(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
修飾生ウシ・ウイルス性下痢症ウイルス１ｂ型（ＢＶＤＶ−１ｂ）、および獣医学的に許容可能な担体を含む、免疫原性組成物であって、前記修飾生ＢＶＤＶ−１ｂがＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１１５５３で寄託される株である、免疫原性組成物。
【請求項２】
該修飾生ウシ・ウイルス性下痢症ウイルスが細胞変性ＢＶＤＶ−１ｂウイルスである、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
修飾生パラインフルエンザウイルス３型（ＰＩ３）、
修飾生ウシ呼吸器合胞体ウイルス（ＢＲＳＶ）、
修飾生ウシヘルペスウイルス（ＢＨＶ−１）、
修飾生ウシ・ウイルス性下痢症ウイルス１ａ型（ＢＶＤＶ−１ａ）、または
修飾生ウシ・ウイルス性下痢症ウイルス２型（ＢＶＤＶ−２）
の１種以上をさらに含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
免疫学的に有効量の少なくとも１つのさらなる抗原をさらに含む、請求項１に記載の免疫原性組成物であって、前記少なくとも１つのさらなる抗原が、アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ブラキスピラ（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エーリキア（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）、エリジペロトリックス（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ヒストフィルス（Ｈｉｓｔｏｐｈｉｌｕｓ）、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、マンヘミア（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ）、モラクセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、およびストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）からなる群から選択される生物に特異的である、免疫原性組成物。
【請求項５】
該少なくとも１つのさらなる抗原が不活性化された微生物病原体である、請求項４に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
非ヒト哺乳動物におけるウシ・ウイルス性下痢症ウイルス１ｂ型（ＢＶＤＶ−１ｂ）特異的免疫反応を誘発する方法であって、請求項１に記載の免疫原性組成物を該非ヒト哺乳動物に投与する工程を含み、前記組成物が、用量あたり少なくとも２ｘ１０３  ＴＣＩＤ５０の修飾生ＢＶＤＶ−１ｂを含む、方法。
【請求項７】
該組成物が予防的に該非ヒト哺乳動物に投与される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
非ヒト動物における輸送熱を予防する方法であって、請求項１に記載の免疫原性組成物を該非ヒト動物に投与する工程を含み、前記組成物が、用量あたり少なくとも２ｘ１０３  ＴＣＩＤ５０の修飾生ＢＶＤＶ−１ｂを含む、方法。
【請求項９】
該非ヒト動物が、ペスチウイルスにより感染されているか、またはペスチウイルスからの感染に感受性がある、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
該非ヒト動物がウシである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
ペスチウイルス感染に感受性がある非ヒト動物においてペスチウイルスにより引き起こされる疾患の１つ以上の症状を予防、処置、管理、または改善する方法であって、請求項１に記載の免疫原性組成物を該非ヒト動物に投与する工程を含み、前記組成物が、用量あたり少なくとも２ｘ１０３  ＴＣＩＤ５０の修飾生ＢＶＤＶ−１ｂを含む、方法。
【請求項１２】
該組成物が、ウシロタウイルス、ＢＲＳＶ、ＢＨＶ−１、ウシコロナウイルス、ＰＩ３、ウシパラミクソウイルス、口蹄疫ウイルス、ＢＶＤＶ−１ａ、ＢＶＤＶ−２、マンヘモア・ヘモリチカ（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）Ａ１型、マンヘモア・ヘモリチカ（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）Ａ６型、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ヒストフィルス・ソムニ（Ｈｉｓｔｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｏｍｎｉ）、およびマイコプラズマ・ボビス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂｏｖｉｓ）の１種以上に由来する免疫原をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
該非ヒト動物がウシである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
ＢＶＤＶ−１ｂにより引き起こされる疾患に対して非ヒト動物を予防する方法であって、請求項１に記載の免疫原性組成物を該非ヒト動物に投与する工程を含み、前記組成物が、用量あたり少なくとも２ｘ１０３  ＴＣＩＤ５０の修飾生ＢＶＤＶ−１ｂを含む、方法。
【請求項１５】
ウシ鼻気管炎ウイルス、ウシ呼吸器合胞体ウイルス、もしくはパラインフルエンザ３ウイルス、またはそれらの組み合わせの同時投与をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
該疾患が、輸送熱、ウシ呼吸器病症候群、またはウシ・ウイルス性下痢症である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の免疫原性組成物およびアジュバントを含むワクチンであって、前記免疫原性組成物が、用量あたり少なくとも２ｘ１０３  ＴＣＩＤ５０の修飾生ＢＶＤＶ−１ｂを含む、ワクチン。
【請求項１８】
免疫学的有効量の少なくとも１つの不活性化された微生物病原体をさらに含む、請求項１７に記載のワクチン。
【請求項１９】
用量あたり少なくとも５ｘ１０３  ＴＣＩＤ５０の修飾生ＢＨＶ−１、
用量あたり少なくとも５ｘ１０３  ＴＣＩＤ５０の修飾生ＢＶＤＶ−１ａ、
用量あたり少なくとも３ｘ１０３  ＴＣＩＤ５０の修飾生ＢＶＤＶ−２、
用量あたり少なくとも６ｘ１０４  ＴＣＩＤ５０の修飾生ＰＩ３、および
用量あたり少なくとも７ｘ１０２  ＴＣＩＤ５０の修飾生ＢＲＳＶ
の１種以上をさらに含む、請求項１７に記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、「多価輸送熱ワクチンのウイルス構成要素を同定し、そして区別するための組成物および方法」と題される同時係属米国仮特許出願第６１／４２７，４０４号（本明細書と同時に２０１０年１２月２７日に出願され、そしてその全体が明確に特に本明細書に援用される）に関連する。
【０００２】
政府が支援する研究または開発に関する言及
該当なし
【０００３】
共同研究契約に関する団体の名称
該当なし
【０００４】
発明の分野
本発明は、一般的に、獣医学および動物ワクチンの分野に関する。より詳細には、本発明は、免疫原性組成物、こうした組成物を作製する方法、ならびに微生物またはウイルス感染、またはその症状、および特にウシ呼吸器病症候群（ＢＲＤＣ）などの多因子疾患を含む、哺乳動物家畜中の呼吸器感染症を、予防、治療、改善、および／または管理するための方法に関する。開示するのは、ペスチウイルス感染、ならびに特に感受性があるまたは感染した動物における、輸送熱、ＢＲＤＣ、およびウシ・ウイルス性下痢症の原因となるかまたはこれらに関与するペスチウイルスの１またはそれより多い症状を予防、治療、および／または改善するための抗原性組成物、ならびに予防剤および療法剤の製剤化および投与におけるその使用法である。
【背景技術】
【０００５】
関連技術の説明
ＢＲＤＣは、販売経路において、そして目的地の牧場またはフィードロットで、頻繁に若い食肉牛／肥育素牛が罹患する多因子疾患症候群である。この疾患の主な細菌病原体は、マンヘミア・ヘモリチカ（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ヒストフィルス・ソムニ（Ｈｉｓｔｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｏｍｎｉ）（以前のヘモフィルス・ソムヌス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｏｍｎｕｓ））およびマイコプラズマ・ボビス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂｏｖｉｓ）である。輸送熱と関連づけられてきたウイルス病原体は、ウシヘルペスウイルス１型（ＢＨＶ−１）、パラインフルエンザ３（ＰＩ３）、ウシ呼吸器合胞体ウイルス（ＢＲＳＶ）およびウシ・ウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）である。
【０００６】
ウシ・ウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）
ＢＶＤＶは、現在、ウシ呼吸器病症候群（ＢＲＤＣ）（しばしば一般的に「輸送熱」と呼ばれる）の重要な病原体と認識される。全年齢の畜牛（授乳中の子ウシを含む）を感染させるこの疾患は、呼吸促迫、咳、抑鬱、食欲不振、目および鼻の分泌物、ならびに体温上昇によって特徴付けられる。急性大流行においては、死亡は症状の開始後２４時間以内に起こりうる。ＢＶＤＶの治療は、抗ウイルス療法剤が存在しないことから問題であり、そしてペスチウイルス感染による死亡率は高い。さらに、ＢＲＤＣに関与する細菌性病原体の治療はまた、多くの例において、療法薬剤に対する抗微生物耐性による多くの例で複雑となっている。
【０００７】
ウシ・ウイルス性下痢症ウイルスは、表現型的（例えばＢａｋｅｒ、１９９５を参照されたい）（細胞変性性または非細胞変性性）および遺伝型的（例えばＲｉｄｐａｔｈら、１９９４；Ｖｉｌｃｅｋら、２００１；およびＦｌｏｒｅｓら、２００２を参照されたい）の両方で分類可能な、ウイルスの異なる群である。家畜におけるＢＶＤＶに対する防御免疫の確立には、多くの理由で問題があった。いくつかの他のウイルス仲介疾患と同様、ＢＶＤＶに対する血清抗体レベルは、疾患に対する保護と必ずしも相関しない。授乳中の子ウシにおける防御免疫の確立は、さらなる障害を提示し、これはＢＶＤＶに対する母性抗体が、注入された免疫原を枯渇させ、そしてワクチンを有効に中和する可能性があるためである。
【０００８】
Ｆｕｌｔｏｎら（２００６）による研究は、米国フィードロットに入った２１，７４３頭の子ウシを評価し、そして８８頭の子ウシがＢＶＤＶに持続感染（ＰＩ）していると決定した。８８頭のＰＩ子ウシのうち、７７．９％がＢＶＤＶ−１ｂに感染し；１１．６％のみがＢＶＤＶ−１ａに感染し、そして１０．５％のみがＢＶＤＶ−２ａに感染していた。これらのデータは、ＢＶＤＶ−１ｂが米国内フィードロットに入るＰＩ畜牛の主なサブタイプであることを明らかに立証したが、不運なことに、現在、ＢＶＤＶ−１ｂ感染に特異的なＵＳＤＡ認可ワクチンはない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、先行技術に固有のこれらのおよび他の理由のため、活発でそして多くの局面を持つ免疫反応を誘発するＢＶＤＶワクチン配合物、および特にＢＶＤＶの１ｂ型に対する免疫反応を誘発するものが必要である。ワクチン接種されていない群れにおける大きな経済的損失のため、哺乳動物家畜集団におけるＢＶＤＶ感染に対する予防を誘導する、修飾された生ＢＶＤＶ−１ｂウイルスを含有する費用効率的（および好ましくは単回用量）ワクチンの必要性がある。
【００１０】
同様に、ＢＲＤＣおよび関連する輸送熱疾患などの多因子疾患に対する現代の多価ワクチンは、ＢＶＤＶ−１ｂによる感染を予防するにはほぼ無効であるため、ＢＶＤＶ−１ｂ感受性の家畜における疾患大流行の予防および抑制をよりよく達成する、改善されたワクチン接種様式に関する必要性もまたある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の簡単な要約
本発明は、新規でそして有用な組成物、ならびにその必要がある動物に対する予防的および／または療法的剤の送達を好適に改善可能である、該組成物の使用法を含む。本発明は、慣用的な配合物より優れた利点を提供するワクチン組成物を提供し、そして１またはそれより多いペスチウイルスによって引き起こされる疾患、および特に１ｂ型下位遺伝子型のもの（すなわちＢＶＤＶ−１ｂ）を含むＢＶＤＶウイルスによって引き起こされるものを予防するかまたは抑制する方法を特に提供する。
【００１２】
全体のそして一般的な意味において、本発明は、組成物、こうした組成物を作製する方法、ならびにウイルスおよび／または微生物感染、発病、および疾患の予防、治療、および／または管理におけるその使用法を含む。本明細書に開示する免疫原性組成物、ならびにその使用法は、獣医学業において、現在利用可能な、慣用的な輸送熱予防法／治療法より優れている、本発明のワクチン組成物およびその使用法を用いた、感受性哺乳動物における輸送熱／ＢＲＤＣの１またはそれより多い症状の予防、治療、および／または改善において特定の使用を見出す。
【００１３】
特定の態様において、本発明は、修飾された生ＢＶＤＶ−１ｂウイルスを含む免疫原性組成物、ならびに該組成物を含有する薬学的配合物、および多様な予防および／または療法措置において、こうしたワクチンを作製するための方法を提供する。こうした組成物および方法は、ＢＶＤＶ感染に感受性である哺乳動物家畜などの動物において、ウイルス性および多因子疾患の予防に特定の使用を見出す。
【００１４】
関連する態様において、本発明はまた、動物におけるウイルス特異的免疫学的反応を誘発するために、開示するワクチン組成物を用いるための方法も提供する。全体のそして一般的な意味において、こうした方法は、一般的に、選択された動物に、動物においてウイルス特異的免疫学的反応を、そして特にＢＶＤＶ特異的免疫学的反応を誘発するのに有効な量（単数または複数）で、そして有効な時間、本明細書に開示する１またはそれより多い免疫原性組成物を提供する工程を含む。こうした態様において、動物は、好ましくは、偶蹄目哺乳動物であり、そしてより好ましくはウシ科（Ｂｏｖｉｄａｅ）のメンバーである。
【００１５】
本発明はまた、１またはそれより多い選択された哺乳動物集団において、ウイルスおよび／または微生物感染（単数または複数）（ならびに特にＢＶＤＶおよび関連する種によって引き起こされるペスチウイルス感染）の大流行を予防するかまたは抑制する方法も提供する。該方法は、一般的に、１またはそれより多い開示する免疫原性またはワクチン組成物の有効量を、こうした集団の感受性があるかまたはリスクがあるメンバーに、一般集団においてこうした感染の大流行を遅延させ、和らげ、減少させ、阻害し、そして／または予防するのに十分な時間、提供する工程を含む。例示的な哺乳動物集団には、限定なしに、ウシ亜科（Ｂｏｖｉｎａｅ）およびヤギ亜科（Ｃａｐｒｉｎａｅ）、そして特に、バイソン属（Ｂｉｓｏｎ）、ウシ属（Ｂｏｓ）、スイギュウ属（Ｂｕｂａｌｕｓ）、ヤギ属（Ｃａｐｒａ）、シロイワヤギ属（Ｏｒｅａｍｎｏｓ）、ジャコウウシ属（Ｏｖｉｂｏｓ）、ヒツジ属（Ｏｖｉｓ）、アフリカスイギュウ属（Ｓｙｎｃｅｒｕｓ）等のものが含まれる。例示的態様において、これらの方法は、限定なしに、アメリカバイソン（Ｂｉｓｏｎ  ｂｉｓｏｎ）、ウシ（Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ）、ヒマラヤヤギ（Ｃａｐｒａ  ｈｉｒｃｕｓ）およびヒツジ（Ｏｖｉｓ  ａｒｉｅｓ）を含む、バイソン属、ウシ属、ヤギ属、およびヒツジ属の商業的家畜の治療において特に望ましい。
【００１６】
別の側面において、本発明は、動物の免疫系を刺激して、ウイルス感染、および特にウシ科病原性ペスチウイルス感染に対して防御免疫反応を生じるための方法を提供する。こうした方法は、一般的に、少なくとも必要がある動物に、免疫学的および予防的に有効な量の１またはそれより多い開示するワクチン組成物を、動物の免疫系を刺激するのに十分な量で、そして十分な時間、投与する工程を含む。１つの態様において、この方法の慣用的な実施において、１またはそれより多い開示する免疫学的および予防的に活性であるワクチン組成物の投与は、好ましくは、少なくとも、動物において抗ペスチウイルス抗体の第一の検出可能な量を誘導し、そしてより好ましくはなお、少なくとも、動物において抗ＢＶＤＶ−１ｂ抗体の第一の検出可能な量を誘導する。好ましい態様において、組成物の投与は、好ましくは、ＢＶＤＶウイルスの１またはそれより多いタイプ、株、およびサブタイプ（限定なしに、ＢＶＤＶ−１ａ、ＢＶＤＶ−２、および他の遺伝的に類似のペスチウイルスを含む）を含む、１またはそれより多い遺伝的に類似のまたはエピトープ的に関連するウイルスによる、最初の、続く、そして／または再発性の感染に対して、動物を免疫する。
【００１７】
さらに別の態様において、本発明は、動物において、ペスチウイルスに対する防御免疫反応を産生するための方法を提供する。こうした方法には、一般的に、必要な動物に、免疫学的にそして予防的に有効な量の１またはそれより多い開示するＢＶＤＶ−１ｂ免疫原性組成物を、１またはそれより多いペスチウイルス種、亜種、または株に対する、そして好ましくは１またはそれより多いＢＶＤＶ種、株、サブタイプ、または血清型に対する防御免疫反応を産生するのに十分な条件下で、そして十分な時間、提供する工程が含まれる。
【００１８】
同様に、本発明はまた、哺乳動物宿主において、第一の細胞に、予防的または療法的組成物を提供する方法も提供する。この方法は、一般的に、必要な哺乳動物に、予防的または療法的に有効な量の１またはそれより多い本明細書に開示するＢＶＤＶ特異的免疫原性組成物を、こうした哺乳動物の少なくとも第一の細胞、組織、臓器、または臓器系に組成物を提供するのに有効な条件下で、そして有効な時間、提供する工程を伴う。
【００１９】
本発明はまた、哺乳動物において、ＢＶＤＶ感染の１またはそれより多い症状を予防し、治療し、そして／または改善するための方法も提供する。こうした方法には、一般的に、必要な哺乳動物に、免疫学的および予防的に有効な量の１またはそれより多い開示するＢＶＤＶ−１ｂ免疫原性組成物を、哺乳動物におけるＢＶＤＶ感染の１またはそれより多い症状を予防し、治療し、そして／または改善するのに十分な条件下で、そして十分な時間、提供する工程が含まれる。
【００２０】
同様に、本発明はまた、哺乳動物において、ＢＲＤＣのような多因子疾患、そして特に、少なくとも第一のＢＶＤＶが疾患の原因または寄与病原体として関与している疾患の１またはそれより多い症状を予防し、治療し、そして／または改善するための方法も提供する。こうした方法は、一般的に、選択された哺乳動物に、少なくとも第一の免疫学的または予防的に有効な量の少なくとも第一の抗ＢＶＤＶ−１ｂワクチン組成物を、哺乳動物における疾患の１またはそれより多い症状を予防し、治療し、そして／または改善するのに十分な条件下で、そして十分な時間、投与する工程を伴う。
【００２１】
さらに別の態様において、本発明は、ウシ科メンバーにおいて、輸送熱の１またはそれより多い症状を予防し、治療し、そして／または改善するための方法を提供する。こうした方法には、一般的に、ウシ科動物に、修飾された生ＢＶＤＶ−１ｂウイルス集団を含む少なくとも第一の免疫学的または予防的に有効な量の第一の組成物を、ウシ科動物における輸送熱の１またはそれより多い症状を予防し、治療し、そして／または改善するのに十分な条件下で、そして十分な時間、投与する工程を伴う。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
免疫原性組成物
１またはそれより多いペスチウイルス、そして特に、ウシ科のメンバーにおけるＢＲＤＣおよび輸送熱に関与する１またはそれより多いウイルス病原体に対するより広い防御を提供するため、本発明者らは１またはそれより多いＢＶＤＶ−１ｂ特異的抗原を含む安全でそして有効なワクチン配合物を開発した。一価および多価ワクチン配合物の両方が記載されてきており、これには一価ワクチンの場合、ＢＶＤＶのみに特異的な免疫反応を誘発する１またはそれより多い抗原、エピトープ、または修飾生ウイルス、あるいは多価ワクチンの場合、ＢＶＤＶに対してだけではなく、１またはそれより多いさらなる病原体に対しても特異的免疫反応を誘発する１またはそれより多い抗原、エピトープ、または修飾生ウイルスを含有するものが含まれる。
【００２３】
例示的な態様において、修飾生ＢＶＤＶ−１ｂを含む一価免疫原性組成物は、ＢＶＤＶ−１ｂ感染から家畜を保護するように開発されてきている。さらに、ＢＲＤＣおよび関連する輸送熱に特異的な多価免疫原性組成物もまた、本発明によって提供され、これには、動物における、１またはそれより多い、好ましくは２またはそれより多い、そしてより好ましくは３またはそれより多いＢＨＶ−１、ＰＩ３、ＢＲＳＶ、ＢＶＤＶ  １型の２つの下位遺伝子型（１ａおよび１ｂ）、およびＢＶＤＶ  ２型に対する免疫反応を特異的に誘導するための抗原性構成要素を含む、例示的な六種（ｓｉｘ−ｗａｙ）（すなわち「六価」）修飾生ウシ・ウイルス配合物が含まれる。より好ましい態様において、配合物は、前述の各々に対して、典型的には多様なレベルに、免疫反応を誘導する。
【００２４】
さらなる態様において、本発明は、前述の免疫原を含有するワクチン配合物、ならびに動物におけるペスチウイルス感染、そして特に哺乳動物家畜におけるＢＶＤＶ−１ｂ感染の１またはそれより多い症状の予防、療法、および／または改善における使用のための方法を提供する。本発明はさらに、ワクチン配合物、ならびにウシ科および他の関連哺乳動物種における、輸送熱、例えばＢＲＤＣの１またはそれより多い症状の予防、治療、および／または改善において該配合物を使用する方法を含む。
【００２５】
ワクチン配合物
本発明は、１またはそれより多いウイルス感染の予防において使用するための免疫原性組成物およびそのワクチン配合物、ならびに選択された哺乳動物における１またはそれより多い多因子疾患症候群の予防または療法において使用するための組成物を提供する。特に、本発明は、予防、予防、または療法のためのワクチン薬剤の製造における、開示する１またはそれより多い免疫原性組成物の使用、ならびに特に、哺乳動物における１またはそれより多い疾患、あるいはこうした疾患の１またはそれより多い症状、例えば家畜におけるＢＶＤＶ感染を予防し、管理し、改善し、そして／または治療するための獣医学的に許容されうる薬剤の製造において使用を提供する。
【００２６】
一般の当業者に利用可能な選択された哺乳動物のための任意の適切な投与経路によって、好ましくは筋内または皮下注射、あるいは鼻内、経口、皮膚、経皮または皮内投与によって、本発明のワクチンを投与しうる。好ましくは、ＢＶＤＶ−１ｂに対するワクチンのため、ワクチン接種は、皮下的に、あるいは筋内または鼻内経路によって投与され、皮下送達が最も好ましい。ワクチンは、典型的には、離乳前に、離乳時に、あるいは牧場またはフィードロットに入る際に投与される。進行中の成体畜牛操作の一部として、こうしたワクチンの１またはそれより多い「ブースター」用量もまたルーチンに使用可能であり、これには例えば、毎年の再ワクチン接種／維持スケジュールの一部としてのものが含まれる。
【００２７】
本発明の薬学的配合物およびワクチンは、任意の適切な獣医学的に許容されうる配合物中で調製可能であるが、特定の態様において、本発明は、獣医学業の一般の当業者に知られるように、すぐに投与可能な溶液または懸濁物の形の、投与前に希釈するのが適切な濃縮ストック溶液中の、あるいは凍結乾燥、フリーズドライ、または凍結調製物などの再構成可能な型のワクチンを提供する。
【００２８】
修飾生ペスチウイルス組成物の調製、ならびに他の免疫原（１またはそれより多いアジュバントを伴うまたは伴わない）本発明の組成物およびワクチンの配合はどちらも、本明細書の指針に基づいて慣用的であり、そしてこれには、生弱毒化ペスチウイルスと薬学的に許容されうるキャリアーまたは希釈剤を、場合によって他の免疫原と、そして場合によってアジュバントと混合する工程が含まれる。
【００２９】
薬学的配合物およびワクチンのキャリアー、希釈剤、あるいは他の不活性または非活性構成要素は、獣医学業で使用可能であるような、１またはそれより多い安定化剤、保存剤および／または緩衝剤を含むことも可能である。例示的な安定化剤には、限定なしに、ＳＰＧＡ、および１またはそれより多い以下が含まれる：炭水化物（限定されるわけではないが、ソルビトール、マンニトール、デンプン、スクロース、デキストラン、グルタメートまたはグルコース）、タンパク質（限定されるわけではないが、粉乳、血清アルブミン、カゼイン、あるいは植物または微生物由来などの他の供給源由来のタンパク質）等。適切な緩衝剤には、限定なしに、１またはそれより多いアルカリ金属ホスフェートが含まれる。開示する薬学的組成物およびワクチンの配合において有用な例示的な保存剤には、限定なしに、チメロサール、メルチオレート（ｍｅｒｔｈｉｏｌａｔｅ）、ゲンタマイシン、ネオマイシン、ナイスタチン、アンホテリシンＢ、テトラサイクリン、ペニシリン、ストレプトマイシン、ポリミキシンＢ、およびその任意の組み合わせが含まれる。例示的な希釈剤には、限定なしに、無菌水、１またはそれより多い水性緩衝液（例えば緩衝生理食塩水等）、１またはそれより多いアルコール（ポリオール、例えばグリセロール等を含む）、およびその任意の組み合わせが含まれる。
【００３０】
望ましい場合、本発明のワクチン組成物はまた、さらに場合によって１またはそれより多いアジュバントも含んでもよい。アジュバント活性を有する適切な化合物および組成物の限定されない例には、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムまたは酸化アルミニウム、限定なしにＤｒａｋｅｏｌ（登録商標）、Ｂａｙｏｌ（登録商標）、またはＭａｒｃｏｌ（登録商標）などのミネラルオイルに基づく水中油、油中水、水中油中水エマルジョン；植物油、例えば限定なしに綿実油、ピーナツ油、またはコーン油；酢酸ビタミンＥ；サポニン；魚油、例えば限定なしにスクアレンまたはスクアラン；あるいはその任意の組み合わせが含まれる。
【００３１】
本発明記載のＢＶＤＶ特異的ワクチン配合物はまた、さらに場合によって、免疫される動物に対してやはり潜在的に病原性である１またはそれより多いさらなるウイルスおよび／または微生物に特異的な、１またはそれより多い他の免疫原も含有しうる。例えば、畜牛および関連するウシ類において、組成物中に存在しうるさらなる免疫原は、ウシ病原性ウイルスの１またはそれより多い種由来であることも可能であり、これには限定なしに、ロタウイルス、ウシ呼吸器合胞体ウイルス、ウシヘルペスウイルス（１型を含む）、ウシコロナウイルス、パラインフルエンザウイルス（３型を含む）、ウシパラミクソウイルス等、あるいは１またはそれより多いウシ病原性微生物種、例えば限定なしに、パスツレラ・マルトシダ、マンヘミア・ヘモリチカ（以前のパスツレラ・ヘモリチカ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ））、ヒストフィルス・ソムニ（以前のヘモフィルス・ソムヌス）、マイコプラズマ・ボビス等、あるいは前述のいずれかの組み合わせが含まれる。
【００３２】
いくつかの態様において、一般の当業者に理解されるであろうように、関連する場合、本発明の免疫原性組成物およびワクチンには、動物への単回用量の投与が含まれることも可能であり、あるいは長期に渡って、動物への多数回の、および／または連続した用量の投与が含まれることも可能である。あるいは、本発明の免疫原性組成物はまた、単独で、あるいはさらに１またはそれより多い別個の微生物特異的免疫原またはワクチン配合物の投与と組み合わされて、１またはそれより多い抗ウイルスまたは抗微生物化合物と同時投与されうる。
【００３３】
本発明の別の重要な側面は、開示する免疫原性組成物を用いて、哺乳動物の感染または疾患の１またはそれより多い症状を治療するかまたは改善するための１またはそれより多い療法剤を送達するための方法に関する。こうした方法は、一般的に、必要がある哺乳動物に、１またはそれより多い開示する免疫原性組成物を、こうした哺乳動物においてこうした疾患または感染の重症度、期間、または度合いを治療するか、改善するか、または和らげるのに十分な量で、そして十分な時間、投与することを伴う。
