(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヌクレアーゼおよび操作されたジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質であって、前記操作されたジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインが、ラットＲｏｓａ遺伝子内の標的部位に結合し、そして前記操作されたジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインが、Ｎ末端からＣ末端にかけて、Ｆ１からＦ４、Ｆ１からＦ５、又はＦ１からＦ６の順番で示される４つ、５つ又は６つのジンクフィンガーＤＮＡ認識領域を含み、そしてさらに、前記操作されたジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインが：
（ｉ）
Ｆ１：ＲＳＤＨＬＳＥ（配列番号４８）；
Ｆ２：ＲＳＡＡＬＡＲ（配列番号４９）；
Ｆ３：ＲＳＤＨＬＳＴ（配列番号５０）；
Ｆ４：ＱＮＡＨＲＩＴ（配列番号５１）；及び
Ｆ５：ＲＳＡＶＬＳＥ（配列番号５２）；
（ｉｉ）
Ｆ１：ＱＳＧＤＬＴＲ（配列番号１７）；
Ｆ２：ＴＳＧＳＬＴＲ（配列番号１８）；
Ｆ３：ＲＳＡＮＬＴＲ（配列番号４２）；
Ｆ４：ＲＳＤＨＬＴＫ（配列番号４５）；及び
Ｆ５：ＮＳＤＨＬＳＲ（配列番号４６）；
（ｉｉｉ）
Ｆ１：ＱＳＧＤＬＴＲ（配列番号１７）；
Ｆ２：ＲＳＤＮＬＴＲ（配列番号５８）；
Ｆ３：ＲＳＤＮＬＳＥ（配列番号２１）；
Ｆ４：ＱＮＡＨＲＫＴ（配列番号２２）；
Ｆ５：ＲＳＤＨＬＳＥ（配列番号４８）；及び
Ｆ６：ＴＳＳＴＲＫＴ（配列番号５９）；
（ｉｖ）
Ｆ１：ＴＳＧＮＬＴＲ（配列番号６０）；
Ｆ２：ＱＳＧＮＬＡＲ（配列番号６１）；
Ｆ３：ＲＳＤＡＬＳＶ（配列番号６２）；
Ｆ４：ＤＳＳＨＲＴＲ（配列番号６３）；及び
Ｆ５：ＲＳＤＶＬＳＥ（配列番号６４）
（ｖ）
Ｆ１：ＲＳＤＮＬＳＥ（配列番号２１）；
Ｆ２：ＱＮＡＨＲＫＴ（配列番号２２）；
Ｆ３：ＲＳＤＨＬＳＥ（配列番号４８）；
Ｆ４：ＴＳＳＴＲＫＴ（配列番号５９）；及び
Ｆ５：ＴＳＧＨＬＳＲ（配列番号４０）；
（ｖｉ）
Ｆ１：ＴＳＧＮＬＴＲ（配列番号６０）；
Ｆ２：ＱＳＧＮＬＡＲ（配列番号６１）；
Ｆ３：ＲＳＤＡＬＳＶ（配列番号６２）；及び
Ｆ４：ＤＳＳＨＲＴＲ（配列番号６３）；
（ｖｉｉ）
Ｆ１：ＱＲＳＮＬＶＲ（配列番号６５）；
Ｆ２：ＲＳＤＨＬＴＱ（配列番号６６）；
Ｆ３：ＱＳＧＨＬＱＲ（配列番号６７）；及び
Ｆ４：ＤＲＳＨＬＡＲ（配列番号６８）；
（ｖｉｉｉ）
Ｆ１：ＲＳＤＶＬＳＥ（配列番号６４）；
Ｆ２：ＱＲＮＨＲＴＴ（配列番号６９）；
Ｆ３：ＴＫＲＳＬＩＥ（配列番号７０）；
Ｆ４：ＴＳＳＮＬＳＲ（配列番号７１）；
Ｆ５：ＲＳＤＤＬＳＫ（配列番号２５）；及び
Ｆ６：ＤＮＲＤＲＩＫ（配列番号５５）；
（ｉｘ）
Ｆ１：ＲＳＤＨＬＳＡ（配列番号７２）；
Ｆ２：ＱＳＧＨＬＳＲ（配列番号２４）；
Ｆ３：ＲＳＤＨＬＳＲ（配列番号４７）；
Ｆ４：ＱＮＤＮＲＩＫ（配列番号７３）；及び
Ｆ５：ＱＳＧＮＬＡＲ（配列番号６１）；
（ｘ）
Ｆ１：ＮＮＲＤＬＩＮ（配列番号７４）；
Ｆ２：ＴＳＳＮＬＳＲ（配列番号７１）；
Ｆ３：ＲＳＤＶＬＳＥ（配列番号６４）；
Ｆ４：ＱＲＮＨＲＴＴ（配列番号６９）；
Ｆ５：ＴＫＲＳＬＩＥ（配列番号７０）；及び
Ｆ６：ＴＳＳＮＬＳＲ（配列番号７１）
から成る群から選択されるジンクフィンガーＤＮＡ認識領域を含む、融合タンパク質。
【請求項２】
ヌクレアーゼが、切断ドメインまたは切断ハーフドメインを含む請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
ヌクレアーゼが、タイプＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼ切断ドメインまたは切断ハーフドメインを含む請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
切断ドメインまたは切断ハーフドメインが、天然または操作されている請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の融合タンパク質または請求項５に記載のポリヌクレオチドを含む細胞。
【請求項７】
細胞が胚細胞である請求項６に記載の細胞。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の融合タンパク質または請求項５に記載のポリヌクレオチドおよび薬学的に許容可能な賦形剤を含む組成物。
【請求項９】
細胞中の１つまたは複数のＲｏｓａ遺伝子を切断する方法であって、
１つまたは複数のＲｏｓａ遺伝子が切断されるように、１つまたは複数の請求項１〜４のいずれか１項に記載の融合タンパク質または１つまたは複数の請求項５に記載のポリヌクレオチドを細胞中に導入するステップを含む方法。
【請求項１０】
外因性のポリヌクレオチド配列を細胞のゲノム中に導入する方法であって、
請求項９に記載の１つまたは複数のＲｏｓａ遺伝子を切断するステップ；および
細胞を外因性のポリヌクレオチド配列と接触させるステップを含み；
１つまたは複数の遺伝子の切断が、外因性のポリヌクレオチド配列のゲノム中への相同組換えによる組込みを刺激する方法。
【請求項１１】
外因性のポリヌクレオチド配列が、物理的にゲノム中に挿入される請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
外因性のポリヌクレオチド配列が、核酸複製プロセスを介してゲノム中に組み込まれる請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
外因性のポリヌクレオチド配列が、非相同依存性標的組込みを介してゲノム中に組み込まれる請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
胚細胞のゲノム中のＲｏｓａ遺伝子配列を改変する方法であって、
１つまたは複数の請求項９に記載のＲｏｓａ遺伝子を切断するステップを含み、
（ｉ）第１のＺＦＮが第１の切断部位を切断し、第２のＺＦＮが第２の切断部位を切断し；
（ｉｉ）Ｒｏｓａ遺伝子配列が、第１切断部位と第２切断部位の間に位置し；
（ｉｉｉ）第１と第２切断部位の切断により非相同末端結合または相同指向修復により遺伝子配列の改変が生ずる、
方法。
【請求項１５】
改変が欠失を含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
改変が外因性の配列の挿入を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ヒト以外の遺伝子導入動物を生成する方法であって、
請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の胚細胞中のＲｏｓａ遺伝子配列を改変するステップ；および
動物中で胚を発生させるステップ、
を含む方法。
【請求項１８】
改変が、指定された位置での１つまたは複数のランダム変異を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
改変が、ヒト化遺伝子の挿入を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
ヒト化遺伝子が、薬剤代謝に関係している請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
動物が性的成熟動物であり、改変遺伝子配列が、性的成熟動物の少なくとも一部の配偶子中に存在する請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
対象の少なくとも１つのＲｏｓａ遺伝子座中に１つまたは複数の遺伝性変異対立遺伝子を作る方法であって、
請求項１７〜２1のいずれか１項に記載の遺伝子導入動物を生成するステップ、ここで胚を性的成熟に育てる；および
その性的成熟動物に子孫を作らせるステップ、ここで少なくとも一部の子孫がその変異対立遺伝子を含む、
方法。
【請求項２３】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の融合タンパク質または請求項５に記載のポリヌクレオチドを含むキット。
【請求項２４】
１つまたは複数の外因性の配列、使用説明書、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される追加の成分をさらに含む請求項２３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１０年４月２６日出願の米国特許仮出願第６１／３４３，２８７号の利益を主張する。本仮出願の開示は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府から資金提供を受けた研究開発により行われた発明の権利に関する記載
該当なし。
【０００３】
技術分野
本開示は、体細胞遺伝子および遺伝性遺伝子の挿入／破壊、ゲノム変化、ランダム変異を有する対立遺伝子の生成、および／またはトランスジーンのＲｏｓａ遺伝子座への挿入、等のゲノムエンジニアリングの分野に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
Ｒｏｓａ遺伝子産物は、成長の全段階で広範に発現する。従って、この遺伝子座は、内在性または導入プロモーターにより内在性配列を発現させる目的、および、例えば、胚性幹細胞由来の遺伝子導入マウスを生成する目的で広く使用されている。例えば、Ｓｔｒａｔｈｄｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ、Ｉｓｓｕｅ  １、ｅ４；Ｎｙａｂｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．３７：ｅ５５、を参照。
【０００５】
しかし、標的挿入の従来の方法は、複雑な標的ベクターの構築が必要とされ得る。従って、Ｒｏｓａ遺伝子への標的挿入および／または標的手法によるＲｏｓａ遺伝子の修正の方法に対する必要性がまだ残されている。ゲノム遺伝子座の正確な標的部位特異的切断は、従来の相同組換えに対する効率的な補助手段および／または代替手法を提供する。二重鎖切断（ＤＳＢ）の生成により、標的遺伝子座での相同組換えの頻度を１０００倍超増加させる。さらに解りやすく言えば、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）による部位特異的ＤＳＢの不正確な修復は、遺伝子破壊も生ずる可能性がある。２つのこのようなＤＳＢの生成は、大きな領域の欠失を任意に生成することになる。ジンクフィンガータンパク質のモジュラーＤＮＡ認識に対する優先性により、部位特異的マルチフィンガーＤＮＡ結合タンパク質の合理的な設計が可能となる。タイプＩＩ制限酵素ＦｏｋＩ由来のヌクレアーゼドメインの部位特異的ジンクフィンガータンパク質への融合により、部位特異的ヌクレアーゼの生成が可能となる。例えば、米国特許公開第２００３０２３２４１０号；同第２００５０２０８４８９号；同第２００５００２６１５７号；同第２００５００６４４７４号；同第２００６０１８８９８７号；同第２００６００６３２３１号；同第２００７０１３４７９６号；２００８０１５１６４号；同第２００８０１３１９６２号；同第２００８０１５９９６ならびに国際公開０７／０１４２７５号および同２００８／１３３９３８号、を参照のこと。これら全特許公開は、ジンクフィンガーヌクレアーゼの使用に関し記載しており、また、これらは参照によってその全体が全目的のために組み込まれる。
【発明の概要】
【０００６】
概要
本明細書では、Ｒｏｓａ遺伝子座への標的挿入のための組成物および方法が開示される。本明細書記載の組成物および方法は、ゲノム編集に使用可能であり、限定されないが、次記を含む：１つまたは複数の遺伝子中の標的変化（挿入、欠失および／または置換変異）を生ずる動物細胞中の１つまたは複数の遺伝子の切断（これらの標的変化の生殖系列への組込みを含む）；非内在性核酸配列、動物中の１つまたは複数の遺伝子の部分的または完全不活性化の標的導入；相同指向修復、遺伝子導入動物（例えば、げっ歯類）の生成および／または動物遺伝子の新規対立遺伝子型をコードするランダム変異の生成を誘導する方法。
