(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞に形態変化を生じさせる化学物質のスクリーニング方法であって、
（ａ）細胞にスクリーニング対象である第１の化学物質を接触させる工程と、
（ｂ）前記第１の化学物質を接触させた細胞を時系列に撮像した複数の画像を読み込む工程と、
（ｃ）前記（ｂ）における前記画像に含まれる各々の細胞の形態的な特徴を示す特徴値を前記画像からそれぞれ求める工程と、
（ｄ）各々の前記画像に対応する前記特徴値の度数分布である統計処理データをそれぞれ求める工程と、（ｅ）前記画像間での前記統計処理データの変化に基づいて、前記第１の化学物質を接触させた細胞の形態変化を評価する評価情報を生成する工程と、
を含むことを特徴とする化学物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
前記（ｅ）の後、
（ｆ）前記第１の化学物質を接触させた細胞に、更に前記第１の化学物質又は前記第１の化学物質に該当しないスクリーニング対象である追加化学物質を接触させる工程と、
（ｇ）前記追加化学物質を接触させた細胞を時系列に撮像した複数の画像を読み込む工程と、
（ｈ）前記（ｇ）における前記画像に含まれる各々の細胞の形態的な特徴を示す特徴値を前記画像からそれぞれ求める工程と、
（ｉ）各々の前記画像に対応する前記特徴値の度数分布である統計処理データをそれぞれ求める工程と、（ｊ）前記画像間での前記統計処理データの変化に基づいて、前記追加化学物質を接触させた細胞の形態変化を評価する評価情報を生成する工程と、
（ｋ）前記追加化学物質を接触させた細胞における前記評価情報に基づき、（ｆ）〜（ｊ）を繰り返すか否かを判断する工程と、
を少なくとも１回繰り返す工程を含む請求項１に記載の化学物質のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記第１の化学物質及び前記追加化学物質が、それぞれ独立して、低分子化合物、抗体、タンパク質、ペプチド、アンチセンス核酸、リボザイム、ｓｈＲＮＡ及びｓｉＲＮＡからなる群より選ばれる少なくとも１つである請求項１又は２に記載の化学物質のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記第１の化学物質がｓｉＲＮＡである請求項３に記載の化学物質のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記第１の化学物質が低分子化合物である請求項３に記載の化学物質のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記（ｅ）及び前記（ｊ）は、前記画像間での前記度数分布の差分を用いて、前記評価情報を生成する工程である請求項２〜５のいずれか一項に記載の化学物質のスクリーニング方法。
【請求項７】
前記（ｃ）及び前記（ｈ）は、各々の前記画像について複数種類の前記特徴値を求める工程であり、前記（ｄ）及び前記（ｉ）は、前記特徴値の種類ごとにそれぞれ前記度数分布を求める工程であり、前記（ｅ）及び前記（ｊ）は、複数種類の前記度数分布の変化の情報を用いて、前記評価情報を生成する工程である請求項２〜６のいずれか一項に記載の化学物質のスクリーニング方法。
【請求項８】
前記（ｄ）及び前記（ｉ）は、各々の前記度数分布における度数の区分を、前記特徴値の種類ごとの標準偏差を用いてそれぞれ正規化する工程である請求項７に記載の化学物質のスクリーニング方法。
【請求項９】
前記（ｅ）及び前記（ｊ）は、前記画像の撮影時間及び前記特徴値の種類がそれぞれ異なる複数の前記度数分布の組み合わせのうちから、前記評価情報の生成に用いる前記度数分布の組み合わせを抽出し、前記評価情報の計算モデルを求める工程である請求項７または８に記載の化学物質のスクリーニング方法。
【請求項１０】
前記（ｅ）及び前記（ｊ）は、教師付き学習により前記計算モデルを求める工程である請求項９に記載の化学物質のスクリーニング方法。
【請求項１１】
細胞に形態変化を生じさせる化学物質又は前記化学物質を含む医薬組成物の製造方法であって、
（ｌ）請求項１〜１０のいずれか一項に記載のスクリーニング方法により細胞に形態変化を生じさせる化学物質を選択する工程と、
（ｍ）選択された化学物質又は前記化学物質を含む医薬組成物を製造する工程と、
を含むことを特徴とする化学物質又は前記化学物質を含む医薬組成物の製造方法。
【請求項１２】
細胞に形態変化を生じさせる化学物質又は前記化学物質を含む医薬組成物の製造方法であって、
（ｌ）請求項１〜１０のいずれか一項に記載のスクリーニング方法により細胞に形態変化を生じさせる化学物質を選択する工程と、
（ｎ）選択された化学物質の構造を最適化する工程と、
（ｏ）最適化された化学物質又は前記化学物質を含む医薬組成物を製造する工程と、
を含むことを特徴とする化学物質又は前記化学物質を含む医薬組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞に形態変化を生じさせる化学物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、細胞を用いた生理活性物質のハイスループットスクリーニングには、単純な系が用いられていた。例えば、抗癌作用を示す低分子化合物のスクリーニング方法の多くには、ＭＴＴ（Ｍｅｔｈｙｌ ｔｈｉａｚｏｌｙｌ ｔｅｔｒａｚｏｒｉｕｍ）アッセイやａｌａｍａｒＢｌｕｅアッセイといった１つのウェル内における細胞の生存数を定量し、生存率を算出する方法が用いられていた。
【０００３】
近年、創薬ターゲットのスクリーニング方法や低分子化合物のスクリーニング方法は、機器やイメージング技術の発展と共に複雑化している。顕微鏡技術がスクリーニングに応用されるようになり、１種類の細胞から複数のパラメータについて解析が行われるようになってきている。このようなスクリーニング方法をＨｉｇｈ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ（以下、ＨＣＳ）という（非特許文献１参照）。
【０００４】
ＨＣＳは、細胞内の複数のターゲットを多重蛍光染色し、これらの蛍光を同時に解析することにより、細胞における複数の現象を指標とするスクリーニング方法である。この方法によれば、細胞が有する特定の機能に作用する生理活性物質に着目することにより、薬効を示すものをスクリーニングすることができる。よって、ＨＣＳは、単に毒性のみを指標とするスクリーニング方法に比べて、副作用やオフターゲット等を排除できる観点から優れている。
【０００５】
ＨＣＳは、細胞に形態変化を生じさせるような薬剤の探索、または形態変化に関与する遺伝子の探索に好適に用いられる。細胞の形態変化は、例えば細胞骨格に関与する分子や細胞周期における分裂期に関与する分子に薬剤等を作用させることにより観察される（非特許文献２、非特許文献３参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｋｒａｕｓｚ、Ｍｏｌ．ＢｉｏＳｙｓｔ．、第３巻、第２３２〜２４０頁、２００７年
【非特許文献２】Ｋｉｇｅｒら、Ｊ  Ｂｉｏｌ、第２巻、第２７．１〜２７．１５頁、２００３年
【非特許文献３】Ｎｅｕｍａｎｎら、Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．、第３巻、第３８５〜３９０頁、２００６年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
非特許文献２に挙げられている形態変化に関与する分子のスクリーニング方法は、細胞を固定化し、蛍光染色する方法である。蛍光染色は一定のコストがかかるため、膨大な数の低分子化合物ライブラリーやｓｉＲＮＡライブラリーを用いる場合にはコスト面で難がある。
また、染色の過程で生じる染色ムラがスクリーニング結果に影響を与える可能性がある。さらに、蛍光色素を細胞内に導入するためには、細胞を固定化する必要があるため、時間経過を解析したい場合には、サンプルの数を増やさなければならず、手間である。
【０００８】
これに対し、非特許文献３では、細胞にＧＦＰ（
Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）を融合させたＨｉｓｔｏｎｅ  Ｈ２ＢをＨｅＬａ細胞に安定化発現させた細胞株を作製し、導入した蛍光タンパク質の挙動を指標にタイムラプス解析をする方法が挙げられている。
しかしながら、この方法は、安定性発現株の作製が必須であるため、遺伝子導入に適していない細胞をスクリーニングに用いることができず、多種類の細胞をスクリーニングに用いる場合に適していない。
【０００９】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、細胞を固定、染色することなく、安価で迅速な解析を可能とする、細胞に形態変化を生じさせる化学物質のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記の課題を解決するため、鋭意研究を行った結果、後記する構成を有する解析装置を用いることにより課題を解決できることを見出した。すなわち本発明は、下記（１）〜（１３）を提供するものである。
（１）本発明の化学物質のスクリーニング方法は、細胞に形態変化を生じさせる化学物質のスクリーニング方法であって、
（ａ）細胞にスクリーニング対象である第１の化学物質を接触させる工程と、
（ｂ）前記第１の化学物質を接触させた細胞を時系列に撮像した複数の画像を読み込む工程と、
（ｃ）前記（ｂ）における前記画像に含まれる各々の細胞の形態的な特徴を示す特徴値を前記画像からそれぞれ求める工程と、
（ｄ）各々の前記画像に対応する前記特徴値の度数分布である統計処理データをそれぞれ求める工程と、（ｅ）前記画像間での前記統計処理データの変化に基づいて、前記第１の化学物質を接触させた細胞の形態変化を評価する評価情報を生成する工程と、
を含むことを特徴とする。
（２）本発明の化学物質のスクリーニング方法は、前記（ｅ）の後、
（ｆ）前記第１の化学物質を接触させた細胞に、更に前記第１の化学物質又は前記第１の化学物質に該当しないスクリーニング対象である追加化学物質を接触させる工程と、
（ｇ）前記追加化学物質を接触させた細胞を時系列に撮像した複数の画像を読み込む工程と、
（ｈ）前記（ｇ）における前記画像に含まれる各々の細胞の形態的な特徴を示す特徴値を前記画像からそれぞれ求める工程と、
（ｉ）各々の前記画像に対応する前記特徴値の度数分布である統計処理データをそれぞれ求める工程と、（ｊ）前記画像間での前記統計処理データの変化に基づいて、前記追加化学物質を接触させた細胞の形態変化を評価する評価情報を生成する工程と、
