(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
受入番号ＣＥＣＴ７４８１の下にスペイン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＣＥＣＴ）において寄託されたラクトバチルス・プランタラム(Lactobacillus plantarum)株および／またはその変異体であって、該変異体は、出発物質として寄託された株ＣＥＣＴ７４８１を使用することにより、変異誘発または再単離技術により得られ、該変異体は、出発物質として使用された寄託された株と少なくとも同程度で、口腔ストレス状態に対して生存し、口腔組織に付着し、凝集物を形成し、口腔病原体を阻害する能力を保持する変異体、および／または、
受入番号ＣＥＣＴ７４８０の下にスペイン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＣＥＣＴ）において寄託されたラクトバチルス・ブレビス(Lactobacillus brevis)株および／またはその変異体であって、該変異体は、出発物質として寄託された株ＣＥＣＴ７４８０を使用することにより、変異誘発または再単離技術により得られ、該変異体は、出発物質として使用された寄託された株と少なくとも同程度で、口腔ストレス状態に対して生存し、口腔組織に付着し、凝集物を形成し、口腔病原体を阻害する能力を保持する変異体を含む組成物。
【請求項２】
医薬としての使用のための、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ヒトを含む動物において口腔病原体により引き起こされる口腔における障害の予防および／または処置における使用のための、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
口腔における障害が歯垢関連障害である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
歯垢関連障害が、歯肉炎、歯周炎、齲蝕または知覚過敏である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
口腔における障害が口臭である、請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
口腔における障害がカンジダ症である、請求項３に記載の組成物。
【請求項８】
請求項１−７のいずれかに記載の組成物および少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項９】
請求項１−８のいずれかに記載の組成物を含むプロバイオティック(probiotic)製品。
【請求項１０】
請求項１−８のいずれかに記載の組成物および少なくとも１つの食用成分を含む食用製品。
【請求項１１】
栄養補助食品である、請求項１０に記載の食用製品、請求項１−８のいずれかに記載の組成物または請求項９に記載のプロバイオティック製品。
【請求項１２】
請求項１−８のいずれかに記載の組成物および少なくとも１つの美容上許容される賦形剤を含む美容用組成物。
【請求項１３】
有効量の、請求項１−８のいずれかに記載の組成物または請求項１２に記載の美容用組成物を含む、口腔ケア製品。
【請求項１４】
チューインガム、練り歯磨き、マウススプレー(mouth spray)、ロゼンジまたは口腔分散性錠剤である、請求項１３に記載の口腔ケア製品。
【請求項１５】
受入番号ＣＥＣＴ７４８１の下にスペイン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＣＥＣＴ）において寄託されたラクトバチルス・プランタラム株および／またはその変異体であって、該変異体は、出発物質として寄託された株ＣＥＣＴ７４８１を使用することにより、変異誘発または再単離技術により得られ、該変異体は、出発物質として使用された寄託された株と少なくとも同程度で、口腔ストレス状態に対して生存し、口腔組織に付着し、凝集物を形成し、口腔病原体を阻害する能力を保持する変異体。
【請求項１６】
受入番号ＣＥＣＴ７４８０の下にスペイン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＣＥＣＴ）において寄託されたラクトバチルス・ブレビス株および／またはその変異体であって、該変異体は、出発物質として寄託された株ＣＥＣＴ７４８０を使用することにより、変異誘発または再単離技術により得られ、該変異体は、出発物質として使用された寄託された株と少なくとも同程度で、口腔ストレス状態に対して生存し、口腔組織に付着し、凝集物を形成し、口腔病原体を阻害する能力を保持する変異体。
【請求項１７】
出発物質としてラクトバチルス・プランタラムＣＥＣＴ７４８１またはラクトバチルス・ブレビスＣＥＣＴ７４８０を使用すること、および、変異誘発または再単離技術を適用することを含む、ラクトバチルス・プランタラムＣＥＣＴ７４８１またはラクトバチルス・ブレビスＣＥＣＴ７４８０の変異体を得るための方法であって、該得られた変異体は、出発物質として使用された寄託された株の、口腔ストレス状態に対して生存し、口腔組織に付着し、凝集物を形成し、口腔病原体を阻害する能力を少なくとも保持する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学、微生物学および栄養学の分野、特に、口腔衛生の分野において有用なプロバイオティックラクトバチルス株および組成物の新規組合せに関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
歯垢関連疾患、特に歯肉炎、歯周炎および齲蝕は、世界口腔疾患負担の大部分を示す。
【０００３】
歯周疾患（歯肉炎および歯周炎）は、主として特定のグラム陰性菌の細菌感染により引き起こされ、軟結合組織の最初の破壊、次に、歯を支持する下層の歯槽骨および靱帯の破壊を引き起こす。細菌の種ポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)は、歯周炎の発症および進行における主な病原因子として関与している。歯肉炎の一因となる他の種はまた、トレポネーマ・デンティコラ(Treponema denticola)、プレボテラ・デンティコラ(Prevotella denticola)およびフゾバクテリウム・ヌクレアタム(Fusobacterium nucleatum)である。世界保健機関の調査に基づくと、多数の子供は歯肉炎の兆候を有し、成人では、歯周疾患の最初の段階が高度にまん延している。例えば、欧州において、成人集団のおよそ１５−３５％が、該多因子疾患に罹患している。
【０００４】
齲蝕（虫歯としても知られている）は、細菌作用が堅い歯質を傷つける疾患である。ストレプトコッカス・ミュータンス(Steptococcus mutans)は、歯の表面に対する多くの付着を手助けする受容体を備えた少数の特殊な生物体の１つであり、したがって、歯の表面の早期定着種であり、齲蝕の最も重要な一因である。該先駆種の増殖および代謝は、高度に石灰化した歯のエナメル質を虫歯になりやすくする口内の酸性環境を作る。
【０００５】
上記に加えて、１つのさらなる口腔障害、口臭(halitosis)は、人口の大部分に影響すると考えられる。臭い息(bad breath)としても称される口臭は、硫黄含有アミノ酸の細菌分解に由来する多くの揮発性化合物により引き起こされる。関与している細菌（主に、フゾバクテリウム・ヌクレアタム、ポルフィロモナス・ジンジバリス、ポルフィロモナス・インターメディア(Porphyromonas intermedia)、およびトレポネーマ・デンティコラ）は、口腔の停滞域、例えば、舌の背面、歯周ポケットおよび隣接歯間領域に住む。該障害は、それを罹患している者に対して個人的および社会的に有意な影響を有し、虫歯および歯周疾患に続く、歯科医の助けを求める３番目に多い理由であると推定される。
【０００６】
口腔細菌は、全ての堅い、および柔らかい口腔組織上に生物膜（歯垢）を形成し、口の病理学的状態において主な病原因子であると考えられる。乏しい口腔衛生維持により促進される生物膜内の細菌の蓄積により、微生物群における同種シフト(allogenic shift)しやすくなり、歯周炎および齲蝕形成の発生をもたらし、ならびに口臭に寄与する。
【０００７】
酵母、および特に、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)はまた、口腔における障害の原因であり得る。高齢者は、慢性疾患、薬物療法、乏しい口腔衛生、唾液分泌の減少または免疫系の損傷によって誘発されるカンジダ感染に対して弱い。カンジダによるコロニー形成が無症候性であったとしても、多量の増殖は、通常、種々の型の粘膜病変および症状を伴う局所的カンジダ症を引き起こす。
【０００８】
