(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シロ‐イノシトールの製造方法であって、以下の工程：
１）  イノシトール‐１‐リン酸合成酵素遺伝子、イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子、ミオイノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子およびシロ‐イノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を保有する形質転換微生物を用意する工程；
２）  前記微生物の生育及び／又は維持に適した条件下で、該微生物とグルコース又はグルコース単位を有する二糖類若しくは多糖類を接触させる工程；
を含み、前記形質転換微生物が大腸菌であり、前記イノシトール‐１‐リン酸合成酵素遺伝子、イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子、ミオイノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子およびシロ‐イノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子が該大腸菌に導入されることで該形質転換微生物内で過剰発現されることを特徴とする、前記製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シロ‐イノシトールの製造における遺伝子組換技術の応用に関する。特に、一段階の行程によりグルコース等の遍在的原料からシロ‐イノシトールを生産し得る形質転換体、及び当該形質転換体を利用したシロ‐イノシトールの工業的製造方法に関する。また、本発明は、前記形質転換体によって生産され得るシロ‐イノシトール誘導体及びその製造方法、並びに当該誘導体からのシロ‐イノシトールの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
シロ‐イノシトール（ｓｃｙｌｌｏ‐ｉｎｏｓｉｔｏｌ；ｃｉｓ‐１，３，５‐ｔｒａｎｓ‐２，４，６‐シクロヘキサンへキソール）は、イノシトールの光学不活性異性体の一つであり、古くから動物及び植物に見出されていた化合物である。しかし、近年になり、シロ‐イノシトールが有する様々な生理活性が注目されてきている。【０００３】
例えば、非特許文献１は、シロ‐イノシトールがアミロイドβ蛋白質凝集抑制作用を有することを報告しており、当該作用は、シロ‐イノシトールのアルツハイマー病治療における潜在的有用性を示唆している。また、特許文献１は、シロ‐イノシトールを有効成分とする血糖値低下剤を特許請求している。したがって、シロ‐イノシトールを工業的に生産することの明確な必要性が存在している。【０００４】
古典的な生産方法では、シロ‐イノシトールが植物体から抽出されるか、ミオイノシトールを原料として当該化合物が化学合成されていた（非特許文献２及び３、特許文献２等）。しかし、近年になって、天然型微生物或いは微生物由来の酵素を利用して、より効率的にシロ‐イノシトールを生産する方法が検討されてきている。【０００５】
特許文献３は、アグロバクテリウム属に属する微生物を、ミオイノシトールを含有する培地で培養して培養液中にイノシトール立体異性体を生成させるか、又はアグロバクテリウム属に属する微生物の菌体または菌体処理物をミオイノシトールに作用させて、イノシトール立体異性体を生成させる方法を開示している。それらの異性体化により、ミオイノシトールが、シロ‐イノシトール、キロ‐イノシトール（ｃｈｉｒｏ‐ｉｎｏｓｉｔｏｌ：Ｄ体とＬ体の混合物として）及びネオ‐イノシトール（ｎｅｏ‐ｉｎｏｓｉｔｏｌ）の混合物に変換されたとされている。【０００６】
特許文献４には、ミオイノシトールに対してシュードモナス  ｓｐ．ＡＢ１００６４株（ＦＥＲＭＰ‐１８３３０）或いはアセトバクター  ｓｐ．ＡＢ１０２５３株（ＦＥＲＭＰ‐１８８６８）を作用させて、ミオイノシトールをシロ‐イノソース（ｓｃｙｌｌｏ‐ｉｎｏｓｏｓｅ）へと変換させることが記載されている。更に、それによって生成したシロ‐イノソースを水素化ホウ素ナトリウムで還元することで、シロ‐イノシトールを合成することが試みられたが、当該還元処理では、根本的に、シロ‐イノシトールはミオイノシトール（つまり、原料への逆行反応）との混合物としてのみ、生成された。したがって、特許文献４に記載されたシロ‐イノシトールの製造方法では、ミオイノシトールの微生物によるシロ‐イノソースへの変換と水素化ホウ素ナトリウムによる還元処理を繰り返しながら、漸次、シロ‐イノシトールの含有量を増加させていく必要があった。【０００７】
特許文献５は、ミオイノシトールを原料として用い、ミオイノシトールからシロ‐イノソースを生成するミオイノシトール２‐デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１８）と、シロ‐イノソースを立体選択的にシロ‐イノシトールに還元するシロ‐イノシトールデヒドロゲナーゼと、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋を混合した溶液中で、ミオイノシトールをシロ‐イノシトールへ酵素変換反応させる、シロ‐イノシトールの製造方法を開示している。当該文献でのミオイノシトールからシロ‐イノシトールへの変換は、収量ベースで３１％であったとされる。【０００８】
従って、上記のいずれの文献も、ミオイノシトールを出発原料としてシロ‐イノシトールを生産する方法に関するものであり、ｄｅ  ｎｏｖｏのシロ‐イノシトール生合成、つまりグルコース等の遍在的原料からシロ‐イノシトールを直接的に且つ一段階行程で生産する方法を教示していない。【０００９】
殊に、そもそもミオイノシトールは、それ自体が極めて有用で且つ貴重な生理活性物質である。すなわち、ミオイノシトールは、多くの高等動物にとって必要不可欠な物質であるため、栄養食品、飼料、医薬品等の成分として広範に利用されている。例えば、ミオイノシトールは、脂肪やコレステロール類の代謝において重要な役割を担っていることが知られており、特に高コレステロール血症等の予防や治療に有効とされている。【００１０】
従って、現実的には、ミオイノシトールの工業的スケールでの製造プロセスについてさえも多くの改良が提案されている最中なのである。例えば、特許文献６は、ミオイノシトールを菌体外に分泌し得るキャンディダ属酵母の発見及びその利用を開示している。特許文献７及び８は、それぞれ、前記ミオイノシトール分泌性キャンディダ属酵母にグルコース代謝拮抗物質及び抗生物質に対する耐性を付与する突然変異を導入することを開示している。特許文献９、１０及び１１もまた、それぞれ、ミオイノシトール生産能を有するキャンディダ属酵母に対して３級アミン、ヘキサクロロシクロヘキサン及びセチルトリメチルアンモニウム塩に対する耐性を付与する突然変異を導入することで、ミオイノシトールの収率を向上させることを開示している。特許文献１２は、同じくミオイノシトール生産能を有するキャンディダ属酵母に対して６‐ハロゲノ‐６‐デオキシグルコースに対する耐性を付与する突然変異を導入することを開示している。特許文献１３も、ミオイノシトール生産能を有するキャンディダ属酵母に対してハロゲン化ピルビン酸に対する耐性を付与する突然変異を導入することを開示している。そしてその他にも、例えば、特許文献１４は、一連のミオイノシトール生合成反応においてイノシトール‐１‐リン酸合成酵素が律速反応を担うとの妥当な推論の下で、ミオイノシトール分泌能を有さないキャンディダ属酵母を前記イノシトール‐１‐リン酸合成酵素コード化ＤＮＡの単独によって形質転換することで、当該酵母に対してミオイノシトール生産能を付与できたことを開示しているし、特許文献１５は、酵母に対して、グリセロール‐３‐リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターの制御下におかれたイノシトール‐１‐リン酸合成酵素コード化ＤＮＡを単独で導入することにより、該酵母のミオイノシトール生産性を向上させることを開示している。【００１１】
上記の事実はいずれも、ミオイノシトールの効率的且つ経済的な生産方法を確立すること自体が、今日においても、依然として重要な技術的課題である事を物語っている。従ってまた、そのように貴重で高価なミオイノシトールを原料としなければならない従来技術のシロ‐イノシトール製造方法の低効率性や不経済性は、一目瞭然である。【００１２】
更に、上記のいずれの文献も、シロ‐イノシトール誘導体、とりわけ糖類により誘導体化されたシロ‐イノシトールを開示も示唆もしていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開２００３‐１６０４７８号公報
【特許文献２】西ドイツ特許公開公報第３，４０５，６６３号公報
【特許文献３】特開平９‐１４０３８８号公報
【特許文献４】特開２００３‐１０２４９２号公報
【特許文献５】特開２０１０‐１８７６８８号公報
【特許文献６】特開平８‐００２５８号公報
【特許文献７】特開平８‐３８１８８号公報
【特許文献８】特開平８‐８９２６２号公報
【特許文献９】特開平９‐１１７２９５号公報
【特許文献１０】特開平１０‐４２８６０号公報
【特許文献１１】特開平１０‐４２８８２号公報
【特許文献１２】特開平１０‐４２８８３号公報
【特許文献１３】特開２０００‐４１６８９公報
【特許文献１４】特開平９‐２２００９３号公報
【特許文献１５】特開平１０‐２７１９９５号公報
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌ．２７５、Ｎｏ．２４、ｐｐ．１８４９５〜１８５０２（２０００）
【非特許文献２】薬学雑誌、８９巻、１３０２〜１３０５頁（１９６９）
【非特許文献３】Ｌｉｅｂｉｇｓ  Ａｎｎ．Ｃｈｅｍ．、８６６〜８６８頁（１９８５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
従って、本発明の第１の課題は、グルコース等の安価で遍在的原料から、一段階の行程によりシロ‐イノシトールを生産し得る工業的製造方法に関連する。更に、本発明者らは、前記研究の過程で、糖類と結合した本発明のシロ‐イノシトール誘導体を始めて発見した。当該シロ‐イノシトール誘導体は、シロ‐イノシトールが本来から示す水溶性に比べてさえも、格段に優れた水溶性を示した。例えば、セロビオース（Ｄ‐グルコピラノシル‐（β１→４）‐Ｄ‐グルコース）は、グルコースよりも低い溶解性を示すことから、本発明の知見は驚くべきものであった。したがって、本発明の第２の課題は、新規なシロ‐イノシトール誘導体の提供である。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
