(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
KCTC11818BPの寄託番号を有するストレプトコッカスディスガラクティエＩＤ9103菌株。
【請求項２】
請求項１記載の菌株を炭素源及び窒素源を含む培地で培養する段階を含むヒアルロン酸生産方法。
【請求項３】
前記炭素源は、ブドウ糖、果糖、麦芽糖、乳糖、ガラクトース、グリセロール及びこれらの混合物からなる群より選ばれることを特徴とする請求項２記載のヒアルロン酸生産方法。
【請求項４】
前記窒素源は、酵母エキス、カゼインペプトン、カゼイン酸分解物、カゼイン酵素分解物、バクトペプトン、カジトン、ネオペプトン及びこれらの混合物からなる群より選ばれることを特徴とする請求項２記載のヒアルロン酸生産方法。
【請求項５】
前記培地は、アミノ酸を追加して含むことを特徴とする請求項２記載のヒアルロン酸生産方法。
【請求項６】
前記アミノ酸は、グルタミン、リシン、システイン、アルギニン、メチオニン、アスパラギン酸、グリシン及びこれらの混合物からなる群より選ばれることを特徴とする請求項５記載のヒアルロン酸生産方法。
【請求項７】
前記窒素源は、カゼイン酵素分解物であり、前記アミノ酸はリシンであることを特徴とする請求項５記載のヒアルロン酸生産方法。
【請求項８】
前記カゼイン酵素分解物は0.5%(w/v)乃至3.0%(w/v)の濃度で含まれ、前記リシンは0.015%(w/v)乃至0.6%(w/v)の濃度で含まれることを特徴とする請求項７記載のヒアルロン酸生産方法。
【請求項９】
前記炭素源はブドウ糖であることを特徴とする請求項７記載のヒアルロン酸生産方法。
【請求項１０】
前記炭素源及び窒素源は流加式で投入されることを特徴とする請求項２記載のヒアルロン酸生産方法。
【請求項１１】
流加式で投入される、前記炭素源はブドウ糖であり、前記窒素源はカゼイン酵素分解物であることを特徴とする請求項10記載のヒアルロン酸生産方法。
【請求項１２】
請求項１記載の菌株をネオペプトン、カゼインペプトン及びカゼイン酵素分解物からなる群より選ばれた一つ以上の窒素源及びグルタミン、システイン及びリシンからなる群より選ばれた一つ以上のアミノ酸を含む培地で培養する段階を含み、
前記培養する段階により、生産されるヒアルロン酸の平均分子量を600万Da乃至1100万Daに調節するヒアルロン酸の分子量を調節する方法。
【請求項１３】
請求項１２記載の方法であって、前記培地に、ネオペプトン及びグルタミン、又はカゼインペプトン及びシステインが含まれ、前記培養する段階により、生産されるヒアルロン酸の平均分子量を600万Da乃至700万Daに調節する方法。
【請求項１４】
請求項１２記載の方法であって、前記培地に、カゼイン酵素分解物及びグルタミン、又はカゼインペプトン及びリシンが含まれ、前記培養する段階により、生産されるヒアルロン酸の平均分子量を700万Da乃至800万Daに調節する方法。
【請求項１５】
請求項１２記載の方法であって、前記培地に、カゼイン酵素分解物及びリシンが含まれ、前記培養する段階により、生産されるヒアルロン酸の平均分子量を800万Da乃至900万Daに調節する方法。
【請求項１６】
請求項１２記載の方法であって、前記培地に、カゼイン酵素分解物及びリシンが含まれ、前記カゼイン酵素分解物を流加式で供給し、前記培養する段階により、生産されるヒアルロン酸の平均分子量を900万Da乃至1100万Daに調節する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高分子のヒアルロン酸を高い収率で生産するストレプトコッカス属菌株及びこれを利用したヒアルロン酸生産方法に関するもので、より詳細にはKCTC11818BPの寄託番号を有するストレプトコッカスディスガラクティエＩＤ9103菌株及び前記菌株を培養する段階を含むヒアルロン酸生産方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸(Hyaluronic  acid(HA)，Hyaluronan，(C14H2ONNaO11)n,n>1000))は、生体に存在する高分子であってglycosaminoglycanと言う多糖類である。その構造は、D-glucuronic  acidとN-acetylglucosamineがβ-1,3とβ-1,4結合により繰返し連結された構造を有している。水溶性物質であって粘度が極めて高く、高弾性の特性を有していて、分子量は1,000〜10,000,000  daltons(Da)に至る広範囲の直鎖の多糖類である。
【０００３】
ヒアルロン酸は塩構造として優れた効能効果を示しており、保湿効果が強く、物理的摩擦状態で強力な潤滑作用の機能が極めて優れている。また、細菌などの侵入に対する保護効果などの効能と物性において、極めて好ましい長所を有しているので、近年、医療の分野において、適用されている。このような長所は化粧品や医薬品としての役割だけでなく、医薬部外品と食品、さらに、各種の多様な素材にまで適用することができるので、ヒアルロン酸を基にする適用分野は拡大の一途にあり、開発のための試みが継続されている。