口腔内の微生物叢の病原性の可能性を修飾することは、これらの障害に対抗することにおける興味深い戦略である。この方向において、部分的に病原性微生物を置き換えるためのプロバイオティックのラクトバチルスの導入は、口腔感染をコントロールするための有望な手段である。しかしながら、消化器疾患と比較して、口腔衛生適用のためのプロバイオティックの使用は、ほとんど研究されていない。現在、このような健康適用を組み込んだプロバイオティックを含む市販製品は、ほとんど市場に出回っていない。
【０００９】
これらの製品の１つは、ＢｉｏＧａｉａからのＰｒｏｄｅｎｔｉｓ（登録商標）である。Ｐｒｏｄｅｎｔｉｓは、プロバイオティックのラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ５５７３０株を含むチューインガムであり、臨床試験において歯肉炎を低下させることが証明されている（Twetman Sら “Short-term effect of chewing gums containing probiotic Lactobacillus_reuteri on the levels of inflammatory mediators in gingival crevicular fluid”. Acta Odontol Scand, 2009, vol. 67, p. 19-24）。同じ株であるラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ５５７３０は、齲蝕原性ストレプトコッカス・ミュータンスに対する強いアンタゴニスト活性を発揮することが報告されている（Caglar Eら “Salivery mutans streptococci and lactobacilli levels after ingestion of the probiotic bacterium Lactobacillus_reuteri ATCC 55730 by straws or tablets”. Acta Odontol Scand, 2009, vol. 64, p. 314-318）。しかしながら、他の口腔病原体に対するラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ５５７３０の影響についてはほとんど知られていない。さらに、ラクトバチルス・ロイテリは、口腔からではなく腸から単離されており、該株が、長期効果を有するために、生物膜を形成するか、または該環境に定着する能力を有するのか否か知られていない。ラクトバチルス種は、口腔状態を模倣する試験モデル系において、唾液被覆表面への付着能力が非常に多様であることが示されている（Stamatova Iら “In vitro evaluation of yoghut starter lactobacilli and Lactobacillus rhamnosus GG adhesion to saliva-coated surfaces”. Oral Microbiol Immunol, 2009, vol. 24, p. 218-223）。
【００１０】
ストレプトコッカス・サリバリウスＫ１２は、口腔における使用のために意図された別の市販のプロバイオティックである。ストレプトコッカス・サリバリウス(S. salivarius)Ｋ１２は、健康児の唾液から単離され、口臭の病因と見なされる種々の細菌種に対するインビトロでの抗菌活性を行うことが示されている（Burton JPら “Preliminary study of the effect of probiotic Streptococcus salivarius K12 on oral malodor parameters”. J Appl Microbiol, 2006, vol. 100, p. 754-764）。しかしながら、該株の有益な効果は、口臭症状の改善に限定される。
【００１１】
したがって、プロバイオティックは、適当なプロバイオティック株が同定されるという条件で、口腔において有益な効果を提供する可能性を有する。この試みにおいて、宿主に対する推定的な利益、また、株の安全性ならびに口腔において起こり得る副次的作用も考慮する必要がある。後者は、特定の口腔ラクトバチルスは、堅い組織、例えば、エナメル質および象牙質の分解を助ける高い酸産生の可能性によって齲蝕原性と言われているため、口腔ラクトバチルスの使用を考慮する間、特別な関連をもたらす。
【００１２】
口腔プロバイオティックの分野における進歩にもかかわらず、口腔における広範囲の利益を有し、副次的作用を提供しない新規プロバイオティック株が必要とされることは上記から明らかである。
【発明の概要】
【００１３】
発明の概要
本発明者らは、ヒト口腔微生物叢由来の新規株を単離した。該株のラクトバチルス・プランタラムＣＥＣＴ７４８１およびラクトバチルス・ブレビスＣＥＣＴ７４８０は、それらを口腔衛生の改善における使用に適当にする種々の機能特性を示す。このような特性は、口腔病原体に対する良いアンタゴニスト特性だけでなく、口腔にコロニーを作る能力および低酸性化プロフィールもまた含む。以下に議論されているとおり、両方の株が単一の組合せにおいて使用されるとき、口腔における健康上の利益が顕著であることも見いだした。
【００１４】
したがって、第１の局面において、本発明は、ラクトバチルス・プランタラムＣＥＣＴ７４８１およびラクトバチルス・ブレビスＣＥＣＴ７４８０を含む組成物を提供する。
【００１５】
出発物質として寄託された株を使用することにより、当業者は、慣用の変異誘発または再単離技術により、本発明の組成物を形成する株の本明細書に記載されている関連する特徴および利点を保持または増強するさらなる変異体またはそれらの誘導体を日常的に得ることができることは、明らかである。このような変異体または誘導体は、遺伝的に修飾されているか、または天然であってよい。当業者は、該株の機能活性を決定するために使用される十分な方法を決定し得る。これらの活性を測定するために可能な方法の例は、以下の実施例において示されている。
【００１６】
したがって、「ラクトバチルス・プランタラムＣＥＣＴ７４８１」は、受入番号ＣＥＣＴ７４８１の下にスペイン・タイプ・カルチャー・コレクションにおいて寄託されたラクトバチルス・プランタラム株、ならびに出発物質として寄託された株を使用する当分野で既知の技術により得られる変異体または誘導体微生物、株ラクトバチルス・プランタラムＣＥＣＴ７４８１の本明細書に記載されている関連する特徴および利点を少なくとも保持するこのような変異体または誘導体であると理解される。「ラクトバチルス・ブレビスＣＥＣＴ７４８０」は、受入番号ＣＥＣＴ７４８０の下にスペイン・タイプ・カルチャー・コレクションにおいて寄託されたラクトバチルス・ブレビス株、ならびに出発物質として寄託された株を使用する当分野で既知の技術により得られる変異体または誘導体微生物、株ラクトバチルス・ブレビスＣＥＣＴ７４８０の本明細書に記載されている関連する特徴および利点を少なくとも保持するこのような変異体または誘導体であると理解される。
【００１７】
本発明の株は、プロバイオティックとして特に有用であるという利点を有する。
【００１８】
「プロバイオティック」なる用語は、十分な量において投与されるとき、宿主に健康上の利益を与える微生物として当分野で認識される。プロバイオティック微生物は、毒性の欠如、生存能力、付着および有益な効果に関するいくつかの必要条件を満たすべきである。これらのプロバイオティック特徴は、同じ種の細菌の中でも株依存性である。したがって、全てのプロバイオティックの必要条件においてより良い能力を有する株と見つけることが重要である。
【００１９】
好ましくは、本発明の株は、口腔プロバイオティック、すなわち口腔衛生を増強するためのプロバイオティックとして有用である。ラクトバチルス・プランタラムＣＥＣＴ７４８１およびラクトバチルス・ブレビスＣＥＣＴ７４８０が、口腔障害、例えば、歯肉炎、歯周炎、齲蝕および口臭の発症に関与する口腔の非常に多数の病原体に対する有意な阻害活性を示すが、ヒト口腔細菌叢の一般的な共生株に対する最小のアンタゴニスト作用を示すことを見いだした。さらに、これらの２つの株は、それらの間の阻害活性の欠如を示し、したがって単一の処方においてこれらの組合せ使用を可能にする。さらに、以下の実施例において見ることができるとおり、単一の処方へのこれらの株の組合せ（すなわち本発明の組成物）は、別々に使用される個々の株の活性と比較して、口腔病原体に対するより高いアンタゴニスト活性を示すという利点を有する。したがって、本発明の株は、口腔病原体に対する共同活性を示し、組合せにおいて使用されるとき、とりわけ有用である。
【００２０】
口腔における病理学的状態に関与する微生物、例えば、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ポルフィロモナス・ジンジバリス、トレポネーマ・デンティコラ、プレボテラ・デンティコラおよびフゾバクテリウム・ヌクレアタムをアンタゴナイズすることにより、これらの株は、口腔微生物学的プロフィールをより健康的なプロフィールに変化する効果を有し、それにより口腔衛生状態の利益となる。
【００２１】
