(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理活性細胞および温度感受性細胞安定化生体用材料を含む注射可能製剤であって、
（ｉ）８℃以下で実質的に固体状態、および
（ｉｉ）外界温度以上で実質的に液体状態、
を維持し、
生体用材料が、ヒドロゲルを含み、８℃および外界温度以上の間で固体−液体遷移状態であり、かつ
生理活性細胞が、遷移状態の間、生体用材料中に懸濁されており、生体用材料全体に分散されている、製剤。
【請求項２】
前記生理活性細胞が腎臓細胞を含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
前記生理活性細胞が、細胞安定化生体用材料全体にわたり均質に分散されている、請求項１に記載の製剤。
【請求項４】
前記実質的に固体状態がゲル状態である、請求項１に記載の製剤。
【請求項５】
前記ヒドロゲルがゼラチンを含む、請求項１〜４の何れか一項に記載の製剤。
【請求項６】
前記ゼラチンが、０．５％〜１％（ｗ／ｖ）の濃度で前記製剤中に存在する、請求項５に記載の製剤。
【請求項７】
前記ゼラチンが、０．７５％（ｗ／ｖ）の濃度で前記製剤中に存在する請求項５に記載の製剤。 
【請求項８】
細胞生存薬剤をさらに含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項９】
前記細胞生存薬剤が、抗酸化剤、酸素担体、免疫調節因子、細胞動員因子、細胞付着因子、抗炎症剤、免疫抑制剤、血管新生因子、および創傷治癒因子、からなる群より選択される薬剤を含む、請求項８に記載の製剤。
【請求項１０】
前記細胞生存薬剤が抗酸化剤である、請求項８に記載の製剤。
【請求項１１】
前記抗酸化剤が、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸である、請求項１０に記載の製剤。
【請求項１２】
前記６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸が、５０μＭ〜１５０μＭの濃度で存在する、請求項１１に記載の製剤。
【請求項１３】
前記６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸が、１００μＭの濃度で存在する、請求項１１に記載の製剤。 
【請求項１４】
前記細胞生存薬剤が酸素担体である、請求項９に記載の製剤。
【請求項１５】
前記酸素担体がパーフルオロカーボンである、請求項１４に記載の製剤。
【請求項１６】
前記細胞生存薬剤が免疫調節剤である、請求項９に記載の製剤。
【請求項１７】
前記細胞生存薬剤が免疫抑制剤である、請求項９に記載の製剤。
【請求項１８】
生理活性腎臓細胞、０．７５％（ｗ／ｖ）のゼラチンを含む温度感受性細胞安定化生体用材料、および１００μＭの６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸を含む注射可能製剤であって、 
（ｉ）８℃以下で実質的に固体状態、および 
（ｉｉ）外界温度以上で実質的に液体状態、
であり、
生理活性細胞が、生体用材料中に懸濁されており、生体用材料全体に分散されている、製剤。
【請求項１９】
前記生理活性腎臓細胞が、細胞安定化生体用材料全体にわたり均質に分散されている、請求項１８に記載の製剤。 
【請求項２０】
前記細胞安定化生体用材料が、８℃および外界温度の間で固体−液体遷移状態である、請求項１８に記載の製剤。 
【請求項２１】
前記実質的に固体状態がゲル状態である、請求項１８に記載の製剤。
【請求項２２】
細胞生存薬剤をさらに含む、請求項１８に記載の製剤。
【請求項２３】
前記細胞生存薬剤が、抗酸化剤、酸素担体、免疫調節因子、細胞動員因子、細胞付着因子、抗炎症剤、血管新生因子、および創傷治癒因子、からなる群より選択される薬剤を含む、請求項２２に記載の製剤。
【請求項２４】
前記細胞生存薬剤が酸素担体である、請求項２３に記載の製剤。
【請求項２５】
前記酸素担体がパーフルオロカーボンである、請求項２４に記載の製剤。
【請求項２６】
前記細胞生存薬剤が免疫調節剤である、請求項２３に記載の製剤。
【請求項２７】
前記細胞生存薬剤が免疫抑制剤である、請求項２３に記載の製剤。
【請求項２８】
生体用材料を含む生体適合性ビーズをさらに含む請求項１〜２７のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項２９】
前記ビーズが架橋されている、請求項２８に記載の製剤。
【請求項３０】
前記架橋ビーズが、非架橋生体適合性ビーズに比べて、酵素分解に対する低減した感受性を有する、請求項２９に記載の製剤。 
【請求項３１】
前記架橋ビーズが、カルボジイミド架橋ビーズである、請求項２９に記載の製剤。
【請求項３２】
前記カルボジイミドが、ｌ−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、ＤＣＣ−Ｎ、Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、およびＮ、Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）、からなる群より選択される、請求項３１に記載の製剤。
【請求項３３】
前記カルボジイミドが、ｌ−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）である、請求項３１に記載の製剤。
【請求項３４】
前記架橋ビーズが、非架橋ビーズに比べて、低減した数の遊離一級アミンを有する、請求項３０に記載の製剤。 
【請求項３５】
前記遊離一級アミンの数が、３５５ｎｍの分光測定で検出可能である、請求項３４に記載の製剤。
【請求項３６】
前記ビーズが、生理活性細胞を播種されている、請求項２９に記載の製剤。
【請求項３７】
前記生理活性細胞が腎臓細胞である、請求項３６に記載の製剤。
【請求項３８】
（ｉ）外界温度以下で実質的に固体状態、および 
（ｉｉ）３７℃以上で実質的に液体状態、
を維持する温度感受性生体用材料を含む追加の生体適合性ビーズをさらに含む、請求項２９に記載の製剤。
【請求項３９】
前記ビーズの生体用材料が、外界温度および３７℃の間で固体−液体遷移状態である、請求項３８に記載の製剤。
【請求項４０】
前記実質的に固体状態がゲル状態である、請求項３８に記載の製剤。
【請求項４１】
前記ビーズの生体用材料がヒドロゲルを含む、請求項３８に記載の製剤。
【請求項４２】
前記ヒドロゲルがゼラチンを含む、請求項４１に記載の製剤。
【請求項４３】
前記ビーズが、５％（ｗ／ｖ）〜１０％（ｗ／ｖ）の濃度のゼラチンを含む、請求項４２に記載の製剤。
【請求項４４】
前記追加の生体適合性ビーズがスペーサービーズである、請求項３８に記載の製剤。
【請求項４５】
前記スペーサービーズは生理活性細胞を播種されていない、請求項４４に記載の製剤。
【請求項４６】
腎臓細胞集団により分泌された産物をさらに含む、請求項２、１８〜２８、および３６〜３７のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項４７】
前記産物がパラクリン因子を含む、請求項４６に記載の製剤。
【請求項４８】
前記産物が内分泌因子を含む、請求項４６に記載の製剤。
【請求項４９】
前記産物がジャクスタクライン因子を含む、請求項４６に記載の製剤。
【請求項５０】
前記産物が小胞を含む、請求項４６に記載の製剤。
【請求項５１】
前記小胞が微小胞を含む、請求項５０に記載の製剤。
【請求項５２】
前記小胞がエキソソームを含む、請求項５０に記載の製剤。
【請求項５３】
前記小胞が、パラクリン因子、内分泌因子、ジャクスタクライン因子、およびＲＮＡ、からなる群より選択される分泌産物を含む、請求項５０〜５２のいずれか１項に記載の製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、生理活性細胞集団、等の活性薬剤を含む治療製剤、およびこの調製方法、ならびにこの製剤を必要としている対象に投与する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
コラーゲンおよびゼラチンベース生体用材料は、種々の組織工学における応用へ首尾よく用いられている（Ｒｏｈａｎｉｚａｄｅｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｍａｔｅｒ  Ｓｃｉ  Ｍａｔｅｒ  Ｍｅｄ  ２００８；１９：１１７３−１１８２；Ｔａｋｅｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｐａｒｔ  Ａ  ２００８；１４：１６２９−１６３８；Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２００５；１０９：２５６−２７４）。これらの高分子の両方は、優れた生体適合性および低い抗原性を特徴とする（Ｃｅｎｎｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｍａｔｅｒ  Ｓｃｉ  Ｐｏｌｙｍ  Ｅｄ  ２０００；１１：６８５−６９９；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  ２００１；２２１：１−２２；Ｗａｋｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９４９；６３：４２７−４３３）；しかし、コラーゲンの加水分解によりゼラチンが得られるので、ゼラチンは、コラーゲンに比べ、下記に示す一定の利点がある：
（ａ）入手が容易で、使いやすい；（ｂ）分子量およびブルーム強度に対して選択肢（すなわち、物理特性に対する制御）を提供する；および（ｃ）化学修飾に対しより柔軟で、製造がより容易である。さらに、生物学的観点から、ゼラチンは、コラーゲンに類似の細胞適合性および細胞接着特性を維持する（Ｅｎｇｖａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １９７７；２０：１−５；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｒａｌ  Ｓｕｒｇ  Ｏｒａｌ  Ｍｅｄ  Ｏｒａｌ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｏｒａｌ  Ｒａｄｉｏｌ  Ｅｎｄｏｄ  ２００９；１０８：ｅ９４−１００）。
【０００３】
これらの高分子の架橋を、それらの生分解を遅らせて（組織工学における応用での）インビボ持続を伸ばす、または薬剤放出能力を目的に合わせて調節する（薬剤担体として使用する場合）目的のために行うことに関する種々の方法が報告されている。コラーゲンまたはゼラチンの化学的もしくは光化学的架橋に関し、多くの方法が報告されている（Ａｄｈｉｒａｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ  ２００７；２４：６４７−６５９；Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ  Ｂｉｏｓｃｉ  ２００７；７：５００−５０７；Ｇａｇｎｉｅｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｅｎｇ  ２００７；１７：９−１８；Ｋｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｍａｔｅｒ  Ｓｃｉ  Ｐｏｌｙｍ  Ｅｄ  ２０１０；２１：４６３−４７６；Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  Ａ  ２００４；７１：３３４−３４２；Ｖａｎｄｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．ＩｎｔＪ  Ｐｈａｒｍ  ２００１；２１５：１７５−１８４；Ｖａｎｄｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２００４；９６：６７−８４）。これらの方法の大部分は、これらの生体用材料の酵素分解に対する感受性の低減およびインビボでの滞留時間の延長に向けられている（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、前出、２００７；Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．、前出、２００４）。他の架橋方法は、通常、薬剤、タンパク質または核酸の徐放担体として適切なゼラチンまたはコラーゲンベース生体用材料を得るために用いられる（Ｋｉｍｕｒａ、前出、２０１０；Ｖａｎｄｅｌｌｉ、前出、２００４；Ｋｏｍｍａｒｅｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２００７；３：３２−４２；Ｓｅｈｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  ２００９；６：６８７−６９５；Ｓｕｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ２００７；１１９：３０１−３１２）。コラーゲンおよびゼラチンならびに他の組織工学に適応する系のための広く使用されている架橋剤クラスは、カルボジイミドである（Ａｄｈｉｒａｊａｎ、前出、２００７；Ｏｌｄｅ  Ｄａｍｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  １９９６；１７：７６５−７７３；Ｐｉｅｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２０００；２１：５８１−５９３；Ｃｏｒｎｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｐｏｄｉａｔｒ  Ｍｅｄ  Ｓｕｒｇ  ２００９；２６：５０７−５２３）。これらの分子は、ゼロ長架橋剤として知られ、架橋される種に存在するカルボキシルおよび一級アミン官能基の間でのアミド結合形成を媒介することにより機能する。さらに、カルボジイミドは、他のよく用いられる架橋剤（例えば、グルタルアルデヒド）に比べて細胞毒性が少ない（Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｍａｔｅｒ  Ｓｃｉ  Ｍａｔｅｒ  Ｍｅｄ  ２０１０；２１：１８９９−１９１１）。グルタルアルデヒドは、Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ（登録商標）ビーズにおいて架橋剤として使用される。Ｂｕｒｇの米国特許第６，９９１，６５２号は、対象に送達され得る細胞用の３次元支持構築物を含む組織工学複合材について記載している。
【０００４】
再生医療技術は、慢性腎疾患（ＣＫＤ）に対する次世代の治療選択肢を提供する。Ｐｒｅｓｎｅｌｌらの国際公開第２０１０／０５６３２８号およびＨａｇａｎらの国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７号は、尿細管およびエリスロポエチン（ＥＰＯ）産生腎臓細胞集団を含む単離生理活性腎臓細胞、およびそれを単離および培養する方法、ならびに必要としている対象をその細胞集団を使って治療する方法を記載している。
【０００５】
組織工学および再生医療への適用において、例えば、生理活性細胞等の活性薬剤の必要としている対象への送達に適する治療製剤が必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
一態様では、本発明は、活性薬剤、例えば、生理活性細胞を含む注射可能な治療製剤を提供する。一実施形態では、注射可能製剤は、生理活性細胞および温度感受性細胞安定化生体用材料を含む。別の実施形態では、温度感受性細胞安定化生体用材料は、（ｉ）約８℃以下で実質的に固体状態、および／または（ｉｉ）外界温度以上で実質的に液体状態を維持する。他の一実施形態では、生理活性細胞は、本明細書記載のように、腎臓細胞を含む。別の実施形態では、生理活性細胞は、細胞安定化生体用材料の全体にわたり実質的に均一に分散される。他の実施形態では、生体用材料は、約８℃およびおよそ外界温度以上の間で固体−液体遷移状態を有する。一実施形態では、実質的な固体状態は、ゲル状態である。別の実施形態では、細胞安定化生体用材料は、ヒドロゲルを含む。他の一実施形態では、ヒドロゲルは、ゼラチンを含む。他の実施形態では、ゼラチンは、約０．５％〜約１％（ｗ／ｖ）の濃度で製剤中に存在する。一実施形態では、ゼラチンは、約０．７５％（ｗ／ｖ）の濃度で製剤中に存在する。別の実施形態では、製剤は、細胞生存薬剤をさらに含む。他の一実施形態では、細胞生存薬剤は、抗酸化剤、酸素担体、免疫調節因子、細胞動員因子、細胞付着因子、抗炎症剤、免疫抑制剤、血管新生因子、および創傷治癒因子からなる群より選択される薬剤を含む。いくつかの実施形態では、細胞生存薬剤は、抗酸化剤である。一実施形態では、抗酸化剤は、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸である。別の実施形態では、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸は、約５０μＭ〜約１５０μＭの濃度で存在する。他の一実施形態では、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸は、約１００μＭの濃度で存在する。いくつかの実施形態では、細胞生存薬剤は、酸素担体である。一実施形態では、酸素担体は、パーフルオロカーボンである。他の実施形態では、細胞生存薬剤は、免疫調節剤である。一実施形態では、細胞生存薬剤は、免疫抑制剤である。
【０００７】
別の態様では、本発明は、生理活性腎臓細胞を含む注射可能な治療製剤を提供する。一実施形態では、製剤は、生理活性腎臓細胞、約０．７５％（ｗ／ｖ）のゼラチン、および約１００μＭの６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸を含み、製剤は、（ｉ）約８℃以下で実質的に固体状態、および（ｉｉ）外界温度以上で実質的に液体状態である。別の実施形態では、生理活性腎臓細胞は、細胞安定化生体用材料全体にわたり、実質的に均一に分散される。他の一実施形態では、生体用材料は、約８℃とおよそ外界温度の間で固体−液体遷移状態を有する。他の実施形態では、実質的に固体の状態は、ゲル状態である。いくつかの実施形態では、製剤は、細胞生存薬剤をさらに含む。さらに別の実施形態では、細胞生存薬剤は、抗酸化剤、酸素担体、免疫調節因子、細胞動員因子、細胞付着因子、抗炎症剤、血管新生因子、および創傷治癒因子からなる群より選択される薬剤を含む。一実施形態では、細胞生存薬剤は、酸素担体である。別の実施形態では、酸素担体は、パーフルオロカーボンである。他の一実施形態では、細胞生存薬剤は、免疫調節剤である。他の実施形態では、細胞生存薬剤は、免疫抑制剤である。
【０００８】
他の一態様では、本発明は、生体適合性ビーズをさらに含む本明細書記載の製剤を提供する。一実施形態では、生体適合性ビーズは、生体用材料を含む。別の実施形態では、ビーズは、架橋されている。他の一実施形態では、架橋ビーズは、非架橋生体適合性ビーズに比べ、酵素分解に対する感受性が低減されている。他の実施形態では、架橋ビーズは、カルボジイミド架橋ビーズである。一実施形態では、カルボジイミドは、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、ＤＣＣ−Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、およびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）からなる群より選択される。別の実施形態では、カルボジイミドは、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）である。他の一実施形態では、架橋ビーズは、非架橋ビーズに比べて、少ない数の遊離一級アミンを含む。他の実施形態では、遊離一級アミンの数は、約３５５ｎｍの分光測定で検出できる。いくつかの実施形態では、ビーズは、生理活性細胞を播種される。一実施形態では、生理活性細胞は、腎臓細胞である。別の実施形態では、製剤は、温度感受性の生体用材料を含む追加の生体適合性ビーズをさらに含み、この生体用材料は、（ｉ）外界温度以下で実質的に固体状態、および（ｉｉ）約３７℃以上で実質的に液体状態を維持する。他の一実施形態では、ビーズの生体用材料は、外界温度とおよそ３７℃の間に固体−液体遷移状態を有する。他の実施形態では、実質的に固体の状態は、ゲル状態である。一実施形態では、ビーズの生体用材料は、ヒドロゲルを含む。別の実施形態では、ヒドロゲルは、ゼラチンを含む。他の一実施形態では、ビーズは、約５％（ｗ／ｖ）〜約１０％（ｗ／ｖ）の濃度のゼラチンを含む。いくつかの実施形態では、追加の生体適合性ビーズは、スペーサービーズである。他の実施形態では、スペーサービーズには生理活性細胞が播種されていない。
【０００９】
別の態様では、本発明の製剤は、腎臓細胞集団により分泌された産物を含む。一実施形態では、製剤は、腎臓細胞集団および／または生理活性細胞により分泌された産物を含む。他の一実施形態では、生理活性細胞は、腎臓細胞である。別の実施形態では、産物は、パラクリン因子、内分泌因子、およびジャクスタクライン因子のうちの１つ以上を含む。他の一実施形態では、産物は、小胞を含む。他の実施形態では、小胞は、微小胞を含む。一実施形態では、小胞は、エキソソームを含む。別の実施形態では、小胞は、パラクリン因子、内分泌因子、ジャクスタクライン因子、およびＲＮＡからなる群より選択される分泌産物を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】非架橋ゼラチンビーズの温度応答性。
【図２】懸濁された個別腎臓細胞を含むマトリックス。
【図３】細胞凝集体を含むマトリックス。
【図４】マイクロ担体ビーズに結合した細胞を含むマトリックス。
【図５】細胞に加えて可溶性因子（ヒアルロン酸）を含むマトリックス。
【図６】４℃のマトリックス中で３日経過後の細胞生存状態。
【図７】Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ  Ｓビーズと混合（１週間）したスペーサービーズを注射した腎臓の組織構造で、ビーズの生体適合性およびそれらの空隙生成能力を示す。
【図８】マトリックスの構造健全性の喪失を図示したもの（左パネル：固体；右パネル：液体）。
【図９】カルボジイミド媒介ゼラチン架橋合成スキームで、反応に関与するアミノ酸残基（非架橋ゼラチンの場合）およびそれらが形成するアミド結合（架橋ゼラチンの場合）を示す。
【図１０】ゼラチンビーズ形態。Ａ−走査電子顕微鏡像：非架橋ゼラチンビーズの全体形態およびサイズ分布を示す（スケールバー：１ｍｍ）。Ｂ−高倍率走査電子顕微鏡像：ビーズの多孔性、中空構造を示す（スケールバー：１００μｍ）。
【図１１】ビーズのサイズ分布プロファイル。
【図１２】：ビーズの表面トポグラフィー。上段（Ａ）−ドライビーズのＳＥＭ（走査電子顕微鏡）像。下段（Ｂ）−ウエットビーズの明視野顕微鏡像。両セットの像は、ビーズの多孔性表面を示す。ＳＥＭ像は、また、中空の内部も示す。
【図１３】架橋ゼラチン中のアミンの定量。Ａ− 一級アミンとピクリルスルホン酸の間のオレンジ色の付加物の形成を示す反応スキーム。Ｂ−触媒的に消化された、異る架橋をされたゼラチンビーズ（ｎ＝３）中に存在する一級アミン基の定量。分散分析による統計分析Ｐ＝０．００７。
【図１４】異なる架橋をされたゼラチンビーズの酵素分解プロファイル（Ａ）およびＣｕｌｔｉｓｐｈｅｒ  Ｓビーズとの比較（Ｂ）。
【図１５】１０ｍＭ  ＥＤＣ架橋ビーズの細胞適合性；ビーズへの細胞付着および細胞生存度を示す（緑＝生存；赤＝死細胞）。
【図１６】架橋ビーズの細胞適合性；架橋ゼラチンビーズ上の初代ラット腎臓細胞のＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）染色。
【図１７】０．１Ｍ  ＥＤＣ架橋ゼラチンビーズを注射した腎組織（１週間）；ビーズの生体適合性を示す。
【図１８】腎臓切片の組織評価；注射後１週間の架橋ゼラチンビーズの分解を示す。
【図１９】腎臓切片の組織評価；注射後４週間の架橋ゼラチンビーズの分解を示す。
【図２０】ＮＫＡプロトタイプの作製用戦略アウトライン。
【図２１】選択されたげっ歯類再生腎臓細胞生体用材料構築物の代表的ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ染色（Ａ：細胞／ＰＢＳ；Ｂ：細胞／ＧＢＨ；Ｃ：細胞／ビーズ）。
【図２２】移植４週後の主要腎臓生理指標のまとめ（分散分析）。（Ａ）体重；（Ｂ）血中尿素窒素（ＢＵＮ）；（Ｃ）血清クレアチニン（Ｓｅｒｅ）。
【図２３】移植４週後の腎臓生理指標としての（Ａ）尿タンパク質／クレアチニン（ＵＰＣ）および（Ｂ）尿タンパク質（Ｕｐｒｏｔｅｉｎ）のまとめ（分散分析）。
【図２４】移植４週後の腎臓生理指標としての（Ａ）比重および（Ｂ）尿クレアチニン（Ｕｃｒｅ）のまとめ（分散分析）。
【図２５】半腎切除モデルにおけるげっ歯類腎臓内の細胞／生体用材料構築物の移植に伴う代表的組織構造の結果。
【図２６】多層ステップ勾配技術（左パネル）または単層混合勾配技術（右パネル）を使って新たに分離した腎組織由来のＥＰＯ産生細胞画分の富化を示す。両方法とも、ＥＰＯバンド由来の非ＥＰＯ産生細胞成分（主に尿細管細胞）の部分的欠乏を生ずる。このバンドは、１．０２５ｇ／ｍＬおよび１．０３５ｇ／ｍＬの間に現れる。
【図２７】別々に採取し、同じステップ勾配を並行して適用した「正常酸素圧」（２１％酸素）および「低酸素」（２％酸素）げっ歯類培養物のステップ勾配を示す。
【図２８】別々に採取し、同じステップ勾配を並行して適用した「正常酸素圧」（２１％酸素）および「低酸素」（２％酸素）下のイヌの培養物のステップ勾配を示す。
【図２９】ＵＮＦＸ馴化培地の調製と分析のための模式図を示す。
【図３０】細胞凝集体の調製方法。Ａ−ローバインディングプレートを備えたオービタルローテーター；Ｂ−細胞を含むスピナーフラスコ。
【図３１】細胞凝集体またはスフェロイドを示す。
【図３２】細胞凝集体を示す−ＮＫＣＣ２−緑；核−青。
【図３３】細胞凝集体を示す−ＧＧＴ−１−緑；核−青。
【図３４】細胞凝集体を示す−アクアポリン１−緑；核−青。
【図３５】細胞凝集体を示す−ロイシンアミノペプチダーゼ３−赤；核−青。
【図３６】細胞凝集体を示す−有機イオン輸送体ｌ（ＯＡＴｌ）−赤；核−青。
【図３７】細胞凝集体を示す−キュビリン−赤；核−青。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
発明の詳細な説明
本発明は、生理活性細胞等の活性薬剤を含む治療製剤、ならびにそれを調製する方法および製剤を使って必要としている対象を治療する方法に関する。生理活性細胞製剤は、生理活性腎臓細胞（ＢＲＣ）の異種起源混合物または画分に対して適切であり得る。生理活性腎臓細胞は、尿細管およびエリスロポエチン（ＥＰＯ）産生腎臓細胞を含む単離腎臓細胞であってもよい。ＢＲＣ細胞集団は、富化尿細管およびＥＰＯ産生細胞集団を含んでもよい。ＢＲＣは、健康な個体由来腎臓細胞画分由来か、または画分それ自体であってもよい。さらに、本発明は、対応する健康な個体の腎臓細胞画分と比較して、特定の細胞成分が欠如している可能性があるが、それでも、治療特性を保持している不健康な個体から採取した腎臓細胞画分を提供する。本発明は、また、健康な個体に比較して細胞成分が欠けている治療的に活性な細胞集団を提供し、一実施形態では、この細胞集団は、種々の疾患状態の自己ソースから単離、増殖できる。
【００１２】
生理活性細胞製剤が本明細書に記載されているが、本発明は、他の種々の活性薬剤を含む製剤も意図している。他の適切な活性薬剤には、限定されないが、細胞凝集体、無細胞生体用材料、生理活性細胞由来の分泌産物、大および小分子治療薬、ならびにこれらの組み合わせが含まれる。例えば、１つのタイプの生理活性細胞は、治療分子または別のタイプの生理活性細胞を含めて、または含めないで、生体用材料ベースマイクロ担体と組み合わせることができ、非結合細胞は、無細胞粒子と組み合わせることができる。
【００１３】
１．定義
別途定義されなければ、本明細書で使われる技術的および科学的用語は、本発明の属する当業者により共通に理解されているものと同じ意味を有する。Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、３ｒｄ  Ｅｄ．（Ｒ  Ｌａｎｚａ、Ｒ  Ｌａｎｇｅｒ、＆  Ｊ  Ｖａｃａｎｔｉ編）、２００７、は本出願で使われる多くの用語に対する一般的な指針を当業者に提供する。当業者なら、本明細書記載のものと類似の、または等価な、本発明の実施に使用可能な多くの方法と材料を認識するであろう。実際、本発明は、記載されている方法と材料に決して限定されるものではない。
【００１４】
本明細書で使用される用語の「細胞集団」は、適切な組織源、通常は哺乳動物、から直接単離することにより得られいくつかの細胞を指す。単離細胞集団は、その後、インビトロで培養してもよい。当業者なら、本発明で使用するために細胞集団を単離し培養する種々の方法、および本発明で使用される細胞集団中の様々な数の細胞について理解できるであろう。細胞集団は、臓器または組織、例えば、腎臓由来の未分画の異種起源細胞集団であってもよい。例えば、異種起源細胞集団は、組織生検から、または全臓器組織から単離できる。あるいは、異種起源細胞集団は、組織生検または全臓器組織から確立された哺乳動物細胞のインビトロ培養由来であってもよい。未分画異種起源細胞集団は、また、非富化細胞集団とも呼ばれる。一実施形態では、細胞集団は、生理活性細胞を含む。
【００１５】
「天然の臓器」という用語は、生体の臓器を意味するものとする。対象は、健康であっても、不健康であってもよい。不健康な対象は、その特定の臓器に関連する疾患を有し得る。
【００１６】
「天然の腎臓」という用語は、生体の腎臓を意味するものとする。対象は、健康でも不健康でもよい。不健康対象は、腎疾患に罹患し得る。
【００１７】
「再生効果」という用語は、天然の臓器、例えば、腎臓に対する利益を提供する効果を意味するものとする。効果は、限定されないが、天然の臓器に対する障害度の減少、または天然の臓器機能の改善、修復もしくは安定化を含み得る。腎損傷は、線維形成、炎症、糸球体肥大、等の形態であり得、対象の天然の臓器関連疾患に関連し得る。
【００１８】
本明細書で使用される用語の「混合物」は、２つ以上の未分画、異種起源の細胞集団由来の単離された、富化細胞集団の組み合わせを指す。特定の実施形態によると、本発明の細胞集団は、腎臓細胞集団である。
【００１９】
「富化」細胞集団または調製物は、出発臓器細胞集団（例えば、未分画、異種起源の細胞集団）に由来し、出発集団中のその細胞型の割合よりも高い割合の特定細胞型を含む、細胞集団を指す。例えば、出発腎臓細胞集団は、第１、第２、第３、第４、第５、等の対象細胞集団用として富化することができる。本明細書で使用される用語の「細胞集団」、「細胞調製物」および「細胞プロトタイプ」は、同義に使用される。
【００２０】
一態様では、本明細書で使用される用語の「富化」細胞集団は、出発臓器細胞集団（例えば、腎生検または培養哺乳類腎臓細胞由来の細胞懸濁液）に由来し、出発集団中のＥＰＯ産生可能な細胞の割合よりも高い割合のＥＰＯ産生可能な細胞を含む細胞集団を指す。例えば、「Ｂ４」という用語は、出発集団に比べて、より大きな割合のＥＰＯ産生細胞、糸球体細胞、および血管細胞を含む出発腎臓細胞集団由来の細胞集団である。本発明の細胞集団は、１つ以上の細胞型を富化させ、１つ以上の他の細胞型を枯渇させることができる。例えば、富化ＥＰＯ産生細胞集団は、間質性線維芽細胞を富化させ、尿細管細胞を枯渇させて、非富化細胞集団、すなわち、富化細胞集団が得られる出発細胞集団中の間質性線維芽細胞および尿細管細胞に比べて、管上皮細胞を集合させることができる。ＥＰＯ富化または「Ｂ４」集団に言及している全ての実施形態において、富化細胞集団は、内在性天然ＥＰＯ遺伝子からの酸素で調節可能なＥＰＯ発現により示されるように、酸素調節手法でＥＰＯを産生出来る細胞を含む異種起源の細胞集団である。
【００２１】
別の態様では、出発集団の細胞型の割合より大きな割合の特定細胞型、例えば、血管、糸球体、または内分泌細胞を含む富化腎臓細胞集団は、また、健康な個体または対象由来の出発腎臓細胞集団に比べて、１つ以上の特定細胞型、例えば、血管、糸球体、または内分泌細胞が欠けているか、または不足し得る。例えば、一態様では、「Ｂ４’」、または「Ｂ４プライム」という用語は、健康な個体に比較して、出発標本の疾患状態に応じて、１つ以上の細胞型、例えば、血管、糸球体または内分泌型が欠けているか、または不足している出発腎臓細胞集団由来の細胞集団である。一実施形態では、Ｂ４’細胞集団は、慢性腎疾患の対象由来である。一実施形態では、Ｂ４’細胞集団は、巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）の対象由来である。別の実施形態では、Ｂ４’細胞集団は、自己免疫性糸球体腎炎の対象由来である。別の態様では、Ｂ４’は、１つ以上の細胞型、例えば、血管、糸球体、または内分泌細胞が、後で、枯渇するか、または不足する、全細胞型、例えば、血管、糸球体、または内分泌細胞を含む出発細胞集団由来の細胞集団である。さらに別の態様では、Ｂ４’は、１つ以上の特定細胞型、例えば、血管、糸球体、または内分泌細胞が、後で、富化される、全細胞型、例えば、血管、糸球体、または内分泌細胞を含む出発細胞集団由来の細胞集団である。例えば、一実施形態では、Ｂ４’細胞集団は、血管細胞が富化されるが、糸球体および／または内分泌細胞が枯渇され得る。別の実施形態では、Ｂ４’細胞集団は、糸球体細胞が富化されるが、血管および／または内分泌細胞が枯渇され得る。別の実施形態では、Ｂ４’細胞集団は、内分泌細胞が富化されるが、血管および／または糸球体細胞が枯渇され得る。別の実施形態では、Ｂ４’細胞集団は、血管および内分泌細胞が富化されるが、糸球体細胞が枯渇され得る。好ましい実施形態では、Ｂ４’細胞集団が、単独で、または別の富化細胞集団、例えば、Ｂ２および／またはＢ３と混合されて、治療特性を保持する。Ｂ４’細胞集団は、例えば、本明細書の実施例、例えば、実施例１１〜１３に記載されている。
【００２２】
別の態様では、富化細胞集団は、上記で論じた出発腎臓細胞集団由来であり、出発集団中でいくつかのＥＰＯ産生細胞と共に１つ以上の血管、糸球体および近位尿細管マーカーを発現している細胞の割合よりも、いくつかのＥＰＯ産生細胞と共に１つ以上の血管、糸球体および近位尿細管マーカーを発現している、より大きい割合の細胞を含む細胞集団を意味し得る。例えば、「Ｂ３」という用語は、出発腎臓細胞集団に由来し、出発集団に比べて、大きな割合の近位尿細管細胞ならびに血管および糸球体細胞を含む細胞集団を指す。一実施形態では、Ｂ３細胞集団は、出発集団に比べて、大きな割合の近位尿細管細胞を含むが、Ｂ２細胞集団に比べて、より少ない割合の近位尿細管細胞を含む。別の実施形態では、Ｂ３細胞集団は、出発集団に比べて、いくつかのＥＰＯ産生細胞と共に大きな割合の血管および糸球体細胞マーカーを含むが、Ｂ４細胞集団に比べて、いくつかのＥＰＯ産生細胞と共により少ない割合の血管および糸球体細胞マーカーを含む。
【００２３】
別の態様では、富化細胞集団は、また、上でで論じた出発腎臓細胞集団に由来し、出発集団中の１つ以上の尿細管細胞マーカー発現細胞の割合よりも大きな割合の１つ以上の尿細管細胞マーカー発現細胞を含む細胞集団をも指し得る。例えば、「Ｂ２」という用語は、出発腎臓細胞集団に由来し、出発集団に比較して、より大きな割合の尿細管細胞を含む細胞集団を指す。さらに、１つ以上の尿細管細胞マーカーを発現する細胞を富化した細胞集団（すなわち「Ｂ２」）は、集合管系由来の一部の上皮細胞を含み得る。１つ以上の尿細管細胞マーカーを発現する細胞を富化した細胞集団（すなわち「Ｂ２」）は、相対的に、ＥＰＯ産生細胞、糸球体細胞、および血管細胞が枯渇しているが、富化集団は、出発集団に比べてより小さな割合のこれらの細胞（ＥＰＯ産生、糸球体、および血管細胞）を含み得る。一般的に、異種起源の細胞集団は、１つ以上の細胞型が枯渇し、その結果、枯渇細胞集団は、枯渇前の異種起源の細胞集団に含まれる細胞型の割合に比較して、より小さい割合の細胞型を含む。枯渇する可能性のある細胞型は、腎臓細胞のいずれの型でもあり得る。例えば、特定の実施形態では、枯渇する可能性のある細胞型には、大きな粒度の集合管および尿細管系を有する細胞が含まれ、これは、密度が約１．０４５ｇ／ｍｌ未満で、「Ｂ１」と呼ばれる。他の特定の実施形態では、枯渇する可能性のある細胞型には、低粒度および低生存率の壊死組織片および小細胞が含まれ、密度は約１．０９５ｇ／ｍｌ超で、「Ｂ５」と呼ばれる。いくつかの実施形態では、尿細管細胞を富化した細胞集団は、相対的に次の全てが枯渇している：「Ｂ１」、「Ｂ５」、酸素で調節可能なＥＰＯ発現細胞、糸球体細胞、および血管細胞。
【００２４】
本明細書で使用される用語の「低酸素性の」培養条件は、細胞が大気酸素レベル（約２１％）で培養される標準的培養条件に比較して、細胞が培養系で利用可能な酸素レベルの低下にさらされる培養条件を指す。非低酸素性条件は、本明細書では、正常、または正常酸素圧培養条件と呼ばれる。
【００２５】
本明細書で使用される用語の「酸素で調節可能な」は、細胞に利用可能な酸素量に基づいて、遺伝子発現を調節（上昇または低下）する細胞の能力を指す。「低酸素誘導可能」は、酸素圧力の減少に応答した遺伝子発現上昇を指す（前誘導または出発酸素圧力にかかわらず）。
【００２６】
本明細書で使われる用語の「生体材料」は、生きている組織中への導入に適した天然または合成生体適合性材料を指す。天然生体材料は、生体系により作られるか、またはそれ由来材料である。合成生体材料は、生体系では作られない材料であるか、またはそれ由来でない材料である。本明細書で開示の生体材料は、天然および合成生体適合性材料の組み合わせであってもよい。本明細書で使用される生体材料には、例えば、高分子マトリックスおよび足場が含まれる。当業者には、生体材料は、例えば、多孔性発泡体、ゲル、液体、 ビーズ, 固体のような種々の形態に作られてもよく、１つ以上の天然または合成生体適合性材料を含んでもよいことは理解されるであろう。一実施形態では、生体用材料は、ヒドロゲルになりうる溶液の形態である。
【００２７】
「調節放出（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ）」という用語、または徐放（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ）」、「遅延放出（ｄｅｌａｙｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ）」、または「持続放出（ｓｌｏｗ  ｒｅｌｅａｓｅ）」という同等語は、投与後に時間をかけて、または１つの時点より多くの時点で、生理活性細胞等の活性薬剤を個体に対し放出する製剤を意味する。所望の時間範囲にわたって、例えば、分、時間、週、または製剤に応じてさらに長期間にわたって起こる活性薬剤の調節放出は、実質的に全体投与単位が投与直後に利用できる標準的製剤と対照をなす。組織工学および再生医療への応用のために好ましい放出調節製剤は、局所投与（例えば、活性薬剤の固体臓器への直接投与）後に、複数の時点で活性薬剤の放出を行う。例えば、生理活性細胞の放出調節製剤は、投与の時間後直ちに初期細胞放出を行い、次に、後の時間に第２の細胞放出を行ない得る。初期投与後の、第２の活性薬剤のための放出時間の遅延は、分単位、時間単位、または日単位の長さであり得る。一般的に、放出遅延の期間は、活性薬剤の生体用材料担体が構造健全性を失うまでに要する期間に対応する。活性薬剤の遅延放出は、この健全性が低下し始めるにときに始まり、健全性が完全に損なわれる時間までに完結する。当業者なら、他の適切な放出機序を理解するであろう。
【００２８】
本明細書で使用される用語の「貧血」は、対象のＥＰＯ産生細胞による機能性ＥＰＯタンパク質の不適切は産生、および／または全身循環へのＥＰＯタンパク質の不適切放出、および／または骨髄中の赤芽球がＥＰＯタンパク質に反応できないこと、による赤血球数および／またはヘモグロビンレベルの不足を指す。貧血の対象は、赤血球恒常性を維持できない。一般的に、腎臓機能の低下または喪失（例えば、慢性腎不全）による貧血、相対的ＥＰＯ欠乏に関連した貧血、うっ血性心不全に関連した貧血、化学療法または抗ウイルス療法（例えば、ＡＺＴ）等の骨髄抑制療法に関連した貧血、非骨髄性癌に関連した貧血、ＨＩＶ等のウイルス性感染症に関連した貧血、および自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ）、肝臓疾患、および多相器系不全等の慢性疾患の貧血が発生しうる。
【００２９】
「ＥＰＯ欠乏」という用語は、貧血を含む、エリスロポエチン受容体アゴニスト（例えば、組換え型ＥＰＯまたはＥＰＯ類似体）で治療可能な任意の状態または障害を指す。
【００３０】
本明細書で使われる用語の「臓器関連疾患」は、臓器の機能の実行能力の低下をもたらす、急性または慢性臓器不全のいずれかの段階または程度に関連する障害を意味する。
【００３１】
本明細書で使用される用語の「腎疾患」は、腎臓の血液濾過および血液からの過剰体液、電解質、および廃棄物の除去機能の実行能力の低減を生ずる急性または慢性腎不全の任意の段階または程度に関連した障害を指す。腎疾患は、また内分泌機能異常、例えば、貧血（エリスロポエチン欠乏）、およびミネラル不均衡（ビタミンＤ欠乏）を含む。腎疾患は、腎臓が起源であるか、または心不全、高血圧症、糖尿病、自己免疫疾患、または肝臓疾患（これらに限定されない）を含む種々の状態に続発することもありうる。腎疾患は、腎臓に対する急性傷害後に発生する慢性腎不全の状態でありうる。例えば、虚血および／または毒物への暴露による腎臓に対する障害が、急性腎不全を引き起こす可能性がある；急性腎傷害後の不完全回復が慢性腎不全の発生をもたらす可能性がある。
【００３２】
「処置」という用語は、腎疾患、貧血、ＥＰＯ欠乏、尿細管輸送機能欠損、または糸球体濾過機能低下に対する治療の処置および予防または防止手段の両方を指す。この場合、目的は、標的の障害を逆戻りさせるか、防ぐか、または減速させる（小さくする）ことである。処置を必要としている人には、既に、腎疾患、貧血、ＥＰＯ欠乏、尿細管輸送機能欠損、または糸球体濾過機能低下に罹患している人、ならびに腎疾患、貧血、ＥＰＯ欠乏、尿細管輸送機能欠損、または糸球体濾過機能低下になりそうな人、または腎疾患、貧血、ＥＰＯ欠乏、尿細管輸送機能欠損、または糸球体濾過機能低下を予防すべき人が含まれる。本明細書で使用される用語の「処置」は、腎臓機能の安定化および／または改善を含む。
【００３３】
本明細書で使用される用語の「インビボで接触」は、細胞富化集団による分泌産物および天然の臓器の間のインビボ直接接触を意味する。例えば、腎臓細胞富化集団（または腎臓細胞／腎臓細胞画分を含む混合物または構築物）により分泌された産物は、天然の腎臓にインビボで接触できる。直接インビボ接触は、パラクリン、内分泌、またはジャクスタクラインの性質であり得る。分泌された産物は、本明細書記載の異なる産物の異種起源の集団であってもよい。
【００３４】
本明細書で使用される用語の「リボ核酸」または「ＲＮＡ」は、ヌクレオチドユニットの鎖であり、各ユニットが、窒素性塩基、リボース糖、およびリン酸塩で構築されているものを指す。ＲＮＡは、単鎖型でも二重鎖型でもよい。ＲＮＡは、小胞の一部であっても、小胞内に存在しても、または小胞に関連するものでもよい。小胞は、エキソソームであり得る。ＲＮＡには、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、小型ＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、および非コードＲＮＡが含まれるがこれらに限定されない。ＲＮＡは、ヒトＲＮＡが好ましい。
