(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列に下記の（１）〜（１７）；
（１）２番目がイソロイシン、４６番目がメチオニン、
（２）５番目がアルギニン、２３番目がスレオニン、１００番目がスレオニン、２０１番目がリジン、
（３）２６番目がチロシン、
（４）２８番目がヒスチジン、６１番目がグリシン、２３４番目がロイシン、
（５）６８番目がセリン、
（６）８０番目がチロシン、１３０番目がアスパラギン、
（７）８１番目がスレオニン、
（８）８３番目がアラニン、
（９）８８番目がセリン、
（１０）９５番目がグリシン、
（１１）９６番目がリジン、
（１２）１０５番目がスレオニン、２２６番目がバリン、
（１３）１１９番目がグルタミン酸、１９６番目がロイシン、
（１４）１２３番目がグリシン、
（１５）１５２番目がセリン、
（１６）２００番目がバリン、および
（１７）２３０番目がイソロイシン、
から選択されるアミノ酸置換が導入されており、
配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるカルボニル還元酵素と比較して、塩化物イオン存在下での安定性が向上しているポリペプチド。
【請求項２】
配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列に下記の（１）〜（５５）；
（１）２番目がアラニン、４０番目がアルギニン、２２９番目がバリン、
（２）２番目がイソロイシン、
（３）２番目がイソロイシン、１１番目がバリン、４６番目がメチオニン、６４番目がスレオニン、
（４）２番目がイソロイシン、１１番目がスレオニン、４６番目がメチオニン、
（５）２番目がイソロイシン、２８番目がロイシン、４６番目がメチオニン、
（６）２番目がイソロイシン、２９番目がロイシン、３２番目がヒスチジン、４６番目がメチオニン、
（７）２番目がイソロイシン、３２番目がヒスチジン、４６番目がメチオニン、
（８）２番目がイソロイシン、４５番目がスレオニン、４６番目がメチオニン、
（９）２番目がイソロイシン、４５番目がバリン、４６番目がメチオニン、
（１０）２番目がイソロイシン、４５番目がプロリン、４６番目がメチオニン、１６８番目がアルギニン、
（１１）２番目がイソロイシン、４５番目がセリン、４６番目がメチオニン、９０番目がセリン、
（１２）２番目がイソロイシン、４６番目がイソロイシン、
（１３）２番目がイソロイシン、４６番目がメチオニン、
（１４）２番目がイソロイシン、４６番目がメチオニン、４８番目がスレオニン、
（１５）２番目がイソロイシン、４６番目がメチオニン、６２番目がスレオニン、
（１６）２番目がイソロイシン、４６番目がメチオニン、６５番目がスレオニン、
（１７）２番目がイソロイシン、４６番目がメチオニン、６６番目がバリン、
（１８）２番目がイソロイシン、４６番目がメチオニン、６８番目がセリン、
（１９）２番目がイソロイシン、４６番目がメチオニン、７８番目がヒスチジン、
（２０）２番目がイソロイシン、４６番目がメチオニン、１７７番目がアラニン、
（２１）５番目がアルギニン、２３番目がスレオニン、１００番目がスレオニン、２０１番目がリジン、
（２２）８番目がアラニン、
（２３）２８番目がヒスチジン、６１番目がグリシン、２３４番目がロイシン、
（２４）２８番目がヒスチジン、６２番目がアラニン、７９番目がアラニン、１６４番目がスレオニン、
（２５）２９番目がシステイン、
（２６）３０番目がセリン、２３１番目がフェニルアラニン、
（２７）３３番目がロイシン、
（２８）３４番目がメチオニン、
（２９）４６番目がメチオニン、
（３０）４６番目がメチオニン、６８番目がセリン、
（３１）６２番目がアラニン、１１５番目がイソロイシン、１４１番目がバリン、１６９番目がセリン、１８０番目がシステイン、２４２番目がスレオニン、２６２番目がメチオニン、
（３２）６８番目がセリン、
（３３）６８番目がロイシン、１０５番目がバリン、
（３４）７１番目がグルタミン、
（３５）７２番目がフェニルアラニン、１３３番目がアスパラギン酸、
（３６）７５番目がシステイン、１３７番目がスレオニン、２０３番目がグリシン、
（３７）７５番目がヒスチジン、２２６番目がスレオニン、
（３８）８０番目がチロシン、１３０番目がアスパラギン、
（３９）８１番目がスレオニン、
（４０）８３番目がアラニン、
（４１）８３番目がアラニン、１７６番目がバリン、
（４２）８８番目がセリン、
（４３）９０番目がセリン、
（４４）９５番目がグリシン、
（４５）９６番目がアスパラギン酸、１７０番目がアルギニン、
（４６）１０３番目がヒスチジン、１８９番目がスレオニン、１９１番目がイソロイシン、
（４７）１０８番目がスレオニン、１４６番目がアラニン、１６４番目がスレオニン、２１８番目がバリン、
（４８）１１６番目がスレオニン、１２８番目がヒスチジン、
（４９）１１９番目がグルタミン酸、１９６番目がロイシン、
（５０）１２３番目がグリシン、
（５１）１５２番目がセリン、
（５２）２０１番目がアラニン、
（５３）２１１番目がバリン、２６４番目がトリプトファン、
（５４）２２５番目がセリン、２６４番目がアルギニン、および
（５５）２４０番目がアラニン、
から選択されるアミノ酸置換および／またはアミノ酸付加が導入されており、
配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるカルボニル還元酵素と比較して、塩化物イオンによる反応阻害に対する抵抗性が向上しているポリペプチド。
【請求項３】
配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列に下記の（１）〜（４４）；
（１）２番目がアラニン、４０番目がアルギニン、２２９番目がバリン、
（２）２番目がイソロイシン、１１番目がバリン、４６番目がメチオニン、６４番目がスレオニン、
（３）２番目がイソロイシン、１１番目がスレオニン、４６番目がメチオニン、
（４）２番目がイソロイシン、２８番目がロイシン、４６番目がメチオニン、
（５）２番目がイソロイシン、２９番目がロイシン、３２番目がヒスチジン、４６番目がメチオニン、
（６）２番目がイソロイシン、３２番目がヒスチジン、４６番目がメチオニン、
（７）２番目がイソロイシン、４５番目がスレオニン、４６番目がメチオニン、
（８）２番目がイソロイシン、４５番目がバリン、４６番目がメチオニン、
（９）２番目がイソロイシン、４５番目がプロリン、４６番目がメチオニン、１６８番目がアルギニン、
（１０）２番目がイソロイシン、４５番目がセリン、４６番目がメチオニン、９０番目がセリン、
（１１）２番目がイソロイシン、４６番目がイソロイシン、
（１２）２番目がイソロイシン、４６番目がメチオニン、
（１３）２番目がイソロイシン、４６番目がメチオニン、４８番目がスレオニン、
（１４）２番目がイソロイシン、４６番目がメチオニン、６２番目がスレオニン、
（１５）２番目がイソロイシン、４６番目がメチオニン、６５番目がスレオニン、
（１６）２番目がイソロイシン、４６番目がメチオニン、６６番目がバリン、
（１７）２番目がイソロイシン、４６番目がメチオニン、６８番目がセリン、
（１８）２番目がイソロイシン、４６番目がメチオニン、７８番目がヒスチジン、
（１９）２番目がイソロイシン、４６番目がメチオニン、１７７番目がアラニン、
（２０）８番目がアラニン、
（２１）２８番目がヒスチジン、６１番目がグリシン、２３４番目がロイシン、
（２２）２８番目がヒスチジン、６２番目がアラニン、７９番目がアラニン、１６４番目がスレオニン、
（２３）２９番目がシステイン、
（２４）３３番目がロイシン、
（２５）３４番目がメチオニン、
（２６）４６番目がメチオニン、６８番目がセリン、
（２７）６８番目がセリン、
（２８）７１番目がグルタミン、
（２９）７５番目がシステイン、１３７番目がスレオニン、２０３番目がグリシン、
（３０）７５番目がヒスチジン、２２６番目がスレオニン、
（３１）８０番目がチロシン、１３０番目がアスパラギン、
（３２）８１番目がスレオニン、
（３３）８３番目がアラニン、
（３４）８３番目がアラニン、１７６番目がバリン、
（３５）８８番目がセリン、
（３６）９０番目がセリン、
（３７）９５番目がグリシン、
（３８）９６番目がアスパラギン酸、１７０番目がアルギニン、
（３９）１１６番目がスレオニン、１２８番目がヒスチジン、
（４０）１１９番目がグルタミン酸、１９６番目がロイシン、
（４１）１２３番目がグリシン、
（４２）１５２番目がセリン、
（４３）２０１番目がアラニン、および
（４４）２２５番目がセリン、２６４番目がアルギニン、
から選択されるアミノ酸置換が導入されており、
配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるカルボニル還元酵素と比較して、有機塩化物存在下での安定性が向上しているポリペプチド。
【請求項４】
前記有機塩化物がクロロケトンである、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記クロロケトンがクロロアセトン、３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オンのいずれかである、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち次の群；
２番目がイソロイシン、４６番目がメチオニン、６８番目がセリン、および９５番目がグリシン、
から選択される１つもしくは複数のアミノ酸置換が導入されており、
配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるカルボニル還元酵素と比較して、補酵素に対する親和性が高いポリペプチド。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項７に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項９】
還元型補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
還元型補酵素再生能を有するポリペプチドがグルコース脱水素酵素である、請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれかに記載のベクターにより宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項１２】
前記宿主細胞が大腸菌である請求項１１記載の形質転換体。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれかに記載のポリペプチド、または、請求項１１もしくは請求項１２に記載の形質転換体および／またはその処理物を、カルボニル化合物に作用させることを特徴とする、アルコール化合物の製造方法。
【請求項１４】
前記カルボニル化合物が非対称ケトンであり、生成物が光学活性アルコールである、請求項１３に記載の製造方法。
【請求項１５】
前記カルボニル基を有する化合物が、下記式（１）：
【化１】
0005889785.tif 000017
（式中、Ｒ１及びＲ２は水素原子、ハロゲン原子、置換されていても良いアルキル基、置換されていても良いアラルキル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていても良いアルコキシ基、アミノ基、またはニトロ基であるか、もしくは、Ｒ１とＲ２が互いに結合し環を形成しても良い。但し、Ｒ１とＲ２は構造が異なる）で表される非対称ケトンであり、その生成物が下記式（２）：
【化２】
0005889785.tif 000018
（式中、Ｒ１、Ｒ２は前記と同じ、＊は不斉炭素を表す）で表される光学活性アルコールである、請求項１４に記載の製造方法。
【請求項１６】
前記カルボニル基を有する化合物が、３−キヌクリジノンもしくはその塩、３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オン、３−クロロ−１−（２−フェニル）プロパン−１−オンのいずれかである請求項１４に記載の製造方法。
【請求項１７】
請求項１〜６のいずれかに記載のポリペプチド、または、請求項１１もしくは請求項１２に記載の形質転換体および／またはその処理物を、カルボニル化合物に作用させて、光学活性アルコールを得る工程を有することを特徴とする、医薬品原薬の製造方法。
【請求項１８】
前記光学活性アルコールが（Ｒ）−３−キヌクリジノンであり医薬品原薬がソリフェナシン、または、前記光学活性アルコールが（Ｓ）−３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オールであり医薬品原薬がデュロキセチンである、請求項１７に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改変型カルボニル還元酵素、その遺伝子、その遺伝子を含むベクター、そのベクターで形質転換された形質転換体、およびそれらを利用した光学活性アルコールの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬品や農薬の合成原料及び中間体として有用な光学活性アルコールの製造方法の一つとして、カルボニル化合物のカルボニル基を微生物や酵素により不斉還元する方法が知られている。カルボニル化合物を不斉還元する酵素（以下、カルボニル還元酵素）は各種光学活性アルコールの製造において有用である。【０００３】
カルボニル還元酵素を用いた不斉還元反応では、基質や生成物、ｐＨ調整に使用する酸やアルカリ、反応液性を改善するために添加される界面活性剤や有機溶媒などにより酵素が失活、もしくは酵素反応が阻害されることがある。例えば、非特許文献１には、ハロゲン原子を含む化合物がごく低濃度で存在する場合でも、不斉還元酵素の活性が著しく阻害されることが記載されている。【０００４】
これに対し、機能が改善されたカルボニル還元酵素としては、例えば、ランダム変異導入により作製された、有機溶媒に耐性を持つ酵素が知られている（特許文献１）。【０００５】
ハロゲン原子を有する化合物は、基質、生成物、酸、アルカリ、界面活性剤、及び有機溶媒に含まれることが多いので、こうした酵素失活や酵素反応阻害を回避するカルボニル還元酵素を提供することができれば、反応時間の短縮や反応収率の向上につながり、光学活性アルコールを工業的に生産する上で有用である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−６１１１１号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１０４，４１６−４１９（２００７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、ハロゲン原子存在下で反応性が低下する野生型酵素を改変し、ハロゲン原子存在下での反応性が野生型酵素よりも向上した改変型カルボニル還元酵素を提供することである。また、該酵素または該酵素を生産する形質転換体を利用した光学活性アルコールの効率的な製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、野生型酵素遺伝子にランダムに変異を導入して作製した変異型酵素ライブラリーの中から、ハロゲン原子存在下での反応性が野生型酵素よりも向上した改変型カルボニル還元酵素を見出し、本発明を完成するに至った。【００１０】
すなわち、本発明は以下の（ａ）〜（ｃ）；（ａ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列と配列同一性が８５％以上であり、（ｂ）３−キヌクリジノンを還元して（Ｒ）−３−キヌクリジノールを生成し、もしくは、３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オンを還元して（Ｓ）−３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オールを生成し、（ｃ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるカルボニル還元酵素と比較して、ハロゲン原子存在下でのカルボニル化合物に対する反応性が高い、の性質を示すポリペプチドに関する。【００１１】
前記ハロゲン原子は塩素原子であることが好ましい。【００１２】
前記配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち次の群；２、５、８、１１、２３、２６、２８、２９、３０、３２、３３、３４、４０、４５、４６、４８、６１、６２、６４、６５、６６、６８、７１、７２、７５、７８、７９、８０、８１、８３、８８、９０、９５、９６、１００、１０３、１０５、１０８、１１５、１１６、１１９、１２３、１２８、１３０、１３３、１３７、１４１、１４６、１５２、１６４、１６８、１６９、１７０、１７６、１７７、１８０、１８９、１９１、１９６、２００、２０１、２０３、２１１、２１８、２２５、２２６、２２９、２３０、２３１、２３４、２４０、２４２、および２６２番目、から選択される１つもしくは複数のアミノ酸が置換されているか、および／またはＮ末端及びＣ末端のいずれかにアミノ酸が１つもしくは複数個付加されていることが好ましい。【００１３】
前記配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち次の群；２番目がイソロイシンもしくはアラニン、５番目がアルギニン、８番目がアラニン、１１番目がバリンもしくはスレオニン、２３番目がスレオニン、２６番目がチロシン、２８番目がヒスチジンもしくはロイシン、２９番目がロイシン、３０番目がセリン、３２番目がヒスチジン、３３番目がロイシン、３４番目がメチオニン、４０番目がアルギニン、４５番目がセリンもしくはスレオニン、バリン、プロリン、４６番目がメチオニンもしくはイソロイシン、４８番目がスレオニン、６１番目がグリシン、６２番目がアラニンもしくはスレオニン、６４番目がスレオニン、６５番目がスレオニン、６６番目がバリン、６８番目がセリンもしくはロイシン、７１番目がグルタミン、７２番目がフェニルアラニン、７５番目がシステインもしくはヒスチジン、７８番目がヒスチジン、７９番目がアラニン、８０番目がチロシン、８１番目がスレオニン、８３番目がアラニン、８８番目がセリン、９０番目がセリン、９５番目がグリシン、９６番目がアスパラギン酸もしくはリジン、１００番目がスレオニン、１０３番目がヒスチジン、１０５番目がスレオニンもしくはバリン、１０８番目がスレオニン、１１５番目がイソロイシン、１１６番目がスレオニン、１１９番目がグルタミン酸、１２３番目がグリシン、１２８番目がヒスチジン、１３０番目がアスパラギン、１３３番目がアスパラギン酸、１３７番目がスレオニン、１４１番目がバリン、１４６番目がアラニン、１５２番目がセリン、１６４番目がスレオニン、１６８番目がアルギニン、１６９番目がセリン、１７０番目がアルギニン、１７６番目がバリン、１７７番目がアラニン、１８０番目がシステイン、１８９番目がスレオニン、１９１番目がイソロイシン、１９６番目がロイシン、２００番目がバリン、２０１番目がアラニン、２０３番目がグリシン、２１１番目がバリン、２１８番目がバリン、２２５番目がセリン、２２６番目がスレオニンもしくはバリン、２２９番目がバリン、２３０番目がイソロイシン、２３１番目がフェニルアラニン、２３４番目がロイシン、２４０番目がアラニン、２４２番目がスレオニン、２６２番目がメチオニンに置換、Ｃ末端にトリプトファン、およびアルギニンが付加、から選択される１つもしくは複数のアミノ酸置換および／またはアミノ酸付加が導入されていることが好ましい。【００１４】
前記ポリペプチドは、前記（ａ）〜（ｃ）に加え、さらに（ｄ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるカルボニル還元酵素と比較して補酵素に対する親和性が高いとの性質を示すことが好ましい。なお、補酵素に対する親和性の観点では、前記（ｃ）の活性は必須ではなく、前記（ａ）、（ｂ）および（ｄ）の性質を示すポリペプチドであれば補酵素に対して高い親和性を有する。【００１５】
前記配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち次の群；２、４６、６８、および９５番目、
から選択される１つもしくは複数のアミノ酸が置換されていることが好ましく、次の群；２番目がイソロイシン、４６番目がメチオニン、６８番目がセリン、および９５番目がグリシン、
から選択される１つもしくは複数のアミノ酸置換が導入されていることがより好ましい。【００１６】
本発明は、また、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。【００１７】
本発明は、また、前記ポリヌクレオチドを含むベクターに関する。【００１８】
前記ベクターは、還元型補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含むものであることが好ましく、還元型補酵素再生能を有するポリペプチドがグルコース脱水素酵素であることがより好ましい。【００１９】
本発明は、また、前記ベクターにより宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体に関する。【００２０】
