(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪組織由来多系統前駆細胞をポリアミンの存在下で培養する工程を含む、心筋指向性細胞を含む細胞集団の製造方法。
【請求項２】
ポリアミンの存在下で培養された脂肪組織由来多系統前駆細胞より、心筋指向性細胞を少なくとも１０％含む細胞集団を回収する工程、をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ポリアミン添加後１〜５日間細胞培養する工程を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
培地中のポリアミン濃度が５μＭ〜１ｍＭである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ポリアミンが、下記式（Ｉ）：
0005940147.tif 000013
［式中、Ｘは、主鎖のＣＨ２基が１〜４個のＮＨ基で置換されていてもよい、炭素数４〜１４の直鎖状炭化水素基である］
で示される化合物である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ポリアミンが、プトレシン、スペルミン及びスペルミジンからなる群より選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法によって得られる、心筋指向性細胞を含む細胞集団。
【請求項８】
請求項７に記載の細胞集団を含む、細胞製剤。
【請求項９】
請求項７に記載の細胞集団を含む、心疾患治療用細胞製剤。
【請求項１０】
請求項７に記載の細胞集団を含む、細胞シート。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法によって心筋指向性細胞を含む細胞集団を製造する工程；及び
該細胞集団を培養して細胞シートを形成する工程；
を含む細胞シートの製造方法。
【請求項１２】
細胞集団を得るための脂肪組織由来多系統前駆細胞が他家細胞である、請求項８に記載の細胞製剤。
【請求項１３】
細胞集団を得るための脂肪組織由来多系統前駆細胞が他家細胞である、請求項９に記載の心疾患治療用細胞製剤。
【請求項１４】
免疫抑制剤を成分として含まない、請求項１２又は１３に記載の細胞製剤。
【請求項１５】
細胞集団を得るための脂肪組織由来多系統前駆細胞が他家細胞である、請求項１０に記載の細胞シート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心筋指向性細胞を含む細胞集団の製造方法、該方法により得られる細胞集団、等に関する。
【背景技術】
【０００２】
成体の心筋細胞は増殖能力を失っているため、一度傷害された心筋は修復されず、恒久的な機能不全を残して心不全を呈する。高齢化や生活習慣の欧米化による動脈硬化性血管疾患の増加と共に、心不全患者の数は増加しており、特に、頻回の心筋梗塞により残存心筋幹細胞が消失する虚血性心筋症等の重症心不全においては、内科的治療も十分な効果を上げていない。また、ＰＣＩ（冠動脈形成術）や冠動脈バイパス術による血流改善も限定的な効果しかない。これらに治療抵抗性である重症心不全のエンドステージでは１年死亡率が約７５％とされ、新規治療法・医薬品の開発が待たれている。
特許文献１には、分化誘導中のＥＳ細胞をスペルミン等のポリアミンの存在下で培養することによる、心筋移植片を作製する方法が開示されている。スペルミン処理後の細胞は、分化誘導されたペースメーカー様心筋細胞である。
特許文献２には、脂肪組織由来幹細胞をＤＭＳＯ又はＯＰ９培養上清の存在下で培養して心筋芽細胞に分化させ、その心筋芽細胞を含むシートを形成する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００６−２１８０３５号公報
【特許文献２】特開２００８−３０７２０５号公報
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、心筋組織環境下で心筋細胞として分化生着する心筋指向性細胞を含む細胞集団を製造することを目的とする。
本発明者は、前記課題を解決すべく、脂肪組織由来多系統前駆細胞（以下「ＡＤＭＰＣ」ともいう）から心筋指向性細胞へ分化誘導する候補化合物を約４千種類スクリーニングした結果、脂肪組織由来多系統前駆細胞をポリアミンの存在下で培養することによって、心筋組織環境下で心筋細胞として分化生着することができる心筋指向性細胞を含む細胞集団を製造できることを見い出し、本発明を完成させるに至った。即ち、本発明は以下の発明を包含する。
［１］脂肪組織由来多系統前駆細胞をポリアミンの存在下で培養する工程を含む、心筋指向性細胞を含む細胞集団の製造方法。
［２］ポリアミン添加後１〜５日間細胞培養する工程を含む、［１］に記載の方法。
［３］培地中のポリアミン濃度が５μＭ〜１ｍＭである、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］ポリアミンが、下記式（Ｉ）：
0005940147.tif 000002
［式中、Ｘは、主鎖のＣＨ２基が１〜４個のＮＨ基で置換されていてもよい炭素数４〜１４の直鎖状炭化水素基である］
で示される化合物である、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］ポリアミンが、プトレシン、スペルミン及びスペルミジンからなる群より選択される、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］［１］〜［５］のいずれかに記載の方法によって得られる、心筋指向性細胞を含む細胞集団。
