(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
放射線に被曝した対象または放射線被毒を伴う対象における放射線暴露または放射線被毒の予防処置または治療処置において使用するための、架橋してマイクロ粒子になったムラミルジペプチド（ＭＤＰマイクロ粒子）を含む組成物であって、
当該ＭＤＰマイクロ粒子は細菌から単離されたものである、前記組成物。
【請求項２】
放射線に被曝した対象または放射線被毒を伴う対象における骨髄回復の促進において使用するための、架橋してマイクロ粒子になったムラミルジペプチド（ＭＤＰマイクロ粒子）を含む組成物であって、
当該ＭＤＰマイクロ粒子は細菌から単離されたものである、前記組成物。
【請求項３】
放射線に被曝した対象または放射線被毒を伴う対象における脊髄回復の促進において使用するための、架橋してマイクロ粒子になったムラミルジペプチド（ＭＤＰマイクロ粒子）を含む組成物であって、
当該ＭＤＰマイクロ粒子は細菌から単離されたものである、前記組成物。
【請求項４】
放射線に被曝した対象または放射線被毒を伴う対象におけるサイトカインの放出の刺激において使用するための、架橋してマイクロ粒子になったムラミルジペプチド（ＭＤＰマイクロ粒子）を含む組成物であって、
当該ＭＤＰマイクロ粒子は細菌から単離されたものである、前記組成物。
【請求項５】
放射線に被曝した対象または放射線被毒を伴う対象における血小板増加の誘導において使用するための、架橋してマイクロ粒子になったムラミルジペプチド（ＭＤＰマイクロ粒子）を含む組成物であって、
当該ＭＤＰマイクロ粒子は細菌から単離されたものである、前記組成物。
【請求項６】
放射線が電離性放射線であり、あるいは放射線被毒が電離性放射線により起きるものである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
放射線が、宇宙線、紫外線、アルファ線、ベータ線、陽子ビーム、重粒子ビーム、Ｘ線、ガンマ線、電子ビーム、および中性子ビームから選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
ＭＤＰマイクロ粒子を含む組成物を、静脈内、経口、筋肉内、鼻腔内、直接に肺の気道または鼻粘膜への噴霧吸入または乾燥粉末投与により投与する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
ＭＤＰマイクロ粒子を、１μｇから２０ｍｇ／Ｋｇ体重の用量で投与する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
ＭＤＰマイクロ粒子を、１μｇ〜１５０μｇ／Ｋｇ体重、もしくは１μｇ〜１５μｇ／Ｋｇ体重の投与量範囲から；または１、５、１０もしくは１５ｍｇ／Ｋｇ体重から選択される用量で投与する、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
ＭＤＰマイクロ粒子を含む組成物に、医薬的に許容できるキャリヤーを配合する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
放射線被曝が放射線療法により起きる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
ＭＤＰマイクロ粒子を含む組成物を、放射線療法の最高７日前に投与する、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
ＭＤＰマイクロ粒子を含む組成物を、放射線療法の少なくとも２４時間前に投与する、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
ＭＤＰマイクロ粒子を含む組成物を、放射線療法の少なくとも３０分前に投与する、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１６】
ＭＤＰマイクロ粒子を含む組成物を、放射線療法開始前のいずれかの時点、放射線療法開始の時点、または放射線療法中に投与する、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１７】
ＭＤＰマイクロ粒子を含む組成物を、放射線療法のコースが終了した患者に投与する、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１８】
ＭＤＰマイクロ粒子を含む組成物を、放射線被曝の直後に投与する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
ＭＤＰマイクロ粒子を含む組成物を、放射線源被曝の後、１分〜２時間までに投与する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
ＭＤＰマイクロ粒子を含む組成物を、放射線被曝の少なくとも５分以内に投与する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
ＭＤＰマイクロ粒子を含む組成物を、放射線被曝の後、少なくとも２４時間以内に投与する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
放射線被曝または放射線被毒が、吸入、経口摂取による放射能被曝、または外部直接被曝により起きる、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
ＭＤＰマイクロ粒子を、マイクロ粒子と結合または会合した、免疫調節サイトカインを刺激することができる少なくとも１種類の免疫刺激リガンドと組み合わせる、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
リガンドが、ＴＬＲ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、ＮＯＤ−１またはＮＯＤ−２を含む病原性分子パターン認識受容体から選択される、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
少なくとも１種類の免疫刺激リガンドが、ＭＤＰマイクロ粒子の表面と架橋しているか、または会合している、請求項２３または２４に記載の組成物。
【請求項２６】
ＭＤＰマイクロ粒子が、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の産生を刺激する、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２７】
ＭＤＰマイクロ粒子が、ＧＭ−ＣＳＦおよびインターロイキン−３（ＩＬ−３）の両方の産生を刺激する、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２８】
ＭＤＰマイクロ粒子が、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）および腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）の産生をも刺激する、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２９】
ＭＤＰマイクロ粒子が、白血球および血小板の産生を増大させることにより造血再構成をも刺激する、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３０】
ＭＤＰマイクロ粒子が、赤血球の産生を増大させることにより赤血球産生をも刺激する、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３１】
ＭＤＰマイクロ粒子を含む組成物を、放射線被曝または放射線被毒の処置のための１種類以上の他の薬剤と組み合わせて使用する、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３２】
放射線被曝または放射線被毒の処置のための１種類以上の他の薬剤が、不溶性プルシアンブルー、Ｃａ−ＤＴＰＡ、Ｚｎ−ＤＴＰＡ、フィルグラスチム、骨髄移植、輸血、またはホルモンおよびサイトカインから選択される、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
サイトカインが、ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、またはＴＮＦαから選択される、請求項２３〜３２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３４】
ＭＤＰマイクロ粒子を含む組成物を、放射線被曝または放射線被毒の処置のための１種類以上の他の薬剤と組み合わせる共療法として使用する、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３５】
