(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
中性ｐＨの水溶液中でβシート構造を形成し得る自己組織化ペプチド、および、骨片を含む、骨形成促進材であって、
該自己組織化ペプチドが、配列番号１〜１９のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチド、および、これらのペプチドのＮ末端アミノ基およびＣ末端カルボキシル基に保護基が導入されたペプチドから選択される、骨形成促進材。
【請求項２】
血液および／または血液由来成分をさらに含む、請求項１に記載の骨形成促進材。
【請求項３】
骨形成因子をさらに含む、請求項１または２に記載の骨形成促進材。
【請求項４】
骨形成促進材用保持器具と共に用いられる、請求項１から３のいずれかに記載の骨形成促進材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨形成促進材に関する。より詳細には、自己組織化ペプチドおよび骨片を含む骨形成促進材に関する。
【背景技術】
【０００２】
脊椎は、身体を重力から支えるという役割だけではなく、中枢神経である脊髄を保護するという役割をも有する。整形外科、特に脊椎関連分野では、脊髄等の神経を圧迫する疾患（例えば、頚椎症性脊髄症）や、脊椎の骨折が大きな問題となっている。脊髄圧迫に対しては、脊髄を圧迫する骨を切除して対応せざるを得ない。通常、切除することにより不安定になった脊椎には、本人から採取した骨の移植や、金属のボルトまたはプレート等の金属を用いた固定術が施される。【０００３】
また、骨折治療の基本は整復と固定であり、一般的に、金属を用いて固定し、骨癒合させる方法がとられている。しかしながら、四肢骨折の場合には２〜３ヶ月、脊椎骨折では半年から１年以上と長期の癒合期間が必要となる。なかでも、高齢者の場合には、骨自体が弱くなっているため、骨癒合が得られる前に再度骨折する場合や、固定のために用いた金属がずれる場合がある。また、大腿骨頚部骨折や脊椎骨折では安静臥床が必要となる場合も有り、そのため廃用症候群が進み介護が必要となるおそれもある。【０００４】
近年、様々な手術方法や固定材料が開発されており、骨折の治癒率が向上している。しかしながら、依然として、遷延治癒（骨癒合の遅れ）や偽関節（骨癒合の停止）といった後遺症が生じている。また、脊椎手術においても、脊椎再建のための脊椎固定術において、より効果的なインプラントや手術手技が開発されている。しかしながら、骨再生機能の低下した高齢者に適応する場合には、骨癒合が適切に進行しないおそれがある。【０００５】
近年、骨の再生を促進する手法として、骨芽細胞等の培養細胞を患部に移植する手法や、患部への細胞足場の留置等が試みられている。当該細胞足場としては、例えば、ゼラチンおよびコラーゲンに代表される細胞外基質が用いられているが、ゼラチンおよびコラーゲンは、材料の供給源となる動物等により用途が限定されるという欠点がある。これに対して、完全合成の自己組織化ペプチドの単独投与あるいは骨分化誘導因子との混合投与において骨再生の促進が報告されている（特許文献１、特許文献２、特許文献３、非特許文献１）。しかしながら、これまでに骨再生の促進が報告されている自己組織化ペプチドを含む骨形成促進材は、生体内環境に近い中性条件下では、十分な強度を確保することが困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１２−８２１８０号公報
【特許文献２】特表２０１０−５０４９７２号公報
【特許文献３】国際公開第２００７／０００９７９号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．１５，ｐ９０３−９１０，２００６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、生体安全性が高く、骨形成を促進し得る骨形成促進材を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の骨形成促進材は、中性ｐＨの水溶液中でβシート構造を形成し得る自己組織化ペプチド、および、骨片を含む。この自己組織化ペプチドを構成するアミノ酸残基のｐＨ７．０における電荷の総和は０ではない。
１つの実施形態において、上記自己組織化ペプチドは、下記のアミノ酸配列からなる自己組織化ペプチドである。
アミノ酸配列：ａ１ｂ１ｃ１ｂ２ａ２ｂ３ｄｂ４ａ３ｂ５ｃ２ｂ６ａ４
（該アミノ酸配列中、ａ１〜ａ４は、塩基性アミノ酸残基であり；ｂ１〜ｂ６は、非電荷極性アミノ酸残基および／または疎水性アミノ酸残基であり、ただし、そのうちの少なくとも５個は、疎水性アミノ酸残基であり；ｃ１およびｃ２は、酸性アミノ酸残基であり；ｄは、疎水性アミノ酸残基である）。
１つの実施形態において、上記骨形成促進材は血液および／または血液由来成分をさらに含む。
１つの実施形態において、上記骨形成促進材は骨形成因子をさらに含む。
１つの実施形態において、上記骨形成促進材は骨形成促進材用保持器具と組み合せて用いられる。
本発明の別の局面においては、骨形成促進材用保持器具が提供される。本発明の骨形成促進材用保持器具は、上記骨形成促進材と共に用いられる。
１つの実施形態においては、上記骨形成促進材用保持器具は炭素系材料、エンジニアリング樹脂、または、スーパーエンジニアリング樹脂で構成される。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、生体安全性が高く、骨形成を促進し得る骨形成促進材が提供される。本発明の骨形成促進材は、中性ｐＨの水溶液中でβシート構造を形成し得る自己組織化ペプチドおよび骨片を含む。これにより、骨形成の起点が多数形成され、骨形成を好適に促進し得る。そのため、骨自体の強度および骨再生能力が低下した高齢者においても、骨形成を向上させることができる。また、本発明の骨形成促進材は、骨形成に直接関与する細胞等を用いることなく、骨新生を誘導し得る。さらに、本発明で用いる自己組織化ペプチドは、中性ｐＨの水溶液中でβシート構造を形成し、上記自己組織化ペプチドを構成するアミノ酸残基のｐＨ７．０における電荷の総和は０ではない。そのため、本発明の骨形成促進材は生体環境に近い中性のｐＨで十分な強度を発揮し得る。さらに、本発明の骨形成促進材用保持器具等の適切な保持器具を用いて、所望の位置に骨形成促進材を固定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】培養０日後のＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の写真および培養１日後のＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の写真およびＡＬＰ染色した写真である。
