(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体の完全長ＩｇＧ形態が１６０ｐＭ以下の結合親和性でヒトＨＧＦＡに特異的に結合し、ＨＧＦＡの残基４４９、４５０、４５２、４５３、４５５、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９６、５７８、５７９、５８０、６３６、６３７、６４０、６４３、６４４の全てに結合し、更に、ＨＧＦＡをアロステリックに阻害し、ＨＧＦＡへの結合についてＨＧＦＡ活性部位ブロッカーＫＤ１又はＡｃ-ＫＱＬＲ-クロロメチルケトン（「ＫＱＬＲ」、配列番号：１０として開示）と競合するが、ＨＧＦＡへの結合についてベンズアミジンと競合しない単離された抗ＨＧＦＡ抗体であって、
（ａ）配列ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号：１）を含んでなるＨＶＲ-Ｌ１；（ｂ）配列ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号：２）を含んでなるＨＶＲ-Ｌ２；（ｃ）配列ＱＱＳＮＲＡＰＡＴ（配列番号：３）を含んでなるＨＶＲ-Ｌ３を含んでなる軽鎖可変領域；及び／又は（ｄ）配列ＧＴＹＩＨ（配列番号：４）を含んでなるＨＶＲ-Ｈ１；（ｅ）配列ＧＩＹＰＡＧＧＡＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号：５）を含んでなるＨＶＲ-Ｈ２；及び（ｆ）配列ＷＷＡＷＰＡＦＤＹ（配列番号：６）を含んでなるＨＶＲ-Ｈ３を含んでなる重鎖可変領域を含んでなる抗体。
【請求項２】
配列：ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＮＲＡＰＡＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号：８）を有する軽鎖可変ドメインを含んでなり、更に重鎖可変ドメインを含む請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
配列：ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＧＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＧＩＹＰＡＧＧＡＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＷＷＡＷＰＡＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：９）を有する重鎖可変ドメインを含んでなり、更に軽鎖可変ドメインを含む請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
配列：ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＮＲＡＰＡＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号：８）を有する軽鎖可変ドメイン；及び配列：ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＧＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＧＩＹＰＡＧＧＡＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＷＷＡＷＰＡＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：９）を有する重鎖可変ドメインを含んでなる請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
ヒトκサブグループコンセンサスフレームワーク配列を含む請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
重鎖ヒトサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク配列を含む請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
一又は複数の位置７１又は７３に置換を含む請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
置換が一又は複数のＲ７１Ａ、Ｎ７３Ｔ、又はＮ７８Ａである請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
モノクローナル抗体である請求項１に記載の抗体。
【請求項１０】
キメラ抗体、ヒト化抗体、親和性成熟抗体、ヒト抗体、及び二重特異性抗体から成る群から選択される請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
抗体断片である請求項９に記載の抗体。
【請求項１２】
請求項１−１１の何れか一項に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１２のポリヌクレオチドを含んでなる宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１−１１の何れか一項に記載の抗体を製造する方法であって、抗体が生産されるように宿主細胞を培養することを含んでなる前記方法。
【請求項１５】
宿主細胞から抗体を回収することを更に含んでなる請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１−１１の何れか一項に記載の抗体及び細胞傷害剤を含んでなるイムノコンジュゲート。
【請求項１７】
請求項１−１１の何れか一項に記載の抗体及び薬学的に許容可能な担体を含んでなる薬学的製剤。
【請求項１８】
追加の治療剤を更に含んでなる請求項１７に記載の薬学的製剤。
【請求項１９】
医薬としての使用のための請求項１−１１の何れか一項に記載の抗体。
【請求項２０】
癌の治療における使用のための請求項１−１１の何れか一項に記載の抗体。
【請求項２１】
血管新生の阻害における使用のための請求項１−１１の何れか一項に記載の抗体。
【請求項２２】
細胞増殖の阻害における使用のための請求項１−１１の何れか一項に記載の抗体。
【請求項２３】
医薬の製造における請求項１−１１の何れか一項に記載の抗体の使用。
【請求項２４】
医薬が癌の治療のためである請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
医薬が血管新生の阻害又は細胞増殖の阻害のためである請求項２３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００９年１０月１９日に出願された、米国仮出願第６１／２５２，９７３号の優先権を主張するものであり、その内容は出典明記によりその全体を本明細書中に援用する。
【０００２】
本発明は一般に、分子生物学及び増殖因子制御の分野に関する。より具体的には、本発明は、肝細胞増殖因子アクチベーター機能のモジュレーター、及び前記モジュレーターの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
肝細胞増殖因子アクチベーター(ＨＧＦＡ)は、主に肝臓によって分泌される血漿トリプシン様セリンプロテアーゼであり、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ、散乱因子（ＳＦ）としても知られる)の分裂促進的、運動源性、形態形成活性をを調節する(Shimomura et al., Cytotech., 8:219-229 (1992))。ＨＧＦは、胚発生、組織再生及び浸潤性腫瘍増殖に関与する。この活性は、ＨＧＦの２鎖、ジスルフィド連結α,β-ヘテロ二量体形態へのタンパク質分解プロセスを必要とする。ＨＧＦＡは、これまでに同定されたＨＧＦの最も強力なアクチベーターの一つである。(Shimomura et al., Eur. J. Biochem. 229 (1995))。ＨＧＦＡ発現は、正常な胃腸腎臓組織において、及び中枢神経系において、並びに膵臓、肝細胞、結腸直腸、前立腺、及び肺癌細胞において報告されている。(Itoh et al., Biochim. Biophys. Acta, 1491:295-302 (2000); van Adelsberg et al., J. Biol. Chem., 276:15099-15106 (2001); Hayashi et al., Brain Res., 799:311-316 (1998); Moriyama et al., FEBS Lett., 372:78-82 (1995); Parr et al., Int. J. Oncol., 19:857-863 (2001); Kataoka et al., Cancer Res., 60:6148-6159 (2000); Nagata et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 289:205-211 (2001))。最近、複数の骨髄腫細胞からのＨＧＦＡ分泌が、ＨＧＦの強力なパラクリン及び／又はオートクリンと関連づけられた。(Tjin et al., Blood, 104:2172-2175 (2004))。
【０００４】
ＨＧＦＡは、凝固因子ＸＩＩ（ＦＸＩＩａ）のものと似たドメイン構造を有する９６ｋＤａの酵素前駆体（ｐｒｏＨＧＦＡ）として分泌され、６つのドメインを有する。これらのドメインは、Ｎ末端フィブロネクチンタイプＩＩドメイン、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）様ドメイン、フィブロネクチンタイプ１ドメイン、別のＥＧＦ様ドメイン、クリングルドメイン、及びＣ末端トリプシン相同セリンプロテアーゼドメインを含む。(Miyazawa, et al., J. Biol. Chem., 268:10024-10028 (1993))。残基Ａｒｇ３７２及びＶａｌ３７３間のカリクレイン感受性部位での切断は、最初の５ドメインを欠く短い３４ｋＤａを生成することができる。ｐｒｏＨＧＦＡの両９６ｋＤａ及び３４ｋＤａ形態は、トロンビンにより残基Ａｒｇ４０７及びＩｌｅ４０８間で切断され活性ＨＧＦＡになることができる。(Shimomura et al., J. Biol. Chem., 268, 22927-22932 (1993))。トロンビンは、凝血原刺激の最終エフェクターであり、活性ＨＧＦＡの生成は、創傷治癒においてＨＧＦの活性と一致するだろう。(Bussolino et al., J. Cell Biol., 119:625-641 (1992))。
【０００５】
要因の中でＨＧＦ／Ｍｅｔシグナル伝達に影響するものは、ｐｒｏＨＧＦＡの活性化及びその後のＨＧＦＡの阻害である。同定されたＨＧＦＡの生理学的阻害因子は、スプライスバリアントＨＡＩ-１及びＨＡＩ-１Ｂ（肝細胞増殖因子アクチベーターインヒビター-１）、及びＨＡＩ-２（胎盤ビクニンとしても知られる）である。(Shimomura et al., J. Biol. Chem., 272:6370-6376 (1997); Kawaguchi et al., J. Biol. Chem., 272:27558-27564 (1997); Kirchhofer et al., J. Biol. Chem. 278:36341-36349 (2003))。ＨＧＦＡは、制限された基質特異性を有する(Kataoka et al., Cancer metastasis reviews 22, 223-239 (2005); Miyazawa et al., J Biol Chem 268, 10024-10028 (1993))：２つの高分子基質、プロ肝細胞増殖因子（ｐｒｏ-ＨＧＦ) (Shinomura et al., Eur J Biochem 229, 257-261 (1995)及びプロマクロファージ刺激タンパク質（ｐｒｏ-ＭＳＰ）(Kawaguchi et al, Febs J 276(13)3481-3490 (2009)のみが、ＨＧＦＡにより加工されることが知られ、高く制限された酵素の基質特異性を例証する。ＨＧＦＡは、クニッツタイプインヒビターＨＧＦＡインヒビター-１によって阻害され、これは、カノニカルな阻害メカニズムによりＨＧＦＡを阻害するためにＮ末端クニッツドメイン-１（ＫＤ１）を利用する(Shia et al., J Mol Biol 346, 1335-13492005)。ＨＧＦＡは組織再生に影響し、ｐｒｏ-ＨＧＦプロセシング及び続くＨＧＦ／Ｍｅｔシグナル伝達経路の活性化により癌増殖を促進する(Parr and Jiang, Int’l J of Oncol 19, 857-863 (2001))。
【０００６】
酵素のアロステリック制御は、定義により、遠隔のエフェクター相互作用部位から生じる変化した触媒作用を含む。実際、全ての動的タンパク質（単量体及び多量体）は、アロステリズムの可能性を有するように思われる(Gunasekaran et al., Proteins 57, 433-443 (2004))。アロステリック調節及びその伝達の経路の解明は、かなりの注目を受けた(Swain and Gierasch, Curr Op in Structural Biol 16, 102-108 (2006); Yu and Koshland, PNAS 98, 9517-9520 (2001))。アロステリーの古典的な例はヘモグロビンに観察され(Perutz, Nature 228, 726-739 (1970))、アロステリック調節への最初の推定機構を提供する。その後、幾つかのＸ線結晶学的研究が登場し、アロステリック調節中のコンフォメーション的変化を説明した(Changeux and Edelstein, Science 308, 1424-1428 (2005); Di Cera, J Biol Chem 281, 1305-1308 (2006); Pellicena and Kuriyan, Nature 228, 726-739 (2006); Xu et al., Nature 388, 741-750 (1997))。アロステリーはまた、プロテアーゼの触媒作用を調節する非常に一般的で強力なメカニズムである(Hauske et al., Chembiochem 9, 2920-2928 (2008); Turk, Nature Reviews 5, 785-799 (2006))。活性部位と異なり、遠位に位置するアロステリック部位は通常、より少なく保存され、特異性を得るために活用できる(Hauske et al., supra)。アロステリックな抗プロテアーゼタンパク質に基づく薬剤は、それらが、強力で高い特異性を有し、それらの標的プロテアーゼによる何れかの偶発性プロセシングから保護されるため、良い治療可能性を有する。セリンプロテアーゼファミリーのアロステリック制御因子の例は(Clan PA, Family S1 in MEROPS nomenclature (Rawlings et al., Nucleic Acids Res 36, D320-325 (2008)))、ＨｔｒＡプロテアーゼファミリーのアクセサリーＰＤＺドメイン(Sohn et al., Cell 131, 572-583 (2007))、多くの凝固因子に対するカルシウム(Bjelke et al., J Biol Chem 283, 25863-25870 (2008))、トロンビンに対するナトリウム(Huntington, Biological chemistry 389, 1025-1035 (2008); Wells and Di Cera, Biochem 31, 11721-11730 (1992))、凝固因子ＶＩＩａに対する組織因子等のコファクター(Eigenbrot and Kirchhofer, Trends in Cardiovascular Med 12, 19-26 (2002))及び「活性化ポケット」へのＮ末端ペプチド挿入(Friedrich et al., Nature 425, 535-539 (2003); Huber and Bode, Acc Chem Res 11, 114-122 (1978))である。
【０００７】
プロテアーゼは、多くのヒトの病理学的過程に関係づけられてきた(Barrett et al., (1998). Handbook of Proteolytic Enzymes.? San Diego: Academic Press (1998); Egeblad and Werb, Nature Rev Cancer 2, 161-174 (2002); Hooper, Proteases in Biology and Medicine. In Essays in Biochemistry, London: Portland Press (2002); Luttun et al., Curr Atheroscler. Rep 2, 407-416 (2000))。従って、アロステリックインヒビターによるタンパク質分解活性の調節は、活性部位トポロジーは一般に同じファミリーのメンバー間で保存されるため不十分な特異性にしばしば悩まされる(Hedstrom, Chem Revs 102, 4501-4524 (2002))活性部位インヒビターへの有望な代替的アプローチを示しうる(Peterson and Golemis, J Cell Biochem 93, 68-73 (2004))。活性部位と異なり、遠位に位置するアロステリック部位は通常、より少なく保存され、特異性を得るために活用できる(Hauske et al., supra)。特異的であり強力なアロステリックインヒビターの素晴らしい例が、凝固因子ＶＩＩａ及びカスパーゼに関して記載された(Hardy et al., PNAS 101, 12461-12466 (2004); Hardy and Wells, Curr Op Structural Biol 14, 706-715 (2009))。
【０００８】
ｐｒｏ-ＨＧＦの活性は、ＨＧＦＡ等のコンバターゼによる切断を必要とするため、ＨＧＦＡ機能及び／又はそれの基質との相互作用の調節は、効果的な治療アプローチであると証明できる。この点において、ＨＧＦＡの活性を調節及び／又はと特異的に相互作用できる臨床的に関連した薬剤を同定する明瞭な必要性がある。
【０００９】
全ての刊行物、特許、及び特許文献は、出典明記により個々に援用するように、出典明記により本明細書中に援用する。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、肝細胞増殖因子アクチベーター(ＨＧＦＡ)機能を調節し、それによってＨＧＦＡ活性の生理学的効果を調節するための方法、組成物、キット及び製品を提供する。ＨＧＦＡ機能の調節は、ここに記載する抗体の使用によって達成される。ここに記載されるものは、アロステリックにＨＧＦＡ機能を阻害する抗ＨＧＦＡ抗体である。アロステリック抗プロテアーゼ抗体は、強力であり非常に特異的であり、それらの標的プロテアーゼにより何れの偶発的なプロセシングから保護されているため、大きな治療可能性を有しうる。
【００１１】
一態様では、本発明は、治療使用に適切であり、ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達経路の様々な程度の崩壊を達成できる抗ＨＧＦＡ治療剤を提供する。例えば、本発明は、単離された抗ＨＧＦＡ抗体であって、該抗体の完全長ＩｇＧ形態が、２０ｐｍ以下の結合親和性でヒトＨＧＦＡに特異的に結合する抗体を提供する。一実施態様では、単離された抗ＨＧＦＡ抗体は、約１０Ｘ１０５Ｍ−１ｓ−１以上のＫｏｎでヒトＨＧＦＡに特異的に結合する。一実施態様では、単離された抗ＨＧＦＡ抗体は、約１．７Ｘ１０−４ｓ−１以下のＫｏｆｆでヒトＨＧＦＡに特異的に結合する。
【００１２】
一実施態様では、ヒトＨＧＦＡに対する抗体の二価親和性が、（ａ）配列ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号：１）を含んでなるＨＶＲ-Ｌ１；（ｂ）配列ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号：２）を含んでなるＨＶＲ-Ｌ２；（ｃ）配列ＱＱＳＹＴＴＰＰＴ（配列番号：７）を含んでなるＨＶＲ-Ｌ３；（ｄ）配列ＧＴＹＩＨ（配列番号：４）を含んでなるＨＶＲ-Ｈ１；（ｅ）配列ＧＩＹＰＡＧＧＡＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号：５）を含んでなるＨＶＲ-Ｈ２；及び（ｆ）配列ＷＷＡＷＰＡＦＤＹ（配列番号：６）を含んでなるＨＶＲ-Ｈ３を含んでなる、から成る、から基本的に成る抗体の二価親和性より低い、例えば少なくとも３、５、７又は１０倍以下、又はそれ以上、例えば４０倍又は６０倍以上低い親和性成熟抗ＨＧＦＡ抗体を提供する。
【００１３】
当技術分野で良く達成されたように、リガンドのその受容体への結合親和性は、様々なアッセイの何れかを使用して決定でき、様々な定量的値によって表されることができる。
【００１４】
従って、一実施態様では、結合親和性はＫｄ値として表され、内因性結合親和性を反映する（例えば最小化されたアビディティー効果と共に）。一般に、好ましくは、結合親和性は、無細胞又は細胞関連セッティングに関わらずインビトロで測定される。ここにより詳細に記載されるように、結合親和性における倍差異（fold difference）は、ヒト化抗体の一価の結合親和性値（例えばＦａｂ形態において）及び参照／コンパレータ抗体の一価の結合親和性値（例えばＦａｂ形態において）の比によって定量化でき、結合親和性値は類似のアッセイ条件下で決定される。従って、一実施態様では、結合親和性における倍差異は、Ｆａｂ形態でのヒト化抗体及び参照／コンパレータＦａｂ抗体のＫｄ値の比として決定される。例えば、一実施態様では、本発明の抗体（Ａ）は参照抗体（Ｍ）の親和性より「３倍低い」親和性を有し、ＡのＫｄ値が３ｘの場合、ＭのＫｄ値は１ｘと考えられ、ＡのＫｄ対ＭのＫｄの比は３：１だろう。逆に、一実施態様では、本発明の抗体（Ｃ）の親和性が参照抗体（Ｒ）の親和性より「３倍大きい」場合は、ＣのＫｄ値が１ｘの場合は、ＲのＫｄ値は３ｘであり、ＣのＫｄ対ＲのＫｄの比は１：３だろう。ここに記載のものを含め、当分野で知られる多くのアッセイの何れかを、結合親和性測定を得るために使用でき、例えばＢｉａｃｏｒｅ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及びＥＬＩＳＡを含む。
【００１５】
一態様では、本発明は単離された抗ＨＧＦＡ抗体であって、抗体が、ＨＧＦＡの残基４４６、４４９、４５０、４５２、４５３、４５５、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９６、４９９、５０１、５７８、５７９、５８０、６３６、６３７、６４０、６４３、６４４の少なくとも１、２、３、４、又は全てまでの何れかの数に結合し、更に、抗体がアロステリックにＨＧＦＡを阻害し、ＨＧＦＡへの結合をＨＧＦＡ活性部位ブロッカーＫＤ１又はＡｃ-ＫＱＬＲ-クロロメチルケトン(配列番号：１０として開示される「ＫＱＬＲ」)と競合するが、ＨＧＦＡへの結合をベンズアミジンと競合しない抗体を提供する。幾つかの実施態様では、抗体は、ＨＧＦＡ活性（触媒）部位を遮断する化合物の不在下ではＨＧＦＡに結合するが、ＨＧＦＡ活性部位を遮断する化合物の存在下ではＨＧＦＡに結合しない。幾つかの実施態様では、抗体は、ＨＧＦＡ基質のＨＧＦＡ活性化を競合的に阻害する。幾つかの実施態様では、抗体は、ＨＧＦＡの残基４４９、４５０、４５２、４８２、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１の少なくとも１、２、３、４、又は全てまでの何れかの数に結合する。幾つかの実施態様では、抗体は、ＨＧＦＡの残基４４６、４８２、４８４、４９０、４９９、５０１の少なくとも１、２、３、４、又は全てまでの何れかの数に結合する。
【００１６】
一態様では、本発明は、（ａ）配列ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号：１）を含んでなるＨＶＲ-Ｌ１；（ｂ）配列ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号：２）を含んでなるＨＶＲ-Ｌ２；（ｃ）配列ＱＱＳＮＲＡＰＡＴ（配列番号：３）を含んでなるＨＶＲ-Ｌ３；（ｄ）配列ＧＴＹＩＨ（配列番号：４）を含んでなるＨＶＲ-Ｈ１；（ｅ）配列ＧＩＹＰＡＧＧＡＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号：５）を含んでなるＨＶＲ-Ｈ２；及び（ｆ）配列ＷＷＡＷＰＡＦＤＹ（配列番号：６）を含んでなるＨＶＲ-Ｈ３；からなる群から選択される少なくとも１、２、３、４、５、及び／又は６の超可変領域（ＨＶＲ）配列を有する単離された抗ＨＧＦＡ抗体を提供する。幾つかの実施態様では、ＨＶＲ-Ｈ１は配列ＮＧＴＹＩＨ（配列番号：４３）を有する。幾つかの実施態様では、ＨＶＲ-Ｈ１は配列ＧＦＴＦＮＧＴＹＩＨ（配列番号：４４）を有する。幾つかの実施態様では、ＨＶＲ-Ｈ２は配列ＧＧＩＹＰＡＧＧＡＴＹＹ（配列番号：４５）を有する。幾つかの実施態様では、ＨＶＲ-Ｈ３は配列ＫＷＷＡＷＰＡＦＤＹ（配列番号：４６）を有する。
【００１７】
一態様では、本発明は、（ａ）配列ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号：１）を含んでなるＨＶＲ-Ｌ１；（ｂ）配列ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号：２）を含んでなるＨＶＲ-Ｌ２；（ｃ）配列ＱＱＳＮＲＡＰＡＴ（配列番号：３）を含んでなるＨＶＲ-Ｌ３を含んでなる軽鎖可変領域を含んでなる抗ＨＧＦＡ抗体を提供する。
【００１８】
一態様では、本発明は、（ｄ）配列ＧＴＹＩＨ（配列番号：４）を含んでなるＨＶＲ-Ｈ１；（ｅ）配列ＧＩＹＰＡＧＧＡＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号：５）を含んでなるＨＶＲ-Ｈ２；及び（ｆ）配列ＷＷＡＷＰＡＦＤＹ（配列番号：６）を含んでなるＨＶＲ-Ｈ３を含んでなる重鎖可変領域を含んでなる抗ＨＧＦＡ抗体を提供する。
【００１９】
一態様では、本発明は、（ａ）配列ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号：１）を含んでなるＨＶＲ-Ｌ１；（ｂ）配列ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号：２）を含んでなるＨＶＲ-Ｌ２；（ｃ）配列ＱＱＳＮＲＡＰＡＴ（配列番号：３）を含んでなるＨＶＲ-Ｌ３を含んでなる軽鎖可変領域；及び（ｄ）配列ＧＴＹＩＨ（配列番号：４）を含んでなるＨＶＲ-Ｈ１；（ｅ）配列ＧＩＹＰＡＧＧＡＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号：５）を含んでなるＨＶＲ-Ｈ２；及び（ｆ）配列ＷＷＡＷＰＡＦＤＹ（配列番号：６）を含んでなるＨＶＲ-Ｈ３を含んでなる重鎖可変領域を含んでなる抗ＨＧＦＡ抗体を提供する。
【００２０】
一実施態様では、本発明の抗ＨＧＦＡ抗体は、配列：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＮＲＡＰＡＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号：８）を有する軽鎖可変ドメインを有し：更に重鎖可変ドメインを有する。
【００２１】
一実施態様では、本発明の抗ＨＧＦＡ抗体は、配列：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＧＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＧＩＹＰＡＧＧＡＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＷＷＡＷＰＡＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：９）を有する重鎖可変ドメインを有し：更に軽鎖可変ドメインを有する。
【００２２】
一実施態様では、本発明の抗ＨＧＦＡ抗体は、
配列：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＮＲＡＰＡＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号：８）を有する軽鎖可変ドメイン；及び
配列：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＧＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＧＩＹＰＡＧＧＡＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＷＷＡＷＰＡＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：９）を有する重鎖可変ドメインを有する。
【００２３】
本発明の抗体は、ＨＧＦＡ結合活性が実質的に保持されるならば、何れかの適切なフレームワーク及び／又は軽鎖可変ドメイン配列を更に有することができる。例えば、幾つかの実施態様では、これらの抗体は、ヒトサブグループＩＩＩ重鎖フレームワークコンセンサス配列を更に含む。これらの抗体の一実施態様では、フレームワークコンセンサス配列は、位置７１、７３及び／又は７８で置換を有する。これらの抗体の幾つかの実施態様では、位置７１はＡ、７３はＴ及び／又は７８はＡである。一実施態様では、これらの抗体は、ヒト化４Ｄ５抗体の重鎖可変ドメインフレームワーク配列を有する（ｈｕＭＡｂ ４Ｄ５-８）(HERCEPTINR, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA) (also referred to in U.S. Pat. No. 6,407,213 and Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-93)。一実施態様では、ヒト化４Ｄ５-８抗体は米国特許第６，４０７，２１３号に記載される抗体である。一実施態様では、これらの抗体は、ヒトκＩ軽鎖フレームワークコンセンサス配列を更に有する。
