(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するグリコシドハイドロラーゼのアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の表１（ｉ）記載の位置又はこれらに相当する位置におけるアミノ酸残基からなる群より選ばれる１以上のアミノ酸残基が、当該表１（ｉｉ）記載のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなり、かつ液体洗剤に対する溶解性が向上した、変異グリコシドハイドロラーゼ。
【表１】
0005977029.tif 000020
【請求項２】
配列番号２で示されるアミノ酸配列の９３位に相当する位置におけるアミノ酸残基がグルタミン酸であり、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列の１５４位に相当する位置におけるアミノ酸残基がアスパラギン酸である、請求項１記載の変異グリコシドハイドロラーゼ。
【請求項３】
配列番号２で示されるアミノ酸配列の表２（ｉ）記載の位置に相当する位置におけるアミノ酸残基が、当該表２（ｉｉ）記載のアミノ酸残基である、請求項２記載の変異グリコシドハイドロラーゼ。
【表２】
0005977029.tif 000021
【請求項４】
前記１以上のアミノ酸残基が、（Ｇ）１４４位、（Ｌ）２５９位、（Ｑ）３２７位、（Ｒ）３２９位、（Ｔ）３４２位、（Ｖ）３４８位、（Ｗ）３６７位、（Ｘ）３７０位及び（Ｙ）３８１位又はこれらに相当する位置におけるアミノ酸残基からなる群より選ばれる１以上のアミノ酸残基を含む、請求項１〜３のいずれか１項記載の変異グリコシドハイドロラーゼ。
【請求項５】
前記１以上のアミノ酸残基が、（Ｇ）１４４位、（Ｌ）２５９位、（Ｑ）３２７位、（Ｒ）３２９位、（Ｔ）３４２位、（Ｖ）３４８位、（Ｗ）３６７位、（Ｘ）３７０位及び（Ｙ）３８１位、又はこれらに相当する位置におけるアミノ酸残基からなる群より選ばれる２以上のアミノ酸残基を含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の変異グリコシドハイドロラーゼ。
【請求項６】
前記（Ｇ）１４４位、（Ｌ）２５９位、（Ｑ）３２７位、（Ｒ）３２９位、（Ｔ）３４２位、（Ｖ）３４８位、（Ｗ）３６７位、（Ｘ）３７０位及び（Ｙ）３８１位、又はこれらに相当する位置におけるアミノ酸残基からなる群より選ばれる１以上のアミノ酸残基が、下記アミノ酸残基に置換されている、請求項１〜５のいずれか１項記載の変異グリコシドハイドロラーゼ。
（Ｇ）１４４位又はこれに相当する位置：イソロイシン
（Ｌ）２５９位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（Ｑ）３２７位又はこれに相当する位置：トリプトファン
（Ｒ）３２９位又はこれに相当する位置：トリプトファン
（Ｔ）３４２位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（Ｖ）３４８位又はこれに相当する位置：イソロイシン
（Ｗ）３６７位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（Ｘ）３７０位又はこれに相当する位置：イソロイシン
（Ｙ）３８１位又はこれに相当する位置：チロシン
【請求項７】
セルラーゼ活性、リケナーゼ活性又はキシラナーゼ活性のいずれか１以上を有する、請求項１〜６のいずれか１項記載の変異グリコシドハイドロラーゼ。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項記載の変異グリコシドハイドロラーゼをコードする遺伝子。
【請求項９】
請求項８記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項１０】
請求項９記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項１１】
請求項１０記載の形質転換体を用いる変異グリコシドハイドロラーゼの製造方法。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか１項記載の変異グリコシドハイドロラーゼを含有する液体洗剤組成物。
【請求項１３】
配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するグリコシドハイドロラーゼのアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の表３（ｉ）記載の位置又はこれらに相当する位置におけるアミノ酸残基からなる群より選ばれる１以上のアミノ酸残基を、当該表３（ｉｉ）記載のアミノ酸残基に置換する工程を含む、グリコシドハイドロラーゼの液体洗剤への溶解性を向上させる方法。
【表３】
0005977029.tif 000022
【請求項１４】
前記配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するグリコシドハイドロラーゼのアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の９３位に相当する位置のアミノ酸残基がグルタミン酸であり、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列の１５４位に相当する位置のアミノ酸残基がアスパラギン酸である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するグリコシドハイドロラーゼのアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の表４（ｉ）記載の位置に相当する位置のアミノ酸残基が、当該表４（ｉｉ）記載のアミノ酸残基である、請求項１４記載の方法。
【表４】
0005977029.tif 000023
【請求項１６】
前記１以上のアミノ酸残基が、（Ｇ）１４４位、（Ｌ）２５９位、（Ｑ）３２７位、（Ｒ）３２９位、（Ｔ）３４２位、（Ｖ）３４８位、（Ｗ）３６７位、（Ｘ）３７０位及び（Ｙ）３８１位又はこれらに相当する位置におけるアミノ酸残基からなる群より選ばれる１以上のアミノ酸残基を含む、請求項１３〜１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
前記１以上のアミノ酸残基が、（Ｇ）１４４位、（Ｌ）２５９位、（Ｑ）３２７位、（Ｒ）３２９位、（Ｔ）３４２位、（Ｖ）３４８位、（Ｗ）３６７位、（Ｘ）３７０位及び（Ｙ）３８１位、又はこれらに相当する位置におけるアミノ酸残基からなる群より選ばれる２以上のアミノ酸残基を含む、請求項１３〜１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
前記（Ｇ）１４４位、（Ｌ）２５９位、（Ｑ）３２７位、（Ｒ）３２９位、（Ｔ）３４２位、（Ｖ）３４８位、（Ｗ）３６７位、（Ｘ）３７０位及び（Ｙ）３８１位、又はこれらに相当する位置におけるアミノ酸残基からなる群より選ばれる１以上のアミノ酸残基が、下記アミノ酸残基に置換される、請求項１３〜１７のいずれか１項記載の方法。
（Ｇ）１４４位又はこれに相当する位置：イソロイシン
（Ｌ）２５９位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（Ｑ）３２７位又はこれに相当する位置：トリプトファン
（Ｒ）３２９位又はこれに相当する位置：トリプトファン
（Ｔ）３４２位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（Ｖ）３４８位又はこれに相当する位置：イソロイシン
（Ｗ）３６７位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（Ｘ）３７０位又はこれに相当する位置：イソロイシン
（Ｙ）３８１位又はこれに相当する位置：チロシン
【請求項１９】
前記グリコシドハイドロラーゼが、セルラーゼ活性、リケナーゼ活性又はキシラナーゼ活性のいずれか１以上を有する、請求項１３〜１８のいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
前記液体洗剤が界面活性剤４０〜９０質量％を含有する濃縮液体洗剤である、請求項１３〜１９のいずれか１項記載の方法。
【請求項２１】
前記液体洗剤が界面活性剤４０〜９０質量％を含有する濃縮液体洗剤である、請求項１〜７のいずれか１項記載の変異グリコシドハイドロラーゼ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異グリコシドハイドロラーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、クチナーゼ、リケナーゼ等の複数の酵素を洗浄補助剤として洗剤に配合することは以前から検討又は実施されている。グリコシドハイドロラーゼの一つであるセルラーゼは、木綿単繊維の非晶質領域に作用し、単繊維内の皮脂汚れ等を効果的に除去するため、衣料用洗剤に配合するのに適している。
【０００３】
衣料用洗剤等の洗剤用酵素として優れた効果を発揮する酵素として、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＫＳＭ−Ｎ２５７株由来のアルカリセルラーゼが開発され、特許出願されている（特許文献１及び２）。
上記ＫＳＭ−Ｎ２５７株由来のアルカリセルラーゼは、グリコシドハイドロラーゼのファミリー８（ＧＨファミリー８）に属する酵素である。当該ファミリーのグルコシドハイドロラーゼは、β−１，４グルカン、キシラン、キトサン、リケナン等のβ−１，４結合を切断することを特徴とする一群の酵素群である。上記ＫＳＭ−Ｎ２５７株由来の酵素も、カルボキシメチルセルロースや結晶性セルロース等のセルロース分解活性以外にリケナン分解活性も有する、グリコシドハイドロラーゼである。
当該ＫＳＭ−Ｎ２５７株由来の酵素（以下、Ｎ２５７グリコシドハイドロラーゼ）については、同じＧＨファミリー８に属するセルラーゼであるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ由来のセルラーゼ（非特許文献１）やＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＫＳＭ−３３０株由来のセルラーゼ（非特許文献２）とのアミノ酸配列の比較や、酵素タンパク質結晶のＸ線解析により、触媒部位のアミノ酸及び保存アミノ酸の解析が行われている（非特許文献３）。
【０００４】
洗剤はその形態により、粉末洗剤と液体洗剤に分類することが出来る。液体洗剤は、粉末洗剤に比べて溶解性に優れ、また、汚れ部分に原液を直接塗布出来るメリットもある。さらに最近では、使用量が従来の液体洗剤の半分程度でよい液体洗剤（いわゆる、濃縮液体洗剤）も市販されている。濃縮液体洗剤は、容器が小さく収納に場所をとらないことや、洗濯時間を短縮し、水の使用量を節約できるという利点も有している。