前記宿主細胞が大腸菌であることが好ましい。【００２１】
本発明は、また、前記ポリペプチド、または、前記形質転換体および／またはその処理物を、カルボニル化合物に作用させることを特徴とする、アルコール化合物の製造方法に関する。【００２２】
前記カルボニル化合物が非対称ケトンであり、生成物が光学活性アルコールであることが好ましい。【００２３】
前記カルボニル基を有する化合物が、下記式（１）：
【化１】
0005889785.tif 000002
（式中、Ｒ１及びＲ２は水素原子、ハロゲン原子、置換されていても良いアルキル基、置換されていても良いアラルキル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていても良いアルコキシ基、アミノ基、またはニトロ基であるか、もしくは、Ｒ１とＲ２が互いに結合し環を形成しても良い。但し、Ｒ１とＲ２は構造が異なる）で表される非対称ケトンであり、その生成物が下記式（２）：
【化２】
0005889785.tif 000003
（式中、Ｒ１、Ｒ２は前記と同じ、＊は不斉炭素を表す）で表される光学活性アルコールであることが好ましい。【００２４】
前記カルボニル基を有する化合物が、３−キヌクリジノンもしくはその塩、３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オン、３−クロロ−１−（２−フェニル）プロパン−１−オンのいずれかであることが好ましい。【００２５】
本発明は、また、前記ポリペプチド、または、前記形質転換体および／またはその処理物を、カルボニル化合物に作用させて光学活性アルコールを得る工程を有することを特徴とする、医薬品原薬の製造方法に関する。【００２６】
前記光学活性アルコールが（Ｒ）−３−キヌクリジノンであり医薬品原薬がソリフェナシン、または、前記光学活性アルコールが（Ｓ）−３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オールであり医薬品原薬がデュロキセチンであることが好ましい。
【発明の効果】
【００２７】
本発明により、ハロゲン原子存在下での反応性が野生型よりも向上した改変型カルボニル還元酵素及びその遺伝子、その遺伝子を含むベクター、そのベクターで形質転換された形質転換体、その形質転換体の処理物、およびそれらを利用した光学活性アルコールの効率的な製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明の参考例１及び参考例２に関する組換えベクターの構築図である。
【図２】比較例４の測定結果を示すラインウィーバー・バーク・プロットである。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明のポリペプチドは、以下の（ａ）〜（ｃ）の性質を示すことを特徴とする：
（ａ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列と配列同一性が８５％以上であり、（ｂ）３−キヌクリジノンを還元して（Ｒ）−３−キヌクリジノールを生成し、もしくは、３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オンを還元して（Ｓ）−３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オールを生成し、（ｃ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるカルボニル還元酵素と比較して、ハロゲン原子存在下でのカルボニル化合物に対する反応性が高い。
【００３０】
［変異の記載方法］
なお、本明細書において、アミノ酸、ペプチド、タンパク質は下記に示すＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会（ＣＢＮ）で採用された略号を用いて表される。また、特に明示しない限り、ペプチドおよびタンパク質のアミノ酸残基の配列は、左端から右端にかけてＮ末端からＣ末端となるように表される。また、参照を容易にするため、一般的に用いられている下記の命名法を適用する。１つは、“もとのアミノ酸；位置；置換したアミノ酸”と記述する方法であり、例えば、位置６４におけるチロシンのアスパラギン酸への置換は「Ｙ８４Ｄ」と表される。多重変異については、ハイフン記号“−”により分けることで表記する。例えば、「Ｓ４１Ａ−Ｙ６４Ｄ」とは、位置４１のセリンをアラニンへ、かつ、位置６４のチロシンをアスパラギン酸へ置換することを示す。
【００３１】
［アミノ酸の略号］
Ａ＝Ａｌａ＝アラニン、Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン、  
Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸、Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸、  
Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン、Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン、  
Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン、Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン、  
Ｋ＝Ｌｙｓ＝リシン、Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン、  
Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン、Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン、  
Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン、Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン、  
Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン、Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン、  
Ｔ＝Ｔｈｒ＝スレオニン、Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン、  
Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン、Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン    
【００３２】
［配列同一性］
ポリペプチドやポリヌクレオチドの「配列同一性」とは、対比される２つのポリペプチドまたはポリヌクレオチドを最適に整列させ、アミノ酸又は核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が両方の配列で一致した位置の数を比較塩基総数で除し、そして、この結果に１００を乗じた数値で表される。
【００３３】
配列同一性は、例えば、以下の配列分析用ツールを用いて算出し得る；ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ（ウィスコンシン大学）、ｔｈｅ  ＥｘＰＡＳｙ  Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ分子生物学用サーバー（スイスバイオインフォマティックス研究所）、ＢＬＡＳＴ（米国生物工学情報センター）、ＧＥＮＥＴＹＸ（ゼネティックス社）。
【００３４】
本発明において、変異を導入する前の野生型酵素は、配列表の配列番号１で表される２６３個のアミノ酸残基からなり、３−キヌクリジノンを還元して（Ｒ）−３−キヌクリジノールを生成する、もしくは、３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オンを還元して（Ｓ）−３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オールを生成する能力を有するポリペプチドである。
【００３５】
ポリペプチドの起源は限定されるものではないが、好ましくはバークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属に属する微生物、より好ましくはバークホルデリア・エスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．）ＹＴ株由来のカルボニル還元酵素である。本菌株は、小野寺らにより見出された微生物であり、平成２０年８月１８日付けで、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−６１３として、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託されている。また、野生型酵素は塩化物により反応が阻害されることが知られている（Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１０４，４１６−４１９（２００７））。
【００３６】
本発明の野生型酵素は、配列表の配列番号２に示されるポリヌクレオチドによりコードされる。このポリヌクレオチドは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））等に記載される通常の遺伝子工学的手法に準じてバークホルデリア属、好ましくはバークホルデリア・エスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．）ＹＴ株から取得することができる。
【００３７】
即ち、バークホルデリア・エスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．）ＹＴ株のゲノムＤＮＡから後述の［参考例１］に記載の方法でＰＣＲを行うことにより、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、または配列番号２で示されるポリヌクレオチドを増幅して野生型酵素遺伝子を調製することができる。
【００３８】
本発明のポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列に改変を加えて得られるものであってもよい。
【００３９】
配列番号１に示すアミノ酸配列に加える改変としては、置換、付加、挿入もしくは欠失が挙げられ、１種類の改変（例えば置換）のみを含むものであっても良いし、２種以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいても良い。上記の「複数個のアミノ酸」とは、例えば、４０個、好ましくは２０個、より好ましくは１０個、さらに好ましくは８個、５個、４個、３個、または２個のアミノ酸を意味する。
【００４０】
また、改変を加えた後のアミノ酸配列と、配列番号１に示すアミノ酸配列との配列の同一性は８５％以上、好ましくは９２％以上、より好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、９８％以上、９８．５％以上、９９％以上である。
【００４１】
改変を加えたカルボニル還元酵素は、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、少なくとも１個、または複数個のアミノ酸が置換、付加、挿入もしくは欠失されたアミノ酸配列を有し、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のカルボニル還元酵素と配列同一性が８５％以上のポリペプチドからなる酵素であることが好ましい。
【００４２】
配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列においてアミノ酸が置換、挿入、欠失、付加される場所は特に制限されないが、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、２、５、８、１１、２３、２６、２８、２９、３０、３２、３３、３４、４０、４５、４６、４８、６１、６２、６４、６５、６６、６８、７１、７２、７５、７８、７９、８０、８１、８３、８８、９０、９５、９６、１００、１０３、１０５、１０８、１１５、１１６、１１９、１２３、１２８、１３０、１３３、１３７、１４１、１４６、１５２、１６４、１６８、１６９、１７０、１７６、１７７、１８０、１８９、１９１、１９６、２００、２０１、２０３、２１１、２１８、２２５、２２６、２２９、２３０、２３１、２３４、２４０、２４２、２６２番目のアミノ酸のいずれか１つ、もしくは複数が置換されており、および／またはＮ末端、Ｃ末端のいずれかにアミノ酸が１つもしくは複数個付加されているポリペプチドであることが好ましい。
【００４３】
さらに好ましくは、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち次の群；２番目がイソロイシンもしくはアラニン、５番目がアルギニン、８番目がアラニン、１１番目がバリンもしくはスレオニン、２３番目がスレオニン、２６番目がチロシン、２８番目がヒスチジンもしくはロイシン、２９番目がロイシン、３０番目がセリン、３２番目がヒスチジン、３３番目がロイシン、３４番目がメチオニン、４０番目がアルギニン、４５番目がセリンもしくはスレオニン、バリン、プロリン、４６番目がメチオニンもしくはイソロイシン、４８番目がスレオニン、６１番目がグリシン、６２番目がアラニンもしくはスレオニン、６４番目がスレオニン、６５番目がスレオニン、６６番目がバリン、６８番目がセリンもしくはロイシン、７１番目がグルタミン、７２番目がフェニルアラニン、７５番目がシステインもしくはヒスチジン、７８番目がヒスチジン、７９番目がアラニン、８０番目がチロシン、８１番目がスレオニン、８３番目がアラニン、８８番目がセリン、９０番目がセリン、９５番目がグリシン、９６番目がアスパラギン酸もしくはリジン、１００番目がスレオニン、１０３番目がヒスチジン、１０５番目がスレオニンもしくはバリン、１０８番目がスレオニン、１１５番目がイソロイシン、１１６番目がスレオニン、１１９番目がグルタミン酸、１２３番目がグリシン、１２８番目がヒスチジン、１３０番目がアスパラギン、１３３番目がアスパラギン酸、１３７番目がスレオニン、１４１番目がバリン、１４６番目がアラニン、１５２番目がセリン、１６４番目がスレオニン、１６８番目がアルギニン、１６９番目がセリン、１７０番目がアルギニン、１７６番目がバリン、１７７番目がアラニン、１８０番目がシステイン、１８９番目がスレオニン、１９１番目がイソロイシン、１９６番目がロイシン、２００番目がバリン、２０１番目がアラニン、２０３番目がグリシン、２１１番目がバリン、２１８番目がバリン、２２５番目がセリン、２２６番目がスレオニンもしくはバリン、２２９番目がバリン、２３０番目がイソロイシン、２３１番目がフェニルアラニン、２３４番目がロイシン、２４０番目がアラニン、２４２番目がスレオニン、２６２番目がメチオニンに置換、Ｃ末端にトリプトファンもしくはアルギニンが付加、からなるいずれかのアミノ酸置換および／またはアミノ酸付加が１つもしくは複数導入されているポリペプチドである。
【００４４】
また、本発明のポリペプチドは、塩化物イオン存在下での安定性の向上の観点から、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち次の群；２番目がイソロイシン、２６番目がチロシン、２８番目がヒスチジン、４６番目がメチオニン、６１番目がグリシン、６８番目がセリン、８０番目がチロシン、８１番目がスレオニン、８３番目がアラニン、９５番目がグリシン、９６番目がリジン、１１９番目がグルタミン酸、１２３番目がグリシン、１３０番目がアスパラギン、１５２番目がセリン、１９６番目がロイシン、２００番目がバリン、２３０番目がイソロイシン、２３４番目がロイシン、から選択される１つもしくは複数のアミノ酸置換が導入されていることが好ましい。
【００４５】
さらに、下記の（１）〜（１７）；（１）２番目がイソロイシン、４６番目がメチオニン、（２）５番目がアルギニン、２３番目がスレオニン、１００番目がスレオニン、２０１番目がリジン、（３）２６番目がチロシン、（４）２８番目がヒスチジン、６１番目がグリシン、２３４番目がロイシン、（５）６８番目がセリン、（６）８０番目がチロシン、１３０番目がアスパラギン、（７）８１番目がスレオニン、（８）８３番目がアラニン、（９）８８番目がセリン、（１０）９５番目がグリシン、（１１）９６番目がリジン、（１２）１０５番目がスレオニン、２２６番目がバリン、（１３）１１９番目がグルタミン酸、１９６番目がロイシン、（１４）１２３番目がグリシン、（１５）１５２番目がセリン、（１６）２００番目がバリン、および（１７）２３０番目がイソロイシン、から選択されるアミノ酸置換が導入されているポリペプチドであることがより好ましい。
【００４６】
また、本発明のポリペプチドは、塩化物イオンによる反応阻害に対する抵抗性の向上の観点から、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列に次の群；２番目がイソロイシンもしくはアラニン、５番目がアルギニン、８番目がアラニン、２３番目がスレオニン、２６番目がチロシン、２８番目がヒスチジンもしくはロイシン、２９番目がロイシン、３０番目がセリン、３２番目がヒスチジン、３３番目がロイシン、３４番目がメチオニン、４０番目がアルギニン、４５番目がセリンもしくはスレオニン、バリン、プロリン、４６番目がメチオニンもしくはイソロイシン、４８番目がスレオニン、６１番目がグリシン、６２番目がアラニンもしくはスレオニン、６５番目がスレオニン、６６番目がバリン、６８番目がセリンもしくはロイシン、７１番目がグルタミン、７２番目がフェニルアラニン、７５番目がシステインもしくはヒスチジン、７８番目がヒスチジン、７９番目がアラニン、８０番目がチロシン、８１番目がスレオニン、８８番目がセリン、９０番目がセリン、９５番目がグリシン、９６番目がアスパラギン酸もしくはリジン、１００番目がスレオニン、１０３番目がヒスチジン、１０５番目がバリン、１０８番目がスレオニン、１１５番目がイソロイシン、１１６番目がスレオニン、１２３番目がグリシン、１２８番目がヒスチジン、１３０番目がアスパラギン、１３３番目がアスパラギン酸、１３７番目がスレオニン、１４１番目がバリン、１４６番目がアラニン、１５２番目がセリン、１６４番目がスレオニン、１６８番目がアルギニン、１６９番目がセリン、１７０番目がアルギニン、１７６番目がバリン、１７７番目がアラニン、１８０番目がシステイン、１８９番目がスレオニン、１９１番目がイソロイシン、２００番目がバリン、２０３番目がグリシン、２１１番目がバリン、２１８番目がバリン、２２５番目がセリン、２２６番目がスレオニン、２２９番目がバリン、２３０番目がイソロイシン、２３１番目がフェニルアラニン、２３４番目がロイシン、２４０番目がアラニン、２４２番目がスレオニン、２６２番目がメチオニンに置換、Ｃ末端にトリプトファン、アルギニンが付加、から選択される１つもしくは複数のアミノ酸置換および／またはアミノ酸付加が導入されていることが好ましい。
【００４７】