【００２４】
一態様では、本発明は、ＨＧＦＡへの結合に関して上記記載の抗体の何れかと競合する抗体を提供する。一態様では、本発明は、上記抗体の何れかと同じＨＧＦＡ上のエピトープに結合する抗体を提供する。
【００２５】
一実施態様では、本発明の抗体は、親和性成熟、ヒト化、キメラ、又はヒト抗体である。一実施態様では、本発明の抗体は、(ここに記載の)抗体断片又は実質的に完全長の抗体である。一実施態様では、本発明の抗体は、野生型Ｆｃ領域、又はその変異体を有する。一実施態様では、本発明の抗体は、ＩｇＧ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＥ又はＩｇＤである。
【００２６】
一態様では、本発明の抗体は、細胞傷害剤等の毒素に結合される。これらの分子／物質は、放射線及び／又は化学療法剤等の添加／促進剤と組み合わせて製剤又は投与されることができる。
【００２７】
ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達経路は、例えば細胞増殖刺激（例えば細胞増殖、細胞生存、細胞遊走、細胞形態形成）及び血管新生を含む複数の生物学的及び生理学的機能に関与する。従って、別の態様では、本発明は、ｃ-ｍｅｔ活性型細胞増殖（例えば増殖及び／又は生存）を阻害する方法を提供し、前記方法は、細胞又は組織を本発明の抗体を接触させることを含み、これによりｃ-ｍｅｔ活性化に関連する細胞増殖が阻害される。更に別の態様では、本発明は、血管新生を阻害する方法を提供し、前記方法は、異常血管新生を伴う状態を有する細胞、組織、及び／又は被験体に、本発明の抗体を投与することを含んでなり、これによって血管新生が阻害される。
【００２８】
一態様では、本発明は、病気、例えば癌、腫瘍、細胞増殖性疾患、免疫(例えば自己免疫)疾患、及び／又は血管新生関連疾患の治療及び／又は予防的処置のための医薬の調製における、本発明の抗体の使用を提供する。
【００２９】
一態様では、本発明は、病気、例えば癌、腫瘍、細胞増殖性疾患、免疫(例えば自己免疫)疾患、及び／又は血管新生関連疾患の治療及び／又は予防的処置のための医薬の調製における、本発明の核酸の使用を提供する。
【００３０】
一態様では、本発明は、病気、例えば癌、腫瘍、細胞増殖性疾患、免疫(例えば自己免疫)疾患、及び／又は血管新生関連疾患の治療及び／又は予防的処置のための医薬の調製における、本発明の発現ベクターの使用を提供する。
【００３１】
一態様では、本発明は、病気、例えば癌、腫瘍、細胞増殖性疾患、免疫(例えば自己免疫)疾患、及び／又は血管新生関連疾患の治療及び／又は予防的処置のための医薬の調製における、本発明の宿主細胞の使用を提供する。
【００３２】
一態様では、本発明は、病気、例えば癌、腫瘍、細胞増殖性疾患、免疫(例えば自己免疫)疾患、及び／又は血管新生関連疾患の治療及び／又は予防的処置のための医薬の調製における、本発明の製造品の使用を提供する。
【００３３】
一態様では、本発明は、病気、例えば癌、腫瘍、細胞増殖性疾患、免疫(例えば自己免疫)疾患、及び／又は血管新生関連疾患の治療及び／又は予防的処置のための医薬の調製における、本発明のキットの使用を提供する。
【００３４】
一態様では、本発明は、ｃ-ｍｅｔ活性化細胞増殖を阻害する方法を提供するものであり、該方法は、本発明の有効量の抗体と、細胞又は組織とを接触させることを含み、よってｃ-ｍｅｔ活性化に関連した細胞増殖が阻害される。
一態様では、本発明は、患者のｃ-ｍｅｔ活性化の調節不全に関連した病態を処置する方法を提供するものであり、該方法は、本発明の有効量の抗体を患者に投与することを含み、よって該病態は処置される。
【００３５】
一態様では、本発明は、ｃ-ｍｅｔ又は肝細胞増殖因子又はその双方を発現する細胞の増殖を阻害する方法を提供するもので、該方法は、本発明の抗体と該細胞とを接触させることを含み、よって該細胞の増殖が阻害される。一実施態様では、細胞は種々の細胞により発現されるＨＧＦにより(例えばパラクリン作用を介して)接触させられる。
一態様では、本発明は、ｃ-ｍｅｔ又は肝細胞増殖因子又はその双方を発現する細胞を含有する癌性腫瘍を有する哺乳動物を治療的処置する方法を提供するもので、該方法は、本発明の有効量の抗体を、該哺乳動物に投与することを含み、それにより、該哺乳動物が効果的に処置される。一実施態様では、細胞は種々の細胞により発現されるＨＧＦにより(例えばパラクリン作用を介して)接触させられる。
【００３６】
一態様では、本発明は、ＨＧＦＡの増加した発現又は活性を伴う細胞増殖性疾患を治療又は防止する方法を提供し、前記方法は、かかる治療を必要とする被験体に有効量の本発明の抗体を投与することを含んでなり、これにより前記細胞増殖性疾患を効果的に治療又は防止する。一実施態様では、前記増殖性疾患は癌である。
【００３７】
一態様では、本発明は、ｃ-ｍｅｔ又は肝細胞増殖因子又はその双方の増加した発現又は活性を伴う細胞増殖性疾患を治療又は防止する方法を提供し、前記方法は、かかる治療を必要とする被験体に有効量の本発明の抗体を投与することを含んでなり、これにより前記細胞増殖性疾患を効果的に治療又は防止する。一実施態様では、前記増殖性疾患は癌である。
【００３８】
一態様では、本発明は細胞増殖を阻害する方法を提供するもので、ここで該細胞増殖は、ＨＧＦＡの増殖効果に少なくとも部分的に依存しており、該方法は、本発明の有効量の抗体を該細胞と接触させることを含み、それにより、該細胞の増殖が阻害される。一実施態様では、細胞は種々の細胞により発現されるＨＧＦにより(例えばパラクリン作用を介して)接触させられる。
【００３９】
一態様では、本発明は細胞増殖を阻害する方法を提供するもので、ここで該細胞増殖は、ｃ-ｍｅｔ又は肝細胞増殖因子又はその双方の増殖効果に少なくとも部分的に依存しており、該方法は、本発明の有効量の抗体を該細胞と接触させることを含み、それにより、該細胞の増殖が阻害される。一実施態様では、細胞は種々の細胞により発現されるＨＧＦにより(例えばパラクリン作用を介して)接触させられる。
【００４０】
一態様では、本発明は、哺乳動物の腫瘍を治療的に処置する方法を提供し、該腫瘍の増殖は、ＨＧＦＡの増殖効果に少なくとも部分的に依存しており、該方法は、本発明の有効量の抗体を、該細胞と接触させることを含み、それにより、該腫瘍が効果的に処置される。一実施態様では、細胞は種々の細胞により発現されるＨＧＦにより(例えばパラクリン作用を介して)接触させられる。
【００４１】
一態様では、本発明は、哺乳動物の腫瘍を治療的に処置する方法を提供し、該腫瘍の増殖は、ｃ-ｍｅｔ又は肝細胞増殖因子又はその双方の増殖効果に少なくとも部分的に依存しており、該方法は、本発明の有効量の抗体を、該細胞と接触させることを含み、それにより、該腫瘍が効果的に処置される。一実施態様では、細胞は種々の細胞により発現されるＨＧＦにより(例えばパラクリン作用を介して)接触させられる。
【００４２】
本発明の方法は、例えばＨＧＦのＨＧＦＡ活性化に関連したＨＧＦ活性を増加することにより、例えばＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達経路の調節不全に関連した細胞及び／又は組織の、任意の適切な病理状態に影響を与えるように使用することができる。一実施態様では、本発明の方法の標的細胞は癌細胞である。例えば、癌細胞は、乳癌細胞、直腸結腸癌細胞、肺癌細胞、乳頭癌細胞(例えば甲状腺)、大腸癌細胞、膵癌細胞、卵巣癌細胞、子宮頸癌細胞、中枢神経系癌細胞、骨原性肉腫細胞、腎癌細胞、肝臓癌細胞、膀胱癌細胞、aprostate癌細胞、胃癌細胞、頭部及び頸部の扁平上皮癌細胞、中皮腫細胞、黒色腫細胞、及び白血病細胞からなる群から選択することができる。一実施態様では、本発明の方法の標的細胞は、過剰増殖性及び／又は過形成細胞である。一実施態様では、本発明の方法の標的細胞は形成異常細胞である。さらなる他の実施態様では、本発明の方法の標的細胞は転移細胞である。
【００４３】
本発明の方法は、付加的な処置工程をさらに含む。例えば一実施態様では、方法は、放射線処置又は化学療法剤に、標的細胞及び／又は組織(例えば癌細胞)を暴露させる工程をさらに含む。
【００４４】
ここで記載したように、ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔ活性化は重要な生物学的プロセスであり、その調節不全により、多数の病態に至る。従って、本発明の方法の一実施態様では、標的細胞(例えば癌細胞)とは、同じ組織起源の正常な細胞と比較して、ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔの活性度が高められているものである。一実施態様では、本発明の方法は、標的細胞に死をもたらす。例えば、本発明のモジュラー分子と接触すると、結果としてｃ-ｍｅｔ経路を介したシグナル伝達に対して細胞不能になり、結果として細胞死となる。
【００４５】
ｃ-ｍｅｔの活性化（従ってシグナル伝達）の調節不全は、多くの細胞変化から生じ得、例えば、ＨＧＦ（ｃ-ｍｅｔの同族リガンド）及び／又はＨＧＦＡの過剰発現、及び／又はＨＧＦＡによるＨＧＦの活性化亢進を含む。従って、幾つかの実施態様では、本発明の方法は、同じ起源の正常組織と比較して、一又は複数のＨＧＦＡ、ｃ-ｍｅｔ及び肝細胞増殖因子が大量に発現されている及び／又は存在する組織（例えば癌）を標的にすることを含む。ＨＧＦ又はｃ-ｍｅｔ発現細胞は、様々な供給源からのＨＧＦＡによって調節されることが可能であり、すなわちオートクリン又はパラクリンである。例えば、本発明の方法の一実施態様では、標的化細胞は、異なる細胞で発現されたＨＧＦＡによって活性化された肝細胞増殖因子によって接触／結合される（例えばパラクリン作用によって）。前記異なる細胞は、同じ又は異なる組織起源が可能である。一実施態様では、標的化細胞は、標的化細胞自身によって発現されたＨＧＦＡによって活性化されたＨＧＦに接触／結合される（例えばオートクリン作用／ループによって）。
【００４６】
一態様では、本発明は、一又は複数の本発明の抗体及び担体を含んでなる組成物を提供する。一実施態様では、担体は薬学的に許容可能である。一態様では、本発明は、本発明の抗体をコードする核酸を提供する。一実施態様では、本発明の核酸は、抗体又はその断片であるか又はを含むモジュレーター分子をコードする。
【００４７】
一態様では、本発明は、本発明の核酸を含んでなるベクターを提供する。一態様では、本発明は、本発明の核酸又はベクターを含んでなる宿主細胞を提供する。ベクターは何れのタイプが可能であり、例えば発現ベクターなどの組換えベクターである。様々な宿主細胞の何れかを使用することが可能である。一実施態様では、宿主細胞は原核生物細胞であり、例えば大腸菌である。一実施態様では、宿主細胞は真核生物細胞であり、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等の哺乳類細胞である。
【００４８】
一態様では、本発明は本発明の抗体の製造方法を提供する。例えば、本発明は、抗体（又はその断片）であるか又はを含むモジュレーター分子の製造方法を提供し、前記方法は、適切な宿主細胞において、前記抗体（又はその断片）をコードする本発明の組換えベクターを発現すること、及び前記抗体を回収することを含んでなる。
【００４９】
一態様では、本発明は、容器、及び容器に収容される組成物を含んでなる製造品を提供し、組成物は、一又は複数の本発明の抗体を含有する。一実施態様では、組成物は本発明の核酸を有する。一実施態様では、抗体を含んでなる組成物は担体を更に含んでなり、それは幾つかの実施態様では薬学的に許容可能である。一実施態様では、本発明の製造品は、被験体に組成物（例えば抗体）を投与するための指示を更に有する。
【００５０】
一態様では、一又は複数の本発明の抗体を含んでなる組成物を収容する第一の容器；及びバッファーを収容する第二の容器を含んでなるキットを提供する。一実施態様では、バッファーは薬学的に許容可能である。一実施態様では、抗体を含んでなる組成物は担体を更に含み、それは幾つかの実施態様では薬学的に許容可能である。一実施態様では、キットは、被験体に組成物（例えば抗体）を投与するための指示を更に有する。
【００５１】
一態様では、本発明は疾患を診断する方法であって、サンプルを本発明の抗体に接触することによって組織細胞の試験サンプルにおけるＨＧＦＡのレベルを決定することを含んでなり、抗体に結合されたＨＧＦＡはサンプルにおけるＨＧＦＡの存在及び／又は量を示す方法を提供する。別の態様では、本発明は、個体が疾患の危険にあるか決定する方法であって、試験サンプルを本発明の抗体と接触させることによって、組織細胞の試験サンプルにおけるＨＧＦＡのレベルを決定することを含んでなり、これによってサンプルに存在するＨＧＦＡの量を決定し、試験サンプルと同じ細胞起源の正常組織を含んでなるコントロールサンプルと比較して試験サンプルにおけるＨＧＦＡのより高いレベルは、個体が疾患の危険にあることを示す方法を提供する。本発明の方法の一実施態様では、ＨＧＦＡのレベルは、試験サンプルにおける抗体に結合されたＨＧＦＡの量によって示されるＨＧＦＡポリペプチドの量に基づいて決定される。方法で使用される抗体は場合によっては検出可能に標識されてもよく、固相サポートに結合等されてもよい。
【００５２】
一態様では、本発明は、血流、例えば血液中に存在するＨＧＦＡに、本発明の抗体を結合する方法を提供する。
【００５３】
更に別の態様では、本発明は、本発明の抗体を、ＨＧＦＡを発現する及び／又はに関与する細胞に結合する方法を指向し、方法は、ＨＧＦＡへの抗体の結合に適切であり、それらの間の結合を可能にする条件下で、前記細胞と前記抗体を接触することを含む。一実施態様では、細胞におけるＨＧＦＡへの前記抗体の結合は、ＨＧＦＡの生物学的機能を阻害する。一実施態様では、前記抗体は、ＨＧＦＡとその基質分子との相互作用を阻害しない。一実施態様では、前記抗体は細胞上のＨＧＦＡに結合し、別の分子（例えばｐｒｏ-ＨＧＦ）がＨＧＦＡ分子に結合するのを阻害する。
【００５４】
一態様では、本発明は、宿主におけるＨＧＦＡ関連組織に治療剤をターゲティングするする方法を提供し、該方法は本発明の抗体に結合された形態における前記治療剤を宿主に投与することを含んでなり、これによって薬剤が宿主におけるＨＧＦＡ関連組織に向けられる方法を提供する。一実施態様では、ＨＧＦＡに結合する抗体は、細胞におけるＨＧＦＡに特異的に結合することが可能であり（インビトロ又はインビボ何れか）、例えばＨＧＦＡは細胞の表面に存在するところである。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】抗ＨＧＦＡ抗体のＣＤＲ配列。残基はＫａｂａｔ番号付けシステムにより番号付けされる(Kabat et al., 1991)。Ａｂ３９及びＡｂ４０間の配列バリエーションはシェーディングされる。Ｆａｂ４０の一残基欠失（Ｔｒｐ９６Ｈ）を太字で強調した。図１は、「ＣＤＲ-Ｌ１」を配列番号１、１、及び１として、「ＣＤＲ-Ｌ２」を配列番号２、２、及び２として、「ＣＤＲ-Ｌ３」を配列番号２２、３、及び３として、「ＣＤＲ-Ｈ１」を配列番号２３、２３、及び２３として、「ＣＤＲ-Ｈ２」を配列番号４７、４７、及び４７として、及び「ＣＤＲ-Ｈ３」を配列番号４６、４６、及び２４として開示する。
【図２】Ａｂ４０によるＨＧＦＡ酵素的活性の阻害。（ａ）Ａｂ４０の３倍段階希釈の存在下におけるＨＧＦＡよる１２５Ｉ-ｐｒｏ-ＨＧＦの切断。切断産物ＨＧＦα及びβ鎖をＳＤＳ-ＰＡＧＥ（還元条件）、その後Ｘ線フィルム露光によって分析した。（ｂ）Ａｂ４０による発色性基質Ｓ-２２６６加水分解の部分阻害（ＨＧＦＡ部分活性ｖｉ／ｖｏとして表す）、及びＡｂ４０．ΔＴｒｐによる阻害の欠如。（ｃ）Ａｂ４０によるＨＧＦＡ阻害のＥａｄｉｅ-Ｈｏｆｓｔｅｅプロット（３倍希釈工程において１μＭ−０．００４μＭ；黒ダイヤモンド＝「無抗体」コントロール）は競合阻害を示す（コントロールに関してＶｍａｘ＝０．９９μＭ ｐＮＡ／分及びＫｍ＝０．２３ｍＭ；１μＭのＡｂ４０に関してＶｍａｘａｐｐ＝０．９９μＭ ｐＮＡ／分及びＫｍａｘａｐｐ＝０．８２ｍＭ）。
【図３】ＨＧＦＡに結合する抗体における活性部位阻害剤の効果。（ａ−ｂ，ｅ−ｆ）ＨＧＦＡ（ａ，ｅ）又はＨＧＦＡ-ＫＱＬＲ（ｂ，ｆ）複合体（配列番号：１０として開示される「ＫＱＬＲ」）の共注入後の、固定化抗体、Ａｂ４０（ａ−ｂ）又はＡｂ４０．ΔＴｒｐ（ｅ−ｆ）への結合の表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）測定。（ｃ）異なる濃度のＫＤ１の存在下における、固定化Ａｂ４０へのＨＧＦＡの競合結合（ＢＩＡｃｏｒｅ）。（ｄ）漸増抗体濃度の存在下におけるＨＧＦＡのビチオン下ＫＤ１への結合を測定する競合結合ＥＬＩＳＡ。
【図４Ａ】ＨＧＦＡ／Ｆａｂ４０複合体の構造。（ａ）二次構造を有する表面表現であり、ＨＧＦＡ (リボン)及びＦａｂ４０（軽鎖: 薄い灰色及び重鎖：暗い灰色)間での複合体を強調する。触媒三残基（Ｈｉｓ５７-Ａｓｐ１０２-Ｓｅｒ１９５）残基を示し、９９-ループを矢印で強調する。
【図４Ｂ】ＨＧＦＡ／Ｆａｂ４０複合体の構造。（ｂ）ＨＧＦＡ／Ｆａｂ４０（薄い灰色）構造とＨＧＦＡ／Ｆａｂ７５(Wu et al, 2007) (暗い灰色) の重ね合わせであり、９９-ループ (黒)での変化以外、ＨＧＦＡのコンフォメーションにおける著しい変化を示さない。
【図４Ｃ】ＨＧＦＡ／Ｆａｂ４０複合体の構造。（ｃ）Ｆａｂ４０のＣＤＲ-ループ（Ｌ１-３，Ｈ１-３）とＨＧＦＡ(表面表現)との相互作用の接近図。界面相互作用に関与する必須残基を強調し、９９-ループを赤で示す。幾つかの水素結合とは別に、ＨＧＦＡのＡｓｐ２４１及びＦａｂ４０のＬｙｓ６４Ｈ間の単塩橋が観察される。
【図５Ａ】ＨＧＦＡ／Ｆａｂ４０エピトープ及びパラトープ、ＨＧＦＡ (薄い灰色)及びＦａｂ４０（軽鎖を薄い灰色、重鎖を暗い灰色）。（ａ）ＨＧＦＡ（薄い灰色）におけるＦａｂ４０定常領域のエピトープ（暗い灰色，４Ａカットオフ）。触媒三残基及び基質結合サブサイトＳ１-Ｓ４を示す。
【図５Ｂ】ＨＧＦＡ／Ｆａｂ４０エピトープ及びパラトープ、ＨＧＦＡ (薄い灰色)及びＦａｂ４０（軽鎖を薄い灰色、重鎖を暗い灰色）。（ｂ）ＨＧＦＡにおけるＦａｂ４０定常領域の異なる見方であり、トロンビン（緑）におけるエキソサイトに対応する領域と部分的な重なりを有する。
【図５Ｃ】ＨＧＦＡ／Ｆａｂ４０エピトープ及びパラトープ、ＨＧＦＡ (薄い灰色)及びＦａｂ４０（軽鎖を薄い灰色、重鎖を暗い灰色）。（ｃ）Ｆａｂ４０におけるＨＧＦＡ定常領域（点線，４Ａカットオフ）。重鎖が、ＨＧＦＡとの密接接触に関与し、Ｆａｂ４０結合の際にＨＧＦＡに埋まる全アクセス可能表面積の三分の二に貢献する。
【図６ＡＢ】ＨＧＦＡの９９-ループの３つの構造的スナップショット。（ａ）９９-ループのコンフォメーションにおける「アロステリックスイッチ」は、深い疎水性ポケット（暗い灰色，ＨＧＦＡの残基Ａｌａ５６、Ｐｒｏ９０、Ｔｙｒ８８、Ｖａｌ９６、Ｖａｌ１０５及びＩｌｅ１０７）の形成に導き、Ｆａｂ４０のＴｒｐ９６Ｈの結合を可能にする。（ｂ）ＨＧＦＡ／Ｆａｂ４０．ΔＴｒｐにおける疎水性ポケット（暗い灰色）のサイズは、Ｖａｌ９６及びこのポケットを裏打ちする他の残基の動きにより厳しく制限される。
【図６ＣＤＥＦ】ＨＧＦＡの９９-ループの３つの構造的スナップショット。（ｃ）他の既知の構造に見られるＨＧＦＡの９９-ループの「リラックス」状態(Shia et al., 2005; Wu et al., 2007)。（ｄ）ＨＧＦＡ（薄い灰色及びＨＧＦＡ／Ｆａｂ４０（暗い灰色）複合体の９９-ループの重ね合わせ。Ｆａｂ４０結合における９９-ループの構造遷移、９９-ループ残基の主鎖は＞１Ａシフトし、側鎖コンフォメーションは、＞２．０取り外される。Ｆａｂ４０のＣＤＲ-Ｈ３ループをスティク表現（上部）において強調する。（ｅ）ＨＧＦＡ／Ｆａｂ４０．ΔＴｒｐの９９-ループの、ＨＧＦＡの９９-ループ、及びＨＧＦＡ／Ｆａｂ４０の９９-ループとの重ね合わせ。９９-ループのコンフォメーション（薄い灰色）は、Ｆａｂ４０．ΔＴｒｐ／ＨＧＦＡ複合体構造における「リラックス」状態にほぼ復帰している。Ｆａｂ４０．ΔＴｒｐのＣＤＲ-Ｈ３ループを、スティック表現（暗い灰色）で強調する。（ｆ）ＨＧＦＡ／Ｆａｂ４０．ΔＴｒｐの９９-ループの、ＨＧＦＡ／Ｆａｂ４０の９９-ループとの重ね合わせ、Ｆａｂ４０のＴｒｐ９６Ｈの欠如（点線）におけるＣＤＲ-Ｈ３ループにおけるマイナー変化を示す。
【図７】アロステリック機構（ａ）ペプチドインヒビターＡｃ-ＫＱＬＲ-ｃｍｋ（配列番号：１０として開示される「ＫＱＬＲ」）（暗い灰色のＣＰＫ球表現に埋め込まれたスティック、下側）の立体視が、ＨＧＦＡ-ＫＱＬＲ／Ｆａｂ４０．ΔＴｒｐ複合体（配列番号：１０として開示される「ＫＱＬＲ」）におけるＨＧＦＡの活性Ｓｅｒ１９５及びＨｉｓ５７に共有結合される。Ｐ２-Ｌｅｕは、９９-ループ（薄い灰色のトッド表現に埋め込まれたスティック）のＰｒｏ９９ａに対してきつく詰められ、Ｓｅｒ９９との水素結合がＰ４-Ｌｙｓを安定化する。
【図７Ｂ】アロステリック機構（ｂ）ＨＧＦＡ／Ｆａｂ４０構造のＨＧＦＡ-ＫＱＬＲ／Ｆａｂ４０．ΔＴｒｐ（配列番号：１０として開示される「ＫＱＬＲ」）との重ね合わせから得られたＨＧＦＡ-ＫＱＬＲ／Ｆａｂ４０（配列番号：１０として開示される「ＫＱＬＲ」）のモデルの立体視は、アロステリック阻害が、Ｐｒｏ９９ａ及びＳｅｒ９９間での９９-ループのＰ２-Ｌｅｕ（白のドット表現に埋め込まれたスティック）との立体衝突によることを示す。
【図７Ｃ】アロステリック機構（ｃ）ＨＧＦＡ-ＫＱＬＲ／Ｆａｂ４０．ΔＴｒｐ（配列番号：１０として開示される「ＫＱＬＲ」）のＨＧＦＡ-ＫＱＬＲ／Ｆａｂ４０（配列番号：１０として開示される「ＫＱＬＲ」）のモデルとの重ね合わせの立体視であり、決定的なコンフォメーション変化及び、ＨＧＦＡのＳｅｒ９９及び阻害剤のＰ４-Ｌｙｓ間の水素結合の破壊を強調する。
【図８】阻害のアロステリック機構を図示する漫画モデル。機能的活性状態では、結合サブサイトは基質に対して到達可能であり、「アロステリックスイッチ」は「ＯＦＦ」状態である。Ｆａｂ４０は一過性に形成されたコンフォメーションの一つを優先的にサンプルし、機能的活性状態から平衡をシフトし、酵素分子の大部分を、「アロステリックスイッチ」「ＯＦＦ」状態から「ＯＮ」状態に駆動する。対照的に、酵素活性を阻害しないＦａｂ４０．ΔＴｒｐは単に酵素に結合し、状態における変化を駆動しない。
【図９】（ａ）抗体特異性。直接結合ＥＬＩＳＡにおいて、９６-ウェルプレートを２ｍｇ／ｍｌのＨＧＦＡ、マトリプターゼ(Kirchhofer et al. (2003) J Biol Chem 278:36341-36349)、ウロキナーゼ(American Diagnostica)、又は第ＸＩＩａ因子(American Diagnostica)でコートし、ＰＢＳ，０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ-２０（ＰＢＴ）バッファーにおいて１０ｍｇ／ｍｌの抗ＨＧＦＡ抗体でインキュベートした。洗浄後、結合抗体を、抗ヒト抗体ＨＲＰコンジュゲート（ＰＢＴバッファー中に１：２，５００で希釈）及びＴＭＢ基質を加えることによって検出した。（ｂ）Ａｂ３９によるＨＧＦＡ阻害のＥａｄｉｅ-Ｈｏｆｓｔｅｅプロット（３倍希釈工程において１μＭ−０．００４μＭ；黒ダイヤモンド＝「無抗体」コントロール）は競合阻害を示す（コントロール、Ｖｍａｘ＝０．９９μＭ ｐＮＡ／分及びＫｍ＝０．２５ｍＭ；１μＭのＡｂ３９、Ｖｍａｘａｐｐ＝０．９７μＭ ｐＮＡ／分及びＫｍａｐｐ＝０．９１ｍＭ）。
【図１０】電子密度マップ(2fofc contoured at 1s)の質を示す立体図。（ａ）９９-ループは、ＨＧＦＡ／Ｆａｂ４０構造において「非」コンピテントコンフォメーションを採用する。（ｂ）９９-ループはＨＧＦＡ／Ｆａｂ４０．ΔＴｒｐ構造において「コンピテント」コンフォメーションに復帰する。（ｃ）９９-ループはＨＧＦＡ-ＫＱＬＲ／Ｆａｂ４０．ΔＴｒｐ（配列番号：１０として開示される「ＫＱＬＲ」）構造において「コンピテント」コンフォメーションを採用するため、ＨＧＦＡ活性部位における共有結合のＫＱＬＲペプチド（配列番号：１０）はＦａｂ４０ΔＴｒｐの結合を乱さない。
【図１１】ＨＧＦＡ-ＫＱＬＲ／Ｆａｂ４０．ΔＴｒｐ複合体（配列番号：１０として開示される「ＫＱＬＲ」）構造における活性部位での化学構造及び水素結合ネットワーク。ペプチド性インヒビターＫＱＬＲ（配列番号：１０）（中央）はＳｅｒ１９５及びＨｉｓ５７に共有結合する。
【図１２】ＨＧＦＡ／Ｆａｂ４０．ΔＴｒｐ（薄い灰色）及びＨＧＦＡ-ＫＱＬＲ／Ｆａｂ４０．ΔＴｒｐ（配列番号：１０として開示される「ＫＱＬＲ」）（暗い灰色，ＫＱＬＲ（配列番号：１０）-最も暗い灰色）複合体構造の重ね合わせ。９９-ループのコンフォメーションは、他の既知のＨＧＦＡの構造で見られる「コンピテント」コンフォメーションにある。
【図１３】ＨＧＦＡ／Ｆａｂ４０及びＨＧＦＡ／ＫＤ１(Shia et al (2005) J Mol Biol 346(5): 1335-49)複合体構造の重ね合わせ。Ｆａｂ４０（暗い灰色，リボン）の結合部位は、ＫＤ１（暗い灰色）の結合部位との直接のオーバーラップはないが、９９-ループの動きがＫＤ１のＨＧＦＡ／Ｆａｂ４０複合体への結合に向けて幾らかの立体的衝突を生じうる。
【図１４】ＨＧＦＡ／Ｆａｂ４０（９９-ループの「非コンピテント」コンフォメーション（互換的に「テンス」コンフォメーションと称される；薄い灰色）複合体及び公開ＨＧＦＡ（９９-ループの「コンピテント」コンフォメーション（互換的に「リラックス」コンフォメーションと称される）；黒）構造の重ね合わせ。Ｆａｂ４０のＣＤＲ-Ｈ３ループ残基におけるＴｒｐ９６Ｈ、Ａｌａ９７Ｈ及びＴｒｐ９８Ｈと、コンピテント」コンフォメーションにおけるＨＧＦＡの９９-ループ残基間で、立体的衝突が生じうる。
【図１５Ａ１】トリプシン様プロテアーゼドメイン、構造的相同性を使用して整列させた。ＨＧＦＡの天然シーケンシャル残基番号付けを配列の上に、キモトリプシノーゲン番号付けを配列に下に示す。キモトリプシノーゲン番号付けは、キモトリプシノーゲン配列と比較して小文字で示す挿入（例えばＨｉｓ６０ａ）及び欠失（例えば残基番号２１８は無く、よって２１７に２１９が続く）を含む。残基６０ａ、６０ｂ、６０ｃ及び６０ｄは残基６０に続き、残基１１１ａ、１１１ｂ、１１１ｃ及び１１１ｄは残基１１１に続き、残基１７０ａ及び１７０ｂは残基１７０に続く。しかし残基９９ａは残基９９に先行し、残基１８４ａは残基１８４に先行し、残基１８８ａは残基１８８に先行し、残基２２１ａは残基２２１に先行する。図１５Ａは配列番号２５−３３を開示し、図１５Ｂは配列番号３４−４１を開示し、全てそれぞれ出現の順である。
【図１５Ａ２】トリプシン様プロテアーゼドメイン、構造的相同性を使用して整列させた。ＨＧＦＡの天然シーケンシャル残基番号付けを配列の上に、キモトリプシノーゲン番号付けを配列に下に示す。キモトリプシノーゲン番号付けは、キモトリプシノーゲン配列と比較して小文字で示す挿入（例えばＨｉｓ６０ａ）及び欠失（例えば残基番号２１８は無く、よって２１７に２１９が続く）を含む。残基６０ａ、６０ｂ、６０ｃ及び６０ｄは残基６０に続き、残基１１１ａ、１１１ｂ、１１１ｃ及び１１１ｄは残基１１１に続き、残基１７０ａ及び１７０ｂは残基１７０に続く。しかし残基９９ａは残基９９に先行し、残基１８４ａは残基１８４に先行し、残基１８８ａは残基１８８に先行し、残基２２１ａは残基２２１に先行する。図１５Ａは配列番号２５−３３を開示し、図１５Ｂは配列番号３４−４１を開示し、全てそれぞれ出現の順である。
【図１５Ｂ】トリプシン様プロテアーゼドメイン、構造的相同性を使用して整列させた。ＨＧＦＡの天然シーケンシャル残基番号付けを配列の上に、キモトリプシノーゲン番号付けを配列に下に示す。キモトリプシノーゲン番号付けは、キモトリプシノーゲン配列と比較して小文字で示す挿入（例えばＨｉｓ６０ａ）及び欠失（例えば残基番号２１８は無く、よって２１７に２１９が続く）を含む。残基６０ａ、６０ｂ、６０ｃ及び６０ｄは残基６０に続き、残基１１１ａ、１１１ｂ、１１１ｃ及び１１１ｄは残基１１１に続き、残基１７０ａ及び１７０ｂは残基１７０に続く。しかし残基９９ａは残基９９に先行し、残基１８４ａは残基１８４に先行し、残基１８８ａは残基１８８に先行し、残基２２１ａは残基２２１に先行する。図１５Ａは配列番号２５−３３を開示し、図１５Ｂは配列番号３４−４１を開示し、全てそれぞれ出現の順である。
【図１６Ａ】Ａ．抗ＨＧＦＡ抗体の軽鎖可変ドメイン配列。Ｂ．重鎖可変ドメイン配列。残基はＫａｂａｔ番号付けに従って番号付けされ、Ｋａｂａｔ，Ｃｈｏｔｈｉａ及び接触ＣＤＲを図式的に示す。
【図１６Ｂ】Ａ．抗ＨＧＦＡ抗体の軽鎖可変ドメイン配列。Ｂ．重鎖可変ドメイン配列。残基はＫａｂａｔ番号付けに従って番号付けされ、Ｋａｂａｔ，Ｃｈｏｔｈｉａ及び接触ＣＤＲを図式的に示す。
【００５６】
（発明の詳細な説明）
本発明は、肝細胞増殖因子アクチベーター機能のモジュレーターを含んでなる方法、組成物、キット及び製造品を提供し、かかるモジュレーターの使用方法を含む。
【００５７】
これらの方法、組成物、キット及び製造品の詳細はここに提供される。
【００５８】
(一般的技術)
