(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
0005930205.tif 000031
［式中、
Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ９は水素原子である、
Ｒ２及びＲ３は、メトキシ基、エトキシ基、又はプロポキシ基である、
Ｒ７は、水素原子；ハロゲン原子；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；非置換の炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基−ＮＯ２である、
Ｒ８は、水素原子；ハロゲン原子；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；又は非置換の炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基である、
又は、Ｒ７およびＲ８は、一緒になって−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−または−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−を形成している、
Ｒ１０−Ｒ１１は、水素原子である、
Ｘは、硫黄原子である、および
ｎは、０から６の整数である］
の化合物またはその塩を含む、多能性幹細胞の心筋分化促進剤。
【請求項２】
ｎが、０から４の整数である、
請求項１の心筋分化促進剤。
【請求項３】
Ｒ７が、ハロゲン原子である、請求項１または２の心筋分化促進剤。
【請求項４】
Ｒ８が、水素原子である、請求項１〜３のいずれかの心筋分化促進剤。
【請求項５】
ｎが、０から４の整数である、
Ｒ７が、ハロゲン原子である、および
Ｒ８が、水素原子である、
請求項１の心筋分化促進剤。
【請求項６】
Ｒ２及びＲ３が、メトキシ基である、請求項１〜５のいずれかの心筋分化促進剤。
【請求項７】
ｎが、１から４の整数である、請求項１〜６のいずれかの心筋分化促進剤。
【請求項８】
ｎが、２または３である、請求項１〜７のいずれかの心筋分化促進剤。
【請求項９】
式（Ｉ）：
【化２】
0005930205.tif 000032
［式中、
Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８、及びＲ９は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基である、
Ｒ２及びＲ３は、炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基である、又はＲ２及びＲ３が、一緒になって−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−または−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−を形成している、
Ｒ７は、基−Ｃ（Ｏ）Ａで置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基（Ａは、非置換又は炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基で置換された飽和または不飽和５または６員環であり、該環は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子から独立に選択される１または２個の原子を含んでいてもよい）である、および
Ｒ１０−Ｒ１１は、各々独立して、水素原子；又は炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基である、
Ｘは、酸素原子；硫黄原子；基−ＮＲ１５（Ｒ１５は、水素原子、炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基、又は炭素数１〜５の直鎖又は分岐アシル基である）である、および
ｎは、０から６の整数である］
の化合物またはその塩を含む、多能性幹細胞の心筋分化促進剤。
【請求項１０】
Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８、及びＲ９が、水素原子である、
Ｒ２及びＲ３が、メトキシ基、エトキシ基、又はプロポキシ基である、
Ｒ１０及びＲ１１が、水素原子である、
Ｘが、硫黄原子である、
Ａが、非置換又は炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基で置換された、ピペリジニル基、ピペラジニル基、又はモルホリニル基である、および
ｎが、０から４の整数である、
請求項９の心筋分化促進剤。
【請求項１１】
以下から選択される化合物またはその塩を含む、多能性幹細胞の心筋分化促進剤。
ＳＯ０８７
【化３】
0005930205.tif 000033
ＫＹ０１０４１
【化４】
0005930205.tif 000034
Ｔ６１１６４
【化５】
0005930205.tif 000035
ＫＹ０２１１１
【化６】
0005930205.tif 000036
ＫＹ０２１１４
【化７】
0005930205.tif 000037
ＫＹ０１０４５
【化８】
0005930205.tif 000038
ＫＹ０１０４０
【化９】
0005930205.tif 000039
ＫＹ０２１０９
【化１０】
0005930205.tif 000040
ＫＹ０１０４２
【化１１】
0005930205.tif 000041
ＫＹ０１０４３
【化１２】
0005930205.tif 000042
ＫＹ０１０４６
【化１３】
0005930205.tif 000043
ＰＢ２８５２
【化１４】
0005930205.tif 000044
Ｎ１１４７４
【化１５】
0005930205.tif 000045
ＰＢ２５７２
【化１６】
0005930205.tif 000046
ＰＢ２５７０
【化１７】
0005930205.tif 000047
ＫＹ０２１０４
【化１８】
0005930205.tif 000048
ＳＯ１０２
【化１９】
0005930205.tif 000049
ＳＯ０９６
【化２０】
0005930205.tif 000050
ＳＯ０９４
【化２１】
0005930205.tif 000051
【請求項１２】
多能性幹細胞が哺乳類である、請求項１〜１１のいずれかの心筋分化促進剤。
【請求項１３】
多能性幹細胞が霊長類である、請求項１２の心筋分化促進剤。
【請求項１４】
別の心筋分化促進因子と併用される、請求項１〜１３のいずれかの心筋分化促進剤。
【請求項１５】
別の心筋分化促進因子が、ニトロビン；bＦＧＦ、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＤＫＫ１、およびアクチビンＡの組み合わせ；またはＷｎｔシグナル阻害剤である、請求項１４の心筋分化促進剤。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれかの心筋分化促進剤を含む、心筋分化促進用キット。
【請求項１７】
さらに別の心筋分化促進因子を含む、請求項１６のキット。
【請求項１８】
請求項１〜１５のいずれかの心筋分化促進剤を含む培地中で多能性幹細胞を培養することを含む、多能性幹細胞を心筋細胞に分化誘導する方法。
【請求項１９】
請求項１〜１５のいずれかの心筋分化促進剤を含む培地中で多能性幹細胞を培養することを含む、多能性幹細胞から心筋細胞を製造する方法。
【請求項２０】
式（Ｉ）：
【化２２】
0005930205.tif 000052
［式中、
Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ９は水素原子である、
Ｒ２及びＲ３は、メトキシ基、エトキシ基、又はプロポキシ基である、
Ｒ７は、ハロゲン原子である、
Ｒ８は、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基である、
Ｒ１０−Ｒ１１は、水素原子である、
Ｘは、酸素原子；硫黄原子；基−ＮＲ１５（Ｒ１５は、水素原子、炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基、又は炭素数１〜５の直鎖又は分岐アシル基である）である、
、および
ｎは、０から６の整数である］
を有する化合物またはその塩、
但し、
（ｉ）Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、およびＲ１１が水素原子であり、Ｒ２およびＲ３がメトキシ基であり、Ｘが硫黄原子であり、かつｎが１のとき、Ｒ７は−ＯＣＨ３、−Ｃｌ、または−ＮＯ２ではない、
（ｉｉ）Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、およびＲ１１が水素原子であり、Ｒ２およびＲ３がメトキシ基であり、Ｘが硫黄原子であり、かつｎが２のとき、Ｒ７は−Ｃｌではない、および
（ｉｉｉ）Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、およびＲ１１が水素原子であり、Ｒ２およびＲ３がメトキシ基であり、Ｘが硫黄原子であり、かつｎが０のとき、Ｒ７は水素原子ではない。
【請求項２１】
Ｘが、硫黄原子である、および
ｎが、０から４の整数である、
請求項２０の化合物またはその塩。
【請求項２２】
Ｒ８が、水素原子である、請求項２０または２１の化合物またはその塩。
【請求項２３】
Ｒ２及びＲ３が、メトキシ基である、請求項２０〜２２のいずれかの化合物またはその塩。
【請求項２４】
ｎが、１から４の整数である、請求項２０〜２３のいずれかの化合物またはその塩。
【請求項２５】
ｎが、２または３である、請求項２０〜２４のいずれかの化合物またはその塩。
【請求項２６】
式（Ｉ）：
【化２３】
0005930205.tif 000053
［式中、
Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８、及びＲ９は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基である、
Ｒ２及びＲ３は、炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基である、又はＲ２及びＲ３が、一緒になって−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−または−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−を形成している、
Ｒ７は、基−Ｃ（Ｏ）Ａで置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基（Ａは、非置換又は炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基で置換された飽和または不飽和５または６員環であり、該環は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子から独立に選択される１または２個の原子を含んでいてもよい）である、および
Ｒ１０−Ｒ１１は、各々独立して、水素原子；又は炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基である、
Ｘは、酸素原子；硫黄原子；基−ＮＲ１５（Ｒ１５は、水素原子、炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基、又は炭素数１〜５の直鎖又は分岐アシル基である）である、
ｎは、０から６の整数である］
を有する化合物またはその塩。
【請求項２７】
Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８、及びＲ９が、水素原子である、
Ｒ２及びＲ３が、メトキシ基、エトキシ基、又はプロポキシ基である、
Ｒ１０及びＲ１１が、水素原子である、
Ｘが、硫黄原子である、
Ａが、非置換又は炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基で置換された、ピペリジニル基、ピペラジニル基、又はモルホリニル基である、および
ｎが、０から４の整数である、
請求項２６の化合物またはその塩。
【請求項２８】
以下：
ＳＯ０８７
【化２４】
0005930205.tif 000054
ＫＹ０２１１４
【化２５】
0005930205.tif 000055
ＳＯ１０２
【化２６】
0005930205.tif 000056
ＳＯ０９６
【化２７】
0005930205.tif 000057
ＳＯ０９４
【化２８】
0005930205.tif 000058
のいずれかの式を有する化合物またはその塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性幹細胞の心筋細胞への分化促進剤、多能性幹細胞を心筋細胞に分化誘導する方法、および多能性幹細胞から心筋細胞を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多能性幹細胞の分化誘導方法は、再生医療の実現やインビトロでの薬効評価試験、あるいは薬剤安全性試験の確立の鍵を握るものである。特に、心疾患は現在日本人の死亡原因の第二位であり、再生医療や心疾患薬効評価については重要である。また心臓に対して心不全や不整脈など重篤な副作用を引き起こす薬物が多いことから、心毒性試験に用いることのできる均一な心筋細胞の供給が求められている。これまで、ヒトＥＳ細胞を心筋細胞へ分化させる手法として、マウス由来の支持細胞であるＥＮＤ２細胞とヒトＥＳ細胞を共培養する方法が報告されている（非特許文献１）。しかしながら、その分化効率は十分ではなく、またマウス由来のＥＮＤ２細胞がヒト心筋細胞に混入しやすいため、純粋なヒト心筋細胞が得られにくいという問題がある。また、他の手法として、ＥＳ細胞から胚様体を形成し、そこに数種類のサイトカイン（維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、骨形態形成タンパク４（ＢＭＰ４）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、Dickkopf-1 （ＤＫＫ１）、アクチビンＡ）を添加し、心筋細胞への分化を誘導する方法も報告されている（非特許文献２、３）。しかしながら、この方法は大量のサイトカインを必要とするためコストがかかる上、その分化効率も十分ではない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Mummery, C., et al., Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes: role of coculture with visceral endoderm-like cells. Circulation. 107(21),  2733-40 (2003).
