(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
顕微鏡のステージに設置され、生体試料を当該ステージに対して固定するための生体試料固定器であって、
前記ステージに設置される透明の板部と、前記板部に重ねて設けられ当該板部との間に流路を形成するカバー部と、を備え、
前記カバー部又は前記板部には、前記流路の一部と繋がり当該流路内の流体を吸引するための吸引部が設けられ、前記カバー部の、前記板部を間に挟んで前記顕微鏡の対物レンズに対向する位置には、前記流路の他部と繋がっていると共に前記生体試料の一部を前記流路内に侵入させる開口が設けられていることを特徴とする生体試料固定器。
【請求項２】
顕微鏡のステージに設置され、生体試料を当該ステージに対して固定するための生体試料固定器であって、
前記ステージに設置される透明の板部と、前記板部に重ねて設けられ当該板部との間に流路を形成するカバー部と、を備え、
前記カバー部又は前記板部には、前記流路の一部と繋がり当該流路内の流体を吸引するための吸引部が設けられ、前記カバー部には、前記流路の他部と繋がっていると共に前記生体試料の一部を前記流路内に侵入させる開口が設けられ、
前記板部は、前記流路内の流体の吸引により前記開口に保持されかつ当該開口から前記流路内に侵入させる前記生体試料の一部を接触可能とする接触面を有している、生体試料固定器。
【請求項３】
前記カバー部は、前記流路を構成するための凹溝部と、この凹溝部を囲み前記板部の面に当接する当接面を有する本体部と、を有し、
前記当接面は、前記流路内の流体を吸引すると前記板部の前記面に密着し、当該吸引を解除した状態では前記板部の前記面と分離可能である非接着面である請求項１又は２に記載の生体試料固定器。
【請求項４】
前記カバー部は、前記板部よりも弾性係数の小さい部材からなる請求項１〜３のいずれか一項に記載の生体試料固定器。
【請求項５】
前記流路は、前記吸引部と繋がっている主流路と、この主流路から分岐し前記開口とそれぞれが繋がっている複数の枝流路と、を有している請求項１〜４のいずれか一項に記載の生体試料固定器。
【請求項６】
前記カバー部の前記枝流路間には、前記流路内の減圧によって当該枝流路が潰れるのを防ぐ補剛部が形成されている請求項５に記載の生体試料固定器。
【請求項７】
顕微鏡のステージに設置され、生体試料を当該ステージに対して固定するための生体試料固定器であって、
前記ステージに設置される透明の板部材に重ねて設けられ当該板部材との間に流路を形成するカバー部材を備え、
前記カバー部材には、前記流路の一部と繋がり当該流路内の流体を吸引するための吸引部と、前記流路の他部と繋がっていると共に前記生体試料の一部を前記流路内に侵入させる開口と、が形成され、
前記開口は、前記カバー部材の、前記板部材を間に挟んで前記顕微鏡の対物レンズに対向する位置に設けられる、生体試料固定器。
【請求項８】
顕微鏡のステージに設置され、生体試料を当該ステージに対して固定するための生体試料固定器であって、
前記ステージに設置される透明の板部材に重ねて設けられ当該板部材との間に流路を形成するカバー部材を備え、
前記カバー部材には、前記流路の一部と繋がり当該流路内の流体を吸引するための吸引部と、前記流路の他部と繋がっていると共に前記生体試料の一部を前記流路内に侵入させる開口と、が形成され、
前記板部材は、前記流路内の流体の吸引により前記開口に保持されかつ当該開口から前記流路内に侵入させる前記生体試料の一部を接触可能とする接触面を有している、生体試料固定器。
【請求項９】
顕微鏡のステージに設置され、生体試料を当該ステージに対して固定するための生体試料固定器であって、
前記ステージに設置される透明の板部材に重ねて設けられ当該板部材との間に流路を形成するカバー部材を備え、
前記カバー部材の、前記板部材を間に挟んで前記顕微鏡の対物レンズに対向する位置には、前記流路の一部と繋がっていると共に前記生体試料の一部を前記流路内に侵入させる開口が形成され、
前記カバー部材は、前記流路の他部と繋がり当該流路内の流体を吸引するための吸引部が形成されている前記板部材に重ねて設けられることを特徴とする生体試料固定器。
【請求項１０】
顕微鏡のステージに設置され、生体試料を当該ステージに対して固定するための生体試料固定器であって、
前記ステージに設置される透明の板部材に重ねて設けられ当該板部材との間に流路を形成するカバー部材を備え、
前記カバー部材には、前記流路の一部と繋がっていると共に前記生体試料の一部を前記流路内に侵入させる開口が形成され、
前記カバー部材は、前記流路の他部と繋がり当該流路内の流体を吸引するための吸引部が形成されている前記板部材に重ねて設けられ、
