(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
0006042481.tif 000022
［式中、Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ２−Ｃ４アルケニルおよびアリールから成る群より選択され、
Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、Ｆ、ＯＨ、メトキシ、エトキシおよびプロポキシから成る群より独立して選択され、
Ｒ５は、Ｓ、ＳｅおよびＢＨ３から成る群より選択され、
Ｒ４およびＲ６は、Ｏ、Ｓ、ＳｅおよびＢＨ３から成る群より独立して選択され、
ｎは１、２または３であり、
置換基Ｒ５を含むＰ原子における立体化学的配置は、β−Ｓ−ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマーのＰβ原子における立体化学的配置に対応する。］
に従った５'末端キャップ構造で修飾されたＲＮＡを含有するワクチン組成物。
【請求項２】
前記５'末端キャップ構造が、前記ＲＮＡを未熟抗原提示細胞に導入したとき、式（Ｉ）による前記５'末端キャップ構造を有さない同じ前記ＲＮＡと比較して、前記ＲＮＡの安定性を高める、前記ＲＮＡの翻訳効率を高める、前記ＲＮＡの翻訳を延長させる、前記ＲＮＡの総タンパク質発現を増大させる、および／または前記ＲＮＡによってコードされる抗原もしくは抗原ペプチドに対する免疫応答を増大させることができる、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
結節内注入用に製剤された、請求項１または２に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
式（Ｉ）：
【化２】
0006042481.tif 000023
［式中、Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ２−Ｃ４アルケニルおよびアリールから成る群より選択され、
Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、Ｆ、ＯＨ、メトキシ、エトキシおよびプロポキシから成る群より独立して選択され、
Ｒ５は、Ｓ、ＳｅおよびＢＨ３から成る群より選択され、
Ｒ４およびＲ６は、Ｏ、Ｓ、ＳｅおよびＢＨ３から成る群より独立して選択され、
ｎは１、２または３であり、
置換基Ｒ５を含むＰ原子における立体化学的配置は、β−Ｓ−ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマーのＰβ原子における立体化学的配置に対応する。］
による５'末端キャップ構造で修飾されたＲＮＡを含有する、単離された未熟抗原提示細胞。
【請求項５】
個体において免疫応答を誘導する方法に使用される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
個体において免疫応答を誘導する方法に使用される、請求項４に記載の単離された未熟抗原提示細胞。
【請求項７】
個体において免疫応答を誘導する方法に使用される、請求項４に記載の単離された未熟抗原提示細胞であって、
前記ＲＮＡが前記未熟抗原提示細胞に導入されている、単離された未熟抗原提示細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸に基づくワクチン接種の分野に属する。本発明は、ＲＮＡワクチン接種に関連して、修飾によるＲＮＡの安定化に関し、５'末端キャップ類似体で修飾されたＲＮＡを含有するワクチン組成物、そのようなＲＮＡを含有する未熟抗原提示細胞、ならびに本発明によるワクチン組成物または未熟抗原提示細胞を使用して個体において免疫応答を誘発するための方法を提供する。さらに、本発明は、未熟抗原提示細胞におけるＲＮＡの安定性を高めるための方法、未熟抗原提示細胞におけるＲＮＡの発現を高めるための方法、対象とする抗原を提示するＭＨＣ分子の割合を増大させるための方法、ならびに免疫エフェクター細胞を刺激するおよび／または活性化するための方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
組換えワクチンは、感染性および癌性疾患の予防および治療のための人間医学および獣医学において特に重要である。一定の疾患の予防または治療において有効な、一定の抗原に対する特異的免疫反応を誘導することが組換えワクチンによる免疫の目的である。公知の組換えワクチンは、組換えタンパク質、合成ペプチドフラグメント、組換えウイルスまたは核酸に基づく。
【０００３】
最近、ＤＮＡおよびＲＮＡベースのワクチンが重要性を増してきた。プラスミドＤＮＡの直接筋肉内注射は、コードされる遺伝子の持続的な発現をもたらすことが示された（Ｗｏｌｆｆら，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：１４６５−１４６８）。この所見は、免疫療法における核酸の適用性をさらに検討するための当該分野における重要な誘因となった。最初は、感染性病原体に対するＤＮＡベースのワクチンが検討された（Ｃｏｘら，１９９３，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：５６６４−５６６７；Ｄａｖｉｓら，１９９３，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２：１８４７−１８５１；Ｕｌｍｅｒら，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１７４５−１７４９；Ｗａｎｇら，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：４１５６−４１６０）。さらに、腫瘍に対する遺伝子治療における、および特異的抗腫瘍免疫の誘導のための、核酸の適用性が検討されてきた（Ｃｏｎｒｙら，１９９４，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：１１６４−１１６８；Ｃｏｎｒｙら，１９９５，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：５９−６５；Ｓｐｏｏｎｅｒら，１９９５，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：１７３−１８０；Ｗａｎｇら，１９９５，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．６：４０７−４１８）。
【０００４】
核酸ベースの免疫法は多くの利点を示す。例えば、核酸ベースのワクチンの製造は直接的で、比較的コストがかからず、ＤＮＡベースのワクチンは長期保存に対して安定である。しかし、特に、ＤＮＡベースのワクチンは種々の潜在的な安全上の危険性、例えば抗ＤＮＡ抗体の誘導（Ｇｉｌｋｅｓｏｎら，１９９５，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５：１３９８−１４０２）や導入遺伝子の宿主ゲノムへの潜在的な組込みの可能性などを示す。これは、細胞遺伝子の不活性化、導入遺伝子の制御不能の長期的な発現、または腫瘍形成を導く可能性があり、従って、一般にｅｒｂ−Ｂ２（Ｂａｒｇｍａｎｎら，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ  ３１９：２２６−２３０）およびｐ５３（Ｇｒｅｅｎｂｌａｔｔら，１９９４，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：４８５５−４８７８）などの腫瘍形成の潜在的可能性がある腫瘍関連抗原には適用されない。
【０００５】
ＲＮＡの使用は、ＤＮＡベースのワクチンの潜在的危険性を回避する魅力的な代替策を提供する。ＲＮＡに基づく免疫法の利点の一部は、一過性の発現および非形質転換特性である。さらに、ＲＮＡは、導入遺伝子が発現されるために核内に輸送される必要がなく、さらには、宿主ゲノムに組み込まれることができない。ＤＮＡの注入と同様に（Ｃｏｎｄｏｎら，１９９６，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：１１２２−１１２８；Ｔａｎｇら，１９９２，Ｎａｔｕｒｅ  ３５６：１５２−１５４）、ＲＮＡの注入はインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で細胞性ならびに体液性免疫応答の両方を生じさせ得る（Ｈｏｅｒｒら，２０００，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：１−７；Ｙｉｎｇら，１９９９，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：８２３−８２７）。
【０００６】
インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で転写されたＲＮＡ（ＩＶＴ−ＲＮＡ）による免疫療法のために２つの異なる戦略が推進されており、どちらも様々な動物モデルにおいて成功裏に試験されてきた。ＲＮＡは種々の免疫経路によって患者に直接注入されるか（Ｈｏｅｒｒら，２０００，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：１−７）、またはインビトロで従来のトランスフェクション法を用いて樹状細胞をＩＶＴ−ＲＮＡでトランスフェクトし、次にトランスフェクトされた樹状細胞を患者に投与する（Ｈｅｉｓｅｒら，２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：５５０８−５５１４）。ＲＮＡでトランスフェクトされた樹状細胞による免疫は、インビトロおよびインビボで抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を誘導することが示されている（Ｓｕら，２００３，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：２１２７−２１３３；Ｈｅｉｓｅｒら，２００２，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０９：４０９−４１７）。さらに、実験動物のリンパ節への裸のＲＮＡの直接注入（結節内注入）は、おそらくマクロピノサイトーシスと呼ばれるプロセスによって（独国特許発明第  １０  ２００８  ０６１  ５２２．６号明細書参照）、主として未熟な樹状細胞による前記ＲＮＡの取込みを導くことが示されている。免疫応答を誘発するためにＲＮＡが翻訳され、発現されたタンパク質が抗原提示細胞の表面のＭＨＣ分子に提示されると推測される。
【０００７】
ＲＮＡベースのワクチン接種の主たる難点は、インビボでの、特に免疫系の細胞における、ＲＮＡの不安定性である。長鎖ＲＮＡの５'末端からの分解は、ＲＮＡ鎖からｍ７ＧＤＰを切断する、いわゆる「デキャッピング」酵素Ｄｃｐ２によって細胞内で誘導される。従って、切断はＲＮＡキャップのαリン酸基とβリン酸基の間で起こると推測される。
【０００８】
デキャッピング過程を阻害するため、従ってインビボでのＲＮＡの安定性を高めるために、前記ＲＮＡの安定性へのホスホロチオエートキャップ類似体の作用が検討されてきた。５'末端キャップのβリン酸基における硫黄原子の酸素原子による置換はＤｃｐ２に対する安定化をもたらすことが示されている。ＲＮＡの５'末端キャップのホスホロチオエート修飾は、ＲＮＡ鎖へのキャップの逆方向組込みを阻害する「抗逆方向キャップ類似体（ａｎｔｉ−ｒｅｖｅｒｓｅ  ｃａｐ  ａｎａｌｏｇ）」（ＡＲＣＡ）修飾と組み合わされてきた。生じたキャップ類似体、すなわちｍ２（７，２'−Ｏ）ＧｐｐｓｐＧは、β−Ｓ−ＡＲＣＡと命名された（図１参照）。架橋リン酸における硫黄原子の酸素原子による置換は、ＨＰＬＣでの溶出パターンに基づきＤ１およびＤ２と称されるホスホロチオエートジアステレオマーを生じさせる。興味深いことに、２つのジアステレオマーはヌクレアーゼに対する感受性が異なる。β−Ｓ−ＡＲＣＡのＤ２ジアステレオマーを担持するＲＮＡは、Ｄｃｐ２切断に対してほぼ完全に抵抗性であり（非修飾ＡＲＣＡ  ５'末端キャップの存在下で合成されたＲＮＡと比較して６％だけの切断）、一方β−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ１）５'末端キャップを有するＲＮＡはＤｃｐ２切断に対して中間的な感受性を示す（７１％の切断）ことが明らかにされた。さらに、３つのキャップ類似体、ＡＲＣＡ、β−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ１）およびβ−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ２）は、真核生物翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅに対する結合親和性が異なる。どちらのホスホロチオエートキャップ類似体も、従来の５'末端キャップを有するＲＮＡよりもｅＩＦ４Ｅに対してより高い親和性を有する。さらに、Ｄｃｐ２切断に対する安定性の上昇はＨＣ１１細胞におけるタンパク質発現の上昇と相関することが示された。特に、β−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ２）キャップを担持するＲＮＡは、β−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ１）キャップを担持するＲＮＡよりもＨＣ１１細胞においてより効率的に翻訳されることが示された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】独国特許発明第  １０  ２００８  ０６１  ５２２．６号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｗｏｌｆｆら，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：１４６５−１４６８
【非特許文献２】Ｃｏｘら，１９９３，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：５６６４−５６６７
【非特許文献３】Ｄａｖｉｓら，１９９３，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２：１８４７−１８５１
【非特許文献４】Ｕｌｍｅｒら，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１７４５−１７４９
【非特許文献５】Ｗａｎｇら，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：４１５６−４１６０
【非特許文献６】Ｃｏｎｒｙら，１９９４，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：１１６４−１１６８
【非特許文献７】Ｃｏｎｒｙら，１９９５，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：５９−６５
【非特許文献８】Ｓｐｏｏｎｅｒら，１９９５，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：１７３−１８０
【非特許文献９】Ｗａｎｇら，１９９５，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．６：４０７−４１８
【非特許文献１０】Ｇｉｌｋｅｓｏｎら，１９９５，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５：１３９８−１４０２
【非特許文献１１】Ｂａｒｇｍａｎｎら，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ  ３１９：２２６−２３０
【非特許文献１２】Ｇｒｅｅｎｂｌａｔｔら，１９９４，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：４８５５−４８７８
【非特許文献１３】Ｃｏｎｄｏｎら，１９９６，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：１１２２−１１２８
【非特許文献１４】Ｔａｎｇら，１９９２，Ｎａｔｕｒｅ  ３５６：１５２−１５４
【非特許文献１５】Ｈｏｅｒｒら，２０００，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：１−７
【非特許文献１６】Ｙｉｎｇら，１９９９，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：８２３−８２７
【非特許文献１７】Ｈｏｅｒｒら，２０００，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：１−７
【非特許文献１８】Ｈｅｉｓｅｒら，２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：５５０８−５５１４
【非特許文献１９】Ｓｕら，２００３，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：２１２７−２１３３
【非特許文献２０】Ｈｅｉｓｅｒら，２００２，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０９：４０９−４１７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
要約すると、ＲＮＡは臨床適用に特に良好に適する。しかし、遺伝子治療およびＲＮＡワクチン接種におけるＲＮＡの使用は、主として、低いおよび／または不十分なタンパク質発現をもたらす、ＲＮＡの短い半減期、特に細胞質における短い半減期によって制限される。
【００１２】
従って、ＲＮＡワクチン接種のためには、抗原提示細胞におけるＲＮＡの安定性を高めることが特に重要である。リンパ節に注入された裸のＲＮＡは、主として未熟抗原提示細胞によって、特に未熟樹状細胞によって取り込まれるので、未熟抗原提示細胞におけるＲＮＡの安定性を高めることがＲＮＡワクチン接種に関連して特に重要である。従って、ＲＮＡワクチン接種に特に適するＲＮＡを提供する、すなわち、特に未熟抗原提示細胞においてＲＮＡを安定化する手段を提供することが本発明の目的である。この技術的な問題は、特許請求の範囲の内容により本発明に従って解決される。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
第１の態様では、本発明は、式（Ｉ）：
【化１】
0006042481.tif 000002
［式中、Ｒ１は、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアリール、および任意に置換されたヘテロアリールから成る群より選択され、
Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、ハロ、ＯＨおよび任意に置換されたアルコキシから成る群より独立して選択されるか、またはＲ２とＲ３は、一緒になってＯ−Ｘ−Ｏ［式中、Ｘは、任意に置換されたＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）およびＣ（ＣＨ３）２から成る群より選択される。］を形成するか、またはＲ２は、Ｒ２が結合して−Ｏ−ＣＨ２−もしくは−ＣＨ２−Ｏ−を形成する環の４'位で水素原子と結合しており、
Ｒ５は、Ｓ、ＳｅおよびＢＨ３から成る群より選択され、
Ｒ４およびＲ６は、Ｏ、Ｓ、ＳｅおよびＢＨ３から成る群より独立して選択され、
ｎは１、２または３であり、
置換基Ｒ５を含むＰ原子における立体化学的配置は、β−Ｓ−ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマーのＰβ原子における立体化学的配置に対応する。］
に従った５'末端キャップ構造で修飾されたＲＮＡを含有するワクチン組成物を提供する。
【００１４】
好ましい実施形態では、５'末端キャップ構造は、前記ＲＮＡを未熟抗原提示細胞に導入したとき、式（Ｉ）による５'末端キャップ構造を有さない同じＲＮＡと比較して、ＲＮＡの安定性を高める、ＲＮＡの翻訳効率を高める、ＲＮＡの翻訳を延長させる、ＲＮＡの総タンパク質発現を増大させる、および／または前記ＲＮＡによってコードされる抗原もしくは抗原ペプチドに対する免疫応答を増大させることができる。
【００１５】
好ましい実施形態では、Ｒ１は、任意に置換されたＣ１−Ｃ４アルキル、任意に置換されたＣ２−Ｃ４アルケニル、および任意に置換されたアリールから成る群より選択される。
【００１６】
好ましい実施形態では、Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、Ｆ、ＯＨ、メトキシ、エトキシおよびプロポキシから成る群より独立して選択される。
【００１７】
特に好ましい実施形態では、ＲＮＡの５'末端キャップはβ−Ｓ−ＡＲＣＡのジアステレオマーＤ１である。
【００１８】
好ましくは、ワクチン組成物は結節内注入用に製剤される。
【００１９】
第２の態様では、本発明は、式（Ｉ）：
【化２】
0006042481.tif 000003
［式中、Ｒ１は、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアリール、および任意に置換されたヘテロアリールから成る群より選択され、
Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、ハロ、ＯＨおよび任意に置換されたアルコキシから成る群より独立して選択されるか、またはＲ２とＲ３は、一緒になってＯ−Ｘ−Ｏ［式中、Ｘは、任意に置換されたＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）およびＣ（ＣＨ３）２から成る群より選択される。］を形成するか、またはＲ２は、Ｒ２が結合して−Ｏ−ＣＨ２−もしくは−ＣＨ２−Ｏ−を形成する環の４'位で水素原子と結合しており、
Ｒ５は、Ｓ、ＳｅおよびＢＨ３から成る群より選択され、
Ｒ４およびＲ６は、Ｏ、Ｓ、ＳｅおよびＢＨ３から成る群より独立して選択され、
ｎは１、２または３であり、
置換基Ｒ５を含むＰ原子における立体化学的配置は、β−Ｓ−ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマーのＰβ原子における立体化学的配置に対応する。］
に従った５'末端キャップ構造で修飾されたＲＮＡを含有する未熟抗原提示細胞を提供する。
【００２０】
第３の態様では、本発明は、個体において免疫応答を誘発する方法であって、本発明の最初の態様のワクチン組成物または本発明の２番目の態様の未熟抗原提示細胞を前記個体に投与するステップを含む方法を提供する。
【００２１】
第４の態様では、本発明は、未熟抗原提示細胞におけるＲＮＡの安定性を高めるおよび／または未熟抗原提示細胞におけるＲＮＡの発現を高める方法であって、
式（Ｉ）：
【化３】
0006042481.tif 000004
［式中、Ｒ１は、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアリール、および任意に置換されたヘテロアリールから成る群より選択され、
Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、ハロ、ＯＨおよび任意に置換されたアルコキシから成る群より独立して選択されるか、またはＲ２とＲ３は、一緒になってＯ−Ｘ−Ｏ［式中、Ｘは、任意に置換されたＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）およびＣ（ＣＨ３）２から成る群より選択される。］を形成するか、またはＲ２は、Ｒ２が結合して−Ｏ−ＣＨ２−もしくは−ＣＨ２−Ｏ−を形成する環の４'位で水素原子と結合しており、
Ｒ５は、Ｓ、ＳｅおよびＢＨ３から成る群より選択され、
Ｒ４およびＲ６は、Ｏ、Ｓ、ＳｅおよびＢＨ３から成る群より独立して選択され、
ｎは１、２または３であり、
置換基Ｒ５を含むＰ原子における立体化学的配置は、β−Ｓ−ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマーのＰβ原子における立体化学的配置に対応する。］
に従った５'末端キャップ構造を有する前記ＲＮＡを準備すること、ならびに
前記ＲＮＡを導入した未熟抗原提示細胞を準備すること
を含む方法を提供する。
【００２２】
第５の態様では、本発明は、抗原提示細胞の表面に対象とする抗原を提示するＭＨＣ分子の割合を増大させる方法であって、
前記の対象とする抗原またはその抗原ペプチドを含むペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、式（Ｉ）：
【化４】
0006042481.tif 000005
［式中、Ｒ１は、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアリール、および任意に置換されたヘテロアリールから成る群より選択され、
Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、ハロ、ＯＨおよび任意に置換されたアルコキシから成る群より独立して選択されるか、またはＲ２とＲ３は、一緒になってＯ−Ｘ−Ｏ［式中、Ｘは、任意に置換されたＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）およびＣ（ＣＨ３）２から成る群より選択される。］を形成するか、またはＲ２は、Ｒ２が結合して−Ｏ−ＣＨ２−もしくは−ＣＨ２−Ｏ−を形成する環の４'位で水素原子と結合しており、
Ｒ５は、Ｓ、ＳｅおよびＢＨ３から成る群より選択され、
Ｒ４およびＲ６は、Ｏ、Ｓ、ＳｅおよびＢＨ３から成る群より独立して選択され、
ｎは１、２または３であり、
置換基Ｒ５を含むＰ原子における立体化学的配置は、β−Ｓ−ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマーのＰβ原子における立体化学的配置に対応する。］
に従った５'末端キャップ構造で修飾されたＲＮＡを準備すること、ならびに
前記ＲＮＡを導入した未熟抗原提示細胞を準備すること
を含む方法を提供する。
【００２３】
第６の態様では、本発明は、免疫エフェクター細胞を刺激するおよび／または活性化するための方法であって、
対象とする抗原またはその抗原ペプチドを含むペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、式（Ｉ）：
【化５】
0006042481.tif 000006
［式中、Ｒ１は、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアリール、および任意に置換されたヘテロアリールから成る群より選択され、
Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、ハロ、ＯＨおよび任意に置換されたアルコキシから成る群より独立して選択されるか、またはＲ２とＲ３は、一緒になってＯ−Ｘ−Ｏ［式中、Ｘは、任意に置換されたＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）およびＣ（ＣＨ３）２から成る群より選択される。］を形成するか、またはＲ２は、Ｒ２が結合して−Ｏ−ＣＨ２−もしくは−ＣＨ２−Ｏ−を形成する環の４'位で水素原子と結合しており、
Ｒ５は、Ｓ、ＳｅおよびＢＨ３から成る群より選択され、
Ｒ４およびＲ６は、Ｏ、Ｓ、ＳｅおよびＢＨ３から成る群より独立して選択され、
ｎは１、２または３であり、
置換基Ｒ５を含むＰ原子における立体化学的配置は、β−Ｓ−ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマーのＰβ原子における立体化学的配置に対応する。］
に従った５'末端キャップ構造で修飾されたＲＮＡを準備すること、
前記ＲＮＡを導入した未熟抗原提示細胞を準備すること、ならびに
抗原提示細胞を免疫エフェクター細胞と接触させること
を含む方法を提供する。
【００２４】
抗原提示細胞を免疫エフェクター細胞と接触させることは、インビトロまたはインビボで実施され得る。
【００２５】
第７の態様では、本発明は、個体において免疫応答を誘導する方法であって、
対象とする抗原またはその抗原ペプチドを含むペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、式（Ｉ）：
【化６】
0006042481.tif 000007
［式中、Ｒ１は、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアリール、および任意に置換されたヘテロアリールから成る群より選択され、
Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、ハロ、ＯＨおよび任意に置換されたアルコキシから成る群より独立して選択されるか、またはＲ２とＲ３は、一緒になってＯ−Ｘ−Ｏ［式中、Ｘは、任意に置換されたＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）およびＣ（ＣＨ３）２から成る群より選択される。］を形成するか、またはＲ２は、Ｒ２が結合して−Ｏ−ＣＨ２−もしくは−ＣＨ２−Ｏ−を形成する環の４'位で水素原子と結合しており、
Ｒ５は、Ｓ、ＳｅおよびＢＨ３から成る群より選択され、
Ｒ４およびＲ６は、Ｏ、Ｓ、ＳｅおよびＢＨ３から成る群より独立して選択され、
ｎは１、２または３であり、
置換基Ｒ５を含むＰ原子における立体化学的配置は、β−Ｓ−ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマーのＰβ原子における立体化学的配置に対応する。］
に従った５'末端キャップ構造で修飾されたＲＮＡを準備すること、ならびに
前記ＲＮＡを前記個体に投与すること
を含む方法を提供する。
【００２６】
好ましい実施形態では、ＲＮＡはリンパ節内注入によって投与される。
【００２７】
第８の態様では、本発明は、個体において免疫応答を誘導する方法であって、
対象とする抗原またはその抗原ペプチドを含むペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、式（Ｉ）：
【化７】
0006042481.tif 000008
［式中、Ｒ１は、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアリール、および任意に置換されたヘテロアリールから成る群より選択され、
Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、ハロ、ＯＨおよび任意に置換されたアルコキシから成る群より独立して選択されるか、またはＲ２とＲ３は、一緒になってＯ−Ｘ−Ｏ［式中、Ｘは、任意に置換されたＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）およびＣ（ＣＨ３）２から成る群より選択される。］を形成するか、またはＲ２は、Ｒ２が結合して−Ｏ−ＣＨ２−もしくは−ＣＨ２−Ｏ−を形成する環の４'位で水素原子と結合しており、
Ｒ５は、Ｓ、ＳｅおよびＢＨ３から成る群より選択され、
Ｒ４およびＲ６は、Ｏ、Ｓ、ＳｅおよびＢＨ３から成る群より独立して選択され、
ｎは１、２または３であり、
置換基Ｒ５を含むＰ原子における立体化学的配置は、β−Ｓ−ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマーのＰβ原子における立体化学的配置に対応する。］
に従った５'末端キャップ構造で修飾されたＲＮＡを準備すること、
前記ＲＮＡを導入した未熟抗原提示細胞を準備すること、ならびに
抗原提示細胞を前記個体に投与すること
を含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】５'末端キャップジヌクレオチドの構造を示す図である。逆相ＨＰＬＣでの溶出特徴に従ってＤ１およびＤ２と称される、Ｐ立体中心によるホスホロチオエートキャップ類似体β−Ｓ−ＡＲＣＡの２つのジアステレオマーが存在する。
【図２】樹状細胞におけるタンパク質発現への５'末端キャップ構造の作用を示す図である。（Ａ）未熟および成熟樹状細胞（それぞれｉＤＣおよびｍＤＣ）を、様々なキャップジヌクレオチド（示されているような）の存在下で転写された５'末端キャップ構造、またはワクシニアウイルスのキャッピング酵素（ｍ７ＧｐｐｐＧ（ｐ．−ｔ．））を使用して転写後に５'末端キャップが組み込まれた５'末端キャップ構造、ルシフェラーゼをコードする同じ量のＲＮＡで電気穿孔した５'末端キャップ構造。２、４、８、２４、４８および７２時間後にルシフェラーゼ活性（ＲＬＵで示す）を２回測定した。平均±標準偏差で示している。（Ｂ）ｉＤＣおよびｍＤＣを、（Ａ）で述べたように調製した、ｄ２ｅＧＦＰをコードする同じ量のＲＮＡで電気穿孔した。２、４、８、２４、４８および７２時間後に細胞を採取し、フローサイトメトリーを用いてｄ２ｅＧＦＰ蛍光（ＭＦＩで示す）を測定した。
【図３】ＡＲＣＡキャップＲＮＡとβ−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ１）キャップＲＮＡとの間での翻訳の競合を示す図である。未熟樹状細胞（ｉＤＣ）を、（Ａ）ルシフェラーゼをコードする漸増量のＲＮＡまたは（Ｂ）指示されているようにＡＲＣＡもしくはβ−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ１）のいずれかで共転写的にキャップした、ルシフェラーゼおよびｄ２ｅＧＦＰをコードする指示量のｍＲＮＡで電気穿孔した。２、４、８、２４、４８および７２時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。（Ａ）４０ｐｍｏｌと２０ｐｍｏｌのルシフェラーゼをコードするＲＮＡによる電気穿孔後に得られたルシフェラーゼ活性の比（２つの独立した実験の±ＳＤ）、ならびに（Ｂ）ＲＮＡなしにルシフェラーゼをコードするＲＮＡだけで電気穿孔した細胞（ＡＲＣＡキャップＲＮＡおよびβ−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ１）キャップＲＮＡの両方について１に設定した）と比較した相対的ルシフェラーゼ活性を示す。
【図４】樹状細胞におけるｍＲＮＡの安定性への５'末端キャップの影響を示す図である。（Ａ）未熟樹状細胞（ｉＤＣ）および成熟樹状細胞（ｍＤＣ）を、指示されている種々のキャップ類似体の存在下で転写されたｄ２ｅＧＦＰをコードする等しい量のｍＲＮＡで電気穿孔した。２、４、８、２４、４８および７２時間後に細胞を採取し、ｄ２ｅＧＦＰ転写産物レベルをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量した。各時点について、ｄ２ｅＧＦＰをコードするＲＮＡと、内部対照として使用したヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ１）の閾値サイクル数（Ｃｔ）の差を示す。データを二相性減衰（ｉＤＣ；図４Ａ）または単相性減衰（ｍＤＣ；図４Ｂ）に適合させた。
【図５】インビボでのタンパク質発現への５'末端キャップ構造の作用を示す図である。マウス（ｎ＝９）に、５'末端にＡＲＣＡまたはβ−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ１）を有する（指示されているように）、ルシフェラーゼをコードする同じ量のＲＮＡを結節内注射した。２、４、８、２４、４８および７２時間後にルシフェラーゼ活性（ＲＬＵで示す）を測定した。（Ａ）ＡＲＣＡまたはβ−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ１）ＲＮＡを注射した代表的マウスの指示時点での動物全体の画像を示す。光子数は図に示すグレースケールに対応して表示されている。（Ｂ）時間的経過に従って測定した平均±平均の標準誤差。統計解析を用いて有意性を決定した（＊：Ｐ＜０．００５および＊＊：Ｐ＜  ０．０２）。
【図６】ＲＮＡによる結節内免疫後のＴ細胞の新たなプライミングへの５'末端キャップ構造の作用を示す図である。マウス（ｎ＝５）を、５'末端にＡＲＣＡまたはβ−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ１）のいずれかを担持する、特異的ペプチド抗原をコードする同じ量のＲＮＡの１日２回（０日目と３日目）の結節内注射によって免疫した。テトラマー陽性ＣＤ８＋細胞の頻度を、テトラマー解析を用いて８日目に測定した。（Ａ）ＡＲＣＡまたはβ−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ１）ＲＮＡで免疫した（指示されているように）マウスの末梢血および脾臓からの細胞の代表的なドットプロット。（Ｂ）８日目に測定したテトラマー陽性ＣＤ８＋細胞の平均数±平均の標準誤差（％）。統計解析を用いて有意性を決定した（＊：Ｐ＜０．０７５）。
【図７】ｍ２７，２'−ＯＧｐｐＳｐＧ（Ｄ１）および（Ｄ２）（すなわちβ−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ１）および（Ｄ２））のＨＰＬＣ分析を示す図である。β−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ１）：（Ｄ２）のモル比が１：３のジアステレオマー混合物の分析ＨＰＬＣを、Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ  ＬＣ−１８−Ｔ  ＲＰカラム（５μｍ、４．６×２５０ｍｍ、流速：１．３ｍｌ／分）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  １２００  Ｓｅｒｉｅｓ装置で、１５分以内に０．０５Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ＝５．９中のメタノールの０〜２５％直線勾配を用いて実施した。ＵＶ検出（ＶＷＤ）を２６０ｎｍで実施し、蛍光検出（ＦＬＤ）を２８０ｎｍでの励起および３３７ｎｍでの検出で実施した。保持時間：β−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ１）＝１０．４分。β−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ２）＝１０．７分。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明を以下で詳細に説明するが、手順、プロトコールおよび試薬は異なり得るので、本発明は、本明細書で述べる特定の方法、プロトコールおよび試薬に限定されないことが了解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することだけを目的とし、本発明の範囲を限定することを意図されず、本発明の範囲は付属の特許請求の範囲によってのみ限定されることも了解されるべきである。特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および学術用語は、当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００３０】
以下では、本発明の要素を説明する。これらの要素は特定の実施形態と共に列挙されるが、それらは、さらなる実施形態を創造するために任意の方法および任意の数で組み合され得ることが了解されるべきである。様々な記述される実施例および好ましい実施形態は、本発明を、明白に記述された実施形態だけに限定すると解釈されるべきではない。この説明は、明白に記述された実施形態を多くの開示されたおよび／または好ましい要素と組み合わせた実施形態を支持し、包含することが了解されるべきである。さらに、本出願において記述されるすべての要素の任意の順序および組合せが、文脈によって特に指示されない限り、本出願の記述によって開示されるとみなされるべきである。例えば、１つの好ましい実施形態において５'末端キャップ構造のＲ２がメトキシであり、別の好ましい実施形態では５'末端キャップ構造のＲ５がＳである場合、１つの好ましい実施形態では、５'末端キャップ構造のＲ２はメトキシであり、およびＲ５はＳである。
【００３１】
好ましくは、本明細書で使用される用語は、「Ａ  ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｕａｌ  ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｅｒｍｓ：（ＩＵＰＡＣ  Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ）」，Ｈ．Ｇ．Ｗ．Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｂ．Ｎａｇｅｌ，ａｎｄ  Ｈ．Ｋｏｌｂｌ，Ｅｄｓ．，Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，ＣＨ−４０１０  Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，（１９９５）に記載されているように定義される。
【００３２】
本発明の実施には、特に指示されない限り、当技術分野の文献（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋらｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  １９８９）において説明される化学、生化学および組換えＤＮＡ技術の従来の方法を使用する。
【００３３】
本明細書および以下の特許請求の範囲全体を通して、文脈によって特に求められない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語ならびに「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」などの変形は、記載される成員、整数または段階または成員、整数もしくは段階の群の包含を意味するが、任意の他の成員、整数または段階または成員、整数もしくは段階の群の排除を意味しないことが了解される。「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」という用語ならびに本発明を説明することに関連して（特に特許請求の範囲に関連して）使用される同様の言及は、本明細書で特に指示されない限りまたは文脈によって明らかに矛盾しない限り、単数と複数の両方を包含すると解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、単にその範囲内に含まれる各々別個の値を個別に言及する省略方法としての役割を果たすことが意図されている。本明細書で特に指示されない限り、各々個別の値は、本明細書で個別に列挙されているかのごとくに本明細書に組み込まれる。本明細書で述べるすべての方法は、本明細書で特に指示されない限りまたは文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施できる。本明細書で提供されるありとあらゆる例または例示的な言語（例えば、「など」）の使用は、単に本発明をよりよく説明することを意図されており、特許請求される本発明の範囲に限定を課すものではない。本明細書中のいかなる言語も、本発明の実施に必須の特許請求されない要素を指示すると解釈されるべきではない。
【００３４】
本明細書の記載全体を通していくつかの資料が引用される。上記または下記で、本明細書において引用する資料（すべての特許、特許出願、学術出版物、製造者の仕様書、指示書等を含む）の各々は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書中のいかなる内容も、本発明が、先行発明のためにそのような開示に先行する権利を有さないことの承認と解釈されるべきではない。
【００３５】
本発明によれば、「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、それらの組合せおよびそれらの修飾形態を含む。この用語は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、組換え生産された分子および化学的に合成された分子を含む。本発明によれば、核酸は、一本鎖または二本鎖としておよび線状または共有結合閉環状分子として存在し得る。核酸は、本発明によれば、単離され得る。「単離された核酸」という用語は、本発明によれば、核酸が、（ｉ）インビトロで、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅された、（ｉｉ）クローニングによって組換え生産された、（ｉｉｉ）例えば切断とゲル電気泳動による分離によって、精製された、または（ｉｖ）例えば化学合成によって、合成されたことを意味する。
【００３６】
本発明に関連して、「ＲＮＡ」という用語は、少なくとも１個のリボヌクレオチド残基を含む分子に関する。「リボヌクレオチド」は、β−Ｄ−リボフラノシル基の２'位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドに関する。この用語は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、部分的にまたは完全に精製されたＲＮＡなどの単離されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、１またはそれ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または変化によって天然に生じるＲＮＡとは異なる修飾されたＲＮＡなどの組換え生成されたＲＮＡを含む。「ｍＲＮＡ」という用語は「メッセンジャーＲＮＡ」を意味し、ＤＮＡ鋳型を使用することによって生成され、ペプチドまたはタンパク質をコードする「転写産物」に関する。典型的には、ｍＲＮＡは、５'ＵＴＲ、タンパク質コード領域および３'ＵＴＲを含む。ｍＲＮＡは、細胞においておよびインビトロで限られた半減期しか有さない。本発明に関連して、ｍＲＮＡはＤＮＡ鋳型からインビトロ転写によって生成され得る。インビトロ転写の方法は当業者に公知である。例えば、様々なインビトロ転写キットが市販されている。本発明に関連して、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡは、５'末端キャップ構造で修飾されている。
【００３７】
好ましい実施形態では、本発明によるＲＮＡは、１もしくはそれ以上の抗原および／または１もしくはそれ以上の抗原ペプチドを含むペプチドまたはタンパク質をコードし、特に未熟抗原提示細胞などの細胞に導入された場合、１もしくはそれ以上の抗原および／または１もしくはそれ以上の抗原ペプチドを含む前記ペプチドまたはタンパク質を発現することができる。ＲＮＡはまた、免疫刺激エレメントなどの他のポリペプチド配列をコードする配列も含み得る。さらに、ＲＮＡは、発現の調節に関与するエレメント（例えば５'ＵＴＲまたは３'ＵＴＲ配列等）を含み得る。