【図１Ｂ】培養７日後のＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の写真およびＡＬＰ染色した写真である。
【図１Ｃ】培養１４日後のＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の写真およびＡＬＰ染色した写真である。
【図１Ｄ】培養２８日後のＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の写真およびＡＬＰ染色した写真である。
【図２】培養１日後、７日後、１４日後および２８日後の各細胞における骨形成マーカーの発現量を示すグラフである。
【図３】実施例１〜３の骨形成促進材および比較例１の骨形成促進材の培養１４日後および２８日後の写真およびＡＬＰ染色した写真である。
【図４】大腿骨欠損モデルの作製に用いた創外固定具の写真である。
【図５】大腿骨欠損モデルの作製に用いたケージの写真である。
【図６】創外固定を行ったマウスの大腿骨の写真である。
【図７】創外固定から５６日経過後のマウス大腿骨のＸ線画像である。
【図８】創外固定から５６日経過後のマウス大腿骨のＣＴ画像である。
【図９】図９（ａ）は実施例５のｂｏｒｎ  ｃｈｉｐ添加前のゲルの写真であり、図９（ｂ）は実施例６のｂｏｒｎ  ｃｈｉｐ添加前のゲルの写真であり、図９（ｃ）は比較例２のｂｏｒｎ  ｃｈｉｐ添加前のゲルの写真である。
【図１０】図１０（ａ）は実施例５のｂｏｒｎ  ｃｈｉｐ添加後のゲル（骨形成促進材）の写真であり、図１０（ｂ）は実施例６のｂｏｒｎ  ｃｈｉｐ添加後のゲル（骨形成促進材）の写真であり、図１０（ｃ）は比較例２のｂｏｒｎ  ｃｈｉｐ添加後のゲル（骨形成促進材）の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
［Ａ．骨形成促進材］
本発明の骨形成促進材は、中性ｐＨの水溶液中でβシート構造を形成し得る自己組織化ペプチドと骨片とを含む。この自己組織化ペプチドを構成するアミノ酸残基のｐＨ７．０における電荷の総和は０ではない。１つの実施形態においては、本発明の骨形成促進材は血液および／または血液由来成分をさらに含む。また、他の実施形態においては、本発明の骨形成促進材は、骨形成因子をさらに含む。
【００１３】
本発明の骨形成促進材の回転式レオメーターを用いた動的粘弾性測定における３７℃での貯蔵弾性率（Ｇ’）は、例えば、１Ｐａ〜５０００Ｐａであり、好ましくは１Ｐａ〜４０００Ｐａ、より好ましくは１Ｐａ〜３０００Ｐａである。貯蔵弾性率が当該範囲内であれば、後述する本発明の骨形成促進材用保持器具と併用し、好適に骨形成を促進することができる。なお、本明細書でいう貯蔵弾性率は、周波数変化測定を行ったときの角振動数が１ラジアン／秒であるときの値を意味する。
【００１４】
［Ａ−１．自己組織化ペプチド］
自己組織化ペプチドとしては、水溶液中においてペプチド分子同士の相互作用を介して自発的に集合してゲルを形成し得る任意の適切なペプチドが用いられ得る。本発明で用いる自己組織化ペプチドは、中性ｐＨでβシート構造を形成し得るものである。より具体的には、水溶液中においてペプチド分子同士の相互作用を介して自発的に集合して繊維状分子集合体を形成し、当該分子集合体間の相互作用により三次元網目構造を発達させてゲルを形成し得るペプチドが好ましく用いられ得る。ペプチド分子同士の相互作用としては、例えば、水素結合、イオン間相互作用、ファンデルワールス力等の静電的相互作用および疎水性相互作用が挙げられる。なお、本明細書において、「中性ｐＨ（中性領域）」とは、ｐＨ５．０〜８．０、好ましくはｐＨ５．５〜７．５、より好ましくはｐＨ６．０〜７．０、さらに好ましくはｐＨ７．０の領域をいう。
【００１５】
自己組織化ペプチドを構成するアミノ酸は、Ｌ−アミノ酸であってもよく、Ｄ−アミノ酸であってもよい。好ましくはＬ−アミノ酸である。また、天然アミノ酸であってもよく、非天然アミノ酸であってもよい。低価格で入手可能であり、ペプチド合成が容易であることから、好ましくは天然アミノ酸である。
【００１６】
自己組織化ペプチドを構成するアミノ酸残基のｐＨ７．０における電荷の総和は０ではない。該電荷の総和は、好ましくは−３〜−１または＋１〜＋３であり、より好ましくは−３、−２、＋２または＋３である。このように、中性領域において自己組織化ペプチドに含まれるアミノ酸残基の側鎖に由来するプラス電荷とマイナス電荷とが相殺されないことにより、ゲル形成に適した静電的引力及び斥力のバランスが保たれ、その結果として、中性領域で透明かつ安定なゲルを形成し得るからである。
【００１７】
各ｐＨにおける上記自己組織化ペプチドの電荷は、ＰＲＯＴＥＩＮ  ＣＡＬＣＵＬＡＴＯＲ  ｖ３．４のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｔｃａｌｃ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／）上で利用可能なプログラムにより行なわれ得る。
【００１８】
本発明に好ましく使用され得る自己組織化ペプチドの具体例としては、下記の式（Ｉ）のアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。
ａ１ｂ１ｃ１ｂ２ａ２ｂ３ｄｂ４ａ３ｂ５ｃ２ｂ６ａ４      （Ｉ）
（上記アミノ酸配列中、ａ１〜ａ４は、塩基性アミノ酸残基であり；ｂ１〜ｂ６は、非電荷極性アミノ酸残基および／または疎水性アミノ酸残基であり、ただし、そのうちの少なくとも５個は、疎水性アミノ酸残基であり；ｃ１およびｃ２は、酸性アミノ酸残基であり；ｄは、疎水性アミノ酸残基である。）
【００１９】
上記アミノ酸配列中、ａ１〜ａ４は、塩基性アミノ酸残基である。塩基性アミノ酸は、好ましくはアルギニン、リシン、またはヒスチジンであり、より好ましくはアルギニンまたはリシンである。これらのアミノ酸は、塩基性が強いからである。ａ１〜ａ４は、同一のアミノ酸残基であってもよく、異なるアミノ酸残基であってもよい。