本発明の実施では、別段の記載がない限り、当業者の技量の範囲に入る分子生物学(組換え技術を含む)、微生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学での一般的な技術が使用される。このような技術は、文献、例えば 「分子クローニング：研究室用マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」、第２版、(Sambrookら, 1989); 「オリゴヌクレオチドの合成(Oligonucleotide Synthesis)」 (M. J. Gait編, 1984); 「動物細胞培養(Animal Cell Culture)」 (R. I. Freshney編, 1987); 「酵素学における方法(Methods in Enzymology)」(Academic Press, Inc.); 「分子生物学における現代のプロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)」 (F. M. Ausubelら編, 1987、定期的に更新);「ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応(PCR: The Polymerase Chain Reaction)」(Mullisら編, 1994); 「分子クローニングの解説書(A Practical Guide to Molecular Cloning)」(Perbal Bernard V., 1988);“Phage Display: A Laboratory Manual” (Barbas et al., 2001)において十分に説明されている。
【００５９】
定義
「肝細胞増殖因子アクチベーター」又は「ＨＧＦＡ」なる用語は、ここで使用される場合、特に又は文脈的に別段の記載をしない限り、ＨＧＦに結合できる、及び／又は、プロセスが生じることを可能にする条件下、例えばＨＧＦの２鎖形態の形成を可能にする条件下で、ＨＧＦを活性化できる何れかの天然又は変異体（天然又は合成にかかわらず）ＨＧＦＡポリペプチドを意味する。「野生型ＨＧＦＡ配列」なる用語は、一般に、天然に生じるＨＧＦＡに見られるアミノ酸配列を意味し、天然に生じる切断型又は分泌型形態、変異形態（例えば選択的スプライシング形態）及び天然に生じる対立遺伝子多型を含む。野生型ＨＧＦＡの例は、表４（配列番号：１９）に示すアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドである。ＨＧＦＡの配列番号付けは、SWISS-PROT entry HGFA_HUMAN受入番号Q04756に従い、表４に示す。プロテアーゼドメイン内の残基に対して、キモトリプシノーゲン由来の代わりに番号付けスキームが使用されることがある。これらの２つの残基番号付けスキームの相互変換に関しては、図１５を参照のこと。一般に、この出願を通して、利用する番号付けシステムは同一である。
【００６０】
「活性化ＨＧＦＡ」又はその変異体とは、野生型ＨＧＦＡタンパク質の転換の１鎖から２鎖形態への際に、野生型ＨＧＦＡによって採用された一又は複数のコンフォメーションを有するＨＧＦＡ鎖の何れかである。幾つかの実施態様では、転換は、少なくとも一部は、ＨＧＦＡタンパクの残基４０７及び残基４０８の間での切断から生じる。幾つかの実施態様では、コンフォメーションとは特にプロテアーゼドメインのコンフォメーションを意味する。活性化ＨＧＦＡはまた、３４ｋＤａ形態等の完全長ＨＧＦＡの断片から生成されうる。３４ｋＤａ形態は、残基３７２及び３７３間での切断によって生成されることができる。ＨＧＦＡは、ヒト組織又はヒト血漿等の様々な供給源から単離され得、又は組換え又は合成方法によって調製されうる。活性化ＨＧＦＡの一実施態様は、表５に示すアミノ酸配列を有する(配列番号：２０)。(番号付けは、ここに記載の天然ＨＧＦＡのものである)。
【００６１】
「ＨＧＦＡ変異体」は、ここで使用する場合、参照ポリペプチドと異なる配列を有するポリペプチドを意味する。幾つかの実施態様では、参照ポリペプチドは、表４に示す配列を含んでなるＨＧＦＡ ポリペプチドである。変異体は「非天然に」生じる変異体を含む。幾つかの実施態様では、変異体は、表４に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する。変異体は、置換、挿入又は欠失を有するそれらのポリペプチドを含む。幾つかの実施態様では、変異体は、ＨＧＦに結合する及び／又はそれを活性化する生物学的活性を有する。他の実施態様では、変異体はＨＧＦに結合できるが、それを活性化できない。通常、ＨＧＦＡ変異体ポリペプチドは、表４に示す配列を含んでなるアミノ酸配列を含んでなるＨＧＦＡポリペプチド又は表５に示す配列を含んでなるＨＧＦＡポリペプチドと、少なくとも８０％配列同一性、より好ましくは少なくとも８１％の配列同一性、より好ましくは少なくとも８２％の配列同一性、より好ましくは少なくとも８３％配列同一性、より好ましくは少なくとも８４％配列同一性；より好ましくは少なくとも８５％配列同一性、より好ましくは少なくとも８６％配列同一性、より好ましくは少なくとも８７％配列同一性、より好ましくは少なくとも８８％配列同一性、より好ましくは少なくとも８９％配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％配列同一性、より好ましくは少なくとも９１％配列同一性、より好ましくは少なくとも９２％配列同一性、より好ましくは少なくとも９３％配列同一性、より好ましくは少なくとも９４％配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％配列同一性、より好ましくは少なくとも９６％配列同一性、より好ましくは少なくとも９６％配列同一性、より好ましくは少なくとも９７％配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％配列同一性、より好ましくは少なくとも９９％配列同一性を有する。
【００６２】
ペプチド又はポリペプチド配列に関する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」とは、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした後の、特定のペプチド又はポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を測定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ(ＤＮＡＳＴＡＲ)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、米国特許第６，８２８，１４６号に記載の配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ-２を使用することによって得られる。ＡＬＩＧＮ-２プログラムはジェネンテック社、サウス サン フランシスコ, カリフォルニアから公的に入手可能であり、ソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ-２プログラムは、ＵＮＩＸ(登録商標)オペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ(登録商標)Ｖ４．０Ｄでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ-２プログラムによって設定され変動しない。
【００６３】
アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ-２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性(あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる)は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ-２のＡ及びＢのプログラムアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
【００６４】
特に断らない限りは、ここでの全ての％アミノ酸配列同一性値は、直ぐ上のパラグラフに示したようにＡＬＩＧＮ-２コンピュータプログラムを用いて得られる。
【００６５】
ここで使用される場合、「ベクター」なる用語は、それが結合している他の核酸を輸送可能な核酸分子を称することを意図している。ベクターの一タイプは、付加的なＤＮＡセグメントが結合していてもよい、環状の二重鎖ＤＮＡループと称される「プラスミド」である。他のタイプのベクターはファージベクターである。さらに他のタイプのベクターは、付加的なＤＮＡセグメントがウイルスゲノムに結合していてもよいウイルスベクターである。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律増殖可能である(例えば、複製の細菌起源を有する細菌性ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞へ導入されると、宿主細胞のゲノムに結合可能で、それにより宿主ゲノムと共に複製される。さらに、ある種のベクターは、それらが操作的に結合している遺伝子の発現に指向可能である。ここでは、このようなベクターは「組換え発現ベクター」(又は単に、「組換えベクター」)と称される。一般的に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、多くの場合プラスミドの形態をしている。本明細書において、「プラスミド」及び「ベクター」は、最も一般的には、プラスミドがベクターの形態で使用される場合に、交換可能に使用され得る。
【００６６】
ここで交換可能に使用される場合、「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドポリマーを称し、ＤＮＡ及びＲＮＡが含まれる。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド又は塩基、及び／又はそれらの類似体、又はＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼにより、もしくは合成反応によりポリマー中に取り込み可能な任意の基質とすることができる。ポリヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチド及びそれらの類似体を含み得る。もし存在するならば、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの組み立ての前後になされ得る。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分により中断されてもよい。ポリヌクレオチドは合成後に、例えば標識と結合することによりさらに修飾されてもよい。他のタイプの修飾には、例えば「キャップ」、類似体による自然に生じたヌクレオチドの一又は複数の置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電性結合(例えばホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホアミダーゼ、カルバマート等)及び荷電性結合(ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート等)を有するもの、ペンダント部分、例えばタンパク質(例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ply-L-リジン等)を含むもの、介入物を有するもの(例えばアクリジン、ソラレン等)、キレート剤を含むもの(例えば金属、放射性金属、ホウ素、酸化的金属等)、アルキル化剤を含むもの、修飾された結合を含むもの(例えばアルファアノマー核酸等)、並びにポリヌクレオチド(類)の未修飾形態が含まれる。さらに、糖類に通常存在する任意のヒドロキシル基は、例えばホスホナート基、ホスファート基で置き換えられてもよく、標準的な保護基で保護されてもよく、又は付加的なヌクレオチドへのさらなる結合を調製するために活性化されてもよく、もしくは固体状又は半固体状支持体に結合していてもよい。５'及び３'末端のＯＨはホスホリル化可能であり、又は１〜２０の炭素原子を有するアミン又は有機キャッピング基部分で置換することもできる。また他のヒドロキシル類は標準的な保護基に誘導されてもよい。さらにポリヌクレオチドは当該技術で一般的に知られているリボース又はデオキシリボース糖類の類似形態のものをさらに含み、これらには例えば２'-Ｏ-メチル-、２'-Ｏ-アリル、２'-フルオロ-又は２'-アジド-リボース、炭素環式糖の類似体、アルファ-アノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロース類又はリキソース類、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体、及び脱塩基性ヌクレオチド類似体、例えばメチルリボシドが含まれる。一又は複数のホスホジエステル結合は代替の結合基で置き換えてもよい。これらの代替の結合基には、限定されるものではないが、ホスファートがＰ(Ｏ)Ｓ(「チオアート」)、Ｐ(Ｓ)Ｓ(「ジチオアート」)、「(Ｏ)ＮＲ.sub.２(「アミダート」)、Ｐ(Ｏ)Ｒ、Ｐ(Ｏ)ＯＲ'、ＣＯ又はＣＨ.sub.２(「ホルムアセタール」)と置き換えられた実施態様のものが含まれ、ここでそれぞれのＲまたはＲ'は独立して、Ｈ又は、エーテル(-Ｏ-)結合を含んでいてもよい置換もしくは未置換のアルキル(１-２０Ｃ)、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル又は��ラルジル(araldyl)である。ポリヌクレオチド中の全ての架橋が同一である必要はない。先の記述において、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む、ここで引用された全てのポリヌクレオチドに適用される。
【００６７】
ここで使用される場合、「オリゴヌクレオチド」とは、短く、一般的に単鎖であり、また必ずしもそうではないが、一般的に約２００未満のヌクレオチド長さの合成のポリヌクレオチドを称する。「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」なる用語は、相互に排他的なものではない。ポリヌクレオチドについての上述した記載はオリゴヌクレオチドと等しく、十分に適用可能である。
【００６８】
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、その抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれうる。好ましい実施態様では、抗体は、（１）ローリー法で測定して９５重量％抗体を越えるまで、最も好ましくは９９重量％を越えるまで、（２）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端又は内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、（３）クーマシーブルー又は好ましくは銀染色を用いた還元又は非還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥにより均一になるまで、精製される。単離された抗体には、抗体の自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも一つの精製工程により調製される。
【００６９】
「カバットにおける可変ドメイン残基番号付け」、「カバットにおけるアミノ酸位置番号付け」及びその変形は、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)における抗体の編集の重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインについて使用される番号付けシステムを意味する。この番号付けシステムを使用すると、実際の線形アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＨＶＲを短くするか、又はそこに挿入される対応のより少ないか又は付加的なアミノ酸を含みうる。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に単一のアミノ酸挿入物(カバットに従い残基５２ａ)、及び重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入残基(例えば、カバットに従い残基８２ａ、８２ｂ、及び８２ｃ等)を含む。残基のカバット番号付けは、「標準的な」カバット番号の配列を有する抗体の配列を相同性領域で配列させることにより、与えられた抗体について決定されうる。特に指定のない限り、ここのアミノ酸の番号付けはカバット番号付けシステムに従う。
【００７０】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選別において最も共通して生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選別は、可変ドメイン配列のサブグループから行う。一般に、配列のサブグループはカバットによるサブグループである。一実施態様では、ＶＬについて、サブグループはカバットによるサブグループκIである。一実施態様では、ＶＨについて、サブグループはカバットによるサブグループＩＩＩである。
【００７１】
「ＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク」は、Kabat et alの可変重鎖サブグループＩＩＩにおけるアミノ酸配列から得られたコンセンサス配列を有する。一実施態様では、ＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワークアミノ酸配列は、各以下の配列の少なくとも一部又は全てを有する：ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号：１１）-Ｈ１-ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ（配列番号：１２）-Ｈ２-ＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣ（配列番号：１３）-Ｈ３-ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：１４）。
【００７２】
「ＶＬサブグループＩコンセンサスフレームワーク」は、Kabat et alの可変軽鎖カッパサブグループＩにおけるアミノ酸配列から得られたコンセンサス配列を有する。一実施態様では、ＶＬサブグループＩコンセンサスフレームワークアミノ酸配列は、各以下の配列の少なくとも一部又は全てを有する：ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号：１５）-Ｌ１-ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号：１６）-Ｌ２-ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（配列番号：１７）-Ｌ３-ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号：１８）。
【００７３】
「抗体」及び「免疫グロブリン」なる用語は、広義において相互交換可能に使用され、モノクローナル抗体(例えば、全長又は無傷のモノクローナル抗体)、ポリクローナル抗体、一価抗体、多価抗体、多重特異性抗体(例えば、所望の生物活性を示す限り二重特異性抗体)、及び抗体断片が含まれる。抗体は、ヒト、ヒト化及び／又は親和性成熟したものであってよい。
【００７４】
「抗体断片」は無傷抗体の一部のみを含み、該一部は、無傷抗体に存在する場合に、その一部に通常関連している機能の少なくとも一部、好ましくはほとんど又は全ての機能を保持している。一実施態様では、抗体断片は、無傷抗体の抗原結合部位を含み、よって抗原に結合する能力を保持している。他の実施態様では、抗体断片、例えばＦｃ領域を含むものは、特にＦｃＲｎ結合、抗体半減期調節、ＡＤＣＣ機能及び補体結合等、無傷抗体に存在する場合に、Ｆｃ領域に通常関連している少なくとも一の生物学的機能を保持している。一実施態様では、抗体断片は、無傷抗体と実質的に類似のインビボ半減期を有する一価の抗体である。例えば、かかる抗体断片は、断片にインビボ安定性を与えることができるＦｃ配列に連結された抗原結合アームを有しうる。
【００７５】
ここで使用される場合、「モノクローナル抗体」なる用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を称する、すなわち、集団に含まれる個々の抗体が、少量で存在しうる自然に生じる可能な突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、一つの抗原部位に対している。さらに、異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的には含むポリクローナル抗体調製物と比べて、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。
【００７６】
ここで、モノクローナル抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種由来の抗体あるいは特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同であり、鎖の残りの部分が他の種由来の抗体あるいは他の抗体クラスあるいはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同である「キメラ」抗体、並びにそれが所望の生物活性を示す限りこのような抗体の断片を特に含む(米国特許第4,816,567号;及びMorrisonほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855(1984))。
【００７７】
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」形とは、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。大部分においてヒト化抗体は、レシピエントの高度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類のような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)の高度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含んでもよい。これらの修飾は抗体の特性を更に洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、全てあるいはほとんど全ての高度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲがヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、場合によっては免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる。更なる詳細は、Jones等, Nature 321, 522-525(1986)；Reichmann等, Nature 332, 323-329(1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596(1992)を参照のこと。また、次の総論及びここで引用された参考文献：Vaswani及びHamilton, Ann. Allergy, Asthma &amp; Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle及びGross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)も参照のこと。
【００７８】
「ヒト抗体」は、ヒトによって生産される抗体のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有するもの、及び／又はここにおいて開示されたヒト抗体を作製するいずれかの技術を使用して製造されたものである。ヒト抗体のこの定義は、特に非ヒト抗原結合残基を含んでなるヒト化抗体を除く。
【００７９】
「親和性成熟」抗体とは、変化を有しない親抗体と比較し、抗原に対する抗体の親和性に改良を生じせしめる、抗体の一又は複数のＣＤＲにおける一又は複数の変化を伴うものである。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対してナノモル又はピコモルの親和性を有する。親和性成熟抗体は、当該分野において知られる手順によって生産される。Marksら. Bio/Technology, 10：779-783(1992)は、ＶＨ及びＶＬドメイン混合による親和性成熟について記載している。ＣＤＲ及び／又はフレームワーク残基のランダム突然変異誘発は、Barbas等, Proc Nat Acad. Sci, USA 91：3809-3813(1994)；Schier 等, Gene, 169：147-155(1995)；Yelton等, J. Immunol.155：1994-2004(1995)；Jackson等, J. Immunol.154(7)：3310-9(1995)；及びHawkins等, J. Mol. Biol.226：889-896(1992)に記載されている。
【００８０】
「遮断（ブロッキング）」抗体又は「アンタゴニスト」抗体は、結合する抗原の生物学的活性を阻害又は低減させるものである。好ましい遮断抗体又はアンタゴニスト抗体は抗原の生物学的活性を実質的に又は完全に阻害する。
【００８１】
「疾患」は、本発明の物質／分子又は方法で処置されることで恩恵を受ける任意の病状のことである。これには、問題の疾患に哺乳動物を罹患させた慢性及び急性の疾患が含まれる。ここで処置される疾患の非限定的例には、良性及び悪性の腫瘍；非白血病及びリンパ性悪性疾患；ニューロン、グリア、星状細胞、視床下部及び他の腺、マクロファージ、上皮、間質及び胞胚腔の疾患；及び炎症、免疫学的及び他の血管新生に関連した疾患を含む。
【００８２】
「細胞増殖性疾患」及び「増殖性疾患」なる用語は、ある程度の異常な細胞増殖を伴う疾患を意味する。一実施態様では、細胞増殖性疾患は癌である。
【００８３】
ここで用いられる「腫瘍」は、悪性又は良性に関わらず、全ての腫瘍形成細胞成長及び増殖、及び全ての前癌性及び癌性細胞及び組織を意味する。「癌」、「癌性」、「細胞増殖性疾患」、「増殖性疾患」及び「腫瘍」なる用語はここに示すように互いに排他的なものではない。
【００８４】
「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長／増殖を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか記述する。癌の例には、これらに限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれる。このような癌のより特定の例には、扁平細胞癌(squamous cell cancer)、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、及び肺の扁平癌腫(squamous carcinoma)を含む肺癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸管癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、産卵口癌、甲状腺癌、肝臓癌、並びに様々なタイプの頭部及び頸部の癌が含まれる。
【００８５】
血管形成調節不全により、本発明の組成物及び方法によって治療される多くの疾患が引き起こされうる。これらの疾患には、非腫瘍性又は腫瘍性症状の両方が含まれる。腫瘍性のものは上記に記載のものに限らない。非腫瘍性疾患には、限定するものではないが、望ましくない又は異常な肥大、関節炎、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬、乾癬の斑、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化、アテローム動脈硬化性斑、未熟児の網膜症を含む糖尿病性及び他の増殖性の網膜症、水晶体後繊維増殖、血管新生緑内障、年齢関連性黄斑変性、糖尿病性黄斑浮腫、角膜血管新生、角膜移植片血管新生、角膜移植片拒絶、網膜／脈絡叢血管新生、虹彩(angle)（ルベオーシス）の血管新生、眼性新生血管疾患、脈管再狭窄、動静脈奇形（ＡＶＭ）、髄膜腫、血管腫、血管線維腫、甲状腺の過形成（グレーブズ病を含む）、角膜及び他の組織移植、慢性炎症、肺炎症、急性肺損傷／ＡＲＤＳ、敗血症、原発性肺高血圧症、悪性の肺滲出、大脳浮腫（例えば、急性脳卒中／非開放性頭部損傷／外傷と関連している）、滑液炎症、ＲＡのパンヌス形成、筋炎骨化、高親和性骨形成、骨関節炎（ＯＡ）、抵抗性腹水、多嚢胞性卵巣の疾患、子宮内膜症、液体性疾患の第３の間隔(3rd spacing)（膵炎、コンパートメント症候群、熱傷、腸疾患）、子宮類線維腫、早産、慢性炎症、例えばＩＢＤ（クローン病および潰瘍性大腸炎）、腎臓同種異系移植片拒絶反応、炎症性腸疾患、ネフローゼ症候群、望ましくない又は異常な組織塊成長（癌以外）、血友病関節、肥大した瘢痕、体毛成長の抑制、Ｏｓｌｅｒ-Ｗｅｂｅｒ症候群、化膿性肉芽腫水晶体後繊維増殖、強皮症、トラコーマ、脈管粘着力、関節滑膜炎、皮膚炎、子癇前症、腹水、心嚢貯留液（例えば心外膜炎と関連しているもの）および胸水が含まれる。
【００８６】
