(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ステンレス鋼、スズ、鉄、又はチタニウムから作られた支持体の露出表面の一以上に化合物を共有結合させる方法であって、前記支持体の露出表面を、ＩＶ型緑膿菌（Ｐ. ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（Ｔ４Ｐ）ピリンのＣ末端レセプター結合タンパク質に由来するジスルフィドループ及び前記ループのＮ末端側又はＣ末端側のいずれか又は両方上に０−１０の追加的残基を含む天然又は合成ピリンペプチドと、接触させる工程、それにより前記ピリンペプチドを前記露出表面に共有結合させる工程、及び
前記接触させる工程及び前記共有結合させる工程の前又は後に、前記化合物を前記ピリンペプチドに共有結合させる工程、を含む前記方法。
【請求項２】
前記支持体表面が露出した粒界領域を有すること、及び前記接触させる工程が露出した粒界領域に前記化合物を優先的に局在させるために効果的であること、を特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ピリンペプチドがＬ−アミノ酸で作られることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ピリンペプチドがＤ−アミノ酸、Ｌ−及びＤ−アミノ酸の混合物、又はレトロインバーソ（ＲＩ）でのＤ−アミノ酸で作られることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ピリンペプチドが配列番号１０として同定された配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ピリンペプチドが配列番号３、４、又は９として同定された配列を含むことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記化合物がペプチド類、オリゴサッカロイド類、脂質類、核酸類、及び小さな有機分子類からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記支持体が多孔性又は網状であること、及びコーティングする工程が前記ピリンペプチドを前記支持体中の孔又は網目により形成された内側の面に結合させることを効果的にすること、を特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法により作られた共有結合した化合物を有するステンレス鋼、スズ、鉄、又はチタニウム支持体の製造方法であって、前記支持体表面へのピリンペプチドの結合及び前記化合物が前記ピリンペプチドに共有結合することにより、前記支持体が改変された電子仕事関数を有することを特徴とする前記支持体の製造方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の製造方法により製造された支持体が、移植可能な医療機器の一部であることを特徴とする請求項９に記載の支持体の製造方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の製造方法により製造された支持体を使用するバイオセンサー装置の製造方法であって、さらに、表面結合レセプターへの検体関連リガンドの結合に応答して支持体表面にわたって電流の変化を検出するための検出器を含み、ここで、前記レセプターは前記化合物それ自身であるか又は前記化合物に高親和性結合により付着していることを特徴とする前記装置の製造方法。
【請求項１２】
共有結合した前記化合物がＫ又はＥコイルであること、及びレセプターがＥ／Ｋコイルドコイル複合体を通して表面に結合すること、を特徴とする請求項１１に記載のバイオセンサー装置の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＶ型緑膿菌（Ｐ.  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（Ｔ４Ｐ）ピリンペプチドを使用する物質コーティングの分野及びその適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
バクテリアＩＶ型線毛（ｐｉｌｉ）は多くのグラム陰性細菌の宿主コロニー形成及び毒性にとって不可欠であり、また、あるグラム陽性細菌の発病の役割も果たすことがある。ＩＶ型線毛は、バクテリアの表面から伸び、生物及び非生物表面への特異的な付着を仲介する。この結合に関与する線毛結合ドメインは、タンパク質のＣ末端領域にある１２−１７のジスルフィドループ領域内にコードされ、例えば、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＩＶ型ピリン由来の残基１２８−１４４から構成されるジスルフィドループペプチドのような、この領域のみを含む合成ペプチドは生物及び非生物表面へ結合することが示されている。
【０００３】
現在の発明者及び同僚は、ピリン誘導タンパク質ナノチューブ（ＰＮＴ）が高親和性でステンレス鋼に結合することを最近示した。またこの結合は、ＩＶ型ピリンペプチド結合ドメインに対応する合成ペプチドによるＰＮＴ結合の拮抗的阻害を受けながら、Ｃ末端先端が関連することを示した。（Ｙｕ，  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｎａｎｏｓｃｉｅｎｃｅ，  １：７３−８３  （２００７）。その後、現在の発明者及び同僚によって、Ｃ末端レセプター結合ドメインに由来したピリンペプチドが、ステンレス鋼、スズ、アルミニウム、チタニウム、クロム、プラスチック、ガラス、シリケート、セラミックス、及びそれらの混合物のような、非生物表面に結合された時、塗布面上のバクテリアのバイオフィルム形成を防止することができることをさらに実証した（Ｕ．Ｓ．  ２００８０２８７３６７）。
【０００４】
今回、ＩＶ型緑膿菌（Ｐ.  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（Ｔ４Ｐ）ピリンのＣ末端レセプター結合タンパク質に由来するジスルフィドループを含む合成ピリンペプチドをいくつかの金属に結合させることが、金属の、表面だけの特性を著しく増強させ（つまりバイオフィルム形成と無関係に）、いくつかの金属の中で、例えば、バイオセンサーの適用に、利用することができるような態様で表面の電子特性を変更させることを発見した。
【発明の概要】
【０００５】
ある態様においては、本発明は、ステンレス鋼、スズ、鉄、又はチタニウムから作られる支持体の露出表面の一以上に化合物を共有結合させる方法を含む。方法は、
ｉ）材料の露出表面をＩＶ型緑膿菌（Ｐ.  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（Ｔ４Ｐ）ピリンのＣ末端レセプター結合タンパク質に由来するジスルフィドループ及び前記ループのＮ末端側又はＣ末端側のいずれか又は両方上に０−１０、好ましくは０−５の追加的残基を含む合成ペプチドと接触させ、ピリンペプチドを露出表面に共有結合させる工程、及び
ｉｉ）ペプチドを前記支持体に結合する前又は後に、化合物をピリンペプチドに直接的に又は間接的に共有結合させる工程、を含む。前記接触させる工程が、材料の露出した粒界領域に前記化合物を優先的に局在させてよい。
【０００６】
ピリンペプチドが、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、Ｌ−及びＤ−アミノ酸の混合物、又はレトロインバーソ（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）（ＲＩ）形態のＤ−アミノ酸で作られてよい。
【０００７】
好ましいＴ４Ｐピリンペプチドは、配列K/A/S/T-C-T/K/A-S/T-D/T/N-Q/V/A-D/E-E/P/A/N-Q/M/K-F/Y-I/T/R/L-P-K/N-G/T-C-S/D/T/Q/N-K/N/D/T  （配列番号１０）を含む。ペプチドの例としては、配列番号３、４、又は９として同定された配列を含む。
【０００８】
別の好ましいＴ４Ｐピリンペプチドは、配列S/T-I-D-W-G/A-C-A/T-S-D/A-S-N-A-V/T-S/--S--G/A-T-D/A-R/Q-N/G-M/F-P/T-A/G-L/M-T/A-A-G-T/S-L/V-P-A/Q-R/E-F-A-P-S/A-E/Q-C-R  (配列番号１１)を含む。ペプチドの例としては、配列番号１及び２として同定された配列を含む。
【０００９】
支持体が多孔性又は網状であり、コーティング工程が、ピリンペプチドを材料中の孔又は網目により形成された内側の面に結合するために実施されてよい。
【００１０】
支持体に付着する化合物の例は、ポリペプチド類、オリゴサッカロイド類、脂質類、核酸類、及び小さな有機分子類を含む。
【００１１】
方法の中で考えられる他の支持体金属は、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、ルテニウム、ロジウム、パラジウム、銀、カドミウム、オスミウム、白金、金、クロム、及び水銀、及びそれらの混合物及び合金を含む、周期表の４−６列及び９−１２カラムからの遷移金属、及びメタロイド・シリコン及びメタロイド・ゲルマニウム、及びそれらの酸化物である。
【００１２】
また、本明細書は、上記方法により作成された共有結合した化合物を有するステンレス鋼、スズ、鉄、又はチタニウム支持体を開示する。支持体の表面へのＴ４Ｐピリンペプチドの共有結合により、支持体が、改変された仕事関数を有する。支持体は移植可能な医療機器の一部でよく、共有結合した化合物（直接的に又は間接的に結合した）は、好ましくは、例えば骨形態形成因子のような、生物活性化合物である。あるいは、支持体は、表面結合レセプターへの検体関連リガンドの結合に応答して支持体表面にわたる、電流の変化を検出するためのバイオセンサー装置中の電流センサー部品として使用されてよい。ここで前記レセプターは、ピリン・ペプチドに直接に付けられているか、ビオチン／アビジン対又はロイシンジッパーコイルド‐コイル対（ｌｅｕｃｉｎｅ−ｚｉｐｐｅｒ  ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ  ｐａｉｒ）のような、高親和性結合対を介してピリン・ペプチドに間接的に付けられていることを特徴とする。
【００１３】
より一般的な態様（それはガラス、ポリマー、ラテックス、シリケートを含む（下記を参照）、様々な材料へのピリン・ペプチドの高親和性結合の利点を有する）においては、本発明は、非ピリンに由来する化合物を一つの又はこれらの材料から構成される表面を有する装置へ付ける方法を含み、該方法は、そのような表面へピリン・ペプチドを付着させること、及びそのように付着させる前に又は後に、化合物をピリン・ペプチドに、直接的に又は間接的に、共有結合させることを含む。上記のように、間接の結合が高親和性結合対を介してよい。この方法により作られた、コーティングした装置も考えられる。
【００１４】
