(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルバペネム耐性遺伝子を同定するためのオリゴヌクレオチドプライマー対セットであって、該オリゴヌクレオチドが１５〜５０ヌクレオチド長であり、かつ、配列番号１５と１６、配列番号１もしくは４９と２、配列番号９と１０、配列番号１３と１４、配列番号１９と２０、および配列番号２１と２２からなる群から選択されるヌクレオチド配列をプライマーの３’末端側に含んでなり、生体サンプルが細菌においてカルバペネム耐性を引き起こすカルバペネマーゼ遺伝子を含んでなることを示す、ＫＰＣ、ＯＸＡ−４８遺伝子、およびＶＩＭ、ＧＥＳ、またはＩＭＰ遺伝子の少なくとも一つの存在を判定するための、オリゴヌクレオチドプライマー対セット。
【請求項２】
生体サンプルにおいてカルバペネマーゼ遺伝子を検出する方法であって、下記工程を含んでなる方法：
生体サンプル由来の核酸鋳型と、請求項１に記載のプライマー対セットの存在下でマルチプレックス増幅反応を行う工程、
これらの産物の解離曲線を分析する工程、および
その生体サンプルが細菌においてカルバペネム耐性を引き起こすカルバペネマーゼ遺伝子を含んでなることを示す、カルバペネム耐性を担うＫＰＣ、ＯＸＡ−４８遺伝子、およびＶＩＭ、ＧＥＳ、またはＩＭＰ遺伝子の少なくとも一つの存在を判定する工程。
【請求項３】
１５〜５０ヌクレオチド長であり、かつ配列番号３と４、配列番号５と６、配列番号７と８、配列番号１１と１２、および配列番号１７と１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列をプライマーの３’末端側に含んでなる、ＳＭＥ、ＧＩＭ−１、ＳＩＭ−１、ＳＰＭ、および／またはＩＭＩ／ＮＭＣ−Ａ遺伝子またはそれらのサブバリアントの２以上の存在を判定するためのプライマー対をさらに含んでなる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
１５〜５０ヌクレオチド長であり、かつ配列番号３と４、配列番号５と６、配列番号１１と１２、および配列番号１７と１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列をプライマーの３’末端側に含んでなる、ＳＭＥ、ＧＩＭ−１、ＳＰＭ、および／またはＩＭＩ／ＮＭＣ−Ａ遺伝子の２以上の存在を判定するためのプライマー対をさらに含んでなる、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
１５〜５０ヌクレオチド長であり、かつ配列番号２３と２４、配列番号２５と２６、配列番号２７と２８、配列番号２９と３０、配列番号３１と３２、配列番号３３と３４、配列番号３５と３６、配列番号３７と３８、配列番号３９と４０、および配列番号４１と４２からなる群から選択されるヌクレオチド配列をプライマーの３’末端側に含んでなる、ＯＸＡ−２４、２５、２６、−４０、−７２、ＯＸＡ−２３、−２７、ＯＸＡ−５０、ＯＸＡ−５１、６４−７１、７５−７８、８３、８４、８６−８９、−９２、−９４、−９５、ＯＸＡ−５５、ＯＸＡ−５８、ＯＸＡ−６０、ＯＸＡ−６２、ＳＦＣ−１、および／またはＣＭＹ−１、−１０、−１１遺伝子またはそれらのサブバリアントの２以上の存在を判定するためのプライマー対をさらに含んでなる、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
反応が、共通の適合増幅条件を有する二つ以上の独立したマルチプレックス反応で行われる、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
請求項１に記載のプライマー対セットを含んでなる、キット。
【請求項８】
１５〜５０ヌクレオチド長であり、かつ、配列番号３と４、配列番号５と６、配列番号７と８、配列番号１１と１２、および配列番号１７と１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなる、ＳＭＥ、ＧＩＭ−１、ＳＩＭ−１、ＳＰＭ、ＩＭＩ／ＮＭＣ−Ａ遺伝子またはそれらのサブバリアントの２以上の存在を判定するためのプライマー対をさらに含んでなる、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
１５〜５０ヌクレオチド長であり、かつ、配列番号３と４、配列番号５と６、配列番号１１と１２、および配列番号１７と１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなる、ＳＭＥ、ＧＩＭ−１、ＳＰＭ、および／またはＩＭＩ／ＮＭＣ−Ａ遺伝子またはそれらのサブバリアントの２以上の存在を判定するためのプライマー対をさらに含んでなる、請求項７に記載のキット。
【請求項１０】
１５〜５０ヌクレオチド長であり、かつ、配列番号２３と２４、配列番号２５と２６、配列番号２７と２８、配列番号２９と３０、配列番号３１と３２、配列番号３３と３４、配列番号３５と３６、配列番号３７と３８、配列番号３９と４０、および配列番号４１と４２からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなる、ＯＸＡ−２４、２５、２６、−４０、−７２、ＯＸＡ−２３、−２７、ＯＸＡ−５０、ＯＸＡ−５１、６４−７１、７５−７８、８３、８４、８６−８９、−９２、−９４、−９５、ＯＸＡ−５５、ＯＸＡ−５８、ＯＸＡ−６０、ＯＸＡ−６２、ＳＦＣ−１および／またはＣＭＹ−１、−１０、−１１遺伝子またはそれらのサブバリアントの２以上の存在を判定するためのプライマー対をさらに含んでなる、請求項７〜９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１】
第一および第二のマルチプレックス反応を含んでなり、第一のマルチプレックス反応において、ＫＰＣ、ＯＸＡ−４８遺伝子、およびＶＩＭ、ＧＥＳ、またはＩＭＰの少なくとも一つが一反応内で検出され、該検出が、請求項１に記載のプライマー対セットを使用することによって行われる、細菌においてカルバペネム耐性を引き起こすカルバペネマーゼ遺伝子を同定するための方法。
【請求項１２】
マルチプレックス反応において、一反応内でＳＭＥ、ＧＩＭ−１、ＳＰＭ、およびＩＭＩ／ＮＭＣ−Ａからなる群から選択される遺伝子、遺伝子ファミリー、および／またはサブバリアントの２以上または全てがさらに検出され、該検出が、１５〜５０ヌクレオチド長であり、かつ、配列番号３と４、配列番号５と６、配列番号１１と１２、および配列番号１７と１８からなる群から選択されるプライマー対を含んでなるプライマーを用いることによって行われる、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、細菌（すなわち、カルバペネム耐性細菌）においてカルバペネム耐性を引き起こすカルバペネマーゼ遺伝子を検出するための方法およびキットに関する。本発明はまた、その検出において使用することができるオリゴヌクレオチドプライマーに関する。
【０００２】
背景技術
ペニシリンおよびケファロスポリン(kefalosporins)などのβ−ラクタム系抗生物質に対する耐性の増大は、グラム陰性桿菌によって引き起こされる感染の治療上の問題となっている。従って、β−ラクタム系抗生物質を広いスペクトルを有する抗生物質に置き換えていかなければならない。
【０００３】
カルバペネム類は、難しい院内感染を処置するための重要な広域抗生物質群である。カルバペネム類は一般にほとんどの好気性グラム陽性菌およびグラム陰性菌に対して、また嫌気性細菌に対して効果的である。よく用いられるカルバペネム類は、イミペネム、メロペネム、およびエルタペネムである。これらの薬剤に対して耐性のある細菌株が、特にギリシャ、イスラエル、米国、トルコおよび極東（中国）、また中央アメリカにおいて、入院患者に見られる。
【０００４】
カルバペネム感受性が低下した典型的な細菌は大腸菌、クレブシエラ種(Klebsiella sp.)、および他の腸内細菌種(Enterobacteriaceae sp.)である。さらに、環境起源の緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)およびその近縁種、ならびに免疫応答が弱まった患者に見られるアシネトバクター種は、カルバペネム感受性が低い場合が多い。
【０００５】
カルバペネム抗生物質に対する感受性の低下は、何百という異なるβ−ラクタム系抗生物質耐性遺伝子により、細胞壁透過性の変化（例えば、特異的ポーリンの変化）および／またはａｍｐＣ  β−ラクタマーゼの過剰生産に関連した能動的流出と相まって引き起こされると考えられる。一般に、これがカルバペネム感受性の低下を引き起こし、この低下は可逆的であり、抗生物質処置を止めれば終わる。この理由は、この機構の維持が細菌にとってエネルギーを消耗し、その栄養供給に不利であるためである。
【０００６】