【００２０】
上記アミノ酸配列中、ｂ１〜ｂ６は、非電荷極性アミノ酸残基および／または疎水性アミノ酸残基であり、そのうちの少なくとも５個は、疎水性アミノ酸残基である。疎水性アミノ酸は、好ましくはアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、グリシン、またはプロリンである。非電荷極性アミノ酸は、好ましくはチロシン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、またはシステインである。これらのアミノ酸は、入手が容易だからである。
【００２１】
好ましくは、ｂ３およびｂ４は、それぞれ独立して任意の適切な疎水性アミノ酸残基であり、さらに好ましくはロイシン残基、アラニン残基、バリン残基、またはイソロイシン残基であり、特に好ましくはロイシン残基またはアラニン残基である。
【００２２】
好ましくは、ｂ１〜ｂ６はすべて疎水性アミノ酸残基である。自己組織化ペプチドが好適にβシート構造を形成し、自己組織化し得るからである。より好ましくは、ｂ１〜ｂ６は、それぞれ独立してロイシン残基、アラニン残基、バリン残基、またはイソロイシン残基であり、さらに好ましくはロイシン残基またはアラニン残基である。好ましい実施形態においては、ｂ１〜ｂ６のうちの４個以上がロイシン残基であり、より好ましくはそのうちの５個以上がロイシン残基であり、さらに好ましくは全てがロイシン残基である。
【００２３】
上記アミノ酸配列中、ｃ１およびｃ２は、酸性アミノ酸残基である。酸性アミノ酸は、好ましくはアスパラギン酸またはグルタミン酸である。これらのアミノ酸は、入手が容易だからである。ｃ１およびｃ２は、同一のアミノ酸残基であってもよく、異なるアミノ酸残基であってもよい。
【００２４】
上記アミノ酸配列中、ｄは、疎水性アミノ酸残基である。ｄは、好ましくはアラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、またはイソロイシン残基である。
【００２５】
１つの好ましい実施形態においては、ｂ３、ｄ、ｂ４の連続する３つのアミノ酸残基のうち２つがロイシン残基であり、残りがアラニン残基である。この場合、ｂ３、ｄ、ｂ４のいずれがアラニン残基であってもよい。また、別の好ましい実施形態においては、ｂ３、ｄ、ｂ４の連続する３つのアミノ酸残基がすべてロイシン残基である。
【００２６】
式（Ｉ）のアミノ酸配列の好ましい具体例を以下に例示する。
ｎ−ＲＬＤＬＲＬＡＬＲＬＤＬＲ−ｃ（配列番号１）
ｎ−ＲＬＤＬＲＬＬＬＲＬＤＬＲ−ｃ（配列番号２）
ｎ−ＲＡＤＬＲＬＡＬＲＬＤＬＲ−ｃ（配列番号３）
ｎ−ＲＬＤＬＲＬＡＬＲＬＤＡＲ−ｃ（配列番号４）
ｎ−ＲＡＤＬＲＬＬＬＲＬＤＬＲ−ｃ（配列番号５）
ｎ−ＲＡＤＬＲＬＬＬＲＬＤＡＲ−ｃ（配列番号６）
ｎ−ＲＬＤＬＲＡＬＬＲＬＤＬＲ−ｃ（配列番号７）
ｎ−ＲＬＤＬＲＬＬＡＲＬＤＬＲ−ｃ（配列番号８）
【００２７】
本発明に好ましく使用され得る別の自己組織化ペプチドとしては、ＷＯ２００７／０００９７９に記載のペプチド、すなわち、極性アミノ酸残基と非極性アミノ酸残基（疎水性アミノ酸残基）とを有する自己組織化ペプチドであって、該極性アミノ酸残基として酸性アミノ酸残基及び塩基性アミノ酸残基を含み、中性領域において、該酸性アミノ酸残基の電荷と該塩基性アミノ酸残基の電荷との総和が０を除く数であり、水溶液中において自己組織化した際に該非極性アミノ酸残基のみが一方の面に配置されたβ−シート構造を形成しうる自己組織化ペプチドが挙げられる。
【００２８】
上記自己組織化ペプチドのなかでも、極性アミノ酸として、酸性アミノ酸残基と塩基性アミノ酸残基と非電荷極性アミノ酸とを含むペプチドが好ましい。係る自己組織化ペプチドの好ましい具体例を以下に例示する。
ｎ−ＲＡＳＡＲＡＤＡＲＡＳＡＲＡＤＡ−ｃ（配列番号９）
ｎ−ＲＡＮＡＲＡＤＡＲＡＮＡＲＡＤＡ−ｃ（配列番号１０）
ｎ−ＲＡＡＡＲＡＤＡＲＡＡＡＲＡＤＡ−ｃ（配列番号１１）
ｎ−ＲＡＳＡＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＳＡ−ｃ（配列番号１２）
ｎ−ＲＡＤＡＲＡＳＡＲＡＳＡＲＡＤＡ−ｃ（配列番号１３）
ｎ−ＲＡＳＡＲＡＳＡＲＡＳＡＲＡＤＡ−ｃ（配列番号１４）
ｎ−ＲＡＳＡＲＡＤＡＲＡＳＡ−ｃ        （配列番号１５）
ｎ−ＫＡＳＡＫＡＥＡＫＡＳＡＫＡＥＡ−ｃ（配列番号１６）
ｎ−ＳＡＥＡＫＡＥＡＳＡＥＡＫＡＥＡ−ｃ（配列番号１７）
ｎ−ＫＬＳＬＫＬＤＬＫＬＳＬ−ｃ        （配列番号１８）
ｎ−ＫＬＡＬＫＬＤＬＫＬＡＬ−ｃ        （配列番号１９）
【００２９】
上記自己組織化ペプチドは、任意の適切な製造方法によって製造され得る。例えば、Ｆｍｏｃ法等の固相法又は液相法等の化学合成方法、遺伝子組換え発現等の分子生物学的方法が挙げられる。
【００３０】
上記自己組織化ペプチドは、目的等に応じて任意の適切な修飾が施されていてもよい。修飾が行われる部位は、特に限定されず、例えば、自己組織化ペプチドのＮ末端アミノ基、Ｃ末端カルボキシル基、またはその両方が挙げられる。
【００３１】
上記修飾としては、修飾後のペプチドが自己組織化能を有する範囲において任意の適切な修飾が選択され得る。例えば、Ｎ末端アミノ基のアセチル化、Ｃ末端カルボキシル基のアミド化等の保護基の導入；アルキル化、エステル化、またはハロゲン化等の官能基の導入；水素添加；単糖、二糖、オリゴ糖、または多糖等の糖化合物の導入；脂肪酸、リン脂質、または糖脂質等の脂質化合物の導入；アミノ酸またはタンパク質の導入；ＤＮＡの導入；その他生理活性を有する化合物等の導入が挙げられる。修飾は１種のみ行われてもよく、２種以上を組み合わせて行ってもよい。例えば、上記自己組織化ペプチドのＣ末端に所望のアミノ酸を導入した付加ペプチドのＮ末端をアセチル化し、Ｃ末端をアミド化してもよい。
【００３２】
アミノ酸またはタンパク質が導入される場合、導入されるアミノ酸の数は、好ましくは１〜１８０であり、より好ましくは１〜５０、さらに好ましくは１〜３０、特に好ましくは１〜１０、最も好ましくは１〜５である。導入するアミノ酸残基数が１８０を超えると、自己組織化能が損なわれる場合がある。
【００３３】
本発明の骨形成促進材は、１種類のみの自己組織化ペプチドを含んでもよく、２種以上の自己組織化ペプチドを含んでもよい。