（ｋ）前記追加化学物質を接触させた細胞における前記評価情報に基づき、（ｆ）〜（ｊ）を繰り返すか否かを判断する工程と、
を少なくとも１回繰り返す工程を含むことが好ましい。
（３）本発明の化学物質のスクリーニング方法は、前記第１の化学物質及び前記追加化学物質が、それぞれ独立して、低分子化合物、抗体、タンパク質、ペプチド、アンチセンス核酸、リボザイム、ｓｈＲＮＡ及びｓｉＲＮＡからなる群より選ばれる少なくとも１つであることが好ましい。
（４）本発明の化学物質のスクリーニング方法は、前記第１の化学物質がｓｉＲＮＡであることが好ましい。
（５）本発明の化学物質のスクリーニング方法は、前記第１の化学物質が低分子化合物であることが好ましい。
（６）本発明の化学物質のスクリーニング方法は、前記（ｅ）及び前記（ｊ）が、前記画像間での前記度数分布の差分を用いて、前記評価情報を生成する工程であることが好ましい。
【００１１】
（８）本発明の化学物質のスクリーニング方法は、前記（ｃ）及び前記（ｈ）が、各々の前記画像について複数種類の前記特徴値を求める工程であり、前記（ｄ）及び前記（ｉ）が、前記特徴値の種類ごとにそれぞれ前記度数分布を求める工程であり、前記（ｅ）及び前記（ｊ）が、複数種類の前記度数分布の変化の情報を用いて、前記評価情報を生成する工程であることが好ましい。
（９）本発明の化学物質のスクリーニング方法は、前記（ｄ）及び前記（ｉ）が、各々の前記度数分布における度数の区分を、前記特徴値の種類ごとの標準偏差を用いてそれぞれ正規化する工程であることが好ましい。
（１０）本発明の化学物質のスクリーニング方法は、前記（ｅ）及び前記（ｊ）が、前記画像の撮影時間及び前記特徴値の種類がそれぞれ異なる複数の前記度数分布の組み合わせのうちから、前記評価情報の生成に用いる前記度数分布の組み合わせを抽出し、前記評価情報の計算モデルを求める工程であることが好ましい。
（１１）本発明の化学物質のスクリーニング方法は、前記（ｅ）及び前記（ｊ）が、教師付き学習により前記計算モデルを求める工程であることが好ましい。
（１２）本発明の化学物質又は前記化学物質を含む医薬組成物の製造方法は、細胞に形態変化を生じさせる化学物質又は前記化学物質を含む医薬組成物の製造方法であって、
（ｌ）先に記載のスクリーニング方法により細胞に形態変化を生じさせる化学物質を選択する工程と、
（ｍ）選択された化学物質又は前記化学物質を含む医薬組成物を製造する工程と、
を含むことを特徴とする。
（１３）本発明の化学物質又は前記化学物質を含む医薬組成物の製造方法は、細胞に形態変化を生じさせる化学物質又は前記化学物質を含む医薬組成物の製造方法であって、
（ｌ）先に記載のスクリーニング方法により細胞に形態変化を生じさせる化学物質を選択する工程と、
（ｎ）選択された化学物質の構造を最適化する工程と、
（ｏ）最適化された化学物質又は前記化学物質を含む医薬組成物を製造する工程と、
を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、細胞を固定、染色することなく、安価で迅速な解析を可能とする、細胞に形態変化を生じさせる化学物質のスクリーニング方法を提供することができる。
本発明の化学物質のスクリーニング方法は、非破壊の系であるため、タイムラプス解析に好適に用いられ、かつスクリーニングに用いたサンプルそのものを別の評価系に供することができ、スクリーニング結果を別の系から評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明に用いられるインキュベータの概要を示すブロック図である。
【図２】本発明に用いられるインキュベータの正面図である。
【図３】本発明に用いられるインキュベータの平面図である。
【図４】インキュベータでの観察動作の一例を示す流れ図である。
【図５】計算モデルの生成処理の一例を示す流れ図である。
【図６】各特徴値の概要を示す図である。
【図７】（ａ）〜（ｃ）：「Ｓｈａｐｅ Ｆａｃｔｏｒ」の経時的変化の例を示すヒストグラム、（ｄ）〜（ｆ）：「Ｆｉｂｅｒ Ｌｅｎｇｔｈ」の経時的変化の例を示すヒストグラムである。
【図８】（ａ）〜（ｃ）：正常な細胞群をタイムラプス観察した顕微鏡画像を示す図である。
【図９】（ａ）〜（ｃ）：正常な細胞にがん細胞を混在した細胞群をタイムラプス観察した顕微鏡画像を示す図である。
【図１０】ＡＮＮの概要を示す図である。
【図１１】ＦＮＮの概要を示す図である。
【図１２】ＦＮＮにおけるシグモイド関数を示す図である。
【図１３】培養状態評価処理の動作例を示す流れ図である。
【図１４】本発明のスクリーニング方法の一態様を示したフローチャート図である。
【図１５】本発明のスクリーニング方法及び従来のスクリーニング方法の一態様を示したフローチャート図である。
【図１６】本発明のスクリーニング方法の一態様を示したフローチャート図である。
【図１７】実施例における正常な細胞又はｐ５３を標的とするｓｉＲＮＡを処理した細胞をタイムラプス観察した顕微鏡画像、及びこれらの画像に基づいて解析された「Ｌｅｎｇｔｈ」の経時的変化を示すヒストグラムである。
【図１８】実施例におけるｐ５３を標的とするｓｉＲＮＡを処理した細胞の各時間後のｐ５３及びＲｈｏＡのｍＲＮＡの発現レベルについて、０時間を１とした時の相対値を示したグラフである。
【図１９】実施例におけるＲｈｏＡを標的とするｓｉＲＮＡを処理した細胞、及びネガティブコントロールをタイムラプス観察した顕微鏡画像である。
【図２０】実施例におけるＲｈｏＡを標的とするｓｉＲＮＡを処理した細胞、及びネガティブコントロールをタイムラプス観察した顕微鏡画像である。
【図２１】実施例におけるＲｈｏＡを標的とするｓｉＲＮＡを処理した細胞、又はネガティブコントロールをタイムラプス観察した顕微鏡画像、及びこれらの画像に基づいて解析された「円形度」の経時的変化を示すヒストグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
≪培養状態評価装置≫
本発明の化学物質のスクリーニング方法において、細胞に形態変化を生じさせる化学物質を接触させた後の工程（ｂ）〜（ｅ）及び（ｇ）〜（ｋ）は、これらの工程を組み込んだ培養状態評価装置を用いて行われる。よって、まず前記培養状態評価装置を含むインキュベータについて説明する。
【００１５】
図１は、本発明に用いられるインキュベータの概要を示すブロック図である。また、図２、図３は、本発明に用いられるインキュベータの正面図および平面図である。
【００１６】
本発明に用いられるインキュベータ１１は、上部ケーシング１２と下部ケーシング１３とを有している。インキュベータ１１の組立状態において、上部ケーシング１２は下部ケーシング１３の上に載置される。なお、上部ケーシング１２と下部ケーシング１３との内部空間は、ベースプレート１４によって上下に仕切られている。
【００１７】
まず、上部ケーシング１２の構成の概要を説明する。上部ケーシング１２の内部には、細胞の培養を行う恒温室１５が形成されている。この恒温室１５は温度調整装置１５ａおよび湿度調整装置１５ｂを有しており、恒温室１５内は細胞の培養に適した環境（例えば温度３７℃、湿度９０％の雰囲気）に維持されている（なお、図２、図３での温度調整装置１５ａ、湿度調整装置１５ｂの図示は省略する）。
【００１８】
恒温室１５の前面には、大扉１６、中扉１７、小扉１８が配置されている。大扉１６は、上部ケーシング１２および下部ケーシング１３の前面を覆っている。中扉１７は、上部ケーシング１２の前面を覆っており、大扉１６の開放時に恒温室１５と外部との環境を隔離する。小扉１８は、細胞を培養する培養容器１９を搬出入するための扉であって、中扉１７に取り付けられている。この小扉１８から培養容器１９を搬出入することで、恒温室１５の環境変化を抑制することが可能となる。なお、大扉１６、中扉１７、小扉１８は、パッキンＰ１，Ｐ２，Ｐ３によりそれぞれ気密性が維持されている。
【００１９】
また、恒温室１５には、ストッカー２１、観察ユニット２２、容器搬送装置２３、搬送台２４が配置されている。ここで、搬送台２４は、小扉１８の手前に配置されており、培養容器１９を小扉１８から搬出入する。
【００２０】
ストッカー２１は、上部ケーシング１２の前面（図３の下側）からみて恒温室１５の左側に配置される。ストッカー２１は複数の棚を有しており、ストッカー２１の各々の棚には培養容器１９を複数収納することができる。なお、各々の培養容器１９には、培養の対象となる細胞が培地とともに収容されている。
【００２１】
観察ユニット２２は、上部ケーシング１２の前面からみて恒温室１５の右側に配置される。この観察ユニット２２は、培養容器１９内の細胞のタイムラプス観察を実行することができる。
【００２２】
ここで、観察ユニット２２は、上部ケーシング１２のベースプレート１４の開口部に嵌め込まれて配置される。観察ユニット２２は、試料台３１と、試料台３１の上方に張り出したスタンドアーム３２と、位相差観察用の顕微光学系および撮像装置（３４）を内蔵した本体部分３３とを有している。そして、試料台３１およびスタンドアーム３２は恒温室１５に配置される一方で、本体部分３３は下部ケーシング１３内に収納される。
【００２３】
試料台３１は透光性の材質で構成されており、その上に培養容器１９を載置することができる。この試料台３１は水平方向に移動可能に構成されており、上面に載置した培養容器１９の位置を調整できる。また、スタンドアーム３２にはＬＥＤ光源３５が内蔵されている。そして、撮像装置３４は、スタンドアーム３２によって試料台３１の上側から透過照明された培養容器１９の細胞を、顕微光学系を介して撮像することで細胞の顕微鏡画像を取得できる。
【００２４】
容器搬送装置２３は、上部ケーシング１２の前面からみて恒温室１５の中央に配置される。この容器搬送装置２３は、ストッカー２１、観察ユニット２２の試料台３１および搬送台２４との間で培養容器１９の受け渡しを行う。
【００２５】
図３に示すように、容器搬送装置２３は、多関節アームを有する垂直ロボット３４と、回転ステージ３５と、ミニステージ３６と、アーム部３７とを有している。回転ステージ３５は、垂直ロボット３４の先端部に回転軸３５ａを介して水平方向に１８０°回転可能に取り付けられている。そのため、回転ステージ３５は、ストッカー２１、試料台３１および搬送台２４に対して、アーム部３７をそれぞれ対向させることができる。
【００２６】
また、ミニステージ３６は、回転ステージ３５に対して水平方向に摺動可能に取り付けられている。ミニステージ３６には培養容器１９を把持するアーム部３７が取り付けられている。
【００２７】
次に、下部ケーシング１３の構成の概要を説明する。下部ケーシング１３の内部には、観察ユニット２２の本体部分３３や、インキュベータ１１の制御装置４１が収納されている。