放射線被曝または放射線被毒の処置のための１種類以上の他の薬剤を、補助療法としてＭＤＰマイクロ粒子を含む組成物と共に使用できる、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
療法が、他の薬剤およびＭＤＰマイクロ粒子を含む組成物を同時または逐次投与することを含む、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
逐次投与において、数分、数時間、数日または数週間のいずれか適切な時間枠で間隔をおくことができる、請求項３６に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に免疫刺激剤、特に放射線被曝、放射線被毒の処置、および放射線の毒作用の緩和における、架橋ムラミルジペプチドマイクロ粒子の形の免疫刺激剤の使用に関する。
【０００２】
本発明は、主に放射線被曝の処置法として使用するために開発され、以下においてはこの用途に関して記載する。しかし、本発明がこの特定の分野での使用に限定されないことは明らかであろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
発明の背景
本明細書全体において、先行技術の考察はいずれも、そのような先行技術が広く知られていることまたはこの分野に共通の一般的知識の一部を形成することを認めるものとは決してみなすべきでない。
【０００４】
放射線被曝は、ある場合には放射線被毒をもたらす；これは、電離性放射線源への被曝の増大による、生体組織に対する損傷の１形態である。放射線被毒は一般に短期間における多量の放射線により生じる急性問題を表わすために用いられるが、これは低レベル放射線への長期被曝で起きる可能性がある。放射線被毒の多くの症状は、電離性放射線が細胞分裂に干渉することによるものである。
【０００５】
電離性放射線は高エネルギーの粒子または波動を含み、これは原子または分子から少なくとも１つの電子を離脱させ、これによりそれを電離させることができる。電離能は個々の粒子または波動のエネルギーの関数であって、それらの個数の関数ではない。個々の粒子または波動のエネルギーが不十分であれば、大部分の一般的状況では多数の粒子または波動が電離を引き起こすことはない。
【０００６】
電離性放射線の例は、エネルギーに富むベータ粒子、中性子、およびアルファ粒子である。Ｘ線およびガンマ線はほぼすべての分子または原子を電離させるであろう；遠紫外線は多くの分子または原子を電離させるであろう；近紫外線および可視光線はごく少数の分子に対して電離性である；マイクロ波および電波は非電離性形態の放射線である。
【０００７】
放射線被曝の症状は変動する場合があるが、吐き気および嘔吐；下痢；皮膚熱傷（放射線皮膚炎）；衰弱；疲労；食欲不振；失神；脱水症；組織の炎症（腫脹、紅潮または圧痛）；その鼻、口、歯肉または直腸からの出血；低い赤血球数（貧血）および脱毛を呈する可能性がある。放射線被曝の徴候および症状は、どの程度の量の放射線を受けたか、およびどの組織が被曝したかに依存する。放射線源の照射は癌の治療にも利用される。そのような照射が一時的な慢性放射線被毒の原因となる可能性もある。
【０００８】
現在のところ、放射線被曝の影響を反転させることはできない。結果的に生じる免疫系欠損による二次感染に対抗するための抗生物質と共に、被曝の症状に対抗するために麻酔薬および制吐薬が投与される。貧血が発症すれば輸血も必要な場合がある。
【０００９】
米国食品医薬品庁（ＦＤＡ）が産業事故またはダーティー・ボム（ｄｉｒｔｙ  ｂｏｍｂ）による放射線汚染の処置のために承認した薬物には、ラジオガルダーゼ（Ｒａｄｉｏｇａｒｄａｓｅ）、ペンテテートトリナトリウムカルシウム（ｐｅｎｔｅｔａｔｅ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ）（Ｃａ−ＤＴＰＡ）およびペンテテートトリナトリウム亜鉛（ｐｅｎｔｅｔａｔｅ  ｚｉｎｃ  ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ）（Ｚｎ−ＤＴＰＡ）が含まれる。不溶性プルシアンブルー（Ｐｒｕｓｓｉａｎ  Ｂｌｕｅ）としても知られるラジオガルダーゼは、有害な量のセシウム−１３７またはタリウムを含有する放射線に被曝した人々を処置するために使用できる。Ｃａ−ＤＴＰＡおよびＺｎ−ＤＴＰＡは、放射性形態のプルトニウム、アメリシウムおよびキュリウムによる汚染に対して使用できる。３種類の薬物はすべて、放射性物質を人体から除去する作用をもつ。
【００１０】
高い放射線量に被曝した場合に有用な可能性のある他の薬物はフィルグラスチム（ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ）（ノイポジェン（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ））、すなわち化学療法または放射線療法を受けた人々に現在用いられている薬物である。この薬物は、白血球の増殖を刺激し、骨髄損傷の修復を補助することができる。
【００１１】
本発明の目的は、先行技術の欠点の少なくとも一部を克服または改善し、あるいは有用な代替品を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、一部は、架橋してマイクロ粒子になったムラミルジペプチド（ｍｕｒａｍｙｌ  ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ）（ＭＤＰマイクロ粒子）が、放射線、特に電離性放射線に被曝した後の造血損傷もしくは骨髄損傷の予防または骨髄回復の促進において臨床的に有用であることが知られている免疫調節サイトカインのデノボ合成を誘導しうるという意外な所見に基づく。さらに、ＭＤＰマイクロ粒子は、免疫調節サイトカインのデノボ合成を増強しうる１種類以上のリガンドで官能化することができ、こうして電離性放射線その他の放射線などの被曝による損傷の予防または修復が増強される。
【００１３】
したがって、第１観点によれば、本発明は、電離性放射線被曝または放射線被毒を予防処置または治療処置する方法であって、その処置を必要とする対象に、有効量のＭＤＰマイクロ粒子、またはＭＤＰマイクロ粒子を含む組成物を投与することを含む方法を提供する。
【００１４】
したがって、第２観点において本発明は、放射線に被曝した対象または放射線被毒を伴う対象において骨髄回復を促進する方法であって、その処置を必要とする対象に、有効量のＭＤＰマイクロ粒子、またはＭＤＰマイクロ粒子を含む組成物を投与することを含む方法を提供する。
【００１５】
したがって、第３観点において本発明は、放射線に被曝した対象または放射線被毒を伴う対象において脊髄回復を促進する方法であって、その処置を必要とする対象に、有効量のＭＤＰマイクロ粒子、またはＭＤＰマイクロ粒子を含む組成物を投与することを含む方法を提供する。
【００１６】
第４観点によれば、本発明は、放射線に被曝した対象または放射線被毒を伴う対象においてサイトカインの放出を刺激する方法であって、その処置を必要とする対象に、有効量のＭＤＰマイクロ粒子、またはＭＤＰマイクロ粒子を含む組成物を投与することを含む方法を提供する。
【００１７】
したがって、第５観点において本発明は、放射線に被曝した対象または放射線被毒を伴う対象において血小板増加を誘導する方法であって、その処置を必要とする対象に、有効量のＭＤＰマイクロ粒子、またはＭＤＰマイクロ粒子を含む組成物を投与することを含む方法を提供する。
【００１８】
ＭＤＰマイクロ粒子を、マイクロ粒子と結合または会合した、電離性放射線被曝後の造血損傷を予防するかまたは骨髄回復を促進することが知られている免疫調節サイトカインのデノボ合成を刺激することができる少なくとも１種類の免疫刺激リガンドと組み合わせることができる。適切なリガンドは、ＴＬＲ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、ＮＯＤ−１、ＮＯＤ−２などを含めた前記の病原性分子パターン認識受容体の既知のリガンドから選択できる。他の有用な受容体は当技術分野で周知であり、当業者が容易に同定できる。
【００１９】
好ましくは、少なくとも１種類の免疫刺激リガンドがＭＤＰマイクロ粒子の表面に架橋している。
【００２０】
好ましくは、ＭＤＰマイクロ粒子は顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の産生を刺激する。最も好ましくは、ＭＤＰマイクロ粒子はＧＭ−ＣＳＦおよびインターロイキン−３（ＩＬ−３）両方の産生を刺激する。
【００２１】
ＭＤＰマイクロ粒子がインターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）および腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）の産生をも刺激することが利点である。
【００２２】