しかしながら、口腔病原体をアンタゴナイズする細菌株の単一の能力は、口腔におけるプロバイオティック効果を保証するために十分ではない。本発明の組成物の株は、強いアンタゴニスト活性に加えて、口腔にコロニーを作る良い能力を示すため、良い口腔プロバイオティックである。以下の実施例７において見ることができるとおり、ラクトバチルス・プランタラムＣＥＣＴ７４８１およびラクトバチルス・ブレビスＣＥＣＴ７４８０は、リゾチームおよび過酸化水素の存在下で増殖することができる。有利には、これらの株はまた、口腔組織に付着する良い能力を有する。
【００２２】
さらに、本発明の株は、凝集物を形成する高い能力を示す利点を有する。これは、該株が病原体の生物膜形成と干渉することにより歯垢を阻害または減少させることが可能であるため、重要である。凝集活性を有する乳酸菌プロバイオティック株は、互いの、または他の微生物との病理学的細菌の凝集の結果である病原体細菌による歯垢形成を阻害または減少させることができることが知られている。上記のとおり、堅い、および柔らかい口腔組織上に口腔病原体により形成される生物膜は、口の病理学的状態における重要な病原因子と考えられ、歯周炎、齲蝕形成および口臭の発生を引き起こす。本発明の株による凝集物の形成は、両方の株が組成物に組み合わせられるとき、増加され、該株が、単一の処方に組み合わせられるとき、病原体細菌を置き換えることにおいてより有効であることを意味する。
【００２３】
驚くべきことに、本発明者らはまた、株ＣＥＣＴ７４８１およびＣＥＣＴ７４８０が特に低酸性化プロフィールを示すことを見いだした。ラクトバチルス種は、多くの乳酸菌と同様に、ヒトの食物中の糖の発酵の結果としての揮発性酸の高い生産により特徴付けられる。しかしながら、これらの細菌の酸産生特性は、齲蝕の危険性を高めるため、口腔における起こり得る副次的作用となり得る。実際、多数のラクトバチルスは、齲蝕原性であると考えられている。したがって、本発明の組成物を形成するラクトバチルス株により示される酸生産の減少は、それらを口腔における健康適用のために特に適当にする。
【００２４】
上記有益な特性に加えて、本発明の株は、悪臭化合物、例えば、揮発性硫黄化合物、吉草酸、酪酸およびプトレシンを生産しないか、またはこれらを非常に低量で生産するという利点を有する。これはまた、口腔において本発明の組成物を適用するとき適切である。
【００２５】
さらに、プロバイオティックとしての使用のための株に一致するとおり、本発明の組成物を形成する株は、欧州食品安全機関（ＥＦＳＡ）により定義される「安全性適格推定」（ＱＰＳ）ステータスを有する細菌種に属する。さらに、本発明者らは、これらの株がヒトおよび／または獣医学的に重要な抗生物質（アンピシリン、ゲンタマイシン、ストレプトマイシン、エリスロマイシン、テトラサイクリン、クリンダマイシンおよびクロラムフェニコール）に対する有意な耐性を示さず、したがって抗生物質耐性の病原性種への起こり得る移入の危険性を排除することを見いだした。
【００２６】
上記を考慮して、本発明の株は、口腔プロバイオティックの分野で知られている市販の株と比較したとき、口腔プロバイオティックに関連する全てのパラメーターに対してより良いパフォーマンスを有する。以下の実施例に示されるとおり、新規株は、ストレプトコッカス・サリバリウス(Streptococcus salivarius)Ｋ１２およびラクトバチルス・ロイテリＡＴＴＣ５５７３０およびラクトバチルス・ブレビスＣＤ２よりも、口腔状態に対してより抵抗性であり、凝集物を形成するより良い能力、より高い（およびより広い）アンタゴニスト活性、より良い付着および／またはより低い酸性化プロフィールを有する。該特性のそれぞれを決定するためのプロトコールは、以下に含まれる。さらに、単一の組成物への本発明の両方の株の組合せは、一般的に、関連した機能性において株の共同パフォーマンスをもたらす。したがって、両方の株を含む組成物は、口腔プロバイオティックとしての使用のために特に適当である。
【００２７】
ヒト宿主においていくつかの有益な効果を発揮することにおいて、本発明の第１の局面の組成物は、医薬として有用である。特に、ラクトバチルス・プランタラムＣＥＣＴ７４８１およびラクトバチルス・ブレビスＣＥＣＴ７４８０を含む組成物が投与されるとき、口腔における障害の予防および／または処置において、好ましくは、口腔における病原体により引き起こされる障害の予防および／または処置のために有用である。
【００２８】
理論に縛られることは望まないが、本発明の組成物を形成する株の有益な効果は、口腔の微生物学的プロフィールを改善し、より健康的な口腔細菌叢を得た結果である。これらの有益な細菌の口腔における増殖は、一般的な、および／または日和見的な病原性微生物の増殖を阻害する環境圧を誘導する。該環境圧は、プロバイオティック細菌の凝集による付着部位および栄養に対する競合、抗菌性化合物の生産ならびに病原体の置換に由来する。
【００２９】
考慮に入れるさらなる１つの項目は、プロバイオティック細菌が免疫応答を調節する能力である。プロバイオティックが免疫を調節するメカニズムは、消化器構造において広く研究されている。プロバイオティック種は、上皮細胞により分泌される炎症性および抗炎症性サイトカインのバランスを変化させる能力を示した。プロバイオティックはまた、トール様受容体制御シグナル伝達経路を介して、先天免疫を増強すること、および病原体誘導炎症を調節することにより、免疫応答を制御する。プロバイオティックによる局所免疫応答ならびに全身免疫応答の増強は、末梢粘膜表面における感染、例えば、口腔における感染を防止することにおいて、プロバイオティックのための新たな機会を提供し得る。
【００３０】
したがって、第３の局面において、本発明は、医薬としての使用のための本発明の株を含む組成物を提供する。
【００３１】
第４の局面において、本発明は、ヒトを含む動物における口腔病原体により引き起こされる口腔の障害の予防および／または処置における使用のための本発明の第１の局面において記載されている組成物を提供する。あるいは、該局面は、ヒトを含む動物における口腔病原体により引き起こされる口腔の障害の予防および／または処置のための医薬の製造のための本発明の第１の局面において記載されている組成物の使用として規定することができる。
【００３２】
本発明はまた、本発明の第１の局面において記載されている組成物を必要とする動物に投与することを含む、ヒトを含む動物における口腔病原体により引き起こされる口腔の障害の予防および／または処置のための方法を提供する。
【００３３】
「口腔病原体により引き起こされる口腔の障害」なる用語は、口腔病原体、例えば、細菌、ウイルスまたは酵母により引き起こされている口腔において見いだすことができるあらゆる障害または異常として、広範な意味において本明細書において使用される。このような障害は、深刻な病理学的状態ならびにささいな状態または不快症状であり得る。「口腔病原体により引き起こされる口腔の障害」の説明的な非限定的な例は、特に、齲蝕、歯肉炎、歯周炎、カンジダ症、ヘルペスおよび潰瘍、ならびに口臭、着色した歯、知覚過敏である。
【００３４】
本発明の第４の局面の１つの態様において、組成物は、歯垢関連障害の処置および／または予防のために使用される。好ましくは、歯垢関連障害は、齲蝕、知覚過敏、歯肉炎および歯周炎からなる群から選択される。
【００３５】
本発明の第４の局面の別の態様において、組成物は、口臭の処置および／または予防のために使用される。
【００３６】
本発明の第４の局面のさらなる態様において、組成物は、カンジダ症の処置および／または予防のために使用される。
【００３７】
本発明の株を含む本発明の組成物は、食用、美容用または医薬品として処方することができる。該組成物は、本発明の株に加えて、１つ以上の他の活性剤および／または美容上許容される賦形剤（美容用組成物の場合において）、薬学的に許容される賦形剤（医薬組成物の場合において）または適切な食用成分（食用組成物の場合において）を含むことができる。本発明の特定の態様において、本発明の組成物は、１つ以上の活性剤をさらに含む。好ましくは、さらなる活性剤は、本発明の組成物を形成する株に対してアンタゴニスト性でない他のプロバイオティック細菌である。さらに好ましくは、さらなる活性剤は、口臭、カンジダ症、齲蝕、知覚過敏および／または歯周疾患を処置および／または予防するために適当である。処方に依存して、株は、精製された細菌として、細菌培養物として、細菌培養物の一部として、後処理された細菌培養物として、単独または適当な担体または成分と共に加えられ得る。プロバイオティクスも加えることができる。
【００３８】
組成物は、固体、液体または気体であってもよく、とりわけ、粉末、錠剤、膜調製物、溶液、エアロゾル、顆粒、ロゼンジ、丸薬、懸濁液、エマルジョン、カプセル、シロップ、液体、エリキシル剤、エキス剤、チンキ剤または流エキス剤の形態、または経口投与のために特に適当である形態であってもよい。
【００３９】