【００３４】
本発明の骨形成促進材における自己組織化ペプチドの濃度は、組成、用途等に応じて適切に設定され得る。自己組織化ペプチドの濃度は、好ましくは０．１重量％〜５．０重量％、より好ましくは０．１重量％〜３．０重量％、さらに好ましくは０．１重量％〜２．０重量％である。上記範囲の濃度であれば、本発明の効果が好適に得られ得る。
【００３５】
［Ａ−２.骨片］
本発明で用いる骨片は、本発明の骨形成促進材を用いて治療を行う患者自身の骨であってもよく、他者の骨であってもよい。また、骨形成促進材を適用しようとする部位から採取した骨であってもよく、他の部位から採取した骨であってもよい。骨片として用いる骨としては、例えば、除圧のために切除した骨片等を用いることができる。
【００３６】
上記骨片は採取したものをそのまま用いてもよく、任意の適切な前処理を施した後、用いてもよい。前処理としては、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で灌流することによる洗浄、乾燥等が挙げられる。
【００３７】
上記骨片の大きさは、特に制限はなく、骨形成促進材を適用する部位に応じて任意の適切な大きさであり得る。例えば、採取した骨片をそのまま用いてもよく、所望の厚みの切片にしてもよく、任意の適切な大きさ（例えば、粉末状）に加工して用いてもよい。採取した骨片をそのまま適用する場合、骨片の大きさは、例えば、０．５ｍｍ〜５．０ｍｍであり、好ましくは１．０ｍｍ〜４．０ｍｍである。また、任意の適切な大きさ（例えば、粉末状）に加工して用いる場合、骨片の大きさは、例えば、０．０１ｍｍ〜０．５ｍｍであり、好ましくは０．０２ｍｍ〜０．４ｍｍである。骨片の大きさは、好ましくは０．０３ｍｍ〜０．３ｍｍであり、より好ましくは０．０４ｍｍ〜０．２ｍｍである。骨片の大きさが上記の範囲内であることにより、より好適に骨形成を促進し得る。本明細書において、骨片の大きさは、１つの骨片において最大サイズの部分の大きさをいう。
【００３８】
上記骨片は任意の適切な手段により、所望の大きさに加工し得る。例えば、粉砕ミル等が挙げられる。
【００３９】
本発明の骨形成促進材における骨片の含有量は、好ましくは自己組織化ペプチドゲル１００重量部に対して、１重量部〜１００重量部であり、より好ましくは１重量部〜９０重量部である。骨片の含有量が上記の範囲内であることにより、より好適に骨形成を促進し得る。なお、本明細書において、基準となる自己組織化ペプチドゲルは自己組織化ペプチドおよび水のみからなるゲルをいう。
【００４０】
［Ａ−３．血液および血液由来成分］
本発明の骨形成促進材は好ましくは、血液および／または血液由来成分をさらに含む。血液および／または血液由来成分をさらに含むことにより、軟骨形成の誘導の促進という効果を得ることができる。血液由来成分としては、例えば、赤血球、白血球、血小板、血漿等が挙げられる。これらの血液由来成分は単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００４１】
上記血液および／血液由来成分は、患者から採取したものであってもよく、他者から採取したものであってもよい。また、全血製剤、赤血球製剤、血漿製剤、血小板製剤等の血液製剤を用いてもよい。
【００４２】
本発明の骨形成促進材における血液および／または血液由来成分の濃度は、好ましくは０．００１ｐｐｍ〜１０００ｐｐｍであり、より好ましくは０．０１ｐｐｍ〜１０００ｐｐｍである。血液および／または血液由来成分の濃度が上記の範囲内であることにより、より好適に骨形成を促進し得る。
【００４３】
［Ａ−４．骨形成因子］
本発明の骨形成促進材は、骨形成因子（Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ,  ＢＭＰ）をさらに含むことが好ましい。骨形成因子をさらに含むことにより、本発明の骨形成促進材は骨形成をさらに促進し得る。骨形成因子の具体例としては、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４等のＢＭＰ２/４系ＢＭＰ、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ等のＯＰ-１系ＢＭＰ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０等のＢＭＰ９系ＢＭＰ、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７等のＧＤＦ５系のＢＭＰ等が挙げられる。上記骨形成因子としては、骨形成を好適に促進することができる点から、ＢＭＰ−２が好ましい。なお、上記骨形成因子と同等の骨形成促進作用を有する範囲において、骨形成因子が適宜修飾されていてもよい。また、骨形成因子としてヒト組み換え骨形成因子（ｒｈＢＭＰ）を用いてもよい。骨形成因子は単独で用いてもよく、２種以上を組み合せて用いてもよい。これらのヒトＢＭＰは、すでにクローニングされているので、その塩基配列に基づいて遺伝子工学的手法によって得ることができる。
【００４４】
本発明の骨形成促進材における骨形成因子の濃度は、通常０．００１ｐｐｍ〜１０００ｐｐｍ、好ましくは０．０１ｐｐｍ〜１０００ｐｐｍである。当該濃度範囲であれば、生理活性物質の作用が好適に発揮されて、骨形成が促進され得る。
【００４５】
［Ａ−５．他の生理活性物質］
本発明の骨形成促進材は、上記骨形成因子以外の生理活性物質をさらに含んでいてもよい。本発明の骨形成促進材が含み得る生理活性物質としては、骨もしくは軟骨の分化を誘導または促進する分化制御因子（例えば、ＴＧＦ−β）；成長ホルモン；ＥＧＦ、ＦＧＦ等の細胞機能制御因子；インターフェロン、インターロイキン等の免疫または炎症関連因子；等が挙げられる。
【００４６】
本発明の骨形成促進材における生理活性物質の濃度は、通常０．００１ｐｐｍ〜１０００ｐｐｍ、好ましくは０．０１ｐｐｍ〜１０００ｐｐｍである。当該濃度範囲であれば、生理活性物質の作用が好適に発揮されて、骨形成が促進され得る。
【００４７】
［Ａ−６．他の添加物］
本発明の骨形成促進材は、必要に応じて任意の適切な添加物をさらに含み得る。添加物の具体例としては、ｐＨ調整剤；緩衝剤；等張化剤；塩類；アミノ酸類；ビタミン類；アルコール類；蛋白質；薬物等が挙げられる。これらの添加物は、単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００４８】