【非特許文献２】Yang, L., et al., Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature. 453(7194),  524-8 (2008).
【非特許文献３】Leschik, J., et al., Cardiac commitment of primate embryonic stem cells. Nat Protoc. 3(9),  1381-7 (2008).
【０００４】
以上の文献は引用により本明細書に含まれる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
高効率かつ低コストにて均一な心筋細胞を得る方法が、再生医療や創薬の分野において必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、９６００種類のライブラリー化合物について、サルＥＳ細胞から心筋細胞への分化促進効果を検討し、低分子化合物Ｎ１１４７４が心筋分化促進効果を有することを見出した。さらに、Ｎ１１４７４の合成展開によって得られた類縁体ＫＹ０２１１１およびその周辺化合物に心筋分化促進効果が認められることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００７】
本発明は、
式（Ｉ）：
【化１】
0005930205.tif 000002
［式中、
Ｒ１−Ｒ５は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基；基−ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基である）である、ここでＲ１−Ｒ５のうち隣接する２つが一緒になって−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−または−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−を形成していてもよい、
Ｒ６−Ｒ９は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；基−Ｃ（Ｏ）Ａで置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基（Ａは、非置換又は炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基で置換された飽和または不飽和５または６員環であり、該環は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子から独立に選択される１または２個の原子を含んでいてもよい）；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基；基−ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基である）である、ここでＲ６−Ｒ９のうち隣接する２つが一緒になって−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−または−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−を形成していてもよい、
Ｒ１０−Ｒ１１は、各々独立して、水素原子；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基である、
Ｘは、−ＣＲ１４（Ｒ１４は、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基、非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基である）；酸素原子；硫黄原子；セレン原子；基−ＮＲ１５（Ｒ１５は、水素原子、炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基、炭素数１〜５の直鎖又は分岐アシル基である）である、および
ｎは、０から６の整数である］
の化合物またはその塩を含む、多能性幹細胞の心筋分化促進剤を提供する。【０００８】
別の態様において、本発明は、前記心筋分化促進剤を含む培地中で多能性幹細胞を培養することを含む、多能性幹細胞を心筋細胞に分化誘導する方法を提供する。【０００９】
別の態様において、本発明は、前記心筋分化促進剤を含む培地中で多能性幹細胞を培養することを含む、多能性幹細胞から心筋細胞を製造する方法を提供する。【００１０】
別の態様において、本発明は、
式（Ｉ）：
【化２】
0005930205.tif 000003
［式中、
Ｒ１、Ｒ４及びＲ５は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基；基−ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基である）である、
Ｒ２及びＲ３は、炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基である、又はＲ２及びＲ３は、一緒になって−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−または−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−を形成している、
Ｒ６−Ｒ９は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；基−Ｃ（Ｏ）Ａで置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基（Ａは、非置換又は炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基で置換された飽和または不飽和５または６員環であり、該環は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子から独立に選択される１または２個の原子を含んでいてもよい）；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基；基−ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基である）である、ここでＲ６−Ｒ９のうち隣接する２つが一緒になって−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−又は−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−を形成していてもよい、
Ｒ１０−Ｒ１１は、各々独立して、水素原子；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基である、
Ｘは、酸素原子；硫黄原子；基−ＮＲ１５（Ｒ１５は、水素原子、炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基、炭素数１〜５の直鎖又は分岐アシル基である）である、および
ｎは、０から６の整数である、但し、ｎが１又は２のとき、Ｒ７はＣｌ及びメトキシ基ではなく、Ｒ２はメトキシ基ではない］
を有する化合物またはその塩を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、支持細胞を使用することなく、多能性幹細胞を心筋細胞へ分化誘導し、純粋な心筋細胞を得ることが可能となった。また、本発明により、既知の方法と比較して高効率かつ低コストに心筋細胞への分化を誘導し、心筋細胞を製造することが可能となった。本発明は、薬剤安全性試験として重要なＱＴ延長試験をハイスループットスクリーニングで行うため、あるいは心疾患に対する薬効評価に用いる均一かつ成熟したヒト心筋細胞の大量生産や、心臓疾患などに対する移植用心筋細胞の生産に特に有用である。また、本発明の心筋分化促進剤とこれまで報告されていた心筋分化促進因子との間には分子構造の相同性がなく、本発明の心筋分化促進剤は全く新たなタイプの心筋分化促進因子と考えられるため、他の心筋分化促進因子との併用によりさらに分化効率を高めることができると期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】心筋分化促進物質の探索スクリーニング方法。
【図２】スクリーニングシステムとＮ１１４７４の検出。
【図３】ＫＹ０２１１１とその周辺化合物の構造活性相関。
【図４】サイトカイン、Ｇ−ＣＳＦ、ニトロビン、Ｎ１１４７４、ＫＹ０２１１１、およびＫＹ０１０４２の心筋分化促進効果の比較。
【図５−１】心筋分化促進におけるニトロビンとＮ１１４７４の相乗効果。
【図５−２】心筋分化促進におけるニトロビンとＫＹ０２１１１の相乗効果。
【図６】Ｎ１１４７４のヒトＥＳ細胞に対する心筋分化促進効果（ＧＦＰ発現量の増加）。
【図７−１】心筋分化促進効果を有する化合物（１）。
【図７−２】各化合物の心筋分化促進効果。
【図８】遺伝子発現に対するＫＹ０２１１１の効果。
【図９−１】遺伝子発現に対するＷｎｔシグナル阻害剤とＷｎｔシグナル活性化剤の効果（１）。
【図９−２】遺伝子発現に対するＷｎｔシグナル阻害剤とＷｎｔシグナル活性化剤の効果（２）。
【図１０】ＫＹ０２１１１、Ｎ１１４７４、既知のＷｎｔシグナル阻害剤（ＩＷＰ２、ＸＡＶ９３９、ＩＷＲ１）、および心筋分化促進効果が知られるタンパク質（Ｇ−ＣＳＦ、ＩＧＦＢＰ４、Ｄｋｋ１、サイトカイン）の心筋分化促進効果の比較。
【図１１−１】ＫＹ０２１１１、ＸＡＶ９３９、およびＩＷＰ２の心筋分化促進効果に対するＷｎｔシグナル活性化剤の効果（サルＥＳ細胞由来心筋細胞）。
【図１１−２】ＫＹ０２１１１、ＸＡＶ９３９、およびＩＷＰ２の心筋分化促進効果に対するＷｎｔシグナル活性化剤の効果（ヒトｉＰＳ細胞）。
【図１２】心筋分化促進におけるＫＹ０２１１１とＸＡＶ９３９またはＩＷＰ２との相乗効果。
【図１３】心筋分化促進効果を有する化合物（２）および各化合物の心筋分化促進効果。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、
式（Ｉ）：
【化３】
0005930205.tif 000004
［式中、
