(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
高レベルのスフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）と相関している疾患または障害を治療または予防するための医薬品の製造における抗Ｓ１Ｐ抗体または抗Ｓ１Ｐ抗体フラグメントの使用であって、 前記抗Ｓ１Ｐ抗体または抗Ｓ１Ｐ抗体フラグメントが  ｃ．Ｓ１Ｐに特異的に結合し、少なくとも１つの免疫グロブリン重鎖可変ドメインおよび少なくとも１つの免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む、単離された抗Ｓ１Ｐ抗体分子または抗Ｓ１Ｐ抗体フラグメントであって、  （ｉ）各免疫グロブリン重鎖が、ＤＨＴＩＨ（配列番号１３）、ＡＩＳＰＲＨＤＩＴＫＹＮＥＭＦＲＧ（配列番号３１）およびＧＧＦＹＧＳＴＩＷＦＤＦ（配列番号１５）のそれぞれから構成される、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３配列を含み、  （ｉｉ）各免疫グロブリン軽鎖が、ＩＴＴＴＤＩＤＤＤＭＮ（配列番号１０）、ＥＧＮＩＬＲＰ（配列番号１１）およびＬＱＳＤＮＬＰＦＴ（配列番号１２）のそれぞれから構成されるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３配列を含む；および  ｇ．少なくとも１つの免疫グロブリン重鎖可変ドメインおよび少なくとも１つの免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む、単離された抗Ｓ１Ｐ抗体分子または抗Ｓ１Ｐ抗体フラグメントであって、各免疫グロブリン重鎖可変ドメインが、下記アミノ酸配列ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＱＳＦＧＹＩＦＩＤＨＴＩＨＷＭＲＱＭＰＧＱＧＬＥＷＭＧＡＩＳＰＲＨＤＩＴＫＹＮＥＭＦＲＧＱＶＴＩＳＡＤＫＳＳＳＴＡＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＦＣＡＲＧＧＦＹＧＳＴＩＷＦＤＦＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳを含み、各免疫グロブリン軽鎖可変ドメインが、下記アミノ酸配列ＥＴＴＶＴＱＳＰＳＦＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＩＴＴＴＤＩＤＤＤＭＮＷＦＱＱＥＰＧＫＡＰＫＬＬＩＳＥＧＮＩＬＲＰＧＶＰＳＲＦＳＳＳＧＹＧＴＤＦＴＬＴＩＳＫＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＳＤＮＬＰＦＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫを含み、前記抗Ｓ１Ｐ抗体または抗Ｓ１Ｐ抗体フラグメントがＳ１Ｐに特異的に結合する；からなる群から選択される、使用。
【請求項２】
前記疾患または障害が、癌、炎症性障害、脳血管疾患、心血管疾患、眼球障害、過剰な繊維形成に関連する疾患または障害ならびに病理学的脈管形成に関連する疾患または障害からなる群から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
対象がヒトである、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
Ｓ１Ｐの含有が分かっているまたは疑われるサンプルを抗Ｓ１Ｐ抗体または抗Ｓ１Ｐ抗体フラグメントに曝すこと、
ここで前記抗Ｓ１Ｐ抗体または抗Ｓ１Ｐ抗体フラグメントが
ｃ．Ｓ１Ｐに特異的に結合し、少なくとも１つの免疫グロブリン重鎖可変ドメインおよび少なくとも１つの免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む、単離された抗Ｓ１Ｐ抗体分子または抗Ｓ１Ｐ抗体フラグメントであって、
（ｉ）各免疫グロブリン重鎖が、ＤＨＴＩＨ（配列番号１３）、ＡＩＳＰＲＨＤＩＴＫＹＮＥＭＦＲＧ（配列番号３１）およびＧＧＦＹＧＳＴＩＷＦＤＦ（配列番号１５）のそれぞれから構成される、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３配列を含み、
（ｉｉ）各免疫グロブリン軽鎖が、軽鎖は免疫グロブリン軽鎖の可変ドメインに由来する少なくとも１つのフレームワーク領域を含み、ＩＴＴＴＤＩＤＤＤＭＮ（配列番号１０）、ＥＧＮＩＬＲＰ（配列番号１１）およびＬＱＳＤＮＬＰＦＴ（配列番号１２）のそれぞれから構成されるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３配列を含む；および
ｇ．少なくとも１つの免疫グロブリン重鎖可変ドメインおよび少なくとも１つの免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む、単離された抗Ｓ１Ｐ抗体分子または抗Ｓ１Ｐ抗体フラグメントであって、
各免疫グロブリン重鎖可変ドメインが、下記アミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＱＳＦＧＹＩＦＩＤＨＴＩＨＷＭＲＱＭＰＧＱＧＬＥＷＭＧＡＩＳＰＲＨＤＩＴＫＹＮＥＭＦＲＧＱＶＴＩＳＡＤＫＳＳＳＴＡＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＦＣＡＲＧＧＦＹＧＳＴＩＷＦＤＦＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
を含み、
各免疫グロブリン軽鎖可変ドメインが、下記アミノ酸配列
ＥＴＴＶＴＱＳＰＳＦＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＩＴＴＴＤＩＤＤＤＭＮＷＦＱＱＥＰＧＫＡＰＫＬＬＩＳＥＧＮＩＬＲＰＧＶＰＳＲＦＳＳＳＧＹＧＴＤＦＴＬＴＩＳＫＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＳＤＮＬＰＦＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
を含み、前記抗Ｓ１Ｐ抗体または前記抗Ｓ１Ｐ抗体フラグメントがＳ１Ｐに特異的に結合する；からなる群から選択され、
ならびに前記抗Ｓ１Ｐ抗体または抗Ｓ１Ｐ抗体フラグメントのサンプルへの結合を測定すること、ここで、前記抗Ｓ１Ｐ抗体または抗Ｓ１Ｐ抗体フラグメントがＳ１Ｐに特異的に結合する、
を含むＳ１Ｐを検出する方法。
【請求項５】
結合の検出がＳ１Ｐを含むことが分かっている、または含むことが疑われるサンプルに、前記抗Ｓ１Ｐ抗体または抗Ｓ１Ｐ抗体フラグメントを、Ｓ１Ｐがそのサンプル中に存在すれば前記抗Ｓ１Ｐ抗体または抗Ｓ１Ｐ抗体フラグメントがＳ１Ｐと結合することが可能な条件下で、曝すことにより結合を検出する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記サンプルが組織または液体サンプルである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記液体サンプルが全血、血漿、血清、尿、精液、胆汁、眼房水、硝子体液、粘膜および痰からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記抗Ｓ１Ｐ抗体または抗Ｓ１Ｐ抗体フラグメントが、モノクローナル抗体またはモノクローナル抗体フラグメントである、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記抗Ｓ１Ｐ抗体または抗Ｓ１Ｐ抗体フラグメントが固相支持体に結合されている、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
ＥＬＩＳＡアッセイである、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗Ｓ１Ｐ抗体または抗Ｓ１Ｐ抗体フラグメントが、モノクローナル抗体またはモノクローナル抗体フラグメントである、請求項１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
先行出願
本願は、２００６年、１０月２７日出願の仮出願第６０／８５４，９７１号（弁理士事件番号ＬＰＴ−３０１０−ＰＶ）の利益と優先権を主張するものであり、その内容は目的を問わず、出典明示より、そのまま本明細書の一部とされる。
【０００２】
配列表
本願は、添付の配列表とともに出願し、それを含んでいるが、この配列表は適用すべき規則および手続きに従って作製および提出したものである。この配列表も、目的を問わず、出典明示より、そのまま本明細書の一部とされる。
【０００３】
１．発明の分野
本発明は、スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）と結合する薬剤、特に、生理条件下でＳ１Ｐと特異的に反応する、ヒト化モノクローナル抗体、抗体フラグメントおよび抗体誘導体に関する。このような薬剤は、このような薬剤を含有する医薬組成物の送達による種々の疾患または障害の治療および／または予防に使用可能である。
【０００４】
以下の記載は本発明の理解に役立つ情報を含んでいる。本明細書に示される情報または本明細書中で明示的または暗示的に引用される刊行物はいずれも、ここに請求される発明の先行技術である、あるいは特にここに請求される発明と関連することを認めるものではない。
【背景技術】
【０００５】
２．背景
生物活性シグナル伝達脂質
脂質およびそれらの誘導体は現在、単に細胞膜の単純な構造要素またはβ−酸化、解糖もしくは他の代謝過程のエネルギー源としてだけではなく、医学研究の重要な標的として認識されている。特に、ある種の生物活性脂質は、動物およびヒトの疾患において重要なシグナル伝達メディエーターとして機能する。原形質膜の脂質のほとんどのものはもっぱら構造的役割を果たすが、一部のものは細胞外刺激を細胞へ中継することに関与する。「脂質シグナル伝達」とは、セカンドメッセンジャーとして細胞膜脂質を用いるいくつかの細胞シグナル伝達経路を指すとともに、脂質シグナル伝達分子とその固有の特異的受容体との直接的相互作用を指す。脂質シグナル伝達経路は、増殖因子から炎症性サイトカインまで、種々の細胞外刺激によって活性化され、アポトーシス、分化および増殖などの細胞の運命の決定を調節する。ますます多くの生物活性脂質が確認され、それらの作用が同定されているので、生物活性脂質シグナル伝達に対する研究は、活発な科学研究分野である。
【０００６】
生物活性脂質の例としては、エイコサノイド（カンナビノイド、ロイコトリエン、プロスタグランジン、リポキシン、エポキシエイコサトリエン酸およびイソエイコサノイドを含む）、非エイコサノイドカンナビノイドメディエーター、リン脂質およびそれらの誘導体、例えば、ホスファチジン酸（ＰＡ）およびホスファチジルグリセロール（ＰＧ）など、血小板活性化因子（ＰＡＦ）およびカルジオリピン、ならびにリゾリン脂質、例えば、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）および種々のリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）が挙げられる。生物活性シグナル伝達脂質性メディエーターとしてはまた、スフィンゴミエリン、セラミド、セラミド−１−リン酸、スフィンゴシン、スフィンゴシルホスホリルコリン、スフィンガニン、スフィンガニン−１−リン酸（ジヒドロ−Ｓ１Ｐ）およびスフィンゴシン−１−リン酸などのスフィンゴ脂質が挙げられる。スフィンゴ脂質およびそれらの誘導体は、重要な細胞プロセスに対して多面発現作用を有する細胞外および細胞内シグナル伝達分子の一群を表す。生物活性シグナル伝達脂質の他の例としては、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＡ）、ジアシルグリセリド（ＤＧ）、スルファチド、ガングリオシドおよびセレブロシドが挙げられる。
【０００７】
スフィンゴ脂質は、それらの当初の不可解な性質のためにスフィンクスにちなんで命名されたユニークな脂質種である。スフィンゴ脂質は最初に、細胞膜の主要な構造成分として同定されたが、最近の研究では、スフィンゴ脂質は細胞シグナル伝達・調節分子としても働くことが示されている(Hannun, et al., Adv. Lipid Res. 25:27-41, 1993; Speigel ,et al., FASEB J. 10:1388-1397, 1996; Igarashi, J. Biochem 122:1080-1087, 1997; Hla, T. (2004). Semin Cell Dev Biol, 15, 513-2; Gardell, S.E., Dubin, A.E. & Chun, J. (2006). Trends Mol Med, 12, 65-75)。スフィンゴ脂質は、細胞シグナル伝達・調節分子としても働く、細胞膜の主要な構造成分である(Hannun and Bell, Adv. Lipid Res. 25: 27-41, 1993; Igarashi, J. Biochem 122: 1080-1087, 1997)。スフィンゴ脂質シグナル伝達メディエーターであるセラミド（ＣＥＲ）、スフィンゴシン（ＳＰＨ）およびスフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）は最も広く研究されており、最近、心血管系、脈管形成および腫瘍生物学におけるそれらの役割が認識されている(Claus, et al., Curr Drug Targets 1: 185-205, 2000; Levade, et al., Circ. Res. 89: 957-968, 2001; Wang, et al., J. Biol. Chem. 274: 35343-50, 1999; Wascholowski and Giannis, Drug News Perspect. 14: 581-90, 2001; Spiegel, S. & Milstien, S. (2003). Sphingosine-1-phosphate: an enigmatic signaling lipid. Nat Rev Mol Cell Biol, 4, 397-407)。
【０００８】
スフィンゴ脂質代謝の総説としては、Liu, et al., Crit Rev. Clin. Lab. Sci. 36:511-573, 1999を参照。スフィンゴミエリンシグナル伝達経路の総説としては、Hannun, et al., Adv. Lipid Res. 25:27-41, 1993; Liu, et al., Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 36:511-573, 1999; Igarashi, J. Biochem. 122:1080-1087, 1997; Oral, et al., J. Biol. Chem. 272:4836-4842, 1997;およびSpiegel et al., Biochemistry (Moscow) 63:69-83, 1998を参照。
【０００９】
Ｓ１Ｐは細胞増殖のメディエーターであり、生存経路の活性化によってアポトーシスから保護する(Maceyka, et al. (2002), BBA, vol. 1585): 192-201およびSpiegel, et al. (2003), Nature Reviews Molecular Cell Biology, vol. 4: 397-407)。ＣＥＲ／ＳＰＨレベルとＳ１Ｐの間のバランスが、細胞が細胞死経路へ向けられるかアポトーシスから保護されるかを決定するレオスタット機構をもたらすのではないかと提案されている。このレオスタット機構の鍵となる調節酵素はスフィンゴシンキナーゼ（ＳＰＨＫ）であり、その役割は細胞死促進生物活性シグナル伝達脂質（ＣＥＲ／ＳＰＨ）を成長促進Ｓ１Ｐへ変換することである。Ｓ１Ｐは２つの運命を持ち、Ｓ１Ｐは、Ｓ１Ｐをホスホエタノールアミンとヘキサデカナールに切断する酵素Ｓ１Ｐリアーゼにより分解されるか、あるいは多くはないが、Ｓ１ＰホスファターゼによりＳＰＨへと加水分解され得る。
【００１０】
Ｓ１Ｐの多面発現的生物活性は、もともと内皮分化遺伝子（ＥＤＧ）として知られるＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）ファミリーによって媒介される。Ｓ１Ｐ１／ＥＤＧ−１、Ｓ１Ｐ２／ＥＤＧ−５、Ｓ１Ｐ３／ＥＤＧ−３、Ｓ１Ｐ４／ＥＤＧ−６およびＳ１Ｐ５／ＥＤＧ−８という５つのＧＰＣＲが高親和性Ｓ１Ｐ受容体（Ｓ１ＰＲ）として同定されており、１９９８年といった最近になって初めて確認されたものである(Lee, et al., 1998)。Ｓ１Ｐによって誘発される多くの反応は種々のヘテロ三量体Ｇタンパク質（Ｇｑ−、Ｇｉ、Ｇ１２−１３）およびＲｈｏファミリーの小さなＧＴＰアーゼと結びついている(Gardell, et al., 2006)。
【００１１】
成体では、Ｓ１Ｐは、血小板(Gardell, et al., 2006)および肥満細胞から放出され、創傷治癒を促進し、炎症性応答に関与するために遊離Ｓ１Ｐの局部的パルスを（Ｓ１ＰＲのＫｄを十分超えるように）作り出す。正常な条件下では、血漿中の全Ｓ１Ｐはかなり高い（３００〜５００ｎＭ）が、大部分のＳ１Ｐは血清タンパク質、特に、リポタンパク質（例えば、ＨＤＬ＞ＬＤＬ＞ＶＬＤＬ）およびアルブミンによって緩衝されている可能性があることから、生物活性Ｓ１Ｐ（またはＳ１Ｐの遊離画分）はＳ１ＰＲを認め得るほどに活性化するのに十分なものではない(Murata et al., 2000)。もしこの限りでなければ、不適切な脈管形成や炎症が起こる。Ｓ１Ｐの細胞内作用も示唆されている（例えば、Spiegel S, Kolesnick R (2002), Leukemia, vol. 16: 1596-602; Suomalainen, et al (2005), Am J Pathol, vol. 166: 773-81参照。）
【００１２】
細胞表面Ｓ１Ｐ受容体の散在発現は、増殖、接着、収縮、運動性、形態形成、分化および生存を含む、Ｓ１Ｐに多様な細胞応答域に影響を及ぼさせる。この応答域は、細胞および組織系の中のＳ１Ｐ受容体の重複または異なる発現パターンに依存しているように思われる。さらに、Ｓ１Ｐと血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）および塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含む増殖因子シグナル伝達経路の間のクロストークが最近実証された（例えば、Baudhuin, et al. (2004), FASEB J, vol. 18: 341-3)。Ｓ１Ｐを含む種々の細胞プロセス、とりわけ、ニューロンシグナル伝達、血管緊張、創傷治癒、免疫細胞移動、生殖および心血管機能の調節に特定の影響を有する。これらの系内のＳ１Ｐの内在レベルの変更は、癌、炎症、脈管形成、心疾患、喘息および自己免疫疾患を含むいくつかの病態生理学的状態を誘発する有害な作用を持つ。
【００１３】
心血管疾患、脳血管疾患および種々のな癌を含む種々の疾患および障害の処置に対する最近の新規なアプローチは、単独で、または他の処置と組み合わせて、生物学的に利用可能なＳ１Ｐのレベルを低下させることを含む。ＳＰＨＫのようなスフィンゴ脂質代謝経路の鍵酵素を標的とするスフィンゴ脂質に基づく処置戦略が提案されているが、脂質性メディエーターＳ１Ｐ自体との干渉は、大方は、この脂質標的を直接緩和することが困難なために、特に、Ｓ１Ｐ標的に対する抗体をまず作製し、次に検出することが困難なために、最近になるまで強調されて来なかった。
【００１４】
最近、Ｓ１Ｐに特異的な抗体の作製が記載された。例えば、同一所有者の米国特許出願第２００７０１４８１６８号；ＷＯ２００７／０５３４４７参照。このような抗体は、例えば、血清からＳ１Ｐを選択的に吸収することができ、細胞外Ｓ１Ｐを中和する分子スポンジとして働く。同一所有者の米国特許第６，８８１，５４６号および同第６，８５８，３８３号および米国特許出願第１０／０２９，３７２号も参照。Lpath, Inc.が開発し、上記で引用された特許または特許出願に記載されているネズミモノクローナル抗体（ｍＡｂ）であるＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢ（商標）は、ヒト疾患モデルで有効であることが示されている。場合によっては、特に、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答が生じ得る、ヒトにおける治療的使用のためには、ネズミ抗体よりもヒト化抗体のほうが好ましい場合がある。このような応答は、結合活性を中和することにより、かつ／または身体において循環から抗体を迅速に浄化することにより、抗体の有効性を低減し得る。ＨＡＭＡ応答はまた、その後マウス抗体を投与した際に毒性を生じる可能性がある。
【００１５】
今般、ヒト化抗Ｓ１Ｐ抗体が開発され、本明細書に記載される。この抗体は、Ｓ１Ｐとの結合、Ｓ１Ｐの中和、およびＳ１Ｐに関連する病態の調節における有効性に関してネズミｍＡｂの利点を全て持ち、ヒトに関して用いる場合のネズミｍＡｂの潜在的欠点を全く持たないと予想される。以下の例に記載されるように、このヒト化抗体（ＬＴ１００９またはｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂと呼ぶ）は、実際に、疾患の動物モデルにおいて親（ネズミ）抗体よりも大きな活性が示されている。
【発明の概要】
【００１６】
３．定義
本発明を詳しく述べる前に、本発明の文脈で用いるいくつかの用語を定義する。これらの用語に加え、他のものも必要に応じて本明細書の他所で定義する。特に断りのない限り、本明細書で用いられる技術用語はそれらの技術分野で認識されている意味を有する。矛盾がある場合には、定義を含む本明細書を調整する。
【００１７】
「免疫誘導部分」は、抗体（Ａｂ）または免疫グロブリン（Ｉｇ）を含み、免疫グロブリン遺伝子に由来するか、免疫グロブリン遺伝子の後にモデル化されるか、または免疫グロブリン遺伝子にコードされている任意の形態のペプチド、ポリペプチド、または誘導形態、あるいは抗原またはエピトープと結合し得るこのようなペプチドまたはポリペプチドのフラグメントを指す（例えば、Immunobiology, 5th Edition, Janeway, Travers, Walport, Shlomchiked. (editors), Garland Publishing (2001)参照）。本発明において、抗原は生物活性脂質分子である。
【００１８】
「抗Ｓ１Ｐ抗体」または「Ｓ１Ｐに対して反応性のある免疫誘導部分」とは、Ｓ１Ｐと結合する任意の抗体または抗体由来分子を指す。これらの定義から理解されるように、抗体または免疫誘導部分はポリクローナルであってもモノクローナルであってもよく、様々な手段で作製し、かつ／またはヒト対象を含む動物から単離することができる。
【００１９】
「生物活性脂質」とは、脂質シグナル伝達分子を指す。一般に、生物活性脂質は、そのシグナル伝達作用を発揮する際は生体膜には存在せず、いわば、このような脂質種は生体膜（例えば、細胞膜、細胞オルガネラの膜など）のいくつかの点に存在する可能性があり、生体膜と結びついた際には「生物活性脂質」ではなく、代わりに「構造脂質」分子となる。生物活性脂質は、細胞外および／または細胞内シグナル伝達を媒介し、従って、分化、遊走、増殖、分泌、生存および他のプロセスを変調することにより、多くの細胞種の機能の制御に関与するという点で構造脂質（例えば、膜結合リン脂質）とは区別される。in vivoにおいて、生物活性脂質は細胞外液中に見られ、そこでそれらは、例えばアルブミンおよびリポタンパク質などの血清タンパク質などの他の分子と複合体を形成しているか、または「遊離」形態、すなわち、別の分子種と複合体を形成していない可能性がある。細胞外メディエーターとして、いくつかの生物活性脂質は、膜結合型イオンチャネルまたはＧタンパク質共役型受容体（次に、細胞の機能または生存に変化をもたらす複雑なシグナル伝達系を活性化させる）を活性化することにより、細胞のシグナル伝達を変更する。細胞内メディエーターとして、生物活性脂質は、酵素およびイオンチャネルなどの細胞内成分と直接相互作用することによって、それらの作用を発揮し得る。生物活性脂質の代表例としては、ＬＰＡおよびＳ１Ｐがある。
【００２０】
「治療薬」とは、脈管形成および／または新血管新生、例えば、ＣＮＶおよびＢＶの成熟、浮腫、血管透過性および繊維症、繊維形成およびそれに関連する瘢痕化、または眼球の疾患および症状の基礎にある病態の一部を軽減する薬剤を意味する。
【００２１】
「併用療法」とは、示された治療効果を得るために少なくとも２つの異なる療法の提供を含む治療計画を指す。例えば、併用療法は、例えば抗ＬＰＡ抗体と抗Ｓ１Ｐ抗体などの、２種類以上の化学的に異なる有効成分の投与を含み得る。あるいは、併用療法は生物活性脂質に対して反応性のある免疫誘導部分の投与と１以上の他の化学療法薬の投与を含み得る。あるいはまた、併用療法は、放射線療法および／または外科術などの他の処置の送達を伴う抗脂質抗体の投与を含み得る。さらに、併用療法は、１以上の他の生物薬剤（例えば、抗ＶＥＧＦ、ＴＧＦβ、ＰＤＧＦまたはｂＦＧＦ剤）、化学療法薬ならびに放射線療法および／または外科術などの他の処置を伴う抗脂質抗体の投与を含み得る。２種類以上の化学的に異なる有効成分を用いた併用療法については、これらの有効成分は同じ組成物の一部として投与することもできるし、あるいは異なる組成物として投与することもできると理解される。別個の組成物として投与する場合、異なる有効成分を含む組成物は同時または異なる時間に、同じまたは異なる経路で、同じまたは異なる投与計画を用いて(using the same of different)投与することができる（全て、特定の文脈の必要に応じ、また、担当医の判断に従う）。同様に、単独または１以上の化学療法薬と組み合わせた、１以上の抗脂質抗体種、例えば抗ＬＰＡ抗体を、例えば放射線および／または外科術と併用する場合、これらの薬剤は外科術または放射線処置の前または後に送達することができる。
【００２２】
「抗Ｓ１Ｐ剤」とは、Ｓ１Ｐに対して特異的に活性がある任意の薬剤を指し、Ｓ１Ｐおよびその変異体と結合する抗体または抗体由来分子もしくは非抗体由来部分を含む。
【００２３】
「ハプテン」とは、ハプテンとコンジュゲートして、それによりハプテンを免疫原性とするのに適合した分子を指す。代表的な、非限定種のハプテンはタンパク質であり、その例としてアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、ヘマグルタニン(hemaglutanin)、破傷風およびジフテリア毒が挙げられる。本発明に従った使用に好適なハプテン分子の他の種類および例は当技術分野で公知である。これらの、ならびに今後発見されるか、または発明される天然ハプテンまたは合成ハプテンは本発明に従った適用に適合させることができる。
【００２４】
「化学療法薬」とは、抗癌剤および他の抗過剰増殖剤を意味する。簡単には、「化学療法薬」とは、細胞および組織を破壊することを意図した化学物質を指す。このような薬剤としては、限定されるものではないが、（１）ＤＮＡ傷害薬およびＤＮＡ合成を阻害する薬剤：アントラサイクリン（ドキソルビシン(doxorubicin)、ドノルビシン(donorubicin)、エピルビシン(epirubicin)）、アルキル化剤（ベンダムスチン(bendamustine)、ブスルファン(busulfan)、カルボプラチン(carboplatin)、カルムスチン(carmustine)、シスプラチン(cisplatin)、クロラムブシル(chlorambucil)、シクロホスファミド(cyclophosphamide)、ダカルバジン(dacarbazine)、ヘキサメチルメラミン(hexamethylmelamine)、イフォスファミド(ifosphamide)、ロムスチン(lomustine)、メクロレタミン(mechlorethamine)、メルファラン(melphalan)、ミトタン(mitotane)、マイトマイシン(mytomycin)、ピポブロマン(pipobroman)、プロカルバジン(procarbazine)、ストレプトゾシン(streptozocin)、チオテパ(thiotepa)およびトリエチレンメラミン(triethylenemelamine)）、白金誘導体（シスプラチン(cisplatin)、カルボプラチン(carboplatin)、シスジアミンジクロロ白金）、テロメラーゼならびにトポイソメラーゼ阻害剤（カンプトサー(Camptosar)）、（２）（２）チューブリン脱重合薬：タキソイド（パクリタキセル(Paclitaxel)、ドセタキセル(docetaxel)、ＢＡＹ５９−８８６２）、（３）カペシタビン(capecitabine)、クロロデオキシアデノシン(chlorodeoxyadenosine)、シタラビン(cytarabine)（およびその活性化形態、ａｒａ−ＣＭＰ）、シトシンアラビノシド、デカルバジン(dacabazine)、フロクスウリジン(floxuridine)、フルダラビン(fludarabine)、５−フルオロウラシル、５−ＤＦＵＲ、ゲムシタビン(gemcitabine)、ヒドロキシ尿素、６−メルカプトプリン、メトトレキサート(methotrexate)、ペントスタチン、トリメトレキサート、６−チオグアニン）などの代謝拮抗物質、（４）抗脈管形成剤（アバスチン(Avastin)、サリドマイド(thalidomide)、サニチニブ(sunitinib)、レナリドミド(lenalidomide)、血管障害剤（フラボノイド／フラボン、ＤＭＸＡＡ、コンブレタスタチン誘導体（例えば、ＣＡ４ＤＰ、ＺＤ６１２６、ＡＶＥ８０６２Ａなど）、（５）抗体または抗体フラグメントなどの生物製品（ヘルセプチン(Herceptin)、アバスチン(Avastin)、パノレックス(Panorex)、リツキサン(Rituxan)、ゼバリン(Zevalin)、マイロターグ(Mylotarg)、キャンパス(Campath)、ベキサール(Bexar)、エルビタックス(Erbitux)、ルセンチス(Lucentis)）、ならびに（６）内分泌療薬：アロマターゼ阻害剤（４−ヒドロアンドロステンジオン(4-hydroandrostendione)、エキセメスタン(exemestane)、アミノグルテヒミド(aminoglutehimide)、アナストロゾール(anastrozole)、レトゾール(letozole)）、抗エストロゲン作用薬（タモキシフェン(Tamoxifen)、トレミフィン(Toremifine)、ラオキシフェン(Raoxifene)、ファスロデックス(Faslodex)）、ステロイド（デキサメタゾン(dexamethasone)など）、（７）免疫調節剤：サイトカイン（ＩＦＮ−βおよびＩＬ２など）、インテグリン、他の接着タンパク質およびマトリックスメタロプロテイナーゼに対する阻害剤、（８）ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤。（９）イマチニブ(imatinib)（グリベック(Gleevec)）のようなチロシンキナーゼ阻害剤などのシグナル伝達阻害剤、（１０）熱ショックタンパク質阻害剤、（１１）全てのトランスレチノイン酸などの���チノイド、（１２）増殖因子受容体または増殖因子自体の阻害剤、（１２）ナベルビン(navelbine)、パクリタキセル(paclitaxel)、タキソテール(taxotere)、ビンブラスチン(vinblastine)、ビンクリスチン(vincristine)、ビンデシン(vindesine)およびビノレルビン(vinorelbine)などの抗有糸分裂化合物、（１４）ＣＯＸ阻害剤などの抗炎症薬、ならびに（１５）細胞周期レギュレーター、例えば、チェックポイントレギュレーターおよびテロメラーゼ阻害剤などが含まれる。
【００２５】
本明細書において「スフィンゴ脂質」とは、限定されるものではないが以下の化合物を含むスフィンゴ脂質として当技術分野で知られている化合物種を指す（後ろに英数の文字列で示されているリンクを含むサイトとしてのhttp//www.lipidmaps.org参照。これらのリンクは対応する化合物の化学式、構造情報などを含む）：
スフィンゴイド塩基［ＳＰ０１］
スフィング−４−エニン（スフィンゴシン）［ＳＰ０１０１］
スフィンガニン［ＳＰ０１０２］
４−ヒドロキシスフィンガニン（フィトスフィンゴシン）［ＳＰ０１０３］
スフィンゴイド塩基相同体および変異体［ＳＰ０１０４］
スフィンゴイド塩基１−リン酸［ＳＰ０１０５］
リゾスフィンゴミエリンおよびリゾグリコスフィンゴ脂質［ＳＰ０１０６］
Ｎ−メチル化スフィンゴイド塩基［ＳＰ０１０７］
スフィンゴイド塩基類似体［ＳＰ０１０８］
セラミド［ＳＰ０２］
Ｎ−アシルスフィンゴシン（セラミド）［ＳＰ０２０１］
Ｎ−アシルスフィンガニン（ジヒドロセラミド）［ＳＰ０２０２］
Ｎ−アシル−４−ヒドロキシスフィンガニン（フィトセラミド）［ＳＰ０２０３］
アシルセラミド［ＳＰ０２０４］
セラミド１−リン酸［ＳＰ０２０５］
ホスホスフィンゴ脂質［ＳＰ０３］
セラミドホスホコリン（スフィンゴミエリン）［ＳＰ０３０１］
セラミドホスホエタノールアミン［ＳＰ０３０２］
セラミドホスホイノシトール［ＳＰ０３０３］
ホスホノスフィンゴ脂質［ＳＰ０４］
中性グリコスフィンゴ脂質［ＳＰ０５］
単純Ｇｌｃ系（ＧｌｃＣｅｒ、ＬａｃＣｅｒなど）［ＳＰ０５０１］
ＧａｌＮＡｃｂ１−３Ｇａｌａ１−４Ｇａｌｂ１−４Ｇｌｃ−（グロボ(Globo)系）［ＳＰ０５０２］
ＧａｌＮＡｃｂ１−４Ｇａｌｂ１−４Ｇｌｃ−（ガングリオ(Ganglio)系）［ＳＰ０５０３］
Ｇａｌｂ１−３ＧｌｃＮＡｃｂ１−３Ｇａｌｂ１−４Ｇｌｃ−（ラクト(Lacto)系）［ＳＰ０５０４］
Ｇａｌｂ１−４ＧｌｃＮＡｃｂ１−３Ｇａｌｂ１−４Ｇｌｃ−（ネオラクト(Neolacto)系）［ＳＰ０５０５］
ＧａｌＮＡｃｂ１−３Ｇａｌａ１−３Ｇａｌｂ１−４Ｇｌｃ−（イソグロボ(Isoglobo系）［ＳＰ０５０６］
ＧｌｃＮＡｃｂ１−２Ｍａｎａ１−３Ｍａｎｂ１−４Ｇｌｃ−（モル(Mollu)系）［ＳＰ０５０７］
ＧａｌＮＡｃｂ１−４ＧｌｃＮＡｃｂ１−３Ｍａｎｂ１−４Ｇｌｃ−（アルトロ(Arthro)系）［ＳＰ０５０８］
Ｇａｌ−（ガラ(Gala)系）［ＳＰ０５０９］
その他［ＳＰ０５１０］
酸性グリコスフィンゴ脂質［ＳＰ０６］
ガングリオシド［ＳＰ０６０１］
スルホグリコスフィンゴ脂質（スルファチド）［ＳＰ０６０２］
グルクロノスフィンゴ脂質［ＳＰ０６０３］
ホスホグリコスフィンゴ脂質［ＳＰ０６０４］
その他［ＳＰ０６００］
塩基性グリコスフィンゴ脂質［ＳＰ０７］
両性グリコスフィンゴ脂質［ＳＰ０８］
アルセノスフィンゴ脂質［ＳＰ０９］
【００２６】
本発明は、以下にさらに詳細に記載するように、癌などの過剰増殖性障害および心血管または脳血管の疾患および障害ならびに種々の眼球障害を治療または予防するのに有用な抗スフィンゴ脂質Ｓ１Ｐ薬を提供する。特に本発明は、Ｓ１Ｐならびに限定されるものではないが、スフィンゴシン−１−リン酸［スフィンゲネ−１−リン酸；Ｄ−エリスロ−スフィンゴ−１−リン酸；スフィング−４−エニン−１−リン酸；（Ｅ，２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−オクタデク−４−エノキシ］ホスホン酸（ＡＳ２６９９３−３０−６）、ＤＨＳ１Ｐはジヒドロスフィンゴ−１−リン酸［スフィンガニン−１−リン酸と定義される；［（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−オクタデクオキシ］ホスホン酸；Ｄ−エリスロ−ジヒドロ−Ｄ−スフィンゴ−１−リン酸（ＣＡＳ１９７９４−９７−９］；ＳＰＣはスフィンゴシルホスホリルコリンである、リゾスフィンゴミエリン、スフィンゴシルホスホコリン、スフィンゴシンホスホリルコリン、エタンアミニウム；２−（（（（２−アミノ−３−ヒドロキシ−４−オクタデセニル）オキシ）ヒドロキシホスフィニル）オキシ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−、クロリド、（Ｒ−（Ｒ＊，Ｓ＊−（Ｅ）））、２−［［（Ｅ，２Ｒ，３Ｓ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−オクタデク−４−エノキシ］−ヒドロキシ−ホスホリル］オキシエチル−トリメチル−アザニウムクロリド（ＣＡＳ１０２１６−２３−６）を含むその変異体に導かれる。
【００２７】
本明細書において「エピトープ」または「抗原決定基」とは、特に断りのない限り、抗Ｓ１Ｐ剤が反応性を示すＳ１Ｐの領域を指す。
【００２８】
「過剰増殖性障害」とは、限定されるものではないが、癌または新生物および良性腫瘍を生じる器官および組織の細胞の制御されない増殖を含む、制御されない増殖細胞に関連する疾患および障害を指す。内皮細胞に関連する過剰増殖性障害は、血管腫、子宮内膜症、肥満、加齢性黄斑変性および種々の網膜症などの脈管形成の疾患、ならびにアテローム性動脈硬化症の処置におけるステント留置の結果として再狭窄を引き起こす内皮細胞および平滑筋細胞の増殖を起こし得る。繊維芽細胞を含む過剰増殖性障害（例えば、繊維形成）としては、限定されるものではないが、加齢性黄斑変性、心筋梗塞に関連する心臓のリモデリングおよび心不全などの過剰な瘢痕化（例えば、繊維症）、外科術または損傷、ケロイド、ならびに繊維性腫瘍およびステント留置の結果として通常起こるものなどの過剰な創傷治癒が含まれる。
【００２９】
本発明の組成物はスフィンゴ脂質に基づく療法に用いられる。「療法」とは、疾患、障害または物理的外傷の予防および／または治療を指す。
【００３０】
「心血管療法」は、心臓療法ならびに心疾患などの心血管系に関連する他の障害の予防および／または治療を包含する。「心疾患」とは、心臓または心筋組織を含むいずれの種類の疾患、障害、外傷または外科処置も包含する。特に注目されるものとして、低酸素症および／または心筋組織の虚血および／または心不全に関連する心疾患がある。虚血から起こり得る心疾患の１つの種類が、抗凝固薬、血小板溶解薬または抗狭心症薬が療法に用いられる場合、あるいは心臓血管が血管形成術により、または冠動脈移植により外科的に開かれた場合に起こり得るものなどの再潅流傷害である。本発明が対象とする別の種の心疾患は、虚血の一般的な原因である動脈硬化症、特にアテローム性動脈硬化症から起こり得る冠動脈疾患（ＣＡＤ）である。ＣＡＤは安定または不安定狭心症などの症状を有し、心筋梗塞（ＭＩ）や突然心臓死をもたらすことがある。特に注目される症状としては、限定されるものではないが、心筋虚血；急性心筋梗塞（ＡＭＩ）；冠動脈疾患（ＣＡＤ）；急性冠動脈症候群（ＡＣＳ）；ステント留置を伴う、または伴わない経皮的血行再建術（冠動脈血管形成術）の際に、またはその結果として起こり得る心臓細胞および組織の傷害；冠動脈バイパス移植（ＣＡＢＧ）またはヒトにおいて虚血性もしくは虚血性／再潅流傷害を引き起こし得るその他の外科的もしくは医学的手順もしくは療法；および心血管外傷が挙げられる。「心不全」とは、急性心筋梗塞、心筋炎、心筋症、うっ血性心不全、敗血性ショック、心臓外傷および特発性心不全を包含する。心不全をもたらす範囲の虚血症状を急性冠動脈症候群（ＡＣＳ）と呼ぶ。
【００３１】
「心臓治療薬」とは、心臓および心筋疾患および障害によって引き起こされる、または関連する疾患および疾患(diseases and diseases)に対する治療薬となる薬剤を指す。
【００３２】
「脳血管療法」とは、脳虚血および／または低酸素症に関連する疾患および障害の予防および／または治療に向けられる療法を指す。特に注目されるものとして、限定されるものではないが心不全を含む心疾患から起こる全虚血から起こる脳虚血および／または低酸素症がある。
【００３３】
「スフィンゴ脂質代謝産物」とは、スフィンゴ脂質が作られる、ならびに特定のスフィンゴ脂質の分解から生じる化合物を指す。言い換えれば、「スフィンゴ脂質代謝産物」は、スフィンゴ脂質代謝経路に関与する化合物である。代謝産物は、代謝前駆体および代謝生成物を含む。「代謝前駆体」とは、スフィンゴ脂質が作られる化合物を指す。特に注目される代謝前駆体としては、限定されるものではないが、ＳＰＣ、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴシン、ジヒドロセラミドおよび３−ケトスフィンガニンが挙げられる。「代謝生成物」とは、ホスホリルコリン（例えば、ホスホコリン、コリンホスフェート）、遊離脂肪酸などの脂肪酸、およびヘキサデカナール（例えば、パルミトアルデヒド）などのスフィンゴ脂質の分解から生じる化合物を指す。
【００３４】
本明細書において「治療の」とは、疾患または障害の処置全域を包含する。本発明の「治療」薬は、リスクがあると特定され得る個体に対してデザインされた手順を組み込んだものを含む予防的または回避的な様式（薬理遺伝学）、または本質的に緩和的または治癒的な様式で働く場合もあるし、あるいは処置される疾患または障害の少なくとも１つの症状の進行の速度または程度を緩慢にする働きをする場合もあるし、あるいは必要な時間、不快感もしくは痛みの存在もしくは程度、または疾患、障害もしくは物理的外傷からの回復に関連する物理的制限を最小化する働きをする場合もあるし、あるいは他の療法および処置に対する補助として使用される場合もある。
【００３５】
「処置」とは、治療的処置と予防的または回避的手段の双方を指す。処置を必要とするものには、すでに障害を有しているものならびに障害が予防されるものが含まれる。
【００３６】
「併用療法」とは、示された治療効果を得るために少なくとも２つの異なる療法の提供を含む治療計画を指す。例えば、併用療法は、例えば即効性化学療法薬と抗脂質抗体などの、２種類以上の化学的に異なる有効成分の投与を含み得る。あるいは、併用療法は単独、または放射線療法および／または外科術などの他の処置の送達を伴う、抗脂質抗体および／または１以上の化学療法薬の投与を含み得る。さらに、併用療法は、１以上の他の生物薬剤（例えば、抗ＶＥＧＦ、ＴＧＦβ、ＰＤＧＦまたはｂＦＧＦ剤）、化学療法薬ならびに放射線療法および／または外科術などの他の処置を伴う抗脂質抗体の投与を含み得る。２種類以上の化学的に異なる有効成分の併用療法については、これらの有効成分は同じ組成物の一部として投与することもできるし、あるいは異なる組成物として投与することもできると理解される。別個の組成物として投与する場合、異なる有効成分を含む組成物は同時または異なる時間に、同じまたは異なる経路で、同じまたは異なる投与計画を用いて(using the same of different)投与することができる（全て、特定の文脈の必要に応じ、また、担当医の判断に応じる）。同様に、単独または１以上の化学療法薬と組み合わせた、１以上の抗脂質抗体種、例えば抗ＬＰＡ抗体を、例えば放射線および／または外科術と併用する場合、これらの薬剤は外科術または放射線処置の前または後に送達することができる。
【００３７】
「単剤療法」とは、単回投与としての投与であれ、経時的に数回の投与であれ、１種類の治療上有効量の化合物の送達に基づく処置計画を指す。
【００３８】
「新生物」または「癌」とは、異常、かつ、制御されない細胞成長を指す。「新生物」または腫瘍は、異常で、制御されず、無秩序な細胞成長の増殖であり、一般に癌と呼ばれる。新生物は良性または悪性であり得る。破壊的な増殖、浸潤性および転移の特性を持っていれば、新生物は悪性、または癌性である。浸潤性とは、一般に組織の境界を規定している基底膜を破り、それによりしばしば身体の循環系に入り込む、周囲組織の浸潤または破壊による新生物の局部的拡散を指す。転移とは一般に、リンパ管または血管による腫瘍細胞の伝播を指す。転移とはまた、漿液腔、またはくも膜下もしくは他の空間を通じた直接的拡大による腫瘍細胞の遊走を指す。転移の過程を通じた、腫瘍細胞の身体の他の部位への遊走は最初に出現した部位から離れた領域に新生物を形成する。
【００３９】
処置の目的で「哺乳類」とは、ヒト、家庭動物および農場動物、ならびに動物園、競技またはペット動物（イヌ、ウマ、ネコ、ウシなど）を含む哺乳類として分類される任意の動物を指す。好ましくは、哺乳類はヒトである。
【００４０】
「天然抗体」および「天然免疫グロブリン」は通常、２つの同じ軽（Ｌ）鎖と２つの同じ重（Ｈ）鎖からなる、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は１つの共有結合的ジスルフィド結合によって重鎖と連結されているが、このジスルフィド結合の数は免疫グロブリンイソ型が異なる重鎖では異なっている。各重鎖および軽鎖はまた、規則的に配置された鎖内ジスルフィド橋も有する。各重鎖は一方の末端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、その後にいくつかの定常ドメインが続く。各軽鎖は一方の末端に可変ドメイン（ＶＬ）と、他方の末端に定常ドメインを有し、この軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一の定常ドメインと一直線となり、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと一直線になっている。特定のアミノ酸残基が軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの間の境界をなすと考えられている。
【００４１】
「可変」領域は、フレームワークおよびＣＤＲ（他に超可変としても知られる）を含み、可変ドメインのある特定の部分が抗体間で配列が広範囲に異なり、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合および特異性に用いられるということとを指す。しかしながら、この可変性は抗体の可変ドメインに一様に分布しているのではない。可変性は、軽鎖および重鎖可変ドメイン双方の超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより保存性の高い部分はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然重鎖および軽鎖の可変ドメインは各々、４つのＦＲ（それぞれＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）を含み、主として、３つの超可変領域によって接続されたβ−シート構造をとり、このβ−シートを接続し、場合によってはその一部をなすループを形成している。各鎖の超可変領域はこれらのＦＲによってともに近接して保持され、他方の鎖に由来する超可変領域とともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), pages 647-669参照）。定常ドメインは抗体と抗原の結合には直接関与しないが、抗体依存性細胞毒性における抗体の関与のような種々のエフェクターを発揮する。
【００４２】
本明細書において「超可変領域」とは、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」に由来するアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメインでは、残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）、また、重鎖可変ドメインでは、３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）；Kabat, et al. (1991), 前掲）および／または「超可変ループ」に由来するの残基（例えば、軽鎖可変ドメインでは、残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｌ３）、また、重鎖可変ドメインでは２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）および９６〜１０１（Ｈ３）; Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）を含む。「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書で定義されたような超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００４３】
抗体のパパイン消化によって、それぞれ１つの抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる２つの同じ抗原結合フラグメントと残りの「Ｆｃ」フラグメントを生じ、その名称は容易に結晶化するその能力を表している。ペプシン処理では、２つの抗原会合部位を有して、なお抗原架橋能がある２つのＦ（ａｂ’）２フラグメントを生じる。
【００４４】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識・結合部位を含む最小の抗体フラグメントである。この領域は、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインの強固な非共有結合の二量体からなる。各可変ドメインの３つの超可変領域がＶＨ−ＶＬ二量体の表面で抗原結合部位を規定すべく相互作用するには、この部位である。これら６つの超可変領域は一緒になって抗体に対して抗原結合特異性を付与する。しかしながら、１つの可変ドメイン（または抗原に対して特異的な超可変領域を３つだけ含むＦｖの半分）であっても、完全な結合部位よりも親和性は低いが、抗原を認識し、抗原と結合することができる。
【００４５】
Ｆａｂフラグメントはまた、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一の定常ドメイン（ＣＨ１）も含む。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域由来の１以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に数個の残基が付加されていることでＦａｂフラグメントとは異なる。本明細書では、Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を保持しているＦａｂ’を表す。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、初めは、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’フラグメント対として作製された。抗体フラグメントの他の化学組合せも知られている。
【００４６】
脊椎動物種由来の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる明らかに異なる２種類に割り付けることができる。
【００４７】
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは異なるクラスに割り付けられる。現在、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭの５つの主要なクラスの免疫グロブリンがあり、これらのいくつかは、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡおよびＩｇＡ２などのサブクラス（イソ型）にさらに分類される。異なるクラスの免疫グロブリンに相当する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元構造はよく知られている。
【００４８】
本明細書において「抗体」は最も広い意味で用いられ、特に、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、抗体フラグメントおよび親抗体のＣＤＲを用いる結合因子（または抗原結合活性を保持するその変異体）を包含する。抗体は、本明細書では、親抗体の少なくとも１つの所望の活性を保持しているとして定義される。所望の活性としては、抗原と特異的に結合する能力、in vitroでプロレレーション(proleration)を阻害する能力、in vivoで脈管形成を阻害する能力およびin vitroでサイトカイン特性を変化させる能力が含まれる。「抗体フラグメント」は、全長抗体の一部、一般にその抗原結合ドメインまたは可変ドメインを含む。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメント；ダイアボディー；線状抗体；単鎖抗体分子；および抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が挙げられる。
【００４９】
本明細書において「モノクローナル抗体」とは、実質的にホモな抗体の集団から得られた抗体を指し、例えば、その集団に含まれる個々の抗体は、わずかな量で存在し得る自然発生突然変異の可能性があること以外は、同一である。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一の抗原部位に向けられている。さらに、一般に異なる決定基（エピトープ）に向けられた異なる抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に向けられている。修飾詞「モノクローナ」は、実質的にホモな抗体集団から得られたという抗体の特徴を示すのであって、その抗体をいずれかの特定の方法によって生産することが必要であると考えるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Kohler, et al., Nature 256:495 (1975)によって初めて記載されたハイブリドーマ法によって作製することができるか、または組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照）によって作製することができる。「モノクローナル抗体」はまた、例えばClackson, et al., Nature 352:624-628 (1991)およびMarks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)に記載されている技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
【００５０】
本明細書においてモノクローナル抗体は特に、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来する、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属す抗体の対応する配列と同一または相同であるが、その鎖の残りの部分は、別種に由来する、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属す抗体、ならびに所望の生物活性を示す限りは、そのような抗体のフラグメンの対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含む（米国特許第４，８１６，５６７号；およびMorrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)参照）。
【００５１】