より一般的に、検体検出装置は、金属、プラスチック、セラミック、ガラス、又はシリケート支持体を含む検体検出装置を含み、前記支持体は、ＩＶ型緑膿菌（Ｐ.  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（Ｔ４Ｐ）ピリンのＣ末端レセプター結合タンパク質に由来するジスルフィド・ループを含む合成ペプチドにより支持体表面に付着した化合物を有し、及び化合物は共有結合で付着される。装置は支持体上の化合物に結合する検体関連分子を検出するための検出器を含む。
【００１５】
また、本発明は、材料の表面硬度を増加させ、及び腐食速度を低減させるために、露出した粒界領域を持つ表面を有する、ステンレス鋼、スズ、鉄又はチタニウム金属材料を処理する方法の改善を含む。この方法は、露出した粒界領域の電子仕事関数を、０．２ＥＦＷ単位以上変化させるのに、及び所定の力を有する原子間顕微鏡のチップで金属表面を打って生じるナノインデンテーションにより測定して、露出した粒界領域の硬度を２０％以上増加させるのに、有効な条件下にて、材料中の露出した表面粒界領域をＩＶ型緑膿菌（Ｐ.  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（Ｔ４Ｐ）ピリンのＣ末端レセプター結合タンパク質に由来するジスルフィドループを含み、かつ前記ループのＮ又はＣ末端側のいずれか又は両方上に０−１０、好ましくは０−５の追加的残基を含む、合成ピリンペプチドと接触させることを含む。
【００１６】
方法の中で考えられる他の金属は、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、ルテニウム、ロジウム、パラジウム、銀、カドミウム、オスミウム、白金、金、クロム、及び水銀、及びそれらの混合物及び合金、及びメタロイドのシリコン及びゲルマニウム、及びそれらの酸化物を含む、周期表及びの４−６列及び９−１２カラムからの遷移金属である。
【００１７】
構造がステンレス鋼である場合、これをコーティングすると、表面全体にわたって流れる腐食電流を測定して、コーティングした表面の腐食速度を少なくとも３０％低減するのに効果的でよい。材料が、多孔性又は網状である場合、コーティングする工程が、ピリンペプチドを材料中の孔又は網目により形成された内側の面に結合するように実施されてよい。接触工程は、ピリンペプチドを前記粒界領域に選択的に結合させるために効果的であり得、その粒界領域にて表面を優先的に保護することにより、材料表面の硬度及び腐食耐性を増強させる。
【００１８】
ピリンペプチドが、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、Ｌ−及びＤ−アミノ酸の混合物、又はレトロインバーソ（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）形態でのＤ−アミノ酸で作られてよい。
【００１９】
好ましいＴ４Ｐピリンペプチドは、配列K/A/S/T-C-T/K/A-S/T-D/T/N-Q/V/A-D/E-E/P/A/N-Q/M/K-F/Y-I/T/R/L-P-K/N-G/T-C-S/D/T/Q/N-K/N/D/T  （配列番号１０）を含む。ペプチドの例としては、配列番号３、４、又は９として同定された配列を含む。
【００２０】
別の好ましいＴ４Ｐピリンペプチドは、配列S/T-I-D-W-G/A-C-A/T-S-D/A-S-N-A-V/T-S/--S--G/A-T-D/A-R/Q-N/G-M/F-P/T-A/G-L/M-T/A-A-G-T/S-L/V-P-A/Q-R/E-F-A-P-S/A-E/Q-C-R  (配列番号１１)を含む。ペプチドの例としては、配列番号１及び２として同定された配列を含む。
【００２１】
さらに、本発明は、ＩＶ型緑膿菌（Ｔ４Ｐ）ピリンのＣ末端レセプター結合タンパク質に由来したジスルフィド・ループ及びそのループのＮ又はＣ末端側のどちらか又は両方上で０−１０、好ましく０−５の追加の残基を含む合成ピリン・ペプチドでガラスの外部表面をコーティングすることによる、ガラスを硬化する方法を含む。ピリン・ペプチドはアミノ酸形態を有してよく、好ましい配列は上記に言及した。
【００２２】
また、本発明は、ＩＶ型緑膿菌（Ｔ４Ｐ）ピリンのＣ末端レセプター結合タンパク質に由来したジスルフィド・ループ及び（ｉｉ）そのループのＮ又はＣ末端側のどちらか又は両方上で０−１０、好ましく０−５の追加の残基を含む合成ピリン・ペプチドで構成要素の表面をコーティングすることによって、器械中の、互いとの可動接触子にある構成要素間の摩擦を低減する方法を含む。ピリン・ペプチドはアミノ酸形態を有してよく、好ましい配列を上記に言及した。
【００２３】
別の態様においては、本発明は、例えばチタニウム又はステンレス鋼構造のような、金属移植構造を含む骨インプラントを含む。前記構造の一部は、領域内に又はその領域に対して置かれるのに適し、及びこの一部は、ＩＶ型緑膿菌（Ｔ４Ｐ）ピリンのＣ末端レセプター結合タンパク質に由来したジスルフィド・ループを含む、及びそのループのＮ又はＣ末端側のどちらか又は両方上で０−１０、好ましく０−５の追加の残基を含む、合成ピリン・ペプチド及び骨形態形成因子の複合体を含む骨形態形成ペプチドのコーティングを施される。
【００２４】
関節置換移植として使用するために、コーティングを施した部分は骨の皮質の領域内に置かれるのに適しており、複合体は、ピリン・ペプチド及び骨形態形成因子の共有結合性の複合体でよく、骨形態形成因子は、ＲＧＤ及び骨形態形成因子ＢＭＰ２−ＢＭＰ７から成る群から選択されてよい。
【００２５】
歯科インプラントして使用するために、コーティングを施した部分は、上顎又は下顎の骨の中で形成されたホール内に置かれるのに適したインプラントを含んでよく、複合体は、ピリン・ペプチド及び骨形態形成因子の共有結合性の複合体でよく、骨形態形成因子は、ＲＧＤ及び骨形態形成因子ＢＭＰ２−ＢＭＰ７から成る群から選択されてよい。
【００２６】
また、例えば、本明細書にて開示される、ステントの外部表面領域に設けられる、ステンレス鋼、チタニウム、クロム支持体のような、拡張型支持体を含む血管内ステントを含む。そのステントは、ＩＶ型緑膿菌（Ｐ.  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（Ｔ４Ｐ）ピリンのＣ末端レセプター結合タンパク質に由来するジスルフィド・ループを含み、かつそのループのＮ又はＣ末端側のどちらか又は両方上に０−１０、好ましく０−５の追加の残基を含む、合成ピリンペプチドのコーティングを含む。ステントは、抗再狭窄化合物を含む薬物放出コーティングでさらにコーティングされてよい。
【００２７】
また、別の態様においては、本発明は、対象に挿入された又は移植された医療機器に対する炎症反応を阻害する方法であって、
移植する前に、機器の露出表面を、
ＩＶ型緑膿菌（Ｐ.  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（Ｔ４Ｐ）ピリンのＣ末端レセプター結合タンパク質に由来するジスルフィドループ、及び
（ｉｉ）前記ループのＮ末端側又はＣ末端側のいずれか又は両方上に０−１０、好ましくは０−５の追加的残基、及び
Ｄ−アミノ酸、Ｌ−及びＤ−アミノ酸の混合物、又はレトロインバーソ（ＲＩ）形態でのＤ−アミノ酸から構成されること、
を含む合成ピリンペプチドとコーティングすることを含む前記方法を含む。１つの好ましい実施態様においては、医療機器のコーティングを施した部分はステンレス鋼、スズ、鉄又はチタニウム表面である。
【００２８】
関連する態様においては、本発明は、身体に移植される時、炎症反応細胞にさらされる表面を有する医療機器であって、そのような表面が、
（ｉ）ＩＶ型緑膿菌（Ｐ.  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（Ｔ４Ｐ）ピリンのＣ末端レセプター結合タンパク質に由来するジスルフィドループ、
（ｉｉ）前記ループのＮ末端又はＣ末端のいずれか又は両方上に０−１０好ましくは０−５の追加的残基、及び
（ｉｉｉ）Ｄ−アミノ酸、Ｌ−及びＤ−アミノ酸の混合物、又はレトロインバーソ（ＲＩ）形態でのＤ−アミノ酸の構成、
を有する合成ピリンペプチドとコーティングすることを特徴とする前記機器を含む。露出表面はステンレス鋼、スズ、鉄又はチタニウム表面でよい。
【００２９】
また、さらなる態様においては、本発明は、
（ｉ）ステンレス鋼、スズ、鉄、チタニウム、クロム、プラスチック、ガラス、シリケート、セラミックス、及びその混合物から成る群から選択された材料から作られた固体担体を、ＩＶ型緑膿菌（Ｐ.  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（Ｔ４Ｐ）ピリンのＣ末端レセプター結合タンパク質に由来するジスルフィドルを含む、及び前記ループのＮ末端又はＣ末端のいずれか又は両方上に０−１０好ましくは０−５の追加的残基を含む、合成ピリン・ペプチドに、切断リンカーを介して、目的ポリペプチドのＮ又はＣ末端にて、結合された目的ポリペプチドを含む融合ポリペプチドを含む組成物と接触させる工程、
（ｉｉ）、この接触させる工程により、固体支持体への融合タンパク質を付ける工程、
（ｉｉｉ）、固体担体を洗浄し、組成物中の非結合成分を除去する工程、
（ｉｖ）、融合タンパク質中のリンカーを切断するのに効果的な薬剤で、洗浄した固体担体を処理し、それにより、固体担体から無傷の形態の目的のポリペプチドを放出する工程、及び
（ｖ）放出された目的のポリペプチドを固体担体から分離させる工程、
により、目的のポリペプチドを得る方法を含む。ピリン・ペプチドはアミノ酸形態を有してよく、好ましい配列は、上記に言及した。
【００３０】
融合タンパク質中のリンカーは、選択されたタンパク分解酵素によってリンカーを切断しやすくするアミノ酸配列を含んでよく、工程（ｉｖ）の処理は選択されたタンパク分解酵素の存在下にて固体担体をインキュベートすることを含んでよい。
【００３１】
次の発明の詳細な説明が添付した図面と共に読まれる時、これら及び本発明の他の目的及び特徴はより完全に明白になるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
図１Ａ−１Ｄは、多くのバクテリアの属／種／株の中のＩＶ型緑膿菌（Ｐ.  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（Ｔ４Ｐ）ピリンのＣ末端レセプター結合ドメインの配列を示す。
【００３３】
図２Ａと２Ｂは、コーティングがないステンレス鋼又はＫ１２２−４（２Ａ）及びＰＡＯ（２Ｂ）ピリン・ペプチドでコーティングしたステンレス鋼上でなされた付着力測定を示すプロットである。
【００３４】
図３Ａと３Ｂは、コーティングがないステンレス鋼及びＫ１２２−４（３Ａ）及びＰＡＫ（３Ｂ）ピリン・ペプチドでコーティングしたステンレス鋼での電子仕事関数（ＥＷＦ）を示すプロットである。
【００３５】
図４は、２か月の期間にわたって得られた、コーティングした及びコーティングがない、ステンレス鋼を用いたＥＷＦ測定を示す。
【００３６】
図５は、８００ｎＭ荷重下にて、ペプチドをコーティングした及びコーティングしていない、ステンレス鋼の力‐変位曲線を示す。
【００３７】
図６Ａと６Ｂは、２０μＮ（６Ａ）及び５０μＮ（６Ｂ）荷重で行なわれたナノ‐インデンテーション試験の結果を示す。
【００３８】
図７Ａと７Ｂは、ペプチドコーティング（７Ａ中のＰＡＯ及び７Ｂ中のＫ１２２−４）及びコーティングがない、ステンレス鋼での荷重を増加させながらの変位測定のプロットである。
