(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一種の抗酸化剤、及び線維芽細胞増殖因子−２を含み、
前記抗酸化剤が、Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸塩とＮ−アセチル−Ｌ−システインとの組合せであることを特徴とする生体外でヒト間葉系幹細胞を増殖させる補助剤。
【請求項２】
前記ヒト間葉系幹細胞体は、脂肪間葉系幹細胞、骨髄間葉系幹細胞、或いは臍帯間葉系幹細胞からなる一群から選ばれることを特徴とする請求項１に記載の生体外でヒト間葉系幹細胞を増殖させる補助剤。
【請求項３】
前記線維芽細胞増殖因子−２の使用濃度は、１〜２０ナノグラム／ミリリットルであることを特徴とする請求項１に記載の生体外でヒト間葉系幹細胞を増殖させる補助剤。
【請求項４】
前記ヒト間葉系幹細胞の細胞内細胞サイクリン依存性キナーゼインヒビタ（ｐ２１及びｐ２７）の発現を抑制することで、サイクリン依存性キナーゼ−２（ＣＤＫ−２）、サイクリン依存性キナーゼ−４（ＣＤＫ−４）、細胞周期タンパク質（ＣＤＣ２）の発現を向上させることを特徴とする請求項１に記載の生体外でヒト間葉系幹細胞を増殖させる補助剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の補助剤を、ヒト間葉系幹細胞を含む培養基中に加え、前記ヒト間葉系幹細胞を増殖させ、実質未分化のヒト間葉系幹細胞を取り出すステップを含むことを特徴とする生体外でヒト間葉系幹細胞を増殖させる方法。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の補助剤を、血清添加物とヒト間葉系幹細胞を含む培養基中に加え、前記ヒト間葉系幹細胞を増殖させ、実質未分化のヒト間葉系幹細胞を取り出すステップを含むことを特徴とする生体外でヒト間葉系幹細胞を増殖させる方法。
【請求項７】
前記血清添加物は、ヒト血清或いはウシ胎児血清であり、使用する体積パーセンテージ濃度が２〜１０％であることを特徴とする請求項６に記載の生体外でヒト間葉系幹細胞を増殖させる方法。
【請求項８】
増殖した前記ヒト間葉系幹細胞を冷凍保存するステップをさらに含むことを特徴とする請求項５〜７のいずれか一項に記載の生体外でヒト間葉系幹細胞を増殖させる方法。
【請求項９】
冷凍保存された増殖したヒト間葉系幹細胞を含むセルバンクに保存するステップをさらに含むことを特徴とする請求項８に記載の生体外でヒト間葉系幹細胞を増殖させる方法。
【請求項１０】
前記ヒト間葉系幹細胞の細胞抽出物を取り出す抽出ステップをさらに含むことを特徴とする請求項５〜７のいずれか一項に記載の生体外でヒト間葉系幹細胞を増殖させる方法。
【請求項１１】
前記ヒト間葉系幹細胞から分化した細胞を得る誘導分化ステップをさらに含むことを特徴とする請求項５〜７のいずれか一項に記載の生体外でヒト間葉系幹細胞を増殖させる方法。
【請求項１２】
前記ヒト間葉系幹細胞から分化した細胞は、骨細胞、脂肪細胞、或いは軟骨細胞の内の一つを含むことを特徴とする請求項１１に記載の生体外でヒト間葉系幹細胞を増殖させる方法。
【請求項１３】
前記実質未分化のヒト間葉系幹細胞、或いは前記ヒト間葉系幹細胞から分化した細胞は、医薬組成物に用いられることを特徴とする請求項５〜１２のいずれか一項に記載の生体外でヒト間葉系幹細胞を増殖させる方法。
【請求項１４】
請求項５〜１３の任意の一項に記載の方法により培養後、前記培養基中で成長因子を取り出すことを特徴とする生体外でヒト間葉系幹細胞の成長因子を取り出す方法。
【請求項１５】
前記成長因子は、ＦＧＦ−２、ＥＧＦ、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７、ＨＢ−ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＰＢ−４、ＩＧＦＢＰ−６、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−Ｉ  ＳＲ、ＩＧＦ−ＩＩ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ  Ｒ、ＰＤＧＦ  Ｒα、ＰＤＧＦ−Ｒβ、ＰＤＡＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＩＧＦ、ＳＣＦ、ＴＧＦ−β３、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ  Ｒ２を含むことを特徴とする請求項１４に記載の生体外でヒト間葉系幹細胞の成長因子を取り出す方法。
【請求項１６】
前記成長因子は、傷口の癒合を促す薬物の調合に用いられることを特徴とする請求項１４に記載の生体外でヒト間葉系幹細胞の成長因子を取り出す方法。
【請求項１７】
前記成長因子は、スキンケア用品に用いられることを特徴とする請求項１４に記載の生体外でヒト間葉系幹細胞の成長因子を取り出す方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体外でヒト間葉系幹細胞を増殖させる方法、およびそれに用いる補助剤、ならびに、生体外でヒト間葉系幹細胞の成長因子を取り出す方法およびその成長因子の用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、科学界は幹細胞を、定義し、その特性も定義している。
それは、細胞自己複製（Ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ）、増殖（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）能力を備え、同時に、長期間未分化（Ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）状態を維持する細胞で、適当な誘導刺激を受けると、異なる血統の細胞群に分化し、及び特定機能の組織の多重分化（ｍｕｌｔｉ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｔｉｏｎ）特性を備える。
【０００３】
幹細胞は、幹細胞のソースとその分化潜在能力の違いに応じて、以下のように分類される。
全能性幹細胞  （Ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）：完全に独立した生物体に発展する能力を備える。受精卵（Ｚｙｇｏｔｅ）や胚が約八細胞に発育する時期の細胞群などを指す。
多機能性幹細胞（Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）：受精卵（Ｚｙｇｏｔｅ）は受精約４日後に、全機能性幹細胞は分化を始め胞胚期に入る。胞胚は、細胞外層（ｏｕｔｅｒ  ｌａｙｅｒ  ｏｆ  ｃｅｌｌｓ）と内部細胞塊（ｉｎｎｅｒ  ｃｅｌｌ  ｍａｓｓ）という２部分で分けられる。胚の発育過程で、細胞外層は、胎盤と胎児が子宮に付着するために必要な支持組織を形成する。内部細胞塊は、外胚葉、中胚葉、内胚葉を形成する。各胚葉は、さらに各種異なるシステムと器官に分化する。内部細胞塊は、人体の各部分を形成する能力を備えるが、もし単独で内部細胞塊をヒトの成熟した女性の健康な子宮内に入れると、細胞外層がないことで、胎盤及び胎児の成長に必要な外在支持システムと環境を形成することができない。よって、完全な個体に発展することがなく、その多機能性が制限される。
多能性幹細胞（Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）：現在最も盛んに研究されている幹細胞である。上述した多機能性幹細胞は、さらに分化し、特定組織の幹細胞に特化することができる。例えば、造血幹細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）等がある。造血幹細胞は、末梢血、臍帯血、骨髄等からなり、各種血球系細胞及びリンパ球系細胞に分化することができる。間葉幹細胞は、脂肪、骨膜（ｐｅｒｉｏｓｔｅｕｍ）、関節膜  （ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）、骨髄、及び胎盤等ある種の臓器の間質組織（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｔｉｓｓｕｅ）になる。造血幹細胞を例とすると、造血幹細胞はさらにリンパ系幹細胞と骨髄幹細胞に分化する。リンパ系幹細胞はリンパ球、キラー細胞等に分化することができ、骨髄幹細胞は赤血球系細胞、白血球系細胞、血小板等に分化することができる。成人と子供の体内で共に多能性幹細胞が見つかり、幹細胞の「自己再生」能力により、多能性幹細胞は我々の体内で正常に消耗される細胞を補充し更新することができる。現在既に分離されている多能性幹細胞には、脳、網膜、骨髄、肝臓、骨格筋、皮膚、臍帯、臍帯血、脂肪組織等がある。
単能性幹細胞（Ｕｎｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）：特定のある一種の組織に分化する能力を有する幹細胞で、前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ）とも呼ばれる。このタイプの細胞は、各部分の組織に広く存在し、最も容易に発見される幹細胞で、肝前駆細胞、神経前駆細胞等がある。
【０００４】
最初、間葉幹細胞は、学術、コロニー形成単位の線維芽細胞（ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ−  ＣＦＵ−Ｆｓ）と分類された。
培養の過程において、間葉幹細胞を単層でプラスチックシャーレ表面に貼り付けることができる。間葉幹細胞は、形態が線維芽細胞に類似しており、スピンドル状を呈し、生体外で、迅速に増殖し、コロニーを形成し、骨芽細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）、脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）、軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ）に分化する潜在能力を保有する。
近年では、肝細胞、心筋細胞、神経細胞、すい臓細胞等（Ｍｉｎｇｕｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）に分化するとする研究もある。
【０００５】
間葉幹細胞は、人体の多くの異なる組織から分離することができる。
例えば、手術で切除、或いは脂肪吸引術で得た脂肪組織からは、豊富な幹細胞を取り出すことができ、脂肪幹細胞（Ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ，  ＡＤＳＣｓ）を分離することができる。
その長所は以下の通りである。
取得方法の侵襲性が低く、人体に対する害が小さい。
、一回に取得可能な量が多く、生体外増殖培養等が可能である。
さらに、脂肪幹細胞は硬骨、軟骨、筋肉、脂肪細胞に分化可能な潜在能力を備える（Ｚｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）。