カルバペネム耐性のもう一つの、より重要な理由は、カルバペネム抗生物質を分解する酵素、いわゆる、カルバペネマーゼ(carbapenemase)である。カルバペネマーゼの存在下では、細菌は野生型細菌に比べてその競合能を有意に呈する必要はない。従って、カルバペネマーゼはそれだけで著しいカルバペネム耐性の理由となり得る。この機構は、最初に述べた、感受性の低下とその結果としての耐性を増す機構と組み合わさっているものと思われる。カルバペネマーゼ遺伝子は、染色体とプラスミドの双方に存在し得る。特に、プラスミドに存在するものは、基質拡張型β−ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）株の場合と同様に、他の細菌種に容易に移行する。カルバペネマーゼを産生する株は、多くの場合、ＥＳＢＬ株でもある。特に、肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)カルバペネマーゼ（ＫＰＣ）遺伝子およびＶｅｒｏｎａイミペネマーゼ（ＶＩＭ）遺伝子ファミリーは、現在入手可能な抗生物質処置にとって潜在的な脅威である。ＫＰＣ産生細菌は、慣例の抗生物質感受性検査に基づく検出は困難であるので、感染管理措置において問題をなり得る。カルバペネマーゼ特性を有するもう一つの一般的なβ−ラクタマーゼファミリーは、ギアナ基質拡張型β−ラクタマーゼ（ＧＥＳ）であり、これもまた、慣例の抗生物質感受性検査に基づく検出が特に困難である。
【０００７】
環境種におけるカルバペネム耐性遺伝子の大きなリザーバーと、増加するカルバペネム使用が相まって、まだ同定されていない稀なまたは新規なカルバペネマーゼ遺伝子の出現の危険を誘発する。他方、カルバペネム耐性は上記のような可逆的機構によっても生じ得る。従って、細菌サンプルにおいてカルバペネム耐性細菌を誘発するカルバペネマーゼ遺伝子を検出する方法が改良される必要性がある。
【発明の概要】
【０００８】
本発明の一つの目的は、この従来技術の問題の少なくともいくつかを解決することである。特に、本発明の一つの目的は、ある細菌サンプルがカルバペネム抗生物質群に耐性のある細菌を含むか否かを見つけ出す方法を提供することである。
【０００９】
より具体的には、本発明の一つの目的は、細菌においてカルバペネム耐性を引き起こす、すなわち、カルバペネム群の抗生物質に対する耐性を引き起こすカルバペネマーゼ遺伝子をスクリーニングする方法を提供することである。
【００１０】
本発明は、生体サンプルから耐性遺伝子をスクリーニングする分子生物学的方法の使用に基づくものである。特に、本発明は、カルバペネム耐性を引き起こすカルバペネマーゼ遺伝子を検出することができる、特異的に設計されたプライマーの使用に基づくものである。これらの方法は生物学的方法の代わりに用いるかまたはこれら併用することができる。
【００１１】
本発明は、生体サンプル中に存在する細菌（カルバペネム耐性細菌）においてカルバペネム耐性を引き起こすカルバペネマーゼ遺伝子を検出する方法を提供する。
【００１２】
本発明はまた、カルバペネマーゼ遺伝子を同定するためのキットおよびプライマーも提供する。
【００１３】
さらに、本発明は、カルバペネマーゼ遺伝子を同定するための構成(arrangement)を提供する。本発明は、多くの利点を有する。病院の衛生および継続管理を脅かす株を迅速に同定することが可能となる。これは生化学的方法を用いるだけでも部分的に可能となる。分子生物学的方法を単独で用いるかまたは生化学的方法と併用すれば、従来技術が著しく改良される。
【００１４】
以下、本発明を、詳細な説明の目的で、いくつかの実施例を参照しながら、さらに詳しく説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、４つの異なるカルバペネマーゼ遺伝子の遺伝子増幅曲線を示す。
【図２】図２は、融解曲線分析を示す。種々の遺伝子産物をそれらの融解温度の違いに基づいて分離することができる。
【発明の具体的説明】
【００１６】
本発明は、カルバペネム抗生物質に対して耐性のある遺伝子をスクリーニングすることを可能とする。この方法は細菌においてカルバペネム耐性を引き起こすカルバペネマーゼ遺伝子の検出に基づくものである。より具体的には、このスクリーニングは、ＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）またはＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法などの増幅法に使用に基づくものである。
【００１７】
好ましくは、増幅反応はＰＣＲ法、特に、リアルタイムＰＣＲである。より有利には、この方法は、リアルタイムＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ検出に基づくＰＣＲ、好ましくは、その産物の融解曲線分析を用いる。
【００１８】
本明細書においてＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎとは、蛍光を惹起し、蛍光の放出をモニタリングし、蛍光の放出が、反応の完了を示すプラトー相に達するサイクルを決定するために選択された光の波長で、核酸結合蛍光色素が結合した核酸結合蛍光色素が発光する増幅産物を意味する。好ましくは、核酸結合蛍光色素は、ＳＹＢＲ．ＴＭ．  ＧＲＥＥＮ  Ｉ、臭化エチジウム、ピコグリーン、ＥＶＡ  Ｇｒｅｅｎ、アクリジンオレンジ、チアゾールオレンジ、ＹＯ−ＰＲＯ−１、およびクロモマイシンＡ３からなる群から選択されるメンバーである。
【００１９】
本明細書においてリアルタイムＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ検出とは、生体サンプル中の標的核酸配列のポリメラーゼ連鎖反応による増幅をリアルタイムにモニタリングする方法を意味する。この方法は、好ましくは、ＳＹＢＲ．ＴＭ．  Ｇｒｅｅｎ  Ｉの存在下でのポリメラーゼ連鎖反応により標的配列を増幅する工程（このポリメラーゼ連鎖反応は、生体サンプルに熱安定性ポリメラーゼおよび標的化された核酸配列に対するプライマーを加える工程と、この生体サンプルを少なくとも変性温度と伸長温度の間で温度周期に曝す工程を含んでなる）、この生体サンプルを、ＳＹＢＲ．ＴＭ．  Ｇｒｅｅｎ  Ｉによって吸収される波長の光で励起し、生体サンプルからの発光を検出する工程、およびＳＹＢＲ．ＴＭ．  Ｇｒｅｅｎ  Ｉからの温度依存性蛍光をモニタリングする工程を含んでなる。好ましくは、このモニタリング工程は、増幅された標的配列の融解特性を決定することを含んでなる。
【００２０】
本明細書において「生体サンプル」とは、直接的臨床サンプル、例えば、血液もしくは尿などの体液、または咽頭スワブ、鼻腔スワブ、皮膚スワブ、唾液、糞便もしくは気管支吸引物を意味する。生体サンプルはまた、様々環境からの細菌の純粋培養物も意味する場合がある。一般に、細菌培養物は、細菌を平板培養し、増殖させることによって生体サンプルから調製することができる。
【００２１】
増幅反応、一般にＰＣＲ反応は、生体サンプル、本明細書では一般に臨床サンプル中、または細菌の純粋培養物中で核酸をそのまま増幅させるために使用することができ、あるいは増幅反応、一般にＰＣＲ反応は、単離された核酸を増幅させるためにも使用することができる。
【００２２】
本明細書において「プライマー」とは、検出されるポリヌクレオチドに特異的となるように設計されたオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーは、標的ポリヌクレオチド配列と相補的な配列を含んでなるように、または有するように設計することができる。塩基対形成によって標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるフォワードおよびリバースプライマーを設計することができる。本発明の一実施形態では、プライマーは、カルバペネム耐性を引き起こすと思われるカルバペネマーゼ遺伝子を検出するように設計される。本発明の好ましい実施形態では、プライマーは、配列番号１〜４９を含んでなる群から選択される配列を少なくとも部分的に含むかまたはそれを含んでなるかまたは有する。
【００２３】
これらのプライマーは好ましくは１５〜５０ヌクレオチド長、一般に２０〜４０、または２０〜３５ヌクレオチド長である。これらのプライマーのいずれかの一端または両端に、例えば１個、２個または３個の付加的ヌクレオチドを付加してもよい。あるいは、１個、２個または３個のヌクレオチドがこれらのプライマーのいずれかの一端または両端から欠失されていてもよいし、またはいずれかの一端または両端において置換されていてもよい。場合によっては、１個、２個または３個のヌクレオチドが、このプライマーの中央で、すなわち末端部分以外の部分において付加、欠失、または置換されていてもよい。
【００２４】