【００３５】
「構築物」という用語は、１つ以上の合成または天然生体適合性材料から作られた足場またはマトリックスの表面上またはその中に堆積された１つ以上の細胞集団を指す。１つ以上の細胞集団は、１つ以上の合成または天然生体適合性生体材料、高分子、タンパク質、またはペプチドから作られた生体材料でコートするか、その上に堆積させるか、その中に包埋するか、それに付着させるか、またはその中に封入してもよい。１つ以上の細胞集団は、生体材料または足場もしくはマトリックスとインビトロまたはインビボで組み合わせてもよい。一般的に、足場／生体材料を形成するために使用される１つ以上の生体適合性材料は、少なくとも１つの堆積した細胞集団の多細胞３次元組織化を進行させるか、促進するか、または許容するように選択される。構築物を生成するのに使用される１つ以上の生体材料は、構築物または構築物の細胞成分の、内在の宿主組織との分散および／または一体化を進行させるか、促進するか、もしくは許容するか、または構築物もしくは構築物の細胞成分の生存、生着、耐性、もしくは機能的性能を進行させるか、促進するか、もしく許容するように選択できる。
【００３６】
「マーカー」または「バイオマーカー」という用語は、通常、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、炭水化物、または糖脂質ベース分子マーカーを指し、培養した細胞集団中でのそれらの発現または存在は、標準的な方法（または本明細書で開示の方法）により検出可能で、特定の細胞型である培養した細胞集団中の１つ以上の細胞と一致する。マーカーは、細胞により発現されたポリペプチドまたは特定可能な染色体上の物理的位置、例えば、遺伝子、制限エンドヌクレアーゼ認識部位または天然の細胞により発現されるポリペプチドをコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ）であり得る。マーカーは、「遺伝子発現マーカー」と呼ばれる遺伝子の発現領域、または既知のコード機能のない一部のＤＮＡセグメントであり得る。バイオマーカーは、細胞由来の産物、例えば、分泌産物であってもよい。
【００３７】
「差異発現遺伝子」、「差異遺伝子発現」という用語およびそれらの同義語は、同義に使用され、第１細胞または細胞集団の発現が、第２細胞または細胞集団のその発現に比べて、より高いまたはより低いレベルに活性化された遺伝子を指す。この用語は、また、第１または第２細胞の継代培養時間の間の異なる段階で、より高いまたはより低いレベルに活性化された遺伝子を含む。また、差異発現遺伝子は、核酸レベルまたはタンパク質レベルで活性化もしくは阻害されてもよく、または選択的スプライシングに供され、異なるポリペプチド産物を生じてもよいことは理解されよう。このような差異は、例えば、ｍＲＮＡレベルの変化、表面発現、分泌またはポリペプチドのその他の区分け手法により立証できる。差異遺伝子発現には、２つ以上の遺伝子もしくはそれらの遺伝子産物間の比較、または２つ以上の遺伝子もしくはそれらの遺伝子産物間の発現比率の比較、またはさらに第１細胞と第２細胞の間で異なる別々に処理された２つの同じ遺伝子の産物の比較を含んでもよい。差異発現には、例えば、第１細胞および第２細胞中の遺伝子またはその発現産物の時間的または細胞発現パターンにおける定量的、ならびに定性的差異の両方が含まれる。本発明の目的としては、第１細胞と第２細胞の間の所与の遺伝子の発現の差異がある場合に、「差異遺伝子発現」が存在するとされる。マーカーの差異発現は、投与後の患者由来の細胞（第２細胞）中の発現に比べて、細胞集団、混合物、または構築物（第１細胞）の投与前の患者由来の細胞中に存在し得る。
【００３８】
「阻害する」、「下方制御する」、「過小発現する」および「減らす」という用語は同義に使われ、遺伝子の発現、またはＲＮＡ分子もしくは１つ以上のタンパク質またはタンパク質サブユニットをコードする等価ＲＮＡ分子のレベル、または１つ以上のタンパク質またはタンパク質サブユニットの活性が、１つ以上の対照、例えば、１つ以上の陽性および／または陰性対照に比べて低減することを意味する。過小発現は、投与後の患者由来の細胞に比べて、細胞集団、混合物、または構築物の投与前の患者由来の細胞中に存在し得る。
【００３９】
「上方制御する」または「過剰発現する」という用語は、遺伝子の発現、またはＲＮＡ分子もしくは１つ以上のタンパク質またはタンパク質サブユニットをコードする等価ＲＮＡ分子のレベル、または１つ以上のタンパク質もしくはタンパク質サブユニットの活性が、１つ以上の対照、例えば、１つ以上の陽性および／または陰性対照に比べて高められていることの意味に使用される。過剰発現は、投与前の患者由来の細胞に比べて、細胞集団、混合物、または構築物の投与後の患者由来の細胞中に存在し得る。
【００４０】
「対象」という用語は、腎疾患、貧血、またはＥＰＯ欠乏等の器官に関連する疾患の１つ以上の徴候、症状、または他の指標を経験しているか、または経験したことがある、治療適格患者を含む、任意の個々のヒトの対象を意味する。そのような対象には、限定されないが、腎疾患、貧血、またはＥＰＯ欠乏を新規に診断された、または以前に診断されたか、および現在これらの再発または再燃を経験しているか、またはこれらに罹患のリスクがある対象が、理由がなんであれ、含まれる。対象は、腎疾患等の臓器関連疾患、貧血、またはＥＰＯ欠乏の治療を以前行っていても、また、そうでなくてもよい。
【００４１】
「患者」という用語は、任意の個々の動物、より好ましくは、治療が必要な哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウサギ、動物園の動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、および非ヒト霊長類、等の非ヒト動物を含む）を指す。本明細書の患者は、ヒトが最も好ましい。
【００４２】
「試料」または「患者試料」または「生物試料」は、通常、対象または患者、体液、体組織、細胞株、組織培養物、または他の源から採取した任意の生物試料を意味するものとする。この用語は、組織生検、例えば、腎生検を含む。この用語は、培養細胞、例えば、培養された哺乳類の腎臓細胞を含む。哺乳動物から組織生検および培養細胞を得る方法は、当技術分野でよく知られている。用語の「試料」が単独で使用される場合、「試料」は、依然として「生物試料」または「患者試料」を意味するものとし、すなわち、これらの用語は、同義に使用される。
【００４３】
「試験試料」という用語は、本発明の方法で処置された対象由来の試料を指す。この試験試料は、限定されないが、血液、精液、血清、尿、骨髄、粘膜、組織、等を含む哺乳類対象の種々のソース由来であり得る。
【００４４】
「対照」または「対照試料」という用語は、陰性または陽性の結果により、試験試料の結果の相関付けを支援することが期待される陰性または陽性対照を指す。本発明に適する対照には、限定されないが、正常な赤血球恒常性の指標特性を示すことが解っている試料、貧血の指標特性を示すことが解っている試料、貧血でないことが解っている対象から採取した試料、および貧血であると解っている対象から採取した試料が含まれる。本発明の方法に使用可能なさらなる対照には、限定されないが、赤血球生成を調節すると解っている薬剤（例えば、組換え型ＥＰＯまたはＥＰＯ類似体）で処置されたことがある対象由来の試料が含まれる。さらに、対照は、本発明の方法により処置される前に対象から採取した試料であってもよい。追加の適する対照は、いずれかの型または段階の腎疾患であると解っている対象から採取した試験試料、およびいずれの型または段階の腎疾患でもないことが解っている対象から採取した試料であってもよい。対照は、正常で健康な対応付けられた対照であってもよい。当業者なら、本発明での使用に適した他の対照が解るであろう。
【００４５】
「再生予後（Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）」、「再生予後（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）」、または「再生予後（ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｆｏｒ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）」は、通常、本明細書記載の細胞集団、混合物または構築物の投与または移植の可能な再生経過または転帰の予見または予測を指す。予後に対して、予見または予測は、以下のうちの１つ以上により知ることができる：移植または投与後の、機能する臓器（例えば腎臓）の改善、移植または投与後の機能する腎臓の発生、移植または投与後の改善腎臓機能または能力の発生、および移植または投与後の天然の腎臓による、ある特定のマーカーの発現。
【００４６】
「再生臓器」は、本明細書記載の細胞集団、混合物、または構築物の移植または投与後の天然の臓器を指す。再生臓器は、限定されないが、天然の臓器中の機能または能力の発生、天然の臓器中の機能または能力の改善、および天然の臓器中のある特定のマーカーの発現、等の種々の指標を特徴とする。当業者なら、他の指標も再生臓器を特徴付けのに適する可能性があることを理解するであろう。
【００４７】
「再生腎臓」は、本明細書記載の細胞集団、混合物、または構築物の移植または投与後の天然の腎臓を指す。再生腎臓は、限定されないが、天然の腎臓中の機能または能力の発生、天然の腎臓中の機能または能力の改善、および天然の腎臓中のある特定のマーカーの発現、を含む種々の指標を特徴とする。当業者なら、他の指標が、再生腎臓を特徴付けるのに適切である可能性があることを理解するであろう。
【００４８】
「細胞凝集体」または「スフェロイド」という用語は、単層として増殖するのではなく、３Ｄ増殖を可能とする、培養された細胞の凝集体または構築物を指す。「スフェロイド」という用語は、凝集体が幾何学的な球であることを含意しないことに留意されたい。凝集体は、明確に定義された形態を有し高度に組織化され得、または組織化されていない塊であり得る。また、それはただ１つの細胞型であっても、２つ以上の細胞型を含んでもよい。細胞は、初代単離物でも、または永久細胞株でも、またはこれらの組み合わせでもよい。オルガノイドおよび器官型培養物が、この定義に含まれる。
【００４９】
「外界温度」という用語は、本発明の製剤が対象に投与される温度を指す。一般的に、外界温度は、温度制御された環境の温度である。外界温度は、約１８℃〜約３０℃の範囲である。一実施形態では、外界温度は、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、または約３０℃である。
【００５０】
２．細胞集団
本発明の製剤は、腎疾患の処置に使用するために、すなわち、腎臓機能の安定化および／または改善および／または再生を提供するために、特異的生理活性成分または細胞型を富化した、および／または特異的不活性または望ましくない成分または細胞型を枯渇させた異種起源の単離腎臓細胞集団、およびそれらの混合物を含んでもよく、以前に、ｒｅｓｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．米国特許公開第２０１１−０１１７１６２号およびＩｌａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７号に記載された。これらの特許の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。製剤は、健康な個体に比べて、細胞成分を欠くが、依然として、治療特性を保持している、すなわち、腎臓機能の安定化および／または改善および／または再生を行える単離腎臓細胞画分を含み得る。本明細書記載の細胞集団、細胞画分、および／または細胞の混合物は、健康な個体、腎疾患の個体、または本明細書記載の対象由来であり得る。
【００５１】
本明細書記載の発明が提供する製剤は、限定されないが、単離細胞集団、細胞画分、混合物、富化細胞集団、細胞凝集体、およびこれらの任意の組み合わせを含む種々の生理活性細胞集団の使用に適する。一実施形態では、生理活性細胞集団は、生理活性腎臓細胞である。
【００５２】
生理活性細胞集団
本発明は、必要としている対象の標的臓器または組織に投与される生理活性細胞集団に適する治療製剤を意図している。生理活性細胞集団は、通常、対象への投与に際し、治療特性を有する可能性を有する細胞集団を意味する。例えば、必要としている対象への投与時に、生理活性腎臓細胞集団は、対象の腎臓機能の安定化および／または改善および／または再生を提供できる。治療特性は、再生効果を含み得る。
【００５３】
生理活性細胞集団には、限定されないが、胚性幹細胞、羊水幹細胞、成人幹細胞（例えば、造血、乳腺、腸、間葉、胎盤、肺、骨髄、血液、臍帯、内皮、歯髄、脂肪、神経、嗅覚、神経堤、精巣）、誘導多能性幹細胞；遺伝的改変細胞；ならびに身体の任意の源由来の細胞集団または組織外植片、等の幹細胞（例えば、多能性、多分化能、寡能性、または単能性）が含まれる。本発明の製剤は、また、２０１１年６月９日出願のＢａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１１／３９８５９号に記載の腎臓脂肪由来細胞集団；およびＬｕｄｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．米国特許公開第２０１０−０１３１０７５号および２０１１年５月３日出願のＬｕｄｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１１／３５０５８号に記載の脂肪由来もしくは末梢血由来平滑筋細胞；またはＡｔａｌａ、米国特許第６，５７６，０１９号に記載の膀胱由来尿路上皮もしくは平滑筋細胞と一緒に使用することができる。これらの特許は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。生理活性細胞集団は、単離、富化、精製され、均質または異種起源の性質を有し得る。当業者なら、本発明の製剤での使用に適した他の生理活性細胞集団を理解するであろう。
【００５４】
一実施形態では、細胞の源は、意図している標的臓器または組織と同じである。例えば、腎臓細胞は、製剤の投与を受ける腎臓から入手できる。別の実施形態では、細胞の源は、意図している標的臓器または組織と同じでない。例えば、エリスロポエチン発現細胞は、製剤の投与を受ける腎臓の腎臓脂肪から入手できる。
【００５５】
一態様では、本発明は、生理活性成分を富化させ、不活性または望ましくない成分を枯渇させた異種起源の腎臓細胞集団の特定の亜画分を含む製剤を提供し、出発集団より優れた治療および再生結果を与える。例えば、本明細書記載の生理活性腎臓細胞、例えば、不活性または望ましくない成分、例えば、Ｂ１およびＢ５が枯渇しているＢ２、Ｂ４、およびＢ３は、単独または混合して、腎臓機能の安定化および／または改善および／または再生のために使用される製剤の一部となりうる。
【００５６】
別の態様では、製剤は、単独で、または他の生理活性亜画分、例えば、Ｂ２および／またはＢ３と混合した場合、治療特性、例えば、腎臓機能の安定化および／または改善および／または再生特性を保持している１つ以上の細胞型、例えば、血管、内分泌、または内皮細胞型が枯渇または不足している特異的亜画分であるＢ４、すなわち、Ｂ４’を含む。好ましい実施形態では、生理活性細胞集団はＢ２ある。ある特定の実施形態では、Ｂ２細胞集団は、Ｂ４またはＢ４’と混合される。他の実施形態では、Ｂ２細胞集団は、Ｂ３と混合される。他の実施形態では、Ｂ２細胞集団は、Ｂ３とＢ４の両方、またはＢ３および／またはＢ４の特定細胞成分と混合される。
【００５７】
Ｂ２細胞集団は、下記のうちの１つ以上からなる群より選択される尿細管細胞マーカーの発現を特徴とする：メガリン、キュビリン、ヒアルロン酸シンターゼ２（ＨＡＳ２）、ビタミンＤ３  ２５−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ２Ｄ２５）、Ｎ−カドヘリン（Ｎｃａｄ）、Ｅ−カドヘリン（Ｅｃａｄ）、アクアポリン−１（Ａｑｐ１）、アクアポリン−２（Ａｑｐ２）、ＲＡＢ１７、メンバーＲＡＳ癌遺伝子ファミリー（Ｒａｂ１７）、ＧＡＴＡ結合タンパク質３（Ｇａｔａ３）、ＦＸＹＤドメイン含有イオン輸送制御因子４（Ｆｘｙｄ４）、溶質担体ファミリー９（ナトリウム／水素交換体）、メンバー４（Ｓｌｃ９ａ４）、アルデヒド脱水素酵素３ファミリー、メンバーＢ１（Ａｌｄｈ３ｂ１）、アルデヒド脱水素酵素１ファミリー、メンバーＡ３（Ａｌｄｈ１ａ３）、およびカルパイン−８（Ｃａｐｎ８）、ならびに集合管マーカーアクアポリン−４（Ａｑｐ４）。Ｂ２は、Ｂ３および／またはＢ４より大きく、より粒状化しており、従って、約１．０４５ｇ／ｍｌ〜約１．０６３ｇ／ｍｌ（げっ歯類）、約１．０４５ｇ／ｍｌ〜１．０５２ｇ／ｍｌ（ヒト）、および約１．０４５ｇ／ｍｌ〜約１．０５８ｇ／ｍｌ（イヌの）の浮遊密度を有する。
【００５８】
Ｂ３細胞集団は、一部のＥＰＯ産生細胞を伴ったＢ２とＢ４に比べて中間的サイズと粒度の血管、糸球体および近位の尿細管マーカーの発現を特徴とする。従って、約１．０６３ｇ／ｍｌ〜約１．０７３ｇ／ｍｌ（げっ歯類）、約１．０５２ｇ／ｍｌ〜約１．０６３ｇ／ｍｌ（ヒト）、および約１．０５８ｇ／ｍｌ〜約１．０６３ｇ／ｍｌ（イヌの）の浮遊密度を有する。Ｂ３は、下記のうちの１つ以上からなる群より選択されるマーカーの発現を特徴とする：アクアポリン７（Ａｑｐ７）、ＦＸＹＤドメイン含有イオン輸送制御因子２（Ｆｘｙｄ２）、溶質担体ファミリー１７（リン酸ナトリウム）、メンバー３（Ｓｌｃ１７ａ３）、溶質担体ファミリー３、メンバー１（Ｓｌｃ３ａ１）、クローディン２（Ｃｌｄｎ２）、ナプシンＡアスパラギン酸ペプチダーゼ（Ｎａｐｓａ）、溶質担体ファミリー２（促進性ブドウ糖輸送体）、メンバー２（Ｓｌｃ２ａ２）、アラニル（膜）アミノペプチダーゼ（Ａｎｐｅｐ）、膜貫通タンパク質２７（Ｔｍｅｍ２７）、アシルＣｏＡシンテターゼ中等度鎖ファミリーメンバー２（Ａｃｓｍ２）、グルタチオンペルオキシダーゼ３（Ｇｐｘ３）、果糖−１、６−ビホスファターゼ１（Ｆｂｐ１）、およびアラニン−グリオキシル酸アミノ基転移酵素２（Ａｇｘｔ２）。Ｂ３は、また、血管発現マーカーである血小板内皮細胞接着分子（Ｐｅｃａｍ）および糸球体発現マーカーであるポドシン（Ｐｏｄｎ）を特徴とする。
【００５９】
Ｂ４細胞集団は、ＰＥＣＡＭ、ＶＥＧＦ、ＫＤＲ、ＨＩＦ１ａ、ＣＤ３１、ＣＤ１４６のうちの１つ以上を含む血管マーカーセットの発現；ポドシン（Ｐｏｄｎ）、およびネフリン（Ｎｅｐｈ）の内の１つ以上を含む糸球体マーカーセットの発現；ならびに未分画（ＵＮＦＸ）、Ｂ２およびＢ３に比較して、酸素で調節可能なＥＰＯ富化集団、を特徴とする。Ｂ４は、また、下記のうちの１つ以上のマーカーの発現を特徴とする：ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体４（Ｃｘｃｒ４）、エンドセリン受容体Ｂ型（Ｅｄｎｒｂ）、コラーゲン、Ｖ型、アルファ２（Ｃｏｌ５ａ２）、カドヘリン５（Ｃｄｈ５）、プラスミノーゲン活性化因子、組織（Ｐｌａｔ）、アンジオポエチン２（Ａｎｇｐｔ２）、キナーゼ挿入ドメインタンパク質受容体（Ｋｄｒ）、分泌タンパク質、酸性の、システインリッチ（オステオネクチン）（Ｓｐａｒｃ）、セルグリシン（Ｓｒｇｎ）、ＴＩＭＰメタロペプチダーゼ阻害剤３（Ｔｉｍｐ３）、ウイルムス腫瘍１（Ｗｔ１）、ウィングレス型ＭＭＴＶ統合部位ファミリー、メンバー４（Ｗｎｔ４）、Ｇ−タンパク質シグナル伝達制御因子４（Ｒｇｓ４）、血小板内皮細胞接着分子（Ｐｅｃａｍ）、およびエリスロポエチン（Ｅｐｏ）。Ｂ４は、また、Ｂ２またはＢ３に比較して、より小さい、より少ない粒状化細胞を特徴とし、約１．０７３ｇ／ｍｌ〜約１．０９１ｇ／ｍｌ（げっ歯類）、約１．０６３ｇ／ｍｌ〜約１．０９１ｇ／ｍＬ（ヒトおよびイヌ）の浮遊密度を有する。 
【００６０】
Ｂ４’細胞集団は、１．０６３ｇ／ｍＬ〜１．０９１ｇ／ｍＬの浮遊密度を有し、下記うちの１つ以上のマーカーを発現するとして定義される：ＰＥＣＡＭ、ｖＥＧＦ、ＫＤＲ、ＨＩＦ１ａ、ポドシン、ネフリン、ＥＰＯ、ＣＫ７、ＣＫ８／１８／１９。一実施形態では、Ｂ４’細胞集団は、ＰＥＣＡＭ、ｖＥＧＦ、ＫＤＲ、ＨＩＦ１ａ、ＣＤ３１、ＣＤ１４６の内の１つ以上を含む血管マーカーセットを発現することを特徴とする。別の実施形態では、Ｂ４’細胞集団は、内分泌マーカーであるＥＰＯの発現を特徴とする。一実施形態では、Ｂ４’細胞集団は、ポドシン（Ｐｏｄｎ）、およびネフリン（Ｎｅｐｈ）の内の１つ以上を含む糸球体マーカーセットの発現を特徴とする。特定の実施形態では、Ｂ４’細胞集団は、ＰＥＣＡＭ、ｖＥＧＦ、ＫＤＲ、ＨＩＦ１ａの内の１つ以上を含む血管マーカーセットの発現、および内分泌マーカーであるＥＰＯの発現を特徴とする。別の実施形態では、Ｂ４’は、また、Ｂ２またはＢ３に比べて、より小さい、より少ない粒状化細胞を特徴とし、約１．０７３ｇ／ｍｌ〜約１．０９１ｇ／ｍｌ（げっ歯類）、約１．０６３ｇ／ｍｌ〜約１．０９１ｇ／ｍＬ（ヒトおよびイヌの）の浮遊密度を有する。
【００６１】
一態様では、本発明は、１．０６３ｇ／ｍＬ〜１．０９１ｇ／ｍＬの密度の、エリスロポエチン（ＥＰＯ）産生細胞、血管細胞、および糸球体細胞のうちの少なくとも１つを含む単離された、ヒト腎臓細胞富化Ｂ４’集団を含む製剤を提供する。一実施形態では、Ｂ４’細胞集団は、血管マーカーの発現を特徴とする。ある特定の実施形態では、Ｂ４’細胞集団は、糸球体マーカーの発現を特徴としない。いくつかの実施形態では、Ｂ４’細胞集団は、酸素で調節可能なエリスロポエチン（ＥＰＯ）発現が可能である。
【００６２】
一実施形態では、製剤は、Ｂ４’細胞集団を含むが、尿細管細胞を含む１．０４５ｇ／ｍＬ〜１．０５２ｇ／ｍＬの密度のＢ２細胞集団を含まない。別の実施形態では、Ｂ４’細胞集団製剤は、集合管および尿細管系のより大きな粒状化細胞を含む１．０４５ｇ／ｍｌ未満の密度のＢ１細胞集団を含まない。さらに別の実施形態では、Ｂ４’細胞集団製剤は、低粒度および低生存率の壊死組織片および小細胞を含む１．０９１ｇ／ｍｌ超の密度のＢ５細胞集団を含まない。
【００６３】
一実施形態では、Ｂ４’細胞集団含有製剤は、尿細管細胞を含む１．０４５ｇ／ｍＬ〜１．０５２ｇ／ｍＬの密度のＢ２細胞集団；集合管および尿細管系のより大きな粒状化細胞を含む１．０４５ｇ／ｍｌ未満の密度のＢ１細胞集団；および低粒度および低生存率の壊死組織片および小細胞を含む１．０９１ｇ／ｍｌ超の密度のＢ５細胞集団を含まない。いくつかの実施形態では、Ｂ４’細胞集団は、腎疾患の対象由来であってもよい。
【００６４】
一態様では、本発明は、単離された、尿細管細胞富化集団を含む１．０４５ｇ／ｍＬ〜１．０５２ｇ／ｍＬの密度の第１細胞集団、Ｂ２、およびエリスロポエチン（ＥＰＯ）産生細胞および血管細胞を含むが、糸球体細胞が枯渇した約１．０６３ｇ／ｍＬ〜１．０９１ｇ／ｍＬの密度の第２細胞集団、Ｂ４’を含むヒト腎臓細胞の混合物を含む製剤を提供する。この混合物は、集合管および尿細管系の１．０４５ｇ／ｍｌ未満の密度の大きな粒状化細胞を含むＢ１細胞集団、または低粒度および低生存率の壊死組織片および小細胞を含む１．０９１ｇ／ｍｌ超の密度のＢ５細胞集団を含まない。ある特定の実施形態では、Ｂ４’細胞集団は、血管マーカーの発現を特徴とする。一実施形態では、Ｂ４’細胞集団は、糸球体マーカーの発現を特徴としない。ある特定の実施形態では、Ｂ２は、集合管上皮細胞をさらに含む。一実施形態では、製剤は、受容体媒介アルブミンの取込が可能な細胞の混合物を含む。別の実施形態では、細胞の混合物は、酸素で調節可能なエリスロポエチン（ＥＰＯ）発現が可能である。一実施形態では、混合物は、インビトロおよびインビボの両方で、ヒアルロン酸（ＨＡ）の高分子量種の産生可能な、および／または産生を刺激可能なＨＡＳ−２発現細胞を含む。全ての実施形態で、第１および第２細胞集団は、腎組織または培養腎臓細胞由来であってもよい（Ｂａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｌｉｐｉｄｓ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ、２０１１、１０：１７１）。
【００６５】
一実施形態では、製剤は、インビボ送達時に再生刺激を与えることができる混合物を含む。他の実施形態では、混合物は、インビボ送達時に、糸球体濾過、尿細管再吸収、尿産生、および／または内分泌機能の低下を減らし、これらを安定化し、または改善することができる。一実施形態では、Ｂ４’細胞集団は、腎疾患の対象由来である。
【００６６】
一態様では、本発明は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）産生細胞、血管細胞、および糸球体細胞の内の少なくとも１つを含む１．０６３ｇ／ｍＬ〜１．０９１ｇ／ｍＬの密度の単離された、ヒト腎臓細胞富化Ｂ４’集団を含む製剤を提供する。一実施形態では、Ｂ４’細胞集団は、血管マーカーの発現を特徴とする。特定の実施形態では、Ｂ４’細胞集団は、糸球体マーカーの発現を特徴としない。発現しない糸球体マーカーは、ポドシンであってもよい（実施例７参照）。いくつかの実施形態では、Ｂ４’細胞集団は、酸素で調節可能なエリスロポエチン（ＥＰＯ）発現が可能である。
【００６７】
一実施形態では、Ｂ４’細胞集団含有製剤は、１．０４５ｇ／ｍＬ〜１．０５２ｇ／ｍＬの密度の尿細管細胞含有Ｂ２細胞集団を含まない。別の実施形態では、Ｂ４’細胞集団製剤は、集合管および尿細管系の大きな粒状化細胞を含む１．０４５ｇ／ｍｌ未満の密度のＢ１細胞集団を含まない。さらに別の実施形態では、Ｂ４’細胞集団製剤は、低粒度および低生存率の壊死組織片および小細胞を含む１．０９１ｇ／ｍｌ超の密度のＢ５細胞集団を含まない。
【００６８】
一実施形態では、Ｂ４’細胞集団含有製剤は、尿細管細胞を含む１．０４５ｇ／ｍＬ〜１．０５２ｇ／ｍＬの密度のＢ２細胞集団；集合管および尿細管系の大きな粒状化細胞を含む１．０４５ｇ／ｍｌ未満の密度のＢ１細胞集団；および低粒度および低生存率の壊死組織片および小細胞を含む１．０９１ｇ／ｍｌ超の密度のＢ５細胞集団を含まない。いくつかの実施形態では、Ｂ４’細胞集団は、腎疾患の対象由来であってもよい。
【００６９】
一態様では、本発明は、単離された、尿細管細胞富化集団を含む１．０４５ｇ／ｍＬ〜１．０５２ｇ／ｍＬの密度の第１細胞集団、Ｂ２、およびエリスロポエチン（ＥＰＯ）産生細胞および血管細胞を含むが、糸球体細胞が枯渇している約１．０６３ｇ／ｍＬ〜１．０９１ｇ／ｍＬの密度の第２細胞集団、Ｂ４’を含むヒト腎臓細胞の混合物を含む製剤を提供する。この混合物は、集合管および尿細管系の大きな粒状化細胞を含む１．０４５ｇ／ｍｌ未満の密度のＢ１細胞集団、または低粒度および低生存率の壊死組織片および小細胞を含む１．０９１ｇ／ｍｌ超の密度のＢ５細胞集団を含まない。ある特定の実施形態では、Ｂ４’細胞集団は、血管マーカーの発現を特徴とする。一実施形態では、Ｂ４’細胞集団は、糸球体のマーカーの発現を特徴としない。特定の実施形態では、Ｂ２は、集合管上皮細胞をさらに含む。一実施形態では、細胞の混合物は、受容体媒介アルブミン取込が可能である。別の実施形態では、細胞の混合物は、酸素で調節可能なエリスロポエチン（ＥＰＯ）発現が可能である。一実施形態では、混合物は、インビトロおよびインビボの両方で、ヒアルロン酸（ＨＡ）の高分子量種の産生および／または産生の刺激が可能なＨＡＳ−２発現細胞を含む。全ての実施形態で、第１および第２細胞集団は、腎組織または培養腎臓細胞由来であってもよい。
【００７０】
別の態様では、本発明は、細胞画分または富化細胞集団（例えば、Ｂｌ、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４（またはＢ４’）、およびＢ５）の組み合わせを含む異種起源腎臓細胞集団を含む製剤を提供する。一実施形態では、組み合わせは、約１．０４５ｇ／ｍｌ〜約１．０９１ｇ／ｍｌの浮遊密度を有する。他の一実施形態では、組み合わせは、約１．０４５ｇ／ｍｌ未満〜約１．０９９ｇ／ｍｌまたは約１．１００ｇ／ｍｌの浮遊密度を有する。別の実施形態では、組み合わせは、密度勾配を使った分離、例えば、遠心分離により決定される浮遊密度を有する。さらに別の実施形態では、細胞画分の組み合わせは、Ｂ１および／またはＢ５が枯渇したＢ２、Ｂ３、およびＢ４（またはＢ４’）を含む。いくつかの実施形態では、細胞画分の組み合わせは、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４（またはＢ４’）、およびＢ５を含むが、Ｂ１が枯渇している。Ｂ１および／またはＢ５が枯渇するとすぐに、Ｂ２、Ｂ３、およびＢ４（またはＢ４’）細胞画分の組み合わせを含む製剤の調製の前に、その組み合わせをインビトロで培養してもよい。
【００７１】
驚いたことに、本発明の発明者は、Ｂ１の枯渇したＢ２、Ｂ３、Ｂ４、およびＢ５の組み合わせのインビトロ培養により、Ｂ５の枯渇が生じることを発見した。一実施形態では、少なくとも１、２、３、４、または５継代の後にＢ５は、枯渇する。他の一実施形態では、本明細書記載の条件下で継代されたＢ２、Ｂ３、Ｂ４、およびＢ５細胞画分の組み合わせは、継代細胞集団中の約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、または約０．５％未満の割合のＢ５を有する継代細胞集団を提供する。
【００７２】
別の実施形態では、Ｂ４’は、細胞画分の組み合わせの一部である。他の一実施形態では、インビトロ培養によるＢ５の枯渇は、低酸素性の条件下で起こる。
【００７３】
一実施形態では、製剤は、インビボ送達時に再生刺激を与えることができる混合物を含む。他の実施形態では、混合物は、インビボ送達時に、糸球体濾過、尿細管再吸収、尿産生、および／または内分泌機能の低下を減らし、これらを安定化または改善できる。一実施形態では、Ｂ４’細胞集団は、腎疾患の対象由来である。
【００７４】
好ましい実施形態では、製剤は、Ｂ２を、Ｂ３および／またはＢ４と組み合わせて含む混合物を含む。別の好ましい実施形態では、混合物は、Ｂ２を、Ｂ３および／またはＢ４’と組み合わせて含む。他の好ましい実施形態では、混合物は、（ｉ）Ｂ２をＢ３および／またはＢ４と組み合わせて；または（ｉｉ）Ｂ２をＢ３および／またはＢ４’と組み合わせて構成されるか、または基本的に構成される。
【００７５】
Ｂ４’細胞集団を含む混合物は、また、不健康対象から採取したＢ２および／またはＢ３細胞集団を含んでもよい。不健康な対象は、Ｂ４’画分が得られたのと同じ対象であってもよい。Ｂ４’細胞集団とは対照的に、不健康対象から採取したＢ２およびＢ３細胞集団は、健康な個体由来の出発腎臓細胞集団に比べて、通常、１つ以上の特定細胞型が欠如していない。
【００７６】
Ｐｒｅｓｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第２０１０／０５６３２８号に記載のように、Ｂ２細胞集団中でより特異的に富化されているマーカーであるヒアルロン酸シンターゼ−２（ＨＡＳ−２）の作用により、インビトロおよびインビボの両方で、Ｂ２およびＢ４細胞調製物が、より大きい分子量種のヒアルロン酸（ＨＡ）を発現可能であることが明らかとなった。５／６ＮｘモデルにおけるＢ２を使った処置が、強力なＨＡＳ−２インビボ発現および予期された処置組織内の高分子量ＨＡの産生に付随して、線維形成を減らすことが示された。特に、未処置で残された５／６Ｎｘモデルは、わずかのＨＡＳ−２の検出および極わずかな高分子量ＨＡの産生と共に、線維形成が生じた。理論に拘泥する意図はないが、Ｂ２により主として産生される（ある程度はＢ４による）このＨＡの抗炎症性高分子量種は、腎線維症の減少および腎臓再生の支援において、細胞調製物と相乗的に作用すると仮定される。従って、本発明は、アルロン酸含有生体材料と一緒に、本明細書記載の生理活性腎臓細胞を含む製剤を含む。移植細胞を使った直接産生または産生の刺激による再生刺激生体材料成分の提供もまた本発明で意図される。
【００７７】
一態様では、本発明は、治療を必要としている対象の腎疾患、貧血および／またはＥＰＯ欠乏の処置に使われる、単離された、異種起源のＥＰＯ産生腎臓細胞集団を含む製剤を提供する。一実施形態では、細胞集団は、腎生検由来である。別の実施形態では、細胞集団は、全腎組織由来である。もう一つの実施形態では、細胞集団は、腎生検または全腎組織から確立された哺乳類腎臓細胞のインビトロ培養物由来である。全ての実施形態で、これらの集団は、未分画細胞集団であり、また、本明細書では非富化細胞集団と呼ばれる。
【００７８】
別の態様では、本発明は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）産生腎臓細胞がさらに富化され、それにより、出発または初期細胞集団中のＥＰＯ産生細胞の割合に比較して、富化亜集団中のＥＰＯ産生細胞の割合が大きくなった単離ＥＰＯ産生腎臓細胞集団を含む製剤を提供する。一実施形態では、富化ＥＰＯ産生細胞画分は、非富化初期集団に含まれる間質性線維芽細胞および尿細管細胞に比較して、より大きな割合の間質性線維芽細胞およびより小さな割合の尿細管細胞を含む。ある特定の実施形態では、富化ＥＰＯ産生細胞画分は、非富化初期集団に含まれる糸球体細胞、血管細胞および集合管細胞に比較して、より大きな割合の糸球体細胞および血管細胞およびより小さな割合の集合管細胞を含む。このような実施形態では、これらの集団は、本明細書では、「Ｂ４」細胞集団と呼ばれる。
【００７９】
別の態様では、本発明は、１つ以上の追加の腎臓細胞集団と混合されたＥＰＯ産生腎臓細胞集団含有製剤を提供する。一実施形態では、ＥＰＯ産生細胞集団は、ＥＰＯ産生細胞を富化した第１細胞集団、例えば、Ｂ４である。別の実施形態では、ＥＰＯ産生細胞集団は、ＥＰＯ産生細胞を富化していない第１細胞集団、例えば、Ｂ２である。別の実施形態では、第１細胞集団は、第２腎臓細胞集団と混合される。いくつかの実施形態では、第２細胞集団は、尿細管細胞が富化され、これは尿細管細胞表現型の存在により示され得る。別の実施形態では、尿細管細胞表現型は、１つの尿細管細胞マーカーの存在により示され得る。別の実施形態では、尿細管細胞表現型は、１つ以上の尿細管細胞マーカーの存在により示すことができる。尿細管細胞マーカーには、限定されないが、メガリン、キュビリン、ヒアルロン酸シンターゼ２（ＨＡＳ２）、ビタミンＤ３  ２５−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ２Ｄ２５）、Ｎ−カドヘリン（Ｎｃａｄ）、Ｅ−カドヘリン（Ｅｃａｄ）、アクアポリン−１（Ａｑｐ１）、アクアポリン−２（Ａｑｐ２）、ＲＡＢ１７、メンバーＲＡＳ癌遺伝子ファミリー（Ｒａｂ１７）、ＧＡＴＡ結合タンパク質３（Ｇａｔａ３）、ＦＸＹＤドメイン含有イオン輸送制御因子４（Ｆｘｙｄ４）、溶質担体ファミリー９（ナトリウム／水素交換体）、メンバー４（Ｓｌｃ９ａ４）、アルデヒド脱水素酵素３ファミリー、メンバーＢ１（Ａｌｄｈ３ｂ１）、アルデヒド脱水素酵素１ファミリー、メンバーＡ３（Ａｌｄｈ１ａ３）、およびカルパイン−８（Ｃａｐｎ８）、が含まれる。別の実施形態では、第１細胞集団は、限定されないが、下記を含むいくつかの型の内の少なくとも１つの腎臓細胞と混合される：間質由来細胞、尿細管細胞、集合管由来細胞、糸球体由来細胞、および／または血液または脈管構造由来細胞。
【００８０】
本発明の製剤は、Ｂ２および／またはＢ３との混合物の形態の、または富化細胞集団、例えば、Ｂ２＋Ｂ３＋Ｂ４／Ｂ４’の形態のＢ４またはＢ４’ を含むＥＰＯ産生腎臓細胞集団を含んでもよい。
【００８１】
一態様では、製剤は、ＥＰＯ発現および酸素に対する生物学的応答を特徴とするＥＰＯ産生腎臓細胞集団を含み、培養系の酸素圧力の減少によりＥＰＯ発現が誘導される。一実施形態では、ＥＰＯ産生細胞集団は、ＥＰＯ産生細胞が富化される。一実施形態では、ＥＰＯ発現は、通常の雰囲気（約２１％）の利用可能酸素に比べて、利用可能な培養系の酸素レベルが減少している条件下で細胞集団を培養する場合に誘導される。一実施形態では、通常の酸素条件下で培養したＥＰＯ産生細胞に比べて、低酸素条件下で培養したＥＰＯ産生細胞は、より高いレベルのＥＰＯを発現する。一般的に、低いレベルの利用可能酸素での細胞培養（低酸素性培養条件とも呼ばれる）は、低い酸素のレベルが、通常の雰囲気レベルの利用可能酸素（正常または正常酸素圧培養条件と呼ばれる）での細胞の培養に比べて、低下していることを意味する。一実施形態では、低酸素性細胞培養条件は、１％酸素未満、約２％酸素未満、約３％酸素未満、約４％酸素未満、または約５％酸素未満で細胞を培養することを含む。別の実施形態では、正常または正常酸素圧培養条件は、約１０％酸素、約１２％酸素、約１３％酸素、約１４％酸素、約１５％酸素、約１６％酸素、約１７％酸素、約１８％酸素、約１９％酸素、約２０％酸素、または約２１％酸素で細胞を培養することを含む。
【００８２】
もう一つの別の実施形態では、約５％未満の利用可能酸素で細胞を培養し、ＥＰＯ発現レベルを大気圧（約２１％）酸素下で培養した細胞と比較することにより、ＥＰＯの発現誘導または発現増加が得られ、また、観察できる。別の実施形態では、一定期間細胞の培養が大気中酸素（約２１％）下で行われる第１培養相および利用可能酸素レベルが低減され、約５％未満の利用可能酸素下で同じ細胞が培養される第２培養相を含む方法により、ＥＰＯの誘導は、ＥＰＯを発現できる細胞の培養中に得られる。別の実施形態では、低酸素性条件に応答するＥＰＯ発現は、ＨＩＦ１αにより調節されている。当業者なら、当技術分野で既知の他の酸素操作培養条件も本明細書記載の細胞の目的に使用可能であることを理解するであろう。
【００８３】
一態様では、製剤は、灌流条件に対する生物学的応答（例えば、ＥＰＯ発現）を特徴とするＥＰＯ産生哺乳動物細胞富化集団を含む。一実施形態では、灌流条件は、一過性、間欠性、または連続の液体流動（灌流）を含む。一実施形態では、流動を介して動力を細胞に移す方式で、細胞培養用培地を間欠的にまたは連続的に循環させるか、または攪拌する場合に、ＥＰＯ発現が機械的に誘導される。一実施形態では、一過性、間欠性、または連続的液体流動に曝された細胞は、それらがフレームワークおよび／またはこのような３次元構造を形成する空間を提供する材料中または材料上の３次元構造体として存在する方式で培養される。一実施形態では、細胞は、多孔性ビーズ上で培養され、揺動プラットホーム、軌道周回プラットホーム、またはスピナーフラスコを用いて間欠性または連続的液体流動に曝される。別の実施形態では、細胞は、３次元足場上で培養され、装置中に置かれる。これにより、足場は固定され、液体は、足場を通る、または横切る方向へ流動する。当業者なら、当技術分野で既知の他の灌流培養条件を、本明細書記載の細胞用として使用可能であることを理解するであろう。
【００８４】
細胞凝集体
他の一態様では、本発明の製剤は、細胞凝集体またはスフェロイドを含む。一実施形態では、細胞凝集体は、本明細書記載の生理活性細胞集団を含む。別の実施形態では、細胞凝集体は、生理活性腎臓細胞、例えば、腎臓細胞混合物、富化腎臓細胞集団、および腎臓細胞画分の組み合わせを含む。
【００８５】
特定の実施形態では、本発明の生理活性腎臓細胞は、本明細書でさらに記載されるように３Ｄ形式で培養できる。いくつかの実施形態では、「オルガノイド」という用語は、天然の腎臓と一致する表現型および／または機能を有する細胞の累積物を意味する。いくつかの実施形態では、オルガノイドは、所与の組織中で、インビボで典型的に認められる種々の系列の細胞の混合集団を含む。いくつかの実施形態では、本発明のオルガノイドは、本発明の細胞が凝集体を形成し、それが次いで、スフェロイド、オルガノイド、またはこれらの組み合わせを形成できるいずれかの手段を介してインビトロで形成される。いくつかの実施形態では、このような凝集体、スフェロイドまたはオルガノイドは、特定の臓器と整合性を有する構造を呈する。いくつかの実施形態では、このような凝集体、スフェロイドまたはオルガノイドは、通常、特定の臓器の細胞により発現される表面マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、このような凝集体、スフェロイドまたはオルガノイドは、特定の臓器の細胞により通常発現される化合物または物質を産生する。特定の実施形態では、本発明の細胞は、天然の基質、例えば、ゼラチン上で培養できる。他の実施形態では、本発明の細胞は、合成された基質、例えば、ＰＧＬＡ上で培養できる。細胞凝集体を得る代表的方法は、実施例２０で提供される。
【００８６】
不活性細胞集団
本明細書で記載のように、本発明は、１つには、生理活性成分富化および不活性または望ましくない成分が枯渇している腎臓細胞の異種起源の集団の特定亜画分が、出発集団よりも優れた処置および再生の結果を提供するという驚くべき知見に基づいている。好ましい実施形態では、本発明で提供される製剤は、Ｂ１および／またはＢ５細胞集団が枯渇している細胞集団を含む。例えば、下記のものが、Ｂ１および／またはＢ５を枯渇し得る：Ｂ２、Ｂ３、およびＢ４（またはＢ４’）の内の２つ以上の混合物；Ｂ２、Ｂ３、およびＢ４（またはＢ４’）富化細胞集団。
【００８７】
Ｂ１細胞集団は、集合管および尿細管系の大きな、粒状細胞を含み、その集団の細胞は、約１．０４５ｇ／ｍ未満の浮遊密度を有する。Ｂ５細胞集団は、低粒度および低生存率の約１．０９１ｇ／ｍｌ超の浮遊密度を有する壊死組織片および小細胞から構成される。
【００８８】
細胞集団を単離・培養する方法
一態様では、本発明の製剤は、腎組織から単離および／または培養された細胞集団を含む。腎疾患、貧血、ＥＰＯ欠乏、尿細管輸送機能欠損、および糸球体濾過機能低下の処置を含む治療上の使用のために、製剤に使用される腎臓細胞成分、例えば、富化細胞集団を分離し、単離する方法が本明細書で提供される。一実施形態では、細胞集団は新たに消化された、すなわち、機械的に、もしくは酵素的に消化された腎組織から、または哺乳類腎臓細胞のインビトロ異種起源培養物から単離される。
【００８９】
製剤は、密度勾配による分離の前に低酸素性培養条件下で培養され、Ｂ４’を含むＢ４およびＢ２および／またはＢ３画分の両方が増強された分布と細胞組成を与える腎臓細胞の異種起源混合物を含むことができる。病気、および非疾患腎臓の両方から単離された腎臓細胞で、Ｂ２からＢ４への酸素依存性細胞の富化が認められた。理論に拘泥する意図はないが、これは、下記のうちの１つ以上の事象に起因する可能性がある：１）低酸素性培養期間の間の特定細胞成分の選択的生存、死亡、または増殖；２）低酸素性培養に応答した細胞粒度および／またはサイズの変化と、それによる浮遊密度およびその後の密度勾配分離の間の局在化の変化への影響；および３）低酸素性培養期間に応答した細胞遺伝子／タンパク質発現の変化と、それによる所与のいずれかの勾配画分内の細胞の特性差異が生ずる。従って、一実施形態では、製剤は、低酸素耐性である尿細管細胞富化細胞集団、例えば、Ｂ２を含む。
【００９０】
本発明の細胞集団の分離と単離のための代表的技術には、対象集団に含まれる異なる細胞型の比重の差異に基づいた密度勾配による分離が含まれる。任意の所与の細胞型の比重は、細胞内の粒度、細胞内の水の容量、および他の因子に影響され得る。一態様では、本発明は、限定されないが、ヒト、イヌ、およびげっ歯類を含む複数の種にわたる本発明細胞調製物、例えば、Ｂ２とＢ４’含有Ｂ４の単離のための最適勾配条件を提供する。好ましい実施形態では、密度勾配が、異種起源の腎臓細胞集団由来の新規尿細管細胞画分富化集団、すなわち、Ｂ２細胞集団を得るために使用される。一実施形態では、密度勾配が、異種起源の腎臓細胞集団由来の新規ＥＰＯ産生細胞画分富化集団、すなわち、Ｂ４細胞集団を得るために使用される。他の実施形態では、密度勾配が、腎臓の尿細管細胞、糸球体細胞、および内皮細胞富化亜集団を得るために使用される。一実施形態では、ＥＰＯ産生および尿細管細胞の両方が、赤血球および細胞壊死組織片から分離される。一実施形態では、ＥＰＯ産生、糸球体、および血管細胞が、他の細胞型ならびに赤血球および細胞壊死組織片から分離され、一方、尿細管細胞および集合管細胞亜集団が、同時に他の細胞型ならびに赤血球および細胞壊死組織片から分離される。もう一つの別の実施形態では、内分泌、糸球体、および／または血管細胞が、他の細胞型ならびに赤血球および細胞壊死組織片から分離され、一方、尿細管細胞および集合管細胞亜集団が、他の細胞型ならびに赤血球および細胞壊死組織片から同時に分離される。
