(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のＲＮＡ配列からなる第１鎖および第２のＲＮＡ配列からなる第２鎖を含むｉＲＮＡ剤であって、第１鎖の第１のＲＮＡ配列および第２鎖の第２のＲＮＡ配列は互いにハイブリダイズするために互いに十分な相補的を有し、第１のＲＮＡ配列は第１の標的ＲＮＡと相補的であり、第２のＲＮＡ配列は、第１の標的ＲＮＡに相補的な第２の標的ＲＮＡと相補的であり、第１鎖および第２鎖の長さは３０ヌクレオチド未満であり、以下の式（Ｉ）を有する少なくとも１つのサブユニットが前記第１鎖および第２鎖のうち少なくとも１つの中に取り込まれているｉＲＮＡ剤。
【化１】
0005881970.tif 000172
（式中、
ＸはＮ（ＣＯ）Ｒ7またはＮＲ7であり、
ＹはＮＲ8、Ｏ、Ｓ、ＣＲ9Ｒ10であるかまたは存在せず、
ＺはＣＲ11Ｒ1２であるかまたは存在せず、
Ｒ1、Ｒ２、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ9、およびＲ10のそれぞれは独立にＨ、ＯＲa、ＯＲb、（ＣＨ2）nＯＲa、または（ＣＨ2）nＯＲbである、ただし、Ｒ1、Ｒ２、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ9、およびＲ10の少なくとも１つはＯＲaまたはＯＲbであり、かつＲ1、Ｒ２、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ9、およびＲ10の少なくとも１つは（ＣＨ2）nＯＲa、または（ＣＨ2）nＯＲbであり、
前記少なくとも１つのサブユニットは、Ｒ1、Ｒ２、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ9、およびＲ10から選択された少なくとも２つのバックボーン結合点を介して前記２つの鎖のうちの少なくとも
一つの３’末端に取り込まれており、
Ｒ1、Ｒ２、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ9、およびＲ10の１つがＲaを含み、かつＲ1、Ｒ２、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ9、およびＲ10の１つがＲbを含み、
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ11、およびＲ12のそれぞれは独立にＨ、任意選択で１〜３個のＲ13で置換されたＣ１〜Ｃ6アルキル、またはＣ（Ｏ）ＮＨＲ7であり；あるいは、Ｒ５およびＲ11が一体となって、任意選択でＲ14により置換されたＣ３〜Ｃ８シクロアルキルをなし、
Ｒ7はＮＲcＲdで置換されたＣ１〜Ｃ20アルキルであり、
Ｒ8はＣ１〜Ｃ6アルキルであり、
Ｒ13はヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ4アルコキシ、またはハロであり、
Ｒ14はＮＲcＲ7であり、
ＲaはＨまたは
【化２】
0005881970.tif 000173
であり、
ＲbはＨまたは
【化３】
0005881970.tif 000174
であり、
前記式中の鎖は前記ｉＲＮＡ剤の前記第１鎖または前記第２鎖であり、
ＡとＣのそれぞれは独立にＯまたはＳであり、
ＢはＯＨ、Ｏ−、または
【化４】
0005881970.tif 000175
であり、
ＲcはＨまたはＣ１〜Ｃ6アルキルであり、
Ｒdは、肝臓を標的とするリガンドであり、
ｎは１〜４である。）
【請求項２】
ＸはＮ（ＣＯ）Ｒ7またはＮＲ7であり、ＹはＣＲ9Ｒ10であり、Ｚは存在しない請求項１に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項３】
Ｒ1は（ＣＨ2）nＯＲbであり、Ｒ3はＯＲaである請求項２に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項４】
Ｒ1とＲ3はシスである請求項３に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項５】
Ｒ1とＲ3はトランスである請求項３に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項６】
ｎは１である請求項３に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項７】
ＡはＯまたはＳである請求項３に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項８】
Ｒ1は（ＣＨ2）nＯＲbであり、Ｒ3はＯＲbである請求項２に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項９】
Ｒ1は（ＣＨ2）nＯＲaであり、Ｒ3はＯＲbである請求項２に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項１０】
Ｒ7は（ＣＨ2）5ＮＨＲdまたは（ＣＨ2）5ＮＨＣ（Ｏ）Ｒdである請求項３に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項１１】
Ｒdはコレステロール、コール酸、ジヒドロテストステロン、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、またはＯ３−（オレオイル）コール酸である請求項３に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項１２】
Ｒdは多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、または多価マンノースである請求項３に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項１３】
Ｒ1はＯＲbであり、Ｒ3は（ＣＨ2）nＯＲbである請求項２に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項１４】
Ｒ1はＯＲbであり、Ｒ3は（ＣＨ2）nＯＲaである請求項２に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項１５】
Ｒ1はＯＲaであり、Ｒ3は（ＣＨ2）nＯＲbである請求項２に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項１６】
Ｒ1とＲ3はシスである請求項１５に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項１７】
Ｒ1とＲ3はトランスである請求項１５に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項１８】
ｎは１である請求項１５に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項１９】
Ｒ1は（ＣＨ2）nＯＲbであり、Ｒ9はＯＲaである請求項２に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項２０】
ａｐｏＢ−１００を標的とする請求項１に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項２１】
グルコース−６−ホスファターゼを標的とする請求項１に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項２２】
Ｒｄは、葉酸基、コレステロール基、糖質基、ビタミンＡ基、ビタミンＥ基、およびビタミンＫ基からなる群から選択される、請求項３に記載のｉＲＮＡ剤。    
【請求項２３】
Ｒｄは、脂質、コレステロール、オレイル、レチニル、コレステリル残基、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、およびフェノキサジンからなる群から選択される、請求項１に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項２４】
ＹはＣＲ9Ｒ10であり、かつＺはＣＲ11Ｒ1２である、請求項１に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項２５】
ＹはＮＲ8であり、かつＺはＣＲ11Ｒ1２である、請求項１に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項２６】
ＹはＯであり、かつＺはＣＲ11Ｒ1２である、請求項１に記載のｉＲＮＡ剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡｉおよび関連する方法、例えば、ｉＲＮＡ剤を作製および使用する方法に関する。本発明は、肝臓で発現される遺伝子をサイレンシングするための方法および組成物、ならびに肝臓に対してｉＲＮＡ剤を方向付けるための方法および組成物を含む。
【背景技術】
【０００２】
［関連出願］
本願は、２００３年４月９日に出願された米国仮出願第６０／４６２，０９７号；２００３年４月１０日に出願された米国仮出願第６０／４６１，９１５号；２００３年４月１７日に出願された米国仮出願第６０／４６３，７７２号；２００３年４月２５日に出願された米国仮出願第６０／４６５，８０２号；２００３年８月８日に出願された米国仮出願第６０／４９３，９８６号；２００３年８月１１日に出願された米国仮出願第６０／４９４，５９７号；２００３年９月２６日に出願された米国仮出願第６０／５０６，３４１号；２００３年１１月７日に出願された米国仮出願第６０／５１８，４５３号；２００３年５月９日に出願された米国仮出願第６０／４６９，６１２号；２００３年１０月９日に出願された米国仮出願第６０／５１０，２４６号；２００３年１０月１０日に出願された米国仮出願第６０／５１０，３１８号；２００３年４月２５日に出願された米国仮出願第６０／４６５，６６５号；２００３年４月１４日に出願された米国仮出願第６０／４６２，８９４号；２００４年３月８日に出願された国際出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ０４／０７０７０号；および２００４年４月５日に出願された国際出願番号第［ｘｘｘｘｘｘ］の利益を主張する。これらの出願の内容はその全体を本願明細書に援用する。
【０００３】
［背景］
ＲＮＡ干渉または「ＲＮＡｉ」は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が線虫に導入されたときに、該二本鎖ＲＮＡが遺伝子発現を阻害することが可能であるという観察を説明するために、ファイア（Ｆｉｒｅ）および共同研究者らによって最初に作られた用語である（非特許文献１）。短いｄｓＲＮＡは、脊椎動物を含む多くの生物において遺伝子特異的に転写後サイレンシングを為し、遺伝子の機能を研究するための新規なツールを提供してきた。ＲＮＡｉはｍＲＮＡ分解を伴うことが可能である。
【０００４】
この分野における研究は、生きている哺乳動物へのｄｓＲＮＡの送達に対する比較的厄介な取り組みによって代表される。例えば、マッカーフリーら（非特許文献２）は、マウスにおけるルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を阻害するためのｄｓＲＮＡの使用について実証した。ｄｓＲＮＡは、流体力学的な尾静脈注射という方法によって投与された（さらに、阻害は２ｍｇ／ｋｇを超えるｄｓＲＮＡの注射に依存するようであった）。本発明者らは、とりわけ、いくつかの報告された方法に代表される扱いにくい方法が、哺乳動物に有効量のｄｓＲＮＡを提供するために必要ではないこと、特にヒト対象に治療量のｄｓＲＮＡを提供するために必要ではないことを発見した。本発明の利点には、実用的で、複雑でない、投与方法および治療的適用の方法（例えば、２ｍｇ／ｋｇ未満の用量における方法）が含まれる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】ファイアら（Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９８年、Ｎａｔｕｒｅ  第３９１巻、ｐ．８０６〜８１１
【非特許文献２】マッカーフリーら（ＭｃＣａｆｆｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．）、２００２年、Ｎａｔｕｒｅ  第４１８巻、ｐ．３８−３９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、肝臓において発現する遺伝子をサイレンシングするための組成物および方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の態様は、例えば、肝臓の障害または肝臓に関連する障害を治療するために、肝臓において発現する遺伝子をサイレンシングするための組成物および方法に関する。本発明のｉＲＮＡ剤組成物は、肝臓に優先的となるように分布を変化させるべく修飾されているものであり得る。本発明の組成物は、ｉＲＮＡ剤、例えば、本明細書中に記載されているｉＲＮＡ剤またはｓＲＮＡ剤を含む。
【０００８】
１つの態様において、本発明は、対象（例えば、ヒトなどの哺乳動物）においてａｐｏＢ−１００のレベルを低下させる方法を特徴とする。該方法は、ａｐｏＢ−１００を標的とするｉＲＮＡ剤を対象に投与する工程を含む。このｉＲＮＡ剤は本明細書に記載されるものでよく、ａｐｏＢ−１００遺伝子のある領域と実質的に同一であるｄｓＲＮＡであり得る。このｉＲＮＡは長さが３０ヌクレオチド未満、例えば、２１〜２３ヌクレオチド長であり得る。好ましくは、このｉＲＮＡの長さは２１ヌクレオチドである。１つの実施形態において、ｉＲＮＡの長さは２１ヌクレオチドであり、このｉＲＮＡの二本鎖領域の長さは１９ヌクレオチドである。別の実施形態において、ｉＲＮＡは３０ヌクレオチドよりも長い。
【０００９】
好ましい実施形態において、対象は表９または１０に列挙される配列のうちの１つを標的とするｉＲＮＡ剤で治療される。好ましい実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、表９または１０に提示されるパリンドローム構造の対をなす配列の両方を標的とする。最も好ましい標的は、表９または１０において好ましい順に列挙されており、換言すれば、より好ましい標的は、表９または１０において初めの方に列挙されている。
【００１０】
好ましい実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、表９または１０に挙げた対に対して相補的である領域または鎖を含む。好ましい実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、表９または１０のパリンドローム対に対して相補的な領域を二本鎖領域として含む。
【００１１】
好ましい実施形態において、ｉＲＮＡ剤の二本鎖領域は表９または１０に列挙された配列を標的とするが、標的配列と完全に相補的ではなく、例えば、少なくとも１塩基対が相補的でない。好ましくは、ｉＲＮＡ剤は、全体で、または鎖当たりで、１個、２個、３個、４個、または５個以内の、標的配列とハイブリダイズしない塩基を有する。
【００１２】
ａｐｏＢ−１００を標的とするｉＲＮＡ剤は、ａｐｏＢ−１００  ｍＲＮＡの発現を減少させるために十分な量で投与されうる。１つの実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、ａｐｏＢ−１００タンパク質の発現を（例えば、少なくとも２％、４％、６％、１０％、１５％、２０％）減少させるために十分な量投与される。好ましくは、ｉＲＮＡ剤は、ａｐｏＢ−４８のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を減少させない。これは、例えば、ａｐｏＢ−１００転写物中でＲＮＡ編集を受けるヌクレオチドを特異的に標的とするｉＲＮＡ剤を選択することによって実施可能である。
【００１３】
ａｐｏＢ−１００を標的とするｉＲＮＡ剤を、ａｐｏＢ−１００の発現上昇またはそうでなければ望ましくないａｐｏＢ−１００の発現、コレステロールレベルの上昇またはそうでなければ望ましくないコレステロールレベル、および脂質代謝の調節不全のうち少なくともいずれかによって特徴付けられる障害に罹患している対象に投与することが可能で
ある。ｉＲＮＡ剤は、該障害または該障害の徴候の発症を遅延させるために該障害のリスクを有する個体に投与することも可能である。これらの障害には、ＨＤＬ／ＬＤＬコレステロールの不均衡；異常脂質血症、例えば、家族性複合型高脂血症（ＦＣＨＬ）、後天性高脂血症；高コレステロール血症；スタチン抵抗性高コレステロール血症；冠状動脈疾患（ＣＡＤ）冠動脈性心疾患（ＣＨＤ）アテローム性動脈硬化症が含まれる。１つの実施形態において、ａｐｏＢ−１００を標的とするｉＲＮＡがスタチン抵抗性高コレステロール血症に罹患している対象に投与される。
【００１４】
該ａｐｏＢ−１００  ｉＲＮＡ剤は、対象における血清ＬＤＬ−ＣおよびＨＤＬ−Ｃのうち少なくともいずれかならびに総コレステロールのうち少なくともいずれかのレベルを低下させるために十分な量で投与されうる。例えば、該ｉＲＮＡは、対象における総コレステロールを、少なくとも０．５％、１％、２．５％、５％、１０％減少させるために十分な量で投与される。１つの実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、対象における心筋梗塞のリスクを減少させるために十分な量で投与される。
【００１５】
好ましい実施形態において、ｉＲＮＡ剤は反復投与される。ｉＲＮＡ剤の投与は、一定の範囲の期間にわたって実施することが可能である。ｉＲＮＡ剤は、毎日、数日毎に１回、毎週、または毎月投与することが可能である。投与のタイミングは、患者の徴候の重症度のような要因に依存して、患者毎に変化し得る。例えば、有効用量のｉＲＮＡ剤を、無期限で、または患者が治療を必要としなくなるまで、１ヶ月に１回、患者に投与することが可能である。さらに、患者の血液中において比較的一定な用量を維持するためにｉＲＮＡ剤を含む持続放出組成物を使用することが可能である。
【００１６】
１つの実施形態において、ｉＲＮＡ剤を肝臓へ向かわせる（肝臓指向性とする）ことが可能であり、該ａｐｏＢ  ｉＲＮＡ剤の投与後に肝臓においてａｐｏＢの発現レベルが低下する。例えば、ｉＲＮＡ剤を、肝臓を標的とする構成部分、例えば、肝臓上の受容体に結合する抗体またはリガンドとともに複合物とすることが可能である。
【００１７】
ｉＲＮＡ剤、特に、ａｐｏＢ、β−カテニン、またはグルコース−６−ホスファターゼのＲＮＡを標的とするｉＲＮＡ剤を、例えば、親油性部分（例えば、脂質残基、コレステロール残基、オレイル残基、レチニル残基、またはコレステリル残基）にｉＲＮＡ剤を結合させること（例えば、複合体化すること）によって、肝臓へ向かわせる（肝臓指向性とする）ことが可能である。ｉＲＮＡ剤と結合させる（例えば、複合体化する）ことが可能な他の親油性部分には、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジンが含まれる。１つの実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）（例えば、ラクトシル化ＬＤＬ）にｉＲＮＡ剤を結合させること（例えば、複合体化すること）によって、肝臓へ向かわせる（肝臓指向性とする）ことが可能である。別の実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、糖残基を有するポリマー担体複合体にｉＲＮＡ剤を結合させること（例えば、複合体化すること）によって、肝臓指向性とすることが可能である。
【００１８】
別の実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、糖残基と複合体化されたリポソームにｉＲＮＡ剤を結合（例えば、複合体化）させることによって肝臓指向性とすることが可能である。糖（例えば、ガラクトースおよびそのアナログのうち少なくともいずれか）を組み込む標的化剤が特に有用である。これらの標的化剤は、特に肝臓の実質細胞を標的とする（表１を参照されたい）。好ましい実施形態において、標的化部分には、複数の、好ましくは２つまたは３つのガラクトース部分が含まれる。好ましくは、標的化部分には、例えば、互
いに約１５オングストローム間隔の３つのガラクトース部分が含まれる。標的化部分はラクトースでもよい。ラクトースは、ガラクトースに結合したグルコースである。好ましくは、標的化部分は３つのラクトースを含む。標的化部分はまた、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−Ａｃ−グルコサミンでもよい。マンノース、またはマンノース−６−リン酸の標的化部分は、マクロファージに対する標的化のために使用することが可能である。
【００１９】
標的化剤は、例えば、共有結合または非共有結合により、ｉＲＮＡ剤または別の送達様式もしくは処方様式（例えば、リポソーム）に直接的に連結させることが可能である。例えば、標的化部分を有するｉＲＮＡ剤または標的化部分を含まないｉＲＮＡ剤を、標的化部分を有する送達様式または標的化部分を含まない送達様式（例えば、リポソーム）に組み込むことが可能である。
【００２０】
ａｐｏＢ、β−カテニン、またはグルコース−６−ホスファターゼを標的とするｉＲＮＡ剤にｉＲＮＡ標的化剤を複合体化するために、親油性物質に複合体化されたｉＲＮＡを使用することが特に好ましい。
【００２１】
１つの実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、送達薬剤、例えば、本明細書中に記載されるような送達薬剤（例えば、リポソーム）であって、肝臓に優先的に分布するように分布を変化させる修飾が施されている送達薬剤で修飾されているか、または該送達薬剤と結合されている。１つの実施形態において、この修飾により、血清アルブミン（ＳＡ）（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ））またはその断片との結合が仲介される。
【００２２】
ｉＲＮＡ剤、特に、ａｐｏＢ、β−カテニン、またはグルコース−６−ホスファターゼのＲＮＡを標的とするｉＲＮＡ剤は、例えば、ＳＡ分子（例えば、ＨＳＡ分子）またはその断片にｉＲＮＡ剤を結合させること（例えば、複合体化させること）によって、肝臓に向かわせることが可能である。１つの実施形態において、ｉＲＮＡ剤またはその組成物は、ＳＡ（例えば、ＨＳＡ）に対する親和性を有し、この親和性は、肝臓中でのそのレベルが、ＳＡ（例えば、ＨＳＡ）の存在下では少なくとも１０％、２０％、３０％、５０％、または１００％大きいように、または外部からＳＡを付加することにより肝臓への送達が増加するように、十分に高い。これらの判断基準は、例えば、マウスにおける分布を、外来のマウスＳＡまたはヒトＳＡの存在下または非存在下において試験することによって測定することが可能である。
【００２３】
ＳＡ（例えば、ＨＳＡ）標的化剤は、ｉＲＮＡ剤または別の送達様式もしくは処方様式（例えば、リポソーム）に、直接的に（例えば、共有結合または非共有結合により）連結させることが可能である。例えば、標的化部分を備えたｉＲＮＡ剤または備えていないｉＲＮＡ剤を、標的化部分を備えた送達様式または備えていない送達様式（例えば、リポソーム）に組み込むことが可能である。
【００２４】
ＳＡ（例えば、ＨＳＡ）分子に複合体化されたｉＲＮＡを使用することが特に好ましく、ここでｉＲＮＡ剤はａｐｏＢ、β−カテニン、またはグルコース−６−ホスファターゼｉＲＮＡ標的化剤である。
【００２５】
別の態様において、本発明は、対象（例えば、ヒトなどの哺乳動物）におけるグルコース−６−ホスファターゼレベルを低下させるための方法を特徴とする。この方法は、グルコース−６−ホスファターゼを標的とするｉＲＮＡ剤を対象に投与する工程を包含する。このｉＲＮＡ剤は、グルコース−６−ホスファターゼ遺伝子の配列と実質的に同一である配列を有するｄｓＲＮＡであり得る。
【００２６】
好ましい実施形態において、対象は、表１１に列挙された配列の１つを標的とするｉＲ
ＮＡ剤で処置される。好ましい実施形態において、該ｉＲＮＡ剤は、表１１に提供されるパリンドローム対の両方の配列を標的とする。最も好ましい標的は、表１１において好ましい順に列挙されており、換言すれば、より好ましい標的は、表１１においてより初めの方に列挙されている。
【００２７】
好ましい実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、表１１の対に相補的である領域または鎖を含む。好ましい実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、表１１のパリンドローム対に対して相補的な領域を二本鎖として含む。
【００２８】
好ましい実施形態において、ｉＲＮＡ剤の二本鎖領域は表１１において列挙される配列を標的とするが、標的配列と完全に相補的ではなく、例えば、少なくとも１塩基対が相補的でない。好ましくは、該二本鎖領域は、全体でまたは鎖当たりで、１個、２個、３個、４個、または５個以下の、標的配列とハイブリダイズしない塩基を有する。
【００２９】
好ましい実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、突出部、例えば、３’または５’突出部、好ましくは１つまたは複数の３’突出部を含む。突出部は、本明細書中の他の箇所で詳細に議論されるが、好ましくは約２ヌクレオチド長である。突出部は、標的とされる遺伝子配列に対して相補的であってもよいし、または他の配列であってもよい。好ましい突出部の配列はＴＴである。ｉＲＮＡ剤の第１および第２の配列を、例えば、ヘアピンを形成するための追加の塩基によって、または他の非塩基リンカーによって、結合することも可能である。
【００３０】
表１１は、ヒトのグルコース−６−ホスファターゼ由来の配列に言及している。表１２はラットのグルコース−６−ホスファターゼ由来の配列に言及している。表１２の配列は、例えば、ラットまたはラット培養細胞を用いる実験において使用することが可能である。
【００３１】
好ましい実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、任意の構成様式、例えば、本明細書中に記載される構成様式を有することが可能である。例えば、本明細書中に記載されるような突出部構造、全体の長さ、ヘアピン構造対２本鎖構造を有するｉＲＮＡ剤を生じる構成様式が組み込まれてもよい。さらに、天然に存在するリボヌクレオチド以外のモノマーが、選択されたｉＲＮＡ剤において使用されてもよい。
【００３２】
グルコース−６−ホスファターゼを標的とするｉＲＮＡは、グルコース−６−ホスファターゼｍＲＮＡの発現を減少させるために十分な量で投与することが可能である。
【００３３】
グルコース−６−ホスファターゼを標的とするｉＲＮＡは、糖尿病（例えば、２型糖尿病）などのグルコース代謝関連障害の治療のために、肝臓のグルコース生産を阻害するために対象に投与することが可能である。ｉＲＮＡ剤は、該障害または該障害の徴候の発症を遅延させるために、障害のリスクを有する個体に投与することが可能である。
【００３４】
他の実施形態において、肝臓のグルコース生産を阻害するために、以下の遺伝子に対して配列の類似性を有するｉＲＮＡ剤を使用することも可能である。これらの他の遺伝子には、「横紋筋肉腫のフォークヘッドホモログ（forkhead homologue in rhabdomyosarcoma; ＦＫＨＲ）」；グルカゴン；グルカゴン受容体；グリコーゲンホスホリラーゼ；ＰＰＡＲ−γコアクチベータ（ＰＧＣ−１）；フルクトース−１，６−ビスホスファターゼ；グルコース−６−リン酸ロケーター（glucose-6-phosphate locator ）；グルコキナーゼ阻害性調節タンパク質（glucokinase inhibitory regulatory protein ）；およびホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）が含まれる。
【００３５】
１つの実施形態において、ｉＲＮＡ剤に肝臓を標的とさせることが可能であり、標的とされた遺伝子のＲＮＡ発現レベルは該ｉＲＮＡ剤の投与後に肝臓において低下する。
【００３６】
ｉＲＮＡ剤は本明細書中に記載されるものでよく、かつ標的遺伝子の配列と実質的に同一の配列を有するｄｓＲＮＡであり得る。このｉＲＮＡは長さが３０ヌクレオチド未満、例えば２１〜２３ヌクレオチドであり得る。好ましくは、このｉＲＮＡは２１ヌクレオチド長である。１つの実施形態において、このｉＲＮＡは２１ヌクレオチド長であり、かつこのｉＲＮＡの二本鎖領域は１９ヌクレオチドである。別の実施形態において、ｉＲＮＡは３０ヌクレオチド長よりも大きい。
【００３７】
別の態様において、本発明は、対象（例えば、ヒトなどの哺乳動物）におけるβ−カテニンのレベルを低下させるための方法を特徴とする。この方法は、β−カテニンを標的とするｉＲＮＡ剤を対象に投与することを包含する。このｉＲＮＡ剤は本明細書中に記載されるものでよく、かつβ−カテニン遺伝子の配列と実質的に同一の配列を有するｄｓＲＮＡであり得る。このｉＲＮＡは長さが３０ヌクレオチド未満、例えば２１〜２３ヌクレオチド長であり得る。好ましくは、このｉＲＮＡは２１ヌクレオチド長である。１つの実施形態において、このｉＲＮＡは２１ヌクレオチド長であり、かつこのｉＲＮＡの二本鎖領域は１９ヌクレオチド長である。別の実施形態において、このｉＲＮＡは３０ヌクレオチド長よりも大きい。
【００３８】
好ましい実施形態において、対象は表１３に列挙された配列の１つを標的とするｉＲＮＡ剤で処置される。好ましい実施形態において、該ｉＲＮＡ剤は、表１３に提供されるパリンドローム対の両方の配列を標的とする。最も好ましい標的は、表１３において好ましい順に列挙されており、換言すれば、より好ましい標的は、表１３においてより初めの方に列挙されている。
【００３９】
好ましい実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、表１３における１つの対に相補的な領域または鎖を含む。好ましい実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、表１３のパリンドローム対に対して相補的な領域を二本鎖領域として含む。
【００４０】
好ましい実施形態において、ｉＲＮＡ剤の二本鎖領域は表１３に列挙される配列を標的とするが、標的配列と完全に相補的ではなく、例えば、少なくとも１塩基対が相補性的ない。好ましくは、該二本鎖領域は、全体でまたは鎖当たりで、１個、２個、３個、４個、または５個以下の、標的配列とハイブリダイズしない塩基を有する。
【００４１】
好ましい実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、突出部、例えば、３’または５’突出部、好ましくは１つまたは複数の３’突出部を含む。突出部は、本明細書中の他の箇所で詳細に議論されるが、好ましくは約２ヌクレオチド長である。突出部は、標的とされる遺伝子配列に対して相補的であってもよいし、または他の配列であってもよい。好ましい突出部の配列はＴＴである。ｉＲＮＡ剤の第１および第２の配列を、例えば、ヘアピンを形成するための追加の塩基によって、または他の非塩基リンカーによって、結合することも可能である。
【００４２】
β−カテニンを標的とするｉＲＮＡ剤は、β−カテニン  ｍＲＮＡの発現を減少させるために十分な量で投与可能である。１つの実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、β−カテニンタンパク質の発現を（例えば、少なくとも２％、４％、６％、１０％、１５％、２０％）減少させるために十分な量で投与される。
【００４３】
β−カテニンを標的とするｉＲＮＡ剤を、対象に投与することが可能であり、ここで、この対象は、肝臓または肝臓組織における望ましくない細胞増殖（例えば、肝臓から発生
した転移性組織）によって特徴付けられる障害に罹患している。例としては、良性または悪性の障害、例えば、がん（例えば、肝細胞がん（ＨＣＣ）、肝転移、または肝芽腫）が含まれる。
【００４４】
ｉＲＮＡ剤は、該障害または該障害の徴候の発症を遅延させるために、障害のリスクを有する個体に投与することが可能である。
【００４５】
好ましい実施形態において、ｉＲＮＡ剤は反復して投与される。ｉＲＮＡ剤の投与は、一定期間の範囲にわたって実施することが可能である。ｉＲＮＡ剤は、毎日、数日毎に１回、毎週、または毎月投与することが可能である。投与のタイミングは、患者の徴候の重篤度のような要因に依存して、患者によって変化し得る。例えば、ｉＲＮＡ剤の有効用量は、無期限の間、または患者がもはや治療を必要としなくなるまで、１ヶ月に１回、患者に投与することが可能である。さらに、ｉＲＮＡ剤を含む持続放出組成物を用いて、患者の血液中で比較的一定な用量を維持することが可能である。
【００４６】
１つの実施形態において、ｉＲＮＡ剤に肝臓を標的とさせることが可能であり、β−カテニンの発現レベルは、β−カテニンｉＲＮＡ剤の投与後に肝臓において低減される。例えば、ｉＲＮＡ剤を、肝臓を標的とする構成部分、例えば、肝臓上のレセプターに結合する抗体またはリガンドと複合体化させることが可能である。
【００４７】
別の実施形態において、本発明は、肝臓障害（例えば、肝臓の、望ましくない細胞増殖によって特徴付けられる障害、血液学的な障害、炎症性障害によって特徴付けられる障害、および代謝性またはウイルス性の疾患または障害）を治療するための方法を提供する。肝臓の増殖性障害は、例えば、良性または悪性の障害、例えば、がん（例えば、肝細胞がん（ＨＣＣ）、肝転移、または肝芽腫）であり得る。肝臓の血液学的障害または炎症性の障害は、例えば、凝固因子に関する障害、補体を介した炎症、または線維症であり得る。肝臓の代謝性疾患には、異常脂質血症、およびグルコース調節の異常が挙げられる。肝臓のウイルス性疾患には、Ｃ型肝炎およびＢ型肝炎が挙げられる。１つの実施形態において、肝臓障害は、その肝臓障害に関与する遺伝子中の配列と実質的に同一である配列を有する１つまたは複数のｉＲＮＡ剤を投与することによって治療される。
【００４８】
１つの実施形態において、肝臓障害を治療するためのｉＲＮＡ剤は、β−カテニン遺伝子またはｃ−ｊｕｎ遺伝子の配列と実質的に同一である配列を有する。別の実施形態において、例えば、Ｃ型肝炎またはＢ型肝炎の治療のために、ｉＲＮＡ剤は、それぞれＣ型肝炎ウイルスまたはＢ型肝炎ウイルスの遺伝子の配列と実質的に同一である配列を有することが可能である。例えば、ｉＲＮＡ剤は、ＨＣＶの５’コア領域を標的とすることが可能である。この領域は、開始メチオニンにまたがるリボソームの足指紋（toe-print ）のすぐ下流に存在する。別例として、本発明のｉＲＮＡ剤は、ＨＣＶ：ＮＳ３、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、または５Ｂの非構造タンパク質のいずれか１つを標的とすることが可能である。Ｂ型肝炎の治療のために、例えば、ｉＲＮＡ剤はＸタンパク質（ＨＢｘ）遺伝子を標的とすることが可能である。
【００４９】
好ましい実施形態において、対象は表１４に列挙される配列の１つを標的とするｉＲＮＡ剤で治療される。好ましい実施形態において、該ｉＲＮＡ剤は、表１４に提供されるパリンドローム対の両方の配列を標的とする。最も好ましい標的は、表１４において好ましい順に列挙されており、換言すれば、より好ましい標的は、表１４においてより初めの方に列挙されている。
【００５０】
好ましい実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、表１４の対に対して相補的な領域または鎖を含む。好ましい実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、表１４のパリンドローム対に対して
相補的な領域を二本鎖領域として含む。
【００５１】
好ましい実施形態において、ｉＲＮＡ剤の二本鎖領域は表１４において列挙される配列を標的とするが、標的配列と完全に相補的ではなく、例えば、少なくとも１塩基対が相補的でない。好ましくは、ｉＲＮＡ剤は、全体でまたは鎖当たりで、標的配列とハイブリダイズしない１個、２個、３個、４個、または５個以下の塩基を有する。
【００５２】
好ましい実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、突出部、例えば、３’または５’突出部、好ましくは１つまたは複数の３’突出部を含む。突出部は、本明細書中の他の箇所で詳細に議論されるが、好ましくは約２ヌクレオチド長である。突出部は、標的とされる遺伝子配列に対して相補的でもよいし、他の配列でもよい。突出部の好ましい配列はＴＴである。第１および第２のｉＲＮＡ剤の配列が、例えば、ヘアピンを形成するための追加の塩基によって、または他の非塩基リンカーによって結合されてもよい。
【００５３】
別の態様において、ｉＲＮＡ剤は、血液凝固を調節するために、例えば、血塊を形成する傾向を減少するために投与することが可能である。好ましい実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、好ましくは肝臓において、第Ｖ因子の発現を標的とする。１つまたは複数のｉＲＮＡ剤を、野生型対立遺伝子、変異型対立遺伝子（例えば、ライデン第Ｖ因子対立遺伝子）、またはその両方を標的とするように使用することが可能である。このような投与は、静脈血栓症（例えば、深部静脈血栓症もしくは肺塞栓症）、または、例えば肝臓における、第Ｖ因子の発現上昇もしくは望ましくない発現によって引き起こされる別の障害を治療または予防するために使用することが可能である。１つの実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、対象、例えば、ライデン第Ｖ因子を有する、または血塊を形成するという望ましくない傾向と関連する他の遺伝的形質を有するヒトを治療することが可能である。
【００５４】
好ましい実施形態において、第Ｖ因子を標的とするｉＲＮＡ剤の投与は、第２の治療、例えば、血液が凝固する傾向を低減させる治療（例えば、ヘパリンまたは低分子量ヘパリンの投与）を伴う。
【００５５】
１つの実施形態において、第Ｖ因子を標的とするｉＲＮＡ剤は、患者、例えば、ライデン第Ｖ因子を有し、血栓症のリスクに置かれている患者、例えば、外科手術を受ける予定の患者（特に、静脈血栓の形成との関連が知られている高リスクの外科手順を受ける予定の患者）、長時間にわたりあまり動かない状態に置かれる（例えば、自動車、列車または航空機の飛行（例えば、３時間または５時間より長く続く空の旅その他の旅行）によりあまり動かない状態に置かれる）予定である患者における予防処置として使用することが可能である。このような治療は低分子量（ＬＭＷ）ヘパリンの予防剤の治療的使用に対する補助となり得る。
【００５６】
別の実施形態において、第Ｖ因子を標的とするｉＲＮＡ剤は、深部静脈血栓症（ＤＶＴ）または肺塞栓症（ＰＥ）を処置するためにライデン第Ｖ因子を有する患者に投与することが可能である。このような治療は、ヘパリンまたはクマディン（商品名）の治療的使用に対する補助（またはその代替）となりうる。該治療は、吸入によってまたは一般的には経肺投与によって施すことが可能である。
【００５７】
好ましい実施形態において、肝臓障害を治療するために投与されるｉＲＮＡ剤は、肝臓に対して標的化される。例えば、ｉＲＮＡ剤を、標的化部分、例えば、肝臓に特異的な受容体を認識する抗体またはリガンドと複合体化させることが可能である。
【００５８】
本発明はまた、本明細書中に議論される遺伝子のいずれか、特に、ａｐｏＢ−１００、グルコース−６−ホスファターゼ、β−カテニン、第Ｖ因子のいずれか、または本明細書
中で議論されるＨＣＶ遺伝子のいずれかをサイレンシングするｉＲＮＡ剤の、実質的に純粋な調製物または薬学的に許容可能な調製物を含む調製物を含む。
【００５９】
本発明の方法および組成物、例えば、本明細書中に記載されている肝臓疾患および肝臓障害を治療するための方法および組成物を、記載されるｉＲＮＡ剤のいずれかを用いて使用することが可能である。さらに、本発明の方法および組成物は、本明細書中に記載される任意の疾患および障害の治療のため、および任意の対象（例えば、任意の動物、任意の哺乳動物（例えば、任意のヒト））の治療のために使用することが可能である。
【００６０】
本発明の方法および組成物、例えば、本明細書中に記載される肝臓系の疾患を治療するための方法およびｉＲＮＡ組成物は、本明細書中に記載される任意の用量および／または製剤を用いて、ならびに本明細書中に記載される任意の投与経路を用いて使用することが可能である。
【００６１】
「実質的に同一である」配列は、ｉＲＮＡ剤またはその断片が標的遺伝子のダウンレギュレーション（下方制御）を仲介することが可能であるように、標的遺伝子に対して十分な相同性を有する領域を含み、十分なヌクレオチド数の長さを有する。したがって、ｉＲＮＡ剤は、標的のＲＮＡ転写物に対して少なくとも部分的に、およびある実施形態においては完全に、相補的な領域であるか、または同領域を含む。ｉＲＮＡ剤と標的との間に完全な相補性が存在することは必ずしも必要ではないが、ｉＲＮＡ剤と標的との間の対応は、ｉＲＮＡ剤またはその切断産物が、例えば、標的ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）のＲＮＡｉ切断によって、配列特異的なサイレンシングを導くことが可能であるために、十分でなくてはならない。標的鎖との相補性、または相同性の程度は、アンチセンス鎖において最も重大である。特にアンチセンス鎖では完全に相補的であることが望ましいことが多いが、ある実施形態は、特にアンチセンス鎖において、１つ以上であるが好ましくは６つ、５つ、４つ、３つ、２つ、またはそれより少ないミスマッチ（標的ＲＮＡに関して）を含むことが可能である。ミスマッチは、特にアンチセンス鎖においては、末端領域において最も受け入れられやすく、存在する場合、好ましくは末端領域において、例えば、５’末端および３’末端のうち少なくともいずれかにおいて６ヌクレオチド以内、５ヌクレオチド以内、４ヌクレオチド以内、または３ヌクレオチド以内である。センス鎖は、分子の二本鎖としての性質全体を維持するために十分なだけアンチセンス鎖と相補的であればよい。
【００６２】
本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細は、添付図面および以下の説明において示される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、この説明から、および特許請求の範囲から明らかとなろう。本願は、すべての引用した文献、特許、および特許出願の全体を、本願に援用する。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】偽相補性のｓｉＲＮＡ２における塩基対形成の構造を示す図。
【図２】ＨＣＶゲノムを標的とするように設計された二重標的化ｓｉＲＮＡの模式図。
【図３】ＨＣＶゲノムを標的とするように設計された、偽相補性かつ二重機能性ｓｉＲＮＡの模式図。
【図４】オリゴヌクレオチドにＲＲＭＳモノマーを組み込むための一般的な合成スキーム。
【図５Ａ】代表的なＲＲＭＳ担体の表を示す図。パネル１はピロリン系のＲＲＭＳを示し；パネル２は３−ヒドロキシプロリン系のＲＲＭＳを示し；パネル３はピペリジン系のＲＲＭＳを示し；パネル４はモルホリンおよびピペラジン系のＲＲＭＳを示し；パネル５はデカリン系のＲＲＭＳを示す。Ｒ１はコハク酸またはホスホロアミデートであり、Ｒ２はＨまたは複合体リガンドである。
【図５Ｂ】代表的なＲＲＭＳ担体の表を示す図。パネル１はピロリン系のＲＲＭＳを示し；パネル２は３−ヒドロキシプロリン系のＲＲＭＳを示し；パネル３はピペリジン系のＲＲＭＳを示し；パネル４はモルホリンおよびピペラジン系のＲＲＭＳを示し；パネル５はデカリン系のＲＲＭＳを示す。Ｒ１はコハク酸またはホスホロアミデートであり、Ｒ２はＨまたは複合体リガンドである。
【図５Ｃ】代表的なＲＲＭＳ担体の表を示す図。パネル１はピロリン系のＲＲＭＳを示し；パネル２は３−ヒドロキシプロリン系のＲＲＭＳを示し；パネル３はピペリジン系のＲＲＭＳを示し；パネル４はモルホリンおよびピペラジン系のＲＲＭＳを示し；パネル５はデカリン系のＲＲＭＳを示す。Ｒ１はコハク酸またはホスホロアミデートであり、Ｒ２はＨまたは複合体リガンドである。
【図５Ｄ】代表的なＲＲＭＳ担体の表を示す図。パネル１はピロリン系のＲＲＭＳを示し；パネル２は３−ヒドロキシプロリン系のＲＲＭＳを示し；パネル３はピペリジン系のＲＲＭＳを示し；パネル４はモルホリンおよびピペラジン系のＲＲＭＳを示し；パネル５はデカリン系のＲＲＭＳを示す。Ｒ１はコハク酸またはホスホロアミデートであり、Ｒ２はＨまたは複合体リガンドである。
【図６】マウスの血中グルコースレベルを示すグラフ。  （Ａ）非特異的なウミシイタケ（Renilla ）ＲＮＡで処置したマウス、またはｓｉＲＮＡで処置していないマウスの血中グルコースレベルを示すグラフ。非特異的なウミシイタケＲＮＡで処置するマウスには７日目に注射を実施した。  （Ｂ）グルコース−６−ホスファターゼを標的とするｓｉＲＮＡで処置したマウスの血中グルコースレベルを示すグラフ。グルコース−６−ホスファターゼを標的とするｓｉＲＮＡで処置するマウスには７日目に注射を実施した。  （Ｃ）ｓｉＲＮＡを注射していないか、または注射したが注射に失敗したマウスの血中グルコースレベルを示すグラフ。注射するマウスには７日目に注射を実施した。
【図７】グルコース−６−ホスファターゼを標的とするｓｉＲＮＡで処置した４匹のマウス、および非特異的なウミシイタケＲＮＡで処置したか、またはｓｉＲＮＡで処置しなかった４匹のマウス（三角形）における平均血中グルコースレベルを示すグラフ。ｓｉＲＮＡまたはウミシイタケＲＮＡは流体力学的尾静脈注射によって７日目に投与された。
【図８Ａ】緩衝液またはｓｉＲＮＡを尾静脈へ静脈内注射（ｉｖ）した後のＣＭＶ−Ｌｕｃマウス（キセノジェン社）の肝臓中におけるルシフェラーゼｍＲＮＡのレベルを示すグラフ。各棒グラフは１匹のマウス由来のデータを表す。ＲＮＡレベルはＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ（登録商標）アッセイ（米国カリフォルニア州フレモント所在のジェノスペクトラ・インコーポレイテッド（Genospectra, Inc. ）によって定量した。Ｙ軸は１秒間当たりの計数（ＣＰＳ）で表された化学発光の値を表す。
【図８Ｂ】ＣＭＶ−Ｌｕｃマウス（キセノジェン社）の肝臓におけるルシフェラーゼｍＲＮＡのレベルを示すグラフ。値は、図８Ａに示されたデータを平均したものである。
【図９】コレステロール複合型ｓｉＲＮＡおよび複合体化していないｓｉＲＮＡの薬物動態を示すグラフ。ひし形プロットは複合体化されていない３３Ｐ標識ｓｉＲＮＡ（ＡＬＮ−３０００）のマウス血漿中の量を経時的に表し；四角形のプロットはコレステロールで複合体化された３３Ｐ標識ｓｉＲＮＡ（ＡＬＮ−３０００）のマウス血漿中の量を経時的に表す。「Ｌ１１６３」とはＡＬＮ３０００に相当する用語であり；「Ｌ１１６３Ｃｈｏｌ」はＡＬＮ−３００１に相当する用語である。
【図１０】尾静脈注射後の一定時間にわたりマウスの単離された全肝臓組織において検出された、コレステロール複合型ｓｉＲＮＡの量（暗色の棒グラフ）および複合体化されていないｓｉＲＮＡの量（明色の棒グラフ）を示すグラフ。ｓｉＲＮＡの量は、総用量またはマウスに送達された３３Ｐ標識ｓｉＲＮＡに対する割合（％）として表されている。「Ｌ１１６３」はＡＬＮ３０００に相当する用語であり（明色の棒グラフ）；「Ｌ１１６３Ｃｈｏｌ」はＡＬＮ−３００１に相当する用語である（暗色の棒グラフ）。
【図１１】２匹の異なるＣＭＶ−マウス（「マウス６９」（明色の棒グラフ）および「マウス６３」（暗色の棒グラフ））の種々の組織において検出されたコレステロール複合型ｓｉＲＮＡの量を示すグラフ。尾静脈注射によってマウスに５０ｍｇ／ｋｇのＡＬ−３００１  ｓｉＲＮＡを注射し、２２時間後に組織を採取した。ｓｉＲＮＡをＲＮＡｓｅ保護アッセイによって検出し、ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（商標）によるスキャニングを使用してｓｉＲＮＡを定量した。ｓｉＲＮＡは肝臓組織１ｇあたりの量（μｇ）として表されている。
【図１２】流体力学的（ｈｄ）尾静脈注射後の経過時点におけるＢａｌｂｃマウスの肝臓中で検出されたＵ／Ｕ  ｓｉＲＮＡ（表１９を参照のこと）のゲルを示す図。Ｕ／Ｕ  ｓｉＲＮＡは４ｍｇ／ｋｇの濃度で注射した。ｓｉＲＮＡはＲＮＡ保護アッセイによって検出した。「標準品」と記載されたレーンには、サイズおよび品質の標準とするために精製ｓｉＲＮＡを載せた。「注射なし」は、Ｕ／Ｕ  ｓｉＲＮＡを注射しなかったマウスの肝臓から単離した対照試料を表す。対照試料は、並行するＲＮＡｓｅ保護アッセイにおいてさらに使用した。
【図１３】流体力学的（ｈｄ）または非流体力学的な（ｉｖ）尾静脈注射後の経過時点におけるＢａｌｂｃマウスの肝臓中で検出された異なるｓｉＲＮＡ種を比較するゲルを示す図。Ｕ／Ｕ  ｓｉＲＮＡはｈｄおよびｉｖ注射によって注射した。３’Ｃ／３’Ｃおよび３’Ｃ／Ｕ（表１９を参照のこと）は各々ｉｖ注射によって４ｍｇ／ｋｇの濃度で注射した。ｓｉＲＮＡはＲＮＡ保護アッセイによって検出した。「標準品」と記載されたレーンには、サイズおよび品質の標準とするために精製ｓｉＲＮＡを載せた。「注射なし」はｓｉＲＮＡを注射しなかったマウスの肝臓から単離した対照試料を表す。対照試料は、並行するＲＮＡｓｅ保護アッセイにおいてさらに使用した。
【図１４】ｓｉＲＮＡ（ＡＬＮ−３００１）を注射したＣＭＶ−Ｌｕｃマウスの肝臓抽出物におけるルシフェラーゼ活性の割合（％）を示すグラフ。ルシフェラーゼ活性の割合（％）は、ＰＢＳ（ｐＨ４．７）を注射したＣＭＶ−Ｌｕｃマウスにおける活性に対する割合とした。「緩衝液１  ｓｉＲＮＡ１」、「緩衝液２  ｓｉＲＮＡ２」、および「緩衝液３  ｓｉＲＮＡ３」は、３回の別々の実験において観察された平均活性を表す。
【発明を実施するための形態】
【００６４】
二本鎖（ｄｓＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られるプロセスを通してｍＲＮＡを配列特異的にサイレンシングする。このプロセスは、哺乳動物および他の脊椎動物を含む広範な種々の生物において起こる。
【００６５】
ｄｓＲＮＡの２１〜２３ヌクレオチドのフラグメントが、例えば、ＲＮＡ分解を引き起こすことによるＲＮＡサイレンシングの配列特異的メディエータであることが実証されている。理論に束縛されることを望まないが、これらの２１〜２３ヌクレオチドフラグメント中に存在する、単に特定の長さのフラグメントであるにすぎない分子シグナルが、ＲＮＡｉを仲介する細胞因子をリクルートするということのようである。これらの２１〜２３ヌクレオチドフラグメント、および他のｉＲＮＡ剤を調製および投与するための方法、ならびに遺伝子の機能を特異的に不活性化するためのそれらの使用が本明細書中に記載される。ｉＲＮＡ剤（または同じかもしくは類似の性質の組換え生産もしくは化学合成されたオリゴヌクレオチド）の使用は、哺乳動物細胞におけるサイレンシングのための特異的ｍＲＮＡの標的化を可能にする。さらに、より長いｄｓＲＮＡ剤フラグメントもまた、例えば、以下に記載されるように使用されることが可能である。
【００６６】
哺乳動物細胞において、長いｄｓＲＮＡは、有害であることの多いインターフェロン応答を誘導することが可能であるが、ｓＲＮＡは、少なくとも細胞および宿主に対して有害である程度まではインターフェロン応答を誘発しない。特に、ｓＲＮＡ剤中のｉＲＮＡ剤の鎖の長さは、例えば、有害なインターフェロン応答の誘発を回避するために十分に短い、３１、３０、２８、２５、または２３ヌクレオチド未満であり得る。したがって、ｓＲＮＡ剤の組成物（例えば、本明細書中に記載されるように処方される）の哺乳動物細胞への投与は、インターフェロン応答を回避しながら標的遺伝子の発現を抑制するために使用されることが可能である。さらに、個々のｉＲＮＡ剤の使用は、例えば、対立遺伝子につ
いてヘテロ接合である対象において、標的遺伝子の１つの対立遺伝子を選択的に標的とするために使用されることが可能である。
【００６７】
さらに、１つの実施形態において、哺乳動物細胞は、インターフェロン応答の構成成分（例えば、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）活性化プロテインキナーゼＰＫＲ）に影響を与えるｉＲＮＡ剤で処理される。このような細胞は、標的ＲＮＡに対して相補的な配列を含み、その他の点ではインターフェロン応答を誘発する可能性のある長さを有する第２のｉＲＮＡ剤で処理されることが可能である。
【００６８】
代表的な実施形態において、対象は、ウシ、ウマ、マウス、ラット、イヌ、ブタ、ヤギ、または霊長類などの哺乳動物である。この対象は酪農用動物（例えば、ウシまたはヤギ）または他の農業用動物（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、ヒツジ、ブタ、魚類、エビ）であり得る。はるかに好ましい実施形態において、この対象はヒトであり、例えば、正常な個人、あるいは疾患もしくは障害を有するか、これらを有すると診断されているか、またはそれらを有すると予測される個人である。
【００６９】
さらに、ｉＲＮＡ剤により仲介されるサイレンシングはｉＲＮＡ剤組成物を投与した後で数日間の間持続するので、多くの場合において、１日あたり１回未満、またはある例としては、治療計画全体について１回のみの頻度で、組成物を投与することが可能である。例えば、あるがん細胞の治療は、単回のボーラス投与によって行われることが可能であるのに対して、慢性ウイルス感染は規則的な投与、例えば、週に１回または１カ月に１回を必要とする可能性がある。
【００７０】
対象にｉＲＮＡ剤を投与するために使用されることが可能である多数の例示的な送達の経路が記載される。さらに、ｉＲＮＡ剤は、本明細書中に記載される例示的な方法に従って製剤化されることが可能である。
【００７１】
肝臓疾患
本発明の方法および組成物によって治療可能な例示的な疾患および障害は、肝臓系の疾患である。
【００７２】
肝臓に関与する障害には以下が含まれるがこれらに限定されない：肝外傷；黄疸および胆汁鬱滞（例えば、ビリルビンおよび胆汁形成）；肝不全および肝硬変（例えば、肝硬変、門脈圧亢進症（腹水を含む）、門脈体静脈シャント、および巨脾腫症など）；ウイルス性肝炎などの感染性障害（Ａ〜Ｅ型肝炎感染および他の肝炎ウイルスによる感染、臨床病理学的症候群（例えば、キャリアの状態）、無症候性感染、急性ウイルス性肝炎、慢性ウイルス性肝炎、および劇症肝炎を含む）；自己免疫性肝炎；薬物および毒素誘導性の肝臓疾患（例えば、アルコール性肝臓疾患）；先天性代謝異常および小児肝疾患（例えば、血色素症、ウィルソン病、ａ１抗トリプシン欠損症、および新生児肝炎）；肝内胆管疾患（例えば、二次性胆汁性肝硬変、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、および胆道系の異常）；循環障害（例えば、肝臓に入る血流の障害（肝動脈障害ならびに門脈の閉塞および血栓症を含む）、肝臓を通る血流の障害（受動性鬱血および小葉中心性ネクローシスおよび肝臓紫斑病を含む）、肝静脈流出障害（肝静脈血栓症（バッド・キアリ症候群）および肝静脈閉塞症を含む））；妊娠に関連する肝臓疾患（例えば、子癇前症および子癇、妊娠性急性脂肪肝、および妊娠性肝内胆汁鬱滞）；臓器移植または骨髄移植の肝合併症（例えば、骨髄移植後の薬物毒性、対宿主性移植片病および肝臓拒絶、および肝臓同種移植片に対する非免疫学的損傷）；腫瘍および腫瘍状態（例えば、結節性過形成、腺腫、および悪性腫瘍（原発性肝がんおよび転移性腫瘍を含む））。
【００７３】
ｉＲＮＡ剤はまた、肝臓における第Ｖ因子の発現を阻害するために投与することが可能
である。米国の人口の２〜５％が、１９６１位の単一のアミノ酸変化をコードする第Ｖ因子遺伝子の対立遺伝子についてヘテロ接合である。これらのヘテロ接合の個体は、３〜８倍高い静脈血栓症のリスクを有するが、これは、第Ｖ因子活性の増加と関連するリスクである。この活性の増加は、プロトロンビナーゼ複合体からのトロンビン生成の増加をもたらす。第Ｖ因子に対して向けられたｉＲＮＡ剤は、静脈血栓症を治療もしくは予防することもできるし、またはライデン第Ｖ因子を有するヒトを治療することも可能である。第Ｖ因子を標的とするｉＲＮＡ剤は、高リスクの外科手術を受けるライデン第Ｖ因子を有する患者における予防剤としても使用可能であり、この予防剤は、低分子量（ＬＭＷ）ヘパリン予防剤の治療的使用に対する補助であり得る。
【００７４】
第Ｖ因子を標的とするｉＲＮＡ剤は、深部静脈血栓症（ＤＶＴ）または肺塞栓症（ＰＥ）を治療するために、ライデン第Ｖ因子を有する患者に投与することも可能である。このような治療は、ヘパリンまたはクマディンの治療的使用に対する補助であり得る。第Ｖ因子のレベルの上昇または望ましくないレベルの第Ｖ因子によって引き起こされる任意の他の障害を、第Ｖ因子を標的とするｉＲＮＡ剤を投与することによって治療することが可能である。
【００７５】
本発明のｉＲＮＡ剤は、その過剰発現が肝臓疾患と関連している任意の遺伝子を標的とすることが可能である。
【００７６】
肝臓へのｉＲＮＡ剤の標的化
本発明のｉＲＮＡ剤は、肝臓指向性とした場合に特に有用である。ｉＲＮＡ剤を、ｉＲＮＡ剤と肝臓標的化剤とを含む組成物によって肝臓指向性とすることが可能である。例えば、肝臓標的化剤は親油性部分であり得る。好ましい親油性部分には、脂質、コレステロール、オレイル、レチニル、またはコレステリル残基が含まれる（表１を参照のこと）。肝臓標的化剤として機能することが可能である他の親油性部分には、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジンが含まれる。
【００７７】
ｉＲＮＡ剤はまた、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）（例えば、ラクトシル化ＬＤＬ）との結合によって、肝臓指向性とすることが可能である。糖残基と複合されたポリマー担体もまた、ｉＲＮＡ剤を肝臓指向性とするように作用することが可能である。
【００７８】
糖（例えば、ガラクトースおよび／またはそのアナログ）を組み込む標的化剤が特に有用である。これらの標的化剤は、特に肝臓の実質細胞を標的とする（表１を参照されたい）。例えば、標的化部分は、互いに約１５オングストローム間隔の、複数、好ましくは２つまたは３つのガラクトース部分を含むことが可能である。この標的化部分は、別例として、ガラクトースに結合したグルコースである、ラクトース（例えば、３つのラクトース部分）であってもよい。標的化部分はまた、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−Ａｃ−グルコサミンでもよい。マンノースまたはマンノース−６−リン酸の標的化部分は、マクロファージを標的とするために使用することが可能である。
【００７９】
血清アルブミン（ＳＡ）（例えば、ヒト血清アルブミン）とのｉＲＮＡ剤の複合体化もまた、ｉＲＮＡ剤を肝臓指向性とするために使用することが可能である。
【００８０】
ｉＲＮＡ剤は、肝臓における特定の受容体を認識する特異的な標的化剤を使用することによって、肝臓内の特定の細胞種を標的とすることが可能である。例示的な標的化部分お
よびそれらに関連する受容体を表１に提示する。
【００８１】
【表１】
0005881970.tif 000002
【００８２】
ｉＲＮＡ剤の構造
ＲＮＡｉを仲介する単離ｉＲＮＡ剤（例えば、ＲＮＡ分子（二本鎖；一本鎖））が本明細書中に記載される。このｉＲＮＡ剤は、対象者の内在性遺伝子または病原体の遺伝子に関連してＲＮＡｉを好適に仲介する。
【００８３】
「ＲＮＡ剤」は、本明細書中で使用される場合、非修飾ＲＮＡ、修飾ＲＮＡ、またはヌクレオシド代用物であり、これらのすべてが本明細書中で定義される（例えば、以下のＲＮＡ剤という表題の節を参照されたい）。多数の修飾ＲＮＡおよびヌクレオシド代用物が記載されるが、好ましい例には、非修飾ＲＮＡよりもヌクレアーゼ分解に対する抵抗性の高いものが含まれる。好ましい例には、２’糖修飾、一本鎖突出部（好ましくは３’一本鎖突出部）における修飾、または、特に一本鎖の場合、１つ以上のリン酸基もしくは１つ以上のリン酸基アナログを含む５’修飾を有するものが含まれる。
【００８４】
「ｉＲＮＡ剤」は、本明細書中で使用される場合、標的遺伝子、好ましくは内在性または病原体の標的ＲＮＡの発現をダウンレギュレートすることが可能であるＲＮＡ剤へと切断されることが可能であるＲＮＡ剤である。理論によって束縛されることを望まないが、ｉＲＮＡ剤は、当該分野においてＲＮＡｉと呼ばれることもある標的ｍＲＮＡの転写後切
断、または転写前もしくは翻訳前のメカニズムを含む多数のメカニズムの１つ以上によって作用することが可能である。ｉＲＮＡ剤は、一本鎖を含むことも、または一本以上の鎖を含むことも可能であり、例えば、ｉＲＮＡ剤は、二本鎖ｉＲＮＡ剤であり得る。ｉＲＮＡ剤が一本鎖である場合、１つ以上のリン酸基または１つ以上のリン酸基のアナログを含む５’修飾を含むことが特に好ましい。
【００８５】
ｉＲＮＡ剤は、該ｉＲＮＡ剤またはそのフラグメントが標的遺伝子のダウンレギュレーションを仲介することが可能であるように、標的遺伝子に対して十分な相同性の領域を含み、かつヌクレオチドの長さが十分であるべきである。（説明を簡略化するために、本明細書中では、用語ヌクレオチドまたはリボヌクレオチドは、ＲＮＡ剤の１つ以上のモノマーサブユニットを指すために使用されることがある。本明細書中において、用語「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」を使用するとき、修飾ＲＮＡまたはヌクレオチド代用物の場合においては、修飾ヌクレオチド、または１つ以上の位置での代用物で置換した部分をも意味し得ることが本明細書中で理解されよう。）したがって、ｉＲＮＡ剤は、少なくとも部分的に、およびある実施形態においては完全に、標的ＲＮＡに相補的な領域であるか、またはその領域を含む。ｉＲＮＡ剤と標的との間の完全な相補性が存在することは必ずしも必要ではないが、その一致は、ｉＲＮＡ剤またはその切断産物が、例えば、標的ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）のＲＮＡｉ切断によって、配列特異的にサイレンシングすることを可能にするために十分でなくてはならない。
【００８６】
標的鎖との相補性、または相同性の程度は、アンチセンス鎖において最も重大である。特に、アンチセンス鎖における完全な相補性が望ましいことが多いが、ある実施形態は、特にアンチセンス鎖において、１つ以上であるが好ましくは６個、５個、４個、３個、２個、またはそれより少ないミスマッチ（標的ＲＮＡに関して）を含むことが可能である。特にアンチセンス鎖におけるミスマッチは、末端領域において最も寛容性が高く、存在する場合、好ましくは末端領域において、例えば、５’末端および／または３’末端の６ヌクレオチド以内、５ヌクレオチド以内、４ヌクレオチド以内、または３ヌクレオチド以内である。センス鎖は、該分子の二本鎖全体の性質を維持するために十分なだけのアンチセンス鎖との相補性があればよい。
【００８７】
本明細書中の他の箇所で議論されるように、ｉＲＮＡ剤は、しばしば修飾されるかまたはＲＲＭＳに加えてヌクレオシド代用物を含む。ｉＲＮＡ剤の一本鎖領域は、しばしば、修飾されるかまたはヌクレオシド代用物を含み、例えば、ヘアピン構造の対合していない領域（例えば、２つの相補性領域をつなぐ領域）は、修飾またはヌクレオシド代用物を有し得る。ｉＲＮＡ剤の１つ以上の３’末端もしくは５’末端を、例えば、エキソヌクレアーゼに対して安定化するための修飾、またはアンチセンスｓＲＮＡ剤をＲＩＳＣに優先的に入れるための修飾もまた、好ましい。修飾は、Ｃ３（またはＣ６、Ｃ７、Ｃ１２）アミノリンカー、チオールリンカー、カルボキシルリンカー、非ヌクレオチド性スペーサー（Ｃ３、Ｃ６、Ｃ９、Ｃ１２、無塩基、トリエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール）、特殊なビオチン、あるいは、ホスホルアミダイトとして提供され、かつ別のＤＭＴ保護されたヒドロキシル基を有し、ＲＮＡ合成の際に複数のカップリングを可能にするフルオレセイン試薬を含むことが可能である。
【００８８】
ｉＲＮＡ剤には以下のものが含まれる：インターフェロン応答を誘発するために十分に長い分子（これはダイサー（Ｄｉｃｅｒ、ベルンシュタインら（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．）、２００１．Ｎａｔｕｒｅ、４０９：３６３〜３６６）によって切断され、ＲＩＳＣ（ＲＮＡｉ誘導性サイレンシング複合体）に入る）；およびインターフェロン応答を誘発しないために十分に短い分子（この分子もまたＤｉｃｅｒによって切断されることが可能であり、かつ／またはＲＩＳＣに入る）、例えば、ＲＩＳＣに入ることを可能にするサイズである分子、例えば、Ｄｉｃｅｒ切断産物に類似する分子。インターフェロン
応答を誘発しない十分に短い分子は、本明細書中では、ｓＲＮＡ剤または短いｉＲＮＡ剤と呼ばれる。「ｓＲＮＡ剤または短いｉＲＮＡ剤」は、本明細書中で使用される場合、ｉＲＮＡ剤、例えば、ヒト細胞において有害なインターフェロン応答を誘導しない十分に短い二本鎖ＲＮＡ剤または一本鎖ＲＮＡ剤をいい、例えば、同ＲＮＡ剤は、６０ヌクレオチド対未満、しかし好ましくは、５０、４０、または３０ヌクレオチド対未満の二本鎖領域を有する。このｓＲＮＡ剤またはその切断産物は、例えば、標的ＲＮＡ（好ましくは、内在性または病原性の標的ＲＮＡ）に関してＲＮＡｉを誘導することによって、標的遺伝子をダウンレギュレートすることが可能である。
【００８９】
ｓＲＮＡ剤の各々の鎖は、３０、２５、２４、２３、２２、２１、または２０ヌクレオチド長以下であり得る。鎖は、好ましくは、少なくとも１９ヌクレオチド長である。例えば、各々の鎖は２１から２５の間のヌクレオチド長であり得る。好ましいｓＲＮＡ剤は、１７、１８、１９、２９、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド対の二本鎖、および１つ以上の突出部、好ましくは２〜３ヌクレオチドの１つまたは２つの３’突出部を有する。
【００９０】
標的ＲＮＡに対する相同性および標的遺伝子をダウンレギュレートする能力に加えて、ｉＲＮＡ剤は好ましくは以下の特性の１つ以上を有する：
（１）以下の「ＲＮＡ剤」の節において示される式１、式２、式３、または式４のものである；
（２）一本鎖である場合、１つ以上のリン酸基または１つ以上のリン酸基アナログを含む５’修飾を有する；
（３）非常に多数またはすべてのヌクレオシドが修飾されているにもかかわらず、正確な塩基対を形成可能であり、例えば標的ＲＮＡの切断によって標的のダウンレギュレーションを可能にするために十分な、相同な標的ＲＮＡとの二本鎖構造を形成することが可能なように、正しい三次元構造にある塩基（または修飾塩基）を提供することが可能なアンチセンス鎖を有する；
（４）非常に多数またはすべてのヌクレオシドが修飾されているにもかかわらず、なお「ＲＮＡ様の」特性を有する。すなわち、リボヌクレオチドに基づく含量では独占的でなく、または部分的でさえあるにも関わらす、ＲＮＡ分子の全体的な構造、化学的特性および物理的特性を有する。例えば、ｉＲＮＡ剤は、例えば、すべてのヌクレオチド糖が２’ヒドロキシルの代わりに例えば２’フルオロを含むセンス鎖および／またはアンチセンス鎖を含むことが可能である。このデオキシリボヌクレオチド含有剤は、なおＲＮＡ様の特性を示すことが予測されうる。理論によって束縛されることを望まないが、電気的に陰性のフッ素は、リボースのＣ２’位に結合されたときに軸方向に配向する傾向がある。このフッ素の空間的な優先傾向は、ひいては、糖のＣ３’内部にくぼみを形成させる。これは、ＲＮＡ分子中で観察されるのと同じくぼみ形成様式であり、ＲＮＡに特徴的なＡファミリー型ヘリックスを生じる。さらに、フッ素は良好な水素結合のアクセプターであるので、ＲＮＡ構造を安定化させることが知られている水分子と同じ水素結合相互作用に関与することが可能である。一般的には、糖の２’位で修飾された部分は、デオキシリボヌクレオチドのＨ部分よりも、リボヌクレオチドのＯＨ部分により特徴的であるＨ結合に入ることができることが好ましい。好ましいｉＲＮＡ剤は：その糖の全体、またはその糖の少なくとも５０、７５、８０、８５、９０、または９５％において、Ｃ３’内部にくぼみを示し；ｉＲＮＡ剤の十分量の糖においてＣ３’内部のくぼみを示し、ＲＮＡに特徴的なＡファミリー型ヘリックスを生じることが可能であり；Ｃ３’内部のくぼみ構造ではない２０個、１０個、５個、４個、３個、２個、または１個以下の糖を有する。これらの制限はアンチセンス鎖において特に好ましい；
（５）修飾の性質にかかわらず、およびＲＮＡ剤が、特に突出部または他の一本鎖領域内にデオキシヌクレオチドまたは修飾デオキシヌクレオチドを含むことが可能であるとしても、ＤＮＡ分子、あるいは、分子中のヌクレオチドの５０、６０、もしくは７０％より
多く、または二本鎖領域のヌクレオチドの５０、６０、または７０％より多くがデオキシリボヌクレオチド、あるいは２’位がデオキシである修飾デオキシリボヌクレオチドである任意の分子は、ＲＮＡ剤の定義から除外することが好ましい。
【００９１】
「一本鎖ｉＲＮＡ剤」は、本明細書中で使用される場合、単一の分子から作られているｉＲＮＡ剤である。これは、鎖内の対合によって形成される二本鎖領域を含んでもよく、例えば、該領域はヘアピン構造またはパン−ハンドル構造であってもよいし、これを含んでもよい。一本鎖ｉＲＮＡ剤は、標的分子に関してアンチセンスであることが好ましい。好ましい実施形態において、一本鎖ｉＲＮＡ剤は５’がリン酸化されるか、または５’プライム末端にホスホリルアナログを含む。５’リン酸修飾は、ＲＩＳＣが仲介する遺伝子サイレンシングと適合性であるものを含む。適切な修飾には以下が含まれる：５’一リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’二リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’三リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’グアノシンキャップ（７−メチル化または非メチル化）（７ｍ−Ｇ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）、および任意の修飾または非修飾ヌクレオチドキャップ構造（Ｎ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’一チオリン酸（ホスホロチオエート；（ＨＯ）２（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’一ジチオリン酸（ホスホロジチオエート；（ＨＯ）（ＨＳ）（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’ホスホロチオール酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｓ−５’）；酸素／硫黄置換一リン酸、二リン酸、および三リン酸の任意のさらなる組合せ（例えば、５’−α−チオ三リン酸、５’−γ−チオ三リン酸など）、５’ホスホルアミデート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−ＮＨ−５’、（ＨＯ）（ＮＨ２）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’アルキルホスホン酸（Ｒ＝アルキル＝メチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’−、（ＯＨ）２（Ｏ）Ｐ−５’−ＣＨ２）、５’アルキルエーテルホスホン酸（Ｒ＝アルキルエーテル＝メトキシメチル（ＭｅＯＣＨ２‐）、エトキシメチルなど、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’−）。（これらの修飾はまた、二本鎖ｉＲＮＡのアンチセンス鎖とともに使用されることも可能である。）
一本鎖ｉＲＮＡ剤は、それがＲＩＳＣに入ることが可能であり、かつＲＩＳＣの仲介による標的ｍＲＮＡの切断に関与することが可能であるように、十分に長くあるべきである。一本鎖ｉＲＮＡ剤は、少なくとも１４ヌクレオチド長、およびより好ましくは、少なくとも１５、２０、２５、２９、３５、４０、または５０ヌクレオチド長である。一本鎖ｉＲＮＡ剤は好ましくは、２００、１００、または６０ヌクレオチド長未満である。
【００９２】
ヘアピンｉＲＮＡ剤は、１７、１８、１９、２９、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド対に等しいか、または少なくとも１７、１８、１９、２９、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド対の二本鎖領域を有する。この二本鎖領域の長さは、好ましくは、２００、１００、または５０ヌクレオチド対以下である。二本鎖領域の好ましい範囲は、１５〜３０、１７〜２３、１９〜２３、および１９〜２１ヌクレオチド対長である。ヘアピンは、好ましくは、一本鎖突出部または末端（好ましくはヘアピンのアンチセンス側の好ましくは３’末端）の非対合領域を有する。好ましい突出部は２〜３ヌクレオチド長である。
【００９３】
「二本鎖（ｄｓ）ｉＲＮＡ剤」は、本明細書中で使用される場合、鎖間のハイブリダイゼーションにより二本鎖構造を形成することが可能である、１本より多くの鎖、好ましくは２本の鎖を含むｉＲＮＡ剤である。
【００９４】
二本鎖ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２５、２９、４０、または６０ヌクレオチド長に等しいか、または少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、２５、２９、４０、または６０ヌクレオチド長であるべきである。
これは、２００、１００、または５０ヌクレオチド長以下であるべきである。好ましい範囲は、１７〜２５、１９〜２３、および１９〜２１ヌクレオチド長である。
【００９５】
二本鎖ｉＲＮＡ剤のセンス鎖は、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２５、２９、４０、または６０ヌクレオチド長に等しいか、または少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、２５、２９、４０、または６０ヌクレオチド長であるべきである。これは、２００、１００、または５０ヌクレオチド長以下であるべきである。好ましい範囲は、１７〜２５、１９〜２３、および１９〜２１ヌクレオチド長である。
【００９６】
二本鎖ｉＲＮＡ剤の二本鎖部分は、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２９、４０、または６０ヌクレオチド対長に等しいか、または少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２９、４０、または６０ヌクレオチド対長であるべきである。これは、２００、１００、または５０ヌクレオチド対長以下であるべきである。好ましい範囲は、１５〜３０、１７〜２３、１９〜２３、および１９〜２１ヌクレオチド対長である。
【００９７】
多くの実施形態において、ｄｓ  ｉＲＮＡ剤は、内在性分子によって（例えば、Ｄｉｃｅｒによって）切断されてより小さなｄｓ  ｉＲＮＡ剤（例えば、ｓＲＮＡ剤）を生じることが可能であるように十分に大きい。
【００９８】
二本鎖ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖およびセンス鎖の一方または両方を修飾することが望ましい可能性がある。ある場合において、これらの鎖は同じ修飾または同じクラスの修飾を有するが、他の場合において、センス鎖およびアンチセンス鎖は異なる修飾を有し、例えば、ある場合において、センス鎖のみが修飾されることが望ましい。センス鎖のみを、例えばセンス鎖を不活性化するために修飾することが望ましい可能性があり、例えば、センス鎖は、センス鎖を不活性化し、かつ活性なｓＲＮＡ／タンパク質またはＲＩＳＣの形成を妨害するために修飾されることが可能である。これは、センス鎖の５’リン酸化を妨害する修飾によって、例えば、５’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを用いる修飾によって達成されることが可能である（ニーケネンら（Ｎｙｋａｅｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）、（２００１）「ATP requirements and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway. 」Ｃｅｌｌ  １０７、３０９〜３２１を参照のこと）。例えば、単に５’ＯＨをＯ−ＭｅではなくＨによって置換する、リン酸化を妨害する他の修飾もまた使用可能である。代替例として、大きなかさ高い基が５’リン酸基に付加され、これがホスホジエステル結合に転換されてもよいが、これは、ホスホジエステラーゼがこのような結合を切断し、かつ機能的ｓＲＮＡ５’末端を遊離することが可能であるので、より望ましくない可能性がある。アンチセンス鎖修飾は、５’リン酸化ならびに本明細書中で議論される他の５’修飾のいずれか、特に単鎖ｉＲＮＡ分子に関する節において上記に議論された５’修飾を含む。
【００９９】
ｄｓ  ｉＲＮＡ剤が分子の一方または両方の末端で一本鎖領域または不対合領域を含むように、センス鎖およびアンチセンス鎖が選択されることが好ましい。したがって、ｄｓ
ｉＲＮＡ剤は、好ましくは突出部（例えば、１つまたは２つの５’または３’突出部であるが好ましくは２〜３ヌクレオチドの３’突出）を含むように対合したセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む。多くの実施形態は３’突出部を有する。好ましいｓＲＮＡ剤は一本鎖突出部、好ましくは、各々の末端に１ヌクレオチド長または好ましくは２もしくは３ヌクレオチド長の３’突出部を有する。この突出部は、ある鎖が他の鎖よりも長い結果であってもよいし、または、ずれを有する同じ長さの２つの鎖の結果であってもよい。５’末端は好ましくはリン酸化される。
【０１００】
二本鎖領域についての好ましい長さは、例えば、上記に議論したｓＲＮＡ剤の範囲にお
いて、１５から３０の間のヌクレオチド長、最も好ましくは１８、１９、２０、２１、２２、および２３ヌクレオチド長である。ｓＲＮＡ剤は、長さおよび構造が、長いｄｓＲＮＡからの天然のＤｉｃｅｒ処理産物に類似する可能性がある。ｓＲＮＡ剤の２つの鎖が結合される（例えば、共有結合される）実施形態もまた含まれる。ヘアピン、または必要とされる二本鎖領域を提供する他の一本鎖構造物、および好ましくは３’突出部もまた、本発明の範囲内にある。
【０１０１】
ｄｓ  ｉＲＮＡ剤およびｓＲＮＡ剤を含む、本明細書に記載される単離ｉＲＮＡ剤は、標的ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、例えば、タンパク質をコードする遺伝子の転写物のサイレンシングを仲介することが可能である。便宜上、このようなｍＲＮＡは、本明細書中ではサイレンシングされるｍＲＮＡとも呼ばれる。このような遺伝子はまた、標的遺伝子ともいわれる。一般的に、サイレンシングされるＲＮＡは内在性遺伝子または病原体遺伝子である。さらに、ｍＲＮＡ以外のＲＮＡ、例えば、ｔＲＮＡおよびウイルスＲＮＡを標的とすることも可能である。
【０１０２】
本明細書中で使用される場合、語句「ＲＮＡｉを仲介する」とは、配列特異的な様式で、標的ＲＮＡをサイレンシングする能力をいう。理論によって束縛されることを望まないが、サイレンシングは、ＲＮＡｉの機構またはプロセスおよびガイドＲＮＡ（例えば、２１〜２３ヌクレオチドのｓＲＮＡ剤）を使用すると考えられる。
【０１０３】
本明細書中で使用される場合、「特異的にハイブリダイズ可能である」および「相補的」は、安定かつ特異的な結合が本発明の化合物と標的ＲＮＡ分子の間に起こるような、十分な程度の相補性を示すために使用される用語である。特異的結合は、特異的結合が望ましい条件下で、すなわち、インビボアッセイもしくは治療的処置の場合においては生理学的条件下で、またはインビトロアッセイの場合においてはそのアッセイが実行される条件下で、オリゴマー化合物の非標的配列への非特異的結合を回避するために十分な程度の相補性を必要とする。非標的配列は、一般的には、少なくとも５ヌクレオチド異なる。
【０１０４】
１つの実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、ｉＲＮＡ剤が標的ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の産生をサイレンシングするように、標的ＲＮＡ（例えば、標的ｍＲＮＡ）に「十分に相補的」である。別の実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、標的ＲＮＡに対して「厳密に相補的」であり（ＲＲＭＳ含有サブユニットを除外する）、例えば、標的ＲＮＡおよびｉＲＮＡ剤は、好ましくは、厳密に相補的な領域におけるワトソン−クリック塩基対から独占的に構成されるハイブリッドを形成するようにアニールする。「十分に相補的な」標的ＲＮＡは、標的ＲＮＡに厳密に相補的である内部領域（例えば、少なくとも１０ヌクレオチドの領域）を含み得る。さらに、ある実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、単一ヌクレオチドの違いを特異的に区別する。この場合において、ｉＲＮＡ剤は、厳密な相補性が単一ヌクレオチドの違いの領域（例えば、７ヌクレオチド以内の領域）において見出される場合のみにＲＮＡｉを仲介する。
【０１０５】
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、核酸分子（ＲＮＡまたはＤＮＡ）、好ましくは、１００、２００、３００、または４００未満の長さのヌクレオチドをいう。