よって、脂肪幹細胞は、最も高い研究発展の潜在能力を秘めた幹細胞の一つと考えられている。
【０００６】
幹細胞の研究と応用は、基礎医学研究においても、臨床治療においても、充分な細胞数が必要である。
、適した微小環境、成長因子等の刺激を含む適当な環境下で培養する必要がある。
これにより、幹細胞が培養、増殖過程で老化が進み、活性を失い、或いは他の細胞に分化することを回避可能である。
【０００７】
しかし、細胞分離技術、成長培養基、培養条件の差異は、幹細胞の増殖と分化能力を大きく影響する（Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。
この他、多くの文献やレポートが、間葉系幹細胞の、培養増殖過程中の老化傾向問題について開示している（Ｂｏｎａｂ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６；Ｓｈｉｂａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）。
よって、幹細胞増殖の過程において遭遇する細胞性能と老化の差異が間葉系幹細胞の臨床用途を阻害する可能性は極めて高い。
そのため、いかにして効果的、かつ迅速に、取得が容易でない幹細胞を培養し、数を増やすか、同時に、未分化状態を保持し、老化現象を減らし、多機能性特徴を保有させるかが問題である。
【０００８】
近年の研究レポートには以下のように指摘されている。
骨髄間葉系幹細胞（ＢＭＭＳＣ）を培養する条件培地中において、傷口の癒合を促すパラクリン因子の大量の存在が発見された（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）。
例えば、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−Ｉ）、表皮成長因子（ＥＧＦ）、角質細胞増殖因子（ＫＧＦ）、アンジオポエチン（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１）、ストロマ細胞由来因子（ｓｔｒｏｍａｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆａｃｔｏｒ−１）、マクロファージ炎症性タンパク（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１α、ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１  β）、エリスロポエチン（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）等である。
【０００９】
脂肪間葉系幹細胞（ＡＤＳＣ）は、骨髄間葉系幹細胞、臍帯血間葉系幹細胞、骨膜間葉系幹細胞、滑膜間葉系幹細胞、筋肉間葉系幹細胞と、遺伝子の表現及び表現型において、顕著な差異がないことが、既に証明されている（Ｓｈｅｅｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２；Ｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２；Ｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）。
脂肪間葉系幹細胞は、骨髄間葉系幹細胞に比べ、より良い分離及び生体外増殖条件を備えるため、創傷治癒と再生に応用できると期待されている。
条件培地で、脂肪間葉系幹細胞は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、角質細胞増殖因子  （ＫＧＦ）、ベータ型変異増殖因子（ＴＧＦ−β）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）等の成長因子を分泌することが知られている。
これらの成長因子は、みな、傷口癒合と関連を有する。
よって、いかにして間葉系幹細胞を増殖させ、成長因子を大量に生産するかは、重要な研究課題である。
【００１０】
特許文献１に開示されている「生体外無血清成体幹細胞拡大培養技術」は、生体外無血清成体幹細胞拡大培養の方法を提供する。
その方法は、自家成長因子（ＰＲＧＦ）を、無血清幹細胞培養液中に添加することで、ヒト成体幹細胞の初代培養及び継代培養を行う。
この方法により培養されるヒト成体幹細胞は、多数回の継代培養を経過しても、実質未分化の状態を保持している。
【００１１】
但し、その培養方法により得られた幹細胞の数は、継代培養から第三代（Ｐ３）まで、約５５，０００細胞数／平方センチに過ぎず、より多くの幹細胞数を得ようとするなら、培養日数及び継代培養の代数を増やし需要に応える必要がある。
しかしながら、多数回継代培養には、汚染されるリスクがある。
【００１２】
特許文献２に開示する「低密度合併低酸素培養増殖間葉系幹細胞の方法」は、細胞増殖と幹細胞特性に影響を及ぼさない状況下で、迅速かつ効率的に、ヒト間葉系幹細胞を増殖させることができ、生体外或いは体内で増殖させられ、老化を減らし、分化潜在能力を高めることができる。
【００１３】
しかし、大部分の研究機関が細胞の培養に用いるインキュベーターの多くは、二酸化炭素分圧及び湿度調整機能しか提供しない。
そのため、低酸素環境下での培養を要する場合には、酸素分圧調整機能を備えたインキュベーターを別に購入しなければならない。
これにより拡大する研究費は、研究機関にとって大きな負担である。
【００１４】
特許文献３に開示する「多種の成長因子を備えるスキンケア用品の製造工程」では、先ず、健康な脂肪を取り出す。
次に、所定量の溶剤を脂肪組織に混入し、脂肪組織を洗浄する。
所定量の試剤を、所定量の脂肪組織に加え、遠心分離を行う。
分離後に生じる脂肪組織に、遠心管で、所定量の酵素を混入し、遠心管に対して震動を加える。
こうして生じた沈殿物に対して細胞培養を行い、体細胞を作る。
体細胞を取得後、上記した方式で得られた細胞培養液を培養することで、細胞が分泌する成長因子（ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ｂ−ＦＧＦ、ＴＧＦ、ＩＧＦなど）を取り出し、効果の高いスキンケア用品の原料を完成する。
【００１５】
しかし、それが掲示する培養方法は、体細胞を、１０％ウシ胎児血清（１０％ＦＢＳ）を含む基礎培養基ＤＭＥＭ  （Ｄｕｌｂｅｃｃｏ｀ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）の中に入れて培養するが、体細胞増殖速度が遅く、それが分泌する成長因子少ない。
そのため、大量の成長因子を得ようとするなら、培養日数と継代培養の代数を増やす必要がある。
よって、多数回の継代培養による汚染を抑制する必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】台湾特許番号第２０１３３１３６６号明細書
【特許文献２】台湾特許番号第２０１１１８１７２号明細書
【特許文献３】台湾特許番号第２０１２３１０８７号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
しかし、上述した発明は使用上に欠点があり、改善する必要がある。その原因は下記の通りである。
【００１８】
生体外ヒト間葉系幹細胞を増殖させ、同時に幹細胞の多機能性の特徴を保持し、同時に、ヒト間葉系幹細胞が分泌する成長因子を大量に取得するためには、ヒト間葉系幹細胞培養の補助剤及び培養方法が必要であり、そうでなければ迅速かつ効率的に細胞数を増殖し、大量の成長因子を得ることができない。
【００１９】
本発明は、上述の問題に鑑みてなされたものであり、その目的は、生体外でヒト間葉系幹細胞を増殖させる方法、およびそれに用いる補助剤、ならびに、生体外でヒト間葉系幹細胞の成長因子を取り出す方法およびその成長因子の用途を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明による生体外でヒト間葉系幹細胞を増殖させる補助剤は、少なくとも一種の抗酸化剤及び線維芽細胞増殖因子−２（Ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ，  ＦＧＦ−２）を備える。
さらに、ヒト間葉系幹細胞体は、脂肪間葉系幹細胞、骨髄間葉系幹細胞、或いは臍帯間葉系幹細胞からなる一群から選ばれる。
【００２１】
さらに、抗酸化剤は、長時間作用型アスコルビン酸誘導体（Ｌｏｎｇ−ａｃｔｉｎｇ  ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）  及びＮ−アセチル−Ｌ−システイン（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ，  ＮＡＣ）の組合せを含む。
さらに、長時間作用型アスコルビン酸誘導体は、Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸塩（Ｌ−ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ−２  −ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，  ＡｓＡ２Ｐ）である。さらに、線維芽細胞増殖因子−２の使用濃度は、１ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍＬ）〜２０ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍＬ）である。
さらに、ヒト間葉系幹細胞の細胞内細胞サイクリン依存性キナーゼインヒビター（ｐ２１及びｐ２７）の発現を抑制することで、サイクリン依存性キナーゼ−２（ＣＤＫ−２）、サイクリン依存性キナーゼ−４（ＣＤＫ−４）、細胞周期タンパク質（ＣＤＣ２）の発現を向上させる。
【００２２】
本発明は、生体外でヒト間葉系幹細胞を増殖させる方法は、補助剤をヒト間葉系幹細胞を含む培養基中に加え、ヒト間葉系幹細胞を増殖させ、実質未分化のヒト間葉系幹細胞を取り出す。
【００２３】
生体外でヒト間葉系幹細胞を増殖させる方法は、補助剤を、血清添加物及びヒト間葉系幹細胞を含む培養基中に加え、ヒト間葉系幹細胞を増殖させ、実質未分化のヒト間葉系幹細胞を取り出す。
さらに、血清添加物は、ヒト血清或いはウシ胎児血清であり、使用する体積パーセンテージ濃度が２〜１０％である。
【００２４】
生体外でヒト間葉系幹細胞を増殖させる方法は、増殖したヒト間葉系幹細胞を冷凍保存するステップを含む。
さらに、生体外でヒト間葉系幹細胞を増殖させる方法は、抽出ステップを執行し、ヒト間葉系幹細胞の細胞抽出物を取り出す。
【００２５】
さらに、生体外でヒト間葉系幹細胞を増殖させる方法は、誘導分化ステップを含み、ヒト間葉系幹細胞から分化した細胞を得る。
ヒト間葉系幹細胞から分化した細胞は、骨細胞、脂肪細胞、或いは軟骨細胞の内の一つを含む。
【００２６】
本発明はまた、医薬組成物を提供する。
医薬組成物は、生体外でヒト間葉系幹細胞を増殖させる方法で得られた実質未分化のヒト間葉系幹細胞、或いはヒト間葉系幹細胞から分化した細胞を含む。
さらに、医薬組成物は、生体適合性材料を結合し、再生医学或いは医再生工学に応用する。