【００３９】
図８Ａ及び８Ｂは、コーティングがない（８Ａ）及びＴ４Ｐ１７ピリン・ペプチドでコーティングを施した（８Ｂ）ステンレス鋼支持体及びＡＦＭチップの間の電流のコンダクタンスＡＦＭ表面マップである．
【００４０】
図９Ａ−９Ｂは、コーティングした及びコーティングがないステンレス表面の腐食特性の測定であり、ピリンをコーティングしたステンレス鋼が、コーティングがないステンレス鋼より著しく低い腐食電流（Ｉｃｏｒｒ）を有すること（９Ａ）、並びにピリンコーティング及びコーティングがないステンレス鋼は、著しく異なる腐食電位（Ｅｃｏｒｒ）（９Ｂ）がないことを示す。
【００４１】
図１０Ａと１０Ｂは、ピリンをコーティングしたステンレス鋼がコーティングがないステンレス鋼より著しく低い腐食速度（１０Ａ）及びコーティングがないステンレス鋼と比較して、分極に対する著しく高い耐性（１０Ｂ）を有することを示すプロットである。
【００４２】
図１１は、ピリン・ペプチドが別のペプチドに、この場合、ロイシンジッパー型Ｅコイル又はＥ／Ｋコイルドコイルに接合する場合、金属表面へ結合するピリン・ペプチドの腐食阻害作用を逆になりえることを示す。
【００４３】
図１２Ａ−１２Ｃは、コーティングがないか（１２Ａ）、ピリン・ペプチドでコーティングしたか（１２Ｂ）、又はピリンに接合するコイル‐コイル二重螺旋を有するピリン・ペプチドでコーティングしたか、どちらかであるステンレス鋼サンプル上の腐食の視覚的な効果を示す写真である。
【００４４】
図１３は、増加する量の外因性ペプチドを使用する競合結合測定法のステンレス鋼表面から結合ピリン・ペプチドが置き換えられないことを示す。
【００４５】
図１４はコーティングがない及びＫ−１２２−４ピリン・ペプチドコーティング、ステンレス鋼サンプルのＸＰＳプロットである。
【００４６】
図１５Ａと１５Ｂは、ＬとＤ形態の両方又はピリン・ペプチドでコーティングした、ステンレス鋼サンプル上の付着力測定（１５Ａ）及びピリン・ペプチドの同じＬ及びＤ形態でコーティングしたステンレス鋼サンプル上のＥＷＦ力測定（１５Ｂ）を示す。
【００４７】
図１６Ａと１６Ｂは、ピリン・ペプチド（Ｄ形態）がステンレス鋼ステント（１６Ａ）及びガラス表面（１６Ｂ）にしっかりと結合する能力を実証する。
【００４８】
図１７Ａと１７Ｂは、ステンレス鋼サンプルに結合したＬアミノ酸及びＤ−アミノ酸ピリンの中でプロテアーゼ消化に対する相対的抵抗性を示す棒グラフである。
【００４９】
図１８Ａと１８Ｂは、本発明の１つの実施態様として構築されたバイオセンサー装置の操作を示す略図である。
【００５０】
図１９は、ピリン・ペプチドを介して、検体を結合する薬剤Ｒがバイオセンサー表面に直接に付けられたバイオセンサーにおける検体を結合する工程を例示する。
【００５１】
図２０は、検体を結合する薬剤Ｒが、ピリン・ペプチド・コイルド‐コイル複合体を介して、バイオセンサー表面に付けられたバイオセンサーにおける検体を結合する工程を例示する。
【００５２】
図２１は本発明のバイオセンサーの中で異なる検出構成配置を示す。
【００５３】
図２２Ａと２２Ｂは、レセプターに結合する検体を結合する前に及び後に、バイオセンサー装置に記録されたサイクリックボルタンメトリー・プロットであり、２２Ｂは、図２２Ａの中の長方形パネルの拡大である。
【００５４】
図２３Ａ及び２３のＢは、本発明のより一般的な実施態様によって構築された検体検出装置を示す。
【００５５】
図２４Ａ−２４Ｄは、ステンレス鋼（２４Ａ）、冠状動脈のステント（２４Ｂ）、フォーリー（Foley）（ラテックス）カテーテル（２４Ｃ）及び中心静脈の（シリコーン）（２４Ｄ）カテーテルにＴ４Ｐ１７ピリン・ペプチドが結合することを示す棒グラフである。
【００５６】
図２５Ａと２５Ｂは、コーティングがない及びピリンコーティングした、チタニウム又はステンレス鋼表面にＰＢＭＣ免疫学的応答について、Ｄピリン・ペプチド・コーティングの影響を示すウェスタンブロット（２５Ａ）と棒グラフのプロット（２５Ｂ）である。
【００５７】
図２６Ａ及び２６Ｂは、コーティングがない及びピリンコーティングした、チタニウム又はステンレス鋼表面にヒトマクロファージ免疫学的応答について、Ｄピリン・ペプチド・コーティングの影響を示すウェスタンブロット（２６Ａ）と棒グラフのプロット（２６Ｂ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
１．定義
「線毛（ｐｉｌｕｓ）」は多くのバクテリアの表面で見つけられた細い付属器官である。
【００５９】
ピリンは線毛のタンパク質サブユニットの一般名である。
【００６０】
「ＩＶ型緑膿菌（Ｐ.  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（Ｔ４Ｐ）ピリン」は、生物又は非生物表面に線毛の遠位末端を付着させてバクテリアを前へ引くために線毛を収縮することにより、運動性の力を作りだすために緑膿菌バクテリアが使用する線毛構造をいう。ＩＶ型緑膿菌（Ｐ.  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（Ｔ４Ｐ）線毛すべては、酸化体の中で、１２−残基ループ又は１７−残基ループのいずれかに分類することができるジスルフィド・ループを含むＣ末端レセプター結合領域を含む。図１は、Ｃ末端ピリン領域が配列された多くのバクテリアの種の中のジスルフィド・ループ領域を示す。
【００６１】
「ＩＶ型緑膿菌（Ｐ.  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（Ｔ４Ｐ）ピリンのＣ末端レセプター結合タンパク質に由来したジスルフィド・ループ」は、そのアミノ酸配列が例えば緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｏｇｉｎｏｓａ）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４によって同定されたＰＡＫ菌株のような公知のバクテリアジスルフィドループのアミノ酸配列に相当するか、或いは４つの緑膿菌の菌株ＰＡＫ、ＰＡＯ、ＰＡ８２９３５及びＫ−１２２−４のジスルフィド・ループ配列の複合体として形成されるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０に含まれる配列のうちの１つのような、２つ以上の異なるバクテリアの種及び／又は菌株の間のジスルフィドループ配列中に一以上のアミノ酸変異を置換として形成する配列のうちのひとつのような、既知のバクテリアのジスルフィド・ループ・アミノ酸配列にそのアミノ酸配列が相当するジスルフィド・ループをいう。
【００６２】
「合成ペプチド」は、固相又は組み換えのペプチド合成によって形成されるペプチドをいう。
【００６３】
「ステンレス鋼、スズ、鉄又はチタニウムから作られた支持体」は、ステンレス鋼、スズ、鉄又はチタニウム又はこれらの金属の２つ以上の混合物からつくられた金属支持体、又は、ステンレス鋼、スズ、鉄又はチタニウム又はその混合物でコーティングした金属又は非金属支持体を意味する。支持体は、他の金属、特にコバルト、ニッケル、銅、亜鉛、ルテニウム、ロジウム、パラジウム、銀、カドミウム、オスミウム、白金、金、クロム（ステンレス鋼の中にある）、及び水銀を含む周期表の列４−６及び９−１２カラムからの遷移金属、の小さな割合を含んでよい。
【００６４】
「ステンレス鋼、スズ、鉄又はチタニウムから作られた金属支持体へのＴ４Ｐピリン・ペプチドの共有結合」は、ピリン・ペプチドが、（ｉ）遊離ピリン・ペプチドにより置換に抵抗する、及び（ｉｉ）金属の表面ｅ−軌道の変化を示す改変したエレクトロン仕事関数（ＥＷＦ）を有する結合を通じて金属表面へ付けられていることを意味する。また、そのような金属支持体へのピリン・ペプチドの共有結合は、（ｉ）表面の付着力の変化、（ｉｉ）表面硬度の変化、（ｉｉｉ）コンダクタンスの変化、及び／又は（ｉｖ）Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）で見られた結合するエネルギーのピークの変化が特徴であってもよい。
【００６５】
「共有結合した化合物を有する金属支持体」は、支持体表面に共有結合で結合するＴ４Ｐピリンペプチド及びピリンペプチドに直接に又は間接的に共有結合で結合するピリンタンパク質のもう一つの部分以外の化合物を有するステンレス鋼、スズ、鉄又はチタニウム支持体を意味する。化合物がコイルド‐コイル・ロイシンジッパー・ペア、ビオチン・アビジン・ペアなどのような高親和性結合ペアによってピリン・ペプチドに結合される場合、化合物は間接的にＴ４Ｐピリン・ペプチドに共有結合で結合され、ここで、ペアのメンバーのうちの１つがピリン・ペプチドに共有結合で結合され、及び他方は化合物に共有結合で結合される。
【００６６】
金属支持体の「露出した粒界領域」は、粒界が生じる支持体の（すなわち支持体を形成する金属原子の２つの多結晶の配向の境界で）外面領域をいう。
【００６７】
「露出した粒界領域でのピリンペプチドの優先的な局在化」は、ピリンペプチド、及びピリンペプチドに共有結合する任意の化合物が、粒界間の露出した領域より大きな分子濃度及び／又は粒界領域での表面コーティングの大きな厚さを有することを意味する。
【実施例】
【００６８】
ＩＩ．ピリンペプチド
図１Ａ−１Ｄは、シーケンス情報が利用可能な様々なバクテリアの属／種／株のジスルフィドループを含むＣ末端ピリンペプチド領域に関する配列を示す。所望の配列はジスルフィドループ配列（システイン残基（Ｃ）で始まり及び終了し、いくつかの場合、ループの一方の側に５までもしくはそれ以上の残基を含む）を含む。一文字の英字アミノ酸指示は標準規則によるものである。ペプチドの正常な酸化体では、ペプチドは、システイン残基間のジスルフィド架橋を含んでいる。
【００６９】
本発明の中で用いる合成ペプチドは、図１Ａ−１Ｄの中で示される配列の１つ以上を含むか、これらに由来する。配列が、示された配列のうちの一つを含む場合、配列はそのジスルフィド・ループを単独で含んでよく、又はそのループは、ループのＮ末端又はＣ末端側のどちらか又は両方にて、１０まで、好ましくは５未満の残基をさらに含んでよく、ここで、追加の非ループ残基が、典型的には隣接した非ループ配列の１以上を含むか、またはこれらに由来する。より一般的に、ループ及び非ループ領域両方の配列は、配列、好ましくは、ジスルフィド・ループ中に同じ数又はほとんど同じ数の残基を有する配列、を整列させることによる２つ以上の配列に由来してよい。例えば、図１Ａの中で、緑膿菌（Ｐ.  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）株ＰＡＯ（配列番号：３）、ＰＡＫ（配列番号：４）、ＰＡ８２９３５（配列番号：７）及びＫ１２２−４（配列番号：９）に対応する４ペプチドは、１４量体のジスルフィド・ループを含む。図１Ａの中の４つの緑膿菌株からのジスルフィド・ループ配列を整列させることによって、組み合わせた配列Ｋ／Ａ／Ｓ／Ｔ−Ｃ−Ｔ／Ｋ／Ａ−Ｓ／Ｔ−Ｄ／Ｔ／Ｎ−Ｑ／Ｖ／Ａ−Ｄ／Ｅ−Ｅ／ＩＰ／Ａ／Ｎ−Ｑ／Ｍ／Ｋ−Ｆ／Ｙ−Ｉ／Ｔ／Ｒ／Ｌ−Ｐ−Ｋ／Ｎ−Ｇ／Ｔ−−Ｃ−Ｓ／Ｄ／Ｔ／Ｑ／Ｎ−Ｋ／Ｎ／Ｄ／Ｔ（配列番号：  １０）が明らかになる。この１７の残基ペプチド（また、総称的にＴ４Ｐ１７と呼ぶ）は１４のジスルフィド・ループ残基、ひとつの上流（Ｎ末端側）非ループ残基及び２つの下流非ループ残基を含む。この配列内の配列の例は、配列番号：１０に由来される実際の４つの異なる配列、つまりＰＡＫ（配列番号：  ３）、ＰＡＯ（配列番号：  ４）、ＰＡ８２９３５（配列番号：  ７）、及びＫ−１２２−４（配列番号：  ９）に対応する配列を含む。