Ｒ１−Ｒ５は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基−ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基である）である、ここでＲ１−Ｒ５のうち隣接する２つが一緒になって−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−または−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−を形成していてもよい、
Ｒ６−Ｒ９は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；基−Ｃ（Ｏ）Ａで置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基（Ａは、非置換又は炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基で置換された飽和または不飽和５または６員環であり、該環は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子から独立に選択される１または２個の原子を含んでいてもよい）；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基−ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基である）である、ここでＲ６−Ｒ９のうち隣接する２つが一緒になって−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−または−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−を形成していてもよい、
Ｒ１０−Ｒ１１は、各々独立して、水素原子；又は炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基である、
Ｘは、−ＣＲ１４（Ｒ１４は、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基、非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基である）；酸素原子；硫黄原子；セレン原子；又は基−ＮＲ１５（Ｒ１５は、水素原子、炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基、又は炭素数１〜５の直鎖又は分岐アシル基である）である、および
ｎは、０から６の整数である］。
の化合物またはその塩を含む、多能性幹細胞の心筋分化促進剤を提供する。
【００１４】
炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ペンチルオキシ基が挙げられる。
【００１５】
炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基が挙げられる。
【００１６】
炭素数１〜５の直鎖又は分岐アシル基としては、例えば、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、バレリル基、イソバレリル基が挙げられる。
【００１７】
ハロゲン原子としては、Ｃｌ、Ｂｒ、ＩまたはＦが挙げられる。
【００１８】
好ましい態様において、Ｒ１−Ｒ５は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基であり、ここでＲ１−Ｒ５のうち隣接する２つが一緒になって−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−または−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−を形成していてもよい。
【００１９】
Ｒ２及びＲ３は、好ましくは、炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基であるか、又は、一緒になって−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−または−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−を形成している。さらに好ましくは、Ｒ２及びＲ３は、メトキシ基、エトキシ基、又はプロポキシ基であり、最も好ましくはメトキシ基又はエトキシ基である。
【００２０】
Ｒ１、Ｒ４及びＲ５は、好ましくは、水素原子である。
【００２１】
ある態様において、Ｒ６−Ｒ９は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基−ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖または分岐のアルキル基である）であり、ここでＲ６−Ｒ９のうち隣接する２つが一緒になって−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−または−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−を形成していてもよい。
【００２２】
Ｒ６及びＲ９は、好ましくは、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基であり、より好ましくは、水素原子である。
【００２３】
好ましい態様において、Ｒ７は、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；基−Ｃ（Ｏ）Ａで置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基（Ａは、非置換又は炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基で置換された飽和または不飽和５または６員環であり、該環は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子から独立に選択される１または２個の原子を含んでいてもよい）；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基−ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基である）であって、Ｒ８は、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基であるか、又は、Ｒ７及びＲ８は、一緒になって−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−または−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−を形成している。
【００２４】
ある態様において、Ｒ７は、基−Ｃ（Ｏ）Ａで置換された炭素数１〜５の直鎖アルコキシ基であり、基−Ｃ（Ｏ）Ａは前記アルコキシ基の末端の炭素原子に結合している。
【００２５】
好ましい態様において、Ａは窒素原子を少なくとも１つ含み、そのようなＡとしては、非置換又は炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基で置換された、ピロリジニル、イミダゾリジニル、ピラゾリジニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、ピペリジニル、ピペラジニル、モルホリニル、ピリジル、ピリミジニル、ピラジニル、及びピリダジニル基が例示される。より好ましい態様において、Ａは、非置換又は炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基で置換された、ピペリジニル基、ピペラジニル基、又はモルホリニル基である。さらに好ましい態様において、Ａは、非置換又は炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基で置換された、ピペリジン−１−イル基、ピペラジン−１−イル基、又はモルホリン−４−イル基である。
【００２６】
Ｒ１０及びＲ１１は、好ましくは、水素原子である。
【００２７】
好ましい態様において、Ｘは、酸素原子；硫黄原子；基−ＮＲ１５（Ｒ１５は、水素原子、炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基、炭素数１〜５の直鎖又は分岐アシル基である）である。Ｘは、好ましくは、硫黄原子である。
【００２８】
好ましい態様において、ｎは、０から４の整数である。別の好ましい態様において、ｎは、１から６の整数、１から４の整数、又は２若しくは３である。
【００２９】
好ましい態様において、本発明の心筋分化促進剤は、以下から選択される化合物またはその塩を含む：
ＫＹ０１０４１
【化４】
0005930205.tif 000005
Ｔ６１１６４
【化５】
0005930205.tif 000006
ＫＹ０２１１１
【化６】
0005930205.tif 000007
ＫＹ０２１１４
【化７】
0005930205.tif 000008
ＫＹ０１０４５
【化８】
0005930205.tif 000009
ＫＹ０１０４０
【化９】
0005930205.tif 000010
ＫＹ０２１０９
【化１０】
0005930205.tif 000011
ＫＹ０１０４２
【化１１】
0005930205.tif 000012
ＫＹ０１０４３
【化１２】
0005930205.tif 000013
ＫＹ０１０４６
【化１３】
0005930205.tif 000014
ＰＢ２８５２
【化１４】
0005930205.tif 000015
Ｎ１１４７４
【化１５】
0005930205.tif 000016
ＰＢ２５７２
【化１６】
0005930205.tif 000017
ＰＢ２５７０
【化１７】
0005930205.tif 000018
ＫＹ０２１０４
【化１８】
0005930205.tif 000019
ＳＯ０８７
【化１９】
0005930205.tif 000020
ＳＯ１０２
【化２０】
0005930205.tif 000021
ＳＯ０９６
【化２１】
0005930205.tif 000022
ＳＯ０９４
【化２２】
0005930205.tif 000023
【００３０】
本発明の化合物は、例えば、J. Med. Chem., 1965, 8 (5), pp 734-735（引用により本明細書に含まれる）に記載されている（Ｎ１１４７４、Ｔ６１１６４)。また、UkrOrgSynthesis社（ＰＢ２８５２、ＰＢ２５７２、ＰＢ２５７０）やENAMINE社（Ｔ６１１６４）などから入手可能である。