プライマーが標的核酸配列とハイブリダイズすることができる、標的核酸配列との十分な相補性を有する限り、プライマーの改変（特に、遺伝的改変）または部分的配列が可能である。標的ポリヌクレオチド配列、すなわち、カルバペネム耐性を担う遺伝子であるカルバペネマーゼ(carabapenemase)遺伝子をなお検出することができる改変プライマーまたはプライマーの部分的配列も本発明の範囲内ある。
【００２５】
ハイブリダイゼーション条件は好ましくはストリンジェント条件であり、本明細書においては、５８℃＋／−７℃、好ましくは＋／−３℃でのハイブリダイゼーションを表す。試験は、最適濃度のイオン、例えば、プライマーハイブリダイゼーション（ＰＣＲの場合にはアニーリング）および伸長反応のためにはＭｇ２＋、Ｋ＋およびＮＨ４＋を含有する市販のＰＣＲマスターを用いて実施することができる。例えば、高いＰＣＲ効率に対してＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎの使用量が少ないＭＡＸＩＭＡ  ＳＹＢＲ  ｑＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ。この反応における成分は、１０マイクロリットルのｑＰＣＲマスターミックス、６．８マイクロリットルのオリゴミックス１、または６．４マイクロリットルのオリゴミックス２、および１マイクロリットルのＤＮＡ鋳型である。
【００２６】
耐性は１１０を超える遺伝子によって引き起こされるので、生化学的方法を用いるだけでは、カルバペネム耐性の背景にある遺伝機構を解明することはできない。この耐性機構の知見は、抗生物質感受性アッセイの解釈および患者の治療に用いる薬剤の選択を本質的に改善する。例えば、ＶＩＭなどの広い基質域を有するカルバペネマーゼはβ−ラクタム系抗生物質のin vivo使用を妨げるが、ＩＭＩなどの他の機構は、いくつかのβ−ラクタム処置の選択肢を利用可能なものとして、その余地を残し得る。
【００２７】
本開示は、カルバペネム耐性を担う遺伝子（すなわち、カルバペネマーゼ耐性を引き起こすカルバペネマーゼ遺伝子）を検出するように設計されたプライマーを提供する。これらのプライマーは実験的に試験し、至適化されたものである。本発明の好ましい一実施形態によれば、この同定反応は二つの独立した反応で行われる。これらの反応では、増幅条件は共通に適合するものである。これによりＨＴＰスクリーニン（ハイスループットスクリーニング）が可能となる。
【００２８】
結果として、この方法は、試験コストを最小にすることができる。この方法はまた簡単で使いやすい。さらに、この方法は日常的診断の使用に好適である。
【００２９】
本発明の好ましい実施形態によれば、この試験は、それらのサブバリアント（subvariant）を含む１１０の耐性遺伝子を同定することができる。これは、リアルタイムＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎをもとにした同定に基づく、また、解離温度の決定を伴う、好ましくは二つ（またはそれを超える、好ましくは二つの）マルチプレックス(multiplex)ＰＣＲ反応で行われる。
【００３０】
本発明の好ましい一実施形態によれば、一つの（または第一の）マルチプレックス反応は、腸内細菌科内の９９％を超えるカルバペネマーゼをカバーする。この第一のマルチプレックス反応を使用することで、腸内細菌科に属する大腸菌群桿菌をスクリーニングすることができる。
【００３１】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、もう一つの（第二の）マルチプレックス反応は、特に、免疫抑制患者から多剤耐性細菌をスクリーニングすることを目的とする。一般に、これらはシュードモナス種およびアシネトバクター種に属する細菌である。
【００３２】
さらなる一実施形態によれば、一つ（または第一の）マルチプレックス反応は一般に、メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子Ｂ群、大部分のカルバペネマーゼ遺伝子Ａ群（ペニシリナーゼ遺伝子）およびＤ群に属するＯＸＡ−４８遺伝子（オキサシリナーゼ）を検出する。他方の（または第二の）マルチプレックス反応は一般に、カルバペネマーゼ遺伝子Ｄ群（オキサシリナーゼ遺伝子）、カルバペネマーゼ遺伝子Ｃ群（セファロスポリナーゼ遺伝子）およびＡ群に属するＳＦＣ遺伝子（ペニシリナーゼ）およびＮＭＤ−１を検出する。
【００３３】
本発明の好ましい一実施形態によれば、この方法は、次の工程を含んでなる。
【００３４】
工程１および２  生体サンプルの調製
これは核酸の単離を含み得る。これは一般に煮沸または抽出ロボットにより半自動的に行われる。サンプルはそのまま使用してもよいし、またはそのサンプルから調製された細菌の純粋培養物を使用してもよい。
【００３５】
３．遺伝子増幅
ａ）ポリメラーゼおよびＰＣＲバッファーを含んでなるマスターミックス、
ｂ）ヌクレオシド３リン酸モノマー、
ｃ）これらの反応のためのオリゴヌクレオチドプライマー、
ｄ）サンプル由来の核酸鋳型、
ｅ）増幅とその産物の解離曲線の分析。
これは好ましくはリアルタイムＰＣＲ装置によって行われる。
【００３６】
４．結果の分析
ａ）陽性対照および陰性対照の提供、
ｂ）解離温度は多くの場合この機構の指標となり、その結果は、必要であれば、別の反応においてその産物の配列決定により確認することができ、
ｃ）この試験は臨床種において開示されている本質的に総てのカルバペネマーゼ遺伝子を含んでいるので、陰性結果は高い確率のカルバペネマーゼを持って排除する。
【００３７】
サンプルから単離される核酸および核酸鋳型は好ましくはＤＮＡである。
大部分のサンプルは陰性であるので、このスクリーニング法はその性質において極めて効果的でハイスループットなものである。
【００３８】
本発明の好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマーは、
ＶＩＭ  １−２２、ＩＭＰ  １−２４、ＯＸＡ−４８、ＫＰＣ  １−７、ＧＥＳ  １−１０、ＳＰＭ、ＮＭＣ−Ａ、ＩＭＩ  １−３、ＳＭＥ  １−３、ＧＩＭ−１、およびＳＩＭ−１
を含んでなる群から選択される遺伝子または遺伝子ファミリーまたは遺伝子サブバリアントの検出のために設計される。
【００３９】
さらに好ましい実施形態によれば、遺伝子または遺伝子ファミリーのそれぞれの少なくとも一つが一反応で検出される。さらにより好ましい実施形態では、２以上の遺伝子もしくは遺伝子ファミリー、または２以上の遺伝子サブバリアント、または総ての遺伝子もしくは遺伝子ファミリーもしくは遺伝子サブバリアントが一つの反応で検出される。
【００４０】
本発明の別の好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマーは、
ＯＸＡ−２４−２５、２６、−４０、−７２、ＯＸＡ−２３、−２７、ＯＸＡ−５０、ＯＸＡ−５１、６４−６６、６８−７１、７５−７８、８３、８４、８６−８９、−９２、−９４、−９５、ＯＸＡ−５５、ＯＸＡ−５８、ＯＸＡ−６０、ＯＸＡ−６２、ＳＦＣ−１、およびＣＭＹ−１、−１０
を含んでなる群から選択される遺伝子または遺伝子ファミリーまたはそれらのサブバリアントの検出のために設計される。
【００４１】
さらに好ましい実施形態によれば、遺伝子または遺伝子ファミリーのそれぞれの少なくとも一つが一反応で検出される。さらにより好ましい実施形態においては、２以上の遺伝子もしくは遺伝子ファミリー、または２以上の遺伝子サブバリアント、または総ての遺伝子もしくは遺伝子ファミリーもしくは遺伝子サブバリアントが一反応で検出される。
【００４２】
本発明のさらなる好ましい実施形態では、各ＯＸＡ遺伝子または遺伝子ファミリーのそれぞれの少なくとも一つが一反応で検出され、より好ましくは、２以上の遺伝子もしくは遺伝子ファミリー、または２以上のサブバリアント、または総てのＯＸＡ遺伝子もしくは遺伝子ファミリーもしくはサブバリアントが一反応で検出される。
【００４３】
本発明のさらなる好ましい一実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマーは、
ＯＸＡ−４８、ＳＭＥ、ＧＩＭ−１、ＶＩＭ  １−２２、ＳＰＭ、ＧＥＳ  １−１０、ＫＰＣ  １−７、ＩＭＩ  １−３／ＮＭＣ−Ａ、ＩＭＰ  １−２４
を含んでなる群から選択される遺伝子または遺伝子ファミリーまたはそれらのサブバリアントの検出のために設計される。
【００４４】
さらに好ましい実施形態によれば、遺伝子または遺伝子ファミリーのそれぞれの少なくとも一つが一反応で検出される。さらにより好ましい実施形態では、２以上の遺伝子もしくは遺伝子ファミリー、または２以上の遺伝子サブバリアント、または総ての遺伝子もしくは遺伝子ファミリーもしくは遺伝子サブバリアントが一反応で検出される。
【００４５】
本発明の他のさらなる好ましい一実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマーは、