【００３８】
本発明において使用されるＲＮＡに関連して「修飾」という用語は、前記ＲＮＡ中に天然では存在しないＲＮＡの任意の修飾を包含する。特に、修飾という用語は、ＲＮＡに、式（Ｉ）に示す構造を有する５'末端キャップ類似体を提供することに関する。例えば、ＲＮＡに５'末端キャップ類似体を提供することは、前記５'末端キャップ類似体の存在下でのＤＮＡ鋳型のインビトロ転写によって実施でき、前記５'末端キャップは生成されたＲＮＡ鎖に共転写的に組み込まれ、または、例えばインビトロ転写によってＲＮＡを生成し、キャッピング酵素、例えばワクシニアウイルスのキャッピング酵素を用いて転写後に５'末端キャップをＲＮＡに結合し得る。ＲＮＡはさらなる修飾を含み得る。例えば、本発明で使用されるＲＮＡ、好ましくは本発明で使用されるｍＲＮＡのさらなる修飾は、天然に生じるポリ（Ａ）尾部の伸長もしくは末端切断または前記ＲＮＡ、好ましくは前記ｍＲＮＡのコード領域に関連しない非翻訳領域（ＵＴＲ）の導入などの５'ＵＴＲもしくは３'ＵＴＲの変化、例えばグロビン遺伝子、例えばα２グロビン、α１グロビン、βグロビン、好ましくはβ−グロビン、より好ましくはヒトβグロビンに由来する３'ＵＴＲと既存の３'ＵＴＲの交換または前記グロビン遺伝子由来の３'ＵＴＲの１またはそれ以上、好ましくは２コピーの挿入であり得る。
【００３９】
「５'末端キャップ」という用語は、ｍＲＮＡ分子の５'末端に認められるキャップ構造を指し、一般に、異例の５'−５'三リン酸結合を介してｍＲＮＡに連結されたグアノシンヌクレオチドから成る。１つの実施形態では、このグアノシンは７位でメチル化されている。「従来の５'末端キャップ」という用語は、天然に生じるＲＮＡの５'末端キャップ、好ましくは７−メチルグアノシンキャップ（ｍ７Ｇ）を指す。本発明に関連して、「５'末端キャップ」という用語は、ＲＮＡキャップ構造に類似し、好ましくはインビボで、好ましくは未熟抗原提示細胞において、最も好ましくは未熟樹状細胞において、ＲＮＡに結合された場合そのＲＮＡを安定化する能力を有するように修飾された５'末端キャップ類似体を包含する。本発明において使用される５'末端キャップは、式（Ｉ）による構造を示す。
【００４０】
本発明に関連して、「ワクチン組成物」という用語は、ＲＮＡを含有する抗原製剤に関する。ワクチン組成物は、１またはそれ以上の抗原に対する個体の体液性および／または細胞性免疫系を刺激するために受容者に投与される。これに関連して、ＲＮＡは、前記抗原もしくは抗原ペプチドを含む抗原、タンパク質またはペプチドをコードし得る。本発明に関連してワクチン組成物は１またはそれ以上のアジュバント、希釈剤、担体および／または賦形剤等をさらに含有してよく、抗原に対する防御および／または治療的免疫反応を誘発するために任意の適切な経路で個体に適用される。
【００４１】
本発明による投与、特にワクチン組成物の形態での投与のために、ＲＮＡは、裸のＲＮＡであり得るかまたは担体、例えばリポソームもしくは遺伝子導入のための他の粒子に組み込まれてよく、好ましくは裸のＲＮＡの形態である。
【００４２】
本発明による「抗原」は、免疫応答を誘発する任意の物質を包含する。特に、「抗原」は、抗体またはＴリンパ球（Ｔ細胞）と特異的に反応する任意の物質に関する。本発明によれば、「抗原」という用語は、少なくとも１つのエピトープを含む任意の分子を包含する。好ましくは、本発明に関連して抗原は、場合によりプロセシング後に、好ましくは抗原に対して特異的な、免疫反応を誘導する分子である。本発明によれば、免疫反応のための候補物質である、任意の適切な抗原を使用してよく、前記免疫反応は体液性ならびに細胞性免疫反応の両方であり得る。本発明の実施形態に関連して、抗原は、好ましくは細胞によって、好ましくは、ＭＨＣ分子との関連で、抗原に対する免疫反応を生じさせる抗原提示細胞によって提示される。抗原は、好ましくは天然に生じる抗原に対応するまたは天然に生じる抗原に由来する生成物である。そのような天然に生じる抗原は、アレルゲン、ウイルス、細菌、真菌、寄生生物および他の感染性因子および病原体を含み得るもしくはそれらに由来し得るか、または抗原は腫瘍抗原であってもよい。本発明によれば、抗原は天然に生じる生成物、例えばウイルスタンパク質またはその一部に対応し得る。
【００４３】
好ましい実施形態では、抗原は、腫瘍抗原、すなわち細胞質、細胞表面または細胞核に由来し得る腫瘍細胞の一部、特に主として細胞内でまたは腫瘍細胞の表面抗原として生じるものである。例えば、腫瘍抗原は、癌胎児性抗原、α１フェトプロテイン、イソフェリチンおよび胎児性スルホグリコプロテイン、α２−Ｈ−フェロプロテインおよびγフェトプロテインならびに様々なウイルス性腫瘍抗原を含む。本発明によれば、腫瘍抗原は、好ましくは腫瘍または癌に特徴的な、ならびに型および／または発現レベルに関して腫瘍細胞または癌細胞に特徴的な任意の抗原を含む。別の実施形態では、抗原は、ウイルス性リボ核タンパク質またはコートタンパク質などのウイルス抗原である。特に、抗原はＭＨＣ分子によって提示されるべきであり、それにより、特にＴ細胞受容体の活性の調節を介した、免疫系の細胞、好ましくはＣＤ４＋およびＣＤ８＋リンパ球の調節、特に活性化を生じさせる。
【００４４】
好ましい実施形態では、抗原は腫瘍抗原であり、本発明は、そのような腫瘍抗原を発現し、好ましくはＭＨＣクラスＩと共にそのような腫瘍抗原を提示する腫瘍細胞に対する抗腫瘍ＣＴＬ応答を刺激することを含む。
【００４５】
「免疫原性」という用語は、免疫反応を誘導するための抗原の相対的有効性に関する。
【００４６】
「病原体」という用語は、病原性微生物に関し、ウイルス、細菌、真菌、単細胞生物および寄生生物を含む。病原性ウイルスの例としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、ＨＢＶ、ＨＣＶ、パピローマウイルスおよびヒトＴリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ）がある。単細胞生物は、マラリア原虫、トリパノソーマ、アメーバ等を含む。
【００４７】
本発明において使用し得る抗原の例としては、ｐ５３、ＡＲＴ−４、ＢＡＧＥ、ｓｓ−カテニン／ｍ、Ｂｃｒ−ａｂＬ  ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ−１、ＣＡＳＰ−８、ＣＤＣ２７／ｍ、ＣＤＫ４／ｍ、ＣＥＡ、ＣＬＡＵＤＩＮ−１２、ｃ−ＭＹＣ、ＣＴ、Ｃｙｐ−Ｂ、ＤＡＭ、ＥＬＦ２Ｍ、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１、Ｇ２５０、ＧＡＧＥ、ＧｎＴ−Ｖ、Ｇａｐ１００、ＨＡＧＥ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＨＰＶ−Ｅ７、ＨＰＶ−Ｅ６、ＨＡＳＴ−２、ｈＴＥＲＴ（またはｈＴＲＴ）、ＬＡＧＥ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、ＭＡＧＥ−Ａ、好ましくはＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１またはＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ｂ、ＭＡＧＥ−Ｃ、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ＭＣ１Ｒ、Ｍｙｏｓｉｎ／ｍ、ＭＵＣ１、ＭＵＭ−１、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、ＮＡ８８−Ａ、ＮＦ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＮＹ−ＢＲ−１、ｐ１９０マイナーＢＣＲ−ａｂＬ、Ｐｌａｃ−１、Ｐｍ１／ＲＡＲａ、ＰＲＡＭＥ、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ３、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＲＡＧＥ、ＲＵ１またはＲＵ２、ＳＡＧＥ、ＳＡＲＴ−１またはＳＡＲＴ−３、ＳＣＧＢ３Ａ２、ＳＣＰ１、ＳＣＰ２、ＳＣＰ３、ＳＳＸ、ＳＵＲＶＩＶＩＮ、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＴＰＩ／ｍ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＴＲＰ−２／ＩＮＴ２、ＴＰＴＥおよびＷＴ、好ましくはＷＴ−１がある。
【００４８】
本発明による「抗原の一部またはフラグメント」または「抗原ペプチド」は、好ましくは抗原の不完全な形態（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）であり、抗原に対する免疫応答を誘発することができる。
【００４９】
これに関連して、本発明はまた、本明細書では「抗原ペプチド」とも称される、抗原に由来するアミノ酸配列を含むペプチドを使用する。「抗原ペプチド」または「抗原に由来する抗原ペプチド」とは、抗原のフラグメントまたはペプチドのアミノ酸配列に実質的に対応するアミノ酸配列を含むオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。抗原ペプチドは任意の長さであってよい。
【００５０】
好ましくは、抗原ペプチドは、抗原、または抗原の発現および好ましくは抗原の提示を特徴とする細胞に対する免疫応答、好ましくは細胞性応答を刺激することができる。好ましくは、抗原ペプチドは、ＭＨＣクラスＩと共に抗原を提示することを特徴とする細胞に対する細胞性応答を刺激することができ、好ましくは抗原応答性ＣＴＬを刺激することができる。好ましくは、本発明による抗原ペプチドは、ＭＨＣクラスＩおよび／もしくはクラスＩＩ提示ペプチドであるか、またはＭＨＣクラスＩおよび／もしくはクラスＩＩ提示ペプチドを産生するようにプロセシングされ得る。好ましくは、抗原ペプチドは、抗原のフラグメントのアミノ酸配列に実質的に対応するアミノ酸配列を含む。好ましくは、抗原の前記フラグメントは、ＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ提示ペプチドである。好ましくは、本発明による抗原ペプチドは、そのようなフラグメントのアミノ酸配列に実質的に対応するアミノ酸配列を含み、そのようなフラグメント、すなわち抗原に由来するＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ提示ペプチドを産生するようにプロセシングされる。
【００５１】
抗原ペプチドが直接、すなわちプロセシングされずに、特に切断されずに提示される場合、その抗原ペプチドはＭＨＣ分子、特にＭＨＣクラスＩ分子に結合するのに適した長さを有し、好ましくは７〜２０アミノ酸長、より好ましくは７〜１２アミノ酸長、より好ましくは８〜１１アミノ酸長、特に９または１０アミノ酸長である。好ましくは、直接提示される抗原ペプチドの配列は抗原のアミノ酸配列に由来する、すなわちその配列は抗原のフラグメントに実質的に対応し、好ましくは完全に同一である。
【００５２】
抗原ペプチドがプロセシング後に、特に切断後に提示される場合、プロセシングによって生成されるペプチドは、ＭＨＣ分子、特にＭＨＣクラスＩ分子に結合するのに適した長さを有し、好ましくは７〜２０アミノ酸長、より好ましくは７〜１２アミノ酸長、より好ましくは８〜１１アミノ酸長、特に９または１０アミノ酸長である。好ましくは、プロセシング後に提示されるペプチドの配列は抗原のアミノ酸配列に由来する、すなわちその配列は抗原のフラグメントに実質的に対応し、好ましくは完全に同一である。従って、本発明による抗原ペプチドは、１つの実施形態では、抗原のフラグメントに実質的に対応し、好ましくは完全に同一である、７〜２０アミノ酸長、より好ましくは７〜１２アミノ酸長、より好ましくは８〜１１アミノ酸長、特に９または１０アミノ酸長の配列を含み、抗原ペプチドのプロセシング後に、提示されるペプチドを形成する。しかし、抗原ペプチドはまた、上記で述べた配列よりもさらに一層長い抗原のフラグメントに実質的に対応し、好ましくは完全に同一である配列も含み得る。１つの実施形態では、抗原ペプチドは抗原の配列全体を含み得る。
【００５３】
ＭＨＣクラスＩによって提示されるペプチドの配列に実質的に対応するアミノ酸配列を有するペプチドは、ＭＨＣクラスＩによって提示されるペプチドのＴＣＲ認識のためまたはＭＨＣへのペプチド結合のために必須ではない１またはそれ以上の残基において異なり得る。そのような実質的に対応するペプチドはまた、抗原応答性ＣＴＬを刺激することができる。ＴＣＲ認識には影響を及ぼさないが、ＭＨＣへの結合の安定性を改善する残基での提示ペプチドとは異なるアミノ酸配列を有するペプチドは、抗原ペプチドの免疫原性を改善することができ、本明細書では「最適化ペプチド」と称され得る。これらの残基のいずれが、ＭＨＣまたはＴＣＲのどちらかへの結合に影響を及ぼす可能性がより高いと考えられるかについての既存の知識を利用して、実質的に対応するペプチドの設計への合理的なアプローチを使用し得る。機能性である生じたペプチドは抗原ペプチドとして企図される。
【００５４】
「抗原プロセシング」は、抗原のフラグメントへの分解（例えばタンパク質のペプチドへの分解）および「抗原提示細胞」による特異的Ｔ細胞への提示のためのこれらのフラグメントの１またはそれ以上とＭＨＣ分子との会合（例えば結合による）を指す。
【００５５】
「抗原応答性ＣＴＬ」とは、抗原提示細胞の表面にＭＨＣクラスＩと共に提示される、抗原または前記抗原に由来するペプチドに対して応答性であるＣＤ８＋Ｔ細胞を意味する。
【００５６】
本発明によれば、ＣＴＬ応答性は、持続的なカルシウム流入、細胞分裂、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αなどのサイトカインの産生、ＣＤ４４およびＣＤ６９などの活性化マーカーの上方調節、ならびに腫瘍抗原を発現する標的細胞の特異的な細胞溶解性死滅を含み得る。ＣＴＬ応答性はまた、ＣＴＬ応答性を正確に示す人工レポーターを用いて測定し得る。
【００５７】
本発明に関連して「免疫応答を誘導すること」という用語は、好ましくは細胞性ならびに体液性免疫応答の誘導を指す。免疫応答は、防御的／防止的／予防的／治療的であり得る。免疫応答は、任意の免疫原または抗原もしくは抗原ペプチドに対してであり得、好ましくは癌関連抗原または病原体関連抗原に対してであり得る。これに関連して「誘導すること」は、誘導の前には特定の抗原または病原体に対する免疫応答が存在しなかったことを意味し得るが、同時に、誘導の前に特定の抗原または病原体に対してある程度の免疫応答が存在し、誘導後に前記免疫応答が増強されることも意味し得る。従って、これに関連して「免疫応答を誘導すること」は、「免疫応答を増強すること」も包含する。好ましくは、個体において免疫応答を誘導した後、前記個体が感染症または癌性疾患などの疾患を発症することから保護されるか、または免疫応答を誘導することによって疾患状態が改善される。
【００５８】
「細胞性免疫応答」または「抗原に対する細胞性応答」は、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩと共に抗原を提示することを特徴とする細胞に対する細胞性応答を包含することが意図されている。細胞性応答は、「ヘルパー」または「キラー」のいずれかとして働く、Ｔ細胞またはＴリンパ球と呼ばれる細胞に関する。ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞とも称される）は、免疫応答を調節することによって中心的役割を果たし、キラー細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、細胞溶解性Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＴＬとも称される）は、腫瘍細胞などの疾患細胞を死滅させ、より多くの疾患細胞の産生を防止する。
【００５９】
「ワクチン接種」および「免疫」という用語は、本明細書で述べるように、１またはそれ以上の免疫原または抗原またはその誘導体を、特にそれをコードするＲＮＡの形態で、個体に投与し、前記１またはそれ以上の免疫原または抗原または前記１もしくはそれ以上の免疫原もしくは抗原の提示を特徴とする細胞に対する免疫応答を刺激する手順に関する。
「免疫反応」という用語は、本明細書ではその従来の意味で使用され、体液性および細胞性免疫を含む。免疫反応は、１またはそれ以上の抗原に対する抗体の発現ならびに、インビトロでの様々な増殖試験またはサイトカイン産生試験において検出され得る、抗原特異的Ｔリンパ球、好ましくはＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔリンパ球、より好ましくはＣＤ８＋Ｔリンパ球の増殖から成る群より選択される１またはそれ以上の反応を含む。
【００６０】
「抗原の提示を特徴とする細胞」または「抗原を提示する細胞」または「抗原提示細胞の表面に抗原を提示するＭＨＣ分子」または同様の表現は、疾患細胞、特に腫瘍細胞などの細胞、または、ＭＨＣ分子、好ましくはＭＨＣクラスＩおよび／もしくはＭＨＣクラスＩＩ分子、最も好ましくはＭＨＣクラスＩ分子に関連して、直接もしくはプロセシング後に、抗原もしくは抗原ペプチドを提示する抗原提示細胞を意味する。
【００６１】
「免疫療法」という用語は、特異的免疫反応の活性化を含む治療に関する。本発明に関連して、「保護する」、「防止する」、「予防的」、「防止的」または「防御的」などの用語は、個体における腫瘍または病原体の発生および／または増殖の予防または治療またはその両方に関する。ワクチン組成物の予防的投与は、腫瘍増殖の発症または病原体による感染から受容者を保護することができる。ワクチン組成物の治療的投与または免疫療法は、個体を、例えば既存の腫瘍の播種または転移から保護し得る。
【００６２】
「アジュバント」という用語は、抗原または抗原ペプチドと組み合わせて個体に投与された場合、免疫応答を延長するまたは増強するまたは促進する化合物に関する。本発明に関連して、ＲＮＡは任意のアジュバントと共に投与され得る。アジュバントは、抗原の表面の増大、体内での抗原の保持時間の延長、抗原放出の遅延化、マクロファージへの抗原の標的化、抗原の取込みの増大、抗原プロセシングの増強、サイトカイン放出の刺激、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、Ｔ細胞などの免疫細胞の刺激および活性化、ならびに免疫細胞の非特異的活性化を含む、１またはそれ以上の機構によってその生物学的活性を及ぼすと推測される。アジュバントは、油性エマルション（例えばフロイントアジュバント）、無機化合物（ミョウバンなど）、細菌産物（百日咳菌毒素など）、リポソームおよび免疫刺激性複合体などの化合物の不均質な群を含む。アジュバントの例としては、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ  ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ）、ＱＳ２１（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ）、ＤＱＳ２１（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ；国際公開広報第ＷＯ９６／３３７３９号）、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８およびＱＳ−Ｌ１などのサポニン（Ｓｏら，１９９７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ  ７：１７８−１８６）、不完全フロイントアジュバント、完全フロイントアジュバント、ビタミンＥ、モンタニド、ミョウバン、ＣｐＧオリゴヌクレオチド（Ｋｒｉｅｇら，１９９５，Ｎａｔｕｒｅ  ３７４：５４６−５４９）、ならびにスクアランおよび／またはトコフェロールなどの生分解性油から調製される様々な油中水型エマルションがある。
【００６３】
「増大させること」、「増強すること」または「延長すること」などの用語は、好ましくは、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらに一層好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも１００％の増大、増強または延長に関する。これらの用語はまた、ゼロ時点で特定の化合物または状態についての検出可能なシグナルが存在せず、ゼロ時点より後の特定の時点で特定の化合物または状態についての検出可能なシグナルが存在する状況にも関し得る。
【００６４】
「抗原提示細胞」（ＡＰＣ）は、その細胞表面にＭＨＣ分子と共同してタンパク質抗原のペプチドフラグメントを提示する細胞である。一部のＡＰＣは抗原特異的Ｔ細胞を活性化し得る。ＡＰＣは、プロフェッショナルＡＰＣと非プロフェッショナルＡＰＣに分けることができる。例えば、プロフェッショナルＡＰＣは、樹状細胞、マクロファージ、単球、Ｂ細胞、ミクログリア等を含む、本発明に関連して、ＡＰＣは、好ましくはプロフェッショナル抗原提示細胞である。本発明に関連して、ＡＰＣは、好ましくは未成熟である。従って、本発明に関連して、ＡＰＣは、好ましくは、未熟樹状細胞、未熟マクロファージ、未熟単球、未熟ミクログリアおよび未熟Ｂ細胞から成る群より選択され、好ましくは未熟樹状細胞である。未熟樹状細胞（ｉＤＣ）または成熟樹状細胞（ｍＤＣ）のサブセットは、例えば骨髄系樹状細胞（ｍｙ−ＤＣ）、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）、単球由来樹状細胞（ｍｏ−ＤＣ）および造血前駆細胞由来樹状細胞（ｈｐ−ＤＣ）を含む。好ましい実施形態では、本発明によるＡＰＣは、哺乳動物、好ましくはヒト、マウスまたはラットである。
【００６５】