【００３１】
本発明の化合物は、公知の方法（J. Med. Chem., 1965, 8 (5), pp 734-735）（引用により本明細書に含まれる）により、あるいは実施例に記載の方法に準じて、合成することができる。
【００３２】
本発明において「多能性幹細胞」とは、成体を構成する全ての細胞に分化することができる多分化能（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）と、細胞分裂を経てもその多分化能を維持することができる自己複製能を有する細胞を意味する。「多能性幹細胞」には、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）が含まれる。「多能性幹細胞」の生物種は特に限定はされないが、好ましくは哺乳類であり、より好ましくは齧歯類または霊長類である。本発明は、サルまたはヒト多能性幹細胞に特に好適である。
【００３３】
ＥＳ細胞は、初期胚に由来する多能性幹細胞であり、胚盤胞の内部細胞塊または着床後の初期胚のエピブラストから樹立することができる。ＥＳ細胞としては、ヒト（Thomson J. A. et al., Science 282: 1145-1147 (1998) 、Biochem Biophys Res Commun. 345(3),  926-32 (2006)；アカゲザルおよびマーモセット等の霊長類（Thomson J. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7844-7848 (1995）；Thomson J. A. et al., Biol. Reprod. 55: 254-259 (1996)）；ウサギ（特表２０００−５０８９１９号）；ハムスター（Doetshman T. et al., Dev. Biol. 127: 224-227 (1988)）、ブタ（Evans M. J. et al., Theriogenology 33: 125128 (1990); Piedrahita J.A. et al., Theriogenology 34: 879-891 (1990); Notarianni E. et al., J. Reprod. Fert. 40: 51-56 (1990); Talbot N. C. et al., Cell. Dev. Biol. 29A: 546-554 (1993)）、ヒツジ（Notarianni E. et al., J. Reprod. Fert. Suppl. 43: 255-260 (1991)）、ウシ（Evans M. J. et al., Theriogenology 33: 125-128 (1990); Saito S. et al., Roux. Arch. Dev. Biol. 201: 134-141 (1992)）、ミンク（Sukoyan M. A. et al., Mol. Reorod. Dev. 33: 418-431 (1993)） などのＥＳ細胞が挙げられる（これら文献は引用により本明細書に含まれる）。
【００３４】
ＥＧ細胞は、始原生殖細胞に由来する多能性幹細胞であり、例えば、ヒトＥＧ細胞（Shamblott, et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 95: 13726-13731 (1998) （引用により本明細書に含まれる）が挙げられる。
【００３５】
本発明において「ｉＰＳ細胞」とは、体細胞や組織幹細胞などの多能性幹細胞以外の細胞から誘導された多能性幹細胞を意味する。ｉＰＳ細胞の作製方法は、例えば、ＷＯ２００７／０６９６６６、ＷＯ２００９／００６９３０、ＷＯ２００９／００６９９７、ＷＯ２００９／００７８５２、ＷＯ２００８／１１８８２０、Cell Stem Cell 3(5): 568-574 (2008) 、Cell Stem Cell 4(5): 381-384 (2009)、Nature 454: 646-650 (2008) 、Cell 136(3) :411-419 (2009) 、Nature Biotechnology 26: 1269-1275 (2008) 、Cell Stem Cell 3: 475-479 (2008) 、Nature Cell Biology 11: 197-203 (2009) 、Cell 133(2): 250-264 (2008)、Cell 131(5): 861-72 (2007)、Science 318 (5858): 1917-20 (2007)（これら文献は引用により本明細書に含まれる）に記載される。しかしながら、人工的に誘導された多能性幹細胞であれば、いかなる方法で作製された細胞も本発明の「ｉＰＳ細胞」に含まれる。
【００３６】
本発明の心筋分化促進剤は、多能性幹細胞の心筋分化培地に、活性成分の最終濃度が例えば０.５〜２０μＭとなるよう添加される。心筋分化培地は、一般的に多能性幹細胞の心筋分化に使用される組成であればよく、特に限定はされないが、例えばＩＭＤＭ培地を基本とした心筋分化培地(実施例で使用している下記の組成のもの)、ＤＭＥＭを基本とした心筋分化培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Sigma）２００ｍｌ、ウシ胎児血清（GIBCO）５０ｍｌ、MEM non-essential amino acid solution （Sigma）２．５ｍｌ、ペニシリン−ストレプトマイシン（GIBCO）２．５ｍｌ、２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン  ２．５ｍｌ、２−メルカプトエタノール）、またはStemPro-34SFM（GIBCO）＋ＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍｌ）のような培地が例示される。本発明の分化促進剤を使用する場合、ＥＮＤ２細胞のような支持細胞を使用する必要がない。本発明の分化促進剤の添加の時期は、使用する多能性幹細胞の種類や心筋分化培地の組成により適宜変更されうるが、例えばサルまたはヒトＥＳ細胞を実施例に記載のＩＭＤＭ培地を基本とした心筋分化培地で培養する場合、心筋分化培地での培養開始後６〜１４日目に添加すればよい。
【００３７】
本発明の心筋分化促進剤は、ニトロビン、サイトカイン（bＦＧＦ、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＤＫＫ１およびアクチビンＡの組み合わせ）、Ｗｎｔシグナル阻害剤などの別の心筋分化促進因子と共に使用してもよい。本発明における「心筋分化促進因子」には、心筋分化促進効果を有するあらゆる物質が含まれ、それゆえ本発明の心筋分化促進剤もまた「心筋分化促進因子」の一つである。本発明における「Ｗｎｔシグナル阻害剤」とは、Ｗｎｔシグナル経路を阻害する物質を意味し、例えばＩＷＰ２、ＸＡＶ９３９、ＩＷＲ１などの既知の化合物、およびＧ−ＣＳＦ、ＩＧＦＢＰ４、Ｄｋｋ１などのタンパク質が挙げられる。本発明の心筋分化促進剤もまた、本発明における有用な「Ｗｎｔシグナル阻害剤」である。すなわち、本発明の心筋分化促進剤とＷｎｔシグナル阻害剤とを併用する態様には、複数種類の本発明の心筋分化促進剤を使用する態様が含まれる。好ましくは、併用する別の心筋分化促進因子は、本発明の心筋分化促進剤と作用機序の異なるものであり、例えばＩＷＰ２やＸＡＶ９３９が挙げられる。別の心筋分化促進因子の添加の時期は、使用する心筋分化促進因子に応じて当業者が適宜決定可能である。
【００３８】
本発明はまた、本発明の心筋分化促進剤を含む心筋分化促進用キットを提供する。本発明のキットは、本発明の心筋分化促進剤に加えて別の心筋分化促進因子を含んでもよい。本発明の心筋分化促進剤と別の心筋分化促進因子とは、別々の容器に保存されていても、同一の容器に保存されていてもよい。
【００３９】
本発明はまた、心筋細胞の分化誘導方法および心筋細胞の製造方法を提供する。本発明の方法は、本発明の心筋分化促進剤を含む培地中で多能性幹細胞を培養することを特徴とする。ある態様において、本発明の方法は、多能性幹細胞を心筋分化培地中で培養すること、心筋分化培地での培養開始後６〜１４日目に本発明の心筋分化促進剤を活性成分の最終濃度が０.５〜２０μＭとなるよう添加すること、および培養１８日目に多能性幹細胞の心筋細胞への分化を確認することにより実施される。心筋細胞への分化は、例えば、拍動心筋細胞の数、心筋分化マーカーであるα−ＭＨＣ遺伝子の発現量により確認することができる。
【００４０】
本発明の方法では、本発明の心筋分化促進剤に加えて、さらに別の心筋分化促進因子を培地に添加してもよい。
【００４１】
本発明の方法により得られた心筋細胞は、インビトロにおける薬剤安全性試験に、あるいは心臓疾患などに対する移植用心筋細胞として、使用することができる。
【００４２】
本発明はまた、
式（Ｉ）：
【化２３】
0005930205.tif 000024
［式中、
Ｒ１、Ｒ４及びＲ５は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基−ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基である）である、
Ｒ２及びＲ３は、炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基である、又はＲ２及びＲ３は、一緒になって−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−または−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−を形成している、
Ｒ６−Ｒ９は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；基−Ｃ（Ｏ）Ａで置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基（Ａは、非置換又は炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基で置換された飽和または不飽和５または６員環であり、該環は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子から独立に選択される１または２個の原子を含んでいてもよい）；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基−ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基である）である、ここでＲ６−Ｒ９のうち隣接する２つが一緒になって−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−又は−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−を形成していてもよい、