【００９１】
一態様では、本発明の製剤は、一部では、６０％非イオン性ヨウ素標識化合物イオジキサノール水溶液を含むＯＰＴＩＰＲＥＰ（登録商標）（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ）密度勾配培地を使って、下記の重要なある特定の特性に基づいて、産生された細胞集団を含む。しかし、当業者なら、本発明の細胞集団を分離するための必要な機能特徴を含む、任意の密度勾配または他の手段、例えば、当技術分野で既知の細胞表面マーカーを使った免疫学分離、が本発明に従って使用可能であることが解るであろう。また、当業者なら、密度勾配（サイズと粒度）による細胞亜集団の分離に寄与する同じ細胞特性が、フローサイトメトリー（前方散乱＝フローサイトメトリーによるサイズを反映、側方散乱＝粒度を反映）により細胞亜集団を分離するために利用できることも認識すべきである。重要なことは、密度勾配培地は、対象の特定細胞に対し低毒性でなければならないことである。密度勾配培地は、対象の特定細胞に対し低毒性でなければならないが、一方で、本発明では、対象の細胞の選択プロセスで、ある種の役割を果たす勾配培地の使用も意図している。理論に拘泥する意図はないが、投入と回収ステップの間でかなりの細胞減少があったので、イオジキサノール含有勾配により回収された本発明の細胞集団は、イオジキサノール抵抗性であるように思われ、勾配の条件下でのイオジキサノールへの暴露により、ある特定の細胞の排除に至ったことが示唆される。イオジキサノール勾配後の特異的バンドに出現する細胞は、イオジキサノールおよび／または密度勾配露出のいかなる不都合な作用にも抵抗性がある。従って、また、本明細書に記載の製剤のための、細胞集団の単離および／または選択において、追加の軽度から中等度の腎毒素である造影剤の使用も意図されている。さらに、密度勾配培地は、また、ヒト血漿中のタンパク質と結合しても、また、対象細胞の重要な機能に悪影響を与えてもいけない。
【００９２】
別の態様では、本発明は、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）を使って腎臓細胞型が富化および／または枯渇された細胞集団を含む製剤を提供する。一実施形態では、腎臓細胞型は、ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ（登録商標）または等価物を使って、富化および／または枯渇させてもよい。
【００９３】
別の態様では、製剤は、磁気細胞選別を使って腎臓細胞型が富化および／または枯渇された細胞集団を含む。一実施形態では、腎臓細胞型は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ａｕｔｏＭＡＣＳ（登録商標）システムまたは等価物を使って富化および／または枯渇されてもよい。
【００９４】
別の態様では、製剤は、３次元培養法を受けた腎臓細胞集団を含んでもよい。一態様では、細胞集団培養方法は、連続灌流による。一実施形態では、３次元培養および連続灌流により培養された細胞集団は、静的に培養した細胞集団に比べて、より高い細胞充実性および相互結合性を示す。別の実施形態では、３次元培養および連続および連続灌流により培養した細胞集団は、このような細胞集団の静的培養に比べて、より多いＥＰＯ発現、ならびに尿細管関連遺伝子、例えば、ｅ−カドヘリンの発現増加を示す。さらに別の実施形態では、連続灌流により培養した細胞集団は、静的に培養した細胞集団に比べて、より高いレベルのブドウ糖およびグルタミンの消費を示す。
【００９５】
本明細書記載（実施例７を含む）のように、本発明の製剤用の細胞集団を調製する方法で、低または低酸素性の酸素条件を使うことができる。しかし、細胞集団を調製する方法は、低酸素条件付けのステップなしで使用可能である。一実施形態では、正常酸素圧条件を使ってもよい。
【００９６】
他の態様では、本発明は、細胞凝集体またはスフェロイド調製用のプロトコルを提供する（例えば、実施例２０を参照）。
【００９７】
当業者なら、本明細書記載の細胞に対し、当技術分野で既知の他の単離と培養方法を使用できることを理解するであろう。
【００９８】
３．生体材料
種々の生体材料を活性薬剤と組み合わせて、本発明の治療製剤を得ることができる。生体材料は、適するどのような形状（例えば、ビーズ）、または形態（例えば、液体、ゲル、等）でもよい。Ｂｅｒｔｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．の特許公開第２００７０２７６５０７号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載のように、ポリマーマトリックスまたは足場は、任意の数の所望形状に成形して、任意の数の全体系、幾何学的配置または空間の制約を満たすことができる。一実施形態では、本発明のマトリックスまたは足場は、３次元であってもよく、また、成形されて、臓器または組織構造の寸法と形状に適合され得る。例えば、腎疾患、貧血、ＥＰＯ欠乏、尿細管輸送機能欠損、または糸球体濾過機能低下の処置のためのポリマー足場の使用で、３次元（３−Ｄ）マトリックスを使用できる。種々の別々に成形された３−Ｄ足場を使用可能である。当然、ポリマーマトリックスは、異なるサイズと形状に成形して別々のサイズの患者に適合させることができる。ポリマーマトリックスは、また、別の方法で成型して、患者の特別なニーズに適合させることができる。別の実施形態では、ポリマーマトリックスまたは足場は、生体適合性、多孔性ポリマー足場であってもよい。足場は、限定されないが、次記を含む種々の合性または天然材料から形成してもよい：連続気泡ポリ乳酸（ＯＰＬＡ（登録商標））、セルロースエーテル、セルロース、セルロースエステル、フッ化ポリエチレン、フェノール、ポリ−４−メチルペンテン、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、ポリアミデイミド、ポリアクリラート、ポリベンゾオキサゾール、ポリカルボナート、ポリシアノアリールエテル、ポリエステル、ポリエステルカルボナート、ポリエーテル、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエーテルイミド、ポリエーテルケトン、ポリエーテルスルホン、ポリエチレン、ポリフルオロオレフィン、ポリイミド、ポリオレフィン、ポリオキサジアゾール、ポリフェニレンオキシド、ポリフェニレンスルフィド、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリスルフィド、ポリスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリチオエーテル、ポリトリアゾール、ポリウレタン、ポリビニル、ポリフッ化ビニリデン、再生セルロース、シリコーン、尿素−ホルムアルデヒド、コラーゲン、ゼラチン、アルギン酸塩、ラミニン、フィブロネクチン、絹、エラスチン、アルギナート、ヒアルロン酸、アガロース、またはそれらの共重合体もしくは物理的混合物。足場の構成は、液体懸濁液から軟多孔性足場、さらに剛直、形状保持多孔性足場に及び得る。一実施形態では、形態は、ヒドロゲルとなることができる溶液の液体形態である。
【００９９】
ヒドロゲルは、種々のポリマー材料から形成でき、種々の生物医学的用途に有用である。ヒドロゲルは、親水性高分子の３次元ネットワークとして物理的に記述できる。ヒドロゲルのタイプに依存して、それらは、さまざまな割合の水を含むが、全体として水には溶解しない。高い水含量にも関わらず、ヒドロゲルは、親水性の残基の存在により、大量の液体とさらなる結合が可能である。ヒドロゲルは、ゼラチン状の構造を変えることなく、大幅に膨潤する。ヒドロゲルの基本的物理特性は、使用されるポリマーおよび製品の特殊付加部分の特性に従って、特異的に改変できる。
【０１００】
好ましくは、ヒドロゲルは、ポリマー、生物由来材料、合成による材料またはそれらの組み合わせであり、生物学的に不活性で、生理学的に哺乳類組織と適合する材料で作られる。ヒドロゲル材料は、炎症反応を誘発しないのが好ましい。ヒドロゲルの形成に用いることのできる他の材料の例には、（ａ）修飾アルギン酸塩、（ｂ）一価カチオンに暴露するとゲル化する多糖類（例えば、ジェランガムおよびカラゲナン）、（ｃ）非常に粘稠な液体、またはチクソトロピックであり、構造の緩慢進化により時間をかけてゲルを形成する多糖類（例えば、ヒアルロン酸）、（ｄ）ゼラチンまたはコラーゲン、および（ｅ）ポリマーヒドロゲル前駆物質（例えば、ポリエチレンオキシド−ポリプロピレングリコールブロック共重合体およびタンパク質）、が含まれる。米国特許第６，２２４，８９３Ｂ１号は、本発明に従ったヒドロゲルの作成に適した種々のポリマー、およびこのようなポリマーの化学特性の詳細説明を提供している。
【０１０１】
足場または生体材料特性は、細胞を足場または生体材料に付着させ、それらと相互作用させることができ、および／またはその中に細胞が捕捉されうる多孔性空隙を提供できる。一実施形態では、本発明の多孔性足場または生体材料は、多孔性足場として構成されている生体材料の上に（例えば、細胞の付着により）、および／または足場の気孔の中に（例えば、細胞の捕捉により）、１つ以上の細胞集団または混合物の付加または堆積を可能とする。別の実施形態では、足場または生体材料は、足場内での細胞：細胞および／または細胞：生体材料の相互作用を可能とするか、または促進して、本明細書記載の構築物を形成する。
【０１０２】
一実施形態では、本発明に従って使用される生体材料は、ヒドロゲル形態のヒアルロン酸（ＨＡ）からなり、５．１ｋＤＡから２ｘ１０６ｋＤａ超までの大きさの範囲のＨＡ分子を含む。別の実施形態では、本発明に従って使用される生体材料は、多孔質発泡体の形態のヒアルロン酸からなり、また、５．１ｋＤＡから２ｘ１０６ｋＤａ超の大きさの範囲のＨＡ分子を含む。さらに別の実施形態では、本発明に従って使用される生体材料は、ポリ乳酸（ＰＬＡ）ベースの発泡体からなり、約５０ミクロン〜約３００ミクロンの孔径の連続気泡構造を有する。さらに別の実施形態では、好ましくはＢ２であるがＢ４でもよい特異的細胞集団は、特に腎臓内移植後に、ヒアルロン酸シンターゼ−２（ＨＡＳ−２）により高分子量ヒアルロン酸を直接的に合成する、および／または合成を刺激する。
【０１０３】
本明細書記載の生体用材料は、また、特定の外部条件、例えば、インビトロまたはインビボ条件に応答するように設計する、または適合させることができる。一実施形態では、生体用材料は、温度感受性（例えば、インビトロでまたはインビボで）である。別の実施形態では、生体用材料は、酵素分解（例えば、インビトロでまたはインビボで）への暴露に応答するように適合される。生体用材料の外部条件への応答は、本明細書記載のように微調整できる。記載の製剤の温度感受性は、製剤中の生体用材料の割合を調節することにより変えることができる。例えば、溶液中のゼラチンの割合を変えて、最終製剤（例えば、液体、ゲル、ビーズ、等）中のゼラチンの温度感受性を調節できる。あるいは、生体用材料を化学的に架橋して、酵素分解に対するさらに大きな抵抗性を付与できる。例えば、カルボジイミド架橋剤を使って化学的にゼラチンビーズを架橋し、それにより、内在性酵素に対する低減した感受性を付与できる。
【０１０４】
一態様では、生体用材料の外部条件に対する応答は、生体用材料の構造健全性に減少に関係する。温度感受性および酵素分解抵抗性は、上で与えられるが、材料の健全性の減少が、異なる生体用材料で発生しうる他の機序が存在する。これらの機序には、限定されないが、熱力学的（例えば、溶融等の相転移、拡散（例えば、生体用材料からのイオン性架橋剤の周辺組織への拡散））、化学的、酵素的、ｐＨ（例えば、ｐＨ感受性リポソーム）、超音波、および感光性（光浸透）の機序を含み得る。生体用材料が構造健全性を失う正確な機序は変化するであろうが、典型的には、機序は、移植または移植後に誘発される。
【０１０５】
当業者なら、当技術分野で既知の他の型の合成または天然材料が、本明細書記載の足場を形成するために使用可能であることを理解するであろう。
【０１０６】
一態様では、本発明は、上で言及の足場または生体材料から作られる本明細書に記載の構築物を提供する。
【０１０７】
４．構築物
一態様では、本発明は、治療を必要としている対象の腎疾患、貧血、またはＥＰＯ欠乏の処置のための１つ以上の本明細書記載の細胞集団を有する移植可能な構築物を含む製剤を提供する。一実施形態では、構築物は、１つ以上の合性または天然生体適合性材料からなる生体適合性材料または生体材料、足場またはマトリックス、および付着および／または捕捉により足場の表面上に堆積させた、または内部に包埋された１つ以上の細胞集団または本明細書記載の細胞の混合物で作られている。特定の実施形態では、構築物は、生体材料、および生体材料成分でコートされた、その上に析出させた、その中に析出させた、それに付着させた、その中に捕捉された、その中に包埋された、それを播種した、またはそれと組み合わされた、１つ以上の細胞集団または本明細書記載の細胞の混合物で作られる。富化細胞集団またはそれらの混合物を含むいずれの本明細書記載の細胞集団も、マトリックスと組み合わせて使用して、構築物を形成することができる。
【０１０８】
一態様では、製剤は、本明細書記載のように外部条件に応答するように設計また適合された生体用材料から構成される構築物を含む。結果として、細胞集団が構築物中の生体用材料と会合する性質は、外部条件に応じて変化する。例えば、細胞集団の温度感受性生体用材料との結合は、温度により変化する。一実施形態では、構築物は、約８℃以下で実質的に固体状態であり、およそ外界温度以上で実質的に液体状態である細胞集団および生体用材料を含み、細胞集団は、約８℃以下で生体用材料中に懸濁される。
【０１０９】
しかし、細胞集団は、およそ外界温度以上で、生体用材料中全体にわたり実質的に自由に動くことができる。低い温度で、実質的に固相で細胞集団を懸濁させることにより、液体中の細胞に比べ、足場依存細胞の場合のように、細胞の安定性という利益が得られる。さらに、実質的に固相で細胞集団を懸濁させることにより、次記の内の１つ以上の利益が得られる：ｉ）細胞の沈殿を防ぐ、ｉｉ）細胞を懸濁状態で生体用材料に固定されたまま残すことが可能となる；ｉｉｉ）生体用材料全体にわたりより均一に分散させたまま残すことを可能とする；ｉｖ）細胞凝集体の形成を防ぐ；およびｖ）製剤の貯蔵および輸送の間の細胞のより良い保護を提供する。対象の投与までそのような特性を保持できる製剤は、少なくとも、製剤中の細胞の全体の健康状態がより良く、より均一であり、より一貫性のある細胞投与をできるという理由で、有益である。
【０１１０】
別の実施形態では、堆積された細胞集団または構築物の細胞成分は、酸素で調節可能なＥＰＯ産生細胞を富化した第１腎臓細胞集団である。別の実施形態では、第１腎臓細胞集団は、酸素で調節可能なＥＰＯ産生細胞に加えて、糸球体および血管細胞を含む。一実施形態では、第１腎臓細胞集団は、Ｂ４’細胞集団である。もう一つの別の実施形態では、析出細胞集団または構築物の細胞成分は、第１富化腎臓細胞集団および第２腎臓細胞集団の両方を含む。いくつかの実施形態では、第２細胞集団は、酸素で調節可能なＥＰＯ産生細胞が富化されていない。別の実施形態では、第２細胞集団は、腎臓尿細管細胞が富化されている。別の実施形態では、第２細胞集団は、腎臓尿細管細胞が富化され、集合管上皮細胞を含む。他の実施形態では、腎臓尿細管細胞は、以下を含み得るが、それらに限定されない、１つ以上の尿細管細胞マーカーの発現を特徴とする：メガリン、キュビリン、ヒアルロン酸シンターゼ２（ＨＡＳ２）、ビタミンＤ３  ２５−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ２Ｄ２５）、Ｎ−カドヘリン（Ｎｃａｄ）、Ｅ−カドヘリン（Ｅｃａｄ）、アクアポリン−１（Ａｑｐ１）、アクアポリン−２（Ａｑｐ２）、ＲＡＢ１７、メンバーＲＡＳ癌遺伝子ファミリー（Ｒａｂ１７）、ＧＡＴＡ結合タンパク質３（Ｇａｔａ３）、ＦＸＹＤドメイン含有イオン輸送制御因子４（Ｆｘｙｄ４）、溶質担体ファミリー９（ナトリウム／水素交換体）、メンバー４（Ｓｌｃ９ａ４）、アルデヒド脱水素酵素３ファミリー、メンバーＢ１（Ａｌｄｈ３ｂ１）、アルデヒド脱水素酵素１ファミリー、メンバーＡ３（Ａｌｄｈ１ａ３）、およびカルパイン−８（Ｃａｐｎ８）。
【０１１１】
一実施形態では、本発明の構築物を形成するために生体材料または足場上に堆積された、またはそれと組み合わされた細胞集団は、種々の源、例えば、自己源由来である。また、非自己源も、限定されないが、同種異系、または同種同系（自家遺伝子系または同遺伝子系）源等が使用に適する。
【０１１２】
当業者なら、細胞集団を堆積させて、あるいは生体材料と組み合わせて構築物を形成するいくつかの適切な方法があることを理解するであろう。
【０１１３】
一態様では、本発明の構築物は、本明細書記載の使用方法で使用するために適切である。一実施形態では、構築物は、任意の原因による腎疾患、貧血、または任意の原因によるＥＰＯ欠乏の治療を必要としている対象に対する投与に適している。他の実施形態では、構築物は、赤血球恒常性の改善または回復を必要としている対象への投与に適している。別の実施形態では、構築物は、腎臓機能の改善を必要としている対象への投与に適している。
【０１１４】
さらに別の態様では、本発明は、腎臓機能改善を必要としている対象への移植のための構築物を提供し、この構築物は、
ａ）１つ以上の生体適合性合成高分子または天然タンパク質またはペプチドを含む生体材料；および
ｂ）腎疾患を有する対象由来の哺乳類腎臓細胞の混合物で、１．０４５ｇ／ｍＬ〜１．０５２ｇ／ｍＬの密度の単離された、尿細管細胞富化集団を含む第１細胞集団、Ｂ２、および、エリスロポエチン（ＥＰＯ）産生細胞および血管細胞を含むが、糸球体細胞が枯渇している１．０６３ｇ／ｍＬ〜１．０９１ｇ／ｍＬの密度の第２細胞集団、Ｂ４’を含み、これら細胞集団は、生体材料成分でコートされ、その上もしくはその中に堆積され、その中に捕捉され、その中に懸濁され、その中に包埋され、および／または別の方法でそれと組み合わされている。特定の実施形態では、混合物は、集合管および尿細管系の大きな粒状細胞を含む１．０４５ｇ／ｍｌ未満の密度のＢ１細胞集団、または低粒度および低生存率の壊死組織片および小細胞を含む１．０９１ｇ／ｍｌ超の密度のＢ５細胞集団を含まない。
【０１１５】
一実施形態では、構築物は、血管マーカーの発現を特徴とするＢ４’細胞集団を含む。いくつかの実施形態では、Ｂ４’細胞集団は、糸球体マーカーの発現を特徴としない。特定の実施形態では、混合物は、酸素で調節可能なエリスロポエチン（ＥＰＯ）発現ができる。全ての実施形態で、混合物は、哺乳類腎組織または培養腎臓細胞から得ることができる。
【０１１６】
一実施形態では、構築物は、混合物の捕捉および／または付着に適切な３次元（３−Ｄ）多孔性生体材料として構成される生体材料を含む。別の実施形態では、構築物は、哺乳動物細胞の包埋、付着、懸濁、またはコーティングに適した液体または半液体ゲルとして構成される生体材料を含む。さらに別の実施形態では、構築物は、主にヒドロゲル形態のヒアルロン酸（ＨＡ）高分子量種からなるように構成される生体材料を含む。別の実施形態では、構築物は、主に多孔性発泡体の形態のヒアルロン酸高分子量種からなる生体材料を含む。さらに別の実施形態では、構築物は、約５０ミクロン〜約３００ミクロンの気孔を有するポリ乳酸ベースの発泡体からなる生体材料を含む。さらに別の実施形態では、構築物は、改善された腎臓機能を必要としている対象に対し自己である腎臓試料由来であり得る１つ以上の細胞集団を含む。特定の実施形態では、試料は、腎生検である。いくつかの実施形態では、対象は、腎疾患を有する。さらに他の実施形態では、細胞集団は、非自己腎臓試料由来である。一実施形態では、構築物は、赤血球恒常性を提供する。
【０１１７】
５．分泌産物
もう一つの別の態様では、本発明は、本明細書記載のように富化腎臓細胞集団または富化腎臓細胞集団の混合物からの分泌産物と組み合わせて、細胞集団等の活性薬剤を含む製剤に関する。一実施形態では、産物は、以下のうちの１つ以上を含む：パラクリン因子、内分泌因子、ジャクスタクライン因子、および小胞。小胞は、以下のうちの１つ以上を含み得る：パラクリン因子、内分泌因子、ジャクスタクライン因子、微小胞、エキソソーム、およびＲＮＡ。分泌産物は、また、微小胞内にない産物を含み得、限定されないが、パラクリン因子、内分泌因子、ジャクスタクライン因子、およびＲＮＡが含まれる。例えば、細胞外のｍｉＲＮＡが、小胞外から検出されている（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２０１０、１−１２ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｑ６０１、Ｊｕｌｙ  ７、２０１０）。分泌産物は、また、細胞由来産物、例えば、細胞由来小胞、と呼ばれる。
【０１１８】
もう一つの別の実施形態では、製剤は、腎臓細胞由来の小胞の一部分である分泌産物を含む。小胞は、因子を他の目的場所へ送達することができ得る。一実施形態では、小胞は、分泌小胞である。いくつかの型の分泌小胞が意図され、これらには、限定されないが、エキソソーム、微小胞、エクトソーム、膜粒子、エキソソーム様小胞、およびアポトーシス性小胞が含まれる（Ｔｈｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．２０１０．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：５８１−５９３）。一実施形態では、分泌小胞は、エキソソームである。もう一つの実施形態では、分泌小胞は、微小胞である。もう一つの別の実施形態では、分泌小胞は、１つ以上の細胞成分を含むか、またはそられからなる。成分は、以下のうちの１つ以上であり得る：膜脂質、ＲＮＡ、タンパク質、代謝産物、細胞質成分、およびこれらの任意の組み合わせ。好ましい実施形態では、分泌小胞は、マイクロＲＮＡを含むか、それから構成されるか、または基本的にそれから構成される。好ましくは、ｍｉＲＮＡは、ヒトｍｉＲＮＡである。一実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−３０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−４４９ａ、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−２３ｂ、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１２４、およびｍｉＲ−１５１からなる群より選択される。もう一つの実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡが、下記からなる群より選択できる：ｌｅｔ−７ａ−１；ｌｅｔ−７ａ−２；ｌｅｔ−７ａ−３；ｌｅｔ−７ｂ；ｌｅｔ−７ｃ；ｌｅｔ−７ｄ；ｌｅｔ−７ｅ；ｌｅｔ−７ｆ−１；ｌｅｔ−７ｆ−２；ｌｅｔ−７ｇ；ｌｅｔ−７ｉ；ｍｉｒ−１−１；ｍｉｒ−１−２；ｍｉｒ−７−１；ｍｉｒ−７−２；ｍｉｒ−７−３；ｍｉｒ−９−１；ｍｉｒ−９−２；ｍｉｒ−９−３；ｍｉｒ−１０ａ；ｍｉｒ−１０ｂ；ｍｉｒ−１５ａ；ｍｉｒ−１５ｂ；ｍｉｒ−１６−１；ｍｉｒ−１６−２；ｍｉｒ−１７；ｍｉｒ−１８ａ；ｍｉｒ−１８ｂ；ｍｉｒ−１９ａ；ｍｉｒ−１９ｂ−１；ｍｉｒ−１９ｂ−２；ｍｉｒ−２０ａ；ｍｉｒ−２０ｂ；ｍｉｒ−２１；ｍｉｒ−２２；ｍｉｒ−２３ａ；ｍｉｒ−２３ｂ；ｍｉｒ−２３ｃ；ｍｉｒ−２４−１；ｍｉｒ−２４−２；ｍｉｒ−２５；ｍｉｒ−２６ａ−１；ｍｉｒ−２６ａ−２；ｍｉｒ−２６ｂ；ｍｉｒ−２７ａ；ｍｉｒ−２７ｂ；ｍｉｒ−２８；ｍｉｒ−２９ａ；ｍｉｒ−２９ｂ−１；ｍｉｒ−２９ｂ−２；ｍｉｒ−２９ｃ；ｍｉｒ−３０ａ；ｍｉｒ−３０ｂ；ｍｉｒ−３０ｃ−１；ｍｉｒ−３０ｃ−２；ｍｉｒ−３０ｄ；ｍｉｒ−３０ｅ；ｍｉｒ−３１；ｍｉｒ−３２；ｍｉｒ−３３ａ；ｍｉｒ−３３ｂ；ｍｉｒ−３４ａ；ｍｉｒ−３４ｂ；ｍｉｒ−３４ｃ；ｍｉｒ−９２ａ−１；ｍｉｒ−９２ａ−２；ｍｉｒ−９２ｂ；ｍｉｒ−９３；ｍｉｒ−９５；ｍｉｒ−９６；ｍｉｒ−９８；ｍｉｒ−９９ａｍｉｒ−９９ｂ；ｍｉｒ−１００；ｍｉｒ−１０１−１；ｍｉｒ−１０１−２；ｍｉｒ−１０３−１；ｍｉｒ−１０３−１−ａｓ；ｍｉｒ−１０３−２；ｍｉｒ−１０３−２−ａｓ；ｍｉｒ−１０５−１；ｍｉｒ−１０５−２；ｍｉｒ−１０６ａ；ｍｉｒ−１０６ｂ；ｍｉｒ−１０７；ｍｉｒ−１２２；ｍｉｒ−１２４−１；ｍｉｒ−１２４−２；ｍｉｒ−１２４−３；ｍｉｒ−１２５ａ；ｍｉｒ−１２５ｂ−１；��ｉｒ−１２５ｂ−２；ｍｉｒ−１２６；ｍｉｒ−１２７；ｍｉｒ−１２８−１；ｍｉｒ−１２８−２；ｍｉｒ−１２９−１；ｍｉｒ−１２９−２；ｍｉｒ−１３０ａ；ｍｉｒ−１３０ｂ；ｍｉｒ−１３２；ｍｉｒ−１３２；ｍｉｒ−１３３ａ−１；ｍｉｒ−１３３ａ−２；ｍｉｒ−１３３ｂ；ｍｉｒ−１３４；ｍｉｒ−１３５ａ−１；ｍｉｒ−１３５ａ−２；ｍｉｒ−１３５ｂ；ｍｉｒ−１３６ＭＩ１０１３５１１２０；ｍｉｒ−１３７；ｍｉｒ−１３８−１；ｍｉｒ−１３８−２；ｍｉｒ−１３９；ｍｉｒ−１４０；ｍｉｒ−１４１；ｍｉｒ−１４２；ｍｉｒ−１４３；ｍｉｒ−１４４；ｍｉｒ−１４５；ｍｉｒ−１４６ａ；ｍｉｒ−１４６ｂ；ｍｉｒ−１４７；ｍｉｒ−１４７ｂ；ｍｉｒ−１４８ａ；ｍｉｒ−１４８ｂ；ｍｉｒ−１４９；ｍｉｒ−１５０；ｍｉｒ−１５１；ｍｉｒ−１５２；ｍｉｒ−１５３−１；ｍｉｒ−１５３−２；ｍｉｒ−１５４；ｍｉｒ−１５５；ｍｉｒ−１８１ａ−１；ｍｉｒ−１８１ａ−２；ｍｉｒ−１８１ｂ−１；ｍｉｒ−１８１ｂ−２；ｍｉｒ−１８１ｃ；ｍｉｒ−１８１ｄ；ｍｉｒ−１８２；ｍｉｒ−１８３；ｍｉｒ−１８４；ｍｉｒ−１８５；ｍｉｒ−１８６；ｍｉｒ−１８７；ｍｉｒ−１８８；ｍｉｒ−１９０；ｍｉｒ−１９０ｂ；ｍｉｒ−１９１；ｍｉｒ−１９２；ｍｉｒ−１９３ａ；ｍｉｒ−１９３ｂ；ｍｉｒ−１９４−１；ｍｉｒ−１９４−２；ｍｉｒ−１９５；ｍｉｒ−１９６ａ−１；ｍｉｒ−１９６ａ−２；ｍｉｒ−１９６ｂ；ｍｉｒ−１９７；ｍｉｒ−１９８；ｍｉｒ−１９９ａ−１；ｍｉｒ−１９９ａ−２；ｍｉｒ−１９９ｂ；ｍｉｒ−２００ａ；ｍｉｒ−２００ｂ；ｍｉｒ−２００ｃ；ｍｉｒ−２０２；ｍｉｒ−２０３；ｍｉｒ−２０４；ｍｉｒ−２０５；ｍｉｒ−２０６；ｍｉｒ−２０８ａ；ｍｉｒ−２０８ｂ；ｍｉｒ−２１０；ｍｉｒ−２１１；ｍｉｒ−２１２；ｍｉｒ−２１４；ｍｉｒ−２１５；ｍｉｒ−２１６ａ；ｍｉｒ−２１６ｂ；ｍｉｒ−２１７；ｍｉｒ−２１８−１；ｍｉｒ−２１８−２；ｍｉｒ−２１９−１；ｍｉｒ−２１９−２；ｍｉｒ−２２１；ｍｉｒ−２２２；ｍｉｒ−２２３；ｍｉｒ−２２４；ｍｉｒ−２９６；ｍｉｒ−２９７；ｍｉｒ−２９８；ｍｉｒ−２９９；ｍｉｒ−３００；ｍｉｒ−３０１ａ；ｍｉｒ−３０１ｂ；ｍｉｒ−３０２ａ；ｍｉｒ−３０２ｂ；ｍｉｒ−３０２ｃ；ｍｉｒ−３０２ｄ；ｍｉｒ−３０２ｅ；ｍｉｒ−３０２ｆ；ｍｉｒ−３２０ａ；ｍｉｒ−３２０ｂ−１；ｍｉｒ−３２０ｂ−２；ｍｉｒ−３２０ｃ−１；ｍｉｒ−３２０ｃ−２；ｍｉｒ−３２０ｄ−１；ｍｉｒ−３２０ｄ−２；ｍｉｒ−３２０ｅ；ｍｉｒ−３２３；ｍｉｒ−３２３ｂ；ｍｉｒ−３２４；ｍｉｒ−３２５；ｍｉｒ−３２６；ｍｉｒ−３２８；ｍｉｒ−３２９−１；ｍｉｒ−３２９−２；ｍｉｒ−３３０；ｍｉｒ−３３１；ｍｉｒ−３３５；ｍｉｒ−３３７；ｍｉｒ−３３８；ｍｉｒ−３３９；ｍｉｒ−３４０；ｍｉｒ−３４２；ｍｉｒ−３４５；ｍｉｒ−３４６；ｍｉｒ−３６１；ｍｉｒ−３６２；ｍｉｒ−３６３；ｍｉｒ−３６５−１；ｍｉｒ−３６５−２；ｍｉｒ−３６７；ｍｉｒ−３６９；ｍｉｒ−３７０；ｍｉｒ−３７；ｍｉｒ−３７２；ｍｉｒ−３７３；ｍｉｒ−３７４ａ；ｍｉｒ−３７４ｂ；ｍｉｒ−３７４ｃ；ｍｉｒ−３７５；ｍ��ｒ−３７６ａ−１；ｍｉｒ−３７６ａ−２；ｍｉｒ−３７６ｂ；ｍｉｒ−３７６ｃ；ｍｉｒ−３７７；ｍｉｒ−３７８；ｍｉｒ−３７８ｂ；ｍｉｒ−３７８ｃ；ｍｉｒ−３７９；ｍｉｒ−３８０；ｍｉｒ−３８１；ｍｉｒ−３８２；ｍｉｒ−３８３；ｍｉｒ−３８４；ｍｉｒ−４０９；ｍｉｒ−４１０；ｍｉｒ−４１１；ｍｉｒ−４１２；ｍｉｒ−４２１；ｍｉｒ−４２２ａ；ｍｉｒ−４２３；ｍｉｒ−４２４；ｍｉｒ−４２５；ｍｉｒ−４２９；ｍｉｒ−４３１；ｍｉｒ−４３２；ｍｉｒ−４３３；ｍｉｒ−４４８；ｍｉｒ−４４９ａ；ｍｉｒ−４４９ｂ；ｍｉｒ−４４９ｃ；ｍｉｒ−４５０ａ−１；ｍｉｒ−４５０ａ−２；ｍｉｒ−４５０ｂ；ｍｉｒ−４５１；ｍｉｒ−４５２；ｍｉｒ−４５４；ｍｉｒ−４５５；ｍｉｒ−４６６；ｍｉｒ−４８３；ｍｉｒ−４８４；ｍｉｒ−４８５；ｍｉｒ−４８６；ｍｉｒ−４８７ａ；ｍｉｒ−４８７ｂ；ｍｉｒ−４８８；ｍｉｒ−４８９；ｍｉｒ−４９０；ｍｉｒ−４９１；ｍｉｒ−４９２；ｍｉｒ−４９３；ｍｉｒ−４９４；ｍｉｒ−４９５；ｍｉｒ−４９６；ｍｉｒ−４９７；ｍｉｒ−４９８；ｍｉｒ−４９９；ｍｉｒ−５００ａ；ｍｉｒ−５００ｂ；ｍｉｒ−５０１；ｍｉｒ−５０２；ｍｉｒ−５０３；ｍｉｒ−５０４；ｍｉｒ−５０５；ｍｉｒ−５０６；ｍｉｒ−５０７；ｍｉｒ−５０８；ｍｉｒ−５０９−１；ｍｉｒ−５０９−２；ｍｉｒ−５０９−３；ｍｉｒ−５１０；ｍｉｒ−５１１−１；ｍｉｒ−５１１−２；ｍｉｒ−５１２−１；ｍｉｒ−５１２−２；ｍｉｒ−５１３ａ−１；ｍｉｒ−５１３ａ−２；ｍｉｒ−５１３ｂ；ｍｉｒ−５１３ｃ；ｍｉｒ−５１４−１；ｍｉｒ−５１４−２；ｍｉｒ−５１４−３；ｍｉｒ−５１４ｂ；ｍｉｒ−５１５−１；ｍｉｒ−５１５−２；ｍｉｒ−５１６ａ−１；ｍｉｒ−５１６ａ−２；ｍｉｒ−５１６ｂ−１；ｍｉｒ−５１６ｂ−２；ｍｉｒ−５１７ａ；ｍｉｒ−５１７ｂ；ｍｉｒ−５１７ｃ；ｍｉｒ−５１８ａ−１；ｍｉｒ−５１８ａ−２；ｍｉｒ−５１８ｂ；ｍｉｒ−５１８ｃ；ｍｉｒ−５１８ｄ；ｍｉｒ−５１８ｅ；ｍｉｒ−５１８ｆ；ｍｉｒ−５１９ａ−１；ｍｉｒ−５１９ａ−２；ｍｉｒ−５１９ｂ；ｍｉｒ−５１９ｃ；ｍｉｒ−５１９ｄ；ｍｉｒ−５１９ｅ；ｍｉｒ−５２０ａ；ｍｉｒ−５２０ｂ；ｍｉｒ−５２０ｃ；ｍｉｒ−５２０ｄ；ｍｉｒ−５２０ｅ；ｍｉｒ−５２０ｆ；ｍｉｒ−５２０ｇ；ｍｉｒ−５２０ｈ；ｍｉｒ−５２１−１；ｍｉｒ−５２１−２；ｍｉｒ−５２２；ｍｉｒ−５２３；ｍｉｒ−５２４；ｍｉｒ−５２５；ｍｉｒ−５２６ａ−１；ｍｉｒ−５２６ａ−２；ｍｉｒ−５２６ｂ；ｍｉｒ−５２７；ｍｉｒ−５３２；ｍｉｒ−５３９；ｍｉｒ−５４１；ｍｉｒ−５４２；ｍｉｒ−５４３；ｍｉｒ−５４４；ｍｉｒ−５４４ｂ；ｍｉｒ−５４５；ｍｉｒ−５４８ａ−１；ｍｉｒ−５４８ａ−２；ｍｉｒ−５４８ａ−３；ｍｉｒ−５４８ａａ−１；ｍｉｒ−５４８ａａ−２；ｍｉｒ−５４８ｂ；ｍｉｒ−５４８ｃ；ｍｉｒ−５４８ｄ−１；ｍｉｒ−５４８ｄ−２；ｍｉｒ−５４８ｅ；ｍｉｒ−５４８ｆ−１；ｍｉｒ−５４８ｆ−２；ｍｉｒ−５４８ｆ−３；ｍｉｒ−５４８ｆ−４；ｍｉｒ−５４８ｆ−５；ｍｉｒ−５４８ｇ；ｍｉｒ−５４８ｈ−１；ｍｉｒ−５４８ｈ−２；ｍｉｒ−５４８ｈ−３；ｍ��ｒ−５４８ｈ−４；ｍｉｒ−５４８ｉ−１；ｍｉｒ−５４８ｉ−２；ｍｉｒ−５４８ｉ−３；ｍｉｒ−５４８ｉ−４；ｍｉｒ−５４８ｊ；ｍｉｒ−５４８ｋ；ｍｉｒ−５４８ｌ；ｍｉｒ−５４８ｍ；ｍｉｒ−５４８ｎ；ｍｉｒ−５４８ｏ；ｍｉｒ−５４８ｐ；ｍｉｒ−５４８ｓ；ｍｉｒ−５４８ｔ；ｍｉｒ−５４８ｕ；ｍｉｒ−５４８ｖ；ｍｉｒ−５４８ｗ；ｍｉｒ−５４８ｘ；ｍｉｒ−５４８ｙ；ｍｉｒ−５４８ｚ；ｍｉｒ−５４９；ｍｉｒ−５５０ａ−１；ｍｉｒ−５５０ａ−２；ｍｉｒ−５５０ｂ−１；ｍｉｒ−５５０ｂ−２；ｍｉｒ−５５１ａ；ｍｉｒ−５５１ｂ；ｍｉｒ−５５２；ｍｉｒ−５５３；ｍｉｒ−５５４；ｍｉｒ−５５５；ｍｉｒ−５５６；ｍｉｒ−５５７；ｍｉｒ−５５８；ｍｉｒ−５５９；ｍｉｒ−５６１；ｍｉｒ−５６２；ｍｉｒ−５６３；ｍｉｒ−５６４；ｍｉｒ−５６６；ｍｉｒ−５６７；ｍｉｒ−５６８；ｍｉｒ−５６９；ｍｉｒ−５７０；ｍｉｒ−５７１；ｍｉｒ−５７２；ｍｉｒ−５７３；ｍｉｒ−５７４；ｍｉｒ−５７５；ｍｉｒ−５７６；ｍｉｒ−５７７；ｍｉｒ−５７８；ｍｉｒ−５７９；ｍｉｒ−５８０；ｍｉｒ−５８１；ｍｉｒ−５８２；ｍｉｒ−５８３；ｍｉｒ−５８４；ｍｉｒ−５８５；ｍｉｒ−５８６；ｍｉｒ−５８７；ｍｉｒ−５８８；ｍｉｒ−５８９；ｍｉｒ−５９０；ｍｉｒ−５９１；ｍｉｒ−５９２；ｍｉｒ−５９３；ｍｉｒ−５９５；ｍｉｒ−５９６；ｍｉｒ−５９７；ｍｉｒ−５９８；ｍｉｒ−５９９；ｍｉｒ−６００；ｍｉｒ−６０１；ｍｉｒ−６０２；ｍｉｒ−６０３；ｍｉｒ−６０４；ｍｉｒ−６０５；ｍｉｒ−６０６；ｍｉｒ−６０７；ｍｉｒ−６０８；ｍｉｒ−６０９；ｍｉｒ−６１０；ｍｉｒ−６１１；ｍｉｒ−６１２；ｍｉｒ−６１３；ｍｉｒ−６１４；ｍｉｒ−６１５；ｍｉｒ−６１６；ｍｉｒ−６１７；ｍｉｒ−６１８；ｍｉｒ−６１９；ｍｉｒ−６２０；ｍｉｒ−６２１；ｍｉｒ−６２２；ｍｉｒ−６２３；ｍｉｒ−６２４；ｍｉｒ−６２５；ｍｉｒ−６２６；ｍｉｒ−６２７；ｍｉｒ−６２８；ｍｉｒ−６２９；ｍｉｒ−６３０；ｍｉｒ−６３１；ｍｉｒ−６３２；ｍｉｒ−６３３；ｍｉｒ−６３４；ｍｉｒ−６３５；ｍｉｒ−６３６；ｍｉｒ−６３７；ｍｉｒ−６３８；ｍｉｒ−６３９；ｍｉｒ−６４０；ｍｉｒ−６４１；ｍｉｒ−６４２ａ；ｍｉｒ−６４２ｂ；ｍｉｒ−６４３；ｍｉｒ−６４４；ｍｉｒ−６４５；ｍｉｒ−６４６；ｍｉｒ−６４７；ｍｉｒ−６４８；ｍｉｒ−
６４９；ｍｉｒ−６５０；ｍｉｒ−６５１；ｍｉｒ−６５２；ｍｉｒ−６５３；ｍｉｒ−６５４；ｍｉｒ−６５５；ｍｉｒ−６５６；ｍｉｒ−６５７；ｍｉｒ−６５８；ｍｉｒ−６５９；ｍｉｒ−６６０；ｍｉｒ−６６１；ｍｉｒ−６６２；ｍｉｒ−６６３；ｍｉｒ−６６３ｂ；ｍｉｒ−６６４；ｍｉｒ−６６５；ｍｉｒ−６６８；ｍｉｒ−６７０；ｍｉｒ−６７１；ｍｉｒ−６７５；ｍｉｒ−６７６；ｍｉｒ−７０８；ｍｉｒ−７１１；ｍｉｒ−７１８；ｍｉｒ−７２０；ｍｉｒ−７４４；ｍｉｒ−７５８；ｍｉｒ−７５９；ｍｉｒ−７６０；ｍｉｒ−７６１；ｍｉｒ−７６２；ｍｉｒ−７６４；ｍｉｒ−７６５；ｍｉｒ−７６６；ｍｉｒ−７６７；ｍｉｒ−７６９；ｍｉｒ−７７０；ｍｉｒ−８０２；ｍｉｒ−８７３；ｍｉｒ−８７４；ｍｉｒ−８７５；ｍｉｒ−８７６；ｍｉｒ−８７７；ｍｉｒ−８８５；ｍｉｒ−８８７；ｍｉｒ−８８８；ｍｉｒ−８８９；ｍｉｒ−８９０；ｍｉｒ−８９１ａ；ｍｉｒ−８９１ｂ；ｍｉｒ−８９２ａ；ｍｉｒ−８９２ｂ；ｍｉｒ−９２０；ｍｉｒ−９２１；ｍｉｒ−９２２；ｍｉｒ−９２４；ｍｉｒ−９３３；ｍｉｒ−９３４；ｍｉｒ−９３５；ｍｉｒ−９３６；ｍｉｒ−９３７；ｍｉｒ−９３８；ｍｉｒ−９３９；ｍｉｒ−９４０；ｍｉｒ−９４１−１；ｍｉｒ−９４１−２；ｍｉｒ−９４１−３；ｍｉｒ−９４１−４；ｍｉｒ−９４２；ｍｉｒ−９４２；ｍｉｒ−９４３；ｍｉｒ−９４４；ｍｉｒ−１１７８；ｍｉｒ−１１７９；ｍｉｒ−１１８０；ｍｉｒ−１１８１；ｍｉｒ−１１８２；ｍｉｒ−１１８３；ｍｉｒ−１１８４−１；ｍｉｒ−１１８４−２；ｍｉｒ−１１８４−３；ｍｉｒ−１１８５−１；ｍｉｒ−１１８５−２；ｍｉｒ−１１９３；ｍｉｒ−１１９７；ｍｉｒ−１２００；ｍｉｒ−１２０２；ｍｉｒ−１２０３；ｍｉｒ−１２０４；ｍｉｒ−１２０５；ｍｉｒ−１２０６；ｍｉｒ−１２０７；ｍｉｒ−１２０８；ｍｉｒ−１２２４；ｍｉｒ−１２２５；ｍｉｒ−１２２６；ｍｉｒ−１２２７；ｍｉｒ−１２２８；ｍｉｒ−１２２９；ｍｉｒ−１２３１；ｍｉｒ−１２３３−１；ｍｉｒ−１２３３−２；ｍｉｒ−１２３４；ｍｉｒ−１２３６；ｍｉｒ−１２３７；ｍｉｒ−１２３８；ｍｉｒ−１２４３；ｍｉｒ−１２４４−１；ｍｉｒ−１２４４−２；ｍｉｒ−１２４４−３；ｍｉｒ−１２４５；ｍｉｒ−１２４６；ｍｉｒ−１２４７；ｍｉｒ−１２４８；ｍｉｒ−１２４９；ｍｉｒ−１２５０；ｍｉｒ−１２５１；ｍｉｒ−１２５２；ｍｉｒ−１２５３；ｍｉｒ−１２５４；ｍｉｒ−１２５５ａ；ｍｉｒ−１２５５ｂ−１；ｍｉｒ−１２５５ｂ−２；ｍｉｒ−１２５６；ｍｉｒ−１２５７；ｍｉｒ−１２５８；ｍｉｒ−１２６０；ｍｉｒ−１２６０ｂ；ｍｉｒ−１２６１；ｍｉｒ−１２６２；ｍｉｒ−１２６３；ｍｉｒ−１２６４；ｍｉｒ−１２６５；ｍｉｒ−１２６６；ｍｉｒ−１２６７；ｍｉｒ−１２６８；ｍｉｒ−１２６９；ｍｉｒ−１２７０−１；ｍｉｒ−１２７０−２；ｍｉｒ−１２７１；ｍｉｒ−１２７２；ｍｉｒ−１２７３；ｍｉｒ−１２７３ｃ；ｍｉｒ−１２７３ｄ；ｍｉｒ−１２７３ｅ；ｍｉｒ−１２７４ａ；ｍｉｒ−１２７４ｂ；ｍｉｒ−１２７５；ｍｉｒ−１２７６；ｍｉｒ−１２７７；ｍｉｒ−１２７８；ｍｉｒ−１２７９；ｍｉｒ−１２８０；ｍｉｒ−１２８１；ｍｉｒ−１２８２；ｍｉｒ−１２８３−１；ｍｉｒ−１２８３−２；ｍｉｒ−１２８４；ｍｉｒ−１２８５−１；ｍｉｒ−１２８５−２；ｍｉｒ−１２８６；ｍｉｒ−１２８７；ｍｉｒ−１２８８；ｍｉｒ−１２８９−１；ｍｉｒ−１２８９−２；ｍｉｒ−１２９０；ｍｉｒ−１２９１；ｍｉｒ−１２９２；ｍｉｒ−１２９３；ｍｉｒ−１２９４；ｍｉｒ−１２９５；ｍｉｒ−１２９６；ｍｉｒ−１２９７；ｍｉｒ−１２９８；ｍｉｒ−１２９９；ｍｉｒ−１３０１；ｍｉｒ−１３０２−１；ｍｉｒ−１３０２−１０；ｍｉｒ−１３０２−１１；ｍｉｒ−１３０２−２；ｍｉｒ−１３０２−３；ｍｉｒ−１３０２−４；ｍｉｒ−１３０２−５；ｍｉｒ−１３０２−６；ｍｉｒ−１３０２−７；ｍｉｒ−１３０２−８；ｍｉｒ−１３０２−９；ｍｉｒ−１３０３；ｍｉｒ−１３０４；ｍｉｒ−１３０５；ｍｉｒ−１３０６；ｍｉｒ−１３０７；ｍｉｒ−１３２１；ｍｉｒ−１３２２；ｍｉｒ−１３２３；ｍｉｒ−１３２４；ｍｉｒ−１４６８；ｍｉｒ−１４６９；ｍｉｒ−１４７０；ｍｉｒ−１４７１；ｍｉｒ−１５３７；ｍｉｒ−１５３８；ｍｉｒ−１５３９；ｍｉｒ−１８２５；ｍｉｒ−１８２７；ｍｉｒ−１９０８；ｍｉｒ−１９０９；ｍｉｒ−１９１０；ｍｉｒ−１９１１；ｍｉｒ−１９１２；ｍｉｒ−１９１３；ｍｉｒ−１９１４；ｍｉｒ−１９１５；ｍｉｒ−１９７２−１；ｍｉｒ−１９７２−２；ｍｉｒ−１９７３；ｍｉｒ−１９７６；ｍｉｒ−２０５２；ｍｉｒ−２０５３；ｍｉｒ−２０５４；ｍｉｒ−２１１０；ｍｉｒ−２１１３；ｍｉｒ−２１１４；ｍｉｒ−２１１５；ｍｉｒ−２１１６；ｍｉｒ−２１１７；ｍｉｒ−２２７６；ｍｉｒ−２２７７；ｍｉｒ−２２７８；ｍｉｒ−２３５５；ｍｉｒ−２８６１；ｍｉｒ−２９０９；ｍｉｒ−３０６５；ｍｉｒ−３０７４；ｍｉｒ−３１１５；ｍｉｒ−３１１６−１；ｍｉｒ−３１１６−２；ｍｉｒ−３１１７；ｍｉｒ−３１１８−１；ｍｉｒ−３１１８−２；ｍｉｒ−３１１８−３；ｍｉｒ−３１１８−４；ｍｉｒ−３１１８−５；ｍｉｒ−３１１８−６；ｍｉｒ−３１１９−１；ｍｉｒ−３１１９−２；ｍｉｒ−３１２０；ｍｉｒ−３１２１；ｍｉｒ−３１２２；ｍｉｒ−３１２３；ｍｉｒ−３１２４；ｍｉｒ−３１２５；ｍｉｒ−３１２６；ｍｉｒ−３１２７；ｍｉｒ−３１２８；ｍｉｒ−３１２９；ｍｉｒ−３１３０−１；ｍｉｒ−３１３０−２；ｍｉｒ−３１３１；ｍｉｒ−３１３２；ｍｉｒ−３１３３；ｍｉｒ−３１３４；ｍｉｒ−３１３５；ｍｉｒ−３１３６；ｍｉｒ−３１３７；ｍｉｒ−３１３８；ｍｉｒ−３１３９；ｍｉｒ−３１４０；ｍｉｒ−３１４１；ｍｉｒ−３１４２；ｍｉｒ−３１４３；ｍｉｒ−３１４４；ｍｉｒ−３１４５；ｍｉｒ−３１４６；ｍｉｒ−３１４７；ｍｉｒ−３１４８；ｍｉｒ−３１４９；ｍｉｒ−３１５０；ｍｉｒ−３１５１；ｍｉｒ−３１５２；ｍｉｒ−３１５３；ｍｉｒ−３１５４；ｍｉｒ−３１５５；ｍｉｒ−３１５６−１；ｍｉｒ−３１５６−２；ｍｉｒ−３１５６−３；ｍｉｒ−３１５７；ｍｉｒ−３１５８−１；ｍｉｒ−３１５８−２；ｍｉｒ−３１５９；ｍｉｒ−３１６０−１；ｍｉｒ−３１６０−２；ｍｉｒ−３１６１；ｍｉｒ−３１６２；ｍｉｒ−３１６３；ｍｉｒ−３１６４；ｍｉｒ−３１６５；ｍｉｒ−３１６６；ｍｉｒ−３１６７；ｍｉｒ−３１６８；ｍｉｒ−３１６９；ｍｉｒ−３１７０；ｍｉｒ−３１７１；ｍｉｒ−３１７３；ｍｉｒ−３１７４；ｍｉｒ−３１７５；ｍｉｒ−３１７６；ｍｉｒ−３１７７；ｍｉｒ−３１７８；ｍｉｒ−３１７９−１；ｍｉｒ−３１７９−２；ｍｉｒ−３１７９−３；ｍｉｒ−３１８０−１；ｍｉｒ−３１８０−２；ｍｉｒ−３１８０−３；ｍｉｒ−３１８０−４；ｍｉｒ−３１８０−５；ｍｉｒ−３１８１；ｍｉｒ−３１８２；ｍｉｒ−３１８３；ｍｉｒ−３１８４；ｍｉｒ−３１８５；ｍｉｒ−３１８６；ｍｉｒ−３１８７；ｍｉｒ−３１８８；ｍｉｒ−３１８９；ｍｉｒ−３１９０；ｍｉｒ−３１９１；ｍｉｒ−３１９２；ｍｉｒ−３１９３；ｍｉｒ−３１９４；ｍｉｒ−３１９５；ｍｉｒ−３１９６；ｍｉｒ−３１９７；ｍｉｒ−３１９８；ｍｉｒ−３１９９−１；ｍｉｒ−３１９９−２；ｍｉｒ−３２００；ｍｉｒ−３２０１；ｍｉｒ−３２０２−１；ｍｉｒ−３２０２−２；ｍｉｒ−３６０５；ｍｉｒ−３６０６；ｍｉｒ−３６０７；ｍｉｒ−３６０９；ｍｉｒ−３６１０；ｍｉｒ−３６１１；ｍｉｒ−３６１２；ｍｉｒ−３６１３；ｍｉｒ−３６１４；ｍｉｒ−３６１５；ｍｉｒ−３６１６；ｍｉｒ−３６１７；ｍｉｒ−３６１８；ｍｉｒ−３６１９；ｍｉｒ−３６２０；ｍｉｒ−３６２１；ｍｉｒ−３６２２ａ；ｍｉｒ−３６２２ｂ；ｍｉｒ−３６４６；ｍｉｒ−３６４７；ｍｉｒ−３６４８；ｍｉｒ−３６４９；ｍｉｒ−３６５０；ｍｉｒ−３６５１；ｍｉｒ−３６５２；ｍｉｒ−３６５３；ｍｉｒ−３６５４；ｍｉｒ−３６５５；ｍｉｒ−３６５６ｍｉｒ−３６５７；ｍｉｒ−３６５８；ｍｉｒ−３６５９；ｍｉｒ−３６６０；ｍｉｒ−３６６１；ｍｉｒ−３６６２；ｍｉｒ−３６６３；ｍｉｒ−３６６４；ｍｉｒ−３６６５；ｍｉｒ−３６６６；ｍｉｒ−３６６７；ｍｉｒ−３６６８；ｍｉｒ−３６６９；ｍｉｒ−３６７０；ｍｉｒ−３６７０；ｍｉｒ−３６７１；ｍｉｒ−３６７１；ｍｉｒ−３６７３；ｍｉｒ−３６７３；ｍｉｒ−３６７５；ｍｉｒ−３６７５；ｍｉｒ−３６７６；ｍｉｒ−３６６３；ｍｉｒ−３６７７；ｍｉｒ−３６７８；ｍｉｒ−３６７９；ｍｉｒ−３６８０；ｍｉｒ−３６８１；ｍｉｒ−３６８２；ｍｉｒ−３６８３；ｍｉｒ−３６８４；ｍｉｒ−３６８５；ｍｉｒ−３６８６；ｍｉｒ−３６８７；ｍｉｒ−３６８８；ｍｉｒ−３６８９ａ；ｍｉｒ−３６８９ｂ；ｍｉｒ−３６９０；ｍｉｒ−３６９１；ｍｉｒ−３６９２；ｍｉｒ−３７１３；ｍｉｒ−３７１４；ｍｉｒ−３９０７；ｍｉｒ−３９０８；ｍｉｒ−３９０９；ｍｉｒ−３９１０−１；ｍｉｒ−３９１０−２；ｍｉｒ−３９１１；ｍｉｒ−３９１２；ｍｉｒ−３９１３−１；ｍｉｒ−３９１３−２；ｍｉｒ−３９１４−１；ｍｉｒ−３９１４−２；ｍｉｒ−３９１５；ｍｉｒ−３９１６；ｍｉｒ−３９１７；ｍｉｒ−３９１８；ｍｉｒ−３９１９；ｍｉｒ−３９２０；ｍｉｒ−３９２１；ｍｉｒ−３９２２；ｍｉｒ−３９２３；ｍｉｒ−３９２４；ｍｉｒ−３９２５；ｍｉｒ−３９２６−１；ｍｉｒ−３９２６−２；ｍｉｒ−３９２７；ｍｉｒ−３９２８；ｍｉｒ−３９２９；ｍｉｒ−３９３４；ｍｉｒ−３９３５；ｍｉｒ−３９３６；ｍｉｒ−３９３７；ｍｉｒ−３９３８；ｍｉｒ−３９３９；ｍｉｒ−３９４０；ｍｉｒ−３９４１；ｍｉｒ−３９４２；ｍｉｒ−３９４３；ｍｉｒ−３９４４；ｍｉｒ−３９４５；ｍｉｒ−４２５１；ｍｉｒ−４２５２；ｍｉｒ−４２５３；ｍｉｒ−４２５４；ｍｉｒ−４２５５；ｍｉｒ−４２５６；ｍｉｒ−４２５７；ｍｉｒ−４２５８；ｍｉｒ−４２５９；ｍｉｒ−４２６０；ｍｉｒ−４２６１；ｍｉｒ−４２６２；ｍｉｒ−４２６３；ｍｉｒ−４２６４；ｍｉｒ−４２６５；ｍｉｒ−４２６６；ｍｉｒ−４２６７；ｍｉｒ−４２６８；ｍｉｒ−４２６９；ｍｉｒ−４２７０；ｍｉｒ−４２７１；ｍｉｒ−４２７２；ｍｉｒ−４２７３；ｍｉｒ−４２７４；ｍｉｒ−４２７５；ｍｉｒ−４２７６；ｍｉｒ−４２７７；ｍｉｒ−４２７８；ｍｉｒ−４２７９；ｍｉｒ−４２８０；ｍｉｒ−４２８１；ｍｉｒ−４２８２；ｍｉｒ−４２８３−１；ｍｉｒ−４２８３−２；ｍｉｒ−４２８４；ｍｉｒ−４２８５；ｍｉｒ−４２８６；ｍｉｒ−４２８７；ｍｉｒ−４２８８；ｍｉｒ−４２８９；ｍｉｒ−４２９０；ｍｉｒ−４２９１；ｍｉｒ−４２９２；ｍｉｒ−４２９３；ｍｉｒ−４２９４；ｍｉｒ−４２９５；ｍｉｒ−４２９６；ｍｉｒ−４２９７；ｍｉｒ−４２９８；ｍｉｒ−４２９９；ｍｉｒ−４３００；ｍｉｒ−４３０１；ｍｉｒ−４３０２；ｍｉｒ−４３０３；ｍｉｒ−４３０４；ｍｉｒ−４３０５；ｍｉｒ−４３０６；ｍｉｒ−４３０７；ｍｉｒ−４３０８；ｍｉｒ−４３０９；ｍｉｒ−４３１０；ｍｉｒ−４３１１；ｍｉｒ−４３１２；ｍｉｒ−４３１３；ｍｉｒ−４３１４；ｍｉｒ−４３１５−１；ｍｉｒ−４３１５−２；ｍｉｒ−４３１６；ｍｉｒ−４３１７；ｍｉｒ−４３１８；ｍｉｒ−４３１９；ｍｉｒ−４３２０；ｍｉｒ−４３２１；ｍｉｒ−４３２２；ｍｉｒ−４３２３；ｍｉｒ−４３２４；ｍｉｒ−４３２５；ｍｉｒ−４３２６；ｍｉｒ−４３２７；ｍｉｒ−４３２８；ｍｉｒ−４３２９；ｍｉｒ−４３２９；およびｍｉｒ−４３３０。