【００２８】
制御装置４１は、温度調整装置１５ａ、湿度調整装置１５ｂ、観察ユニット２２および容器搬送装置２３とそれぞれ接続されている。この制御装置４１は、所定のプログラムに従ってインキュベータ１１の各部を統括的に制御する。
【００２９】
一例として、制御装置４１は、温度調整装置１５ａおよび湿度調整装置１５ｂをそれぞれ制御して恒温室１５内を所定の環境条件に維持する。また、制御装置４１は、所定の観察スケジュールに基づいて、観察ユニット２２および容器搬送装置２３を制御して、培養容器１９の観察シーケンスを自動的に実行する。さらに、制御装置４１は、観察シーケンスで取得した画像に基づいて、細胞の培養状態の評価を行う培養状態評価処理を実行する。
【００３０】
ここで、制御装置４１は、ＣＰＵ４２および記憶部４３を有している。ＣＰＵ４２は、制御装置４１の各種の演算処理を実行するプロセッサである。また、ＣＰＵ４２は、プログラムの実行によって、特徴値演算部４４、度数分布演算部４５、評価情報生成部４６としてそれぞれ機能する（なお、特徴値演算部４４、度数分布演算部４５、評価情報生成部４６の動作については後述する）。
【００３１】
記憶部４３は、ハードディスクや、フラッシュメモリ等の不揮発性の記憶媒体などで構成される。この記憶部４３には、ストッカー２１に収納されている各培養容器１９に関する管理データと、撮像装置で撮像された顕微鏡画像のデータとが記憶されている。さらに、記憶部４３には、ＣＰＵ４２によって実行されるプログラムが記憶されている。
【００３２】
なお、上記の管理データには、（ａ）個々の培養容器１９を示すインデックスデータ、（ｂ）ストッカー２１での培養容器１９の収納位置、（ｃ）培養容器１９の種類および形状（ウェルプレート、ディッシュ、フラスコなど）、（ｄ）培養容器１９で培養されている細胞の種類、（ｅ）培養容器１９の観察スケジュール、（ｆ）タイムラプス観察時の撮像条件（対物レンズの倍率、容器内の観察地点等）、などが含まれている。また、ウェルプレートのように複数の小容器で同時に細胞を培養できる培養容器１９については、各々の小容器ごとにそれぞれ管理データが生成される。
【００３３】
≪培養状態評価装置における観察動作の例≫
次に、図４の流れ図を参照しつつ、本発明に用いられる培養状態評価装置におけるインキュベータ１１での観察動作の一例を説明する。この図４は、恒温室１５内に搬入された培養容器１９を、登録された観察スケジュールに従ってタイムラプス観察する動作例を示している。
【００３４】
ステップＳ１０１：ＣＰＵ４２は、記憶部４３の管理データの観察スケジュールと現在日時とを比較して、培養容器１９の観察開始時間が到来したか否かを判定する。観察開始時間となった場合（ＹＥＳ側）、ＣＰＵ４２はＳ１０２に処理を移行させる。一方、培養容器１９の観察時間ではない場合（ＮＯ側）には、ＣＰＵ４２は次の観察スケジュールの時刻まで待機する。
【００３５】
ステップＳ１０２：ＣＰＵ４２は、観察スケジュールに対応する培養容器１９の搬送を容器搬送装置２３に指示する。そして、容器搬送装置２３は、指示された培養容器１９をストッカー２１から搬出して観察ユニット２２の試料台３１に載置する。なお、培養容器１９が試料台３１に載置された段階で、スタンドアーム３２に内蔵されたバードビューカメラ（不図示）によって培養容器１９の全体観察画像が撮像される。
【００３６】
ステップＳ１０３：ＣＰＵ４２は、観察ユニット２２に対して細胞の顕微鏡画像の撮像を指示する。観察ユニット２２は、ＬＥＤ光源３５を点灯させて培養容器１９を照明するとともに、撮像装置３４を駆動させて培養容器１９内の細胞の顕微鏡画像を撮像する。
【００３７】
このとき、撮像装置３４は、記憶部４３に記憶されている管理データに基づいて、ユーザーの指定した撮像条件（対物レンズの倍率、容器内の観察地点）に基づいて顕微鏡画像を撮像する。例えば、培養容器１９内の複数のポイントを観察する場合、観察ユニット２２は、試料台３１の駆動によって培養容器１９の位置を逐次調整し、各々のポイントでそれぞれ顕微鏡画像を撮像する。なお、Ｓ１０３で取得された顕微鏡画像のデータは、制御装置４１に読み込まれるとともに、ＣＰＵ４２の制御によって記憶部４３に記録される。
【００３８】
ステップＳ１０４：ＣＰＵ４２は、観察スケジュールの終了後に培養容器１９の搬送を容器搬送装置２３に指示する。そして、容器搬送装置２３は、指示された培養容器１９を観察ユニット２２の試料台３１からストッカー２１の所定の収納位置に搬送する。その後、ＣＰＵ４２は、観察シーケンスを終了してＳ１０１に処理を戻す。以上で、図４の流れ図の説明を終了する。
【００３９】
≪培養状態評価装置における培養状態評価処理≫
次に、培養状態評価装置における培養状態評価処理の一例を説明する。この一例では、培養容器１９をタイムラプス観察して取得した複数の顕微鏡画像を用いて、培養容器１９の培養細胞におけるがん細胞の混在率を制御装置４１が推定する例を説明する。
【００４０】
この培養状態評価処理での制御装置４１は、上記の顕微鏡画像から細胞の形態的な特徴を示す特徴値の度数分布を求める。そして、制御装置４１は、この度数分布の経時的な変化に基づいて、がん細胞の混在率を推定した評価情報を生成する。なお、制御装置４１は、得られた評価情報を教師付き学習によって予め生成された計算モデルに適用することで、上記の評価情報を生成する。
【００４１】
≪計算モデルの生成処理の例≫
以下、図５の流れ図を参照しつつ、培養状態評価処理の前処理である計算モデルの生成処理の一例を説明する。この計算モデルの生成処理では、画像の撮影時間および特徴値の種類がそれぞれ異なる複数の度数分布の組み合わせから、評価情報の生成に用いる度数分布の組み合わせを、制御装置４１が決定する。
【００４２】
この図５の例では、がん細胞が混在した細胞群を培養した培養容器１９をインキュベータ１１によって同一視野を同一の撮影条件でタイムラプス観察し、サンプルの顕微鏡画像群を予め用意する。なお、上記のサンプルの顕微鏡画像において、各画像に含まれる細胞の総数とがん細胞の数とは、画像からではなく実験的にカウントされてそれぞれ既知となっている。
【００４３】
図５の例では、培養容器１９のタイムラプス観察は、培養開始から８時間経過後を初回として、８時間おきに７２時間目まで行う。そのため、図５の例において、培養容器１９および観察ポイントが共通するサンプルの顕微鏡画像が、９枚分（８ｈ，１６ｈ，２４ｈ，３２ｈ，４０ｈ，４８ｈ，５６ｈ，６４ｈ，７２ｈ）を１セットとして取得されることとなる。なお、図５の例では、複数の培養容器１９をそれぞれタイムラプス観察して、上記のサンプルの顕微鏡画像を複数セット分用意するものとする。また、同じ培養容器１９の複数ポイント（例えば５点観察または培養容器１９の全体）を同じ観察時間帯で撮影した複数の顕微鏡画像を、タイムラプス観察の１回分の画像として扱うようにしてもよい。
【００４４】
ステップＳ２０１：ＣＰＵ４２は、予め用意されたサンプルの顕微鏡画像のデータを記憶部４３から読み込む。なお、Ｓ２０１でのＣＰＵ４２は、各画像に対応する細胞の総数およびがん細胞の数を示す情報もこの時点で取得するものとする。
【００４５】
ステップＳ２０２：ＣＰＵ４２は、上記のサンプルの顕微鏡画像（Ｓ２０１）のうちから、処理対象となる画像を指定する。ここで、Ｓ２０２でのＣＰＵ４２は、予め用意されているサンプルの顕微鏡画像のすべてを処理対象として順次指定してゆくものとする。
【００４６】
ステップＳ２０３：特徴値演算部４４は、処理対象の顕微鏡画像（Ｓ２０２）について、画像内に含まれる細胞を抽出する。例えば、位相差顕微鏡で細胞を撮像すると、細胞壁のように位相差の変化の大きな部位の周辺にはハロが現れる。そのため、特徴値演算部４４は、細胞壁に対応するハロを公知のエッジ抽出手法で抽出するとともに、輪郭追跡処理によってエッジで囲まれた閉空間を細胞と推定する。これにより上記の顕微鏡画像から個々の細胞を抽出することができる。
【００４７】
ステップＳ２０４：特徴値演算部４４は、Ｓ２０３で画像から抽出した各細胞について、細胞の形態的な特徴を示す特徴値をそれぞれ求める。Ｓ２０４での特徴値演算部４４は、各細胞について以下の１６種類の特徴値をそれぞれ求める。
【００４８】
・Ｔｏｔａｌ ａｒｅａ（図６の（ａ）参照）
「Ｔｏｔａｌ ａｒｅａ」は、注目する細胞の面積を示す値である。例えば、特徴値演算部４４は、注目する細胞の領域の画素数に基づいて「Ｔｏｔａｌ ａｒｅａ」の値を求めることができる。
【００４９】
・Ｈｏｌｅ ａｒｅａ（図６の（ｂ）参照）
「Ｈｏｌｅ ａｒｅａ」は、注目する細胞内のＨｏｌｅの面積を示す値である。ここで、Ｈｏｌｅは、コントラストによって、細胞内における画像の明るさが閾値以上となる部分（位相差観察では白に近い状態となる箇所）を指す。例えば、細胞内小器官の染色されたリソソームなどがＨｏｌｅとして検出される。また、画像によっては、細胞核や、他の細胞小器官がＨｏｌｅとして検出されうる。なお、特徴値演算部４４は、細胞内における輝度値が閾値以上となる画素のまとまりをＨｏｌｅとして検出し、このＨｏｌｅの画素数に基づいて「Ｈｏｌｅ ａｒｅａ」の値を求めればよい。
【００５０】
・ｒｅｌａｔｉｖｅ ｈｏｌｅ ａｒｅａ（図６の（ｃ）参照）
「ｒｅｌａｔｉｖｅ ｈｏｌｅ ａｒｅａ」は、「Ｈｏｌｅ ａｒｅａ」の値を「Ｔｏｔａｌ ａｒｅａ」の値で除した値である（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｈｏｌｅ ａｒｅａ＝Ｈｏｌｅ ａｒｅａ／Ｔｏｔａｌ ａｒｅａ）。この「ｒｅｌａｔｉｖｅ ｈｏｌｅ ａｒｅａ」は、細胞の大きさにおける細胞内小器官の割合を示すパラメータであって、例えば細胞内小器官の肥大化や核の形の悪化などに応じてその値が変動する。
【００５１】
・Ｐｅｒｉｍｅｔｅｒ（図６の（ｄ）参照）
「Ｐｅｒｉｍｅｔｅｒ」は、注目する細胞の外周の長さを示す値である。例えば、特徴値演算部４４は、細胞を抽出するときの輪郭追跡処理により「Ｐｅｒｉｍｅｔｅｒ」の値を取得することができる。
【００５２】
・Ｗｉｄｔｈ（図６の（ｅ）参照）
「Ｗｉｄｔｈ」は、注目する細胞の画像横方向（Ｘ方向）での長さを示す値である。
【００５３】
・Ｈｅｉｇｈｔ（図６の（ｆ）参照）
「Ｈｅｉｇｈｔ」は、注目する細胞の画像縦方向（Ｙ方向）での長さを示す値である。
【００５４】
・Ｌｅｎｇｔｈ（図６の（ｇ）参照）
「Ｌｅｎｇｔｈ」は、注目する細胞を横切る線のうちの最大値（細胞の全長）を示す値である。
【００５５】
・Ｂｒｅａｄｔｈ（図６の（ｈ）参照）
「Ｂｒｅａｄｔｈ」は、「Ｌｅｎｇｔｈ」に直交する線のうちの最大値（細胞の横幅）を示す値である。
【００５６】
・Ｆｉｂｅｒ Ｌｅｎｇｔｈ（図６の（ｉ）参照）