【０００７】
一態様では、本明細書で、ゲノム（例えば、げっ歯類ゲノム）のＲｏｓａ遺伝子中の標的部位に結合するジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）が記載され、ＺＦＰは、１つまたは複数の操作ジンクフィンガー結合ドメインを含む。一実施形態では、ＺＦＰは、標的ゲノム対象領域を切断するジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）であり、ＺＦＮは、１つまたは複数の操作ジンクフィンガー結合ドメインおよびヌクレアーゼ切断ドメインまたは切断ハーフドメインを含む。切断ドメインおよび切断ハーフドメインは、例えば、種々の制限エンドヌクレアーゼおよび／またはホーミングエンドヌクレアーゼから得ることができる。一実施形態では、切断ハーフドメインは、タイプＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）由来である。ある特定の実施形態では、ジンクフィンガードメインは、Ｒｏｓａ遺伝子中の標的部位、例えば、Ｒｏｓａ２６を認識する。
【０００８】
ＺＦＮは、遺伝子のコーディング領域内、または、例えば、リーダー配列、トレーラー配列またはイントロン等の遺伝子内もしくは遺伝子に隣接する非コード配列中の、コーディング領域の上流もしくは下流の非転写領域領域内のＲｏｓａ遺伝子に結合および／またはＲｏｓａ遺伝子を切断することができる。
【０００９】
別の態様では、本明細書で、本明細書記載の１つまたは複数のジンクフィンガーヌクレアーゼを含む組成物が記載される。ある特定の実施形態では、組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤と組み合わせた１つまたは複数のジンクフィンガーヌクレアーゼを含む。
【００１０】
別の態様では、本明細書で、本明細書記載の１つまたは複数のＺＦＮをコードするポリヌクレオチドが記載される。ポリヌクレオチドは、例えば、ｍＲＮＡであってもよい。
【００１１】
別の態様では、本明細書で、本明細書記載の１つまたは複数のＺＦＮをコードする、プロモーターに機能的に連結された、ポリヌクレオチドを含むＺＦＮ発現ベクターが記載される。
【００１２】
別の態様では、本明細書で、本明細書記載の１つまたは複数のＺＦＮ発現ベクターを含む宿主細胞が記載される。宿主細胞は、１つまたは複数のＺＦＰ発現ベクターで安定に形質転換されるか、または一時的に形質移入されるか、またはそれらの組み合わせとすることができる。一実施形態では、宿主細胞は、胚性幹細胞である。他の実施形態では、１つまたは複数のＺＦＰ発現ベクターは、宿主細胞中で１つまたは複数のＺＦＮを発現する。別の実施形態では、宿主細胞は、外因性のポリヌクレオチドドナー配列をさらに含んでもよい。本明細書記載の実施形態のいずれかで、宿主細胞は、胚細胞、例えば、１つまたは複数のマウス、ラット、ウサギまたは他の哺乳動物細胞胚を含み得る。
【００１３】
別の態様では、本明細書で、細胞中の１つまたは複数のＲｏｓａ遺伝子を切断する方法が記載され、該方法は、（ａ）ＺＦＮが発現し、１つまたは複数の遺伝子が切断される条件下で、１つまたは複数の遺伝子中の標的部位に結合する１つまたは複数のＺＦＮをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを細胞中に導入すること、を含む。
【００１４】
さらに別の態様では、本明細書で、外因性の配列を細胞のゲノム中に導入する方法が記載され、該方法は、（ａ）ＺＦＮが発現し、１つまたは複数の遺伝子が切断される条件下で、Ｒｏｓａ遺伝子の標的部位に結合する１つまたは複数のＺＦＮをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを細胞中に導入するステップ；および（ｂ）細胞を外因性ポリヌクレオチドに接触させ、それにより、遺伝子の切断が外因性のポリヌクレオチドのゲノムへの相同組換えによる組込みを刺激するステップを含む。ある特定の実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、物理的にゲノムに組み込まれる。他の実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、核酸複製プロセスを介して宿主細胞ゲノム中に外因性配列を複写することによりゲノム中に組み込まれる（例えば、二重鎖切断の相同指向修復）。さらに他の実施形態では、ゲノム中への組込みは、非相同性依存標的組込み（例えば、「末端キャプチャー（ｅｎｄ−ｃａｐｔｕｒｅ）」）により起こる。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のヌクレアーゼは、タイプＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼの切断ドメイン、および操作ジンクフィンガー結合ドメインとの間で融合する。ある特定の実施形態では、外因性配列は、小哺乳動物（例えば、ウサギまたはげっ歯類、例えば、マウス、ラット、等）のＲｏｓａ遺伝子中に組み込まれる。
【００１５】
別の実施形態では、本明細書で、細胞のゲノム中の１つまたは複数のＲｏｓａ遺伝子配列を改変する方法が記載され、該方法は、（ａ）１つまたは複数のＲｏｓａ配列を含む細胞を提供すること；および（ｂ）細胞中の第１と第２のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を発現させることを含み、第１のＺＦＮが第１の切断部位を切断し、第２のＺＦＮが第２の切断部位を切断し、遺伝子配列は、第１の切断部位と第２の切断部位の間に存在し、第１と第２の切断部位の切断により、非相同末端結合および／または相同指向修復により遺伝子配列の改変がもたらされる。任意選択で、この切断により、外因性配列（トランスジーン）の挿入が生じ、同様に細胞中に導入される。他の実施形態では、非相同末端結合は、第１と第２の切断部位の間で欠失を生じる。遺伝子配列中の欠失のサイズは、第１と第２の切断部位間の距離により定まる。従って、任意のゲノム対象領域中の任意のサイズの欠失を得ることができる。２５、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１、０００ヌクレオチド対の欠失、またはこの範囲内の任意の整数値のヌクレオチド対の欠失を得ることができる。さらに、本明細書に開示の方法と組成物を使って、１、０００ヌクレオチド対より大きい任意の整数値のヌクレオチド対配列の欠失を得ることができる。
【００１６】
本明細書記載の内在性Ｒｏｓａ遺伝子の改変方法を使用して、例えば、遺伝子を（部分的または完全に）不活化することにより、または遺伝子の決まった位置に、これらの遺伝子の新規対立遺伝子型を有する遺伝子導入動物（例えば、ラット、ウサギまたはマウス）の同定または選択を可能とするランダム変異を作ることにより、ヒト化遺伝子の挿入により（非制限的例であるが、薬物代謝研究用）、または例えば、このような変異対立遺伝子の表現型の影響を調べるために対象の変異対立遺伝子を挿入することにより、動物（例えば、ヒト）モデル疾患を作ることが可能である。
【００１７】
さらに別の態様では、本明細書で、１つまたは複数の標的Ｒｏｓａ遺伝子の生殖系列の破壊方法が記載され、該方法は、本明細書記載のいずれかの方法により、１つまたは複数の胚細胞のゲノム中の１つまたは複数のＲｏｓａ配列を改変し、この胚細胞を成長させることを含み、改変遺伝子配列が性的成熟動物の少なくとも一部の配偶子中に存在する。ある特定の実施形態では、動物は、小哺乳動物、例えば、げっ歯類またはウサギである。
【００１８】
別の態様では、本明細書で、少なくとも１つの対象Ｒｏｓａ遺伝子座中の１つまたは複数の遺伝性変異対立遺伝子を作る方法が記載され、該方法は、本明細書記載のいずれかの方法により、１つまたは複数の動物胚細胞のゲノム中の１つまたは複数のＲｏｓａ遺伝子座を改変すること；この胚細胞を性的成熟体に育てること；および性的成熟動物に子孫を作らせることを含み、少なくとも一部の子孫が、変異対立遺伝子を含む。ある特定の実施形態では、動物は、小哺乳動物、例えば、ウサギまたはげっ歯類、例えば、ラット、マウスまたはモルモットである。
【００１９】
本明細書記載のいずれかの方法では、ジップフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはこれらの組み合わせを含むことができる。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、プラスミドを含む。他の実施形態では、ヌクレアーゼをコードするリヌクレオチドは、ｍＲＮＡを含む。
【００２０】
またさらなる態様では、本明細書で、染色体のＲｏｓａ遺伝子座への核酸配列の部位特異的組込み方法が提供される。ある特定の実施形態では、該方法は、（ａ）（ｉ）組み込まれる核酸配列に隣接した上流配列および下流配列を含む少なくとも１つのＤＮＡベクター、および（ｉｉ）Ｒｏｓａ遺伝子座中の組込み部位を認識するジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする少なくとも１つのＲＮＡ分子を胚に注入するステップ、ならびに（ｂ）胚を培養してジンクフィンガーヌクレアーゼの発現を可能とするステップであって、ＤＮＡベクターとの相同組換えを介して、ジンクフィンガーヌクレアーゼにより組込み部位中に導入された二重鎖切断が修復されて、核酸配列を染色体中に組み込む、ステップを含む。
【００２１】
適切な胚が、いくつかの異なる脊椎動物種、例えば、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、および魚類種由来であってよい。一般的に言えば、適切な胚は、収集、注入、および培養して、ジンクフィンガーヌクレアーゼの発現が可能となる胚である。一部の実施形態では、適切な胚は、小哺乳動物（例えば、げっ歯類、ウサギ、等）、愛玩動物、家畜、および霊長類由来の胚を含むことができる。げっ歯類の非制限的例には、マウス、ラット、ハムスター、スナネズミ、およびモルモットを含むことができる。愛玩動物の非制限的例には、ネコ、イヌ、ウサギ、ハリネズミ、およびケナガイタチを含むことができる。家畜の非制限的例には、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ラマ、アルパカ、およびウシを含むことができる。霊長類の非制限的例には、オマキザル、チンパンジー、キツネザル、マカク、マーモセット、タマリン、クモザル、リスザル、およびサバンナモンキーを含むことができる。他の実施形態では、適切な胚には、魚類、爬虫類、両生類、または鳥類由来の胚を含むことができる。あるいは、適切な胚は、昆虫胚子、例えば、ショウジョウバエ胚子または蚊胚子であってもよい。
【００２２】
また、少なくとも１つのＤＮＡベクターを含む胚が提供され、該ＤＮＡベクターは、組み込まれる核酸配列に隣接した上流配列および下流配列を含み、さらに染色体の組込み部位を認識するジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする少なくとも１つのＲＮＡ分子を含む。また、本明細書記載のいずれかの胚由来生物も提供される。
【００２３】
また、本発明のＺＦＰを含むキットも提供される。キットは、ＺＦＰをコードする核酸（例えば、ＲＮＡ分子または適切な発現ベクター中に含まれるＺＦＰをコードする遺伝子）、ドナー分子、適切な宿主細胞株、本発明の方法を実施するための取扱説明書、等を含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】は、Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（商標）（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ）ミスマッチアッセイによりアッセイされた、ラットｒｏｓａ２６遺伝子座の切断後のＮＨＥＪ修復の結果を示すサザンブロットを示す。「Ｇ」は、細胞がＧＦＰ  ＺＦＮを形質移入された場所での反応を示し、番号を付けたレーンは、特異的ＺＦＮ対を示す。矢印は、ＮＨＥＪが起こったレーンを示す。