【００３４】
本発明の方法および組成物はまた、疾患の１またはそれより多い臨床症状の診断または開始、あるいはその１またはそれより多い症状の出現の前、その間、またはその後のいずれかで、１またはそれより多い感染および／または疾患を有するか、有すると推測されるか、発展させるリスクがあるか、またはあると診断されている、動物の防止、予防、および／またはワクチン接種において使用可能である。
【００３５】
免疫反応を誘導するための方法
本発明にはさらに、感受性動物において、１またはそれより多いウイルス病原体に対する検出可能免疫反応を誘導するための方法が含まれる。１つの好ましい方法には、必要がある動物、あるいは例えば所定の疾患または感染に関する既知のリスク要因に基づいて潜在的に必要がある動物に、動物において検出可能な免疫反応を誘導するのに十分な量の本明細書に開示するようなワクチン組成物を投与する工程が含まれる。
【００３６】
いくつかの態様において、本発明は、ペスチウイルス感染、例えばＢＶＤＶに対して、あるいはペスチウイルス感染が関係しているかまたは原因であるかいずれかである多因子疾患、例えばＢＲＤＣに対して、被験体にワクチン接種する方法を含む。こうした方法は、一般的に、必要がある動物に、予防的および／または療法的に有効な量のペスチウイルス特異的ワクチン組成物、および１またはそれより多い薬学的または獣医学的に許容されうるキャリアー、緩衝剤、希釈剤、ビヒクル等を投与して、ペスチウイルス感染、あるいはこうしたペスチウイルス感染によって引き起こされるかまたは悪化する疾患に対して、動物において検出可能な免疫反応を提供する工程を含む。この目的に向けて、本発明は、開示する免疫原性組成物およびワクチン配合物を、動物における１またはそれより多いウイルスまたは微生物疾患または感染、あるいは１またはそれより多いその症状の予防、治療、改善または管理のために用いる方法を提供する。
【００３７】
本発明はまた、疾患の予防または防止のための獣医学的薬剤またはワクチンの製造における、１またはそれより多い開示する免疫原性組成物の使用も提供し、これには、動物における、例えばＢＶＤＶを含むペスチウイルス感染の１またはそれより多い症状を防止するかまたは改善する予防的投与に適した１またはそれより多いワクチンの調製における使用が含まれる。本発明はまた、哺乳動物において、第一の細胞に療法的または予防的免疫原性化合物を提供するための方法も提供し、該方法は一般的に、必要がある哺乳動物に、活性成分として複数の修飾生ウイルス粒子を含む本明細書に開示するようなＢＶＤＶ免疫原性組成物の有効量を、免疫されるまたは治療される哺乳動物において、望ましい療法および／または予防を提供するのに有効な時間、提供する工程も含む。
【００３８】
療法および予防キット
１またはそれより多い開示する免疫原性組成物またはこうした組成物を含む薬学的配合物を含むキット；ならびに１またはそれより多い予防的または療法的措置において、該キットを用いるための使用説明書もまた、本開示の例示的側面に相当する。こうしたキットには、好ましくは、単独で、あるいは１またはそれより多いさらなる療法化合物、薬剤等と組み合わせた、１またはそれより多い開示する免疫原性組成物またはワクチン、および動物における疾患の予防または治療における構成要素の使用のための使用説明書が含まれる。本発明記載のキットは、商品流通のためにパッケージングされることも可能であり、そしてまた場合によって、選択された動物に組成物（単数または複数）を投与するための１またはそれより多い送達デバイス（例えばシリンジ、バイアル、注射物質等）もさらに含むことも可能である。
【００３９】
こうしたキットのための容器（単数または複数）には、典型的には、免疫原性組成物（単数または複数）またはワクチン配合物（単数または複数）を配置し、そして好ましくは動物への投与のために１またはそれより多いアリコットに適切に分配しうる、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、瓶、シリンジまたは他の容器が含まれうる。第二の免疫原性組成物あるいは第一の抗ウイルスまたは抗微生物化合物もまた望ましい場合、キットはまた、第二の別個の容器中に、あるいは投与のための調製まで、２つの構成要素を分離する、壊れやすいまたは壊れにくいバリアを含む単一の容器中に、第二の免疫原性組成物あるいは第一の抗ウイルスまたは抗微生物化合物を含むことも可能である。あるいは、複数の別個の免疫原性組成物（単数または複数）および／または別個の抗ウイルスまた抗微生物化合物（単数または複数）を単一の配合物中で調製することも可能であるし、そして単一の容器、バイアル、フラスコ、シリンジ、カテーテル、カニューレ、瓶、試験管、アンプル、または他の適切な容器中にパッケージングすることも可能である。キットにはまた、上記容器を他の装置等とともに含む場合のように、より大きい容器が含まれうる。多数の用量は、容器内の適切な入れ物（ｖｅｓｓｅｌ）内に含有されてもよく、望ましい場合、好ましくは必要に応じてあらかじめ選択された用量を計測する、任意の適切な重量または容量測定デバイスとともに含有されうる。
【００４０】
薬剤調製において使用するための組成物
本発明の別の重要な側面は、動物、例えば脊椎動物哺乳動物において、疾患、またはその症状を予防するか、治療するかまたは改善するための薬剤調製における、開示する免疫原性組成物（ならびに該組成物を含む配合物）を用いるための方法に関する。開示する免疫原性組成物の使用はまた、微生物またはウイルス起源の１またはそれより多い疾患の療法および／または予防においても意図される。
【００４１】
こうした使用は一般的に、１またはそれより多い開示する免疫原性組成物を、罹患した動物における１またはそれより多い疾患またはその症状を予防するか、治療するか、または管理するのに十分な量で、そして十分な時間、投与する工程を含む。１またはそれより多い開示する免疫原性配合物を含む組成物はまた、本発明の一部を形成し、そして特に、ウイルスおよび／または微生物起源の１またはそれより多い疾患の療法または予防において使用するための少なくとも第一の薬学的に許容されうる賦形剤をさらに含む組成物である。
【００４２】
本発明の免疫原性組成物を、単価（すなわち一価）ワクチンとして、あるいは二価、三価またはさらに多価（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ）（すなわち多価（ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ））ワクチンとして調製することも可能である。例えば、一価ワクチンには、好ましくは、選択されたレシピエント哺乳動物、および特にＢＶＤＶ感染に感受性である哺乳動物の体内に導入された際に、特異的な抗ＢＶＤＶ免疫反応を誘発可能である、本発明の単一の免疫原性組成物（例えば修飾生ＢＶＤＶ−１ｂウイルス）の単一免疫原性組成物が含まれるであろう。
【００４３】
同様に、二価ワクチン組成物には、好ましくは、各々、哺乳動物において特異的な免疫反応を誘発可能である、少なくとも第一のＢＶＤＶ−１ｂ特異的組成物、および少なくとも第二のウイルスまたは微生物特異的免疫原が含まれるであろう。多価（三価または多価を含む）ワクチン組成物には、好ましくは、それぞれ、３またはそれより多いウイルスまたは微生物特異的免疫原が含まれるであろう。本明細書に例示する１つの態様において、本発明者らは、驚くべきことに、そして予期せぬことに、哺乳動物集団において、そして特に家畜において、ＢＲＤＣ感染を抑制するための、ＢＶＤＶ−１ｂ、ＢＶＤＶ  １ａ型（ＢＶＤＶ−１ａ）、ＢＶＤＶ  ２型（ＢＶＤＶ−２）、ＰＩ３、ウシ呼吸器合胞体ウイルス（ＢＲＳＶ）、および感染性ウシ鼻気管炎（ＩＢＲ）の病原体であるＢＨＶ−１に特異的な免疫原を含む、好適な六価（六種）修飾生ワクチン配合物を開発した。
【００４４】
例示的態様の説明
本発明の例示的態様を以下に記載する。明確にするために、本明細書には実際の実施のすべての特徴は記載しない。もちろん、こうした実際の態様の開発のいずれにおいても、１つの実施と別の実施とでは異なるであろう、開発者の特定の目的、例えばシステムに関連するおよびビジネスに関連する制約との適合を達成するため、多くの実施特異的決定を行わなければならないことが認識されるであろう。さらに、こうした開発上の努力は、複雑で、そして時間を消耗するが、本開示の利点を有する一般の当業者にはルーチンの作業であろうことが認識されるであろう。
【００４５】
「輸送熱」
「輸送熱」は、畜牛およびヒツジにおける急性の非常に伝染性が強い敗血症性症候群に与えられた用語であり、熱、気道の急性炎症、鼻分泌物、食欲不振、抑鬱、線維素性肺炎、および感染組織の壊死によって臨床的に特徴付けられる。輸送後のフィードロットで最も頻繁に見られる輸送熱は、若い畜牛の主な死因であり、そして産業に対して、推定５億ドルを超える年間損失の原因となっている。１９９１年のみで、輸送熱は、主に、治療、産生損失、および死亡の費用のため、米国畜牛産業に、ほぼ６億２４００万ドルの概算費用を課した。
【００４６】
輸送熱の病因は、一般的に、不都合な外部影響を含み、動物を最初のウイルス呼吸器感染に罹りやすくし、これが次に、１またはそれより多い二次的細菌感染の増殖に好ましい条件を生じることによる。
【００４７】
ウシ呼吸器病（ＢＲＤ）症候群（ＢＲＤＣ）
輸送熱の主な病原体は、ウシ呼吸器病（ＢＲＤ）またはウシ呼吸器病症候群（ＢＲＤＣ）として知られる多因子状態である。ＢＲＤＣは、肉牛産業における経済的損失の主因であり、ウイルスおよび細菌病原体両方による、付随する連続または同時感染によって特徴付けられる。ＢＲＤＣに関与するウイルス病原体には、ウシヘルペスウイルス１（ＢＨＶ−１）、ウシＰＩ３、ウシ・ウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）、およびウシ呼吸器合胞体ウイルス（ＢＲＳＶ）が含まれる。
【００４８】
ウイルス感染後、罹患した動物は次いで、１またはそれより多い続く細菌感染（例えばマンヘミア（以前のパスツレラ）・ヘモリチカ、パスツレラ・マルトシダ、ヒストフィルス・ソムニ（以前のヘモフィルス・ソムヌス）、アクチノミセス・ピオゲネス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）および多様なマイコプラズマ属種）を発展させ、これらはしばしば急性肺炎を示す。
【００４９】
肺炎の最も一般的でそして最も早期に認識されうる臨床徴候は、抑鬱である。抑鬱を示す子ウシは、垂下した耳、伸びた頭部、および彎曲した背中を有し、そして／または、しばしば、他の畜牛から離れる（ｉｓｏｌａｔｅ  ｔｈｅｍｓｅｌｖｅｓ）であろう。子ウシの健康は次第に悪化し、食べるのをやめ、呼吸速度増加を示し、そして顕著な熱（典型的には１０４°Ｆ〜１０８°Ｆの範囲）を発展させる。
【００５０】
ペスチウイルス
ペスチウイルスは、世界中で動物において経済的に重要な疾患を引き起こす。フラビウイルス科内のペスチウイルス属は、３種の一本鎖＋鎖ＲＮＡウイルス：ウシ・ウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）、古典的ブタ発熱ウイルス（ＣＳＦＶ）、ボーダー病ウイルス（ＢＤＶ）を含む。近年、ＢＶＤＶに遺伝的に関連する、第四の別個の群のペスチウイルスが同定されてきており、そして文献において、ウシ・ウイルス性下痢症ウイルス２型（ＢＶＤＶ−２）と称される（例えば、各々、その全体が明確に特に本明細書に援用される、Ｔｈｉｅｌら、１９９６；およびＢｅｃｈｅｒら、１９９５を参照されたい）。その結果、現在の教科書は、２種を区別するため、ＢＶＤＶの元来の種を「ＢＶＤＶ−１」と称する。
【００５１】
ウシ・ウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）
ペスチウイルスの基準種は、ＢＶＤＶ  １型（ＢＤＶＤ−１）であり、そのゲノムは長さおよそ１２．５ｋｂであり、そして１つの大きなオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有する（その全体が明確に特に本明細書に援用されるＣｏｌｌｅｔｔら、１９８８）。該ＯＲＦは、宿主またはウイルスプロテアーゼによって、翻訳と同時にそしてその後でプロセシングされる、およそ４５０ｋＤａの大きなポリタンパク質をコードする。標準的ＢＶＤＶポリタンパク質のＮ末端は、非構造タンパク質ｐ２０（Ｎｐｒｏ）、カプシドタンパク質ｐ１４（Ｃ）；エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４８（Ｅ０）、ｇｐ２５（Ｅ１）、ｇｐ５３（Ｅ２）；非構造タンパク質ｐ１２５（ＮＳ２３）、ｐ１０（ＮＳ４Ａ）、ｐ３２（ＮＳ４Ｂ）、ｐ５８（ＮＳ５Ａ）およびｐ７５（ＮＳ５Ｂ）を生じる（例えば、各々、その全体が明確に特に本明細書に援用される、Ｔａｕｔｚら、１９９７；Ｘｕら、１９９７；Ｅｌｂｅｒｓら、１９９６；およびＷｉｓｋｅｒｃｈｅｎら、１９９１を参照されたい）。ＢＶＤＶ−１は、２つの生物型、細胞変性型（「ｃｐ」と称される）または非細胞変性型（「ｎｃｐ」）、で存在し、これらは、細胞変性変異体において、単一の８０ｋＤａポリペプチド（非構造タンパク質ｐ８０、ＮＳ３）が産生される点が異なる（例えば、その全体が明確に特に本明細書に援用される、Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅら、１９６０を参照されたい）。
【００５２】
多くのＢＶＤＶ単離体の系統発生分析に基づいて、ＢＶＤＶ−１は、少なくとも１３の別個の下位遺伝子型（ＢＶＤＶ−１ａからＢＶＤＶ−１ｌと称される）を含むことが示されてきており、ＢＶＤＶ−２に関しては、２つの下位遺伝子型（ＢＶＤＶ−２ａおよびＢＶＤＶ−２ｂ）が同定されてきている（例えば、各々、その全体が明確に特に本明細書に援用される、Ｐｅｌｌｅｒｉｎら、１９９４；Ｒｉｄｐａｔｈら、１９９４、およびＸｕｅら、２０１０を参照されたい）。
【００５３】
ＢＶＤＶ−１およびＢＶＤＶ−２は、どちらも、畜牛において急性感染（下痢、発熱、出血性症候群）を引き起こし、そして感染が妊娠中に起こると、流産、胎児の奇形および子ウシの持続感染を引き起こす。持続感染動物は、ウイルスの主な貯蔵所に相当し、そしてこうした動物は、致死性粘膜疾患（ＭＤ）で倒れる可能性もある。
【００５４】
ＢＶＤＶは、ヒツジにおいてより広い疾患を引き起こすウイルス、およびブタにおける古典的ブタ発熱を引き起こすウイルスに緊密に関連する。感染した畜牛は、典型的には、全身性「粘膜疾患」を示し、該疾患は、体温上昇、下痢、咳および消化器粘膜の潰瘍によって特徴付けられる（例えば、各々、その全体が明確に特に本明細書に特に援用される、Ｏｌａｆｓｏｎら、１９４６；およびＲａｍｓｅｙら、１９５３を参照されたい）。
【００５５】
ＢＶＤウイルスは、妊娠した畜牛の胎盤を横断することが可能であり、そしてウイルスに対して免疫寛容性であり、そして残りの一生に渡り持続してウイルス血症性である、持続感染（ＰＩ）子ウシの誕生を生じる可能性もある。これらのＰＩ畜牛は、微生物が引き起こす肺炎または腸疾患の感染に対して非常に素因があり、畜牛におけるＭＤ疾患の大流行に必要なウイルス貯蔵所を提供する（例えば、各々、その全体が明確に特に本明細書に援用される、Ｌｉｅｓｓら、１９７４；Ｂａｒｂｅｒら、１９８５；Ｍａｌｍｑｕｉｓｔ、１９６８；およびＲｏｓｓら、１９８６を参照されたい）。
【００５６】
ＢＶＤＶは、糞口方式で群れに広がり、そしてウイルスを抑制する戦略は、単に経済的な損失を減少させる努力の中でのより厳密な管理実施から、有効であるが典型的には許容されえないレベルのコストを伴う、感染動物を同定する精巧な試験法までの範囲に渡る。
【００５７】
過去３０年間、修飾生ウイルス（ＭＬＶ）および不活化弱毒化ウイルスまたはウイルス粒子両方の、ＢＶＤＶに関する、ほぼ１５０のワクチンが、多様な度合いの成功を伴って、畜牛業界に市販されてきている；商業的ワクチン配合物が広く利用可能になり、そして使用されているにもかかわらず、ＢＶＤＶの大流行はなお、毎年報告されている。疾患管理に対する現在のアプローチは、畜牛に対する毎年反復されるワクチン接種を伴い、そしてＰＩキャリアーとして生まれる子ウシがいないことを確実にすることを試みるさらなる工程が一般的に行われる。ＢＶＤＶの検出、そして／またはＢＶＤＶ感染動物の検出のためにいくつかの異なる試験法が開発されてきており、これには逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、酵素連結イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、標準ウイルス単離技術、および多様な免疫組織化学アッセイが含まれる。
【００５８】
例示的な定義
用語「約」および「およそ」は、本明細書において、交換可能であり、そして一般的に、所定の数値の周囲の数値範囲、ならびに数値の列挙される範囲中のすべての数値を指す（例えば、「約５〜１５」は、別に言及しない限り、「約５〜約１５」を意味する）。さらに、本明細書のすべての数値範囲は、範囲内の各整数を含むと理解されるべきである。本明細書において、用語「抗原」または「免疫原」は、宿主動物において、特異的免疫反応を誘導する物質を意味する。抗原は、全生物、死滅、弱毒化または生存生物；生物のサブユニットまたは部分；免疫原性特性を持つ挿入物を含有する組換えベクター；宿主動物への提示に際して、免疫反応を誘導可能なＤＮＡの片または断片；タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、エピトープ、ハプテン、またはその任意の組み合わせを含むことも可能である。あるいは、免疫原または抗原は、毒素または抗毒素を含むことも可能である。抗原は、一般的に、任意の免疫原性物質、すなわち、感受性動物の組織内に導入されると、免疫反応（例えば特異的抗体分子の産生）を誘発し、そして抗原の導入に反応して産生される抗体に特異的に結合可能である、任意の物質を含む。抗原は、免疫系によって認識され、体液性免疫反応を誘導し、そして／または細胞性免疫反応を誘導して、Ｂおよび／またはＴリンパ球の活性化を導くことが可能である。抗原には、単一エピトープ、あるいは２またはそれより多いエピトープが含まれうる。
【００５９】
本明細書において、用語「抗体」は、それぞれ、重鎖および軽鎖可変ドメイン、ＶＨおよびＶＬを通じて他の分子（抗原）に結合するタンパク質を指す。用語「抗体」は、任意の免疫グロブリン分子を指し、これには例えば、限定されるわけではないが、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、およびその任意のサブクラスまたはその組み合わせが含まれる。用語「抗体」はまた、免疫グロブリン分子の機能性断片も意味し、これには例えば、限定されるわけではないが、別に明らかに記載されない限り、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｄ、ｓｃＦｖおよびｓｄＦｖ断片が含まれる。
【００６０】
本明細書において、「抗原性ポリペプチド」または「免疫原性ポリペプチド」は、脊椎動物内に導入された際、脊椎動物免疫系分子と反応する、すなわち抗原性であり、そして／または脊椎動物において免疫反応を誘導する、すなわち免疫原性である、ポリペプチドである。本発明の単離抗原性および免疫原性ポリペプチドは、本発明のポリヌクレオチドにコードされるものに加えて、組換えタンパク質、精製サブユニット、該タンパク質を発現するウイルスベクターとして提供されうるし、あるいは不活化ウイルスワクチン、例えば生弱毒化ウイルスワクチン、熱殺菌ウイルスワクチン等の形で提供されうる。
【００６１】
本明細書において、「修飾生ワクチン」は、典型的には組織培養細胞において継代されて、疾患を引き起こす能力が弱毒化されるように改変されているが、続いて動物に投与された際に疾患または感染に対して防御する能力を保持するウイルスを含むワクチンである。
【００６２】
本明細書において、「アジュバント」は、こうしたウイルス集団または複数のこうした抗原を含有するワクチン組成物中に存在した際、修飾生ウイルスまたは抗原の免疫原性および有効性を増進する１またはそれより多い物質で構成される組成物を意味する。
【００６３】
本明細書において、ウイルスの「感染単位」はＴＣＩＤ５０、または感受性細胞の組織培養の５０％を感染させるかまたは殺すのに必要な量として定義される。本明細書において、用語「キャリアー」は、適切な動物への投与に薬学的に許容されうる、任意の溶媒（単数または複数）、分散媒体、コーティング（単数または複数）、希釈剤（単数または複数）、緩衝剤（単数または複数）、等張性剤（単数または複数）、溶液（単数または複数）、懸濁物（単数または複数）、コロイド（単数または複数）、不活性物質（単数または複数）等、またはその組み合わせを含むよう意図される。一般に化学的化合物、そして特に免疫原のための、１またはそれより多い送達ビヒクルの使用は、薬学業の一般の当業者に周知である。任意の慣用的媒体または剤が活性成分と不適合である場合を除いて、診断、予防、および療法組成物におけるその使用が意図される。１またはそれより多い補助活性成分（単数または複数）もまた、１またはそれより多い開示する免疫原性組成物およびそのワクチン配合物内に取り込まれることも、またはこれと会合されて投与されることも可能である。
【００６４】
本明細書において、用語「免疫する」または「免疫」または類似の用語は、特定の抗原性エピトープまたは免疫原に対して、検出可能な、または好ましくは実質的な免疫反応を生じさせる能力を与えることを指す。これらの用語は、必ずしも完全な免疫を暗示せず、むしろ、免疫反応は、ベースライン、例えば本発明の免疫原性組成物が投与されていない場合、または慣用的なワクチンを投与した場合よりも実質的に大きい免疫反応を生じる。例えば、哺乳動物は、本明細書に開示するワクチン組成物の投与後に、ターゲット免疫原（単数または複数）に対する細胞性および／または体液性免疫反応が起こる場合（そして好ましくは実質的な免疫反応）、１またはそれより多いターゲット免疫原に対して免疫されると見なされる。
【００６５】
本明細書において、用語、組成物またはワクチンに対する「免疫学的反応」は、宿主動物における、細胞性および／または抗体仲介性免疫反応の発展を示す。一般的に、免疫学的反応には、（限定されるわけではないが）１またはそれより多い以下の効果が含まれる：所定の抗原またはハプテンに対して特異的に向けられる、（ａ）抗体産生；（ｂ）Ｂ細胞産生；（ｃ）ヘルパーＴ細胞産生；および／または（ｄ）細胞傷害性Ｔ細胞産生。
【００６６】
本明細書において、用語「免疫原性」は、また、宿主動物において、免疫学的反応を誘発する、物質、例えばアミノ酸配列、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチド内のアミノ酸配列の一部、あるいは修飾または弱毒化死滅または生ウイルスも指す。本明細書において、用語「免疫原性タンパク質」、「免疫原性ペプチド」、または「免疫原性ポリペプチド」は、ひとたび宿主に投与されると、該タンパク質に対して向けられる体液および／または細胞型の免疫反応を誘発可能であるという意味で、免疫学的に活性である、タンパク質、ペプチド、およびポリペプチドを指す。用語、エピトープは、体液型（Ｂ細胞）および／または細胞型（Ｔ細胞）の免疫反応を誘導可能なタンパク質部位に関する。
【００６７】
用語「病原体」は、本明細書において、例えばウイルス、プリオン、原生動物、寄生虫、ならびに細菌、酵母、カビ、真菌等の微生物を含む任意の種類の感染性病原体と定義される。
【００６８】
本明細書において、用語「個体」（または交換可能に、「宿主」、「被験体」、「レシピエント」、「患者」等とも称される）は、本明細書に開示する１またはそれより多い薬学的組成物またはワクチン配合物を投与可能ないかなる動物も指す。好ましくは、被験体は脊椎動物であり、いかなる動物種（および好ましくは哺乳動物種）も指すよう意図される。特定の態様において、個体は、好ましくは、限定されるわけではないが、非ヒト霊長類、ウシ、イヌ（ｃａｎｉｎｅ）、ヤギ（ｃａｐｒｉｎｅｓ）、イヌ（ｃａｖｉｎｅｓ）、カラス（ｃｏｒｖｉｎｅｓ）、エピネス（ｅｐｉｎｅｓ）、ウマ（ｅｑｕｉｎｅｓ）、ネコ（ｆｅｌｉｎｅｓ）、ヤギ（ｈｉｒｃｉｎｅｓ）、ラピネス（ｌａｐｉｎｅｓ）、ウサギ（ｌｅｐｏｒｉｎｅｓ）、オオカミ（ｌｕｐｉｎｅｓ）、ヒツジ（ｏｖｉｎｅｓ）、ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅｓ）、ラシネス（ｒａｃｉｎｅｓ）、キツネ（ｖｕｌｐｉｎｅｓ）等を含み、家畜、動物学的標本、外来のもの、ならびにコンパニオン動物、ペット、および獣医師にケアされている任意の動物を含む、任意の哺乳動物宿主である。
【００６９】
句「獣医学的に許容されうる」および「薬学的に許容されうる」は、哺乳動物に投与された際、アレルギー性または類似の有害な反応を生じない、分子実体および組成物を指す。本明細書において、「薬学的に許容されうる塩」は、親化合物の望ましい生物学的活性を保持し、そして望ましくないいかなる毒性学的影響も与えない、塩を指す。こうした塩の例には、限定されるわけではないが、無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸等で形成される酸付加塩；ならびに有機酸、例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルクロン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パモ（エンボン）酸、アルギン酸、ナフトエ酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸で形成される塩；多価金属陽イオン、例えば亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウム等を含む塩；Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンまたはエチレンジアミンから形成される有機陽イオンで形成される塩；ならびにその組み合わせが含まれる。
【００７０】
本明細書において、「防御免疫反応」または「療法的免疫反応」は、抗原に対するＣＴＬおよび／またはＨＴＬ反応を指し、これは何らかの方式で、疾患、または症状、副作用または進行を予防するかまたは少なくとも部分的に抑止する。免疫反応にはまた、ヘルパーＴ細胞の刺激によって促進されている抗体反応もまた含まれうる。
【００７１】
本明細書において、用語「ワクチン」は、脊椎動物に、そして好ましくは哺乳動物などの動物に投与されることが可能な型の、本発明の免疫原性組成物を含有する組成物または配合物を指す。典型的には、本発明のワクチンには、その必要がある動物への投与のために配合された、本明細書に開示する１またはそれより多い免疫原性組成物（１またはそれより多い修飾生ウイルス粒子またはその複数のもの）が含まれるであろう。こうした組成物は、いかなる適切な配合物であってもよく、限定なしに、水性ビヒクル中で調製されるもの、ならびに、凍結、フリーズドライ、凍結乾燥または脱水型であり、次いで、投与前に慣用的な薬学的に許容されうるビヒクル（例えば無菌生理食塩水または類似の緩衝水溶液）中で再水和されるかまたは懸濁されるものが含まれる。こうした型において、本発明のワクチン組成物を、感受性動物においてウイルスおよび／または微生物感染の１またはそれより多い状態あるいは１またはそれより多い症状を予防するか、管理するか、または別の方式で治療するために、本明細書に開示する１またはそれより多い方法またはワクチン接種措置において、容易に使用可能な、好適な単回または多数回用量アリコットで製造しうる。
【００７２】
動物宿主内への導入に際して、免疫原性組成物および該組成物を含むワクチンは、生じる免疫反応が、限定されるわけではないが、ワクチン接種された動物の細胞および組織内で、特異的抗体、サイトカインの産生および／または細胞傷害性Ｔ細胞、抗原提示細胞、ヘルパーＴ細胞、樹状細胞および／または他の細胞反応の活性化を検出するアッセイを含む、免疫学業の一般の当業者に知られる慣用的アッセイを用いて容易に検出であるように、免疫反応、および好ましくは導入された抗原（単数または複数）に特異的な免疫反応を誘発可能である。本発明のワクチン組成物には、１またはそれより多いアジュバントが、単独で、あるいは１またはそれより多いさらなる抗原（単数または複数）等と組み合わされて含まれるか、あるいは該ワクチン組成物がこうしたアジュバント中でまたはアジュバントと同時に投与されることも可能である。
【００７３】