前記板部材は、前記流路内の流体の吸引により前記開口に保持されかつ当該開口から前記流路内に侵入させる前記生体試料の一部を接触可能とする接触面を有している、生体試料固定器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡のステージに載せた生体試料の動きを拘束するための生体試料固定器に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、細胞等を観察する観察装置及び標識法の開発が進められており、リアルタイムイメージング及び各種細胞内イベントの可視化が可能となっている。特に培養プレート上の細胞を生きたまま観察できる生細胞リアルタイムイメージング技術により、これまでは観察することのできなかった細胞内の分子シグナル等の観察が可能となっている。
しかし、例えば小動物の臓器における細胞等の挙動は、周囲の細胞を含む三次元構造、及び、周囲の細胞から分泌されるタンパク質によるシグナル伝達等、周囲の細胞からの影響を受けることから、培養細胞を用いた細胞の挙動を観察するのみでは足らず、生きた状態にある小動物の臓器の細胞を可視化する必要がある。
【０００３】
小動物の臓器又は組織の細胞を観察する場合、例えば心臓及び肺の動きに影響を受けにくい、脂肪、固形腫瘍及び皮膚等は、特に固定しなくても、共焦点レーザ顕微鏡を用いて観察することが可能である。しかし、麻酔下であっても生命維持に不可欠である、心臓、肺、腸及び横隔膜直下に存在しその動きの影響を受ける肝臓等に関しては、固定して観察を行うことが必要となる。
【０００４】
生きた状態にある小動物（例えばマウス）の心臓、肝臓等の生体試料を観察するためにその生体試料を固定する技術として、例えば特許文献１に、生体観察用のスタビライザが開示されている。このスタビライザは、図１３に示すように、観察領域９４よりも大きな貫通孔９８を有し臓器に接触させる環状の接触部９１を備えている。この接触部９１のうち、臓器の表面９０との接触面に凹部９２が設けられ、この凹部９２には、凹部９２と表面９０との間に形成される空間を減圧する減圧手段９３が接続されている。
【０００５】
このスタビライザによれば、顕微鏡のステージ上に載せた小動物の臓器の表面９０に対して環状の接触部９１を上から押し付け、減圧手段９２によって凹部９２（空間）を減圧する。すると、この接触部９１は臓器の表面９０を吸着して固定することができ、これにより顕微鏡のステージに対して臓器を固定することが可能となる。
そして、環状である接触部９１の径方向内側を観察領域９４とし、この観察領域９４の中央にある観察部位９５を対物レンズ９６の視野内に収め、顕微鏡観察が行われる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００７−２７９３８９号公報（図２参照）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
小動物等の生体の臓器を顕微鏡で観察する場合、麻酔下であっても、その小動物の生命活動に不可欠である呼吸及び消化運動等により、臓器の運動が継続的に行われていることから、小動物及びその臓器に対する負担をできるだけ抑える必要がある。
しかし、従来のスタビライザの場合、観察部位９５の周囲に、環状の接触部９１を設置する必要があることから、小動物の皮膚の切開範囲９７は、この接触部９１よりも充分に大きな範囲が必要となり、切開範囲９７が観察部位９５に比べてはるかに広くなってしまい、小動物に対する侵襲性が問題となる。
つまり、観察部位９５が例えば２ｍｍ程度の領域であっても、その周囲に存在している環状の接触部９５の外径が３ｃｍであるならば、この３ｃｍよりも充分に大きな切開範囲９７が必要となる。さらに、小動物の臓器における観察部位９５を変更するためには、臓器に対して接触部９１を移動させる必要があり、この場合、さらに大きな切開範囲９７が必要となる。
【０００８】
そこで、本発明は、侵襲性を抑えつつ生体試料を固定することが可能となる生体試料固定器を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、顕微鏡のステージに設置され、生体試料を当該ステージに対して固定するための生体試料固定器であって、前記ステージに設置される透明の板部と、前記板部に重ねて設けられ当該板部との間に流路を形成するカバー部とを備え、前記カバー部又は前記板部には、前記流路の一部と繋がり当該流路内の流体を吸引するための吸引部が設けられ、前記カバー部には、前記流路の他部と繋がっていると共に前記生体試料の一部に臨ませる開口が設けられていることを特徴とする。
【００１０】
本発明によれば、カバー部に形成されている開口に生体試料を臨ませ、流路内の流体を吸引すれば、開口において生体試料の一部を陰圧（負圧）により保持することができる。このため、開口に保持されている生体試料の一部を観察部位として、透明の板部を通じて顕微鏡観察することが可能となる。すなわち、開口に保持されている生体試料の一部は、顕微鏡による観察部位となることから、この生体試料の一部が、例えば小動物等の生体の皮膚から露出していれば足りる。したがって、小動物の皮膚の切開範囲は、生体試料の一部及びその周囲の僅かな部分が露出する範囲で済み、切開範囲を従来と比較して小さくすることができ、小動物等の生体に対する侵襲性を抑えることが可能となる。