【図２】は、Ｒｏｓａ標的ドナーヌクレオチドのマウスゲノムＤＮＡへの挿入を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
詳細な説明
本明細書では、（例えば、マウス、ラットまたはウサギ等の小哺乳動物で）例えば、遺伝子の切断；例えば、切断に続いて外因性配列の挿入（物理的挿入または相同指向修復を介した複製による挿入）および／または切断に続いて非相同末端結合（ＮＨＥＪ）による遺伝子の変化；１つまたは複数の遺伝子の部分的または完全な不活性化；内在性遺伝子の改変発現を作るためのランダム変異を有する対立遺伝子の生成；等および生殖系列中に運び込まれたゲノムの変化、におけるゲノム編集のための組成物と方法が記載されている。また、標的動物（例えば、小哺乳動物）細胞中の例えば、１つまたは複数の遺伝子を編集する（変える）ために、これらの組成物（試薬）を製造し使用する方法が開示されている。従って、本明細書記載の方法および組成物は、標的遺伝子変化（例えば、ノックイン）および／または１つまたは複数の遺伝子のノックアウト（部分的または完全）のための、および／または任意の標的対立遺伝子配列のランダム変異のための非常に効率的な方法を提供し、従って、ヒト疾患の動物モデルの生成を可能とする。
【００２６】
本明細書記載の組成物および方法は、労働集約的な選択および／または選別の必要もなく、最小限のオフターゲット効果で、動物の内在性遺伝子座の迅速、完全、および永続的な標的破壊を提供する。動物全身遺伝子ノックアウトは、また、ＺＦＮ  ｍＲＮＡまたはＺＦＮ発現カセットを注入することにより、１回のステップで容易に生成することができる。
【００２７】
一般事項
方法の実施、ならびに本明細書で開示の組成物の調製と使用には、別段の指示がなければ、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算化学、細胞培養、組換えＤＮＡならびに当該技術分野内の関連分野における従来の技術を採用している。これらの技術は文献中で完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、Ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９  ａｎｄ  Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、２００１；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８７  ａｎｄ  ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ｕｐｄａｔｅｓ；ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ；Ｗｏｌｆｆｅ、ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ  ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＦＵＮＣＴＩＯＮ、Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、１９９８；ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ、Ｖｏｌ．３０４、“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ”（Ｐ．Ｍ．Ｗａｓｓａｒｍａｎ  ａｎｄ  Ａ．Ｐ．Ｗｏｌｆｆｅ、ｅｄｓ．）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、１９９９；ａｎｄ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｖｏｌ．１１９、“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”（Ｐ．Ｂ．Ｂｅｃｋｅｒ、ｅｄ．）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、１９９９、を参照。
【００２８】
定義
用語の「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」は、同義に使用され、直鎖または環状構造、および単鎖または二重鎖型のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的のためには、これらの用語は、ポリマーの長さに関して制限するものと解釈されるべきではない。この用語は、天然ヌクレオチドの類似体、ならびに塩基、糖および／またはリン酸塩成分が改変されているヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエートバックボーン）の既知の類似体を包含し得る。一般的に、特定のヌクレオチドの類似体は、同じ塩基対形成特異性を有し、すなわち、Ａの類似体は、Ｔと塩基対を形成する。
【００２９】
用語の「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、同義に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。また、この用語は、１つまたは複数のアミノ酸が対応する天然アミノ酸の化学的類似体または改変誘導体であるアミノ酸ポリマーにも適用できる。
【００３０】
「結合」は、高分子間の（例えば、タンパク質と核酸間の）配列特異的、非共有結合相互作用を指す。相互作用全体として配列特異的である限りは、必ずしも全ての結合相互作用の成分が、配列特異的である必要はない（例えば、ＤＮＡバックボーン中のリン酸塩残基と接触）。このような相互作用は、通常、１０-6Ｍ-1以下の解離定数（Ｋd）を特徴とする。「親和性」は、結合の強さを指し、結合親和性の増加は、Ｋdの低下に対応する。
【００３１】
「結合タンパク質」は、非共有結合で別の分子に結合することができるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合することができる。タンパク質結合タンパク質の場合は、それは、自身に結合することができ（ホモダイマー、ホモトリマー、等を形成）、および／または異なるタンパク質または異なる複数タンパク質の１つまたは複数の分子に結合できる。結合タンパク質は、２つ以上のタイプの結合活性を有することができる。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合、ＲＮＡ結合およびタンパク質結合活性を持つ。
【００３２】
「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、タンパク質、またはより大きなタンパク質内のドメインで、配列特異的方式で１つまたは複数のジンクフィンガーを介してＤＮＡに結合する。ジンクフィンガーは、構造が亜鉛イオンの配位により安定化されている結合ドメイン内のアミノ酸配列領域である。用語のジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質は、しばしば、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと略される。
【００３３】
ジンクフィンガー結合ドメインは、「操作」されて所定のヌクレオチド配列に結合することができる。フィンガータンパク質を操作する方法の非制限的例は、設計と選択である。設計されたジンクフィンガータンパク質は、天然にはないタンパク質で、その設計／組成は、主として合理的な基準から得られる。合理的な設計基準には、置換ルール、および既存ＺＦＰ設計および結合データのデータベース蓄積情報の情報処理用コンピュータ化アルゴリズムの適用が含まれる。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号；同６，４５３，２４２号；および同６，５３４，２６１号、を参照；また、国際公開第９８／５３０５８号；同９８／５３０５９号；同９８／５３０６０号；同０２／０１６５３６号および同０３／０１６４９６号、を参照。
【００３４】
「選択された」ジンクフィンガータンパク質は、天然に存在しないタンパク質で、その産生は、主に経験的プロセス、例えば、ファージディスプレイ、相互作用捕捉またはハイブリッド選択、からの結果である。例えば、米国特許第５，７８９，５３８号；同５，９２５，５２３号；同６，００７，９８８号；同６，０１３，４５３号；同６，２００，７５９号；国際公開９５／１９４３１号；同９６／０６１６６号；同９８／５３０５７号；同９８／５４３１１号；同００／２７８７８；同０１／６０９７０号；同０１／８８１９７号および同０２／０９９０８４号、を参照。
【００３５】
用語の「配列」は、任意の長さのヌクレオチド配列を指し、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく；直鎖、環状または分岐であってもよく、さらに、単鎖または二重鎖であってもよい。用語の「ドナー配列」は、ゲノム中に挿入されたヌクレオチド配列を指す。ドナー配列は、任意の長さ、例えば、２〜１０，０００ヌクレオチドの長さ（またはその間の、またはそれを超える任意の整数値）であってよく、好ましくは、約１００〜１，０００ヌクレオチドの長さ（またはその間の任意の整数）、より好ましくは、約２００〜５００ヌクレオチドの長さである。
【００３６】
「相同、非同一配列」は、第２の配列とある程度の配列同一性を分け合うが、その配列は第２の配列とは同じではない第１の配列を指す。例えば、変異遺伝子の野性型配列を含むポリヌクレオチドは、変異遺伝子の配列に相同かつ非同一である。ある特定の実施形態では、２つの配列間の相同性の程度は、正常細胞機序を利用して、それらの間の相同組換えを許容するのに充分である。２つの相同非同一配列は、任意の長さでよく、その非相同性の程度は、単一ヌクレオチドの小ささ（例えば、標的相同組換えによるゲノム点変異の補正のために）または１０キロベース以上の大きさ（例えば、染色体の所定の異所性部位で遺伝子の挿入のために）であってもよい。相同非同一配列を含む２つのポリヌクレオチドは、同じ長さである必要はない。例えば、２０〜１０，０００のヌクレオチドまたはヌクレオチド対の外因性ポリヌクレオチド（すなわち、ドナーポリヌクレオチド）を使用可能である。
【００３７】
核酸およびアミノ酸配列同一性を測定する技術は、当技術分野で既知である。通常、このような技術には、遺伝子のためのｍＲＮＡのヌクレオチド配列の決定および／またはそれによりコードされたアミノ酸配列の決定、およびこれらの配列と第２のヌクレオチドまたはアミノ酸配列との比較が含まれる。ゲノム配列もまた、この方式で決定および比較可能である。一般的に、同一性は、それぞれ、ヌクレオチド−対−ヌクレオチドまたはアミノ酸−対−アミノ酸の２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の正確な対応を指す。２つ以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、それらのパーセント同一性を測定することにより比較できる。２つの配列のパーセント同一性は、核酸でもまたはアミノ酸配列でも、２つの整列させた配列の間の正確な一致の数をより短い方の配列の長さで割って、１００倍したものである。
【００３８】