前記のように、最近のいずれの研究も、専らミオイノシトールを出発原料としてシロ‐イノシトールを酵素反応的に変換する方法に関するものであった。前記のいずれの先行文献も、宿主微生物細胞内での機能的なｄｅ  ｎｏｖｏのシロ‐イノシトール生合成系の構築、つまりグルコース等の遍在的原料からシロ‐イノシトールを直接的に且つ一段階行程で発酵生産する方法の確立に成功してはいない。【００１７】
しかしながら、本発明者らは、イノシトール‐１‐リン酸合成酵素遺伝子、イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子、ミオイノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子およびシロ‐イノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を発現する形質転換体が、グルコースからシロ‐イノシトールを直接的に且つ一段階で発酵生産し得ることを見出した。更に、本発明者らは、そのような形質転換体の培養物中に新規のシロ‐イノシトール誘導体を発見した。
従って、本発明の第１の局面は：
（１）シロ‐イノシトールおよびシロイノシトール誘導体の製造方法であって、以下の工程：
１）  イノシトール‐１‐リン酸合成酵素遺伝子、イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子、ミオイノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子およびシロ‐イノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を保有する形質転換微生物を用意する工程；
２）  前記微生物の生育及び／又は維持に適した条件下で、該微生物とグルコース又はグルコース単位を有する二糖類若しくは多糖類を接触させる工程；
を含む、前記製造方法である。【００１８】
より特定的には、形質転換体を用いたシロ‐イノシトールおよびその誘導体の製造方法において、当該形質転換体が、イノシトール‐１‐リン酸合成酵素遺伝子、イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子、ミオイノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子およびシロ‐イノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を発現することを特徴とする、前記製造方法である。【００１９】
前記（１）の培養物中に生産されたシロ‐イノシトール誘導体は新規化合物であり、当該誘導体ではグルコースとシロ‐イノシトールがβ１→４結合していた。従って、本発明の一態様は：
（２）前記シロイノシトール誘導体が、下記の構造式：
【化１】
0005977264.tif 000002
で示される化合物である、上記（１）に記載の製造方法である。【００２０】
更に、驚くべきことに、そのような形質転換体のイノシトールモノフォスファターゼ活性を強化することにより、シロ‐イノシトール生産能が大幅に向上した。また、予期せぬことに、当該形質転換体ではシロ‐イノシトールが優勢に生産され、ミオイノシトールの生産は僅かであった。本願の優先日以前のいずれの先行文献も、当該目的のためにイノシトールモノフォスファターゼ活性を強化することを開示も示唆もしてはいない。従って、本発明の第２の局面は：
（３）前記形質転換微生物が、機能的なイノシトールモノフォスファターゼの過剰生産又はイノシトールモノフォスファターゼの活性化を誘導する遺伝子組換又は変異を有することを特徴とする、上記（１）又は（２）に記載の製造方法である。【００２１】
大腸菌に代表される原核微生物は、その迅速な生育能力や発酵管理の容易さ故に工業的発酵生産の観点から極めて魅力的であるとともに、遺伝子組換技術の適用における実績、確立した安全性の観点からも利点を有する。また、グルコースからミオイノシトールを経てシロ‐イノシトールを生合成する経路を持たない多くの原核微生物は、遺伝子組換技術と連携した合成生物学的手法を用いることで、シロ‐イノシトール生産性を制御しやすいという利点を持つ。殊に大腸菌などの原核微生物宿主は、シロ‐イノシトール生合成経路の中間体であるミオイノシトールを資化する能力（分解能）を持たないため、合成生物学的手法の適用をいっそう容易にする。【００２２】
従って、本発明の好適な態様は：
（４）前記形質転換微生物が、ミオイノシトール資化能を有さない微生物に由来することを特徴とする、上記（１）乃至（３）のいずれかに記載の製造方法、並びに
（５）前記形質転換微生物が、大腸菌、バチルス属細菌、コリネバクテリウム属細菌、ザイモモナス属細菌からなる群から選択される細菌に由来する、上記（１）乃至（４）のいずれかに記載の製造方法である。【００２３】
上記（３）の好適な態様に関して、宿主微生物が内因性イノシトールモノフォスファターゼ活性を有しているか否かに関わらず、該細胞内でイノシトールモノフォスファターゼを過剰生産させることで、該細胞のイノシトールモノフォスファターゼ活性を強化できる。様々な公知の技術を適用して細胞にイノシトールモノフォスファターゼを過剰生産させることができる。従って、本発明は以下の態様：
（６）前記イノシトールモノフォスファターゼの過剰生産が、前記形質転換微生物に対して、
ａ）  外来イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子を導入する、
ｂ）  内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子のコピー数を増加させる、
ｃ）  内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域に変異を導入する、
ｄ）  内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域を高発現誘導性外来調整領域で置換する、又は
ｅ）  内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域を欠失させる、
ことにより誘導される、上記（３）乃至（５）のいずれかに記載の製造方法；及び
（７）前記イノシトールモノフォスファターゼの過剰生産が、前記形質転換微生物に対して外来イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子を導入することにより誘導される、上記（６）に記載の製造方法、
を含む。【００２４】
また、宿主細胞が内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子を有している場合は、以下の態様によっても該細胞のイノシトールモノフォスファターゼ活性を強化できる。従って、本発明は以下の態様：
（８）前記イノシトールモノフォスファターゼの活性化が、前記形質転換微生物に対して、
ｆ）  内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子に変異を導入する、
ｇ）  内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の一部又は全部を置換する、
ｈ）  内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の一部を欠失させる、
ｉ）  イノシトールモノフォスファターゼ活性を低下させる他のタンパク質を減少させる、
ｊ）  イノシトールモノフォスファターゼ活性を低下させる化合物の生成を減少させる、
ことにより誘導される、上記（３）乃至（５）のいずれかに記載の製造方法、
も含む。【００２５】
また、本発明は、前記シロ‐イノシトールおよびその誘導体の製造方法に用いるための形質転換体も意図する。従って、本発明の別の局面は：
（９）イノシトール‐１‐リン酸合成酵素遺伝子、イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子、ミオイノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子およびシロ‐イノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を保有する形質転換微生物である。【００２６】
また、本発明の第２の局面について記載した事項及び態様は、本発明の上記（９）の形質転換体についても当てはまる。従ってそれらは、以下の：
（１０）前記形質転換微生物が、機能的なイノシトールモノフォスファターゼの過剰生産又はイノシトールモノフォスファターゼの活性化を誘導する遺伝子組換又は変異を更に有することを特徴とする、上記（９）に記載の形質転換微生物、
（１１）前記形質転換微生物が、ミオイノシトール資化能を有さない微生物に由来することを特徴とする、上記（９）又は（１０）に記載の形質転換微生物、
（１２）前記形質転換微生物が、大腸菌、バチルス属細菌、コリネバクテリウム属細菌、ザイモモナス属細菌からなる群から選択される細菌に由来する、上記（９）乃至（１１）のいずれかに記載の形質転換微生物、
（１３）前記イノシトールモノフォスファターゼの過剰生産が、前記形質転換微生物に対して、
ａ）  外来イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子を導入する、
ｂ）  内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子のコピー数を増加させる、
ｃ）  内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域に変異を導入する、
ｄ）  内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域を高発現誘導性外来調整領域で置換する、又は
ｅ）  内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域を欠失させる、
ことにより誘導されている、上記（１０）乃至（１２）のいずれかに記載の形質転換微生物、
（１４）前記イノシトールモノフォスファターゼの過剰生産が、前記形質転換微生物に対して外来イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子を導入することにより誘導されている、上記（１３）に記載の形質転換微生物、及び