非ヒト（例えばネズミ）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含むキメラ抗体である。ほとんどの部分では、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域残基が、所望の特異性、親和性および能力を有する、マウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種に由来する超可変領域残基で置き換えられている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基が対応する非ヒト残基で置き換えられている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体には見られない残基を含んでもよい。これらの修飾は、抗体性能をさらに精密にするために行われる。一般に、ヒト化抗体は、超可変領域の全てまたは実質的全てが非ヒト免疫グロブリンのものに相当し、ＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである少なくとも１つ、一般には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は所望により、一般にはヒト免疫グロブリンの、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部も含む。さらに詳しくは、Jones, et al., Nature 321:522-525 (1986); Reichmann, et al., Nature 332:323-329 (1988);およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)およびHansen, WO2006105062を参照）。
【００５２】
「単鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体フラグメントは抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。一般に、ＦｖポリペプチドはさらにＶＨドメインとＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーを含み、これにより、ｓＦｖに抗原結合に求められる構造を採らせることができる。ｓＦｖに関する総説としては、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)を参照。
【００５３】
「ダイアボディー」とは、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメントを指し、これらのフラグメントは、同じポリペプチド鎖内で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む（ＶＨ−ＶＬ）。同じ鎖上の２つのドメイン間で対合するには短いリンカーを使用することで、これらのドメインは別の鎖の相補的ドメインと対合して、２つの抗原結合部位を作り出すことを余儀なくされる。ダイアボディーは例えばＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；およびHollinger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)にさらに詳しく記載されている。
【００５４】
本明細書を通じて用いる「線状抗体」とは、Zapata, et al. Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)に記載されている抗体を指す。要するに、これらの抗体は、１対の抗原結合領域を形成する１対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む。線状抗体は二重特異性または単一特異性である。
【００５５】
本明細書において「変異体」抗スフィンゴ脂質抗体とは、「親」抗スフィンゴ脂質抗体アミノ酸配列とは、１以上のアミノ酸残基の付加、欠失および／または置換のために親抗体配列とアミノ酸配列が異なるが、親抗結合抗体の少なくとも１つの所望の活性を保持する分子を指す。所望の活性としては、抗原と特異的に結合する能力、in vitroでプロレレーション(proleration)を阻害する能力、in vivoで脈管形成を阻害する能力およびin vitroでサイトカイン特性を変化させる能力が含まれる。一実施形態では、変異体は親抗体の１以上の超可変領域に１以上のアミノ酸置換を含む。例えば、この変異体は、親抗体の１以上の超可変領域に少なくとも１つ、例えば約１〜約１０、好ましくは約２〜約５の置換を含み得る。通常、この変異体は親抗体の重鎖または軽鎖可変ドメイン配列と少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。この配列に対する同一性または相同性は本明細書では、配列をアラインし、必要であればギャップを導入して最大パーセントの配列同一性を達成した後に、親抗体残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。配列同一性または相同性に影響を及ぼすとみなされるＮ末端、Ｃ末端もしくは内部延長、欠失または抗体配列中への挿入はない。変異体はスフィンゴ脂質と結合する能力を保持し、好ましくは親抗体よりも優れた所望の活性を有する。例えば、変異体はより強い結合親和性、増強された脈管形成低減および／または腫瘍進行休止能を持ち得る。このような所望の特性（例えば、免疫原性の低下、半減期の延長、安定性の増強、能力の増強）を分析するためには、本明細書に開示されている生物活性アッセイにおいて、抗スフィンゴ脂質抗体の形式がその活性に影響を及ぼすことが分かっていることから、例えば、変異体のＦｂ型と親抗体のＦｂ型を比較するか、あるいは変異体の全長型と親抗体の全長型を比較すべきである。本明細書において特に注目される変異体抗体は少なくとも１つの所望の活性の少なくとも約５％、好ましくは少なくとも約１０％、２５％、５９％またはそれ以上を示すものであり得る。好ましい変異体は、親抗体と比べて、in vitroで測定されるようなより優れた生物物理学的特性またはin vitroもしくはin vivoで測定されるようなより優れた生物学的活性を有するものである。
【００５６】
本明細書において「親」抗体は、変異体の作製に用いられるアミノ酸配列によってコードされているものである。好ましくは、親抗体はヒトフレームワーク領域を有し、存在する場合には、ヒト抗体定常領域を有する。例えば、親抗体はヒト化またはヒト抗体であり得る。
【００５７】
「単離された」抗体とは、その天然環境の成分から同定および分離および／または回収されたものである。その天然環境の夾雑成分は抗体の診断上または治療上の使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモンおよびその他のタンパク質性もしくは非タンパク質性の溶質を含み得る。好ましい実施形態では、抗体は、（１）ローリー法によって測定した場合に抗体が９５重量％を超える、最も好ましくは９９重量％を超えるまで、（２）スピニングカップシークエネーターの使用によって少なくとも１５残基のＮ末端または内部アミノ酸配列を得るのに十分な程度まで、または（３）クーマシーブルーまたは好ましくは銀染色を用いた還元または非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均質となるまで精製される。単離された抗体には、抗体の天然環境の少なくとも１つの成分が存在しないことから、組換え細胞内のin situ抗体を含む。しかしながら通常、単離された抗体は少なくとも１つの精製工程によって調製される。
【００５８】
本明細書において「標識」とは、抗体に直接的または間接的にコンジュゲートされている検出可能な化合物または組成物を指す。標識はそれ自体、自体で検出可能であるか（例えば、放射性同位元素標識または蛍光標識）または酵素標識の場合には、検出可能な基質化合物または組成物の化学変化を触媒し得る。
【００５９】
「固相」とは、本発明の抗体が接着可能であるか、あるいは抗体または他の抗Ｓ１Ｐ結合試薬がそれ以外の方法で固定可能である非水性マトリックスを意味する。本明細書に包含される固相の例としては、部分的または完全にガラスからなるもの（例えば、細孔性ガラス）、多糖類（例えば、アガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコールおよびシリコーンが挙げられる。特定の実施形態では、文脈にもよるが、固相はアッセイプレートの壁面を含んでもよく、他には精製カラム（例えば、アフィニティークロマトグラフィーカラム）がある。この用語はまた、米国特許第４，２７５，１４９号に記載されているものなどの離散粒子の不連続な固相も含む。
【００６０】
「リポソーム」は、薬剤（本明細書に開示される抗スフィンゴ脂質抗体、および任意の化学療法薬など）を哺乳類に送達するのに有用な様々な種類の脂質、リン脂質および／または界面活性剤からなる小胞である。リポソームの成分は一般に、生体膜の脂質配置と類似した二重層の形に配置されている。「単離された」核酸分子は、天然源の抗体核酸において通常会合されている少なくとも１種類の夾雑核酸分子から同定および分離されている核酸分子である。単離された核酸分子は自然状態で見られる形態または状態以外にある。従って、単離された核酸分子は天然細胞中に存在している場合の核酸分子とは区別される。しかしながら、単離された核酸分子は、例えば核酸分子が天然細胞の場合と異なる染色体位置にある抗体を通常発現する細胞に含まれる核酸分子を含む。
【００６１】
「制御配列」とは、特定の宿主生物において作動可能なように連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を指す。例えば、原核生物に好適な制御配列には、プロモーター、任意のオペレーター配列およびリボソーム結合部位が含まれる。真核細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを使用することが知られている。
【００６２】
核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に置かれている場合に、「作動可能なように連結されている」。例えば、あるポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現させる場合には、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡがそのポリペプチドのＤＮＡに作動可能なように連結され；ある配列の転写に影響を及ぼす場合には、プロモーターまたはエンハンサーがそのコード配列に作動可能なように連結され；あるいは翻訳を容易にするように配置される場合には、リボソーム結合部位がコード配列に作動可能なように連結される。一般に、「作動可能なように連結される」とは、連結される核酸分子が隣接している、また、分泌リーダーの場合には隣接し、かつ、読み取り相にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは隣接していなくてもよい。連結は便宜な制限部位における連結反応によって達成される。このような部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが常法に従って用いられる。
【００６３】
本明細書において「細胞」、「細胞系統」および「細胞培養」は互換的に用いられ、このような全ての表記には後代が含まれる。よって、「形質転換体」および「形質転換細胞」には、主題の細胞および移植の回数にかかわらずにそれらに由来する培養物が含まれる。また、意図的または偶発的突然変異によって、全ての後代がＤＮＡ含量が厳密に同じであるわけではないと理解される。最初の形質転換細胞でスクリーニングされたものと同じ機能または生物活性を有する突然変異体後代が含まれる。異なる表記が意図される場合には、それは文脈から明らかである。
【００６４】
本発明の「特許性のある」組成物、方法、機械、または製品は、分析が実施される時点で特許性に関する全ての法定要件を満たすことを意味する。例えば、新規性、非自明性などに関して、後の調査により、１以上のクレームが新規性、非自明性などを否定することになる１以上の実施形態を包含することが明らかになった場合、定義により「特許性のある」実施形態に限定されるクレームは、具体的に特許性のない実施形態を排除する。また、本明細書に添付したクレームは、最も広い妥当な範囲を提供するとともに、それらの妥当性を保持すると解釈すべきである。さらに、特許性に関する１以上の法定要件が訂正されるか、あるいは本願が特許として出願または発行される時から、１以上の添付クレームの妥当性が疑問視される時まで、特許性に関する特定の法定要件を満たすかどうかを評価するための基準が変化する場合には、クレームは、（１）それらの妥当性を保持し、（２）その状況下において最も広い妥当な解釈を提供するものと解釈されるべきである。
【００６５】
「薬学上許容される塩」とは、本発明の薬剤および化合物の生物学的有効性および特性を保持し、かつ、生物学的に、または他の点で不都合がない塩を指す。多くの場合、本発明の薬剤および化合物は、荷電基、例えば、荷電アミノ基および／またはカルボキシル基またはそれに類似する基の存在のために酸塩および／または塩基塩を形成することができる。薬学上許容される酸付加塩は無機酸および有機酸から製造することができ、薬学上許容される塩基付加塩は無機および有機塩基から製造することができる。薬学上許容される塩に関しては、Berge, et al. (1977) J. Pharm. Sci., vol. 66, 1-19を参照。
【００６６】
「複数」とは、１を超えることを意味する。
【００６７】
「分離された」、「精製された」、「単離された」などとは、サンプル保持容器に入ったサンプルの１以上の成分が、その容器内に存在する１以上の他のサンプル成分から物理的に取り出されている、あるいはその存在下で希釈されていることを意味する。分離または精製工程で取り出し、または希釈可能なサンプル成分としては、化学反応生成物、非反応化学物質、タンパク質、炭水化物、脂質および非結合分子が含まれる。
【００６８】
「種」とは、本明細書において、様々な文脈で用いられる（例えば化学療法剤の特定の種）。それぞれの文脈において、この用語は、特定の文脈において言及される種類の化学的に区別できない分子の集団を指す。
【００６９】
「特異的に会合する」および「特異的会合」などとは、２つの分子間の特異的、非無作為の相互作用を指し、この相互作用は、それらの分子間の適当な化学的または分子的相互作用を可能とする構造的、疎水的／親水的、および／または電気的特徴の存在に依存している。
【００７０】
「対象」または「患者」とは、本発明の分子によって達成され得る処置を必要とする動物を指す。本発明に従って処置され得る動物としては脊椎動物を含み、ウシ、イヌ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ブタおよび霊長類（ヒトおよび非ヒト霊長類を含む）などの哺乳類が特に好ましい例である。
【００７１】
「治療上有効な量」（または「有効量」）とは、対象または患者に投与した際に処置を達成するのに十分な有効成分、例えば、本発明の薬剤の量を指す。よって、本発明の組成物の治療上有効な量を構成するものは、当業者により容易に決定することができる。癌療法に関して、「治療上有効な量」とは、眼球の疾患または症状に関連する１以上の遺伝子の発現の増強または低減を含む眼球の疾患または症状の処置、アポトーシスまたは他の細胞死経路の誘導、症候の臨床的改善、異常な新血管新生または炎症などに関連する１以上のパラメーターにおいて客観的に測定される変化をもたらすものである。もちろん、治療上有効な量は、処置される特定の対象および症状、対象の体重および齢、病態の重篤度、選択される特定の化合物、準拠する投与計画、投与のタイミング、投与様式などによって異なり、これらは全て、当業者により容易に決定することができる。併用療法に関して、特定の有効成分の治療上有効な量を構成するものは、単剤療法（すなわち、有効成分として１つの化学存在だけを用いる治療計画）として投与される場合の有効成分の治療上有効な量を構成するものとは異なり得ると考えられる。
【００７２】
「処置」または「処置する」とは、疾患または障害に対する防止または保護（すなわち、臨床徴候を発症させないこと）；疾患または障害の阻害（すなわち、臨床徴候の発症の阻止または抑制）；および／または疾患または障害の緩和（すなわち、臨床徴候を回復させること）を含む。当然のことながら、疾患または障害の「防止」と「抑制」の間の区別は、最終的に誘発される事象が未知であり、または潜在性である場合もあるため、常に可能であるわけではない。よって、「予防」とは、「防止」と「抑制」の双方を含む「処置」の一種をなすと理解される。よって、「処置」には「予防」が含まれる。
【００７３】
「治療計画」とは、化学療法薬、放射線療法、外科術、遺伝子療法、ＤＮＡワクチンおよび療法、ｓｉＲＮＡ療法を含むアンチセンスに基づく療法、抗脈管形成療法、免疫療法、骨髄移植、アプタマーおよび他の生物製品（抗体および抗体変異体など）、受容体デコイおよび他のタンパク質に基づく治療薬を用いる疾患または障害の処置を意味する。
【００７４】
発明の概要
本発明は、特に生理学的に（例えば、生体組織、血液など）および生理条件下で、スフィンゴ脂質に対する強い結合親和性、スフィンゴ−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）と結合し、中和する能力を含む、治療的および／または診断的見地からの所望の特性を有する抗体および抗スフィンゴ脂質抗体変異体を含む特許性のあるヒト化抗スフィンゴ脂質剤、ならびにイソ型、変異体、異性体および関連化合物に関する。特に、本発明はＳ１Ｐに対する抗体、特にモノクローナル抗体、より詳しくはヒト化モノクローナル抗体およびその変異体を記載する。このような抗体および変異体は好ましくは、このような化合物による処置を必要とすることが分かっている、または必要とすると思われる対象に投与するのに好適な医薬組成物中に含まれる。組成物の他、本発明はまた、このような組成物を含むキット、このような抗Ｓ１Ｐ抗体および変異体を製造する方法、ならびにこのような薬剤を用いる処置方法も提供する。
【００７５】
一実施形態では、新たに同定された好ましい配列の可変ドメイン、特に、重鎖としては配列番号２７および配列番号３５、軽鎖としては配列番号３０および配列番号３７を含む単離された抗Ｓ１Ｐ抗体重鎖および軽鎖が提供される。別の実施形態では、生理条件下でスフィンゴ−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）に対して反応性があり、かつ、本明細書の他所で特定されるＣＤＲ配列と少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性（１００％まで（１００％を含む）の同一性）を有する少なくとも１つのＣＤＲペプチドを含む抗Ｓ１Ｐ剤が提供される。
【００７６】
一実施形態では、本発明の抗スフィンゴ脂質抗体は、下記のアミノ酸配列：ＩＴＴＴＤＩＤＤＤＭＮ（配列番号１０；ＣＤＲＬ１）、ＥＧＮＩＬＲＰ（配列番号１１；ＣＤＲＬ２）およびＬＱＳＤＮＬＰＦＴ（配列番号１２；ＣＤＲＬ３）を有する超可変相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む軽鎖可変ドメインを有する。好ましくは、この重鎖可変ドメインは、アミノ酸配列ＤＨＴＩＨ（配列番号１３；ＣＤＲＨ１）、ＧＧＦＹＧＳＴＩＷＦＤＦ（配列番号１５；ＣＤＲＨ３）およびＣＩＳＰＲＨＤＩＴＫＹＮＥＭＦＲＧ（配列番号１４；ＣＤＲＨ２）またはＡＩＳＰＲＨＤＩＴＫＹＮＥＭＦＲＧ（配列番号３１；ＣＤＲＨ２）を有するＣＤＲを含む。本発明の特に好ましい実施形態では、１以上のＣＤＲが、それらのＣＤＲがＳ１Ｐと結合し、中和する能力を保持するようにフレームワーク内にグラフトされる。下記の例に限定されるものではないが、フレームワークは、ＣＤＲにすぐ隣接する抗体軽鎖および重鎖のヒト配列を表すが、ヒト化抗体の性能特徴をＳ１Ｐとの結合に関して、または抗体の効力、安定性、発現、生体半減期、溶解度、免疫原性、薬物分布および保存性を高めるその他の特徴を至適化するようにＣＤＲを提供するいずれの構造も表す。
【００７７】
好ましくは、例えば、下式：ＦＲ１−ＣＤＲＨ１−ＦＲ２−ＣＤＲＨ２−ＦＲ３−ＣＤＲＨ３−ＦＲ４で表される連続配列として、３つの重鎖超可変ＣＤＲ領域がヒトフレームワーク領域に提供される。
【００７８】
本発明はさらに、本明細書において配列番号２７で示されるアミノ酸配列を含む抗スフィンゴ脂質抗体重鎖可変ドメインを提供する。１つの特定の有用な重鎖可変ドメイン配列は、下記の実施例１２に記載されているヒト化抗体のものであり、配列番号３２の重鎖可変ドメイン配列を含む。このような好ましい重鎖可変ドメイン配列は、例えば、本明細書において配列番号３３で示される軽鎖可変ドメイン配列を含むポリペプチドと、または得られる分子がスフィンゴ脂質と結合する限りその他の軽鎖可変ドメイン配列と組み合わせることができる。
【００７９】
別の実施形態では、本発明は、本明細書において配列番号１７で示されるアミノ酸配列を含むヒト化抗スフィンゴ脂質抗体軽鎖可変ドメインを提供する。一実施形態では、１つの有用な軽鎖可変ドメイン配列は、下記の実施例１２のヒト化抗体のものであり、配列番号３０または配列番号３７の軽鎖可変ドメイン配列を含む。
【００８０】
１つの好ましい実施形態では、本発明は、配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖と配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖を有するヒト化抗スフィンゴ脂質抗体を提供する。
【００８１】
この軽鎖可変ドメインは、下記のアミノ酸配列：ＣＤＲＬ１（配列番号１０）、ＣＤＲＬ２（配列番号１１）およびＣＤＲＬ３（配列番号１２）を有する超可変領域を含み得る。好ましくは、例えば、下式：ＦＲ１−ＣＤＲＬ１−ＦＲ２−ＣＤＲＬ２−ＦＲ３−ＣＤ−ＲＬ３−ＦＲ４で示される連続配列として、これら３つの軽鎖超可変領域がヒトフレームワーク領域に提供される。
【００８２】
本発明はまた親抗スフィンゴ脂質抗体の変異体も提供し、好ましくは、この親抗体はヒト化またはヒト抗スフィンゴ脂質抗体である。このような変異体はスフィンゴ脂質、特にＳ１Ｐと結合し、親抗スフィンゴ脂質抗体の重鎖または軽鎖可変ドメインの超可変領域にアミノ酸置換を含む。このような変異体は好ましくは抗スフィンゴ脂質抗体の１以上の超可変領域に１以上の置換を有する。一実施形態によれば、これらの置換は親抗体の重鎖可変ドメインにある。例えば、これらのアミノ酸置換は重鎖可変ドメインのＣＤＲＨ１および／またはＣＤＲＨ３にあってもよい。これらの超可変領域の双方に置換が存在してもよい。このような「親和性成熟した」変異体は、本明細書において、それらが作製された親抗スフィンゴ脂質抗体よりも強くスフィンゴ脂質と結合することが実証されている。例えば、親和性成熟により作製された抗体は、親抗スフィンゴ脂質抗体のものよりも有意に低いＫｄ値を持ち得る。
【００８３】
親和性成熟の代表例は、ネズミ抗Ｓ１Ｐ  ＣＤＲがグラフトされたヒトＩｇＧ  κ１軽鎖および重鎖フレームワークを変更することを含む。これにより、標的リガンド、すなわちＳ１Ｐに対するヒト化抗体の親和性の増強がもたらされる。他の実施形態では、１以上のＣＤＲがヒトＩｇＧフレームワーク以外のアミノ酸配列によって支持されていてもよい。超可変ＣＤＲ領域におけるアミノ酸配列を変更することによる親和性成熟は上記の抗体性能および／または特徴を改良するために行うことができる。この形態の親和性成熟の例が下記の実施例１２に示されており、この場合、重鎖ＣＤＲのシステイン残基が部位特異的突然変異誘発によってアラニン残基に変更され、その結果、Ｓ１Ｐ結合親和性および安定性に実質的な増強が生じた。このような重鎖変異体のあるものでは、可変領域は配列番号２７のアミノ酸配列を含んだ。ＣＤＲＨ２におけるこのような重鎖可変ドメイン配列は所望により、軽鎖可変ドメイン、例えば、配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、または好ましくは配列番号３０のアミノ酸配列の軽鎖可変ドメインと組み合わせることができる。
【００８４】
本明細書では、種々の抗Ｓ１Ｐ分子が意図される。例えば、抗Ｓ１Ｐ剤は抗体、抗体誘導体または非抗体由来部分であり得る。例えば、抗Ｓ１Ｐ剤は、全長抗体（例えば、完全なヒトＦｃ領域を有する抗体）または抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２分子）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、または親和性成熟抗体を含む抗体であり得る。本発明では、限定されるものではないが、このような抗Ｓ１Ｐ剤は抗体の安定性、半減期、効力、薬物分布および／または免疫原性を改良する、またはそうでなければ変更するために生産することができる。例えば、ヒト化Ｆｃドメインは、その免疫原性またはその他の性能特徴を改良するためにそのアミノ酸組成を変更することができる。
【００８５】
他の実施形態では、抗Ｓ１Ｐ剤は、ポリマー、放射性核種、化学療法薬および検出薬などの部分とコンジュゲートさせることができる。
【００８６】
ある特定の好ましい実施形態では、抗Ｓ１Ｐ剤は薬学上許容される担体などの担体とともに処方される。一実施形態では、抗Ｓ１Ｐ剤は、抗体、抗体フラグメント、抗体誘導体、抗体変異体、抗Ｓ１Ｐ剤以外の治療薬またはＳ１Ｐ以外の分子と結合し得る薬剤などの第二の薬剤と組み合わせられる。
【００８７】
本発明はまた、種々の重鎖および軽鎖配列およびＣＤＲを含む、本発明の抗体、抗体変異体およびフラグメントの種々の成分をコードする単離された核酸分子も提供する。これらの核酸分子を含有するベクターおよび宿主細胞も提供される。さらに、ＣＤＲ配列または抗体軽鎖配列および／または重鎖配列などの１以上の好ましいアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドも提供される。
【００８８】
本発明の好ましい実施形態では、各重鎖および各軽鎖に正確に定義されたＣＤＲ配列を含む単離された抗体分子が提供される。このような実施形態の１つでは、単離された抗体分子はヒト化抗体分子である。
【００８９】
Ｓ１Ｐと反応性があり、かつ、１以上の好ましいＣＤＲ配列を含むリガンド結合エレメントを有する多価結合分子も提供される。これらの多価分子(mutivalent  molecues)は、Ｓ１Ｐと反応性のある少なくとも１つ、１０，０００またはそれを超えるまでのリガンド結合エレメントを含み得る。それぞれＳ１Ｐと反応性のあるが、１以上の特徴（例えば、分子構造、結合親和性など）で他のＳ１Ｐ結合エレメントと異なる、異なるリガンド結合エレメント種が含まれ得るように、所望であれば、種々のリガンドと反応性のあるリガンド結合エレメントも含まれ得る。
【００９０】
また、Ｓ１Ｐの異常なレベル、特にレベルの上昇と相関している疾患または障害を治療または予防する方法も提供される。一般に、このような方法は、このような処置を必要とする、ヒトなどの対象に、本発明の抗Ｓ１Ｐ組成物の１つを投与することを含む。このような方法による処置に従う疾患または障害としては、癌、炎症性障害、脳血管疾患、心血管疾患、眼球障害、過剰な繊維形成に関連する疾患および障害ならびに病理学的脈管形成に関連する疾患または障害が含まれる。抗Ｓ１Ｐ組成物は別の治療薬または治療計画と組み合わせて投与することができる。
【００９１】
関連の態様は、過剰増殖性障害の治療または予防のための治療計画の毒性を軽減する方法に関する。このような方法は、過剰増殖性障害に苦しむ対象に、過剰増殖性障害の治療または予防を意図した治療計画を投じる前、投じている際または投じた後に、有効量の本発明の薬剤（または複数の異なる薬剤種）を投与することを含む。好ましい実施形態では、抗体および治療計画は相加作用を有し、治療計画に対して抗体を付加することでその治療計画の用量の低減が可能となり、従って、処置に伴う毒性の軽減が可能となる。
【００９２】
本発明のさらに別の態様は、本発明の抗Ｓ１Ｐ剤の診断的使用に関する。１つの診断的適用では、本発明は標的スフィンゴ脂質のサンプル中の存在を判定するための方法を提供する。一般に、このような方法は、特定のスフィンゴ脂質（すなわち「標的」スフィンゴ脂質）の含有が疑われるサンプル（体液または組織生検サンプル）を本発明の抗スフィンゴ脂質抗体などの抗Ｓ１Ｐ剤に曝し、サンプル中に存在する標的スフィンゴ脂質（例えばＳ１Ｐ）の異常なレベル（すなわち、疾患、症状または障害と関連または相関しているレベル）かどうかを決定することによって行われる。これらの適用のあるものでは、抗体とその使用説明書を含むキットが提供される。
【００９３】
本発明のさらに別の態様は、抗Ｓ１Ｐ剤を製造する方法に関する。このような薬剤の好ましい例としては、抗体、抗体変異体および抗体誘導体（例えば、抗体フラグメント）が含まれる。好ましい実施形態では、特に、１以上のポリペプチド(on or more polypetides)、細胞系統などの生物産生系を含む抗Ｓ１Ｐ剤に関するものが好ましい。もちろん、合成化学法も使用可能である。
【００９４】
本発明のこれらおよびその他の態様および実施形態を以下の節でさらに詳しく述べる。本発明の以上およびその他の態様は以下の詳細な説明、添付図面および特許請求の範囲からさらに明らかになるであろう。本発明の実施または試験においては本明細書に記載されるものと類似または同等の方法および材料も使用可能であるが、好適な方法および材料を以下に記載する。さらに、以下の材料、方法および例は単に例であって、限定を意図するものではない。
【００９５】
発明の詳細な説明
１．化合物
本発明は、生物活性脂質Ｓ１Ｐと特異的に反応性のあるある種の抗Ｓ１Ｐ剤、特に、抗体を含む免疫誘導部分であるものを記載し、言い換えれば、該抗Ｓ１Ｐ剤が反応する生物活性脂質がＳ１Ｐである。
【００９６】
抗体分子または免疫グロブリンは、通常、２種類の異なるポリペプチド鎖からなる、分子量およそ１５０ｋＤａの大きな糖タンパク質分子である。一方のポリペプチド鎖は「重」鎖（Ｈ）と呼ばれ、およそ５０ｋＤａである。もう一方のポリペプチドは「軽」鎖（Ｌ）と呼ばれ、およそ２５ｋＤａである。各免疫グロブリン分子は通常、２つの重鎖と２つの軽鎖からなる。２つの重鎖はジスルフィド結合によって互いに連結され、その数は免疫グロブリンイソ型の異なる重鎖では異なっている。各軽鎖は１つの共有結合的ジスルフィド結合によって重鎖と連結している。いずれの天然抗体分子も、これら２つの重鎖および２つの軽鎖は同一であり、２つの同一の抗原結合部位を保持しており、従って、二価、すなわち、２つの同一の分子と同時に結合する能力を有するとされている。
【００９７】
いずれかの脊椎動物種に由来する抗体分子の「軽」鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、２つの明瞭に異なる種、カッパ（ｋ）とラムダ（λ）のいずれかに割り付けることができる。これら２種の軽鎖の比率は種ごとに異なる。例として、平均ｋ／λ比は、マウスでは２０：１、ヒトでは２：１、ウシでは１：２０である。
【００９８】
いずれかの脊椎動物種に由来する抗体分子の「重」鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、イソ型と呼ばれる５つの明瞭に異なる種のいずれかに割り付けることができる。いくつかのイソ型は、数種の亜種を持っている。５つの主要な免疫グロブリンクラスが、免疫グロブリン（ＩｇＭ）、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）および免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）である。ＩｇＧは最も多いイソ型であり、数種のサブクラス（ヒトでは、ＩｇＧ１、２、３および４）を有する。Ｆｃフラグメントおよびヒンジ領域は異なるイソ型の抗体では異なるので、それらの機能特性を決定づける。しかしながら、これらのドメインの全体的な構成は全てのイソ型で同様である。
【００９９】
「可変領域」とは、抗体分子またはそのフラグメントのＮ末端配列を指す。一般に、これら４つの鎖の各々はそのアミノ末端部分に可変（Ｖ）領域を有し、これはイソ型を決定する抗原結合部位および定常（Ｃ）領域に寄与する。軽鎖は多くの非共有結合的相互作用によって、また、ジスルフィド結合によって重鎖と結合され、重鎖および軽鎖のＶ領域は抗体分子の各腕で、２つの同じ抗原結合部位を形成するように対をなす。いくつかのアミノ酸残基が軽鎖および重鎖可変ドメイン間の界面をなしていると考えられている（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991); Clothia et al., J. Mol. Biol., vol. 186:651 (1985)参照）。
【０１００】
変異性は抗体の可変ドメイン中に一様に分布しているのではなく、軽鎖および重鎖可変ドメインの双方に「相補性決定領域」（ＣＤＲ）または「超可変領域」と呼ばれる３つのセグメントに集中していることを注記しておく。可変ドメインのより保存性の高い部分は「フレームワーク領域」（ＦＲ）と呼ばれる。天然重鎖および軽鎖の可変ドメインは各々、３つのＣＤＲによって接続された４つのＦＲ領域を含む。各鎖のこれらのＣＤＲはＦＲ領域によってともに近接して保持されており、他の鎖のＣＤＲとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)参照）。合わせて考えると、これら６つのＣＤＲは抗体分子の結合特性に寄与している。しかしながら、１本の可変ドメイン（または抗原に特異的なＣＤＲを３つだけ含むＦｖの半分）であっても抗原を認識し、抗原と結合する能力を有する（Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)参照）。
【０１０１】
「定常ドメイン」とは、抗体重鎖または軽鎖のＣ末端領域を指す。一般に、これらの定常ドメインは抗原に対する抗体分子の結合特性に直接的な関与はしないが、抗体依存性の細胞傷害性における抗体の関与といった種々のエフェクター機能を発揮する。ここで、「エフェクター機能」とは、Ｆｃドメインと免疫系のタンパク質との分子的相互作用による免疫細胞の動員により媒介される、抗体の様々な生理学的作用（例えば、オプソニン作用、細胞溶解、肥満細胞、好塩基球および好酸球分解および他のプロセス）を指す。重鎖のイソ型は抗体の機能的特性を決定する。それらの明瞭に異なる機能特性は、重鎖のカルボキシ末端部分によって付与され、それらは軽鎖に関連しない。
【０１０２】
本明細書において「抗体フラグメント」は、完全抗体の抗原結合部位または可変領域を含む完全抗体の一部を指し、この部分は完全抗体のＦｃ領の定常重鎖ドメイン（例えば、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４）を欠いていてもよい。あるいは、定常重鎖ドメイン（例えば、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４）の部分は「抗体フラグメント」に含まれていてもよい。抗体フラグメントの例は抗原結合を保持するものであり、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｄおよびＦｖフラグメント；ダイアボディー；トリアボディー；単鎖抗体分子（ｓｃ−Ｆｖ）；ミニボディー、ナノボディー、および抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が含まれる。例として、Ｆａｂフラグメントはまた軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第一の定常ドメイン（ＣＨ１）も含む。
【０１０３】
「変異体」とは、抗体の天然のアミノ酸配列と、少なくとも１つのアミノ酸残基改変で異なるアミノ酸配列を指す。天然型または親または野生型アミノ酸配列とは、天然に見られる抗体のアミノ酸配列を指す。抗体分子の「変異体」としては、限定されるものではないが、Ｆｃ領域、Ｆａｂ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインおよびヒンジ領域を含む、軽鎖および／または重鎖の可変領域または定常領域内の変化が含まれる。
【０１０４】
「特異的」とは、その標的エピトープへの、抗体の選択的結合を指す。抗体分子は、与えられた条件セット下で、所望の抗原に対する結合と、無関連の抗原または類似体抗原または抗原混合物とを比較することに体抗原または抗原混合物とを比較することにおり、結合の特異性に関して試験することができる。好ましくは、本発明の抗体は、無関連の抗原と、または標的抗原の類似体とさえ、有意な結合をしない。ここで、「抗原」とは、抗原と結合する抗体分子または免疫により誘導される物質によって認識され、結合する分子を指す。抗体が結合する抗原の特的部分は「エピトープ」と呼ばれる。「ハプテン」とは、ほとんどの状況下で、例えばタンパク質、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、金コロイド、シリコーンビーズなどの担体と結合された場合にのみ免疫応答を惹起する（すなわち、抗原として働く）ことができる小分子を指す。この担体は、それ自体によっても免疫応答を惹起しないものであり得る。
【０１０５】
「抗体」とは、最も広い意味で用いられ、モノクローナル、ポリクローナル、多重特異性（例えば、抗体の各腕が同じまたは異なる抗原の異なるエピトープと反応性がある二重特異性）、ミニボディー、ヘテロコンジュゲート、ダイアボディー、トリアボディー、キメラおよび合成抗体、ならびに所望の結合特性および／または生物活性で抗原と特異的に結合する抗体フラグメントを包含する。
【０１０６】
「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）とは、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体または抗体集団を指し、特定の方法による抗体の産生を必要として構築されるものではない。例えば、モノクローナル抗体は、Kohler G. and Milstein C. (1975), Nature, vol. 256:495-497が最初に記載したハイブリドーマ法によって、または組換えＤＮＡ法によって作製することができる。
【０１０７】
「キメラ」抗体（または免疫グロブリン）とは、特定の種に由来するか、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属す抗体中の対応する配列と同一または相同であるが、その鎖の残りの部分は別の種に由来するか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属す抗体中の対応する配列と同一または相同である重鎖および／または軽鎖を含む分子、ならびに所望の生物活性を示す限り、このような抗体のフラグメントを指す(Cabilly, et al., infra; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 81:6851 (1984))。
【０１０８】
「ヒト化抗体」とは、ヒト配列の代わりに非ヒト（例えばネズミ）抗体に由来する選択された配列も含むヒト抗体を意味する。ヒト化抗体は、保存的アミノ酸置換、またはその結合活性および／または生物活性を有意に変化させない、同じ種または異なる種に由来する非天然残基を含み得る。このような抗体は非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。ヒト化抗体は、ほとんどの部分では、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基が、所望の特性を有するマウス、ラット、ラクダ、ウシ、ヤギまたはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲに由来する残基で置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも移入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見られない残基を含むこともできる。これらの改変は抗体の性能をさらに精密にし、最大限とするために行われる。よって、一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、一態様では２つの可変ドメインを全て含み、この場合、全ての、または全ての超可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに相当し、全ての、または実質的に全てのＦＲ領域ヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は所望により、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、またはヒト免疫グロブリンのそれも含む。例えば、Cabilly, et al., 米国特許第４，８１６，５６７号；Cabilly, et al.,欧州特許第０，１２５，０２３  Ｂ１号；Boss, et al., 米国特許第４，８１６，３９７号；Boss, et al.,欧州特許第０，１２０，６９４  Ｂ１号；Neuberger, et al., ＷＯ８６／０１５３３；Neuberger, et al.,欧州特許第０，１９４，２７６  Ｂ１号；Winter, 米国特許第５，２２５，５３９号；Winter,欧州特許第０，２３９，４００  Ｂ１号；Padlan, et al.,欧州特許出願第０，５１９，５９６  Ａ１号;Queen, et al. (1989), Proc. Nat’l Acad. Sci. USA, vol. 86:10029-10033参照。
【０１０９】
「完全ヒト」抗体とは、免疫原とともに提供された際に、必ずしもＣＤＲグラフトを必要としないヒト抗体を産生し得る遺伝的に操作された（すなわち、トランスジェニック）マウス（例えば、Medarexから）で産生された抗体を指し得る。これらの抗体は、非ヒト抗体遺伝子が抑制され、ヒト抗体遺伝子発現と置換されているマウスなどの動物に由来する完全ヒト型（１００％ヒトタンパク質配列）である。出願者らは、これらの遺伝的に操作されたマウスまたは関連のＣＤＲのヒトフレームワークを生成し得る他の動物に提供された際に生物活性脂質に対して抗体が生成され得ると考えている。
【０１１０】
「二重特異性抗体」とは、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体またはモノクローナル抗体を指し得る。一実施形態では、これらのエピトープは同じ抗原に由来する。別の実施形態では、これらのエピトープは２つに異なる抗原に由来する。二重特異性抗体を作製する方法は当技術分野で公知である。例えば、二重特異性抗体は２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現を用いて、組換え的に産生させることができる。あるいは、二重特異性抗体は化学的結合を用いて作製することもできる。当業者ならば、当技術分野で公知であるようなこれら、または他の方法を用いて二重特異性抗体を生産することができる。二重特異性抗体には、二重特異性抗体フラグメントが含まれる。本発明に包含される二重特異性抗体の一例としては、Ｓ１ＰエピトープおよびＬＰＡエピトープに対して結合特性を有する抗体であり、従って、Ｓ１ＰおよびＬＰ１の双方を認識し、それらと結合することができる。本発明に包含される二重特異性抗体の別の例としては、生物活性脂質由来のエピトープおよび細胞表面抗原由来のエピトープに結合特性を有する抗体がある。よって、この抗体は生物活性脂質を認識し、それと結合することができ、例えば標的化のために細胞を認識し、それと結合することができる。
【０１１１】
「ヘテロコンジュゲート抗体」とは、２つの共有結合的に結合された抗体を指す。このような抗体は、架橋剤の使用を含む合成タンパク質化学における公知の方法を用いて作製することができる。本明細書におい「コンジュゲート」とは、１以上の抗体フラグメントまたは結合部分と１以上のポリマー分子の共有結合によって形成された分子を指す。
【０１１２】
「生物学的に活性」とは、所望のエピトープと結合することができ、かつ、何らかの方法で生物学的作用を発揮し得る抗体または抗体フラグメントを指す。生物学的効果としては、限定されるものではないが、成長シグナルの調節、抗アポトーシスシグナルの調節、アポトーシスシグナルの調節、エフェクター機能カスケードの調節および他のリガンド相互作用の調節が挙げられる。
【０１１３】
「組換えＤＮＡ」とは、ヒトにより操作、作出または改変された核酸およびそれらから発現される遺伝子産物を指す。「組換え」ポリペプチドまたはタンパク質は、組換えＤＮＡ技術によって、例えば、所望のポリペプチドまたはタンパク質をコードする外来ＤＮＡ構築物により形質転換された細胞から産生されたポリペプチドまたはタンパク質である。「合成」ポリペプチドまたはタンパク質は化学合成によって製造されたものである。
【０１１４】
「発現カセット」とは、構造遺伝子（すなわち、本発明の抗体などのタンパク質コード配列）の、このような配列に適合した宿主での発現に影響を及ぼし得るヌクレオチド分子を指す。発現カセットとしては、ポリペプチドコード配列と、また所望により、例えば転写終結シグナルなどの他の配列と、作動可能なように連結された少なくとも１つのプロモーターを含む。また、例えばエンハンサーなど、発現の達成に必要または有用な付加的調節エレメントを用いてもよい。よって、発現カセットはプラスミド、発現ベクター、組換えウイルス、任意の形態の組換え型の「裸のＤＮＡ」ベクターなどを含む。
【０１１５】
抗体の供給源は本明細書で例示されているもの（例えば、ネズミおよびヒト化ネズミ抗体）に限定されない。抗体は、哺乳類種（例えば、マウス、ラット、ラクダ、ウシ、ヤギ、ウマ、モルモット、ハムスター、ヒツジおよびウサギ）および鳥類（カモ、ニワトリ）を含む多くの種で作製可能である。作製された抗体は、それらが作製された動物とは異なる種に由来するものであってもよい。例えば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（商標）(Abgenix, Inc., Fremont CA)は完全なヒトモノクローナル抗体を産生する。ある特定の目的では、ある力価のそのようなＳ１Ｐ自己抗体を示し得る個体から単離したＳ１Ｐに対する抗体のような天然ヒト抗体を使用することができる。あるいは、ヒト抗体配列ライブラリーを用いて、ヒト配列を含む抗体を作製することもできる。
【０１１６】
２．適用
本発明は、1以上の望ましくない生物活性脂質、またはその前駆体もしくは代謝産物の活性または濃度を変化させる１以上の治療薬を用い、ある種の疾患および症状を治療または予防する組成物および方法を記載する。本発明の治療方法および組成物は、有効濃度を変更すること、すなわち、特定の望ましくない生物活性脂質の、絶対的、相対的、効果的および／または利用可能な濃度および／または活性を変化させることによって作用する。生物活性脂質の有効濃度を低下させることとは、標的脂質または下流作用を含むその望ましくない作用を「中和する」と言うことができる。ここで、「望ましくない」とは、疾患過程における例えばシグナル伝達分子としてのその関与のために望ましくない生物活性脂質、または過剰に存在する場合に疾患に関与する生物活性脂質の望ましくない量を指す。
【０１１７】
特定の理論に縛られるものではないが、Ｓ１Ｐおよび／またはその代謝産物または下流エフェクターの不適切な濃度は、様々な疾患および障害の発症を引き起こすかまたは関与し得ると考えられる。それ自体、組成物および方法は、特に、特定の標的脂質、例えばＳ１Ｐおよび／またはその変異体の有効in vivo濃度を低下させることによって、これらの疾患および障害を処置するために使用することができる。特に、本発明の組成物および方法は、少なくとも部分的に、異常な新血管新生、脈管形成、繊維形成、線維症、瘢痕化、炎症および免疫応答を特徴とする疾患を処置するのに有用であると考えられる。
【０１１８】
本発明に従って処置され得る数種の疾患の例を以下に記載する。多くの疾患および症状は、少なくとも部分的に、複数の病理学的プロセス（例えば、病理学的新血管新生および瘢痕化の両方）を特徴とし、本明細書で提供される分類は記述的利便性を目的とするものであって、本発明を限定するものではないと考えられる。
【０１１９】
Ｓ１Ｐと過剰増殖性障害
本発明の一態様は、過剰増殖性障害を処置する方法に関する。これらの方法は、意図される適用が必要な場合に、Ｓ１Ｐ関連過剰増殖性障害に罹患していることが分かっている、または罹患していることが疑われる哺乳類（例えば、ウシ、イヌ、ウマ、ヒツジまたはブタ動物、特に、ヒト）に、Ｓ１Ｐ活性を妨げる薬剤を、好ましくは薬学上または獣医学上許容される担体中に含む治療上有効な量の組成物を投与することを含む。Ｓ１Ｐ関連過剰増殖性障害としては、新生物、内皮細胞の増殖に関連する障害および繊維形成に関連する障害が含まれる。ほとんどの場合、新生物は癌である。内皮細胞増殖に関連する典型的な障害は脈管形成依存性障害、例えば、固形腫瘍により引き起こされる癌、血液性腫瘍および加齢性黄斑変性である。繊維形成に関連する障害としては、心不全などの異常な心臓リモデリングに関与するものが含まれる。
【０１２０】
多くの既知の過剰増殖性障害があり、それらでは種々の組織および器官の細胞が異常なパターンの成長、増殖、遊走、シグナル伝達、老化および死滅を示す。これらの疾患のいくつかのものに取り組むためにいくつかの処置が開発されているが、多くがまだ既存の技術ではまだ処置不能であり、他の場合では、処置が適用可能ではあるが、最適と言えるほどのもではない場合が多く、治癒は希有である。
【０１２１】
癌はおそらく最も広く認識されている種類の過剰増殖性障害であろう。癌は破壊的な種類の疾患であり、それらを合わせると、唯一心血管疾患に次ぐ死亡率を持つ。多くの癌は分子レベルで十分理解されていない。結果として、癌は米国政府および製薬会社双方の研究開発プログラムの主な焦点となっている。この結果は先例のないＲ＆Ｄ努力と癌に対抗する助けとなる有用な多くの治療薬の製造をもたらした。
【０１２２】
残念なことに、これらの多大な癌研究は癌によって引き起こされる甚大なダメージを克服するには十分なものとはなっていない。なお、癌と診断される新たな症例はなお年間１００万件を超え、米国だけで５０万人を超える死者を出している。このことは、癌の新規治療薬を開発するために多大な努力を払ってきたとしても、この疾患に対抗する有効な治療薬はつかみどろがないままであるということの劇的な実証である。
【０１２３】
癌は現在主として、外科術、放射線および化学療法の１種類または３種類の療法の組合せで処置される。外科術は罹患組織の本体除去を含む。外科術は、乳房、結腸および皮膚などの特定の部位に存在する腫瘍を除去には有効である場合があるが、背骨などのその他の部位に存在する腫瘍の処置にも、白血病などの播種性の新生物症状の処置には使用できない。放射線療法は生きている組織に電離放射線を当てて、曝された細胞に細胞死または傷害を引き起こすことを含む。放射線療法の副作用は急性または一過性であり得るが、不可逆的なものもある。化学療法は細胞複製または細胞代謝の混乱を含む。
【０１２４】
さらに良くないことに、現行の治療薬は通常、毒性および重篤な副作用という形で患者にとって甚大な欠点を含む。従って、多くのグループが最近、癌と闘うために新しいアプローチを探し始めている。これらの新しいいわゆる「革新的療法」としては、遺伝子療法およびモノクローナル抗体などの治療タンパク質が含まれる。
【０１２５】
癌の処置に臨床上用いられた最初のモノクローナルは、１９９７年に市場に出され、治療薬としての二重特異性モノクローナル抗体の有用性が実証されたリツキサン(Rituxan)（リツキシマブ）であった。よって、驚くことではないが、以来、癌に処方される６つを含む１６の他のモノクローナル抗体が臨床使用に認可された。これらの製品の成功ならびに小分子に比べてのモノクローナル抗体を開発するためのコストの低減および時間の短縮は、モノクローナル抗体治療薬を小分子に次ぐ薬剤候補の第二の最も大きなカテゴリーとした。さらに、小分子治療薬に比べて抗体の絶妙な特異性は有効性および毒性の双方の観点で主要な利点となることが分かった。癌だけで言えば、現在、２７０を超える産業抗体Ｒ＆Ｄ事業が存在し、５０社を超える企業が新規な癌抗体治療薬の開発に関わっている。結論として、癌の処置において主要な役割を演じるものとなりつつあり、それらは増大している癌治療薬市場のシェアを取るものと評価されている。
【０１２６】
腫瘍の成長および生存を促進する細胞外メディエーターの同定は、癌の罹患率および死亡率を引き下げる治療的介入を発見する上で重要な段階である。以下に記載されるように、スフィンゴ脂質シグナル伝達カスケードの鍵となる成分であるスフィンゴ−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）は多面発現性、腫瘍形成性の増殖因子であると考えられる。Ｓ１Ｐは細胞増殖、細胞生存および転移を刺激することによって腫瘍成長を促進する。Ｓ１Ｐはまた、腫瘍内に新血管を形成することから、内皮細胞の遊走および生存を補助することによって腫瘍の脈管形成を促進する。これらのことを考え合わせると、Ｓ１Ｐは癌進行に寄与する、増殖、脈管形成促進性および抗アポトーシス性の一連の事象を誘発する。よって、in vivoでＳ１Ｐレベルを調節する、特に低下させる治療薬は癌の処置に有用である。
【０１２７】
研究によれば、最近、スフィンゴシンキナーゼ（ＳＰＨＫ）が腫瘍成長を促進する細胞外スフィンゴ脂質シグナル伝達分子、スフィンゴ−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）を産生する妥当な癌遺伝子であることが実証された。腫瘍成長は、腫瘍細胞の増殖および転移に関連するＳ１Ｐの増殖因子作用ならびにＳ１Ｐの脈管形成促進作用によって直接的および間接的の双方で促進される。本出願者は、Ｓ１Ｐを選択的に吸収し、それにより腫瘍体積および転移能に予期された低下を伴って、この腫瘍増殖因子の細胞外濃度を低下させると同時に、そうでなければ成長中の腫瘍に血液供給を行う新血管の形成を遮断する治療用分子スポンジとして使用可能な二重特異性モノクローナル抗Ｓ１Ｐ抗体（抗Ｓ１Ｐ  ｍＡｂ）を製造した。この分子吸収の概念の予期された成功は癌処置の革新的アプローチである。後段で実証されるように、本出願者は重要な腫瘍増殖因子であるスフィンゴ−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）に対するｍＡｂを開発した。本出願者は、この抗体が、多くの癌種に関連する増殖、転移能および脈管形成、従って、一般に癌、ならびにその疾患に伴う腫瘍の脈管形成の低下に有効であり得ると考えている。
【０１２８】