【０００５】
液体洗剤が常に一定の洗浄活性を発揮するためには、液体洗剤に配合された酵素が活性を維持し、且つ液体洗剤中において均一状態で安定に存在する必要がある。そして、洗剤の酵素洗浄力を高めるためには、洗剤に酵素をできるだけ多く配合することが望ましい。
しかし、液体洗剤への酵素の安定的な配合に関しては、技術的な困難さがあることが広く知られている。元来、液体中で常温保存すること自体がタンパク質の変性を招きやすい上に、液体洗剤には界面活性剤、脂肪酸、溶剤等が含有され、ｐＨも弱アルカリ性であり、酵素にとって極めて厳しい条件になっている。また、タンパク質である酵素は、同じく洗剤中に配合されたプロテアーゼにより消化される可能性があり、このことが液体洗剤中での安定保存を更に困難なものにしている。さらに、濃縮液体洗剤の場合、従来の液体洗剤と比べて界面活性剤濃度が高く、水分含有量が少ないため、多量の酵素を溶解させることは難しいという問題がある。
【０００６】
液体洗剤中での酵素活性の安定保存のための技術として、カルシウムイオン、ホウ砂、ホウ酸、ホウ素化合物、ギ酸などのカルボン酸、ポリオール等の酵素安定化剤を加えることは公知である。また、プロテアーゼの活性を阻害することにより、自己消化の問題を解決すべく検討もなされており、４−置換フェニルボロン酸や、ある種のペプチドアルデヒド及びホウ素組成物によるプロテアーゼの可逆的阻害による液体洗剤中の酵素の安定化法が報告されている。また、酵素活性自体を洗剤中でより安定的に存在できるように改変することも試みられており、例えば、至適ｐＨが上昇した又は比活性が向上したアルカリセルラーゼ変異体や、界面活性剤又は漂白剤を含むアルカリ水溶液で安定なエンド−β−１，４−グルカナーゼ活性を有する酵素が開発されている。
【０００７】
他方、液体洗剤に対する酵素の溶解性を向上させるための技術は、これまで開発されていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００１−３０９７８１号公報
【特許文献２】特開２００２−８５０７８号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Bueno ら、Nucleic Acids Research, 18, 4248, 1990
【非特許文献２】Ozakiら、J. Gen. Microbiol., 137, 41-48, 1991
【非特許文献３】Hakamadaら、Biochimica et Biophysica Acta, 1570, 174-180, 2002
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、液体洗剤に対する溶解性が向上した変異グリコシドハイドロラーゼを提供することに関する。本発明はまた、当該変異グリコシドハイドロラーゼを含有する液体洗剤組成物を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＫＳＭ−Ｎ２５７株由来のグリコシドハイドロラーゼ（以下、本明細書においてＮ２５７グリコシドハイドロラーゼと称する）のアミノ酸配列上の特定のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することによって、当該酵素の液体洗剤に対する溶解性が向上することを見出した。
【００１２】
すなわち、本発明は、以下の発明に係るものである。
（１）配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するグリコシドハイドロラーゼのアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の表１（ｉ）記載の位置又はこれらに相当する位置におけるアミノ酸残基からなる群より選ばれる１以上のアミノ酸残基が、当該表１（ｉｉ）記載のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなる、変異グリコシドハイドロラーゼ。
【表１】
0005977029.tif 000002
（２）上記同一性が９０％以上である（１）記載の変異グリコシドハイドロラーゼ。
（３）配列番号２で示されるアミノ酸配列の９３位に相当する位置におけるアミノ酸残基がグルタミン酸であり、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列の１５４位に相当する位置におけるアミノ酸残基がアスパラギン酸である、（１）又は（２）記載の変異グリコシドハイドロラーゼ。
（４）配列番号２で示されるアミノ酸配列の表２（ｉ）記載の位置に相当する位置におけるアミノ酸残基が、当該表２（ｉｉ）記載のアミノ酸残基である、（３）記載の変異グリコシドハイドロラーゼ。
【表２】
0005977029.tif 000003
（５）上記１以上のアミノ酸残基が、（Ｇ）１４４位、（Ｌ）２５９位、（Ｑ）３２７位、（Ｒ）３２９位、（Ｔ）３４２位、（Ｖ）３４８位、（Ｗ）３６７位、（Ｘ）３７０位及び（Ｙ）３８１位又はこれらに相当する位置におけるアミノ酸残基からなる群より選ばれる１以上のアミノ酸残基を含む、（１）〜（４）のいずれか１に記載の変異グリコシドハイドロラーゼ。
（６）上記１以上のアミノ酸残基が、（Ｇ）１４４位、（Ｌ）２５９位、（Ｑ）３２７位、（Ｒ）３２９位、（Ｔ）３４２位、（Ｖ）３４８位、（Ｗ）３６７位、（Ｘ）３７０位及び（Ｙ）３８１位、又はこれらに相当する位置におけるアミノ酸残基からなる群より選ばれる２以上のアミノ酸残基を含む、（１）〜（５）のいずれか１に記載の変異グリコシドハイドロラーゼ。
（７）上記（Ｇ）１４４位、（Ｌ）２５９位、（Ｑ）３２７位、（Ｒ）３２９位、（Ｔ）３４２位、（Ｖ）３４８位、（Ｗ）３６７位、（Ｘ）３７０位及び（Ｙ）３８１位、又はこれらに相当する位置におけるアミノ酸残基からなる群より選ばれる１以上のアミノ酸残基が、下記アミノ酸残基に置換されている、（１）〜（６）のいずれか１に記載の変異グリコシドハイドロラーゼ。
（Ｇ）１４４位又はこれに相当する位置：イソロイシン
（Ｌ）２５９位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（Ｑ）３２７位又はこれに相当する位置：トリプトファン
（Ｒ）３２７位又はこれに相当する位置：トリプトファン
（Ｔ）３４２位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（Ｖ）３４８位又はこれに相当する位置：イソロイシン
（Ｗ）３６７位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（Ｘ）３７０位又はこれに相当する位置：イソロイシン
（Ｙ）３８１位又はこれに相当する位置：チロシン
（８）セルラーゼ活性、リケナーゼ活性及びキシラナーゼ活性のいずれか１以上を有する、（１）〜（７）のいずれか１に記載の変異グリコシドハイドロラーゼ。
（９）（１）〜（８）のいずれか１に記載の変異グリコシドハイドロラーゼをコードする遺伝子。
（１０）（９）記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
（１１）（１０）記載の組換えベクターを含む形質転換体。
（１２）（１１）記載の形質転換体を用いる変異グリコシドハイドロラーゼの製造方法。
（１３）（１）〜（８）のいずれか１に記載の変異グリコシドハイドロラーゼを含有する液体洗剤組成物。
（１４）配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するグリコシドハイドロラーゼのアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の表３（ｉ）記載の位置又はこれらに相当する位置におけるアミノ酸残基からなる群より選ばれる１以上のアミノ酸残基を、当該表３（ｉｉ）記載のアミノ酸残基に置換する工程を含む、グリコシドハイドロラーゼの液体洗剤への溶解性を向上させる方法。
【表３】
0005977029.tif 000004
（１５）液体洗剤が界面活性剤４０〜９０質量％を含有する濃縮液体洗剤である、（１４）記載の方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の変異グリコシドハイドロラーゼは、液体洗剤、とりわけ濃縮液体洗剤に対する溶解性が向上しており、これらの洗剤に安定的により多くの量を配合することが可能となる。よって、本発明の変異グリコシドハイドロラーゼを配合した液体洗剤は、従来と比べてより高い酵素活性を有し、高い洗浄力を発揮することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書において、「アミノ酸残基」とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸残基、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＶａｌを意味する。
【００１５】
本明細書において、「（アミノ酸配列間の）同一性」とは、２つのアミノ酸配列を整列（アラインメント）したときに両方の配列において同一のアミノ酸残基が存在する位置の数の全長アミノ酸残基数に対する割合（％）をいう。具体的には、リップマン−パーソン法（Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５，（１９８５））によって計算され、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（Ｖｅｒ．５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ  ｓｉｚｅ  ｔｏ  ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行なうことにより算出できる。
【００１６】
本発明の変異グリコシドハイドロラーゼは、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる親グリコシドハイドロラーゼにおいて、下記表４に示される位置のアミノ酸残基のいずれか１以上が、当該表に示される変異後のアミノ酸残基に置換されたものである。あるいは、本発明の変異グリコシドハイドロラーゼは、配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列の親グリコシドハイドロラーゼにおいて、下記表４に示される位置に相当する位置のアミノ酸残基のいずれか１以上が、当該表に示される変異後のアミノ酸残基に置換されたものである。本発明の変異グリコシドハイドロラーゼは、グリコシドハイドロラーゼ活性を有し、且つ親グリコシドハイドロラーゼと比べて、液体洗剤、好ましくは濃縮液体洗剤に対する溶解性が向上している。
【００１７】
【表４】