ここで「自己免疫疾病」とは、個々の所有する組織から生じる、またこれを指向する、非悪性の疾病又は疾患のことである。ここで自己免疫疾病では、悪性又は癌性の疾病又は状態、特にＢ細胞リンパ腫、急性リンパ性白血病(ＡＬＬ)、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)、ヘアリー細胞白血病及び慢性骨髄芽球性白血病を除く。自己免疫疾病又は疾患の例には、限定されるものではないが、炎症反応、例えば乾癬及び皮膚炎(例えばアトピー性皮膚炎)を含む炎症性皮膚病；全身性強皮症及び硬化症；炎症性腸疾患(例えばクローン病及び潰瘍性大腸炎)に関連した反応；呼吸困難症候群(成人性呼吸困難症候群；ＡＲＤＳを含む)；皮膚炎；髄膜炎；脳炎；ブドウ膜炎；大腸炎；糸球体腎炎；アレルギーによる病状、例えば湿疹及び喘息及びＴ細胞の浸潤に関連した他の病状及び慢性炎症反応；アテローム性動脈硬化症；白血球付着欠損症；リウマチ様関節炎；全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)；真性糖尿病(例えば、Ｉ型真性糖尿病又はインシュリン依存性真性糖尿病)；多発性硬化症；レノー症候群；自己免疫甲状腺炎；アレルギー性脳脊髄炎；シェーグレン(Sjorgen)症候群；若年発症糖尿病；及び結核に典型的に見出されるＴリンパ球及びサイトカインにより媒介される急性及び遅延高血圧に関連した免疫反応、サルコイドーシス、多発性筋炎、肉芽種症及び血管炎；悪性貧血(アジソン病)；白血球血管外遊出に関連した疾病；中枢神経系(ＣＮＳ)炎症疾病；多臓器傷害症候群；溶血性貧血(限定するものではないが、クリオグロブリン血症又はクームズポジティブ貧血を含む)；重症筋無力症；抗原-抗体複合体媒介性疾病；抗糸球体基底膜疾患；抗リン脂質症候群；アレルギー性神経炎；クレーブス病；ランベルト-イートン筋無力症症候群；類天疱瘡；天疱瘡；自己免疫多腺性内分泌障害；ライター病；全身硬直症候群；ベーチット疾患；巨細胞動脈炎；免疫複合体腎炎；ＩｇＡ腎症；ＩｇＭ多発性神経障害；免疫血小板減少性紫斑病(ＩＴＰ)又は自己免疫血小板減少病等が含まれる。
【００８７】
ここで使用されるところの「治療」は、治療されている個体又は細胞の天然の過程を改変するための臨床的介入を意味し、予防のため又は臨床的病理の過程中に実施することができる。治療の望ましい効果には、疾病の発生又は再発の防止、症状の寛解、疾病の任意の直接的又は間接的病理的結果の低減、転移の防止、疾病の進行速度の低減、疾病状態の回復又は緩和、及び寛解又は改善された予後が含まれる。ある実施態様では、本発明の抗体は疾患又は疾病の進行を遅らせるため又は疾患又は疾病の進行をゆっくりにするために用いられる。
【００８８】
「有効量」とは所望の治療又は予防結果を達成するために必要な用量及び時間での効果的な量を意味する。
【００８９】
本発明の物質／分子、アゴニスト又はアンタゴニストの「治療的有効量」は、例えば個体の疾病ステージ、年齢、性別、及び体重、並びに個体に所望の応答を誘発する物質／分子の能力などの因子に従って変わりうる。また、治療的有効量は物質／分子、アゴニスト又はアンタゴニストの任意の毒性又は有害な効果よりも治療的に恩恵のある効果が上回る量ものである。「予防的有効量」とは所望の予防結果を達成するために必要な用量及び時間での効果的な量を意味する。典型的には必ずではないが、予防的用量は疾患の初期ステージ又はその前の患者に用いるので、予防的有効量は治療的有効量よりも少ないであろう。
【００９０】
ここで用いられる「細胞傷害剤」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞の破壊を生ずる物質を指す。この用語は、放射性同位体(例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２及びＬｕの放射性同位体)、化学治療薬、例えばメトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド(ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド)、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロランブシル、ダウノルビシン又はその他インターカレート剤、酵素及びその断片、例えば核溶解性酵素、抗生物質、及び毒素、例えばその断片及び／又は変異体を含む小分子毒素又は細菌、糸状菌、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素、そして下記に開示する種々の抗腫瘍又は抗癌剤を含むように意図されている。他の細胞傷害性薬が下記に記載されている。殺腫瘍性剤は、腫瘍細胞の破壊を引き起こす。
【００９１】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びＣＹＴＯＸＡＮ（商標登録）シクロホスファミドのようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethiylenethiophosphoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン(特にブラタシン及びブラタシノン)；デルタ-９-テトラヒドロカンナビノール(ドロナビロール、MARINOL(登録商標))；β-ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン(合成アナログトポテカン(HYCAMTIN(登録商標)、ＣＰＴ-１１(イリノテカン、CAMPTOSAR(登録商標))、アセチルカンプトテシン、スコポレチン、及び９-アミノカンプトテシンを含む)；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成アナログを含む)；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン(特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８)；ドラスタチン；ドゥオカルマイシン(合成アナログ、ＫＷ-２１８９及びＣＢ１-ＴＭ１を含む)；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンジスタチン；クロランブシル、クロルナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロスレアス(nitrosureas)；抗生物質、例えばエネジイン抗生物質(例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンγ１Ｉ及びカリケアマイシンωＩ１(例えばAgnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)を参照)；ＣＤＰ３２３、経口α-４インテグリンインヒビター；ダイネマイシン(dynemicin)Ａを含むダイネマイシン；エスペラマイシン；並びにネオカルチノスタチン発色団及び関連する色素タンパクエネジイン抗生物質発色団)、アクラシノマイシン類(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorbicin)、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ドキソルビシン(ADRIAMYCIN(登録商標)、モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣｌリポソーム注射(ＤＯＸＩＬ(登録商標))、及びデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マーセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシンＣのようなマイトマイシン、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、ケラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；代謝拮抗剤、例えばメトトレキセート、ゲムシタビン(ＧＥＭＺＡＲ(登録商標))、テガフール(ＵＦＴＯＲＡＬ(登録商標))、カペシタビン(ＸＥＬＯＤＡ(登録商標))、エポチロン及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ)；葉酸アナログ、例えばデノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)；プリンアナログ、例えばフルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えばアンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)；アンドロゲン類、例えばカルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)；抗副腎剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸リプレニッシャー(replenisher)、例えばフロリン酸(frolinic acid)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidainine)；メイタンシノイド(maytansinoid)類、例えばメイタンシン(maytansine)及びアンサミトシン(ansamitocine)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidanmol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ロソキサントロン；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖複合体(JHS Natural Products, Eugene, OR)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン類(特にＴ-２毒素、ベラクリン(verracurin)Ａ、ロリジン(roridine)Ａ及びアングイジン(anguidine))；ウレタン；ビンデシン(ＥＬＩＤＩＳＩＮＥ(登録商標)、ＦＩＬＤＥＳＩＮ(登録商標))；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド(「Ａｒａ-Ｃ」)；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル(ＴＡＸＯＬ(登録商標))、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子製剤(ＡＢＲＡＸＡＮＥＴＭ)およびドセタキセル(ＴＡＸＯＴＥＲＥ(登録商標))；クロランブシル；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；プラチナ類似体、例えばシスプラチン、オキサリプラチン(例えばＥＬＯＸＡＴＩＮ(登録商標))及びカルボプラチン；チューブリン重合が微小管を形成するのを妨げるビンカ、例えばビンブラスチン(ＶＥＬＢＡＮ(登録商標))；エトポシド(ＶＰ-１６)；イホスファミド；マイトキサントロン；ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））；オキサリプラチン；ロイコボリン；ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））；ノバントロン(novantrone)；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロナート(ibandronate)；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸などのレチノイド；及び上述したものの薬学的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体、並びに、上記のうちの２つ以上の組み合わせ、例えば、ＣＨＯＰ(シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニゾロンの併用療法の略称)、及びＦＯＬＦＯＸ(５-ＦＵ及びロイコボリンと組み合わせたオキサリプラチン(ＥＬＯＸＡＴＩＮTM)を用いる治療計画の略称)が含まれる。
【００９２】
またこの定義に含まれるものには、癌の成長を助けるホルモンの作用を調節、低減、遮断又は阻害するように働き、多くの場合全身処置の形態で使用される抗ホルモン剤がある。それらはそれ自体がホルモンであってもよい。それらは例えば抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体調節物質（ＳＥＲＭ）を含み、例えば、タモキシフェン（NOLVADEX(登録商標)タモキシフェンを含む）、ラロキシフェン(raloxifene)（ＥＶＩＳＴＡ（登録商標））、ドロロキシフェン、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン(onapristone)、及びＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標）トレミフェン；抗プロゲステロン；エストロゲンレセプター下方調節剤（ＥＲＤ）；エストロゲン受容体アンタゴニスト、例えばフルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標））；卵巣を抑止又は停止させる機能がある作用剤、例えば酢酸ロイプロリド等（ＬＵＰＲＯＮ（登録商標）及びＥＬＩＧＡＲＤ（登録商標））の黄体形成ホルモン放出ホルモン（LHRH）アゴニスト、酢酸ゴセレリン、酢酸ブセレリン及びトリプテレリン(tripterelin)；その他抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)、ニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド；並びに副腎のエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば４(５)-イミダゾール、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ(登録商標)酢酸メゲストロール、ＡＲＯＭＡＳＩＮ(登録商標)エキセメスタン、フォルメスタニー(formestanie)、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ(登録商標)ボロゾール、ＦＥＭＡＲＡ(登録商標)レトロゾール、及びＡＲＩＭＩＤＥＸ(登録商標)アナストロゾールである。加えて、このような化学療法剤の定義には、クロドロネート（例えばＢＯＮＥＦＯＳ（登録商標）又はＯＳＴＡＣ（登録商標））、ＤＩＤＲＯＣＡＬ（登録商標）エチドロン酸、ＮＥ-５８０９５、ＺＯＭＥＴＡ（登録商標）ゾレドロン酸／ゾレドロネート、ＦＯＳＡＭＡＸ（登録商標）アレンドロネート、ＡＲＥＤＩＡ（登録商標）パミドロン酸、ＳＫＥＬＩＤ（登録商標）チルドロン酸、又はＡＣＴＯＮＥＬ（登録商標）リセドロン酸、並びにトロキサシタビン(troxacitabine)（１,３-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に接着細胞の増殖に結びつくシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えばＰＫＣ-α、Ｒａｆ、及びＨ-Ｒａｓ、及び上皮成長因子レセプター（ＥＧＦ-Ｒ）；ＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）ワクチン及び遺伝子治療ワクチン等のワクチン、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ(登録商標)ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ(登録商標)ワクチン、及びＶＡＸＩＤ(登録商標)ワクチン；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ(登録商標)トポイソメラーゼ１阻害剤；ＡＢＡＲＥＬＩＸ(登録商標)ｒｍＲＨ；ラパチニブ（lapatinib ditosylate）（ＧＷ５７２０１６としても知られるＥｒｂＢ-２及びＥＧＦＲ二重チロシンキナーゼ小分子阻害剤）；ＣＯＸ-２阻害剤、例えばセレコキシブ（ＣＥＬＥＢＲＥＸ（登録商標)；４-(５-(４-メチルフェニル)-３-(トリフルオロメチル)-１Ｈ-ピラゾール-１-イル)ベンゼンスルホンアミド；及び上記のもののいずれかの製薬的に許容される塩類、酸類又は誘導体が含ま��る。
【００９３】
ここで用いられる際の「増殖阻害剤」は、その増殖がＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔ活性に依存する細胞の増殖をインビトロ又はインビボの何れかで阻害する化合物又は組成物を意味する。よって、増殖阻害剤は、Ｓ期でＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔ依存性細胞の割合を有意に減少させるものである。増殖阻害剤の例は、細胞周期の進行を(Ｓ期以外の位置で)阻害する薬剤、例えばＧ１停止又はＭ期停止を誘発する薬剤を含む。古典的なＭ期ブロッカーは、ビンカス(ビンクリスチン及びビンブラスチン)、タキサン類、及びトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。またＧ１停止させるこれらの薬剤は、Ｓ期停止にも波及し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びアラ-Ｃである。更なる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn及びIsrael, 編, Chapter 1, 表題「Cell cycle regulation, oncogene, and antineoplastic drugs」, Murakami等, (WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特に１３頁に見出すことができる。タキサン類(パクリタキセル及びドセタキセル)は、共にイチイに由来する抗癌剤である。ヨーロッパイチイに由来するドセタキセル(TAXOTERE(登録商標)、ローン・プーラン ローラー)は、パクリタキセル(TAXOL(登録商標)、ブリストル-マイヤー スクウィブ)の半合成類似体である。パクリタキセル及びドセタキセルは、チューブリン二量体から微小管の集合を促進し、細胞の有糸分裂を阻害する結果となる脱重合を防ぐことによって微小管を安定化にする。
【００９４】
「ドキソルビシン」はアントラサイクリン抗生物質である。ドキソルビシンの完全な化学名は、(８Ｓ-シス)-１０-[(３-アミノ-２,３,６-トリデオキシ-α-Ｌ-リキソ-ヘキサピラノシル)オキシ]-７,８,９,１０-テトラヒドロ-６,８,１１-トリヒドロキシ-８-(ヒドロキシアセチル)-１-メトキシ-５,１２-ナフタセンジオンである。
【００９５】
ベクター、宿主細胞及び組換え方法
本発明の抗体の組換え生産のために、抗体をコードする核酸が単離され、更なるクローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために、複製可能なベクター中に挿入される。抗体をコードするＤＮＡは直ぐに単離され、常套的な手法を用いて(例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドを使用することによって)配列決定される。多くのベクターが利用可能である。ベクターの選択は一部、使用される宿主細胞に依存する。一般に、好ましい宿主細胞は、原核生物又は真核生物（一般に哺乳離）起源のどちらかのものである。
【００９６】
原核宿主細胞を使用した抗体の生成：
ベクター構築
本発明の抗体のポリペプチド要素をコードするポリヌクレオチド配列は、標準的な組換え技術を使用して得ることができる。所望するポリヌクレオチド配列は、ハイブリドーマ細胞等の抗体産生細胞から単離され、配列決定されてよい。また、ポリヌクレオチドはヌクレオチドシンセサイザー又はＰＣＲ技術を使用して合成することができる。得られたら、ポリペプチドをコードする配列を、原核宿主細胞において異種ポリヌクレオチドを複製し発現できる組換えベクターに挿入する。当該技術で入手可能な公知の多くのベクターを、本発明の目的のために使用することができる。適切なベクターの選択は、主としてベクター、特にベクターで形質転換される宿主細胞に挿入される核酸の大きさに依存する。それぞれのベクターは、それが存在する特定の宿主細胞との適合性及び機能(異種ポリヌクレオチドの増幅又は発現、又は双方)に応じて、種々の成分を含有する。ベクター成分には、限定されるものではないが、一般的に複製起源(特に、ベクターが原核細胞に挿入される場合)、選択マーカー遺伝子、プロモータ、リボソーム結合部位(ＲＢＳ)、シグナル配列、異種核酸挿入物及び転写終結配列が含まれる。
【００９７】
一般に、宿主細胞と適合性のある種から誘導されたレプリコン及び制御配列を含むプラスミドベクターは、これらの宿主に関連して使用される。通常、ベクターは、複製部位、並びに形質転換した細胞に表現型選択を付与可能なマーキング配列を担持している。例えば、大腸菌は、典型的にはｐＢＲ３２２、大腸菌種から誘導されたプラスミドを使用して形質転換される。ｐＢＲ３２２はアンピシリン(Ａｍｐ)及びテトラサイクリン(Ｔｅｔ)耐性をコードする遺伝子を含み、よって形質転換された細胞を同定するための、容易な手段が付与される。また、ｐＢＲ３２２、その誘導体、又は他の細菌性プラスミド又はバクテリオファージも、内在性タンパク質の発現のため、微生物体により使用可能なプロモータを含有、又は含有するように修飾される。特定の抗体の発現のために使用されるｐＢＲ３２２誘導体の例は、Carter et al.,米国特許第５，６４８，２３７号に詳細に記載される。
【００９８】
さらに、宿主微生物と適合性のあるレプリコン及び制御配列を含むファージベクターは、これらの宿主に関連した形質転換ベクターとして使用することができる。例えばバクテリオファージ、特にλＧＥＭ.ＴＭ.-１１は、大腸菌ＬＥ３９２等の感受性宿主細胞を形質転換するために使用可能な組換えベクターを作製するのに利用され得る。
【００９９】
本発明の発現ベクターは各ポリペプチド成分をコードする２又はそれ以上のプロモータ-シストロン（翻訳単位）対を含みうる。プロモーターはその発現を調節するシストロンの上流（５'）に位置している非翻訳配列である。原核生物のプロモーターは典型的には誘導性と構成的との二つのクラスのものがある。誘導性プロモーターは、例えば栄養分の有無又は温度の変化のような、培養条件の変化に応答してその調節下でシストロンの転写レベルを増大させるように誘導するプロモーターである。
【０１００】
様々な潜在的宿主細胞によって認識される多くのプロモータが公知となっている。選択したプロモーターを、制限酵素消化によって供給源ＤＮＡからプロモータを除去し、本発明のベクター内に単離したプロモータを挿入することによって軽鎖又は重鎖をコードするシストロンＤＮＡに作用可能に連結することができる。天然プロモーター配列と多くの異種プロモーターの双方を、標的遺伝子の増幅及び／又は発現を生じさせるために使用することができる。ある実施態様では、天然の標的ポリペプチドプロモーターと比較して、一般的に発現する標的遺伝子をより多く転写させ、効率をよくするので、異種プロモーターが有用である。
【０１０１】
原核細胞宿主を用いた使用に適したプロモータには、ＰｈｏＡプロモータ、β-ガラクタマーゼ(galactamase)及びラクトースプロモータシステム、トリプトファン(ｔｒｐ)プロモータシステム、及びハイブリッドプロモータ、例えばｔａｃ又はｔｒｃプロモータが含まれる。しかしながら、細菌において機能的な他のプロモータ(例えば他の公知の細菌又はファージプロモータ)も適切である。それらのヌクレオチド配列は公開されており、よって当業者であれば、リンカー又はアダプターを使用し、標的となる軽及び重鎖をコードするシストロンにそれらを作用可能な連結させ(Siebenlist等(1980) Cell 20: 269)、任意の必要な制限部位を供給することができる。
【０１０２】
本発明の一態様では、組換えベクター内の各シストロンは、膜を通って発現したポリペプチドの転位を指示する、分泌シグナル配列成分を含有する。一般的に、シグナル配列はベクターの成分であってよく、もしくはベクターに挿入される標的ポリペプチドＤＮＡの一部であってもよい。本発明の目的のために選択されるシグナル配列は、宿主細胞により認識され、プロセシング(すなわち、シグナルペプチターゼにより切断)されたものであるべきである。異種ポリペプチド原産のシグナル配列を認識及びプロセシングしない原核宿主細胞にとって、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐ、又は熱安定性エンテロトキシンＩＩ(ＳＴＩＩ)リーダー、ＬａｍＢ、ＰｈｏＥ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ及びＭＢＰからなる群から選択される原核細胞シグナル配列により置き換えられる。本発明の一実施態様では、発現系の両シストロンにおいて使用されるシグナル配列は、ＳＴＩＩシグナル配列又はその変異体である。
【０１０３】
他の態様では、本発明による免疫グロブリンは宿主細胞の細胞質内で産生されるので、各シストロン内に分泌シグナル配列の存在は必要でない。この点において、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖は発現され、折り畳まれ、集合して細胞質内に機能的免疫グロブリンを形成する。ジスルフィド結合形成に好適な細胞質条件を示し、発現したタンパク質サブユニットを好適に折り畳み、集合することができる宿主系が存在する(例として大腸菌ｔｒｘＢ−系)。Proba及びPluckthun Gene, 159:203 (1995)。
【０１０４】
本発明は、発現されるポリペプチド成分の量的割合を本発明の抗体の分泌及び好適な集積効率が最大となるように調節することができる発現系を提供する。ポリペプチド成分の翻訳強度を同時に調節することによって少なくともある程度その調節が達成される。
【０１０５】
翻訳強度を調節する一つの方法は、Simmons等の米国特許第５８４０５２３号に開示されている。このアプローチはシストロン内の翻訳開始領域（ＴＩＲ）の変異体を利用する。与えられたＴＩＲに対して、ある範囲の翻訳強さを持つ一群のアミノ酸又は核酸配列変異体をつくり出すことができ、それによって、所望の発現レベルの特異的鎖に対してこの因子を調節するための簡便な手段を提供する。ＴＩＲ変異体はアミノ酸配列を改変することができるコドン変化を生じる一般的な突然変異誘発法によって産生することができるが、ヌクレオチド配列のサイレント変化が好ましい。ＴＩＲの変異には、例えばシグナル配列の変更と共に、シャイン-ダルガーノ配列の数又は間隔の変更が含まれうる。変異体シグナル配列を作成するためのある方法はシグナル配列のアミノ酸配列を変化させない（つまり変化がサイレントである）コード配列の最初での「コドンバンク」の産生である。これは、各コドンの第三のヌクレオチド位置を変化させることによって、達成できる；加えて、幾つかのアミノ酸、例えばロイシン、セリン、及びアルギニンはバンクの作製に複雑さを付加し得る複数の第一及び第二の位置を有している。この突然変異誘発の方法はYansura等(1992) METHODS: A Companion to Methods in Enzymol. 4:151-158に詳細に記載されている。
【０１０６】
好ましくは、そこの各シストロンに対してある範囲のＴＩＲ強さを有する一群のベクターが産生される。この制限された群は各鎖の発現レベルと様々なＴＩＲ強さの組合せ下で所望の抗体産物の収量の比較をもたらす。ＴＩＲ強さはSimmons等の米国特許第５８４０５２３号に記載されているレポーター遺伝子の発現レベルを定量することによって決定することができる。翻訳強度を比較することによって、所望の個々のＴＩＲｓが選択されて、本発明の発現ベクターコンストラクト中で組み合わされる。
【０１０７】
本発明の抗体を発現するのに適した原核生物宿主細胞には、古細菌及び真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物が含まれる。有用な細菌の例には、エシェリキア属（例えば大腸菌）、バシラス属（例えば枯草菌）、エンテロバクター属、シュードモナス種（例えば緑膿菌）、ネズミチフス菌、霊菌(Serratia marcescans）、クレブシエラ属、プロテウス属、赤痢菌、根粒菌、ビトレオシラ(Vitreoscilla)又はパラコッカス(Paracoccus)が含まれる。一実施態様では、グラム陰性菌が使用される。一実施態様では、大腸菌細胞が本発明の宿主として使用される。大腸菌株の例として、遺伝子型W3110 ?fhuA (?tonA) ptr3 lac Iq lacL8 ?ompT?(nmpc-fepE) degP41 kanRを有する３３Ｄ３株（米国特許第５，６３９，６３５号）を含むＷ３１１０株 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), 1190-1219頁；ATCC寄託番号27,325)及びその誘導体が含まれる。また、大腸菌２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）、大腸菌Ｂ、大腸菌ｌ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）及び大腸菌ＲＶ３０８（ＡＴＣＣ３１，６０８）など、他の株及びその誘導体も好適である。この例は限定的なものでなく例示的なものである。定義した遺伝子型を有する上記の何れかの細菌の誘導体の構築方法は当業者に公知であり、例として, Bassら., Proteins, 8:309-314 (1990)に記載されている。一般的に、細菌細胞中でのレプリコンの複製能を考慮して適した細菌を選択することが必要である。ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、又はｐＫＮ４１０のようなよく知られたプラスミドを使用してレプリコンを供給する場合、例えば、大腸菌、セラシア属、又はサルモネラ種を宿主として好適に用いることができる。典型的に、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌しなければならず、望ましくは更なるプロテアーゼインヒビターを細胞培養中に導入することができる。