あるいは、ポリヌクレオチド間の配列類似性の程度は、相同領域間で安定な２本鎖の形成を許容する条件下で、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを行い、続いて、単鎖特異的ヌクレアーゼで消化させ、さらに消化断片のサイズ測定により、決定できる。配列が決まった長さの分子に対し、上記の方法を使って測定して、少なくとも約７０％〜７５％、好ましくは、８０％〜８２％、より好ましくは、８５％〜９０％、さらにより好ましくは、９２％、さらにより好ましくは、９５％、および最も好ましくは、９８％の配列同一性を示す場合は、２つの核酸、または２つのポリペプチド配列は、実質的に相互に相同である。本明細書で使われる実質的に相同は、また、特定のＤＮＡまたはポリペプチド配列に対し完全な同一性を示す配列を指す。実質的に相同であるＤＮＡ配列は、例えば、その特定のシステムに対し定義されるストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験により同定できる。適切なハイブリダイゼーション条件の定義は、当業者の技能範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、前出；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、ｅｄｉｔｏｒｓ  Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ、（１９８５）Ｏｘｆｏｒｄ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣ；ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）、を参照。
【００３９】
２つの核酸断片の選択的ハイブリダイゼーションは、以下のように測定できる。２つの核酸分子間の配列同一性の程度は、このような分子間のハイブリダイゼーションイベント効率と強度に影響を与える。部分的に同一な核酸配列は、完全に同一な配列の標的分子へのハイブリダイゼーションを少なくとも部分的に阻害するであろう。完全に同一の配列のハイブリダイゼーションの阻害は、当技術分野でよく知られたハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、サザン（ＤＮＡ）ブロット、ノーザン（ＲＮＡ）ブロット、溶液ハイブリダイゼーション、等、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．を参照）を使って評価できる。このようなアッセイは、様々な程度の選択性を使って、例えば、低から高まで厳密性が変わる条件を使って、実行できる。低厳密性の条件を採用する場合は、非特異的結合の非存在を、部分的な程度の配列同一性にも欠ける第２のプローブ（例えば、標的分子に対し約３０％未満の配列同一性を有するプローブ）を使って評価でき、非特異的結合イベントが無い場合は、第２のプローブは、標的にハイブリダイズしないであろう。
【００４０】
ハイブリダイゼーションに基づいた検出システムを利用する場合は、核酸プローブは、参照核酸配列に相補的なものが選ばれ、次に、適切な条件の選択により、プローブと参照配列が選択的に相互にハイブリダイズ、または結合して、二本鎖分子を形成する。中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、参照配列に選択的にハイブリダイズ可能な核酸分子は、通常、選択核酸プローブの配列に少なくとも約７０％配列同一性を有する少なくとも約１０〜１４ヌクレオチド長さの標的核酸配列の検出を可能とする条件下でハイブリダイズする。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、通常、選択核酸プローブの配列と約９０〜９５％を超える配列同一性を有する少なくとも約１０〜１４ヌクレオチド長さの標的核酸配列の検出を可能とする。プローブおよび参照配列が特定の程度の配列同一性を有する場合、プローブ／参照配列ハイブリダイゼーションに有用なハイブリダイゼーション条件は、当技術分野で既知の方法で決定できる（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、ｅｄｉｔｏｒｓ  Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ、（１９８５）Ｏｘｆｏｒｄ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣ；ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、を参照）。
【００４１】
ハイブリダイゼーションの条件は当業者にはよく知られている。ハイブリダイゼーションの厳密性は、ハイブリダイゼーション条件が、ミスマッチヌクレオチドを含むハイブリッドの形成を嫌う程度を指し、より高い厳密性は、ミスマッチハイブリッドに対するより低い許容性と相関する。ハイブリダイゼーションの厳密性に影響する因子は当業者にはよく知られ、限定されないが、温度、ｐＨ、イオン強度、および、例えば、フォルムアミドおよびジメチルスルホキシド等の有機溶剤の濃度が含まれる。当業者には知られているように、ハイブリダイゼーション厳密性は、より高い温度、より低いイオン強度およびより低い溶媒濃度によってより高くなる。
【００４２】
ハイブリダイゼーションの厳密性条件に関して、多くの等価な条件を採用して、例えば、以下の因子を変えることにより、特定の厳密性を確立できることは当技術分野でよく知られている：長さおよび配列の性質、種々の配列の塩基組成、塩の濃度ならびに他のハイブリダイゼーション溶液成分、ハイブリダイゼーション溶液中のブロッキング剤（例えば、デキストラン硫酸塩、およびポリエチレングリコール）の存在または非存在、ハイブリダイゼーション反応温度および時間パラメーター、ならびに、洗浄条件を変えること。特定のセットのハイブリダイゼーション条件は、以下の当技術分野の標準的な方法により選択される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、を参照）。
【００４３】
「組換え」は、２つのポリヌクレオチド間の遺伝的情報の交換プロセスを指す。本開示の目的としては、「相同組換え（ＨＲ）」は、例えば、相同指向修復機序を介して細胞中の二重鎖切断の修復の間に起こる特殊な形のこのような交換を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列の相同性を必要とし、「ドナー」分子を「標的」分子（すなわち、二重鎖切断を受けた分子）のテンプレート修復に使用し、「非交差遺伝子変換」または「ショートトラクト遺伝子変換」として様々な呼び方で知られているが、理由は、このことが、遺伝子情報をドナーから標的に移すことになるためである。いかなる特定の理論にも拘泥する意図はないが、このような移入は、破壊された標的とドナーの間で形成されるヘテロ二重鎖ＤＮＡのミスマッチ修復、および／または「合成依存的ストランド・アニーリング」（ドナーが標的の一部となるであろう遺伝情報を再合成するために使用される）、および／または関連プロセス、を伴う可能性がある。このような特殊なＨＲは、ドナーポリヌクレオチドの一部または全部の配列が標的ポリヌクレオチド中に組み込まれるような標的分子の配列の変化を生ずることが多い。
【００４４】
本開示の方法では、本明細書記載の１つまたは複数の標的ヌクレアーゼが標的配列（例えば、細胞クロマチン）中の所定の部位で二重鎖切断を作り、切断領域中のヌクレオチド配列に相同性を有する「ドナー」ポリヌクレオチドを細胞中に導入できる。二重鎖切断の存在により、ドナー配列の組込みの促進が認められる。ドナー配列は、物理的に組み込まれてもよく、または、代わりに、ドナーポリヌクレオチドが相同組換えを介した切断修復のテンプレートとして使用され、ドナーの細胞クロマチン中への組込みのように、ヌクレオチド配列の全部または一部の導入が生ずる。従って、細胞クロマチン中の第１の配列は、変えることができ、また、ある特定の実施形態では、ドナーポリヌクレオチド中に存在する配列に変換できる。従って、用語の「置換する（ｒｅｐｌａｃｅ）」または「置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）」の使用は、１つのヌクレオチド配列の別のものでの置換を表すと理解でき（すなわち、情報上の配列の置換）、必ずしも、１つのポリヌクレオチドの別のものでの物理的または化学的置換を必要としない。
【００４５】
本明細書記載のいずれかの方法では、細胞内の追加の標的部位の追加の二重鎖切断に対し、追加のジンクフィンガータンパク質対を使用することができる。
【００４６】
細胞クロマチン中の対象領域中の標的組換えおよび／または置換および／または配列変化の方法に関するある特定の実施形態では、染色体の配列が外因性の「ドナー」ヌクレオチド配列を使った相同組換えにより変化される。このような相同組換えは、切断領域に対する配列相同性が存在する場合は、細胞クロマチン中の二重鎖切断の存在により刺激される。
【００４７】
本明細書記載のいずれかの方法では、第１のヌクレオチド配列（「ドナー配列」）は、対象領域中のゲノム配列に相同な（同一ではない）配列を含む可能性が有り、それにより、相同組換えを刺激して、非同一配列を対象領域に挿入できる。従って、ある特定の実施形態では、対象領域中の配列に相同な一部のドナー配列は、約８０〜９９％（またはその間の任意の整数）の置換されるゲノム配列に対する配列同一性を示す。他の実施形態では、例えば、１００を超える近接塩基対の中でただ１つのヌクレオチドのみがドナーとゲノム配列間で異なる場合は、ドナーおよびゲノム配列間の相同性は、９９％を超える。ある特定の場合、ドナー配列の非相同部分は、対象領域中に存在しない配列を含むことができ、それにより、新規配列が対象領域に導入される。これらの例では、非相同配列には、通常、５０〜１，０００塩基対（またはその間の任意の整数値）または１，０００超の任意の数の塩基対の配列が隣接しており、これら隣接配列は、対象領域の配列に対し相同または同一である。他の実施形態では、ドナー配列は、第１の配列に非相同であり、非相同組換え機序によりゲノム中に挿入される。
【００４８】
本明細書記載のいずれかの方法を使って、対象遺伝子の発現を妨害するドナー配列の標的組込みにより、部分的にまたは完全に細胞中の１つまたは複数の標的配列の不活化をおこなうことができる。部分的または完全不活化遺伝子を有する細胞株もまた提供される。
【００４９】
さらに、本明細書記載の標的組込み方法は、また、１つまたは複数の外因性の配列を組み込むのにも使用可能である。外因性の核酸配列は、例えば、１つまたは複数の遺伝子もしくは相補ＤＮＡ分子、または任意のタイプのコードもしくは非コード配列、ならびに１つまたは複数の調節領域（例えば、プロモーター）を含んでもよい。さらに、外因性の核酸配列が、１つまたは複数のＲＮＡ分子（例えば、低分子ヘアピン型ＲＮＡｓ（ｓｈＲＮＡ）、抑制性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、等）を産生してもよい。
【００５０】
「切断」は、ＤＮＡ分子の共有結合バックボーンの切断を指す。切断は、種々の方法で開始でき、限定されないが、リン酸ジエステル結合の酵素的または化学加水分解が含まれる。単鎖切断および二重鎖切断の両方が可能であり、二重鎖切断は、２つ異なる単鎖切断イベントの結果として発生し得る。ＤＮＡ切断により、平滑末端または付着末端が生成され得る。ある特定の実施形態では、融合ポリペプチドは、標的二重鎖ＤＮＡ切断のために使用される。
【００５１】
「切断ハーフドメイン」は、第２のポリペプチド（同一または異なる）と共に、切断活性（好ましくは二重鎖切断活性）を有する複合体を形成するポリペプチド配列である。用語の「第１と第２切断ハーフドメイン；」「＋および−切断ハーフドメイン」および「右と左切断ハーフドメイン」は、同義に使用され、二量体化する一対の切断ハーフドメインを指す。
【００５２】
「操作切断ハーフドメイン」は、別の切断ハーフドメイン（例えば、別の操作切断ハーフドメイン）と強制的ヘテロダイマーを形成するように改変されている切断ハーフドメインである。また、米国特許公開第２００５／００６４４７４号；同第２００７／０２１８５２８号および同第２００８／０１３１９６２号、を参照。これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００５３】