（１５）前記イノシトールモノフォスファターゼの活性化が、前記形質転換微生物に対して、
ｆ）  内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子に変異を導入する、
ｇ）  内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の一部又は全部を置換する、
ｈ）  内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の一部を欠失させる、
ｉ）  イノシトールモノフォスファターゼ活性を低下させる他のタンパク質を減少させる、
ｊ）  イノシトールモノフォスファターゼ活性を低下させる化合物の生成を減少させる、
ことにより誘導されている、上記（１０）乃至（１２）のいずれかに記載の形質転換微生物、
を含む。【００２７】
本発明の更なる局面は、前記形質転換体の培養物中に生産されることが見出された、新規シロ‐イノシトール誘導体に関連する。すなわち、本発明は：
(１６）下記の構造式：
【化２】
0005977264.tif 000003
で示される化合物も意図する。【００２８】
本発明のシロ‐イノシトール誘導体は、β‐グリコシド結合を加水分解する反応を触媒できる酵素、例えばβ‐グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２１）によって分解され得、容易にグルコースとシロ‐イノシトールを生成する。また、本発明のシロ‐イノシトール誘導体の示す高い水溶性は、そのような酵素反応において有利であり得る。したがって、本発明の更に別のの局面は：
（１７）シロ‐イノシトールの製造方法であって、上記（１６）の化合物を、β‐グリコシド結合を加水分解する反応を触媒できる酵素により分解し、シロ‐イノシトールを生成させることを特徴とする、前記方法である。【００２９】
また、本発明は：
（１８）シロイノシトールと上記（１６）に記載の化合物を含む組成物である。
【発明の効果】
【００３０】
本発明によれば、微生物培養技術による工業的シロ‐イノシトール生産の効率化が達成できる。また、本発明では、新規なシロ‐イノシトール誘導体が提供される。当該誘導体は、極めて水溶性が高いので、生産工程においてバッチあたりの生産濃度を向上させ得るし、関連する製品を製造する際のハンドリングに優れる。また、工業的なシロ‐イノシトールの生産性を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ＩＮＯ１遺伝子のコード領域を示す（配列番号１）。
【図２】ｓｕｈＢ遺伝子のコード領域を示す（配列番号３）。
【図３】ｉｏｌＧ遺伝子のコード領域を示す（配列番号５）。
【図４】ｉｏｌＷ遺伝子のコード領域を示す（配列番号７）。
【図５】本発明のシロ‐イノシトール誘導体の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。図中、矢印で示したピークは不純物由来である。
【図６】本発明のシロ‐イノシトール誘導体の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。
【図７】本発明のシロ‐イノシトール誘導体のβ‐グルコシダーゼ（セロビアーゼ）による分解例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明の第１の課題は、イノシトール‐１‐リン酸合成酵素遺伝子、イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子、ミオイノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子およびシロ‐イノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を保有する形質転換微生物を、グルコース又はグルコース単位を有する二糖類若しくは多糖類を炭素源として含有する培地内で発酵させること、或いは当該形質転換体を前記炭素源と接触させることにより解決される。つまり、本発明の形質転換微生物は、当該微生物内に新たに構築された連続した生合成経路により、グルコース基質を一段階の発酵により、シロ‐イノシトールおよびその誘導体へと変換し得る能力を有する。
【００３３】
典型的に、グルコース基質を本発明のシロ‐イノシトール（或いは同時生産されるシローイノシトール誘導体。以下、両者をまとめて「本発明のシロ‐イノシトール」ということもある。）へと変換する生合成経路は、グルコース基質を、重要な中間体であるミオイノシトールへと変換する部分経路を含む。
【００３４】
具体的に、原核微生物宿主の場合では、次の触媒活性を発現させることで当該微生物内においてミオイノシトール生合成のための部分経路を機能させることができる。
活性１：  適当な炭素源からグルコース‐６‐リン酸を生成させる活性；
活性２：  グルコース‐６‐リン酸をミオイノシトール‐１‐リン酸へ変換する活性、つまり、イノシトール‐１‐リン酸合成酵素活性；及び
活性３：  ミオイノシトール‐１‐リン酸を基質としたフォスファターゼ活性。
但し、活性１の生成物であるグルコース‐６‐リン酸は、微生物が普遍的に生成する代謝中間体であるので、当該活性を敢て形質転換体に付与することは必須ではない。また、活性３についても、本発明者らの知る限りにおいて、従来の遺伝子組換手法による工業的生産に適する原核微生物宿主細胞の大多数は、内因性イノシトールモノフォスファターゼを発現しているか、ミオイノシトール‐１‐リン酸を基質とできる汎用モノフォスファターゼ活性を有している。
【００３５】
他方、活性２について見ると、原核微生物はイノシトール‐１‐リン酸合成酵素遺伝子を有していない例が多い。また、ミオイノシトール生合成反応においてイノシトール‐１‐リン酸合成酵素が律速反応を担うと考えられている（特許文献１４及び１５参照。）。したがって、原核微生物宿主内で機能的なミオイノシトール生合成経路を構築するためには、外来性イノシトール‐１‐リン酸合成酵素遺伝子を該細胞に導入することが必要十分であると考えられる。
【００３６】
しかしながら、本願と同時継続している日本国特許出願第２０１１‐２４８４３８号において、本発明者らは、予期せぬことに、上記の外来性イノシトール‐１‐リン酸合成酵素遺伝子を導入した形質転換体においてイノシトールモノフォスファターゼ活性を強化することで、ミオイノシトール生産能が大幅に向上することを見出した。更に驚くべきことに、後記実施例の通り、本発明の形質転換体は、そのイノシトールモノフォスファターゼ活性を強化することで、極めて多量且つ優勢にシロ‐イノシトールを生産し、一方ミオイノシトールを殆ど生産しないだけでなく、実質量の本発明のシロ‐イノシトール誘導体を生産することが明らかとなった。したがって、本発明の形質転換体に対しては、前記の外来性イノシトール‐１‐リン酸合成酵素遺伝子を導入することに加えて、機能的なイノシトールモノフォスファターゼの過剰生産又はイノシトールモノフォスファターゼの活性化を誘導する遺伝子組換又は変異を導入することが好ましい。
【００３７】
例えば、宿主微生物が内因性イノシトールモノフォスファターゼ活性を有しているか否かに関わらず、形質転換微生物細胞内でイノシトールモノフォスファターゼを過剰生産させることで、該形質転換微生物のイノシトールモノフォスファターゼ活性を強化できる。好適には、当該形質転換微生物に対して外来性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子を導入することによりイノシトールモノフォスファターゼの過剰生産を誘導し得るが、これに限定されない。なお、本明細書において、「外来」乃至「外来性」という用語は、形質転換前の宿主微生物が、本発明により導入されるべき遺伝子を有していない場合、その遺伝子によりコードされる酵素を実質的に発現しない場合、及び異なる遺伝子により当該酵素のアミノ酸配列をコードしているが、形質転換後に匹敵する内因性酵素活性を発現しない場合において、本発明に基づく遺伝子乃至核酸配列を宿主に導入することを意味するために用いられる。
【００３８】
次いで、本発明の形質転換体、つまり、グルコース基質をシロ‐イノシトール（或いは同時生産されるシローイノシトール誘導体）まで変換し得る連続した生合成経路を有する形質転換微生物には、以下の触媒活性が付与される。
活性４：ミオイノシトールを２‐ケト‐ミオ‐イノシトール（ミオ‐イノソース；２，３，４，５，６‐ペンタヒドロキシシクロヘキサン‐１‐オン）に変換する酵素活性；及び
活性５：２‐ケト‐ミオ‐イノシトールをシロ‐イノシトールに変換する酵素活性。
上記活性４を有する酵素としては、例えばＮＡＤ＋の存在下でミオイノシトールを酸化する、ミオイノシトールデヒドロゲナーゼ（酵素番号Ｅ．Ｃ．１．１．１．１８）が挙げられる。また、上記活性５を有する酵素としては、例えばＮＡＤＰ＋の存在下でシロ‐イノシトールを酸化する、シロイノシトールデヒドロゲナーゼが挙げられる。つまり、本発明に用いることができるシロイノシトールデヒドロゲナーゼは、例えばＮＡＤＰＨの存在下では、２‐ケト‐ミオ‐イノシトールをシロ‐イノシトールに変換することができる。それらの酵素の詳細は後記する。
【００３９】
本発明の形質転換体は様々な宿主微生物細胞を用いて作製し得る。特に、原核微生物を宿主にすることは、当該宿主細胞内に本発明のシロ‐イノシトールの生合成経路を新たに構築（つまり、既存の内因性経路の影響がない。）することを可能にするので、合成生物学的手法の適用において極めて魅力的である。例示される原核微生物は：エッシェリシア、シュードモナス、バチルス、ゲオバチルス、メタノモナス、メチロバシラス、メチロフィリウス、プロタミノバクター、メチロコッカス、コリネバクテリウム、ブレビバクテリウム、ザイモモナスおよびリステリア属の細菌である。工業的発酵生産において好適な原核微生物の非限定的な例示は、大腸菌、バチルス属細菌、コリネバクテリウム属細菌、ザイモモナス属細菌を含む。大腸菌は、その迅速な生育能力や発酵管理の容易さ故に特に好ましい宿主微生物の例である。また、本発明の宿主細胞として利用できる細胞株は、通常の意味での野生型であってよく、或いは、栄養要求性変異株、抗生物質耐性変異株であってもよい。更に、本発明の宿主細胞として利用できる細胞株は、上記のような変異に関する各種マーカー遺伝子を有するように既に形質転換されていてもよい。これらの変異や遺伝子は、本発明の形質転換体の作製・維持・管理に有益な性質を提供し得る。好ましくは、クロラムフェニコール、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン等の抗生物質に耐性を示す株を用いることにより、本発明のシロ‐イノシトール生産を簡便に行うことができる。