0005977029.tif 000005
【００１８】
本明細書における「親グリコシドハイドロラーゼ」とは、アミノ酸残基に所定の変異ががなされて変異グリコシドハイドロラーゼとなるグリコシドハイドロラーゼである。本発明の変異グリコシドハイドロラーゼの親グリコシドハイドロラーゼとしては、配列番号２で示されるアミノ酸配列又はそれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるグリコシドハイドロラーゼが挙げられる。
【００１９】
本明細書における「グリコシドハイドロラーゼ活性」とは、β−１，４グルカン、キシラン、キトサン、リケナン等のβ−１，４結合を切断し得る活性であり、セルラーゼ活性、リケナーゼ活性、及びキシラナーゼ活性を含む。本明細書において、「グリコシドハイドロラーゼ活性」を有する酵素とは、セルラーゼ活性、リケナーゼ活性及びキシラナーゼ活性のいずれか１以上の活性を有する酵素であり得る。
【００２０】
配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる親グリコシドハイドロラーゼとしては、例えば、Ｎ２５７株〔バチルス エスピーＫＳＭ−Ｎ２５７株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７４７３）〕由来のグリコシドハイドロラーゼが挙げられる（特許文献１及び２）。
【００２１】
配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる親グリコシドハイドロラーゼとしては、配列番号２で示されるアミノ酸配列とは異なるが、配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９７％以上、なお好ましくは９８％以上、さらになお好ましくは９９％以上の配列同一性を有するグリコシドハイドロラーゼ、ならびに、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１個〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたグリコシドハイドロラーゼが挙げられる。なお、本明細書において、１個〜数個とは、１〜４０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個を意味する。
【００２２】
配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるＮ２５７株〔バチルス エスピーＫＳＭ−Ｎ２５７株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７４７３）〕由来のグリコシドハイドロラーゼの触媒活性に関与するアミノ酸は、９３位のグルタミン酸及び１５４位のアスパラギン酸であることが確かめられている（非特許文献３）。よって、上記配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる親グリコシドハイドロラーゼにおいて、好ましくは、配列番号２で示されるアミノ酸配列の９３位に相当する位置のアミノ酸残基はグルタミン酸であり、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列の１５４位に相当する位置はアスパラギン酸である。
【００２３】
より好ましくは、上記配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる親グリコシドハイドロラーゼにおいて、配列番号２で示されるアミノ酸配列の下記表５（ｉ）記載の位置に相当する位置のアミノ酸残基は、当該表５（ｉｉ）に記載のアミノ酸残基である。下記表５に示す位置のアミノ酸残基は、Ｎ２５７グリコシドハイドロラーゼとともに、非特許文献３に記載のＧＨファミリー８に属する他の酵素、すなわちＧＨファミリー８に属するバチルス  サーキュランス由来のセルロース分解性キシラナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＡＰ２２９４６、アミノ酸配列同一性９７％）、パエニバチルス  エスピーＹ４１２ＭＣ１０由来のリケナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＹＰ＿００３２４０６３０、アミノ酸配列同一性９６％）、パエニバチルス  エスピーＨＧＦ５由来のｇｌｙｃｏｓｙ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ８ (ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＺＰ＿０８２８３３９７、アミノ酸配列同一性９６％)、パエニバチルス  ボルテックスＶ４５３由来のリケナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＺＰ＿０７８９７９６４、アミノ酸配列同一性９３％）及びパエニバチルス  ラクティス１５４由来のリケナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＺＰ＿０９００２３２４、アミノ酸配列同一性８３％）においても保存されているアミノ酸残基である。
【００２４】
【表５】
0005977029.tif 000006
【００２５】
配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる親グリコシドハイドロラーゼの例としては、バチルス  サーキュランス由来のセルロース分解性キシラナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ. ＡＡＰ２２９４６、アミノ酸配列同一性９７％）、パエニバチルス  エスピーＹ４１２ＭＣ１０由来のリケナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＹＰ＿００３２４０６３０、アミノ酸配列同一性９６％）、パエニバチルス  エスピーＨＧＦ５由来のｇｌｙｃｏｓｙ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ８ (ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＺＰ＿０８２８３３９７、アミノ酸配列同一性９６％)、パエニバチルス  ボルテックスＶ４５３由来のリケナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＺＰ＿０７８９７９６４、アミノ酸配列同一性９３％）及びパエニバチルス  ラクティス１５４由来のリケナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＺＰ＿０９００２３２４、アミノ酸配列同一性８３％）等が挙げられる。
このうち、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる親グリコシドハイドロラーゼが有する次の何れかの酵素学的性質を有するものが、親グリコシドハイドロラーゼとしてより好ましい。１）等電点電気泳動法により測定された等電点が９．３である。２）カルボキシメチルセルロースを液化型で良好に分解する。３）基質特異性：カルボキシメチルセルース、リケナン、結晶性セルロース又はセロトリオース以上のセロオリゴ糖及を分解し、還元糖を生成する。４）最適反応ｐＨ：少なくともｐＨ５〜１０で作用し、最適ｐＨは８．５である。５）最適反応温度：グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）で反応を行った場合、最適反応温度は５５℃である。６）安定ｐＨ範囲：３０℃、６０分間で処理した場合、ｐＨ５〜１１の範囲で安定である。７）耐熱性：トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、１５分間の処理において、５５℃まで安定である。８）分子量：ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による推定分子量は、４３ｋＤａである。
【００２６】
本発明の変異グリコシドハイドロラーゼにおいては、置換されている位置は、好ましくは、配列番号２で示されるアミノ酸配列の１４４位、２５９位、３２７位、３２９位、３４２位、３４８位、３６７位、３７０位及び３８１位、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列における上記位置に相当する位置からなる群より選ばれる位置のいずれか１以上を少なくとも含む。より好ましくは、置換される位置は、少なくとも上記に挙げた位置のいずれか２以上を含む。さらに好ましくは、置換される位置は、少なくとも上記に挙げた位置のいずれか３以上を含む。
【００２７】
上記１４４位、２５９位、３２７位、３２９位、３４２位、３４８位、３６７位、３７０位及び３８１位ならびにそれらに相当する位置の単置換、二重又は多重置換に加えて、さらに表４に示した他の位置のアミノ酸残基が置換されていてもよい。
【００２８】
置換後のアミノ酸残基は、１４４位又はこれに相当する位置についてはイソロイシンが好ましく、２５９位又はこれに相当する位置についてはフェニルアラニンが好ましく、３２７位又はこれに相当する位置についてはトリプトファンが好ましく、３２９位又はこれに相当する位置についてはトリプトファンが好ましく、３４２位又はこれに相当する位置についてはフェニルアラニンが好ましく、３４８位又はこれに相当する位置についてはイソロイシンが好ましく、３６７位又はこれに相当する位置についてはフェニルアラニンが好ましく、３７０位又はこれに相当する位置についてはイソロイシンが好ましく、３８１位又はこれに相当する位置についてはチロシンが好ましい。
【００２９】
本明細書において、「相当する位置のアミノ酸残基」の特定は、公知のアルゴリズムを用いて、目的アミノ酸配列を参照配列（配列番号２で示されるアミノ酸配列）と比較し、各グリコシドハイドロラーゼのアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の相同性を与えるように配列を整列（アラインメント）させることにより行なうことができる。グリコシドハイドロラーゼのアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、アミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、相同アミノ酸残基の各グリコシドハイドロラーゼにおける配列中の位置を決めることが可能である。アラインメントは、例えば、上述のリップマン−パーソン法等に基づいて手作業で行うこともできるが、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ，（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２，ｐ．４６７３−４６８０）をデフォルト設定で用いることにより行うことができる。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＥＢＩ，[ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ]）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ，[ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｗｅｌｃｏｍｅ−ｊ．ｈｔｍｌ]）のウェブサイトから利用することができる。