【００７０】
別の例は、２つの緑膿菌株Ｇ７−０９（配列番号：１）及びＰＡ１１０５９４（配列番号：２）はコンポジットシーケンスＳ／Ｔ−Ｉ−Ｄ−Ｗ−Ｇ／Ａ−Ｃ−Ａ／Ｔ−Ｓ−Ｄ／Ａ−Ｓ−Ｎ−Ａ−Ｖ／Ｔ−Ｓ／−−Ｓ−−Ｇ／Ａ−Ｔ−Ｄ／Ａ−Ｒ／Ｑ−Ｎ／Ｇ−Ｍ／Ｆ−Ｐ／Ｔ−Ａ／Ｇ−Ｌ／Ｍ−Ｔ／Ａ−Ａ−Ｇ−Ｔ／Ｓ−Ｌ／Ｖ−Ｐ−Ａ／Ｑ−Ｒ／Ｅ−Ｆ−Ａ−Ｐ−Ｓ／Ａ−Ｅ／Ｑ−Ｃ−Ｒ（配列番号：２１）を形成する。
【００７１】
いったんピリンペプチド配列が選択されると、標準組み換え又は固相合成により合成され得る。例えば、Ｅ−コイルＰＡＫ（１２８−１４４）ｏｘは、ｐＲＬＤ−Ｅプラスミドから組み換え的に発現され、ここで、ＰＡＫ（１２８−１４４）ｏｘＤＮＡ配列が合成オリゴヌクレオチドを利用するＥ−コイルを用いてインフレームでスプラシングされ、既知のテクニック（例えば、  Ｇｉｌｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  （２００６）  ５９（４）：１０８３及び本明細書に引用されるレファレンスを参照願いたい）に従って大腸菌ＢＬ−２１で発現された。発現されたペプチドは、金属親和性クロマトグラフィーにより精製され、純度及びジスルフィド架橋の構成は、質量分析とＮ末端タンパク質シーケンシングによって確認された。
【００７２】
ある実施態様においては、本発明で使用されるピリン・ペプチドは、Ｌアミノ酸、つまり天然Ｌ−異性体形態を有するアミノ酸）から作られる。すべてのＬアミノ酸から構成されるピリン・ペプチドは、従来の組み換え及び固相合成法の両方によって作ることができる。
【００７３】
別の実施態様においては、ピリン・ペプチドは、Ｄ−アミノ酸又はＤ−及びＬ−アミノ酸の混合物から構成される。ピリン・ペプチドにＤ−アミノ酸を含む１つの目的は、ペプチドがさらされるかもしれない１つ以上のプロテアーゼ酵素によるタンパク質分解に対するペプチドの耐性を増加させることである。例えば、シュードモナス（Ｐｓｅｕｏｄｍｏｎａｓ）バクテリアは、ペプチド切断において、エラスターゼ、メタロプロテアーゼ、及びリジン及び／又はアルギニン残基を要求又は標的にする、古典的トリプシン様セリンプロテアーゼを含むプロテアーゼのコレクションがある。つまり、例えば、Ｋ１２２−４ピリン・ペプチド中のＫ１３６及びＫ１４０にてＤ−リジンを含むようにピリン・ペプチドを合成され得る。好ましくは、ペプチドをできるだけ多くのプロテアーゼに対して耐性にさせる場合、ピリン・ペプチドは完全にＤ−アミノ酸から形成されるはずだ。すべてＤ−アミノ酸又はＤとＬアミノ酸の混合物から構成されるピリン・ペプチドは、合成において、活性化されたＤ又はＬ型アミノ酸試薬を用いる従来の固相法によって作ることができる。（例えば、Ｇｕｉｃｈａｒｄ，  Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  Ｖｏｌ．  ９１，  ｐｐ．  ９７６５−９７６９，  １９９４年１０月を参照。）
【００７４】
別の実施態様では、ピリン・ペプチドは、いわゆるレトロインバーソ（ＲＩ）ピリン・ペプチドを生産するために、逆の配列の方向に（すなわち、カルボキシ末端からアミン末端方向へ）合成されたＤ−アミノ酸からできている。またレトロインバーソ（ＲＩ）形態ピリンペプチドは、プロテアーゼに対する一層大きな耐性を有するという長所を持ち、ピリン塗装物がプロテアーゼにさらされるか（例えば生物学的なセッティングの中で）、細菌増殖にさらされる環境において、本明細書に記載の適用において有利な効果を有する。ＲＩ形態ペプチドを合成する方法は、Ｆｌｅｔｃｈｅｒ，  Ｍ．Ｄ．  ａｎｄ  Ｃａｍｐｂｅｌｌ，  Ｍ．Ｍ．，  Ｐａｒｔｉａｌｌｙ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｒｅｔｒｏ−Ｉｎｖｅｒｓｏ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ａｎｄ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  Ｂｅｈａｖｉｏｒ，  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ，  １９９８，  ９８：７６３−７９５の中で、例えば詳述される。それは引用によって本明細書に組込まれる。
【００７５】
ＩＩＩ．金属表面の処理
ある態様においては、本発明は、材料の腐食の速度を低減するために、露出した粒界領域を有する表面があるステンレス鋼、スズ、鉄又はチタニウム金属材料を処理するための改善された方法を含む。方法は、別々に又はパッシベーションのような多くの他の耐食方法のうちの１つと組み合わせて使用されてもよい。金属材料は、粒界領域を有する単一の露出面や複数の処理される外部表面を有し得、又は材料の外部表面からアクセス可能な空隙又は内部の網目を有してよい。理解されるように、この方法は、例えば、酸化雰囲気中で、又は塩基性か酸性の液体のような腐食性液体との接触によって、化学腐蝕にさらされるあらゆる、ステンレス鋼、スズ、鉄、又はチタニウム金属材料を処理するいずれの場合にも適している。
【００７６】
方法を実行する際に、混入物質を除去するために、金属材料を最初に例えば、エタノール浴の中で１回以上洗浄してよい。その後、材料を、共有結合でピリンを材料の露出面に結合するのに効果的な条件の下にて、ピリンの溶液と接触させる。典型的な処理方法では、材料を、ほぼ中性のｐＨ（例えばｐＨ７）にて、水性の緩衝液（例えばリン酸緩衝生理食塩水）中、２μｇ／ｍＬと５０μｇ／ｍＬの間、例えば１０μｇ／ｍＬ、のピリンペプチド濃度にて、ピリン・ペプチドの溶液中に放置し、ピリン・ペプチドの適切なコーティングが生ずるまで、例えば５−１２０分間、溶液と接触させる。
【００７７】
あるいは、コーティングされる材料をピリン溶液で吹きかけ、所望の接触時間（例えば５−１２０分）にわたって、高湿環境中でスプレーされた溶液と接触させてよい。
【００７８】
別の実施態様では、ピリン・コーティングは、例えば、ミクロファブリケーション操作において、又は材料上の露出した粒界領域にペプチドを選択的に塗布するために、選択された金属表面に塗られる。この実施態様では、ペプチドの溶液は、エリアに特異的な方法で（例えばインクジェット・プリンターなどによって）材料の露出面に供給される。
【００７９】
ＩＩＩＡ．処理方法及び金属表面特性の変更
このセクションは、増加した耐食性に加えて、その耐食性を増強するために金属表面を処理するための典型的な方法、及び次のことを実施する発明をサポートするために行われた研究について記述する。
（ｉ）処理した表面の低減した付着力、
（ｉｉ）処理した表面の改変した電子仕事関数、
（ｉｉｉ）処理した表面の増加した硬度、
（ｉｖ）低減したコンダクタンス、及び
（ｖ）少なくとも２か月の期間にわたるコーティング安定性。
【００８０】
試料調製  厚さ１ｍｍの商用銘柄３０４  ２Ｂ継目板（２０ゲージ）ステンレス鋼板を１ｃｍｘ１ｃｍの寸法を有するサンプルへカットした。サンプルを空気中１時間１１４０℃で焼き戻し、空気中で冷却した。表面を１２０、２４０、３２０、４００、６００及び８００＃グリットの研磨紙を使用して、磨き、その後、１２００＃グリットの研磨紙で最終磨きを行った。
【００８１】
１ｃｍｘ１ｃｍｘ１ｃｍの寸法を有するアルミニウムとステンレス鋼のサンプルは以前に記載された磨きプロトコルを使用して磨かれた。これらのサンプルのどちらも、みがきに先立って焼き戻されなかった。
【００８２】
ペプチド又はモノマーの線毛でサンプルをコーティングする工程  ステンレス鋼とアルミニウムのサンプルを商業用の皿洗い用石鹸を使用して１分間洗浄し、その後、蒸留水ですすいだ。その後、サンプルを１５分間穏やかな撹拌で９５％のエタノールに浸し、蒸留水ですすぎ、１分間試薬用アセトン中へ浸した。サンプルを蒸留水で５回すすぎ、風乾させた。サンプルをペプチド又はモノマーの線毛の１０μｇ／ｍＬを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液に浸し、穏やかな撹拌で１時間室温（ＲＴ）でインキュベートした。溶液を除去し、サンプルを蒸留水で６回洗い、風乾させた。
【００８３】
炭素鋼サンプルを水にさらされた時に生じる迅速な空気腐食を防ぐために、アセトン洗浄ステップに続き、１００％のメタノールですすぎ、１００％のメタノールの中で直ちに浸した以外は、上記に記述されたプロトコールを使用して、きれいにした。ペプチドを１００％のメタノールに溶解し、最終濃度１０μｇ／ｍＬを炭素鋼サンプルを浸すために使用した。サンプルを穏やかな撹拌で１時間ＲＴにてインキュベートした。サンプルを１００％メタノールで６回洗浄し、風乾させた。
【００８４】
付着力測定  ５０−７０ｎｍのチップの丸みを有する標準ＡｕコートＡＦＭ窒化ケイ素チップとペプチドコーティング面の間の付着力を原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を使用して測定した。ＡＦＭチップとコート面の間の付着力を決定するために、ＡＦＭを「コンタクト」モードで使用した。チップを表面に近付け、接触させ、チップが表面から引き離される時、カンチレバーのデフレクション（ｄｅｆｌｅｃｔｉｏｎ）を測定した。デフレクションの全量（それは付着力を反映する）を、レーザー光線によって検知した。カンチレバーのばね定数が知られている場合、付着力は、ビーム偏向から定量的に決定することができる。この研究では、カンチレバーばね定数は０．０６Ｎ／ｍだった。各実験については、２０と５０の間で、付着力測定は１つのサンプル当たり得られた。
【００８５】
Ｋ１２２−４又はＰＡＯピリン・ペプチドのいずれかでコーティングしたステンレス鋼サンプルを用いた付着研究の結果を図２Ａ及び２Ｂそれぞれ中でプロットする。図２Ａで見られるように、付着力が約４０−７５ｎＮの間で、平均約６０ｎＮで集団となった、コーティングがされないサンプルに比較して、約５−４０ｎＮ（ナノニュートン（ｎａｎｏＮｅｗｔｏｎ））の間の範囲の中で、平均約２０ｎＮで、コーティングされた金属の付着力は、集団となった。同様の結果はＰＡＯピリン・コーティングで得られた。付着力が電子の反射活性、例えばファンデワールス相互作用、であるので、ペプチドをコーティングすることが金属表面エレクトロン層を覆う役目をすることが結論付けられる。
【００８６】
ペプチドをコーティングしたアルミニウム板上の同様の付着測定は、コーティングした及びコーティングしていない、プレート間の接着力の差を実質的に示さなかった。
【００８７】