【００２７】
本発明は、生体外でヒト間葉系幹細胞を増殖させ成長因子を取り出す方法を提供し、生体外でヒト間葉系幹細胞を増殖させる方法により培養後、培養基中で成長因子を取得する。
【００２８】
成長因子は、ＦＧＦ−２、ＥＧＦ、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７、ＨＢ−ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＰＢ−４、ＩＧＦＢＰ−６、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−Ｉ  ＳＲ、ＩＧＦ−ＩＩ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ  Ｒ、ＰＤＧＦ  Ｒα、ＰＤＧＦ−Ｒβ、ＰＤＡＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＩＧＦ、ＳＣＦ、ＴＧＦ−β３、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ  Ｒ２を含む。
【００２９】
本発明が提供する成長因子は、生体外でヒト間葉系幹細胞を増殖させ成長因子を取り出す方法に基づき、得られる。
【００３０】
本発明が提供する医薬組成物は、生体外でヒト間葉系幹細胞を増殖させ成長因子を取り出す方法により得られた成長因子を含む。
【００３１】
本発明は、前述のような成長因子を含み、それは傷口の癒合を促進する薬物を調合する用途を有する。
【００３２】
本発明は、成長因子をスキンケア用品などに用いる用途を提供する。
【００３３】
本発明の効果は下記の通りである。
（１）細胞を増殖させることができる。本発明の生体外でヒト間葉系幹細胞を増殖させる補助剤を培養基中に添加することで、ヒト間葉系幹細胞体の初代或いは継代培養時に、細胞周期合成期（Ｓ  ｐｈａｓｅ）が出現する比率を高め、細胞の迅速な分裂と増殖の現象を促すことができ、幹細胞多機能性分化の潜在能力を確保可能である。
【００３４】
（２）細胞の老化を減らすことができる。本発明の生体外でヒト間葉系幹細胞を増殖させる補助剤を培養基中に添加することで、ヒト間葉系幹細胞体テロメラーゼ逆転写（Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，  ＴＥＲＴ）を高め、テロメア（Ｔｅｌｏｍｅｒｅ）短縮の時間を延長することができ、細胞の老化スピードを遅くし、細胞の寿命を延ばすことができる。
【００３５】
（３）大量の成長因子を迅速に得ることができる。本発明のヒト間葉系幹細胞を生体外で増殖させる補助剤を培養基中に添加することで、体積パーセンテージ濃度が１０％のウシ胎児血清を含む培養基中での従来の培養に比べ、少なくとも２〜３倍以上の成長因子［インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、表皮成長因子（ＥＧＦ）など］含量を得ることができる。
【００３６】
（３）病源汚染を低下させることができる。本発明のヒト間葉系幹細胞を生体外で増殖させる補助剤を、ヒト血清に合わせて培養を行う時には、異体或いは異種の血清を用いて培養を行うことにより存在する、異体或いは異種間の病源交互汚染のリスクを回避することができる。  
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１Ａ】本発明の一実施形態において、ヒト間葉系幹細胞の培養日数と細胞密度の関係を示す特性図である。
【図１Ｂ】本発明の一実施形態において、ヒト間葉系幹細胞の培養日数と細胞密度の関係を示す特性図である。
【図１Ｃ】本発明の一実施形態において、ヒト間葉系幹細胞の培養日数と細胞密度の関係を示す特性図である。
【図２Ａ】本発明の一実施形態において、脂肪幹細胞の細胞周期を示す特性図である。
【図２Ｂ】本発明の一実施形態において、脂肪幹細胞の細胞周期を示す特性図である。
【図３】本発明の一実施形態において、脂肪幹細胞の細胞相対テロメアの長さを示す特性図である。
【図４Ａ】本発明の一実施形態において、脂肪幹細胞の培養日数と細胞総数との関係を示す特性図である。
【図４Ｂ】本発明の一実施形態において、脂肪幹細胞の細胞周期に対するタンパクの影響を示す特性図である。
【図５Ａ】本発明の一実施形態において、脂肪幹細胞の細胞数量と形態を示す模式図である。
【図５Ｂ】本発明の一実施形態において、脂肪幹細胞の細胞培養日数と細胞数量の関係を示す特性図である。
【図５Ｃ】本発明の一実施形態において、脂肪幹細胞の細胞培養日数と細胞数量の関係を示す特性図である。
【図５Ｄ】本発明の一実施形態において、脂肪幹細胞の細胞培養日数と細胞数量の関係を示す特性図である。
【図６Ａ】本発明の一実施形態において、脂肪幹細胞の細胞表面抗原の分析結果を示す特性図である。
【図６Ｂ】本発明の一実施形態において、脂肪幹細胞の幹細胞遺伝子の表現型を示す特性図である。
【図７Ａ】本発明の一実施形態において、脂肪幹細胞を硬骨細胞に誘導分化した後、化学染色を行った結果を示す特性図である。
【図７Ｂ】本発明の一実施形態において、脂肪幹細胞を硬骨細胞に誘導分化した後、化学染色を行った結果を示す特性図である。
【図７Ｃ】本発明の一実施形態において、脂肪幹細胞を硬骨細胞に誘導分化した後、硬骨細胞分子マーカーに相対する表現型を示す特性図である。
【図８Ａ】本発明の一実施形態において、脂肪幹細胞を軟骨細胞に誘導分化した後、化学染色を行った結果を示す特性図である。
【図８Ｂ】本発明の一実施形態において、脂肪幹細胞を軟骨細胞に誘導分化した後、軟骨細胞分子マーカーに相対する表現型を示す特性図である。
【図８Ｃ】本発明の一実施形態において、脂肪幹細胞を脂肪細胞に誘導分化した後、化学染色を行った結果を示す特性図である。
【図８Ｄ】本発明の一実施形態において、脂肪幹細胞を脂肪細胞に誘導分化した後、脂肪細胞分子マーカーに相対する表現型を示す特性図である。
【図９Ａ】本発明の一実施形態において、脂肪幹細胞の細胞因子配列を示す特性図である。
【図９Ｂ】本発明の一実施形態において、図９Ａの細胞因子配列の分析結果を示す模式図である。
【図９Ｃ】本発明の一実施形態において、図９Ｂの細胞因子配列の表現型を示す特性図である。
【図９Ｄ】本発明の一実施形態において、図９Ｂの細胞因子配列の表現型を示す特性図である。
【図９Ｅ】本発明の一実施形態において、脂肪幹細胞の細胞因子の表現型を示す模式図である。
【図９Ｆ】本発明の一実施形態において、脂肪幹細胞の細胞因子配列を示す模式図である。
【図９Ｇ】本発明の一実施形態において、図９Ｆの細胞因子配列の分析結果の比較図である。
【図１０Ａ】本発明の一実施形態において、マイクロキャリアで培養する脂肪間葉系幹細胞を示す模式図である。
【図１０Ｂ】本発明の一実施形態において、マイクロキャリアで培養する脂肪間葉系幹細胞を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明の一実施形態による生体外でヒト間葉系幹細胞を増殖させる方法、およびそれに用いる補助剤、ならびに、生体外でヒト間葉系幹細胞の成長因子を取り出す方法およびその成長因子の用途を図面に基づいて説明する。
（一実施形態）
本発明の一実施形態による生体外でヒト間葉系幹細胞を増殖させる補助剤は、少なくとも一種の抗酸化剤、及び線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ−２）を含む。
【００３９】
抗酸化剤は、長時間作用型アスコルビン酸誘導体及びＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）の組合せを含む。
長時間作用型アスコルビン酸誘導体は、Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸塩（Ａｓｃ  ２−Ｐ）で、線維芽細胞増殖因子−２の使用濃度は、１〜２０ナノグラム／ミリリットルである。
ヒト間葉系幹細胞体は、脂肪間葉系幹細胞、骨髄間葉系幹細胞、或いは臍帯間葉系幹細
胞により構成するグループから選択される。
【００４０】
本実施形態の生体外でヒト間葉系幹細胞を増殖させる補助剤は、ヒト間葉系幹細胞の細胞内細胞サイクリン依存性キナーゼインヒビター（ｐ２１及びｐ２７）の発現を抑制することで、サイクリン依存性キナーゼ−２（ＣＤＫ−２）、サイクリン依存性キナーゼ−４（ＣＤＫ−４）、細胞周期タンパク質（ＣＤＣ２）の発現を向上させ、これにより細胞周期が合成期（Ｓ  ｐｈａｓｅ）に入る比率を高め、こうして細胞を迅速に分裂増殖させる。
【００４１】
本実施形態は、同時に、生体外でヒト間葉系幹細胞を増殖する方法を提供する。それは、補助剤を、ヒト間葉系幹細胞を含む培養基中に加え培養を行い、ヒト間葉系幹細胞を増殖させ、実質未分化のヒト間葉系幹細胞を取り出す。
本実施形態は、さらに、生体外でヒト間葉系幹細胞を増殖させる方法を提供する。それは、補助剤を、血清添加物及びヒト間葉系幹細胞を含む培養基中に加え、ヒト間葉系幹細胞を増殖させ、実質未分化のヒト間葉系幹細胞を取り出す。
血清添加物は、ヒト血清或いはウシ胎児血清であり、使用する体積パーセンテージ濃度は、２〜１０％である。
【００４２】
生体外でヒト間葉系幹細胞を増殖させる方法は、抽出ステップを含み、ヒト間葉系幹細胞の細胞抽出物を取り出す。
生体外でヒト間葉系幹細胞を迅速に増殖させる方法はさらに、該増殖したヒト間葉系幹細胞を冷凍保存するステップを含む。
ここで使用する「冷凍保存」という言葉は、通常は、細胞に、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）或いはグリセリンなどの冷凍保護剤を加えた後、マイナス８０℃或いはマイナス１９６℃（液体窒素の沸点）などの零下の温度まで冷却して保存する方法を指す。
冷凍保存は、項技術を熟知する人が通常行う方法とプロセスで、本実施形態のポイントではないため、詳述しない（１９９７年ＨｕｍｍａＰｒｅｓｓ社出版の第２版Ｐｏｌｌａｒｄ，Ｊ．Ｗ．とＷａｌｋｅｒ，Ｊ．Ｍ．．著「基礎細胞培養プロセス」及び２０００年Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ社出版の第４版Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ｒ．Ｉ．，著「動物細胞の培養」参照）。
【００４３】
本実施形態は、セルバンクに保存するステップを有し、それは生体外でヒト間葉系幹細胞を増殖させる方法により冷凍保存された増殖したヒト間葉系幹細胞を含む。
生体外でヒト間葉系幹細胞を増殖させる方法は、さらに、誘導分化ステップを含み、ヒト間葉系幹細胞から分化した細胞を得る。
ヒト間葉系幹細胞から分化した細胞は、骨細胞、脂肪細胞、或いは軟骨細胞の内の一つを含む。
【００４４】
本実施形態は、さらに、医薬組成物を提供し、それは生体外でヒト間葉系幹細胞を増殖させる方法で得られた実質未分化のヒト間葉系幹細胞、或いはヒト間葉系幹細胞から分化した細胞を含む。
医薬組成物は、ヒト間葉系幹細胞、それが分化した細胞、細胞分泌物、或いは細胞抽出物の内の一つ或いはその組合せと、治療上受け入れ可能なキャリア／賦形剤を含む。
細胞分泌物はいくつかの実施形態中では、細胞培養基中で純化及び濃縮後に得られる。