［７］［６］に記載の細胞集団を含む、細胞製剤。
［８］［６］に記載の細胞集団を含む、心疾患治療用細胞製剤。
［９］［６］に記載の細胞集団を含む、細胞シート。
［１０］［１］〜［５］のいずれかに記載の方法によって心筋指向性細胞を含む細胞集団を製造する工程；及び
該細胞集団を培養して細胞シートを形成する工程；
を含む細胞シートの製造方法。
［１１］［６］に記載の細胞集団又は［７］若しくは［８］に記載の細胞製剤を被験体に投与すること、或いは［９］に記載の細胞シートを被験体の心臓障害部位に移植すること、を含む、心疾患の治療方法。
［１２］心疾患が虚血性心疾患である、［１１］に記載の方法。
［１３］１×１０４〜１×１０９個／体重ｋｇの細胞集団を投与する、［１１］又は［１２］に記載の方法。
［１４］脂肪組織由来多系統前駆細胞が自己由来細胞または他家細胞である、［１］〜［５］に記載の方法。
［１５］脂肪組織由来多系統前駆細胞が他家細胞である、［７］に記載の細胞製剤。
［１６］脂肪組織由来多系統前駆細胞が他家細胞である、［８］に記載の心疾患治療用細胞製剤。
［１７］免疫抑制剤を成分として含まない、［１５］又は［１６］に記載の細胞製剤。
［１８］脂肪組織由来多系統前駆細胞が他家細胞である、［９］に記載の細胞シート。
［１９］脂肪組織由来多系統前駆細胞が他家細胞である、［１１］〜［１３］のいずれかに記載の方法。
［２０］免疫抑制のステップを含まない、［１９］に記載の方法。
［２１］免疫抑制のステップが免疫抑制剤を投与するステップである、［２０］に記載の方法。
［２２］被験体への投与に際して免疫抑制の工程を含まないことが記載された使用説明書とともに、［７］、［８］及び［１５］〜［１７］のいずれかに記載の細胞製剤を含むキット。
［２３］被験体への投与に際して免疫抑制のステップを含まないことが記載された使用説明書とともに、［７］、［８］及び［１５］〜［１７］のいずれかに記載の細胞製剤を含むパッケージ。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０１２−１００３６２号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
図１は、ポリアミンの存在下で脂肪組織由来多系統前駆細胞から分化誘導された心筋指向性細胞における、各種分化マーカー発現についての培養時間及び成長因子による影響を示した図である（図１Ａ〜図１Ｇ）。
図２は、脂肪組織由来多系統前駆細胞から心筋指向性細胞への分化誘導における、スペルミンとＤＭＳＯの影響を比較した図である（図２Ａ〜図２Ｇ）。
図３は、本発明の細胞製剤を重症心筋梗塞ブタモデル動物に経冠動脈投与した後の左心駆出率（％ＥＦ）（図３Ａ）、及び投与直前値との差ΔＥＦ（％）（図３Ｂ）を経時的に調べた図である。
図４は、本発明の細胞製剤投与１２週間後のブタ心筋組織の切片を、ヒト由来のα−ＣＡ抗体（上図）およびヒト由来のアクチニン抗体（下図）により免疫染色した図である。
図５は、本発明の細胞製剤を重症心筋梗塞ブタモデル動物に、図示したスケジュール（図５Ａ）に従って経冠動脈に頻回投与した後の左心駆出率（％ＥＦ）（図５Ｂ）、及び投与直前値との差ΔＥＦ（％）（図５Ｃ）を経時的に調べた図である。
図６は、自家由来細胞で作製された本発明の細胞製剤、または他家細胞で作製された本発明の細胞製剤を重症心筋梗塞ブタモデル動物に、図示したスケジュール（図６Ａ）に従って経冠動脈投与した後の左心駆出率（％ＥＦ）（図６Ｂ）、及び投与直前値との差ΔＥＦ（％）（図６Ｃ）を経時的に調べた図である。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
以下、本発明を詳細に説明する。
＜心筋指向性細胞を含む細胞集団＞
本発明によれば、脂肪組織由来多系統前駆細胞をポリアミンの存在下で培養することによって、心筋指向性細胞を含む細胞集団を製造することができる。
本明細書において「脂肪組織由来多系統前駆細胞」とは、本願の発明者によって見出された体性幹細胞の一種であり、内胚葉、中胚葉、外胚葉等の種々の細胞系列に分化することができる細胞である。当該細胞の特徴の一つとして、当該細胞は未分化マーカーであるＩｓｌｅｔ−１、その他ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６を発現する細胞である（ＷＯ２００８／１５３１７９）。脂肪組織由来多系統前駆細胞が由来する動物種は特に限定されず、例えばヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、サル、ブタ等を含む哺乳類であり、より好ましくはヒトである。脂肪組織由来多系統前駆細胞を用いた治療を行う場合は、被験体と同種であることが好ましい。本発明に用いられる細胞は、自家由来の細胞（遺伝的に同種・同系）、または他家由来の細胞（遺伝的に同種・異系）である。
前記脂肪組織由来多系統前駆細胞は、例えばＷＯ２００８／１５３１７９に記載の公知の方法により作製することができる。具体的には、被験体から脂肪組織を採取し、コラゲナーゼ処理した消化産物をろ過する。その後、得られた脂肪組織由来細胞集団から赤血球を除去する。続いて、得られた細胞集団から脂肪組織由来多系統前駆細胞以外の細胞を除去して、脂肪組織由来多系統前駆細胞を得ることができる。