【００１１】
また、前記開口は、前記板部を間に挟んで、前記顕微鏡の対物レンズに対向する位置に設けられることにより、流路内の流体を吸引することで開口に保持される生体試料の一部を、顕微鏡の対物レンズの視野内に収めることができる。
【００１２】
また、前記カバー部は、前記流路を構成するための凹溝部と、この凹溝部を囲み前記板部の面に当接する当接面を有する本体部とを有し、前記当接面は、前記流路内の流体を吸引すると前記板部の前記面に密着し、当該吸引を解除した状態では前記板部の前記面と分離可能である非接着面であるのが好ましい。
この場合、流路内の流体を吸引すれば、カバー部の当接面は板部の面に密着し、カバー部を板部に固定することができる。そして、流路内の流体の吸引を解除すれば、カバー部は板部から分離可能となり、カバー部と板部との内の一方を交換することができる。
【００１３】
また、流路内の流体を吸引することによって、生体試料の一部はカバー部（開口）に密着することから、生体試料を傷めないように、前記カバー部は、前記板部よりも弾性係数の小さい部材からなるのが好ましい。これにより、カバー部は板部より柔軟性を有し、生体試料を傷めるのを防ぐことができる。
【００１４】
また、前記板部は、前記流路内の流体の吸引により前記開口に保持されかつ当該開口から前記流路内に侵入させる前記生体試料の一部を接触可能とする接触面を有しているのが好ましい。
この場合、開口に保持されかつこの開口から流路内に侵入させた生体試料の一部が、板部のステージと反対側の面（接触面）に接触可能となる。そして、この接触面に接触している生体試料の一部を顕微鏡により観察することができる。
【００１５】
また、前記流路は、前記吸引部と繋がっている主流路と、この主流路から分岐し前記開口とそれぞれが繋がっている複数の枝流路とを有しているのが好ましい。
この場合、開口に保持される生体試料の一部の周囲を複数方向から吸引し、その周囲の空間を減圧することができ、生体試料の一部を開口に保持させることができる。
【００１６】
また、主流路から複数の枝流路が分岐している場合において、前記カバー部の前記枝流路間には、前記流路内の減圧によって当該枝流路が潰れるのを防ぐ補剛部が形成されているのが好ましい。
枝流路が形成されている領域ではカバー部の剛性が、主流路が形成されている領域の剛性に比べて低くなる場合があるが、補剛部によってカバー部の剛性が低下するのを抑えることができる。
【００１７】
また、本発明は、顕微鏡のステージに設置され、生体試料を当該ステージに対して固定するための生体試料固定器であって、前記ステージに設置される透明の板部材に重ねて設けられ当該板部材との間に流路を形成するカバー部材を備え、前記カバー部材には、前記流路の一部と繋がり当該流路内の流体を吸引するための吸引部と、前記流路の他部と繋がっていると共に前記生体試料の一部に臨ませる開口とが形成されていることを特徴とする。
さらに本発明は、顕微鏡のステージに設置され、生体試料を当該ステージに対して固定するための生体試料固定器であって、前記ステージに設置される透明の板部材に重ねて設けられ当該板部材との間に流路を形成するカバー部材を備え、前記カバー部材には、前記流路の一部と繋がっていると共に前記生体試料の一部に臨ませる開口が形成され、前記カバー部材は、前記流路の他部と繋がり当該流路内の流体を吸引するための吸引部が形成されている前記板部材に重ねて設けられることを特徴とする。
【００１８】
これら本発明によれば、カバー部材に形成されている開口に生体試料を臨ませ、流路内の流体を吸引すれば、開口において生体試料の一部を陰圧（負圧）により固定することができる。このため、開口に保持されている生体試料の一部を観察部位として、透明の板部材を通じて顕微鏡観察することが可能となる。すなわち、開口に保持されている生体試料の一部は、顕微鏡による観察部位となることから、この生体試料の一部が、例えば小動物等の生体の皮膚から露出していれば足りる。したがって、小動物の皮膚の切開範囲は、生体試料の一部及びその周囲の僅かな部分が露出する範囲で済み、切開範囲を従来と比較して小さくすることができ、小動物等の生体に対する侵襲性を抑えることが可能となる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の生体試料固定器によれば、小動物等の皮膚の切開範囲は、生体試料の一部及びその周囲の僅かな部分が露出する範囲で済み、切開範囲を従来と比較して小さくすることができ、小動物等の生体に対する侵襲性を抑えることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の生体試料固定器をステージに設置した顕微鏡の模式図である。
【図２】生体試料固定器の説明図である。
【図３】生体試料固定器の断面図であり、図２のＢ矢視の断面図である。
【図４】図２のＡ矢視の断面図である。
【図５】図２のＣ矢視の断面図である。