樹状細胞は、特有の形態および広範囲に広がる組織分布を有する不均質な細胞集団を含む。Ｓｔｅｉｎｍａｎ（１９９１，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：２７１−２９６）は、樹状細胞系および免疫系におけるその役割についての総説を提供する。樹状細胞は、ＭＨＣ拘束性Ｔ細胞を感作する能力を示し、Ｔ細胞に抗原を提示するうえで非常に有効である。「樹状細胞」または「ＤＣ」という用語は、リンパ系または非リンパ系組織に位置する、形態学的に類似の細胞型の多様な集団の成員に関する。樹状細胞は、例えば造血系骨髄前駆細胞に由来する。これらの前駆細胞は、最初に未熟樹状細胞に変換される。未熟樹状細胞は、末梢血および臍帯血中でならびに胸腺およびリンパ節などのリンパ系において認められる。これらの細胞は、高いエンドサイトーシス活性と低いＴ細胞活性化潜在能を特徴とする。未熟樹状細胞は、ウイルスおよび細菌などの病原体に関して絶えず周囲の環境をサンプリングする。これは、受容体媒介性機構および受容体非依存性機構（例えばマクロピノサイトーシス）の両方を介して行われる。トル様受容体（ＴＬＲ）などのパターン認識受容体（ＰＲＲ）は、病原体のサブセット上に認められる特定の化学的痕跡を認識する。未熟樹状細胞はまた、ニブリングと呼ばれる過程で、自身の生細胞から少量の膜も貪食し得る。ひとたびそれらが提示可能な抗原と接触すると、それらは成熟樹状細胞へと活性化する。未熟樹状細胞は病原体を貪食し、それらのタンパク質を小片に分解して、成熟後にＭＨＣ分子を用いてそれらのフラグメントを細胞表面に提示する。同時に、それらは、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）およびＣＤ４０などのＴ細胞活性化における共受容体として働く細胞表面受容体を上方調節し、Ｔ細胞を活性化する能力を大きく増強する。それらはまた、樹状細胞が血流を通って脾臓にまたはリンパ系を通ってリンパ節に移動することを誘導する走化性受容体であるＣＣＲ７も上方調節する。ここでは未熟樹状細胞は抗原提示細胞として働く：それらは、非抗原特異的共刺激シグナルと並行して、ヘルパーＴ細胞およびキラーＴ細胞ならびにＢ細胞を病原体に由来する抗原と共に提示することによってそれらを活性化する。樹状細胞はすべての抗原提示細胞のうちで最も強力であり、記憶Ｔ細胞およびナイーブＴ細胞の両方を活性化することができる。活性化された成熟樹状細胞は、Ｔ細胞の活性化および増殖に必要なシグナルを提供することが示されている。これらのシグナルは２つのタイプに分類され得る。免疫応答に特異性を与える、最初のタイプは、Ｔ細胞受容体／ＣＤ３（「ＴＣＲ／ＣＤ３」）複合体と、ＡＰＣの表面に主要組織適合遺伝子複合体（「ＭＨＣ」）クラスＩまたはクラスＩＩタンパク質によって提示される抗原ペプチドとの間の相互作用を通して媒介される。共刺激シグナルと呼ばれる２番目のタイプのシグナルは、抗原特異的またはＭＨＣ拘束性のいずれでもなく、最初のタイプのシグナルの存在下でＴ細胞の完全な増殖応答およびＴ細胞エフェクター機能の誘導を導くことができる。この二重のシグナル伝達は、従って、活発な免疫応答を生じさせる、樹状細胞の成熟の種々の系統および程度は、それらの特定の形態、食作用／エンドサイトーシス能力、ならびにそれらのＭＨＣクラスＩＩ表面発現の程度およびＴ細胞、特にナイーブＴ細胞に抗原を提示する能力によって区別され得る。未熟樹状細胞の典型的なマーカーは、ＭＨＣクラスＩＩが検出可能であり、ＣＤ８６が検出可能であり、そして特にＣＤ８３が陰性である。
【００６６】
典型的には、未熟樹状細胞を作製するために、最初に、血液中に存在する他の混入細胞型から単球前駆体を精製または富化しなければならない。単球は、例えばリンパ球およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの末梢血中に認められる他の細胞よりもプラスチックに付着する傾向が大きいので、これは一般に単球前駆体のプラスチック（ポリスチレン）表面への接着を介して実施される。強く洗浄することによって混入細胞を実質的に除去した後、単球前駆体を未熟樹状細胞に変換するサイトカインと共に単球を培養する。単球前駆体を未熟樹状細胞に分化させるための方法は、Ｓａｌｌｕｓｔｏ  ａｎｄ  Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ（参照により本明細書に組み込まれる、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７９：１１０９−１１１８，１９９４）によって最初に記述され、彼らは、単球の未熟樹状細胞への分化を誘導するサイトカインＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を使用した。サイトカインのこの組合せが最も典型的に使用されるが、ＩＬ−４をＩＬ−１３またはＩＬ−１５に置き換えるなどの、様々な他の組合せも同じ目的を達成するために記述されている。この過程の最終結果は、Ｔ細胞共刺激分子ならびに検出可能なレベルの主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の分子を発現するが、樹状細胞成熟マーカーＣＤ８３を発現しない、「ベールで隠された（ｖｅｉｌｅｄ）」細胞である。これらの細胞は皮膚のランゲルハンス細胞に類似し、その主要な生理的機能は侵入微生物を捕捉することである。この方法の変法には、例えばタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）を含む、またはビーズに付着させた抗体を単球上の表面分子に結合することによる、単球を精製する種々の方法が含まれる。混入細胞を洗浄して除去した後、単球がビーズから溶出されるように、結合細胞を有するビーズをカラム中または磁気面で濃縮する。樹状細胞前駆体を得るためのさらに別の方法では、血液（参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，９９４，１２６号）または骨髄のいずれかから、幹細胞マーカーＣＤ３４を発現している細胞を精製する。これらの細胞を必須のサイトカインＧＭ−ＣＳＦと共に培養して、未熟樹状細胞に分化させることができる。
【００６７】
これらの樹状細胞は、一見したところ、単球から生成される未熟樹状細胞と非常に類似した特徴および機能的特性を有する。未熟樹状細胞は、抗原を取り込み、プロセシングする高い能力を有するが、免疫応答を開始する能力は限られている。免疫応答を開始する能力は未熟樹状細胞の成熟によって獲得される。この成熟は、樹状細胞を活性化することまたは樹状細胞の活性化とも称される。成熟過程は、成熟誘導性サイトカイン、細菌産物またはウイルス成分等との接触を介して開始される。
【００６８】
好ましくは、未熟樹状細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からインビトロで生成され得る単球由来の未熟樹状細胞である。未熟樹状細胞は、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびインターロイキン（ＩＬ−４）などのサイトカインの存在下に、リポ多糖または腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）などの成熟因子の不在下で、ＰＢＭＣから分化され得る。１つの実施形態では、未熟樹状細胞は、ＧＭ−ＣＳＦおよび／またはＩＬ−４などの１またはそれ以上のサイトカインの存在下で末梢血単球を少なくとも約３日間または少なくとも約７日間培養することによって得られたまたは得られ得る単球由来の未熟樹状細胞である。例えば、組織培養フラスコでのＰＢＭＣの平板培養によって単球の接着が可能となる。ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦでのこれらの単球の処理により、約１週間で未熟樹状細胞への分化に至る。その後のＴＮＦ−αでの処理により、未熟樹状細胞は成熟樹状細胞へとさらに分化する。本発明に関連して、未熟樹状細胞は、造血幹細胞（ＣＤ３４＋細胞）から分化させ得るか、または白血球搬出法を用いて個体から精製し得る。
【００６９】
成熟樹状細胞は、それらの形態の変化、非接着性、および１またはそれ以上のマーカーの存在によって同定できる。そのようなマーカーは、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＭＨＣクラスＩＩなどの細胞表面マーカーを含むが、これらに限定されない。成熟樹状細胞（ｍＤＣ）についての典型的なマーカーは、ＣＤ８３が検出可能であり、ＭＨＣ  ＩＩならびにＣＤ８６のレベルが未熟樹状細胞（ｉＤＣ）に比べて高い。あるいは、成熟は、炎症性サイトカインなどのサイトカインの産生を観察するまたは測定することによって同定できる。成熟樹状細胞は、典型的なサイトフルオログラフィーおよびセルソーティング技術と装置、例えば蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）を用いて収集し、分析することができる。成熟樹状細胞の細胞表面抗原に特異的な抗体は市販されている。
【００７０】
「ＭＨＣ結合ペプチド」という用語は、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するペプチドに関する。ＭＨＣクラスＩ／ペプチド複合体の場合、結合ペプチドは、典型的には８〜１０アミノ酸長であるが、より長いまたはより短いペプチドも有効であり得る。ＭＨＣクラスＩＩ／ペプチド複合体の場合、結合ペプチドは、典型的には１０〜２５アミノ酸長、特に１３〜１８アミノ酸長であるが、より長いまたはより短いペプチドも有効であり得る。「主要組織適合遺伝子複合体」という用語および「ＭＨＣ」という略語はｍＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ分子を含み、すべての脊椎動物において生じる遺伝子の複合体に関する。ＭＨＣタンパク質または分子は、正常な免疫反応におけるリンパ球と抗原提示細胞との間のシグナル伝達のために重要であり、正常な免疫反応では、ＭＨＣタンパク質または分子がペプチドに結合して、Ｔ細胞受容体による認識のためにそれらを提示する。
【００７１】
本発明に関連して「免疫エフェクター細胞」という用語は、免疫反応においてエフェクター機能を果たす細胞に関する。「免疫エフェクター細胞」は、好ましくは、抗原または抗原の提示を特徴とする細胞に結合し、免疫応答を媒介することができる。例えば、そのような細胞は、サイトカインおよび／またはケモカインを分泌し、微生物を死滅させ、抗体を分泌し、感染細胞または癌細胞を認識して、場合によりそのような細胞を排除する。例えば、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、腫瘍浸潤性Ｔ細胞）、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、好中球、マクロファージおよび樹状細胞を含む。好ましくは、本発明に関連して、「免疫エフェクター細胞」は、Ｔ細胞、好ましくはＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋細胞である。
【００７２】
好ましくは、「免疫エフェクター細胞」は、特に抗原提示細胞または腫瘍細胞のような疾患細胞の表面などにＭＨＣ分子に関連して提示された場合、抗原または前記抗原に由来する抗原ペプチドをある程度の特異性で認識する。好ましくは、前記認識は、抗原または前記抗原に由来する抗原ペプチドを認識する細胞が応答性であることを可能にする。細胞が、ＭＨＣクラスＩＩ分子に関連して抗原または前記抗原に由来する抗原ペプチドを認識する受容体を担持するヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）である場合、そのような応答性は、サイトカインの放出ならびに／またはＣＤ８＋リンパ球（ＣＴＬ）および／もしくはＢ細胞の活性化を含み得る。細胞がＣＴＬである場合、そのような応答性は、例えばアポトーシスまたはパーフォリン媒介性細胞溶解を介した、ＭＨＣクラスＩ分子に関連して提示される細胞、すなわちＭＨＣクラスＩと共に抗原を提示することを特徴とする細胞の排除を含み得る。抗原または前記抗原に由来する抗原ペプチドを認識し、応答性であるそのようなＣＴＬは、本明細書では「抗原応答性ＣＴＬ」とも称される。細胞がＢ細胞である場合、そのような応答性は免疫グロブリンの放出を含み得る。
【００７３】
「半減期」という用語は、分子の活性、量または数の半分を排除するために必要とされる時間に関する。本発明に関連して、ＲＮＡの半減期は、前記ＲＮＡの安定性を示す。
【００７４】
「患者」、「個体」または「動物」という用語は哺乳動物に関する。例えば、本発明に関連して哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長動物、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ブタ、ウマ等のような家畜、マウス、ラット、ウサギ、モルモット等のような実験動物、ならびに動物園の動物などの捕らえられている動物である。本明細書で使用される「動物」はまた、ヒトを含む。
【００７５】
本発明によれば、「腫瘍」または「腫瘍性疾患」という用語は、細胞（新生細胞または腫瘍細胞と呼ばれる）の異常増殖によって形成される腫脹または病変を指す。「腫瘍細胞」とは、急速で制御されない細胞増殖によって成長し、新たな増殖を開始させた刺激が停止した後も成長し続ける異常細胞を意味する。腫瘍は、構造機構および正常組織との機能的協調の部分的または完全な欠如を示し、通常、良性、前悪性または悪性であり得る明確な組織塊を形成する。
【００７６】
好ましくは、本発明による腫瘍性疾患は、癌疾患、すなわち悪性疾患であり、腫瘍細胞は癌細胞である。好ましくは、腫瘍性疾患は、抗原、すなわち腫瘍抗原が発現されるまたは異常発現される細胞を特徴とする。好ましくは、腫瘍性疾患または腫瘍細胞は、ＭＨＣクラスＩと共に腫瘍抗原を提示することを特徴とする。
【００７７】
「異常発現」は、本発明によれば、健常個体における状態と比較して、発現が変化している、好ましくは増大していることを意味する。発現の増大は、少なくとも１０％、特に少なくとも２０％、少なくとも５０％または少なくとも１００％の増加を指す。１つの実施形態では、発現は疾患組織においてのみ認められ、健常組織における発現は抑制されている。
【００７８】
好ましくは、本発明による腫瘍性疾患は癌であり、本発明による「癌」という用語は、白血病、精上皮腫、黒色腫、奇形腫、リンパ腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、直腸癌、子宮内膜癌、腎癌、副腎癌、甲状腺癌、血液癌、皮膚癌、脳の癌、子宮頸癌、腸癌、肝癌、結腸癌、胃癌、腸癌、頭頸部癌、消化器癌、リンパ節癌、食道癌、結腸直腸癌、膵癌、耳鼻咽喉（ＥＮＴ）癌、乳癌、前立腺癌、子宮の癌、卵巣癌および肺癌ならびにそれらの転移を含む。その例としては、肺癌腫、乳癌腫、前立腺癌腫、結腸癌腫、腎細胞癌腫、子宮頸癌腫、または上述した癌型または腫瘍の転移である。本発明による「癌」という用語はまた、癌の転移を包含する。
【００７９】
本発明による組成物は、一般に「医薬的に許容される量」でおよび「医薬的に許容される製剤」中で適用される。そのような組成物は、塩、緩衝剤、防腐剤、担体および場合により他の治療薬を含有し得る。「医薬的に許容される塩」は、例えば酸付加塩を含み、酸付加塩は、例えば、塩酸、硫酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酢酸、安息香酸、クエン酸、酒石酸、カルボン酸またはリン酸などの医薬的に許容される酸の溶液と化合物の溶液を混合することによって形成され得る。さらに、化合物が酸性部分を担持する場合、その適切な医薬的に許容される塩は、アルカリ金属塩（例えばナトリウム塩またはカリウム塩）；アルカリ土類金属塩（例えばカルシウム塩またはマグネシウム塩）；ならびに適切な有機配位子で形成される塩（例えばハロゲン化物、水酸化物、カルボン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、アルキルスルホン酸塩およびアリールスルホン酸塩などの対アニオンを使用して形成されるアンモニウム、第四級アンモニウムおよびアミンカチオン）を含み得る。医薬的に許容される塩の説明的な例は、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、重硫酸塩、重酒石酸塩、ホウ酸塩、臭化物、酪酸塩、エデト酸カルシウム、ショウノウ酸塩、カンファースルホン酸塩、カンシル酸塩（ｃａｍｓｙｌａｔｅ）、炭酸塩、塩化物、クエン酸塩、クラブラン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、二塩酸塩、ドデシル硫酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エストール酸塩（ｅｓｔｏｌａｔｅ）、エシル酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルセプチン酸塩、グルコヘプトン酸塩、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリセロリン酸塩、グリコリルアルサニル酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヘキシルレゾルシン酸塩（ｈｅｘｙｌｒｅｓｏｒｃｉｎａｔｅ）、ヒドラバミン、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、ヨウ化物、イソチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩（ｌａｃｔｏｂｉｏｎａｔｅ）、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、メタンスルホン酸塩、メチル硫酸塩、粘液酸塩（ｍｕｃａｔｅ）、２−ナフタレンスルホン酸塩、ナプシル酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、Ｎ−メチルグルカミンアンモニウム塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩（エンボン酸塩）、パルミチン酸塩、パントテン酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩／二リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、ポリガラクツロン酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、硫酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩、トシル酸塩、トリエチオダイド（ｔｒｉｅｔｈｉｏｄｉｄｅ）、ウンデカン酸塩、吉草酸塩等を含むが、これらに限定されない（例えば、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅら，「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ」，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，６６，ｐｐ．１−１９（１９７７）参照）。
【００８０】
本明細書で使用される場合「賦形剤」という用語は、有効成分ではない医薬製剤中のすべての物質、例えば担体、結合剤、潤滑剤、増粘剤、界面活性剤、防腐剤、乳化剤、緩衝剤、着香剤または着色剤などを指示することが意図されている。
【００８１】
本発明による組成物は、医薬的に許容される担体を含有し得る。本発明に関連して「医薬的に許容される担体」という用語は、ヒトへの投与に適する、１またはそれ以上の適合性の固体または液体充填剤または希釈剤に関する。「担体」という用語は、活性成分の適用を容易にするために活性成分と組み合わされる天然または合成の有機または無機成分に関する。好ましくは、担体成分は、鉱油、動物または植物に由来するものを含む、水または油など、例えば落花生油、ダイズ油、ゴマ油、ヒマワリ油等のような滅菌液体である。塩溶液ならびにデキストロースおよびグリセリン水溶液も水性担体化合物として使用し得る。
【００８２】
本発明によれば、組成物は治療有効量で投与される。「治療有効量」は、単独でまたはさらなる投与量と組み合わせて、所望反応または所望作用を生じさせる量に関する。特定の疾患または特定の状態の治療の場合、所望反応は疾患の進行の阻害に関する。これは、疾患の進行の減速、特に疾患の進行の中断を含む。疾患または状態の治療のための所望反応はまた、疾患または状態の発生の遅延化または発生の阻害であり得る。本発明による組成物の有効量は、状態または疾患、疾患の重症度、年齢、生理的状態、身長および体重を含む患者の個別のパラメータ、治療の期間、場合により併用される治療の種類、特定の投与経路および同様の因子に依存する。初期用量で患者の反応が不十分である場合は、より高い用量（またはより局所的な投与経路によって達成され得るより高い有効用量）を適用し得る。一般に、ヒトにおける治療または免疫反応の誘導もしくは増大のために、好ましくは１ｎｇ〜７００μｇ、１ｎｇ〜５００μｇ、１ｎｇ〜３００μｇ、１ｎｇ〜２００μｇまたは１ｎｇ〜１００μｇの範囲のＲＮＡの用量が製剤され、投与される。
【００８３】
本発明に関連して、「転写」という用語は、ＤＮＡ配列中の遺伝暗号がＲＮＡに転写される過程に関する。その後、ＲＮＡはタンパク質に翻訳され得る。本発明によれば、「転写」という用語は「インビトロ転写」を含み、「インビトロ転写」という用語は、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡが、好ましくは適切な細胞抽出物を使用して、無細胞系においてインビトロで合成される過程に関する。好ましくは、転写産物の作製のためにクローニングベクターを適用する。これらのクローニングベクターは一般に転写ベクターと称され、本発明により「ベクター」の用語に包含される。本発明によれば、本発明において使用されるＲＮＡは、適切なＤＮＡ鋳型のインビトロ転写によって入手し得る。転写を制御するためのプロモーターは、任意のＲＮＡポリメラーゼについての任意のプロモーターであり得る。ＲＮＡポリメラーゼの特定の例としては、Ｔ７、Ｔ３およびＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼがある。好ましくは、本発明によるインビトロ転写はＴ７またはＳＰ６プロモーターによって制御される。インビトロ転写のためのＤＮＡ鋳型は、核酸、特にｃＤＮＡをクローニングし、それをインビトロ転写のための適切なベクターに導入することによって入手し得る。ｃＤＮＡはＲＮＡの逆転写によって入手し得る。
【００８４】
「発現」という用語は、本明細書ではその最も広い意味で使用され、ＲＮＡの産生またはＲＮＡとタンパク質の産生を含む。ＲＮＡに関して、「発現」または「翻訳」という用語は、特にペプチドまたはタンパク質の産生に関する。発現は一過性であり得るかまたは安定であり得る。
【００８５】
本発明に関連して「翻訳」という用語は、ｍＲＮＡ鎖がアミノ酸配列の構築を制御してタンパク質またはペプチドを生成する、リボソームにおける過程に関する。
【００８６】
本発明によれば、ＲＮＡは、例えばリンパ系、好ましくはリンパ節へのＲＮＡの投与によって、インビトロまたはインビボのいずれかで未熟抗原提示細胞に移入される。これに関して、「移入すること」または「トランスフェクトすること」などの用語は、本明細書では交換可能に使用され、核酸、特に外因性または異種核酸、特にＲＮＡの細胞への導入に関する。本発明によれば、ＲＮＡを細胞に移入するのに適した任意の技術を使用して、ＲＮＡを細胞に導入し得る。好ましくは、標準的な技術によってＲＮＡを細胞にトランスフェクトする。そのような技術は、核酸のリン酸カルシウム沈殿物のトランスフェクション、ＤＥＡＥに結合した核酸のトランスフェクション、対象とする核酸を担持するウイルスを用いたトランスフェクションまたは感染、電気穿孔法、リポフェクションおよびマイクロインジェクションを含む。本発明によれば、核酸の投与は、裸の核酸としてまたは投与試薬と組み合わせて達成される。好ましくは、核酸の投与は裸の核酸の形態で行われる。好ましくは、ＲＮＡは、ＲＮアーゼ阻害剤などの安定化物質と組み合わせて投与される。特に好ましい実施形態では、ＲＮＡおよび／または本発明の組成物は、好ましくはリンパ節内注入によって裸のＲＮＡとして投与される。本発明によれば、従来のトランスフェクション技術は、裸のＲＮＡを細胞に、好ましくは抗原提示細胞に、好ましくは未熟抗原提示細胞に、好ましくは未熟樹状細胞に導入するために絶対的に必要というわけではない。なぜなら、特に未熟樹状細胞などの未熟抗原提示細胞は、マクロピノサイトーシスによって裸のＲＮＡを取り込むことができるからである。好ましくは、抗原または抗原ペプチドをコードするＲＮＡの細胞への導入は、細胞における前記抗原または抗原ペプチドの発現を生じさせる。特定の実施形態では、特定の細胞への核酸の標的化が好ましい。そのような実施形態では、核酸を細胞に投与するために適用される担体（例えばレトロウイルスまたはリポソーム）は、標的分子を展示する。例えば、標的細胞上の表面膜タンパク質に特異的な抗体または標的細胞上の受容体に対するリガンドなどの分子を核酸担体に組み込み得るかまたはそれに結合し得る。核酸がリポソームによって投与される場合、標的化および／または取込みを可能にするために、エンドサイトーシスに関連する表面膜タンパク質に結合するタンパク質をリポソーム製剤に組み込み得る。そのようなタンパク質は、特定の細胞型に特異的なキャプシドタンパク質またはそのフラグメント、インターナライズされるタンパク質に対する抗体、細胞内の位置を標的するタンパク質等を包含する。