有利には、ＭＤＰマイクロ粒子、またはＭＤＰマイクロ粒子を含む組成物を用いて、癌療法などに用いられる放射線療法に伴う放射線毒性を予防および／または改善することができる。この場合、ＭＤＰマイクロ粒子またはその組成物を、放射線療法の最高７日前に投与することができる。より好ましくは、ＭＤＰマイクロ粒子またはその組成物を、放射線療法の少なくとも２４時間前に投与することができる。より好ましくは、ＭＤＰマイクロ粒子またはその組成物を、放射線療法の少なくとも３０分前に投与することができる。もちろん、ＭＤＰマイクロ粒子またはその組成物を状況の要求に応じて放射線療法開始前または放射線療法中のいずれかの時点で投与できることは、当業者には認識されるであろう。ＭＤＰマイクロ粒子または組成物を放射線療法のコースが終了した患者に投与できることも考慮される。
【００２３】
予想外の放射線被曝を処置するためには、好ましくは放射線源に被曝した直後にＭＤＰマイクロ粒子を投与する。より好ましくは、被曝の少なくとも５分以内にＭＤＰマイクロ粒子を投与することができる。最も好ましくは、放射線源に被曝した後、約１分から約２時間までにＭＤＰマイクロ粒子を投与することができる。
【００２４】
あるいは、放射線被曝の後、約２４時間以内にＭＤＰマイクロ粒子を投与する。
【００２５】
放射線被毒は、吸入、経口摂取による放射能被曝、または外部直接被曝により起きる可能性がある。
【００２６】
放射線被毒は、電離性放射線源の被曝により起きる可能性がある。電離性放射線源は、例えばアルファ粒子、ベータ粒子、中性子、Ｘ線またはガンマ線の可能性がある。
【００２７】
放射線被曝が職業上のものである可能性があるが、例えば放射線療法などの療法処置の結果である可能性もある。
【００２８】
有利には、ＭＤＰマイクロ粒子を放射線被曝または放射線被毒の処置のための１種類以上の他の薬剤と組み合わせて使用することができる。放射線被曝または放射線被毒の処置のための１種類以上の他の薬剤は、不溶性プルシアンブルー、Ｃａ−ＤＴＰＡ、Ｚｎ−ＤＴＰＡ、フィルグラスチム、またはホルモンおよびサイトカイン、例えばＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦαから選択することができる。本発明の処置を、骨髄移植または輸血などの方法と組み合わせることもできる。
【００２９】
好ましくは、ＭＤＰマイクロ粒子を放射線被曝または放射線被毒の処置のための１種類以上の他の薬剤と組み合わせる共療法（ｃｏ−ｔｈｅｒａｐｙ）として使用することができる。あるいは、放射線被曝または放射線被毒の処置のための１種類以上の他の薬剤を、補助療法（ａｄｊｕｎｃｔｉｖｅ  ｔｈｅｒａｐｙ）としてＭＤＰマイクロ粒子と共に使用できる。そのような療法は、該薬剤およびＭＤＰマイクロ粒子の同時または逐次投与を含むことができる。逐次投与は、数分、数時間、数日または数週間のいずれか適切な時間枠で間隔をおくことができる。放射線被曝または放射線被毒に対する処置の上記リストは完全ではなく、他の薬剤を共療法または補助療法としてＭＤＰマイクロ粒子と共に使用できることは認識されるであろう。
【００３０】
さらに、ＭＤＰマイクロ粒子に医薬的に許容できるキャリヤーを配合できることは認識されるであろう。適切なキャリヤーおよび配合物は当業者に既知であり、あるいは例えばRemington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Ed, 1995 (Mack Publishing Co. Pennsylvania, USA), British Pharmacopoeia, 2000などから得ることができる。
【００３１】
本発明がどのように作動するかについていずれか特定の理論により拘束されたくはないが、ＭＤＰマイクロ粒子が放射線被曝または放射線被毒を処置する能力は、細網内皮系内の細胞を明らかに刺激して、骨髄回復および脊髄回復を促進することが知られているサイトカイン、例えばＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−６およびＴＮＦαを分泌させることから生じると考えられる。好ましくは、サイトカインはＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦまたはＴＮＦαから選択される。
【００３２】
ＭＤＰマイクロ粒子を静脈内投与することができる。あるいは、ＭＤＰマイクロ粒子を他の経路で、例えば経口、筋肉内、鼻腔内、直接に肺の気道または鼻粘膜への噴霧吸入または乾燥粉末投与により投与することができる。ＭＤＰマイクロ粒子を、約１μｇから約１５０μｇ／Ｋｇ体重まで、好ましくは約１μｇから約１５μｇ／Ｋｇ体重までの用量で、放射線被曝または放射線被毒の影響を阻止または改善する予防介入および治療介入のために投与することができる。もちろん、この範囲内のいかなる投与量も有用であろう。必要に応じて、より高い範囲の投与量も採用でき、例えば約１μｇから約２０ｍｇ／Ｋｇ体重までの範囲において選択される用量、またはこの範囲のいずれか適切な用量を適切に採用できる。もちろん、投与経路および用量が、治療用と予防用、ならびに受ける放射線量、患者の状態、および測定可能な他の検査室パラメーター、例えば血球数などに応じて著しく変動することは、当業者には認識されるであろう。
【００３３】
対象に影響を及ぼす放射線は電離性放射線である可能性があるが、宇宙または太陽の放射線である可能性もある。より詳細には、放射線は電波、電磁波、赤外線、可視光線、紫外線、例えば紫外線−Ａ、紫外線−Ｂまたは紫外線−Ｃ、アルファ線、ベータ線、陽子ビーム、重粒子ビーム、Ｘ線、ガンマ線、電子ビーム、中性子ビームなどである可能性がある。放射線被曝は、放射線療法、例えば癌の治療に使用されるものにより起きる可能性もある。
【００３４】
予防用途において、ＭＤＰマイクロ粒子は、細網内皮系ならびに他の免疫系および内分泌系の細胞を刺激して、対象を致死量の放射線から防護することができるサイトカインを分泌させることができる。あるいは、ＭＤＰマイクロ粒子は放射線療法を用いる癌の治療中に放射線療法防護剤として使用できる。
【００３５】
好ましくは、サイトカインはＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−６およびＴＮＦαから選択される。
【００３６】
第６観点によれば、本発明は、放射線に被曝した対象または放射線被毒を伴う対象における放射線被曝または放射線被毒の予防処置または治療処置のための、ＭＤＰマイクロ粒子、またはＭＤＰマイクロ粒子を含む組成物を提供する。
【００３７】
第７観点によれば、本発明は、放射線に被曝した対象または放射線被毒を伴う対象において骨髄回復を促進するための、ＭＤＰマイクロ粒子、またはＭＤＰマイクロ粒子を含む組成物を提供する。
【００３８】
第８観点によれば、本発明は、放射線に被曝した対象または放射線被毒を伴う対象において脊髄回復を促進するための、ＭＤＰマイクロ粒子、またはＭＤＰマイクロ粒子を含む組成物を提供する。
【００３９】
第９観点によれば、本発明は、放射線に被曝した対象または放射線被毒を伴う対象においてサイトカインの放出を刺激するための、ＭＤＰマイクロ粒子、またはＭＤＰマイクロ粒子を含む組成物を提供する。
【００４０】
第１０観点によれば、本発明は、放射線に被曝した対象または放射線被毒を伴う対象において血小板増加を誘導するための、ＭＤＰマイクロ粒子、またはＭＤＰマイクロ粒子を含む組成物を提供する。
【００４１】
本発明に関して、用語“ＭＩＳ”、“ＭＩＳ（４１６）”および“ＭＤＰマイクロ粒子”は、互換性をもって使用できる。
【００４２】
本発明に関して、用語“治療”は既存の状態の治癒処置を意味するものとし、用語“予防”は疾患または状態が発現するのを防止もしくは阻止し、または少なくとも完全には発現させないことを意味するものとする。
【００４３】
“骨髄回復（ｂｏｎｅ  ｍａｌｌｏｗ  ｒｅｓｔｒａｔｉｏｎ）”は、全般的に骨髄の正常な機能の回復、例えば赤色骨髄（主に骨髄組織からなる）および黄色骨髄（主に脂肪細胞からなる）、すなわち骨の空洞を充填し、新たな血球を産生する組織の回復を表わす。“脊髄回復（ｍｙｅｒｏｒｅｓｔｒａｔｉｏｎ）”は、血球を産生する髄質内組織の回復を表わす。“血小板増加（ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｓｉｓ）”は、血小板産生の増強および／または血中の血小板数の増加を表わす。“造血再構成（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）”は、造血幹細胞に由来する細胞性の血球成分の再構成を表わす。造血幹細胞は骨髄（ｍｅｄｕｌｌａ（ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ））中に存在し、種々の成熟血球タイプを生成する特異な能力をもつ。“赤血球産生（Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ）”は、赤血球（ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ））を産生するプロセスを表わす。成人において、これは通常は骨髄内で行なわれる。本発明に関して、放射線被曝または放射線被毒の処置に際してのＭＤＰマイクロ粒子の投与は、以上に述べたプロセスを保存、促進、刺激または誘導するためのものである。