本発明のワクチンおよび免疫原性組成物は、免疫後に、動物に免疫反応を与える。本明細書において、用語「免疫反応」は、Ｂおよび／またはＴリンパ球の活性化または増殖を導く、体液性免疫反応および／または細胞性免疫反応を指す。しかし、いくつかの例において、免疫反応は、より低い強度である可能性もあり、そして本発明にしたがった少なくとも１つの物質を用いた際にのみ検出可能となる可能性もある一方、他のものは、反復投与、アジュバント、第二のまたはさらなる活性剤、あるいは１またはそれより多いその組み合わせを必要とする可能性もある。用語「アジュバント」は、免疫系の１またはそれより多い機能が増加し、そして免疫原性剤に対して向けられるように、生存生物の免疫系を刺激するために用いられる剤を指す。
【００７４】
本明細書において、用語「治療」、「治療する」、「治療された」、または「治療している」は、その発展が感受性動物に影響を及ぼす前または後のいずれかでの、疾患の１またはそれより多い症状の療法または改善、あるいは疾患またはその症状の度合いまたは重症度の減少を指す。感染性疾患に関して用いた際、例えば該用語は、感染の重症度を減少させるか、あるいは感染に起因しうる疾病の１またはそれより多い症状を和らげるかまたは遅延させる、ならびに例えば治療される個体の身体からの感染の減少および／または除去を含む、感染動物が感染と闘う能力、あるいは疾患が悪化するのを、または罹患動物と接触する他の動物に広がるのを和らげるかまたは予防する能力を増加させる、治療または治療措置を指す。
【００７５】
用語「免疫原性的に有効な量」は、当該技術分野において、通常の意味を有し、すなわち免疫原と免疫学的特徴を共有する病原体を有意に関与させる（ｅｎｇａｇｅ）免疫反応を誘導可能な免疫原の量を指す。この用語はまた、療法的または予防的に有効な量、あるいはその両方も含むことも可能である。
【００７６】
本明細書において、用語「予防」、「予防する」、「予防された」、「予防している」、「ワクチン接種する」および「ワクチン接種」は、予防、あるいは感染の部分的または完全な阻害、あるいは疾患に対する素因がある可能性があるが、まだ曝露されていないかまたは該疾患を有すると診断されていない動物において、１またはそれより多い疾患あるいは１またはそれより多いその症状の減少または開始の遅延を指す。例えば感染性疾患に関して用いる場合、該用語は、本発明の１またはそれより多い免疫原性組成物の予防的投与を指し、これは１またはそれより多いウイルスまたは微生物病原体での感染に対して、動物の耐性を増加させる傾向があるか、あるいは言い換えると、被験体が病原体（単数または複数）に感染する可能性を減少させるか、または感染した場合、感染動物において、症状を遅延させるか、感染の重症度を減少させるか、または感染に起因しうる疾病の症状を減少させるか、またはその任意の組み合わせである、本発明の１またはそれより多い免疫原性組成物の予防的投与を指す。
【００７７】
「予防する」および「治療する」の各々には、動物における、特定の感染、疾患、状態、またはその症状を管理すること、ならびに疾患または状態の、あるいはその任意の症状の候補状態または経過の任意の有益な修飾が含まれる。管理は、根底にある感染、あるいはそこから生じる疾患または状態いずれかに実際に患わされることを伴いまたは伴わず、症状のいくつかまたはすべてと取り組むことも可能である。
【００７８】
用語「例えば」は、本明細書において、単に例示として用いられ、限定は意図されず、そして本明細書に明確に列挙する項目のみを指すと見なしてはならない。
【００７９】
長年に渡る特許法慣例にしたがって、単語「ａ」および「ａｎ」は、本出願で用いた際、請求項を含めて、「１またはそれより多い」を指す。
【実施例】
【００８０】
以下の実施例は、本発明の例示的態様を実証するために含まれる。一般の当業者には、以下の実施例に開示する技術は、本発明の実施においてよく機能することが発見された技術に相当し、そしてしたがって、その実施のための好ましい様式を構成すると見なされうることが認識されなければならない。しかし、一般の当業者は、本開示を考慮して、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、開示する特定の態様において、多くの変化を実行し、そしてなお同様のまたは類似の結果を得られうることを認識しなければならない。
【００８１】
実施例１−ＢＶＤＶ修飾生ウイルスの産生
本実施例は、ＢＶＤＶ−１ｂ修飾生ウイルス（ＭＬＶ）の大規模産生のための例示的方法を提供する。
【００８２】
材料および方法
ウイルスおよび微生物
ＢＶＤＶ−１ｂのＴＧＡＣ株は、米国農務省（ＵＳＤＡ）、動植物衛生検査部（ＡＰＨＩＳ）、獣医学生物学研究所（ＣＶＢ−Ｌ）（米国アイオワ州エームズ）より得た。マスターシード（ＭＳ）は、続いて、「ＴＶＬ−ＢＶＤＶ１ｂ  ＭＳ  ０４／２７／２００７  ＤＷ３−０９５」と名付けられ、そして現在ここにともに出願されている、本出願者の同時係属米国仮特許出願第６１／４２７，４０４号に記載するように、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．１４および３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１２２の下に権利を与えられている、特許および商標局長によって決定されるものに対する本特許出願の係属中に、培養へのアクセスが利用可能であることを確実にする条件下で寄託されている。寄託物は、本出願の対応物またはその成果（ｐｒｏｇｅｎｙ）が出願されている国の外国特許法によって必要とされるように入手可能である。しかし、寄託物の入手可能性は、政府の法的措置によって許諾される特許権の逸脱において、本発明を実施する許可を構成しないことが理解されなければならない。本培養寄託物は、微生物寄託に関するブダペスト条約の規定にしたがって、保存され、そして公共に入手可能となり、すなわち該寄託物は、寄託物の試料の最終加工物に関する最近の要求後、少なくとも５年間、そしていかなる場合であっても、寄託日後、少なくとも３０年間、または寄託された培養の開示を生じうる、任意の特許の法的効力存続期間に渡って、寄託物が生存し、そして混入されないまま維持されるために必要である、すべての注意を伴って保存されるであろう。寄託者は、寄託物の状態のために、要求された際に寄託物が試料を与えることが不可能である場合には、寄託物を交換する義務を認識している。本培養寄託物の公共に対する利用可能性に関するすべての制限は、開示する特許の付与に際して、取り消し不能に除去されるであろう。ＴＶＬ  ＢＶＤＶ１ｂ  ＭＳ  ０４／２７／２００７  ＤＷ３−０９５ウイルスの寄託物は、ブダペスト条約の条件下で、２０１０年１２月２１日、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ，  ２０１１０−２２０９，  ＵＳＡに位置する、アメリカンタイプカルチャー研究所の特許寄託物の永続的コレクションに入っており、この際、貯蔵所によって、寄託番号ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１１５５３を割り当てられた。
【００８３】
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイを用いて、ＭＳウイルス（ＭＳＶ）の同定を実行して、ＭＳウイルスがＢＶＤＶ−１ｂとして陽性に同定された。ＰＣＲによるＢＶＤＶの分化に関するプロトコルは、ＲｉｄｐａｔｈおよびＢｏｌｉｎ、１９９８（その全体が明確に特に本明細書に援用される）によって開発された。免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）を用いて、陽性同定を行った（ＭｃＮｕｌｔｙら、１９８４）。Ｔｅｘａｓ  Ｖｅｔ  Ｌａｂウシ腎臓（ＴＶＬ−ＢＫ）細胞におけるこれらのウイルスの複製は、容易に認識可能な細胞変性変化を生じた。
【００８４】
微生物の同定の頻度
産生シードウイルスをＴＶＬ−ＢＫ細胞に接種する前に、細胞を顕微鏡的に視覚化して、細胞が先に記載される形態を示すことを確認する。産生ウイルスの各バッチを採取する前に、ＴＶＬ−ＢＫ細胞を観察して、これらが、ウイルスに関連する典型的な細胞変性効果（ＣＰＥ）を示すことを確認する。
【００８５】
培養または継代培養の病原性、維持、および範囲
このワクチンに用いるＢＶＤＶ−１ｂの病原性、強度、および抗原性の一貫性を、凍結乾燥または凍結条件での保存、ならびに継代または継代培養数に対する制限によって、助長した。
【００８６】
範囲：産生ウイルス＝ＭＳＶ＋１０（有効性連続継代）であるが、５〜１０の間の任意の継代であることも可能である。産生細胞ストック＝ＭＣＳ＋２０（有効性連続継代）であるが、しかし２０未満の任意の継代であることも可能である。
【００８７】
シードおよび産生培養に用いる培地の組成および反応
シードおよび産生培養に用いる培地の組成および反応は以下の通りであった：作業ウイルス接種物（ＭＳＶ＋１〜ＭＳＶ＋８）および産生ウイルス接種物（典型的には、排他的ではないがＭＳＶ＋９であった）をＴＶＬ−ＢＫ細胞中で増殖させ；但し、ウイルス増殖のためのＴＶＬ−ＢＫ細胞継代数は、ＭＣＳから２０継代を超えない。増殖培地（作業および産生細胞調製物両方のためのもの）は、ダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）であった。生じたＭＳＶを凍結乾燥し、凍結保存培地中、液体窒素中で保存するか、または凍結保存培地中、−７０〜−８５℃で保存しうる。ＭＣＳを凍結保存培地中（液体窒素中）で保存しうるし、または凍結保存培地中、−７０〜−８５℃で保存しうる。
【００８８】
シーディングおよび接種のための懸濁物を調製する方法
凍結ＴＶＬ−ＢＫ細胞を含有する凍結バイアルを迅速に融解した。培養フラスコを、推奨される容量の培地で満たし、そして懸濁細胞を凍結バイアルから培養フラスコに無菌的に移した。また、１：３〜１：６（ｃｍ２：ｃｍ２）の範囲の比で、活発に増殖している培養を分割することによってもまた、培養容器に植え付けた。継代培養が意図されるフラスコまたはローラーボトル中のＴＶＬ−ＢＫを、増殖培地を無菌的に除去し、そして１ｘトリプシン−ＥＤＴＡ溶液を添加することによって、培養表面から遊離させた。インキュベーション後（５分間、３５〜３９℃）、単層を分散させた。分散させた細胞を増殖培地とともに培養容器に添加することによって、トリプシンを不活化した。ウイルスの凍結アリコットを迅速に融解するか、またはシードが凍結乾燥されている場合は、培地に再懸濁した。ＴＶＬ−ＢＫ細胞（＋２０またはそれ未満）にウイルスを接種した。フラスコまたはローラーボトル中で複製している、継代培養が意図されるウイルスを、適切なインキュベーション時間後に、そして／またはＣＰＥを観察した後に、収集した。次いで、ウイルス液を６〜−８０℃で保存するか、または直ちに用いて、他の培養容器に接種した。
【００８９】
標準細胞培養技術を用いて、シードおよび産生培地の両方に接種した。継代数２０またはそれ未満のＴＶＬ−ＢＫ細胞を接種した。典型的にはＭＳＶ＋９である凍結産生ウイルス接種物を迅速に融解した。細胞あたり０．０１〜１．０ウイルスの範囲の感染多重度を達成するための、ウイルス接種物の体積は、培養面積１６００ｃｍ２あたり、１〜２５ｍＬであった。最小接種力価は以下のとおりであった：ＢＶＤＶ−１ｂに関しては、ｍＬあたり１０５．０  ＴＣＩＤ５０。接種培養物を３７±２℃および５±１％  ＣＯ２で２〜４日間インキュベーションした。
【００９０】
採取
採取当日、ウイルス特異的ＣＰＥおよび無菌性に関して培養を調べた。典型的な最小インキュベーション時間は、ＢＶＤＶ−１ｂ接種後２日間であった。典型的な最大インキュベーション時間は、ＢＶＤＶ−１ｂ接種後４日間であった。ウイルス懸濁物を産生容器から無菌的に採取した。試料を収集して、採取物のＴＣＩＤ５０を決定した。採取材料を６〜−８０℃で保存した。採取材料は、最終産物の製造前に、凍結より上では、最長１ヶ月、そして凍結状態では最長６ヶ月、保存可能であった。
【００９１】
非典型的なＣＰＥまたは混入の証拠を示す採取液を廃棄した。典型的なＣＰＥおよび混入不含を示す採取液のみが、さらなる産生使用に適格であった。最小許容採取ウイルス力価は、１０６  ＴＣＩＤ５０／ｍＬであった。採取液の純度を以下のように確認した。２ｍＬの採取液試料を無菌的に３８ｍＬのＳＣＤＢに添加し、そして陰性（培地のみ）および陽性対照とともに、３５〜３９℃で、４６〜５０時間インキュベーションした。培養中の巨視的増殖の不在ならびに陰性対照によって、採取液が純粋であり、そしてさらなる産生使用に満足出来ることが確立された。純粋でないことが見出された採取液を廃棄した。
【００９２】
ＢＶＤＶ生修飾ウイルスの例示的な配合物
無菌技術を用いて、すべての操作を行った。適切な抗生物質、例えばネオマイシンおよびナイスタチン（マイコスタチン）を、それぞれ１５μｇおよび１５単位／用量の率で、ワクチンのシリーズまたはサブシリーズ集合中に添加した。濃度を調整するために、必要に応じて、採取液をＤＭＥＭ中で希釈し、そして０．２μｍでろ過したスクロース溶液を添加することによって安定化させ、２０±１％の最終スクロース濃度を生じた。場合によって、１０ｋＤａ分子量カットオフフィルターを用いた無菌限外ろ過によって、ウイルス採取液を濃縮した。濃縮の度合いは、典型的には５０倍を超えなかった。
【００９３】
採取ウイルス液の各バッチを分析して、ＴＣＩＤ５０を決定した。簡潔には、採取材料の対数希釈（１０−１〜１０−８）を用いて、９６ウェルプレート上のＴＶＬ−ＢＫ細胞に接種した。プレートを３７±２℃および５±１％ＣＯ２で、９６±６時間インキュベーションした。インキュベーション後、プレートを１００倍の拡大で読み取り、そしてＣＰＥに関して調べる。Ｆｉｎｎｅｙ（１９７８）によって修飾されるようなＳｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ法によって力価を決定した。あらかじめ滅菌しておいた最終容器に無菌的に満たした。最終容器を無菌内部密封栓で部分的にキャップした。最終産物バイアルをフリーズドライ装置に移し、そして乾燥させた。乾燥周期時間は、２４〜７２時間の間であり、最大産物温度は２２℃であった。乾燥最終産物の水分含量５％を超えず、そして最終容器中の用量あたりの抗原性物質の最小量は、好ましくは、用量あたりおよそ８ｘ１０３ＴＣＩＤ５０であった。
【００９４】
実施例２−ＢＤＶＤ−１Ｂ一価ワクチン子ウシ曝露研究
本実施例は、ワクチン接種動物における感染を予防する際のＢＶＤＶ−１ｂ一価ワクチンの有効性を立証する。
【００９５】
材料および方法
動物
健康な４〜５ヶ月の雑種雌子ウシを商業的供給源より購入し、ランダムに引き当てた耳標によって同定し、そしてＢＶＤＶに対する感受性に関して血清学的にスクリーニングした。すべての子ウシには、到着時に、１用量のセフチオフル結晶遊離酸（Ｅｘｃｅｄｅ（登録商標）、Ｐｆｉｚｅｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ、米国ニューヨーク州ニューヨーク）を投与した。子ウシは、水、干し草およびペレット状餌配給に自由選択でアクセス可能であった。
【００９６】
ワクチン
ＢＶＤＶ−１ｂワクチン、修飾生ウイルスを上述のように調製した。簡潔には、ＢＶＤＶ−１ｂマスターシードウイルスをＴＶＬ−ＢＫ細胞株（第２０継代）中で増殖させ、第１０継代で採取し、産生概略にしたがって安定化させ、ボトルを満たし、そしてフリーズドライした。ＢＶＤＶ濃度は、Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ法（例えばＦｉｎｎｅｙ、１９７８を参照されたい）によって決定されるように、８ｘ１０３  ＴＣＩＤ５０であった。希釈剤として無菌水を用いて、ワクチンを再水和した。
【００９７】
ワクチンおよび子ウシの曝露
１９頭のＢＶＤＶ陰性子ウシを選別路地（ａｌｌｙ）中で混合した。ＣＶＢ−Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ（米国アイオワ州エームズ）によって提供されるマッチセットランダム化スキーム（表１）を用いることによって、各子ウシを２つの群（ワクチン接種または非ワクチン接種対照）の一方に入れた。
【００９８】
【表１】
0006053036.tif 000002
【００９９】
血清学的に陰性の子ウシ１０頭に、１用量のＢＶＤＶ−１ｂワクチンを接種した。各ワクチン接種動物に、第０日、首の左側への皮下注射によって、２ｍＬ用量の産物を投与した。残りの子ウシにはいかなるウイルスワクチンも投与されなかった。ワクチン接種後、曝露２日前まで、２群の子ウシを分けて、しかし同等の囲い中に維持した。
【０１００】
血液試料を到着日に収集し、そしてＢＶＤＶ力価に関して試験した。血液試料をまた、ワクチン接種日および曝露日にも収集した。一定ウイルス減少血清中和法（Ｓｃｈｅｆｅｒｓら、２００８）によって、ＢＶＤＶ−１ｂ抗体力価を決定した。曝露２日前、ワクチン接種および非ワクチン接種対照群の両方を、曝露前臨床観察の目的のため、混合した。ワクチン接種１４日後、囲いで死亡した子ウシの肺から得たＢＶＤＶ−１ｂの病原性単離体に、ワクチン接種および対照子ウシを曝露した。１０％ウマ血清を含有するＤＭＥＭを用いて、ＴＶＬ−ＢＫ細胞上、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでウイルスを継代した。４ｍＬ中、８ｘ１０７  ＴＣＩＤ５０の曝露用量を各子ウシに投与し、各２ｍＬを吸気中、各鼻孔に投与した。
【０１０１】
各ウシに関して、曝露前２日間、曝露日、および曝露後連続１４日間、直腸温度を毎日記録した。
【０１０２】
各子ウシに関して、曝露前２日間、曝露日、および曝露後連続１４日間、白血球（ＷＢＣ）数を決定した。試料をＥＤＴＡ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）試験管中に収集し、そしてＤｒｅｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（米国コネチカット州ウォーターベリー）、Ｈｅｍａｖｅｔ  ９５０ＴＭ示差ＷＢＣ計数装置を用いて、計数を行った。
【０１０３】
ＢＶＤＶ単離の目的のため、各子ウシから、曝露前２日間、曝露日、および曝露後連続１４日間、鼻スワブおよびバフィーコートを収集した。液体Ｓｔｕａｒｔ培地を含むＢＢＬ培養スワブ（Ｂｅｃｔｏｎ，  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、米国メリーランド州スパークス）を用いて鼻スワブを収集した。試料由来の培地を滅菌ろ過し、そして培養中の８０％集密（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）ＴＶＬ−ＢＫ細胞に接種するのに用いた。ＥＤＴＡバキュテーナー試験管からバフィーコートを収集し、そして培養中の８０％集密ＴＶＬ−ＢＫ細胞に接種するのに用いた。１時間インキュベーションした後、バフィーコートを取り除いた。培養を３７±３℃、５±２％  ＣＯ２で４〜５日間インキュベーションした。適切な検出プローブを用いて、本発明者らが開発したＢＶＤＶ−１ｂ特異的プライマーセット（ＢＶＤＶ−１ｂ（第一））を用いたＲＴ−ＰＣＲによって、すべての培養試料由来の上清を、ＢＶＤＶ−１ｂの存在に関してアッセイした：
【０１０４】
ＢＶＤＶ−１ｂ（第一）：
フォワードプライマー：５’−ＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＴＧＴＡＴＴＣＡＴＡＧＣ−３’（配列番号１）；
リバースプライマー：５’−ＴＧＣＣＣＡＣＡＧＣＡＣＡＴＣＴＴＡＡＣＣ−３’（配列番号２）；および
ＢＶＤＶ−１ｂ検出プローブ：５’−ＴＣＡＣＣＴＧＧＡＣＧＡＣＣＣ−３’（配列番号３）
ＢＶＤＶ−１ｂ（第二）：
第二のフォワードプライマー：５’−ＧＴＣＧＴＣＣＡＧＧＴＧＡＡＡＡＣＧＧＴ−３’  （配列番号１９）；
第二のリバースプライマー：５’−ＧＴＣＧＴＣＣＡＧＧＴＧＡＡＡＡＣＧＧＴ−３’  （配列番号２０）；および
第二のＢＶＤＶ−１ｂ検出プローブ：５’−ＧＴＣＧＴＣＣＡＧＧＴＧＡＡＡＡＣＧＧＴ−３’（配列番号２１）。
【０１０５】
ＢＶＤＶ−１ｂ（第一）は許容されうる結果を提供するが、ＢＶＤＶ−１ｂ（第二）は、より優れた結果を示す。
【０１０６】
すべての臨床的観察は独立に行われ、そしてワクチン接種および非ワクチン接種対照群の両方が混合され、唯一の区別特徴は耳標番号であったため、観察者はブラインド化された。研究のどの時点でも、観察者は、臨床評価が結論づけられるまで、個々の試験動物のワクチン接種状態の知識を提供されなかった。
【０１０７】
統計分析
白血球減少症：第−２日〜第０日の白血球数を平均することによって、曝露前白血球平均値を計算した。曝露後各々第１日〜第１４日まで、曝露前平均に比較して毎日の白血球数の比（曝露前の比率としての白血球数）を計算した。この比率データを分析して、ベースラインからの数の２５％減少として定義されるような白血球減少症を、個々の動物が発展させたかどうかを決定した。ＴａｎｎｅｒおよびＭｏｒｇａｎ（１９９３）によって記載されるように、予防可能分率を計算して、本研究において、ワクチン接種が白血球減少症の発展を予防したかどうかを決定した。
【０１０８】
鼻排出：鼻スワブ分析によるウイルス単離データは、ＢＶＤＶが曝露後から単離された対照の比率に比較した際の、ＢＶＤＶが単離されたワクチン接種動物の比率に基づく。ＢＶＤＶ−１ｂ排出の予防可能分率を、ＴａｎｎｅｒおよびＭｏｒｇａｎ（１９９３）によって記載されるように計算した。
【０１０９】
ウイルス血症：ＢＶＤＶ−１ｂが曝露後から単離された対照の比率に比較した際の、ＢＶＤＶ−１ｂが単離されたワクチン接種動物の比率に基づいて、血液試料のバフィーコートからのウイルス単離データを分析した。予防可能分率を、ＴａｎｎｅｒおよびＭｏｒｇａｎ（１９９３）によって記載されるように計算した。
【０１１０】
抗体力価：通常のスケールの力価の群比較を、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定を用いて分析した。
【０１１１】
直腸温度：曝露前平均直腸温度を各動物に関して測定した。群、日および群＊日相互作用に関する項を含む反復測定分散分析（ＡＮＯＶＡ）における共変数として、この平均を用いた。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用のＳＡＳ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ｖ２．０（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  Ｉｎｃ．、米国ノースカロライナ州キャリー）を用いて、すべての統計分析を行った。
【０１１２】
結果
白血球減少症は、１０頭のワクチン接種動物のうち１頭で、そして９頭の対照のうち８頭で検出され、８７％の予防可能分率を生じた。白血球の生データを表２に記録する。
【０１１３】
【表２】
0006053036.tif 000003
0006053036.tif 000004
【０１１４】
各個々の子ウシの曝露前平均の毎日の比率を表３に示す。
【０１１５】
【表３】
0006053036.tif 000005
0006053036.tif 000006
【０１１６】
ＢＶＤＶ−１ｂは、１０頭のワクチン接種動物のうち１頭、そして９頭の対照のうち８頭の鼻分泌物から単離され、９０％の予防可能分率を生じた。これらのデータを表４に記録する。
【０１１７】
【表４】
0006053036.tif 000007
0006053036.tif 000008
【０１１８】
＋は陽性の結果を示し；−は陰性の結果を示す。
【０１１９】
ＢＶＤＶ−１ｂは、２頭のワクチン接種子ウシ、および９頭すべての対照子ウシのバフィーコートから単離され、８０％の予防可能分率を生じた。これらのデータを表５に示す。
【０１２０】
【表５】
0006053036.tif 000009
0006053036.tif 000010
【０１２１】
ワクチン接種は、ＢＶＤＶ−１ｂ  ＳＮ抗体力価の統計的に有意な（Ｐ＜０．０５）増加を誘導した。ワクチンは、ＢＶＤＶ−１ａまたはＢＶＤＶ−２  ＳＮ力価の有意な増加を引き起こさなかった。個々のＳＮ抗体力価を表６に示す。
【０１２２】
【表６】
0006053036.tif 000011
【０１２３】
直腸温度データの分析は、ワクチン接種のいかなる統計的に有意な影響も明らかにしなかった。直腸温度データを表７に示す。
【０１２４】
【表７】
0006053036.tif 000012
0006053036.tif 000013
【０１２５】
本研究経過中、いずれの子ウシにおいてもＢＶＤＶ感染の臨床徴候は観察されなかった。
【０１２６】
健康な４〜５ヶ月齢の雑種雌子ウシに１用量のＢＶＢＶ−１ｂワクチン（修飾生ウイルス）をワクチン接種すると、白血球減少症に対して８７％、ＢＶＤＶ−１ｂの鼻排出に対して９０％、そしてウイルス血症に対して８０％のワクチン有効性が生じた。血清学的分析もまた、ワクチン接種子ウシにおいて、抗原性反応を明らかにした。
【０１２７】
実施例３−ＢＶＤＶ−１Ｂウイルス逆継代（ｂａｃｋｐａｓｓａｇｅ）評価
本実施例は、ＴＶＬ−ＢＶＤＶ−１ｂ  ＭＳＶの安定性を評価し、これが動物に投与された際に病原性に復帰しないことを保証する。
【０１２８】
ウイルスの１本のアンプルを融解し、そしてこれを用いてＴＶＬ−ＢＫ細胞に接種し、ＴＶＬ−ＢＶＤＶ−１ｂ＋１（５ｘ１０７  ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）を産生する。このウイルスを用いて、１０頭の初乳無摂取（ｃｏｌｏｓｔｒｕｍ−ｄｅｐｒｉｖｅｄ）乳牛子ウシの第１組に、子ウシ当たり１ｘ１０６  ＴＣＩＤ５０の率で鼻内接種する。第２組〜第５組の子ウシには、先行する子ウシ組由来のプールした鼻分泌物を鼻内接種する。
【０１２９】
第１組は１０頭の子ウシからなり、第２組〜第５組の子ウシの数は、１０頭の子ウシの第１組由来のウイルスを排出した子ウシの数に応じて、２〜５頭の子ウシの範囲である。各子ウシは、単離された囲い中に留まり、そして研究の主な転帰は、子ウシにおけるＢＶＤＶの臨床徴候の欠如、および少なくとも５回の連続ｉｎ  ｖｉｖｏ継代を通じたＭＳの遺伝的安定性である。
【０１３０】
実験の単位は、一定ウイルス減少血清中和法によって決定されるように、スクリーニング時に≧２のＢＶＤＶ−１ａ、ＢＶＤＶ−１ｂまたはＢＶＤＶ−２力価を有するならば、研究から排除される。
【０１３１】
接種日（第０日）および研究終了時のスクリーニングプロセス中、子ウシから血清学用の血液試料を収集する。鼻分泌物は、第１組の各個々の子ウシから、接種後第２日〜第８日まで収集する。これらの日各々に関して、各個々の子ウシからの鼻分泌物アリコットをウイルス単離に関してアッセイし、そして凍結保存する。ＢＶＤＶ−１ｂを排出する個々の子ウシの数が最大であった日（すなわち最大排出日）を決定し、そしてその日からすべての鼻分泌試料をプールし、そして第２組の子ウシに接種するのに用いる。鼻分泌物を、このあらかじめ決定した最大排出日に、続く群の子ウシから採取する。次いで、これらの試料をウイルス単離に関してアッセイし、そしてウイルスの存在を確認し、そして試料をプールし、そして次の組の子ウシに接種するか、またはさらなるウイルスが単離されなくなるまで、凍結保存する。
【０１３２】
耳標番号によって子ウシを同定し、そして育種のための一般的な畜産および飼育実施を用いて、牛乳代替物で６〜８週間飼育した。
【０１３３】
転帰変数には、ＢＶＤＶの臨床徴候、鼻試料からのウイルス排出、および５回の連続ｉｎ  ｖｉｖｏ継代を通じたウイルスの遺伝的安定性が含まれる。すべての子ウシを、ＢＶＤＶ感染の臨床徴候に関して観察し、そして最後の逆継代群を回収ウイルスの投与後２１日間観察する。すべての臨床徴候を記録し、そして臨床疾患の病因に関して決定を行う。鼻分泌標本を子ウシから採取し；各試料の個々のアリコットをウイルス単離および分析用に維持する。０．２μｍフィルターを通じた滅菌ろ過によって試料をプロセシングする。次いで、ＴＶＬ−ＭＤＢＫ（〜８０％集密）を含有する１２ウェルプレートの各ウェルに、試料を接種する。プレートあたり１つのウェルは未接種のままにし、そして陰性対照として用いる。プレートの１つのウェルにＭＳの希釈を接種し、そして陽性対照として用いる。プレートを３５〜３９℃の温度で、５〜７日間、３〜７％  ＣＯ２でインキュベーションする。試料を二次プレート上でさらに５〜７日間、継代培養する。典型的なＢＶＤＶ−１ｂ細胞変性形態を示すウェル由来の培地をさらにプロセシングして、ＰＣＲアッセイによって感染性病原体の同一性を決定する。
【０１３４】
マスターシードに、子ウシから回収した最高継代ＢＶＤＶを比較することによって、マスターシードの遺伝的安定性を分析する。研究の第１組のすべての１０頭の子ウシからの排出物がなくなるか、または病原性に復帰しないウイルスが単離されたら（ＢＶＤＶの定義臨床徴候の欠如によって立証されるように）、これは逆継代研究の成功およびＭＳの遺伝的安定性の指標である。