【０１０６】
本明細書中で議論されるＲＮＡ剤は、その他の点では未修飾のＲＮＡ、ならびに、例えば、効力を改善するために修飾されたＲＮＡ、およびヌクレオシド代用物のポリマーを含む。未修飾のＲＮＡとは、核酸の成分、すなわち、糖、塩基、およびリン酸の部分が、天然に存在する、好ましくは人体において天然に存在するのと同じかまたは実質的に同じである分子をいう。当該分野では、修飾ＲＮＡのような、まれなまたは一般的でないが天然に存在するＲＮＡについて言及されており、例えば、リンバックら（Ｌｉｍｂａｃｈ  ｅ
ｔ  ａｌ．）、（１９９４）Ｓｕｍｍａｒｙ：ｔｈｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ｏｆ  ＲＮＡ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：２１８３〜２１９６を参照されたい。しばしば修飾ＲＮＡと呼ばれる（明らかに一般的には転写後修飾の結果によるからである）、このようなまれなまたは一般的でないＲＮＡは、本明細書中で使用される場合には用語「非修飾ＲＮＡ」の範囲内にある。修飾ＲＮＡは、本明細書中で使用される場合、１つ以上の核酸の成分、すなわち、糖、塩基、およびリン酸の部分が、天然に存在するものと異なる、好ましくは人体において存在するものと異なる分子をいう。これらは修飾「ＲＮＡ」と呼ばれるが、当然、修飾されているのでＲＮＡではない分子を含むことになる。ヌクレオシド代用物は、リボリン酸バックボーンが、塩基が正しい空間的関連において提示されることを可能にする非リボリン酸構築物で置き換えられている分子であり、その結果、ハイブリダイゼーションは、リボリン酸バックボーンの場合に見られるのと実質的に同様である（例えば、リボリン酸バックボーンの非荷電模倣物）。上記のすべての例が本明細書中で議論される。
【０１０７】
以下の議論の多くが一本鎖分子に言及する。本発明の多くの実施形態において、二本鎖ｉＲＮＡ剤（例えば、部分的に二本鎖のｉＲＮＡ剤）が必要とされるかまたは好ましい。したがって、以下に記載される一本鎖構造から作られる二本鎖構造（例えば、２つの別々の分子が接触して二本鎖領域を形成する場合、または二本鎖領域が分子内対合（例えば、ヘアピン構造）によって形成される場合）は本発明の範囲内に含まれることが理解される。好ましい長さは本明細書中の他の箇所に記載される。
【０１０８】
核酸は、サブユニットまたはモノマーのポリマーであるので、以下に記載される修飾の多くが核酸内で反復される位置に存在する（例えば、塩基、またはリン酸部分、またはリン酸部分の非結合Ｏの修飾）。ある場合において、修飾は、核酸中の対象の位置のすべてに存在するが、しかし、多くの場合および実際上大部分においてはそうではない。例として、修飾は、３’または５’末端にのみ存在する可能性があり、末端領域（例えば、末端ヌクレオチドの位置または鎖の最後の２、３、４、５、もしくは１０ヌクレオチド）にのみ存在する可能性がある。修飾は、二本鎖領域、一本鎖領域、または両方において存在する可能性がある。修飾は、ＲＮＡの二本鎖領域中にのみ存在する可能性もあるし、またはＲＮＡの一本鎖領域にのみ存在する可能性もある。例えば、非結合Ｏ位置のホスホロチオエート修飾が、一方の末端にのみもしくは両方の末端に存在してもよいし、末端領域（例えば、末端ヌクレオチド上の位置に、または鎖の最後の２、３、４、５、もしくは１０ヌクレオチド）にのみ存在してもよいし、または二本鎖および一本鎖の領域、特に末端に存在することも可能である。５’末端（一方または両方）がリン酸化されることも可能である。
【０１０９】
ある実施形態において、一本鎖突出部（例えば、５’もしくは３’突出部、もしくはその両方）において、例えば、安定性を増強すること、突出部に特定の塩基を含ませること、または修飾ヌクレオチドもしくはヌクレオチド代用物を含めることが特に好ましい。例えば、突出部にプリンヌクレオチドを含めることが望ましいことがあり得る。ある実施形態において、３’または５’の突出部における塩基のすべてまたはいくつかの塩基が、例えば、本明細書中に記載される修飾を用いて修飾される。修飾は、例えば、リボース糖の２’ＯＨ基での修飾の使用、例えば、リボヌクレオチドの代わりとしてのデオキシリボヌクレオチド（例えば、デオキシチミジン）の使用、およびリン酸基中での修飾（例えば、ホスホチオエート修飾）が含まれうる。突出部は、標的配列と相同である必要はない。
【０１１０】
修飾およびヌクレオチド代用物は以下に議論される。
【０１１１】
【化１】
0005881970.tif 000003
【０１１２】
式１において上記に提示されるバックボーンはリボ核酸の部分を表す。基本成分はリボース糖、塩基、末端リン酸、およびヌクレオチド間リン酸リンカーである。塩基は天然に存在する塩基（例えば、アデニン、ウラシル、グアニン、またはシトシン）であり、糖は非修飾２’ヒドロキシルリボース糖（示されているとおり）、およびＷ、Ｘ、およびＺはすべてＯであり、式１は天然に存在する非修飾オリゴリボヌクレオチドを表す。
【０１１３】
非修飾オリゴリボヌクレオチドは、ある適用においては最適には満たない可能性があり、例えば、非修飾オリゴリボヌクレオチドは、例えば、細胞ヌクレアーゼによる分解を受ける傾向があり得る。ヌクレアーゼは核酸のホスホジエステル結合を加水分解することが可能である。しかし、上記のＲＮＡ成分の１つ以上への化学修飾は改善された特性を付与することが可能であり、例えば、オリゴリボヌクレオチドをヌクレアーゼに対してより安定性にすることが可能である。未修飾のオリゴリボヌクレオチドはまた、ｉＲＮＡ剤にリガンドまたは他の部分を結合するためのつなぎ止め部分を提供するという観点で最適に満たない可能性がある。
【０１１４】
修飾核酸およびヌクレオチド代用物は、以下の１つ以上を含むことが可能である：
（ｉ）変化、例えば、非結合リン酸酸素（ＸおよびＹ）の一方もしくは両方の置換、および／または結合リン酸酸素（ＷおよびＺ）の１つ以上の置換（リン酸が末端位置にある場合、位置ＷまたはＺの１つは、天然に存在するリボ核酸中ではさらなるエレメントにリン酸を結合しない。しかし、用語の単純化のために、他に注記される場合以外は、核酸の５’末端のＷ位置および核酸の３’末端のＺ位置は、本明細書中で使用される用語「結合リン酸酸素」の範囲内にある）；
（ｉｉ）変化、例えば、リボース糖の構成成分（例えば、リボース糖上の２’ヒドロキシル）の置換、またはリボース糖の、リボース以外の構造（例えば、本明細書中に記載されるようなもの）による大規模置換；
（ｉｉｉ）リン酸部分（括弧Ｉ）の、「リンを含まない（ｄｅｐｈｏｓｐｈｏ）」リンカーによる大規模置換；
（ｉｖ）天然に存在する塩基の修飾または置換；
（ｖ）リボース−リン酸バックボーン（括弧ＩＩ）の置換または修飾；
（ｖｉ）ＲＮＡの３’末端または５’末端の修飾、例えば、末端リン酸基の除去、修飾、もしくは置換、または構成部分の結合（例えば、ＲＮＡの３’末端または５’末端のいずれかへの蛍光標識部分の結合）。
【０１１５】
用語「置換」、「修飾」、「変化」などは、この文脈で使用される場合、任意の工程の限定を意味するものではなく、例えば、修飾とは、標準のまたは天然に存在するリボ核酸を用いて開始しかつそれを修飾して修飾リボ核酸を産生しなくてはならないことを意味するものではなく、「修飾された」とは、単に天然に存在する分子との違いを意味する。
【０１１６】
当然のことであるが、ある化学的実体の実際の電子的構造を、たった１つの標準的な型（すなわち、ルイス構造）によって十分に表すことは可能ではない。理論によって束縛されることを望まないが、実際の構造は、その代わりに、共鳴型または共鳴構造として集合的に知られる、２つ以上の標準的な型のある混合物または加重平均であり得る。共鳴構造は、個別の化学的実体ではなく、紙の上でのみ存在する。これらは、特定の化学的実体についての結合電子および非結合電子の配置または「局在」においてのみ、互いに異なる。１つの共鳴構造が他よりもより高い程度でハイブリッドに寄与することが可能であり得る。したがって、本発明の実施形態について記載かつ図示される説明は、特定の種類の実体についての主要な共鳴型として当該分野で認識されているものに関してなされる。例えば、任意のホスホロアミデート（非結合酸素の窒素による置換）が、上記の図においてはＸ＝ＯおよびＹ＝Ｎによって表される。
【０１１７】
特定の修飾は以下により詳細に議論される。
【０１１８】
リン酸基
リン酸基は負に荷電した基である。電荷は、２つの非結合酸素原子（すなわち、上記の式１のＸおよびＹ）にわたって均一に分布している。しかし、リン酸基は、１つの酸素を異なる置換基に置換することによって修飾することが可能である。ＲＮＡリン酸バックボーンへのこのような修飾の１つの結果は、ヌクレアーゼ分解に対するオリゴリボヌクレオチドの耐性の増加であり得る。したがって、理論によって束縛されることを望まないが、ある態様において、荷電していないリンカー、または非対称型の電荷分布を有する荷電したリンカーのいずれかを生じる変化を導入することが望ましい可能性がある。
【０１１９】
修飾リン酸基の例には、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、ホスホネート水素、ホスホロアミデート、アルキルまたはアリールホスホネート、およびホスホトリエステルが含まれる。ホスホロジチオエートは、両方の非結合酸素が硫黄で置換されている。ＸまたはＹの１つのみが変化している状況と異なり、ホスホロジチオエートにおけるリン中心はアキラルであり、アキラルはオリゴリボヌクレオチドのジアステレオマーの形成を妨害する。ジアステレオマー形成により、個々のジアステレオマーがヌクレアーゼに対する種々の耐性を示す調製物を生じることが可能である。さらに、キラルリン酸基を含むＲＮＡのハイブリダイゼーション親和性は、対応する未修飾のＲＮＡ種と比較して低い可能性がある。したがって、理論によって束縛されることを望まないが、キラル中心を除去するＸおよびＹの両方に対する修飾（例えば、ホスホロジチオエート形成）は、該修飾がジアステレオマー混合物を産生することが可能でないという意味で、望ましい可能性がある。したがって、Ｘは、Ｓ、Ｓｅ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｎ、またはＯＲ（Ｒはアルキルまたはアリールである）のいずれか１つであり得る。したがって、Ｙは、Ｓ、Ｓｅ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｎ、またはＯＲ（Ｒはアルキルまたはアリールである）のいずれか１つであり得る。ＸおよびＹのうち少なくともいずれかの硫黄での置換が好ましい。
【０１２０】
リン酸リンカーが、結合している酸素（すなわち、式１におけるＷまたはＺ）の、窒素（架橋ホスホロアミデート）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）、および炭素（架橋メチレンホスホネート）での置換によって修飾されることも可能である。この置換は、末端の酸素（位置Ｗ（３’）または位置Ｚ（５’））で起こり得る。Ｗの炭素による置換またはＺの窒素による置換が好ましい。
【０１２１】
候補剤は、以下に記載されるような適合性について評価されることが可能である。
【０１２２】
糖基
修飾ＤＮＡは、リボ核酸の糖基のすべてまたはいくつかの修飾を含むことが可能である。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）は、多数の異なる「オキシ」または「デオキシ」置換基で修飾または置換されることが可能である。理論によって束縛されるものではないが、ヒドロキシルがもはや脱プロトン化されて２’アルコキシドを形成することが可能でないので、安定性の増強が予測される。２’アルコキシドは、リンカーのリン原子上への分子内求核攻撃による分解を触媒することが可能である。再び、理論によって束縛されることを望まないが、２’位におけるアルコキシド形成が可能でない変化を導入することが、ある実施形態に対して望ましい可能性がある。
【０１２３】
「オキシ」−２’ヒドロキシル基修飾の例には以下が含まれる：アルコキシまたはアリールオキシ（ＯＲ、例えば、Ｒ＝Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ；２’ヒドロキシルが、例えばメチレン架橋によって同じリボース糖の４’炭素に接続されている「ロックト（固定化された）」核酸（ＬＮＡ）；Ｏ−ＡＭＩＮＥ（ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）およびアミノアルコキシ、Ｏ（ＣＨ２）ｎＡＭＩＮＥ、（例えば、ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）。メトキシエチル基（ＭＯＥ）、（ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、ＰＥＧ誘導体）のみを含むオリゴヌクレオチドが堅固なホスホロチオエート修飾で修飾されたものに匹敵しうるヌクレアーゼ安定性を示すことは注目すべきことである。
【０１２４】
「デオキシ」修飾には以下が含まれる：水素（すなわち、デオキシリボース糖、これは、部分的にｄｓのＲＮＡの突出部に特に関連する）；ハロ（例えば、フルオロ）；アミノ（例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸）；ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２−ＡＭＩＮＥ（ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ）、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（Ｒ＝アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖）、シアノ；メルカプト；アルキル−チオ−アルキル；チオアルコキシ；およびアルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニル、およびアルキニル（これらは場合により、例えば、アミノ官能基で置換されてもよい）。好ましい置換基は、２’−メトキシエチル、２’−ＯＣＨ３、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリル、および２’−フルオロである。
【０１２５】
糖基は、リボース中の対応する炭素の立体化学的配置とは反対の立体化学的配置を有する１つ以上の炭素を含むことも可能である。したがって、修飾ＲＮＡは、例えば、糖としてアラビノースを含むヌクレオチドを含むことが可能である。
【０１２６】
修飾ＲＮＡは、Ｃ−１’に核酸塩基を欠く「無塩基」糖を含むことも可能である。これらの無塩基糖はまた、構成成分である糖の１つ以上の原子においてさらに修飾を含むことが可能である。
【０１２７】
ヌクレアーゼ耐性を最大化するために、上記２’修飾が、１つ以上のリン酸リンカー修飾（例えば、ホスホロチオエート）と組み合わせて使用されることが可能である。いわゆる「キメラ」オリゴヌクレオチドは、２つ以上の異なる修飾を含むものである。
【０１２８】
修飾はまた、ｉＲＮＡ剤の１つ以上の部位においてリボース構造の別の実体による大規模置換を伴い得る。これらの修飾は、ＲＲＭＳのためのリボース置換という表題の節において記載されている。
【０１２９】
候補修飾は以下に記載されるように評価されることが可能である。
【０１３０】
リン酸基の置換
リン酸基は、リン酸以外のものを含む接続部によって置換されることが可能である（上記の式１中の括弧Ｉを参照のこと）。理論によって束縛されることを望まないが、荷電したホスホジエステル基はヌクレアーゼ分解における反応中心なので、この基を中性の構造模倣物で置換することは、ヌクレアーゼ安定性の増強を付与するはずであると考えられている。この場合も理論によって束縛されることを望まないが、ある態様において、荷電したリン酸基が中性部分によって置換される変化を導入することが望ましい可能性がある。
【０１３１】
リン酸基を置換することが可能である部分の例には以下が含まれる：シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキサイドリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、およびメチレンオキシメチルイミノ。好ましい置換には、メチレンカルボニルアミノ基およびメチレンメチルイミノ基が含まれる。
【０１３２】
候補修飾は以下のように評価されることが可能である。
【０１３３】
リボリン酸バックボーンの置換
リン酸リンカーおよびリボース糖が、ヌクレアーゼ耐性のヌクレオシドまたはヌクレオチドの代用物によって置換されるオリゴヌクレオチド模倣バックボーンを構築することも可能である（上記の式１の括弧ＩＩを参照のこと）。理論によって束縛されることを望まないが、反復して荷電したバックボーンが存在しなければ、ポリアニオンを認識するタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ）への結合が減少すると考えられている。再度、理論によって束縛されることを望まないが、ある態様において、塩基が中性の代用バックボーンによって連結される変化を導入することが望ましい可能性がある。
【０１３４】
例には、モフィリノ（mophilino ）、シクロブチル、ピロリジン、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）などのヌクレオシド代用物が含まれる。好ましい代用物はＰＮＡ代用物である。
【０１３５】
候補修飾は以下に記載されるように評価されることが可能である。
【０１３６】
末端修飾
オリゴヌクレオチドの３’末端および５’末端が修飾されることが可能である。このような修飾は、分子の３’末端、５’末端、または両方の末端においてなされ得る。該修飾は、末端のリン酸全体または末端リン酸基の１つ以上の原子の修飾または置換を含むこと
が可能である。例えば、オリゴヌクレオチドの３’末端および５’末端が、他の機能的分子実体、例えば標識部分（例えば、ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３色素もしくはＣｙ５色素などの蛍光団）または保護基（例えば、硫黄、ケイ素、ホウ素、もしくはエステルを含む基など）に複合体化することが可能である。前記機能的分子実体は、リン酸基および／またはスペーサーを介して糖に結合することが可能である。スペーサーの末端原子は、リン酸基の結合原子または糖のＣ−３’もしくはＣ−５’のＯ、Ｎ、Ｓ、もしくはＣ基を接続または置換することが可能である。代替的には、スペーサーは、ヌクレオチド代用物（例えば、ＰＮＡ）の末端原子を接続または置換することが可能である。これらのスペーサーまたはリンカーは、例えば、−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮ−、−（ＣＨ２）ｎＯ−、−（ＣＨ２）ｎＳ−、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＨ（例えば、ｎ＝３または６）、無塩基糖、アミド、カルボキシ、アミン、オキシアミン、オキシイミン、チオエーテル、ジスルフィド、チオ尿素、スルホンアミド、またはモルホリノなど、またはビオチン試薬およびフルオレセイン試薬を含み得る。「スペーサー／リン酸‐機能的分子実体−スペーサーリン酸」という配列構造が、ｉＲＮＡ剤の２つの鎖の間に介在するとき、この配列構造は、ヘアピン型ＲＮＡ剤中のヘアピンＲＮＡループの代わりに機能することが可能である。３’末端は−ＯＨ基であり得る。理論に束縛されることを望まないが、特定の部分の複合体化は、輸送、ハイブリダイゼーションおよび特異性についての特性を改善することが可能であると考えられている。再度、理論に束縛されることを望まないが、ヌクレアーゼ耐性を改善する末端の変化を導入することが望ましい可能性がある。末端修飾の他の例には、色素、インターカレート剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、ソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サッフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性担体（例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コール酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）およびペプチド複合体（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、リン酸、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射線標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾール複合体、テトラアザマクロ環のＥｕ３＋複合体）が含まれる。
【０１３７】
末端修飾は、本明細書中の他の箇所で議論される理由を含む多くの理由のために、活性を調節するために、または分解に対する耐性を調節するために、加えられることが可能である。活性を調節するために有用である末端修飾には、リン酸またはリン酸アナログによる５’末端の修飾が含まれる。例えば、好ましい態様において、ｉＲＮＡ剤、とりわけアンチセンス鎖は、５’リン酸化されてもよいし、または５’プライム末端にリン酸基アナログを含んでもよい。５’リン酸修飾には、ＲＩＳＣ介在性の遺伝子サイレンシングと適合可能であるものが含まれる。適切な修飾には以下が含まれる：５’一リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’二リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’三リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−グアノシンキャップ（７−メチル化または非メチル化）（７ｍ−Ｇ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）、および任意の修飾または非修飾ヌクレオチドキャップ構造（Ｎ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’一チオリン酸（ホスホロチオエート；（ＨＯ）２（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’一ジチオリン酸（ホスホロジチオエート；（ＨＯ）（ＨＳ
）（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−ホスホロチオール酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｓ−５’）；酸素／硫黄置換一リン酸、二リン酸、および三リン酸の任意のさらなる組合せ（例えば、５’−α−チオ三リン酸、５’−γ−チオ三リン酸など）、５’−ホスホルアミデート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−ＮＨ−５’、（ＨＯ）（ＮＨ２）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−アルキルホスホン酸（Ｒ＝アルキル＝メチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’、（ＯＨ）２（Ｏ）Ｐ−５’−ＣＨ２）、５’−アルキルエーテルホスホン酸（Ｒ＝アルキルエーテル＝メトキシメチル（ＭｅＯＣＨ２）、エトキシメチルなど、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’）。
【０１３８】
末端修飾はまた、分布をモニターするためにも有用でありうるが、このような場合において、付加される好ましい基には、蛍光団（例えば、フルオレセイン）またはＡｌｅｘａ（商標）色素（例えば、Ａｌｅｘａ  ４８８）が含まれる。末端修飾はまた、取り込みを増強するために有用でありうるが、このために有用な修飾にはコレステロールが含まれる。末端修飾はまた、ＲＮＡ剤を別の部分に架橋するために有用でありうるが、このための有用な修飾にはマイトマイシンＣが含まれる。
【０１３９】
候補修飾は、以下に記載されるように評価されることが可能である。
【０１４０】
塩基
アデニン、グアニン、シトシン、およびウラシルはＲＮＡにおいて見出される最も一般的な塩基である。これらの塩基は、改善された特性を有するＲＮＡを提供するために修飾または置換されることが可能である。例えば、ヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドは、これらの塩基を用いて、または合成もしくは天然の核酸塩基（例えば、イノシン、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌバラリン（ｎｕｂｕｌａｒｉｎｅ）、イソグアニシン（ｉｓｏｇｕａｎｉｓｉｎｅ）、またはツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎｅ））および上記の修飾のいずれか１つを用いて調製されることが可能である。代替的には、上記のうち任意の塩基の置換アナログまたは修飾アナログ、例えば、「一般的でない塩基」および「汎用的な塩基」が利用されることも可能である。例としては、非限定的に以下が含まれる：２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、６−アゾウラシル、６−アゾシトシン、および６−アゾチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、５−ハロウラシル、５−（２−アミノプロピル）ウラシル、５−アミノアリルウラシル、８−ハロ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシル、および他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニン、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、およびＮ−２，Ｎ−６、およびＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニンを含む）、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、ジヒドロウラシル、３−デアザ−５−アザシトシン、２−アミノプリン、５−アルキルウラシル、７−アルキルグアニン、５−アルキルシトシン、７−デアザアデニン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデニン、２，６−ジアミノプリン、５−アミノ−アリル−ウラシル、Ｎ３−メチルウラシル、置換１，２，４−トリアゾール、２−ピリジノン、５−ニトロインドール、３−ニトロピロール、５−メトキシウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウラシル、５−メチルアミノメチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウラシル、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ４−アセチルシトシン、２−チオシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｎ６−イソペンチルアデニン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、Ｎ−メチルグアニン、またはＯ−アルキル化塩基。さらなるプリンおよびピリミジンは、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されるもの、「Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ
Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、８５８〜８５９頁、クロシュビッツ  ジェー  アイ（Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ  Ｊ．Ｉ．）編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆
Ｓｏｎｓ、１９９０に開示されるもの、およびイングリッシュら（Ｅｎｇｌｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．）、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１、３０巻、ｐ．６１３によって開示されるものが含まれる。
【０１４１】
一般的には、塩基の変化は、安定性を促進するためには好ましくないが、他の理由のために有用である可能性がある。例えば、いくつかの２，６−ジアミノプリンおよび２アミノプリンは蛍光性である。修飾塩基により標的特異性が減少する可能がある。このことは、ｉＲＮＡ剤の設計において考慮されるべきである。
【０１４２】
候補修飾は以下に記載されるように評価されることが可能である。
【０１４３】
候補ＲＮＡの評価
候補ＲＮＡ剤（例えば、修飾ＲＮＡ）を、そのＲＮＡ剤または修飾分子および対照分子を適切な条件に曝露すること、ならびに選択された特性の存在について評価することによって、選択された特性について評価することが可能である。例えば、分解剤に対する耐性は以下のようにして評価されることが可能である。候補修飾ＲＮＡ（および好ましくは対照分子、通常は非修飾型）は、分解的な条件、例えば、分解剤（例えば、ヌクレアーゼ）を含む環境に曝露されることが可能である。例えば、生物学的試料を使用することが可能であり、該試料は、例えば、治療的使用、例えば、血液または細胞画分（例えば、無細胞ホモジネートまたは破砕された細胞）において遭遇しうる環境と類似の生物学的試料である。次いで、候補および対照を、多数のアプローチのいずれかによって、分解に対する耐性について評価することが可能である。例えば、候補および対照を、例えば、放射性標識もしくは酵素標識または蛍光標識（例えば、Ｃｙ３もしくはＣｙ５など）を用いて、好ましくは、曝露の前に標識することが可能である。対照ＲＮＡおよび修飾されたＲＮＡを、分解剤、および場合によっては対照（例えば、不活化された（例えば、熱不活化された）分解剤）とともにインキュベートすることが可能である。次いで、物理学的パラメータ（例えば、修飾分子および対照分子のサイズ）を決定する。これらは、物理学的方法によって（例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはサイズ分画カラムによって）、その分子がその元々の長さを維持していたかを評価するために決定してもよいし、または機能的に評価することも可能である。代替的には、ノーザンブロット分析を使用して、未標識の修飾分子の長さをアッセイすることが可能である。
【０１４４】
機能的アッセイもまた、候補剤を評価するために使用することが可能である。機能的アッセイは、修飾が、遺伝子発現をサイレンシングする分子の能力を変化させるか否かを決定するために、最初に、または初期の非機能的アッセイ（例えば、分解に対する耐性についてのアッセイ）の後で適用することが可能である。例えば、細胞（例えば、マウスまたはヒトの細胞などの哺乳動物細胞）を、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）を発現するプラスミドおよびその蛍光タンパク質をコードする転写物に相同である候補ＲＮＡ剤で同時トランスフェクトすることが可能である（例えば、国際公開公報第００／４４９１４号パンフレットを参照されたい）。例えば、ＧＦＰ  ｍＲＮＡに相同である修飾ｄｓＲＮＡは、トランスフェクションに候補ｄｓＲＮＡを含めなかった対照細胞（例えば、ＲＮＡ剤を加えられなかった対照、および／または非修飾ＲＮＡを加えられなかった対照）と比較して、細胞の蛍光の減少についてモニターすることによって、ＧＦＰ発現を阻害する能力についてアッセイすることが可能である。遺伝子発現に対する候補剤の効力は、修飾ｄｓＲＮＡ剤および非修飾ｄｓＲＮＡ剤の存在下での細胞の蛍光を比較することによって評価可能である。
【０１４５】
代替的な機能的アッセイにおいて、内在性マウス遺伝子（好ましくは、ｃ−ｍｏｓなど
の母方で発現される遺伝子）に相同な候補ｄｓＲＮＡ剤が、インビボで遺伝子発現を阻害するＲＮＡ剤の能力を評価するために、未成熟のマウス卵母細胞に注入されてもよい（例えば、国際公開公報第０１／３６６４６号パンフレットを参照されたい）。卵母細胞の表現型（例えば、中期ＩＩにおける停止を維持する能力）を、ＲＮＡ剤が発現を阻害する指標としてモニター可能である。例えば、ｄｓＲＮＡ剤によるｃ−ｍｏｓ  ｍＲＮＡの切断は、卵母細胞が中期における停止を抜け出て単為生殖的発生を開始することを引き起こす（カレッジら（Ｃｏｌｌｅｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ  ３７０：６５〜６８、１９９４；ハシモトら（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ、３７０：６８〜７１、１９９４）。標的ＲＮＡレベルに対する修飾ＲＮＡ剤の効果は、陰性対照と比較して、標的ｍＲＮＡのレベルの減少についてアッセイするためのノーザンブロットによって、または標的タンパク質のレベルの減少についてアッセイするためのウエスタンブロット分析によって確認可能である。対照は、ＲＮＡ剤が添加されない細胞、および／または非修飾ＲＮＡが添加される細胞を含むことが可能である。
【０１４６】
参考文献
一般的参考文献
本発明に従って使用されるオリゴリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオシドは、固相合成を用いて可能であり、例えば、以下を参照されたい：「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ」、エム
ジェー  ガイト（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ）編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８４；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」エフ  エックスタイン（Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９９１（とりわけ、第１章「Ｍｏｄｅｒｎ  ｍａｃｈｉｎｅ−ａｉｄｅｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、第２章「Ｏｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、第３章「２’−Ｏ−Ｍｅｔｈｙｌｏｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｓ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、第４章「Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」、第５章「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｔｈｉｏａｔｅｓ」、第６章「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏ−２’−ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ」、および第７章「Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｂａｓｅｓ」）。他の特に有用な合成手順、試薬、ブロッキング基、および反応条件は、マーティン  ピー（Ｍａｒｔｉｎ，Ｐ．）、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．１９９５、７８、４８６〜５０４；ボカジュ  エス  エル（Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．）およびアイヤル  アール  ピー（Ｉｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、１９９２、４８、２２２３〜２３１１ならびにボカジュ  エス  エル（Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．）およびアイヤル  アール  ピー（Ｉｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、１９９３、４９、６１２３〜６１９４、またはそこに引用される参考文献に記載されている。
【０１４７】
国際公開公報第００／４４８９５号パンフレット、国際公開公報第０１／７５１６４号パンフレット、または国際公開公報第０２／４４３２１号パンフレットに記載される修飾は、本明細書中で使用されることが可能である。
【０１４８】
本明細書中で列挙されるすべての刊行物、特許、および公開特許出願の開示は、本願明細書に援用される。
【０１４９】
リン酸基の参考文献
ホスフィン酸オリゴリボヌクレオチドの調製は、米国特許第５，５０８，２７０号に記載される。アルキルホスホン酸オリゴリボヌクレオチドの調製は、米国特許第４，４６９
，８６３号に記載される。ホスホルアミダイトオリゴリボヌクレオチドの調製は、米国特許第５，２５６，７７５号または米国特許第５，３６６，８７８号に記載される。ホスホトリエステルオリゴリボヌクレオチドの調製は、米国特許第５，０２３，２４３号に記載される。ボラノリン酸オリゴリボヌクレオチドの調製は、米国特許第５，１３０，３０２号および米国特許第５，１７７，１９８号に記載される。３’−デオキシ−３’−アミノホスホルアミデートリボオリゴヌクレオチドの調製は、米国特許第５，４７６，９２５号に記載されている。３’−デオキシ３’−メチレンホスホネートオリゴリボヌクレオチドは、アン（Ａｎ），Ｈら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００１、６６、２７８９〜２８０１に記載されている。硫黄架橋ヌクレオチドの調製は、スプロートら（Ｓｐｒｏａｔ  ｅｔ
ａｌ．）、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １９８８、７、６５１およびクロスティックら（Ｃｒｏｓｓｔｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９８９、３０、４６９３に記載されている。
【０１５０】
糖基の参考文献
２’修飾に対する改変は、フェルマ（Ｖｅｒｍａ），Ｓ．ら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９８、６７、９９〜１３４および同文献内のすべての参考文献において見出されることが可能である。リボースに対する特異的修飾は以下の参考文献において見出されることが可能である：２’−フルオロ（カワサキら（Ｋａｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９９３、３６、８３１〜８４１）、２’−ＭＯＥ（マーティン  ピー（Ｍａｒｔｉｎ，Ｐ．）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  １９９６、７９、１９３０〜１９３８）、「ＬＮＡ」（ウェンゲル（Ｗｅｎｇｅｌ）、Ｊ．Ａｃｃ  Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．１９９９、３２、３０１〜３１０）。
【０１５１】
リン酸基の置換に関する参考文献
メチレンメチルイミノ結合オリゴリボヌクレオシド（本明細書中では、ＭＭＩ結合オリゴリボヌクレオシドとしても同定される）、メチレンジメチルヒドラゾ結合オリゴリボヌクレオシド（本明細書中では、ＭＤＨ結合オリゴリボヌクレオシドとしても同定される）、およびメチレンカルボニルアミノ結合オリゴヌクレオシド（本明細書中では、アミド−３結合オリゴリボヌクレオシドとしても同定される）、およびメチレンアミノカルボニル結合オリゴヌクレオシド（本明細書中では、アミド−４結合オリゴリボヌクレオシドとしても同定される）、ならびに混合バックボーン化合物（例えば、交互にＭＭＩおよびＰＯまたはＰＳ結合を有する）は、米国特許第５，３７８，８２５号、同第５，３８６，０２３号、同第５，４８９，６７７号、ならびに公開されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０４２９４号およびＰＣＴ／ＵＳ９２／０４３０５号（それぞれ、国際公開公報第９２／２０８２２号および国際公開公報第９２／２０８２３号パンフレットとして公開されている）に記載されるように調製されることが可能である。ホルムアセタールおよびチオホルムアセタール結合オリゴリボヌクレオシドは、米国特許第５，２６４，５６２号および米国特許第５，２６４，５６４号に記載されるように調製されることが可能である。エチレンオキサイド結合オリゴリボヌクレオシドは、米国特許第５，２２３，６１８号に記載されるように調製されることが可能である。シロキサン置換については、コーミア  ジェー  エフら（Ｃｏｒｍｉｅｒ，Ｊ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９８８、１６、４５８３に記載されている。カーボネート置換は、ティテンサー  ジェー  アール（Ｔｉｔｔｅｎｓｏｒ，Ｊ．Ｒ．）、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃ１９７１、１９３３に記載されている。カルボキシメチル置換は、エッジ  エム  ディーら（Ｅｄｇｅ，Ｍ．Ｄ．）、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．１  １９７２、１９９１に記載されている。カルバメート置換は、スターチャク  イー  ピー（Ｓｔｉｒｃｈａｋ，Ｅ．Ｐ．）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９８９、１７、６１２９に記載されている。
【０１５２】
リン酸−リボースバックボーンの置換に関する参考文献
糖代用品のシクロブチル化合物は、米国特許第５，３５９，０４４号に記載されるように調製されることが可能である。ピロリジン糖代用物は、米国特許第５，５１９，１３４号に記載されるように調製されることが可能である。モルホリノ糖代用物は、米国特許第５，１４２，０４７号および米国特許第５，２３５，０３３号、ならびに他の関連する特許の開示に記載されるように調製されることが可能である。ペプチド核酸（ＰＮＡ）はそれ自体公知であり、「Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ（ＰＮＡ）：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９６、４、５〜２３において引用される種々の手順のいずれかに従って調製されることが可能である。これらはまた、米国特許第５，５３９，０８３号に従って調製されることが可能である。
【０１５３】
末端修飾の文献
末端修飾は、マノハラン  エムら（Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．）、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２、１０３〜１２８（２００２）および同文献中の引用文献に記載されている。
【０１５４】
塩基の参考文献
Ｎ−２置換プリンヌクレオシドアミダイトは、米国特許第５，４５９，２５５号に記載されるように調製されることが可能である。３−デアザプリンヌクレオシドアミダイトは、米国特許第５，４５７，１９１号に記載されるように調製されることが可能である。５，６−置換ピリミジンヌクレオシドアミダイトは、米国特許第５，６１４，６１７号に記載されるように調製されることが可能である。５−プロピニルピリミジンヌクレオシドアミダイトは、米国特許第５，４８４，９０８号に記載されるように調製されることが可能である。さらなる参考文献は、塩基修飾についての上記の節に開示されることが可能である。
【０１５５】
好ましいｉＲＮＡ剤
好ましいＲＮＡ剤は以下の構造を有する（以下の式２を参照のこと）：
【０１５６】
【化２】
0005881970.tif 000004
【０１５７】
上記の式２を参照すると、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、各々独立して、Ｈ（すなわち、脱塩基ヌクレオチド）、アデニン、グアニン、シトシン、およびウラシル、イノシン、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌバラリン、ツベルシジン、イソグアニシン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、６−アゾウラシル、６−アゾシトシン、および６−アゾチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、５−ハロウラシル、５−（２−アミノプロピル）ウラシル、５−アミノアリルウラシル、８−ハロ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシル、および他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニン、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンおよびＮ−２，Ｎ−６、およびＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニンを含む）、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、ジヒドロウラシル、３−デアザ−５−アザシトシン、２−アミノプリン、５−アルキルウラシル、７−アルキルグアニン、５−アルキルシトシン、７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデニン、２，６−ジアミノプリン、５−アミノ−アリル−ウラシル、Ｎ３−メチルウラシル、置換１，２，４−トリアゾール、２−ピリジノン、５−ニトロインドール、３−ニトロピロール、５−メトキシウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウラシル、５−メチルアミノメチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウラシル、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ４−アセチルシトシン、２−チオシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｎ６−イソペンチルアデニン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、Ｎ−メチルグアニン、またはＯ−アルキル化塩基である。
【０１５８】
Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は、各々独立して、ＯＲ８、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２ＯＲ８；Ｏ（ＣＨ２）ｎＲ９；Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ９、Ｈ；ハロ；ＮＨ２；ＮＨＲ８；Ｎ（Ｒ８）２；ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｍＣＨ２ＣＨ２ＮＨＲ９；ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ８；シアノ；メルカプト；ＳＲ８；アルキル−チオ−アルキル；アルキル、アラルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルケニル、アルキニル（これらの各々は、場合により、ハロ、ヒドロキシ、オキソ、ニトロ、ハロアルキル、アルキル、アルカリル、アリール、アラルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、アシルアミノ、アルキルカルバモイル、アリールカルバモイル、アミノアルキル、アルコキシカルボニル、カルボキシ、ヒドロキシアルキル、アルカンスルホニル、アルカンスルホンアミド、アレンスルホンアミド、アラルキルスルホンアミド、アルキルカルボニル、アシルオキシ、シアノ、またはウレイドで置換されてもよい）であるか；または、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は、Ｒ７と一緒に組み合わさって、糖の２’炭素と４’炭素の間の［−Ｏ−ＣＨ２−］共有結合架橋を形成する。
【０１５９】
Ａ１は
【０１６０】
【化３】
0005881970.tif 000005
【０１６１】
；Ｈ；ＯＨ；ＯＣＨ３；Ｗ１；脱塩基ヌクレオチドであるか；または存在せず、
（好ましいＡ１は、とりわけアンチセンス鎖に関して、以下の：５’一リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’二リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’三リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−グアノシンキャップ（７−メチル化または非メチル化）（７ｍ−Ｇ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）、および任意の修飾または非修飾ヌクレオチドキャップ構造（Ｎ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’一チオリン酸（ホスホロチオエート；（ＨＯ）２（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’一ジチオリン酸（ホスホロジチオエート；（ＨＯ）（ＨＳ）（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−ホスホロチオール酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｓ−５’）；酸素／硫黄置換一リン酸、二リン酸、および三リン酸の任意のさらなる組合せ（例えば、５’−α−チオ三リン酸、５’−γ−チオ三リン酸など）、５’−ホスホルアミデート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−ＮＨ−５’、（ＨＯ）（ＮＨ２）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−
アルキルホスホン酸（Ｒ＝アルキル＝メチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’−、（ＯＨ）２（Ｏ）Ｐ−５’−ＣＨ２）、５’−アルキルエーテルホスホン酸（Ｒ＝アルキルエーテル＝メトキシメチル（ＭｅＯＣＨ２−）、エトキシメチルなど、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’−）から選択される。）
Ａ２は
【０１６２】
【化４】
0005881970.tif 000006
【０１６３】
であり、Ａ３は
【０１６４】
【化５】
0005881970.tif 000007
【０１６５】
であり；かつＡ４は
【０１６６】
【化６】
0005881970.tif 000008
【０１６７】
；Ｈ；Ｚ４；逆向きのヌクレオチド；脱塩基ヌクレオチドであるか；または存在しない。
【０１６８】
Ｗ１は、ＯＨ、（ＣＨ２）ｎＲ１０、（ＣＨ２）ｎＮＨＲ１０、（ＣＨ２）ｎＯＲ１０、（ＣＨ２）ｎＳＲ１０、Ｏ（ＣＨ２）ｎＲ１０、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ１０、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＲ１０、Ｏ（ＣＨ２）ｎＳＲ１０、Ｏ（ＣＨ２）ｎＳＳ（ＣＨ２）ｎＯＲ１０、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）ＯＲ１０、ＮＨ（ＣＨ２）ｎＲ１０；ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＲ１０；ＮＨ（ＣＨ２）ｎＯＲ１０、ＮＨ（ＣＨ２）ｎＳＲ１０；Ｓ（ＣＨ２）ｎＲ１０、Ｓ（ＣＨ２）ｎＮＲ１０、Ｓ（ＣＨ２）ｎＯＲ１０、Ｓ（ＣＨ２）ｎＳＲ１０Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２ＯＲ１０；Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２ＮＨＲ１０；ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｍＣＨ２ＣＨ２ＮＨＲ１０；Ｑ−Ｒ１０、Ｏ−Ｑ−Ｒ１０、Ｎ−Ｑ−Ｒ１０、Ｓ−Ｑ−Ｒ１０、または−Ｏ−である。Ｗ４は、Ｏ、ＣＨ２、ＮＨ、またはＳである。
【０１６９】
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４は、各々独立して、ＯまたはＳである。
【０１７０】
Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、およびＹ４は、各々独立して、ＯＨ、Ｏ−、ＯＲ８、Ｓ、Ｓｅ、ＢＨ３−、Ｈ、ＮＨＲ９、Ｎ（Ｒ９）２、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、これらの各々が場合によっては置換されてもよい。
【０１７１】
Ｚ１、Ｚ２、およびＺ３は、各々独立して、Ｏ、ＣＨ２、ＮＨ、またはＳである。Ｚ４は、ＯＨ、（ＣＨ２）ｎＲ１０、（ＣＨ２）ｎＮＨＲ１０、（ＣＨ２）ｎＯＲ１０、（ＣＨ２）ｎＳＲ１０、Ｏ（ＣＨ２）ｎＲ１０、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ１０、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＲ１０、Ｏ（ＣＨ２）ｎＳＲ１０、Ｏ（ＣＨ２）ｎＳＳ（ＣＨ２）ｎＯＲ１０、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）ＯＲ１０、ＮＨ（ＣＨ２）ｎＲ１０；ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＲ１０；ＮＨ（ＣＨ２）ｎＯＲ１０、ＮＨ（ＣＨ２）ｎＳＲ１０；Ｓ（ＣＨ２）ｎＲ１０、Ｓ（ＣＨ２）ｎＮＲ１０、Ｓ（ＣＨ２）ｎＯＲ１０、Ｓ（ＣＨ２）ｎＳＲ１０Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２ＯＲ１０；Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２ＮＨＲ１０；ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｍＣＨ２ＣＨ２ＮＨＲ１０；Ｑ−Ｒ１０、Ｏ−Ｑ−Ｒ１０、Ｎ−Ｑ−Ｒ１０、Ｓ−Ｑ−Ｒ１０である。
【０１７２】
ｘは、本明細書中に記載されるＲＮＡ剤の長さを満足するように選択され、５〜１００である。
【０１７３】
Ｒ７はＨであるか、またはＲ４、Ｒ５、またはＲ６と一緒に組み合わさって糖の２’炭素と４’炭素の間に［−Ｏ−ＣＨ２−］共有結合架橋を形成する。  
【０１７４】
Ｒ８は、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、アミノ酸、または糖であり；Ｒ９は、ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸であり；およびＲ１０はＨ；蛍光団（例えば、ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３色素もしくはＣｙ５色素）；硫黄、ケイ素、ホウ素、もしくはエステルの保護基；インターカレート剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、ソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サッフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性担体（コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コール酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）およびペプチド複合体（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、リン酸、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ；アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール；放射線標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾール複合体、テトラアザマクロ環のＥｕ３＋複合体）；またはＲＮＡ剤である。ｍは０〜１，０００，０００であり、かつｎは０〜２０である。Ｑは、脱塩基性の糖（ａｂａｓｉｃ  ｓｕｇａｒ）、アミド、カルボキシ、オキシアミン、オキシイミン、チオエーテル、ジスルフィド、チオ尿素、スルホンアミドもしくはモルホリノ、ビオチン、またはフルオレセイン試薬からなる群より選択されるスペーサーである。
【０１７５】
リン酸基全体が置換されている好ましいＲＮＡ剤は以下の構造を有する（以下の式３を参照のこと）：
【０１７６】
【化７】
0005881970.tif 000009
【０１７７】
式３を参照すると、Ａ１０−Ａ４０はＬ−Ｇ−Ｌであり；Ａ１０およびＡ４０のうち少なくともいずれかは存在しなくてもよい。ここでＬはリンカーであり、一方または両方のＬは存在していても存在していなくてもよく、かつＣＨ２（ＣＨ２）ｇ；Ｎ（ＣＨ２）ｇ；Ｏ（ＣＨ２）ｇ；Ｓ（ＣＨ２）ｇからなる群より選択される。Ｇは、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキサイドリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、およびメチレンオキシメチルイミノからなる群より選択される官能基である。
【０１７８】
Ｒ１０、Ｒ２０、およびＲ３０は、各々独立して、Ｈ（すなわち、脱塩基ヌクレオチド）、アデニン、グアニン、シトシン、およびウラシル、イノシン、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌバラリン、ツベルシジン、イソグアニシン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、６−アゾウラシル、６−アゾシトシン、および６−アゾチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、５−ハロウラシル、５−（２−アミノプロピル）ウラシル、５−アミノアリルウラシル、８−ハロ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシル、および他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニン、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、およびＮ−２，Ｎ
−６、およびＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニンを含む）、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、ジヒドロウラシル、３−デアザ−５−アザシトシン、２−アミノプリン、５−アルキルウラシル、７−アルキルグアニン、５−アルキルシトシン、７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデニン、２，６−ジアミノプリン、５−アミノ−アリル−ウラシル、Ｎ３−メチルウラシル置換１，２，４−トリアゾール、２−ピリジノン、５−ニトロインドール、３−ニトロピロール、５−メトキシウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウラシル、５−メチルアミノメチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウラシル、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ４−アセチルシトシン、２−チオシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｎ６−イソペンチルアデニン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、Ｎ−メチルグアニン、またはＯ−アルキル化塩基である。
【０１７９】
Ｒ４０、Ｒ５０、およびＲ６０は、各々独立して、ＯＲ８、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２ＯＲ８；Ｏ（ＣＨ２）ｎＲ９；Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ９、Ｈ；ハロ；ＮＨ２；ＮＨＲ８；Ｎ（Ｒ８）２；ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｍＣＨ２ＣＨ２Ｒ９；ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ８；；シアノ；メルカプト；ＳＲ７；アルキル−チオ−アルキル；アルキル、アラルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルケニル、アルキニル（これらの各々は、場合により、ハロ、ヒドロキシ、オキソ、ニトロ、ハロアルキル、アルキル、アルカリル、アリール、アラルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、アシルアミノ、アルキルカルバモイル、アリールカルバモイル、アミノアルキル、アルコキシカルボニル、カルボキシ、ヒドロキシアルキル、アルカンスルホニル、アルカンスルホンアミド、アレンスルホンアミド、アラルキルスルホンアミド、アルキルカルボニル、アシルオキシ、シアノ、またはウレイド基で置換されてもよい）であり；または、Ｒ４０、Ｒ５０、およびＲ６０は、Ｒ７０と一緒に組み合わさって、糖の２’炭素と４’炭素の間の［−Ｏ−ＣＨ２−］共有結合架橋を形成する。
【０１８０】
ｘは、本明細書中に記載されるＲＮＡ剤の長さを満足するように選択され、５〜１００である。
【０１８１】
Ｒ７０はＨであるか、またはＲ４０、Ｒ５０、またはＲ６０と一緒に組み合わさって、糖の２’炭素と４’炭素の間の［−Ｏ−ＣＨ２−］共有結合架橋を形成する。
【０１８２】
Ｒ８は、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、アミノ酸、または糖であり；Ｒ９は、ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸である、ｍは０〜１，０００，０００であり、ｎは０〜２０であり、かつｇは０〜２である。
【０１８３】
好ましいヌクレオシド代用物は以下の構造を有する（以下の式４を参照のこと）：
【０１８４】
【化８】
0005881970.tif 000010
【０１８５】
Ｓは、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン、およびペプチド核酸からなる群より選択される。Ｌはリンカーであり、かつＣＨ２（ＣＨ２）ｇ；Ｎ（ＣＨ２）ｇ；Ｏ（ＣＨ２）ｇ；Ｓ（ＣＨ２）ｇ；−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−からなる群より選択されるか、または存在していなくてもよい。Ｍは、アミド結合；スルホンアミド；スルフィン酸；リン酸基；本明細書中に記載されるような修飾リン酸基であるか；または存在していなくてもよい。
【０１８６】
Ｒ１００、Ｒ２００、およびＲ３００は、各々独立して、Ｈ（すなわち、脱塩基ヌクレオチド）、アデニン、グアニン、シトシン、およびウラシル、イノシン、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌバラリン、ツベルシジン、イソグアニシン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、６−アゾウラシル、６−アゾシトシン、および６−アゾチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、５−ハロウラシル、５−（２−アミノプロピル）ウラシル、５−アミノアリルウラシル、８−ハロ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシル、および他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニン、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンおよびＮ−２，Ｎ−６、およびＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニンを含む）、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、ジヒドロウラシル、３−デアザ−５−アザシトシン、２−アミノプリン、５−アルキルウラシル、７−アルキルグアニン、５−アルキルシトシン、７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデニン、２，６−ジアミノプリン、５−アミノ−アリル−ウラシル、Ｎ３−メチルウラシル置換１，２，４−トリアゾール、２−ピリジノン、５−ニトロインドール、３−ニトロピロール、５−メトキシウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウラシル、５−メチルアミノメチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウラシル、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ４−アセチルシトシン、２−チオシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｎ６−イソペンチルアデニン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、Ｎ−メチルグアニン、またはＯ−アルキル化塩基である。
【０１８７】
ｘは、本明細書中に記載されるＲＮＡ剤の長さを満足するように選択され、５〜１００であり；ｇは０〜２である。
【０１８８】
ヌクレアーゼ耐性モノマー
ＲＮＡ、例えばｉＲＮＡ剤に、本明細書に記載されるような、さらに同時係属中の共同所有される２００３年５月９日に申請された米国仮特許出願第６０／４６９，６１２号および国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０４／０７０７０号（いずれも本願に援用する）に記載されるようなヌクレアーゼ耐性モノマー（ＮＲＭ）を組み入れることが可能である。
【０１８９】
さらに、本発明はＮＲＭおよび本明細書に記載の他の要素を有するｉＲＮＡ剤を含む。例えば、本発明は、本明細書に記載のｉＲＮＡ剤、例えばパリンドローム構造のｉＲＮＡ剤、非標準的な対合を有するｉＲＮＡ剤、本明細書に記載の遺伝子、例えば肝臓において活性を示す遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤、本明細書に記載の構成様式もしくは構造を有するｉＲＮＡ剤、本明細書に記載の両親媒性送達剤と結合したｉＲＮＡ剤、本明細書に記載の薬剤送達モジュールと結合したｉＲＮＡ剤、本明細書に記載のように投与されるｉＲＮＡ剤、または本明細書に記載のように製剤化されたｉＲＮＡ剤であって、ＮＲＭも取り込むｉＲＮＡ剤を含む。
【０１９０】
ｉＲＮＡ剤は、例えば、対象の体内に見られるヌクレアーゼ（例えばエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ）による分解を阻害するように修飾されたモノマーを含みうる。これらのモノマーをここではＮＲＭ、またはヌクレアーゼ耐性促進モノマーもしくはヌクレアーゼ耐性促進修飾体と称する。多くの場合、これらの修飾は、ｉＲＮＡ剤の他の特性、例えばタンパク質（例えば輸送タンパク質（例えば血清アルブミン））もしくはＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導サイレシング複合体）の構成メンバーと相互作用する能力、または最初の配列と２番目の配列が相互に二本鎖を形成もしくは別の配列、例えば標的分子と二本鎖を形成する能力という特性も同様に調節する。
【０１９１】
理論に縛られることは望まないが、ｉＲＮＡ剤の糖、塩基および／またはリン酸バックボーンの修飾体は、エンドヌクレアーゼ耐性およびエキソヌクレアーゼ耐性を増強し、さらに輸送タンパク質およびＲＩＳＣ複合体の１つまたは複数の機能的要素との相互作用を亢進すると考えられる。好ましい修飾体は、エキソヌクレアーゼ耐性およびエンドヌクレアーゼ耐性を高め、したがって、ＲＩＳＣ複合体と相互作用する前のｉＲＮＡ剤の半減期を延長するが、同時に、ＲＩＳＣ複合体におけるエンドヌクレアーゼの活性に対してはｉＲＮＡ剤を耐性にしない修飾体である。繰り返すが、いかなる理論にも縛られることは望まないが、上記修飾をアンチセンス鎖の３’末端および／もしくは５’末端またはこれらの近くに配置することにより、上記に描写される好ましいヌクレアーゼ耐性の基準を満たすｉＲＮＡ剤が生じると考えられる。やはり繰り返すが、いかなる理論にも縛られることは望まないが、修飾を、例えばセンス鎖の中央に配置することにより、オフターゲットの可能性が比較的低いｉＲＮＡ剤が作製可能と考えられる。
【０１９２】
本明細書に記載の修飾を、例えばｉＲＮＡ剤などの、本明細書に記載の任意の二本鎖ＲＮＡおよびＲＮＡ様分子へ組み込むことが可能である。ｉＲＮＡ剤はハイブリッド形成したセンス鎖およびアンチセンス鎖からなる二本鎖を含むことができ、この場合アンチセンス鎖および／またはセンス鎖は、本明細書に記載される１つまたは複数の修飾を含むことが可能である。アンチセンス鎖は、３’末端および／もしくは５’末端、ならびに／または鎖のいずれかの末端から１〜６ヌクレオチド、例えば１〜５、１〜４、１〜３、１〜２ヌクレオチドにある１つもしくは複数の位置に修飾を含むことが可能である。センス鎖は、３’末端および／もしくは５’末端、ならびに／または鎖の両末端の間にある介入位置のいずれか１つに修飾を含むことが可能である。また、ｉＲＮＡ剤は、ハイブリッド形成した２つのアンチセンス鎖からなる二本鎖を含むことが可能である。第１および／または第２のアンチセンス鎖は、本明細書に記載の１つまたは複数の修飾を含むことが可能である。したがって、１つおよび／または両方のアンチセンス鎖は、３’末端および／もしくは５’末端、ならびに／または鎖のいずれかの末端から１〜６ヌクレオチド、例えば１〜５、１〜４、１〜３、１〜２ヌクレオチドにある１つもしくは複数の位置に修飾を含むことが可能である。以降に特定の構造について述べる。
【０１９３】
上記により描写される好ましいヌクレアーゼ耐性の基準を満たすｉＲＮＡ剤を作製するために有用と考えられる修飾は、以下に記すような、糖、塩基および／またはリン酸バックボーンについての１つまたは複数の化学的および／または立体化学的修飾を含むことが可能である：  （ｉ）キラル（ＳＰ）チオエート。したがって、好ましいＮＲＭは、通常は酸素によって占められる非架橋位置、例えば位置ＸのＳｐまたはＲｐにヘテロ原子を含む特定のキラル型の修飾リン酸基について富化された、または前記修飾リン酸基について純粋なヌクレオチド二量体を含む。また、Ｘの原子にはＳ、Ｓｅ、Ｎｒ２またはＢｒ３が考えられる。ＸがＳならば、富化された、またはキラル型について純粋なＳｐとの結合が好ましい。富化とは好ましい型が少なくとも７０、８０、９０、９５または９９％であることを意味する。そのようなＮＲＭについては以下により詳細に記載する；
（ｉｉ）糖、塩基および／またはリン酸バックボーン部分もしくは修飾リン酸バックボーン部分のリン原子への１つまたは複数のカチオン基の結合。したがって、好ましいＮＲ
Ｍは、末端にカチオン基で誘導体化されたモノマーを含む。アンチセンス配列の５’末端は、末端−ＯＨまたはリン酸基を有する必要があるので、前記のＮＲＭは、アンチセンス配列の５’末端では使用されないことが好ましい。このカチオン基は、水素結合形成およびハイブリッド形成との干渉を最少化する塩基上の位置、例えばもう一方の鎖の相補的塩基と相互作用する面から離れた位置（例えばピリミジンの５’位またはプリンの７位）で結合しなければならない。これらについては以下により詳細に述べる；
（ｉｉｉ）末端での非リン酸結合。したがって、好ましいＮＲＭは、例えば切断に対する耐性がリン酸結合よりも大きくなる４原子の結合などの、非リン酸結合を含む。例として、３’ＣＨ２−ＮＣＨ３−Ｏ−ＣＨ２−５’および３’ＣＨ２−ＮＨ−（Ｏ＝）−ＣＨ２−５’が挙げられる。
【０１９４】
（ｉｖ）３’架橋チオリン酸塩および５’架橋チオリン酸塩。したがって、好ましいＮＲＭは前記の構造を含むことが可能である。
【０１９５】
（ｖ）Ｌ−ＲＮＡ、２’−５’結合、逆向きの結合、α−ヌクレオシド。したがって、他の好ましいＮＲＭに含まれるものは、ＬヌクレオシドおよびＬ−ヌクレオシド由来のヌクレオチド二量体；２’−５’リン酸塩、非リン酸塩および修飾リン酸塩の結合、例えばチオリン酸塩、ホスホルアミデートおよびホウ素化リン酸塩；逆向きの結合、例えば３’−３’または５’−５’結合を有する二量体；糖の１’位にα結合を有するモノマー、例えば本明細書に記載のα結合を有する構造が挙げられる；
（ｖｉ）結合基。したがって、好ましいＮＲＭは、例えば標的結合部分、または、例えば糖、塩基もしくはバックボーンを通してモノマーと結合する、本明細書に記載の結合リガンドを含むことが可能である。
【０１９６】
（ｖｉ）脱塩基結合。したがって、好ましいＮＲＭは、例えば本明細書に記載されるような脱塩基モノマー（例えば核酸塩基のないモノマー）、本明細書に記載されるような芳香族モノマーもしくは複素環式モノマー、または多複素環式芳香族モノマーを含むことが可能である；
（ｖｉｉ）５’−ホスホネートおよび５’−ホスフェート型プロドラッグ。したがって、好ましいＮＲＭは、好ましくは末端部位（例えば５’位）に、リン酸基の１つまたは複数の原子が保護基により誘導体化されているモノマーを含み、この１つまたは複数の保護基は、対象の体内成分、例えばカルボキシエステラーゼまたは対象の体内に存在する酵素の作用により除去される。例えば、カルボキシエステラーゼが保護分子を切断する結果チオエートアニオンが生じ、チオエートアニオンがリン酸塩のＯに隣接する炭素を攻撃する結果として保護されていないリン酸塩が生じるリン酸プロドラッグ。
【０１９７】
１つまたは複数の異なるＮＲＭ修飾をｉＲＮＡ剤またはｉＲＮＡ剤の配列中に導入することが可能である。ＮＲＭ修飾は、配列またはｉＲＮＡ剤に２回以上使用することが可能である。一部のＮＲＭはハイブリッド形成を妨げるので、取り込む総数は、許容可能なレベルのｉＲＮＡ剤の二本鎖形成が維持されるものでなければならない。
【０１９８】
一部の実施形態において、ＮＲＭ修飾は、対象の所望の配列または遺伝子を標的としない配列（センス鎖またはセンス配列）の末端切断部位または切断領域へ導入される。このことによりオフターゲットによるサイレンシングを低減しうる。
【０１９９】
キラルＳＰチオエート
修飾は、１つもしくは両方の非結合（ＸおよびＹ）リン酸酸素および／または１つもしくは複数の結合（ＷおよびＺ）リン酸酸素の変更（例えば置換）を含みうる。下記の式Ｘは２つの糖／糖代用物‐塩基部分（ＳＢ１およびＳＢ２）が結合しているリン酸塩部分を表す。
【０２００】
【化９】
0005881970.tif 000011
【０２０１】
特定の実施形態において、リン酸バックボーン部分の非結合リン酸酸素（ＸおよびＹ）の１つは次のいずれか１つ：Ｓ、Ｓｅ、ＢＲ３（Ｒは水素、アルキル、アリールなど）、Ｃ（すなわち、アルキル基、アリール基など）、Ｈ、ＮＲ２（Ｒは水素、アルキル、アリールなど）、またはＯＲ（Ｒはアルキルまたはアリール）と置換可能である。非修飾リン酸基のリン原子はアキラルである。しかし、非結合酸素の１つを上記の原子または原子群の１つと置換することにより、リン原子がキラル化される。いいかえれば、このように修飾されたリン酸基内のリン酸原子は立体中心である。立体中心のリン原子は「Ｒ」配置（ここではＲＰ）または「Ｓ」配置（ここではＳＰ）を有することが可能である。したがって、立体中心のリン原子の６０％がＲＰ配置を有するとき、残る４０％の立体中心のリン原子はＳＰ配置を有することになる。
【０２０２】
一部の実施形態において、リン酸非結合酸素が他の原子または原子群で置換されているリン酸基を有するｉＲＮＡ剤は、立体中心の原子の少なくとも約５０％（例えば立体中心の原子の少なくとも約６０％、同原子の少なくとも約７０％、同原子の少なくとも約８０％、同原子の少なくとも約９０％、同原子の少なくとも約９５％、同原子の少なくとも約９８％、同原子の少なくとも約９９％）がＳＰ配置を有する立体中心リン原子の集団を含むことが可能である。あるいは、リン酸非結合酸素が他の原子または原子群で置換されているリン酸基を有するｉＲＮＡ剤は、立体中心の原子の少なくとも約５０％（例えば立体中心の原子の少なくとも約６０％、同原子の少なくとも約７０％、同原子の少なくとも約８０％、同原子の少なくとも約９０％、同原子の少なくとも約９５％、同原子の少なくとも約９８％、同原子の少なくとも約９９％）がＲＰ配置を有する立体中心リン原子の集団を含むことが可能である。他の実施形態において、立体中心リン原子の集団がＳＰ配置を有し、かつＲＰ配置を有する立体中心リン原子を実質的に含まないことが可能である。さらに他の実施形態において、立体中心リン原子の集団がＲＰ配置を有し、かつＳＰ配置を有する立体中心リン原子を実質的に含まないことが可能である。本明細書では、「ＲＰ配置を有する立体中心リン原子を実質的に含まない」という句は、ＲＰ配置を有する立体中心リン原子を含む部分が当技術分野で公知の従来の方法（キラルＨＰＬＣ、キラルシフト試薬を使用した１Ｈ  ＮＭＲ分析など）により検出できないことを意味する。本明細書では、「ＳＰ配置を有する立体中心リン原子を実質的に含まない」という句は、Ｓｐ配置を有する立体中心リン原子を含む部分が当技術分野で公知の従来の方法（キラルＨＰＬＣ、キラルシフト試薬を使用した１Ｈ  ＮＭＲ分析など）により検出できないことを意味する。
【０２０３】
好ましい実施形態において、修飾ｉＲＮＡ剤はホスホロチオエート基、すなわちリン酸の非結合酸素がイオウ原子と置換されているリン酸基を含む。特に好ましい実施形態において、ホスホロチオエートの立体中心リン原子の集団はＳＰ配置を有し、かつＲＰ配置を有する立体中心リン原子を実質的に含まないことが可能である。
【０２０４】
ホスホロチオエートを、二量体（例えば式Ｘ−１および式Ｘ−２）
【０２０５】
【化１０】
0005881970.tif 000012
【０２０６】
を使用してｉＲＮＡ剤に組み込むことが可能である。前者は、鎖の３’末端にホスホロチオエートを導入するために使用することができ、後者は鎖の５’末端または例えばいずれかの末端から１、２、３、４、５または６つ目のヌクレオチドの位置に修飾を導入するために使用する。上記の式で、Ｙは２−シアノエトキシでよく、ＷおよびＺはＯでよく、Ｒ２’は、例えば糖にＣ−３末端構造を付与しうる置換基、例えばＯＨ、Ｆ、ＯＣＨ３でよく、ＤＭＴはジメトキシトリチルであり、「塩基」は天然の塩基でも、通常でない塩基でも、または普遍的な塩基でもよい。
【０２０７】
Ｘ−１およびＸ−２は、キラル試薬を使用して、または基本的にＲＰ配置だけを有する（すなわち、実質的にＳＰ配置を含まない）もしくはＳＰ配置だけを有する（すなわち、実質的にＲＰ配置を含まない）立体中心リン原子の集団を有するホスホロチオエート含有二量体を生じさせることが可能な配位性制御基を使用して調製可能である。あるいは、二量体が、約５０％がＲＰ配置を有し、原子の約５０％がＳＰ配置を有する立体中心リン原子の集団を有するように調整することが可能である。ＲＰ配置の立体中心リン原子を有する二量体を特定し、例えば酵素的分解および／または通常のクロマトグラフィ法を使用してＳＰ配置の立体中心リン構造を有する二量体から分離することが可能である。
【０２０８】
カチオン基