仕事関数測定  コーティングした及びコーティングしていない、ステンレス鋼サンプルの電子仕事関数（ＥＷＦ）をＳＫＰ３７０  走査型ケルビンプローブ（Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｋｅｌｖｉｎ  Ｐｒｏｂｅ）で従来通りに測定した。方法は振動するキャパシタンスプローブを使用して操作され、掃引バッキングポテンシャル（ｓｗｅｐｔ  ｂａｃｋｉｎｇ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）を通して、仕事関数の差はスキャニングプローブリファレンスチップとサンプル表面の間で測定される。調べられたサンプルは、ＰＡＫでピリン・ペプチドをコーティングしたサンプルも試験された以外は、付着試験の中で使用されるものに似ていた。
【００８８】
研究の結果はコーティングされないサンプル及びＫ１２２−４ピリン・ペプチドコーティングサンプルについて図３Ａの中でプロットされ、コーティングされないサンプル及びＰＡＯ−及びＰＡＫピリン・ペプチドコーティングサンプルについて図３Ｂの中でプロットした。３つのコーティングすべてについては、ピリン・ペプチド・コーティングは少なくとも約０．５ｅＶの差で、最終値約５ｅＶまで、表面のＥＷＦを上げた。
【００８９】
ペプチドコーティングアルミニウム板上の同様のＥＷＦ測定は、実質的にはコーティング及び未コーティングプレート間のＥＷＦの差を示さなかった。
【００９０】
ペプチド・コーティングの安定性  図４は、コーティングの後に２か月の期間にわたって得られたＫ１２２−４ピリンペプチドコーティングサンプル上の測定の結果を示す。未コーティングのスライドに対して、コーティングサンプルのより大きなＥＦＷは、２か月の試験期間にわたって観察され、少なくとも２か月のコーティング安定性を示した。
【００９１】
ナノインデンテーション／硬度Ａ  トリボスコープ（ｔｒｉｂｏｓｃｏｐｅ）（Ｈｙｓｉｔｒｏｎ、ミネアポリス、アメリカ）は、ペプチドコーティングを施したサンプルの機械的性質の変化を検査するために使用された。トリボスコープ（ｔｒｉｂｏｓｃｏｐｅ）はナノメカニカルなプローブ及びＡＦＭの組合せである。プローブ（ダイヤモンドのピラミッド形のビッカース（Ｖｉｃｋｅｒｓ）圧子）は、１００ｎＮの荷重感度及び０．２ｎｍの変位分解能を伴う１５０ｎｍの名目上の半径を有する。ナノインデンテーション、力と変位の曲線は各インデンテーションについて得られ、サンプルの表面へのチップの全深さ変位は、このカーブから得られた。ナノインデンテーションテストは、５０〜８００μＮの荷重を用いて行なわれた。５つの荷重‐変位曲線が各荷重について得られた。
【００９２】
５０〜８００μＮの間の荷重範囲の下で、ペプチドコーティング（暗い）、及びペプチド未コーティング（明るい）ステンレス鋼の荷重‐変位曲線を図５に示す。８００μＮ荷重の全変位はグラフの上に示され、コーティングスライドは範囲４５−５５ｎｍあり、未コーティングスライドは約９０−９５ｎｍの間にある。このテストに基づいて、コーティングスライドは、未コーティングスライドの硬度のほぼ２倍を有する。より一般的に、コーティングはステンレス鋼、スズ、鉄、又はチタニウムの金属表面の硬度を少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約３０％、及び５０％以上まで増加させるのに効果的である。
【００９３】
図６Ａと６Ｂは、コーティング及び未コーティングスライドについて、２０μＮ（６Ａ）及び５０μＮ（６Ｂ）で作られたナノインデンテーション有する変位をプロットする。コーティングが、未コーティングスライドより約２０％−１００％大きい硬度を持っていたことは、図５からのデータと一致している。
【００９４】
ＰＡＯコーティング（７Ａ）及びＫ１２２−４コーティングについて、５０−８００μＮ（７Ａ）及び５０−４００μＮ（７Ｂ）の荷重範囲にわたり、同じタイプの試験を図７Ａ及び７Ｂ中でプロットし、実質的に、同じ結果を伴う。両方の場合では、ピリン・ペプチドコーティングは、金属試料の表面硬度を約２倍にした。
【００９５】
ペプチドコーティングアルミニウム板の同様のナノインデンテーションテストは、コーティング及び未コーティングのプレート間で実質的には表面硬度の変化を示さなかった。
【００９６】
増加したコンダクタンス  コンダクタンスは、材料が電流を導く能力を有することの尺度である。表面コンダクタンスを測定するための１つの標準分析法は、指定された低電圧用の電位のバイアスの下で表面上の指定された位置からＡＦＭチップまで流れる電流を測定するために原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を使用する。ＡＦＭは、それぞれ、未コーティング及びコーティングピリンステンレスプレートについて、図８Ａ及び８Ｂにおいて、異なる濃淡のレベルによって表わされて、特異的な色として表面とチップの間の電流（ｐＡ）を定量的に表示する。一般に、濃色から淡色への色調の変化は大量から小量への電流（２８．０〜２４．５ｐＡ間）の変化を示す。２つの図から、図８Ａ中の未コーティングステンレス鋼サンプルの表面領域が、サンプル表面にわたってかなり変化し得ることが観察され、比較的高い電流を示す濃い色調を有し、一方、図８Ｂ中のピリンコーティングサンプル表面領域は著しく低いコンダクタンスで、実質的にコンダクタンス・プロファイルが均一である。ピリンコーティング材料中で実質的により高い金属仕事関数（表面電子を抽出するために必要な仕事関数の尺度）を示す。この結果は、図３Ａと３ＢからのＥＷＦデータと一致する。
【００９７】
耐食性  材料表面中の腐食に対する耐性又は腐食感受性の調査に利用可能な多くの方法がある。１つの方法は、固定電位で金属板をわたって流れる電流を測定することである。測定された電流は、酸化還元反応に伴い往復する表面電子を反映し、高い電流は腐食の大きなポテンシャルを示す。図９Ａ中のプロットは、Ｋ−１２２−４ピリン・ペプチドでコーティングされ又はコーティングされていないで、上記のように調製された３０４の２Ｂ継目板（２０ゲージ）ステンレス鋼板について測定した電流（Ｉｃｏｒｒ）を示す。結果は、コーティング板について、著しくより低いＩｃｏｒｒを示した。これはより大きな耐食性を示す。
【００９８】
上記の試験で観察されたＩｃｏｒｒの差が、電流が金属表面を横切って最初に流れ始めるポテンシャル（Ｅｃｏｒｒ）と関係があるかどうかが尋ねられるかもしれない。この質問は、金属中の電流が最初に流れ始めるポテンシャル（Ｅｃｏｒｒ）を見ることにより試験された。図９Ｂの中で示される試験の結果は、図９Ａで見られたＩｃｏｒｒ値の差が２つのサンプル間の電位レスポンスの差によらないことを示して、コーティング又は未コーティング金属試料が同様のＥｃｏｒｒ値を持っていることを示す。
【００９９】
Ｋ−１２２−４コーティング及び未コーティングサンプルについてミリ（ｍｉｌｌ）（ミリインチ(ｍｉｌｌｉｉｎｃｈ)）／年（ｙｅａｒ）（ｍｐｙ）で測定された、腐食速度測定を図１０Ａ中でプロットした。結果は図９Ａで見られたＩｃｏｒｒの差と一致している。特に、平均速度が比較される場合、ピリン・ペプチド・コーティングは腐食速度を３倍以上に低減するように見える。
【０１００】
腐食モニタリングで別の広く用いられる方法は、自由腐食電位にて電位電流密度曲線の傾きとして規定される、分極抵抗であり、既知の数学的関係によって腐食電流と関係がありうる抵抗性値Ｒｐをもたらす。図１０Ｂは、コーティング及び未コーティングステンレス鋼値に対するＲｐ値をプロットし、ペプチドコーティングが耐食性の尺度としてのＲｐを著しく増大することを示す。
【０１０１】
興味深いことには、ピリン・ペプチドが強い双極子及び／又は高い電荷密度を有する別のペプチドに結合する場合（この場合、ロイシンジッパー型Ｅコイル、又はそれに結合した同じＥコイル、Ｅコイル／Ｋコイルペア中の反対に帯電したＫコイル）、腐食の防止におけるピリン・ペプチドの影響は逆になり得る。図１１で見られるように、未コーティングステンレス鋼サンプルでの腐食速度は、ピリンＥ又はＥ／Ｋコイル中に結合ピリンを有するサンプルより実質的に低い。
【０１０２】
上記に議論された様々なステンレス鋼サンプルに対する腐食試験法の視覚的な影響は、図１２Ａ−１２Ｃで見られる。この試験では、サンプルはピリン・ペプチド未コーティング（１２Ｂ）又はピリン・ペプチド（１２Ａ）コーティングいずれか又はＥ／Ｋコイルドコイル・ペアに結合したピリン・ペプチドであった。各場合では、サンプルは薄い食塩水中ですでに記載された腐食試験法を行った。未コーティングプレートと比較して、ピリンコーティング板は表面の腐食をほとんど示さず、その一方でピリン結合コーティングは、腐食を著しく増強するようだ。
【０１０３】
手短にいえば、ステンレス鋼、スズ、鉄、又はチタニウムのような金属を、ＩＶ型緑膿菌（Ｔ４Ｐ）ピリンのＣ末端レセプター結合タンパク質に由来したジスルフィド・ループを含む、及び前記ループのＮ又はＣ末端側のどちらか又は両方上の０−１０、好ましくは、０−５の追加の残基を含む、合成ピリン・ペプチドでコーティングすることは、金属表面の硬度及び耐食性両方を増加するのに効果的である。増加した耐食性は、例えば、０．２ＥＦＷユニット以上で金属表面の電子仕事関数を増加、並びに上述のように、Ｉｃｏｒｒ、腐食速度及びＲｐ値など、変化によって証拠づけられ、増加した硬度は、一定の力を有する原子間力顕微鏡のチップで金属表面を押し込んで、つくられた、２０％以上低減されたナノインデンテーションにより証拠づけられる。
【０１０４】
方法の中で意図される他の金属は、周期表の列４−６及び９−１２カラム由来の遷移金属であって、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、ルテニウム、ロジウム、パラジウム、銀、カドミウム、オスミウム、白金、金、及び水銀、及びそれらの混合物及び合金、及びメタロイドのシリコン及びゲルマニウム、及びそれらの酸化物を含む。
【０１０５】
ＩＩＩＢ．処理された金属へピリン・ペプチドの共有結合の追加的証拠
コーティング金属の改変された電子仕事関数及び増強された耐浸蝕性は、ピリン・ペプチドがコーティング表面の電子特性を変化させたことを示し、金属の自由電子軌道を変更させるペプチド及び金属の間の共有結合の形成を示唆する。この発見の追加的サポートは、このサブセクションの中で報告されるペプチド置換アッセイ及びＸ線光電子分光法（ＸＰＳ）研究からもたらされる。
【０１０６】