さらに、医薬組成物は、生体適合性材料を結合し、再生医学或いは医再生工学に応用する。
【００４５】
本実施形態はさらに、生体外でヒト間葉系幹細胞を増殖させ成長因子を取り出す方法を提供し、生体外でヒト間葉系幹細胞を増殖させる方法により培養後、細胞は増殖する同時に、多種の細胞成長因子を培養基中に分泌し、これにより培養基中で成長因子を得ることができる。
成長因子は、ＦＧＦ−２、ＥＧＦ、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７、ＨＢ−ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＰＢ−４、ＩＧＦＢＰ−６、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−Ｉ  ＳＲ、ＩＧＦ−ＩＩ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ  Ｒ、ＰＤＧＦ  Ｒα、ＰＤＧＦ−Ｒβ、ＰＤＡＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＩＧＦ、ＳＣＦ、ＴＧＦ−β３、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ  Ｒ２を含む。
本実施形態が提供する成長因子は、生体外でヒト間葉系幹細胞を増殖させ成長因子を取り出す方法に基づき、得られる。
【００４６】
本実施形態が提供する医薬組成物は、生体外でヒト間葉系幹細胞を増殖させ成長因子を取り出す方法で得られた成長因子を含み、皮膚創傷の治療に用いることができるが、これに限定するものではない。
【００４７】
本実施形態は、前述のような成長因子を含み、それは傷口の癒合を促進する薬物を調合する用途を提供する。
本実施形態は、成長因子を含むスキンケア用品を提供し、それは皮膚のサンバーン修復、或いは皮膚細胞の老化の緩和に用いることができる。
【００４８】
本実施形態は、成長因子をスキンケア用品などとする用途を提供する。
【００４９】
本実施形態で言う「ヒト間葉系幹細胞」とは、ヒト間質組織から得られる任意の細胞で、無限の自己再生能力を備え、かつ多種の細胞或いは組織形式に分化可能である。
例えば、ヒト間葉系幹細胞は、脂肪間葉系幹細胞、骨髄間葉系幹細胞、或いは臍帯間葉系幹細胞、臍帯血間葉系幹細胞、骨膜間葉系幹細胞、滑膜間葉系幹細胞、及び筋肉間葉系幹細胞により構成されるグループの一つから選ばれるが、これに限定しない。
本実施形態の実施形態は、ヒト脂肪間葉系幹細胞の実施形態により明示するが、本実施形態は以下の実施形態の制限を受けるものではない。
【００５０】
（実験一）
本実施形態の補助剤を、異なるヒト間葉系幹細胞に使用し、正常酸素及び低酸素環境下で培養を行い、細胞成長に対する影響を調べる。
１．ヒト間葉系幹細胞の分離及び生体外培養
本実験は、仏教慈済総合医院の内部審≡委員会（ＩＲＢ１００−１０２）が許可し行ったもので、それぞれヒト脂肪組織、臍帯及び骨髄組織から幹細胞のソースを取得した。
しかし、ここでのヒト間葉系幹細胞の分離方法は、従来の技術であり、本実施形態の請求重点ではないため、詳述しない。
主な目的は、どれも、ヒト間葉系幹細胞を取り出し、初代培養を行うことである。
本実験の細胞培養条件を、基礎培養基にＦＧＦ−２を加えた正常酸素環境での培養組、基礎培養基にＦＧＦ−２を加えた低酸素環境での培養組、基礎培養基に本実施形態の補助剤を加えた正常酸素環境での培養組の三組に分ける。
いわゆる正常酸素環境とは、約２１％酸素分圧下で、低酸素環境とは、約５％酸素分圧下をいう。
基礎培養基は、ＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ｀ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ｀ｓ  ｍｅｄｉｕｍ，  ＧＩＢＣＯ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０％のウシ胎児血清  （ＦＢＳ，  ＭＳＣ−Ｑｕａｌｉｆｉｅｄ，  ＧＩＢＣＯ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び２ミリモル濃度（ｍＭ）のＬ−グルタミン酸（Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，  ＧＩＢＣＯ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む。
成長因子ＦＧＦ−２の使用濃度は、１０  ｎｇ／ｍＬ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で、本実施形態の補助剤は、２ミリモル濃度（ｍＭ）のＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ，  Ｓｉｇｍａ）及び０．２ミリモル濃度（ｍＭ）のＬ−アスコルビン酸−２−リン酸塩（ＡｓＡ２Ｐ，  Ｓｉｇｍａ）を含む。
各組幹細胞は、一平方センチ当たり３０００個の細胞（３０００  ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）の細胞密度で、６ウェルプレート中（６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅｓ，  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で培養し、すべての細胞は摂氏３７度、５％二酸化炭素分圧、９５％湿度環境下のインキュベーター（Ｆｏｒｍａ  Ｓｅｒｉｅｓ  ＩＩ  Ｍｏｄｅｌ  ３１１０，  Ｔｈｅｒｍｏ）で培養し、３日に一回培養基を交換する。
また、低酸素培養環境の培養実験は、別のインキュベーター（ＭＣＯ−１８Ｍ，  Ｓａｎｙｏ）中で行う。
これにより、７日以内で、異なるヒト間葉系幹細胞の異なる培養条件下での、細胞増殖に対する影響を観察する。
【００５１】
１．１  細胞成長密度分析
各組幹細胞を、リン酸塩緩衝溶液（ＰＢＳ）で一回洗浄後、トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ）溶液により、摂氏３７度で５分間作用後、完全に作用されていない細胞を、スパチュラで注意深く取り除き、等比率のウシ胎児血清を含む培養基中に加え、トリプシンの酵素と作用活性させる。
すべての細胞数はどれも細胞計数機（Ｖｉ−ＣＥＬＬ  ＡＳ，  Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）で計算する。
生存している細胞は、０．４％トリパンブルー（Ｔｒｙｐａｎ−ｂｌｕｅ，  ＧＩＢＣＯ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により、死んだ細胞と区別する。
計算時には、生存している間葉系幹細胞を判定するパラメータを、１００  ｉｍａｇｅｓ，  Ｓｉｚｅ  １０―３０ミクロン、７５％現場輝度、５％現場区域と設定する。
結果の表示は、各組実験データを三度繰り返し測定し、平均値±標準差によりこれを表示する。
【００５２】
１．２  実験結果
以上の実験データを、マイクロソフト社のＥｘｃｅｌ（登録商標）プログラムｔテスト（ｔ−ｔｅｓｔ）により統計分析し、  ｐ＜０．０５を顕著な水準とし、結果を統計図に定量化する。
先ず、図１Ａは、脂肪幹細胞の、上記した３種の異なる培養条件下での成長状況を示す。
基礎培養基にＦＧＦ−２を加えた正常酸素環境での培養組と基礎培養基にＦＧＦ−２を加えた低酸素環境での培養組の２組を比較したところ、幹細胞は、低酸素環境下で増殖がより迅速であることが発見された。
特に、三日目時には、既に顕著な差異が見られ、四日目には、さらに明確になり始める。
これにより、脂肪間葉系幹細胞の増殖速度は、低酸素環境下の方が、正常酸素環境下より良いということを示している。
別に、基礎培養基にＦＧＦ−２を加えた低酸素環境での培養組と基礎培養基に本実施形態の補助剤を加えた正常酸素環境での培養組の２組を比較したところ、正常酸素環境下で、本実施形態の補助剤を加えた培養は、低酸素環境下での培養と近い増殖速度を達成可能であることが発見された。
さらには、五日目より、低酸素環境下での培養の増殖速度を上回っている。
これにより明らかなように、本実施形態の補助剤の添加により、脂肪間葉系幹細胞の正常酸素環境の培養下で、増殖を加速する効果を達成できる。
さらに、図１Ｂ及び図１Ｃに示すように、相同の結果は、骨髄間葉系幹細胞或いは臍帯間葉系幹細胞の培養実験中でも見られる。
本実験より分かるように、本実施形態の補助剤の添加は、脂肪間葉系幹細胞、骨髄間葉系幹細胞、或いは臍帯間葉系幹細胞に対して、正常酸素環境培養下で、増殖を加速する効果を達成することができる。
【００５３】
２．  細胞周期分析
上記した脂肪間葉系幹細胞を異なる培養条件下で培養する各実験組に、１０％ウシ胎児血清を含む基礎培養基だけを対照組とする。
フローサイトメトリー及びそのプログラム（Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｆｌｏｗ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）により、その細胞周期の変化状況を測定して分析する。
各組は培養三日後にサンプル採取し、各組は三回繰り返し実験し、エタノールで固定後、ヨウ化プロピジウム（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ，  Ｓｉｇｍａ）染色剤を使用し、細胞のＤＮＡを染色し、細胞周期の変化を分析する。
【００５４】
２．１  実験結果
図２Ａは、対照組と上記した三組の異なる培養条件下で、脂肪間葉系幹細胞の細胞周期に対する影響を示す。
その内、＊  Ｐ  ＜  ０．０５，  ＊＊  Ｐ  ＜  ０．０１，  ＊＊＊  Ｐ  ＜  ０．００５である。
実験結果から分かるように、基礎培養基にＦＧＦ−２を加えた低酸素環境での培養組と基礎培養基に本実施形態の補助剤を加えた正常酸素環境での培養組の２組は、その脂肪間葉系幹細胞が、細胞周期中の合成期（Ｓ  ｐｈａｓｅ）にある時のパーセンテージは、対照組と基礎培養基にＦＧＦ−２を加えた正常酸素環境での培養組に比較し、明確に高まっている。
基礎培養基にＦＧＦ−２を加えた低酸素環境での培養組と基礎培養基に本実施形態の補助剤を加えた正常酸素環境での培養組の２組のＧ０／Ｇ１期（停止分裂期／成長期）のパーセンテージは、対照組と基礎培養基にＦＧＦ−２を加えた正常酸素環境での培養組に比較し、非常に低い。
これにより明らかなように、低酸素環境下、或いは本実施形態の補助剤を添加した正常酸素環境下での培養は共に、細胞周期を合成期とでき、細胞ＤＮＡの継続的な合成を促し、これにより細胞を分裂増殖させる。
本実施形態の補助剤を添加し、正常酸素環境下で培養する脂肪間葉系幹細胞の細胞周期が合成期である時のパーセンテージは、低酸素環境下での培養組を上回っており、顕著な差異を備える。
よって、本実施形態の補助剤を添加し、正常酸素環境で培養すれば、迅速増殖の効果を達成できるだけでなく、低酸素環境下での培養で得られる細胞増殖速度向上の効果を上回ることができる。
【００５５】