【００４０】
前述の通り、本発明の形質転換体が有すべきシロ‐イノシトール生合成経路は、グルコース基質を、重要な中間体であるミオイノシトールへと変換するための部分経路を含む。更に、前述の通り、ミオイノシトール生合成においてイノシトール‐１‐リン酸合成酵素が律速反応を担うと考えられているので、本発明の形質転換体には、第１の生物活性として、イノシトール‐１‐リン酸合成酵素を発現することが要求される。特に、原核微生物はイノシトール‐１‐リン酸合成酵素遺伝子を有していない例が多いので、通常は、外来性イノシトール‐１‐リン酸合成酵素遺伝子が本発明の形質転換体の細胞内に発現可能に導入される。イノシトール‐１‐リン酸合成酵素遺伝子は公知であり（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏs．ＡＢ０３２０７３、ＡＦ０５６３２５、ＡＦ０７１１０３、ＡＦ０７８９１５、ＡＦ１２０１４６、ＡＦ２０７６４０、ＡＦ２８４０６５、ＢＣ１１１１６０、Ｌ２３５２０、Ｕ３２５１１）、そのいずれも使用することができる。特に、酵母由来のＩＮＯ１遺伝子（配列番号１）は、よく知られているイノシトール‐１‐リン酸合成酵素遺伝子の例であり、本発明においても好適に使用することができる。但し、本発明の形質転換体作製に利用できるイノシトール‐１‐リン酸合成酵素遺伝子は酵母由来のものに限られず、他の真核微生物やそれ以外の生物に由来するものであっても、或いは人工的に合成したものであっても、前記宿主微生物細胞内で実質的なイノシトール‐１‐リン酸合成酵素活性を発現できるものであればよい。
【００４１】
したがってまた、本発明の目的に利用できるイノシトール‐１‐リン酸合成酵素遺伝子は、前記形質転換微生物内で実質的なイノシトール‐１‐リン酸合成酵素活性を発現できるものであれば、自然界で発生し得るすべての変異や、人工的に導入された変異及び修飾を有していてもよい。例えば、特定のアミノ酸をコードする種々のコドンには余分のコドン（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）が存在することが知られている。そのため本発明においても同一のアミノ酸に最終的に翻訳されることになる代替コドンを利用してよい。つまり、遺伝子コードは縮重しているので、ある特定のアミノ酸をコードするのに複数のコドンを使用でき、そのためアミノ酸配列は任意の１セットの類似のＤＮＡオリゴヌクレオチドでコードされ得る。そのセットの唯一のメンバーだけが天然型酵素の遺伝子配列に同一であるが、ミスマッチのあるＤＮＡオリゴヌクレオチドでさえ適切な緊縮条件下（例えば、３ｘＳＳＣ、６８℃でハイブリダイズし、２ｘＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ及び６８℃で洗浄）で天然型配列にハイブリダイズでき、天然型配列をコードするＤＮＡを同定、単離でき、更にそのような遺伝子も本発明において利用できる。特に、ほとんどの生物は特定のコドン（最適コドン）のサブセットを優先的に用いることが知られているので（Ｇｅｎｅ、Ｖｏｌ．１０５、ｐｐ．６１−７２、１９９１等）、宿主微生物に応じて「コドン最適化」を行うこと有用であり得る。
【００４２】
しかして、本発明の形質転換体の作製においても、イノシトール‐１‐リン酸合成酵素遺伝子が「発現カセット」として宿主微生物細胞内に導入されることにより、より安定的で高レベルのイノシトール‐１‐リン酸合成酵素活性が得られることを当業者は理解するであろう。本明細書において、「発現カセット」とは、発現対象の核酸または発現対象の遺伝子に機能的に結合された転写および翻訳をレギュレートする核酸配列を含むヌクレオチドを意味する。典型的に、本発明の発現カセットは、コード配列から５’上流にプロモーター配列、３’下流にターミネーター配列、場合により更なる通常の調節エレメントを機能的に結合された状態で含み、そのような場合に、発現対象の核酸または発現対象の遺伝子が宿主微生物に発現可能に導入される。
【００４３】
プロモーターは、構造性プロモーターであるか調節プロモーターであるかに拘わらず、ＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡに結合させ、ＲＮＡ合成を開始させるＤＮＡ配列と定義される。強いプロモーターとはｍＲＮＡ合成を高頻度で開始させるプロモーターであり、本発明の形質転換体作製においても好適に使用される。ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ又はＴＲＣ系、λファージの主要オペレーター及びプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、解糖系酵素（例えば、３−ホスホグリセレートキナーゼ、グリセルアルデヒド‐３‐リン酸脱水素酵素）、グルタミン酸デカルボキシラーゼＡ、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼに対するプロモーター等が、その宿主細胞の性質等に応じて利用可能である。プロモーターおよびターミネーター配列のほかに、他の調節エレメントの例として挙げられ得るのは、選択マーカー、増幅シグナル、複製起点などである。好適な調節配列については、例えば、”Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５”、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９０）に記載されている。
【００４４】
上記で説明した発現カセットは、例えば、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、ＩＳエレメント、ファスミド、コスミド、又は線状もしくは環状のＤＮＡ等から成るベクターに組み入れて、宿主微生物中に挿入される。プラスミドおよびファージが好ましい。これらのベクターは、宿主微生物中で自律複製されるものでもよいし、また染色体により複製されてもよい。好適なプラスミドは、例えば、大腸菌のｐＬＧ３３８、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＫＣ３０、ｐＲｅｐ４、ｐＨＳ１、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＨＥ１９．２、ｐＨＳ２、ｐＰＬｃ２３６、ｐＭＢＬ２４、ｐＬＧ２００、ｐＵＲ２９０、ｐＩＮ−ＩＩＩ１１３−Ｂ１、λｇｔ１１又はｐＢｄＣＩ；桿菌のｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４又はｐＢＤ２１４；コリネバクテリウム属のｐＳＡ７７又はｐＡＪ６６７などである。これらの他にも使用可能なプラスミド等は、”Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ”、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、１９８５に記載されている。ベクターへの発現カセットの導入は、適当な制限酵素による切り出し、クローニング、及びライゲーションを含む慣用の方法によって可能である。
【００４５】
上記ような発現カセットを有するベクターが構築された後、該ベクターを宿主微生物に導入する際に適用できる手法として、例えば、共沈、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、レトロウイルストランスフェクションなどの慣用のクローニング法およびトランスフェクション法が使用される。それらの例は、「分子生物学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｆ．  Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｐｕｂｌ．Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９７、またはＳａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験室マニュアル」、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９に記載されている。
【００４６】
次いで、本発明の形質転換体が有すべき第２の生物活性は、イノシトールモノフォスファターゼ活性である。当該イノシトールモノフォスファターゼ活性も、グルコース基質を中間体ミオイノシトールへと変換するために要求される。しかし、前述の通り、従来の遺伝子組換手法による工業的生産に適する原核微生物宿主細胞の大多数は、内因性イノシトールモノフォスファターゼを発現しているか、ミオイノシトール‐１‐リン酸を基質とできる汎用モノフォスファターゼ活性を有しているので、本発明の形質転換体に当該酵素活性を敢て導入する必要はない場合が多い。更にしかしながら、本発明の形質転換体が強化されたイノシトールモノフォスファターゼを示すことは特に好ましい。すわなち、予期せぬことに、本発明のシロ‐イノシトール生産性形質転換体は、そのイノシトールモノフォスファターゼ活性を強化することで、極めて多量且つ優勢にシロ‐イノシトールを生産しつつミオイノシトールを殆ど生産しないだけでなく、顕著にシロ‐イノシトール誘導体を生産することが明らかとなった。したがって、本発明の好適な局面は、シロ‐イノシトール生産性形質転換体内でイノシトールモノフォスファターゼを過剰生産させることを包含する。
【００４７】
本発明で意図されるイノシトールモノフォスファターゼとは、イノシトール‐１‐リン酸に対して高い基質特異性を示すものの他にも、広範な基質に対して作用し得るリン酸モノエステル加水分解酵素活性を示すことにより、イノシトール‐１‐リン酸を実質的に加水分解化できるタンパク質を含む。典型的なイノシトールモノフォスファターゼとしては、例えば、イノシトール‐１‐モノフォスファターゼが知られており、多くの生物由来の当該遺伝子（ｓｕｈＢ遺伝子）はＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏs．ＺＰ＿０４６１９９８８、ＹＰ＿００１４５１８４８等で公表されている。特に、大腸菌由来のｓｕｈＢ遺伝子（配列番号３：ＡＡＣ７５５８６（ＭＧ１６５５））の使用は、大腸菌を宿主細胞とする場合に便利である。
【００４８】