Ｒ１０−Ｒ１１は、各々独立して、水素原子；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基である、
Ｘは、酸素原子；硫黄原子；又は基−ＮＲ１５（Ｒ１５は、水素原子、炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基、又は炭素数１〜５の直鎖又は分岐アシル基である）である、および
ｎは、０から６の整数である、但し、ｎが１又は２のとき、Ｒ７はＣｌ及びメトキシ基ではなく、Ｒ２はメトキシ基ではない］
を有する化合物またはその塩を提供する。
【００４３】
好ましい態様において、Ｒ１、Ｒ４及びＲ５は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基であり、好ましくは、水素原子である。
【００４４】
好ましい態様において、Ｒ２及びＲ３は、メトキシ基、エトキシ基、又はプロポキシ基である。
【００４５】
好ましい態様において、Ｒ６及びＲ９は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基であり、好ましくは、水素原子である。
【００４６】
好ましい態様において、Ｒ７は、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；基−Ｃ（Ｏ）Ａで置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基（Ａは、非置換又は炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基で置換された飽和または不飽和５または６員環であり、該環は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子から独立に選択される１または２個の原子を含んでいてもよい）；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基−ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基である）であって、Ｒ８は、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基であるか、又は、Ｒ７及びＲ８は、一緒になって−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−または−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−を形成している。
【００４７】
ある態様において、Ｒ７は、基−Ｃ（Ｏ）Ａで置換された炭素数１〜５の直鎖アルコキシ基であり、基−Ｃ（Ｏ）Ａは前記アルコキシ基の末端の炭素原子に結合している。
【００４８】
好ましい態様において、Ａは窒素原子を少なくとも１つ含み、そのようなＡとしては、非置換又は炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基で置換された、ピロリジニル、イミダゾリジニル、ピラゾリジニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、ピペリジニル、ピペラジニル、モルホリニル、ピリジル、ピリミジニル、ピラジニル、及びピリダジニル基が例示される。より好ましい態様において、Ａは、非置換又は炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基で置換された、ピペリジニル基、ピペラジニル基、又はモルホリニル基である。さらに好ましい態様において、Ａは、非置換又は炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基で置換された、ピペリジン−１−イル基、ピペラジン−１−イル基、又はモルホリン−４−イル基である。
【００４９】
好ましい態様において、Ｒ１０及びＲ１１は、水素原子である、
【００５０】
好ましい態様において、Ｘは、硫黄原子である。
【００５１】
好ましい態様において、ｎは、０から４の整数である。別の好ましい態様において、ｎは、１から６の整数、１から４の整数、又は２若しくは３である。
【００５２】
好ましい態様において、本発明の化合物は、
ＫＹ０２１１４
【化２４】
0005930205.tif 000025
ＳＯ０８７
【化２５】
0005930205.tif 000026
ＳＯ１０２
【化２６】
0005930205.tif 000027
ＳＯ０９６
【化２７】
0005930205.tif 000028
ＳＯ０９４
【化２８】
0005930205.tif 000029
である。
【００５３】
本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明する。
【実施例】
【００５４】
（１）ライブラリー化合物のスクリーニング
図１に示すように、サルＥＳ細胞の心筋分化を促進する物質の探索スクリーニングを実施した。サルＥＳ細胞株（カニクイザルＣＭＫ６．４株）に、心筋分化マーカーであるα−ＭＨＣ遺伝子のプロモーターの制御下で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するベクターを導入し、９６ウェルプレート（Greiner/655090：96穴FIAブラックプレート）上に５．０×１０３細胞/ウェルにて播種し、ＩＭＤＭ培地を基本とした心筋分化培地（ＩＭＤＭ培地（Sigma l3390）２００ｍｌ、ウシ胎児血清（GIBCO 10099-141）５０ｍｌ、MEM non-essential amino acid solution （Sigma M7145）２．５ｍｌ、ペニシリン−ストレプトマイシン（GIBCO 15140）２．５ｍｌ、２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン  ２．５ｍｌ、２−メルカプトエタノール（Sigma M7522）  ２μｌ、５Ｎ  ＮａＯＨ  ２５５μｌを混合したもの）で１４日間培養した。培養後６〜１４日に、９６００種類のライブラリー化合物を、１ウェルあたり１化合物（約１〜５μＭ）投与した。培養後１４日に、ＨＣＳ（high contents screening）システム（モレキュラーデバイス/MetaMorph イメージングシステム）を用いてＧＦＰ発現量を測定した。その結果、低分子化合物Ｎ１１４７４を投与したウェルのＧＦＰ発現量が高い値を示し、Ｎ１１４７４が心筋分化促進効果を有することが明らかとなった（図２）。【００５５】
（２）ＫＹ０２１１１およびその周辺化合物の構造活性相関
心筋分化促進効果を有することが示されたＮ１１４７４の類縁体ＫＹ０２１１１およびその周辺化合物を合成し、これらの心筋分化促進効果を検討した。サルＥＳ細胞を６ウェルプレート（旭硝子/ 5816-006 ：Ezview カルチャープレート）に４．０×１０５細胞/ウェルにて播種し、培養４〜１０日目に最終濃度が１０μＭとなるように各化合物を投与し、培養１４日目にＧＦＰ発現を観察した。その結果、化合物の分子構造に対応して、ＧＦＰ発現量の顕著な増加が見られた（図３）。また、心筋分化促進効果は、ジメトキシフェニル基に結合する炭素鎖の長さと相関することが示唆された（図３）。【００５６】
（３）ニトロビンおよびサイトカインとの比較
心筋分化促進因子として報告されているサイトカイン（bＦＧＦ、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＤＫＫ１、アクチビンＡ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、および本発明者らが心筋分化促進効果を有することを見出したニトロビンと、本発明の化合物の心筋分化促進効果をＧＦＰ発現量の増加で比較した。上記（２）と同様にして、６ウェルプレートにサルＥＳ細胞を播種し、培養４〜１０日目に、Ｎ１１４７４、ＫＹ０２１１１、ＫＹ０１０４２（最終濃度各１０μＭ）、Ｇ−ＣＳＦ（最終濃度５ｎｇ／ｍｌ）、培養８〜１４日目にニトロビン（最終濃度５μＭ）を、培養１〜１４日目にサイトカイン（bＦＧＦ、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＤＫＫ１、アクチビンＡ）（最終濃度各５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５０ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ）を投与し、培養１４日目にＧＦＰ発現を観察した。その結果、Ｎ１１４７４、ＫＹ０２１１１、およびＫＹ０１０４２は、サイトカイン（約３００％）やＧ−ＣＳＦ（約２５０％）、ニトロビン（約４００％）よりもはるかに高いＧＦＰ発現量の増加（Ｎ１１４７４＝１０００％、ＫＹ０２１１１＝７４００％、ＫＹ０１０４２＝７０００％）を示した（図４）。【００５７】
（４）ニトロビンとの相乗効果
ニトロビンとＮ１１４７４について、心筋分化促進効果における相乗効果を調べた。Ｎ１１４７４（１０μＭ）を培養４〜１０日目に、ニトロビン（３μＭ）を培養８〜１４日目に投与し、培養１４日目にＧＦＰ発現を観察した。その結果、ＧＦＰ発現量の増加は、ニトロビンまたはＮ１１４７４の単独投与の場合約３〜４倍であったのに対して、ニトロビンとＮ１１４７４を併用することで約９倍となった（図５−１、左グラフ）。また、ＧＦＰコロニー数の割合は、ニトロビンまたはＮ１１４７４の単独投与の場合約３〜４割の増加であったのに対して、ニトロビンとＮ１１４７４の併用により約８割の増加となった（図５−１、右グラフ）。【００５８】
