III）でＴｍ値を決定することには、Ｔｍの温度を決定することだけでなく、Ｔ
ｍのピークの高さを決定することを含む。ピークの高さにより、多型を有する塩基配列の存在比を決定することができる。なお、多型を有する塩基配列の存在比をより定量的に決定するには、下記に示すような検量線を作成し、それに基づいて存在比を決定することが好ましい。
【００３２】
多型を有する塩基配列の存在比を定量的に決定する方法について、野生型と特定の変異型の存在比の決定を例に挙げて以下に示す。ただし、この方法は一例にすぎず、多型を有する塩基配列の存在比の決定の仕方はこれに限定されない。
【００３３】
まず、野生型の核酸Ｗｔと変異型の核酸Ｍｔとの２種類の核酸の存在比を各々異ならせた複数の核酸混合物を作製し、複数の核酸混合物の各々について、融解曲線解析装置等を
用いて融解曲線を得る。
図１（Ａ）に、ある１つの核酸混合物の温度と蛍光強度との関係で表された融解曲線、及び図１（Ｂ）に温度と蛍光強度の微分値との関係で表された融解曲線（微分融解曲線ともいう）を示す。この微分融解曲線からピークを検出することにより、核酸Ｗｔの融解温度ＴｍW及び核酸Ｍｔの融解温度ＴｍMを検出して、ＴｍW及びＴｍMを含む温度範囲の各々を設定する。ＴｍWを含む温度範囲ΔＴWとしては、例えば、ＴｍWとＴｍMとの間で蛍光強度の微分値が最小となる温度を下限、蛍光強度のピークの裾野に対応する温度を上限とする温度範囲を設定することができる。また、ＴｍMを含む温度範囲ΔＴMとしては、例えば、ＴｍWとＴｍMとの間で蛍光強度の微分値が最小となる温度を上限、蛍光強度のピークの裾野に対応する温度を下限とする温度範囲を設定することができる。なお、温度範囲ΔＴW及び温度範囲ΔＴMは、同一の幅（例えば、１０℃）または異なる幅（例えば、温度範囲ΔＴWが１０℃、温度範囲ΔＴMが７℃）となるように設定することができる。また、温度範囲ΔＴW及び温度範囲ΔＴMは、それぞれの融解温度ＴｍからプラスＸ℃、マイナスＸ℃の幅（Ｘ℃は例えば１５℃以内、望ましくは１０℃以内）というように設定することができる。
【００３４】
次に、温度範囲ΔＴW及び温度範囲ΔＴMの各々について、微分融解曲線の温度範囲の下限に対応する点と上限に対応する点とを通る直線と微分融解曲線とで囲まれた面積（図１（Ｂ）の斜線部分）を求める。面積の求め方の一例として、具体的に以下のように求めることができる。温度Ｔにおける蛍光強度の微分値をｆ（Ｔ）とし、温度Ｔにおけるベース値をＢ（Ｔ）として、下記（１）式により求める。
面積Ｓ＝｛ｆ（Ｔs+1）−Ｂ（Ｔs+1）｝＋｛ｆ（Ｔs+2）−Ｂ（Ｔs+2）｝
＋・・・＋｛ｆ（Ｔe-1）−Ｂ（Ｔe-1）｝      ・・・（１）
ただし、Ｔsは各温度範囲における下限値、Ｔeは上限値である。また、各温度Ｔにおけるベース値Ｂ（Ｔ）は、下記（２）式により求まる値であり、蛍光強度の検出信号に含まれるバックグラウンドレベルを表すものである。このベース値を蛍光強度の微分値から減算することにより、蛍光強度の検出信号に含まれるバックグラウンドの影響を除去する。
Ｂ（Ｔ）＝ａ×（Ｔ−Ｔs）＋ｆ（Ｔs）      ・・・（２）
ただし、ａ＝｛ｆ（Ｔe）−ｆ（Ｔs）｝／（Ｔe−Ｔs）  である。
【００３５】
上記（１）式及び（２）式に従って、各核酸混合物について、温度範囲ΔＴWにおける
面積ＳW及び温度範囲ΔＴWにおける面積ＳMを求め、面積比と各核酸混合物の存在比との
関係を表す検量線を作成する。図２に、横軸に存在比（核酸混合物の総量に対する核酸Ｍｔの割合）をとり、縦軸に面積比（ＳM／ＳW）をとった検量線の一例を示す。なお、面積比はＳW／ＳMで定めてもよい。
実際の試料を用いて得られた融解曲線と微分融解曲線から面積比を算出し、上記のようにしてあらかじめ作成した検量線に基づいて、実際の試料中に含まれる多型を有する塩基配列の存在比を決定することができる。
【００３６】
本発明において、試料中のＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡでもよいし二本鎖ＤＮＡであってもよい。前記ＤＮＡが二本鎖ＤＮＡの場合は、例えば、前記ハイブリダイズ工程に先立って、加熱により前記試料中の二本鎖ＤＮＡを解離させる工程を含むことが好ましい。二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離することによって、次のハイブリダイズ工程において、検出用プローブとのハイブリダイズが可能となる。
【００３７】