【００４４】
状況からそうでないことが明らかに要求されない限り、本明細書および特許請求の範囲の全体において、“含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）”などは、限定的または網羅的な意味とは異なり、包括的な意味に解釈すべきである；すなわち、“含むけれどもそれらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ，ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）”ことをいう。
【００４５】
図面の簡単な説明
本発明の好ましい態様を、例示のみを目的とする添付の図面を参照して以下に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１は、ヒト全血をＭＤＰマイクロ粒子で刺激した後のＧＭ−ＣＳＦのインビトロ産生を示すグラフである。
【図２】図２は、ヒトＰＢＭＣをＭＤＰマイクロ粒子で刺激した後のＧＭ−ＣＳＦのインビトロ産生を示すグラフである。
【図３】図３は、種々の用量のＭＤＰマイクロ粒子（ＭＩＳ）で処理したウサギにおける血小板数を示すグラフである。血小板の正常範囲は２００〜６５０ｘ１０９／Ｌである。
【図４】図４は、５ｍｇのＭＤＰマイクロ粒子を静脈内送達した後、Ｔ＝０、２４および４８時間目に測定した、ヒト末梢血血清ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３造血サイトカインレベルを示すグラフである。
【図５】図５は、４５０μｇのＭＤＰマイクロ粒子を静脈内送達した後、Ｔ＝０、５および２４時間目に測定した、ヒト末梢血血清ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３造血サイトカインレベルを示すグラフである。
【図６】図６は、ヒトＰＢＭＣをＭＤＰマイクロ粒子で刺激した後のＩＬ−１ベータ、ＩＬ−６およびＴＮＦ−アルファのインビトロ産生を示すグラフである。
【図７】図７は、対照マウスおよび非致死量の７．２Ｇｙの放射線を照射した後にＭＤＰマイクロ粒子で処理したマウスにおける体重減少を示すグラフである。
【図８】図８は、対照マウスおよび非致死量の７．２Ｇｙの放射線を照射した後にＭＤＰマイクロ粒子で処理したマウスの生存率を示すグラフである。
【図９】図９は、対照マウスおよび致死量の９Ｇｙの放射線を照射した後にＭＤＰマイクロ粒子で処理したマウスにおける体重減少を示すグラフである。
【図１０】図１０は、対照マウスおよび致死量の９Ｇｙの放射線を照射した後にＭＤＰマイクロ粒子で処理したマウスの生存率を示すグラフである。
【図１１】図１１は、対照マウスならびに致死量の９Ｇｙの放射線を照射する前および後にＭＤＰマイクロ粒子で処理したマウスの生存率を示すグラフである。
【図１２】図１２は、対照マウスならびにＬＤ７０／３０用量（７．９６Ｇｙ）のガンマ線を全身照射する前および後にＭＤＰマイクロ粒子（ＭＩＳ）で処理したマウスの生存率を示すグラフである。
【図１３−１】図１３は、対照マウスならびにＬＤ７０／３０用量（７．９６Ｇｙ）のガンマ線を全身照射する前および後にＭＤＰマイクロ粒子（ＭＩＳ）で処理したマウスの白血球、好中球および血小板の免疫再構成を示すグラフである。
【図１３−２】図１３は、対照マウスならびにＬＤ７０／３０用量（７．９６Ｇｙ）のガンマ線を全身照射する前および後にＭＤＰマイクロ粒子（ＭＩＳ）で処理したマウスの白血球、好中球および血小板の免疫再構成を示すグラフである。
【図１３−３】図１３は、対照マウスならびにＬＤ７０／３０用量（７．９６Ｇｙ）のガンマ線を全身照射する前および後にＭＤＰマイクロ粒子（ＭＩＳ）で処理したマウスの白血球、好中球および血小板の免疫再構成を示すグラフである。
【図１４】図１４は、対照マウスならびにＬＤ７０／３０用量（７．９６Ｇｙ）のガンマ線を全身照射する前および後にＭＤＰマイクロ粒子（ＭＩＳ）で処理したマウスの赤血球再構成を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
先に本発明者は、ＨＩＶおよび炭疽病の処置のためのムラミルジペプチドマイクロ粒子の形の免疫刺激剤を開示した；それぞれオーストラリア特許Ｎｏ．７３２８０９および国際特許出願Ｎｏ．ＰＣＴ／ＮＺ２００８／０００１３１。しかし、本発明者は、ムラミルジペプチドマイクロ粒子が有毒レベルの放射線の被曝の処置において、放射線被曝の前に投与した場合および後に投与した場合のいずれにおいても有用であることを意外かつ予想外に見出した。
【００４８】
本発明は、一部は、架橋してマイクロ粒子になったムラミルジペプチド（ＭＤＰマイクロ粒子）が、電離性放射線に被曝した後の造血損傷の予防または骨髄回復の促進において臨床的有用性をもつことが知られている免疫調節サイトカインのデノボ合成を誘導しうるという意外な所見に基づく。さらに、ＭＤＰマイクロ粒子は、免疫調節サイトカインのデノボ合成を増強しうる１種類以上のリガンドで官能化することができ、こうして電離性放射線の被曝による損傷の予防または修復を増強する。
【００４９】
本発明は、放射線、特に電離性放射線の被曝または放射線被毒を予防処置または治療処置する方法であって、その処置を必要とする対象に、有効量のＭＤＰマイクロ粒子、またはＭＤＰマイクロ粒子を含む組成物を投与することを含む方法を提供する。
【００５０】
放射線、例えば電離性放射線の被曝による損傷の予防または修復を増強するために、ＭＤＰマイクロ粒子を、マイクロ粒子と結合した、またはマイクロ粒子内にある、電離性放射線被曝後の造血損傷を予防するかまたは骨髄回復を促進することが知られている免疫調節サイトカインのデノボ合成を刺激することができる少なくとも１種類の免疫刺激リガンドと組み合わせることができる。適切なリガンドは、ＴＬＲ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、ＮＯＤ−１、ＮＯＤ−２などを含めた前記の病原性分子パターン認識受容体の既知のリガンドから選択できる。他の有用な受容体は当技術分野で周知であり、当業者が容易に同定できる。他の有用な免疫刺激リガンドは当技術分野で周知であり、当業者が容易に同定できる；例えばヒートショックタンパク質および糖脂質抗原。
【００５１】
免疫刺激リガンド（単数または複数）を使用する場合、それはＭＤＰマイクロ粒子の表面に架橋するかまたは会合していてもよいが、それらをＭＤＰマイクロ粒子と共投与してもよいことは理解されるであろう。
【００５２】
以下において理論またはいずれか特定の作用機序により拘束されたくはないが、ＭＤＰマイクロ粒子およびその組成物は、特に顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の産生、またはＧＭ−ＣＳＦおよびインターロイキン−３（ＩＬ−３）両方の産生を刺激する。ＩＬ−３は造血サイトカインとしてＧＭ−ＣＳＦと協同作用することが知られているので、これは有利である。有利には、ＭＤＰマイクロ粒子はインターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）および腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）の産生をも刺激することができる。
【００５３】
ＭＤＰマイクロ粒子は、白血球および血小板の産生を増大させることにより造血再構成をも刺激し、あるいは赤血球の産生を増大させることにより赤血球産生をも刺激することができる。
【００５４】
有利には、ＭＤＰマイクロ粒子、またはＭＤＰマイクロ粒子を含む組成物を用いて、癌療法などに用いられる放射線療法に伴う放射線毒性を予防および／または改善することができる。この目的で用いる場合、ＭＤＰマイクロ粒子またはその組成物を放射線療法開始前または放射線療法中のいずれかの時点で投与できることは当業者には認識されるであろう。ＭＤＰマイクロ粒子またはその組成物を、放射線療法の最高７日前に投与することができるが、実際には、また好ましくは、それを放射線療法の２４時間〜３０分前に投与することができる。ＭＤＰマイクロ粒子または組成物を放射線療法のコースが終了した患者に投与して目的とする有益な効果を達成できることも考慮される。
【００５５】
予想外の放射線被曝を処置するためには、好ましくは放射線源に被曝した直後にＭＤＰマイクロ粒子を投与する。放射線源に被曝した後、約１分から約２時間までに、または被曝後、約２４時間で、ＭＤＰマイクロ粒子を投与することができる。例えば、被曝の５分以内にＭＤＰマイクロ粒子を投与することができる。