他の局面において、本発明は、本発明の組成物を薬学的に許容される賦形剤と共に含む医薬組成物を提供する。この点において、医薬品は、本発明の組成物を形成する株のバイオアベイラビリティに負に影響しない任意の適当な形態において調製され得る。組成物の特定の目的を考慮して、処方のための賦形剤および最も適当な方法の選択は、製薬技術分野の当業者の範囲内である。
【００４０】
本明細書において使用される「薬学的に許容される」なる用語は、正しい医学的判断の範囲内で、過剰毒性、炎症、アレルギー性応答、または他の問題もしくは合併症なしで対象（ヒトまたは非ヒト動物のいずれか）の組織との接触における使用のために適当であり、妥当な利益／危険比に見合う、化合物、材料、組成物、および／または投与形態を示す。それぞれの担体、賦形剤などはまた、処方の他の成分との適合性という意味において「許容され」なければならない。適当な担体、賦形剤などは、標準的製薬テキストにおいて見いだすことができる。
【００４１】
本発明の別の局面は、本発明の組成物を美容上許容される賦形剤と共に含む美容用組成物を提供する。病理学的細菌により引き起こされる口腔障害を予防および／または処置することにおいて、本発明の組成物は、これらの障害により生じる症状の改善および／または予防のために有用である。このような症状は、限定はしないが、臭い息および着色した歯を含む。
【００４２】
「美容上許容される」なる用語は、健全な医学的判断の範囲内で、特に、過度の毒性、不適合性、不安定性およびアレルギー性応答を伴うことなくヒト皮膚と接触して使用するために適当である、化合物、材料、組成物、および／または投与形態を示す。それぞれの「美容上許容される」担体、賦形剤などはまた、美容用処方の他の成分との適合性という意味において「許容され」なければならない。美容用処方のための適当な担体、賦形剤などは、標準的テキストにおいて見いだすことができる。
【００４３】
本発明の株はまた、種々の食用製品、例えば、乳製品、ヨーグルト、カード、チーズ（例えば、クォーク(quark)、クリーム、プロセス、ソフトおよびハード）、発酵乳、ミルク粉末、ミルクをベースとする発酵させた製品、アイスクリーム、発酵させたシリアルをベースとする製品、ミルクをベースとする粉末、飲料、ドレッシングおよびペットフードに包含させることができる。「食用製品」なる用語は、美容用、医薬用および獣医用製品を除かず、動物により摂取され得る表示のあらゆる形態における製品の任意の型を含む、広範な意味において、本明細書において使用される。他の食用製品の例は、肉製品（例えば、レバーペースト、フランクフルトソーセージおよびサラミソーセージまたはミートスプレッド）、チョコレートスプレッド、充填物（例えば、トリュフ、クリーム）およびフロスティング、チョコレート、菓子（例えば、キャラメル、キャンディー、フォンダンまたはタフィー）、焼いた食品（ケーキ、ペストリー）、ソースおよびスープ、果汁およびコーヒー用クリームである。動物性食物用の飼料もまた、本発明の範囲内に含まれる。本発明の組成物はまた、他の食品中の成分として使用することができる。特に興味のある食用製品は機能性食品および特殊調製粉乳である。
【００４４】
したがって、本発明の別の局面において、本発明の組成物を他の食用成分と共に含む食用組成物を提供する。
【００４５】
「食用成分」なる用語は、食べられることに適している、すなわち動物、限定はしないが好ましくはヒト、ウシまたはペットによる食物として使用される成分を示す。
【００４６】
しばしば、プロバイオティック細菌組成物、例えば本明細書に記載されているものは、栄養補助食品として考えられる。食品サプリメントまたは栄養サプリメントとしても知られている栄養補助食品は、正常食物において通常摂取されない有益な成分を提供する。主として、栄養補助食品は、食品として考えられるが、ときどき、薬物、自然健康製品または栄養補助食品として定義される。本発明という意味において、栄養補助食品はまた、栄養補助食品を含む。栄養補助食品は、「カウンターごしに」、すなわち処方箋なしで、通常販売される。
【００４７】
好ましい態様において、本発明の組成物は栄養補助食品である。
【００４８】
本発明の組成物が栄養補助食品であるとき、それは、それ自体を投与することができ、適当な飲用液体、例えば、水、ヨーグルト、ミルクまたは果汁と混合することができ、または固体または液体食物と混合することができる。この文脈において、栄養補助食品は、錠剤、丸薬、カプセル、ロゼンジ、顆粒、粉末、懸濁液、小袋、トローチ、スイーツ、棒状物、シロップおよび対応する投与形態の形態で、通常、投与用量の形態であり得る。好ましくは、本発明の組成物を含む栄養補助食品は、栄養補助食品を調製する慣用のプロセスにおいて製造される、錠剤、ロゼンジ、カプセル、または粉末の形態で投与される。
【００４９】
上記から導き出すことができるとおり、本発明の組成物を含む製品は、口腔障害を予防もしくは処置することによるか、またはこれらの障害に由来する症状を改善することによって、口腔衛生適用における使用のためのものである。したがって、本発明の別の局面は、上記の組成物を、薬学的に賦形剤または美容上許容される賦形剤または他の食用成分と共に含む口腔ケア製品を提供する。
【００５０】
本発明の意味において、該組成物は、通常の使用過程において、特定の治療剤の全身投与の目的のために意図的に飲み込まれず、むしろ、口腔活性の目的のために、実質的に全ての歯の表面および／または口腔組織に接触するために十分な時間、口腔内に保持される口腔用製品であってもよい。このような製品の非限定的な例は、練り歯磨き、歯磨き剤、歯磨き粉、局所口腔用ゲル、洗口液、義歯用製品、マウススプレー、チューインガム、デンタルフロスまたはデンタルテープである。口腔用組成物は、単一相の口腔用組成物であってよく、または２つ以上の口腔用組成物の組合せであってよい。
【００５１】
１つの態様において、口腔ケア製品は、チューインガム、練り歯磨き、マウススプレー、ロゼンジまたは口腔分散性錠剤である。好ましくは、口腔ケア製品は、ロゼンジまたは口腔分散性錠剤の形態である。
【００５２】
本発明の口腔ケア製品はまた、他の口腔に活性な剤、例えば、過酸化物、過ホウ酸塩、過炭酸塩、ペルオキシ酸塩、過硫酸塩、亜塩素酸金属、およびそれらの組合せのような漂白または酸化剤を含む歯科用ホワイトニング活性物質を含み得る。歯の色を修飾する物質もまた、本発明において有用な口腔ケア活性物質の中に考えられ得る。口腔ケア製品は、香味化合物、例えば、メントールをさらに含み得る。
【００５３】
本発明の組成物を形成する株は、好ましくは、生存可能である細胞の形態である。しかしながら、本発明の株はまた、生存可能でない細胞の形態、例えば、ラクトバチルス・プランタラムＣＥＣＴ７４８１およびラクトバチルス・ブレビスＣＥＣＴ７４８０により生じる有益な因子を含む死菌物または組成物であり得る。これは、熱的に死滅された微生物またはｐＨ、超音波処理、放射線もしくは圧力負荷の変化への暴露により死滅された微生物を含むことができる。生存可能でない細胞を用いると、製品の調製がより簡単であり、細胞は市販の製品に容易に組み込むことができ、保存的必要条件は生存可能である細胞よりもはるかに少ない。
【００５４】
本発明の組成物の形態において使用されるとき、株は意図される使用のために適当な任意の濃度比であることができる。例えば、株は、３：１から１：３（ラクトバチルス・プランタラムＣＥＣＴ７４８１：ラクトバチルス・ブレビスＣＥＣＴ７４８０）に含まれる濃度比であることができる。好ましくは、濃度比は１：１である。さらに、本発明の株は、必要とされる使用に対する有効量において組成物中に含まれる。
【００５５】
本明細書において使用される「有効量」なる用語は、健全な医学的判断の範囲内で、処置される状態を良い方向に修飾できるほど十分高いが、（合理的な利益／危険比で）深刻な副次的作用を回避できるほど十分低い、組成物中のそれぞれの株に対するコロニー形成単位（ｃｆｕ）の量である。該プロバイオティック微生物の有効量は、当業者により決定され、なし遂げられる特定の目的、処置される患者の年齢および健康状態、根底にある障害の重症度、および最終的な処方によって変化する。例えば、口腔衛生製品において、株は、約１０５ｃｆｕ／ｇから約１０１２ｃｆｕ／ｇの量、好ましくは約１０７ｃｆｕ／ｇから約１０１１ｃｆｕ／ｇの量で存在する。「コロニー形成単位」（「ｃｆｕ」）なる用語は、寒天プレート上の微生物学的カウントにより示される細菌細胞の数として定義される。特定の態様において、本発明の組成物は、１０７−１０１０ｃｆｕ／ｇにて含む口腔ケア製品である。
【００５６】
栄養補助食品は、通常、１０５から１０１２ｃｆｕ／ｇの範囲である量におけるプロバイオティック株を含む。特定の態様において、本発明の組成物は、１０７−１０１０ｃｆｕ／ｇにて含む栄養補助食品である。
【００５７】