本発明において、試料に含まれるＤＮＡは、例えば、生体試料に元来含まれるＤＮＡでもよいが、検出精度を向上できることから、生体試料に元来含まれているＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ等によりａｂｌ遺伝子の変異箇所を含む領域を増幅させた増幅産物であることが好ましい。増幅産物の長さは、特に制限されないが、例えば、５０〜１０００ｍｅｒであり、好ましくは８０〜２００ｍｅｒである。また、試料中のＤＮＡは、例えば、生体試
料由来のＲＮＡ（トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ等）からＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔ
ｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＰＣＲ）により合成したｃＤＮＡであってもよい。
【００３８】
本発明の多型検出方法を適用する試料は、ａｂｌ遺伝子が存在する試料が挙げられる。具体例としては、白血球細胞等の血球試料、全血試料等が挙げられる。なお、本発明において、試料の採取方法、ＤＮＡの調製方法等は、制限されず、従来公知の方法が採用できる。
【００３９】
本発明において、前記試料中のＤＮＡに対する、本発明のプローブの添加割合（モル比）は、制限されないが、検出シグナルを十分に確保できることから、試料中のＤＮＡに対して１倍以下が好ましく、０．１倍以下がより好ましい。この際、試料中のＤＮＡとは、例えば、検出目的の多型が発生している検出対象ＤＮＡと前記多型が発生していない非検出対象ＤＮＡとの合計でもよいし、検出目的の多型が発生している検出対象配列を含む増幅産物と前記多型が発生していない非検出対象配列を含む増幅産物との合計でもよい。なお、試料中のＤＮＡにおける前記検出対象ＤＮＡの割合は、通常、不明であるが、結果的に、前記プローブの添加割合（モル比）は、検出対象ＤＮＡ（検出対象配列を含む増幅産物）に対して１０倍以下となることが好ましく、より好ましくは５倍以下、さらに、好ましくは３倍以下である。また、その下限は特に制限されないが、例えば、０．００１倍以上であり、好ましくは０．０１倍以上であり、より好ましくは０．１倍以上である。
【００４０】
前記ＤＮＡに対する本発明のプローブの添加割合は、例えば、二本鎖ＤＮＡに対するモル比でもよいし、一本鎖ＤＮＡに対するモル比でもよい。
【００４１】
Ｔｍ値について説明する。二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。この現象に基づき、融解温度Ｔｍとは、一般に、吸光度が、吸光度全上昇分の５０％に達した時の温度と定義される。
【００４２】
本発明において、Ｔｍ値を決定するための温度変化に伴うシグナル変動の測定は、前述のような原理から２６０ｎｍの吸光度測定により行うこともできるが、本発明のプローブに付加した標識のシグナルに基づくシグナルであってＤＮＡとプローブとのハイブリッド形成の状態に応じて変動するシグナルを測定することが好ましい。このため、本発明のプローブとして、前述の標識化プローブを使用することが好ましい。前記標識化プローブとしては、例えば、標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、且つ標的配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少（消光）する蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブ、または標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、且つ標的配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が増加する蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブが挙げられる。前者のようなプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成している際にはシグナルを示さないか、シグナルが弱いが、加熱によりプローブが遊離するとシグナルを示すようになるか、シグナルが増加する。また、後者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成することによってシグナルを示し、加熱によりプローブが遊離するとシグナルが減少（消失）する。したがって、この標識に基づくシグナルの変化をシグナル特有の条件（吸光度等）で検出することによって、前記２６０ｎｍの吸光度測定と同様に、融解の進行ならびにＴｍ値の決定を行うことができる。標識化プローブにおける標識化物質は、例えば、前述のとおりであるが蛍光色素標識化プローブが好ましい。