また、当業者であれば、未分化マーカーであるＩｓｌｅｔ−１、その他ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６の遺伝子発現プロファイルを参照して、公知の方法（特開２００９−１４２２７８号公報；  Ｓｚａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ．  ２０１０，  ４６８（７３２３），  ５２１−６．；Ｌａｄｅｗｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ２０１２  Ａｐｒ８．）により任意の細胞から当該遺伝子を発現するよう遺伝子等の導入及び／又は低分子化合物の処理を施された細胞であって、被験体より採取した脂肪組織由来多系統前駆細胞と機能的に同等な細胞を作製することができる。本願において、上述のように作製された細胞も「脂肪組織由来多系統前駆細胞」に含まれる。
本発明では、脂肪組織由来多系統前駆細胞を含む細胞集団を、心筋指向性細胞の分化誘導のための出発細胞として使用することができる。
本明細書において「ポリアミン」とは、第一級アミノ基が２つ以上結合した直鎖脂肪族炭化水素であり、例えば、１，３−ジアミノプロパン、プトレシン、カダベリン、カルジン、スペルミジン、ホモスペルミジン、アミノプロピルカダベリン、テルミン、スペルミン、テルモスペルミン、カナバルミン、アミノペンチルノルスペルミジン、Ｎ，Ｎ−ビス（アミノプロピル）カダベリン、ホモスペルミン、カルドペンタミン、ホモカルドペンタミン、カルドヘキサミン、ホモカルドヘキサミン、ジエチレントリアミン等が挙げられる。好ましくは、下記式（Ｉ）：
0005940147.tif 000003
［式中、Ｘは、主鎖のＣＨ２基が１〜４個のＮＨ基で置換されていてもよい炭素数４〜１４の直鎖状炭化水素基である。但し、炭素数が４個のときに置換されるＮＨ基の数は１〜３個である。］
で示される化合物である。但し、式（Ｉ）の構造において、Ｈ２Ｎ−ＮＨ−及び−ＮＨ−ＮＨ−の配置にならないことが好ましい。より好ましくは、上記式（Ｉ）において、炭素数が４〜７のとき、ＮＨ基は１又は２個含まれ、炭素数が８〜１２のとき、ＮＨ基は１、２又は３個含まれ、炭素数が１３〜１４のとき、ＮＨ基は１、２、３又は４個含まれる。上記式（Ｉ）において、炭素数が８〜１２であり、ＮＨ基が１、２又は３個含まれる場合が特に好ましい。さらに好ましくは、プトレシン、スペルミン又はスペルミジンであり、特に、スペルミン又はスペルミジンが好ましい。これらのポリアミンは、本発明の目的や用途に応じて単独又は混合物で用いることができる。
本明細書において「心筋指向性細胞」とは、心筋系細胞に分化するよう方向付けられた（コミットメントされた）細胞であって、少なくとも核内転写因子であるＮｋｘ２．５及びＩｓｌｅｔ−１を発現している細胞をいう。該心筋指向性細胞は、さらにＧＡＴＡ−４、心筋α−アクチン（α−ＣＡ）、心筋トロポニンＩ、ミオシン軽鎖（ｍｙｏｓｉｎ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ又はＭＬＣ）及び／又はミオシン重鎖（ｍｙｏｓｉｎ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ又はＭＨＣ）を発現していることが好ましく、ＤＭＳＯ存在下で作製された心筋芽細胞とは異なる各遺伝子の相対的発現プロファイルを有する。核内転写因子Ｎｋｘ２．５及びＩｓｌｅｔ−１は、幹細胞から心筋前駆細胞又は心筋系細胞へ分化誘導する際の重要な転写因子であると考えられている。そのＮｋｘ２．５及びＩｓｌｅｔ−１の下流にＧＡＴＡ−４が位置し、ＧＡＴＡ−４の活性化により心筋構成タンパク質の転写が誘導されることが知られている。また、本発明の心筋指向性細胞は、完全に分化した拍動心筋細胞ではない。心筋指向性細胞が由来する動物種は特に限定されず、例えばヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、サル、ブタ等を含む哺乳類であり、より好ましくはヒトである。心筋指向性細胞を用いた治療を行う場合は、治療されるべき被験体と同種のものが好ましい。
本明細書において「心筋指向性細胞を含む細胞集団」とは、少なくとも前記心筋指向性細胞を含む細胞の集まりをいい、前記脂肪組織由来多系統前駆細胞や、夾雑物として赤血球、血管内皮細胞、繊維芽細胞等のその他の細胞を含んでもよい。かかる細胞集団には、好ましくは、全細胞中、心筋指向性細胞が少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％含まれる。心筋指向性細胞の割合は、当業者に公知の方法、例えば、定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて心筋指向性細胞マーカー遺伝子であるＮｋｘ２．５、さらにＩｓｌｅｔ−１、ＧＡＴＡ−４、α−ＣＡ、心筋トロポニンＩ、ＭＬＣ及び／又はＭＨＣの発現レベルを定量することにより決定することができる。
前記脂肪組織由来多系統前駆細胞から前記心筋指向性細胞を得るためには、例えば、脂肪組織由来多系統前駆細胞を平面培養で培養した後、ポリアミン含有培地にて培地交換して、所定時間培養（３７℃、５％ＣＯ２濃度）することにより得られる。あるいは、同様に平面培養した脂肪組織由来多系統前駆細胞を細胞解離剤により剥離して洗浄後、ポリアミンを添加した培地に所定濃度で懸濁し、培養皿に播種して所定時間培養することにより得られる。培養のスケールアップは、所望する目的に応じて、培養皿等を調節することにより適宜実施することができる。