本発明の株は、適当な培地中で、および適当な条件下で細菌を培養することにより生じる。株は、純粋な培養物を形成するように単独で、または他の微生物と共に混合培養物として、または種々の型の細菌を別々に培養し、次に、それらを所望の比率で混合することにより、培養することができる。培養後、細胞懸濁液は、回収され、それ自体を使用されるか、または所望の手段において、例えば、濃縮またはフリーズドライにより処理され、さらに製品の調製において使用される。ときどき、プロバイオティック調製物は、保存期間を改善するために、固定化またはカプセル化処理に付される。細菌の固定化またはカプセル化のためのいくつかの技術は、当分野で知られている。特定の態様において、本発明の組成物の一部を形成する株は、被包性細菌として口腔ケア製品に組み込まれる。
【００５８】
当業者に明らかなとおり、ラクトバチルス・プランタラムＣＥＣＴ７４８１およびラクトバチルス・ブレビスＣＥＣＴ７４８０は、単一の組成物において混合された場合のみでなく、それらが単独で、あるいは、同時に、連続して、または特定の期間後に別々に投与される２つの異なる組成物において使用される場合も有効である。さらに、当業者は、該株の１つを、口腔障害、特に口腔病原体により生じる障害、さらに好ましくは歯垢関連障害および／または口臭および／またはカンジダ症を予防または処置するために、口腔衛生のための他の株と共に使用されるように処方することができることを理解している。
【００５９】
結果として、本発明の１つのさらなる局面は、ラクトバチルス・プランタラムＣＥＣＴ７４８１を提供する。
【００６０】
最後に、本発明の別の局面は、ラクトバチルス・ブレビスＣＥＣＴ７４８０を提供する。
【００６１】
本発明の株は、初めて本明細書において開示され、したがって新規である。図１に示されるとおり、ラクトバチルス・プランタラムＣＥＣＴ７４８１およびラクトバチルス・ブレビスＣＥＣＴ７４８０の両方の株は、密接に関連する市販のラクトバチルス株、例えば、ラクトバチルス・プランタラム２９９ｖ、ラクトバチルス・プランタラムＶＳＬ＃３、ラクトバチルス・カゼイＶＳＬ＃３およびラクトバチルス・カゼイＤＮ１１４．００１と、異なるパルスフィールドゲル電気泳動パターンを有する。
【００６２】
当分野のいくつかの文献は、ラクトバチルス・プランタラムおよびラクトバチルス・ブレビスの株を含む組成物を記載している。しかしながら、本発明の組成物は、該組成物に対して新規である。
【００６３】
特に、ＫＲ１００７８００３０は、ラクトバチルス・ブレビスおよびラクトバチルス・プランタラムの株を含む発酵させた豆乳を記載している。記載された株は、韓国において典型的である発酵させた野菜からなる食べ物であるキムチから単離された。対照的に、本発明の株は、キムチが消費されていない南アメリカの開発地域における子供の唾液から単離された。したがって、本発明のラクトバチルス・ブレビスおよびラクトバチルス・プランタラム株は言及された韓国の株と完全に異なる起源を有し、ラクトバチルス・プランタラムＣＥＣＴ７４８１またはラクトバチルス・ブレビスＣＥＣＴ７４８０のいずれかが同じであるという意味である。
【００６４】
別の韓国特許出願ＫＲ１００８６６５０４は、ラクトバチルス・プランタラムＰ２（微生物受託番号ＫＣＴＣ１１３９１ＢＰ）および／またはラクトバチルス・ブレビスＭ２（微生物受託番号ＫＣＴＣ１１３９０ＢＰ）を使用する発酵させた赤色朝鮮人参を記載している。これらの株は、朝鮮人参から単離された。再び、本発明の株は南アメリカの開発地域において消費されていない植物から単離されたため、記載された韓国の株は本発明の株と完全に異なる起源を有する。これは、ラクトバチルス・プランタラムＣＥＣＴ７４８１またはラクトバチルス・ブレビスＣＥＣＴ７４８０のいずれかが言及された韓国の株と同じであるとういことを不可能にさせる。
【００６５】
国際特許出願ＷＯ２００５／０８２１５７およびＷＯ０２／３９８２５はまた、ラクトバチルス・プランタラムおよびラクトバチルス・ブレビス株の組合せを記載している。ＷＯ２００５／０８２１５７の組成物に記載されているラクトバチルス・ブレビスＬＢＲ０１株は、台湾におけるマスタードピクルスから単離された。ＷＯ０２／３９８２５の組成物に記載されているラクトバチルス・ブレビスＣ２１は、モンゴルの豆腐から単離された。上記のとおり、これらのラクトバチルス・ブレビス株の完全に異なる起源にしたがって、それらが本発明の株と同じであることは不可能である。そのうえ、記載されているラクトバチルス・ブレビスＬＢＲ０１およびラクトバチルス・ブレビスＣ２１株は、一般に利用できないようである。
【００６６】
さらに、ＷＯ２００６／０８００３５は、ラクトバチルス・ブレビスＣＤ２および不特定のラクトバチルス・プランタラム株を、ラクトバチルス・サリバリウス(L. salivarius)株と共に含む婦人科組成物を記載している。しかしながら、株ラクトバチルス・ブレビスＣＤ２は、ラクトバチルス・ブレビスＣＥＣＴ７４８０と異なっている。表４において示されるとおり、株ラクトバチルス・プランタラムＣＥＣＴ７４８１とラクトバチルス・ブレビスＣＤ２を混合したとき、アンタゴニスト効果は、凝集物を形成するする能力について観察される。対照的に、ラクトバチルス・プランタラムＣＥＣＴとラクトバチルス・ブレビスＣＥＣＴ７４８０との組合せは、凝集物を形成するより良い能力をもたらす。さらに、本発明のラクトバチルス・ブレビス株は、市販のラクトバチルス・ブレビスＣＤ２と比較して有意に低い酸性化プロフィールを有することが証明されている（表５参照）。したがって、ラクトバチルス・ブレビスＣＥＣＴ７４８０は、ラクトバチルス・ブレビスＣＤ２と異なるだけでなく、口腔衛生適用に対してより適当である。要するに、異なる効果を有する一方で、本発明の組合せは、ＷＯ２００６／０８００３５に記載されているものと異なっている。
【００６７】
最後に、ＷＯ０２／０１８５４２は、チェダー・チーズにおいて頻繁に見られるラクトバチルス株が、ラクトバチルス・ブレビスおよびラクトバチルス・プランタラム株を含むことを記載しており、特許出願ＦＲ２４４８８６５（１０頁、１１−１７行）は、ラクトバチルス・ブレビスを加えることができるラクトバチルス・プランタラムを含む組成物を記載している。しかしながら、これらの文献は、特定のラクトバチルス・ブレビス株および特定のラクトバチルス・プランタラム株を含む組成物を記載していない。したがって、特定のラクトバチルス・ブレビス株、すなわちラクトバチルス・ブレビスＣＥＣＴ７４８０、および特定のラクトバチルス・プランタラム株、すなわち、ラクトバチルス・プランタラムＣＥＣＴ７４８１を含む本発明の組成物は、新規である。
【００６８】
明細書および特許請求の範囲中、「含む」なる用語およびその派生語は、他の技術的特徴、付加物、成分または工程を排除することを意図しない。本発明のさらなる目的、利点および特徴は、明細書の試験に基づいて当業者に明らかとなるか、または本発明の実施により知ることができる。さらに、本発明は、本明細書に記載されている特定の、および好ましい態様の全ての起こり得る組合せを含む。実施例および図面は、説明の手段として提供され、本発明の限定を意図しない。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】１、ラクトバチルス・プランタラムＣＥＣＴ７４８１（Ｆ２０９６）；２、ラクトバチルス・プランタラム２９９Ｖ；３、ラクトバチルス・プランタラムＶＳＬ＃３；４、ラクトバチルス・ブレビスＣＥＣＴ７４８０（Ｉ３１４１）；５、ラクトバチルス・カゼイＶＳＬ＃３；６、ラクトバチルス・カゼイＤＮ１１４．００１のＳｆｉ−Ｉ（Ａ、Ｂ）およびＳｍａ−Ｉ（Ｃ、Ｄ）制限ゲノムＤＮＡのパルスフィールド電気泳動パターン。Ｍは分子マーカーを表す。
【実施例】
【００７０】
実施例
以下の部は、本発明の株の特性および口腔衛生適用に関する特定のプロバイオティック特徴を記載する。
【００７１】
１．微生物の単離
新規株Ｆ２０９６およびＩ３１４１は、熱帯の南アメリカの開発地域の０−５歳の子供由来の唾液から単離された。唾液をＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）に溶解させ、アリコートし、１０μｇ／ｍｌのバンコマイシン（SIGMA）を補ったＭＲＳ（Man Rogosa Sharp, Sigma-Aldrich Chem, Spain）寒天上に置いた。株を３７℃で微好気的条件（５％ＣＯ２）下で培養した。増殖させた後、単離された株を、１５％のスキムミルク粉末を有するＰＢＳ  ０．１Ｘ中で凍結乾燥により保存した。
【００７２】
株Ｆ２０９６およびＩ３１４１は、それぞれラクトバチルス・プランタラムおよびラクトバチルス・ブレビスとして同定された（以下の２の部参照）。両方の株は、スペイン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託された（Universitat de Valisncia, Campus de Burjassot, Edif. de Investigacion, 46100 Burjassot, Valisncia, Spain）。ラクトバチルス・プランタラム（株Ｆ２０９６）は、２１．０１．２００９にて寄託され、受入番号７４８１と与えられた。ラクトバチルス・ブレビス（株Ｉ３１４１）は、１８．０２．２００９にて寄託され、受入番号７４８０と与えられた。両方の寄託された株は、生存可能であり、寄託に関連する全ての特徴を維持している。