３．  ウエスタンブロット法により、細胞周期の調節に関連するタンパクの発現状況を分析する。
従来のウエスタンブロット法は、抗体、抗原の特異性結合の特性を利用し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動を対応させ、特定タンパク発現の定性と定量を分析する。
しかし、方法は広く知られた技術であるため、ここでは詳述しない。
本実験は、既に文献で報導された、Ｃｙｃｌｉｎ  Ａ２、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ３、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＣＤＣ２、ｐ２１及びｐ２７等の細胞周期の調節に関連するタンパクに対して、上記した各タンパクとその抗体との間の特異性結合を利用し、上記したウエスタンブロット法を通して、異なる培養条件で培養された脂肪間葉系幹細胞中の、細胞周期調節に関連するタンパク発現の影響を分析して観察する。
β−ａｃｔｉｎタンパク発現量を対照とし、上記した各タンパク発現を定量化し、データの標準化の基準依拠とする。
β−ａｃｔｉｎタンパクは、一種のハウスキーピング遺伝子（Ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ  ｇｅｎｅ）が転写して出たタンパク質であるため、細胞は正常な生理現象を維持する必要があり、各種実験条件により、変化が大きくなり過ぎないように、適当に定量化し、データ標準化の基準依拠とする。
【００５６】
３．１  実験結果
図２Ｂは、上記した図２Ａに示す四組の実験組において、細胞周期の調節に関連するタンパクの発現の分析である。
図中の各タンパク質は、異なる実験組中での発現状況であるため、発現既に文献で報導された細胞周期の進行を抑制すると認められる細胞サイクリン依存性キナーゼインヒビター（ｐ２１及びｐ２７）タンパクの発現量は、上記した対照組と基礎培養基にＦＧＦ−２を加えた正常酸素環境での培養組、基礎培養基にＦＧＦ−２を加えた低酸素環境での培養組と基礎培養基に本実施形態の補助剤を加えた正常酸素環境での培養組に比較し、明確に低減状態を呈する。
さらには、基礎培養基に本実施形態の補助剤を加えた正常酸素環境での培養組のｐ２１及びｐ２７タンパクの発現量は、基礎培養基にＦＧＦ−２を加えた低酸素環境での培養組に近いか、或いは低い状況を呈する。
別に、サイクリン依存性キナーゼ−２（ＣＤＫ−２）、サイクリン依存性キナーゼ−４（ＣＤＫ−４）及び細胞周期タンパク質（ＣＤＣ２）の発現量は、上記した対照組と基礎培養基にＦＧＦ−２を加えた正常酸素環境での培養組、基礎培養基にＦＧＦ−２を加えた低酸素環境での培養組と基礎培養基に本実施形態の補助剤を加えた正常酸素環境での培養組に比較し、明確に向上状態を呈する。
さらには、基礎培養基に本実施形態の補助剤を加えた正常酸素環境での培養組のＣＤＫ−２、ＣＤＫ−４及びＣＤＣ２タンパクの発現量は、基礎培養基にＦＧＦ−２を加えた低酸素環境での培養組に、近いか或いは高い状況を呈する。
これにより明らかなように、本実施形態の補助剤を添加し、正常酸素環境下で脂肪間葉系幹細胞を培養すると、迅速増殖の効果を達成でき、細胞サイクリン依存性キナーゼインヒビター（ｐ２１及びｐ２７）タンパクの発現を抑制することで、ＣＤＫ−２、ＣＤＫ−４及びＣＤＣ２タンパクの発現量を高めることができ、これにより細胞の迅速な複製、分裂を促進でき、迅速増殖の効果を達成することができる。
【００５７】
４．  細胞相対テロメア（Ｔｅｌｏｍｅｒｅ）の長さ分析
細胞内では、染色体構造は、ＤＮＡ組織により構成され、「テロメア」とは、染色体末端のＤＮＡの重複配列で、その作用は、染色体の完全性を保護することである。
染色体は、細胞分裂の前に先に複製され、ＤＮＡが複製される度に、テロメアは、一点短縮される。
テロメアが一定程度まで短縮されると、染色体の安定を維持できなくなり、細胞は最終的に死に至る。
よって、テロメアの長さに基づき、細胞の年齢を予測することができる。
三組の異なる培養条件及び上記した対照組（１０％ウシ胎児血清を含む基礎培養基）の四組の脂肪間葉系幹細胞を１４日間培養後、既に文献で報導された細胞相対テロメア長さ（Ｔ／Ｓ  ｒａｔｉｏ）を測定できる技術方法（Ｃａｗｔｈｏｎ，  ２００２）を用いて、異なる培養条件下での、脂肪間葉系幹細胞のテロメアに対する影響を観察する。
【００５８】
４．１  実験結果
図３に示すように、上記した従来の細胞相対テロメア長さ（Ｔ／Ｓ  ｒａｔｉｏ）を測定する方法により、四組の実験組培養条件下で、そのテロメアのＴ／Ｓ  ｒａｔｉｏを得ることができる。
内、＊  Ｐ  ＜  ０．０５である。
結果より分かるように、対照組を基準とする時には、基礎培養基にＦＧＦ−２を加えた低酸素環境での培養組と基礎培養基に本実施形態の補助剤を加えた正常酸素環境での培養組は、基礎培養基にＦＧＦ−２を加えた正常酸素環境での培養組に比べて高く、顕著な差異を備える。
これにより明らかなように、低酸素環境下での培養、或いは本実施形態の補助剤を添加した正常酸素環境下での培養は共に、相対テロメア長さの比率を高めることができ、これにより細胞の老化を緩やかにする効果を達成する。
【００５９】
５．  脂肪間葉系幹細胞の、正常酸素或いは高酸素環境下培養における影響
本実験では、培養条件を基礎培養基にＦＧＦ−２を加えた正常酸素環境での培養組、基礎培養基にＦＧＦ−２を加えた高酸素環境での培養組、基礎培養基に本実施形態の補助剤を加えた正常酸素環境での培養組及び基礎培養基に、本実施形態の補助剤を加えた高酸素環境での培養組の四組に分ける。
高酸素環境とは、約３７．５％酸素分圧下で、他の培養条件パラメータ（基礎培養基、インキュベーター及び細胞培養密度など）は皆、上記「実験一」の１．内容と相同である。
【００６０】
５．１  脂肪間葉系幹細胞の細胞成長密度分析
細胞を、リン酸塩緩衝溶液（ＰＢＳ）で一回洗浄後、トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ）溶液により、摂氏３７度で５分間作用後、完全に作用されていない細胞を、スパチュラで注意深く取り除き、等比率のウシ胎児血清を含む培養基中に加え、トリプシンの酵素と作用活性させる。
すべての細胞数はどれも細胞計数機（Ｖｉ−ＣＥＬＬ  ＡＳ，  Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）で計算する。
生存している細胞は、０．４％トリパンブルー（Ｔｒｙｐａｎ−ｂｌｕｅ，  ＧＩＢＣＯ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により、死んだ細胞と区別する。
計算時には、生存している間葉系幹細胞を判定するパラメータを、１００  ｉｍａｇｅｓ、Ｓｉｚｅ  １０―３０ミクロン、７５％現場輝度、５％現場区域と設定する。
結果の表示は、各組実験データを三度繰り返し測定し、平均値±標準差によりこれを表示する。
【００６１】
５．１．１  実験結果
図４Ａは、脂肪間葉系幹細胞の異なる培養条件、培養日数と総細胞数の関係を示す。
結果より分かるように、培養日数の増加に従い、基礎培養基に本実施形態の補助剤を加えた正常酸素環境での培養組の細胞数は、二日目以降急速に上昇し、五日目には既に１．５×１０６以上の数に達している。
基礎培養基にＦＧＦ−２を加えた正常酸素環境での培養組に比べ、明確に高く、迅速である。
基礎培養基にＦＧＦ−２を加え、高酸素環境で組織を培養すると、細胞数は非常に緩慢な増加を示す。
さらには、七日目の細胞総数は、２．５×１０５数に達しておらず、高酸素環境は、細胞の増殖に、不利な影響を及ぼすことが分かる。
基礎培養基に、本実施形態の補助剤を加えた高酸素環境での組織培養の細胞総数は、二日目には、基礎培養基にＦＧＦ−２を加えた高酸素環境での培養組に比べ、向上する趨勢を示し、六日目時には、その細胞総数は１．０×１０６以上の数に達している。
基礎培養基にＦＧＦ−２を加えた高酸素環境での組織培養に比べ、細胞総数は、明確に増え、迅速になっている。
これにより明らかなように、本実施形態の補助剤を添加した正常酸素環境下での培養は、本実施形態の補助剤を添加しない者に比べ、その細胞増殖速度は迅速で、数も多い。
基礎培養基に、本実施形態の補助剤を加えた高酸素環境での培養高酸素環境下での培養で、細胞増殖に対して不利な影響があっても、本実施形態の補助剤は、高酸素環境の細胞増殖に対する不利な影響を確実に軽減することができる。
こうして、細胞の一部は、増殖を計測する現象を示すことができる。
【００６２】
５．２  脂肪間葉系幹細胞の、異なる培養条件における、ｐ２１タンパク及びＣＤＫ２タンパク発現に対する影響
脂肪間葉系幹細胞の培養条件は、上記５．で記載したように四組に分け、上記ウエスタンブロット法を用いて、異なる培養条件で培養された脂肪間葉系幹細胞中の、細胞周期調節に関連するタンパク（如ｐ２１、ＣＤＫ２）発現に対する影響を分析、観察する。
同様に、β−ａｃｔｉｎタンパク発現量により対照し、上記した各タンパク発現を定量化し、データの標準化の基準依拠とする。
【００６３】
５．２．１  実験結果
図４Ｂに示すように、基礎培養基にＦＧＦ−２を加えた正常酸素環境での培養組と基礎培養基に本実施形態の補助剤を加えた正常酸素環境での培養組のｐ２１タンパク発現量には、低減の現象が見られた。
ＣＤＫ２タンパクの発現量には、増加の現象が見られた。
基礎培養基にＦＧＦ−２を加えた高酸素環境での培養組は、高酸素環境による、ｐ２１タンパク発現量を明確に高め、こうしてそのＣＤＫ２タンパクの発現の、細胞増殖に対する不利な影響を抑制した。
基礎培養基に、本実施形態の補助剤を加えた高酸素環境での培養組は、高酸素環境下での培養にあるが、本実施形態の補助剤を添加したため、ｐ２１タンパク発現量は、基礎培養基にＦＧＦ−２を加えた高酸素環境での培養組に比べ、明確に低下する効果を備える。
こうして、そのＣＤＫ２タンパクの発現も明確に向上する。
よって、本実施形態の補助剤を添加すると、正常酸素環境下でも、高酸素環境下でも、本実施形態の補助剤を添加しない者に比べ、間葉系幹細胞の増殖速度を明確に速めることが、ここで再び証明された。
【００６４】
（実験二）
（脂肪間葉系幹細胞の異なる血清添加物培養下における細胞増殖に対する影響）
本実験の細胞培養条件を、基礎培養基に１０％ウシ胎児血清を加える組、基礎培養に１０％のヒト血清を加える組、基礎培養基に１０％ヒト血清を加え、本実施形態の補助剤組を加える組、基礎培養基に２％のヒト血清を加え、本実施形態の補助剤を加える組の四組に分ける。
基礎培養基は、ＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ｀ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ｀ｓ  ｍｅｄｉｕｍ，  ＧＩＢＣＯ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培養基で、それにさらに２ミリモル濃度（ｍＭ）のＬ−グルタミン酸（Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，  ＧＩＢＣＯ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えて組成する。