ペプチド／線毛置換アッセイ  化合物と支持体の間の共有結合の相互作用のひとつの標識は、複合体が溶質の形態にある中、化合物の存在下にてインキュベートされる場合に、化合物が支持体から脱離できないことである。ここで、外来性のピリン・ペプチドがステンレス鋼表面に結合されたピリン・ペプチドを離脱させる能力を試験した。すでに記載したように、厚さ１ｍｍの商用銘柄３０４  ２Ｂ継目板（２０ゲージ）ステンレス鋼板をきれいにした。これらの板は焼き戻しされなかったし磨かれなかった。板を９６ウェルＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ  Ｍｉｎｉｆｏｌｄ  ＴＭ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｍａｎｄｅｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の中へ集めた。ビオチン化ＰＡＫペプチド又はビオチン化精製線毛の１０μｇ／ｍＬを含む５０マイクロリットルの溶液をウェル（５つの複製）に加え、マニホールドを穏やかな撹拌で１時間ＲＴでインキュベートした。ウェルを１ｘＰＢＳで６回洗浄した。ラベル化していないＰＡＫペプチドを、量を増やしながら（０〜１０μｇ／ｍＬ）、複製ウェルに加え、鋼マニホールドを穏やかな撹拌でＲＴにて１時間インキュベートした。その後、ウェルをＰＢＳで６回洗浄した。結合ビオチン化ペプチド又は線毛の置換をストレプトアビジン・ホースラッディシュペルオキシダーゼ（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）（ＨＲＰ）を使用して評価した。Ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（シグマ）を１／５００に希釈し、１００μＬを各ウェルに加え、マニホールドをＲＴで１時間インキュベートした。１５０マイクロリットルのデベロッピング緩衝液（ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）（１ｍＭ２，２’−Ａｚｉｎｏ−ｂｉｓ−（３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）  ｄｉａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓａｌｔ（ＡＢＴＳ）（シグマ）及び０．０３％（ｖ／ｖ）過酸化水素含有０．０１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．２）を各ウェル加えた。マニホールドは穏やかな撹拌で１０分間ＲＴでインキュベートした。反応溶液を９６ウェル平底マイクロタイタープレート（コーニング）に移し、４０５ｎｍの吸光度をＦＬＵＯｓｔａｒ  ＯＰＴＩＭＡプレートレーダー（ＢＭＧ  ＬＡＢＴＥＣＨ）を使用して測定した。
【０１０７】
図１３にプロットされたデータから見られるように、可溶性ピリン・ペプチドの比較的高濃度にさえ、金属表面による結合ピリン・ペプチドの消失は測定できず、結合ピリン・ペプチドが非結合ペプチドと釣り合っていることを実証し、ペプチドと金属表面間の共有結合を示す。金属表面へのペプチドの共有結合の詳細な証拠は、耐食性試験によって下に提供される。
【０１０８】
ＸＰＳ特性  Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）は、材料内に存在する元素の元素組成及び電子状態を測定する量的分光器の方法である。ＸＰＳスペクトルは、Ｘ線ビームで材料を照らし、一方、分析された物質の頂部１から１０ｎｍまでから放出される電子の運動エネルギー及び数を同時に測定することにより得られる。ＸＰＳは極めて高い真空（ＵＨＶ）条件を必要とする。
【０１０９】
Ａｘｉｓ−１６５１スペクトロメーター（Ｋｒａｔｏｓ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）を未コーティングのサンプル及びピリンコーティングされたサンプルから発生した光電子（ｐｈｏｔｏ−ｅｍｉｔｔｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ）を試験するために使用した。２つのサンプルから放出された電子についてのスペクトルを図１４に示す。見てわかるように、ピリンコーティングされたサンプルは、未コーティングのサンプルの中には存在しない、約１００及び１５０ｅＶの結合エネルギーを有する２つのユニークなピークを有する。１つの可能性は、２つのピークが、共役電子結合により、実質的に赤にシフトした、硫黄金属結合を表すということである。金属とＮ又はＯ結合形成の証拠はなく、ピリンと金属間との好ましい共有結合の（共有電子）相互作用は、ピリン・ペプチド中の２つの硫黄原子の１つ又は両方とであることを示唆する。
【０１１０】
ＩＩＩＣ.  粒界効果
粒界は、多結晶体中の２つの粒子（又は晶子）間の境界である。粒界は結晶構造の欠陥で、材料の電気的及び熱伝導性を減少させる傾向がある。ほとんどの粒界中の高い界面エネルギー及び比較的弱い結合形成は、しばしばそれらに腐食の発現及び固形物から新しい相の沈殿のための好ましい部位を作る。
【０１１１】
粒界が腐食のための開始部位として役立つことができるので、金属表面へ結合するピリン・ペプチドが粒界部位で優先的に生じたかどうか判断することは興味深かった。この問題を調べるために、ピリン・ペプチドコーティングＡＦＭチップを用いる、上記に説明した付着力試験を、粒子内の及び粒界での付着力効果を調べるためにさらに改良した。試験における「テスト」及び「コントロール」表面は、ＰＡＯピリン・ペプチド又はＰＡＯアミノ酸のスクランブル配列を有するペプチドでコーティングしたステンレス鋼プレートだった。各サンプルについては、粒子内の及び粒界での付着力を測定した。
【０１１２】
下記の表１の結果からわかるように、ピリン・ペプチドは、粒界の内側でスクランブル配列を有する同じ材料より約２０ｎＮ低い付着力を有し、粒界で約４３ｎＮ低い付着力を有する。結果は、ピリン・ペプチドが粒界で優先的に局在化している、言い換えると、ピリン・ペプチドが、粒界で大きなコーティング厚さを有するか、又はピリン結合の同じレベルは粒界で大きな付着力効果をもたらすかのいずれかを示す。いずれの場合も、データは、ピリン・ペプチドを金属表面に結合することにより見られる耐食効果の大きさについて説明する。
【０１１３】
【表１】
0005979789.tif 000002
【０１１４】
ＩＩＩＤ．ピリンのＤ形態及びＲＩ形態によって結合しているピリンペプチド
金属（ステンレス鋼）サンプルに結合する、ピリンペプチドのＤ形態及びＲＩ形態の能力及びピリンコーティング材料の特性を検討するために、Ｋ１２２−４ピリンペプチドのＤ及びＲＩ形態を合成し、同じピリンペプチドのＬ形態に対して試験した。ステンレス鋼プレートは、Ｌ形態ピリン・ペプチド（３つの異なるバッチ）、Ｄ形態ピリン又はＲＩ形態ピリンでコーティングし、１枚のプレートはコーティングしなかった。
【０１１５】
プレートは、付着力の変化について（図２Ａと２Ｂに関して上記に報告された試験と同様）最初に試験した。図１５Ａでわかるように、付着力の大幅な低減は、未コーティングプレートと比較して、ピリン・ペプチドの３つの形態すべてに見られた。
【０１１６】
図３Ａ−３Ｂに関して上記に記載されたものとして行なわれた同じ６つのサンプル上のＥＷＦ測定を図１５Ｂの中でプロットした。興味深いことには、Ｄ−アミノ酸形態は未コーティングプレートを含む他の５枚のプレートのうちのどれより実質的に低いＥＷＦを与えた。しかし、ＲＩ形態は同程度又はＬ型ピリン・サンプルより高いＥＷＦ値を与えた。
【０１１７】
結果は、金属表面の電子特性を改変する方法において、ピリン・ペプチドのＤ形態及びＲＩ形態の両方がステンレス鋼板と相互作用することができることを示す。
【０１１８】
Ｄ形態ピリンがステンレス鋼にしっかりと結合する能力は、コーティングしていないか、又はビオチン化コントロールペプチド（ピリン配列のスクランブル化又は非結合領域のいずれかの）でコーティングしたもの、又はビオチン化Ｄ形態ピリンペプチドでコーティングしたもののいずれかの、ステンレス鋼ステントに結合するペプチドの比較により調べた。個々のステント表面に結合したペプチドの量を３７ｏＣでＳＤＳの３％の溶液の表面を最初に洗い、引き続き、ＰＢＳで数回洗浄することにより測定した。洗浄表面を、ストレプトアビジンＨＲＰ（西洋わさびペルオキシダーゼ）（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ  （ｈｏｒｓｅ  ｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ））でインキュベートし、次に、ＡＢＴＳ基質にさらし、４０５ｎｍで吸光度を測定した。図１６Ａで見られるように、コントロール・ペプチドのものより、ステンレス鋼ステントに結合したＤ形態ピリン・ペプチドは約２倍だった。
【０１１９】
金属結合したＬ形態ピリン・ペプチドに比べて、金属結合したＤ形ピリン・ペプチドの酵素タンパク質分解に対する耐性を調査するために、ステンレス鋼プレートをＬ型ペプチド、Ｄ形ペプチド及びコントロール（スクランブル化ピリン配列）で、複製して、コーティングした。その後、各複製からの１つのサンプルを、０．２５％、ＥＤＴＡ  １ｍＭ、ｐＨ７．４の濃度で、６０分間３７ｏＣにてトリプシンでインキュベートした。その後、サンプルを上記に記述したＨＲＴアッセイ方法によって結合タンパク質について分析した。
【０１２０】
図１７Ａは、トリプシンへの暴露前後にＬ形態ピリンの結合したペプチド・レベルを示す。図からわかるように、ピリン・ペプチドの半分以上はプロテアーゼ処理によって除かれた。対照的に、結合Ｄ形ピリン・ペプチドの量は、プロテアーゼ消化（図１７Ｂ）に実質的に影響されなかった。結果は、（ｉ）ステンレス鋼へのＬ形態ペプチドの共有結合がプロテアーゼ消化からの保護を与えない、及び（ｉｉ）結合Ｄ形態ピリン・ペプチドは、酵素タンパク質分解から実質的に防御される、ことを実証した。
【０１２１】
ＩＩＩＥ．関連する適用
また、ピリン・ペプチド結合がコーティングした材料の硬度を増加することができる能力は、本発明の別の態様に従って、板ガラス又は自動車安全ガラスのような、他の硬い材料表面に利用することができる。この適用では、掃除されたガラス表面が、ピリンの層で表面をコーティングするのに効果的な条件の下にてピリン・ペプチドで接触される。支持体に結合したタンパク質の量をＨＲＰアッセイを使用して、上記のように測定した。図１６Ｂで見られるように、Ｄ形態ペプチドは、ＳＤＳ処理によってでさえ除去に抵抗して、ガラス表面にしっかりと結合され、コントロール・ペプチドで行ったのより、ステンレス鋼ステントに結合されたピリン・ペプチドは約２倍であった。
【０１２２】
別の適用では、表面処理は機械中の互いとの可動接触子にあるコーティングした金属表面の潤滑性を増強するために使用される。ここで目的機械部品を、共有結合でピリン・コーティングを形成する条件の下で、上記のように、ピリン・ペプチドに部品をさらすことにより、増強された表面潤滑性のために前処理する。あるいは、ピリン・ペプチド溶液を機械操作の間に機械部品のより大きな潤滑性を維持するために、操作又は一時停止の間に機械の接触表面に塗布してよい。
【０１２３】
ＩＶ．コーティングした金属支持体及びバイオセンサー装置
このセクションは、検体に特異的な目標化合物（例えばレセプター）が発明に係るピリン・ペプチドを介して検出表面に付けられている診断装置への本発明の適用を考える。検出表面がピリン・ペプチドに共有結合で結合する金属である場合、下記に記載するように、金属表面と電子的相互作用を通じて、装置は電子バイオセンサー・モードで機能してよい。
【０１２４】
ＩＶＡ．共有結合で結合した化合物を有する金属支持体