前記脂肪組織由来多系統前駆細胞を前記ポリアミンの存在下で培養する際の培地は、公知の哺乳動物細胞培養用の培地、例えば、変法イーグル培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ウイリアムズＥ培地、ハムのＦ−１０培地、Ｆ−１２培地、ＰＲＭＩ−１６４０培地、  ＭＣＤＢ２０１培地、これらの混合培地等が用いられる。好ましくは、培地の浸透圧を低く調整している培地が用いられる（例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＫｎｏｃｋｏｕｔ−ＤＭＥＭ、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ−ＤＭＥＭ／Ｆ−１２が列挙されるが、これらに限定されない）。血清は、加えても加えなくてもよい。添加する場合は、ＦＢＳ等を加えることができる。また、血清に代わるサプリメントを加えることもできる。サプリメントとしては、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＫｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）、和光純薬工業（株）ＳｔｅｍＳｕｒｅ（登録商標）Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＳＲ）等を加えることができ、その他適宜、非必須アミノ酸、アスコルビン酸、デキサメタゾン、Ｌ−グルタミン、２−メルカプトエタノール、抗生剤、ＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）、ｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）、アクチビン、Ｇ−ＣＳＦ等を加えることができるが、これらに限定されない。培養は、既知の方法に基づいて、浮遊培養又は接着培養にて行うことができる。
前記心筋指向性細胞を含む細胞集団を製造するための、培地中のポリアミン濃度は、心筋指向性細胞で見られる発現プロファイル（例えばＮｋｘ２．５、Ｉｓｌｅｔ−１など）、心筋指向性細胞で高発現であるＮｋｘ２．５、Ｉｓｌｅｔ−１などの遺伝子の発現レベルを指標として、適宜決定することができる。本発明の心筋指向性細胞は、ポリアミン非存在化で培養する場合と比べてＮｋｘ２．５、Ｉｓｌｅｔ−１の発現量が十分に高い状態となれば本発明に利用することができる。
心筋指向性細胞の発現プロファイルの指標となる遺伝子として、例えば、Ｎｋｘ２．５はポリアミン非存在化で培養する場合と比べて３倍以上、好ましくは５倍以上、より好ましくは７倍以上の発現レベルを持つ。心筋指向性細胞の発現プロファイルの指標となる遺伝子として、例えば、Ｉｓｌｅｔ−１はポリアミン非存在化で培養する場合と比べて２．５倍以上、好ましくは５倍以上、より好ましくは７倍以上の発現レベルを持つ。心筋指向性細胞の発現プロファイルの指標となる遺伝子として、例えば、ＧＡＴＡ４および／またはミオシン重鎖は、ポリアミン非存在化で培養する場合では発現が確認されないため、ＧＡＴＡ４および／またはミオシン重鎖は発現が定性的に確認されれば良い。心筋指向性細胞の発現プロファイルの指標となる遺伝子として、例えば、心筋α−アクチンはポリアミン非存在化で培養する場合と比べて２倍以上、好ましくは３倍以上、より好ましくは５倍以上の発現レベルを持ち、心筋トロポニンはポリアミン非存在化で培養する場合と比べて３倍以上、好ましくは４倍以上、より好ましくは５倍以上の発現レベルを持つ。心筋指向性細胞であるかを判定する際に選択される発現プロファイルの遺伝子は、好ましくはＩｓｌｅｔ−１、Ｎｋｘ２．５、ＧＡＴＡ４、心筋α−アクチン、心筋トロポニンおよびミオシン重鎖から選択される１種以上の遺伝子であり、より好ましくはＩｓｌｅｔ−１、Ｎｋｘ２．５、ＧＡＴＡ４およびミオシン重鎖から選択される１種以上の遺伝子であり、より好ましくはＮｋｘ２．５である。
上記の心筋指向性細胞を含む細胞集団を製造する方法として、培地中に加えるポリアミン濃度は、例えば、２５〜５００μＭ又は５０〜２５０μＭであり、好ましくは７０〜２３０μＭであり、より好ましくは８０〜２２０μＭである。また、上記式（Ｉ）の化合物の場合では、例えば、５μＭ〜１ｍＭ、２５〜５００μＭ又は５０〜２５０μＭであり、好ましくは７０〜２３０μＭであり、より好ましくは８０〜２２０μＭである。スペルミンの場合では、通常５０〜２５０μＭであり、好ましくは７０〜１５０μＭであり、より好ましくは８０〜１２０μＭである。スペルミジンの場合では、通常８０〜２５０μＭであり、好ましくは１００〜２３０μＭであり、より好ましくは１５０〜２２０μＭである。
十分な数の心筋指向性細胞を得るためには、ポリアミン添加後、通常１〜５日間、好ましくは１〜４日間、より好ましくは１〜３日間培養することが望ましい。
前記心筋指向性細胞を含む細胞集団を製造するためには、培地中にポリアミン以外の成分を加えてもよく、例えば、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ等の成長因子を加えることができる。
本発明の心筋指向性細胞を含む細胞集団の製造方法では、脂肪組織由来多系統前駆細胞をポリアミン存在下で培養し、該細胞集団を回収した後、ポリアミンを除去するために洗浄工程を含むことができる。洗浄には、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液等を用いることができる。
＜心筋指向性細胞を含む細胞製剤＞