本実施形態の補助剤は、２ミリモル濃度（ｍＭ）のＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ，  Ｓｉｇｍａ）及び０．２ミリモル濃度（ｍＭ）のＬ−アスコルビン酸−２−リン酸塩（ＡｓＡ２Ｐ，  Ｓｉｇｍａ）を含む。
各組幹細胞は、一平方センチ当たり３０００個細胞（３０００  ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）の細胞密度で、６ウェルプレート中（６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅｓ，  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で培養し、すべての細胞は摂氏３７度、５％二酸化炭素分圧及び９５％湿度環境下のインキュベーター（Ｆｏｒｍａ  Ｓｅｒｉｅｓ  ＩＩ  Ｍｏｄｅｌ  ３１１０，  Ｔｈｅｒｍｏ）中で培養する。
一週間培養し、３日に一回培養基を交換する。
７日間、異なる脂肪間葉系幹細胞の異なる培養条件における細胞増殖に対する影響を観察する。
【００６５】
１．  細胞成長密度分析
各組幹細胞を、リン酸塩緩衝溶液（ＰＢＳ）で一回洗浄後、トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ）溶液により、摂氏３７度で５分間作用後、完全に作用されていない細胞を、スパチュラで注意深く取り除き、等比率のウシ胎児血清を含む培養基中に加え、トリプシンの酵素と作用活性させる。
すべての細胞数はどれも細胞計数機（Ｖｉ−ＣＥＬＬ  ＡＳ，  Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）で計算する。
生存している細胞は、０．４％トリパンブルー（Ｔｒｙｐａｎ−ｂｌｕｅ，  ＧＩＢＣＯ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により、死んだ細胞と区別する。
計算時に生存している間葉系幹細胞を判定するパラメータを、１００  ｉｍａｇｅｓ、Ｓｉｚｅ  １０―３０ミクロン、７５％現場輝度、５％現場区域と設定する。
結果の表示は、各組実験データを三度繰り返し測定し、平均値±標準差によりこれを表示する。
【００６６】
１．１  実験結果
以上の実験データを、マイクロソフト社のＥｘｃｅｌプログラムｔテスト（ｔ−ｔｅｓｔ）により統計分析し、  ｐ＜０．０５を顕著な水準とし、結果を統計図に定量化する。
内、＊  Ｐ  ＜  ０．０５，  ＊＊  Ｐ  ＜  ０．０１，  ＊＊＊  Ｐ  ＜  ０．００５である。
先ず，図５Ａは、脂肪間葉系幹細胞の異なる培養条件における、顕微鏡下組織細胞形態を示す。
スケールは５００  ミクロン（μｍ）である。
各組織細胞形態はすこぶる類似しており、シャトル状の細胞形態をしていることが、観察で発見された。
【００６７】
図５Ｂは、基礎培養基に１０％ウシ胎児血清を加えた組と基礎培養基に１０％ヒト血清を加えた組の培養日数と細胞密度の関係図である。
培養四日後から、基礎培養基に１０％ヒト血清を加えた組の細胞の密度は、基礎培養基に１０％ウシ胎児血清を加えた組に比べ、２８％〜７４％の細胞数が明らかに増えており、顕著な差異を備える。
これから分かるように、ヒト血清を細胞培養時の血清添加物とすると、ウシ胎児血清を加えるよりも、脂肪間葉系幹細胞の増殖を迅速化できる。
【００６８】
図５Ｃは、基礎培養基に１０％ヒト血清を加えた組と基礎培養基に１０％ヒト血清を加え、本実施形態の補助剤を加えた組の細胞密度比較図である。
結果より分かるように、基礎培養基に１０％ヒト血清を加え、本実施形態の補助剤を加えた組の、培養一日後の細胞密度は、基礎培養基に１０％ヒト血清を加えた組より、１５５％〜３２４％の細胞数が明らかに増えており、顕著な差異を備える。
これから分かるように、本実施形態の補助剤を加えて培養すると、脂肪間葉系幹細胞の増殖の速度をより迅速化でき、相同の培養日数下で、より大量の細胞数を得ることができる。
【００６９】
図５Ｄは、基礎培養基に１０％ヒト血清を加えた組と基礎培養基に２％ヒト血清を加え本実施形態の補助剤を加えた組の比較を示す。
結果より分かるように、基礎培養基に２％ヒト血清を加え本実施形態の補助剤を加えた組では、ヒト血清は２％だけであるが、本実施形態の補助剤を添加し培養後は、脂肪間葉系幹細胞の最初の五日間の培養では、細胞増殖の速度は、基礎培養基に１０％ヒト血清を加えた組と近似している。
これから分かるように、本実施形態の補助剤の添加により、少ヒト血清の使用量を減らすことができるばかりか、脂肪間葉系幹細胞の迅速増殖を促す効果を保有することもできる。
【００７０】
２．  典型的な間葉幹細胞の細胞表面抗原分析
本実験では、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ，  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により、細胞表面抗原の測定を行う。
それぞれ四組の異なる培養条件下で培養した脂肪間葉系幹細胞を付着させ、リン酸緩衝液で洗浄後、適量のリン酸緩衝液中に溶かし、それぞれ異なる抗原に対して、ＣＤ１３、ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、β２ミクロスタンパク（Ｂ２Ｍ）及び  ＨＬＡ−ＤＲ等抗体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）などの、対応する免疫蛍光抗体により染色を行う。
暗所、室温下で１５分間染色後、適量のリン酸緩衝液を加えた後、機械分析を行い、フローサイトメトリーによりデータを収集後、フローサイトメトリー分析プログラム（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ，  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により分析を行う。
内、マイナス対照群は、上記した抗体の染色ステップを省略する。
【００７１】
２．１  実験結果
図６Ａに示すように、結果から以下のことが分かる。
四組の異なる培養条件下の脂肪間葉系幹細胞の細胞グループは、ＣＤ１３  ＋、ＣＤ３４  −  、ＣＤ４４  ＋  、ＣＤ７３  ＋  、ＣＤ９０  ＋  、ＣＤ１０５  ＋で、間葉系幹細胞の細胞グループに類似している。
すなわち、四組の異なる培養条件下の脂肪間葉系幹細胞は、間葉系幹細胞に類似した表面抗原の特徴を保有しているといえる。
ヒト血清を添加した三組の実験のＣＤ４４及びＣＤ７３の発現量は、基礎培養基に１０％ウシ胎児血清を加えた組より高い。
この結果は、ヒト血清を添加して培養した三組の実験において、それが保有する間葉系幹細胞の表面抗原特徴に類似した効果は、ウシ胎児血清を加えた培養の効果より、優れていることを説明している。
【００７２】
３．  幹細胞遺伝子発現の分析
本実験は、それぞれ四組の異なる培養条件下で培養し得られた脂肪間葉系幹細胞を、即時ポリメラーゼ鏈鎖反応装置（Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ）により、未分化幹細胞の相関遺伝子の発現を分析する。  
培養された細胞を、リン酸緩衝液で洗浄後、１．５  ｍｌの遠心管（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）中に収集し、１ｍｌのトリゾール（ＴｒｉＺｏｌ、１０２９６−０１０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）試剤を加え、室温で五分間置き、１００μｌのＢＣＰ（ＢＰ．  １５１，ＭＲＣ）溶液を加え、Ｖｏｒｔｅｘを加え、均一に混合しピンク色の溶液にした後、室温で１５分間置き、さらに１５，０００  ｇの遠心処理を４℃で１５分間行う。
遠心処理の完了後、遠心管（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）内は三層に分かれる。
下層は赤色層、中間層は薄い白色層、上層は透明層である。
上層を吸出し、新しい１．５ミリリットル遠心管（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）中に入れる。
吸出しの過程では、細心の注意を払い、残りの二層を吸わないようにする。
新しい遠心管中に０．５  ミリリットルのイソプロパノール（ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ）を加え、振って均一にした後、室温で３０分間置く。
その後、さらに１５，０００  ｇ遠心処理を４℃で１０分間行い、上澄み液を抽出する。
その際には、ペレット（ｐｅｌｌｅｔ）を吸わないよう注意し、１  ミリリットルの７５％エタノール（ｅｔｈａｎｏｌ）で洗浄する。
次に、１５，０００  ｇ遠心処理を４℃で１０分間行い、エタノールを抽出後、１０分間空気乾燥させ、ＲＮａｓｅ阻害剤（ＤＥＰＣ）を含む水で溶かした後、ＲＮＡ抽出を完成する。
約１０マイクログラム（μｇ）  のＲＮＡを抽出し、反転写試剤キット（ＲＴ−ｆｏｒ−ＰＣＲ  ｋｉｔ，  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を加え、ポリメラーゼ連鎖反応装置（ＰＣＲ  ｍａｃｈｉｎｅ）により、反転写を完成後、ポリメラーゼ（ＧｏＴａｑ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ，  Ｍ７１２２，  Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え、ポリメラーゼ鏈鎖反応を行う。
Ｐ反応の設定条件は、プライマー（Ｐｒｉｍｅｒ）が異なれば、Ｔｍ値も異なり、やや調整する。
Ｎａｎｏｇ，  ＳＯＸ２，  ＣＸＣＲ４，  ＴＥＲＴ等の幹細胞と関連のある未分化の相関遺伝子を分析する。
本実験は、Ｎａｎｏｇ，  ＳＯＸ２，  ＣＸＣＲ４，  ＴＥＲＴと対照群β−ａｃｔｉｎ  遺伝子を分析する。
【００７３】
各遺伝子分析に使用するプライマーは下記の表１に示す。
【表１】
0005889856.tif 000002
【００７４】
３．１  実験結果
図６Ｂに示す結果により、我々は以下のことを発見した。
ヒト血清を添加した三組の実験（１０％ヒト血清、１０％ヒト血清＋補助剤、２％ヒト血清＋補助剤）において、その幹細胞遺伝子（Ｎａｎｏｇ，  ＳＯＸ２，  ＣＸＣＲ４，  ＴＥＲＴ）の発現は、皆、基礎培養基に１０％ウシ胎児血清を加えた組より、明らかに高い。
同様に、以下のことが観察された。
基礎培養基に２％ヒト血清を加え本実施形態の補助剤を加えた組では、ヒト血清は２％だけであるが、本実施形態の補助剤を添加し培養すると、１０％ヒト血清を添加し培養したように、上記した幹細胞遺伝子の発現を保持していることができる。
これにより、本実施形態の補助剤を添加し細胞培養を行えば、ヒト血清の使用量を確実に減らすことができる。
【００７５】
４．  脂肪間葉系幹細胞の分化
文献や報道で、脂肪間葉系幹細胞は、脂肪や骨頭細胞などの中胚葉細胞に分化する能力を備えると、指摘されている。