【００５６】
放射線被毒は、吸入、経口摂取による放射能／電離性放射線源被曝により、または外部直接被曝により起きる可能性がある。電離性放射線源は、例えばアルファ粒子、ベータ粒子、中性子、Ｘ線またはガンマ線である可能性がある。
【００５７】
放射線被曝が職業上のものである可能性があるが、例えば癌の治療に使用する放射線療法などの療法措置の結果である可能性もある。
【００５８】
有利には、ＭＤＰマイクロ粒子を放射線被曝または放射線被毒の処置のための１種類以上の他の薬剤と組み合わせて使用することができる。放射線被曝または放射線被毒の処置のためのそのような１種類以上の他の薬剤は、不溶性プルシアンブルー、Ｃａ−ＤＴＰＡ、Ｚｎ−ＤＴＰＡ、フィルグラスチム、またはホルモンおよびサイトカイン、例えばＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦαから選択することができる。本発明の処置を、骨髄移植および輸血などの方法と組み合わせることもできる。
【００５９】
あるいは、放射線被曝または放射線被毒の処置のための１種類以上の他の薬剤を、補助療法としてＭＤＰマイクロ粒子と共に使用できる。そのような療法は、該薬剤およびＭＤＰマイクロ粒子の同時または逐次投与を含むことができる。逐次投与は、数分、数時間、数日または数週間のいずれか適切な時間枠で間隔をおくことができる。放射線被曝または放射線被毒の処置のための上記リストは完全ではなく、他の薬剤を共療法または補助療法としてＭＤＰマイクロ粒子と共に使用できることは認識されるであろう。
【００６０】
さらに、ＭＤＰマイクロ粒子に医薬的に許容できるキャリヤーを配合できることは認識されるであろう。適切なキャリヤーおよび配合物は当業者に既知であり、あるいは例えばRemington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Ed, 1995 (Mack Publishing Co. Pennsylvania, USA), British Pharmacopoeia, 2000などから得ることができる。
【００６１】
本発明のＭＤＰマイクロ粒子は、ペプシンおよび極端なｐＨおよび変性条件による処理に対して抵抗性である；例えばｐＨ３．５のペプシンによる処理、または１未満および１１を超えるｐＨにおける周囲温度での処理、または６Ｍ尿素もしくは６Ｍ塩酸グアニジン中での変性条件による処理。
【００６２】
本発明がどのように作動するかについていずれか特定の理論により拘束されたくはないが、ＭＤＰマイクロ粒子が放射線被曝または放射線被毒を処置する能力は、細網内皮系内の細胞を明らかに刺激して、骨髄回復および脊髄回復を促進することが知られているサイトカイン、例えばＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−６およびＴＮＦαを分泌させることから生じると考えられる。
【００６３】
したがって本発明は、放射線に被曝した対象または放射線被毒を伴う対象において、骨髄回復を促進し、脊髄回復を促進し、および／またはサイトカインの放出を刺激する方法であって、その処置を必要とする対象に、有効量のＭＤＰマイクロ粒子を投与することを含む方法をも含む。
【００６４】
好ましくは、サイトカインはＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦまたはＴＮＦαから選択される。ＭＤＰマイクロ粒子は静脈内投与することができるが、他の経路で、例えば経口、筋肉内、鼻腔内、直接に肺の気道または鼻粘膜への噴霧吸入または乾燥粉末投与により投与することもできる。ＭＤＰマイクロ粒子を、約１μｇから約１５０μｇ／Ｋｇ体重までの用量で、放射線被曝の影響を阻止または改善する予防介入および治療介入のために投与することができる。一般に、ＭＤＰマイクロ粒子またはその組成物を、約１μｇから約１５０μｇ／Ｋｇ体重まで、好ましくは約１μｇから約１０μｇ／Ｋｇ体重までの用量で、放射線被曝または放射線被毒の影響を阻止または改善する予防介入および治療介入のために投与することができる。ＭＤＰマイクロ粒子を、要求に応じて、例えば約１、３、５、７、１０、１２、１５、１７、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００または１５０μｇ／Ｋｇ体重から選択される中間用量で投与することもできる。必要に応じて、より高い範囲の用量、例えば約１、３、５、７、１０、１３、１５、１７または２０ｍｇ／Ｋｇ体重から選択される用量も使用できる。もちろん、投与経路および用量が、治療用と予防用、ならびに受ける放射線量、患者の状態、および測定可能な他の検査室パラメーター、例えば血球数などに応じて著しく変動することは、当業者には認識されるであろう。処置は１日１回、１日多数回、またはより低い頻度、例えば隔日、週１回、または月１回で投与される用量を含むことができる。
【００６５】
本発明の組成物および方法は、多様な放射線源、例えば電離性放射線、太陽放射線、宇宙放射線、地球外の線源、およびラドンに対する被曝の処置（予防または治療、すなわち阻止的または治癒的）のために有効である。電離性放射線は、例えばアルファ粒子、ベータ粒子、中性子、および場合により光子として存在する。紫外線、Ｘ線およびガンマ線は、既知の形態の電離性放射線の若干例である。幾つかの電離性放射線源には、放射性物質、Ｘ線管、および粒子加速器が含まれるが、これらに限定されない。電離性放射線被曝は生体組織に損傷を与える可能性があり、放射線病および皮膚熱傷を生じる可能性がある。十分に高い線量の電離性放射は癌および腫瘍を発現する可能性もあり、極端な場合には死に至る可能性すらある。低い線量は、ＤＮＡ鎖の一方もしくは両方を破壊することにより、またはフリーラジカルを形成することにより遺伝子損傷を引き起こすことが示された。電離性放射線は、医療目的で、すなわち癌処置の一部として悪性細胞を制御するためにも使用できる。太陽放射線とは、太陽から放射される可視光線および近可視光線（紫外線および近赤外線）を表わす。太陽放射線の電離性成分は、地球表面における他の形態の放射線と比較して無視できる。しかし、太陽光線からの紫外線部分の過剰被曝は多数タイプの皮膚癌と関連づけられている。さらに、日焼けは皮膚に軽度の炎症を引き起こす可能性があり、紫外線被曝は皮膚の老化を促進する可能性がある。
【００６６】
より詳細な例には、宇宙線、電波、電磁波、赤外線、可視光線、紫外線（紫外線−Ａ、紫外線−Ｂおよび紫外線−Ｃ）、アルファ線、ベータ線、陽子ビーム、重粒子ビーム、Ｘ線、ガンマ線、電子ビーム、中性子ビームなどが含まれる。一般に、本発明における放射線のタイプは、それに対する防護が必要なもの、例えば宇宙線、電磁波、紫外線−Ａ、紫外線−Ｂ、アルファ線、ベータ線、陽子ビーム、重粒子ビーム、Ｘ線、ガンマ線、電子ビームおよび中性子ビームである。
【００６７】
予防用途において、ＭＤＰマイクロ粒子は、細網内皮系を刺激して、対象を致死量の放射線から防護することができるサイトカインを分泌させることができる。あるいは、ＭＤＰマイクロ粒子は放射線療法を用いる癌の治療中に放射線療法防護剤として使用できる。
【００６８】
好ましくは、サイトカインはＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−６およびＴＮＦαから選択される。これらのサイトカインはそれらの個別および相補的な作用機序によって相乗的な放射線防護を与えることが知られているので、これは有利である。
【００６９】
したがって本発明は、放射線に被曝した対象または放射線被毒を伴う対象において血小板増加を誘導する方法であって、有効量のＭＤＰマイクロ粒子を対象に投与することを含む方法も考慮する。
【実施例】
【００７０】
限定ではない実施例を参照して本発明の好ましい態様を以下に記載する。
【００７１】
実施例１−ＭＤＰマイクロ粒子の調製
プロピオニバクテリウム−アシニ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｉｎｉ）から単離したムラミルジペプチド（ＭＤＰ）の多重反復配列が、この実施例のＭＤＰマイクロ粒子キャリヤー複合体のコア構造を形成した。好ましいモノマーサブユニットの化学組成は下記のものである：
【００７２】
【化１】
0006053283.tif 000002
【００７３】
ＭＤＰは周知の免疫刺激特性をもち、これは免疫機能の増強に対するそれの効果を測定するために設計された試験において広く評価されている。現在まで、天然源から単離されたＭＤＰおよび合成ＭＤＰの両方とも、哺乳動物に投与した際に著しい毒性を伴っていた。この毒性は、アジュバントとしてのＭＤＰの有効性を制限していた。
【００７４】