また、修飾は、糖、塩基および／またはリン酸バックボーン部分もしくは修飾リン酸バックボーン部分のリン原子への１つまたは複数のカチオン基の結合を含むことも可能である。カチオン基は、天然の塩基、通常でない塩基または普遍的な塩基上で置換可能な任意の原子に結合可能である。好ましい位置は、ハイブリッド形成を妨げない、すなわち塩基対形成に必要な水素結合の相互作用を妨げない位置である。カチオン基は、例えば糖のＣ２’位、または環状もしくは非環状の糖代用物中の類似の位置を介して結合することが可能である。カチオン基は、例えばＯ−ＡＭＩＮＥ（ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテルシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノまたはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）由来のプロトン化アミノ基、例えばＯ（ＣＨ２）ｎＡＭＩＮＥ（例えばＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテルシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノまたはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノなど）のアミノアルコキシ、アミノ（例えばＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテルシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノまたはアミノ酸）、またはＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２−ＡＭＩＮＥ（例えばＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテルシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノまたはジヘテロアリールアミノ）を含むことが可能である。
【０２０９】
非リン酸結合
また、修飾は鎖の５’末端および３’末端のうち少なくともいずれかに非リン酸結合を組み込むことが可能である。リン酸基を置換することが可能な非リン酸結合の例には、メチルホスホン酸、ヒドロキシルアミノ、シロキサン、炭酸、カルボキシメチル、カルバミン酸、アミド、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スルホン酸、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾおよびメチレンオキシメチルイミノを含む。好ましい置換体は、メチルホスホン酸基およびヒドロキシルアミノ基を含む。
【０２１０】
３’架橋チオリン酸および５’架橋チオリン酸塩；ロックトＲＮＡ、２’−５’結合、逆向きの結合、α−ヌクレオシド；結合基；脱塩基結合；ならびに５’ホスホン酸および５’リン酸プロドラッグ
上記の式Ｘについて言及すると、修飾はリン酸バックボーン部分の架橋または結合リン酸酸素（ＷおよびＺ）のうちの１つの置換体を含むことが可能である。ＸまたはＹのうち１つだけを変更する状況とは違い、ホスホロジチオエートのリン原子の中心はアキラルであり立体中心リン原子を含むｉＲＮＡ剤の形成を妨げる。
【０２１１】
また、修飾は、１番目の糖の２’位と２番目の糖の５’位を経るリン酸基または修飾リン酸基を介して２つの糖を結合することを含むことが可能である。同様に考えられるのは、１番目の糖と２番目の糖がそれぞれの３’位を通してそれぞれ結合する逆向きの結合である。また、修飾ＲＮＡは、Ｃ−１’で核酸塩基を欠く「脱塩基性の」糖を含むことも可能である。糖基は、リボースにおける対応する炭素とは反対の立体化学的配置を有する炭素を１つまたは複数含むことも可能である。したがって、修飾ｉＲＮＡ剤は、糖として、例えばアラビノースを含むヌクレオチドを含むことが可能である。上記修飾のもう１つのサブセットでは、天然の塩基、通常でない塩基または普遍的な塩基はα−配置を有することが可能である。また、修飾体は、Ｌ−ＲＮＡを含むことが可能である。
【０２１２】
また、修飾は例えばＰ（Ｏ）（Ｏ−）２−Ｘ−Ｃ５’−糖（Ｘ＝ＣＨ２、ＣＦ２、ＣＨ
Ｆなど）の５’−ホスホン酸および例えばＰ（Ｏ）［ＯＣＨ２ＣＨ２ＳＣ（Ｏ）Ｒ］２ＣＨ２Ｃ５’−糖などの５’ホスホン酸プロドラッグを含むことが可能である。後者の場合、プロドラッグ基は、最初にカルボキシエステラーゼで始まる作用を介して分解される可能性がある。分子内ＳＮ２置換を介した残るエチルチオレート基は、エピスルフィドとして分離され、非誘導体化リン酸基を生じることが可能である。
【０２１３】
また、修飾は、本明細書の他の場所に記載した結合基を追加することも含むことが可能であり、結合基は結合可能な任意のアミノ基を介してｉＲＮＡ剤へ結合されることが好ましい。
【０２１４】
ヌクレアーゼ耐性の修飾には、末端のみに配置することが可能な修飾といかなる位置でも配置可能な修飾とがある。通常、ハイブリッド形成を抑制することが可能な修飾は、末端領域でのみ使用することが好ましく、対象の配列または遺伝子を標的とする配列の切断部位または切断領域では使用しないことが好ましい。ｉＲＮＡ剤の２つの配列間で十分なハイブリッド形成が維持されるという条件であれば、センス配列のどの位置においても使用することが可能である。一部の実施形態では、オフターゲットのサイレンシングを最小化することが可能なため、対象の配列または遺伝子を標的としない配列の切断位置または切断領域にＮＲＭを配することが望ましい。
【０２１５】
さらに、本明細書に記載のｉＲＮＡ剤は、ｉＲＮＡ剤の他方の配列と二本鎖構造を形成しない突出部を有することが可能である。これは突出部ではあるが、それ自体と、またはｉＲＮＡ剤のもう一方の配列以外の別の核酸と、ハイブリッド形成する。
【０２１６】
ほとんどの場合、ヌクレアーゼ耐性促進修飾は、その配列が対象の配列を標的にするか（多くの場合、アンチセンス配列と呼ばれる）、対象の配列を標的にしないか（多くの場合、センス配列と呼ばれる）により配置が異なる。配列が対象の配列を標的にするならば、エンドヌクレアーゼによる切断を妨害または阻害する修飾は、ＲＩＳＣの仲介による切断を受ける領域、例えば切断部位または切断領域に挿入すべきではない。（エルバッシャーら［Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．］、２００１年、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ．１５：１８８［参照により本願に援用］に記載されるように、標的の切断は、およそ２０もしくは２１ｎｔのガイドＲＮＡのほぼ中央またはガイド配列に相補的な最初のヌクレオチドの１０もしくは１１ヌクレオチド上流で起きる。本明細書では、切断部位とは、標的上または標的とハイブリッド形成するｉＲＮＡ剤の鎖上の、切断部位の両側のヌクレオチドを指す。切断領域は、切断部位のヌクレオチドとその両方向の１、２または３ヌクレオチドを意味する）。
【０２１７】
そのような修飾は、対象の配列を標的とする配列または標的としない配列の末端領域、例えば末端、または末端の２、３、４もしくは５位の位置へ導入することが可能である。
【０２１８】
ｉＲＮＡ剤は以下から選択した第１鎖および第２鎖を有することが可能である。
【０２１９】
配列を標的とせず、かつ３’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置にＮＲＭ修飾を有する第１鎖、
配列を標的とせず、かつ５’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置にＮＲＭ修飾を有する第１鎖、
配列を標的とせず、かつ３’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置にＮＲＭ修飾を有し、さらに５’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置にＮＲＭ修飾を有する第１鎖、
配列を標的とせず、切断部位または切断領域にＮＲＭ修飾を有する第１鎖、
配列を標的とせず、切断部位または切断領域にＮＲＭ修飾を有し、かつ、３’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置のＮＲＭ修飾と、５’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置のＮＲＭ修飾と、あるいは３’末端および５’末端の両方から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置のＮＲＭ修飾とのうち１つまたは複数を有する第１鎖と、
配列を標的とし、３’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置にＮＲＭ修飾を有する第２鎖、
配列を標的とし、５’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置にＮＲＭ修飾を有する第２鎖（５’末端の修飾は、末端よりむしろアンチセンス鎖の５’末端から１、２、３、４、５または６位離れた位置が好ましい）、
配列を標的とし、３’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置にＮＲＭ修飾を有し、さらに５’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置にＮＲＭ修飾を有する第２鎖、
配列を標的とし、好ましくは切断部位または切断領域にＮＲＭ修飾が存在しない第２鎖、
配列を標的とし、切断部位または切断領域のＮＲＭ修飾、ならびに、３’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置のＮＲＭ修飾、５’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置のＮＲＭ修飾、あるいは３’末端および５’末端の両方から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置のＮＲＭ修飾のうち１つまたは複数が存在しない第２鎖（５’末端の修飾は、末端よりむしろアンチセンス鎖の５’末端から１、２、３、４、５または６位離れた位置が好ましい）。
【０２２０】
また、ｉＲＮＡ剤は２つの配列を標的とすることも可能であり、次から選択される第１鎖および第２鎖を有することが可能である。
【０２２１】
配列を標的とし、３’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置にＮＲＭ修飾を有する第１鎖、
配列を標的とし、５’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置にＮＲＭ修飾を有する第１鎖（５’末端の修飾は、末端よりむしろアンチセンス鎖の５’末端から１、２、３、４、５または６位離れた位置が好ましい）、
配列を標的とし、３’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置にＮＲＭ修飾を有し、さらに５’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置にＮＲＭ修飾を有する第１鎖、
配列を標的とし、好ましくは切断部位または切断領域にＮＲＭ修飾が存在しない第１鎖、
配列を標的とし、切断部位または切断領域のＮＲＭ修飾、ならびに、３’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置のＮＲＭ修飾、５’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置のＮＲＭ修飾、あるいは３’末端および５’末端の両方から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置のＮＲＭ修飾のうち１つまたは複数が存在しない第１鎖（５’末端の修飾は、末端よりむしろアンチセンス鎖の５’末端から１、２、３、４、５または６位離れた位置が好ましい）と、
配列を標的とし、３’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置にＮＲＭ修飾を有する第２鎖、
配列を標的とし、５’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置にＮＲＭ修飾を有する第２鎖（５’末端の修飾は、末端よりむしろアンチセンス鎖の５’末端から１、２、３、４、５または６位離れた位置が好ましい）、
配列を標的とし、３’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置にＮＲＭ修飾を有し、さらに５’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置にＮＲＭ修飾を有する第２鎖、
配列を標的とし、好ましくは切断部位または切断領域にＮＲＭ修飾が存在しない第２鎖、
配列を標的にし、切断部位または切断領域のＮＲＭ修飾、ならびに、３’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置のＮＲＭ修飾、５’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置のＮＲＭ修飾、あるいは３’末端および５’末端の両方から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置のＮＲＭ修飾のうち１つまたは複数が存在しない第２鎖（５’末端の修飾は、末端よりむしろアンチセンス鎖の５’末端から１、２、３、４、５または６位離れた位置が好ましい）。
【０２２２】
リボース模倣体
ＲＮＡ、例えばｉＲＮＡ剤は、リボース模倣体、例えば本願明細書に記載するリボース模倣体、ならびにいずれも本願明細書に援用する、２００３年３月１３日に出願された同時係属で共同所有の米国仮出願第６０／４５４，９６２号、および国際出願Ｎｏ．ＰＣＴ／ＵＳ０４／０７０７０中に記載されたリボース模倣体などを取り込むことが可能である。
【０２２３】
さらに本発明は、リボース模倣体および本願明細書に記載する他の構成要素を有するｉＲＮＡ剤を含む。例えば本発明は、本願明細書に記載するｉＲＮＡ剤、例えばパリンドローム構造のｉＲＮＡ剤、非標準的な対合を有するｉＲＮＡ剤、本願明細書に記載する遺伝子、例えば肝臓中で活性がある遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤、本願明細書に記載する構成様式または構造を有するｉＲＮＡ剤、本願明細書に記載する両親媒性送達物質と結合したｉＲＮＡ、本願明細書に記載する薬剤送達モジュールと結合したｉＲＮＡ、本願明細書に記載するように投与されるｉＲＮＡ剤、または本願明細書に記載するように製剤化されたｉＲＮＡ剤であって、リボース模倣体も取り込むｉＲＮＡ剤を含む。
【０２２４】
したがって、本発明の１態様は、効率を増大させ、かつ／あるいはｉＲＮＡ剤にヌクレアーゼ耐性を与えることが可能である、第２ヒドロキシル基を含むｉＲＮＡ剤を特徴とする。ヌクレアーゼ、例えば細胞ヌクレアーゼは、核酸のホスホジエステル結合を加水分解し、核酸の部分的または完全な分解をもたらすことが可能である。第２ヒドロキシル基は、この修飾を欠くｉＲＮＡと比べて、ｉＲＮＡ剤がヌクレアーゼ分解を受ける傾向を低下させることによって、ｉＲＮＡ剤にヌクレアーゼ耐性を与える。理論によって縛られることは望まないが、ｉＲＮＡ剤上の第２ヒドロキシル基の存在が３’リボースのヒドロキシル基の構造上の模倣体として働くことによって、ｉＲＮＡ剤が分解を受けにくくなると考えられる。
【０２２５】
第２ヒドロキシル基は、２つの他の炭素および水素によって置換された炭素原子と結合している「ＯＨ」基を指す。上記のようにヌクレアーゼ耐性を与える第２ヒドロキシル基は、任意の非環式炭素含有基の一部であってもよい。ヒドロキシル基は、任意の環式炭素
含有基の一部であってもよく、以下の条件、すなわち（１）ヒドロキシル基と末端リン酸基の間にリボース部分が存在しないこと、または（２）該ヒドロキシル基は塩基と結合した糖部分には存在しないこと、のうち１つまたは複数に見合うことが好ましい。ヒドロキシル基は、ｉＲＮＡ剤の末端リン酸基のリンから、少なくとも２結合（化学結合２個）の位置にある（例えば、少なくとも３結合離れて、少なくとも４結合離れて、少なくとも５結合離れて、少なくとも６結合離れて、少なくとも７結合離れて、少なくとも８結合離れて、少なくとも９結合離れて、少なくとも１０結合離れている）。好ましい実施形態では、末端リン酸基のリンと第２ヒドロキシル基の間に５つの介在結合が存在する。
【０２２６】
末端リン酸基のリンと第２ヒドロキシル基の間に５つの介在結合を有する、好ましいｉＲＮＡ剤送達モジュールは、以下の構造を有する（以下の式Ｙを参照）：
【０２２７】
【化１１】
0005881970.tif 000013
【０２２８】
式Ｙに言及すると、ＡはｉＲＮＡ剤であり、本明細書に記載する任意のｉＲＮＡ剤を含む。ｉＲＮＡ剤は、リン酸基の「Ｗ」と直接的あるいは間接的に（例えばスペーサーまたはリンカーを介して）結合することが可能である。これらのスペーサーまたはリンカーは、例えば−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮ−、−（ＣＨ２）ｎＯ−、−（ＣＨ２）ｎＳ−、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＨ（例えば、ｎ＝３または６）、脱塩基性の糖、アミド、カルボキシ、アミン、オキシアミン、オキシイミン、チオエーテル、ジスルフィド、チオ尿素、スルホンアミド、もしくはモルホリノ、またはビオチン試薬およびフルオレセイン試薬を含むことが可能である。
【０２２９】
ｉＲＮＡ剤は、非修飾状態（例えば、Ｗ、Ｘ、Ｙ、およびＺがＯである）の末端リン酸基または修飾されている末端リン酸基を有し得る。修飾されているリン酸基では、ＷおよびＺは独立にＮＨ、ＯまたはＳであってよく；ＸおよびＹは独立にＳ、Ｓｅ、ＢＨ３−、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｈ、Ｏ、Ｏ−、アルコキシまたはアミノ（アルキルアミノ、アリールアミノなどを含む）であってよい。Ｗ、ＸおよびＺがＯであり、ＹがＳであることが好ましい。
【０２３０】
Ｒ１およびＲ３はそれぞれ独立に、水素；またはＣ１〜Ｃ１００アルキルであり、Ｃ１〜Ｃ１００アルキルは任意選択でヒドロキシル、アミノ、ハロ、リン酸または硫酸基で置
換されており、かつ／あるいは任意選択でＮ、Ｏ、Ｓ、アルケニルまたはアルキニルが挿入されていてもよい。
【０２３１】
Ｒ２は水素；またはＣ１〜Ｃ１００アルキルであり、Ｃ１〜Ｃ１００アルキルは任意選択でヒドロキシル、アミノ、ハロ、リン酸または硫酸基で置換されており、かつ／あるいは任意選択でＮ、Ｏ、Ｓ、アルケニルまたはアルキニルが挿入されていてもよく；あるいはｎが１であるとき、Ｒ２がＲ４またはＲ６と合わさって５〜１２原子の環を形成してもよい。
【０２３２】
Ｒ４は水素；またはＣ１〜Ｃ１００アルキルであり、Ｃ１〜Ｃ１００アルキルは任意選択でヒドロキシル、アミノ、ハロ、リン酸または硫酸基で置換されており、かつ／あるいは任意選択でＮ、Ｏ、Ｓ、アルケニルまたはアルキニルが挿入されていてもよく；あるいはｎが１であるとき、Ｒ４がＲ２またはＲ５と合わさって５〜１２原子の環を形成してもよい。
【０２３３】
Ｒ５は水素、またはＣ１〜Ｃ１００アルキルであり、Ｃ１〜Ｃ１００アルキルは任意選択でヒドロキシル、アミノ、ハロ、リン酸または硫酸基で置換されており、かつ／あるいは任意選択でＮ、Ｏ、Ｓ、アルケニルまたはアルキニルが挿入されていてもよく；あるいはｎが１であるとき、Ｒ５がＲ４と合わさって５〜１２原子の環を形成してもよい。
【０２３４】
Ｒ６は水素、またはＣ１〜Ｃ１００アルキルであり、Ｃ１〜Ｃ１００アルキルは任意選択でヒドロキシル、アミノ、ハロ、リン酸または硫酸基で置換されており、かつ／あるいは任意選択でＮ、Ｏ、Ｓ、アルケニルまたはアルキニルが挿入されていてもよく、あるいはｎが１であるとき、Ｒ６がＲ２と合わさって６〜１０原子の環を形成してもよい。
【０２３５】
Ｒ７は水素、Ｃ１〜Ｃ１００アルキル、またはＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｑＣ（Ｏ）ＮＨＲ９であり；Ｔは水素または官能基であり；ｎおよびｑはそれぞれ独立に１〜１００であり；Ｒ８はＣ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ６〜Ｃ１０アリールであり；かつＲ９は水素、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリールまたは固形支持体物質である。
【０２３６】
好ましい実施形態は、以下のｉＲＮＡ剤送達モジュールのサブセットの１つまたは複数を含むことが可能である。
【０２３７】
ＲＮＡｉ剤送達モジュールの１つのサブセットでは、Ａは該ＲＮＡ剤の末端３’または５’リボース糖の炭素を介して、直接的あるいは間接的に結合することが可能である。
【０２３８】
ＲＮＡｉ剤送達モジュールの他のサブセットでは、Ｘ、ＷおよびＺがＯであり、ＹがＳである。
【０２３９】
ＲＮＡｉ剤送達モジュールのさらに他のサブセットでは、ｎは１であり、Ｒ２とＲ６が合わさって６原子を含む環を形成し、Ｒ４とＲ５が合わさって６原子を含む環を形成する。環系はトランス−デカリンであることが好ましい。例えば、このサブセットのＲＮＡｉ剤送達モジュールは、式（Ｙ−１）の化合物を含むことが可能である：
【０２４０】
【化１２】
0005881970.tif 000014
【０２４１】
官能基は例えば、標的化（ターゲティング）基（例えばステロイドまたは糖質）、レポーター基（例えばフルオロフォア）、または標識（同位元素で標識された部分）であってよい。標的化基は、タンパク質結合物質、内皮細胞標的化基（例えばＲＧＤペプチドおよび模倣体）、癌細胞標的化基（例えば葉酸ビタミンＢ１２、ビオチン）、骨細胞標的化基（例えばビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸）、多価マンノース（例えばマクロファージ試験用）、ラクトース、ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、モノクローナル抗体、糖タンパク質、レクチン、メラノトロピン、またはチロトロピンをさらに含むことが可能である。
【０２４２】
当業者によって理解され得るように、本明細書中の式の化合物を合成する方法は当業者には明らかであろう。合成した化合物を反応混合物から分離し、カラム・クロマトグラフィ、高速液体クロマトグラフィ、または再結晶化などの方法によってさらに精製することが可能である。さらに、様々な合成工程を他の順序または順番で行って、所望の化合物を与えることも可能である。本明細書に記載した化合物を合成する際に有用な、合成化学変換および保護基に関する方法（保護および脱保護）は当分野で知られており、例えばアール  ラロック（Ｒ．Ｌａｒｏｃｋ）、「Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ」、ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８９）；ティー  ダブリュー  グリーン（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ）およびピー  エム  ジー  ワッツ（Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ）、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、第２版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９１）；エル  ファイザー（Ｌ．Ｆｉｅｓｅｒ）およびエム  ファイザー（Ｍ．Ｆｉｅｓｅｒ）、「Ｆｉｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｆｉｅｓｅｒ’ｓ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９４）；およびエル  パクエッテ（Ｌ．Ｐａｑｕｅｔｔｅ）、ｅｄ．、「Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９５）、ならびにその後続版に記載されたものなどを含む。
【０２４３】
リボース置換モノマーサブユニット
ｉＲＮＡ剤の１つまたは複数の特性を最適化することが可能ないくつかの方法で、ｉＲＮＡ剤を修飾することが可能である。ＲＮＡ物質、例えばｉＲＮＡ剤はリボース置換モノマーサブユニット（ＲＲＭＳ）、例えば本明細書中に記載されたＲＲＭＳならびに本願明細書に援用する２００３年８月８日に出願された米国仮出願第６０／４９３，９８６号；本願明細書に援用する２００３年８月１１日に出願された米国仮出願第６０／４９４，５９７号；本願明細書に援用する２００３年９月２６日に出願された米国仮出願第６０／５０６，３４１号；本願明細書に援用する２００３年１１月７日に出願された米国仮出願第６０／１５８，４５３号；および本願明細書に援用する２００４年３月８日に出願された国際出願Ｎｏ．ＰＣＴ／ＵＳ０４／０７０７０のうち１つまたは複数中に記載されたＲＲ
ＭＳなどを含むことが可能である。
【０２４４】
さらに本発明は、ＲＲＭＳおよび本願明細書に記載する他の構成要素を有するｉＲＮＡ剤を含む。例えば本発明は、本願明細書に記載のｉＲＮＡ剤、例えばパリンドローム構造のｉＲＮＡ剤、非標準的な対合を有するｉＲＮＡ剤、本願明細書に記載の遺伝子、例えば肝臓中で活性がある遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤、本願明細書に記載の構成様式または構造を有するｉＲＮＡ剤、本願明細書に記載の両親媒性送達物質と結合したｉＲＮＡ、本願明細書に記載の薬剤送達モジュールと結合したｉＲＮＡ、本願明細書に記載のように投与されるｉＲＮＡ剤、または本願明細書に記載のように製剤化されるｉＲＮＡ剤であって、ＲＲＭＳも取り込むｉＲＮＡ剤、を含む。
【０２４５】
ｉＲＮＡ剤の１つまたは複数のリボヌクレオチド・サブユニットのリボース糖は、他の構成部分、例えば非糖質の（好ましくは環式の）担体で置換することが可能である。サブユニットのリボース糖がこのように置換されているリボヌクレオチド・サブユニットを、本願明細書ではリボース置換修飾サブユニット（ＲＲＭＳ）と呼ぶ。環式担体は炭素環系（すなわち、すべての環原子が炭素原子）であってもよいし、あるいはヘテロ環系（すなわち、１つまたは複数の環原子がヘテロ原子、例えば窒素、酸素、イオウ）であってもよい。環式担体は単環系であってよく、あるいは２つ以上の環、例えば縮合環を含むことも可能である。環式担体は完全に飽和な環系であってよく、あるいはそれは１つまたは複数の二重結合を含むことも可能である。
【０２４６】
担体はさらに、（ｉ）少なくとも２つの「バックボーン結合点」および（ｉｉ）少なくとも１つの「連結部結合点」を含む。本願明細書で使用する「バックボーン結合点」は、官能基、例えばヒドロキシル基、または一般的に、バックボーン（例えばリボ核酸のリン酸バックボーンまたはイオウを含むなどの修飾リン酸バックボーン）への担体の取り込みに利用可能かつ好適な結合を指す。本願明細書で使用する「連結部結合点」は、環式担体の構成環原子、例えば炭素原子またはヘテロ原子（バックボーン結合点を提供する原子とは異なるもの）であって、選択した構成部分と結合する原子を指す。選択した構成部分は、例えばリガンド（例えば標的化部分または送達成分）、またはｉＲＮＡ剤の物理的性質（例えば親油性）を変える構成部分であってよい。場合によっては、選択した成分は、介在する連結部によって環式担体と結合する。したがって選択した成分は、官能基（例えばアミノ基）を含むか、または一般的に、他の化学的実体（例えば該構成環に対するリガンド）の取り込みまたは連結に適した結合を与えることになる。
【０２４７】
本願明細書に記載する１つまたは複数のＲＲＭＳを、ＲＮＡ剤（例えばｉＲＮＡ剤）中へ取り込むことによって、特に適切な実体と連結された場合、１つまたは複数の新しい性質を該ＲＮＡ剤に与え、かつ／あるいは該ＲＮＡ分子の１つまたは複数の既存の性質を変化させ、高め、あるいは調節することが可能である。例えば、親油性またはヌクレアーゼ耐性のうち１つまたは複数を変化させることが可能である。本願明細書に記載する１つまたは複数のＲＲＭＳをｉＲＮＡ剤中へ取り込むことによって、特にＲＲＭＳが適切な実体と連結された場合、標的ｍＲＮＡに対するｉＲＮＡ剤の結合親和性を調節する（例えば増大させる）ことが可能であり、ｉＲＮＡ剤の二重らせん形の形状を変化させることが可能であり、分布を変化させることや、ｉＲＮＡ剤を身体の特定部分に向けることが可能であり、あるいは（例えばＲＩＳＣ形成時および鎖の分離時の）核酸結合タンパク質との相互作用を改変することが可能である。
【０２４８】
したがって、１態様では、本発明は、好ましくは第１鎖および第２鎖を含むｉＲＮＡ剤であって、式（Ｒ−１）を有する少なくとも１つのサブユニットが前記鎖のうち少なくとも１つの中に取り込まれているｉＲＮＡ剤を特徴とする。
【０２４９】
【化１３】
0005881970.tif 000015
【０２５０】
式（Ｒ−１）を参照すると、ＸはＮ（ＣＯ）Ｒ７、ＮＲ７またはＣＨ２であり；ＹはＮＲ８、Ｏ、Ｓ、ＣＲ９Ｒ１０であるかまたは存在せず、かつＺはＣＲ１１Ｒ１２であるかまたは存在しない。
【０２５１】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、およびＲ１０のそれぞれは独立にＨ、ＯＲａ、ＯＲｂ、（ＣＨ２）ｎＯＲａ、または（ＣＨ２）ｎＯＲｂである、ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、およびＲ１０の少なくとも１つはＯＲａまたはＯＲｂであり、かつＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、およびＲ１０の少なくとも１つは（ＣＨ２）ｎＯＲａ、または（ＣＨ２）ｎＯＲｂであり（ＲＲＭＳが末端に存在するとき、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、およびＲ１０の１つはＲａを含み、かつ１つはＲｂを含み；ＲＲＭＳが内部に存在するとき、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、およびＲ１０のうち２つがそれぞれＲｂを含む）；さらに、ＯＲａは（ＣＨ２）ｎＯＲｂとともにのみ存在し、（ＣＨ２）ｎＯＲａはＯＲｂとともにのみ存在することが好ましいものとする。
【０２５２】
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ１１、およびＲ１２のそれぞれは独立にＨ、任意選択で１〜３個のＲ１３で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、またはＣ（Ｏ）ＮＨＲ７であり；あるいは、Ｒ５およびＲ１１が一体となって、任意選択でＲ１４により置換されたＣ３〜Ｃ８シクロアルキルをなす。
【０２５３】
Ｒ７はＮＲｃＲｄで置換されたＣ１〜Ｃ２０アルキルであり；Ｒ８はＣ１〜Ｃ６アルキルであり；Ｒ１３はヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、またはハロであり；かつＲ１４はＮＲｃＲ７である。
【０２５４】
Ｒａは
【０２５５】
【化１４】
0005881970.tif 000016
【０２５６】
であり；かつ
Ｒｂは
【０２５７】
【化１５】
0005881970.tif 000017
【０２５８】
である。
【０２５９】
ＡとＣのそれぞれは独立にＯまたはＳである。
【０２６０】
ＢはＯＨ、Ｏ−、または
【０２６１】
【化１６】
0005881970.tif 000018
【０２６２】
である。
【０２６３】
ＲｃはＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；ＲｄはＨまたはリガンドであり；ｎは１〜４である。
【０２６４】
好ましい実施形態では、リボースはピロリン骨格で置換され、かつＸはＮ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７であり、ＹはＣＲ９Ｒ１０であり、かつＺは存在しない。
【０２６５】
他の好ましい実施形態では、リボースはピペリジン骨格で置換され、かつＸはＮ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７であり、ＹはＣＲ９Ｒ１０であり、かつＺはＣＲ１１Ｒ１２である。
【０２６６】
他の好ましい実施形態では、リボースはピペラジン骨格で置換され、かつＸはＮ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７であり、ＹはＮＲ８であり、かつＺはＣＲ１１Ｒ１２である。
【０２６７】
他の好ましい実施形態では、リボースはモルホリノ骨格で置換され、かつＸはＮ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７であり、ＹはＯであり、かつＺはＣＲ１１Ｒ１２である。
【０２６８】
他の好ましい実施形態では、リボースはデカリン骨格で置換され、かつＸはＣＨ２であり；ＹはＣＲ９Ｒ１０であり；かつＺはＣＲ１１Ｒ１２であり；かつＲ５およびＲ１１は一体となってＣ６シクロアルキルをなす。
【０２６９】
他の好ましい実施形態では、リボースはデカリン／インダン骨格で置換され、かつＸは
ＣＨ２であり；ＹはＣＲ９Ｒ１０であり；かつＺはＣＲ１１Ｒ１２であり；かつＲ５およびＲ１１は一体となってＣ５シクロアルキルをなす。
【０２７０】
他の好ましい実施形態では、リボースはヒドロキシプロリン骨格で置換される。
【０２７１】
本願明細書に記載するＲＲＭＳは、本願明細書に記載する任意の二本鎖ＲＮＡ様分子、例えばｉＲＮＡ剤に取り込ませることが可能である。ｉＲＮＡ剤は、ハイブリダイズしたセンス鎖とアンチセンス鎖とからなる二本鎖を含むことが可能であり、このときアンチセンス鎖および／またはセンス鎖は、本願明細書に記載する１つまたは複数のＲＲＭＳを含むことが可能である。ＲＲＭＳは、二本鎖ｉＲＮＡ剤の一方または両方の鎖の中の１つまたは複数の個所に導入することが可能である。ＲＲＭＳは、センス鎖の３’または５’端またはその近く（１、２、または３位以内）に配置されてもよいし、あるいはアンチセンス鎖の３’端またはその近く（２または３位以内）に配置されてもよい。いくつかの実施形態では、ＲＲＭＳはアンチセンス鎖の５’端またはその近く（１、２、または３位以内）にはないことが好ましい。ＲＲＭＳは内部に存在してもよく、アンチセンスが標的と結合するのに重要ではない領域中に位置することが好ましいであろう。
【０２７２】
１実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’端（または３’端から１、２、もしくは３位以内）にＲＲＭＳを有することが可能である。１実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’端（または３’端から１、２、もしくは３位以内）およびセンス鎖の３’端（または３’端から１、２、もしくは３位以内）に、ＲＲＭＳを有することが可能である。１実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’端（または３’端から１、２、または３位以内）にＲＲＭＳを、およびセンス鎖の５’端にＲＲＭＳを有することが可能であり、この場合両方のリガンドがｉＲＮＡ剤の同じ端に位置する。
【０２７３】
いくつかの実施形態では、２つのリガンドが連結され、好ましくは、それぞれの鎖上のリガンドは疎水性の構成部分である。理論によって縛られることは望まないが、疎水性リガンドが対になることにより、分子間のファン−デル−ワールス相互作用によって、ｉＲＮＡ剤を安定化させることが可能であると考えられる。
【０２７４】
１実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’端（または３’端から１、２、または３位以内）にＲＲＭＳを、かつセンス鎖の５’端にＲＲＭＳを有することが可能であり、この場合両方のＲＲＭＳが、各ＲＲＭＳとリガンド上の別々の位置との結合によって、同じリガンド（例えばコール酸）を共有することが可能である。２つの隣接するＲＲＭＳ間で共有されるリガンドを、本願明細書では「ヘアピン・リガンド」と呼ぶ。
【０２７５】
他の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、センス鎖の３’端にＲＲＭＳを、かつセンス鎖の内部位置にＲＲＭＳを有することが可能である。ｉＲＮＡ剤は、センス鎖の内部位置にＲＲＭＳを有することが可能であり；あるいはアンチセンス鎖の内部位置にＲＲＭＳを有することが可能であり；あるいはセンス鎖の内部位置にＲＲＭＳを、かつアンチセンス鎖の内部位置にＲＲＭＳを有することも可能である。
【０２７６】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は第１配列および第２配列を含み、該配列は同じ鎖上に位置する２つの配列ではなく２つの別個の分子であり、例えば生理的条件下、例えばヘリカーゼまたは他の巻き戻し酵素と接触しない生理的条件下でハイブリダイズする（およびそれによって二本鎖領域を形成する）ために互いに十分な相補性を有することが好ましい。
【０２７７】
ｄｓ  ｉＲＮＡ剤が分子の一端または両端に一本鎖領域または非対合領域を含むように、第１配列および第２配列を選択することが好ましい。したがって、ｄｓ  ｉＲＮＡ剤は
、好ましくは突出部を含むように対合した第１配列および第２配列を含み、該突出部は例えば１つまたは２つの５’または３’突出部であり、ただし好ましくは２〜３ヌクレオチドの３’突出部である。大部分の実施形態は３’突出部を有する。好ましいｓＲＮＡ剤は、それぞれの端に１ヌクレオチド長あるいは好ましくは２または３ヌクレオチド長の一本鎖突出部、好ましくは３’突出部を有する。これらの突出部は、１本の鎖が他方より長い結果でもよいし、あるいは同じ長さの２本の鎖がずれた結果でもよい。５’端はリン酸化されていることが好ましい。
【０２７８】
好ましい（ただし限定するものではない）ＲＲＭＳを含むＲＮＡ剤、例えばｉＲＮＡ剤を、式（Ｒ−２）として図４に表す。担体は、２つの「バックボーン結合点」（ヒドロキシル基）、１つの「連結部結合点」、および介在する連結部によって担体と間接的に結合した１つのリガンドを含む。ＲＲＭＳはＲＮＡ分子の５’または３’末端サブユニットであってもよく、すなわち、２つの「Ｗ」基の１つはヒドロキシル基であってよく、もう１つの「Ｗ」基は、２つ以上の非修飾または修飾リボヌクレオチドの鎖であってよい。あるいはＲＲＭＳが内部位置を占めてもよく、２つの「Ｗ」基がいずれも１つまたは複数の非修飾または修飾リボヌクレオチドであってよい。２つ以上のＲＲＭＳがＲＮＡ分子、例えばｉＲＮＡ剤中に存在してよい。
【０２７９】
式（Ｒ−２）の修飾ＲＮＡ分子は、当分野で知られているオリゴヌクレオチド合成法を使用して得ることが可能である。好ましい実施形態では、式（ＩＩ）の修飾ＲＮＡ分子は、例えばホスホアミダイト法またはＨ−ホスホネート結合法を使用して、１つまたは複数の対応するＲＲＭＳモノマー化合物（ＲＲＭＳモノマー、例えば図４中のＡ、Ｂ、およびＣを参照）を、伸長中のセンス鎖またはアンチセンス鎖に取り込ませることによって調製することが可能である。
【０２８０】
ＲＲＭＳモノマーは一般に、担体分子（例えば図４中のＡを参照）と結合した２つの異なる官能化ヒドロキシル基（図４のＯＦＧ１およびＯＦＧ２）、および連結部結合点を含む。本願明細書で使用する、用語「官能化ヒドロキシル基」は、ヒドロキシル基のプロトンが他の置換基に置換されていることを意味する。代表的構造ＢおよびＣに示すように、担体上の１つのヒドロキシル基（ＯＦＧ１）は、保護基（ＰＧ）によって官能化されている。もう１つのヒドロキシル基（ＯＦＧ２）は、（１）Ｂのように、液相または固相の合成支持試薬（中実円）でリンカーＬを介して直接的または間接的に、あるいは（２）Ｃのように、リンを含有する構成部分（例えばホスホアミダイト）によって、官能化することが可能である。伸長中のセンス鎖またはアンチセンス鎖中にモノマーを取り込ませるとき、連結部結合点を、水素原子、連結部、または連結部に連結されたリガンドと結合することが可能である（スキーム１のＲを参照）。連結部に連結されたリガンドは、伸長中の鎖にモノマーを取り込ませるときにモノマーと結合させることが可能であるが、必ずしもそうする必要はない。いくつかの実施形態では、連結部、リガンドまたは連結部に連結されたリガンドを、「前駆体」ＲＲＭＳモノマーを鎖に取り込ませた後に、「前駆体」ＲＲＭＳと結合させることが可能である。
【０２８１】
例えばティー  ダブリュー  グリーン（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ）およびピー  エム  ジー  ワッツ（Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ）、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、第２版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９１）から、（ＯＦＧ１）保護基を所望に応じて選択することが可能である。保護基は、アミダイト合成条件、保存条件、およびオリゴヌクレオチド合成条件下で安定であることが好ましい。ヒドロキシル基、−ＯＨは求核基（すなわちルイス塩基）であり、酸素を介して求電子剤（すなわちルイス酸）と反応する。水素が保護基、例えばトリアリールメチル基またはトリアルキルシリル基に置換されているヒドロキシル基は、置換反応では求電子剤としてほとんど反応性がない。したがって、保護ヒドロキシル基は、例え
ばオリゴヌクレオチド合成中に構造Ｃによって例示される化合物のホモ結合を防ぐ際に有用である。好ましい保護基は、ジメトキシトリチル基である。
【０２８２】
ＢのＯＦＧ２が、可溶性または不溶性の支持試薬と結合したリンカー、例えば長鎖の有機リンカーを含む場合は、ひとたびＯＦＧ１が脱保護され、求電子基（例えばアミダイト基）を含む他のヌクレオシドまたはモノマーと求核剤として自由に反応できるようになると、溶液相または固相合成技法を使用して、天然および／または修飾リボヌクレオチドの鎖を構築することが可能である。あるいは、天然もしくは修飾リボヌクレオチドまたはオリゴリボヌクレオチド鎖を、ＯＦＧ２のアミダイト基またはＨ−ホスホネート基を介してモノマーＣと結合させることが可能である。この操作の後に、ＯＦＧ１を脱ブロック化することが可能であり、回復した求核性ヒドロキシル基は、求電子基を含む他のヌクレオシドまたはモノマーと反応することが可能である（図１を参照）。Ｒ’は置換または非置換アルキルまたはアルケニルであってよい。好ましい実施形態では、Ｒ’はメチル、アリルまたは２−シアノエチルである。Ｒ”はＣ１〜Ｃ１０アルキル基であってよく、Ｒ”は３個以上の炭素を含む分岐基、例えばイソプロピルであることが好ましい。
【０２８３】
ＢのＯＦＧ２は、リンカーを用いてヒドロキシルを官能化し、該リンカーが次にリンカーのもう一方の末端に液体または固体相合成支持試薬を含むことも可能である。支持試薬は、本願明細書に記載するモノマーを支持することが可能な任意の支持媒体であってよい。リンカーＬを介してモノマーを不溶性支持体と結合させることによって、該支持体が置かれている溶媒中でモノマー（および伸長中の鎖）を可溶化することが可能である。可溶化しているが依然固定されているモノマーは、周囲の溶媒中で試薬と反応することが可能であり；未反応試薬および可溶性副産物は、モノマーまたはモノマー由来の生成物が結合している固形支持体から、容易に洗浄除去することが可能である。あるいは、モノマーを可溶性支持体成分、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と結合させることも可能であり、液相合成技法を使用して鎖を構築することが可能である。リンカーおよび支持媒体の選択は、当分野の技術内にある。一般にリンカーは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｑＣ（Ｏ）−、または−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｑＳ−であってよく、オキサリル、スクシニルまたはチオグリコリルであることが好ましい。標準的な細孔性ガラスの固相合成支持体を、フッ化物に対して不安定な５’シリル保護基とともに使用することは可能ではない。何故なら、ガラスがフッ化物によって分解され、完全長の生成物の量が大幅に減少するからである。フッ化物に対して安定なポリスチレン系支持体、またはＰＥＧが好ましい。
【０２８４】
好ましい担体は、以下に与える一般式（Ｒ−３）を有する。（該構造中、好ましいバックボーン結合点は、Ｒ１またはＲ２；Ｒ３またはＲ４；あるいはＹがＣＲ９Ｒ１０である場合はＲ９およびＲ１０から選択することが可能である（２つの位置を選択して、２つのバックボーン結合点、例えばＲ１およびＲ４、あるいはＲ４およびＲ９とする）。好ましい連結部結合点はＲ７；ＸがＣＨ２であるときはＲ５またはＲ６を含む。これらの担体は、鎖中に取り込ませることが可能な実体として以下に記載される。したがって、当然ながら、これらの構造は、１つ（末端位置の場合）あるいは２つ（内部位置の場合）の結合点、例えばＲ１またはＲ２；Ｒ３またはＲ４；あるいはＲ９およびＲ１０（ＹがＣＲ９Ｒ１０であるとき）が、リン酸、または修飾リン酸、例えばイオウ含有バックボーンと結合する状態も含む。例えば、前述のＲ基の１つは−ＣＨ２−であってよく、この場合１つの結合は担体と結合しており、１つの結合はバックボーン原子、例えば結合酸素または中心のリン原子と結合している。）
【０２８５】
【化１７】
0005881970.tif 000019
【０２８６】
ＸはＮ（ＣＯ）Ｒ７、ＮＲ７またはＣＨ２であり；ＹはＮＲ８、Ｏ、Ｓ、ＣＲ９Ｒ１０であり；かつＺはＣＲ１１Ｒ１２であるか、あるいは存在しない。
【０２８７】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、およびＲ１０のそれぞれは独立に、Ｈ、ＯＲａ、または（ＣＨ２）ｎＯＲｂである、ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、およびＲ１０のうち少なくとも２つはＯＲａおよび／または（ＣＨ２）ｎＯＲｂである。
【０２８８】
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ１１、およびＲ１２のそれぞれは独立に、リガンド、Ｈ、任意選択で１〜３個のＲ１３で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、またはＣ（Ｏ）ＮＨＲ７であり；あるいは、Ｒ５およびＲ１１が一体となって、任意選択でＲ１４により置換されたＣ３〜Ｃ８シクロアルキルをなす。
【０２８９】
Ｒ７はＨ、リガンド、またはＮＲｃＲｄで置換されたＣ１〜Ｃ２０アルキルであり；Ｒ８はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；Ｒ１３はヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、またはハロであり；Ｒ１４はＮＲｃＲ７であり；Ｒ１５は任意選択でシアノにより置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、またはＣ２〜Ｃ６アルケニルであり；Ｒ１６はＣ１〜Ｃ１０アルキルであり；かつＲ１７は液相または固相の支持試薬である。
【０２９０】
Ｌは−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｑＣ（Ｏ）−、または−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｑＳ−であり；ＲａはＣＡｒ３であり；ＲｂはＰ（Ｏ）（Ｏ−）Ｈ、Ｐ（ＯＲ１５）Ｎ（Ｒ１６）２またはＬ−Ｒ１７であり；ＲｃはＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；かつＲｄはＨまたはリガンドである。
【０２９１】
それぞれのＡｒは独立に、任意選択でＣ１〜Ｃ４アルコキシによって置換されたＣ６〜Ｃ１０アリールであり；ｎは１〜４であり；かつｑは０〜４である。
【０２９２】
代表的な担体には、例えばＸがＮ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７であり、ＹがＣＲ９Ｒ１０であり、かつＺが存在しない担体；またはＸがＮ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７であり、ＹがＣＲ９Ｒ１０であり、かつＺがＣＲ１１Ｒ１２である担体；またはＸがＮ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７であり、ＹがＮＲ８であり、かつＺがＣＲ１１Ｒ１２である担体；またはＸがＮ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７であり、ＹがＯであり、かつＺがＣＲ１１Ｒ１２である担体；またはＸがＣＨ２であり、ＹがＣＲ９Ｒ１０であり、ＺがＣＲ１１Ｒ１２であり、かつＲ５とＲ１１が一体となってＣ６シクロアルキル（式Ｈ、ｚ＝２）を形成する担体、またはインダン環系、例えばＸがＣＨ２であり、ＹがＣＲ９Ｒ１０であり、ＺがＣＲ１１Ｒ１２であり、かつＲ５とＲ１１が一体となってＣ５シクロアルキル（式Ｈ、ｚ＝１）を形成する担体がある。
【０２９３】
いくつかの実施形態では、担体は、ピロリン環系または３−ヒドロキシプロリン環系、例えばＸがＮ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７であり、ＹがＣＲ９Ｒ１０であり、かつＺが存在しないものに基づいてよい（式Ｄ）。
【０２９４】
【化１８】
0005881970.tif 000020
【０２９５】
ＯＦＧ１は５員環中の炭素の１つと結合した第１級炭素、例えば環外アルキレン基、例えばメチレン基と結合することが好ましい（式Ｄ中の−ＣＨ２ＯＦＧ１）。ＯＦＧ２は、５員環中の炭素の１つと直接結合することが好ましい（式Ｄ中の−ＯＦＧ２）。ピロリン系担体に関しては、−ＣＨ２ＯＦＧ１はＣ−２と結合し、かつＯＦＧ２はＣ−３と結合することが可能であり；あるいは−ＣＨ２ＯＦＧ１はＣ−３と結合し、かつＯＦＧ２はＣ−４と結合することが可能である。いくつかの実施形態では、ＣＨ２ＯＦＧ１およびＯＦＧ２は、前述の炭素の１つとジェミナル位で置換されていてよい。３−ヒドロキシプロリン系担体に関しては、−ＣＨ２ＯＦＧ１はＣ−２と結合し、かつＯＦＧ２はＣ−４と結合することが可能である。したがって、ピロリン系および３−ヒドロキシプロリン系モノマーは、結合（例えば炭素−炭素結合）を含むことが可能であり、このとき結合の回転はその個々の結合について制限される（例えば環の存在が原因の制限）。したがって、ＣＨ２ＯＦＧ１およびＯＦＧ２は、前述のあらゆる対において互いにシスでもトランスでもよい。したがって、すべてのシス／トランス異性体が明白に含まれる。モノマーは１つまたは複数の不斉中心を含むことが可能であり、したがってラセミ化合物およびラセミ混合物、単一のエナンチオマー、個々のジアステレオマーおよびジアステレオマー混合物として存在することも可能である。すべてのこのようなモノマー異性体が明白に含まれる。連結部結合点は窒素であることが好ましい。
【０２９６】
いくつかの実施形態では、担体はピペリジン環系（式Ｅ）、例えばＸがＮ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７であり、ＹがＣＲ９Ｒ１０であり、かつＺがＣＲ１１Ｒ１２であるものに基づいてよい。
【０２９７】
【化１９】
0005881970.tif 000021
【０２９８】
ＯＦＧ１は６員環中の炭素の１つと結合した第１級炭素、例えば環外アルキレン基、例えばメチレン基（ｎ＝１）またはエチレン基（ｎ＝２）と結合することが好ましい［式Ｅ中の−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１］。ＯＦＧ２は、６員環中の炭素の１つと直接結合することが好ましい（式Ｅ中の−ＯＦＧ２）。−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１およびＯＦＧ２は環上でジェミナル位に配置していてもよい、すなわち、２つの基が同じ炭素、例えばＣ−２、Ｃ−３、またはＣ−４に結合することが可能である。あるいは、−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１およびＯＦＧ２は環上でビシナル位に配置していてよい、すなわち、２つの基は環の隣接する炭素原子と結合することが可能であり、例えば、−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１はＣ−２と結合し、かつＯＦＧ２はＣ−３と結合することが可能であり；−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１はＣ−３と結合し、かつＯＦＧ２はＣ−２と結合することが可能であり；−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１はＣ−３と結合し、かつＯＦＧ２はＣ−４と結合することが可能であり；あるいは−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１はＣ−４と結合し、かつＯＦＧ２はＣ−３と結合することが可能である。ピペリジン系モノマーは、したがって結合（例えば炭素−炭素結合）を含むことが可能であり、このとき結合の回転はその個々の結合について制限される（例えば環の存在が原因の制限）。したがって、−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１およびＯＦＧ２は、前述のあらゆる対において互いにシスでもトランスでもよい。したがって、すべてのシス／トランス異性体が明白に含まれる。モノマーは１つまたは複数の不斉中心を含むことが可能であり、したがってラセミ化合物およびラセミ混合物、単一のエナンチオマー、個々のジアステレオマーおよびジアステレオマー混合物として存在することも可能である。すべてのこのようなモノマー異性体が明白に含まれる。連結部結合点は窒素であることが好ましい。
【０２９９】
いくつかの実施形態では、担体は、例えばＸがＮ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７であり、ＹがＮＲ８であり、かつＺがＣＲ１１Ｒ１２であるピペラジン環系（式Ｆ）、または例えばＸがＮ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７であり、ＹがＯであり、かつＺがＣＲ１１Ｒ１２であるモルホリン環系（式Ｇ）に基づいていてもよい。
【０３００】
【化２０】
0005881970.tif 000022
【０３０１】
ＯＦＧ１は６員環中の炭素の１つと結合した第１級炭素、例えば環外アルキレン基、例えばメチレン基と結合することが好ましい（式Ｆまたは式Ｇ中の−ＣＨ２ＯＦＧ１）。ＯＦＧ２は、６員環中の炭素の１つと直接結合することが好ましい（式Ｆまたは式Ｇ中の−ＯＦＧ２）。ＦおよびＧに関しては、−ＣＨ２ＯＦＧ１はＣ−２と結合し、かつＯＦＧ２はＣ−３と結合してもよいし；あるいは逆も然りである。いくつかの実施形態では、ＣＨ２ＯＦＧ１およびＯＦＧ２は、前述の炭素の１つとジェミナル位で置換されていてよい。ピペラジン系およびモルホリン系モノマーは、したがって結合（例えば炭素−炭素結合）を含むことが可能であり、このとき結合の回転はその個々の結合について制限される（例えば環の存在が原因の制限）。したがって、ＣＨ２ＯＦＧ１およびＯＦＧ２は、前述のあらゆる対において互いにシスでもトランスでもよい。したがって、すべてのシス／トランス異性体が明白に含まれる。モノマーは１つまたは複数の不斉中心を含むことが可能であり、したがってラセミ化合物およびラセミ混合物、単一のエナンチオマー、個々のジアステレオマーおよびジアステレオマー混合物として存在することも可能である。すべてのこのようなモノマー異性体が明白に含まれる。Ｒ’’’は例えばＣ１〜Ｃ６アルキル、好ましくはＣＨ３であってよい。式Ｆおよび式Ｇのいずれにおいても、連結部結合点は窒素であることが好ましい。
【０３０２】
いくつかの実施形態では、担体は、例えばＸがＣＨ２であり、ＹがＣＲ９Ｒ１０であり、ＺがＣＲ１１Ｒ１２であり、およびＲ５とＲ１１が一体となってＣ６シクロアルキルを形成するデカリン環系（式Ｈ、ｚ＝２）、または例えばＸがＣＨ２であり、ＹがＣＲ９Ｒ１０であり、ＺがＣＲ１１Ｒ１２であり、およびＲ５とＲ１１が一体となってＣ５シクロアルキルを形成するインダン環系（式Ｈ、ｚ＝１）に基づいていてもよい。
【０３０３】
【化２１】
0005881970.tif 000023
【０３０４】
ＯＦＧ１はＣ−２、Ｃ−３、Ｃ−４、またはＣ−５の１つと結合した第１級炭素、例えば、環外メチレン基（ｎ＝１）またはエチレン基（ｎ＝２）と結合することが好ましい［式Ｈ中の−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１］。ＯＦＧ２は、Ｃ−２、Ｃ−３、Ｃ−４、またはＣ−５の１つと直接結合することが好ましい（式Ｈ中の−ＯＦＧ２）。−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１およびＯＦＧ２は環上でジェミナル位に配置していてよい、すなわち、２つの基が同じ炭素、例えばＣ−２、Ｃ−３、Ｃ−４、またはＣ−５と結合していてもよい。あるいは、−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１およびＯＦＧ２は環上でビシナル位に配置していてよい、すなわち、２つの基は環の隣接する炭素原子と結合することが可能であり、例えば、−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１はＣ−２と結合し、かつＯＦＧ２はＣ−３と結合することが可能であり；−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１はＣ−３と結合し、かつＯＦＧ２はＣ−２と結合することが可能であり；−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１はＣ−３と結合し、かつＯＦＧ２はＣ−４と結合することが可能であり；あるいは−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１はＣ−４と結合し、かつＯＦＧ２はＣ−３と結合することが可能であり；−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１はＣ−４と結合し、かつＯＦＧ２はＣ−５と結合することが可能であり；あるいは−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１はＣ−５と結合し、かつＯＦＧ２はＣ−４と結合することが可能である。デカリン系またはインダン系モノマーは、したがって結合（例えば炭素−炭素結合）を含むことが可能であり、このとき結合の回転はその個々の結合について制限される（例えば環の存在が原因の制限）。したがって、−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１およびＯＦＧ２は、前述のあらゆる対において互いにシスでもトランスでもよい。したがって、すべてのシス／トランス異性体が明白に含まれる。モノマーは１つまたは複数の不斉中心を含むことが可能であり、したがってラセミ化合物およびラセミ混合物、単一のエナンチオマー、個々のジアステレオマーおよびジアステレオマー混合物として存在することも可能である。すべてのこのようなモノマー異性体が明白に含まれる。好ましい実施形態では、Ｃ−１およびＣ−６における置換は、互いにトランスである。連結部結合点はＣ−６またはＣ−７であることが好ましい。
【０３０５】
他の担体は、３−ヒドロキシプロリンに基づく担体を含み得る（式Ｊ）。
【０３０６】
【化２２】
0005881970.tif 000024
【０３０７】
したがって、−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１およびＯＦＧ２は、互いにシスでもトランスでもありうる。したがって、すべてのシス／トランス異性体が明白に含まれる。モノマーは１つまたは複数の不斉中心を含み、したがってラセミ化合物およびラセミ混合物、単一のエナンチオマー、個々のジアステレオマーおよびジアステレオマー混合物として存在することも可能である。すべてのこのようなモノマー異性体が明白に含まれる。連結部結合点は窒素であることが好ましい。
【０３０８】
代表的な担体を図５に示す。
【０３０９】
いくつかの実施形態では、ある構成部分、例えばリガンドを、介在する連結部の仲介によって、担体に間接的に結合させることが可能である。連結部は担体と連結部結合点（ＴＡＰ）において結合し、好ましくは少なくとも１つの窒素原子を有する任意のＣ１〜Ｃ１００炭素含有構成部分（例えばＣ１〜Ｃ７５、Ｃ１〜Ｃ５０、Ｃ１〜Ｃ２０、Ｃ１〜Ｃ１０、Ｃ１〜Ｃ６）を含むことが可能である。好ましい実施形態では、該窒素原子は連結部上の末端アミノ基の一部を形成し、リガンドとの結合点として働くことが可能である。好ましい連結部（下線部）としては、ＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎＮＨ２；ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＮＨ２；またはＴＡＰ−ＮＲ’’’’（ＣＨ２）ｎＮＨ２が挙げられるが、ここでｎは１〜６であり、Ｒ’’’’はＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｒｄは水素またはリガンドである。他の実施形態では、窒素が末端オキシアミノ基、例えば−ＯＮＨ２、またはヒドラジノ基、−ＮＨＮＨ２の一部を形成することが可能である。連結部は任意選択で例えばヒドロキシ、アルコキシ、ペルハロアルキルで置換されてもよいし、かつ／あるいは任意選択で１つまたは複数の追加のヘテロ原子、例えばＮ、Ｏ、またはＳが挿入されてもよい。好ましい連結部に連結されたリガンドには、例えば
ＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎＮＨ（リガンド）、
ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＮＨ（リガンド）、またはＴＡＰ−ＮＲ’’’’（ＣＨ２）ｎＮＨ（リガンド）；
ＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎＯＮＨ（リガンド）、ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＯＮＨ（リガンド）、または
ＴＡＰ−ＮＲ’’’’（ＣＨ２）ｎＯＮＨ（リガンド）；ＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎＮＨＮＨ２（リガンド）、
ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＮＨＮＨ２（リガンド）、またはＴＡＰ−ＮＲ’’’’（ＣＨ２）ｎＮＨＮＨ２（リガンド）
が挙げられる。
【０３１０】
他の実施形態では、連結部は、好ましくは該連結部の末端位置に、求電子基を含むことが可能である。好ましい求電子基には、例えばアルデヒド、ハロゲン化アルキル、メシレ
ート、トシレート、ノシレート、またはブロシレート、あるいは活性化カルボン酸エステル、例えばＮＨＳエステル、またはペンタフルオロフェニルエステルがある。好ましい連結部（下線部）には、ＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎＣＨＯ；ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＣＨＯ；またはＴＡＰ−ＮＲ’’’’（ＣＨ２）ｎＣＨＯ（ｎは１〜６であり、Ｒ’’’’はＣ１〜Ｃ６アルキルである）；
あるいはＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）ＯＮＨＳ；ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）ＯＮＨＳ；またはＴＡＰ−ＮＲ’’’’（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）ＯＮＨＳ（ｎは１〜６であり、Ｒ’’’’はＣ１〜Ｃ６アルキルである）；
ＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）ＯＣ６Ｆ５；ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）ＯＣ６Ｆ５；またはＴＡＰ−ＮＲ’’’’（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）ＯＣ６Ｆ５（ｎは１〜６であり、Ｒ’’’’はＣ１〜Ｃ６アルキルである）；
あるいは−（ＣＨ２）ｎＣＨ２ＬＧ；ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＣＨ２ＬＧ；またはＴＡＰ−ＮＲ’’’’（ＣＨ２）ｎＣＨ２ＬＧ（ｎは１〜６であり、Ｒ’’’’はＣ１〜Ｃ６アルキルである）（ＬＧは脱離基、例えばハロゲン化物、メシレート、トシレート、ノシレート、ブロシレートであってよい）が挙げられる。リガンドの求核基、例えばチオールまたはアミノ基と、連結部上の求電子基とのカップリングによって、連結を行うことが可能である。
【０３１１】
連結されるもの
広く様々なもの（実体）を、ｉＲＮＡ剤に、例えばＲＲＭＳの担体に連結させることが可能である。以下にＲＲＭＳと関連付けて実施例を記載するが、該ＲＲＭＳは単に好ましいものであるにすぎず、実体は他の地点においてｉＲＮＡ剤に結合させることも可能である。好ましい実体は、肝臓を標的とする実体である。
【０３１２】
好ましい構成部分はリガンドであり、リガンドはＲＲＭＳの担体と、好ましくは共有結合により、直接的あるいは介在する連結部を介して間接的に結合される。好ましい実施形態では、リガンドは介在する連結部を介して担体に結合される。前に論じたように、リガンドまたは連結部に連結されたリガンドは、ＲＲＭＳモノマーが伸長する鎖に取り込まれるときにＲＲＭＳモノマー上に存在していてもよい。いくつかの実施形態では、「前駆体」ＲＲＭＳモノマーを伸長する鎖に取り込ませた後に、「前駆体」ＲＲＭＳにリガンドを取り込ませることが可能である。例を挙げれば、例えばアミノ末端を有する連結部を備えた（すなわちリガンドが結合していない）ＲＲＭＳモノマー、例えばＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎＮＨ２を、伸長するセンスまたはアンチセンス鎖に取り込ませることが可能である。後の操作において、すなわち前駆体モノマーを鎖に取り込ませた後、続いて、求電子基（例えばペンタフルオロフェニルエステルまたはアルデヒド基）を有するリガンドを、リガンドの求電子基と前駆体ＲＲＭＳの連結部の末端求核基とのカップリングによって、前駆体ＲＲＭＳと結合させることが可能である。
【０３１３】
好ましい実施形態では、リガンドは、同リガンドが取り込まれたｉＲＮＡ剤の分布、標的指向性または寿命を変化させる。好ましい実施形態では、リガンドは、例えばこのようなリガンドが存在しない分子種と比較して、選択された標的、例えば分子、細胞または細胞種、コンパートメント、例えば細胞または臓器のコンパートメント、組織、臓器または身体の領域に関する高い親和性をもたらす。好ましいリガンドは、二本鎖の核酸における二本鎖の対合には関与しないであろう。
【０３１４】
好ましいリガンドは、輸送、ハイブリダイゼーション、および特異性を向上させることが可能であり、生成する天然または修飾オリゴリボヌクレオチド、または本願明細書に記載するモノマーおよび／または天然もしくは修飾リボヌクレオチドの任意の組合せを含んでなるポリマー分子の、ヌクレアーゼ耐性を向上させることも可能である。
【０３１５】
一般的なリガンドとしては、例えば取り込みを増大させるための治療用調節物質；例えば分布を調べるための診断用化合物またはレポーター基；架橋剤；およびヌクレアーゼ耐性を与える構成部分が挙げられる。一般例には、脂質、ステロイド、ビタミン、糖、タンパク質、ペプチド、ポリアミン、およびペプチド模倣体がある。
【０３１６】
リガンドには、天然に存在する物質、例えばタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、またはグロブリン）；糖質（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリンまたはヒアルロン酸）；または脂質などが挙げられる。リガンドは、合成ポリマー、例えば合成ポリアミノ酸などの、組換え分子または合成分子であってもよい。ポリアミノ酸の例には、ポリリシン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−無水マレイン酸コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル−無水マレイン酸コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−アクリル酸エチル）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンがある。ポリアミンの例には、ポリエチレンイミン、ポリリシン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、プソイドペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第四級塩、またはαらせん状ペプチドがある。
【０３１７】
リガンドは、標的化基、例えば細胞または組織を標的とする物質、例えばレクチン、糖タンパク質、脂質またはタンパク質、例えば肝細胞などの特定の細胞種と結合する抗体も含み得る。標的化基は、チロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタントタンパク質Ａ、ムチン、糖質、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンＢ１２、ビオチン、あるいはＲＧＤペプチドまたはＲＧＤペプチド模倣体であってよい。
【０３１８】
リガンドの他の例には、染料、インターカレート剤（例えばアクリジン）、架橋剤（例えばソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えばＥＤＴＡ）、親油性分子、例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メンソール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コール酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）、およびペプチド複合体（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、リン酸、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えばＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射標識マーカー、酵素、ハプテン（例えばビオチン）、輸送／吸収促進物質（例えばアスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾール複合体、テトラアザマクロ環のＥｕ３＋複合体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰ、またはＡＰがある。
【０３１９】
リガンドはタンパク質（例えば糖タンパク質）またはペプチド、例えば共通のリガンドに関する特異的親和性を有する分子、または抗体（例えば癌細胞、内皮細胞、または骨細
胞などの特定の細胞種と結合する抗体）であってよい。リガンドは、ホルモンおよびホルモン受容体も含み得る。リガンドは、脂質、レクチン、糖質、ビタミン、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン多価マンノース、または多価フコースなどの、非ペプチドの分子種も含み得る。リガンドは、例えばリポ多糖、ｐ３８ＭＡＰキナーゼの活性化剤、またはＮＦ−κＢの活性化剤であってよい。
【０３２０】
リガンドは、例えば細胞の細胞骨格を破壊することによって、例えば細胞の微小管、マイクロフィラメント、および／または中間径フィラメントを破壊することによって、細胞内へのｉＲＮＡ剤の取り込みを増大させることが可能な物質、例えば薬物であってよい。薬物は例えば、タキソン（ｔａｘｏｎ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノライド（ｊａｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホライドＡ、インダノシン（ｉｎｄａｎｏｃｉｎｅ）、またはミオセルビン（ｍｙｏｓｅｒｖｉｎ）であってよい。
【０３２１】
リガンドは、例えば炎症応答を活性化させることによって、細胞内へのｉＲＮＡ剤の取り込みを増大させることが可能である。このような効果を有すると思われる例示的なリガンドには、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン−１β、またはγインターフェロンがある。
【０３２２】
１態様では、リガンドは脂質または脂質系分子である。このような脂質または脂質系分子は、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と結合することが好ましい。ＨＳＡ結合リガンドは、身体の標的組織、例えば非肝臓標的組織に、本発明の複合体を分布させることが可能である。好ましくは、標的組織は、肝臓の実質細胞を含めた肝臓である。ＨＳＡと結合することが可能である他の分子も、リガンドとして使用することが可能である。例えば、ネプロキシンまたはアスピリンを使用することが可能である。脂質または脂質系リガンドは、（ａ）複合体の分解に対する耐性を増大させること、（ｂ）標的細胞または細胞膜への標的指向性または輸送を増大させることが可能であり、かつ／あるいは（ｃ）血清タンパク質、例えばＨＳＡとの結合を調節するために使用することが可能である。
【０３２３】
脂質系リガンドを使用して、本発明の複合体と標的組織の結合を調節する、例えば制御することが可能である。例えば、ＨＳＡとさらに強く結合する脂質または脂質系リガンドは、肝臓に対する標的指向性が低くなると思われ、したがって身体から除去されにくくなると思われる。
【０３２４】
好ましい実施形態では、脂質系リガンドはＨＳＡと結合する。リガンドは、本発明の複合体が好ましくは非腎臓組織に分布するような十分な親和性で、ＨＳＡと結合することが好ましい。しかしながら、その親和性は、ＨＳＡとリガンドとの結合が不可逆的であるほど強くはないことが好ましい。
【０３２５】
他の態様では、リガンドは、標的細胞、例えば増殖細胞によって取り込まれる構成部分、例えばビタミンである。これらのリガンドは、望ましくない細胞増殖、例えば悪性または非悪性型の細胞増殖、例えば癌細胞の増殖によって特徴付けられる疾患を治療するのに非常に有用である。例示的なビタミンには、ビタミンＡ、Ｅ、およびＫがある。他の例示的なビタミンには、Ｂビタミン、例えば葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサール、あるいは癌細胞によって取り込まれるその他のビタミンまたは栄養素がある。ＨＳＡおよび低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）も含まれる。
【０３２６】
他の態様では、リガンドは、細胞透過性物質、好ましくはらせん状の細胞透過性物質で
ある。該物質は両親媒性であることが好ましい。例示的な物質は、ｔａｔまたはアンテナペディアなどのペプチドである。該物質がペプチドである場合、ペプチジル模倣体、インバートマー、非ペプチド結合または偽ペプチド結合、およびＤ−アミノ酸の使用を含めて、該ペプチドを改変することが可能である。らせん状物質は、親油性および撥油性の相を好ましくは有する、αらせん状物質であることが好ましい。
【０３２７】
リガンドは、ペプチドまたはペプチド模倣体であってよい。ペプチド模倣体（本願明細書ではオリゴペプチド模倣体とも呼ぶ）は、天然のペプチドと類似した一定の３次元構造にフォールディング可能な分子である。ペプチドおよびペプチド模倣体と、ｉＲＮＡ剤が結合することによって、細胞の認識および吸収を高めることなどにより、ｉＲＮＡの薬物動態学的分布に影響を与えることが可能である。ペプチドまたはペプチド模倣体の構成部分は、約５〜５０アミノ酸長、例えば約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸長であってよい（例えば表２を参照）。
【０３２８】
【表２】
0005881970.tif 000025
【０３２９】
ペプチドまたはペプチド模倣体は、例えば細胞透過性ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、または疎水性ペプチド（例えば、主にＴｙｒ、ＴｒｐまたはＰｈｅから構成される）であってよい。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、制約型（ｃｏｎ
ｓｔｒａｉｎｅｄ）ペプチドまたは架橋ペプチドであってよい。ペプチド部分は、Ｌ−ペプチドでもＤ−ペプチドでもよい。他の代替例では、ペプチド部分は、疎水性の膜移行配列（ＭＴＳ）を含むことが可能である。例示的な疎水性ＭＴＳ含有ペプチドは、アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号６７１５）を有するＲＦＧＦである。疎水性ＭＴＳを含むＲＦＧＦ類似体（例えば、アミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号６７１６））も、標的化部分であり得る。ペプチド部分は、ペプチド、オリゴヌクレオチド、およびタンパク質を含めた大きな極性分子を、細胞膜を横切って運ぶことができる「送達」ペプチドであってよい。例えば、ＨＩＶ  Ｔａｔタンパク質由来の配列（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号６７１７））、およびショウジョウバエのアンテナペディア・タンパク質由来の配列（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号６７１８））は、送達ペプチドとして機能しうることが見出されている。ペプチドまたはペプチド模倣体は、ファージ・ディスプレイ・ライブラリー、または１ビーズ１化合物（ＯＢＯＣ）コンビナトリアル・ライブラリーから同定されたペプチドなど、ＤＮＡのランダムな配列によってコードされてもよい（ラムら（Ｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ、３５４：８２〜８４、１９９１）。取り込まれたモノマーユニットを介してｉＲＮＡ剤と連結したペプチドまたはペプチド模倣体は、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）ペプチド、またはＲＧＤ模倣体などの、細胞標的化ペプチドであることが好ましい。ペプチド部分の長さは、約５アミノ酸〜約４０アミノ酸の範囲であってよい。ペプチド部分は、安定性を増大させるため、あるいは立体構造上の特性を得るためなどの、構造的改変を有し得る。以下に記載する任意の構造的改変を、使用することが可能である。
【０３３０】
ＲＧＤペプチド部分を使用して、内皮腫瘍細胞または乳癌腫瘍細胞などの、腫瘍細胞を標的とすることが可能である（ジッツマンら（Ｚｉｔｚｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、６２：５１３９〜４３、２００２）。ＲＧＤペプチドは、肺、腎臓、脾臓、または肝臓を含めた様々な他の組織の腫瘍を標的としたｉＲＮＡ剤の指向性を促進し得る（アオキら（Ａｏｋｉ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８：７８３〜７８７、２００１）。ＲＧＤペプチドは直鎖状でも環状でもよく、これらを修飾、例えばグリコシル化またはメチル化して、特定の組織を標的とした指向性を促進することが可能である。例えば、グリコシル化ＲＧＤペプチドは、αＶβ３を発現する腫瘍細胞にｉＲＮＡ剤を送達することが可能である（ハウブナーら（Ｈａｕｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊｏｕｒ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．、４２：３２６〜３３６、２００１）。
【０３３１】
増殖している細胞中に豊富なマーカーを標的とするペプチドを、使用することが可能である。例えば、ＲＧＤを含有するペプチドおよびペプチド模倣体は、がん細胞、特にαＶβ３インテグリンを提示する細胞を標的とすることが可能である。したがって、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤを含む環状ペプチド、Ｄ−アミノ酸を含むＲＧＤペプチド、および合成ＲＧＤ模倣体を使用することが可能であると思われる。ＲＧＤ以外に、αＶβ３インテグリン・リガンドを標的とする他の構成部分を使用することが可能である。一般に、このようなリガンドを使用して、増殖している細胞および血管新生を制御することが可能である。この型の好ましい複合体には、ＰＥＣＡＭ−１、ＶＥＧＦ、または他のがん遺伝子、例えば本願明細書で記載するがん遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤がある。
【０３３２】