【図６】（Ａ）は生体試料固定器を用いて、マウスの腸を固定して観察した結果を示し、（Ｂ）はマウスの腸を固定しないで観察した結果を示している。
【図７】生体試料固定器を用いて、マウスの肝臓を固定して観察した結果を示している。
【図８】生体試料固定器を用いて、マウスの肝臓における幹細胞の分布及び移動を観察した結果を示している。
【図９】生体試料固定器を用いて、マウスの肝臓を長時間観察した結果を示している。
【図１０】生体試料固定器の他の実施形態を示す斜視図である。
【図１１】生体試料固定器のさらに別の実施形態を示す断面図であり、（Ａ）は生体試料を吸着する前の状態であり、（Ｂ）は生体試料を吸着した状態を示している。
【図１２】さらに別の実施形態に係る生体試料固定器の断面図である。
【図１３】従来技術の説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
〔生体試料固定器の全体構成〕
図１は、本発明の生体試料固定器１をステージ６に設置した顕微鏡５の模式図である。この生体試料固定器１は、生きた状態にある小動物等の生体の臓器又は組織（生体試料）を、ステージ６に対して固定し、その動きを拘束するための装置であり、しかも、その臓器等を、生体の体外へ取り出すことなく体内に収められた状態で、その生体の皮膚の一部を切開して露出させ、顕微鏡５によって観察するために用いられる機器である。なお、本実施形態では生体をマウスＭとして説明する。
【００２２】
顕微鏡５は、ステージ６と、対物レンズ７を有しステージ６の下側に設けられている対物ユニット８とを備えた倒立顕微鏡である。ステージ６の上に生体試料固定器１が載せられ、この生体試料固定器１の上にマウスＭが載せられ、ステージ６に形成されている貫通孔６ａを通じて、マウスＭの臓器Ｐが観察される。なお、マウスＭには麻酔が適用されるが、このマウスＭの全身をステージ６に固定する必要はない。
対物ユニット８は、対物レンズ７の他に、レーザ光源８ａ、マイクロレンズディスク８ｂ、ピンホールディスク８ｃ、ダイクロイックミラー８ｄ及びＣＣＤカメラ８ｅを有しており、臓器Ｐの高速撮影を行う。なお、観察対象となるマウスＭは、うつ伏せ姿勢であり、その腹部の皮膚が切開され、臓器Ｐを体内に残しながら体外へ露出させた状態とする。
【００２３】
図２は、生体試料固定器１の斜視図である。図３は、生体試料固定器１の断面図（図２のＢ矢視の断面図）であり、臓器Ｐを保持した状態にある。図４は、図２のＡ矢視における断面図である。生体試料固定器１は、ステージ６上に設置される透明の板部（１０）と、この板部（１０）の上面１１（ステージ６と反対側の面）に重ねて設けられているカバー部（２０）とを備えている。なお、板部（１０）とカバー部（２０）とは、一体不可分の構造であってもよいが、本実施形態では別の部材からなり、板部は板部材（ガラス板１０）からなり、カバー部はカバー部材２０からなる。また、カバー部材２０の内部を説明するために、その内部構造を、図２では細線で示している。
【００２４】
本実施形態では、前記板部材は透明の薄いガラス板１０であって、光に対して透明であり、一般的に光学顕微鏡観察において用いられるカバーガラスである。ガラス板１０はステージ６に固定される。
カバー部材２０は、ガラス板１０と同様に薄い板部材であって、本実施形態では、シリコンゴム製（ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製）である。カバー部材２０は、ガラス板１０の上に載って積層状態にある。なお、カバー部材２０及び板部材は他の材質であってもよい。
【００２５】
〔カバー部材２０及びガラス板１０について〕
カバー部材２０の一面（下面）側であってその中央部には、凹溝部２２が形成されており、カバー部材２０がガラス板１０に重ねられると、この凹溝部２２によってガラス板１０との間に流路３０が形成される。本実施形態では、顕微鏡５及び生体試料固定器１は大気中に設置されることから、この流路３０には空気（大気）が流れる。
【００２６】
図４において、ガラス板１０の上にカバー部材２０が重ねられた状態で、凹溝部２２の溝底面（上面）２２ａと、左右両側の溝側面２２ｂ，２２ｃと、ガラス板１０の上面１１とで囲まれた空間によって、流路３０が形成される。
そして、カバー部材２０に凹溝部２２が形成されることにより、その溝底面２２ａを下面として有する薄肉部２５と、それ以外の厚肉部２６とが形成される。厚肉部２６は凹溝部２２が形成されていない部分である。
【００２７】
また、図２と図３とにおいて、カバー部材２０には、吸引部３１と、開口３２とが設けられている。吸引部３１は、薄肉部２５上に設けられており、流路３０の一部３０ａ（図３参照）と繋がっており、流路３０内の空気を吸引するためのパイプ３３が接続されている接続ポートである。
開口３２は、流路３０の他部３０ｂ（図３参照）と繋がっていると共にマウスＭの臓器Ｐの一部Ｐａに臨ませる貫通孔からなる。つまり、カバー部材２０の薄肉部２５をその厚さ方向に貫通して形成した貫通孔によって、開口３２が構成されており、開口３２は流路３０内の空間とマウスＭが存在する外部空間とを連通している。