【０１３５】
実施例４−六価ＢＲＤＣワクチン（修飾生ウイルス）の調製
本実施例は、上述のようなＢＶＤＶ−１ｂ  ＭＳを取り込んだ多価（六種）ＢＲＤＣワクチンの調製を記載する。
【０１３６】
材料および方法
用いる微生物
ＢＨＶ−１：  ＢＨＶのＣｏｏｐｅｒ（コロラド）単離体は、上気道疾患を有するウシ科の肺から、１９５６年に単離された（Ｙｏｒｋら、１９５７）。このマスターシードウイルスは、ＴＶＬ−ＢＨＶ（Ｃｏｏｐｅｒ）ＰＯ、１９９７年８月５日、ＤＷ−１−２１−Ｗと同定された。
ＢＶＤＶ−１ａ：  ＢＶＤＶ−１ａのＳｉｎｇｅｒ株は、ＡＰＨＩＳから得られた。このマスターシードは、ＴＶＬ−ＢＶＤ（Ｓｉｎｇｅｒ）Ｐ０、１９９８年１２月、ＤＷ４−２９と同定された。
ＢＶＤＶ−１ｂ：  ＢＶＤＶ−１ｂのＴＧＡＣ株は、ＡＰＨＩＳから得られた。このマスターシードは、ＴＶＬ−ＢＶＤＶ  １ｂ  ＭＳ  ０４／２７／２００７  ＤＷ３−０９５と同定された。
ＢＶＤＶ−２：  ＢＶＤＶ−２の１２５株は、ＡＰＨＩＳから得られた。このマスターシードは、ＴＶＬ−ＢＶＤＶ  ２  株１２５  Ｐ０  １１／０１／０１  ＤＷ３−９０と同定された。
ＰＩ３：  ＰＩ３のＲｅｉｓｉｎｇｅｒ  ＳＦ４株は、ＡＰＨＩＳから得られた。このマスターシードは、ＴＶＬ−ＰＩ３（Ｒｅｉｓｉｎｇｅｒ  ＳＦ−４Ｐ０、２００１年４月２日（ＳＭ−８３））と同定された。
ＢＲＳＶ：  ＢＲＳＶのＮ３７５株は、ＡＰＨＩＳから得られた。このマスターシードは、ＴＶＬ−ＢＲＳＶ  Ｐ０、２００１年７月２０日、ＤＷ３−８７と同定された。
【０１３７】
プロトコル
ＴＶＬ−ＢＫ細胞に産生シードウイルスを接種する前に、細胞を顕微鏡的に可視化して、細胞が、先に記載される形態を示していることを確認した。産生ウイルスの各バッチを採取する前に、ＴＶＬ−ＢＫ細胞を観察して、これらがウイルスに関連する典型的な細胞変性効果（ＣＰＥ）を示していることを確認した。
【０１３８】
このワクチンに用いるＢＨＶ−１、ＢＶＤＶ−１ａ、ＢＶＤＶ−１ｂ、ＢＶＤＶ−２、ＰＩ３、およびＢＲＳＶの病原性、強度、および抗原性の一貫性を、凍結乾燥または凍結条件での保存、ならびに継代数または継代培養数に対する制限によって、助長した。産生ウイルス＝ＭＳＶ＋１０（有効性連続継代）であるが、５〜１０の間の任意の継代であることも可能である。産生細胞ストック＝ＭＣＳ＋２０（有効性連続継代）であるが、２０未満の任意の継代であることも可能である。
【０１３９】
作業ウイルス接種物（ＭＳＶ＋１〜ＭＳＶ＋８）および産生ウイルス接種物（典型的には、排他的ではないがＭＳＶ＋９であった）を、典型的にはＴＶＬ−ＢＫ細胞中で増殖させ；但し、ウイルス増殖のためのＴＶＬ−ＢＫ細胞継代数は、ＭＣＳから約２０継代を超えない。
【０１４０】
作業および産生細胞調製物用の増殖培地は、５〜１０％ウマ血清を含有するＤＭＥＭであった。上述のようにＭＳＶを調製し、そして保存した。
【０１４１】
培養容器に、１：３〜１：６（ｃｍ２：ｃｍ２）の範囲の比で、活発に増殖している培養を分割することによって植え付けた。実施例１に記載するように、フラスコまたはローラーボトル中のＴＶＬ−ＢＫ（継代培養を意図される）を、増殖培地を無菌的に除去し、そして実施例１に記載するように１ｘトリプシン−ＥＤＴＡ溶液を添加することによって、培養表面から遊離させた。３５〜３９℃で約５分間、インキュベーションした後、単層を分散させた。分散させた細胞を増殖培地とともに培養容器に添加することによって、トリプシンを不活化した。シードが凍結乾燥されている場合、ウイルスの凍結アリコットを迅速に融解するか、または培地に懸濁した。ＴＶＬ−ＢＫ細胞（＋２０またはそれ未満）にウイルスを接種した。フラスコまたはローラーボトル中で複製している、継代培養が意図されるウイルスを、適切なインキュベーション時間そして／またはＣＰＥが観察された後に収集した。ウイルス液を６℃〜−８０℃で保存するか、または直ちに用いて、他の培養容器に接種した。標準細胞培養技術を用いて、シードおよび産生培地の両方に接種した。継代２０またはそれ未満のＴＶＬ−ＢＫ細胞を接種した。典型的にはＭＳＶ＋９である凍結産生ウイルス接種物を迅速に融解した。細胞あたり０．０１〜１ウイルスの範囲の感染多重度を達成するための、ウイルス接種物の体積は、典型的には、培養面積１６００ｃｍ２あたり、１〜２５ｍＬであった。最小接種力価は以下のとおりであった：ＢＨＶに関しては、ｍＬあたり１０５．５  ＴＣＩＤ５０、ＢＶＤＶ−１ａに関しては、ｍＬあたり１０５．０  ＴＣＩＤ５０、ＢＶＤＶ−１ｂに関しては、ｍＬあたり１０５．０  ＴＣＩＤ５０、ＢＶＤＶ−２に関しては、ｍＬあたり１０５．０  ＴＣＩＤ５０、ＰＩ３ウイルスに関しては、ｍＬあたり１０６．０  ＴＣＩＤ５０、そしてＢＲＳＶに関しては、ｍＬあたり１０４．５  ＴＣＩＤ５０。接種培養物を３７±２℃および５±１％  ＣＯ２でインキュベーションした。ＢＨＶおよびＰＩ３は２〜４日間、ＢＶＤＶ−１ａ、ＢＶＤＶ−１ｂ、およびＢＶＤＶ−２は４〜６日間、そしてＢＲＤＶは５〜８日間、インキュベーションした。
【０１４２】
採取
採取当日、ウイルス特異的ＣＰＥおよび無菌性に関して培養を調べた。最小インキュベーション時間は、ＢＨＶまたはＰＩ３接種後２日間、ＢＶＤＶ−１ａ、ＢＶＤＶ−１ｂまたはＢＶＤＶ−２接種後４日間、そしてＢＲＳＶ接種後５日間であった。最大インキュベーション時間は、ＢＨＶまたはＰＩ３接種後４日間、ＢＶＤＶ−１ａ、ＢＶＤＶ−１ｂ、またはＢＶＤＶ−２接種後６日間、そしてＢＲＳＶ接種後８日間であった。
【０１４３】
ウイルス懸濁物を産生容器から無菌的に採取した。試料を収集して、採取物のＴＣＩＤ５０を決定した。採取材料を６℃〜−８０℃で保存した。採取材料は、最終産物の製造前に、凍結より上では、最長１ヶ月、そして凍結状態では最長６ヶ月、保存可能であった。
【０１４４】
標準的無菌技術を用いて、すべての操作を行った。ネオマイシンおよびナイスタチン（マイコスタチン（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ、米国ニューヨーク州ニューヨーク）を、それぞれ１５μｇおよび１５単位／用量の率で、ワクチンのシリーズまたはサブシリーズ集合中に添加した。
【０１４５】
採取液をＤＭＥＭ中で希釈し、そして０．２μｍでろ過したスクロース溶液を添加することによって安定化させ、１０±１％の最終スクロース濃度を生じた。１０ｋＤａ分子量カットオフフィルターを用いた無菌限外ろ過によって、ウイルス採取液を濃縮した。濃縮の度合いは、典型的には５０倍を超えなかった。
【０１４６】
採取ウイルス液のバッチを分析して、ＴＣＩＤ５０を決定した（例えば、Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ法）。
【０１４７】
実施例５−六価ＢＲＤＣワクチン（修飾生ウイルス）のための有効性研究
実施例５〜１０は、六価ＢＲＤＣ修飾生ワクチンが、含有されるウイルス各々によって引き起こされる疾患を予防する際の有効性を立証する。この第一の実施例において、ワクチンは、ＢＶＤＶ−１ｂによって引き起こされる疾患を予防する際に有効であることが示される。
【０１４８】
材料
六価ワクチン（修飾生ウイルス）を、上記産生法にしたがって調製した。簡潔には、ＢＨＶ−１（Ｃｏｏｐｅｒ株）、ＢＶＤＶ−１ａ（Ｓｉｎｇｅｒ株）、ＢＶＤＶ−１ｂ（ＴＧＡＣ株）、ＢＶＤＶ−２（１２５）、ＰＩ３（Ｒｅｉｓｉｎｇｅｒ  ＳＦ−４）、およびＢＲＳＶ（Ｎ３７５）をＴＶＬ−ＢＫ細胞株（第２０継代）中で増殖させた。個々の分画を第１０継代で採取し、そして六種産物とともにブレンドした。欠失プラセボを有効性シリーズ各々と平行して作製した。例えば、ＢＶＤＶ欠失プラセボは、対応する有効性シリーズと同じＢＲＳＶ、ＢＨＶ、およびＰＩ３採取バッチを含有した。ＢＶＤＶ構成要素の代わりに培地を用いて、有効性シリーズおよびＢＶＤＶ欠失プラセボ間で同等の体積を維持した。六価ワクチンＭＬＶの各構成要素に関して、類似の欠失プラセボを構築した。
【０１４９】
実験法
各研究のため、およそ３〜４ヶ月齢の商業的な若い食肉牛／肥育素牛を得て、ランダム化し、そして耳標によって同定した。これらの子ウシを駆虫し、そしてパスツレラ病、マイコプラズマ病、および黒脚病に対してワクチン接種した。ワクチン接種および対照群にいる子ウシを分けて、隣接させないが、同等の囲い中で曝露２日前（第−２日）まで維持し、この時点で１つの囲い中で混合した。第０日、すべての子ウシを、関心対象のウイルスの病原性単離体に曝露した。例えば、病原性ＢＶＤＶ−１ｂ（Ｐｏｋｅｙ  Ｆｅｅｄｅｒｓ（米国カンザス州スコットシティ）の囲いで死亡した子ウシの肺から得られたもの）を、１０％ウマ血清を含むＤＭＥＭを用いて、ＴＶＬ−ＢＫ細胞上、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで継代した。４ｍＬ中、およそ８ｘ１０７  ＴＣＩＤ５０の曝露用量を各子ウシに投与し、２ｍＬを吸気中、各鼻孔に投与した。子ウシは、水、沿岸性バミューダ乾草、および抗コクシジウム剤を含有するが、抗生物質を含有しないペレット状餌配給に自由選択でアクセス可能であった。
【０１５０】
ランダム化
マッチランダム化スキームを用いて、ＣＶＢ−Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓによって提供されるランダム化表を用い、子ウシを２つの処置群（ワクチン接種またはプラセボワクチン接種対照）に割り当てた（表１を参照されたい）。傾斜台に進入する一連の３頭の子ウシを、２：１の比で２つの処置群にランダム化した。血清学的評価のために、最初に血液を抜き取る際に、バケツからランダムに耳標を抜き取り、子ウシを同定する。曝露前、ウシの２群を分けて、しかし同等の囲いに維持した。曝露２日前（第−２日）、子ウシを１つの囲い中で混ぜた。
【０１５１】
ブラインド化
ブラインド化された職員は、対照またはワクチン接種動物の同一性の知識を持たなかった。すべての野外および実験室職員は、記録者を除いて、研究に対してブラインド化された。
【０１５２】
転帰
選択された一次転帰は、曝露後の白血球減少症であった。白血球減少症は、ベースラインＷＢＣ数からの２５％の減少と定義された。ワクチンの有効性をさらに支持する他の転帰には、鼻排出、ウイルス血症、発熱、抗体産生およびウイルス感染の臨床徴候が含まれた。
【０１５３】
評価因子
個々の白血球（ＷＢＣ）数を、曝露前平均のパーセントに変換し、そして連続間隔スケールで測定した。これらの変換ＷＢＣ数のパーセントを曝露後少なくとも１４日間、毎日決定し、そして評価のための一次基準として用いた。白血球減少症の検出は、曝露に対する耐性（罹患せず）または感受性（罹患）を決定するための一次基準として働いた。罹患および非罹患群を比較して、ワクチン接種がウイルス曝露後の白血球減少症を予防したかどうかを決定した。呼吸器疾患の臨床徴候および鼻／バフィーコート試料からのウイルスの検出は、曝露に対する感受性を決定するための二次基準として働いた。白血球減少症の期間および排出期間（個々の子ウシからウイルスが検出される日数）を分析して、ワクチン接種がこれらのパラメータに対して緩和効果を有するかどうかを決定した。曝露前平均温度（ベースライン）を共変数として用いて、すべての個々の毎日直腸温度を分析した。研究開始時に、≧２のウイルス力価を有する場合、実験単位を研究から排除した。
【０１５４】
試料採取フレームおよび方法
有効性シリーズまたは対応する欠失プラセボのワクチン接種直前（第−２８日〜第−２１日）、子ウシから血液試料を収集した。曝露直前に（第０日）、そして再び、曝露１４日後（第１４日）、血液試料をまた収集した。示差ＷＢＣ数およびウイルス単離用の血液試料を、第−２日〜少なくとも第１４日まで収集した。試料をＥＤＴＡ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、米国ニュージャージー州フランクリンレークス）試験管中に収集し、そしてＤｒｅｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｈｅｍａｖｅｔ  ９５０示差ＷＢＣ計数装置を用いて、計数を行った。ウイルス単離用の鼻スワブを第−２日〜少なくとも第１４日に採取した。
【０１５５】
観察およびデータ収集
第２日〜第１４日、鼻試料および血液試料を収集し、そして子ウシをウイルス感染の臨床徴候に関して観察した。第−２日〜第１４日、各子ウシの直腸温度を測定した。
【０１５６】
ＷＢＣ数のデータを分析して、曝露後数の減少を決定した。各動物に関して、第−２日〜第０日のＷＢＣ数を平均することによって、曝露前平均を計算した。観察者の裁量で、各々、曝露１日後〜１４日後、またはそれより長期間、曝露前平均に対する毎日ＷＢＣ数の比を計算した（曝露前の比率としてのＷＢＣ数）。比率が２５％減少していたならば、個体は白血球減少症と分類された。両方の鼻孔を、液体Ｓｔｕａｒｔ培地を含むＢＢＬ培養スワブ（登録商標）で拭き取ることによって、曝露日および曝露後連続１４日間、各子ウシから鼻スワブを採取した。収集日、０．２μｍフィルターを通じて滅菌ろ過することによって、試料をプロセシングした。次いで、ＴＶＬ−ＭＤＢＫ（〜８０％集密）を含有する１２ウェルプレートの各ウェルに、試料を接種した。プレートあたり１つのウェルは未接種のままにし、そして陰性対照として用いた。プレートの１つのウェルに曝露ウイルスの希釈を接種し、そして陽性対照として用いた。プレートを３５〜３９℃の温度で、２〜４日間、３〜７％  ＣＯ２でインキュベーションした。各ウェルから培地を採取し、そして−１８℃〜−２２℃で保存した。すべてのウェル由来の培地をＲＴ−ＰＣＲ（ＲｉｄｐａｔｈおよびＢｏｌｉｎ  １９９８）によって評価して、特定のウイルスが培養中に存在するかどうかを決定した。ウイルスが培養陽性であった個体を「排出」と分類した。
【０１５７】
血液試料由来のバフィーコートを用いて、ＴＶＬ−ＭＤＢＫ（〜８０％集密）を含有する１２ウェルプレートの各ウェルに接種した。プレートあたり１つのウェルは未接種のままにし、そして陰性対照として用いた。プレートの１つのウェルに曝露ウイルスの希釈を接種し、そして陽性対照として用いた。プレートを３５〜３９℃の温度で、２〜４日間、３〜７％  ＣＯ２でインキュベーションした。各ウェルから培地を採取し、そして−１８℃〜−２２℃で保存した。すべてのウェル由来の培地をＲＴ−ＰＣＲ（ＲｉｄｐａｔｈおよびＢｏｌｉｎ  １９９８）によって評価して、ウイルスが培養中に存在するかどうかを決定した。特定のウイルスに関して培養陽性であった個体を「病原性」と分類した。
【０１５８】
各動物に関する毎日直腸温度を、研究第−２日〜第１４日の間（曝露前２日間、曝露日、および曝露後１４日間）記録した。各動物に関して、第−２日〜第０日の温度値を平均することによって、曝露前平均を計算した。ベースラインを共変数として用いて、毎日温度を分析した。
【０１５９】
ＢＶＤＶ−１ｂ抗体力価：ＢＶＤＶ−１ｂ有効性の場合、最初のワクチン接種日（第−２１日）、曝露日（第０日）、および研究終了時、各動物に関して、一定ウイルス減少血清法によって、ＢＶＤＶ−１ｂに対する血清中和抗体力価を決定した。特別概略Ａ−１７、ウシ・ウイルス性下痢症ウイルス１型中和抗体の力価決定の修飾法を用いて抗体力価を決定した。修飾アッセイは、ＢＶＤＶ−１ａ単離体の代わりに、指標ウイルスとして、細胞変性ＢＶＤＶ−１ｂ単離体を用いた。≧８の抗体力価を発展させる動物をＢＶＤＶ−１ｂに血清変換したと見なした。
【０１６０】
ワクチン接種群および対照群の間の、白血球減少症の期間、排出、およびウイルス血症の相違を概算した（緩和分率）。曝露前平均温度（ベースライン）を共変数として用いて直腸温度を分析した。選択された信頼区間は９５％であった。
【０１６１】
白血球減少症：白血球減少症データの分析は、ウイルス曝露後、白血球減少症であるプラセボワクチン接種対照の比率に比較した際、白血球減少症であるワクチンの比率に基づいた。ＴａｎｎｅｒおよびＭｏｒｇａｎ（１９９３）によって記載されるような予防可能分率を決定することによってこれを評価した。
【０１６２】
排出およびウイルス血症：排出およびウイルス血症データの分析は、ウイルス曝露後に排出するかまたはウイルス血症であるプラセボワクチン接種対照の比率に比較した際の、ウイルスを排出するか、またはウイルス血症である、ワクチン接種動物の比率に基づく。ＴａｎｎｅｒおよびＭｏｒｇａｎ（１９９３）によって記載されるような予防可能分率を決定することによって、これらを評価した。
【０１６３】
２群間の白血球減少症の期間の相違中央値を概算し、そしてＦｅｒｇｅｎ（２００４）にしたがって緩和分率を計算した。２群間の排出期間の相違中央値およびウイルス血症期間の相違中央値を概算し、そしてＦｅｒｇｅｎ（２００４）にしたがって緩和分率を計算した。
【０１６４】
臨床観察：ベースラインを共変数として用い、群、日および群＊日相互作用に関する項を含む反復測定分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて、第１日〜第１４日の直腸温度の分析を行った。群＊日相互作用が有意である（ｐ＜０．５）場合、各時点に関する群の単純な影響を通じて、ワクチン接種群を対照に比較した。これらの単純な影響の比較を群＊日相互作用から得た。
【０１６５】
統計分析：Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定を用いて、抗体力価の群比較を分析した。上述のようなＭＳ−Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用のＳＡＳ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ｖ２．０を用いて、すべての統計分析を行った。
【０１６６】
実施例５Ａ−六価ＢＲＤＣワクチンに関する有効性研究
本研究の結果は、修飾生ウシ・ウイルス性下痢症ウイルス−１ｂ型（ＢＶＤＶ１ｂ）、ウシ鼻気管炎−ウイルス下痢症−パラインフルエンザ３−呼吸器合胞体ウイルスワクチン修飾生ウイルスは抗原性であり、そしてＢＶＤＶ１ｂによって引き起こされる疾患の予防の補助として有効である。１用量のワクチンを２１頭のＢＶＤＶ血清陰性子ウシに投与した。１０頭の血清陰性対照子ウシに産物マッチプラセボワクチン１用量をワクチン接種した。すべての子ウシをＢＶＤＶ１ｂに鼻内曝露した。ワクチン接種は、増加したＢＶＤＶ１ｂ抗体力価増加を生じ、そしてＢＶＤＶ１ｂ誘導性ウイルス血症、鼻排出物、発熱、疾患の臨床徴候および白血球減少症を予防するかまたは減少させた。その結果、用量あたり２ｘ１０３の最小ＢＶＤＶ１ｂ−ＴＣＩＤ５０が、このワクチンのＢＶＤＶ１ｂ分画に関して確立されてきている。このワクチンは、ＢＨＶ−１、ＰＩ３、ＢＲＳＶ、ＢＶＤＶ１型の２つの下位遺伝子型（１ａおよび１ｂ）およびＢＶＤＶ  ２型を含有する。
【０１６７】
ワクチン接種、曝露および試料収集：３１頭のＢＶＤＶ陰性子ウシを選別路地中で混合した。マッチセットランダム化スキームを用いることによって、各子ウシはランダムに集められる際にゲートで分けられ（ｇａｔｅ  ｃｕｔ）、３頭の子ウシが同時に、路地を通じて２つの群（群Ａ−ワクチン接種、または群Ｂ−プラセボワクチン接種対照）の一方に分けられた。２１頭の子ウシを１用量のウシ鼻気管炎−ウイルス下痢症−パラインフルエンザ３−呼吸器合胞体ワクチン修飾生ウイルスでワクチン接種した。各ワクチン接種動物に、第０日、首の左側への皮下注射によって、２ｍＬ用量の産物を投与した。１０頭の子ウシには、産物マッチプラセボワクチン（ＢＶＤＶ欠失）をワクチン接種した。曝露２日前、ワクチン接種および対照群の両方を、曝露前臨床観察の目的のため、そしてベースライン体温およびＷＢＣ読み取り値を得るため、混合した。ワクチン接種および対照子ウシを、ワクチン接種２１日後、囲いで死亡した子ウシの肺から得られたＢＶＤＶ１の病原性単離体に曝露した。ウイルスは、１０％ウマ血清を含むダルベッコの修飾イーグル培地を用いて、ＴＶＬ−ＢＫ細胞上、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで継代された。４ｍＬ中、４ｘ１０７  ＴＣＩＤ５０の曝露用量を各子ウシに投与し、２ｍＬを吸気中、各鼻孔に投与した。
【０１６８】
ワクチン接種前、曝露日（ワクチン接種２１日後）、および曝露後１４日間、抗体力価を決定するため、血液試料を収集した。一定ウイルス減少血清中和法によって、ウシ・ウイルス性下痢症ウイルス抗体力価を決定した。
【０１６９】
液体Ｓｔｕａｒｔ培地中のＢＢＬ培養スワブ（登録商標）で両方の鼻孔を拭き取ることによって、曝露日および曝露後連続１４日間、ウイルス単離用の鼻スワブを子ウシから収集した。
【０１７０】
ＥＤＴＡバキュテーナー試験管内に静脈穿刺することによって、曝露日および曝露後連続１４日間、バフィーコートウイルス単離用の血液試料を子ウシから収集した。
【０１７１】
曝露前連続２日間、曝露日および曝露後連続１４日間、各子ウシに関して直腸温度を毎日記録した。
【０１７２】
各子ウシに関して臨床観察を行い、そして記録した。ワクチン接種および対照群両方が混合され、唯一の区別特徴は耳標番号であったため、観察者はブラインド化された。研究のどの時点でも、観察者は、個々の試験動物のワクチン接種状態の知識を提供されなかった。実験室職員は、ウシのワクチン接種状態の知識を持たなかった。曝露前連続２日間、曝露日および曝露後連続１４日間、示差ＷＢＣ数を決定するための血液試料を収集した。ＥＤＴＡバキュテーナー試験管中で試料を収集し、そしてＤｒｅｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｈｅｍａｖｅｔ  ９５０示差ＷＢＣ計数装置を用いて、カウントを行った。
【０１７３】
ＢＶＤＶ検出：細胞培養増進ＰＣＲ技術を利用して、収集試料中のＢＶＤＶ１ｂを検出した。簡潔には、培養中のＴＶＬ−ＢＫ細胞に対して滅菌ろ過（０．２μｍ）することによって、鼻試料をプロセシングした。細胞を洗い流す前、４５〜７５分間、培養中のＴＶＬ−ＢＫ細胞上に、直接バフィーコートを乗せた。培養を３７℃±２℃および５±１％ＣＯ２で４日間インキュベーションした。慣用的なＲＴ  ｑＰＣＲ方法論および以下のプローブ／プライマーセットを用いて、ＢＶＤＶ１ｂの存在／非存在に関して、すべての培養試料由来の上清を個々にアッセイした：
【０１７４】
フォワードプライマー：ＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＴＧＴＡＴＴＣＡＴＡＧＣ（配列番号１）
リバースプライマー：ＴＧＣＣＣＡＣＡＧＣＡＣＡＴＣＴＴＡＡＣＣ（配列番号２）
ＴａｑＭａｎ  ＭＧＢプローブ：ＴＣＡＣＣＴＧＧＡＣＧＡＣＣＣ（配列番号３）
【０１７５】
ＰＣＲによる１ａ、１ｂおよび２型ウシ・ウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）の区別，  Ｊｕｌｉａ  Ｆ．  ＲｉｄｐａｔｈおよびＳｔｅｖｅｎ  Ｒ．  Ｂｏｌｉｎ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  １３０  （２００５）  １４５−１４８に基づいてこの方法を開発した。この方法はまた、Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ａｎｄ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｔｅｓｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ−Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｖｉｒａｌ  Ｄｉａｒｒｈｅａ  Ｖｉｒｕｓ，  第ＢＰＰＲ０２０１０．０１号にも基づく。ＢＶＤＶの遺伝子型および下位遺伝子型を区別するこれらの方法はどちらもゲノムの５’非翻訳領域（ＵＴＲ）に存在する遺伝子相違を利用する。このプローブ／プライマーセットは、非常に特異的なプローブによってＢＶＤＶ１ｂ配列がユニークに検出可能な、５’ＵＴＲのセクションを増幅するように特異的に設計された。プローブ／プライマーセットの特異性を社内で確認し、そしてこれらは、ＢＨＶ、ＰＩ３、ＢＲＳＶ、ＢＶＤＶ１ａ、またはＢＶＤＶ２とは交差反応しなかった。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００上でのＴａｑｍａｎ（登録商標）に基づくアッセイを用いて、ＲＴ  ｑＰＣＲアッセイを行った。
【０１７６】
統計分析：抗体力価：Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定を用いて、一般的にスケーリングされる力価の群比較を分析した。
【０１７７】
ウイルス血症：ＢＶＤＶ１ｂが曝露後に単離された対照の比率に比較した際の、ＢＶＤＶ１ｂが単離されたワクチン接種動物の比率に基づいて、血液試料のバフィーコート由来のウイルス単離データを分析した。ＢＶＤＶ１ｂウイルス血症に関する予防可能分率を、ＴａｎｎｅｒおよびＭｏｒｇａｎ（１９９３）によって記載されるように計算した。
【０１７８】
鼻排出：鼻スワブ分析によるウイルス単離データは、ＢＶＤＶ１ｂが曝露後から単離された対照の比率に比較した際の、ＢＶＤＶ１ｂが単離されたワクチン接種動物の比率に基づく。ＢＶＤＶ−１ｂ排出の予防可能分率を、ＴａｎｎｅｒおよびＭｏｒｇａｎ（１９９３）によって記載されるように計算した。
【０１７９】
直腸温度：曝露前平均直腸温度を各動物に関して測定した。群、日および群＊日相互作用に関する項を含む反復測定分散分析（ＡＮＯＶＡ）における共変数として、この平均を用いた。
【０１８０】
疾患の臨床徴候：各観察者によって独立に、疾患の臨床徴候を毎日記録した。曝露後観察日の少なくとも１日に関して徴候を示した子ウシはいずれも「罹患した」と見なした。臨床徴候に関する予防可能分率を、ＴａｎｎｅｒおよびＭｏｒｇａｎ（１９９３）によって記載されるように計算した。
【０１８１】
白血球減少症：各動物に関して、第−２日〜第０日の間の白血球数を平均することによって、曝露前白血球平均値を計算した。曝露後各々第１日〜第１４日まで、曝露前平均に比較して毎日の白血球数の比（曝露前の比率としての白血球数）を計算した。この比率データを分析して、ベースラインから数の４０％減少として定義されるような白血球減少症を、個々の動物が発展させたかどうかを決定した。ＴａｎｎｅｒおよびＭｏｒｇａｎ（１９９３）によって記載されるように、予防可能分率を計算して、本研究において、ワクチン接種が白血球減少症の発展を予防したかどうかを決定した。
【０１８２】
Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用のＳＰＳＳバージョン１６を用いて、すべての統計分析を行った。
【０１８３】
結果
血清中和抗体力価：本研究のすべての子ウシは、＜１：２のワクチン接種前ＢＶＤＶ（ＢＶＤＶ１ａ、ＢＶＤＶ１ｂおよびＢＶＤＶ２）血清中和抗体力価を有した。曝露日（第２１日）までに、ワクチン接種群は、１：８３の平均ＢＶＤＶ１ｂ力価を有し、これは対照群＜１：２のものより有意に（ｐ≦．０５）大きかった。ＢＶＤＶ１ｂ抗体力価は、対照およびワクチン接種子ウシの両方で曝露１４日後に増加し、子ウシがＢＶＤＶ１ｂに曝露されたことを示した。
【０１８４】
バフィーコート由来のＢＶＤＶ１ｂ単離：本研究における１０頭の対照子ウシはすべて、本研究の曝露後の期間の間にウイルス血症となった。しかし、対照子ウシの７頭は、ＢＶＤＶ曝露後ウイルス血症が典型的に観察される臨界時間フレーム中にウイルス血症であった。３頭の対照子ウシ（１、１４、３０）は、曝露日にウイルス血症であった。これらの同じ３頭の子ウシとともに子ウシ２６は曝露翌日にウイルス血症であった。この観察は、血清学的、鼻スワブ単離および直腸温度データとともに、これらの子ウシが研究のワクチン接種期の後期に、天然に感染し、ウイルス血症となり、そして本研究の曝露期初期に排出し始めたことを示唆する。これらの４頭の子ウシの１頭（子ウシ３０）は、典型的な曝露後ウイルス血症／排出期間中に、ウイルス血症となり、そしてウイルスを排出した。２１頭のワクチン接種動物はいずれも曝露後の期間にウイルス血症ではなかった。天然に保護された対照３／１０および保護されたワクチン接種動物２１／２１の比を用いて、予防分率を計算した。これによって、１．０の予防可能分率が生じる。
【０１８５】
鼻スワブからのＢＶＤＶ１ｂ単離：本研究において、すべての１０頭の対照子ウシは、本研究の曝露後の期間中、ＢＶＤＶ１ｂを排出した。しかし、対照子ウシ７頭は、ＢＶＤＶ曝露後排出が典型的に観察される臨界時間フレーム中に排出した。２頭の対照子ウシ（２６および３０）は、曝露日に排出した。３頭の対照子ウシ（１、１４および３０）は、曝露翌日に排出した。この観察は、血清学的、バフィーコート単離および直腸温度データとともに、これらの子ウシが研究のワクチン接種期の後期に、天然に感染し、ウイルス血症となり、そして本研究の曝露期初期に排出し始めたことを示唆する。これらの４頭の子ウシの１頭（子ウシ３０）は、典型的な曝露後ウイルス血症／排出期間中に、ウイルス血症となり、そしてウイルスを排出した。２１頭のワクチン接種動物のうち１頭のみが曝露後の期間にＢＶＤＶ１ｂを排出した。天然に保護された対照３／１０および保護されたワクチン接種動物２０／２１の比を用いて、予防分率を計算した。これによって、０．９３の予防可能分率が生じる。