本明細書において「心筋指向性細胞を含む細胞集団を含む細胞製剤」とは、少なくとも前記心筋指向性細胞を含む細胞集団を含む製剤である。心筋指向性細胞を含む細胞集団は、各細胞が浮遊した状態、凝集して細胞塊となった状態、または双方が混在した状態でもよい。心筋指向性細胞を含む細胞集団は、通常、薬学的に許容される希釈用担体、例えば、生理食塩水、緩衝液等に懸濁される。当該細胞集団は、必要に応じてアルブミン等のタンパク質や薬理活性成分等の添加剤を加えて、任意にバイアル、バッグ、シリンジ等の容器に入れて細胞製剤とすることができる。１バイアル当たり又は１用量当たりの心筋指向性細胞を含む細胞集団の細胞数は、例えば１×１０５〜１×１０９個に調整することができる。また、この細胞集団を濃縮して用いて細胞製剤としてもよい。希釈用担体やタンパク質、添加剤は、この細胞製剤に含まれる細胞集団に適合するように適宜選択することができる。細胞製剤には、さらにＤＭＳＯ等の保護剤を加え、凍結して細胞製剤とすることもできる。
前記細胞製剤は、心疾患治療のために使用しうる。心疾患の例は、下記の＜心筋指向性細胞の投与による心疾患の治療方法＞の項に記載されている。
＜心筋指向性細胞を含む細胞集団を含む細胞シート＞
本明細書において「心筋指向性細胞を含む細胞集団を含む細胞シート」とは、少なくとも前記心筋指向性細胞を含む、細胞が互いに連結又は接着してシート状になったものをいう。細胞シートは、１つの細胞層から構成されても、２以上の細胞層から構成されてもよい。シートの心筋指向性細胞以外の構成成分としては、例えば、脂肪組織由来多系統前駆細胞、心筋細胞、細胞用スキャホールド、血管内皮、細胞外マトリックス等が挙げられる。シートの大きさ及び厚さは、適用される傷害領域の大きさ等種々の条件に応じて適宜選択することができる。
シートに含まれる心筋指向性細胞の割合は、特に限定されず、例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％である。心筋指向性細胞の割合は、当業者に公知の方法、例えば、定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて心筋指向性細胞マーカー遺伝子であるＮｋｘ２．５、さらにＩｓｌｅｔ−１、ＧＡＴＡ−４、α−ＣＡ、心筋トロポニンＩ、ＭＬＣ及び／又はＭＨＣを定量することにより決定することができる。
本発明の細胞シートの機能は、公知の方法、例えば、シートを被験体に移植して、移植された被験体の心機能を心エコーにより、あるいは拡張末期径（ＬＶＤｄ）、収縮末期径（ＬＶＤｓ）、左室駆出率（％ＥＦ）又は左室内径短縮率（％ＦＳ）等を計測することにより評価することができる。
本発明の細胞シートの製造方法は、（１）前記方法によって心筋指向性細胞を含む細胞集団を製造する工程、及び（２）該細胞集団を培養して細胞シートを形成する工程を含む。例えば、平面培養した脂肪組織由来多系統前駆細胞を、ポリアミン含有培地にて培地交換し、所定時間後に細胞層を剥離することにより得られる。あるいは、心筋指向性細胞を含む細胞集団を培養皿に付着した状態で増殖させて細胞層を形成させ、必要に応じて、該細胞層の上に該細胞集団を播種し同様に培養して新たな細胞層を形成し、必要に応じて、この操作を繰り返し、次に、形成された細胞層を剥離することにより細胞シートが製造される。用いられる心筋指向性細胞の数及び培養時間は、得られるシートの大きさ、シートに含まれる心筋指向性細胞の数等種々の条件に応じて適宜選択することができる。具体的には、３５ｍｍ培養皿に対し、心筋指向性細胞を含む細胞集団１×１０５〜５×１０７個を２４〜１２０時間培養することにより、細胞シートを得ることができる。培養する際は、培養皿の大きさに対し、面積比で細胞数を調整することができる。培養皿は、例えば１００ｍｍの大きさのものも使用できる。細胞層の剥離は、好ましくは、温度感受性培養皿を用いて培養し、例えば、２０℃以下でインキュベーションすることにより行うことができる。
＜心筋指向性細胞の投与による心疾患の治療方法＞
本発明によれば、心筋指向性細胞を含む細胞集団又は細胞製剤を被験体に投与することにより、心疾患を治療することができる。あるいは、前記細胞シートを被験体の心臓の障害部位に移植することによって心疾患を治療することができる。
本明細書において「被験体」とは、本発明の方法により治療されるべき対象をいい、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、サル、ブタ等の哺乳類を挙げることができる。好ましくはヒトである。
本明細書において「心疾患」とは、心臓における疾患をいい、例えば、心筋梗塞及び狭心症等の虚血性心疾患、並びにその末期症状である虚血性心筋症、あるいは拡張型心筋症等の心不全をいう。また、本発明の心疾患の治療方法では、該方法を先天性心疾患の手術後の心筋治療や、左室形成術の併用手技として用いてもよい。
投与方法としては、本発明の細胞製剤を心臓に到達させることができる方法であれば限定されない。例えば、静脈内投与、動脈内投与、心筋内投与等が挙げられる。具体的には、患者の疾患部位に注射針を通して直接細胞製剤を送達することができる。また、冠動脈にカテーテルを通して細胞製剤を投与することもできる。この場合、細胞は、冠動脈とつながる心血管に送達され、その血管内から心筋内へと浸潤することにより心筋へと運ばれ、分化生着するものと考えられる。
一回に投与する細胞集団の数は、心筋指向性細胞が心筋細胞へ分化生着するのに十分な数であれば特に限定されず、例えば、１×１０４〜１×１０９個／体重ｋｇ、好ましくは１×１０５〜１×１０７個／体重ｋｇ、より好ましくは１×１０５〜１×１０６個／体重ｋｇである。また、細胞製剤中の細胞濃度は、通常１×１０４〜１×１０７個／ｍＬ、好ましくは１×１０５〜５×１０６個／ｍＬ、より好ましくは３×１０５〜３×１０６個／ｍＬである。投与は、被験体の状態や疾患の重篤度等に応じて、複数回行ってもよい。