【００２８】
そして、パイプ３３に減圧手段３４が接続されており、減圧手段３４がパイプ３３を通じて流路３０内の空気を吸引することで、流路３０内が減圧される。これにより、開口３２に臨ませたマウスＭの臓器Ｐの一部Ｐａが、開口３２に吸着して保持され、臓器Ｐの動きが拘束される（図３参照）。減圧手段３４は、図示しないが、ポンプ又はシリンジ等とすることができる。
【００２９】
そして、開口３２は、ガラス板１０を間に挟んで、対物レンズ７に対向する位置に設けられており（図３参照）、吸引部３１を通じて流路３０内の空気が吸引されることで、流路３０内が減圧され、臓器Ｐの一部Ｐａが、開口３２に保持されると共に開口３２から流路３０内に侵入する。そして、ガラス板１０の上面１１（ステージ６と反対側の面）の一部１２は、開口３２から流路３０内に侵入した臓器Ｐの一部Ｐａが接触可能となる接触面となる。
この接触面（１２）に接触している臓器Ｐの一部Ｐａを、対物レンズ７の視野内に収め、この接触している一部Ｐａに焦点を合わせることにより、顕微鏡５により観察することができる。また、ガラス板１０の接触面（１２）に臓器Ｐの一部Ｐａが接触することで、この一部Ｐａを観察部位とした場合に、この観察部位とガラス板１０との間に空気の層が介在しないため良好な観察状態が得られる。
【００３０】
また、図４において、カバー部材２０は、流路３０を構成するための凹溝部２２と、この凹溝部２２を囲む本体部２３とを有している。本体部２３のうち凹溝部２２を前後左右四方から囲む部分が前記厚肉部２６となり、凹溝部２２を上から覆う部分が前記薄肉部２５となる。
そして、本体部２３は、ガラス板１０の上面１１に当接する当接面２４を有しており、この当接面２４は、ガラス板１０の上面１１と分離可能である平滑な非接着面である。つまり、カバー部材２０の下面２１とガラス板１０の上面１１とは、面接触しているが、接着剤等が用いられて接着されておらず、分離可能である。
【００３１】
凹溝部２２は、カバー部材２０の外縁を除く中央にのみ形成されており、当接面２４は、凹溝部２２の開口縁（下縁）を全周にわたって囲む範囲に設けられている。したがって、吸引部３１を通じて流路３０内の空気を吸引すれば、流路３０内は減圧され、カバー部材２０の当接面２４はガラス板１０の上面１１に密着し、カバー部材２０をガラス板１０に固定することができる。そして、流路３０内の空気の吸引を解除（停止）すれば、カバー部材２０はガラス板１０から分離可能となり、カバー部材２０とガラス板１０との内の一方を残して他方のみを交換することができる。
【００３２】
〔流路３０について〕
図２に示すように、流路３０は、吸引部３１と繋がっている主流路３６と、この主流路３６から分岐している複数の枝流路３７とを有している。枝流路３７それぞれは、開口３２と繋がっている。
主流路３６は、直線的に一条形成されており、その端部に設けられている分岐部３８ａから、３つの枝流路３７ａ，３７ｂ，３７ｃが分岐している。枝流路３７ａは、開口３２と繋がっているが、他の枝流路３７ｂ，３７ｃの端部には、第２と第３の分岐部３８ｂ，３８ｃが設けられており、第２の分岐部３８ｂから２つの枝流路３７ｄ，３７ｅが分岐し、第３の分岐部３８ｃから２つの枝流路３７ｆ，３７ｇが分岐している。枝流路３７ｄ，３７ｆは、開口３２と繋がっているが、他の枝流路３７ｅ，３７ｇは、合流部３９で合流し、合流した枝流路３７ｈが開口３２と繋がっている。なお、第１〜第８の枝流路３７ａ〜３７ｈは、カバー部材２０に形成されている凹溝によって構成されることから、この凹溝の溝底面を下面として有する部分は、薄肉部２５となる（図５参照）。図５は、図２のＣ矢視の断面図である。
【００３３】
このように複数の枝流路３７が形成されていることによって、流路３０内の減圧によって枝流路３７が潰れるのを防ぐための補剛部として隔壁４０が、カバー部材２０に形成されている。つまり、例えば枝流路３７ａ，３７ｃ間には、隔壁４０が形成されている。この隔壁４０の下面は、ガラス板１０の上面１１と面で接触する（図５参照）。
カバー部材２０のうち、枝流路３７が複数形成されている領域では、空間が多くなってカバー部材２０の剛性が、主流路３６が形成されている領域の剛性に比べて低くなる場合があるが、隔壁４０によって、この剛性の低下を抑えることができる。つまり、隔壁４０は補剛部（柱部材）として機能することができる。
【００３４】
〔その他について〕
カバー部材２０は、上記のとおりＰＤＭＳ製であり、ガラス板１０よりも弾性係数（ヤング率）の小さい部材からなるが、領域に応じてその特性（弾性係数）を変化させてもよい。つまり、凹溝部２２が形成されている同じ薄肉部２５であっても、その薄肉部２５は、開口３２から離れている第１領域４１（図３参照）と、開口３２を取り囲む領域である第２領域４２（図３参照）とを有しており、第２領域４２は、第１領域４１よりも弾性係数が小さく構成されている。本実施形態では、第２領域４２は、枝流路３７が形成されている領域である。