天然型のスフィンゴミエリナーゼ（ｎＳＭａｓｅ）は、スフィンゴ脂質シグナル伝達経路の鍵となる最初の成分である(Chatterjee, Adv. Lipid Res. 26: 25-46, 1993; Liu, Obein, and Hannun, Semin. Cell Dev. Biol. 8: 311-322, 1997)。ｎＳＭａｓｅは、アルカリ性、酸性、酸性亜鉛依存性および中性マグネシウム依存性を含む、少なくとも５つの同定されているＳＭａｓｅのうちの１つである(Liu, Obein, and Hannun, Semin. Cell Dev. Biol. 8: 311-322, 1997)。ｎＳＭａｓｅクラスは一般に表面膜に関連しており(Das, Cook, and Spence, Biochim Biophys Acta 777: 339 - 342, 1984; Dobrowsky, Cell Signal 12: 81-90., 2000)、炎症性サイトカイン、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）(Segui, et al., J. Clin. Invest. 108: 143-151, 2001)、Ｔ細胞受容体(Tonnetti, et al., J. Exp. Med 189: 1581-1589, 1999)、電離放射線(Haimovitz-Friedman, et al., J. Exp. Med 180: 525-535, 1994)およびアントラサイクリン抗新生物薬(Andrieu-Abadie, et al., FASEB J. 13: 1501-1510, 1999)などの、アポトーシスを引き起こす種々の刺激によって活性化され得る。腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）は、癌細胞系統(Andrieu-Abadie, et al., FASEB J. 13: 1501-1510, 1999; Hannun and Obein, Trends in Biol. Sci. 20: 72-76, 1995; Kolesnick, trends Biochem Sci 24: 224-5, 1999; Obeid, et al., Science 259: 1769-1771, 1993)を含む多くの細胞種において、ｎＳＭａｓｅ(Adam, et al., J. Bio Chem 271: 14617-14622, 1996; Dressler, Mathias, and Kolesnick, Science 255: 1715-1718, 1992; Kim, et al., J. Biol. Chem. 266:1: 484-489, 1991; Kronke, Chem Phys Lipids 102: 157-66., 1999; Yanaga and Watson, FEBS Letters 314: 297-300, 1992)、ＣＥＲ産生(Kronke, Chem Phys Lipids 102: 157-66., 1999)およびアポトーシス(Rath and Aggarwal, J. Clin. Immuno. 19: 350-364, 1999; Robaye, et al., Am J Pathol 138: 447-453, 1991; Takeda et al., Int. Immunol. 5: 691-694, 1993)の周知のアクチベーターであり、このｎＳＭａｓｅの活性化はＴＮＦαにより誘発されるアポトーシスに重要であることが示されている(Luberto, et al., J. Biol. Chem. 277: 41128-41139, 2002; Segui, et al., J. Clin. Invest. 108: 143-151, 2001)。結論として、ｎＳＭａｓｅはまた、創薬の標的としても提案されている(Wascholowski and Giannis, Drug News Perspect. 14: 581-90, 2001)。
【０１２９】
スフィンゴ脂質シグナル伝達分子であるＳ１Ｐは、スフィンゴシンキナーゼ（ＳＰＨＫ）の作用によってＳＰＨから産生される。このキナーゼの２つのイソ型ＳＰＨＫ１およびＳＰＨＫ２が同定されている(Liu, J Biol Chem 275: 19513-20, 2000; Nava, et al., Exp Cell Res 281: 115-127, 2002)。ＣＥＲおよびＳＰＨは一般にアポトーシスに関連するが、これに対してＳ１Ｐは細胞増殖および生存経路の活性化のメディエーターである(An, Ann N Y Acad Sci 905: 25-33, 2000; Maceyka, et al., BBA 1585: 193-201, 2002; Zhang, et al., J. Cell Biol. 114: 155-167, 1991)。それは、最近、以前はＥｄｇ受容体として知られていたＳ１Ｐ／ＬＰＡ受容体ファミリーに属する一連のＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）を活性化し得る細胞外メディエーターとして認識されているが(An, Ann N Y Acad Sci 905: 25-33, 2000; An, Goetzl, and Lee, J. cell biochem 30/31: 147-157, 1998; Lee, et al., Science 279: 1552-1555, 1998; Okamoto, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 260: 203-208, 1999)、Ｓ１Ｐの細胞内作用も示唆されてきた(Van Brocklyn, et al., J.  Cell Biol. 142: 229-240, 1998)。さらに、ＣＥＲ／ＳＰＨレベルとＳ１Ｐの間のバランスが、細胞が細胞死経路に送られるのか、アポトーシスから保護されるのかを決めるレオスタット機構を提供することが示唆されている(Kwon, et al., J Biol Chem 276: 10627-10633, 2001; Maceyka, et al., BBA 1585: 193-201, 2002; Pyne, Biochem J. 349: 385-402, 2000)。このレオスタット機構の鍵となる調節酵素がＳＰＨＫであり、その役割は、細胞死を促進するスフィンゴ脂質（ＣＥＲ／ＳＰＨ）を、成長を促進するＳ１Ｐに変換することである。
【０１３０】
最初にＳＰＨＫを癌遺伝子として提案した画期的な研究はアデレードのグループによって発表され、このキナーゼで安定的にトランスフェクトされたＮＩＨ−３Ｔ３繊維芽細胞が、Ｓ１Ｐ産生の増強を伴った高い細胞増殖を示したということが実証された(Vadas and Gamble, Circ. Res. 79: 1216-1217, 1996; Xia et al., Curr Biol 10: 1527-1530, 2000)。さらに、これらのＳＰＨＫ過剰発現体は、形質転換細胞が一般に示す特性である接触阻害を回避した。この知見は、Ｓ１Ｐが選択されたヒト癌細胞系統の転移能を増強することを示す最近の報告(Igarashi, Ann. N.Y. Acad. Sci. 845: 19-31, 1998; Takuwa, Biochim Biophys Acta. 1582: 112-120, 2002)と一致している。さらにまた、これらの形質転換体は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに皮下注射した際には腫瘍を作り出した。これらの結果は、最近、腹腔内投与されたＳＰＨＫの小分子阻害剤が、ＪＣ乳腺癌細胞の皮下注入を受けたＳＣＩＤマウスにおいて腫瘍体積を低減可能であったことを示す研究で確認されている(French, et al., Cancer Res 63: 5962-5969, 2003)。有意義にも、ＳＰＨＫが新規な癌遺伝子であり得るという概念は、ＳＰＨＫが乳房、結腸、肺、卵巣、胃、子宮、腎臓および直腸のものなど、多くの固形腫瘍で過剰発現されるという知見(French, et al., Cancer Res 63: 5962-5969, 2003)によって確実となった。さらに、数種のヒト腫瘍由来細胞系統がＳＰＨＫ小分子阻害剤で処置した際にアポトーシスへ導かれ得ること、およびそれらの有効性がＳ１Ｐレベルを低下させるそれらの能力によるものと考えられ得ることが実証された。まとめると、これらの知見は、Ｓ１Ｐが腫瘍細胞自体により産生され得る増殖因子であり、Ｓ１Ｐの濃度の低下が増殖因子を除去した際に見られるアポトーシスを引き起こし得ることを実証する。
【０１３１】
Ｓ１Ｐと腫瘍脈管形成
脈管形成は、既存の血管から新たな血管が形成されるプロセスである。脈管形成はいくつかの生理学的プロセスに重要な役割を果たし、腫瘍成長、浸潤および転移を含む種々の障害の病因に関連づけられている。固形腫瘍および循環腫瘍に関連する脈管形成プロセス（腫瘍脈管形成）は、腫瘍形成および疾患進行の重要な成分であると考えられ、新しい血管が非癌性細胞よりも腫瘍細胞に有利な成長を与える。従って、脈管形成の臨床管理は癌およびその他の脈管形成依存性疾患の処置に重要な成分となる。血管内皮細胞（ＥＣ）は癌細胞ほど容易に突然変異せず、そのため、ＥＣは癌細胞よりも長期療法に耐性を獲得しにくく、それらは良好な潜在的治療標的となるので、抗脈管形成治療薬は特に魅力的である。
【０１３２】
数種の増殖因子が癌性脈管形成に関連づけられている。生体脂質スフィンゴ−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）は、癌にとって重要な多くの細胞プロセスのメディエーターであることが判明している。Ｓ１Ｐはその作用の大部分を、Ｓ１Ｐ１−５と呼ばれるＧタンパク質共役型受容体ファミリーの特異的リガンドとして発揮する。これらの受容体は、脈管形成および血管成熟、細胞遊走およびリンパ球移動を調節する。Ｓ１Ｐとは対照的に、Ｓ１Ｐの前駆体であるスフィンゴシンおよびセラミドは成長の停止およびアポトーシスに関連づけられている。最後に、Ｓ１ＰとＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ｂＦＧＦおよびＩＬ−８などの他の脈管形成促進性増殖因子の間には複雑なクロストークが存在する。Ｓ１Ｐは受容体Ｓ１Ｐ１と結合することにより、ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲおよびＰＤＧＦＲで見られるような増殖因子受容体チロシンキナーゼをトランス活性化する。脈管形成依存性腫瘍におけるＳ１Ｐの重要性はＳ１Ｐを癌処置の格好の標的とする。これらの知見に基づき、細胞外Ｓ１Ｐを中和する抗体アプローチは血管形成の阻害をもたらし、腫瘍成長を支えるのに必要な栄養および酸素を同時に欠乏させる。さらに、最近の研究では、多くの脈管形成阻害剤が、最初の腫瘍から離れた部位へ癌の拡散を軽減する助けとなり得る抗浸潤化合物および抗転移化合物としても働き得ることが示唆されている。
【０１３３】
最も強力な脈管形成促進薬の１つとしてＳ１Ｐを関連づける、増えつつある最近の証拠は、Ｓ１ＰをＶＥＧＦおよびｂＦＧＦなどの薬剤と直接比較する研究から得られるものである。Ｓ１Ｐは、多細胞構造の分化の誘導中にＤＮＡ合成およびヒト静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の走化運動性を刺激し、その全てが初期の血管形成におけるＳ１Ｐの役割を示唆している(Argraves, et al., 2004; Lee et al., 1999; Liu, et al., 2000)。また、Ｓ１Ｐは、骨髄由来ＥＣ前駆体の新血管新生部位への遊走を促進する(Annabi, et al., 2003)。Ｓ１Ｐ１を過剰発現する細胞は抗脈管形成薬サリドマイドおよびネオバスタット(neovastat)に耐性がある(Annabi et al., 2003)。さらに、Ｓ１ＰとＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ｂＦＧＦおよびＩＬ−８などの他の脈管形成促進性増殖因子の間に実質的なクロストークが存在することも実証されている。例えば、Ｓ１ＰはＥＧＦ受容体(Shida, et al., 2004)およびＶＥＧＦ２受容体(Spiegel & Milstien, 2003)をトランス活性化し、ＶＥＧＦはＳ１Ｐ１受容体の発現をアップレギュレーションする(Igarashi, et al., 2003)。また、Ｓ１Ｐ１および「ＶＥＧＦ軸」を介して作用するＳ１Ｐは、後脚の脈管形成および新血管新生にも必要とされる(Chae, et al., 2004)。
【０１３４】
癌に対する抗脈管形成アプローチは、抗脈管形成薬ベバシズマブ（アバスチン(Avastin)（登録商標）、Genentech）が結腸癌処置のために細胞傷害性化学療法の補助として最近ＦＤＡ認可されたことによって大きく進展した。
【０１３５】
Ｓ１Ｐに対して高い結合親和性および特異性を有する抗Ｓ１ＰネズミＭＡｂであるＬＴ１００２が最近開発された。ＬＴ１００２はヒト癌の数種の動物モデルで、腫瘍進行および関連の脈管形成を有意に遅くすることが示された。さらに、ＬＴ１００２は、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）の脈管形成の十分確立されたモデルで、脈絡膜の新血管新生（ＣＮＶ）病変形成を緩和した。ＣＮＶはブルッフ膜および網膜色素上皮の異常がある疾患で見られる。このタイプの最も一般的な疾患が、高齢患者における重篤な視野欠損の最も多い原因であるＡＭＤである。これらの結果は、ＬＴ１００２が、（１）腫瘍細胞増殖に対する直接的作用、（２）血管内皮細胞に対する間接的な抗脈管形成作用および（３）他の脈管形成促進性増殖因子の放出および作用を防止する間接的な抗脈管形成作用を含む、いくつかの作用機序を持つことを示唆した。
【０１３６】
Ｓ１Ｐが腫瘍脈管形成に寄与することの最も直接的なin vivo証拠は、分子吸入によって細胞外Ｓ１Ｐを中和するように設計されたネズミモノクローナル抗体（ｍＡｂ）に着目した本発明者らの最近の発表から得られる(Visentin, et al., 2006)。ＨＵＶＥＣを用いた種々のin vitroアッセイでは、抗Ｓ１Ｐ  ｍＡｂは管形成、血管内皮細胞の遊走および細胞死からの保護（それぞれＳ１Ｐによって誘発されたもの）を中和した。Ｓ１Ｐはマウスに移植されたマトリゲルプラグへの新たな毛細血管成長を増強し、この作用は抗Ｓ１Ｐ  ｍＡｂの全身投与によって中和とされた。ｍＡｂはネズミマトリゲルプラグアッセイでｂＦＧＦおよびＶＥＧＦによって誘発された脈管形成を実質的に中和し、in vitroおよびin vivoにおいてＳ１Ｐにより刺激された、腫瘍細胞からの脈管形成促進性サイトカイン（ＶＥＧＦ、ＩＬ−８、ＩＬ−６）の放出を緩和した。重要なことに、正所性のヒト癌細胞を異種移植したマウスは、抗Ｓ１Ｐ  ｍＡｂ処置により腫瘍進行の実質的遅延を示した。このことは、ヒト乳癌、卵巣癌および肺癌のネズミモデルならびにネズミ黒色腫の同種移植モデルで実証された(Visentin, et al., 2006)。
【０１３７】
種々の疾患および障害の治療的処置としてのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の使用は、それらが安全で効果的な治療薬であることが示されたことから、急速に増えている。認可された治療用ｍＡｂとしては、アバスチン(Avastin)（登録商標）、エルビタックス(Erbitux)（登録商標）およびリツキサン(Rituxan)（登録商標）がある。さらなるｍＡｂが種々の疾患に対する臨床開発の様々な段階にあり、その大多数が種々の形態の癌を標的としている。一般に、モノクローナル抗体は非ヒト哺乳類で作製される。しかしながら、ネズミモノクローナル抗体の治療上の有用性は、主として、ヒト患者がネズミ抗体に対して固有の抗体応答を装備しているという事実のために限定されたものである。この応答、いわゆるＨＡＭＡ（ヒト抗マウス抗体）応答の結果、最終的な中和とネズミｍＡｂの急速な排除が起こる。この制限は、ネズミ抗体の「ヒト化」と呼ばれるプロセスの開発によって克服された。ヒト化は、投与された治療用ＭＡｂに対する免疫応答の発生を大きく緩和し、それにより、ＨＡＭＡの結果としての半減期の短縮および治療効力の低減を回避する。大部分、ヒト化プロセスは、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）にネズミ相補性決定領域（ＣＤＲ）をグラフトすることからなる。この戦略は「ＣＤＲグラフティング」と呼ばれる。最初にグラフトされた構築物に欠損している親和性を回復させるために、ヒトＦＲ中の選択された残基のネズミアミノ酸残基に対する「復帰突然変異」が必要な場合が多い。
【０１３８】
ｍＡｂの製造は、タンパク質自体の可変性から来る複雑なプロセスである。ｍＡｂの可変性はタンパク質主鎖および／または炭水化物部分に存在し得る。このヘテロ性は選択的ジスルフィド対合の形成、脱アミド化およびイソアスパルチル残基の形成、メチオニンおよびシステインの酸化、Ｎ末端グルタミン残基のピルグルタメートへの環化および哺乳類カルボキシペプチダーゼによるＣ末端リシンの部分的酵素切断に帰することができる。操作は一般に、安定性、プロテアーゼ耐性、凝集挙動の増強など、それらの特性を改良するため、およびヘテロ系での発現レベルを増強するために抗体分子に適用される。
【０１３９】
ここでは、Ｓ１Ｐに対するネズミＭＡｂのヒト化を記載する。全体的な戦略は、ＬＴ１００２由来の６つのＣＤＲをヒトフレームワークにグラフトすることからなった。抗体性能をさらに精密化および至適化するためにさらなる改良を施した。このヒト化ＭＡｂはＬＴ１００２と同じ特徴を示し、よって、臨床試験にかけるのに好適である。
【０１４０】
Ｓ１Ｐと繊維症
繊維芽細胞、特に、筋繊維芽細胞は、細胞の傷害および炎症に応答した瘢痕形成の鍵となる細胞エレメントである[Tomasek, et al. (2002), Nat Rev Mol Cell Biol, vol 3: 349-63およびVirag and Murry (2003), Am J Pathol, vol 163: 2433-40]。筋線維芽細胞によるコラーゲン遺伝子発現はリモデリングの特徴であり、瘢痕形成に必要である[Sun and Weber (2000), Cardiovasc Res, vol 46: 250-6およびSun and Weber (1996), J Mol Cell Cardiol, vol 28: 851-8]。Ｓ１Ｐは、コラーゲン生産の増加中に繊維芽細胞の遊走および増殖を活性化することによって創傷治癒を促進する[Sun, et al. (1994), J Biol Chem, vol 269: 16512-7]。傷害を受けた細胞によって局部的に産生されたＳ１Ｐは、リモデリングおよび瘢痕形成に関連する不適応な創傷治癒の一因となり得る。よって、Ｓ１Ｐ阻害剤は少なくとも部分的に異常な繊維形成または繊維症を特徴とする疾患または症状に有用であると考えられる。ここで、「繊維形成」は、繊維芽細胞の過剰な活性または数と定義され、「繊維症」は、過剰または不適切なコラーゲン生産および瘢痕化、生理学的組織構造の破壊および／または網膜剥離などの病理をもたらすマトリックスの不適切な収縮または器官機能の障害をもたらすその他のプロセスに至る繊維芽細胞の過剰な活性または数と定義される。
【０１４１】
Ｓ１Ｐと繊維芽細胞コラーゲンの発現：Ｓ１Ｐは、静止中の繊維芽細胞の分化を促進して、瘢痕形成の際に高いコラーゲン発現を示す筋繊維芽細胞を活性化させる[Urata, et al. (2005), Kobe J Med Sci, vol 51: 17-27]。繊維芽細胞の増殖および瘢痕化領域への遊走とともに、筋繊維芽細胞は主としてオステオポンチンおよびフィブロネクチンからなる一次的顆粒ネットワークを沈積する[Sun and Weber (2000), Cardiovasc Res, vol 46: 250-6]。リモデリングプロセスとして、この一次的マトリックスは吸収され、コラーゲンネットワークが確立される[Sun and Weber (2000), Cardio生産を促進することを実証した。周知の繊維性メディエーターであるＴＧＦβは、おそらくはＳ１Ｐの作用によって、数種の繊維形成促進性タンパク質をアップレギュレーションし、繊維芽細胞を筋繊維芽細胞へ変換し、炎症性タンパク質の発現を刺激することが示されている[Squires, et al. (2005), J Mol Cell Cardiol, vol 39: 699-707およびButt, Laurent and Bishop (1995), Eur J Cell Biol, vol 68: 330-5]。ＴＧＦβにより刺激される繊維芽細胞から筋繊維芽細胞への分化に関連づけられているシグナル伝達分子ＴＩＭＰ１のアップレギュレーションはＳＰＨＫ１に対するｓｉＲＮＡによって遮断される[Yamanaka, et al., J Biol Chem. 2004 Dec 24;279(52):53994-4001]が、このことはヒト化型の抗Ｓ１Ｐ抗体がＴＧＦβの繊維形成促進作用を緩和するととともにＳ１Ｐ自体の繊維形成作用も緩和し得ることを示唆している。
【０１４２】
不適応な瘢痕化を最小限とすることは、限定されるものではないが、眼球疾患、心血管疾患、創傷治癒および硬皮症を含む繊維性疾患および症状の処置に有用であると考えられる。
【０１４３】
硬皮症の処置のための抗Ｓ１Ｐ抗体
本発明の組成物および方法は、少なくとも部分的に、異常な新血管新生、脈管形成、繊維形成、線維症、瘢痕化、炎症および免疫応答を特徴とする障害および疾患の処置において有用である。このような疾患の１つが硬皮症であり、全身性硬化症とも呼ばれる。
【０１４４】
硬皮症は、皮膚の瘢痕化または肥厚を引き起こし、時には、肺、心臓および／または腎臓を含む他の身体領域も含む自己免疫疾患である。硬皮症は、身体の皮膚および臓器において、関連領域の肥厚および硬化をもたらし、結果として機能低下を伴い得る瘢痕組織の形成（線維症）を特徴とする。今日、硬皮症財団によれば、約３００，０００人のアメリカ人が硬皮症を有する。罹患している３分の１またはそれ以下の者は広範囲の疾患を有し、残りの３分の２は主に皮膚疾患を有する。該疾患が肺に作用して瘢痕化を引き起こす場合には、このような肺はもはやあるべきような拡張ができないことから、呼吸が制限されるようになり得る。呼吸の能力を測定するために、医師は強制肺活量（ＦＶＣ）を評価する装置を用いる。予測値の５０パーセント未満のＦＶＣを有する人々において、硬皮症に関連した肺疾患からの１０年間の死亡率は約４２パーセントである。死亡率が非常に高い１つの理由は、現在利用できる有効な処置がないためである。
【０１４５】
本願の実施例に記載されているように、Ｓ１Ｐが、繊維芽細胞の活性化、増殖およびその結果としての不適応な瘢痕化およびリモデリングと関連する繊維芽細胞の活性の増強に寄与し得る繊維形成促進性増殖因子であることを示す証拠が存在する。さらに、皮膚および他のタイプの繊維芽細胞の活性におけるＳ１Ｐの潜在的役割が実証された。例えば、生物活性脂質はネズミ皮膚繊維芽細胞の遊走を刺激すること(Hama, et al., J Biol Chem. 2004 Apr 23;279(17):17634-9)およびヒト皮膚繊維芽細胞が数種のＳ１Ｐ受容体サブタイプを発現すること(Zhang, et al., Blood. 1999 May 1;93(9):2984-90)が示されている。繊維芽細胞の活性に対するＳ１Ｐの多くの直接的作用に加えて、Ｓ１Ｐはまた、繊維芽細胞の活性に対する多くの潜在的な間接的作用も持ち得る。例えば、Ｓ１Ｐは、ＴＧＦ−βおよび血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）などの他の周知の繊維形成促進因子の作用を促進し得る。ＴＧＦ−βは、最も広く研究され、認識されている繊維症の因子の１つである(Desmouliere, et al., J Cell Biol 122: 103-111, 1993)。ＴＧＦ−βは、ＳｐｈＫ１の発現および活性をアップレギュレーションして、ＥＣＭ分解を阻害するタンパク質であるメタロプロテイナーゼ１（ＴＩＭＰ−１）の組織阻害剤の発現増強をもたらす(Yamanaka, et al., J Biol Chem 279: 53994-54001, 2004)。ＴＩＭＰ−１の発現増強は、心不全患者における間質性繊維症および拡張機能不全と関連がある(Heymans, et al., Am J Pathol 166: 15-25, 2005)。逆に、Ｓ１ＰはＴＧＦ−βの発現および放出を刺激する(Norata, et al., Circulation 111: 2805-2811, 2005)。Ｓ１ＰとＰＤＧＦの間のクロストークの明らかな証拠もある。Ｓ１Ｐは、ＰＤＧＦの発現を直接刺激する(Usui, et al., J Biol Chem 279: 12300-12311, 2004)。さらに、Ｓ１Ｐ１受容体およびＰＤＧＦ受容体は互いに結合し、その会合は種々の細胞種の増殖および遊走に関与する下流シグナル伝達のＰＤＧＦ活性化に必要である(Long, et al., Prostaglandins Other Lipid Mediat 80: 74-80, 2006; Baudhuin et al.,  Faseb J 18: 341-343, 2004)。繊維症に対するＴＧＦ−βおよびＰＤＧＦの作用はそれ自体、部分的に、Ｓ１Ｐシグナル伝達経路とのクロストークによるものであり得る。本発明の組成物および方法はそれ自体、特に、特定の標的脂質、例えばＳ１Ｐの有効in vivo濃度を低下させることによって硬皮症を処置するために使用することができる。
【０１４６】
全身性の硬皮症は、ＰＤＧＦ受容体に対する刺激性自己抗体によって悪化すると考えられ(Baroni, et al., N Engl J Med. 2006 v354(25):2667-76)、ＰＤＧＦ受容体がＴＧＦ−βに応答した硬皮症繊維芽細胞においてアップレギュレーションされる(Yamakage, et al., J Exp Med. 1992 May 1;175(5):1227-34)。Ｓ１Ｐ、ＰＤＧＦおよびＴＧＦ−βシグナル伝達系間の実質的なクロストークのために、Ｓ１Ｐの生物活性を抗Ｓ１Ｐ剤（例えば、抗Ｓ１Ｐ  ｍＡｂ）で遮断すると、ＰＤＧＦおよびＴＧＦ−βの硬化促進作用を間接的に緩和することができた。さらに、このような抗Ｓ１Ｐ剤による処置は、皮膚および疾患の進行に関与する他の形態の繊維芽細胞に対するＳ１Ｐの直接的作用を緩和することによって硬皮症患者に有益であり得た。
【０１４７】
Ｓ１Ｐと眼球の疾患および症状
病理学的なまたは異常な脈管形成／新血管新生、異常なリモデリング、繊維症および瘢痕化および炎症が、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）などの網膜および眼球の疾患と関連して、また、未熟児網膜症（ＲＯＰ）および他の発育障害において起こり[Eichler, et al. (2006), Curr Pharm Des, vol 12: 2645-60]、ならびに眼に対する感染および機械的損傷の結果である [Ciulla, et al. (2001), Curr Opin Ophthalmol, vol 12: 442-9およびDart et al (2003), Eye, vol 17: 886-92]。Ｓ１Ｐに対する抗体は、病理学的なまたは異常な脈管形成／新血管新生、異常なリモデリング、繊維症および瘢痕化または炎症がその成分である眼球疾患を処置するのに有用であると考えられる。
【０１４８】
眼の脈管形成／新血管新生
病理学的な眼球脈管形成は、様々な臨床症状において失明の主因である。脈絡膜新血管新生（ＣＮＶ）はいくつかの眼球疾患で起こり、最も多いものは滲出型または「ウェット」型のＡＭＤである。高齢者が増えてきた結果として、ＡＭＤは今日、西洋諸国で６０歳以上の患者に流行し、失明の主因となっている。ＡＭＤによって引き起こされる視力喪失が流行しているにもかかわらず、ＡＭＤの進行を遅延させ得るのはほんのいくつかの療法であり（ほとんどのものが抗ＶＥＧＦに基づく）、視力喪失を逆転できるものはさらに少ない[Bylsma and Guymer (2005), Clin Exp Optom,. vol 88: 322-34, Gryziewicz (2005), Adv Drug Deliv Rev, vol 57: 2092-8およびLiu and Regillo (2004), Curr Opin Ophthalmol, vol 15: 221-6]。従って、病理学的新血管新生のための新規な処置を発見することは非常に重要である。
【０１４９】
ＡＭＤは、異常な脈間形成／新血管新生、異常なリモデリング、繊維症および瘢痕化、および炎症に関係する眼球症状を記載する上で単に例示のために本明細書で用いられるものであり、その症状は、本明細書で開示および特許請求されるような他の眼球疾患および障害においても見出される。ＡＭＤは、加齢性の病理学的変化を包含する[Tezel, Bora, and Kaplan (2004), Trends Mol Med, vol 10: 417-20およびZarbin (2004), Arch Ophthalmol, 122: 598-614]。複数の理論が存在するが、ＡＭＤの正確な病因および病理はまだ十分に理解されていない。加齢は、酸化損傷の蓄積、ブルッフ膜の肥厚および結晶腔の形成と関連がある。酸化ストレスは、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞および場合によっては脈絡毛細管枝に損傷をもたらす[Zarbin (2004), Arch Ophthalmol, vol 122: 598-614およびGorin, et al. (1999), Mol Vis,. vol 5: 29]。ＲＰＥへの損傷は、ブルッフ膜および脈絡膜内に慢性的な炎症性応答を誘起する傾向がある[Johnson et al. (2000), Exp Eye Res,. vol 70: 441-9]。この損傷および炎症は、ＣＮＶおよび萎縮を刺激することによって網膜損傷を助長し、増進させる[Zarbin (2004), Arch Ophthalmol, vol 122: 598-614およびWitmer, et al. (2003), Prog Retin Eye Res, vol 22: 1-29]。ＣＮＶは、創傷として認識される可能性のある血管（ＢＶ）の欠損および漏出をもたらす[Kent and Sheridan (2003), Mol Vis, vol 9: 747-55]。創傷治癒は脈絡膜から起こり、ブルッフ膜およびＲＰＥを経て網膜下空間へ入る。創傷治癒応答は、典型的な初期炎症応答、著しい脈管形成応答および組織形成、その後の関与するエレメントの最終段階の成熟を特徴とする。創傷リモデリングは、光受容体とそのそばのＲＰＥを不可逆的に損なうことになり、抗脈管形成療法以上のものでＣＮＶを処置する必要性が当化される[La Cour, Kiilgaard, and Nissen (2002), Drugs Aging, vol 19: 101-33.12]。
【０１５０】
ＣＮＶ関連繊維症、浮腫および炎症の結果としての正常な網膜および網膜下構造における変化は、個々にまたは累積的にＡＭＤ関連の視力喪失をもたらす[Tezel and  Kaplan (2004), Trends Mol Med, vol 10: 417-20およびAmbati, et al. (2003), Surv Ophthalmol, vol 48: 257-93]。滲出性ＡＭＤと関連のある複数の細胞とサイトカインの相互作用は、有効な処置の探索を極めて複雑にする。ＣＮＶおよび浮腫は抗ＶＥＧＦ治療薬により部分的に管理することができるが、瘢痕形成および炎症を緩和し得る可能性のある処置は十分に取り組まれてきていない[Bylsma and Guymer (2005), Clin Exp Optom, vol 88: 322-34およびPauleikhoff (2005), Retina, vol 25: 1065-84]。新生血管複合体が完全な状態で維持される限り、抗ＶＥＧＦ剤で処置された患者の場合がそうであるように、網膜下繊維症および将来的な視力喪失の可能性が続く。
【０１５１】
抗ＶＥＧＦ−Ａ療法は、滲出性ＡＭＤの処置において近年顕著な進歩を示す。しかしながら、ＶＥＧＦ−Ａの１６５のイソ型を選択的に阻害する高親和性アプタマーであるＰＥＧＡＰＴＡＮＩＢを用いた第ＩＩＩ相ＶＩＳＩＯＮ治験では、平均的な患者は視力を喪失し続け、少ない割合の患者のみが視力を得たことを示している[Gragoudas, et al. (2004), N Engl J Med, vol 351: 2805-16]。抗体フラグメントＲＡＮＩＢＩＺＵＭＡＢによるＶＥＧＦ−Ａの全てのイソ型の阻害（ｐａｎ−ＶＥＧＦ阻害）では、はるかに優れた結果が得られた[Brown, et al., N Eng Med (2006), vol. 355:1432-44, Rosenfeld, et al. N Eng J Med (2006), vol. 355:1419-31]。２年間のＭＡＲＩＮＡ治験および１年間のＡＮＣＨＯＲ治験から、およそ４０％の患者がある程度の視力回復を達成したことが示された。これらの結果は滲出性ＡＭＤを処置するための本発明者らの能力の大きな進歩を示すが、６０％の患者は視力改善を示さないこともまた示す。さらに、これらの患者は、厳密に定義された包含・除外基準を満たさなければならなかった。より大きな患者集団においての結果は、確実性が低いかもしれない。
【０１５２】
ＣＮＶの進行における他のステップを標的とするさらなる治療薬および最終的に光受容体破壊をもたらすプロセスを開発するという十分定義された必要性がなおある。第一に、脈絡膜ＢＶの成長には、全プロセスを調節または阻害する機会を提供する、ＶＥＧＦのみならず多くのメディエーター間での組織的な相互作用が含まれる[Gragoudas, et al. (2004), N Engl J Med, vol 351: 2805-16]。第二に、滲出性ＡＭＤは血管および血管外成分からなる。血管成分は血管内皮細胞（ＥＣ）、ＥＣ前駆体および周皮細胞を含む。容量的に最大成分であると思われる血管外成分は、炎症性細胞、グリア細胞、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞および繊維芽細胞からなる。組織損傷は、いずれかの成分から生じ得る。病理プロセスのこれら他の態様は、現在の抗ＶＥＧＦ処置では取り組まれていない。ＡＭＤに関連する脈管形成カスケードのさらなるエレメントを標的化すると、療法に対するより有効かつ相乗的なアプローチが提供できる[Spaide, RF (2006), Am J Ophthalmol, vol 141: 149-156]。
【０１５３】
眼球疾患における炎症
炎症、特にマクロファージおよび補体系[Klein, et al. (2005), Science, vol 308: 385-9;およびHageman, et al.(2005), Proc Natl Acad Sci U S A, vol 102: 7227-32]が滲出性ＡＭＤの病因において重要な役割を果たすという証拠が増えている。外科的に摘出した脈絡膜新生血管膜の組織病理は、マクロファージがほとんど普遍的に存在するということを示す[Grossniklaus, et al. (1994), Ophthalmology, vol 101: 1099-111およびGrossniklaus, et al. (2002), Mol Vis, vol 8: 119-26]。マクロファージは、細胞を傷害し、ブルッフ膜を分解するとともに脈管形成促進性サイトカインを放出し得る酵素の分泌を含む複数の作用[Otani, et al. (1999), Ophthalmol Vis Sci, vol 40: 1912-20およびAmin, Puklin, and Frank (1994), Invest Ophthalmol Vis Sci, vol 35: 3178-88]によって、ＣＮＶの形成および増殖を媒介する上で能動的な役割を果たし得るという証拠が増大している[Grossniklaus, et al. (2003), Mol Vis, vol 8: 119-26; Espinosa-Heidmann, et al. (2003), Invest Ophthalmol Vis Sci, vol 44: 3586-92; Oh, et al. (1999), Invest Ophthalmol Vis Sci, vol 40:  1891-8; Cousins, et al. (2004), Arch Ophthalmol, vol 122: 1013-8; Forrester (2003), Nat Med, vol 9: 1350-1およびTsutsumi, et al. (2003), J Leukoc Biol, vol 74: 25-32] 。損傷部位で、マクロファージは、脱顆粒など、活性化の微細形態学的徴候を示す[Oh, et al. (1999), Invest Ophthalmol Vis Sci, vol 40: 1891-8およびTrautmann et al. (2000), J Pathol, vol 190: 100-6]。すなわち、マクロファージ浸潤を脈絡膜新生血管複合体中に制限した分子は、ＣＮＶ形成を制限する助けとなり得ると考えられる。
【０１５４】
眼球疾患における脈絡膜新血管新生および血管成熟
脈管形成は、炎症性細胞に酸素および栄養素を送達し、残渣の除去を助けするので、正常な創傷治癒の必須構成要素である[Lingen (2001), Arch Pathol Lab Med, vol 125: 67-71]。進行性の脈管形成は、２つの異なるプロセスからなる：ステージＩ：血管ＥＣの、近傍刺激に応答した、それらが増殖し、管腔構造を形成する毛細血管の先端への遊走；およびステージＩＩ：血管網の退縮(pruning)および血管系の最適化[Guo, et al. (2003), Am J Pathol, vol 162: 1083-93]。
【０１５５】
ステージＩ：新血管新生
脈管形成はほとんどの場合、創傷治癒を補助する。しかしながら、制御されなければ、新生血管は一般に欠陥があり、漏出、大量出血および炎症を助長する。脈管形成促進性ＧＦを標的化することによって機能不全ＢＶおよび漏出性ＢＶを低下させることは、ＡＭＤの進行をある程度遅延できることが示されている[Pauleikhoff (2005), Retina, vol 25: 1065-84.14およびvan Wijngaarden, Coster, and Williams (2005), JAMA, vol 293: 1509-13]。
【０１５６】
ステージＩＩ：血管成熟および薬剤脱感作
Ｐａｎ−ＶＥＧＦ阻害は、実際のＣＮＶ病変が著しくは退縮しないので、主として、網膜内および網膜下の浮腫の分解をもたらす抗透過性作用を介して有益な作用を発揮するものと思われる。著しいＣＮＶ退縮がないのは、１つには、周皮細胞被覆による、新しく形成された血管の成熟の結果かもしれない。周皮細胞は、血管組織の発達と維持に重要な役割を果たす。周皮細胞の存在は、抗ＶＥＧＦ剤に対する耐性を付与し、脈管形成を阻害するそれらの能力を抑えるようである[Bergers and Song (2005), Neuro-oncol, vol 7: 452-64; Yamagishi and Imaizumi (2005), Int J Tissue React, vol 27: 125-35; Armulik, Abramsson and Betsholtz (2005), Circ Res, vol 97: 512-23; Ishibashi et al. (1995), Arch Ophthalmol, vol 113: 227-31]。周皮細胞の動員に対して阻害作用を有する薬剤はおそらく、血管チャネルの構築および脈絡膜の新生血管チャネルの成熟を妨害し、それにより抗脈管形成薬に対するそれらの感受性を保持するのであろう。
【０１５７】
血管網のリモデリングは、栄養要求を満たすための血管（ＢＶ）密度の調整を含む[Gariano and Gardner (2005), Nature, 438: 960-6]。ＢＶ未成熟期間は、新生血管は機能するが周皮細胞被覆をまだ獲得していない期間に相当する[Benjamin, Hemo, and Keshet (1998), Development, 125: 1591-8およびGerhardt and Betsholtz (2003), Cell Tissue Res, 2003. 314: 15-23]。この遅延は、網膜または脈絡膜の栄養要求に従い、発達中の血管系の微調整に可塑性の余地をもたらすのに不可欠なものである。
【０１５８】
生物活性脂質スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、アンギオポエチン（Ａｎｇ）および他の増殖因子（ＧＦ）は、血管成長を増大させ、平滑筋細胞（ＳＭＣ）および周皮細胞をナイーブ血管に動員して、出現血管のリモデリングを促進するする[Allende and Proia (2002), Biochim Biophys Acta, vol 582: 222-7; Gariano and Gardner (2005), Nature, vol 438: 960-6; Grosskreutz, et al. (1999), Microvasc Res, vol 58: 128-36; Nishishita, and Lin (2004), J Cell Biochem, vol 91: 584-93およびErber, et al. (2004), FASEB J, vol 18: 338-40.32]。周皮細胞は、ほとんどに場合、おそらく、ＥＣ発芽時にin situにおいて間葉細胞前駆体の分化によってか、または動脈平滑筋細胞の遊走および脱分化から生じ、緊密に会合し、ＥＣを被覆し、血管全体の成熟および生存をもたらす[Benjamin, Hemo, and Keshet (1998), Development, vol 125: 1591-8]。最近の研究では、Ｓ１ＰおよびＳ１Ｐ１受容体が、細胞−細胞間の接着分子Ｎ−カドヘリンの細胞表面移動および活性化に関与することが示されている[Paik, et al. (2004), Genes Dev, vol 18: 2392-403]。Ｎ−カドヘリンは、安定な血管床の発達を促進するＥＣ、周皮細胞および壁細胞の間の相互作用に不可欠である[Gerhardt and Betsholtz (2003), Cell Tissue Res, vol 314: 15-23]。Ｓ１Ｐ１遺伝子の広範囲な欠失により、胚発生中のＢＶ安定化に必要な発生期ＢＶの異常な壁細胞被覆をもたらす[Allende and Proia (2002), Biochim Biophys Acta, vol 1582: 222-7]。腫瘍異種移植モデルにおいてｓｉＲＮＡをＳ１Ｐ１へ局所注入すると、血管の安定化が抑制される[Chae, et al. (2004), J Clin Invest, vol 114: 1082-9]。トランスジェニックマウス試験では、ＶＥＧＦおよびＰＤＧＦ−Ｂが、新生ＢＶの成熟および安定化を促進することが示された[Guo, et al. (2003), Am J Pathol, 162: 1083-93およびGariano and Gardner (2005), Nature, vol 438: 960-6.50]。ＶＥＧＦはＡｎｇ−１（ｍＲＮＡおよびタンパク質）をアップレギュレーションする[Asahara, et al. (1998), Circ Res, vol 83: 233-40]。Ａｎｇ−１は、周皮細胞による内皮周辺の支持を補充および維持する上で主要な役割を果たす[Asahara, et al. (1998), Circ Res, vol 83: 233-40]。ＶＥＧＦの眼球内注射は、ＥＣ網状組織の周皮細胞被覆を促進した[Benjamin, Hemo, and Keshet (1998), Development, vol 125: 1591-8]。ＰＤＧＦ−Ｂ欠損マウスの胚は、微細血管周皮細胞欠損しており、これが浮腫、微細動脈瘤および致命的な出血につながる[Lindahl, et al. (1997), Science, vol 277: 242-5]。マウス胎児の研究では、血管床成熟の完全なＶＥＧＦ刺激およびＰＤＧＦ刺激にはさらなるシグナルが必要とされることが示された。上記のＳ１Ｐのトランス活性化に基づけば、この因子はＳ１Ｐである可能性がある[Erber et al. (2004), FASEB J, vol 18: 338-40]。血管の安定化および成熟は、可塑性の低下、ならびにＶＥＧＦおよび他のＧＦの離脱に対する退行の不在ならびに抗脈管形成療法に対する耐性と関連がある[Erber, et al. (2004), FASEB J, vol 18: 338-40およびHughes and Chan-Ling (2004), Invest Ophthalmol Vis Sci, vol 45: 2795-806]。脈管形成阻害剤に対するＢＶの耐性は、まず成熟した血管を安定化させる周皮細胞、そして療法の際に未熟な血管に動員される周皮細胞によって付与される[Erber, et al. (2004), FASEB J, vol 18: 338-40]。未熟なＥＣの被覆後、周皮細胞は、アポトーシス促進剤からＥＣを保護する代償的生存因子（Ａｎｇ−１およびＰＤＧＦ−Ｂ）を発現する。
【０１５９】
眼球疾患における浮腫および血管透過性
ＣＮＶ膜は、それらの血管内内容物を周辺空間に漏出し、その結果、網膜下出血、滲出物および体液蓄積をもたらす傾向のある有窓血管ＥＣからなる[Gerhardt and Betsholtz (2003), Cell Tissue Res, vol 14: 15-23]。長い間、ＣＮＶ組織それ自体が、また最近では網膜内新血管新生が、ＡＭＤに関連する視力低下に関与していることが示唆されてきた。しかしながら現在では、血管透過性（ＶＰ）の増加により引き起こされる黄斑浮腫とそれに続く血液網膜関門（ＢＲＢ）の崩壊が、ＡＭＤと関連した視力喪失および他の眼球疾患（糖尿病関連の失明を含む）において主要な役割を果たすと考えられている[Hughes and Chan-Ling (2004), Invest Ophthalmol Vis Sci, vol 45: 2795-806; Felinski and Antonetti (2005), Curr Eye Res, vol 30: 949-57; Joussen, et al. (2003), FASEB J, vol 17: 76-8およびStrom, et al. (2005), Invest Ophthalmol Vis Sci, vol 46: 3855-8]。特に、糖尿病性網膜症（ＤＲ）および糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）は糖尿病患者において一般的な微小血管合併症であり、糖尿病関連の失明の最も多い原因である。ＤＭＥは微小血管透過性の増大から起こる。Joussen, et al. (2003), FASEB J, vol 17: 76-8。これらを一緒にすると、労働人口において新たな失明の最も多い原因である。Ｓ１Ｐを標的とする抗体などの化合物はこれらの症状に治療上有用であると考えられる。
【０１６０】
本発明に従って処置され得る数種の疾患の例を以下に記載する。多くの疾患および症状は、少なくとも部分的に、複数の病理学的プロセス（例えば、病理学的新血管新生および瘢痕化の両方）を特徴とし、本明細書で提供される分類は記述的利便性を目的とするものであって、本発明を限定するものではないと考えられる。
【０１６１】
ａ．網膜上および／または網膜下の膜形成を特徴とする病理学的新血管新生および疾患と関連した虚血性網膜症
虚血性網膜症（ＩＲ）は、網膜血流の低下を特徴とする多様な障害群である。ＩＲの例としては、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、鎌状細胞網膜症および網膜静脈閉塞性疾患が含まれる。これらの障害は全て、ＶＥＧＦにより駆動される病理学的な網膜新血管新生の増殖に関連づけることができ、やがては眼球内出血、網膜上膜形成および牽引性網膜剥離に至り得る。特発性網膜上膜（ＥＲＭ）は、黄斑パッカーまたはセロファン網膜症とも呼ばれ、網膜構造の変形に次いで視力低下を引き起こし得る。これらの膜は、外科的に除去しても再発することがあり、網膜虚血を伴うこともある。ＶＥＧＦおよびその受容体はＥＲＭに局在している。増殖性糖尿病網膜症、増殖性硝子体網膜症および黄斑パッカーと関連のある膜内にＶＥＧＦが存在することは、このサイトカインが、脈管形成において、虚血性網膜疾患において、また、増殖性硝子体網膜障害における膜増殖において、重要な役割を果たすことをさらに示唆する。さらにＶＥＧＦ受容体ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２もまた、ＥＲＭの細胞で同定される。これらのデータは、ＶＥＧＦが血管性および無血管性ＥＲＭの進行に関与し得る自己分泌および／またはパラ分泌刺激因子であり得るということを示す。ＰＤＧＦおよびその受容体[Robbins, et al. (1994), Invest Ophthalmol Vis Sci; vol 35: 3649-3663]は、増殖性網膜疾患に罹患している眼球において記載されている[Cassidy, et al. (1998), Br J Ophthamol; vol 82: 181-85およびFreyberger, et al. (2000), Exp Clin Endocrinol Diabetes, vol 108: 106-109]。これらの知見は、ＰＤＧＦリガンドおよび受容体は、種々の起源の増殖性網膜の膜中に拡散していることを示唆し、ＰＤＧＦによる自己分泌およびパラ分泌刺激はＥＲＭ病理に関与し得ることを示唆している。トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）は、ＴＧＦ染色および免疫活性によって示されるように、ＥＲＭの形成と関与している[Pournaras, et al. (1998), Klin Monatsbl Augenheilkd, vol 212: 356-358]。さらに、ＴＧＦ−β受容体ＩＩは、糖尿病性膜およびＰＶＲ膜のＥＲＭの筋繊維芽細胞で発現される。これらの結果は、網膜およびＥＲＭの複数の細胞種で産生されたＴＧＦ−βは、ＰＶＲ、糖尿病性の、および二次的なＥＲＭの処置のための魅力的な標的であることを示唆する。インターロイキン−６（ＩＬ−６）は、増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）においてヒト硝子体中で増加するということが報告されており[La Heij, et al. (2002), Am J Ophthal, 134: 367-375]、ある研究では、研究された１００％糖尿病性ＥＲＭがＩＬ−６タンパク質を発現した[Yamamoto, et al. (2001) Am J Ophthal, vol 132: 369-377]。
【０１６２】
塩基性繊維芽細胞性増殖因子（ｂＦＧＦ）の外的投与は、内皮増殖およびＶＥＧＦ発現を誘発することが示されている[Stavri, et al. (1995), Circulation, vol 92: 11-14]。これらの知見と一致して、ｂＦＧＦ濃度は、ＰＤＲ患者からの硝子体サンプル内で増加している[Sivalingam, et al. (1990), Arch Ophthalmol, vol 108: 869-872およびBoulton, et al. (1997), Br J Ophthalmol, vol 81: 228-233]。ｂＦＧＦは、ＥＲＭの形成にも関与しており[Hueber, et al. (1996), Int. Ophthalmol, vol 20: 345-350]、試験した１０のＰＤＲ膜のうち８つの膜においてｂＦＧＦを示した。さらに、これらの研究者らは、対応する受容体ＦＧＦＲ１について陽性染色を見出した。また、ｂＦＧＦに対する免疫反応性は、無血管性特発性ＥＲＭにおいても示されている。これらの結果は、血管性および無血管性ＥＲＭの双方の形成にｂＦＧＦを関連づけるものである。Harada, et al. (2006), Prog in Retinal and Eye Res, vol 25; 149-164。上昇したｂＦＧＦは、ＲＯＰ患者の血清でも検出されている[Becerril, et al. (2005), Ophthalmology, vol 112, 2238]。
【０１６３】
Ｓ１Ｐの既知の多面発現作用、およびＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−６との相互作用を考えれば、Ｓ１Ｐと結合する、Ｓ１Ｐに拮抗する、Ｓ１Ｐの作用または産生を阻害する薬剤は、虚血性網膜症および血管性または無血管性ＥＲＭ形成を特徴とする後眼部疾患において病理学的網膜新血管新生を抑制する際に有効であると考えられる。少なくとも部分的に、異常な新血管新生または脈管形成を特徴とする他の眼球症状には、加齢性黄斑変性、角膜移植拒絶反応、新生血管緑内障、コンタクトレンズの過剰装着、角膜感染（単純ヘルペス、帯状疱疹および原虫感染を含む）、翼状片、感染性ブドウ膜炎、慢性網膜剥離、レーザー損傷、鎌状細胞網膜症、静脈閉塞疾患、脈絡膜新血管新生、網膜血管腫増殖および特発性ポリープ状脈絡膜血管障害を含む。
【０１６４】
ｂ．増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）
ＰＶＲは、自然発生的裂孔原性網膜剥離後および外傷性網膜剥離後に見られる。それは、網膜剥離術の失敗が主な原因である。それは、後部硝子体表面および硝子体基体上での網膜両側の細胞膜の増殖および収縮を特徴とする。眼におけるこの過剰な瘢痕組織の発生は、牽引性網膜剥離の進行をもたらし、そのために増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）の予防または阻害に向けた処置は、網膜剥離の管理に関する論理的原理である。病理組織学的にＰＶＲは、過剰なコラーゲン産生、収縮および細胞増殖を特徴とする[Michels, Retinal Detachment 2nd Edition. Wilkinsin CP, Rice TA Eds, Complicated types of retinal detachment, pp 641-771, Mosby St Louis 1997]。ＰＶＲ膜において同定された細胞種は、主として網膜色素上皮細胞、繊維芽細胞、マクロファージおよび血管内皮細胞を含む[Jerdan, et al. (1989), Ophthalmology, vol 96: 801-10およびVidinova, et al. (2005), Klin Monatsbl Augenheilkd; vol 222:568-571]。この過剰な瘢痕化反応の病態生理は、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）β、塩基性繊維芽細胞性増殖因子（ｂＦＧＦ）、インターロイキン−６（ＩＬ）−６およびインターロイキン−８（ＩＬ）−８を含む多くのサイトカインによって媒介されることが明らかである[Nagineni, et al. (2005), J Cell Physiol, vol 203: 35-43; La Heij, et al (2002), Am J Ophthalmol, 134: 367-75; Planck, et al. (1992), Curr Eye Res; vol 11: 1031-9; Canataroglu et al. (2005) Ocul Immunol Inflamm; vol 13: 375-81およびAndrews, et al. (1999), Ophthalmol Vis Sci; vol 40: 2683-9]。これらのサイトカインの阻害は、タイミング良く与えられれば、ＰＶＲの発症を防ぐか、またはその重篤度を制限するのに役立ち得る[Akiyama, et al (2006), J Cell Physiol, vol 207:407-12およびZheng, et al (2003), Jpn J Ophthalmolm, vol 47:158-65]。