【００４３】
次に、本発明の多型検出方法について、本発明のプローブとして、蛍光色素で標識化された標識化プローブを使用する例を挙げて説明する。なお、本発明の多型検出方法は、本発明のプローブを使用すること自体が特徴であり、その他の工程や条件については何ら制限されない。
【００４４】
まず、全血からゲノムＤＮＡを単離する。全血からのゲノムＤＮＡの単離は、従来公知の方法によって行うことができ、例えば、市販のゲノムＤＮＡ単離キット（商品名ＧＦＸ
Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ；ＧＥヘルスケ
アバイオサイエンス社製）等が使用できる。
【００４５】
次に、単離したゲノムＤＮＡを含む試料に標識化プローブを添加する。前記標識化プローブとしては、例えば、ＱＰｒｏｂｅがある。このＱＰｒｏｂｅとは、一般に、プローブ末端のシトシン塩基を蛍光色素で標識化したプローブであり、これが検出対象配列にハイブリッドすることで前記蛍光色素と検出対象配列のグアニン塩基とが相互作用し、その結果、蛍光が減少（または消光）するものである。標識化プローブの配列は、前述の通りであって、検出目的の多型に応じて、適宜選択すればよい。
【００４６】
前記検出用プローブは、単離したゲノムＤＮＡを含む液体試料に添加してもよいし、溶媒中でゲノムＤＮＡと混合してもよい。前記溶媒としては、特に制限されず、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ2、ＭｇＳＯ4、グリセロール等を含む溶媒、ＰＣＲ反応液等、従来公知のものが挙げられる。
【００４７】
前記検出用プローブの添加のタイミングは、特に制限されず、例えば、後述するＰＣＲ等の増幅処理を行う場合、増幅処理の後、ＰＣＲ増幅産物に対して添加してもよいし、増幅処理前に添加してもよい。このようにＰＣＲ等による増幅処理前に前記検出用プローブを添加する場合は、例えば、前述のように、その３'末端に、蛍光色素を付加したり、リ
ン酸基を付加することが好ましい。
【００４８】
好ましくは、単離したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ等の遺伝子増幅法によって検出目的の多型を生じる部位を含む配列（検出対象配列および／または非検出対象配列）を増幅させる。前記遺伝子増幅法は、制限されず、例えば、ＰＣＲ（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅ
ｎｃｅ ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法等が挙げられるが、ＰＣＲ法が
好ましい。なお、以下、ＰＣＲ法を例にあげて、本発明を説明するが、これには制限されない。なお、ＰＣＲの条件は、特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。
【００４９】
ＰＣＲのプライマーの配列は、目的の検出対象配列および／または非検出対象配列（プローブがハイブリダイズする領域）を増幅できるものであれば特に制限されず、目的の配列に応じて、従来公知の方法により適宜設計できる。プライマーの長さは、特に制限されず、一般的な長さ（例えば、１０〜５０ｍｅｒ）に設定できる。以下に、前記Ｐ１〜Ｐ９のプローブを使用する際の、検出対象配列の増幅に使用できるプライマーセットの一例を示す。なお、これらは例示であって、本発明を制限するものではない。
【００５０】
Ｐ１プローブ用のプライマーセット
センスプライマー  配列番号２１
５’−  ｇｇｃｃｇｇｃｃｃｃｇｔｇｇｔｇｃｔｇｃｔｇｔａｃａｔｇ−３’
アンチセンスプライマー  配列番号２２
５’−  ｔｃｃａｔｇｇｃｇｃａｇｇｃｔｇｃｃｔｇ−３’
Ｐ２〜Ｐ４プローブ用のプライマーセット
センスプライマー  配列番号２３
５’−  ｇａｃａａｇｔｇｇｇａｇａｔｇｇａａｃｇｃ−３’
アンチセンスプライマー  配列番号２４
５’−  ｃａｃｇｇｃｃａｃｃｇｔｃａｇｇ−３’
Ｐ８〜Ｐ９プローブ用のプライマーセット
センスプライマー  配列番号２５
５’−  ｇａａａｇａａｇｃｔｇｃａｇｔｃａｔｇａａａｇａｇａｔ−３’
アンチセンスプライマー  配列番号２６
５’−  ｃｇｃｇａｇａｃｃｃｔｃｔｃｔｔｃａｇａｇｃ−３’
Ｐ５〜Ｐ７プローブ用のプライマーセットも配列番号３に基づいて容易に設計することができる。
【００５１】