ｐＨ調整剤としては、塩酸、クエン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム等が挙げられる。
【００４９】
緩衝剤としては、リン酸、リン酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム等のリン酸塩；ホウ酸、ホウ砂、ホウ酸ナトリウム、ホウ酸カリウム等のホウ酸塩；クエン酸ナトリウム、クエン酸二ナトリウム等のクエン酸塩；酢酸ナトリウム、酢酸カリウム等の酢酸塩、Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ等が挙げられる。
【００５０】
等張化剤としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム等の塩化物；グルコース、フルクトース、ガラクトース等の単糖；スクロース、トレハロース、マルトース、ラクトース等の二糖；マンニトール、ソルビトール等の糖アルコール；等が挙げられる。
【００５１】
塩類としては、上記で例示した添加物以外の任意の適切な塩が用いられ得る。例えば、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム等が挙げられる。
【００５２】
上記添加物の添加量は、その目的等に応じて任意の適切な値に設定され得る。
【００５３】
［Ｂ．調製方法］
本発明の骨形成促進材は、任意の適切な方法により調製され得る。例えば、自己組織化ペプチドと水と他の任意成分とを混合した後、静置することにより自己組織化ペプチドゲルを調製し、該ゲルと骨片とを混合することにより調製することができる。本発明で用いる自己組織化ペプチドは、溶液中においてペプチド分子同士の相互作用を介して自発的に集合して繊維状の分子集合体を形成し、さらに静置を続けることにより、当該分子集合体間の相互作用によって三次元網目構造が発達してゲルの形態となる。静置時間および静置温度は、投与対象、自己組織化ペプチドの濃度および種類等に応じて適切に設定され得る。上記水としては、イオン交換水、蒸留水等の精製された水が好ましく用いられ得る。
【００５４】
骨片としてサイズの小さい骨片（例えば、粉末状の骨片）を用いる場合には、均一に分散させることができるという点から、自己組織化ペプチドゲルと骨片とを混合することが好ましい。また、骨片としてサイズが大きい骨片（例えば、３ｍｍ程度の骨片）を用いる場合には、自己組織化ペプチドゲルと骨片とを混合してもよく、該ゲルと骨片とを混合しなくとも（ゲル内に骨片を添加するのみでも）よい。混合方法としては、特に制限はなく、任意の適切な手段を用いて混合すればよい。
【００５５】
本発明の骨形成促進材の調製方法は、ろ過等の精製；高圧蒸気滅菌、放射線滅菌、乾熱滅菌等の滅菌；包装容器への分注；等の任意の工程をさらに含み得る。
【００５６】
［Ｃ．骨形成促進材用保持器具］
１つの実施形態においては、本発明の骨形成促進材は骨形成促進材用保持器具と共に用いられる。上記骨形成促進材は、生体内環境に近い中性ｐＨで十分な強度を有する。この骨形成促進材を本発明の保持器具で固定することにより、骨形成促進材を投与対象部位に保持することができる。これにより、目的とする投与対象部位において、骨形成を促進することができ、例えば、骨癒合を促進することができる。
【００５７】
骨形成促進材用保持器具は、好ましくはネット、または、網目状の構造を有する器具である。このような形態であることにより、本発明の保持器具は投与対象部位に過度の負荷をかけることなく、骨形成促進を保持し得る。そのため、例えば、骨自体の強度が低下した高齢者にも、骨に負担をかけることなく、適用することなく用いることができる。また、骨折の場合、形状が複雑な部位では固定を行うことが困難であった。しかしながら、本発明の骨形成促進材用保持器具ではネットを用いることが可能であるため、複雑な形状な部位にも追従可能であり、良好に骨形成促進材を保持し得る。網目状の構造を有する器具としては、例えば、ステントが挙げられる。
【００５８】
本発明の骨形成促進材用保持器具は生体安全性に優れるという点から、炭素系材料で構成されることが好ましい。炭素系材料としては、任意の適切な材料を用いることができる。炭素系材料としては、例えば、炭素系繊維、カーボンナノチューブ等が挙げられる。炭素系材料としては、炭素系繊維、カーボンナノチューブが好ましい。
【００５９】
また、骨形成促進材用保持器具として、任意の適切な整形インプラント製品を用いてもよい。具体的には、ケージ、スクリュー、ロッド等が挙げられる。
【００６０】
整形インプラント製品は、任意の適切な材料で構成され得る。例えば、純チタン、チタン合金、チタン・ニッケル合金、コバルトクロム等の金属、ポリカーボネート樹脂；ポリアセタール樹脂；ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、ポリシクロヘキシレンジメチルテレフタレート等のポリエステル樹脂；ポリフェニレンエーテル樹脂；ポリフェニレンオキシド；ナイロン６、ナイロン６６、芳香族ポリアミド等のポリアミド樹脂；シンジオタクチックポリスチレン；超高分子量ポリエチレン等のエンジニアリング樹脂、および、ポリフェニレンサルファイド樹脂、ポリスルフォン樹脂、ポリエーテルスルホン樹脂、ポリエーテルエーテルケトン樹脂、ポリアリレート樹脂、液晶ポリマー、芳香族ポリエステル樹脂、ポリイミド樹脂、ポリアミドイミド樹脂、ポリエーテルイミド樹脂、アラミド樹脂等のスーパーエンジニアリング樹脂等が挙げられる。高耐熱性、機械的強度、耐薬品性、および、耐摩耗性に優れるという点から、エンジニアリング樹脂またはスーパーエンジニアリング樹製の整形インプラント製品を用いることが好ましい。また、エンジニアリング樹脂またはスーパーエンジニアリング樹脂は、炭素繊維等の強化材を含んだものであってもよい。
【００６１】
［Ｄ．骨形成促進材の使用方法］
本発明の骨形成促進材は、１つの実施形態においては、ゲルの形態で投与され、サイズの小さい骨片（例えば、粉末状の骨片）を好適に用いることができる。そのため、シリンジ等で容易に投与することができ、複雑または狭小な投与対象部位（例えば、骨のひび割れの間隙）にも充填することができる。
【００６２】