「Ｆｉｂｅｒ Ｌｅｎｇｔｈ」は、注目する細胞を擬似的に線状と仮定した場合の長さを示す値である。特徴値演算部４４は、下式（１）により「Ｆｉｂｅｒ Ｌｅｎｇｔｈ」の値を求める。
【００５７】
【数１】
0005848885.tif 000002
【００５８】
但し、本明細書の式において「Ｐ」はＰｅｒｉｍｅｔｅｒの値を示す。同様に「Ａ」はＴｏｔａｌ Ａｒｅａの値を示す。
【００５９】
・Ｆｉｂｅｒ Ｂｒｅａｄｔｈ（図６の（ｊ）参照）
「Ｆｉｂｅｒ Ｂｒｅａｄｔｈ」は、注目する細胞を擬似的に線状と仮定した場合の幅（Ｆｉｂｅｒ Ｌｅｎｇｔｈと直交する方向の長さ）を示す値である。特徴値演算部４４は、下式（２）により「Ｆｉｂｅｒ Ｂｒｅａｄｔｈ」の値を求める。
【００６０】
【数２】
0005848885.tif 000003
【００６１】
・Ｓｈａｐｅ Ｆａｃｔｏｒ（図６の（ｋ）参照）
「Ｓｈａｐｅ Ｆａｃｔｏｒ」は、注目する細胞の円形度（細胞の丸さ）を示す値である。特徴値演算部４４は、下式（３）により「Ｓｈａｐｅ Ｆａｃｔｏｒ」の値を求める。
【００６２】
【数３】
0005848885.tif 000004
【００６３】
・Ｅｌｌｉｐｔｉｃａｌ ｆｏｒｍ Ｆａｃｔｏｒ（図６の（ｌ）参照）
「Ｅｌｌｉｐｔｉｃａｌ ｆｏｒｍ Ｆａｃｔｏｒ」は、「Ｌｅｎｇｔｈ」の値を「Ｂｒｅａｄｔｈ」の値で除した値（Ｅｌｌｉｐｔｉｃａｌ ｆｏｒｍ Ｆａｃｔｏｒ＝Ｌｅｎｇｔｈ／Ｂｒｅａｄｔｈ）であって、注目する細胞の細長さの度合いを示すパラメータとなる。
【００６４】
・Ｉｎｎｅｒ ｒａｄｉｕｓ（図６の（ｍ）参照）
「Ｉｎｎｅｒ ｒａｄｉｕｓ」は、注目する細胞の内接円の半径を示す値である。
【００６５】
・Ｏｕｔｅｒ ｒａｄｉｕｓ（図６の（ｎ）参照）
「Ｏｕｔｅｒ ｒａｄｉｕｓ」は、注目する細胞の外接円の半径を示す値である。
【００６６】
・Ｍｅａｎ ｒａｄｉｕｓ（図６の（ｏ）参照）
「Ｍｅａｎ ｒａｄｉｕｓ」は、注目する細胞の輪郭を構成する全点とその重心点との平均距離を示す値である。
【００６７】
・Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｒａｄｉｕｓ（図６の（ｐ）参照）
「Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｒａｄｉｕｓ」は、注目する細胞と同面積の円の半径を示す値である。この「Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｒａｄｉｕｓ」のパラメータは、注目する細胞を仮想的に円に近似した場合の大きさを示している。
【００６８】
ここで、特徴値演算部４４は、細胞に対応する画素数に誤差分を加味して上記の各特徴値を求めてもよい。このとき、特徴値演算部４４は、顕微鏡画像の撮影条件（撮影倍率や顕微光学系の収差など）を考慮して特徴値を求めるようにしてもよい。なお、「Ｉｎｎｅｒ ｒａｄｉｕｓ」、「Ｏｕｔｅｒ ｒａｄｉｕｓ」、「Ｍｅａｎ ｒａｄｉｕｓ」、「Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｒａｄｉｕｓ」を求めるときには、特徴値演算部４４は、公知の重心演算の手法に基づいて各細胞の重心点を求め、この重心点を基準にして各パラメータを求めればよい。
【００６９】
ステップＳ２０５：特徴値演算部４４は、処理対象の顕微鏡画像（Ｓ２０２）について、各細胞の１６種類の特徴値（Ｓ２０４）をそれぞれ記憶部４３に記録する。
【００７０】
ステップＳ２０６：ＣＰＵ４２は、全ての顕微鏡画像が処理済み（全てのサンプルの顕微鏡画像で各細胞の特徴値が取得済みの状態）であるか否かを判定する。上記要件を満たす場合（ＹＥＳ側）には、ＣＰＵ４２はＳ２０７に処理を移行させる。一方、上記要件を満たさない場合（ＮＯ側）には、ＣＰＵ４２はＳ２０２に戻って、未処理の他の顕微鏡画像を処理対象として上記動作を繰り返す。
【００７１】
ステップＳ２０７：度数分布演算部４５は、各々の顕微鏡画像について特徴値の種類ごとにそれぞれ特徴値の度数分布を求める。したがって、Ｓ２０７での度数分布演算部４５は、１回の観察で取得される顕微鏡画像に対して１６種類の特徴値の度数分布を求めることとなる。また、各々の度数分布において、特徴値の各区分に対応する細胞の数を頻度（％）として求めるものとする。
【００７２】
また、Ｓ２０７での度数分布演算部４５は、上記の度数分布における度数の区分を、特徴値の種類ごとの標準偏差を用いて正規化する。ここでは一例として、「Ｓｈａｐｅ Ｆａｃｔｏｒ」の度数分布での区分を決定する場合を説明する。
【００７３】
まず、度数分布演算部４５は、各々の顕微鏡画像から求めた全ての「Ｓｈａｐｅ Ｆａｃｔｏｒ」の値の標準偏差を算出する。次に、度数分布演算部４５は、上記の標準偏差の値をＦｉｓｈｅｒの式に代入して、「Ｓｈａｐｅ Ｆａｃｔｏｒ」の度数分布における度数の区分の基準値を求める。このとき、度数分布演算部４５は、全ての「Ｓｈａｐｅ Ｆａｃｔｏｒ」の値の標準偏差（Ｓ）を４で除するとともに、小数点以下３桁目を四捨五入して上記の基準値とする。なお、一の実施形態での度数分布演算部４５は、度数分布をヒストグラムとして図示する場合、２０級数分の区間をモニタ等に描画させるものとする。
【００７４】
一例として、「Ｓｈａｐｅ Ｆａｃｔｏｒ」の標準偏差Ｓが２５９のとき、２５９／４＝６４．７５０から「６４．７５」が上記の基準値となる。そして、注目する画像の「Ｓｈａｐｅ Ｆａｃｔｏｒ」の度数分布を求めるとき、度数分布演算部４５は、「Ｓｈａｐｅ Ｆａｃｔｏｒ」の値に応じて０値から６４．７５刻みで設定された各クラスに細胞を分類し、各クラスでの細胞の個数をカウントすればよい。
【００７５】
このように、度数分布演算部４５が、特徴値の種類毎に標準偏差で度数分布の区分を正規化するため、異なる特徴値の間でも度数分布の傾向を大局的に近似させることができる。よって、一の実施形態では、異なる特徴値間で細胞の培養状態と度数分布の変化との相関を求めることが比較的容易となる。
【００７６】
ここで、図７（ａ）は、がん細胞の初期混在率が０％のときの「Ｓｈａｐｅ Ｆａｃｔｏｒ」の経時的変化を示すヒストグラムである。図７（ｂ）は、がん細胞の初期混在率が６．７％のときの「Ｓｈａｐｅ Ｆａｃｔｏｒ」の経時的変化を示すヒストグラムである。図７（ｃ）は、がん細胞の初期混在率が２５％のときの「Ｓｈａｐｅ Ｆａｃｔｏｒ」の経時的変化を示すヒストグラムである。
【００７７】
また、図７（ｄ）は、がん細胞の初期の混在率が０％のときの「Ｆｉｂｅｒ Ｌｅｎｇｔｈ」の経時的変化を示すヒストグラムである。ただし、この図では理解しやすさのため、ヒストグラムをＦｉｂｅｒ Ｌｅｎｇｔｈ＝３２３までで省略してある。図７（ｅ）は、がん細胞の初期の混在率が６．７％のときの「Ｆｉｂｅｒ Ｌｅｎｇｔｈ」の経時的変化を示すヒストグラムである。図７（ｆ）は、がん細胞の初期の混在率が２５％のときの「Ｆｉｂｅｒ Ｌｅｎｇｔｈ」の経時的変化を示すヒストグラムである。
【００７８】
ステップＳ２０８：評価情報生成部４６は、特徴値の種類ごとにそれぞれ上記の度数分布の経時的変化を求める。
【００７９】
Ｓ２０８での評価情報生成部４６は、１セット分の顕微鏡画像から取得した度数分布（９×１６）のうち、特徴値の種類が同じで撮影時間の異なる２つの度数分布を組み合わせる。一例として、評価情報生成部４６は、特徴値の種類が同じで撮影時間の異なる９つの度数分布について、８時間目および１６時間目の度数分布と、８時間目および２４時間目の度数分布と、８時間目および３２時間目の度数分布と、８時間目および４０時間目の度数分布と、８時間目および４８時間目の度数分布と、８時間目および５６時間目の度数分布と、８時間目および６４時間目の度数分布と、８時間目および７２時間目の度数分布とをそれぞれ組み合わせる。つまり、１セット分における１種類の特徴値に注目したとき、その特徴値の度数分布につき、計８通りの組み合わせが発生する。
【００８０】
そして、評価情報生成部４６は、上記８通りの組み合わせについて、以下の式（４）により度数分布の変化量（画像間での度数分布の差分の絶対値を積分したもの）をそれぞれ求める。
【００８１】
【数４】
0005848885.tif 000005
【００８２】
但し、式（４）において、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は初期状態の度数分布（８時間目）における１区間分の度数（細胞数）を示す。また、「Ｓａｍｐｌｅ」は、比較対象の度数分布における１区間分の度数を示す。また、「ｉ」は、度数分布の区間を示す変数である。
【００８３】
評価情報生成部４６は、特徴値の種類ごとに上記演算を行うことで、すべての特徴値についてそれぞれ８通りの度数分布の変化量を取得できる。更に、すなわち、１セット分の顕微鏡画像について、１６種類×８通りで１２８の度数分布の組み合わせをとることができる。
以下、本明細書では、上記の度数分布の組み合わせの１つを単に「指標」と表記する。なお、Ｓ２０８での評価情報生成部４６は、複数の顕微鏡画像のセットにおいて、各指標に対応する１２８の度数分布の変化量をそれぞれ求めることはいうまでもない。
【００８４】
ここで、度数分布の経時的変化に注目する理由を説明する。図８は、正常な細胞群（がん細胞の初期混在率０％）をインキュベータ１１で培養してタイムラプス観察したときの顕微鏡画像をそれぞれ示す。なお、図８の各顕微鏡画像から求めた「Ｓｈａｐｅ Ｆａｃｔｏｒ」の度数分布を示すヒストグラムは、図７（ａ）で示している。
【００８５】
この場合、図８の各画像では時間の経過に伴って細胞の数は増加するものの、図７（ａ）に示す「Ｓｈａｐｅ Ｆａｃｔｏｒ」のヒストグラムでは、各画像に対応する度数分布はいずれもほぼ同じ形状を保っている。
【００８６】
一方、図９は、正常な細胞群に予めがん細胞を２５％混在させたものをインキュベータ１１で培養してタイムラプス観察したときの顕微鏡画像をそれぞれ示す。なお、図９の各顕微鏡画像から求めた「Ｓｈａｐｅ Ｆａｃｔｏｒ」の度数分布を示すヒストグラムは、図７（ｃ）で示している。
【００８７】
この場合、図９の各画像では時間の経過に伴って、正常細胞と形状の異なるがん細胞（丸みを帯びた細胞）の比率が増加する。これにより、図７（ｃ）に示す「ＳｈａｐｅＦａｃｔｏｒ」のヒストグラムでは、時間の経過に応じて各画像に対応する度数分布の形状に大きな変化が現れる。よって、度数分布の経時的変化が、がん細胞の混在と強い相関を有することが分かる。本発明者らは、上記知見に基づいて、度数分布の経時的変化の情報から培養細胞の状態を評価するものである。
【００８８】