本発明の形質転換体が有するべき第３の生物活性は、ミオイノシトールデヒドロゲナーゼ活性である。当該酵素は、典型的には以下の反応により、ＮＡＤ＋の存在下でミオイノシトールを２‐ケト‐ミオ‐イノシトールに変換する。
【化３】
0005977264.tif 000004
【００４９】
種々のミオイノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子が公知且つ利用可能である。例えば、特開平６−７１５８号公報には、ＮＡＤ＋の存在下でミオイノシトールを２‐ケト‐ミオ‐イノシトールに変換し得るバチルス属細菌由来の酵素（ＥＣ．１．１．１．１８）及びそのコード化核酸配列が記載されている。その他にも、特許文献５にはＮＡＤ＋非依存型ミオイノシトールデヒドロゲナーゼが開示されており、当該酵素も本発明の形質転換体作製に使用し得るであろう。特に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＮＢＲＣ１３７１９株由来のｉｏｌＧ遺伝子（下記の配列番号５）の使用は便利である。
【化４】
0005977264.tif 000005
【００５０】
本発明の形質転換体が有するべき第４の生物活性は、シロ‐イノシトールデヒドロゲナーゼ活性である。当該酵素は、典型的には以下の反応により、ＮＡＤＰ＋の存在下でシロ‐イノシトールを２‐ケト‐ミオ‐イノシトールに変換するが、ＮＡＤＰＨの存在下で２‐ケト‐ミオ‐イノシトールを選択的にシロ‐イノシトールへと還元する。本発明の形質転換体内では、後者の反応が利用される。
【化５】
0005977264.tif 000006
【００５１】
種々のシロ‐イノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子が公知且つ利用可能である。特許文献５には大腸菌、アセトバクター属細菌、バチルス属細菌、アグロバクテリウム属細菌、キサントモナス属細菌のシロ‐イノシトールデヒドロゲナーゼ及び関連するアミノ酸配列が開示されている。特に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＮＢＲＣ１３７１９株由来のｉｏｌＷ遺伝子（下記の配列番号７）の使用は便利である。
【化６】
0005977264.tif 000007
【００５２】
イノシトール‐１‐リン酸合成酵素遺伝子について記載した、変異や修飾及びコドン最適化、並びに発現カセット、プロモーター等のレギュレーター配列及びプラスミド等とそれによる形質転換の説明は、全て上記のイノシトールモノフォスファターゼ遺伝子、ミオイノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子及びシロ‐イノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子についても当てはまることを当業者は容易に理解するであろう。したがって、本発明の形質転換体は、イノシトール‐１‐リン酸合成酵素をコードする核酸を含む発現カセット、ミオイノシトールデヒドロゲナーゼをコードする核酸を含む発現カセット及びシロ‐イノシトールデヒドロゲナーゼをコードする核酸を含む発現カセットの３つの発現カセットを保有し、その場合、本発明の形質転換体には内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子が存在する。好適な本発明の形質転換体は、配列番号１で示されるヌクレオチド配列を有する核酸を含む発現カセット、配列番号５で示されるヌクレオチド配列を有する核酸を含む発現カセット、及び配列番号7で示されるヌクレオチド配列を有する核酸を含む発現カセットを保有している。
【００５３】
上記の３つ発現カセットは、１つのベクター上に配置されて宿主微生物にトランスフェクトされてよい。或いは、そのうちの任意の２つの発現カセットが配置されたベクターと残りの発現カセットが配置されたベクターが宿主微生物にコ‐トランスフェクトされてもよいし、各々の発現カセットが配置された３つのベクターが宿主微生物にコ‐トランスフェクトされてもよい。更に、上記３つの発現カセットのうちの任意の１つ以上が宿主微生物のゲノムに組み込まれ、残りの発現カセットはプラスミドとして当該形質転換体内に存在してよい。例えば、イノシトール‐１‐リン酸合成酵素コード化核酸（ＩＮＯ１）を含む発現カセットを染色体上に組み込んで得た大腸菌ＡＫＣ−０１７株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２２１８０として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センターに２０１１年１０月２５日に寄託されている。国際寄託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５１３）に対して、ミオイノシトールデヒドロゲナーゼをコードする核酸を含む発現カセット及びシロ‐イノシトールデヒドロゲナーゼをコードする核酸を含む発現カセットを配置したプラスミドをトランスフェクトすることも可能である。
【００５４】
更に、繰り返し記載したとおり、本発明の形質転換体が強化されたイノシトールモノフォスファターゼを示すことは特に好ましい。したがって、本発明の形質転換体が、上記３つの発現カセットに加えて、イノシトールモノフォスファターゼをコードする核酸を含む発現カセットを保有することが好ましい。したがって、更に好適な本発明の形質転換体として、配列番号１で示されるヌクレオチド配列を有する核酸を含む発現カセット、配列番号３で示されるヌクレオチド配列を有する核酸を含む発現カセット、配列番号５で示されるヌクレオチド配列を有する核酸を含む発現カセット、及び配列番号7で示されるヌクレオチド配列を有する核酸を含む発現カセットを保有している形質転換体が挙げられる。
【００５５】
上記の４つ発現カセットは、１つのベクター上に配置されて宿主微生物にトランスフェクトされてよい。或いは、そのうちの任意の２つ以上の発現カセットが配置されたベクターと残りの発現カセットが配置されたベクターが宿主微生物にコ‐トランスフェクトされてもよいし、各々の発現カセットが配置された４つのベクターが宿主微生物にコ‐トランスフェクトされてもよい。更に、上記４つの発現カセットのうちの任意の１つ以上が宿主微生物のゲノムに組み込まれ、残りの発現カセットはプラスミドとして当該形質転換体内に存在してよい。例えば、イノシトール‐１‐リン酸合成酵素コード化核酸（ＩＮＯ１）を含む発現カセット及びイノシトールモノフォスファターゼをコードする核酸（ｓｕｈＢ）を含む発現カセットの双方を染色体上に有する大腸菌ＡＫＣ−０１８株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２２１８１として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センターに２０１１年１０月２５日に寄託されている。国際寄託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５１４）に対して、ミオイノシトールデヒドロゲナーゼをコードする核酸を含む発現カセット及びシロ‐イノシトールデヒドロゲナーゼをコードする核酸を含む発現カセットを配置したプラスミドをトランスフェクトすることも可能である。
【００５６】
更にまた、本発明の好適な形質転換体において強化されたイノシトールモノフォスファターゼ活性を誘導する方法に関連して、当該イノシトールモノフォスファターゼの過剰生産を、内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子のコピー数を増加させる；内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域に変異を導入する；内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域を高発現誘導性外来調整領域で置換する；及び内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域を欠失させることによっても誘導し得る。具体的にイノシトールモノフォスファターゼの過剰発現を達成するためには、内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子を含むか、或いは当該内因性遺伝子のコード化領域に好適な調整領域を付加した発現カセットを含む構築物により前記宿主微生物を形質転換して、当該形質転換体内での当該イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子のコピー数を元の宿主細胞に比べて実質的に増加させるか、内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子を有する元の宿主細胞に関して、染色体の変異、付加および欠失を公知の遺伝子組換技術により実施するか、あるいは、変異剤などを用いて染色体にランダムに変異導入を行うことで達成することができる。イノシトールモノフォスファターゼの過剰生産の確認には、公知のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析法などを用いることができる
【００５７】
更に、イノシトールモノフォスファターゼ活性を強化するための本発明の別の態様は、本発明の形質転換体においてイノシトールモノフォスファターゼの活性化を誘導することを含む。その目的のために、１）内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子に変異を導入する、２）内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の一部又は全部を置換する、３）内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の一部を欠失させる、４）イノシトールモノフォスファターゼ活性を低下させる他のタンパク質を減少させる、及び／又は５）イノシトールモノフォスファターゼ活性を低下させる化合物の生成を減少させる、といった手法を例示できる。
【００５８】
上記イノシトールモノフォスファターゼ活性を強化するための１）〜５）の手法に関して、具体的には、イノシトールモノフォスファターゼの遺伝子に変異、付加あるいは欠失を施した後に当該遺伝子をコードするイノシトールモノフォスファターゼの活性を評価することで、イノシトールモノフォスファターゼ活性の強化されたイノシトールモノフォスファターゼを得ることができる。
【００５９】