同様に、ニトロビンとＫＹ０２１１１について、心筋分化促進効果における相乗効果を調べた。ＫＹ０２１１１（５μＭ）を培養４〜８日目に、ニトロビン（１μＭ）を培養８〜１２日目に投与し、培養１４日目にＧＦＰ発現を観察した。その結果、ＧＦＰ発現量の増加は、コントロール（ＤＭＳＯ）に比べニトロビンまたはＫＹ０２１１１の単独投与の場合、それぞれ約３倍、約３０倍であったのに対して、ニトロビンとＫＹ０２１１１を併用することで約５０倍となった（図５−２、左下グラフ）。また、ＧＦＰコロニー数の割合は、ニトロビンまたはＫＹ０２１１１の単独投与の場合、それぞれ２２％、７３％であったのに対して、ニトロビンとＫＹ０２１１１の併用によりほぼすべて（１００％）のコロニーがＧＦＰ蛍光陽性となった（図５−２、右下グラフ）。さらに、拍動コロニーの割合についても、ニトロビンまたはＫＹ０２１１１の単独投与の場合、それぞれ約１６％、３０％であったのに対して、ニトロビンとＫＹ０２１１１の併用により５８％となった（図５−２、右下グラフ）。【００５９】
（５）サル、ヒト、マウスＥＳ細胞およびヒトｉＰＳ細胞における心筋分化促進効果
Ｎ１１４７４およびＫＹ０２１１１について、各種ＥＳ／ｉＰＳ細胞での心筋分化促進効果を、ＧＦＰ発現量と拍動コロニー数を指標に確認した。ヒトＥＳ細胞株（Ｋｈ−１株）（Suemori, H., et al., Efficient establishment of human embryonic stem cell lines and long-term maintenance with stable karyotype by enzymatic bulk passage. Biochem Biophys Res Commun. 345(3), 926-32 (2006)）（引用により本明細書に含まれる）を６ウェルプレート（旭硝子／  ５８１６−００６  ：Ｅｚｖｉｅｗ  カルチャープレート）に１．２×１０６細胞／ウェルにて播種し、ＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍｌ）を培養後０〜４日目まで投与し、Ｎ１１４７４（１０μＭ）またはＫＹ０２１１１（５μＭ）を培養後４〜１４日目まで投与し、２２日間培養した。ヒトｉＰＳ細胞株（２５３Ｇ１、ＩＭＲ９０−１、ＩＭＲ９０−４、ＲＣＨＩＰＣ０００３）（Takahashi, K., et al., Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131(5), 861-72 (2007); Yu, J., et al., Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318(5858), 1917-20 (2007).）（これら文献は引用により本明細書に含まれる）については、ヒトＥＳ細胞と同じ方法で心筋分化培養を行った。マウスＥＳ細胞（Ｒ１）からの心筋分化方法は、文献（ Transient inhibition of BMP signaling by Noggin induces cardiomyocyte differentiation of mouse embryonic stem cells.Yuasa S, Itabashi Y, Koshimizu U, Tanaka T, Sugimura K, Kinoshita M, Hattori F, Fukami S, Shimazaki T, Ogawa S, Okano H, Fukuda K.Nat Biotechnol. 2005 May;23(5):607-11. Epub 2005 May 1. Erratum in: Nat Biotechnol. 2005 Jul;23(7):897. ）（引用により本明細書に含まれる）に従って行った。心筋分化培養後６〜９日目までの３日間、ＫＹ０２１１１（５μＭ）を投与し、９日目に拍動心筋コロニーを解析した。サルＥＳ細胞（ＣＭＫ６．４）については、上記（２）と同様にして心筋分化培養を行った。【００６０】
その結果、培養１４日以降、ＧＦＰ発現量の顕著な増加が観察された（図６）。また、拍動コロニー数についても、サルＥＳ細胞（ＣＭＫ６．４）、マウスＥＳ細胞（Ｒ１）、ヒトＥＳ細胞（Ｋｈ−１）、およびヒトｉＰＳ細胞（２５３Ｇ１、ＩＭＲ９０−１、ＩＭＲ９０−４、ＲＣＨＩＰＣ０００３）において、Ｎ１１４７４、ＫＹ０２１１１の投与により最大約６０倍もの顕著な増加が観察された（表１）。以上のとおり、これら化合物はヒトＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞、マウスＥＳ細胞においても強い心筋分化促進効果を有することがわかった。
【表１】
0005930205.tif 000030
【００６１】
（６）その他の活性化合物（１）
上記（２）と同様にして、さらに幾つかの周辺化合物が心筋分化促進効果を有することを見出した（図７）。【００６２】
（７）作用機序の検討
本発明の化合物の作用機序を調べるため、ヒトｉＰＳ細胞を上記（１）記載の心筋分化培地へ播種し、培養３日目にＤＭＳＯまたはＫＹ０２１１１（１０μＭ）を添加し、添加後１２時間および２４時間の遺伝子発現をＤＮＡアレイにより調べた。その結果、以下の遺伝子の発現がＫＹ０２１１１の添加により低下することがわかった：（１２時間後最も発現が低下した遺伝子から順に）ＨＯＸＡ１、ＭＳＧＮ１、ＮＫＤ１、Ｔ、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ、ＤＫＫ１、ＤＫＫ４、ＣＤＸ２、ＭＳＸ１、ＮＯＤＡＬ、ＦＧＦ４、ＰＡＰＰＡ、ＰＲＲＸ１、ＬＲＡＴ、ＣＹＰ１Ｂ１、ＳＬＣ３４Ａ２、ＡＸＩＮ２、ＬＧＬ１、ＳＰ５、ＭＩＸＬ１、ＡＰＣＤＤ１、ＤＳＥＬ。ＴＣＦ／ＬＥＦ転写因子認識配列を用いたプロモーター解析を行ったところ、これら遺伝子にはＷｎｔシグナル経路の下流で機能する遺伝子が多く含まれていることがわかった。これら遺伝子の一部（ＭＳＧＮ１、ＨＯＸＡ１、Ｔ、Ｄｋｋ１、ＦＧＦ４）について、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により発現を確認したところ、いずれの遺伝子についてもＤＮＡアレイと同様の結果が得られた（図８）。【００６３】
次に、ＫＹ０２１１１の添加により発現が低下することが明らかとなった遺伝子群の発現に対する、ＫＹ０２１１１、既知のＷｎｔシグナル阻害剤であるＸＡＶ９３９およびＩＷＰ−２、ならびにＷｎｔシグナル活性化剤であるＢＩＯの効果を、定量的ＰＣＲにより調べた。検討した遺伝子は以下のとおりである：ＭＳＧＮ１、ＨＯＸＡ１；Ｔ、ＭＩＸＬ１；Ｄｋｋ１、ＡＸＩＮ２；ＮＯＤＡＬ、ＦＧＦ４（すべてＷｎｔシグナル標的遺伝子として報告されている）。その結果、これら遺伝子の発現は、ＫＹ０２１１１、ＸＡＶ９３９およびＩＷＰ−２のいずれの化合物によっても低下し、反対にＷｎｔシグナル活性化剤であるＢＩＯによって増加した（図９）。【００６４】
以上の結果は、ＤＮＡアレイにおいてＫＹ０２１１１の添加により発現低下が観察された遺伝子群がＷｎｔシグナル経路の下流の遺伝子であること、および、ＫＹ０２１１１がＷｎｔシグナル阻害剤であることを示唆している。【００６５】
（８）心筋分化促進効果の比較
上記（２）と同様にして、ＫＹ０２１１１およびＮ１１４７４と、既知のＷｎｔシグナル阻害剤（ＩＷＰ２、ＸＡＶ９３９、ＩＷＲ１）および心筋分化促進効果が知られるタンパク質（Ｇ−ＣＳＦ、ＩＧＦＢＰ４、Ｄｋｋ１、サイトカイン（bＦＧＦ、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＤＫＫ１、アクチビンＡの組み合わせ））との心筋分化促進効果を比較した。６ウェルプレートにサルＥＳ細胞を播種し、培養４〜１０日目に、ＫＹ０２１１１、Ｎ１１４７４（最終濃度各１０μＭ）、ＩＷＰ２（最終濃度１０μＭ）、ＸＡＶ９３９（最終濃度１０μＭ）、ＩＷＲ１（最終濃度１０μＭ）、Ｇ−ＣＳＦ（最終濃度５ｎｇ／ｍｌ）、ＩＧＦＢＰ４（最終濃度１μｇ／ｍｌ）、Ｄｋｋ１（最終濃度１５０ｎｇ／ｍｌ）、培養１〜１４日目にサイトカイン（bＦＧＦ、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＤＫＫ１、アクチビンＡの組み合わせ）（最終濃度各５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５０ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ）を投与し、培養１４日目にＧＦＰ発現を観察した。その結果、既知のＷｎｔシグナル阻害剤も心筋分化促進効果を示したが、ＫＹ０２１１１の心筋分化効果が最も強かった（図１０）。【００６６】
（９）心筋分化促進効果に対するＷｎｔシグナル活性化剤の効果
ＫＹ０２１１１、ＸＡＶ９３９、およびＩＷＰ２の心筋分化促進効果に対するＷｎｔシグナル活性化剤であるＢＩＯの効果を検討した。上記（８）と同様にして、サルＥＳ細胞に、培養４〜１０日目にＫＹ０２１１１、ＸＡＶ９３９、またはＩＷＰ２とともにＢＩＯ（最終濃度５μＭ）を投与し、培養１４日目にＧＦＰ発現を観察した。その結果、ＢＩＯはＸＡＶ９３９およびＩＷＰ２の心筋分化効果を抑制したが、ＫＹ０２１１１の効果は抑制しなかった（図１１）。同様の結果が、上記（５）記載のようにヒトｉＰＳ細胞（ＩＭＲ９０−１）を用いて拍動コロニー数を調べた場合にも得られた（図１１）。これらの結果は、ＫＹ０２１１１の心筋分化効果の作用機序が既知のＷｎｔシグナル阻害剤とは異なることを示唆する。【００６７】
（１０）既知のＷｎｔシグナル阻害剤との相乗効果
心筋分化促進における、ＫＹ０２１１１と既知のＷｎｔシグナル阻害剤であるＸＡＶ９３９またはＩＷＰ２との相乗効果について検討した。上記（８）と同様にして、サルＥＳ細胞に培養４〜１０日目にＫＹ０２１１１、ＸＡＶ９３９、およびＩＷＰ２を投与し、培養１４日目にＧＦＰ発現を観察した。その結果、ＫＹ０２１１１とＸＡＶ９３９とに相乗効果が観察された（図１２）。また、上記（８）記載のようにヒトｉＰＳ細胞（ＩＭＲ９０−１）を用いて拍動コロニー数を調べたところ、ＫＹ０２１１１とＸＡＶ９３９、ＫＹ０２１１１とＩＷＰ２との間に相乗効果が観察された（図１２−２）。以上の結果は、ＫＹ０２１１１の作用機序が既知のＷｎｔシグナル阻害剤とは異なることを支持し、両者を併用するとさらに強い心筋分化促進効果が得られることを示す。【００６８】
（１１）その他の活性化合物（２）
上記（２）と同様にして、さらに幾つかの心筋分化促進効果を有する化合物を見出した（図１３）。【００６９】
（１２）本発明の化合物の製造例
ＫＹ０１０４１