「細胞透過性ペプチド」は、細胞、例えば細菌または真菌細胞などの微生物細胞、またはヒト細胞などの哺乳動物細胞を透過することが可能である。微生物細胞透過性ペプチドは、例えばα−らせん状直鎖ペプチド（例えばＬＬ−３７またはセロピンＰ１）、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えば、α−ディフェンシン、β−ディフェンシンまたはバクテネシン）、またはわずか１種または２種のアミノ酸を主に含むペプチド（例えばＰＲ−３９またはインドリシディン）であってよい。細胞透過性ペプチドは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）をも含み得る。例えば、細胞透過性ペプチドは、ＨＩＶ−１  ｇｐ４１の融合ペプチドドメインとＳＶ４０大型Ｔ抗原のＮＬＳとに由来するＭＰＧなどの、２部分の両
親媒性ペプチドであってよい（シメオニら（Ｓｉｍｅｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：２７１７〜２７２４、２００３）。
【０３３３】
１実施形態では、ＲＲＭＳに連結される標的化ペプチドは、両親媒性のαらせん状ペプチドであってよい。例示的な両親媒性のαらせん状ペプチドには、セクロピン、ライコトキシン、パラダキシン、ブフォリン、ＣＰＦ、ボンビニン様ペプチド（ＢＬＰ）、カテリシディン、セラトトキシン、Ｓ．ｃｌａｖａペプチド、メクラウナギ腸管の抗菌性ペプチド（ＨＦＩＡＰ）、マガイニン、ブレビニン−２、ダーマセプチン、メリチン、プレウロシディン、Ｈ２Ａペプチド、アフリカツメガエルのペプチド、エスカレンチン−１、およびカエリンがあるが、これらだけには限られない。らせんの安定性を完全に保つために、いくつかの要因を考慮することが好ましいであろう。例えば、らせん安定化残基を最大数使用し（例えばｌｅｕ、ａｌａ、またはｌｙｓ）、らせん不安定化残基を最小数とする（例えばプロリン、または環状モノマーユニット）。キャップ構造の残基も考えられる（例えば、ＧｌｙはＮキャップ構造残基の例であり、かつ／あるいはＣ末端アミド化を使用して、らせんを安定化させるための特別なＨ結合を与えることが可能である）。ｉ±３、あるいはｉ±４位離れた、正反対の電荷を有する残基間の塩架橋の形成によって、安定性をもたらす可能性がある。例えば、リシン、アルギニン、ホモ−アルギニン、オルニチンまたはヒスチジンなどのカチオン性残基は、アニオン性の残基、グルタミン酸またはアスパラギン酸と、塩架橋を形成することが可能である。
【０３３４】
ペプチドおよびペプチド模倣体のリガンドには、天然または修飾ペプチド、例えばＤまたはＬペプチド；α、β、またはγペプチド；Ｎ−メチルペプチド；アザペプチド；１つまたは複数のアミドを有するペプチド、すなわち１つまたは複数の尿素、チオ尿素、カルバメート、またはスルホニル尿素結合で置換されたペプチド結合；または環状ペプチドを有するリガンドがある。
【０３３５】
ｉＲＮＡ剤を作製するための方法
ｉＲＮＡ剤は、修飾塩基または非天然塩基、例えば本願明細書に援用する、２００３年４月１７日に出願された同時係属かつ共同所有の米国仮出願第６０／４６３，７７２号明細書に、および／または本願明細書に援用する、２００３年４月２５日に出願された同時係属かつ共同所有の米国仮出願第６０／４６５，８０２号明細書に記載された塩基を含むことが可能である。このような塩基を含むモノマーおよびｉＲＮＡ剤は、２００３年４月１７日に出願された米国仮出願第６０／４６３，７７２号明細書、および／または２００３年４月２５日に出願された米国仮出願第６０／４６５，８０２号明細書に見られる方法によって作製することが可能である。
【０３３６】
さらに本発明は、修飾または非天然塩基および本願明細書に記載する他の要素を有するｉＲＮＡ剤を含む。例えば本発明は、本願明細書に記載するｉＲＮＡ剤、例えばパリンドローム構造のｉＲＮＡ剤、非標準的な対合を有するｉＲＮＡ剤、本願明細書に記載する遺伝子、例えば肝臓中で活性がある遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤、本願明細書に記載する構成様式または構造を有するｉＲＮＡ剤、本願明細書に記載する両親媒性送達物質と結合したｉＲＮＡ、本願明細書に記載する薬剤送達モジュールと結合したｉＲＮＡ、本願明細書に記載するように投与されるｉＲＮＡ剤、または本願明細書に記載するように製剤化されるｉＲＮＡ剤であって、修飾または非天然塩基も取り込むｉＲＮＡ剤を含む。
【０３３７】
オリゴヌクレオチドペプチド複合体の合成および精製は、確立されている方法によって実施することが可能である。例えば、テゥルーフェルトら（Ｔｒｕｆｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、５２：３００５、１９９６；およびＭａｎｏｈａｒａｎ、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、
ｅｄ中、エス  ティー  クルーク、マルセル  デッカー、インコーポレイテッド社（Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、２００１を参照のこと。
【０３３８】
本発明の１実施形態では、ペプチド模倣体を修飾して、明確で特異的な好ましい立体構造をとる制約型ペプチドを作製することが可能であり、該立体構造によってペプチドの効力および選択性を増大させることが可能である。例えば、制約型ペプチドはアザペプチドであってよい（Ｇａｎｔｅ、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、４０５〜４１３、１９８９）。アミノ酸側鎖の構造を変えずに、アミノ酸のα−炭素を窒素原子で置換することによって、アザペプチドが合成される。例えば、ヒドラジンを「カルボニル・ドナー」、例えばクロロギ酸フェニルと反応させることなどによって、伝統的なペプチド合成カップリング法においてヒドラジンを使用することによって、アザペプチドを合成することが可能である。
【０３３９】
本発明の１実施形態では、ペプチドまたはペプチド模倣体（例えば、ＲＲＭＳに連結されるペプチドまたはペプチド模倣体）は、Ｎ−メチルペプチドであってよい。Ｎ−メチルペプチドはＮ−メチル・アミノ酸から構成されるが、Ｎ−メチル・アミノ酸はペプチドのバックボーン中に追加のメチル基を与えることによってタンパク質分解酵素による切断に対する他の耐性手段を与える可能性がある。Ｎ−メチルペプチドは、当分野で知られている方法によって合成することが可能である（例えば、リンドグレンら（Ｌｉｎｄｇｒｅｎ
ｅｔ  ａｌ．）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２１：９９、２０００；Ｃｅｌｌ  Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ａｎｄ
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｌａｎｇｅｌ、ｅｄ．、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、ＦＬ、２００２；フィッシェら（Ｆｉｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ．Ｃｈｅｍ．１２：８２５、２００１；ワンダーら（Ｗａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２４：１３３８２、２００２を参照）。例えば、ＡｎｔペプチドまたはＴａｔペプチドが、Ｎ−メチルペプチドであってもよい。
【０３４０】
本発明の１実施形態では、ペプチドまたはペプチド模倣体（例えば、ＲＲＭＳに連結されるペプチドまたはペプチド模倣体）は、β−ペプチドであってよい。β−ペプチドは、溶液中でらせん、プリーツ・シート、ターンおよびヘアピンなどの安定した２次構造を形成する。β−ペプチドの環状誘導体は、固体状態で折りたたまれてナノチューブになりうる。β−ペプチドは、タンパク質分解酵素による分解に対して耐性がある。β−ペプチドは、当分野で知られている方法によって合成することが可能である。例えば、ＡｎｔペプチドまたはＴａｔペプチドは、β−ペプチドであってもよい。
【０３４１】
本発明の１実施形態では、ペプチドまたはペプチド模倣体（例えば、ＲＲＭＳに連結されるペプチドまたはペプチド模倣体）は、オリゴカルバメートであってよい。オリゴカルバメートペプチドは、カルバメートトランスポーターによって促進される輸送経路により細胞内に内在化する。例えば、ＡｎｔペプチドまたはＴａｔペプチドが、オリゴカルバメートであってもよい。
【０３４２】
本発明の１実施形態では、ペプチドまたはペプチド模倣体（例えば、ＲＲＭＳに連結されるペプチドまたはペプチド模倣体）は、ペプチド模倣体のアミド結合が尿素部分で置換されているオリゴ尿素複合体（またはオリゴチオ尿素複合体）であってよい。アミド結合の置換によって、タンパク質分解酵素、例えば胃腸間内でのタンパク質分解酵素による分解に対する高い耐性が与えられる。１実施形態では、オリゴ尿素複合体を、経口送達において使用するためにｉＲＮＡ剤と連結させる。オリゴ尿素ペプチド模倣体のそれぞれの繰り返しユニット中のバックボーンは、天然アミノ酸と比較して１炭素原子だけ広がる可能性がある。１炭素原子の広がりによって、例えばペプチドの安定性および親油性が増大する可能性がある。したがってオリゴ尿素ペプチドは、ｉＲＮＡ剤が細菌細胞壁の通過を目
的とするとき、あるいは神経障害の治療などのためにｉＲＮＡ剤が血液−脳関門を横断しなければならないときに、有利である可能性がある。１実施形態では、受容体との高い親和性を生み出すために、水素結合ユニットをオリゴ尿素ペプチドに結合させる。例えば、ＡｎｔペプチドまたはＴａｔペプチドが、オリゴ尿素複合体（またはオリゴチオ尿素複合体）であってもよい。
【０３４３】
本発明のｓｉＲＮＡペプチド複合体は、ｉＲＮＡ剤上の様々な位置に存在するＲＲＭＳと関連付ける、例えば連結させることが可能である。例えばペプチドを、センス鎖上またはアンチセンス鎖上のいずれかにおいて末端に結合させてもよいし、ペプチドをビス結合（１つのペプチドが各端で連結され、一端がセンス鎖に結合し、一端がアンチセンス鎖に結合する）。他の選択肢では、ペプチドは、短いヘアピン構造のｉＲＮＡ剤のループ中など、内部に結合し得る。さらに他の選択肢では、ペプチドはペプチド−担体複合体などの複合体と関連付けられてもよい。
【０３４４】
ペプチド−担体複合体は、（生体系および／または細胞に送達するためなどの）１つまたは複数のｉＲＮＡ剤を内包しうる少なくとも１つの担体分子と、担体複合体を特定の組織または細胞種に対して指向させるためなどの、前記担体分子の外側に連結されたペプチド部分とから構成される。担体複合体は、該複合体の外側に追加の標的化分子、または細胞への送達を助ける細胞融合剤を担持することも可能である。担体内に被包される１つまたは複数のｉＲＮＡ剤を、担体の内部への物質の送達を助けることが可能な親油性分子と結合させてもよい。
【０３４５】
担体分子または担体構造物は、例えばミセル、リポソーム（例えばカチオン性リポソーム）、ナノ粒子、ミクロスフェア、または生分解性ポリマーであってよい。ペプチド部分は、ジスルフィド結合、酸不安定結合、ペプチド系結合、オキシアミノ結合またはヒドラジン結合などの様々な結合によって、担体分子と連結することが可能である。例えば、ペプチド系結合はＧＦＬＧペプチドであってよい。いくつかの結合は個々の利点を有し、その利点（または欠点）を、標的組織または目的とする用途に応じて考慮することが可能である。例えば、ペプチド系結合は血流中では安定性があるが、リソソーム中では酵素による切断を受けやすい。
【０３４６】
標的化
本発明のｉＲＮＡ剤は、肝臓を標的とする場合に特に有用である。ｉＲＮＡ剤は、肝臓を標的とするリガンドを含むＲＲＭＳを組み込むことによって、肝臓指向性とすることが可能である。例えば、肝臓標的化剤は親油性部分である。好ましい親油性部分には、脂質、コレステロール、オレイル、レチニル、またはコレステリル残基が含まれる。肝臓標的化剤として機能することが可能である他の親油性部分には、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジンが含まれる。
【０３４７】
ｉＲＮＡ剤はまた、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）（例えば、ラクトシル化ＬＤＬ）にｉＲＮＡ剤を結合させることによって、肝臓指向性とすることが可能である。糖残基と複合させたポリマー担体もまた、ｉＲＮＡ剤が肝臓指向性となるように機能することが可能である。
【０３４８】
糖、例えばガラクトースおよび／またはその類似体を取り込む標的化剤は、特に有用である。これらの標的化剤は、特に、肝臓の実質細胞を標的とする。例えば標的化部分は、
互いに約１５オングストローム隔てられた、２つ以上の、好ましくは２つまたは３つのガラクトース部分を含んでいてもよい。あるいは標的化部分は、ガラクトースと結合したグルコースである、ラクトース（例えば３つのラクトース部分）であってよい。標的化部分は、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−Ａｃ−グルコサミンであってもよい。マンノースまたはマンノース−６−リン酸の標的化部分は、マクロファージを標的とするために使用することが可能である。
【０３４９】
ｉＲＮＡ剤とヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン（ＳＡ）との結合を使用して、ｉＲＮＡ剤を、肝臓などの非腎臓組織に向けることも可能である。
【０３５０】
本願明細書に記載するＲＲＭＳ標的化部分によって肝臓を標的とするｉＲＮＡ剤は、肝臓中で発現される遺伝子を標的とすることが可能である。
【０３５１】
本明細書に記載されるＲＲＭＳ標的化部分によって肝臓を標的とするｉＲＮＡ剤は、肝臓において発現される遺伝子を標的とすることが可能である。例えば、ｉＲＮＡ剤は、例えば肝臓のがんを治療するために、ｐ２１（ＷＡＦ１／ＤＩＰ１）、Ｐ２７（ＫＩＰ１）、α−フェトプロテイン遺伝子、β−カテニン、またはｃ−ＭＥＴを標的とすることが可能である。別の実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、例えば、ＨＤＬ／ＬＤＬコレステロールの不均衡；異常脂質血症、例えば、家族性複合型高脂血症（ＦＣＨＬ）、もしくは後天性高脂血症；高コレステロール血症；スタチン抵抗性高コレステロール血症；冠状動脈疾患（ＣＡＤ）；冠動脈性心疾患（ＣＨＤ）またはアテローム性動脈硬化症の治療のために、ａｐｏＢ−１００を標的とすることが可能である。別の実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、例えば糖尿病の治療のために、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）における肝臓のグルコース生産の阻害を目的として、横紋筋肉腫のフォークヘッドホモログ（ＦＫＨＲ）；グルカゴン；グルカゴン受容体；グリコーゲンホスホリラーゼ；ＰＰＡＲ−γコアクチベータ（ＰＧＣ−１）；フルクトース−１，６−ビスホスファターゼ；グルコース−６−ホスファターゼ；グルコース−６−リン酸トランスロケーター；グルコキナーゼ阻害性調節タンパク質；およびホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）を標的とすることが可能である。別の実施形態において、肝臓を標的とするｉＲＮＡ剤は、例えば、血塊を形成する傾向を低減するために、第Ｖ因子、例えば、ライデン第Ｖ因子対立遺伝子を標的とすることが可能である。肝臓を標的とするｉＲＮＡ剤は、肝炎ウイルス（例えば、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型、Ｆ型、Ｇ型、またはＨ型肝炎ウイルス）を標的とする配列を含むことが可能である。例えば、本発明のｉＲＮＡ剤は、ＨＣＶ：ＮＳ３、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、または５Ｂの非構造タンパク質のうちいずれか１つを標的とすることが可能である。Ｂ型肝炎の治療のために、ｉＲＮＡ剤は、例えば、Ｘタンパク質（ＨＢｘ）遺伝子を標的とすることが可能である。
【０３５２】
ＲＲＭＳ上の好ましいリガンドには、葉酸、グルコース、コレステロール、コール酸、ビタミンＥ、ビタミンＫ、またはビタミンＡが挙げられる。
【０３５３】
定義
用語「ハロ」は、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素の任意の基を指す。
【０３５４】
用語「アルキル」は、示した数の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を指す。例えば、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルとは、該基が１個〜１２個の炭素原子をその中に有することが可能であることを示す。用語「ハロアルキル」は、１つまたは複数の水素原子がハロによって置換されているアルキルを指し、すべての水素がハロによって置換されているアルキル部分（例えばペルフルオロアルキル）を含む。アルキルおよびハロアルキル基は、任意選択でＯ、Ｎ、またはＳが挿入されていてもよい。用語「アラルキル」は、アルキル水素原子がアリール基によって置換されているアルキル部分を指す。アラルキルは、２
つ以上の水素原子がアリール基によって置換されている基を含む。「アラルキル」の例には、ベンジル、９−フルオレニル、ベンズヒドリル、およびトリチル基がある。
【０３５５】
用語「アルケニル」は、２〜８個の炭素原子を含み１つまたは複数の二重結合を有することを特徴とする、直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を指す。典型的なアルケニルの例には、アリル、プロペニル、２−ブテニル、３−ヘキセニルおよび３−オクテニル基があるが、これらだけには限られない。用語「アルキニル」は、２〜８個の炭素原子を含み１つまたは複数の三重結合を有することを特徴とする、直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を指す。典型的なアルキニルのいくつかの例は、エチニル、２−プロピニル、および３−メチルブチニル、およびプロパルギルである。ｓｐ２およびｓｐ３炭素が、任意選択で、それぞれアルケニル基およびアルキニル基の結合点として作用してもよい。
【０３５６】
用語「アルコキシ」は、−Ｏ−アルキル基を指す。用語「アミノアルキル」は、アミノで置換されたアルキルを指す。用語「メルカプト」は、−ＳＨ基を指す。用語「チオアルコキシ」は、−Ｓ−アルキル基を指す。
【０３５７】
用語「アルキレン」は、２価アルキル（すなわち−Ｒ−）、例えば−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−、および−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−を指す。用語「アルキレンジオキソ」は、構造−Ｏ−Ｒ−Ｏ−（Ｒはアルキレンを表す）の２価の分子種を指す。
【０３５８】
用語「アリール」は、置換可能な任意の環原子を置換基によって置換することが可能な、芳香族単環、２環、または３環炭化水素環系を指す。アリール部分の例には、フェニル、ナフチル、およびアントラセニルがあるが、これらだけには限られない。
【０３５９】
本願明細書で使用する用語「シクロアルキル」は、置換可能な任意の環原子を置換基によって置換することが可能な、３〜１２個の炭素を有する飽和環状、２環、３環、または多環炭化水素基を含む。本願明細書に記載するシクロアルキル基は、縮合環も含み得る。縮合環は、共通の炭素−炭素結合を共有する環である。シクロアルキル部分の例には、シクロヘキシル、アダマンチル、およびノルボルニルがあるが、これらだけには限られない。
【０３６０】
用語「ヘテロシクリル」は、非芳香族３〜１０員の単環、８〜１２員の２環、または１１〜１４員の３環の環系であって、単環の場合１〜３個のヘテロ原子、２環の場合１〜６個のヘテロ原子、または３環の場合１〜９個のヘテロ原子を有し、前記ヘテロ原子がＯ、Ｎ、またはＳから選択されることを特徴とする環系（例えば炭素原子と、単環、２環、または３環である場合、Ｎ、ＯまたはＳのヘテロ原子それぞれ１〜３個、１〜６個、または１〜９個）であり、置換可能な任意の環原子を置換基によって置換することが可能な環系を指す。本願明細書に記載するヘテロシクリル基は、縮合環も含み得る。縮合環は、共通の炭素−炭素結合を共有する環である。ヘテロシクリルの例には、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、ピペリジニル、モルホリノ、ピロリニルおよびピロリジニルがあるが、これらだけには限られない。
【０３６１】
用語「ヘテロアリール」は、芳香族５〜８員の単環、８〜１２員の２環、または１１〜１４員の３環の環系であって、単環の場合１〜３個のヘテロ原子、２環の場合１〜６個のヘテロ原子、または３環の場合１〜９個のヘテロ原子を有し、前記ヘテロ原子がＯ、Ｎ、またはＳから選択されることを特徴とする環系（例えば炭素原子と、単環、２環、または３環である場合、Ｎ、ＯまたはＳのヘテロ原子それぞれ１〜３個、１〜６個、または１〜９個）であり、置換可能な任意の環原子を置換基によって置換することが可能な環系を指す。
【０３６２】
用語「オキソ」は、炭素と結合している場合はカルボニルを形成し、窒素と結合している場合はＮ−オキシドを形成し、イオウと結合している場合はスルホキシドまたはスルホンを形成する酸素原子を指す。
【０３６３】
用語「アシル」は、いずれも置換基によってさらに置換することが可能な、アルキルカルボニル、シクロアルキルカルボニル、アリールカルボニル、ヘテロシクリルカルボニル、またはヘテロアリールカルボニル置換基を指す。
【０３６４】
用語「置換基」は、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロシクリル、ヘテロシクロアルケニル、シクロアルケニル、アリール、またはヘテロアリール基上で該基の任意の原子について「置換された」基を指す。適切な置換基には、制限を設けるものではないが、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、ＳＯ３Ｈ、硫酸、リン酸、ペルフルオロアルキル、ペルフルオロアルコキシ、メチレンジオキシ、エチレンジオキシ、カルボキシル、オキソ、チオオキソ、イミノ（アルキル、アリール、アラルキル）、Ｓ（Ｏ）ｎアルキル（ｎは０〜２）、Ｓ（Ｏ）ｎアリール（ｎは０〜２）、Ｓ（Ｏ）ｎヘテロアリール（ｎは０〜２）、Ｓ（Ｏ）ｎヘテロシクリル（ｎは０〜２）、アミン（モノ−、ジ−、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、ヘテロアラルキル、およびこれらの組合せ）、エステル（アルキル、アラルキル、ヘテロアラルキル）、アミド（モノ−、ジ−、アルキル、アラルキル、ヘテロアラルキル、およびこれらの組合せ）、スルホンアミド（モノ−、ジ−、アルキル、アラルキル、ヘテロアラルキル、およびこれらの組合せ）、非置換アリール、非置換ヘテロアリール、非置換ヘテロシクリル、および非置換シクロアルキルがある。１態様では、基上の置換基は独立に、前述の置換基のいずれか１つ、またはいずれかのサブセットである。
【０３６５】
用語「アデニニル、シトシニル、グアニニル、チミニル、およびウラシリル」などは、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、およびウラシルの基を指す。
【０３６６】
本願明細書で使用する「通常でない」核酸塩基は、以下のいずれか１つを含むことが可能である：
２−メチルアデニニル、
Ｎ６−メチルアデニニル、
２−メチルチオ−Ｎ６−メチルアデニニル、
Ｎ６−イソペンテニルアデニニル、
２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニニル、
Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデニニル、
２−メチルチオ−Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデニニル、
Ｎ６−グリシニルカルバモイルアデニニル、
Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデニニル、
２−メチルチオ−Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデニニル、
Ｎ６−メチル−Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデニニル、
Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデニニル、
２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデニニル、
Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデニニル、
３−メチルシトシニル、
５−メチルシトシニル、
２−チオシトシニル、
５−ホルミルシトシニル、
【０３６７】
【化２３】
0005881970.tif 000026
【０３６８】
Ｎ４−メチルシトシニル、
５−ヒドロキシメチルシトシニル、
１−メチルグアニニル、
Ｎ２−メチルグアニニル、
７−メチルグアニニル、
Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアニニル、
【０３６９】
【化２４】
0005881970.tif 000027
【０３７０】
Ｎ２，７−ジメチルグアニニル、
Ｎ２，Ｎ２，７−トリメチルグアニニル、
１−メチルグアニニル、
７−シアノ−７−デアザグアニニル、
７−アミノメチル−７−デアザグアニニル、
プソイドウラシリル、
ジヒドロウラシリル、
５−メチルウラシリル、
１−メチルプソイドウラシリル、
２−チオウラシリル、
４−チオウラシリル、
２−チオチミニル
５−メチル−２−チオウラシリル、
３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウラシリル、
５−ヒドロキシウラシリル、  ５−メトキシウラシリル、
ウラシリル５−オキシ酢酸、
ウラシリル５−オキシ酢酸メチルエステル、
５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシリル、
５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシリルメチルエステル、
５−メトキシカルボニルメチルウラシリル、
５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウラシリル、
５−アミノメチル−２−チオウラシリル、
５−メチルアミノメチルウラシリル、
５−メチルアミノメチル−２−チオウラシリル、
５−メチルアミノメチル−２−セレノウラシリル、
５−カルバモイルメチルウラシリル、
５−カルボキシメチルアミノメチルウラシリル、
５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシリル、
３−メチルウラシリル、
１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）プソイドウラシリル、
５−カルボキシメチルウラシリル、
５−メチルジヒドロウラシリル、または
３−メチルプソイドウラシリル。
【０３７１】
パリンドローム
ＲＮＡ、例えばｉＲＮＡ剤は、本願明細書に記載するパリンドローム構造、およびいずれも本願明細書に援用する、２００３年３月７日に出願された米国仮出願第６０／４５２，６８２号；２００３年４月１４日に出願された米国仮出願第６０／４６２，８９４号；および２００４年３月８日に出願された国際出願Ｎｏ．ＰＣＴ／ＵＳ０４／０７０７０の１つまたは複数中に記載されたものを有することが可能である。本発明のｉＲＮＡ剤は、２つ以上のＲＮＡ領域を標的とすることが可能である。例えばｉＲＮＡ剤は、互いにハイブリダイズするのに十分相補的な第１配列および第２配列を含むことが可能である。第１配列は第１の標的ＲＮＡ領域と相補的であってよく、第２配列は第２の標的ＲＮＡ領域と相補的であってよい。ｉＲＮＡ剤の第１配列および第２配列が異なるＲＮＡ鎖上にあり、かつ第１配列と第２配列の間のミスマッチを、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、または１％未満とすることができる。ｉＲＮＡ剤の第１配列および第２配列が同じＲＮＡ鎖上にあり、かつ関連実施形態では、該ｉＲＮＡ剤の５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％より多く、あるいは１％が、２分子の形態であってもよい。ｉＲＮＡ剤の第１配列と第２配列が、互いに完全に相補的であってもよい。
【０３７２】
第１の標的ＲＮＡ領域が第１の遺伝子によってコードされ、かつ第２の標的ＲＮＡ領域が第２の遺伝子によってコードされてもよいし、あるいは第１の標的ＲＮＡ領域と第２の標的ＲＮＡ領域が、１つの遺伝子由来のＲＮＡの異なる領域であってよい。第１配列と第
２配列は、少なくとも１ヌクレオチド異なる可能性がある。
【０３７３】
第１の標的ＲＮＡ領域と第２の標的ＲＮＡ領域は、第１配列および第２配列の変異体、例えば１つの遺伝子の第１および第２の対立遺伝子によってコードされる転写物上に存在してもよい。配列の変異は、例えば突然変異、または多型性であってよい。第１の標的ＲＮＡ領域が、第２の標的ＲＮＡ領域と比べてヌクレオチドの置換、挿入、または欠失を含むことも可能であり、あるいは第２の標的ＲＮＡ領域が、第１の標的領域の突然変異体または変異体であることも可能である。
【０３７４】
第１の標的ＲＮＡ領域と第２の標的ＲＮＡ領域は、ウイルスまたはヒトのＲＮＡ領域を含むことが可能である。第１の標的ＲＮＡ領域と第２の標的ＲＮＡ領域は、がん遺伝子の変異体転写物上に存在することも可能であるし、あるいは腫瘍抑制遺伝子の転写物の異なる突然変異を含むことも可能である。さらに、第１の標的ＲＮＡ領域と第２の標的ＲＮＡ領域は、遺伝的変異のホット・スポットに相当していてもよい。
【０３７５】
本発明の組成物は、ｉＲＮＡ剤分子の混合物を含むことが可能である。例えば、１つのｉＲＮＡ剤は、互いにハイブリダイズするのに十分相補的な第１配列および第２配列を含むことが可能であり、さらに第１配列は第１の標的ＲＮＡ領域と相補的であり、第２配列は第２の標的ＲＮＡ領域と相補的である。この混合物は、互いにハイブリダイズするのに十分相補的な第３配列および第４配列を含む、少なくとも１つの他の種類のｉＲＮＡ剤を含むことも可能であり、この場合第３配列は第３の標的ＲＮＡ領域と相補的であり、第４配列は第４の標的ＲＮＡ領域と相補的である。さらに、第１配列または第２配列は、第３配列または第４配列と、互いにハイブリダイズすることが可能であるほど十分相補的であってもよい。第１配列と第２配列は同じＲＮＡ鎖上に存在しても異なるＲＮＡ鎖上に存在してもよく、第３配列と第４配列は同じＲＮＡ鎖上に存在しても異なるＲＮＡ鎖上に存在してもよい。
【０３７６】
標的ＲＮＡ領域は、ウイルスＲＮＡまたはヒトＲＮＡの変異体配列であってもよく、いくつかの実施形態では、少なくとも２つの標的ＲＮＡ領域が、がん遺伝子または腫瘍抑制遺伝子の変異体転写物上に存在しうる。標的ＲＮＡ領域は、遺伝的ホット・スポットに相当してもよい。
【０３７７】
ｉＲＮＡ剤組成物を作製する方法は、標的遺伝子（例えばウイルス遺伝子またはヒト遺伝子、あるいはがん遺伝子または腫瘍抑制遺伝子、例えばｐ５３）のＲＮＡ領域であって、（例えばヒトにおける）高度の多様性または突然変異頻度を有する領域についての情報を入手することまたは提供することを含み得る。さらに、該領域内の複数のＲＮＡ標的についての情報を入手または提供することが可能であり、この場合それぞれのＲＮＡ標的が該遺伝子の異なる変異体または突然変異体に対応する（例えば、ｐ５３  ２４８Ｑおよび／またはｐ５３  ２４９Ｓをコードするコドンを含む領域）。第１配列が複数の変異体ＲＮＡ標的のうちの第１の標的（例えば２４９Ｑをコードする標的）と相補的であり、第２配列が複数の変異体ＲＮＡ標的のうちの第２の標的（例えば２４９Ｓをコードする標的）と相補的であり、かつ第１配列と第２配列がハイブリダイズするのに十分相補的であり得るように、ｉＲＮＡ剤を構築することが可能である。
【０３７８】
例えば標的遺伝子中の共通の突然変異を同定するために、配列分析を使用して、高度の多様性または突然変異頻度を有する標的遺伝子の領域を同定することが可能である。高度の多様性または突然変異頻度を有する標的遺伝子の領域は、個体群由来の標的遺伝子についての遺伝子型情報を入手または提供することによって、同定することが可能である。
【０３７９】
互いにハイブリダイズするほど十分相補的な第１配列および第２配列を有するｉＲＮＡ
剤を提供することによって、標的遺伝子の発現を調節する、例えばダウンレギュレーションまたはサイレンシングすることが可能である。さらに、第１配列が第１の標的ＲＮＡ領域と相補的であり、かつ第２配列が第２の標的ＲＮＡ領域と相補的であってもよい。
【０３８０】
ｉＲＮＡ剤は、第１の変異体ＲＮＡ標的領域と相補的な第１配列、および第２の変異体ＲＮＡ標的領域と相補的な第２配列を含むことが可能である。この第１および第２の変異体ＲＮＡ標的領域は、標的遺伝子、例えばウイルス遺伝子、腫瘍抑制遺伝子またはがん遺伝子の第１および第２の変異体または突然変異体に対応するものでもよい。第１および第２の変異体ＲＮＡ標的領域は、標的遺伝子の対立遺伝子変異、突然変異（例えば点突然変異）、または多型を含んでいてもよい。第１および第２の変異体ＲＮＡ標的領域は、遺伝的ホット・スポットに対応していてもよい。
【０３８１】
複数のｉＲＮＡ剤（例えばパネルまたはバンク）を提供することも可能である。
【０３８２】
標準的なワトソン−クリック以外の二本鎖構造
ＲＮＡ、例えばｉＲＮＡ剤は、別のモノマー、例えば別の鎖上のモノマーと標準的なワトソンクリック以外の対合を形成することができるモノマー（例えば、本明細書中に記載するもの、ならびに２００３年４月２５日付けで出願された米国仮出願第６０／４６５，６６５号及び２００４年３月８日付けで出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０４／０７０７０号（これらはともに、参照により本明細書に援用される）に記載されるもの）を包含することができる。
【０３８３】
二本鎖のモノマー間の「標準的なワトソン−クリック以外の対合」の使用は、二本鎖のすべて又は一部の融解を制御（多くの場合は促進）するのに使用することができる。ｉＲＮＡ剤は、選択された位置又は制約された位置にモノマーを包含することができ、その結果、ｉＲＮＡ剤二本鎖における（例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤の２つの別個の分子間での）第１のレベルの安定性、及びｉＲＮＡ剤の配列と別の配列分子（例えば、対象者における標的配列又はオフターゲット（標的ではない）配列）との間の二本鎖における第２のレベルの安定性をもたらす。場合によっては、第２の二本鎖は、例えばｉＲＮＡ剤のアンチセンス配列と標的ｍＲＮＡとの間の二本鎖において、比較的高いレベルの安定性を有する。この場合、１つ又はそれ以上のモノマー、ｉＲＮＡ剤におけるモノマーの位置、及び標的配列（本明細書中では、選択パラメータ又は制約パラメータと称することもある）の選択は、ｉＲＮＡ剤二本鎖が比較的低い会合の自由エネルギーを有する（メカニズム又は理論により拘束されることを望まないが、このことはＲＩＳＣに関しては二本鎖ｉＲＮＡ剤の解離を促進することにより有効性に寄与すると考えられる）一方で、標的指向性のアンチセンス配列とその標的配列との間で形成される二本鎖が、比較的高い会合の自由エネルギーを有する（メカニズム又は理論により拘束されることを望まないが、このことはアンチセンス配列と標的ＲＮＡとの会合を促進することにより有効性に寄与すると考えられる）ようになされる。
【０３８４】
他の場合では、第２の二本鎖は、例えばｉＲＮＡ剤のセンス配列とオフターゲットｍＲＮＡとの間の二本鎖において、比較的低いレベルの安定性を有する。この場合、１つ又はそれ以上のモノマー、ｉＲＮＡ剤におけるモノマーの位置、及びオフターゲット配列の選択は、ｉＲＮＡ剤二本鎖が比較的高い会合の自由エネルギーを有する一方で、標的指向性のセンス配列とそのオフターゲット配列との間で形成される二本鎖が、比較的低い会合の自由エネルギーを有する（メカニズム又は理論により拘束されることを望まないが、センス鎖とオフターゲット配列から形成される二本鎖の解離を促進することにより有効性に寄与し、オフターゲット配列をサイレンシングするレベルを低減すると考えられる）ようになされる。
【０３８５】
したがって、ｉＲＮＡ剤内の二本鎖に関する第１の安定性、ならびにｉＲＮＡ剤由来の配列と別のＲＮＡ、例えば標的ｍＲＮＡとの間で形成される二本鎖に関する第２の安定性を有するという特性は、ｉＲＮＡ剤の構造において固有のものである。上述のように、この特性は、選択された位置又は制約された位置の１つ又はそれ以上のモノマーの慎重な選択、選択された位置又は制約された位置を設定するための二本鎖における位置の選択、及び標的配列の配列（例えば、標的とされるべき標的遺伝子の特定の領域）の選択により達成され得る。これらの要件を満たすｉＲＮＡ剤配列は、本明細書中では制約配列と称することもある。制約パラメータ又は選択パラメータは、例えば、検査により、あるいはコンピュータ支援方法により達成することができる。パラメータの使用により、例えば二本鎖の安定性又は相対安定性に関して所望の結果が得られるように、標的配列及び特定のモノマーを選択することができる。
【０３８６】
したがって、別の態様では、本発明は、第１の標的領域を標的とする第１の配列及び第２の標的領域を標的とする第２の配列を包含するｉＲＮＡ剤を特徴とする。第１の配列及び第２の配列は、例えば生理学的条件下で（例えば、生理学的条件下であるが、ヘリカーゼ又は他の巻き戻し酵素とは接触しない条件下で）互いにハイブリダイズするのに十分な相補性を有する。ｉＲＮＡ剤の二本鎖領域では、選択された位置又は制約された位置で、第１の標的領域が第１のモノマーを有し、第２の標的領域が第２のモノマーを有する。第１のモノマー及び第２のモノマーは、相補的位置又は対応する位置を占める。一方のモノマー、及び好ましくは両方のモノマーが、第１の配列と第２の配列との間での二本鎖に寄与するモノマーの対合の安定性が、第１の配列又は第２の配列と標的配列との間での対合の安定性と異なるように選択される。
【０３８７】
通常、モノマーは、ｉＲＮＡ剤配列と標的ＲＮＡ二本鎖との間の二本鎖におけるモノマーとその相補的モノマーとの対合により保有されるであろう解離の自由エネルギー及びＴｍよりも、低い解離の自由エネルギー及び低いＴｍを有するｉＲＮＡ剤二本鎖における対合をモノマーが形成するように選択される（標的配列の選択も同様に要求され得る）。
【０３８８】
モノマーに与えられる制約は、選択部位に、あるいは２個以上の選択部位に適用され得る。例えば、ｉＲＮＡ剤二本鎖において、２個以上であるが、３個未満、４個未満、５個未満、６個未満又は７個未満の部位に制約が適用され得る。
【０３８９】
制約部位又は選択部位は、ｉＲＮＡ剤二本鎖の多数の位置に存在することができる。例えば、制約部位又は選択部位は、二本鎖の配列の３’末端又は５’末端の一方から３位、４位、５位又は６位以内の位置に存在することができる。制約部位又は選択部位は、二本鎖領域の中央に存在することもでき、例えば、制約部位又は選択部位は、二本鎖の領域の末端から４位以上、５位以上、６位以上又は７位以上の位置であり得る。
【０３９０】
幾つかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤の二本鎖領域は、選択部位又は制約部位（単数又は複数）のほかに、ミスマッチを有する。好ましくは、ｉＲＮＡ剤の二本鎖領域は、標準的なワトソン−クリック対を形成しないか、又はハイブリダイズしない１個以下、２個以下、３個以下、４個以下又は５個以下の塩基を有する。突出部については、本明細書中の他の箇所で詳述しているが、好ましくは約２ヌクレオチド長である。突出部は、標的とされる遺伝子配列に対して相補的であってもよいし、又は他の配列でもよい。ＴＴは、突出部の好ましい配列である。第１のｉＲＮＡ剤配列及び第２のｉＲＮＡ剤配列はまた、例えばヘアピンを形成するための追加の塩基により、あるいは他の非塩基リンカーにより連結させることもできる。
【０３９１】
モノマーは、第１のモノマー及び第２のモノマーが天然に存在するリボヌクレオチド又は天然に存在する塩基を有する修飾リボヌクレオチドであるように、かつ、相補的部位を
占有する場合、対合もせず実質的レベルのＨ結合も有さないか、又は非標準的ワトソン−クリック対合を形成して非標準的なＨ結合のパターンを形成する（通常、標準的なワトソン−クリック対合で見られるよりも低い解離の自由エネルギーを有するか、あるいはそうでなければ予め選択した値の会合の自由エネルギー未満であるか、例えば標準的な対合の会合の自由エネルギーよりも低い会合の自由エネルギーとなるように対合する）ように選択することができる。ｉＲＮＡ剤の配列の一方（又は両方）が標的と二本鎖を形成する場合、第１の（又は第２の）モノマーは、標的上の相補的位置にある塩基と標準的なワトソン−クリック対合を形成するか、あるいはｉＲＮＡ剤における対合で見られるよりも高い解離の自由エネルギー及び高いＴｍを有する非標準的なワトソン−クリック対を形成する。古典的なワトソン−クリック対は、以下の通りである：Ａ−Ｔ、Ｇ−Ｃ及びＡ−Ｕ。非標準的なワトソン−クリック対合は、当該技術分野で既知であり、Ｕ−Ｕ、Ｇ−Ｇ、Ｇ−Ａトランス、Ｇ−Ａシス及びＧＵを挙げることができる。
【０３９２】
配列の一方又は両方におけるモノマーの選択は、モノマーが対合をしないか、あるいは他方の配列の対応するモノマーとの対を形成し、その対が安定性を最小限にする（例えば、一方の配列の選択部位のモノマーと他方の配列の対応する部位のモノマーとの間で形成されるＨ結合は、一方（又は両方）の配列のモノマーと各々の標的配列とにより形成されるＨ結合よりも安定性が劣る）ようになされる。一方又は両方の鎖におけるモノマーの選択はまた、鎖とその標的配列により作製される二本鎖の一方又は両方における安定性を促進するように為される。例えば、１つ又はそれ以上のモノマー及び標的配列の選択は、選択位置又は制約位置で、ｉＲＮＡ剤二本鎖中でＨ結合が形成されないか、もしくは非標準的な対合が形成されるか、あるいはそうでなければ予め選択した値の会合の自由エネルギー未満であるか、又は例えば標準的な対合の会合の自由エネルギーよりも低い会合の自由エネルギーを付与するように対合するが、一方（又は両方の）配列が各々の標的と二本鎖を形成する場合は、選択部位又は制約部位での対合は標準的なワトソン−クリック対であるようにすることができる。
【０３９３】
このようなモノマーを含むことにより、以下の１つ又はそれ以上の効果、すなわち：ｉＲＮＡ剤二本鎖を不安定化すること、センス配列と意図されない標的配列（オフターゲット配列と称することもある）との間の相互作用を不安定化すること、配列と意図される標的との間の相互作用は不安定化されないこと、を有することになる。
【０３９４】
例を挙げる。
【０３９５】
第１の配列の選択部位のモノマーは、Ａ（又はＴと対合する修飾塩基）を含み、第２の配列の選択位置のモノマーは、対合しないか、又は非標準的な対合を形成するモノマー（例えば、Ｇ）から選ばれる。これらは、第１の配列の標的配列が選択位置にＴを有する場合の用途において有用である。標的二本鎖がともに安定化される実施形態では、第２の鎖の標的配列が、第２の鎖の選択位置に関して選択されるモノマーと標準的なワトソン−クリック対を形成するモノマーを有する場合に有用である。
【０３９６】
第１の配列の選択部位のモノマーは、Ｕ（又はＡと対合する修飾塩基）を含み、第２の配列の選択位置のモノマーは、対合しないか、又は非標準的な対合を形成するモノマー（例えば、Ｕ又はＧ）から選ばれる。これらは、第１の配列の標的配列が選択位置にＴを有する場合の用途において有用である。標的二本鎖がともに安定化される実施形態では、第２の鎖の標的配列が、第２の鎖の選択位置に関して選択されるモノマーと標準的なワトソン−クリック対を形成するモノマーを有する場合に有用である。
【０３９７】
第１の配列の選択部位のモノマーは、Ｇ（又はＣと対合する修飾塩基）を含み、第２の配列の選択位置のモノマーは、対合しないか、又は非標準的な対合を形成するモノマー（
例えば、Ｇ、Ａシス、Ａトランス、又はＵ）から選ばれる。これらは、第１の配列の標的配列が選択位置にＴを有する場合の用途において有用である。標的二本鎖がともに安定化される実施形態では、第２の鎖に関する標的配列が、第２の鎖の選択位置に関して選択されるモノマーと標準的なワトソン−クリック対を形成するモノマーを有する場合に有用である。
【０３９８】
第１の配列の選択部位のモノマーは、Ｃ（又はＧと対合する修飾塩基）を含み、第２の配列の選択位置のモノマーは、対合しないか、又は非標準的な対合を形成するモノマーから選ばれる。これらは、第１の配列の標的配列が選択位置にＴを有する場合の用途において有用である。標的二本鎖がともに安定化される実施形態では、第２の鎖に関する標的配列が、第２の鎖の選択位置に関して選択されるモノマーと標準的なワトソン−クリック対を形成するモノマーを有する場合に有用である。
【０３９９】
天然に存在しないモノマー又は修飾モノマー（単数又は複数）の選択は、天然に存在しないモノマー又は修飾モノマーがｉＲＮＡ剤の選択位置又は制約位置に配置される場合は第１の解離の自由エネルギーを示し、かつそれらの一方（又は両方）が天然に存在するモノマーと対合する場合は、対が第２の解離の自由エネルギーを示す（通常、第２の解離の自由エネルギーは、第１のモノマーと第２のモノマーの対合の解離の自由エネルギーよりも高い）ように実施することができる。例えば、第１のモノマー及び第２のモノマーが相補的位置を占める場合、第１のモノマー及び第２のモノマーは、対合もせず、実質的レベルのＨ結合も有さないか、又は、該モノマーの一方が天然に存在するモノマーと形成するよりも弱い結合を形成して、その二本鎖の安定性を低減するが、その二本鎖が解離すると、少なくとも一方の鎖は標的と二本鎖を形成し、標的との二本鎖においては、選択モノマーは安定性を促進する（例えばモノマーは、標的配列中の天然に存在するモノマーと、ｉＲＮＡ剤において形成される対合よりも安定な対を形成する）。
【０４００】
このような対の例は、２−アミノＡ、及びＵ又はＴの２−チオピリミジン類縁体のいずれかである。
【０４０１】
ｉＲＮＡ剤の相補的位置に配置される場合、これらのモノマーはほとんど対合せず、安定性は最小限となる。しかしながら、２−アミノＡと天然に存在する標的のＵとの間で二本鎖が形成されるか、あるいは、２−チオＵと天然に存在する標的のＡとの間、又は２−チオＴと天然に存在する標的のＡとの間で二本鎖が形成され、比較的高い解離の自由エネルギーを有し、かつより安定となる。これを、図１に示す。
【０４０２】
図１に示す対（２−アミノＡならびに２−ｓＵ及びＴ）は例示的なものである。別の実施形態では、センス鎖の選択位置のモノマーは、普遍的に対合する構成部分であり得る。普遍的に対合する物質は、２個以上、好ましくはすべての天然に存在するモノマーとある程度のレベルのＨ結合を形成する。普遍的に対合する部分の例は、３−ニトロピロールを含むモノマーである。（普遍的な塩基類縁体の他の候補は、例えばロークス（Ｌｏａｋｅｓ）、２００１年、ＮＡＲ  ２９：２４３７〜２４４７ページ（参照により本明細書に援用される）に見出すことができる。例はまた、以下の普遍的塩基に関するセクションに見出すことができる。）これらの場合、アンチセンス鎖の対応する位置のモノマーは、標的と二本鎖を形成するその能力に応じて選ぶことができ、例えばＡ、Ｕ、Ｇ又はＣを挙げることができる。
【０４０３】
本発明のｉＲＮＡ剤は、以下のものを包含することができる：
好ましくは対象中に存在する配列を標的としないセンス配列、及び対象中の標的遺伝子を標的とするアンチセンス配列。センス配列及びアンチセンス配列は、例えば生理学的条件下で（例えば生理学的条件下であるが、ヘリカーゼ又は他の巻き戻し酵素とは接触しな
い条件下で）互いにハイブリダイズするのに十分な相補性を有する。ｉＲＮＡ剤の二本鎖領域では、選択位置又は制約位置について、モノマーは以下を満たすように選択される：
センス配列のモノマーは、該モノマーが対合しないか、あるいはアンチセンス鎖の対応するモノマーと安定性を最小限にするような対を形成する（例えば、センス配列における選択部位のモノマーとアンチセンス鎖の対応する部位のモノマーとの間で形成されるＨ結合は、アンチセンス配列のモノマーとその標準的なワトソン−クリックパートナー（アンチセンス鎖中のモノマーが修飾塩基を含む場合には、該修飾塩基の天然型類縁体とその標準的なワトソン−クリックパートナー）により形成されるＨ結合よりも安定性が劣る）ように選択されること；
アンチセンス鎖の対応する位置のモノマーは、該モノマーが標的配列とともに形成する二本鎖の安定性を最大限にすること、例えば、該モノマーが標的鎖上の対応する位置のモノマーと標準的なワトソン−クリック対を形成するように選択されること；
任意選択で、センス配列のモノマーは、該モノマーが対合しないか、あるいはアンチセンス鎖の対応するモノマーと、オフターゲット配列との安定性を最小限にするような対を形成すること。
【０４０４】
このようなモノマーを含むことにより、以下の１つ又はそれ以上の効果、すなわち、ｉＲＮＡ剤二本鎖を不安定化すること、センス配列と意図されない標的配列（オフターゲット配列と称することもある）との間の相互作用を不安定化すること、アンチセンス配列と意図される標的との間の二本鎖相互作用は不安定化されないこと、を有することになる。
【０４０５】
モノマーに与えられる制約は、選択部位に、あるいは２個以上の選択部位に適用され得る。例えば、ｉＲＮＡ剤二本鎖において、２個以上であるが、３個未満、４個未満、５個未満、６個未満又は７個未満の部位に制約が適用され得る。
【０４０６】
制約部位又は選択部位は、ｉＲＮＡ剤二本鎖の多数の位置に存在することができる。例えば、制約部位又は選択部位は、二本鎖の配列の３’末端又は５’末端の一方から３位、４位、５位又は６位以内の位置に存在することができる。制約部位又は選択部位は、二本鎖領域の中央に存在することも可能であり、例えば、制約部位又は選択部位は、二本鎖の領域の末端から４位以上、５位以上、６位以上又は７位以上の位置であり得る。
【０４０７】
幾つかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤の二本鎖領域は、選択部位又は制約部位（単数又は複数）のほかに、ミスマッチを有する。好ましくは、ｉＲＮＡ剤の二本鎖領域は、標準的なワトソン−クリック対を形成しないか、又はハイブリダイズしない１個以下、２個以下、３個以下、４個以下又は５個以下の塩基を有する。突出部については、本明細書中の他の箇所で詳述しているが、好ましくは約２ヌクレオチド長である。突出部は、標的とされる遺伝子配列に対して相補的であってもよいし、又は他の配列でもよい。ＴＴは、突出部の好ましい配列である。第１のｉＲＮＡ剤配列及び第２のｉＲＮＡ剤配列はまた、例えばヘアピンを形成するための追加の塩基により、あるいは他の非塩基リンカーにより連結させることができる。
【０４０８】
モノマーは、第１のモノマー及び第２のモノマーが天然に存在するリボヌクレオチド又は天然に存在する塩基を有する修飾リボヌクレオチドであるように、かつ、相補的部位を占有する場合、対合もせず実質的レベルのＨ結合も有さないか、又は非標準的ワトソン−クリック対合を形成して非標準的なＨ結合のパターンを形成する（通常、標準的なワトソン−クリック対合で見られるよりも低い解離の自由エネルギーを有するか、あるいはそうでなければ予め選択した値の会合の自由エネルギー未満であるか、例えば標準的な対合の会合の自由エネルギーよりも低い会合の自由エネルギーとなるように対合する）ように選択することができる。ｉＲＮＡ剤の配列の一方（又は両方）が標的と二本鎖を形成する場合、第１の（又は第２の）モノマーは、標的上の相補的位置にある塩基と標準的なワトソ
ン−クリック対合を形成するか、あるいはｉＲＮＡ剤における対合で見られるよりも高い解離の自由エネルギー及び高いＴｍを有する非標準的なワトソン−クリック対を形成する。古典的なワトソン−クリック対は、以下の通りである：Ａ−Ｔ、Ｇ−Ｃ及びＡ−Ｕ。非標準的なワトソン−クリック対合は、当該技術分野で既知であり、Ｕ−Ｕ、Ｇ−Ｇ、Ｇ−Ａトランス、Ｇ−Ａシス及びＧＵを挙げることができる。
【０４０９】
配列の一方又は両方におけるモノマーの選択は、モノマーが対合をしないか、あるいは他方の配列の対応するモノマーとの対を形成し、その対が安定性を最小限にする（例えば、一方の配列の選択部位のモノマーと他方の配列の対応する部位のモノマーとの間で形成されるＨ結合は、一方（又は両方）の配列のモノマーと各々の標的配列とにより形成されるＨ結合よりも安定性が劣る）ようになされる。一方又は両方の鎖におけるモノマーの選択はまた、鎖とその標的配列により作製される二本鎖の一方又は両方における安定性を促進するように為される。例えば、１つ又はそれ以上のモノマー及び標的配列の選択は、選択位置又は制約位置で、ｉＲＮＡ剤二本鎖中でＨ結合が形成されないか、もしくは非標準的な対合が形成されるか、あるいはそうでなければ予め選択した値の会合の自由エネルギー未満であるか、又は例えば標準的な対合の会合の自由エネルギーよりも低い会合の自由エネルギーを付与するように対合するが、一方（又は両方の）配列が各々の標的と二本鎖を形成する場合は、選択部位又は制約部位での対合は標準的なワトソン−クリック対であるようにすることができる。
【０４１０】
このようなモノマーを含むことにより、以下の１つ又はそれ以上の効果、すなわち：ｉＲＮＡ剤二本鎖を不安定化すること、センス配列と意図されない標的配列（オフターゲット配列と称することもある）との間の相互作用を不安定化すること、配列と意図される標的との間の相互作用は不安定化されないこと、を有することになる。
【０４１１】
例を挙げる。
【０４１２】
第１の配列の選択部位のモノマーは、Ａ（又はＴと対合する修飾塩基）を含み、第２の配列の選択位置のモノマーは、対合しないか、又は非標準的な対合を形成するモノマー（例えば、Ｇ）から選ばれる。これらは、第１の配列の標的配列が選択位置にＴを有する場合の用途において有用である。標的二本鎖がともに安定化される実施形態では、第２の鎖の標的配列が、第２の鎖の選択位置に関して選択されるモノマーと標準的なワトソン−クリック対を形成するモノマーを有する場合に有用である。
【０４１３】
第１の配列の選択部位のモノマーは、Ｕ（又はＡと対合する修飾塩基）を含み、第２の配列の選択位置のモノマーは、対合しないか、又は非標準的な対合を形成するモノマー（例えば、Ｕ又はＧ）から選ばれる。これらは、第１の配列の標的配列が選択位置にＴを有する場合の用途において有用である。標的二本鎖がともに安定化される実施形態では、第２の鎖の標的配列が、第２の鎖の選択位置に関して選択されるモノマーと標準的なワトソン−クリック対を形成するモノマーを有する場合に有用である。
【０４１４】
第１の配列の選択部位のモノマーは、Ｇ（又はＣと対合する修飾塩基）を含み、第２の配列の選択位置のモノマーは、対合しないか、又は非標準的な対合を形成するモノマー（例えば、Ｇ、Ａシス、Ａトランス、又はＵ）から選ばれる。これらは、第１の配列の標的配列が選択位置にＴを有する場合の用途において有用である。標的二本鎖がともに安定化される実施形態では、第２の鎖に関する標的配列が、第２の鎖の選択位置に関して選択されるモノマーと標準的なワトソン−クリック対を形成するモノマーを有する場合に有用である。
【０４１５】
第１の配列の選択部位のモノマーは、Ｃ（又はＧと対合する修飾塩基）を含み、第２の
配列の選択位置のモノマーは、対合しないか、又は非標準的な対合を形成するモノマーから選ばれる。これらは、第１の配列の標的配列が選択位置にＴを有する場合の用途において有用である。標的二本鎖がともに安定化される実施形態では、第２の鎖に関する標的配列が、第２の鎖の選択位置に関して選択されるモノマーと標準的なワトソン−クリック対を形成するモノマーを有する場合に有用である。
【０４１６】
天然に存在しないモノマー又は修飾モノマー（単数又は複数）の選択は、天然に存在しないモノマー又は修飾モノマーがｉＲＮＡ剤の選択位置又は制約位置に配置される場合は第１の解離の自由エネルギーを示し、かつそれらの一方（又は両方）が天然に存在するモノマーと対合する場合は、対が第２の解離の自由エネルギーを示す（通常、第２の解離の自由エネルギーは、第１のモノマーと第２のモノマーの対合の解離の自由エネルギーよりも高い）ように実施することができる。例えば、第１のモノマー及び第２のモノマーが相補的位置を占める場合、第１のモノマー及び第２のモノマーは、対合もせず、実質的レベルのＨ結合も有さないか、又は、該モノマーの一方が天然に存在するモノマーと形成するよりも弱い結合を形成して、その二本鎖の安定性を低減するが、その二本鎖が解離すると、少なくとも一方の鎖は標的と二本鎖を形成し、標的との二本鎖においては、選択モノマーは安定性を促進する（例えばモノマーは、標的配列中の天然に存在するモノマーと、ｉＲＮＡ剤において形成される対合よりも安定な対を形成する）。
【０４１７】
このような対の例は、２−アミノＡ、及びＵ又はＴの２−チオピリミジン類縁体のいずれかである。
【０４１８】
ｉＲＮＡ剤の相補的位置に配置される場合、これらのモノマーはほとんど対合せず、安定性は最小限となる。しかしながら、２−アミノＡと天然に存在する標的のＵとの間で二本鎖が形成されるか、あるいは、２−チオＵと天然に存在する標的のＡとの間、又は２−チオＴと天然に存在する標的のＡとの間で二本鎖が形成され、比較的高い解離の自由エネルギーを有し、かつより安定となる。
【０４１９】
センス鎖の選択位置のモノマーは、普遍的に対合する構成部分であり得る。普遍的に対合する物質は、２個以上、好ましくはすべての天然に存在するモノマーとある程度のレベルのＨ結合を形成する。普遍的に対合する部分の例は、３−ニトロピロールを含むモノマーである。（普遍的な塩基類縁体の他の候補は、例えばロークス（Ｌｏａｋｅｓ）、２００１年、ＮＡＲ  ２９：２４３７〜２４４７ページ（参照により本明細書に援用される）に見出すことができる。例はまた、以下の普遍的塩基に関するセクションに見出すことができる。）これらの場合、アンチセンス鎖の対応する位置のモノマーは、標的と二本鎖を形成するその能力に応じて選ぶことができ、例えばＡ、Ｕ、Ｇ又はＣを挙げることができる。
【０４２０】
本発明のｉＲＮＡ剤は、以下のものを包含することができる：
好ましくは対象中に存在する配列を標的としないセンス配列、及び対象中の標的遺伝子を標的とするアンチセンス配列。センス配列及びアンチセンス配列は、例えば生理学的条件下で（例えば生理学的条件下であるが、ヘリカーゼ又は他の巻き戻し酵素とは接触しない条件下で）互いにハイブリダイズするのに十分な相補性を有する。ｉＲＮＡ剤の二本鎖領域では、選択位置又は制約位置について、モノマーは以下を満たすように選択される：
センス配列のモノマーは、該モノマーが対合しないか、あるいはアンチセンス鎖の対応するモノマーと安定性を最小限にするような対を形成する（例えば、センス配列における選択部位のモノマーとアンチセンス鎖の対応する部位のモノマーとの間で形成されるＨ結合は、アンチセンス配列のモノマーとその標準的なワトソン−クリックパートナー（アンチセンス鎖中のモノマーが修飾塩基を含む場合には、該修飾塩基の天然型類縁体とその標準的なワトソン−クリックパートナー）により形成されるＨ結合よりも安定性が劣る）よ
うに選択されること；
アンチセンス鎖の対応する位置のモノマーは、該モノマーが標的配列とともに形成する二本鎖の安定性を最大限にすること、例えば、該モノマーが標的鎖上の対応する位置のモノマーと標準的なワトソン−クリック対を形成するように選択されること；
任意選択で、センス配列のモノマーは、該モノマーが対合しないか、あるいはアンチセンス鎖の対応するモノマーと、オフターゲット配列との安定性を最小限にするような対を形成すること。
【０４２１】
このようなモノマーを含むことにより、以下の１つ又はそれ以上の効果、すなわち、ｉＲＮＡ剤二本鎖を不安定化すること、センス配列と意図されない標的配列（オフターゲット配列と称することもある）との間の相互作用を不安定化すること、アンチセンス配列と意図される標的との間の二本鎖相互作用は不安定化されないこと、を有することになる。
【０４２２】
モノマーに与えられる制約は、選択部位に、あるいは２個以上の選択部位に適用され得る。例えば、ｉＲＮＡ剤二本鎖において、２個以上であるが、３個未満、４個未満、５個未満、６個未満又は７個未満の部位に制約が適用され得る。
【０４２３】
制約部位又は選択部位は、ｉＲＮＡ剤二本鎖の多数の位置に存在することができる。例えば、制約部位又は選択部位は、二本鎖の配列の３’末端又は５’末端の一方から３位、４位、５位又は６位以内の位置に存在することができる。制約部位又は選択部位は、二本鎖領域の中央に存在することも可能であり、例えば、制約部位又は選択部位は、二本鎖の領域の末端から４位以上、５位以上、６位以上又は７位以上の位置であり得る。
【０４２４】
ｉＲＮＡ剤は、本明細書中に記載する任意の遺伝子を含む広範囲の遺伝子を標的とするように選択することができる。
【０４２５】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、本明細書中に記載する構成様式を有する（構成様式とは、全体の長さ、二本鎖領域の長さ、突出部の存在、数、位置又は長さ、二本鎖の形態に対する単鎖の形態のうち、１つ又はそれ以上を指す）。
【０４２６】
例えば、ｉＲＮＡ剤は、３０ヌクレオチド長未満、例えば２１〜２３ヌクレオチド長であり得る。好ましくは、ｉＲＮＡは２１ヌクレオチド長であり、約１９対の二本鎖領域が存在する。一実施形態では、ｉＲＮＡは、２１ヌクレオチド長であり、ｉＲＮＡの二本鎖領域は１９ヌクレオチド長である。別の実施形態では、ｉＲＮＡは３０ヌクレオチド長を上回る。
【０４２７】
幾つかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤の二本鎖領域は、選択部位又は制約部位（単数又は複数）のほかに、ミスマッチを有する。好ましくは、ｉＲＮＡ剤の二本鎖領域は、標準的なワトソン−クリック対を形成しないか、又はハイブリダイズしない１個以下、２個以下、３個以下、４個以下又は５個以下の塩基を有する。突出部については、本明細書中の他の箇所で詳述しているが、好ましくは約２ヌクレオチド長である。突出部は、標的とされる遺伝子配列に対して相補的であってもよいし、又は他の配列でもよい。ＴＴは、突出部の好ましい配列である。第１のｉＲＮＡ剤配列及び第２のｉＲＮＡ剤配列はまた、例えばヘアピンを形成するための追加の塩基により、あるいは他の非塩基リンカーにより連結させることができる。
【０４２８】
１つ又はそれ以上の選択パートナー又は制約パートナーは、センス配列及びアンチセンス配列の選択部位のモノマーがいずれも天然に存在するリボヌクレオチド又は天然に存在する塩基を有する修飾リボヌクレオチドであり、かつｉＲＮＡ剤二本鎖において相補的部位を占める場合、対合もせず、実質的レベルのＨ結合も有さないか、又は非標準的ワトソ
ン−クリック対を形成して非標準的なパターンのＨ結合を形成する（この非標準的ワトソン−クリック対は通常、ワトソン−クリック対合で見られるよりも低い解離の自由エネルギーを有するか、あるいはそうでなければ予め選択した値の会合の自由エネルギー未満であるか、又は例えば標準的な対合の会合の自由エネルギーよりも低い会合の自由エネルギーを付与するように対合する）ように使用することができる。ｉＲＮＡ剤の配列のうちの一方、通常アンチセンス配列が、別の配列、通常は対象中に存在する配列、及び一般に標的配列と二本鎖を形成する場合、モノマーは、標的上の相補的位置の塩基と古典的なワトソン−クリック対を形成するか、あるいはｉＲＮＡ剤における対合で見られるよりも高い解離の自由エネルギー及び高いＴｍを有する非標準的なワトソン−クリック対を形成する。任意選択で、ｉＲＮＡ剤の他方の配列、通常センス配列が、別の配列、通常は対象中に存在する配列、及び一般にオフターゲット配列と二本鎖を形成する場合、モノマーは、オフターゲット配列上の相補的位置の塩基と標準的なワトソン−クリック対を形成することができず、例えば、モノマーは、より低い解離の自由エネルギー及びより低いＴｍを有する非標準的なワトソン−クリック対を形成する。
【０４２９】
例を挙げる。
【０４３０】
アンチセンス鎖における選択部位のモノマーはＡ（又はＴと対合する修飾塩基）を含み、標的における対応するモノマーはＴであり、センス鎖は、対合しないか、又は非標準的な対を形成する塩基から選ばれる（例えば、Ｇ）；
アンチセンス鎖における選択部位のモノマーはＵ（又はＡと対合する修飾塩基）を含み、標的における対応するモノマーはＡであり、センス鎖は、対合しないか、又は非標準的な対を形成する塩基から選ばれる（例えば、Ｕ又はＧ）；
アンチセンス鎖における選択部位のモノマーはＣ（又はＧと対合する修飾塩基）を含み、標的における対応するモノマーはＧであり、センス鎖は、対合しないか、又は非標準的な対を形成する塩基から選ばれる（例えば、Ｇ、Ａシス、Ａトランス又はＵ）；または、
アンチセンス鎖における選択部位のモノマーはＧ（又はＣと対合する修飾塩基）を含み、標的における対応するモノマーはＣであり、センス鎖は、対合しないか、又は非標準的な対を形成する塩基から選ばれる。
【０４３１】
別の実施形態では、天然に存在しないモノマー又は修飾モノマー（単数又は複数）は、該モノマーがｉＲＮＡ剤における相補的な位置を占める場合は第１の解離の自由エネルギーを示し、かつそれらの一方（又は両方）が天然に存在するモノマーと対合する場合は、その対は第２の解離の自由エネルギーを示す（通常、第２の解離の自由エネルギーは、第１のモノマーと第２のモノマーの対合の解離の自由エネルギーよりも高い）ように選ばれる。例えば、第１のモノマー及び第２のモノマーが相補的位置を占める場合、第１のモノマー及び第２のモノマーは、対合もせず、実質的レベルのＨ結合も有さないか、又は該モノマーの一方が天然に存在するモノマーと形成するよりも弱い結合を形成して、その二本鎖の安定性を低減するが、二本鎖が解離すると、少なくとも１つの鎖は標的と二本鎖を形成し、標的との二本鎖においては選択モノマーが安定性を促進する（例えばモノマーは、標的配列中の天然に存在するモノマーとともに、ｉＲＮＡ剤において形成される対合よりも安定な対を形成する）。
【０４３２】
このような対の例は、２−アミノＡ、及びＵもしくはＴの２−チオピリミジン類縁体のいずれかである。上述のように、ｉＲＮＡ剤の相補的位置に配置される場合、これらのモノマーは、ほとんど対合せず、安定性は最小限となる。しかしながら、二本鎖は、２−アミノＡと天然に存在する標的のＵとの間で形成されるか、あるいは二本鎖は、２−チオＵと天然に存在する標的のＡとの間、又は２−チオＴと天然に存在する標的のＡとの間で形成され、比較的高い解離の自由エネルギーを有し、かつより安定である。
【０４３３】
センス鎖の選択位置のモノマーは、普遍的に対合する構成部分であり得る。普遍的に対合する物質は、２個以上、好ましくはすべての天然に存在するモノマーとある程度のレベルのＨ結合を形成する。普遍的に対合する部分の例は、３−ニトロピロールを含むモノマーである。普遍的な塩基類縁体の他の候補は、例えばロークス（Ｌｏａｋｅｓ）、２００１年、ＮＡＲ  ２９：２４３７〜２４４７ページ（参照により本明細書に援用される）に見出すことができる。これらの場合、アンチセンス鎖の対応する位置のモノマーは、標的と二本鎖を形成するその能力に応じて選ぶことができ、例えばＡ、Ｕ、Ｇ又はＣを挙げることができる。
【０４３４】
別の態様では、本発明は、以下のものを包含するｉＲＮＡ剤を特徴とする：
好ましくは対象者中に存在する配列を標的としないセンス配列、及び対象者中の複数の標的遺伝子を標的とするアンチセンス配列（ここで、標的の配列は、１位のみ又は少数、例えば５個以下、４個以下、３個以下又は２個以下の位置で異なっている）。該センス配列及びアンチセンス配列は、例えば生理学的条件下で（例えば生理学的条件下であるが、ヘリカーゼ又は他の巻き戻し酵素とは接触しない条件下で）互いにハイブリダイズするのに十分な相補性を有する。ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖の配列は、標的配列間で配列が異なる位置に相当する位置のうち１つ、幾つか又はすべてについて、アンチセンス鎖が、少なくとも２つの異なる標的配列とＨ結合を形成するモノマーを含むように選択される。好ましい例では、アンチセンス配列は、普遍的モノマー又は無差別に対合するモノマー、例えば５−ニトロピロール、２−アミノＡ、２−チオＵ又は２−チオＴ、あるいは本明細書中で言及する他の普遍的塩基を包含するモノマーを含む。
【０４３５】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、単一の遺伝子、複数の遺伝子又はウイルスゲノム（例えば、ＨＣＶゲノム）中の反復配列（互いに１部位のみ又は少数の部位が異なる反復配列）を標的とする。
【０４３６】
一実施形態を図２及び図３に示す。
【０４３７】
別の態様では、本発明は、例えば測定又は計算により、ｉＲＮＡ剤二本鎖における選択位置又は制約位置のモノマーの間の対合の安定性を決定すること、かつ好ましくは、ｉＲＮＡ剤由来の配列と別のＲＮＡ（例えば、標的配列）との間の二本鎖における対応する対合の安定性を決定することを特徴とする。決定の結果を、比較することができる。したがって、分析したｉＲＮＡ剤を、さらに修飾したＲＮＡ剤の開発に使用することもできるし、あるいは対象に投与することもできる。このような分析は、最適化されたｉＲＮＡ剤を洗練又は設計するために引き続いて実施することができる。
【０４３８】
別の態様では、本発明は、１つ又はそれ以上の本明細書中以下に記載するｉＲＮＡと、該ｉＲＮＡ剤が封入される滅菌容器と、使用に関する説明書とを含むキットを特徴とする。
【０４３９】
別の態様では、本明細書中に記載する方法により作製される制約配列を含有するｉＲＮＡ剤を特徴とする。該ｉＲＮＡ剤は、本明細書中で言及する１つ又はそれ以上の遺伝子を標的とすることができる。
【０４４０】
例えば本明細書中に記載するような制約部位又は選択部位を有するｉＲＮＡ剤は、本明細書中に記載する任意の方法で使用することができる。したがって、例えば本明細書中に記載するような制約部位又は選択部位を有するｉＲＮＡ剤は、例えば本明細書中に記載する方法のいずれかにおいて標的をサイレンシングするために、また本明細書中に記載する遺伝子のいずれかを標的とするために、あるいは本明細書中に記載する障害のいずれかを治療するために使用することができる。例えば本明細書中に記載するような制約部位又は
選択部位を有するｉＲＮＡ剤は、任意の製剤又は調製物、例えば本明細書中に記載する医薬品又は滅菌調製物に組み込むことができる。例えば本明細書中に記載する制約部位又は選択部位を有するｉＲＮＡ剤は、本明細書中に記載する投与経路のいずれかにより投与することができる。
【０４４１】
「標準的なワトソン−クリック以外の対合」という用語は、本明細書中で使用する場合、二本鎖の第１の配列の第１のモノマーと第２の配列の対応する位置の第２のモノマーとの間での対合であって、下記のうち１つまたはそれ以上が事実であるものを指す：（１）該２つのモノマーの間に本質的に対合が存在しない、例えばモノマー間に有意なレベルのＨ結合が存在しないか、あるいはモノマー間の結合が二本鎖の安定性に対していかなる有意な寄与もしていない、（２）該モノマーが、天然に存在する塩基を有する非標準的なモノマー対である、すなわち、Ａ−Ｔ、Ａ−Ｕ又はＧ−Ｃ以外であり、かつ該モノマーは、モノマー間のＨ結合を形成するが、概して形成されるＨ結合パターンは、標準的な対合により形成される結合よりも弱い、あるいは（３）該モノマーの少なくとも１つは天然に存在しない塩基を包含し、かつモノマー間で形成されるＨ結合は、好ましくは、標準的な対合すなわちＡ−Ｔ、Ａ−Ｕ、Ｇ−Ｃのうち１つ又はそれ以上により形成される結合よりも弱い。
【０４４２】
「オフターゲット」という用語は、本明細書中で使用する場合、サイレンシングされるべき配列以外の配列を指す。
【０４４３】
普遍的塩基：「ワイルドカード」；形状に基づいた相補性
（「ジフルオロトルエンとアデニンとの間の塩基対の、二本鎖の多重部位における複製：「逆」シーケンシングによる確認（Bi-stranded, multisite replication of a base pair between difluorotoluene and adenine: confirmation by 'inverse' sequencing.）」、リウ、ディー；モラン、エス；クール、イー．ティー（Ｌｉｕ，Ｄ．；Ｍｏｒａｎ，Ｓ；Ｋｏｏｌ，Ｅ．Ｔ．）、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、１９９７年、第４巻、９１９〜９２６ページ）
【０４４４】
【化２５】
0005881970.tif 000028
【０４４５】
（「ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片による３’末端プルーフリーディングにおける末端塩基対水素結合の重要性（Importance of terminal base pair hydrogen-bonding in 3'-end proofreading by the Klenow fragment of DNA polymerase I.）」、モラレス、ジェー．シー；クール、イー．ティー（Ｍｏｒａｌｅｓ，Ｊ．Ｃ；Ｋｏｏｌ，Ｅ．Ｔ．）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０００年、第３９巻、２６２６〜２６３２ページ）
（「水素結合を伴わない選択的かつ安定なＤＮＡ塩基対合（Selective and stable DNAbase pairing without hydrogen bonds. ）」、マトレイ、ティー、ジェー；クール、イ
ー、ティー（Ｍａｔｒａｙ，Ｔ．Ｊ；Ｋｏｏｌ，Ｅ．Ｔ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９８年、第１２０巻、６１９１〜６１９２ページ）
【０４４６】
【化２６】
0005881970.tif 000029
【０４４７】
（「チミンに関する無極性同配体であるジフルオロトルエンは、ＤＮＡ複製において特異的かつ効率的にアデニンをコードする（Difluorotoluene, a nonpolar isostere for thymine, codes specifically and efficiently for adenine in DNA replication.）」、モラン、Ｓ；レン、アール．エックス．−エフ；ラムネイ  アイブイ、エス；クール、イー．ティー（Ｍｏｒａｎ，Ｓ．Ｒｅｎ，Ｒ．Ｘ．−Ｆ；Ｒｕｍｎｅｙ  ＩＶ，Ｓ；Ｋｏｏｌ，Ｅ．Ｔ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９７年、第１１９巻、２０５６〜２０５７ページ）
（「デオキシアデノシンに関する複製可能な無極性同配体の構造及び塩基対特性（Structure and base pairing properties of replicable nonpolar isostere for deoxyadenosine. ）」、グクキアン、ケー．エム；モラレス、イー．ティー（Ｇｕｃｋｉａｎ，Ｋ．Ｍ．；Ｍｏｒａｌｅｓ，Ｊ．Ｃ．；Ｋｏｏｌ，Ｅ．Ｔ．）、Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１９９８年、第６３巻９６５３〜９６５６ページ）
【０４４８】
【化２７】
0005881970.tif 000030
【０４４９】
【化２８】
0005881970.tif 000031
【０４５０】
（「ハイブリダイゼーション、複製及び鎖終結用の普遍的塩基（Universal bases for hybridization, replication and chain termination. ）」、バーガー、エム；ウー．ワイ．；オガワ、エー．ケー．；マクミン、ディー．エル．；シュルツ、ピー．ジー．；ロメスベルグ、エフ．イー．（Ｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．；Ｗｕ．Ｙ．；Ｏｇａｗａ，Ａ．Ｋ．；ＭｃＭｉｎｎ，Ｄ．Ｌ．；Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．；Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ，Ｆ．Ｅ．）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２０００年、第２８巻、２９１１〜２９１４ページ）
【０４５１】
【化２９】
0005881970.tif 000032
【０４５２】
（１．「遺伝子アルファベットの拡大に対する取り組み：非天然の疎水性塩基対による情報保存及び複製（Efforts toward expansion of the genetic alphabet: Information storage and replication with unnatural hydrophobic base pairs.）」、オガワ、エー
．ケー．；ウー．ワイ．；マクミン、ディー．エル．；リウ、ジェー．；シュルツ、ピー．ジー．；ロメスベルグ、エフ．イー．（Ｏｇａｗａ，Ａ．Ｋ．；Ｗｕ．Ｙ．；ＭｃＭｉｎｎ，Ｄ．Ｌ．；Ｌｉｕ，Ｊ．；Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．；Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ，Ｆ．Ｅ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２０００年、第１２２巻、３２７４〜３２８７ページ。２．「動力学的選択性の増大による非天然塩基対の合理的設計（Rational design of an unnatural base pair with increased kinetic selectivity. ）」、オガワ、エー．ケー．；ウー．ワイ．；バーガー、エム；シュルツ、ピー．ジー．；ロメスベルグ、エフ．イー．（Ｏｇａｗａ，Ａ．Ｋ．；Ｗｕ．Ｙ．；Ｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．；Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．；Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ，Ｆ．Ｅ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２０００年、第１２２巻、８８０３〜８８０４ページ）
【０４５３】
【化３０】
0005881970.tif 000033
【０４５４】
（「遺伝子アルファベットの拡大に対する取り組み：３つの塩基対によるＤＮＡの複製（Efforts toward expansion of the genetic alphabet: replication of DNA with three base pairs. ）」、タエ、イー．エル．；ウー．ワイ．；キシア、ジー．；シュルツ、ピー．ジー．；ロメスベルグ、エフ．イー．（Ｔａｅ，Ｅ．Ｌ．；Ｗｕ．Ｙ．；Ｘｉａ，Ｇ．；Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．；Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ，Ｆ．Ｅ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２００１年、第１２３巻、７４３９〜７４４０ページ）
【０４５５】
【化３１】
0005881970.tif 000034
【０４５６】
（１．「遺伝子アルファベットの拡大に対する取り組み：塩基間疎水性相互作用の最適化（Eff orts toward expansion of the genetic alphabet: Optimization of interbase
hydrophobic interactions. ）」、ウー．ワイ．；オガワ、エー．ケー．；バーガー、
エム；マクミン、ディー．エル．；シュルツ、ピー．ジー．；ロメスベルグ、エフ．イー．（Ｗｕ．Ｙ．；Ｏｇａｗａ，Ａ．Ｋ．；Ｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．；ＭｃＭｉｎｎ，Ｄ．Ｌ．；Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．；Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ，Ｆ．Ｅ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２０００年、第１２２巻、７６２１〜７６３２ページ。２．「遺伝子アルファベットの拡大に対する取り組み：非常に安定な自己対合疎水性塩基のＤＮＡポリメラーゼ認識（Efforts toward expansion of the genetic alphabet: DNA polymerase recognition
of a highly stable, self-pairing hydrophobic base. ）」、マクミン、ディー．エル
．；オガワ、エー．ケー．；ウー．ワイ．；リウ、ジェー．；シュルツ、ピー．ジー．；ロメスベルグ、エフ．イー．（ＭｃＭｉｎｎ，Ｄ．Ｌ．；Ｏｇａｗａ，Ａ．Ｋ．；Ｗｕ．Ｙ．；Ｌｉｕ，Ｊ．；Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．；Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ，Ｆ．Ｅ．）、Ｊ