ステップＳ２０９：評価情報生成部４６は、１２８の指標のうちから、細胞の培養状態をよく反映する指標を多変量解析により１以上指定する。この指標の組合せの選択は、後述するファジーニューラルネットワークと同等の非線形モデル以外にも、細胞とその形態の複雑性に応じて線形モデルの利用も有効である。このような指標の組合せの選択と共に、評価情報生成部４６は、上記の指定された１以上の指標を用いて、顕微鏡画像からがん細胞の数を導出する計算モデルを求める。
【００８９】
ここで、Ｓ２０９での評価情報生成部４６は、ファジーニューラルネットワーク（Ｆｕｚｚｙ Ｎｅｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋ：ＦＮＮ）解析によって上記の計算モデルを求める。
【００９０】
ＦＮＮとは、人工ニューラルネットワーク（Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｎｅｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋ：ＡＮＮ）とファジィ推論とを組み合わせた方法である。このＦＮＮでは、ファジイ推論の欠点であるメンバーシップ関数の決定を人間に頼るという部分を回避すべく、ＡＮＮをファジィ推論に組み込んでその自動決定を行う。学習機械のひとつであるＡＮＮ（図１０参照）は、生体の脳における神経回路網を数学的にモデル化したものであり、以下の特徴を持つ。ＡＮＮにおける学習は、目的の出力値（教師値）をもつ学習用のデータ（入力値：Ｘ）を用いて、バックプロパゲーション（Ｂａｃｋ ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ：ＢＰ）法により教師値と出力値（Ｙ）との誤差が小さくなるように、ノード（図１０において丸で示す）間をつなぐ回路における結合荷重を変え、その出力値が教師値に近づくようにモデルを構築する過程である。このＢＰ法を用いれば、ＡＮＮは学習により自動的に知識を獲得することができる。そして、最終的に学習に用いていないデータを入力することにより、そのモデルの汎用性を評価できる。従来、メンバーシップ関数の決定は、人間の感覚に頼っていたが、上で述べたようなＡＮＮをファジイ推論に組み込むことで自動的なメンバーシップ関数の同定が可能になる。これがＦＮＮである。ＦＮＮでは、ＡＮＮと同様に、ＢＰ法を用いることによりネットワークに与えられた入出力関係を、結合荷重を変化させることで自動的に同定しモデル化できる。ＦＮＮは、学習後のモデルを解析することでファジィ推論のように人間に理解しやすい言語的なルール（一例として図１１の右下の吹き出しを参照）として知識を獲得できるという特徴をもっている。つまり、ＦＮＮは、その構造、特徴から、細胞の形態的特徴を表した数値のような変数の組み合わせにおける最適なファジィ推論の組み合わせを自動決定し、予測目標に関する推定と、予測に有効な指標の組み合わせを示すルールの生成を同時に行うことができる。
【００９１】
ＦＮＮの構造は、「入力層」、シグモイド関数に含まれるパラメータＷｃ、Ｗｇを決定する「メンバーシップ関数部分（前件部）」、Ｗｆを決定するとともに入力および出力の関係をルールとして取り出すことが可能な「ファジィルール部分（後件部）」、「出力層」の４層から成り立っている（図１１参照）。ＦＮＮのモデル構造を決定する結合荷重にはＷｃ、Ｗｇ、Ｗｆがある。結合荷重Ｗｃは、メンバーシップ関数に用いられるシグモイド関数の中心位置、Ｗｇは中心位置での傾きを決定する（図１２参照）。モデル内では、入力値がファジィ関数により、人間の感覚的に近い柔軟性を持って表現される（一例として図１１の左下の吹き出しを参照）。結合荷重Ｗｆは各ファジイ領域の推定結果に対する寄与を表しており、Ｗｆよりファジィルールを導くことができる。即ち、モデル内の構造はあとから解読でき、ルールとして書き起こすことができる（一例として図１１中右下の吹き出しを参照）。
【００９２】
ＦＮＮ解析におけるファジィルールの作成には結合荷重のひとつであるＷｆ値が用いられる。Ｗｆ値が正の値で大きいと、そのユニットは「予測に有効である」と判定されることに対する寄与が大きく、そのルールに当てはまった指標は「有効である」と判断される。Ｗｆ値が負の値で小さいと、そのユニットは「予測に有効でない」と判定されることに対する寄与が大きく、そのルールに当てはまった指標は「有効でない」と判断される。
【００９３】
より具体的な例として、Ｓ２０９での評価情報生成部４６は、以下の（Ａ）から（Ｈ）の処理により、上記の計算モデルを求める。
【００９４】
（Ａ）評価情報生成部４６は、１２８の指標のうちから１つの指標を選択する。
【００９５】
（Ｂ）評価情報生成部４６は、（Ａ）で選択された指標による度数分布の変化量を変数とした計算式により、各々の顕微鏡画像のセットでのがん細胞の数（予測値）を求める。
【００９６】
仮に、１つの指標からがん細胞の数を求める計算式を「Ｙ＝αＸ１」（但し、「Ｙ」はがん細胞の計算値（例えばがん細胞の増加数を示す値）、「Ｘ１」は上記の選択された指標に対応する度数分布の変化量（Ｓ２０８で求めたもの）、「α」はＸ１に対応する係数値、をそれぞれ示す。）とする。このとき、評価情報生成部４６は、αに任意の値を代入するとともに、Ｘ１に各セットにおける度数分布の変化量をそれぞれ代入する。これにより、各セットでのがん細胞の計算値（Ｙ）が求められる。
【００９７】
（Ｃ）評価情報生成部４６は、各々の顕微鏡画像のセットについて、（Ｂ）で求めた計算値Ｙと、実際のがん細胞の数（教師値）との誤差をそれぞれ求める。なお、上記の教師値は、Ｓ２０１で読み込んだがん細胞の数の情報に基づいて、評価情報生成部４６が求めるものとする。
【００９８】
そして、評価情報生成部４６は、各顕微鏡画像のセットでの計算値の誤差がより小さくなるように、教師付き学習により上記の計算式の係数αを修正する。
【００９９】
（Ｄ）評価情報生成部４６は、上記の（Ｂ）および（Ｃ）の処理を繰り返し、上記（Ａ）の指標について、計算値の平均誤差が最も小さくなる計算式のモデルを取得する。
【０１００】
（Ｅ）評価情報生成部４６は、１２８の各指標について、上記（Ａ）から（Ｄ）の各処理を繰り返す。そして、評価情報生成部４６は、１２８の各指標における計算値の平均誤差を比較し、その平均誤差が最も低くなる指標を、評価情報の生成に用いる１番目の指標とする。
【０１０１】
（Ｆ）評価情報生成部４６は、上記（Ｅ）で求めた１番目の指標と組み合わせる２番目の指標を求める。このとき、評価情報生成部４６は、上記の１番目の指標と残りの１２７の指標とを１つずつペアにしてゆく。次に、評価情報生成部４６は、各々のペアにおいて、計算式でがん細胞の予測誤差を求める。
【０１０２】
仮に、２つの指標からがん細胞の数を求める計算式を「Ｙ＝αＸ１＋βＸ２」（但し、「Ｙ」はがん細胞の計算値、「Ｘ１」は１番目の指標に対応する度数分布の変化量、「α」はＸ１に対応する係数値、「Ｘ２」は、選択された指標に対応する度数分布の変化量、「β」はＸ２に対応する係数値、をそれぞれ示す。）とする。そして、評価情報生成部４６は、上記の（Ｂ）および（Ｃ）と同様の処理により、計算値の平均誤差が最も小さくなるように、上記の係数α、βの値を求める。
【０１０３】
その後、評価情報生成部４６は、各々のペアで求めた計算値の平均誤差を比較し、その平均誤差が最も低くなるペアを求める。そして、評価情報生成部４６は、平均誤差が最も低くなるペアの指標を、評価情報の生成に用いる１番目および２番目の指標とする。
【０１０４】
（Ｇ）評価情報生成部４６は、所定の終了条件を満たした段階で演算処理を終了する。例えば、評価情報生成部４６は、指標を増やす前後の各計算式による平均誤差を比較する。そして、評価情報生成部４６は、指標を増やした後の計算式による平均誤差が、指標を増やす前の計算式による平均誤差より高い場合（または両者の差が許容範囲に収まる場合）には、Ｓ２０９の演算処理を終了する。
【０１０５】
（Ｈ）一方、上記（Ｇ）で終了条件を満たさない場合、評価情報生成部４６は、さらに指標の数を１つ増やして、上記（Ｆ）および（Ｇ）と同様の処理を繰り返す。これにより、上記の計算モデルを求めるときに、ステップワイズな変数選択によって指標の絞り込みが行われることとなる。
【０１０６】
ステップＳ２１０：評価情報生成部４６は、Ｓ２０９で求めた計算モデルの情報（計算式に用いる各指標を示す情報、計算式で各々の指標に対応する係数値の情報など）を記憶部４３に記録する。以上で、図５の説明を終了する。
【０１０７】
ここで、上記の計算モデルの指標として、『「Ｓｈａｐｅ Ｆａｃｔｏｒ」の８時間目、７２時間目の度数分布の組み合わせ』と、『「Ｐｅｒｉｍｅｔｅｒ」の８時間目、２４時間目の度数分布の組み合わせ』と、『「Ｌｅｎｇｔｈ」の８時間目、７２時間目の度数分布の組み合わせ』との３つを用いた場合、がん細胞の予測精度が９３．２％となる計算モデルを得ることができた。
【０１０８】
また、上記の計算モデルの指標として、『「Ｓｈａｐｅ Ｆａｃｔｏｒ」の８時間目、７２時間目の度数分布の組み合わせ』と、『「Ｆｉｂｅｒ Ｂｒｅａｄｔｈ」の８時間目、５６時間目の度数分布の組み合わせ』と、『「ｒｅｌａｔｉｖｅ ｈｏｌｅ ａｒｅａ」の８時間目、７２時間目の度数分布の組み合わせ』と、『「Ｓｈａｐｅ Ｆａｃｔｏｒ」の８時間目、２４時間目の度数分布の組み合わせ』と、『「Ｂｒｅａｄｔｈ」の８時間目、７２時間目の度数分布の組み合わせ』と、『「Ｂｒｅａｄｔｈ」の８時間目、６４時間目の度数分布の組み合わせ』との６つを用いた場合、がん細胞の予測精度が９５．５％となる計算モデルを得ることができた。
【０１０９】
なお、上記に説明したステップＳ２０８の処理においては、評価情報生成部４６は、８時間目を基準として、１種類の特徴値に対して８通りの指標を求め、１６種類の特徴値に対して合計１２８（１６種類×８通り）の指標を求めた。しかし、指標としてはこれに限られるものではなく、評価情報生成部４６は、８時間目、１６時間目、２４時間目、３２時間目、４０時間目、４８時間目、５６時間目、６４時間目、および、７２時間目の各々を基準として、１種類の特徴値に対して３６（＝９×８÷２）通りの指標をそれぞれ求め、１６種類の特徴値に対して合計５７６（１６種類×３６通り）の指標を求めてもよい。
【０１１０】
≪培養状態評価処理の例≫
次に、図１３の流れ図を参照しつつ、培養状態評価処理の動作例を説明する。
【０１１１】
ステップＳ３０１：ＣＰＵ４２は、評価対象となる複数の顕微鏡画像のデータを記憶部４３から読み込む。ここで、評価対象の顕微鏡画像は、細胞群を培養した培養容器１９をインキュベータ１１によって同一視野を同一の撮影条件でタイムラプス観察して取得されたものとする。また、この場合のタイムラプス観察は、図５の例と条件を揃えるために、培養開始から８時間経過後を初回として８時間おきに７２時間目まで行うものとする。
【０１１２】