別の実施形態においては、本発明の骨形成促進材は、骨形成促進材をゲル化した後、投与対象部位に投与（注入）することにより使用される。骨形成促進材をゲル化することにより、骨形成促進材中に骨片が良好に分散した状態が維持され得る。そのため、本発明の骨形成促進材の骨形成促進効果を好適に発揮することができる。
【００６３】
骨形成促進材の投与対象部位への注入は、シリンジ、チューブ、ピペット等の任意の適切な手段を用いて行われ得る。
【００６４】
本発明の骨形成促進材に含まれる自己組織化ペプチドは生体分解性に優れる。また、本発明の骨形成促進材に含まれる骨片は、骨形成を進行させ、新たな骨形成に寄与する。なお、本発明の骨形成促進材に含まれる骨片は、自己組織化ペプチドの分解後も投与対象部位に残存し、癒合骨の一部となり得る。
【００６５】
さらに、別の実施形態においては、本発明の骨形成促進材は、上記骨形成促進材用保持器具と共に使用される。例えば、投与対象部位にゲル状の骨形成促進材を投与した後、ネットの形態である骨形成促進材用保持器具を用いて、投与対象部位および骨形成促進材を被覆することにより、骨形成促進材を保持し得る。さらに、骨形成促進材用保持器具（例えば、ケージ）内に骨形成促進材を充填した後、該保持器具を投与対象部位に取り付けてもよい。また、投与対象部位に予め骨形成促進材用保持器具（例えば、ステント）を適用した状態で、投与対象部位に例えばゲルの形態の骨形成促進材を投与し、使用してもよい。この実施形態においては、骨形成促進材と保持器具とが一体化し得る。しかしながら、本発明の骨形成促進材に含まれる自己組織化ペプチドは生体分解性に優れることから、経時的に吸収・分解され、骨片は癒合骨の一部となり得る。そのため、骨形成が完了した後、必要に応じて、骨形成促進材用保持器具のみを除去することができる。
【００６６】
本発明の骨形成促進材は、必要に応じて、任意の適切な固定方法を併用してもよい。例えば、脊椎は絶えず大きな負荷がかかる部位であるため、より安定して固定する必要がある。そのため、例えば、脊椎骨折に本発明の骨形成促進材を適用する場合には、従来の固定方法であるプレートやスクリューと併せて、本発明の骨形成促進材を用いることにより、安定して固定した状態で骨形成を促進し、より適切な状態において骨癒合を促進し得る。
【００６７】
本発明の骨形成促進材は、例えば、骨組織、歯周組織等における欠損部位の修復等に用いられ得る。また、本発明の骨形成促進材は、骨への負荷を軽減させながら、骨形成を促進させ得る。そのため、骨の強度低下や骨再生の機能低下が懸念される高齢者にも好適に適用することができる。
【実施例】
【００６８】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によって限定されるものではない。【００６９】
［試験例１：細胞培養試験］
自己組織化ペプチドゲル１（株式会社メニコン製、商品名：Ｐａｎａｃｅａ  Ｇｅｌ  ＳＰＧ−１７８−２０８（Ｎ末端がアセチル化され、Ｃ末端がアミド化された配列番号１のペプチド（ＳＰＧ−１７８）（自己組織化ペプチドを構成するアミノ酸残基の中性領域（ｐＨ７．０）における電荷の総和：＋２）を含むペプチドゲル、ペプチド濃度：０．８ｗ／ｗ％）６μｌを４℃で１．５時間静置した。次いで、培地（ＭＥＭαに１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリンストレプトマイシン（ＰｅｎＳｔｒｅｐ）溶液を添加したもの）５００μｌを添加し、３７℃で１時間静置した後、培地を交換し、２４ウェルプレートに添加した。添加した２４ウェルプレートにＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を５０，０００ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるよう播種し、室温で２４時間培養した後、培地を分化誘導培地（上記培地にさらに１％アスコルビン酸、０．２％ヒドロコルチゾン、２％β‐グリセロリン酸塩を添加したもの）に交換し、室温にて細胞培養を行った。また、比較として、自己組織化ペプチドゲル１に代えて、自己組織化ペプチドゲルＣ１（３Ｄマトリックス社製、製品名「ＰｕｒａｍａｔｒｉｘＴＭ」、Ａｃ−ＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡ−ＣＯＮＨ２のペプチド濃度１重量％のゲル）を用いた以外は同様にして、細胞培養を行った。さらに、自己組織化ペプチドゲルを添加せず、細胞のみの培養も同様に行った。培養から１日後、７日後、１４日後、２８日後に細胞のＡＬＰ染色およびＲＮＡ抽出を行った。ＲＮＡでの発現量はＲＴ−ＰＣＲにより測定した。アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）染色については、以下の方法で行った。【００７０】
（ＡＬＰ染色）
ヒストファインＳＡＢ−ＰＯ（Ｒ）キット（ニチレイバイオサイエンス社製）を用いて、染色処理を行った。各ウェルから培地を吸引し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した。次いで、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定し、１０分間静置した後、ＰＢＳで３回洗浄した。その後、０．２％トリトンＸ（登録商標）−ＰＢＳ溶液で透過処理を行い、１０分間静置し、ＰＢＳで３回洗浄した。ブロッキング試薬Ｉ（３％過酸化水素加メタノール）を添加した後、１０分〜１５分間静置し、ＰＢＳで３回洗浄した。その後、ブロッキング試薬ＩＩ（１０％ヤギ正常血清）を添加した後、１０分間静置し、第一抗体（ＡＬＰ抗体：ａｂｃａｍ  Ａｎｔｉ−Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ［ＥＰＲ４４７７］  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｂ  １０８３３７）を添加し、２時間静置した後、ＰＢＳで３回洗浄した。次いで、第二抗体（ビオチン標識抗ウサギＩｇＧ抗体）を添加して、１０分間静置し、ＰＢＳで３回洗浄した。次いで、酵素試薬（ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン）を添加し、５分間静置した後、ＰＢＳで３回洗浄した。次いで、基質溶液（ＤＡＢ基質キット：発色基質（試薬Ａ)２滴（約４０μｌ)と基質緩衝液（試薬Ｂ)２滴（約４０μｌ)を精製水１ｍｌに加え、泡立てないように混合し、発色試薬（試薬Ｃ)を１滴（約４０μｌ)を加え泡立てないように混合した溶液）を加え、５分〜２０分間静置し、精製水で３回洗浄した。次いで、対比染色（ヘマトキシリン）し、２分間静置し、水で色出しし、１０分間静置し、顕微鏡で観察した。【００７１】