【００８７】
本発明によれば、「ペプチド」という用語は、オリゴペプチドおよびポリペプチドを含み、ペプチド結合によって共有結合連結された２またはそれ以上、好ましくは３またはそれ以上、好ましくは４またはそれ以上、好ましくは６またはそれ以上、好ましくは８またはそれ以上、好ましくは１０またはそれ以上、好ましくは１４またはそれ以上、好ましくは１６またはそれ以上、好ましくは２１またはそれ以上、好ましくは８、１０、２０、３０、４０または５０まで、特に１００アミノ酸を含む物質を指す。「タンパク質」という用語は、大型ペプチド、好ましくは１００アミノ酸残基超を有するペプチドを指すが、一般に「ペプチド」と「タンパク質」という用語は同義語であり、本明細書では交換可能に使用される。
【００８８】
「対象とする抗原を提示するＭＨＣ分子の割合」という用語は、細胞の表面上のＭＨＣ分子の総量に対する、特定の抗原または前記抗原に由来する抗原ペプチドが負荷されている、すなわち結合している抗原提示細胞の表面上のＭＨＣ分子の割合を指す。好ましい実施形態では、本発明で使用されるＲＮＡは、ＲＮＡが移入された抗原提示細胞の表面に対象とする抗原を提示するＭＨＣ分子の割合を増大させることができる。これは、式（Ｉ）による構造を有する５'末端キャップを担持しないＲＮＡ、特に従来のＲＮＡキャップを担持するＲＮＡと比較してである。
【００８９】
「アルキル」という用語は、飽和直鎖または分枝炭素鎖を指す。好ましくは、鎖は１〜１０個の炭素原子、すなわち１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の炭素原子、好ましくは１〜４個の炭素原子、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｓｅｃ−ペンチル、ｎｅｏ−ペンチル、１，２−ジメチルプロピル、イソアミル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル、ｓｅｃ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、イソヘプチル、ｎ−オクチル、２−エチル−ヘキシル、ｎ−ノニルおよびｎ−デシルを含む。アルキル基は任意に置換されている。
【００９０】
それ自体でのまたは他の用語と組み合わせた「シクロアルキル」という用語は、特に明記されない限り、好ましくは３〜１０個の炭素原子、すなわち３、４、５、６、７、８、９または１０個の炭素原子、好ましくは３〜６個の炭素原子を有し、環を形成する、「アルキル」の環状型、好ましくはシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニルまたはシクロデシルを表す。「シクロアルキル」という用語はまた、二環式を含むことが意図される。二環式環が形成される場合は、それぞれの環が２個の隣接炭素原子で互いに結合していることが好ましいが、あるいは２つの環は同じ原子を介して結合している、すなわちそれらはスピロ環系を形成するかまたは「架橋」環系を形成する。シクロアルキルの好ましい例としては、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、特にシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、スピロ［３，３］ヘプチル、スピロ［３，４］オクチル、スピロ［４，３］オクチル、ビシクロ［４．１．０］ヘプチル、ビシクロ［３．２．０］ヘプチル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル、ビシクロ［２．２．２］オクチル、ビシクロ［５．１．０］オクチルおよびビシクロ［４．２．０］オクチルを含む。
【００９１】
本発明に関連して「アルケニル」という用語は、１またはそれ以上の二重結合を有するオレフィン系不飽和直鎖または分枝炭素鎖を指す。好ましくは、鎖は２〜１０個の炭素原子、すなわち２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の炭素原子、好ましくは２〜４個の炭素原子を含む。例えば、アルケニルは、ビニル、アリル、１−プロペニル、２−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−ペンテニル、４−ペンテニル、１−ヘキセニル、２−ヘキセニル、３−ヘキセニル、４−ヘキセニル、５−ヘキセニル、１−ヘプテニル、２−ヘプテニル、３−ヘプテニル、４−ヘプテニル、５−ヘプテニル、６−ヘプテニル、１−オクテニル、２−オクテニル、３−オクテニル、４−オクテニル、５−オクテニル、６−オクテニル、７−オクテニル、１−ノネニル、２−ノネニル、３−ノネニル、４−ノネニル、５−ノネニル、６−ノネニル、７−ノネニル、８−ノネニル、１−デセニル、２−デセニル、３−デセニル、４−デセニル、５−デセニル、６−デセニル、７−デセニル、８−デセニルまたは９−デセニルであり得る。
【００９２】
本発明に関連して「アルケニル」という用語はまた、１またはそれ以上の二重結合を有する１またはそれ以上の環を含むオレフィン系不飽和基を指す「シクロアルケニル」を包含する。好ましくは、シクロアルケニル環は３〜１０個の炭素原子、すなわち３、４、５、６、７、８、９または１０個の炭素原子、例えばシクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル、シクロオクチル、スピロ［３，３］ヘプテニル、スピロ［３，４］オクテニル、スピロ［４，３］オクテニル、ビシクロ［４．１．０］ヘプテニル、ビシクロ［３．２．０］ヘプテニル、ビシクロ［２．２．１］ヘプテニル、ビシクロ［２．２．２］オクテニル、ビシクロ［５．１．０］オクテニルまたはビシクロ［４．２．０］オクテニルを含む。
【００９３】
本発明に関連して「アルキニル」という用語は、１またはそれ以上の三重結合を有する不飽和直鎖または分枝炭素鎖を指す。好ましくは、鎖は２〜１０個の炭素原子、すなわち２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の炭素原子、好ましくは２〜４個の炭素原子を含む。アルキニルの例としては、エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、３−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−ペンチニル、４−ペンチニル、１−ヘキシニル、２−ヘキシニル、３−ヘキシニル、４−ヘキシニル、５−ヘキシニル、１−ヘプチニル、２−ヘプチニル、３−ヘプチニル、４−ヘプチニル、５−ヘプチニル、６−ヘプチニル、１−オクチニル、２−オクチニル、３−オクチニル、４−オクチニル、５−オクチニル、６−オクチニル、７−オクチニル、１−ノニニル、２−ノニニル、３−ノニニル、４−ノニニル、５−ノニニル、６−ノニニル、７−ノニニル、８−ノニニル、１−デシニル、２−デシニル、３−デシニル、４−デシニル、５−デシニル、６−デシニル、７−デシニル、８−デシニルまたは９−デシニルがある。
【００９４】
「ヘテロシクリル」という用語は、環内の１〜３個の炭素原子がＯ、ＳまたはＮのヘテロ原子によって置換されている、上記で定義したシクロアルキル基を意味する。
【００９５】
「アリール」という用語は、５〜１４個の炭素原子を含む芳香環構造、例えばフェニル、インデニル、１−ナフチル、２−ナフチル、１−アントリル、２−アントリル、９−アントリル、１−フェナントリル、２−フェナントリル、３−フェナントリル、４−フェナントリルおよび９−フェナントリルを指す。好ましくは、「アリール」は、６個の炭素原子を含む単環式環または１０個の炭素原子を含む芳香族二環式環系を指す。好ましい例はフェニルまたはナフチルである。アリール基は任意に置換されている。
【００９６】
「ヘテロアリール」という用語は、環内の１〜３個の炭素原子がＯ、ＳまたはＮのヘテロ原子によって置換されている、上記で定義したアリール基を意味する。好ましくは、この用語は、１〜３個の炭素原子がＯ、ＮまたはＳの同じかまたは異なるヘテロ原子によって置換されている５員または６員芳香族単環式環を指す。あるいは、この用語は、１〜３個の炭素原子がＯ、ＮまたはＳの同じかまたは異なるヘテロ原子で置換されている芳香族二環式環系を意味する。好ましい例としては、フラニル、チエニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、１，２，５−オキサジアゾリル、１，２，３−オキサジアゾリル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、１，２，３−トリアゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、１，２，３−チアジアゾリル、１，２，５−チアジアゾリル、ピリジニル、ピリミジニル、ピラジニル、１，２，３−トリアジニル、１，２，４−トリアジニル、１，３，５−トリアジニル、１−ベンゾフラニル、２−ベンゾフラニル、インドリル、イソインドリル、ベンゾチエニル、２−ベンゾチエニル、１Ｈ−インダゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、インドオキサジニル、２，１−ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、１，２−ベンゾイソチアゾリル、２，１−ベンゾイソチアゾリル、ベンゾトリアゾリル、キノリニル、イソキノリニル、２，３−ベンゾジアジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、１，２，３−ベンゾトリアジニルまたは１，２，４−ベンゾトリアジニルがある。
【００９７】
本発明に関連して「ハロ」という用語は、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨード、好ましくはフルオロを意味する。
【００９８】
「アルコキシ」という用語は、−ＯＲ基［式中、Ｒはアルキル、アリールまたはシクロアルキルである。］を指し、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ペントキシ、ヘキシルオキシ、ヘプチルオキシ、オクチルオキシ、ノニルオキシまたはデシルオキシを含み得る。
【００９９】
「任意に置換された」という用語は、１またはそれ以上の水素原子が、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、ハロアルキル、アミノ、アルキルアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロアルコキシ、アリールおよびヘテロアリール等のような水素とは異なる基で置換されていることを示す。任意選択の置換基は、それ自体が、ハロゲン、特にフルオロなどの置換基によって置換されていてもよい。
【０１００】
「ヒドロキシ」という用語は、−ＯＨ基を指す。
【０１０１】
「ハロアルキル」という用語は、１またはそれ以上のハロゲンで置換されたアルキルまたはシクロアルキル基（例えばトリフルオロメチル）を指す。
【０１０２】
「ハロアルコキシ」という用語は、−ＯＲ基［式中、Ｒは、１またはそれ以上のハロゲンで置換されたアルキル、アリールまたはシクロアルキルである。］を指す。
【０１０３】
アミノという用語は、−ＮＨ２基を指す。
【０１０４】
「アルキルアミノ」という用語は、−ＮＲ'Ｒ基［式中、Ｒは水素、アルキル、アリールまたはシクロアルキルであり、およびＲ'はアルキル、アリールまたはシクロアルキルである。］を指す。
【０１０５】
「アシルアミノ」という用語は、−ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ基［式中、各々のＲは独立して水素、アルキル、アリールまたはヘテロアリールである。］を指す。
【０１０６】
「カルボニル」という用語は、Ｃ＝Ｏ基［式中、炭素はアルキル鎖または環系の一部であってよい。］を指す。
【０１０７】
「置換基Ｒ５を含むＰ原子における立体化学的配置は、β−Ｓ−ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマーのＰβ原子における立体化学的配置に対応する」という語句は、置換基Ｒ５を含み、かつキラル中心を有する、従って２つの立体化学的配置のいずれかで存在することができるリン原子が、主として１つの所望立体化学的配置、すなわちβ−Ｓ−ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマーのＰβ原子における立体化学的配置で存在することを意味する。β−Ｓ−ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマーのＰβ原子に関して場合によっては、これは（Ｒ）立体配置または（Ｓ）立体配置のいずれかであり得る。好ましくは、対象とする基の５０％以上が所望立体化学的配置を有し、好ましくは対象とする基の少なくとも７５％が所望立体化学的配置を有し、より好ましくは対象とする基の少なくとも９０％が所望立体化学的配置を有し、さらに一層好ましくは対象とする基の少なくとも９５％が所望立体化学的配置を有し、最も好ましくは対象とする基の少なくとも９９％が所望立体化学的配置を有する。
【０１０８】
「β−Ｓ−ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマー」または「β−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ１）」は、β−Ｓ−ＡＲＣＡのＤ２ジアステレオマー（β−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ２））と比較してＨＰＬＣカラムで最初に溶出し、従ってより短い保持時間を示すβ−Ｓ−ＡＲＣＡのジアステレオマーである。ＨＰＬＣは、好ましくは分析ＨＰＬＣである。１つの実施形態では、好ましくは５μｍ、４．６×２５０ｍｍの体裁の、Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ  ＬＣ−１８−Ｔ  ＲＰカラムを分離のために使用し、それにより１．３ｍｌ／分の流量が適用できる。１つの実施形態では、酢酸アンモニウム中のメタノールの勾配、例えば１５分以内で０．０５Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ＝５．９中のメタノールの０〜２５％直線勾配を使用する。ＵＶ検出（ＶＷＤ）は２６０ｎｍで実施でき、蛍光検出（ＦＬＤ）は２８０ｎｍでの励起および３３７ｎｍでの検出で実施できる。
【０１０９】
発明者は、驚くべきことに、ホスホジエステル基ではなくホスホロチオエート基の一部である場合に、Ｄｃｐ２による分解に対する感受性を低下させる、Ｐ原子、すなわち式（Ｉ）中のｎが１である場合はＰβ原子、式（Ｉ）中のｎが２である場合はＰγ原子、または式（Ｉ）中のｎが３である場合はＰδ原子における特定の立体化学的配置を示し、前記のＰ原子における特定の立体化学的配置が５'末端キャップ類似体β−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ１）のＰβ原子における立体化学的配置に対応する、特定の５'末端キャップ構造、特にホスホロチオエート５'末端キャップ構造を含むように修飾されたＲＮＡが、特に未熟抗原提示細胞、特に未熟樹状細胞において高い安定性を有し、従ってまた高い発現を示すことを見出した。
【０１１０】
本発明は、好ましくは免疫細胞における、より好ましくは未熟免疫細胞における、さらに一層好ましくは未熟抗原提示細胞における、最も好ましくは未熟樹状細胞におけるＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡの安定性を高めるための、前記ＲＮＡの修飾に関する。本発明において述べる修飾されたＲＮＡは、ＲＮＡワクチン接種のために特に有用である。
【０１１１】
「５'末端キャップ構造で修飾されたＲＮＡ」は、５'末端キャップ構造が、キャップ構造のグアノシンがＲＮＡの一部となり、キャップ構造の修飾されたグアノシンが５'−５'三リン酸結合または修飾された三リン酸結合を介してＲＮＡに結合している、修飾されたＲＮＡを生じさせるように結合しているＲＮＡを意味する。従って、そのような修飾されたＲＮＡは、例えば式ｍ２（７，２'−Ｏ）ＧｐｐｓｐＧＲＮＡを有し得る。
【０１１２】
本発明において使用される５'末端キャップ構造で修飾されたＲＮＡは、以下の構造：
【化８】
0006042481.tif 000009
［式中、Ｒ１は、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアリール、および任意に置換されたヘテロアリールから成る群より選択され、
Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、ハロ、ＯＨおよび任意に置換されたアルコキシから成る群より独立して選択されるか、またはＲ２とＲ３は、一緒になってＯ−Ｘ−Ｏ［式中、Ｘは、任意に置換されたＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）およびＣ（ＣＨ３）２から成る群より選択される。］を形成するか、好ましくはＲ２とＲ３は一緒になって２'，３'−イソプロピリデンを形成するか、またはＲ２は、Ｒ２が結合して−Ｏ−ＣＨ２−もしくは−ＣＨ２−Ｏ−を形成する環の４'位で水素原子と結合しており、
Ｒ５は、Ｓ、ＳｅおよびＢＨ３から成る群より選択され、好ましくはＲ５はＳであり、
Ｒ４およびＲ６は、Ｏ、Ｓ、ＳｅおよびＢＨ３から成る群より独立して選択され、好ましくはＲ４およびＲ６は、ＯおよびＳから独立して選択され、より好ましくはＲ４およびＲ６はＯであり、
ｎは１、２または３であり、好ましくはｎは１または２であり、より好ましくはｎは１であり、
置換基Ｒ５を含むＰ原子における立体化学的配置は、β−Ｓ−ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマーのＰβ原子における立体化学的配置に対応する。］
を有する。
【０１１３】
本発明において使用される修飾されたＲＮＡの５'末端キャップは、式（Ｉ）に示す以下の構造：
【化９】
0006042481.tif 000010
［式中、Ｒ１は、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアリール、および任意に置換されたヘテロアリールから成る群より選択され、
Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、ハロ、ＯＨおよび任意に置換されたアルコキシから成る群より独立して選択されるか、またはＲ２とＲ３は、一緒になってＯ−Ｘ−Ｏ［式中、Ｘは、任意に置換されたＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）およびＣ（ＣＨ３）２から成る群より選択される。］を形成するか、好ましくはＲ２とＲ３は一緒になって２'，３'−イソプロピリデンを形成するか、またはＲ２は、Ｒ２が結合して−Ｏ−ＣＨ２−もしくは−ＣＨ２−Ｏ−を形成する環の４'位で水素原子と結合しており、
Ｒ５は、Ｓ、ＳｅおよびＢＨ３から成る群より選択され、好ましくはＲ５はＳであり、
Ｒ４およびＲ６は、Ｏ、Ｓ、ＳｅおよびＢＨ３から成る群より独立して選択され、好ましくはＲ４およびＲ６は、ＯおよびＳから独立して選択され、より好ましくはＲ４およびＲ６はＯであり、
ｎは１、２または３であり、好ましくはｎは１または２であり、より好ましくはｎは１であり、
置換基Ｒ５を含むＰ原子における立体化学的配置は、β−Ｓ−ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマーのＰβ原子における立体化学的配置に対応する。］
を有する。
【０１１４】
「Ｒ４およびＲ６は、Ｏ、Ｓ、ＳｅおよびＢＨ３から成る群より独立して選択される」という語句は、置換基Ｒ６が、存在する各々の場合にＯ、Ｓ、ＳｅおよびＢＨ３から成る群より独立して選択され、従って同じであってもよくまたは異なってもよいことを意味する。例えば、ｎが２である場合、式（Ｉ）に示す構造は２個のＲ６置換基を含み、これらの２個のＲ６置換基の各々は、同じ式中の１番目のＲ６置換基と２番目のＲ６置換基が同じであってもよくまたは異なってもよいようにＯ、Ｓ、ＳｅおよびＢＨ３から成る群より独立して選択される。
【０１１５】
好ましくは、本発明で使用される修飾されたＲＮＡの５'末端キャップは、修飾されたＲＮＡを未熟抗原提示細胞に導入したとき、５'末端キャップ構造を有さない同じＲＮＡと比較して、ＲＮＡの安定性を高める、ＲＮＡの翻訳効率を高める、ＲＮＡの翻訳を延長させる、ＲＮＡの総タンパク質発現を増大させる、および／または前記ＲＮＡによってコードされる抗原に対する免疫応答を増大させることができる。未熟抗原提示細胞は未熟樹状細胞であることが特に好ましい。当業者は、修飾されたＲＮＡの５'末端キャップが上記機能を果たすことができるかどうかを、例えば、ＲＮＡの一方は式（Ｉ）による５'末端キャップを担持し、他方のＲＮＡ（標準ＲＮＡ）は、（ｉ）５'末端キャップを含まない、（ｉｉ）従来のｍＲＮＡ  ５'末端キャップ、すなわちメチル−７−グアノシンキャップを担持する、または（ｉｉｉ）式（Ｉ）による５'末端キャップの機能と比較すべき任意の他のキャップを担持する、５'末端キャップだけが異なる２個のＲＮＡを、例えばインビトロ転写によって作製することにより、容易に判定し得る。例えば、標準ＲＮＡは、β−Ｓ−ＡＲＣＡのＤ２ジアステレオマーに対応する５'末端キャップを担持し得る。本発明で使用される修飾されたＲＮＡの５'末端キャップ構造は、修飾されたＲＮＡを未熟抗原提示細胞に導入したとき、従来のｍＲＮＡ  ５'末端キャップを有する同じＲＮＡと比較した場合、および／または同じ５'末端キャップ構造を有するが、置換基Ｒ５を担持するＰ原子における立体化学的配置が異なる、すなわち前記立体化学的配置がβ−Ｓ−ＡＲＣＡのＤ２ジアステレオマーのＰβ原子における立体化学的配置に対応する同じＲＮＡと比較した場合、好ましくはβ−Ｓ−ＡＲＣＡのＤ２ジアステレオマーに対応する５'末端キャップを有する同じＲＮＡと比較した場合、ＲＮＡの安定性を高める、ＲＮＡの翻訳効率を高める、ＲＮＡの翻訳を延長させる、ＲＮＡの総タンパク質発現を増大させる、および／または前記ＲＮＡによってコードされる抗原に対する免疫応答を増大させることができることが特に好ましい。
【０１１６】
好ましくは、Ｒ１は、本発明で使用される５'末端キャップが、前記５'末端キャップを担持するＲＮＡの翻訳を阻害しないように選択される。特に、Ｒ１は、前記ＲＮＡ、特に５'末端キャップが、好ましくはインビボおよびインビトロで、翻訳開始機構によって認識されるように、好ましくは５'末端キャップが真核生物翻訳開始機構によって認識されるように選択される。例えば、当業者は、ＲＮＡまたはＲＮＡ  ５'末端キャップが真核生物翻訳開始機構によって認識されるかどうかを、前記ＲＮＡまたは前記ＲＮＡ  ５'末端キャップに対する真核生物翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅの親和性を測定することによって判定し得る。