【０１６５】
スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）は、多面発現作用を有する生物活性リゾ脂質である。それは脈間形成促進性、炎症性（マクロファージおよびマスト細胞の動員を刺激する）および繊維形成促進性（瘢痕形成を刺激する）である。Ｓ１Ｐは一般に、細胞を刺激して増殖させ、遊走させ、抗アポトーシス性である。Ｓ１Ｐは、多くのサイトカインおよび増殖因子との相互作用を介してこれらの生物学的に多様な機能を達成する。モノクローナル抗体（ＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢ）を介するＳ１Ｐの阻害は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ｂＦＧＦ、ＩＬ−６およびＩＬ−８の機能を遮断することを示されている[Visentin, B et al. (2006), Cancer Cell, vol 9: 1-14]。また、Ｓ１ＰとＳ１Ｐ１受容体との結合は、ＰＤＧＦ産生も増加させることができ、従って、Ｓ１Ｐと結合する薬剤はＰＤＧＦ産生も低下させると予想される[Milstien and Spiegel (2006), Cancer Cell, vol 9:148-150]。下記の実施例で示されるように、今般、in vitroにおいて、Ｓ１ＰはヒトＲＰＥ細胞を、ＰＶＲで見られる種類と類似した筋繊維芽細胞様の表現型に変換することが示された。ＰＶＲにおいて見られる過剰な瘢痕化を最終的にもたらす病態生理およびこれらの同じ重要なメディエーターに対するＳ１Ｐの既知の作用を考えれば、Ｓ１Ｐと結合する、Ｓ１Ｐと拮抗する、またはＳ１Ｐの作用または産生を阻害する薬剤は、ＰＶＲの発症および眼に対するその重篤な損傷作用を排除または最小限にする点で有効であると考えられる。
【０１６６】
ｃ．ブドウ膜炎．
ブドウ膜炎は、眼のブドウ膜の炎症性障害である。それは、眼の前部（前方）または後部（後方）またはその双方に影響し得る。それは、病因においては特発性または伝染性であって、視力を脅かす可能性がある。特発性ブドウ膜炎は、前房におけるＣＤ４＋発現の増強と関連づけられている[Calder, et al. (1999), Invest Ophthalmol Vis Sci, vol 40: 2019-24]。これらデータはまた、ブドウ膜炎の病理におけるＴリンパ球およびその化学誘引物質ＩＰ−１０の病理学的役割も示唆している[Abu El-Asrar (2004), Am J Ophthalmol, vol 138: 401-11]。急性前部ブドウ膜炎におけるその他のケモカインとしては、マクロファージ炎症性タンパク質、単球走化性タンパク質−１およびＩＬ−８が含まれる。これらのサイトカインはおそらく、急性前部ブドウ膜炎における白血球動員に重要な役割を果たしている。Verma, et al. (1997), Curr Eye Res; vol 16; 1202-8。Ｓ１Ｐシグナル伝達カスケードの著しい多面発現作用を考えれば、生物活性脂質の有効濃度を低下させるＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢおよびその他の免疫部分は、ブドウ膜炎に関連する眼球内炎症を軽減または調節する有効な方法として役立つと考えられる。
【０１６７】
ｄ．屈折矯正手術．
角膜創傷治癒応答は、安全性および効力の主要な決定因子であるため、屈折矯正法に対して特に関連がある。これらの手法は、近眼、遠視および乱視の処置のために行われる。レーザーin situ角膜曲率形成術（ＬＡＳＩＫ）および光学的角膜切除術（ＰＲＫ）は最も一般的な屈折矯正法であるが、合併症を克服する試みにおいてその他の方法も開発されている。これらの合併症には、とりわけ、過剰矯正、矯正不足、退行および間質角膜混濁が含まれる。多くの一般的な合併症は治療応答に関連し、手術に対する生物学的応答にその基礎を持つ。角膜の生物学における最大の挑戦の１つは、繊維形成ではなく再生による組織修復を促進することである。再生と繊維形成の間の選択は繊維芽細胞活性化の制御にあると考えられる[Stramer, et al (2003), Invest Ophthalmol Vis Sci; vol 44: 4237-4246およびFini (1999) Prog Retin Eye Res, vol 18: 529-551]。筋繊維芽細胞と呼ばれる細胞は、手術または損傷後１〜２週間で上皮下間質に出現し得る。おそらく、筋繊維芽細胞は、ＴＧＦ−βの影響下にあるケラチノサイト(kerateocytes)から誘導される[Jester, et al. (2003), Exp Eye Res, vol 77: 581-592]。角膜のかすみおよび間質の瘢痕化は、角膜の透明性の低下を特徴とし、繊維芽細胞および筋繊維芽細胞生成と関連づけることができる。in situおよびin vitroにおける研究では、ＴＧＦ−βおよびＰＤＧＦが筋繊維芽細胞分化の刺激に重要であることが示唆されている[Folger, et al. (2001), Invest Ophthalmol Vis Sci; 42: 2534-2541]。かすみは、特定の環境下でのＬＡＳＩＫ後の中心部の界面において言及することができる。これらには、広範囲の表層角膜炎、ドーナツ型フラップおよび界面での上皮破片の保持が含まれる。これらの各々は、上皮細胞から活性化されたケラチノサイトへのＴＧＦ−βのアクセス増と関連するようである[Netto, et al. (2005), Cornea, vol 24: 509-522]。退行は、角膜繊維芽細胞および／または筋繊維芽細胞による上皮調節増殖因子の産生増加などの、高まった上皮−間質創傷治癒の相互作用のためである可能性が最も高い[Netto, et al. (2005), 前掲]。局所的抗ＴＧＦ−β抗体を用いたＴＧＦ−βの受容体への結合の阻害は、ＰＲＫにより誘発されるかすみを軽減することが示されている[Jester, et al. (1997), Cornea, vol 16: 177-187]。それは、繊維形成過程に対する抗生物活性脂質抗体およびＴＧＦ−βの既知の作用を考えれば、かすみ、間質の瘢痕化および退行などの屈折矯正手術の合併症のいくつかを処置する助けとなると考えられる。
【０１６８】
ｅ．緑内障濾過手術の調節
緑内障は、従来、高い眼球内圧が視神経に損傷を引き起こし、最終的には視野および／または視力が低下する疾患であると考えられてきた。視神経損傷が正常圧の状況で起こり得る他の形態の緑内障、いわゆる「正常眼圧緑内障」も存在する。多くの患者に対して、投薬でその疾患を管理することができるが、眼内に外科的に瘻孔を作出して体液を排出させる緑内障濾過手を必要とする場合もある。これは、繊維柱帯切除術、医療装置の移植またはその他の外科的介入法を介して果たすことができる。緑内障濾過手術は、繊維芽細胞の増殖および最終的な瘢痕化を特徴とする創傷治癒過程のために上手くいかない。５−フルオロウラシルおよびマイトマイシンＣなどの代謝拮抗物質はその後の瘢痕化を軽減することができるが、これらの薬剤を用いたとしても、長期間追跡すると、外科的失敗がなお深刻な臨床的課題であることが示される[Mutsch and Grehn (2000), Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol; vol 238: 884-91およびFontana, et al. (2006), Ophthalmology, vol 113: 930-936]。ヒトのトノン嚢繊維芽細胞の研究では、それらがｂＦＧＦおよびＰＤＧＦおよびＴＧＦ−βを合成する能力を有すること、およびこれらの増殖因子がこの方法の失敗の一因となる緑内障濾過手術後の組織修復過程に関わっていることを示している。Trpathi, et al. (1996), Exp Eye Res, vol 63: 339-46。また、これらの増殖因子を浸潤後の創傷応答に関連づけたさらなる研究では[Denk, et al. (2003), Curr Eye Res; vol 27: 35-44]、ＰＤＧＦの様々なイソ型が緑内障濾過手術後のトノン嚢繊維芽細胞の増殖の主な刺激因子であり、一方、ＴＧＦ−βはトノン嚢繊維芽細胞から筋繊維芽細胞への変換に不可欠であることが結論づけられた。本発明者らは、Ｓ１Ｐがヒトのトノン嚢／結膜の繊維芽細胞に存在すること、およびＳ１Ｐが創傷治癒応答において強く発現するということを実証した。Ｓ１Ｐはまた、複数の繊維芽細胞種の繊維形成促進機能および筋繊維芽細胞表現型への変換およびコラーゲン産生も刺激する。Ｓ１Ｐの特異的な多面発現作用およびｂＦＧＦ、ＰＤＧＦおよびＴＧＦ−βとのその既知の相互作用を考えれば、Ｓ１Ｐと結合する、Ｓ１Ｐに拮抗する、Ｓ１Ｐの作用または産生を阻害する薬剤は、緑内障手術の失敗をもたらす創傷治癒および／または繊維形成促進応答を調節するのに有効であり、首尾よい外科的成果を高める有効な治療方法であると考えられる。この薬剤は例えば硝子体内または結膜下注射により、または局所的に投与できると考えられる。
【０１６９】
ｆ．角膜移植
角膜移植（全層角膜移植（ＰＫ））は、ヒトにおいて最も成功している組織移植法である。米国では年間４７，０００例の角膜移植が行われるが、角膜の同種移植片拒絶は、依然として角膜移植の失敗の主因である[Ing, et al. (1998), Ophthalmology, vol 105: 1855-1865]。現在のところ、免疫抑制および免疫調節は有望なアプローチであり得るが、同種移植片拒絶を十分に回避することはできない。最近、ＣＤ４（＋）Ｔ細胞が角膜同種移植片の拒絶反応においてヘルパー細胞ではなくエフェクター細胞として直接的に機能することが発見された。Hegde, et al. (2005), Transplantation, vol 79: 23-31。ネズミでの研究では、拒絶を受けている角膜の間質において好中球、マクロファージおよびマスト細胞の数の増加が示された。マクロファージが主要な浸潤細胞種であり、これにＴ細胞、マスト細胞および好中球が続いた。リスクの高い角膜移植における初期のケモカインの発現は、ＩＬ−８（マクロファージ炎症タンパク質−２）および単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）のマウスホモログであった[Yamagami, et al. (2005), Mol Vis, vol 11, 632-40]。
【０１７０】
ＦＴＹ７２０（ＦＴＹ）は、リンパ球移動を変化させることによって作用する新規な免疫抑制薬であり、末梢血リンパ球減少およびリンパ節におけるリンパ球数増加をもたらす。ＦＴＹは、リンパ球で発現したＳＩＰ受容来のいくつかと結合することによって、その免疫調節作用に介在する[Bohler, et al. (2005), Transplantation, vol 79: 492-5]。該薬剤を経口投与すると、一回の経口用量により、末梢リンパ球数を３０〜７０％まで減少させた。ＦＴＹはＴ細胞サブセットのＣＤ８（＋）細胞よりもＣＤ４（＋）細胞をより減少させた。Bohler, et al. (2004), Nephrol Dial Transplant, vol 19: 702-13。ＦＴＹ処置マウスは、経口投与した場合に、同所角膜移植片生着期間の有意な延長を示した。Zhang, et al. (2003), Transplantation, vol 76: 1511-3。ＦＴＹ経口処置はまた、ラット対マウス角膜異種移植モデルにおける拒絶を顕著に遅延させ、その重篤度を引き下げた[Sedlakova, et al. (2005), Transplantation, vol 79, 297-303]。同種移植片拒絶の既知の病因を、Ｓ１Ｐシグナル伝達の作用を調節することで角膜移植片生着率を改善できることを示唆するデータを考え合わせると、生物活性脂質の有効濃度を低下させる免疫部分、例えばＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢもまた、例えば、免疫応答を弱めることにより、同種移植片拒絶などの免疫学的症状の処置に有用であり、従って、ＰＫ後の角膜移植片生着率を改善する可能性があると考えられる。また該薬剤は、全身投与の他、局所投与、例えば局所的眼周囲送達または眼球内送達が可能であるという付加的利点も持ち得る。
【０１７１】
炎症または免疫成分を有する他の眼球疾患には、慢性硝子体炎、（単純ヘルペス、帯状疱疹および原虫感染感染を含む）および眼球ヒストプラズマ症が含まれる。
【０１７２】
ｇ．瘢痕化を特徴とする前眼部疾患
また、生物活性脂質を標的とする抗体を用いた処置は、前眼部の瘢痕化を特徴とするいくつかの症状に利益を与えると考えられる。これらには下記のものが含まれる。
ｉ．外傷
眼の前方構造としての角膜は、物理的外傷をもたらし得る空気中のゴミから鈍的外傷にわたる様々な危険に曝されている。角膜および前眼部表面は、手術および酸やアルカリなどの化学物質の傷害による他の形態の外傷に曝される可能性もある。これらの種類の傷害の結果は壊滅的であり得、角膜および結膜の瘢痕化眼球癒着(symblephera)形成をもたらすことも多い。さらに角膜の新血管新生が結果として起こり得る。好中球の蓄積、ロイコトリエンのそれらの放出、およびインターロイキン−１およびインターロイキン−６の存在は、角膜に浸潤し、タンパク質分解酵素を放出する炎症性細胞の一連の波を動員する働きをし[Sotozono, et al. (1997), Curr Eye Res, vol 19: 670-676]、さらなる角膜組織の損傷および分解ならびに角膜溶解をもたらす。さらに、角膜および結膜の繊維芽細胞が活性化され、浸潤してコラーゲン沈着および繊維症をもたらす。過剰な炎症および瘢痕化の望ましくない作用は、ＴＧＦ−βによって促進される。Saika, et al. (2006), Am J Pathol vol 168, 1848-60。この過程は角膜の透明性の損失および視力喪失をもたらす。好中球浸潤の低下および繊維症の低下を含む炎症の低下は、アルカリ焼けした角膜のマウスモデルにおいてより迅速かつより完全な治癒をもたらした[Ueno, et al. (2005), Ophthalmol Vis Sci, vol 46: 4097-106]。
【０１７３】
ｉｉ．眼球瘢痕性類天疱瘡（ＯＣＰ）
ＯＣＰは、主として結膜を侵す慢性瘢痕性（瘢痕形成性）自己免疫疾患である。該疾患は常に進行性であり、予後は極めて悪い。その最終ステージにおいて、結膜の瘢痕化および関連した角膜症が両眼失明をもたらす。組織学的にこの結膜は、粘膜下の瘢痕化および慢性的炎症を示し、この場合、マスト細胞の関与が驚くほど大きい[Yao, et al. (2003), Ocul Immunol Inflamm, vol 11: 211-222]。自己抗原は自己抗体の形成をもたらす。自己抗原に対する自己抗体の結合は、Ｔリンパ球の浸潤を伴う複雑な一連の事象を始動させ、この場合には、ＣＤ４（ヘルパー）細胞はＣＤ８（サプレッサー）細胞よりも遙かに数が多い。マクロファージおよびマスト細胞の浸潤、さらには炎症性および繊維形成促進性サイトカインの放出も結果として起こる。サイトカインにより誘発された結膜繊維芽細胞の増殖および活性化が、結果としての上皮下の繊維症とともに起こる（下記実施例参照）。研究から、ＯＣＰ患者での結膜繊維症におけるＴＧＦ−βおよびＩＬ−１の役割が示された[Razzaque, et al. (2004), Invest Ophthalmol Vis Sci, vol 45: 1174-81]。
【０１７４】
ｉｉｉ．スティーブンス・ジョンソン症候群（ＳＪＳ）および中毒性表皮壊死症（ＴＥＮ） 
ＳＪＳおよびＴＥＮは、投薬に対する生命を脅かす副作用である。これら２つの関連症状の眼球後遺症は重篤であり、眼球および眼瞼結膜、瞼および角膜の病理学的変化を含む。薬剤および感染症が最も多い関与因子である。慢性的な眼の所見としては、瘢痕化、瞼球癒着形成および初期炎症過程の結果としての結膜の瘢痕形成が含まれる。これは、眼瞼内反形成、睫毛乱生症および涙液層の不安定化をもたらす。眼球表面の崩壊は、角膜の瘢痕化、新血管新生および重篤な場合には角質化をもたらす。ＯＣＰの場合と同様に、結膜の上皮下繊維症が起こる。薬剤または感染に対する活発な自己免疫リンパ球応答は、ＳＪＳ／ＴＥＮの発症に役割を果たすと考えられる。Harilaos, et al. (2005), Erythema Multiforme, Stevens Johnson Syndrome, and Toxic Epidermal Necrolysis, in Cornea 2nd edition. Krachmer, Mannis, Holland eds.Elesevier Mosby Philadelphia。ＳＪＳにおける浸潤性細胞集団は、マクロファージ、ＣＤ４陽性Ｔ細胞およびＣＤ８陽性Ｔ細胞を含む。この細胞集団は化学損傷に見られるものと類似している。Kawasaki, et al. (2000), J Ophthalmol, vol 84: 1191-3。
【０１７５】
ｉｖ．             翼状片
臨床上、翼状片は、眼瞼間の裂溝に存在する肉質の血管塊として見られる。翼状片本体は、肉質の繊維性血管塊である。活発な翼状片は、著しい血管充血および連続的成長を特徴とする。それらは、眼球に強固に付着する。進行した症例では、翼状片は、角膜上に侵入し、視軸内で角膜の透明性の損失または異常な乱視に次ぐ、視力喪失を引き起こし得る。症候的には、患者は、異質な身体感覚、裂傷およびぼやけた視力を経験し得る。組織病理学は、固有質の上皮下結合組織のヒアリン化、繊維芽細胞数の増加およびマスト細胞の増加を示す。Butrus, et al. (1995), Am J Ophthalmol, vol 119: 236-237。翼状片の管理には問題が残っている。外科的切除が行われる場合が多いが、再発率は高い[Krag, et al. (1992), Acta Ophthalmol, vol 70: 530]。翼状片の再発率を引き下げる助けとするために、マイトマイシン−Ｃおよびダウノルビシンなどの種々の薬理学的アジュバンドが用いられている。これらは有用であり得るが、長期データは限られており、それらは胸膜薄層化および角膜溶解に関わり得る。Dougherty, et al. [(1996), Cornea, vol 15: 537-540およびLee, et al. (2001)は、ＶＥＧＦが翼状片の発症に重要な役割を果たし得ることを初めて実証し、翼状片の上皮組織においてＶＥＧＦおよび一酸化窒素を同定した。これらの研究者らは、これらは、他のサイトカインと同様に、翼状片に特徴的な繊維性血管の増殖を担うという仮説を立てた。原発性および再発性双方の翼状片において、塩基性ＦＧＦおよびＴＧＦ−β１の存在が示されており[Kira, et al. (1998), Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol, vol 236: 702-8]、発表された形態学的および免疫組織学化学的証拠は、脈管形成が翼状片の形成において役割を果たし得るという概念をさらに裏付けるものであった[Marcovich, et al (2002), Curr Eye Res, vol 25:17-22]。他の研究では、翼状片の発症に関連し得るメディエーターとしてＩＬ−６およびＩＬ−８ならびにＶＥＧＦを示唆した[Di Girolamo, et al. (2006), Invest Ophthalmol Vis Sci, vol 47: 2430-7]。翼状片の形成および成長に対する有効な薬剤は、外科的介入の必要性を低くするか、または再発率を減少させ得る。
【０１７６】
繊維形成、繊維症または瘢痕化成分を有する他の眼球疾患および症状としては、ＡＭＤ、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、鎌状細胞網膜症、虚血性網膜症、網膜静脈閉塞性疾患およびコンタクトレンス過剰装着を含む。
【０１７７】
要約すると、過剰な瘢痕化は、多くの眼球疾および非眼球の疾患および症状の病態生理の根本的な要素である。生物活性脂質様のＳ１Ｐがこの過程において役割を果たし、これらの薬剤の濃度を減少させるための抗体関連処置は、該処置を受ける患者に対して治療的利益をもたらす可能性がある。一実施形態において、生物活性脂質の阻害剤、特にＳ１Ｐに対するモノクローナル抗体および／またはその変異体は、外科的および外傷性の創傷治癒応答を調節するのに有用であると考えられる。
【０１７８】
繊維症、繊維形成および瘢痕形成
網膜下繊維症の形成は、光受容体への不可逆的な損傷および永久的な視力低下をもたらす。新生血管複合体が完全な状態を維持する限り、抗ＶＥＧＦ剤で処置された患者の場合がそうであるように、網膜下繊維症および将来的な視力喪失の可能性が残る。ＲＡＮＩＢＩＺＵＭＡＢ(ルセンチス(Lucentis)（登録商標）)のＰＲＯＮＴＯ試験の最新情報では、視力を失った患者は、網膜下繊維症またはＲＰＥ裂傷のいずれかの結果としてそうなったことが見出された。繊維芽細胞浸潤およびコラーゲン沈着の程度を低減可能な薬剤は有用である。
【０１７９】
繊維芽細胞、特に筋繊維芽細胞は、細胞の損傷および炎症に応答した瘢痕形成における重要な細胞要素である[Tomasek, et al. (2002), Nat Rev Mol Cell Biol, vol 3: 349-63およびVirag and Murry (2003), Am J Pathol, vol 163: 2433-40]。筋繊維芽細胞によるコラーゲン遺伝子の発現はリモデリングの顕著な特徴であり、瘢痕形成に必要である[Sun and Weber (2000), Cardiovasc Res, vol 46: 250-6およびSun and Weber (1996), J Mol Cell Cardiol, vol 28: 851-8]。Ｓ１Ｐは、繊維芽細胞の遊走および増殖を活性し、一方でコラーゲン産生を増強することによって創傷治癒を促進する[Sun, et al. (1994), J Biol Chem, vol 269: 16512-7]。損傷細胞によって局所的に産生されたＳ１Ｐは、リモデリングおよび瘢痕形成に関連する不適応な創傷治癒を担い得る。よって、Ｓ１Ｐ阻害剤は、少なくとも部分的に、異常な繊維形成または繊維症を特徴とする疾患または症状に有用であると考えられる。
【０１８０】
網膜下繊維症の形成は、光受容体への不可逆的な損傷および永久的な視力低下をもたらす。新生血管複合体が完全な状態を維持する限り、抗ＶＥＧＦ剤で処置された患者の場合がそうであるように、網膜下繊維症および将来的な視力喪失の可能性が残る。
【０１８１】
Ｓ１Ｐの中和による不適応な瘢痕形成の最小化は有益であり、網膜下繊維症およびそれに続く光受容器の損傷の程度を制限することにより、視力の不可逆的低下を防ぐ。Ｓ１Ｐが滲出性ＡＭＤに関連する不適応な網膜リモデリングの初期および後期ステージの双方に関与し得ることを示唆する証拠が増えている。Ｓ１Ｐは著しい非ＶＥＧＦ依存性脈管形成促進作用を有する。Ｓ１Ｐはまた、滲出性ＡＭＤおよび他の眼球障害の複数の不適応なプロセスに関与する）の遊走、増殖および生存も刺激する。Ｓ１Ｐは、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦおよび滲出性ＡＭＤの病理に関与するその他の増殖因子（ＧＦ）の酸性および活性化に関連する。最後に、Ｓ１Ｐは、抗脈管形成薬に対する感受性の低下をもたらす過程である新生血管の成熟を調節し得る。Ｓ１Ｐの作用を阻害することは、もっぱら抗ＶＥＧＦアプローチにまさる有意な利点を与え得るか、または最終的にＡＭＤに関連する視力喪失をもたらす複雑な過程および複数のステップに取り組むためにそれらと相乗作用し得る滲出性ＡＭＤに対する有効な治療的処置であり得る。
【０１８２】
ＡＭＤに対する現行の好ましい治療モダリティーとしてはルセンチス（登録商標）)およびオフラベル使用のアバスチン（Avastin）（登録商標））(Genentech, Inc.)が含まれ、双方とも単一の増殖因子（ＶＥＧＦ−Ａ）を標的とし、実際の脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）病変は著しくは退縮しないので、網膜下および網膜内浮腫の消散をもたらす抗透過性作用を介してそれらの有益な効果の大部分を発揮するようである。しかしながら、滲出性ＡＭＤに関連する視力喪失はＣＮＶにより誘発される網膜下および網膜内浮腫よるだけではない。ＣＮＶ、網膜下繊維症、浮腫および炎症が一緒になって引き起こす網膜および網膜下構造の病理学的な破壊およびリモデリングはＡＭＤに関連する視力の喪失をもたらす。これらの複数の原因は、ルセンチス（登録商標）を含む利用可能な処置によって取り組まれていない。従って、視力喪失を引き起こす複数の機構を処置することができる治療薬は、単剤療法として、または抗ＶＥＧＦ剤（例えば、ルセンチス（登録商標）またはアバスチン（登録商標））との組合せで大きな価値がある。
【０１８３】
よって、特定の理論に縛られるものではないが、Ｓ１Ｐなどの望ましくないスフィンゴ脂質および／または１以上のそれらの代謝産物のレベルが、不適切な炎症、繊維症および／または脈管形成が疾患の病因に関与する種々の眼球疾患および症状の発症に原因であるか、または関与すると考えられる。抗Ｓ１Ｐ抗体が臨床上有用である可能性のある眼の疾患および症状としては、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、ＰＶＲ、前眼部疾患および加齢性黄斑浮腫、緑内障の柵状識切除術または弁移植などの術後のウエット型とドライ型の双方が含まれる。
【０１８４】
硬皮症の処置のための抗Ｓ１Ｐ抗体
本発明の組成物および方法は、少なくとも部分的に、異常な新血管新生、脈管形成、繊維形成、線維症、瘢痕化、炎症および免疫応答を特徴とする障害および疾患の処置において有用である。このような疾患の１つが硬皮症であり、全身性硬化症とも呼ばれる。
【０１８５】
硬皮症は、皮膚の瘢痕化または肥厚を引き起こし、時には、肺、心臓および／または腎臓を含む他の身体領域も含む自己免疫疾患である。硬皮症は、身体の皮膚および臓器において、関連領域の肥厚および硬化をもたらし、結果として機能低下を伴い得る瘢痕組織の形成（線維症）を特徴とする。今日、硬皮症財団によれば、約３００，０００人のアメリカ人が硬皮症を有する。罹患している３分の１またはそれ以下の者は広範囲の疾患を有し、残りの３分の２は主に皮膚疾患を有する。該疾患が肺に作用して瘢痕化を引き起こす場合には、このような肺はもはやあるべきような拡張ができないことから、呼吸が制限されるようになり得る。呼吸の能力を測定するために、医師は強制肺活量（ＦＶＣ）を評価する装置を用いる。予測値の５０パーセント未満のＦＶＣを有する人々において、硬皮症に関連した肺疾患からの１０年間の死亡率は約４２パーセントである。死亡率が非常に高い１つの理由は、現在利用できる有効な処置がないためである。
【０１８６】
特定の理論に縛られるものではないが、Ｓ１Ｐなどの脂質および／またはその代謝産物の不適切な濃度は硬皮症を引き起こす、またはその発症に関与すると考えられる。本発明の組成物および方法はそれ自体、特に、例えばＳ１Ｐなどの特定の標的脂質の有効in vivo濃度を低下させることによって硬皮症の処置に使用することができる。
【０１８７】
本願の他所に記載されているように、Ｓ１Ｐが、繊維芽細胞の活性化、増殖およびその結果としての不適応な瘢痕化およびリモデリングと関連する繊維芽細胞の活性の増強に寄与し得る繊維形成促進性増殖因子であることを示す証拠が存在する。Ｓ１Ｐの生物活性を抗Ｓ１Ｐ剤（例えば、抗Ｓ１Ｐ  ｍＡｂ）で遮断すると、ＰＤＧＦおよびＴＧＦ−βの硬化促進作用を間接的に緩和することができると考えられる。さらに、このような抗Ｓ１Ｐ剤による処置は、皮膚および疾患の進行に関与する他の形態の繊維芽細胞に対するＳ１Ｐの直接的作用を緩和することによって硬皮症患者に有益であり得た。
【０１８８】
心血管および脳血管障害
特定の理論に縛られるものではないが、ＣＥＲ、ＳＰＨまたはＳ１Ｐおよび／または１以上のそれらの代謝産物といった望ましくないスフィンゴ脂質のレベルは、心臓機能不全、再潅流傷害およびその結果としての心臓リモデリングおよび心不全などの心虚血の際またはその後に、心臓機能不全の直接的原因となり得る。
【０１８９】
Ｓ１Ｐなどのスフィンゴ脂質は肝臓組織の繊維形成および創傷治癒(Davaille, et al., J. Biol. Chem. 275:34268-34633, 2000; Ikeda, et al., Am J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol 279:G304-G310, 2000)、受傷した血管系の治癒(Lee, et al., Am. J. Physiol. Cell Physiol. 278:C612-C618, 2000)、ならびに癌、脈管形成および炎症などのような疾患に関連するその他の病状または事象(Pyne, et al., Biochem. J. 349:385-402, 2000)に関連することから、本開示の組成物および方法は、これらの疾患だけでなく心臓疾患の処置にも適用可能である。
【０１９０】
このことは、心臓またはその他の非脳起源のスフィンゴ脂質が脳卒中に関与することを示唆する。結局のところ、スフィンゴ脂質の産生および／または作用の妨害は、脳卒中、特に、末梢血管疾患、アテローム性動脈硬化症および心臓障害によって引き起こされる脳卒中の緩和に有益であり得る。最近の証拠としては、外的に投与されたＳ１Ｐは血液脳関門を通過し、脳血管収縮を促進することが示唆されている(Tosaka, et al., Stroke 32: 2913-2919.2001)。
【０１９１】
心虚血の過程における初期事象（すなわち、心臓への血液供給に欠如）は、天然化合物スフィンゴの心筋による過剰生産であること、およびその他の代謝産物、特に、Ｓ１Ｐも心臓組織自体か、または心臓のスフィンゴ脂質産生と、それに続く血中での変換に結果としての血液成分のいずれかによって産生される。本発明は、Ｓ１Ｐをヒト化モノクローナル抗体で中和する方法を提供する。よって、本発明はヒト化抗スフィンゴ脂質抗体および関連組成物ならびに鍵となるスフィンゴ脂質Ｓ１Ｐの血液および組織レベルを低下させる方法を提供する。このような抗体は例えば全血中の望ましくないスフィンゴ脂質と結合し、そのの有効濃度を低下させるのに有用である。
【０１９２】
本発明の治療方法および組成物は、これらの療法がある特定の望ましくない、有毒な、または心臓毒性のスフィンゴ脂質の相対的濃度、絶対濃度または利用可能な濃度を変化させ得ることを示すために「スフィンゴ脂質に基づく」と言われる。「有毒なスフィンゴ脂質」とは、細胞の壊死および／またはアポトーシスを引き起こす、または増強する、またはそうでなければ、場合によっては特定の組織または器官に見られる特定の細胞種を含む、器官または組織の機能を損なう（例えば、過剰な繊維症による）可能性のあるいずれのスフィンゴ脂質も指す。「心臓毒性スフィンゴ脂質」は、不適応な瘢痕化（繊維形成）によって心不全を直接的または間接的に引き起こし、心臓に見られる、または心臓に関連する細胞（限定されるものではないが、心筋細胞、心臓ニューロンなどを含む）の陰性変力状態を引き起こすか、それらの壊死および／またはアポトーシスを引き起こす、もしくは増強し、かつ／またはスフィンゴ脂質および／またはそれらの代謝産物の陰性変力的律動的冠動脈血管収縮／痙攣作用によって心機能の低下を引き起こし得る有毒なスフィンゴ脂質である。「望ましくないスフィンゴ脂質」としては、有毒および心臓毒性スフィンゴ脂質、ならびに有毒および心臓毒性スフィンゴ脂質の代謝産物、特に、代謝前駆体を含む。特に注目される望ましくない、心臓毒性および／または有毒スフィンゴ脂質としては、限定されるものではないが、セラミド（ＣＥＲ）、セラミンド−１−リン酸（Ｃ１Ｐ）、スフィンゴ−１−リン酸（Ｓ−１−Ｐ）、ジヒドロ−Ｓ１Ｐ（ＤＨＳ１Ｐ）、スフィンゴシルホスホリルコリン（ＳＰＣ）、スフィンゴ（ＳＰＨ；Ｄ（＋）−エリスロ−２−アミノ−４−トランス−オクタデセン−１，３−ジオール、またはスフィンガニン）および種々の代謝産物が含まれる。
【０１９３】
低酸素症および再酸素化に対する心筋細胞の最も早い応答の１つは、中性スフィンゴミエリナーゼの活性化とセラミドの蓄積であることが知られている。Hernandez, et al. (2000), Circ. Res. 86:198-204, 2000。ＳＰＨは様々な細胞種のアポトーシス細胞死において初期のシグナル伝達事象を媒介するとして物議を醸してきた(Ohta, et al., FEBS Letters 355:267-270, 1994; Ohta, et al., Cancer Res. 55:691-697, 1995; Cuvlilier, et al., Nature 381:800-803, 1996)。低酸素症の心臓毒性作用は、１つには、心機能に悪影響を及ぼすスフィンゴ脂質の産生および／または他の代謝産物（例えば、プロトン、カルシウムおよびある種のフリーラジカル）またはシグナル伝達分子（例えば、ＭＡＰキナーゼ、カスパーゼ）の不適切な産生から起こり得る。
【０１９４】
Ｓ１Ｐは血小板に保存され、ヒト血漿および血清の通常の構成要素である(Yatomi, et al., J. Biochem. 121:969-973, 1997)。Ｓ１Ｐは冠動脈血管収縮薬であり、イヌ心臓においてその他の生物作用を持つ。Sugiyama, et al. (2000), Cardiovascular Res. 46:119-125。アテローム性動脈硬化症におけるＳ１Ｐの役割には仮説がある(Siess, et al., IUBMB Life 49:161-171, 2000)。これは、ＨＤＬの保護作用がＳ１Ｐ産生の遮断によるものであるという証拠を含む他のデータによっても裏付けられている(Xia, et al., PNAS 95:14196-14201, 1988; Xia, et al., J Biol Chem 274:33143-33147, 1999)。
【０１９５】
低酸素症下にある実験動物においてセラミドの代謝前駆体であるスフィンゴミエリンが上昇していることが報告されている(Sergeev, et al., Kosm. Biol. Aviakosm. Med. (Russian) 15:71-74, 1981)。他の研究では、筋細胞の内膜が高い含量のＳＰＨおよびスフィンゴミエリンを含んでいるという報告がある(Sumnicht, et al., Arch. Biochem. Biophys. 215:628-637, 1982; Sabbadini, et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 193752-758, 1993)。実験動物をフモニシンＢ真菌毒素で処置すると、ＳＰＨおよびＤＨＳＰＨの血清レベルが上昇し（Ｓ１Ｐは測定されなかった）、心臓に対する陰性変力作用を伴う(Smithe, et al., Toxicological Sciences 56:240-249, 2000)。
【０１９６】
他の疾患または症状
新血管新生、脈管形成、異常な繊維形成、繊維症および瘢痕化、ならびに炎症および免疫応答を含む多くのプロセスにおいて生物活性脂質シグナル伝達が関与するため、これらの１以上のプロセスに関連する多様な疾患および症状において、これらの生物活性脂質の阻害剤は有用であると考えられる。このような疾患および症状は、全身（例えば、全身性硬皮症）であるか、または１以上の特定の身体系、身体部分または器官（例えば、皮膚、肺、心血管系または眼）に局在し得る。
【０１９７】
患者において望ましくないスフィンゴ脂質の量を制御するための１つの方法は、１以上のスフィンゴ脂質に結合し、それにより遊離型の望ましくないスフィンゴ脂質のレベルを低下させる治療「スポンジ」として作用させる１以上のヒト化抗スフィンゴ脂質抗体を含む組成物を提供するによる。化合物を「遊離型」であるとする場合、その化合物は、その望ましくない作用を発揮する部位に到達することを制限する手段が何もない。一般に、遊離化合物はその遊離化合物の作用部位であるか、または作用部位を含むか、あるいは化合物がそこから作用部位へ自由に遊走可能な血液および組織中に存在する。遊離化合物はまた、その化合物を望ましくない化合物に変換する酵素によって作用されるべく、利用され得る。
【０１９８】
特定の理論に縛られるものではないが、ＳＰＨまたはＳ１Ｐなどの望ましくないスフィンゴ脂質および／またはそれらの１以上の代謝産物のレベルは心臓および心筋疾患および障害を引き起こすか、またはその発症に関与すると考えられる。
【０１９９】
スフィンゴ脂質は肝臓組織の繊維形成および創傷治癒 (Davaille, et al., J. Biol. Chem. 275:34268-34633, 2000; Ikeda, et al., Am J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol 279:G304-G310, 2000)、受傷した血管系の治癒(Lee, et al., Am. J. Physiol. Cell Physiol. 278:C612-C618, 2000)および他の病態または障害、あるいは癌、脈管形成、過剰な繊維症および炎症に関連する種々の眼球疾患などの疾患または障害に関連した事象にも関与することから、本開示の組成物および方法はこれらの疾患よび障害ならびに心臓および心筋疾患および障害の処置に適用することができる。
【０２００】
スフィンゴ脂質に基づく療法の１つの形態としては、望ましくない有毒スフィンゴ脂質の実際の、相対的なおよび／または利用可能なin vivo濃度を低下させるためにスフィンゴ脂質の代謝経路を操作することを含む。本発明は、ヒト化抗スフィンゴ脂質抗体を患者に投与して望ましくない有毒なスフィンゴ脂質またはその代謝産物と結合させる、疾患、障害または物理的外傷を治療または予防するための組成物および方法を提供する。
【０２０１】
このようなヒト化抗スフィンゴ脂質抗体は、疾患、障害または物理的外傷の処置を含む多様な目的で有用な医薬組成物として製剤化することができる。本発明の１以上のヒト化抗スフィンゴ脂質抗体を含む医薬組成物は、このような処置のためのキットおよび医療デバイス中に組み込むこともできる。医療デバイスは、本発明の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与するために使用可能であり、本発明の一実施形態によれば、このようなデバイスを含むキットが提供される。このようなデバイスおよびキットは、本発明の医薬組成物の自己投与を含む通常の投与向けにデザイン可能である。このようなデバイスおよびキットはまた、例えば、救急または応急室、手術中、または損傷の可能性があるが、十分な医学的留意をすぐには使えない活動（例えば、ハイキングおよびキャンプまたは戦闘状態）における応急使用向けにデザインすることもできる。
【０２０２】
投与方法
本明細書に記載されている疾患および症状の処置は、種々の製剤およびデバイス用いる様々な経路によって本発明の薬剤および組成物を投与することにより行うことができる。好適な薬学上許容される希釈剤、担体および賦形剤は当技術分野でよく知られている。当業者ならば、任意の特定の処置プロトコールのために投与すべき量は容易に決定できるとことが分かるであろう。好適な量は、１０μｇ／用量〜１０ｇ／用量の範囲内、好ましくは１０ｍｇ／用量〜１ｇ／用量の範囲内にある。
【０２０３】
薬剤物質は、限定されるものではないが全身、皮下、皮内、粘膜（吸入によるものを含む）および局所投与を含む当技術分野で既知の技術によって投与することができる。粘膜は、身体の内腔をつなぐ上皮組織を指す。例えば、粘膜は、口、食道、胃、腸および肛門を含む消化管；鼻腔、気管、気管支および肺を含む気道；および性器を含む。本明細書の目的では、粘膜には、眼の外表面、すなわち角膜および結膜も含まれる。本アプローチは潜在的な全身性副作用を制限でき、治療効果もなお認められるので、局所投与（全身投与に対して）が有利であり得る。
【０２０４】
本発明において用いられる医薬組成物は、限定されるものではないが、溶液、エマルションおよびリポソーム含有製剤を含む。これらの組成物は、限定されるものではないが、既製の液体、自己乳化固体および自己乳化半固体を含む多様な成分から調製することができる。
【０２０５】
本発明において用いられる医薬製剤は、製薬業で周知の従来技術に従って調製することができる。このような技術には、有効成分を医薬担体または賦形剤と会合させるステップを含む。好ましい担体は、特に該組成物がヒトの治療的使用を意図したものである場合には、薬学上許容されるものを含む。非ヒト治療適用（例えば、愛玩動物、家畜、魚または家禽の処置)では、獣医学上許容される担体も使用することができる。一般に、該製剤は、有効成分を液体担体または微粉固体担体または双方と、均一かつ緊密に会合させた後、必要であればその生成物を成形することによって調製される。
【０２０６】
本発明の組成物は、限定されるものではないが、錠剤、カプセル、液体シロップ、ソフトゲル、坐剤および浣腸などの多くの可能な投与形のいずれかへ製剤化することができる。また、本発明の組成物は、水性、非水性または混合媒体中の懸濁液として製剤化することもできる。水性懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストランを含む懸濁液の粘度を高める物質をさらに含有し得る。該懸濁液はまた安定剤を含んでもよい。
【０２０７】
一実施形態では、該医薬組成物は、泡沫として製剤化および使用することができる。医薬泡沫は、限定されるものではないが、エマルション、ミクロエマルシン、クリーム、ゼリーおよびリポソームなどの製剤を含む。
【０２０８】
基本的には天然と同様に、これらの製剤は最終生成物の成分およびコンシステンシーにおいて様々である。このような組成物および製剤の調製に対するノウハウは、製薬および調剤分野の技術者には一般に知られており、本発明の組成物の製剤に適用することができる。
【０２０９】
一実施形態において、免疫誘導部分は、例えば、局所用点滴剤または軟膏、眼周囲の注射を介して眼へ、体腔内的に前房または硝子体中へ、埋め込みデポー剤を介して、または全身的に注射もしくは経口投与により送達することができる。抗体の使用量は当業者によって容易に決定することができる。
【０２１０】
治療薬を眼へ送達する従来のアプローチとしては、局所適用、全身投与後の眼への再分布または直接的な眼球内／眼周囲の注射が含まれる[Sultana, et al. (2006),Current Drug Delivery, vol 3: 207-217; Ghate and Edelhauser (2006), Expert Opinion, vol 3: 275-287;およびKaur and Kanwar (2002), Drug Develop Industrial Pharmacy, vol 28: 473-493]。抗Ｓ１Ｐまたは他の抗生物活性脂質抗体治療薬は、これらのいずれの方法とも併用可能であるが、全て、利点と欠点がある程度認識されている。局所点滴剤は便利であるが、主として前眼部へは適用した薬剤の５％未満、後眼部へはその用量のさらに少ない部分しか送達できないことが多い鼻涙排液のために洗い流される。点滴剤に加え、スプレー剤は、局所投与のための別の様式を与える。３つめの様式は、製剤と眼球表面との接触時間を長くするために使用され得る眼用軟膏またはエマルションであるが、視野のぼやけ、瞼のもつれが問題となり得る。眼球障害を処置するための治療剤の全身投与は、全身を薬剤の潜在毒性に曝すおそれがあるので、このような局所的アプローチが依然として好ましい。
【０２１１】
加齢黄斑変性、糖尿病性網膜症、後部ブドウ膜炎および緑内障が米国および他の先進国で視力喪失の主因であるため、後眼部の処置は医学上重要である。Myles, et al. (2005), Adv Drug Deliv Rev; 57: 2063-79。後眼部への薬剤送達の最も有効な様式は、扁平部を介した硝子体内注射である。しかしながら、直接的注射は、該送達を達成するために熟練した医療従事者を必要とし、多くの患者において処置を制限する懸念が生じる。眼周囲注射、すなわち結膜下、眼球裏、眼球周辺および後部テノン嚢下注射を含むアプローチは、硝子体内注射よりもいくぶん侵入性が小さい。反復的および長期の硝子体内注射は硝子体出血、網膜剥離または眼内炎などの合併症を引き起こし得る。
【０２１２】
抗生物活性脂質抗体処置は、より新しい眼球送達系の１つを用いて行ってもよく[Sultana, et al. (2006),Current Drug Delivery, vol 3: 207-217;およびGhate and Edelhauser (2006), Expert Opinion, vol 3: 275-287]、これには（ａ）眼球インサート（可溶性、浸食性、非浸食性またはヒドロゲル系）、角膜シールド、例えば、眼に対する薬剤の制御送達を提供するコラーゲンに基づく眼帯およびコンタクトレンス、（ｂ）眼内でゲル形態に変換される点滴剤として投与の簡易性を提供し、これにより眼内の薬剤のある程度の徐放効果を提供するin situゲル化系、（ｃ）標的化送達、生体適合性および視力のぼやけがないという利点を提供するリポソーム、ニオソーム(niosomes)／ディスコーム(discomes)などの小胞系、（ｄ）眼内への良好な保持を提供する粘膜付着系、（ｅ）プロドラッグ、（ｆ）浸透促進剤、（ｇ）凍結乾燥担体系、（ｈ）微粒子、（ｉ）サブミクロンエマルション、（ｊ）イオン泳動、（ｋ）デンドリマー、（ｌ）生体接着性マイクロスフェアを含むマイクロスフェア、（ｍ）ナノスフェアおよび他のナノ粒子、（ｎ）コラソーム(collasome)および（ｏ）相加的またはさらには相乗的な、有益な効果を提供するために１以上の上術の系を組み合わせる薬剤送達系などの徐放性または制御放出系が含まれる。これらのアプローチの大部分は、前眼部を標的とし、前眼部の疾患を標的とするのに有効であり得る。しかしながら、比較的低分子量の脂質は眼内での脂質のかなりの移動を許容するようであるので、これらの１以上のアプローチは後眼部の生物活性脂質の濃度に影響を与えるのにもやはり有用であり得る。さらに、前眼部に導入された抗体も、Ｆａｂフラグメントなどのより低分子量の抗体変異体で製造されれば、眼全域に遊走することができる可能性がある。認可されたものや開発中のものなど（前掲の参照文献を参照）、後眼部に対する徐放性薬剤送達系も使用可能である。
【０２１３】
従前に述べたように、後部網膜、脈絡膜および黄斑の疾患の処置は、医学上極めて重要である。これに関して、経強膜的イオン泳動[Eljarrat-Binstock and Domb (2006), Control Release, 110: 479-89]は重要な前進であり、後眼部に抗体を送達する効果的な方法を提供し得る。
【０２１４】
また、療法の性能を改良するために製剤化した抗体に添加することができる様々な賦形剤は、この療法をより便利にするか、または製剤化した抗体がその意図し、認可された目的のためにのみ使用されることを明らかに保証する。賦形剤の例としては、ｐＨを制御する化学物質、抗菌薬、抗体効力の失効を防ぐための保存剤、眼球使用専用の製剤であることを識別するための染料、製剤中の抗体の濃度を高めるための可溶化剤、浸透促進剤および浸透圧および／または粘度を調節するための薬剤の使用が挙げられる。例えばプロテアーゼの阻害剤は、抗体の半減期を延長するために加えることができる。一実施形態では、抗体は、眼に好適なｐＨでリン塩緩衝生理食塩水を含む溶液として硝子体内注射によって眼に送達される。
【０２１５】
また、抗Ｓ１Ｐ剤（例えば、ヒト化抗体）は、従前に上記した製剤またはデバイスの１つで投与されるプロドラッグが得られるように化学的に修飾することもできる。その後、内在酵素の作用によって活性型の抗体が放出される。本願で考えられる、可能性のある眼球酵素としては、種々のシトクロムｐ４５０、アルデヒドレダクターゼ、ケトンレダクターゼ、エステラーゼまたはＮ−アセチル−β−グルコサミダーゼである。抗体に対す他のる化学修飾はその分子量を増加させ、結果として眼における抗体の滞留時間を延長することができる。このような化学修飾の例としては、ジスルフィド[Shaunak, et al. (2006), Nat Chem Biol ; 2:312-3]またはチオール[Doherty, et al. (2005), Bioconjug Chem; 16: 1291-8]などの官能基に一般的または特異的であり得るがある。
【０２１６】
本明細書の以下の例は、スフィンゴ脂質に対する強力な結合親和性を含む、治療の観点から望ましい特性を有するヒト化および変異体抗スフィンゴ脂質抗体の産生を記載する。特に、本発明はＳ１Ｐおよびその変異体について記載され、スフィンゴ−１−リン酸［スフィンゲン−１−リン酸として定義されるＳ１Ｐ自体；Ｄ−エリスロ−スフィンゴ−１−リン酸；スフィング−４−エニン−１−リン酸；（Ｅ，２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−オクタデク−４−エノキシ］ホスホン酸（ＡＳ２６９９３−３０−６）、ＤＨＳ１Ｐはジヒドロスフィンゴ−１−リン酸［スフィンガニン−１−リン酸と定義される；［（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−オクタデクオキシ］ホスホン酸；Ｄ−エリスロ−ジヒドロ−Ｄ−スフィンゴ−１−リン酸（ＣＡＳ１９７９４−９７−９］；ＳＰＣはスフィンゴシルホスホリルコリン、リゾスフィンゴミエリン、スフィンゴシルホスホコリン、スフィンゴホスホリルコリン、エタンアミニウムである；２−（（（（２−アミノ−３−ヒドロキシ−４−オクタデセニル）オキシ）ヒドロキシホスフィニル）オキシ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−、クロリド、（Ｒ−（Ｒ＊，Ｓ＊−（Ｅ）））、２−［［（Ｅ，２Ｒ，３Ｓ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−オクタデク−４−エノキシ］−ヒドロキシ−ホスホリル］オキシエチル−トリメチル−アザニウムクロリド（ＣＡＳ１０２１６−２３−６）を含み得る。
【０２１７】
抗体の作製と同定
抗体親和性は本明細書の下記の実施例に記載されるように求めることができる。好ましいヒト化または変異体抗体は約１×１０−７Ｍ以下、好ましくは約１×１０−８Ｍ以下、最も好ましくは約５×１０−９Ｍ以下のＫｄ値でスフィンゴ脂質と結合するものである。
【０２１８】
スフィンゴ脂質に対して強い結合親和性を有する抗体の他、治療の観点から他の有益な特性を有するヒト化または変異体抗体を選択することも望ましい。例えば、該抗体は、脈管形成を低下させ、腫瘍進行を変化させるものであり得る。好ましくは、該抗体は、直接結合ＥＬＩＳＡアッセイにて測定した場合に約約１０μｇ／ｍｌ以下、好ましくは約１μｇ／ｍｌ以下、最も好ましくは約０．１μｇ／ｍｌ以下の有効濃度（ＥＣ５０）値を有する。好ましくは、該抗体は、１μＭのＳ１Ｐの存在下での細胞アッセイで測定した場合に約１０μｇ／ｍｌ未満、好ましくは約１μｇ／ｍｌ未満、最も好ましくは約０．１μｇ／ｍｌ未満の有効濃度値を有し、例えば、これらの濃度で該抗体はin vitroにおけるスフィンゴ脂質により誘発されたＩＬ−８の放出を少なくとも１０％阻害することができる。好ましくは、該抗体は、レーザー火傷後のＣＮＶ動物モデルにて測定した場合に約１０μｇ／ｍｌ以下、好ましくは約１μｇ／ｍｌ以下、最も好ましくは約０．１μｇ／ｍｌ以下の有効濃度値を有し、例えば、これらの濃度で該抗体はin vivoにおいてスフィンゴ脂質により誘発された新血管新生を少なくとも５０％阻害することができる。
【０２１９】
本発明の抗スフィンゴ脂質抗体の活性を測定するためのアッセイとしては、以下の実施例に示されるようなＥＬＩＳＡアッセイが含まれる。
【０２２０】
好ましくは、該ヒト化または変異体抗体は、治療上有効な量の抗体をヒト患者に投与した際に、免疫応答を惹起することができない。免疫応答が惹起される場合、好ましくはこの応答は、その抗体がそれで処置された患者になお治療利益を与えるようなものである。
【０２２１】
本発明の一実施形態によれば、ヒト化抗スフィンゴ脂質抗体は本明細書で定義されたような「エピトープ」と結合する。着目する抗体が結合するスフィンゴ脂質上のエピトープと結合する抗体（例えば、スフィンゴ脂質に対する抗体の結合を遮断するもの）をスクリーニングするため、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)に記載されているものなどの慣例の交叉遮断アッセイを行うことができる。あるいは、例えばChampe, et al. [J. Biol. Chem. 270:1388-1394 (1995)]に記載されているようなエピトープマッピングを行って、その抗体が着目するエピトープと結合するかどうかを決定することができる。
【０２２２】
本発明の抗体は、式：ＦＲ１−ＣＤＲＨ１−ＦＲ２−ＣＤＲＨ２−ＦＲ３−ＣＤＲＨ３−ＦＲ４（式中、「ＦＲ１−４」は４つのフレームワーク領域を表し、「ＣＤＲＨ１−３」は抗スフィンゴ脂質抗体重鎖可変ドメインの３つの超可変領域を表す。ＦＲ１−４は、下記の例のように「コンセンサス配列」（例えば、ヒト免疫グロブリンの重鎖または軽鎖のクラス、サブクラスまたはサブグループの最も共通したアミノ酸）に由来してもよく、または個々のヒト抗体フレームワーク領域もしくは異なるフレームワーク領域配列の組合せに由来してもよい。多くのヒト抗体フレームワーク領域配列は、例えばKabat, et al.（前掲）に編集されている。一実施形態では、重鎖可変ＦＲはKabat, et al.（前掲）が編集しているように、ヒト免疫グロブリンサブグループのコンセンサス配列により提供される。好ましくは、ヒト免疫グロブリンサブグループはヒト重鎖サブグループＩＩＩ（例えば、配列番号１６）である。
【０２２３】
ヒト重鎖可変ＦＲ配列は好ましくはその中に１以上の置換を有し、例えば、ヒトＦＲ残基が対応する非ヒト残基により（「対応する非ヒト残基」とは、ヒトおよび非ヒト配列がアラインされた際に着目するヒト残基と同じＫａｂａｔの位置ナンバリングを有する非ヒト残基を意味するが、非ヒト残基での置換は必ずしも必要ではない。例えば、対応する非ヒト残基以外の置換ＦＲ残基をファージディスプレイにより選択することができる。置換可能な重鎖可変ＦＲ残基の例としては、ＦＲ残基番号：３７Ｈ、４９Ｈ、６７Ｈ、６９Ｈ、７１Ｈ、７３Ｈ、７５Ｈ、７６Ｈ、７８Ｈおよび９４Ｈ（ここではＫａｂａｔの残基ナンバリングを用いる）のいずれか１以上が含まれる。好ましくは、これらの残基のうち少なくとも２つ、または少なくとも３つ、または少なくとも４つが置換される。ＦＲ置換の特に好ましい組合せは、４９Ｈ、６９Ｈ、７１Ｈ、７３Ｈ、７６Ｈ、７８Ｈおよび９４Ｈである。重鎖超可変領域については、これらは好ましくは下表２に挙げられているアミノ酸配列を有する。