【０１０８】
(抗体生成)
宿主細胞は、上述した発現ベクターを用いて形質転換され、プロモータの誘発、形質転換体の選択、又は所望する配列をコードする遺伝子の増幅のために適切に変性された従来からの栄養培地で培養される。
【０１０９】
形質転換とは、ＤＮＡを原核生物宿主中に導入し、そのＤＮＡを染色体外要素として、又は染色体組込みによって複製可能にすることを意味する。使用される宿主細胞に応じて、形質転換はそのような細胞に適した標準的技術を使用してなされる。塩化カルシウムを用いるカルシウム処理は実質的な細胞壁障害を含む細菌細胞のために一般に使用される。形質転換のための他の方法はポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを用いる。さらに別の方法はエレクトロポレーションである。
【０１１０】
本発明のポリペプチドを生産するために使用される原核宿主細胞は、当該技術で公知の任意の培地で成長させることができ、選択された宿主細胞の培養に適している。適切な培地の例は、必要な栄養素サプリメントがプラスされたルリアブロス(ＬＢ)を含む。幾つかの実施態様では、また培地は、発現ベクターを含む原核細胞の成長を選択的に可能にする、発現ベクターの構造に基づき選択される、選択剤を含む。例えば、アンピシリンはアンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞を成長させるための培地に添加される。
【０１１１】
炭素、窒素、及び無機ホスファート源の他の任意の必要なサプリメントも、単独で、又は他のサプリメント又は培地、例えば複合窒素源との混合物として導入され、適切な濃度で含まれる。通常、培養培地は、グルタチオン、システイン、システアミン、チオグリコラート、ジチオエリトリトール及びジチオスレイトールからなる群から選択される、一又は複数の還元剤を含んでいてよい。
【０１１２】
原核宿主細胞は適温で培養される。大腸菌の成長においては、例えば好ましい温度は約２０℃〜約３９℃、より好ましくは約２５℃〜約３７℃の範囲、さらに好ましくは約３０℃である。培地のｐＨは、主として宿主生物に応じて、約５〜約９の範囲の任意のｐＨであってよい。大腸菌にとっては、ｐＨは、好ましくは約６．８〜約７．４、より好ましくは約７．０である。
【０１１３】
誘導プロモータが本発明の発現ベクターに使用される場合、タンパク質の発現はプロモータの活性化に適した条件下で誘導される。本発明の一態様では、ＰｈｏＡプロモータがポリペプチドの転写の制御に使用される。従って、形質転換された宿主細胞は、誘導のためのホスファート制限培地で培養される。好ましくはホスファート制限培地は、Ｃ．Ｒ．Ａ．Ｐ培地である（例えばSimmons et al., J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147を参照）。多様な他の誘導因子は、当該技術で公知のようにして、使用されるベクター作成物に応じて使用されてよい。
【０１１４】
一実施態様では、本発明の発現されたポリペプチドは、宿主細胞の周辺質に分泌され、そこから回収され得る。タンパク質の回収は、一般的に浸透圧衝撃、超音波処理又は溶解等の手段による、微生物の破壊を典型的に含む。細胞が破壊されると、細胞片又は全細胞が、遠心分離又は濾過により除去され得る。さらにタンパク質は、例えば親和性樹脂クロマトグラフィーにより精製されてよい。また、タンパク質は培養培地に運ばれ、そこから単離することもできる。細胞を培養物から除去し、培養上清を濾過し、生成したタンパク質のさらなる精製のために濃縮してもよい。発現したポリペプチドはさらに単離され、一般的に公知の方法、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）及びウエスタンブロットアッセイを使用して同定することができる。
【０１１５】
本発明の一側面では、抗体産生は発酵法によって大量において実施される。組換えタンパク質の生産には様々な大規模流加発酵法を利用することができる。大規模発酵は少なくとも１０００リットルの容量、好ましくは約１０００から１０００００リットルの容量である。これらの発酵槽は、酸素と栄養分、特にグルコース（好ましい炭素／エネルギー源）を分散させる撹拌翼を使用する。小規模発酵とは一般におよそ１００リットル以下の容積で、約１リットルから約１００リットルの範囲でありうる発酵槽での発酵を意味する。
【０１１６】
発酵法では、タンパク質の発現の誘導は、典型的には、細胞が適切な条件下にて、初期定常期に細胞があるステージで、所望の密度、例えば約１８０−２２０のＯＤ５５０まで増殖したところで開始される。当該分野で知られ上述されているように、用いられるベクターコンストラクトに応じて、様々なインデューサーを用いることができる。細胞を誘導前の短い時間の間、増殖させてもよい。細胞は通常約１２−５０時間の間、誘導されるが、更に長い又は短い誘導時間としてもよい。
【０１１７】
本発明のポリペプチドの生産収量と品質を改善するために、様々な発酵条件を変更することができる。例えば、分泌される抗体ポリペプチドの正しい組み立てとフォールディングを改善するために、例えばＤｓｂタンパク質（ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤ及び／又はＤｓｂＧ）又はＦｋｐＡ（シャペロン活性を持つペプチジルプロピルシス、トランス-イソメラーゼ）のようなシャペロンタンパク質を過剰発現する更なるベクターを用いて宿主原核細胞を同時形質転換させることができる。シャペロンタンパク質は細菌宿主細胞中で生産される異種性タンパク質の適切な折り畳みと溶解性を容易にすることが実証されている。Chen等 (1999) J Bio Chem 274:19601-19605；Georgiou等, 米国特許第６０８３７１５号；Georgiou等, 米国特許第６０２７８８８号；Bothmann及びPluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105；Ramm及びPluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113；Arie等 (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210。
【０１１８】
発現された異種タンパク質（特にタンパク分解を受けやすいもの）のタンパク質分解を最小にするために、タンパク質分解酵素を欠くある種の宿主株を本発明に用いることができる。例えば、原核生物宿主細胞株を改変して、プロテアーゼＩＩＩ、ＯｍｐＴ、ＤｅｇＰ、Ｔｓｐ、プロテアーゼＩ、プロテアーゼＭｉ、プロテアーゼＶ、プロテアーゼＶＩ及びその組合せのような既知の細菌プロテアーゼをコードしている遺伝子に遺伝子突然変異を生じさせることができる。幾つかの大腸菌プロテアーゼ欠損株が利用でき、例えば、上掲のJoly等 (1998)；Georgiou等, 米国特許第５２６４３６５号；Georgiou等, 米国特許第５５０８１９２号；Hara等 (1996) Microbial Drug Resistance 2:63-72に記載されている。
【０１１９】
ある実施態様では、タンパク質溶解性酵素を欠損した、一以上のシャペロンタンパク質を過剰発現するプラスミドで形質転換した大腸菌株を本発明の発現系の宿主細胞として用いる。
【０１２０】
抗体精製
ある実施態様では、本明細書に記載の生成した抗体タンパク質をさらに精製して、更なるアッセイ及び使用のために実質的に均一な調製物を得る。当分野で公知の標準的なタンパク質精製方法を用いることができる。以下の方法は好適な精製手順の例である：免疫親和性又はイオン交換カラムによる分画化、エタノール沈降法、逆相ＨＰＬＣ、シリカ又はＤＥＡＥなどの陽性交換樹脂によるクロマトグラフィ、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈降法及び、例えばＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ-７５を用いたゲル濾過法。
【０１２１】
一態様では、固形層に固定したプロテインＡを本発明の抗体産物の免疫親和性精製法に用いる。プロテインＡは抗体のＦｃ領域に高い親和性で結合する黄色ブドウ球菌から単離した４１ｋＤの細胞壁タンパク質である。Lindmark ら (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13。プロテインＡを固定した固形層は、ガラス又はシリカ表面、より好ましくは孔を調節したガラスカラム又はケイ酸カラムを含むカラムが好ましい。ある方法では、カラムは非特異的な混入物の接着を防ぐためにグリセロールなどの試薬でコートされている。
【０１２２】
精製の初めの工程では、上記に記載のように細胞培養物からの調製物をプロテインＡ固定固形層に適応し、プロテインＡに対象とする抗体を特異的に結合させる。ついで、固形層を洗浄して、固形層に非特異的に結合した混入物を除去する。最後に、対象とする抗体を溶出により固形層から除去する。
【０１２３】
真核生物の宿主細胞を用いた抗体の生成
一般的に、ベクターは、限定するものではないが、以下の一以上を含む：シグナル配列、複製起点、一以上のマーカ遺伝子、エンハンサー因子、プロモータ及び転写終末配列。
【０１２４】
（ｉ）シグナル配列成分
真核生物の宿主細胞に用いるベクターは、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいは対象とするポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドを含んでいてもよい。好ましく選択された異種シグナル配列は宿主細胞によって認識され加工される(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。哺乳動物細胞での発現においては、哺乳動物のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルが利用できる。
このような前駆体領域のＤＮＡは、多価抗体をコードするＤＮＡに読み枠を一致させて結合される。
【０１２５】
（ｉｉ）複製開始点
一般には、哺乳動物の発現ベクターには複製開始点成分は不要である。例えば、ＳＶ４０開始点は典型的にはただ初期プロモーターを有しているために用いられる。
（ｉｉｉ）選択遺伝子成分
発現及びクローニングベクターは、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(ａ)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(ｂ)必要があれば栄養要求性欠陥を補い、又は(ｃ)複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
選択方法の一例では、宿主細胞の成長を抑止する薬物が用いられる。異種性遺伝子で首尾よく形質転換した細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を生産し、よって選択工程を生存する。このような優性選択の例は、薬剤ネオマイシン、ミコフェノール酸及びハイグロマイシンを使用する。
哺乳動物細胞に適切な選択可能なマーカーの他の例は、抗体核酸を捕捉することのできる細胞成分を同定することを可能にするもの、例えばＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネインＩ及びＩＩ、好ましくは、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等々である。
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子によって形質転換された細胞は、先ず、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトリキセート(Ｍｔｘ)を含む培地において形質転換物の全てを培養することで同定される。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性に欠陥のあるチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)株化細胞である（例として、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ-９０９６）。
あるいは、抗体をコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲタンパク質、及びアミノグリコシド３'-ホスホトランスフェラーゼ(ＡＰＨ)のような他の選択可能マーカーで形質転換あるいは同時形質転換した宿主細胞(特に、内在性ＤＨＦＲを含む野生型宿主)は、カナマイシン、ネオマイシンあるいはＧ４１８のようなアミノグリコシド抗生物質のような選択可能マーカーの選択剤を含む培地中での細胞増殖により選択することができる。米国特許第４９６５１９９号を参照のこと。
【０１２６】
（ｉｖ）プロモーター成分
発現及びクローニングベクターは通常は宿主生物体によって認識され抗体ポリペプチド核酸に作用可能に結合しているプロモーターを含む。真核生物に対してもプロモーター配列が知られている。実質的に全ての真核生物の遺伝子が、転写開始部位からおよそ２５ないし３０塩基上流に見出されるＡＴリッチ領域を有している。多数の遺伝子の転写開始位置から７０ないし８０塩基上流に見出される他の配列は、Ｎが任意のヌクレオチドであるＣＮＣＡＡＴ領域である。大部分の真核生物遺伝子の３'末端には、コード配列の３'末端へのポリＡ尾部の付加に対するシグナルであるＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列は全て真核生物の発現ベクターに適切に挿入される。
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからの抗体ポリペプチドの転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウィルス４０(ＳＶ４０)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターにょって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り、調節される。
ＳＶ４０ウィルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点を更に含むＳＶ４０制限断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガロウィルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩＥ制限断片として簡便に得られる。ベクターとしてウシ乳頭腫ウィルスを用いて哺乳動物宿主中でＤＮＡを発現させる系が、米国特許第４４１９４４６号に開示されている。この系の変形例は米国特許第４６０１９７８号に開示されている。また、単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの調節下でのマウス細胞中でのヒトβインターフェロンｃＤＮＡの発現について、Reyes等, Nature, 297：598-601(1982)を参照のこと。あるいは、ラウス肉腫ウィルス長末端反復をプロモーターとして使用することができる。
【０１２７】
（ｖ）エンハンサーエレメント成分
より高等の真核生物によるこの発明の抗体ポリペプチドをコードしているＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによってしばしば増強される。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。真核生物プロモーターの活性化のための増強要素については、Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)もまた参照のこと。エンハンサーは、抗体ポリペプチドコード配列の５'又は３'位でベクター中にスプライシングされうるが、好ましくはプロモーターから５'位に位置している。
【０１２８】
（ｖｉ）転写終結成分
また、真核生物宿主細胞に用いられる発現ベクターは、典型的には、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの５'、時には３'の非翻訳領域から一般に取得できる。これらの領域は、抗体をコードしているｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。一つの有用な転写終結成分はウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第９４／１１０２６号とそこに開示された発現ベクターを参照のこと。
【０１２９】
（ｖｉｉ）宿主細胞の選択及び形質転換
ここに記載のベクター中のＤＮＡをクローニングあるいは発現させるために適切な宿主細胞は、脊椎動物の宿主細胞を含む本明細書中に記載の高等真核生物細胞を含む。培養(組織培養)中での脊椎動物細胞の増殖は常套的な手順になっている。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (ＣＯＳ-７, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１);ヒト胚腎臓株（２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977)）；ハムスター乳児腎細胞(ＢＨＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０)；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ, Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));マウスのセルトリ細胞（ＴＭ４, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)）;サルの腎細胞 (ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０); アフリカミドリザルの腎細胞(ＶＥＲＯ-７６, ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１５８７); ヒト子宮頸癌細胞 (ＨＥＬＡ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ２); イヌ腎細胞 (ＭＤＣＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４); バッファローラット肝細胞 (ＢＲＬ３Ａ, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２); ヒト肺細胞 (Ｗ１３８, ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５); ヒト肝細胞 (Ｈｅｐ Ｇ２, ＨＢ８０６５); マウス乳房腫瘍細胞 (ＭＭＴ０６０５６２, ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１);ＴＲＩ細胞（Mather等, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)）；ＭＲＣ５細胞;ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌株(ＨｅｐＧ２)である。
宿主細胞は、抗体生産のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適切に修飾された常套的栄養培地で培養される。
【０１３０】
（ｖｉｉｉ）宿主細胞の培養
本発明の抗体を産生するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ｈａｍ)のＦ１０(シグマ)、最小必須培地((ＭＥＭ),(シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地((ＤＭＥＭ),シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980), 米国特許第４７６７７０４号；同４６５７８６６号；同４９２７７６２号；同４５６０６５５号；又は同５１２２４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；又は米国再発行特許第３０９８５号に記載された何れの培地も宿主細胞に対する培地として使用できる。これらの培地には何れもホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインシュリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオチド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ<SUP>TM</SUP>薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は等価なエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について過去に用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【０１３１】
（ｉｘ）抗体の精製
組換え技術を用いる場合、抗体は細胞内で生成され、又は培地内に直接分泌される。抗体が細胞内に生成された場合、第１の工程として、宿主細胞か溶解された断片の何れにしても、粒子状の細片が、例えば遠心分離又は限外濾過によって除去される。抗体が培地に分泌された場合は、そのような発現系からの上清を、一般的には先ず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎ又はＰｅｌｌｉｃｏｎの限外濾過装置を用いて濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めて、タンパク質分解を阻害してもよく、また抗生物質を含めて外来性の汚染物の成長を防止してもよい。
【０１３２】
細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製でき、アフィニティクロマトグラフィーが好ましい精製技術である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する免疫グロブリンＦｃ領域の種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる（Lindmark等, J. immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)）。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨されている（Guss等, EMBO J. 5: 16571575 (1986)）。アフィニティーリガンドが結合されるマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他の材料も使用可能である。孔制御ガラスやポリ(スチレンジビニル)ベンゼン等の機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるものより早い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸＴＭ樹脂（J.T. Baker, Phillipsburg, NJ）が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンでのクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂上でのＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭクロマトグラフィー（ポリアスパラギン酸カラム）、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿法も、回収される多価抗体に応じて利用可能である。
予備的精製工程に続いて、目的の抗体および混入物を含む混合液をｐＨ約２．５−４．５、好ましくは低塩濃度（例として、約０−０．２５Ｍ塩）の溶出緩衝液を用いて低ｐＨ疎水性作用クロマトグラフィを行う。
【０１３３】
活性アッセイ
本発明の抗体は当該分野で知られている様々なアッセイによってその物理的／化学的性質及び生物学的機能について特徴付けることができる。
【０１３４】
精製された免疫グロブリンは、限定されるものではないが、Ｎ末端シークエンシング、アミノ酸解析、非変性サイズ排除高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量分析、イオン交換クロマトグラフィー及びパパイン消化を含む一連のアッセイによって更に特徴付けることができる。
【０１３５】
本発明の特定の実施態様では、ここで生産された免疫グロブリンはその生物学的活性について分析される。ある実施態様では、本発明の免疫グロブリンはその抗原結合活性について試験される。当該分野で知られ、ここで使用することができる抗原結合アッセイには、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、エライザ（酵素結合免疫吸着検定法）、「サンドウィッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、蛍光イムノアッセイ、及びプロテインＡイムノアッセイのような技術を使用する任意の直接的又は競合的結合アッセイが制限なく含まれる。説明的な抗原結合アッセイを下の実施例のセクションに提供する。
【０１３６】
一実施態様では、本発明はすべてではなくいくつかのエフェクター機能を有する変更した抗体を考慮し、このことによって抗体のインビボ半減期が重要なある種のエフェクター機能（補体又はＡＤＣＣなど）が不要で有害である多くの手法の所望する候補となる。特定の実施態様では、生成した免疫グロブリンのＦｃ活性を測定して、所望の特性が維持されていることを確認する。インビボ及び／又はインビトロ細胞障害アッセイを行って、ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）結合アッセイを行って、抗体がＦｃγＲ結合を欠損している（すなわちＡＤＣＣ活性をほとんど欠損している）が、ＦｃＲｎ結合能は維持していることを確認することができる。ＡＤＣＣに関与している第一細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現しており、その一方で単核細胞はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現している。造血系細胞でのＦｃＲ発現については、Ravetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)の464頁の表3に要約されている。対象とする分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの例は、米国特許第5,500,362号又は同第5,821,337号に記載されている。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、又は加えて、対象とする分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynes ら. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)に開示されているような動物モデル内でインビボに評価することができる。また、Ｃ１ｑ結合アッセイを行って、抗体がＣ１ｑに結合できない、つまりＣＤＣ活性を欠損していることを確認してもよい。補体活性化を評価するために、例えばGazzano-Santoro ら., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載のように、ＣＤＣアッセイを行ってもよい。また、ＦｃＲｎ結合及びインビボクリアランス／半減期測定を、当分野で公知の方法を用いて行うことができる。
【０１３７】
ヒト化抗体
本発明は、ヒト抗体を包含する。非ヒト抗体をヒト化する様々な方法は当分野でよく知られている。例えば、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入されている。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と呼ばれる。ヒト化は、本質的にはヒト抗体の該当する高頻度可変領域配列を置換することによりウィンターと共同研究者の方法(Jonesほか, Nature, 321:522-525 (1986)、Riechmannほか, Nature, 332:323-327 (1988)、Verhoeyenほか, Science, 239:1534-1536(1988))を使用して実施することができる。よって、このような「ヒト化」抗体は、完全なヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の該当する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は、典型的にはいくらかの高頻度可変領域残基及び場合によってはいくらかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