【０１８６】
直腸温度：データ分析によって、有意な群＊日相互作用が示された（ｐ＝．０３４）。日による分析によって、対照群の温度が、曝露後第１日、第４日、第７日および第８日に、ワクチン接種群よりも有意に（ｐ＜０．０５）高いことが示された。第１２日、対照群の直腸温度は低下し、そしてワクチン接種群のものより有意に（ｐ＜０．０５）低かった。
【０１８７】
ＢＶＤＶ１ｂの臨床徴候：対照群中の１０頭の子ウシのうち８頭（８／１０罹患）は、ＢＶＤＶ１ｂ感染に寄与しうる臨床徴候を示した。臨床徴候には、下痢、大量の透明な鼻分泌物、多呼吸および目の分泌物が含まれた。ワクチン接種群の子ウシはいずれも（０／２１罹患）、研究の曝露後の期間中、これらの臨床徴候のいずれも示さなかった。天然に保護された対照２／１０および保護されたワクチン接種動物２１／２１の比を用いて、予防分率を計算した。これによって、１．０の予防可能分率が生じる。子ウシのいずれにおいても、不都合なワクチン接種後反応は観察されなかった。
【０１８８】
白血球減少症：２１頭のワクチン接種動物のうち４頭で、そして１０頭の対照のうち５頭で白血球減少症が検出され、６２％の予防可能分率が生じた。
【０１８９】
結論
先行の記述は、ＢＶＤＶ１ｂによって引き起こされる疾患の予防における補助として、ウシ鼻気管炎−ウイルス下痢症−パラインフルエンザ３−呼吸器合胞体ウイルスワクチン修飾生ウイルスのＢＶＤＶ１ｂ分画の抗原性および有効性を立証する。この併合産物のＢＶＤＶ１ｂ分画の抗原性および有効性は、以下のように証明される：
１）対照群に比較した際のワクチン接種群におけるＢＶＤＶ１ｂに対する抗体力価の有意な増加。ワクチン接種群におけるすべての子ウシは、１回の２ｍｌ用量の投与後、ＢＶＤＶ１ｂ力価≧１：８を発展させ、９ＣＦＲ  １１３．３１１（ｃ）（５）に定義される必要条件を満たす。
２）ウイルス単離研究によって、１用量の投与が、曝露後ＢＶＤＶ１ｂ誘導性ウイルス血症および鼻排出の有意な減少を生じることが明らかになった。
３）ワクチン接種子ウシは、対照子ウシに比較した際、有意に低い発熱を示し、そして疾患の臨床徴候をまったく示さなかった。
４）ワクチン接種はまた、ＢＶＤＶ１ｂ誘導性白血球減少症を発展させる可能性も減少させた。
【０１９０】
本研究は、対照群の子ウシのうち少なくとも３頭が曝露のわずかに前にＢＶＤＶ１ｂに感染したという事実によって、わずかに影響を受けた。感染したものも含めてすべての対照子ウシは、曝露時点でなお、血清陰性であったという事実のため、研究のワクチン接種期後期に、天然曝露が起きたと結論づけられた。おそらく、曝露２日前まで、対照群と別個に維持されていたため、ワクチン接種群においては天然曝露の臨床的証拠はなかった。典型的な若い食肉牛／肥育素牛環境において、曝露研究を行う際には、天然曝露は内在する可能性である。ＴａｎｎｅｒおよびＭｏｒｇａｎによれば、予防可能分率によって決定されるようなワクチン有効性の概算は、自然免疫のいくつかのレベルに関する、観察された保護およびワクチン有効性の間の関係を考慮する。
【０１９１】
本研究の知見は、統計的に有意であり、そしてかつ臨床的に適切であり、したがって、ワクチン中に含有されるＢＶＤＶ１ｂ分画の有効性が立証された。
【０１９２】
実施例６−ＢＲＳＶ有効性プロトコル
本実施例は、六価ＭＬＶワクチンのウシ呼吸器合胞体ウイルス（ＢＲＳＶ）分画は、ＢＲＳＶによって引き起こされる疾患の予防を補助することを立証する。
【０１９３】
材料および方法
ＢＲＳＶ欠失プラセボを調製し、そしてＢＶＤＶ−１ｂに関して実施例５に記載したものと類似の方式の有効性シリーズと一緒に用いる。このＢＲＳＶ欠失プラセボは、有効性シリーズと同じＢＶＤＶ−１ａ、ＢＶＤＶ−１ｂ、ＢＶＤＶ−２、ＢＨＶおよびＰＩ３採取バッチを含有し、ＢＲＳＶ構成要素の代わりに培地を用いて、有効性シリーズおよびＢＲＳＶ欠失プラセボ間で同等の体積を維持する。無菌希釈剤を用いて、本明細書に記載するように、六価ＭＬＶワクチンおよびＢＲＳＶ欠失プラセボの両方を再水和する。
【０１９４】
実験法
ほぼ同じ起源、種類、体重および年齢を有する比較的均質な集団由来の、およそ３〜４ヶ月齢の商業的な若い食肉牛／肥育素牛を用いる。子ウシを駆虫し、そしてパスツレラ病、マイコプラズマ病、および黒脚病に対してワクチン接種する。このプロトコルにおいて、同数のワクチン接種子ウシおよび対照子ウシを用いる；子ウシ２群を分けて、隣接させないが、同等の囲い中で維持し、そして曝露２日前（第−２日）に１つの囲い中で混合する。子ウシは、水、沿岸性バミューダ乾草、および抗コクシジウム剤を含有するが、抗生物質を含有しないペレット状餌配給に自由選択でアクセス可能である。
【０１９５】
ランダム化
マッチランダム化スキームを用いて、ＣＶＢ−Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓランダム化表を用い、子ウシを２つの処置群（ワクチン接種またはプラセボワクチン接種対照）に割り当て、ここで傾斜台に進入する一連の３頭の子ウシを、２：１の比で２つの処置群にランダム化する。血清学的評価のために、最初に血液を抜き取る際に、バケツからランダムに耳標を抜き取り、子ウシを同定する。
【０１９６】
ブラインド化
職員はすべて研究に対してブラインド化され（記録者を例外とする）、そして対照またはワクチン接種動物の同一性の知識を持たない。
【０１９７】
転帰
一次転帰は、曝露後のＢＲＳＶウイルスの鼻排出の予防であり、これはプロトコル中のすべての子ウシの鼻孔から毎日収集される鼻試料におけるＢＲＳＶの存在または非存在によって決定される。他の二次転帰には、１またはそれより多いＢＲＳＶ感染の減少した臨床徴候、発熱の減少、および／またはＢＲＳＶを排出する子ウシにおける排出期間の減少が含まれうる。ワクチン接種および対照群によるＢＲＳＶの排出は、曝露後１４日間、毎日測定され、ＢＲＳＶの検出は、曝露に対する耐性（罹患せず）または感受性（罹患）を決定するための一次基準として働く。罹患および非罹患群を比較して、ワクチン接種がＢＲＳＶ曝露後のＢＲＳＶ排出を予防したかどうかを決定する。呼吸器疾患の臨床徴候は、曝露に対する感受性を決定するための二次基準として働く。排出期間（個々の子ウシからＢＲＳＶが検出される日数）を分析して、ワクチン接種がこのパラメータに対して緩和効果を有するかどうかを決定する。曝露前平均温度（ベースライン）共変数に対して、すべての個々の毎日直腸温度を分析する。研究開始時に、≧２のＢＲＳＶ  ＳＮ力価を有する場合、実験単位を研究から排除する。
【０１９８】
試料採取フレームおよび方法
有効性シリーズまたはＢＲＳＶ欠失プラセボを用いたワクチン接種直前（第−２８日〜第−２１日）、子ウシから血液試料を収集し、そして再び曝露直前に（第０日）、そして再び、曝露１４日後（第１４日）、採取する。
【０１９９】
観察およびデータ収集
両方の鼻孔を、液体Ｓｔｕａｒｔ培地を含むＢＢＬ培養スワブ（登録商標）で拭き取ることによって、曝露日および曝露後連続１４日間、各子ウシから鼻スワブを採取する。ＢＲＳＶを検出するために特異的に設定されたプローブ／プライマーセットを用いたリアルタイムＰＣＲによって、試料由来の培地をＢＲＳＶの存在に関してアッセイする。
【０２００】
フォワードプライマー：５’ＡＡＴＧＣＴＧＣＡＧＧＡＣＴＡＧＧＴＡＴＡＡＴ−３’（配列番号４）；
リバースプライマー：５’−ＡＣＡＣＴＧＴＡＡＴＴＧＡＴＧＡＣＣＣＣＡＴＴＣＴ−３’（配列番号５）；および
ＢＲＳＶ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭＧＢプローブ：５’−ＡＡＧＡＣＴＴＧＴＡＴＧＡＴＧＣＴＧＣＣＡＡ−３’（配列番号６）
【０２０１】
期間データを分析して、ワクチン接種が、鼻試料中でＢＲＳＶが検出される期間に対して緩和効果を有することを立証する。
【０２０２】
臨床観察：各動物に関する毎日直腸温度を、研究第−２日〜第１４日の間（曝露前２日間、曝露日、および曝露後１４日間）記録し、各動物に関して、第−２日〜第０日の温度値を平均することによって、曝露前平均を計算する。次いで、ベースラインを共変数として用いて、毎日温度を分析する。
【０２０３】
ワクチン接種日、研究の第０日および第１４日、各動物に関して、一定ウイルス減少血清法によって、血清中和抗体力価を決定する（Ｓｃｈｅｆｅｒｓら、２００８）。
【０２０４】
肉牛子ウシにおけるＢＲＳＶの臨床徴候は、Ｂａｋｅｒ（１９８６）によって先に記載されてきている。臨床徴候には、限定されるわけではないが、鼻および涙腺分泌物、呼吸数増加、直腸温度上昇、軽い抑鬱、餌摂取減少、過流涎および呼吸困難が含まれる。ＢＲＳＶ感染臨床徴候は、伝統的な曝露モデルよりもより明らかではなく、それは曝露に用いられるウイルスが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖によって弱毒化されているためであり、そしてこれらのモデルを評価する際の唯一の重要なパラメータは、ウイルス排出である（Ｗｒｅｎ、２００１）。それゆえ、臨床徴候を曝露前２日間、曝露日、および曝露後１４日間記録する。ＢＲＳＶの臨床徴候の観察をデータ分析中に考慮するが、一次転帰とは見なさず、これは、これらの徴候が、商業的なウシにおいて一般的に見られる多くの呼吸器疾患を示しうるためである。
【０２０５】
罹患または非罹患のいずれかと分類されるワクチン接種群およびプラセボワクチン接種対照群の比率（予防分率）を概算し、ワクチン接種および対照群間の排出期間の相違もまた概算する（緩和分率）。
【０２０６】
六価ＭＬＶワクチンのＢＲＳＶウイルス分画の有効性は、ＴａｎｎｅｒおよびＭｏｒｇａｎ（１９９３）によって記載されるような予防可能分率を決定することによって、容易に評価可能である。この分析は、耐性であるプラセボワクチン接種対照の比率に比較した際の、ＢＲＳＶ曝露に対して耐性であるワクチン接種動物の比率に基づく。
【０２０７】
統計分析：Ｆｅｒｇｅｎの方法（２００４）にしたがって、２群間の排出期間の相違中央値を概算可能であり、そして緩和分率を計算可能である。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定を用いて、抗体力価の群比較を分析可能である。上述のようなＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用のＳＡＳ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ２．０を用いて、すべての統計分析を行った。
【０２０８】
実施例６Ａ−ＢＲＳＶ有効性研究
本研究の結果は、ウシ鼻気管炎−ウイルス下痢症−パラインフルエンザ３−呼吸器合胞体ウイルスワクチン修飾生ウイルスの修飾生ウシ呼吸器合胞体ウイルス（ＢＲＳＶ）分画が抗原性であり、そして若い食肉牛／肥育素牛におけるウシ呼吸器合胞体ウイルスの排出の予防の補助として有効であることを立証する。１用量のワクチンを２２頭のＢＲＳＶ血清陰性子ウシに投与した。１１頭の血清陰性対照子ウシに産物マッチプラセボワクチン１用量をワクチン接種した。すべての子ウシをＢＲＳＶに鼻内曝露した。ワクチン接種は、増加したＢＲＳＶ抗体力価増加を生じ、そして曝露後のＢＲＳＶ排出を予防した。その結果、用量あたり７ｘ１０２の最小ＢＲＳＶ−ＴＣＩＤ５０が、このワクチンのＢＲＳＶ分画に関して確立されてきている
【０２０９】
材料および方法
ワクチン接種および子ウシの曝露：３３頭のＢＲＳＶ陰性子ウシを選別路地中で混合した。ＣＶＢ−Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓによって提供されるマッチセットランダム化スキームを用いることによって、各子ウシはランダムに集められる際にゲートで分けられ、３頭の子ウシが同時に、路地を通じて２つの群（群Ａ−ワクチン接種、または群Ｂ−プラセボワクチン接種対照）の一方に分けられた。
【０２１０】
２２頭の血清陰性子ウシにウシ鼻気管炎−ウイルス下痢症−パラインフルエンザ３−呼吸器合胞体ワクチン修飾生ウイルスワクチンの１用量をワクチン接種した。各ワクチン接種動物に、第０日、首の左側への皮下注射によって、２ｍＬ用量の産物を投与した。１１頭の子ウシには、産物マッチプラセボワクチン（ＢＲＳＶ欠失）をワクチン接種した。鼻スワブを収集し、子ウシから出血させ、そして血清学的にスクリーニングして、一定ウイルス減少血清中和アッセイによって、ＢＲＳＶに対する感受性を確認した。曝露２日前、ワクチン接種および対照群の両方を、曝露前臨床観察の目的のため、混合した。ワクチン接種および対照子ウシを、ワクチン接種３２日後、４ｍｌ（鼻孔あたり２ｍｌ）のＴＶＬ−ＢＲＳＶ、Ｎ３７５単離体に曝露した。曝露ウイルスを曝露直前に力価決定し（１０６．６／ｍｌのＴＣＩＤ５０）、そして再び曝露直後に力価決定した（１０６．２／ｍｌのＴＣＩＤ５０）。曝露ウイルスは、曝露プロセス中、冷却して維持された。
【０２１１】
ワクチン接種日、曝露日、および曝露後１４日間、血液試料を収集した。一定ウイルス減少血清中和法によって、ウシ呼吸器合胞体ウイルス抗体力価を決定した。
【０２１２】
曝露日および曝露後連続１４日間、鼻スワブを収集した。
【０２１３】
曝露前連続２日間、曝露日および曝露後連続１４日間、各子ウシに関して直腸温度を毎日記録した。
【０２１４】
臨床観察を行った。ワクチン接種群および対照群が混合され、唯一の区別特徴は耳標番号であったため、観察者はブラインド化された。研究のどの時点でも、観察者は、個々の試験動物のワクチン接種状態の知識を提供されなかった。実験室職員は、子ウシのワクチン接種状態の知識を持たなかった。
【０２１５】
ＢＲＳＶ検出：液体Ｓｔｕａｒｔ培地中のＢＢＬ培養スワブ（登録商標）で両方の鼻孔を拭き取ることによって、鼻スワブを子ウシから収集した。細胞培養増進ＰＣＲ技術とともに、ＢＲＳＶ特異的ＣＰＥの視覚的観察を利用して、収集試料中のＢＲＳＶを検出した。簡潔には、培養中のＴＶＬ−ＢＫ細胞に対して滅菌ろ過（０．２μｍ）することによって、試料をプロセシングした。培養を３７℃±２℃および５±１％ＣＯ２で５日間インキュベーションした。ＢＲＳＶ特異的ＣＰＥに関して培養を観察し、そして結果を記録した。Ｍ．  Ｂｏｘｕｓら（ウシ呼吸器合胞体ウイルスの検出および定量化のためのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ，  Ｍ．  Ｂｏｘｕｓ，  Ｃ．  Ｌｅｔｅｌｌｉｅｒ，  Ｐ．  Ｋｅｒｋｈｏｆｓ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  １２５  （２００５）  １２５−１３０）に記載されるプローブ／プライマーセットを用いて、ＢＲＳＶの存在／非存在に関して、すべての培養試料由来の上清（＋および−ＣＰＥ両方）を個々にアッセイした。プローブ／プライマーセットの特異性を社内で確認し、そしてこれはＢＨＶ、ＰＩ３、ＢＶＤＶ１ａ、ＢＶＤＶ１ｂまたはＢＶＤＶ２とは交差反応しなかった。Ｔａｑｍａｎ（登録商標）に基づくアッセイを用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００上、ＲＴ  ｑＰＣＲアッセイを行った。
【０２１６】
ＢＲＳＶ特異的ＣＰＥ陽性であるすべての試料はまた、ＰＣＲ陽性でもあった。ＢＲＳＶ特異的ＣＰＥに関して陰性であり、そしてＰＣＲアッセイによってＢＲＳＶに関して陽性であった１０の試料があった。これは、ＰＣＲに基づくアッセイが、ＢＲＳＶ特異的ＣＰＥの観察に基づくアッセイよりもより感受性であることを示す社内研究と一致する。初代培養後、ＢＲＳＶに関して陰性である試料を継代培養し、そして継代培養した液体由来の上清を、同じ方法にしたがって、ＢＲＳＶの存在／非存在に関してアッセイした。
【０２１７】
統計分析：このワクチンのＢＲＳＶ分画の有効性は、主に、曝露後、ＢＲＳＶを排出する対照の比率に比較した際の、ＢＲＳＶを排出するワクチン接種動物の比率に基づいた。予防可能分率をＴａｎｎｅｒおよびＭｏｒｇａｎ（１９９３）に記載されるように計算した。研究中に個々の子ウシからＢＲＳＶが単離される曝露後の日数を評価した。群を比較して、ＢＲＳＶ単離（排出）頻度が、ＢＲＳＶ曝露後、対照群に比較した際、ワクチン接種群で有意に減少しているかどうかを決定した。
【０２１８】
一般的なスケールの力価データの群比較を、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定によって比較した。曝露前温度平均を共変数として用いて、直腸温度を分析した。反復測定分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて、第１日〜第１４日の曝露後温度の分析を行った。Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用のＳＡＳを用いて、すべての統計分析を行った。
【０２１９】
結果
血清中和抗体力価：本研究のすべての子ウシは、＜１：２のワクチン接種前血清中和抗体力価を有した。ワクチン接種後、対照群のものに比較した際、ワクチン接種群では、血清中和抗体力価は有意に（ｐ≦．０５）大きかった。２２頭のワクチン接種子ウシのうち２１頭がワクチン接種後、ＢＲＳＶ力価の増加を示し、一方、１１頭のプラセボワクチン接種対照すべてが、曝露前のワクチン接種期間全体で陰性のままであった。ワクチン接種群の平均抗体力価は８．５であり、一方、対照群の平均力価は＜２であった。
【０２２０】
ＢＲＳＶ単離：本研究において、本研究の曝露後の期間中、１１頭の対照子ウシすべてがＢＲＳＶを排出した。２２頭のワクチン接種動物のうち、３頭のみがこの期間にＢＲＳＶを排出した。これは、０．８６３６の予防可能分率を生じる。排出頻度においてもまた、有意な相違（ｐ＜０．０５）があった。対照群は、平均６．００日間ＢＲＳＶを排出し、一方、ワクチン接種動物はわずか０．２２７日間排出した。これは５．７７３日の相違である。
【０２２１】
直腸温度：共変数として曝露前平均温度を用いた曝露後直腸温度分析によって、群間に統計的に有意な相違がないことが明らかになった。このデータのさらなる分析は追究しなかった。
【０２２２】
ＢＲＳＶの臨床徴候：曝露前連続２日間、曝露日および曝露後連続１４日間、呼吸器疾患の臨床徴候に関して、各動物を調べた。ＢＲＳＶ感染に間違いなく寄与しうる臨床徴候はまったく観察されなかった。しかし、子ウシが活発にＢＲＳＶを排出する期間と同時に、１１頭の対照のうち７頭に関して、臨床徴候として、過剰な透明な鼻分泌物が記録された。本研究中、ワクチン接種群に関しては、臨床徴候は記録されなかった。子ウシいずれにおいても、不都合なワクチン接種後反応は観察されなかった。
【０２２３】
結論
先行する報告は、若い食肉牛／肥育素牛において、ＢＲＳＶの排出予防における補助として、ウシ鼻気管炎−ウイルス下痢症−パラインフルエンザ３−呼吸器合胞体ウイルスワクチン修飾生ウイルスのＢＲＳＶ分画の有効性を立証する。
【０２２４】
この組み合わせ産物のＢＲＳＶ分画の有効性および抗原性は、以下のように証明される：
１）ウイルス（ＢＲＳＶ）単離研究によって、１用量のワクチンの投与が、対照における１００％感受性（１１／１１）に比較した際、ワクチン接種子ウシにおける８６％（１９／２２）の防御を提供することが明らかになった（予防可能分率＝０．８６３６）。
２）対照群に比較した際の、ワクチン接種群の排出頻度の有意な減少。対照子ウシは、ワクチン接種動物よりも、５，７７３日より長くＢＲＳＶを排出した。
３）対照群に比較した際のワクチン接種群のＢＲＳＶに対する抗体力価の有意な増加。
【０２２５】
実施例７−ＩＢＲ（ＨＢＶ−１）有効性プロトコル
この実施例は、六価ＭＬＶワクチンのＢＨＶ−１ウイルス分画がＩＢＲの予防に役立つことを実証する。
【０２２６】
材料および方法
六価修飾した生ウイルスワクチンを上記のように調製する。つまり、ＢＨＶ−１（Ｃｏｏｐｅｒ株）、ＢＶＤＶ−１ａ（Ｓｉｎｇｅｒ株）、ＢＶＤＶ−１ｂ（ＴＧＣＡ株）、ＢＶＤＶ−２（１２５）、ＰＩ３（Ｒｅｉｓｉｎｇｅｒ  ＳＦ−４）、およびＢＲＳＶ（Ｎ３７５）をＴＶＬ−ＢＫ細胞株（第２０継代）中で増殖させる。個々の分画を第１０継代で採取し、そして六種産物とともにブレンドした。ＢＨＶ−１欠失プラセボを有効性シリーズと平行して作製する。ＢＨＶ−１欠失プラセボは、有効性シリーズと同じＢＶＤＶ−１ａ、ＢＶＤＶ−１ｂ、ＢＶＤＶ−２、ＰＩ３およびＢＲＳＶ採取バッチを含有する。ＢＨＶ−１構成要素の代わりに培地を用いて、有効性シリーズおよびＢＨＶ−１欠失プラセボ間で同等の体積を維持する。滅菌希釈剤を使用してワクチンおよびＢＨＶ−１欠失プラセボの両方を再水和する。
【０２２７】
およそ３〜４ヶ月齢の商業的な若い食肉牛／肥育素牛を上記のようにランダム化し、次いで駆虫し、パスツレラ病、マイコプラズマ病、および黒脚病に対してワクチン接種する。全ての子ウシは、水、沿岸性バミューダ乾草、および抗コクシジウム剤を含有するが、抗生物質を含有しないペレット状餌配給に自由選択でアクセス可能である。子ウシに給餌した後、干し草利用可能性は後で制限できる。約２０個以上のワクチンおよび１０頭以上の対照の子ウシをこの単一レベルの研究に使用する。曝露前に、２群の子ウシを別々だが、同等の囲い中に維持する。次いで子ウシを曝露２日前（第−２日）に１つの囲い中で混合する。
【０２２８】
ランダム化
子ウシのマッチランダム化スキームを用いて、子ウシを２つの処置群（ワクチン接種またはプラセボワクチン接種対照）に割り当てることができる。例えば、傾斜台に進入する一連の３頭の子ウシを、２：１の比で２つの処置群にランダム化する。血清学的評価のために、最初に血液を抜き取る際に、バケツからランダムに取った耳標を、子ウシを識別するために使用する。
【０２２９】
ブラインド化
ブラインド化された職員は、対照またはワクチン接種動物の識別の知識を持たず、すべての野外および実験室職員は、（記録者を除いて）研究の間、ブラインド化される。
【０２３０】
転帰
この研究についての一次転帰は、ＩＢＲと関連する鼻病変の差である。これは鼻病変の存在または非存在として定義する。鼻病変の期間および重症度、鼻孔からのＢＨＶ−１の単離、および体温を含むＩＢＲの他の臨床兆候は全て二次転帰とみなす。鼻病変スコア自体を、順序を示すカテゴリーとして評価する。ＩＢＲの目に見える鼻粘膜特徴の病変の期間および重症度の両方が評価のための基準として役立つ。呼吸器疾患および鼻排出の臨床的兆候もまた、曝露に対する耐性（影響を受けない）または感受性（影響を受ける）を決定するための基準として使用されてもよい。曝露前の平均温度（ベースライン）を共変量として用いて個体の毎日の直腸温度を定期的に分析する。研究の開始時に実験単位が２以上のＢＨＶ−１ＳＮ力価を有する場合、それらを研究から除外する。有効性シリーズまたはＢＨＶ−１欠失プラセボでのワクチン接種直前（第−２８日から第−２１日）に子ウシから血液試料を採取する。同様に血液試料を曝露の直前（第０日）および曝露の１４日後（第１４日）に再び採取する。
【０２３１】
試料採取フレーム、データ収集、および臨床的観察
鼻試料を採取し、第０日〜第１４日に目に見える鼻粘膜の病変およびＩＢＲの臨床徴候について子ウシを観察する。第−２日〜第１４日に各々の子ウシについて直腸温度を測定する。結果因子は、ＩＢＲ、直腸温度、ウイルス単離、抗体力価およびＩＢＲの臨床徴候と一致する目に見える鼻粘膜の病変を含む。ＩＢＲの肉視的鼻病変はＲｏｓｎｅｒ（１９６８）により記載されている。観察される典型的な病変としては、出血を伴う鼻腔の炎症および浮腫ならびに粘液内層に対するフィブロネクチン滲出物の付着が挙げられる。時々、壊死滲出物は下層組織から分離される偽膜性滲出物を生成する鼻腔内にその壊死滲出物は非常に広範に及ぶことがＲｏｓｎｅｒにより報告されている。Ｒｏｓｎｅｒはまた、それらの病理学的所見がＩＢＲの推定診断をするのに高度の信頼性を与えると報告している。鼻病変スコアは、確立された基準、およびワクチン接種が、病変が観測される期間に対する軽減効果を有するかどうかを実証するのに分析される期間データに従って割り当てられ得る。直腸温度評価、ウイルス単離、抗体力価、および統計的方法は以前の実施例に記載されている。ＩＢＲの臨床徴候は、Ｒｏｓｎｅｒ（１９６８）により記載され、限定されないが、呼吸促迫、食欲不振、発熱、咳嗽、鼻汁、体重減少および病態が挙げられる。臨床徴候は、曝露の２日前、曝露の日、および曝露後１４日間に記録される。ＩＢＲの臨床徴候の観察はデータの分析の間に考慮され得るが、それらの徴候はまた、商業的な子ウシに一般に見出される多くの他の呼吸器疾患の指標でもあり得るため、一次転帰とみなされない。
【０２３２】
統計的分析：Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定を用いて抗体力価の群比較を分析した。上記のようにＭＳ−Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用のＳＡＳ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ｖ２．０を使用して全ての統計的分析を実施した。
【０２３３】
実施例７ａ−ＩＢＲ（ＨＢＶ−１）有効性研究
この研究の結果は、ウシ鼻気管炎の修飾された生ウシヘルペスウイルス−１（ＢＨＶ−１）分画−ウイルス性下痢症−パラインフルエンザ３−呼吸器合胞体ウイルスワクチン、修飾された生ウイルスが、ウシ伝染性鼻気管炎（ＩＢＲ）の減少に役立つ抗原性があり、有効であることを実証する。２用量のワクチンを２２頭のＢＨＶ−１血清陰性子ウシに投与した。２用量の生成物に頭敵するプラシボワクチンを用いて１２頭の血清陰性対照子ウシにワクチン接種した。全てのウシにＢＨＶ−１を鼻腔内に曝露した。ワクチン接種により、高いＢＨＶ−１抗体力価ならびにＩＢＲと関連する鼻病変の期間および重症度の減少が生じた。ワクチン接種はまた、典型的に子ウシにおけるＢＨＶ曝露の後に続く排出および発熱反応の期間を減少させた。したがって、５×１０３／用量の最小のＢＨＶ−１  ＴＣＩＤ５０がこのワクチンのＢＨＶ−１分画について確立される。
【０２３４】
材料および方法
子ウシのワクチン接種および曝露：３４頭のＢＨＶ−１陰性子ウシを選別路地中で混合した。ＣＶＢ−Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓによって提供されるマッチセットランダム化スキームを用いることによって、各々の子ウシをランダムに集める際にゲートで分け、３頭の子ウシが同時に、路地を通じて２つの群（群Ａ−ワクチン接種、または群Ｂ−プラセボワクチン接種対照）の一方に分けた。２１頭の子ウシを１用量のウシ鼻気管炎−ウイルス下痢症−パラインフルエンザ３−呼吸器合胞体ワクチン、修飾された生ウイルスでワクチン接種した。各ワクチン接種動物に、第０日、首の左側への皮下注射によって、２ｍｌ用量の産物を投与した。１２頭の子ウシには、産物マッチプラセボワクチン（ＢＨＶ−１欠失）をワクチン接種した。鼻スワブをＢＨＶ−１ウイルス単離のために採取し、血液をＢＨＶ−１に対する感受性の血清学的確認のために全ての子ウシから抜いた。１３日目に、ワクチンおよび対照子ウシに、首の右側への皮下注射によって、２回目の２ｍｌ用量の有効性シリーズおよび産物マッチプラセボを与えた。曝露２日前、ワクチン接種および対照群の両方を、曝露前臨床観察の目的のため、そしてベースライン体温読み取りを得るために混合した。ワクチン接種および対照子ウシを、曝露１５日後、ＵＳＤＡ−ＡＰＨＩＳ−ＣＶＢ、Ｃｏｏｐｅｒｓ株、ロット番号０５−０８、充填日−２００５年１０月２６日により提供される４ｍｌ（２ｍｌ／鼻孔）のＢＨＶ−１曝露ウイルスで２回目のワクチン接種をした。ＣＶＢにより曝露ウイルス力価を１０８．２ＴＣＩＤ５０／２ｍＬであると決定した。曝露ウイルスを曝露直前に滴定し、１０８．０ＴＣＩＤ５０／４ｍＬであると決定し、再び曝露直後に、１０７．４ＴＣＩＤ５０／４ｍＬであると決定した。曝露ウイルスは曝露プロセスの間中、冷却を維持した。ワクチン接種の日、曝露の日、曝露１４日後に血液試料を採取した。一定のウイルス減少血清中和法によってウシヘルペスウイルス抗体力価を決定した。ワクチン接種の日、曝露の日および曝露後連続して１４日間、鼻スワブを採取した。各子ウシについて曝露前２日、曝露の日および曝露後連続して１４日間、直腸温度を毎日記録した。臨床的観察を行い、鼻病変スコアを割り当てた。ＢＨＶにより引き起こされる肉視的病変は、Ｓ．Ｆ．Ｒｏｓｎｅｒ，ＪＡＶＭＡ  Ｖｏｌ１５３，Ｎｏ．１２，１９６８年１２月，ｐ．１６３１−１６３８に記載されている。観測される典型的な病変としては、出血を伴う鼻腔の炎症および浮腫ならびに粘液内層に対するフィブロネクチン滲出物の付着が挙げられる。時々、壊死滲出物が、下層組織から分離される偽膜性滲出物を形成する鼻腔にその壊死滲出物が非常に広範に及ぶことはＲｏｓｎｅｒにより報告されている。Ｒｏｓｎｅｒはまた、それらの病理学的所見が、ＩＢＲの推定診断をする際に高度の信頼性を与えることを報告している。以下に記載した基準に従って鼻病変スコアを割り当てた：