上記のようにして得られる形質転換体は、本発明のシロ‐イノシトール生産のために、前記形質転換体の生育及び／又は維持に適した条件下で培養及び維持される。各種の宿主微生物細胞に由来する形質転換体のための好適な培地組成、培養条件、培養時間は当業者に公知である。
【００６０】
培地は、1つ以上の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミン、及び場合により微量元素乃至ビタミン等の微量成分を含む天然、半合成、合成培地であってよい。しかし、使用する培地は、培養すべき形質転換微生物の栄養要求を適切に満たさなければならないことは言うまでもない。更に本発明に使用し得る培地は、本発明の形質転換体によりｄｅ  ｎｏｖｏのシロ‐イノシトール生合成及びシロ‐イノシトール誘導体の生合成を容易に進行させるために、グルコース又はグルコース単位を有する二糖類若しくは多糖類を含んでいる。数多くのグルコース単位を有する二糖類若しくは多糖類が当業者に周知である。それらの非限定的例としては、スクロース、マルトース、ラクトース、でんぷん、セルロースが挙げられる。また、それらは米ぬか、廃糖密、トウモロコシ分解液やセルロース分解液等のバイオマスに多量に含まれているので、これらの天然資源を炭素源とした培地の使用は好適である。更に培地は、形質転換体が有用な付加的形質を発現する場合、例えば抗生物質への耐性マーカーを有する場合、対応する抗生物質を含んでいてよい。それにより、発酵中の雑菌による汚染リスクが低減される。なお、セルロースなどの炭素源を宿主微生物が資化できない場合は、当該宿主微生物に外来遺伝子を導入するなどの公知の遺伝子工学的手法を施すことで、これら炭素源を使用したシロ‐イノシトールおよびその誘導体生産に適応させることができる。外来遺伝子としては、例えば、セルラーゼ遺伝子やアミラーゼ遺伝子などを挙げることができる。
【００６１】
培養は、バッチ式であっても連続式であってもよい。また、いずれの場合にも、培養の適切な時点で追加の前記炭素源等を補給する形式であってもかまわない。更に、培養は、好適な温度、酸素濃度、ｐＨ等を維持しながら継続されるべきである。一般的な微生物宿主細胞に由来する形質転換体の好適な培養温度は、通常１５℃〜４５℃、好ましくは２５℃〜３７℃の範囲である。宿主微生物が好気性の場合、発酵中の適切な酸素濃度を確保するために振盪（フラスコ培養等）、攪拌／通気（ジャー・ファーメンター培養等）を行う必要がある。それらの培養条件は、当業者にとって容易に設定可能である。
【００６２】
上記の培養物からシロ‐イノシトール或いはその誘導体を精製する方法は、当業者に公知の精製手段を、適宜、組み合わせたものであってよい。原核微生物宿主細胞の形質転換体の場合、本発明のシロ‐イノシトールは培養上清中または菌体内に存在し、よって必要であれば培養菌体からも抽出してもよい。培養菌体から抽出する場合、例えば、培養物を遠心分離して上清と菌体を分離し、ホモジナイザーを利用しつつ、界面活性剤、有機溶媒、酵素等により菌体を破壊し得る。培養上清、及び場合により菌体抽出液からもシロ‐イノシトールおよびその誘導体を精製する典型的な方法としては、ｐＨ調整等によるタンパク質沈澱を利用した除タンパク処理、活性炭を利用した不純物の吸着による除去、イオン交換樹脂等を利用したクロマトグラフィーなどの精製工程を実施することが挙げられる。更に、クロマトグラフィーで分離され画分を乾燥して得られた固体を、例えば水−エタノール系から再結晶してもよい。勿論、製品により目的とされる純度に応じて一部の工程を削除したり、或いは追加のクロマトグラフィーや再結晶等を実施したりしてもよいことは言うまでもない。
【００６３】
本発明の第２の課題に関連するシロ‐イノシトール誘導体は、グルコース残基とシロ‐イノシトール残基とがβ１→４結合を介して結合した構造を有し、以下の構造式により表されるものである。
【化７】
0005977264.tif 000008
上記化合物は新規であり、１−Ｏ−β−Ｄ‐グルコピラノシル‐シロ‐イノシトールとも呼称され得る。
【００６４】
後記実施例のとおり、本発明のシロ‐イノシトール誘導体は、β‐グリコシド結合を加水分解する反応を触媒できる酵素、例えばβ‐グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２１）によって容易に分解され得、容易にグルコースとシロ‐イノシトールを生成する。したがって、本発明のシロ‐イノシトール誘導体に対して当該酵素を作用させることによりシロ‐イノシトールを生産できる。
【００６５】
殊に、本発明のシロ‐イノシトール誘導体は、後述のとおりに、もとのシロ‐イノシトールに比べて、少なくとも４倍以上（２５℃、Ｗ／Ｖ）の水溶性を示す。しかして、本発明のシロ‐イノシトール誘導体は、水性液中で高濃度にて生産及び処理することができるから、本発明のシロ‐イノシトール誘導体を得て、それを上記酵素処理することでシロ‐イノシトールを生産することの利点は多く、よってそのような方法は本発明のシロ‐イノシトール誘導体の好適な利用方法の一つである。
【００６６】
上記のシロ‐イノシトール生産のために、本発明のシロ‐イノシトール誘導体をβ‐グルコシダーゼ等により酵素的に分解するには、例えば水や緩衝液（酢酸緩衝液、燐酸緩衝液等）による本発明のシロ‐イノシトール誘導体の溶液に対して適当量の酵素を添加し、その酵素反応に適切な条件及び時間にて、該溶液をインキュベーションすればよい。そのような目的において有利に使用できるβ‐グルコシダーゼは市販されており、そのいずれも使用できるが、例えばアスペルギルス属のカビ由来のＣｅｌｌｏｂｉａｓｅ（ＳＩＧＭＡ社）を利用すればよい。添加する酵素の量は、製造元の指示を参考にしながら、本発明のシロ‐イノシトール誘導体の溶液中の濃度等に基づいて、適宜決定すればよい。また、反応時のｐＨは、一般的にはｐＨ４．０〜９．０の範囲であるが、要は、使用する酵素の至適ｐＨとすればよい。また、反応時の温度も、使用する酵素の至適温度範囲とすればよく、例えば、約２０〜５０℃程度の範囲とすればよい。反応時間は、本発明のシロ‐イノシトール誘導体の分解率を定量的に追跡しつつ、ほぼ全ての本発明のシロ‐イノシトール誘導体がシロ‐イノシトールに変換された時点とすればよい。その後、反応液からシロ‐イノシトールを、再結晶等により分離すればよい。
【００６７】
なお、後記実施例のように、本発明の形質転換体を、シロ‐イノシトールとともに実質量の本発明のシロ‐イノシトール誘導体が生産される条件下で培養した場合には、当該形質転換体の培養物をそのまま前記酵素で処理するか、或いは当該培養物を除タンパク処理や活性炭処理程度で粗精製した後に酵素処理することにより、シロ‐イノシトールの生産性を更に高めることができる。
【００６８】
また、医薬品、食品、化粧品等の有効成分や機能性成分として用いることも、本発明のシロ‐イノシトール誘導体の潜在的な用途の一つである。つまり、前記のとおりにシロ‐イノシトールの生理活性が明らかになってきており、そして、本発明のシロ‐イノシトール誘導体は酵素的に分解されて容易にシロ‐イノシトールを生成することから、本発明のシロ‐イノシトール誘導体が生体内で酵素的に分解されてシロ‐イノシトールを産生することを期待して、本発明のシロ‐イノシトール誘導体自体を医薬品等に添加することは、極めて興味深い本発明の利用態様である。
【００６９】
以上の説明を与えられた当業者は、本発明を十分に実施できる。以下、更なる説明の目的として実施例を与え、したがって、本発明は当該実施例に限定されるものではない。なお、本明細書において得に断りのない限りヌクレオチド配列は５’から３’方向に向けて記載される。
【実施例】
【００７０】
実施例１：イノシトールモノフォスファターゼ活性を強化しない形質転換体によるシロ‐イノシトールｄｅ  ｎｏｖｏ生産
本実施例では、イノシトール‐１‐リン酸合成酵素をコードする核酸を含む発現カセット、ミオイノシトールデヒドロゲナーゼをコードする核酸を含む発現カセット及びシロ‐イノシトールデヒドロゲナーゼをコードする核酸を含む３つの発現カセットを保有する本発明の形質転換微生物を作製し、それによるシロ‐イノシトールの生産能力を調べた。【００７１】
１−ａ）  イノシトール‐１‐リン酸合成酵素発現カセット
単離した酒精酵母の培養液から菌体を回収し、Ｎｕｃｌｅｏ  Ｓｐｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅ（製品名、ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ社製）を使用してゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したゲノムＤＮＡを鋳型に用い、以下のプライマーによりＰＣＲ増幅し（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（製品名、タカラバイオ製）  反応条件：９８℃  １０ｓｅｃ，５５℃  ５ｓｅｃ，７２℃  ２０ｓｅｃ，２８ｃｙｃｌｅ）、ＩＮＯ１遺伝子のコード領域（配列番号１）をクローニングした。
【化８】
0005977264.tif 000009
【００７２】
次いで、得られたｉｎｏ１コード領域は下記配列のプロモーターの下流に転写可能に挿入した。
【化９】
0005977264.tif 000010
【００７３】
すなわち、プラスミドｐＮＦＰ−Ａ５１（ＦＥＲＭ  Ｐ−２２１８２として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センターに２０１１年１０月２５日に寄託した。国際寄託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５１５）のマルチクローニングサイトにターミネーター配列及び前記プロモーター配列を挿入した。導入されたプロモーター配列の下流に上記でクローニングされたｉｎｏ１コード領域をライゲーションして、ｐＮＦＰ−Ｄ７８を構築した。構築したｐＮＦＰ−Ｄ７８を、塩化カルシウム法（羊土社  遺伝子工学実験ノート  上  田村隆明著、参照）により大腸菌ＡＫＣ−０１６株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２２１０４として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに２０１１年４月２０日に寄託した。国際寄託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５１２）にトランスフェクトした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより当該大腸菌の可溶性画分でのイノシトール‐１‐リン酸合成酵素の高発現を確認した。【００７４】