抗原性を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方の可変ドメインの選択が非常に重要である。「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒト配列をヒト化抗体のヒトフレームワークとして受け入れる(Simsほか, J. Immunol., 151:2296 (1993)；Chothiaら, J. Mol. Biol., 196:901(1987))。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用できる(Carterほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Prestaほか, J. Immunol., 151:2623(1993))。
【０１３８】
更に、抗体を、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、一方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、高頻度可変領域残基は、直接的かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
【０１３９】
抗体変異体
一態様では、本発明は、Ｆｃ領域を含むＦｃポリペプチドの作用面内に修飾を有する抗体断片を提供するものであり、ここでいう修飾によって異種性二量体化を容易にする及び／又は促進される。この修飾は、第一Ｆｃポリペプチド内への隆起と第二Ｆｃポリペプチド内への腔の導入を含むものであり、ここでいう隆起は第一Ｆｃポリペプチドと第二Ｆｃポリペプチドの複合体化を促進するために腔内に位置する。これらの修飾を有する抗体の生成方法は当分野で公知であり、例えば米国特許第５，７３１，１６８号に記載されている。
ある実施態様では、本明細書中に記載の抗体のアミノ酸配列の修飾を考える。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望まれうる。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体核酸中に適当なヌクレオチド変化を導入することにより、又はペプチド合成により調製される。そのような修飾は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失及び／又は挿入及び／又は置換を含む。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせをその最終コンストラクトに達するまでなされることによって最終コンストラクトが所望の特徴を有する。配列を作製すると同時に目的の抗体アミノ酸配列にアミノ酸修飾を導入するのがよい。
【０１４０】
突然変異誘発の好ましい位置である抗体の所定の残基又は領域の特定のために有用な方法は、Cunningham及びWells, Science 244: 1081-1085 (1989)に記載されているように「アラニンスキャンニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここで、標的残基の残基又は基が同定され（例えば、arg, asp, his, lys,及びglu等の荷電残基）、中性又は負荷電アミノ酸（最も好ましくはアラニン又はポリアラニン）に置換され、アミノ酸と抗原との相互作用に影響を及ぼす。ついで置換に対する機能的感受性を示すこれらのアミノ酸の位置は、置換部位において又はそれに対して更なる又は他の変異体を導入することにより精製される。しかして、アミノ酸配列変異を導入する部位は予め決定されるが、変異自体の性質は予め決める必要はない。例えば、与えられた部位における変異の性能を分析するために、ａｌａスキャンニング又はランダム突然変異誘発を標的コドン又は領域で実施し、発現された免疫グロブリンを所望の活性についてスクリーニングする。
アミノ酸配列挿入は、１残基から１００以上の残基を含むポリペプチドの長さの範囲のアミノ-及び／又はカルボキシル末端融合物、並びに一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入物を含む。末端挿入物の例には、Ｎ末端メチオニル残基を持つ抗体ないし細胞障害性ポリペプチドに融合した抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体は、抗体の血清半減期を向上させる酵素(例えばＡＤＥＰＴ)又はポリペプチドへの、抗体のＮ又はＣ末端への融合物を含む。
他の型の変異体はアミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、抗体分子において少なくとも一つのアミノ酸残基が異なる残基で置換されている。置換突然変異に対して最も興味深い部位は高頻度可変領域を含むが、ＦＲ変化も考えられる。保存的置換は、「好ましい置換」と題して表２に示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、以下の表に「例示的置換」と名前を付け、又はアミノ酸の分類に関して以下に更に記載するような、より実質的な変化を導入し、生成物をスクリーニングしてもよい。
0005889794.tif 000002
【０１４１】
抗体の生物学的性質における実質的な修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位の分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩を維持するそれらの効果において実質的に異なる置換を選択することにより達成される。アミノ酸は共通の側鎖特性に基づいて群に分けることができる：
（１）非極性：Ａｌａ（Ａ），Ｖａｌ（Ｖ），Ｌｅｕ（Ｌ），Ｉｌｅ（Ｉ），Ｐｒｏ（Ｐ），Ｐｈｅ（Ｆ），Ｔｒｐ（Ｗ），Ｍｅｔ（Ｍ）
（２）荷電のない極性：Ｇｌｙ（Ｇ），Ｓｅｒ（Ｓ），Ｔｈｒ（Ｔ），Ｃｙｓ（Ｃ），Ｔｙｒ（Ｙ），Ａｓｎ（Ｎ），Ｇｌｎ（Ｑ）
（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ），Ｇｌｕ（Ｅ）
（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ），Ａｒｇ（Ｒ），Ｈｉｓ（Ｈ）
あるいは、天然に生じる残基は共通の側鎖性質に基づくグループに分けられる：
（１）疎水性：ノルロイシン，Ｍｅｔ，Ａｌａ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ａｓｎ，Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ，Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ，Ｌｙｓ，Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ，Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，Ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。また、保存的置換部位又はより好ましくは残りの（非保存的）部位内に置換された残基を導入してもよい。
【０１４２】
ある型の置換変異体は、親抗体（例えば、ヒト化又はヒト抗体）の一又は複数の高頻度可変領域残基の置換を含む。一般的に、さらなる発展のために選択され、得られた変異体は、それらが作製された親抗体と比較して向上した生物学的特性を有している。そのような置換変異体を作製する簡便な方法は、ファージディスプレイを使用する親和性突然変異を含む。簡潔に言えば、幾つかの高頻度可変領域部位（例えば６−７部位）を突然変異させて各部位における全ての可能なアミノ酸置換を生成させる。このように生成された多価抗体は、繊維状ファージ粒子から、各粒子内に充填されたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合物としてディスプレイされる。ファージディスプレイ変異体は、ついで、ここに開示されるようなそれらの生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。修飾のための候補となる高頻度可変領域部位を同定するために、アラニンスキャンニング突然変異誘発を実施し、抗原結合に有意に寄与する高頻度可変領域残基を同定することができる。別法として、又はそれに加えて、抗原-抗体複合体の結晶構造を分析して抗体と抗原の接点を特定するのが有利である場合もある。このような接触残基及び隣接残基は、ここに述べた技術に従う置換の候補である。そのような変異体が生成されると、変異体のパネルにここに記載するようなスクリーニングを施し、一又は複数の関連アッセイにおいて優れた特性を持つ抗体を更なる開発のために選択する。
抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、この分野で知られた種々の方法によって調製される。これらの方法は、限定するものではないが、天然源からの単離（天然に生じるアミノ酸配列変異体の場合）又は初期に調製された抗体の変異体又は非変異体のオリゴヌクレオチド媒介（又は部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、及びカセット突然変異誘発による調製を含む。
【０１４３】
本発明の免疫グロブリンポリペプチドのＦｃ領域内に一以上のアミノ酸修飾を導入してＦｃ領域変異型を生成することが望ましい。Ｆｃ領域変異体は、ヒンジシステイン修飾を含む、一以上のアミノ酸位置でのアミノ酸修飾（例えば、置換）を有するヒトＦｃ領域配列（例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４  Ｆｃ領域）を含みうる。
当分野での記載や教示に従って、ある実施態様では、本発明の方法を用いた抗体が野生型の対応抗体と比較して例えばＦｃ領域内に一以上の変異を有することを考慮する。にもかかわらず、この抗体はその野生型対応物と比較して治療的有用性を示す実質的に同じ特徴を維持している。例えば、ＷＯ９９／５１６４２などに記載のようにＣ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）を変更する（すなわち改良又は減少する）結果となるＦｃ領域内に特定の変異を生じさせることが考えられる。また、Ｆｃ領域変異型の他の例に関するDuncan &amp; Winter Nature 322:738-40 (1988)；米国特許第5,648,260号；米国特許第5,624,821号；及びWO94/29351を参照。
【０１４４】
免疫コンジュゲート
また、本発明は、化学療法剤、薬剤、成長阻害剤、毒素（例えば、細菌、糸状菌、植物又は動物由来の酵素活性性毒素、又はその断片）、又は放射性同位体（すなわち放射性コンジュゲート）などの細胞毒性剤にコンジュゲートした抗体を含む免疫コンジュゲート又は抗体-薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）に関する。
細胞障害性又は細胞分裂停止性の薬剤、すなわち癌治療における腫瘍細胞を殺す又は阻害するための薬剤の局部運搬に抗体-薬剤コンジュゲートを用いると(Syrigos及びEpenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172；米国特許第4,975,278号)、論理的に腫瘍への薬剤成分の標的とする運搬とそこでの細胞内集積が可能となるものであり、この非コンジュゲート薬物作用剤の全身性投与により正常細胞並びに除去しようとする腫瘍細胞への毒性が容認できないレベルとなりうる(Baldwinら., (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05; Thorpe, (1985) 「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review,」 in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pincheraら. (ed.s), pp. 475-506)。これによって、最小限の毒性で最大限の効果を求める。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体はこの方策に有用であるとして報告されている(Rowlandら., (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21:183-87)。この方法に用いる薬物には、ダウノマイシン、ドキソルビジン、メトトレキサート及びビンデジンが含まれる(Rowlandら., (1986)、上掲)。抗体-毒素コンジュゲートに用いる毒素には、ジフテリア毒素などの細菌性毒素、ゲルダナマイシン(Mandlerら(2000) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581；Mandlerら(2000) Bioorganic &amp; Med. Chem. Letters 10:1025-1028；Mandlerら(2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791)、メイタンシノイド(EP 1391213；Liuら., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623)、及びカリケアマイシン(Lodeら (1998) Cancer Res. 58:2928；Hinmanら (1993) Cancer Res. 53:3336-3342)などのリシン、小分子毒素などの植物毒が含まれる。該毒素は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合又はトポイソメラーゼ阻害を含む機能によりその細胞障害性及び細胞分裂停止性の効果に影響しうる。ある種の細胞障害性剤は、大きな抗体又はタンパク質レセプターリガンドにコンジュゲートした場合に、不活性又は活性が低減する傾向がある。
【０１４５】
ゼバリン(ZEVALIN)（登録商標）（イブリツモマブチウキセタン(ibritumomab tiuxetan), Biogen/Idec）は正常及び悪性のＢリンパ球の細胞表面上にみられるＣＤ２０抗原に対するマウスＩｇＧ１κモノクローナル抗体と<SUP>111</SUP>In又は<SUP>90</SUP>Y放射性同位体とがチオウレアリンカーキレート剤にて結合した抗体-放射性同位体コンジュゲートである(Wisemanら (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77；Wisemanら (2002) Blood 99(12):4336-42；Witzigら (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63；Witzigら (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69)。ゼバリンはＢ細胞非ホジキン性リンパ球（ＮＨＬ）に対して活性を有するが、投与によってほとんどの患者に重症で長期の血球減少を引き起こす。カリケアマイシンに連結したｈｕＣＤ３３抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるマイロターグ(MYLOTARG)（登録商標）（ゲムツズマブオゾガミシン(gemtuzumab ozogamicin), Wyeth Pharmaceuticals）は、急性骨髄性白血病の治療用注射剤として２０００年に認可された(Drugs of the Future (2000) 25(7):686；米国特許第4970198号；同第5079233号；同第5585089号；同第5606040号；同第5693762号；同第5739116号；同第5767285号；同第5773001号)。ジスルフィドリンカーＳＰＰを介してメイタンシノイド薬剤分子ＤＭ１と連結しているｈｕＣ２４２抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるカンツズマブメルタンシン(Cantuzumab mertansine)(Immunogen, Inc.)は、ＣａｎＡｇを発現する癌、例として大腸、膵臓、胃などの治療用に第ＩＩ相試験へと進んでいる。メイタンシノイド薬剤分子ＤＭ１と連結している抗前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）モノクローナル抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるＭＬＮ-２７０４(Millennium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc.)は、前立腺癌の潜在的治療の開発段階にある。アウリスタチン(auristatin)ペプチド、アウリスタチンＥ（ＡＥ）及びモノメチルアウリスタチン（ＭＭＡＥ）、ドラスタチン(dolastatin)の合成類似体は、キメラモノクローナル抗体ｃＢＲ９６（癌細胞上のルイスＹに特異的）及びｃＡＣ１０（血液系悪性腫瘍上のＣＤ３０に特異的）(Doroninaら (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784)にコンジュゲートしており、治療的開発段階にある。
【０１４６】
このような免疫複合体（免疫コンジュゲート）の生成に有用な化学治療薬を上に記載した。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質（PAPI、PAPII、及びPAP-S）、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria officinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)が含まれる。放射性コンジュゲート抗体の生成には、様々な放射性ヌクレオチドが利用可能である。例としては、<SUP>２１２</SUP>Ｂｉ、<SUP>１３１</SUP>Ｉ、<SUP>１３１</SUP>Ｉｎ、<SUP>９０</SUP>Ｙ及び<SUP>１８６</SUP>Ｒｅが含まれる。抗体及び細胞障害性薬の複合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオナート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣＬ等）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレート等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビス-アジド化合物（ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等）、ビス-ジアゾニウム誘導体（ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トリエン２，６-ジイソシアネート等）、及びビス-活性フッ素化合物（１，５-ジフルオロ-２，４-ジニトロベンゼン等）を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238: 1098 (1987)に記載されているように調製することができる。カーボン-１４-標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ-ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合のためのキレート剤の例である。国際公開９４／１１０２６参照。
抗体のコンジュゲートと一又は複数の小分子毒素、例えばカリケアマイシン、メイタンシノイド、トリコセン(trichothene)及びＣＣ１０６５、及び毒性活性を有するこれらの毒素の誘導体が、ここで考察される。
【０１４７】
メイタンシン及びメイタンシノイド
一実施態様では、本発明の抗体(完全長又は断片)は一又は複数のメイタンシノイド分子と結合している。
メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害するように作用する分裂阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカシラブMaytenus serrataから単離されたものである(米国特許第３８９６１１１号)。その後、ある種の微生物がメイタンシノイド類、例えばメイタンシノール及びＣ-３メイタンシノールエステルを生成することが発見された(米国特許第４１５１０４２号)。合成メイタンシノール及びその誘導体及び類似体は、例えば米国特許第４１３７２３０号；同４２４８８７０号；同４２５６７４６号；同４２６０６０８号；同４２６５８１４号；同４２９４７５７号；同４３０７０１６号；同４３０８２６８号；同４３０８２６９号；同４３０９４２８号；同４３１３９４６号；同４３１５９２９号；同４３１７８２１号；同４３２２３４８号；同４３３１５９８号；同４３６１６５０号；同４３６４８６６号；同４４２４２１９号；同４４５０２５４号；同４３６２６６３号；及び同４３７１５３３号に開示されており、その開示は出典を明示してここに取り込まれる。
【０１４８】
メイタンシノイド-抗体コンジュゲート
治療指標を改善する試みにおいて、メイタンシン及びメイタンシノイドは、腫瘍細胞抗原に特異的に結合する抗体と結合している。メイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲート及びそれらの治療用途は、例えば米国特許第５，２０８，０２０号、同５，４１６，０６４号、欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号に開示されており、その開示は出典を明示してここに取り込まれる。Liu等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：8618-8623(1996)には、ヒト結腸直腸癌に対するモノクローナル抗体Ｃ２４２に結合するＤＭ１と命名されたメイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲートが記載されている。前記コンジュゲートは培養された結腸癌細胞に対して高い細胞障害性を有することが見出されており、インビボ腫瘍成長アッセイにおいて抗腫瘍活性を示す。Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)には、メイタンシノイドが、ジスルフィド結合を介して、ヒト結腸癌株化細胞の抗原に結合するマウス抗体Ａ７、又はＨＥＲ-２／ｎｅｕオンコジーンに結合する他のマウスモノクローナル抗体ＴＡ.１に結合している免疫コンジュゲートが記載されている。ＴＡ.１-メイタンシノイドコンジュゲートの細胞障害性はヒト乳癌株化細胞ＳＫ-ＢＲ-３におけるインビトロで試験され、細胞当たり３×１０<SUP>５</SUP>ＨＥＲ-２表面抗原が発現した。薬剤コンジュゲートにより、遊離のメイタンシノイド剤に類似した細胞障害度が達成され、該細胞障害度は、抗体分子当たりのメイタンシノイド分子の数を増加させることにより増加する。Ａ７-メイタンシノイドコンジュゲートはマウスにおいては低い全身性細胞障害性を示した。
【０１４９】
抗体-メイタンシノイドコンジュゲート(免疫コンジュゲート)
抗体-メイタンシノイドコンジュゲートは、抗体又はメイタンシノイド分子のいずれの生物学的活性もほとんど低減することなく、メイタンシノイド分子に抗体を化学的に結合させることにより調製される。１分子の毒素／抗体は、裸抗体の使用において細胞障害性を高めることが予期されているが、抗体分子当たり、平均３−４のメイタンシノイド分子が結合したものは、抗体の機能又は溶解性に悪影響を与えることなく、標的細胞に対する細胞障害性を向上させるといった効力を示す。メイタンシノイドは当該技術分野でよく知られており、公知の技術で合成することも、天然源から単離することもできる。適切なメイタンシノイドは、例えば米国特許第５２０８０２０号、及び他の特許、及び上述した特許ではない刊行物に開示されている。好ましいメイタンシノイドは、メイタンシノール、及び種々のメイタンシノールエステル等の、メイタンシノール分子の芳香環又は他の位置が修飾されたメイタンシノール類似体である。
例えば、米国特許第５２０８０２０号又は欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号、及びChari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)に開示されているもの等を含む、抗体-メイタンシノイドコンジュゲートを作製するために、当該技術で公知の多くの結合基がある。結合基には、上述した特許に開示されているようなジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチターゼ不安定性基、又はエステラーゼ不安定性基が含まれるが、ジスルフィド及びチオエーテル基が好ましい。
【０１５０】
抗体とメイタンシノイドとのコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トルエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。特に好ましいカップリング剤には、ジスルフィド結合により提供されるＮ-スクシンイミジル-４-(２-ピリジルチオ)ペンタノアート(ＳＰＰ)及びＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)(Carlsson等, Biochem. J. 173：723-737[1978])が含まれる。
リンカーは結合の種類に応じて、種々の位置でメイタンシノイド分子に結合し得る。例えば、従来からのカップリング技術を使用してヒドロキシル基と反応させることによりエステル結合を形成することができる。反応はヒドロキシル基を有するＣ-３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ-１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ-１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ-２０位で生じる。好ましい実施態様において、結合はメイタンシノール又はメイタンシノールの類似体のＣ-３位で形成される。
【０１５１】
カリケアマイシン
対象の他の免疫コンジュゲートには、一又は複数のカリケアマイシン分子と結合した抗体が含まれる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはサブ-ピコモルの濃度で二重鎖ＤＮＡ破壊を生じることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第５７１２３７４号、同５７１４５８６号、同５７３９１１６号、同５７６７２８５号、同５７７０７０１号、同５７７０７１０号、同５７７３００１号、同５８７７２９６号(全て、American Cyanamid Company)を参照のこと。使用可能なカリケアマイシンの構造類似体には、限定するものではないが、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ-アセチル-γ１Ｉ、ＰＳＡＧ及びθＩ１(Hinman等, Cancer Research, 53：3336-3342(1993)、Lode等 Cancer Research, 58：2925-2928(1998)及び上述したAmerican Cyanamidの米国特許)が含まれる。抗体が結合可能な他の抗腫瘍剤は、葉酸代謝拮抗薬であるＱＦＡである。カリケアマイシン及びＱＦＡは双方共、細胞内に作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。よって抗体媒介性インターナリゼーションによるこれらの薬剤の細胞への取込により、細胞障害効果が大きく向上する。
【０１５２】
他の細胞障害剤
本発明の抗体と結合可能な他の抗腫瘍剤には、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン及び５-フルオロウラシル、米国特許第５０５３３９４号、同５７７０７１０号に記載されており、集合的にＬＬ-Ｅ３３２８８複合体として公知の薬剤のファミリー、並びにエスペラマイシン(esperamicine)(米国特許第５８７７２９６号)が含まれる。
使用可能な酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖(シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)より)、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン(sarcin)、アレウライツ・フォルディイ(Aleurites fordii)プロテイン、ジアンシン(dianthin)プロテイン、フィトラッカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)プロテイン(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ-Ｓ)、モモルディカ・キャランティア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン、サパオナリア(sapaonaria)オフィシナリスインヒビター、ゲロニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス(tricothecenes)が含まれる。例えば、１９９３年１０月２８日公開の国際公開第９３／２１２３２号を参照のこと。