【０２２４】
本明細書における好ましい実施形態の抗体は、式：ＦＲ１−ＣＤＲＬ１−ＦＲ２−ＣＤＲＬ２−ＦＲ３−ＣＤＲＬ３−ＦＲ４（式中、「ＦＲ１−４」は４つのフレームワーク領域を表し、「ＣＤＲＬ１−３」は抗スフィンゴ脂質抗体重鎖可変ドメインの３つの超可変領域を表す）で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを有する。ＦＲ１−４は、下記の例のように「コンセンサス配列」（例えば、ヒト免疫グロブリンの重鎖または軽鎖のクラス、サブクラスまたはサブグループの最も共通したアミノ酸）に由来してもよく、または個々のヒト抗体フレームワーク領域もしくは異なるフレームワーク領域配列の組合せに由来してもよい。一実施形態では、重鎖可変ＦＲはKabat, et al.（前掲）が編集しているように、ヒト免疫グロブリンサブグループのコンセンサス配列により提供される。好ましくは、ヒト免疫グロブリンサブグループはヒトκ軽鎖サブグループＩ（例えば、配列番号１７）である。
【０２２５】
ヒト軽鎖可変ＦＲ配列は好ましくはその中に置換を有し、例えば、ヒトＦＲ残基が対応するマウス残基により置換されるが、非ヒト残基での置換は必ずしも必要ではない。例えば、対応する非ヒト残基以外の置換ＦＲ残基をファージディスプレイにより選択することができる。置換可能な軽鎖可変ＦＲ残基の例としては、限定されるものではないがＦ４、Ｙ３６、Ｙ４９、Ｇ６４、Ｓ６７を含むいずれか１以上のＦＲ残基番号が含まれる。
【０２２６】
ＣＤＲについては、これらは好ましくは下表２に挙げられているアミノ酸配列を有する。
【０２２７】
本明細書で着目されるヒト化抗スフィンゴ脂質抗体の作製方法は以下にさらに詳しく述べられる。
【０２２８】
Ａ．抗体の調製
非ヒト抗スフィンゴ脂質抗体をヒト化し、抗スフィンゴ脂質抗体の変異体を作製する方法は以下の実施例に記載されている。抗スフィンゴ脂質抗体をヒト化するため、非ヒト抗体出発材料を調製する。変異体を作製する場合には、親抗体を作製する。このような非ヒト抗体出発材料および親抗体を作製する技術例を以下の節に示す。
【０２２９】
（ｉ）抗原の調製
抗体の調製に用いるスフィンゴ脂質抗原は、例えば完全なスフィンゴ脂質またはスフィンゴ脂質の一部（例えば、「エピトープ」を含むスフィンゴ脂質のフラグメント）であってよい。抗体の作製に有用な他の形態の抗原は当業者には明らかである。抗体の作製に用いられるスフィンゴ脂質抗原は以下に実施例に記載されている。一実施形態では、該抗原はスフィンゴ脂質の誘導体化形態であり、担体タンパク質を伴ってもよい。
【０２３０】
（ｉｉ）ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は好ましくは、関連抗原とアジュバントの複数回の皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射によって動物で作製される。関連抗原と、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリンまたは大豆トリプシン阻害剤などの、免疫される種において免疫原性のあるタンパク質を、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介してコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキＣＩＳクシンイミド（リシン残基を介する）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、またはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、ＲおよびＲ１は異なるアルキル基である）を用いてコンジュゲートさせることが有用であり得る。
【０２３１】
動物を、例えば、１００μｇまたは５μｇのタンパク質またはコンジュゲート（例えば、それぞれウサギまたはマウス）と３倍容のフロイントの完全アジュバントと合わせ、この溶液を複数の部位に皮内注射することにより、抗原、免疫原性コンジュゲートまたは誘導体に対して免疫する。１か月後、動物に最初の量の０．１〜０．２倍のフロイントの完全アジュバント(Freun''s complete adjuvant)中ペプチドまたはコンジュゲートで、複数部位に皮下注射することにより追加抗原刺激を行う。７〜１４日後、動物を放血させ、血清の抗体力価をアッセイする。力価が平衡に達するまで動物に追加抗原刺激を行う。好ましくは、動物を同じ抗原のコンジュゲートで追加抗原刺激するが、異なるタンパク質に、かつ／または異なる架橋試薬を介してコンジュゲートする。また、コンジュゲートは、タンパク質融合物として組換え細胞培養でも作製することができる。また、免疫応答を増強するために、ミョウバンなどの凝集剤を適宜使用することができる。
【０２３２】
（ｉｉｉ）モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、Kohler, et al., Nature, 256:495 (1975)により初めて記載されたハイブリドーマ法を用い、または組換えＤＮＡ法を含む他の好適な方法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照）によって作製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、またはハムスターもしくはマカクザルなどの他の適当な宿主動物が、上記のように、免疫に用いられるタンパク質と特異的に結合する抗体を産生する、または産生し得るリンパ球を惹起するように免疫される。あるいは、リンパ球をin vitroで免疫してもよい。次に、リンパ球を、ポリエチレングリコールなどの好適な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986))。
【０２３３】
このようにして作製されたハイブリドーマ細胞を、好ましくは融合していない親骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する１以上の物質を含む好適な培養培地に播種し、増殖させる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合には、ハイブリドーマの培養培地は一般に、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を阻害する物質であるヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む（ＨＡＴ培地）。
【０２３４】
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベル産生を支持し、ＨＡＴ培地などの培地に感受性のあるものである。これらの中で、好ましい骨髄腫細胞系統は、the Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. USAから入手可能なＭＯＰ−２１およびＭ．Ｃ．−１１マウス腫瘍、ならびにＳＰ−２またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞に由来するものなどのネズミ骨髄腫系統である。また、ヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞系統も、ヒトモノクローナル抗体の産生のために記載されている(Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur, et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。
【０２３５】
ハイブリドーマ細胞が増殖する培養培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生に関してアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などの免疫沈降またはin vitro結合アッセイにより判定する。
【０２３６】
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Scatchard analysis of Munson, et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)によって判定することができる。
【０２３７】
ハイブリドーマ細胞が所望の特異性、親和性および／または活性の抗体を産生することが確認された後、クローンを制限希釈法によってサブクローニングし、標準的な方法(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986))により増殖させることができる。この目的で好適な培養培地としては、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地が含まれる。さらに、ハイブリドーマ細胞を動物の腹水腫瘍としてin vivoで増殖させることができる。
【０２３８】
サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は、例えば、Ａタンパク質−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティークロマトグラフィーなどの通常の免疫グロブリン精製手順によって培養培地、腹水または血清から適宜分離される。
【０２３９】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは通常の手順（例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することによる）を用いて容易に単離および配列決定される。ハイブリドーマ細胞はこのようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。一度単離されれば、そのＤＮＡは発現ベクターに入れることができ、次にこれを、そうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌(E. coli)細胞、シミアンＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または骨髄腫細胞などの宿主細胞へトランスフェクトし、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成を得る。抗体の組換え生産は以下に詳しく記載する。
【０２４０】
（ｉｖ）ヒト化およびアミノ酸配列変異体
下記の実施例１２は、抗スフィンゴ脂質抗体のヒト化のための手順が記載している。ヒト化の一般法は例えば、ＵＳ５８６１１５５、ＵＳ１９９６０６５２５５８、ＵＳ６４７９２８４、ＵＳ２００００６６０１６９、ＵＳ６４０７２１３、ＵＳ１９９３０１４６２０６、ＵＳ６６３９０５５、ＵＳ２００００７０５６８６、ＵＳ６５００９３１、ＵＳ１９９５０４３５５１６、ＵＳ５５３０１０１、ＵＳ５５８５０８９、ＵＳ１９９５０４７７７２８、ＵＳ５６９３７６１、ＵＳ１９９５０４７４０４０、ＵＳ５６９３７６２、ＵＳ１９９５０４８７２００、ＵＳ６１８０３７０、ＵＳ１９９５０４８４５３７、ＵＳ２００３２２９２０８、ＵＳ２００３０３８９１５５、ＵＳ５７１４３５０、ＵＳ１９９５０３７２２６２、ＵＳ６３５０８６１、ＵＳ１９９７０８６２８７１、ＵＳ５７７７０８５、ＵＳ１９９５０４５８５１６、ＵＳ５８３４５９７、ＵＳ１９９６０６５６５８６、ＵＳ５８８２６４４、ＵＳ１９９６０６２１７５１、ＵＳ５９３２４４８、ＵＳ１９９１０８０１７９８、ＵＳ６０１３２５６、ＵＳ１９９７０９３４８４１、ＵＳ６１２９９１４、ＵＳ１９９５０３９７４１１、ＵＳ６２１０６７１、ＵＳ６３２９５１１、ＵＳ１９９９０４５０５２０、ＵＳ２００３１６６８７１、ＵＳ２００２００７８７５７、ＵＳ５２２５５３９、ＵＳ１９９１０７８２７１７、ＵＳ６５４８６４０、ＵＳ１９９５０４５２４６２、ＵＳ５６２４８２１およびＵＳ１９９５０４７９７５２に記載されている。ある特定の実施形態では、特にヒト化抗体の結合親和性またはその他の生物学的特性を改良する場合、これらのヒト化抗体のアミノ酸配列変異体を作製することが望ましい場合がある。実施例１２は、親抗体よりも親和性が増強された抗スフィンゴ脂質抗体のアミノ酸配列変異体を作製するための方法論を記載している。
【０２４１】
抗スフィンゴ脂質抗体のアミノ酸配列変異体は、抗スフィンゴ脂質抗体ＤＮＡに適当なヌクレオチド変化を導入することによって、またはペプチド合成によって作出される。このような変異体としては、例えば、本明細書の例の抗スフィンゴ脂質抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、および／または残基への挿入、および／または残基の置換を含む。最終構築物に到達するために、最終構築物が所望の特徴を持つ限り、欠失、挿入および置換のいずれの組合せを行ってもよい。アミノ酸変化はまた、グリコシル化部位の数または位置の変化など、ヒト化または変異体抗スフィンゴ脂質抗体の翻訳後過程を変化させてもよい。
【０２４２】
突然変異誘発の好ましい位置である抗スフィンゴ脂質抗体のある特定の残基または領域の同定のための有用な方法は、Cunningham and Wells Science, 244:1081-1085 (1989)によって記載されているように、「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここでは、アミノ酸とスフィンゴ脂質抗原の相互作用に影響を与えるために、標的残基のある残基または残基群を同定し（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓおよびｇｌｕなどの変化した残基）、中性または負電荷を有するアミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）で置換する。次に、これらの置換に機能的感受性を示すアミノ酸の位置を、その置換部位に、またはその置換部位に対してさらなる、またはその他の変異体を導入することにより精密化する。従って、アミノ酸配列変異体を導入するための部位は予め決定されるが、突然変異自体の性質は予め決定する必要はない。例えば、ある部位における突然変異の性能を分析するためには、その標的コドンまたは領域においてａｌａスキャニングまたはランダム突然変異誘発を行い、発現された抗スフィンゴ脂質抗体変異体を所望の活性に関してスクリーニングする。アミノ酸配列の挿入としては、１残基から１００以上の残基を含むポリペプチドまでの長さのアミノ末端および／またはカルボキシル末端融合物、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗スフィンゴ脂質抗体またはエピトープタグと融合された抗体を含む。抗スフィンゴ脂質抗体分子の他の挿入変異体としては、抗スフィンゴ脂質抗体のＮ末端またはＣ末端と抗体の血清半減期を延長する酵素またはポリペプチドとの融合物が含まれる。
【０２４３】
別のタイプの変異体として、アミノ酸置換変異体がある。これらの変異体は、抗スフィンゴ脂質抗体分子の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、その位置に異なる残基が挿入されている。置換突然変異誘発に関して最も注目される部位としては超可変領域が含まれるが、ＦＲ変異も考えられる。保存的置換が好ましい置換である。このような置換が生物活性に変化をもたらす場合には、以下に挙げられている「置換例」と表示されている、またはアミノ酸種に関して以下にさらに記載されているようなさらなる置換変異を導入し、それらの生成物をスクリーニングすることができる。
【０２４４】
【表１】
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【０２４５】
抗体の生物特性における実質的修飾は、（ａ）例えばシートまたはらせんコンフォメーションとしての、置換領域におけるポリペプチド主鎖の構造、（ｂ）標的部位における分子の変化または疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩、を維持する上でのそれらの作用が有意に異なる置換を選択することによって達成される。天然残基は一般的な側鎖特性：
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
（５）鎖の配向に影響を及ぼす残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；および
（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ
に基づいた群に分類される。非保存的置換はこれらのクラスのあるメンバーを他のクラスのものと交換することを意味する。
【０２４６】
ヒト化または変異体抗スフィンゴ脂質抗体の適切なコンフォメーションの維持に関与しないシステイン残基はいずれも、分子の酸化安定性を向上させるために、また、異常な架橋を防ぐために置換することができる。逆に、その安定性を向上させるために抗体にシステイン結合を付加してもよい（特に、抗体がＦｖフラグメントなどの抗体フラグメントである場合）。
【０２４７】
置換変異体の１つのタイプは、親抗体（例えば、ヒト化またはヒト抗体）の１以上の超可変領域残基を置換することを含む。一般に、結果としての、さらなる開発のために選択された変異体は、それらが作出された親抗体よりも生物特性が改良されている。このような置換変異体を作出する便宜な方法は、ファージディスプレイを用いた親和性成熟である。要するに、いくつかの超可変領域部位（例えば、６〜７部位）を、各部位においてあらゆる可能性のあるアミノ置換を作出するように変異誘発させる。このようにして作出された抗体変異体は、各粒子内にパッケージングされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩＩ産物との融合物としての繊維状ファージ粒子から一価形式でディスプレイされる。次に、これらのファージディスプレイ変異体を本明細書に開示されているようにそれらの生物活性（例えば、結合親和性）に関してスクリーニングする。修飾のための候補超可変領域を同定するために、アラニンスキャニング突然変異誘発を行って、抗原結合に有意に関与する超可変領域残基を同定することができる。あるいは、またはそれに加えて、抗体とスフィンゴ脂質の間の接点を同定するため、抗原−抗体複合体の結晶構造を分析することも有益であり得る。このような接点残基と隣接残基は本明細書において精密化された技術による置換の候補である。このような変異体が一度作出されると、その変異体パネルに対して本明細書に記載されるようなスクリーニングを行い、１以上の関連アッセイにおいて、より優れた特性を有する抗体をさらなる開発のために選択することができる。
【０２４８】
抗体の別のタイプのアミノ酸変異体は、抗体の元のグリコシル化パターンを変化させる。変化させるとは、その抗体に見られる１以上の炭水化物部分を欠失させること、および／またはその抗体には存在しない１以上のグリコシル化を付加することを意味する。
【０２４９】
抗体のグリコシル化は一般に、Ｎ−結合および／またはまたはＯ−結合のいずれかである。Ｎ−結合とは、アスパラギン残基の側鎖に対する炭水化物部分の結合を示す。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（ここで、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖に対する炭水化物部分の酵素的結合のための最も一般的な認識配列である。よって、ポリペプチドにこれらのトリペプチド配列のいずれかが存在すると、潜在的グリコシル化部位ができる。Ｏ−結合グリコシル化とは、糖類Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースの１つとヒドロキシアミノ酸（最も一般にはセリンまたはトレオニンであるが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンを用いてもよい）の結合を指す。
【０２５０】
抗体に対するグリコシル化部位の付加は、便宜には、１以上の上記トリペプチド配列を含むようにアミノ酸配列を変更することによって達成される（Ｎ−結合グリコシル化部位の場合）。この変更はまた、元の抗体の配列に１以上のセリンまたはトレオニン残基を付加、またはそれらに置換することによって行ってもよい（Ｏ−結合グリコシル化部位の場合）。
【０２５１】
抗スフィンゴ脂質抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当技術分野で既知の様々な方法によって作製される。これらの方法としては、限定されるものではないが、天然源からの単離（天然のアミノ酸配列変異体の場合）または抗スフィンゴ脂質抗体の初めに作製された変異体もしくは非変異型のオリゴヌクレオチド媒介（または部位指定）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発およびカセット突然変異誘発による作製が含まれる。
【０２５２】
（ｖ）ヒト抗体
ヒト化の代わりに、免疫に際して、ヒト抗体を作製することもできる。例えば、今では、内因性の免疫グロブリン産生の不在下でヒト抗体の前レパートリーを産生し得るトランスジェニック動物（例えばマウス）を作出することができる。例えば、キメラおよび生殖細胞系突然変異マウスにおける抗体重鎖接合領域（ＪＨ）遺伝子の同形接合性が欠如すると、内因性の抗体産生の完全な阻害が起こることが記載されている。このような生殖細胞系突然変異マウスにおいてヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイを移入すると、抗原投与時にヒト抗体の産生が起こる。例えば、Jakobovits, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits, et al., Nature, 362:255-258(1993); Bruggermann, et al., Year in Immuno., 7:33 (1993);ならびに米国特許第５，５９１，６６９号、同第５，５８９，３６９号および同第５，５４５，８０７号参照。ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーに由来してもよい(Hoogenboom, et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks, et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991);ならびに米国特許第５，５６５，３３２号および同第５，５７３，９０５号)。上述のように、ヒト抗体はまた、in vitroで活性化されたＢ細胞（例えば、米国特許第５，５６７，６１０号および同第５，２２９，２７５号参照）または他の好適な方法によっても作製可能である。
【０２５３】
（ｖｉ）抗体フラグメント
特定の実施形態では、ヒト化または変異体抗スフィンゴ脂質抗体は、抗体フラグメントである。抗体フラグメントの作製のために種々の技術が開発されている。従来、これらのフラグメントは完全抗体のタンパク質加水分解性消化によって得られてきた（例えば、Morimoto, et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117(1992);およびBrennan, et al., Science 229:81 (1985)参照）。しかしながら、これらのフラグメントは、今では、組換え宿主細胞によって直接生産することができる。例えば、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントは大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合させてＦ（ａｂ’）２フラグメントを形成させることができる(Carter, et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992))。別の実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、Ｆ（ａｂ’）２分子の組み立てを促進するためにロイシンジッパーＧＣＮ４を用いて形成される。別のアプローチによれば、Ｆｖ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントは、組換え宿主細胞培養から直接単離することができる。抗体フラグメントの生産のための他の技術は、当業者には明らかである。
【０２５４】
（ｖｉｉ）多重特異性抗体
いくつかの実施形態では、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する多重特異性（例えば、二重特異性）ヒト化または変異体抗スフィンゴ脂質抗体を作製することが望ましい場合がある。二重特異性抗体の例はスフィンゴ脂質２つの異なるエピトープと結合し得る。あるいは、抗スフィンゴ脂質アームを、異なる分子と結合するアームと組みあわせてもよい。二重特異性抗体は全長抗体または抗体フラグメント（例えばＦ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として作製することができる。
【０２５５】
二重特異性抗体を作製するための別のアプローチによれば、１対の抗体分子間の界面を、組換え細胞培養から回収されるヘテロ二量体のパーセンテージを最大にするように操作することができる。好ましい界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第一の抗体分子の界面に由来する１以上の小さなアミノ酸側鎖がより大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置換される。この大きな側鎖と同一または類似した大きさの補償となる「キャビティ」は、大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの（例えばアラニンまたはトレオニン）に置換することによって第二の抗体の分子の界面に作出される。これは、ホモ二量体などの他の望まない副生成物よりもヘテロ二量体の生産を高める機構を提供する。例えば、米国特許第５，７３１，１６８号参照。
【０２５６】
二重特異性抗体としては、架橋抗体または「ヘテロコンジュゲート」抗体が含まれる。例えば、ヘテロコンジュゲートにおける抗体の一方はアビジンと結合させ、他方はビオチンと結合させることができる。ヘテロコンジュゲート抗体はいずれの便宜な架橋法を用いて作製してもよい。好適な架橋剤は当技術分野でよく知られており、例えば米国特許第４，６７６，９８０号に、いくつかの架橋技術とともに開示されている。
【０２５７】
抗体フラグメントから二重特異性抗体を作製する技術も文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体は化学結合を用いて作製することができる。Brennan, et al., Science 229:81 (1985)は、完全な抗体がタンパク質加水分解的に切断されてＦ（ａｂ’）２フラグメントを作製する手順を記載している。これらのフラグメントは、隣接するジチオールを安定化させ、かつ、分子間ジスルフィド形成を防ぐためにジチオール複合体形成剤亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元させる。作製されたＦａｂ’フラグメントを次にチオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体へ変換する。次に、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の１つを、メルカプトエチルアミンで還元することよってＦａｂ’−チオールへ再変換し、等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して、二重特異性抗体を形成させる。作製された二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化のための薬剤として使用することができる。なおさらなる実施形態では、大腸菌から直接回収されたＦａｂ’−ＳＨフラグメントをin vitroで化学的に結合させて二重特異性抗体を作製することができる。Shalaby, et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)。
【０２５８】
組換え細胞培養物から直接二重特異性抗体フラグメントを作製および単離するための種々の技術も記載されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを用いて作製されている。Kostelny, et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合によって２つの異なる抗体のＦａｂ’部分と連結された。抗体ホモ二量体をそのヒンジ領域において還元して単量体を形成させた後、再酸化して抗体ヘテロ二量体を形成された。この方法はまた、抗体ホモ二量体の作製にも利用可能である。Hollinger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)により記載されている「ダイアボディー」技術は、二重特異性抗体フラグメントを作製するためのもう１つの機構を提供した。これらのフラグメントは、同じ鎖上の２つのドメインの間で対合を可能とするには短すぎるリンカーによって、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。よって、１つのフラグメントのＶＨドメインとＶＬドメインは、別のフラグメントの相補的ＶＬドメインおよびＶＨドメインと対合して、それにより２つの抗原結合部位を形成することを余儀なくされる。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体に使用によって二重特異性抗体フラグメントを作製するためのもう１つの戦略も報告されている。例えば、Gruber, et al., J. Immunol. 152:5368 (1994)参照。あるいは、二重特異性抗体は、例えば、Zapata, et al. Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)に記載されているように作製された「線状抗体」であってもよい。
【０２５９】
また、二価を超える抗体も意図される。例えば、三重特異性抗体が作製可能である。Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)。
【０２６０】
１アームにつき１以上の結合部位を含む本発明の抗体（またはポリマーもしくはポリペプチド）またはそのフラグメントは、本明細書において「多価」抗体と呼ばれる。例えば、本発明の「二価」抗体は、Ｆａｂまたはそのフラグメント当たり２つの結合部位を含み、本発明の「三価」ポリペプチドはＦａｂまたはそのフラグメントにつき３つの結合部位を含む。本発明の多価ポリマーにおいて、Ｆａｂ当たり２以上の結合部位は、同じまたは異なる抗原と結合している可能性がある。例えば、本発明の多価ポリペプチドにおける２以上の結合部位は、同じ抗原、例えば、該抗原の同じ部分もしくはエピトープ、または該抗原の２以上の同じもしくは異なる部分もしくはエピトープに向けられてもよく、かつ／または異なる抗原に向けられてもよく、あるいはその組合せであってもよい。よって、例えば本発明の二価ポリペプチドは２つの同じ結合部位を含んでもよく、抗原の第一の部分もしくはエピトープに向けられた第一の結合部位と、該抗原の同じ部分もしくはエピトープに、または該抗原の別部分もしくはエピトープに向けられた第二の結合部位を含んでなり得るか、あるいは抗原の第一の部分もしくはエピトープに向けられた第一の結合部位と、異なる抗体に向けられた第二の結合部位を含み得る。しかしながら、以上の記載から明らかなように、本発明の多価ポリペプチドが同じまたは異なる抗原に向けられるいずれかの数の結合部位を含み得るという点で、本発明はそれに限定されない。
【０２６１】
Ｆａｂまたはそのフラグメント当たり少なくとも２つの結合部位（ここで、少なくとも１つの結合部位は第一の抗原に向けられ、第二の結合部位は第一の抗原とは異なる第二の抗原に向けられる）を含む本発明の抗体（またはポリマーもしくはポリペプチド）は「多重特異性」とも呼ばれる。例えば、「二重特異性」ポリマーは、第一の抗原に向けられた少なくとも１つの部位と、第二の抗原に向けられた少なくとも１つの第二の部位を含み、「三重特異性」は、第一の抗原に向けられた少なくとも１つの結合部位、第二の抗原に向けられた少なくとも１つのさらなる、および第三の抗原に向けられた少なくとも１つのさらなる結合部位を含むポリマーなどである。よって、それらの最も単純な形態では、本発明の二重特異性ポリペプチドは本発明の二価ポリペプチド（Ｆａｂ当たり）である。しかしながら、以上の記載から明らかなように、本発明の多価ポリペプチドが２以上の異なる抗原に向けられるいずれかの数の結合部位を含み得るという点で、本発明はそれに限定されない。
【０２６２】
（ｖｉｉｉ）他の修飾
ヒト化または変異体抗スフィンゴ脂質抗体の他の修飾も意図される。例えば、本発明はまた、毒素（例えば、細菌、真菌、植物または動物起源の酵素的な活性な毒素またはそのフラグメント）または放射性同位元素（例えば、ラジオコンジュゲート）などの細胞傷害性薬剤にコンジュゲートされた本発明に記載の抗体を含む免疫複合体に関する。コンジュゲートは、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣＬなど）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トリエン２，６−ジイソシアネートなど）およびビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）などの種々の二官能性タンパク質カップリング剤を用いて作製される。
【０２６３】
本明細書で開示される抗スフィンゴ脂質抗体はまた、イムノリポソームとして製剤化することができる。抗体を含むリポソームは、Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030 (1980);および米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号に記載されているものなどの当技術分野で知られている方法により作製される。循環時が高められたリポソームが米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。例えば、リポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ−誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発法によって作製することができる。リポソームは、所望の径を有するリポソームを得るために所定の孔径のフィルターを通して押し出される。本発明の抗体のＦａｂ’フラグメントは、ジスルフィド交換反応を介し、Martin, et al., J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982)に記載されているようなリポソームとコンジュゲートさせることができる。所望により、別の有効成分をリポソーム内に収容してもよい。
【０２６４】
酵素またはその他のポリペプチドは、上述のヘテロ二官能性架橋試薬の使用などの当技術分野で周知の技術によって、抗スフィンゴ脂質抗体に共有結合させることができる。あるいは、本発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部分と結合された本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域を含む融合タンパク質を、当技術分野で周知の組換えＤＮＡ技術を用いて構築することができる（例えば、Neuberger, et al., Nature 312:604-608 (1984)参照）。
【０２６５】
本発明の特定の実施形態では、例えば、標的組織および細胞の浸透性を増強するために、完全抗体よりもむしろ抗体フラグメントを用いる方が望ましい場合がある。この場合、その血清半減期を延長するために、抗体フラグメントを修飾することが望ましい場合がある。これは、例えば、抗体フラグメントへのサルベージ受容体結合エピトープの組み込みにより（例えば、抗体フラグメントの適当な領域の突然変異によるか、またはペプチドタグにエピトープを組み込んだ後、いずれかの末端または中間部で抗体フラグメントと融合させことにより、例えば、ＤＮＡまたはペプチド合成により）達成可能である。例えば、米国特許第６，０９６，８７１号参照。
【０２６６】
ヒト化または変異体抗スフィンゴ脂質抗体の共有結合的修飾も本発明の範囲内に含まれる。それらは、適用可能であれば、化学合成により、または抗体の酵素的または化学的切断により作製され得る。該抗体の他のタイプの共有結合的修飾は、抗体の標的アミノ酸残基を、選択された側鎖またはＮもしくはＣ末端残基と反応し得る有機誘導体化剤と反応させることによって分子に導入される。ポリペプチドの共有結合的修飾の例は、米国特許第５，５３４，６１５号に記載されており、出典明示より具体的に本明細書の一部とされる。抗体の共有結合的修飾の好ましいタイプは、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２号または同第４，１７９，３３７号に示される方法で、種々の非タンパク質性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンの１つに抗体を結合させることを含む。
【０２６７】
Ｂ．ベクター、宿主細胞および組換え法
本発明はまた、ヒト化または変異体抗スフィンゴ脂質抗体をコードする単離された核酸、該核酸を含むベクターおよび宿主細胞、ならびに該抗体の産生のための組換え技術も提供する。
【０２６８】
抗体の組換え生産では、それをコードする核酸単離が、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）のためまたは発現のための複製可能なベクターへ挿入され得る。別の実施形態では、抗体は、米国特許第５，２０４，２４４号に記載されているような相同組換えによって作製可能である。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは常法を用いて（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）容易に単離および配列決定される。多くのベクターが利用可能である。ベクター成分としては一般に、限定されるものではないが、例えば米国特許第５，５３４，６１５号に記載されているように、シグナル配列、複製起点、１以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーターおよび転写終結配列の１以上が含まれる。
【０２６９】
本明細書においてベクターでＤＮＡをクローニングまたは発現するための好適な宿主細胞は、上記の原核生物、酵母または高等真核生物細胞である。この目的で好適な原核生物としては、グラム陰性またはグラム陽性生物などの真正細菌、例えば、エシェリキア属（例えば、大腸菌）、エンテロバクター属、エルウィニア属、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ菌属（例えば、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)）、セラチア属（例えば、レイ菌(Serratia marcescans)および赤痢菌属、ならびにバチルス属（例えば、枯草菌(B. subtilis)およびB. licheniformis（例えば、B. licheniformis  ４１Ｐ）、シュードモナス属（例えば、緑膿菌(P. aeruginosa)および放線菌属などの腸内細菌科が含まれる。１つの好ましい大腸菌クローニング宿主は大腸菌２９４（ＡＴＣＣ  ３１，４４６）であるが、大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）および大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）などの他の株も好適である。これらの例は限定ではなく例示である。
【０２７０】
原核生物の他、線維状真菌または酵母などの真核生物も、抗スフィンゴ脂質抗体をコードするベクター好適なクローニングまたは発現宿主である。下等真核生物の宿主微生物の中でサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、または一般的なパン製造酵母が最もよく用いられている。しかしながら、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)；クルイベロミセス属宿主、例えば、Ｋ．ラクチス(K. lactis)、Ｋ．フラギリス(K. fragilis)（ＡＴＣＣ１２，４２４）、Ｋ．ブルガリクス(K. bulgaricus)（ＡＴＣＣ１６，０４５）、Ｋ．ウィケラミイ(K. wickeramii)（ＡＴＣＣ２４，１７８）、Ｋ．ワルチー(K. waltii)（ＡＴＣＣ５６，５００）、Ｋ．ドロソフィラルム(K. drosophilarum)（ＡＴＣＣ３６，９０６）、Ｋ．サーモトレランス(K. thermotolerans)およびＫ．マルキシアヌス(K. marxianus)；ヤロウイア属（ＥＰ４０２，２２６）；ピキア・パストリス(Pichia pastoris)（ＥＰ１８３，０７０）；カンジダ；トリコデルマ・リーシア(Trichoderma reesia)（ＥＰ２４４，２３４）；ニューロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa)；スクワニミセス・オクシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)などのスクワニミセス属；例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリプクラジウムおよびアスペルギルス宿主、例えば、Ａ．ニデュランス(A. nidulans)およびＡ．ニゲル(A. niger)および繊維状真菌などの他のいくつかの属、種および株も一般に利用でき、本明細書において有用である。
【０２７１】
グリコシル化抗スフィンゴ脂質抗体の発現のための好適な宿主細胞は多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例としては、植物および昆虫細胞が含まれる。多くの馬キュロウイルス株および変異体ならびにヨトウガ(Spodoptera frugiperda)（毛虫）、Aedes aegypti（蚊）、Aedes albopictus（蚊）、Drosophils melanogaster（ショウジョウバエ）およびカイコ(Bombyx mori)が確認されている。例えば、オートグラファ・カリフォルニカ(Autographa californica) ＮＰＶのＬ−１変異体およびカイコ(Bombyx mori)ＮＰＶのＢｍ−５株など、トランスフェクションのための様々なウイルス株が公的に入手可能であり、このようなウイルスは、本明細書において、特にヨトウガ(Spodoptera frugiperda)細胞のトランスフェクションのために、本発明に従ってウイルスとして使用可能である。綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマトおよびタバコの植物培養細胞も宿主として利用可能である。
【０２７２】
しかしながら、脊椎動物細胞における関心が最大であり、培養脊椎動物細胞（組織培養）の増殖は常法となっている。有用な哺乳類宿主細胞系統の例としては、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系統；ヒト胚腎臓系統（懸濁培養で増殖させるためにサブクローニングされた２９３または２９３細胞、Graham, et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Urlaub, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)）；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞(Mather, et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982))；ＭＲＣ  ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝細胞腫系統（Ｈｅｐ  Ｇ２）がある。
【０２７３】
宿主細胞を抗スフィンゴ脂質抗体生産のための上記の発現またはクローニングベクターで形質転換し、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために適宜改変された通常の栄養培地で培養する。
【０２７４】
本発明の抗スフィンゴ脂質抗体を生産するために用いられる宿主細胞は種々の培地で培養することができる。ハムのＦ１０(Sigma)、最小必須培地（（ＭＥＭ）、(Sigma)、ＲＰＭＩ−１６４０(Sigma)およびダルベッコの改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Sigma）などの市販の培地が宿主細胞の培養に好適である。さらに、Ham, et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes, et al., Anal. Biochem.102:255 (1980),米国特許第４，７６７，７０４号；同第４，６５７，８６６号；同第４，９２７，７６２号；同第４，５６０，６５５号；または同第５，１２２，４６９号；ＷＯ９０／０３４３０；ＷＯ８７／００１９５；または米国特許第３０，９８５号に記載されているいずれの培地も宿主細胞の培養培地として使用可能である。これらの培地はいずれも、必要に応じて、ホルモンおよび／またはその他の増殖因子（インスリン、トランスフェリンまたは上皮細胞増殖因子など）、塩類（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸塩など）、バッファー（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生物質（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標））、微量元素（通常、マイクロモル範囲の終濃度で存在する無機化合物として定義）およびグルコースまたは等価なエネルギー源を添加してもよい。他の必要ないずれの添加物も当業者に知られている適当な濃度で含めることができる。温度、ｐＨなどの培養条件は発現用に選択された宿主細胞とともにこれまで用いられているものであり、当業者には明らかである。
【０２７５】
組換え技術を用いる場合、抗体を周辺質にて細胞内生産することもできるし、直接培地に分泌させることもできる。抗体が細胞内生産される場合、第一工程として、宿主細胞または溶解フラグメントいずれかの粒子残渣を、例えば遠心分離または限外濾過によって除去する。Carter, et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)は、大腸菌の周辺質空間に分泌される抗体を単離するための手順を記載している。要するに、細胞ペーストを酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡおよびフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０間にわたって解凍する。細胞残渣は遠心分離によって除去することができる。抗体が培地中に分泌される場合には、このような発現系からの上清を一般にはまず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニット用いて濃縮する。タンパク質分解を阻害するため、前記の工程のいずれにＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を含めてもよく、偶然の混入物の増殖を防ぐために抗生物質を含めてもよい。
【０２７６】
細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析およびアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することができるが、アフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製技術である。Ａタンパク質の親和性リガンドとして妥当性は、抗体中に存在する免疫グロブリンＦｃドメインの種およびイソ型に依存する。Ａタンパク質は、ヒト重鎖に基づく抗体を精製するのに使用できる(Lindmark, et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983))。Ｇタンパク質は全てのマウスイソ型とヒトγ３に関して奨励される(Guss, et al., EMBO J. 5:15671575 (1986))。親和性リガンドが結合されたマトリックスはほとんどの場合アガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。制御細孔ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定なマトリックスは流速を速めることができ。アガロースで達成し得るものよりも短い時間処理時間を可能とする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ（商標）樹脂(J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿法、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンセファロース（商標）でのクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび硫安沈殿法など、タンパク質精製のためのその他の技術も、回収される抗体に応じて利用可能である。
【０２７７】
予備精製工程の後、着目する抗体と夾雑物を含む混合物に対して、ｐＨ約２．５〜４．５の間で溶離バッファーを用い、好ましくは低塩濃度（例えば約０〜０．２５Ｍ塩）で行われる、低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーを行えばよい。
【０２７８】
Ｃ．医薬製剤
本発明の抗体または免疫誘導部分の治療製剤は、所望の純度を有する抗体と任意の生理学上許容される担体、賦形剤または安定剤（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)参照）を、凍結乾燥製剤または水溶液の形で混合することにより、保存向けに調製される。許容される担体、賦形剤または安定剤は用いる用量および濃度でレシピエントに対して無毒であり、リン酸、クエン酸およびその他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸およびメチオニンを含む酸化防止剤；保存剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む単糖類、二糖類およびその他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；および／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。
【０２７９】
本明細書の製剤はまた、処置される特定の適応の必要に応じて１を超える有効化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない補足的活性を有するものを含んでもよい。このような分子は、意図した目的に効果的な量の組合せで適切に存在する。
【０２８０】
有効成分はまた、例えば、コアセルベーション技術によるか、または界面重合により調製されたマイクロカプセル、それぞれ例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中に、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子およびナノカプセル）またはマクロエマルションとして捕捉してもよい。このような技術はRemington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
【０２８１】
in vivo投与の用いる製剤は無菌でなければならない。これは、例えば無菌濾過膜をとした濾過によって容易に達成される。
【０２８２】
徐放性製剤が好ましい場合がある。徐放性製材の好適な例としては、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、このマトリックスは、例えばフィルムまたはマイクロカプセルなどの成型品の形である。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えば、Ｌｕｐｒｏｎ  Ｄｅｐｏｔ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーと酢酸ロイプロリドからなる注射可能なマイクロスフェア）およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸などのポリマーは１００以上分子の放出が可能であるが、ある特定のヒドロゲルはより短い期間だけタンパク質を放出する。カプセル化された抗体が体内に長時間留まる場合、それらは３７℃で水分に曝される結果として変性または凝集する場合があり、その結果、生物活性の低下および免疫原性の変化する可能性がある。合理的な戦略は関与する機構に応じて安定化のために考案することができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド相互作用を介した分子間Ｓ−Ｓ結合の形成であることが見出されれば、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾すること、酸性溶液から凍結乾燥させること、水分含量を制御すること、適当な添加剤を使用すること、および特殊なポリマーマトリックス組成物を開発することによって達成することができる。
【０２８３】
Ｄ．抗体の非治療的使用
本発の抗体はアフィニティー精製剤として使用可能である。この過程で、抗体は、当技術分野で周知の方法を用い、セファデックス樹脂または濾紙などの固相に固定する。この固定抗体に精製するスフィンゴ脂質を含有するサンプルと接触させ、その後、この支持体を、サンプル中の固定抗体に結合されているスフィンゴ脂質以外の材料を実質的に全て除去する好適な溶媒で洗浄する。最後に、この支持体を、抗体からスフィンゴ脂質を遊離させる、例えばｐＨ３〜ｐＨ５．０の間の別の好適な溶媒（グリシンバッファーなど）で洗浄する。