ＩＳａｂａｌプロモーターを有するＯＸＡ−２３群、ＯＸＡ−２４群、ＯＸＡ−５１群、ならびにＯＸＡ−５５、ＯＸＡ−５８、ＯＸＡ−６０、ＯＸＡ−６２、ＣＭＹ  １、−１０、−１１、ＳＦＣ−１、ＮＤＭ−１およびＳＩＭ−１
を含んでなる群から選択される遺伝子または遺伝子ファミリーまたはそれらのサブバリアントの検出のために設計される。
【００４６】
さらに好ましい実施形態によれば、遺伝子または遺伝子ファミリーのそれぞれの少なくとも一つが一つの反応により検出される。さらにより好ましい実施形態では、２以上の遺伝子もしくは遺伝子ファミリー、または２以上の遺伝子サブバリアント、または総ての遺伝子もしくは遺伝子ファミリーもしくは遺伝子サブバリアントが一反応で検出される。
【００４７】
ＮＤＭ−１は、インドおよびパキスタン由来の新たなメタロ−β−ラクタマーゼ（ＭＢＬ）であり、他のＭＢＬとの同一性は極めて低く、最も類似性の高いＭＢＬはＶＩＭ−１／ＶＩＭ−２であるが、それが持つ同一性は３２．４％に過ぎない。ＮＤＭ−１は、アズトレオナムを除く総てのβ−ラクタムを加水分解することができる。ＶＩＭ−２に比べて、ＮＤＭ−１は、ほとんどのセファロスポリン、特に、セフロキシム、セホタキシムおよびセファロチンと、また、ペニシリンとも強固な結合を示す。ＮＤＭ−１はin vivoで他の細菌種と接合することができ、この接合は接合完了体プラスミドによって媒介される。
【００４８】
生体サンプルにおけるカルバペネマーゼ耐性の最も確度の高い結果は多くのカルバペネマーゼ遺伝子の存在を調べることによって得ることができるが、検出すべき最も重要な遺伝子（または遺伝子ファミリーまたは遺伝子サブバリアント）は、ＫＰＣ  １−７、ＯＸＡ−４８、ＶＩＭ  １−２２、ＧＥＳ  １−１０および／またはＩＭＰ１−２４を含んでなる群から選択される。検出に最も重要なのはＫＰＣ  １−７であり、２番目に最も重要なのはＯＸＡ−４８および／またはＶＩＭ  １−２２であり、３番目に重要なのはＧＥＳ  １−１０であり、４番目に重要なのはＩＭＰ１−２４である。
【００４９】
さらに、検出に重要なのはまた、遺伝子（または遺伝子ファミリーまたは遺伝子サブバリアント）ＳＭＥ  １−３、ＧＩＭ−１、ＳＰＭ、および／またはＩＭＩ  １−３／ＮＭＣ−Ａである。
【００５０】
また、検出に重要なのは、遺伝子（または遺伝子ファミリーまたは遺伝子サブバリアント）ＩＳａｂａｌプロモーターを有するＯＸＡ−２３群、ＯＸＡ−２４群、ならびにＯＸＡ−５１群ならびにＯＸＡ−５８および／またはＮＤＭ−１である。さらに、検出に重要なのはまた、ＣＭＹ−１、−１０、−１１、ＳＦＣ−１および／またはＳＩＭ−１遺伝子（または遺伝子ファミリーまたは遺伝子サブバリアント）である。また、ＯＸＡ−５５、ＯＸＡ−６０および／またはＯＸＡ−６２遺伝子（または遺伝子ファミリーまたは遺伝子サブバリアント）も検出可能である。
【００５１】
しかしながら、どの遺伝子が検出に重要なのかは、地理的地域、すなわち、その地理的地域におけるある特定の耐性遺伝子および／または細菌の分布にもよる。
【００５２】
上述の遺伝子は総て文献に記載されている。この試験は、陽性対照株に加え、２５０を超える臨床ＥＳＢＬ株、５０を超える多剤耐性アシネトバクター株およびシュードモナス株、および最も重要な臨床好気性桿菌を包含する約６０の他の陰性対照株（特異性）でもバリデーションを行った。
【００５３】
本発明の一つの実施形態においては、オリゴヌクレオチドは好ましくは次の配列を有するかまたは含む。
【表１】
0006054178.tif 000002
【００５４】
オリゴヌクレオチドは、次の標的遺伝子が好ましくは次のオリゴヌクレオチドで検出されること以外は、上記に示されたような配列を有するかまたは含む。
【表２】
0006054178.tif 000003
【００５５】
本発明の好ましい一つの実施形態では、次の遺伝子、遺伝子ファミリーまたは遺伝子サブバリアント：ＯＸＡ−４８、ＳＭＥ  １−３、ＧＩＭ−１、ＶＩＭ  １−２２、ＳＰＭ、ＧＥＳ  １−１０、ＫＰＣ  １−７、ＩＭＩ  １−３／ＮＭＣ−Ａ、Ｉおよび／またはＩＭＰ  １−２４は、一反応（第一の反応）において検出することができる。
【００５６】
好ましくは、もう一つの（第二の）反応は、次の遺伝子、遺伝子ファミリーまたは遺伝子サブバリアント：ＩＳａｂａｌプロモーターを有するＯＸＡ−２３群、ＯＸＡ−２４群、ＯＸＡ−５１群、ならびにＯＸＡ−５５、ＯＸＡ−５８、ＯＸＡ−６０、ＯＸＡ−６２、ＣＭＹ−１、−１０、−１１、ＳＦＣ−１、ＮＤＭ−１、および／またはＳＩＭ−１を検出することができる。
【００５７】
ＯＸＡ−２３群はＯＸＡ−２３とＯＸＡ−２７の双方を検出することができる。ＯＸＡ−５１は、ＩＳＡｂａｌ−ＯＸＡ−５１連結部位で置換されている。ＯＸＡ−５１は総てのアシネトバクター・バウマニー(Acinetobacter baumannii)細菌に見出すことができ、遺伝子の読み取りを増強する遺伝子領域ＩＳＡｂａｌと連結された場合、臨床上重要である。ＯＸＡ−２４向けに設計されたプライマーは、ＯＸＡ−２４、−２５、−２６、−４０および−７２を検出することができる。
マルチプレックス反応における反応条件は同じである。
【００５８】
本発明の好ましい実施形態では、増幅反応は、典型的な二段階の遺伝子増幅およびアニーリング／伸張工程でのリアルタイム検出、およびその後の解離温度の分析を含んでなるＰＣＲプログラムを使用することにより、ＰＣＲ反応として行われる。この装置は好ましくはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＭｘＰｒｏ  ３００５Ｐである。
【００５９】
【表３】
0006054178.tif 000004
【００６０】
また、ＰＣＲ条件が若干改変されている実施形態も本発明の範囲内にある。工程１〜８で温度を１℃、２℃もしくは３℃上昇させる条件、あるいは工程１で反応工程の時間を１〜５分もしくは１〜３分、または工程２〜８で１〜３秒短縮または延長する条件は当業者の範囲内である。
【００６１】
反応混合物中のオリゴヌクレオチドプライマーの量は等量であってもよいし、あるいは各オリゴヌクレオチドの量を反応に最適となるように選択することもできる。
【００６２】
生体サンプル中の標的核酸配列の増幅はリアルタイムでモニタリングするが、この方法は、一定量のＳＹＢＲ．ＴＭ．  Ｇｒｅｅｎ  Ｉの存在下でのポリメラーゼ連鎖反応によって標的配列を増幅させる工程（このポリメラーゼ連鎖反応はＳＹＢＲ．ＴＭ．  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、熱安定性ポリメラーゼおよび標的核酸配列に対するプライマーを生体サンプルに加えて増幅混合物を作出する工程、およびこの増幅混合物を少なくとも変性温度と伸長温度の間で複数回の増幅周期で温度周期に曝す工程を含んでなる）、複数回の増幅周期の少なくとも一部において、その混合物にＳＹＢＲ．ＴＭ．  Ｇｒｅｅｎ  Ｉによって吸収される波長の光を照射する工程、およびサンプル照射後にＳＹＢＲ．ＴＭ．  Ｇｒｅｅｎ  Ｉからの蛍光放出を検出する工程（該蛍光放出はそのサンプル中の増幅された標的核酸の量と相関している）を含んでなる。温度を上昇させつつサンプルを照射し、蛍光を検出して、融解曲線を作成する。
【００６３】
リアルタイムで標的核酸配列の増幅をモニタリングするのに好適な方法は例えば米国特許第６，５６９，６２７号公報に記載されている。
【００６４】
本発明は、多くの利点を有する。病院の衛生および継続管理を脅かす株を迅速に同定することが可能となる。これは一つには、生化学的方法を用いるだけでも可能となる。分子生物学的方法を単独で用いるかまたは生化学的方法と併用すれば、従来技術が著しく改良される。
【００６５】
遺伝機構の明確かつ正確な知見は、最適な抗生物質の選択を含む適切な処置を使用することを可能とする(Poirel L et al, Future Microbiol. 2007, 2(5), 501-512)。
【００６６】
特に、リアルタイム−ＰＣＲは、使用が容易で、コンタミネーションのリスクが小さい（閉系）ので、臨床診断ルーチンに技術的に非常に適している。
【００６７】
本発明の好ましい実施形態では、標識されたプローブは必要なく、ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎまたはＥＶＡ  Ｇｒｅｅｎ化学が好ましい。
【００６８】
実施例に記載されているように、この新規なハイスループットスクリーニングアッセイを使用することにより、ＩＭＩ−２遺伝子を保有するＥ．クロアカエ(E.cloacae)が同定された。ＩＭＩ−２遺伝子を保有するE. cloaceaは過去に中国で一度だけ明確に報告された。
【００６９】
生化学的方法は、カルバペネム耐性機構を同定するには不十分であると考えられていた(Giskeら、2009)。本発明は、その好ましい実施形態において、特に、腸内細菌科、アシネトバクター種およびシュードモナス種で、臨床上重要なカルバペネム耐性遺伝子（カルバペネマーゼ遺伝子）のスクリーニングのためのリアルタイムマルチプレックスＰＣＲに基づく同定方法を提供する。