ステップＳ３０２：ＣＰＵ４２は、記憶部４３の計算モデルの情報（図５のＳ２１０で記録されたもの）を読み込む。
【０１１３】
ステップＳ３０３：特徴値演算部４４、度数分布演算部４５および評価情報生成部４６は、上記の計算モデルの変数に対応する各指標について、それぞれ度数分布の変化量を求める。このＳ３０３の処理は、図５のＳ２０３、Ｓ２０４、Ｓ２０７、Ｓ２０８に対応するため重複説明は省略する。
【０１１４】
ステップＳ３０４：評価情報生成部４６は、Ｓ３０３で求めた各指標の度数分布の変化量を、Ｓ３０２で読み出した計算モデルに代入して演算を行う。そして、評価情報生成部４６は、上記の演算結果に基づいて、評価対象の顕微鏡画像におけるがん細胞の混在率を示す評価情報を生成する。その後、評価情報生成部４６は、この評価情報を不図示のモニタ等に表示させる。以上で、図１３の説明を終了する。
【０１１５】
本発明に用いられるインキュベータによれば、制御装置４１は、タイムラプス観察で取得した顕微鏡画像を用いて、特徴値の度数分布の経時的変化からがん細胞の混在率を精度よく予測できる。また、制御装置４１は、ありのままの細胞を評価対象にできるので、例えば医薬品のスクリーニングや再生医療の用途で培養される細胞を評価するときに極めて有用である。
以上、本発明に用いられるインキュベータにおいて、「度数分布」に限定して説明したが、「統計処理データ」についてのものであれば何ら限定されない。
【０１１６】
≪化学物質のスクリーニング方法≫
本発明の化学物質のスクリーニング方法は、細胞に形態変化を生じさせる化学物質のスクリーニング方法であって、
（ａ）細胞にスクリーニング対象である第１の化学物質を接触させる工程と、
（ｂ）前記第１の化学物質を接触させた細胞を時系列に撮像した複数の画像を読み込む工程と、
（ｃ）前記（ｂ）における前記画像に含まれる各々の細胞の形態的な特徴を示す特徴値を前記画像からそれぞれ求める工程と、
（ｄ）各々の前記画像に対応する前記特徴値の統計処理データをそれぞれ求める工程と、
（ｅ）前記画像間での前記統計処理データの変化に基づいて、前記第１の化学物質を接触させた細胞の形態変化を評価する評価情報を生成する工程と、
を含むことを特徴とする。
以下、各工程について説明する。
また、以下の説明においては「統計処理データ」が「度数分布」である場合について説明する。
【０１１７】
本発明において、「化学物質」とは、細胞中の遺伝子またはその遺伝子産物であるタンパク質を標的とするものであり、有機化合物、無機化合物、あるいはこれらの複合体を示す。具体的な「化学物質」としては、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子化合物等が挙げられる。さらに、核酸としては、アンチセンス核酸、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ等が挙げられる。上記中、前記化学物質は、低分子化合物、抗体、
タンパク質、ペプチド、アンチセンス核酸、リボザイム、ｓｈＲＮＡ及びｓｉＲＮＡからなる群より選ばれる少なくとも１つであることが好ましい。
また、本発明のスクリーニング方法において、スクリーニングに用いる最初の化学物質を「第１の化学物質」という。標的タンパク質が酵素であった場合、前記第１の化学物質は低分子化合物であることがより好ましい。また、遺伝子を標的とする場合、前記第１の化学物質はｓｉＲＮＡであることがより好ましい。
【０１１８】
本発明において、「細胞に形態変化を生じさせる」とは、細胞において形態変化に関与している経路を直接的または間接的にモジュレートすることを意味する。したがって、投与される化学物質が細胞の形態変化を作用させることが目的のものでなくても良く、結果的に細胞に形態変化が生じてしまうものも含まれる。例えば、形態変化は、細胞骨格、細胞周期における分裂期、またはアポトーシス等に関与している遺伝子またはその遺伝子産物を阻害することによってもたらされる。本発明の化学物質のスクリーニング方法においては、例えば細胞障害活性を有する化学物質をその目的物質とする場合、単に細胞毒性を有するものではなく、その作用機序がある程度明らかなものを得ることができる。
【０１１９】
工程（ａ）において、細胞にスクリーニング対象である第１の化学物質を接触させる。
図１４は、標的とする化学物質をｓｉＲＮＡとした場合の、本発明のスクリーニング方法の一態様を示したフローチャート図である。ｓｉＲＮＡを細胞にトランスフェクションする方法は、用いるトランスフェクション試薬によって異なるが、一例を説明する。まず、トランスフェクションの１日前に細胞を播き、インキュベータ中で培養する。翌日、培地を低血清培地に代え１時間置く。次に例えばリポソーム法によりｓｉＲＮＡを培養液中に滴下し、インキュベータ中で培養する。６時間後、低血清培地を通常の培地に代え、前述した培養状態評価装置を含むインキュベータで培養する。尚、比較対象としてｓｉＲＮＡを混入せずに同様の操作を行った細胞を用意しておいてもよい。
【０１２０】
上述したように、本発明の化学物質のスクリーニング方法において、細胞に形態変化を生じさせる化学物質を接触させた後の工程（ｂ）〜（ｅ）及び（ｇ）〜（ｋ）は、これらの工程を組み込んだ培養状態評価装置を含むインキュベータを用いて行われる。培養状態評価装置を含むインキュベータについては、既に説明しているため、その説明を省略する。
【０１２１】
次に、登録された観察スケジュールに従って、タイムラプス観察を行う（工程（ｂ））。工程（ｂ）において、前記第１の化学物質を接触させた細胞を時系列に撮像した複数の画像を読み込む。撮像画像のデータは、制御装置４１に読み込まれる。
図１４に示されるように、ｓｉＲＮＡ処理後の標的遺伝子の発現は、時間に従って変動する。本発明のスクリーニング方法は、決められた時間ごとに画像データを取得していくものであるため、ｓｉＲＮＡ処理により、標的とする遺伝子の発現が効率よく抑制されるタイミングを逃すことがない。
【０１２２】
次に、工程（ｃ）において、工程（ｂ）で読み込まれた前記画像に含まれる各々の細胞の形態的な特徴を示す特徴値を前記画像からそれぞれ求める。特徴値演算部４４は、撮像画像について、画像内に含まれる細胞を抽出し、抽出した各細胞について、１６種類の特徴値をそれぞれ求めていく。
【０１２３】
次に、工程（ｄ）において、各々の前記画像に対応する前記特徴値の度数分布をそれぞれ求める。度数分布演算部４５は、各時間の観察で取得される撮像画像について１６種類の特徴値の度数分布を求めていく。
【０１２４】
次に、工程（ｅ）において、前記画像間での前記度数分布の変化に基づいて、前記第１の化学物質を接触させた細胞の形態変化を評価する評価情報を生成する。評価情報生成部４６は、上述した１６種類の特徴値の種類ごとに度数分布の経時的変化を求め、各指標のうちから、細胞の培養状態をよく反映する指標を多変量解析により１以上指定する。例えば、図１４においては、ｓｉＲＮＡ処理後、４２時間後及び６６時間後の「Ｌｅｎｇｔｈ」のヒストグラムに大きな変化が現れている。上述したように、この指標の組合せの選択には、ＦＮＮと同等の非線形モデル以外に、細胞とその形態の複雑性に応じて線形モデルを利用してもよい。
また、第１の化学物質を接触させなかった細胞についても工程（ｂ）〜（ｄ）を行い、工程（ｅ）において、前記第１の化学物質を接触させた細胞における前記画像間での度数分布の変化と、前記第１の化学物質を接触させなかった細胞における前記画像間での度数分布の変化を比較し、その結果を第１の化学物質を接触させた細胞の形態変化を評価する評価情報に加味してもよい。
【０１２５】
本発明の化学物質のスクリーニング方法は、非破壊であるため、工程（ａ）〜（ｅ）を行い、解析の終了したサンプルを別の評価系に用いることができる。例えば、ｓｉＲＮＡを用いた実験において、形態変化の解析されたサンプルをそのままＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔに用いて、標的とする遺伝子がタンパク質レベルでサイレンシングされていることを確認してもよいし、リアルタイムＰＣＲに用いて、遺伝子レベルでサイレンシングされていることを確認してもよい。
本発明のスクリーニング方法によれば、解析に用いたサンプルをそのまま他の評価系に用いることができるため、解析結果により一層の信頼性を付与することができる。
【０１２６】
また、図１５に示すように、従来の方法において化学物質（例えば、ｓｉＲＮＡ）処理後の時間ごとに蛍光画像を取得し、測定する場合には、サンプリングポイントごとのサンプル数が必要であった。本発明の化学物質のスクリーニング方法は、上述したように非破壊であるため、サンプル数を徒に増やすことなく、細胞形態の経時変化を測定することができる。
【０１２７】
本発明の化学物質のスクリーニング方法は、前記（ｅ）の後、
（ｆ）前記第１の化学物質を接触させた細胞に、更に前記第１の化学物質又は前記第１の化学物質に該当しないスクリーニング対象である追加化学物質を接触させる工程と、
（ｇ）前記追加化学物質を接触させた細胞を時系列に撮像した複数の画像を読み込む工程と、
（ｈ）前記（ｇ）における前記画像に含まれる各々の細胞の形態的な特徴を示す特徴値を前記画像からそれぞれ求める工程と、
（ｉ）各々の前記画像に対応する前記特徴値の統計処理データをそれぞれ求める工程と、
（ｊ）前記画像間での前記統計処理データの変化に基づいて、前記追加化学物質を接触させた細胞の形態変化を評価する評価情報を生成する工程と、
（ｋ）前記追加化学物質を接触させた細胞における前記評価情報に基づき、（ｆ）〜（ｊ）を繰り返すか否かを判断する工程と、
を少なくとも１回繰り返す工程を含むことが好ましい。
以下、各工程について説明する。
また、以下の説明においては「統計処理データ」が「度数分布」である場合について説明する。
【０１２８】
前記工程（ｅ）の後、工程（ｆ）において、前記第１の化学物質を接触させた細胞に、更に前記第１の化学物質又は前記第１の化学物質に該当しないスクリーニング対象である追加化学物質を接触させる。
本発明の化学物質のスクリーニング方法は、非破壊の系であるため、細胞に第１の化学物質を細胞に処理し、解析した後に、更に前記細胞に追加化学物質を接触させ、その薬効を評価することができる。
本発明において、「追加化学物質」とは、前記第１の化学物質と同一の化学物質、又は前記第１の化学物質に該当しないスクリーニング対象である化学物質を意味する。
【０１２９】
追加化学物質を第１の化学物質と同一のものとする例として、以下のことが挙げられる。