本発明の細胞シートを移植する場合は、例えば、心筋梗塞、狭心症等で虚血性の障害を受けた心筋組織の障害部位に直接貼付するか、貼付後に縫合、挿入等を行うことができる。
本発明の細胞集団は、脂肪組織由来多系統前駆細胞が自己由来細胞又は他家細胞から作製されうるが、後述の実施例７に示されるように、他家細胞で作製された細胞集団、又は該細胞集団を含んでなる細胞製剤は、被験体において、免疫抑制剤の投与なしでも拒絶反応などの副作用を示さないまま自己由来細胞で作製したものと同等又はそれ以上の心機能改善効果を示す。本発明の細胞集団又は細胞製剤を前記他家細胞から作製した場合、投与対象の患者由来の細胞に依存せずに該細胞集団又は該細胞製剤を製造することができるため、生産及び保管の面で有利となるだろう。
このため、本発明の治療法においては、被験体に対する免疫抑制のためのステップを不要としうる。このような免疫抑制には、通常、免疫抑制剤の投与を含むが、本発明の治療法では、免疫抑制剤の投与が必須ではなく、必要になったときに使用すればよい。
＜キット又はパッケージ＞
本発明はさらに、被験体への投与に際して免疫抑制のステップを含まないことが記載された使用説明書とともに、前記の細胞製剤を含むキット又はパッケージを提供する。
キット及びパッケージはいずれも、心疾患治療のための用途を有する。このような形態とすることにより、医療従事者は、安全にかつ簡便に、本発明の細胞製剤を取り扱うことが可能になる。細胞製剤は、上記のとおり、衛生管理された場所で、シリンジ、バイアル、バッグ等の滅菌容器に、前記の治療有効量の細胞集団を仕込むことにより製造される。
使用説明書には、細胞製剤の取り扱い方、注意事項などが記載されている他に、被験体への投与に際して免疫抑制のステップを含まない旨の記載が追加される。
【実施例】
【０００７】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
［試験方法］
＜脂肪組織由来多系統前駆細胞（Ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｍｕｌｔｉ−ｌｉｎｅａｇｅ／Ｍｕｌｔｉ−ｐｏｔｅｎｔ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌｓ：ＡＤＭＰＣ）の調製＞
インフォームドコンセントを受けた被験体から、皮下組織より吸引手術により脂肪組織の提供をうけた。ステロイド剤又はＴＺＤの投与を受けている被験体はいなかった。脂肪組織を細切し、次に、０．０６７％コラゲナーゼ（Ｒｏｃｈｅａｐｐｌｉｅｄ  ｓｃｉｅｎｃｅ社）含有ハンクス緩衝塩類溶液（ＨＢＳＳ）中、３７℃のウォーターバスにて振盪しながら１時間消化した。消化産物をＣｅｌｌＳｔｒａｉｎｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）で濾過し、８００ｇにて１０分間遠心した。Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ｄ＝１．０７７）（Ｎｙｃｏｍｅｄ社）を用い、比重法により赤血球を除去し、得られたＳｔｒｏｍａｌ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｆｒａｃｔｉｏｎを１０％ウシ胎児血清（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を含むＤＭＥＭ中に細胞を播種した。２４時間培養して細胞を付着させ、洗浄後、ＥＤＴＡで処理して、ＡＤＭＰＣを得た。次に、ＡＤＭＰＣを、培地Ｉ：６０％  ＤＭＥＭ−低グルコース、４０％ＭＣＤＢ２０１、１０μｇ／ｍＬ  ＥＧＦ、１ｎＭデキサメサゾン、１００μＭアスコルビン酸、及び５％ＦＢＳ中、密度１０，０００細胞／ｃｍ２にてヒトフィブロネクチンコートディッシュに播種し、３から５継代し、実験に用いた。
＜リアルタイムＰＣＲによる各種マーカーの発現解析＞
得られた細胞から、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて製造元の推奨プロトコールに従い、トータルＲＮＡを単離した。トータルＲＮＡ５００ｎｇをＤＮａｓｅ処理し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素ＲＮａｓｅ  Ｈ（−）（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、ｃＤＮＡを合成した。
続いて、作成したｃＤＮＡ９μｌに、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）１０μｌ及びＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）１μｌを添加した。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｙｏｓｙｔｅｍｓ  ７９００  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステムにて次の条件でリアルタイムＰＣＲを行った：９５℃で１０分間変性、９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間を４０サイクル。Ｉｓｌｅｔ−１、Ｎｋｘ２．５、ＧＡＴＡ−４、α−ＣＡ、心筋トロポニンＩ、ＭＬＣ、ＭＨＣ及びＧＡＰＤＨについて用いたＴａｑＭａｎプローブ及びアッセイＩＤ（ＧｅｎＢａｎｋ／ＮＣＢＩ（米国）から入手可能）を以下の表１に示す。