なお、増幅の際、リアルタイムＰＣＲによって増幅をモニタリングし、試料に含まれるＤＮＡ（検出対象配列）のコピー数を調べることもできる。すなわち、ＰＣＲによるＤＮＡ（検出対象配列）の増幅に従ってハイブリッドを形成するプローブの割合が増えるので蛍光強度が変動する。これをモニタリングすることで、試料に含まれる検出対象配列（正常ＤＮＡまたは変異ＤＮＡ）のコピー数や存在比を調べることができる。
【００５２】
次に、得られたＰＣＲ増幅産物の解離、および、解離により得られた一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリダイズを行う。
【００５３】
前記解離工程における加熱温度は、前記増幅産物が解離できる温度であれば特に制限されないが、例えば、８５〜９５℃である。加熱時間も特に制限されないが、通常、１秒〜１０分であり、好ましくは１秒〜５分である。
【００５４】
また、解離した一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリダイズは、例えば、前記解離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件としては、例えば、４０〜５０℃である。
【００５５】
ハイブリダイズ工程の反応液における各組成の体積や濃度は、特に制限されない。具体例としては、前記反応液におけるＤＮＡの濃度は、例えば、０．０１〜１μＭであり、好ましくは０．１〜０．５μＭ、前記標識化プローブの濃度は、例えば、前記ＤＮＡに対する添加割合を満たす範囲が好ましく、例えば、０．００１〜１０μＭであり、好ましくは０．００１〜１μＭである。
【００５６】
そして、得られた前記一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリッド形成体を徐々に加熱し、温度上昇に伴うシグナルの変動を測定する。例えば、ＱＰｒｏｂｅを使用した場合、一本鎖ＤＮＡとのハイブリダイズした状態では、蛍光が減少（または消光）し、解離した状態では、蛍光を発する。したがって、例えば、蛍光が減少（または消光）しているハイブリッド形成体を徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【００５７】
蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されないが、例えば、開始温度が室温〜８５℃であり、好ましくは２５〜７０℃であり、終了温度は、例えば、４０〜１０５℃である。また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば、０．１〜２０℃／秒であり、好ましくは０．３〜５℃／秒である。
【００５８】
次に、前記シグナルの変動を解析してＴｍ値として決定する。具体的には、得られた蛍光強度から各温度における値（−ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ）を算出し、最も低い値を示す温度をＴｍ値として決定できる。また、単位時間当たりの蛍光強度増加量（蛍光強度増加量／ｔ）が最も高い点をＴｍ値として決定することもできる。なお、標識化プローブとして、消光プローブではなく、単独でハイブリッド形成によりシグナル強度が増加するプローブを使用した場合には、反対に、蛍光強度の減少量を測定すればよい。
【００５９】
前記Ｔｍ値は、例えば、従来公知のＭＥＬＴＣＡＬＣソフトウエア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｌｔｃａｌｃ．ｃｏｍ／）等により算出でき、また、隣接法（Ｎｅａｒｅｓｔ
Ｎｅｉｇｈｂｏｒ Ｍｅｔｈｏｄ）によって決定することもできる。
【００６０】
また、本発明においては、前述のように、ハイブリッド形成体を加熱して、温度上昇に伴うシグナル変動を測定する方法に代えて、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナル変動の測定を行ってもよい。すなわち、前記プローブを添加した試料の温度を降下させてハイブリッド形成体を形成する際に、前記温度降下に伴うシグナル変動を測定してもよい。
【００６１】