遺伝子またはその遺伝子産物であるタンパク質を標的とするｓｉＲＮＡや低分子化合物を細胞に接触させ、その効果を解析する場合、短時間の阻害では効果が観察されない可能性がある。長期間の阻害による効果を観察するためには、培地中でこれらの化学物質が分解してしまうことも考慮に入れ、随時培地中に化学物質を添加する必要がある。本発明においては、第１の化学物質を追加化学物質として、数回細胞に接触させその結果を解析することができる。
【０１３０】
追加化学物質を第１の化学物質に該当しないものとする例として、以下のことが挙げられる。図１６Ａにおいて、第１の化学物質をｓｉＲＮＡとして、細胞に接触させ、工程（ｅ）までを行い、第１の化合物質を処理したことによる効果を確認する。実施例において後述するように、第１の化学物質として、ｐ５３を標的とするｓｉＲＮＡを用いた場合には形態変化が観察され、ｐ５３がサイレンシングされたことを確かめることができる。次に追加化学物質として、例えば、低分子化合物または他の分子を標的とするｓｉＲＮＡを細胞に接触させる。工程（ｆ）〜（ｊ）を行い、細胞にアポトーシスが誘導された場合には、追加化学物質は、ｐ５３の不活化されたがん細胞に効果を示す低分子化合物または標的分子であることが分かる。本発明のスクリーニング方法においては、特定の遺伝子が除去された細胞に形態変化をもたらす化学物質をスクリーニングすることができる。
【０１３１】
また、第１の化学物質を低分子化合物とした場合には、追加化学物質から、第１の化学物質の薬効を増強する低分子化合物または標的分子をスクリーニングすることができる。
【０１３２】
更に、図１６Ｂに示されるように、追加物質は複数であってもよい。例えば遺伝子導入により樹立されたｉＰＳ細胞において、種々の転写因子の発現が経時的に変化することにより、分化の方向性が定まっていく。そこで、転写に関与する１以上の分子に対するｓｉＲＮＡを異なるタイミングで添加し、万能性に寄与する遺伝子の発現を阻害することにより分化の過程を解析することができる。
【０１３３】
工程（ｇ）〜（ｊ）は、第１の化学物質を接触させた細胞に追加物質を接触させ、前述した工程（ｂ）〜（ｅ）と同様の操作を行う工程である。また、工程（ｋ）は、工程（ｊ）で得られた評価情報に基づいて、再度工程（ｆ）〜（ｊ）を繰り返すか否かを判断する工程である。工程（ｆ）〜（ｊ）は少なくとも１回繰り返されるため、工程（ｇ）〜（ｊ）において解析される細胞は第１の化学物質と１以上の追加化学物質を接触させたものである。繰り返しが増える度に、第１の化学物質を接触させた細胞が接触する追加化学物質の種類、または培地交換しない場合には、追加化学物質の培地中濃度は増えていく。
本発明のスクリーニング方法は、非破壊の系であるため実験計画が予め定まっている従来法と異なり、工程（ｋ）によって実験計画をリアルタイムに更新することができる。
【０１３４】
≪化学物質又は前記化学物質を含む医薬組成物の製造方法≫
本発明の化学物質又は前記化学物質を含む医薬組成物の製造方法は、細胞に形態変化を生じさせる化学物質又は前記化学物質を含む医薬組成物の製造方法であって、
（ｌ）先に記載のスクリーニング方法により細胞に形態変化を生じさせる化学物質を選択する工程と、
（ｍ）選択された化学物質又は前記化学物質を含む医薬組成物を製造する工程と、
を含むことを特徴とする。
また、本発明の化学物質又は前記化学物質を含む医薬組成物の製造方法は、細胞に形態変化を生じさせる化学物質又は前記化学物質を含む医薬組成物の製造方法であって、
（ｌ）先に記載のスクリーニング方法により細胞に形態変化を生じさせる化学物質を選択する工程と、
（ｎ）選択された化学物質の構造を最適化する工程と、
（ｏ）最適化された化学物質又は前記化学物質を含む医薬組成物を製造する工程と、
を含むことを特徴とする。
以下、各工程について説明する。
【０１３５】
工程（ｌ）において、先に記載のスクリーニング方法により細胞に形態変化を生じさせる化学物質を選択する。本発明のスクリーニング方法により選択された化学物質を「Ｈｉｔ」化学物質という。
【０１３６】
次に工程（ｎ）において、選択された化学物質の構造を最適化する。すなわち（ｎ）は、「Ｈｉｔ」化学物質を最適化し、「Ｌｅａｄ」化学物質を創出する工程である。この工程は、医薬品開発の公知の手法を用いて行われる。
例えば、「Ｈｉｔ」化学物質が低分子化合物であった場合、化合物の側鎖を誘導化し、標的分子に対する活性の増大や、無関係の分子（特に標的分子の類縁分子）に対する活性の低減を試みる。更に、ＡＤＭＥ（吸収・分布・代謝・排泄）の改良を試み、Ｉｎ ｖｉｖｏ試験において、体内動態に優れた化合物を誘導化する。
【０１３７】
また、このように最適化された化学物質が低分子化合物である場合、この低分子化合物は、その薬学的に許容しうる塩もしくはエステルとしても使用することができる。薬学的に許容しうる塩の典型例としては、例えばナトリウム、カリウム等のアルカリ金属との塩、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩、過塩素酸塩等の無機酸塩；例えば酢酸塩、プロピオン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、フマール酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩等の有機酸塩；例えばメタンスルホン酸塩、イセチオン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩等のスルホン酸塩；例えばアスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等の酸性アミノ酸塩等を挙げることができる。
【０１３８】
低分子化合物の薬学的に許容しうる塩の製造法は、有機合成化学分野で通常用いられる方法を適宜組み合わせて行うことができる。具体的には、低分子化合物の遊離型の溶液をアルカリ溶液あるいは酸性溶液で中和滴定すること等が挙げられる。
【０１３９】
低分子化合物のエステルとしては、例えば、メチルエステル、エチルエステルなどを挙げることができる。これらのエステルは遊離カルボキシ基を常法に従ってエステル化して製造することができる。
【０１４０】
スクリーニングに用いるライブラリーの数や質によっては、「Ｈｉｔ」化学物質が誘導化を必要とせず、すでに「Ｌｅａｄ」化学物質である場合がある。そのような場合には、工程（ｎ）を行わずに、工程（ｍ）を行う。
【０１４１】
次に工程（ｍ）において、選択された化学物質又は前記化学物質を含む医薬組成物を製造する。または、工程（ｏ）において、最適化された化学物質又は前記化学物質を含む医薬組成物を製造する。本発明において、医薬組成物とは、選択された前記化学物質または最適化された前記化学物質を主成分とし、公知の製剤学的方法により製剤化したものをいう。また、本発明においては、製剤化を必要とせず、化学物質自体を直接患者に投与することもあり得る。
【０１４２】
医薬組成物における製剤化の例としては、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤として経口的に使用されるものが挙げられる。または、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用されるものが挙げられる。更には、薬理学上許容される担体若しくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤等と適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化されたものが挙げられる。
【０１４３】
錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記の材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
【０１４４】
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０と併用してもよい。
【０１４５】
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
【０１４６】
患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。また、当該化合物がＤＮＡによりコードされうるものであれば、当該ＤＮＡを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
【０１４７】
化合物の投与量は、症状により差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約０．１から１００ｍｇ、好ましくは約１．０から５０ｍｇ、より好ましくは約１．０から２０ｍｇであると考えられる。
【０１４８】
非経口的に投与する場合は、その１回の投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では通常成人（体重６０ｋｇとして）においては、通常、１日当り約０．０１から３０ｍｇ、好ましくは約０．１から２０ｍｇ、より好ましくは約０．１から１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合であると考えられる。
【０１４９】
本発明に係る化学物質又は前記化学物質を含む医薬組成物の治療効果が期待される好適な一例として腫瘍が挙げられ、例えばヒトの固形がん等が挙げられる。ヒトの固形がんとしては、例えば、脳がん、頭頸部がん、食道がん、甲状腺がん、小細胞がん、非小細胞がん、乳がん、胃がん、胆のう・胆管がん、肝がん、膵がん、結腸がん、直腸がん、卵巣がん、絨毛上皮がん、子宮体がん、子宮頸がん、腎盂・尿管がん、膀胱がん、前立腺がん、陰茎がん、睾丸がん、胎児性がん、ウイルムスがん、皮膚がん、悪性黒色腫、神経芽細胞腫、骨肉腫、ユ−イング腫、軟部肉腫などが挙げられる。
また、アルツハイマー病やパーキンソン病といった神経変性疾患等も挙げられる。
【０１５０】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０１５１】
（ｓｉＲＮＡ処理後のＮＨＤＦ細胞の形態変化の測定）
１−１  材料  
以下に示す材料をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より購入した。
（１）ｐ５３  ｓｉＲＮＡ（カタログ番号：ＶＨＳ４０３６７）  
【０１５２】
１−２  トランスフェクション