【０１１７】
好ましくは、Ｒ１は、任意に置換されたＣ１−Ｃ４アルキル、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、任意に置換されたベンジル、任意に置換されたフェニルエチルおよび任意に置換されたナフチルメチル、任意に置換されたＣ２−Ｃ４アルケニル、例えばエテニル、プロペニルまたはブテニル、ならびに任意に置換されたアリールから成る群より選択される。好ましくは、Ｒ１はＣ１−Ｃ４アルキル、および任意に置換されたアリールよりなる群より選択される。さらに一層好ましくは、Ｒ１は、メチル、エチル、任意に置換されたベンジル、任意に置換されたフェニルエチル、および任意に置換されたナフチルメチルから成る群より選択される。好ましくは、Ｒ１はメチルである。
【０１１８】
好ましくは、Ｒ２およびＲ３の立体配置は、５'末端キャップが一方向でのみＲＮＡ鎖に組み込まれ得る配置である。Ｐａｓｑｕｉｎｅｌｌｉら（１９９５，ＲＮＡ  Ｊ．１：９５７−９６７）は、インビトロ転写においてバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼが転写の開始のために７−メチルグアノシン単位を利用し、それによりキャップを有する転写産物の約４０〜５０％が逆方向のキャップ−ジヌクレオチドを有する（すなわち初期反応産物はＧｐｐｐｍ７ＧｐＮである）ことを明らかにした。正しいキャップを有するＲＮＡと比較して、逆方向のキャップを有するＲＮＡは、コードされるタンパク質の翻訳に関して機能性ではない。従って、キャップを正しい方向に組み込む、すなわちｍ７ＧｐｐｐＧｐＮ等に基本的に対応する構造を有するＲＮＡを生じさせることが望ましい。キャップ−ジヌクレオチドの逆方向組込みは、メチル化グアノシン単位の２'−ＯＨ基または３'−ＯＨ基のいずれかの置換によって阻害されることが示されている（Ｓｔｅｐｉｎｓｋｉら，２００１；ＲＮＡ  Ｊ．７：１４８６−１４９５；Ｐｅｎｇら，２００２；Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２４：１６１−１６４）。そのような「抗逆方向キャップ類似体」、すなわちＡＲＣＡの存在下で合成されるＲＮＡは、従来の５'末端キャップｍ７ＧｐｐｐＧの存在下でインビトロ転写されたＲＮＡよりも効率的に翻訳される。さらに、Ｋｏｒｅら（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００９  Ａｐｒ  ２２．［印刷物に先駆けたオンライン出版］）は、ロックト核酸（ＬＮＡ）−修飾ジヌクレオチドｍＲＮＡキャップ類似体も、ＲＮＡ鎖に逆方向で組み込まれないことを認めた（Ｋｏｒｅら２００９，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３１：６３６４−６３６５）。
【０１１９】
従って、特に好ましい実施形態では、Ｒ１は、真核生物翻訳開始機構が本発明で使用される修飾されたＲＮＡを認識することができるように選択され、Ｒ２および／またはＲ３は、キャップがＲＮＡ鎖に逆方向で組み込まれることができないように選択される。
【０１２０】
好ましくは、Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、Ｆ、ＯＨ、メトキシ、エトキシおよびプロポキシから成る群より独立して選択される。好ましくは、Ｒ２およびＲ３の一方はＯＨであり、他方はＯＨではない。より好ましくは、Ｒ２およびＲ３の少なくとも１つはＯＨではない。置換基Ｒ２およびＲ３を含む環構造がリボースの立体化学的配置を有する場合、Ｒ２およびＲ３の少なくとも１つはＯＨでないことが特に好ましい。好ましくは、ＯＨではない残基は、Ｈ、ハロおよび任意に置換されたＣ１−Ｃ１０アルコキシから成る群より選択され、好ましくはＨ、Ｆ、メトキシ、エトキシおよびプロポキシから成る群より選択され、より好ましくはメトキシである。好ましい実施形態では、特に置換基Ｒ２およびＲ３を含む環構造がリボースの立体化学的配置を有する場合、Ｒ２はＯＨであり、およびＲ３はメトキシであるか、またはＲ２はメトキシであり、およびＲ３はＯＨである。
【０１２１】
１つの実施形態では、置換基Ｒ２およびＲ３を含む環構造の立体化学的配置がリボースの立体化学的配置に対応しない、例えばアラビノース、キシロースまたはリキソースの立体化学的配置に対応する場合、特に前記環構造の立体化学的配置がアラビノースの立体化学的配置に対応する場合は、Ｒ２およびＲ３はどちらもＯＨであってよい。しかし、この実施形態において、Ｒ２およびＲ３は上記で指定されたように選択されることも可能である。
【０１２２】
特に好ましい実施形態では、Ｒ５はＳである。好ましくは、Ｒ４およびＲ６は、ＯおよびＳから成る群より選択され、好ましくはＯである。好ましくは、ｎは１または２であり、より好ましくはｎは１である。
【０１２３】
式（Ｉ）による５'末端キャップ構造の好ましい実施形態を以下で説明する。以下で述べる構造、式および化合物はすべて、「式（Ｉ）による５'末端キャップ構造」という用語に包含されることが了解されるべきである。
【０１２４】
最も好ましい実施形態では、本発明で使用される５'末端キャップは、式（ＩＩ）に従った以下の構造：
【化１０】
0006042481.tif 000011
を有するβ−Ｓ−ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマーに対応する。
【０１２５】
これに関連して、「に対応する」は、５'末端キャップがβ−Ｓ−ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマーと同一である、またはβ−Ｓ−ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマーと基本的に同一であることを意味し、好ましい実施形態では本発明で使用されるＲＮＡの５'末端キャップとβ−Ｓ−ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマーとの間にわずかな相違しか存在し得ないことを意味する。例えば、７−メチルグアノシン単位の２'位の置換基はＨまたはエトキシであってよく、および／または７−メチルグアノシン単位のＮ７原子の置換基はエチルであってよく、および／または７−メチルグアノシン単位の２'位の置換基はＯＨであってよく、および７−メチルグアノシンの３'位の置換基はＯＨとは異なってよく、例えばＨまたはメトキシ、好ましくはメトキシであってよい。
【０１２６】
以下では、本発明にいて使用されるＲＮＡの特に好ましい実施形態を開示する：
【化１１】
0006042481.tif 000012
［式中、Ｒ１は、任意に置換されたＣ１−Ｃ４アルキル、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、任意に置換されたベンジル、任意に置換されたフェニルエチルまたは任意に置換されたナフチルメチル、任意に置換されたＣ２−Ｃ４アルケニル、例えばエテニル、プロペニルまたはブテニル、ならびに任意に置換されたアリールから成る群より選択され、
Ｒ２は、Ｈ、ＯＨ、Ｆ、メトキシ、エトキシおよびプロポキシから成る群より選択され、好ましくはＲ２はＯＨであるか、またはＲ２は、Ｒ２が結合して−Ｏ−ＣＨ２−もしくは−ＣＨ２−Ｏ−を形成する環の４'位で水素原子と結合しており、
Ｒ４およびＲ６は、Ｏ、Ｓ、ＳｅおよびＢＨ３から成る群より独立して選択され、好ましくはＲ４およびＲ６は、ＯおよびＳから成る群より独立して選択され、最も好ましくはＲ４およびＲ６はＯであり、
Ｐβ原子における立体化学的配置は、β−Ｓ−ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマーのＰβ原子における立体化学的配置に対応する。］。
【化１２】
0006042481.tif 000013
［式中、Ｒ１は、任意に置換されたＣ１−Ｃ４アルキル、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、任意に置換されたベンジル、任意に置換されたフェニルエチルまたは任意に置換されたナフチルメチル、任意に置換されたＣ２−Ｃ４アルケニル、例えばエテニル、プロペニルまたはブテニル、ならびに任意に置換されたアリールから成る群より選択され、
Ｒ３は、Ｈ、ＯＨ、Ｆ、メトキシ、エトキシおよびプロポキシから成る群より選択され、好ましくはＲ３はＯＨであり、
Ｒ４およびＲ６は、Ｏ、Ｓ、ＳｅおよびＢＨ３から成る群より独立して選択され、好ましくはＲ４およびＲ６は、ＯおよびＳから成る群より独立して選択され、最も好ましくはＲ４およびＲ６はＯであり、
Ｐβ原子における立体化学的配置は、β−Ｓ−ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマーのＰβ原子における立体化学的配置に対応する。］。
【化１３】
0006042481.tif 000014
［式中、Ｒ３は、Ｈ、ハロおよび任意に置換されたＣ１−Ｃ１０アルコキシから成る群より選択され、好ましくはＲ３は、Ｈ、Ｆ、メトキシ、エトキシおよびプロポキシから選択され、好ましくはＲ３はＨまたはメトキシであり、
Ｒ４およびＲ６は、Ｏ、Ｓ、ＳｅおよびＢＨ３から成る群より独立して選択され、好ましくはＲ４およびＲ６は、ＯおよびＳから成る群より独立して選択され、最も好ましくはＲ４およびＲ６はＯであり、
Ｐβ原子における立体化学的配置は、β−Ｓ−ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマーのＰβ原子における立体化学的配置に対応する。］。
【化１４】
0006042481.tif 000015
［式中、Ｒ２は、Ｈ、ハロおよび任意に置換されたＣ１−Ｃ１０アルコキシより成る群より選択され、好ましくはＲ２は、Ｈ、Ｆ、メトキシ、エトキシおよびプロポキシから選択され、好ましくはＲ２はＨもしくはメトキシであるか、またはＲ２は、Ｒ２が結合して−Ｏ−ＣＨ２−もしくは−ＣＨ２−Ｏ−を形成する環の４'位で水素原子と結合しており、
Ｒ４およびＲ６は、Ｏ、Ｓ、ＳｅおよびＢＨ３から成る群より独立して選択され、好ましくはＲ４およびＲ６は、ＯおよびＳから成る群より独立して選択され、最も好ましくはＲ４およびＲ６はＯであり、
Ｐβ原子における立体化学的配置は、β−Ｓ−ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマーのＰβ原子における立体化学的配置に対応する。］。
【化１５】
0006042481.tif 000016
［式中、Ｒ２は、Ｈ、ＯＨ、ハロおよび任意に置換されたＣ１−Ｃ１０アルコキシから成る群より選択され、好ましくはＲ２は、Ｈ、ＯＨ、Ｆ、メトキシ、エトキシおよびプロポキシから選択され、好ましくはＲ２はＯＨであるか、またはＲ２は、Ｒ２が結合して−Ｏ−ＣＨ２−もしくは−ＣＨ２−Ｏ−を形成する環の４'位で水素原子と結合しており、
Ｒ４およびＲ６は、Ｏ、Ｓ、ＳｅおよびＢＨ３から成る群より独立して選択され、好ましくはＲ４およびＲ６は、ＯおよびＳから成る群より独立して選択され、最も好ましくはＲ４およびＲ６はＯであり、
Ｐβ原子における立体化学的配置は、β−Ｓ−ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマーのＰβ原子における立体化学的配置に対応する。］。
【化１６】
0006042481.tif 000017
［式中、Ｒ３は、Ｈ、ＯＨ、ハロおよび任意に置換されたＣ１−Ｃ１０アルコキシから成る群より選択され、好ましくはＲ３は、Ｈ、ＯＨ、Ｆ、メトキシ、エトキシおよびプロポキシから選択され、好ましくはＲ３はＯＨであり、
Ｒ４およびＲ６は、Ｏ、Ｓ、ＳｅおよびＢＨ３から成る群より独立して選択され、好ましくはＲ４およびＲ６は、ＯおよびＳから成る群より独立して選択され、最も好ましくはＲ４およびＲ６はＯであり、
Ｐβ原子における立体化学的配置は、β−Ｓ−ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマーのＰβ原子における立体化学的配置に対応する。］。
【化１７】
0006042481.tif 000018
［式中、Ｒ１は、任意に置換されたＣ１−Ｃ４アルキル、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、任意に置換されたベンジル、任意に置換されたフェニルエチルまたは任意に置換されたナフチルメチル、任意に置換されたＣ２−Ｃ４アルケニル、例えばエテニル、プロペニルまたはブテニル、ならびに任意に置換されたアリールから成る群より選択され、
Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、Ｆ、ＯＨ、メトキシ、エトキシおよびプロポキシから成る群より独立して選択されるか、またはＲ２とＲ３は、一緒になってＯ−Ｘ−Ｏ［式中、Ｘは、任意に置換されたＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）およびＣ（ＣＨ３）２から成る群より選択される。］を形成するか、好ましくはＲ２とＲ３は一緒になって２'，３'−イソプロピリデンを形成するか、またはＲ２は、Ｒ２が結合して−Ｏ−ＣＨ２−もしくは−ＣＨ２−Ｏ−を形成する環の４'位で水素原子と結合しており、好ましくはＲ２およびＲ３は、５'末端キャップが逆方向でＲＮＡに組み込まれることができないように選択され、
Ｐβ原子における立体化学的配置は、β−Ｓ−ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマーのＰβ原子における立体化学的配置に対応する。］。
【化１８】
0006042481.tif 000019
［式中、Ｒ１は、任意に置換されたＣ１−Ｃ４アルキル、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、任意に置換されたベンジル、任意に置換されたフェニルエチルまたは任意に置換されたナフチルメチル、任意に置換されたＣ２−Ｃ４アルケニル、例えばエテニル、プロペニルまたはブテニル、ならびに任意に置換されたアリールから成る群より選択され、
Ｒ４およびＲ６は、Ｏ、Ｓ、ＳｅおよびＢＨ３から成る群より独立して選択され、好ましくはＲ４およびＲ６は、ＯおよびＳから独立して選択され、より好ましくはＲ４およびＲ６はＯであり、
ｎは１、２または３であり、好ましくはｎは１または２であり、より好ましくはｎは１であり、そして
置換基としてＳを担持するＰ原子における立体化学的配置は、β−Ｓ−ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマーのＰβ原子における立体化学的配置に対応する。］。
【０１２７】
好ましくは、本発明で使用されるＲＮＡの安定性および翻訳効率を、必要に応じてさらに改変し得る。例えば、安定化作用および／または翻訳効率を高める作用を有する１またはそれ以上の修飾によってＲＮＡを安定化し、その翻訳効率を高め得る。そのような修飾は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開広報第ＷＯ２００７／０３６３６６号に記載されている。
【０１２８】
例えば、マスクされていないポリＡ配列（マスクされていないポリＡ尾部）を有するＲＮＡは、マスクされたポリＡ配列を有するＲＮＡよりも効率的に翻訳される。「ポリＡ配列」という用語は、典型的にはＲＮＡ分子の３'末端に位置するアデニル（Ａ）残基の配列に関し、「マスクされていないポリＡ配列」は、ＲＮＡ分子の３'末端のポリＡ配列がそのポリＡ配列のＡで終了し、そのポリＡ配列の３'末端側、すなわち下流に位置するＡ以外のヌクレオチドが後続していないことを意味する。さらに、約１２０ヌクレオチドの長いポリＡ配列は最適の転写産物安定性および翻訳効率をもたらす。
【０１２９】
従って、本発明で使用されるＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡは、好ましくは、１０〜５００ヌクレオチドの長さを有する、好ましくは３０〜３００ヌクレオチドの長さを有する、より好ましくは６５〜２００ヌクレオチドの長さを有する、より好ましくは１００〜１５０ヌクレオチド、例えば１００、１１０、１２０、１３０、１４０または１５０ヌクレオチド、好ましくは１２０ヌクレオチドの長さを有するポリＡ尾部をさらに含む。好ましくは、前記ポリＡ配列はマスクされていないポリＡ配列である。従って、好ましくは、上記で特定した本発明で使用されるＲＮＡは、１０〜５００ヌクレオチドの長さを有する、好ましくは３０〜３００ヌクレオチドの長さを有する、より好ましくは６５〜２００ヌクレオチドの長さを有する、より好ましくは１００〜１５０ヌクレオチド、例えば１００、１１０、１２０、１３０、１４０または１５０ヌクレオチド、好ましくは１２０ヌクレオチドの長さを有するマスクされていないポリＡ尾部を含む。
【０１３０】
加えて、ＲＮＡ分子の３'非翻訳領域（ＵＴＲ）への３'非翻訳領域の組込みは、翻訳効率の改善をもたらすことができる。そのような３'ＵＴＲの２またはそれ以上を組み込むことによって相乗作用を達成し得る。３'ＵＴＲは、それらが導入されるＲＮＡに対して自家または異種であってよく、例えば、β−グロビンｍＲＮＡの３'ＵＴＲであり得る。従って、好ましくは、本発明で使用されるＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡは、β−グロビン遺伝子、好ましくはヒトβ−グロビン遺伝子の３'非翻訳領域（３'ＵＴＲ）の１またはそれ以上のコピー、好ましくは２コピーをさらに含み得る。
【０１３１】
本発明で使用されるＲＮＡは、上述した修飾の組合せ、すなわちポリＡ配列の組込み、ポリＡ配列の脱マスク化および１またはそれ以上の３'ＵＴＲの組込みの組合せによって修飾されていることが特に好ましい。
【０１３２】
特に好ましい実施形態では、本発明で使用されるＲＮＡは、免疫原、抗原または抗原ペプチドを含むペプチドまたはタンパク質をコードする。１つの実施形態では、前記ペプチドまたはタンパク質は、発現後に前記免疫原、抗原または抗原ペプチドを提供するようにプロセシングされる。別の実施形態では、ペプチドまたはタンパク質自体が免疫原、抗原または抗原ペプチドである。
【０１３３】
第１の態様では、本発明は、上述した構造を有するＲＮＡを含有するワクチン組成物を提供する。好ましい実施形態では、前記ワクチン組成物は、１またはそれ以上の医薬的に許容される担体、賦形剤および／または希釈剤をさらに含有する。前記ワクチン組成物は、個体において免疫反応を増強するおよび／または支持することができる化合物または物質をさらに含有し得る。例えば、本発明のワクチン組成物は、上述したアジュバントまたはサイトカイン、例えばインターロイキン１２（ＩＬ−１２）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）またはインターロイキン１８（ＩＬ−１８）をさらに含有し得る。さらに、本発明によるワクチン組成物は、ＲＮアーゼ阻害剤などのＲＮＡ安定化物質、医薬的に許容される塩もしくは緩衝剤、塩化ベンザルコニウム、クロルブタノール、パラベンもしくはチメロサールなどの防腐剤、湿潤剤、乳化剤、および／または付加的な薬剤もしくは活性物質をさらに含有し得る。特に好ましい実施形態では、ＲＮＡは、裸のＲＮＡの形態で本発明によるワクチン組成物中に存在する。本発明のワクチン組成物は、非経口投与用に、例えば静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、リンパ内またはリンパ節内投与用に、最も好ましくはリンパ節内投与用に製剤されることが特に好ましい。本発明のワクチン組成物は、最も好ましくはリンパ節、好ましくは鼠径リンパ節への注射用に、リンパ管および／または脾臓への注射用に製剤される。好ましくは、ワクチン組成物は、受容者、すなわちワクチン接種される個体の血液と等張である水溶液または非水溶液の形態である。例えば、リンガー液、等張塩化ナトリウム溶液またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を使用し得る。特に、ワクチン組成物は、好ましくは滅菌であり、上記で特定したＲＮＡを治療有効量で含有する。
【０１３４】
第２の態様では、本発明は、上記で特定したＲＮＡを含む未熟抗原提示細胞を提供する。好ましい実施形態では、未熟抗原提示細胞は、未熟マクロファージ、未熟単球、未熟Ｂ細胞および未熟樹状細胞から成る群より選択され、好ましくは、未熟抗原提示細胞は未熟樹状細胞である。特に好ましい実施形態では、本発明による未熟抗原提示細胞は医薬組成物に製剤され、前記医薬組成物は、好ましくは、個体に投与された場合免疫応答を誘発するのに適しており、前記免疫応答は、好ましくは、本発明の未熟抗原提示細胞中に存在するＲＮＡによってコードされるタンパク質もしくはペプチド、または本発明の未熟抗原提示細胞中に存在するＲＮＡによってコードされるタンパク質もしくはペプチドに含まれる抗原および／もしくは免疫原を対象とする。従って、本発明は、本発明の２番目の態様に従った未熟抗原提示細胞を含有する医薬組成物を提供する。
【０１３５】
第３の態様では、本発明は、個体において免疫応答を誘発する方法であって、本発明のワクチン組成物または本発明の未熟抗原提示細胞を前記個体に投与するステップを含む方法を提供する。好ましくは、前記免疫応答は、本発明のワクチン組成物もしくは未熟抗原提示細胞に含まれるＲＮＡによってコードされるタンパク質もしくはペプチドを特異的に対象とするか、または前記タンパク質もしくはペプチドに含まれる抗原を特異的に対象とする。前記免疫応答は治療的および／または防御的であり得る。前記ワクチン組成物および前記未熟抗原提示細胞、好ましくは未熟樹状細胞は、本発明の最初の態様について上記で特定したように非経口的に、好ましくはリンパ節内注射によって、好ましくは鼠径リンパ節への注射によって投与されることが特に好ましい。
【０１３６】
第４の態様では、本発明は、未熟抗原提示細胞におけるＲＮＡの安定性を高めるためおよび／または未熟抗原提示細胞におけるＲＮＡの発現を増大させる方法であって、上記で特定した式（Ｉ）による５'末端キャップ構造を有する前記ＲＮＡを準備することを含む方法を提供する。好ましくは、前記未熟抗原提示細胞は、未熟単球、未熟マクロファージ、未熟グリア細胞、未熟Ｂ細胞および未熟樹状細胞から成る群より選択され、好ましくは、未熟抗原提示細胞は未熟樹状細胞である。未熟抗原提示細胞におけるＲＮＡの安定性を評価するため、当業者は、前記ＲＮＡの導入後一定の時点で、例えば本明細書中以下の実施例４で述べるようにリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用することにより、未熟抗原提示細胞内の検討されるＲＮＡの存在を検出し得るまたはＲＮＡの量を定量化し得る。未熟抗原提示細胞におけるＲＮＡの発現は、ルシフェラーゼまたは緑色蛍光タンパク質などのマーカータンパク質、好ましくはｄ２ＥＧＦＰをコードするＲＮＡを使用して測定し得るが、当業者に公知の任意の他のマーカータンパク質であってもよく、本明細書中以下の実施例３で述べるようにＲＮＡの導入後一定の時点で前記マーカータンパク質の発現を測定し得る。
【０１３７】