「クロマチン」は、細胞ゲノムを含む核タンパク質構造である。細胞クロマチンは、核酸、１次ＤＮＡ、およびタンパク質を含み、ヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質を含む。大部分の真核細胞クロマチンは、ヌクレオソームの形で存在し、ヌクレオソームのコアは、２つの各ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４を含む八量体と会合した約１５０塩基対のＤＮＡを含み；さらに、（生物体に応じて可変長さの）リンカーＤＮＡがヌクレオソームコアの間に広がる。ヒストンＨ１の分子は、通常、リンカーＤＮＡと会合している。本開示の目的としては、用語の「クロマチン」は、原核生物および真核生物両方のあらゆるタイプの細胞核タンパク質を包含することを意味している。細胞クロマチンは、染色体およびエピソームクロマチンの両方を含む。
【００５４】
「染色体」は、細胞のゲノムの全体または一部を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムは、しばしば、その核型を特徴とし、細胞のゲノムを含む全ての染色体の収集である。細胞のゲノムは、１つまたは複数の染色体を含むことができる。
【００５５】
「エピソーム」は、複製する核酸、核タンパク質複合体または細胞の染色体核型の一部ではない核酸を含む他の構造である。エピソームの例には、プラスミドおよびある特定のウイルスゲノムが含まれる。
【００５６】
「標的部位」または「標的配列」は、結合のための充分な条件が存在すれば、結合分子が結合する核酸の一部を決める核酸配列である。例えば、配列５’−ＧＡＡＴＴＣ−３’は、ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼに対する標的部位である。
【００５７】
「外因性の」分子は、通常は細胞中に存在しない分子であるが、１つまたは複数の遺伝的、生化学的または他の方法により細胞中に導入可能である。「細胞中で通常の存在」は、細胞の特定の発生段階および環境条件に関して決定される。従って、例えば、筋肉胚発生の間のみに存在する分子は、成人筋細胞に対しては外因性の分子である。同様に、熱ショックにより誘導された分子は、非熱ショック細胞に対しては、外因性の分子である。外因性分子には、例えば、機能バージョンの動作異常内在性分子または動作異常バージョンの正常機能内在性分子を含んでもよい。外因性分子は、また、別の種、例えば、動物のゲノム中に導入されたヒト配列、で通常見出される分子であってもよい。
【００５８】
外因性の分子は、とりわけ、例えば、コンビナトリアルケミストリープロセスにより生成される小分子、または高分子、例えば、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上記分子のいずれかの改変誘導体、または１つまたは複数の上記分子を含むいずれかの複合体であってもよい。核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含み、単鎖でも二重鎖でもよく；直鎖、分岐または環状でもよく；さらに任意の長さでよい。核酸には、二重鎖を形成できるもの、ならびに三重鎖形成核酸が含まれる。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号および同５，４２２，２５１号、を参照。タンパク質には、限定されないが、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ギラーゼおよびヘリカーゼが含まれる。
【００５９】
外因性分子は、内在性分子、例えば、外因性のタンパク質または核酸と同じタイプの分子であってもよい。例えば、外因性の核酸は、細胞中に導入された感染ウイルスゲノム、プラスミドまたはエピソーム、または通常は細胞中に存在しない染色体を含んでもよい。外因性分子の細胞中への導入方法は、当業者には既知であり、限定されないが、脂質媒介導入（すなわち、中性および陽イオン脂質を含むリポソーム）、電気穿孔、直接注入、細胞融合、微粒子銃、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介導入およびウイルスベクター媒介導入、が含まれる。
【００６０】
対照的に、「内在性」分子は、特定の発生段階で特定の環境条件下、通常特定の細胞中に存在する分子である。例えば、内在性核酸は、染色体、ミトコンドリア、葉緑体または他のオルガネラのゲノム、または天然エピソーム核酸を含んでもよい。追加の内在性分子には、タンパク質、例えば、転写因子および酵素を含んでもよい。
【００６１】
「融合」分子は、２つ以上サブユニット分子が、好ましくは共有結合で、連結されている分子である。サブユニット分子は、同じ化学タイプの分子でも、または異なる化学タイプの分子であってもよい。第１のタイプの融合分子の例には、限定されないが、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメインと切断ドメインの融合体）および融合核酸（例えば、前に記載の融合タンパク質をコードする核酸）が含まれる。第２のタイプの融合分子の例には、限定されないが、三量体形成核酸とポリペプチド間の融合体、および小溝結合剤と核酸の間の融合体が含まれる。
【００６２】
細胞中の融合タンパク質の発現は、融合タンパク質の細胞への送達または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの細胞への送達により行わせることができ、ポリヌクレオチドが転写され、転写物が翻訳されて、融合タンパク質を生成する。トランススプライシング、ポリペプチド切断およびポリペプチド連結反応は、また、細胞中のタンパク質の発現に関与し得る。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの細胞への送達方法は、本開示の別のところで示している。
【００６３】
本開示の目的のための「遺伝子」には、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（下記を参照）、ならびに遺伝子産物の産生を調節する全ＤＮＡ領域が含まれるが、このような調節配列がコードおよび／または複写配列に隣接して存在するか否にかかわらない。従って、遺伝子には、限定されないが、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列、例えば、リボソーム結合部位および内部リボソームエントリー部位、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター配列、境界エレメント、複製起点、マトリックス付着部位および遺伝子座調節領域、が含まれる。
【００６４】
「遺伝子発現」は、遺伝子中に含まれる情報の遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡまたはいずれかの他のタイプのＲＮＡ）であっても、またはｍＲＮＡの翻訳により産生されたタンパク質であってもよい。遺伝子産物には、また、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、および編集、等のプロセスにより改変されているＲＮＡ、および、例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、ミリスチル化、およびグリコシル化により改変されたタンパク質、が含まれる。
【００６５】
遺伝子発現の「調節」は、遺伝子の活性の変化を指す。発現の調節には、限定されないが、遺伝子活性化および遺伝子抑制が含まれる。ゲノム編集（例えば、切断、変化、不活性化、ランダム変異）は、発現を調節するために使用可能である。遺伝子不活性化は、本明細書記載のＺＦＰを含まない細胞と比較して、遺伝子発現の何らかの減少を指す。従って、遺伝子不活性化は、部分的でも完全でもありうる。
【００６６】
「対象領域」は、例えば、遺伝子または遺伝子内または隣接した非コード配列、等の細胞クロマチンのいずれかの領域であり、この領域中で外因性の分子に結合するのが望ましい。結合は、標的ＤＮＡ切断および／または標的組換えの目的のためであってもよい。対象領域は、染色体、エピソーム、オルガネラゲノム（例えば、ミトコンドリア、葉緑体）、または、例えば、感染ウイルスゲノム中に存在してもよい。対象領域は、遺伝子のコード領域内、例えば、リーダー配列、トレーラー配列もしくはイントロン等の転写非コード領域内、またはコード領域の上流または下流の非転写領域内であってもよい。対象領域は、単一ヌクレオチド対程度の小ささでも、または２，０００ヌクレオチド対もの長さでも、または任意の整数値のヌクレオチド対でもよい。
【００６７】
用語の「作動可能連結（ｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｌｉｎｋａｇｅ）」および「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」（または「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」）は、２つ以上の要素（配列要素、等）の近位に関連して同義に使用され、この場合、要素が、両方の要素が正常に機能し、少なくとも１つの要素が、少なくとも１つの他の要素に対して行使する機能を媒介することができることを可能とするように配列されている。実例として、１つまたは複数の転写調節因子の存在または非存在に応じて、転写調節配列がコード配列の転写レベルを制御する場合、プロモーター等の転写調節配列は、作動可能なようにコード配列に連結される。転写調節配列は、通常、コード配列とシスに作動可能なように連結されるが、すぐ隣である必要はない。例えば、エンハンサーは、作動可能なようにコード配列に連結されている転写調節配列であるが、それらは隣接していない。
【００６８】
融合ポリペプチドに関する用語の「作動可能に連結された」は、各要素が、連結されていない場合に行うのと同じ機能を、連結時に他の要素に対し実行するという事実を指す。例えば、ＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメインが切断ドメインに融合されている融合ポリペプチドに関して、融合ポリペプチド中で、ＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメイン部分が、その標的部位および／またはその結合部位に結合でき、一方、切断ドメインは、標的部位の近傍でＤＮＡを切断することができる場合は、ＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメインが作動可能に連結されている。
【００６９】
タンパク質、ポリペプチドまたは核酸の「機能的断片」は、その配列は、完全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同一でないが、それでも完全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同じ機能を保持しているタンパク質、ポリペプチドまたは核酸である。機能的断片は、対応するネイティブ分子に比べ、より多い、より少ない、または同じ数の残基を持つことができ、および／または１つまたは複数のアミノ酸またはヌクレオチド置換を含むことができる。核酸の機能（例えば、コーディング機能、別の核酸にハイブリダイズする能力）を測定する方法は、当技術分野でよく知られている。同様に、タンパク質機能を測定する方法も、よく知られている。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能は、例えば、フィルター結合、電気泳動の移動度シフト、または免疫沈降アッセイによって測定できる。ＤＮＡ切断は、ゲル電気泳動法によりアッセイできる。Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、前出、を参照。タンパク質の別のタンパク質と相互作用する能力は、例えば、免疫共沈降、ツーハイブリッドアッセイまたは、遺伝的および生化学的の両方の相補性により測定できる。例えば、Ｆｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４０：２４５−２４６；米国特許第５，５８５，２４５号および国際公開第９８／４４３５０号、を参照。