【０２３５】
【表８】
0006053036.tif 000014
【０２３６】
ワクチン接種および対照群の両方が、識別する特徴が耳標の数字のみである状態で混合されることに起因して観測者はブラインド化された。研究の間中、観測者は、個々の試験動物のワクチン接種状態に関する知識を与えられなかった。実験職員は子ウシのワクチン接種状態の知識を有さなかった。
【０２３７】
ＢＨＶ−１検出：液体Ｓｔｕａｒｔ培地中のＢＢＬ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｗａｂ（登録商標）を用いて両方の鼻孔をスワブすることによって子ウシから鼻スワブを採取した。細胞培養を高めるＰＣＲ技術と共にＢＨＶ−１特異的ＣＰＥの視覚的観察を利用して、採取した試料中にＢＨＶ−１を検出した。つまり、培地中のＴＶＬ−ＢＫ細胞上で滅菌濾過（０．２μｍ）により試料を処理した。３７℃±２℃および５±１％ＣＯ２にて４日間、培養物をインキュベートした。培養物をＢＨＶ−１特異的ＣＰＥについて観察し、結果を記録した。全ての培養物試料（＋および−の両方のＣＰＥ）からの上清を、従来のＲＴ  ｑＰＣＲ方法および以下のプローブ／プライマーセット：
フォワードプライマー：ＣＣＡＴＧＴＴＡＧＣＧＣＴＣＴＧＧＡＡＣＣ（配列番号１６）
リバースプライマー：ＣＧＴＣＴＴＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＡＣＴＣＣ（配列番号１７）
ＴａｑＭａｎ  ＭＧＢプローブ：ＡＣＧＧＡＣＧＴＧＣＧＣＧＡＡ（配列番号１８）
を使用してＢＨＶ−１の存在／非存在について個々にアッセイした。社内でプローブ／プライマーセットの特異性を確認し、ＰＩ３、ＢＲＳＶ、ＢＶＤＶ１ａ、ＢＶＤＶ１ｂまたはＢＶＤＶ２と交差反応しなかった。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ７５００においてＴａｑｍａｎ（登録商標）ベースのアッセイを使用してＲＴｑＰＣＲアッセイを実施した。ＢＨＶ−１特異的ＣＰＥ陽性であった全ての試料はまた、ＰＣＲ陽性でもあった。ＰＣＲアッセイにより、ＢＨＶ−１特異的ＣＰＥについて陰性であり、ＢＨＶについて陽性である８個の試料が存在した。これは、ＰＣＲベースのアッセイが、ＢＨＶ−１特異的ＣＰＥの観察に基づいたアッセイよりわずかに高い感受性であることを示す社内での研究と一致する。最初の培養後にＢＨＶ−１について陰性であった試料を継代培養し、ＣＰＥについて観察した。継代培養した流体からの上清を、同じ方法に従ってＢＨＶ−１の存在／非存在についてアッセイした。
【０２３８】
鼻病変：研究の一次転帰はＢＨＶ−１と関連する鼻病変の相違であった。予防された分率を、個々の子ウシにおける病変の存在または非存在に基づいてＴａｎｎｅｒおよびＭｏｒｇａｎ（１９９３）に記載されているように算出した。影響を受けた子ウシにおける病変の重症度の推定される条件付きの軽減した分画は、Ｂ．Ｊ．Ｆｅｒｇｅｎ，Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ  ａｎ  Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｎ  Ｏｕｔｃｏｍｅ  Ｓｅｖｅｒｉｔｙ，ＵＳＤＡ，ＣＶＢに従って決定した。病変の期間（病変を観測した最初から最後の日までの日数）を、各々の影響を受けた子ウシについて決定し、２つの群の間の病変の期間の相違を推定した。
【０２３９】
体温：研究の二次転帰は、ワクチン接種した子ウシと対照群の子ウシとの間の体温の相違であった。１〜１４日間の直腸温度の分析を、群、日および群＊日相互作用についての項を含み、共変量としてベースライン温度を使用する分散の反復測定分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて行った。群＊日相互作用は有意（ｐ＜０．５）であったので、ワクチン接種した群を各時点についての群の簡単な作用により対照と比較した。それらの簡単な作用は群＊日相互作用から得た。
【０２４０】
ウイルス排出：研究の別の二次転帰は、ワクチン接種した子ウシと対照子ウシとの間の曝露後のＢＨＶ排出の相違であった。予防された分率を、個々の子ウシからの鼻試料中のＢＨＶの単離および同定に基づいてＴａｎｎｅｒおよびＭｏｒｇａｎ（１９９３）に記載されるように算出した。排出期間（ＢＨＶ−１が検出された最初から最後の日までの日数）を、各々の影響を受けた子ウシについて決定し、２つの群の間の排出期間の相違を推定した。Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用のＳＰＳＳバージョン１７を使用して全ての統計的分析を実施した。
【０２４１】
結果
血清中和抗体力価：この研究において全ての子ウシはワクチン接種前に１：２未満のＢＨＶ−１血清中和抗体力価を有した。対照群における全ての１２頭の子ウシは依然として曝露の日に血清陰性であった（１：２未満の抗体力価）。２２頭の子ウシのうち２１頭は、曝露の日までに１：２以上の力価を有する血清変換を有した（１：４の群平均力価）。曝露後１４日までに全ての子ウシはＢＨＶ−１に対する血清変換を有した（平均ワクチン接種力価＞２５６、平均対照力価１２８）。
【０２４２】
鼻病変：１２頭全ての対照子ウシ（１００％）および２２頭のうちの２０頭のワクチン接種した子ウシ（９１％）において鼻病変を観測した。観測される鼻病変についての推定される予防分率は９％であった。影響を受けた子ウシの重症度についての推定される軽減した分率は９０％（９５％ＣＩ：７２％、１００％）であった。影響を受けた対照の中での病変は影響を受けたワクチン接種した中より重症であった。鼻病変を観測した平均期間はワクチン接種について６日および対照について１０．５日であった。２つの群の間の期間の推定される変化は４．５日であった。
【０２４３】
直腸温度：共変量として曝露前の平均温度を使用した曝露後の直腸温度分析により、統計的有意性（ｐ＜０．０５）の群および日の効果による群が明らかにされた。その分析により、対照群の温度は、曝露後３〜９日および１１日にワクチン接種した群と比較してベースラインから有意（ｐ＜０．０５）に増加することが明らかにされた。
【０２４４】
ＢＨＶ−１単離：対照およびワクチン接種した子ウシの全てはこの研究の曝露後の段階の間、ＢＨＶ−１を排出した。ワクチン接種した群からのＢＨＶ−１単離の平均期間は６日であり、対照について１０．５日であった。排出期間の推定した変化は４．５日であった。ＢＨＶ特異的ＣＰＥを示した全ての試料をＰＣＲにより確認した。しかしながら、ＣＰＥがまだ観察されなかった８個の試料が存在し、それらは弱い陽性ＰＣＲ信号を有した。それらの８個の試料はこの分析について陽性として含まれなかった。
【０２４５】
ＢＨＶ−１の臨床徴候：曝露前の連続した２日間、曝露の日および曝露後連続した１４日間、呼吸器疾患の臨床徴候について各動物を検査した。ＢＨＶ−１感染に起因し得る臨床徴候を観察し、記録した。いずれの子ウシにおいても有害なワクチン接種後の反応は観測されなかった。
【０２４６】
結論
先行の報告は、若い食肉牛／肥育素牛におけるＢＨＶ−１に起因する疾患の減少に役立つ、ＢＨＶ−１分画のウシ鼻気管炎−ウイルス性下痢症−パラインフルエンザ３−呼吸器合胞体ウイルスワクチン、修飾された生ウイルスの有効性を実証する。この組み合わせた生成物のＢＨＶ−１分画の有効性および抗原性は以下により証明される：
１）対照群と比較してワクチン接種した群における鼻病変の重症度および期間の減少。
２）対照群と比較してワクチン接種した群における発熱の減少。
３）対照群と比較してワクチン接種した群のＢＨＶ−１に対する血清変換。
【０２４７】
実施例８−ＰＩ３有効性プロトコル
この実施例は、六価ＭＬＶワクチンのＰＩ３分画がＰＩ３により引き起こされる疾患の予防に役立つことを実証する。
【０２４８】
材料および方法
六価の修飾された生ウイルスワクチンは上記のように調製する。ＰＩ３欠失プラセボは有効性シリーズと共に生成する。ＰＩ３欠失プラセボは、有効性シリーズとして同じＢＨＶ−１、ＢＶＤＶ−１ｂ、ＢＶＤＶ−２、ＢＶＤＶ−１ａ、およびＢＲＳＶ収集バッチを含む。培地は、有効性シリーズとＰＩ３欠失プラセボとの間で等体積を維持するためにＰＩ３成分と置き換える。滅菌希釈剤を使用して、ワクチンおよびＰＩ３欠失プラセボの両方を再水和する。
【０２４９】
ほぼ３〜４ヶ月齢の商業的な若い食肉牛／肥育素牛を上記のようにランダム化し、次いで駆虫し、パスツレラ病、マイコプラズマ病、および黒脚病に対してワクチン接種する。全ての子ウシは、水、沿岸性バミューダ乾草および抗コクシジウム剤を含有するが、抗生物質を含有しないペレット状餌配給に自由選択でアクセス可能である。子ウシに給餌した後、干し草利用可能性は後で制限できる。
【０２５０】
約２０頭以上のワクチン接種した子ウシおよび１０頭以上の対照子ウシをこの単一レベル研究において使用する。２つの群の子ウシを曝露前に別々だが、同等の囲いに維持する。次いで曝露の２日前（第−２日）に子ウシを１つの囲いに合わせる。
【０２５１】
ランダム化
子ウシのマッチランダム化スキームを用いて、子ウシを２つの処置群（ワクチン接種またはプラセボワクチン接種対照）に割り当てる。例えば、傾斜台に進入する一連の３頭の子ウシを、２：１の比で２つの処置群にランダム化できる。血清学的評価のために、最初に血液を抜き取る際に、バケツからランダムに取った耳標を、子ウシを識別するために使用する。
【０２５２】
ブラインド化された職員は、対照またはワクチン接種動物の識別の知識を持たない。すべての野外および実験室職員は、（記録者を除いて）研究の期間の間、ブラインド化される。
【０２５３】
転帰
この研究についての一次転帰は、曝露後のＰＩ３ウイルスの鼻排出の予防である。これは研究過程の間に全ての子ウシの鼻孔から毎日採取した鼻試料中のＰＩ３の存在または非存在により決定される。他の予測される二次転帰は、ＰＩ３を排出する子ウシにおけるＰＩ３感染の減少した臨床徴候、発熱の減少および排出器官の減少を含む。実験単位は、それらが研究の開始時に２以上のＰＩ３力価を有する場合、この研究から除外する。
【０２５４】
試料採取フレーム、データ収集、および臨床観察
有効性シリーズまたはＰＩ３欠失プラセボのワクチン接種直前（−２８日〜−２１日）に子ウシから血液試料を収集する。曝露直前に（０日）および再び曝露１４日後（１４日）に血液試料をまた収集する。示差ＷＢＣ数用の血液試料を、第−２日〜少なくとも第１４日まで収集する。全ての試料をＥＤＴＡ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）管中に収集し、Ｄｒｅｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｈｅｍａｖｅｔ９５０示差ＷＢＣ計数装置を使用して計数を実施する。第−２日〜少なくとも第１４日に鼻スワブをウイルス単離のために採取する。ワクチン接種および対照群によるＰＩ３の排出を、曝露後１４日間、毎日決定する。ＰＩ３の検出は、曝露に対する耐性（影響を受けていない）または感受性（影響を受けた）を決定するための一次基準として役立つ。ＰＩ３曝露後にワクチン接種がＰＩ３の排出を予防するかどうかを決定するために影響を受けた群と影響を受けていない群を比較する。呼吸器疾患の臨床徴候は、曝露に対する感受性または耐性を決定するための二次基準として役立つ。ワクチン接種がこのパラメータに対して軽減した作用を有するかどうかを決定するために排出期間（ＰＩ３が個々のウシから検出された日数）を分析する。共変量として曝露前の平均温度（ベースライン）を使用して全ての個体の毎日の直腸温度を分析する。
【０２５５】
ＰＩ３検出：液体Ｓｔｕａｒｔ培地と共にＢＢＬ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｗａｂ（登録商標）を用いて両方の鼻孔をスワブすることによって曝露の日および曝露後連続して１４日に各子ウシから鼻スワブを採取する。本明細書に記載されるＰＩ３特異的プローブ／プライマーセットを使用したリアルタイムＰＣＲによりＰＩ３の存在について試料由来の培地をアッセイする。
【０２５６】
排出期間：ＰＩ３が個々の子ウシの鼻スワブ中で検出される日数として排出期間を定義する。ワクチン接種が、ＰＩ３が鼻試料中に検出される期間に対して軽減した作用を有するかどうかを決定するために収集した期間データを分析する。
【０２５７】
直腸温度：第−２日から第１４日（曝露の２日前、曝露の日、および曝露後１４日）の各動物についての毎日の直腸温度を記録する。第−２日〜第０日についての温度値を平均化することにより曝露前の平均を各動物について算出する。共変量としてベースラインを使用して毎日の温度を分析する。
【０２５８】
抗体力価：ワクチン接種の日、０日および研究の１４日に各動物についての一定のウイルス減少血清法によって血清中和抗体力価を決定する。
【０２５９】
臨床徴候：ＰＩ３の臨床徴候はＢｒｙｓｏｎら（１９８９）により記載されている。臨床徴候としては、限定されないが、鈍麻、呼吸促迫、発熱、咳嗽、偶発的および／または不快な肺音が挙げられる。曝露の２日前、曝露の日および曝露の１４日後に臨床徴候を記録する。データの分析の間、ＰＩ３の臨床徴候の観察を考慮するが、これらの徴候は一般に商業的な子ウシに見出される多くの呼吸器疾患を示し得るという事実に起因して一次転帰とみなさない。
【０２６０】
実施例８ａ−ＰＩ３有効性研究
この研究の結果は、ウシ鼻気管炎の修飾された生ウシパラインフルエンザ３ウイルス（ＰＩ３）分画−ウイルス性下痢症−パラインフルエンザ３−呼吸器合胞体ウイルスワクチン、修飾された生ウイルスが、食肉牛／肥育素牛におけるウシパラインフルエンザ３ウイルスの排出の予防に役立つ抗原性があり、有効であることを実証する。２０頭のＰＩ３血清陰性子ウシに２用量のワクチンを投与した。１０頭の血清陰性対照子ウシを、産物マッチプラセボワクチンでワクチン接種した。全ての子ウシにＰＩ３を鼻内に曝露した。ワクチン接種により、曝露後、増加したＰＩ３抗体力価および予防されたＰＩ３排出が生じた。従って、６×１０４／用量の最小ＰＩ３−ＴＣＩＤ５０をこのワクチンのＰＩ３分画について確立した。
【０２６１】
材料および方法
子ウシのワクチン接種および曝露：三十（３０）頭のＰＩ３陰性子ウシを選別路地中で混合した。マッチセットランダム化スキームを用いることによって、各子ウシはランダムに集められる際にゲートで分けられ、３頭の子ウシが同時に、路地を通じて２つの群（Ａ群−ワクチン接種またはＢ群−プラセボワクチン接種対照）の一方に分けられた。２１頭の子ウシを１用量のウシ鼻気管炎−ウイルス下痢症−パラインフルエンザ−３−呼吸器合胞体枠林、修飾した性ウイルスでワクチン接種した。各ワクチン接種動物に、０日、首の左側への皮下注射によって、２ｍｌ用量の産物を投与した。１０頭の子ウシには、産物マッチプラセボワクチン（ＰＩ３欠失）をワクチン接種した。ＰＵ３ウイルス単離のために鼻スワブを収集し、ＰＩ３に対する感受性の血清学的確認のために全ての子ウシから血液を抜き取った。２５日に、ワクチン接種した子ウシおよび対照子ウシに、首の右側への皮下注射によって、２回目の２ｍｌ用量の有効性シリーズおよび産物マッチプラセボを与えた。曝露２日前、ワクチン接種および対照群の両方を、曝露前臨床観察の目的のため、およびベースライン体温読み取り値を得るために混合した。ワクチン接種した子ウシおよび対照子ウシを、２回目のワクチン接種の１５日後に、ＵＳＤＡ−ＡＰＨＩＳ−ＣＶＢ、Ｒｅｉｓｉｎｇｅｒ株、ロット番号０５−０７、充填日２００５年６月２６日により提供される４ｍｌ（２ｍｌ／鼻孔）のＰＩ３曝露ウイルスで曝露した。曝露ウイルス力価をＣＶＢにより１０８．２ＴＣＩＤ５０／２ｍＬであると決定した。曝露直前に曝露ウイルスを滴定し、１０８．３ＴＣＩＤ５０／４ｍＬであると決定し、再び曝露直後に１０８．２ＴＣＩＤ５０／４ｍＬであると決定した。曝露プロセスの間中、曝露ウイルスを冷却して維持した。
【０２６２】
ワクチン接種の日、ワクチン接種の６日後、曝露の日、曝露の６日後および曝露の１４日後に血液試料を採取した。ウシパラインフルエンザ３ウイルス抗体力価を、一定のウイルス減少血清中和法により測定した。ワクチン接種の日、曝露の日および曝露後連続して１０日間、鼻スワブを採取した。曝露前の２日間、曝露の日、および曝露後連続して１４日間、各ウシについて直腸温度を毎日記録した。臨床観察を行った。識別する特徴が耳標番号のみであるワクチン接種および対照群の両方を混合することに起因して観察はブラインド化した。研究全体にわたって、観察者が個々の試験動物のワクチン接種状態の知識を得る時間はなかった。検査室の職員はウシのワクチン接種状態の知識を有さなかった。
【０２６３】
ＰＩ３検出：液体Ｓｔｕａｒｔ培地中のＢＢＬ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｗａｂ（登録商標）を用いて両方の鼻孔をスワブすることによって子ウシから鼻スワブを採取した。細胞培養を高めるＰＣＲ技術と共にＰＩ３特異的ＣＰＥの視覚的観察を利用して、採取した試料中にＰＩ３を検出した。つまり、培地中のＴＶＬ−ＢＫ細胞上で滅菌濾過（０．２μｍ）により試料を処理した。３７℃±２℃および５±１％ＣＯ２にて４日間、培養物をインキュベートした。培養物をＰＩ３特異的ＣＰＥについて観察し、結果を記録した。全ての培養物試料（＋および−の両方のＣＰＥ）からの上清を、従来のＲＴ  ｑＰＣＲ方法および以下のプローブ／プライマーセット：
フォワードプライマー：ＧＧＡＧＡＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＧＡＧＡＴＧ（配列番号１３）
リバースプライマー：ＣＧＴＣＴＧＣＣＣＡＴＧＣＡＴＡＡＧＧ（配列番号１４）
ＴａｑＭａｎ  ＭＧＢプローブ：ＡＣＣＴＣＧＧＴＣＡＴＣＣＡＴＡＧ（配列番号１５）
を使用してＢＨＶ−１の存在／非存在について個々にアッセイした。
【０２６４】
この方法は、Ａ．Ｈｕら（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ３．Ａ．Ｈｕ，Ｍ．Ｃｏｌｅｌｌａ，Ｐ．Ｚｈａｏ，Ｆ．Ｌｉ，Ｊ．Ｓ．Ｔａｍ，Ｒ．Ｒａｐｐａｐｏｒｔ，Ｓ．Ｍ．Ｃｈｅｎｇ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１３０（２００５）１４５−１４８）の研究に基づいて開発された。プローブ／プライマーセットの特異性を社内で確認し、ＢＨＶ、ＢＲＳＶ、ＢＶＤＶ１ａ、ＢＶＤＶ１ｂまたはＢＶＤＶ２と交差反応しなかった。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００でＴａｑｍａｎ（登録商標）ベースのアッセイを使用してＲＴ  ｑＰＣＲアッセイを実施した。
【０２６５】
ＰＩ３特異的陽性であった全ての試料はまた、ＰＣＲ陽性でもあった。ＰＣＲアッセイにより、ＰＩ３特異的ＣＰＥについて陰性であり、ＰＩ３について陽性である１７個の試料が存在した。これは、ＰＣＲベースのアッセイが、ＰＩ３特異的ＣＰＥの観察に基づくアッセイより感受性があることを示す社内での研究と一致する。最初の培養後、ＰＩ３について陰性であった試料をサブクローニングし、ＣＰＥについて観察した。サブクローニングした流体からの上清を、同じ方法に従ったＰＩ３の存在／非存在についてアッセイした。
【０２６６】
統計的分析：このワクチンのＰＩ３分画の効果は、曝露後にＰＩ３を排出した対照の割合と比較してＰＩ３を排出するワクチン接種の割合に主に基づいた。ＴａｎｎｅｒおよびＭｏｒｇａｎ（１９９３）に記載されているように予防可能な分画を算出した。通常のスケールの力価データの群比較をＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定によって比較した。曝露後の１〜１４日間の温度の分析を、分散の反復測定（ＡＮＯＶＡ）を用いて行った。Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用のＳＡＳを使用して全ての統計的分析を実施した。
【０２６７】
結果
血清中和抗体力価：本研究のすべての子ウシは、＜１：２のワクチン接種前ＰＩ３血清中和抗体力価を有した。ワクチン接種した子ウシのどれも、ワクチンに対する既往の免疫反応を示さなかった。曝露日までに、ワクチン接種群は、１：１６の平均ＰＩ３力価を有し、これは対照群＜１：３のものより有意に（ｐ≦．０５）大きかった。この研究過程の間、対照群の１頭の子ウシ、子ウシ７は１：１６の力価を発生した。この子ウシはまた、曝露に対する既往反応を示し、曝露後６日に１：１２８の力価を有した。他の９頭の対照子ウシは曝露の日に血清陰性であり、曝露に対する既往反応を示さなかった。
【０２６８】
ＰＩ３単離：この研究における全ての１０頭の対照子ウシは、この研究の曝露段階の後、ＰＩ３を排出した。２０頭のワクチン接種のうちの４頭のみがこの時間の間にＰＩ３を排出した。これにより、０．８０の予防可能な分画が生じる。ＰＩ３特異的ＣＰＥを示す全ての試料をＰＣＲにより確認した。しかしながら、ＣＰＥがまだ観察されなかった１７個の試料が存在し、それらは弱い陽性ＰＣＲ信号を有した。これらの１７個の試料はこの分析についてＰＩ３陽性として含まれる。
【０２６９】
直腸温度：共変量として曝露前の平均温度を使用した曝露後の直腸温度分析により、群間で統計的に有意な差は現れなかった。このデータのさらなる分析は追跡しなかった。
【０２７０】
ＰＩ３の臨床徴候：曝露前２連続日、曝露の日および曝露後１４連続日の間、呼吸器疾患の臨床徴候について各動物を試験した。ＰＩ３感染に明らかに起因し得る臨床徴候は観察されなかった。いずれの子ウシにおいてもワクチン接種後の有害な反応は観察されなかった。
【０２７１】
結論
以前の報告は、若い食肉牛／肥育素牛のＰＩ３の排出の予防に役立つとしてＰＩ３分画ウシ鼻気管炎−ウイルス下痢症−パラインフルエンザ３−呼吸器合胞体ウイルスワクチン、修飾生ウイルスの効果を実証している。
【０２７２】
この組み合わせた生成物のＰＩ３分画の効果および抗原性を以下により証明する：
１）ウイルス（ＰＩ３）単離研究により、２ワクチンの用量の投与が、対照（予防可能な分画＝０．８０）における１００％（１０／１０）感受性と比較して、ワクチン接種した子ウシにおいて８０％（１６／２０）防御を与えたことが明らかになった。
２）対照群と比較してワクチン接種した群のＰＩ３に対する抗体力価の顕著な増加。
【０２７３】
実施例９−ＢＶＤＶ−２有効性プロトコル
この実施例は、六価ＭＬＶワクチンのＢＶＤＶ２型分画が、ＢＶＤＶ−２により引き起こされる疾患の予防に役立つことを実証する。
【０２７４】
材料および方法
六価修飾生ウイルスワクチンを上記のように調製する。ＢＶＤＶ−２欠失プラセボを有効性シリーズと共に生成する。ＢＶＤＶ−２欠失プラセボは、有効シリーズとして同じＢＨＶ−１、ＢＶＤＶ−１ｂ、ＢＶＤＶ−１ａ、ＰＩ３およびＢＲＳＶ収集バッチを含有する。有効性シリーズとＢＶＤＶ−２欠失プラセボとの間の等体積を維持するために培地をＢＶＤＶ−２成分と置き換える。滅菌希釈剤を使用して、ワクチンおよびＢＶＤＶ−２欠失プラセボの両方を再水和する。
【０２７５】
約３〜４ヶ月齢の商業的な若い食肉牛／肥育素牛を上記のようにランダム化し、次いで駆虫し、パスツレラ病、マイコプラズマ病、および黒脚病に対してワクチン接種する。全ての子ウシは、水、沿岸性バミューダ乾草、および抗コクシジウム剤を含有するが、抗生物質を含有しないペレット状餌配給に自由選択でアクセス可能であった。子ウシに給餌した後、干し草利用可能性は後で制限できる。
【０２７６】
約２０頭以上のワクチン接種した子ウシおよび１０頭以上の対照子ウシをこの単一レベル研究に使用する。曝露前に２つの群の子ウシを別々だが同等の囲いに維持する。次いで曝露の２日前（第−２日）に子ウシを１つの囲いに混合する。
【０２７７】
ランダム化、ブラインド化、および転帰
ランダム化、ブラインド化、および転帰を実施例１０に記載する。
【０２７８】
試料採取フレーム、データ収集、および臨床観察
有効性シリーズまたはＢＶＤＶ−２欠失プラセボのワクチン接種直前（第−２８日〜第−２１日）、子ウシから血液試料を収集する。曝露直前に（第０日）、そして再び、曝露１４日後（第１４日）、血液試料をまた収集する。示差ＷＢＣ数用の血液試料を、第−２日〜少なくとも第１４日まで収集する。全ての試料をＥＤＴＡ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）管中に収集し、Ｄｒｅｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｈｅｍａｖｅｔ９５０示差ＷＢＣ計数装置を使用して計数を実施する。ウイルス単離用の鼻スワブを第−２日〜少なくとも第１４日に単離する。
【０２７９】
転帰変数には、白血球減少、発熱、鼻ウイルス排出、ウイルス血症、中和抗体生産および臨床徴候が含まれる。一次転帰は、ＢＶＤＶ−２曝露後の対照と比較して、ワクチン接種群におけるＢＶＤＶ−２により誘発される白血球減少症の予防である。
【０２８０】
白血球減少：曝露後の数の減少が存在するかどうかを決定するためにＷＢＣ数データを分析する。第−２日〜第０日間のＷＢＣ数を平均化することにより各動物について曝露前の平均を計算する。曝露前の平均に対する毎日のＷＢＣ数の比を、観察者の裁量で、曝露後１〜１４日またはそれより長期間、計算する（曝露前の比率としてＷＢＣ数）。比率が２５％減少する場合、個体は白血球減少症と分類される。
【０２８１】
排出：曝露の日および曝露後１４連続日に、液体Ｓｔｕａｒｔ培地を含むＢＢＬ培養スワブを用いて両方の鼻孔を拭き取ることによって鼻スワブを各子ウシから採取する。採取の日に、０．２μｍフィルターを通して試料を滅菌濾過により処理する。次いでＴＶＬ−ＭＤＢＫ（約８０％コンフルエント）を含有する１２ウェルプレートの各ウェルを試料とインキュベートする。１つのウェル／プレートは未接種の状態にし、陰性対照として役立てる。プレートの１つのウェルは、曝露ウイルスの希釈物を接種し、陽性対照として役立てる。プレートを３５〜３９℃の温度にて２〜４日間、３〜７％のＣＯ２で接種する。各ウェルから培地を収集し、−１８〜−２２℃に保存する。典型的なＢＶＤＶ−１ａ細胞変性形態を示すウェルからの培地をさらに処理して、感染因子の識別を決定する。培養陽性である個体を「排出」と分類する。
【０２８２】
ウイルス血症：血液試料由来のバフィーコートを使用して、ＴＶＬ−ＭＤＢＫ（約８０％コンフルエント）を含有する１２ウェルプレートの各ウェルを接種する。１つのウェル／プレートは未接種の状態にし、陰性対照として役立てる。プレートの１つのウェルは、曝露ウイルスの希釈物を接種し、陽性対照として役立てる。プレートを３５〜３９℃の温度にて２〜４日間、３〜７％のＣＯ２で接種する。各ウェルから培地を収集し、−１８〜−２２℃に保存する。典型的なＢＶＤＶ−２細胞変性形態を示すウェル由来の培地をさらに処理して、感染因子の識別を決定する。ＢＶＤＶ−２について培養陽性である個体を「ウイルス血症」とみなす。
【０２８３】
抗体力価：開始ワクチン接種の日（第−２１日）、曝露の日（第０日）、および研究の結果において、各動物についての一定のウイルス減少血清法によってＢＶＤＶ−２に対する血清中和抗体力価を決定する。特別概略Ａ−１７、ウシ・ウイルス性下痢症ウイルス２型中和抗体の力価に従って抗体力価を決定する。≧８の抗体力価を発展させる動物をＢＶＤＶ−２に血清変換したと見なす。
【０２８４】
臨床徴候：ＢＶＤＶ−２の臨床徴候には、限定されないが、発熱、白血球減少症、呼吸困難、鼻汁および軟便が含まれる。ＢＶＤＶ感染の全ての関連する臨床徴候を、曝露の２日前、曝露の日および曝露後１４日間に記録する。データ分析の間のＢＶＤＶ−２の臨床徴候の観察を考慮するが、一次転帰とみなさない。なぜなら、それらの徴候は、このクラスの畜牛において一般に遭遇する他の疾患を示す場合があるからである。
【０２８５】
実施例９Ａ−ＢＶＤＶ−２有効性研究
この研究の結果により、ウシ鼻気管炎の修飾生ウシ・ウイルス性下痢症ウイルス−２型（ＢＶＤＶ２）分画−ウイルス性下痢症−パラインフルエンザ３−呼吸器合胞体ウイルス、修飾生ウイルスは抗原性であり、ＢＶＤＶ２により引き起こされる疾患の予防に役立つことが実証される。１用量を２０頭のＢＶＤＶ血清陰性子ウシに投与した。１０頭の血清陰性対照子ウシに、１用量の産物マッチプラセボワクチンをワクチン接種した。全ての子ウシにＢＶＤＶ２（株１３７３）を鼻腔内に曝露した。ワクチン接種により、高いＢＶＤＶ２抗体力価（＜２の平均〜２４）、曝露後の低い死亡率（７／１０の対照の死、０／２０のワクチン接種した死）が得られた。したがって、３×１０３ＴＣＩＤ５０／用量の最小のＢＶＤＶ２−ＴＣＩＤ５０を、このワクチンのＢＶＤＶ２分画について確立する。