【０１１９】
本発明は、本明細書記載の細胞集団または構築物から得ることができる細胞由来または分泌ｍｉＲＮＡを含む製剤に関する。あるいは、製剤は、本明細書記載のｍｉＲＮＡ配列を含む核酸分子を含む。一実施形態では、製剤は、天然の腎臓に対し再生効果を与えるために使用できる１つ以上の個別ｍｉＲＮＡを含む。個別ｍｉＲＮＡの組み合わせは、このような効果を与えるのに適切であることができる。例示の組み合わせには、以下のうちの２つ以上が含まれる：ｍｉＲ−２１；ｍｉＲ−２３ａ；ｍｉＲ−３０ｃ；ｍｉＲ−１２２４；ｍｉＲ−２３ｂ；ｍｉＲ−９２ａ；ｍｉＲ−１００；ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ；ｍｉＲ−１９５；ｍｉＲ−１０ａ−５ｐ；およびこれらの任意の組み合わせ。別の例示の組み合わせには、以下のうちの２つ以上が含まれる：ｍｉＲ−３０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−４４９ａ、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−２３ｂ、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１５１、およびこれらの任意の組み合わせ。一実施形態では、ｍｉＲＮＡの組み合わせは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多い個別のｍｉＲＮＡを含み得る。当業者なら、他のｍｉＲＮＡおよびｍｉｒＲＮＡの組み合わせが、本発明での使用に適する可能性があることを理解するであろう。追加のｍｉＲＮＡのソースには、ｈｔｔｐ：／／ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇのｍｉＲＢａｓｅが含まれ、これは、英国マンチェスター大学・生命工学部（Ｆａｃｕｌｔｙ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で運営、維持されている。
【０１２０】
一実施形態では、製剤は、アルファ−１ミクログロブリン、ベータ−２−ミクログロブリン、カルビンジン、クラスタリン、結合組織増殖因子、シスタチン−Ｃ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼアルファ、腎障害分子１、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン、オステオポンチン、トレフォイルファクター３、タムホースフォール尿糖蛋白質、メタロプロテアーゼ１の組織阻害剤、血管内皮細胞増殖因子、フィブロネクチン、インターロイキン−６、単球走化性タンパク質−１、等のパラクリン、および／またはジャクスタクライン因子を含む分泌産物を含む。
【０１２１】
一般的に、パラクリン因子は、短い距離を拡散し、隣接細胞の変化、すなわち、パラクリン相互作用、を誘導するか、または起こさせることができる細胞により合成された分子である。拡散可能分子は、パラクリン因子と呼ばれる。一般的に、ジャクスタクライン因子は、細胞膜のオリゴ糖、脂質、またはタンパク質成分を介して送信される細胞間伝達を促進する分子であり、送信細胞またはそのすぐ隣の細胞に影響を与えることができる。ジャクスタクラインシグナル伝達は、通常、関与する２つの細胞間の物理的接触が関与する。
【０１２２】
さらに別の実施形態では、本発明は、１つ以上の単離された本明細書記載の腎臓細胞由来分泌小胞を含む製剤に関する。当業者なら、分泌小胞を含む種々の型の製剤が適することを理解できるであろう。
【０１２３】
別の態様では、本発明は、腎臓細胞分泌産物、例えば、小胞を含む製剤を調製する方法を提供する。一実施形態では、方法は、１つ以上の富化腎臓細胞集団の混合物を含む腎臓細胞集団を用意するステップを含む。別の実施形態では、方法は、適切な条件下でその集団を培養するステップをさらに含む。その条件は、低酸素条件であり得る。別の実施形態では、方法は、腎臓細胞集団から分泌産物を分離するステップをさらに含む。分泌小胞は、細胞集団の細胞培地から採取してもよい。分泌産物は、単離された後に、本明細書に記載の製剤の一部として使用することができる。もう一つの別の実施形態では、分泌産物を与える腎臓細胞は、酸素レベルに対する生物学的応答である小胞産生および／または分泌を特徴とし、その結果、培養系の酸素圧力の低下が小胞産生および／または分泌の誘導をもたらす。一実施形態では、通常の大気（約２１％）レベルの利用可能酸素で培養した細胞集団に比べて、培養系の利用可能酸素レベルの低下した環境に曝される条件下で細胞集団が培養される場合に、小胞産生および／または分泌が誘導される。一実施形態では、より低酸素条件下で培養した細胞集団は、通常の酸素条件下で培養した細胞集団に比べて、より高いレベルの小胞を産生および／または分泌する。一般的に、低いレベルの利用可能酸素下（低酸素性培養条件とも呼ばれる）での細胞の培養は、低い酸素レベルが、通常の大気レベルの利用可能酸素（正常または正常酸素圧培養条件とも呼ばれる）下での細胞培養に比べて、減らされていることを意味する。一実施形態では、低酸素性細胞培養条件には、約１％酸素未満、約２％酸素未満、約３％酸素未満、約４％酸素未満、または約５％酸素未満での細胞の培養が含まれる。別の実施形態では、正常または正常酸素圧培養条件には、約１０％酸素、約１２％酸素、約１３％酸素、約１４％酸素、約１５％酸素、約１６％酸素、約１７％酸素、約１８％酸素、約１９％酸素、約２０％酸素、または約２１％酸素での細胞の培養が含まれる。好ましい実施形態では、方法は、腎臓細胞からエキソソームおよび／または微小胞の単離を提供する。
【０１２４】
一実施形態では、製剤は、腎臓細胞から分泌される産物を含む。産物は、足場上にない、例えば、細胞が本明細書記載の構築物の一部ではない、腎臓細胞から分泌されてもよい。
【０１２５】
別の実施形態では、製剤は、足場上、例えば、構築物上に播種されている腎臓細胞により分泌される産物を含む。構築物は、足場上またはその中に直接播種されている１つ以上の富化腎臓細胞集団またはそれらの混合物が含まれる。
【０１２６】
別の態様では、本発明は、１つ以上の富化腎臓細胞集団、および処方前の該集団を含む混合物または構築物の生物学的治療効力を選別／最適化／モニタリングするためのインビトロの方法を提供する。一実施形態では、方法は、１つ以上の試験集団、試験混合物または試験構築物（「被検物質」）を用意するステップを含む。別の実施形態では方法は、本明細書記載の適切な条件下で被検物質を培養するステップを含む。もう一つの別の実施形態では、方法は、培養した被検物質から細胞培地を集めるステップを含む。この培地は、「馴化培地」と呼ぶことができ、被検物質の腎臓細胞により分泌された産物を含むことが予期される。
【０１２７】
もう一つの他の態様では、馴化培地を使って、１つ以上のインビトロアッセイを行いい、被検物質の生物学的治療効力を試験することもできる。一実施形態では、馴化培地は、上皮間葉転換（ＥＭＴ）アッセイに供される。このアッセイは、ＴＧＦβ１により誘導されたＥＭＴを試験できる。実施例１８は、このアッセイ用の例となるプロトコルを提供する。
【０１２８】
別の実施形態では、馴化培地は、例えば、ＰＣＲベースアッセイによるＲＮＡの検出、および／または例えば、ＦＡＣＳによる小胞またはエキソソームの検出に供される。もう一つの別の実施形態では、馴化培地は、シグナル伝達経路アッセイ、例えば、免疫応答（例えば、ＮＦκＢ）、線維化反応（ＰＡＩ−１）、および血管新生アッセイに供される。実施例１５〜１７は、これらのアッセイ用の代表的プロトコルを提供する。
【０１２９】
６．使用方法
別の態様では、本発明の製剤は、疾患の処置のために投与できる。例えば、生理活性細胞は、本明細書記載の製剤の一部として天然の臓器に投与できる。一実施形態では、生理活性細胞は、投与の対象である天然の臓器から得ても、または対象となる天然の臓器ではない源から得てもよい。
【０１３０】
一態様では、本発明は、治療を必要としている対象の腎疾患、貧血、またはＥＰＯ欠乏を本明細書記載の腎臓細胞集団および腎臓細胞の混合物を含む製剤により処置する方法を提供する。一実施形態では、方法は、ＥＰＯ産生細胞が富化した第１腎臓細胞集団を含む組成物を含む製剤を対象に投与することを含む。別の実施形態では、第１細胞集団は、ＥＰＯ産生細胞、糸球体細胞、および血管細胞が富化されている。一実施形態では、第１腎臓細胞集団は、Ｂ４’細胞集団である。別の実施形態では、組成物は、１つ以上の追加の腎臓細胞集団をさらに含んでもよい。一実施形態では、追加の細胞集団は、ＥＰＯ産生細胞が富化されていない第２細胞集団である。別の実施形態では、追加の細胞集団は、ＥＰＯ産生細胞、糸球体細胞、または血管細胞が富化されていない第２細胞集団である。別の実施形態では、組成物は、また、本明細書記載の疾患または障害の処置のために、生体材料中に堆積されて、その上に堆積されて、その中に包埋されて、それによりコートされて、その中に懸濁されて、またはその中に捕捉されて本明細書記載の移植可能な構築物を形成する腎臓細胞集団または腎臓細胞混合物を含む。一実施形態では、細胞集団は、単独または他の細胞または生体材料、例えば、ヒドロゲル、多孔性足場、または天然のもしくは合成ペプチドまたはタンパク質と組み合わせて使用し、急性または慢性疾患状態の再生を刺激する。
【０１３１】
別の態様では、本発明の方法による対象の腎疾患、貧血、またはＥＰＯ欠乏の効果的処置は、赤血球生成および／または腎臓機能の種々の指標により観察できる。一実施形態では、赤血球恒常性の指標には、限定されないが、ヘマトクリット（ＨＣＴ）、ヘモグロビン（ＨＢ）、平均赤血球血色素量（ＭＣＨ）、赤血球数（ＲＢＣ）、網状赤血球数、網状赤血球％、平均赤血球容積（ＭＣＶ）、および赤血球分布幅（ＲＤＷ）が含まれる。もう一つの別の実施形態では、腎臓機能の指標には、限定されないが、血清アルブミン、グロブリン対アルブミン比（Ａ／Ｇ比）、血清亜リン酸、血清ナトリウム、腎臓の大きさ（超音波で測定）、血清カルシウム、亜リン酸：カルシウム比、血清カリウム、蛋白尿、尿クレアチニン、血清クレアチニン、血中窒素尿素（ＢＵＮ）、コレステロールレベル、トリグリセリドレベルおよび糸球体濾過率（ＧＦＲ）が含まれる。さらに、総体的な健康および生活の健康度のいくつかの指標には、限定されないが、体重増または減少、生存時間、血圧（平均体血圧、拡張期血圧、または収縮期血圧）、および持久力、が含まれる。
【０１３２】
別の実施形態では、生理活性腎属細胞製剤を用いた有効な処置は、１つ以上の腎臓機能指標の安定化により立証される。腎臓機能の安定化は、本発明の方法により処置されていない対象の同じ指標と比較して、本発明の方法により処置された対象の指標の変化の観察により立証される。あるいは、腎臓機能の安定化は、処置前の同じ対象の同じ指標と比較して、本発明の方法により処置された対象の指標の変化の観察により立証できる。第１の指標の変化は、値の増加でも減少であり得る。一実施形態では、本発明により提供される処置は、対象の血中尿素窒素（ＢＵＮ）レベルの安定化を含み得、この場合、対象の観察ＢＵＮレベルは、本発明の方法により処置されていない類似の疾患状態の対象と比較して、より低い。もう一つの実施形態では、処置は、血清クレアチニンレベルの安定化を含み得、この場合、対象の観察血清クレアチニンレベルは、本発明の方法により処置されていない類似の疾患状態の対象と比較して、より低い。別の実施形態では、処置は、対象のヘマトクリット（ＨＣＴ）レベルの安定化を含み得、この場合、対象の観察ＨＣＴレベルは、本発明の方法により処置されていない類似の疾患状態の対象と比較して、より高い。別の実施形態では、処置は、対象の赤血球（ＲＢＣ）レベルの安定化を含み得、この場合、対象の観察ＲＢＣレベルは、本発明の方法により処置されていない類似の疾患状態の対象と比較して、より高い。当業者には、１つ以上の本明細書記載のまたは当技術分野で既知の追加の指標を測定して対象の腎疾患の効果的な処置を判定できることは理解されよう。
【０１３３】
別の態様では、本発明は、対象において赤血球恒常性を提供する方法における使用のための製剤に関する。一実施形態では、この方法は、（ａ）対象に腎臓細胞集団、例えば、本明細書記載のＢ２もしくはＢ４’、または腎臓細胞混合物、例えば、Ｂ２／Ｂ４’および／またはＢ２／Ｂ３、または、富化腎臓細胞集団を含む製剤を投与するステップ；および（ｂ）対象からの生物試料において、対照の指標レベルに比べて、赤血球生成指標のレベルが異なり、指標レベルの差異が（ｉ）対象が（ａ）の投与ステップに応答していることを示すか、または（ｉｉ）対象の赤血球恒常性を示すことを測定するステップを含む。別の実施形態では、方法は、（ａ）対象に本明細書記載の腎臓細胞集団または腎臓細胞混合物を含む製剤を投与するステップ；および（ｂ）対象由来の生物試料において、対照の指標レベルに比べ赤血球生成指標が異なり、指標レベルの差異が、（ｉ）対象が（ａ）の投与ステップに応答していることを示すか、または（ｉｉ）対象の赤血球恒常性を示すことを測定するステップを含む。別の実施形態では、方法は、（ａ）生体材料または生体適合性高分子足場を用意するステップ；（ｂ）生体材料または足場の上または中に本発明の腎臓細胞集団または腎臓細胞の混合物を本明細書記載の方法で堆積させ、移植可能な構築物を形成するステップ；（ｃ）構築物を含む製剤を調製するステップ；（ｄ）構築物を対象に移植するステップ；および（ｅ）対象からの生物試料において、赤血球生成指標のレベルが対照の指標レベルに比較して異なり、指標レベルの差異が（ｉ）対象が（ａ）の投与ステップに応答していることを示すか、または（ｉｉ）対象の赤血球恒常性を示すことを測定するステップを含む。
【０１３４】
別の態様では、本発明は、腎臓機能の安定化および赤血球恒常性の回復の両方を必要としている対象に提供する方法で使用される製剤に関し、その対象は腎臓機能不足および貧血および／またはＥＰＯ欠乏の両方を有する。一実施形態では、方法は、以下の細胞型のうちの少なくとも１つを含む本明細書記載の腎臓細胞集団または腎臓細胞の混合物を含む製剤を投与するステップを含む：尿細管由来細胞、糸球体由来細胞、間質由来細胞、集合管由来細胞、間質組織由来細胞、または脈管構造から由来の細胞。別の実施形態では、集団または混合物は、ＥＰＯ産生細胞および尿細管上皮細胞の両方を含み、尿細管細胞は、以下のマーカーのうちの少なくとも１つにより特定される：メガリン、キュビリン、ヒアルロン酸シンターゼ２（ＨＡＳ２）、ビタミンＤ３  ２５−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ２Ｄ２５）、Ｎ−カドヘリン（Ｎｃａｄ）、Ｅ−カドヘリン（Ｅｃａｄ）、アクアポリン−１（Ａｑｐ１）、アクアポリン−２（Ａｑｐ２）、ＲＡＢ１７、メンバーＲＡＳ癌遺伝子ファミリー（Ｒａｂ１７）、ＧＡＴＡ結合タンパク質３（Ｇａｔａ３）、ＦＸＹＤドメイン含有イオン輸送制御因子４（Ｆｘｙｄ４）、溶質担体ファミリー９（ナトリウム／水素交換体）、メンバー４（Ｓｌｃ９ａ４）、アルデヒド脱水素酵素３ファミリー、メンバーＢ１（Ａｌｄｈ３ｂ１）、アルデヒド脱水素酵素１ファミリー、メンバーＡ３（Ａｌｄｈ１ａ３）、およびカルパイン−８（Ｃａｐｎ８）。この実施形態では、対象の処置は、未処置対象または対象の処置前指標と比較して、少なくとも１つの赤血球生成指標の改善と同時に、少なくとも１つの腎臓機能の指標の改善により立証されるであろう。
【０１３５】
一態様では、本発明は、本明細書記載のＥＰＯ産生細胞富化腎臓細胞集団またはＥＰＯ産生細胞富化細胞集団を含む腎臓細胞の混合物を投与することにより（ｉ）腎疾患、貧血、またはＥＰＯ欠乏の処置；（ｉｉ）腎臓機能の安定化、（ｉｉｉ）赤血球恒常性の回復、または（ｉｖ）これらのいずれかの組み合わせの方法で使用する製剤を提供し、投与の薬効は、ＥＰＯ産生細胞が富化されていない細胞集団の投与の効果よりも大きい。別の実施形態では、富化細胞集団は、血清血中尿素窒素（ＢＵＮ）レベルを改善する。別の実施形態では、富化細胞集団は、血清中のタンパク質の保持を改善する。別の実施形態では、富化細胞集団は、血清コレステロールおよび／またはトリグリセリドのレベルを改善する。別の実施形態では、富化細胞集団は、ビタミンＤのレベルを改善する。一実施形態では、富化細胞集団は、非富化細胞集団に比べて、リン：カルシウム比率を改善する。別の実施形態では、富化細胞集団は、非富化細胞集団に比べて、ヘモグロビンのレベルを改善する。さらなる実施形態では、富化細胞集団は、非富化細胞集団に比べて、血清クレアチニンのレベルを改善する。さらに別の実施形態では、富化細胞集団は、非富化細胞集団に比べて、ヘマトクリットのレベルを改善する。さらなる実施形態では、富化細胞集団は、非富化細胞集団に比べて、赤血球数（ＲＢＣ＃）のレベルを改善する。一実施形態では、改善レベルのヘマトクリットは、９５％正常な健康レベルに回復される。さらなる実施形態では、富化細胞集団は、非富化細胞集団に比べて、網状赤血球数を改善する。他の実施形態では、富化細胞集団は、非富化細胞集団に比べて、網状赤血球割合を改善する。さらに他の実施形態では、富化細胞集団は、非富化細胞集団に比べて、赤血球容量分布幅（ＲＤＷ）レベルを改善する。さらに別の実施形態では、富化細胞集団は、非富化細胞集団に比べて、ヘモグロビンレベルを改善する。さらに別の実施形態では、富化細胞集団は、骨髄での赤血球造血反応を提供し、それにより、骨髄細胞充実性は正常に近くなり、骨髄：赤血球比率はほぼ正常になる。
【０１３６】
別の態様では、本発明は、富化細胞集団を投与することにより、（ｉ）腎疾患、貧血、またはＥＰＯ欠乏の処置；（ｉｉ）腎臓機能の安定化、（ｉｉｉ）赤血球恒常性の回復、または（ｉｖ）これらの任意の組み合わせの方法で使用する製剤を提供し、本明細書記載の腎臓細胞集団または腎臓細胞の混合物集団の投与の薬効は、組換え型ＥＰＯ（ｒＥＰＯ）の投与による薬効に比較して、赤血球恒常性の改善を特徴とする。一実施形態では、必要としている対象に投与する場合、集団または混合物は、組換え型ＥＰＯタンパク質の投与に比較して、赤血球恒常性を改善する（ヘマトクリット、ヘモグロビン、またはＲＢＣ＃で判定して）。一実施形態では、集団または混合物は、投与された場合、組換え型ＥＰＯに比較して、ヘマトクリット、ＲＢＣ、またはヘモグロビンレベルを改善し、対照のヘマトクリットより約１０％を超えて低くなること、または高くなることはない。さらなる実施形態では、投与する場合、集団または混合物の１回量または送達により、組換え型ＥＰＯタンパク質の１回量または送達により赤血球恒常性が改善される期間を大きく超える期間にわたり、処理対象の赤血球恒常性が改善される（ヘマトクリット、ヘモグロビン、またはＲＢＣ＃の増加で判定して）。別の実施形態では、集団または混合物は、本明細書記載の用量で投与された場合、同等の健康な対照の正常なレベルの約１１０％を越えるヘマトクリット、ヘモグロビン、またはＲＢＣ＃を生じない。さらなる実施形態では、集団または混合物は、本明細書記載の用量で投与された場合、本明細書記載の用量で送達した組換え型ＥＰＯタンパク質に比べて、優れた赤血球恒常性を与える（ヘマトクリット、ヘモグロビン、またはＲＢＣ＃で判定して）。別の実施形態では、組換え型ＥＰＯは、約１００ＩＵ／ｋｇ、約２００ＩＵ／ｋｇ、約３００ＩＵ／ｋｇ、約４００ＩＵ／ｋｇ、または約５００ＩＵ／ｋｇの用量で送達される。当業者なら、当技術分野で既知の組換え型ＥＰＯの他の投与量も適する可能性があることを理解するであろう。
【０１３７】
別の本発明の実施形態は、本明細書記載の富化細胞集団およびそれらの混合物、または本明細書記載の移植可能な構築物、または本明細書記載の分泌産物を含む、少なくとも１つの細胞集団を含む製剤の、必要としている対象の腎疾患、貧血、またはＥＰＯ欠乏の処置に有用な薬物の調製、必要としている対象の赤血球恒常性の提供、必要としている対象の腎臓機能の改善、または天然の腎臓に対する再生効果の提供のための、使用に関する。
【０１３８】
別の本発明の実施形態は、具体的に立証された治療特性に基づく特定細胞亜集団の選択を基準にした特定の病因の腎疾患の処置のための、特定の富化細胞集団（本明細書記載の）を含む製剤に関する。
【０１３９】
さらに別の態様では、本発明は、必要としている対象の腎疾患の処置方法で使用される製剤を提供し、この方法は、単離された、尿細管細胞富化集団を含む１．０４５ｇ／ｍＬ〜１．０５２ｇ／ｍＬの密度の第１細胞集団、Ｂ２、およびエリスロポエチン（ＥＰＯ）産生細胞および血管細胞を含むが、糸球体細胞が枯渇している１．０６３ｇ／ｍＬ〜１．０９１ｇ／ｍＬの密度の第２細胞集団、Ｂ４’を含む哺乳類腎臓細胞の混合物を含む製剤を対象に投与することを含み、混合物は、大きな集合管および尿細管系粒状細胞を含む１．０４５ｇ／ｍｌ未満の密度のＢ１細胞集団、または低粒度および低生存率の壊死組織片および小細胞を含む１．０９１ｇ／ｍｌ超の密度のＢ５細胞集団を含まない。ある特定の実施形態では、方法は、腎臓機能指標レベルが、対照の指標レベルに比べて、異なり、指標レベルの差異が、対象の１つ以上の腎臓機能の低下の減少、安定化、または改善を示す対象由来の試験試料の測定を含む。一実施形態では、その方法で使用されるＢ４’細胞集団は、血管マーカーの発現を特徴とする。ある特定の実施形態では、その方法で使われるＢ４’細胞集団は、糸球体マーカーの発現を特徴としない。一実施形態では、その方法で使われる細胞の混合物は、酸素で調節可能なエリスロポエチン（ＥＰＯ）発現ができる。ある特定の実施形態では、本発明の方法により処置される腎疾患は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）欠乏が付随する。ある特定の実施形態では、ＥＰＯ欠乏は、貧血である。いくつかの実施形態では、ＥＰＯ欠乏または貧血は、対象の腎不全に引き続いて発生する。いくつかの実施形態では、ＥＰＯ欠乏または貧血は、慢性腎不全、原発性ＥＰＯ欠乏、化学療法もしくは抗ウイルス療法、非骨髄性癌、ＨＩＶ感染症、肝臓疾患、心臓不全、関節リウマチ、または多臓器不全からなる群より選択される障害に引き続いて起こる。ある特定の実施形態では、その方法で使用される組成物は、１つ以上の生体適合性合成高分子および／または天然タンパク質またはペプチドを含む生体材料をさらに含み、その混合物は、生体材料でコートされ、その上にまたは中に堆積され、その中に捕捉され、その中に懸濁され、その中に包埋され、および／または他の方法でそれと組み合わされる。特定の実施形態では、本発明の製剤で使用される混合物は、哺乳類腎組織または培養哺乳類腎臓細胞由来である。他の実施形態では、混合物は、必要としている対象に対し自己である腎臓試料由来である。一実施形態では、試料は、腎生検である。他の実施形態では、製剤は、非自己腎臓試料由来の混合物を含む。
【０１４０】
さらに別の態様では、本発明は、治療を必要としている対象の腎疾患、貧血またはＥＰＯ欠乏の処置に有用である薬物の調製のための、本明細書記載の細胞調製物および混合物または本発明の移植可能な構築物を含む製剤の使用を提供する。
【０１４１】
別の態様では、本発明は、治療を必要としている対象の天然の腎臓の再生のための方法で使用する製剤を提供する。一実施形態では、方法は、本明細書記載の細胞集団、混合物、または構築物を対象に投与または移植するステップを含む。再生天然の腎臓は、天然の腎臓の機能または能力の発生、天然の腎臓の機能または能力の改善、およびある特定の天然の腎臓マーカーの発現（これらに限定されない）を含むいくつかの指標を特徴とすることができる。一実施形態では、機能または能力の発生または改善は、上述の赤血球恒常性および腎臓機能の種々の指標に基づいて観察することができる。別の実施形態では、再生腎臓は、１つ以上の幹細胞マーカーの差異発現を特徴とする。幹細胞マーカーは、以下のうちの１つ以上であり得る：ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）−ｂｏｘ２（Ｓｏｘ２）；未分化胚細胞転写因子（ＵＴＦ１）；マウス由来Ｎｏｄａｌホモログ（ＮＯＤＡＬ）；プロミニン１（ＰＲＯＭ１）またはＣＤ１３３（ＣＤ１３３）；ＣＤ２４；およびこれらの任意の組み合わせ（Ｄａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７号を参照。本特許は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。別の実施形態では、幹細胞マーカーの発現は、対照に比べ、上方調節されている。
【０１４２】
富化細胞集団およびそれらの混合物ならびにそれらを含む構築物を含む本明細書記載の細胞集団を使用して、天然の腎臓に対し再生効果を与えることができる。その効果は、細胞それ自体によって、および／または細胞からの分泌産物によって提供され得る。再生効果は、１つ以上の以下のうちの１つ以上を特徴とし得る：上皮間葉転換の減少（ＴＧＦ−βシグナル伝達の減弱を介し得る）；腎臓線維形成の減少；腎臓炎症の減少；天然の腎臓の幹細胞マーカーの差異発現；移植細胞および／または天然の細胞の腎損傷部位、例えば、尿細管傷害部位への移行、腎損傷部位、例えば、尿細管傷害部位での移植細胞の生着；１つ以上の腎臓機能指標の安定化（本明細書記載の）；赤血球恒常性の回復（本明細書記載の）；およびこれらの任意の組み合わせ。
【０１４３】
７．再生をモニタリングする方法
別の態様では、本発明は、本明細書記載の細胞集団、混合物、または構築物を含む製剤の対象への投与または移植後の天然の腎臓の再生をモニタリングするための予後徴候予測方法を提供する。一実施形態では、方法は、対象由来試験試料および対照試料中のマーカー発現レベルを検出するステップを含み、対照試料に比べてより高いレベルの試験試料中のマーカーの発現は、対象の天然の腎臓の再生の予後徴候となる。別の実施形態では、方法は、試料中の１つ以上の幹細胞マーカーの発現の検出を含む。幹細胞マーカーは、Ｓｏｘ２；ＵＴＦ１；ＮＯＤＡＬ；ＣＤ１３３；ＣＤ２４；およびこれらの任意の組み合わせから選択できる（Ｉｌａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７号の実施例１１参照）。検出ステップは、幹細胞マーカーの発現が上方調節されているか、または対照試料に比べ試験試料中で高いことを測定することを含み得、より高いレベルの発現は、対象の天然の腎臓再生の予後徴候となる。もう一つの別の実施形態では、幹細胞マーカーのｍＲＮＡ発現が検出される。他の実施形態では、ｍＲＮＡ発現の検出は、ＰＣＲベース方法、例えば、ｑＲＴ−ＰＣＲによることができる。インサイツハイブリダイゼーションもまた、ｍＲＮＡ発現の検出に使用できる。別の実施形態では、また、幹細胞マーカーのポリペプチド発現を、抗幹細胞マーカー試薬を使って検出できる。もう一つの別の実施形態では、試薬は、マーカーに対する抗体である。別の実施形態では、幹細胞マーカーポリペプチド発現は、免疫組織化学またはウェスタンブロットを使って検出される。当業者なら、マーカーのｍＲＮＡおよび／またはポリペプチド発現を検出する他の方法が解るであろう。
【０１４４】
別の態様では、本発明は、本明細書記載の細胞集団、混合物、または構築物を含む製剤の移植または投与後の患者の予後評価の方法を提供する。一実施形態では、方法は、（ａ）前記対象から採取した試験試料のマーカー発現のレベルの検出ステップ；（ｂ）対照試料に対するマーカー発現のレベル（または制御基準値）と比較した試験試料中の発現レベルを決定するステップ；および（ｃ）マーカー発現レベルの測定に基づいて患者の再生予後徴候を予測するステップを含み、対照試料（または制御基準値）に比べて、試験試料のマーカーのより高いレベルの発現は、対象の再生に対する予後徴候である。
【０１４５】
もう一つの態様では、本発明は、本明細書記載の細胞集団、混合物、または構築物を含む製剤の対象への投与または移植後の天然の腎臓の再生のモニタリングを使った非侵襲的方法による予後予測方法を提供する。組織生検の代替として、処置を受けている対象の再生結果は、体液、例えば、尿の検査から評価できる。対象由来の尿源から採取した微小胞は、限定されないが、特異的タンパク質および本発明の細胞集団による処置により影響を受けた腎臓細胞集団から最終的に誘導されるｍｉＲＮＡ等の、ある特定の成分を含むことが明らかになった。これらの成分は、幹細胞複製および分化、アポトーシス、炎症ならびに免疫調節に関与する因子を含む可能性がある。微小胞関連ｍｉＲＮＡ／タンパク質発現パターンの経時的分析は、本発明の細胞集団、混合物、または構築物を受けている対象の腎臓内の再生結果の連続モニタリングを可能とする。実施例１９は、対象の尿の分析用の例となるプロトコルについて記載する。
【０１４６】
これらの対象の腎臓由来小胞および／または腎臓由来小胞の尿中流入内腔含有物は、再生結果を示すバイオマーカーのために分析することができる。
【０１４７】
一実施形態では、本発明は、腎疾患（ＫＤ）患者が治療製剤による処置に反応するかどうかを評価する方法を提供する。方法は、対照試料中の小胞の量と比較またはそれに対して、治療薬で処置したＫＤ患者由来の試験試料中の小胞またはその内腔含有物の量の測定または検出するステップ、を含むことができ、対照試料中の小胞またはその内腔含有物の量に比べて、より高いまたはより低い試験試料中の小胞またはその内腔含有物の量は、処置患者の治療薬による処置に対する応答性を示す。
【０１４８】
また、本発明は、ＫＤ患者の治療薬による処置の効力のモニタリング方法を提供する。一実施形態では、方法は、対照試料中の小胞またはその内腔含有物の量に比べて、またはそれに対して、治療薬で処置したＫＤ患者由来の試験試料中の小胞の量を測定または検出するステップを含み、対照試料中の小胞またはその内腔含有物の量に比較して、より高いまたはより低い試験試料中の小胞またはその内腔含有物の量は、ＫＤ患者における治療薬による処置の効力の指標となる。
【０１４９】
本発明は、試薬が腎疾患（ＫＤ）の処置に有効である患者亜集団を特定する方法を提供する。一実施形態では、方法は、試薬の効力と、対照試料由来の試料中の小胞またはその内腔含有物の量と比較した、患者亜集団由来の試料中の小胞の量の存在の間の相関を判定するステップを含み、対照試料中の小胞またはその内腔含有物の量と比較して、患者亜集団由来試料中のより高いまたはより低い小胞またはその内腔含有物の量は、試薬が患者亜集団中のＫＤを処置するのに有効であるという指標となる。
【０１５０】
測定または検出ステップは、試験試料中に存在する可能性のあるｍｉＲＮＡまたは他の分泌産物の量を分析することを含み得る（実施例１９参照）。
【０１５１】
非侵襲的予後推定方法は、本明細書記載の細胞集団、混合物、または構築物の投与または移植前および／または後に対象から尿試料を採取するステップを含み得る。小胞および他の分泌産物は、望ましくない壊死組織片を除去する遠心分離（これに限定されない）を含む標準的な方法を使って尿試料から単離できる（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．２００８．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．７４（５）：６１３−６２１；Ｓｋｏｇ  ｅｔ  ａｌ．米国特許公開第２０１１００５３１５７号：これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１５２】
本発明は、処置後の対象の再生結果を検出する非侵襲的方法に関する。方法は、処置対象由来の尿中の小胞またはその内腔含有物の検出を含む。内腔含有物は、１つ以上のｍｉＲＮＡであり得る。個別の組み合わせまたはパネルｍｉＲＮＡの検出は、このような予後推測方法に対し適切であり得る。代表的組み合わせには、以下のうちの２つ以上の組み合わせが含まれる：ｍｉＲ−２４；ｍｉＲ−１９５；ｍｉＲ−８７１；ｍｉＲ−３０ｂ−５ｐ；ｍｉＲ−１９ｂ；ｍｉＲ−９９ａ；ｍｉＲ−４２９；ｌｅｔ−７ｆ；ｍｉＲ−２００ａ；ｍｉＲ−３２４−５ｐ；ｍｉＲ−１０ａ−５ｐ；およびこれらの任意の組み合わせ。一実施形態では、ｍｉＲＮＡの組み合わせは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、またはそれ超の個別ｍｉＲＮＡを含み得る。当業者なら、他のｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの組み合わせでも、このような予後推測方法の使用に適する可能性があることを理解するであろう。さらなるｍｉＲＮＡの源には、ｈｔｔｐ：／／ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇのｍｉＲＢａｓｅが含まれ、これは、英国マンチェスター大学・生命工学部（Ｆａｃｕｌｔｙ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で運営、維持されている。
【０１５３】
当業者なら、この再生を検出する予後予測方法は、本明細書記載の細胞集団および構築物とは別に、当技術分野で既知の他の治療薬で処置された対象に適する可能性があることを理解するであろう。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、決定ステップは、（ｉ）試験試料および対照中のマーカー発現（または小胞／小胞含有物）の差異レベルの測定；および／または（ｉｉ）試験試料および対照中のマーカー発現の差異レベルの測定から得たデータの解析の目的のために、適切なプロセッサにより実行されるソフトウェアプログラムの使用を含む。適切なソフトウェアおよびプロセッサは、当技術分野でよく知られており、市販品として利用可能である。プログラムは、有形媒体、例えば、ＣＤ−ＲＯＭ、フロッピーディスク、ハードディスク、ＤＶＤ、またはプロセッサに付属のメモリーに保存されたソフトウェア中に組み込まれてもよいが、当業者なら、全体プログラムまたはその一部は、プロセッサ以外の装置、および／またはファームウェア中に組み込まれた装置および／または専用ハードウェアを使って、よく知られた方法で、代替法として実行できることが容易に解るであろう。
【０１５５】
決定ステップ後、測定結果、所見、診断、予測および／または処置提案が、通常記録され、例えば、技師、医師および／または患者に連絡される。特定の実施形態では、コンピュータを使って、このよう情報を関係者、例えば、患者および／または主治医に連絡する。いくつかの実施形態では、診断結果が連絡される国または管轄区域とは異なる国または管轄区域で、アッセイが行われるか、またはアッセイ結果が解析される。
【０１５６】
好ましい実施形態では、マーカー発現レベルの差異を有する試験対象で測定されたマーカー発現のレベルに基づく予後、予測、および／または処置提案は、アッセイの完了および予後および／または予測生成後すぐに対象に連絡される。結果および／または関連情報は、対象の治療医師により対象に連絡され得る。あるいは、結果は、文書、電子形式通信、例えば、電子メール、または電話、等の任意の連絡手段で試験対象に直接連絡してもよい。連絡は、例えば、電子メールコミュニケーションの場合のように、コンピュータを使って円滑化され得る。ある特定の実施形態では、電気通信の専門家にはよく知られているコンピュータハードとソフトの組み合わせを使って、予後徴候試験結果および／または試験から得た結論および／または処置提案を含む連絡が自動的に生成され、対象に送付される。健康管理指向コミュニケーション系の一例が、米国特許第６，２８３，７６１号に記載されている。しかし、本発明は、この特定のコミュニケーション系を使う方法に限定されない。本発明の方法の、ある特定の実施形態では、試料のアッセイ、再生の予後および／または予測、ならびにアッセイ結果または予後の連絡を含む全てまたは一部の方法のステップは、多様な（例えば、外国の）管轄区域で行うことができる。
【０１５７】
別の態様では、本明細書記載の予後予測方法は、移植または投与による再生の成功に関する情報を関係者に提供する。
【０１５８】
全ての実施形態では、本明細書記載の処置を必要としている対象に再生腎臓を提供する方法には、上述の移植後の再生予後評価のステップを含んでもよい。
【０１５９】
８．生理活性細胞製剤
本明細書記載の製剤は、対象に投与される活性薬剤、例えば、生理活性腎臓細胞に対し好ましい環境を作り出す特性を有する生体用材料を組み込む。一実施形態では、製剤は、活性薬剤が生体用材料で処方される時間から対象へ投与の時点まで、好ましい環境を提供する第１の生体用材料を含む。他の一実施形態では、好ましい環境は、対象への投与の前に液体中の細胞に比べて（本明細書記載のように）、実質的に固体状態中に懸濁された生理活性細胞を有することの利益に関係する。別の実施形態では、第１の生体用材料は、温度感受性生体用材料である。温度感受性生体用材料は、（ｉ）約８℃以下で実質的に固体状態、および（ｉｉ）外界温度以上で実質的に液体状態でありうる。一実施形態では、外界温度は、およそ室温である。
【０１６０】
別の態様では、製剤は、処方時間から対象への投与後の時点まで、組み合わされた細胞に好ましい環境を与える第２の生体用材料と組み合わされた生理活性細胞を含む。一実施形態では、第２の生体用材料により与えられる好ましい環境は、対象への投与の時点までおよび投与後の期間のあいだ、構造健全性を保持する生体用材料中の細胞を投与することの利益に関係する。一実施形態では、移植後の第２の生体用材料の構造健全性は、分単位、時間単位、日単位、または週単位の長さである。一実施形態では、構造健全性は、１ヶ月未満、１週間未満、１日未満、または１時間未満である。相対的に短い期間の構造健全性は、活性薬剤および生体用材料を組織または臓器内の標的部位に、制御された処理、配置または分布を伴って、組み込まれた成分と、それが配置される組織または臓器との相互作用に対する障害または障壁とならずに、送達できる製剤を提供する。
【０１６１】
別の実施形態では、第２の生体用材料は、第１の生体用材料とは異なる感受性を有する温度感受性生体用材料である。第２の生体用材料は、（ｉ）およそ外界温度以下で実質的に固体状態、および（ｉｉ）約３７℃以上で実質的に液体状態でありうる。一実施形態では、外界温度は、およそ室温である。
【０１６２】
一実施形態では、第２の生体用材料は、架橋ビーズである。架橋ビーズは、本明細書記載のように、架橋度に依存して微調整可能なインビボ滞留時間を持つことができる。別の実施形態では、架橋ビーズは、生理活性細胞を含み、本明細書記載のように、酵素分解に対し抵抗性である。
【０１６３】
本発明の製剤は、活性薬剤、例えば、生理活性細胞と組み合わせた第２の生体用材料を含むか、または含まないで、活性薬剤、例えば、生理活性細胞と組み合わせて第１の生体用材料を含んでもよい。製剤が第２の生体用材料を含む場合は、それは、温度感受性ビーズおよび／または架橋ビーズであり得る。種々の代表的製剤が以下の実施例で提供される（図３〜７も参照）。
【０１６４】
本明細書記載の生理活性細胞調製物、混合物、および／または構築物は、生理活性細胞製剤として投与できる。一態様では、製剤は、細胞および本明細書記載の生理活性細胞調製物、混合物、および／または構築物に対し安定性を与える１つ以上の生体用材料を含む。一実施形態では、生体用材料は、温度に依存して少なくとも２つの異なる相または状態を保持できる温度感受性生体用材料である。生体用材料は、第１の温度で第１の状態を、第２の温度で第２の状態を、および／または第３の温度で第３の状態を維持できる。第１、第２、または第３の状態は、実質的に固体、実質的に液体、または実質的に半固形もしくは半液体状態であり得る。一実施形態では、生体用材料は、第１の温度で第１の状態、第２の温度で第２の状態を有し、第１の温度は、第２の温度より低い。
【０１６５】
他の一実施形態では、温度感受性生体用材料の状態は、約８℃以下の温度で実質的に固体状態である。他の実施形態では、実質的に固体状態は、約１℃、約２℃、約３℃、約４℃、約５℃、約６℃、約７℃、または約８℃で維持される。一実施形態では、実質的に固体状態は、ゲルの形態である。他の実施形態では、温度感受性生体用材料の状態は、外界温度以上で実質的に液体状態である。一実施形態では、実質的な液体状態は、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、または約３７℃で維持される。一実施形態では、外界温度はおよそ室温である。
【０１６６】
別の実施形態では、温度感受性生体用材料の状態は、およそ外界温度以下の温度で実質的に固体状態である。一実施形態では、外界温度は、およそ室温である。別の実施形態では、実質的な固体状態は、約１７℃、約１６℃、約１５℃、約１４℃、約１３℃、約１２℃、約１１℃、約１０℃、約９℃、約８℃、約７℃、約６℃、約５℃、約４℃、約３℃、約２℃、または約１℃で維持される。一実施形態では、実質的な固体状態は、ビーズの形態である。別の実施形態では、温度感受性生体用材料の状態は、約３７℃以上の温度で実質的に液体状態である。他の一実施形態では、実質的な固体状態は、約３７℃、約３８℃、約３９℃、または約４０℃で維持される。
【０１６７】
温度感受性生体用材料は、溶液の形態で、ビーズの形態で、または本明細書記載の、および／または当業者に既知の他の適切な形態で、提供できる。本明細書記載の細胞集団および調製物は、温度感受性生体用材料でコートしても、その上に堆積させても、その中に埋め込まれても、それに接着させても、それに播種しても、その中に懸濁させても、またはその中に封入されてもよい。あるいは、温度感受性生体用材料は、何らの細胞も含まず、例えば、スペーサービーズの形態で、提供できる。
【０１６８】
他の実施形態では、温度感受性生体用材料は、第１の状態と第２の状態の間で遷移状態を有する。一実施形態では、遷移状態は、約８℃の温度およびおよその外界温度の間での固体−液体遷移状態である。一実施形態では、外界温度は、およそ室温である。他の一実施形態では、固体−液体遷移状態は、約８℃、約９℃、約１０℃、約１１℃、約１２℃、約１３℃、約１４℃、約１５℃、約１６℃、約１７℃、および約１８℃の内の１つ以上の温度で起こる。
【０１６９】
温度感受性生体用材料は、所与の温度でのセンチポイズ（ｃＰ）で測定される特定の粘度を有する。一実施形態では、生体用材料は、２５℃で、約１ｃＰ〜約５ｃＰ、約１．１ｃＰ〜約４．５ｃＰ、約１．２ｃＰ〜約４ｃＰ、約１．３ｃＰ〜約３．５ｃＰ、約１．４ｃＰ〜約３．５ｃＰ、約１．５ｃＰ〜約３ｃＰ、約１．５５ｃＰ〜約２．５ｃＰ、または約１．６ｃＰ〜約２ｃＰの粘度を有する。別の実施形態では、０．７５％（ｗ／ｖ）溶液は、３７℃で、約１．０ｃＰ〜約１．１５ｃＰの粘度を有する。３７℃での粘度は、約１．０ｃＰ、約１．０１ｃＰ、約１．０２ｃＰ、約１．０３ｃＰ、約１．０４ｃＰ、約１．０５ｃＰ、約１．０６ｃＰ、約１．０７ｃＰ、約１．０８ｃＰ、約１．０９ｃＰ、約１．１０ｃＰ、約１．１１ｃＰ、約１．１２ｃＰ、約１．１３ｃＰ、約１．１４ｃＰ、または約１．１５ｃＰであり得る。他の一実施形態では、生体用材料は、ゼラチン溶液である。ゼラチンは、溶液中に、（ｗ／ｖ）で、約０．５％、約０．５５％、約０．６％、約０．６５％、約０．７％、約０．７５％、約０．８％、約０．８５％、約０．９％、約０．９５％または約１％、の濃度で存在する。一例では、生体用材料は、ＰＢＳ中の０．７５％（ｗ／ｖ）ゼラチン溶液である。一実施形態では、０．７５％（ｗ／ｖ）溶液は、２５℃での粘度が、約１．６ｃＰ〜約２ｃＰである。一実施形態では、０．７５％（ｗ／ｖ）溶液は、３７℃での粘度が、約１．０７ｃＰ〜約１．０８ｃＰである。ゼラチン溶液は、ＰＢＳ、ＤＭＥＭ、または別の適切な溶媒中で提供され得る。