【００７０】
ジンクフィンガーヌクレアーゼ
本明細書では、１つまたは複数のＲｏｓａ遺伝子のゲノム編集（例えば、切断、変化、不活性化および／またはランダム変異）に使用できるジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）が記載されている。ＺＦＮは、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）およびヌクレアーゼ（切断）ドメイン（例えば、切断ハーフドメイン）を含む。
【００７１】
Ａ．ジンクフィンガータンパク質
ジンクフィンガー結合ドメインは、選択配列に結合するように操作できる。例えば、Ｂｅｅｒｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５−１４１；Ｐａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３−３４０；Ｉｓａｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６−６６０；Ｓｅｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２−６３７；Ｃｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１−４１６、を参照。操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然ジンクフィンガータンパク質に比べて新規結合特異性を持つことができる。操作方法には、限定されないが、合理的な設計および種々のタイプの選択が含まれる。合理的な設計には、例えば、トリプレット（またはクアドルプレット）ヌクレオチド配列および個別ジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースの使用を含み、この場合、各トリプレットまたはクアドルプレットヌクレオチド配列が、特定のトリプレットまたはクアドルプレット配列と結合するジンクフィンガーの１つまたは複数のアミノ酸配列と会合している。例えば、共有米国特許第６，４５３，２４２号および同６，５３４，２６１号、を参照。これらは、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【００７２】
ファージディスプレイおよびツーハイブリッドシステムを含む代表的選択方法が、米国特許第５，７８９，５３８号；同５，９２５，５２３号；同６，００７，９８８号；同６，０１３，４５３号；同６，４１０，２４８号；同６，１４０，４６６号；同６，２００，７５９号；および同６，２４２，５６８号；ならびに国際公開第９８／３７１８６号；同９８／５３０５７号；同００／２７８７８号；同０１／８８１９７号および英国特許第２，３３８，２３７号に開示されている。さらに、ジンクフィンガー結合ドメインのための結合特異性の増強に関し、例えば、共有特許国際公開第０２／０７７２２７号に記載されている。
【００７３】
標的部位、ＺＦＰの選択および融合タンパク質（および前記をコードするポリヌクレオチド）の設計と構築方法の選択は、当業者には既知であり、米国特許公開第２００５００６４４７４号および２００６０１８８９８７号に詳細に記載されている。これらは、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【００７４】
さらに、これらおよび他の参考に開示されているように、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガー化ジンクフィンガータンパク質は、例えば、５以上のアミノ酸長のリンカー（例えば、ＴＧＥＫＰ（配列番号１）、ＴＧＧＱＲＰ（配列番号２）、ＴＧＱＫＰ（配列番号３）、および／またはＴＧＳＱＫＰ（配列番号４））等の任意の適切なリンカー配列を使って一緒に連結できる。また、６以上のアミノ酸長の代表的リンカー配列に関しては、米国特許第６，４７９，６２６号；同６，９０３，１８５号；および同７，１５３，９４９号、を参照。本明細書記載のタンパク質は、それぞれのタンパク質ジンクフィンガーの間にいずれかの適切なリンカーの組み合わせを挿入することができる。
【００７５】
後で記載するように、ある特定の実施形態では、４つ、５つ、または６つのフィンガー結合ドメインが、切断ハーフドメイン、例えば、ＦｏｋＩ等のタイプＩＩｓ制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインに融合される。１つまたは複数のこのようなジンクフィンガー／ヌクレアーゼハーフドメイン融合体対が、例えば、米国特許公開２００５００６４４７４号で開示のように、標的切断に使用される。
【００７６】
標的切断に関して、結合部位の近端は、５以上のヌクレオチド対により分離することが可能であり、各融合タンパク質は、ＤＮＡ標的の逆ストランドに結合できる。オールペアワイズコンビネーション  １（Ａｌｌ  ｐａｉｒｗｉｓｅ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  １）が、Ｒｏｓａ遺伝子の標的切断のために使用可能である。本開示に従って、ＺＦＮは、動物のゲノム中の任意の配列を標的にすることができる。
【００７７】
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、植物病原体ザントモナス由来のＴＡＬエフェクターからの操作されたドメインである（Ｂｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ、（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６：１５０９−１５１２  および  Ｍｏｓｃｏｕ  ａｎｄ  Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ、（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６：１５０１、を参照）。
【００７８】
Ｂ．切断ドメイン
ＺＦＮは、また、ヌクレアーゼ（切断ドメイン、切断ハーフドメイン）を含む。本明細書に開示の融合タンパク質の切断ドメイン部分は、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインが得られる代表的エンドヌクレアーゼには、限定されないが、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが含まれる。例えば、２００２−２００３カタログ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ；およびＢｅｌｆｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３７９−３３８８、を参照。ＤＮＡを切断するさらなる酵素が知られている（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ；マングビーンヌクレアーゼ；膵臓ＤＮアーゼＩ；小球菌ヌクレアーゼ；酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ；また、Ｌｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９３、を参照）。１つまたは複数のこれらの酵素（またはその機能性断片）が、切断ドメインおよび切断ハーフドメインのソースとして使用できる。
【００７９】
同様に、切断ハーフドメインは、上記で説明したように、任意のヌクレアーゼまたはその一部から得ることができる。これは、切断活性のためには二量体化が必要である。一般的に、融合タンパク質が切断ハーフドメインを含む場合は、２つの融合タンパク質が切断に必要である。あるいは、２つの切断ハーフドメインを含む単一タンパク質が、使用可能である。２つの切断ハーフドメインは、同じエンドヌクレアーゼ（またはその機能性断片）から得ることができ、または各切断ハーフドメインは、異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能性断片）から得ることができる。さらに、２つの融合タンパク質に対する標的部位は、２つの融合タンパク質のそれぞれの標的部位との結合が、切断ハーフドメインを相互に空間定位に置き、切断ハーフドメインに、例えば、二量体化による機能的切断ドメインを形成させるように、相互に配置されるのが好ましい。従って、ある特定の実施形態では、標的部位の近端は、５〜８ヌクレオチドまたは１５〜１８ヌクレオチドだけ分離されている。しかし、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が、２つの標的部位間に介在できる（例えば、２〜５０ヌクレオチド対またはそれを超える）。一般的に、切断部位は、標的部位の間に位置する。
【００８０】
制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種に存在し、ＤＮＡに対する配列特異的結合（認識部位で）が可能で、また結合部位またはその近傍でＤＮＡを切断可能である。ある特定の制限酵素（例えば、タイプＩＩＳ）は、認識部位から離れた部位でＤＮＡを切断し、分離可能な結合および切断ドメインを有する。例えば、タイプＩＩＳ酵素ＦｏｋＩは、１つの鎖の認識部位から９ヌクレオチドの位置、および、もう一方の鎖の認識部位から１３ヌクレオチドの位置でのＤＮＡ二重鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号；同５，４３６，１５０号および同５，４８７，９９４号；ならびにＬｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４２７５−４２７９；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：２７６４−２７６８；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４ａ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：８８３−８８７；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４ｂ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３１，９７８−３１，９８２、を参照のこと。従って、一実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも１つのタイプＩＩＳ制限酵素由来の切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）および１つまたは複数のジンクフィンガー結合ドメイン（操作されていても、そうでなくてもよい）を含む。
【００８１】
切断ドメインが結合ドメインから分離可能な代表的タイプＩＩＳ制限酵素は、ＦｏｋＩである。この特定の酵素は、ダイマーとして活性である。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１０，５７０−１０，５７５。従って、本開示の目的のためには、開示された融合タンパク質で使用されるＦｏｋＩ酵素の一部は、切断ハーフドメインと見なされる。従って、ジンクフィンガーＦｏｋＩ融合体を使った標的二重鎖切断および／または細胞配列の標的置換のためには、それぞれＦｏｋＩ切断ハーフドメインを含む２つの融合タンパク質を使用して、触媒的に活性な切断ドメインを再構成できる。あるいは、ジンクフィンガー結合ドメインおよび２つのＦｏｋＩ切断ハーフドメインを含む単一ポリペプチド分子を使うこともできる。ジンクフィンガーＦｏｋＩ融合体を使った標的切断および標的配列変化のためのパラメーターは、本開示の別のところで提供される。