【０２８６】
実施例１０−ＢＶＤＶ−１Ａ有効性プロトコル
この実施例は、六価ＭＬＶワクチンのＢＶＤＶ１ａ型分画が、ＢＶＤＶ−１ａにより引き起こされる疾患の予防に役立つことを実証する。
【０２８７】
材料および方法
六価修飾生ウイルスワクチンを上記のように調製する。ＢＶＤＶ−１ａ−欠失プラセボを有効性シリーズと共に生成する。ＢＶＤＶ−１ａ欠失プラセボは、有効性シリーズとして同じＢＨＶ−１、ＢＶＤＶ−１ｂ、ＢＶＤＶ−２、ＰＩ３およびＢＲＳＶ収集バッチを含有する。有効性シリーズとＢＶＤＶ−１ａ欠失プラセボとの間で同等の体積を維持するために培地をＢＶＤＶ−１ａ成分と置き換える。滅菌希釈物を使用して、ワクチンおよびＢＶＤＶ−１ａ欠失プラセボの両方を再水和する。約３〜４ヶ月齢の商業的な若い食肉牛／肥育素牛を上記のようにランダム化し、次いで駆虫し、パスツレラ病、マイコプラズマ病および黒脚病に対してワクチン接種する。全ての子ウシは、水、沿岸性バミューダ乾草、および抗コクシジウム剤を含有するが、抗生物質を含有しないペレット状餌配給に自由選択でアクセス可能であった。子ウシに給餌した後、干し草利用可能性は後で制限できる。約２０頭以上のワクチン接種子ウシおよび１０頭以上の対照子ウシをこの単一レベルの研究に使用する。曝露前に２群の子ウシを別であるが、同等の囲いに維持する。次いで子ウシを曝露の２日前（第−２日）に１つの囲いに混合する。
【０２８８】
ランダム化
子ウシのマッチしたランダム化スキームを使用して、子ウシを２つの処置群（ワクチン接種またはプラセボワクチン接種した対照）に割り当てることができる。例えば、傾斜台に進入する一連の３頭の子ウシを、２：１の比で２つの処置群にランダム化できる。血清学的評価のために、最初に血液を抜き取る際に、バケツからランダムに抜き取った耳標を使用して子ウシを識別する。
【０２８９】
ブラインド化
ブラインド化された職員は、対照またはワクチン接種動物の同一性の知識を持たなかった。すべての野外および実験室職員（記録者を除く）は、研究の期間、ブラインド化される。
【０２９０】
転帰
一次転帰は曝露後の白血球減少症である。白血球減少症はベースラインＷＢＣ数から２５％減少と定義する。ワクチンの効果をさらに支持する他の転帰には、鼻排出、ウイルス血症、発熱、抗体産生およびＢＶＤＶの臨床徴候が含まれる。実験単位が研究の開始時にＢＶＤＶ−１力価≧２を有する場合、この研究から排除する。
【０２９１】
試料採取フレーム、データ収集、および臨床観察
有効性シリーズまたはＢＶＤＶ欠失プラセボのワクチン接種直前（第−２８日〜第−２１日）、子ウシから血液試料を収集する。曝露直前に（第０日）、そして再び、曝露１４日後（第１４日）、血液試料をまた収集する。示差ＷＢＣ数用の血液試料を、第−２日〜少なくとも第１４日まで収集する。全ての試料をＥＤＴＡ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）管中に収集し、Ｄｒｅｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｈｅｍａｖｅｔ９５０示差ＷＢＣ計数装置を使用して計数を実施する。ウイルス単離用の鼻スワブを第−２日〜少なくとも第１４日に単離する。
【０２９２】
転帰変数には、白血球減少、発熱、鼻ウイルス排出、ウイルス血症、中和抗体生産および臨床徴候が含まれる。一次転帰は、ＢＶＤＶ−１ａ曝露後の対照群と比較して、ワクチン接種群におけるＢＶＤＶにより誘発される白血球減少症の予防である。
【０２９３】
白血球減少、排出、およびウイルス血症：ＷＢＣ数データを実施例９に記載されるように分析し、液体Ｓｔｕａｒｔ培地を含むＢＢＬ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｗａｂ（登録商標）を用いて両方の鼻孔を拭き取ることによって曝露の日および曝露後１４連続日に鼻スワブを各子ウシから採取して、同様に実施例９に記載されるように排出を決定する。血液試料由来のバフィーコートを使用して、ＴＶＬ−ＭＤＢＫ（約８０％コンフルエント）を含有する１２ウェルプレートの各ウェルを接種し、実施例９に記載されるようにアッセイする。
【０２９４】
抗体力価：開始ワクチン接種の日（第−２１日）、曝露の日（０日）、および研究の結果において、各動物について「一定ウイルス減少血清」法によりＢＶＤＶ−１ａに対する血清中和抗体力価を決定する。特別概略Ａ−１７、ウシ・ウイルス性下痢症ウイルス１ａ型中和抗体の力価に従って抗体力価を決定する。抗体力価≧８を発展させる動物をＢＶＤＶ−１に血清変換したとみなす。
【０２９５】
臨床徴候：ＢＶＤＶ−１ａの臨床徴候には、限定されないが、発熱、白血球減少症、呼吸困難、鼻汁および軟便が含まれ得る。ＢＶＤＶ感染の全ての関連する臨床徴候を、曝露の２日前、曝露の日および曝露後１４日に記録する。ＢＶＤＶ−１の臨床徴候の観察はデータの分析の間に考慮に入れるが、一次転帰とみなさない。なぜならそれらの徴候は、このクラスの子ウシに一般に遭遇される他の疾患を示す場合があるからである。
【０２９６】
実施例１０Ａ−ＢＶＤＶ−１Ａ有効性研究
この研究の結果は、ウシ鼻気管炎の修飾生ウイルスウシ・ウイルス性下痢症ウイルス−１ａ型（ＢＶＤＶ１ａ）分画−ウイルス性下痢症−パラインフルエンザ３−呼吸器合胞体ウイルスワクチン、修飾生ウイルスが、抗原性で、有効性である、ＢＶＤＶ１ａにより引き起こされる感染の予防に役立つことを実証する。ワクチンの１用量を２０頭のＢＶＤＶ血清陰性子ウシに投与した。１０頭の血清陰性対照子ウシに、１用量の産物マッチプラセボワクチンをワクチン接種した。全ての子ウシにＢＶＤＶ１ａを鼻孔内に曝露した。ワクチン接種により、高いＢＶＤＶ１ａ抗体力価が得られ、ＢＶＤＶ１ａにより誘発されるウイルス血症、鼻排出、発熱、リンパ球減少症および白血球減少症を予防または減少させた。したがって、５×１０３ＴＣＩＤ５０／用量の最小ＢＶＤＶ１ａ−ＴＣＩＤ５０を、このワクチンのＢＶＤＶ１ａ分画について確立する。
【０２９７】
材料および方法
ワクチン接種、曝露および試料採取：３０頭のＢＶＤＶ陰性子ウシを選別路地中で混合した。各子ウシはランダムに集められる際にゲートで分けられ、３頭の子ウシが同時に、ＣＶＢ−Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓにより提供されるマッチしたセットランダム化スキームを使用することによって、路地を通じて２つの群（群Ａ−ワクチン接種、または群Ｂ−プラセボワクチン接種対照）の一方に分けられた。
【０２９８】
２０頭の子ウシに、１用量の鼻気管炎−ウイルス性下痢症−パラインフルエンザ３−呼吸器合胞体ワクチン、修飾生ウイルスをワクチン接種した。各ワクチン接種は、０日に首の左側への皮下注射により２ｍｌ用量の産物を与えた。１０頭の子ウシに産物マッチプラセボ（ＢＶＤＶ欠失）をワクチン接種した。曝露の２日前に、ワクチン接種群および対照群の両方を、曝露前の臨床観察の目的のため、およびベースライン体温およびＷＢＣ読み取り値を獲得するために混合した。ワクチン接種子ウシおよび対照子ウシを、カンザス州ハンストンのＲｕｆｆファームにおける囲いの死んだ子ウシの肺から得たＢＶＤＶ１ａの悪性単離株を用いてワクチン接種後２１日に曝露した。ウイルスを、１０％のウマ血清を含むダルベッコ改変イーグル培地を使用してＴＶＬ−ＢＫ細胞においてインビトロで継代した。曝露ウイルスを滴定し、曝露直前に１０７．８ＴＣＩＤ５０／４ｍｌであると測定し、曝露直後に１０７．３ＴＣＩＤ５０／４ｍｌであると測定した。２ｍｌの曝露ウイルスを刺激の間に各鼻腔内に投与した。曝露プロセスの間、曝露ウイルスを冷却し続けた。ワクチン接種前、曝露の日（ワクチン接種後２１日）、および曝露の１４日後に抗体力価を測定するために血液試料を採取した。ウシ・ウイルス性下痢症ウイルス抗体力価を一定ウイルス減少血清中和法によって測定した。
【０２９９】
ウイルス単離用の鼻スワブを、曝露の日および曝露後１４連続日の間、液体Ｓｔｕａｒｔ培地中のＢＢＬ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｗａｂ（登録商標）を用いて両方の鼻孔を拭き取ることによって子ウシから採取した。曝露の日および曝露の連続１４日後にＥＤＴＡバキュテーナー管中での静脈穿刺によりバフィーコートウイルス単離用の血液試料を各子ウシから採取した。曝露前の２連続日の間、曝露の日および曝露後１４連続日、各子ウシについて直腸温度を毎日記録した。各子ウシについての臨床観察を行い、記録した。識別する特徴が耳標の番号であることのみで混合されたワクチン接種群および対照群の両方により観察者はブラインド化された。研究の間中、観察者は個々の試験動物のワクチン接種状態の知識を得る時間はなかった。実験室の作業員は子ウシのワクチン接種状態の知識を有さなかった。曝露前の２連続日、曝露の日、および曝露後１４連続日に示差ＷＢＣ数を決定するための血液試料を採取した。試料をＥＤＴＡバキュテーナー管に採取し、Ｄｒｅｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｈｅｍａｖｅｔ９５０示差ＷＢＣ計数装置を用いて計数測定を実施した。
【０３００】
ＢＶＤＶ検出：ＣＰＥの観察および細胞培養を高めたＰＣＲ技術を利用して、採取した試料中のＢＶＤＶ１ａを検出した。手短に述べると、培養物中のＴＶＬ−ＢＫ細胞において滅菌濾過（０．２μｍ）により鼻試料を処理した。バフィーコートを、細胞を洗い落とす前に４５〜７５分間、培養物中のＴＶＬ−ＢＫ細胞上に直接置いた。３７℃±２℃および５±１％ＣＯ２にて４日間、培養物をインキュベートした。ＢＶＤＶ特異的ＣＰＥの存在／非存在について各培養物を観察し、各培養物からの上清を、従来のＲＴ  ｑＰＣＲ方法および以下のプローブ／プライマーセット：
フォワードプライマー：ＧＧＴＣＧＣＣＣＡＧＧＴＡＡＡＡＧＣＡ（配列番号７）
リバースプライマー：ＧＣＣＴＣＴＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡ（配列番号８）
ＴａｑＭａｎ  ＭＧＢプローブ：ＡＡＣＣＧＡＣＴＧＴＴＡＣＧＡＡＴＡＣ（配列番号９）
を使用してＢＶＤＶ１ａの存在／非存在について個々にアッセイした。
【０３０１】
この方法は、（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｙｐｅｓ  １ａ，１ｂ  ａｎｄ  ２  ｂｏｖｉｎｅ  ｖｉｒａｌ  ｄｉａｒｒｈｅａ  ｖｉｒｕｓ（ＢＶＤＶ）ｂｙ  ＰＣＲ，Ｊｕｌｉａ  Ｆ．  Ｒｉｄｐａｔｈ  ａｎｄ  Ｓｔｅｖｅｎ  Ｒ．  Ｂｏｌｉｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１３０（２００５）１４５−１４８）に基づいて開発された。この方法はまた、Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ａｎｄ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｔｅｓｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ−Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｖｉｒａｌ  Ｄｉａｒｒｈｅａ  Ｖｉｒｕｓ，第ＢＰＰＲ０２０１０．０１号に基づく。ＢＶＤＶの遺伝子型および下位遺伝子型を区別するこれらの方法はどちらもゲノムの５’非翻訳領域（ＵＴＲ）に存在する遺伝子相違を利用する。このプローブ／プライマーセットは、非常に特異的なプローブによってＢＶＤＶ１ｂ配列がユニークに検出可能な、５’ＵＴＲのセクションを増幅するように特異的に設計された。プローブ／プライマーセットの特異性を社内で確認し、そしてこれらは、ＢＨＶ、ＰＩ３、ＢＲＳＶ、ＢＶＤＶ１ａ、またはＢＶＤＶ２とは交差反応しなかった。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００上でのＴａｑｍａｎ（登録商標）に基づくアッセイを用いて、ＲＴ  ｑＰＣＲアッセイを行った。
【０３０２】
統計分析：抗体力価：Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定を用いて、一般的にスケーリングされる力価の群比較を分析した。
【０３０３】
鼻排出：鼻スワブ分析によるウイルス単離データは、ＢＶＤＶ１ａが曝露後から単離された対照の比率に比較した際の、ＢＶＤＶ１ａが単離されたワクチン接種動物の比率に基づく。予防可能分率をＣＰＥの観察およびＰＣＲによる検出に基づいて独立して計算した。ＢＶＤＶ−１ａ排出の予防可能分率を、ＴａｎｎｅｒおよびＭｏｒｇａｎ（１９９３）によって記載されるように計算した。
【０３０４】
ウイルス血症：ＢＶＤＶ１ａが曝露後から単離された対照の比率に比較した際の、ＢＶＤＶ１ａが単離されたワクチン接種動物の比率に基づいて、血液試料のバフィーコートからのウイルス単離データを分析した。予防可能分率をＣＰＥの観察およびＰＣＲによる検出に基づいて独立して計算した。ＢＶＤＶ１ａウイルス血症の予防可能分率を、ＴａｎｎｅｒおよびＭｏｒｇａｎ（１９９３）によって記載されるように計算した。
【０３０５】
直腸温度：曝露前平均直腸温度を各動物に関して測定した。群、日および群＊日相互作用に関する項を含む反復測定分散分析（ＡＮＯＶＡ）における共変数として、この平均を用いた。
【０３０６】
疾患の臨床徴候：各観察者により独立して疾患の臨床徴候を毎日記録した。
【０３０７】
リンパ球減少症：第−２日〜０日間、リンパ球数を平均化することによって曝露前のリンパ球平均を各動物について計算した。曝露前の平均に対する毎日のリンパ球数の比を、曝露後１〜１４日の各々について計算した（曝露前の比率としてリンパ球数）。ベースラインからの数の２５％減少により定義されるように、個々の動物がリンパ球減少症を発生するかどうかを決定するために、この比率データを分析した。ワクチン接種がこの研究においてリンパ球減少症の発生を予防するかどうかを決定するために、予防可能分率を、ＴａｎｎｅｒおよびＭｏｒｇａｎ（１９９３）によって記載されるように計算した。
【０３０８】
白血球減少症：第−２日〜第０日の間、白血球数を平均化することにより曝露前の白血球平均を各動物について計算した。曝露前の平均に対する毎日の白血球数の比を、曝露後１〜１４日の各々について計算した（曝露前の比率として白血球数）。ベースラインからの数の２５％減少により定義されるように、個々の動物が白血球減少症を発生するかどうかを決定するためにこの比率データを分析した。ワクチン接種がこの研究においてリンパ球減少症の発生を予防するかどうかを決定するために、予防可能分率を、ＴａｎｎｅｒおよびＭｏｒｇａｎ（１９９３）によって記載されるように計算した。
【０３０９】
Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用のＳＰＳＳバージョン１６を用いて全ての統計的分析を実施した。
【０３１０】
結果
血清中和抗体力価：この研究における全ての子ウシは、ワクチン接種前に＜１：２のＢＶＤＶ（ＢＶＤＶ１ａ、ＢＶＤＶ１ｂおよびＢＶＤＶ２）血清中和抗体力価を有した。曝露の日（第２１日）までに、ワクチン接種群は、１：２１の平均ＢＶＤＶ１ａ力価を有し、これは対照群＜１：２のものより有意（ｐ≦０．５）であった。対照子ウシおよびワクチン接種子ウシの両方における曝露後１４日のＢＶＤＶ１ａ抗体力価は増加し、子ウシがＢＶＤＶ１ａで曝露されたことを示す。
【０３１１】
鼻スワブからのＢＶＤＶ１ａ単離：ＢＶＤＶ特異的ＣＰＥの観察に基づいて、この研究における全ての１０頭の対照子ウシは、この研究の曝露後の段階の間、ＢＶＤＶ１ａを排出した。２０頭のワクチン接種した子ウシのうちの３頭のみが、曝露後の期間の間にＢＶＤＶ１ａを排出した。０／１０の自然に予防された対照および１７／２０のワクチン接種による予防の比を使用して予防可能分率を計算した。この結果、０．８５の予防可能分率が得られる。ＢＶＤＶ１ａの細胞培養を高めたＰＣＲ検出に基づいて、この研究における全ての１０頭の対照子ウシは、この研究の曝露後の段階の間、ＢＶＤＶ１ｂを排出した。２０頭のワクチン接種のうちの５頭のみが、曝露後の期間、ＢＶＤＶ１ａを排出した。０／１０の自然に予防された対照および１５／２０のワクチン接種による予防を使用して予防分画を計算した。この結果、０．７５の予防可能分率が得られる。
【０３１２】
バフィーコートからのＢＶＤＶ１ａ単離：ＢＶＤＶ特異的ＣＰＥに基づいて、この研究の曝露後の段階の間、この研究における１０頭の対照子ウシのうち６頭はウイルス血症であった。曝露後の期間の間、２０頭のワクチン接種のいずれもウイルス血症ではなかった。４／１０自然に予防された対照および２０／２０のワクチン接種による予防を使用して予防可能分率を計算した。この結果、１．０の予防可能分率が得られる。
【０３１３】
ＢＶＤＶ１ａの細胞培養を高めたＰＣＲ検出に基づいて、この研究において１０頭の対照のうちの７頭は、この研究の曝露後の段階の間、ウイルス血症であった。２０頭のワクチン接種のうちの２頭は、曝露後の期間の間、ウイルス血症であった。３／１０の自然に予防された対照および１８／２０のワクチン接種による予防を使用して予防可能分率を計算した。この結果、０．８６の予防可能分率が得られる。
【０３１４】
直腸温度：共変量として曝露前の平均温度を使用した曝露後の直腸温度分析により、日の作用による群間の統計的有意性（ｐ＜０．０５）が明らかにされた。その分析により、対照群の温度が、６、８および１４日におけるワクチン接種群より有意に高く、５および１１日に有意性が近づいたことが明らかにされた。
【０３１５】
ＢＶＤＶ１ａの臨床徴候：対照群の１頭の子ウシが、ＢＶＤＶ１ａ感染の原因となり得る臨床徴候を示した。子ウシ２１から観察した臨床徴候は、多量の粘液膿性鼻排出であった。ワクチン接種群の子ウシのいずれも、この研究の曝露後の段階の間、ＢＶＤＶ１ａ感染の臨床徴候を示さなかった。子ウシのいずれにおいてもワクチン接種後の有害な反応を感作しなかった。
【０３１６】
リンパ球減少症：２０頭のワクチン接種のうちの２頭および１０頭の対照のうちの５頭においてリンパ球減少症を検出し、８０％の予防可能な分画を生じた。比率データの毎日の平均により、ＢＶＤＶ曝露（リンパ球減少症後の反発したスパイク）に対する対照子ウシの典型的な反応が明らかにされる。ワクチン接種した子ウシは同様に反応しなかった。
【０３１７】
白血球減少症：２０頭のワクチン接種のうちの５頭および１０頭の対照のうちの４頭において白血球減少症を検出し、３７％の予防可能分率を得た。比率データの毎日の平均を図３にグラフにより表す。
【０３１８】
結果
上記の報告により、ＢＶＤＶ１ａにより引き起こされる感染の予防に役立つ、ＢＶＤＶ１ａ分画ウシ鼻気管炎ウイルス−ウイルス性下痢症−パラインフルエンザ３−呼吸器合胞体ウイルスワクチン、修飾生ウイルスの抗原性および有効性が実証される。この混合した産物のＢＶＤＶ１ａ分画の抗原性および有効性を以下により証明する：
１）対照群と比較してワクチン接種群におけるＢＶＤＶ１ａに対する抗体力価の有意な増加。ワクチン接種群における２０頭の子ウシのうちの１９頭は、２ｍｌ用量ワクチンの投与後、ＢＶＤＶ１ａ力価≧１：８を発生し、これは９ＣＦＲ１１３．３１１（ｃ）（５）に定義された必要性を満たす。
２）ウイルス単離研究により、１用量の投与が、曝露後のウシにおいてＢＶＤＶ１ａにより誘発される鼻排出およびウイルス血症を減少させることが明らかにされた。
３）ワクチン接種子ウシは、対照子ウシと比較して、有意に低い熱を示した。
４）ワクチン接種はまた、曝露後のウシにおいてＢＶＤＶ１ａにより誘発されるリンパ球減少症および白血球減少症を減少させた。
【０３１９】
この研究の結果は、両方統計的に有意であり、臨床的に関連するので、ウシ鼻気管炎ウイルス−ウイルス性下痢症−パラインフルエンザ３−呼吸器合胞体ウイルスワクチン−修飾生ウイルスに含有されるＢＶＤＶ１ａ分画の効果を実証する。
【０３２０】
実施例１１−熱輸送ワクチンについての有効性アッセイプロトコル
「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ  Ｖｉｒａｌ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  Ｓｈｉｐｐｉｎｇ  Ｆｅｖｅｒ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ」という発明の名称の同時係属の米国仮特許出願第６１／４２７，４０４号（２０１０年１２月２７日において本願と同時に出願され、その全体は本明細書に参照することにより具体的に組み込まれる）において、本発明者らは、多価ワクチンにおける個々のウイルス成分の各々の直接ウイルス定量（すなわち「有効性」）を得るのに有用な修飾された遺伝子ベースのアッセイプロトコルの開発を報告した。本発明は、従来のＦＡ／ＩＦＡアッセイ（現在のＳＡＭ１０１アッセイに記載されているものなど）をＲＴ−ｑＰＣＲアッセイと置き換えて、個々のアッセイウェル（すなわち希釈物）における特定のウイルス種、型、または亜種の存在または非存在を測定する。
【０３２１】
本明細書に記載される六価ＭＬＶワクチンなどの多価ワクチンの個々の成分についての有効性試験もまた、ＣＰＥの視覚的観察を個々のウェルのＲＴ−ｑＰＣＲ／ｑＰＣＲ分析に置き換えることにより十分に客観的になされ得る。例えば、ウイルス力価アッセイにおけるＣＰＥの観察は主観的であり得、しばしば、試験施設間のＭＬＶワクチン力価の差異の源であるとみなされる。しかしながら、アッセイの客観性を増加させることにより、実験室間の再産生も増加するはずである。
【０３２２】
パラインフルエンザ３ウイルスワクチン（ＭＶＳＡＭ１０２．０１）の力価のための修飾された捕捉アッセイ法を使用してＰＩ３についての有効性試験を実施できる。ワクチン（ＭＶＳＡＭ０１２９．０１）中のウシ呼吸器合胞体ウイルスの力価のための修飾された捕捉アッセイ法を使用してＢＲＳＶについての有効性試験を実施できる。これらのアッセイは、ＣＰＥの視覚観察のための個々のウェルのリアルタイムｑＰＣＲ分析に置き換えることにより修飾される。ワクチン（ＭＶＳＡＭ０１０５．０１）中のウシ伝染性鼻気管炎ウイルスの力価のための修飾された捕捉アッセイ法を使用してＢＨＶ分画の力価を実施する。このアッセイにおいて、多価ワクチン分析のためのアッセイを標準化するために、標準的な６ウェルフォーマットの代わりに９６ウェルフォーマットを使用してもよい。重要なことには、このプロトコルは、より正確かつ信頼できるアッセイを提供するために、視覚観察のための個々のウェルのｑＰＣＲ分析を置き換えること、およびＢＨＶプラークを計数することを含む。
【０３２３】
本実施例は、本明細書に記載される六価ＭＬＶワクチンの６個の個々のウイルス成分の各々の有効性を首尾良く決定するために、本発明者らの同時係属米国仮特許出願第６１／４２７，４０４号に記載されている定量的（リアルタイム）ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）技術の使用を実証する。本発明者らは、このアッセイが、多価の例において遺伝的に関連する株の個々の有効性を決定するのに既存の方法より特に有益であることを示す。モデルとして六価ＭＬＶ  ＢＲＤＣワクチンを使用することにより、このアッセイが、下位遺伝子型に含まれるＢＶＤＶ−１ａ、ＢＶＤＶ−１ｂ、およびＢＶＤＶ−２の３つの遺伝的な下位遺伝子型の個々の有効性を効果的に定量することを実証する。
【０３２４】
材料および方法
細胞培養
従来の技術、およびＦｒｅｓｈｎｅｙ（１９８７）に記載されている供給物を使用して全ての培養物を調製する。培養物中の典型的な上皮様形態を示す、ＴＶＬ−ウシ腎臓細胞株を全ての培養アッセイに使用する。
【０３２５】
プライマー／プローブセットの特異性
ＲＮＡを、以下の米国農務省（ＵＳＤＡ）により承認されたウイルス種：ＢＶＤＶ−１ａ（Ｓｉｎｇｅｒ株）、ＢＶＤＶ−１ｂ（ＴＧＡＣ株）、ＢＶＤＶ−２（１２５）、ＰＩ３（Ｒｅｉｓｉｎｇｅｒ  ＳＦ−４）、およびＢＲＳＶ（Ｎ３７５）（抽出プロセスはＢＨＶ−１［銅株］において実施しない。なぜならそれらはＤＮＡウイルスだからである）の各々由来のウイルス流体から抽出する。ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ（登録商標）−４ＰＣＲ（Ａｍｂｉｏｎ；Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）を使用して抽出を実施する。
【０３２６】
ＲＮＡウイルス試料の各々を、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ワンステップＲＴ−ＰＣＲ化学を使用して６個のプライマー／プローブセットの各々について別のＲＴ−ｑＰＣＲ反応においてテンプレート（試料）として使用する。ＤＮＡウイルス（ＢＨＶ−１）もまた、上記の６個のプライマー／プローブの各々と共に別のｑＰＣＲ反応においてテンプレート（試料）として使用する。六価ワクチンの全ての６個のウイルス分画に対するＢＲＳＶプライマー／プローブセットの分析により、他のウイルス分画のいずれか１つとプライマー／プローブセットの各々について交差反応が存在しないことが示される。
【０３２７】
ｑＰＣＲアッセイ
Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ７５００リアルタイムＰＣＲシステムを使用してｑＰＣＲアッセイを実施する。
【０３２８】
オリゴヌクレオチドプライマーおよび標識された分子プローブ
以下の慣用のＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブおよびウイルス特異的フォワードおよびリバースプライマー対をＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）により作製した。
【０３２９】
ＢＶＤＶ−１ｂ（第１）：
フォワードプライマー：５’−ＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＴＧＴＡＴＴＣＡＴＡＧＣ−３’（配列番号１）；
リバースプライマー：５’−ＴＧＣＣＣＡＣＡＧＣＡＣＡＴＣＴＴＡＡＣＣ−３’（配列番号２）；および
ＢＶＤＶ−１ｂ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭＧＢプローブ：５’−ＴＣＡＣＣＴＧＧＡＣＧＡＣＣＣ−３’（配列番号３）。
【０３３０】
ＢＶＤＶ−１ｂ（第２）：
第２のフォワードプライマー：５’−ＧＴＣＧＴＣＣＡＧＧＴＧＡＡＡＡＣＧＧＴ−３’（配列番号１９）；
第２のリバースプライマー：５’−ＧＴＣＧＴＣＣＡＧＧＴＧＡＡＡＡＣＧＧＴ−３’（配列番号２０）；および
第２のＢＶＤＶ−１ｂ検出プローブ：５’−ＧＴＣＧＴＣＣＡＧＧＴＧＡＡＡＡＣＧＧＴ−３’（配列番号２１）。
【０３３１】
ＢＲＳＶ：
フォワードプライマー：５’−ＧＣＡＡＴＧＣＴＧＣＡＧＧＡＣＴＡＧＧＴＡＴＡＡＴ−３’（配列番号４）；
リバースプライマー：５’−ＡＣＡＣＴＧＴＡＡＴＴＧＡＴＧＡＣＣＣＣＡＴＴＣＴ−３’（配列番号５）；および
ＢＲＳＶ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭＧＢプローブ：５’−ＡＡＧＡＣＴＴＧＴＡＴＧＡＴＧＣＴＧＣＣＡＡ−３’（配列番号６）。
【０３３２】
ＢＶＤＶ−１ａ：
フォワードプライマー：５’−ＧＧＴＣＧＣＣＣＡＧＧＴＡＡＡＡＧＣＡ−３’（配列番号７）；
リバースプライマー：５’−ＧＣＣＴＣＴＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡ−３’（配列番号８）；および
ＢＶＤＶ−１ａ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭＧＢプローブ：５’−ＡＡＣＣＧＡＣＴＧＴＴＡＣＧＡＡＴＡＣ−３’（配列番号９）。
【０３３３】
ＢＶＤＶ−２：
フォワードプライマー：５’−ＧＣＴＡＧＣＣＡＴＧＣＣＣＴＴＡＧＴＡＧＧＡＣ−３’（配列番号１０）；
リバースプライマー：５’−ＧＡＣＧＡＧＴＣＣＣＣＴＧＴＡＣＴＣＡＧＧ−３’（配列番号１１）；および
ＢＶＤＶ−２  ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ：５’−ＣＡＧＴＧＡＧＴＣＣＡＴＴＧＧＡＴＧＧ−３’（配列番号１２）。
【０３３４】
ＰＩ３：
フォワードプライマー：５’−ＧＧＡＧＡＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＧＡＧＡＴＧ−３’（配列番号１３）；
リバースプライマー：５’−ＣＧＴＣＴＧＣＣＣＡＴＧＣＡＴＡＡＧＧ−３’（配列番号１４）；および
ＰＩ３ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ：５’−ＡＣＣＴＣＧＧＴＣＡＴＣＣＡＴＡＧ−３’（配列番号１５）。