１−ｂ）  ミオイノシトールデヒドロゲナーゼ発現カセット
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＮＢＲＣ１３７１９）をＬＢ培地中（２ｍｌ）で３０℃にて振盪培養した。培養終了後、培養液から菌体を回収し、Ｎｕｃｌｅｏ  Ｓｐｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅ（製品名、ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ社製）を使用してゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したゲノムＤＮＡを鋳型に用い、以下のプライマーによりＰＣＲ増幅し（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（製品名、タカラバイオ製）  反応条件：９８℃  １０ｓｅｃ，５５℃  ５ｓｅｃ，７２℃  ２０ｓｅｃ，２８ｃｙｃｌｅ）、ｉｏｌＧ遺伝子のコード領域（配列番号５）をクローニングした。
【化１０】
0005977264.tif 000011
【００７５】
得られたｉｏｌＧコード領域は配列番号１１のプロモーターの下流に転写可能に挿入した。すなわち、前記ｐＮＦＰ−Ａ５１のマルチクローニングサイトにターミネーター配列及び前記プロモーター配列を挿入した。導入されたプロモーター配列の下流に上記でクローニングされたｉｏｌＧコード領域をライゲーションして、ｐＮＦＰ−Ｊ２２を構築した。構築したｐＮＦＰ−Ｊ２２を、塩化カルシウム法（羊土社  遺伝子工学実験ノート  上  田村隆明著、参照）により大腸菌株ＦＥＲＭ  Ｐ−２２１０４にトランスフェクトした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより当該大腸菌の可溶性画分でのミオイノシトールデヒドロゲナーゼの高発現を確認した。【００７６】
１−ｃ）  シロ‐イノシトールデヒドロゲナーゼ発現カセット
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＮＢＲＣ１３７１９）をＬＢ培地中（２ｍｌ）で３０℃にて振盪培養した。培養終了後、培養液から菌体を回収し、Ｎｕｃｌｅｏ  Ｓｐｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅ（製品名、ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ社製）を使用してゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したゲノムＤＮＡを鋳型に用い、以下のプライマーによりＰＣＲ増幅し（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（製品名、タカラバイオ製）  反応条件：９８℃  １０ｓｅｃ，５５℃  ５ｓｅｃ，７２℃  ２０ｓｅｃ，２８ｃｙｃｌｅ）、ｉｏｌＷ遺伝子のコード領域（配列番号７）をクローニングした。
【化１１】
0005977264.tif 000012
【００７７】
得られたｉｏｌＷコード領域は配列番号１１のプロモーターの下流に転写可能に挿入した。すなわち、前記ｐＮＦＰ−Ａ５１のマルチクローニングサイトにターミネーター配列及び前記プロモーター配列を挿入した。導入されたプロモーター配列の下流に上記でクローニングされたｉｏｌＷコード領域をライゲーションして、ｐＮＦＰ−Ｊ３６を構築した。構築したｐＮＦＰ−Ｊ３６を、塩化カルシウム法（羊土社  遺伝子工学実験ノート  上  田村隆明著、参照）により大腸菌株ＦＥＲＭ  Ｐ−２２１０４にトランスフェクトした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより当該大腸菌の可溶性画分でのシロ‐イノシトールデヒドロゲナーゼの高発現を確認した。【００７８】
１−ｄ）  形質転換のためのプラスミドの構築
ｐＮＦＰ−Ｄ７８をＳａｌＩで消化し、平滑末端化及び５’末端脱リン酸化した。ｐＮＦＰ−Ｊ２２中のｉｏｌＧ発現カセット及びｐＮＦＰ−Ｊ３６中のｉｏｌＷ発現カセットをクローニングして、両発現カセットをｐＮＦＰ−Ｄ７８にライゲーションした。ｐＮＦＰ−Ｄ７８中のＩＮＯ１発現カセットと順方向にｉｏｌＧ発現カセット及びｉｏｌＷ発現カセットがライゲーションしていたプラスミドを取得した。【００７９】
１−ｅ）  発現カセット含有プラスミドでトランスフェクトした形質転換体によるシロ‐イノシトール生産
上記の手順に従って構築したプラスミドを、大腸菌ＡＫＣ−０１６株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２２１０４として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに２０１１年４月２０日に寄託した。国際寄託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５１２）に塩化カルシウム法（羊土社  遺伝子工学実験ノート  上  田村隆明著、参照）を用いてトランスフェクトした。【００８０】
得られた形質転換体を、アンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）含有ＬＢプレート上で、３７℃、一日間培養して、コロニーを形成させた。アンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）を含むＬＢ培地２ｍＬを１５ｍＬ容の試験管に入れ、上記プレートからコロニーを白金耳で植菌し、３７℃で、３〜５時間、ＯＤ（６００ｎｍ）が０．５程度になるまで１８０ｒｐｍで培養を行い、これを本培養のための前培養液とした。【００８１】
１５０ｍＬ容のフラスコに、２ｇ／Ｌのグルコースと、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地を３０ｍＬ入れ、０．６ｍＬの前培養液を添加し本培養（シロ‐イノシトール生産試験）を行った。培養条件は次のとおり；培養温度  ３２℃；攪拌  １８０ｒｐｍ；培養時間１６．５ｈ。【００８２】
上記の培養液を、４℃で、１０，０００ｇ×１０分間遠心分離して上清を回収し、培養上清のシロ‐イノシトール濃度を測定した。具体的に、ＫＳ−Ｇ（ガードカラム）、Ｓｕｇａｒ  ＫＳ−８０１及びＳｕｇａｒ  ＫＳ−８０２（いずれも商品名、昭和電工株式会社製）を連結してＨＰＬＣ（検出器：ＲＩ、カラム温度：７０℃、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ）を行うことで、培養上清中のシロ‐イノシトール濃度を定量した。定量した結果、シロイノシトールが培養上清中に０．１５ｇ／Ｌ生産され、グルコースは完全消費されていることが明らかとなった。この結果は、イノシトール‐１‐リン酸合成酵素をコードする核酸を含む発現カセット、ミオイノシトールデヒドロゲナーゼをコードする核酸を含む発現カセット及びシロ‐イノシトールデヒドロゲナーゼをコードする核酸を含む３つの発現カセットを保有し、内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子を有する（つまり、イノシトールモノフォスファターゼが強化されていない）本発明の形質転換微生物が、グルコースからシロ‐イノシトールを直接的に且つ一段階行程で生産したことを示している。【００８３】
実施例２：イノシトールモノフォスファターゼ活性を強化した形質転換体によるシロ‐イノシトールｄｅ  ｎｏｖｏ生産
本実施例では、イノシトール‐１‐リン酸合成酵素をコードする核酸を含む発現カセット、イノシトールモノフォスファターゼをコードする核酸を含む発現カセット、ミオイノシトールデヒドロゲナーゼをコードする核酸を含む発現カセット及びシロ‐イノシトールデヒドロゲナーゼをコードする核酸を含む４つの発現カセットを保有する本発明の形質転換微生物を作製し、それによるシロ‐イノシトールの生産能力を調べた。【００８４】
２−a）  イノシトールモノフォスファターゼ発現カセット
大腸菌株Ｗ３１１０（ＮＢＲＣ  １２７１３）をＬＢ培地中（２ｍｌ）で３７℃にて振盪培養した。培養終了後、培養液から菌体を回収し、Ｎｕｃｌｅｏ  Ｓｐｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅ（製品名、ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ社製）を使用してゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したゲノムＤＮＡを鋳型に用い、以下のプライマーによりＰＣＲ増幅し（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（製品名、タカラバイオ製）  反応条件：９８℃  １０ｓｅｃ，５５℃  ５ｓｅｃ，７２℃  ２０ｓｅｃ，２８ｃｙｃｌｅ）、ｓｕｈＢ遺伝子のコード領域（配列番号３）をクローニングした。
【化１２】
0005977264.tif 000013
【００８５】
得られたｓｕｈＢコード領域は下記配列のプロモーターの下流に転写可能に挿入した。
【化１３】
0005977264.tif 000014
【００８６】
すなわち、前記ｐＮＦＰ−Ａ５１のマルチクローニングサイトにターミネーター配列及び配列番号１８のプロモーター配列を挿入した。導入されたプロモーター配列の下流に上記でクローニングされたｓｕｈＢコード領域をライゲーションして、ｐＮＦＰ−Ａ５４を構築した。構築したｐＮＦＰ−Ａ５４を、塩化カルシウム法（羊土社  遺伝子工学実験ノート  上  田村隆明著、参照）により大腸菌株ＦＥＲＭ  Ｐ−２２１０４にトランスフェクトした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより当該大腸菌の可溶性画分でのイノシトールモノフォスファターゼの高発現を確認した。【００８７】
２−ｂ）  形質転換のためのプラスミドの構築
実施例１で作製したｐＮＦＰ−Ｄ７８をＳａｌＩで消化し、平滑末端化及び５’末端脱リン酸化した。ｐＮＦＰ−Ａ５４中のｓｕｈＢ発現カセットをクローニングして、ｐＮＦＰ−Ｄ７８にライゲーションした。ｐＮＦＰ−Ｄ７８中のＩＮＯ１発現カセットと順方向にｓｕｈＢ発現カセットがライゲーションしていたｐＮＦＰ−Ｇ２２を取得した。次いで、ｐＮＦＰ−Ｇ２２をＳａｌＩで消化し、平滑末端化及び５’末端脱リン酸化した。実施例１で作製したｐＮＦＰ−Ｊ２２中のｉｏｌＧ発現カセット及びｐＮＦＰ−Ｊ３６中のｉｏｌＷ発現カセットをクローニングして、両発現カセットをｐＮＦＰ−Ｇ２２にライゲーションした。ｐＮＦＰ−Ｇ２２中のＩＮＯ１発現カセット及びｓｕｈＢ発現カセットと順方向にｉｏｌＧ発現カセット及びｉｏｌＷ発現カセットがライゲーションしていたプラスミドを取得した。【００８８】