【００３０】
当業者であれば、上記で得られたアラインメントを、必要に応じて最適なアラインメントとなるようにさらに微調整することできる。そのような最適アラインメントは、アミノ酸配列の類似性や挿入されるギャップの頻度等を考慮して決定するのが好ましい。ここでアミノ酸配列の類似性とは、２つのアミノ酸配列をアラインメントしたときにその両方の配列に同一又は類似のアミノ酸残基が存在する位置の数の全長アミノ酸残基数に対する割合（％）をいう。類似のアミノ酸残基とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸のうち、極性や電荷の点で互いに類似した性質を有しており、いわゆる保存的置換を生じるようなアミノ酸残基を意味する。そのような類似のアミノ酸残基からなるグループは当業者にはよく知られており、例えば、アルギニン及びリジン；グルタミン酸及びアスパラギン酸；セリン及びトレオニン；グルタミン及びアスパラギン；バリン、ロイシン及びイソロイシン等がそれぞれ挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
上述のアラインメントにより参照配列の任意の位置に対応する位置にアラインされた目的アミノ酸配列のアミノ酸残基の位置は、当該任意の位置に「相当する位置」とみなされ、当該アミノ酸残基は「相当する位置のアミノ酸残基」と称される。
【００３２】
すなわち、上記方法を用いることにより、例えば、上述したグリコシドハイドロラーゼであるセルロース分解性キシラナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＰ２２９４６）において、配列番号２における（Ｇ）１４４位、（Ｌ）２５９位、（Ｑ）３２７位、（Ｒ）３２９位、（Ｔ）３４２位、（Ｖ）３４８位、（Ｗ）３６７位、及び（Ｙ）３８１位の各位置に相当する位置は、それぞれ、１４４位のグルタミン残基、２５９位のアスパラギン残基、３２７位のアラニン残基、３２９位のセリン残基、３４２位のアスパラギン残基、３４８位のトレオニン残基、３６７位のセリン残基、及び３８１位のアスパラギン残基というように特定することができる。
【００３３】
Ｎ２５７グリコシドハイドロラーゼ（配列番号２）のアミノ酸配列の（Ｇ）１４４位、（Ｌ）２５９位、（Ｑ）３２７位、（Ｒ）３２９位、（Ｔ）３４２位、（Ｖ）３４８位、（Ｗ）３６７位、（Ｘ）３７０位及び（Ｙ）３８１位に相当する位置及びアミノ酸残基の具体例を、上記で例示したセルロース分解性キシラナーゼを含め、先述したアミノ酸配列において配列番号２と８０％以上の同一性を有するパエニバチルス  エスピーＹ４１２ＭＣ１０由来のリケナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＹＰ＿００３２４０６３０）、パエニバチルス  エスピーＨＧＦ５由来のｇｌｙｃｏｓｙ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ８（ＧｅｎＢａｎｋ：ＺＰ＿０８２８３３９７）、パエニバチルス  ボルテックスＶ４５３由来のリケナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＺＰ＿０７８９７９６４）、及びパエニバチルス  ラクティス１５４由来のリケナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＺＰ＿０９００２３２４）について示す（表６）。
【００３４】
【表６】
0005977029.tif 000007
【００３５】
斯くして特定される「相当する位置」は、アミノ酸配列において高い同一性を有し、且つグリコシドハイドロラーゼであるタンパク質同士の間では、その三次元構造中で同等の位置に存在すると考えられる。したがって、相当する位置に存在するアミノ酸残基の変異は、グリコシドハイドロラーゼの特異的機能に対して互いに類似した効果を及ぼすと推定される。
【００３６】
本発明の変異グリコシドハイドロラーゼにおいて、表４に記載のアミノ酸残基の置換は、天然に生じたものであっても、人工的に導入したものであってもよい。さらに、本発明の変異グリコシドハイドロラーゼは、表４に記載された位置のアミノ酸残基の置換に加えて、その液体洗剤に対する溶解性向上効果を妨げない限り、且つそのグリコシドハイドロラーゼ活性を損なわない限り、他の任意の位置における変異（例えば、欠失、置換、付加、挿入）を有していてもよい。当該任意の位置における変異もまた、天然に生じたものであっても、人工的に導入したものであってもよい。
【００３７】
本発明のグリコシドハイドロラーゼのアミノ酸残基を置換する手段としては、当技術分野で公知の各種変異導入技術を使用することができる。例えば、親グリコシドハイドロラーゼのアミノ酸配列をコードするグリコシドハイドロラーゼ遺伝子（以下、親グリコシドハイドロラーゼ遺伝子）内の置換対象のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を、置換後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列に変異させ、更にその変異遺伝子から変異グリコシドハイドロラーゼを発現させることにより、置換対象のアミノ酸残基が所望のアミノ酸残基に置換された変異グリコシドハイドロラーゼを得ることができる。
【００３８】
親グリコシドハイドロラーゼ遺伝子への目的の変異の導入は、例えば基本的には、親グリコシドハイドロラーゼ遺伝子を鋳型ＤＮＡとして用いるＰＣＲ増幅や各種ＤＮＡポリメラーゼによる複製反応に基づき、当業者に周知の様々な部位特異的変異導入法を用いて行うことができる。部位特異的変異導入法は、例えば、インバースＰＣＲ法やアニーリング法など（村松ら編、「改訂第４版  新遺伝子工学ハンドブック」、羊土社、ｐ．８２−８８）の任意の手法により行うことができる。必要に応じてＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔや、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｍｕｌｔｉ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ等の各種の市販の部位特異的変異導入用キットを使用することもできる。
【００３９】
親グリコシドハイドロラーゼ遺伝子への部位特異的変異導入は、最も一般的には、導入すべきヌクレオチド変異を含む変異プライマーを用いて行うことができる。そのような変異プライマーは、親グリコシドハイドロラーゼ遺伝子内の置換対象のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を含む領域にアニーリングし、かつその置換対象のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）に代えて置換後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）を有する塩基配列を含むように設計すればよい。置換対象及び置換後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）は、当業者であれば通常の教科書等に基づいて適宜認識し選択することができる。
本発明ではまた、導入すべきヌクレオチド変異を含む相補的な２つの変異プライマーを別々に用いて変異部位の上流側及び下流側をそれぞれ増幅したＤＮＡ断片を、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｂｙ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）−ＰＣＲ（Ｈｏｒｔｏｎ  Ｒ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ（１９８９）７７（１），ｐ．６１−６８）により１つに連結する方法を用いることもできる。このＳＯＥ−ＰＣＲ法を用いた変異導入手順については、後述の実施例にも詳述している。
【００４０】
親グリコシドハイドロラーゼ遺伝子を含む鋳型ＤＮＡは、上述したバチルス エスピーＫＳＭ−Ｎ２５７（ＦＥＲＭ  Ｐ-１７４７３）、バチルス  サーキュランス、パエニバチルスエスピーＹ４１２ＭＣ１０、パエニバチルス  エスピーＨＧＦ５、パエニバチルス  ボルテックスＶ４５３、パエニバチルス  ラクティス１５４、又はそれらの変異株から、常法によりゲノムＤＮＡを抽出するか、又はＲＮＡを抽出し逆転写によりｃＤＮＡを合成することによって、調製することができる。あるいは、親グリコシドハイドロラーゼのアミノ酸配列に基づいて、対応するヌクレオチド配列を合成して鋳型ＤＮＡとして用いてもよい。
【００４１】
上記バチルス属菌株からのゲノムＤＮＡの調製は、例えば、Ｐｉｔｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｔｔ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９８９，８：ｐ．１５１−１５６に記載の方法などを用いて行うことができる。親グリコシドハイドロラーゼ遺伝子を含む鋳型ＤＮＡは、調製したｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡから切り出した親グリコシドハイドロラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を任意のベクター中に挿入した形で調製してもよい。
【００４２】
プライマーは、ホスホロアミダイト法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７，７０５９−７０７１，１９８９）等の周知のオリゴヌクレオチド合成法により作製することができる。そのようなプライマー合成は、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成装置（ＡＢＩ社製など）を用いて作製することもできる。変異プライマーを含むプライマーセットを使用し、親グリコシドハイドロラーゼ遺伝子を鋳型ＤＮＡとして上記のような部位特異的変異導入を行うことにより、目的の変異が導入された変異グリコシドハイドロラーゼ遺伝子を得ることができる。本発明はこのようにして得られる変異グリコシドハイドロラーゼ遺伝子にも関する。なお本発明において「変異グリコシドハイドロラーゼ遺伝子」とは、変異グリコシドハイドロラーゼ遺伝子のアミノ酸配列をコードする任意の核酸断片（ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、及び人工核酸等を含む）を意味する。本発明に係る「遺伝子」は、オープンリーディングフレームに加えて非翻訳領域（ＵＴＲ）などの他の塩基配列を含んでもよい。