【０１７０】
一態様では、生理活性細胞製剤は、また、細胞生存薬剤を含む。一実施形態では、細胞生存薬剤は、抗酸化剤、酸素担体、免疫調節因子、細胞動員因子、細胞付着因子、抗炎症剤、血管新生因子、創傷治癒因子、および生理活性細胞分泌産物からなる群より選択される。
【０１７１】
抗酸化剤は、他の分子の酸化を阻害する能力を特徴とする。抗酸化剤には、限定されないが、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸（トロロクス（登録商標））、カロテノイド、フラボノイド、イソフラボン、ユビキノン、グルタチオン、リポ酸、超酸化物ジスムターゼ、アスコルビン酸、ビタミンＥ、ビタミンＡ、混合カロテノイド（例えば、ベータカロチン、アルファカロチン、ガンマカロチン、ルテイン、リコペン、フィトエン、フィトフルエン、およびアスタキサンチン）、セレン、コエンザイムＱ１０、インドール−３−カルビノール、プロアントシアニジン、リスベラトロール、ケルセチン、カテキン、サリチル酸、クルクミン、ビリルビン、シュウ酸、フィチン酸、リポ酸、バニリン酸、ポリフェノール、フェルラ酸、テアフラビン、およびこれらの誘導体のうちの１つ以上が含まれる。当業者なら、本発明で使用できる他の適切な抗酸化剤を理解するであろう。
【０１７２】
酸素担体は、酸素を運び、放出する能力を特徴とする薬剤である。それらには、限定されないが、パーフルオロカーボンおよびパーフルオロカーボン含有医薬品が含まれる。適切なパーフルオロカーボンベースの酸素担体には、限定されないが、ペルフルオロオクチルブロミド（Ｃ８Ｆ１７Ｂｒ）；ペリフルオロジクロロオクタン（ｐｅｒｆｌｕｏｒｏｄｉｃｈｏｒｏｔａｎｅ）（Ｃ８Ｆ１６Ｃｌ２）；ペルフルオロデシルブロミド；ペルフルブロン；パーフルオロデカリン；ペルフルオロトリポピルアミン；ペルフルオロメチルシクロピペリジン；Ｆｌｕｏｓｏｌ（登録商標）（パーフルオロデカリン＆ペルフルオロトリポピルアミン）；Ｐｅｒｆｔｏｒａｎ（登録商標）（パーフルオロデカリン＆ペルフルオロメチルシクロピペリジン）；Ｏｘｙｇｅｎｔ（登録商標）（ペルフルオロデシルブロミド＆ペルフルブロン）；Ｏｃｙｃｙｔｅ（登録商標）（ペルフルオロ（ｔｅｒｔ−ブチルシクロヘキサン））が含まれる。当業者なら、本発明で使用できる他の適切なパーフルオロカーボンベースの酸素担体を理解するであろう。
【０１７３】
免疫調節因子には、限定されないが、オステオポンチン、ＦＡＳリガンド因子、インターロイキン、形質転換増殖因子ベータ、血小板由来増殖因子、クラスタリン、トランスフェリン；作用時調節正常Ｔ細胞発現分泌タンパク質（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｕｐｏｎ  ａｃｔｉｏｎ、ｎｏｒｍａｌ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ、ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ランテス（ＲＡＮＴＥＳ））、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１（Ｐａｉ−１）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦアルファ）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、アルファ−１ミクログロブリン、およびベータ−２−ミクログロブリン、が含まれる。当業者なら、本発明で使用できる他の適切な免疫調節因子を理解するであろう。
【０１７４】
抗炎症剤または免疫抑制剤（下に記載）も製剤の一部になりうる。当業者なら、本発明で使用できる他の適切な抗酸化剤を理解するであろう。
【０１７５】
細胞動員因子には、限定されないが、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）、およびＣＸＣＬ−１が含まれる。当業者なら、本発明で使用できる他の適切な細胞動員因子を理解するであろう。
【０１７６】
細胞付着因子には、限定されないが、フィブロネクチン、プロコラーゲン、コラーゲン、ＩＣＡＭ−１、結合組織増殖因子、ラミニン、プロテオグリカン、ＲＧＤおよびＹＳＩＧＲ等の特定細胞接着ペプチドが含まれる。当業者なら、本発明で使用できる他の適切な細胞付着因子を理解するであろう。
【０１７７】
血管新生因子には、限定されないが、マトリックスメタロプロテアーゼ１（ＭＭＰ１）、マトリックスメタロプロテアーゼ２（ＭＭＰ−２）、血管内皮細胞増殖因子Ｆ（ＶＥＧＦ）、マトリックスメタロプロテアーゼ９（ＭＭＰ−９）、またはメタロプロテアーゼ−１の組織阻害剤（ＴＩＭＰ−１）、血管内皮細胞増殖因子Ｆ（ＶＥＧＦ）、アンジオポエチン−２（ＡＮＧ−２）が含まれる。当業者なら、本発明で使用できる他の適切な血管新生因子を理解するであろう。
【０１７８】
創傷治癒因子には、限定されないが、ケラチノサイト増殖因子１（ＫＧＦ−１）、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）、カルビンジン、クラスタリン、シスタチンＣ、トレフォイルファクター３が含まれる。当業者なら、本発明で使用できる他の適切な創傷治癒因子を理解するであろう。
【０１７９】
本明細書記載の生理活性細胞からの分泌産物は、また、細胞生存薬剤として生理活性細胞製剤に添加できる。
【０１８０】
他の一態様では、製剤は、本明細書記載の温度感受性生体用材料および生体用材料含有生体適合性ビーズの集団を含む。一実施形態では、ビーズは、架橋される。架橋は、当業者に既知のいずれかの適切な架橋剤を使って実現できる。適切な架橋剤には、例えば、カルボジイミド；アルデヒド（例えば、フルフラル、アクロレイン、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、グリセリルアルデヒド）、スクシンイミドベース架橋剤｛ビス（スルホスクシンイミジル）スベラート（ＢＳ３）、ジスクシンイミジルグルタラート（ＤＳＧ）、ジスクシンイミジルスベラート（ＤＳＳ）、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオナート）、エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシナート）、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシナート）（ＥＧＳ）、ビス（スルホスクシンイミジル）グルタラート（ＢＳ２Ｇ）、ジスクシンイミジルタルトラート（ＤＳＴ）｝；エポキシド（エチレングリコールジグリシジルエーテル、１、４ブタンジオールジグリシジルエーテル）；サッカライド（グルコースおよびアルドース糖）；スルホン酸およびｐ−トルエンスルホン酸；カルボニルジイミダゾール；ゲニピン；イミン；ケトン；ジフェニルホスホリルアジド（ＤＤＰＡ）；テレフタロイルクロリド；セリウム（ＩＩＩ）ニトラート六水和物；微生物トランスグルタミナーゼ；ならびに水素ペルオキシドが含まれる。当業者なら、本発明で使用できる他の適切な架橋剤および架橋方法を理解するであろう。
【０１８１】
一実施形態では、ビーズは、カルボジイミド架橋ビーズである。カルボジイミド架橋ビーズは、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、ＤＣＣ−Ｎ、Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、およびＮ、Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）、からなる群より選択されるカルボジイミドで架橋できる。低濃度のＥＤＣで処理されたビーズは、多い数の遊離一級アミンを持つことが予想され、一方、高濃度の架橋剤で処理された試料は、大部分の一級アミンがアミド結合に関与するであろう。一級アミンおよびピクリルスルホン酸の間の共有結合により発色した、分光測定を使って３３５ｎｍで検出可能なオレンジ色の強度は、試料の中に存在する一級アミンの数に比例する。試料中に存在するミリグラム当たりのタンパク質で正規化すると、存在する遊離アミンの数および架橋に使用したＥＤＣの初期濃度の間に逆相関が観察できる。この結果は、反応に使ったカルボジイミドの量により規定される異なるビーズ架橋度を示す。一般的に、架橋ビーズは、非架橋ビーズに比べ、遊離一級アミンの数の減少を示す。遊離一級アミンの数は、分光測定を使って約３３５ｎｍで検出できる。
【０１８２】
架橋ビーズは、非架橋生体適合性ビーズに比べて、酵素分解に対する感受性が減少し、それにより、ビーズに微調整可能なインビボ滞留時間を与える。例えば、架橋ビーズは、内在性酵素、例えば、コラゲナーゼに対し抵抗性である。架橋ビーズの供給は：（ａ）接着細胞の所望の部位への送達および天然の組織の再生と内方成長および血管供給用の空隙の生成；（ｂ）その部位で、それらの微小環境の確立、機能、再構築を細胞に対し可能とし、また、それら自身の細胞外のマトリックス（ＥＣＭ）を分泌させるのに充分長い持続能力；（ｃ）移植細胞の周辺組織との統合の促進；（ｄ）実質的に固体形態で細胞を移植する能力；（ｅ）送達細胞／材料の組織内方成長または宿主組織との統合に対し顕著な障壁を生じない短期構造健全性；（ｆ）実質的に固体形態で局在性インビボ送達による、移植の間の組織内の細胞の離散の防止；（ｇ）液体中懸濁細胞に比べて、足場依存性細胞の安定性および生存率の改善；および（ｈ）細胞がｉ）実質的に固体形態（例えば、ビーズに接着）、およびｉｉ）実質的に液体形態（例えば、液体中に懸濁）で送達される場合の２相性放出プロファイル；の内の１つ以上を促進する生体用材料の開発と産生に重点を置いた送達システムの一部である。
【０１８３】
一実施形態では、本発明は、ゼラチンを含む架橋ビーズを提供する。非架橋ゼラチンビーズは、生理活性細胞製剤に適しない。その理由は、それらが急速に健全性を失い、細胞が注射部位から散逸するためである。一方、高架橋度ゼラチンビーズは、注射部位で長く持続し過ぎ、新規ＥＣＭ分泌、細胞統合および組織再生を妨げ得る。本発明は、架橋ビーズのインビボ滞留時間の微調整を可能とする。生体用材料の生分解性を目的に合わせるために、カルボジイミドの異なる架橋剤濃度が使用され、一方、全体反応条件は、全試料に対し一定に保持される。例えば、カルボジイミド架橋ビーズの酵素感受性は、架橋剤濃度を約０〜約１Ｍに変えることにより微調整できる。いくつかの実施形態では、その濃度は、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１１ｍＭ、約１２ｍＭ、約１３ｍＭ、約１４ｍＭ、約１５ｍＭ、約１６ｍＭ、約１７ｍＭ、約１８ｍＭ、約１９ｍＭ、約２０ｍＭ、約２１ｍＭ、約２２ｍＭ、約２３ｍＭ、約２４ｍＭ、約２５ｍＭ、約２６ｍＭ、約２７ｍＭ、約２８ｍＭ、約２９ｍＭ、約３０ｍＭ、約３１ｍＭ、約３２ｍＭ、約３３ｍＭ、約３４ｍＭ、約３５ｍＭ、約３６ｍＭ、約３７ｍＭ、約３８ｍＭ、約３９ｍＭ、約４０ｍＭ、約４１ｍＭ、約４２ｍＭ、約４３ｍＭ、約４４ｍＭ、約４５ｍＭ、約４６ｍＭ、約４７ｍＭ、約４８ｍＭ、約４９ｍＭ、約５０ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、約７５ｍＭ、約８０ｍＭ、約８５ｍＭ、約９０ｍＭ、約９５ｍＭ、または約１００ｍＭである。架橋剤濃度は、また、約０．１５Ｍ、約０．２Ｍ、約０．２５Ｍ、約０．３Ｍ、約０．３５Ｍ、約０．４Ｍ、約０．４５Ｍ、約０．５Ｍ、約０．５５Ｍ、約０．６Ｍ、約０．６５Ｍ、約０．７Ｍ、約０．７５Ｍ、約０．８Ｍ、約０．８５Ｍ、約０．９Ｍ、約０．９５Ｍ、または約１Ｍであり得る。別の実施形態では、架橋剤は、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）である。一実施形態では、ＥＤＣ架橋ビーズは、ゼラチンビーズである。図１０は、ゼラチンビーズのＥＤＣ媒介架橋の代表的模式図を示し、図１５は、架橋剤濃度に依存してどのようにビーズの分解％を微調整できるかを示す。
【０１８４】
架橋ビーズは、播種、接着、またはカプセル化を支援する、ある特定の特性を持つことができる。例えば、ビーズは、多孔性表面を有してもよく、および／または実質的に中空であってもよい。気孔の存在は、増加した細胞付着表面を与え、非多孔性または平坦な表面に比べて、より大きな数の細胞の接着を可能とする。さらに、気孔構造は、新規組織の形成を支持する多孔性ビーズとの宿主組織の統合を支援できる。ビーズは、一般粒子分布パターンに対応するワイブルプロットに当てはめることができるサイズ分布を有する。一実施形態では、架橋ビーズは、約１２０μｍ、約１１５μｍ、約１１０μｍ、約１０９μｍ、約１０８μｍ、約１０７μｍ、約１０６μｍ、約１０５μｍ、約１０４μｍ、約１０３μｍ、約１０２μｍ、約１０１μｍ、約１００μｍ、約９９μｍ、約９８μｍ、約９７μｍ、約９６μｍ、約９５μｍ、約９４μｍ、約９３μｍ、約９２μｍ、約９１μｍ、または約９０μｍ未満の平均直径を有する。架橋ビーズの特性は、形成プロセスに依存して変化する。例えば、空気流を使って液体のゼラチン溶液をエアロゾル化し、薄層クロマトグラフィー試薬スプレー（ＡＣＥ  Ｇｌａｓｓｗａｒｅ）により液体窒素中に噴霧するプロセスを使って、前述の特性を有するビーズを得る。当業者なら、形成プロセスのパラメーターを調節することにより、ビーズの異なる特性、例えば、異なるサイズ分布に調整する機会が得られることを理解するであろう。
【０１８５】
最終生理活性細胞製剤に対応する細胞と共にビーズが培養される細胞培養技術を使って架橋ビーズの細胞適合性が、インビトロで調剤する前に評価される。例えば、生理活性の腎臓細胞製剤の調製の前に、ビーズが初代腎臓細胞と共に培養され、ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ細胞アッセイを使って細胞適合性が確認される。
【０１８６】
特定の製剤では、生体適合性架橋ビーズは、約５％（ｗ／ｗ）〜約１５％（ｗ／ｗ）で、温度感受性生体用材料溶液と組み合わされる。架橋ビーズは、溶液の量の約５％（ｗ／ｗ）、約５．５％（ｗ／ｗ）、約６％（ｗ／ｗ）、約６．５％（ｗ／ｗ）、約７％（ｗ／ｗ）、約７．５％（ｗ／ｗ）、約８％（ｗ／ｗ）、約８．５％（ｗ／ｗ）、約９％（ｗ／ｗ）、約９．５％（ｗ／ｗ）、約１０％（ｗ／ｗ）、約１０．５％（ｗ／ｗ）、約１１％（ｗ／ｗ）、約１１．５％（ｗ／ｗ）、約１２％（ｗ／ｗ）、約１２．５％（ｗ／ｗ）、約１３％（ｗ／ｗ）、約１３．５％（ｗ／ｗ）、約１４％（ｗ／ｗ）、約１４．５％（ｗ／ｗ）、または約１５％（ｗ／ｗ）で存在し得る。
【０１８７】
別の態様では、本発明は、分単位、時間単位、または日単位の長さの時間をかけて分解する生体用材料を含む製剤を提供する。これは、日単位、週単位、または月単位の時間をかけてゆっくり分解する固体材料の移植に重点を置いている多くの研究開発とは対照的である。
【０１８８】
別の態様では、本発明は、送達マトリックスと一緒に、生理活性細胞を播種した生体適合性架橋ビーズを有する製剤を提供する。一実施形態では、送達マトリックスは、以下のうちの１つ以上の特性を有する：生体適合性、生分解性／生体吸収性、対象に移植の前およびその間の実質的な固体状態、移植後構造健全性（実質的に固体状態）の喪失、および細胞生存を支援するための細胞適合性環境。移植の間に、移植粒子（例えば、架橋ビーズ）を、間を置いて配置させておく送達マトリックスの能力は、天然の組織の内部成長を強化する。送達マトリックスが存在しない場合、移植の間に、小区画に分かれたビーズの圧縮により、充分な組織内方成長のためには不適切な余地が生じうる。送達マトリックスは、固体製剤の移植を促進する。さらに、構造健全性の持続期間が短いことは、移植するとすぐに、マトリックスは、組織の内部成長または送達細胞／材料と宿主組織の統合に対して大きな障壁とならないことを意味する。送達マトリックスは、挿入された固体ユニットが、送達材料が移植の間に組織内に分散するのを防ぐように支援するために、本明細書記載の製剤の局在化を提供する。細胞ベース製剤に対しては、固体の送達マトリックスは、液体中に懸濁された細胞に比べて、足場依存性細胞の安定性および生存を改善する。
【０１８９】
一実施形態では、送達マトリックスは、細胞を播種していない生体適合性ビーズの集団である。別の実施形態では、播種されていないビーズは、それぞれの細胞播種ビーズの全体に、およびその間に分散される。播種されていないビーズは、移植の前および直後に、細胞播種ビーズの間で「スペーサービーズ」として機能する。スペーサービーズは、第１の温度で実質的に固体状態であり、第２の温度で実質的に液体状態を有する温度感受性生体用材料を含み、第１の温度は、第２の温度よりも低い。例えば、スペーサービーズは、本明細書記載のように、およそ外界温度以下で実質的に固体状態であり、約３７℃で実質的に液体状態を有する生体用材料を含む。一実施形態では、外界温度は、およそ室温である。別の実施形態では、生体用材料は、ゼラチン溶液である。ゼラチン溶液は、約４％、約４．５％、約５％、約５．５％、約６％、約６．５％、約７％、約７．５％、約８％、約８．５％、約９％、約９．５％、約１０％、約１０．５％、または約１１％（ｗ／ｖ）で存在する。ゼラチン溶液は、ＰＢＳ、細胞培地（例えば、ＤＭＥＭ）、または別の適切な溶媒中で提供され得る。
【０１９０】
一態様では、本発明は、実質的に固体状態（例えば、スペーサービーズ）で移植され、身体へ移植後、液化／溶融または他の方式で構造健全性を失う生体用材料を含む製剤を提供する。これは、液体として注射でき、その後、身体中で固化する材料の使用に重点を置いている多くの研究開発とは対照的である。
【０１９１】
スペーサービーズの温度感受性は、調剤に先立ちインビトロで評価できる。スペーサービーズを、標識し、非標識の非温度感受性ビーズと混合できる。混合物は、次に、３７℃でインキュベートされ、物理的遷移の変化が観察される。高温度での標識温度感受性ビーズの形状の喪失が経時的に観察される。例えば、温度感受性ゼラチンビーズは、アルシアンブルー染料とともに作成し、それを物理的遷移のマーカーとして機能させてもよい。青のゼラチンビーズをＣｕｌｔｉｓｐｈｅｒ  Ｓビーズ（白色）と混合し、カテーテルに充填して、押し出し、ＩＸ  ＰＢＳ中、３７℃、ｐＨ７．４でインキュベートする。青いゼラチンビーズの形状の喪失が、異なる時点で顕微鏡により追跡される。青いゼラチンビーズの物理状態の変化は、長いインキュベーション時間に伴い、さらに顕著になった３０分後、目視可能となる。ビーズは、材料の粘度があるため、完全には散逸しない（図２）。
【０１９２】
本明細書記載の生理活性細胞製剤を使って、腎臓への注射用の腎臓細胞ベース製剤を調製できる。しかし、当業者なら、この製剤は、他の多くのタイプの生理活性細胞集団に適することを理解するであろう。例えば、本発明は、任意の固体臓器または組織への注射用の生理活性細胞のための製剤を意図している。
【０１９３】
一態様では、本明細書記載の生理活性細胞製剤は、設定された数の細胞を含む。一実施形態では、製剤用の合計細胞数は、約１０４、約１０５、約１０６、約１０７、約１０８、または約１０９である。一実施形態では、本明細書記載の製剤のための細胞量は、標的臓器または組織の推定質量または機能的質量に基づいて計算できる。ある特定の実施形態では、本発明の生理活性細胞製剤は、製剤による処置の対象となる宿主臓器の重量に基づく細胞数に対応する用量を含む。例えば、生理活性腎臓細胞製剤は、ヒト腎臓の約１５０グラムの平均重量に基づいている。一実施形態では、腎臓１グラム（ｇ）当たりの細胞の数は、約６００細胞／ｇ〜約７．０ｘ１０７細胞／ｇである。いくつかの実施形態では、グラム腎臓当たりの細胞の数は、約６００細胞／ｇ、約１０００細胞／ｇ、約１５００細胞／ｇ、約２０００細胞／ｇ、約２５００細胞／ｇ、約３０００細胞／ｇ、約３５００細胞／ｇ、約４０００細胞／ｇ、約４５００細胞／ｇ、約５０００細胞／ｇ、約５５００細胞／ｇ、約６０００細胞／ｇ、約６５００細胞／ｇ、約７０００細胞／ｇ、約７５００細胞／ｇ、約８０００細胞／ｇ、約８５００細胞／ｇ、約９０００細胞／ｇ、約９５００細胞／ｇ、または約１０，０００細胞／ｇである。
【０１９４】
他の実施形態では、腎臓１グラム当たの細胞数は、約１．５ｘ１０４細胞／ｇ、約２．０ｘ１０４細胞／ｇ、約２．５ｘ１０４細胞／ｇ、約３．０ｘ１０４細胞／ｇ、約３．５ｘ１０４細胞／ｇ、約４．０ｘ１０４細胞／ｇ、約４．５ｘ１０４細胞／ｇ、約５．０ｘ１０４細胞／ｇ、約５．５ｘ１０４細胞／ｇ、約６．０ｘ１０４細胞／ｇ、約６．５ｘ１０４細胞／ｇ、約７．０ｘ１０４細胞／ｇ、約７．５ｘ１０４細胞／ｇ、約８．０ｘ１０４細胞／ｇ、約９．５ｘ１０４細胞／ｇである。
【０１９５】
他の実施形態では、腎臓１グラム当たりの細胞数は、約１．０ｘ１０５細胞／ｇ、約１．５ｘ１０５細胞／ｇ、約２．０ｘ１０５細胞／ｇ、約２．５ｘ１０５細胞／ｇ、約３．０ｘ１０５細胞／ｇ、約３．５ｘ１０５細胞／ｇ、約４．０ｘ１０５細胞／ｇ、約４．５ｘ１０５細胞／ｇ、約５．０ｘ１０５細胞／ｇ、約５．５ｘ１０５細胞／ｇ、約６．０ｘ１０５細胞／ｇ、約６．５ｘ１０５細胞／ｇ、約７．０ｘ１０５細胞／ｇ、約７．５ｘ１０５細胞／ｇ、約８．０ｘ１０５細胞／ｇ、約８．５ｘ１０５細胞／ｇ、約９．０ｘ１０５細胞／ｇ、または約９．５ｘ１０５細胞／ｇである。
【０１９６】
他の実施形態では、腎臓１グラム当たりの細胞数は、約１．０ｘ１０６細胞／ｇ、約１．５ｘ１０６細胞／ｇ、約２．０ｘ１０６細胞／ｇ、約２．５ｘ１０６細胞／ｇ、約３．０ｘ１０６細胞／ｇ、約３．５ｘ１０６細胞／ｇ、約４．０ｘ１０６細胞／ｇ、約４．５ｘ１０６細胞／ｇ、約５．０ｘ１０６細胞／ｇ、約５．５ｘ１０６細胞／ｇ、約６．０ｘ１０６細胞／ｇ、約６．５ｘ１０６細胞／ｇ、約７．０ｘ１０６細胞／ｇ、約７．５ｘ１０６細胞／ｇ、約８．０ｘ１０６細胞／ｇ、約８．５ｘ１０６細胞／ｇ、約９．０ｘ１０６細胞／ｇ、約９．５ｘ１０６細胞／ｇ、１．０ｘ１０７細胞／ｇ、または約１．５ｘ１０７細胞／ｇである。
【０１９７】
合計細胞数は、製剤に対し選択でき、また、製剤量は適切な投与量になるよう調節できる。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、製剤は、対象に対し、単一の投与量、または単一の投与量と追加の用量を加えた投与量である細胞の量を含んでもよい。他の実施形態では、投与量は、本明細書記載の構築物によって提供され得る。本明細書記載の腎臓細胞集団または腎臓細胞の混合物集団の治療有効量は、対象により安全に受け入れられる最大細胞数から、腎疾患の、例えば、安定化、減少率低下、または１つ以上の腎臓機能の改善に必要な最小細胞数の範囲にわたりうる。
【０１９９】
本明細書記載の腎臓細胞集団またはその混合物の治療有効量は、薬学的に許容可能な担体または賦形剤中に懸濁できる。このような担体には、限定されないが、基本培地＋１％血清アルブミン、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、コラーゲン、アルギナート、ヒアルロン酸、フィブリン接着剤、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロースおよびこれらの組み合わせが含まれる。製剤は、投与方法に適合させなければならない。
【０２００】
従って、本発明は、対象の腎疾患の処置用薬物の製造のための、単独のまたはＢ３および／またはＢ４またはＢ４’細胞集団と混合した腎臓細胞集団またはその混合物、例えば、Ｂ２細胞集団を含む組成物の使用を提供する。いくつかの実施形態では、薬物は、組換え型ポリペプチド、例えば、増殖因子、ケモカインまたはサイトカインをさらに含む。さらなる実施形態では、薬物は、ヒト腎臓由来細胞集団を含む。薬物製造に使われる細胞は、本明細書記載の方法のために提供される、いずれかの変形方法を使って単離、誘導、富化できる。
【０２０１】
腎臓細胞調製物もしくはその混合物、または組成物は、ヒトに適合された医薬組成物として、常法により処方される。通常、静脈内投与、動脈内投与または腎被膜内投与用組成物は、例えば、無菌等張性水性緩衝液中の溶液である。また、必要に応じ、組成物は、注射部位での起こりうる疼痛を改善するために局所麻酔剤を含んでもよい。一般的に、成分は、別々に、または混合して一緒に、単位剤形、例えば、気密シール容器、例えば、活性試薬の量を表示したアンプルに入れた凍結保存濃縮製剤として供給される。組成物が注入により投与される場合は、無菌の医薬品グレード水または食塩水を含む注入ボトルで分注できる。組成物が注射により投与される場合は、注射用無菌水または食塩水のアンプルが用意され、投与の前に成分を混合できる。
【０２０２】
薬学的に許容可能な担体は、部分的には、特定の投与組成物、ならびに組成物の投与に使われる特定の方法により決定される。従って、多種多様の適切な医薬組成物製剤が存在する（例えば、Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ  Ｇｅｎｎａｒｏ（ｅｄ）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、以前のレミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）２０ｔｈ  ｅｄ．、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、２００３、を参照のこと。この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。医薬組成物は、一般的に、無菌で、実質的に等張性として処方され、米国食品医薬品局の医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理規則（Ｇｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（ＧＭＰ））に完全に準拠している。
【０２０３】
本発明の一態様は、本発明の腎臓細胞調製物、例えば、単独の、またはＢ３および／またはＢ４またはＢ４’細胞調製物と組み合わせたＢ２細胞調製物、および薬学的に許容可能な担体を含む医薬製剤をさらに提供する。いくつかの実施形態では、製剤は、１０４〜１０９の哺乳類腎臓由来細胞を含む。
【０２０４】
放出調節製剤
一態様では、本発明の製剤は、放出調節製剤として提供される。一般的に、調節された放出は、投与時の第１の活性薬剤の初期放出に続いて、その後の少なくとも１つの追加の第２の活性薬剤の放出を特徴とする。第１と第２の活性薬剤は、同じであっても、異なっていてもよい。一実施形態では、製剤は、同じ製剤中の複数の成分による放出調節を与える。別の実施形態では、放出調節製剤は、活性薬剤が製剤全体を自由に動くことを可能にする第１の成分の一部として活性薬剤を含み、それにより、投与時に標的部位での即時放出を可能にする。第１の成分は、実質的に液体相および実質的に固相を有する温度感受性生体用材料であってもよく、この場合、第１の成分は、投与時には実質的に液体相である。一実施形態では、活性薬剤は、実質的に液体相であり、それにより、製剤全体を実質的に自由に動くことができ、従って、投与時、標的部位に即時放出される。
【０２０５】
別の実施形態では、放出調節製剤は、第２の成分の一部として活性薬剤を有し、活性薬剤は、第２の成分に接着し、その上に堆積され、それでコートされ、その中に包埋され、それに播種され、または、その中に捕捉されて、投与の前後の間、標的部位に残存する。第２の成分は、構造要素を含み、それに対し、活性薬剤が結合でき、それにより、投与時に第２の成分からの活性薬剤の即時放出を防ぐ。例えば、第２成分は、実質的に固体形態、例えば、生体適合性ビーズで提供され、架橋されてインビボ酵素分解を防ぐか、または遅らせることができる。一実施形態では、実質的に固相の活性薬剤は、投与前後の間の製剤内の構造健全性を保持し、従って、投与時に標的部位への活性薬剤の即時放出をしない。放出調節製剤用の適切な担体は、本明細書で記載されているが、当業者なら、本発明での使用に適切な他の担体を理解するであろう。
【０２０６】
一実施形態では、製剤は、細胞、ナノ粒子、治療分子、等の送達成分の初期急速送達／放出とそれに続く、後の成分の遅延放出を提供する。本発明の製剤は、このような２相性放出プロファイル用に設計でき、ここでは、送達される薬剤は、非結合形態（例えば、溶液中の細胞）および接着形態（例えば、ビーズまたは別の適切な担体と一緒の細胞）の両方で提供される。最初の投与時に、妨げのない薬剤が送達部位に即時提供される一方、妨げのある薬剤の放出は、担体（例えば、ビーズ）の構造健全性がなくなり、前に接着した薬剤が放出される時点まで遅延される。下で論じるように、当業者なら他の適切な放出機序に気付くであろう。
【０２０７】
遅延放出は、活性薬剤の特性に基づいて調節できる。例えば、生理活性細胞製剤における遅延放出は、秒単位、分単位、時間単位、または日の単位であり得る。いくつかの状況では、週単位の遅延が適切である場合もある。小さいまたは大きな分子等の他の活性薬剤に対しては、製剤の遅延放出は、秒単位、分単位、時間単位、日単位、週単位、または月の単位であり得る。また、製剤が異なる遅延放出プロファイルを提供する異なる生体用材料を含むことも可能である。例えば、第１の活性薬剤を有する第１の生体用材料が、第１の放出時間を有し得、また、第２の活性薬剤を有する第２の生体用材料が第２の放出時間を有し得る。第１と第２の活性薬剤は、同じでも異なってもよい。
【０２０８】
本明細書で論じるように、遅延放出時間は、一般的に、生体用材料の構造健全性が喪失する時間に対応させることができる。しかし、当業者なら、他の遅延放出機序を理解するであろう。例えば、活性薬剤は、例えば、高分子マトリックスからの薬剤の拡散等の、いずれの特定の生体用材料の分解時間とも無関係な時間にわたり連続的に放出されうる。さらに、生理活性細胞は、生体用材料および生理活性細胞を含む製剤から天然の組織に移動できる。一実施形態では、生理活性細胞は、生体用材料、例えば、ビーズから天然の組織に移動する。
【０２０９】
エチレン酢酸ビニール、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸等の生分解性で、生体適合性の高分子を使うことができる。注射可能製剤の持続的吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアラートおよびゼラチンを製剤中に含めることにより得ることができる。このような製剤の多くの調製方法が特許化され、または当業者に既知である。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、ｅｄ．、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７８、を参照されたい。ポリペプチド薬剤の徐放または持続放出に適用可能な追加の方法が、例えば、米国特許第６，３０６，４０６号および同６，３４６，２７４号、ならびに、例えば、米国特許公開第ＵＳ２００２０１８２２５４号および同２００２００５１８０８号に記載されている。これらの特許は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２１０】
９．投与方法と経路
本発明の生理活性細胞製剤は、単独で、または他の生理活性成分と組み合わせて投与できる。製剤は、組織の再生のための組込み組織工学成分の固体臓器内部への注射または移植に適する。さらに、製剤は、組織工学成分を中空臓器の壁へ注射または移植して組織を再生するために使用される。
【０２１１】
一態様では、本発明は、本明細書記載の生理活性細胞製剤を、必要としている対象に与える方法を提供する。一実施形態では、生理活性細胞の源は、自己または同種異系、同種同系（自家遺伝子系または同系遺伝子系）、およびそれらの任意の組み合わせでよい。源が自己でない場合、方法には、免疫抑制剤の投与を含んでもよい。適切な免疫抑制剤には、限定されないが、アザチオプリン、シクロホスファミド、ミゾリビン、シクロスポリン、タクロリムス水和物、クロランブシル、ロベンザリット二ナトリウム、オーラノフィン、アルプロスタジル、グスペリムス塩酸塩、ビオシンソルブ、ムロモナブ、アレファセプト、ペントスタチン、ダクリズマブ、シロリムス、ミコフェノール酸モフェチル、レフロノミド、バシリキシマブ、ドルナーゼα、ビンダリド、クラドリビン、ピメクロリムス、イロデカキン、セデリズマブ、エファリズマブ、エベロリムス、アニスペリムス、ガビリモマブ、ファラリモマブ、クロファラビン、ラパマイシン、シプリズマブ、サイレイト、ＬＤＰ−０３、ＣＤ４、ＳＲ−４３５５１、ＳＫ＆Ｆ−１０６６１５、ＩＤＥＣ−１１４、ＩＤＥＣ−１３１、ＦＴＹ−７２０、ＴＳＫ−２０４、ＬＦ−０８０２９９、Ａ−８６２８１、Ａ−８０２７１５、ＧＶＨ−３１３、ＨＭＲ−１２７９、ＺＤ−７３４９、ＩＰＬ−４２３３２３、ＣＢＰ−１０１１、ＭＴ−１３４５、ＣＮＩ−１４９３、ＣＢＰ−２０１１、Ｊ−６９５、ＬＪＰ−９２０、Ｌ−７３２５３１、ＡＢＸ−ＲＢ２、ＡＰ−１９０３、ＩＤＰＳ、ＢＭＳ−２０５８２０、ＢＭＳ−２２４８１８、ＣＴＬＡ４−１ｇ、ＥＲ−４９８９０、ＥＲ−３８９２５、ＩＳＡｔｘ−２４７、ＲＤＰ−５８、ＰＮＵ−１５６８０４、ＬＪＰ−１０８２、ＴＭＣ−９５Ａ、ＴＶ−４７１０、ＰＴＲ−２６２−ＭＧ、およびＡＧＩ−１０９６（米国特許第７，５６３，８２２号参照）が含まれる。当業者なら、他の適切な免疫抑制剤を理解するであろう。
【０２１２】
この発明の処置方法は、本明細書記載の生理活性製剤の送達を含む。一実施形態では、恩恵を意図する部位への細胞の直接投与が好ましい。治療を必要としている対象は、また、天然の腎臓を、１つ以上の富化腎臓細胞集団および／または混合物または前記を含む構築物から分泌された産物と一緒に、本明細書記載の生理活性製剤とインビボで接触させることにより、処置可能である。
【０２１３】
天然の腎臓を、インビボで分泌産物と接触させるステップは、細胞培地、例えば、馴化培地由来の分泌産物の集団を含む製剤の使用／投与により、または富化細胞集団、および混合物、または産物をインビボで分泌できる構築物の移植により実現可能である。インビボ接触ステップは、天然の腎臓に対し再生効果を与える。
【０２１４】
本明細書を考慮すると、細胞および／または分泌産物を対象に投与する種々の手段は、当業者には明らかであろう。このような方法には、対象標的部位への細胞の注射が含まれる。
【０２１５】
細胞および／または分泌産物は、送達装置または媒体中に装填でき、対象への注射または移植による導入が促進される。特定の実施形態では、送達媒体は、天然の物質を含み得る。他のある特定の実施形態では、送達媒体は、合成物質を含み得る。一実施形態では、送達媒体は、臓器の構造を模倣する、またはそれにうまく適合する構造を与える。他の実施形態では、送達媒体は、体液様の性質である。このような送達装置には、細胞と液体をレシピエント対象の身体の中に注入するための管、例えば、カテーテルを含み得る。好ましい実施形態では、管は、針、例えば、シリンジをさらに有し、本発明の細胞がそれを通って対象の目的部位に導入されうる。いくつかの実施形態では、哺乳類腎臓由来細胞集団は、カテーテル経由で血管に投与されるように処方される（「カテーテル」という用語は、物質を血管に送達するための様々な管様系のいずれをも含むことを意図される）。あるいは、細胞を、生体材料または足場中または上に挿入でき、生体材料または足場には、限定されないが、織物、例えば、敷布、ニット、ブレード、メッシュ、および不織布、有孔フィルム、スポンジおよび発泡体、ならびにビーズ、例えば、中実または多孔性ビーズ、微粒子、ナノ粒子、等（例えば、Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ−Ｓゼラチンビーズ−Ｓｉｇｍａ）が含まれる。細胞は、種々の異なる形で送達用に調製できる。例えば、細胞は、溶液またはゲル中に懸濁できる。細胞は、本発明の細胞が生存可能な、薬学的に許容可能な担体または希釈剤と混合できる。薬学的に許容可能な担体および希釈剤には、食塩水、水性緩衝液、溶剤および／または分散媒体が含まれる。このような担体および希釈剤の使用は、当技術分野でよく知られている。溶液は、無菌の液体が好ましく、また、等張性であることが多い。溶液は、製造と貯蔵条件下で安定であり、また、微生物、例えば、細菌や真菌の汚染作用に対し、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール、等の使用により、保護されていることが好ましい。当業者なら、本発明の細胞集団およびその混合物の送達に使われる送達媒体は、上述の特性の組み合わせを含んでもよいことを理解するであろう。
【０２１６】
単離された腎臓細胞集団、例えば、単独またはＢ４’および／またはＢ３と混合したＢ２細胞集団を含む製剤の投与方式には、限定されないが、全身性、腎臓内（例えば、実質）、静脈内または動脈内注射および目的作用部位の組織への直接注射が含まれる。本発明で用いられるさらなる投与方式には、直接開腹手術経由の、直接腹腔鏡検査経由の、経腹腔的、または経皮的単回または複数回の注射が含まれる。また本発明で使われるさらなる投与方式には、例えば、逆行注入および腎盂尿管注入が含まれる。外科的投与手段には、一段手術、例えば、限定されないが、腎部分摘出術および構築物移植、腎部分摘出術、腎盂部分切除術、網±腹膜による血管新生、注射筒に取り付ける円錐形状または角錐形状の多源性生検注射痕、および、腎臓柱状置換が含まれ、ならびに、例えば、再移植のためのオルガノイド内部バイオリアクター等の２段手術が含まれる。一実施形態では、細胞の混合物を含む製剤は、同じ経路で、同じ時間に送達される。別の実施形態では、制御された混合物を含むそれぞれの細胞組成物は、別々に特異的部位に送達されるか、または特定の方法を経由して、同時にまたは時間経過制御方式で、１つ以上の本明細書記載の方法により、送達される。
【０２１７】
ヒトの適切な細胞移植投与量は、細胞の活性、例えば、ＥＰＯ産生、に関連する既存情報、または前臨床の試験で行った投薬試験から推定した情報から決定できる。インビトロ培養およびインビボ動物実験から、細胞の量が定量化でき、適切な移植材料投与量の計算に使用できる。さらに、患者をモニターし、追加の移植ができるか、または移植材料をそれに応じて減らすことができるかどうかを決定できる。
【０２１８】
１つ以上の選択された細胞外のマトリックス成分、例えば、１つ以上の当技術分野で既知の型のコラーゲンまたはヒアルロン酸、および／または増殖因子、多血小板血漿および薬剤等の他の成分を本発明の細胞集団およびその混合物に添加できる。
【０２１９】
当業者なら、本明細書記載の分泌産物に適した種々の処方および投与方法が解るであろう。
【０２２０】
１０．製造製品およびキット製品
本発明は、本発明のポリマーマトリックスおよび足場および関連材料、および／または細胞培地および使用説明書を含むキットをさらに含む。使用説明書は、例えば、細胞の培養または細胞および／または細胞産物の投与に関する使用説明書を含んでもよい。一実施形態では、本発明は、本明細書記載の足場および使用説明書を含むキットを提供する。さらに別の実施形態では、キットは、マーカー発現検出用試薬、薬剤を使用するための試薬、および使用説明書を含む。このキットは、本明細書記載の細胞集団、混合物、または構築物の移植または投与後の対象の天然の腎臓の再生予後の測定のために使うことができる。キットは、また、本明細書記載の細胞集団、混合物、または構築物の生物学的治療効力の測定に使用可能である。
【０２２１】
本発明の別の実施形態は、必要としている対象の処置に有用な生理活性細胞を含む製品である。製品は、容器およびラベルまたは容器上に貼付または容器に付随するパッケージインサートを含む。適切な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ等が含まれる。容器は、種々の材料、例えば、ガラスまたはプラスチックで形成できる。容器は、状態の処置に有効な組成物を保持し、無菌のアクセスポートを有してもよい（例えば、容器は、注射針により貫通可能な栓を有する溶液バッグまたはバイアルであってもよい）。製剤中の少なくとも１つの活性薬剤は、本発明の生理活性細胞集団である。ラベルまたはパッケージインサートは、製剤が特定の状態の処置に使用されることを表示する。ラベルまたはパッケージインサートは、患者に製剤を投与するための使用説明をさらに含むであろう。本明細書記載の組み合わせ治療を含む製品およびキットもまた、意図される。パッケージインサートは、治療薬の市販パッケージ中に通常含まれ、このような治療薬の使用に関する適応症、使用法、投与量、投与、禁忌および／または警告についての情報を含む使用説明書を意味する。一実施形態では、パッケージインサートは、製剤が、疾患または障害、例えば、腎疾患または傷害の処置に使われることを表示する。さらに、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、およびシリンジ等の、市販および使用者の観点から望ましい他の物質をさらに含んでもよい。様々な目的のために、例えば、再生結果の評価のために有用なキットも提供される。尿由来小胞および／またはその含有物、例えば、本明細書記載の核酸（ｍｉＲＮＡ、等）、小胞、エキソソーム、等、の検出薬剤を含むキットも提供できる。検出薬剤には、限定されないが、所望の標的のための核酸プライマーおよびプローブ、ならびにインビトロ検出用抗体が含まれる。製品と同様に、キットも、容器およびラベルまたは容器の上に、もしくは容器に付随したパッケージインサートを含む。容器は、少なくとも１つの検出薬剤を含む組成物を保持する。例えば、希釈剤および緩衝剤または対照検出薬剤を含む追加の容器を含めてもよい。ラベルまたはパッケージインサートにより、組成物の説明ならびに目的のインビトロでの予後、または診断への使用のための説明を提供してもよい。
【０２２２】
１１．報告書
本発明の方法では、商業目的で実施する場合、一般的に、再生予後の報告書または要約を作成する。本発明の方法は、本明細書記載の細胞集団、混合物、または構築物を含む製剤のいずれかの投与または移植の前と後の可能な経過または再生結果の予測を含む報告を作成することになる。この報告は、予後に関連するいずれかの指標の情報を含み得る。本発明の方法および報告は、データベースに報告を保存することもさらに含み得る。あるいは、方法は、データベースに対象に対するレコードをさらに作成することができ、レコードにデータを生成することができる。一実施形態では、報告は、文書による報告書であり、別の実施形態では、報告は、聴覚による報告であり、別の実施形態では、報告は電子記録である。報告は、医師および／または患者に提供されることが意図される。報告の受領は、データおよび報告を含むサーバーコンピュータにネットワーク連結を確立すること、およびサーバーコンピュータからデータおよび報告を要求することをさらに含む。本発明により提供される方法は、また、全体または一部が自動化されてもよい。
【０２２３】