さらに、下記の（１）〜（５５）；（１）２番目がアラニン、４０番目がアルギニン、２２９番目がバリン、（２）２番目がイソロイシン、（３）２番目がイソロイシン、１１番目がバリン、４６番目がメチオニン、６４番目がスレオニン、（４）２番目がイソロイシン、１１番目がスレオニン、４６番目がメチオニン、（５）２番目がイソロイシン、２８番目がロイシン、４６番目がメチオニン、（６）２番目がイソロイシン、２９番目がロイシン、３２番目がヒスチジン、４６番目がメチオニン、（７）２番目がイソロイシン、３２番目がヒスチジン、４６番目がメチオニン、（８）２番目がイソロイシン、４５番目がスレオニン、４６番目がメチオニン、（９）２番目がイソロイシン、４５番目がバリン、４６番目がメチオニン、（１０）２番目がイソロイシン、４５番目がプロリン、４６番目がメチオニン、１６８番目がアルギニン、（１１）２番目がイソロイシン、４５番目がセリン、４６番目がメチオニン、９０番目がセリン、（１２）２番目がイソロイシン、４６番目がイソロイシン、（１３）２番目がイソロイシン、４６番目がメチオニン、（１４）２番目がイソロイシン、４６番目がメチオニン、４８番目がスレオニン、（１５）２番目がイソロイシン、４６番目がメチオニン、６２番目がスレオニン、（１６）２番目がイソロイシン、４６番目がメチオニン、６５番目がスレオニン、（１７）２番目がイソロイシン、４６番目がメチオニン、６６番目がバリン、（１８）２番目がイソロイシン、４６番目がメチオニン、６８番目がセリン、（１９）２番目がイソロイシン、４６番目がメチオニン、７８番目がヒスチジン、（２０）２番目がイソロイシン、４６番目がメチオニン、１７７番目がアラニン、（２１）５番目がアルギニン、２３番目がスレオニン、１００番目がスレオニン、２０１番目がリジン、（２２）８番目がアラニン、（２３）２８番目がヒスチジン、６１番目がグリシン、２３４番目がロイシン、（２４）２８番目がヒスチジン、６２番目がアラニン、７９番目がアラニン、１６４番目がスレオニン、（２５）２９番目がシステイン、（２６）３０番目がセリン、２３１番目がフェニルアラニン、（２７）３３番目がロイシン、（２８）３４番目がメチオニン、（２９）４６番目がメチオニン、（３０）４６番目がメチオニン、６８番目がセリン、（３１）６２番目がアラニン、１１５番目がイソロイシン、１４１番目がバリン、１６９番目がセリン、１８０番目がシステイン、２４２番目がスレオニン、２６２番目がメチオニン、（３２）６８番目がセリン、（３３）６８番目がロイシン、１０５番目がバリン、（３４）７１番目がグルタミン、（３５）７２番目がフェニルアラニン、１３３番目がアスパラギン酸、（３６）７５番目がシステイン、１３７番目がスレオニン、２０３番目がグリシン、（３７）７５番目がヒスチジン、２２６番目がスレオニン、（３８）８０番目がチロシン、１３０番目がアスパラギン、（３９）８１番目がスレオニン、（４０）８３番目がアラニン、（４１）８３番目がアラニン、１７６番目がスレオニン、（４２）８８番目がセリン、（４３）９０番目がセリン、（４４）９５番目がグリシン、（４５）９６番目がアスパラギン酸、１７０番目がアルギニン、（４６）１０３番目がヒスチジン、１８９番目がスレオニン、１９１番目がイソロイシン、（４７）１０８番目がスレオニン、１４６番目がアラニン、１６４番目がスレオニン、２１８番目がバリン、（４８）１１６番目がスレオニン、１２８番目がヒスチジン、（４９）１１９番目がグルタミン酸、１９６番目がロイシン、（５０）１２３番目がグリシン、（５１）１５２番目がセリン、（５２）２０１番目がアラニン、（５３）２１１番目がバリン、２６４番目がトリプトファン、（５４）２２５番目がセリン、２６４番目がアルギニン、および（５５）２４０番目がアラニン、から選択されるアミノ酸置換および／またはアミノ酸付加が導入されていることがより好ましい。
【００４８】
また、本発明のポリペプチドは、有機塩化物存在下での安定性の向上の観点から、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列に次の群；２番目がイソロイシン、８番目がアラニン、１１番目がバリンもしくはスレオニン、２６番目がチロシン、２８番目がヒスチジン、３２番目がヒスチジン、３３番目がロイシン、３４番目がメチオニン、４５番目がセリンもしくはスレオニン、４６番目がメチオニンもしくはイソロイシン、４８番目がスレオニン、６１番目がグリシン、６２番目がスレオニン、６４番目がスレオニン、６５番目がスレオニン、６６番目がバリン、６８番目がセリン、７１番目がグルタミン、７５番目がシステインもしくはヒスチジン、７８番目がヒスチジン、７９番目がアラニン、８０番目がチロシン、８１番目がスレオニン、８３番目がアラニン、８８番目がセリン、９０番目がセリン、９５番目がグリシン、９６番目がアスパラギン酸もしくはリジン、１１６番目がスレオニン、１１９番目がグルタミン酸、１２３番目がグリシン、１２８番目がヒスチジン、１３０番目がアスパラギン、１３７番目がスレオニン、１５２番目がセリン、１７０番目がアルギニン、１７６番目がバリン、１７７番目がアラニン、１９６番目がロイシン、２００番目がバリン、２０３番目がグリシン、２２５番目がセリン、２２６番目がスレオニン、２３０番目がイソロイシン、２３４番目がロイシンに置換、Ｃ末端にアルギニンが付加、から選択される１つもしくは複数のアミノ酸置換および／またはアミノ酸付加が１つもしくは複数導入されていることが好ましい。
【００４９】
さらに、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列に下記の（１）〜（４４）；（１）２番目がアラニン、４０番目がアルギニン、２２９番目がバリン、（２）２番目がイソロイシン、１１番目がバリン、４６番目がメチオニン、６４番目がスレオニン、（３）２番目がイソロイシン、１１番目がスレオニン、４６番目がメチオニン、（４）２番目がイソロイシン、２８番目がロイシン、４６番目がメチオニン、（５）２番目がイソロイシン、２９番目がロイシン、３２番目がヒスチジン、４６番目がメチオニン、（６）２番目がイソロイシン、３２番目がヒスチジン、４６番目がメチオニン、（７）２番目がイソロイシン、４５番目がスレオニン、４６番目がメチオニン、（８）２番目がイソロイシン、４５番目がバリン、４６番目がメチオニン、（９）２番目がイソロイシン、４５番目がプロリン、４６番目がメチオニン、１６８番目がアルギニン、（１０）２番目がイソロイシン、４５番目がセリン、４６番目がメチオニン、９０番目がセリン、（１１）２番目がイソロイシン、４６番目がイソロイシン、（１２）２番目がイソロイシン、４６番目がメチオニン、（１３）２番目がイソロイシン、４６番目がメチオニン、４８番目がスレオニン、（１４）２番目がイソロイシン、４６番目がメチオニン、６２番目がスレオニン、（１５）２番目がイソロイシン、４６番目がメチオニン、６５番目がスレオニン、（１６）２番目がイソロイシン、４６番目がメチオニン、６６番目がバリン、（１７）２番目がイソロイシン、４６番目がメチオニン、６８番目がセリン、（１８）２番目がイソロイシン、４６番目がメチオニン、７８番目がヒスチジン、（１９）２番目がイソロイシン、４６番目がメチオニン、１７７番目がアラニン、（２０）８番目がアラニン、（２１）２８番目がヒスチジン、６１番目がグリシン、２３４番目がロイシン、（２２）２８番目がヒスチジン、６２番目がアラニン、７９番目がアラニン、１６４番目がスレオニン、（２３）２９番目がシステイン、（２４）３３番目がロイシン、（２５）３４番目がメチオニン、（２６）４６番目がメチオニン、６８番目がセリン、（２７）６８番目がセリン、（２８）７１番目がグルタミン、（２９）７５番目がシステイン、１３７番目がスレオニン、２０３番目がグリシン、（３０）７５番目がヒスチジン、２２６番目がスレオニン、（３１）８０番目がチロシン、１３０番目がアスパラギン、（３２）８１番目がスレオニン、（３３）８３番目がアラニン、（３４）８３番目がアラニン、１７６番目がバリン、（３５）８８番目がセリン、（３６）９０番目がセリン、（３７）９５番目がグリシン、（３８）９６番目がアスパラギン酸、１７０番目がアルギニン、（３９）１１６番目がスレオニン、１２８番目がヒスチジン、（４０）１１９番目がグルタミン酸、１９６番目がロイシン、（４１）１２３番目がグリシン、（４２）１５２番目がセリン、（４３）２０１番目がアラニン、および（４４）２２５番目がセリン、２６４番目がアルギニン、から選択されるアミノ酸置換が導入されていることがより好ましい。
【００５０】
なお、有機塩化物はクロロケトンであることが好ましく、クロロアセトン、３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オンのいずれかであることがより好ましい。
【００５１】
また、本発明のポリペプチドは、補酵素に対する親和性の観点から、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、２、４６、６８、および９５番目のアミノ酸から選択される１つもしくは複数のアミノ酸が置換されていることが好ましい。
【００５２】
さらに好ましくは、配列表の配列番号１に示すアミノ酸のうち次の群；  
２番目がイソロイシン、４６番目がメチオニン、６８番目がセリン、および９５番目がグリシン、から選択される１つもしくは複数のアミノ酸置換が導入されていることが好ましい。
【００５３】
なお、塩化物イオン存在下での安定性、塩化物イオンによる反応阻害に対する抵抗性、及び有機塩化物存在下での安定性に関しては後述する。
【００５４】
本発明における「３−キヌクリジノンを還元して（Ｒ）−３−キヌクリジノールを生成する活性」は下記評価方法で得られた（Ｒ）−３−キヌクリジノールの光学純度が８５％ｅ．ｅ．以上あればよく、好ましくは９０％ｅ．ｅ．以上、より好ましくは９５％ｅ．ｅ．以上である。最も好ましくは９６、９７、９８、９９％ｅ．ｅ．以上である。
【００５５】
［（Ｒ）−３−キヌクリジノールを生成する能力の評価方法］
０．１Ｍ  ３−キヌクリジノン塩酸塩及び０．１Ｍ  還元型ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰＨ）を含む０．５Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、本発明のポリペプチドを加えて３０℃で反応させる。反応後、ジクロロメタンなどの有機溶媒で抽出操作を行い、下記のガスクロマトグラフィー条件で分析することにより、生成した３−キヌクリジノールの、その立体配置及び光学純度を確認することができる。
【００５６】
＜ガスクロマトグラフィー分析条件＞
カラム：Ｇａｍｍａ  ＤＥＸ（３０ｍ、内径０．２５ｍｍ、ＳＵＰＥＬＣＯ社製）
カラム温度：１５０℃
注入口温度：２２０℃
検出器温度：２２０℃
検出：ＦＩＤ
キャリアーガス：ヘリウム、流量：１００ｋＰａ
保持時間：３−キヌクリジノン  約９．８分、（Ｓ）−３−キヌクリジノール  約１１．５分、（Ｒ）−３−キヌクリジノール  約１２．０分
【００５７】
なお、光学活性３−キヌクリジノールの光学純度は下記式より求めることができる。
Ｒ体の光学純度（％ｅ．ｅ．）＝｛（Ｒ体のピーク面積）−（Ｓ体のピーク面積）｝÷｛（Ｒ体のピーク面積）＋（Ｓ体のピーク面積）｝×１００
【００５８】
また、３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オンを還元して（Ｓ）−３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オールを生成する活性は下記の方法で評価することができる。本発明における「３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オンを還元して（Ｓ）−３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オールを生成する活性」は本評価方法で得られた（Ｓ）−３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オールの光学純度が８５％ｅ．ｅ．以上あればよく、好ましくは９０％ｅ．ｅ．以上、より好ましくは９５％ｅ．ｅ．以上である。最も好ましくは９６、９７、９８、９９％ｅ．ｅ．以上である。
【００５９】
［（Ｓ）−３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オールを生成する能力の評価方法］
１０ｍＭ  ３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オン、１％ジメチルスルホキシド、及び１０ｍＭ  ＮＡＤＰＨを含む０．５Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、本発明のポリペプチドを加えて３０℃で反応させる。反応後、ジクロロメタンなどの有機溶媒で抽出操作を行い、下記のクロマトグラフィー条件で分析することにより、生成した３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オールの、その立体配置及び光学純度を確認することができる。
【００６０】
［高速液体クロマトグラフィーによる分析条件］
カラム：Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ  ＯＤ−Ｈ（２５０ｍｍ、内径４．６μｍ、ダイセル化学工業社製）
カラム温度：３０℃
検出波長：２４０ｎｍ
移動相：ｎ−ヘキサン／イソプロパノール＝９７．５／２．５
保持時間：（Ｓ）−３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オール  約１９．９分、（Ｒ）−３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オール  約２１．５分、３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オン  約１２．２分
【００６１】
なお、（Ｓ）−３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オールの光学純度は下記式より求めることができる。
Ｓ体の光学純度（％ｅ．ｅ．）＝｛（Ｓ体のピーク面積）−（Ｒ体のピーク面積）｝÷｛（Ｓ体のピーク面積）＋（Ｒ体のピーク面積）｝×１００
【００６２】
ハロゲン原子存在下とは、ハロゲン原子のいずれか１つ、または複数を含む化合物と、本発明の酵素が共存する状態を示す。ハロゲン原子とは、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、アスタチン原子のことをいう。ハロゲン原子は、塩素原子であることが好ましい。より好ましくは、塩素分子単体（Ｃｌ２）、塩化物イオン（Ｃｌ−）、無機塩化物あるいは有機塩化物のいずれか１つまたは複数である。
【００６３】
無機塩化物としては、塩化アルミニウム、塩化アンモニウム（塩化ナトリウム）、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化スズ、塩化セシウム、塩化チオニル、塩化ナトリウム、塩化ニトロシル、塩化バリウム、塩化ベンゼンジアゾニウム、塩化マグネシウム、塩化リチウム、塩化亜鉛、塩化鉛、塩化金（ＩＩＩ）酸、塩化銀、塩化水銀、塩化水酸化マグネシウム、塩化水酸化銅（ＩＩ）、塩化水素（塩酸）、塩化鉄、塩化白金（ＶＩ）酸、塩素酸、塩素酸カリウム、過塩素酸、過塩素酸リチウムなどであることが好ましく、塩酸または塩化ナトリウムであることがより好ましい。
【００６４】
有機塩化物としては、１つまたは複数の塩素原子を置換基として有するアルカン、アルケン、アルキン、シクロアルカン、アリール、ヘテロアリール化合物であることが好ましく、クロロアルコール化合物もしくはクロロケトン化合物であることがより好ましく、３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オール、３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オン、クロロアセトン、フェナシルクロライド、ｍ−クロロフェナシルクロライドであることが最も好ましい。
【００６５】
塩化物が酸性またはアルカリ性を示す場合、適当な酸やアルカリでｐＨを調整した状態でも良く、酸性もしくは塩基性の塩化物と有機化合物や無機化合物の塩の形態でも良い。好ましくは３−キヌクリジノン塩酸塩である。
【００６６】
塩化物と酵素が共存する状態とは、必ずしも酵素を含む液体に塩化物が溶解している必要はなく、酵素を含む液体と塩化物を含む液体、もしくは酵素を含む液体と固体の塩化物など不均一な状態でも良く、これを物理的に攪拌し、混合した状態でも良い。
【００６７】
「ハロゲン原子存在下で反応性の高い酵素」とは、配列表の配列番号１に記載の野生型酵素と比較して、前記ハロゲン原子存在下で一定時間処理した後、もしくは、前記ハロゲン原子存在下で、３−キヌクリジノン、もしくは３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オンに対する酵素の還元活性が高いことを示す。好ましくは塩化物に対する酵素の安定性、もしくは塩化物による反応阻害に対する抵抗性が高い酵素である。
【００６８】
塩化物に対する酵素の安定性が高いとは、具体的には、塩化ナトリウムとインキュベートした後の３−キヌクリジノンに対する残存活性を後述の実施例１２に記載する方法で測定した場合に、野生型酵素と比較して残存活性が１％以上高いことであり、好ましくは５％以上、さらに好ましくは１０％以上、最も好ましくは２０％以上高いことをいう。
【００６９】
また、塩化物による反応阻害に対する抵抗性が高いとは、具体的には、塩化ナトリウム存在条件下での３−キヌクリジノンに対する相対活性を後述の実施例１４に記載する方法で測定した場合に、野生型酵素と比較して相対活性が１％以上高いことであり、好ましくは５％以上、さらに好ましくは１０％以上、最も好ましくは２０％以上高いことをいう。
【００７０】
塩化物に対する酵素の安定性は、例えば、以下の方法で評価できる。
［塩化物に対する酵素の安定性の評価方法］
酵素を含む無細胞抽出液に任意の濃度（例えば０．０１％〜５０％）の塩化物を含む緩衝液（好ましくはｐＨ５〜８の０．０１〜１Ｍリン酸緩衝液）を加えて任意の温度（例えば４〜４０℃）でインキュベートする。塩化物と緩衝液が不均一な場合は振とう、または攪拌しながらインキュベートする。塩化物を加えた直後（０時間目）と任意の処理時間（０．１〜４８時間）でサンプリングし、それを０．１Ｍのリン酸カリウム水溶液（ｐＨ７．０）で希釈し、その希釈液を用いて下記の［カルボニル化合物に対する還元能力の評価方法］で酵素の活性を測定する。残存活性は下記式で算出することができる。
残存活性（％）＝［任意の処理時間での酵素活性］÷［０時間目の酵素活性］×１００
【００７１】
配列表の配列番号１に記載のカルボニル還元酵素と比較して塩化物に対する安定性が高い改変型カルボニル還元酵素とは、上記の評価を行なった場合の残存活性が、野生型に比べて１％以上高い酵素であり、好ましくは５％以上、さらに好ましくは１０％以上、最も好ましくは２０％以上高い酵素である。
【００７２】
［カルボニル化合物に対する還元能力の評価方法］
ジメチルスルホキシド０．３％（ｖ／ｖ）を含む１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）にＮＡＤＰＨもしくは還元型ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤＨ）０．２５ｍＭ、還元活性を評価したいカルボニル化合物（例えば３−キヌクリジノンもしくは３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オン）１〜５０ｍＭおよび本発明のポリペプチドを含む反応液を３０℃で反応させ、ＮＡＤＰＨもしくはＮＡＤＨ量の減少に伴う波長３４０ｎｍの吸光度の減少を測定することにより、還元反応の進行を容易に評価することができる。吸光度が減少した場合、本発明のペプチドは評価対象のカルボニル化合物を還元する能力を有する、と判断することができる。なお、吸光度の減少速度が速いほど、評価対象のカルボニル化合物に対する還元能力が高いといえる。また、ポリペプチドの還元能力は数値化することも可能であり、還元活性１Ｕは１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰＨの消費を触媒する酵素量とした。
【００７３】
また、塩化物による反応阻害に対する抵抗性は、例えば、以下のように決定することができる。
［塩化物による反応阻害に対する抵抗性の評価方法］
まず、前記［カルボニル化合物に対する還元能力の評価方法］で塩化物が存在しない条件での酵素の活性を測定する。これを［塩化物非存在下での酵素活性］とする。次に任意の濃度（例えば０．０１％〜５０％）の塩化物と［カルボニル化合物に対する還元能力の評価方法］と同じ濃度のカルボニル化合物とジメチルスルホキシド０．３％（ｖ／ｖ）を含む１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で同様に活性を測定する。これを［塩化物存在下での酵素活性］とする。
相対活性は下記式で算出することができる。
相対活性（％）＝［塩化物存在下での酵素活性］÷［塩化物非存在下での酵素活性］×１００
【００７４】
本明細書中で、配列表の配列番号１に記載のカルボニル還元酵素と比較して塩化物による反応阻害に対する抵抗性が高い改変型カルボニル還元酵素とは、上記の評価を行なった場合の残存活性が、野生型に比べて１％以上高いことであり、好ましくは５％以上、さらに好ましくは１０％以上、最も好ましくは２０％以上高いことである。
【００７５】
本明細書での「補酵素に対する親和性が高い酵素」とは、配列表の配列番号１に記載の野生型酵素と比較して、還元型補酵素に対するＫｍ値が小さい酵素のことを示す。還元型補酵素としては好ましくはＮＡＤＰＨである。同一補酵素濃度では補酵素に親和性が高い酵素ほど反応性が高くなり、有用である。さらに、野生型酵素は塩化物と補酵素が競合阻害する関係にあり、補酵素への親和性が向上した改変型カルボニル還元酵素は、塩化物による阻害抵抗性も向上しているため、有用である（比較例４および実施例３３）。
【００７６】
還元型補酵素のＫｍ値は、例えば、以下の方法で評価できる。
［補酵素に対する親和性の評価方法］
任意の濃度（例えば、１〜０．０１ｍＭの範囲で４つ以上の異なる濃度）の還元型補酵素（例えば、ＮＡＤＰＨ）存在下で前記［カルボニル化合物に対する還元能力の評価方法］と同様の方法で、任意のカルボニル化合物（例えば３−キヌクリジノンもしくは３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オン）に対する還元酵素活性を測定する。測定した還元酵素活性の値を用いてラインウィーバー・バーク・プロットを作成し、これよりＫｍ値を算出することができる。
【００７７】