２−ｃ）  発現カセット含有プラスミドでトランスフェクトした形質転換体によるシロ‐イノシトール生産
上記の手順に従って構築したプラスミドを、大腸菌ＡＫＣ−０１６株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２２１０４として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに２０１１年４月２０日に寄託した。国際寄託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５１２）に塩化カルシウム法（羊土社  遺伝子工学実験ノート  上  田村隆明著、参照）を用いてトランスフェクトした。【００８９】
得られた形質転換体を、アンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）含有ＬＢプレート上で、３７℃、一日間培養して、コロニーを形成させた。アンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）を含むＬＢ培地２ｍＬを１５ｍＬ容の試験管に入れ、上記プレートからコロニーを白金耳で植菌し、３７℃で、３〜５時間、ＯＤ（６００ｎｍ）が０．５程度になるまで１８０ｒｐｍで培養を行い、これを本培養のための前培養液とした。【００９０】
１５０ｍＬ容のフラスコに、２ｇ／Ｌのグルコースと、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含む合成培地（表１）を３０ｍＬ入れ、０．６ｍＬの前培養液を添加し本培養（シロ‐イノシトール生産試験）を行った。培養条件は次のとおり；培養温度  ３２℃；攪拌  １８０ｒｐｍ；培養時間１６．５ｈ。
【表１】
0005977264.tif 000015
【００９１】
上記の培養液を、４℃で、１０，０００ｇ×１０分間遠心分離して上清を回収し、培養上清のシロ‐イノシトール濃度を測定した。具体的に、ＫＳ−Ｇ（ガードカラム）、Ｓｕｇａｒ  ＫＳ−８０１及びＳｕｇａｒ  ＫＳ−８０２（いずれも商品名、昭和電工株式会社製）を連結してＨＰＬＣ（検出器：ＲＩ、カラム温度：７０℃、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ）を行うことで、培養上清中のシロ‐イノシトール濃度を定量した。定量した結果、シロイノシトールが培養上清中に０．０９ｇ／Ｌ生産され、グルコースは完全消費されていることが明らかとなった。一方、本合成培地によるシロイノシトール生産条件下においては、培養時間１６．５ｈ時点で、イノシトールモノファスファターゼ活性非強化株では培養上清にシロ‐イノシトールピークが検出されなかった。【００９２】
従って、本発明の形質転換微生物においてイノシトールモノフォスファターゼ活性を強化することが有利であることが判明した。【００９３】
２−ｄ）  発現カセット含有プラスミドでトランスフェクトした形質転換体によるＪａｒ培養槽を用いたシロ‐イノシトールの生産
上記２−ｃ）での形質転換体を、アンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）含有ＬＢプレート上で、３７℃、一日間培養して、コロニーを形成させた。アンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）を含むＬＢ培地３０ｍＬを１５０ｍＬ容のフラスコに入れ、上記プレートからコロニーを白金耳で植菌し、３７℃で、３〜５時間、ＯＤ（６００ｎｍ）が０．５程度になるまで１８０ｒｐｍで培養を行い、これを本培養のための前培養液とした。【００９４】
１０００ｍＬ容のＪａｒ培養装置（丸菱バイオエンジ社製）に、１ｇ／Ｌのグルコースと、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含む下記の合成培地（表２）を３００ｍＬ入れ、６ｍＬの前培養液を添加し本培養（Ｊａｒ培養装置を用いたシロ‐イノシトール生産試験）を行った。培養条件は次のとおり：培養温度  ３２℃；培養ｐＨ  ６．０〔下限〕；アルカリ添加  ２８％（重量／容量）アンモニア水；攪拌  ８５０ｒｐｍ；通気  １ｖｖｍ。原料となるグルコースフィード溶液（表３）は、培養液中のグルコース濃度が０〜５ｇ／Ｌとなるように適宜添加した。
【表２】
0005977264.tif 000016
【表３】
0005977264.tif 000017
【００９５】
培養時間６８h後、上記の培養液を、４℃で、１０，０００ｇ×１０分間遠心分離して上清を回収し、培養上清のシロ‐イノシトール濃度を測定した。具体的に、ＫＳ−Ｇ（ガードカラム）、Ｓｕｇａｒ  ＫＳ−８０１及びＳｕｇａｒ  ＫＳ−８０２（いずれも商品名、昭和電工株式会社製）を連結してＨＰＬＣ（検出器：ＲＩ、カラム温度：７０℃、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ）を行うことで、培養上清中のシロ‐イノシトール濃度を定量した。【００９６】
定量した結果、これまでに例のない濃度である１２．４ｇ／Ｌのシロイノシトールが培養上清中に生産されていた。一方、精製工程において問題となるミオイノシトールはほとんど培養上清に存在せず、その濃度は０．１％以下であった。【００９７】
実施例３：シロ‐イノシトール誘導体の単離及び構造決定
上記実施例２において、Ｊａｒ培養装置を用いたシロ‐イノシトール生産試験で得られた培養上清をＨＰＬＣ（カラム：Ｓｈｏｄｅｘ  Ａｓａｈｉｐａｋ  ＮＨ２Ｐ−５０  ４Ｅ（商品名：昭和電工株式会社製）、移動相：水／アセトニトリル＝２５／７５、流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度４０℃、検出：ＲＩ）で更に分析したところ、１２．４ｇ／Ｌのシロイノシトールと共に、１．４ｇ／Ｌのシロイノシトール誘導体が培養上清中に生産されていた。当該シロイノシトール誘導体のピークを分取して、以下の実験に用いた。【００９８】
分取した化合物を、以下のＮＭＲ分析によって構造決定した。
装置          ：Ａｖａｎｃｅ６００（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｂｉｏｓｐｉｎ社製）
プローブ      ：クライオプローブ（１３Ｃ高感度）
測定温度      ：１８℃（試料劣化防止と１Ｈ−ＮＭＲの際に水シグナルを移動させるため、全て２９１Ｋ（１８℃）とした。）
溶媒：        ：Ｄ２Ｏ（ＡＬＤＲＩＣＨ社製）
内部標準      ：ＴＳＰ
１Ｈ観測周波数：６００．１３ＭＨｚ
１３Ｃ観測周波数：１５０．９２ＭＨｚ【００９９】
測定結果及びピークの帰属は以下のとおりであった。なお、表中、ピーク番号の「ＧＨ−１」とは、グルコース残基の１位水素であることを示す。また「ＩＨ−１」とは、シロ‐イノシトール残基の１位水素であることを示す。他も同様である。
【化１４】
0005977264.tif 000018
【表４】
0005977264.tif 000019
【表５】
0005977264.tif 000020
【０１００】
上記の、１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ-ＮＭＲを、それぞれ、図５及び図６に示した。また、ピークの帰属は、ＣＯＳＹ、ＣＨ−ＣＯＳＹ、ＨＭＢＣ、Ｊ分解二次元ＮＭＲにより確認した。【０１０１】
実施例４：シロ‐イノシトール誘導体の酵素分解
実施例３で得られた化合物を、アスペルギルス属のカビ由来のβ‐グルコシダーゼである、Ｃｅｌｌｏｂｉａｓｅ（ＳＩＧＭＡ社）により分解した。具体的に、実施例３で得られた化合物を、４００μＬの１５０ｍＭ  Ｂｉｓ‐Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ＝７．０）に、６ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。当該溶液に、２５Ｕ／ｍＬＣｅｌｌｏｂｉａｓｅを１００μＬ加え、４０℃で２０時間までインキュベート（１２００ｒｐｍ、Ｂｉｏｓｈａｋｅｒ  Ｍ・ＢＲ０２２、ＴＡＩＴＥＣ社）して反応させた。反応０時間、３時間、２０時間目に反応液をサンプリングし、ＨＰＬＣ（カラム：Ｓｈｏｄｅｘ  Ａｓａｈｉｐａｋ  ＮＨ２Ｐ−５０  ４Ｅ（商品名：昭和電工株式会社製）、移動相：水／アセトニトリル＝２５／７５、流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度４０℃、検出：ＲＩ）で反応状況を確認した。【０１０２】
図７に示した結果のとおり、反応開始から３時間目には、実施例３で得られた化合物、すなわち本発明のシロ‐イノシトール誘導体がほとんど分解して、対応する量のグルコースとシロ‐イノシトールが生成した。また、反応開始から２０時間後には、本発明のシロ‐イノシトール誘導体は完全に分解していた。このことから、本発明のシロ‐イノシトール誘導体が、β‐グルコシダーゼにより容易に分解されることが判った。また、本酵素実験からも、本発明のシロ‐イノシトール誘導体の構造決定の正しさが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１０３】
本発明は、シロ‐イノシトールの工業的発酵生産に利用できる。本発明の新規なシロ‐イノシトール誘導体も、シロ‐イノシトールの工業的生産に有用である。【０１０４】
本明細書で言及したプラスミド及び微生物は、それらが寄託されていると記載されている場合、いずれも、（寄託機関の名称）「ＩＰＯＤ  独立行政法人  製品評価技術基盤機構特許  微生物寄託センター（ＩＰＯＤ、ＮＩＴＥ）」；（寄託機関のあて名）「日本国  郵便番号３０５−８５６６  茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６」に寄託されている。
【図１】
0005977264.tif 000021
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
0005977264.tif 000026
【図７】
0005977264.tif 000027
【配列表】
0005977264000001.app