３，４−ジメトキシベンゾイルイルクロリド（１００ｍｇ，０．５５ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（８３，０μｌ．６ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（５００μｌ）に溶かし、２−アミノ−６−クロロベンゾチアゾール（１０５ｍｇ，０．５７ｍｍｏｌ）を加え一時間、室温にて撹拌した。反応終了後、塩化メチレンに希釈し、飽和食塩水にて洗浄した。硫酸マグネシウムで乾燥した後に溶媒を留去した。残渣にエタノールを加え、７０度に加熱し、溶解させた後に室温に戻すことで再結晶を行い、２−（３，４−ジメトキシベンズアミド）−６−クロロベンゾチアゾールを１３０ｍｇ、収率６８％で得た。
1H NMR (CDCl3): δ10.15(s, 1H), 7.83 (d, J= 1.8 Hz, 1H), 7.63-7.45 (m, 3H), 7.36 (dd, J= 1.8, 8.7 Hz, 1H), 6.91 (d, J= 8.2 Hz, 1H), 3.96 (s, 3H), 3.94 (s, 3H)
MS(ESI) Found: 349 [M+H]+【００７０】
ＫＹ０２１１１
３−（３，４−ジメトキシフェニル）プロパノイルクロリド（１００ｍｇ，０．４２ｍｍｏｌ）と２−アミノ−６−クロロベンゾチアゾール（７８ｍｇ，０．４２ｍｍｏｌ）を基質に用いて上記と同様に反応を行い、２−（３−（３，４−ジメトキシフェニル）プロパンアミド）−６−クロロベンゾチアゾールを１１３ｍｇ、収率７２％で得た。
1H NMR (CDCl3): δ9.41(s, 1H), 7.79 (d, J= 2.9 Hz, 1H), 7.62 (d, J= 11.7 Hz, 1H), 7.37 (dd, J= 2.6, 11.4 Hz, 1H), 6.80-6.67 (m, 3H), 3.85 (s, 3H), 3.82 (s, 3H), 3.03 (t, J= 9.9 Hz, 2H), 2.77 (t, J= 9.9 Hz, 2H)
MS(ESI) Found: 399 [M+H]+【００７１】
ＫＹ０２１１４
４−（３，４−ジメトキシフェニル）ブタノイルクロリド（１００ｍｇ，０．４１ｍｍｏｌ）と２−アミノ−６−クロロベンゾチアゾール（７６ｍｇ，０．４１ｍｍｏｌ）を基質に用いて上記と同様に反応を行い、２−（４−（３，４−ジメトキシフェニル）ブタンアミド）−６−クロロベンゾチアゾールを１２１ｍｇ、収率７５％で得た。
1H NMR (CDCl3): δ9.15(s, 1H), 7.79 (d, J= 2.9 Hz, 1H), 7.64 (d, J= 11.3 Hz, 1H), 7.39 (dd, J= 2.6, 11.4 Hz, 1H), 6.80-6.68 (m, 3H), 3.87 (s, 3H), 3.84 (s, 3H), 2.67 (t, J= 9.9 Hz, 2H), 2.48 (t, J= 9.9 Hz, 2H), 2.09 (m, 2H)
MS(ESI) Found: 413 [M+H]+【００７２】
ＫＹ０１０４５
５−（３，４−ジメトキシフェニル）ペンタノイルクロリド（３０ｍｇ，０．１３ｍｍｏｌ）と２−アミノ−６−クロロベンゾチアゾール（２３ｍｇ，０．１３ｍｍｏｌ）を基質に用いて上記と同様に反応を行い、２−（５−（３，４−ジメトキシフェニル）ペンタンアミド）−６−クロロベンゾチアゾールを３９ｍｇ、収率７５％で得た。
1H NMR (CDCl3): δ8.91 (s, 1H), 7.79 (d, J= 8.7 Hz, 1H), 7.66 (d, J= 8.7 Hz, 1H), 7.49 (dd, J= 2.3, 8.7 Hz, 1H), 6.79 (d, J= 7.8 Hz, 1H), 6.71 (d, J= 7.8 Hz, 1H) 6.70 (s, 1H), 3.87(s, 3H), 3.86 (s, 3H), 2.62 (t, J= 7.4 Hz, 2H), 2.52 (t, J= 7.3 Hz, 2H), 1.80 (m, 2H), 1.72 (m, 2H)
MS(ESI) Found: 405 [M+H]+【００７３】
ＫＹ０１０４０
３，４−ジメトキシベンゾイルイルクロリド（１００ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）と２−アミノ−６−ニトロベンゾチアゾール（１０５ｍｇ，０．５７ｍｍｏｌ）を基質に用いて上記と同様に反応を行い、２−（３，４−ジメトキシベンズアミド）−６−ニトロベンゾチアゾールを１００ｍｇ、収率５６％で得た。
1H NMR (CDCl3): δ10.15(s, 1H), 8.80 (d, J= 2.3 Hz, 1H), 8.31 (dd, J= 2.3, 9.2 Hz, 1H), 7.73 (d, J= 9.2 Hz, 1H), 7.63-7.47 (m, 2H), 6.95 (d, J= 8.7 Hz, 1H), 3.98 (s, 3H), 3.97 (s, 3H)
MS(ESI) Found: 360 [M+H]+【００７４】
ＫＹ０２１０９
２−（３，４−ジメトキシフェニル）アセチルクロリド（１００ｍｇ，０．５１ｍｍｏｌ）と２−アミノ−６−クロロベンゾチアゾール（９４ｍｇ，０．５１ｍｍｏｌ）を基質に用いて上記と同様に反応を行い、２−（２−（３，４−ジメトキシフェニル）アセトアミド）−６−クロロベンゾチアゾールを１５３ｍｇ、収率８３％で得た。
1H NMR (CDCl3): δ8.91(s, 1H), 8.75 (s, 1H), 8.31 (dd, J= 12.1 Hz, 1H), 7.77 (d, J= 11.7 Hz, 1H), 7.00-6.70 (m, 3H), 3.92 (s, 3H), 3.90 (s, 3H), 3.86 (s, 2H)
MS(ESI) Found: 396 [M+H]+【００７５】
ＫＹ０１０４２
３−（３，４−ジメトキシフェニル）プロパノイルクロリド（１００ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）と２−アミノ−６−ニトロベンゾチアゾール（１０５ｍｇ，０．５７ｍｍｏｌ）を基質に用いて上記と同様に反応を行い、２−（３−（３，４−ジメトキシフェニル）プロパンアミド）−６−ニトロベンゾチアゾールを１３８ｍｇ、収率７１％で得た。
1H NMR (CDCl3): δ9.29(s, 1H), 8.75 (d, J= 1.8 Hz, 1H), 8.31 (dd, J= 2.3, 9.2 Hz, 1H), 7.77 (d, J= 9.2 Hz, 1H), 6.80 (d, J= 8.7 Hz, 1H), 6.75 (d, J= 8.7 Hz, 1H), 6.74 (s, 1H), 3.85 (s, 3H), 3.84 (s, 3H), 3.06 (t, J= 7.3 Hz, 2H), 2.83 (t, J= 7.3 Hz, 2H)
MS(ESI) Found: 388 [M+H]+【００７６】
ＫＹ０１０４３
４−（３，４−ジメトキシフェニル）ブタノイルクロリド（５５ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）と２−アミノ−６−ニトロベンゾチアゾール（５０ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）を基質に用いて上記と同様に反応を行い、２−（４−（３，４−ジメトキシフェニル）ブタンアミド）−６−ニトロベンゾチアゾールを６５ｍｇ、収率６６％で得た。
1H NMR (CDCl3): δ8.75 (d, J= 2.3 Hz, 1H), 8.29 (dd, J= 2.3, 8.7 Hz, 1H), 7.70 (d, J= 8.7 Hz, 1H), 6.75 (d, J= 8.7 Hz, 1H), 6.67 (s, 1H), 6.66 (d, J= 8.7 Hz, 1H), 3.83 (s, 3H), 3.83 (s, 3H), 2.66 (t, J= 7.4 Hz, 2H), 2.54 (t, J= 7.3 Hz, 2H), 2.11 (m, 2H)
MS(ESI) Found: 402 [M+H]+【００７７】
ＫＹ０１０４６
５−（３，４−ジメトキシフェニル）ペンタノイルクロリド（３０ｍｇ，０．１３ｍｍｏｌ）と２−アミノ−６−ニトロベンゾチアゾール（２５ｍｇ，０．１３ｍｍｏｌ）を基質に用いて上記と同様に反応を行い、２−（５−（３，４−ジメトキシフェニル）ペンタンアミド）−６−ニトロベンゾチアゾールを３８ｍｇ、収率７０％で得た。
1H NMR (CDCl3): δ8.94 (s, 1H), 8.75 (d, J= 2.3 Hz, 1H), 8.32 (dd, J= 2.3, 9.2 Hz, 1H), 7.81 (d, J= 9.2 Hz, 1H), 6.80 (d, J= 7.8 Hz, 1H), 6.72 (d, J= 7.8 Hz, 1H) 6.71 (s, 1H), 3.88 (s, 3H), 3.86 (s, 3H), 2.63 (t, J= 7.4 Hz, 2H), 2.56 (t, J= 7.3 Hz, 2H), 1.82 (m, 2H), 1.73 (m, 2H)
MS(ESI) Found: 416 [M+H]+【００７８】
ＫＹ０２１０４
２−（３，４−ジメトキシフェニル）アセチルクロリド（１００ｍｇ，０．５１ｍｍｏｌ）と２−アミノ−６−フルオロベンゾチアゾール（８６ｍｇ，０．５１ｍｍｏｌ）を基質に用いて上記と同様に反応を行い、２−（２−（３，４−ジメトキシフェニル）アセトアミド）−６−フルオロベンゾチアゾールを１５７ｍｇ、収率８９％で得た。
1H NMR (CDCl3): δ9.14(s, 1H), 7.64 (dd, J= 6.2, 12.1 Hz, 1H), 7.50 (dd, J= 3.6, 11.0 Hz, 1H), 7.14 (ddt, J= 3.7, 12.1 Hz, 1H), 6.90-6.78 (m, 3H), 3.90 (s, 3H), 3.87 (s, 3H), 3.80 (s, 2H)
MS(ESI) Found: 369 [M+H]+【００７９】
ＳＯ０８７