．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９９年、第１２１巻、１１５８５〜１１５８６ページ）
（「非水素結合及び非形状相補的塩基対を含有する安定なＤＮＡ二本鎖：安定性決定因子としての鎖間スタッキング（A stable DNA duplex containing a non-hydrogen-bonding and non-shape complementary base couple: Interstrand stacking as the stabilitydetermining factor.）」、ボロッツチー、シー．；ハベルリー、エー．；ロイマン、シ
ー（Ｂｒｏｔｓｃｈｉ，Ｃ．；Ｈａｒｂｅｒｌｉ，Ａ．；Ｌｅｕｍａｎｎ，Ｃ、Ｊ．）、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．、２００１年、第４０巻、３０１２〜３０１４ページ）
（「２，２’−ビピリジンリガンドシド：二本鎖内金属錯体によりＤＮＡを修飾するための新規構成単位（2,2'-Bipyridine Ligandoside: A novel building block for modifying DNA with intra-duplex metal complexes.）」、ワイツマン、エイチ．；トル、ワイ（Ｗｅｉｚｍａｎｎ，Ｈ．；Ｔｏｒ，Ｙ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２００１年、第１２３巻、３３７５〜３３７６ページ）
【０４５７】
【化３２】
0005881970.tif 000035
【０４５８】
（「副溝の水和は、ＤＮＡ二本鎖の安定性に重要である（Minor groove hydration is critical to the stability of DNA duplexes.）」、ラン、ティー．；マクロウグリン、エル．ダブリュ（Ｌａｎ，Ｔ．；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ，Ｌ．Ｗ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２０００年、第１２２巻、６５１２〜６５１３ページ）
【０４５９】
【化３３】
0005881970.tif 000036
【０４６０】
（「隣接天然塩基の選択性に対する普遍的塩基である３−ニトロピロールの影響（Effects of the Universal base 3-nitropyrrole on the selectivity of neighboring natural bases. ）」、オリバー、ジェー．エス．；パーカー、ケー．エー．；サッグス、ジェー．ダブリュ．（Ｏｌｉｖｅｒ，Ｊ．Ｓ．；Ｐａｒｋｅｒ，Ｋ．Ａ．；Ｓｕｇｇｓ，Ｊ．Ｗ）、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔ．、２００１年、第３巻、１９７７〜１９８０ページ。２．「ＤＮＡ二本鎖及び三本鎖の安定性に対する１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロール残基の影響（Effects of the 1-(2'-deoxy- β-D-ribofuranosyl)-3-nitropyrrol residue on the stability of DNA duplexes and triplexes. ）」、アモソバ、オー，；ジョージ  ジェー．；フレスコ、ジェー．アール．（Ａｍｏｓｏｖａ，Ｏ．；Ｇｅｏｒｇｅ  Ｊ．；Ｆｒｅｓｃｏ，Ｊ．Ｒ．）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃ
ｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９９７年、第２５巻、１９３０〜１９３４ページ。３．「普遍的ヌクレオシド：１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロールによる合成、構造及びデオキシリボ核酸シーケンシング（Synthesis, structure and deoxyribonucleic acid sequencing with a universal nucleosides: 1-(2'-deoxy-β-D-ribofuranosyl)-3-nitropyrrol.）」、バーグストロム、ディー．イー．；ツァング、ピー．；トマ、ピー．エイチ．；アンドリュース、ピー．シー．；ニコルズ、アール．（Ｂｅｒｇｓｔｏｒｍ，Ｄ．Ｅ．；Ｚｈａｎｇ，Ｐ．；Ｔｏｍａ，Ｐ．Ｈ．；Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｐ．Ｃ．；Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｒ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９５年、第１１７巻、１２０１〜１２０９ページ）
【０４６１】
【化３４】
0005881970.tif 000037
【０４６２】
（「一般的な三本鎖ＤＮＡ認識スキームを対象とするモデル研究：有機溶媒中でＣＧ塩基対を結合する新規ＤＮＡ塩基（Model studies directed toward a general triplex DNA recognition scheme: a novel DNA base that binds a CG base-pair in an organic solvent. ）」、ジマーマン、エス．シー．；シュミット、ピー．（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ，Ｓ．Ｃ．；Ｓｃｈｍｉｔｔ，Ｐ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９５年、第１１７巻、１０７６９〜１０７７０ページ）
【０４６３】
【化３５】
0005881970.tif 000038
【０４６４】
（「普遍的光切断ＤＮＡ塩基：ニトロピペロニル２’−デオキシリボシド（A universal, photocleavable DNA base: nitropiperonyl 2'-deoxyriboside.）」、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、２００１年、第６６巻、２０６７〜２０７１ページ）
【０４６５】
【化３６】
0005881970.tif 000039
【０４６６】
（「２−アシルアミノ−１，８−ナフチリジンによる単一グアニンバルジの認識（Recognition of a single guanine bulge by 2-acylamino-1,8-naphthyridine. ）」、ナカタニ、ケー．；サンド、エス．；サイトー、アイ．（Ｎａｋａｔａｎｉ，Ｋ．；Ｓａｎｄｏ，Ｓ．；Ｓａｉｔｏ，Ｉ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２０００年、第１２２巻、２１７２〜２１７７ページ。ｂ．「ＧＣダブレットの光酸化により明らかであるような単一グアニンバルジへの２−アミノ−１，８−ナフチリジンの特異的結合（Specific binding of 2-amino-1,8- naphthyridine into single guanine bulge as evidenced by photooxidation of GC doublet.）」、ナカタニ、ケー．；サンド、エス．；ヨシダ、ケー．；サイトー、アイ．（Ｎａｋａｔａｎｉ，Ｋ．；Ｓａｎｄｏ，Ｓ．；Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｋ．；Ｓａｉｔｏ，Ｉ．）、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、２００１年、第１１巻、３３５〜３３７ページ）
【０４６７】
【化３７】
0005881970.tif 000040
【０４６８】
他の普遍的塩基は、下記式を有することができる：
【０４６９】
【化３８】
0005881970.tif 000041
【０４７０】
（式中、
Ｑは、Ｎ又はＣＲ４４であり、
Ｑ’は、Ｎ又はＣＲ４５であり、
Ｑ”は、Ｎ又はＣＲ４７であり、
Ｑ’’’は、Ｎ又はＣＲ４９であり、
Ｑｉｖは、Ｎ又はＣＲ５０であり、
Ｒ４４は、水素、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、保護ヒドロキシ、ＮＨ２、ＮＨＲｂ、又はＮＲｂＲｃ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ６〜Ｃ１０ヘテロアリール、Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクリルであるか、あるいはＲ４５と一体となって−ＯＣＨ２Ｏ−を形成し、
Ｒ４５は、水素、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、保護ヒドロキシ、ＮＨ２、ＮＨＲｂ、又はＮＲｂＲｃ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ６〜Ｃ１０ヘテロアリール、Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクリルであるか、あるいはＲ４４又はＲ４６と一体となって−ＯＣＨ２Ｏ−を形成し、
Ｒ４６は、水素、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、保護ヒドロキシ、ＮＨ２、ＮＨＲｂ、又はＮＲｂＲｃ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ６〜Ｃ１０ヘテロアリー
ル、Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクリルであるか、あるいはＲ４５又はＲ４７と一体となって−ＯＣＨ２Ｏ−を形成し、
Ｒ４７は、水素、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、保護ヒドロキシ、ＮＨ２、ＮＨＲｂ、又はＮＲｂＲｃ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ６〜Ｃ１０ヘテロアリール、Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクリルであるか、あるいはＲ４６又はＲ４８と一体となって−ＯＣＨ２Ｏ−を形成し、
Ｒ４８は、水素、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、保護ヒドロキシ、ＮＨ２、ＮＨＲｂ、又はＮＲｂＲｃ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ６〜Ｃ１０ヘテロアリール、Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクリルであるか、あるいはＲ４７と一体となって−ＯＣＨ２Ｏ−を形成し、
Ｒ４９、Ｒ５０、Ｒ５１、Ｒ５２、Ｒ５３、Ｒ５４、Ｒ５７、Ｒ５８、Ｒ５９、Ｒ６０、Ｒ６１、Ｒ６２、Ｒ６３、Ｒ６４、Ｒ６５、Ｒ６６、Ｒ６７、Ｒ６８、Ｒ６９、Ｒ７０、Ｒ７１及びＲ７２はそれぞれ独立して、水素、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、保護ヒドロキシ、ＮＨ２、ＮＨＲｂ、又はＮＲｂＲｃ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ６〜Ｃ１０ヘテロアリール、Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクリル、ＮＣ（Ｏ）Ｒ１７、又はＮＣ（Ｏ）Ｒ０から選択され、
Ｒ５５は、水素、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、保護ヒドロキシ、ＮＨ２、ＮＨＲｂ、又はＮＲｂＲｃ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ６〜Ｃ１０ヘテロアリール、Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクリル、ＮＣ（Ｏ）Ｒ１７、又はＮＣ（Ｏ）Ｒ０であるか、あるいはＲ５６と一体となって縮合芳香環を形成し、該縮合芳香環は任意選択で置換されていてもよく、
Ｒ５６は、水素、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、保護ヒドロキシ、ＮＨ２、ＮＨＲｂ、又はＮＲｂＲｃ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ６〜Ｃ１０ヘテロアリール、Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクリル、ＮＣ（Ｏ）Ｒ１７、又はＮＣ（Ｏ）Ｒ０であるか、あるいはＲ５５と一体となって縮合芳香環を形成し、該縮合芳香環は任意選択で置換されていてもよく、
Ｒ１７は、ハロ、ＮＨ２、ＮＨＲｂ、又はＮＲｂＲｃであり、
Ｒｂは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル又は窒素保護基であり、
ＲＣは、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ０は、任意選択でハロ、ヒドロキシ、ニトロ、保護ヒドロキシ、ＮＨ２、ＮＨＲｂ、又はＮＲｂＲｃ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ６〜Ｃ１０ヘテロアリール、Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクリル、ＮＣ（Ｏ）Ｒ１７、又はＮＣ（Ｏ）Ｒ０で置換されたアルキルである。）
普遍的塩基の例として以下のものが挙げられる：
【０４７１】
【化３９】
0005881970.tif 000042
【０４７２】
非対称的な修飾
ＲＮＡ、例えばｉＲＮＡ剤は、本明細書中に記載するように、かつ２００４年３月８日付けで出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０４／０７０７０号（これは、参照により本明細書に援用される）に記載されるように、非対称的に修飾することができる。
【０４７３】
さらに、本発明は、非対称的な修飾及び本明細書中に記載する別の構成要素を有するｉＲＮＡ剤を包含する。例えば、本発明は、本明細書中に記載するｉＲＮＡ剤、例えば、パリンドローム構造のｉＲＮＡ剤、非標準的な対合を有するｉＲＮＡ剤、本明細書中に記載する遺伝子（例えば、肝臓で活性な遺伝子）を標的とするｉＲＮＡ剤、本明細書中に記載する構成様式又は構造を有するｉＲＮＡ剤、本明細書中に記載する薬物送達モジュールと結合されたｉＲＮＡ、本明細書中に記載するように投与されるｉＲＮＡ剤、又は本明細書中に記載するように製剤化されるｉＲＮＡ剤であって、非対称的な修飾も取り入れるｉＲＮＡ剤を包含する。
【０４７４】
非対称的に修飾されたｉＲＮＡ剤とは、鎖が他方の鎖上に存在しない修飾を有するｉＲＮＡ剤である。非対称的な修飾とは、一方の鎖上に見られるが、他方の鎖上には見られない修飾である。任意の修飾、例えば本明細書中に記載する任意の修飾は、非対称的な修飾として存在し得る。非対称的な修飾により、修飾に伴う任意の望ましい特性、例えば本明
細書中で論述した特性を付与することができる。例えば、非対称的な修飾は、分解に対する耐性、半減期の変更をもたらすこともできるし、ｉＲＮＡ剤に特定の標的（例えば、特定の組織）を指向させることもできるし、鎖のその相補体又は標的配列に対する親和性を調節（例えば、増大又は低減）することもできるし、あるいは末端部分の修飾（例えば、キナーゼ又はＲＩＳＣ機構の経路に関与する他の酵素による修飾）を妨害又は促進することもできる。ある修飾について１つの特性を有するものとして指定しても、該修飾が他の特性を有していないことを意味するわけではない（例えば、安定化を促進する修飾として言及される修飾が、標的化も増強することもありうる）。
【０４７５】
理論又はいかなる特定の機構モデルによっても拘束されることは望まないが、非対称的な修飾は、ｉＲＮＡ剤をセンス鎖及びアンチセンス鎖の異なるすなわち「非対称的」機能という観点で最適化させることが可能であると考えられる。例えば、両方の鎖がヌクレアーゼ耐性を増大するように修飾されてもよいが、変更によってはＲＩＳＣ活性が阻害され得るため、これらの変更をセンス鎖に関して選択してもよい。さらに、一部の修飾、例えば標的化部分は、例えばＲＩＳＣ複合体の切断活性を妨害しうる大きな嵩高い基を付加することができるので、そのような修飾はセンス鎖に配置されることが好ましい。したがって、標的化部分、特に嵩高い標的化部分（例えば、コレステロール）は、センス鎖に優先的に付加される。一実施形態では、バックボーンのリン酸をＳで置換する非対称的修飾、例えばホスホロチオエート修飾がアンチセンス鎖に存在し、かつ２’修飾、例えば２’ＯＭｅがセンス鎖に存在する。標的化部分は、ｉＲＮＡ剤のセンス鎖の５’又は３’末端のいずれか（又は両方）に存在し得る。好ましい例では、アンチセンス鎖においてはバックボーンのＰがＳで置き換えられ、２’ＯＭｅがセンス鎖に存在し、標的化部分がｉＲＮＡ剤のセンス鎖の５’又は３’末端のいずれかに付加される。
【０４７６】
好ましい実施形態では、非対称的に修飾されたｉＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖上では見られない修飾をセンス鎖上に有し、アンチセンス鎖は、センス鎖上では見られない修飾を有する。
【０４７７】
鎖はそれぞれ、１つ又はそれ以上の非対称的修飾を包含し得る。例を挙げると、一方の鎖は、ｉＲＮＡ剤に対して第１の特性を付与する第１の非対称的修飾を包含することができ、他方の鎖は、ｉＲＮＡに対して第２に特性を付与する第２の非対称的修飾を有することができる。例えば、一方の鎖、例えばセンス鎖は、ｉＲＮＡ剤が組織を標的とするような修飾を有することができ、他方の鎖、例えばアンチセンス鎖は、標的遺伝子配列とのハイブリダイゼーションを促進する修飾を有する。
【０４７８】
幾つかの実施形態では、両方の鎖が同じ特性を最適化するように、例えば核酸分解に対する耐性を増大させるように修飾することができるが、例えば修飾がさらに他の特性に影響を及ぼすという理由で、センス鎖及びアンチセンス鎖に関して異なる修飾が選ばれる。例えば、一部の変更は、ＲＩＳＣ活性に影響を及ぼし得るため、これらの修飾はセンス鎖について選ばれる。
【０４７９】
ある実施形態では、一方の鎖は、非対称的な２’修飾、例えば２’ＯＭｅ修飾を有し、他方の鎖は、リン酸バックボーンの非対称的修飾、例えばホスホロチオエート修飾を有する。したがって、一実施形態では、アンチセンス鎖が非対称的な２’ＯＭｅ修飾を有し、センス鎖が非対称的なホスホロチオエート修飾を有する（あるいは、その逆でもよい）。特に好ましい実施形態では、本発明のｉＲＮＡ剤は、センス鎖上に非対称的な２’−Ｏアルキル、好ましくは２’−ＯＭｅ修飾を、アンチセンス鎖には非対称的なバックボーンのＰ修飾、好ましくはホスホロチオエート修飾を有する。１つ又は多数の２’−ＯＭｅ修飾が存在することができ、例えば、センス鎖の少なくとも２個、３個、４個、５個又は６個のサブユニットを２’−ＯＭｅ修飾することができる。１つ又は多数のホスホロチオエー
ト修飾が存在することができ、例えば、アンチセンス鎖の少なくとも２個、３個、４個、５個又は６個のサブユニットをホスホロチオエート修飾することができる。センス鎖上に多数の２’−ＯＭｅ修飾及びアンチセンス鎖上に多数のホスホロチオエート修飾が存在するｉＲＮＡ剤を有することが好ましい。一方又は両方の鎖上のすべてのサブユニットを前記のように修飾することもできる。両方の鎖上の多数の非対称的修飾の特に好ましい実施形態は、長さが約２０〜２１サブユニット、好ましくは１９サブユニットの二本鎖領域、及び長さが約２サブユニットの１個又は２個の３’突出部を有する。
【０４８０】
非対称的な修飾は、ヌクレアーゼ、例えばエンドヌクレアーゼによる分解に対する耐性を促進するのに有用である。ｉＲＮＡ剤は、分解に対する耐性を促進する１つ又はそれ以上の非対称的修飾を包含することができる。好ましい実施形態では、アンチセンス鎖上の修飾は、標的のサイレンシングを妨害しない修飾、例えば標的の切断を妨害しない修飾である。鎖上のすべてではないにしても、ほとんどの部位が、エンドヌクレアーゼによる分解に対してある程度弱い。相対的に弱い部位を特定し、分解を阻害する非対称的修飾を挿入することができる。多くの場合、ｉＲＮＡ剤におけるＵＡ部位の非対称的修飾を提供することが望ましく、場合によっては、両方の鎖上のＵＡ配列に非対称的修飾を提供することが望ましい。エンドヌクレアーゼによる分解を阻害する修飾の例は、本明細書中に見出すことができる。特に好適な修飾としては、２’位修飾（例えば特にセンス鎖上のＵへの２’ＯＭｅ部分の付与）、バックボーンの修飾（例えば、特にアンチセンス鎖上のＵ若しくはＡ又はその両方についてリン酸バックボーンのＯをＳで置き換えること（例えば、ホスホロチオエート修飾の提供）による修飾）、ＵをＣ５アミノリンカーで置き換えること、ＡをＧで置き換えること（配列の変更は、センス鎖上に位置し、アンチセンス鎖上には位置しないことが好ましい）、及び２’、６’、７’又は８’位の修飾が挙げられる。好ましい実施形態は、１つ又はそれ以上のこれらの修飾がセンス鎖上に存在するが、アンチセンス鎖上には存在しない実施形態、あるいはアンチセンス鎖のほうがこのような修飾の数が少ない実施形態である。
【０４８１】
非対称的な修飾は、エキソヌクレアーゼによる分解を阻害するために使用することができる。非対称的な修飾としては、一方の鎖のみが修飾されるもの、ならびに両方が修飾されるものを挙げることができる。好ましい実施形態では、アンチセンス鎖上の修飾は、標的のサイレンシングを妨害しない修飾、例えば標的の切断を妨害しない修飾である。幾つかの実施形態は、センス鎖上、例えば３’突出部の例えば３’末端に、及びアンチセンス鎖上、例えば３’突出部の例えば３’末端に、非対称的修飾を有する。修飾により異なるサイズの構成部分が導入される場合、大きいほうがセンス鎖上に存在することが好ましい。修飾により異なる電荷の構成部分が導入される場合、より大きな電荷を有する部分がセンス鎖上に存在することが好ましい。
【０４８２】
エキソヌクレアーゼによる分解を阻害する修飾の例は、本明細書中に見出すことができる。特に好適な修飾としては、２’位修飾（例えば３’突出部の例えば３’末端への２’ＯＭｅ部分の提供（３’末端とは、文脈により示されるように、分子の３’位の原子、又は最も３’側の構成部分、例えば最も３’側のＰ又は２’位を意味する））、例えばＰをＳで置き換えること（例えば、ホスホロチオエート修飾の提供）もしくは３’突出部の例えば３’末端におけるメチル化Ｐの使用によるバックボーンの修飾、２’位修飾の組合せ（例えば、２’ＯＭｅ部分の提供と、例えばＰをＳで置き換えること（例えば、ホスホロチオエート修飾の提供）もしくは３’突出部の例えば３’末端におけるメチル化Ｐの使用によるバックボーンの修飾との組合せ）、３’アルキルによる修飾、３’突出部の例えば３’末端における脱塩基ピロリジンによる修飾、ナプロキセン、イブプロフェン又はその他の分解を阻害する構成部分による３’末端の修飾が挙げられる。好ましい実施形態は、１つ又はそれ以上のこれらの修飾がセンス鎖上に存在するが、アンチセンス鎖上には存在しないもの、あるいはアンチセンス鎖のほうがこのような修飾の数が少ない実施形態であ
る。
【０４８３】
標的化に影響を及ぼす修飾、例えば本明細書中に記載する修飾を、非対称的修飾として提供することが可能である。例えば標的の切断を阻害することにより、サイレンシングを阻害し得る標的化修飾は、センス鎖の非対称的修飾として提供され得る。体内分布を変化させる構成部分（例えばコレステロール）は、センス鎖における１つ又はそれ以上（例えば、２つ）の非対称的修飾として提供され得る。比較的大きな分子量（例えば４００、５００又は１，０００ダルトンを上回る分子量）を有する構成部分を導入する標的化修飾、あるいは電荷を有する構成部分（例えば、２つ以上の正電荷又は１つの負電荷を有する構成部分）を導入する標的化修飾は、センス鎖上に配置させることができる。
【０４８４】
鎖のその相補体又は標的に対する親和性を調節する（例えば、増大又は低下させる）修飾、例えば本明細書中に記載する修飾は、非対称的修飾として提供され得る。これらの修飾としては、５メチルＵ、５メチルＣ、プソイドウリジン、ロックト核酸、２チオＵ及び２−アミノ−Ａが挙げられる。幾つかの実施形態では、これらの１つ又はそれ以上がアンチセンス鎖上に提供される。
【０４８５】
ｉＲＮＡ剤は、センス鎖及びアンチセンス鎖を有する規定構造を有し、多くの場合例えば２又は３ヌクレオチドの短い一本鎖の突出部が、一方又は両方の３’末端に存在する。非対称的な修飾を、例えばｉＲＮＡ内に選択的に位置させることにより、このような構造の活性を最適化するのに使用することができる。例えば、センス鎖の５’末端及びアンチセンス鎖の３’末端により規定されるｉＲＮＡ剤の末端領域は、機能にとって重要である。この領域は、末端の２個、３個又は４個のヌクレオチド対と任意の３’突出部とを含むことができる。好ましい実施形態では、以下、すなわち：センス鎖のキナーゼ活性化を阻害するセンス鎖５’末端の修飾（例えば、キナーゼ分子を標的とする複合体の結合、又は５’エキソヌクレアーゼによる分解に対して保護的に作用する修飾の使用など）、又はセンス鎖とアンチセンス鎖との間の結合を増強することにより分子のこの末端にある「緊密な」構造を促進する、いずれか一方の鎖、好ましくはセンス鎖の修飾、のうち１つ又はそれ以上をもたらす非対称的修飾が使用される。
【０４８６】
センス鎖の３’末端及びアンチセンス鎖の５’末端により規定されるｉＲＮＡ剤の末端領域もまた機能にとって重要である。この領域は、末端の２個、３個又は４個のヌクレオチド対と任意の３’突出部とを含むことができる。好ましい実施形態は、センス鎖とアンチセンス鎖との間の結合を減少させることにより分子のこの末端にある「開放的な」構造を促進する、いずれか一方の鎖、好ましくはセンス鎖の非対称的修飾を包含する。このような修飾としては、分子を標的とする複合体を配置すること、あるいはセンス鎖のこの領域におけるヌクレアーゼ耐性を促進する修飾が挙げられる。キナーゼ活性化を阻害するアンチセンス鎖の修飾は、好ましい実施形態では回避される。
【０４８７】
センス鎖に非対称的に配置される例示的な修飾としては、以下のものが挙げられる。
【０４８８】
（ａ）バックボーン修飾（例えば、バックボーンのＰの修飾）であって、ＰをＳで置き換えること、又はアルキル若しくはアリル（例えば、Ｍｅ）で置換されたＰ、及びジチオエート（Ｓ−Ｐ＝Ｓ）を含む；これらの修飾は、ヌクレアーゼ耐性を促進するのに使用することができる；
（ｂ）２’−Ｏアルキル（例えば、２’−ＯＭｅ）、３’−Ｏアルキル（例えば、３’−ＯＭｅ）（末端及び内部位置の少なくともいずれかを修飾）；これらの修飾は、ヌクレアーゼ耐性を促進するため、又はアンチセンス鎖へのセンス鎖の結合を増強するために使用することができ、３’位修飾は、ＲＩＳＣによるセンス鎖活性化を回避するためにセンス鎖の５’末端で使用することができる；
（ｃ）２’〜５’結合（２’−Ｈ、２’−ＯＨ及び２’−ＯＭｅによるもの、及びＰ＝Ｏ又はＰ＝Ｓによるもの）；これらの修飾は、ヌクレアーゼ耐性を促進するため、又はアンチセンス鎖へのセンス鎖の結合を阻害するために使用することもできるし、あるいはＲＩＳＣによるセンス鎖活性化を回避するためにセンス鎖の５’末端で使用することもできる；
（ｄ）Ｌ糖（例えば、２’−Ｈ、２’−ＯＨ及び２’−ＯＭｅを有する２’Ｌ−リボース、Ｌ−アラビノース）；これらの修飾は、ヌクレアーゼ耐性を促進するため、又はアンチセンス鎖へのセンス鎖の結合を阻害するために使用することもできるし、あるいはＲＩＳＣによるセンス鎖活性化を回避するためにセンス鎖の５’末端で使用することもできる；
（ｅ）修飾糖（例えば、ロックト核酸（ＬＮＡ）、ヘキソース核酸（ＨＮＡ）及びシクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ））；これらの修飾は、ヌクレアーゼ耐性を促進するため、又はアンチセンス鎖へのセンス鎖の結合を阻害するために使用することもできるし、あるいはＲＩＳＣによるセンス鎖活性化を回避するためにセンス鎖の５’末端で使用することもできる；
（ｆ）核酸塩基修飾（例えば、Ｃ−５修飾ピリミジン、Ｎ−２修飾プリン、Ｎ−７修飾プリン、Ｎ−６修飾プリン）；これらの修飾は、ヌクレアーゼ耐性を促進するために、又はアンチセンス鎖へのセンス鎖の結合を促進するために使用することができる；
（ｇ）カチオン基及び双性イオン基（末端にあることが好ましい）；これらの修飾は、ヌクレアーゼ耐性を促進するために使用することができる；
（ｈ）複合体基（末端位置にあることが好ましい）、例えば、ナプロキセン、ビオチン、コレステロール、イブプロフェン、葉酸、ペプチド及び糖質；これらの修飾は、ヌクレアーゼ耐性を促進するため、又は分子を標的化するために使用することもできるし、あるいはＲＩＳＣによるセンス鎖活性化を回避するためにセンス鎖の５’末端で使用することもできる。
【０４８９】
アンチセンス鎖に非対称的に配置される例示的な修飾としては、以下のものが挙げられる：
（ａ）バックボーン修飾（例えば、バックボーンのＰの修飾）であって、ＰをＳで置き換えること、又はアルキル若しくはアリル（例えば、Ｍｅ）で置換されたＰ、及びジチオエート（Ｓ−Ｐ＝Ｓ）を含む；
（ｂ）２’−Ｏアルキル（例えば、２’−ＯＭｅ）（末端位置を修飾）；
（ｃ）２’〜５’結合（２’−Ｈ、２’−ＯＨ及び２’−ＯＭｅによるもの（例えば、３’末端での末端修飾）；Ｐ＝Ｏ又はＰ＝Ｓによる好ましくは３’末端の修飾）；これらの修飾は、キナーゼ活性のようなＲＩＳＣ酵素活性を妨害し得るため、５’末端領域からは排除されることが好ましい；
（ｄ）Ｌ糖（例えば、２’−Ｈ、２’−ＯＨ及び２’−ＯＭｅを有するＬ−リボース、Ｌ−アラビノース）；例えば、３’末端での末端修飾；例えばＰ＝Ｏ又はＰ＝Ｓによる好ましくは３’末端の修飾；これらの修飾は、キナーゼ活性を妨害し得るため、５’末端領域から排除されることが好ましい；
（ｅ）修飾糖（例えば、ＬＮＡ、ＨＮＡ及びＣｅＮＡ）；これらの修飾は、センス鎖とアンチセンス鎖との間の対合の望ましくない増強に寄与し得るが、多くの場合は５’領域において「緩い」構造を有することが好ましいので、さらに該修飾はキナーゼ活性を妨害し得るので、５’末端領域からは排除されることが好ましい；
（ｆ）核酸塩基修飾（例えば、Ｃ−５修飾ピリミジン、Ｎ−２修飾プリン、Ｎ−７修飾プリン、Ｎ−６修飾プリン）；
（ｇ）カチオン基及び双性イオン基（末端にあることが好ましい）；
糖の２’位、糖の３’位にあるカチオン基及び双性イオン基；核酸塩基修飾（例えば、Ｃ−５修飾ピリミジン、Ｎ−２修飾プリン、Ｎ−７修飾プリン、Ｎ−６修飾プリン）としてのカチオン基及び双性イオン基；
複合体基（末端位置にあることが好ましい）、例えば、ナプロキセン、ビオチン、コレステロール、イブプロフェン、葉酸、ペプチド及び糖質であって、但し、嵩高い基又は概してＲＩＳＣ活性を阻害する基はあまり好ましくないはずである。
【０４９０】
アンチセンス鎖の５’−ＯＨは、活性を促進するように遊離型に保たれるべきである。幾つかの好ましい実施形態では、ヌクレアーゼ耐性を促進する修飾は、３’末端、特に３’突出部に包含されるべきである。
【０４９１】
別の態様では、本発明は、ｉＲＮＡ剤を最適化する方法、例えば安定化する方法を特徴とする。該方法は、活性を有する配列を選択すること、該配列に１つ又はそれ以上の非対称的な修飾を導入することを包含し、非対称的な修飾の導入によりｉＲＮＡ剤の特性が最適化されるが、活性の減少はもたらされない。
【０４９２】
活性の減少とは、予め選択されたレベルの減少よりも小さい減少とすることができる。好ましい実施形態では、活性の減少とは、修飾が導入されないこと以外は同じｉＲＮＡと比較した場合に、５％、１０％、２０％、４０％又は５０％未満の減少であることを意味する。活性は、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定することができ、いずれにおける結果も、所要の活性維持を実証するのに十分である。
【０４９３】
最適化される特性は、本明細書中に記載する任意の特性、特に本明細書中の非対称的な修飾に関するセクションで論述する特性であり得る。修飾は、任意の非対称的な修飾、例えば、本明細書中の非対称的な修飾に関するセクションで記載する非対称的な修飾であり得る。特に好ましい非対称的な修飾は、特にセンス配列における２’−Ｏアルキル修飾（例えば２’−ＯＭｅ修飾）、及びアンチセンス鎖におけるバックボーンのＯの修飾、特にホスホロチオエート修飾である。
【０４９４】
好ましい実施形態では、センス配列が選択されて非対称的な修飾が付与される一方で、他の実施形態ではアンチセンス配列が選択されて非対称的な修飾が付与される。幾つかの実施形態では、センス配列及びアンチセンス配列がともに選択され、それぞれ１つ又はそれ以上の非対称的な修飾が付与される。
【０４９５】
多数の非対称的な修飾が、センス配列及びアンチセンス配列の一方又は両方に導入され得る。配列は、少なくとも２個、４個、６個、８個又はそれ以上の修飾を有することができ、配列のすべてのモノマー又は実質的にすべてのモノマーを修飾することができる。
【０４９６】
表３は、選択された修飾を有する鎖Ｉ及び選択された修飾を有する鎖ＩＩを有する例を示す。
【０４９７】
【表３】
0005881970.tif 000043
【０４９８】
Ｚ−Ｘ−Ｙ構成様式
ＲＮＡ、例えばｉＲＮＡ剤は、本明細書中に記載するものならびに２００３年１０月９日付けで出願された同時係属中の共同所有されている米国仮出願第６０／５１０，２４６号（これは、参照により本明細書中に援用される）、２００３年１０月１０日付けで出願された同時係属中の共同所有されている米国仮出願第６０／５１０，３１８号（これは、参照により本明細書中に援用される）及び２００４年３月８日付けで出願された同時係属出願中の共同所有されている国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０４／０７０７０号に記載されているもののようなＺ−Ｘ−Ｙ構成様式又は構造を有することができる。
【０４９９】
さらに、本発明は、Ｚ−Ｘ−Ｙ構造及び本明細書中に記載する別の構成要素を有するｉＲＮＡ剤を包含する。例えば、本発明は、本明細書中に記載するｉＲＮＡ剤、例えばパリ
ンドローム構造のｉＲＮＡ剤、非標準的な対合を有するｉＲＮＡ剤、本明細書中に記載する遺伝子（例えば、腎臓で活性な遺伝子）を標的とするｉＲＮＡ剤、本明細書中に記載する両親媒性送達剤と結合されたｉＲＮＡ、本明細書中に記載する薬物送達モジュールと結合されたｉＲＮＡ、本明細書中に記載するように投与されるｉＲＮＡ剤、又は本明細書中に記載するように製剤化されるｉＲＮＡ剤であって、Ｚ−Ｘ−Ｙ構成様式も取り入れるｉＲＮＡ剤を包含する。
【０５００】
したがって、ｉＲＮＡ剤は、第１のセグメントであるＺ領域、第２のセグメントであるＸ領域、及び任意選択で第３の領域であるＹ領域：
Ｚ−Ｘ−Ｙ
を有することができる。
【０５０１】
一方ではＺ及び／又はＹの一方又は両方、かつ他方ではＸにおけるサブユニットを修飾することが望ましい場合がある。場合によっては、サブユニットは、同じ修飾又は同じ種類の修飾を有するが、Ｚ及び／又はＹにおいて施される修飾は、Ｘにおいて施される修飾と異なる場合のほうが多い。
【０５０２】
Ｚ領域は通常、ｉＲＮＡ剤の末端を包含する。Ｚ領域の長さは多様であり得るが、通常２〜１４個、より好ましくは２〜１０個のサブユニットの長さである。通常、Ｚ領域は一本鎖状である（すなわちＺ領域は、別の鎖の塩基と塩基対合しない）が、幾つかの実施形態では、自己会合して、例えばループ構造を形成し得る。このような構造は、鎖の末端が折り返して鎖内二本鎖を形成することにより形成され得る。例えば、通常２個又はそれ以上の対合しないサブユニットでできた折り返し領域又は接続領域を有する２個、３個、４個、５個又はそれ以上の鎖内塩基対が生じ得る。これは、鎖の一方の末端で生じてもよいし両末端で生じてもよい。Ｚ領域の典型的な実施形態は、一本鎖突出部、例えば本明細書の他の箇所に記載する長さの突出部である。したがって、Ｚ領域は、３’又は５’末端の一本鎖でもよいし、又は３’又は５’末端の一本鎖を包含していてもよい。Ｚ領域はセンス鎖でもアンチセンス鎖でもよいが、アンチセンスである場合には、領域は３−突出部であることが好ましい。Ｚ領域における典型的なサブユニット間結合としては、Ｐ＝Ｏ、Ｐ＝Ｓ、Ｓ−Ｐ＝Ｓ、Ｐ−ＮＲ２及びＰ−ＢＲ２が挙げられる。キラルＰ＝Ｘ（式中、Ｘは、Ｓ、Ｎ又はＢである）のサブユニット間結合もまた存在することができる（これらのサブユニット間結合は、本明細書中の他の箇所でより詳細に論述している）。他の好ましいＺ領域サブユニット修飾（同様に本明細書中の他の箇所で論述）としては、３’−ＯＲ、３’ＳＲ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ及び２’ＯＨ修飾ならびに構成部分、α立体配置の塩基、ならびに２’アラビノ修飾を挙げることができる。
【０５０３】
Ｘ領域は多くの場合、一本鎖ｉＲＮＡ剤の場合には一本鎖の対応する領域とともに、あるいは二本鎖のｉＲＮＡ剤の場合には他方の鎖の対応する領域とともに、二本鎖状をなしている。Ｘ領域の長さは多様であり得るが、通常１０〜４５個、より好ましくは１５〜３５個のサブユニットである。特に好ましい領域Ｘは、１７個、１８個、１９個、２９個、２１個、２２個、２３個、２４個又は２５個のヌクレオチド対を包含するが、他の適切な長さは、本明細書中の他の箇所で記載されており、それらを使用することができる。典型的なＸ領域のサブユニットとしては、２’−ＯＨサブユニットが挙げられる。典型的な実施形態では、サブユニット間リン酸結合が好ましい一方で、ホスホロチオエート又は非リン酸結合は存在しない。Ｘ領域において好ましい他の修飾としては、結合を改善するための修飾（例えば、核酸塩基修飾）、カチオン性核酸塩基修飾、及びＣ−５修飾ピリミジン（例えば、アリルアミン）が挙げられる。幾つかの実施形態は、４個又はそれ以上の連続した２’ＯＨサブユニットを有する。ホスホロチオエートの使用は好ましくないこともあるが、４個未満の連続した２’ＯＨサブユニットを結合する場合に使用することもできる。
【０５０４】
Ｙ領域は概して、Ｚ領域に関して記載されたパラメータに準ずる。しかしながら、Ｘ領域及びＺ領域は同じである必要はなく、異なる種類及び異なる数の修飾が存在することができ、実際、一方は通常３’突出部であり、一方は通常５’突出部である。
【０５０５】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、２’ＯＨが例えば２’−ＯＭｅ又は他のアルキルで置換されたリボヌクレオシドをそれぞれが有するＹ及び／又はＺ領域、ならびに２’−ＯＨが非置換のままである少なくとも４個の連続したリボヌクレオシドサブユニットを含むＸ領域を有する。
【０５０６】
ｉＲＮＡ剤のサブユニット結合（サブユニット間の結合）は、例えば分解に対する耐性を促進するために修飾されてもよい。このような修飾の数多くの例が本明細書中に開示されており、その一例がホスホロチオエート結合である。これらの修飾は、領域Ｘ、Ｙ及びＺのいずれかのサブユニット間に付与することができる。しかしながら、それらの修飾は最小限に抑えられることが好ましく、特に連続した修飾結合は回避されることが好ましい。
【０５０７】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、２’ＯＨが例えば２’−ＯＭｅで置換されたリボヌクレオシドをそれぞれが有するＹ及びＺ領域、ならびに２’−ＯＨが非置換のままである少なくとも４個の連続したサブユニット（例えば、リボヌクレオシドサブユニット）を含むＸ領域を有する。
【０５０８】
上述のように、ｉＲＮＡ剤のサブユニット結合は、例えば分解に対する耐性を促進するために修飾されてもよい。これらの修飾は、領域Ｙ、Ｘ及びＺのいずれかのサブユニット間に付与することができる。しかしながら、修飾は最小限に抑えられることが好ましく、特に連続した修飾結合は回避されることが好ましい。
【０５０９】
したがって、好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤のサブユニット結合のすべてが修飾されるわけではなく、より好ましくは、ホスホジエステル結合以外の結合により連結された連続サブユニットの最大数は、２個、３個又は４個である。特に好ましいｉＲＮＡ剤は、サブユニットがそれぞれ修飾結合（すなわちＲＮＡ及びＤＮＡで天然に見られるホスホジエステル結合と比較した場合に分解に対して結合を安定化するように修飾された結合）により結合された４個又はそれ以上の連続したサブユニット、例えば２’−ヒドロキシルリボヌクレオシドサブユニットを持たない。
【０５１０】
領域Ｘにおける上記修飾を最小限に抑えることが特に好ましい。したがって、好ましい実施形態では、Ｘにおけるヌクレオシドサブユニット結合のそれぞれがホスホジエステル結合であるか、あるいは領域Ｘのサブユニット結合が修飾される場合、このような修飾は最小限に抑えられる。例えば、Ｙ及び／又はＺ領域は、分解に対して安定化されたサブユニット間結合を包含することができるが、このような修飾はＸ領域では最小限に抑えられ、特に連続した修飾は最小限に抑えられる。したがって、好ましい実施形態ではホスホジエステル結合以外で結合される連続したサブユニットの最大数は、２個、３個又は４個である。特に好ましいＸ領域は、サブユニットがそれぞれ修飾結合（すなわちＲＮＡ及びＤＮＡで天然に見られるホスホジエステル結合と比較した場合に分解に対して結合を安定化するように修飾された結合）により結合された４個又はそれ以上の連続したサブユニット、例えば２’−ヒドロキシルリボヌクレオシドサブユニットを持たない。
【０５１１】
好ましい実施形態では、Ｙ及び／又はＺは、ホスホロチオエート結合を含まないが、一方又は両方が他の修飾、例えばサブユニット結合の他の修飾を含有してもよい。  好ましい実施形態では、領域Ｘ、あるいは場合によっては全ｉＲＮＡ剤が、同一の２’部分を有
する３個以下又は４個以下のサブユニットを有する。
【０５１２】
好ましい実施形態では、領域Ｘ、あるいは場合によっては全ｉＲＮＡ剤が、同一のサブユニット結合を有する３個以下又は４個以下のサブユニットを有する。
【０５１３】
好ましい実施形態では、１つ又はそれ以上のホスホロチオエート結合（又はサブユニット結合の他の修飾）がＹ及び／又はＺ中に存在するが、このような修飾結合は、２’位修飾（例えば、２’−Ｏ−アルキル部分）を有する隣接した２つのサブユニット（例えばヌクレオシド）を結合しない。例えば、Ｙ及び／又はＺにおけるすべての隣接した２’−Ｏ−アルキル部分は、ホスホロチオエート結合以外の結合により接続される。
【０５１４】
好ましい実施形態では、Ｙ及び／又はＺのそれぞれが独立して、２’位修飾を有する隣接したヌクレオシドなどのサブユニット（例えば、２’−Ｏ−アルキルヌクレオシド）の間に１つだけホスホロチオエート結合を有する。Ｙ及び／又はＺにおいて、２’修飾を有する隣接したヌクレオシドなどのサブユニット（例えば、２’−Ｏ−アルキルヌクレオシド）がもう１組存在する場合、この第２の組は、ホスホロチオエート結合以外の結合、例えばホスホロチオエート結合以外の修飾結合により接続される。
【０５１５】
好ましい実施形態では、Ｙ及び／又はＺのそれぞれが独立して、２’位修飾を有するヌクレオシドなどのサブユニット（例えば、２’−Ｏ−アルキルヌクレオシド）の隣接した対を結合する２個以上のホスホロチオエート結合を有するが、２’位修飾を有するヌクレオシドなどのサブユニット（例えば、２’−Ｏ−アルキルヌクレオシド）の隣接したサブユニットのうち少なくとも１対は、ホスホロチオエート以外の結合、例えばホスホロチオエート結合以外の修飾結合により結合される。
【０５１６】
好ましい実施形態では、Ｙ及び／又はＺにおける隣接したサブユニットに関する上述の制限の１つが、Ｘにおけるサブユニットに関する制限と組み合わされる。例えば、１つ又はそれ以上のホスホロチオエート結合（又はサブユニット結合の他の修飾）がＹ及び／又はＺ中に存在するが、このような修飾結合は、２’修飾（例えば、２’−Ｏ−アルキル部分）を有するヌクレオシドなど、２つの隣接したサブユニットを結合しない。例えば、Ｙ及び／又はＺのあらゆる隣接した２’−Ｏ−アルキル部分は、ホスホロチオエート結合以外の結合により接続される。さらに、Ｘ領域は、３個以下又は４個以下の同一のサブユニット（例えば同一の２’部分を有するサブユニット）を有するか、あるいはＸ領域は、３個以下又は４個以下の同一のサブユニット結合を有するサブユニットを有する。
【０５１７】
Ｙ領域及び／又はＺ領域は、少なくとも１個、好ましくは２個、３個又は４個の本明細書中に開示する修飾を包含することができる。このような修飾は、独立して、本明細書中に記載する任意の修飾（例えば、ヌクレアーゼ耐性サブユニット、修飾塩基を有するサブユニット、修飾サブユニット間結合を有するサブユニット、修飾糖を有するサブユニット、及び別の構成部分（例えば、標的化部分）に連結されたサブユニット）から選ぶことができる。好ましい実施形態では、２個以上のこのようなサブユニットが存在し得るが、幾つかの実施形態では、１個以下、２個以下、３個以下又は４個以下のこのような修飾が行われるか、又は連続して行われることが好ましい。好ましい実施形態では、修飾の頻度は、Ｙ及び／又はＺとＸとの間で異なり、例えば、修飾は、Ｙ及び／又はＺとＸとのうち一方に存在し、他方には存在しない。
【０５１８】
Ｘ領域は、本明細書中に開示する少なくとも１個、好ましくは２個、３個又は４個の修飾を包含することができる。このような修飾は、独立して、本明細書中に記載する任意の修飾から（例えば、ヌクレアーゼ耐性サブユニット、修飾塩基を有するサブユニット、修飾サブユニット間結合を有するサブユニット、修飾糖を有するサブユニット、及び別の構
成部分（例えば、標的化部分）に連結されたサブユニットから）選ぶことができる。好ましい実施形態では、２個以上のこのようなサブユニットが存在し得るが、幾つかの実施形態では、１個以下、２個以下、３個以下又は４個以下のこのような修飾が行われるか、又は連続して行われることが好ましい。
【０５１９】
ＲＲＭＳ（本明細書中の他の箇所に記載する）は、二本鎖のｉＲＮＡ剤の一方又は両方の鎖の１つ又はそれ以上の部位に導入することができる。ＲＲＭＳは、Ｙ及び／又はＺ領域においては、センス鎖の３’若しくは５’末端又はその付近（末端から１、２又は３位以内）に、あるいはアンチセンス鎖の３’末端又はその付近（末端から２又は３位以内）に配置させることができる。幾つかの実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端又はその付近（５’末端から１、２又は３位以内）にＲＲＭＳを有していないことが好ましい。ＲＲＭＳをＸ領域に配置することも可能であり、好ましくはセンス鎖に、あるいは標的に対するアンチセンス鎖の結合に重要でないアンチセンス鎖の領域に配置されることになる。
【０５２０】
末端における二本鎖の安定性の差次的修飾
一態様では、本発明は、末端における二本鎖の安定性の差次的修飾（ＤＭＴＤＳ）を有することができるｉＲＮＡ剤を特徴とする。
【０５２１】
さらに、本発明は、ＤＭＴＤＳ及び本明細書中に記載する別の構成要素を有するｉＲＮＡ剤を包含する。例えば、本発明は、本明細書中に記載するｉＲＮＡ剤、例えば、パリンドローム構造のｉＲＮＡ剤、非標準的な対合を有するｉＲＮＡ剤、本明細書中に記載する遺伝子（例えば、肝臓で活性な遺伝子）を標的とするｉＲＮＡ剤、本明細書中に記載する構成様式又は構造を有するｉＲＮＡ剤、本明細書中に記載する両親媒性送達剤と結合されたｉＲＮＡ、本明細書中に記載する薬物送達モジュールと結合されたｉＲＮＡ、本明細書中に記載するように投与されるｉＲＮＡ剤、又は本明細書中に記載するように製剤化されるｉＲＮＡ剤であって、ＤＭＴＤＳも取り入れるｉＲＮＡ剤を包含する。
【０５２２】
ｉＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖二本鎖の５’末端の領域において、該二本鎖が解離又は融解する傾向を増大させること（二本鎖の会合の自由エネルギーを減少させること）により最適化することができる。このことは、例えば、アンチセンス鎖の５’末端の領域に、二本鎖が解離又は融解する傾向を増大させるサブユニットを含めることにより達成することができる。また、５’末端の領域に、二本鎖が解離又は融解する傾向を増大させるリガンドを結合することにより達成することもできる。理論により拘束されることを望まないが、その効果は、ヘリカーゼのような酵素の作用を促進すること、例えばアンチセンス鎖の５’末端に近接した酵素の作用を促進することに起因し得る。
【０５２３】
本発明者等はまた、アンチセンス鎖二本鎖の３’末端の領域において、該二本鎖が解離又は融解する傾向を減少させること（二本鎖の会合の自由エネルギーを増大させること）により最適化することができることも発見した。このことは、例えばアンチセンス鎖の３’末端の領域に、二本鎖が解離又は融解する傾向を減少させるサブユニットを含めることにより達成することができる。また、５’末端の領域に、二本鎖が解離又は融解する傾向を減少させるリガンドを結合することにより達成することもできる。
【０５２４】
二本鎖の５’末端が解離する傾向を増大させる修飾は、単独で、あるいは本明細書中に記載する他の修飾と、例えば二本鎖の３’末端が解離する傾向を減少させる修飾と併用して使用することができる。同様に、二本鎖の３’末端が解離する傾向を減少させる修飾は、単独で、あるいは本明細書中に記載する他の修飾と、例えば二本鎖の５’末端が解離する傾向を増大させる修飾と併用して使用することができる。
【０５２５】
二本鎖のＡＳ  ５’末端の安定性の減少  サブユニット対は、解離又は融解を促進する
それらの傾向に基づいて順位付けすることができる（例えば、特定の対の会合又は解離の自由エネルギーに関して、最も簡単なアプローチは、個々の対ごとに対を検査することであるが、次の同類又は同様の分析もまた使用することができる）。解離を促進するという観点では、
Ａ：Ｕは、Ｇ：Ｃよりも好ましく、
Ｇ：Ｕは、Ｇ：Ｃよりも好ましく、
Ｉ：Ｃは、Ｇ：Ｃよりも好ましく（Ｉ＝イノシン）；
ミスマッチ、例えば非標準的な対合すなわち標準的対合以外の対合（本明細書中の他の箇所に記載するようなもの）は、標準的な（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）対よりも好ましく；
普遍的塩基を含む対合は、標準的な対合よりも好ましい。
【０５２６】
典型的なｄｓ  ｉＲＮＡ剤は、以下の通りに図示することができる：
【０５２７】
【化４０】
0005881970.tif 000044
【０５２８】
Ｓはセンス鎖を示し、ＡＳはアンチセンス鎖を示し、Ｒ１は任意選択の（かつ好ましくない）５’センス鎖突出部を示し、Ｒ２は任意選択の（しかし、好ましい）３’センス突出部を示し、Ｒ３は任意選択の（しかし、好ましい）３’アンチセンス突出部を示し、Ｒ４は任意選択の（かつ好ましくない）５’アンチセンス突出部を示し、Ｎはサブユニットを示し、［Ｎ］は、さらなるサブユニット対が存在し得ることを示し、Ｐｘは、センス鎖のＮｘとアンチセンス鎖のＮｘとの対を示す。突出部は、Ｐ図では示していない。幾つかの実施形態では、本明細書中の他の箇所に記載するように、３’ＡＳ突出部は領域Ｚに相当し、二本鎖領域は領域Ｘに相当し、３’Ｓ鎖突出部は領域Ｙに相当する。（図は、最大又は最小の長さを暗に示すことを意味するものではなく、長さに関するガイダンスは、本明細書中の他の箇所に提供される）。
【０５２９】
二本鎖を形成する傾向を減少させる対合が、ＡＳ鎖の５’末端で二本鎖の１個又はそれ以上の位置において使用されることが好ましい。末端の対（ＡＳ鎖に関しては最も５’側の対）は、Ｐ−１と称され、それに続く二本鎖内の対合の位置（ＡＳ鎖から見ると３’方向に向かっていく）は、Ｐ−２、Ｐ−３、Ｐ−４、Ｐ−５等と称される。二本鎖形成を調節する修飾を施すための好ましい領域は、Ｐ−５〜Ｐ−１、より好ましくはＰ−４〜Ｐ−１、さらに好ましくはＰ−３〜Ｐ−１である。Ｐ−１の修飾は特に好ましく、単独でも、あるいは他の位置（複数可）（例えば、上記に同定された位置のいずれか）の修飾（複数可）との併用でもよい。上述の領域の１つに存在する少なくとも１個、より好ましくは２個、３個、４個又は５個の対は、独立に、以下の群：
Ａ：Ｕ
Ｇ：Ｕ
Ｉ：Ｃ
ミスマッチ対、例えば非標準的な対、すなわち標準的な対以外の対、あるいは普遍的塩基を含む対合
から選ばれることが好ましい。
【０５３０】
好ましい実施形態では、解離を促進する対合を達成するのに必要とされるサブユニットの変更はセンス鎖で行われるが、幾つかの実施形態では、該変更がアンチセンス鎖で行われる。
【０５３１】
好ましい実施形態では、Ｐ−１〜Ｐ−４における少なくとも２個又は３個の対が、解離を促進する対である。
【０５３２】
好ましい実施形態では、Ｐ−１〜Ｐ−４における少なくとも２個又は３個の対は、Ａ：Ｕである。
【０５３３】
好ましい実施形態では、Ｐ−１〜Ｐ−４における少なくとも２個又は３個の対は、Ｇ：Ｕである。
【０５３４】
好ましい実施形態では、Ｐ−１〜Ｐ−４における少なくとも２個又は３個の対は、Ｉ：Ｃである。
【０５３５】
好ましい実施形態では、Ｐ−１〜Ｐ−４における少なくとも２個又は３個の対は、ミスマッチ対、例えば、非標準的な対、すなわち標準的な対以外の対である。
【０５３６】
好ましい実施形態では、Ｐ−１〜Ｐ−４における少なくとも２個又は３個の対は、普遍的塩基を含む対である。
【０５３７】
二本鎖のＡＳ  ３’末端の安定性の増大
サブユニット対は、安定性を促進し、かつ解離又は融解を阻害するそれらの傾向に基づいて順位付けすることができる（例えば、特定の対合の会合又は解離の自由エネルギーに関して、最も簡単な手法は、個々の対ごとに対を検査することであるが、次の同類又は同様の分析もまた使用することができる）。二本鎖の安定性を促進するという観点では、
Ｇ：Ｃは、Ａ：Ｕよりも好ましく、
ワトソン−クリックの対合（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）は、非標準的な対合、すなわち標準的な対合以外の対合よりも好ましく、
安定性を増大させる類縁体は、ワトソン−クリックの対合（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）よりも好ましく、
２−アミノ−Ａ：Ｕは、Ａ：Ｕよりも好ましく、
２−チオＵ又は５Ｍｅ−チオ−Ｕ：Ａは、Ｕ：Ａよりも好ましく、
Ｇ−クランプ（４個の水素結合を有するＣの類縁体）：Ｇは、Ｃ：Ｇよりも好ましく、
グアナジニウム−Ｇ−クランプ：Ｇは、Ｃ：Ｇよりも好ましく、
プソイドウリジン：Ａは、Ｕ：Ａよりも好ましく、
結合を増強する糖修飾、例えば２’位修飾（例えば、２’Ｆ、ＥＮＡ又はＬＮＡ）は、非修飾部分よりも好ましく、二本鎖の安定性を増強するために一方又は両方の鎖上に存在することができる。二本鎖を形成する傾向を増大させる対合が、二本鎖の１つ又はそれ以上の位置でＡＳ鎖の３’末端で使用されることが好ましい。末端の対（ＡＳ鎖から見て最も３’側の対）は、Ｐ１と称され、これに続く二本鎖の対合の位置（ＡＳ鎖から見て５’方向に向かっていく）は、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５等と称される。二本鎖形成を調節する修飾を施すための好ましい領域は、Ｐ５〜Ｐ１、より好ましくはＰ４〜Ｐ１、さらに好ましくはＰ３〜Ｐ１である。Ｐ１での修飾は特に好ましく、単独でも、あるいは他の位置（複数可）（例えば、上記に同定された位置のいずれか）の修飾（複数可）と併用されてもよい。上述の領域に存在する少なくとも１個、より好ましくは２個、３個、４個又は５個の対は、独立して、以下の群：
Ｇ：Ｃ
ワトソン−クリックの対合（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）を上回って安定性を増大させる
類縁体を有する対
２−アミノ−Ａ：Ｕ  ２−チオＵ又は５Ｍｅ−チオ−Ｕ：Ａ
Ｇ−クランプ（４個の水素結合を有するＣの類縁体）：Ｇ
グアナジニウム−Ｇ−クランプ：Ｇ
プソイドウリジン：Ａ
一方又は両方のサブユニットが、結合を増強する糖修飾、例えば２’位修飾（例えば、２’Ｆ、ＥＮＡ又はＬＮＡ）を有する対
から選ばれることが好ましい。
【０５３８】
好ましい実施形態では、Ｐ−１〜Ｐ−４における少なくとも２個又は３個の対は、二本鎖の安定性を促進する対である。
【０５３９】
好ましい実施形態では、Ｐ１〜Ｐ４における少なくとも２個又は３個の対は、Ｇ：Ｃである。
【０５４０】
好ましい実施形態では、Ｐ１〜Ｐ４における少なくとも２個又は３個の対は、ワトソン−クリックの対合を上回って安定性を増大させる類縁体を有する対である。
【０５４１】
好ましい実施形態では、Ｐ１〜Ｐ４における少なくとも２個又は３個の対は、２−アミノ−Ａ：Ｕである。
【０５４２】
好ましい実施形態では、Ｐ１〜Ｐ４における少なくとも２個又は３個の対は、２−チオＵ又は５Ｍｅ−チオ−Ｕ：Ａである。
【０５４３】
好ましい実施形態では、Ｐ１〜Ｐ４における少なくとも２個又は３個の対は、Ｇ−クランプ：Ｇである。
【０５４４】
好ましい実施形態では、Ｐ１〜Ｐ４における少なくとも２個又は３個の対は、グアニジニウム−Ｇ−クランプ：Ｇである。
【０５４５】
好ましい実施形態では、Ｐ１〜Ｐ４における少なくとも２個又は３個の対は、プソイドウリジン：Ａである。
【０５４６】
好ましい実施形態では、Ｐ１〜Ｐ４における少なくとも２個又は３個の対は、一方又は両方のサブユニットが、結合を増強する糖修飾、例えば２’位修飾（例えば、２’Ｆ、ＥＮＡ又はＬＮＡ）を有する対である。
【０５４７】
Ｇ−クランプ及びグアニジニウムＧ−クランプについては、以下の参照文献で論述されている。ホルムズ及びガイト（Ｈｏｌｍｅｓ  ａｎｄ  Ｇａｉｔ）、「２’−Ｏ−メチルＧ−クランプ含有オリゴヌクレオチドの合成及びＨＩＶ−１  Ｔａｔ−ＴＡＲ相互作用のそれらの阻害(The Synthesis of 2'-O-Methyl G-Clamp Containing Oligonucleotides and Their Inhibition of the HIV-1 Tat-TAR Interaction)」、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ、第２２巻：１２５９〜１２６２ページ、２００３年、ホルムズら（Ｈｏｌｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．）、「２’−Ｏ−メチルＧ−クランプリボヌクレオシド類縁体を含有するオリゴヌクレオチドによるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの及び細胞におけるヒト免疫不全ウイルス１型Ｔａｔ依存性トランス活性化の立体阻害(S teric inhibition of human immunodeficiency virus type-1 Tat-dependent trans-activation in vitro and in cells by oligonucleotides containing 2'-O-methyl G-clamp ribonucleoside analogues)」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ、第３１巻：２７５９〜２７６８ページ、２００３年、ワイルズら（Ｗｉｌｄｓ，ｅｔ
ａｌ．）、「合成三環式シトシン類縁体：グアニジニウムＧ−クランプによるグアノシンの認識に関する構造基盤 (Structural basis for recognition of guanosine by a synthetic tricyclic cytosine analogue:Guanidinium G-clamp) 」、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ、第８６巻：９６６〜９７８ページ、２００３年、ラジェエエフら（Ｒａｊｅｅｖ，ｅｔ  ａｌ．）、「三環式シトシン類縁体を含有する高親和性ペプチド核酸オリゴマー(High-Affinity Peptide Nucleic Acid Oligomers Containing Tricyclic Cytosine Analogues)」、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、第４巻：４３９５〜４３９８ページ、２００２年、アウシンら（Ａｕｓｉｎ，ｅｔ  ａｌ．）、「アミノ−及びグアニジノ−Ｇ−クランプＰＮＡモノマーの合成(Synthesis of Amino- and Guanidino-G-Clamp PNA Monomers)」、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、第４巻：４０７３〜４０７５ページ、２００２年、マイヤーら（Ｍａｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、「三環式シトシン類縁体フェノキサジン及び９−（２−アミノエトキシ）フェノキサジン（「Ｇ−クランプ」）を含有するオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性及びそれらのヌクレアーゼ耐性特性の由来(Nuclease resistance of oligonucleotides containing the tricyclic cytosineanalogues phenoxazine and 9-(2-aminoethoxy)-phenoxazine ("G-clamp") and origins
of their nuclease resistance properties) 」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第４１巻
：１３２３〜７ページ、２００２年、フラナガンら（Ｆｌａｎａｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．）、「アンチセンスオリゴヌクレオチドに対する増強された効力を付与するシトシン類縁体(A cytosine analog that confers enhanced potency to antisense oligonucleotides) 」、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  Ｏｆ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ、第９６巻：３５１３〜８ページ、１９９９年。
【０５４８】
二本鎖のＡＳ  ５’末端の安定性の減少と二本鎖のＡＳ  ３’末端の安定性の増大とを同時に行うこと
上述のように、ｉＲＮＡ剤は、二本鎖のＡＳ  ５’末端の安定性を減少させ、かつ二本鎖のＡＳ  ３’末端の安定性を増大させるように修飾することができる。このことは、二本鎖のＡＳ  ５’末端における１つ又はそれ以上の安定性を減少させる修飾を、二本鎖のＡＳ  ３’末端における１つ又はそれ以上の安定性を増加させる修飾と組み合わせることにより達成することができる。したがって、好ましい実施形態は、Ｐ−５〜Ｐ−１、より好ましくはＰ−４〜Ｐ-1、さらに好ましくはＰ-3〜Ｐ-1における修飾を包含する。Ｐ-1での修飾は特に好ましく、単独でも、あるいは他の位置（例えば、上記に同定された位置）との併用でもよい。二本鎖領域のＡＳ  ５’末端の上述の領域の１つに存在する少なくとも１個、より好ましくは２個、３個、４個又は５個の対は、独立に、以下の群から選ばれることが好ましい：
Ａ：Ｕ
Ｇ：Ｃ
Ｉ：Ｕ
ミスマッチ対、例えば非標準的な対合、すなわち標準的な対合以外の対合、あるいは普遍的塩基を含む対合、及び
Ｐ５〜Ｐ１、より好ましくはＰ４〜Ｐ１、さらに好ましくはＰ３〜Ｐ１での修飾。Ｐ１での修飾は特に好ましく、単独でも、あるいは他の位置（例えば、上記に同定された位置）との併用でもよい。二本鎖領域のＡＳ  ３’末端の上述の領域の１つに存在する少なくとも１個、より好ましくは２個、３個、４個又は５個の対は、独立に、以下の群：
Ｇ：Ｃ
ワトソン−クリックの対合（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）を上回って安定性を増大させる類縁体を有する対
２−アミノ−Ａ：Ｕ
２−チオＵ又は５Ｍｅ−チオ−Ｕ：Ａ
Ｇ−クランプ（４個の水素結合を有するＣの類縁体）：Ｇ
グアナジニウム−Ｇ−クランプ：Ｇ
プソイドウリジン：Ａ
一方又は両方のサブユニットが、結合を増強する糖修飾、例えば２’位修飾（例えば、２’Ｆ、ＥＮＡ又はＬＮＡ）を有する対
から選ばれることが好ましい。
【０５４９】
本発明はまた、ＤＭＴＤＳを有するｉＲＮＡ剤を選択及び作製する方法を包含する。例えば、ｉＲＮＡ剤として使用するための候補配列に関して標的配列をスクリーニングする場合、本明細書中に記載するＤＭＴＤＳ特性を有する配列、及び、所望のレベルのＤＭＴＤＳを付与するために好ましくはできる限り少ない変更で特にＡＳ鎖に対して修飾を施すことができる配列を選択することができる。
【０５５０】
本発明はまた、ｉＲＮＡ剤候補配列を提供すること、ならびにＤＭＴＤＳ  ｉＲＮＡ剤を提供するために、Ｐ−５〜Ｐ−１における少なくとも１個のＰ及び／又はＰ５〜Ｐ1 における少なくとも１個のＰを修飾することを包含する。
【０５５１】
ＤＭＴＤＳ  ｉＲＮＡ剤は、本明細書中に記載する任意の方法において、例えば本明細書中に開示する任意の遺伝子をサイレンシングするために、本明細書中に記載する任意の障害を治療するために、本明細書中に記載する任意の製剤中で、ならびに通常は本明細書中の他の箇所に記載する方法及び組成物において、または本明細書中の他の箇所に記載する方法及び組成物とともに使用することができる。ＤＭＴＤＳ  ｉＲＮＡ剤は、本明細書中に記載する他の修飾、例えば標的化剤を結合すること又は安定性を増強する修飾を含めること、例えばヌクレアーゼ耐性モノマーを含めることもしくは自己会合して鎖内二本鎖構造を形成する一本鎖突出部（例えば、３’ＡＳ突出部及び／又は３’Ｓ鎖突出部）を含めること、を取り入れることができる。
【０５５２】
好ましくは、これらのｉＲＮＡ剤は、本明細書中に記載する構成様式を有する。
【０５５３】
その他の実施形態
ＲＮＡ、例えばｉＲＮＡ剤は、例えば細胞へ送達される外来ＤＮＡの鋳型から、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞において産生され得る。例えば、該ＤＮＡ鋳型をベクターに挿入して、遺伝子治療ベクターとして使用することができる。遺伝子治療ベクターは、例えば静脈内注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号）により、あるいは定位注射（例えば、チェンら（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
第９１巻：３０５４〜３０５７ページ、１９９４年を参照）により対象へ送達することができる。遺伝子治療ベクターの医薬調製物は、許容可能な希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含むこともできるし、あるいは遺伝子送達ビヒクルが包埋される徐放性マトリックスを含むこともできる。例えば、ＤＮＡ鋳型は、２つの転写ユニット（ｉＲＮＡ剤の鎖の上部を包含する転写物を産生するもの、及びｉＲＮＡ剤の下部を包含する転写物を産生するもの）を包含することができる。鋳型が転写されると、ｉＲＮＡ剤が産生され、プロセシングを受けて遺伝子サイレンシングを仲介するｓＲＮＡ剤断片となる。
【０５５４】
ｉｎ  ｖｉｖｏ送達
ｉＲＮＡ剤は、対象（例えば、ヒトのような哺乳類）へｉＲＮＡ剤を効率的に送達するためのポリマーに結合、例えば非共有結合させることができる。ｉＲＮＡ剤は、例えばシクロデキストリンと複合体形成させることができる。シクロデキストリンは、治療用化合物の送達ビヒクルとして使用されている。シクロデキストリンは、シクロデキストリンの疎水性キャビティ内へ収まることが可能な薬物と包接複合体を形成することができる。他の例では、シクロデキストリンは、オリゴヌクレオチド及びそれらの誘導体のような他の生物学的に活性な分子と非共有結合を形成する。シクロデキストリンの使用により、水溶
性の薬物送達複合体が創出され、該複合体は標的指向性の基又は他の官能基で修飾することができる。米国特許第５，６９１，３１６号（これは、参照により本明細書に援用される）に記載されるオリゴヌクレオチド用のシクロデキストリン細胞送達系は、本発明の方法における使用に適している。この系では、オリゴヌクレオチドはシクロデキストリンと非共有結合的に複合体形成されるか、あるいはオリゴヌクレオチドがアダマンチンに共有結合され、続いてアダマンチンがシクロデキストリンと非共有結合的に結合される。
【０５５５】
送達分子には、線状シクロデキストリンコポリマー又は線状酸化シクロデキストリンコポリマーであってシクロデキストリンコポリマーに少なくとも１つのリガンドが結合されたものを挙げることができる。米国特許第６，５０９，３２３号（参照により本明細書に援用される）に記載されるような送達系は、本発明における使用に適している。ｉＲＮＡ剤は、線状シクロデキストリンコポリマー及び／又は線状酸化シクロデキストリンコポリマーに結合させることができる。シクロデキストリンコポリマー又は酸化シクロデキストリンコポリマーの一方又は両方を、別のポリマーに架橋させることもでき、かつ／又はリガンドに結合させることもできる。
【０５５６】
ｉＲＮＡ送達用組成物は、付加物の特徴的な構造を有する分子化合物である「包接複合体」を使用することができる。この構造では、「ホスト分子」が、送達ビヒクル中の別の化合物の少なくとも１部を空間的に封入する。封入される化合物（「ゲスト分子」）は、ホスト分子のフレームワーク構造に影響を及ぼすことなくホスト分子のキャビティに配置される。「ホスト」は、好ましくはデキストリンであるが、米国特許公報第２００３／０００８８１８号（参照により本明細書に援用される）で提唱される任意の分子であり得る。
【０５５７】
シクロデキストリンは、各種のイオン及び分子と相互作用することができ、生じた包接化合物は、「ホスト−ゲスト」複合体の種類に属する。ホスト−ゲストの関係内で、ホスト分子及びゲスト分子の結合部位は、立体電子的意味合いで相補的であるべきである。本発明の組成物は、少なくとも１つのポリマー及び少なくとも１つの治療薬を、通常はポリマー及び治療薬（例えば、ｉＲＮＡ剤）の粒子状複合物の形態で含有することができる。ｉＲＮＡ剤は、１つ又はそれ以上の複合化剤を含有することができる。粒子状複合物の少なくとも１つのポリマーは、ホスト−ゲスト又はゲスト−ホスト相互作用で複合化剤と相互作用して、ポリマーと複合化剤との間で包接複合体を形成することができる。より具体的には、ポリマー及び複合化剤は、組成物に機能性を導入するのに使用することができる。例えば、粒子状複合物の少なくとも１つのポリマーはホスト機能を有し、ゲスト機能を有する複合化剤と包接複合体を形成する。別例として、粒子状複合物の少なくとも１つのポリマーはゲスト機能を有し、ホスト機能を有する複合化剤と包接複合体を形成する。粒子状複合物のポリマーはまた、ホスト機能及びゲスト機能の両方を含有し、ゲストの複合化剤及びホストの複合化剤と包接複合体を形成することもできる。機能性を有するポリマーは、例えば細胞標的化及び／又は細胞との接触（例えば、肝細胞に対する標的化又は肝細胞との接触）、細胞間輸送、ならびに細胞への流入及び細胞からの放出のうち少なくともいずれか）を促進することができる。
【０５５８】
粒子状複合物を形成する際、ｉＲＮＡ剤は、その生物学的又は治療的活性を維持してもよいし、あるいは維持しなくてもよい。治療用組成物から、具体的には粒子状複合物のポリマーから放出されると、ｉＲＮＡ剤の活性は回復する。したがって、粒子状複合物は好適には、例えば分解に起因する活性の損失からｉＲＮＡ剤を保護し、生物学的利用性を増強する。したがって、組成物は、ｉＲＮＡ剤又は任意の活性な化学物質に安定性、特に貯蔵中又は溶液中の安定性を提供するのに使用することができる。ｉＲＮＡ剤は、粒子状複合物又は治療用組成物を形成する前又は後に、リガンドでさらに修飾されてもよい。リガンドは、さらなる機能性を提供することができる。例えば、リガンドは、標的化部分であ
り得る。
【０５５９】
生理学的影響
本明細書中に記載するｉＲＮＡ剤は、治療上の毒性の決定が、該ｉＲＮＡ剤と、ヒト配列および非ヒト動物配列の両方との相補性によってより容易になされるように設計することができる。これらの方法では、ＲＮＡ剤は、ヒト由来の核酸配列及び少なくとも１種類の非ヒト動物、例えば非ヒト哺乳類（例えば、げっ歯類、反すう類又は霊長類）由来の核酸配列に完全に相補的である配列から構成され得る。例えば、非ヒト哺乳類は、マウス、ラット、イヌ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、サル、ピグミーチンパンジー、ナミチンパンジー、アカゲザル又はカニクイザルであり得る。ｉＲＮＡ剤の配列は、非ヒト哺乳類及びヒトの相同遺伝子、例えば発がん遺伝子又は腫瘍抑制遺伝子内の配列に相補的であり得る。非ヒト哺乳類におけるｉＲＮＡ剤の毒性を決定することにより、ヒトにおけるｉＲＮＡ剤の毒性を推定することができる。より厳しい毒性試験のためには、ｉＲＮＡ剤を、ヒト及び２種類以上（例えば２種類又は３種類又はそれ以上）の非ヒト動物に対して相補的とすることができる。
【０５６０】
本明細書中に記載する方法は、ヒトに対するｉＲＮＡ剤の任意の生理学的作用、例えば毒性作用のような任意の望ましくない作用、又は任意の好ましい作用、すなわち所望の作用と相関させるのに使用することができる。
【０５６１】
送達モジュール
ＲＮＡ、例えば本明細書中に記載するｉＲＮＡ剤は、薬物送達複合体又はモジュール（例えば、本明細書中に記載するもの及び同時係属中の共同所有されている２００３年３月１２日付けで出願された米国特許仮出願第６０／４５４，２６５号及び２００４年３月８日付けで出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０４／０７０７０号（これらはともに、参照により本明細書に援用される）に記載されるもの）とともに使用することができる。
【０５６２】
さらに、本発明は、このような薬物送達複合体又はモジュールと組み合わされ、結合され、かつ送達される本明細書中に記載するｉＲＮＡ剤、例えば、パリンドローム構造のｉＲＮＡ剤、非標準的な対合を有するｉＲＮＡ剤、本明細書中に記載する遺伝子（例えば、肝臓で活性な遺伝子）を標的とするｉＲＮＡ剤、本発明に記載する化学修飾（例えば、分解に対する耐性を増強する修飾）を有するｉＲＮＡ剤、本明細書中に記載する構成様式又は構造を有するｉＲＮＡ剤、本明細書中に記載するように投与されるｉＲＮＡ剤、又は本明細書中に記載するように製剤化されるｉＲＮＡ剤を包含する。
【０５６３】
ｉＲＮＡ剤は、モジュラー複合体を特徴とする送達剤に複合体形成させることができる。複合体は、（ａ）縮合剤（例えば、核酸を例えばイオン相互作用又は静電相互作用により誘引（例えば、結合）することが可能な作用物質）、（ｂ）融合剤（例えば、細胞膜（例えば、エンドソーム膜）と融合すること、及び／又は該膜を通過して輸送されることが可能な作用物質）、及び（ｃ）標的化基、例えば、細胞又は組織を標的とする物質（例えば、肝細胞のような特定の細胞種に結合するレクチン、糖タンパク質、脂質又はタンパク質（例えば抗体）、のうち１つ又はそれ以上（好ましくは２つ又はそれ以上、より好ましくは３つすべて）に連結させた担体物質を包含することができる。
【０５６４】
ｉＲＮＡ剤、例えば本明細書中に記載するｉＲＮＡ剤又はｓＲＮＡ剤は、モジュラー複合体に連結（例えばカップリング又は結合）させることができる。ｉＲＮＡ剤は、複合体の縮合剤と相互作用することができ、複合体は、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで、ｉＲＮＡ剤を細胞へ送達するのに使用することができる。例えば、複合体は、ｉＲＮＡ剤の送達を必要とする対象へｉＲＮＡ剤を送達するために、例えば障害（例えば、肝臓の疾患又は障害のような本明細書中に記載する障害）を有する対象へｉＲＮＡ剤を送
達するために使用することができる。
【０５６５】
融合剤及び縮合剤は、異なる作用物質であってもよいし、又は１つの同じ作用物質であってもよい。例えば、ポリアミノ鎖、例えばポリエチレンイミン（ＰＥＩ）は、融合剤及び／又は縮合剤であり得る。
【０５６６】
送達剤は、モジュラー複合体であり得る。例えば、複合体は、以下の：
（ａ）縮合剤（例えば、核酸を例えばイオン相互作用により誘引（例えば、結合）することが可能な作用物質）、
（ｂ）融合剤（例えば、細胞膜（例えば、エンドソーム膜）と融合すること及び／又は該膜を通過して輸送されることが可能な作用物質）、及び
（ｃ）標的化基、例えば、細胞又は組織を標的とする物質（例えば、肝細胞のような特定の細胞種に結合するレクチン、糖タンパク質、脂質又はタンパク質（例えば抗体）のうち１つ又はそれ以上（好ましくは２つ又はそれ以上の、より好ましくは３つすべて）に連結させた担体物質を包含することができる。標的化基は、甲状腺刺激ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタントプロテインＡ、ムチン糖質、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸塩、ビタミンＢ１２、ビオチン、ネプロキシン（Neproxin) 、又はＲＧＤペプチド若しくはＲＤＧペプチド擬似体であり得る。
【０５６７】
担体物質
本明細書中に記載するモジュラー複合体の担体物質は、縮合剤、融合剤及び標的化基のうち１つ又はそれ以上を結合するための基剤であり得る。担体物質は内因性の酵素活性を欠いていることが好ましい。担体物質は好ましくは、生体分子、好ましくは高分子である。高分子の生物学的担体が好ましい。担体分子は生分解性であることもまた好ましい。
【０５６８】
担体物質は、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）又はグロブリン）、糖質（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン又はヒアルロン酸）、又は脂質のような天然に存在する物質であり得る。担体分子はまた、合成ポリマー（例えば、合成ポリアミノ酸）のような組換え分子又は合成分子であり得る。ポリアミノ酸の例としては、ポリリシン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−マレイン酸無水物コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル−マレイン酸無水物コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、又はポリホスファジン（polyphosphazine)が挙げられる。他の有用な担体分子は、日常的な方法により同定することができる。
【０５６９】
担体物質は、（ａ）サイズが少なくとも１Ｄａであること、（ｂ）少なくとも５個の荷電基、好ましくは５〜５，０００個の荷電基を有すること、（ｃ）少なくとも１：１の担体物質対融合剤の比で複合体中に存在すること、（ｄ）少なくとも１：１の担体物質対縮合剤の比で複合体中に存在すること、（ｅ）少なくとも１：１の担体物質対標的化剤の比で複合体中に存在すること、のうち１つ又はそれ以上を特徴とすることができる。
【０５７０】
融合剤
本明細書中に記載するモジュラー複合体の融合剤は、ｐＨ環境に応答性である、例えばｐＨ環境に応じて電荷を変化させる作用物質であり得る。エンドソームのｐＨに遭遇する
と、融合剤は、物理的変化、例えばエンドソーム膜を崩壊するか、又はエンドソーム膜の浸透性を増大する浸透圧特性の変化を引き起こすことができる。好ましくは、融合剤は、生理学的範囲未満のｐＨで、電荷を変化させる（例えば、プロトン化されるようになる）。例えば、融合剤は、ｐＨ４．５〜６．５でプロトン化されるようになり得る。融合剤は、複合体が例えばエンドサイトーシスによって細胞に取り込まれた後、細胞の細胞質へｉＲＮＡ剤を放出するように作用することにより、細胞内のｉＲＮＡ剤の細胞内濃度を増大させることができる。
【０５７１】
一実施形態では、融合剤は、特定のｐＨ範囲に暴露されると、例えば電荷の変化（例えばプロトン化）を受ける構成部分（例えば、アミノ基）を有することができる。融合剤の電荷の変化は、小胞、例えば細胞内小胞（例えば、エンドソーム）の変化（例えば、浸透圧変化）を誘発することができる。例えば、融合剤は、エンドソームのｐＨ環境に暴露されると、エンドソーム膜の多孔性を増大するのに（好ましくは、破裂させるのに）実質的に十分な溶解性又は浸透圧変化を引き起こす。
【０５７２】
融合剤は、ポリマー、好ましくはポリアミノ鎖（例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ））であり得る。ＰＥＩは、直鎖状でも、分岐状でも、合成でも天然でもよい。ＰＥＩは、例えばアルキル置換されたＰＥＩでもよいし脂質置換されたＰＥＩでもよい。
【０５７３】
他の実施形態では、融合剤は、ポリヒスチジン、ポリイミダゾール、ポリピリジン、ポリプロピレンイミン、メリチン又はポリアセタール物質（例えば、カチオン性ポリアセタール）であり得る。幾つかの実施形態では、融合剤は、αらせん構造を有することができる。融合剤は、膜崩壊剤（例えばメリチン）であり得る。
【０５７４】
融合剤は、１つ又はそれ以上の以下の特徴を有することができる：（ａ）サイズが少なくとも１Ｄａであること、（ｂ）少なくとも１０個の荷電基、好ましくは１０〜５，０００個の荷電基、より好ましくは５０〜１，０００個の荷電基を有すること、（ｃ）少なくとも１：１の融合剤対担体物質の比で複合体中に存在すること、（ｄ）少なくとも１：１の融合剤対縮合剤の比で複合体中に存在すること、（ｅ）少なくとも１：１の融合剤対標的化剤の比で複合体中に存在すること。
【０５７５】