【００８２】
切断ドメインまたは切断ハーフドメインは、切断活性を保持する、または多量体を作り（例えば、二量体化）、機能的切断ドメインを形成する能力を保持するタンパク質のいずれの部分であってもよい。
【００８３】
代表的タイプＩＩＳ制限酵素は、国際公開第０７／０１４２７５号に記載されており、その全体が本明細書に組み込まれる。追加の制限酵素は、また、分離可能な結合および切断ドメインを含み、これらも、本開示で意図されている。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：４１８−４２０、を参照。
【００８４】
ある特定の実施形態では、切断ドメインは、１つまたは複数の操作された切断ハーフドメイン（また、二量体化ドメイン変異体とも呼ばれる）を含み、これは、例えば、米国特許公開第２００５００６４４７４号；同２００６０１８８９８７号および同２００８０１３１９６２号に記載されているように、ホモ二量体化を最小限にするか、または防ぐ。これらの開示は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。ＦｏｋＩの位置４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７、および５３８のアミノ酸残基は、全て、ＦｏｋＩ切断ハーフドメインの二量体化に影響を与える標的である。
【００８５】
強制的ヘテロダイマーを形成する代表的ＦｏｋＩの操作された切断ハーフドメインには、第１の切断ハーフドメインが、ＦｏｋＩの４９０および５３８の位置のアミノ酸残基に変異を含み、第２の切断ハーフドメインが４８６および４９９の位置のアミノ酸残基に変異を含む対が含まれる。
【００８６】
従って、一実施形態では、４９０の位置の変異がＧｌｕ（Ｅ）をＬｙｓ（Ｋ）で置換し；５３８の位置の変異がＩｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置換し；４８６の位置の変異がＧｌｎ（Ｑ）をＧｌｕ（Ｅ）で置換し；さらに４９９の位置の変異がＩｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置換する。具体的には、本明細書記載の操作された切断ハーフドメインは、１つの切断ハーフドメインで位置４９０（Ｅ→Ｋ）および５３８（Ｉ→Ｋ）を変異させて「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と命名されている操作された切断ハーフドメインを産生し、また、別の切断ハーフドメインで位置４８６（Ｑ→Ｅ）および４９９（Ｉ→Ｌ）を変異させて「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」と命名されている操作された切断ハーフドメインを産生することにより調製された。本明細書記載の操作された切断ハーフドメインは、異常な切断が最小化または停止された強制的ヘテロダイマー変異体である。例えば、国際公開第０７／１３９８９８号の実施例１を参照。ある特定の実施形態では、操作された切断ハーフドメインは、位置４８６、４９９および４９６に変異（野性型ＦｏｋＩに対して番号付け）、例えば、位置４８６の野性型Ｇｌｎ（Ｑ）残基をＧｌｕ（Ｅ）残基で置換する変異、位置４９９の野性型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｅｕ（Ｌ）残基で置換する変異、および位置４９６の野性型Ａｓｎ（Ｎ）残基をＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）残基（それぞれ、「ＥＬＤ」および「ＥＬＥ」ドメインとも呼ばれる）で置換する変異を含む。他の実施形態では、操作された切断ハーフドメインは、位置４９０、５３８および５３７（野性型ＦｏｋＩに対して番号付け）に変異、例えば、位置４９０の野性型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で置換する変異、位置５３８の野性型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で置換する変異、および位置５３７の野性型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基で置換する変異（それぞれ、「ＫＫＫ」および「ＫＫＲ」ドメインとも呼ばれる）を含む。他の実施形態では、操作された切断ハーフドメインは、位置４９０および５３７（野性型ＦｏｋＩに対して番号付け）に変異、例えば、位置４９０の野性型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で置換する変異、および位置５３７の野性型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基で置換する変異（それぞれ、「ＫＩＫ」および「ＫＩＲ」ドメインとも呼ばれる）を含む。（米国特許出願第１２／９３１，６６０号を参照）。
【００８７】
本明細書記載の操作された切断ハーフドメインは、任意の適切な方法、例えば、米国特許公開第２００５００６４４７４号に記載のように、野性型切断ハーフドメイン（ＦｏｋＩ）の部位特異的変異誘発を使って調製可能である。
【００８８】
Ｃ．追加の標的切断方法
任意のＲｏｓａ遺伝子中に標的部位を有するいずれかのヌクレアーゼは、本明細書で開示の方法に使用可能である。例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼは、非常に長い認識配列を有し、その内の一部は、統計的原則に基づくと、ヒト大のゲノム中に１回は存在する可能性がある。Ｒｏｓａ遺伝子中に標的部位を有するこのようなヌクレアーゼのいずれかは、ジンクフィンガーヌクレアーゼの代わりに、またはそれに追加して、標的切断の目的で使用可能である。
【００８９】
代表的ホーミングエンドヌクレアーゼには、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩおよびＩ−ＴｅｖＩＩＩ、が含まれる。それらの認識配列は既知である。また、米国特許第５、４２０、０３２号；同６、８３３、２５２号；Ｂｅｌｆｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３７９−３３８８；Ｄｕｊｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｇｅｎｅ  ８２：１１５−１１８；Ｐｅｒｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２、１１２５−１１２７；Ｊａｓｉｎ（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１２：２２４−２２８；Ｇｉｍｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：１６３−１８０；Ａｒｇａｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８０：３４５−３５３およびｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓカタログ、も参照のこと。
【００９０】
大抵のホーミングエンドヌクレアーゼの切断特異性は、認識部位の点では絶対的ではないが、部位は、哺乳類サイズのゲノム当たりの単一切断イベントを、単一コピーの認識部位を含む細胞中でホーミングエンドヌクレアーゼを発現することにより得ることができる充分な長さである。また、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼの特異性は、操作することにより、非天然標的部位に結合できることも報告されている。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ１０：８９５−９０５；Ｅｐｉｎａｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：２９５２−２９６２；Ａｓｈｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  ４４１：６５６−６５９；Ｐａｑｕｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：４９−６６、を参照。
【００９１】
送達
本明細書記載のＺＦＮは、例えば、ＺＦＮ  ｍＲＮＡの注入等のいずれかの適切な手段により標的細胞に送達可能である。Ｈａｍｍｅｒｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５９：８７−１１５、を参照のこと。
【００９２】
ジンクフィンガー含有タンパク質の送達方法は、例えば、米国特許第６，４５３，２４２号；同６，５０３，７１７号；同６，５３４，２６１号；同６，５９９，６９２号；同６，６０７，８８２号；同６，６８９，５５８号；同６，８２４，９７８号；同６，９３３，１１３号；同６，９７９，５３９号；同７，０１３，２１９号；および同７，１６３，８２４号に記載されており、これら全ての本開示は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【００９３】
本明細書記載のＺＦＮは、また、１つまたは複数のＺＦＮをコードする配列を含むベクターを使って送達可能である。任意のベクター系が使用可能で、限定されないが、プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター；ヘルペスウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクター、等が含まれる。また、米国特許第６，５３４，２６１号；同６，６０７，８８２号；同６，８２４，９７８号；同６，９３３，１１３号；同６，９７９，５３９号；同７，０１３，２１９号；および同７，１６３，８２４号を参照のこと。これらは、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。さらに、これらのベクターのいずれかが、１つまたは複数のＺＦＮコード化配列を含むことができるのは明らかであろう。従って、１つまたは複数の対のＺＦＮが細胞中に導入される場合、ＺＦＮは、同じベクターで運ばれても、または異なるベクターで運ばれてもよい。複数のベクターが使用される場合は、それぞれのベクターは、１つまたは複数のＺＦＮをコードする配列を含んでもよい。
【００９４】
従来のウイルスおよび非ウイルス系遺伝子移入方法は、操作されたＺＦＰをコードする核酸を細胞中に導入するのに使用可能である。このような方法は、また、ＺＦＰをコードする核酸を細胞にインビトロで投与するためにも使うことができる。ある特定の実施形態では、ＺＦＰをコードする核酸が、インビボまたはエクスビボでの使用のために投与される。
【００９５】