【００７０】
次の符番された各段落で本発明の１以上の例示的変形形態を簡潔に定義する。
１．生体サンプルにおいてカルバペネマーゼ遺伝子を検出する方法であって、下記工程を含んでなる方法：
生体サンプル由来の核酸鋳型と、プライマー（該プライマーは１５〜５０ヌクレオチド長であり、かつ、配列番号１〜４９を含んでなる群から選択されるヌクレオチド配列を少なくとも部分的に有するかまたはそれらを含んでなる）との存在下で増幅反応を行う工程、
それらの産物の解離曲線を分析する工程、および
その生体サンプルがカルバペネム耐性を引き起こすカルバペネマーゼ遺伝子を含んでなることを示す、耐性を引き起こすカルバペネマーゼ遺伝子の証拠であるポリヌクレオチドの存在を判定する工程。
【００７１】
２．生体サンプル由来の核酸鋳型、ポリメラーゼ酵素およびＰＣＲバッファー、ヌクレオシド３リン酸モノマーとＰＣＲプライマーの混合物の存在下で、ポリメラーゼ連鎖反応として増幅を行うことを含んでなる、パラグラフ１に記載の方法。
【００７２】
３．反応の産物が配列決定されることを含んでなる、パラグラフ１または２に記載の方法。
【００７３】
４．配列番号１または４９を含んでなる第一のオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号２の第二のオリゴヌクレオチドプライマー、
配列番号３を含んでなる第一のオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号４を含んでなる第二のオリゴヌクレオチドプライマー、
配列番号５を含んでなる第一のオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号６を含んでなる第二のオリゴヌクレオチドプライマー、
配列番号７を含んでなる第一のオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号８を含んでなる第二のオリゴヌクレオチドプライマー、
配列番号９を含んでなる第一のオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号１０を含んでなる第二のオリゴヌクレオチドプライマー、
配列番号１１を含んでなる第一のオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号１２を含んでなる第二のオリゴヌクレオチドプライマー、
配列番号１３を含んでなる第一のオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号１４を含んでなる第二のオリゴヌクレオチドプライマー、
配列番号１５を含んでなる第一のオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号１６を含んでなる第二のオリゴヌクレオチドプライマー、
配列番号１７を含んでなる第一のオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号１８を含んでなる第二のオリゴヌクレオチドプライマー、
配列番号１９を含んでなる第一のオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号２０を含んでなる第二のオリゴヌクレオチドプライマー、
配列番号２１を含んでなる第一のオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号２２を含んでなる第二のオリゴヌクレオチドプライマー、
配列番号２３を含んでなる第一のオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号２４を含んでなる第二のオリゴヌクレオチドプライマー、
配列番号２５を含んでなる第一のオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号２６を含んでなる第二のオリゴヌクレオチドプライマー、
配列番号２７を含んでなる第一のオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号２８を含んでなる第二のオリゴヌクレオチドプライマー、
配列番号２９を含んでなる第一のオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号３０を含んでなる第二のオリゴヌクレオチドプライマー、
配列番号３１を含んでなる第一のオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号３２を含んでなる第二のオリゴヌクレオチドプライマー、
配列番号３３を含んでなる第一のオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号３４を含んでなる第二のオリゴヌクレオチドプライマー、
配列番号３５を含んでなる第一のオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号３６を含んでなる第二のオリゴヌクレオチドプライマー、
配列番号３７を含んでなる第一のオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号３８を含んでなる第二のオリゴヌクレオチドプライマー、
配列番号３９を含んでなる第一のオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号４０を含んでなる第二のオリゴヌクレオチドプライマー、
配列番号４１を含んでなる第一のオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号４２を含んでなる第二のオリゴヌクレオチドプライマー、
配列番号４３を含んでなる第一のオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号４４を含んでなる第二のオリゴヌクレオチドプライマー、
配列番号４５を含んでなる第一のオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号４６を含んでなる第二のオリゴヌクレオチドプライマー、
配列番号４７を含んでなる第一のオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号４８を含んでなる第二のオリゴヌクレオチドプライマー
を含んでなる群から選択されるプライマー対を含んでなる、パラグラフ１〜３のいずれか一つに記載の方法。
【００７４】
５．反応が、好ましくはＳＹＢＲ（商標）Ｇｒｅｅｎ化学同定に基づくリアルタイムＰＣＲによって行われる、パラグラフ１〜４のいずれか一つに記載の方法。
【００７５】
６．反応が、共通の適合増幅条件(commonly compatible amplification condition)を有する二つの独立したマルチプレックス反応で行われる、パラグラフ１〜５のいずれか一つに記載の方法。
【００７６】
７．第一のマルチプレックス反応が
ＫＰＣ  １−７、ＯＸＡ−４８、ＶＩＭ  １−２２、ＧＥＳ  １−１０およびＩＭＰ１−２４
を含んでなる群から選択される１以上の遺伝子または遺伝子ファミリーを一反応内で検出することができる、パラグラフ１〜６のいずれか一つに記載の方法。
【００７７】
８．第一のマルチプレックス反応が、
ＫＰＣ  １−７、ＯＸＡ−４８、ＶＩＭ  １−２２、ＧＥＳ  １−１０、ＩＭＰ  １−２４、ＳＭＥ  １−３、ＧＩＭ−１、ＳＰＭ、ＩＭＩ  １−３／ＮＭＣ−Ａ
を含んでなる群から選択される１以上の遺伝子または遺伝子ファミリーを一反応内で検出することができる、パラグラフ１〜７のいずれか一つに記載の方法。
【００７８】
９．第一のマルチプレックス反応が、
ＶＩＭ  １−２２、ＩＭＰ  １−２４、ＯＸＡ−４８、ＫＰＣ  １−７、ＧＥＳ  １−１０、ＳＰＭ、ＮＭＣ−Ａ、ＩＭＩ  １−２、ＳＭＥ  １−３、ＧＩＭ−１およびＳＩＭ−１
を含んでなる群から選択される１以上の遺伝子または遺伝子ファミリーを一反応内で検出することができる、パラグラフ１〜７のいずれか一つに記載の方法。
【００７９】
１０．第一のマルチプレックス反応が、各遺伝子または遺伝子ファミリーの少なくとも一つを一反応内で検出することができる、パラグラフ７〜９のいずれか一つに記載の方法。
【００８０】
１１．第一のマルチプレックス反応が、総ての遺伝子、遺伝子ファミリーおよび／または遺伝子サブバリアントを一反応内で検出することができる、パラグラフ７〜１０のいずれか一つに記載の方法。
【００８１】
１２．第二のマルチプレックス反応が、
ＯＸＡ−２４、−２５、２６、−４０、−７２、ＯＸＡ−２３、−２７、ＯＸＡ−５０、ＯＸＡ−５１、６４−７１、７５−７８、８３−８９、−９２、−９４、−９５、ＯＸＡ−５５、ＯＸＡ−５８、ＯＸＡ−６０、ＯＸＡ−６２、ＳＦＣ−１およびＣＭＹ−１、−１０、−１１