【０２８４】
抗スフィンゴ脂質抗体はまた、例えば、特定の細胞、組織（生検サンプルなど）または体液においてその発現を検出する、スフィンゴ脂質の診断アッセイにも有用であり得る。このような診断方法は、心血管または脳血管疾患または障害の診断に有用であり得る。
【０２８５】
診断適用では、抗体を一般に検出可能な部分で標識する。多くの標識が利用可能であり、一般に以下のカテゴリーに分類される。
（ａ）３５Ｓ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈおよび１３１Ｉなどの放射性同位元素。抗体は、例えばCurrent Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience,  New York, N.Y., Pubs. (1991)に記載されている技術を用いて放射性同位元素で標識することができ、シンチレーション計数を用いて放射活性を測定することができる。
【０２８６】
（ｂ）希土類キレート（ユウロピウムキレート）またはフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、リサミン、フィコエリトリンおよびテキサスレッドなどの蛍光標識が利用可能である。これらの蛍光標識は、例えばCurrent Protocols in Immunology,前掲に開示されている技術を用いて抗体にコンジュゲートさせることができる。蛍光は蛍光計を用いて定量することができる。
【０２８７】
（ｃ）種々の酵素−基質標識が利用可能である。例えば、米国特許第４，２７５，１４９号には、これらのいくつかの総論が示されている。この酵素は一般に、様々な技術を用いて測定可能な発色基質に化学変化を触媒する。例えば、この酵素は、分光光度的に測定可能な、基質における色の変化を触媒し得る。あるいは、この酵素は、基質の蛍光または化学発光を変化させ得る。蛍光の変化を定量するための技術は上記されている。化学発光基質は化学反応によって電気的に励起状態となった後、測定可能な（例えば、ケミルミノメーターを用いる）光を発し得るか、または蛍光受容器にエネルギーを与え得る。酵素標識の例としては、ルシフェラーゼ（例えば、ホタル・ルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ；米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）などのペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカライドオキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼおよびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環オキシダーゼ（ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼなど）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなどが含まれる。酵素と抗体をコンジュゲートさせる技術は、O'Sullivan, et al., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (ed J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, New York, 73:147-166 (1981)に記載されている。
【０２８８】
酵素−基質の組合せの例としては、例えば、下記のものがある。
（ｉ）ヒドロジェンペルオキシダーゼを基質とするセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）、この場合、ヒドロジェンペルオキシダーゼは色素前駆体（例えば、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）または３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンヒドロクロリド（ＴＭＢ））を酸化する。
（ｉｉ）パラ−ニトロフェニルホスフェートを発色基質とするアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）および
（ｉｉｉ）発色基質（例えば、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ）または蛍光基質４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼを用いるβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ（β−Ｄ−Ｇａｌ）。
【０２８９】
当業者には、他の多くの酵素−基質の組合せが利用可能である。これらの一般的な総説としては、米国特許第４，２７５，１４９号および同第４，３１８，９８０後を参照。
【０２９０】
標識は抗体と間接的にコンジュゲートされる場合もある。当業者ならば、これを達成するための様々な技術が思い浮かぶであろう。例えば、抗体をビオチンとコンジュゲートさせ、上述の３つの広いカテゴリーの標識のいずれかをアビジンとコンジュゲートさせることができ、あるいは逆もまた可能である。ビオチンはアビジンと選択的に結合し、従って、この標識はこの間接的方式で抗体とコンジュゲートさせることができる。あるいは、標識と抗体の間接的コンジュゲーションを達成するために、抗体を小ハプテン（例えばジゴキシン）とコンジュゲートさせ、上述の異なる種の標識の１つを抗ハプテン抗体（例えば抗ジゴキシン抗体）とコンジュゲートさせる。このようにして標識と抗体の間接的コンジュゲーションが達成できる。
【０２９１】
本発明の別の実施形態では、抗スフィンゴ脂質抗体は標識する必要がなく、その存在は、抗スフィンゴ脂質抗体と結合する標識抗体を用いて検出することができる。
【０２９２】
本発明の抗体は、競合結合アッセイ、直接的および間接的サンドイッチアッセイおよび免疫沈降アッセイなどの既知のいずれかのアッセイ方法で使用可能である。例えば、Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc. 1987)参照。
【０２９３】
競合結合アッセイは、限られた量の抗体との結合をめぐって、試験サンプル分析物と競合する標識標品の能力によるものである。試験サンプル中のスフィンゴ脂質の量は、抗体と結合するようになった標品の量に反比例する。結合するようになった標品の量の測定を容易にするために、一般に競合前または競合後に抗体を不溶性とし、それにより、抗体と結合した標品および分析物は、結合せずに留まっている標品および分析物から便宜に分離することができる。
【０２９４】
サンドイッチアッセイは、それぞれ検出するタンパク質の異なる免疫原性部分またはエピトープと結合し得る２種類の抗体の使用を含む。サンドイッチアッセイでは、試験サンプル分析物は、固相支持体上に固定されている第一の抗体と結合させ、その後、第二の抗体をその分析物と結合させて、不溶性の３成分複合体を形成させる。例えば、米国特許第４，３７６，１１０号参照。第二の抗体はそれ自体、検出可能な部分で標識してもよいし（直接的サンドイッチアッセイ）、または検出可能な部分で標識された抗免疫グロブリン抗体を用いて測定してもよい（間接的サンドイッチアッセイ）。例えば、１つのタイプのサンドイッチアッセイがＥＬＩＳＡアッセイであり、この場合、検出可能な部分は酵素である。
【０２９５】
免疫組織化学では、血液または組織サンプル新鮮物であっても凍結品であってもよく、または例えば、パラフィンに包埋したり、ホルマリンなどの保存剤で固定してもよい。
【０２９６】
抗体はまた、in vivo診断アッセイにも使用可能である。一般に、抗体は放射性核種（１１１Ｉｎ、９９Ｔｃ、１４Ｃ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、３Ｈ、３２Ｐまたは３５Ｓなど）で標識され、これにより、結合した標的分子をイムノシンチログラフィーを用いて位置決定することができる。
【０２９７】
Ｅ．診断キット
便宜上、本発明の抗体は、例えば、診断アッセイを行うための説明書とともに所定の試薬の組合せをパッケージングしたキットを提供し得る。抗体を酵素で標識した場合、キットは、その酵素が必要とする基質および補因子（例えば、検出可能な発色団または蛍光団を提供する基質前駆体）を含む。さらに、安定剤、バッファー（例えば、ブロックバッファーまたは溶解バッファー）などの他の添加剤を含んでもよい。種々の試薬の相対量は、そのアッセイの感度を実質的に至適化する試薬の溶液中の濃度を提供するため、幅広く可変である。特に、これらの試薬は、溶解した際に適当な濃度を有する試薬溶液を提供する賦形剤を含め、乾燥粉末（通常は凍結乾燥されたもの）として提供され得る。
【０２９８】
Ｆ．抗体の治療的使用
治療適用では、本発明の抗スフィンゴ脂質抗体は、ボーラスとして、もしくはある時間にわたる持続的注入による静脈投与、筋肉内経路、腹腔内経路、脳脊髄内経路、皮下経路、動脈内経路、滑液包内経路、くも膜下腔内経路、経口経路、局所経路または吸入経路によってヒトに投与し得るものを含む、上述のものなどの薬学上許容される投与形で哺乳類、好ましくはヒトに投与される。
【０２９９】
疾患の予防または治療のための、抗体の適当用量は、上記で定義したような処置される疾患のタイプ、疾患の重篤度および経過、その抗体が予防目的で投与されるか治療目的で投与されるか、それまでの治療、患者の臨床歴および抗体に対する応答、ならびに担当医の判断によって異なる。抗体は１回または一連の処置期間にわたって患者に適宜投与される。
【０３００】
疾患のタイプおよび重篤度によって、例えば１回以上の分離投与によるものであれ、連続注入によるものであれ、約１μｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ）の抗体が患者投与のための初期候補用量となる。典型的な１日または週間用量は、上述の因子によって約１μｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上の範囲である。症状によって数日またはそれ以上にわたる反復投与では、疾患症候の所望の抑制が見られるまで処置を繰り返す。しかしながら、他の投与計画も有用であり得る。この療法の進行は、例えばＸ線写真画像を含む、従来の技術およびアッセイによって容易に監視される。
【０３０１】
本発明の別の実施形態によれば、疾患の予防または治療における抗体の有効性は、抗体を連続的に、または例えば化学療法的抗癌薬など、その目的に有効である別の薬剤と組み合わせて投与することにより改良することができる。このような他の薬剤は投与される組成物中に存在してもよいし、あるいは別に投与してもよい。抗体は連続的に、または他の薬剤と組み合わせて適宜投与される。
【０３０２】
Ｇ．製品
本発明の別の実施形態では、上記の障害の処置に有用な材料を含む製品が提供される。該製品は、容器とラベルを含む。好適な容器としては、例えば、瓶、バイアル、シリンジおよび試験管が含まれる。これらの容器はガラスまたはプラスチックなどの種々の材料からなってよい。これらの容器は症状を処置するのに有効な組成物を収容し、無菌アクセスポートを有し得る（例えば、この容器は静脈溶液バッグまたは皮下注射針が貫通可能なストッパーを備えたバイアルであり得る）。組成物中の有効薬は抗スフィンゴ脂質抗体である。容器上または容器に添付されたラベルは、その組成物が選択された症状の処置に使用されることを示す。この製品はさらに、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液などの薬学上許容されるバッファーを含む第二の容器を含み得る。それはさらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジおよび使用説明の添付文書を含む、商業的および使用者の立場から望ましい他の材料を含んでもよい。
【０３０３】
本発明は、下記の実施例を参照すればより良く理解できる。これらの実施例は単に現在本発明の実施に関して知られている最良の形態を例示することを意図したものである。本発明の範囲はこれに限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【０３０４】
本願は少なくとも１つのカラー図面を含む。カラーの図面を含む本願のコピーは求めに応じ、必要な料金を払えば提供される。各図面の簡単な要約を以下に示す。
【０３０５】
【図１】図１は２つのパネルＡおよびＢを含む。パネルＡは、Ｓ１Ｐ、ＳＰＨ、ＬＰＡ、ＳＰＣおよびビオチンコンジュゲート抗Ｓ１Ｐモノクローナル抗体をめぐって競合する構造的に類似するその他の生体脂質に関する競合的ＥＬＩＳＡ法の結果をグラフで示したものである。これらの結果は、この抗体がＳ１Ｐに対して特異的かつ感受性があり、構造的に類似する生物活性脂質を認識しないことを示す。下記実施例１に記載されているように、結合した抗体は、ＨＲＰとコンジュゲートしたマウスまたはヒトＩｇＧに特異的な二次抗体によって検出された。発色反応を測定し、光学密度（ＯＤ）として報告した。競合に用いられた脂質の濃度はＸ軸で示す。二次抗体とＳ１Ｐコーティングマトリックス単独の相互作用は検出されなかった（データは示されていない）。パネルＢは、パネルＡに挙げられているＳ１Ｐに類似する生物活性脂質の構造を示す。
【０３０６】
【図２】数種のキメラおよび組換えヒト化抗Ｓ１Ｐ抗体変異体の結合特性を示す。キメラ抗体（ｐＡＴＨ１０＋ｐＡＴＨ５０）に関するＳ１Ｐとの結合をＥＬＩＳＡ結合アッセイで、ヒト化抗Ｓ１Ｐモノクローナル抗体の２つの変型（ｐＡＴＨ２０１＋ｐＡＴＨ３０８）および（ｐＡＴＨ２０１＋ｐＡＴＨ３０９）と比較した。ｐＡＴＨ３０８はフレームワーク領域に５つのネズミ復帰突然変異を有するヒト化軽鎖であり、ｐＡＴＨ３０９は３つの復帰突然変異を有するヒト化軽鎖である。ヒト化重鎖（ｐＡＴＨ２０１）はフレームワーク領域にネズミ復帰突然変異を１つだけ含む。
【０３０７】
【図３】ＳＰＨＩＮＧＯＭＡはＳ１Ｐに特異性が高いことを示すグラフである。このグラフは、競合的ＥＬＩＳＡ法を用いてデータが作成され、他の生物活性脂質と比べた際のＳ１Ｐに対するＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢの特異性を示している。ＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢは、Ｓ１Ｐの直前の代謝前駆体であるスフィンゴ（ＳＰＨ）またはＳ１Ｐと構造的かつ機能的に類似する重要な細胞外シグナル伝達分子であるリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）と交差反応性はないことを示した。ＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢは、セラミド−１−リン酸（Ｃ１Ｐ）、ジヒドロスフィンゴシン（ＤＨ−ＳＰＨ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）またはスフィンゴミエリン（ＳＭ）を含む他の構造的に類似する脂質および代謝産物を認識しなかった。ＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢはジヒドロスフィンゴ−１−リン酸（ＤＨ−Ｓ１Ｐ）と交差反応し、程度は低いがスフィンゴシルホリルコリン(sphingosylphoryl choline)（ＳＰＣ）とも交差反応した。ＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢのＳ１Ｐに対する親和性（Ｋｄ）は１００ｐＭ未満であり、ほとんどの治療抗体、特に他の分子スポンジよりも遙かに高い。
【０３０８】
【図４】図４は２つのＡおよびＢを含む。この図面に示されているデータを得た実験は下記の実施例４に詳説されている。要するに、これらのデータは、ＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢが眼球の病変におけるＣＮＶおよび瘢痕形成を軽減したことを示す。マウスをＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢまたはイソ型適合非特異的モノクローナル抗体で処置した。ＣＮＶ病変はブルッフ膜のレーザー破膜により誘発した。血管新生に関してはローダミンコンジュゲートヒマ(R. communis)凝集素Ｉ（Ａ）で、またはコラーゲン瘢痕形成に関してはまたはマッソン・トリクローム（Ｂ）で染色したマッソンの染色した各処置群のグラフと病変の代表的な画像が示されている。図４Ａは、ネズミＣＮＶ病変形成モデルにおいてＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢが、レーザーにより誘発されたブルッフ膜の破膜から１４日および２８日後に脈絡膜の新血管新生を劇的に緩和することを示す。図４Ｂは、ＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢが、レーザーにより誘発されたブルッフ膜の破膜から２８日後にＣＮＶ病変形成に関連する繊維症を有意に軽減することを示す。
【０３０９】
【図５】図５は２つのパネルＡおよびＢを含む。パネルＡでは、Ｓ１ＰはＨＵＶＥＣ管の形成および遊走の誘導を介して新血管新生を促進し、それがＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢによって軽減されることが示されている。パネル５Ａは、管の形成を評価するために、マトリゲルに播種され、６時間インキュベートされたＨＵＶＥＣの４枚の顕微鏡写真を示す。パネル５Ｂは、マトリゲルインベージョンチャンバーにて６時間、１μＭ  Ｓ１Ｐ±ＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢ（１μｇ／ｍｌ）で処置されたＨＵＶＥＣのデータを示す。マトリゲル膜へ遊走した細胞の数を５つの独立視野で計数した。
【０３１０】
【図６】図６は、ＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢを用いて行った下記の実施例６に記載されている実験のいくつかの写真（Ａ）およびグラフ（ＢおよびＣ）を含む。ＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢはＳ１Ｐ、ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦにより誘発された新血管新生を中和する。図６Ａは、マトリゲルプラグ±示された増殖因子の切片のいくつかの代表的なＦＩＴＣ染色血管の写真を示す。図６Ｂは、Ｓ１Ｐが内皮細胞（ＥＣ）の浸潤を刺激することを示す。図６Ｃは、新血管新生の指標としてＶＥＧＦまたはｂＦＧＦで刺激されたマトリゲルプラグの相対的蛍光の定量を表す。これらのＳ１Ｐ、ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦの作用は、マウスが１または２５ｍｇ／ｋｇのＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢで全身処置された際に阻害された。
【０３１１】
【図７】図７はＡ〜Ｅと表示された５つのグラフと２つのｐｃｏｌｏｒフォトを示す。このデータは抗Ｓ１Ｐモノクローナル抗体ＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢを用いて作製されたものである。実験詳細については、下記の実施例７を参照。要するに、これらのデータは、ＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢがＳ１Ｐによって刺激された瘢痕形成を中和することを示す。これらの実験では(In thes eexperiemnts)、繊維芽細胞を血清飢餓状態とした後、０、０．１、０．５または１μＭのＳ１Ｐ＋／−１μｇ／ｍＬのＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢで１２〜２４時間処置した。これらのデータは、３Ｈ−チミジンの組み込みによって測定されるＳ１Ｐにより刺激されたＳｗｉｓｓ  ３Ｔ３繊維芽細胞増殖（Ａ）、スクラッチアッセイにおけるネズミ心臓繊維芽細胞の遊走（Ｂ）、コラーゲン−ＧＦＰを発現するトランスジェニックマウスから単離された心臓繊維芽細胞におけるコラーゲン遺伝子発現（相対蛍光）（Ｃ）および細胞増殖の低下とα−ＳＭＡ発現の増強によって測定されるＷＩ−３８細胞の筋繊維芽細胞への分化（Ｄ）を示す。ＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢはこれらの各Ｓ１Ｐ作用を中和した。ＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢはin vivoにおいてネズミ永久心筋梗塞モデルで血管周囲の繊維症を軽減した（Ｅ）。
【０３１２】
【図８】図８は３つのパネル８Ａ、８Ｂおよび８Ｃを含む。これらのデータは、Ｓ１Ｐは眼球の上皮細胞および繊維芽細胞の、収縮性、瘢痕組織産生筋繊維芽細胞への形質転換を促進することを示す。下記の実施例８に記載されているように、いくつかのヒト眼球細胞系統の筋繊維芽細胞形質転換に対するＳ１Ｐの作用を検討した。Ｓ１Ｐは、ヒト網膜色素上皮細胞（図８Ａ）およびヒト結膜繊維芽細胞（図８Ｂ）においてα−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ；筋繊維芽細胞マーカー）の産生を刺激することが判明した。これらのデータは初めて、Ｓ１Ｐが眼球の上皮細胞および繊維芽細胞の、収縮性、瘢痕組織産生筋繊維芽細胞への形質転換を促進する因子の１つであることを示す。また、ヒト結膜繊維芽細胞におけるプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤（ＰＡＩ−１）の発現に対するＳ１Ｐの作用も検討した。ＰＡＩ−１発現の増強が結合組織のタンパク質加水分解性の分解の低下と相関し、瘢痕化の増加を含むいくつかの繊維性疾患に関連してアップレギュレーションされる。図８Ｃに示されるように、Ｓ１ＰはＰＡＩ−１発現を用量依存的に刺激する。
【０３１３】
【図９】図９は、ＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢと呼ばれる抗Ｓ１Ｐモノクローナル抗体を用いて作成した実験データを示す２つの棒グラフＡおよびＢを示す。ＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢはin vivoにおける免疫細胞創傷浸潤を軽減した。マウスにＭＩを施し、外科術４８時間後に生理食塩水または２５ｍｇ／ｋｇのＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢで処置し、その後、４日目に犠牲にした。ＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢは、マクロファージ（Ａ）および肥満細胞（Ｂ）の創傷部への浸潤を低下させた。データは生理食塩水処置値の低下倍率として示されている。
【０３１４】
【図１０】図１０は、２つのパネル１０Ａおよび１０Ｂを含む。各パネルはネズミ抗Ｓ１Ｐモノクローナル抗体ＶＬおよびＶＨドメインの発現用のクローニングベクターのマップを示す。図１０Ａは、ＶＬドメインのクローニング用のｐＫＮ１００ベクターのマップである。図１０Ａは、ＶＨドメインのクローニング用のｐＧ１Ｄ２００ベクターのマップである。
【０３１５】
【図１１】図１１は、数種のネズミ、キメラおよび組換えヒト化抗Ｓ１Ｐ抗体の結合特性を示すデータを示す。マウス（ｍｕＭＡｂＳ１Ｐ；四角のデータポイントから作成した曲線）およびキメラ（ｃｈＭＡｂ  Ｓ１Ｐ；上向き三角のデータポイントから作成した曲線）に関するＳ１Ｐとの結合をＥＬＩＳＡ結合アッセイにてヒト化抗体の第一のバージョン（ｐＡＴＨ２００＋ｐＡＴＨ３００；下向き三角のデータポイントから作成した曲線）と比較した。
【０３１６】
【図１２】図１２は、数種のヒト化モノクローナル抗体変異体を用いて行ったin vitro細胞アッセイからのデータを示すパネルＡおよびＢを含む。パネルＡは、ヒト化ｍＡｂが、Ｓ１Ｐがタキソールにより誘発されるアポトーシスからＳＫＯＶ３細胞を保護することを回避することができることを示す。下記の実施例１６に記載されているように、ＳＫＯＶ３細胞は、１μｇ／ｍＬ濃度のｈｕＭＡｂＨＣＬＣ３（３０９）、ｈｕＭＡｂＨＣＬＣ５（３０８）、ｍｕＭＡｂ  Ｓ１Ｐ（ｍｕＭＡｂ）または非特異的ＩｇＧ１（ＮＳ）を伴う５００ｎＭ  Ｓ１Ｐの存在下または不在下にて５００ｎＭタキソール（Ｔａｘ）で４８時間処置した。値は各データポイントで３回ずつ行った場合の平均値±±ＳＥＭ（ｎ＝３）を表す。「ＮＴ」は処置されなかったことを意味し、「Ｖｅｈ」はビヒクル単独を意味する。パネルＢは、Ｓ１Ｐおよび数種の異なる抗Ｓ１Ｐモノクローナル抗体または対照モノクローナル抗体の１つで処置した卵巣癌（ＯＶＣＡＲ３）細胞におけるＩＬ−８分泌を示す。下記の実施例６に詳細に記載されている実験では、１００，０００のＯＶＣＡＲ３細胞／ウェルを一番飢餓状態とし、１μＭ  Ｓ１Ｐを培養培地に加えるだけか、あるいは１μｇ／ｍｌの非特異的抗体（ＮＳ）、ｐＡＴＨ２０１＋ｐＡＴＨ３０９（ＬＣ３）、ｐＡＴＨ２０１＋ｐＡＴＨ３０８（ＬＣ５）、ｐＡＴＨ２０７＋ｐＡＴＨ３０９（ｃｙｓＬＣ３）、ｐＡＴＨ２０７＋ｐＡＴＨ３０８（ｃｙｓＬＣ５）および０．１μｇ／ｍｌ（Ｍ０．１）、１μｇ／ｍｌ（Ｍ１）または１０μｇ／ｍｌ（Ｍ１０）の抗Ｓ１Ｐネズミ抗体とともにプレインキュベートした。インキュベーション２２時間後に、細胞上清を回収し、ＩＬ−８分泌を、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ｈｕｍａｎ  ＣＸＣＬ８／ＩＬ−８キットを用いてＥＬＩＳＡにより測定した。この図で「ＮＴ」は処置されなかった細胞を指す。
【０３１７】
【図１３】図１３は、ＣＮＶ動物モデルにおいて数種のヒトモノクローナル抗体変異体のin vivo有効性をマウス抗Ｓ１Ｐモノクローナル抗体および対照と比較して示す。下記の実施例７に記載されているように、これらの実験では、マウスにネズミ（Ｍｕ）抗Ｓ１Ｐモノクローナル抗体、数種のヒト化抗Ｓ１Ｐモノクローナル抗体変異体（すなわち、変異体ＬＣ３、ＬＣ５、ＨＣｃｙｓＬＣ３およびＨＣｃｙｓＬＣ５）または非特異的モノクローナル抗体（ＮＳ）硝子体内投与により０．５μｇで２回投与した後、ブルッフ膜のレーザー破膜を行った。レーザー術後１４日目にマウスを犠牲にした。強膜−ＲＰＥ−脈絡膜複合体を解剖し、ローダミンコンジュゲートヒマ(R. communis)凝集素Ｉ抗体で染色した。ＣＮＶ病変体積を平均値±ＳＥＭで示す。
【発明を実施するための形態】
【０３１８】
実施例
実施例１：Ｓ１Ｐに対するネズミモノクローナル抗体（Ｓｐｈｉｎｇｏｍａｂ（商標）；ＬＴ１００２）
あるタイプの治療抗体は、望ましくないスフィンゴ脂質と特異的に結合して、例えば（１）心臓毒性作用、腫瘍形成作用、または脈管形成作用などの望ましくない作用を促進する望ましくない有毒スフィンゴ脂質の有効濃度（および／またはそれらの代謝前駆体の有効濃度）を低下させることなどの有益な作用をもたらし；（２）望ましくない、毒性、腫瘍形成性、または脈管形成性スフィンゴ脂質の細胞受容体への結合を阻害し、その結果、かつ／またはこのような受容体との結合が可能なスフィンゴ脂質の濃度を低下させる。かかる治療効果の例としては、限定されるものではないが、利用可能なＳ１Ｐの有効in vivo血清濃度を低下させ、それによってＳ１Ｐの腫瘍形成作用および脈管形成作用ならびにＭＩ後心不全、癌、または繊維形成性疾患(fibrongenic diseases)におけるその役割を遮断または少なくとも制限するための抗Ｓ１Ｐ抗体の使用が挙げられる。
【０３１９】
Ｓ１Ｐの本質的構造的特徴をＫＬＨなどの担体分子と架橋することができる反応性基を含むように、チオール化Ｓ１Ｐを合成した。免疫処置の前に、そのチオ−Ｓ１Ｐ類似体を標準的なプロトコールを用いてＩＯＡまたはＳＭＣＣ架橋を介してタンパク質担体（例えばＫＬＨ）とコンジュゲートした。ＳＭＣＣは、第一級アミンおよびスルフヒドリル基と反応するヘテロ二官能性架橋剤であり、好ましい架橋剤である。
【０３２０】
Ｓｗｉｓｓ  ＷｅｂｓｔｅｒマウスまたはＢＡＬＢ−Ｃマウスを、１回の注射当たり５０μｇの免疫原（チオール化Ｓ１ＰとＫＬＨのＳＭＣＣ促進性コンジュゲート）を用いて２ヶ月かけて４回免疫処置した。第二回目、第三回目および第四回目の免疫処置の２週間後に血清サンプルを採取し、抗Ｓ１Ｐ抗体の存在について直接ＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。次に、抗Ｓ１Ｐ抗体について高力価を示した動物の脾臓を用い、標準的な融合手順によってハイブリドーマを作製した。得られたハイブリドーマを密集状態まで増殖させ、その後、ＥＬＩＳＡ解析のためにその細胞上清を集めた。免疫処置した５５匹のマウスのうち、８匹は良好に応答し、Ｓ１Ｐ反応抗体について著しい血清力価を示した。続いて、これらのマウスの脾臓および骨髄腫細胞を用い、確立された手順に従って融合を行った。次いで、得られた１，５００のハイブリドーマを直接ＥＬＩＳＡによってスクリーニングし、２８７の陽性ハイブリドーマを得た。直接ＥＬＩＳＡによってスクリーニングしたこれらの２８７ハイブリドーマのうち、１５９のハイブリドーマが著しい力価を示した。次いで、１５９のハイブリドーマそれぞれを２４ウェルプレートに増殖させた。その後、増殖させたハイブリドーマの細胞馴化培地を再スクリーニングして、目的の抗体を分泌することができる安定なハイブリドーマを同定した。６０の最大力価安定ハイブリドーマにおいて競合的ＥＬＩＳＡを実施した。
【０３２１】
スクリーニングした５５匹のマウス、ほぼ１，５００のハイブリドーマの中から、性能特性を表示した１つのハイブリドーマを発見し、この性能特性によって限界希釈クローニングが、最終的に真のモノクローナル抗体を作製するのに必要なものとして正当化された。この方法により４７のクローンを得、その大部分はＳ１Ｐ抗体の産生について陽性であると判断した。これらの４７クローンのうち、６クローンを２４ウェルプレートに増殖させ、続いて、競合的ＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。陽性のままであった４クローンから、１つのクローンを選択して、Ｓ１Ｐモノクローナル抗体の大量生産を開始した。これらの細胞をＳＣＩＤマウスに注射し、得られた腹水をＡタンパク質精製し（５０％収率）、内毒素レベルについて解析した（＜３ＥＵ／ｍｇ）。１回の腹水生産では、５０匹のマウスに注射し、合計１２５ｍＬの腹水を生産した。これらの抗体をＩｇＧ１κとイソ型判定し、ＨＰＬＣにより＞９５％純度であると判断した。抗体は１５０ｍＭ塩化ナトリウム含有２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）中で調製し、−７０℃で保存した。この抗体をＬＴ１００２またはＳｐｈｉｎｇｏｍａｂ（商標）と称する。
【０３２２】
陽性ハイブリドーマクローン（クローン３０６Ｄ３２６．２６と称する）はＡＴＣＣに寄託した（安全寄託保存番号ＳＤ−５３６２）。このクローンはＳ１Ｐに対して向けられた第一のネズミｍＡｂである。このクローンは、「ヒト化」抗体変異体の作製に用いることができる抗体重鎖および軽鎖の可変領域、ならびにキメラ抗体を構築するのに必要な配列情報も含む。
【０３２３】
Ｓ１Ｐ特異的抗体についての血清および細胞上清のスクリーニングは、抗原としてチオール化ＳＩＰ類似体を用いた直接ＥＬＩＳＡによるものとした。標準的なＥＬＩＳＡを、最初のインキュベーション中に５０μｌのサンプル（血清または細胞上清）を等量のＰＢＳ／０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）で希釈したことを除き、下記のように実施した。ＥＬＩＳＡは、結合バッファー（３３．６ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３；ｐＨ９．５）中のＢＳＡとコンジュゲートさせた０．１μｇの化学合成チオール化Ｓ１Ｐでコーティングした９６ウェル高結合ＥＬＩＳＡプレート(Costar)において実施した。ＥＬＩＳＡプレートウェル中でチオール化Ｓ１Ｐ−ＢＳＡを３７℃で１時間、４℃で一晩インキュベートした。次いで、これらのプレートをＰＢＳ（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．６８ｍＭ  ＫＣｌ、１０．１４ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．７６ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４；ｐＨ７．４）で４回洗浄し、ＰＢＳＴで室温にて１時間ブロッキングした。最初のインキュベーションステップでは、７５μＬのサンプル（測定すべきＳ１Ｐを含有する）を、ＰＢＳＴで希釈した２５μＬの０．１μｇ／ｍＬ抗Ｓ１Ｐ  ｍＡｂとともにインキュベートし、ＥＬＩＳＡプレートのウェルに入れた。各サンプルを３連のウェルで実施した。室温で１時間のインキュベーション後、ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳで４回洗浄し、各ウェルにつき１００μｌの０．１μｇ／ｍＬ  ＨＲＰヤギ抗マウス二次物(Jackson Immunoresearch)とともに室温で１時間インキュベートした。次いで、プレートをＰＢＳで４回洗浄し、テトラメチルベンジジン(Sigma)に１〜１０分間曝した。等量の１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を加えることによって検出反応を停止させた。ＥＬ−Ｘ−８００  ＥＬＩＳＡプレートリーダー(Bio-Tech)を用い、４５０ｎｍで測定することによってサンプルの光学密度を決定した。
【０３２４】
交差反応性については、競合的ＥＬＩＳＡを、次の変更を除き、上記のように実施した。最初のインキュベーションは競合物（Ｓ１Ｐ、ＳＰＨ、ＬＰＡなど）とビオチンコンジュゲート抗Ｓ１Ｐ  ｍＡｂで構成した。精製モノクローナル抗体のビオチン化をＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ(Pierce)を用いて実施した。ビオチン取り込みはキットプロトコールによって決定し、１抗体につき７〜１１個のビオチン分子であった。競合物は次のとおり調製した：脂質ストックを超音波処理し、アルゴン下で乾燥させた後、ＤＰＢＳ／ＢＳＡ［ＤＰＢＳ（Invitrogen  １４０４０−１３３）中１ｍｇ／ｍｌ脂肪酸フリーＢＳＡ(Calbiochem)］で再構成した。必要に応じて、精製抗Ｓ１Ｐ  ｍＡｂをＰＢＳ／０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で希釈した。競合物３に抗体１の割合を作成するように競合物および抗体溶液を一緒に混合した。ＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジン二次抗体(Jackson Immunoresearch)を用いて、シグナルを作成した。
【０３２５】
競合的ＥＬＩＳＡデータの別の解釈（図１、パネルＡに示す）では、抗Ｓ１Ｐ  ｍＡｂがチオール化Ｓ１Ｐ類似体と、競合試験で加えた天然Ｓ１Ｐを区別することができないということが示される。この解釈では、二重結合なしに類似体が構築されたことから抗Ｓ１Ｐ  ｍＡｂが酸化生成物を全く認識しないことも示される。室温で４８時間そのまま存在させ得る二重結合を含む天然物に対しても抗Ｓ１Ｐ  ｍＡｂを検証した。天然Ｓ１Ｐの逆相ＨＰＬＣをこれまでに報告されている方法(Deutschman, et al. (July 2003), Am Heart J., vol. 146(1):62-8)に従って実施し、その結果より保持時間に差がないことが分かった。さらに、このモノクローナル抗体についての、図１、パネルＡに示した様々な脂質との結合特性の比較により、この抗体によって認識されたエピトープは天然Ｓ１Ｐの二重結合の領域に炭化水素鎖を含まないことも示される。一方、このモノクローナル抗体によって認識されたエピトープは、スフィンゴシン塩基骨格にアミノアルコールを含み、その上遊離リン酸を含む領域である。この遊離リン酸がコリンと結合する（ＳＰＣと同様に）ならば、抗体結合は幾分か減少した。このアミノ基が脂肪酸とエステル結合する(esterfied)（Ｃ１Ｐと同様に）ならば、抗体結合は認められなかった。このスフィンゴシンアミノアルコール骨格がグリセロール骨格に置き換えられた（ＬＰＡと同様に）ならば、ＳＩＰ特異的モノクローナル抗体は結合を示さなかった。これらのエピトープマッピングデータにより、このモノクローナル抗体によって認識されたＳ１Ｐにはただ１つのエピトープしかないこと、そしてこのエピトープがＳ１Ｐの独特の極性頭部基によって定義されることが示される。
【０３２６】
ＥＬＩＳＡ測定を用いる同様の試験では、この抗Ｓ１Ｐモノクローナル抗体がタンパク質担体も架橋剤も認識しないようにするために、好適な対照材料を評価した。例えば、ＥＬＩＳＡにおいてチオール化Ｓ１Ｐを、レイダウン材料(the laydown material)としてのＢＳＡとコンジュゲートする際に、標準の架橋剤ＳＭＣＣをＩＯＡと交換した。
【０３２７】
ＩＯＡを用いた場合、抗体の結合特性は、ＢＳＡ−ＳＭＣＣ−チオール化Ｓ１Ｐを用いた場合とほぼ同じであった。同様に、ＫＬＨを、レイダウン材料としてチオール化Ｓ１Ｐと複合体形成するタンパク質としてのＢＳＡと交換した。この試験でも、抗体の結合特性に有意な差がなかった。
【０３２８】
結合速度論：Ｓ１Ｐとその受容体または他の部分との結合速度論は、脂質の性質から伝統的に問題があるとされてきた。多くの問題が脂質の不溶性に関連していた。ＢＩＡｃｏｒｅ測定では、これらの問題は、Ｓ１ＰをＢＩＡｃｏｒｅチップに直接固定することによって克服された。この後、抗体をチップの表面に流し、光学密度の変化を測定して、抗体とＳ１Ｐとの結合特性を決定した。抗体の二価結合性を回避するために、チップ上に低密度でＳ１Ｐをコーティングした。加えて、そのチップを様々な密度のＳ１Ｐ（７ＲＵ、２０ＲＵおよび１０００ＲＵ）でコーティングし、抗体結合データを１：１相互作用モデルにグローバルフィッティングを行った。図２に示した結果は、３つの異なるＳ１Ｐ密度におけるモノクローナル抗体とＳ１Ｐとの結合に起因する光学密度の変化を示している。概して、Ｓ１Ｐに対するモノクローナル抗体の親和性は非常に高く、結合データを解析するために一価結合モデルを用いたかまたは二価結合モデルを用いたかによって、およそ８８ピコモル（ｐＭ）〜９９ｎＭの範囲にあることが確認された。
【０３２９】
実施例２：ＥＬＩＳＡアッセイ
１．定量的ＥＬＩＳＡ
マイクロタイターＥＬＩＳＡプレート（Costar、カタログ番号３３６１）を、１Ｍ炭酸バッファー（ｐＨ９．５）で希釈したウサギ抗マウスＩｇＧ，Ｆ（ａｂ’）２フラグメント特異的抗体（Jackson、３１５−００５−０４７）で３７℃で１時間コーティングした。プレートをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ／ＢＳＡ／Ｔｗｅｅｎ−２０で３７℃にて１時間ブロッキングした。最初のインキュベーションでは、非特異的マウスＩｇＧまたはヒトＩｇＧ、全分子（較正曲線に使用）および測定サンプルの希釈溶液をウェルに入れた。プレートを洗浄し、１ウェルにつき１００μｌの１：４０，０００希釈ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウス（Ｈ＋Ｌ）（Jackson、カタログ番号１１５−０３５−１４６）とともに３７℃で１時間インキュベートした。洗浄後、酵素反応をテトラメチルベンジジン（Sigma、カタログ番号Ｔ０４４０）で検出し、１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を加えることによってその反応を停止させた。光学密度（ＯＤ）を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＥＸを用いて４５０ｎｍで測定した。解析のために未加工データをＧｒａｐｈＰａｄソフトウエアに送った。
【０３３０】
２．直接ＥＬＩＳＡ
マイクロタイターＥＬＩＳＡプレート（Costar、カタログ番号３３６１）を、１Ｍ炭酸バッファー（ｐＨ９．５）で希釈したＬＰＡ−ＢＳＡで３７℃で１時間コーティングした。プレートをＰＢＳ（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．６８ｍＭ  ＫＣｌ、１０．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．７６ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４；ｐＨ７．４）で洗浄し、ＰＢＳ／ＢＳＡ／Ｔｗｅｅｎ−２０で室温で１時間または４℃で一晩ブロッキングした。試験するサンプルを、０．４μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、０．０５μｇ／ｍＬ、０．０１２５μｇ／ｍＬ、および０μｇ／ｍＬに希釈し、各ウェルに１００μｌを加えた。プレートを洗浄し、１ウェルにつき１００μｌのＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウス（１：２０，０００希釈）（Jackson、カタログ番号１１５−０３５−００３）とともに室温で１時間インキュベートした。洗浄後、酵素反応をテトラメチルベンジジン（Sigma、カタログ番号Ｔ０４４０）で検出し、１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を加えることによってその反応を停止させた。光学密度（ＯＤ）を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＥＸを用いて４５０ｎｍで測定した。解析のために未加工データをＧｒａｐｈＰａｄソフトウエアに送った。
【０３３１】
３．競合アッセイ
ｍＡｂの特異性をＥＬＩＳＡアッセイにより試験した。マイクロタイタープレート  ＥＬＩＳＡプレート（Costar、カタログ番号３３６１）を、１Ｍ炭酸バッファー（ｐＨ９．５）で希釈した１８：０  ＬＰＡ−ＢＳＡで３７℃で１時間コーティングした。プレートをＰＢＳ（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．６８ｍＭ  ＫＣｌ、１０．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．７６ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４；ｐＨ７．４）で洗浄し、ＰＢＳ／ＢＳＡ／Ｔｗｅｅｎ−２０で３７℃で１時間または室温で一晩ブロッキングした。最初のインキュベーションでは、０．４μｇ／ｍＬ  抗ＬＰＡ  ｍＡｂと指定量の（１４：０、１６：０、１８：０、１８：１、１８：２および２０：４）ＬＰＡ、ＤＳＰＡ、１８：１  ＬＰＣ（リゾホスファチジルコリン）、Ｓ１Ｐ、セラミドおよびセラミド−１−リン酸をＥＬＩＳＡプレートのウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、１ウェルにつき１００μｌのＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウス（１：２０，０００希釈）（Jackson、カタログ番号１１５−０３５−００３）または１：５０，０００希釈ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒト（Ｈ＋Ｌ）（Jackson、カタログ番号１０９−０３５−００３）とともに３７℃で１時間インキュベートした。洗浄後、酵素反応をテトラメチルベンジジンで検出し、１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を加えることによってその反応を停止させた。光学密度（ＯＤ）を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＥＸを用いて４５０ｎｍで測定した。解析のために未加工データをＧｒａｐｈＰａｄソフトウエアに送った。
【０３３２】
実施例３：ＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢ  ネズミｍＡｂはＳ１Ｐに対して高度に特異的である
競合的ＥＬＩＳＡにより、他の生体活性脂質と比較して、Ｓ１Ｐに対するＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢの特異性が示されている。ＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢは、Ｓ１Ｐの直接代謝前駆体であるスフィンゴシン（ＳＰＨ）、またはＳ１Ｐと構造的かつ機能的に類似している重要な細胞外シグナル伝達分子であるリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）との交差反応性は示されていない。ＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢは、構造的に類似している他の脂質および代謝産物、セラミド−１−リン酸（Ｃ１Ｐ）、ジヒドロスフィンゴシン（ＤＨ−ＳＰＨ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、またはスフィンゴミエリン（ＳＭ）などを認識しなかった。ＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢは、ジヒドロスフィンゴシン−１−リン酸（ＤＨ−Ｓ１Ｐ）と、そしてより少ない程度に、スフィンゴシルホリルコリン(sphingosylphorylcholine)（ＳＰＣ）とは交差反応した（図３）。
【０３３３】
実施例４：ＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢはＣＮＶネズミモデルにおいてＣＮＶおよび瘢痕形成を著しく減少させる
雌Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスをレーザーによるブルッフ膜破膜に供し、２μｌの生理食塩水で希釈した０．５μｇのＳｐｈｉｎｇｏｍａｂまたはイソ型適合非特異的（ＮＳ）抗体のいずれかをを投与した。レーザー破膜の１４日後および２８日後にマウスを犠牲にした。
【０３３４】
ＣＮＶ病変を誘導するために、眼科用トロピカミド（０．５％）およびフェニレフリン（２．５％）で瞳孔を散大した。眼の上にカバースリップを置いた。５０μｍのスポットサイズで１５０ｍＷで１００ｍ秒のパルスを出すように設定した細隙灯と連結したＯｃｕｌｉｇｈｔ  ＧＬ  ５３２ｎｍ(Iridex Corporation, Mountain View, CA)を用いて、９時、１２時および３時の相対位置において、視神経円板からおよそ５０μｍの位置にある右眼４分の３のブルッフ膜を破膜させた。全てのケースにおいて左眼を無傷の対照とした。気泡のない病変または融合状態となった病変は解析から排除した。
【０３３５】
ＣＮＶ病変サイズを測定するために、鞏膜−脈絡膜−ＲＰＥ複合体の脈絡膜フラットマウントを調製し、血管系（R. communis凝集素Ｉ；赤色）および周皮細胞（ＣＤ１４０ｂ；緑色）について染色した。ＲＧＢ  Ｓｐｏｔ高解像度デジタルカメラおよびレーザー走査共焦顕微鏡(BioRad MRC 1024, BioRad Corporation, Temecula, CA)を備えた落射蛍光Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｌａｎ  ２を用いて、デジタル画像を取り込んだ。容量分析では、ｚシリーズキャプチャーを用い、ｚシリーズ全体にわたる病変領域の合計にｚ厚さ（４μｍ）を乗じ、病変体積を得た。
【０３３６】
コラーゲン沈着を評価するために、鞏膜−脈絡膜−ＲＰＥ複合体をマッソン・トリクロームで染色した。この鞏膜−脈絡膜−ＲＰＥ複合体をパラフィン包埋した後、厚さ６μｍの連続切片を作製した。１病変につきおよそ３０の切片を評価した。コラーゲン沈着量の定量を、ＣＮＶ病変体積に関して記載した方法と同じように算出した。
【０３３７】
取り込んだデジタル画像を、ＩｍａｇｅＪソフトウエア(Research Services Branch, National Institutes of Health, Bethesda, MD)を用いて形態学的に評価した。図４Ａは、ＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢが、レーザーによるブルッフ膜破膜の１４日後および２８日後に脈絡膜新血管新生を劇的に弱めることを示している。図４Ｂは、ＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢが、レーザーによるブルッフ膜破膜の２８日後にＣＮＶ病変形成と関連している繊維症を著しく減少させることを示している。
【０３３８】
実施例５：ＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢは内皮細胞移動および管形成の阻害を含む複数の機構を通じて新血管新生を阻害する
Ｓ１Ｐはヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の移動を促進するが、マトリゲルアッセイおよび他のアッセイ（in vitroでのデノボＢＶ形成）において；ＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢはＳ１Ｐのこれらの作用を無効にすることができる。Visentin et al. (Cancer Cell 2006 Mar; 9(3): 225-38)によって記載されているように、試験を実施した。図５Ａ中のデータは、ＧＦを引き下げたマトリゲル上に播種したＨＵＶＥＣはＳ１Ｐの存在下では多数の毛細血管様構造を形成し、Ｓ１Ｐの不在下でまたはＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢおよびＳ１Ｐとともに同時インキュベートした時には毛細血管様構造を形成しなかったことを示唆している。図５Ｂ中のデータは、マトリゲルケモインベーションアッセイにおいて０．１〜１μＭ  Ｓ１ＰがＨＵＶＥＣ移動を、非処置ＨＵＶＥＣ、またはＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢとともに同時インキュベートしたＨＵＶＥＣの２〜２．５倍刺激する強い能力を示している。まとめると、これらの研究は、ＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢがＥＣへのＳ１Ｐの脈管形成促進作用を効果的に軽減することができることを示している。
【０３３９】
実施例６：ＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢはin vivoでのＳ１Ｐ、ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦの作用の軽減を含む複数の機構を通じて新血管新生を阻害する
Ｓ１Ｐが皮下に埋め込まれたマトリゲルプラグ内への内皮毛細血管成長を増加させることを示したin vivo研究に基づいて、本発明者らは、ＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢによりin vivoでのデノボＢＶ形成を減少させることができると推測した。このことを調査するために、本発明者らは新血管新生に関しin vivoマトリゲルプラグアッセイを用いた。一連の試験において、マトリゲルに１μＭ  Ｓ１Ｐ、０．５μｇ／ｍＬ  ｂＦＧＦまたは１μｇ／ｍＬ  ＶＥＧＦのいずれかを添加した後、マウス（ｎ＝４）にＩ．Ｐ．注射した。１０日後、それらのマウスをヘパリン処理し、蛍光レクチン、イソレクチン  Ｂ４−ＦＩＴＣを注射した。この蛍光レクチンは、血管ＥＣによって発現される接着分子と結合し、その接着分子によって増殖しつつあるＢＶが形作られる。次いで、プラグを切除し、ＯＣＴ中で凍結させ、切片を作製し、ＦＩＴＣ染色されたＢＶについて考察した。図６Ａ中のデータは、ｂＦＧＦまたはＶＥＧＦを含有するプラグと比較して、Ｓ１Ｐを含有するプラグにおいて膨大な量のＦＩＴＣ染色ＢＶから明らかなように、Ｓ１ＰがｂＦＧＦまたはＶＥＧＦよりも強力なin vivo新血管新生刺激因子であることを示唆している [Lee, et al., (1999), Biochem Biophys Res Commun,. vol 264: 743-50]。
【０３４０】
次いで、プラグの切片を、ＥＣ浸潤の評価のためにヘモトキシルンおよびエオジン(hemotoxyln & eosin)で染色した（図６Ｂ）。ＥＣの浸潤は新血管新生において重要なステップである。Ｓ１Ｐを含有するプラグでは、マトリゲルだけのプラグと比較してＥＣ浸潤が３倍増加した。本発明者らは免疫細胞などの他の細胞種も染色される可能性があることを認識しているが、細胞浸潤はＥＣであると推測される。マウスにＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢを４８時間おきに全身投与し（プラグ埋め込みの１日前に開始した）、Ｓ１Ｐをマトリゲルプラグに加えたときでさえも減少した量のＥＣ浸潤を示した。これらの結果は、in vivoでのＥＣ浸潤を阻害するＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢの能力を示している。
【０３４１】
血液および周囲組織由来の内因性Ｓ１Ｐは創傷に脈管形成促進刺激を与えることができた。創傷において内因性Ｓ１Ｐを減少させるＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢの能力を調査した。最適に刺激を与えたプラグ（０．５μｇ／ｍＬ  ｂＦＧＦまたは１０ｍｇ／ｍＬ  ＶＥＧＦを添加したマトリゲル）をマウスに埋め込んだ。マウスにはマトリゲル埋め込みの１日前に開始し、４８時間おきに２５ｍｇ／ｋｇ  ＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢまたは生理食塩水のｉ．ｐ．注射を行った。各処置群（マトリゲル、マトリゲルに加えてＧＦまたはマトリゲルに加えてＧＦさらにＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢ投与）は最低６匹のマウスで構成した。１０日後、それらのマウスをヘパリンで処理し、イソレクチン  Ｂ４−ＦＩＴＣを注射し、プラグを切除し、ＯＣＴ包埋し、媒質を凍結させ、切片を作製した。図６Ｃに示されるように、微小血管密度をレクチン−ＦＩＴＣ染色された血管により定量評価した。ＢＶ染色は対照（未処置）プラグにおいて散発的であるが、一方、ｂＦＧＦまたはＶＥＧＦを含有するプラグは血管新生の有効な証拠を示した。ＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢで処置したマウスからのプラグは、生理食塩水処置マウスからのｂＦＧＦまたはＶＥＧＦプラグと比較して、ＢＶ形成の著しい減少を示した。染色血管の定量により、生理食塩水処置動物と比較して、ＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢで処置した動物からのＶＥＧＦ−またはｂＦＧＦ含有プラグそれぞれの新血管新生の５〜８．５倍減少は明白であった（図６Ｃ）。この評価は、微小血管新生を促進する内因性血清および組織Ｓ１Ｐの能力、さらに内因性Ｓ１Ｐの脈管形成促進作用を無効にするＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢの能力をさらに示している。