他の適切な融合剤は、専門家により試験及び同定され得る。化合物の、ｐＨ環境に応答する（例えば、ｐＨ環境に応じて電荷を変化させる）能力は、日常的な方法により、例えば細胞アッセイにおいて試験することができる。例えば、試験化合物を細胞と組み合わせるか、又は細胞と接触させて、例えばエンドサイトーシスにより細胞に試験化合物を取り込ませる。続いて、接触させた細胞からエンドソーム調製物を作製することができ、該エンドソーム調製物を対照細胞由来のエンドソーム調製物と比較することができる。接触処理した細胞由来のエンドソーム画分の対照細胞に対する変化（例えば、減少）は試験化合物が融合剤として機能することができることを示す。あるいは、接触処理した細胞及び対照細胞を、例えば顕微鏡法により（例えば、光学顕微鏡法又は電子顕微鏡法により）評価して、細胞におけるエンドソーム集団の差を決定することができる。試験化合物を標識してもよい。別のタイプのアッセイでは、本明細書中に記載するモジュラー複合体は、１つ又はそれ以上の試験融合剤又は推定融合剤を用いて構築される。モジュラー複合体は、ｉＲＮＡの替わりに標識された核酸を用いて構築することもできる。融合剤の、ｐＨ環境に応答する（例えば、ｐＨ環境に応じて電荷を変化させる）能力は、モジュラー複合体がいったん細胞により取り込まれれば、上述のように、例えばエンドソーム調製物の調製により、あるいは顕微鏡技法により評価することができる。２工程アッセイもまた実施することができ、該アッセイでは、第１のアッセイが試験化合物単独のｐＨ環境に応答する（例えば、ｐＨ環境に応じて電荷を変化させる）能力を評価し、第２のアッセイが、試験化合物を含むモジュラー複合体のｐＨ環境に応答する（例えば、ｐＨ環境に応じて電荷を変化
させる）能力を評価する。
【０５７６】
縮合剤
本明細書中に記載するモジュラー複合体の縮合剤は、ｉＲＮＡ剤と相互作用（例えば、ｉＲＮＡ剤を誘引、保持又はｉＲＮＡ剤に結合）することができ、（ａ）ｉＲＮＡ剤を縮合（例えば、ｉＲＮＡ剤のサイズ又は電荷を低減）させ、かつ／又は（ｂ）ｉＲＮＡ剤を保護（例えば、分解に対してｉＲＮＡ剤を保護）するように作用することができる。縮合剤は、例えばイオン性相互作用により、核酸（例えば、ｉＲＮＡ剤）と相互作用することができる構成部分（例えば、荷電基）を包含することができる。縮合剤は好ましくは、荷電ポリマー（例えば、ポリカチオン鎖）である。縮合剤は、ポリリシン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、プソイドペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第四級塩又はαらせん状ペプチドであり得る。
【０５７７】
縮合剤は、以下の特徴を有することができる：（ａ）サイズが少なくとも１Ｄａであること、（ｂ）少なくとも２個の荷電基、好ましくは２〜１００個の荷電基を有すること、（ｃ）少なくとも１：１の縮合剤対担体物質の比で複合体中に存在すること、（ｄ）少なくとも１：１の縮合剤対融合剤の比で複合体中に存在すること、（ｅ）少なくとも１：１の縮合剤対標的化剤の比で複合体中に存在すること。
【０５７８】
その他の適切な縮合剤は、専門家により、例えば、核酸（例えば、ｉＲＮＡ剤）と相互作用する試験剤の能力を評価することにより、試験及び同定され得る。試験剤の、核酸（例えば、ｉＲＮＡ剤）と相互作用する（例えば、ｉＲＮＡ剤を縮合又は保護する）能力は、日常的な技法により評価することができる。１つのアッセイでは、試験剤を核酸と接触させて、接触させた核酸のサイズ及び／又は電荷を、分子の質量及び／又は電荷の変化を検出するのに適した技法により評価する。このような技法としては、非変性ゲル電気泳動、免疫学的方法（例えば、免疫沈降）、ゲル濾過、イオン相互作用クロマトグラフィ等が挙げられる。試験剤は、対照と比較して、接触させた核酸の質量及び／又は電荷（好ましくは、両方）を変化させる場合に、縮合剤として同定される。２工程アッセイもまた実施することができ、該２工程アッセイでは、第１のアッセイが試験化合物単独の核酸と相互作用する（例えば、核酸に結合する（例えば、核酸の電荷及び／又は質量を縮合する））能力を評価し、第２のアッセイが、試験化合物を含むモジュラー複合体の、核酸と相互作用する（例えば、核酸に結合する（例えば、核酸の電荷及び／又は質量を縮合する））能力を評価する。
【０５７９】
両親媒性送達剤
ＲＮＡ、例えば本明細書中に記載するｉＲＮＡ剤は、本明細書中に記載する、ならびに係属中の共同所有されている２００３年３月１３日付けで出願された米国仮出願第６０／４５５，０５０号及び２００４年３月８日付けで出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０４／０７０７０号（本願に援用する）に記載されるような、両親媒性送達複合体又はモジュールとともに使用することができる。
【０５８０】
さらに、本発明は、このような両親媒性送達複合体と組み合わされ、結合され、かつこのような両親媒性送達複合体により送達される、本明細書中に記載するｉＲＮＡ剤、例えば、パリンドローム構造のｉＲＮＡ剤、非標準的な対合を有するｉＲＮＡ剤、本明細書中に記載する遺伝子（例えば、肝臓で活性な遺伝子）を標的とするｉＲＮＡ剤、本明細書中に記載する化学修飾（例えば、分解に対する耐性を増強する修飾）を有するｉＲＮＡ剤、本明細書中に記載する構成様式又は構造を有するｉＲＮＡ剤、本明細書中に記載するように投与されるｉＲＮＡ剤、又は本明細書中に記載するように製剤化されるｉＲＮＡ剤を包含する。
【０５８１】
両親媒性分子は、疎水性領域及び親水性領域を有する分子である。このような分子は、脂質（例えば、細胞の脂質二重層）と相互作用する（例えば、浸透又は破壊する）ことができる。したがって、両親媒性分子は、会合された（例えば、結合された）ｉＲＮＡ（例えば、本明細書中に記載するｉＲＮＡ又はｓＲＮＡ）の送達剤として作用することができる。本明細書中に記載する組成物（例えば、本明細書中に記載する両親媒性ｉＲＮＡ構築物）で使用されるべき好ましい両親媒性分子は、ポリマーである。該ポリマーは、二次構造、例えば反復性の二次構造を有し得る。
【０５８２】
両親媒性ポリマーの一例は、両親媒性ポリペプチド、例えばポリペプチドが親水面及び疎水面を有するような二次構造を有するポリペプチドである。両親媒性ペプチド構造（例えば、αらせん状ポリペプチド）の設計は、当業者には日常的である。例えば、以下の参照文献にガイダンスが提供されている：グレルら（Ｇｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．）（２００１年）「タンパク質設計及びフォールディング：自己集合したらせん状の束の鋳型トラッピング(Protein design and folding: template trapping of self-assembled helical bundles) 」、Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｓｃｉ  第７（３）巻：１４６〜５１ページ；チェンら（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）（２００２年）、「両親媒性α−らせんにおけるアミノ酸側鎖の立体化学安定性係数の決定(Determination of stereochemistry stability coefficientsof amino acid side-chains in an amphipathic alpha-helix) 」  Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｒｅ
ｓ  第５９（１）巻：１８〜３３ページ；イワタら（Ｉｗａｔａ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９４年）  「両親媒性３（１０）−らせんペプチドの設計及び合成、ならびにそれらのリン脂質二重層との相互作用及びイオンチャネル形成(Design and synthesis of amphipathic 3(10)-helical peptides and their interactions with phospholipid bilayers and ion channel formation)」  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  第２６９（７）巻：４９２８〜３３ページ；コーナットら（Ｃｏｒｎｕｔ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９４年）  「両親媒性α−らせん概念。メリチンの溶血活性よりも高い溶血活性を有する理論上両親媒性のＬｅｕ、Ｌｙｓペプチドの新規の設計への適用(The amphipathic alpha-helix concept. Application to the de novo design of ideally amphipathic Leu, Lys peptides with hemolytic activity higher than that of melittin)」  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  第３４９（１）巻：２９〜３３ページ；ネグレートら（Ｎｅｇｒｅｔｅ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９８年）
「タンパク質に関する構造上のコードの解読：ドメインクラスでのヘリックスの傾向及びα−らせんにおける統計学的多重残基情報(Deciphering the structural code for proteins: helical propensities in domain classes and statistical multiresidue information in alpha-helices)」  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  第７（６）巻：１３６８〜７９ページ。
【０５８３】
両親媒性ポリマーの別の例は、２つ又はそれ以上の両親媒性サブユニット、例えば環状部分（例えば、１つ又はそれ以上の親水性基及び１つ又はそれ以上の疎水性基を有する環状部分）を含有する２つ又はそれ以上のサブユニットから構成されるポリマーである。例えば、サブユニットは、ステロイド（例えばコール酸）又は芳香族部分を含有してもよい。このような構成部分は、それらがポリマー構造中にある場合、対向する親水面及び疎水面を形成することができるように、アトロプ異性を示すことができることが好ましい。
【０５８４】
推定上の両親媒性分子の、脂質膜（例えば、細胞膜）と相互作用する能力は、日常的な方法により、例えば無細胞アッセイ又は細胞アッセイにおいて試験することができる。例えば、試験化合物を、合成脂質二重層、細胞膜分画又は細胞と組み合わせるか、あるいは接触させて、試験化合物が、脂質二重層、細胞膜又は細胞と相互作用し、細胞膜又は細胞に浸透し、あるいは細胞膜又は細胞を破壊するその能力に関して評価する。試験化合物を、脂質二重層、細胞膜又は細胞との相互作用を検出するために標識することもできる。別のタイプのアッセイでは、試験化合物をレポーター分子又はｉＲＮＡ剤（例えば、本明細
書中に記載するｉＲＮＡ又はｓＲＮＡ）に連結させて、レポーター分子又はｉＲＮＡ剤が脂質二重層、細胞膜又は細胞に浸透する能力を評価する。２工程アッセイもまた実施することができ、該２工程アッセイでは、第１のアッセイが、試験化合物単独の、脂質二重層、細胞膜又は細胞と相互作用する能力を評価し、第２のアッセイが、試験化合物及びレポーター又はｉＲＮＡ剤を含む構築物（例えば、本明細書中に記載する構築物）の、脂質二重層、細胞膜又は細胞と相互作用する能力を評価する。
【０５８５】
本明細書中に記載する組成物において有用な両親媒性ポリマーは、少なくとも２個、好ましくは少なくとも５個、より好ましくは少なくとも１０個、２５個、５０個、１００個、２００個、５００個、１，０００個、２，０００個、５０，０００個又はそれ以上のサブユニット（例えば、アミノ酸又は環状サブユニット）を有する。１つの両親媒性ポリマーを、１つ又はそれ以上、例えば２個、３個、５個、１０個又はそれ以上のｉＲＮＡ剤（例えば、本明細書中に記載するｉＲＮＡ又はｓＲＮＡ剤）に連結させることができる。幾つかの実施形態では、両親媒性ポリマーは、アミノ酸及び環状サブユニット（例えば、芳香族サブユニット）の両方を含有することができる。
【０５８６】
本発明は、両親媒性分子と関係付けられたｉＲＮＡ剤（例えば、本明細書中に記載するｉＲＮＡ又はｓＲＮＡ）を包含する組成物を特徴とする。このような組成物は、本明細書中では「両親媒性ｉＲＮＡ構築物」とも呼ばれる。このような組成物及び構築物は、ｉＲＮＡ剤の送達又は標的化、例えばｉＲＮＡ剤を細胞へ送達又は標的化するのに有用である。理論により拘束されることを望まないが、このような組成物及び構築物は、例えばｉＲＮＡ剤の細胞への進入が可能となるように、脂質（例えば、細胞の脂質二重層）の多孔性を増大させる（例えば、浸透又は崩壊させる）ことができる。
【０５８７】
一態様では、本発明は、両親媒性分子に連結されたｉＲＮＡ剤（例えば、本明細書中に記載するｉＲＮＡ剤又はｓＲＮＡ剤）を含む組成物に関する。ｉＲＮＡ剤及び両親媒性分子は、共有結合又は非共有結合のいずれかにより、互いに持続的に接触した状態に保持されていてもよい。
【０５８８】
該組成物又は構築物の両親媒性分子は、リン脂質以外、例えばミセル、膜又は膜断片以外であることが好ましい。
【０５８９】
組成物又は構築物の両親媒性分子は、好ましくはポリマーである。該ポリマーは、２つ又はそれ以上の両親媒性サブユニットを含んでもよい。１つ又はそれ以上の親水性基及び１つ又はそれ以上の疎水性基がポリマー上に存在してもよい。ポリマーは、反復性の二次構造ならびに第１の面及び第２の面を有してもよい。反復性の二次構造に沿った親水性基及び疎水性基の分布は、ポリマーの一方の面が親水面であり、かつポリマーの他方の面が疎水面であるような分布であり得る。
【０５９０】
両親媒性分子は、ポリペプチド、例えばその二次構造としてα−らせん構造を含むポリペプチドであり得る。
【０５９１】
一実施形態では、両親媒性ポリマーは、１つ又はそれ以上の環状部分（例えば、１つ又はそれ以上の親水性基及び／又は１つ又はそれ以上の疎水性基を有する環状部分）を含有する１つ又はそれ以上のサブユニットを包含する。一実施形態では、ポリマーは、環状部分が交互に疎水性基及び親水性基を有するように環状部分を有するポリマーである。例えば、サブユニットは、ステロイド（例えば、コール酸）を含有してもよい。別の例では、サブユニットは、芳香族部分を含有してもよい。芳香族部分は、アトロプ異性を示すことができるもの、例えば２，２’−ビス（置換）−１，１’−ビナフチル又は２，２’−ビス（置換）ビフェニルであり得る。サブユニットは、式（Ｍ）：
【０５９２】
【化４１】
0005881970.tif 000045
【０５９３】
を有する芳香族部分を含んでもよい。
【０５９４】
本発明は、両親媒性分子と関連付けられたｉＲＮＡ剤（例えば、本明細書中に記載するｉＲＮＡ又はｓＲＮＡ）を包含する組成物を特徴とする。このような組成物は、本明細書中では「両親媒性ｉＲＮＡ構築物」と称し得る。このような組成物及び構築物は、ｉＲＮＡ剤の送達又は標的化、例えば細胞へのｉＲＮＡ剤の送達又は標的化において有用である。理論により拘束されることを望まないが、このような組成物及び構築物は、例えばｉＲＮＡ剤の細胞への進入が可能となるように、脂質（例えば、細胞の脂質二重層）の多孔性を増大させる（例えば浸透又は破壊する）ことができる。
【０５９５】
一態様では、本発明は、両親媒性分子に連結されたｉＲＮＡ剤（例えば、本明細書中に記載するｉＲＮＡ剤又はｓＲＮＡ剤）を含む組成物に関する。ｉＲＮＡ剤及び両親媒性分子は、共有結合又は非共有結合のいずれかにより、互いに持続的に接触した状態に保持されていてもよい。
【０５９６】
組成物又は構築物の両親媒性分子は、リン脂質以外、例えばミセル、膜又は膜断片以外であることが好ましい。
【０５９７】
組成物又は構築物の両親媒性分子は、好ましくはポリマーである。ポリマーは、２つ又はそれ以上の両親媒性サブユニットを含んでもよい。１つ又はそれ以上の親水性基及び１つ又はそれ以上の疎水性基がポリマー上に存在してもよい。ポリマーは、反復性の二次構造ならびに第１の面及び第２の面を有してもよい。反復性の二次構造に沿った親水性基及び疎水性基の分布は、ポリマーの一方の面が親水面であり、かつポリマーの他方の面が疎水面であるような分布であり得る。
【０５９８】
両親媒性分子は、ポリペプチド、例えばその二次構造としてα−らせん構造を含むポリペプチドであり得る。
【０５９９】
一実施形態では、両親媒性ポリマーは、１つ又はそれ以上の環状部分（例えば、１つ又はそれ以上の親水性基及び／又は１つ又はそれ以上の疎水性基を有する環状部分）を含有する１つ又はそれ以上のサブユニットを包含する。一実施形態では、ポリマーは、環状部分が交互に疎水性基及び親水性基を有するように環状部分を有するポリマーである。例えば、サブユニットは、ステロイド（例えば、コール酸）を含有してもよい。別の例では、サブユニットは、芳香族部分を含有してもよい。芳香族部分は、アトロプ異性を示すことができるもの、例えば２，２’−ビス（置換）−１，１’−ビナフチル又は２，２’−ビス（置換）ビフェニルであり得る。
【０６００】
サブユニットは、式（Ｍ）：
【０６０１】
【化４２】
0005881970.tif 000046
【０６０２】
を有する芳香族部分を含んでもよい。
【０６０３】
式Ｍに関して、Ｒ１は、任意選択でアリール、アルケニル、アルキニル、アルコキシ又はハロで置換されるか、かつ／又は任意選択でＯ、Ｓ、アルケニル又はアルキニルが挿入されるＣ１〜Ｃ１００アルキル、Ｃ１〜Ｃ１００ペルフルオロアルキル、又はＯＲ５である。
【０６０４】
Ｒ２は、ヒドロキシ、ニトロ、サルフェート、リン酸、リン酸エステル、スルホン酸、ＯＲ６、又は任意選択でヒドロキシ、ハロ、ニトロ、アリールスルフィニル若しくはアルキルスルフィニル、アリールスルホニル若しくはアルキルスルホニル、サルフェート、スルホン酸、リン酸、リン酸エステル、置換若しくは非置換アリール、カルボキシル、カルボン酸、アミノカルボニル又はアルコキシカルボニルで置換されるか、かつ／又は任意選択でＯ、ＮＨ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、アルケニル又はアルキニルが挿入されるＣ１〜Ｃ１００アルキルである。
【０６０５】
Ｒ３は、水素であるか、又はＲ４と一体となって融合フェニル環を形成する。
【０６０６】
Ｒ４は、水素であるか、又はＲ３と一体となって融合フェニル環を形成する。
【０６０７】
Ｒ５は、任意選択でアリール、アルケニル、アルキニル、アルコキシ又はハロで置換されるか、かつ／又は任意選択でＯ、Ｓ、アルケニル又はアルキニルが挿入されるＣ１〜Ｃ１００アルキル、あるいはＣ１〜Ｃ１００ペルフルオロアルキルであり、Ｒ６は、任意選択でヒドロキシ、ハロ、ニトロ、アリールスルフィニル若しくはアルキルスルフィニル、アリールスルホニル若しくはアルキルスルホニル、サルフェート、スルホン酸、リン酸、リン酸エステル、置換若しくは非置換アリール、カルボキシル、カルボン酸、アミノカルボニル又はアルコキシカルボニルで置換されるか、かつ／又は任意選択でＯ、ＮＨ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、アルケニル又はアルキニルが挿入されるＣ１〜Ｃ１００アルキルである。
【０６０８】
ｄｓＲＮＡの細胞への取り込みの増大
本発明の方法は、ｉＲＮＡ剤、ならびにｉＲＮＡ剤の細胞への取り込みに影響を及ぼす薬物の投与を包含し得る。該薬物は、ｉＲＮＡ剤が投与される前に、ｉＲＮＡ剤が投与された後に、あるいはｉＲＮＡ剤が投与されると同時に投与され得る。薬物はｉＲＮＡ剤と共有結合され得る。薬物は、例えば、リポ多糖、ｐ３８ＭＡＰキナーゼの活性化因子、又はＮＦ−κＢの活性化因子であり得る。薬物は、細胞に対する一過性の影響を有し得る。
【０６０９】
薬物は、例えば細胞の細胞骨格を崩壊させることにより、例えば細胞の微小管、ミクロフィラメント及び／又は中間フィラメントを崩壊させることにより、ｉＲＮＡ剤の細胞への取り込みを増大させることができる。薬物は、例えば、タキソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノライド（japlakinolide ）、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホライド(swinholide)Ａ、インダノシン（indanocine）又はミオセルビン（myoservin ）であり得る。
【０６１０】
薬物はまた、例えば、炎症性応答を活性化することにより、ｉＲＮＡ剤の細胞内への取り込みを増大させることができる。このような作用を有する例示的な薬物としては、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン−１β又はγインターフェロンが挙げられる。
【０６１１】
ｉＲＮＡ複合体
ｉＲＮＡ剤は、第２の作用物質にカップリング（例えば、共有結合）させることができる。例えば、特定の障害を治療するのに使用されるｉＲＮＡ剤は、第２の治療薬、例えばｉＲＮＡ剤以外の作用物質にカップリングさせることができる。第２の治療薬は、同じ障害の治療を対象とするものであり得る。例えば、望ましくない細胞増殖（例えば、がん）を特徴とする障害を治療するのに使用されるｉＲＮＡの場合では、ｉＲＮＡ剤は、抗がん作用を有する第２の作用物質にカップリングさせることができる。例えば、ｉＲＮＡ剤は、免疫系を刺激する作用物質（例えば、ＣｐＧモチーフ）、あるいはより一般的にはｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ受容体を活性化し、かつ／又はγインターフェロンの産生を増大させる作用物質にカップリングさせることができる。
【０６１２】
ｉＲＮＡの生産
ｉＲＮＡは、例えば大量に、各種方法により生産することができる。例示的な方法としては、有機合成及びＲＮＡ切断（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの切断）が挙げられる。
【０６１３】
有機合成
ｉＲＮＡは、二本鎖のＲＮＡ分子の各々の鎖を別個に合成することにより作製することができる。次に、構成成分の鎖をアニーリングさせることができる。
【０６１４】
大きなバイオリアクター（例えば、ファルマシア  バイオテックＡＢ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＡＢ）（スウェーデンウプサラ（Ｕｐｐｓａｌａ）所在）のＯｌｉ
ｇｏＰｉｌｏｔ（商標）ＩＩ）を用いて、所定のｉＲＮＡ用の特定のＲＮＡ鎖を大量に生産することができる。ＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔＩＩリアクターは、１．５Ｍ過剰のホスホロアミダイトヌクレオチドのみを使用して、効率的にヌクレオチドをカップリングすることができる。ＲＮＡ鎖を作製するためには、リボヌクレオチドアミダイトが使用される。標準的なモノマー添加サイクルを使用して、ｉＲＮＡ用の２１〜２３ヌクレオチド鎖を合成することができる。通常、２つの相補的な鎖を別個に生産した後、例えば固体支持体からの放出及び脱保護の後にアニーリングさせる。
【０６１５】
有機合成を使用して、別個のｉＲＮＡ種を生産することができる。特定の標的遺伝子に対する該ｉＲＮＡ種の相補性を、正確に指定することができる。例えば、該ｉＲＮＡ種は、多型、例えば一塩基多型を含む領域に相補的であり得る。さらに、多型の位置は、正確に規定され得る。幾つかの実施形態では、多型は、内部領域、例えば末端の一方又は両方から少なくとも４、５、７又は９ヌクレオチドの位置にある。
【０６１６】
ｄｓＲＮＡ切断
ｉＲＮＡはまた、より大きなｄｓ  ｉＲＮＡを切断することにより作製することができる。切断は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで実現され得る。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの切断によりｉＲＮＡを生産するために、以下の方法を使用することができる：
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写。  ｄｓＲＮＡは、両方向に核酸（ＤＮＡ）セグメントを転写することにより生産される。例えば、ＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標）ＲＮＡｉ転写キット（ニュー  イングランド  バイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ））は、ベクターと、両側にＴ７プロモーターが隣接する位置で該ベクターにクローニングされた核酸セグメントに関してｄｓＲＮＡを生産する方法とを提供する。別個の鋳型が、ｄｓＲＮＡ用の２つの相補鎖のＴ７転写用に生成される。該鋳型は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの添加によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写され、ｄｓＲＮＡが生産される。ＰＣＲ及び／又は他のＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ３ポリメラーゼ又はＳＰ６ポリメラーゼ）を用いた同様の方法もまた使用することができる。一実施形態では、この方法により生成されるＲＮＡは、組換え酵素の調製物に混入し得るエンドトキシンを除去するように慎重に精製される。
【０６１７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ切断。  ｄｓＲＮＡは、例えばＤｉｃｅｒ又は匹敵するＲＮＡアーゼＩＩＩベースの活性を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで切断されてｉＲＮＡとなる。例えば、ｄｓＲＮＡは、ショウジョウバエ由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ抽出物中で、あるいは精製された成分（例えば、精製ＲＮＡアーゼ又はＲＩＳＣ複合体（ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体））を用いてインキュベートすることができる。例えば、ケッテイングら（Ｋｅｔｔｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ２００１年１０月１５日、第１５（２０）巻：２６５４〜９ページ及びハモンド（Ｈａｍｍｏｎｄ）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００１年８月１０日；第２９３（５５３２）巻：１１４６〜５０ページを参照されたい。
【０６１８】
ｄｓＲＮＡの切断により、概して複数のｉＲＮＡ種が生産され、それぞれがもとのｄｓＲＮＡ分子の特定の２１〜２３ｎｔフラグメントである。例えば、もとのｄｓＲＮＡ分子のオーバーラッピング領域及び隣接領域に相補的な配列を含むｉＲＮＡが存在し得る。
【０６１９】
合成方法にかかわらず、ｉＲＮＡ調製物は、製剤化に適した溶液（例えば、水溶液及び／又は有機溶液）中で調製することができる。例えば、ｉＲＮＡ調製物は、純粋な二重に蒸留した蒸留水中で沈殿及び再溶解され、凍結乾燥され得る。続いて、乾燥させたｉＲＮＡは、意図される製剤化プロセスに適した溶液中に再懸濁させることができる。
【０６２０】
修飾ｉＲＮＡ剤及びヌクレオチド代用物のｉＲＮＡ剤の合成は後述する。
【０６２１】
製剤化
本明細書中に記載するｉＲＮＡ剤は、対象への投与用に製剤化することができる。
【０６２２】
説明を簡略化するために、本項での製剤、組成物及び方法は、主として非修飾ｉＲＮＡ剤に関して論述する。しかしながら、これらの製剤、組成物及び方法は、他のｉＲＮＡ剤、例えば修飾ｉＲＮＡ剤で実施することができ、かつそのような実施は本発明の範囲内にあることが理解されるべきである。
【０６２３】
製剤化されたｉＲＮＡ組成物は、様々な状態であると仮定することができる。幾つかの例では、組成物は、少なくとも部分的に結晶性、一様に結晶性、かつ／又は無水（例えば、水分が８０％未満、５０％未満、３０％未満、２０％未満又は１０％未満）である。別の例では、ｉＲＮＡは、水相中に、例えば水を含む溶液中に存在する。
【０６２４】
水相組成物又は結晶性組成物は、例えば送達ビヒクル、例えばリポソーム（特に水相に関して）又は粒子（例えば、結晶性組成物に関して適切であり得るような微粒子）に組み込むことができる。概して、ｉＲＮＡ組成物は、意図される投与方法と適合性の様式で製剤化される（以下を参照）。
【０６２５】
特定の実施形態では、組成物は、以下の方法：噴霧乾燥、凍結乾燥、真空乾燥、蒸発、流動床乾燥（fluid bed drying）又はこれらの技法の組合せ、あるいは液体を用いた超音波処理、フリーズドライ、凝縮及び他の自己集合、の少なくとも１つにより調製される。
【０６２６】
ｉＲＮＡ調製物は、別の作用物質、例えば別の治療薬又はｉＲＮＡを安定化する作用物質（例えば、ｉＲＮＡと複合体形成してｉＲＮＰを形成するためのタンパク質）と組み合わせて製剤化することができる。さらに別の作用物質としては、例えばＥＤＴＡなどのキレート化剤（例えば、Ｍｇ２＋のような二価カチオンを除去するため）、塩、ＲＮＡアーゼ阻害剤（例えば、ＲＮＡｓｉｎのような広域特異性のＲＮＡアーゼ阻害剤）等が挙げられる。
【０６２７】
一実施形態では、ｉＲＮＡ調製物は、別のｉＲＮＡ剤、例えば第２の遺伝子に関して、あるいは同じ遺伝子に関して、ＲＮＡｉを仲介することができる第２のｉＲＮＡを包含する。さらに別の調製物は、少なくとも３個、５個、１０個、２０個、５０個若しくは１００個又はそれ以上の異なるｉＲＮＡ種を包含することができる。このようなｉＲＮＡは、同様の数の異なる遺伝子に関してＲＮＡｉを仲介することができる。
【０６２８】
一実施形態では、ｉＲＮＡ調製物は、少なくとも第２の治療薬（例えば、ＲＮＡ又はＤＮＡ以外の作用物質）を包含する。例えば、ウイルス疾患（例えば、ＨＩＶ）の治療用のｉＲＮＡ組成物は、既知の抗ウイルス剤（例えば、プロテアーゼ阻害剤又は逆転写酵素阻害剤）を含んでもよい。別の例では、がんの治療用のｉＲＮＡ組成物は、化学療法剤をさらに含んでもよい。
【０６２９】
例示的な製剤を以下に論述する。
【０６３０】
リポソーム
説明を簡略化するために、本項での製剤、組成物及び方法は、主として非修飾ｉＲＮＡ剤に関して論述する。しかしながら、これらの製剤、組成物及び方法は、他のｉＲＮＡ剤、例えば修飾ｉＲＮＡ剤で実施することができ、かつそのような実施は本発明の範囲内にあることが理解されるべきである。ｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤又はｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばより大きなｉＲＮＡ剤であってｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るもの、あるいはＤＮＡであって例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤若しく
はｓＲＮＡ剤、又はそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）の調製物は、膜状分子集合体（例えば、リポソーム又はミセル）中で送達されるように製剤化することができる。本明細書中で使用する場合、「リポソーム」という用語は、少なくとも１つの二重層、例えば１つの二重層又は複数の二重層に配置構成された両親媒性脂質から構成されるビヒクルを指す。リポソームとしては、親油性物質と水性の内部とから形成される膜を有する単層及び多重層ビヒクルを包含する。水性部分は、ｉＲＮＡ組成物を含有する。親油性物質は、水性の外部から水性の内部を分離し、通常ｉＲＮＡ組成物を含まないが、幾つかの例では、ｉＲＮＡ組成物を含んでもよい。リポソームは、作用部位への有効成分の移動及び送達に有用である。リポソーム膜は、構造的に生体膜に類似しているため、リポソームが組織に適用されると、リポソーム二重層は、細胞膜の二重層と融合する。リポソーム及び細胞の融合が進行するにつれ、ｉＲＮＡを含む内部の水性内容物が細胞に送達され、該細胞でｉＲＮＡは標的ＲＮＡに特異的に結合することができ、ＲＮＡｉを仲介することができる。場合によっては、リポソームはまた、例えば、本明細書中に記載されるような特定の細胞種へ（例えば、肝臓の細胞へ）ｉＲＮＡを誘導するように、特異的に標的化される。
【０６３１】
ｉＲＮＡを含有するリポソームは、各種方法により調製することができる。
【０６３２】
一例では、リポソームの脂質成分を洗浄剤中に溶解して、脂質成分によりミセルを形成させる。例えば、脂質成分は、両親媒性カチオン脂質又は脂質複合体であり得る。洗浄剤は、高い臨界ミセル濃度を有することができ、非イオン性であり得る。例示的な洗浄剤としては、コール酸塩、ＣＨＡＰＳ、オクチルグルコシド、デオキシコール酸塩及びラウロイルサルコシンが挙げられる。続いて、ｉＲＮＡ調製物を、脂質成分を含むミセルに添加する。脂質上のカチオン基は、ｉＲＮＡと相互作用し、ｉＲＮＡの周囲で凝縮して、リポソームを形成する。凝縮後、洗浄剤を、例えば透析により除去して、ｉＲＮＡのリポソーム調製物を得る。
【０６３３】
必要であれば、凝縮を助長する担体化合物を、例えば制御された添加により、凝縮反応中に添加することができる。例えば、担体化合物は、核酸以外のポリマー（例えば、スペルミン又はスペルミジン）であり得る。凝縮を助けるためにｐＨを調節することもできる。
【０６３４】
送達ビヒクルの構造的成分としてポリヌクレオチド／カチオン脂質複合体を取り入れる安定なポリヌクレオチド送達ビヒクルを生産する方法のさらなる説明は、例えば、国際公開公報第９６／３７１９４号に記載されている。リポソーム形成はまた、フェルグナー、Ｐ．Ｌ．ら（Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  第８巻：７４１３〜７４１７ページ、１９８７年；米国特許第４，８９７，３５５号；米国特許第５，１７１，６７８号、バングハムら（Ｂａｎｇｈａｍ，ｅｔ  ａｌ．）  Ｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第２３巻：２３８ページ、１９６５年；オルソンら（Ｏｌｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．）  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  第５５７巻：９ページ、１９７９年；スゾカら（Ｓｚｏｋａ，ｅｔ  ａｌ．）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．第７５巻：４１９４ページ、１９７８年；メイヒューら（Ｍａｙｈｅｗ，ｅｔ  ａｌ．）  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ７７５巻：１６９ページ、１９８４年；キムら（Ｋｉｍ，ｅｔ  ａｌ．）  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  第７２８巻：３３９ページ、１９８３年及びフクナガら（Ｆｕｋｕｎａｇａ，ｅｔ  ａｌ．）  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．第１１５巻：７５７ページ、１９８４年に記載される例示的な方法の１つ又はそれ以上の態様を包含することができる。送達ビヒクルとして使用するための適切なサイズを有する脂質凝集体を調製するための、一般的に使用されている技法としては、超音波処理及び凍結融解と押出しが挙げられる（例えば、マイヤーら（Ｍａｙｅｒ，ｅｔ  ａｌ．）  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  第８５８巻：１６１ページ、１９８６年を参照）。微小流体操作は、一貫して小さ
く（５０〜２００ｎｍ）かつ比較的一様な凝集体が望ましい場合に使用することができる（メイヒューら（Ｍａｙｈｅｗ，ｅｔ  ａｌ．）  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  第７７５巻：１６９ページ、１９８４年）。これらの方法は、ｉＲＮＡ調製物をリポソームにパッケージングするように容易に適応される。
【０６３５】
ｐＨ感受性の又は負に帯電したリポソームは、核酸分子と複合体形成するのではなく、核酸分子を捕捉する。核酸分子及び脂質の両方が同様に帯電しているため、複合体形成ではなく反発が起きる。それにもかからず、幾つかの核酸分子は、これらのリポソームの水性内部内に捕捉される。ｐＨ感受性のリポソームは、培養において細胞単層にチミジンキナーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを送達するのに使用されている。外来遺伝子の発現が標的細胞で検出された（チョウら（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、第１９巻、（１９９２年）  ２６９〜２７４ページ）。
【０６３６】
リポソーム組成物の主要なタイプの１つとして、天然に由来するホスファチジルコリン以外のリン脂質が挙げられる。例えば、中性のリポソーム組成物は、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成することができる。アニオン性リポソーム組成物は概して、ジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成されるのに対して、アニオン性融合性リポソームは、主としてジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。別のタイプのリポソーム組成物は、例えばダイズＰＣおよび卵ＰＣのようなホスファチジルコリン（ＰＣ）から形成される。別のタイプは、リン脂質および／またはホスファチジルコリンおよび／またはコレステロールの混合物から形成される。
【０６３７】
リポソームをｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで細胞に導入する他の方法の例としては、米国特許第５，２８３，１８５号；米国特許第５，１７１，６７８号；国際公開公報第９４／００５６９号；国際公開公報第９３／２４６４０号；国際公開公報第９１／１６０２４号；フェルグナー（Ｆｅｌｇｎｅｒ）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６９巻：２５５０ページ、１９９４年；ナベル（Ｎａｂｅｌ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．第９０巻：１１３０７ページ、１９９３年；ナベル（Ｎａｂｅｌ）、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．第３巻：６４９ページ、１９９２年；ゲルション（Ｇｅｒｓｈｏｎ）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．第３２巻：７１４３ページ、１９９３年およびストラウス（Ｓｔｒａｕｓｓ）、  ＥＭＢＯ  Ｊ．第１１巻：４１７ページ、１９９２年が挙げられる。
【０６３８】
一実施形態では、カチオン性リポソームが使用される。カチオン性リポソームは、細胞膜に融合することが可能であるという利点を有する。非カチオン性リポソームは、原形質膜とは効率的に融合することは可能でないが、ｉｎ  ｖｉｖｏでマクロファージにより取り込まれ、ｉＲＮＡをマクロファージに送達するのに使用することができる。
【０６３９】
リポソームのさらなる利点としては、天然リン脂質から得られるリポソームは、生体適合性かつ生分解性であること、リポソームは、広範囲の水溶性および脂溶性薬物を取り込むことができること、リポソームが、リポソーム内部のコンパートメント中に被包されたｉＲＮＡを代謝および分解から保護することが挙げられる（ロゾッフ（Ｒｏｓｏｆｆ）、「薬学的投薬形態(Pharmaceutical Dosage Forms) 」より、リーベルマン、リーガーおよびバンカー（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ、ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ）（編）、１９８８年、第１巻、ｐ２４５）。リポソーム製剤の調製における重要な考慮事項は、リポソームの脂質表面電荷、ビヒクルサイズおよび水性容量である。
【０６４０】
正に帯電した合成カチオン性脂質であるＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）は、核酸と自発的
に相互作用して、組織培養細胞の細胞膜の負に帯電した脂質と融合し、その結果ｉＲＮＡの送達をもたらすことができる脂質−核酸複合体を形成する小リポソームを形成するのに使用することができる（例えば、ＤＯＴＭＡおよびＤＮＡとのその使用の説明に関して、フェルグナー、ピー．エルら（Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  第８巻：７４１３〜７４１７ページ、１９８７年および米国特許第４，８９７，３５５号を参照）。
【０６４１】
ＤＯＴＭＡ類縁体である１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニア）プロパン（ＤＯＴＡＰ）は、リン脂質と組み合わせて使用して、ＤＮＡと複合体形成するビヒクルを形成することができる。Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）（ベテスダ  リサーチ  ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、米国メリーランド州ゲイサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）所在）は、負に帯電したポリヌクレオチドと自発的に相互作用して複合体を形成する、正に帯電したＤＯＴＭＡリポソームを含んでなる、高度にカチオン性の核酸を生体組織培養細胞内に送達するための有効な作用物質である。十分に正に帯電したリポソームが使用されると、得られた複合体上の正味の電荷もまた正である。このようにして調製される正に帯電した複合体は、負に帯電した細胞表面に自発的に結合して、原形質膜と融合し、例えば組織培養細胞へ機能的核酸を効率的に送達する。別の市販のカチオン性脂質である、１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３，３−（トリメチルアンモニア）プロパン（「ＤＯＴＡＰ」）（ベーリンガー  マンハイム（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、米国インディアナ州インディアナポリス（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）所在）は、オレオイル部分がエーテル結合ではなくエステルにより連結されるという点でＤＯＴＭＡと異なる。
【０６４２】
他の報告されているカチオン性脂質成分としては、例えば２種類の脂質のうちの１つに結合されており、５−カルボキシスペルミルグリシンジオクタオレオイルアミド（「ＤＯＧＳ」）（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、米国ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）所在）およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン５−カルボキシスペルミルアミド（「ＤＰＰＥＳ」）のような化合物を包含するカルボキシスペルミンを含む様々な部分に結合されているものが挙げられる（例えば、米国特許第５，１７１，６７８号を参照）。
【０６４３】
別のカチオン性脂質複合体としては、ＤＯＰＥと組み合わせてリポソーム内に製剤化されているコレステロールによる脂質の誘導体化（「ＤＣ−Ｃｈｏｌ」）が挙げられる（ガオ、Ｘ．およびフアング、エル．（Ｇａｏ，Ｘ．ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，Ｌ．）、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．第１７９巻：２８０ページ、１９９１年を参照）。ＤＯＰＥにポリリシンを結合させることにより作製されるリポポリリシンは、血清の存在下でのトランスフェクションに有効であることが報告されている（チョウ、エックスら（Ｚｈｏｕ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．）、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  第１０６５巻：８ページ、１９９１年）。ある特定の細胞株に関して、カチオン性脂質が結合されたこれらのリポソームは、ＤＯＴＭＡ含有組成物よりも低毒性を示し、かつより効率的なトランスフェクションを提供すると言われている。他の市販のカチオン性脂質製品としては、ＤＭＲＩＥおよびＤＭＲＩＥ−ＨＰ（バイカル（Ｖｉｃａｌ）、米国カリフォルニア州ラホーヤ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）所在）およびリポフェクタミン（ＤＯＳＰＡ）（ライフ  テクノロジー  インコーポレイテッド社（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｉｇｙ，Ｉｎｃ．）、米国メリーランド州ゲイサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）所在）が挙げられる。オリゴヌクレオチドの送達に適した他のカチオン性脂質は、国際公開公報第９８／３９３５９号および国際公開公報第９６／３７１９４号に記載されている。
【０６４４】
リポソーム製剤は、局所投与に特に適しており、リポソームは、他の製剤を上回る幾つかの利点を提示する。かかる利点としては、投与された薬物の高い全身吸収に関連した副
作用の低減、投与された薬物の所望の標的における蓄積の増大および皮膚へｉＲＮＡを投与する能力が挙げられる。幾つかの実施形態では、リポソームは、上皮細胞へｉＲＮＡを送達するのに、また真皮組織への（例えば、皮膚への）ｉＲＮＡの浸透を増強するのにも使用される。例えば、リポソームは、局所的に塗布することができる。リポソームとして製剤化された薬物の皮膚への局所送達については、実証されている（例えば、ウェイナーら（Ｗｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ、１９９２年、第２巻、４０５〜４１０ページおよびドゥ  プレシスら（ｄｕ  Ｐｌｅｓｓｉｓ  ｅｔ  ａｌ．）、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第１８巻、１９９２年、２５９〜２６５ページ；マンニノ、アール．ジェイ．およびフォウルド−フォゲライト、Ｓ．（Ｍａｎｎｉｎｏ，Ｒ．Ｊ．ａｎｄ  Ｆｏｕｌｄ−Ｆｏｒｇｅｒｉｔｅ，Ｓ．）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  第６巻：６８２〜６９０ページ、１９８８年；イタニ、ティーら（Ｉｔａｎｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．）  Ｇｅｎｅ  第５６巻：２６７〜２７６ページ、１９８７年；ニコラウ、シーら（Ｎｉｃｏｌａｕ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．）  Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．第１４９巻：１５７〜１７６ページ、１９８７年；ストラウビンガー、アール．エム．およびパパハジョポウロス、ディー．（Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｍ．ａｎｄ  Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｄ．）  Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．第１０１巻：５１２〜５２７ページ、１９８３年；ワング、シー．ワイ．およびフアング、エル．（Ｗａｎｇ，Ｃ．Ｙ．ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，Ｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  第８４巻：７８５１〜７８５５ページ、１９８７年を参照）。
【０６４５】
非イオン性リポソーム系もまた、特に非イオン性界面活性剤およびコレステロールを含む系において、薬物の皮膚への送達における該リポソーム系の有用性を決定するために検査されている。Ｎｏｖａｓｏｍｅ（登録商標）Ｉ（グリセリルジラウレート／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）およびＮｏｖａｓｏｍｅ（登録商標）ＩＩ（グリセリルジステアレート／コレステロール／ポリオオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤は、マウス皮膚の真皮へ薬物を送達するのに使用された。ｉＲＮＡを含むかかる製剤は、皮膚科の障害を治療するのに有用である。
【０６４６】
ｉＲＮＡを包含するリポソームは、高度に変形可能とすることができる。かかる変形能は、リポソームが、リポソームの平均半径より小さな孔を通って浸透することを可能とすることができる。例えば、トランスフェロゾーム（transferosome 、登録商標）は、変形可能なリポソームの一種である。トランスフェロゾームは、表面縁活性化因子、通常は界面活性剤を標準的なリポソーム組成物に添加することにより作製することができる。ｉＲＮＡを含むトランスフェロゾームは、例えば皮膚中のケラチノサイトへｉＲＮＡを送達するために皮下注射により送達することができる。無傷の哺乳類皮膚を通過するためには、脂質ビヒクルは、適切な経皮勾配の影響下で、それぞれが直径５０ｎｍ未満の一連の微細孔を通って通過しなければならない。さらに、脂質の特性に起因して、これらのトランスフェロゾームは、自己最適化性（例えば皮膚の中の孔の形状に適応可能）、自己修復性であり得るとともに、多くの場合断片化することなく標的に到達することができ、自己装填性であり得ることが多い。ｉＲＮＡ剤は、リポソームとの会合を改善する部分に連結されたＲＲＭＳを包含することができる。
【０６４７】
界面活性剤
説明を簡略化するために、本項での製剤、組成物および方法は、主として非修飾ｉＲＮＡ剤に関して論述する。しかしながら、これらの製剤、組成物および方法は、他のｉＲＮＡ剤、例えば修飾ｉＲＮＡ剤で実施することができ、かつかかる実施は本発明の範囲内にあることが理解されるべきである。界面活性剤は、エマルジョン（マイクロエマルジョンを含む）およびリポソーム（上記を参照）のような製剤中で広く適用される。ｉＲＮＡ（または前駆体、例えばプロセシングされてｉＲＮＡになり得るより大きなｄｓＲＮＡ、あ
るいはｉＲＮＡまたは前駆体をコードするＤＮＡ）の組成物が、界面活性剤を包含することができる。一実施形態では、ｉＲＮＡは、界面活性剤を含むエマルジョンとして製剤化される。多くの異なるタイプの界面活性剤（天然および合成の両方）の特性を分類およびランク付けする最も一般的な方法は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）の使用によるものである。親水性基の性質は、製剤に使用される種々の界面活性剤を類別するための最も有用な手段を提供する（リーガー（Ｒｉｅｇｅｒ）、「薬学的投薬形態(Pharmaceutical Dosage Forms) 」内、マーセル  デッカー  インコーポレイテッド社（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、米国ニューヨーク州ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）所在、１９８８年、ｐ２８５）。
【０６４８】
界面活性剤分子がイオン化されない場合は、非イオン性界面活性剤として分類される。非イオン性界面活性剤は、薬学的製品において広く適用されており、広範囲のｐＨ値にわたって使用可能である。一般的に、それらのＨＬＢ値は、それらの構造に応じて、２〜約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤としては、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステルおよびエトキシル化エステルのような非イオン性エステルが挙げられる。非イオン性アルカノールアミドおよびエーテル（例えば、脂肪アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコールおよびエトキシル化／プロポキシル化ブロックポリマー）もまた、この種類に含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非イオン性界面活性剤類のうち最も一般的なものである。
【０６４９】
界面活性剤分子が負の電荷を保有する場合、水中に溶解または分散されるときはアニオン性として分類される。アニオン性界面活性剤としては、石鹸のようなカルボキシレート、アシルラクチレート、アミノ酸のアシルアミド、アルキルサルフェートおよびエトキシル化アルキルサルフェートのような硫酸のエステル、アルキルベンゼンスルホネートのようなスルホン酸塩、アシルイセチオネート（acyl isethionate）、アシルタウレートおよびスルホスクシネート、ならびにホスフェートが挙げられる。アニオン性界面活性剤類のうち最も重要なものは、アルキルサルフェートおよび石鹸である。
【０６５０】
界面活性剤分子が正の電荷を保有する場合、水中に溶解または分散されるときはカチオン性として分類される。カチオン性界面活性剤としては、第四級アンモニウム塩およびエトキシル化アミンが挙げられる。第四級アンモニウム塩は、この種類のうちで最もよく使用されるものである。
【０６５１】
界面活性剤分子が正または負の電荷のいずれかを保有する能力を有する場合、該界面活性剤は両性として分類される。両性界面活性剤としては、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ−アルキルベタインおよびホスファチドが挙げられる。
【０６５２】
薬物製品中、製剤中およびエマルジョン中での界面活性剤の使用は概説されている（リーガー（Ｒｉｅｇｅｒ）、「薬学的投薬形態(Pharmaceutical Dosage Forms) 」、マーセル  デッカー  インコーポレイテッド社（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）所在、１９８８年、ｐ２８５）。
【０６５３】
ミセルおよび他の膜状製剤
説明を簡略化するために、本項でのミセルおよび他の製剤、組成物および方法は、主として非修飾ｉＲＮＡ剤に関して論述する。しかしながら、これらのミセルおよび他の製剤、組成物および方法は、他のｉＲＮＡ剤、例えば修飾ｉＲＮＡ剤で実施することができ、かつかかる実施は本発明の範囲内にあることが理解されるべきである。ｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤またはｓＲＮＡ剤（例えば前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖ｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ
剤などのｉＲＮＡ剤、またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）の組成物は、ミセル製剤として提供され得る。「ミセル」は、本明細書中では、両親媒性分子が、同分子の疎水性部分すべてが内側に向き、親水性部分が周囲の水相と接触するように球状構造に配置構成される、特定の種類の分子集合体として定義される。反対の配置構成は、環境が疎水性である場合に存在する。
【０６５４】
経皮膜を通っての送達に適した混合ミセル製剤は、ｉＲＮＡ組成物の水溶液と、アルカリ金属Ｃ８〜Ｃ２２アルカリサルフェートと、ミセル形成化合物とを混合することにより調製され得る。ミセル形成化合物の例としては、レシチン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の薬学的に許容可能な塩、グリコール酸、乳酸、カモミール抽出物、キュウリ抽出物、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、モノオレイン、モノオレエート、モノラウレート、ルリヂサ油、月見草油、メントール、トリヒドロキシオキソコラニルグリシンおよびそれらの薬学的に許容可能な塩、グリセリン、ポリグリセリン、リシン、ポリリシン、トリオレイン、ポリオキシエチレンエーテルおよびそれらの類縁体、ポリドカノールアルキルエーテルおよびそれらの類縁体、ケノデオキシコレート、デオキシコレート、ならびにそれらの混合物が挙げられる。ミセル形成化合物は、アルカリ金属アルキルサルフェートの添加と同時に、あるいは添加後に添加され得る。混合ミセルは、成分の実質的に任意の種類の混合処理により形成するが、より小さなサイズのミセルを提供するためには強力な混合が好ましい。
【０６５５】
１つの方法では、ｉＲＮＡ組成物および少なくともアルカリ金属アルキルサルフェートを含有する第１のミセル組成物が調製される。次に、この第１のミセル組成物を、少なくとも３つのミセル形成化合物と混合して、混合ミセル組成物を形成する。別の方法では、ミセル混合物は、ｉＲＮＡ組成物、アルカリ金属アルキルサルフェートおよび少なくとも１つのミセル形成化合物を混合し、続いて強力に混合しながら、残りのミセル形成化合物を添加することにより調製される。
【０６５６】
フェノールおよび／またはｍ−クレゾールを混合ミセル組成物に添加して、製剤を安定化し、かつ細菌増殖に対して保護してもよい。あるいは、フェノールおよび／またはｍ−クレゾールをミセル形成成分と混合してもよい。グリセリンのような等張剤もまた、混合ミセル組成物の形成後に添加してもよい。
【０６５７】
ミセル製剤をスプレーとして送達するために、製剤をエーロゾルディスペンサーに入れることができ、該ディスペンサーを噴射剤で充満させる。加圧下にある噴射剤は、ディスペンサー中では液体形態である。成分の比は、水相および噴射剤相が１つになるように、すなわち１つの相が存在するように調節される。２つの相が存在する場合、例えば定量弁により内容物の一部を投薬する前に、ディスペンサーを振とうする必要がある。医薬品の投薬用量は、微細スプレーで定量弁から噴射される。
【０６５８】
好ましい噴射剤は、水素含有クロロフルオロカーボン、水素含有フルオロカーボン、ジメチルエーテルおよびジエチルエーテルである。ＨＦＡ  １３４ａ（１，１，１，２−テトラフルオロエタン）がより一層好ましい。
【０６５９】
必須成分の特定濃度は、比較的直接的な実験により決定することができる。口腔による吸収のためには、投与量を注射による投与または胃腸管を介した投与に関する投与量の少なくとも２倍または３倍に増大させることが望ましい場合が多い。
【０６６０】
ｉＲＮＡ剤は、ミセルまたは他の膜状製剤との会合を改善する構成部分に連結されたＲＲＭＳを包含することができる。
【０６６１】
粒子
説明を簡略化するために、本項での粒子、製剤、組成物および方法は、主として非修飾ｉＲＮＡ剤に関して論述する。しかしながら、これらの粒子、製剤、組成物および方法は、他のｉＲＮＡ剤、例えば修飾ｉＲＮＡ剤で実施することができ、かつかかる実施は本発明の範囲内にあることが理解されるべきである。別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤またはｓＲＮＡ剤（例えば前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）の調製物は、粒子（例えば、微粒子）に組み込まれ得る。微粒子は、噴霧乾燥により生産することができるが、凍結乾燥、蒸発、流動床乾燥、真空乾燥またはこれらの技法の組合せを含む他の方法により生産してもよい。さらなる説明は以下を参照されたい。
【０６６２】
持続放出性製剤。本明細書中に記載するｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤またはｓＲＮＡ剤（例えば前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）は、制御された放出（例えば、徐放）用に製剤化することができる。制御放出は、その放出を遅らせる構造または物質内にｉＲＮＡを配することにより達成することができる。例えば、ｉＲＮＡは、多孔質マトリックス内に、あるいは浸食性マトリックス中に配置させることができ、これらのいずれも長期間にわたるｉＲＮＡの放出を可能にする。
【０６６３】
高分子粒子、例えば高分子微粒子は、生分解により微粒子から放出されたときのみ細胞により取り込まれる、ｉＲＮＡの持続放出性リザーバとして使用することができる。したがって、この実施形態の高分子粒子は、食作用を防止するのに十分大きく（例えば、１０μｍより大きい、好ましくは２０μｍより大きく）あるべきである。かかる粒子は、より小さな粒子を作製するのと同じ方法であるが、第１のエマルジョンおよび第２のエマルジョンの混合はあまり強力でない方法により生産することができる。すなわち、均質化速度、ボルテックス混合速度、または超音波処理設定をより低くして、１０μｍではなく直径およそ１００μｍの粒子を得ることができる。混合の時間もまた変更することができる。
【０６６４】
より大きな微粒子は、筋肉内、皮下、皮内、静脈内または腹腔内注射により、吸入により（鼻内または肺内）、経口的にあるいは移植により送達されるように、懸濁液、粉末または移植可能な固体として製剤化することができる。これらの粒子は、比較的長期間にわたる徐放が望ましい場合に、任意のｉＲＮＡの送達に有用である。分解速度、したがって放出速度は、高分子製剤により多様である。
【０６６５】
微粒子は好ましくは、液体懸濁液の媒質が粒子境界を自由に浸透または灌流する孔、空隙、くぼみ、欠損部または他の間質腔を包含する。例えば、有孔の微細構造を用いて、くぼみを有する多孔質噴霧乾燥ミクロスフェアを形成することができる。
【０６６６】
ｉＲＮＡ（例えば、ｓＲＮＡ）を含有する高分子粒子は、例えば二重エマルジョン技法を用いて作製することができる。まず、ポリマーを有機溶媒中に溶解させる。好ましいポリマーは、乳酸／グリコール酸の重量比が６５：３５、５０：５０または７５：２５の乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）である。次に、水溶液中に懸濁させた核酸の試料を該ポリマー溶液に添加して２つの溶液を混合し、第１のエマルジョンを形成する。これらの溶液は、ボルテックス混合または振とうにより混合することができ、好ましい方法では、混合物を超音波処理することができる。最も好ましいのは、核酸が受けるニック形成、剪断または分解の形態の損傷が最少量である一方、依然として適切なエマルジョンの形成を可能にする、任意の方法である。例えば、許容可能な結果は、０．３１７５センチメートル（３．２ｍｍ（１／８インチ））マイクロチッププローブを備えたＶｉｂｒａ−ｃ
ｅｌｌ（商標）モデルＶＣ−２５０ソニケーターにより、設定Ｎｏ．３で得ることができる。
【０６６７】
噴霧乾燥。ｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤またはｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）は、噴霧乾燥により調製することができる。噴霧乾燥したｉＲＮＡを、対象に投与しもよいし、あるいはさらなる製剤化に供してもよい。ｉＲＮＡの医薬組成物は、分散可能な粉末組成物（例えば、医薬組成物）を提供するのに十分な条件下で、ｉＲＮＡを包含する均質水性混合物を噴霧乾燥することにより調製することができる。噴霧乾燥用の材料はまた、１つまたはそれ以上の薬学的に許容可能な賦形剤あるいは分散性を増強する量の生理学的に許容可能な水溶性タンパク質を包含することができる。噴霧乾燥した製品は、ｉＲＮＡを包含する分散可能な粉末であり得る。
【０６６８】
噴霧乾燥は、液体またはスラリー材料を乾燥した粒子形態に変換する処理工程である。噴霧乾燥は、吸入を含む様々な投与経路用の粉末材料を提供するのに使用することができる。例えば、エム．サッチェッティおよびエム．エム．ファン  オルト（Ｍ．Ｓａｃｃｈｅｔｔｉ  ａｎｄ  Ｍ．Ｍ．Ｖａｎ  Ｏｏｒｔ）、「吸入エーロゾル：療法に関する物理的および生物学的基盤（Inhalation Aerosols: Physical and Biological Basis for Therapy）」内、エイ．ジェー．ヒッキー（Ａ．Ｊ．Ｈｉｃｋｅｙ）編、マーセル  デッカー（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋａｒ）、ニューヨーク、１９９６年を参照されたい。
【０６６９】
噴霧乾燥は、液滴の微細ミストを形成するために溶液、エマルジョンまたは懸濁液を噴霧化すること、および液滴を乾燥させることを包含することができる。該ミストを乾燥用チャンバ（例えば、容器、タンク、チューブまたはコイル）内へ発射し、該チャンバ内でミストを乾燥用ガスに接触させることができる。ミストは、固体または液体の細孔形成剤を包含することができる。媒質および細孔形成剤は、液滴から乾燥用ガスへと蒸発して、液滴を固化させ、同時に該固化物（固体）全体にわたって細孔を形成する。続いて、この固体（通常は粉末状粒子形態）を乾燥用ガスから分離および回収する。
【０６７０】
噴霧乾燥は、高度に分散された液体および十分容量の空気（例えば、熱空気）を一緒にして、液体小滴の蒸発および乾燥をもたらすことを包含する。噴霧乾燥されるべき調製物は、任意の溶液、当然、懸濁液、スラリー、コロイド分散液、または選択した噴霧乾燥装置を用いて噴霧化され得るペーストであり得る。通常、該供給物は、媒質を蒸発させて乾燥産物を回収器に運搬するろ過された温気流中に噴霧される。次に、使用済み空気は媒質とともに排出される。幾つかの異なるタイプの装置を用いて、所望の産物を提供してもよい。例えば、ブッチ株式会社（Ｂｕｃｈｉ  Ｌｔｄ．）またはニプロコーポレイション（Ｎｉｐｒｏ  Ｃｏｒｐ．）により製造される市販の噴霧乾燥機は、所望のサイズの粒子を効率的に生産することができる。
【０６７１】
噴霧乾燥した粉末粒子は、形状がほぼ球状であり、サイズがほぼ均一であり、多くの場合くぼみがあり得る。組み込まれる薬物および噴霧乾燥条件に応じて、ある程度の不規則性が存在し得る。多くの場合、噴霧乾燥したミクロスフェアの分散安定性は、該ミクロスフェアの生産において膨張剤（または発泡剤）を使用するとより有効であるようである。特に好ましい実施形態は、分散相または連続相（他方の相は、事実上水性である）として膨張剤を有するエマルジョンを含み得る。膨張剤は好ましくは、界面活性剤溶液を用いて、例えば約３４〜１０３Ｐａ（５，０００〜１５，０００ｐｓｉ）の圧力で市販の微小流動化装置を用いて分散させる。この処理工程により、通常水性連続相中に分散させた水不混和性発泡剤のサブミクロンの小滴を含む、好ましくは組み込まれた界面活性剤により安定化されたエマルジョンが形成される。この技法および他の技法を用いたかかる分散液の
形成は、一般的であり、当業者に既知である。発泡剤は、噴霧乾燥処理中に気化して、一般的にくぼんだ多孔質の空力的に軽いミクロスフェアが残るフッ素化化合物（例えば、ペルフルオロヘキサン、ペルフルオロオクチルブロミド、ペルフルオロデカリン、ペルフルオロブチルエタン）であることが好ましい。以下により詳細に論述するように、他の適切な発泡剤としては、クロロホルム、フレオンおよび炭化水素が挙げられる。窒素ガスおよび二酸化炭素もまた、適切な発泡剤として意図される。
【０６７２】
有孔の微細構造は、上述のように発泡剤を用いて形成されることが好ましいが、当然のことながら、場合によっては、発泡剤を必要とせず、薬物および界面活性剤（複数可）の水性分散液が直接噴霧乾燥される。かかる場合では、製剤は、くぼみを有する比較的多孔質の微粒子の形成を概して導くような処理工程条件（例えば、温度の上昇）に修正可能である。さらに、薬物は、かかる技法における使用に特に適切な特殊な物理化学的特性（例えば、高い結晶性、高い融解温度、界面活性等）を保有し得る。
【０６７３】
有孔の微細構造は、任意選択で１つまたはそれ以上の界面活性剤を伴っても、あるいは含んでもよい。さらに、混和性界面活性剤を、任意選択で懸濁液の媒質液体相と組み合わせてもよい。界面活性剤の使用は、さらに分散安定性を増大し得るか、製剤化の手順を簡素化し得るか、あるいは投与時の生物学的利用能を増大させ得ることが当業者に理解されよう。当然のことながら、液体相中で１つまたはそれ以上の界面活性剤を使用し、かつ有孔の微細構造に関連させて１つまたはそれ以上の界面活性剤を使用することを含む、界面活性剤の組合せは、本発明の範囲内であると意図される。「を伴って、あるいは含んで」とは、構造マトリックスまたは有孔の微細構造が、界面活性剤を組み込み得るか、界面活性剤を吸着し得るか、界面活性剤を吸収し得るか、界面活性剤でコーティングされ得るか、あるいは界面活性剤により形成され得ることを意味する。
【０６７４】
使用に適した界面活性剤としては、構造マトリックスと懸濁媒質との間の界面で層を形成することにより、安定化された呼吸器用分散液の形成および維持を助長する任意の化合物または組成物が挙げられる。界面活性剤は、単一の化合物でもよいし任意の化合物の組合せ（例えばコサーファクタントの場合）を含んでもよい。特に好ましい界面活性剤は、噴射剤中に実質的に不溶であり、フッ素化されておらず、飽和脂質および不飽和脂質、非イオン性洗浄剤、非イオン性ブロックコポリマー、イオン性界面活性剤、ならびにかかる作用物質の組合せから成る群より選択される。上述の界面活性剤のほかに、適切な（すなわち、生体適合性の）フッ素化界面活性剤は、本明細書中の技法と適合性であり、所望の安定化された調製物を提供するのに使用され得ることは強調されるべきである。
【０６７５】
天然および合成の供給源の両方に由来するリン脂質を含む脂質は、様々な濃度で使用されて、構造的マトリックスを形成し得る。概して、適合性の脂質とは、ゲルから液晶への相転移が約４０℃より高いものを含む。好ましくは、組み込まれる脂質は、比較的長い鎖（すなわち、Ｃ６〜Ｃ２２）の飽和脂質であり、より好ましくはリン脂質を含む。開示する安定化された調製物において有用なリン脂質の例は、卵ホスファチジルコリン、ジラウリルホスファチジルコリン、ジオレイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステロイルホスファチジルコリン、短鎖ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、糖脂質、ガングリオシドＧＭ１、スフィンゴミエリン、ホスファチジン酸、カルジオリピン、脂質を含むポリマー鎖（例えば、ポリエチレングリコール、キチン、ヒアルロン酸またはポリビニルピロリドン）、脂質を含むスルホン化単糖、二糖および多糖、脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ステアリン酸およびオレイン酸）、コレステロール、コレステロールエステルおよびコレステロールヘミスクシネートが挙げられる。それらの優れた生体適合性に起因して、リン脂質、ならびにリン脂質およびポロキサマーの組合せは、本明細書中に開示する安
定化された分散物における使用に特に適している。
【０６７６】
適合性の非イオン性洗浄剤は、ソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎｓ（商標）８５）、ソルビタンセスキオレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートおよびポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエートを含むソルビタンエステル、オレイルポリオキシエチレン（２）エーテル、ステアリルポリオキシエチレン（２）エーテル、ラウリルポリオキシエチレン（４）エーテル、グリセロールエステル、ならびにスクロースエステルを含む。他の適切な非イオン性洗浄剤は、「ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ  Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ」（マックパブリッシング社（ＭｃＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．）、米国ニュージャージー州グレンロック（Ｇｌｅｎ  Ｒｏｃｋ）所在）を用いて容易に同定することができる。好ましいブロックコポリマーとしては、ポリオキシエチレンおよびポリオキシプロピレンのジブロックコポリマーおよびトリブロックコポリマー（ポロキサマー１８８（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ．ＲＴＭ．Ｆ６８）、ポロキサマー４０７（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ．ＲＴＭ．Ｆ−１２７）およびポロキサマー３３８を含む）が挙げられる。スルホコハク酸ナトリウムのようなイオン性界面活性剤および脂肪酸石鹸もまた利用することができる。好ましい実施形態では、微細構造は、オレイン酸またはそのアルカリ塩を含んでもよい。
【０６７７】
上述の界面活性剤のほかに、カチオン性界面活性剤または脂質は、ｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤またはｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）の送達の場合に特に好ましい。適切なカチオン性脂質の例としては、ＤＯＴＭＡ、すなわちＮ−［−（２，３）−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド、ＤＯＴＡＰ、すなわち１，２−ジオレイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン、およびＤＯＴＢ、すなわち１，２−ジオレイル−３−（４’−トリメチルアンモニオ）ブタノイル−ｓｎ−グリセロールが挙げられる。ポリリシンのようなポリカチオン性アミノ酸、およびポリアルギニンもまた意図される。
【０６７８】
噴霧処理工程に関して、回転噴霧化、圧力噴霧化および二液噴霧化のような噴霧方法を使用することができる。これらの処理工程で使用される装置の例としては、ヤマトケミカル社（Ｙａｍａｔｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）製造の「パルビスミニスプレー  ＧＡ−３２」および「パルビススプレードライヤ  ＤＬ−４１」が挙げられるし、あるいは大川原化工機株式会社製の「スプレードライヤ  ＣＬ−８」、「スプレードライヤ  Ｌ−８」、「スプレードライヤ  ＦＬ−１２」、「スプレードライヤ  ＦＬ−１６」または「スプレードライヤ  ＦＬ−２０」を、回転円板噴霧器を用いた噴霧方法に関して使用することができる。
【０６７９】
噴霧された材料を乾燥させるのに使用するガスに関して、特に制限は課せられないが、空気、窒素または不活性ガスを使用することが推奨される。噴霧された材料を乾燥させるのに使用するガスの入口温度は、噴霧された材料の熱失活を引き起こさないような温度である。その温度範囲は、約５０℃〜約２００℃、好ましくは約５０℃〜１００℃に及び得る。噴霧された材料を乾燥させるのに使用されるガスの出口の温度は、約０℃〜約１５０℃、好ましくは０℃〜９０℃、さらに好ましくは０℃〜６０℃であり得る。
【０６８０】
噴霧乾燥は、呼吸に適切な粒子サイズ、低水分含有量およびエーロゾル化の準備が可能である流動特性を有する、均質構成の実質的に非晶質の粉末を生じる条件下でなされる。得られる粉末の粒子サイズは、約９８％を上回る質量が約１０μｍ以下の直径を有する粒子であり、質量の約９０％が、５μｍ未満の直径を有する粒子となることが好ましい。別
例として、質量の約９５％は直径１０μｍ未満の粒子を有し、粒子の質量の約８０％は５μｍ未満の直径を有する。
【０６８１】
ｉＲＮＡ調製物を包含する分散性の医薬品ベースの乾燥粉末は、呼吸器投与および肺投与に適切な薬学的担体または賦形剤と任意に組み合わせてもよい。かかる担体は、患者に送達される粉末中のｉＲＮＡ濃度を低減させることが望ましい場合には単に増量剤としての役割を果たし得るが、ｉＲＮＡのより効率的かつ再現性のある送達を提供し、かつ製造および粉末充填を容易にするための流動性および粘稠度のようなｉＲＮＡの取り扱い上の特性を改善するように、ｉＲＮＡ組成物の安定性を増強し、かつ粉末分散デバイス内の粉末の分散性を改善する役割を果たしてもよい。
【０６８２】
かかる担体材料は、噴霧乾燥前に、すなわち精製バルク溶液に担体材料を添加することにより、薬物と組み合わせてもよい。そのようにして、担体粒子が薬物粒子とともに同時に形成されて、均質な粉末を生じる。あるいは、担体を別個に乾燥粉末形態に調製して、ブレンドすることにより乾燥粉末薬物と組み合わせてもよい。粉末担体は、通常結晶であるが（水吸収を回避するため）、場合によっては、非晶質又は結晶と非晶質の混合物であってよい。担体粒子の大きさは、薬物粉末の流動性を改善するように選択してもよく、通常２５μｍ〜１００μｍの範囲である。好ましい担体材料は、上述の範囲のサイズを有する結晶性ラクトースである。
【０６８３】
上述の方法のいずれかにより調製された粉末は、その後の使用のために従来の様式で噴霧乾燥機から回収される。医薬品および他の目的として使用するために、篩い分けまたは他の従来の技法により、形成された全ての凝集物を崩壊させることが望ましいことが多い。医薬品用途に関しては、乾燥粉末製剤は、通常測り取って単回用量とされ、この単回用量がパッケージに密封される。かかるパッケージは、以下に詳述するように、乾燥粉末吸入器中での分散に特に有用である。あるいは、粉末は、多数回用量用の容器中にパッケージングされてもよい。
【０６８４】
疎水性およびその他の薬物および成分を噴霧乾燥させる方法は、米国特許第５，０００，８８８号、同第５，０２６，５５０号、同第４，６７０，４１９号、同第４，５４０，６０２号および同第４，４８６，４３５号に記載されている。ブロッチおよびスペイソン（Ｂｌｏｃｈ  ａｎｄ  Ｓｐｅｉｓｏｎ）（１９８３年）Ｐｈａｒｍ．Ａｃｔａ．Ｈｅｌｖ  第５８巻：１４〜２２ページは、ジオキサン−水および２−エトキシエタノール−水の共沸溶媒中でのヒドロクロロチアジドおよびクロルタリドン（親油性薬物）および親水性補助薬（ペンタエリスリトール）の噴霧乾燥を教示している。ＪＰ第８０６７６６号、ＪＰ第７２４２５６８号、ＪＰ第７１０１８８４号、ＪＰ第７１０１８８３号、ＪＰ第７１０１８９８２号、ＪＰ第７１０１８８１号およびＪＰ第４０３６２３３号を含む多数の日本国特許出願抄録が、親水性−疎水性産物の組合せの噴霧乾燥に関するものである。親水性−疎水性生成物の組合せを噴霧乾燥させることに関連した他の外国特許出願としては、ＦＲ第２５９４６９３号、ＤＥ第２２０９４７７号および国際公開公報第８８／０７８７０号が挙げられる。
【０６８５】
凍結乾燥
ｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤またはｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）の調製物は、凍結乾燥させることにより作製することができる。凍結乾燥は、組成物を凍結させた後に組成物から水を昇華させるフリーズドライ処理工程である。凍結乾燥処理工程に関連した特定の利点は、水溶液中で比較的不安定な生物製剤および医薬品を、温度上昇を伴わずに乾燥させることができ（それにより、有害な熱的影響を排除する）、続いて
安定性の問題があまりみられない乾燥状態で保管することができることである。本発明に関して、かかる技法は、生理活性を弱めることなく核酸を有孔の微細構造に組込むことと特に適合性を有する。凍結乾燥した粒子状物質を提供する方法は当該技術分野で既知であり、本明細書中の教示にしたがって分散適合性の微細構造を提供するのに過度の実験を要さないことは明らかであろう。したがって、所望の多孔性およびサイズを有する微細構造を提供するように凍結乾燥処理工程が使用され得る限りは、凍結乾燥処理工程は本明細書中の教示と適合し、明らかに本発明の範囲内であると意図される。
【０６８６】
標的化
説明を簡略化するために、本項での製剤、組成物および方法は、主として非修飾ｉＲＮＡ剤に関して論述する。しかしながら、これらの製剤、組成物および方法は、他のｉＲＮＡ剤、例えば修飾ｉＲＮＡ剤で実施することができ、かつかかる実施は本発明の範囲内にあることが理解されるべきである。
【０６８７】
幾つかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤またはｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）は、特定の細胞を標的とする。例えば、ｉＲＮＡを包含するリポソームもしくは粒子または他の構造は、標的細胞上の特定の分子を認識する標的化部分を包含することもできる。標的化部分は、標的細胞に関して特異的な親和性を有する分子であり得る。標的化部分には、標的細胞の表面上に見られるタンパク質に対する抗体、あるいは標的細胞の表面上に見られる分子に関するリガンドまたはリガンドの受容体結合部分を挙げることができる。例えば、標的化部分は、肝臓のがん特異的抗原またはウイルス抗原を認識することができ、したがってがん細胞またはウイルス感染細胞へｉＲＮＡを送達する。標的化部分の例としては、抗体（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ等、またはそれらの機能的部分）、細胞表面受容体に関するリガンド（例えば、それらの外部ドメイン）が挙げられる。