本明細書中で、配列表の配列番号１に記載の野生型カルボニル還元酵素と補酵素に対する親和性が高い改変型カルボニル還元酵素とは、上記の評価を行なった場合のＫｍ値が、野生型酵素を１００％とした場合の、９９％以下、好ましくは９５％以下、さらに好ましくは９０％以下、最も好ましくは８０％以下である酵素のことである。
【００７８】
本発明の改変型カルボニル還元酵素は、下記の方法により探索することができる。
エラープローンＰＣＲ法（Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  １，  １１−１５（１９８９））、あるいは同様の原理に基づいたキットを用いて、配列表の配列番号２に示す塩基配列（野生型酵素遺伝子）に１つ以上の塩基配列の置換、挿入、欠失、付加が導入されたＤＮＡ断片を得ることができる。例えば、野生型酵素遺伝子をテンプレートにプライマー１：５’−ＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＴＡＡＧＧＡＧＧＴＴＡＣＡＴＡＴＧ−３’（配列表の配列番号３）、およびプライマー２：５’−ＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＴＡＣＣＴＴＡ−３’（配列表の配列番号４）とＤｉｖｅｒｓｉｆｙ  ＰＣＲ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて、野生型酵素遺伝子全長にランダムに変異が導入され、かつ開始コドンにＮｄｅＩ認識部位が付加され、終始コドンの直後に新たな終止コドン（ＴＡＡ）とＫｐｎＩ認識部位が付加された複数種類の二本鎖ＤＮＡ（変異型酵素遺伝子）を得ることができる。この増幅断片をＮｄｅＩ及びＫｐｎＩで消化し、プラスミドｐＵＣＮ１８（ＰＣＲ法によりｐＵＣ１８（タカラバイオ社製）の１８５番目のＴをＡに改変してＮｄｅＩサイトを破壊し、更に４７１−４７２番目のＧＣをＴＧに改変することにより新たにＮｄｅＩサイトを導入したプラスミド）のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ認識部位とＫｐｎＩ認識部位の間に挿入し、このプラスミドを用いてエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１株（以下、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１）を形質転換する。形質転換した大腸菌を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢプレート培地に塗布し、シングルコロニーの大腸菌を得る。また、野生型遺伝子の代わりに前記方法で得られた変異型酵素遺伝子を用いて、同様の操作でさらに変異を導入した変異酵素ライブラリーを作製することもできる。
【００７９】
上記ライブラリーから、本発明の改変型カルボニル還元酵素を選抜することができる。選抜方法としては特に限定されないが、好ましくは下記の方法である。
［塩化物に対する安定性が向上した酵素のプレート評価による選抜法］
変異酵素ライブラリーの各組換え菌及び野生型酵素を生産する組換え菌（例えば、参考例３に示すＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳ））を適当な培地（例えば２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、塩化ナトリウム  ０．５％、ｐＨ７．０））に接種し、３７℃で２４時間振盪培養する。得られた各培養液を菌体破砕処理し、遠心分離後、沈殿を除去し、無細胞抽出液を得る。各酵素を含む無細胞抽出液に適当な濃度の塩化物（好ましくは終濃度０．６４Ｍの塩化ナトリウム、もしくは終濃度０．０１〜０．０２％のクロロアセトン）を含む緩衝液（好ましくはｐＨ５〜８の０．０１〜１Ｍリン酸緩衝液）を加えて適当な温度（例えば４〜４０℃）でインキュベートする。０．１〜４８時間程度インキュベートした後、処理した各無細胞抽出液を９６穴プレート（ＡＧＣテクノグラス社製）に分注し、ＮＡＤＰＨ（好ましくは１．５ｍＭ）とカルボニル化合物（好ましくは２０ｍＭの３−キヌクリジノン塩酸塩）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ５〜７）を加えて、１０〜４０℃で反応する。経時的にＵＶサンプル撮影装置ＦＡＳ−ＩＩＩ（東洋紡績社製）でＮＡＤＰＨの蛍光を観察する。この時、反応が進行しない酵素液はＮＡＤＰＨの蛍光が残存するが、反応が進行した無細胞抽出液はＮＡＤＰＨの減少に伴い、蛍光がなくなる。対照である野生型酵素に比べ、短時間で蛍光がなくなった酵素を塩化物に対する安定性が向上した酵素として選抜した。選抜した酵素の培養液からプラスミドを抽出し、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズジャパン社製）およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３１３０ｘｌジェネティックアナライザ（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて改変型カルボニル還元酵素遺伝子の塩基配列を決定し、変異部位を特定することができる。
【００８０】
［塩化物による反応阻害に対する抵抗性が向上した酵素のプレート評価による選抜法］
変異酵素ライブラリーの各組換え菌及び野生型酵素を生産する組換え菌（例えば、参考例３に示すＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳ））を適当な培地（例えば前記の培地）に接種し、３７℃で２４時間振盪培養する。得られた各培養液を菌体破砕処理し、無細胞抽出液を得る。各無細胞抽出液を９６穴プレート（ＡＧＣテクノグラス社製）に分注し、適当な濃度の塩化物（好ましくは終濃度０．６４Ｍ〜１．２８Ｍの塩化ナトリウム）、ＮＡＤＰＨ（好ましくは１．５ｍＭ）とカルボニル化合物（好ましくは２０ｍＭの３−キヌクリジノン塩酸塩）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ５〜７）を加えて、１０〜４０℃で反応した。経時的にＵＶサンプル撮影装置ＦＡＳ−ＩＩＩ（東洋紡績社製）でＮＡＤＰＨの蛍光を観察する。反応が進行しない酵素液はＮＡＤＰＨの蛍光が残存するが、反応が進行した無細胞抽出液はＮＡＤＰＨの減少に伴い、蛍光がなくなる。対照である野生型酵素に比べ、短時間で蛍光がなくなった酵素を塩化物による反応阻害に対する抵抗性が向上した酵素として選抜する。選抜した酵素の培養液からプラスミドを抽出し、前記の方法で改変型カルボニル還元酵素遺伝子の塩基配列を決定し、変異部位を特定することができる。
【００８１】
得られた複数の改変型カルボニル還元酵素の変異を部位特異的変異導入によって、一方のいくつか、あるいは双方を組み合わせることで、一方の性質の強化あるいは双方の性質を併せ持つ改変型カルボニル還元酵素を作製できる。このような酵素も本発明の酵素に含まれる。
【００８２】
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードするものであれば特に限定されないが、例えば、配列表の配列番号２に示した野生型酵素をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド、又はこれに改変を加えて得られるポリペプチドが挙げられる。野生型酵素遺伝子の改変方法としては、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９））等に記載の公知の方法を用いることができる。すなわち、野生型酵素遺伝子の塩基の１個、または複数個（例えば、４０個、好ましくは２０個、より好ましくは１０個、さらに好ましくは５個、４個、３個、または２個の塩基）を置換、付加、挿入もしくは欠失することにより、野生型酵素のアミノ酸配列を改変したポリヌクレオチドを作製することができる。例えば、エラープローンＰＣＲ法（Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  １，  １１−１５（１９８９））などのＰＣＲを用いた変異導入法や、あるいは市販のキットＤｉｖｅｒｓｉｆｙ  ＰＣＲ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ  Ｂｅａｎ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）などの利用が挙げられる。
【００８３】
ポリヌクレオチドを部位特異的変異導入法により作製する場合、部位特異的変異導入法としては、例えば、Ｏｌｆｅｒｔ  Ｌａｎｄｔら（Ｇｅｎｅ，９６，１２５−１２８（１９９０））、Ｓｍｉｔｈら（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３，１，  Ｓｅｔｌｏｗ，Ｊ．Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｖｌａｓｕｋら（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｉｎｏｕｙｅ，Ｍ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｈｏｓ．Ｎ．Ｈｕｎｔら（Ｇｅｎｅ，７７，５１（１９８９））の方法やＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）の市販キットの利用等が挙げられる。なお、２箇所に変異を導入する場合には上記方法に準じた方法を２回繰り返すことにより、目的とするポリヌクレオチドを得ることができる。尚、複数の他のポジションが他のアミノ酸で置換されている場合も当該方法により、目的とするポリヌクレオチドを得ることができる。
【００８４】
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、３−キヌクリジノンを還元して（Ｒ）−３−キヌクリジノールを生成し、もしくは、３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オンを還元して（Ｓ）−３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オールを生成する活性を有し、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるカルボニル還元酵素と比較して、ハロゲン原子存在下でのカルボニル化合物に対する反応性が高いポリペプチドをコードし、かつ、配列表の配列番号２に示した塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドが好ましい。
【００８５】
ここで、「配列表の配列番号２に示したポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、配列表の配列番号２に示した塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドをプローブとして、ストリンジェントな条件下にコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるポリヌクレオチドを意味する。
【００８６】
ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））等に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のポリヌクレオチドを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０Ｍの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃の条件下でフィルターを洗浄することにより取得できるＤＮＡを挙げることができる。好ましくは６５℃で０．５倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、より好ましくは６５℃で０．２倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、更に好ましくは６５℃で０．１倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄することにより取得できるポリヌクレオチドである。
【００８７】
以上のようにハイブリダイゼーション条件を記載したが、これらの条件に特に制限されない。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで最適なストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００８８】
上記の条件にてハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、配列番号２に示されるポリヌクレオチドと、配列同一性が７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上のＤＮＡを挙げることができ、コードされるポリペプチドが、本発明のポリペプチドの性質を有する限り、上記ポリヌクレオチドに包含される。
【００８９】
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入することにより、ポリペプチド発現ベクターを作製できる。
【００９０】
上記で用いる発現ベクターとしては、適当な宿主生物内で当該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを発現できるものであれば、特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられ、さらに、他の宿主株との間での遺伝子交換が可能なシャトルベクターも使用できる。
【００９１】
このようなベクターは、例えば大腸菌の場合では、通常、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆＢプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｐＬプロモーター等の制御因子を含み、本発明のＤＮＡと作動可能に連結された発現単位を含む発現ベクターとして好適に使用できる。例えば、ｐＵＣＮ１８（参考例２参照）、ｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）、ｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３公報）などが挙げられる。
【００９２】
本明細書で用いる用語「制御因子」は、機能的プロモーター及び、任意の関連する転写要素（例えばエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有する塩基配列をいう。
【００９３】
本明細書で用いる用語「作動可能に連結」は、遺伝子の発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントと遺伝子が、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。制御因子のタイプ及び種類が、宿主に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
【００９４】
各種生物において利用可能なベクター、プロモーターなどに関して、微生物学基礎講座（８、安藤忠彦、共立出版、（１９８７））などに詳細に記述されている。
【００９５】
ベクターは、還元型補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含んでいてもよい。還元型補酵素再生能を有するポリペプチドとしては、例えば、グルコース脱水素酵素が挙げられる。
【００９６】
ベクターにより宿主細胞を形質転換することにより、形質転換体を得ることができる。
或いは、形質転換体として、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを染色体中に導入して得られる形質転換体も挙げられる。
【００９７】
ベクターにより形質転換するための宿主細胞としては、各ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリペプチド発現ベクターにより形質転換され、導入したポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを発現することができる細胞であれば、特に制限されない。宿主細胞として利用可能な微生物としては、例えば、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリイウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、及びラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属など宿主ベクター系の開発されている細菌、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属及びストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属など宿主ベクター系の開発されている放線菌、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クライベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、及びキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属などの宿主ベクター系の開発されている酵母、ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、及びトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属などの宿主ベクター系の開発されているカビ、などが挙げられる。また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、特に蚕を用いた昆虫（Ｎａｔｕｒｅ，  ３１５，  ５９２−５９４  （１９８５））や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系が開発されており、好適に利用できる。これらのうち、導入及び発現効率から細菌が好ましく、大腸菌が特に好ましい。
【００９８】
本発明のベクターは、公知の方法により宿主微生物に導入できる。例えば、宿主微生物として大腸菌を用いる場合は、ポリペプチド発現ベクターとして前記の発現ベクターｐＵＣＮ１８に改変型カルボニル還元酵素をコードするポリヌクレオチドを導入した本発明のプラスミド（実施例２〜９に示すｐＮＢＳｍ０１〜５８）を、市販のＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）などを用いて、そのプロトコールに従って操作することにより、当該ベクターを宿主細胞に導入した形質転換体（例えば、実施例９に示すＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳｍ５８）が得られる。
【００９９】
また、本発明のポリペプチド及び後述する還元型補酵素再生能を有するポリペプチドの両ポリペプチドを、同一菌体内で発現させた形質転換体も育種することができる。すなわち、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及び還元型補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、同一のベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入することにより得られる他、これら２種類のＤＮＡを不和合性グループの異なる２種のベクターにそれぞれ組み込み、それらを同一の宿主細胞に導入することによっても得られる。
【０１００】
このようにして得られる形質転換体としては、例えば、改変型カルボニル還元酵素をコードするヌクレオチドを前記の発現ベクターｐＵＣＮ１８に導入した組換えベクター（例えば、実施例２に示したｐＮＢＳｍ０１）と還元型補酵素再生能を有するポリペプチドであるグルコース脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドを含むベクター（例えば、参考例８に示すｐＳＴＶＧ）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）に導入した形質転換体であるＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳｍ０１，ｐＳＴＶＧ）（実施例２４参照）などが挙げられる。
【０１０１】
ポリペプチド、もしくは形質転換体および／またはその処理物を、カルボニル化合物に作用させることにより、アルコール化合物を製造することができる。基質となるカルボニル化合物は特に制限されるものではないが、カルボニル基を有する化合物が非対称ケトンである場合、その産物が有用な光学活性アルコールとなるため、非常に有益な反応となる。