【００４３】
得られた変異グリコシドハイドロラーゼ遺伝子を常法により任意のベクター中に挿入し連結することにより、組換えベクターを作製することができる。本発明で用いるベクターは特に限定されず、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、ウイルス、ＹＡＣベクター、シャトルベクター等の任意のベクターであってよい。そのようなベクターとしては、限定するものではないが、細菌内、とりわけバチルス属細菌内で増幅可能なベクターがより好ましく、バチルス属細菌内で導入遺伝子の発現を誘導可能な発現ベクターであることが更に好ましい。中でも、バチルス属細菌と他の生物のいずれでも複製可能なベクターであるシャトルベクターは、変異グリコシドハイドロラーゼ遺伝子を組換え生産する上で特に好適に用いることができる。好ましいベクターの例としては、限定するものではないが、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（大腸菌と枯草菌の両方を形質転換可能な発現ベクター；Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｈ．ａｎｄ  Ｓｈｉｂａｈａｒａ，Ｈ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｇｅｎｅｔ，（１９８５）６０，ｐ．２３５−２４３）、ｐＡＣ３（Ｍｏｒｉｙａｍａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８８）１６，ｐ．８７３２）等のシャトルベクター、ｐＵＢ１１０（Ｇｒｙｃｚａｎ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９７８）１３４，ｐ．３１８−３２９）、ｐＴＡ１０６０７（Ｂｒｏｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｓｍｉｄ，１８（１９８７）ｐ．８−１５）等のバチルス属細菌の形質転換に利用可能なプラスミド、分泌シグナルを組換えタンパク質に付与可能な分泌ベクター（山根他，「枯草菌分泌ベクターによる融合タンパク質」澱粉科学，３４．（１９８７），ｐ．１６３−１７０）等が挙げられる。また大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＥＴ２２ｂ（＋）、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等）を用いることもできる。
【００４４】
変異グリコシドハイドロラーゼ遺伝子を組換え生産する目的では、ベクターは発現ベクターであることが好ましい。発現ベクターは、転写プロモーター、ターミネーター、リボソーム結合部位などの宿主生物における発現に必須な各種エレメントの他、選択マーカー遺伝子やポリリンカー、エンハンサーなどのシスエレメント、ポリＡ付加シグナル、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）等の有用な配列を必要に応じて含み得る。
【００４５】
変異グリコシドハイドロラーゼ遺伝子を含む組換えベクターを用いて、形質転換体を作製することができる。本発明では、本発明に係る変異グリコシドハイドロラーゼ遺伝子を含む組換えベクター（具体的には組換え発現ベクター）を宿主細胞に導入することにより形質転換体（形質転換細胞）を作製し、それを組換えタンパク質の発現が誘導される条件下で培養することにより、変異グリコシドハイドロラーゼを産生させることができる。
【００４６】
組換えベクターを導入する宿主細胞としては、大腸菌や枯草菌等の細菌、酵母細胞を始めとする微生物の他、昆虫細胞、動物細胞（例えば、哺乳動物細胞）、植物細胞等の任意の細胞を使用することができる。本発明においては、特に、枯草菌等のバチルス属細菌を使用することが好ましい。
【００４７】
形質転換には、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、パーテイクルガン法、ＰＥＧ法等の周知の形質転換技術を適用することができる。例えばバチルス属細菌に適用可能な形質転換法としては、コンピテントセル形質転換法（Ｂｏｔｔ．Ｋ．Ｆ．ａｎｄ  Ｗｉｌｓｏｎ，Ｇ．Ａ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９６７）９３，１９２５）、エレクトロポレーション法（Ｂｒｉｇｉｄｉ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．（１９９０）５５，１３５）、プロトプラスト形質転換法（Ｃｈａｎｇ，Ｓ．ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，（１９７９）１６８，ｐ．１１１−１１５）、Ｔｒｉｓ−ＰＥＧ法（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８３）１５６，ｐ．１１３０−１１３４）などが挙げられる。
【００４８】
組換えタンパク質生産のための上記形質転換体の培養は、当業者には一般的な方法に従って行うことができる。例えば、大腸菌や酵母細胞等の微生物宿主に基づく形質転換体を培養する培地としては、宿主微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。培地には、薬剤選択マーカーの種類に対応してアンピシリンやテトラサイクリン等を添加してもよい。プロモーターとして誘導性のものを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した細菌等を培養するときにはイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドール酢酸（ＩＡＡ）等を培地に添加することができる。培養条件は特に限定されないが、好ましくは形質転換に用いる宿主生物に適した条件下で行われる。例えば、組換えタンパク質を生産するための枯草菌形質転換体の培養には、例えば、ＬＢ培地、２×ＹＴ培地、２×Ｌ−マルトース培地、又はＣＳＬ発酵培地等を用いることができる。
【００４９】
本発明に係る変異グリコシドハイドロラーゼ遺伝子は、無細胞翻訳系を使用して変異グリコシドハイドロラーゼ遺伝子又はその転写産物から発現させてもよい。「無細胞翻訳系」とは、宿主となる細胞を機械的に破壊して得た懸濁液にタンパク質の翻訳に必要なアミノ酸等の試薬を加えて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写翻訳系又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系を構成したものである。発現された変異グリコシドハイドロラーゼは、タンパク質精製に用いられる一般的な方法、例えば遠心分離、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、培養液、細胞破砕液、又は無細胞翻訳系から取得することができる。しかし遠心分離や限外濾過型フィルター等を用いて分離又は濃縮したその培養上清や溶菌液上清等の溶液は、粗酵素液としてそのまま使用することもできる。発現された変異グリコシドハイドロラーゼが細胞内から分泌されない場合には、その細胞を破砕してからタンパク質の分離精製を行えばよい。
【００５０】
なお本発明において用いるｍＲＮＡの調製、ｃＤＮＡの作製、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ライブラリーの作製、ベクター中へのライゲーション、細胞の形質転換、ＤＮＡの塩基配列の決定、核酸化学合成、タンパク質のＮ末端側のアミノ酸配列決定、突然変異誘発、タンパク質の抽出等の実験は、通常の実験書に記載の方法によって行うことができる。そのような実験書としては、例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，（２００１）３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．＆Ｒｕｓｓｅｌｌ，ＤＷ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを挙げることができる。特に、枯草菌の遺伝子組換え実験については例えば、吉川博文著“７．２  枯草菌系”「続生化学実験講座１．遺伝子研究法ＩＩ」，（１９８６）東京化学同人社（東京），ｐ．１５０−１６９等の枯草菌の遺伝子操作に関する一般的な実験書を参照することができる。
【００５１】
斯くして、本発明の変異グリコシドハイドロラーゼを得ることができる。従って、本発明はまた、本発明の変異グリコシドハイドロラーゼ遺伝子をコードする遺伝子（ポリヌクレオチド）、当該遺伝子を含むベクター、及び当該ベクターを含む形質転換体、ならびに当該形質転換体を用いる変異グリコシドハイドロラーゼ遺伝子の製造方法を提供する。
【００５２】
本発明の変異グリコシドハイドロラーゼ遺伝子は、アルカリセルラーゼ活性、リケナーゼ活性又はキシラナーゼ活性のいずれか１以上の活性を有し、且つ親グリコシドハイドロラーゼと比べて、液体洗剤、好ましくは濃縮液体洗剤に対する溶解性が向上している。よって、本発明の変異グリコシドハイドロラーゼは、各種液体洗剤配合用酵素、好ましくは、濃縮液体洗剤配合用酵素として有用である。本発明の変異グリコシドハイドロラーゼを含有する液体洗剤は、従来と比べてより多くのグリコシドハイドロラーゼを含有することが可能になるので、従来と比べてより高いグリコシドハイドロラーゼ活性を有することができ、結果としてより強力な酵素洗浄力を発揮することができる。従って、本願発明はまた、本発明の変異グリコシドハイドロラーゼを含有する液体洗剤組成物を提供する。
【００５３】
本発明の液体洗剤組成物における本発明の変異グリコシドハイドロラーゼの含有量は、組成物の０．０００１質量％から５質量％、好ましくは０．０００１質量％から２質量％であり、均一に溶解又は分散可能な範囲で異なる活性を有する酵素を配合することもできる。
【００５４】
本発明の液体洗剤組成物は、本発明のグリコシドハイドロラーゼに加えて、界面活性剤及び水等を含有する。界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、及び陽イオン性界面活性剤等の任意の界面活性剤を１種で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００５５】