有毒成分を含まないＭＤＰを単離するための方法をここに提示する。プロピオニバクテリウム−アクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ）を中間定常増殖期まで増殖させ、細菌培養に由来する夾雑物を除去するために当業者に周知の手法を用いて洗浄した。細胞壁および細胞質に含まれる疎水性成分を、漸増濃度のエタノール／イソプロパノール／水（１０％：１０％：８０％、２５％：２５％：５０％、そして４０％：４０％：２０％）で高められた温度において継続洗浄することにより連続抽出した。次いで、漸減濃度（８０％、５０％、４０％、そして２０％）のエタノールで高められた温度において継続洗浄することにより、イソプロピルアルコールを除去する。得られたＭＤＰマイクロ粒子を次いで２０％エタノールに懸濁し、５４０ｎｍにおけるそれの吸光度を濁度標準品の吸光度と関連づけることにより、それの濃度を測定する。貯蔵およびその後の使用のために、ＭＤＰマイクロ粒子の濃度を１０ｍｇ／ｍｌに調整した。
【００７５】
この調製物の分析により、ムラミルジペプチドが０．０５〜０．２ミクロンの範囲のマイクロ粒子サイズで広範に架橋していることが証明された。ＭＤＰマイクロ粒子は、アミノ結合したＬ−アラニン−Ｄ−イソグルタミンジペプチドをもつムラミン酸を生物活性成分として含有する。そのようなマイクロ粒子は、上記のように天然源から単離することができ、あるいは周知の合成法を用いて合成できる(例えば、Liu G.; Zhang S.-D.; Xia S.-Q.; Ding Z.-K. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, 10(12), 2000, pp. 1361-1363(3); Schwartzman S.M., Ribi E., Prep Biochem. 1980; 10(3): 255-67; Ohya et al. Journal of Bioactive and Compatible Polymers, 1993; 8: 351-364)。これらの提示された方法により調製したＭＤＰマイクロ粒子は広範なサイズ（例えば０．０１〜２．０ミクロン）をもつ可能性があるが、好ましいサイズは０．０５〜０．２ミクロンである。
【００７６】
実施例２−ＭＤＰマイクロ粒子へのリガンドの共有結合
リガンドを使用する場合、ＭＤＰマイクロ粒子へのリガンドの共有結合は、二官能性クロスリンカーにより、あるいはこの実施例に開示するように炭水化物部分のアルデヒド酸化生成物に対して行なうことができる；Current Protocols In Immunology; Series Editor: Richard Coico (Cornell University) Published by John Wiley & Sons, Inc.に記載。
【００７７】
２０％エタノール中のＭＤＰマイクロ粒子（２０ｍｇ）を遠心によりペレット化し、水に再懸濁して徹底的に洗浄する。ＭＤＰマイクロ粒子を次いでペレット化し、メタ過ヨウ素酸ナトリウム（０．５Ｍ）中にＭＤＰマイクロ粒子５０ｍｇ／ｍｌの濃度で再懸濁し、室温で１時間、酸化反応を実施する。メタ過ヨウ素酸ナトリウムで活性化した後、ＭＤＰマイクロ粒子懸濁液を遠心によりペレット化し、水に再懸濁して徹底的に洗浄する。メタ過ヨウ素酸ナトリウムの濃度および反応時間を変更して、酸化に際してＭＤＰマイクロ粒子内に生成する活性部位の数を調節できる。活性化したＭＤＰマイクロ粒子は、ＭＤＰマイクロ粒子当たり少なくとも１分子の被験リガンド、好ましくはＭＤＰマイクロ粒子当たり１０〜１００分子の被験リガンド、最も好ましくはＭＤＰマイクロ粒子当たり１００〜１０００の被験リガンドと反応して共有結合するはずである。高度に活性化したＭＤＰマイクロ粒子調製物を得るためには、最終濃度０．５Ｍのメタ過ヨウ素酸ナトリウムを使用し、酸化反応を１時間実施する。
【００７８】
メタ過ヨウ素酸ナトリウム酸化の後、ＭＤＰマイクロ粒子を次いでペレット化し、徹底的に洗浄してメタ過ヨウ素酸ナトリウムを除去する。活性化したＭＤＰマイクロ粒子を次いで、炭酸水素ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ  ｐＨ９．５）中の目的リガンド（例えば、ＴＬＲ９またはＮＯＤ２、＞１ｍｇ／ｍｌ、２０：１  ｗ／ｗの比率）に再懸濁し、１８〜２４時間インキュベートする（周囲温度）。反応物を遠心し、この時点でＭＤＰマイクロ粒子に中間シッフ塩基により結合しているリガンドを含有するペレットを還元して、ＭＤＰマイクロ粒子とリガンドの間に安定な共有結合を形成する。多数の還元剤を使用でき、水素化ホウ素ナトリウムはこの目的に一般に用いられる還元剤の一例である。シッフ塩基の還元後、ＭＤＰマイクロ粒子−リガンドコンジュゲートをペレット化し、洗浄し、目的とするワクチン緩衝液に目的とするリガンド濃度で再懸濁する。
【００７９】
１種類より多いリガンドの投与を希望する場合、カクテルに導入する各リガンドの効力を最適化する比率の個々のコンジュゲートを混合することにより、リガンド−ＭＤＰマイクロ粒子コンジュゲートのカクテルを調製することができる。この形態で、単一のレスポンダー細胞による細胞応答を増強するのに十分なリガンドが各マイクロ粒子コンジュゲート上に得られる（１００〜１０００リガンド／マイクロ粒子）。ＭＤＰマイクロ粒子キャリヤー当たりの被験リガンド数および所望によりカクテル内のリガンド比の両方を調整することにより被験リガンドの活性を最適化して、目的とする細胞応答を達成することができる。
【００８０】
ムラミルジペプチドの多重反復配列を用いて、例えば過ヨウ素酸ナトリウムで糖残基を緩和に酸化し、続いて水素化ホウ素ナトリウムなどで緩和に還元することにより、アルデヒド基への被験リガンドの結合を生成することができる。次いでこのシッフ塩基中間体を安定な共有結合に変換する。マイクロ粒子当たりのリガンド数は、酸化条件の変更により制御でき、必要に応じて放射性トレーサーの使用により定量できる。これらの方法は当技術分野で周知である(例えば、Current Protocols in Immunology; Series Editor: Richard Coico (Cornell University) Published by John Wiley & Sons, Inc.)。
【００８１】
実施例３−ヒト全血をＭＤＰマイクロ粒子で刺激した後のインビトロＧＭ−ＣＳＦ産生
ＭＤＰマイクロ粒子は希釈した全血においてＧＭ−ＣＳＦ分泌を誘導することが示された（図１）。２０μｇ／ｍｌのＭＤＰマイクロ粒子でインビトロ刺激した後、Ｔ＝２４および８８時間目に、ＧＭ−ＣＳＦレベルを標準フローサイトメトリービーズアレイ法により測定した（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、米国サンノゼ）。ＰＭＡ（２５ｎＭ）およびイオノマイシン（ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ）（１μｇ／ｍｌ）を比較のために含めた。
【００８２】
実施例４−ヒトＰＢＭＣをＭＤＰマイクロ粒子で刺激した後のインビトロＧＭ−ＣＳＦ産生
ＭＤＰマイクロ粒子は単離したＰＢＭＣの刺激アッセイにおいてＧＭ−ＣＳＦ分泌を誘導することが示された（図２）。５または１μｇ／ｍｌのＭＤＰマイクロ粒子、または比較のための１０８粒子／ｍｌのＨＫＳＡ（熱死滅（ｈｅａｔ  ｋｉｌｌｅｄ）黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ））でインビトロ刺激した後、Ｔ＝２４および７２時間目にＧＭ−ＣＳＦレベルを測定した。
【００８３】
実施例５−５００μｇのＭＤＰマイクロ粒子を静脈内投与した後のウサギ血小板数
ＭＤＰマイクロ粒子は、ウサギに５００μｇのＭＤＰマイクロ粒子を静脈内ボーラス投与した７日後にウサギにおいて血小板増加を誘導することが示された（図３）。この処理により血小板数が７３％増加した（非処理対照と対比してｐ＝０．０３）。
【００８４】
実施例６−５ｍｇまたは４５０μｇのＭＤＰマイクロ粒子を投与した後のヒト末梢血血清ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３造血サイトカインのレベル
ＭＤＰマイクロ粒子による処理は、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧＭ−ＣＳＦと協同作用することが知られている他の造血サイトカインであるＩＬ−３のレベルの上昇をもたらすことが２患者の血清において認められた。１患者（図４）には５ｍｇ用量のＭＤＰマイクロ粒子を投与した（０．２ｍＬ生理食塩水中で静脈内投与）。５ｍｇのＭＤＰマイクロ粒子を静脈内送達した後、Ｔ＝０、２４および４８時間目に、造血サイトカインレベルを標準フローサイトメトリービーズアレイ法により測定した（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、米国サンノゼ）。
【００８５】
第２患者（図５）には、４５０μｇのＭＤＰマイクロ粒子を投与した（静脈内）。４５０μｇのＭＤＰマイクロ粒子を静脈内送達した後、Ｔ＝０、５および２４時間目に造血サイトカインレベルを測定した。