【０３４２】
実施例７：ＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢはin vivoでの瘢痕形成を阻害する
Ｓ１Ｐは、繊維芽細胞移動、増殖およびコラーゲン産生を活性化することにより創傷治癒に大きく貢献し；ＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢは、これらの作用を無効にする。様々なタイプの繊維芽細胞を用いたいくつかの研究により創傷治癒を促進するＳ１Ｐの能力が裏付けられる：１）標準的な方法を用いて３Ｈ−チミジン取り込みによって測定されるように、Ｓ１ＰはＳｗｉｓｓ−３Ｔ３繊維芽細胞増殖を増加させ（図７Ａ）；２）標準的な掻傷治癒アッセイにおいて、Ｓ１Ｐは心臓繊維芽細胞の移動を促進し（図７Ｂ）；３）免疫蛍光顕微鏡によって示されるように、Ｓ１Ｐはコラーゲン１ａ  ＧＦＰリポーターを有するトランスジェニックマウスから単離された心臓繊維芽細胞によるコラーゲン発現を促進し（図７Ｃ）；そして４）イムノブロット解析を用いて筋繊維芽細胞マーカータンパク質である平滑筋アクチンの発現の増加によって示されるように、Ｓ１ＰはＷＩ−３８肺繊維芽細胞の筋繊維芽細胞（瘢痕リモデリングにおいて作用する細胞）への分化を誘導した（図７Ｄ）。これらのアッセイそれぞれにおいて、ＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢはＳ１Ｐの作用を無効にした。眼繊維芽細胞はＳ１ＰおよびＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢに対して同じように反応すると思われる。心血管疾患とＡＭＤの新生血管病変（瘢痕リモデリングおよびその後の不適合繊維組織形成を含む）との類似点が指摘されており (Vine, et al. (2005), Ophthalmology,. vol 112: 2076-80およびSeddon and Chen (2004), Int Ophthalmol Clin,. vol 44: 17-39)；そのため、ＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢは、心血管系において証明された作用と同様に、眼新血管新生および瘢痕化においても作用があると思われる。
【０３４３】
研究により、マウスにおいて冠動脈左下行枝の結紮による永久的心筋梗塞（ＭＩ）後に心臓瘢痕形成を減少させるＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢの有効性を評価した。手術の４８時間後に２５ｍｇ／ｋｇ  ＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢまたは生理食塩水の全身投与を開始した。リモデリング初期に起こる正常な修復瘢痕形成を可能にし、かつＭＩ直後に有益な、Ｓ１Ｐ刺激による脈管形成を可能にするように４８時間時点での抗体投与をを選択した。梗塞の２週間後に、マウスを犠牲にし、心臓組織のＭａｓｓｏｎ’ｓ  ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色によって繊維症を評価した。ＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢ処置を受けた動物は血管周囲の繊維症のほぼ完全な排除を示した（図７、写真）。非特異的創傷治癒反応の対照として、シャム動物に冠動脈結紮を行わない開胸術を行った（図７Ｅ）。
【０３４４】
実施例８：Ｓ１Ｐは眼上皮細胞および繊維芽細胞の、収縮性のある瘢痕組織産生筋繊維芽細胞への転換を促進する
病理組織の繊維症（瘢痕形成）は、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、増殖性硝子体網膜症および緑内障手術の影響を含む多数の眼障害における第一要因である。
【０３４５】
これらの障害の多くでは、循環増殖因子およびケモカインが、正常眼細胞の、「筋繊維芽細胞」と呼ばれている、繊維収縮性瘢痕組織産生細胞への転換を促進する。通常、筋繊維芽細胞は外傷後、創傷治癒反応の一部として組織修復に関与する。しかしながら、筋繊維芽細胞の数および機能の変化は、肝臓、皮膚、肺、腎臓、心臓および眼における病理的瘢痕組織形成を特徴とする疾患に関係している。眼において、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の筋繊維芽細胞表現型への転換は、網膜剥離、その後の視力障害の原因となる繊維収縮性膜の形成につながる。加えて、眼外傷後、眼繊維芽細胞の筋繊維芽細胞への転換が異常瘢痕組織産生をもたらし、このことが後に視力喪失につながる可能性がある。筋繊維芽細胞を促進する眼の循環タンパク質因子の多くは同定されているが、このプロセスにおけるＳ１Ｐなどのリゾ脂質の役割に関しては何も分かっていない。そのため、本発明者らはいくつかのヒト眼細胞系統の筋繊維芽細胞転換に対するＳ１Ｐの作用を調べた。図８にて示されるように、Ｓ１Ｐはヒト網膜色素上皮細胞（図８Ａ）およびヒト結膜繊維芽細胞（図８Ｂ）におけるα−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ；筋繊維芽細胞マーカー）の産生を刺激する。これらのデータによって、Ｓ１Ｐが、眼上皮細胞および繊維芽細胞の、網膜剥離、眼繊維症およびその後の視力障害につながる可能性がある収縮性のある瘢痕組織産生筋繊維芽細胞への転換を促進する循環化学因子環境の１つであることが初めて示される。
【０３４６】
これらの試験では、α−ＳＭＡ発現を促進するＳ１Ｐの能力が網膜色素上皮細胞と結膜繊維芽細胞との間で濃度依存的に異なっていた。示したように、上皮細胞では０．００１μＭ濃度でα−ＳＭＡ発現の著しい増加が認められ、１０μＭ濃度で基礎レベルまで減少した。これに対して、結膜繊維芽細胞では１０μＭ濃度でのみα−ＳＭＡ発現の著しい増加が認められた。この違いは、繊維芽細胞と比較して、上皮細胞で増加したＳ１Ｐ受容体発現に起因すると思われる。Ｓ１Ｐ受容体発現レベルの増加により、網膜色素上皮細胞は低濃度でＳ１Ｐに対する感受性がより高いと思われる。その一方で、高Ｓ１ＰレベルではＳ１Ｐ受容体は感作されるかまたは場合によっては内在化され、Ｓ１Ｐによる刺激は減少する。
【０３４７】
コラーゲンは、体内の全ての組織を支える一次構造タンパク質の１つであり、瘢痕組織の主成分の１つである。非病的状況では、組織内の全コラーゲン含量は、繊維芽細胞によるコラーゲン産生とある特定の酵素による分解とのバランスによって維持される。瘢痕組織レベルの増加を伴う多数の障害は、瘢痕形成に必要なコラーゲンの分解を阻害する生理学的プロセスおよび分子プロセスに一部起因する。瘢痕組織形成を促進するＳ１Ｐの能力は、コラーゲン分解を阻害し、それによって器官内の瘢痕組織の純増加をもたらすその能力によって生じ得るという仮説を立てた。そこで、ヒト結膜繊維芽細胞におけるプラスミノーゲン活性化因子阻害剤（ＰＡＩ−１）の発現に対するＳ１Ｐの作用を調べた。ＰＡＩ−１発現の増加は、結合組織のタンパク質加水分解の減少と相関し、瘢痕化の増加を伴ういくつかの繊維症に関連してアップレギュレートされる。図８Ｃにて示されるように、Ｓ１ＰはＰＡＩ−１発現を用量依存的に刺激する。これらのデータは、その分解を阻害するタンパク質の発現を刺激することによって瘢痕組織形成も促進し得ることを示しており、これにより、Ｓ１Ｐは、眼疾患と関連している病理的瘢痕化を促進および維持する複数の機構経路を通じて機能することが示唆される。
【０３４８】
実施例９：ＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢは炎症細胞および免疫細胞浸潤を阻害する
炎症はリモデリングプロセスにおける初期反応である。炎症は、虚血によっても細胞損傷によっても誘発され、死細胞の貧食のためにそして炎症性応答をさらにアップレギュレートするためにマクロファージおよび好中球の外傷部位への移動を刺激するサイトカイン発現のアップレギュレーションをもたらす[Jordan, et al. (1999), Cardiovasc Res,. vol 43: 860-78]。肥満細胞は炎症性応答の重要な細胞メディエーターでもある。肥満細胞から放出されるＳ１Ｐは、炎症実験動物モデルにおいて見られる有害反応の多くに関与する[Jolly, et al (2004), J Exp Med,. vol 199: 959-70およびJolly et al (2005), Blood,. vol 105: 4736-42]。
【０３４９】
ＣＮＶおよびＣＶＤにおける免疫応答および炎症性応答の類似性に基づいて、ＡＭＤ中のこれらの損傷の軽減におけるＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢの潜在的作用の指標として、ネズミ梗塞モデルにおいて創傷への免疫細胞浸潤を軽減するＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢの有効性を評価した[Vine, et al.(2005), Ophthalmology,. vol 112: 2076-80;およびSeddon and Chen(2004), Int Ophthalmol Clin,. vol 44: 17-39]。ＭＩの４日後、危険性がある領域内でマクロファージおよび肥満細胞浸潤をそれぞれＭＡＣ−１抗体およびＭＣＧ３５抗体を用いて評価した。ＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢは、炎症性マクロファージ（図９Ａ）および肥満細胞（図９Ｂ）の密度を劇的に弱め、これにより、ＳＰＨＩＮＧＯＭＡＢがＡＭＤ中に免疫損傷および炎症性損傷を回避し得ることが示唆される。
【０３５０】
実施例１０：Ｓ１Ｐネズミモノクローナル抗体（ＬＴ１００２；Ｓｐｈｉｎｇｏｍａｂ）の可変ドメインのクローニングおよび特性解析
この実施例では、Ｓ１Ｐに対するネズミｍＡｂのクローニングを報告する。全体的な戦略は軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）両方のネズミ可変ドメインのクローニングで構成した。３０６Ｄ  ＶＨのコンセンサス配列は定常領域フラグメントがγ  ２ｂイソ型と一致することを示している。ネズミ可変ドメインを、軽鎖（ＣＬ）の定常ドメインと、そして重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）の定常ドメインとともにクローニングし、結果としてキメラ抗体構築物を得た。
【０３５１】
１．ネズミｍＡｂのクローニング
抗Ｓ１Ｐハイブリドーマ細胞株３０６Ｄ３２６．１（ＡＴＣＣ番号ＳＤ−５３６２）由来のクローンを、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）Ｉ、４５００ｍｇ／Ｌ  Ｄ−グルコース、ナトリウムプルベート(Sodium Puruvate)；Gibco/Invitrogen, Carlsbad, CA、１１１−０３５−００３）、１０％ＦＢＳ（Ｓｔｅｒｉｌｅ  Ｆｅｔａｌ  Ｃｌｏｎｅ  １、Perbio Science）および１Ｘグルタミン／ペニシリン／ストレプトマイシン(Gibco/Invitrogen)を含むＤＭＥＭ（ダルベッコの改変イーグル培地（Dulbecco's Dulbecco's Modified Eagle Medium)  中で増殖させた。全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ(Qiagen, Hilden Germany)に基づいた手順を用いて１０７  ハイブリドーマ細胞から単離した。このＲＮＡを用いて、製造業者のプロトコールに従って一本鎖ｃＤＮＡを作製した（１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ、Amersham Biosciences）。
【０３５２】
免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）ｃＤＮＡを、ＭＨＶ７プライマー（ＭＨＶ７：５’−ＡＴＧＧＲＡＴＧＧＡＧＣＫＧＧＲＴＣＴＴＴＭＴＣＴＴ−３’［配列番号１］）をＩｇＧ２ｂ定常領域プライマーＭＨＣＧ１／２ａ／２ｂ／３混合物（ＭＨＣＧ１：５’−ＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣＡＧＡＴＧＧＧＧＧ−３’［配列番号２］；ＭＨＣＧ２ａ：５’−ＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣＣＧＡＴＧＧＧＧＣ−３  ［配列番号３］；ＭＨＣＧ２ｂ：５’−ＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣＴＧＡＴＧＧＧＧＧ−３’［配列番号４］；ＭＨＣＧ３：５’−ＣＡＡＧＧＧＡＴＡＧＡＣＡＧＡＴＧＧＧＧＣ−３’［配列番号５］）と組み合わせて用いてＰＣＲによって増幅した。この反応産物を、ＴＯＰＯ−ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）ｋｉｔおよび配列を用いてｐＣＲ２．１（登録商標）−ＴＯＰＯ（登録商標）ｖｅｃｔｏｒ (Invitrogen)に連結した。次いで、重鎖の可変ドメインをこのベクターからＰＣＲによって増幅し、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩおよびＡｐａ  Ｉフラグメントとして挿入し、ＨＣＭＶｉプロモーター、リーダー配列およびγ−１定常領域を含む発現ベクターｐＧ１Ｄ２００（米国特許第７，０６０，８０８号参照）またはｐＧ４Ｄ２００（同文献）に連結して、プラスミドｐＧ１Ｄ２００３０６ＤＶＨ（図１０）を作製した。３０６Ｄ  ＶＨのコンセンサス配列（下記に示す）は定常領域フラグメントがγ  ２ｂイソ型と一致することを示した。
【０３５３】
同様に、免疫グロブリンκ鎖可変領域（ＶＫ）を、ＭＫＶ２０プライマー（５’−ＧＴＣＴＣＴＧＡＴＴＣＴＡＧＧＣＡ−３’［配列番号６］）をκ定常領域プライマーＭＫＣ（５’−ＡＣＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧ−３’［配列番号７］）と組み合わせて用いて増幅した。この反応産物を、ＴＯＰＯ−ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）ｋｉｔおよび配列を用いてｐＣＲ２．１（登録商標）−ＴＯＰＯ（登録商標）ｖｅｃｔｏｒに連結した。次いで、軽鎖の可変ドメインをＰＣＲによって増幅した後、Ｂａｍ  ＨＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩフラグメントとしてＨＣＭＶプロモーター、リーダー配列およびヒトκ定常ドメインを含む発現ベクターｐＫＮ１００（米国特許第７，０６０，８０８号参照）に挿入し、プラスミドｐＫＮ１００３０６ＤＶＫを作製した。
【０３５４】
重鎖および軽鎖プラスミド  ｐＧ１Ｄ２００３０６ＤＶＨとｐＫＮ１００３０６ＤＶＫをＤＨ４ａ細菌に形質転換させ、グリセロールに入れてストックした。製造業者（Qiagen、ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ−ｆｒｅｅ  ＭＡＸＩＰＲＥＰ（商標）ｋｉｔ）によって記載されているように、大量のプラスミドＤＮＡを調製した。Qiagen社のＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ＫｉｔまたはＥｎｄｏＦｒｅｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｅｇａ／Ｍａｘｉ  Ｋｉｔを用いて精製したＤＮＡサンプルを、ＡＢＩ  ３７３０ｘｌ自動シーケンサーを用いて配列決定した、このシーケンサーは蛍光シグナルをそれらの対応する核酸塩基配列への変換も行う。５’および３’末端において、得られた配列がオーバーラップするようにプライマーを設計した。プライマーの長さは１８〜２４塩基であり、好ましくは、それらはＧＣ含量５０％でありかつ推定二量体または二次構造を含まないものとした。Ｓｐｈｉｎｇｏｍａｂ（商標）のマウスＶＨおよびＶＬドメインのアミノ酸配列はそれぞれ配列番号８および９である（表２）。表２ではＣＤＲ残基（Kabat, EA (1982), Pharmacol Rev, vol. 34: 23-38参照）に下線を施し、下の表３において個別に示している。
【０３５５】
【表２】
0006053834.tif 000003
【０３５６】
【表３】
0006053834.tif 000004
【０３５７】
表４においていくつかのキメラ抗体可変（ＶＨおよびＶＬ）ドメインのアミノ酸配列を比較している。これらの変異体をLonza社製発現ベクターにクローニングした。ネズミＶＨおよびＶＬドメインの配列を用いて、どのフレームワーク残基をヒト化抗体に組み込むべきかを確認するための分子モデルを構築した。
【０３５８】
【表４−１】
0006053834.tif 000005
【０３５９】
【表４−２】
0006053834.tif 000006
【０３６０】
対応するヌクレオチド配列を表５に示す：
【表５】
0006053834.tif 000007
【０３６１】
２．キメラ抗体の発現および結合特性
ｐＧ１Ｄ２００３０６ＤＶＨとｐＫＮ１００３０６ＤＶＫの両方の重鎖および軽鎖プラスミドをＤＨ４ａ細菌に形質転換させ、グリセロールに入れてストックした。製造業者（Qiagen、ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ−ｆｒｅｅ  ＭＡＸＩＰＲＥＰ（商標）ｋｉｔ  カタログ番号１２３６２）によって記載されているように、大量のプラスミドＤＮＡを調製した。
【０３６２】
非ヒト哺乳類系での抗体発現では、各プラスミド１０μｇを用いたエレクトロポレーション（１０７細胞／ｍｌで０．７ｍｌ）により、プラスミドをアフリカミドリザル腎臓繊維芽細胞系統ＣＯＳ  ７にトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を８ｍｌの増殖培地中で４日間培養した。キメラ３０６ＤＨ１ｘ３０６ＤＶＫ−２抗体を１．５μｇ／ｍｌで、一過性同時トランスフェクトＣＯＳ細胞馴化培地中で発現させた。この抗体とＳ１Ｐとの結合を、Ｓ１Ｐ  ＥＬＩＳＡを用いて測定した。
【０３６３】
キメラ抗体の発現レベルを定量的ＥＬＩＳＡにより次のとおり決定した。マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ  ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ、Invitrogen）を、１００μｌアリコートの０．４μｇ／ｍｌＰＢＳ希釈ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体(Sigma, St. Louis, MO)でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。次いで、これらのプレートを２００μｌ／ウェルの洗浄バッファー（１ｘＰＢＳ、０．１％ＴＷＥＥＮ）で３回洗浄した。各希釈血清サンプルまたは融合上清の２００μＬアリコートを毒素コーティングプレートに移し、３７℃で１時間インキュベートした。洗浄バッファーで６回洗浄した後、ヤギ抗ヒトκ軽鎖ペルオキシダーゼコンジュゲート(Jackson Immuno Research)を１：５０００希釈で各ウェルに加えた。室温で１時間反応を行い、プレートを洗浄バッファーで６回洗浄し、各ウェルに１５０μＬのＫ−ＢＬＵＥ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Sigma）を加え、暗所で室温で１０分間インキュベートした。５０μｌのＲＥＤ  ＳＴＯＰ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ (SkyBio Ltd.)を加えることによってこの反応を停止させ、Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｒ  Ｒｅａｄｅｒ  ３５５０(Bio-Rad Laboratories Ltd.)を用いて６５５ｎｍで吸収を測定した。抗体結合アッセイの結果は図１１に示している。
【０３６４】
３．２９３Ｆ発現
重鎖および軽鎖プラスミドをＴｏｐ  １０大腸菌（Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  Ｔｏｐ  １０  ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ｃｅｌｌｓ（Invitrogen、Ｃ４０４０−１０））に形質転換させ、グリセロールに入れてストックした。製造業者（Qiagen、ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ−ｆｒｅｅ  ＭＡＸＩＰＲＥＰ（商標）ｋｉｔ  カタログ番号１２３６２）によって記載されているように、大量のプラスミドＤＮＡを調製した。
【０３６５】
ヒト系での抗体発現では、２９３ｆｅｃｔｉｎ(Invitrogen)を用い、培養に２９３Ｆ−ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  Ｍｅｄｉａ(Invitrogen)を用いて、プラスミドをヒト胎児腎臓細胞系統２９３Ｆ(Invitrogen)にトランスフェクトした。軽鎖および重鎖プラスミドをいずれも０．５ｇ／ｍＬでトランスフェクトした。トランスフェクションは細胞密度１０６細胞／ｍＬで実施した。トランスフェクションの３日後、１１００ｒｐｍで２５℃で５分間の遠心分離により上清を集めた。発現レベルは定量的ＥＬＩＳＡにより定量し（上記実施例参照）、キメラ抗体については約０．２５〜０．５ｇ／ｍＬであった。
【０３６６】
４．抗体精製
培養上清をＡタンパク質／Ｇカラム（Pierce、カタログ番号５３１３３）に０，．５ｍＬ／分で通すことによって、培養上清からモノクローナル抗体を精製した。移動相は１Ｘ  Pierce社製ＩｇＧ  ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（カタログ番号２１００１）および０．１Ｍグリシン  ｐＨ２．７（Pierce、Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ、カタログ番号２１００４）で構成した。０．１Ｍグリシン中の抗体収集物を１Ｍリン酸バッファー、ｐＨ８．０で１０％（ｖ／ｖ）希釈して、ｐＨを中和した。ＩｇＧ１収集物をプールし、１Ｘ  ＰＢＳに対して徹底的に透析した（Pierce社製Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ、３，５００  ＭＷＣＯ、カタログ番号６６３８２）。溶出液をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ  ＹＭ−３（１０，０００  ＭＷＣＯ  Ａｍｉｃｏｎ  カタログ番号４２０３）を用いて２，５００ｒｃｆで１時間の遠心分離により濃縮した。抗体濃度は標準として市販の骨髄腫ＩｇＧ１ストック溶液を用いて上記のように定量的ＥＬＩＳＡにより決定した。重鎖タイプのｍＡｂを、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  Ｋｉｔ（Sigma、ＩＳＯ−２）を用いてＥＬＩＳＡにより決定した。
【０３６７】
５．抗体変異体のＳ１Ｐに対する比較結合
下記表６では変異株とキメラ抗体との比較分析を示している。マウスまたはヒトＩｇＧに対して特異的な、ＨＲＰとコンジュゲートされた二次抗体によって結合抗体を検出して、これらの結果を得た。発色反応を測定し、光学密度（ＯＤ）として報告した。抗体パネルの濃度は０．１μｇ／ｍｌであった。Ｓ１Ｐコーティングマトリックス単独との二次抗体の相互作用は全く検出されなかった。
【０３６８】
【表６】
0006053834.tif 000008
【０３６９】
６．表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による結合速度論の測定
Ｂｉａｃｏｒｅ  ２０００  ｏｐｔｉｃａｌ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ(Biacore AB, Uppsala Sweden)において全結合データを収集した。マレイミドＣＭ５センサーチップにＳ１Ｐを結合させた。まず、ＣＭ５チップをＮＨＳ／ＥＤＣの等量混合物で７分間活性化し、続いてエチルジアミンでの７分のブロッキングステップを行った。次に、その表面にｓｕｌｆｏ−ＭＢＳ(Pierce Co.)を、ＨＢＳランニングバッファー（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００５％ｐ２０、ｐＨ７．４）中濃度０．５ｍＭで通した。Ｓ１ＰをＨＢＳランニングバッファー中に濃度０．１ｍＭまで希釈し、異なる時間の長さで注入し、２つの異なる密度のＳ１Ｐ表面（３０５ＲＵおよび４７０ＲＵ）を作成した。次に、マウス、２０１３０８、２０１３０９および２０７３０８抗体それぞれについて１６．７ｎＭ、５０．０ｎＭ、５０．０ｎＭ、１６．７ｎＭおよび１６．７ｎＭからの３倍希釈系列を用いてｍＡｂの結合データを収集した。
【０３７０】
各濃度を二反復で試験した。表面を５０ｍＭ  ＮａＯＨで再生した。全データを２５℃で収集した。参照表面ならびにブランク注入を用いて反応データを加工した。データセット（２回試験した２表面と各変異体の反応を相互作用モデルに当てはめ、結合パラメーターを得た。異なるｍＡｂ濃度のデータを、１：１（マウス）または１：２（変異体）相互作用モデルを用いてグローバルフィッティングを行い、見かけの結合速度定数を決定した。括弧内の数字は下１桁の誤差を示す。
【０３７１】
実施例１１  Ｓ１Ｐに対するキメラｍＡｂ
本明細書において、「キメラ」抗体（または「免疫グロブリン」）とは、特定の種に由来するまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属す抗体における対応配列と同一または相同な重鎖および／または軽鎖を含むが、残りの鎖は別の種に由来するまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属す抗体における対応配列と同一または相同である分子、ならびに所望の生物活性を示す限り、このような抗体のフラグメントを指す(Cabilly et al., 前掲; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851 (1984))。
【０３７２】
Ｓ１Ｐに対するキメラ抗体は、特定のハイブリドーマ(ATCC safety deposit storage number SD-5362)由来のネズミ抗体の活性Ｓ１Ｐ結合領域をヒトＩｇＧ１免疫グロブリンのＦｃ領域とともに含む可変領域（Ｆｖ）を用いて作製された。これらのＦｃ領域は、ヒト抗体のＣＬ、ＣｈＬおよびＣｈ３ドメインを含んだ。特定の方法に限定されるものではなく、キメラ抗体はまたヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡまたはＩｇＭのＦｃ領域からも作製されている。当技術分野では言うまでもないことであるが、「ヒト化」抗体は、ネズミ抗Ｓ１Ｐ  ｍＡｂの相補性決定領域（ＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ１〜４）をＩｇＧ１のフレームワーク領域などのヒト抗体フレームワーク領域（例えば、Ｆｒ１、Ｆｒ４など）とともにグラフトすることにより作製可能である。図１１は、レイダウン材料としてチオール化Ｓ１Ｐを用いる、直接的ＥＬＩＳＡ測定におけるキメラおよび完全ネズミｍＡｂの結合を示す。
【０３７３】
図１１に示されている直接的ＥＬＩＳＡ実験は、Ｓ１Ｐに対するキメラ抗体の結合特性は完全ネズミモノクローナル抗体に対する結合特性と同等であった。ＥＬＩＳＡは、結合バッファー（３３．６ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３；ｐＨ９．５）中、ＢＳＡにコンジュゲートさせた０．１μｇの化学合成チオール化Ｓ１Ｐでコーティングした９６ウェルhigh-binding ELISAプレート(Costar)で行った。このチオール化Ｓ１Ｐ−ＢＳＡをＥＬＩＳＡプレートで３７℃にて１時間または４℃にて一晩インキュベートした。次に、プレートをＰＢＳ（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．６８ｍＭ  ＫＣｌ、１０．１４ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．７６ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４；ｐＨ７．４）で４回洗浄し、ＰＢＳＴで室温にて１時間ブロッキングした。一次インキュベーション工程では、７５μＬのサンプル（測定するＳ１Ｐを含む）を、ＰＢＳＴに希釈した０．１μｇ／ｍＬ抗Ｓ１Ｐモノクローナル抗体２５μＬとともにインキュベートし、ＥＬＩＳＡプレートのウェルに加えた。サンプルにつき３反復のウェルで行った。室温で１時間インキュベートした後、ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳで４回洗浄し、ウェル当たり１００μｌの０．１μｇ／ｍＬ  ＨＲＰヤギ抗マウス二次抗体(Jackson Immunoresearch)とともに室温で１時間インキュベートした。その後、プレートをＰＢＳで４回洗浄し、テトラメチルベンジジン(Sigma)に１〜１０分間曝した。この検出反応を、等量の１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を加えることで停止させた。これらのサンプルの光学密度を、ＥＬ−Ｘ−８００  ＥＬＩＳＡプレートリーダー(Bio-Tech)を用い、４５０ｎｍで測定することにより決定した。
【０３７４】
同様に、免疫動物の血清またはハイブリドーマなどの抗体産生細胞の細胞馴化培地（たとえば、上清）の抗体力価を測定する好ましい方法は、ＢＳＡなどのタンパク質担体と共有結合された標的リガンド（例えば、Ｓ１Ｐ、ＬＰＡなどのチオール化類似体）でＥＬＩＳＡプレートをコーティングすることを含む。
【０３７５】
特定の方法または例に限定されるものではなく、キメラ抗体は、ＬＰＡ、セラミド、スルファチド、セレブロシド、カルジオリピン、ホスホチジルセリン、ホスホチジルイノシトール、ホスファチジン酸、ホスホチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、エイコシノイド、およびその他のロイコトリエンなどのような他の脂質標的に対しても作製することができる。さらに、これらの脂質の多くは、所望によりグリコシル化および／またはアセチル化することもできる。
【０３７６】
実施例１２：ヒト化抗Ｓ１Ｐモノクローナル抗体ＬＴ１００９（Ｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂ）の作製および特性解析
Ｓ１Ｐと特異的に結合するネズミ抗Ｓ１Ｐモノクローナル抗体３０６Ｄ（ＬＴ１００２；Ｓｐｈｉｎｇｏｍａｂ（商標））は、様々な動物モデルにおいて脈管形成および腫瘍成長を強く抑制することが証明されている。以下に記述するように、ＬＴ１００２を、ネズミＣＤＲをグラフトするヒトフレームワークの配列同一性および相同性検索といくつかのフレームワーク逆突然変異を導くコンピューター処理モデルを用いてヒト化した。２つの変異体、ＨｕＭＡｂＨＣＬＣ３（ＬＴ１００４）（軽鎖に３つの逆突然変異を含む）およびＨｕＭＡｂＨＣＬＣ５（ＬＴ１００６）（軽鎖に５つの逆突然変異を含む）はナノモル範囲で結合親和性を示した。ヒト化変異体の生物物理学的特性および生物学的特性を向上させる目的で、さらなる工学的処理を行った。ＨＣＤＲ２中のフリーシステイン残基がアラニンで置き換えられたヒト化変異体  ＨｕＭＡｂＨＣＣｙｓＡｌａＬＣ３（ＬＴ１００７）およびＨｕＭＡｂＨＣＣｙｓＡｌａＬＣ５（ＬＴ１００９）はピコモル範囲で結合親和性を示した。全てのヒト化変異体が加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）の脈絡膜新血管新生（ＣＮＶ）モデルにおいて脈管形成を阻害し、ＨｕＭＡｂＨＣＣｙｓＡｌａＬＣ５（ＬＴ１００９）は、親ネズミ抗体と比較して、優れた安定性およびin vivo有効性を示した。この変異体  ｈｕＭＡｂＨＣｃｙｓａｌａＬＣ５（ＬＴ１００９）をＳｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂ（商標）と称した。
【０３７７】
ａ．抗Ｓ１Ｐ抗体のヒト化設計
ネズミｍＡｂ  ＬＴ１００２（Ｓｐｈｉｎｇｏｍａｂ（商標））の可変ドメインをＣＤＲグラフティングによってヒト化した（Winter  米国特許第５，２２５，５３９号）。Kabat et al. 1991によって記載されているように、ＣＤＲ残基を配列超可変性に基づいて同定した。
【０３７８】
この研究では、構造アライメントプログラム（ＳＲ  ｖ７．６）を用いたＩＭＧＴおよびＫａｂａｔデータベース内のヒト抗体の相同性検索に基づいて、好適なアクセプター構造を選択した。最初のステップは、これらのヒト重鎖可変（ＶＨ）および軽鎖可変（ＶＬ）配列データベース(these human heavy variable (VH) and light variable (VL) sequence databases)にＬＴ１００２  ＶＨおよびＶＬタンパク質配列それぞれについて問い合わせること、バーニア残基(Foote, J. & Winter, G. Antibody framework residues affecting the conformation of the hypervariable loops. J Mol. Biol. 224, 487-499 (1992))、カノニカル残基(Morea, et al., Antibody modeling: implications for engineering and design, Methods 20, 267-279 (2000)およびＶＨ−ＶＬ界面残基(Chothia, C., Novotny, J., Bruccoleri, R., & Karplus, M. Domain association in immunoglobulin molecules. The packing of variable domains. J Mol. Biol. 186, 651-663 (1985))において、ＦＲ内に高い配列同一性を有し、かつ同一カノニカルクラスおよび／または長さのＣＤＲを有するヒトフレームワーク（ＦＲ）を同定することである。このライブラリーの各メンバーの、マウス抗体の個別アライン残基に対する同一性を、前記プログラムを用いて計算した。マウスＦＲと最も同一性の高いＦＲ配列を有するヒト配列を同定し、ヒト「アクセプター」配列の最初のショートリストを作成した。バーニア残基、カノニカル残基およびＶＨ−ＶＬ界面（ＶＣＩ）残基においてマウス抗体と最も同一性の高い配列も計算した。ヒトとマウスとの間でのこれらの位置における相違は、保存的置換と非保存的置換に分類され、ＬＴ１００２との非保存的ＶＣＩの相違が最低値であることを最良のフレームワーク選択とした。ＬＴ１００２のＣＤＲループ  Ｌ３およびＨ１はカノニカル構造に分類することができた。これらのＬ３およびＨ１構造を用いて、同一カノニカル構造を有するヒト抗体ＦＲを選択した。分類されないＣＤＲについては、ＣＤＲ長さがマウス抗体と同一であるヒトフレームワークを選択するよう試みた。この理論的解釈は、ＣＤＲループ構造が、ＣＤＲループ配列自体だけでなく、その基礎となるフレームワーク残基（カノニカル残基）にも依存しているということである。そのため、マッチするカノニカルＣＤＲ構造および／またはＣＤＲ長さを有するヒトフレームワークは、グラフトしたマウスＣＤＲを、抗原結合親和性を維持するのに最も適した配向で保持する可能性が高い。ＣＤＲ  Ｈ３を除く全てのＣＤＲでは、これはヒトフレームワーク配列の選択によって行われた。加えて、可能であれば、普通でないシステインまたはプロリン残基を有するフレームワークを排除した。重鎖および軽鎖配列についてはこれらの計算を別々に実施した。最後に、最良にマッチする配列におけるフレームワーク領域全体での個別配列の相違を比較した。上記比較計算結果に最良にフィットするヒト抗体のうち、抗体  ＡＹ０５０７０７およびＡＪ００２７７３を、軽鎖および重鎖それぞれについて最も適したヒトフレームワークプロバイダーとして選択した。
【０３７９】
第二ステップは、ＬＴ１００２の可変領域の分子モデルを作成すること、および抗原結合に作用する可能性があるがバーニア残基、カノニカル残基および界面残基のグループには含まれないＦＲ残基を同定することであった。様々なＦＲ残基がどのようにＣＤＲループのコンホメーションに影響を及ぼすのか（またはその逆の場合も）をよりよく理解するために、グラフトドナーおよびアクセプター可変ドメインの多くの構造的特徴を調べた。バーニアおよびカノニカル定義（上記参照）から、ＣＤＲに影響を及ぼす可能性が高いＬＴ１００２中の非保存ＦＲ残基を同定し、そしてヒトＦＲのいくつかの残基を原初のネズミアミノ酸に復帰させた（逆突然変異させた）。
【０３８０】
ｂ．突然変異誘発
可変ドメイン配列内の突然変異を、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Stratagene、カタログ番号２００５２４）を用いて作出した。個別反応は、、５０ｎｇの二本鎖ＤＮＡ鋳型、２．５ＵのＰｆｕＵｌｔｒｅ  ＨＦ  ＤＮＡポリメラーゼおよびその対応するバッファー（Stratagene、カタログ番号２００５２４）、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘならびに５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）および０．１ｍＭ  ＥＤＴＡに再懸濁した１２５ｎｇの各突然変異誘発オリゴヌクレオチドを用いて実施した。最初の変性を９５℃で３０秒間行い、続いて１６サイクルの増幅：９５℃３０秒間、５５℃６０秒間および６８℃８分間を行った。温度サイクル後、最終反応物をＤｐｎＩ  ｄｉｇｅｓｔで３７℃で１時間消化して、メチル化親ＤＮＡを除去した。得られた変異株をｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換させ、５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ寒天にプレーティングした。その後、コロニーを配列決定によりチェックした。次いで、各変異株を１ｌ振盪フラスコで培養し、Qiagen社製、カタログ番号１２３６２のＥｎｄｏＦｒｅｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製した。
【０３８１】
ｃ．ヒト化抗体変異体の作製
全長抗体を哺乳類細胞内で発現させるために、ＬＴ１００２の可変ドメインをκ鎖および重鎖のヒト定常領域を含むベクターにクローニングすることによりマウス−ヒトキメラ抗体（ｃｈＭＡｂ  Ｓ１Ｐ）を構築した。ＬＴ１００２  ＶＨのＫａｂａｔ  ＣＤＲ  １、２および３を、ＡＪ００２７７３のアクセプターフレームワーク内へグラフトすることによりヒト化重鎖を得た。ＡＪ００２７７３に最も近い生殖細胞遺伝子はＶＨ５−５１であり、このリーダー配列をリーダー配列としてヒト化重鎖変異体に組み込んだ。ＶＨ５−５１リーダー配列を有する、第一ヒト化型ＬＴ１００２  ＶＨであるｐＡＴＨ２００のタンパク質配列を表４に示している。ＬＴ１００２のＶＨドメインの場合では、２位、２７位、３７位、４８位、６７位および６９位の残基はバーニア残基であるかまたはＶＨおよびＶＬドメインの界面にあり、ＣＤＲ配向に影響を及ぼす可能性が高い。３７位はＶＨドメインとＶＬドメインとの界面に重要であるように思われた。ヒトフレームワーク内のこれらの位置にある残基を、対応する位置に見られるネズミ残基で逆突然変異させた。突然変異、Ｖ３７Ｍ、Ｍ４８ＩおよびＹ２７Ｆを個別に試験した。１つの型（ｐＡＴＨ２０５）は３つ全ての突然変異とともに、Ｖ６７Ａと、さらにＩ６９Ｌを含み、別の型（ｐＡＴＨ２０６）は５つ全ての突然変異とＶ２Ａを含んだ。
【０３８２】
ＬＴ１００２  ＶＬのＫａｂａｔ  ＣＤＲ  １、２および３を、ＡＹ０５０７０７のアクセプターフレームワーク内へグラフトすることによりヒト化軽鎖を得た。ＡＹ０５０７０７に最も近い生殖細胞遺伝子はＬ１１であり、このリーダー配列をヒト化軽鎖構築物に組み込んだ。ｐＡＴＨ３００（ＬＴ１００２軽鎖）のタンパク質およびＤＮＡ配列はそれぞれ配列番号１７および２８である（アミノ酸配列については表４参照）。ＶＬの場合では、４つの非保存バーニア位置４位、３６位、４９位、６４位はＣＤＲループの構造の支持に関与するため、ネズミ残基の逆突然変異のためにそれらの位置を選択した。ＬＴ１００２の分子モデルの検討により、Ｔｙｒ  ６７がＣＤＲ表面に近く、抗原結合面に向かって配向しており、Ｓ１Ｐと相互作用することができる示唆された。そのため、後のヒト化型にＳ６７Ｙ逆突然変異も追加した。２つの突然変異を別々に導入して、Ｙ４９ＳまたはＹ３６Ｆのいずれかを含む２つの型を作製した。次の突然変異組合せを用いていくつかの型を作出した：（Ｙ４９Ｓ、Ｆ４Ｖ）、（Ｙ４９Ｓ、Ｙ３６Ｆ）、（Ｙ４９Ｓ、Ｙ３６Ｆ、Ｆ４Ｖ）、（Ｙ４９Ｓ、Ｇ６４Ｓ）、（Ｙ４９Ｓ、Ｙ３６Ｆ、Ｆ４Ｖ、Ｇ６４Ｓ）、（Ｙ４９Ｓ、Ｙ３６Ｆ、Ｆ４Ｖ、Ｇ６４Ｓ、Ｓ６７Ｙ）、（Ｙ４９Ｓ、Ｇ６４Ｓ、Ｓ６７Ｙ）。
【０３８３】
ｄ．ヒト化リード候補の選択
基本グラフト型（ｐＡＴＨ  ２００およびｐＡＴＨ  ３００）可変領域および逆突然変異を含む全ての変異体をヒトＶＨまたはＶＬ定常領域を含む発現ベクターにクローニングした。キメラ（ｃｈＭＡｂ）抗体と同じ条件下で哺乳類細胞において全てのヒト化変異体を作製し、ＥＬＩＳＡによりＳ１Ｐとの結合について試験した。この際の収率はヒト化変異体についておよそ１０〜２０ｍｇ／ｌ、ｃｈＭＡｂ  Ｓ１Ｐについて０．３〜０．５ｍｇ／ｌであった。還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、軽鎖および重鎖の推定質量と一致する２５ｋＤａおよび５０ｋＤａにおいて高純度（＞９８％）の２つのバンドが現われた。非還元条件下では推定質量約１５０ｋの単一バンドが観察された。ｃｈＭＡｂは、親マウス抗体と同じ可変領域を含み、ヒト化抗体と同じ定常領域を有し、そのため同じＥＬＩＳＡプロトコールを用いて検出することができるため、ｃｈＭＡｂをヒト化抗体結合アッセイにおいて標準として用いた。
【０３８４】
６つのネズミＣＤＲが未変異ヒトフレームワーク内にグラフトされた最初のヒト化抗体は、Ｓ１Ｐとの検出可能な結合を全く示さなかった（図１１）。４つの逆突然変異（Ｙ４９Ｓ、Ｙ３６Ｆ、Ｆ４ＶおよびＧ６４Ｓ）を含むκ軽鎖は、キメラ重鎖を伴い、ＥＬＩＳＡによって示されるように、Ｓ１Ｐとの次善の結合を示した。Ｙ６７位置へさらなる突然変異を組み込むことで、その結合が著しく改善した。逆突然変異  Ｙ４９Ｓ、Ｙ３６Ｆ、Ｆ４Ｖ、Ｇ６４ＳおよびＳ６７Ｙを含むｐＡＴＨ３０８型および逆突然変異  Ｙ４９Ｓ、Ｇ６４ＳおよびＳ６７Ｙを含むｐＡＴＨ３０９型は、キメラ重鎖を伴い、いずれも、ＥＬＩＳＡによって確認されるように、キメラ抗体と同様のＳ１Ｐと結合した抗体を生じた。２つの突然変異  Ｙ３６ＦおよびＦ４Ｖは、Ｓ１Ｐ結合の観点から必要な逆突然変異とはみなされなかった。活性を回復させるためには、ＶＬフレームワーク内に３つ〜５つの逆突然変異を工学的処理することが必要であった。
【０３８５】
重鎖のヒトフレームワーク内へのバーニア逆突然変異  Ｖ３７Ｍの組み込みは、キメラ軽鎖を伴い、キメラ抗体と同様の結合挙動を回復させるのに十分であった（図１１）。
【０３８６】
要約すれば、ＬＴ１００２  ＶＨドメインのヒト化にはネズミフレームワーク配列の１つのアミノ酸しか必要でなかったが、一方、ネズミ親ＬＴ１００２と同等の結合を得るために、ネズミＶＬフレームワークドメイン、３つまたは５つのネズミ残基を保持する必要があった。
【０３８７】
ｅ．ヒト化リード候補の最適化
ネズミ抗Ｓ１Ｐ抗体は、重鎖のＣＤＲ２内に遊離システイン残基（Ｃｙｓ５０）を含み、この残基は抗体分子を多少不安定にさせる可能性があった。部位特異的突然変異誘発を用いて、システイン残基を、アラニン（ｈｕＭＡｂＨＣｃｙｓａｌａＬＣ３）（ｐＡＴＨ２０７）、グリシン（ｈｕＭＡｂＨＣｃｙｓａｌａＬＣ３）、セリン（ｈｕＭＡｂＨＣｃｙｓｓｅｒＬＣ３）およびフェニルアラニン（ｈｕＭＡｂＨＣｃｙｓｐｈｅＬＣ３）と置換することによりｐＡＴＨ２０１変異体を作出した。また、システイン変異株の重鎖を、５つの逆突然変異を含むヒト化軽鎖（ｐＡＴＨ  ３０８）（ｈｕＭＡｂＨＣｃｙｓａｌａＬＣ５＝ＬＴ１００９）を用いて試験した。これらの変異体を哺乳類細胞で発現させた後、in vitroアッセイのパネルで特性解析した。重要なことには、ヒト化変異体の発現率はｃｈＭＡｂ  Ｓ１Ｐの場合よりも著しく高かった。
【０３８８】
ｆ．ヒト化リード候補の詳細特性解析
ｉ．特異性
Ｓ１Ｐおよびいくつかの他の生体脂質(several other biolipids)に対する競合的ＥＬＩＳＡアッセイ（図１）により、ヒト化変異体を特異性について試験した。このアッセイには、エピトープマッピングが可能であるという付加利益がある。ヒト化抗体ＬＴ１００９は、Ｓ１Ｐの直接代謝前駆体であるスフィンゴシン（ＳＰＨ）、またはＳ１Ｐと構造的かつ機能的に類似している重要な細胞外シグナル伝達分子であるＬＰＡ（リゾホスファチジン酸）との交差反応性は示されていない。さらに、ｒｈｕＭＡｂ  Ｓ１Ｐは、構造的に類似している他の脂質および代謝産物、セラミド（ＣＥＲ）、セラミド−１−リン酸（Ｃ１Ｐ）などを認識しなかった。しかしながら、予想どおりＬＴ１００９は、スフィンゴシルホスホコリン(sphingosylphosphocholine)（ＳＰＣ）（Ｓ１Ｐの遊離リン酸基がコリン残基と結合している脂質）とは交差反応した。重要なことには、全てのヒト化変異体はマウス抗体に匹敵する特異性プロフィールを示した。
【０３８９】
ｉｉ．結合親和性  Ｓ１ＰコーティングチップへのＩｇＧ結合についてのＢｉａｃｏｒｅ測定により、変異体  ＬＴ１００４またはＬＴ１００６が、図１１にて示されるように、ｃｈＭＡｂ  Ｓ１Ｐと同様の低ナノモル範囲で結合親和性を示すことがわかった。システイン残基がアラニンで置き換えられたヒト化変異体  ＬＴ１００７およびＬＴ１００９は、ネズミ親ＬＴ１００２（Ｓｐｈｉｎｇｏｍａｂ（商標））と同様のピコモル範囲で結合親和性を示した。
【０３９０】
ｉｉｉ．安定性  ヒト化変異体を高温でのチャレンジ後の安定性について試験した。各ヒト化変異体について、上清を６０〜７４℃の範囲の温度に供することによって熱変性転移の近似中心点（ＴＭ）を決定した。これらの温度は、幅広い範囲の温度の間  ５０〜８０℃間での温度刺激の後にネズミ抗体分子で見られた変性プロフィールに基づいて選択した。各変異体の結合特性を温度刺激の前後に決定した。ネズミ抗体はＴＭ６５℃を示した。変異体  ｈｕＭＡｂＨＣｃｙｓａｌａＬＣ５（ＬＴ１００９）は、他の全ての変異体と比較して、優れたＴＭを示した。表７ではリードヒト化候補とそれらの特性を示している。
【０３９１】
表７：リードヒト化Ｓ１Ｐ  ｍＡｂ候補と特性
重鎖および軽鎖中の突然変異の数を示している。種類欄に重鎖および軽鎖の識別を記載する。
【０３９２】
【表７】
0006053834.tif 000009
【０３９３】
ｉｖ．配列
天然に存在する抗体と同様に、ＬＴ１００９は、１抗体分子に含まれる２つの軽鎖ポリペプチドそれぞれと２つの重鎖ポリペプチドそれぞれに３つの相補性決定領域（それぞれ「ＣＤＲ」）を含む。これらの６つのＣＤＲそれぞれのアミノ酸配列を直下に記載する（「ＶＬ」は免疫グロブリン軽鎖の可変領域を示し、一方「ＶＨ」は免疫グロブリン重鎖の可変領域を示す）：
ＣＤＲ１  ＶＬ：ＩＴＴＴＤＩＤＤＤＭＮ［配列番号１０］
ＣＤＲ２  ＶＬ：ＥＧＮＩＬＲＰ［配列番号１１］
ＣＤＲ３  ＶＬ：ＬＱＳＤＮＬＰＦＴ［配列番号１２］
ＣＤＲ１  ＶＨ：ＤＨＴＩＨ［配列番号１３
ＣＤＲ３  ＶＨ：ＧＧＦＹＧＳＴＩＷＦＤＦ［配列番号１５］
ＣＤＲ２  ＶＨ：ＡＩＳＰＲＨＤＩＴＫＹＮＥＭＦＲＧ［配列番号３１］
【０３９４】
ＬＴ１００９の重鎖および軽鎖ポリペプチドについてのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を直下に記載する：
LT1009 HC 可変ドメインのアミノ酸配列 ［配列番号３２］：
【表８】
0006053834.tif 000010
LT1009 LC可変ドメインのアミノ酸配列 ［配列番号３３］：
【表９】
0006053834.tif 000011
LT1009 HCヌクレオチド酸配列 ［配列番号３４］：
【表１０】
0006053834.tif 000012
LT1009 HCアミノ酸配列［配列番号３５］：
【表１１】
0006053834.tif 000013
LT1009 LCヌクレオチド酸配列 ［配列番号３６］：
【表１２】
0006053834.tif 000014
LT1009 LCアミノ酸配列 ［配列番号３７］： 
【表１３】
0006053834.tif 000015
【０３９５】
実施例１３：ヒト化Ｓ１Ｐ  ｍＡｂの生産および精製
この実施例では、生体活性脂質スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）と高親和性で結合する組換えヒト化モノクローナル抗体（ＬＴ１００９；Ｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂ（商標））の生産を記載する。ＬＴ１００９は、２つの同一軽鎖と２つの同一重鎖からなる、全分子量１５０ｋＤａの全長ＩｇＧ１ｋイソ型抗体である。重鎖はＮ結合型グリコシル化部位を含む。オリゴ糖構造の性質はまだ決定されていないがコアフコースを含む複雑な二分岐構造であると予想されている。現在のところ主要であろう糖型の性質は分かっていない。多少のＣ末端不均質性は、重鎖の定常ドメイン内にリジン残基が存在することによると思われる。２つの重鎖は、２つの鎖間ジスルフィド結合を通じて互いに共有結合しており、これはヒトＩｇＧ１の構造と一致している。
【０３９６】
ＬＴ１００９は、もともと、Ｓ１Ｐで免疫処置したマウスから作製したハイブリドーマを用いて生産したネズミモノクローナル抗体（ＬＴ１００２；Ｓｐｈｉｎｇｏｍａｂ（商標））から得られた。ネズミ抗体のヒト化では、ネズミ親抗体とのその構造類似性で選択されるヒト抗体フレームワークのＣＤＲの代わりに６つのネズミＣＤＲの挿入を必要とした。ヒト化抗体を工学的処理するために、フレームワーク内で一連の置換を行った。これらの置換は逆突然変異と呼ばれ、ヒト残基を、抗体と抗原との相互作用において重要な役割を果たすネズミ残基と置換する。最終的なヒト化型は、重鎖の可変ドメインのヒトフレームワーク内に１つのネズミ逆突然変異と軽鎖の可変ドメインのヒトフレームワーク内に５つのネズミ逆突然変異を含む。加えて、重鎖のＣＤＲ  ＃２内に存在する１つの残基もアラニン残基へと置換した。この置換は、抗体分子の安定性および効力を増加させることが分かった。
【０３９７】
ヒト化可変ドメインをLonza社のＧＳ遺伝子発現系にクローニングして、プラスミド  ｐＡＴＨ１００９を作製した。この発現系は、抗体遺伝子の定常ドメインを有する発現ベクターと、選択マーカーであるグルタミンシンセターゼ（ＧＳ）とからなる。ＧＳは、グルタミン酸とアンモニアからのグルタミン生合成に関与する酵素である。抗体遺伝子と選択マーカーの両方を有するベクターを、細胞が外因性グルタミンなしに生存するのに十分なグルタミンを供給した無血清培地中での増殖に適したプロプライエタリーチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯＫ１ＳＶ）宿主細胞系統にトランスフェクトする。加えて、ベクターによって提供されるＧＳ活性を有する細胞系統だけが生存し得るように内因性ＧＳの活性を阻害するために、この培地に特異的ＧＳ阻害剤であるメチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）を添加する。トランスフェクト細胞を、ＭＳＸの存在下でグルタミンフリー培地中で増殖するそれらの能力について選択し、分離株を活性ＬＴ１００９の高レベル分泌について選択した。こうして、毒性学および臨床開発に毒性学研究および臨床開発のための材料がもたらされた。
【０３９８】
ＡＴＣＣ寄託：ｐＡＴＨ１００９プラスミドを含む大腸菌ＳｔＢ１２は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託した（寄託番号  ＰＴＡ−８４２１）。ＤＮＡプラスミド  ｐＡＴＨ１００９でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞系統  ＬＨ１  ２７５もＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託した（寄託番号  ＰＴＡ−８４２２）。
【０３９９】
実施例１４：ヒト化ｍＡｂの製造
一般に、生産プロセスには３段階ある：播種トレイン、接種トレインおよび生産培養。全ての段階で無血清試薬と低タンパク質細胞培養増殖培地を用いる。播種トレインを開始するために、ｗｏｒｋｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｂａｎｋの細胞を用い；細胞を３〜４日おきに継代培養し、播種トレイン培養下で指定期間の後に接種トレインを開始する。生産段階への導入に向けて細胞を増殖させるために、非選択培地（ＭＴＸフリー培地(MTX-freee medium)）を好ましくは用いる。細胞を漸増容量の容器への連続継代培養により増殖させる。接種トレイン中の一定の日数時点において、生産段階を開始する。生産培養は２００Ｌ、４００Ｌ、２０００Ｌ、または２００００Ｌ容量のバイオリアクター内で実施する。バイオリアクターの一例を以下に記載する。
【０４００】
バイオリアクター例：２Ｌバイオリアクターからのスケールアップでは、まず、Ａｐｐｌｉｋｏｎ  １５Ｌ攪拌タンクへ移し、その後、５０Ｌバイオリアクター、２００Ｌバイオリアクター、最後に２０００Ｌバイオリアクターへと順次移す（全て同じスケールで生産）。これらのタンクの特徴は次のとおりである：
【０４０１】
製造業者：ABEC, Inc. 