なお、弾性係数の差は、第１領域４１と第２領域４２とで、ＰＤＭＳの特性（材料の混合比）を変化させることにより生じさせてもよく、（薄肉部２５ではあるが）さらにその厚さを相違させることにより生じさせてもよい。
このように、カバー部材２０を弾性係数の小さい部材とすることで、カバー部材２０は柔軟性を有することができる。また、カバー部材２０はガラス板１０よりも硬さが低い。
【００３５】
このように、開口３２を取り囲む領域である第２領域４２の弾性係数を小さくすることで、吸引部３１を通じて流路３０内の空気を吸引した際に、この第２領域４２に含まれる開口３２は、臓器Ｐの一部Ｐａに追従して変形可能となり、開口３２と臓器Ｐとの間に隙間が生じるのを防ぎ密封性を高め、流路３０内の陰圧による臓器Ｐの固定性能を高めることができる。そして、剛性の高い第１領域４１では、流路３０内が陰圧となって流路３０が潰れるのを防ぐことができる。
【００３６】
生体試料固定器１の各部の寸法について説明する。ガラス板１０は、例えば、短辺２５ｍｍ、長辺７５ｍｍ、厚さ０．１７ｍｍ程度である。カバー部材２０は、外周輪郭形状がガラス板１０よりも小さく設定されている。カバー部材２０（本体部２３）の厚さは、２ｍｍ以下であり、この厚さが厚肉部２６の厚さとなる。そして、このカバー部材２０に形成されている凹溝部２２の溝深さは、例えば５０〜２００μｍである。つまり、流路３０の厚さが５０〜２００μｍとなる。なお、流路３０（主流路３６）の幅は、０．１ｍｍ〜１ｍｍ程度である。カバー部材２０の厚さから凹溝部２２の溝深さを除いた厚さが、薄肉部２５の厚さとなる。
そして、開口３２の開口寸法、つまり本実施形態では円形である開口３２の直径は２ｍｍ〜４ｍｍ程度であり、本実施形態では３ｍｍである。
このように、カバー部材２０及び凹溝部２２（流路３０）は非常に薄く、カバー部材２０及びマイクロ流路構造である凹溝部２２は、例えば鋳造により成型される。
開口３２の開口寸法（直径）は、流路３０（主流路３６）の幅よりも大きいことから、開口３２が形成される領域の周囲には、主流路３６から流体通過断面が拡大される拡大空間が形成され、この拡大空間に隔壁４０が設けられている。
【００３７】
また、開口３２が形成される部分も薄肉部２５であり、薄肉部２５の厚さ及び流路３０の厚さを薄くすることによって、開口３２から侵入させた臓器Ｐの一部Ｐａは、ガラス板１０の一部（接触面）１２に接触可能となる。
つまり、薄肉部２５の厚さ及び流路３０の厚さが大きくなると、臓器Ｐの一部Ｐａをガラス板１０に接触させるためには、その厚さに応じて臓器Ｐの一部Ｐａを大きく流路３０内に引き込む必要があり、この場合、臓器Ｐの一部Ｐａが例えば鬱血して観察部位として不適切な状態になるおそれがある。また、薄肉部２５の厚さ及び流路３０の厚さが大きすぎて、臓器Ｐの一部Ｐａをガラス板１０に接触させることができない場合、一部Ｐａとガラス板１０との間に空気の層が介在して、顕微鏡５による良好な観察状態が得られない。しかし、本実施形態のように、カバー部材２０等を薄く構成することによって、このような不具合の発生を防ぐことが可能となる。
なお、開口３２の開口寸法（本実施形態では直径３ｍｍ）の１／３以上（つまり１ｍｍ以上）の寸法の広さを有する範囲で、臓器Ｐの一部Ｐａがガラス板１０に接触できるような値に、カバー部材２０の厚さ（及び流路３０の厚さ）は設定されている。
【００３８】
〔実施例〕
図６（Ａ）は、上記実施形態（図３）の生体試料固定器１を用いて、マウスＭの腸を固定して観察した結果を示している。マウスＭの腹部に、切開範囲として５ｍｍ四方程度の切り口を作成し、高速撮影（３３ｍｓ／ｆｒａｍｅ）を行った。また、その比較として図６（Ｂ）は、生体試料固定器１を用いることなく、つまり、マウスＭの腸を固定しないで観察した結果を示している。図６（Ａ）（Ｂ）では、蛍光色素をＰＢＳ、生理食塩水等に分散させ、これをマウスＭの尾静脈より投与している。図６（Ａ）に示すように、生体試料固定器１を用いた場合、生体試料の一部（観察部位）の動きを拘束することができ、明確な観察が可能となる。これに対して、図６（Ｂ）に示すように、固定しない場合は、時間が変化すると焦点が合わず、また、観察部位がずれてしまう。
なお、本実施形態の生体試料固定器１によれば、マウスＭの肝臓、心臓及び肺についても同様の観察が可能である。
【００３９】
図７は、上記実施形態（図３）の生体試料固定器１を用いて、マウスＭの肝臓を固定して観察した結果を示しており、図７の左側から順に、流路３０内の空気を吸引した状態（ＯＮ状態）、流路３０内の空気の吸引を停止した状態（ＯＦＦ状態）、再びＯＮ状態とした場合の観察結果を示している。
一旦、吸引をオフ状態にすると、肝臓に対する顕微鏡５の焦点がずれるが、再びオン状態にすると、肝臓の別の場所を保持することができ、観察を再開することができる。つまり、吸引のＯＮ／ＯＦＦの切り替えにより観察部位を変更することが可能となる。