【００８６】
実施例７−ヒトＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）をＭＤＰマイクロ粒子で刺激した後のＩＬ−１ベータ、ＩＬ−６およびＴＮＦ−アルファのインビトロ産生
いずれか特定の機序または理論により拘束されたくはないが、インビトロ細胞サブセット取り込みデータならびにインビトロおよびインビボ広域サイトカイン誘導分析に基づけば、これらのデータは、ＭＤＰマイクロ粒子が細網内皮系内の細胞を刺激して、骨髄回復を促進できるサイトカインまたは致死量の放射線から防護できるサイトカインを分泌させる作用をすることを指摘する。ＭＤＰマイクロ粒子は、脊髄回復に関連するＧＭ−ＣＳＦの産生のほか、ＩＬ−１、ＩＬ−６およびＴＮＦα、すなわち相乗的な放射線防護をもたらすことが知られているサイトカインの産生を誘導することも示された（図６）。２０μｇ／ｍｌのＭＤＰマイクロ粒子でインビトロ刺激した後、Ｔ＝２４および７２時間目に、サイトカインレベルを標準フローサイトメトリービーズアレイ法により測定した（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、米国サンノゼ）。
【００８７】
実施例８−致死量下および致死量の放射線被曝後に投与した場合の放射線防護剤としてのＭＤＰマイクロ粒子の使用
異なる放射線量を用いて２つの実験を行なった−コバルト６０源からの７．２Ｇｙおよび９．０Ｇｙのガンマ線。この放射線源およびタイプは有用かつ簡便な放射線発生源として使われ、これは、有効に利用できる、あるいは環境において遭遇する可能性がある、または治療その他の目的に使用できる放射線の他の線源を適切に代表および例示する。
【００８８】
両実験において、２４匹のＣ５７Ｂｌ／６マウスを０日目に全身照射し、対照マウス１２匹および被験マウス１２匹のグループに分けた。＋１日目に生理食塩水またはＭＤＰマイクロ粒子を静脈内注射した（両方とも２５０μｇ−容量２５０μＬ）。これを＋４日目に繰り返した；ただし皮下注射による（両方とも１００μｇ−容量５００μＬ）。
【００８９】
偶発被曝／テロリスト襲撃に際して使用するための薬剤に関する米国国立予防衛生研究所指針により課された規定に合わせて、ＭＤＰマイクロ粒子による処理を＋１日目に行なった。
【００９０】
実験１
２４匹のＣ５７Ｂｌ／６マウスを、対照マウス１２匹およびＭＤＰマイクロ粒子処理マウス１２匹の２グループに分けた。次いで致死量下の７．２Ｇｙの放射線を０日目に付与した。マウスを０、４、８、１０、１１、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２８および３０日目に体重測定した。
【００９１】
図７を見ると、対照マウスと対比したマイクロ粒子処理マウスの体重が分かる。非致死量の放射線に被曝した後、ＭＤＰマイクロ粒子による処理が対照マウスと比較して体重減少を阻止したことが明らかである。図８は、非致死量の放射線に被曝した対照マウスおよび被曝後にＭＤＰマイクロ粒子で処理したマウスの生存率を示す。ＭＤＰマイクロ粒子で処理したマウスは対照マウスより良好な生存率をもち、１００％のＭＤＰマイクロ粒子処理マウスが生存した。
【００９２】
実験２
実験１と同様に、２４匹のＣ５７Ｂｌ／６マウスを、対照マウス１２匹およびＭＤＰマイクロ粒子処理マウス１２匹の２グループに分けた。次いで致死量の９Ｇｙの放射線を０日目に付与した。マウスを０、４、６、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２４、２６および２８日目に体重測定し、生存をモニターした（図８）。図９は、対照マウスと対比したワクチン接種マウスの体重の平均を示す。致死量の放射線に被曝した後、ＭＤＰマイクロ粒子による処理が対照マウスと比較して体重減少を阻止したことが明らかである。
【００９３】
図１０は、致死量の放射線に被曝したＭＤＰマイクロ粒子処理マウスおよび対照マウスの生存率を示す。この結果は、ＭＤＰマイクロ粒子で処理したマウスが対照マウスより大きな生存率をもつことを明らかに示す。対照マウス１２匹はすべて、致死量の放射線に被曝して１９日以内に死亡した。
【００９４】
実施例９−放射線被曝の前および後に投与した場合の放射線防護剤としてのＭＤＰマイクロ粒子の使用
実験１
ＣＤ２Ｆ１雄マウス（１２〜１４週齢）を体重測定した。低体重および高体重の動物を排除した。残りの動物をランダムに処理グループに分けた（グループ当たり１６匹の動物）。動物に飼料（Ｈａｒｌａｎ，ＩＮ）および酸性化した水（ｐＨ２．５〜３．０）を任意に与えた。ＭＤＰマイクロ粒子原液（５ｍｇ／ｍＬ）の部分試料を注射の当日に生理食塩水中に希釈し、１０ｍｇ／ｋｇを０．１ｍＬ／マウスでｉｐ（腹腔内）経路により送達した。被験動物に９．０Ｇｙの全身照射を０．６Ｇｙ／分の線量率のコバルト６０ガンマ線で行なった。薬物処理マウスには、１０ｍｇ／ｋｇのＭＤＰマイクロ粒子を全身照射の時点に対して−２４時間目および＋１時間目に腹腔内投与した。
【００９５】
図１１は、放射線被曝の２４時間前におけるマウスの前処理がそれらの生存率を有意に高めたことを明らかに示す。ＭＤＰマイクロ粒子で処理しなかったマウスは放射線被曝後３０日目までに８％の生存率を示し、これに対しＭＤＰマイクロ粒子で腹腔内処理したマウスは３８％の生存率を示した。
【００９６】
実験２
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１０〜１２週齢）を体重測定し、雌および雄の平均体重を判定した。動物をランダムに処理グループに分けた（グループ当たり３０匹）。動物に飼料（Ｈａｒｌａｎ  ２０１８Ｃ）および酸性化した水（ｐＨ２．０〜３．０）を任意に与えた。ＭＤＰマイクロ粒子（ＭＩＳ４１６）を生理食塩水中１ｍｇ／ｍＬで投与した。すべての雌マウスに雌の平均体重に基づいて投薬し、すべての雄マウスに雄の平均体重に基づいて投薬した。ＭＤＰマイクロ粒子を腹腔内注射経路により投与した。下記の投与計画を実施した：
ａ）１回、１２．５ｍｇ／Ｋｇ（２５０μｇ／２０ｇのマウス）、照射の１４日＋６時間前；
ｂ）１回、５ｍｇ／Ｋｇ（１００μｇ／２０ｇのマウス）、照射の２４±４時間前；
ｃ）１回、５ｍｇ／Ｋｇ（１００μｇ／２０ｇのマウス）、照射の２４±４時間後；
ｄ）２回、５ｍｇ／Ｋｇ（１００μｇ／２０ｇのマウス）、照射の２４±４時間前と２４±４時間後。
【００９７】
ＬＤ７０／３０（７．９６Ｇｙ）に等しい致死量下線量の放射線を、１３７Ｃｓ放射線源からの１回均一全身線量のガンマ線として０．６５〜０．６９Ｇｙ／分の照射率で付与した。
【００９８】
別個のケージにおいてランダムに選択したマウス５匹／グループについて、１０および２２日目に鑑別（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）および末梢血スミアによる血球計数（ｃｅｌｌ  ｂｌｏｏｄ  ｃｏｕｎｔ（ＣＢＣ））を行なった。血液対照としての照射していない同等齢の対照マウス４匹についてもＣＢＣを行なった。
【００９９】
図１２の結果は、７９６ｃＧｙの放射線を照射し、５ｍｇ／ＫｇのＭＤＰマイクロ粒子（ＭＩＳ４１６）（１００μｇ／２０ｇマウス）で照射の２４時間前もしくは２４時間後に１回、または照射の２４時間前と２４時間後に２回処理したマウスの３０日生存率が、対照と比較して有意に増大したことを明らかに示す（それぞれ、生存率＝１００％、９６．７％、１００％、および５０％）。
【０１００】
図１３において、ＣＢＣ白血球サブセット計数の結果は、１０および２２日目に、−１日目、および−１，＋１日目  ＭＤＰマイクロ粒子処理グループにおいて、対照と比較して白血球（ＷＢＣ）、好中球（ＡＮＣ）および血小板が有意に増加したことを示す。
【０１０１】
図１４において、２２日目に、−１日目、および−１，＋１日目  ＭＤＰマイクロ粒子処理グループにおいて、対照と比較して赤血球（ＲＢＣ）が有意に増加した。
【０１０２】
本発明を特定の好ましい態様および限定ではない実施例に関して記載したが、開示した発明概念の精神を維持した変更および改変も本発明の範囲に含まれる。
[請求項１]
放射線被曝または放射線被毒を予防処置または治療処置する方法であって、その処置を必要とする対象に、有効量のＭＤＰマイクロ粒子、またはＭＤＰマイクロ粒子を含む組成物を投与することを含む、前記方法。
[請求項２]
放射線に被曝した対象または放射線被毒を伴う対象において骨髄回復を促進する方法であって、その処置を必要とする対象に、有効量のＭＤＰマイクロ粒子、またはＭＤＰマイクロ粒子を含む組成物を投与することを含む、前記方法。
[請求項３]
放射線に被曝した対象または放射線被毒を伴う対象において脊髄回復を促進する方法であって、その処置を必要とする対象に、有効量のＭＤＰマイクロ粒子、またはＭＤＰマイクロ粒子を含む組成物を投与することを含む、前記方法。
[請求項４]
放射線に被曝した対象または放射線被毒を伴う対象においてサイトカインの放出を刺激する方法であって、その処置を必要とする対象に、有効量のＭＤＰマイクロ粒子、またはＭＤＰマイクロ粒子を含む組成物を投与することを含む、前記方法。