【０３３５】
ＢＨＶ−１：
フォワードプライマー：５’−ＣＣＡＴＧＴＴＡＧＣＧＣＴＣＴＧＧＡＡＣＣ−３’（配列番号１６）；
リバースプライマー：５’−ＣＧＴＣＴＴＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＡＣＴＣＣ−３’（配列番号１７）；および
ＢＨＶ−１  ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭＧＢプローブ：５’−ＡＣＧＧＡＣＧＴＧＣＧＣＧＡＡ−３’（配列番号１８）。
【０３３６】
多価ワクチンについての有効性アッセイ
以下のアッセイの各々についてのプロトコルは、力価プレートの個々のウェルが等価の基準ウェルより多量のウイルスを含有するかどうかを決定するために、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ７５００比較閾値サイクル（ＣＴ）方法を利用する。ほとんどのウイルス試料はＰＣＲアッセイにより検出できるいくらかの非生存ウイルス粒子を含有するので、潜在的に偽陽性結果を与える。この問題は細胞を含まない基準プレートの使用により解決される。試料は、ウイルス複製についての可能性を排除するために細胞を含まないが、アッセイプレートにおけるように、基準プレート中で正確に希釈される。各アッセイにおけるウェルの各々についてベースラインまたはバックグランドＣＴ値を生成するために基準プレートが使用される。アッセイプレートにおけるウェルがより高い。アッセイプレートにおけるウェルが対応するバックグランドウェルより高いＣＴ値を有する場合、ウイルス複製が生じ、ウェルは陽性であるとみなされる。ウェルについてのＣＴ値を測定しない場合、またはＣＴ値がバックグランドＣＴ値と等しい場合、ウェルは陰性であるとみなされる。
【０３３７】
多価ワクチンについての有効性アッセイ
ＩＢＲ／ＢＶＤＶ−１ａ、−１ｂ、−２／ＰＩ３／ＲＳＶ六価ワクチン、修飾生ウイルアスのパイロットシリーズを本明細書に記載されるように調製した。手短に述べると、ＢＨＶ−１（Ｃｏｏｐｅｒ株）、ＢＶＤＶ−１ａ（Ｓｉｎｇｅｒ株）、ＢＶＤＶ−１ｂ（ＴＧＡＣ株）、ＢＶＤＶ−２（１２５）、ＰＩ３（Ｒｅｉｓｉｎｇｅｒ  ＳＦ−４）、およびＢＲＳＶ（Ｎ３７５）をＴＶＬ−ＢＫ細胞株（第２０継代）中で増殖させた。六種ワクチンの各分画についての有効性試験を、適切な中和抗血清を加えることにより本明細書に記載されるように実施できる。各々のウイルス分画のＴＣＩＤ５０を、ＣＰＥ／ＦＡ／ＩＦＡ結果に基づいて決定し、ＲＴ−ｑＰＣＲ／ｑＰＣＲに基づいたものと皮革する。
【０３３８】
ＢＶＤＶ−１Ａ、−１Ｂおよび−２有効性試験
一価ＢＶＤＶ−１ａ、ＢＶＤＶ−１ｂおよびＢＶＤＶ−２試料は、ワクチン（ＳＡＭ１０１）中のウシ・ウイルス性下痢症ウイルスの滴定のための捕捉アッセイ法に従って別々に滴定できる。手短に述べると、アッセイを二連で実施し、プレートの１つを上記のようにＣＰＥおよび／またはＦＡ／ＩＦＡに基づいた力価計算のために使用する。もう１つのプレートはＲＴ−ｑＰＣＲに基づいた力価を測定するために使用する。細胞欠損基準プレートはウイルスの各々について上記のように含まれる。
【０３３９】
ＰＩ３有効性試験
ＰＩ３についての有効性試験を二連で実施し、プレートの１つはＣＰＥに基づいた力価計算のために使用する。もう１つのプレートは、ＲＴ−ｑＰＣＲにより測定されるようにＰＩ３の比較ＣＴ値に基づいた力価を測定するために使用する。細胞欠損基準プレートは上記のように含まれる。
【０３４０】
ＢＲＳＶ有効性試験
ＢＲＳＶについての有効性試験を二連で実施し、プレートの１つは上記のようにＣＰＥに基づいた力価計算のために使用し、残りのプレートは、ＲＴ−ｑＰＣＲにより測定されるＢＲＳＶの比較ＣＴ値に基づいた力価を決定するために使用する。上記に説明したように、細胞欠損基準プレートもまた、このアッセイに含まれる。
【０３４１】
ＢＨＶ有効性試験
ＢＨＶについての有効性試験を、従来の視覚観察を個々のウェルのｑＰＣＲ分析に置き換え、プラークを計数することにより、９６ウェルフォーマットにおいて実施する。このアッセイは二連で実施し、プレートの１つは、個々のウェル（希釈物）中のＣＰＥの存在または非存在に基づいた力価計算のために使用し、一方で、残りのプレートは、ＱＰＣＲにより測定されるようにＢＨＶの比較ＣＴ値に基づいて力価を計算するために使用する。細胞欠損プレートは上記のように含まれる。
【０３４２】
参考文献
以下の参考文献は、それらが例示的な手順または本明細書に記載されるものに対する他の詳細な補足を与える程度に、それらの全体が本明細書に参照することにより本明細書に具体的に組み込まれる。
Ｃａｒｕｔｈｅｒｓらによる米国特許出願第４，４１５，７３２号
Ｃａｒｕｔｈｅｒｓらによる米国特許出願第４，４５８，０６６号
Ｍｕｌｌｉｓらによる米国特許出願第４，６８３，１９５号
Ｍｕｌｌｉｓらによる米国特許出願第４，６８３，２０２号
Ｋｏｓｔｅｒらによる米国特許出願第４，７２５，６７７号
Ｃａｒｕｔｈｅｒｓらによる米国特許出願第４，９７３，６７９号
Ｍｏｌｋｏらによる米国特許出願第４，９８０，４６０号
Ｐｉｃｏｎｅらによる米国特許出願第５，６１４，３８８号
Ａｇｒａｗａｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １８：５４１９−５４２３，  １９９０
Ｂａｋｅｒ，  Ｊ．Ｃ．，  “Ｔｈｅ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  ｖｉｒａｌ  ｄｉａｒｒｈｅａ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，”  Ｖｅｔ．  Ｃｌｉｎ．  Ｎ．  Ａｍ．  Ｆｏｏｄ  Ａｎｉｍ．  Ｐｒａｃｔ．，  １１：４２５−４４５，  １９９５．
Ｂａｋｅｒ，  Ｊ．Ｃ．，  Ｗｅｒｄｉｎ，  Ｒ．Ｅ．，  Ａｍｅｓ，  Ｔ．Ｒ．，  Ｍａｒｋｈａｍ，  Ｒ．Ｊ．，  ａｎｄ  Ｌａｒｓｏｎ，  Ｖ．Ｌ．，  “Ｓｔｕｄｙ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｅｔｉｏｌｏｇｉｃ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  ｏｆ  ｄａｉｒｙ  ｃａｌｖｅｓ，”  Ｊ．  Ａｍ．  Ｖｅｔ．  Ｍｅｄ．  Ａｓｓｏｃ．，  １８９（１）：６６−７０，  １９８６．
Ｂａｒｂｅｒ，  Ｄ．Ｍ．，  Ｎｅｔｔｌｅｔｏｎ，  Ｐ．Ｆ．，  ａｎｄ  Ｈｅｒｒｉｎｇ，  Ｊ．Ａ．，  “Ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ａ  ｄａｉｒｙ  ｈｅｒｄ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｐｒｅａｄ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  ｄｉａｒｒｈｏｅａ  ｖｉｒｕｓ，”  Ｖｅｔ．  Ｒｅｃ．，  １１７（１８）：４５９−４６４，  １９８５．
Ｂｅａｕｃａｇｅ  ａｎｄ  Ｉｙｅｒ，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，  ４８：２２２３−２３１１，  １９９２．
Ｂｅｃｈｅｒ，  Ｐ．，  Ｋｏｎｉｇ，  Ｍ．，  Ｐａｔｏｎ，  Ｄ．Ｊ．，  ａｎｄ  Ｔｈｉｅｌ，  Ｈ．Ｊ．，  “Ｆｕｒｔｈｅｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｏｒｄｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ  ｉｓｏｌａｔｅｓ：  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ  ｔｈｒｅｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ｇｅｎｕｓ  ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ，”  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ２０９（１）：２００−２０６，  １９９５．
Ｃｏｌｌｅｔｔ，  Ｍ．Ｓ．，  Ｒ．  Ｌａｒｓｏｎ，  Ｓ．Ｋ．  Ｂｅｌｚｅｒ，  ａｎｄ  Ｅ．  Ｒｅｔｚｅｌ，  “Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ｂｏｖｉｎｅ  ｖｉｒａｌ  ｄｉａｒｒｈｅａ  ｖｉｒｕｓ：  ｔｈｅ  ｇｅｈｏｍｉｃ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ，”  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  １６５（１）：２００−２０８，  １９８８．
Ｅｌｂｅｒｓ，  Ｋ．，  Ｎ．  Ｔａｕｔｚ，  Ｐ．  Ｂｅｃｈｅｒ，  Ｄ．  Ｓｔｏｌｌ，  Ｔ．  Ｒｕｍｅｎａｐｆ，  ａｎｄ  Ｈ．Ｊ．  Ｔｈｉｅｌ，  “Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ  Ｅ２−ＮＳ２  ｒｅｇｉｏｎ：  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｐ７  ａｎｄ  Ｅ２ｐ７，”  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ７０（６）：４１３１−４１３５，  １９９６．
Ｆｅｒｇｅｎ，  Ｂ．Ｊ．，  “Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ  ａｎ  Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｎ  Ｏｕｔｃｏｍｅ  Ｓｅｖｅｒｉｔｙ，”  ＵＳＤＡ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，  Ａｍｅｓ，  ＩＡ，  ＵＳＡ；  Ｐｅｒｓｏｎａｌ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ，  ２００４．
Ｆｉｎｎｅｙ，  Ｄ．Ｊ．，  “Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｓｓａｙ，”  ３ｒｄ  Ｅｄ．，  Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｇｒｉｆｆｉｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｌｔｄ．，  Ｌｏｎｄｏｎ，  １９７８．
Ｆｌｏｒｅｓ，  Ｅ．Ｆ．，  Ｒｉｄｐａｔｈ，  Ｊ．Ｆ．，  Ｗｅｉｂｌｅｎ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｂｒａｚｉｌｉａｎ  ｂｏｖｉｎｅ  ｖｉｒａｌ  ｄｉａｒｒｈｅａ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ２  （ＢＶＤＢ−２）  ｉｓｏｌａｔｅｓ：  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｓｕｂｇｅｎｏｔｙｐｅ  ｗｉｔｈｉｎ  ＢＶＤＶ−２，”  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．，  ８７：５１−６０，  ２００２．
Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ｒ．Ｉ．，  “Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，  Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，”  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｄｅｐｔ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｌａｓｇｏｗ，  Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ，  ＵＳＡ，  １９８７．
Ｆｕｌｔｏｎ，  Ｒ．Ｗ．，  Ｈｅｓｓｍａｎｄ，  Ｂ，  Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｂ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  “Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｔｅｓｔ  ｕｓｅｄ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  ｖｉｒａｌ  ｄｉａｒｒｈｅａ  ｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ  １ａ，  １ｂ  ａｎｄ  ２ａ  ｉｎ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔｌｙ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｃａｔｔｌｅ  ｅｎｔｅｒｉｎｇ  ａ  ｆｅｅｄｌｏｔ，”  Ｊ．  Ａｍ．  Ｖｅｔ．  Ｍｅｄ. Ａｓｓｏｃ．，  ２２８（４）：５７８−５８４，  ２００６．
Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ，  Ｊ．Ｈ．，  Ｊ．Ａ．  Ｂａｋｅｒ，  ａｎｄ  Ｋ．  ＭｃＥｎｔｅｅ，  “Ａ  ｃｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｓｔｒａｉｎ  ｏｆ  ｖｉｒｕｓ  ｄｉａｒｒｈｅａ  ｖｉｒｕｓ，”    Ｃｏｒｎｅｌｌ  Ｖｅｔ．，  ５０：７３−７９，  １９６０．
Ｈｏｆｍａｎｎ，  Ｍ．Ａ．，  Ｂｒｅｃｈｔｂｕｈｌ，  Ｋ．，  ａｎｄ  Ｓｔａｕｂｅｒ，  Ｎ．，  “Ｒａｐｉｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｗ  ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｂｙ  ｄｉｒｅｃｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ＰＣＲ−ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｃＤＮＡ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ５’  ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ，”  Ａｒｃｈ．  Ｖｉｒｏｌ．，  １３９：２１７−２２９，  １９９４．
Ｈｏｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８８：７２７６−７２８０，  １９９１．
Ｌｉｅｓｓ，  Ｂ．，  Ｈ．Ｒ．  Ｆｒｅｙ，  Ｈ．  Ｋｉｔｔｓｔｅｉｎｅｒ，  Ｆ．  Ｂａｕｍａｎｎ，  ａｎｄ  Ｗ．  Ｎｅｕｍａｎｎ，  “Ｂｏｖｉｎｅ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ，  ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｘｐｌａｉｎａｂｌｅ  ｌａｔｅ  ｓｔａｇｅ  ｏｆ  ＢＶＤ−ＭＤ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ  ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｏｆ  ａ  ‘ｓｌｏｗ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，’”    Ｄｔｓｃｈ．  Ｔｉｅｒａｅｒｚｔｉ．  Ｗｓｃｈｒ．，  ８１（２）：４８１−４８７，  １９７４．
Ｍａｌｍｑｕｉｓｔ，  Ｗ．Ａ．，  “Ｂｏｖｉｎｅ  ｖｉｒａｌ  ｄｉａｒｒｈｅａ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ：  ｅｔｉｏｌｏｇｙ，  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｅｄ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ，”  Ｊ．  Ａｍ．  Ｖｅｔ．  Ｍｅｄ．  Ａｓｓｏｃ．，  １５２：７６３−７６８，  １９６８．
ＭｃＮｕｌｔｙ  Ｍ．Ｓ．，  Ａｌｌａｎ  Ｇ．Ｍ．，  “Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｖｉｒａｌ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，”  Ｉｎ：  Ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｖｉｒｕｓ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，  ＭｃＮｕｌｔｙ  ＭＳ，  ＭｃＦｅｒｒａｎ  ＪＢ  （Ｅｄｓ．），  ｐｐ．  １５−２６．  Ｍａｒｔｉｎｕｓ  Ｎｉｊｈｏｆｆ，  Ｔｈｅ  Ｈａｇｕｅ，  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，  １９８４．  
Ｏｌａｆｓｏｎ，  Ｐ．，  Ａ．Ｄ．，  ＭａｃＣａｌｌｕｍ，  ａｎｄ  Ｆ．Ｈ．  Ｆｏｘ，  “Ａｎ  ａｐｐａｒｅｎｔｌｙ  ｎｅｗ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｏｆ  ｃａｔｔｌｅ，”  Ｃｏｒｎｅｌｌ  Ｖｅｔ．，  ３６：２０５−２１３，  １９４６．
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Ｓｃｈａｌｋ，  Ｊ．Ａ．Ｃ．，  Ｅｌｚｅｎ  ，Ｃ．Ｖ．Ｄ．，  Ｏｖｅｌｇｏｎｎｅ，  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｉｎ  ｌｉｖｅ  ｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ，”  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  Ｍｅｔｈ．，  １１７：１７９−１８７，  ２００４．
Ｓｃｈｅｆｅｒｓ，  Ｊ．，  Ｍｕｎｏｚ−Ｚａｎｚｉ，  Ｃ．，  Ｃｏｌｌｉｎｓ，  Ｊ．Ｅ．，  Ｇｏｙａｌ，  Ｓ．Ｍ．，  ａｎｄ  Ａｍｅｓ，  Ｔ．Ｒ．，  “Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｅｃｏｌｏｓｔｒａｌ  ｓｅｒｕｍ  ｓａｍｐｌｅｓ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  Ｂｏｖｉｎｅ  ｖｉｒａｌ  ｄｉａｒｒｈｅａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｌａｒｇｅ  ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  ｄａｉｒｙ  ｈｅｒｄｓ，”  Ｊ．  Ｖｅｔ．  Ｄｉａｇｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．，  ２０：６２５−６２８，  ２００８．
Ｔａｎｎｅｒ，  Ｊ．Ｅ．，  ａｎｄ  Ａ．  Ｐ．  Ｍｏｒｇａｎ，  “Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｔｒｉａｌｓ，”  Ｖｅｔ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ３７（３−４）：２２１−２３０，  １９９３．
Ｔａｕｔｚ，  Ｎ．，  Ｅｌｂｅｒｓ，  Ｋ．，  Ｓｔｏｌｌ，  Ｄ．，  Ｍｅｙｅｒｓ，  Ｇ．，  ａｎｄ  Ｔｈｉｅｌ，  Ｈ．Ｊ．，  “Ｓｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｏｆ  ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓｅｓ：  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｓｉｔｅｓ，”  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ７１（７）：５４１５−５４２２，  １９９７．
Ｔｈｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｔｈｅ  ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓｅｓ，”  Ｉｎ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  Ｆｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （ｅｄｓ．）  （Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ＰＡ，  ＵＳＡ），  ｐｐ．１０５９−１０７３，  １９９６．
Ｖｉｌｃｅｋ，  Ｓ，  Ｐａｔｏｎ，  Ｄ．Ｊ．，  Ｄｕｒｋｏｖｉｃ，  Ｂ，  ｅｔ  ａｌ．  “Ｂｏｖｉｎｅ  ｖｉｒａｌ  ｄｉａｒｒｈｅａ  ｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ  １  ｃａｎ  ｂｅ  ｓｅｐａｒａｔｅｄ  ｉｎｔｏ  ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｅｌｅｖｅｎ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｇｒｏｕｐｓ．”  Ａｒｃｈ．  Ｖｉｒｏｌ．，  １４６：９９−１１５，  ２００１．
Ｗａｎｇ，  Ｆ，  Ｐｕｄｄｙ，  Ａ．Ｃ．，  Ｍａｔｈｉｓ，  Ｂ．Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｕｓｉｎｇ  ＱＰＣＲ  ｔｏ  ａｓｓｉｇｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｐｏｔｅｎｃｉｅｓ  ｔｏ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｂａｓｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ：  ｔｏｗａｒｄ  ａ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｆａｃｉｌｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｖｅｃｔｏｒ  ｐｏｔｅｎｃｙ，”  Ｖａｃｃｉｎｅ，  ２３：４５００−４５０８，  ２００５．
Ｗｉｓｋｅｒｃｈｅｎ，  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｍ．Ｓ．  Ｃｏｌｌｅｔｔ，  “Ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐ８０  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  ｖｉｒａｌ  ｄｉａｒｒｈｅａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｓ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，”  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  １８４（１）：３４１−３５０，  １９９１．
Ｗｒｅｎ，  Ｇ．，  “Ｎｅｗ  Ｔｈｉｎｋｉｎｇ  ｏｎ  ＢＲＳＶ：    Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎｔｏ  ＢＲＳＶ  ａｎｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｎｅｗ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｂｏｕｔ  ｈｏｗ  ｔｈｅ  ｖｉｒｕｓ  ｂｅｈａｖｅｓ  ａｎｄ  ｈｏｗ  ｉｔ  ｍａｙ  ｉｎｔｅｒａｃｔ  ｗｉｔｈ  ｋｉｌｌｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ，”  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａｎ，  （Ｆｅｂｒｕａｒｙ）  ｐｐ．  １６−１９，  ２００１．
Ｘｕ，  Ｊ．，  Ｅ．  Ｍｅｎｄｅｚ，  Ｐ．Ｒ．  Ｃａｒｏｎ，  Ｃ．  Ｌｉｎ，  Ｍ．Ａ．  Ｍｕｒｃｋｏ，  Ｍ．Ｓ．  Ｃｏｌｌｅｔｔ，  ａｎｄ  Ｃ．Ｍ．  Ｒｉｃｅ，  “Ｂｏｖｉｎｅ  ｖｉｒａｌ  ｄｉａｒｒｈｅａ  ｖｉｒｕｓ  ＮＳ３  ｓｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ：  ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｓｉｔｅｓ，  ｃｏｆａｃｔｏｒ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ，  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ａｎ  ｅｎｚｙｍｅ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，”    Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ７１（７）：５３１２−５３２２，  １９９７．
Ｘｕｅ，  Ｗ．，  Ｄ．  Ｍａｔｔｉｃｋ，  Ｌ．  Ｓｍｉｔｈ，  Ｊ．  Ｕｍｂａｕｇｈ，  ａｎｄ  Ｅ．  Ｔｒｉｇｏ，  “Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｌｉｖｅ  ｂｏｖｉｎｅ  ｖｉｒａｌ  ｄｉａｒｒｈｅａ  ｖｉｒｕｓ  （ＢＶＤＶ）  ｔｙｐｅ  １ａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ  ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ  ｃａｌｖｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｗｉｔｈ  ＢＶＤＶ  ｔｙｐｅ  １  ｂ  ｓｔｒａｉｎｓ，”  ，  Ｖａｃｃｉｎｅ，  ２９（１）：７０−７６，  Ｄｅｃ．  １０，  ２０１０，  ［ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ  Ｏｃｔ．  ２７，  ２０１０］．
【０３４３】
本明細書に開示され、特許請求される組成物および方法の全ては、本開示を考慮して過度の実験を行わずに生成され、実施され得る。本発明の組成物および方法は例示的な実施形態に関して記載されているが、本発明の概念、精神および範囲から逸脱せずに、変更が、本明細書に記載される組成物、方法および方法の工程の順序に適用されてもよいことは当業者に明らかであろう。より具体的には、化学的および生理学的の両方に関連する特定の因子が、同じまたは同様の結果を達成する限り、本明細書に記載される因子と置き換えられてもよいことは明らかであろう。当業者に明らかな全てのそのような置換および修飾は、本発明の精神、添付の特許請求の範囲により規定される範囲および概念の範囲内であるとみなされる。したがって、特許されることを目的とする排他的な権利が以下の特許請求の範囲に記載される。
【配列表】
0006053036000001.app