【００７３】
以下において使用されるとおり、株Ｆ２０９６は、ラクトバチルス・プランタラムＣＥＴＣ７４８１に、株Ｉ３１４１は、ラクトバチルス・ブレビスＣＥＣＴ７４８０に対応する。
【００７４】
ペデイオコッカス・アシディラクティシィ(pediococcus acidilactici)Ｆ２０１９（本明細書において以下ペデイオコッカス・アシディラクティシィ(P. acidilactici)と称する）、ラクトバチルス・パラカゼイＩ３１５２（本明細書において以下ラクトバチルス・パラカゼイ(L. paracasei)と称する）およびペデイオコッカス・ペントサセウス(Pediococcus pentosaceus)Ｉ５４（本明細書において以下ペデイオコッカス・ペントサセウス(P. pentosaceus)と称する）は、上記説明のとおりヒト唾液から単離された。ストレプトコッカス・サリバリウスＫ１２は、ＴＢＳ（トリプシン分解ダイズ培養液）中の市販のＢＬＩＳ  Ｋ１２（登録商標）から単離され、３７℃で好気状態下で培養した。ラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ５５７３０株は、市販のＲｅｕｔｅｒｉ  Ｄｒｏｐｓ（登録商標）から、ラクトバチルス・プランタラム２９９ｖはＰｏｖｉｖａ（登録商標）から、ラクトバチルス・ブレビスＣＤ２はＩｎｅｒｓａｎ（登録商標）から、ラクトバチルス・プランタラムＶＳＬ＃３およびラクトバチルス・カゼイＶＳＬ＃３はＶＳＬ＃３（登録商標）から、ラクトバチルス・カゼイＤＮ１１４．００１はＡｃｔｉｍｅｌ（登録商標）から単離された。後者の株の全てはＭＲＳ上で単離し、３７℃で５％  ＣＯ２下で培養した。潜在的に病原性の株ポルフィロモナス・ジンジバリスＣＩＰ１０３６８３、フゾバクテリウム・ヌクレアタムＣＩＰ１０４９８８、トレポネーマ・デンティコラＣＩＰ１０３９１７およびプレボテラ・デンティコラＣＩＰ１０４４７８Ｔは、パスツール研究所から得、提供者の指示にしたがって培養した。臨床的起源のストレプトコッカス・ミュータンスは、３７℃で５％  ＣＯ２下でブレインハート（Brain Heart）寒天上で培養した。株の同定は、シーケンシングにより行った。
【００７５】
２．株の分類学的特性
２．１．属および種の遺伝的同定
Ａ）方法
本発明の株を、３７℃で５％  ＣＯ２を含む雰囲気下でＭＲＳ培地（ｐＨ６．４）上で一晩培養した。さらに、細菌を回収し、洗浄し、前溶解バッファー（４８０μｌのＥＤＴＡ  ５０ｍＭ  ｐＨ８．０；１２０μｌのリゾチーム  １０ｍｇ／ｍｌ）に再懸濁し、さらに３７℃で６０分インキュベートした。ＤＮＡを、ＷｉｚａｒｄゲノムＤＮＡ精製キット（Promega）を使用して抽出した。１４０００ｇで２分間、前処理された細菌を遠心分離し、上清を除去した後、Ｐｒｏｍｅｇａのプロトコールを続けた。簡潔には、細菌を核溶解溶液に再懸濁し、８０℃で５分間インキュベートし、次に室温に冷やした。細胞溶解物をＲＮａｓｅ溶液中で３７℃で６０分間インキュベートし、タンパク質にタンパク質沈殿溶液を加え、高速で回転させることにより、沈殿させた。サンプルを冷やし、１５０００ｇで３分間遠心した。ＤＮＡを含む上清をきれいな１．５ｍｌ微量遠心チューブに移し、反転により６００μｌのイソプロパノールと混合した。ＤＮＡを１５０００ｇで２分間遠心分離により回収し、注意深く上清を捨てた。ＤＮＡサンプルを、穏やかにチューブを数回反転させることにより、６００μｌの７０％エタノールで洗浄した。エタノールを、１５０００ｇで２分間遠心分離後に、吸引により除去した。最後に、ＤＮＡペレットは、６５℃で１時間インキュベートすることにより、１００μｌのＲｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ溶液に再懸濁した。サンプルを２−８℃で貯蔵した。
【００７６】
１６Ｓ  ｒＲＮＡを、１６Ｓのほぼ全配列のフラグメント（１０００個以上のヌクレオチド）を生産するユニバーサルプライマーＥｕｂ２７ｆおよびＥｕｂ１４９２ｒを使用して、ＰＣＲにより増幅した（表１）。次に、上記説明のとおりに得られたＤＮＡを、キットＱｕｉａｑｕｉｃｋ（Quiagene）を使用して洗浄した。
【００７７】
４連続シーケンシング反応を、表１において示されるプライマーを使用するＢｉｇＤｙｅ  キット  ｖ．３．１を使用して、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ３１３０（Applied Biosystems）においてそれぞれのサンプルに対して行った。データ回収およびクロマトグラムを、ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｖ．５．２  ソフトウェア（Applied Biosystems）を使用して作り、Ｃｈｒｏｍａｓ（Technelysium Pty Ltd.）およびＢｉｏＥｄｉｔ（Ibis Biosciences）での視覚分析により確認した。
【００７８】
属同定は、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔツールを使用して行った（Wang Qら “Naive Bayesian Classifier for Rapid Assignment of rRNA Sequences into the New Bacteial Taxonomy”, Appl Environ Microbiol, 2007, vol. 73, p. 5261-5267）。種同定は、ＢＬＡＳＴＮの手段によるＲｅｆＳｅｑ  データベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/）、およびＲｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（http://rdp.cme.msu.edu/, J.R. Cole et al., “The Ribosomal Database Project (RDP-II): introducing myRDP space and quality controlled public data”, Nucl. Acids Res., 2007, vol. 35, p. 169-172）の両方から、既知の生物体の１６Ｓ配列での得られた配列の比較により行った。
表１．１６Ｓ遺伝子を増幅し、シーケンシングするために使用されるプライマー
【表１】
0005879349.tif 000002
【００７９】
Ｂ）結果
ＲＤＰ（Ribosimal Database Project）ツールによって、株Ｆ２０９６がラクトバチルス・プランタラム種に属し、株Ｉ３１４１がラクトバチルス・プランタラム種に属すると同定された。
【００８０】
２．２．株の遺伝子型決定
Ａ）方法
特性評価は、ゲノム消化およびパルスフィールドゲル電気泳動により行った。Ｆ２０９６およびＩ３１４１株を、以前に記載されたプロトコール（Rodas AMら “Polyphasic study of wine Lactobacillus strains: taxonomic implications”, Int J Syst Evol Microbiol, 2005, vol. 55, p. 197-207）に付した。市販の株、ラクトバチルス・プランタラム２９９Ｖ、ラクトバチルス・プランタラムＶＳＬ＃３、ラクトバチルス・カゼイＶＳＬ＃３およびラクトバチルス・カゼイＤＮ１１４．００１はまた、コントロール株としてアッセイに含んだ。全ての株をＭＲＳ寒天プレート上で増殖させ、３７℃で５％  ＣＯ２下で１８時間インキュベートした。細胞を回収し、８ｍｌのＰＥＴ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．６、１Ｍ  ＮａＣｌ）中で３回洗浄し、次に、６０００ｒｐｍで１０分間遠心した。ペレットを７００μｌの溶解バッファー（６ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．１Ｍ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＳＬＳ、０．２％  デオキシコール酸；１ｍｇ／ｍｌ  リゾチーム；４０Ｕ／ｍｌ  ムタノリシン；２０（ｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅ）に再懸濁した。同等の容量の１．６％低融点アガロース（FMC BioProducts, Rockland, ME, USA）を再懸濁された細胞に加え、４℃で１時間で凝固させた。挿入物を２ｍｌ溶解バッファーＩＩ（０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  ｐＨ９．２、１％  Ｎ−ラウロイルサルコシンおよび１ｍｇ／ｍｌ  プロナーゼ）に移し、５０℃で４８時間インキュベートした。次に、挿入物を室温でＴＥバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０）で洗浄した。全ＤＮＡ消化をＳｆｉ−ＩおよびＳｍａ−Ｉ制限酵素（Roche Diagnostics）により行った。