本発明は、抗体と核酸分解活性を有する化合物(例えばリボヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮアーゼ)との間に形成される免疫コンジュゲートをさらに考察する。
【０１５３】
腫瘍を選択的に破壊するため、抗体は高い放射性を有する原子を含有してよい。放射性コンジュゲートした抗体を生成するために、種々の放射性同位体が利用される。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体が含まれる。コンジュゲートが検出用に使用される場合、それはシンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴(ＮＭＲ)映像(磁気共鳴映像、ｍｒｉとしても公知)用のスピン標識、例えばヨウ素-１２３、ヨウ素-１３１、インジウム-１１１、フッ素-１９、炭素-１３、窒素-１５、酸素-１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含有し得る。
放射-又は他の標識が、公知の方法でコンジュゲートに導入される。例えば、ペプチドは生物合成されるか、又は水素の代わりにフッ素-１９を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する化学的なアミノ酸合成により合成される。標識、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８及びＩｎ１１１は、ペプチドのシステイン残基を介して結合可能である。イットリウム-９０はリジン残基を介して結合可能である。IODOGEN法(Fraker等(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80：49-57)は、ヨウ素-１２３の導入に使用することができる。他の方法の詳細は、「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal, CRC Press 1989)に記載されている。
【０１５４】
抗体と細胞障害剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238:1098(1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素-１４標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレン-トリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)が抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。国際公開第９４／１１０２６号を参照されたい。リンカーは細胞中の細胞障害剤の放出を容易にするための「切断可能リンカー」であってよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカーが使用され得る(Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)；米国特許第５２０８０２０号)。
本発明の化合物は、限定するものではないが、架橋剤：市販されている(例えば、Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.Aより)BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、スルホ-EMCS、スルホ-GMBS、スルホ-KMUS、スルホ-MBS、スルホ-SIAB、スルホ-SMCC、及びスルホ-SMPB、及びSVSB (succinimidyl-(4-ビニルスルホン)安息香酸塩)にて調製したＡＤＣが特に考えられる。2003-2004 Applications Handbook and Catalogの４６７−４９８頁を参照。
【０１５５】
抗体薬剤コンジュゲートの調製
本発明の抗体薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）において、抗体（Ａｂ）を、リンカー（Ｌ）を介して、一つ以上の薬剤部分（Ｄ）、例えば抗体につき約１〜約２０の薬剤部分にコンジュゲートする。式ＩのＡＤＣはいくつかの手段、当業者に公知の有機化学反応、状態および試薬を用いて調製されうる：(１)共有結合の後に薬剤部分Ｄと反応してＡｂ-Ｌを形成するための、二価のリンカー試薬を用いた抗体の求核基の反応；及び(２)共有結合の後に抗体の求核基と反応してＤ-Ｌを形成するための、二価のリンカー試薬を用いた薬剤部分の求核基の反応、が含まれる。
Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｐ            Ｉ
抗体上の求核基には、限定するものでなく、以下のものを含む：（ｉ）Ｎ末端アミン基、（ｉｉ）側鎖アミン基、例えばリシン、（ｉｉｉ）側鎖チオール基、例えばシステイン、および（ｉｖ）抗体がグリコシル化される糖水酸基又はアミノ基。アミン、チオールおよび水酸基は、求核であり、反応して、リンカー部分上の求電子性の群およびリンカー試薬により共有結合を形成することができる：（ｉ）活性エステル、例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロギ酸および酸ハロゲン化物；（ｉｉ）アルキルおよびベンジルハライド、例えばハロアセトアミド；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシルおよびマレイミド群、が含まれる。特定の抗体は、還元しうる鎖間ジスルフィド、すなわちシステイン架橋を有する。抗体は、還元剤、例えばＤＴＴ（ジチオトレイトール）による処置によって、リンカー試薬を用いたコンジュゲート反応を行ってもよい。ゆえに、各々のシステイン架橋は、理論的には、２の反応性のチオール求核基を形成する。チオールにアミンを転換させる２-イミノチオラン（トラウトの試薬）を用いてリシンを反応させることによって抗体に付加的な求核基を導入することができる。
【０１５６】
また、本発明の抗体薬剤コンジュゲートは、抗体を修飾して求電子性の部分を導入する（リンカー試薬又は薬剤上の求核置換基を用いて反応させることができる）ことによって生成してもよい。グリコシル化された抗体の糖質を、例えば過ヨウ素酸塩酸化剤を用いて酸化して、リンカー試薬又は薬剤部分のアミン基と反応するアルデヒド又はケトン基を形成させてもよい。生じたイミンシッフ塩基群が安定結合を形成するか、又は例えば安定アミン結合を形成させるホウ化水素試薬によって、還元してもよい。一実施態様では、ガラクトースオキシダーゼ又はナトリウムメタ過ヨウ素酸塩の何れかによるグリコシル化抗体の炭水化物部分の反応により、薬剤(Hermanson, Bioconjugate Techniques)上の適当な基と反応することができるタンパク質のカルボニル（アルデヒドおよびケトン）基が生じうる。他の実施態様では、Ｎ末端セリン又はスレオニン残基を含んでいるタンパク質はナトリウムメタ過ヨウ素酸塩と反応して、第一のアミノ酸の代わりにアルデヒドを生成する(Geoghegan &amp; Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146；US 5362852)。このようなアルデヒドは、薬剤部分又はリンカー求核基と反応することができる。
同様に、薬剤部分上の求核基には、限定するものではないが、以下のものを含む：反応して、リンカー部分およびリンカー試薬上の求電子性の基と共有結合することができるアミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボン酸エステルおよびアリールヒドラジド基：(ｉ)活性エステル（例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロギ酸および酸ハロゲン化物）；(ｉｉ)アルキルおよびベンジルハライド、例えばハロアセトアミド；(ｉｉｉ)アルデヒド、ケトン、カルボキシルおよびマレイミド基、が含まれる。
【０１５７】
別法として、抗体及び細胞障害剤を含有する融合タンパク質は、例えば組換え技術又はペプチド合成により作製される。ＤＮＡの長さは、コンジュゲートの所望する特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により離間しているか、又は互いに隣接しているコンジュゲートの２つの部分をコードする領域をそれぞれ含有する。
他の実施態様において、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセプター」(例えばストレプトアビジン)に抗体をコンジュゲートし、ここで抗体-レセプターコンジュゲートを患者に投与し、続いて清澄剤を使用し、循環から非結合コンジュゲートを除去し、細胞障害剤(例えば放射性ヌクレオチド)にコンジュゲートする「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。
【０１５８】
抗体誘導体
本発明の抗体は当該分野において知られ直ぐに利用できる更なる非タンパク質性部分を含むように更に修飾することができる。好ましくは、抗体の誘導体化に適した部分は水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの非限定的な例には、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-１,３-ジオキソラン、ポリ-１,３,６-トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーかランダムコポリマー）、及びデキストラン又はポリ(ｎ-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール、及びそれらの混合物が含まれる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは水中におけるその安定性のために製造の際に有利であろう。ポリマーは任意の分子量であってよく、分枝状でも非分枝状でもよい。抗体に結合するポリマーの数は変化してもよく、一を超えるポリマーが結合する場合、それらは同じでも異なった分子でもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又はタイプは、限定されるものではないが、その抗体誘導体が定まった条件下での治療に使用されるかどうか、改善される抗体の特定の性質又は機能を含む考慮事項に基づいて決定することができる。
【０１５９】
医薬製剤
本発明の抗体を含んでなる治療用製剤は、所望の純度を持つ抗体と、場合によっては生理学的に許容される担体、賦形剤又は安定化剤を混合することにより（Remington's Pharmaceutical Sciences １６版, Osol, A. 編 (1980)）、水溶液、凍結乾燥又は他の乾燥製剤の形態に調製されて保存される。許容される担体、賦形剤又は安定化剤は、用いられる用量と濃度でレシピエントに非毒性であり、ホスフェート、シトレート、ヒスチジン及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；保存料（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド、ベンズエトニウムクロリド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ-タンパク質複合体）；及び／又はＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭ又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。
【０１６０】
ここでの製剤は、治療される特定の徴候のために必要ならば一以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を与えない相補的活性を持つものも含んでよい。そのような分子は、好適には、意図する目的のために有効な量で組み合わされて存在する。
また活性成分は、例えばコアセルベーション技術あるいは界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ-(メタクリル酸メチル)マイクロカプセルに、コロイド状ドラッグデリバリー系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ-粒子及びナノカプセル）に、あるいはマクロエマルションに捕捉させてもよい。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences １６版, Osol, A.編 (1980)に開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通して濾過することにより容易に達成される。
【０１６１】
徐放性調合物を調製してもよい。徐放性調合物の好ましい例は、本発明の免疫グロブリンを含む疎水性固体ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリクスは成形物、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリクスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチルメタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール)）、ポリラクチド(米国特許第３７７３９１９号)、Ｌ-グルタミン酸とγエチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注射可能なミクロスフィア）、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシブチル酸が含まれる。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸等のポリマーは、分子を１００日以上かけて放出することを可能にするが、ある種のヒドロゲルはタンパク質をより短い時間で放出する。カプセル化された抗体が体内に長時間残ると、３７℃の水分に暴露された結果として変性又は凝集し、生物活性を喪失させ免疫原性を変化させるおそれがある。合理的な戦略を、関与するメカニズムに応じて安定化のために案出することができる。例えば、凝集機構がチオ-ジスルフィド交換による分子間Ｓ-Ｓ結合の形成であることが見いだされた場合、安定化はスルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥させ、水分含有量を制御し、適当な添加剤を使用し、また特定のポリマーマトリクス組成物を開発することによって達成されうる。
【０１６２】
ある実施態様では、細胞障害性剤とコンジュゲートした抗体を含んでなる免疫コンジュゲートを患者に投与する。ある実施態様では、免疫コンジュゲート及び／又はそれが結合する抗原が細胞に内在化されていると、結合する標的細胞を殺す際の免疫コンジュゲートの治療効果が増す。一実施態様において、細胞障害性剤は標的細胞内の核酸を標的とするか又は妨げる。このような細胞障害性剤の例には、本明細書に記載の何れかの化学療法剤（例えばメイタンシノイド又はカリケアマイシン）、放射性同位元素、又はＲＮＡ分解酵素ないしＤＮＡエンドヌクレアーゼが含まれる。
【０１６３】
本発明の抗体は、単独で、または、他の組成物と組み合わせて治療に用いることができる。例えば、本発明の抗体は、他の抗体、化学療法剤（一又は複数）（化学療法剤の混合を含む）、他の細胞障害性剤（一又は複数）、抗血管形成剤（一又は複数）、サイトカインおよび／または増殖阻害性剤（一又は複数）と同時に投与してもよい。本発明の抗体が腫瘍成長を阻害する場合、腫瘍成長を阻害する一つ以上の他の治療薬と組み合わせることが特に望ましい。あるいは又は加えて、放射線療法（例えば、外部光線照射、又は放射性標識した抗体などの作用剤を用いた治療）を患者に併用してもよい。上記の併用治療には、併用投与（２以上の作用剤が同じか又は別の製剤に包含される）及び別々の投与、別々の場合には、本発明の抗体は補助治療（一又は複数）の前及び／又はその後に投与することができる。
【０１６４】
本発明の抗体（及び補助治療薬）は、非経口的、皮下、腹膜内、肺内、鼻腔内、そして、必要に応じて局所の治療のために、病巣内投与を含む任意の好適な手段によって投与する。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹膜内、又は皮下的な投与を含む。加えて、抗体を、特に抗体の用量を減少して、パルス注入によって好適に投与する。投与が短期のものであるか慢性的なものであるかにある程度依存して、例えば、静脈内又は皮下注射などの注射によって、好適な任意の方法投与することができる。
【０１６５】
本発明の抗体組成物は、医学的実用性に合わせた様式で調製し、１回分に分けて、投与する。ここで考慮する要因は、治療する特定の疾患、治療する特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、疾患の原因、薬剤の運搬部位、投与の方法、投与の日程計画、および医師が知る他の因子を含む。必要ではないが場合によっては、問題の疾患を予防するかまたは治療するために一般に用いられる一つ以上の作用剤と抗体とを調製する。そのような他の作用剤の有効量は、製剤中の本発明の抗体の量、疾患の型又は治療、及び上記の他の因子に依存する。一般的に、以前用いたのと同じ用量及び投与経路で、又は前回用いた用量の１〜９９％で用いる。
【０１６６】
疾患の予防又は治療のために、本発明の抗体の好適な用量は（単独で用いる場合、又は化学療法剤などの他の作用剤と組み合わせて用いる場合）、治療する疾患のタイプ、抗体のタイプ、疾患の重症度及び経過、抗体を予防目的で投与するか治療目的で投与するか、以前の治療法、患者の病歴及び抗体への応答性、及び担当医師の判断に依存するであろう。抗体は一時的又は一連の治療にわたって好適に患者に投与される。例えば、一又は複数の個別の投与、又は持続注入かにより、ある典型的な１日量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であろう。症状に応じて、数日間以上にわたる繰り返し投与は、所望の疾患症状の抑制が得られるまで持続する。しかしながら、他の投与計画が有効かもしれない。この治療の進行は、従来技術及びアッセイにより容易にモニターすることができる。
【０１６７】
(製造品)
本発明の他の態様では、上述の疾病の処置、予防及び／又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。製造品は容器と該容器上又はそれに付随したラベル又はパッケージ挿入物を含んでなる。好適な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ等が含まれる。容器は、ガラス又はプラスチック等の様々な材料から形成されてもよい。容器は、組成物それ自体、又は症状を処置、予防及び／又は診断するのに有効な他の組成物と組み合わせて該組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも一の活性剤は本発明の抗体である。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が癌のような選択した症状の処置のために使用されることを示している。さらに、製造品は（ａ）そこに本発明の抗体を含有する組成物を含む第一の容器と；（ｂ）そこにさらなる細胞障害剤を含有する組成物含む第二の容器とを含み得る。本発明のこの実施態様における製造品は、第一及び第二抗体組成物が、癌等の特定の病状を処置するのに使用可能であることを示すパッケージ挿入物を更に含みうる。あるいは、又は付加的に、製造品は、薬学的に許容可能なバッファー、例えば注射用の静菌水(ＢＷＦＩ)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第二（又は第三）の容器をさらに含んでもよい。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
【０１６８】
次は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上述した一般的に記載を与えたので、種々の他の実施態様も実施することができるものと理解される。
【０１６９】
実施例
材料及び方法
抗体ファージディスプレイ：合成抗体ライブラリはＭ１３ファージ上に二価Ｆａｂ断片を表示し、多様性を重鎖の３つのＣＤＲにおけるオリゴ指定突然変異誘発の使用によって生成した。Ｆａｂライブラリの詳細は前に記載された(Lee et al, 2004a; Lee et al, 2004b)。Ｎｕｎｃ９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐイムノプレートをＨＧＦＡ（１０μｇ／ｍｌ）を用いて４ｏＣで一晩コートし、次いでファージブロッキングバッファーＰＢＳＴ（ＰＢＳ，１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ，０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０）で室温で１時間ブロックした。抗体ファージライブラリをＨＧＦＡでコートされたプレートに加え、室温で一晩インキュベートした。プレートをＰＢＴ（ＰＢＳ，０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ-２０）バッファーで洗浄し、結合されたファージを５０ｍＭのＨＣｌ−５００ｍＭのＮａＣｌで３０分間溶出し、等量の１ＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌ，ｐＨ７．５で中和した。回収したファージを大腸菌ＸＬ-１青色細胞において増幅した。続く選択ラウンドの間、抗原コートプレートを用いた抗体ファージのインキュベーションは２−３時間に減少し、プレート洗浄のストリンジェンシーを徐々に増加した。
【０１７０】
Ａｂ３９を、選択の間の潜在アビディティ効果を低減するために、二価Ｆａｂの代わりに一価Ｆａｂを使用することによって親和性成熟させた。親和性成熟の効果を改善するために、停止コドンをＣＤＲ-Ｌ３に導入した。３つの異なるＣＤＲ組み合わせライブラリ、Ｌ１／Ｌ２／Ｌ３、Ｌ３／Ｈ１／Ｈ２及びＬ３／Ｈ３を、選択した位置が時間の５０％だけ変異されるような野生型配列バイアスを維持する「ソフトランダム化」を使用して、ランダム化のための標的とした(Liang et al., 2007)。親和性成熟クローンを選択するために、前述したように、ファージライブラリを最初のラウンドに関してはプレートソーティングに課し、その後４回の液相ソーティングを行った(Liang et al., 2007)。ビオチン化ＨＧＦＡの量を減少することにより、増加ストリンジェンシーを４回の液相ソーティングの間使用した。過剰量の非標識ＨＧＦＡ（５００〜２０００倍）を選択の最後２ラウンドに加え、高速オフレートバインダーを競合オフした。Ａｂ３９は比較的高い会合速度定数（ｋｏｎ）を有するが、比較的速い解離速度定数（ｋｏｆｆ）を有するため、オフレート選択ストラテジーを使用した（表１）。その後、抗ＨＧＦＡ ＦａｂをＩｇＧに再編成した。
【０１７１】
抗体再編成及びＨＧＦＡに対する解離速度定数の決定：抗ＨＧＦＡ Ｆａｂを、個々のクローンのＶＬ及びＶＨ領域をＬＰＧ３及びＬＰＧ４ベクターにそれぞれクローニングすることによってヒトＩｇＧ１に再編成した(Liang et al, 2007)。完全長抗体をチャイニーズハムスター卵巣細胞において一過性に発現させ、プロテインＡカラムで精製した。再編成抗ＨＧＦＡ抗体の親和性結合の決定のために、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ-３０００機器(GE Health Care, NJ)において表面プラズモン共鳴測定を実施した。ウサギ抗ヒトＩｇＧをＣＭ５バイオセンサーチップ上に化学的に固定化し(アミン結合)、抗ＨＧＦＡ抗体を捕獲しておよそ２５０反応単位（ＲＵ）を得た。動態測定のために、２倍段階希釈のＨＧＦＡ又は活性部位遮断ＨＧＦＡ（０．９ｎＭから２５０ｎＭ）を、３０μｌ／分の流量で２５°ＣでＰＢＴバッファーに注入した。室温で２時間、２倍モル過剰のＡｃ-ＫＱＬＲ-ｃｍｋ（配列番号：１０として開示される「ＫＱＬＲ」）を用いてＨＧＦＡをインキュベートし、次いでサイズ排除クロマトグラフィーによって非組み込みＡｃ-ＫＱＬＲ-ｃｍｋ（配列番号：１０として開示される「ＫＱＬＲ」）を除去することによって、ＨＧＦＡ-ＫＱＬＲ（配列番号：１０として開示される「ＫＱＬＲ」）を生成した。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）を単純１対１ラングミュア結合モデル(BIAEvaluation)を使用して得て、平衡解離定数（ＫＤ）を算出した（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）。２倍段階希釈のＨＧＦＡ又はＨＧＦＡ-ＫＱＬＲ（配列番号：１０として開示される「ＫＱＬＲ」）（１．５ｎＭから３０００ｎＭ）の、捕獲抗体（Ａｂ４０．ΔＴｒｐ）センサーチップ上へのより長い注入（５分）を実行し、最大結合（Ｒｍａｘ）を得て定常状態に達した。Ｒｅｑの値（２０−８０％のＲｍａｘ）を算出し、BIAEvaluation Softwareを使用して、Ｃ（ＨＧＦＡ又はＨＧＦＡ-ＫＱＬＲ（配列番号：１０として開示される「ＫＱＬＲ」)の濃度）に対して個々にプロットし、定常状態分析でＫＤを決定した。
【０１７２】
ＨＧＦＡ精製、酵素動態アッセイ及び競合ＥＬＩＳＡ：ＨＧＦＡ（Ｖａｌ３７３-Ｓｅｒ６５５）を、バキュロウイルス-昆虫細胞発現システムを使用し、Ｎｉ-ＮＴＡアガロースカラムで精製し、次いで記載したサイズ排除クロマトグラフィー(Kirchhofer et al, 2003)によって生成した。１ｎＭのＨＧＦＡ及び２５μｇ／ｍｌの１２５Ｉ-ｐｒｏ-ＨＧＦでインキュベートした抗体の段階希釈を使用し、活性部位切断ＨＧＦＡを用いたＰｒｏ-ＨＧＦ活性化アッセイを、基本的に記載に従い実施した(Kirchhofer et al., 2003)。Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ Ｓ-２２６６(Ｈ-Ｄ-バリル-Ｌ-ロイシル-Ｌ-アルギニン-パラニトロアニリド )(Diapharma, Westchester, OH)を用いた発色性基質アッセイでは、５ｎＭのＨＧＦＡを、ＴＮＣＴバッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ，ｐＨ８．０，１５０ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのＣａＣｌ２，０．０１％-ＴｒｉｔｏｎＸ-１００）において、漸増濃度の抗体を用いて、９６ウェルプレートにおいて４０分間インキュベートした。Ｓ-２２６６（０．２４ｍＭ ~ Ｋｍ）を加えた後、４０５ｎｍでの吸収における増加の線形速度を、動態マイクロプレートリーダーにおいて測定した(Spectramax-M5, Molecular devices, Sunnyvale, CA)。Ａｂ３９及びＡｂ４０の酵素動態（Enzyme kinetic）測定を、４０分間ＴＮＣＴバッファーにおいて、様々な抗体濃度（３倍希釈において１μＭ−０．００４μＭ）でインキュベートした３ｎＭのＨＧＦＡを用いて実行した。様々な濃度のＣｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ Ｓ-２２６６を加え、４０５ｎｍでの吸収増加の線形速度を測定した。得られたデータのＥａｄｉｅ-Ｈｏｆｓｔｅｅプロット（ｖ対ｖ／［Ｓ］）は、競合阻害メカニズムを示す。競合ＥＬＩＳＡ実験を、ＨＧＦＡに結合するＫＤ１に関するＡｂ４０の効果を評価するために実施した。ＨＧＦＡ（１μｇ／ｍｌ）でコートした９６ウェルMaxisorpプレートをＰＢＳＴバッファーにおいて２時間、漸増濃度のＡｂ４０を用いてインキュベートし、次いで、１５分間１ｎＭのビオチン化ＫＤ１を加えた。ＨＧＦＡに結合したビオチン化ＫＤ１を、ストレプトアビジン-ＨＲＰコンジュゲートによって検出した。
【０１７３】
競合ＨＧＦＡ結合ＥＬＩＳＡ実験：結合特異性測定のために、９６ウェルMaxisorpプレートを、２μｇ／ｍｌのＨＧＦＡ、マトリプターゼ、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子又は因子ＸＩＩａでコートし、室温で少なくとも１時間ＰＢＳＴバッファーにおいて１０μｇ／ｍｌの抗ＨＧＦＡ ＩｇＧを用いてインキュベートした。プレートをＰＢＴバッファーで洗浄し、結合抗体をＰＢＳＴバッファーにおいて１：２５００に希釈した抗ヒト抗体ＨＲＰコンジュゲートで検出し、ＴＭＢ基質でおよそ５分間展開させ、１ＭのＨ３ＰＯ４でクエンチし、吸収をマイクロプレートリーダーにおいて４５０ｎｍで測定した。
【０１７４】