【０１０２】
前記カルボニル基を有する化合物としては、例えば、下記式（１）：
【化３】
0005889785.tif 000004
【０１０３】
（式中、Ｒ１及びＲ２は水素原子、ハロゲン原子、置換されていても良いアルキル基、置換されていても良いアラルキル基、置換されていても良いアリール基、置換されていても良いアルコキシ基、ヒドロキシル基、アミノ基、またはニトロ基であるか、もしくは、Ｒ１とＲ２が互いに結合し環を形成しても良い。但し、Ｒ１とＲ２は構造が異なる）で表される非対称ケトンが挙げられ、その場合、生成物は下記式（２）：
【化４】
0005889785.tif 000005
（式中、Ｒ１、Ｒ２は前記と同じ、＊は不斉炭素を表す）で表される光学活性アルコールである。
【０１０４】
前記Ｒ１、Ｒ２は炭素数１〜１４のアルキル基、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数４〜１４のヘテロアリール基、炭素数１〜５のアルコキシ基、炭素数２〜５のアルコキシカルボキシル基、炭素数１〜５の直鎖もしくは分岐鎖アルキル基、炭素数２〜５のアルケニル基、炭素数５〜１０のシクロアルキル基、炭素数４〜９のヘテロシクロアルキル基、カルボキシル基、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アミノ基、またはニトロ基が好ましい。
【０１０５】
なお、上記で言う置換基としてはハロゲン原子、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、シアノ基、ニトロ基、アルキル基、アリール基、アラルキル基、アルコキシ基などである。また、上記で言うハロゲン原子とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子などである。
【０１０６】
基質である非対称ケトンとしては、３−キヌクリジノンもしくはその塩酸塩、３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オン、３−クロロ−１−（２−フェニル）プロパン−１−オンが特に好ましい。
【０１０７】
本発明のポリペプチドもしくは本発明のポリペプチドを発現させた形質転換体および／またはその処理物を用いて、前記カルボニル基を有する化合物を還元してアルコールを製造する場合、以下のように実施され得る。但し、以下の方法に限定されるわけではない。
【０１０８】
適当な溶媒（例えば１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）など）、カルボニル化合物である基質（例えば、３−キヌクリジノン、もしくはその塩酸塩、３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オン）を加え、ＮＡＤＰＨや酸化型ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰ＋）等の補酵素、及び該形質転換体の培養物および／またはその処理物などを添加し、ｐＨ調整下、攪拌して反応させる。
【０１０９】
ここで、処理物とは、例えば、粗抽出液、培養菌体、凍結乾燥生物体、アセトン乾燥生物体、菌体破砕物、またはそれらの固定化物等で、該ポリペプチドの酵素触媒活性が残存している物を意味する。
【０１１０】
この反応は５〜８０℃、好ましくは１０〜６０℃、より好ましくは２０〜４０℃の温度で行われ、反応中反応液のｐＨは３〜１０、好ましくは４〜９、より好ましくは５〜８に維持する。反応はバッチ式あるいは連続方式で行われ得る。バッチ方式の場合は、反応基質は０．０１〜１００％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．１〜７０％、より好ましくは０．５〜５０％の仕込み濃度で添加され得る。また、反応の途中で新たに基質を追加添加しても良い。
【０１１１】
また、反応には水系溶媒を用いても良いし、水系の溶媒と有機系の溶媒とを混合して用いても良い。有機系溶媒としては、例えば、トルエン、酢酸エチル、酢酸ｎ−ブチル、ヘキサン、イソプロパノール、ジイソプロピルエーテル、メタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。
【０１１２】
ここで形質転換体の処理物等とは、例えば、無細胞抽出液、培養菌体、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、あるいはそれらの磨砕物、これらの混合物などを意味する。更にそれらは、ポリペプチド自体あるいは菌体のまま公知の手段で固定化されて用いられ得る。
【０１１３】
また、本反応を行う際に、本発明のポリペプチド及び還元型補酵素再生能を有するポリペプチドの両者を生産する形質転換体、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳｍ０１，ｐＳＴＶＧ）（実施例２４参照）を用いれば、補酵素の使用量を大幅に減らすことが可能となる。還元型補酵素再生能を有するポリペプチドについて、次に詳述する。
【０１１４】
本発明のポリペプチドの生産能を有する形質転換体を用いて、カルボニル化合物を還元してアルコール化合物を合成する場合、補酵素としてＮＡＤＰＨもしくはＮＡＤＨが必要となる。上記のように、反応系にＮＡＤＰＨもしくはＮＡＤＨを必要な量だけ添加しても実施し得る。しかし、酸化された該補酵素（ＮＡＤＰ＋やＮＡＤ＋）を還元型ＮＡＤＰＨやＮＡＤＨに変換する能力（以後還元型補酵素再生能力と呼ぶ）を有する酵素をその基質と共に、つまり補酵素再生系を本発明のポリペプチドと組み合わせて反応を行うことにより、高価な補酵素の使用量を大幅に削減することができる。還元型補酵素再生能力を有する酵素としては、ヒドロゲナーゼ、ギ酸脱水素酵素、カルボニル還元酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素及びグルコース脱水素酵素等を用いることができる。好適には、グルコース脱水素酵素が用いられる。
【０１１５】
このような反応は、補酵素再生系を不斉還元反応系内に添加することによっても行われ得るが、本発明の酵素をコードするポリヌクレオチド及び還元型補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの両者により形質転換された形質転換体を触媒とした場合は、還元型補酵素再生能を有する酵素を別に調製し反応系内に添加しなくても、効率的に反応を行うことができる。このような形質転換体は、先述の「宿主−ベクター系及び形質転換体について」で記載した方法により得られる。例えば、前記Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳｍ０１，ｐＳＴＶＧ）（実施例２４）が挙げられる。
【０１１６】
反応後の反応液からのアルコールの採取方法は特に限定されないが、反応液から直接、あるいは菌体等を分離後、酢酸エチル、トルエン、ｔ−ブチルメチルエーテル、ヘキサン、塩化メチレン等の溶剤で抽出し、脱水後、蒸留、再結晶あるいはシリカゲルカラムクロマトグラフィー等により精製すれば、高純度のアルコール化合物が容易に得られる。
【０１１７】
本発明のポリペプチド、形質転換体及び／またはその処理物を、カルボニル化合物に作用させて光学活性アルコールを得る工程を経て、医薬品原薬を製造することができる。好ましくは（Ｒ）−３−キヌクリジノールを原料として、公知の方法（例えば、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４８，６５９７−６６０６（２００５）に記載の方法）で、（１Ｓ，３´Ｒ）−キヌクリジン−３´−イル  １−フェニル−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−２−カルボン酸（ソリフェナシン）が容易に製造できる。また、別の好ましい医薬品原薬としては（Ｓ）−３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オールを原料として、公知の方法（例えば、Ｊ．Ｌａｂｅｌ．Ｃｏｍｐｄ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．３４，２１３−２２３（１９９５）に記載の方法）で、（Ｓ）−Ｎ−メチル−３−（１−ナフタレニルオキシ）−３−（２−チオフェン）−プロパンアミン（デュロキセチン）が容易に製造できる。
【実施例】
【０１１８】
以下、実施例で本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。なお、以下の実施例において用いた組み換えＤＮＡ技術に関する詳細な操作方法などは、次の成書に記載されている：
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９））。【０１１９】
（参考例１）バークホルデリア・エスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．）ＹＴ株由来の３−キヌクリジノン還元活性を有するポリペプチド（野生型酵素）をコードするＤＮＡの取得
バークホルデリア・エスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．）ＹＴ株（ＮＩＴＥ  Ｐ−６１３）より、３−キヌクリジノン及び３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オンに対する還元活性を有するポリペプチド（以下、本ポリペプチドをＲＢＳと呼ぶ）をコードするＤＮＡをＰＣＲにより取得した。【０１２０】
［バークホルデリア・エスピー  ＹＴ株の染色体ＤＮＡの調製］
５００ｍｌ容坂口フラスコに、バクトトリプトン１６ｇ、酵母エキス１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、アデカノールＬＧ−１０９（日油（株）製）０．１ｇ（いずれも１Ｌ当たり）の組成からなる液体培地（ｐＨ７）５０ｍｌを調製し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌をおこなった。この培地に、予め同培地にて前培養しておいたバークホルデリア・エスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．）ＹＴ株の培養液を５ｍｌ接種し、３０℃で１８時間振盪しながら培養を行った。この培養液から、Ｍｕｒｒａｙ等の方法（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．８，４３２１（１９８０））に記載の方法に従って染色体ＤＮＡを抽出した。【０１２１】
［ＰＣＲ反応］
プライマー３：５’−ＡＴＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＣＣＣＡＣＣＣＧＣＡＡＣＣＣＣＧ−３’（配列表の配列番号５）、プライマー４：５’−ＴＡＴＡＧＧＴＡＣＣＴＴＡＴＣＡＡＡＧＣＴＴＧＴＣＧＡＡＣＧＣＧＡＧ−３’（配列表の配列番号６）を用いて、バークホルデリア・エスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．）ＹＴ株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。その結果、配列表の配列番号２に示す塩基配列からなる遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ認識部位が付加され、かつ終始コドンの直後に新たな終止コドン（ＴＡＡ）とＫｐｎＩ認識部位が付加された二本鎖ＤＮＡ（ＲＢＳ遺伝子）が得られた。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラ−ゼとして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。【０１２２】
（参考例２）組換えベクターｐＮＢＳの構築
参考例１で得られたＲＢＳ遺伝子をＮｄｅＩ及びＫｐｎＩで消化し、プラスミドｐＵＣＮ１８（ＰＣＲ法によりｐＵＣ１８（タカラバイオ社製）の１８５番目のＴをＡに改変してＮｄｅＩサイトを破壊し、更に４７１−４７２番目のＧＣをＴＧに改変することにより新たにＮｄｅＩサイトを導入したプラスミド）のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ認識部位とＫｐｎＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＢＳを構築した。【０１２３】
（参考例３）ポリペプチドを発現する組換え生物の作製
参考例２で構築した組換えベクターｐＮＢＳを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳ）を得た。また、ｐＵＣＮ１８を用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＵＣＮ１８）を得た。【０１２４】
（参考例４）組換え生物におけるＤＮＡの発現
参考例３で得た２種類の組換え生物（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＵＣＮ１８）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳ））を、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、塩化ナトリウム  ０．５％、ｐＨ７．０）５ｍｌに接種し、３７℃で２４時間振盪培養した。上記の培養で得られたそれぞれ培養液について、遠心分離により菌体を集め、５ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁した。これを、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。これら無細胞抽出液の３−キヌクリジノン還元活性を測定した。【０１２５】
３−キヌクリジノンに対する還元活性は、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、３−キヌクリジノン５ｍＭ、補酵素ＮＡＤＰＨ  ０．２５ｍＭ、および無細胞抽出液を添加して３０℃で１分間反応を行い、波長３４０ｎｍにおける吸光度の減少速度より算出した。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰＨをＮＡＤＰに酸化する酵素活性を１Ｕと定義した。【０１２６】
それぞれの組換え生物の３−キヌクリジノン還元活性を以下に示す。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＵＣＮ１８）については、３−キヌクリジノン還元活性は０．１Ｕ／ｍｇ以下であった。一方、ＲＢＳを発現させたＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳ）の３−キヌクリジノン還元活性は１００Ｕ／ｍｇであった。【０１２７】
また、３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オンに対する還元活性は、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オン  １０ｍＭ、補酵素ＮＡＤＰＨ  ０．２５ｍＭ、および無細胞抽出液を添加して３０℃で１分間反応を行い、波長３４０ｎｍにおける吸光度の減少速度より算出した。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰＨをＮＡＤＰに酸化する酵素活性を１Ｕと定義した。【０１２８】
それぞれの組換え生物の３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オン還元活性を以下に示す。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＵＣＮ１８）については、３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オン還元活性は０．１Ｕ／ｍｇ以下であった。一方、ＲＢＳを発現させたＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳ）の３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オン還元活性は２５Ｕ／ｍｇであった。【０１２９】
以上のように、参考例３で得られた組換え生物は３−キヌクリジノン及び３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オンに対する還元活性を有し、ＲＢＳの発現が認められた。【０１３０】
（参考例５）野生型酵素ＲＢＳの各種化合物に対する安定性
参考例４と同様の方法で野生型酵素の無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液の３−キヌクリジノン還元活性を測定し、これを０時間目の活性とした。この無細胞抽出液に表１に示した化合物を添加し、硫酸もしくは水酸化ナトリウムでｐＨ６．５に調整後、３０℃で２４時間インキュベートした。また、対照として何も添加しない無細胞抽出液も同様にインキュベートした。２４時間後、各無細胞抽出液を希釈し、参考例４と同様の方法で３−キヌクリジノン還元活性を測定した。残存活性は下記式より算出し、この値を各種化合物に対する安定性の指標とした。
残存活性（％）＝［２４時間目の酵素活性］÷［０時間目の酵素活性］×１００
結果を表１に示す。【０１３１】
【表１】
0005889785.tif 000006
【０１３２】
野生型酵素は硫酸ナトリウムに比べて、無機塩化物である塩化ナトリウム、塩化カリウム存在下での安定性が低かった。また、野生型酵素はアセトフェノンに比べて有機塩化物であるフェナシルクロライド、ｍ−クロロフェナシルクロライドに対する安定性が低かった。このように野生型酵素は塩化物に対する安定性が低かった。【０１３３】
（参考例６）野生型酵素ＲＢＳの各種化合物による反応阻害
参考例４と同様の方法で野生型酵素の無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液の３−キヌクリジノン還元活性を測定し、これを阻害剤なしの活性とした。表２に示した化合物及び５ｍＭ  ３−キヌクリジノン、０．２５ｍＭ補酵素ＮＡＤＰＨを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、無細胞抽出液を添加して３０℃で１分間反応を行い、波長３４０ｎｍにおける吸光度の減少速度より３−キヌクリジノンに対する還元活性を算出した。【０１３４】
相対活性は下記式より算出し、この値を各種化合物による反応阻害の指標とした。
相対活性（％）＝［各種化合物存在下での酵素活性］÷［阻害剤なしの酵素活性］×１００
結果を表２に示す。【０１３５】
【表２】
0005889785.tif 000007
【０１３６】
野生型酵素は硫酸ナトリウムに比べて、無機塩化物である塩化ナトリウム、塩化カリウムにより大きく阻害を受けた。このように野生型酵素は塩化物により強い反応阻害を受けた。【０１３７】
（実施例１）変異酵素ライブラリーの作製
参考例２で作製したＲＢＳ遺伝子を含むプラスミドｐＮＢＳをテンプレートに、プライマー１：５’−ＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＴＡＡＧＧＡＧＧＴＴＡＣＡＴＡＴＧ−３’（配列表の配列番号３）およびプライマー２：５’−ＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＴＡＣＣＴＴＡ−３’（配列表の配列番号４）を用いてエラープローンＰＣＲ法（Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  １，１１−１５（１９８９））を用いて、ＲＢＳ遺伝子全長にランダムな変異を導入したＤＮＡ増幅断片を得た。この増幅断片を制限酵素ＮｄｅＩおよびＫｐｎＩで消化したのち、同酵素で処理した高発現ベクターｐＵＣＮ１８に組み込み、複数の変異酵素発現プラスミドを作製した。このプラスミドを用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１を形質転換し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢプレート培地に塗布した。生育したコロニーは変異導入されたＲＢＳ遺伝子を有する組換え大腸菌であり、この組換え菌群を変異酵素ライブラリー１とした。【０１３８】
（実施例２）改変型カルボニル還元酵素の選抜１