（ｉ）上記に詳述するように、支持体へのピリン・ペプチドの共有結合及びピリンへの直接的又は間接的化合物の共有結合、言い換えると、ピリン化合物複合体を介する、という手段で、本発明の本態様は、例えば、レセプターなどの化合物が支持体にて共有結合する金属支持体を含む。未結合ピリンペプチドについて上記に説明のように、コーティングした支持体は、最初に金属表面へ結合していないピリン・ペプチドを付着させること、続いて、結合ピリンへ化合物を共有結合することにより、あるいは最初にピリン化合物複合体を作り、続いて、金属表面へのその複合体を結合することにより、作成される。ピリン・ペプチドに化合物を共有結合で結合する方法は、例えば、アミン又はカルボキシル基を介して直接的な化学結合により、又は二官能基カップリング試薬を使用することによって行うなど、周知である。化合物がそれ自体ペプチドである場合、ピリン化合物複合体は組み換え又は固相合成によって融合タンパク質として形成することができる。コーティングした支持体は、金属表面へのピリン結合による改変された表面電子特性を有し、下記に詳述されるように、本発明を実証するために行なわれた試験は、表面結合化合物に検体関連分子が結合することにより、支持体表面を流れる電流が調整されることを示し、支持体にわたって流れる電流の変化によって、そのような結合態様を記録することを可能にする。以下に見られるように、化合物も、支持体に（例えばＥ／Ｋコイルド‐コイル複合体によって）共有結合で間接的に結合してよい。
【０１２５】
ＩＶＢ．結合ピリン支持体を有するバイオセンサー装置
図１８Ａと１８Ｂは、発明の実施態様に従って構築されたバイオセンサー・アッセイ装置３２を示す。装置は、金属検出プレート３４上にピリン・ペプチド・コーティングで観察された、改変された電子特性の有益性を有する。すなわち、プレート３４は、ステンレス鋼、スズ、鉄、又はチタニウムのような金属から作られ、ピリン・ペプチドによってコーティングされた場合、改変された電子表面性質を有する。上記のように、ピリン・コーティングは、プレート表面を上記のピリン・ペプチド３６及び検体を結合する部分３８の複合体にさらすことにより、又は結合した、非複合体ピリン・ペプチドに化合物を付けることにより形成される。プレートはそれ自体、その側面が装置中の壁４０によって形成され、部分的に水性の導電媒体４２で充填される浅いバイオセンサー反応容器４１の下部表面を形成する。
【０１２６】
反対の回線接続が検出プレートの下部側面へある場合、装置中のバイオセンサー回線は容器、電圧ソース４６及び電流計４８へ伸びる電極４４を含む。
【０１２７】
図１９と２０は、バイオセンサーの２つの表面の構成を示す。図１９では、レセプター（リガンド結合）分子（Ｒ）は、ピリン・ペプチド（かぎ型部分）に共有結合で結合し、次に、バイオセンサー表面に共有結合で結合される。バイオセンサー支持体を横切ったコンダクタンスは、（ｉ）支持体表面とピリン・ペプチドの結合相互作用及び（ｉｉ）コンダクタンス上のレセプターＲの影響によって決定される。リガンドＬ（例えば検体）がレセプターに結合する場合、表面での電子特性はさらに変調され、その結果観察されたバイオセンサー電流の変化を引き起こす。図２１に示された電流の変化は、リガンドがレセプターに結合後、高い電流から低い電流となる。
【０１２８】
図２０では、レセプターＲは、支持体へのピリン／Ｋコイル複合体の共有結合を通じて支持体表面に間接的に結合され、その後、レセプター‐Ｅコイル複合体とのコイルド‐コイル相互作用する。この実施態様の中で、結合している、バイオセンサー表面コーティングの形成は、ピリン・ペプチドとレセプターＲに結合するＫコイル、Ｅコイルの及びレセプターＲに結合することができるリガンドＬである、３−構成要素の複合体である。この実施態様では、表面上のコーティング、マスキングＫ−コイル部位に検体を結合するために、最初に、バイオセンサーを検体と反応させる。この反応をＫ−コイルのマスクキングによって引き起こされた電流の変化として直接に読んでもよく、又は検体反応の後にまだマスキングされていないＫ−コイルの量に応じて、Ｅ−コイルに結合するために、Ｅ−コイル試薬が、この段階で添加されてもよい。
【０１２９】
図２２Ａと２２Ｂは、図２０に示したコイルドコイル構成によってＨｉｓ部分（レセプター）が支持体表面に結合されるバイオセンサー相互作用についてボルタメーター・サイクル・カーブである。図２２Ａは、それ自身及びその後Ｈｉｓの部分の特異的抗‐Ｈｉｓ抗体を添加することにより、ピリン構築物を介してステンレス鋼に共有結合でリンクされたＥ−コイルに複合体化したＫ−コイルに表示されたＨｉｓの部分について完全な環式のボルタメトリーカーブを示す。図２２Ｂは、正電圧バイアスだけでなくマイナス電圧バイアスの下でＨｉｓ部分に結合する抗体によって電流が変化させられることを実証する、左ねじれ部分の環式のボルタメトリーのカーブの増幅を示す。Ｈｉｓレセプターにａｎｔｉ―Ｈｉｓ抗体を結合することは、最低の電流サイクルを生産し、バイオセンサー表面に結合する「検体」を有する電流の低下を証拠づける。Ｈｉｓレセプターがピリン・ペプチドによってバイオセンサー表面に直接に結合された時、同様の結果は得られ、使用された検体はａｎｔｉ―Ｈｉｓ抗体だった。
【０１３０】
センサーの操作を理解するために、下記の表２からのデータであって、（ｉ）コーティングがないステンレス鋼板（修飾されない）（ｉｉ）Ｅ−コイル（負に帯電したロイシンジッパー）ペプチド（Ｅ−ＰＡＫ）に結合したピリン・ペプチドでコーティングしたステンレス鋼板、及び（ｉｉｉ）反対に帯電したＫ−コイルペプチドに結合した同じ複合体でコーティングされた第３のステンレス鋼板、すなわち、そのペプチドは、Ｅ−コイル／Ｋ−コイルヘテロダイマー（Ｋ−Ｅ−ＰＡＫ）に結合する、ステンレス鋼板について、Ｉｃｏｒｒ、Ｅｃｏｒｒ、腐食速度及びＲｐデータを示すデータからの耐食性データを考慮することは有用である。Ｉｃｏｒｒカラムを考慮すると、データは、プレートに結合するＥ−ＰＡＫがそのＩｃｏｒｒ値を著しく増加させることを示し、ＰＡＫピリンで単独で見られた効力と反対である。（図９Ａを参照）。複合体が中和される場合（Ｋ−Ｅ−ＰＡＫ）、Ｉｃｏｒｒ値は、未コーティング金属より実質的に低く、未結合ペプチドで観察された効力に同様である。Ｅｃｏｒｒ、腐食速度及びＲｐ値に対する同様の影響は、データから見られ、すなわち、反対に帯電したＫコイルで結合することによるＥ−コイル影響を中和することが、Ｅ−ＰＡＫピリン結合によりもたらされた表面効果を改変させる。
【０１３１】
【表２】
0005979789.tif 000003
【０１３２】
バイオセンサーの様々な利点は上記の記載から評価することができる。第一に、検体結合レセプターをバイオセンサー表面に共有結合で結合するピリン・ペプチドが、バイオセンサー表面にて直接に電子活性に影響するので、電流の中で、直接効果（例えば低減）をもたらすリガンド結合により、表面の複合体のサイズ及び電荷を改変させる。第２に、電子活性又は分子と直接に相互に作用する金属の表面の電子の能力が、相互作用の程度及び力を決定するので、金属表面と分子の相互作用はプラスチックとの相互作用とは基本的に異なる。酸化被膜を形成しない金属（金のような）は非常に活性のある表面の電子（結晶のエッジ効果による）を持っており、それらの表面への材料を容易に吸収する。これらの材料は、サンプル・マトリックスからのタンパク質及び他の分子の非特異性の吸着に影響を受けやすく、したがって、バイオセンサー・プラットフォームとして有用ではない。ステンレス鋼のような金属は、表面の酸化を受け、不動酸化物層（不動態化された）を形成し、非特異的に結合するイベントを最小化にし、材料をそれらの表面に容易に結合しない（従って医療と食品産業でのそれらの広範囲の使用）４−６。Ｔ４Ｐ１７ペプチドを使用して、特異的なペプチド／タンパク質成分を不動態化されたステンレス鋼に容易に結合させる能力は、バイオセンサー適用のリガンド・レセプター相互作用を検出する際に信号対ノイズ比を改善する際に有効な利点を与える。上述したように、ステンレス鋼に結合するＴ４Ｐ１７は電子伝達を仲介し、電圧バイアスにさらされた時バイオセンサーとして機能することができる。上記に報告した実験は、金属表面に結合したピリン‐レセプター結合物に結合するリガンドに応答してバイオセンサー表面を横切って電子流を変調する能力を実証する。
【０１３３】
ＩＶＥ．結合ピリン支持体を有する一般的なアッセイ装置
図２３Ａと２３Ｂは、プレート１８を有する検体探知装置１６を示し、そのプレートの上部の検出表面がピリン・ペプチド２０及び検体‐特異的ターゲット分子２２の複合体でコーティングされる。プレートはピリン・ペプチドが結合する様々な材料から作られてよいが、プレートは、好ましくは、ピリンがそれに共有結合で結合する、ステンレス鋼、スズ、鉄、及びチタニウム表面のような金属である。共有結合は、生産、タンパク質安定性、コーティング安定性の容易さの点から多くの利点を与える。また、装置は、２５で示されるように検出表面を照らすために、例えばＵＶ源のような、ビーム源２４及び光検出器２６を含む。
【０１３４】
操作では、検出プレートの表面は、可溶性検体分子３０として図１２Ｂの中で示される目的の検体を含む流体サンプルで覆われ、これらは、検出表面上の検体特異的な分子２２と反応することを許される。示された蛍光検出器では、反応混合物は、検出表面に結合した検体と特異的に反応することができる蛍光性の標識抗体又は他の媒体を含んでよい。その後、検出表面は、非結合成分を除去するために洗浄される。ついで、図１２Ｂで示されるように、蛍光２７が放射され、反応表面は結合螢光の存在の有無及び存在するときはその量について分析され、アッセイを完成する。
【０１３５】
便利な螢光アッセイが装置に組み入れられてよいと認識されるだろう。例えば、ピリン・ペプチドは蛍光性部分を含んでよく、検体結合部分は、ピリン蛍光性部分から螢光を消すのに有効な蛍光性の消光物質を含んでよい。この実施態様では、検体を検体結合部分に結合することは、消光物質の効果を覆うのに有効であり、検体結合部分に結合する検体の存在下にて、より大きな螢光を生産する。
【０１３６】
代替的な実施態様においては、ピリン・ペプチド及び検体結合部分は第１と第２の蛍光種をそれぞれ含んでよく、所定の励起波長で励起された時、それは蛍光共鳴エネルギー転移を生産するのに有効である。この構成において、検体結合種への検体の結合はそのようなエネルギー転移を阻害するのに有効であり、観察された螢光を低減させる。
【０１３７】
Ｖ．コーティングした金属表面を有する医療機器
例えば、ステンレス鋼、スズ、鉄、及びチタニウム表面のような、ある金属表面に結合するペプチドついて、上記に記載の試験は、ペプチドと金属の間の共有結合の（電子共有）結合の形成を示して、ピリン・ペプチド結合が金属の表面の電子特性を改変することを実証する。この発見は、ステンレス鋼、スズ、鉄、及びチタニウム表面に、例えばペプチド、脂質、核酸、代謝産物、又は薬物分子のような、生物活性の分子を共有結合で結合するための方法及びピリン・ペプチドを介して、露出した機器の金属に共有結合で結合する生物活性化合物を有する新しい医療機器を提供する。
【０１３８】
方法の中で意図する他の金属は、周期表の列４−６及びカラム９−１２からの遷移金属であって、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、ルテニウム、ロジウム、パラジウム、銀、カドミウム、オスミウム、白金、金、及び水銀、及びそれらの混合物及び合金を含み、メタロイドのシリコン及びゲルマニウム、及びそれらの酸化物を含む。
【０１３９】
この方法では、金属の表面は、ＩＶタイプ緑膿菌（Ｐ．  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（Ｔ４Ｐ）ピリンのＣ末端レセプター結合タンパク質から由来するジスルフィド・ループを含む、及びそのループのＮ又はＣ末端側上のどちらか又は両方の、０−１０、好ましくは、０−５の追加の残基を含む、合成ピリン・ペプチドで接触される。
【０１４０】