【００８１】
パルスフィールド電気泳動を、ＣＨＥＦ  ＤＲＩＩＩ装置（BioRad Laboratories）を使用して行った。挿入物を１％  アガロースゲル（SeaKem ME agarose, FMC BioProducts, ME, USA）に負荷した。表２は、それぞれの酵素に対する電気泳動状態を記載している。ＤＮＡ分子量マーカーは、Ｌａｍｂｄａ  ｌａｄｄｅｒ  ＰＦＧ  ＭａｒｋｅｒおよびＬｏｗ  Ｒａｎｇｅ  ＰＦＧ  Ｍａｒｋｅｒ（New England Biolabs）であった。電気泳動後、ＧｅｌＤｏｃ  Ｓｙｓｔｅｍ（BioRad）を使用して、ゲルを臭化エチジウムおよびＵＶで染色した。
表２．Ｆ２０９６およびＩ３１４１株由来のＳｆｉ−ＩおよびＳｍａ−Ｉ制限ゲノムＤＮＡに対する電気泳動状態
【表２】
0005879349.tif 000003
【００８２】
Ｂ）結果
図１に示されるとおり、Ｆ２０９６株に対するパルスフィールド電気泳動Ｓｆｉ−ＩおよびＳｍａ−Ｉ制限パターンは、市販のラクトバチルス・プランタラム２９９ｖおよびラクトバチルス・プランタラムＶＳＬ＃３株のものと異なり、Ｉ３１４１に対する制限パターンは、非常に関連した市販のラクトバチルス・カゼイ株のものと異なる。したがって、Ｆ２０９６およびＩ３１４１株が新規株であると結論づけることができる。
【００８３】
３．病原体をアンタゴナイズする能力
Ａ）方法
株Ｆ２０９６およびＩ３１４１がアンタゴニスト活性を示すか否かを評価するために、Ｃａｍｐｂｅｌｌプロトコールを、Ｏｘｏｉｄ培地中に細菌性病原体で播種された寒天プレートを使用して行った。試験において使用される病原体は、ヒトの口腔において一般的に存在するものの中から選択された（表１参照）。簡潔には、Ｆ２０９６、Ｉ３１４１およびペデイオコッカス・アシディラクティシィ、ヒトの唾液から単離された別の株を、それぞれ上記特定の状態下で一晩培養した。インキュベーション後、培養物を１０８ｃｆｕ／ｍｌに標準化し、以下の混合培養物を調製した：Ｆ２０９６＋Ｉ３１４１、Ｆ２０９６＋ペデイオコッカス・アシディラクティシィ、およびＩ３１４１＋ペデイオコッカス・アシディラクティシィ。該混合培養物は、等量のそれぞれのこれらの構成株および単一株の培養物として同じ全細菌濃度、すなわち１０８ｃｆｕ／ｍｌを含んだ。固定された容量のそれぞれの単一株の培養物および混合培養物を一様に播種し、適当な温度で５％  ＣＯ２インキュベーターでコンフルエンスにまで増殖させた。次に、コンフルエンス寒天プレートの一様なサイズのシリンダー部を、病原体プレート上にローン  トゥ  ローン(loan-to-loan)で置き、３７℃で一晩インキュベートした。
【００８４】
次の日、阻害部を、平らな物差しの上に寒天プレートを置くことにより測定した。株のアンタゴニスト特性を、阻害部直径（ＩＺＤ）からシリンダー直径（ＣＤ）を引き、この差を２で割ること、以下の式ＧＩＡ＝（ＩＺＤ−ＣＤ）／２により計算される、増殖阻害活性（ＧＩＡ）として測定した。本発明の株の阻害能力を、市販の口腔プロバイオティック株ストレプトコッカス・サリバリウスＫ１２およびラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ５５７３０のものと比較した。
【００８５】
Ｂ）結果
株Ｆ２０９６およびＩ３１４１の増殖阻害活性は、表３において示される。結果は、トリプリケート実験の平均である。
表３．口腔病原体に対する増殖阻害活性
【表３】
0005879349.tif 000004
ＮＩ、阻害なし
【００８６】
該結果により分かるとおり、Ｐ２０９６およびＩ３１４１の両方は、口腔病原体に対する広範な阻害パターンを有する。これは、予備試験がポルフィロモナス・ジンジバリスに対するアンタゴニスト活性がまれである（結果は示されていない）ことを示したため、ポルフィロモナス・ジンジバリスととりわけ関連している。さらに、混合培養物中のＦ２０９６およびＩ３１４１の組合せが、単一の培養物として別々に使用される個々の株の活性と比較して、口腔病原体に対するより高いアンタゴニスト活性を示すことに注目すべきである。混合培養物中のそれぞれの株の濃度が単一の培養物中の濃度の半分であり、したがって、組合せのアンタゴニスト効果が、これらの株に対する個々の効果の合計よりも高いことに注意すること。この相乗効果は、それぞれの株が口腔の別の生息動物であるペデイオコッカス・アシディラクティシィと混合されるとき、起こらない。したがって、本発明の株は、口腔病原体に対する相乗活性を示し、単一の処方物において使用されるとき、とりわけ有用である。
【００８７】
市販のプロバイオティックストレプトコッカス・サリバリウスＫ１２およびラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ５５７３０と比較した場合、本発明の株は、有意に高いアンタゴニスト能力を有する。最後に、Ｆ２０９６およびＩ３１４１は、互いに、またはヒトの口腔細菌叢の一般的な共生株に対して、最小のアンタゴニスト作用を示した。
【００８８】
４．凝集物の形成
Ａ）方法
凝集物を形成する能力を、凝集物および沈殿物の形成による、一晩培養物の６２０ｎｍでの光学濃度の減少をモニタリングすることにより評価した。凝集能力パーセント（％ＡＣ）値を、以下の式：％ＡＣ＝（１−（ＯＤｔｆ／ＯＤｔ０）／１００（式中、ＯＤｔｆおよびＯＤｔ０はそれぞれ最後および最初の光学濃度である）を使用して得た。最初のＯＤは、全ての培養物が等量のｃｆｕ／ｍｌを含むことができるように、調節した。混合された培養物は、５０％のそれぞれの株を含む所望の全ｃｆｕ／ｍｌを得るように、適当な量の単一の株を混合することにより調製された。
【００８９】
Ｂ）結果
凝集物を形成する能力は、該株が、病原体生物膜形成に干渉することにより歯垢を阻害または減少させることができるため、口腔衛生適用でのプロバイオティック株に重要である。
【００９０】
新規株およびそれらの組合せまたはペデイオコッカス・アシディラクティシィもしくはラクトバチルス・ブレビスＣＤ２との組合せに対する平均凝集能力値は、コントロール株と比較されて表４に示される。これらの結果は、新規単離物が、市販のコントロール  ストレプトコッカス・サリバリウスＫ１２およびラクトバチルス・ロイテリＡＴＴＣ５５７３０の両方よりも、有意に高い非常に良い凝集活性を示したことを明確に証明する。さらに、本発明の株による凝集物形成が、両方の株が混合培養物において混合されるとき増加され、該株が、単一の組成物に混合されるとき、病原体細菌の置換においてさらに有効であることを意味する。しかしながら、この協力は、本発明の株が、良い凝集能力を有する他の株、例えば、ペデイオコッカス・アシディラクティシィおよびラクトバチルス・ブレビスＣＤ２と別々に混合されたとき、存在しない。さらに、本発明の株とラクトバチルス・ブレビスＣＤ２とを混合するとき、アンタゴニスト効果が観察され、本発明の株が、ラクトバチルス・ブレビスＣＤ２と混合されたとき、病原体細菌の置換においてあまり有効でないことを意味する。
表４．凝集能力（％）
【表４】
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【００９１】
５．酸の生産
Ａ）方法
ヒト食物に存在する種々の糖を補った培養培地において増殖させるときの、新規株が酸を生産する能力を評価した。該株を、以下の培地中で５％  ＣＯ２下で３７℃で１８時間増殖した：ＭＲＳおよび４％  グルコース、４％  フルクトース、４％  ラクトースまたは４％  スクロースを補った最小培地。最小培地は、２ｇ／Ｌ  ペプトン水、２ｇ／Ｌ  酵母抽出物、０．１ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、０．０４ｇ／Ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４、０．０４ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、０．０１ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ、２ｇ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３、０．０５ｇ／Ｌ  ヘルミナ(hemina)（少数の１ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＯＨ滴に溶解させた）、０．５ｇ／Ｌ  システインＨＣｌ、０．５ｇ／Ｌ  胆汁塩、２ｇ／Ｌ  Ｔｗｅｅｎ  ８０、および１０μｌ  ビタミン  Ｋ１（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍ、Ｓｐａｉｎから全ての成分を得た）を含んだ。培養物をＨＣｌでｐＨ７に調節した。ｐＨおよび生存細胞の数（ｃｆｕ／ｍｌ）を、インキュベーション時間の最後に測定した。それぞれの培養培地に対する酸価の生産は、以下の式：ＰＡ値＝ｐＨ＊ｌｏｇ（ｃｆｕ／ｍｌ）により得た。