具体例として、標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、且つ標的配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少（消光）する蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブ（例えば、ＱＰｒｏｂｅ）を使用した場合、前記プローブを試料に添加した際には、前記プローブは解離しているため蛍光を発しているが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、前記蛍光が減少（または消光）する。したがって、例えば、前記加熱した試料の温度を徐々に降下して、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。
他方、ハイブリッド形成によりシグナルが増加する標識化プローブを使用した場合、前記プローブを試料に添加した際には、前記プローブは解離しているため蛍光を発していないが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光を発するようになる。したがって、例えば、前記試料の温度を徐々に降下して、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
本発明のａｂｌ遺伝子多型検出方法によれば、ａｂｌ遺伝子の、白血病に対する薬剤（例えば、イマチニブ）への耐性に関与する変異の有無を調べることができる。多型の有無や変異配列と正常配列の存在比に基づいて抗白血病薬に対する耐性や抗白血病薬の薬効を判定することができる。そして、本発明の方法は、変異の有無や変異配列の存在比に基づいて、薬剤の投与量の増加、他の治療薬への変更、骨髄移植等への切り替え等の白血病の治療方針を決定するのに有用である。
【００６２】
＜ａｂｌ遺伝子多型検出用試薬キット＞
本発明のａｂｌ遺伝子多型検出用試薬キットは、ａｂｌ遺伝子の多型の検出に使用する試薬キットであり、本発明のプローブを含むことを特徴とする。本発明の試薬キットにおいて、本発明のプローブは、一種類でもよいし二種類以上であってもよい。後者の場合、二種類以上のプローブは、混合された状態で含まれてもよいし、別個の試薬として含まれていてもよい。また、二種類以上の本発明のプローブが混合された状態で本発明のプローブキットに含まれる場合や、別個の試薬として含まれているが、例えば、使用時に同じ反応系で、各プローブと各検出対象配列とのＴｍ分析を行う場合、各プローブは、別個の蛍光物質で標識化されていることが好ましい。このように蛍光物質の種類を変えることで、同じ反応系であっても、それぞれのプローブについての検出が可能になる。前記蛍光物質としては、例えば、検出波長が異なる物質であることが好ましい。
また、ａｂｌ遺伝子多型検出用試薬キットは上記多型部位を含む配列（プローブがハイブリダイズする領域）を増幅するためのプライマーセットを含むものであってもよい。
【００６３】
前述のように、ａｂｌ遺伝子には、白血病に関連する複数の変異が知られており、本発
明のプローブによれば、前述した各種変異を検出することが可能である。白血病に関与するａｂｌ遺伝子は、いずれか一箇所の変異のみが検出される場合もあるが、複数個所の変異が検出される場合もあるので、複数の変異を検出し、それらの結果を総合的に判断することで、より良い診断や治療が可能になる。したがって、本発明の試薬キットにおいて、本発明のプローブを２種類以上含有させることによって、診断や治療等のための変異の検出をより簡便に行うことができる。
【００６４】
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は下記の実施例により制限されない。
【実施例１】
【００６５】
ａｂｌ遺伝子の１０７６番目塩基の点突然変異（Ｔ→Ｇ）
本発明のプローブを使用して、ａｂｌ遺伝子における１０７６番目塩基の点突然変異（Ｔ→Ｇ）について、全自動SNPs検査装置（商品名i-densy（商標）、アークレイ社製）を
用いてPCRおよびTm分析を行った。
【００６６】
配列番号１に示す１３３番目の塩基Ｔに変異を有さない正常ａｂｌ遺伝子配列（配列番号１）を挿入したプラスミド（ｗｔＤＮＡ）と、前記１３３番目の塩基ＴがＧに変異した変異ａｂｌ遺伝子（ａｂｌチロシンキナーゼＴ１０７６Ｇ（Ｆ３５９Ｃ）、配列番号２）を挿入したプラスミド（ｍｔＤＮＡ）を所定の割合（ｍｔＤＮＡ：ｗｔＤＮＡ＝２５コピー：９７５コピー）で混合し（変異含有率２．５％）、１，０００コピー／μＬに希釈調製してこれを鋳型核酸とした。反応溶液は表２の処方とした。ＰＣＲ反応は９５℃で６０秒処理した後、９５℃１秒および６４℃３０秒を１サイクルとして５０サイクル繰り返した。その後さらに９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理し、続けて温度の上昇速度を１℃／３秒で４０℃から９５℃に加熱していき、経時的な蛍光強度の変化を測定した（ＷＡＶＥ３:５８５〜７００ｎｍ）。