変異酵素ライブラリーより無機塩化物の１つである塩化ナトリウムに対する安定性が向上した改変型カルボニル還元酵素を選抜した。実施例１で作製した変異酵素ライブラリー１の各組換え菌及び参考例３で作製したＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳ）（対照）をそれぞれ参考例４と同様の方法で培養した。得られた各培養液６０μｌに１０ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ及び１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２４０μｌを加え、３７℃で１時間インキュベートした。各処理液を遠心し、上清を無細胞抽出液とした。各無細胞抽出液１００μｌに１．２４Ｍ  塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を加え、３０℃で１８時間インキュベートした（塩化ナトリウム処理）。塩化ナトリウム処理した各無細胞抽出液を９６穴プレート（ＡＧＣテクノグラス社製）に５０μｌ分注し、６ｍＭのＮＡＤＰＨを含むリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）５０μｌと２０ｍＭ  ３−キヌクリジノン塩酸塩を含むリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１００μｌを加え３０℃で反応した。経時的にＵＶサンプル撮影装置ＦＡＳ−ＩＩＩ（東洋紡績社製）でＮＡＤＰＨの蛍光を観察した。反応が進行しない酵素液はＮＡＤＰＨの蛍光が残存するが、反応が進行した無細胞抽出液はＮＡＤＰＨの減少に伴い、蛍光がなくなった。対照であるＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳ）の無細胞抽出液（野生型酵素）に比べ、早く蛍光がなくなった酵素を塩素原子存在下で反応性の高い酵素、すなわち塩化ナトリウムに対する安定性が向上した改変型カルボニル還元酵素として選抜した。選抜した酵素の培養液からプラスミドを抽出し、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズジャパン社製）およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３１３０ｘｌジェネティックアナライザ（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて変異型ＲＢＳ遺伝子の塩基配列を決定し、変異部位を特定した。塩化ナトリウムに対する安定性の向上した改変型カルボニル還元酵素を表３に示す。【０１３９】
【表３】
0005889785.tif 000008
【０１４０】
表３に示す１７種類の塩化ナトリウムに対する安定性が向上した酵素を取得した。【０１４１】
（実施例３）改変型カルボニル還元酵素の選抜２
変異酵素ライブラリーより有機塩化物の１つであるクロロアセトンに対する安定性が向上した改変型カルボニル還元酵素を選抜した。実施例１で作製した変異酵素ライブラリー１の各組換え菌及び参考例３で作製したＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳ）（対照）をそれぞれ参考例４と同様の方法で培養した。得られた各培養液６０μｌに１０ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ及び１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２４０μｌを加え、３７℃で１時間インキュベートした。各処理液を遠心し、上清を無細胞抽出液とした。各無細胞抽出液１００μｌに０．０２％  クロロアセトンを含むリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を加え、３０℃で１８時間インキュベートした（クロロアセトン処理）。塩化ナトリウム処理した各無細胞抽出液を９６穴プレート（ＡＧＣテクノグラス社製）に５０μｌ分注し、６ｍＭのＮＡＤＰＨを含むリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）５０μｌと２０ｍＭ  ３−キヌクリジノン塩酸塩を含むリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１００μｌを加え３０℃で反応した。経時的にＵＶサンプル撮影装置ＦＡＳ−ＩＩＩ（東洋紡績社製）でＮＡＤＰＨの蛍光を観察した。対照であるＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳ）の無細胞抽出液（野生型酵素）に比べ、早く蛍光がなくなった酵素を塩素原子存在下で反応性の高い酵素、すなわちクロロアセトンに対する安定性が向上した酵素として選抜した。実施例２と同様の方法で変異型ＲＢＳ遺伝子の塩基配列を決定し、変異部位を特定した。クロロアセトンに対する安定性が向上した酵素を表４に示す。【０１４２】
【表４】
0005889785.tif 000009
【０１４３】
表４に示す１３種類のクロロアセトンに対する安定性が向上した酵素を取得した。【０１４４】
（実施例４）改変型カルボニル還元酵素の選抜３
変異酵素ライブラリーより無機塩化物の１つである塩化ナトリウムによる反応阻害に対する抵抗性が向上した改変型カルボニル還元酵素を選抜した。実施例１で作製した変異酵素ライブラリー１の各組換え菌及び参考例３で作製したＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳ）（対照）をそれぞれ参考例４と同様の方法で培養した。得られた各培養液６０μｌに１０ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ及び１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２４０μｌを加え、３７℃で１時間インキュベートした。各処理液を遠心し、上清を無細胞抽出液とした。無細胞抽出液を９６穴プレート（ＡＧＣテクノグラス社製）に５０μｌ分注し、６ｍＭのＮＡＤＰＨを含むリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）５０μｌと１．２４Ｍ塩化ナトリウムと２０ｍＭ  ３−キヌクリジノン塩酸塩を含むリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１００μｌを加え３０℃で反応した。経時的にＵＶサンプル撮影装置ＦＡＳ−ＩＩＩ（東洋紡績社製）でＮＡＤＰＨの蛍光を観察した。対照であるＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳ）の無細胞抽出液（野生型酵素）に比べ、早く蛍光がなくなった酵素を塩素原子存在下で反応性の高い酵素、すなわち塩化ナトリウムによる反応阻害に対する抵抗性が向上した改変型カルボニル還元酵素として選抜した。実施例２と同様の方法で変異型ＲＢＳ遺伝子の塩基配列を決定し、変異部位を特定した。塩化ナトリウムによる反応阻害に対する抵抗性が向上した酵素を表５に示す。【０１４５】
【表５】
0005889785.tif 000010
【０１４６】
表５に示す２３種類の塩化ナトリウムによる反応阻害に対する抵抗性が向上した酵素を取得した。【０１４７】
（実施例５）変異酵素ライブラリーの作製
実施例２で取得したＴ２Ｉ−Ｌ４６Ｍ変異酵素の変異型ＲＢＳ遺伝子を含むプラスミドｐＮＢＳｍ１をテンプレートに実施例１と同様の方法で変異酵素ライブラリーを作製し、これを変異酵素ライブラリー２とした。【０１４８】
（実施例６）改変型カルボニル還元酵素の選抜４
変異酵素ライブラリー２より有機塩化物の１つであるクロロアセトンに対する安定性が向上した改変型カルボニル還元酵素を選抜した。実施例５で作製した変異酵素ライブラリー２の各組換え菌及び実施例２で取得したＴ２Ｉ−Ｌ４６Ｍ変異酵素を生産するＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳｍ１）（対照）をそれぞれ参考例４と同様の方法で培養した。得られた各培養液６０μｌに１０ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ及び１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２４０μｌを加え、３７℃で１時間インキュベートした。各処理液を遠心し、上清を無細胞抽出液とした。各無細胞抽出液１００μｌに０．０２％  クロロアセトンを含むリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を加え、３０℃で１８時間インキュベートした（クロロアセトン処理）。クロロアセトン処理した各無細胞抽出液を９６穴プレート（ＡＧＣテクノグラス社製）に５０μｌ分注し、６ｍＭのＮＡＤＰＨを含むリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）５０μｌと２０ｍＭ  ３−キヌクリジノン塩酸塩を含むリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１００μｌを加え３０℃で反応した。経時的にＵＶサンプル撮影装置ＦＡＳ−ＩＩＩ（東洋紡績社製）でＮＡＤＰＨの蛍光を観察した。対照であるＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳｍ１）の無細胞抽出液（Ｔ２Ｉ−Ｌ４６Ｍ変異酵素）に比べ、早く蛍光がなくなった酵素をクロロアセトンに対する安定性が向上した酵素として選抜した。実施例２と同様の方法で変異型ＲＢＳ遺伝子の塩基配列を決定し、変異部位を特定した。得られたクロロアセトンに対する安定性が向上した改変型カルボニル還元酵素を表６に示す。【０１４９】
【表６】
0005889785.tif 000011
【０１５０】
表６に示す１１種類のクロロアセトンに対する安定性が向上した改変型カルボニル還元酵素を取得した。【０１５１】
（実施例７）改変型カルボニル還元酵素の選抜５
変異酵素ライブラリー２より無機塩化物の１つである塩化ナトリウムによる反応阻害に対する抵抗性が向上した改変型カルボニル還元酵素を選抜した。実施例５で作製した変異酵素ライブラリー２の各組換え菌及び実施例２で取得したＴ２Ｉ−Ｌ４６Ｍ変異酵素を生産するＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳｍ１）（対照）をそれぞれ参考例４と同様の方法で培養した。得られた各培養液６０μｌに１０ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ及び１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２４０μｌを加え、３７℃で１時間インキュベートした。各処理液を遠心し、上清を無細胞抽出液とした。無細胞抽出液を９６穴プレート（ＡＧＣテクノグラス社製）に５０μｌ分注し、６ｍＭのＮＡＤＰＨを含むリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）５０μｌと１．２４Ｍ塩化ナトリウムと２０ｍＭ  ３−キヌクリジノン塩酸塩を含むリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１００μｌを加え３０℃で反応した。経時的にＵＶサンプル撮影装置ＦＡＳ−ＩＩＩ（東洋紡績社製）でＮＡＤＰＨの蛍光を観察した。対照であるＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳｍ１）の無細胞抽出液（Ｔ２Ｉ−Ｌ４６Ｍ変異酵素）に比べ、早く蛍光がなくなった酵素を塩化ナトリウムによる反応阻害に対する抵抗性が向上した改変型カルボニル還元酵素として選抜した。実施例２と同様の方法で変異型ＲＢＳ遺伝子の塩基配列を決定し、変異部位を特定した。得られた塩化ナトリウムによる反応阻害に対する抵抗性が向上した改変型カルボニル還元酵素を表７に示す。【０１５２】
【表７】
0005889785.tif 000012
【０１５３】
表７に示す１３種類の塩化ナトリウムによる反応阻害に対する抵抗性が向上した改変型カルボニル還元酵素を取得した。【０１５４】
（実施例８）多重変異改変型カルボニル還元酵素の作製
実施例２で取得したプラスミドｐＮＢＳｍ０１を鋳型として、プライマー５：５’−ＡＴＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＴＣＣＡＣＣＣＧＣＡＡＣＣＣＣＧ−３’（配列表の配列番号７）、プライマー６：５’−ＣＧＧＣＧＡＴＣＣＧＣＧＧＣＡＧＧＧＡＧＣＣＧＧＣＣＣＡＧＴ−３’（配列表の配列番号８）を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＴ２Ｉ、Ｌ４６Ｍ、Ｆ６８Ｓのアミノ酸置換を有するＮ末端側のポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た（Ｎ末端側ＤＮＡ）。同様にプラスミドｐＮＢＳｍ０１を鋳型として、プライマー７：５’−ＡＣＴＧＧＧＣＣＧＧＣＴＣＣＣＴＧＣＣＧＣＧＧＡＴＣＧＣＣＧ−３’（配列表の配列番号９）、プライマー８：５’−ＴＡＴＡＧＧＴＡＣＣＴＴＡＴＣＡＡＡＧＣＴＴＧＴＣＧＡＡＣＧ−３’（配列表の配列番号１０）を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＦ６８Ｓのアミノ酸置換を有するＣ末端側のポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た（Ｃ末端側ＤＮＡ）。Ｎ末端側ＤＮＡとＣ末端側ＤＮＡを混合し、これを鋳型として、プライマー５、プライマー８を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＴ２Ｉ、Ｌ４６Ｍ、Ｆ６８Ｓのアミノ酸置換を有するポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た。参考例２と同様の方法でｐＵＣＮ１８に導入し、ｐＮＢＳｍ５７を作製した。このｐＮＢＳｍ５７を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、改変型カルボニル還元酵素Ｔ２Ｉ−Ｌ４６Ｍ−Ｆ６８Ｓを生産する組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳｍ５７）を得た。【０１５５】
（実施例９）多重変異改変型カルボニル還元酵素の作製
実施例２で取得したプラスミドｐＮＢＳｍ０１を鋳型として、プライマー９：５’−ＡＴＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＣＣＣＡＣＣＣＧＣＡＡＣＣＣＣＧ−３’（配列表の配列番号１１）、プライマー６を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＬ４６Ｍ、Ｆ６８Ｓのアミノ酸置換を有するＮ末端側のポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た（Ｎ末端側ＤＮＡ）。同様にプラスミドｐＮＢＳｍ０１を鋳型として、プライマー７、プライマー８を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＦ６８Ｓのアミノ酸置換を有するＣ末端側のポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た（Ｃ末端側ＤＮＡ）。Ｎ末端側ＤＮＡとＣ末端側ＤＮＡを混合し、これを鋳型として、プライマー９、プライマー８を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＬ４６Ｍ、Ｆ６８Ｓのアミノ酸置換を有するポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た。参考例２と同様の方法でｐＵＣＮ１８に導入し、ｐＮＢＳｍ５８を作製した。このｐＮＢＳｍ５８を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、改変型カルボニル還元酵素Ｌ４６Ｍ−Ｆ６８Ｓを生産する組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳｍ５８）を得た。【０１５６】
（実施例１０）改変型カルボニル還元酵素の作製
参考例２で取得したプラスミドｐＮＢＳを鋳型として、プライマー５：５’−ＡＴＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＴＣＣＡＣＣＣＧＣＡＡＣＣＣＣＧ−３’（配列表の配列番号７）、プライマー８：５’−ＴＡＴＡＧＧＴＡＣＣＴＴＡＴＣＡＡＡＧＣＴＴＧＴＣＧＡＡＣＧ−３’（配列表の配列番号１０）を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＴ２Ｉのアミノ酸置換を有するポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た。参考例２と同様の方法でｐＵＣＮ１８に導入し、ｐＮＢＳｍ５９を作製した。このｐＮＢＳｍ５９を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、改変型カルボニル還元酵素Ｔ２Ｉを生産する組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳｍ５９）を得た。【０１５７】
（実施例１１）改変型カルボニル還元酵素の作製
参考例２で取得したプラスミドｐＮＢＳｍ０１を鋳型として、プライマー９：５’−ＡＴＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＣＣＣＡＣＣＣＧＣＡＡＣＣＣＣＧ−３’（配列表の配列番号１１）、プライマー８：５’−ＴＡＴＡＧＧＴＡＣＣＴＴＡＴＣＡＡＡＧＣＴＴＧＴＣＧＡＡＣＧ−３’（配列表の配列番号１０）を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＬ４６Ｍのアミノ酸置換を有するポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た。参考例２と同様の方法でｐＵＣＮ１８に導入し、ｐＮＢＳｍ６０を作製した。このｐＮＢＳｍ６０を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、改変型カルボニル還元酵素Ｌ４６Ｍを生産する組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳｍ６０）を得た。【０１５８】
（実施例１２）改変型カルボニル還元酵素の評価１
実施例２で取得した改変型カルボニル還元酵素の各組換え菌及び参考例３で作製したＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳ）（対照）をそれぞれ参考例４と同様の方法で培養した。得られた各培養液について、遠心分離により菌体を集め、培養液と等量の１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁した。これを、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。無細胞抽出液５００μｌに１．２４Ｍ塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５００μｌを加え、３０℃でインキュベートした（塩化ナトリウム処理）。０時間目と２０時間目の塩化ナトリウム処理液をサンプリングし、希釈して参考例４に示した方法で３−キヌクリジノンに対する還元活性を測定した。下記式より残存活性は算出し、この値を塩化ナトリウムに対する安定性の指標とした。
残存活性（％）＝［２０時間目の酵素活性］÷［０時間目の酵素活性］×１００
野生型酵素及び改変型カルボニル還元酵素の残存活性を表８に示す。【０１５９】
【表８】
0005889785.tif 000013
【０１６０】
表８に示した改変型カルボニル還元酵素は野生型酵素よりも無機塩化物の１つである塩化ナトリウムに対する安定性が向上していた。【０１６１】
（実施例１３）改変型カルボニル還元酵素の評価２
実施例２〜９で取得した改変型カルボニル還元酵素の各組換え菌及び参考例３で作製したＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳ）（対照）をそれぞれ参考例４と同様の方法で培養した。得られた各培養液について、遠心分離により菌体を集め、培養液と等量の１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁した。これを、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。無細胞抽出５００μｌに０．０２％クロロアセトンを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５００μｌを加え、３０℃でインキュベートした（クロロアセトン処理）。０時間目と２０時間目のクロロアセトン処理液をサンプリングし、希釈して参考例４に示した方法で３−キヌクリジノンに対する還元活性を測定した。下記式より残存活性は算出し、この値をクロロアセトンに対する安定性の指標とした。
残存活性（％）＝［２０時間目の酵素活性］÷［０時間目の酵素活性］×１００