本明細書で適宜例示された本発明は、本明細書に具体的に開示されていないいずれの要素または複数要素や制限または複数制限もなく、実施できる。従って、例えば、本明細書の各例において、用語の「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「〜から基本的に構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」および「〜から構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」のいずれも、他の２つの用語のいずれかと置換することができる。従って、それらの用語の１つを使った本発明の実施形態に対し、本発明は、また、これらの用語の１つがこれらの用語の内の別のもので置換されている別の実施形態も含む。それぞれの実施形態で、用語は、その確定した意味を持つ。従って、例えば、１つの実施形態は、多数の成分を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」製剤を包含し得、別の実施形態は、同じ成分「から基本的に構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」製剤を包含し得、さらに、第３の実施形態は、同じ成分「から構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」製剤を包含し得る。採用されている用語および表現は、説明の用語として使用されており、制限のためではなく、また、このような用語および表現の使用により、示され、記載される特性またはその一部のいずれかの等価物を排除する意図はなく、請求された本発明の範囲内で種々の変更が可能であることは理解されよう。従って、本発明は、好ましい実施形態および追加の特徴にによって具体的に開示されたが、本明細書に開示の概念の変更および変形を当業者により行うことができ、このような変更および変形が貼付の請求項により規定される本発明の範囲内にあると見なされることは理解されよう。
【０２２４】
前に記載の説明は、当業者に本発明の実施を可能にするには充分と考えられる。以下の実施例は、例示的目的のみのために提供され、本発明の範囲を制限する意図は全くない。実際、示された、または本明細書に記載のものに加えて、当業者には、前出の説明から本発明の様々な変更が明白であり、これらも添付請求項の範囲に入るであろう。
【０２２５】
本明細書で引用されている全ての特許、特許出願、および文献の参照は、参照によってその全体が組み込まれる。
【０２２６】
実施例
実施例１：短期構造健全性を有する送達マトリックスの使用
我々のげっ歯類注射モデルを使った新規生体用材料／細胞系の調査およびその性能評価の過程で、我々は、ゼラチンをベースにした熱的に可逆的なビーズならびに熱的に可逆的なゼラチン連続相送達マトリックスを作る方法を設計し開発した。この送達マトリックスは、細胞誘導細胞外マトリックスリモデリング、細胞−細胞相互作用、細胞移行、増殖および組織再生が許容される小さな区画に分かれたビーズの周りの生物模倣型微小環境、細胞凝集体または単一細胞懸濁液を作り出すことが可能である。我々は、室温未満で固体であり、体温で液体であるゼラチン溶液の形態の送達マトリックス技術の有用性を具体的に証明した。この熱的に可逆的な注射可能マトリックスを使用して、遊離細胞、細胞凝集体、マイクロ担体ビーズ上の細胞、および遊離細胞とマイクロ担体上の細胞の混合物をラット腎臓実質中に移植した。
【０２２７】
方法
ビーズ製作。１０％ｗ／ｖゼラチン溶液（Ｇｅｌｉｔａ、Ｉｎｃ．、Ｓｉｏｕｘ  Ｃｉｔｙ、IＡ）を脱イオン水中で調製し、次に、薄層クロマトグラフィー試薬スプレーを使って、液体窒素（ＬＮ２）中に圧縮空気で噴霧した。ＬＮ２を化学ドラフト中で蒸発させ、ビーズを集めた。
【０２２８】
生体用材料の細胞適合性およびインビボ移植評価。蛍光顕微鏡画像処理と共にＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ哺乳動物細胞生存率／細胞毒性キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使って、細胞適合性を評価した。Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ  Ｓビーズと混合したスペーサービーズを注射された腎臓の組織分析を行い（移植１週間後）、ビーズの生体適合性およびそれらの空隙生成能力を評価した。組織スライドをマッソントリクローム（これは、コラーゲンブルーに染色する）またはヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。画像を、正の指標（組織の内部成長、１ヶ月間および健康な組織で生体用材料の最低限の検出〜非検出、）および負の指標（マクロファージ、巨細胞、および他の炎症性の細胞の存在；線維性カプセル形成を支援する生体用材料残留および集合管寸法の増加）の両方で評価した。
【０２２９】
結果
熱可逆性ビーズ
ビーズを、２５℃未満の温度で材料のゲル化／凝固を可能とし、３０℃を超える温度で液化を可能とする濃度で、ブタゼラチン溶液から作製した。非架橋ゼラチンビーズ（青）の温度応答性を観察した。アルシアンブルー染料を最初のゼラチン溶液に加え、物理的遷移のマーカーとして機能させた。次に、青色ゼラチンビーズを市販のマイクロ担体ビーズ（白）と混合し、カテーテルに充填した後、押し出し、１Ｘ  ＰＢＳ中、ｐＨ７．４、３７℃でインキュベートした。異なる時点での青いゼラチンビーズの形状の喪失を顕微鏡により追跡した。青色ゼラチンビーズの物理状態の変化は、３０分後に目視可能となり、インキュベーション時間が長くなるとさらに明確になった。ビーズは、材料の粘度のために、完全には消失しなかった（図１）。
【０２３０】
熱可逆性送達マトリックス
熱可逆性注射可能マトリックスを液体状態で送達される成分と組み合わせて、尿細管カテーテル中におき、室温未満で冷却し、マトリックスをゲル化させた。蛍光顕微鏡像で、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ（登録商標）哺乳動物細胞生存率／細胞毒性キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）染色を使って、生細胞染色を緑で、死細胞染色を赤で示した（図２〜６）。我々は、熱可逆性注射可能マトリックス中に埋め込んだ細胞は、冷却してマトリックスをゲル化した後で、生存可能な状態で残ることを見出した。マイクロ担体ビーズを含むマトリックスが移植された組織の分析（移植後１週間）は、マイクロ担体ビーズを暗い紫色の構造として示した。マトリックス材料は、このスライドでは目視されず、それが組織の内部成長に対する障壁であるといる証拠は認められなかった（図７）。
【０２３１】
マトリックスの構造健全性の喪失の例証を、図８に示す。マトリックスは、室温では流動しないが、３７℃では流動する。マトリックス材料の観察された性質および特徴は、多くの組織工学および再生医療適用において組み込まれた成分の送達を可能とするであろう。具体的には、本発明は、１）移植の前とその間の構造健全性、ならびに２）移植後すぐの時点での構造の喪失、の両方の利点を利用して、組み込まれた成分と組み込む組織または臓器の間の相互作用に対する障害または障壁も無く、制御された取扱、配置、または分散を使って、組織または臓器中の標的部位中に材料を送達する。
【０２３２】
実施例２：化学架橋による生体用材料の酵素感受性の調整
内在性コラゲナーゼに対する生体用材料の酵素感受性を調整するために、ブタゼラチンをベースにした熱可逆性ビーズの作成（上述の実施例１のように）では、化学的架橋度を種々変えて行い、インビボ滞留時間を調節することができる。これにより、この材料が離散する組織再生構築物（例えば、担体ビーズ上に播種された細胞）の間のスペーサーとして機能することを可能とし、組織内方成長を促進し、生物模倣型微小環境を生成する。さらに、この材料は、細胞、薬剤または他の分子送達系として機能する可能性を有する。このために、我々は、良好に特徴付けされ、広く使用されている試薬、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を使用する選択をした。このゼロ長架橋剤は、分子内または分子間に配置された空間的に隣接したカルボキシルおよび一級アミン官能基間のアミド結合形成を促進する（図９）。
【０２３３】
方法
材料。低エンドトキシンゼラチンをＧｅｌｉｔａ、Ｉｎｃ．、Ｓｉｏｕｘ  Ｃｉｔｙ、ＩＡ、から購入した。ピクリルスルホン酸溶液（ＴＮＢＳ）およびＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、から購入した。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）哺乳動物細胞生存率／細胞毒性障害性キットをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、から購入した。水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）および２−［モルホリノ］エタンスルホン酸、０．９％ＮａＣｌ、ｐＨ４．７（ＭＥＳ）緩衝液をＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ、から購入した。コラゲナーゼＩＶをＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．、Ｌａｋｅｗｏｏｄ、ＮＪから、ディスパーゼＩ（４Ｕ／ｍｌ）をＳｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ、から購入した。ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ケラチノサイト無血清培地（ケラチノサイト−ＳＦＭ）および燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、から購入した。
【０２３４】
化学架橋。凍結乾燥ゼラチンビーズを０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ４．７（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）（２０ｍｌ緩衝液／グラムビーズ）中で懸濁し、好ましくは４℃で、１〜３時間再水和した。次に緩衝液（ｐＨおよび化学反応の緩衝要件に基づき選択）を取り除き、ＥＤＣ（ｌ−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩）／ビーズ容量と同じ量のＭＥＳ  ｐＨ７．４溶液（ＥＤＣ濃度は、１０〜１００ｍＭの範囲）を使って作った１：１（ｖ／ｖ）懸濁液を短時間ボルテックスの後、懸濁液を室温の静的条件下で一晩インキュベートした。その後、ビーズを濾過し、脱イオン水で洗浄し（洗浄体積＝２０Ｘビーズ体積）、凍結し、凍結乾燥した。
【０２３５】
インビトロ酵素分解アッセイ。種々ＥＤＣ濃度で架橋したビーズの分解速度を、コラゲナーゼ／ディスパーゼ消化に対する感受性によりアッセイし、市販のＣＵＬＴＩＳＰＨＥＲ（登録商標）ビーズと比較した。ＣＵＬＴＩＳＰＨＥＲ（登録商標）および架橋ビーズを秤量し、ｐＨ７．４のＰＢＳ中で、濃度約２０ｍｇ／ｍｌで懸濁した。０．５ｍｌのビーズ懸濁液に、０．５ｍＭのＣａＣｌ２を含む５０μｌの３０Ｕ／ｍｌコラゲナーゼ／ディスパーゼ混合物（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加え、試料をボルテックスし、３７℃で１時間、ロッカー上でインキュベートした（使用した各架橋剤濃度に対しｎ＝３）。その後、部分的に消化された試料から２０μｌの上清を集め、染料：タンパク質溶液比率を１：９ｖ／ｖに設定し、感度を上げた改良Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイを用いて、可溶性タンパク質含量を評価した。残りの消化混合物を一晩上述のようにインキュベートして、同様に全タンパク量測定アッセイを行った。これらの値を用いて、部分的に消化された試料の値を正規化した。試料中の総タンパク質の量は、完全に消化された後にＢｒａｄｆｏｒｄ試薬でアッセイされた既知の量のゼラチンから作られた溶液のＡ５９５値をプロッティングすることにより得たゼラチン検量線から計算された。試料中の総タンパク質量を、１００％と見なし、部分消化により得られたタンパク質量を１００％に対して正規化した。分解は、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイで測定された、１時間での可溶タンパク質／合計可溶タンパク質、の比率として計算された。
【０２３６】
アミンの定量。５μｌの１Ｍ  ＮａＯＨを各バイアル（最終ｐＨ値は、約８．５であった）に添加することにより、完全に消化された架橋ビーズ溶液（上述のように得られた）（ｎ＝３）のｐＨを高めた。その後、ＴＮＢＳを各試料に加え、最終濃度の０．２５％ｗ／ｖにして、バイアルを３７℃で２時間、ロッカー上でインキュベートした。Ａ３３５値をプレートリーダーを使って求め、値を、前に測定（上述）したように、各試料中の１ミリグラムのタンパク質当たりに正規化した。試料中の総タンパク質の量は、完全に消化された後にＢｒａｄｆｏｒｄ試薬でアッセイされた既知の量のゼラチンから作られた溶液のＡ５９５値をプロッティングすることにより得たゼラチン検量線から計算された。
【０２３７】
ビーズの整粒。サイズ分布を狭めるために、架橋ビーズを７０％ｖ／ｖのエタノール中に懸濁し、規定の孔径のナイロンメッシュを使った連続篩い分けにより、６４〜２５０μｍに整粒した。
【０２３８】
形態とサイズ分布。凍結乾燥ビーズを炭素のテープを貼り付けたスタブ上に塗布し、スパッターコートし、Ｐｈｉｌｉｐｓ５１５走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）で画像化した。ビーズのサイズ分布を、１０のＳＥＭ像を分析することにより測定し、測定値を５００ビーズ（ｎ＝５００）用に編集した。
【０２３９】
結果
濃縮ゼラチン溶液を液体窒素中に噴霧し、得られたビーズを噴霧乾燥の後、それらをカルボジイミドと反応させてゼラチンベースの、化学架橋多孔性ビーズを得た。架橋溶液の濃度を変えることにより（０〜１Ｍ  ＥＤＣ）、架橋度を制御でき、微調整可能な酵素感受性を有するビーズの合成が可能となった。
【０２４０】
噴霧ビーズの形態およびサイズ分布をＳＥＭにより解析した（図１０Ａ〜Ｂ）。ビーズは、球状に見え、多孔性表面および中空コアを有していた。水和または架橋は、ビーズの物理的特性に影響を与えなかった（結果は示さず）。
【０２４１】
全集団のサイズ分布は、粒子に特異的なワイブル分布プロファイルに従い、大部分のビーズ径は、１００μｍより小さく、典型的には、５０〜７５μｍであった（図１１）。この形態およびサイズ範囲は、我々の以前の腎組織工学標的生体用材料選別の調査と一致している（Ｂａｓｕ、前出、２０１１）。
【０２４２】
さらに、ビーズの内部は中空であり、これがマイクロ担体としての種々の適用に適するものにするであろう。ビーズの全体的な表面は、多孔性の外観を呈し、それは湿状態では、水和のために、さらに顕著になった（図１２Ａ〜Ｂ）。気孔の存在は、スムーズ表面の場合に比べて、より大きな数の細胞の接着を可能とするであろう細胞付着表面の増加に繋がる。上述の物理的特性、特に、ビーズサイズは、形成プロセスに強く依存する。この場合では、ビーズは、空気流を使って液体ゼラチン溶液をエアロゾル化し、薄層クロマトグラフィー試薬スプレー（ＡＣＥ  Ｇｌａｓｓｗａｒｅ）を使って、液体窒素中に噴霧することにより得た。このプロセスに関連するパラメーターの調節は、異なるサイズ分布を生じうる。
【０２４３】
生理学的条件下で、非架橋ゼラチンビーズは、健全性を数分以内に喪失し、そのことが、担体としての適用性の範囲を制限する。目的は、細胞を所望の部位に送達し、また一方で、それらが新しい環境中に統合され始めるまで、所定の位置に留めることができる担体系を開発することであった。さらに、担体は、局在化し、協調した外因性および内在性細胞の相互作用により、組織再生プロセスを媒介できるであろうものであった。この目的に対し、ゼラチンは、一連のカルボジイミド濃度を用いて共有結合で架橋された。架橋の程度は、反応完了後、ゼラチン中の残存一級アミンの数を計数する比色測定により測定された（図１３Ａ〜Ｂ）。
【０２４４】
低濃度のＥＤＣで処理されたビーズは、より多数の遊離一級アミンを有することが予測され、一方、高濃度の架橋剤で処理された試料は、ほとんどの一級アミンがアミド結合に関与することとなる。一級アミンとピクリルスルホン酸の間の共有結合により発色した３３５ｎｍの分光測定により検出可能なオレンジ色の強度は、試料中に存在する一級アミンの数に比例する。試料中に存在する１ミリグラム当たりのタンパク質に正規化すると、我々の結果では、存在する遊離アミンの数および架橋に使用したＥＤＣの初期濃度の間に良好な逆相関が認められた。この結果は、反応に使ったカルボジイミドの量により規定される種々の異なるビーズ架橋を示す。
【０２４５】
我々は、架橋ゼラチンビーズの酵素分解等の生理的パラメーターに対する感受性が、化学架橋度に比例して変化すると仮定した。これを試験するために、種々異なる架橋度のビーズを部分的に触媒分解し、データを全体試料量当たりに正規化した。最適化Ｂｒａｄｆｏｒｄ試薬アッセイに基づいて選別試験を開発して、調整可能酵素感受性をインビトロ評価した。３０Ｕのコラゲナーゼ／ディスパーゼ混合物と共に試料を１時間インキュベートし、分解に関しアッセイした（ｎ＝３）。酵素分解の完了（一晩）後、測定した試料中のゼラチン全体量に対し値を正規化した。分散分析Ｐ＝０．０００８。コラゲナーゼ／ディスパーゼへの暴露により、Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒおよび架橋ゼラチンビーズの両方から種々の量の可溶性タンパク質が放出された。ゼラチンビーズに対しては、これらのインビトロ分解速度は、架橋に使ったＥＤＣ濃度と良好な相関を示した。架橋ゼラチンビーズの分解速度は、コラゲナーゼ／ディスパーゼ酵素混合物に暴露１時間後、ＥＤＣ架橋剤の濃度に大略比例する。我々の結果は、仮説に一致して、最も高い架橋度を有する試料は、酵素分解に対し最小の感受性であり、消化速度は、反応に使用したＥＤＣ濃度と良好な相関（Ｒ2＝０．９７）を示した（図１４Ａ〜Ｂ）。結果は、架橋ビーズのインビボ滞留時間が、架橋度と相関する可能性があることを示唆する。
【０２４６】
実施例３−小さな区画に分かれた架橋ビーズの検証
生体用材料の健康な成体ラットの腎臓への直接微量注入後に、架橋ビーズの生分解性をインビトロおよびインビボの両方で評価した。架橋ビーズの細胞適合性に取り組むために、初代ラット腎臓細胞を動的条件下、架橋ビーズ上で培養した。２４時間後、ビーズの細胞生存アッセイを行った。非架橋ビーズは、培養条件（３７℃）下で液化したため、このアッセイには含めなかった。
【０２４７】
方法
選択腎臓細胞（ＳＲＣ）調製物。生検材料をハンクス液（ＨＢＳＳ）で洗浄後、細かく切り刻み、秤量した後、４ユニットのディスパーゼ１のＨＢＳＳ中溶液および５ｍＭのＣａＣｌ２を含む３００ユニット／ｍｌのコラゲナーゼＩＶ型から構成される緩衝液中で解離させた。得られた細胞懸濁液を高ブドウ糖（４．５ｇ／Ｌ）ＤＭＥＭ：ＫＳＦＭ含有５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳの１：１混合物で洗浄後、高ブドウ糖（４．５ｇ／Ｌ）ＤＭＥＭ：ＫＳＦＭ含有５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳの１：１混合物、２．５μｇヒト組換え型上皮増殖因子１−５３（ｒＥＧＦ１−５３）、２５ｍｇウシ下垂体エキス（ＢＰＥ）、１Ｘ  ＩＴＳ（インスリン／トランスフェリン／セレン）中（さらに平板培養用１Ｘ抗生物質／抗真菌剤を含む）に再懸濁する。３７℃／５％ＣＯ２下でインキュベーションを行う。細胞を取り剥がし、ＥＤＴＡを含む０．２５％トリプシンで継代培養する。生存をトリパンブルー色素排除により評価し、血球計を使ってマニュアルで計数を行った。
【０２４８】
培養後分離の前に、培養液を大気酸素に近い条件（１６〜２１％）から生理学的にさらに関連のある低酸素（２％）環境に一晩移す。細胞を取り剥がし、ＥＤＴＡ含有０．２５％トリプシンを使って採取する。生存をトリパンブルー色素排除により評価し、血球計を使ってマニュアルで計数を行う。細胞懸濁液を２ｍＬの非補充ＫＳＦＭ（ｕＫＳＦＭ）中の６０〜７５ｘ１０６細胞として調製し、２ステップイオジキサノール（ＯｐｔｉＰｒｅｐ（登録商標）；ｕＫＳＦＭ中の６０％ｗ／ｖ）密度勾配（１６％、７％）を使って、１５ｍＬ円錐形ポリプロピレン管で、８００ｘｇ、室温で２０分間遠心分離（ブレーキ無し）を行って分離した。１６％と７％イオジキサノール層の間の界面の細胞バンドを集め、処方の前に、３ｘの無菌の食塩水中で洗浄する。
【０２４９】
処方。バンド形成後、選択腎臓細胞（ＳＲＣ）をペレット化し、計数し、食塩水中で洗浄し、さらに、ゼラチンで最終洗浄を行う。最終遠心分離後、ゼラチン溶液上清を取り除き、充分な容量の１００ｕＭトロロクス等量を含む０．７５％ゼラチンを加えて目標容量／細胞濃度にする。
【０２５０】
あるいは、最初にＳＲＣを、２．５ｘ１０６細胞／３５μｌビーズ（遠心分離容量）の比率で架橋ビーズ上に播種し、１．５ｍｌ基本培地／百万細胞と共に、１ｒｐｍの回転装置中の管に入れて、３７℃／５％ＣＯ２で一晩インキュベートする。基本培地は、１：１の容量比率のＤＭＥＭ−ＨＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とケラチノサイト−ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の混合物から構成される。これらの細胞播種ビーズは、次に、遠心分離により穏やかにペレット化され、上清が取り出された後、１０％ゼラチンのＰＢＳ中溶液に再懸濁することによりさらに処方される。１０％ゼラチンは、外界温度でゲルであるが、３７℃では液体である。ゼラチン：ビーズ体積比率は、１：５であった。
【０２５１】
細胞適合性．ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）細胞生存率／細胞毒性キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使って、処方細胞の２４時間後の生存率アッセイを行った。
【０２５２】
生体用材料のインビボ移植および評価。架橋ビーズに細胞を播種し、上述のように処方した。全ての実験方法をＣａｒｏｌｉｎａｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＣｅｎｔｅｒのＰＨＳおよびＬＡＣＵＣガイドラインに従って実施した。イソフルラン麻酔下、雌Ｌｅｗｉｓラットは、正中切開され、左腎臓を露出された。処方生体用材料（３５μｌ）を微量注入法により腎実質に導入した（Ｂａｓｕ、前出、２０１１）。注射後１または４週でラットを屠殺した。早期死亡は無かった。
【０２５３】
統計分析。サイズ分布プロファイルに対して、ビーズ直径値を２パラメーターワイブル式に当てはめた。アミン定量および酵素消化データのために、値を一因子分散分析により比較した。
【０２５４】
結果
予想通り、ビーズは、高細胞付着および生存率を持続した（図１５）。動的条件下で２４時間のインキュベーション後、架橋ビーズの細胞適合性を、２５ｍＭ  ＥＤＣで架橋した架橋ゼラチンビーズ上の初代ラット腎臓細胞をＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）染色により評価した（図１６）。２５ｍＭ  ＥＤＣ架橋ビーズ上の染色したラット腎臓細胞の画像をこのシリーズの代表として選択した。顕微鏡評価により細胞付着と生存率の両方が、ＥＤＣ架橋生体用材料の細胞適合性に関する以前報告のデータと一致することが解った（Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．、前出、２０１０；Ｌｖ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  Ａ２００８；８４：１９８−２０７）。
【０２５５】
我々のインビトロ観察をさらに確認するために、代表的な小さな区画に分かれた架橋ビーズ（２５、５０および１００ｍＭ  ＥＤＣ）を雌Ｌｅｗｉｓラット腎臓の同所に注射し、１週および４週後、組織評価を行った。第１週では、架橋材料の全注射部位は、局所的、軽度尿細管拡張／萎縮症および、軽度線維形成反応を伴った、主に慢性炎症性浸潤（マクロファージ、血漿細胞、リンパ球および巨細胞）からなる細胞過多応答の増加を特徴としていた。全体として、この時点では、我々は、生体用材料の中等度の分解、および中等度の組織内方成長および血管新生に注目した。重要なのは、注射後１週間で、既に、観察された分解パターンが、インビトロデータにより示された傾向と良い相関があるように見えることである。
【０２５６】
げっ歯類（腎臓注射）におけるこれらの生体用材料のインビボ性能評価により、ビーズは生体適合性であり、生体適合性微小環境を付与することができ、そこで、細胞が生理学的に機能できることが確認された（図１７）。さらに、架橋ビーズの微調整可能分解パターンは、我々のインビトロ観察と相関した（図１８）。図１８と図１９は、その上に播種されたラット細胞を有するゼラチンビーズの組織像を示す。組織スライドをマッソントリクローム（コラーゲンブルーに染色）またはヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。画像を正の指標（組織内方成長、１ヶ月間および健康な組織で生体用材料の最低限の検出〜非検出）および負の指標（マクロファージ、巨細胞、および他の炎症性細胞の存在；線維性カプセル形成を支援する生体用材料残留および集合管寸法の増加）の両方で評価した。これらの画像は、最小の炎症反応および軽度の線維カプセル形成を伴った生体用材料中への頑強な組織内方成長を示す。さらに、移植に関連して良好に血管新生された組織が形成された。
【０２５７】
図１８は、注射の１週間後の架橋ゼラチンビーズの分解を示す腎臓切片の組織評価である。白色矢印は、Ｈ＆Ｅおよびトリクローム染色切片の両方の架橋ビーズを示す。トリクロームはゼラチンを青に染色し、ビーズ（白色矢印）、およびビーズ分解から生じたゼラチン痕跡（黒色矢印）の両方の可視化を可能とする（全画像について、スケールバーは２００μｍ）。４週間では、全注射部位は、中等度の線維細胞応答および慢性間質性炎症（単球性）を示した。
【０２５８】
図１９は、注射の４週間後の架橋ゼラチンビーズの分解を示す腎臓切片の組織評価である。白色矢印は、Ｈ＆Ｅおよびトリクローム染色切片の両方の架橋ビーズを示す。トリクロームはゼラチンを青に染色し、ビーズ（白色矢印）、およびビーズ分解から生じたゼラチン痕跡（黒色矢印）の両方の可視化を可能とする（全画像について、スケールバーは２００μｍ）。生体用材料の分解は、中等度（１００ｍＭ  ＥＤＣ架橋）から顕著（２５ｍＭ  ＥＤＣ架橋）にランク付けされた（図１９、ビーズは、白色矢印で示す；黒色矢印は、分解された材料を示す）。２５ｍＭ  ＥＤＣ架橋ビーズに対しては、最小限の残存生体用材料（ビーズ）があり、中等度から顕著な組織内方成長および中等度の血管新生を伴って、軽度の慢性炎症（マクロファージおよび巨細胞）により取り囲まれている。中等度から顕著な分解が、５０ｍＭ  ＥＤＣ架橋ビーズに認められたが、一方、１００ｍＭ  ＥＤＣの方は、部分的に（軽度に）分解したビーズの無定形凝集体として認められ、これは、主にマクロファージと巨細胞、および、少しの血漿細胞とリンパ球から構成される中等度の慢性炎症により取り囲まれていた。また、この試料に対し、適切な組織／細胞の内部成長を伴って、末梢に中等度から顕著な線維細胞応答が認められた（図１９）。全体としては、両時点での我々の組織観察は、我々のインビトロ試験で観察された分解パターンと一致した。さらに、架橋度の異なるビーズは、インビボ耐容性良好で、生体用材料の線維カプセル封入を誘発せず、周辺組織にうまく一体化した。
【０２５９】
ゼラチンベースビーズのインビトロ酵素分解速度は、合成時の架橋に使用するＥＣＤの濃度で制御可能である。本明細書で提示の製作プロセスは、臨床的産物の産生に現在使われている試薬を使って、微調整可能な酵素感受性を有する生分解性足場の製作用の単純でコスト効率の高いプロセスを示すことを意図している。微調整可能なインビトロ分解から微調整可能なインビボ分解への移行は、活発に研究中であり、また、生体用材料製作用の有用なプラットホーム技術を示すことが可能となり、それにより、空間的、構造的特性の時間的持続を、再生される予定の臓器および／または組織の特異的ニーズに最適化でき得る。
【０２６０】
生体用材料の物理化学的、生物学的特性の制御は、いずれの組織工学適用への成功にとっても重要である。我々の場合は、１つの要求は、生存可能な細胞を所望の部位へ送達できる特異的インビボ滞留時間を有する生体用材料に対し、細胞を新しい環境条件に適応させ、適切な組織や臓器に分化させる間に、細胞浸潤および増殖から生ずる再生の変化、およびその後の再吸収に必要な空隙を提供することであった。我々は、ここで、ＥＤＣ（コラーゲンベースＦＤＡ認可デバイスの製造で広く採用されているカルボジイミド）および水ベースの化学架橋プロセスを使って、広い範囲にまたがる生分解速度を有するゼラチンビーズを得ることができることを示した。さらに、このプロセスは、非常に再現性がよい。全体として、この手法は、臓器特異的生分解速度を有する組織工学生体用材料を作製する有効で、効率的な手段を提供する。
【０２６１】
全体として、我々は、種々の分子に対するスペーサー、細胞送達系またはミクロ担体として機能できるゼラチンベースミクロビーズを製造することができた。この設計は、ゼラチンの濃度依存性融解温度を調べ、この特性を適用して、温度応答性スペーサービーズを得る。さらに、単純な、十分に特性化された化学反応を用いて、これらのビーズをインビボおよびインビトロの両方で所望の酵素分解速度に従うように適合させることができる。以前報告した類似の架橋系は、ここで報告した物理的特徴を有していなかった。この特徴が、我々の系をマイクロ担体または細胞送達への適用にとってさらに適したものにする。
【０２６２】
実施例４−げっ歯類半腎切除モデルの、選択腎臓細胞および生体用材料から構成される新腎臓増強プロトタイプの移植に対する生物応答
腎機能を回復するための新規治療に対する必要性に対処する目的で、組織と臓器の再生を触媒できる独特の統合再生医療技術プラットホームが開発された。
【０２６３】
生体用材料および選択再生腎臓細胞（ＳＲＣ）から構成される新腎臓増強（ＮＫＡ）産物プロトタイプは、腎組織の再生を促進できる、そのようなプラットホームの１つである。ＳＲＣは、腎臓生検の酵素消化および細胞の密度勾配分離から得られる。ゼラチンベースヒドロゲル（ＧＢＨ）を、生体用材料として使用した。哺乳類腎臓のＮＫＡプロトタイプの移植に対する生物応答は、健康な成体げっ歯類で以前に評価されている（Ｂａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．、２０１１、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、印刷中）。しかし、げっ歯類からの単一腎臓の除去（半腎切除）は、モデルの感度を増加させ、全身的作用の中毒効果の検出を可能とする。この研究では、１５匹の半腎切除げっ歯類のレムナント腎臓の腎実質内にＮＫＡプロトタイプを注射し、主要腎臓生理指標を評価した。
【０２６４】
方法
新腎臓増強プロトタイプを、選択腎臓細胞を表１に示す生体用材料と組み合わせて作成した。細胞／生体用材料構築物は、図２０（ＮＫＡ構築物作製用戦略のアウトライン）に示すように調製した。
【０２６５】
ゼラチン溶液調製：
０．７５％または１．０％ｗ／ｖゼラチン／１００μＭトロロクス等量溶液を作るために必要な粉末ゼラチンおよびトロロクス等量／ＰＢＳの量を計算する。ＰＢＳを、磁気攪拌子付きビーカー中に置き、１５分間５０℃に設定された攪拌用ホットプレート上で暖める。ゼラチンを、ゆっくり添加し、この混合物を５０℃で１時間攪拌する。予熱した無菌フィルター組み立て品を使って、得られたゼラチン溶液を濾過する。次に、無菌のゼラチン溶液をより小さい体積（１５ｍｌ管の１０ｍｌ）に分注し、使用するまで４℃で貯蔵する。
【０２６６】
ＳＲＣとの混合により、所望の０．７５％（または１．０％）ゼラチン／１００μＭトロロクス等量溶液が得られる場合は、好ましい手法は、０．７６％または１．０１％ゼラチンのＰＢＳ中溶液を作り、その後、充分な容量の１００Ｘ（１０ｍＭ）トロロクス等量を加えることである。
（表１）
半腎切除げっ歯類群への生体用材料送達の要約
0006054299.tif 000002
【０２６７】
結果：
図２１Ａ〜Ｃは、選択げっ歯類再生腎臓細胞生体用材料構築物の代表的ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ染色を示す。構築物を、半腎切除Ｌｅｗｉｓラット（２月齢）のレムナント腎臓に１８標準規格注射針を使って送達した。全血、血清および尿化学から得た生理的指数を移植前または移植後４週目の時点で、評価した。動物を注射後４週で屠殺し、炎症性または線維性生物応答の証拠のために、レムナント腎臓の組織調査を行った。
【０２６８】
ＮＫＡプロトタイプの移植は、主要腎臓生理指標に大きな影響を与えず、炎症性、壊死のまたは線維性生物応答の最小限の証拠を示した。従って、ＧＢＨ中のＳＲＣに基づくＮＫＡプロトタイプは、げっ歯類半腎切除モデルにおいて、レムナント腎臓に対し耐容性良好である。
【０２６９】
図２２は、移植４週後の群による体重（Ａ）、血液尿素窒素レベル（Ｂ）および血清クレアチンレベル（Ｃ）の変化の要約を示す（分散分析）−Ａ：群ＩＤによる重量増分の一元分析；Ｂ：群ＩＤによるｓＢＵＮ増分の一元分析（ＢＵＮ：血液尿素窒素）；Ｃ：群ＩＤによるＳｅｒｅ増分の一元分析（Ｓcｒｅ：血清クレアチニン）。
【０２７０】
図２３は、移植４週後の群による尿タンパク質／クレアチニン（Ａ）および尿タンパク質（Ｂ）の変化の要約を示す（分散分析）−Ａ：群ＩＤによるＵＰＣ増分の一元分析（ＵＰＣ：尿タンパク質／クレアチニン）；Ｂ：群ＩＤによるＵｐｒｏｔｅｉｎ増分の一元分析（Ｕｐｒｏｔｅｉｎ：尿タンパク質）。
【０２７１】
図２４は、移植４週後の群による比重（Ａ）および尿クレアチニン（Ｂ）の変化の要約を示す（分散分析）−Ａ：群ＩＤによる比重増分の一元分析；Ｂ：群ＩＤによるＵｃｒｅ増分の一元分析（Ｕｃｒｅ：尿クレアチニン）。全体として、細胞／生体用材料構築物の半腎切除げっ歯類モデルへの導入は、ＳＲＣに比べ、１ヶ月間にわたる期間、腎臓生理機能の主要指標に影響を与えなかった。
【０２７２】
また、細胞／生体用材料構築物の半腎切除げっ歯類モデルへの導入も、レムナント腎臓に大きな組織学的影響を与えなかった。
【０２７３】
図２５は、４週後の半腎切除ラット；腎臓外髄質（内側線条）；ＨＥ、ｘ４００を示す。バッチＡ（図２５上段）；核の肥満化を特徴とする尿細管壊死（バッチ１に記載）もラットＨＮ−１６およびＨＮ−１８で観察されたが、ＨＮ−７およびＨＮ−１０では観察されず、これらには、腎臓実質内に大きな病変は認められなかった。バッチＢ（図２５下段）；外髄質の内側線条に核の肥満化を示す最小限の局所的尿細管壊死が１匹のラット（ＨＮ−１１）で認められたが、残りの動物（ＨＮ−１２、ＨＮ−１３およびＨＮ−１４）では認められず、従って、正常な限界内であると考えられた。
【０２７４】
まとめると、選択腎臓細胞／生体用材料新腎臓増強プロトタイプのげっ歯類半腎切除モデルへの移植は、レムナント腎臓生理機能または組織に影響を与えない。
【０２７５】
実施例５−生物学的応答性腎臓細胞の単離および特徴付け
成体雄ブタ（イノシシ）の貧血を伴う特発性進行性慢性腎疾患（ＣＫＤ）の症例から、同年齢の正常なブタ腎組織と直接比較して細胞組成物の評価と特徴付けを行うための、新鮮な腎臓患部組織が提供された。採取時間での腎組織の組織学的検査により、重篤なびまん性慢性間質性線維症および多巣性線維形成を伴う半月体形成性糸球体腎炎を特徴とする腎疾患であると確認された。臨床化学により、高窒素血症（血中尿素窒素および血清クレアチニンの上昇）、および軽度の貧血（ヘマトクリットの軽度の減少および低下したヘモグロビンレベル）である事が確認された。病気および正常の両方の腎組織由来の細胞が単離され、増殖されて、特性が明らかにされた。Ｐｒｅｓｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第２０１０／０５６３２８号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の図１に示されるように、ゴモリのトリクローム染色により正常な腎組織に比較して腎臓患部組織中の線維形成が強調される（矢印で示す青色染色）。キュビリン：メガリンを発現し、受容体媒介アルブミン輸送ができる機能性尿細管細胞が、正常および病気両方の腎組織から増殖する。エリスロポエチン（ＥＰＯ）発現細胞は、また、培養物中に存在し、複数の継代中保持され、冷凍／解凍サイクルを受ける。さらに、分子分析により、正常および患部組織の両方由来のＥＰＯ発現細胞は、インビトロの低酸素性の条件に応答し、ＥＰＯおよびｖＥＧＦ等の他の低酸素調節遺伝子標的のＨＩＦ１α駆動型誘導が起こる。細胞は、コラゲナーゼ＋ディスパーゼの酵素消化によりブタ腎組織から単離され、また、単純な機械的消化および外植片培養を行うことにより、別の実験でも単離された。継代２で、ＥＰＯ発現細胞含有の外植片由来細胞培養を大気（２１％）および可変の低酸素性（＜５％）培養の両方の条件に供し、低酸素への暴露が、ＥＰＯ遺伝子発現の上昇発現の結果をもたらすのかどうかを判定した。げっ歯類培養について述べたように（実施例３を参照）、正常なブタは、酸素依存性発現およびＥＰＯ遺伝子調節を示した。驚くべきことに、ＣＫＤブタの尿毒性／貧血状態（ヘマトクリット＜３４、クレアチニン＞９．０）にもかかわらず、ＥＰＯ発現細胞は、容易に単離され、組織から増殖し、ＥＰＯ遺伝子の発現は、低酸素に調節されたままであった（Ｐｒｅｓｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第２０１０／０５６３２８号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の図２に示すように）。Ｐｒｅｓｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第２０１０／０５６３２８号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の図３に示すように、増殖培養物中の細胞は、尿細管様構造へと自己組織化する能力を示した。Ｐｒｅｓｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第２０１０／０５６３２８号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の図４に示すように、培養細胞によるＦＩＴＣ複合化アルブミンの受容体媒介取込を観察することにより、培養物（継代３の）中の機能的尿細管細胞の存在が確認された。緑色の点（細い白色の矢で示す）は、取り込まれたフルオレセイン複合化アルブミンを表し、これは、尿細管細胞特異的受容体であるメガリンとキュビリンにより媒介され、機能的尿細管細胞によるタンパク質の再吸収を示す。青色染色（細い白色の矢で示す）は、Ｈｏｅｓｃｈｔ染色した核である。まとめると、これらのデータは、機能的尿細管および内分泌細胞は、ＣＫＤに激しく侵されている腎組織であっても、ブタ腎組織から単離、増殖できることを示唆している。さらに、これらの知見は、ＣＫＤの処置に対する自己細胞ベースの治療薬の進展を支援する。
【０２７６】
さらに、ＥＰＯ産生細胞は、正常なヒト成人腎臓から酵素を使って単離された（上述の実施例１のように）。Ｐｒｅｓｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第２０１０／０５６３２８号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の図５に示すように、単離プロセスにより、初期組織中よりも、単離後に相対的により多くのＥＰＯ発現が生じた。Ｐｒｅｓｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第２０１０／０５６３２８号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の図６に示すように、培養中にヒトＥＰＯ産生細胞を維持し、ＥＰＯ遺伝子発現を保持することが可能である。ヒト細胞を組織培養物処置プレーンプラスチックまたは一部の細胞外のマトリックス、例えば、フィブロネクチンまたはコラーゲンコートプラスチック上で培養／増殖し、全てのものが経時ＥＰＯ発現を裏付けることが明らかになった。
【０２７７】
実施例６−特定生理活性腎臓細胞の単離および富化
腎臓細胞単離：簡単に述べると、１０、２週齢雄Ｌｅｗｉｓラット腎臓のバッチを市販品納入業者（Ｈｉｌｌｔｏｐ  Ｌａｂ  Ａｎｉｍａｌｓ  Ｉｎｃ．）から入手し、約４℃のＶｉａｓｐａｎ保存培地中に入れ一晩輸送した。本明細書記載の全ステップは、生物学的安全キャビネット（ＢＳＣ）中で行い、無菌を保った。腎臓を、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で３回洗浄してＶｉａｓｐａｎ保存培地を洗い流した。３回目の洗浄後、残っている腎臓カプセル剤、ならびに残っている全ての間質組織が除去された。また、主要腎杯を顕微解剖技術を使って取り出した。次に、腎臓を無菌のメスを使って細かく分割してスラリーにした。その後、スラリーを５０ｍｌの遠心分離機の円錐管に移し、秤量した。小試料をＲＮＡ分析用に集め、無菌の無ＲＮアーゼ１．５ｍｌ微量遠心分離機管中に入れ、液体窒素中で急速凍結した。凍結するとすぐに、−８０℃フリーザーに移し、分析まで保存した。１０個の若齢腎臓の組織重量は、約１グラムに相当する。バッチの重量に基づいて、消化培地を、１グラムの組織当たり２０ｍｌの消化培地になるように調節した。この手続き用消化緩衝液には、４ユニットのＨＢＳＳ中ディスパーゼ１（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈ）、５ｍＭ  ＣａＣｌ２（シグマ）含有３００Ｕｎｉｔｓ／ｍｌのコラゲナーゼタイプＩＶ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）を含めた。
【０２７８】
適切な体積の予熱した消化緩衝液を管に添加し、密封して、３７℃のインキュベーター中のロッカーに２０分間入れた。この第１消化ステップは、多くの赤血球を除き、残っている組織の消化を高める。２０分後、管を取り出し、ＢＳＣ中に入れた。組織を管の底に静置し、次に、上清を取り除いた。残っている組織に、出発容量と等量の新しい消化緩衝液を補充した。追加の３０分間、３７℃インキュベーター中のロッカーに管を再度入れた。
【０２７９】
３０分後、消化混合物を７０μｍセルストレーナー（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）を使って等容量の中和緩衝液中に分注し（ＤＭＥＭｗ／１０％ＦＢＳ）、消化反応を停止させた。その後、細胞懸濁液を３００ｘｇの遠心分離により５分間洗浄した。遠心分離後、ペレットをＫＳＦＭ培地に再懸濁し、トリパンブルー色素排除を使った細胞計数および生存率評価用に試料を採取した。細胞数を計算するとすぐに、百万個の細胞をＲＮＡ分析用に集め、ＰＢＳで洗浄し、急速液体窒素中で凍結した。残った細胞懸濁液をＫＳＦＭ培地で５０ｍｌにして、再度３００ｘｇの遠心分離により５分間洗浄した。洗浄後、ＫＳＦＭ  １ｍｌ当たり１千５百万細胞の濃度で細胞ペレットを再懸濁した。
【０２８０】
次に、５ｍｌの腎臓細胞懸濁液を１５ｍｌ遠心分離機円錐管（ＢＤＦａｌｃｏｎ）中の５ｍｌの３０％（ｗ／ｖ）Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（登録商標）に添加し、６回反転により混合した。これにより、１５％（ｗ／ｖ）のＯｐｔｉｐｒｅｐ（登録商標）の最終混合物が形成された。反転後、管を１ｍＬ  ＰＢＳで注意深く層状化した。管をブレーキなしで、８００ｘｇで１５分間遠心分離した。遠心分離後、管を取り出し、混合勾配の先端に細胞バンドを形成した。また、赤血球、死細胞、および少しの小さな顆粒状の少ない細胞、少しのＥＰＯ産生細胞、少しの尿細管細胞、および少しの内皮細胞、等の小集団の生細胞を含むペレットも存在した。バンドを、ピペットで注意深く取り出し、別の１５ｍｌ円錐管に移した。吸引により勾配培地を取り除き、ペレットを１ｍｌのＫＳＦＭ中へ再懸濁した。次に、バンド細胞およびペレット細胞を再度組み合わせて、ＫＳＦＭを使って少なくともの集めたバンド容量の３倍の希釈度にして再懸濁し、３００ｘｇの遠心分離で５分間洗浄した。洗浄後、細胞を２０ｍｌのＫＳＦＭに再懸濁し、細胞計数用試料を集めた。トリパンブルー色素排除を使った細胞数の計数が終わるとすぐ、ＲＮＡ試料として百万個の細胞を集め、ＰＢＳで洗浄し、液体窒素中で急速凍結した。