【００４０】
図８は、上記実施形態（図３）の生体試料固定器１を用いて、マウスＭの肝臓における幹細胞の分布及び移動を観察した結果を示している。まず、マウスＭの大腿骨より採取した骨髄細胞から得られた間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を、培養プレートに播種し、量子ドット含有培地で培養することにより、細胞の蛍光標識を行った。次に、蛍光標識されたＭＳＣを、マウスＭの尾静脈より投与した。そして、マウス腹部に、切開範囲として５ｍｍ四方程度の切り口を作成し、生体試料固定器１で肝臓を固定し、高速撮影（３３ｍｓ／ｆｒａｍｅ）を行った。図８に示すように、ＭＳＣが肝臓に流入し、分布する様子、及び、ローリング、接着等の挙動も可視化することができる。
また、この応用として、内在性の細胞の挙動を可視化することを目的として、白血球に特異的に認識される蛍光修飾抗体をマウスの尾静脈から投与し、生きたマウスの腸における白血球の挙動の撮影を行うことが可能である。
【００４１】
図９は、上記実施形態（図３）の生体試料固定器１を用いて、マウスＭの肝臓を長時間観察した結果を示している。蛍光標識されたリポソームを、マウスの尾静脈より投与し、マウス腹部に、切開範囲として５ｍｍ四方程度の切り口を作成し、生体試料固定器１で肝臓を固定し、高速撮影（５００ｍｓ／ｆｒａｍｅ）を行った。蛍光標識リポソームが肝臓に流入し、分布する様子を、長時間にわたって撮影することができている。しかも、長時間にわたって観察部位が対物レンズの視野内でずれることがなく、撮影されている。
なお、図９では、７０分観察した結果を示しているが、１２０分、観察部位が対物レンズの視野内でずれることがなく撮影することができたことも確認されている。
【００４２】
以上のように、本実施形態に係る生体試料固定器１によれば、カバー部材２０に形成されている開口３２に臓器Ｐを臨ませ、吸引部３１を通じて流路３０内の空気を吸引すれば、開口３２において臓器Ｐの一部Ｐａを陰圧（負圧）により保持することができる（図３参照）。このため、臓器Ｐをステージ６に対して固定することができ、開口３２に保持されている臓器Ｐの一部Ｐａを観察部位（観察対象部位）として、ガラス板１０を通じて顕微鏡観察することが可能となる。
そして、開口３２に保持されている臓器Ｐの一部Ｐａは、顕微鏡５による観察部位となることから、この臓器Ｐの一部Ｐａが、マウスＭの皮膚Ｓから露出していれば足りる。したがって、マウスＭの皮膚Ｓの切開範囲は、臓器Ｐの一部Ｐａ及びその周囲の僅かな部分が露出する範囲で済み、切開範囲を従来（図１３参照）と比較して小さくすることができ、マウスＭに対する負担（侵襲性）を抑えることが可能となる。
【００４３】
具体的に説明すると、本実施形態では、開口３２は直径が３ｍｍであり、ガラス板１０の一部１２に接触させる臓器Ｐの一部Ｐａが１ｍｍ程度でよく、この場合、マウスＭの皮膚Ｓの切り口寸法は、開口３２の開口寸法（３ｍｍ）よりも僅かに大きい５ｍｍ程度で済み、マウスＭへの負担は小さい。つまり、本実施形態に係る生体試料固定器１では、観察部位である臓器Ｐの一部Ｐａが、この一部Ｐａを陰圧によって固定する固定部位と同じであるため、この部位及びその周囲の小領域のみを皮膚Ｓから露出可能となる切開で済み、低侵襲的である。
以上より、麻酔、人工呼吸器、体温維持装置等によってマウスＭを生かした状態とし、対物レンズ７の視野程度の小さな切り口をマウスＭの皮膚Ｓに設ければよいので、マウスＭへの影響を最小限にして臓器Ｐの観察が可能となる。また、マウスＭ及び臓器Ｐを自然な状態として観察することができる。
【００４４】
開口３２において行われる臓器Ｐの一部Ｐａの動きの拘束についてさらに説明する。図３に示すように、生体試料固定器１の上にマウスＭをうつ伏せの姿勢で載せることにより、開口３２にその臓器Ｐの一部Ｐａを載せることができ、この開口３２に載せた臓器Ｐの一部Ｐａは、マウスＭの自重によって、開口３２に接触すると共に、開口３２に僅かに入り込むことができる。そして、吸引部３１を通じて流路３０内の空気が吸引されることによって、流路３０内が減圧され、臓器Ｐの一部Ｐａは、更に流路３０内に引き込まれ、ガラス板１０の一部１２に接触する。この際、臓器Ｐの一部Ｐａと開口３２との間には、微小隙間δが形成され、この微小隙間δ、つまり、一部Ｐａの周囲が減圧される。
この減圧状態では、空気の吸引方向は、開口３２の中心線に平行な方向（本実施形態では鉛直方向）ではなく、この中心線に直交する方向の成分を有した方向（本実施形態では水平方向）であり、特に流路３０内であって、開口３２から離れた部分では、中心線に直交する方向となる。このように、開口３２に保持した臓器Ｐに対する空気の吸引方向は、従来（図１３）の吸引方向とは異なる。
【００４５】
また、本実施形態では、枝流路３７を複数形成することによって、開口３２に保持される臓器Ｐの一部Ｐａの周囲を、複数方向から減圧することができ、臓器Ｐの一部Ｐａを安定して開口３２に保持することが可能となる。