共有結合された生物活性分子を含むように、前もってピリン・ペプチドを調製した場合、接触させる工程単独により、金属表面への生物活性分子の共有結合をもたらす。生物活性分子を有するペプチド（この場合ピリン・ペプチド）の複合体を調製する方法は、周知であり、ペプチドとペプチド生物活性分子の間の融合タンパク質を形成すること、及びペプチドへの生物活性分子の共有結合の反応サイトを提供するための具体的に改良した化学反応の使用を含む。例えば、ピリン・ペプチドの固相合成中の最終工程は、例えばアルデヒドのような、反応性基（それは生物活性分子と共有結合の反応に使用することができる）の追加を含んでよい。
【０１４１】
あるいは、金属表面へペプチドをつけた後に、金属表面上の結合ピリンに生物活性分子を共有結合でつなぐために、再度、従来の二価性試薬又は特定の化学基化学反応使用して、ピリン・ペプチドで生物活性分子を反応させてもよい。
【０１４２】
目的のポリペプチドを得る際に使用するポリペプチドための別の適用は、例えば、組み換えのポリペプチド合成によるように、目的のポリペプチドを有する、上記に記載されたタイプのピリン・ペプチドを含む、融合タンパク質を最初に合成することにより実行される。その後、融合タンパク質は、ステンレス鋼、スズ、鉄、チタニウム、クロム、プラスチック、ガラス、ケイ酸塩、セラミックス、又はそれらの混合物から作られた支持体で接触を受けて、それによって、支持体へのピリン・ペプチド部分の結合を介して、支持体へ融合タンパク質が結合する。
【０１４３】
非結合材料を除去するために支持体を洗った後に、支持体は、結合ピリン・ペプチドから目的のポリペプチドを特異的に切断することができる薬剤で処理される。これは融合タンパク質中の規定された配列リンカーを特異的に切断することができるタンパク質分解酵素で支持体を処理すること又は融合タンパク質中の前記リンカーの特異的に切断できる化学薬品又は放射エネルギー源で支持体を処理することを含んでよい。その後、放出された目的のポリペプチドは、実質的に精製された形態で、支持体から溶出される又は洗われる。
【０１４４】
結合方法の別の適用は、所望の表面性質を有するか、又はそれらの表面上の所望の生物活性分子を運ぶ移植可能な装置を調製する際にある。例えば、本発明の骨インプラントはステンレス鋼又はチタニウムの移植構造を含み、その一部は骨の領域内に、又はその領域に対して放置するのに適している。移植へのボンド・アタッチメントを加速するために、この部分は、上述の合成ピリン・ペプチド、及びＲＧＤのような、骨形態形成タンパク質因子、又は骨形態形成タンパク質因子ＢＭＰ２−ＢＭＰ７の複合体でコーティングされる。
【０１４５】
関連する適用では、ピリン・ペプチドは、金属又はポリマーのステントの表面に適用され、例えば、血管内の移植組織部位での望まれない凝固又は瘢痕をもたらしうる表面反応が促進することをより少ない傾向にするような、改善された表面性質を有する、本発明によるステントを生産する。あるいは、コーティングは、例えばピリンと薬の間のエステル・リンカーのような、バイオリリーサブル（ｂｉｏｒｅｌｅａｓａｂｌｅ）リンカーを持つ、ピリン−ｌｉｍｕｓ薬剤複合体のような、ピリン・ペプチド及び生物活性分子の複合体によって形成されてよい。
【０１４６】
下記に見られるように、コーティングした金属表面は、装置に対して、身体におこりうる炎症反応を著しく低減する。
【０１４７】
ＶＩ．低減された炎症反応を備えた医療機器
感染又は細胞の損傷／ストレスによって伝達した炎症に加えて、莫大な量の医原性の炎症は、医療機器類によって引き起こされる。非生物学的適合の医療機器へのヒト組織、細胞、及びタンパク質の露出は、臨床効果が非常に過小評価される、機能障害の宿主レスポンスを引き起こす。実施例は、組織反応、及び血管グラフト、人工関節及び他の移植可能な装置を含む医療用人工装具の挿入に続く機能障害の創傷治癒を含む。同様に、白血球及び凝固系の活性は、心肺バイパスと血液透析のような体外循環血液回路に定期的にさらされる患者に重大な罹患率をもたらす。これらのイベントは、さらに急性及び慢性疾患を持った患者の治癒、再生及びリハビリテーションに影響を与える。
【０１４８】
発明の別の態様によれば、Ｄ−アミノ酸、ＤとＬアミノ酸の混合物、及びレトロインバーソ（ＲＩ）形態でのＤ−アミノ酸で作られたピリン・ペプチドで金属表面をコーティングすることにより、例えばチタニウムのような、医療機器の中で使用されるある金属への炎症反応を調査した。
【０１４９】
ある試験では、人間の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）細胞を標準細胞培養状態の下で単独で、又はＤ形態ピリン・ペプチドでコーティングしていないか又はコーティングしたかいずれかである、チタニウム又は鋼板の存在下においてインキュベートした。３７ｏＣにて、ＲＰＭＩ培地中２４時間のインキュベーション後、培養培地をサイトカインＩＬ−１β（それはＰＢＭＣの中の炎症反応のインジケータである）について分析した。チューブリンをハウスキーピング・コントロールとして分析した。図２５Ａは、５つのサンプルの各々について測定されたＩＬ−１β及びチューブリンのウェスタンブロットを示す。結果からわかるように、Ｄ形態ピリン・ペプチド・コーティングはステンレス鋼及びチタニウムサンプルの両方中の炎症反応を防止するのに効果的だった。この結果は、チタニウム・サンプルについて図２５Ｂの中で示される棒グラフで定量的に見ることができる。
【０１５０】
同様の試験が同じサンプルに対するヒトＴＨＰ−１マクロファージ細胞の炎症反応を試験するために行なわれたが、非結合ピリン・ペプチド配列を表わすコントロール・ペプチド１又は２でコーティングした、ステンレス鋼又はチタニウムから作られた追加サンプルを含んでいた。その後、コーティングした及びコーティングしていないサンプルを７２時間３７℃にてＲＰＭＩ培地中ＴＨＰ−１マクロファージとインキュベートした。その後、培養培地及び細胞の溶解産物をサイトカインＩＬ−１β及びハウスキーピング・タンパク質チューブリンについて分析した。結果を図２６Ａの中の２つのウェスタンブロット中に示す。結果からわかるように、チタニウム単独が、Ｄ形態ピリン・コーティングによって実質的に縮小された強い炎症反応を引き起こした。図２６Ｂの中で与えられたステンレス鋼サンプルについての量的図は、コーティングしていないステンレス鋼への炎症反応はやや小さかったが、それにもかかわらず、結果はＤペプチド・コーティングによって防止されたことを示す。Ｄ形態ピリン・コーティングの影響が、かなり特異的であることは２つのコントロール・ペプチドサンプル（それらは適度に強いレスポンスを示す）から明白である。
【０１５１】
ある態様においては、本発明は、身体に移植された時、炎症反応細胞に露出される表面がある医療機器を含み、ここで、身体中においてこれらの表面は、
（ｉ）ＩＶ型緑膿菌（Ｐ．  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（Ｔ４Ｐ）ピリンのＣ末端レセプター結合タンパク質に由来するジスルフィド・ループ、
（ｉｉ）前記ループのＮ又はＣ末端側上のいずれかの０−１０、好ましくは、０−５の、追加的残基、及び
（ｉｉｉ）Ｄ−アミノ酸、Ｄ、Ｌアミノ酸の混合物、又はレトロインバーソ（ＲＩ）形態でのＤ−アミノ酸から構成されること
を含む合成ピリン・ペプチドでコーティングされていることを特徴とする。
【０１５２】
図２４Ａ−２４Ｄにおける結合試験は、ステンレス鋼（図２４Ａ）、クロム・コバルト・ステント（図２４Ｂ）、ラテックス・カテーテル（図２４Ｃ）及びシリコーン静脈カテーテル（図２４Ｄ）を含む様々な医療機器及び機器表面へのＤ形態ピリン・ペプチドの強い結合を実証する。各ケースでは、サンプルはコーティングがない（図２４の中の白い棒グラフ）、コントロールスクランブルＤ形態ピリン・ペプチドでコーティングした（斜線を施した棒グラフ）、又はＤ形態ピリン・ペプチドでコーティングした、のどちらかだった。その後、サンプルを洗浄し、上記に記述されたＨＲＴアッセイによって結合タンパク質について分析した。すべてのサンプルについては、結合ピリン・ペプチドのレベルが、実質的にコントロールのレベル以上であり、ステンレス鋼を有するサンプルが、最も高い、結合コーティングを生ずるようだった。本発明は、金属及び非金属ステントの両方、さまざまな弾力性のある材料から作ったカテーテル、カテーテルの末端の支持装置、及び心臓及び他の血管のバルブを含む、対象となる身体に移植されるか一時的に移植される他の医療機器を含み、前記機器が、身体中の炎症反応にさらされる表面を含み、Ｄ形態又はＲＩ形態ピリン・ペプチドでコーティングされていることを特徴とする。
【０１５３】
関連する態様においては、本発明は、医療機器を移植する前に、
（ｉ）ＩＶ型緑膿菌（Ｔ４Ｐ）ピリンのＣ末端レセプター結合タンパク質に由来するジスルフィド・ループ、
（ｉｉ）ループのＮあるいはＣ末端側のどちらか又は両方上の０−１０、好ましくは、０−５の追加の残基、及び
（ｉｉｉ）Ｄ−アミノ酸、ＤとＬアミノ酸の混合物、又はレトロインバーソ（ＲＩ）形態でのＤ−アミノ酸の構成
を有する合成ピリン・ペプチドで機器の露出表面をコーティングすることにより、対象内に移植された医療機器に対する炎症反応を防止する方法も含む。
【０１５４】
本発明は特定の実施態様及び適用に関して記述されたが、様々な修飾が特許請求の範囲を逸脱せずに作ることができることが理解されるだろう。
【０１５５】
0005979789.tif 000004
0005979789.tif 000005
【図１】
0005979789.tif 000006
【図２】
0005979789.tif 000007
【図３】
0005979789.tif 000008
【図４】
0005979789.tif 000009
【図５】
0005979789.tif 000010
【図６】
0005979789.tif 000011
【図７】
0005979789.tif 000012
【図８】
0005979789.tif 000013
【図９】
0005979789.tif 000014
【図１０】
0005979789.tif 000015
【図１１】
0005979789.tif 000016
【図１２】
0005979789.tif 000017
【図１３】
0005979789.tif 000018
【図１４】
0005979789.tif 000019
【図１５】
0005979789.tif 000020
【図１６】
0005979789.tif 000021
【図１７】
0005979789.tif 000022
【図１８Ａ】
0005979789.tif 000023
【図１８Ｂ】
0005979789.tif 000024
【図１９】
0005979789.tif 000025
【図２０】
0005979789.tif 000026
【図２１】
0005979789.tif 000027
【図２２】
0005979789.tif 000028
【図２３Ａ】
0005979789.tif 000029
【図２３Ｂ】
0005979789.tif 000030
【図２４】
0005979789.tif 000031
【図２５】
0005979789.tif 000032
【図２６】
0005979789.tif 000033
【配列表】
0005979789000001.xml