【表１】
0005940147.tif 000004
＜細胞移植後の心筋組織の解析＞
本発明の細胞製剤を投与して１２週間後にブタを犠牲死させて、心臓を摘出した。摘出した心臓を４％パラホルムアルデヒド液で固定した後、７０％エタノールに置換した。固定した心臓を数ミリ幅に切り出し、パラフィンで固めてブロックを作製した。得られたパラフィンブロックを、ミクロトームを用いて２μｍに薄切し、スライドガラスに張り付け、乾燥させた。得られた薄切片について免疫組織染色を以下の通り行った。
［実施例１］スペルミンによる心筋指向性細胞マーカー発現誘導解析
スペルミンによるＡＤＭＰＣから心筋指向性細胞への分化誘導について調べるため、スペルミン処理後の細胞集団の心筋指向核内転写因子（ｉｓｌｅｔ−１（ｉｓｌ−１又はｉｓｌ１ともいう）、ｎｋｘ２．５、ＧＡＴＡ−４）及び心筋構成タンパク（α−ＣＡ、心筋トロポニンＩ、ミオシン重鎖、ミオシン軽鎖）の発現量を測定した。
平面培養にて４回継代したＡＤＭＰＣをＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、以下同様）にて剥離し洗浄後、０、５、２５、５０、１００、２００、５００μＭ又は１ｍＭのスペルミン（和光純薬（日本）、以下同様）及び２０％ＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ；Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、以下同様）を添加したＫｎｏｃｋｏｕｔ−ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、以下同様）に、１×１０５／ｍＬの濃度で懸濁し、低接着性培養皿であるＥＺ−Ｓｐｈｅｒｅ（径１０ｃｍ、ＡＧＣ社、以下同様）に１０ｍＬ播種し、浮遊培養を行った。２４時間後、細胞を回収し、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲにて定量的発現解析を実施し、ＧＡＰＤＨ比を算出した。
結果は、ｉｓｌ−１、ｎｋｘ２．５、ＧＡＴＡ−４及びα−ＣＡ、心筋トロポニンＩ、ＭＨＣのいずれも発現が確認された。特に、スペルミンを１００μＭ添加した場合、いずれのマーカーも発現量が最も高かった。これらの結果から、ＡＤＭＰＣはスペルミンにより心筋指向性細胞へと分化誘導されることが示された。
［実施例２］スペルミジンによる心筋指向性細胞マーカー発現誘導解析
実験は、スペルミンの代わりにスペルミジン（和光純薬（日本））を０、５、２５、５０、１００、２００、５００μＭ又は１ｍＭ添加し、心筋指向核内転写因子（ｉｓｌ１、ｎｋｘ２．５、ＧＡＴＡ−４）について発現量解析を行った以外は、実施例１と同様に行った。
結果は、ｉｓｌ−１、ｎｋｘ２．５、ＧＡＴＡ−４のいずれも発現が確認された。特に、スペルミジンを２００μＭ添加した場合、いずれのマーカーも発現量が最も高かった。これらの結果から、ＡＤＭＰＣはスペルミジンにより心筋指向性細胞へと分化誘導されることが示された。
［実施例３］各種マーカー発現量の培養時間依存性及び成長因子による影響
スペルミン１００μＭによるＡＤＭＰＣから心筋指向性細胞への分化誘導について、浮遊培養時間及び成長因子（ＥＧＦ（ペプロテック社）及びｂＦＧＦ（ペプロテック社））の影響を検討した。
心筋指向性細胞への分化誘導は、心筋指向核内転写因子（ｉｓｌ−１、ｎｋｘ２．５、ＧＡＴＡ−４）及び心筋構成タンパク（α−ＣＡ、心筋トロポニンＩ、ＭＨＣ、ＭＬＣ）の発現量のＧＡＰＤＨ比率を、浮遊培養開始前のＡＤＭＰＣを対照としてその比率を調べた。但し、ＧＡＴＡ−４及びＭＨＣについては、対照で発現を認めないことからＧＡＰＤＨ比で示した。
実施例１と同様に、培養皿に細胞を播種し、２４、７２、１２０時間後、細胞を回収し、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲにて定量的発現解析を行った。
結果を図１に示す。ｉｓｌ−１、ｎｋｘ２．５、ＧＡＴＡ−４及びα−ＣＡ、心筋トロポニンＩ、ＭＨＣ、ＭＬＣのいずれにおいても、２４時間から１２０時間で発現が確認され、心筋指向性細胞へと分化誘導されることが示された。また、成長因子の有無は、発現量に大きく影響しなかった。
［実施例４］スペルミンとＤＭＳＯによる各種マーカー発現誘導の比較試験
実施例１と同様に、ＤＭＳＯ（ナカライテスク（日本））（培地中０．１％添加）を４８時間処理し、また、スペルミン１００μＭを２４、７２、１２０時間処理して各種マーカーの発現量を解析した。
結果を、表２〜８と図２Ａ〜Ｇに示す。いずれのマーカーにおいても、ＤＭＳＯ処理の場合と比べ、数倍〜数百倍の発現量の増強が確認された。これらの結果より、ＤＭＳＯを用いる場合と比べスペルミンを用いる場合の方が、より心筋指向性細胞に分化誘導されることが示された。
【表２】
0005940147.tif 000005
【表３】
0005940147.tif 000006
【表４】
0005940147.tif 000007
【表５】
0005940147.tif 000008
【表６】
0005940147.tif 000009
0005940147.tif 000010
【表７】
0005940147.tif 000011
【表８】
0005940147.tif 000012
［実施例５］細胞製剤投与後の心筋組織の解析