野生型酵素及び改変型カルボニル還元酵素の残存活性を表９に示す。【０１６２】
【表９】
0005889785.tif 000014
【０１６３】
表９に示した改変型カルボニル還元酵素は野生型酵素よりも有機塩化物の１つであるクロロアセトンに対する安定性が向上していた。また、実施例８及び９で作製した多重変異酵素Ｔ２Ｉ−Ｌ４６Ｍ−Ｆ６８Ｓ、Ｌ４６Ｍ−Ｆ６８Ｓは改変型カルボニル還元酵素Ｔ２Ｉ−Ｌ４６ＭやＦ６８Ｓに比べてさらに安定性が向上していた。【０１６４】
（実施例１４）改変型カルボニル還元酵素の評価３
実施例２〜１１で取得した改変型カルボニル還元酵素の各組換え菌及び参考例３で作製したＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳ）（対照）をそれぞれ参考例４と同様の方法で培養した。得られた各培養液について、遠心分離により菌体を集め、培養液と等量の１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁した。これを、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。塩化ナトリウム存在下での３−キヌクリジノンに対する還元活性を、０．６２Ｍ  塩化ナトリウム、５ｍＭ  ３−キヌクリジノン、０．２５ｍＭ補酵素ＮＡＤＰＨを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、無細胞抽出液を添加して３０℃で１分間反応を行い、波長３４０ｎｍにおける吸光度の減少速度より算出した。また、塩化ナトリウム非存在下での３−キヌクリジノンに対する還元活性についても参考例４に示した方法で算出した。下記式より相対活性を算出し、この値を塩化ナトリウムによる反応阻害に対する抵抗性の指標とした。
相対活性（％）＝［塩化ナトリウム存在下での酵素活性］÷［塩化ナトリウム非存在下での酵素活性］×１００
野生型酵素及び改変型カルボニル還元酵素の相対活性を表１０に示す。【０１６５】
【表１０】
0005889785.tif 000015
【０１６６】
表１０に示した改変型カルボニル還元酵素は野生型酵素よりも無機塩化物の１つである塩化ナトリウムによる反応阻害に対する抵抗性が向上していた。また、実施例８及び９で作製した多重変異酵素Ｔ２Ｉ−Ｌ４６Ｍ−Ｆ６８Ｓ、Ｌ４６Ｍ−Ｆ６８Ｓは改変型カルボニル還元酵素Ｔ２Ｉ−Ｌ４６ＭやＦ６８Ｓに比べて、さらに反応阻害に対する抵抗性が向上していた。【０１６７】
（実施例１５）
参考例４と同様の方法で野生型酵素及び改変型カルボニル還元酵素Ｔ２Ｉ−Ｌ４６Ｍを生産するＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳ０１）およびＴ２Ｉ−Ｒ３２Ｈ−Ｌ４６Ｍを生産するＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳ４３）を培養し、無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液の３−キヌクリジノン還元活性を測定し、これを阻害剤なしの活性とした。表１１に示した化合物及び５ｍＭ  ３−キヌクリジノン、０．２５ｍＭ補酵素ＮＡＤＰＨを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、無細胞抽出液を添加して３０℃で１分間反応を行い、波長３４０ｎｍにおける吸光度の減少速度より３−キヌクリジノンに対する還元活性を算出した。【０１６８】
相対活性は下記式より算出し、この値を各種化合物による反応阻害の指標とした。結果を表１１に示す。
相対活性（％）＝［各種化合物存在下での酵素活性］÷［阻害剤なしの酵素活性］×１００【０１６９】
【表１１】
0005889785.tif 000016
【０１７０】
表１１に示した改変型カルボニル還元酵素は野生型酵素よりも臭化カリウムやヨウ化ナトリウムのようなハロゲン原子を含む化合物による反応阻害に対する抵抗性が向上していた。【０１７１】
（実施例１６）改変型カルボニル還元酵素を用いた（Ｒ）−３−キヌクリジノールの製造
実施例２〜１１で取得した改変型カルボニル還元酵素を生産する各組換え菌をそれぞれ参考例４と同様に培養後、超音波ホモゲナイザーによる菌体破砕を実施し、無細胞抽出液１ｍｌを得た。この無細胞抽出液１ｍｌに、ＮＡＤＰＨ５１ｍｇ、３−キヌクリジノン塩酸塩１０ｍｇを添加し、６Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ６．５に調製し、３０℃で１時間攪拌した。反応液の一部をサンプリングし、６Ｎ  水酸化ナトリウムでｐＨ１３以上とした後にｎ−ブタノールで抽出した。抽出液を後述の［ガスクロマトグラフィーによる分析条件（２）］の条件で分析することにより、３−キヌクリジノールの生成を確認した。その結果、取得したすべての改変型カルボニル還元酵素が３−キヌクリジノンを立体選択的に還元し、（Ｒ）−３−キヌクリジノールを生成していた。【０１７２】
（比較例１）組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳ）を用いた（Ｒ）−３−キヌクリジノールの製造
野生型酵素を生産するＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳ）を参考例４と同様に培養後、超音波ホモゲナイザーによる菌体破砕を実施し、無細胞抽出液１００ｍｌを得た。この無細胞抽出液１００ｍｌに、グルコース脱水素酵素（商品名：ＧＬＵＣＤＨ”Ａｍａｎｏ”ＩＩ、天野エンザイム社製）１０００Ｕ、グルコース２４ｇ、ＮＡＤＰ＋３ｍｇ、塩化物として塩酸を含む３−キヌクリジノン塩酸塩１９ｇを添加し、５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによりｐＨ６．５に調整しながら、３０℃で２０時間攪拌した。反応液の一部をサンプリングし、６Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ１３以上とした後にｎ−ブタノールで抽出した。抽出液を下記の［ガスクロマトグラフィーによる分析条件（１）］で分析し、（Ｒ）−３−キヌクリジノールへの変換率を測定した。また、抽出液を下記の［ガスクロマトグラフィーによる分析条件（２）］の条件で分析することにより、（Ｒ）−３−キヌクリジノールの光学純度を測定した。その結果、（Ｒ）−３−キヌクリジノールへの変換率は４５％であり、その光学純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。野生型酵素は塩化物存在下で反応阻害、酵素失活を受けるため変換率が低かった。【０１７３】
［ガスクロマトグラフィーによる分析条件（１）］
カラム：Ｒｔｘ−５  ａｍｉｎｅ  キャピラリーカラム（３０ｍ、内径０．２５ｍｍ、Ｒｅｓｔｅｋ社製）
検出器：水素炎イオン化検出器
注入部温度：２２０℃、
カラム温度：１５０℃、
検出器温度：２２０℃
キャリアーガス：ヘリウム、流量１３０ＫＰａ【０１７４】
［ガスクロマトグラフィーによる分析条件（２）］
カラム：Ｇａｍｍａ  ＤＥＸ（３０ｍ、内径０．２５ｍｍ、ＳＵＰＥＬＣＯ社製）  
検出器：水素炎イオン化検出器
注入部温度：２２０℃、
カラム温度：１５０℃、
検出器温度：２２０℃
キャリアーガス：ヘリウム、流量７０ＫＰａ【０１７５】
（比較例２）組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳ）を用いた（Ｒ）−３−キヌクリジノールの製造
塩化物非存在下で野生型酵素を用いて、（Ｒ）−３−キヌクリジノールを製造した。３−キヌクリジノン塩酸塩を等量の水に溶解し、水酸化ナトリウムでｐＨ１２に調整した後、２倍量のｎ−ブタノールで３回抽出した。抽出液を減圧濃縮し、フリー体３−キヌクリジノンの結晶を得た。野生型酵素を生産するＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳ）を参考例４と同様に培養後、超音波ホモゲナイザーによる菌体破砕を実施し、無細胞抽出液１００ｍｌを得た。この無細胞抽出液１００ｍｌに、グルコース脱水素酵素（商品名：ＧＬＵＣＤＨ”Ａｍａｎｏ”ＩＩ、天野エンザイム社製）１０００Ｕ、グルコース２４ｇ、ＮＡＤＰ＋３ｍｇを添加し、硫酸でｐＨ６．５に調整しながら３−キヌクリジノン１５ｇを加えた。５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによりｐＨ６．５に調整しながら、３０℃で２０時間攪拌した。反応液の一部をサンプリングし、６Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ１３以上とした後にｎ−ブタノールで抽出した。抽出液を前記の［ガスクロマトグラフィーによる分析条件（１）］で分析し、（Ｒ）−３−キヌクリジノールへの変換率を測定した。また、抽出液を下記の［ガスクロマトグラフィーによる分析条件（２）］の条件で分析することにより、（Ｒ）−３−キヌクリジノールの光学純度を測定した。その結果、（Ｒ）−３−キヌクリジノールへの変換率は１００％であり、その光学純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。野生型酵素は塩化物非存在下では比較例１に比べ変換率が高かった。しかし、本法ではフリー体３−キヌクリジノンを調製する工程が必要であり、効率的な製造法ではなかった。【０１７６】
（実施例１７）組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳｍ０１）を用いた（Ｒ）−３−キヌクリジノールの製造
実施例２で取得した改変型カルボニル還元酵素Ｔ２Ｉ−Ｌ４６Ｍを生産するＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳｍ０１）を参考例４と同様の方法で無細胞抽出液を調製し、比較例１と同様の方法でキヌクリジノン還元反応を実施した。その結果、（Ｒ）−３−キヌクリジノールへの変換率は１００％であり、その光学純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。【０１７７】
改変型カルボニル還元酵素Ｔ２Ｉ−Ｌ４６Ｍを用いた反応での変換率は比較例１の野生型酵素を用いた場合よりも高く、塩化物の１つである３−キヌクリジノン塩酸塩存在下での反応性が向上していた。【０１７８】
（実施例１８）組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳｍ０５）を用いた（Ｒ）−３−キヌクリジノールの製造
実施例２で取得した改変型カルボニル還元酵素Ｆ６８Ｓを生産するＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳｍ０５）について、実施例１７と同様の方法でキヌクリジノン還元反応を実施した。その結果、変換率は１００％、光学純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。【０１７９】
改変型カルボニル還元酵素Ｆ６８Ｓを用いた反応での変換率は比較例１の野生型酵素を用いた場合よりも高く、塩化物の１つである３−キヌクリジノン塩酸塩存在下での反応性が向上していた。【０１８０】
（実施例１９）組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳｍ１０）を用いた（Ｒ）−３−キヌクリジノールの製造
実施例２で取得した改変型カルボニル還元酵素Ｄ９５Ｇを生産するＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳｍ１０）について、実施例１７と同様の方法でキヌクリジノン還元反応を実施した。その結果、変換率は１００％、光学純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。【０１８１】
改変型カルボニル還元酵素Ｄ９５Ｇを用いた反応での変換率は比較例１の野生型酵素を用いた場合よりも高く、塩化物の１つである３−キヌクリジノン塩酸塩存在下での反応性が向上していた。【０１８２】
（実施例２０）組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳｍ０１）を用いた（Ｒ）−３−キヌクリジノールの製造【０１８３】
実施例２で取得した改変型カルボニル還元酵素Ｔ２Ｉ−Ｌ４６Ｍを生産するＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳｍ０１）を参考例４と同様に培養後、超音波ホモゲナイザーによる菌体破砕を実施し、無細胞抽出液１００ｍｌを得た。この無細胞抽出液１００ｍｌに、グルコース脱水素酵素（商品名：ＧＬＵＣＤＨ”Ａｍａｎｏ”ＩＩ、天野エンザイム社製）１０００Ｕ、グルコース３２ｇ、ＮＡＤＰ＋３ｍｇ、３−キヌクリジノン塩酸塩２６ｇを添加し、５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによりｐＨ６．５に調整しながら、３０℃で３０時間攪拌した。反応液の一部をサンプリングし、６Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ１３以上とした後にｎ−ブタノールで抽出した。抽出液を比較例１と同様の方法で分析した。その結果、（Ｒ）−３−キヌクリジノールへの変換率は９５％であり、その光学純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。【０１８４】
塩化物存在下での反応性が向上した改変型カルボニル還元酵素Ｔ２Ｉ−Ｌ４６Ｍは比較例１の野生型酵素よりも高濃度の反応が可能だった。【０１８５】
（実施例２１）組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳｍ４３）を用いた（Ｒ）−３−キヌクリジノールの製造
実施例６で取得した改変型カルボニル還元酵素Ｔ２Ｉ−Ｒ３２Ｈ−Ｌ４６Ｍを生産するＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳｍ４３）について実施例２０と同様の方法でキヌクリジノン還元反応を実施した。その結果、（Ｒ）−３−キヌクリジノールへの変換率は１００％であり、その光学純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。【０１８６】
（実施例２２）組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳｍ４４）を用いた（Ｒ）−３−キヌクリジノールの製造
実施例６で取得した改変型カルボニル還元酵素Ｔ２Ｉ−Ａ４５Ｓ−Ｌ４６Ｍ−Ｇ９０Ｓを生産するＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳｍ４４）について実施例２０と同様の方法でキヌクリジノン還元反応を実施した。その結果、（Ｒ）−３−キヌクリジノールへの変換率は１００％であり、その光学純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。【０１８７】
（実施例２３）組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳｍ４５）を用いた（Ｒ）−３−キヌクリジノールの製造
実施例６で取得した改変型カルボニル還元酵素Ｔ２Ｉ−Ａ４５Ｔ−Ｌ４６Ｍを生産するＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳｍ４５）について実施例２０と同様の方法でキヌクリジノン還元反応を実施した。その結果、（Ｒ）−３−キヌクリジノールへの変換率は１００％であり、その光学純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。【０１８８】
（参考例７）組換えベクターｐＳＴＶＧの構築
プライマー１０：５’−ＧＣＣＧＡＡＴＴＣＴＡＡＧＧＡＧＧＴＴＡＡＣＡＡＴＧＴＡＴＡＡＡＧＡＴＴＴＡＧＡＡＧＧ−３’（配列表の配列番号１２）と、プライマー１１：５’−ＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＴＡＴＣＣＧＣＧＴＣＣＴＧＣＴＴＧＧ−３’（配列表の配列番号１３）を用い、プラスミドｐＧＤＫ１（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８６，３８９（１９８９））に記載の方法で取得及び調製可能）を鋳型としてＰＣＲを行い、バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＩＡＭ１０３０株由来のグルコース脱水素酵素（以後、ＧＤＨと呼ぶ）遺伝子の開始コドンから５塩基上流に大腸菌のリボゾーム結合配列に、さらにその直前にＥｃｏＲＩ認識部位が付加され、かつ、終止コドンの直後にＳａｌＩおよびＰｓｔＩ認識部位が付加された二本鎖ＤＮＡ（ＧＤＨ遺伝子）を取得した。得られたＧＤＨ遺伝子をＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで消化し、プラスミドｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）のＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ部位に挿入して、組換えベクターｐＳＴＶＧを構築した。【０１８９】
（参考例８）ポリペプチドを発現する組換え生物の作製
参考例２で構築した組換えベクターｐＮＢＳおよび参考例７で構築したｐＳＴＶＧの２つの組換えベクターを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳ，ｐＳＴＶＧ）を得た。また、ｐＵＣＮ１８及びｐＳＴＶ２８を用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＵＣＮ１８，ｐＳＴＶ２８）を得た。【０１９０】
（参考例９）  組換え生物におけるＤＮＡの発現
参考例８で得た２種の組換え生物（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳ，ｐＳＴＶＧ）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＵＣＮ１８，ｐＳＴＶ２８））、それぞれを、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび１００μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、塩化ナトリウム０．５％、ｐＨ７．０）５ｍｌに接種し、３７℃で２４時間振盪培養した。【０１９１】
上記の培養で得られたそれぞれの培養液について、遠心分離により菌体を集め、５ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁した。これを、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。これら無細胞抽出液の３−キヌクリジノン還元活性を参考例６と同様の方法で測定した。また、ＧＤＨ活性についても測定した。【０１９２】
ＧＤＨ活性は、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、グルコース０．１Ｍ、補酵素ＮＡＤＰ２ｍＭ、および無細胞抽出液を添加して２５℃で１分間反応を行い、波長３４０ｎｍにおける吸光度の増加速度より算出した。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰをＮＡＤＰＨに還元する酵素活性を１Ｕと定義した。
それぞれの組換え生物の３−キヌクリジノン還元活性およびＧＤＨ活性を以下に示す。【０１９３】
Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１（ｐＵＣＮ１８，ｐＳＴＶ２８）については、３−キヌクリジノン還元活性、ＧＤＨ活性共に０．１Ｕ／ｍｇ以下であった。【０１９４】
また、ＲＢＳ、ＧＤＨを共発現させたＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳ，ｐＳＴＶＧ）の３−キヌクリジノン還元活性は１００Ｕ／ｍｇ、ＧＤＨ活性は４０Ｕ／ｍｇであった。【０１９５】
（実施例２４）組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳｍ０１，ｐＳＴＶＧ）の作製
実施例２で取得した改変型カルボニル還元酵素Ｔ２Ｉ−Ｌ４６Ｍをコードする遺伝子を含む組換えベクターｐＮＢＳｍ０１および参考例５で構築したｐＳＴＶＧの２つの組換えベクターを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳｍ０１，ｐＳＴＶＧ）を得た。【０１９６】
（実施例２５）組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳｍ０１，ｐＳＴＶＧ）を用いた（Ｒ）−３−キヌクリジノールの製造