を含んでなる群から選択される１以上の遺伝子または遺伝子ファミリーを一反応内で検出することができる、パラグラフ１〜１１のいずれか一つに記載の方法。
【００８２】
１３．第二のマルチプレックス反応が、
ＩＳａｂａｌプロモーターを有するＯＸＡ−２３群、ＯＸＡ−２４群、ＯＸＡ−５１群、ならびにＯＸＡ−５８およびＮＤＭ−１
を含んでなる群から選択される１以上の遺伝子または遺伝子ファミリーを検出することができる、パラグラフ１〜１１のいずれか一つに記載の方法。
【００８３】
１４．第二のマルチプレックス反応が、
ＩＳａｂａｌプロモーターを有するＯＸＡ−２３群、ＯＸＡ−２４群、ＯＸＡ−５１群、ならびにＯＸＡ−５５、ＯＸＡ−５８、ＯＸＡ−６０、ＯＸＡ−６２、ＣＭＹ−１、−１０、ＳＦＣ−１、ＮＤＭ−１およびＳＩＭ−１
を含んでなる群から選択される１以上の遺伝子または遺伝子ファミリーを検出することができる、パラグラフ１〜１１のいずれか一つに記載の方法。
【００８４】
１５．第二のマルチプレックス反応が、各遺伝子または遺伝子ファミリーの少なくとも一つを一反応内で検出することができる、パラグラフ１２〜１４のいずれか一つに記載の方法。
【００８５】
１６．第二のマルチプレックス反応が、総ての遺伝子、遺伝子ファミリーおよび／または遺伝子サブバリアントを一反応内で検出することができる、パラグラフ１２〜１５のいずれか一つに記載の方法。
【００８６】
１７．第二のマルチプレックス反応が、各ＯＸＡ遺伝子または遺伝子ファミリーの少なくとも一つを一反応内で、好ましくは総てのＯＸＡ遺伝子、遺伝子ファミリーおよび／または遺伝子サブバリアントを一反応内で検出することができる、パラグラフ１２〜１６のいずれか一つに記載の方法。
【００８７】
１８．細菌においてカルバペネム耐性を引き起こすカルバペネマーゼ遺伝子を同定するための１セットのプライマー対を含んでなるキットであって、該プライマーが１５〜５０ヌクレオチド長であり、かつ、配列番号１〜４９を含んでなる群から選択されるヌクレオチド配列、またはその改変形態を少なくとも部分的に有するかまたはそれらを含んでなる、キット。
【００８８】
１９．配列番号１または４９を含んでなる第一のオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号２を含んでなる第二のオリゴヌクレオチドプライマー、
配列番号３を含んでなる第一のオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号４を含んでなる第二のオリゴヌクレオチドプライマー、
配列番号５を含んでなる第一のオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号６を含んでなる第二のオリゴヌクレオチドプライマー、
配列番号７を含んでなる第一のオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号８を含んでなる第二のオリゴヌクレオチドプライマー、
配列番号９を含んでなる第一のオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号１０を含んでなる第二のオリゴヌクレオチドプライマー、
配列番号１１を含んでなる第一のオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号１２を含んでなる第二のオリゴヌクレオチドプライマー、
配列番号１３を含んでなる第一のオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号１４を含んでなる第二のオリゴヌクレオチドプライマー、
配列番号１５を含んでなる第一のオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号１６を含んでなる第二のオリゴヌクレオチドプライマー、
配列番号１７を含んでなる第一のオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号１８を含んでなる第二のオリゴヌクレオチドプライマー、
配列番号１９を含んでなる第一のオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号２０を含んでなる第二のオリゴヌクレオチドプライマー、
配列番号２１を含んでなる第一のオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号２２を含んでなる第二のオリゴヌクレオチドプライマー、
配列番号２３を含んでなる第一のオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号２４を含んでなる第二のオリゴヌクレオチドプライマー、
配列番号２５を含んでなる第一のオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号２６を含んでなる第二のオリゴヌクレオチドプライマー、
配列番号２７を含んでなる第一のオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号２８を含んでなる第二のオリゴヌクレオチドプライマー、
配列番号２９を含んでなる第一のオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号３０を含んでなる第二のオリゴヌクレオチドプライマー、
配列番号３１を含んでなる第一のオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号３２を含んでなる第二のオリゴヌクレオチドプライマー、
配列番号３３を含んでなる第一のオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号３４を含んでなる第二のオリゴヌクレオチドプライマー、
配列番号３５を含んでなる第一のオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号３６を含んでなる第二のオリゴヌクレオチドプライマー、
配列番号３７を含んでなる第一のオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号３８を含んでなる第二のオリゴヌクレオチドプライマー、
配列番号３９を含んでなる第一のオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号４０を含んでなる第二のオリゴヌクレオチドプライマー、
配列番号４１を含んでなる第一のオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号４２を含んでなる第二のオリゴヌクレオチドプライマー、
配列番号４３を含んでなる第一のオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号４４の第二のオリゴヌクレオチドプライマー、
配列番号４５を含んでなる第一のオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号４６を含んでなる第二のオリゴヌクレオチドプライマー、
配列番号４７を含んでなる第一のオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号４８を含んでなる第二のオリゴヌクレオチドプライマー
を含んでなる群から選択されるプライマー対を含んでなる、パラグラフ１２に記載のキット。
【００８９】
１４．ＫＰＣ  １−７、ＯＸＡ−４８、ＶＩＭ  １−２２、ＧＥＳ  １−１０およびＩＭＰ１−２４
を含んでなる群から選択される１以上の遺伝子または遺伝子ファミリーまたは遺伝子サブバリアントを一反応内で同定するためのプライマー対を含んでなる、パラグラフ１２または１３に記載のキット。
【００９０】
１５．ＫＰＣ  １−７、ＯＸＡ−４８、ＶＩＭ  １−２２、ＧＥＳ  １−１０、ＩＭＰ  １−２４、ＳＭＥ  １−３、ＧＩＭ−１  、ＳＰＭ、ＩＭＩ  １−３／ＮＭＣ−Ａ
を含んでなる群から選択される１以上の遺伝子または遺伝子ファミリーまたは遺伝子サブバリアントを一反応内で同定するためのプライマー対を含んでなる、パラグラフ１２〜１４のいずれか一つに記載のキット。
【００９１】
１６．ＶＩＭ  １−２２、ＩＭＰ  １−２４、ＯＸＡ−４８、ＫＰＣ  １−７、ＧＥＳ  １−１０、ＳＰＭ、ＮＭＣ−Ａ、ＩＭＩ  １−２、ＳＭＥ  １−３、ＧＩＭ−１およびＳＩＭ−１
を含んでなる群から選択される１以上の遺伝子または遺伝子ファミリーまたは遺伝子サブバリアントを一反応内で同定するためのプライマー対を含んでなる、パラグラフ１２〜１４のいずれか一つに記載のキット。
【００９２】
１７．各遺伝子または遺伝子ファミリーの少なくとも一つを一反応内で検出することができる第一のマルチプレックス反応のためのプライマー対を含んでなる、パラグラフ１２〜１６のいずれか一つに記載のキット。