【００６７】
【表２】
0005940771.tif 000003
【００６８】
センスプライマー  配列番号２１
５’−ｇｇｃｃｇｇｃｃｃｃｇｔｇｇｔｇｃｔｇｃｔｇｔａｃａｔｇ−３’
アンチセンスプライマー  配列番号２２
５’−ｔｃｃａｔｇｇｃｇｃａｇｇｃｔｇｃｃｔｇ−３’
（実施例１）
検出用プローブＰ１  配列番号９
５’−ｃｃｔｇｔｇｇａｔｇＣａｇｔｔｔｔｔｃ−（ＴＡＭＲＡ）−３’
（比較例１）
検出用プローブ  配列番号９
５’−（ＴＡＭＲＡ）−ｃｃｔｇｔｇｇａｔｇＣａｇｔｔｔｔｔｃ−Ｐ−３’
このプローブは、実施例１の検出用プローブと配列は同じであるが、５’末端のｃ（配列番号２の塩基番号１４３のｇの相補塩基であるｃ）が蛍光色素で標識されているプローブである。
【００６９】
この結果を図３に示す。図３Ａは、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ分析のグラフである。検出用プローブＰ１を用いてPCRおよびTm分析を行った結果、ｗｔＤＮＡの
ピークが５１℃付近にみられ、ｍｔＤＮＡのピークが６１℃付近にみられた。
この結果から、検出用プローブＰ１によれば、ｍｔＤＮＡとｗｔＤＮＡとが共存する場合でも、ｍｔＤＮＡの検出感度を向上できることがわかった。
これに対して、図３Ｂより、比較例１の検出用プローブを使用した場合、検出ピークがほとんど確認できず、変異の有無が不明であった。以上の結果から、プローブのいずれかのｃが蛍光標識されていればよいというわけではなく、１２５番目のｇの相補塩基であるｃが蛍光標識されていることが重要であることが理解された。
【実施例２】
【００７０】
ａｂｌ遺伝子の７５７番目塩基の点突然変異（Ｔ→Ｃ）
本発明のプローブを使用して、ａｂｌ遺伝子における７５７番目塩基の点突然変異（Ｔ→Ｃ）について、全自動SNPs検査装置（商品名i-densy（商標）、アークレイ社製）を用
いてPCRおよびTm分析を行った。
【００７１】
配列番号３に示す１３５番目の塩基Ｔに変異を有さない正常ａｂｌ遺伝子配列（配列番号３）を挿入したプラスミド（ｗｔＤＮＡ）と、前記１３５番目の塩基ＴがＣに変異した変異ａｂｌ遺伝子（ａｂｌチロシンキナーゼＴ７５７Ｃ（Ｙ２５３Ｈ）、配列番号４）を挿入したプラスミド（ｍｔＤＮＡ）を所定の割合（ｍｔＤＮＡ：ｗｔＤＮＡ＝１００コピー：９００コピー）に混合し（変異含有率１０％）、１０００コピー／μＬに希釈調製してこれを鋳型核酸として反応を行った。なお、検出用プローブＰ２については変異含有率２０％と０％についても評価した。反応溶液は表３の処方とした。ＰＣＲ反応は９５℃で６０秒処理した後、９５℃１秒および５８℃３０秒を１サイクルとして５０サイクル繰り返した。その後さらに９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理し、続けて温度の上昇速度を１℃／３秒で４０℃から９５℃に加熱していき、経時的な蛍光強度の変化を測定した（ＷＡＶＥ３:５８５〜７００ｎｍ）。
【００７２】
【表３】
0005940771.tif 000004
センスプライマー  配列番号２３
５’−ｇａｃａａｇｔｇｇｇａｇａｔｇｇａａｃｇｃ−３’
アンチセンスプライマー  配列番号２４
５’−ｃａｃｇｇｃｃａｃｃｇｔｃａｇｇ−３’
（実施例２−１）
検出用プローブＰ２  配列番号１０
５’−（ＴＡＭＲＡ）−ｃａｃｃｔｃｃｃｃｇｔＧｃｔｇ−Ｐ−３’
（実施例２−２）
検出用プローブＰ３  配列番号１１
５’−（ＴＡＭＲＡ）−ｃｃｔｃｃｃｃｇｔＧｃｔｇｇｃ−Ｐ−３’
（実施例２−３）
検出用プローブＰ４  配列番号１２
５’−ｇｔａｃａｃｃｔｃｃｃｃｇｔＧｃ−（ＴＡＭＲＡ）−３’
【００７３】
これらの結果を図４に示す。図４は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ分析のグラフである。図４において、（Ａ）は、実施例２−１、（Ｂ）は、実施例２−２、（Ｃ）は、実施例２−３の結果である。（Ａ）より、検出用プローブＰ２を用いてPCRおよびTm分析を行った結果、変異含有率０％ではｗｔＤＮＡのピークのみが５２℃付近にみられ
（I）、変異含有率１０％（II）、２０％（III）ではｗｔＤＮＡのピークとともにｍｔＤＮＡのピークが５８℃付近にみられ、ｍｔＤＮＡのピークは変異含有率とともに増大した。検出用プローブＰ３を用いてPCRおよびTm分析を行った結果、ｗｔＤＮＡのピークが５６℃付近にみられ、ｍｔＤＮＡのピークが６２℃付近にみられた（Ｂ）。検出用プローブＰ４を用いてPCRおよびTm分析を行った結果、ｗｔＤＮＡのピークが５７℃付近にみられ