非イオン性界面活性剤としては、例えば、以下が挙げられる：
Ｒ1Ｏ−（ＡＯ）ｍ−Ｈ（Ｒ1＝Ｃ８−Ｃ２２炭化水素、ＡＯ＝Ｃ２−Ｃ５オキシアルキレン基、ｍ＝１６〜３５）〔特開２０１０−２７５４６８号公報〕；
Ｒ1Ｏ−（ＥＯ）ｌ−（ＡＯ）ｍ−（ＥＯ）ｎ−Ｈ（Ｒ1＝Ｃ８−Ｃ１８炭化水素、ＥＯ＝Ｃ２オキシアルキレン基、ＡＯ＝Ｃ３−Ｃ５オキシアルキレン基、ｌ＝３〜３０、ｍ＝１〜５、ｌ＋ｎ＝１４〜５０）〔特開２０１１−６３７８４号公報〕；
Ｒ1Ｏ−（ＥＯ）ｍ／（ＡＯ）ｎ−Ｈ（Ｒ1＝Ｃ８−Ｃ２２炭化水素、ＥＯ＝Ｃ２オキシアルキレン基、ＡＯ＝Ｃ３−Ｃ５オキシアルキレン基、ｍ＝１０〜３０、ｎ＝０〜５、ＥＯ及びＡＯはランダム又はブロック結合）〔特開２０１０−１８９５５１号公報〕；
Ｒ1（ＣＯ）ｌＯ−（ＥＯ）ｍ／（ＡＯ）ｎ−Ｒ2（Ｒ1＝Ｃ８−Ｃ２２炭化水素、ＥＯ＝Ｃ２オキシアルキレン基、ＡＯ＝Ｃ３−Ｃ５オキシアルキレン基、ｌ＝０〜１、ｍ＝１４〜５０、ｎ＝１〜５、Ｒ2＝水素（ｌ＝０）又はＣ１−Ｃ３アルキル基、ＥＯ及びＡＯはランダム又はブロック結合）〔特開２０１０−２２９３８５号公報〕；
Ｒ1Ｏ−（ＥＯ）ｍ−（ＡＯ）ｎ−Ｈ（Ｒ1＝Ｃ８−Ｃ２２炭化水素、ＥＯ＝Ｃ２オキシアルキレン基、ＡＯ＝Ｃ３−Ｃ５オキシアルキレン基、ｍ＝１５〜３０、ｎ＝１〜５）〔特開２０１０−２２９３８７号公報〕；
Ｒ1Ｏ−（ＡＯ）ｍ／（Ｇｌｙ）ｎ−Ｈ及び／又はＲ2−ＣＯＯ−（ＡＯ）ｐ／（Ｇｌｙ）ｑ−Ｈ（Ｒ1＝Ｃ８−Ｃ２２炭化水素基、Ｒ2＝Ｃ７−Ｃ２１炭化水素基、ＡＯ＝Ｃ２−Ｃ３オキシアルキレン基、Ｇｌｙ＝グリセロール基、ｍ＝０〜５、ｎ＝２〜１０、ｐ＝０〜５、ｑ＝２〜１０、ＡＯ及びＧｌｙはランダム又はブロック結合）〔特開２０１０−２５４８８１号公報〕；
Ｒ1−ＣＯＯ−（ＰＯ）ｍ／（ＥＯ）ｎ−Ｒ2（Ｒ1＝Ｃ７−Ｃ２１炭化水素基，ＣＯＯ＝カルボニルオキシ基、Ｒ2＝Ｃ１−Ｃ３アルキル基、ＰＯ＝オキシプロピレン基、ＥＯ＝オキシエチレン基、ｍ＝０．３〜５、ｎ＝８〜２５、ＰＯ及びＥＯはランダム又はブロック結合）〔特開２０１０−２６５３３３号公報〕；
Ｒ1Ｏ−（ＥＯ）ｌ−（ＡＯ）ｍ−（ＥＯ）ｎ−Ｈ（Ｒ1＝Ｃ８−Ｃ１８炭化水素、ＥＯ＝Ｃ２オキシアルキレン基、ＡＯ＝Ｃ３−Ｃ５オキシアルキレン基、ｌ＝３〜３０、ｍ＝１＝５、ｌ＋ｎ＝１４〜５０）〔特開２０１０−２６５４４５号公報〕；
Ｒ1Ｏ−（ＥＯ）ｌ−（ＰＯ）ｍ−（ＥＯ）ｎ−Ｈ（Ｒ1＝Ｃ８−Ｃ２０炭化水素、ＥＯ＝Ｃ２オキシアルキレン基、ＰＯ＝オキシプロピレン基、ｌ＞＝１、ｎ＞＝１、０＜ｍ＜ｌ＋ｎ、ＥＯ及びＰＯはブロック結合）〔ＷＯ９８／２４８６５〕；
Ｒ1Ｏ−（ＥＯ）ｍ−（ＰＯ）ｎ−Ｈ（Ｒ1＝Ｃ１０−Ｃ１６のアルキル基又はアルケニル基、ＥＯ＝エチレンオキシド基、ＰＯ＝プロピレンオキシド基、ｍ＝５〜１５、ｎ＝１〜３）〔特開平８−１５７８６７号公報〕；
Ｒ1（ＣＯ）−（ＥＯ）ｍ−ＯＲ2（Ｒ1＝Ｃ１１−Ｃ１３直鎖又は分岐状アルキル基又はアルケニル基、Ｒ2＝Ｃ１−Ｃ３アルキル基、ＥＯ＝エチレンオキシド基、ｍ＝１０〜２０）〔特開２００８−７７０６号公報、特開２００９−７４５１号公報、特開２００９−１５５５９４号公報、特開２００９−１５５６０６号公報〕；
Ｒ1（ＣＯ）−（ＡＯ）ｍ−ＯＲ2（Ｒ1＝Ｃ９−Ｃ１３直鎖又は分岐状アルキル基又はアルケニル基、ＡＯ＝Ｃ２−Ｃ４オキシアルキレン基、Ｒ2＝Ｃ１−Ｃ３アルキル基、ｍ＝５〜３０）〔特開２００９−１４４００２号公報、特開２００９−１７３８５８号公報、特開２０１０−１８９６１２号公報〕；
ならびに、脂肪酸アルカノールアミド、脂肪酸アルカノールグルカミド、アルキルポリグルコシド等が挙げられる。
【００５６】
陰イオン界面活性剤としては、例えば、カルボキシレート型陰イオン界面活性剤、スルホン酸型又は硫酸エステル型陰イオン界面活性剤、非石鹸系アニオン界面活性剤、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸又はその塩、、ポリオキシエチレンアルキル硫酸エステル塩、α−オレフィンスルホン酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、α−スルホ脂肪酸塩、脂肪酸石鹸、リン酸エステル塩系界面活性剤、アシルアラニネート、アシルタウレート、アルキルエーテルカルボン酸、アルコール硫酸エステル等が挙げられる。好ましくは炭素数８〜２２の長鎖アルキル基を１つ有する第４級アンモニウム型界面活性剤、炭素数８〜２２の長鎖アルキル基を１つ有する３級アミンが挙げられる。
【００５７】
陽イオン界面活性剤としては、例えば長鎖アルキル基を有する第４級アンモニウム塩、長鎖アルキル基を１つ有する３級アミン、アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、アルキルピリジニウム塩等が挙げられる。両性イオン活性剤としては、アルキル酢酸ベタイン、アルカノールアミドプロピル酢酸ベタイン、アルキルイミダゾリン、アルキルアラニン等、、アルキルベタイン型、アルキルアミドベタイン型、イミダゾリン型、アルキルアミノスルホン型、アルキルアミノカルボン酸型、アルキルアミドカルボン酸型、アミドアミノ酸型又はリン酸型の両性界面活性剤等が挙げられる。好ましくは炭素数１０〜１８のアルキル基を有するスルホベタイン又はカルボベタインを挙げることができる。
【００５８】
本発明の液体洗剤組成物は、好ましくは濃縮液体洗剤組成物である。
本明細書において、「濃縮液体洗剤」とは、界面活性剤を４０質量％以上、水を６０質量％未満含有する液体洗剤を意味し得る。好ましくは、界面活性剤を４０〜９０質量％、水を５質量％以上６０質量％未満含有する液体洗剤であり得、より好ましくは、界面活性剤を４５〜９０質量％、水を５質量％以上５５質量％未満含有する液体洗剤であり得、さらに好ましくは、界面活性剤を５０〜７５質量％、水を５〜５０質量％未満含有する液体洗剤であり得る。
上記のような「濃縮液体洗剤」の例としては、使用量が従来の半分程度又はそれ以下でよい液体洗剤、例えば、衣料用液体洗剤であれば、水槽式洗濯機で水３０Ｌに対する標準使用量が７〜１３ｇ又はそれ以下と表示されているものを挙げることができる。
【００５９】
本発明の液体洗剤組成物は、さらに、液体洗剤に通常使用される成分、例えば、水溶性ポリマー、水混和性有機溶剤、アルカリ剤、キレート剤、本発明の変異グリコシドハイドロラーゼ以外の他の酵素、酵素安定化剤、蛍光剤、再汚染防止剤及び分散剤、色移り防止剤、仕上げ剤、過酸化水素等の漂白剤、酸化防止剤、ｐＨ調製剤、緩衝剤、防腐剤、香料、塩、アルコール、糖類等を含み得る。
【００６０】
水溶性ポリマーとしては、例えば、（ｉ）炭素数２〜５のエポキシド由来の重合単位を含んで構成されるポリエーテル鎖部分と（ii）アクリル酸、メタクリル酸及びマレイン酸から選ばれる一種以上の不飽和カルボン酸単量体由来の重合単位を含んで構成されるポリマー鎖部分とを有し、（ｉ）又は（ii）はいずれかが幹鎖となり、他方が枝鎖となったグラフト構造を有する高分子化合物（特開２０１０−２７５４６８号公報）、ならびにアルキレンテレフタレート単位及び／又はアルキレンイソフタレート単位と、オキシアルキレン単位及び／又はポリオキシアルキレン単位を有する水溶性ポリマー（特開２００９−１５５６０６号公報）等が挙げられる。
【００６１】
水混和性有機溶剤としては、例えばアルカノール類、のアルキレングリコール類やグリセリン、ポリアルキレングリコール類、（ポリ）アルキレングリコール（モノ又はジ）アルキルエーテル類、アルキルグリセリルエーテル類、（ポリ）アルキレングリコールの芳香族エーテル類が挙げられる。エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、又はヘキシレングリコールなどの炭素数２〜６のアルキレングリコール類やグリセリン、又はポリエチレングリコールモノフェニルエーテル、エチレングリコールモノベンジルエーテル、ジエチレングリコールモノベンジルエーテル等が好ましい。本発明の液体洗剤組成物における当該水混和性有機溶剤の含有量は、１〜４０質量％、好ましくは１〜３５質量％である。
【００６２】
アルカリ剤としては、例えばＣ２−Ｃ４のアルカノールを１〜３個有するアルカノールアミンとして、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、又はポリオキシアルキレンアミン、ジメチルアミノプロピルアミン等が挙げられる。モノエタノールアミン、トリエタノールアミンが好ましい。本発明の液体洗剤組成物における当該アルカリ剤の含有量は、０〜２０質量％、好ましくは０〜１０質量％である。
【００６３】
キレート剤としては、例えばニトリロ三酢酸、イミノ二酢酸、エチレンジアミン酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、グリコールエーテルジアミン四酢酸、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸、トリエチレンテトラアミン六酢酸、ジエンコル酸等のアミノポリ酢酸又はこれらの塩、ジグリコール酸、オキシジコハク酸、カルボキシメチルオキシコハク酸、クエン酸、乳酸、酒石酸、シュウ酸、リンゴ酸、オキシジコハク酸、グルコン酸、カルボキシメチルコハク酸、カルボキシメチル酒石酸等の有機酸又はこれらの塩、アミノトリ（メチレンホスホン酸）、１−ヒドロキシエチリデン−１，１−ジホスホン酸、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）、ジエチレントリアミンペンタ（メチレンホスホン酸）、これらのアルカリ金属または低級アミン塩等が挙げられる。本発明の液体洗剤組成物における当該キレート剤の含有量は、０．１〜５質量％が好ましく、より好ましくは０．１〜４質量％である。
【００６４】
有機酸又はその塩としては、例えば、飽和脂肪酸、、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、またはそれらの塩などの多価カルボン酸類；クエン酸、リンゴ酸、グリコール酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、安息香酸又はそれらの塩等のヒドロキシカルボン酸類が挙げられ、なかでもクエン酸又はその塩が特に好ましい。本発明の液体洗剤組成物における当該有機酸又はその塩の含有量は、０〜５質量％、好ましくは０〜３質量％である。
【００６５】
再汚染防止剤及び分散剤としては、例えばポリアクリル酸、ポリマレイン酸、カルボキシメチルセルロース、重量平均分子量５０００以上のポリエチレングリコール、無水マレイン酸−ジイソブチレン共重合体、無水マレイン酸−メチルビニルエーテル共重合体、無水マレイン酸−酢酸ビニル共重合体、ナフタレンスルホン酸塩ホルマリン縮合物、及び特開昭５９−６２６１４号公報の請求項１〜２１（１頁３欄５行〜３頁４欄１４行）記載のポリマーなどの再汚染防止剤及び分散剤を挙げることができるが、配合に適さない場合は除外してもよい。