【００９３】
１８．総ての遺伝子、遺伝子ファミリーおよび／または遺伝子サブバリアントを一反応内で検出することができる第一のマルチプレックス反応のためのプライマー対を含んでなる、パラグラフ１２〜１７のいずれか一つに記載のキット。
【００９４】
１９．第二のマルチプレックス反応が、
ＯＸＡ−２４、−２５、２６、−４０、−７２、ＯＸＡ−２３、−２７、ＯＸＡ−５０、ＯＸＡ−５１  、６４−７１、７５−７８、８３−８９、−９２、−９４、−９５、ＯＸＡ−５５、ＯＸＡ−５８、ＯＸＡ−６０、ＯＸＡ−６２、ＳＦＣ−１およびＣＭＹ−１、−１０、−１１
を含んでなる群から選択される１以上の遺伝子または遺伝子ファミリーまたは遺伝子サブバリアントを一反応内で検出することができる、パラグラフ１２〜１８のいずれか一つに記載のキット。
【００９５】
２０．第二のマルチプレックス反応が、
ＩＳａｂａｌプロモーターを有するＯＸＡ−２３群、ＯＸＡ−２４群、ＯＸＡ−５１群、ならびにＯＸＡ−５８、およびＮＤＭ−１
を含んでなる群から選択される１以上の遺伝子または遺伝子ファミリーまたは遺伝子サブバリアントを一反応内で検出することができる、パラグラフ１２〜１８のいずれか一つに記載のキット。
【００９６】
２１．第二のマルチプレックス反応が、
ＩＳａｂａｌプロモーターを有するＯＸＡ−２３群、ＯＸＡ−２４群、ＯＸＡ−５１群、ならびにＯＸＡ−５５、ＯＸＡ−５８、ＯＸＡ−６０、ＯＸＡ−６２、ＣＭＹ−１、−１０、ＳＦＣ−１、ＮＤＭ−１およびＳＩＭ−１
を含んでなる群から選択される１以上の遺伝子または遺伝子ファミリーまたは遺伝子サブバリアントを検出することができる、パラグラフ１２〜２０のいずれか一つに記載のキット。
【００９７】
２２．各遺伝子または遺伝子ファミリーの少なくとも一つを一反応内で検出することができる第二のマルチプレックス反応のためのプライマー対を含んでなる、パラグラフ１２〜２１のいずれか一つに記載のキット。
【００９８】
２３．総ての遺伝子、遺伝子ファミリーおよび／または遺伝子サブバリアントを一反応内で検出することができる第二のマルチプレックス反応のためのプライマー対を含んでなる、パラグラフ１２〜２２のいずれか一つに記載のキット。
【００９９】
２４．各ＯＸＡ遺伝子または遺伝子ファミリーの少なくとも一つを一反応内で、好ましくは総てのＯＸＡ遺伝子、遺伝子ファミリーおよび／または遺伝子サブバリアントを一反応内で検出することができる第二のマルチプレックス反応のためのプライマー対を含んでなる、パラグラフ１２〜２３のいずれか一つに記載のキット。
【０１００】
２５．オリゴヌクレオチドが、配列番号１〜４９を含んでなる群から選択されるヌクレオチド配列、またはその改変形態を少なくとも部分的に有するかまたはそれらを含んでなる、カルバペネム耐性遺伝子を同定するためのオリゴヌクレオチドプライマー。
【０１０１】
２６．配列番号１〜４９を含んでなる群から選択されるオリゴヌクレオチド。
【０１０２】
２７．第一および第二のマルチプレックス反応を含んでなり、第一のマルチプレックス反応において、
ＫＰＣ  １−７、ＯＸＡ−４８、ＳＭＥ  １−３、ＧＩＭ−１、ＶＩＭ  １−２２、ＳＰＭ、ＧＥＳ  １−１０、ＩＭＰ  １−２４、ＮＭＣ−Ａ／ＩＭＩ  １−２およびＳＩＭ−１、または
ＫＰＣ  １−７、ＯＸＡ−４８、ＳＭＥ、ＧＩＭ−１、ＶＩＭ  １−２２、ＳＰＭ、ＧＥＳ  １−１０、ＩＭＰ  １−２４、およびＩＭＩ  １−３／ＮＭＣ−Ａ
を含んでなる群から選択される１以上のまたは総ての遺伝子または遺伝子ファミリーおよび／または遺伝子サブバリアントが検出され、かつ、第二のマルチプレックス反応において、
ＯＸＡ−２４、−２５、２６、−４０、−７２、ＯＸＡ−２３、−２７、ＯＸＡ−５０、ＯＸＡ−５１、６４−７１、７５−７８、８３−８９、−９２、−９４、−９５、ＯＸＡ−５５、ＯＸＡ−５８、ＯＸＡ−６０、ＯＸＡ−６２
を含んでなる群から選択される、または
ＩＳａｂａｌプロモーターを有するＯＸＡ−２３群、ＯＸＡ−２４群、ＯＸＡ−５１群、ならびにＯＸＡ−５５、ＯＸＡ−５８、ＯＸＡ−６０、ＯＸＡ−６２、ＮＤＭ−１、およびＳＩＭ−１
を含んでなる群から選択される１以上のまたは総ての遺伝子または遺伝子ファミリーおよび／またはサブバリアントが検出される、カルバペネマーゼ遺伝子を同定するための構成。
【０１０３】
２８．第二のマルチプレックス反応において、ＳＦＣ−１、ＣＭＹ−１、−１０、−１１の１以上のまたは総ての遺伝子または遺伝子ファミリーまたはサブバリアントがさらに検出される、パラグラフ２７に記載の構成。
【０１０４】
２９．生体サンプルにおいてカルバペネマーゼ遺伝子を検出する方法であって、
生体サンプル由来の核酸鋳型とプライマー（該プライマーは１５〜５０ヌクレオチド長であり、かつ、配列番号１５と１６、１、４９、２、９、１０、１３、１４、１９、２０、２１、２２を含んでなる群から選択されるヌクレオチド配列、または該配列の改変配列を少なくとも部分的に有するかまたはそれらを含んでなる）の存在下で増幅反応を行う工程：
これらの産物の解離曲線を分析する工程、および
その生体サンプルが細菌においてカルバペネマーゼ耐性を引き起こすカルバペネマーゼ遺伝子を含んでなることを示す、カルバペネム耐性を担うＫＰＣ、ＯＸＡ−４８、ＶＩＭ、ＧＥＳ、および／またはＩＭＰ遺伝子またはそれらのサブバリアントの存在を判定する工程
を含んでなる、方法。
【０１０５】
３０．前記プライマー配列が標的ポリヌクレオチド配列であるカルバペネマーゼ遺伝子を検出することができる、パラグラフ２９に記載の方法。
【０１０６】
３１．１５〜５０ヌクレオチド長であり、かつ、配列番号３、４、５、６、７、８、１１、１２、１７、および１８を含んでなる群から選択されるヌクレオチド配列、またはその改変形態を少なくとも部分的に有するかまたはそれらを含んでなる、ＳＭＥ、ＧＩＭ−１、ＳＩＭ−１、ＳＰＭ、ＮＭＣ−Ａおよび／またはＩＭＩ遺伝子またはそれらのサブバリアントの存在を判定するためのプライマーをさらに含んでなる、パラグラフ２９または３０に記載の方法。
【０１０７】
３２．１５〜５０ヌクレオチド長であり、かつ、配列番号３、４、５、６、１１、１２、１７、および１８を含んでなる群から選択されるヌクレオチド配列、またはその改変形態を少なくとも部分的に有するかまたはそれらを含んでなる、ＳＭＥ、ＧＩＭ−１、ＳＰＭ、および／またはＩＭＩ／ＮＭＣ−Ａの存在を判定するためのプライマーをさらに含んでなる、パラグラフ２９〜３０のいずれか一つに記載の方法。
【０１０８】
３３．１５〜５０ヌクレオチド長であり、かつ、配列番号２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３および３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、および４２を含んでなる群から選択されるヌクレオチド配列、またはその改変形態を少なくとも部分的に有するかまたはそれらを含んでなる、ＯＸＡ−２４、２５、２６、−４０、−７２、ＯＸＡ−２３、−２７、ＯＸＡ−５０、ＯＸＡ−５１、６４−７１、７５−７８、８３、８４、８６−８９、−９２、−９４、−９５、ＯＸＡ−５５、ＯＸＡ−５８、ＯＸＡ−６０、ＯＸＡ−６２、ＳＦＣ−１、および／またはＣＭＹ−１、−１０遺伝子またはそれらのサブバリアントの１以上の存在を判定するためのプライマーをさらに含んでなる、パラグラフ２９〜３２のいずれか一つに記載の方法。
【０１０９】
３４．１５〜５０ヌクレオチド長であり、かつ、配列番号２５、２６、４３、４４、４５、４６、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４７、および４８を含んでなる群から選択されるヌクレオチド配列、またはその改変形態を少なくとも部分的に有するかまたはそれらを含んでなる、ＩＳａｂａｌプロモーターを有するＯＸＡ−２３群、ＯＸＡ−２４群、ＯＸＡ−５１群、ならびにＯＸＡ−５５、ＯＸＡ−５８、ＯＸＡ−６０、ＯＸＡ−６２、ＣＭＹ−１、−１０、ＳＦＣ−１、ＮＤＭ−１、および／またはＳＩＭ−１遺伝子またはそれらのサブバリアントの１以上の存在を判定するためのプライマーをさらに含んでなる、パラグラフ２９〜３２のいずれか一つに記載の方法。
【０１１０】
３５．反応が、共通の適合増幅条件を有する二つの独立したマルチプレックス反応で行われる、パラグラフ２９〜３４のいずれか一つに記載の方法。
【０１１１】
３６．カルバペネマーゼ遺伝子を同定するための１セットのプライマー対を含んでなるキットであって、該プライマーが１５〜５０ヌクレオチド長であり、かつ、配列番号１５、１６、１または４９、２、９、１０、１３、１４、１９、２０、２１、および２２を含んでなる群から選択されるヌクレオチド配列、またはその改変形態を少なくとも部分的に有するかまたはそれらを含んでなり、ＫＰＣ、ＯＸＡ−４８、ＶＩＭ、ＧＥＳ、および／またはＩＭＰ遺伝子またはそれらのサブバリアントの存在を判定するためのものである、キット。
【０１１２】