、ｍｔＤＮＡのピークが６３℃付近にみられた（Ｃ）。
これらの結果から、検出用プローブＰ２〜４によれば、ｍｔＤＮＡとｗｔＤＮＡとが共存する場合でも、ｍｔＤＮＡの検出感度を向上できることがわかった。
配列番号４の塩基番号１４６、１４４または１３４番目のｇの相補塩基であるｃが蛍光標識されていることが重要であることが理解された。
【実施例３】
【００７４】
ａｂｌ遺伝子の７６４番目塩基の点突然変異（Ａ→Ｔ）
本発明のプローブを使用して、ａｂｌ遺伝子における７６４番目塩基の点突然変異（Ａ→Ｔ）について、全自動SNPs検査装置（商品名i-densy（商標）、アークレイ社製）を用
いてPCRおよびTm分析を行った。
【００７５】
配列番号３に示す１４２番目の塩基Ａに変異を有さない正常ａｂｌ遺伝子配列（ｗｔＤＮＡ）の相補鎖オリゴヌクレオチド（配列番号２７）と、前記１４２番目の塩基ＡがＴに変異した変異ａｂｌ遺伝子（ａｂｌチロシンキナーゼＡ７６４Ｔ（Ｅ２５５Ｖ））（ｍｔＤＮＡ）の相補鎖オリゴヌクレオチド（配列番号２８）を合成した。そして、両者を所定の割合（ｍｔＤＮＡ：ｗｔＤＮＡ＝１μＭ：９μＭ）に混合した（変異含有率１０％）。プローブのハイブリダイゼーションおよび蛍光強度の検出を以下表４の組成の反応液を反応チューブに添加し、９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理し、続けて温度の上昇速度を１℃／３秒で４０℃から９５℃に加熱していき、経時的な蛍光強度の変化を測定した（ＷＡＶＥ３:５８５〜７００ｎｍ）。
【００７６】
【表４】
0005940771.tif 000005
【００７７】
（実施例３−１）
検出用プローブＰ５  配列番号１３
５’−ｃｃｔｃｇｔａｃａｃｃＡｃｃｃｃ−（ＴＡＭＲＡ）−３’
（実施例３−２）
検出用プローブＰ６  配列番号１４
５’−（ＴＡＭＲＡ）−ｃｃｔｃｇｔａｃａｃｃＡｃｃｃｃ−Ｐ−３’
（実施例３−３）
検出用プローブＰ７  配列番号１５
５’−（ＴＡＭＲＡ）−ｃｇｔａｃａｃｃＡｃｃｃｃｇｔａ−Ｐ−３’
（実施例３−４）
検出用プローブＰ３’  配列番号１６
５’−（ＴＡＭＲＡ）−ｃｃＡｃｃｃｃｇｔａｃｔｇｇｃｃ−Ｐ−３’
【００７８】
これらの結果を図５に示す。図５は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ分析のグラフである。図５において、（Ａ）は、実施例３−１、（Ｂ）は、実施例３−２、（Ｃ）は、実施例３−３、（Ｄ）は、実施例３−４の結果である。検出用プローブＰ５を用いてTm分析を行った結果、ｗｔＤＮＡのピークが５６℃付近にみられ、ｍｔＤＮＡのピークが６２℃付近にみられた（Ａ）。検出用プローブＰ６を用いてTm分析を行った結果、ｗｔＤＮＡのピークが５５℃付近にみられ、ｍｔＤＮＡのピークが６２℃付近にみられた（Ｂ）。検出用プローブＰ７を用いてTm分析を行った結果、ｗｔＤＮＡのピークが５０℃付近にみられ、ｍｔＤＮＡのピークが５９℃付近にみられた（Ｃ）。検出用プローブＰ３’を用いてTm分析を行った結果、ｗｔＤＮＡのピークが５８℃付近にみられ、ｍｔＤＮＡのピークが６３℃付近にみられた（Ｄ）。
これらの結果から、検出用プローブＰ３’、５〜７によれば、ｍｔＤＮＡとｗｔＤＮＡとが共存する場合でも、ｍｔＤＮＡの検出感度を向上できることがわかった。
配列番号５の塩基番号１３８、１５３、１５０または１４４番目のｇの相補塩基であるｃが蛍光標識されていることが重要であることが理解された。
【実施例４】
【００７９】
ａｂｌ遺伝子の８９５番目塩基の点突然変異（Ｇ→Ｃ／Ｔ）
本発明のプローブを使用して、ａｂｌ遺伝子における８９５番目塩基の点突然変異（Ｇ→Ｃ／Ｔ）について、全自動SNPs検査装置（商品名i-densy（商標）、アークレイ社製）
を用いてPCRおよびTm分析を行った。
【００８０】
配列番号６に示す１２６番目の塩基Ｇに変異を有さない正常ａｂｌ遺伝子配列（配列番号６）を挿入したプラスミド（ｗｔＤＮＡ）と、前記１２６番目の塩基ＧがＣまたはＴに変異した変異ａｂｌ遺伝子（ａｂｌチロシンキナーゼＧ８９５Ｃ／Ｔ（Ｖ２９９Ｌ）、配
列番号７または８）を挿入したプラスミド（ｍｔＤＮＡ）を所定の割合（ｍｔＤＮＡ：ｗｔＤＮＡ＝５０コピー：９５０コピー）に混合し（変異含有率５％）、１０００コピー／μＬに希釈調製してこれを鋳型核酸として反応を行った。反応溶液は表５の処方とした。ＰＣＲ反応は９５℃で６０秒処理した後、９５℃１秒および６４℃１５秒を１サイクルとして５０サイクル繰り返した。その後さらに９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理し、続けて温度の上昇速度を１℃／３秒で４０℃から９５℃に加熱していき、経時的な蛍光強度の変化を測定した（ＷＡＶＥ２:５２０〜５５５ｎｍ、ＷＡＶＥ３:５８５〜７００ｎｍ）。