本実験では（実験二）同様、脂肪間葉系幹細胞を、四組の異なる培養条件下で培養し六日後、それを誘導し、硬骨細胞、軟骨細胞及び脂肪細胞に分化させ、上記した四組の異なる培養条件下で培養六日後に、幹細胞多機能性分化能力をなお備えているかどうかを確認する。
本実施形態中の誘導分化実験は、従来の文献中で既に普通に使用されている幹細胞誘導分化システム（Ｋａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１；Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）に基づき、本実施形態の重点ではないため、詳述しない。
その主な目的は、本実施形態において上記した四組の異なる培養条件下で培養後、幹細胞は、多機能性分化能力をなお備えているか否かを確認することである。
【００７６】
４．１  細胞の化学染色及び分子マーカー分析
分化した硬骨細胞を、アルカリホスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，  ＡＬＰ）で染色する。
アルカリホスファターゼは、成熟骨芽細胞分化の重要な指標で、その染色方法は、従来の染色技術（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）に基づき行うため、ここでは詳述しない。
別に、従来のＶｏｎ−ｋｏｓｓａ染色を行う、リン酸カルシウムの存在を確認する。
分化した軟骨細胞は、アルシアンブルー染色法（Ａｌｃｉａｎ  ｂｌｕｅ）で、軟骨組織中に含まれるプロテオグリカン（Ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ）の存在を確認する（Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）。
分化した脂肪細胞は、オイルレッド０染色（Ｏｉｌ  ｒｅｄ  Ｏ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）により、脂質液胞（Ｌｉｐｉｄ  ｖａｃｕｏｌｅｓ）の存在（Ｋａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）があるか否かを確認する。
別に、本実験では、硬骨細胞が擁する分子マーカー［コア結合因子（ｃｂｆａ１）、オステオカルシン（Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ，  ＯＣ）及び第一型コラーゲン（ＣＯＬ  ＩＡ１）等遺伝子］、軟骨細胞が擁する分子マーカー［軟骨糖タンパク質（ＡＣＡＮ）、第二型コラーゲン（ＣＯＬ  ＩＩＡ１）  等遺伝子］及び脂肪細胞の脂肪合成相関遺伝子［ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）、脂肪結合タンパク質（ａＰ２）］の発現に対して、β−ａｃｔｉｎ  遺伝子を対照群とし、即時ポリメラーゼ鏈鎖反応（Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）を行い、その相対発現量を分析する。
【００７７】
各遺伝子分析に使用するプライマーは下記の表１に示す。
【表２】
0005889856.tif 000003
【００７８】
４．２  実験結果
図７Ａは、アルカリホスファターゼ染色結果を示す。
スケールは５００  ミクロン（μｍ）である。
脂肪間葉系幹細胞は、四組の異なる培養条件下において、硬骨細胞に誘導分化され、アルカリホスファターゼ染色を経ると、どれも黒色結晶の部分を現す。
これは、アルカリホスファターゼの存在を示しており、四組は、どれも、肪間葉系幹細胞に幹細胞分化の能力を保有させられることを示している。
【００７９】
図７Ｂは、フォンクザーヌス（Ｖｏｎ−ｋｏｓｓａ）染色結果を示す。
スケールは５００  ミクロン（μｍ）である。
四組はどれも、黒色或いは茶褐色のリン酸カルシウム結晶を現していることが分かり、これによっても四組は、どれも、肪間葉系幹細胞に幹細胞分化の能力を保有させられることを示している。
【００８０】
図７Ｃは、硬骨細胞の分子マーカー発現の分析結果を示す。
オステオカルシン（ＯＣ）相対発現量中において、基礎培養基に１０％ヒト血清を加え、本実施形態の補助剤を加えた組と基礎培養基に２％ヒト血清を加え本実施形態の補助剤を加えた組の二組において、その硬骨細胞の分子マーカー発現はどれも、基礎培養基に１０％ウシ胎児血清を加えた組と基礎培養基に１０％ヒト血清を加えた組より、明らかに高いことが分かる。
内、＊  Ｐ  ＜  ０．０５，  ＊＊  Ｐ  ＜  ０．０１，  ＊＊＊  Ｐ  ＜  ０．００５である。
特に、基礎培養基に２％ヒト血清を加え本実施形態の補助剤を加えた組において、そのｃｂｆａ１、ＯＣ及びＣＯＬ  ＩＡ１の相対発現量は、基礎培養基に１０％ウシ胎児血清を加えた組より明確に高い。
これにより明らかなように、本実施形態の補助剤を添加し、ヒト血清を加え、脂肪間葉系幹細胞培養を行うと、幹細胞がもともと持っている分化能力を保有させられ、硬骨細胞に誘導分化する効果はさらに高くなる。
【００８１】
図８Ａは、アルシアンブルー染色結果を示す。
スケールは５００  ミクロン（μｍ）である。
四組はどれも青色のプロテオグリカン染色結果を現し、特に、基礎培養基に２％ヒト血清を加え本実施形態の補助剤を加えた組の青色プロテオグリカン染色区域は、他の三組をはるかに上回っていることが分かる。
【００８２】
図８Ｂは、軟骨細胞の分子マーカー発現分析を示す。
基礎培養基に１０％ヒト血清を加え、本実施形態の補助剤を加えた組と基礎培養基に２％ヒト血清を加え本実施形態の補助剤を加えた組は、ＡＣＡＮ及びＣＯＬ  ＩＩＡ１  等遺伝子の相対発現量において、基礎培養基に１０％ウシ胎児血清を加えた組と基礎培養基に１０％ヒト血清を加えた組より、明らかに高いことが分かる。
内、＊  Ｐ  ＜  ０．０５，  ＊＊  Ｐ  ＜  ０．０１，  ＊＊＊  Ｐ  ＜  ０．００５である。
特に、基礎培養基に２％ヒト血清を加え本実施形態の補助剤を加えた組において、その軟骨細胞の分子マーカー発現は、さらに大きく向上している。
これにより明らかなように、本実施形態の補助剤を添加しヒト血清を加え、脂肪間葉系幹細胞培養を行うと、幹細胞がもともと持っている分化能力を保有させられ、軟骨細胞に誘導分化する効果はいっそう向上する。
【００８３】
図８Ｃは、オイルレッドＯ染色結果を示す。
スケールは５００  ミクロン（μｍ）である。
四組はどれも赤色の脂質液胞染色結果を示すことが分かる。
【００８４】
図８Ｄは、脂肪合成相関遺伝子ＰＰＡＲγ及びａＰ２の相対発現量を示す。
内、＊  Ｐ  ＜  ０．０５，  ＊＊  Ｐ  ＜  ０．０１である。
基礎培養基に１０％ヒト血清を加え、本実施形態の補助剤を加えた組において、そのＰＰＡＲγ及びａＰ２の相対発現量は、基礎培養基に１０％ウシ胎児血清を加えた組と基礎培養基に１０％ヒト血清を加えた組に比べ、明確に高いことが分かる。
これにより明らかなように、本実施形態の補助剤を添加しヒト血清を加え、脂肪間葉系幹細胞培養を行うと、幹細胞がもともと持っている分化能力を保有させられ、脂肪細胞に誘導分化する効果はよりいっそう高い。
【００８５】
５．  細胞因子配列分析と相対遺伝子発現の分析
本分析実験は、脂肪間葉系幹細胞の三種の状態（１０％ヒト血清培養前、１０％ヒト血清培養及び１０％ヒト血清に補助剤を加えた培養）において、その培養基の上澄み液をそれぞれ取り、市販の４１種のヒト細胞因子配列を含む分析セット（Ｃａｔ  ＃ＡＡＨ−ＧＦ−１，  ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ，  Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，  ＧＡ）を利用し、分析を行い、上記三種の状態下で、脂肪間葉系幹細胞の分泌細胞因子及び成長因子に対する影響を観察する。
配列分析セットの分析方法は、本実施形態の請求の重点ではないため、詳述しない。
その詳細は、ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ社提供のＣａｔ  ＃ＡＡＨ−ＧＦ−１説明書を参照されたい。
【００８６】
また、本実験では、上記した四組の異なる培養条件下で培養後の脂肪間葉系幹細胞において、（実験二）の３．の分析方法などにより、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−１）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、表皮成長因子（ＥＧＦ）等の特定成長因子に対して、β−ａｃｔｉｎ  遺伝子を対照群とし、即時ポリメラーゼ鏈鎖反応（Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）を行い、その相対発現量を分析する。
【００８７】
各遺伝子分析に使用するプライマーは下記表３に示す。
【表３】
0005889856.tif 000004
【００８８】
この他、本実験では、脂肪間葉系幹細胞に対して、下記の三種の培養条件において、基礎培養基に１０％ウシ胎児血清を加える組、基礎培養基加上１０％ウシ胎児血清（５％酸素分圧の低酸素環境）組及び基礎培養基に１０％ウシ胎児血清を加え、本実施形態の補助剤を加えた組の三組を培養し、その培養基の上澄み液をそれぞれ取り、ヒト細胞因子配列分析（Ｃａｔ  ＃ＡＡＨ−ＧＦ−１，  ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ，  Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，  ＧＡ）を行い、脂肪間葉系幹細胞分泌細胞因子及び成長因子に対する影響を観察する。
【００８９】
５．１  実験結果
図９Ａ及び図９Ｂは、細胞因子配列分析結果と細胞因子配列分析結果の比較模式図である。
内、ＰＯＳはプラス対照群を示し、ＮＥＧはマイナス対照群を示し、＊  Ｐ  ＜  ０．０５で、    ＊＊  Ｐ  ＜  ０．０１で、  ＊＊＊  Ｐ  ＜  ０．００５である。
結果比較より、脂肪間葉系幹細胞は、本実施形態の補助剤を添加し培養後、条件培地において、ＦＧＦ−２、ＥＧＦ、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７、ＨＢ−ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＰＢ−４、ＩＧＦＢＰ−６、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−Ｉ  ＳＲ、ＩＧＦ−ＩＩ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ  Ｒ、ＰＤＧＦ  Ｒα、ＰＤＧＦ−Ｒβ、ＰＤＡＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＩＧＦ、ＳＣＦ、ＴＧＦ−β３、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ  Ｒ２のような細胞因子及び成長因子を分泌することが分かる。