トランスフェクションの前日に、ＮＨＤＦ細胞をｓｉＲＮＡ導入時に３０〜５０％コンフルエントになるように播き、抗生物質を含まない培地で培養した。翌日、ｓｉＲＮＡ及びＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ２０００をそれぞれ、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ社）で希釈し、５分間室温でインキュベーションした。次に、ＯｐｔｉＭＥＭ／ｓｉＲＮＡ混合物と、ＯｐｔｉＭＥＭ／ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ２０００混合物を混合し、室温に放置した。この混合物を培地に加え、培養プレートをＢｉｏｓｔａｔｉｏｎ  ＣＴ（ニコン社）の３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ中でインキュベートした。
【０１５３】
トランスフェクション処理された細胞と未処理の細胞について、それぞれ２時間間隔で３日目までタイムラプス観察を行った。図１７上段は、各細胞（ｐ５３  ｓｉＲＮＡ処理細胞（ｐ５３変異）及び未処理細胞（正常））の４２時間後及び６６時間後の撮像画像を示し、図１７下段は、撮像画像に基づいて解析された、「Ｌｅｎｇｔｈ」の４２時間後及び６６時間後のヒストグラムを示す。未処理の細胞（正常細胞）におけるヒストグラムの形状変化と比較して、トランスフェクション処理された細胞（ｐ５３変異）におけるヒストグラムの形状変化は顕著である。図１７上段において、ｐ５３のｓｉＲＮＡ処理６６時間後の細胞の形態は４２時間後の形態と明らかに異なり、丸みを帯びている。このことから解析結果が、撮像画像中の細胞の形態変化の状態を反映していることが確認された。
【０１５４】
図１８上段は、図１７におけるｐ５３変異細胞におけるノックダウン対象遺伝子ｐ５３の発現量をＲＴ−ＰＣＲにて定量したものである。０時間を１とした時の各時間の遺伝子発現量の相対値を示したグラフである(ＧＡＰＤＨにより補正)。図１７に示されたヒストグラムの変化が現れる少し前の時間帯に、実際には、細胞内での遺伝子発現がｓｉＲＮＡによって確かに抑制されていることがわかる。この効果は時間がたつにつれて回復していくが３６時間後における変化がその後、形態の変化として４２〜６６時間後の間の形態分布の変化として検出されたと言える。
図１８下段は、ｐ５３遺伝子の制御下（下流）にある遺伝子であるＲｈｏＡの各経時中の遺伝子発現量をＲＴ−ＰＣＲにて定量評価したものである。ｐ５３遺伝子のｓｉＲＮＡは、３６時間後において確かに対象であるｐ５３をノックダウンできており、その影響によってその下流の遺伝子であるＲｈｏＡもほぼ同時間に発現制御されていたことが確認できる。ｐ５３遺伝子のノックダウンは、ＲｈｏＡという細胞骨格の制御に関与するタンパク質の制御を引き起こし、これによって形の変化が生じていたのではないかと考察される。このデータは、ｓｉＲＮＡのノックダウン対象であったｐ５３が下流の遺伝子まで含めた形で確実にノックダウンできていたという実験の確実性を示すと共に、転写因子でしかないｐ５３を抑制したｓｉＲＮＡの影響がなぜ形態変化として４２〜６６時間後に現れたのかを生理現象的に示す一つのデータでもある。
【０１５５】
本発明のスクリーニング方法は、非破壊であるため徒にサンプル数を増やす必要が無い。また、本発明のスクリーニング方法によれば、解析に用いたサンプルをそのまま他の評価系に用いることができるため、解析結果により一層の信頼性を付与することができる。例えば、形態変化が観察されたｐ５３変異細胞を用いてＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔやリアルタイムＰＣＲを行い細胞中のｐ５３が確かにサイレンシングされていることを確かめることができる。
【０１５６】
（ｓｉＲＮＡ連続処理後のＨＴ１０８０細胞の形態変化の測定）
２−１  材料  
以下に示す材料をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より購入した。
（１）ＲｈｏＡ  ｓｉＲＮＡ（カタログ番号：ＶＨＳ４０４７１）  
【０１５７】
２−２  トランスフェクション（１回目）
トランスフェクションの前日に、ＨＴ１０８０をｓｉＲＮＡ導入時に３０〜５０％コンフルエントになるように播き、抗生物質を含まない培地で培養した。翌日、ｓｉＲＮＡ及びＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ２０００をそれぞれ、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ社）で希釈し、５分間室温でインキュベーションした。次に、ＯｐｔｉＭＥＭ／ｓｉＲＮＡ混合物と、ＯｐｔｉＭＥＭ／ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ２０００混合物を混合し、室温に放置した。この混合物を培地に加え、培養プレートをＢｉｏｓｔａｔｉｏｎ  ＣＴ（ニコン社）の３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ中でインキュベートした。
また、上記と同様のトランスフェクション処理において、ｓｉＲＮＡの代わりに水を用いたサンプルをネガティブコントロールとした。
【０１５８】
ＲｈｏＡ  ｓｉＲＮＡを導入された細胞（以下、ＲｈｏＡ  ｓｉＲＮＡ処理細胞１）とネガティブコントロールの細胞（以下、ネガティブコントロール１）について、それぞれ２時間間隔で３日目までタイムラプス観察を行った。図１９は、各細胞（ＲｈｏＡ  ｓｉＲＮＡ処理細胞１及びネガティブコントロール１）の０時間後及び４８時間後の撮像画像を示す。０時間後の両細胞においては、細胞形態に顕著な変化が観察されなかった。一方、４８時間後では、ＲｈｏＡ  ｓｉＲＮＡ処理細胞１においてのみ、形態変化が観察され、ＲｈｏＡ  ｓｉＲＮＡ処理細胞１の形態は、長細い形状を示した。
【０１５９】
２−３  トランスフェクション（２回目）
２回目のトランスフェクションの前日に、９６時間後の上記ＲｈｏＡ  ｓｉＲＮＡ処理細胞１をｓｉＲＮＡ導入時に３０〜５０％コンフルエントになるように播き、抗生物質を含まない培地で培養した。翌日、ｓｉＲＮＡ及びＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ２０００をそれぞれ、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ社）で希釈し、５分間室温でインキュベーションした。次に、ＯｐｔｉＭＥＭ／ｓｉＲＮＡ混合物と、ＯｐｔｉＭＥＭ／ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ２０００混合物を混合し、室温に放置した。この混合物を培地に加え、培養プレートをＢｉｏｓｔａｔｉｏｎ  ＣＴ（ニコン社）の３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ中でインキュベートした。
尚、ｓｉＲＮＡの代わりに水を用いた以外は、ネガティブコントロール１に上記トランスフェクション処理と同様の処理を施した（ネガティブコントロール２）。
【０１６０】
ＲｈｏＡ  ｓｉＲＮＡを導入された細胞（以下、ＲｈｏＡ  ｓｉＲＮＡ処理細胞２）とネガティブコントロールの細胞（以下、ネガティブコントロール２）について、それぞれ２時間間隔で３日目までタイムラプス観察を行った。尚、２回目のトランスフェクション時を０時間とする（通算１２０時間）。図２０は、各細胞（ＲｈｏＡ  ｓｉＲＮＡ処理細胞２及びネガティブコントロール２）の０時間（通算１２０時間）後及び４８時間（通算１６８時間）後の撮像画像を示す。０時間（通算１２０時間）後の両細胞においては、細胞形態に顕著な変化が観察されなかった。一方、４８時間（通算１６８時間）後では、ＲｈｏＡ  ｓｉＲＮＡ処理細胞２においてのみ、形態変化が観察され、ＲｈｏＡ  ｓｉＲＮＡ処理細胞２の形態は、長細い形状を示した。この結果は、１回目のトランスフェクションの結果と同様であり、ＨＴ１０８０細胞に導入されたＲｈｏＡ  ｓｉＲＮＡの効果は、トランスフェクション後、２回目のトランスフェクション時（通算１２０時間）には、完全に消失し、ＲｈｏＡ  ｓｉＲＮＡを導入された細胞は、ｓｉＲＮＡ導入前の形態にまで回復していることが観察された。
【０１６１】
上記タイムラプス観察における撮像画像に基づいて、０時間後及び４８時間後（ＲｈｏＡ  ｓｉＲＮＡ処理細胞２及びネガティブコントロール２においては、通算１２０時間後及び通算１６８時間後）における各細胞の「円形度」を解析した。結果を図２１に示す。
０時間後のＲｈｏＡ  ｓｉＲＮＡ処理細胞１とネガティブコントロール１との間におけるヒストグラムの形状変化、又は０時間後（通算１２０時間後）のＲｈｏＡ  ｓｉＲＮＡ処理細胞２とネガティブコントロール２との間におけるヒストグラムの形状変化に特徴的なものは確認されなかった（図２１上段）。
一方、４８時間後のネガティブコントロール１とＲｈｏＡ  ｓｉＲＮＡ処理細胞１との間においては、ヒストグラムのピークが右にシフトしていることが確認された（図２１下段）。この形状変化は４８時間後（通算１６８時間後）のネガティブコントロール２とＲｈｏＡ  ｓｉＲＮＡ処理細胞２との間においても再現されている。このことから解析結果が撮像画像中の細胞の形態変化の状態を反映していることが確認された。
【０１６２】
本発明の化学物質のスクリーニング方法は、非破壊の系であるため、細胞に第１の化学物質を細胞に処理し、解析した後に、更に前記細胞に追加化学物質を接触させ、その薬効を評価することができることが明らかである。
本発明の化学物質のスクリーニング方法によれば、例えば、細胞内で経時的に発現が変化する遺伝子の挙動を詳細に解析することができる。
【符号の説明】
【０１６３】
１１…インキュベータ、１５…恒温室、１９…培養容器、２２…観察ユニット、３４…撮像装置、４１…制御装置、４２…ＣＰＵ、４３…記憶部、４４…特徴値演算部、４５…度数分布演算部、４６…評価情報生成部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１８】
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【図２１】
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【図８】
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【図９】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１９】
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【図２０】
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