【０６８８】
α‐フェトプロテインなどの抗原を用いてｉＲＮＡ剤の標的を肝細胞とすることができる。
【０６８９】
一実施形態では、標的化部分はリポソームに結合される。例えば、米国特許第６，２４５，４２７号は、タンパク質またはペプチドを用いてリポソームを標的化する方法について記載している。別の例では、リポソームのカチオン性脂質成分が、標的化部分で誘導体化される。例えば、国際公開公報第９６／３７１９４号は、Ｎ−グルタリルジオレオイルホスファチジルエタノールアミンをＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルに変換することについて記載している。該生成物は続いてＲＧＤペプチドにカップリングされた。
【０６９０】
遺伝子および疾患
一態様では、本発明は、望ましくない細胞増殖、例えば悪性または非悪性の細胞増殖の危険性があるか、あるいは悪性または非悪性細胞増殖に罹患した対象を治療する方法を特徴とする。該方法は、以下の：
ｉＲＮＡ剤、例えば本明細書中に記載のｓＲＮＡまたはｉＲＮＡ剤（例えば、本明細書中に記載の構造を有するｉＲＮＡ）を提供することと、該ｉＲＮＡは、望ましくない細胞増殖を促進する遺伝子に相同であり、同遺伝子を例えば切断によりサイレンシングすることができることを特徴とすることと、
ｉＲＮＡ剤（例えば、本明細書中に記載するｓＲＮＡまたはｉＲＮＡ剤）を対象、好ましくはヒト対象に投与することと、
それにより対象を治療することと
を包含する。
【０６９１】
好ましい実施形態では、遺伝子は、成長因子遺伝子または成長因子受容体遺伝子、キナーゼ（例えば、タンパク質チロシン、セリンまたはスレオニンキナーゼ）遺伝子、アダプタータンパク質遺伝子、Ｇタンパク質スーパーファミリー分子をコードする遺伝子、または転写因子をコードする遺伝子である。
【０６９２】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＰＤＧＦβ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＰＤＧＦβ発現を特徴とする障害（例えば、精巣がんおよび肺がん）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０６９３】
別の好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、Ｅｒｂ−Ｂ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＥｒｂ−Ｂ発現を特徴とする障害（例えば、乳がん）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０６９４】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、Ｓｒｃ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＳｒｃ発現を特徴とする障害（例えば、大腸がん）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０６９５】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＣＲＫ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＣＲＫ発現を特徴とする障害（例えば、大腸がん及び肺がん）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０６９６】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＧＲＢ２遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＧＲＢ２発現を特徴とする障害（例えば、偏平上皮細胞がん）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０６９７】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＲＡＳ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＲＡＳ発現を特徴とする障害（例えば、膵臓がん、大腸がん及び肺がん、ならびに慢性白血病）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０６９８】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＭＥＫＫ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＭＥＫＫ発現を特徴とする障害（例えば、偏平上皮細胞がん、黒色腫又は白血病）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０６９９】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＪＮＫ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＪＮＫ発現を特徴とする障害（例えば、膵臓がん又は乳がん）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７００】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＲＡＦ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＲＡＦ発現を特徴とする障害（例えば、肺がん又は白血病）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７０１】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、Ｅｒｋ１／２遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＥｒｋ１／２発現を特徴とする障害（例えば、肺がん）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７０２】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＰＣＮＡ（ｐ２１）遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＰＣＮＡ発現を特徴とする障害（例えば、肺がん）を有する
か、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７０３】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＭＹＢ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＭＹＢ発現を特徴とする障害（例えば、大腸がん又は慢性ミエロイド性白血病）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７０４】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ｃ−ＭＹＣ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないｃ−ＭＹＣ発現を特徴とする障害（例えば、バーキットリンパ腫又は神経芽細胞腫）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７０５】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＪＵＮ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＪＵＮ発現を特徴とする障害（例えば、卵巣がん、前立腺がん又は乳がん）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７０６】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＦＯＳ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＦＯＳ発現を特徴とする障害（例えば、皮膚がん又は前立腺がん）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７０７】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＢＣＬ−２遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＢＣＬ−２発現を特徴とする障害（例えば、肺がん、前立腺がん又は非ホジキンリンパ腫）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７０８】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、サイクリンＤ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないサイクリンＤ発現を特徴とする障害（例えば、食道がん及び大腸がん）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７０９】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＶＥＧＦ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＶＥＧＦ発現を特徴とする障害（例えば、食道がん及び大腸がん）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７１０】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＥＧＦＲ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＥＧＦＲ発現を特徴とする障害（例えば、乳がん）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７１１】
別の好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、サイクリンＡ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないサイクリンＡ発現を特徴とする障害（例えば、肺がん及び子宮頸がん）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７１２】
別の好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、サイクリンＥ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないサイクリンＥ発現を特徴とする障害（例えば、肺がん及び乳がん）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７１３】
別の好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＷＮＴ−１遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＷＮＴ−１発現を特徴とする障害（例えば、基底細胞がん）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７１４】
別の好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、β−カテニン遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないβ−カテニン発現を特徴とする障害（例えば、腺がん又は肝細
胞がん）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７１５】
別の好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ｃ−ＭＥＴ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないｃ−ＭＥＴ発現を特徴とする障害（例えば、肝細胞がん）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７１６】
別の好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＰＫＣ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＰＫＣ発現を特徴とする障害（例えば、乳がん）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７１７】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＮＦＫＢ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＮＦＫＢ発現を特徴とする障害（例えば、乳がん）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７１８】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＳＴＡＴ３遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＳＴＡＴ３発現を特徴とする障害（例えば、前立腺がん）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７１９】
別の好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、サバイビン遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないサバイビン発現を特徴とする障害（例えば、子宮頸がん又は膵臓がん）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７２０】
別の好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＨｅｒ２／Ｎｅｕ発現を特徴とする障害（例えば、乳がん）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７２１】
別の好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、トポイソメラーゼＩ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないトポイソメラーゼＩ発現を特徴とする障害（例えば、卵巣がん及び大腸がん）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７２２】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、トポイソメラーゼＩＩα遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないトポイソメラーゼＩＩα発現を特徴とする障害（例えば、乳がん及び大腸がん）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７２３】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ｐ７３遺伝子の突然変異をサイレンシングし、したがって、望ましくないｐ７３発現を特徴とする障害（例えば、結腸直腸腺がん）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７２４】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ｐ２１（ＷＡＦ１／ＣＩＰ１）遺伝子における突然変異をサイレンシングし、したがって、望ましくないｐ２１（ＷＡＦ１／ＣＩＰ１）発現を特徴とする障害（例えば、肝臓がん）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７２５】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ｐ２７（ＫＩＰ１）遺伝子における突然変異をサイレンシングし、したがって、望ましくないｐ２７（ＫＩＰ１）発現を特徴とする障害（例えば、肝臓がん）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７２６】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、腫瘍抑制遺伝子における突然変異をサイレンシングし、したがって、化学療法剤と組み合わせて、アポトーシス活性を促進する方法として使用することができる。
【０７２７】
別の態様では、本発明は、血管新生阻害が有益でありうる疾患又は障害（例えば、がん）の危険性があるか、該疾患又は障害に罹患した対象（例えば、ヒト）を治療する方法を特徴とする。該方法は、以下の：
ｉＲＮＡ剤、例えば本明細書中に記載の構造を有するｉＲＮＡ剤を提供することと、該ｉＲＮＡ剤は、血管新生を仲介する遺伝子に相同であり、かつ同遺伝子を例えば切断によりサイレンシングすることができることと、
ｉＲＮＡ剤を対象に投与することと、  それにより対象を治療することと
を包含する。
【０７２８】
別の態様では、本発明は、ウイルスに感染した対象、あるいはウイルス感染に関連した障害若しくは疾患の危険性があるか、又は該障害若しくは疾患に罹患した対象を治療する方法を特徴とする。該方法は、以下の：
ｉＲＮＡ剤、例えば本明細書中に記載の構造を有するｉＲＮＡ剤を提供することと、該ｉＲＮＡ剤は、ウイルス遺伝子またはウイルスの機能（例えば、侵入又は増殖）を媒介する細胞遺伝子に相同であり、かつ同遺伝子を例えば切断によりサイレンシングすることができることと、
ｉＲＮＡ剤を対象（好ましくは、ヒト対象）に投与することと、
それにより対象を治療することと
を包含する。
【０７２９】
したがって、本発明は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に感染した患者、あるいはＨＰＶにより媒介される障害（例えば、子宮頸がん）の危険性があるか、又は該障害に罹患した患者を治療する方法を提供する。ＨＰＶは、子宮頸がんの９５％に関係し、したがって抗ウイルス療法は、これらのがん及びウイルス感染の他の症状を治療するための魅力的な方法である。
【０７３０】
好ましい実施形態では、ＨＰＶ遺伝子の発現が低減される。別の好ましい実施形態では、ＨＰＶ遺伝子は、Ｅ２、Ｅ６又はＥ７の群のうちの１つである。
【０７３１】
好ましい実施形態では、ＨＰＶ複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０７３２】
本発明はまた、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染した患者、あるいはＨＩＶにより媒介される障害（例えば、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ））の危険性があるか、又は該障害に罹患した患者を治療する方法を提供する。
【０７３３】
好ましい実施形態では、ＨＩＶ遺伝子の発現が低減される。別の好ましい実施形態では、ＨＩＶ遺伝子は、ＣＣＲ５、Ｇａｇ又はＲｅｖである。
【０７３４】
好ましい実施形態では、ＨＩＶ複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。別の好ましい実施形態では、遺伝子はＣＤ４又はＴｓｇ１０１である。
【０７３５】
本発明はまた、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に感染した患者、あるいはＨＢＶにより媒介される障害（例えば、肝硬変及び肝細胞がん）の危険性があるか、又は該障害に罹患した患者を治療する方法を提供する。
【０７３６】
好ましい実施形態では、ＨＢＶ遺伝子の発現が低減される。別の好ましい実施形態では
、標的とされるＨＢＶ遺伝子は、ＨＢＶコアタンパク質のテール領域、ｐｒｅ−ｃｒｅｇｉｏｕｓ（ｐｒｅ−ｃ）領域、又はｃｒｅｇｉｏｕｓ（ｃ）領域の群のうちの１つをコードする。別の好ましい実施形態では、標的とされるＨＢＶ−ＲＮＡ配列は、ポリ（Ａ）テールを含んで構成される。
【０７３７】
好ましい実施形態では、ＨＢＶ複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０７３８】
本発明はまた、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）に感染した患者、あるいはＨＡＶにより媒介される障害の危険性があるか、又は該障害に罹患した患者を治療する方法を提供する。
【０７３９】
好ましい実施形態では、ＨＡＶ複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０７４０】
本発明はまた、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染した患者、あるいはＨＣＶにより媒介される障害（例えば、肝硬変）の危険性があるか、又は該障害に罹患した患者を治療する方法を提供する。
【０７４１】
好ましい実施形態では、ＨＣＶ遺伝子の発現が低減される。
【０７４２】
別の好ましい実施形態では、ＨＣＶ複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０７４３】
本発明はまた、Ｄ型、Ｅ型、Ｆ型、Ｇ型又はＨ型を含む肝炎ウイルス株の群のいずれかに感染した患者、あるいはこれらの肝炎株のいずれかにより媒介される障害の危険性があるか、又は該障害に罹患した患者を治療する方法を提供する。
【０７４４】
好ましい実施形態では、Ｄ型、Ｅ型、Ｆ型、Ｇ型又はＨ型肝炎ウイルス遺伝子の発現が低減される。
【０７４５】
別の好ましい実施形態では、Ｄ型、Ｅ型、Ｆ型、Ｇ型又はＨ型肝炎ウイルスの複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０７４６】
本発明の方法はまた、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に感染した患者、あるいはＲＳＶにより媒介される障害（例えば、乳児における下気道感染及び小児喘息、例えば高齢者における肺炎及び他の合併症）の危険性があるか、又は該障害に罹患した患者を治療することを提供する。
【０７４７】
好ましい実施形態では、ＲＳＶ遺伝子の発現が低減される。別の好ましい実施形態では、標的とされるＨＢＶ遺伝子は、遺伝子Ｎ、Ｌ又はＰの群のうちの１つをコードする。
【０７４８】
好ましい実施形態では、ＲＳＶ複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０７４９】
本発明の方法は、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）に感染した患者、あるいはＨＳＶにより媒介される障害（例えば、陰部ヘルペス及び単純ヘルペスならびに主として免疫不全状態の患者における生命にかかわる疾患又は視覚障害をもたらす疾患）の危険性があるか、又は該障害に罹患した患者を治療することを提供する。
【０７５０】
好ましい実施形態では、ＨＳＶ遺伝子の発現が低減される。別の好ましい実施形態では、標的とされるＨＳＶ遺伝子は、ＤＮＡポリメラーゼ又はＤＮＡヘリカーゼ−プライマーゼをコードする。
【０７５１】
好ましい実施形態では、ＨＳＶ複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０７５２】
本発明はまた、ヘルペスサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に感染した患者、あるいはＣＭＶにより媒介される障害（例えば、先天性ウイルス感染及び免疫不全状態の患者における病的状態）の危険性があるか、又は該障害に罹患した患者を治療する方法を提供する。
【０７５３】
好ましい実施形態では、ＣＭＶ遺伝子の発現が低減される。
【０７５４】
好ましい実施形態では、ＣＭＶ複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０７５５】
本発明の方法はまた、ヘルペスエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）に感染した患者、あるいはＥＢＶにより媒介される障害（例えば、ＮＫ／Ｔ−細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫及びホジキン病）の危険性があるか、又は該障害に罹患した患者を治療する方法を提供する。
【０７５６】
好ましい実施形態では、ＥＢＶ遺伝子の発現が低減される。
【０７５７】
好ましい実施形態では、ＥＢＶ複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０７５８】
本発明の方法はまた、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）（ヒトヘルペスウイルス８型とも呼ばれる）に感染した患者、あるいはＫＳＨＶにより媒介される障害（例えば、カポジ肉腫、多中心性キャッスルマン病及びＡＩＤＳ関連原発性滲出液リンパ腫）の危険性があるか、又は該障害に罹患した患者を治療することを提供する。
【０７５９】
好ましい実施形態では、ＫＳＨＶ遺伝子の発現が低減される。
【０７６０】
好ましい実施形態では、ＫＳＨＶ複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０７６１】
本発明はまた、ＪＣウイルス（ＪＣＶ）に感染した患者、あるいはこのウイルスに関連した疾患又は障害（例えば、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ））を治療する方法を包含する。
【０７６２】
好ましい実施形態では、ＪＣＶ遺伝子の発現が低減される。
【０７６３】
好ましい実施形態では、ＪＣＶ複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０７６４】
本発明の方法はまた、ミクソウイルスに感染した患者、あるいはミクソウイルスにより媒介される障害（例えば、インフルエンザ）の危険性があるか、又は該障害に罹患した患者を治療することを提供する。
【０７６５】
好ましい実施形態では、ミクソウイルス遺伝子の発現が低減される。
【０７６６】
好ましい実施形態では、ミクソウイルス複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０７６７】
本発明の方法はまた、ライノウイルスに感染した患者、あるいはライノウイルスにより媒介される障害（例えば、風邪）の危険性があるか、又は該障害に罹患した患者を治療することを提供する。
【０７６８】
好ましい実施形態では、ライノウイルス遺伝子の発現が低減される。
【０７６９】
好ましい実施形態では、ライノウイルス複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０７７０】
本発明の方法はまた、コロナウイルスに感染した患者、あるいはコロナウイルスにより媒介される障害（例えば、風邪）の危険性があるか、又は該障害に罹患した患者を治療することを提供する。
【０７７１】
好ましい実施形態では、コロナウイルス遺伝子の発現が低減される。
【０７７２】
好ましい実施形態では、コロナウイルス複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０７７３】
本発明の方法はまた、フラビウイルスである西ナイルウイルスに感染した患者、あるいは西ナイルウイルスにより媒介される障害の危険性があるか、又は該障害に罹患した患者を治療することを提供する。
【０７７４】
好ましい実施形態では、西ナイルウイルス遺伝子の発現が低減される。別の好ましい実施形態では、西ナイルウイルス遺伝子は、Ｅ、ＮＳ３又はＮＳ５を含む群のうちの１つである。
【０７７５】
好ましい実施形態では、西ナイルウイルスの複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０７７６】
本発明の方法はまた、フラビウイルスであるセントルイス脳炎ウイルスに感染した患者、あるいはこのウイルスに関連した障害若しくは疾患（例えば、ウイルス性出血熱又は神経系疾患）の危険性があるか、又は該障害若しくは疾患に罹患した患者を治療することを提供する。
【０７７７】
好ましい実施形態では、セントルイス脳炎ウイルス遺伝子の発現が低減される。  好ましい実施形態では、セントルイス脳炎ウイルスの複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０７７８】
本発明の方法はまた、ダニ媒介性脳炎フラビウイルスにより感染されたか、あるいはダニ媒介性脳炎ウイルスにより媒介される障害（例えば、ウイルス性出血熱及び神経系疾患）の危険性があるか、又は該障害に罹患した患者を治療することを提供する。
【０７７９】
好ましい実施形態では、ダニ媒介性脳炎ウイルス遺伝子の発現が低減される。
【０７８０】
好ましい実施形態では、ダニ媒介性脳炎ウイルスの複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０７８１】
本発明の方法はまた、通常ウイルス性出血熱及び神経系疾患をもたらすマレー渓谷脳炎フラビウイルスに感染した患者を治療する方法を提供する。
【０７８２】
好ましい実施形態では、マレー渓谷脳炎ウイルス遺伝子の発現が低減される。
【０７８３】
好ましい実施形態では、マレー渓谷脳炎ウイルス複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０７８４】
本発明はまた、デング熱フラビウイルスに感染した患者、あるいはこのウイルスに関連した疾患又は障害（例えば、デング熱出血性熱）を治療する方法を包含する。
【０７８５】
好ましい実施形態では、デング熱ウイルス遺伝子の発現が低減される。
【０７８６】
好ましい実施形態では、デング熱ウイルスの複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０７８７】
本発明の方法はまた、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）に感染した患者、あるいはＳＶ４０により媒介される障害（例えば、腫瘍形成）の危険性があるか、又は該障害に罹患した患者を治療することを提供する。
【０７８８】
好ましい実施形態では、ＳＶ４０遺伝子の発現が低減される。
【０７８９】
好ましい実施形態では、ＳＶ４０複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０７９０】
本発明はまた、ヒトＴ細胞白血球ウイルス（ＨＴＬＶ）に感染した患者、あるいはこのウイルスに関連した疾患又は障害（例えば、白血病及びミエロパシー）を治療する方法を包含する。
【０７９１】
好ましい実施形態では、ＨＴＬＶ遺伝子の発現が低減される。別の好ましい実施形態では、ＨＴＶＬ１遺伝子は、Ｔａｘ転写活性化因子である。
【０７９２】
好ましい実施形態では、ＨＴＬＶ複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０７９３】
本発明の方法はまた、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏ−ＭｕＬＶ）に感染した患者、あるいはＭｏ−ＭｕＬＶにより媒介される障害（例えば、Ｔ細胞白血病）の危険性があるか、又は該障害に罹患した患者を治療することを提供する。
【０７９４】
好ましい実施形態では、Ｍｏ−ＭｕＬＶ遺伝子の発現が低減される。
【０７９５】
好ましい実施形態では、Ｍｏ−ＭｕＬＶ複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０７９６】
本発明の方法はまた、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）に感染した患者、あるいはＥＭＣＶにより媒介される障害（例えば、心筋炎）の危険性があるか、又は該障害に罹患した患者を治療することを提供する。ＥＭＣＶは、マウスおよびブタにおいて心筋炎を引き起こし、ヒト心筋細胞に感染することができる。したがって、このウイルスは、異種移植を受けた患者に関する問題事項である。
【０７９７】
好ましい実施形態では、ＥＭＣＶ遺伝子の発現が低減される。
【０７９８】
好ましい実施形態では、ＥＭＣＶ複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０７９９】
本発明はまた、麻疹ウイルス（ＭＶ）に感染した患者、ＭＶにより媒介される障害（例えば、麻疹）の危険性があるか、又は該障害に罹患した患者を治療する方法を包含する。
【０８００】
好ましい実施形態では、ＭＶ遺伝子の発現が低減される。
【０８０１】
好ましい実施形態では、ＭＶ複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０８０２】
本発明はまた、水痘−帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）に感染した患者、あるいはＶＺＶにより媒介される障害（例えば、水疱瘡又は帯状ヘルペス（帯状疱疹とも呼ばれる））の危険性があるか、又は該障害に罹患した患者を治療する方法を包含する。
【０８０３】
好ましい実施形態では、ＶＺＶ遺伝子の発現が低減される。
【０８０４】
好ましい実施形態では、ＶＺＶ複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０８０５】
本発明はまた、アデノウイルスに感染した患者、あるいはアデノウイルスにより媒介される障害（例えば、気道感染）の危険性があるか、又は該障害に罹患した患者を治療する方法を包含する。
【０８０６】
好ましい実施形態では、アデノウイルス遺伝子の発現が低減される。
【０８０７】
好ましい実施形態では、アデノウイルス複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０８０８】
本発明はまた、黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）に感染した患者、あるいはＹＦＶにより媒介される障害（例えば、気道感染）の危険性があるか、又は該障害に罹患した患者を治療する方法を包含する。
【０８０９】
好ましい実施形態では、ＹＦＶ遺伝子の発現が低減される。別の好ましい実施形態では、好ましい遺伝子は、Ｅ、ＮＳ２Ａ又はＮＳ３遺伝子を包含する群のうちの１つである。
【０８１０】
好ましい実施形態では、ＹＦＶ複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０８１１】
本発明の方法はまた、ポリオウイルスに感染した患者、あるいはポリオウイルスにより媒介される障害（例えば、ポリオ）の危険性があるか、又は該障害に罹患した患者を治療することを提供する。
【０８１２】
好ましい実施形態では、ポリオウイルス遺伝子の発現が低減される。
【０８１３】
好ましい実施形態では、ポリオウイルス複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０８１４】
本発明の方法はまた、ポックスウイルスに感染した患者、あるいはポックスウイルスにより媒介される障害（例えば、天然痘）の危険性があるか、又は該障害に罹患した患者を治療することを提供する。
【０８１５】
好ましい実施形態では、ポックスウイルス遺伝子の発現が低減される。
【０８１６】
好ましい実施形態では、ポックスウイルス複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０８１７】
別の態様では、本発明は、病原体（例えば、細菌、アメーバ、寄生生物又は真菌などの病原体）に感染した対象を治療する方法を特徴とする。上記方法は、以下の：
ｉＲＮＡ剤、例えば本明細書中に記載の構造を有するｓｉＲＮＡ剤を提供することと、ｓｉＲＮＡ剤は、病原体遺伝子に相同であり、かつ例えば病原体遺伝子の切断により同遺伝子をサイレンシングすることができることと、
ｉＲＮＡ剤を対象（好ましくは、ヒト対象）に投与することと、
それにより対象を治療することと
を包含する。
【０８１８】
標的遺伝子は、増殖、細胞壁合成、タンパク質合成、転写、エネルギー代謝（例えばクレブス回路）又は毒素産生に関与するものであり得る。
【０８１９】
したがって、本発明は、マラリアを引き起こすマラリア原虫に感染した患者を治療する方法を提供する。
【０８２０】
好ましい実施形態では、マラリア原虫遺伝子の発現が低減される。別の好ましい実施形態では、該遺伝子は、頂端膜抗原１（ＡＭＡ１）である。
【０８２１】
好ましい実施形態では、マラリア原虫の複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０８２２】
本発明はまた、マイコバクテリウム・ウルセランス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｕｌｃｅｒａｎｓ）に感染した患者、あるいはこの病原体に関連した疾患又は障害（例えば、ブルーリ潰瘍）を治療する方法を包含する。
【０８２３】
好ましい実施形態では、マイコバクテリウム・ウルセランス遺伝子の発現が低減される。
【０８２４】
好ましい実施形態では、マイコバクテリウム・ウルセランスの複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０８２５】
本発明はまた、ヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に感染した患者、あるいはこの病原体に関連した疾患又は障害（例えば、結核）を治療する方法を包含する。
【０８２６】
好ましい実施形態では、ヒト結核菌遺伝子の発現が低減される。
【０８２７】
好ましい実施形態では、ヒト結核菌の複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０８２８】
本発明はまた、らい菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ）に感染した患者、あるいはこの病原体に関連した疾患又は障害（例えば、らい病）を治療する方法を包含する。
【０８２９】
好ましい実施形態では、らい菌遺伝子の発現が低減される。
【０８３０】
好ましい実施形態では、らい菌の複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０８３１】
本発明はまた、細菌である黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）に感染した患者、あるいはこの病原体に関連した疾患又は障害（例えば、皮膚及び粘膜の感染）を治療する方法を包含する。
【０８３２】
好ましい実施形態では、黄色ブドウ球菌遺伝子の発現が低減される。
【０８３３】
好ましい実施形態では、黄色ブドウ球菌の複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減
される。
【０８３４】
本発明はまた、細菌の肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に感染した患者、あるいはこの病原体に関連した疾患又は障害（例えば、肺炎又は小児期下気道感染）を治療する方法を包含する。
【０８３５】
好ましい実施形態では、肺炎連鎖球菌遺伝子の発現が低減される。
【０８３６】
好ましい実施形態では、肺炎連鎖球菌の複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０８３７】
本発明はまた、細菌の化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に感染した患者、あるいはこの病原体に関連した疾患又は障害（例えば、連鎖球菌性咽頭炎又は猩紅熱）を治療する方法を包含する。
【０８３８】
好ましい実施形態では、化膿連鎖球菌遺伝子の発現が低減される。
【０８３９】
好ましい実施形態では、化膿連鎖球菌の複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０８４０】
本発明はまた、細菌の肺炎クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に感染した患者、あるいはこの病原体に関連した疾患又は障害（例えば、肺炎又は小児期下気道感染）を治療する方法を包含する。
【０８４１】
好ましい実施形態では、肺炎クラミジア遺伝子の発現が低減される。
【０８４２】
好ましい実施形態では、肺炎クラミジアの複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０８４３】
本発明はまた、細菌の肺炎マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に感染した患者、あるいはこの病原体に関連した疾患又は障害（例えば、肺炎又は小児期下気道感染）を治療する方法を包含する。
【０８４４】
好ましい実施形態では、肺炎マイコプラズマ遺伝子の発現が低減される。
【０８４５】
好ましい実施形態では、肺炎マイコプラズマの複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０８４６】
ヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）は、ＬＯＨ領域において配列、例えば遺伝子にヘミ接合性をもたらし得る。これは正常細胞と疾患状態の細胞（例えばがん細胞）との間に重大な遺伝的差異をもたらす可能性があり、正常細胞と疾患状態の細胞（例えばがん細胞）との間の有用な差異を提供する。この差異は、遺伝子又はその他の配列が正倍数体細胞ではヘテロ接合体であるが、ＬＯＨを有する細胞ではヘミ接合体であるために生じ得る。ＬＯＨの領域は、多くの場合、喪失すると好ましくない増殖を促進する遺伝子、例えば腫瘍抑制遺伝子、及び例えば別の遺伝子（場合によっては正常に機能（例えば、増殖）するのに必須の遺伝子）を含有する別の配列を含む。本発明の方法は、一部には、必須遺伝子の１つの対立遺伝子を本発明のｉＲＮＡ剤で特異的に切断又はサイレンシングすることによる。上記ｉＲＮＡ剤は、該ｉＲＮＡ剤が、ＬＯＨを有する細胞に見出される必須遺伝子の１つの対立遺伝子を標的にするが、ＬＯＨを示さない細胞に存在する別の対立遺伝子はサイレンシングしないように選択される。実質的に、ｉＲＮＡ剤は２つの対立遺伝子を区別し、
選択された対立遺伝子を選択的にサイレンシングする。実質的には、多型、例えばＬＯＨにより影響を受ける必須遺伝子のＳＮＰｓは、ＬＯＨを有する細胞、例えばＬＯＨを有するがん細胞を特徴とする疾患用の標的として使用される。
【０８４７】
例えば、当業者は、腫瘍抑制遺伝子に近接し、且つ腫瘍抑制遺伝子を含むＬＯＨ領域内にある必須遺伝子を同定することができる。ヒトＲＮＡポリメラーゼ  ＩＩ（ＰＯＬＲ２Ａ）の大サブユニットをコードする遺伝子、腫瘍抑制遺伝子ｐ５３に近接して位置する遺伝子は、このような遺伝子である。このような遺伝子は、がん細胞ではＬＯＨの領域内に多く存在する。ＬＯＨ領域内に存在し、且つ多くのがん細胞種では欠けているその他の遺伝子は、複製タンパク質Ａ  ７０ｋＤａサブユニット、複製タンパク質Ａ３２−ｋＤａ、リボヌクレオチドレダクターゼ、チミジル酸合成酵素、ＴＡＴＡ関連因子２Ｈ、リボソームタンパク質Ｓ１４、真核生物の開始因子５Ａ、アラニルｔＲＮＡシンテターゼ、システイニルｔＲＮＡシンテターゼ、ＮａＫ  ＡＴＰアーゼ、α−１サブユニット及びトランスフェリン受容体を含む群を包含する。
【０８４８】
したがって、本発明は、ＬＯＨを特徴とする障害、例えばがんを治療する方法を特徴とする。該方法は：
任意選択で、ＬＯＨ領域の遺伝子の対立遺伝子の遺伝子型を決定することと、好ましくは、正常細胞における該遺伝子の両対立遺伝子の遺伝子型を決定することと、
ＬＯＨ細胞に見出される対立遺伝子を選択的に切断又はサイレンシングするｉＲＮＡ剤を提供することと、
対象にｉＲＮＡを投与すること、
それにより疾患を治療することと
を包含する。
【０８４９】
本発明はまた、本明細書中で開示されるｉＲＮＡ剤、例えば多型遺伝子の１つの対立遺伝子を選択的にサイレンシング（例えば切断）することができるｉＲＮＡ剤を包含する。
【０８５０】
別の態様では、本発明は、２つ以上の遺伝子をｉＲＮＡ剤で切断又はサイレンシングする方法を提供する。これらの実施形態では、上記ｉＲＮＡ剤は、２つ以上の遺伝子に見出される配列に十分な相同性を有するように選択される。例えば、配列ＡＡＧＣＴＧＧＣＣＣＴＧＧＡＣＡＴＧＧＡＧＡＴ（配列番号６７１９）は、マウスのラミンＢ１、ラミンＢ２、ケラチン複合体２−遺伝子１及びラミンＡ／Ｃ間で保存されている。したがって、この配列を標的とするｉＲＮＡ剤は、該遺伝子集団全体を効率的にサイレンシングするであろう。
【０８５１】
本発明はまた、２つ以上の遺伝子をサイレンシングすることができる、本明細書中で開示されるｉＲＮＡ剤を包含する。
【０８５２】
送達経路
説明を簡略化するために、本項の製剤、組成物及び方法は、主として非修飾ｉＲＮＡ剤に関して論述される。しかしながら、これらの製剤、組成物及び方法は、別のｉＲＮＡ剤、例えば、修飾ｉＲＮＡ剤に関して実施可能であり、且つかかる実施は本発明の範囲内にあることは理解されるべきである。ｉＲＮＡを包含する組成物は種々の経路で対象に送達され得る。典型的な経路は、静脈内、局所、経直腸、経肛門、経膣、経鼻、経肺及び経眼経路を包含する。
【０８５３】
本発明のｉＲＮＡ分子は、投与に好適な医薬組成物中に組み込まれることが可能である。かかる組成物は、通常、１種類または複数種類のｉＲＮＡと医薬として許容可能な担体とを包含する。本明細書中で使用する場合、「医薬として許容可能な担体」という用語は
、医薬品の投与と適合する任意かつすべての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張な吸収遅延剤等を包含することを意図する。医薬としての活性を有する物質に関するこのような媒体および試薬を使用することは、当該技術分野で周知である。いかなる従来の媒体および試薬も該活性化合物と適合しない場合を除き、組成物に従来の媒体および試薬を使用することが想定される。また、補助的な活性化合物が組成物に包含されることも可能である。
【０８５４】
本発明の医薬組成物は、局所治療又は全身治療のどちらが所望されるかによって、且つ治療されるべき領域によって、多様な方法で投与され得る。投与は、局所（経眼、経膣、経直腸、経鼻、経皮を含む）、経口又は非経口であってよい。非経口投与は、静脈内点滴投与、皮下投与、腹腔内注射又は筋肉内注射、又は鞘内投与若しくは脳室内投与を包含する。
【０８５５】
投与の経路及び部位は標的指向性を増大するように選択してもよい。例えば、筋細胞を標的とする場合、目的の筋肉に筋肉内注射することは、論理的な選択であろう。エアロゾル形態のｉＲＮＡを投与することにより肺細胞を標的とすることもできよう。バルーン・カテーテルをｉＲＮＡでコーティングすることにより、且つ機械的にＤＮＡを導入することにより血管内皮細胞を標的とすることもできる。
【０８５６】
局所投与用の製剤には、経皮貼布剤、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、点滴剤、坐剤、噴霧剤、液剤及び粉末剤を挙げることができる。従来の医薬担体、水溶性基剤、粉末状基剤又は油状基剤、増粘剤等が、必要又は望ましいものであり得る。コーティングされたコンドーム、グローブ等もまた有用であり得る。
【０８５７】
経口投与用の組成物には、粉剤又は顆粒剤、水中懸濁液又は水溶液、シロップ、エリキシル又は非水溶性媒体、錠剤、カプセル、薬用キャンディ、又はトローチが包含される。錠剤の場合、使用可能な担体は、ラクトース、クエン酸ナトリム及びリン酸塩を含む。デンプン等の種々の錠剤分解物質、ならびに、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム及びタルク等の潤滑剤が、一般に錠剤に使用される。カプセル形態での経口投与については、有用な希釈剤は、ラクトース及び高分子量ポリエチレングリコールである。水溶性の懸濁液が経口使用に必要とされる場合、本発明の核酸組成物は、乳化剤及び懸濁剤と組み合わせることができる。所望により、ある種の甘味剤及び／又は香料剤を添加することができる。
【０８５８】
鞘内投与又は脳室内投与のための組成物は、緩衝剤、希釈剤及びその他の好適な添加剤も含有し得る殺菌水溶液を含み得る。
【０８５９】
非経口投与のための製剤は、緩衝剤、希釈剤及びその他の好適な添加剤も含有し得る殺菌水溶液を含み得る。脳室内注射は、例えばリザーバに取り付けられた脳室内カテーテルにより容易となり得る。脳室内で使用される場合、溶質の総濃度は、調製物が等張となるように制御されるべきである。
【０８６０】
経眼投与に関しては、軟膏又は滴下可能な液剤が、アプリケータ又は目薬用容器等の当業者には既知の眼球送達システムにより送達され得る。このような組成物は、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヒドロキシプロピルメチルセルロース又はポリ（ビニルアルコール）等の粘性剤（mucomimetics）、ソルビン酸、ＥＤＴＡ又は塩化ベンジルクロニウム等の防腐剤、及び通常量の希釈剤及び／又は担体を包含することができる。
【０８６１】
局所送達
説明を簡略化するために、本項の製剤、組成物及び方法は、主として非修飾ｉＲＮＡ剤
に関して論述する。しかしながら、これらの製剤、組成物及び方法は、別のｉＲＮＡ剤、例えば、修飾ｉＲＮＡ剤に関して実施可能であり、且つかかる実施は本発明の範囲内にあることは理解されるべきである。好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖ｉＲＮＡ剤、又はｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）は、局所投与を介して対象に送達される。「局所投与」とは、対象の表面に直接製剤を接触させることによって、該対象に送達することを言う。局所送達の最も一般的な形態は皮膚に対してであるが、本明細書中で開示される組成物は、体の別の表面、例えば目、粘膜、体腔の表面又は体内の表面に対して、直接適用することもできる。上記したように、最も一般的な局所送達は皮膚に対してである。この用語は、局所及び経皮を含むいくつかの投与経路を包含するが、これらに制限されない。これらの投与の形態は、通常、皮膚の透過障壁への浸透及び標的組織又は標的層への効率的な送達を含む。局所投与は、組成物が表皮及び真皮に浸透し、最終的に全身への送達を達成する手段として使用されることができる。また、局所投与は、対象の表皮又は真皮に、又はその特定の層に、又はその下の組織に、オリゴヌクレオチドを選択的に送達する手段として使用されることができる。
【０８６２】
本明細書中で用いる場合、「皮膚」という用語は、動物の表皮及び／又は真皮をいう。哺乳類の皮膚は、２つの主要かつ明確な層から構成されている。皮膚の外側の層は、表皮と呼ばれる。表皮は、角質層、顆粒層、有棘層、及び基底層から成り、角質層は皮膚の表面にあり、基底層は表皮の最も深い部分にある。表皮は、体の場所に応じて５０μｍ〜０．２ｍｍの厚さである。
【０８６３】
表皮の下に真皮があり、真皮は表皮よりもはるかに厚い。真皮は、主として繊維束状のコラーゲンから構成されている。このコラーゲン束は、とりわけ、血管、毛細リンパ管、腺、神経終末及び免疫学的に活性な細胞に対する支えを提供する。
【０８６４】
臓器としての上記皮膚の主要な機能の１つは、体内への物質の侵入を制御することである。皮膚の主たる透過障壁は、種々な分化状態の多くの細胞の層から形成される角質層により提供される。角質層での細胞間の空隙は、皮膚透過障壁をさらに増大するように、密閉を提供する格子様の構造に配置構成された様々な脂質で満たされている。
【０８６５】
皮膚により提供される透過障壁は、約７５０Ｄａより大きい分子量を有する分子に対しては主として非透過性である。大きな分子が皮膚の透過障壁を通過するためには、通常の浸透現象以外の機構が使用されなければならない。
【０８６６】
いくつかの要因が、投与される物質に対する皮膚の透過性を決定付けている。これらの要因は、投与を受けた皮膚の特性、送達剤の特性、薬物と送達剤及び薬物と皮膚の両方の間の相互作用、投与された薬物の用量、治療の形態、治療後の措置を包含する。選択的に表皮及び真皮を標的とするために、薬物が予め選択された層へと浸透することを可能とする、１つ又はそれ以上の浸透促進剤を包含する組成物を配合することが可能なこともある。
【０８６７】
経皮送達は、脂質可溶性の治療剤の投与に有用な経路である。真皮は、表皮よりも透過性が高いため、擦過した皮膚、熱傷した皮膚又は剥離した皮膚を介すると吸収はより迅速となる。また、皮膚への血流を増加させる炎症及びその他の生理学的な条件も、経皮吸収を増大させる。この経路を介する吸収は、油状ビヒクル（塗擦剤）の使用により、又は１つ以上の浸透促進剤の使用により増大し得る。経皮経路を介して本明細書中に開示される組成物を送達する別の効率的な方法としては、皮膚の水分補給及び制御放出型の局所貼布剤の使用が挙げられる。経皮経路は、全身治療及び／又は局所治療のための、本明細書中
に開示される組成物を送達する潜在的に効率的な手段を提供する。
【０８６８】
加えて、イオントフォレーシス（電場の影響下で生体膜を介してイオン性溶質を移動すること）（リーら（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ）、「治療剤担体システムにおける評論総説（Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems）」、１６３ページ、１９９１年）、フォノフォレーシス又はソノフォレーシス（生体膜、特に皮膚及び角膜を横切る種々の治療剤の吸収を増大させるための超音波の使用）（リーら（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ）、「治療剤担体システムにおける評論総説」、１６６ページ、１９９１年）、並びに、投薬の状態及び投与部位における保持力に応じたビヒクル特性の最適化（リーら（Ｌｅｅ  ｅｔ
ａｌ）、「治療剤キャリアシステムにおける評論総説」、１６８ページ、１９９１年）は、皮膚及び粘膜部位を横切って局所投与される組成物の移送を増大させる有用な方法であり得る。
【０８６９】
提供された上記組成物及び方法は、種々のタンパク質及び遺伝子の機能を、培養又は保存された真皮組織においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで、かつ動物において試験するために使用することもできる。したがって、本発明は、任意の遺伝子の機能を試験するために適用することができる。また、本発明の方法は、治療的に又は予防的に使用され得る。例えば、乾癬、扁平苔癬、中毒性表皮壊死症、多形性紅斑、基底細胞がん、有棘細胞がん、悪性黒色腫、パジェット病、カポジ肉腫、肺線維症、ライム病、ならびにウイルス、真菌及びバクテリアの皮膚感染等の疾患に罹患しているとわかっている動物又は該疾患への罹患が疑われる動物の治療のために使用されうる。
【０８７０】
肺送達
説明を簡略化するために、本項の製剤、組成物及び方法は、主として非修飾ｉＲＮＡ剤に関して論述する。しかしながら、これらの製剤、組成物及び方法は、別のｉＲＮＡ剤、例えば、修飾ｉＲＮＡ剤に関して実施可能であり、且つこのような実施は本発明の範囲内にあることは理解されるべきである。ｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖ｉＲＮＡ剤、又はｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）を含む組成物は、肺送達により対象に投与されうる。肺送達組成物は、患者により分散剤が吸入され、該分散剤内の組成物、好ましくはｉＲＮＡが肺に到達して肺胞領域を介して直接血液循環へ容易に吸収され得るように、送達されることができる。肺送達は、肺の疾患を治療するために、全身送達及び局所送達の両方に有効であり得る。
【０８７１】
肺送達は、霧状の、エアロゾル化された、ミセル化された、かつ乾燥粉末ベースの製剤の使用など、様々な手法で達成可能である。送達は、液体ネブライザー、エアロゾル吸入器、および乾燥粉末散布デバイスを用いて達成されうる。定量式のデバイスが好ましい。アトマイザー又は吸入器を使用する利点の１つは、上記デバイスが内蔵型であるために雑菌混入の可能性が最小限となることである。乾燥粉末散布デバイスは、例えば、容易に乾燥粉末として製剤化され得る薬物を送達する。ｉＲＮＡ組成物は、凍結乾燥粉末又は噴霧乾燥粉末として、単独又は好適な粉末担体との組み合わせとして安定に貯蔵され得る。吸入用の組成物の送達は、機器に組み込まれた時に、エアロゾル薬の投与期間中の、服用量の追跡、服用順守の監視、及び／又は患者に対する服用の誘発を可能にする、タイマー、投与量計測器、時間測定器、又は時間表示器などの服用時間計測要素を介して実施されてもよい。
【０８７２】
「粉末」という用語は、微小な分散固形粒子から成る組成物を意味し、上記粒子は自由に流動し、且つ吸入器内で容易に分散されうるとともに、続いて対象によって吸入されて肺へ到達し肺胞内に浸透可能となることを特徴とする。したがって、上記粉末は、「呼吸
用」であると言える。平均粒径は、直径が約１０μｍ未満であることが好ましく、比較的均一に球状の形状に分布していることが好ましい。直径が、約７．５μｍ未満であることがより好ましく、約５．０μｍ未満であることが最も好ましい。通常、粒径分布は、直径が約０．１μｍ〜約５μｍであり、特に約０．３μｍ〜約５μｍであることが好ましい。
【０８７３】
「乾燥」という用語は、組成物が、約１０重量％（％ｗ）未満の水分含有量、通常は、約５％ｗ未満、好ましくは約３％ｗ未満の水分含有量を有することを意味する。乾燥組成物は、上記粒子が吸入器内で容易に分散可能でエアロゾルを形成するようなものでありうる。
【０８７４】
「治療上有効な量」という用語は、期待される生理学的応答を得るために治療すべき対象に所望のレベルの薬物を提供するのに必要とされる、組成物中の存在量である。  「生理学的に有効な量」という用語は、所望の症状緩和効果又は治療効果を得るために対象に送達される量である。
【０８７５】
「医薬として許容可能な担体」という用語は、肺に対する重大な悪影響である毒性効果を伴わずに、肺に摂取させることができる担体を意味する。
【０８７６】
担体として有用である医薬賦形剤の種類としては、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）等の安定剤、糖質、アミノ酸及びポリペプチド等の充填剤、ｐＨ調整剤又は緩衝剤、塩化ナトリウム等の塩等が挙げられる。これらの担体は、結晶形態でも非晶質の形態でもよく、又は該２つの形態の混合物であってもよい。
【０８７７】
特に有用である充填剤としては、適合性の糖質、ポリペプチド、アミノ酸又はそれらの組み合わせが挙げられる。好適な糖質としては、ガラクトース、Ｄ−マンノース、ソルボース等の単糖、ラクトース、トレハロース等の二糖、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン等のシクロデキストリン、及びラフィノース、マルトデキストリン、デキストラン等の多糖、マンニトール、キシリトール等のアルジトール等が挙げられる。糖質の好ましい群としては、ラクトース、トレハロース、ラフィノース、マルトデキストリン及びマンニトールが挙げられる。好適なポリペプチドとしては、アスパルテームが挙げられる。アミノ酸としては、アラニン及びグリシンが挙げられ、グリシンが好ましい。
【０８７８】
本発明の組成物の微量成分である添加剤は、噴霧乾燥中の立体構造の安定性及び粉末の分散性の向上のために包含されてもよい。これらの添加剤は、トリプトファン、チロシン、ロイシン及びフェニルアラニン等の疎水性アミノ酸を含む。
【０８７９】
好適なｐＨ調整剤又は緩衝剤としては、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム等の、有機酸及び塩基から調製される有機塩が挙げられるが、クエン酸ナトリウムが好ましい。
【０８８０】
ミセル状ｉＲＮＡ製剤の経肺投与は、テトラフルオロエタン、ヘプタフルオロエタン、ジメチルフルオロプロパン、テトラフルオロプロパン、ブタン、イソブタン、ジメチルエーテル、およびその他の非ＣＦＣ噴霧剤及びＣＦＣ噴霧剤等の噴霧剤を用いて、定量噴霧器で達成され得る。
【０８８１】
経口又は経鼻送達
説明を簡略化するために、本項の製剤、組成物及び方法は、主として非修飾ｉＲＮＡ剤に関して論述する。しかしながら、これらの製剤、組成物及び方法は、別のｉＲＮＡ剤、例えば、修飾ｉＲＮＡ剤に関して実施可能であり、且つかかる実施は本発明の範囲内にあることは理解されるべきである。口腔及び鼻腔の膜はいずれも、別の投与経路と比べて有
利な点を与える。例えば、これらの膜を介して投与された薬物は、急速に作用を開始し、薬効レベルの血漿中濃度を提供し、肝代謝の初回通過効果を回避し、不都合な胃腸（ＧＩ）環境への薬物の暴露を回避する。更なる利点は、上記膜部位に容易に接近することができるので、薬物を簡単に投与し、局在させ、且つ除去することができることである。
【０８８２】
経口送達では、組成物が、口腔の表面に、例えば、舌下粘膜（舌の腹側表面の膜及び口底を含む）又は頬の内面を構成する頬粘膜を標的とするようにすることが可能である。舌下粘膜は比較的透過性が高いため、迅速な吸収と、且つ多くの薬物に対する許容可能な生物学的利用性が得られる。さらに、舌下粘膜は、便利で、許容可能で、且つ容易に接触可能である。
【０８８３】
分子が口腔粘膜を介して透過する能力は、分子サイズ、脂質溶解度及びペプチドタンパク質のイオン化に関連すると思われる。１，０００ダルトン未満の小さい分子は、迅速に粘膜を通過すると思われる。分子サイズが増加するのに伴い、透過性は急速に減少する。脂質可溶性の化合物は、脂質可溶性でない分子よりも透過性が高い。分子がイオン化されていない、または電荷において中性である場合に、最大吸収が生じる。したがって、荷電分子は、口腔粘膜を介した吸収にとって最も大きな課題となる。
【０８８４】
また、ｉＲＮＡの医薬組成物は、上述のような混合ミセル医薬製剤及び噴霧剤を、定量噴霧器から、吸入ではなくヒトの口腔内へ噴霧することにより、口腔に投与され得る。一実施形態では、上記噴霧器は、医薬製剤及び噴霧剤を口腔内へ噴霧する前にまず振とうされる。
【０８８５】
デバイス
説明を簡略化するために、本項のデバイス、製剤、組成物及び方法は、主として非修飾ｉＲＮＡ剤に関して論述される。しかしながら、これらのデバイス、製剤、組成物及び方法は、別のｉＲＮＡ剤、例えば、修飾ｉＲＮＡ剤に関して実施可能であり、且つかかる実施は本発明の範囲内にあることは理解されるべきである。ｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖ｉＲＮＡ剤、又はｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）は、例えば、対象へ移植するかまたは別の方法で対象に設置されるデバイス等のデバイス上又はデバイス内へ配置されることができる。典型的なデバイスとしては、血管系に導入されるデバイス（例えば血管組織の管腔内に挿入されるデバイス）、又はステント、カテーテル、心臓弁、及び別の血管用デバイスを含有する、デバイス自体が血管の一部を形成するデバイスが挙げられる。これらのデバイス、例えばカテーテル又はステントは、肺、心臓又は足の血管に配置されることができる。
【０８８６】
別のデバイスとしては、血管用デバイス以外のデバイス、例えば腹膜、又は臓器又は腺組織に移植されるデバイス、例えば人工臓器が挙げられる。このデバイスは、ｉＲＮＡに加えて治療物質を放出することが可能であり、例としては、デバイスはインスリンを放出することができる。
【０８８７】
その他のデバイスは、股関節等の人工関節、及び別の整形外科移植片を含む。
【０８８８】
一実施形態では、ｉＲＮＡを含む組成物の単位用量又は一定用量は、移植デバイスにより分配される。該デバイスは、対象の体内であるパラメータを監視するセンサーを包含することができる。例えば、該デバイスがポンプを備え、例えば任意選択で電子機器と連携されていてもよい。
【０８８９】
組織、例えば肝臓等の細胞又は臓器が、ｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤またはｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）を用いてｅｘ  ｖｉｖｏで処理され、次に対象に投与または移植されることも可能である。
【０８９０】
上記組織は、自己、同種、又は異種の組織であり得る。例えば、組織（例えば肝臓）は、移植片対宿主病を減少させるように処理可能である。別の実施形態では、組織は同種組織であり、該組織（肝臓等）における好ましくない遺伝子発現を特徴とする疾患を治療するために処理される。他の例では、造血性細胞を含有する組織、例えば骨髄造血性細胞は、好ましくない細胞増殖を阻害するように処理され得る。
【０８９１】
自己組織であれ移植組織であれ、処理された組織の導入は、別の治療と組み合わせることができる。  いくつかの実施では、ｉＲＮＡで処理された細胞は、例えば該細胞が移植片から離れるのを阻止するが、体内の分子が該細胞に到達するのを可能にし、かつ該細胞により産生された分子が体内に侵入するのを可能にする半透過性多孔質障壁により、別の細胞から隔離される。一実施形態では、該多孔質障壁は、アルギン酸から形成される。
【０８９２】
一実施形態では、避妊具（避妊用デバイス）が、ｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤またはｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）でコーティングされるか、又は該ｉＲＮＡ剤を含有する。典型的なデバイスとしては、コンドーム、避妊ペッサリー、ＩＵＤ（移植可能な子宮用デバイス）、スポンジ、膣コンドーム、及び産児制限器具が挙げられる。一実施形態では、ｉＲＮＡは精子又は卵を不活性化するように選択される。他の実施形態では、ｉＲＮＡは、ウイルス又は病原体ＲＮＡ、例えばＳＴＤのＲＮＡに相補的であるように選択される。いくつかの例では、ｉＲＮＡ組成物は、殺精子剤を含むことができる。
【０８９３】
用量
一態様では、本発明は、対象（例えばヒト対象）に、ｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖ｉＲＮＡ剤、又はｓＲＮＡ剤を投与する方法を特徴とする。該方法は、ｉＲＮＡ剤、例えばｓＲＮＡ剤、例えば二本鎖ｓＲＮＡ剤であって（ａ）二本鎖部分が１９〜２５ヌクレオチド（ｎｔ）長、好ましくは２１〜２３ｎｔであり、（ｂ）標的ＲＮＡ（例えば、内在性標的ＲＮＡ又は病原体標的ＲＮＡ）に相補的であり、且つ任意選択で（ｃ）少なくとも１つの３’突出部１〜５ヌクレオチド長を含む二本鎖ｓＲＮＡ剤を単位用量投与することを包含する。一実施形態では、上記単位用量は、体重１ｋｇ当たり１．４ｍｇ未満、又は体重１ｋｇ当たり１０、５、２、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５又は０．００００１ｍｇ未満、及び体重１ｋｇ当たり２００ｎｍｏｌ未満のＲＮＡ剤（例えば約４．４×１０１６コピー）、又は体重１ｋｇ当たり１，５００、７５０、３００、１５０、７５、１５、７．５、１．５、０．７５、０．１５、０．０７５、０．０１５、０．００７５、０．００１５、０．０００７５、０．０００１５ｎｍｏｌ未満のＲＮＡ剤である。
【０８９４】
規定された量は、疾患又は障害、例えば肝臓に存在するＲＮＡ等の標的ＲＮＡに関連する疾患又は障害を、治療又は抑制するのに効果的な量であり得る。単位用量は、例えば、注射（例えば、静脈内又は筋肉内）、吸入投与、又は局所投与により投与され得る。用量は、体重１ｋｇあたり２、１又は０．１ｍｇ未満であることが特に好ましい。
【０８９５】
好ましい実施形態では、単位用量は、１日に１回未満の頻度、例えば、２，４，８又は３０日毎よりも低い頻度で投与される。他の実施形態では、単位用量は、頻繁に投与され
ない（例えば、規則正しい頻度では投与されない）。例えば、単位用量が単回で投与されてもよい。
【０８９６】
一実施形態では、有効用量がその他の従来の治療様式で投与される。一実施形態では、対象がウイルス感染症であり、上記治療様式は、ｉＲＮＡ剤以外の抗ウイルス剤（例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤又はｓＲＮＡ剤以外）である。他の実施形態では、対象がアテローム性動脈硬化症であり、有効用量のｉＲＮＡ剤（例えば二本鎖ｉＲＮＡ剤又はｓＲＮＡ剤）が、外科的介入と組み合わせて、例えば外科的介入（例えば血管形成術）の後に投与される。
【０８９７】
一実施形態では、対象に、初回用量及び１又はそれ以上の維持用量のｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤またはｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤、またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）が投与される。維持用量は、一般に初回用量より少ない（例えば、初回用量の１／２少ない）。維持投与計画は、対象を、１日に体重１ｋｇ当たり０．０１μｇ〜１．４ｍｇの範囲、例えば１日に体重１ｋｇ当たり１０、１、０．１、０．０１、０．００１、又は０．００００１ｍｇの用量で治療することを包含する。維持用量は、５、１０、又は３０日毎に１回以下で投与されるのが好ましい。さらに、治療投与計画は、個々の疾患の性質、該疾患の重症度及び患者の全体的な状態により変化し得る期間中は持続され得る。好ましい実施形態では、用量は、１日当たり１回以下、例えば２４、３６、４８時間以上当たり１回以下、例えば５又は８日毎に１回以下で送達され得る。治療に続いて、患者の状態の変動及び疾患状態の症状の緩和について、患者をモニタリングしてもよい。患者が現在の用量レベルでは有意に応答しない場合には、化合物の用量は増加されてもよいし、又は疾患状態の症状の緩和が認められる場合、疾患状態が除去されている場合、又は望ましくない副作用が認められる場合には、用量を減らしてもよい。
【０８９８】
有効用量は、個別の状況の下で所望される、又は適切と考えられるように、単回投与で又は２回以上の投与で投与され得る。所望により、反復又は頻繁な注入を容易にするためには、送達デバイス（例えば、ポンプ、半永久ステント（例えば、静脈内、腹腔内、嚢内又は関節内））又はリザーバを移植することが望ましい。
【０８９９】
一実施形態では、ｉＲＮＡ剤医薬組成物は、複数の種類のｉＲＮＡ剤を包含する。他の実施形態では、複数種類のｉＲＮＡ剤が、天然に存在する標的配列に関して別の種類のｉＲＮＡ剤と重複せずかつ隣接しない配列を有する。他の実施形態では、複数の種類のｉＲＮＡ剤は、天然に存在する異なる標的遺伝子に特異的である。他の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は対立遺伝子特異的である。
【０９００】
場合によっては、患者は、ｉＲＮＡ剤を用いて別の治療様式と併せて治療される。例えば、肝臓病を治療中の患者は、疾患の進行を増大することが知られている標的遺伝子に特異的なｉＲＮＡ剤を、該標的遺伝子の産物の活性を阻害する既知の薬物と併せて投与されてもよい。例えば、肝臓がんを治療中の患者は、腫瘍細胞の増殖に必須な標的に特異的なｉＲＮＡ剤を、化学療法と併用して投与されてもよい。
【０９０１】
治療の成功に続いて、病状の再発を予防するための維持療法を患者に施すことが望ましく、該療法では、本発明の化合物が、体重１ｋｇ当たり０．０１μｇ〜１００ｇの維持用量で投与される（米国特許第６，１０７，０９４号を参照）。
【０９０２】
ｉＲＮＡ剤組成物の濃度は、疾患を治療又は抑制するのに、又はヒトにおける生理学的状態を調節するのに十分効果的な量である。投与されるｉＲＮＡ剤の濃度又は量は、該ｉ
ＲＮＡ剤及び投与方法（例えば、経鼻、経口、経肺）に対して決定されたパラメータに依存し得る。例えば、経鼻製剤は、鼻腔の刺激又は焼けつきを回避するために、いくつかの成分をかなり低濃度とする必要がある傾向にある。好適な経鼻製剤を提供するために、経口製剤を１０〜１００倍に希釈するのが望ましいこともある。
【０９０３】
疾患又は障害の重症度、事前の治療、対象の通常の健康状態及び／又は年齢、ならびに別の疾患の存在など（これらに限定されない）、ある種の要因が、対象を効果的に治療するのに必要とされる用量に影響を及ぼす可能性がある。さらに、治療上有効な量のｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤またはｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）を用いた対象の治療は、単一の治療を包含することもできるし、又は、好ましくは一連の治療を包含することもできる。また、治療に使用されるｓＲＮＡ剤等のｉＲＮＡ剤の有効用量を、個々の治療の経過により増やしても減らしてもよいことは当然のことである。用量を変化させることは可能であり、本明細書中で記載されるような診断アッセイの結果から明らかになり得る。例えば、対象は、ｉＲＮＡ剤組成物の投与後にモニタリングされ得る。モニタリングの情報に基づいて、ｉＲＮＡ剤組成物の追加量が投与され得る。
【０９０４】
数日間〜数ヶ月間続く治療の経過とともに、又は治療が効果を上げるか若しくは疾患状態の減少が達成されるまで、投薬は治療されるべき病状の重症度及び応答性によって決まる。最適な投与計画は、患者の体内における薬物蓄積量の測定から算出され得る。当業者は、最適の用量、投与の手順及び反復頻度を容易に決定することができる。最適の用量は、個々の化合物の相対的な効能に依存して変化しうるものであり、通常、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの動物モデルで効果的であることが見出されたＥＣ５０を基に概算可能である。いくつかの実施形態では、上記動物モデルには、ヒト遺伝子、例えば、標的ＲＮＡを産生する遺伝子を発現するトランスジェニック動物が挙げられる。トランスジェニック動物は、対応する内在のＲＮＡを欠いているものであってもよい。他の実施形態では、試験用の組成物は、少なくとも内部領域においては、動物モデルの標的ＲＮＡとヒトの標的ＲＮＡとの間で保存されている配列と相補的であるｉＲＮＡ剤を包含する。
【０９０５】
本明細書中に記載のｉＲＮＡ剤が、数多くの方法で、哺乳類、特に大型哺乳類、例えばヒト以外の霊長類又はヒトに投与され得ることを、本発明者等は見出している。
【０９０６】
一実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば二本鎖ｉＲＮＡ剤、又はｓＲＮＡ剤）組成物の投与は、非経口、例えば静脈内（例えばボーラスとして又は拡散注入として）、皮内、腹腔内、筋肉内、鞘内、脳室内、頭蓋内、皮下、経粘膜的、口腔内、舌下、経内視鏡的、経直腸、経口、経膣、局所、経肺、鼻腔内、尿道又は経眼で実施される。投与は、対象者により、又は他の人（例えば医療提供者）により行われ得る。該薬剤は、一定用量で、又は一定量を送達する分配容器中に提供され得る。選択された送達様式については、以下により詳細に述べる。
【０９０７】
本発明は、本明細書中に記載のｉＲＮＡ剤を直腸投与又は直腸送達するための方法、組成物及びキットを提供する。
【０９０８】
したがって、本明細書中に記載のｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖ｉＲＮＡ剤、又はｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）、例えば本明細書中に記載の治療上有効な量のｉＲＮＡ剤、例えば４０ヌクレオチド未満、好ましくはヌクレオチド３０未満の二本鎖領域を有し、１つ又は２つの１〜３ヌクレオチド長の１本鎖３’突出部を有するｉＲＮＡ剤は、直腸投
与され得る（例えば、直腸を介して下方大腸又は上方大腸内へ導入され得る）。この手法は、炎症性疾患、好ましくない細胞増殖を特徴とする障害、例えばポリープ又は大腸がんを治療する場合に、特に有用である。
【０９０９】
該薬剤は、分注用デバイス、例えば、大腸の検査又はポリープの除去に使用されるデバイスと類似した、可撓性の、カメラガイド付きデバイスであって、薬剤を送達する手段を備えたものを導入することにより、大腸内の部位に送達され得る。
【０９１０】
ｉＲＮＡ剤の直腸投与には、浣腸剤を用いる。浣腸剤のｉＲＮＡ剤は、生理食塩水又は緩衝溶液に溶解され得る。また、直腸投与には坐剤を用いることも可能であり、坐剤は、別の成分、例えばココアバター又はヒドロプロピルメチルセルロース等の賦形剤を含み得る。
【０９１１】
本明細書中に記載の任意のｉＲＮＡ剤は、例えば錠剤、カプセル、ゲルカプセル、薬用キャンディ、トローチ又は液状シロップの形状で経口投与され得る。さらに、該組成物は、口腔の表面に局所施用され得る。
【０９１２】
本明細書中に記載の任意のｉＲＮＡ剤は、口腔投与されることができる。例えば、該薬剤は口腔内に噴霧されてもよいし、又は直接、例えば液状、固形またはゲル状で、口腔内の表面に施用されてもよい。このような投与は、口腔内（例えば、歯茎又は舌）の炎症の治療に特に望ましく、例えば一実施形態では、その口腔投与は、例えば吸入を伴わずに、分配容器、例えば医薬組成物及び噴霧剤を分配する定量噴霧容器から口腔内へ噴霧されることにより実施される。
【０９１３】
本明細書中に記載の任意のｉＲＮＡ剤は、眼球組織に投与され得る。例えば、該薬剤は、眼又は隣接する組織（例えば、瞼の内側）に投与され得る。該薬剤は、例えば噴霧することにより、滴剤として、洗眼液として、又は軟膏として局所投与され得る。投与は、対象者により、又は他の人（例えば医療提供者）により実施され得る。該薬剤は、一定用量で、又は一定用量を送達する容器内で提供され得る。また、該薬剤は、眼の内側に投与されることも可能であり、選択された領域又は構造に対して該薬剤を導入することができる針又は別の送達デバイスにより導入され得る。眼球治療は、眼又は隣接する組織の炎症を治療するのに特に望ましい。
【０９１４】
本明細書中に記載の任意のｉＲＮＡ剤は、皮膚へ直接投与され得る。例えば、該薬剤は、例えば、皮膚内に侵入するが、好ましくはその下にある筋組織には侵入しない極微針又は一連の極微針を使用することにより、皮膚層に局所投与又は送達され得る。ｉＲＮＡ剤組成物の投与は、局所的であり得る。局所投与は、例えば、対象の真皮又は表皮に上記組成物を送達することができる。局所投与は、経皮貼布剤、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、点滴剤、坐剤、噴霧剤、液剤及び粉末剤の形態であり得る。局所投与用の組成物は、リポソーム、ミセル、乳化剤又は別の脂溶性分子集合体として製剤化され得る。経皮投与は、イオントフォレーシス、フォノフォレーシス又はソノフォレーシス等の少なくとも１つの浸透促進法を用いて投与され得る。
【０９１５】
本明細書中に記載の任意のｉＲＮＡ剤は、肺器官系に投与され得る。経肺投与は、吸入により、又は肺器官系内へ送達デバイスを導入することにより、例えば該薬剤を分配することができる送達デバイスを導入することにより達成され得る。肺送達の好ましい方法には、吸入を用いる。該薬剤は、該薬剤（例えば湿った薬剤又は乾燥した薬剤であって、吸入可能なように十分に小さい形状の薬剤）を送達する容器中で提供され得る。該デバイスは、一定用量の薬剤を送達し得る。対象者でも他の人でも該薬剤を投与し得る。
【０９１６】
肺送達は、肺組織に直接影響する疾患だけでなく、別の組織に影響する疾患にも効果的である。
【０９１７】
ｉＲＮＡ剤は、液体または液体以外のもの（例えば粉末、結晶）、又は肺送達用のエアロゾルとして製剤化され得る。
【０９１８】
本明細書中に記載の任意のｉＲＮＡ剤は、経鼻投与され得る。経鼻投与は、送達デバイスを鼻内に導入することにより、例えば該薬剤を分配することができる送達デバイスを導入することにより達成され得る。経鼻送達の方法は、鼻腔の表面に、噴霧剤、エアロゾル、液剤を、例えば滴下により又は局所投与により投与することを包含する。該薬剤は、該薬剤（例えば湿った薬剤又は乾燥した薬剤であって、吸入可能なように十分に小さい形状の薬剤）を送達する容器中で提供され得る。該デバイスは、一定用量の薬剤を送達し得る。対象者でも他の人でも該薬剤を投与し得る。
【０９１９】
経鼻送達は、鼻組織に直接影響する疾患だけでなく、別の組織に影響する疾患にも効果的である。  ｉＲＮＡ剤は、液体または液体以外のもの（例えば粉末、結晶）、又は経鼻送達用として製剤化され得る。
【０９２０】
ｉＲＮＡ剤は、天然のウイルスキャプシド内にパッケージングされてもよいし、化学的若しくは酵素的に生産された人工キャプシド又はそれらに由来する構造内にパッケージングされてもよい。
【０９２１】
ｉＲＮＡ剤を含む医薬組成物の用量は、疾患状態（例えばがん又は心疾患）の症状を緩和するために投与され得る。対象は、上記の任意の方法により、該医薬組成物を用いて治療され得る。
【０９２２】
対象における遺伝子発現は、ｉＲＮＡ剤を含む医薬組成物を投与することにより調節され得る。