【００９０】
図９Ｂが示す１０％ヒト血清培養前と１０％ヒト血清培養の比較図では、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、表皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板派生成長因子（ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＡＢ、ＢＢ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ  Ｒ３）等の左下向き斜線のブロックでは、細胞に吸收利用された状況を示している。
図中では、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、インスリン様増殖因子結合タンパク（ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＧＦＢＰ−６）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）等の右下向き斜線のブロックは、細胞から培養基中へ分泌した状況を示している。
【００９１】
図９Ｃ及び図９Ｄは、１０％ヒト血清培養及び１０％ヒト血清に補助剤を加えた培養の結果を比較した定量化模式図である。
血小板派生成長因子（ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＡＢ、ＢＢ）が、持続的に細胞に吸收利用された状況を示している。
肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、インスリン様増殖因子結合タンパク（ＩＧＦＢＰ−１）及び血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）は、持続的に細胞から培養基中へ分泌した状況を示しているばかりか、１０％ヒト血清に補助剤を加えた培養の結果より、明らかに高い。
これにより明らかなように、本実施形態の補助剤を添加しヒト血清を加え、脂肪間葉系幹細胞培養を行うと、ＨＧＦ、ＩＧＦＢＰ−１及びＶＥＧＦ等のある種の成長因子の分泌を高める効果を備える。
【００９２】
図９Ｅは、脂肪間葉系幹細胞を、四組の異なる培養条件下で培養後の、その成長因子ＩＧＦ−１、ＨＧＦ及びＥＧＦの相対発現量結果を示す。
内、＊  Ｐ  ＜  ０．０５で、＊＊  Ｐ  ＜  ０．０１で、＊＊＊  Ｐ  ＜  ０．００５である。
結果により、ヒト血清を添加して培養した三組（１０％ヒト血清、１０％ヒト血清＋補助剤、２％ヒト血清＋補助剤）のＩＧＦ−１、ＨＧＦ及びＥＧＦの相対発現量はどれも、基礎培養基に１０％ウシ胎児血清を加えた組より、明らかに高いことが分かる。
特に、基礎培養基に２％ヒト血清を加え本実施形態の補助剤を加えた組の相対発現量は、最高である。
これにより明らかなように、本実施形態の補助剤を添加し、ヒト血清を加え、脂肪間葉系幹細胞の培養を行った後、ＩＧＦ−１、ＨＧＦ及びＥＧＦ等の成長因子の相対発現量を高めることができる。
【００９３】
図９Ｆ及び図９Ｇは、細胞因子配列の分析結果図及び上記した細胞因子配列の分析結果の比較図である。
図９Ｇにおいて、各細胞因子ブロック中に、もし中央が白い円形の図があれば、基礎培養基に１０％ウシ胎児血清を加えた組の脂肪間葉系幹細胞は、この細胞因子を分泌したことを示している。
同様に、もし完全に黒い円形の図があれば、基礎培養基に１０％ウシ胎児血清を加えた（５％酸素分圧の低酸素環境）組の脂肪間葉系幹細胞は、この細胞因子を分泌したことを示している。
斜線の円形の図があれば、基礎培養基に１０％ウシ胎児血清を加え、本実施形態の補助剤を加えた組の脂肪間葉系幹細胞は、この細胞因子或いは成長因子を分泌したことを示している。
【００９４】
図９Ｇにより、脂肪間葉系幹細胞培養は、ある条件下では、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−６、ＩＧＦ−ＩＩ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ  Ｒ、ＮＴ−４、ＰＤＧＦ  Ｒβ、ＰＩＧＦ、ＴＧＦ−β３、ＶＥＧＦ等細胞因子或いは成長因子を分泌することが分かる。
さらに、基礎培養基に１０％ウシ胎児血清を加えた（５％酸素分圧の低酸素環境）組及び基礎培養基に１０％ウシ胎児血清を加え、本実施形態の補助剤を加えた組はどれも、脂肪間葉系幹細胞が分泌する細胞因子或いは成長因子の種類を増やすことができる。
但し、基礎培養基に１０％ウシ胎児血清を加え、本実施形態の補助剤を加えた組で増加する種類及び量はどれも、β−ＮＧＦ、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−Ｉ  ＳＲ、ＧＣＳＦ、ＧＤＮＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＳＣＦ、ＶＥＧＦ  Ｒ２、ＶＥＧＦ  Ｒ３、ＶＥＧＦ−Ｄ等細胞因子或いは成長因子が多い。
これにより明らかなように、本実施形態の補助剤を添加し、脂肪間葉系幹細胞の培養を行えば、低酸素環境培養に比べ、脂肪間葉系幹細胞が分泌する細胞因子或いは成長因子の種類及び量を増やすことができる。
【００９５】
上記した結果により、以下のことが分かった。
脂肪間葉系幹細胞は、本実施形態の補助剤を添加しヒト血清を加えた基礎培養基で培養しようと、本実施形態の補助剤だけを添加し１０％ウシ胎児血清を含む基礎培養基で培養しようと、迅速増殖の効果を達成できるだけでなく、同時に、脂肪間葉系幹細胞培養期間に大量に分泌される成長因子をも得ることができる。
本実施形態の補助剤を添加し、ヒト血清を加えた基礎培養基の条件下での培養が、最良の培養条件である。
【００９６】
これにより、傷口の癒合を促す薬物の調合に用い、及び傷口の癒合を促す薬物の調合の用途に用い、或いはスキンケア用品の調合に用い、及びスキンケア用品の調合の用途に用いる。
【００９７】
（実験三）
（脂肪間葉系幹細胞マイクロキャリア培養）
生体外で培養するヒト間葉系幹細胞の多くは、付着依存性（Ａｎｃｈｏｒａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ）の培養方式によって行う。
よって、付着依存性に適合した培養システムを用いて、大量で、品質が一致した細胞を生成することは、再生医学と医再生工学の応用において、必要である。
本実験では、撹拌式マイクロキャリア培養反応器（Ｓｐｉｎｎｅｒ  Ｆｌａｓｋｓ，  Ｂｅｌｌｃｏ  Ｇｌａｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｖｉｎｅｌａｎｄ，  ＮＪ，  ＵＳＡ  ）を用い、脂肪間葉系幹細胞の培養を行う。
細胞を反応器に入れる前に、先ず、培養反応器内部表面を、シリコン（Ｓｉｇｍａｃｏｔｅ，  Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ，  ＵＳＡ）で処理する。
使用するマイクロキャリア（ＣｕｌｔｉＳｐｈｅｒ−Ｇ；ＨｙＣｌｏｎｅ，  Ｌｏｇａｎ，  ＵＴ，  ＵＳＡ）は、操作ハンドブック上のステップに従い順番に重さを量り、水を加えて混合し、及び滅菌器を使用し１５分間１２１℃で処理する。
【００９８】
細胞を混入する前に、先ず、余分なリン酸塩緩衝溶液を取り除き、次に、培養しようとする細胞の培養液を加入し、約２４時間平衡化する。
脂肪間葉系幹細胞を、予め培養液とマイクロキャリアのバランスをとって計約５０ミリリットルとした撹拌式培養反応器中に入れ、最初は間歇式の方式で外付け式の電磁撹拌システムを起動し、一回２５ｒ．ｐ．ｍで３０分間後に１０〜２０分間休ませるサイクルで２時間運転する。
上記の２時間後に、２５ｒ．ｐ．ｍの回転速度で培養を始め、３日に一回陪養液を交換し、一回に約５０％〜７０％の培養液を交換する。
交換前には先ず撹拌を約５分間停止し、細胞とマイクロキャリアを、反応器の底部に落ち着かせる。
内、マイクロキャリアの培養過程は、３７℃、湿度９５％及び５％二酸化炭素分圧の環境下で七日間培養する。
培養基は、ＩＭＤＭに１０％  ヒト血清を加え、２ミリモル濃度（ｍＭ）のＬ−グルタミン酸及び本実施形態の補助剤を含み組成する。
補助剤は、１０ｎｇ／ＭｌのＦＧＦ−２、２ミリモル濃度のＮ−アセチル−Ｌ−システイン及び０．２ミリモル濃度のＬ−アスコルビン酸−２−リン酸塩を含む。
【００９９】
細胞の、マイクロキャリア上での成長と分布状況を観察するため、毎日１ミリリットルのマイクロキャリアを含む細胞液を取り出し、遠心処理で培養基を除去し、リン酸緩衝溶液により一回の洗浄を行う。
次に、１０％ホルマリン固定液を用い室温で１０分間固定後、固定液を除去し、リン酸緩衝溶液で洗浄する。
さらに、５ミリグラム／ミリリットルの緑色蛍光アセテート（ＦＤＡ）と２ミリグラム／ミリリットルのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）により、生きている細胞と死んだ細胞をそれぞれ染色する。
室温暗所で５分間置いた後、染色剤を除去し、リン酸緩衝溶液で三回洗浄する。
さらに、細胞とマイクロキャリアをスライド上に平均に分布させ、蛍光顕微鏡を使用して観察する。
【０１００】
（実験結果）
図１０Ａと図１０Ｂは、脂肪間葉系幹細胞を、マイクロキャリアで７日間培養した、光学顕微鏡下の画像、及び蛍光顕微鏡下の画像である。
内、緑色蛍光は生きた細胞を示し、赤色蛍光は死んだ細胞を示す。
図１０Ｂの画像観察より分かるように、脂肪間葉系幹細胞は、マイクロキャリアに貼りつき、微細構造状態を形成しやすい。
これにより、脂肪間葉系幹細胞を、マイクロキャリア等の生体適合性材料で培養すれば、微細構造状態を形成でき、再生医学或いは医再生工学の用途できることが分かる。
【０１０１】
上記した実験結果から分かるように、本実施形態のヒト間葉系幹細胞を生体外で増殖させる補助剤を、ヒト間葉系幹細胞を含む培養基中に加え、正常酸素環境（約２１％酸素分圧）で培養後、低酸素環境（約５％酸素分圧）下での培養と同様に、細胞分裂が迅速で、細胞周期合成期（Ｓ  ｐｈａｓｅ）の比率が向上し、老化を減らすことができ、分化潜在能力を高めることができる等の現象が現われ、ヒト血清をウシ胎児血清に置換し培養を行うと、その細胞増殖速度はさらに速くなり、細胞が分泌する成長因子量は多くなり、種類は拡大する。
すなわち、本実施形態はヒト間葉系幹細胞を迅速かつ効率的に増殖させられるだけでなく、幹細胞に多機能性の特徴を保有させることもでき、ヒト間葉系幹細胞の迅速増殖、成長因子獲得の効果を達成することができる。
【０１０２】
上述の実施形態は、本発明の操作、使用、及び本発明の効果を充分に説明するためのものである。上述の実施形態は単に本発明の好ましい実施形態であり、これによって本発明の特許請求の範囲を限定することではない。即ち本発明の特許請求の範囲及び説明書の内容に基づいて、同等効果を有する簡単な変化及び修飾は、全て、本発明の範囲内に属するものとする。
【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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