２−アミノ−６−ブロモベンゾチアゾール（５００ｍｇ，２．１８ｍｍｏｌ）、３−（３，４−ジメトキシフェニル）プロピオン酸（５０５ｍｇ，２．４０ｍｍｏｌ）、Ｏ−（６−クロロベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（１．０９ｇ，２．６３ｍｍｏｌ）、およびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン（４１９μｌ，２．４１ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（５ｍｌ）溶液を室温にて終夜攪拌した。反応終了後、反応溶液を酢酸エチルにて希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、蒸留水、飽和塩化ナトリウム水溶液にて洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥した後に溶媒を留去した。残渣にエタノールを加えて還流し、再結晶を行い、２−（３−（３，４−ジメトキシフェニル）プロパンアミド）−６−ブロモベンゾチアゾールを３２０ｍｇ、収率３５％で得た。
1H NMR (DMSO-d6): δ12.45 (s, 1H), 8.25 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.66 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.56 (dd, J = 1.8, 8.4 Hz, 1H), 6.87-6.83 (m, 2H), 6.77-6.73 (m, 1H), 3.71 (s, 3H), 3.70 (s, 3H), 2.88 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.79 (t, J = 7.0 Hz, 2H)【００８０】
ＳＯ１０２
２−アミノ−６−クロロベンゾチアゾール（５５ｍｇ，０．２９８ｍｍｏｌ）および３−（３，４−ジメトキシフェニル）プロピオン酸（８０ｍｇ，０．３５７ｍｍｏｌ）を基質に用いてＳＯ０８７と同様に反応を行い，Ｎ−（６−クロロベンゾチアゾール−２−イル）−３−（４−エトキシ−３−メトキシフェニル）プロパンアミドを４０ｍｇ、収率３４％で得た。
1H NMR (DMSO-d6): δ12.44 (s, 1H), 8.11 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 7.71 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.44 (dd, J = 2.2, 8.8 Hz, 1H), 6.90-6.82 (m, 2H), 6.72 (dd, J = 1.8, 7.0 Hz), 3.94 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 3.72 (s, 3H), 2.91-2.85 (m, 2H), 2.82-2.75 (m, 2H), 1.28 (t, J = 7.0 Hz, 3H)【００８１】
ＳＯ０９４
２−アミノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾール（４００ｍｇ，２．４１ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（７ｍｌ）溶液をアルゴン雰囲気下、氷冷攪拌中、水素化ナトリウム（６０％）（１０６ｍｇ，２．６５ｍｍｏｌ）を加えて３０分攪拌後、４−ブロモ酪酸エチル（５２１μｌ，３．６２ｍｍｏｌ）を加えて室温にて終夜攪拌した。反応終了後、反応溶液を酢酸エチルにて希釈し、飽和塩化アンモニウム水溶液、飽和塩化ナトリウム水溶液にて洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥した後に溶媒を留去し、エチル  ４−（（２−アミノベンゾチアゾール−６−イル）オキシ）ブタノエートを３７２ｍｇ、収率５５％で得た。【００８２】
エチル  ４−（（２−アミノベンゾチアゾール−６−イル）オキシ）ブタノエート（３７２ｍｇ，１．３３ｍｍｏｌ）、３−（３，４−ジメトキシフェニル）プロピオン酸（３３５ｍｇ，１．５９ｍｍｏｌ）、Ｏ−（６−クロロベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（６５９ｍｇ，１．５９ｍｍｏｌ）、およびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン（２７８μｌ，１．５９ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（５ｍｌ）溶液を室温にて終夜攪拌した。反応終了後、反応溶液を酢酸エチルにて希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、蒸留水、飽和塩化ナトリウム水溶液にて洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥した後に溶媒を留去した。残渣にエタノールを加えて還流し、再結晶を行い、エチル  ４−（（２−（３−（３，４−ジメトキシフェニル）プロパンアミド）ベンゾチアゾール−６−イル）オキシ）ブタノエートを４４７ｍｇ、収率７６％で得た。【００８３】
エチル  ４−（（２−（３−（３，４−ジメトキシフェニル）プロパンアミド）ベンゾチアゾール−６−イル）オキシ）ブタノエート（４４７ｍｇ，０．９４６ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン溶液に、５Ｎ  ＮａＯＨ水溶液（３７８μｌ）を加えて室温にて終夜攪拌した。反応終了後、反応溶液を濃縮し、氷冷下、６Ｎ  塩酸にて中和した。析出物を吸引ろ取し、水洗し，４−（（２−（３−（３，４−ジメトキシフェニル）プロパンアミド）ベンゾチアゾール−６−イル）オキシ）ブタン酸を２７１ｍｇ，収率６４％で得た。【００８４】
４−（（２−（３−（３，４−ジメトキシフェニル）プロパンアミド）ベンゾチアゾール−６−イル）オキシ）ブタン酸（１００ｍｇ，０．２２５ｍｍｏｌ）およびモルホリン（２２μｌ，０．２４８ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（１ｍｌ）溶液に、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（３８ｍｇ，０．２４８ｍｍｏｌ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（５２ｍｇ，０．２７０ｍｍｏｌ）を加えて室温にて２日間攪拌した。反応終了後、反応溶液を酢酸エチルにて希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、蒸留水、飽和塩化ナトリウム水溶液にて洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥した後に溶媒を留去した。残渣にエタノールを加えて還流し、再結晶を行い、３−（３，４−ジメトキシフェニル）−Ｎ−（６−（４−モルホリノ−４−オキソブトキシ）ベンゾチアゾール−２−イル）プロパンアミドを５０ｍｇ、収率４３％で得た。
1H NMR (DMSO-d6): δ12.20 (s, 1H), 7.60 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.55 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 7.01 (dd, J = 2.6, 8.8 Hz, 1H), 6.86-6.83 (m, 2H), 6.75 (dd, J = 1.8, 8.1 Hz), 4.03 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 3.71 (s, 3H), 3.70 (s, 3H), 3.56-3.53 (m, 4H), 3.46-3.42 (m, 4H), 2.87 (t, J = 7.0 Hz), 2H), 2.75 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.51-2.46 (m, 2H), 1.96 (t, J = 7.0 Hz, 2H)【００８５】
ＳＯ０９６
４−（（２−（３−（３，４−ジメトキシフェニル）プロパンアミド）ベンゾチアゾール−６−イル）オキシ）ブタン酸（８０ｍｇ，０．１８０ｍｍｏｌ）および１−メチルピペラジン（２１．８μｌ，０．１９８ｍｍｏｌ）を基質に用いてＳＯ０９４と同様に反応を行い、３−（３，４−ジメトキシフェニル）−Ｎ−（６−（４−（４−メチルピペラジン−１−イル）−４−オキソブトキシ）ベンゾチアゾール−２−イル）プロパンアミドを３９ｍｇ、収率４１％で得た。
1H NMR (DMSO-d6): δ12.20 (br s, 1H), 7.54 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.48 (d, J = 2.6Hz, 1H), 6.96 (dd, J = 2.6, 8.8 Hz, 1H), 6.86-6.82 (m, 2H), 6.73 (dd, J = 1.8, 8.1 Hz, 1H), 4.01 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 3.71 (s, 3H), 3.69 (s, 3H), 3.45-3.41 (m, 4H), 2.86 (t, J = 7.7 Hz, 2H), 2.70 (t, J = 7.7 Hz, 2H), 2.50-2.45 (m, 2H), 2.29-2.20 (m, 4H), 2.15 (s, 3H), 1,94 (t, J = 7.0 Hz, 2H)
【図１】
0005930205.tif 000059
【図２】
0005930205.tif 000060
【図３】
0005930205.tif 000061
【図４】
0005930205.tif 000062
【図５−１】
0005930205.tif 000063
【図５−２】
0005930205.tif 000064
【図６】
0005930205.tif 000065
【図７−１】
0005930205.tif 000066
【図７−２】
0005930205.tif 000067
【図８】
0005930205.tif 000068
【図９−１】
0005930205.tif 000069
【図９−２】
0005930205.tif 000070
【図１０】
0005930205.tif 000071
【図１１−１】
0005930205.tif 000072
【図１１−２】
0005930205.tif 000073
【図１２】
0005930205.tif 000074
【図１３】
0005930205.tif 000075