[請求項５]
放射線に被曝した対象または放射線被毒を伴う対象において血小板増加を誘導する方法であって、その処置を必要とする対象に、有効量のＭＤＰマイクロ粒子、またはＭＤＰマイクロ粒子を含む組成物を投与することを含む、前記方法。
[請求項６]
放射線が電離性放射線であり、あるいは放射線被毒が電離性放射線により起きるものである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
[請求項７]
放射線が、宇宙線、電波、電磁波、赤外線、可視光線、紫外線、アルファ線、ベータ線、陽子ビーム、重粒子ビーム、Ｘ線、ガンマ線、電子ビームおよび中性子ビームから選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
[請求項８]
ＭＤＰマイクロ粒子、またはＭＤＰマイクロ粒子を含む組成物を、静脈内、経口、筋肉内、鼻腔内、直接に肺の気道または鼻粘膜への噴霧吸入または乾燥粉末投与により投与する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
[請求項９]
ＭＤＰマイクロ粒子、またはＭＤＰマイクロ粒子を含む組成物を、約１μｇから約２０ｍｇ／Ｋｇ体重の用量で投与する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
[請求項１０]
ＭＤＰマイクロ粒子、またはＭＤＰマイクロ粒子を含む組成物を、約１μｇ〜約１５０μｇ／Ｋｇ体重、もしくは約１μｇ〜約１５μｇ／Ｋｇ体重の投与量範囲から；または約１、５、１０もしくは１５ｍｇ／Ｋｇ体重から選択される用量で投与する、請求項９に記載の方法。
[請求項１１]
ＭＤＰマイクロ粒子、またはＭＤＰマイクロ粒子を含む組成物に、医薬的に許容できるキャリヤーを配合する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
[請求項１２]
放射線被曝が放射線療法により起きる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
[請求項１３]
ＭＤＰマイクロ粒子またはその組成物を、放射線療法の最高７日前に投与する、請求項１２に記載の方法。
[請求項１４]
ＭＤＰマイクロ粒子またはその組成物を、放射線療法の少なくとも２４時間前に投与する、請求項１２に記載の方法。
[請求項１５]
ＭＤＰマイクロ粒子またはその組成物を、放射線療法の少なくとも３０分前に投与する、請求項１２に記載の方法。
[請求項１６]
ＭＤＰマイクロ粒子またはその組成物を、放射線療法開始前のいずれかの時点、放射線療法開始の時点、または放射線療法中に投与する、請求項１２に記載の方法。
[請求項１７]
ＭＤＰマイクロ粒子または組成物を、放射線療法のコースが終了した患者に投与する、請求項１２に記載の方法。
[請求項１８]
ＭＤＰマイクロ粒子を放射線被曝の直後に投与する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
[請求項１９]
ＭＤＰマイクロ粒子を放射線源被曝の後、約１分から約２時間までに投与する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
[請求項２０]
ＭＤＰマイクロ粒子を、放射線被曝の少なくとも５分以内に投与する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
[請求項２１]
ＭＤＰマイクロ粒子を、放射線被曝の後、少なくとも２４時間以内に投与する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
[請求項２２]
放射線被曝または放射線被毒が、吸入、経口摂取による放射能被曝、または外部直接被曝により起きる、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
[請求項２３]
ＭＤＰマイクロ粒子を、マイクロ粒子と結合または会合した、免疫調節サイトカインを刺激することができる少なくとも１種類の免疫刺激リガンドと組み合わせる、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
[請求項２４]
リガンドが、ＴＬＲ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、ＮＯＤ−１またはＮＯＤ−２を含む病原性分子パターン認識受容体から選択される、請求項２３に記載の方法。
[請求項２５]
少なくとも１種類の免疫刺激リガンドが、ＭＤＰマイクロ粒子の表面と架橋しているか、または会合している、請求項２３または２４に記載の方法。
[請求項２６]
ＭＤＰマイクロ粒子が、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の産生を刺激する、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
[請求項２７]
ＭＤＰマイクロ粒子が、ＧＭ−ＣＳＦおよびインターロイキン−３（ＩＬ−３）両方の産生を刺激する、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
[請求項２８]
ＭＤＰマイクロ粒子が、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）および腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）の産生をも刺激する、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
[請求項２９]
ＭＤＰマイクロ粒子が、白血球および血小板の産生を増大させることにより造血再構成をも刺激する、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
[請求項３０]
ＭＤＰマイクロ粒子が、赤血球の産生を増大させることにより赤血球産生をも刺激する、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
[請求項３１]
ＭＤＰマイクロ粒子を、放射線被曝または放射線被毒の処置のための１種類以上の他の薬剤と組み合わせて使用する、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
[請求項３２]
放射線被曝または放射線被毒の処置のための１種類以上の他の薬剤が、不溶性プルシアンブルー、Ｃａ−ＤＴＰＡ、Ｚｎ−ＤＴＰＡ、フィルグラスチム、骨髄移植、輸血、またはホルモンおよびサイトカインから選択される、請求項３１に記載の方法。
[請求項３３]
サイトカインが、ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦまたはＴＮＦαから選択される、請求項２３〜３２のいずれか１項に記載の方法。
[請求項３４]
ＭＤＰマイクロ粒子を、放射線被曝または放射線被毒の処置のための１種類以上の他の薬剤と組み合わせる共療法として使用する、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
[請求項３５]
放射線被曝または放射線被毒の処置のための１種類以上の他の薬剤を、補助療法としてＭＤＰマイクロ粒子と共に使用できる、請求項３４に記載の方法。
[請求項３６]
療法が、他の薬剤およびＭＤＰマイクロ粒子を同時または逐次投与することを含む、請求項３５に記載の方法。
[請求項３７]
逐次投与を、数分、数時間、数日または数週間のいずれか適切な時間枠で間隔をおくことができる、請求項３６に記載の方法。
[請求項３８]
放射線に被曝した対象または放射線被毒を伴う対象における放射線被曝または放射線被毒の予防処置または治療処置のための、ＭＤＰマイクロ粒子、またはＭＤＰマイクロ粒子を含む組成物。
[請求項３９]
放射線に被曝した対象または放射線被毒を伴う対象において骨髄回復を促進するための、ＭＤＰマイクロ粒子、またはＭＤＰマイクロ粒子を含む組成物。
[請求項４０]
放射線に被曝した対象または放射線被毒を伴う対象において脊髄回復を促進するための、ＭＤＰマイクロ粒子、またはＭＤＰマイクロ粒子を含む組成物。
[請求項４１]
放射線に被曝した対象または放射線被毒を伴う対象においてサイトカインの放出を刺激するための、ＭＤＰマイクロ粒子、またはＭＤＰマイクロ粒子を含む組成物。
[請求項４２]
放射線に被曝した対象または放射線被毒を伴う対象において血小板増加を誘導するための、ＭＤＰマイクロ粒子、またはＭＤＰマイクロ粒子を含む組成物。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１４】
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