【００６６】
色移り防止剤としては、例えばポリビニルピロリドンが挙げられ、含有量は０．０１〜１０質量％が好ましい。
【００６７】
漂白剤としては、例えば過酸化水素、過炭酸塩、過硼酸塩などの漂白剤は１〜１０質量％配合するのが好ましい。漂白剤を使用するときは、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）や特開平６−３１６７００号公報記載などの漂白活性化剤（アクチベーター）を０．０１〜１０質量％配合することができる。
【００６８】
蛍光剤としては、例えばビフェニル型蛍光剤（チノパールＣＢＳ−Ｘなど）やスチルベン型蛍光剤（ＤＭ型蛍光染料など）が挙げられる。蛍光剤は０．００１〜２質量％配合するのが好ましい。
【００６９】
本発明の変異グリコシドハイドロラーゼ以外の他の酵素としては、例えば、プロテアーゼ、他のセルラーゼ、他のリケナーゼ、他のβ−グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、キシログルカナーゼ、他のキシラナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ペクチンリアーゼ、マンナナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、及びトランスグルタミナーゼ等を始めとする加水分解酵素、並びにそれらのうち２種以上の混合物が挙げられる。
【００７０】
その他成分として、例えばホウ素化合物、カルシウムイオン源（カルシウムイオン供給化合物）、ビヒドロキシ化合物、蟻酸等の酵素安定化剤、ブチルヒドロキシトルエン、ジスチレン化クレゾール、亜硫酸ナトリウム及び亜硫酸水素ナトリウム等の酸化防止剤、パラトルエンスルホン酸、クメンスルホン酸、メタキシレンスルホン酸、安息香酸塩（防腐剤としての効果もある）などの可溶化剤、オクタン、デカン、ドデカン、トリデカンなどのパラフィン類、デセン、ドデセンなどのオレフィン類、塩化メチレン、１，１，１−トリクロロエタンなどのハロゲン化アルキル類、Ｄ−リモネンなどのテルペン類などの水非混和性有機溶剤、色素、香料、抗菌防腐剤、シリコーン等の消泡剤等を配合しても良い。
【００７１】
本発明の液体洗剤組成物の好ましい組成として、特開２０１０−１８９５５１、特開２０１０−２６５３３３又は特開２０１０−２７５４６８の実施例に記載の組成が挙げられる。例えば、特開２０１０−２７５４６８の実施例１に記載の液体洗剤組成物は、界面活性剤を６６％（非イオン界面活性剤４６％、陰イオン界面活性剤を２０％）、水溶性ポリマー（ポリエチレングリコール（エチレンオキシド平均付加モル数２５）アリルエーテル／アクリル酸＝７５／２５（質量比）共重合体）を３％、水混和性有機溶剤（ジエチレングリコールモノブチルエーテル、プロピレングリコール）を１４％、アルカリ剤（モノエタノールアミン）を５％、イオン交換水１１％及び色素、香料等を配合した組成物に酵素を配合することにより、調製することができる。
例えば下記市販液体洗剤組成物は、界面活性剤を４０％以上含有する濃縮液体洗剤であるが、製品表示ラベルに記載の成分を以下に示す。
組成物Ａ（アタックＮｅｏ；花王株式会社製）：界面活性剤（非イオン系界面活性剤、陰イオン活性剤：直鎖アルキルベンゼン系、脂肪酸系）７４質量％、安定化剤（ブリルカルビトール）、アルカリ剤、分散剤、酵素、
組成物Ｂ（ＮＡＮＯＸ；ライオン株式会社製）：界面活性剤（ポリオキシエチレンアルキル硫酸エステル塩）５５質量％、安定化剤、酵素。
【００７２】
本発明の液体洗剤組成物は、限定するものではないが、好ましくは衣料用、又は布製品（シーツ、カーテン、カーペット、壁クロス等）用のものである。本発明に係る液体洗剤組成物は、本発明の変異グリコシドハイドロラーゼ含有することにより、酵素を従来品と比べて多量に含有することができることから、高い酵素洗浄力を発揮することができる。
【実施例】
【００７３】
以下、実施例を用いて本発明を更に具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００７４】
参考例１  Ｎ２５７グリコシドハイドロラーゼの調製
液体洗剤に対する酵素の溶解性評価方法について、バチルス  サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）ＫＳＭ−Ｎ２５７株（ＦＥＲＭＰ−１７４７３）由来のＮ２５７グリコシドハイドロラーゼを例として以下に示す。
Ｎ２５７グリコシドハイドロラーゼ（配列番号２）をコードする遺伝子（配列番号１）［以下、Ｎ２５７グリコシドハイドロラーゼ遺伝子とも称する；塩基配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０５９２６７に基づき入手可能；Hakamada et al., Biochim. Biophys. Acta., 1570, (2002) p.174-180］におけるＮ２５７グリコシドハイドロラーゼのＮ末端アミノ酸（配列番号２の３１番目のアラニン）からターミネーター配列までをコードする核酸断片を増幅した。さらに、Ｓ２３７セルラーゼをコードする遺伝子（配列番号３）［以下、Ｓ２３７セルラーゼ遺伝子とも称する；塩基配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ１８４２０に基づき入手可能；Hakamada et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 64(11), (2000) p.2281-2289；特開２０００−２１００８１号公報］のプロモーター及びシグナル配列の核酸断片を増幅した。
ＳＯＥ−ＰＣＲにて２つの核酸断片を連結し、シャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ（ヤクルト本社；Ishiwa, H. & Shibahara, H., Jpn. J. Genet. (1985) 60, p.235-243）に導入することでＮ２５７グリコシドハイドロラーゼ遺伝子を含む発現プラスミドを作製した。
【００７５】
詳細には、初めにバチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＳＭ−Ｓ２３７株からゲノムＤＮＡを常法により抽出し、これを鋳型ＤＮＡとして、表３に示すプライマーＳ２３７ＵＢ１  ＦＷ（配列番号４）とＳ２３７−ＰＳ  ＲＶ（配列番号５）からなるプライマーセットを用いて、Ｓ２３７セルラーゼをコードする遺伝子（配列番号３）のプロモーター及びシグナル配列を含むＤＮＡ断片を増幅した。ＤＮＡ断片の増幅は、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムズ）を使用し、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）と付属の試薬類を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により行った。ＰＣＲの反応液は、適宜希釈した鋳型ＤＮＡを１μＬ、センスプライマー及びアンチセンスプライマーを各々２０ｐｍｏｌ、及びＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼを２．５Ｕ混合し、水を加えて反応液総量を５０μＬにして調製した。ＰＣＲ反応は、９８℃で１０秒間、５５℃で３０秒間及び７２℃で１〜５分間（目的増幅産物に応じて調整したが、目安は１ｋｂ当たり１分間）の３段階の温度変化を３０サイクル繰り返した後、７２℃で５分間反応させる条件で行った。
次に、バチルス  サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）ＫＳＭ−Ｎ２５７株からゲノムＤＮＡを常法により抽出し、これを鋳型ＤＮＡとして、表３に示すＮ２５７ｍａｔ−Ｑｓｔｅｒ  ＦＷ（配列番号６）とＮ２５７−Ｃｒｙｔｅｒ  ＲＶ（配列番号７）からなるプライマーセットを用いて、上述のＤＮＡ断片の増幅と同様の方法にて、Ｎ２５７グリコシドハイドロラーゼの構造遺伝子及びターミネーターの遺伝子の配列（配列番号２の３１番目のアラニンからターミネーター配列までをコードする核酸断片）を増幅した。
得られたＳ２３７セルラーゼのプロモーター及びシグナル配列とＮ２５７の構造遺伝子及びターミネーターとを含むＤＮＡ断片を、表７に示すＳ２３７ＵＢ１  ＦｗとＮ２５７−Ｃｒｙｔｅｒ  Ｒｖからなるプライマーセットを用いて、ＳＯＥ−ＰＣＲによって増幅した。
【００７６】
【表７】
0005977029.tif 000008
【００７７】
シャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ（ヤクルト本社；Ishiwa, H. & Shibahara, H., Jpn. J. Genet. (1985) 60, p.235-243）をＳｍａＩにて制限酵素処理し、これに増幅断片を挿入し、組換えプラスミドｐＨＹ−Ｎ２５７を構築した。プラスミド中に挿入されたＮ２５７グリコシドハイドロラーゼ遺伝子断片については、３１００ＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて配列決定することにより、Ｓ２３７セルラーゼをコードする遺伝子（配列番号３）のプロモーター及びシグナル配列と配列番号２の３１番目のアラニンからターミネーター配列が連結した塩基配列を有することを確認した。次いでプロトプラスト形質転換法により、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ  Ｍａｒｂｕｒｇ  Ｎｏ．１６８株（Nature, 390, (1997) p.249））を組換えプラスミドｐＨＹ−Ｎ２５７を用いて形質転換した。
【００７８】