非ウイルスベクター送達システムには、電気穿孔、リポフェクション、微量注入、遺伝子銃、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡ、人工ウイルス粒子、およびＤＮＡの試薬増強取込が含まれる。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ  ２０００  ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｉｃｈ−Ｍａｒ）を使ったソノポレーションは、また、核酸の送達に使用可能である。ウイルスベクター送達システムには、ＤＮＡおよびＲＮＡウイルスが含まれ、これは、細胞に送達後、エピソームまたは統合ゲノムのいずれかを有する。追加の代表的核酸送達システムには、Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍａｘｃｙｔｅ、Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）、ＢＴＸ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃ、（例えば、米国特許第６００８３３６号参照）により提供されるものが含まれる。リポフェクションについては、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号，同４，９４６，７８７号；および同４，８９７，３５５号に記載されている。またリポフェクション試薬は、市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的受容体認識リポフェクションに適切な陽イオン性および中性脂質には、Ｆｅｌｇｎｅｒ、国際公開第９１／１７４２４号、同９１／１６０２４号のものが含まれる。送達は、細胞（エクスビボで投与）に対しても、または標的組織（インビボで投与）に対して行ってもよい。標的リポソーム、例えば、免疫脂質（ｉｍｍｕｎｏｌｉｐｉｄ）複合体を含む脂質：核酸複合体の調製は、当業者にはよく知られている（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４０４−４１０（１９９５）；Ｂｌａｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：２９１−２９７（１９９５）；Ｂｅｈｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：３８２−３８９（１９９４）；Ｒｅｍｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：６４７−６５４（１９９４）；Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２：７１０−７２２（１９９５）；Ａｈｍａｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：４８１７−４８２０（１９９２）；米国特許第４，１８６，１８３号、同４，２１７，３４４号、同４，２３５，８７１号、同４，２６１，９７５号、同４，４８５，０５４号、同４，５０１，７２８号、同４，７７４，０８５号、同４，８３７，０２８号、および同４，９４６，７８７号を参照）。
【００９６】
追加の送達方法には、ＥｎＧｅｎｅＩＣ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｖｅｈｉｃｌｅ（ＥＤＶ）に送達する核酸のパッケージングの使用が含まれる。これらのＥＤＶは、１つの抗体のアームが標的組織に対する特異性を有し、もう一方がＥＤＶに対し特異性を有する二重特異性抗体を使って、特異的に標的組織に送達される。抗体は、ＥＤＶを標的細胞表面に運び、次に、ＥＤＶがエンドサイトーシスにより細胞中に取り込まれる。細胞中に入るとすぐに、含有物が放出される（ＭａｃＤｉａｒｍｉｄ  ｅｔ  ａｌ（２００９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ  ２７（７）ｐ．６４３、を参照）。
【００９７】
上記したように、開示された方法と組成物はあらゆるタイプの細胞に使用可能である。動物細胞の子孫、変異体および誘導体にも使用できる。
【００９８】
応用
開示された方法と組成物は、いずれのＲｏｓａ遺伝子または複数遺伝子のゲノム編集にも使用可能である。ある特定の応用では、この方法と組成物は、ゲノムＲｏｓａ配列の不活化に使用できる。他の応用では、この方法と組成物は、未編集遺伝子またはヒト化遺伝子の組込みに比較して、異なる発現を有する新規対立遺伝子型の遺伝子の生成を含む、ランダム変異の生成を可能とし、これが、次に、動物モデルの生成を可能とする。他の応用では、この方法と組成物は、遺伝子の決められた位置でのランダム変異を生成するため使用でき、これにより、新規対立遺伝子型のそれらの遺伝子を有する動物の同定または選択が可能となる。他の応用では、この方法と組成物は、外因性の（ドナー）配列の任意のゲノムの選択領域、例えば、マウスまたはラットＲｏｓａ遺伝子中への標的組込みを可能とする。調節配列（例えば、プロモーター）を、標的の手法で対象部位に組み込むことができる。「組込み」は、（例えば、宿主細胞のゲノム中への）物理的挿入および、核酸複製プロセスを介したドナー配列の宿主細胞ゲノム中への複写による組込みの両方が意図される。ドナー配列は、また、核酸、例えば、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等を含んでもよい。これらの小分子核酸ドナーは、ゲノム内の対象遺伝子に与えるそれらの効果を調査するために使用できる。追加の対象ドナー配列は、疾患モデルに関連するタンパク質をコードするヒト遺伝子であってもよい。このような遺伝子の非制限的例には、ヒト因子ＶＩＩＩおよびヒト因子ＩＸが含まれる。従って、これらの遺伝子のＲｏｓａ遺伝子座中への挿入が、研究者がこれらタンパク質をより詳細にインビボで調査することを可能とする。動物遺伝子のゲノム編集（例えば、不活性化、組込みおよび／または標的またはランダム変異）は、例えば、単一切断イベント、切断に続く非相同末端結合、切断に続く相同指向修復機序、切断に続くドナー配列の物理的組込み、２つの部位の切断に続く２つの切断部位間の配列削除のための結合、ミスセンスまたは非センスコドンのコード領域中への標的組換え、遺伝子または調節領域を破壊するための無関係の配列（すなわち、「詰め物（ｓｔｕｆｆｅｒ）」配列）の遺伝子またはその調節領域中への標的組換え、または転写物のミススプライシングを起こすためのスプライス受容体配列のイントロン中への標的組換え、により達成可能である。米国特許公開第２００３０２３２４１０号；同２００５０２０８４８９号；同２００５００２６１５７号；同２００５００６４４７４号；同２００６０１８８９８７号；同２００６００６３２３１号；および国際公開第０７／０１４２７５号、を参照のこと。これらの開示は、参照によってその全体が組み込まれる。
【００９９】
Ｒｏｓａ遺伝子のＺＦＮ媒介ゲノム編集に関しては、種々の応用がある。本明細書記載の方法と組成物は、ヒト疾患モデルの生成を可能とする。例えば、ｐ５３遺伝子の編集により、癌調査および癌治療試験のための動物モデルを提供する「癌ラット」の生成が可能となる。
【実施例】
【０１００】
実施例１：ラットゲノムのｒＲｏｓａ２６核酸領域への標的組込み用制限断片長多型（ＲＦＬＰ）ドナー核酸の構築
また、ＮｏｔＩおよびＰｍｅＩ  ＲＦＬＰ部位のラットゲノムのｒＲｏｓａ２６領域への標的組込み用にプラスミドも構築した。プラスミドの設計および構築については、上記した。ｒＲｏｓａ２６相同性領域の増幅に使用したＰＣＲプライマー対を表１に示す。
【表１】
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【０１０１】
ラットＲｏｓａ２６の表示した標的部位を標的としたジンクフィンガー設計を表２と３に示す。ＺＦＰ認識ヘリックスにより接触される標的部位中のヌクレオチドを大文字、非接触ヌクレオチドを小文字で示す。
【表２】
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【表３】
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【０１０２】
ラットＣ６細胞は、ＧＦＰ対照またはＺＦＮの各８対を形質移入された。形質移入の一日後、その細胞ＤＮＡを調製した。ＺＦＮ切断を、例えば、米国特許公開第２００８００１５１６４号；同２００８０１３１９６２号および同２００８０１５９９９６号に記載のように、それぞれのプライマーで増幅した産物を使って、Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（商標）ヌクレアーゼでアッセイした。結果を図１に示す。矢印で示している切断は、ＺＦＮ対を含む試料でのみ認められ、ＧＦＰ特異的ＺＦＮを形質移入した細胞を有する対照試料では認められなかった。
【０１０３】
実施例２：マウスＲｏｓａ２６遺伝子座特異的ジンクフィンガーヌクレアーゼ
マウスＲｏｓａ２６の表示標的部位を標的にしたジンクフィンガー設計を表４と５に示す。ＺＦＰ認識ヘリックスにより接触される標的部位中のヌクレオチドを大文字、非接触ヌクレオチドを小文字で示す。
【表４】
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【表５】
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【０１０４】
ＺＦＮ対１８４７３／１８４７７および１８４７３／２５０９６に対し上述のようにＣｅｌ−Ｉ分析を行い、認められたパーセントＮＨＥＪは、次の通りであった：ＺＦＮ対１８４７７／１８４７３では２６．５％ＮＨＥＪ、およびＺＦＮ対１８４７３／２５０９６では３５．７０％ＮＨＥＪ。
【０１０５】
実施例３：ドナーポリヌクレオチドのマウスゲノムのＲｏｓａ２６遺伝子座への標的組込み
次のオリゴヌクレオチドを使って作ったＰＣＲ産物のクローニングによりＲｏｓａドナーを構築した：５２７ｂｐ左アームに対しては、ＰＣＲ用に使用したオリゴヌクレオチドは、５’−ｇｇｃ  ｔｃｇ  ａｇｔ  ｇａｇ  ｔｃａ  ｔｃａ  ｇａｃ  ｔｔｃ  ｔａａ  ｇａｔ  ｃａｇ  ｇ−３’（配列番号３１）；４１３ｂｐ左アームドナーに対しては、逆方向プライマー５’−ｃｔｇ  ａａｔ  ｔｃｇ  ａａｔ  ｇｇｇ  ｃｇｇ  ｇａｇ  ｔｃｔ  ｔｃｔ  ｇｇｇ  ｃａ−３’（配列番号３３）と組み合わせた５’−ｇｇｃ  ｔｃｇ  ａｇｔ  ｔｔｔ  ｇａｔ  ａａｇ  ｇｃｔ  ｇｃａ  ｇａａ  ｇ−３’（配列番号３２）であった。
【０１０６】
６４０ｂｐ右アームに対しては、ＰＣＲ用に使用したオリゴヌクレオチドは、５’−ｃｃａ  ａｇｃ  ｔｔｇ  ｇａｇ  ｇｔａ  ｇｇｔ  ｇｇｇ  ｇｔｇ  ａｇｇ−３’（配列番号３４）；２００ｂｐアームに対しては、５’−ｃｃａ  ａｇｃ  ｔｔａ  ｇｔｃ  ｇｃｔ  ｃｔｇ  ａｇｔ  ｔｇｔ  ｔａｔ  ｃ−３’（配列番号３５）；１００ｂｐアームに対しては、逆方向プライマー５’−ｃａｔ  ｔｃｇ  ａａｔ  ｔｃａ  ｇａａ  ａｇａ  ｃｔｇ  ｇａｇ  ｔｔｇ  ｃａｇ  ａｔｃ−３’（配列番号３７）と組み合わせた５’−ｃｃａ  ａｇｃ  ｔｔｔ  ｃｔｇ  ｇｇａ  ｇｔｔ  ｃｔｃ  ｔｇｃ  ｔｇｃ  ｃ−３’（配列番号３６）であった。個別アームアンプリコンを、融合ＰＣＲにより連結し、クローニングして種々の相同性のアームを有するドナーを産生した。Ａｍａｘａ−Ｓｈｕｔｔｌｅ  Ｎｅｕｒｏ２ａ高効率プロトコルを使って、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞（２００、０００）を、２μｇのＳＦ溶液中の表示したドナーと一緒に、各４００ｎｇのＳＢＳ１８４７３および１８４７７で同時形質移入した。
【０１０７】
形質移入の７２時間後、ゲノムＤＮＡを採取し、１００ｎｇを使って、５’−ｃｃｃａｇｃｔａｃａｇｃｃｔｃｇａｔｔｔ−３’、５’−ｃａｃａａａｔｇｇｃｇｔｇｔｔｔｔｇｇｔ−３’および試料当たり５μＣｉの３２Ｐ−ｄＡＴＰと３２Ｐ−ｄＣＴＰの両方を用いて、アニール温度６８℃（７２℃で２分追加）、２８サイクルでＰＣＲを行った。Ｇ−５０カラム精製の後、各５０μＬ反応物の内１０μＬを、ＥｃｏＲＩを使い３７℃で２時間消化し、１０％ポリアクリルアミドゲルに供した。
【０１０８】
図２に示すように、ドナーヌクレオチドが表示した頻度でＲｏｓａ遺伝子座中に挿入された。
【０１０９】
本明細書で取り上げた全特許、特許出願および出版物は、本明細書により、参照によってその全体が組み込まれる。
【０１１０】
明確な理解を目的として、説明と例を用いて幾分詳細に開示を提供してきたが、本開示の精神や範囲から逸脱することなく、種々の変更と改変を行い得ることは当業者には明らかであろう。従って、前出の記載と例は、限定するものと解釈されるべきではない。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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