２段階塞栓・再還流法にて８週齢のブタを用いて重症心筋梗塞モデルを作製した。具体的には、大腿動脈から経皮経管的に６Ｆのガイドカテーテルを左冠動脈入口部にかけ、そこからガイドワイヤーを第１対角枝（ＡＨＡ分類の＃９）に挿入し、ガイド下にてバルーニング（閉塞再開通）でプレコンディショニングを行った。１週間後、ガイドワイヤーを左冠動脈前下降枝（ＡＨＡ分類の＃６〜＃８）に挿入し、左冠動脈回旋枝分岐部直下の左前下降枝（ＡＨＡ分類の＃６）にてバルーニング（閉塞再開通）を行い、心筋虚血流域を得た。その４週間後（最初の閉塞再開通からは５週間後）に心臓超音波検査にて心駆出率が３５％以下の個体を重症心不全モデルとして試験に供することとした。
２回目の塞栓・再還流から４週間後に、スペルミン１００μＭで処理した細胞（２４時間培養）を１×１０５個／体重ｋｇ、３×１０５個／体重ｋｇ、１×１０６個／体重ｋｇ、３×１０６個／体重ｋｇ、カテーテルにて経冠動脈に投与した。投与直前、投与後１カ月、２か月、３カ月にて心臓超音波（エコー）にて、左心駆出率（％ＥＦ）を計測し（図３Ａ）、投与直前値との差をΔＥＦ（％）として調べた（図３Ｂ）。なお、免疫抑制化のため、細胞投与５日前より犠牲死させるまで連日シクロスポリンの筋肉注射を行った。
図３の通り、対照では左心駆出率が経時的に減少したのに対して、スペルミン処理した細胞を投与したいずれの場合でも、左心駆出率が改善した。
また、投与後１２週間後の心筋組織切片を、ヒト由来のα−ＣＡ抗体（上図）及びアクチニン抗体（下図）により免疫染色した蛍光像を図４に示す。結果より、梗塞後のｓｃａｒ内でも心筋細胞に分化生着したことが明らかとなった。
さらに、これらの投与実験を、実施例４に記載されるＤＭＳＯ処理した細胞でも同様に行ったところ、ＤＭＳＯ処理した細胞に比べ、スペルミン処理した細胞では、分化生着する心筋細胞の割合について再現性が有意に高かった。
［実施例６］細胞製剤の頻回投与後の解析
実施例５と同様にして作製された重症心不全モデルとなる慢性心筋梗塞ブタに対し、頻回投与の効果検討を行った。慢性心筋梗塞ブタへの経冠動脈的投与を２週間後にも行った（２回投与）。さらに、初回投与から２週間後、４週間後それぞれにおいて経冠動脈的投与を行った（３回投与）。初回投与から一か月、二か月、三か月後のそれぞれで心駆出率（ＥＦ）を実施例５と同様に算出した（図５）。
上記の頻回投与有効性蓄積試験の結果、心駆出率の差分（ΔＥＦ）が１０％と５％以上であり、複数回投与における有効性蓄積が確認された。
［実施例７］ブタ同種・自己由来細胞と他家細胞の比較試験
実施例５と同様にして作製された重症心不全モデルとなる慢性心筋梗塞ブタに対し、実施例５と同じ投与方法と心駆出率を算出方法によって、自己由来細胞で作製された心筋指向性細胞を含む細胞製剤（図６中：ａｕｔｏ）と、他家細胞で作製された心筋指向性細胞を含む細胞製剤（図６中：ａｌｌｏ）の有効性を、対照（細胞製剤の投与なし）と比較した。他家細胞で作製された心筋指向性細胞を含む細胞製剤を投与した群においては免疫抑制剤を投与せず、自己由来細胞の場合と条件を同一にした。
その結果、驚くべきことに免疫抑制剤を投与せずとも投与群において特筆すべき副作用もなく、自己由来細胞と同等以上の心駆出率が確認された。
【産業上の利用可能性】
【０００８】
本発明によれば、心筋組織環境下で心筋細胞として分化生着する心筋指向性細胞を含む細胞集団が提供される。この心筋指向性細胞は、ＤＭＳＯ又はＯＰ９培養上清の存在下で培養して分化誘導した従来の心筋芽細胞と比べて、心筋系細胞のマーカーである核内転写因子Ｎｋｘ２．５、Ｉｓｌｅｔ−１（Ｉｓｌ−１ともいう）、ＧＡＴＡ−４、心筋構成タンパク質である、心筋α−アクチン（α−ＣＡ）、心筋トロポニンＩ、ミオシン軽鎖（ＭＬＣ）、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）の発現レベルが高く、また、分化生着能がより優れている。さらに、本発明の細胞集団は、例えば冠動脈に注入することにより、虚血性心筋症等の心不全の治療に有効に用いることができる。さらに、他家細胞で作製された本発明の細胞集団又は細胞製剤は、免疫抑制剤なしでも副作用を示さないまま自己由来細胞で作製したものと同等以上である。他家細胞で作製した場合、投与対象の患者由来の細胞に依存せずに細胞集団又は細胞製剤を製造することができるため、工業生産に向いた細胞製剤を提供することができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１Ａ】
0005940147.tif 000014
【図１Ｂ】
0005940147.tif 000015
【図１Ｃ】
0005940147.tif 000016
【図１Ｄ】
0005940147.tif 000017
【図１Ｅ】
0005940147.tif 000018
【図１Ｆ】
0005940147.tif 000019
【図１Ｇ】
0005940147.tif 000020
【図２Ａ】
0005940147.tif 000021
【図２Ｂ】
0005940147.tif 000022
【図２Ｃ】
0005940147.tif 000023
【図２Ｄ】
0005940147.tif 000024
【図２Ｅ】
0005940147.tif 000025
【図２Ｆ】
0005940147.tif 000026
【図２Ｇ】
0005940147.tif 000027
【図３】
0005940147.tif 000028
【図５】
0005940147.tif 000029
【図６】
0005940147.tif 000030
【図４】
0005940147.tif 000031