３７．１５〜５０ヌクレオチド長であり、かつ、配列番号３、４、５、６、７、８、１１、１２、１７、および１８を含んでなる群から選択されるヌクレオチド配列、またはその改変形態を少なくとも部分的に有するかまたはそれらを含んでなる、ＳＭＥ、ＧＩＭ−１、ＳＩＭ−１、ＳＰＭ、ＮＭＣ−Ａ、および／またはＩＭＩ遺伝子またはそれらのサブバリアントの存在を判定するためのプライマーをさらに含んでなる、パラグラフ３６に記載のキット。
【０１１３】
３８．１５〜５０ヌクレオチド長であり、かつ、３、４、５、６、１１、１２、１７、および１８を含んでなる群から選択されるヌクレオチド配列、またはその改変形態を少なくとも部分的に有するかまたはそれらを含んでなる、ＳＭＥ、ＧＩＭ−１、ＳＰＭ、および／またはＩＭＩ  １−３／ＮＭＣ−Ａの存在を判定するためのプライマーをさらに含んでなる、パラグラフ３６または３７に記載のキット。
【０１１４】
３９．１５〜５０ヌクレオチド長であり、かつ、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３および３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、および４２を含んでなる群から選択されるヌクレオチド配列、またはその改変形態を少なくとも部分的に有するかまたはそれらを含んでなる、ＯＸＡ−２４、２５、２６、−４０、−７２、ＯＸＡ−２３、−２７、ＯＸＡ−５０、ＯＸＡ−５１、６４−７１、７５−７８、８３、８４、８６−８９、−９２、−９４、−９５、ＯＸＡ−５５、ＯＸＡ−５８、ＯＸＡ−６０、ＯＸＡ−６２、ＳＦＣ−１、および／またはＣＭＹ−１、−１０遺伝子またはそれらのサブバリアントの存在を判定するためのプライマーをさらに含んでなる、パラグラフ３６〜３８のいずれか一つに記載のキット。
【０１１５】
４０．１５〜５０ヌクレオチド長であり、かつ、２５、２６、４３、４４、４５、４６、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４７、および４８を含んでなる群から選択されるヌクレオチド配列、またはその改変形態を少なくとも部分的に有するかまたはそれらを含んでなる、ＩＳａｂａｌプロモーターを有するＯＸＡ−２３群、ＯＸＡ−２４群、ならびにＯＸＡ−５１群、ＯＸＡ−５５、ＯＸＡ−５８、ＯＸＡ−６０、ＯＸＡ−６２、ＣＭＹ−１、−１０、ＳＦＣ−１、ＮＤＭ−１、およびＳＩＭ−１遺伝子またはそれらのサブバリアントの１以上の存在を判定するためのプライマーをさらに含んでなる、パラグラフ３６〜３８のいずれか一つに記載のキット。
【０１１６】
４１．カルバペネマーゼ遺伝子を同定するためのオリゴヌクレオチドであって、配列番号１５、１６、１、４９、２、９、１０、１３、１４、１９、２０、２１、および２２を含んでなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなる、オリゴヌクレオチド。
【０１１７】
４２．第一および第二のマルチプレックス反応を含んでなり、第一のマルチプレックス反応において、ＫＰＣ、ＯＸＡ−４８、ＶＩＭ、ＧＥＳおよび／またはＩＭＰの１以上のまたは総ての遺伝子、遺伝子ファミリーおよび／または遺伝子サブバリアントが一反応内で検出され、該検出が、１５〜５０ヌクレオチド長であり、かつ、配列番号１５、１６、１、２、９、１０、１３、１４、１９、２０、２１、および２２を含んでなる群から選択されるヌクレオチド配列、またはその改変形態を少なくとも部分的に有するかまたはそれらを含んでなるプライマーを使用することによって行われる、カルバペネマーゼ遺伝子を同定するための構成。
【０１１８】
４３．第二のマルチプレックス反応において、ＩＳａｂａｌプロモーターを有するＯＸＡ−２３群、ＯＸＡ−２４群、ＯＸＡ−５１群、ならびにＯＸＡ−５８および／またはＮＤＭ−１の１以上のまたは総ての遺伝子、遺伝子ファミリーおよび／またはサブバリアントが一反応内で検出され、該検出が、１５〜５０ヌクレオチド長であり、かつ、配列番号２４、２５、４３、４４、４５、４６、４７、３３、３４、および４８を含んでなる群から選択されるヌクレオチド配列、またはその改変形態を少なくとも部分的に有するかまたはそれらを含んでなるプライマーを使用することによって行われる、パラグラフ４２に記載の構成。
【０１１９】
参考文献
1. Queenan AM, Bush K. Carbapenemases: the Versatile β-Lactamases, Clinical Microbiology Reviews, 2007 20(3), 440-458.
2. Poirel L, Pitout JD, Nordman P. Carbapenemases: molecular diversity and consequences, Future Microbiol. 2007 2(5), 501-512.
3. Giske CG, Redefining extended-spectrum {beta}-lactamases: balancing science and clinical need. J Antimicrob Chemother. 2009 63(1), 1-4. Epub 2008 Oct 28.
【実施例】
【０１２０】
方法
リアルタイムＰＣＲアッセイの設計は、二つのマルチプレックス反応に分割された。第一のマルチプレックスは、ＶＩＭ  １−２２、ＩＭＰ  １−２４、ＯＸＡ−４８、ＫＰＣ  １−７、ＧＥＳ  １−１０、ＳＰＭ、ＮＭＣ−Ａ、ＩＭＩ  １−２、ＳＭＥ  １−３、ＧＩＭ−１およびＳＩＭ−１遺伝子を検出するように設計された。他方のマルチプレックスは、ＯＸＡ−２４、−２５、２６、−４０、−７２、ＯＸＡ−２３、−２７、ＯＸＡ−５０、ＯＸＡ−５１、６４−７１、７５−７８、８３−８９、−９２、−９４、−９５、ＯＸＡ−５５、ＯＸＡ−５８、ＯＸＡ−６０、およびＯＸＡ−６２を含む、カルバペネマーゼ特性を有するＯＸＡ遺伝子のみに対して設計された。一反応内で多数の遺伝子の検出を可能とするようにＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ化学を選択した。融解曲線分析を用いて陽性サンプルの推定分子機構を予備同定し、参照プライマーを用いて配列決定した。このアッセイをも用いて、推定ＥＳＢＬ株を体系的にスクリーニングした。さらに、このスクリーニングアッセイは、ＮＬＳＩ標準に従ってメロペネム、イミペネムまたはエルタペネムに対する感受性が低下した（メロペネムディスク径＜２３ｍｍ）、またはＭＩＣ（Ｉ／Ｒ）が低下した推定腸内細菌種をスクリーニングするための診断ルーチンの一部である。
【０１２１】
結果
２５０を超える推定ＥＳＢＬ株を体系的にスクリーニングしてカルバペネマーゼ産生株の分布を評価した。対照的に、ＩＭＩ−２遺伝子を保有する高カルバペネム耐性エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)株は、集中治療室の患者から単離された。このＩＭＩ−２陽性株は、メロペネム（ＭＩＣ＞３２）、イミペネム（ＭＩＣ＞３２）およびエルタペネム（ＭＩＣ＞２５６）に対して多高い耐性を有していたが、興味深いことに、第三世代のセファロスポリンまたはトリメトプリム／スルファに対しては耐性でなった。さらに、このアッセイを用い、ＯＸＡ−２３群および／またはＯＸＡ−５１群、またはＶＩＭ−２カルバペネマーゼを保有する３０を超える臨床アシネトバクター単離株の同定にも成功した。
【０１２２】
実施例２
実施例１に記載の方法を繰り返し、第一のマルチプレックス反応において、ＯＸＡ−４８、ＳＭＥ、ＧＩＭ−１、ＶＩＭ、ＳＰＭ、ＧＥＳ、ＫＰＣ、ＩＭＩ  １−３／ＮＭＣ−Ａ、ＩＭＰ−１０、ＩＭＰ−１１を、そして第二のマルチプレックス反応において、ＩＳａｂａｌプロモーターを有するＯＸＡ−２３群、ＯＸＡ−２４群、ＯＸＡ−５１群、ならびにＯＸＡ−５５、ＯＸＡ−５８、ＯＸＡ−６０、ＯＸＡ−６２、ＣＭＹ−１、−１０、ＳＦＣ−１、ＮＤＭ−１およびＳＩＭ−１を検出した。
【０１２３】
これらの試験では、ＫＰＣ遺伝子を有する肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)４株、ＯＸＡ−４８を有する大腸菌１株、ＧＥＳを有する緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)３株、およびＩＭＰ遺伝子を有する緑膿菌／シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)６株が見出された。
【０１２４】
また、ＯＸＡ−２３、ＯＸＡ−２４、ＯＸＡ−５８遺伝子の種々の組合せを有する、５０株を超えるアシネトバクター・バウマニー複合株も見出された。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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