【００８１】
【表５】
0005940771.tif 000006
センスプライマー  配列番号２５
５’−ｇａａａｇａａｇｃｔｇｃａｇｔｃａｔｇａａａｇａｇａｔ−３’
アンチセンスプライマー  配列番号２６
５’−ｃｇｃｇａｇａｃｃｃｔｃｔｃｔｔｃａｇａｇｃ−３’
（実施例４−１）
検出用プローブＰ８  配列番号１７
５’−ｃｃｔｇＣｔｇｃａｇｃｔｃｃ−（ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ）−３’
（実施例４−２）
検出用プローブＰ９  配列番号１８
５’−ａｃｃｃｔａａｃｃｔｇＣｔｇｃ−（ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ）−３’
（実施例４−３）
検出用プローブＰ８  配列番号１９
５’−ａａｃｃｔｇＴｔｇｃａｇｃｔｃｃ−（ＴＡＭＲＡ）−３’
（実施例４−４）
検出用プローブＰ９  配列番号２０
５’−ｔｃａａａｃａｃｃｃｔａａｃｃｔｇＴｔｇｃ−（ＴＡＭＲＡ）−３’
【００８２】
これらの結果を図６に示す。図６は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ分析のグラフである。図６において、（Ａ）は、実施例４−１、（Ｂ）は、実施例４−２、（Ｃ）は、実施例４−３、（Ｄ）は、実施例４−４の結果である。検出用プローブＰ８を用いてPCRおよびTm分析を行った結果、ｗｔＤＮＡのピークが４７℃付近にみられ、ｍｔＤＮ
Ａのピークが６１℃付近にみられた（Ａ）。検出用プローブＰ９を用いてPCRおよびTm分
析を行った結果、ｗｔＤＮＡのピークが４４℃付近にみられ、ｍｔＤＮＡのピークが５８℃付近にみられた（Ｂ）。検出用プローブＰ８を用いてPCRおよびTm分析を行った結果、
ｗｔＤＮＡのピークが５２℃付近にみられ、ｍｔＤＮＡのピークが６１℃付近にみられた（Ｃ）。検出用プローブＰ９を用いてPCRおよびTm分析を行った結果、ｗｔＤＮＡのピー
クが５８℃付近にみられ、ｍｔＤＮＡのピークが６３℃付近にみられた（Ｄ）。
これらの結果から、検出用プローブＰ８，９によれば、ｍｔＤＮＡとｗｔＤＮＡとが共存する場合でも、ｍｔＤＮＡの検出感度を向上できることがわかった。
配列番号７，８の塩基番号１３５または１２９番目のｃが蛍光標識されていることが重要であることが理解された。
【００８３】
実施例１〜４の結果より、Ｐ１〜９（配列番号９〜２０）のプローブを用いたとき、ａｂｌ遺伝子の多型（T1076G (F359C)、T757C (Y253H)、A764T (E255V)、およびG895C/T (V299L)）について、Tm分析で解析の可能な蛍光強度の変化が認められた。すなわち、変異
型は、野生型のピークに加えて、他のピークを有するものであり、固有の蛍光強度の変化量のパターンの変化が存在する。従って、Ｐ１〜９（配列番号９〜２０）のプローブを用いることにより、ａｂｌ遺伝子の多型を検出することができる。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明は医療、診断、研究等の分野で好適に利用できる。
【図１】
0005940771.tif 000007
【図２】
0005940771.tif 000008
【図３Ａ】
0005940771.tif 000009
【図３Ｂ】
0005940771.tif 000010
【図４Ａ】
0005940771.tif 000011
【図４Ｂ】
0005940771.tif 000012
【図４Ｃ】
0005940771.tif 000013
【図５Ａ】
0005940771.tif 000014
【図５Ｂ】
0005940771.tif 000015
【図５Ｃ】
0005940771.tif 000016
【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
0005940771.tif 000018
【図６Ｂ】
0005940771.tif 000019
【図６Ｃ】
0005940771.tif 000020
【図６Ｄ】
0005940771.tif 000021
【配列表】
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