実施例２４で取得したＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳｍ０１，ｐＳＴＶＧ）を参考例４と同様に培養後、超音波ホモゲナイザーによる菌体破砕を実施し、無細胞抽出液１００ｍｌを得た。この無細胞抽出液１００ｍｌにグルコース２４ｇ、ＮＡＤＰ＋３ｍｇ、３−キヌクリジノン塩酸塩１９ｇを添加し、５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによりｐＨ６．５に調整しながら、３０℃で２０時間攪拌した。反応液の一部をサンプリングし、６Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ１３以上とした後にｎ−ブタノールで抽出した。抽出液を比較例１と同様の方法で分析した。その結果、（Ｒ）−３−キヌクリジノールへの変換率は１００％であり、その光学純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。【０１９７】
（比較例３）組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳ）を用いた（Ｓ）−３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オールの製造
野生型酵素を生産するＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳ）を参考例４と同様に培養後、超音波ホモゲナイザーによる菌体破砕を実施し、無細胞抽出液１００ｍｌを得た。この無細胞抽出液１００ｍｌに、グルコース脱水素酵素（商品名：ＧＬＵＣＤＨ”Ａｍａｎｏ”ＩＩ、天野エンザイム社製）１０００Ｕ、グルコース３０ｇ、トルエン１０ｇ、ＮＡＤＰ＋１０ｍｇ、３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オンを１５ｇ添加し、５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによりｐＨ６．２５に調整しながら、３０℃で攪拌した。反応開始後２４時間目に反応液の一部をサンプリングし、酢酸エチルで抽出した。抽出液を下記の高速液体クロマトグラフィーの条件で分析し、（Ｓ）−３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オールへの変換率とその光学純度を測定した。その結果、変換率は７８％であり、その光学純度は９９％ｅ．ｅ．であった。【０１９８】
［高速液体クロマトグラフィーによる分析条件］
カラム：Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ  ＯＤ−Ｈ（４．６μｍ（内径）×２５０ｍｍ；ダイセル化学社製）
カラム温度：３０℃
検出波長：２４０ｎｍ
移動相：ｎ−ヘキサン／イソプロパノール＝９７．５／２．５
保持時間：（Ｓ）−３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オール  約１９．９分、（Ｒ）−３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オール  約２１．５分、３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オン  約１２．２分【０１９９】
（実施例２６）組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳｍ０１）を用いた（Ｓ）−３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オールの製造
実施例２で取得した改変型カルボニル還元酵素Ｔ２Ｉ−Ｌ４６Ｍを生産するＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳｍ０１）について比較例３と同様の方法で３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オン還元反応を実施した。反応終了後、比較例２と同様の方法で分析した。その結果、（Ｓ）−３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オールの変換率は９５％であり、その光学純度は９９％ｅ．ｅ．であった。【０２００】
改変型カルボニル還元酵素Ｔ２Ｉ−Ｌ４６Ｍを用いた反応での変換率は比較例３の野生型酵素を用いた場合よりも高く、有機塩化物の１つである３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オン存在下での反応性が向上していた。【０２０１】
（実施例２７）組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳｍ０５）を用いた（Ｓ）−３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オールの製造
実施例２で取得した改変型カルボニル還元酵素Ｆ６８Ｓを生産するＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳｍ０５）について実施例２６と同様の方法で３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オン還元反応を実施した。その結果、（Ｓ）−３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オールの変換率は９２％であり、その光学純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。【０２０２】
改変型カルボニル還元酵素Ｆ６８Ｓを用いた反応での変換率は比較例３の野生型酵素を用いた場合よりも高く、有機塩化物の１つである３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オン存在下での反応性が向上していた。【０２０３】
（実施例２８）組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳｍ１０）を用いた（Ｓ）−３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オールの製造
実施例２で取得した改変型カルボニル還元酵素Ｄ９５Ｇを生産するＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳｍ１０）について実施例２６と同様の方法で３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オン還元反応を実施した。その結果、（Ｓ）−３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オールの変換率は９６％であり、その光学純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。【０２０４】
改変型カルボニル還元酵素Ｄ９５Ｇを用いた反応での変換率は比較例３の野生型酵素を用いた場合よりも高く、有機塩化物の１つである３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オン存在下での反応性が向上していた。【０２０５】
（実施例２９）組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳｍ４３）を用いた（Ｓ）−３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オールの製造
実施例６で取得した改変型カルボニル還元酵素Ｔ２Ｉ−Ｒ３２Ｈ−Ｌ４６Ｍを生産するＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳｍ４３）について実施例２６と同様の方法で３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オン還元反応を実施した。その結果、（Ｓ）−３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オールの変換率は９８％であり、その光学純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。【０２０６】
改変型カルボニル還元酵素Ｔ２Ｉ−Ｒ３２Ｈ−Ｌ４６Ｍを用いた反応での変換率は比較例３の野生型酵素を用いた場合よりも高く、有機塩化物の１つである３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オン存在下での反応性が向上していた。【０２０７】
（実施例３０）組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳｍ０１，ｐＳＴＶＧ）を用いた（Ｓ）−３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オールの製造
実施例２４で取得したＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳｍ０１，ｐＳＴＶＧ）を参考例４と同様に培養し、培養液１００ｍｌを得た。この培養液１００ｍｌにグルコース３０ｇ、トルエン１０ｇ、ＮＡＤＰ＋１０ｍｇ、３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オンを１５ｇ添加し、５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによりｐＨ６．２５に調整しながら、３０℃で攪拌した。反応開始後２４時間目に反応液の一部をサンプリングし、酢酸エチルで抽出した。抽出液を比較例２と同様の方法で分析した。その結果、（Ｓ）−３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オールの変換率は９６％であり、その光学純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。【０２０８】
（実施例３１）（１Ｓ，３´Ｒ）−キヌクリジン−３´−イル  １−フェニル−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−２−カルボン酸塩酸塩の製造
（工程１）
実施例２４で取得したＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳｍ０１，ｐＳＴＶＧ）を参考例４と同様に培養後、超音波ホモゲナイザーによる菌体破砕を実施し、無細胞抽出液２００ｍｌを得た。この無細胞抽出液２００ｍｌにグルコース４８ｇ、ＮＡＤＰ＋６ｍｇ、３−キヌクリジノン塩酸塩３８ｇを添加し、５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによりｐＨ６．５に調整しながら、３０℃で２０時間攪拌した。２０時間後、反応液を比較例１と同様の方法で分析した。その結果、（Ｒ）−３−キヌクリジノールの光学純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。反応液を６Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ１３以上とした後にｎ−ブタノールで抽出し、抽出液を減圧乾燥し、結晶を得た。この結晶を再結晶化し、（Ｒ）−３−キヌクリジノール２１ｇの結晶を得た。【０２０９】
（工程２）
ジクロロメタン２００ｍｌに（Ｓ）−１−フェニル−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン１０．６ｇと炭酸カリウム１０．６ｇを加え、氷中で冷却しながら、ジクロロメタン２０ｍｌとクロロぎ酸エチル５．８ｍｌを混合した溶液を添加し、室温で一晩攪拌した。一晩後、反応液に水を添加し、室温で３０分攪拌した。有機層を分離した後、水と飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで脱水した後、減圧濃縮した。濃縮液をシリカゲルクロマトグラフィーで精製し、（Ｓ）−１−フェニル−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−２−カルボン酸を得た。【０２１０】
（工程３）
トルエン１２０ｍｌに精製した（Ｓ）−１−フェニル−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−２−カルボン酸１２ｇと（Ｒ）−３−キヌクリジノール１６．３ｇを加え、水素化ナトリウム１．７ｇを添加した後、１４０℃で３時間加熱した。反応後、室温まで冷却し、飽和食塩水を添加した後、酢酸エチルで抽出した。抽出液を水で洗浄した後、２０％塩酸で抽出した。水層を１Ｍ水酸化ナトリウムでｐＨ１０に調整した後、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、硫酸マグネシウムで脱水した。抽出液を減圧濃縮した後、塩酸を加えたアセトニトリルとジエチルエーテル中で結晶化し、無色の結晶の（１Ｓ，３´Ｒ）−キヌクリジン−３−イル−１−フェニル−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−２−カルボン酸塩酸塩１０．１ｇを得た。【０２１１】
改変型カルボニル還元酵素により製造した（Ｒ）−３−キヌクリジノールを原料に用いて、容易に医薬品原薬（１Ｓ，３´Ｒ）−キヌクリジン−３´−イル  １−フェニル−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−２−カルボン酸塩酸塩（ソリフェナシン）を製造できた。【０２１２】
（実施例３２）（Ｓ）−Ｎ−メチル−３−（１−ナフタレニルオキシ）−３−（２−チオフェン）−プロパンアミン塩酸塩の製造
（工程１）
実施例２４で取得したＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳｍ０１，ｐＳＴＶＧ）を参考例４と同様に培養し、培養液２００ｍｌを得た。この培養液１００ｍｌにグルコース６０ｇ、トルエン２０ｇ、ＮＡＤＰ＋２０ｍｇ、３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オンを３０ｇ添加し、５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによりｐＨ６．２５に調整しながら、３０℃で２４時間攪拌した。反応後、トルエンで抽出し、有機層を減圧濃縮し、（Ｓ）−３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オール２６ｇを得た。濃縮液を比較例２と同様の方法で分析した結果、（Ｓ）−３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オールの光学純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。【０２１３】
（工程２）
４０％メチルアミン／メタノール溶液９３ｇに（Ｓ）−３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オール２１．６ｇを室温で滴下し、３０分間反応させた。メタノール及びメチルアミンを減圧下で留去した後、水を加えメチル−ｔ−ブチルエーテルで抽出した。有機層を食塩水で洗浄した後、減圧濃縮した。濃縮物にｎ−ヘプタンを加え、析出した固体をろ別し、（Ｓ）−３−Ｎ−メチルアミノ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オールの微黄色結晶１７．４ｇを得た。【０２１４】
（工程３）
ペンタンで洗浄した水素化ナトリウム５ｇをジメチルアセトアミドに懸濁し、（Ｓ）−３−Ｎ−メチルアミノ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オール１７ｇを添加した後、７０℃で加熱しながら攪拌した。溶液が透明になった後、１−フルオロナフタレン２６ｇを添加し、９０℃で２時間攪拌した。反応後、水を添加し、ジエチルエーテルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、減圧濃縮した。濃縮液をカラムクロマトグラフィーで精製し、（Ｓ）−Ｎ−メチル−３−（１−ナフタレニルオキシ）−３−（２−チオフェン）−プロパンアミン１７ｇを得た。次に（Ｓ）−Ｎ−メチル−３−（１−ナフタレニルオキシ）−３−（２−チオフェン）−プロパンアミンを酢酸エチルに溶解した後、０．４４Ｍ塩酸／酢酸エチル溶液を滴下し、結晶化させた。室温で１時間攪拌後、冷却し、ジエチルエーテルを混合して、結晶をろ別し、（Ｓ）−Ｎ−メチル−３−（１−ナフタレニルオキシ）−３−（２−チオフェン）−プロパンアミン塩酸塩１５ｇを得た。【０２１５】
改変型カルボニル還元酵素により製造した（Ｓ）−３−クロロ−１−（２−チエニル）プロパン−１−オールを原料に用いて、容易に医薬品原薬（Ｓ）−Ｎ−メチル−３−（１−ナフタレニルオキシ）−３−（２−チオフェン）−プロパンアミン塩酸塩を製造できた。【０２１６】
（比較例４）野生型酵素の補酵素に対するＫｍ値の算出
参考例３で作製したＥ．  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳ）（対照）を参考例４と同様の方法で培養した。得られた培養液について、遠心分離により菌体を集め、培養液と等量の１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁した。これを、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。３−キヌクリジノンに対する還元活性を、５ｍＭ  ３−キヌクリジノン、０．０２５ｍＭ〜０．２５ｍＭ  補酵素ＮＡＤＰＨを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、無細胞抽出液を添加して３０℃で１分間反応を行い、波長３４０ｎｍにおける吸光度の減少速度より算出した。また、０．６２Ｍ  塩化ナトリウム存在下での３−キヌクリジノンに対する還元活性についても同様に補酵素濃度を変えて測定した。各測定結果のラインウィーバー・バーク・プロットを図２に示す。【０２１７】
ＮＡＤＰＨに対するＫｍ値は塩化ナトリウム非存在下では１８．９μＭ、塩化ナトリウム存在下では１９１．３μＭであった。また、塩化ナトリウム非存在下及び存在下それぞれのラインウィーバー・バーク・プロットの関係から塩化ナトリウムはＮＡＤＰＨと競合阻害の関係にあることが示された。【０２１８】
（実施例３３）変異型酵素の補酵素に対するＫｍ
実施例２及び実施例１１で取得した改変型カルボニル還元酵素Ｔ２Ｉ−Ｌ４６Ｍ、Ｆ６８Ｓ、Ｄ９５Ｇ及びＬ４６Ｍをそれぞれ生産するＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳｍ０１）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳｍ０５）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳｍ１０）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳｍ６０）について比較例４と同様の方法で塩化ナトリウム非存在下でのＮＡＤＰＨに対するＫｍ値を算出した。【０２１９】
その結果、塩化ナトリウム非存在下でのＮＡＤＰＨに対するＫｍ値はＴ２Ｉ−Ｌ４６Ｍが６．４μＭ、Ｆ６８Ｓが１３．８μＭ、Ｄ９５Ｇが１５．５μＭ、Ｌ４６Ｍが６．３μＭであった。比較例４の野生型酵素のＫｍ値を１００％とした場合、これらの改変型カルボニル還元酵素はそれぞれ３３．９％、７３．０％、８２．０％、３３．３％とＮＡＤＰＨに対するＫｍ値が小さく、補酵素ＮＡＤＰＨに対する親和性が向上していた。また、実施例１４に示したようにこれらの改変型カルボニル還元酵素は野生型酵素に比べ塩化ナトリウムに対する阻害抵抗性も向上していた。参考例１０で示したように、野生型酵素において、塩化ナトリウムはＮＡＤＰＨと競合阻害の関係にあり、補酵素に対する親和性の向上は塩化ナトリウムに対する阻害抵抗性の向上効果をもたらすことが示された。
【配列表フリーテキスト】
【０２２０】
記載した配列の解説
配列番号１：Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．に由来するポリペプチド配列である。
配列番号２：Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．に由来するポリヌクレオチド配列である。
配列番号３：プライマー１である。
配列番号４：プライマー２である。
配列番号５：プライマー３である。
配列番号６：プライマー４である。
配列番号７：プライマー５である。
配列番号８：プライマー６である。
配列番号９：プライマー７である。
配列番号１０：プライマー８である。
配列番号１１：プライマー９である。
配列番号１２：プライマー１０である。
配列番号１３：プライマー１１である。
【図１】
0005889785.tif 000019
【図２】
0005889785.tif 000020
【配列表】
0005889785000001.app