プロトプラスト形質転換法では、まず、枯草菌株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  Ｍａｒｂｕｒｇ  Ｎｏ．１６８株：Nature, 390, 1997, p.249）を、５０ｍＬのＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ）中で３７℃にて約２時間振盪培養し、６００ｎｍにおける吸光度が０．４となった時点で、室温で遠心分離（７０００ｒｐｍ、１５分間）により菌体を集めた。集めた菌体を５ｍＬのＳＭＭＰ［０．５Ｍシュークロース、２０ｍＭマレイン酸二ナトリウム、２０ｍＭ塩化マグネシウム６水塩、３５％（ｗ／ｖ）Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  Ｍｅｄｉｕｍ  ３（Ｄｉｆｃｏ）］に懸濁後、ＳＭＭＰ溶液に溶解した５００μＬのリゾチーム溶液（３０ｍｇ／ｍＬ）を加え、３７℃で１時間保温して菌体をプロトプラスト化した。保温終了後、室温で遠心分離（２８００ｒｐｍ、１５分間）によりプロトプラストを集め、５ｍＬのＳＭＭＰに懸濁しプロトプラスト溶液を調製した。０．５ｍＬのプロトプラスト溶液に、１０μＬのプラスミド溶液（Ｎ２５７グリコシドハイドロラーゼをコードする遺伝子を含むプラスミドベクターを含む）と１．５ｍＬの４０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ８０００、Ｓｉｇｍａ）を加え、緩やかに攪拌して室温で２分間放置した後、直ちに５ｍＬのＳＭＭＰ溶液を混和し、室温で遠心分離（２８００ｒｐｍ、１５分間）によりプロトプラストを集め、１ｍＬのＳＭＭＰ溶液に再懸濁した。プロトプラスト懸濁液を、３７℃で９０分間振盪（１２０ｒｐｍ）した後、テトラサイクリン（１５μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）を含むＤＭ３再生寒天培地［０．８％（ｗ／ｖ）寒天（和光純薬）、０．５％コハク酸２ナトリウム６水塩、０．５％カザミノ酸テクニカル（Ｄｉｆｃｏ）、０．５％酵母エキス、０．３５％リン酸１カリウム、０．１５％リン酸２カリウム、０．５％グルコース、０．４％塩化マグネシウム６水塩、０．０１％牛血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）、０．５％カルボキメチルセルロース、０．００５％トリパンブルー（Ｍｅｒｃｋ）及びアミノ酸混液（トリプトファン、ロイシン、メチオニン各１０μｇ／ｍＬ）］上に塗布し、３０℃で７２時間培養して、生育したコロニーを形質転換体として分離した。
得られた形質転換体を１０ｍＬのＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ）で３０℃にて一夜振盪培養を行い、更にこの培養液０．０５ｍＬを５０  ｍＬの２×Ｌ−マルトース培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、７．５％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン４−５水和物、１５ｐｐｍテトラサイクリン）に接種し、３０℃にて３日間振盪培養を行った。培養によって得られたＮ２５７グリコシドハイドロラーゼを含む培養液を遠心分離し、培養上清を得た。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて、培養上清に含まれる蛋白質がＮ２５７グリコシドハイドロラーゼであることを確認した。必要に応じてゲル濾過カラムＥｃｏｎｏｐａｃｋ  １０−ＤＧ（バイオラッド）にて脱塩精製を行なった。
【００７９】
参考例２  酵素溶解性評価法
（１）グリコシドハイドロラーゼ蛋白量測定方法
培養上清中または脱塩精製サンプル中のグリコシドハイドロラーゼ蛋白量の測定は、プロテインアッセイラピッドキット（和光純薬工業）を用いて以下の通り行なった。すなわち、９６穴プレートの各ウェルに、同キットの発色液２５０μＬを加え、さらに適宜希釈した酵素サンプル１０μＬを混和し、室温で３０分間撹拌したのち、マイクロプレートリーダーＶｅｒｓａＭａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ社）を用いて６６０ｎｍにおける吸光度を測定した。同キット付属の牛胸腺アルブミン（ＢＳＡ）標準液を用いて同時に作製した検量線から、グリコシドハイドロラーゼタンパク濃度（ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ相当）を算出した。
【００８０】
（２）グリコシドハイドロラーゼの液体洗剤への溶解性評価
親グリコシドハイドロラーゼ、又は変異グリコシドハイドロラーゼを含む培養上清を用いて、液体洗剤への溶解性を評価した。すなわち、９６穴プレートの各ウェルに１５０μＬの液体洗剤（例えば組成物Ｃ；公開特許公報２０１０−２７５４６８の実施例１に記載）を添加し、そこに各種タンパク濃度のグリコシドハイドロラーゼを含む培養上清６.５μＬを加え、十分に攪拌した。室温で２時間放置の後、マイクロプレートリーダーＶｅｒｓａＭａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ社）にて、６５０ｎｍにおける吸光度を測定した。ブランクとして、培養上清の代わりにイオン交換水を加えた際の吸光度を差引いた値を算出し、これを濁度（ΔＯＤ６５０ｎｍ）としてグリコシドハイドロラーゼの溶解性の指標とした。
以上の方法により得られたΔＯＤ６５０ｎｍ値に基づき、次式によって各変異体における親グリコシドハイドロラーゼ（ＷＴ）との相対濁度を算出した。
相対濁度（％）＝（各変異体の濁度／各変異体の濃度）／（親グリコシドハイドロラーゼの濁度／親グリコシドハイドロラーゼの濃度）×１００
【００８１】
実施例１  グリコシドハイドロラーゼ変異体の作製
本発明のグリコシドハイドロラーゼ変異体の作製方法を、野生型（親）Ｎ２５７グリコシドハイドロラーゼ成熟酵素領域のアミノ酸配列（配列番号２）における４３番目のセリン（Ｓ４３）をトリプトファンに変異させた変異体「Ｓ４３Ｗ」の作製方法を例として以下に示す。
【００８２】
十分に希釈したプラスミドｐＨＹ−Ｎ２５７（上記参考例１参照）を鋳型とし、表８−１に示したプライマーＳ４３−ＲＶ（配列番号８）とＳ４３Ｗ−ＦＷ（配列番号９）からなるプライマーセット、及びＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｂａｓａｌ  Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いて、インバースＰＣＲを行った。詳細には、鋳型としてｐＨＹ−Ｎ２５７  １００ｐｇ、各プライマー（フォワード、リバース）２μＭ、Ｋｉｔに付属のＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＭＡＸ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ２５μＬを、滅菌水を用いて５０μＬに調製した。反応は、変性を９８℃  １０秒、アニーリングを５５℃  ５秒、伸長を７２℃  ４５秒で３５サイクルにて行った。本ＰＣＲシステムでは、プラスミドを鋳型に５’側が１５塩基オーバーラップしたプライマーを用いて、インバースＰＣＲを行うことによって、オーバーラップ部分が５’側に突出したプラスミドの配列をすべて含むＰＣＲ産物を得ることができる。この増幅産物は形質転換可能な環状構造をとることが出来るため、この増幅産物を用いることで形質転換を直接行うことが出来る。本実施例では、フォワードプライマーのオーバーラップ配列直後の３’側の３塩基を目的のアミノ酸の塩基配列に変えることで、同じ位置のアミノ酸残基を置換する場合には、リバースプライマーを共用できるようにした。以上の方法により、Ｎ２５７グリコシドハイドロラーゼ遺伝子の４３位のアミノ酸残基に対応する位置をトリプトファンに置換した変異を含むｐＨＹ−Ｎ２５７＿Ｓ４３Ｗを得た。
次いで、参考例１と同様に、組換えプラスミドｐＨＹ−Ｎ２５７＿Ｓ４３Ｗを枯草菌に導入し、得られた形質転換体を培養した。得られた培養物から遠心分離にて菌体を除いてタンパク質を含む培養上清を取得した。この組換えタンパク質は、Ｎ２５７グリコシドハイドロラーゼのアミノ酸配列（配列番号２）の４３位のセリンがトリプトファンに置換された変異Ｎ２５７グリコシドハイドロラーゼ（以下、Ｎ２５７＿Ｓ４３Ｗとも称する）である。
【００８３】
同様に、Ｓ４３−ＲＶ及びＳ４３Ｗ−ＦＷに代えて、下記表８−１〜８−４の「変異プライマーＲ」欄及び「変異プライマーＦ」欄に記載プライマーをそれぞれ用いて同様の操作を行うことで、下記表８−１〜８−４の「Ｎ２５７グリコシドハイドロラーゼ変異」欄記載の変異を有するＮ２５７グリコシドハイドロラーゼ変異体を含む培養上清を得た。
【００８４】
【表８−１】
0005977029.tif 000009
【表８−２】
0005977029.tif 000010
【表８−３】
0005977029.tif 000011
【表８−４】
0005977029.tif 000012
【００８５】
実施例２  グリコシドハイドロラーゼ変異体の溶解性評価
実施例１で得た変異グリコシドハイドロラーゼの培養上清中のタンパク濃度を参考例２（１）の方法にて求め、さらに参考例２（２）の方法にて、同培養上清を一定量加えた組成物Ｃにおける濁度から相対濁度（％）を求めた。
結果を表９に示す。いずれの変異グリコシドハイドロラーゼも、親グリコシドハイドロラーゼ（ＷＴ）に比較し、相対濁度が１５％以上低下した。すなわち変異グリコシドハイドロラーゼは親グリコシドハイドロラーゼに比較し、溶解性が向上した。
【００８６】
【表９】
0005977029.tif 000013
【００８７】
実施例３  多重変異体の溶解性評価
実施例２で見出された溶解性向上変異を多重化し、その効果を評価した。すなわち、実施例２で得られた溶解性が向上した変異グリコシドハイドロラーゼを産生する宿主菌からプラスミドを抽出し、このプラスミドを鋳型として実施例１と同様の方法を用いて、実施例２で見出された別の溶解性向上変異を導入し、二重変異体とした。３重変異体の作製は、同様の方法を用いて、２重変異体を産生する宿主菌からプラスミドを抽出し、このプラスミドを鋳型として実施例２で見出された別の溶解性向上変異を導入した。実施例２と同様の手順で、培養液上清中の各変異体の二重変異体及び三重変異体のタンパク濃度及び組成物Ｃにおける濁度を測定し、親グリコシドハイドロラーゼに対する相対濁度（％）を求めた。結果を表１０、表１１に示した。各表記載の二重変異体及び三重変異体は親グリコシドハイドロラーゼに比較し、溶解性が向上した。
【００８８】
【表１０】
0005977029.tif 000014
【００８９】
【表１１】
0005977029.tif 000015
【００９０】
実施例４  市販洗剤に対するグリコシドハイドロラーゼ変異体の溶解性評価
実施例２、３で用いた変異グリコシドハイドロラーゼを含む培養上清を用いて、同培養上清に含まれる変異グリコシドハイドロラーゼの市販濃縮液体洗剤〔組成物Ａ；アタックＮｅｏ（花王）、及び組成物Ｂ；ＮＡＮＯＸ（ライオン）、各組成を表１２に示す〕における相対濁度（％）を参考例２（２）の方法にて求めた。市販洗剤は、７０℃で８時間恒温とした後に、評価に用いた。
結果を表１３〜１５に示す。変異グリコシドハイドロラーゼは、親グリコシドハイドロラーゼに比較し、溶解性が向上した。
【００９１】
【表１２】
0005977029.tif 000016
【００９２】
【表１３】
0005977029.tif 000017
【００９３】
【表１４】
0005977029.tif 000018
【００９４】
【表１５】
0005977029.tif 000019
【配列表】
0005977029000001.app