【０４０２】
ASME, Section VIII Pressure Vessel Code規格製品。接触面は３１６Ｌ  ＳＳである。
【０４０３】
ボトムオフセットドライブ、ABEC設計
【０４０４】
低剪断インペラー  ３１６ＬＳＳ、１５〜２０マイクロインチに研磨、不動態化済。直径  容器直径の約１／２。
【０４０５】
制御機器：Allen Bradley社製Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｌｏｇｉｃ  ＰＬＣ、Ｖｅｒｓａ  ｖｉｅｗオペレーターインターフェイス装備。
【０４０６】
攪拌：Allen Bradley社製センサー、ＲＰＭ制御のためのＶＦＩ出力についてのＡ−Ｂ  ＰＬＣ  ｃｏｎｔｒｏｌ
【０４０７】
温度：デュアルコントロール１００オーム白金ＲＴＤセンサー、Ａ−Ｂ  ＰＬＣ  ｃｏｎｔｒｏｌ  加熱、冷却および蒸気弁  ｗ／再循環ポンプ。バイオリアクターエンプティー時に自動滅菌サイクル。
【０４０８】
ｐＨ：Ingold社製センサー、ＣＯ２スパージについてのゲル充填加圧式Ａ−Ｂ  ＰＬＣ  ｃｏｎｔｒｏｌ。
【０４０９】
溶存酸素：Ingold社製ポーラログラフ電極センサー、Ｏ２スパージについてのＡ−Ｂ  ＰＬＣ  ｃｏｎｔｒｏｌ。
【０４１０】
空気およびガス流：センサーは空気、Ｏ２、Ｎ２およびＣＯ２スパージングについての４台のBrooks社製熱質量流量計であり、空気オーバーレイのためにＢｒｏｏｋｓサーマルマス(a Brooks thermal mass)も供給する、Ａ−Ｂ  ＰＬＣを通過する全ガス流のｐＨ自動、ＤＯ自動または手動制御のためのガス流についてのＡ−Ｂ  ＰＬＣ  ｃｏｎｔｒｏｌ。
【０４１１】
容器圧：センサーはRosemount社製サニタリーダイヤフラム型変換器であり、制御は背圧制御弁を備えた変換器のＡ−Ｂ  ＰＬＣ  ｃｏｎｔｒｏｌである。
【０４１２】
プログラマブル論理制御装置（ＰＬＣ）：示したプロセスの連続ループ制御のためのAllen Bradley社製Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｌｏｇｉｘ  Ｓｙｓｔｅｍ。ソフトウエア：ＰＬＣプログラムミングにはRockwell Software(Allen Bradley)社製ＲＳ  Ｌｏｇｉｘ  ５０００を利用する。
【０４１３】
ヒューマンマシンインターフェース（ＨＭＩ）：ローカルオペレーターインターフェイスは、イーサネット（登録商標）によってＰＬＣと通信する一体型ＦＰＤ／タッチスクリーン入力方式のAllen Bradley社製ＨＭＩ  Ｖｅｒｓｏ  Ｖｉｅｗ工業用コンピューターに備わっている。ソフトウエアはRockwell Software社製ＲＳ  Ｖｉｅｗ  ３２である。
【０４１４】
生産プロセス例
【０４１５】
温度、溶存酸素およびｐＨの制御を行うステンレス製攪拌式バイオリアクター。
【０４１６】
播種密度は最適収量が得られるように決定する。
【０４１７】
一般に無血清培地を利用する。
【０４１８】
一般に流加法。
【０４１９】
一般に温度変化を伴う。
【０４２０】
バイオリアクター内での培養期間は８〜１４日と予測された。
【０４２１】
収穫時の生存力を明らかにする。
【０４２２】
収穫物は濾過により清澄化する。
【０４２３】
清澄化後および精製まで収穫物を２〜８℃で保存する。
【０４２４】
実施例１５：ヒト化ｍＡｂの大量精製
製剤原料精製プロセスは一般に４ステップからなる：Ａタンパク質クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｑセファロース）、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＭセファロース）および限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）。アフィニティーカラムは一般に収穫および清澄化後の第一ステップである。このカラムには一般に固定化したＡタンパク質樹脂を利用する。このアフィニティーステップでは宿主細胞タンパク質およびＤＮＡに対する抗体を精製する。潜在するウイルスを不活性化するために、一般に溶出液をウイルス不活性化プロセスに供し、続いて、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、Ａタンパク質および潜在するウイルスを減らすために陰イオン交換クロマトグラフィーステップを行う。次に、一般に陽イオン交換クロマトグラフィーステップを用いて、宿主細胞タンパク質および抗体凝集物の残留量をさらに減らす。最後に、そのプールを透析濾過し、さらに濃縮する。
【０４２５】
代表的な精製プロセス：
Ａタンパク質カラムの前に収穫物を濃縮し、バッファー交換してよい。本プロセスの次のステップはＡタンパク質カラムアフィニティークロマトグラフィーである。結合した抗体を低ｐＨバッファーで溶出する。このＡタンパク質溶出液は、ウイルスを不活性化するために一時的にを保持する。
【０４２６】
本プロセスの次のステップは、Ｑ（＋）カラムにおける、抗体産物が流出し、ＤＮＡおよび宿主細胞タンパク質などの混入物がカラム樹脂と結合する条件下でのイオン交換クロマトグラフィーであり得る。
【０４２７】
本プロセスの次のステップは、Ｓ（−）カラムにおける、混入物がカラムから流出する条件下での第二回目のイオン交換クロマトグラフィーであり得る。Ｓ（−）カラムステップの代わりに疎水性相互作用カラムステップを用いてもよい。本プロセスの次のステップは、ＤＶ２０またはＰｌａｎｏｖａフィルターを用いたナノフィルトレーションウイルス除去ステップである場合が多い。抗体産物はフィルターから流出する。本プロセスの最終ステップは、最終的な製剤原料処方バッファーへの透析濾過と目的のタンパク質濃度を得るための限外濾過である。
【０４２８】
実施例１６：ネズミ抗Ｓ１Ｐ抗体のヒト化変異体の生物活性
In vitro細胞アッセイ
図１２にて示されるように、ヒト化抗体を、化学療法薬の存在下で腫瘍細胞生存を変更するそれらの能力について試験した。ＳＫＯＶ３腫瘍細胞を、アポトーシス実行体であるカスパーゼ−３の活性化によって腫瘍細胞死を誘導する化学療法薬であるタキソールに曝露した。Ｓ１Ｐは、対照非処置細胞と比較して、タキソールによって誘導されるカスパーゼ−３活性化および／または細胞死を減少させることができた。アポトーシスアッセイを製造業者（Promega、カタログ番号Ｇ７７９２）の推奨するとおりに実施した。簡潔には、処置の前に、Ａ５４９細胞（１ウェルにつき２５００個の細胞）を９６−ウェルプレート中に播種し、８０％密集状態まで増殖させた。次いで、これらの細胞をマッコイ培地中、０．１〜１μＭパクリタキセル（Sigma、カタログ番号Ｔ  ７４０９）、０．１〜１μＭ  Ｓ１Ｐおよび１μｇ／ｍＬの抗Ｓ１Ｐ  ｍＡｂを用いてまたは用いないで４８時間処置した。４８時間後、これらの細胞にカスパーゼアッセイバッファーを加えた。上清のカスパーゼ−３活性を、Ａｐｏ−Ｏｎｅ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｃａｓｐａｓｅ−３／７  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Promega、カタログ番号Ｇ７７９２）により製造業者のプロトコールに従って測定した。カスパーゼ−３／７活性はビヒクル処置細胞に対する蛍光シグナルの増加倍数として表す。
【０４２９】
カスパーゼ−３活性化は、Ｓ１Ｐの存在下で抗Ｓ１Ｐ  ｍＡｂを加えることによって増加し、この抗体によるＳ１Ｐの選択的吸収によってＳ１Ｐの保護的抗アポトーシス作用が除かれることが示唆された。ヒト化抗体変異体、ｈｕＭＡｂＨＣＬＣ３（ＬＴ１００４）およびｈｕＭＡｂＨＣＬＣ５（ＬＴ１００６）の両方が、ＬＴ１００２と比較して優れた活性を示した。同時に、全ての変異体を、癌細胞からのＳ１Ｐ誘発性サイトカイン放出に対するそれらの作用について試験した。Ｓ１Ｐは、癌細胞からの細胞馴化培地への著しいＩＬ−８放出を引き起こすことが分かっている。マウス対照抗Ｓ１Ｐ  ｍＡｂを加えることによって卵巣癌細胞からのＩＬ−８放出が濃度依存的に減少した。２つのヒト化変異体  ｈｕＭＡｂＨＣｃｙｓａｌａＬＣ３（ＬＴ１００７）およびｈｕＭＡｂＨＣｃｙｓａｌａＬＣ５（ＬＴ１００９）は、ＨｕＭＡｂＨＣＬＣ３（ＬＴ１００４）およびｈｕＭＡｂＨＣＬＣ５（ＬＴ１００６）よりも大きなＩＬ−８放出の減少を示した。
【０４３０】
実施例１７：新血管新生動物モデルにおいてヒト化ｍＡｂ（Ｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂ）と対比したネズミｍＡｂ（Ｓｐｈｉｎｇｏｍａｂ）のin vivo有効性
脈絡膜新血管新生（ＣＮＶ）とは、眼においてブルッフ膜の破壊を通じて脈絡膜から網膜下色素上皮（ｓｕｂ−ＲＰＥ）または網膜下腔内へと生じる新血管の成長を指す。ＣＮＶは、黄斑変性および他の眼症状における視力喪失の主な原因である。この実施例ではＳ１Ｐに対するｍＡｂの評価のためにＣＮＶマウスモデルを用いる。
【０４３１】
ヒト化抗体変異体とネズミ抗体を、図１３にて示されるように、ＡＭＤのＣＮＶ動物モデルにおいて新血管新生を阻害するそれらの能力について比較した。マウスにネズミ（Ｍｕ；ＬＴ１００２）、ヒト化変異体［ＬＣ３（ＬＴ１００４）、ＬＣ５（ＬＴ１００６）、ＨＣｃｙｓＬＣ３（ＬＴ  １００７）およびＨＣｃｙｓＬＣ５（ＬＴ１００９）］または非特異的ｍＡｂ（ＮＳ）  ０．５μｇを２回（第０日および第６日）硝子体内投与により投与した後、ブルッフ膜のレーザー破膜に供した。レーザー手術の１４日後にマウスを犠牲にした。対照マウスを水性バッファー（ＰＢＳ）またはイソ型適合非特異的抗体で処置した。ヒト化変異体の３つは、ＣＮＶ領域の測定によって評価されるように、ネズミ抗体と本質的に同等に脈管形成を阻害した。ＣＮＶ病変体積は平均＋ＳＥＭとして表す。軽鎖に５つの逆突然変異を含み、重鎖のＣＤＲ２内にシステイン突然変異を有するヒト化変異体（ｈｕＭＡｂＨＣｃｙｓＬＣ５；ＬＴ１００９）は新血管新生を顕著に抑制した。この差は高度に統計的に有意であった。
【０４３２】
ＣＮＶの誘導では、マウスに滅菌生理食塩水中のケタミン（１４ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（３０ｍｇ／ｋｇ）の混合物で麻酔をかけ、体重２０ｇ当たり５μＬの用量で腹膜内投与した。次いで、眼科用トロピカミド（０．５％）およびフェニレフリン（２．５％）それぞれの各１滴でそれらの瞳孔を散大した。相対的９時、１２時および３時位置において、視神経円板からおよそ５０μｍの位置にある右眼４分の３のブルッフ膜を破膜させるために、５０μｍのスポットサイズで１５０ｍＷで１００ｍ秒のパルスを出すように設定した細隙灯と連結したアルゴングリーン眼科用レーザー（Ｏｃｕｌｉｇｈｔ  ＧＬ  ５３２ｎｍ、Iridex Corporation, Mountain View, CA）を用いる。全てのケースにおいて左眼を無傷の対照とした。
【０４３３】
ＣＮＶ病変の形態および体積を次のとおり測定した。ＣＮＶレーザー誘導の２週間後、これまでに記載されているように(Sengupta et al., 2003)、過剰量のケタミン−キシラジン混合物により動物を安楽死させた後、心穿刺により６ｍｌ  ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド、ｐＨ７．５（固定液）の全身潅流を行う。次いで、眼球を摘出し、辺縁後方１ｍｍに２７ｇ針を刺し、固定液中に室温で１時間浸漬した後、ＰＢＳ中に３０分間浸漬することにより２Ｘ洗浄する。さらに、眼球を切開して、網膜色素上皮、脈絡毛細管板および鞏膜からなる後部を取り出す。次に、これまでに記載されているように(Sengupta et al., 2003; Sengupta et al., 2005)、この組織を透過処理し、ローダミンコンジュゲートR. communis凝集素Ｉ(Vector Laboratories, Burlingame, CA)と反応させて、ＣＮＶ病変を検出した。さらに、ＲＧＢ  Ｓｐｏｔ高解像度デジタルカメラおよびレーザー走査共焦顕微鏡(BioRad MRC 1024, BioRad Corporation, Temecula, CA)を備えた落射蛍光Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｌａｎ  ２によりデジタル画像を取り込むために、この後部カップを４〜７の放射状スライスで切断し、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ  ａｎｔｉｆａｄｅ  ｍｅｄｉｕｍ(Vector Laboratories, Burlingame, VT)を１滴加えた顕微鏡用スライド上に平らに装着した。
【０４３４】
取り込んだデジタル画像を、ＩｍａｇｅＪソフトウエア(Research Services Branch, National Institutes of Health, Bethesda, MD)を用いて形態学的に評価した。赤色および緑色チャネルの解析のために、画像を独立したＲＧＢチャネルに次のとおり分解した：１）特定の対象と顕微鏡の較正を適用して、画素と長さの比を設定し；２）Ｏｔｓｕアルゴリズムを用いて閾値を適用し；３）画像を二値画像にし；４）病変領域全体を含むように関心領域（ＲＯＩ）を描き；５）粒子分析を実施して、ＲＯＩ内の閾値レベルを超える画素領域を定量した。容量分析では、ｚシリーズキャプチャーを用いたことを除き、上記と同様の方法とした。この際、ｚシリーズ全体にわたる病変領域の合計にｚ厚さ（一般に４μｍ）を乗じ、病変体積を得た。
【０４３５】
このモデルで試験した製剤は、ＬＴ１００２（Ｓ１Ｐに対するネズミｍＡｂ；Ｓｐｈｉｎｇｏｍａｂ（商標））；ＬＴ１００４（ヒト化ｍＡｂ）、ＬＴ１００６（ヒト化ｍＡｂ）、ＬＴ１００７（ヒト化ｍＡｂ）およびＬＴ１００９（ヒト化ｍＡｂ；Ｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂ（商標））であった。生理食塩水ビヒクルおよび非特異的抗体（ＮＳＡ）対照も含めた。図１３にて示されるように、ネズミｍＡｂ  ＬＴ１００２（Ｓｐｈｉｎｇｏｍａｂ（商標））およびヒト化ｍＡｂ  ＬＴ１００９（Ｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂ（商標））はいずれもこのＣＮＶマウスモデルにおいて病変サイズを有意に減少させた。試験した全てのｍＡｂが病変サイズのおよそ８０〜９８％減少を示し、これは全てのケースにおいて有意であった（ｐ＜０．００１  生理食塩水との対比）。加えて、ＬＴ１００７およびＬＴ１００９はまた、非特異的抗体対照と比較しても有意な阻害（ｐ＜０．０５）を示した。病変サイズの阻害率は、ＬＴ１００２（ネズミ）ではおよそ８０％、ＬＴ１００４（ヒト化）では８２％、ＬＴ１００６では８１％、ＬＴ１００９では９９％であった。このように、ＬＴ１００９はこのin vivo新血管新生モデルにおいて最も活性の高いヒト化ｍＡｂ変異体であった。
【０４３６】
実施例１８：Ｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂ用量反応の測定
レーザーによるブルッフ膜破膜の１日前に、マウス（ｎ＝１０）に漸増用量のｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂ（０．０５μｇ／眼、０．５μｇ／眼、１．０μｇ／眼もしくは３．０μｇ／眼）または高用量非特異的（ＮＳ）抗体（３．０μｇ／眼）の両側性硝子体内注射を１回行った。レーザー破膜の１４日後、マウスに麻酔をかけ、フルオレセイン標識デキストランをを潅流させ、ＣＮＶ病変サイズの解析のために脈絡膜フラットマウントを調製した。
【０４３７】
この研究では、ＣＮＶ阻害に対するｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂ投与量および投与間隔の影響を、ＣＮＶ領域を定量する別の有効な方法を用いて調べた。この方法では犠牲にする直前に、動物にフルオレセイン標識デキストランを潅流させた。ＳｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂはＣＮＶ領域の用量依存的な減少をもたらし、３．０μｇ／眼の用量においておよそ５０％の最大阻害を得た。この減少は有意であった（ｐ＜０．０００１  対応のないｔ検定を用いた非特異的抗体対照との比較）。投与回数の研究では、１４日の研究中、単一時点（第０日）においてまたは複数の時点（第０日および第７日）においてＳｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂで処置した群間では同様の有効性が観察された。
【０４３８】
Ｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂ処置（３．０μｇ／眼）で見られたおよそ５０％の最大阻害は、同じモデルにおいて、同じ研究者によって行われたＶＥＧＦトラップ（４．９２μｇ／眼）によるＣＮＶ領域の減少を示すこれまでに公開されたデータと比べてまさるとも劣らない。Saishin, et al. J Cell Physiol, 2003. 195(2): p. 241-8。「トラップ」(Regeneron Pharmaceuticals, Inc.)は、２つの異なる受容体成分とＦｃ領域と呼ばれる抗体分子のＦｃ領域との融合物であり、ＶＥＧＦトラップは、眼疾患および癌用にRegeneron社で購入されている。これらの２つの独立した研究の比較により、ＳｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂによるＣＮＶ病変サイズの減少がＶＥＧＦトラップで観察されたものよりも２０％ポイント大きいことが分かる。よって、これらのデータは、ＣＮＶネズミモデルにおいて病変形成を減少させる抗Ｓ１Ｐ療法の能力に関する本発明者らの予備調査結果を裏付けるだけでなく、ＣＮＶ病変形成を阻害するヒト化抗体、ｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂの有効性の増加も示し、抗透過性作用を理解する上での手掛かりともなる。
【０４３９】
実施例１９：未熟児網膜症ネズミモデルにおける網膜新血管新生の発生を減少させるＳｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂの有効性
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝７）を生後７日に７５％酸素中に置き、生後１２日に大気に戻し、片側の眼に３μｇのｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂの、反対側の眼にビヒクルの眼内圧注射を行った。これらのマウスに第１７日目にＦＩＴＣ標識抗ＰＥＣＡＭ抗体の眼内圧注射を行い、８時間後に、マウスを安楽死させ、眼球を摘出し、ＰＢＳ緩衝ホルマリン中に室温で５時間固定した。網膜を切開し、０．２５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００含有リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、全てを装着した。Nikon社製蛍光顕微鏡を用いてスライドを観察し、画像解析により１網膜当たりの網膜ＮＶ領域を測定した。
【０４４０】
ネズミレーザー破膜モデルで観察されたＣＮＶの減少と一致するように、本発明者らは未熟児網膜症（ＲＯＰ）ネズミモデルにおいてＣＮＶの劇的な減少も観察した。Ｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂ（３．０μｇ／眼）の硝子体内投与では、生理食塩水対照と比較して、網膜新血管新生のほぼ４倍の減少が生じた。これらのデータは、ブルッフ膜の虚血によるものであれ、破膜によるものであれ、網膜血管床および脈絡膜血管床の両方における病理的眼脈管形成を阻害するｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂの有効性を裏付けている。
【０４４１】
実施例２０：マトリゲルプラグアッセイでのＶＥＧＦ誘発性脈管形成に対するＳｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂの作用
Staton, et al., Int J Exp Pathol, 2004. 85(5): p. 233-48に記載のとおり、ＧＦＲ  マトリゲルプラグアッセイを用いてin vivo新血管新生を実施した。４〜６週齢のｎｕ／ｎｕマウスに左脇腹に５００μＬの氷冷ＧＦＲ  マトリゲルを注射した。ＧＦＲ  マトリゲルは、単独で（対照）または１００μｇ／ｍｌヘパリンを添加した１０μｇ／ｍＬ  ＶＥＧＦの添加後に注射した。対照およびｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂ処置に関し、３動物で群を構成した。ＧＦＲ  マトリゲル移植の１日前に生理食塩水またはｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂ（１０ｍｇ／ｋｇ）で動物を処置し、試験期間は７２時間おきにｉ．ｐ．投与した。１２日後に動物を犠牲にし；プラグを切除し、すぐに亜鉛およびホルマリンフリーの固定液中に一晩固定し、パラフィン包埋し、切片を作製した（５μｍ）。次いで、パラフィン包埋切片をＣＤ３１(Pharmingen)について染色した。デジタルカメラにより２０ｘ倍率で画像（１切片につき９画像、１プラグにつき３切片）を撮影し、ＰｈｏｔｏＳｈｏｐ  ６．０プログラムによりＣＤ３１陽性染色を定量し、ＩｍａｇｅＪにより脈管形成スコア（ピクセル２）として表した。
【０４４２】
このマトリゲルプラグアッセイではｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂの抗脈管形成作用は明らかであった。予想どおり１０μｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦを添加したマトリゲルプラグでは、広範囲に及ぶ新血管新生（ＶＥＧＦまたはｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂを受けない未処置対照で見られるもののおよそ５．７５ｘ）が誘導された。重要なことには、マトリゲル注射前のｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂでの全身的ｉ．ｐ．処置により、細胞充実性および微細血管密度のこのＶＥＧＦ刺激による増加のほぼ８０％が妨げられた。この減少は有意であり（ｐ＜０．０５  ＶＥＧＦ単独との比較）、動物に全身投与したときのｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂの強力な抗脈管形成活性を裏付け、ｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂがＶＥＧＦ誘発性脈管形成を有意に阻害し得ることを強く示唆している。この発見は、ネズミ同所性乳癌モデルにおいてＳ１Ｐ抗体がいくつかの脈管形成因子（ＶＥＧＦを含む）の血清レベルを減少させたLpathのオンコロジープログラムのデータと一致する。
【０４４３】
ＡＭＤに伴う血管成長の主要素は、成長しつつある内皮管を鞘で覆いかつ支える周皮細胞の補充である。Jo, et al., Am J Pathol, 2006. 168(6): p. 2036-53。トランスジェニックマウス研究により、ＶＥＧＦおよびＰＤＧＦ−Ｂが周皮細胞の浸潤および分化を刺激し、血管成熟および安定化につながる主な要因であることが分かった。Guo, et al., Am J Pathol, 2003. 162(4): p. 1083-93; Benjamin, L. E., I. Hemo and E. Keshet, Development, 1998. 125(9): p. 1591-8。重要なことには、Ｓ１ＰはＶＥＧＦおよびＰＤＧＦのトランス活性化を促進する。そのため、これらの増殖因子を間接的に無効にするｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂの能力は、ＡＭＤ中に異常な血管成長を妨げることができることを示唆している。
【０４４４】
実施例２１：Ｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂはブルッフ膜のレーザー破膜後の血管漏出を著しく減少させる
ブルッフ膜レーザー破膜ネズミモデルにおいて、（上記に示したように新血管新生を阻害することに加えて）血管漏出を阻害するために投与したｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂの有効性を評価した。
【０４４５】
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝１０）に各眼３箇所にブルッフ膜のレーザー破膜を行い、片側の眼に３μｇのｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂの、反対側の眼にビヒクルの眼内圧注射を行った。。レーザー破膜後１週間の時点において、これらのマウスに１２μｌ／ｇ  体重の１％フルオレセインナトリウムの腹腔内注射を行い、５分後に安楽死させた。眼球を摘出し、ＰＢＳ緩衝ホルマリン中に室温で５時間固定した。次に、網膜を切開し、洗浄し、一次抗ＰＥＣＡＭ−１とともにインキュベートした。次いで、網膜を洗浄し、二次抗体（ローダミンとコンジュゲートしたヤギ抗ラットＩｇＧ）とともにインキュベートした後、平らに装着した。
【０４４６】
ＣＮＶ病変領域の定量を、ＰＥＣＡＭ−１染色により測定する。血管漏出の定量を、フルオレセインナトリウム染色により測定する。ＣＮＶからの漏出領域全体＝ＣＮＶ＋漏出（緑色）−ＣＮＶ領域（赤色）。値はｎ＝１０  マウス／群の平均±ＳＥＭである。脈絡膜新血管新生領域（ＰＥＣＡＭ−１により染色されている）は、ＬＴ１００９で処置した動物ではおよそ０．０１５ｍｍ２、生理食塩水処置対照動物ではおよそ０．０３ｍｍ２であった。これは新血管新生の５０％減少である（ｐ−０．０１８）。脈絡膜新血管新生からの漏出領域（フルオレセインにより染色されている）は、ＬＴ１００９で処置した動物ではおよそ０．１２５ｍｍ２、生理食塩水処置対照動物ではおよそ０．２ｍｍ２であった。これは血管漏出のおよそ３８％減少（ｐ−０．０１７）である。
【０４４７】
３．０μｇ／眼のＳｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂまたはＰＢＳ対照で処置したマウスにおける脈絡膜新血管新生および血管漏出の減少についての代表的な免疫組織化学画像は、これらの結果と一致する。このように、ｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂは、ＣＮＶの減少に加えて、ブルッフ膜レーザー破膜後の血管漏出、すなわち視力喪失の主な原因であり、（ｉ）ＡＭＤにおける脈絡膜新生血管系漏出および（ｉｉ）糖尿病における血液−網膜関門の破壊：と関連している網膜浮腫を著しく減少させた。Gerhardt, H. and C. Betsholtz, Cell Tissue Res, 2003. 314(1): p. 15-23  Ｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂは、眼における病理的血管形成だけでなく網膜浮腫をもたらす血管漏出も減少させた。これらの発見は、マウスにフルオレセイン標識デキストラン潅流させたＣＮＶ領域定量試験から得たデータと一致する。この方法によるＣＮＶ定量が血管透過性の影響を受けることは確かである。非常に好都合な結果は、脈絡膜血管床における抗透過性作用を立証している。これらのデータを前提に、本発明者らはｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂには単剤療法となる可能性があると考える。現行の汎ＶＥＧＦ−Ａ遮断薬との相乗作用の可能性もある。
【０４４８】
実施例２２：Ｓ１Ｐに対する抗体での処置後の網膜におけるマクロファージ浸潤の減少
加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）は、シャープな中心視野を徐々に破壊する加齢に伴う疾患である。黄斑変性には２つの主要なタイプがある。ＡＭＤ症例の８５〜９０％を占めている乾燥型または萎縮型および異常な血管の成長を特徴とする湿潤型ＡＭＤ。乾燥型黄斑変性は、ドルーゼとして知られている黄色がかった斑点が主に斑領域の悪化する組織の沈殿物または残屑から蓄積し始めた場合に診断される。徐々に中心視野の喪失が起こり得る。最も多く見られる萎縮（乾燥）型ＡＭＤには有効な処置はない。萎縮性ＡＭＤは、光受容細胞の下に位置し通常はこれらの光感受性細胞に不可欠の代謝支援を提供する網膜色素上皮（ＲＰＥ）の異常によって引き起こされる。ＲＰＥ機能障害に続発する斑のある桿状体および円錐体が変性し、不可逆的視力喪失につながる。酸化的ストレス、虚血、ドルーゼの形成、脂褐素の蓄積、局所炎症および反応性神経膠症は、萎縮性ＡＭＤの病因に関係している病理学的プロセスである。これらのプロセスのうち、炎症は組織損傷の重要な一因として現われる。乾性ＡＭＤ患者の斑へのマクロファージ浸潤は、損傷性炎症性応答の重要な要素であることが証明されている。そのため、マクロファージ浸潤の阻害によって斑のある組織の損傷が軽減される可能性があることから、マクロファージ浸潤を軽減することができる作用物質は有益な治療用物質であろう。かかる作用物質は乾性ＡＭＤが湿性ＡＭＤへと変わる速度も低下させ得る。
【０４４９】
虚血性および炎症性網膜症モデルでは、これまでに、抗Ｓ１Ｐ抗体での処置後にマクロファージ浸潤の５５％阻害が示されている。これらのデータは十分に確立されたネズミ酸素誘発性網膜症モデル（未熟児網膜症（ＲＯＰ）モデルとしても知られている）を用いて得られた。具体的には、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを生後７日に７５％酸素中に置き、生後１２日に大気に戻し、片側の眼に３μｇのヒト化抗Ｓ１Ｐ抗体（ＬＴ１００９、Ｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂ（商標））の、他側の眼にビヒクルの眼内圧注射を行った。これらのマウスに生後１７日目にＦ４／８０（汎マクロファージマーカー）に対するＦＩＴＣ標識抗体の眼内圧注射を行い、８時間後に、マウスを安楽死させた。眼球を摘出し、ＰＢＳ緩衝ホルマリン中に室温で５時間固定した。網膜を切開し、０．２５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００含有リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、全てを装着した。Nikon社製蛍光顕微鏡を用いてスライドを観察し、網膜マクロファージを定量した。これらの結果を下記の表８に示す。
【０４５０】
【表１４】
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【０４５１】
これらのデータと乾性ＡＭＤの病因におけるマクロファージの既知の役割に基づいて、抗Ｓ１Ｐ抗体は乾性ＡＭＤの処置に有効な治療薬であると考える。
【０４５２】
実施例２３：２５〜７５ｍｇ／ｋｇ  ＬＴ１００９での、単独およびＡａｖａｓｔｉｎまたはパクリタキセルと組み合わせての処置に対する、ヌードＮＣｒマウスにおけるＳＣ  ＣＯＬＯ２０５  結腸直腸腫瘍異種移植片の反応
この研究の目的は、ＬＴ１００９の、単独および他の抗癌薬と組み合わせての有効性を判定すること、雌Ｎｃｒ（ｎｕ／ｎｕ）マウスに皮下移植（ｓｃ）し、定着したヒト結腸直腸（ＣＯＬＯ２０５）癌腫瘍の進行を遅らせることであった。
【０４５３】
ヌードマウスに１マウスにつきin vivo継代のＣＯＬＯ  ２０５腫瘍１断片を右脇腹付近にｓｃ埋め込みを行った。各試験の６０匹のマウスにおよそ１００〜２００ｍｍ３のサイズの腫瘍が定着した日に全ての処置を開始した。その際、マウス（１群当たりｎ＝１０）を２５ｍｇ／ｋｇのＬＴ１００９か、５０ｍｇ／ｋｇ  ＬＴ１００９か、４０ｍｇ／ｋｇ  Ａａｖａｓｔｉｎか、５０ｍｇ／ｋｇ  ＬＴ１００９と４０ｍｇ／ｋｇ  Ａａｖａｓｔｉｎか、１５ｍｇ／ｋｇパクリタキセルかまたはビヒクル（生理食塩水）で処置した。試験期間中２５ｍｇ／ｋｇまたは５０ｍｇ／ｋｇ  ＬＴ１００９および生理食塩水は、０．１ｍＬ／２０ｇ体重の量でｑ３ｄで１回(once q3d)ｉｐ投与した。Ａａｖａｓｔｉｎは、４０ｍｇ／ｋｇ／投与の投与量でｑ７ｄスケジュールでｉｖ投与し、０．１ｍＬ／２０ｇ体重の量で注射した。パクリタキセル（陽性対照）は、１５ｍｇ／ｋｇ／投与の投与量でｑ１ｄｘ５スケジュールでｉｖ投与し、０．１ｍＬ／１０ｇ体重の量で注射した。研究期間中、第２１日目に、２５ｍｇ／ｋｇ  ＬＴ１００９の用量を７５ｍｇ／ｋｇ  ＬＴ１００９へと増加した。
【０４５４】
毎日死亡率について動物を観察した。処置第１日目から開始して研究終了日を含め、週２回、腫瘍寸法および体重を採取した。各研究においてビヒクル処置対照群の腫瘍中央値がおよそ４，０００ｍｇに達したときに、研究を終了した。各動物の腫瘍を採取し、湿重量を記録し、ＣＤ−３１染色による微小血管密度（ＭＶＤ）の測定のために腫瘍を処理した。腫瘍重量（ｍｇ）は、楕円球の方程式  （ｌｘｗ２）／２＝ｍｍ３（式中、ｌおよびｗは、各測定において採取した長径および短径を意味する）を用い、単位密度（１ｍｍ３＝１ｍｇ）を仮定して計算した。
【０４５５】
【表１５】
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【０４５６】
最終腫瘍重量によって測定されたように、５０ｍｇ／ｋｇ  ＬＴ１００９は、腫瘍進行を実質的に阻害し（ｐ＜０．０１８）、生理食塩水処置動物の腫瘍と比較したときには３２％阻害した。２５／７５ｍｇ／ｋｇ  ＬＴ１００９も最終腫瘍重量を２０％減少させるのに有効であった；しかしながら、この減少は統計的に有意ではなかった。５０ｍｇ／ｋｇ  ＬＴ１００９は、最終腫瘍重量の減少においてＡａｖａｓｔｉｎと同様の作用があった（それぞれ３２％減少と３５％減少）。ＬＴ１００９とＡａｖａｓｔｉｎの組合せは、いずれかの薬剤単独よりも効果的であり、生理食塩水処置動物と比較したときには腫瘍重量の４８％減少を示した。このように、ＬＴ１００９とＡａｖａｓｔｉｎの作用は相加的であるように思われる。陽性対照、パクリタキセルは、事前定着腫瘍を完全に排除した。
【０４５７】
実施例２４：５０ｍｇ／ｋｇ  ＬＴ１００９での、単独ならびにＡａｖａｓｔｉｎおよび５−ＦＵと組み合わせての処置に対する、ヌードＮＣｒマウスにおけるＳＣ  ＨＴ２９結腸直腸腫瘍異種移植片の反応
この研究の目的は、ＬＴ１００９の、単独および他の抗癌薬と組み合わせての抗腫瘍作用を、雌無胸腺ＮＣｒ−ｎｕ／ｎｕマウスにｓｃ埋め込みを行ったヒトＨＴ２９結腸腫瘍異種移植片に対して評価することである。
【０４５８】
ヌードマウスに１マウスにつきin vivo継代のＨＴ２９腫瘍１断片を右脇腹付近にｓｃ埋め込みを行った。各試験の６０匹のマウスにおよそ１００〜２００ｍｍ３のサイズの腫瘍が定着した日に全ての処置を開始した。１処置群を１０匹のマウスとした。試験期間中、５０ｍｇ／ｋｇ  ＬＴ１００９および生理食塩水は、０．１ｍＬ／２０ｇ体重の量でｑ２ｄでｉｐ投与した。７５ｍｇ／ｋｇ  ５−ＦＵおよび２０ｍｇ／ｋｇ  Ａａｖａｓｔｉｎはそれぞれ、７５ｍｇ／ｋｇ／投与および２０ｍｇ／ｋｇ／投与の投与量でｑ４ｄでｉｐおよびｉｖ投与し、０．１ｍＬ／１０ｇ体重の量で注射した。ＬＴ１００９の初回投与は、ｉｖ投与により１００ｍｇ／ｋｇであった。
【０４５９】
毎日死亡率について動物を観察した。処置第１日目から開始して研究終了日を含め、週２回、腫瘍寸法および体重を採取した。各研究においてビヒクル処置対照群の腫瘍中央値がおよそ４，０００ｍｇに達したときに、研究を終了した。各動物の腫瘍を採取し、湿重量を記録し、ＣＤ−３１染色によるＭＶＤの測定のために腫瘍を処理した。腫瘍重量（ｍｇ）は、楕円球の方程式  （ｌｘｗ２）／２＝ｍｍ３（式中、ｌおよびｗは、各測定において採取した長径および短径を意味する）を用い、単位密度（１ｍｍ３＝１ｍｇ）を仮定して計算した。
【０４６０】
【表１６】
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【０４６１】
腫瘍重量によって測定されたように、５０ｍｇ／ｋｇ  ＬＴ１００９は、生理食塩水処置動物の腫瘍と比較したときに腫瘍進行を１３％抑制し、一方、Ａａｖａｓｔｉｎは腫瘍重量を３０％減少させた。ＬＴ１００９とＡａｖａｓｔｉｎの組合せは、いずれかの薬剤単独よりも効果的であり、生理食塩水処置動物と比較したときには統計的に有意な、腫瘍重量の４１％減少を示した。５−ＦＵでの処置では腫瘍重量が２８％減少した。５−ＦＵはＬＴ１００９とわずかな相加作用を示し、最終腫瘍重量の２９％抑制を示した。
【０４６２】
実施例２５：５０ｍｇ／ｋｇ  ＬＴ１００９での、単独またはＡａｖａｓｔｉｎもしくはパクリタキセルと組み合わせての処置に対する、ヌードＮＣｒマウスにおけるＳＣ  ＤＵ１４５前立腺腫瘍異種移植片の反応
この研究の目的は、ＬＴ１００９の、単独および他の抗癌薬と組み合わせての有効性を判定すること、雌Ｎｃｒ（ｎｕ／ｎｕ）マウスに皮下移植（ｓｃ）し、定着したヒト前立腺（ＤＵ１４５）癌腫瘍の進行を遅らせることであった。
【０４６３】
ヌードマウスに１マウスにつきin vivo継代のＤＵ１４５腫瘍１断片を右脇腹付近にｓｃ埋め込みを行った。各試験の６０匹のマウスにおよそ１００〜２００ｍｍ３のサイズの腫瘍が定着した日に全ての処置を開始した。その際、マウス（１群当たりｎ＝１０）を５０ｍｇ／ｋｇのＬＴ１００９か、２０ｍｇ／ｋｇ  Ａａｖａｓｔｉｎか、７．５ｍｇ／ｋｇ  パクリタキセルか、５０ｍｇ／ｋｇ  ＬＴ１００９と２０ｍｇ／ｋｇ  Ａａｖａｓｔｉｎか、５０ｍｇ／ｋｇ  ＬＴ１００９と７．５ｍｇ／ｋｇ  パクリタキセルかまたはビヒクル（生理食塩水）で処置した。試験期間中、５０ｍｇ／ｋｇ  ＬＴ１００９および生理食塩水は、０．１ｍＬ／２０ｇ体重の量でｑ２ｄでｉｐ投与した。パクリタキセルおよびＡａｖａｓｔｉｎはそれぞれ、７．５ｍｇ／ｋｇ／投与および２０ｍｇ／ｋｇ／投与の投与量でｑ１ｄ  ｘ５およびｑ４ｄでｉｖおよびｉｐ投与し、０．１ｍＬ／１０ｇ体重の量で注射した。ＬＴ１００９の初回投与は、ｉｖ投与により１００ｍｇ／ｋｇであった。
【０４６４】
研究期間中、ｓｃ腫瘍を三つの座標軸上で測定し、体積を計算することによって、腫瘍成長モニタリングした。研究終了時に最終腫瘍重量および体積を測定し、その後、マウスを犠牲にし、腫瘍を採取した。そして、ＣＤ−３１染色により腫瘍の微小血管密度（ＭＶＤ）を測定した。
【０４６５】
【表１７】
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【０４６６】
最終腫瘍重量によって測定されたように、５０ｍｇ／ｋｇ  ＬＴ１００９は、腫瘍進行を有意に（ｐ＜０．００）２８％抑制した。Ａａｖａｓｔｉｎおよびパクリタキセルも、生理食塩水処置動物の腫瘍と比較したときに最終腫瘍重量を有意に（ｐ＜０．００）８０％減少させた。最終腫瘍体積によって測定されたように、ＬＴ１００９は、Ａａｖａｓｔｉｎまたはパクリタキセルの抗腫瘍活性を有意に増加させなかった。
【０４６７】
実施例２６：２５ｍｇ／ｋｇまたは５０ｍｇ／ｋｇ  ＬＴ１００９での、単独およびボルテゾミブと組み合わせての処置に対する、ＣＢ１７  ＳＣＩＤマウスにおけるＲＰＭＩ  ８２２６  ヒト骨髄腫腫瘍異種移植片の反応
この研究の目的は、ＬＴ１００９の、単独および抗癌薬ボルテゾミブと組み合わせての抗腫瘍作用を、雌ＣＢ１７  ＳＣＩＤマウスにｓｃ埋め込みを行ったヒトＲＰＭＩヒト骨髄腫腫瘍異種移植片に対して評価することである。
【０４６８】
ヌードマウス（ＣＢ１７  ＳＣＩＤ、４〜５週齢、体重１８〜２２ｇ、Harlan社から入手した雌マウス）に組織培養物から採取したＲＰＭＩ  ８２２６細胞（約１ｘ１０７細胞／マウス）をｓｃ注射した。腫瘍がおよそ１００ｍｍ３のサイズに成長したときに、動物を腫瘍サイズにより処置群と対照群（１群当たり１０匹のマウス）にペアマッチングした。初回投与はペアマッチング後第1日目に開始した。全ての群の動物に体重により投薬した（１ｇ当たり０．０１ｍｌ；１０ｍｌ／ｋｇ）。ビヒクル中のＬＴ１００９は、研究終了まで３日に１回（終了までＱ３Ｄ）腹腔内（ＩＰ）注射により投与した。ボルテゾミブは、３日に１回、６回処置（Ｑ３Ｄｘ６）で尾静脈経由での静脈内注射により投与した。陰性対照とするために、ＬＴ１００９ビヒクル（０．９％生理食塩水）は、終了までＱ３ＤのスケジュールでをＩＰ投与した。
【０４６９】
個体および群の平均腫瘍体積±ＳＥＭを第1日目から研究終了まで週２回記録する。研究終了時に各群の最終平均腫瘍体積±ＳＥＭを記録する；部分的もしくは完全腫瘍退縮が起こった動物または技術的な死もしくは薬物関連死が起こった動物はこれらの計算から検閲する。
【０４７０】
【表１８】
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【０４７１】
本明細書において記載し、主張する組成物および方法の全ては、本開示内容に照らして過度の実験を行うことなく、作り、実行することができる。本発明の組成物および方法については好ましい実施形態に関して記載してきたが、該組成物および方法に変形を加えてもよいことは当業者には明らかである。添付の特許請求の範囲によって定義されるように、当業者には明らかなかかる全ての同様の代替物および修飾は本発明の精神および範囲内であると考えられる。
【０４７２】
本明細書に記載した全ての特許、特許出願および刊行物は、本発明が属する分野の技術者のレベルを示している。全ての特許、特許出願および刊行物（優先権または別の利益を主張するものを含む）は、個々の刊行物が具体的かつ個別に引用することにより本明細書の一部とされることが示されたのと同程度に引用することにより本明細書の一部とされる。
【０４７３】
本明細書において例示的に記載した本発明は、本明細書において具体的に開示されていない任意の要素の不在下でも適切に実施し得る。よって、例えば、本明細書におけるいずれの場合においても、用語「含んでなる(comprising)」、「から本質的になる(consisting essentially of)」および「からなる(consisting of)」はいずれも、残る２つの用語のいずれかと置き換えてよい。使用した用語および表現は、限定ではなく説明の言葉とし用いられ、かかる用語および表現の使用において、示し、記載した特徴の等価物またはその部分を排除する意図はなく、主張した本発明の範囲内で様々な修飾が可能であることは認識されている。従って、本発明を好ましい実施形態によって具体的に開示してきたが、当業者ならば本明細書に開示した概念の任意選択の特徴、修飾および変形を用い得ること、そして添付の特許請求の範囲によって定義されるように、かかる修飾および変形は本発明の精神および範囲内であると考えられることは理解すべきである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
0006053834.tif 000022
【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
0006053834.tif 000027
【図５Ｂ】
0006053834.tif 000028
【図６Ａ】
0006053834.tif 000029
【図６Ｂ】
0006053834.tif 000030
【図６Ｃ】
0006053834.tif 000031
【図７Ａ】
0006053834.tif 000032
【図７Ｂ】
0006053834.tif 000033
【図７Ｃ】
0006053834.tif 000034
【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
0006053834.tif 000036
【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
0006053834.tif 000040
【図９Ｂ】
0006053834.tif 000041
【図１０Ａ】
0006053834.tif 000042
【図１０Ｂ】
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【図１１】
0006053834.tif 000044
【図１２Ａ】
0006053834.tif 000045
【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【配列表】
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