【０２８１】
密度勾配分離を使って特定の生理活性腎臓細胞の生存率と培養能力を高めるための前培養「清浄化（Ｃｌｅａｎ−ｕｐ）」：不純物のない、生存可能な培養用細胞集団を得るために、「腎臓細胞単離」で上述したように、最初に細胞懸濁液を生成した。随意選択ステップとして、および初期調製物を精製する手段として、無菌の等張性緩衝液中に懸濁させた１億個もの合計細胞と、ストックの６０％（ｗ／ｖ）イオジキサノールから室温で調製した等体積の３０％Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（登録商標）とを完全に１：１に室温で混合し（従って、最終的に１５％ｗ／ｖ  Ｏｐｔｉｐｒｅｐ溶液が得られる）、６回の反転により完全に混ぜ合わせる。混合後、１ｍｌのＰＢＳ緩衝液を混合細胞懸濁液の上端に注意深く層状に加えた。その後、勾配管を注意深く遠心分離機に装填し、適性バランスを確保した。勾配管を８００ｘｇ、２５℃で１５分間、ブレーキなしで遠心分離した。清浄化細胞集団（生存可能で、かつ機能的集合管、尿細管、内分泌、糸球体、および血管細胞を含む）は、１．０２５〜１．０４５ｇ／ｍＬの間の密度に対応する６％と８％（ｗ／ｖ）Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（登録商標）の間に分配された。他の細胞および壊死組織片は、管の底部にペレット化された。
【０２８２】
腎臓細胞培養：１つにまとめた細胞バンドとペレットを、次に、ＤＭＥＭ（高ブドウ糖）／｛５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、２．５μｇＥＧＦ、２５ｍｇＢＰＥ、抗生物質／抗真菌剤を含む１ＸＩＴＳ（インスリン／トランスフェリン／亜セレン酸ナトリウム培地補助剤）を含むＫＳＦＭ｝の５０：５０混合物１５０ｍｌ中に３０、０００細胞／ｃｍ２の細胞濃度で、組織培養物処理トリプルフラスコ（Ｎｕｎｃ  Ｔ５００）または等価物中に播種した。細胞を、加湿５％ＣＯ２インキュベーター中で２〜３日培養し、２１％大気酸素レベルを細胞に与えた。２日後、培地を交換し、培養物をＣＯ２／窒素ガスマルチガス加湿インキュベーター（Ｓａｎｙｏ）から提供された２％酸素レベル環境中に２４時間置いた。２４時間のインキュベーション後、細胞を６０ｍｌの１Ｘ  ＰＢＳで洗浄し、４０ｍｌの０．２５％（ｗ／ｖ）トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）で取り出した。取り出しに際し、細胞懸濁液を等容量の１０％ＦＢＳ含有ＫＳＦＭで中和した。その後、細胞を３００ｘｇの遠心分離で１０分間洗浄した。洗浄後、細胞を２０ｍｌのＫＳＦＭ中に再懸濁し、５０ｍｌ円錐管に移して、細胞計数用試料を集めた。生存可能な細胞数がトリパンブルー色素排除を使って決定されるとすぐに、ＲＮＡ試料として百万個の細胞を集め、ＰＢＳで洗浄後、液体窒素中で急速凍結した。細胞をＰＢＳで再度洗浄し、３００ｘｇの遠心分離で５分間、集めた。洗浄した細胞ペレットをＫＳＦＭ中に３千７百５０万細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。
【０２８３】
密度ステップ勾配分離を使った特定の生理活性腎臓細胞の富化：、主に腎臓尿細管細胞からなるが、他の細胞型（集合管、糸球体、血管、および内分泌細胞）小亜集団を含む培養腎臓細胞を、複数の濃度ｗ／ｖのイオジキサノール（Ｏｐｔｉｐｒｅｐ）から作られた密度ステップ勾配を使って、それらの成分亜集団に分離した。採取前に、培養物を低酸素性環境中に２４時間まで置き、勾配にかけた。無菌の１５ｍＬ円錐管中で４つの異なる密度の培地を相互の上端の上に層状に導入することによりステップ勾配を形成し、最高密度の溶液を底部に配置し、最低密度溶液を上端に層状に導入した。細胞をステップ勾配の上端に加え、遠心分離し、これにより、集団をサイズと粒状性に基づき複数のバンドに分離させる結果を得た。
【０２８４】
簡単に述べると、ＫＦＳＭ培地を希釈剤として使用して、７、１１、１３、および１６％Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（登録商標）（６０％ｗ／ｖイオジキサノール）の濃度を作った。例えば、５０ｍｌの７％（ｗ／ｖ）Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（登録商標）に対し、５．８３ｍｌのストック６０％（ｗ／ｖ）イオジキサノールを４４．１７ｍｌのＫＳＦＭ培地に添加し、反転により良く混合した。無菌の毛細血管に連結した無菌のＬ／Ｓ  １６タイゴン管を備えたぜん動ポンプ（Ｍａｓｔｅｒ  Ｆｌｅｘ  Ｌ／Ｓ）を、２ｍｌ／分の流量に設定し、２ｍＬの各４つの溶液を、最初に１６％溶液、続いて１３％溶液、１１％溶液、そして７％溶液の順に、無菌の１５ｍＬ円錐管に加えた。最後に、７千５百万個の培養げっ歯類腎臓細胞含有２ｍＬ細胞懸濁液をステップ勾配の頂上に加えた（上述の「腎臓細胞培養」にあるようにして懸濁液が生成された）。重要なのは、ポンプが勾配溶液を管に送り始めると、液体が４５°の角度で管の側面をゆっくり流れ落ちるようにして、適正な界面が各勾配の層の間に確実に形成されるように注意したことである。細胞を負荷されたステップ勾配は、次に、８００ｘｇで２０分間、ブレーキなしで遠心分離にかけられた。遠心分離後、管を各界面を乱さないように注意深く取り出した。５つの異なる細胞画分が得られた（４バンドおよびペレット）（Ｂ１〜Ｂ４、＋ペレット）（図２６、左円錐管参照）。各画分を無菌のディスポーザブルバルブピペットまたは５ｍｌピペットを使って集め、表現型および機能性の観点から特徴付けした（Ｐｒｅｓｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第２０１０／０５６３２８号の実施例１０を参照）。げっ歯類腎臓細胞懸濁液をステップ勾配分画にかけると、尿細管細胞富化画分（および集合管由来の細胞を少し含む）は、１．０６２〜１．０８８ｇ／ｍＬの密度区分に分配された。対照的に、エクスビボ培養後に密度勾配分離を行った場合、尿細管細胞富化画分（および集合管由来の細胞を少し含む）は、１．０５１〜１．０６２ｇ／ｍＬの密度区分に分配された。同様に、単離直後に、げっ歯類腎臓細胞懸濁液がステップ勾配分画にかけられた場合、ＥＰＯ産生細胞、糸球体有足細胞、および血管細胞（「Ｂ４」）富化画分は、１．０２５〜１．０３５ｇ／ｍＬの密度区分に分配された。対照的に、エクスビボ培養後に、密度勾配分離を行った場合は、ＥＰＯ産生細胞、糸球体有足細胞、および血管細胞（「Ｂ４」）富化画分は、１．０７３〜１．０９１ｇ／ｍＬの密度の区分に分配された。重要なのは、培養物の低酸素性培養環境への暴露（約１時間〜約２４時間の間）により、培養後に細胞の「Ｂ２」および「Ｂ４」画分への分配が高められたことである（低酸素は、採取およびステップ勾配手続きの前で、２１％（大気）未満の酸素レベルとして定義される（バンド分布に対する低酸素効果についてのさらなる詳細は、実施例７で提供される））。
【０２８５】
各バンドを３ｘ容量のＫＳＦＭで希釈し、よく混合し、３００ｘｇで５分間遠心分離することにより洗浄した。ペレットを２ｍｌのＫＳＦＭ中に再懸濁し、生存可能な細胞をトリパンブルー色素排除および血球計を使って計測した。百万個の細胞をＲＮＡ試料のために集め、ＰＢＳで洗浄し、液体窒素中で急速凍結した。尿毒性および貧血雌ラットに対する移植調査のために、Ｂ２およびＢ４由来の細胞を使用した。これらのラットは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓで２段ステップ５／６腎摘出術法により生成された。エリスロポエチンとｖＥＧＦの酸素調節発現、糸球体マーカーの発現（ネフリン、ポドシン）、および血管マーカーの発現（ＰＥＣＡＭ）を含むＢ４の特性は、定量リアルタイムＰＣＲにより確認された。「Ｂ２」画分の表現型は、Ｅ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリン、およびアクアポリン−２．の発現により確認された。Ｐｒｅｓｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第２０１０／０５６３２８号の図４９ａと４９ｂを参照。
【０２８６】
従って、ステップ勾配戦略の使用は、ＥＰＯ産生細胞（Ｂ４）の希少な集団の富化のみでなく、機能的尿細管細胞（Ｂ２）が相対的に富化された画分を生成する手段も可能とする（Ｐｒｅｓｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第２０１０／０５６３２８号の図５０と５１を参照）。ステップ勾配戦略は、また、ＥＰＯ産生および尿細管細胞の、赤血球、細胞壊死組織片、および他の潜在的に望ましくない細胞型、例えば、大きな細胞凝集物および特定の型の免疫細胞からの分離を可能とする。
【０２８７】
ステップ勾配手続きは、採用された特定の密度について、細胞成分の良好な分離を得るために調節が必要な場合がある。好ましい勾配調節手法には、１）勾配の底の高密度（例えば、１６〜２１％Ｏｐｔｉｐｒｅｐ）から、勾配の上端の相対的に低密度（例えば、５〜１０％）までの連続的密度勾配を機能させることが含まれる。連続的勾配は、任意の標準的密度勾配溶液（フィコール、パーコール、ショ糖、イオジキサノール）を使って、標準的な方法（Ａｘｉｓ  Ｓｈｉｅｌｄ）に従って調製できる。対象の細胞を連続勾配に加え、８００ｘＧで２０分、ブレーキなしで遠心分離する。類似のサイズと粒度の細胞は、一緒に勾配中に分離する傾向があり、その結果、勾配の相対的位置が測定でき、さらに、その位置の溶液の比重も、測定できる。従って、その後で、特定条件下で密度勾配を全体にわたるその能力に基づいて、特定の細胞集団の単離に焦点を合わせた確定したステップ勾配を得ることができる。不健康−対−健康組織由来細胞を単離する場合、または、異なる種由来の特定細胞を単離する場合に、このような最適化が、採用される必要がありうる。例えば、最適化がイヌのおよびヒト両方の腎臓細胞培養物に対して行われ、ラットで同定された特異的Ｂ２およびＢ４亜集団を他の種から単離可能であることを確実にした。げっ歯類Ｂ２およびＢ４亜集団の単離用最適勾配は、７％、１１％、１３％、および１６％（ｗ／ｖ）Ｏｐｔｉｐｒｅｐから構成される。イヌのＢ２およびＢ４亜集団の単離用最適勾配は、７％、１０％、１１％、および１６％（ｗ／ｖ）から構成される。ヒトＢ２およびＢ４亜集団単離用最適勾配は、７％、９％、１１％、１６％（ｗ／ｖ）から構成される。この結果、培養げっ歯類、イヌ、およびヒト腎臓細胞のＢ２およびＢ４に対する局在化密度範囲は、表２に示される。
（表２）
種の密度範囲
0006054299.tif 000003
【０２８８】
実施例７−勾配前の低酸素培養が、バンド分布、組成、および遺伝子発現に影響する
プロトタイプＢ２およびＢ４の分布および組成に与える酸素条件の効果を測定するために、勾配ステップの前に、異なる種由来の新規腎臓（ｎｅｏｋｉｄｎｅｙ）細胞調製物を種々の酸素条件に暴露した。ラット細胞単離および培養開始のための標準的手順を使って、上述のように、げっ歯類新規腎臓増強（ＮＫＡ）細胞調製物（ＲＫ０６９）を確立した。２１％（大気）酸素条件下で２〜３日間、全てのフラスコを培養した。培地を交換し、半分のフラスコを２％酸素に設定された酸素制御インキュベーターに再配置し、一方、残りのフラスコを追加の２４時間の間、２１％酸素条件に保持した。次に、上述の標準的な酵素による採取法を使って、各セットの条件から細胞を採取した。標準的手続きに従ってステップ勾配を調製し、「正常酸素圧」（２１％酸素）および「低酸素性の」（２％酸素）培養物を別々に採取し、並行してステップ勾配に適用した（図２７）。両条件で４バンドおよびペレットが生成されたが、勾配全体の細胞の分布は、２１％と２％酸素培養バッチで異なっていた（表３）。具体的には、Ｂ２の収率は、低酸素で増加し、同時にＢ３が減少した。さらに、低酸素性培養細胞から生成された勾配中でＢ４特異的遺伝子（例えば、エリスロポエチン）の発現が増加した（Ｐｒｅｓｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第２０１０／０５６３２８号の図７３を参照）。
【０２８９】
上述のように、イヌ細胞単離および培養に関する標準的手順（げっ歯類単離および培養手順に類似の）を使って、イヌのＮＫＡ細胞調製物（ＤＫ００８）を確立した。全てのフラスコを２１％（大気）酸素条件下で４日間培養した後、フラスコのサブセットを低酸素（２％）環境に２４時間移したが、一方、サブセットのフラスコを、２１％で維持した。続けて、各セットのフラスコから回収し、同じステップ勾配供した（図２８）。ラットの結果（実施例６）と同様に、低酸素性培養イヌ細胞は、大気圧酸素培養イヌ細胞とは異なって、勾配全体に分配された（表３）。ここでも、Ｂ２の収率は、勾配の前の低酸素性暴露により増加し、同時にＢ３への分配は減少した。
（表３）
0006054299.tif 000004
【０２９０】
上のデータは、勾配前の低酸素への暴露が、Ｂ２の成分ならびに特定の分化細胞（エリスロポエチン産生細胞、血管細胞、および糸球体細胞）のＢ４への分配を高めることを示す。従って、上述の低酸素性培養、それに続く密度勾配分離は、種全体にわたる「Ｂ２」と「Ｂ４」細胞集団の生成の有効な方法である。
【０２９１】
実施例８−ヒト腎臓からの尿細管／糸球体細胞の単離
全体にわたり記載されている酵素を使った単離方法により、正常なヒト腎組織から尿細管および糸球体細胞を単離し、増殖した。上述の勾配方法により、尿細管細胞画分を培養後、エクスビボで富化した。Ｐｒｅｓｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第２０１０／０５６３２８号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の図６８に示すように、表現型特性は単離および増殖中、維持された。標識アルブミンの取込により評価された尿細管細胞機能は、また、繰り返された継代後も維持され、冷凍保存された。Ｐｒｅｓｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第２０１０／０５６３２８号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の図６９は、尿細管富化および尿細管枯渇集団が３Ｄの動的培養により培養される場合、尿細管マーカー、カドヘリン発現の有意な増加が尿細管富化集団で認められた。このことにより、細胞が３Ｄの動的環境で培養される場合、尿細管細胞の富化が、初期の富化を越えて維持できることが確認される。上述の実施例７で記載の腎臓細胞の同じ培養集団をフローサイトメトリー分析に供し、前方散乱および側方散乱を調査した。小さくて、顆粒がより少ないＥＰＯ産生細胞集団は識別可能であり（８．１５％）、また、フローサイトメーターの選別能力を使って、小さくて、顆粒がより少ない集団のポジティブセレクションにより分離される（Ｐｒｅｓｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第２０１０／０５６３２８号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の図７０を参照））。
【０２９２】
実施例９−自己免疫糸球体腎炎患者試料から単離された腎臓細胞の未分画混合物の特徴付け
腎臓細胞の未分画混合物を上述のように自己免疫性糸球体腎炎患者試料から単離した。腎組織から単離、増殖された腎臓細胞の特定亜集団の不偏の遺伝子型組成を決定するために、定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴＰＣＲ）分析（Ｂｒｕｎｓｋｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、前出、２００８）を採用し、細胞亜画分中の細胞型特異的および経路特異的遺伝子発現パターンの差異を特定した。Ｉｌａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７号の表６．１に示すように、ＨＫ２０は、自己免疫性糸球体腎炎患者試料である。Ｉｌａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７号の表６．２に示すように、ｑＲＴＰＣＲによる測定で、ＨＫ２０から生成された細胞は、糸球体細胞が欠乏している。
【０２９３】
実施例１０−巣状分節性糸球体硬化症の症例から単離された治療に適する腎臓生理活性細胞集団の遺伝的プロファイリング
腎組織から単離、増殖された腎臓細胞の特定亜集団の不偏の遺伝子型組成を決定するために、定量リアルタイムＰＣＲ（ＲＴＰＣＲ）分析（Ｂｒｕｎｓｋｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、前出、２００８）を採用し、細胞亜画分中の細胞型特異的および経路特異的遺伝子発現パターンの差異を特定した。糸球体の大部分が破壊されている巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）の症例由来の、ヒト調製物ＨＫ０２３をＢ４画分の糸球体細胞の存在に関し、採取時に評価した。簡単に述べると、未分画（ＵＮＦＸ）培養物を生成し（Ａｂｏｕｓｈｗａｒｅｂ  ｅｔ  ａｌ．、前出、２００８）、標準的生検方法を使って腎臓から採取した４つのコア生検をそれぞれ相互に独立に維持した。ＵＮＦＸエクスビボでの２継代後、細胞を採取し、密度勾配法（実施例６のように）に供し、げっ歯類、イヌ、および他のヒト試料で行った研究に基づいて、内分泌、血管、および糸球体細胞が富化されていると解っている亜画分Ｂ４を含む亜画分を生成した。
【０２９４】
１．０６３〜１．０９１ｇ／ｍＬの浮遊密度を有する細胞の異なるバンドと思われるＨＫ０２３の各独立ＵＮＦＸ試料からＢ４画分を別々に集めた。ＲＮＡを各試料から単離し、ポドシン（糸球体細胞マーカー）およびＰＥＣＡＭ（内皮細胞マーカー）の発現を定量リアルタイムＰＣＲにより調べた。重篤ＦＳＧＳの生検由来試料から予期されたように、画分中のポドシン（＋）糸球体細胞の存在に関し一貫性がなく、試料の２／４でポドシン検出不可であった。対照的に、ＰＥＣＡＭ＋血管細胞は、生検で惹起された培養物の４／４のＢ４画分で一貫して存在した。従って、Ｂ４画分は、重篤な疾患状態のヒト腎臓からの場合であっても、１．０６３〜１．０９１ｇ／ｍＬ密度範囲で単離できる。
（表４）
ＦＳＧＳの症例から単離された亜画分Ｂ４中の糸球体および血管細胞の検出のためのポドシンおよびＰＥＣＡＭの発現
0006054299.tif 000005
【０２９５】
さらに、Ｉｌａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７号の表７．２に示すように、ヒト試料（ＨＫ０１８）は、密度勾配遠心分離後のｑＲＴＰＣＲでは、ポドシン（糸球体のマーカー）が検出されなかった。
【０２９６】
実施例１１−蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）を用いた生存可能な腎臓細胞型の富化／枯渇
蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）を使って、１つ以上の単離腎臓細胞を富化でき、および／または単離した１次腎組織から１つ以上の特定の腎臓細胞型を枯渇できる。
【０２９７】
試薬：７０％エタノール；洗浄緩衝液（ＰＢＳ）；５０：５０腎臓細胞培地（５０％ＤＭＥＭ（高グルコース））：５０％ケラチノサイト−ＳＦＭ；トリパンブルー０．４％；標的腎臓細胞集団、例えば、腎臓内皮細胞のためのＣＤ３１および腎臓糸球体細胞のためのネフリン、に対する一次抗体。対応するアイソタイプ特異的蛍光二次抗体；染色緩衝液（ＰＢＳ中０．０５％ＢＳＡ）。
【０２９８】
方法：生物学的安全キャビネット（ＢＳＣ）を標準的手順で洗浄後、１次単離または培養細胞由来の腎臓細胞の単一細胞懸濁液は、Ｔ５００Ｔ／Ｃ処理フラスコから得ることができ、腎臓細胞培地に再懸濁させて、氷上に置く。次に、トリパンブルー色素排除法を用いて細胞数と生存率を測定する。例えば、異種起源の集団からの糸球体細胞または内皮細胞の腎臓細胞富化／枯渇に対しては、１０〜５０ｅ６個の少なくとも７０％の生存率の生細胞を得る。腎臓細胞の異種起源の集団を、次に、出発濃度１μｇ／０．１ｍｌの染色緩衝液／１ｘ１０６細胞（必要に応じ力価）の、標的細胞型特異的一次抗体で染色する。標的抗体は、例えば、ＣＤ３１ＰＥ（腎臓内皮細胞特異的）のように複合化できるか、例えば、ネフリン（腎臓糸球体細胞特異的）のように複合化されないようにできる。
【０２９９】
その後、３０分間、光から保護された４℃の氷上で細胞を染色する。３０分のインキュベーション後、細胞を３００ｘｇで５分間遠心分離して、洗浄する。次に、複合化アイソタイプ特異的二次抗体が必要かどうかに応じ、ＰＢＳまたは染色緩衝液中にペレットを再懸濁する。細胞を蛍光色素複合化一次抗体で標識する場合は、１０ｅ７細胞当たり２ｍｌのＰＢＳ中に細胞を再懸濁し、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａまたは等価な細胞選別機で処理する。細胞を蛍光色素複合化抗体で標識しない場合は、１μｇ／０．１ｍｌ／１ｅ６細胞の出発濃度のアイソタイプ特異的蛍光色素複合化二次抗体で細胞を標識する。
【０３００】
次に、３０分間、光から保護された４℃の氷上で細胞を染色する。３０分のインキュベーション後、細胞を３００ｘｇで５分間遠心分離して、洗浄する。遠心分離後、ペレットを５ｅ６／ｍｌ（ＰＢＳ）の濃度でＰＢＳに再懸濁し、１２ｘ７５ｍｍ当たり４ｍｌを無菌の管に移す。
【０３０１】
ＦＡＣｓ  Ａｒｉａをメーカーのインストラクション（ＢＤＦＡＣｓ  Ａｒｉａユーザーマニュアル）に従って、生細胞無菌選別用に準備する。試料管をＦＡＣｓ  Ａｒｉａに装填し、データ取込開始後、ＰＭＴ電圧を調整する。ゲートを特定の波長を使った蛍光の強度により腎臓の特異的細胞型を選択するように設定する。別のゲートを、陰性集団を選択するように設定する。所望のゲートを陽性標的集団および陰性集団を包含するように設定するとすぐに、メーカーの指示に従って、細胞が選別される。
【０３０２】
陽性の標的集団を、１つの１５ｍｌ円錐管に集め、陰性集団を１ｍｌの腎臓細胞培地を入れた別の１５ｍｌ円錐管に集める。収集後、各管からの試料を、フローサイトメトリーにより分析し、純度を測定する。集めた細胞を３００ｘｇで５分間の遠心分離により洗浄し、ペレットを腎臓細胞培地に再懸濁し、さらなる分析と実験に備える。
【０３０３】
実施例１２−磁気細胞選別を使った腎臓細胞型の富化／枯渇
１つ以上の単離された腎臓細胞を富化でき、および／または１つ以上の特定の腎臓細胞型を単離１次腎組織から枯渇できる。
【０３０４】
試薬：７０％エタノール、洗浄緩衝液（ＰＢＳ）、５０：５０腎臓細胞培地（５０％ＤＭＥＭ（高グルコース））：５０％ケラチノサイト−ＳＦＭ、トリパンブルー０．４％、操作緩衝液（ＰＢＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％ＢＳＡ）、リンス緩衝液（ＰＢＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）、洗浄溶液（７０％ｖ／ｖエタノール）、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＦＣＲブロッキング試薬、いずれかのＩｇＧアイソタイプに特異的なＭｉｌｔｅｎｙｉマイクロビーズ、標的抗体、例えば、ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ）もしくはネフリン、または二次抗体。
【０３０５】
方法：生物学的安全キャビネット（ＢＳＣ）清浄化のための標準手順に従い、１次単離または培養由来の腎臓細胞の単一細胞懸濁液を得て、腎臓細胞培地に再懸濁する。細胞数および生存率をトリパンブルー色素排除法により測定する。異種起源の集団から、例えば、糸球体細胞または内皮細胞腎臓細胞の富化／枯渇のためには、少なくとも７０％の生存率の少なくとも１０ｅ６〜４ｅ９個の生細胞を得る。
【０３０６】
富化／枯渇手法のための最良の分離は、対象標的細胞に基づいて決定される。１０％未満の標的出現頻度の細胞の富化、例えば、ネフリン抗体を使った糸球体細胞、に対しては、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ａｕｔｏＭＡＣＳのＰＯＳＳＥＬＤＳ（高感度モードのダブルポジティブ選択（ｄｏｕｂｌｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ））、または同等の計器プログラムが用いられる。１０％超の標的出現頻度の細胞の枯渇に対しては、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ａｕｔｏＭＡＣＳのＤＥＰＬＥＴＥＳ（高感度モードの枯渇（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ））、または同等の計器プログラムが使われる。
【０３０７】
１５ｍｌのコニカル遠心分離管に０．０５％ＢＳＡを含む１μｇ／１０ｅ６細胞／０．１ｍｌ  ＰＢＳを加えることにより、生細胞を標的特異的一次抗体、例えば、糸球体細胞のためのネフリン腎生検ポリクローナル抗体、で標識し、それに続いて、４℃で１５分のインキュベーションを行う。
【０３０８】
標識後、細胞を洗浄して、１０ｅ７細胞当たり１〜２ｍｌの緩衝液を加え、続けて、３００ｘｇで５分間遠心分離することにより非結合一次抗体を除去する。洗浄後、アイソタイプ特異的二次抗体、例えば、０．０５％ＢＳＡ含有１μｇ／１０ｅ６／０．１ｍｌ  ＰＢＳのニワトリ抗ウサギＰＥを添加し、続いて、４℃で１５分のインキュベーションを行う。
【０３０９】
インキュベーション後、細胞を洗浄し、１０ｅ７細胞当たり１〜２ｍｌの緩衝液を加え、続けて、３００ｘｇで５分間遠心分離することにより非結合一次抗体を除去する。上清を取り除き、細胞ペレットを再懸濁した１０ｅ７全体細胞当たり６０μｌの緩衝液中に再検索後、１０ｅ７全体細胞当たり２０μｌのＦＣＲブロッキング試薬を添加し、これをよく混合する。
【０３１０】
２０μｌのダイレクトＭＡＣＳマイクロビーズ（例えば、抗ＰＥマイクロビーズ）を添加、混合し、４℃で１５分のインキュベーションを行う。
【０３１１】
インキュベーション後、標識容量の１０〜２０ｘの緩衝液を添加し、３００ｘｇで５分間、懸濁液を遠心分離することにより細胞を洗浄し、細胞ペレットを１０ｅ８細胞当たり５００μｌ〜２ｍｌの緩衝液に添加して再懸濁する。
【０３１２】
メーカーの指示に従い、ａｕｔｏＭＡＣＳシステムを清浄化し、ａｕｔｏＭＡＣＳを使った磁気細胞分離のための準備をする。新規無菌収集管を出口の下に置く。ａｕｔｏＭＡＣＳ細胞分離プログラムを選択する。選別では、ＰＯＳＳＥＬＤＳプログラムを選ぶ。枯渇に対しては、ＤＥＰＬＥＴＥＳプログラムを選ぶ。
【０３１３】
標識細胞を取込ポートに挿入後、プログラムを開始する。
細胞選別または枯渇の後に、試料を集め、使用まで氷上に置く。
枯渇または選別された試料の純度をフローサイトメトリーで検証する。
【０３１４】
実施例１３−正常および慢性疾患腎組織から治療可能性のある細胞を単離、増殖できる
本調査の目的は、ハイコンテントアナリシス（ＨＣＡ）によりヒトＮＫＡ細胞の機能的特性解析を行うことにあった。ハイコンテントイメージング（ＨＣＩ）は、多くの試料全体に対し、２つ以上の蛍光プローブ（多重処理）を使って、複数の細胞下イベントの同時画像処理を提供する。ハイコンテントアナリシス（ＨＣＡ）は、ハイコンテントイメージングで捕捉された複数の細胞パラメーターーの同時定量測定を提供する。簡単に述べると、未分画（ＵＮＦＸ）培養物を生成し（Ａｂｏｕｓｈｗａｒｅｂ  ｅｔ  ａｌ．、前出、２００８）、標準的生検手順を使って、進行性慢性腎疾患（ＣＫＤ）および３つの非ＣＫＤヒト腎臓を含む５つのヒト腎臓から採取したコア生検とは独立に維持する。ＵＮＦＸのエクスビボによる（２）継代後、細胞を採取し、密度勾配法（実施例２のように）に供し、亜画分Ｂ２、Ｂ３、および／またはＢ４を含む亜画分を生成する。
【０３１５】
Ｉｌａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７号の表１０．１にまとめられるように、ヒト腎組織を非ＣＫＤおよびＣＫＤヒトドナーから入手した。Ｉｌａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７号の図４は、ＨＫ１７とＨＫ１９試料の病理組織学的特徴を示す。エクスビボ培養物を全ての非ＣＫＤ（３／３）およびＣＫＤ（５／５）腎臓から生成した。対象領域（ＲＯＩ）を規定するヒトＮＫＡ細胞のアルブミン輸送のハイコンテントアナリシス（ＨＣＡ）をＩｌａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７号の図５（ヒトＮＫＡ細胞中のアルブミン輸送のＨＣＡ）に示す。非ＣＫＤおよびＣＫＤ腎臓由来ＮＫＡ細胞のアルブミン輸送の定量比較をＩｌａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７号の図６に示す。Ｉｌａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７号の図６で認められるように、アルブミン輸送は、ＣＫＤ由来ＮＫＡ培養物に易感染性ではない。尿細管富化Ｂ２および尿細管細胞枯渇Ｂ４亜画分の間のマーカー発現の比較分析をＩｌａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７号の図７（ＣＫ８／１８／１９）に示す。
【０３１６】
尿細管富化Ｂ２および尿細管細胞枯渇Ｂ４亜画分の間の比較に基づくアルブミン輸送の機能分析をＩｌａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７号の図８に示す。亜画分Ｂ２が近位の尿細管細胞中で富化され、その結果、アルブミン輸送機能の増加を示す。
【０３１７】
アルブミン取込：２４ウエル、コラーゲンＩＶプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｃｏａｔ（登録商標））中で培養密度に成長させた細胞の培地を１８〜２４時間の間、フェノールレッド不含で、無血清の１Ｘ抗真菌性／抗生物質および２ｍＭグルタミン含有低グルコースＤＭＥＭ（ｐｒ−／ｓ−／ｌｇＤＭＥＭ）で置換した。アッセイ直前に、細胞を洗浄し、ｐｒ−／ｓ−／ｌｇＤＭＥＭ＋１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２ｍＭグルタミン、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２、および１ｍＭ  ＭｇＣｌ２と共に３０分間インキュベートした。細胞を２５μｇ／ｍＬローダミンコンジュゲート化ウシアルブミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に３０分間暴露し、  氷冷ＰＢＳで洗浄してエンドサイトーシスを停止させ、２５μｇ／ｍＬ  Ｈｏｅｃｈｓｔ核染料含有２％パラホルムアルデヒドで直ちに固定した。阻害実験にのために、１μＭ受容体関連タンパク質（ＲＡＰ）（Ｒａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ  ＧＡ）をアルブミン添加の１０分前に添加した。ＢＤ  Ｐａｔｈｗａｙ（登録商標）８５５ハイコンテントバイオイメージャー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて顕微鏡画像処理および分析を行った（Ｋｅｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１０  Ｎｏｖ；２９９（５）：Ｆ１０２６−３９．Ｅｐｕｂ  Ｓｅｐ  ８、２０１０、を参照）。
【０３１８】
結論として、ＨＣＡは、細胞レベルデータを与え、他のアッセイでは検出できない集団動態、すなわち遺伝子またはタンパク質発現を示すことができる。アルブミン輸送（ＨＣＡ−ＡＴ）機能の測定のための定量化可能なエクスビボＨＣＡアッセイを利用して、ヒト腎臓尿細管細胞をヒトＮＫＡプロトタイプの成分として特徴付けることができる。ＨＣＡ−ＡＴは、比較に基づく細胞機能の評価を可能とし、アルブミン輸送コンピテント細胞がヒトＣＫＤ腎臓由来ＮＫＡ培養物中に保持されたことを示した。また、ＮＫＡ培養物の特定の亜画分であるＢ２およびＢ４は、高められたアルブミン輸送活性を有する尿細管細胞富化画分であるＢ２とは、表現型と機能が異なることも示された。ヒトＣＫＤ由来Ｂ２細胞亜集団は、インビボでの効力を立証した（上述）げっ歯類Ｂ２細胞と表現型的に、また機能的に類似である。
【０３１９】
実施例１４−１次腎臓細胞に由来するエキソソームはマイクロＲＮＡを含有する
我々は、再生結果を得る機序を解明するためのインビボ調査の設計に繋げるために、特定のエキソソーム由来ｍｉＲＮＡと、標的細胞における機能的に関連した結果とをインビトロで関連付けることを求めた。
【０３２０】
方法：馴化培地の再生治癒応答に関連したシグナル伝達経路に与える効果について、商業的に利用可能な細胞であるＨＫ−２（ヒト近位尿細管細胞株）、１次ヒト腎臓糸球体間質細胞（ＨＲＭＣ）、およびヒト臍帯内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を用いて調査を行った。ヒトおよびラット１次腎臓細胞培養物（ＵＮＦＸ）由来馴化培地中のエキソソームからのＲＮＡ含有物を、既知ｍｉＲＮＡを検出するように設計したＰＣＲベースアレイにより選別した。低酸素は、エキソソーム排出（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）に影響すると報告されている；そのため、培養群を、培地採集の前の２４時間の間、低酸素（２％Ｏ２）に暴露した。エキソソームをＦＡＣＳにより細胞性壊死組織片と分離した。
【０３２１】
図２９は、ＵＮＦＸ馴化培地の調製と分析に対する模式図を示す。
【０３２２】
結果：ＵＮＦＸ馴化培地は、再生治癒応答に関連したシグナル伝達経路に影響することが明らかになった；これらの応答は、非馴化培地を使った対照では観察されなかった。特に、ＮＦκＢ（免疫応答）および上皮間葉転換（線維化応答）がＨＫ−２細胞で低下し、ＰＡＩ−１（線維化応答）がＨＲＭＣ細胞で低下し、さらに、血管新生がＨＵＶＥＣで促進された。ＵＮＦＸ馴化培地由来エキソソーム含有物のＰＣＲアレイ選別による予備的データは、ＵＮＦＸがＵＮＦＸ馴化培地に対する観察された応答と一致するｍｉＲＮＡ配列を含むエキソソームを産生することを示している。
【０３２３】
Ｉｌａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７号の図１３Ａ〜Ｃは、ＵＮＦＸ培養物由来馴化培地が、再生結果に関連する可能性のある複数の細胞プロセスにインビトロで影響することを示す。ＮＦｋＢシグナル伝達は、腎疾患のプロセスの主要炎症性メディエーターとして提案されており（Ｒａｎｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００９．Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ  １２：３４９６−３５２２；Ｓａｎｚ  ｅｔ  ａｌ．、２０１０．Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  ２１：１２５４−１２６２）、また、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）により活性化されうる。ＨＫ−２細胞を、非馴化培地（左）またはＵＮＦＸ馴化培地（右）で、３７℃、１時間プレインキュベートし、その後、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαのある場合とない場合で活性化を行なった。
【０３２４】
Ｉｌａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７号の図１３Ａは、ＵＮＦＸ馴化培地がＮＦ−ｋＢのＴＮＦ−α媒介活性化を弱めることを示す。ＮＦｋＢ活性化は、ＲｅｌＡ／ｐ６５免疫蛍光染色（緑）により測定した。Ｈｏｅｃｈｓｔ対比染色核（青）およびファロイジン染色繊維状アクチン（赤）がＲｅｌＡ／ｐ６５核局在化（白色矢印）の評価を容易にする。
【０３２５】
Ｉｌａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７号の図１３Ｂは、ＵＮＦＸ馴化培地が、ＨＵＶＥＣ細胞培養物の血管新生促進作用を増やすことを示す。ＨＵＶＥＣ細胞（ウエル当たり１００，０００個）を、０．５％ＢＳＡ添加培地２００中に入れた重合マトリゲルの上に重ねて入れた。非馴化培地（左）またはＵＮＦＸ馴化培地（右）を添加し、細胞組織化応答を、画像キャプチャを使って３〜６時間の間、目視によりモニターした。細胞組織化を、細胞移行（白色矢頭）、整列化（黒色矢頭）、尿細管形成（赤色矢頭）、および閉じ多角形の形成（アスタリスク）について評点した。ＵＮＦＸ馴化培地は、非馴化培地に比べて、より多くの尿細管および閉じ多角形を誘導し、培地中に血管新生促進因子が存在することを示唆している。
【０３２６】
Ｉｌａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７号の図１３Ｃは、ＵＮＦＸ馴化培地が、上皮細胞中の線維形成経路を弱めることを示す。ＨＫ−２細胞は、インビトロで形質転換増殖因子（ＴＧＦ）に暴露した場合、上皮の特性を失い、間葉表現型を獲得し、腎臓の線維形成の進行に関連する上皮間葉転換（ＥＭＴ）を再現する（Ｚｅｉｓｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．２００３Ｎａｔ  Ｍｅｄ９：９６４−９６８）。ＨＫ−２細胞を、非馴化培地（ＣＴＲＬ）、１０ｎｇ／ｍｌＴＧＦβ１（ＴＧＦβ１）含有非馴化培地、または１０ｎｇ／ｍｌＴＧＦβ１（ＴＧＦβ１＋ＣＭ）含有ＵＮＦＸ馴化培地中で７２時間培養した。細胞のＣＤＨ１（上皮のマーカー）、ＣＮＮ１（間葉マーカー）およびＭＹＨ１１（間葉マーカー）を定量ＲＴ−ＰＣＲによりアッセイした。馴化培地は、ＣＤＨ１、ＣＮＮ１、およびＭＹＨ１１遺伝子発現により測定して、ＴＧＦβ１誘導ＥＭＴの程度を低減させる。エラーバーは、３回の反復実験の平均標準誤差（ＳＥＭ）を表す。
【０３２７】
Ｉｌａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７号の図１３Ｄは、そのまま放置すれば、細胞外マトリックスタンパク質の進行性蓄積につながる可能性がある、ＴＧＦβ１およびプラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１（ＰＡＩ−１）により形成される陽性のフィードバックループを示す（Ｓｅｏ  ｅｔ  ａｌ．、２００９．Ａｍ  Ｊ  Ｎｅｐｈｒｏｌ ３０：４８１−４９０）。
【０３２８】
Ｉｌａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７号の図１４Ａ〜Ｂは、糸球体間質細胞における線維形成経路の減弱を示す。対照（ＣＴＲＬ）、または５ｎｇ／ｍｌＴＧＦβ１の添加の有る場合（＋）と無い場合（−）のＵＮＦＸ馴化培地（ＵＮＦＸ  ＣＭ）中で、ＨＲＭＣを２４時間培養した。ＰＡＩ−１のウェスタンブロット分析は、ＵＮＦＸ  ＣＭが、ＴＧＦβ１誘導ＰＡＩ−１タンパク質レベルの増加を弱めることを示す。β−アクチンは、ローディング・コントロールとして示される。ヒト腎臓糸球体間質細胞（ＨＲＭＣ）は、５ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦｂ１の存在下（＋）、増加したレベルのＰＡＩ−１を発現する。ヒト生理活性腎臓細胞由来馴化培地（ＣＭ）との共培養は、ＴＧＦｂ１誘導されたＰＡＩ−１タンパク質発現を低下させる。ｍＲＮＡレベルでのＰＡＩ−１発現のＣＭによる変化は生じなかった（データは示さず）。
【０３２９】
Ｉｌａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７号の図１４Ｂは、ラット生理活性腎臓細胞由来ＣＭには、培養ＨＲＭＣ誘導（＋）および非誘導（−）に与える、ＴＧＦｂ１と類似の効果があったことを示す。遠心分離後採集したＣＭ上清（枯渇ラットＣＭ）は、ＰＡＩ−１発現の低下に関し有効性がより低く、ＰＡＩ−１タンパク質の観察された減弱化の原因のＣＭ成分は、ラット生理活性腎臓細胞による小胞分泌に関連している可能性があることを示唆している。
【０３３０】
Ｉｌａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７号の図１５は、ＵＮＦＸ由来馴化培地が、分泌小胞を含むことを示す。Ｉｌａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７号の図１５Ａは、分泌小胞（エキソソームを含む）を示し、これは、細胞質由来内部成分（緑）を包含する二相脂質構造（赤）である。ホスファチジルセリン（青三角形）は、小胞生合成中に細胞外の空隙中に暴露される膜の成分である（Ｔｈｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．、２０１０．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：５８１−５９３）。
【０３３１】
ＰＫＨ２６およびＣＦＳＥは、それぞれ、分泌小胞の脂質膜および細胞質を標識し（Ａｌｉｏｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．、２０１０．Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ３８：２３３−２４５）、一方、アネキシンＶはホスファチジルセリンに結合する。
【０３３２】
Ｉｌａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７号の図１５Ｂ〜Ｃは、ＦＡＣＳ選別を示す。ＵＮＦＸ馴化培地をＰＫＨ２６、ＣＦＳＥ、およびＡＰＣコンジュゲートアネキシンＶで標識し、蛍光支援細胞選別（ＦＡＣＳ）により選別した。分泌小胞を表すトリプルポジティブ粒子を集め、トリゾール試薬を使って全体ＲＮＡを抽出した。市販の利用可能なＲＴ−ＰＣＲベースアレイを使って、既知の配列に対しマイクロＲＮＡ含量物を選別した。
【０３３３】
表５は、分泌小胞が治療結果が予想されるマイクロＲＮＡを含むことを示す。ＵＮＦＸ細胞は、既知のｍｉＲＮＡ配列を含むエキソソームを放出する。ＵＮＦＸ馴化培地は、機能的に関連するヒト細胞株の再生応答に影響を与える。検出ｍｉＲＮＡと観察された再生応答の間の原因と効果の関係は、鋭意調査中であるが、現在までに得られた結果から、ＵＮＦＸ細胞が、ｍｉＲＮＡの標的細胞と組織へのエキソソーム媒介輸送による治療に関連するパラクリン効果をもたらす可能性があることが示唆される。
（表５）
0006054299.tif 000006
*Taganov et al, 2006. Proc Natl Acad Sci USA 103:12481-12486.