【００９２】
Ｂ）結果
上記式にしたがって、低い値は、高い酸産生性の株に対応する。高い酸生産は、齲蝕形成を促進するため、口腔プロバイオティックに対する望ましくない副次的作用である。種々の糖において増殖されるＦ２０９６およびＩ３１４１ならびにいくつかのプロバイオティックコントロール株に対する酸生産値は、市販の株に対して得られた値と共に、表５に示すことができる。ＭＭは最小培地を表す。
表５．酸の生産
【表５】
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【００９３】
これらの結果は、種々の糖における株Ｆ２０９６およびＩ３１４１の増殖が、口腔から単離されている他の細菌株、すなわち、ラクトバチルス・パラカゼイ、ペデイオコッカス・ペントサセウスおよびペデイオコッカス・アシディラクティシィと比較して、有意に乏しい酸生産をもたらすことを証明する。本発明の株はまた、市販の口腔プロバイオティックのストレプトコッカス・サリバリウスＫ１２よりも少ない酸産生である。さらに、株Ｉ３１４１は、特に低い酸産生であることが知られており、抗齲蝕原性プロバイオティックとして売買されているラクトバチルス・ロイテリＡＴＴＣ５５７３０と比較したとき、より低い酸性化プロフィールを有する。本発明Ｉ３１４１のラクトバチルス・ブレビス株が、市販のラクトバチルス・ブレビスＣＤ２と比較して、有意に低い酸性化プロフィールを有することも注目すべきである。したがって、株Ｆ２０９６およびＩ３１４１は低酸性化プロフィールを有し、したがって口腔衛生適用に対して適当である。
【００９４】
６．悪臭揮発性化合物の生産
Ａ）方法
新規株による悪臭揮発性化合物の生産を、ヒトの食物に類似している培養培地において培養したとき、感覚評価の手段により決定した。簡潔には、株を、５％  ＣＯ２下で３７℃で４８時間、グルコース（０．５％  ｗ／ｖ）、フルクトース（０．５％  ｗ／ｖ）、酵母抽出物（１％  ｗ／ｖ）、肉抽出物（１％  ｗ／ｖ）、真核細胞（２００  細胞／ｍｌ）およびペクチン（０．５％  ｗ／ｖ）を含む培地において培養した。株は、１が臭気がなく、５が非常に不快な臭気である１から５の悪臭値の生産をもたらす。
【００９５】
Ｂ）結果
悪臭化合物の生産は、口腔プロバイオティックに対して非常に望ましくない。しかしながら、本発明の株は、ヒトの食物に類似している培養培地において培養されている間、一切不快な臭気を生産しなかった。
表６．不快な臭気の生産
【表６】
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【００９６】
７．口腔状態に対する生存
Ａ）方法
口腔における株の生存は、それらを口腔ストレス状態に置くことにより試験した。５＊１０７ｃｆｕのそれぞれの細菌株を、Ｆ２０９６、Ｉ３１４１およびラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ５５７３０の場合、２００μｌのＭＲＳ培地の、またはストレプトコッカス・サリバリウスＫ１２の場合、トリプシン分解ダイズ培養液（TSB, Oxoid）の９６ウェル培養プレートに播種した。培養物に、生理学的濃度のリゾチーム（Sigma-Aldrich Chem, Spain）または過酸化水素（Sigma-Aldrich Chem, Spain）を補った。プレートを、５％  ＣＯ２下で３７℃で６時間インキュベートした。細菌増殖を、６２０ｎｍで光学濃度を測定することにより定量した。細菌増殖値を、補足なしの標準ＭＲＳ培地中で同じ株によりなし遂げられる増殖と比較することにより得た。
【００９７】
Ｂ）結果
全生存パーセント値（％ＳＶ）を以下のとおりに計算した：％ＳＶ＝［（ＯＤｔｆ−ＯＤｔ０（補足あり））／（ＯＤｔｆ−ＯＤｔ０（補足なし））］＊１００（式中、ＯＤは光学濃度であり、ｔｆおよびｔ０はそれぞれ最後および最初の時間である）。以下の値は、トリプリケート結果の平均である：
表７．口腔状態に対する生存
【表７】
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【００９８】
新規株Ｆ２０９６およびＩ３１４１は、市販の株ストレプトコッカス・サリバリウスＫ１２およびラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ５５７３０よりも口腔ストレスに対して良い耐性を示した。
【００９９】
８．口腔組織に付着する能力
Ａ）方法
腸のブタの舌、Ｃａｃｏ−２細胞（歯肉を刺激するため）およびヒドロキシアパタイト（ＨＡ）ビーズ（歯を刺激するため）へのＦ２０９６、Ｉ３１４１および市販のコントロール株のインビトロでの付着アッセイを行った。それぞれの株を１０μｌ／ｍｌの５−［３Ｈ］チミジン（１．０μＣｉ／ｍｌ、Amersham Biosciences, UK）で一晩インキュベートした。調製物を遠心し、ペレットを１０８ｃｆｕ／ｍｌの濃度にＰＢＳバッファーで再懸濁した。微生物に取り込まれたトリチウムシグナルは、シンチレーションリーダー（Wallac 1410）において最初のトリチウムシグナルおよび上清シグナルから計算した。この数（バイオマスに取り込まれたシグナル）と培養物中の微生物の数の比は、ｃｐｍ／ｃｆｕ（シグナル／細菌）をもたらす。
【０１００】
付着測定は、ＥＬＩＳＡプレート中の１．０５＊０．５ｃｍ−フラグメントのブタの舌または前インキュベートされたＣａｃｏ−２細胞または５０ｍｇのＨＡビーズ（８０μｍの直径）のいずれかへの、３．３ｍｌの放射標識された１０８ｃｆｕのそれぞれの株の添加により行った。４５分後、上清を注意深く除去した。ＨＡビーズ（付着された細菌と共に）を遠心分離により回収した。付着している細菌と共に舌またはＣａｃｏ−２細胞を、ＥＬＩＳＡウェルから廃棄した。最後に、回収した細菌を溶解し、特定の放射能（ｃｐｍ／ｃｆｕ）を計算した。
【０１０１】
全てのアッセイをトリプリケートにおいて行い、結果を１ｃｍ２あたりの付着した細菌の数として示した。ストレプトコッカス・サリバリウスが多数の試験された特性（上記結果参照）に対して良い結果を示したため、該株を付着アッセイのためのコントロール株として使用した。
Ｂ）結果
表８．口腔組織への付着
【表８】
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【０１０２】
これらの結果は、株Ｆ２０９６およびＩ３１４１が、口腔プロバイオティック株のストレプトコッカス・サリバリウスＫ１２と比較したとき、口腔組織への全体的な良い付着能力を有することを証明する。口腔組織へ付着するする能力は、病原体に対する付着部位を競合し、口腔における耐久性を助けるとき、これらの細菌に競合的利点を与えるため、プロバイオティックとして使用される株のための関連する特徴である。結果として、口腔組織への良い付着を示す株は、口腔からの病原体の置換に寄与し、より健康的な口腔細菌叢を促進する。
【０１０３】
９．抗生物質感受性
Ａ）方法
株Ｆ２０９６およびＩ３１４１に対する抗生物質感受性を、欧州食品安全機関（ＥＦＳＡ）による技術的ガイドラインにしたがって試験した（“Update of the criteria used in the assessment of bacterial resistance to antibiotics of human or veterinary importance”. The EFSA Journal, 2008, vol. 732, p. 1-15）。株に対する培養条件は以下のとおりであった：３７℃で５％ＣＯ２下でＥＦＳＡ推奨抗生物質濃度を含むＭＲＳ寒天プレートの表面上の増殖。
【０１０４】
Ｂ）結果
抗生物質含有培地上での株の増殖は、表９に示される。ＥＦＳＡにより推奨されるアッセイのそれぞれの抗生物質の濃度は、ｍｇ／ｍｌにおいて与えられる。抗生物質濃度に対して示されていない値は、ラクトバチルス・ブレビス種に対するＥＦＳＡにより記載されており、したがって、ラクトバチルス・ブレビス株Ｉ３１４１における抗生物質耐性は、この種が属するグループの偏性ヘテロ型発酵性のラクトバチルスに対して推奨される濃度を使用してアッセイした。
【０１０５】
結果は、Ｆ２０９６およびＩ２１４１が抗生物質耐性を有しないことを示す。したがって、それらはヒトの消費のために適当である。
表９．株Ｆ２０９６およびＩ３１４１の抗生物質耐性
【表９】
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ｎ．ｒ．、ＥＦＳＡにより推奨されていない
【０１０６】
書誌参照
【表１０】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【配列表】
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