【０９２３】
対象は、粉末形態、例えば結晶性粒子等の微粒子の集合体である一定量のｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤またはｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤）組成物を投与することにより治療され得る。該組成物は、複数のｉＲＮＡ剤、例えば、１つ又はそれ以上の異なる内在性標的ＲＮＡに特異的なｉＲＮＡ剤を包含し得る。上記方法は、本明細書中に記載の別の特徴を包含し得る。
【０９２４】
対象は、噴霧乾燥を含む方法（すなわち溶液、乳化剤、又は懸濁液を噴霧し、直後にその液滴を乾燥ガスに暴露させ、得られた多孔質粉末粒子を回収すること）により調製された一定量のｉＲＮＡ剤組成物を投与することにより治療され得る。上記組成物は、複数のｉＲＮＡ剤、例えば、１つ又はそれ以上の異なる内在性標的ＲＮＡに特異的なｉＲＮＡ剤を包含し得る。上記方法は、本明細書中に記載の別の特徴を包含し得る。
【０９２５】
ｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖ｉＲＮＡ剤、又はｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）は、粉末形態、結晶形態又はその他の微細に分割された形態で、担体、例えば吸入又は別の経肺送達に適したマイクロ粒子又はナノ粒子とともに、あるいは担体を伴わずに、提供され得る。このことは、エアロゾル調製物、例えばエアロゾル化した噴霧乾燥組成物を提供することを包含する。該エアロゾル組成物は、定量送達デバイス中に提供されるか、又は該デバイスにより分配されるかのうち少なくともいずれかでありうる。
【０９２６】
対象は、吸入により、例えば噴霧乾燥したｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖ｉＲＮＡ剤、又はｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）の組成物を、エアロゾル化し、且つ該エアロゾル化組成物を吸入することにより、治療可能な状態を治療され得る。ｉＲＮＡ剤はｓＲＮＡであり得る。上記組成物は、複数のｉＲＮＡ剤、例えば、１つ又はそれ以上の異なる内在性標的ＲＮＡに特異的なｉＲＮＡ剤を包含し得る。上記方法は、本明細書中に記載の別の特徴を包含し得る。
【０９２７】
対象は、有効量／一定量のｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、又はｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤、またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）を含む組成物を投与することにより治療されることができ、該組成物は、噴霧乾燥、凍結乾燥、真空乾燥、蒸発、流動床乾燥、又はこれらの技法の組合せを含む方法により調製される。
【０９２８】
別の態様では、本発明は、対象の細胞における多量の転写産物に関連したパラメータを評価すること、参照値に対して評価されたパラメータを比較すること、及び評価されたパラメータが参照値に対して予め選択された相関を有する（例えば値が大きい）場合にｉＲＮＡ剤（又は、ｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤等の前駆体、又はｉＲＮＡ剤又はその前駆体をコードするＤＮＡ）を該対象に投与することを包含する方法を特徴とする。一実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、評価される転写産物に相補的な配列を含む。例えば、パラメータは、転写レベルの直接的な測定、タンパク質レベルの測定、疾患又は障害の症状又は特徴（例えば細胞増殖速度及び／又は腫瘍質量、ウイルス負荷）の測定であり得る。
【０９２９】
別の態様では、本発明は、ｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖ｉＲＮＡ剤、又はｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）を含む第１の量の組成物であって該ｉＲＮＡ剤が標的核酸と実質的に相補的である鎖を含むことを特徴とする組成物を、対象に投与することと、標的核酸によりコードされたタンパク質と関連する活性を評価し、該評価を第２の量が投与されるべきかどうかを決定するために使用することを含む方法を特徴とする。好ましい実施形態では、上記方法は、第２の量の組成物を投与することを包含し、第２の量についての投与時間又は用量は、前記評価の関数である。上記方法は、本明細書中に記載の別の特徴を包含し得る。
【０９３０】
別の態様では、本発明は、二本鎖ｉＲＮＡ剤（ｄｓ  ｉＲＮＡ剤）の供給源を対象に投与する方法を特徴とする。該方法は、（ａ）１９〜２５ヌクレオチド長、好ましくは２１〜２３ヌクレオチドの二本鎖領域を含み、（ｂ）標的ＲＮＡ（例えば、内在性ＲＮＡ又は病原体ＲＮＡ）に相補的であり、且つ任意選択で（ｃ）少なくとも１つの３’突出部１〜５ｎｔ長を含むｄｓ  ｉＲＮＡ剤、例えばｓＲＮＡ剤の供給源を投与または移植することを包含する。一実施形態では、上記供給源は、長期にわたりｄｓ  ｉＲＮＡ剤を放出し、例えば上記供給源は、制御放出又は遅延放出型の供給源であり、例えばｄｓ  ｉＲＮＡ剤を徐々に放出する微粒子である。他の実施形態では、上記供給源は、ポンプ、例えばセンサーを含むポンプ、又は１つ又はそれ以上の単位用量を放出することができるポンプである。
【０９３１】
一態様では、本発明は、標的ＲＮＡに相補的なヌクレオチド配列、例えば、実質的及び
／又は正確に相補的なヌクレオチド配列を含むｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖ｉＲＮＡ剤、又はｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）を含む医薬組成物を特徴とする。標的ＲＮＡは、内在性のヒト遺伝子の転写産物であり得る。一実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、（ａ）１９〜２５ヌクレオチド長、好ましくは２１〜２３ヌクレオチドであり、（ｂ）内在性標的ＲＮＡに相補的であり、且つ任意選択で（ｃ）少なくとも１つの３’突出部１〜５ｎｔ長を含む。一実施形態では、医薬組成物は、乳化剤、マイクロエマルジョン、クリーム、ゼリー又はリポソームであり得る。
【０９３２】
一例では、医薬組成物は、局所送達剤と混合されたｉＲＮＡ剤を含む。局所送達剤は、複数の微小ビヒクルであり得る。微小ビヒクルは、リポソームであり得る。好ましい実施形態では、リポソームはカチオン性のリポソームである。
【０９３３】
別の態様では、医薬組成物は、局所浸透促進剤と混合されたｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖ｉＲＮＡ剤、又はｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）を含む。一実施形態では、上記局所浸透促進剤は、脂肪酸である。脂肪酸は、アラキドン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸、トリカプリン酸、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル  １−モノカプリン酸、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、又はＣ１−１０アルキルエステル、モノグリセリド、ジグリセリド又は医薬として許容可能なその塩であり得る。
【０９３４】
別の実施形態では、局所浸透促進剤は、胆汁酸塩である。上記胆汁酸塩は、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル又は医薬として許容可能なその塩であり得る。
【０９３５】
別の実施形態では、浸透促進剤は、キレート剤である。該キレート剤は、ＥＤＴＡ、クエン酸、サリチル酸、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、ラウレス−９、β−ジケトンのＮ−アミノアシル誘導体又はその混合物であり得る。
【０９３６】
別の実施形態では、浸透促進剤は、界面活性剤、例えばイオン性又は非イオン性界面活性剤である。上記界面活性剤は、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテル、ペルフルオロ化合物の乳化剤又はその混合物であり得る。
【０９３７】
別の実施形態では、浸透促進剤は、不飽和環状尿素、１−アルキル−アルコン、１−アルケニルアザシクロ−アラカノン、ステロイド性の抗炎症剤及びそれらの混合物から成る群から選択され得る。さらに別の実施形態では、浸透促進剤は、グリコール、ピロール、アゾン（azone ）又はテルペン類であり得る。
【０９３８】
一態様では、本発明は、経口送達に好適な形態の、ｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖ｉＲＮＡ剤、又はｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）を含む医薬組成物を特徴とする。一実施
形態では、経口送達は、胃腸管の細胞又は領域、例えば小腸、大腸（例えば、大腸がんを治療するため）などに対してｉＲＮＡ剤組成物を送達するのに使用され得る。経口送達の形態は、錠剤、カプセル又はゲルカプセルであり得る。一実施形態では、医薬組成物のｉＲＮＡ剤は、細胞接着タンパク質の発現を調節し、細胞の増殖速度を調節し、又は真核生物の病原体又はレトロウイルスに対抗する生物活性を有する。別の実施形態では、医薬組成物は、哺乳類の胃内で、錠剤、カプセル又はゲルカプセルが溶解するのを実質的に抑制する腸溶性材料を包含する。好ましい実施形態では、腸溶性材料はコーティング剤である。該コーティング剤は、酢酸フタル酸、プロピレングリコール、モノオレイン酸ソルビタン、トリメリト酸酢酸セルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース又は酢酸フタル酸セルロースであり得る。
【０９３９】
別の実施形態では、経口投薬形態の医薬組成物は、浸透促進剤を含む。該浸透促進剤は、胆汁酸塩又は脂肪酸であり得る。胆汁酸塩は、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸及びそれらの塩であり得る。脂肪酸は、カプリン酸、ラウリン酸又はそれらの塩であり得る。
【０９４０】
別の実施形態では、経口投薬形態の医薬組成物は、賦形剤を含む。一例では、賦形剤はポリエチレングリコールである。他の例では、賦形剤はＰｒｅｃｉｒｏｌ（登録商標）である。
【０９４１】
別の実施形態では、経口投薬形態の医薬組成物は、可塑剤を含む。可塑剤は、ジエチルフタル酸、トリアセチンセバシン酸ジブチル、ジブチルフタル酸又はトリエチルクエン酸であり得る。
【０９４２】
一態様では、本発明は、ｉＲＮＡ剤及び送達ビヒクルを包含する医薬組成物を特徴とする。一実施形態では、該ｉＲＮＡ剤は、（ａ）１９〜２５ヌクレオチド長、好ましくは２１〜２３ヌクレオチドであり、（ｂ）内在性標的ＲＮＡに相補的であり、且つ任意選択で（ｃ）少なくとも１つの３’突出部１〜５ヌクレオチド長を含む。
【０９４３】
一実施形態では、送達ビヒクルは、ｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖ｉＲＮＡ剤、又はｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）を、局所の投与経路により細胞に送達し得る。送達ビヒクルは、微小ビヒクルであり得る。一例では、微小ビヒクルはリポソームである。好ましい実施形態では、リポソームはカチオン性リポソームである。他の例では、微小ビヒクルはミセルである。一態様では、本発明は、注射可能な投薬形態の、ｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖ｉＲＮＡ剤、又はｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）を含む医薬組成物を特徴とする。一実施形態では、医薬組成物の注射可能な投薬形態は、殺菌水溶液又は分散液及び殺菌粉末を含む。好ましい実施形態では、上記殺菌溶液は、水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン又はプロピレングリコール等の希釈剤を含み得る。
【０９４４】
一態様では、本発明は、経口投薬形態の、ｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖ｉＲＮＡ剤、又はｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）を含む医薬組成物を特徴とする。一実施形態では、経口投薬形態は、錠剤、カプセル及びゲルカプセルから成る群から選択される。別の実施形態では、医薬組成物は、哺乳類の胃内で、錠剤、カプセル又はゲルカプセルが溶解するのを実質的に抑制する腸溶性材料を含む。好ましい実施形態では、腸溶性材料はコーテ
ィング剤である。コーティング剤は、酢酸フタル酸、プロピレングリコール、モノオレイン酸ソルビタン、トリメリト酸酢酸セルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース又は酢酸フタル酸セルロースであり得る。一実施形態では、経口投薬形態の医薬組成物は、浸透促進剤、例えば、本明細書中に記載の浸透促進剤を含む。
【０９４５】
一態様では、本発明は、直腸投薬形態の、ｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖ｉＲＮＡ剤、又はｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）を含む医薬組成物を特徴とする。一実施形態では、直腸投薬形態は浣腸剤である。別の実施形態では、直腸投薬形態は坐剤である。
【０９４６】
一態様では、本発明は、膣内投薬形態の、ｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖ｉＲＮＡ剤、又はｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）を含む医薬組成物を特徴とする。一実施形態では、膣内投薬形態は坐剤である。別の実施形態では、膣内投薬形態は、泡沫剤、クリーム又はゲルである。
【０９４７】
一態様では、本発明は、経肺又は経鼻投薬形態の、ｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖ｉＲＮＡ剤、又はｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）を含む医薬組成物を特徴とする。一実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、粒子、例えばミクロスフェア等のマイクロ粒子内に組み込まれ得る。上記粒子は、噴霧乾燥、凍結乾燥、蒸発、流動床乾燥、真空乾燥又はこれらの技法の組合せにより産生され得る。ミクロスフェアは、懸濁液、粉末又は移植可能な固形として製剤化され得る。
【０９４８】
一態様では、本発明は、対象が吸入するのに好適な、噴霧乾燥されたｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖ｉＲＮＡ剤、又はｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）の組成物であって、（ａ）吸入によって対象の状態を治療するのに好適な治療上有効なｉＲＮＡ剤の量、（ｂ）糖質及びアミノ酸から成る群から選択される医薬として許容可能な賦形剤、及び（ｃ）任意選択で、分散性を促進する量の生理学的に許容可能かつ水溶性のポリペプチド、を含む組成物を特徴とする。
【０９４９】
一実施形態では、賦形剤は糖質である。該糖質は、単糖、二糖、三糖及び多糖から成る群から選択され得る。好ましい実施形態では、糖質は、デキストロース、ガラクトース、マンニトール、Ｄ−マンノース、ソルビトール及びソルボースから成る群から選択される単糖である。他の好ましい実施形態では、糖質は、ラクトース、マルトース、スクロース及びトレハロースから成る群から選択される二糖である。
【０９５０】
別の実施形態では、賦形剤はアミノ酸である。一実施形態では、該アミノ酸は疎水性アミノ酸である。好ましい実施形態では、疎水性アミノ酸は、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン及びバリンから成る群から選択される。さらに別の実施形態では、アミノ酸は極性アミノ酸である。好ましい実施形態では、アミノ酸は、アルギニン、ヒスチジン、リシン、システイン、グリシン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、アスパラギン酸及びグルタミン酸から成る群から選択される。
【０９５１】
一実施形態では、分散性を促進するポリペプチドは、ヒト血清アルブミン、α−ラクトアルブミン、トリプシノーゲン及びポリアラニンから成る群から選択される。
【０９５２】
一実施形態では、噴霧乾燥されたｉＲＮＡ剤組成物は、１０μｍ（ミクロン）未満の質量中央径（ＭＭＤ）を有する粒子を含む。別の実施形態では、噴霧乾燥されたｉＲＮＡ剤組成物は、５μｍ未満の質量中央径を有する粒子を含む。さらに別の実施形態では、噴霧乾燥されたｉＲＮＡ剤組成物は、５μｍ未満の空気力学的質量中央径（ＭＭＡＤ）を有する粒子を含む。
【０９５３】
幾つかの他の態様では、本発明は、ｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖ｉＲＮＡ剤、又はｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）の医薬製剤を収容している好適な容器を含むキットを提供する。ある実施形態では、該医薬製剤の個々の成分は、１つの容器内に提供され得る。別例として、医薬製剤の成分を別個に２つ又はそれ以上の容器、例えばｉＲＮＡ剤調製物用の１つの容器、担体化合物用の少なくとももう１つの容器を提供するのが望ましい。上記キットは、単一ボックス内に入った１つ又はそれ以上の容器等の、多くの異なる構成で包装されてもよい。異なる成分が、例えばキットに付属の取り扱い説明書に従って併用されてもよい。上記成分は、例えば医薬組成物を調製して投与するために、本明細書中に記載の方法に従って組み合わせることが可能である。また、上記キットは送達デバイスも含み得る。
【０９５４】
別の態様では、本発明は、デバイス、例えば移植可能なデバイスを特徴とし、該デバイスは、ｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖ｉＲＮＡ剤、又はｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）、例えば内在性転写産物をサイレンシングするｉＲＮＡ剤を含む組成物を、分配又は投与することができる。一実施形態では、該デバイスは上記組成物でコーティングされる。別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤がデバイス内に配置される。別の実施形態では、デバイスは、単位用量の組成物を分配するための機構を備えている。別の実施形態では、デバイスは、例えば拡散により連続的に組成物を放出する。代表的なデバイスとしては、ステント、カテーテル、ポンプ、人工臓器又は人工臓器部品（例えば、人工心臓、心臓弁等）、及び縫合糸が挙げられる。
【０９５５】
本明細書中で使用される場合、「結晶性の」という用語は、結晶の構造又は特性を有する固体、すなわち、一定の角度で平坦な面が交差し、かつ規則的な内部構造を有する三次元構造の粒子を言う。本発明の組成物は、様々な結晶形状を有しうる。結晶形状は、例えば噴霧乾燥等を包含する種々の方法により調製され得る。
【０９５６】
本発明について以下の実施例によりさらに説明するが、該実施例によりさらに制限されると解釈されるべきではない。
【実施例１】
【０９５７】
［脂質関連疾患の治療標的としてのａｐｏＢタンパク質］
アポリポタンパク質Ｂ（ａｐｏＢ）は、脂質関連疾患の新規な治療法の開発の標的遺伝子候補である。
【０９５８】
ａｐｏＢレベルの上昇をもたらす脂質代謝障害を治療する治療ツールとしての特定のｓｉＲＮＡの効力を評価するために、本明細書に記載の方法を用いることができる。標的のａｐｏＢ  ｍＲＮＡに選択的に結合して不活性化するためのｓｉＲＮＡ二本鎖を使用する
ことが、上記障害を治療するための方法である。
【０９５９】
２つの方法：
ｉ）ヒトａｐｏＢ  ｍＲＮＡに相同なｓｉＲＮＡ二本鎖をヒト肝臓がん細胞株（ＨｅｐＧ２）にトランスフェクションし、ａｐｏＢタンパク質およびＲＮＡをそれぞれウエスタンブロット法およびＲＴ‐ＰＣＲを用いてモニターすることによる、ｅｘ  ｖｉｖｏモデルにおけるａｐｏＢの阻害。ａｐｏＢの発現を効率良く阻害するｓｉＲＮＡ分子を、ｉｎ
ｖｉｖｏにおいて同様の効果について試験する。
【０９６０】
ｉｉ）ａｐｏＢトランスジェニックマウスモデル（ａｐｏＢ１００トランスジェニックマウス、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ‐ＴｇＮ（ＡＰＯＢ１００）、注文モデル番号：１００４−Ｔ（ヘミ接合）、Ｂ６（対照））を用いるｉｎ  ｖｉｖｏ試験。ｓｉＲＮＡ二本鎖を、ａｐｏＢ‐１００トランスジェニックマウス、またはコレステロールエステル輸送タンパク質（ＣＥＴＰ）およびａｐｏＢの両方を発現するＣＥＴＰ／ａｐｏＢ二重トランスジェニックマウスを標的とするように設計する。ｉｎ  ｖｉｖｏにおける遺伝子発現に対するｓｉＲＮＡの効果は、血清中のＨＤＬ／ＬＤＬコレステロールレベルをモニターすることにより測定可能である。この実験の結果から、高コレステロール血症、ＨＤＬ／ＬＤＬコレステロールの不均衡、家族性複合型高脂血症、および後天的な高脂血症を含めた脂質関連疾患を治療するためのｓｉＲＮＡの治療上の潜在能力が示唆されるであろう。
【０９６１】
（背景）  トリグリセリドの形態の脂肪は、高度に還元されかつ無水物であるため、エネルギーの貯蔵に理想的である。脂肪細胞（adipocyte ）は、核、細胞膜、およびトリグリセリドから構成され、脂肪細胞の機能はトリグリセリドを貯蔵することである。
【０９６２】
ヒトの食物の脂質部分は主にトリグリセリドとコレステロール（およびそのエステル）とから構成されている。これらは、吸収されるためには乳化されて消化されなければならない。具体的には、脂肪（トリアシルグリセロール）が摂取されると、肝臓で生産される胆汁（胆汁酸、胆汁酸塩、およびコレステロール）が胆嚢により分泌される。膵臓のリパーゼはトリグリセリドを消化して脂肪酸とし、またジアシルグリセロールおよびモノアシルグリセロールも消化する。脂肪酸は腸の上皮細胞により吸収されて細胞内部に入ると再合成されてトリアシルグリセロールとなる。これらのトリグリセリドおよび一部のコレステロールは、アポリポタンパク質と結合してカイロミクロンを生じる。カイロミクロンの約９５％はトリグリセリドで構成されている。カイロミクロンは脂肪酸を末梢組織へと輸送する。過剰な脂肪はすべて脂肪組織に貯蔵される。
【０９６３】
血中から細胞内、細胞から血中および肝臓への脂質の輸送と除去は、リポタンパク質の輸送タンパク質によって仲介される。この種のタンパク質はおよそ１７種であり、３つのグループ、すなわちアポリポタンパク質、リポタンパク質プロセシングタンパク質、およびリポタンパク質受容体に分けることができる。
【０９６４】
アポリポタンパク質はリポタンパク質粒子を被覆し、Ａ−Ｉ、Ａ−ＩＩ、Ａ−ＩＶ、Ｂ、ＣＩ、ＣＩＩ、ＣＩＩＩ、Ｄ、Ｅ、Ａｐｏ（ａ）タンパク質が挙げられる。リポタンパク質プロセシングタンパク質には、リポタンパク質リパーゼ、肝臓リパーゼ、レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼおよびコレステロールエステル輸送タンパク質が挙げられる。リポタンパク質受容体には、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体、カイロミクロンレムナント受容体（ＬＤＬ受容体様タンパク質またはＬＤＬ受容体関連タンパク質‐ＬＲＰ）およびスカベンジャー受容体が挙げられる。
【０９６５】
（リポタンパク質代謝）  小腸へと吸収されたトリグリセリド、コレステロールエステル、およびコレステロールは水性の溶媒には溶解しないので、巨大な油滴を形成しないよ
うに適切なタンパク質（アポリポタンパク質）と結合しなければならない。結合の結果生じるリポタンパク質は、血流およびある特定の臓器（特に肝臓）を通過する際に一種の代謝作用を受ける。
【０９６６】
高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）も肝臓で合成され、アポタンパク質Ａ−１、Ａ−２、Ｃ−１、およびＤを含む。ＨＤＬは末梢組織および血管からコレステロールを回収し、肝臓へと戻す。ＬＤＬは細胞表面の特異的受容体によってエンドソーム内に取り込まれ、エンドソームはリソソームと融合し、該リソソームにおいてコレステロールエステルが遊離コレステロールへと変換される。アポタンパク質（ａｐｏＢ−１００を含む）は消化されてアミノ酸となる。受容体タンパク質は細胞膜へと再生される。
【０９６７】
このプロセスにより形成された遊離コレステロールは２種類の運命をたどる。第１には、遊離コレステロールは小胞体（ＥＲ）へと移動して、ＨＭＧ‐ＣｏＡレダクターゼ、ＨＭＧ‐ＣｏＡレダクターゼの合成、および細胞表面のＬＤＬ受容体の合成を阻害することができる。ＥＲでは、コレステロールによってＨＭＧ‐ＣｏＡレダクターゼの分解も促進されうる。遊離コレステロールは、アシルＣｏＡおよびアシルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）により変換されてコレステロールエステルとなり、油滴を形成することもできる。
【０９６８】
ＡｐｏＢは、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ、血漿中トリグリセリドのほとんどを担持する）および低密度リポタンパク質（ＬＤＬ、血漿中コレステロールのほとんどを担持する）のカイロミクロンの主要なアポリポタンパク質である。ＡｐｏＢは、２つのアイソフォーム、ａｐｏＢ−４８およびａｐｏＢ−１００としてヒト血漿中に存在する。
【０９６９】
ＡｐｏＢ−１００はＬＤＬ受容体の主要な生理学的リガンドである。ＡｐｏＢ前駆体は４５６３アミノ酸であり、成熟型のａｐｏＢ−１００は４５３６アミノ酸残基を有する。ＡｐｏＢ−１００のＬＤＬ結合ドメインはアミノ酸残基３１２９〜３５３２位に位置すると提唱されている。ＡｐｏＢ−１００は肝臓で合成され、超低密度リポタンパク質ＶＬＤＬの会合に必須であり、かつトリグリセリド（ＴＧ）とコレステロールとを肝臓から他の組織へと輸送するためのａｐｏＢ−１００の生成に必要である。ＡｐｏＢ−１００は他のリポタンパク質のようにリポタンパク質粒子間で入れ替わることはなく、ＩＤＬ粒子およびＬＤＬ粒子中に見出される。アポリポタンパク質Ａ、ＥおよびＣが除去された後、ａｐｏＢは肝細胞によりＶＬＤＬへと取り込まれる。ＡｐｏＢ−４８はカイロミクロン内に存在し、食事性脂肪の腸吸収において必須の役割を果たしている。ＡｐｏＢ−４８は小腸で合成される。ＡｐｏＢ−４８はａｐｏＢ−１００のＮ末端４８％からなり、ａｐｏＢ−１００  ｍＲＮＡのコドン２１５３を変更（Ｃ→Ｕ）する転写後修飾により生産される。このような変更は、腸内で発現されるａｐｏＢＥＣ−１ｂ酵素によるものである。この変更によりグルタミンコドンのかわりに停止コドンが生じることによって、腸内ではａｐｏＢ−１００のかわりにａｐｏＢ−４８が発現される（ａｐｏＢ−１００は肝臓で発現される）。
【０９７０】
総コレステロールまたはＬＤＬコレステロールのレベルよりも、血漿中のａｐｏＢレベルのほうが冠状動脈疾患（ＣＡＤ）の危険性に関するよりよい指標となりうるという強力な証拠もある。臨床研究により、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、および健常な対象においてａｐｏＢを測定した値が示されている。
【０９７１】
【表４】
0005881970.tif 000047
【０９７２】
（ヒトおよび突然変異誘発モデルマウスにおける脂質代謝の分子遺伝学）  ＬＤＬおよびａｐｏＢの血漿中レベルの上昇は、主要な死因であるアテローム性動脈硬化および冠状動脈性心疾患のリスクの上昇と関連がある。ＡｐｏＢは、ＬＤＬ粒子の必須の構成成分である。リポタンパク質代謝におけるａｐｏＢの役割に加えて、ａｐｏＢは雄の不妊および胎児の発育にも関与する要因であるとされている。さらに、血漿中ａｐｏＢレベルを調節する２つの量的形質遺伝子座がトランスジェニックマウスモデルを用いて発見されている。今後の実験により、血漿中ａｐｏＢレベルの調節因子をコードするヒトのオーソロガス遺伝子の同定が進められるであろう。これらの遺伝子座は血漿中ａｐｏＢレベルの変化により特徴付けられるヒトの障害に対する治療標的候補である。そのような障害には、非ａｐｏＢ関連型の低βリポタンパク質血症および家族性複合型高脂血症が挙げられる。上記遺伝子座の同定により、ａｐｏＢの分泌の調節に関与する潜在的な新規経路が明らかとなり、薬理学的治療のための新たな治療部位が明らかになる可能性がある。
【０９７３】
（疾患および臨床薬理学）  家族性複合型高脂血症（ＦＣＨＬ）は米国人１０人のうち１人に発症すると見積もられている。ＦＣＨＬは心疾患の早期発症の原因となりうる。
【０９７４】
（家族性高コレステロール血症（高レベルａｐｏＢ））  一般的な遺伝的脂質代謝障害である。家族性高コレステロール血症は、黄色板腫、腱黄色腫、結節状黄色腫、急速なアテローム性動脈硬化、および心筋梗塞（ＭＩ）による早期死亡に関連する血清中ＴＣの上昇を特徴とする。家族性高コレステロール血症は細胞のＬＤＬ受容体の欠如または不全が原因であり、ＬＤＬクリアランスの遅延、血漿中ＬＤＬレベルの上昇、ならびに、関節および圧点を覆うマクロファージ内と血管内とにおけるＬＤＬコレステロールの蓄積がもたらされる。
【０９７５】
（アテローム性動脈硬化（高レベルａｐｏＢ））  アテローム性動脈硬化は、血中から細胞へ、かつ細胞から血中および肝臓への脂質の輸送およびクリアランスにおける障害を原因とする、コレステロールおよび脂肪の動脈壁への堆積として発症する。
【０９７６】
臨床研究から、総コレステロール（ＴＣ）、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ‐Ｃ）およびａｐｏＢの上昇がヒトのアテローム性動脈硬化を促進することが示されている。同様に、高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ‐Ｃ）レベルの低下はアテローム性動脈硬化の発症と関係がある。
【０９７７】
ＡｐｏＢは高コレステロールの遺伝的原因における要因である可能性がある。
【０９７８】
（冠状動脈疾患（ＣＡＤ）の危険性（高レベルａｐｏＢ））  心臓血管疾患、例えば冠状動脈性心疾患および脳梗塞などは、死亡および身体障害の原因となる。主な危険因子には、年齢、性別、低密度リポタンパク質コレステロールの血中レベルの上昇、高密度リポ
タンパク質コレステロールのレベルの低下、喫煙、高血圧、および糖尿病が挙げられる。新たな危険因子には、リポタンパク質（ａ）、レムナントリポタンパク質、およびＣ反応性タンパク質の上昇が挙げられる。食事摂取量、運動および遺伝的性質も心臓血管疾患の危険性に影響を与える。高血圧および年齢は脳梗塞の主な危険因子である。
【０９７９】
無βリポタンパク質血症は、血漿中にａｐｏＢ含有リポタンパク質がほぼ完全に存在しないことを特徴とするヒトの遺伝疾患であり、ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＰ）の遺伝子の突然変異によって生じる。
【０９８０】
（ヒトアテローム性動脈硬化のモデル（リポタンパク質Ａトランスジェニックマウス））  数多くの研究から、リポタンパク質（ａ）（Ｌｐ（ａ））の血漿中レベルの上昇が冠動脈性心疾患（ＣＨＤ）の主な独立の危険因子であることが実証されている。しかしながら、現在の治療法は、ａｐｏ（ａ）のレベルに対してほとんど作用しないかまたは全く作用せず、ａｐｏ（ａ）とプラスミノーゲンとの間の相同性が薬物開発の障壁となっている。Ｌｐ（ａ）粒子はａｐｏ（ａ）タンパク質およびａｐｏＢ‐１００タンパク質から構成され、霊長類およびハリネズミにおいてのみ見出される。ＬＰＡトランスジェニックマウスの開発には、ＬＰ（ａ）の会合を達成するためにヒトのａｐｏＢおよびａｐｏ（ａ）遺伝子を発現する動物を創出する必要がある。アテローム性動脈硬化のマウスモデルにより、該疾患の進行および進行に影響を与える因子の研究が促進され、さらには治療剤または予防剤の開発も促進されるであろう。遺伝子を対象とする治療については幾つかの戦略がある。例えば、欠失した遺伝子または機能しない遺伝子を置換してもよいし、望ましくない遺伝子活性を阻害してもよい。
【０９８１】
（脂質代謝およびアテローム性動脈硬化のモデル）  ＤＮＸトランスジェニックサイエンシズ社（DNX Transgenic Sciences ）により、ＣＥＴＰ／ＡｐｏＢトランスジェニックマウスおよびＡｐｏＢトランスジェニックマウスのいずれもアテローム斑を生じることが実証されている。
【０９８２】
（ａｐｏＢ‐１００過剰発現モデル）  ａｐｏＢ‐１００トランスジェニックマウスは高レベルのヒトａｐｏＢ‐１００を発現する。その結果該マウスではＬＤＬコレステロールの血清中レベルが上昇する。６ヶ月間高脂肪食とした後、このマウスは内皮下および中膜内側における顕著な泡沫細胞の蓄積、ならびにコレステロール結晶および繊維化病変を生じる。
【０９８３】
（コレステロールエステル輸送タンパク質過剰発現モデル）  ａｐｏＢ‐１００トランスジェニックマウスはヒトの酵素であるＣＥＴＰを発現し、その結果ＨＤＬコレステロールの血清中レベルが著しく低下する。
【０９８４】
（ａｐｏＢ‐１００ならびにＣＥＴＰ過剰発現モデル）  ａｐｏＢ‐１００トランスジェニックマウスはＣＥＴＰおよびａｐｏＢ‐１００のいずれも発現し、その結果マウスはヒト様の血清中ＨＤＬ／ＬＤＬ分布を示す。６ヶ月間高脂肪食とした後、このマウスは内皮下および中膜内側における顕著な泡沫細胞の蓄積、ならびにコレステロール結晶および繊維化病変を生じる。
【０９８５】
（ＡｐｏＢトランスジェニックマウス（注文モデル番号：１００４−Ｔ（ヘミ接合）、Ｂ６（対照）））  このマウスはヒトａｐｏＢ‐１００を高レベルで発現し、その結果このマウスではＬＤＬコレステロールの血清中レベルが上昇する。このマウスは、上昇したＬＤＬコレステロールのレベルとアテローム性動脈硬化のリスクとを低下させる化合物を同定し評価する際に有用である。高脂肪コレステロール食を与えると、このマウスは内皮下および中膜内側において顕著な泡沫細胞の蓄積を生じ、対照の動物よりも著しく複雑な
アテローム性動脈硬化病変を有する。
【０９８６】
（二重トランスジェニックマウスＣＥＴＰ／ＡｐｏＢ１００（注文モデル番号：１００７−ＴＴ））  このマウスはＣＥＴＰおよびａｐｏＢ‐１００の両方を発現し、その結果ヒト様の血清中ＨＤＬ／ＬＤＬ分布を示す。このマウスは、高コレステロール血症またはＨＤＬ／ＬＤＬコレステロールの不均衡を治療してアテローム性動脈硬化を発症するリスクを低減するための化合物を評価するのに有用である。高脂肪高コレステロール食を与えると、このマウスは内皮下および中膜内側において顕著な泡沫細胞の蓄積を生じ、対照の動物よりも著しく複雑なアテローム性動脈硬化病変を有する。
【０９８７】
（ＡｐｏＥ遺伝子ノックアウトマウス）  ホモ接合のａｐｏＥノックアウトマウスは強度の高コレステロール血症を示すが、これは主に血漿からのリポタンパク質クリアランス不全によりＶＬＤＬおよびＩＤＬのレベルが上昇することが原因である。このマウスはアテローム性動脈硬化病変を生じ、該病変は加齢とともに進行し、かつヒトの病変に類似している（ツァン（Zha ng ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２５８巻、ｐ．４６−７１、１９９
２年；プランプ（Plump ）ら、Ｃｅｌｌ、第７１巻、ｐ．３４３−３５３；ナカシマ（Nakashima ）ら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｐ．第１４巻、ｐ．１３３−１４０、１９９４年；レディック（Reddick ）ら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ．第１４巻、ｐ．１４１−１４７、１９９４年）。このマウスは、食事および薬物のアテローム性動脈硬化に対する作用を研究するための有望なモデルである。
【０９８８】
低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）は、リポタンパク質粒子表面のａｐｏＢおよびａｐｏＥの認識を介した血漿からのリポタンパク質クリアランスを仲介する。ＬＤＬ受容体が欠如しているかまたは数が少ないヒトは家族性高コレステロール血症であり早期にＣＨＤを発症する。
【０９８９】
（ＡｐｏＥノックアウトマウス（注文モデル番号：ＡＰＯＥ−Ｍ））  ａｐｏＥノックアウトマウスは、胚性幹細胞における遺伝子ターゲティングによりａｐｏＥ遺伝子を破壊して創出された。糖タンパク質であるＡｐｏＥは、肝臓で合成される超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）および腸で合成されるカイロミクロンの構造成分である。ＡｐｏＥは、細胞間でコレステロールを輸送する作用に関与する高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）のあるサブクラスの構成物質でもある。ａｐｏＥの最も重要な役割の１つは、ａｐｏＥを含有するカイロミクロンおよびＶＬＤＬ粒子が低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の受容体に高い親和性で結合するのを仲介することである。このことにより、肝臓による上記粒子の特異的取り込みが可能となるが、この取り込みは血漿中にコレステロール豊富なレムナントが蓄積するのを防止している輸送のために必要である。ａｐｏＥ遺伝子をホモ接合で不活性化すると動物は血清中にａｐｏＥを欠くことになる。このマウスは正常に発育するように見えるが、正常な血清の５倍の血漿コレステロールを示し、アテローム性動脈硬化病変を自然発症する。このことは、ＬＤＬ受容体に結合できないａｐｏＥ遺伝子変異体を有し、アテローム性動脈硬化の早期発症ならびに血漿中のトリグリセリドレベルおよびコレステロールレベルの上昇のリスクを有する人々の疾患に類似している。ａｐｏＥが、免疫系の調節、神経の再生および筋肉の分化にも関与するという示唆もある。ａｐｏＥノックアウトマウスは、脂質代謝、アテローム発生、および神経傷害におけるａｐｏＥの役割の研究、またアテローム発生の過程を修正する介入的治療法の探索に使用することができる。
【０９９０】
（Ａｐｏｅ４を対象とした置換マウス（注文モデル番号：００１５４９−Ｍ））  ＡｐｏＥはコレステロールの輸送に関与する血漿タンパク質であり、ヒトのアイソフォーム３種（Ｅ２、Ｅ３およびＥ４）がアテローム性動脈硬化およびアルツハイマー病に関連がある。１２９ＥＳ細胞の遺伝子ターゲティングにより、マウスａｐｏＥのコード配列を、マウスの制御配列を破壊しないようにヒトＡＰＯＥ４で置換した。Ｅ４アイソフォームはヒ
ト集団のおよそ１４％に出現し、血漿中コレステロールレベルの上昇および冠状動脈疾患のリスクの増大に関連がある。このａｐｏＥ４を対象としたタコニック社（Taconic ）の置換モデルは正常な血漿中コレステロールレベルおよびトリグリセリドレベルを有するが、血漿中の種々のリポタンパク質粒子の量が変化している。このモデルでは、コレステロールが豊富なリポタンパク質粒子（ＶＬＤＬ）の血漿クリアランスが遅く、ａｐｏＥ３を対象とした置換モデルのクリアランス速度のわずか半分である。ａｐｏＥ３のモデルと同じように、ａｐｏＥ４マウスでは血漿中のリポタンパク質の値が変化し、アテロームを発生させる食事を与えればアテローム斑を生じる。しかしながら、ａｐｏＥ４モデルではアテローム性動脈硬化がより重篤であり、プラークはａｐｏＥ３モデルよりも大きく、コレステロールａｐｏＥおよびａｐｏＢ−４８のレベルはａｐｏＥ３モデルの２倍である。このタコニックのａｐｏＥ４を対象とした置換モデルは、ａｐｏＥ２およびａｐｏＥ３を対象とした置換マウスとともに、ヒトａｐｏＥアイソフォームのｉｎ  ｖｉｖｏ研究のための優れたツールを提供する。
【０９９１】
（ＣＥＴＰトランスジェニックマウス（注文モデル番号：１００３−Ｔ））  この動物はヒトの血漿中の酵素であるＣＥＴＰを発現し、その結果マウスは血清中のＨＤＬコレステロールが激減している。このマウスは、アテローム性動脈硬化を発症するリスクを低減するためにＨＤＬコレステロールのレベルを増大させる化合物を同定し評価する際に有用となりうる。
【０９９２】
（外来遺伝子／プロモーター：ヒトアポリポタンパク質Ａ−Ｉ）  このマウスは、ヒトアポリポタンパク質Ａ−Ｉを含有するマウスのＨＤＬコレステロール粒子を産生する。外来遺伝子の発現は雄雌いずれにおいても生涯続く（米国ニューヨーク市所在のロックフェラー大学、遺伝生化学および代謝研究室（Biochemical Genetics and Metabolism Laboratory））。
【０９９３】
（無βリポタンパク質血症のマウスモデル）  無βリポタンパク質血症は、血漿中にａｐｏＢ含有リポタンパク質がほぼ全く存在しないことを特徴とするヒトの遺伝性疾患であり、ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＰ）遺伝子の突然変異によって生じる。遺伝子ターゲティングを用いてマウスのＭＴＰ遺伝子（Ｍｔｔｐ）をノックアウトした。ヘテロ接合のノックアウトマウス（Ｍｔｔｐ＋／−）では、ＭＴＰのｍＲＮＡ、タンパク質、および活性のレベルは肝臓および腸のいずれにおいても５０％低下した。ヘテロ接合のＭＴＰノックアウトマウスを用いた最近の研究から、肝臓においてＭＴＰレベルが正常の半分であることによりａｐｏＢの分泌が低下することが示唆されている。ＭＴＰレベルが正常の半分である状況におけるａｐｏＢ分泌の低下は、小胞体におけるＭＴＰ：ａｐｏＢ比が低下し、このことがａｐｏＢ‐ＭＴＰ相互作用の数を低下させたことが原因であろうとの仮説がたてられた。この仮説が正しければ、ＭＴＰレベルが正常の半分であることは、ａｐｏＢの合成が正常の半分である状況におけるリポタンパク質の分泌には（ａｐｏＢに対するＭＴＰの比が異常に低くなることはないので）ほとんど影響を与えないであろうし、ａｐｏＢの過剰発現の状況におけるリポタンパク質分泌の低下を（ａｐｏＢに対するＭＴＰの比が一層低くなるので）過大視する原因となるであろう。この仮説を検証するために、正常レベルのａｐｏＢ合成、正常の半分のレベルのａｐｏＢ合成（ヘテロ接合のＡｐｏｂ欠損）、および高レベルのａｐｏＢ合成（外来遺伝子ヒトａｐｏＢの過剰発現）という状況においてヘテロ接合のＭＴＰ欠損がａｐｏＢの代謝に与える影響について調査が行われた。予想に反して、正常の半分のレベルのＭＴＰにより、血漿中のａｐｏＢ−１００レベルは各々のａｐｏＢ合成レベルについて同程度（〜２５−３５％）減少した。さらに、初代培養肝細胞からのａｐｏＢ分泌は各々のａｐｏＢ合成レベルについて同程度に低下した。従って、これらの結果から、ＭＴＰ：ａｐｏＢ比よりもむしろ小胞体内のＭＴＰ濃度がリポタンパク質分泌の重要な決定因子であることが示される。最後に、ヘテロ接合のａｐｏＢノックアウト変異ではヘテロ接合のＭＴＰノックアウト対立遺伝子よ
りも血漿中のａｐｏＢ−１００レベルが低いことが見出された。この結果と一致して、肝臓へのトリグリセリドの蓄積はヘテロ接合のＭＴＰノックアウトマウスよりもヘテロ接合のａｐｏＢノックアウトマウスのほうが多かった。組織特異的なＣｒｅ／ｌｏｘＰ組換え技法を用いて肝臓特異的なＭｔｔｐノックアウトマウスも作製された。肝臓におけるＭｔｔｐ遺伝子の不活性化により、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）トリグリセリドが著しく減少し、ＶＬＤＬ／低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）および高密度リポタンパク質コレステロールレベルのいずれも大きく減少した。肝臓特異的ノックアウトマウスの組織学的研究から、中程度の肝臓脂肪症が明らかとなった。現在、肝臓におけるトリグリセリドの蓄積により、肝臓が二次的な要因（例えばリポ多糖）による傷害をより受けやすくなるという仮説を検証中である。
【０９９４】
（ヒトａｐｏＢ（アポリポタンパク質Ｂ）トランスジェニックマウスは、ａｐｏＢ遺伝子座が雄の不妊の原因となる役割を有することを示している）  ａｐｏＢ（アポリポタンパク質Ｂ）（＋／−）マウスの稔性を、（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに対する）戻し交配と試験交配の過程で記録した。雌のａｐｏＢ（＋／−）マウスおよび野生型雌マウスにおいては、雌マウスの膣栓の存在によって実証されたように、明らかな稔性上の問題は認められなかった。ａｐｏＢ（＋／−）マウスが正常に交配したにもかかわらず、戻し交配第２世代の動物のうちわずか４０％にしか４ヶ月の試験期間内に子孫が生まれなかった。子孫が生まれた動物のうち、同腹の子は実証された交配の＜５０％に由来するものであった。これに対し、試験した野生型マウスは全て（６／６すなわち１００％）稔性を有していた。以上のデータは、ヘテロ接合の雄のうち不妊でないのは少数であったことから、不稔性という表現型への遺伝的影響を示唆している。ｉｎ  ｖｉｖｏ受精は雄のａｐｏＢ（＋／−）マウスにおいて著しく低下していた。調べた卵の７４％が野生型マウスの精子によって受精したのに対し、ａｐｏＢ（＋／−）マウスの精子では調べた卵のわずか３％しか受精しなかった。ａｐｏＢ（＋／−）マウスの精子の数は対照と比較して少しではあるが有意に減少していた。しかしながら、運動性の精子の割合（％）はａｐｏＢ（＋／−）マウスでは野生型の対照マウスに比べて顕著に減少していた。ａｐｏＢ（＋／−）マウスの精子のうち２０％（すなわち最初の２０％の運動性精子のうち４．９％）が６時間のインキュベーション後にも運動性を維持していたのに対し、対照においては運動性精子のうち４５％（すなわち最初の６９．５％のうち３３．６％）が同じ時間経た後で運動性を維持していた。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精では、ａｐｏＢ（＋／−）マウスを用いて３回試みたが受精卵は得られなかったのに対し、野生型の対照マウスは５３％の受精率を示した。しかしながら、ａｐｏＢ（＋／−）マウスの精子は、一旦透明帯を取り除かれた卵の８４％を受精させた。数多くのａｐｏＢ（＋／−）マウス由来の精子が無傷の透明帯を有する卵に結合していることが認められた。しかしながら、これらの精子は結合の４〜６時間後に観察すると運動性を失っており、ａｐｏＢ（＋／−）マウス由来の精子は透明帯を貫通することができないが、精子と卵との相互作用は直接的ではないと思われることが示された。透明帯のない卵細胞への精子の結合は正常ではなかった。ａｐｏＢ（＋／−）マウスでは、前核がはっきりと形成された後でも精子の結合が弱まらず、ａｐｏＢの欠損により精子と卵との表面相互作用が異常になっていることが示唆された。
【０９９５】
マウスａｐｏＢ遺伝子をノックアウトした結果、ホモ接合体では胚致死となり、ヘテロ接合体では食事による高コレステロール血症からの防護と、マウスの発育異常が認められた。
【０９９６】
（インスリン耐性、異常脂質血症およびヒトａｐｏＢ過剰発現のモデル）  ａｐｏＢマウスの肝臓では大量のＶＬＤＬ粒子が組み立てられて分泌されることが示された。
【実施例２】
【０９９７】
［ｉＲＮＡを用いた２型糖尿病の治療］
（導入）  肝臓におけるグルコース新生の調節は血中のグルコースレベルの調整における重要な過程である。肝臓におけるグルコース生産の病的な変化は２型糖尿病の主要な特徴である。例えば、２型糖尿病患者にみられる空腹時血糖は、この疾患の根本にあるインスリン耐性により、肝臓におけるグルコース新生およびグリコーゲン分解の抑制が失われていることを反映している。極度のインスリン耐性状態は、例えば肝臓特異的なインスリン受容体ノックアウト（「ＬＩＲＫＯ」）マウスにおいて観察可能である。このマウスでは、グルコース新生の２つの律速酵素、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）およびグルコース‐６‐ホスファターゼ触媒サブユニット（Ｇ６Ｐａｓｅ）の発現が上昇する。インスリンは、ＰＥＰＣＫおよびＧ６Ｐａｓｅのいずれの遺伝子発現も転写レベルで抑制することが知られているが、インスリンによるＧ６ＰａｓｅおよびＰＥＰＣＫ遺伝子発現の調節に関与するシグナル伝達はごく一部しか理解されていない。ＰＥＰＣＫは肝臓におけるグルコース新生のごく初期段階（オキサロ酢酸からのホスホエノールピルビン酸の合成）に関与する一方、Ｇ６Ｐａｓｅはグルコース新生およびグリコーゲン分解の両方の最終的な段階、グルコース‐６‐リン酸を切断してリン酸と遊離のグルコースとにする反応を触媒する。遊離のグルコースは次いで血流へと送達される。
【０９９８】
ＰＥＰＣＫおよびＧ６Ｐａｓｅの発現調節への薬理学的介入を用いて、糖尿病に関連する代謝異常を治療することができる。２型糖尿病患者において、肝臓におけるグルコース生産を、ｉＲＮＡを用いたＰＥＰＣＫおよびＧ６Ｐａｓｅ酵素活性の低減により減少させることができる。
【０９９９】
（ｉＲＮＡの標的）
グルコース‐６‐ホスファターゼ（Ｇ６Ｐａｓｅ）
Ｇ６ＰａｓｅのｍＲＮＡは主に肝臓および腎臓において発現され、小腸では少量発現されている。膜結合型Ｇ６Ｐａｓｅは小胞体に会合している。骨格筋および星状細胞においても低い活性が検出されている。
【１０００】
Ｇ６Ｐａｓｅはグルコース新生およびグリコーゲン分解の最終的な段階を触媒する。この酵素の活性は糖尿病の動物では数倍高く、おそらくは糖尿病のヒトにおいても同様である。絶食および糖尿病により、肝臓におけるＧ６Ｐａｓｅ活性は２−３倍に上昇し、Ｇ６ＰａｓｅのｍＲＮＡは２−４倍に増加する。
【１００１】
ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）
マウスにおいてＰＥＰＣＫを過剰発現させると、２型糖尿病の症候が現れる。ＰＥＰＣＫの過剰発現により、Ｇ６ＰａｓｅのｍＲＮＡを増加させ、かつインスリン受容体基質（ＩＲＳ）−２タンパク質の選択的減少、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ活性の低下、およびグルコース新生に関わる遺伝子発現に対するインスリンの抑制能の低下をもたらす代謝パターンとなる。
【１００２】
【表５】
0005881970.tif 000048
【１００３】
材料と方法
動物：レプチン受容体遺伝子に点突然変異を有するＢＫＳ．Ｃｇ−ｍ＋／＋Ｌｅｐｒ  ｄｂマウスを用いて上記に列挙した標的についてのｉＲＮＡの効果を調べる。
【１００４】
ＢＫＳ．Ｃｇ−ｍ＋／＋Ｌｅｐｒ  ｄｂはジャクソンラボラトリー（Jackson Laboratory）より入手可能である（ストック番号０００６４２）。この動物は生後３‐４週で肥満となり、１０−１４日で血漿中インスリンが上昇し、４−８週で血糖が上昇し、無制限に血糖が上昇する。外部からインスリンを与えても血中のグルコースレベルを制御することはできず、グルコース新生作用が高まる。
【１００５】
以下の数の動物（雄、＞１２週齢）を以下のｉＲＮＡを用いて試験すればよい：
ＰＥＰＣＫ、２種類の配列、１配列あたり動物５匹
Ｇ６Ｐａｓｅ、２種類の配列、１配列あたり動物５匹
１種類の非特異的配列、動物５匹
１対照群（注射のみ、ｓｉＲＮＡなし）、動物５匹
１対照群（注射なし、ｓｉＲＮＡなし）、動物５匹
試薬：必要な試薬としては、理想的には、グルコースの定量にはＧｌｕｃｏｍｅｔｅｒ
Ｅｌｉｔｅ（登録商標）ＸＬ（米国ペンシルベニア州ピッツバーグ所在のバイエル）、およびインスリンの定量にはインスリンラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）キット（米国ニュージャージー州ピスカタウェイ所在のアマシャム）が挙げられる。
【１００６】
アッセイ：
Ｇ６Ｐ酵素アッセイおよびＰＥＰＣＫ酵素アッセイを用いて酵素の活性を測定する。ノーザンブロット法を用いてＧ６ＰおよびＰＥＰＣＫのｍＲＮＡレベルを検出する。抗体を使用する技法（例えば、免疫ブロット法、免疫蛍光法など）を用いてＧ６ＰおよびＰＥＰＣＫのタンパク質レベルを検出する。グリコーゲンの染色を用いて肝臓のグリコーゲンレベルを検出する。組織学的分析を実施して組織を分析する。
【１００７】
遺伝子情報：
Ｇ６Ｐａｓｅ
ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）番号：ＮＭ＿００８０６１、マウス（Mus musculus）グルコース‐６‐ホスファターゼ、触媒性（Ｇ６ｐｃ）、ｍＲＮＡ  １．．２２５９、ＯＲＦ  
８３．．１１５６；
ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）番号：Ｕ００４４５、マウス（Mus musculus）グルコース‐６‐ホスファターゼｍＲＮＡ、完全長ｃｄｓ  １．．２２５９、ＯＲＦ  ８３．．１１５６
ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）番号：ＢＣ０１３４４８
ＰＥＰＣＫ
ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）番号：ＮＭ＿０１１０４４、マウス（Mus musculus）ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ１、細胞質（Ｐｃｋ１）、ｍＲＮＡ  １．．２６１８、ＯＲＦ  １４１．．２００９
ｉＲＮＡの投与：
上述の遺伝子に対応するｉＲＮＡは、流体力学的注射（hydrodynamic injection）によりマウスに投与すればよい。対照動物群の１つは、肝臓のグルコースレベル低減の陽性対照としてメトフォルミンで治療すればよい。
【１００８】
（実験プロトコール）
マウスは、午前７時から午後７時までの間照明をつけた設備で飼育すればよい。マウスは、午後７時から午前７時までの間は餌を自由摂取とし、午前７時から午後７時までの間は絶食とすればよい。
第０日：午後７時：約１００μｌの血液を尾部から抜きとればよい。血清を単離して、グルコース、インスリン、ＨｂＡ１ｃ（ＥＤＴＡ血）、グルカゴン、ＦＦＡ、乳酸、コルチコステロン、血清トリグリセリドを測定すればよい。
第１−７日：毎日午前８時と午後６時に血中グルコースを測定すればよい（約３−５μｌ；血中グルコース測定器（Haemoglucometer ）により測定）
第８日：毎日午前８時と午後６時に血中グルコースを測定すればよい。ｉＲＮＡは午前１０時から午後２時の間に注射すればよい。
第９−２０日：毎日午前８時と午後６時に血中グルコースを測定すればよい。
第２１日：１０時間絶食させた後にマウスを屠殺すればよい。血液を単離し、グルコース、インスリン、ＨｂＡ１ｃ（ＥＤＴＡ血）、グルカゴン、ＦＦＡ、乳酸、コルチコステロン、血清トリグリセリドを測定すればよい。肝臓組織を単離して、組織学的分析、タンパク質アッセイ、ＲＮＡアッセイ、グリコーゲンの定量、および酵素アッセイを実施すればよい。
【実施例３】
【１００９】
［ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるグルコース‐６‐ホスファターゼｉＲＮＡによる阻害］
グルコース‐６‐ホスファターゼ（Ｇ６Ｐ）遺伝子を標的とするｉＲＮＡを用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるグルコース代謝に対するＧ６Ｐ発現阻害の効果を調べた。
【１０１０】
１０週齢の雌のマウス（系統はＢＫＳ．Ｃｇ−ｍ＋／＋Ｌｅｐｒ  ｄｂ、ジャクソンラボラトリー）を用いて肝臓におけるグルコース生産の酵素のｉｎ  ｖｉｖｏ分析を実施した。マウスを、午前６：３０から午後６：３０までの間照明をつけた設備で飼育した。マウスは、夜間は餌を与え（自由摂取）、昼間は絶食させた。
【１０１１】
第１日に、後眼窩静脈叢に穿刺することにより被験動物から約１００μｌの血液を採取した。第１−７日には、尾静脈から得た血液（約３−５μｌ）中のグルコースを、グルコース測定器（Ｅｌｉｔｅ（登録商標）ＸＬ、バイエル社）を用いて測定した。血中グルコース用には、毎日午前８時および午後６時にサンプリングした。
【１０１２】
第７日のおよそ午後２時に、ＧＬ３プラスミド（１０μｇ）と、ｓｉＲＮＡ（１００μｇのＧ６Ｐａｓｅ特異的ｓｉＲＮＡ、非特異的ウミシイタケｓｉＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡを含まない対照物）とを、流体力学的注射により同時に動物に送達した。
【１０１３】
第８日には、ａｖｅｒｔｉｎ（商標）で麻酔した後にルシフェリン（３ｍｇ）を注射することによりＧＬ３の発現を分析し、画像化した。これは、流体力学的送達の成功を示すための対照として実施した。
【１０１４】
第８−１０日には、尾静脈から得た血液（約３−５μｌ）中のグルコースを、グルコース測定器（Ｅｌｉｔｅ（登録商標）ＸＬ、バイエル社）を用いて測定した。
【１０１５】
第１０日には、１０時間絶食させた後にマウスを屠殺した。屠殺した動物から血液および肝臓を単離した。
【１０１６】
表６は、ＧＬ３プラスミドおよびＧ６Ｐａｓｅ  ｉＲＮＡ（Ｇ６Ｐ４）、またはＧＬ３プラスミドおよび非特異的なウミシイタケｉＲＮＡ（ＲＬ）を注射したマウス、あるいはＧＬ３プラスミドをｉＲＮＡは含めずに注射したマウス（ｎｏ）についての血中グルコースレベル（ｍｇ／ｄｌ）を列挙している。核酸を注射した日には影をつけてある。
【１０１７】
【表６】
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【１０１８】
表７は、ＧＬ３プラスミドおよびＧ６Ｐａｓｅ  ｉＲＮＡ（Ｇ６Ｐ４）、もしくはＧＬ３プラスミドおよび非特異的なウミシイタケｉＲＮＡ（ＲＬ）を注射したマウス、ＧＬ３プラスミドをｉＲＮＡは含めずに注射したマウス（ｎｏ）、あるいは注射を行わなかったマウスまたは注射に失敗したマウスについての、第１‐６日または第７日における平均血中グルコースレベル（ｍｇ／ｄｌ）を列挙している。
【１０１９】
【表７】
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【１０２０】
図６のＡ、ＢおよびＣは、それぞれ対照またはｓｉＲＮＡを含めずに注射したマウス、Ｇ６Ｐａｓｅ  ＲＮＡを注射したマウス、あるいは注射を行わなかったマウスの、第１‐６日または第７日における血中グルコースレベルを示すグラフである。図７は、Ｇ６Ｐａｓｅ  ＲＮＡを注射したマウス（実線）、ならびに非特異的なウミシイタケｉＲＮＡ（ＲＬ）またはｉＲＮＡを含めずに（ｎｏ）注射したマウス（点線）の平均血中グルコースレベルを示すグラフである。
【１０２１】
表８は、Ｇ６Ｐａｓｅ  ＲＮＡを注射したマウス、または非特異的なウミシイタケｉＲＮＡ（ＲＬ）を注射したマウスおよびｉＲＮＡを含めずに注射したマウスについて、平均血中グルコースレベルを列挙している。
【１０２２】
【表８】
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【実施例４】
【１０２３】
［選択されたパリンドローム構造の配列］
以降の表９−１４は、次の遺伝子、すなわちヒトＡｐｏＢ、ヒトのグルコース‐６‐ホスファターゼ、ラットグルコース‐６‐ホスファターゼ、βカテニン、およびＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）由来の、選択されたパリンドローム構造の配列を提示している。
【１０２４】
【表９】
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【１０２５】
0005881970.tif 000053
【１０２６】
0005881970.tif 000054
【１０２７】
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【１０２８】
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【１０２９】
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【１０３０】
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【１０３１】
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【１０３２】
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【１０３３】
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【１０３４】
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【１０３５】
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【１０３６】
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【１０３７】
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【１０３８】
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【１０３９】
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【１０４０】
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【１０４１】
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【１０４２】
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【１０４３】
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【１０４４】
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【１０４５】
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【１０４６】
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【１０４７】
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【１０４８】
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【１０４９】
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【１０５０】
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【１０５１】
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【１０５２】
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【１０５３】
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【１０５４】
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【１０５５】
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【１０５６】
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【１０５７】
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【１０５８】
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【１０５９】
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【１０６０】
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【１０６１】
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【１０６２】
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【１０６３】
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【１０６４】
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【１０６６】
0005881970.tif 000094
【１０６７】
表中、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：は配列番号、＃は適合番号、Ｂは中央部の適合塩基を表す。
【１０６８】
【表１０】
0005881970.tif 000095
【１０６９】
0005881970.tif 000096
【１０７０】
0005881970.tif 000097
【１０７１】
0005881970.tif 000098
【１０７２】
0005881970.tif 000099
【１０７３】
0005881970.tif 000100
【１０７４】
0005881970.tif 000101
【１０７５】
0005881970.tif 000102
【１０７６】
0005881970.tif 000103
【１０７７】
0005881970.tif 000104
【１０７８】
0005881970.tif 000105
【１０７９】
0005881970.tif 000106
【１０８０】
0005881970.tif 000107
【１０８１】
0005881970.tif 000108
【１０８２】
0005881970.tif 000109
【１０８３】
0005881970.tif 000110
【１０８４】
0005881970.tif 000111
【１０８５】
0005881970.tif 000112
【１０８６】
0005881970.tif 000113
【１０８７】
0005881970.tif 000114
【１０８８】
0005881970.tif 000115
【１０８９】
0005881970.tif 000116
【１０９０】
0005881970.tif 000117
【１０９１】
0005881970.tif 000118
【１０９２】
0005881970.tif 000119
【１０９３】
0005881970.tif 000120
【１０９４】
0005881970.tif 000121
【１０９５】
0005881970.tif 000122
【１０９６】
0005881970.tif 000123
【１０９７】
表中、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：は配列番号を表す。
【１０９８】
【表１１】
0005881970.tif 000124
【１０９９】
0005881970.tif 000125
【１１００】
表中、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：は配列番号を表す。
【１１０１】
【表１２】
0005881970.tif 000126
【１１０２】
表中、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：は配列番号を表す。
【１１０３】
【表１３】
0005881970.tif 000127
【１１０４】
表中、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：は配列番号を表す。
【１１０５】
【表１４】
0005881970.tif 000128
【１１０６】
0005881970.tif 000129
【１１０７】
0005881970.tif 000130
【１１０８】
0005881970.tif 000131
【１１０９】
0005881970.tif 000132
【１１１０】
0005881970.tif 000133
【１１１１】
0005881970.tif 000134
【１１１２】
0005881970.tif 000135
【１１１３】
0005881970.tif 000136
【１１１４】
0005881970.tif 000137
【１１１５】
0005881970.tif 000138
【１１１６】
表中、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：は配列番号を表す。
【１１１７】
【表１５】
0005881970.tif 000139
【１１１８】
表中、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：は配列番号を表す。
【１１１９】
【表１６】
0005881970.tif 000140
【１１２０】
0005881970.tif 000141
【１１２１】
0005881970.tif 000142
【１１２２】
0005881970.tif 000143
【１１２３】
0005881970.tif 000144
【１１２４】
0005881970.tif 000145
【１１２５】
0005881970.tif 000146
【１１２６】
0005881970.tif 000147
【１１２７】
0005881970.tif 000148
【１１２８】
0005881970.tif 000149
【１１２９】
0005881970.tif 000150
【１１３０】
0005881970.tif 000151
【１１３１】
0005881970.tif 000152
【１１３２】
0005881970.tif 000153
【１１３３】
0005881970.tif 000154
【１１３４】
0005881970.tif 000155
【１１３５】
0005881970.tif 000156
【１１３６】
0005881970.tif 000157
【１１３７】
0005881970.tif 000158
【１１３８】
0005881970.tif 000159
【１１３９】
0005881970.tif 000160
【１１４０】
0005881970.tif 000161
【１１４１】
0005881970.tif 000162
【１１４２】
0005881970.tif 000163
【１１４３】
0005881970.tif 000164
【１１４４】
0005881970.tif 000165
【１１４５】
表中、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：は配列番号を表す。
【実施例５】
【１１４６】
［ｓｉＲＮＡはｉｎ  ｖｉｖｏにおいてｍＲＮＡレベルを低下させる］  キセノジェン社（Xenogen ：米国ニュージャージー州クランベリ所在）から入手した雄のＣＭＶ‐Ｌｕｃマウス（８−１０週齢）に、コレステロール複合型ｓｉＲＮＡ（表１７参照）を投与した。
【１１４７】
【表１７】
0005881970.tif 000166
【１１４８】
【表１８】
0005881970.tif 000167
【１１４９】
緩衝液またはｓｉＲＮＡ溶液を含む試験溶液２００−２５０μｌを動物（尾静脈）に注射した。第１群には緩衝液、第２群にはコレステロール複合型ｓｉＲＮＡ（ＡＬＮ‐３００１）を、用量を体重１ｋｇあたり５０ｍｇとして投与した。注射の２２時間後に動物を屠殺して肝臓を回収した。臓器をドライアイス中で急速に凍結させてから、乳鉢と乳棒で粉砕した。
【１１５０】
ルシフェラーゼｍＲＮＡの分析（ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ（商品名、米国カリフォルニア州フレモント所在のゲノスペクトラ・インコーポレイテッド（Genospectra, Inc. ）を使用）には、約１０ｍｇの組織粉末を組織溶解用緩衝液に再懸濁し、製造業者のプロトコールに従って処理した。溶解物試料を、ルシフェラーゼまたはＧＡＰＤＨ特異的なプローブ（ＰｒｏｂｅＤｅｓｉｇｎｅｒソフトウェア（商品名、米国カリフォルニア州フレモント所在のゲノスペクトラ・インコーポレイテッド）を用いて設計）を使用して３連でハイブリダイゼーションし、発光分析用に処理した。ルシフェラーゼについての値をＧＡＰＤＨに対して標準化した。平均値を、エラーバー（ルシフェラーゼ測定値の標準偏差に相当）とともにプロットした。
【１１５１】
結果から、コレステロール複合型ｓｉＲＮＡを注射した動物におけるルシフェラーゼＲＮＡのレベルは、緩衝液を注射した動物に比べて約７０％低下することが示された（図８Ａおよび８Ｂ）。
【１１５２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性
ルシフェラーゼを発現するＨｅＬａ細胞を、表１８に列挙した各ｓｉＲＮＡでトランスフェクションした。ＡＬＮ−１０００ｓｉＲＮＡが最も効率よくルシフェラーゼｍＲＮＡレベルを低下させた（〜０．６ｎＭのｓｉＲＮＡによりｍＲＮＡレベルが元の発現レベルの〜６５％まで低下し、１．０ｎＭのｓｉＲＮＡによりｍＲＮＡレベルは元の発現レベルの〜２０％まで低下した）。ＡＬＮ−３００１ｓｉＲＮＡは最も効果が低かった（〜０．６ｎＭのｓｉＲＮＡはｍＲＮＡレベルにほとんど影響が無く、１．０ｎＭのｓｉＲＮＡによりｍＲＮＡレベルは元の発現レベルの〜４０％まで低下した）。
【１１５３】
薬物動態／生体内分布
マウスおよびラットにおいて薬物動態学的分析を実施した。試験用ｓｉＲＮＡ分子は、スプリントライゲーション（splint ligation ）により３３Ｐでアンチセンス鎖を放射標識した。標識したｓｉＲＮＡ（５０ｍｇ／ｋｇ）を尾静脈注射により投与し、ｓｉＲＮＡの血漿中レベルを２４時間にわたり定期的にシンチレーション測定によって測定した。コレステロール複合型ｓｉＲＮＡ（ＡＬＮ−３００１）は、非複合型のｓｉＲＮＡ（ＡＬＮ−３０００）よりも長い時間マウスの血漿中を循環することが見出された（図９）。ＲＮＡｓｅ保護アッセイから、コレステロール複合型ｓｉＲＮＡ（ＡＬＮ−３００１）は注射１２時間後にマウスの血漿中で検出可能であり、非複合型ｓｉＲＮＡ（ＡＬＮ−３０００）は注射後２時間以内にマウスの血漿中で検出不可能となることが示された。ラットにおいても同様の結果が認められた。
【１１５４】
ｓｉＲＮＡ注射後、様々な時点（０．０８‐２４時間）でマウスの肝臓を採取し、肝臓に局在するｓｉＲＮＡを定量した。調べた期間全体にわたって、肝臓において検出されたコレステロール複合型ｓｉＲＮＡ（ＡＬＮ−３００１）の量はマウスに投与した総用量の１４．３−３．５５％の範囲であった。肝臓において検出された非複合型ｓｉＲＮＡ（ＡＬＮ−３０００）の量はこれよりも低く、投与した総用量の３．９１−１．７５％の範囲であった（図１０）。
【１１５５】
様々な組織におけるｓｉＲＮＡの検出
５０ｍｇ／ｋｇのＡＬＮ−３００１を注射して２２時間後の２匹のＣＭＶ−Ｌｕｃマウスから、種々の組織および臓器（脂肪、心臓、腎臓、肝臓、および脾臓）を採取した。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を、ＲＮＡｓｅ保護アッセイによって検出した。肝臓は最も高濃度のｓｉＲＮＡを含んでおり（組織１ｇあたり〜８−１０μｇのｓｉＲＮＡ）、脾臓、心臓および腎臓に含まれる量はそれよりも低く（組織１ｇあたり〜２−７μｇのｓｉＲＮＡ）、脂肪組織では含まれるｓｉＲＮＡの量が最も少なかった（組織１ｇあたり＜〜１μｇのｓｉＲＮＡ）（図１１）。
【１１５６】
ＲＮＡｓｅ保護アッセイによるグルコース‐６‐ホスファターゼｓｉＲＮＡの検出
Ｂａｌｂｃマウスに、グルコース‐６‐ホスファターゼ（Ｇ６Ｐａｓｅ）を標的とするＵ／Ｕ、３’Ｃ／Ｕ、または３’Ｃ／３’Ｃ  ｓｉＲＮＡ（４ｍｇ／ｋｇ）を注射した（表１９を参照されたい）。投与は流体力学的尾静脈注射（ｈｄ）または非流体力学的な尾静脈注射（ｉｖ）により実施し、その後ＲＮＡｓｅ保護アッセイにより肝臓におけるｓｉＲＮＡを検出した。
【１１５７】
【表１９】
0005881970.tif 000168
【１１５８】
ｈｄにより送達された非複合体型のｓｉＲＮＡ（Ｕ／Ｕ）は、注射１５分後（１５’）（最も早い測定時点）までに検出され、注射１８時間後（１８ｈ）でも肝臓中に検出可能であった（図１２）。
【１１５９】
標準的なｉｖ投与による送達では、注射１時間後（１ｈ）の肝臓において３’Ｃ／３’Ｃ  ｓｉＲＮＡ（ビスコレステロール複合体）の濃度が最大となった（モノコレステロール複合体である３’Ｃ／３’Ｕ  ｓｉＲＮＡとの比較）。注射１８時間後（１８ｈ）でも、３’Ｃ／３’Ｃ  ｓｉＲＮＡおよび３’Ｃ／Ｕ  ｓｉＲＮＡは肝臓中に検出可能であり、モノ複合体に比べてビス複合体において高レベルであった（図１３）。
【実施例６】
【１１６０】
［ｓｉＲＮＡはｉｎ  ｖｉｖｏにおいてタンパク質の活性レベルを低下させる］
雄のＣＭＶ‐Ｌｕｃマウスは米国マサチューセッツ州ウィルミントン所在のチャールス・リバー・ラボラトリーズ・インコーポレイテッド（Charles River Laboratories, Inc.）で飼育されたものである。マウス（６−７週齢）にコレステロール複合型ｓｉＲＮＡを投与した（表２０−２２を参照されたい）。
【１１６１】
【表２０】
0005881970.tif 000169
【１１６２】
【表２１】
0005881970.tif 000170
【１１６３】
【表２２】
0005881970.tif 000171
【１１６４】
緩衝液またはｓｉＲＮＡ溶液を含む試験溶液２００−２５０μｌを動物（尾静脈）に注射した。第１群には緩衝液、第２群にはコレステロール複合型ｓｉＲＮＡ（ＡＬＮ‐３００１）を、用量を体重１ｋｇあたり７５ｍｇとして投与した。注射の１９〜２２時間後に動物を屠殺して肝臓を回収した。臓器をドライアイス中で急速に凍結させてから、乳鉢と乳棒で粉砕した。
【１１６５】
ルシフェラーゼｍＲＮＡを分析するために、約５０ｍｇの組織粉末を０．５ｍｌの細胞溶解用緩衝液（プロメガ・インコーポレイテッド（Promega, Inc. ））中に再懸濁した。試料を３分間激しく渦流混合し、液体窒素中で急速に凍結させてから３７℃の温水槽で融解させた。この処理工程をさらに２回繰り返した。最後に融解させた後、試料を３分間渦流混合した。微量遠心分離機（４度）にて全速で４分間遠心分離して不溶物を取り除いた。上清を回収した。各試料２０〜２５μｌをピペットにてアッセイ用チューブに３連で注入し、室温になるまで放置した。活性を測定するために、「Ｂｒｉｇｈｔ  Ｇｌｏｗ」アッセイ試薬（プロメガ・インコーポレイテッド）２００μｌを試験用試料に加え、１０秒間にわたって発光を記録するようにルミノメータ（ベルトールド・インコーポレイテッド（Berthold Inc. ））をプログラムした。
【１１６６】
総タンパク質を測定するために、上清試料を３０倍希釈し、５μｌ試料を３連でブラッドフォード法によるタンパク質微量アッセイ（バイオラッド（Bio-Rad ））にて測定した。標準曲線を作成するためにウシ血清アルブミンを使用した。
【１１６７】
ルシフェラーゼ活性は、ルミノメータによる平均測定値を平均タンパク質含量に対して標準化したものとして決定した。各実験の緩衝液処理群およびｓｉＲＮＡ処理群について標準化された値の平均を算出した。各実験について、ｓｉＲＮＡ処理群の標準化されたＬｕｃレベルを緩衝液対照群（１００％とした）に対する割合（％）として表す。エラーバーは標準偏差を示す。
【１１６８】
結果から、コレステロール複合型ｓｉＲＮＡを注射した動物におけるルシフェラーゼ活性のレベルは、緩衝液を注射した動物に比べて約５５％低下することが示された（図１４）。
【１１６９】
［その他の実施形態］
本発明について、好ましい実施形態に関して具体的に示し説明してきたが、当業者には当然のことながら、添付の特許請求の範囲により包含される本発明の範囲を逸脱することなく本発明の形態および細部について種々の変更を施すことが可能である。
【図１】
0005881970.tif 000176
【図２】
0005881970.tif 000177
【図３】
0005881970.tif 000178
【図４】
0005881970.tif 000179
【図５Ａ】
0005881970.tif 000180
【図５Ｂ】
0005881970.tif 000181
【図５Ｃ】
0005881970.tif 000182
【図５Ｄ】
0005881970.tif 000183
【図６】
0005881970.tif 000184
【図７】
0005881970.tif 000185
【図８Ａ】
0005881970.tif 000186
【図８Ｂ】
0005881970.tif 000187
【図９】
0005881970.tif 000188
【図１０】
0005881970.tif 000189
【図１１】
0005881970.tif 000190
【図１２】
0005881970.tif 000191
【図１３】
0005881970.tif 000192
【図１４】
0005881970.tif 000193
【配列表】
0005881970000001.app