**Chen and Gorski, 2008. Blood 111:1217-1226.
***Rogler et al., 2009. Hepatology 50:575-584.
【０３３４】
これらのデータは、生理活性腎臓細胞培養ぶつから得られる分泌小胞が、ＴＧＦｂ１／ＰＡＩ−１フィードバックループにより誘導されるＰＡＩ−１を弱める成分を含むという結論を支持する。
【０３３５】
マイクロアレイおよびＲＴ−ＰＣＲ分析：Ｌｅｗｉｓラット由来未分画（ＵＮＦＸ）生理活性腎臓細胞を、基本培地（ＤＭＥＭおよびＫＳＦＭの５０：５０混合物；血清または補充薬品なし）中で、低酸素条件（２％Ｏ２）下、２４時間培養した。馴化培地を集め、１００，０００ｘｇ、４℃、２時間の条件で超遠心分離を行い、分泌小胞（例えば、微小胞、エキソソーム）をペレット化した。得られたペレットから全体ＲＮＡを抽出し、既知マイクロＲＮＡ種に対し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによりアッセイした（Ｒａｔ  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｖ２．０  ＰＣＲ  Ａｒｒａｙ；Ｑｉａｇｅｎ＃ＭＡＲ−１００Ａ）。Ｉｌａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７号の７４ページの２６行〜７７ページの６７行に挙げたｍｉＲＮＡが検出可能である。
【０３３６】
実施例１５−生理活性腎臓細胞由来のパラクリン因子
この試験では、我々は、インビトロ細胞ベースアッセイを採用し、生理活性腎臓細胞がプラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１（ＰＡＩ−１）等のメディエーターにより線維形成を調節できる可能性のあるパラクリン機序を調査した。
【０３３７】
材料と方法：馴化培地を、生理活性腎臓細胞（Ａｂｏｕｓｈｗａｒｅｂ  ｅｔ  ａｌ．、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｕｒｏｌ  ２６、２９５、２００８；Ｐｒｅｓｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．２０１０、前出）のラットおよびヒトの血清と補充物質不含条件の培養物から集め、インビトロアッセイに利用した。インビトロアッセイでは、市販品として利用可能なラットおよびヒト由来糸球体間質細胞を宿主応答組織の代用試薬として使った。理由は、糸球体間質細胞は、傷害または病気の腎臓中のＰＡＩ−１産生の源であるためである（Ｒｅｒｏｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ  ５８、１８４１、２０００．）。ＰＡＩ−１遺伝子およびタンパク質発現を、それぞれ、定量ＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロットでアッセイした。細胞により培地中に排出された小胞粒子（例えば、エキソソーム）を高速遠心分離により集め（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２０１０、１−１２ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｑ６０１、Ｊｕｌｙ  ７、２０１０）、トリゾール試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使って全ＲＮＡをペレットから抽出した。小胞のＲＮＡ含有物を、既知のマイクロＲＮＡ配列のＰＣＲベースアレイ（Ｑｉａｇｅｎ）を使って選別した。
【０３３８】
結果：生理活性腎臓細胞培養由来の馴化培地は、ＴＧＦβ１誘導による糸球体間質細胞中のＰＡＩ−１定常状態タンパク質レベルの増加を弱めたが、定常状態ｍＲＮＡレベルに影響を与えなかった。これは、マイクロＲＮＡが標的遺伝子を調節するという機序と一致する観察であった。マイクロＲＮＡが細胞外の小胞輸送により細胞間を移動できるという仮説（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、前出、２０１０）に基づき、我々は、馴化培地のマイクロＲＮＡ含有物を分析し、ＰＡＩ−１阻害剤と推定されるマイクロＲＮＡ３０ｂ−５ｐ（ｍｉＲ−３０ｂ−５ｐ）の存在を確認した。
【０３３９】
ここに提示のデータは、生理活性腎臓細胞が、エキソソーム経由ｍｉＲ−３０ｂ−５ｐの標的糸球体間質細胞への細胞間移動により線維形成を直接調整できることを示唆している。糸球体間質細胞によるｍｉＲ−３０ｂ−５ｐ取込の結果として、定常状態ＰＡＩ−１タンパク質レベルでのＴＧＦβ１による誘導増加が弱められ、腎組織において、最終的に糸球体の空隙内の細胞外マトリックスの析出を減らす応答を弱め得る、応答である。現在、ＰＡＩ−１が実際にｍｉＲ−３０ｂ−５ｐを直接に標的にすることを確認するための調査が進行中である。
【０３４０】
Ｉｌａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７号の図１４Ａ〜Ｂは、対照（ＣＴＲＬ）またはＴＧＦβ１の培地への添加のある場合（＋）と無い場合（−）の生理活性腎臓細胞馴化培地（ＣＭ）で２４時間培養したヒト糸球体間質細胞中のＰＡＩ−１とα−アクチン（対照）タンパク質発現のウェスタンブロットを示す。ＣＴＲＬ培養では、ＴＧＦβ１がＰＡＩ−１タンパク質発現を増加させた。ＣＭ培養では、ＴＧＦβ１−誘導応答が減弱した。
【０３４１】
分泌小胞について、ＰＡＩ−１の推定抑制因子であり得るマイクロＲＮＡを分析した。ヒトおよびラット生理活性腎臓細胞ＣＭ由来分泌小胞を高速遠心分離により集め、既知の配列のＰＣＲベースアレイを使って、マイクロＲＮＡ含有物をアッセイした。ｍｉＲ−４４９ａ、ＰＡＩ−１（６）の推定制御因子、を特定した。ＨＲＭＣは、一時的にｍｉＲ−４４９ａを形質移入したか、または形質移入しなかった（ＣＴＲＬ）。形質移入２４時間後に、細胞を、さらに２４時間、５ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦｂ１（＋）に暴露するか、または暴露しなかった（−）。
【０３４２】
Ｉｌａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７号の図１６Ａは、総タンパク質を調製し、ＰＡＩ−１とβ−アクチンをアッセイしたウェスタンブロットを示す。ｍｉＲ−４４９ａは、定常状態ＰＡＩ−１タンパク質レベルを減らし（レーン１〜レーン３を比較）、ＰＡＩ−１タンパク質の誘導レベルもまた、ｍｉＲ−４４９ａ形質移入培養物で低下した（レーン２〜レーン４を比較）。このデータは、分泌小胞がｍｉＲ−４４９ａを含み、ｍｉＲ−４４９ａの糸球体間質細胞中への取込は、ＰＡＩ−１発現を低下させるという結論を支持する。
【０３４３】
Ｉｌａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７号の図１６Ｂは、マイクロＲＮＡであるｍｉＲ−３０ｂ−５ｐを示し、これも、ＰＣＲベースアレイで特定され、予測アルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ−ｍｉＲＢａｓｅは、英国マンチェスター大学・生命工学部（Ｆａｃｕｌｔｙ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で運営、維持されている）に基づいたＰＡＩ−１の推定制御因子である。
【０３４４】
糸球体中のＰＡＩ−１タンパク質レベルを、５／６腎摘出術により生理活性腎臓細胞で誘導されたＣＫＤの処置後、インビボで調査した。
【０３４５】
Ｉｌａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７号の図１７Ａ〜Ｃは、片側腎摘出術（Ａ）、５／６腎摘出術（Ｂ）、または５／６腎摘出術と生理活性腎臓細胞の腎臓内送達（Ｃ）を受けたＬｅｗｉｓラット腎臓のＰＡＩ−１の代表的免疫組織化学像（Ａ〜Ｃ）を示す。処置（Ｃ）の結果、５／６腎摘出術式（Ｂ）の結果としての糸球体（矢頭）中のＰＡＩ−１の蓄積が減少した。
【０３４６】
別の調査では、死体解剖時に採取した腎組織に対しｑＲＴ−ＰＣＲを行い、相対的遺伝子発現値を調査日数に対しプロットした。
【０３４７】
Ｉｌａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７号の図１７Ｄは、５／６腎摘出ラット（赤正方形）が、生理活性腎臓細胞（青菱形）および偽手術された対照（緑三角形）で処置されたものに比べ、より強力なＰＡＩ−１の発現を立証したことを示す。
【０３４８】
Ｉｌａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７号の図１７Ｅは、処置後３ヶ月および６ヶ月で採取された腎臓試料の代表的ウェスタンブロット分析を示す。５／６腎摘出ラット（Ｎｘ）の処置組織（Ｎｘ＋Ｔｘ）は、ＰＡＩ−１とフィブロネクチン（ＦＮ）タンパク質の蓄積が減少した（Ｋｅｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．２０１０、前出）。
【０３４９】
このデータは、５／６腎摘出術により誘導されたＣＫＤの生理活性腎臓細胞による処置後、インビボで糸球体中のＰＡＩ−１タンパク質レベルが減少するという結論を支持する。
まとめると、実施例１５〜１６は、生理活性腎臓細胞の腎臓内送達が腎機能を改善する１つの機序は、常在性腎臓細胞の線維化経路を調節する成分の細胞間移動を経由する可能性があるという仮説を支持する。
【０３５０】
実施例１６−生理活性腎臓細胞由来分泌因子がＮＦκＢシグナル伝達経路を弱める
この試験では、我々は、５／６腎摘出術モデルの疾患進行のＮＫＡ媒介減弱化におけるＮＦκＢ経路の役割を調査し、また、ＮＦκＢ活性化の直接調節による再生結果に対し寄与し得る生理活性腎臓細胞の特性を特定することを検討した。Ｉｌａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７号の図１７Ｇは、ＴＮＦαによるＮＦｋＢ経路の標準的活性化を示す。
【０３５１】
材料と方法：残遺物腎臓を、ＰＢＳ中のＢ２＋Ｂ４（ＮＫＡプロトタイプ）での処置の６週前に２段５／６腎摘出術式を行ったＬｅｗｉｓラットから採取した。ＮＫＡ処置（ＴＸ）または未処置（ＵＮＴＸ）組織に対し、免疫組織化学、ＲＴ−ＰＣＲ、ウェスタンブロット分析、および電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）によりＮＦκＢ活性化をアッセイした。血清および補助剤不含培地中で成長させたエクスビボＮＫＡ細胞培養物から集めた馴化培地（ＣＭ）をインビトロ機能性アッセイ用に用いた。ヒトの近位尿細管細胞株（ＨＫ−２）を、分子および免疫蛍光法ベースアッセイ読み取りのための標的細胞型として使用した。細胞により培地中に排出された小胞粒子（エキソソーム）を高速遠心分離により集めた。エキソソームから単離された全ＲＮＡを既知マイクロＲＮＡ配列のＰＣＲベースアレイ（Ｑｉａｇｅｎ）を使って選別した。
【０３５２】
結果：５／６腎摘出ラット由来残遺物腎臓中にＮＦκＢサブユニット、ＲｅｌＡ／ｐ６５の核局在化が観察され、ＵＮＴＸ組織中の炎症経路の活性化を示唆する。ＲＴ−ＰＣＲによるＴＸ組織との予備的比較により、ＲｅｌＡ遺伝子発現の低減が示され、ＮＫＡ処置がＲｅｌＡ／ｐ６５発現の抑制を介してＮＦκＢ経路活性化に影響する可能性があることが示唆された。この仮説は、ＣＭ腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）に対する応答に比べ、暴露ＨＫ−２細胞中のＲｅｌＡ／ｐ６５の核局在化の低減（Ｉｌａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７号の図１７Ｆ）からも明らかなように、ＣＭがＴＮＦα誘導ＮＦκＢ活性化をインビトロで弱める観察により支持される。進行中のＮＫＡエキソソームマイクロＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析では、ＮＦκＢ経路に影響することが既知の配列が存在するか否かを調査している。
【０３５３】
Ｉｌａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７号の図１７Ｆは、免疫蛍光アッセイで、ＮＫＡＣＭに対する２時間暴露が、ＴＮＦαで前処置された対照培養物中に比べ、ＨＫ−２中のＮＦκＢｐ６５（緑）の核局在化を減らすことを示す。ＨＫ−２では、ＮＦｋＢｐ６５（緑）は、ＴＮＦα（対照培地）への暴露３０分後、核に局在化する。しかし、ＨＫ−２細胞のＮＫＡ馴化培地によるＴＮＦα添加の前の２時間の前処置が、ＮＦｋＢｐ６５核局在化応答を弱めた。核をＤＡＰＩ（青）で染色し、繊維状アクチンをＡｌｅｘａ５９４−ファロイジン（赤）で染色して、ＮＦκＢ核局在化の強さの定性的評価を支援する（組み合わせパネル中最下段のＴＮＦα処置対照細胞の少し薄くなったファロイジン境界に注意されたい）。対比染色は、組み合わせ画像中のＮＦｋＢ局在化に対する基準を与える。
【０３５４】
Ｌｅｗｉｓラットの腎組織中のＮＦｋＢｐ６５サブユニットの免疫組織化学は、５／６腎摘出術（パネルＢ）により惹起された進行性ＣＫＤの動物では、対照動物（パネルＡ）の片側腎摘出術により惹起された非進行性腎不全に比べて、より強力なＮＦｋＢｐ６５サブユニットの核局在化が、特に尿細管上皮細胞（黒の矢頭）中で起こることを示す。腎摘出術後６週で採取した組織。倍率２００Ｘ。
【０３５５】
パネルＣ：５／６腎摘出術を受けたＬｅｗｉｓラット腎組織の細胞質（「Ｃ」）および核（「Ｎ」）タンパク質抽出物中のＮＦｋＢｐ６５のウェスタンブロット分析。管リンレベル（ローディング・コントロール）が相対的に一定である１週と１３週の比較では、核のＮＦｋＢｐ６５は、時間経過と共に増加し、免疫組織化学結果と一致する。
【０３５６】
パネルＤ：核抽出物の電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）により、５／６腎摘出術後に核に局在化するＮＦｋＢは、ＤＮＡ結合のために活性化されることが確認される。レーンは、各時点で２つの動物から調製された核抽出物を表す。
【０３５７】
ＮＦｋＢ経路は、慢性腎疾患の５／６腎摘出術モデルにおいて徐々に活性化される。Ｌｅｗｉｓラットの腎組織中のＮＦｋＢｐ６５サブユニットの免疫組織化学分析を行った。
【０３５８】
Ｉｌａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７号の図１８Ａ〜Ｄは、５／６腎摘出術（パネルＢ）により惹起された進行性ＣＫＤの動物では、対照動物（パネルＡ）の片側腎摘出術により惹起された非進行性腎不全に比べ、ＮＦｋＢｐ６５サブユニットのより強い核局在化が、特に尿細管上皮細胞（黒色矢頭）中で、発生することを示す。腎摘出術後６週に採取した組織。倍率２００Ｘ。
【０３５９】
Ｉｌａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７号の図１８Ｃは、５／６腎摘出術を受けたＬｅｗｉｓラット腎組織の細胞質（「Ｃ」）および核（「Ｎ」）タンパク質抽出物中のＮＦｋＢｐ６５のウェスタンブロット分析を示す。管リンレベル（ローディング・コントロール）が相対的に一定である１週と１３週を比較すると、核のＮＦｋＢｐ６５は、時間経過につれ増加し、免疫組織化学結果と一致する。
【０３６０】
Ｉｌａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７号の図１８Ｄは、核抽出物の電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を示し、５／６腎摘出術後に核に局在化するＮＦｋＢは、ＤＮＡ結合のために活性化されることが確認される。レーンは、各時点で２つの動物から調製された核抽出物を表す。１ｍｇの核タンパク質を５ｎｇのＮＦｋＢＤＮＡ結合部位と共にインキュベートし、６％ＤＮＡ遅延ゲルで電気泳動を行い、続けて臭化エチジウムで染色した。
【０３６１】
ＮＫＡ細胞の腎臓内送達がＮＦｋＢ核局在化を減らす：複数の確定腎臓細胞亜集団を単離し、ＣＫＤの５／６腎摘出術モデルの腎機能の改善におけるインビボで生理活性をアッセイした（Ｐｒｅｓｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．２０１０、前出）。ＮＫＡ細胞は、生理活性を示したが、一方、他の亜集団は生理活性を示さなかった（Ｋｅｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．２０１０前出）。
【０３６２】
Ｉｌａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７号の図１８Ｅは、ＮＫＡ（Ａ）または非生理活性腎臓細胞（Ｂ）の腎臓内注射を受けた確立されたＣＫＤのＬｅｗｉｓラットを示す。確立されたＣＫＤを有するＬｅｗｉｓラットは、ＮＫＡ（Ａ）または非生理活性腎臓細胞（Ｂ）の腎臓内注射を受けた。処置後６ヶ月で、組織を採取し、免疫組織化学によりＮＦｋＢｐ６５サブユニットについてアッセイした。ＮＫＡ処置動物由来組織は、非生理活性腎臓細胞で処理した動物由来組織に比べ、より少ないＮＦｋＢｐ６５の核局在化を、特に近位尿細管中で示し、ＮＫＡ処置がインビボでＮＦｋＢ経路活性の低減に寄与したことを示唆する。
【０３６３】
ヒトおよびラットＮＫＡ馴化培地から高速遠心分離で単離された分泌小胞の既知配列のＰＣＲベースアレイを使ったマイクロＲＮＡ含有物の分析により、ＮＦｋＢを介して免疫応答に影響を与え得るいくつかのマイクロＲＮＡ種を、文献の報告（Ｍａｒｑｕｅｚ  ＲＴ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２９８：Ｇ５３５；Ｔａｇａｎｏｖ  ＫＤ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０３：１２４８１）、または予測アルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ−ｍｉＲＢａｓｅは、英国マンチェスター大学・生命工学部（Ｆａｃｕｌｔｙ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で運営、維持されている）に基づいて特定した。
小胞中のマイクロＲＮＡ 標的ｍＲＮＡ
ｍｉＲ−２１                   Ｐｅｌｌｉｎｏ−１（Ｍａｒｑｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．）
ｍｉＲ−１４６ａ        ＩＲＡＫ１、ＴＲＡＦ６（Ｔａｇａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．）
ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１５１   ＮＦＫＢ／ＲｅｌＡ（ｍｉＲＢａｓｅ）
【０３６４】
インビボおよびインビトロ知見は、どのようにして、生理活性腎臓細胞（ＮＫＡ）が、免疫応答経路、例えば、ＮＦｋＢ活性化により影響を受けた経路を調節することにより慢性疾患腎臓の腎機能を改善でき得るかに関する洞察を与える。活性化ＮＦｋＢ（ｐ６５核局在化、特に近位尿細管細胞中で）は、５／６腎摘出術げっ歯類モデルの慢性腎疾患の形成に関連し、ＮＫＡ処置により弱められる。近位尿細管細胞（ＨＫ−２）のＮＫＡ馴化培地に対するインビトロ応答は、ＮＫＡ処置に応答したＮＦｋＢ核局在化のインビボ減弱化を模倣する。ＮＦｋＢ活性化に対する細胞間抑制の推定メディエーター（マイクロＲＮＡ）がＮＫＡ馴化培地中で特定された。まとめると、これらのデータは、生理活性腎臓細胞の腎臓内送達が腎機能を改善する１つの機序は、常在性腎臓細胞の免疫応答を調節する成分、例えば、ＲＮＡの細胞間移動を経由している可能性があるという仮説を支持する。
【０３６５】
実施例１７−ＮＫＡ構築物の機能評価
ゼラチンまたはＨＡベースヒドロゲル上に播種した腎臓細胞集団は生存可能であり、トランスクリプトーム、プロテオミクス、セクレトームおよび共焦点免疫蛍光法アッセイにより測定して、３日間のインビトロ成熟の間、尿細管上皮機能性表現型を維持した。ＮＫＡ構築物が疾患状態に影響する可能性のある機序を調べるため、ＣＫＤ進行に付随する尿細管間質性線維形成に関係するＴＧＦ−βシグナル伝達経路に対する馴化培地の効果を評価した。馴化培地は、ヒト近位尿細管細胞株（ＨＫ２）中でのインビトロＴＧＦ−β−誘導上皮間葉転換（ＥＭＴ）を弱めることが観察された。材料と方法は、Ｉｌａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７号に記載されている。
【０３６６】
ＨＫ２細胞中のＴＧＦ−β媒介ＥＭＴの分析：フィブロネクチンまたはコラーゲン（ＩＶ）コート培養皿（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に入れた５０：５０培地中でＨＫ２細胞（ＡＴＣＣ）を培養した。ＥＭＴアッセイに対しては、５０：５０培地または２次元（２Ｄ）ヒトＵＮＦＸ培養物から、もしくは培地採取の前３日間熟成したヒトＵＮＦＸで作ったＮＫＡ構築物から集めた馴化培地と共に、ＨＫ２細胞を２４ウエルコラーゲン（ＩＶ）コートプレートに７０〜８０％の培養密度で播種した。ＥＭＴアッセイ用細胞からのＲＮＡの単離の３日前に、１０ｎｇ／ｍｌを培地に加えることによりＴＧＦ−β誘導を惹起した。３日間のインキュベーション期間の終わりに、Ｅ−カドヘリンの相対的発現（上皮マーカー）およびカルポニン（間葉マーカー）をｑＲＴ−ＰＣＲで分析することにより、ＥＭＴをモニターした。採取したＨＫ２細胞から、ＴａｑＭａｎ  ｑＲＴ−ＰＣＲ分析用ＲＮＡを上述のように調製した。各試料の等分散を仮定して、標準的両側スチューデントｔ検定を使って、統計的分析を行った。９５％（ｐ値＜０．０５）および９９％（ｐ値＜０．０１）の信頼区間を使用して統計的有意性を求めた。
【０３６７】
結果：ＮＫＡ構築物由来馴化培地のＨＫ２細胞中のＴＧＦ−β誘導ＥＭＴに与える効果：ＣＫＤの進行の間の尿細管間質性線維形成の発生は、尿細管上皮細胞のＴＧＦ−β媒介ＥＭＴと関連がある（Ｚｅｉｓｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １６０（６）：２００１−２００８；２００２）。また、進行性ＣＫＤのげっ歯類モデルにおいて、ＴＧＦ−β経路の減弱化がインビボで観察され、ＵＮＦＸおよびＢ２細胞を使った処置により生存が延長され、腎機能が改善された（Ｐｒｅｓｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第２０１０／０５６３２８号）。ヒト近位尿細管細胞株ＨＫ２は、ＴＧＦ−β誘導ＥＭＴに対する小分子またはタンパク質の刺激または阻害効果を試験するためのインビトロモデルシステムとして充分確立されている（Ｄｕｄａｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｄｉａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２４（５）：１４０６−１４１６；２００９；Ｈｉｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２９６（３）：Ｆ６１４−６２１；２００９）。移植後腎組織応答に対するＮＫＡ構築物の影響に関する可能な機序を検討するために、ＵＮＦＸ細胞とヒドロゲルから産生したＮＫＡ構築物から集めた馴化培地をＨＫ２  ＥＭＴアッセイ系で評価した。
【０３６８】
Ｉｌａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７号の図２６は、ＮＫＡ構築物由来の馴化培地がＨＫ２細胞中のＴＧＦ−β誘導ＥＭＴをインビトロで弱めることを示す。ＥＣＡＤ（上皮）およびＣＮＮ１（間葉）マーカーの相対発現を定量化することによりＥＭＴをモニターした。表示のように、５０：５０培地（対照およびＴＧＦＢ対照試料）またはヒトＵＮＦＸ細胞（ＴＣ）もしくはヒトＵＮＦＸ細胞の２Ｄ培養物およびゼラチンもしくはＨＡ／ゼラチンから産生されたＮＫＡ構築物由来の馴化培地（ＣＭ）中でＨＫ２細胞を培養した。ＥＭＴを誘導するために、１０ｎｇ／ｍｌＴＧＦ−βをアッセイ前の３日間、各試料（対照を除く）に添加した。ＨＫ２細胞を５０：５０培地（対照）中で培養した場合、ＣＮＮ１（間葉マーカー）より高レベルでＥＣＡＤ（上皮マーカー）が発現した。ＴＧＦ−βを３日間、培地に添加した場合（ＴＧＦＢ対照）、ＥＣＡＤ発現は、ＣＮＮ１の上方制御と同時に、著しく下方制御され、ＥＭＴイベントの誘導と一致した。２Ｄ  ＵＮＦＸ細胞培養由来馴化培地は、ＨＫ２細胞のＴＧＦ−β（ＴＣ  ＣＭ）に対するＥＭＴ応答を有意に弱めた（ＥＣＡＤおよびＣＮＮ１の両方に対しｐ＜０．０５）。ＮＫＡ構築物（ゼラチンＣＭおよびＨＡ／ゼラチンＣＭ）由来の馴化培地も、また、ＴＧＦ−βに対するＥＭＴの応答を弱めた；しかし、全体的効果は、２Ｄ  ＵＮＦＸ細胞培養由来馴化培地で観察された効果より小さかった（両方のＮＫＡ構築物でのＥＣＡＤに対しては有意（ｐ＜０．０５）で、対照の方に近づく傾向があるが、ＣＮＮ１に対しては統計的に有意でない）。追加の間葉マーカーを選別し、類似の結果を得た（データは示さず）。これらのデータは、ＮＫＡ構築物が、細胞ベース処置（Ｐｒｅｓｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第２０１０／０５６３２８号）で観察されたものと類似の形式で、尿細管間質性線維形成に関連するＴＧＦ−β経路にインビボで影響を与える可能性があることを示唆している。これらのデータは、また、インビボ応答がインビトロＥＭＴ応答と統計的に有意な関連性があることが示され得るならば、インビトロＥＭＴアッセイは、ＮＫＡ構築物のバイオセラピューティック効力の選別／最適化／モニタリング対する適用の可能性がありそれにより、時間のかかる、高価なインビボアッセイの必要性を低減可能性があることを示唆している。
【０３６９】
実施例１８−培養ヒト腎臓細胞の低酸素暴露が細胞移行および付着のメディエーターを誘導し、尿細管細胞単層の修復をインビトロで促進する
慢性腎疾患（ＣＫＤ）モデルの立証された治療機能を有する腎臓上皮細胞選択集団（Ｂ２）の単離および機能における酸素圧力の役割を調査した。この試験では、処理中の低酸素暴露が選択されたヒトの選択腎臓細胞（ＳＲＣ）または生理活性腎臓細胞（ＢＲＣ）の組成および機能を変えるのか否かを調べた。２％酸素への暴露に際し、以下が観察された：密度勾配全体にわたる細胞の分布の変化（Ｐｒｅｓｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第１０／０５６３２８号を参照；この特許は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、全体の勾配後収率の改善、酸素により調節される遺伝子発現（Ｋｅｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．前出、（２０１０）、で以前に報告）の調節、エリスロポエチン、ＶＥＧＦ、ＨＩＦ１アルファ、およびＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ２）の発現増加。処理中の低酸素への暴露は、選択生理活性腎臓細胞の傷害性尿細管を修復／再生する能力を高める。
【０３７０】
Ｉｌａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７号の図２７は、細胞を処理中に低酸素へ暴露する手順を示す。Ｉｌａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７号の図２８は、２％酸素に暴露に際し、以下が観察されたことを示す：密度勾配全体にわたる細胞の分布の変化、全体の勾配後収率の改善。低酸素暴露（＜３％）は、大気酸素圧力（２１％）に比べて、培養ヒトＣＫＤ由来腎臓細胞のイオジキサノールベース密度勾配からの回収率を増加させ（９６％対７４％）、また、選択細胞（Ｂ２）の高密度（＞９％イオジキサノール）画分への相対的配分を増加させた（２１．６％対１１．２％）。
【０３７１】
競合的インビトロアッセイは、Ｂ２細胞の低酸素性条件への２４時間の事前暴露は、２１％酸素圧力で培養したＢ２細胞よりも、傷害性腎臓の近位尿細管単層培養物の修復に対しより高い能力を有し、傷害の２時間以内に修復の発生が５８．６％±３％であったことを示した。
【０３７２】
Ｉｌａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７号の図２９Ａは、尿細管単層の修復をインビトロで観察するために開発されたアッセイを示す。１．細胞を蛍光染料で標識する（２％酸素、２１％酸素、およびＨＫ２尿細管細胞）。２．尿細管細胞単層を確立し、創傷を与えた。３．酸素暴露標識細胞を添加（２％および２１％暴露細胞）。それらを、２０，０００／ｃｍ２で均等に播種する。培養は、無血清培地中、５％Ｏ２で２４時間行う。４．創傷を修復する細胞を定量する。図２９Ｂ−定量画像解析（ＢＤ  Ｐａｔｈｗａｙ  ８５５  ＢｉｏＩｍａｇｅｒ）−赤色円＝２％Ｏ２で培養細胞、青色円＝２１％Ｏ２培養。図２９Ｃ−２％酸素誘導細胞がより急速に付着し（２時間）、２４時間わずかな優位性を持続することが観察された。２％酸素で誘導された細胞は、尿細管上皮単層の修復に対し、より大きな能力を有する。
【０３７３】
Ｉｌａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７号の図３０Ａは、尿細管単層の修復をインビトロで観察するために開発されたアッセイを示す。１．細胞を蛍光染料で標識する。２．８μｍ孔径のトランスウエルインサートの底部に尿細管細胞単層を形成し、創傷を与えた。３．インサートを反転し、酸素暴露標識細胞を添加する（２％および２１％酸素暴露細胞）。それらに、５０，０００／ｃｍ２で均等に播種する。培養は、無血清培地中、５％Ｏ２で２４時間行う。４．創傷を修復する細胞を定量する。
【０３７４】
Ｉｌａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７号の図３０Ｂは、２％酸素暴露細胞による誘導により、非誘導（２１％酸素）に比べ、移行および創傷修復が強化されたことを示す。図３０Ｃは、移行時間に対し移行細胞の％をプロットしたものである。細胞の平均数および細胞の平均パーセンテージは、表６に示されている。
【０３７５】
低酸素は、また、ＣＸＣＲ４、ＭＭＰ９、ＩＣＡＭ１、およびジストログリカンのｍＲＮＡ発現も誘導した；これらは、細胞移行および付着を媒介する遺伝子である。ＭＭＰ９の局所的蓄積および細胞の細胞膜へのコネキシン４３凝集体の増加が免疫細胞化学手法により確認された。
【０３７６】
Ｉｌａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７号の図３１Ａは、オステオポンチンが尿細管細胞により分泌され、傷害に対する応答で発現上昇することを示す（オステオポンチン免疫細胞化学：Ｈｏｅｃｈｓｔ核染色（青）、オステオポンチン（赤）、１０ｘ）。オステオポンチンは、分泌リン酸化糖タンパク質である（Ｋｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ、１９９９）。オステオポンチンは、免疫蛍光（Ｉｌａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７号の図３１Ａ）およびＥＬＩＳＡ（Ｉｌａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７号の図３１Ｂ）により示されるように、尿細管中で発現し、付着および移行に関与する。オステオポンチンは、尿細管細胞単層中に形成された傷害により発現上昇する。
（表６）
0006054299.tif 000007
Simple PCIを使った定量画像解析 
【０３７７】
Ｉｌａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７号の図３２Ａは、細胞の移行応答が、部分的に、オステオポンチンにより媒介されることを示す（緑＝移行細胞（５ｘ））。Ｉｌａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７号の図３２Ｂは、オステオポンチンに対する中和抗体（ＮＡｂ）が腎臓細胞移行応答を５０％減らすことを示す。
【０３７８】
Ｉｌａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７号の図３３は、細胞低酸素誘導が組織リモデリング遺伝子の発現を調節することを示す。カベオリン１は、インテグリンシグナル伝達の調節に関与する足場タンパク質である。ＭＭＰ９は、細胞外のマトリックス分解を介して移行を促進するメタロプロテアーゼである。ＩＣＡＭ１は、上皮細胞運動性に関連する細胞間接着分子である。ＣＸＣＲ４は、細胞移行を媒介するケモカイン表面受容体である。
【０３７９】
Ｉｌａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７号の図３４は、腎臓再生に繋がる低酸素による細胞の生理活性増強に対する推定機序を示す。
【０３８０】
まとめると、これらの結果は、低酸素下暴露が尿細管傷害のインビトロ修復に対する立証された生理活性を有する特異的腎臓細胞亜集団の単離を促進し、その結果、これらの細胞のインビボ送達の後に患部組織へ移行し生着する能力を潜在的に高めることができることを示唆する。ＳＲＣは、進行性ＣＫＤのげっ歯類モデルの腎機能を安定化させ、生存を延長する能力を立証した。低酸素レベル（２％Ｏ２）は、以下を提供した：選択再生細胞の培養後回収率の増加；尿細管傷害に応答した細胞付着および単層修復の強化；ならびに尿細管傷害に応答した細胞移行の刺激。さらに、細胞移行および付着は、部分的に、オステオポンチンによりインビトロで媒介された。低酸素は、組織リモデリング、移行、および細胞間情報伝達を媒介するインテグリン、分泌タンパク質、および細胞接着分子を発現上昇させた。
【０３８１】
実施例１９−尿由来微小胞
尿中に排出された腎臓由来微小胞の内腔含有物内に含まれるｍｉＲＮＡおよびタンパク質の分析を行い、再生結果を評価するためのバイオマーカーとして使用可能かどうかを判定した。過剰微小胞が細胞外の空隙に排出されると、一部は隣接細胞と融合し、他のものは、尿中に分泌される（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．２００８．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．７４（５）：６１３−６２１）。これらの尿中の微小胞は、今度は、処置結果のより良い理解に向けたアッセイ開発のための優れたバイオマーカーになる。
【０３８２】
ＺＳＦ１慢性進行性腎不全の代謝疾患のげっ歯類モデルを使用した。Ｂ２＋Ｂ４細胞をＺＳＦ１動物の腎実質に注射した。健康な動物およびＰＢＳ溶媒を対照として使用した。尿由来小胞を、以下にまとめたように、種々の時点で分析した。
１：ＺＳＦ１動物−ＰＢＳ溶媒注射；注射後１９７日に尿採取
２：ＺＳＦ１動物−ＰＢＳ溶媒注射；注射後２５３日に尿採取
３：ＺＳＦ１動物−Ｂ２＋Ｂ４画分注射；注射後１９７日に尿採取
４：ＺＳＦ１動物−Ｂ２＋Ｂ４画分注射；注射後２５３日に尿採取
５．ＺＳＦ１動物−注射なし；調査の１９７日目に尿採取
６．ＺＳＦ１動物−注射なし；調査の２５３日目に尿採取
７．健康動物−注射なし；調査の１９７日目に尿採取
８．健康動物−注射なし；調査の２５３日目に尿採取
処置後１９７日目および約２５３日目に試験動物から尿を採取した。当技術分野で既知の標準的な方法により尿から微小胞を回収した（例えば、Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．２００８  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ；７４（５）：６１３−６２１、を参照）。Ｉｌａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７号の図３５の標準的ウェスタンブロッティングで示されるように、処置動物の尿から回収された微小胞（レーン３〜４）は、溶媒処置（レーン１〜２）または未処置対照（レーン５〜８）に比較して、前駆細胞関連タンパク質（ＣＤ１３３およびＷＮＴ７Ａ）の増加を示した。実際、微小胞は、微小胞特異的タンパク質ＣＤ６３の発現（Ｉｌａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７号の図３５）により示されるように、病気の動物の尿（レーン１〜６）のみから回収され、健康な対照（レーン７〜８）からは回収されなかった。ＣＤ１３３含有微小胞は、腎臓細胞から排出されたプロミノソーム（ｐｒｏｍｉｎｏｓｏｍｅ）であるように見える。ＣＤ１３３およびＷＮＴ７Ａの両方は、再生および幹細胞分裂と関連付けられている（Ｒｏｍａｇｎａｎｉ  Ｐ  ａｎｄ  Ｋａｌｌｕｒｉ  Ｒ．２００９．Ｆｉｂｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｐａｉｒ．２（１）：３；Ｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．２００５．Ｎａｔｕｒｅ．４３７（７０６３）：１３７０−５；Ｗｉｌｌｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｎａｔｕｒｅ．４２３（６９３８）：４４８−５２；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．２００９．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９７（６）：Ｆ１５２６−３３）。まとめると、このことは、再生をモニターするように設計されたアッセイ開発のために、微小胞中でバイオマーカーとして発現したタンパク質を標的とすることを支持する。
【０３８３】
ｍｉＲＮＡマイクロアレイおよびＲＴ−ＰＣＲ．尿由来小胞からのｍｉＲＮＡのマイクロアレイおよびＲＴ−ＰＣＲ分析を当技術分野で既知の標準的方法により行った（例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、前出、２０１０、を参照）。単離微小胞の含有物中で、タンパク質に加えて、ｍｉＲＮＡが認められた。Ｉｌａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７号の表１７．１に、処置に伴い増加することが解ったｍｉＲＮＡ例が示されている。ｍｉＲＮＡの経時変化をＢ２＋Ｂ４で処置されたＺＳＦ１動物で分析した（１９７日目および２５３日目）。Ｉｌａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７号の９８ページ１行目〜１００ページ５０行目に列挙されたｍｉＲＮＡに対し、倍率変化が観察された。Ｂ２＋Ｂ４で処置されたＺＳＦ１動物のｍｉＲＮＡレベル（２５３日目）を分析し、ＰＢＳビークルで処置されたＺＳＦ１動物のｍｉＲＮＡレベル（２５３日目）と比較した。Ｉｌａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７号の１００ページ５３行目〜１０３ページ７行目に列挙されたｍｉＲＮＡに対し、倍率変化が観察された。Ｂ２＋Ｂ４で処置されたＺＳＦ１動物のｍｉＲＮＡレベル（１９７日目）を分析し、ＰＢＳビークルで処置されたＺＳＦ１動物のｍｉＲＮＡレベル（１９７日目）と比較した。Ｉｌａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７号の１０３ページ１２行目〜１０５ページ１０行目に列挙されたｍｉＲＮＡに対し、倍率変化が観察された。
【０３８４】
Ｉｌａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７号の表１７．１に挙げたｍｉＲＮＡは、組織再生に関連するプロセスに結びつけられているｍｉＲＮＡの例を提供する。ｍｉＲ−１５ｂは、ＢＣＬ−２およびカスパーゼ調節を介してアポトーシスの調節（Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．２００９．Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ．５０（４）：７６６−７８）、ならびにサイクリンの調節を介して細胞周期進行（Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ．２００９．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．３８０（２）：２０５−１０）に結びつけられている。ｍｉＲ−２１は、生存経路ＭＡＰＫ／ＥＲＫを調節することによりアポトーシスを阻害することが示された。ｍｉＲＮＡのｍｉＲ−３０ファミリーは、有足細胞構造および機能にとって重要で、増加が糸球体形成に必要である可能性があることを示唆している。ｍｉＲ−１４１、２００ａ、２００ｃおよび４２９は、全て、線維形成を減らす可能性のあるＴＧＦ−βシグナル伝達に対し応答した上皮から間葉への転換（ＥＭＴ）の調節に関与する（Ｓａａｌ  ｅｔ  ａｌ．２００９．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．１８：３１７−３２３）。ｍｉＲ−１４６ａおよび１５１は、ＮＦκＢ調節に関係づけられており、従って、インビボで炎症反応を減らす可能性がある（Ｔａｇａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．２００６．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１０３（３３）：１２４８１−６；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．２００６．ＮＡＲ．３４  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｉｓｓｕｅ：Ｄ１４０−Ｄ１４４）。まとめると、これらのｍｉＲＮＡは、成功している再生結果に関連するプロセスを調節する；従って、それらをアッセイ開発のための候補バイオマーカーとする。全体的に見て、このデータは、尿中の微小胞および／またはそれらの内腔含有物が再生アッセイ用の実行可能な標的であるという構想を支持する。理由は、それらが、処置のモニタリングの非侵襲的手段を開業医に提供することに加えて、ＴＧＦβ−１、ＮＦκＢ、アポトーシス、細胞分裂、および多分化能、等の複数の経路を調節することができるタンパク質およびｍｉＲＮＡを含むからである。
【０３８５】
実施例２０−ヒト腎臓細胞凝集体を調製する方法
上記のように、標準的ＮＫＡ生成操作法を使ってヒト腎臓細胞を単離した。細胞を増殖させ、２代継代を行って継代培養した後、低酸素環境（２％Ｏ２）に１８時間暴露した。暴露後、細胞を採取し、２ステップ密度勾配（７％と１６％ｗ／ｖ  Ｏｐｔｉｐｒｅｐ）に供し、８００ｘｇで２０分間、ブレーキ無しで遠心分離を行った。結果として７％層と１６％層の間に形成されたバンドを集め、洗浄した（Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４）。細胞を計数し、生存率を評価した。接着を防ぐためにポリＨＥＭＡコートしたマルチウエルプレートに入れ、インキュベーター中のオービタルローテーター上で２４時間、細胞培養（２０〜３０ｘ１０３細胞／ｃｍ２）することにより、細胞凝集体またはスフェロイドが生成された（図３０Ａ）。あるいは、バンド形成細胞を、３７℃／５％ＣＯ２環境下、７５ｍｌの腎臓増殖培地中に再懸濁し（ｌｘ１０６細胞／ｍｌの濃度）、インキュベーター中のマグネチックスターラ（４〜４０ｒｐｍ）上の１２５ｍｌスピナーフラスコ（ＢＤ）中に入れた（図３０Ｂ）。自己凝集して、スフェロイドを生成するように２４〜４８時間細胞を残した後、表現型の変化に関しアッセイした（図３１）。細胞は、スピナーフラスコ中でアッセイしても、またはアッセイのためにスフェロイドを維持しているより小さいポリＨＥＭＡコートマルチウエルプレートに移してもよい。任意の数の適切なアッセイを行って、表現型の変化、機能、生存率、およびアポトーシスを測定する。表７は、代表的アッセイおよび対応する結果を示す。
（表７）
腎臓スフェロイド上の機能性マーカーの例
0006054299.tif 000008
【図９】
0006054299.tif 000009
【図１１】
0006054299.tif 000010
【図１３】
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【図１４】
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【図２０】
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【図２２】
0006054299.tif 000014
【図２３】
0006054299.tif 000015
【図２４】
0006054299.tif 000016
【図２９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
0006054299.tif 000020
【図４】
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【図５】
0006054299.tif 000022
【図６】
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【図７】
0006054299.tif 000024
【図８】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２１】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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