そして、本実施形態に係る生体試料固定器１によれば、高倍率（２０倍、４０倍）となっても、長時間にわたって観察部位が対物レンズ７の視野内でずれることなく観察可能となる。また、本実施形態によれば、臓器を体外へ出して行う観察とは異なることから、長時間の観察を行っても臓器の乾燥が問題とならない。しかも、生体試料固定器１をステージ６に載せ、その上に生体（生体試料）を載せればよいことから、観察の準備が簡単である。なお、従来のスタビライザ（図１３）の場合、生体試料に対するスタビライザの位置調整が必要となり、観察の準備に手間を要する。
また、上記実施例で説明したように、流路３０内の空気の吸引を、ＯＮ／ＯＦＦ切り替えることによって、何度でも、観察部位を変更することが可能となる（図７参照）。
【００４６】
図１０は、生体試料固定器の他の実施形態を示す斜視図である。この生体試料固定器５１と、図２に示している生体試料固定器１とは、枝流路３７及び隔壁４０の構成が異なるが、その他の構成は同じである。図１０の実施形態の場合、開口３２に対して三方向から空気が吸引される。
【００４７】
図１１は、生体試料固定器のさらに別の実施形態を示す断面図である。図１１（Ａ）に示すように、カバー部材２０は、開口３２の周囲に環状の突起部４５を有している。突起部４５も、本体部２３と同じ素材（ＰＤＭＳ）からなり、弾性変形が可能である。突起部４５が形成されている点以外は、図２に示す生体試料固定器１と同じである。
そして、吸引部３１を通じて流路３０内の空気を吸引すると、図１１（Ｂ）に示すように、臓器Ｐの一部Ｐａが突起部４５に吸着すると共に、この突起部４５が一部Ｐａに沿って拡径方向に弾性変形する。これにより、開口３２と臓器Ｐとは密着し、密封性を高めることができる。
【００４８】
また、前記各実施形態では、ガラス板１０とカバー部材２０とにより生体試料固定器が構成される場合を説明したが、本発明の生体試料固定器は、ガラス板１０に重ねて載せるためのカバー部材２０のみを備えた構成であってもよい。
【００４９】
また、本発明の生体試料固定器は、図示する形態に限らず本発明の範囲内において他の形態のものであってもよい。例えば、吸引部３１の形状は図示した以外の形状であってもよい。また、枝流路３７を省略して、一条の流路の一端部側に吸引部３１を設け、他端部側に開口３２を形成した簡単な構成であってもよい。なお、枝流路３７を設ける場合、その分岐の構成も図示した構成以外であってもよい。
また、吸引部３１を通じて流路３０内の吸引を行う対象は、上記実施形態では空気として説明したが、流路３０内に液体を充填しこれを吸引してもよい。
【００５０】
さらに、上記実施形態では、ガラス板１０とカバー部材２０とは分離可能として説明したが、ガラス板１０とカバー部材２０とは接着等によって固定されていてもよく、さらには、上記実施形態では、ガラス板１０とカバー部材２０とは異なる材質であり、別部材からなる場合を説明したが、ガラス板１０に相当する板部と、カバー部材２０に相当するカバー部とは、ＰＤＭＳ等により一体成型品であってもよい。
また、上記実施形態では、吸引部３１と開口３２との双方がカバー部材（カバー部）２０に設けられている場合を説明したが、図１２に示すように、吸引部３１については、ガラス板（板部）１０に設けられていてもよい。
【００５１】
さらに、図示しないが、カバー部材２０は二層構造であってもよい。この場合、図１２と同様に、吸引部３１については、ガラス板（板部）１０に設けられていてもよく、図３のように開口３２と同層である上側のカバー部材（上側のカバー部）に設けられていてもよく、又は、その下層である下側のカバー部材（下側のカバー部）に設けられていてもよい。この二層構造の場合、下側のカバー部材がガラス板１０に重ねて設けられる。また、この場合、上側のカバー部材と下側のカバー部材とは、同じ材質であってもよく、異なっていてもよい。また、各層は接着されていてもよく、分離可能であってもよい。
また、上記実施形態では、生体試料固定器を倒立顕微鏡に設置した場合として説明したが、正立顕微鏡に設置してもよい。この場合、生体試料固定器を、図３の場合と上下反対にして設置する。
【符号の説明】
【００５２】
１：生体試料固定器    ５：顕微鏡    ６：ステージ    ７：対物レンズ    １０：ガラス板（板部）    １１：上面    １２：一部（接触面）    ２０：カバー部材（カバー部）    ２２：凹溝部    ２３：本体部    ２４：当接面    ３０：流路    ３０ａ：一部    ３０ｂ：他部    ３１：吸引部    ３２：開口    ３６：主流路    ３７：枝流路    ４０：隔壁（補剛部）    ５１：生体試料固定器    Ｐ：臓器（生体試料）    Ｐａ：一部（生体試料の一部）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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