第５の態様では、本発明は、抗原提示細胞の表面に対象とする抗原を提示するＭＨＣ分子の割合を増大させる方法であって、前記の対象とする抗原またはその抗原ペプチドを含むペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、上記で特定した式（Ｉ）による５'末端キャップ構造で修飾されたＲＮＡを準備すること、および前記ＲＮＡを導入した未熟抗原提示細胞を準備することを含む方法を提供する。いかなる理論にも拘束されるものではないが、式（Ｉ）によるキャップ構造でＲＮＡを修飾することは、特に未熟抗原提示細胞内、例えば未熟樹状細胞内での前記ＲＮＡの安定性を高めると推測される。この安定性上昇は、前記ＲＮＡの発現上昇、従って前記ＲＮＡによってコードされるタンパク質またはペプチドの蓄積を導く。前記タンパク質またはペプチドは、抗原または抗原ペプチドを含み得る。従って、前記タンパク質のプロセシング後に、抗原または抗原ペプチドは抗原提示細胞の表面上でＭＨＣ分子に負荷され得る。あるいは、前記タンパク質またはペプチドは、それ自体が抗原または抗原ペプチドであってもよく、プロセシングなしでＭＨＣ分子に負荷され得る。式（Ｉ）による５'末端キャップ構造で修飾された、抗原または抗原ペプチドを含む特定のタンパク質またはペプチドをコードするＲＮＡは、従来の５'末端キャップを有する同じＲＮＡと比較した場合、好ましくはＡＲＣＡ  ５'末端キャップを有する同じＲＮＡと比較した場合、より好ましくは、置換基Ｒ５を有するＰ原子における立体化学的配置が異β−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ２）のＰβ原子における立体化学的配置に対応することを除き、同じ５'末端キャップ構造を有する同じＲＮＡと比較した場合、前記ＲＮＡによってコードされるタンパク質またはペプチドに由来するペプチドを提示する抗原提示細胞の細胞表面上のＭＨＣ分子の割合／画分を増大させると推測される。抗原提示細胞の表面に特定の抗原を提示するＭＨＣ分子の密度は、前記特定抗原に特異的な誘導される免疫応答の強さを決定するので、抗原提示細胞に導入された、抗原をコードするＲＮＡの安定性を高めることは前記特定抗原に対する免疫応答の増大を導くと推測される。
【０１３８】
第６の態様では、本発明は、免疫エフェクター細胞を刺激するおよび／または活性化するための方法であって、対象とする抗原またはその抗原ペプチドを含むペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、式（Ｉ）による５'末端キャップ構造で修飾されたＲＮＡを準備すること、前記ＲＮＡを導入した未熟抗原提示細胞を準備すること、および抗原提示細胞を免疫エフェクター細胞と接触させることを含む方法を提供する。好ましくは、前記免疫エフェクター細胞は、抗原特異的に活性化されるおよび／または刺激される。好ましくは、この方法により、抗原特異的エフェクター細胞、好ましくはＴ細胞の量が増大する。好ましくは、未熟抗原提示細胞は未熟樹状細胞である。好ましい実施形態では、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、好ましくはＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋細胞である。１つの実施形態では、前記ＲＮＡを未熟抗原提示細胞に導入する段階は、上述したリポフェクション、電気穿孔法またはマイクロインジェクションなどの当業者に公知の任意の核酸導入法、例えばトランスフェクション法によってインビトロで実施される。別の実施形態では、前記ＲＮＡを未熟抗原提示細胞に導入する段階は、例えば、ＲＮＡを個体に投与することによって、好ましくは非経口投与によって、好ましくはリンパ内投与によって、好ましくはリンパ節への注射、すなわちリンパ節内注射によって、リンパ管への注射によって、または脾臓への注射によってインビボで実施される。好ましくは、前記投与は、好ましくはリンパ節内で未熟樹状細胞によって取り込まれるＲＮＡのリンパ節内注射による。投与されるＲＮＡは、好ましくは裸のＲＮＡの形態である。１つの実施形態では、抗原提示細胞を免疫エフェクター細胞と接触させる段階は、インビトロで、例えば組織培養皿において実施される。別の実施形態では、抗原提示細胞を免疫エフェクター細胞と接触させる段階はインビボで実施される。この実施形態では、ＲＮＡを未熟抗原提示細胞に導入する段階は、上述したようにインビトロまたはインビボで実施され得る。ＲＮＡがインビトロで導入された抗原提示細胞をインビボで免疫エフェクター細胞と接触させるために、抗原提示細胞を、好ましくは非経口投与によって、例えば静脈内、筋肉内、皮下、リンパ節内、リンパ内または腹腔内注射によって、好ましくはリンパ管、脾臓および／またはリンパ節、好ましくは鼠径リンパ節への注射などのリンパ系への注射によって、個体に投与する。本発明の６番目の態様の実施形態では、前記方法は、ＲＮＡを未熟抗原提示細胞に導入した後および抗原提示細胞を免疫エフェクター細胞と接触させる前に、未熟抗原提示細胞を成熟抗原提示細胞に分化させる段階をさらに含み得る。分化段階はインビトロまたはインビボで実施され得る。例えば、ＲＮＡを未熟抗原提示細胞に、好ましくは未熟樹状細胞に導入し、未熟抗原提示細胞をインビトロで分化させ、分化した成熟抗原提示細胞、好ましくは成熟樹状細胞を、上述したようにインビトロまたはインビボで、好ましくはインビボで免疫エフェクター細胞と接触させる。ＲＮＡがインビトロで導入される未熟抗原提示細胞は、個体、例えば免疫される患者から単離し得るか、または造血幹細胞から��化させ得る。
【０１３９】
免疫エフェクター細胞、特にＴ細胞の刺激および／または活性化は、典型的には免疫エフェクター細胞の増殖、細胞傷害反応性および／またはサイトカイン分泌に関連する。従って、当業者は、免疫エフェクター細胞が刺激されるおよび／または活性化されるかどうかを、典型的にはＴ細胞を使用して実施される、簡単なインビトロ試験によって判定し得る。そのようなＴ細胞は、Ｔ細胞ハイブリドーマなどの形質転換されたＴ細胞株またはげっ歯動物、例えばマウスもしくはラットなどの哺乳動物から単離されたＴ細胞によって提供され得る。適切なＴ細胞ハイブリドーマは、市販されているかまたは公知の方法によって作製され得る。Ｔ細胞は公知の方法によって哺乳動物から単離され得る（Ｓｈｉｍｏｎｋｅｖｉｔｚら，１９８３，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５８：３０３−３１６参照）。Ｔ細胞の活性化および／または刺激に関して試験するための適切な実験設定を以下の段階（１）〜（４）で述べる。Ｔ細胞は、試験し得るおよびＴ細胞の活性化またはＴ細胞活性の調節を指示する適切なマーカーを発現する。マウスＴ細胞ハイブリドーマＤＯ１１．１０は活性化後にインターロイキン２（ＩＬ−２）を発現するので、前記ハイブリドーマをこの目的に使用し得る。Ｔ細胞の活性化／刺激を確認するためまたは組成物が前記Ｔ細胞ハイブリドーマの活性を調節することができるかどうかを判定するためにＩＬ−２濃度を測定し得る。この試験は以下の段階によって実施される：（１）Ｔ細胞ハイブリドーマからまたは哺乳動物からの単離によってＴ細胞を提供する、（２）増殖を可能にする条件下でＴ細胞を培養する、（３）増殖中のＴ細胞を、抗原またはそれをコードする核酸と接触させておいた抗原提示細胞と接触させる、および（４）Ｔ細胞をマーカーに関して試験する、例えばＩＬ−２産生を測定する。試験に使用される細胞は、増殖を可能にする条件下で培養する。例えば、ＤＯ１１．１０  Ｔ細胞ハイブリドーマを完全培地（１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミンおよび５×１０−５Ｍ  ２−メルカプトエタノールを添加したＲＰＭＩ  １６４０）において３７℃および５％ＣＯ２で適切に培養する。Ｔ細胞活性化シグナルは、適切な抗原性ペプチドを負荷された抗原提示細胞によって提供される。
【０１４０】
あるいは、Ｔ細胞活性の調節を、抗原特異的Ｔ細胞の変化または増殖を測定することによって確認してもよく、これは、例えば公知の放射性標識法によって測定し得る。例えば、標識ヌクレオチドを試験培地に添加し得る。そのような標識ヌクレオチドのＤＮＡへの組込みは、Ｔ細胞増殖に関する指標としての役割を果たし得る。この試験は、Ｔ細胞ハイブリドーマのようなその増殖のために抗原提示を必要としないＴ細胞には適用されない。この試験は、哺乳動物から単離された非形質転換Ｔ細胞の場合にＴ細胞活性の調節を測定するために有用である。
【０１４１】
第７の態様では、本発明は、個体において免疫応答を誘導する方法であって、対象とする抗原またはその抗原ペプチドを含むペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、式（Ｉ）による５'末端キャップ構造で修飾されたＲＮＡを準備すること、および前記ＲＮＡを前記個体に投与することを含む方法を提供する。対象とする抗原は任意の抗原であってよく、好ましくは上記で定義したとおりである。好ましい実施形態では、前記ＲＮＡは、好ましくは非経口投与によって、例えば静脈内、筋肉内、皮下、リンパ節内、リンパ内または腹腔内注射によって、好ましくはリンパ管、脾臓および／またはリンパ節、好ましくは鼠径リンパ節への注射などのリンパ系への注射によって、裸のＲＮＡの形態で投与される。好ましくは、投与されたＲＮＡは個体の未熟樹状細胞によって取り込まれる。好ましくは、免疫応答は防御的および／または治療的であり、例えば、癌性疾患または感染症などの疾患を治療するおよび／または予防するために有用である。
【０１４２】
第８の態様では、本発明は、個体において免疫応答を誘導する方法であって、対象とする抗原またはその抗原ペプチドを含むペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、式（Ｉ）による５'末端キャップ構造で修飾されたＲＮＡを準備すること、前記ＲＮＡを導入した未熟抗原提示細胞を準備すること、および抗原提示細胞を前記個体に投与することを含む方法を提供する。本発明のこの態様では、ＲＮＡを、上述した当業者に公知の任意の核酸導入法、例えばリポフェクション、電気穿孔法またはマイクロインジェクションなどのトランスフェクションによってインビトロで未熟抗原提示細胞に導入する。好ましくは、未熟抗原提示細胞は未熟樹状細胞である。ＲＮＡがインビトロで導入される未熟抗原提示細胞は、個体、例えば免疫される患者から単離し得るか、または造血幹細胞から分化させ得、造血幹細胞は患者から単離し得る。未熟抗原提示細胞または造血幹細胞は白血球搬出法によって個体から単離し得る。好ましくは、未熟抗原提示細胞は未熟樹状細胞である。好ましくは、未熟抗原提示細胞を免疫される個体から単離し、ＲＮＡを前記単離細胞に導入して、その細胞を、好ましくは非経口投与によって、例えば静脈内、筋肉内、皮下、リンパ節内、リンパ内または腹腔内注射によって、好ましくはリンパ管、脾臓および／またはリンパ節、好ましくは鼠径リンパ節への注射などのリンパ系への注射によって前記個体に戻す。
【０１４３】
標的疾患に対するワクチン接種への適合性を含む、免疫反応を誘導する能力は、インビボ試験によって容易に判定され得る。例えば、組成物、例えばワクチン組成物または医薬組成物を実験動物、例えばマウス、ラット、ウサギ等のような哺乳動物に投与し、組成物の投与の前および組成物の投与後定められた時点で、例えば投与の１、２、３、４、５、６、７および８週間後に前記動物から血液試料を採取し得る。血液試料から血清を調製し、投与／免疫後に生じた抗体の発現を測定し得る。例えば、抗体の濃度を測定し得る。さらに、Ｔ細胞を哺乳動物の血液および／またはリンパ系から単離し、それを、免疫のために使用された抗原に対する反応性に関して試験し得る。当業者に公知の任意の読み取りシステムを使用してよく、例えば増殖アッセイ、サイトカイン分泌アッセイ、細胞傷害活性を試験するアッセイまたはテトラマー解析等を使用し得る。さらに、免疫反応性の増大も、抗原特異的Ｔ細胞の数、それらの潜在的細胞傷害能または上記で述べたようなそれらのサイトカイン分泌パターンを測定することによって判定し得る。
【０１４４】
さらに、本発明は、医学適用における使用のための、好ましくは個体において免疫応答を誘導するための、例えば個体のワクチン接種のための、例えば前記個体において癌性疾患もしくは感染症を予防するためまたは癌性疾患もしくは感染症に罹患している個体を治療するための、本明細書で述べるＲＮＡ、本発明の最初の態様に従ったワクチン組成物、本発明の２番目の態様に従った未熟抗原提示細胞および前記細胞を含有する医薬組成物を提供する。
【０１４５】
本発明の方法、特に免疫エフェクター細胞を活性化および／または刺激し、個体において免疫応答を誘導するための方法ならびに前記方法における使用のためのワクチン組成物、未熟抗原提示細胞およびＲＮＡは、ＲＮＡに基づく免疫後に抗原特異的Ｔリンパ球の頻度の定量的増大を可能にする。この効率の上昇は、より良好な臨床効率またはワクチン用量の低減に関して患者の免疫療法のために利用され得る。さらに、本発明は、かろうじて存在する前駆Ｔ細胞から抗原特異的Ｔ細胞を大幅に増幅する機会を提供する。さらに、本発明を適用した効率の上昇にはコスト削減が付随する。
【０１４６】
本発明を以下の図面および実施例によって詳細に説明するが、これらは説明のみを目的とし、限定を意図されない。説明および実施例により、同様に本発明に含まれるさらなる実施形態が当業者にアクセス可能となる。
【実施例】
【０１４７】
実施例１：ヒト単球由来樹状細胞の作成。
【０１４８】
細胞培養フラスコ（１５０ｃｍ２、Ｆａｌｃｏｎ  Ｎｒ  ３５５００１）、１０００Ｕ／ｍｌヒト顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、Ｅｓｓｅｘ，Ｌｕｚｅｒｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）および１０００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−４（ヒトインターロイキン４、Ｓｔｒａｔｈｍａｎｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加したＤＣ培地（２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、可欠アミノ酸および１０％熱不活性化ヒトＡＢ血清を含むＲＰＭＩ  １６４０；すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＤＰＢＳ／ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，ＧｅｒｍａｎｙからのＤＰＢＳ、およびＥＤＴＡ  ２ｍｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、１５ｍｌおよび５０ｍｌ反応管、使い捨てピペット、ピペットチップ、ＦＡＣＳチューブ、冷却遠心機（４℃）、氷を準備する。
【０１４９】
手順：
【０１５０】
０日目：
ＣＤ１４陽性細胞を、ビーズ結合した抗Ｃ１４抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を製造者の指示に従って使用して選択し、通過した溶出液の試料および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）画分をその後のＦＡＣＳ分析のために保持した（実施例２参照）。溶出後に細胞を計数し、４℃で遠心分離（１５分間、３４０ｒｃｆ）を実施した。細胞を約１×１０６細胞／ｍｌ（最大５×１０７細胞／フラスコ）の密度でＤＣ培地に再懸濁した。１０００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−４および１０００Ｕ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦ（上述したような）を培養液に添加した。
【０１５１】
２（場合により３）日目：
培養液の３分の１を取り出し、４℃で遠心分離した（１５分間、３４０ｒｃｆ）。２０００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−４および２０００Ｕ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦを含む同じ容量の培養液を添加した。
【０１５２】
５（場合により４）日目：
培養液の３分の１を取り出し、４℃で遠心分離した（１５分間、３４０ｒｃｆ）。２０００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−４および２０００Ｕ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦを含む同じ容量の培養液を添加した。
【０１５３】
７日目：
繰り返しピペットを上下して取ることによって組織培養フラスコの底部から細胞を取り出した。培養液全体を取り出し、フラスコを冷ＰＢＳ／ＥＤＴＡ  約３０ｍｌで洗浄した。遠心分離によって細胞を採取し、冷ＤＣ培地１０ｍｌに再懸濁した。細胞を氷上に置き、計数した。細胞の試料をその後のＦＡＣＳ分析のために保持した。細胞の密度をＤＣ培地で１．０×１０７／４０ｍｌに調整し、フラスコにつきＤＣ培地４０ｍｌを添加した。以下のサイトカインを培養液に添加した：
５００Ｕ／ｍｌ      ＩＬ−４
８００Ｕ／ｍｌ      ＧＭ−ＣＳＦ
１０ｎｇ／ｍｌ      ＩＬ−１Ｂ
１０ｎｇ／ｍｌ      ＴＮＦ−α
１０００Ｕ／ｍｌ    ＩＬ−６
１μｇ／ｍｌ        ＰＧＥ２
【０１５４】
９（場合により１０）日目：
静かに洗い流すことによって組織培養フラスコから細胞を取り出した。細胞を計数し、試料をその後のＦＡＣＳ分析のために保持した（実施例２参照）。細胞を遠心分離し、必要に応じて細胞数を調整した。
【０１５５】
実施例２：ＦＡＣＳ染色。
【０１５６】
約２ｘ１０５細胞を各々の染色のためにＦＡＣＳチューブに取った。ＦＡＣＳ緩衝液（５ｍＭ  ＥＤＴＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙおよび５％ＦＣＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙを含む、ＤＰＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で容量を１００μｌに調整した。α−ＣＤｘ−ＦＩＴＣ  ５μｌおよび場合によりα−ＣＤｙ−ＰＥ  ５μｌをＦＡＣＳチューブに添加した。チューブを暗所にて４℃で３０〜４０分間インキュベートした後、ＦＡＣＳ緩衝液４ｍｌを添加し、試料を遠心分離した。上清を吸引して除去し、細胞ペレットおよび細胞をＦＡＣＳ緩衝液４００μｌに再懸濁して、４℃で保存した。
【０１５７】
α−ＣＤ１４−ＦＩＴＣ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびα−ＣＤ３−ＰＥ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してＰＢＭＣを染色した。別途の染色では、α−ＣＤ１９−ＰＥ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＰＢＭＣを染色した。７日目と９日目に染色を実施した。染色を実施するまで細胞試料を氷上で保存した。
【０１５８】
実施例３：５'末端に特定のホスホロチオエートキャップ類似体を有するＲＮＡは未熟樹状細胞においてタンパク質発現の増強と延長を生じさせる。
【０１５９】
ルシフェラーゼをコードするＲＮＡを、鋳型となる最適化したベクター（国際公開広報第ＷＯ２００７／０３６３６６号；Ｈｏｌｔｋａｍｐら，２００６，Ｂｌｏｏｄ  １０８：４００９−４０１７）を用いてインビトロで転写した。線状化ベクターＤＮＡを分光光度的に定量し、基本的にＰｏｋｒｏｖｓｋａｙａとＧｕｒｅｖｉｃｈ（Ｐｏｋｒｏｖｓｋａｖａ  ＆  Ｇｕｒｅｖｉｃｈ，１９９４，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２０：４２０−４２３）により記載されたようにインビトロ転写に供した。キャップジヌクレオチドの１つ、ｍ７ＧｐｐｐＧ（Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚら，１９８８，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：８９５３−８９６２）、ｍ７Ｇｐｐｐｐｍ７Ｇ、ｍ２（７，３'−Ｏ）ＧｐｐｐＧ（以下ではＡＲＣＡと称する）（Ｓｔｅｐｉｎｓｋｉら，１９９５，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １４：７１７−７２１，Ｓｔｅｐｉｎｓｋｉら，２００１，ＲＮＡ  ７：１４８６−１４９５）、ｍ２（７，２'−Ｏ）ＧｐｐｓｐＧ（Ｄ１）（本発明ではβ−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ１）と命名する）またはｍ２（７，２'−Ｏ）ＧｐｐｓｐＧ（Ｄ２）（本発明ではβ−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ２）と命名する）（Ｋｏｗａｌｓｋａら，２００８，ＲＮＡ  １４：１１１９−１１３１）を転写反応に添加して、対応して修飾された５'末端キャップ構造を有するＲＮＡを得た（図１も参照のこと）。キャップ類似体を含む反応では、ＧＴＰは１．５ｍＭで存在し、一方キャップ類似体は６．０ｍＭで存在した。キャップ類似体を含まない反応では、ＧＴＰは７．５ｍＭで存在した。転写反応の最後に、線状化ベクターＤＮＡを０．１Ｕ／μｌ  ＴＵＲＢＯ  ＤＮアーゼ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ／ＴＸ，ＵＳＡ）で３７℃にて１５分間消化した。ＲＮＡを、ＭＥＧＡｃｌｅａｒ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ／ＴＸ，ＵＳＡ）を用いて製造者のプロトコールに従ってこれらの反応物から精製した。所望する場合は、キャップ類似体の不在下で転写したＲＮＡに、その後、転写後キャッピング（ｍ７ＧｐｐｐＧ（ｐ．−ｔ．））のためにワクシニアウイルスのキャッピング酵素（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ／ＷＩ，ＵＳＡ）を製造者の指示に従って用いてｍ７ＧｐｐｐＧキャップを提供し、ＭＥＧＡｃｌｅａｒ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ／ＴＸ，ＵＳＡ）を製造者のプロトコールに従って使用して前記ＲＮＡをもう一度精製した。上述したように作製したＲＮＡを、電気穿孔法（Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｍｕｎｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙを使用して３００Ｖおよび１５０μＦで）を用いてヒト未熟および成熟樹状細胞に導入し、レポータータンパク質ルシフェラーゼの発現を７２時間の経過の間に測定した。このために、２、４、８、２４、４８および７２時間後にルシフェラーゼ活性（タンパク質の量に比例する；図２）を測定することによってルシフェラーゼタンパク質の量を測定した。コードされるタンパク質の発現分析により、ＲＮＡの翻訳効率（曲線の最大勾配に対応する）および機能的ＲＮＡの安定性（曲線の最大値の時点によって示される）を判定することが可能である。さらに、曲線の積分は、観察した時間範囲にわたる全体的タンパク質発現の強度に対応する。
【０１６０】
未熟樹状細胞における最も高い総タンパク質発現は、β−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ１）の存在下で転写されたＲＮＡに関して認められた（図２Ａ；左側のパネル）。ＨＣ１１細胞ならびにインビトロ翻訳系の両方において５'末端にβ−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ２）を有するＲＮＡが最も強力な総発現を生じさせたので（「背景技術」参照）、この結果は予想外であった。５'末端にβ−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ２）を有するＲＮＡは未熟樹状細胞において２番目に良好な総発現を生じさせただけであり、５'末端にＡＲＣＡを有するＲＮＡおよび転写後修飾されたＲＮＡがそれに続く。