結晶学：Ｆａｂ４０及びＦａｂ４０．ΔＴｒｐを大腸菌において発現させ、プロテインＧセファロース、次いで陽イオン交換クロマトグラフィーを使用して精製した。Ｆａｂ４０及びＦａｂ４０．ΔＴｒｐは、図１に記載する重鎖及び軽鎖可変領域を有する。（ａ）ＨＧＦＡプロテアーゼドメイン（表６）及びＦａｂ４０（ｂ）ＨＧＦＡプロテアーゼドメイン（表６）及びＦａｂ４０．ΔＴｒｐ又は（ｃ）ＨＧＦＡプロテアーゼドメイン（表６）-ＫＱＬＲ（配列番号：１０）及びＦａｂ４０．ΔＴｒｐ間の複合体を、１：２モル比で混合することによって形成し、サイズ排除クロマトグラフィー(Superdex 200)によって精製した。複合体を、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ  ７．２，１５０ｍＭのＮａＣｌにおいて１０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。ＨＧＦＡ／Ｆａｂ４０及びＨＧＦＡ-ＫＱＬＲ／Ｆａｂ４０．ΔＴｒｐ複合体（配列番号：１０として開示される「ＫＱＬＲ」）は、１４％ＰＥＧ １０，０００，１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２下で結晶を産生し、ＨＧＦＡ／Ｆａｂ４０．ΔＴｒｐは、１０％ＰＥＧ １０，０００，１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５下で結晶を産出した。Ｘ線データ収集のために、結晶を１４％ＰＥＧ １０，０００，１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２，２０％グリセロールに移し、液体窒素に沈めた。Ｘ線データをＳＳＲＬ／ＳＬＡＣ（ＨＧＦＡ／Ｆａｂ４０）でビームライン９−２で、又はＡＬＳ ｂｅａｍｌｉｎｅ ５．０．２（ＨＧＦＡ／Ｆａｂ４０．ΔＴｒｐ及びＨＧＦＡ-ＫＱＬＲ／Ｆａｂ４０．ΔＴｒｐ（配列番号：１０として開示される「ＫＱＬＲ」))で１００Ｋで収集し、ＨＫＬ２０００  (Otwinowski and Minor, 1997)を使用して還元した。構造をＰＨＡＳＥＲ(McCoy et al, 2005)を使用して分子置換によって解析し、ＣＣＰ４スイート(CCP4, 1994)(CCP4, 1994)の要素と共にＣＮＸ(Accelrys)を使用して洗練した。データ整理及びモデル精密化統計を表２に示す。分子グラフィックス図をＰｙＭＯＬ(DeLano, W.L. The PyMOL Molecular Graphics System, 2002)を使用して準備した。３つの複合体のコーディネートが、２００９年１０月１９日に出願された同時係属、共同出願、米国仮出願第６１／２５３，０１４号、及びアクセスコード３Ｋ２Ｕ、２ＷＵＢ、及び２ＷＵＣと共にRCSB Protein Data Bankに示される（出典明記によりその全体を本明細書中に援用する）。
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【０１７５】
結果
抗ＨＧＦＡファージ抗体の生成
Ａｂ３９を合成Ｆ（ａｂ’）２ファージディスプレイライブラリのスクリーニングによって同定した(Wu et al, 2000)。その後、Ａｂ３９を方法に記載のように親和性成熟させた。表面プラズモン共鳴実験によって測定した結合親和性における改善は、ＣＤＲ-Ｌ３の配列における４変化により（図１）、６４倍（表１）であった。最も近い相同体第ＸＩＩａ因子及びウロキナーゼを含む、構造的に関連するプロテアーゼに対する結合を測定するために、Ａｂ３９及びＡｂ４０双方の結合特異性をＥＬＩＳＡを使用して評価した(Miyazawa et al., 1993)。結果は、第ＸＩＩａ因子、ウロキナーゼ及びマトリプターゼへの結合の完全な欠如を実証し、良好な特異性を示唆した（図９）。
【０１７６】
酵素反応速度論及びＡｂ４０結合による活性部位占有の効果
Ａｂ４０は、ＨＧＦＡにより媒介されるｐｒｏ-ＨＧＦのα／βヘテロ二量体への切断を阻害し（図２ａ）、能力はその結合親和性と一致した（表１）。Ａｂ４０及びＡｂ３９の阻害効果をまた、合成パラーニトロアニリド基質Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ Ｓ-２２６６（Ｈ-Ｄ-Ｖａｌ-Ｌｅｕ-Ａｒｇ-ｐＮＡ）を用いて酵素アッセイにおいて評価した。ＨＧＦＡの酵素活性は、Ａｂ４０によって部分的にのみ阻害され（図２ｂ）、選択した実験条件下では約６０％の最大阻害であった。Ｅａｄｉｅ-Ｈｏｆｓｔｅｅプロットは、Ａｂ４０（及びＡｂ３９）はＫｍａｐｐを増加したがＶｍａｘａｐｐ値を増加しなかったため、阻害機構が競合的であることを実証した（図２ｃ，９ｂ）。部分阻害に従い、傾斜（−Ｋｍａｐｐ）は高Ａｂ４０濃度で有限極限に近づいた。類似の結果が親Ａｂ３９で得られ（データは示さない）、Ａｂ３９及びＡｂ４０がＨＧＦＡの部分競合インヒビターであることを実証した。抗体結合の際の活性部位専有の影響を分析するために、我々は、小分子及び高分子インヒビターの存在下でのＨＧＦＡへの抗体結合を測定した。トリプシン様セリンプロテアーゼのＳ１ポケットおいてのみ結合するベンズアミジンは、Ａｂ４０のＨＧＦＡへの結合を干渉しなかった（データは示さない）。war-head基にカップリングされたｐｒｏ-ＨＧＦ切断配列に一致するペプチドインヒビター（Ａｃ-ＫＱＬＲ-ｃｍｋ（配列番号：１０として開示される「ＫＱＬＲ」））を、活性部位においてＨＧＦＡを共有結合性修飾するために使用し、これはＳ４-Ｓ１サブサイトを専有した。ＨＧＦＡ-ＫＱＬＲ複合体（配列番号：１０として開示される「ＫＱＬＲ」）を用いた表面プラズモン共鳴研究は、不可逆的結合ペプチド性インヒビターが、Ａｂ４０の結合を干渉することを示した（図３ａ−ｂ）。ＨＧＦＡと比較して、ＨＧＦＡ-ＫＱＬＲ複合体（配列番号：１０として開示される「ＫＱＬＲ」）へのＡｂ４０結合の親和性における８倍低下が観察された（表１）。拡張活性部位領域と相互作用するＫｕｎｉｔｚドメインインヒビターＫＤ１(Shia et al, 2005)もまた、表面プラズモン共鳴実験においてＡｂ４０結合を干渉した（図３ｃ）。一致して、競合ＥＬＩＳＡは、Ａｂ４０によるＨＧＦＡへのＫＤ１結合の中程度な阻害を示した（図３ｄ）。まとめると、Ａｂ４０のＨＧＦＡへの結合は、Ｓ２−Ｓ４を含むがＳ１を含まない、拡張サブサイトでのインヒビター専有に影響された。
【０１７７】
ＨＧＦＡ／Ｆａｂ４０複合体の構造は「アロステリックスイッチ」を示す
ＨＧＦＡ／Ｆａｂ４０複合体の２．３５Å分解構造は、基質結合間隙の周辺でフラットエピトープに結合するために、Ｆａｂ４０が全６ＣＤＲループを使用することを示し、６０−ループ（例えば、天然番号４５１−４５４；キモトリプシン番号６０Ａ−Ｄ）及び９９−ループ（例えば、天然番号４９０−４９３；キモトリプシン番号９６、９７、９８、及び９９ａ）（図４ａ−ｂ）を包含する。触媒三残基（Ｈｉｓ-５７，Ａｓｐ-１０２及びＳｅｒ-１９５）のコンフォメーションは、ＨＧＦＡの他の既知構造と比較して著しい変化は無く（図４ｂ）、基質サブサイトＳ１-Ｓ４は占有されない（図５ａ）。Ｆａｂ４０の最も近い原子は、阻害のアロステリックモードを示す活性部位Ｓｅｒ１９５部位から＞１５Ａである。ＨＧＦＡ／Ｆａｂ４０複合体の重要な特徴は、９９-ループにおける大きいコンフォメーション変化である（図４ｂ及び図１０、電子密度図の質を示す）。ＨＧＦＡにおける何れの有意の変化は観察されず、これが抗体誘導性阻害の理由であることを示唆する。９９-ループのコンフォメーションに埋め込まれた「アロステリックスイッチ」は、ＨＧＦＡ／Ｆａｂ４０構造の、ＨＧＦＡの他の構造との比較から明らかであり(Shia et al, 2005; Wu et al, 2007)、ここにおいて、９９-ループは「コンピテント」コンフォメーション（ＨＧＦＡの触媒的に活性な形態）状態にある。新しいコンフォメーション（「非コンピテント」コンフォメーション、ＨＧＦＡの触媒的に非活性形態）における９９-ループのＰｈｅ９７は、Ｆａｂ４０の軽鎖（Ｔｙｒ４９Ｌ、Ｓｅｒ５０Ｌ及びＰｈｅ５３Ｌ）及び重鎖（Ｔｒｐ９８Ｈ及びＰｒｏ９９Ｈ）の界面で形成された疎水性の溝に埋もれている（図４ｃ）。エピトープは、隆起９９-ループのＬｅｕ-９３を中心とし（図５ａ，ｂ）、ＣＤＲループＬ３及びＨ３間の間隙において挟まれる。９９-ループ及び６０-ループは、ほとんどの場合重鎖ＣＤＲ残基との密接な接触に関与する。重鎖及び軽鎖はそれぞれ、複合体の６５％及び３５％の埋没表面積に貢献する（図５ｃ）。Ｆａｂ４０結合の際に埋まったＨＧＦＡの、全溶媒到達可能表面積は〜１０３０Å２である。全体で、１８の水素結合及び１の静電相互作用（Ａｓｐ２４１-Ｌｙｓ６４Ｈ）が、ＨＧＦＡ及びＦａｂ４０間で形成される（表３）。Ｔｒｐ９５Ｈ、Ｔｒｐ９６Ｈ、Ｔｒｐ９８Ｈ及びＴｙｒ３３Ｈ、Ｔｙｒ５２Ｈ、Ｔｙｒ５８Ｈ等の幾つかの疎水性残基が、６０-及び９９-ループの裏側で小さいポケットに結合する（図４ｃ）。ＨＧＦＡにおけるＦａｂ４０エピトープは、トロンビンにおけるエキソサイトＩＩに該当する領域、トロンビン調節因子と相互作用する電気的陽性領域と大きくオーバーラップする（図５ｂ）。しかしながら、自然において主に静電気的である凝固プロテアーゼにおけるエキソサイトＩＩ相互作用と異なり(Bock et al, 2007)、Ｆａｂ４０のＨＧＦＡへの結合は、水素結合及びｖａｎ ｄｅｒ Ｗａａｌｓ相互作用を主に含む。
【０１７８】
「アロステリックスイッチ」のフリッピング：Ａｂ４０を操作してアロステリック阻害活性を除去する
Ｆａｂ４０のＣＤＲ-Ｈ３ループは、パラトープのコアを形成する３つのトリプトファン残基（Ｔｒｐ９５Ｈ、Ｔｒｐ９６Ｈ及びＴｒｐ９８Ｈ）を有する（図５ｃ）。Ｔｒｐ９６Ｈが、９９-ループにおいて観察されるコンフォメーション変化の中心であり、その大きなインドール側鎖をＨＧＦＡのＡｌａ５６、Ｐｒｏ９０、Ｔｙｒ８８、Ｖａｌ９６、Ｖａｌ１０５及びＩｌｅ１０７によって形成される深い疎水性ポケットに結合する（図６ａ）。Ｖａｌ９６の主鎖並びに側鎖コンフォメーションにおける小さいシフトは、残りの９９-ループ残基（Ｖａｌ９６-Ａｓｐ１００）を通して伝達され、最終的にＣα（９９-ループ）における＞１Åｒｍｓｄのシフトに導く（図６ｃ，ｄ）。コンフォメーション変化におけるＴｒｐ９６Ｈの役目、及び関連するアロステリック阻害活性を調査するために、我々は、この残基（Ｆａｂ４０．ΔＴｒｐ）を欠失させＣＤＲ-Ｈ３ループを短くした（図１）。ＨＧＦＡのＦａｂ４０．ΔＴｒｐとの複合体を、野生型抗体に関して記載したように結晶化した。
【０１７９】
ＨＧＦＡ／Ｆａｂ４０．ΔＴｒｐ（２．９０Ａ）の全体の構造は、ＨＧＦＡ／Ｆａｂ４０のものに非常に類似する。変化は非常に小さく、ＣＤＲ-Ｈ３ループにおける残基Ａｌａ９７Ｈ及びＴｒｐ９８Ｈに限定される（図６ｅ−ｆ）。Ｔｙｒ３３Ｈの側鎖は、そのχ１ねじれ角度でフリップし、ＨＧＦＡ／Ｆａｂ４０構造においてＴｒｐ９６Ｈによって占有された深い疎水性ポケットを一部満たす（図６ｂ）。この疎水性ポケットのサイズは、このポケットを裏打ちする残基、主にＨＧＦＡのＳｅｒ６０、Ｐｒｏ９０及びＴｙｒ９４の移動によって低減されている。著しいことに、９９-ループは、ＨＧＦＡの他の構造で観察されたように、「コンピテント」状態に復帰した（図６ｅ−ｆ）。Ａｂ４０．ΔＴｒｐはもはや、酵素アッセイによって決定したようなＨＧＦＡの阻害剤ではなかった（図２ｂ）。このようなわずかな変化が、かなり低減された親和性であるが結合を保持する一方、阻害活性を除去するのに十分であることは印象的であった（表１）。更に、Ａｂ４０と異なり、ＨＧＦＡ活性部位におけるＫＱＬＲ（配列番号：１０）インヒビターの存在は、ＨＧＦＡ又はＨＧＦＡ-ＫＱＬＲ複合体（配列番号：１０として開示される「ＫＱＬＲ」）の類似のＫＤ値に示されるように、Ａｂ４０．ΔＴｒｐ結合に影響しなかった（図３ｅ，ｆ）。従って、データは、Ａｂ４０によるアロステリック阻害活性のメカニズムが主に９９-ループコンフォメーションの大きな変化によって作動されるという我々の仮説を裏付ける。
【０１８０】
阻害のアロステリック機構に関する構造決定要因
ＨＧＦＡの９９-ループは、基質残基Ｐ２及びＰ４との相互作用に貢献することによる決定的な基質特異性決定要因である。従って、９９-ループのＡｂ４０誘導性の動きが、これらの基質サブサイト相互作用にどのように影響するかに関する詳細な理解を得るために、我々は、ＨＧＦＡ-ＫＱＬＲ複合体（配列番号：１０として開示される「ＫＱＬＲ」）の構造の決定を試みた。ＫＱＬＲ配列（配列番号：１０）は、天然ＨＧＦＡ基質ｐｒｏ-ＨＧＦのＰ４-Ｐ１残基に該当する。残念なことに、これらの試みは、結晶化条件を最適にする幾つかの試みにも関わらず、十分な回折質の結晶を生成することに成功しなかった。代替の方法として、次いで我々は、複合体Ｆａｂ４０．ΔＴｒｐにおけるＨＧＦＡ-ＫＱＬＲ（配列番号：１０として開示される「ＫＱＬＲ」）の構造を解析するこに集中し、これは直ぐに結晶化した。
【０１８１】
ペプチドインヒビターＡｃ-ＫＱＬＲ-ｃｍｋ（配列番号：１０として開示される「ＫＱＬＲ」）に関する電子密度は、この２．７０Ａ解析構造において明確であった。ペプチドインヒビターは、Ｐ１-Ａｒｇ及びＳｅｒ２１４間、及びＰ３-Ｇｌｎ及びＧｌｙ２１６間の、特徴的な主鎖間水素結合を形成するねじれた逆平行コンフォメーションにおける活性部位溝に整列した（図１１）。インヒビターは触媒Ｓｅｒ１９５及びＨｉｓ５７に共有結合し、Ｓ４-Ｓ１サブサイトでの結合の形は、ＫＱＬＲ（配列番号：１０）の、別のＳ１Ａプロテアーゼファミリーメンバーであるヘプシンとの複合体においてのものと非常に類似する(Herter et al, 2005)。塩橋相互作用は、ペプチドインヒビターのＰ１-Ａｒｇと、Ｓ１サブサイトにおけるＡｓｐ１８９を対にする。Ｐ２位でのロイシンに対する強い選好があるようであり、これはＳ２サブサイトが残基Ｐｒｏ９９ａ、Ｓｅｒ９９、Ｔｒｐ２１５及びＨｉｓ５７によって形成される小疎水性ポケットだからである。Ｐ２-Ｌｅｕ側鎖はＰｒｏ９９ａに対して密接にまとまり、Ｐｒｏ９９ａのコンフォメーションにおける微小変化がＰ２特異性に大きな影響を有しうることを示唆する（図７ａ）。従って、ＨＧＦＡに関するＳ２サブサイトでの特異性は、多くの凝固プロテアーゼの場合と同様に特徴的な特徴であるように見える。Ｐ３残基に関する選択性は、酵素-基質相互作用がＰ３側鎖の溶媒露出により制限されるため、ほぼ全てのＳ１ペプチダーゼにおいて乏しい。Ｐ３-Ｇｌｕは、活性部位の溶媒露出領域に向かって外を指す。Ｐ４に対する乏しい選択性を有する多くのＳ１ペプチダーゼと異なり、ＨＧＦＡにおいて、Ｓｅｒ９９との水素結合はＰ４-Ｌｙｓを安定化する（図７ａ）。更に、Ｐ４-Ｌｙｓの側鎖への疎水性安定化が、ＨＧＦＡのＴｒｐ２１５によって提供される。Ｎ末端アセチル基からのカルボニル酸素は、水素結合を通してＨＧＦＡのＡｓｐ２１７を干渉する。
【０１８２】
ＨＧＦＡ-ＫＱＬＲ／Ｆａｂ４０．ΔＴｒｐ複合体(配列番号：１０として開示される「ＫＱＬＲ」)におけるＨＧＦＡのプロテアーゼドメインの構造は、ＨＧＦＡ／Ｆａｂ４０．ΔＴｒｐ複合体と非常に類似し、０．３９Ａのｒｍｓｄ（全ての原子に関して）を有する（図１２）。ＨＧＦＡ-ＫＱＬＲ／Ｆａｂ４０．ΔＴｒｐ（配列番号：１０として開示される「ＫＱＬＲ」）構造における９９-ループのコンフォメーションは、ＨＧＦＡ／Ｆａｂ４０．ΔＴｒｐ及びＨＧＦＡの他の構造に見られる「コンピテント」状態にある。従って、ＨＧＦＡ-ＫＱＬＲ／Ｆａｂ４０．ΔＴｒｐ（配列番号：１０として開示される「ＫＱＬＲ」）は、ＨＧＦＡ-ＫＱＬＲ（配列番号：１０として開示される「ＫＱＬＲ」）構造の非存在下において、ＨＧＦＡにおける基質結合サブサイトの決定のための良い代替物である。ＨＧＦＡ／Ｆａｂ４０構造の、ＨＧＦＡ-ＫＱＬＲ／Ｆａｂ４０．ΔＴｒｐ（配列番号：１０として開示される「ＫＱＬＲ」）との重ね合わせは、アロステリック阻害のもっともらしい原因を示した。９９-ループの動きは、サブサイトＳ２の部分崩壊及びサブサイトＳ４の再編成を導き、基質残基Ｐ２及びＰ４との相互作用を乱す。まず、Ｓ２ポケットの一部である９９-ループ残基Ｐｒｏ９９ａ及びＳｅｒ９９の動きが、それらをＰ２-Ｌｅｕに非常に近接させ（図７ｂ）、立体的衝突を生じる。次に、Ｓ４残基Ｓｅｒ９９の再配置されたヒドロキシル側鎖はもはやＰ４-Ｌｙｓと水素結合を形成することができず（図７ａ，ｂ）、Ｐ２-Ｌｅｕに非常に近接しすぎる。更に、Ｓ２ポケット残基Ｐｒｏ９９ａの動きはまた、Ａｂ４０によるＨＧＦＡへのＫＤ１結合の阻害のアロステリック性質を決定するのに重要な役割を果たす。ＨＧＦＡ／Ｆａｂ４０及びＨＧＦＡ／ＫＤ１(Shiaet al,2005)複合体の重ね合わせは、ＫＤ１-及びＦａｂ４０エピトープ間にオーバーラップがないことを示した（図１３）。ＨＧＦＡ／Ｆａｂ４０／ＫＤ１のモデルは、Ｐｒｏ９９ａの、 Ｓ２サブサイトでの、ＫＤ１のＣｙｓ３８及びＬｅｕ３９との立体的衝突の可能性を予測する。
【０１８３】
考察
酵素のアロステリック調節は、定義によれば、遠隔のエフェクター相互作用部位から生じる変化した触媒作用を含む(Tsai et al, 2009)。小分子又は高分子の結合、リン酸化等を含む様々なエフェクターは、シグナルとなり、シグナルとなり得、タンパク質の特定の機能を活性化又は阻害しうる(Swain and Gierasch, 2006)。かかるシステムは、エフェクター相互作用部位及び変化した活性の部位以上はほとんんど理解されていない。アミノ酸がアロステリック作用を伝達する正確な経路は、一般にほとんど知られていない。最近の研究は、酵素活性部位を標的にする抗体によるプロテアーゼ阻害の構造的基礎への新しい見識を提供した(Farady et al, 2008; Wu et al, 2007)。対照的に、アロステリック抗体が酵素触媒を干渉する正確な分子機構は未だわかりにくい。ここに提示される発見は、総合的な構造的及び動態学的研究に由来し、アロステリック抗体がどのようにしてプロテアーゼ触媒を阻害するかの詳細な見解を提供する。酵素動態学分析は、ファージディスプレイ由来Ａｂ４０が、ＨＧＦＡの競合インヒビターであることを実証した。しかし、Ａｂ４０は「古典的な」立体的妨害によって阻害せず、それは、活性部位と離れたエピトープに結合し、従って、本質的にアロステリックである競合阻害機構を示す。最も重要なことは、Ｆａｂ４０／ＨＧＦＡ複合体の構造が、内在するコンフォメーション変化、すなわち９９-ループの移動を示し、これによって、エピトープ及び活性部位間での機能的ルートに関する構造的基礎を得られることである。
【０１８４】
観察された９９-ループ柔軟性は、幾つかの内因的可動性表面ループを有する、いわゆる「活性化ドメイン」の一部ではないため、トリプシン様セリンプロテアーゼのファミリーにおいては珍しい(Huber and Bode, 1978)。構造的柔軟性の既知の例は、セリンプロテアーゼプロスタシンに観察される(Spraggon et al, 1990)。
【０１８５】
Ａｂ４０結合は、９９-ループの動き以外の何れの大きな構造的変化を伴わず、これが酵素阻害の原因であることを強く示唆する。この仮説を検定するために、我々はＡｂ４０／ＨＧＦＡ界面での主要相互作用の一つ、すなわちＨＧＦＡのＴｒｐ９６Ｈ及びＶａｌ９６間での疎水性接触をを取り除いた。ＨＧＦＡとの複合体における生成されたＴｒｐ９６Ｈ欠失変異体Ａｂ４０．ΔＴｒｐの構造は、９９-ループが機能的に「コンピテント」状態に戻ったことを示し、Ａｂ４０．ΔＴｒｐ／ＨＧＦＡ複合体が酵素的に活性であることを示すアッセイ結果と一致する。従って、９９-ループの移動は、酵素活性を調節する「アロステリックスイッチ」として考えられることが可能であり：Ａｂ４０の結合により「アロステリックスイッチ」はＯＮとなり９９-ループを「非コンピテント」コンフォメーションにロックし、抗体の除去又はＡｂ４０．ΔＴｒｐ変異体の結合は「アロステリックスイッチ」をＯＦＦにし、９９-ループに「コンピテント」コンフォメーションを採らせる。
【０１８６】
「非コンピテント」９９-ループ コンフォメーションが正確はどのように触媒機構を干渉するかに関して疑問が生じた。つまり、Ａｂ４０が結合した時どのアミノ酸が変化するか、なぜそれらの変化が酵素活性を変更するか？９９-ループはＳ１特異性ポケットの形成には貢献せず、結合実験はＳ１-Ｐ１相互作用はＡｂ４０結合に影響されないことを確認した。しかしながら、Ａｂ４０エピトープに関して、９９-ループの「前面」側は、重要な基質サブサイトの形状に寄与し、これが妨害が生じると思われる領域である。非可逆的に結合したＫＱＬＲペプチド（配列番号：１０）を有するＨＧＦＡの構造がもっともらしい答えを提供する。ＫＱＬＲペプチド（配列番号：１０）が、天然基質ｐｒｏ-ＨＧＦのＰ４-Ｐ１配列を構成し、また、Ｐ２-Ｐ１残基を有し、すなわち、我々の酵素アッセイにおいて使用した合成ｐＮＡ基質Ｓ-２２６６のＬＲ。
【０１８７】
構造分析は、９９-ループの「非コンピテント」コンフォメーションが、Ｐ２-Ｌｅｕ及びＳ２サブサイト（Ｐｒｏ９９ａ及びＳｅｒ９９）間での立体衝突、及びＰ４-Ｌｙｓ及びＳ４サブサイト間での安定化相互作用の損失により、Ｓ２及びＳ４サブサイトへの基質アクセスを妨害したことを示した。Ｓｅｒ９９残基のヒドロキシル側鎖が２つの異なるコンフォメーションをとり、従ってＳ２サブサイトでの重要な特異性決定要因として作用することが分かった。この観察は、凝固因子ＩＸ１のＴｙｒ９９に観察される構造変化と類似する(Hopfner et al, 1999)。「コンピテント」コンフォメーションにおいて、疎水性Ｓ２ポケットは、ＬｅｕをＰ２残基として認識するのに理想的に形づくられ、天然基質ｐｒｏ-ＨＧＦ及びｐｒｏ-ＭＳＰ、並びに合成Ｓ-２２６６基質におけるＰ２-Ｌｅｕの存在と一致する。従って、Ａｂ４０結合によるＳ２サブサイトの部分的崩壊は、高分子及び合成基質双方に対する酵素触媒の阻害を導くのに十分だっただろう。この構造解釈に伴う警告は、ＨＧＦＡ-ＫＱＬＲ（配列番号：１０として開示される「ＫＱＬＲ」)の使用の代用としてのＨＧＦＡ-ＫＱＬＲ／Ｆａｂ４０．ΔＴｒｐ（配列番号：１０として開示される「ＫＱＬＲ」）構造の我々の使用であり、我々は結晶化に失敗した。しかしながら、ＨＧＦＡ-KQLR/Fab40.ΔTrp (配列番号：１０として開示される「ＫＱＬＲ」)構造における９９-ループは「コンピテント」コンフォメーションを採用し、従って、我々は、基質とのＳ４-Ｓ１相互作用の非常に良い近似を提供するためにこの構造を採用した。この見解はＫＱＬＲペプチド（配列番号：１０）のコンフォメーションが、関連ＫＱＬＲ-ヘプシン複合体（配列番号：１０として開示される「ＫＱＬＲ」）におけるものと実質的に同一であるという観察に支持される(Herter et al 2005)。我々は、我々の結果の解釈に関して分子間接触の影響を十分に審査した。触媒三残基（Ｈ５７-Ｄ１０２-Ｓ１９５）は、３構造のいずれにおいても結晶接触に関与しなかった。更に、９９-ループは、ＨＧＦＡ／Ｆａｂ４０又はＨＧＦＡ-ＫＱＬＲ／Ｆａｂ４０．ΔＴｒｐ（配列番号：１０として開示される「ＫＱＬＲ」）の構造における結晶接触に関与しない。しかしながら９９-ループは、ＨＧＦＡ／Ｆａｂ４０．ΔＴｒｐの場合に、対称関連分子によって安定化される(両分子は非対称ユニット)。ＨＧＦＡ-ＫＱＬＲ／Ｆａｂ４０．ΔＴｒｐ（配列番号：１０として開示される「ＫＱＬＲ」）における９９-ループのコンフォメーションはＨＧＦＡ／Ｆａｂ４０．ΔＴｒｐにおいてと類似であるため、我々は結晶接触からの影響は無視できると考えた。
【０１８８】
９９-ループのスイッチは、インヒビター（すなわちＡｂ４０）結合部位と基質結合部位を繋げる可動性コンジット（conduit）と考えられる。かかる見解はまた、酵素アッセイにおいて決定される競合阻害形式の理解のための適切なフレームワークを提供するだろう。インヒビター及び基質双方とも、逆傾向ではあるが、９９-ループに力を作用させることが可能であり、基質結合(「非コンピテント」状態)又はインヒビター結合 (「コンピテント」状態)で準最適である９９-ループコンフォメーションとなる。構造モデルは、立体的衝突が両状況で生じることを示し、すなわち「非コンピテント」状態において９９-ループ 及び基質のＰ２-Ｌｅｕ間（図７ｃ）、及び「コンピテント」状態において９９-ループ及びＦａｂ４０のＣＤＲ-Ｈ３におけるＴｒｐ９６Ｈ、Ａｌａ９７Ｈ及びＴｒｐ９８Ｈ間である（図１４）。結晶酵素動態に基づいて、幾つかの競合阻害のモデルが提案され、それらの中でアロステリックモデルがSegel (Segel, 1993)に説明される。解明されたアロステリック機構は、Segelによるモデル-５の改良であり、それはインヒビター結合部位及び活性部位間の分子連鎖の構造基礎を提供する。図８のモデルが、コンピテント状態を好む平衡における、酵素の触媒的コンピテント及び阻害された状態を示す。このモデルにおいて、Ａｂ４０の一過性「非コンピテント」状態 (アロステリック部位*)への結合は、単純に平衡を機能的活性状態からシフトし、従って、酵素分子の大部分を「アロステリックスイッチ」「ＯＦＦ」状態から「ＯＮ」状態にさせる。モデルはまた、ＨＧＦＡ阻害の競合性質を説明し、基質濃度の増加は平衡を左に、すなわちＨＧＦＡの「コンピテント」状態に移動させ、触媒作用の進行を可能にする。変異Ａｂ４０．ΔＴｒｐは触媒作用を妨害せず、なぜならそれは「アロステリックスイッチ」がＯＦＦになった「コンピテント」状態にのみ結合するからである。この解釈は、エフェクター結合がタンパク質コンフォメーションのアンサンブルにおけるシフトを導き、従って特定状態の相対集団を変化させるという点において、一般なアロステリーの見解と一致する。ＨＧＦＡへのＡｂ４０の結合は効果的に、「コンピテント」から「非コンピテント」状態、従って機能的不全酵素へのシフト／再分布となった。この見解をＡｂ４０．ΔＴｒｐに拡張すると、アロステリックエフェクターとして見なされることが可能であり、結合部位にわずかのみの又は無視できる作用を及ぼし、これによって「コンピテント」酵素コンフォメーションをサンプリングする。
【０１８９】
「アロステリックスイッチ」は、比較的単純なアロステリック機構である。これは、アロステリックエフェクター結合部位を活性部位と直接結合する、一つのみの可動性表面ループを含む。これは、他のより複雑であまり理解されていないアロステリック機構、例えばコファクター誘導性酵素活性(Olsen and Persson, 2008)又はＨｔｒＡ１ファミリーメンバーのＰＤＺドメイン媒介阻害／活性 (Sohn et al, 2007)と対照的であり、これらはエフェクター結合が複数の、短-及び長-距離コンフォメーション変化を伴う。しかしながら、その相対的単純さに反して、まだ未知のエフェクター分子によりＨＧＦＡ活性の天然に生じるアロステリック調節機構を複製しうる。特に、Ａｂ４０結合部位は、ヘパリンを含む様々なアロステリックエフェクターの結合部位である、トロンビンのエキソサイトＩＩ及び凝固因子ＩＸ及びＸの該当する領域と著しくオーバーラップする。しかしながら、ＨＧＦＡの対応する領域はヘパリンを結合するには不適当であり、なぜなら凝固因子におけるエキソサイト-ヘパリン相互作用を媒介するＡｒｇ及びＬｙｓ残基の目立つクラスターはＨＧＦＡに最小限で呈されるからである。
【０１９０】
アロステリックインヒビターに関する研究は、とりわけキナーゼ(Vajpai et al., 2008)及びＧＰＣＲ  (Raddatz et al., 2007)に関して活発に探究されてきた。興味深いことは、Ａｂ４０によるアロステリック阻害の機構は、他の既知のアロステリック小分子インヒビターの幾つかに類似であることであり、いずれにせよ、アロステリック阻害は、酵素活性部位におけるコンフォメーション可動性を制限することによって作用する(Goodey and Benkovic, 2008; Lee and Craik, 2009)。
【０１９１】
アロステリック抗プロテアーゼ抗体は、それらは強力であり高く特異的であり、またそれらの標的プロテアーゼによる何れの偶発的プロセシングから保護されているため、良い治療的可能性を有しうる。しかしながら、治療剤としてのそれらの使用は現在、細胞外プロテアーゼに限定され、細胞内プロテアーゼは主にオルソステリック小分子インヒビターに標的にされる。この点において、我々の発見は、アロステリックに作用するペプチド又は小分子インヒビターの構造ベースデザインに受け入れられうるアロステリック「ホットスポット」を同定する新しい方法を示しうる(Hardy and Wells, 2004)。特に、ここに記載するＴｒｐ９６Ｈと、大きい疎水性ポケット（「ホットスポット」）との相互作用は、非コンピテント９９-ループコンフォメーションの安定化に決定的であるが、このポケットの存在は、他のＨＧＦＡ構造から予測できなかっただろう。従って、Ｆａｂ／プロテアーゼ構造決定と併せたＦａｂファージディスプレイライブラリの大規模スクリーニングは、有望なアロステリック「ホットスポット」を同定しうる。かかるアプローチは、Ｆａｂの、タンパク質の結晶化を促進する固有の特性から更に恩恵を受けるだろう(Tereshko et al, 2008)。
【０１９２】
我々の研究の別の態様は、病理学的経路におけるＨＧＦＡの役割を実験的に取り込むための、抗ＨＧＦＡ抗体の潜在的有用性である。例えば、効果的にｐｒｏ-ＨＧＦを加工し、結果的にＨＧＦ／Ｍｅｔシグナル伝達経路を刺激するＨＧＦＡの能力は、癌増殖に貢献しうる(Kataoka et al., 2003a)。Ａｂ４０は、ヒトＨＧＦＡ同様に、マウスＨＧＦＡに結合し遮断し（データは示さない）、それを、マウス腫瘍モデルにおいてＨＧＦＡ機能の更なる調査のための理想的な試薬にする。
【０１９３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６ＡＢ】
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【図６ＣＤＥＦ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ１】
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【図１５Ａ２】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【配列表】
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