＜結果＞
培養０日後、１日後、７日後、１４日後、２８日後の細胞の顕微鏡写真およびＡＬＰ染色した写真を図１Ａ〜図１Ｄに示す。ＡＬＰ染色により、骨形成マーカーであるＡＬＰが染色される。自己組織化ペプチドゲル１を用いた場合、ＡＬＰ染色される骨芽細胞が凝集しており、骨形成を十分に誘導し得ると考えられた（図１）。一方、細胞のみを培養した場合、細胞分化していないため、ＡＬＰ染色による発現は少なかった。自己組織化ペプチドゲルＣ１を用いた場合にも、ＡＬＰ染色された範囲が確認された（図１）。【００７２】
培養１日後、７日後、１４日後、２８日後の各細胞における骨形成マーカー（ＡＬＰ、ＢＭＰ−２、骨シアロタンパク（ＢＳＰ）、オステオカルシン（Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）、オステリクス（Ｏｓｔｅｒｉｘ）、オステオポンチン（ＯＳＰ））の発現量を示すグラフを図２に示す。培養２８日目（骨形成成熟時期）において、ＡＬＰ、ＢＭＰ−２、ＯＰＮ、ＢＳＰ、オステリクスにおいて、自己組織化ペプチドゲル１（図２中のＳＰＧ）を用いた場合、自己組織化ペプチドゲルＣ１（図２中のＰＭ）を用いて培養した場合に比べて有意に発現量が上昇した。ＡＬＰは通常、骨形成の初期において発現量が上昇するマーカーである。ＡＬＰが他の骨形成マーカーと同様に発現量が高いことから、自己組織化ペプチドゲル１を用いることにより、各骨形成マーカーが持続的に誘導されると考えられた。【００７３】
［実施例１］
マウスの大腿骨を粉砕機を用いて砕くことにより、骨片（１ｍｍ〜２ｍｍ）を得た。得られた骨片に自己組織化ペプチドゲル２（株式会社メニコン製、商品名：Ｐａｎａｃｅａ  Ｇｅｌ  ＳＰＧ−１７８−２０４、ペプチド濃度：０．４ｗ／ｗ％）をのせて、静置することによりゲル状の骨形成促進材１を得た。自己組織化ペプチドゲル２の組成を表１に示す。
得られた骨形成促進材を培地ＭＥＭαと１０m％ＦＢＳと１％Ａｎｔｉ−Ａｎｔｉを用いて培養した。培養１４日後、および２８日後の骨形成促進材の写真および該骨形成促進材をＡＬＰ染色した写真を図３に示す。【００７４】
【表１】
0006042038.tif 000002
【００７５】
［実施例２］
自己組織化ペプチドゲル２に代えて、自己組織化ペプチドゲルに１を用いた以外は実施例１と同様にして、骨形成促進材２を得た。得られた骨形成促進材２を実施例１と同様に培養した。培養１４日後、および２８日後の骨形成促進材の写真および該骨形成促進材をＡＬＰ染色した写真を図３に示す。【００７６】
［実施例３］
自己組織化ペプチドゲル２に代えて、自己組織化ペプチドゲル３を用いた以外は実施例１と同様にして、骨形成促進材３を得た。自己組織化ペプチドゲル３の組成を表１に示す。得られた骨形成促進材３を実施例１と同様に培養した。培養１４日後、および２８日後の骨形成促進材の写真および該骨形成促進材をＡＬＰ染色した写真を図３に示す。【００７７】
（比較例１）
自己組織化ペプチドゲル２に代えて、自己組織化ペプチドゲルＣ１（３Ｄマトリックス社製、製品名「ＰｕｒａｍａｔｒｉｘＴＭ」、Ａｃ−ＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡ−ＣＯＮＨ２のペプチド濃度１重量％のゲル）を用いた以外は実施例１と同様にして、骨形成促進材Ｃ１を得た。自己組織化ペプチドゲルＣ１の組成は表１に示す。得られた骨形成促進材Ｃ１を用いた以外は実施例１と同様にして培養した。培養１４日後、および２８日後の骨形成促進材の写真および該骨形成促進材をＡＬＰ染色した写真を図３に示す。【００７８】
（結果）
骨形成促進材１〜３では、ＡＬＰ染色された骨芽細胞が確認された。一方、骨形成促進材Ｃ１では骨片が腐骨化し、骨芽細胞は確認されなかった。【００７９】
［実施例４］
マウス大腿骨にドリルを用いて１ｍｍ×３ｍｍの骨欠損部を作製し大腿骨欠損マウスを得た。
得られた大腿骨欠損マウスの大腿骨欠損部分に実施例１で得られた骨形成促進材１を移植した。移植２日後、７日後、９日後、１４日後、２１日後のマウスの大腿骨部分を切開し、骨形成の様子を観察した。骨形成促進材１を移植したマウスにおいて、欠損部分の骨癒合が進行していた。通常の骨癒合の進行に比べて、本発明の骨形成促進材１では、明らかに骨形成が促進されていた。【００８０】
［試験例２］大腿骨再生試験
大腿骨欠損マウスを用いて、以下の手順により大腿骨再生試験を行った。創外固定後、５６日経過後の大腿骨欠損部をＸ線撮影およびＣＴ撮影し、大腿骨の再生性能を評価した。Ｘ線撮影およびＣＴ撮影の条件は、以下に示す。また、ＣＴ撮影の結果から、骨再生量を算出した。なお、骨形成促進材ごとに４検体のマウスを用いて試験を行った。
（１）大腿骨欠損モデルの作製
１０週齢のメスのラット（中部科学資材から入手）の腹腔内にソムノペンチル（共立製薬（株）社製）を０．１ｍｌ〜０．１５ｍｌ注射して麻酔をかけた後、大腿部を切開し、大腿骨に創外固定具（図４）を装着した。次いで、創外固定具を装着した部分の中間の大腿骨をエアトームで削り、約５ｍｍの骨欠損部を作製した。
（２）ｂｏｒｎ  ｃｈｉｐの作製
上記ラットから採取した大腿骨をエアトームで削り、骨片（ｂｏｒｎ  ｃｈｉｐ）を採取した。採取したｂｏｒｎ  ｃｈｉｐは使用まで−８０℃で保存した。
（３）骨形成促進材の調製
自己組織化ペプチドゲル１（株式会社メニコン製、商品名：Ｐａｎａｃｅａ  Ｇｅｌ  ＳＰＧ−１７８−２０８、ペプチド濃度：０．８ｗ／ｗ％）８０μＬに、上記ｂｏｒｎ  ｃｈｉｐ０．０５ｇを混ぜ、骨形成促進材を得た。自己組織化ペプチドゲル１に代えて、自己組織化ペプチドゲルＣ１（３Ｄマトリックス社製、製品名「ＰｕｒａｍａｔｒｉｘＴＭ」）、または、生理食塩水を用いた以外は同様にして、骨形成促進材を得た。
（４）大腿骨欠損部への創外固定
上記（３）で調製した各骨形成促進材をＰＥＥＫ製のケージ（八十島プロシード（株）社製、長さ：５ｍｍ、外径：５ｍｍ、内径：３ｍｍ、図５）に注入した。次いで、大腿骨欠損マウスの大腿骨欠損部に骨形成促進材を注入したケージを挿入し、図６に示すように創外固定した。【００８１】