【０１６１】
ｍ７ＧｐｐｐＧがインビトロ転写の間に逆方向に組み込まれ得る（従って、５'末端キャップを含むＲＮＡの約半数が翻訳に関して機能性である）という事実と一致して、ｍ７ＧｐｐｐＧを使用して転写されたＲＮＡの発現は明らかにその他のＲＮＡより低い。翻訳効率および機能性ＲＮＡの安定性への複合作用により、β−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ１）は、ｍ７ＧｐｐｐＧの存在下で合成されたＲＮＡと比較して１３倍以上高い総タンパク質発現を生じさせる。５'末端にＡＲＣＡを有するＲＮＡまたは転写後修飾されたＲＮＡと比較して、β−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ１）を有するＲＮＡからの発現は約３の倍数で上昇する。β−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ１）ＲＮＡからの総タンパク質発現は、β−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ２）ＲＮＡからの総タンパク質発現と比較して約２倍高い（表１）。
【０１６２】
ｍ７ＧｐｐｐＧを有するＲＮＡと比較して、ＡＲＣＡを有するＲＮＡの翻訳効率は約２．５倍高く、β−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ１）を有するＲＮＡは約３．４倍、β−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ２）を有するＲＮＡは約３．５倍、そして転写後修飾されたＲＮＡは約４．１倍高い（表１）。
【０１６３】
翻訳効率への作用に加えて、様々なキャップ構造はまた、未熟樹状細胞における機能性ＲＮＡの安定性にも影響を及ぼす。ｍ７ＧｐｐｐＧの存在下で転写されたＲＮＡのタンパク質発現は、電気穿孔の約８時間後にその最大値を示す（表１）。これに対し、ＡＲＣＡまたはβ−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ２）を有するＲＮＡの発現の最大値は１２時間後であり、β−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ１）は機能性ＲＮＡの安定性をさらに一層上昇させ、１５時間以上後に最大値を示す。
【０１６４】
表１．５'−ＲＮＡキャップ構造が翻訳効率に及ぼす影響（図２Ａの曲線の最大勾配によって示す）。最大タンパク質発現の時点および実験の時間経過全体を通しての総タンパク質発現。各々の細胞型（未熟および成熟樹状細胞［それぞれｉＤＣおよびｍＤＣ］）に関して、ｍ７ＧｐｐｐＧの存在下で転写されたＲＮＡで電気穿孔した細胞についての翻訳効率および総シグナルを１に設定した。平均±標準偏差で示す。
【０１６５】
【表１】
0006042481.tif 000020
【０１６６】
興味深いことに、本発明者らは未熟樹状細胞において、以前にインビトロ翻訳系における発現の上昇を生じさせたｍ７Ｇｐｐｐｐｍ７Ｇキャップを有するＲＮＡ（Ｇｒｕｄｚｉｅｎら，２００４，ＲＮＡ  Ｊ．１０：１４７９−１４８７）が、ｍ７ＧｐｐｐＧの存在下で転写されたＲＮＡよりもさらに一層低い未熟樹状細胞における発現を生じさせることを認めた。対照として適用した、キャップを含まないまたは翻訳機構によって認識されないキャップ（ＡｐｐｐＧおよびＧｐｐｐＧ）を有するＲＮＡは、有意の発現を生じさせない。
【０１６７】
成熟樹状細胞では、様々な５'ＲＮＡ構造の作用が未熟樹状細胞における場合と異なる。第一に、機能性ＲＮＡの安定性が未熟樹状細胞におけるよりも一般に高く、ＲＮＡの５'末端の種類にはごくわずかしか依存しないことが注目される。第二に、総タンパク質発現に関する順序が未熟樹状細胞におけるものとは異なる：β−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ２）を有するＲＮＡが成熟樹状細胞において最も高いタンパク質発現を生じさせ、β−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ１）を有するＲＮＡ、転写後修飾されたＲＮＡ、そして次に５'末端にＡＲＣＡを有するＲＮＡが続く。さらに、成熟樹状細胞における発現レベルの差は未熟樹状細胞におけるほど著明ではない。これは、成熟樹状細胞における機能性ＲＮＡの安定性へのキャップ構造の影響がより少ないことと合致する。ｍ７Ｇｐｐｐｐｍ７Ｇを有するＲＮＡも、成熟樹状細胞ではほとんど翻訳されない。これらのデータは、このキャップが、インビトロでのデータに反してインビボでは翻訳機構をごくわずかしか動員できないという仮説を裏付ける。キャップを含まないまたはそれぞれＡｐｐｐＧおよびＧｐｐｐＧを有する対照ＲＮＡは、予想されたようにタンパク質発現を生じさせない。
【０１６８】
観察されたＲＮＡキャップ構造の作用がＲＮＡによってコードされるタンパク質と無関係であることを確認するため、インビトロ転写に関して上述したのと同じ最適化ベクターを使用して緑色蛍光タンパク質（ｄ２ｅＧＦＰと称する）をコードするＲＮＡに関して実験を反復した。未熟および成熟樹状細胞へのＲＮＡの導入後種々の時点で、フローサイトメトリーを用いてｄ２ｅＧＦＰの量を測定し、得られた結果はルシフェラーゼをコードするＲＮＡに関するものと非常に類似していた（図２ＡおよびＢ参照）。β−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ１）を有するＲＮＡは、やはり未熟樹状細胞において最も高い総タンパク質発現を生じさせた（図２Ｂ；左側のパネル）。ルシフェラーゼをコードするＲＮＡに関して認められたように、この作用は未熟樹状細胞に特異的である。これは、未熟樹状細胞における総タンパク質発現についての、他のすべてのキャップ類似体に対するおよび翻訳後修飾に対するβ−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ１）の優位性を確認する。成熟樹状細胞では、β−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ２）を有するＲＮＡが最も高い総タンパク質発現を生じさせ、β−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ１）、翻訳後修飾されたＲＮＡ、次にＡＲＣＡを有するＲＮＡが続く。要約すると、これらのデータは、ＲＮＡの５'末端のキャップ構造は、未熟樹状細胞および成熟樹状細胞において機能性ＲＮＡの安定性および翻訳効率に差別的な影響を及ぼすことを示す。特に、未熟樹状細胞におけるβ−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ１）の作用はユニークであり、以前には認められていない。
【０１６９】
実施例４：未熟樹状細胞における５'末端にβ−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ１）を有するＲＮＡの選択的翻訳。
【０１７０】
ここまでに述べた結果は、樹状細胞においてｍＲＮＡの翻訳効率がその５'末端のキャップ構造の種類によって影響されることを指示する。これは、翻訳機構が種々の５'末端キャップ構造に動員される効率の差に起因する可能性が最も高い。これを裏付けるため、本発明者らは次に、（ｉ）未熟樹状細胞への電気穿孔のために使用されるＲＮＡの量の作用、および（ｉｉ）未熟樹状細胞に同時電気穿孔される２番目のＲＮＡのタンパク質発現への影響を分析した。電気穿孔されるｍＲＮＡの量を増加させることにより、ある時点で１またはそれ以上の翻訳因子が細胞において律速となり、次に外因性ＲＮＡから合成され得るタンパク質の量を制限する。同様に、２番目のＲＮＡは翻訳機構に関して競合し、やはり翻訳効率に影響を及ぼす。
【０１７１】
ＡＲＣＡまたはβ−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ１）のいずれかで共転写的にキャップされた、ルシフェラーゼをコードするＲＮＡの漸増量（２０ｐｍｏｌおよび４０ｐｍｏｌ）を未熟樹状細胞に電気穿孔し、２、４、８、２４、４８および７２時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。興味深いことに、ＡＲＣＡでキャップしたＲＮＡ  ４０ｐｍｏｌを使用して測定したルシフェラーゼ活性は、電気穿孔の２４時間後にＡＲＣＡでキャップしたＲＮＡ  ２０ｐｍｏｌで得られたシグナルと比較して低かった（図３Ａ）。この時点で、ルシフェラーゼタンパク質の活性は、半量のＲＮＡを使用した場合よりも約１．６倍高いだけであった。この比率は、電気穿孔の４８および７２時間後にはさらに一層低下した（それぞれ１．４倍および１．２倍）。これに対し、β−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ１）でキャップしたＲＮＡに関しては、ルシフェラーゼタンパク質のレベルは、一般に実験の経過全体にわたって電気穿孔のために使用したＲＮＡの量に比例し、すなわちＲＮＡ  ４０ｐｍｏｌの電気穿孔後に得られたシグナルは、各々の時点について、ＲＮＡ  ２０ｐｍｏｌを使用した場合のシグナルよりも約２倍高かった。
【０１７２】
同様に、同じ量のｄ２ｅＧＦＰをコードするＲＮＡ（ＡＲＣＡまたはβ−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ１）のいずれかでキャップした）の未熟樹状細胞への同時電気穿孔は、ルシフェラーゼをコードするＲＮＡだけで電気穿孔した対照と比較して、２４、４８および７２時間後にＡＲＣＡでキャップしたルシフェラーゼをコードするＲＮＡの発現を低下させたが、β−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ１）でキャップしたルシフェラーゼをコードするＲＮＡの発現は低下させなかった（図３Ｂ）。合わせて考慮すると、これは、未熟樹状細胞においてＡＣＲＡでキャップしたＲＮＡは、ＲＮＡレベルが１またはそれ以上の制限翻訳因子のアベイラビリティーによって設定される可能性が高い一定の閾値を越えて上昇した場合、明らかに、翻訳機構に関してβ−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ１）でキャップしたＲＮＡほど効率的に内因性ＲＮＡと競合できないことを指示する。従って、５'末端におけるβ−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ１）の組込みは、内因性ＲＮＡまたは別の外因性ＲＮＡと競合した場合選択的に翻訳されるＲＮＡを与える。
【０１７３】
実施例５：未熟樹状細胞におけるホスホロチオエートキャップ類似体によるＲＮＡの安定化。
【０１７４】
図２に示すデータは、５'末端キャップの種類が、翻訳効率のみならず樹状細胞における機能性ｍＲＮＡの安定性にも影響を及ぼすことを指示する。これを実証するため、本発明者らは、樹状細胞において様々な５'末端キャップ構造を有するＲＮＡの絶対的ＲＮＡ安定性を測定した。絶対的安定性はＲＮＡの半減期によって示される。
【０１７５】
ヒト未熟および成熟樹状細胞を、ワクシニアウイルスのキャッピング酵素を使用して共転写的にまたは転写後にキャップ類似体を提供した、ｄ２ｅＧＦＰをコードするＲＮＡで電気穿孔した。２、４、８、２４、４８および７２時間後に細胞の一部を採取し、ｄ２ｅＧＦＰをコードするＲＮＡの量を、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて内因性ＲＮＡ（ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼをコードするＲＮＡ）と比較して測定した（図４）。測定した値を使用してＲＮＡの半減期を計算した（表２）。電気穿孔およびタンパク質発現についての対照として、フローサイトメトリー定量化を用いて２４時間後にｄ２ｅＧＦＰの量を測定し、上述した実験と同じ順序で測定した。
【０１７６】
表２．未熟樹状細胞（ｉＤＣ）および成熟樹状細胞（ｍＤＣ）における種々のキャップ構造を有するＲＮＡの安定性。平均±標準偏差。
【０１７７】
【表２】
0006042481.tif 000021
【０１７８】
興味深いことに、８時間後に既にほぼ完全に分解されていたキャップを含まないＲＮＡを除き、未熟樹状細胞におけるすべてのＲＮＡに関してＲＮＡの二相分解動態を認めた（図４Ａおよび表２）。電気穿孔後最初の８時間以内に、実験終了までのその後の分解期と比較してＲＮＡはより速やかに分解された。
【０１７９】
５'末端にβ−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ１）を有するＲＮＡは、初期分解期ならびに後期分解期（それぞれ約８時間および２７時間の半減期；図４Ａおよび表２）の両方で未熟樹状細胞において最も安定なＲＮＡである。インビトロ試験ではβ−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ２）がデキャッピング酵素Ｄｃｐ２による分解に対して最良の保護を示したので、これは予想外である。キャップを有するＲＮＡの大部分は、それぞれ初期分解期には５〜７時間の範囲の半減期、後期分解期には１５〜１８時間の半減期を示した。これは、実際にβ−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ１）が、特に後期分解期に、ＲＮＡの安定化に明らかな作用を及ぼすことを意味する。その他の５'ＲＮＡ構造の大部分は、しかし、絶対的ＲＮＡ安定性にはわずかな作用しか示さなかった。例外はｍ７ＧｐｐｐｐＧｍ７Ｇである。５'末端にこのキャップを有するＲＮＡは最も不安定なＲＮＡであり、電気穿孔後最初の８時間には２時間半未満の半減期である。電気穿孔の８時間後にまだ細胞中に存在するｍ７ＧｐｐｐｐＧｍ７Ｇ  ＲＮＡは、興味深いことに、約２０時間の半減期を有するその他のＲＮＡと同程度に安定である。
【０１８０】
未熟樹状細胞と異なり、成熟樹状細胞におけるＲＮＡ分解は、検討した時間経過全体を通して均一な動態に従う（図４Ｂおよび表２）。未熟樹状細胞における初期分解動態と比較して、成熟樹状細胞ではＲＮＡは明らかにより安定であり、未熟樹状細胞での後期分解期における半減期と同等の半減期を示した。未熟樹状細胞において既に認められたように、キャップを有するすべてのＲＮＡが１３〜１５時間の類似の半減期を有している（１２時間未満の半減期を示した、５'末端にｍ７ＧｐｐｐｐＧｍ７Ｇを有するＲＮＡを除く）ので、絶対的安定性はキャップ構造にごくわずかしか依存しない。キャップを欠くＲＮＡでさえも、成熟樹状細胞ではかなり安定であり、１０時間以上の半減期を有する。ＲＮＡの同等の半減期は、成熟樹状細胞における同等の機能性ＲＮＡの安定性と一致する（表１参照）。
【０１８１】
要約すると、この実験は、成熟樹状細胞における様々な５'末端キャップ構造を有するＲＮＡのタンパク質発現の強度および期間についての決定的な因子は翻訳効率であることを示す。
【０１８２】
実施例６：マウスのリンパ節への注射後の、５'末端にβ−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ１）を有するＲＮＡの発現上昇。
【０１８３】
最近、本発明者らは、リンパ節へのＲＮＡの注射（リンパ節内注射）が、コードされる抗原に対する免疫応答を得るために最も有望なアプローチであることを示すことができた（独国特許第ＤＥ  １０  ２００８  ０６１  ５２２．６号）。このようにして投与されたＲＮＡは、主として未熟樹状細胞によって取り込まれる。そこで、本発明者らは、他のキャップ構造を有するＲＮＡと比較して（本発明者らが以前の試験で適用したＡＲＣＡに関して例示的に分析した）、β−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ１）ＲＮＡに関してより強力なタンパク質発現がリンパ節においても認められるかどうかを検討した。
【０１８４】
ＡＲＣＡまたはβ−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ１）のいずれかの存在下で転写された、ルシフェラーゼをコードするＲＮＡ（上述したような）をマウスの鼠径リンパ節に注射した。リンパ節の細胞によるＲＮＡに取込みおよびコードされるルシフェラーゼの翻訳後、インビボイメージングを用いてルシフェラーゼ活性を測定することにより、タンパク質発現を定量した。Ｄ−ルシフェリン（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ；１５０ｍｇ／ｋｇ体重）の水溶液をマウスに腹腔内投与した。動物をイソフルランで麻酔し、ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａイメージングシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ，Ｒｕｓｓｅｌｓｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の光密室に入れた。ルシフェリン注射の２５分後に、放出された光子を１分の積分時間について定量した。マウスのグレースケール画像を標準として使用し、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅソフトウエア（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を使用することによってその上に生物発光シグナルを、拡大縮小した擬似カラー画像として重ね合わせた（黒色＝最小強度；白色＝最大強度）。生物発光を定量するため、関心領域（ＲＯＩ）を描画し、ＲＯＩ内の全光束（光子／秒、ｐ／ｓ）を測定した。動物上の非シグナル放出領域からのバックグラウンド生物発光を、各々の動物についてそれぞれの生物発光値から差し引いた。
【０１８５】
単離された未熟樹状細胞における結果と一致して、５'末端にβ−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ１）を有するＲＮＡのタンパク質発現は、各々の時点（ＲＮＡのリンパ節内適用の２、４、８、２４、４８および７２時間後）で５'末端にＡＲＣＡを有するＲＮＡよりも高かった（図５）。時間経過全体を通して、発現（曲線の積分によって示す）は約８倍上昇した。従って、本発明者らは、β−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ１）により、リンパ節内、従って主としてその中に存在する未熟樹状細胞におけるタンパク質発現が強度および期間において増強されることを初めて示すことができた。
【０１８６】
実施例７：５'末端にβ−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ１）を有するＲＮＡを使用したワクチン接種後の新たなＴ細胞プライミングの上昇。
【０１８７】
アミノ末端リーダーペプチドおよびカルボキシ末端のＭＨＣクラスＩ輸送シグナルへの抗原の融合は、ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩエピトープの抗原提示の上昇をもたらす（Ｋｒｅｉｔｅｒら，２００８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８０：３０９−３１８）。それぞれに修飾された抗原をコードし、ポリ（Ａ）配列およびβ−グロビンＵＴＲに関する上述した最適化を含むＡＲＣＡ  ＲＮＡのリンパ節内注射は、ナイーブＴ細胞の新たなプライミングを可能にする（独国特許第ＤＥ  １０  ２００８  ０６１  ５２２．６号）。本発明者らは、新たなプライミングがβ−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ１）を使用することによってさらに増強され得るかどうかを検討した。
【０１８８】
上記修飾を有する特異的抗原をコードする裸のＲＮＡを１日２回結節内注射することによってマウスを免疫した（０日目と３日目）。８日目に、テトラマー染色を用いて末梢血中および脾臓中の抗原特異的Ｔ細胞の頻度を測定した。図６に示すように、末梢血中のＣＤ８＋Ｔ細胞の約５％および脾臓中のＣＤ８＋Ｔ細胞の約６％が、ＡＲＣＡ  ＲＮＡでの２回の免疫後にテトラマー陽性であった。β−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ１）ＲＮＡを使用すると、末梢血中および脾臓中でそれぞれ１２％および１３％以上のテトラマー陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞が測定された。これは、β−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ１）が、プロセシングならびにＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ複合体への輸送に関して最適化した抗原に関連しても、またより高い安定性と翻訳効率を有するＲＮＡの作製のためのＤＮＡ鋳型を使用した場合も、β−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ１）キャップを担持するＲＮＡからのタンパク質発現の増大および延長を導き、それが次に免疫応答の増強（Ｔ細胞の新たなプライミングとして測定される）を生じさせることを初めて明らかにする。
【０１８９】
実施例８：ｍ２７，２'-ＯＧｐｐＳｐＧ（Ｄ１）および（Ｄ２）（すなわちβ−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ１）および（Ｄ２））のＨＰＬＣ分析。
【０１９０】
約１：３のモル比のｍ２７，２'-ＯＧｐｐＳｐＧ（Ｄ１）および（Ｄ２）（すなわちβ−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ１）および（Ｄ２））のジアステレオマー混合物の分析ＨＰＬＣ分析を、Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ  ＬＣ−１８−Ｔ  ＲＰカラム（５μｍ、４．６×２５０ｍｍ、流速：１．３ｍｌ／分）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  １２００  Ｓｅｒｉｅｓ装置で、１５分以内に０．０５Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ＝５．９中のメタノールの０〜２５％直線勾配を用いて実施した。ＵＶ検出（ＶＷＤ）を２６０ｎｍで実施し、蛍光検出（ＦＬＤ）を２８０ｎｍでの励起および３３７ｎｍでの検出で実施した。保持時間：ｍ２７，２'−ＯＧｐｐＳｐＧ（Ｄ１）＝１０．４分、ｍ２７，２'−ＯＧｐｐＳｐＧ（Ｄ２）＝１０．７分（図７）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図７】
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【図５】
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【図６】
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