＜Ｘ線撮影＞
Ｘ線撮影装置：ＳＯＦＴＥＸ／ＣＭＢ−２（ソフテックス（株）製）
（撮影条件）
電圧：５０ＫＶｐ
電流:１０ｍＡ
時間：１５秒
撮影距離：６０ｃｍ
フィルム：ＦＵＪＩＦＩＬＭ
＜ＣＴ撮影＞
ＣＴ撮影装置：高分解能ｉｎ  ｖｉｖｏマイクロＸ線ＣＴスキャナ（ＳＫＹＳＣＡＮ  １１７６）
（撮影条件）
Ｆｉｌｔｅｒ：Ｃｕ＋ＡＬ
Ｓｏｕｒｃｅ  Ｖｏｌｔａｇｅ：８０ＫＶ
Ｓｏｕｒｃｅ  Ｃｕｒｒｅｎｔ：３１３μＡ
Ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  Ｒｏｗｓ：１３３６
Ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  Ｃｏｌｕｍｎｓ：２０００
Ｉｍａｇｅ  Ｐｉｘｅｌ  Ｓｉｚｅ：１７．６μｍ
（Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ条件）
Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ：ＮＲｅｃｏｎ
Ｐｉｘｅｌ  Ｓｉｚｅ:１７．６０２２３μｍ
Ｍｉｎｉｍｕｍ  ｆｏｒ  ＣＳ  ｔｏ  Ｉｍａｇｅ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ：０．００２
Ｍａｘｉｍｕｍ  ｆｏｒ  ＣＳ  ｔｏ  Ｉｍａｇｅ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ：０．０３
＜骨再生量算出方法＞
ＳＫＹＳＣＡＮ社製の数値解析ソフト「ＣＴＡｎ」を用いて骨形態解析を行い、骨再生量の定量化を行った。【００８２】
（結果）
各骨形成促進材を用いて創外固定を行った大腿骨欠損部のＸ線写真を図７に、ＣＴ写真を図８にそれぞれ示す。実施例１で得られた骨形成促進材１を大腿骨欠損部に適用したマウスでは、欠損部全体で骨再生が確認された（図７および図８中のＳＰＧ−１７８）。また、全てのマウスで骨再生量が５０％以上であった（骨再生量の平均値：６６．６８％、ｐ＝０．０１）。一方、骨形成促進材Ｃ１を適用したマウスでは、骨再生は大腿骨の両端からでのみ確認された（図７および図８中のＰｕｒａＭａｔｒｉｘ）。また、骨形成促進材１を用いたものに比べて骨再生量が小さかった（骨再生量の平均値：３１．５４％、ｐ＝０．０１）。さらに、対照として生理食塩水を用いたものよりも骨再生量が小さかった（骨再生量の平均値：４４．１８％、ｐ＝０．０１）。また、骨形成促進材１を用いたマウスでの骨再生量は、骨形成促進材Ｃ１を用いたマウスよりも有意に高い値であった。【００８３】
［実施例５］
自己組織化ペプチドゲル３をＭｉｌｌｉ−Ｑ水で希釈し、１．０ｗ／ｗ％の水溶液を得た。得られた水溶液を２４ウェルプレートに滴下し、ゲルの性状を実体顕微鏡（倍率１００倍）で観察した。また、ゲルのｐＨをｐＨ試験紙で測定した。
試験管に上記試験例２で得られたｂｏｒｎ  ｃｈｉｐ（ラット大腿骨）５ｍｇを入れた後、得られた水溶液５μＬを滴下した。次いで、ボルテックスミキサーで撹拌した後、遠心分離機により気泡を除去し、骨形成促進材５を得た。得られた骨形成促進材５の性状を実体顕微鏡（倍率１００倍）で観察した。また、得られた骨形成促進材のｐＨをｐＨ試験紙で測定した。【００８４】
［実施例６］
自己組織化ペプチドゲル４を用いた以外は実施例５と同様にして骨形成促進材６を得た。自己組織化ペプチドゲル４の組成を表１に示す。ｂｏｒｎ  ｃｈｉｐ添加前のゲルの性状およびｐＨ、ならびに、骨形成促進材６の性状およびｐＨを実施例５と同様に評価した。【００８５】
（比較例２）
自己組織化ペプチドゲルＣ１を用いた以外は実施例５と同様にして骨形成促進材Ｃ２を得た。ｂｏｒｎ  ｃｈｉｐ添加前のゲルの性状およびｐＨ、ならびに、骨形成促進材Ｃ２の性状およびｐＨを実施例５と同様に評価した。【００８６】
［評価］
実施例５〜６および比較例２のｂｏｒｎ  ｃｈｉｐ添加前のゲルの写真を図９に、ｂｏｒｎ  ｃｈｉｐ添加後のゲル（骨形成促進材）の写真を図１０にそれぞれ示す。図９に示すように、ｂｏｒｎ  ｃｈｉｐ添加前のゲルはいずれも均一なゲル（ホモジニアス）であった。実施例５および６の骨形成促進材を実体顕微鏡で観察したところ、いずれも均一にｂｏｒｎ  ｃｈｉｐが分散したホモジニアスな状態であった（図１０（ａ）および（ｂ））。一方、比較例２の骨形成促進材では、ゲル状の析出物が確認され、不均一な状態（ヘテロジニアス）な状態であった（図１０（ｃ））。【００８７】
また、実施例５および６では、ｂｏｒｎ  ｃｈｉｐ添加前後のいずれにおいても、ｐＨは中性（ｐＨ６〜８程度）であった。一方、比較例２ではｂｏｒｎ  ｃｈｉｐ添加前のゲルのｐＨは酸性（ｐＨ４程度）であったが、ｂｏｒｎ  ｃｈｉｐの添加後にｐＨは中性（ｐＨ６〜８程度）になった。【００８８】
実施例５および６では、ｂｏｒｎ  ｃｈｉｐ添加前後でゲルのｐＨが維持されているため、得られる骨形成促進材が均一な性状を維持していた。これらの実施例では、ｂｏｒｎ  ｃｈｉｐが均一に分散しているため、骨形成促進材をスキャホールドとし、骨形成率が向上すると考えられる。一方、比較例２では、ｂｏｒｎ  ｃｈｉｐの添加によるｐＨの変化によりゲルがヘテロジニアスな状態になるため、骨形成を十分に促進できなかったと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
本発明の骨形成促進材は、研究開発や医療の分野において好適に利用され得る。
【図１Ａ】
0006042038.tif 000003
【図１Ｂ】
0006042038.tif 000004
【図１Ｃ】
0006042038.tif 000005
【図１Ｄ】
0006042038.tif 000006
【図２】
0006042038.tif 000007
【図３】
0006042038.tif 000008
【図４】
0006042038.tif 000009
【図５】
0006042038.tif 000010
【図６】
0006042038.tif 000011
【図７】
0006042038.tif 000012
【図８】
0006042038.tif 000013
【図９】
0006042038.tif 000014
【図１０】
0006042038.tif 000015
【配列表】
0006042038000001.app