【０００４】
ヒアルロン酸を開発するためには、生体組織抽出法や微生物培養法が使用されるものの、最近ではウィルス侵入、不純物、炎症反応など多くの短所の原因となるとさか抽出法よりも、分子量と生産性を調節でき高品質の原料収得が可能な微生物培養生産法が、大勢をなしている。特に微生物培養により調節されて生産されたヒアルロン酸の分子量範囲によって、開発用途が決定されることが最近の趨勢である。10万Da以下の超低分子ヒアルロン酸は、主に食品や化粧品の用途に使用され、平均分子量100万Daの低分子ヒアルロン酸は、点眼剤の原料や誘導体開発対象に活用されることもあり、平均分子量300〜400万Daのヒアルロン酸は、膝関節注射剤原料に活用価値が高いとされている。
【０００５】
勿論、より高い分子量範囲のヒアルロン酸は、極めて多様な用途に活用される余地が多く、膝関節治療剤として活用度が極めて高いことは勿論、眼科手術補助剤の活用価値も増大すると予想される。特に、身体内の超高分子としてヒアルロン酸の役割が必要な部分は極めて多いと思われ、現在相対的に低分子ヒアルロン酸を利用して分子量や粘度又は弾性などを増大させたヒアルロン酸架橋物質に対する代替剤の役割も、十分に果たせるであろう。
【０００６】
韓国に出願された主要特許の内容などを見れば、大部分は、高分子ヒアルロン酸の発明に限られていることが分かる。大韓民国特許KR10-0250573(エルジ)は、350万Daのヒアルロン酸生産水準であり、大韓民国特許KR10-0472007(バクテク、コーロン)は平均分子量550万Daのヒアルロン酸を生産する技術に関していた。外国の場合、大部分は、400万Da以下のヒアルロン酸生産技術に関するものであった。US4784990、JP2058502、EP144019などがこれに該当する。特に、US6090596の場合には、ヒアルロン酸を高分子で生産はするものの、極めて低い生産性であり、生産製法は実際に産業的に利用することが難しく、経済性も確保されていないのが実情である。
【０００７】
一般的に、多く開発された高分子である300万〜400万Daのヒアルロン酸を、高粘弾性が必要な医療分野に適用するには、効能効果の面で不足する部分が多いことが周知の事実である。このような短所を解決するために、超高分子域である600万Da以上のヒアルロン酸を経済性も考慮して生産することができるように発明することが主目的であって、超高分子ヒアルロン酸を高付加価値の産業的薬剤として開発するためには、最も独創性を有する方法で競争力と経済的優秀性を有する技術に展開されるべきである。
【０００８】
そこで、これを解決するため、独創的で経済性のある微生物培養培地組成と大量生産技術を適用して、高分子量のヒアルロン酸を、高生産性で生産する方法の開発が必要な状況である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、高分子のヒアルロン酸を効率的に生産できる方法に関して研究する中で、ヒアルロン酸分解酵素が無く、非溶血性突然変異菌株であるストレプトコッカスディスガラクティエＩＤ9103を確保し、これの最適培養条件を確立して本発明を完成した。
【００１０】
本発明の目的は、KCTC11818BPの寄託番号を有するストレプトコッカスディスガラクティエＩＤ9103菌株を提供することである。
【００１１】
本発明の他の目的は、前記菌株を炭素源及び窒素源を含む培地で培養する段階を含むヒアルロン酸生産方法を提供することである。
【００１２】
本発明の他の目的は、ストレプトコッカス属微生物をネオペプトン、カゼインペプトン及びカゼイン酵素分解物からなる群より選ばれた一つ以上の窒素源及びグルタミン、システイン及びリシンからなる群より選ばれた一つ以上のアミノ酸を含む培地で培養する段階を含むヒアルロン酸の分子量を調節する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記の目的を達成するために、本発明はKCTC11818BPの寄託番号を有するストレプトコッカスディスガラクティエＩＤ9103菌株を提供する。
【００１４】
本発明の他の目的を達成するために、本発明の前記菌株を炭素源及び窒素源を含む培地で培養する段階を含むヒアルロン酸生産方法を提供する。
【００１５】
本発明の他の目的を達成するために、本発明はストレプトコッカス属微生物を、ネオペプトン、カゼインペプトン及びカゼイン酵素分解物からなる群より選ばれた一つ以上の窒素源及びグルタミン、システイン及びリシンからなる群より選ばれた一つ以上のアミノ酸を含む培地で培養する段階を含むヒアルロン酸の分子量を調節する方法を提供する。
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
本発明はKCTC11818BPの寄託番号を有するストレプトコッカスディスガラクティエＩＤ9103菌株を提供する。
【００１８】
ストレプトコッカスディスガラクティエＩＤ9103菌株は非溶血性であり、ヒアルロニダーゼ(hyaluronidase)が発現されないことを特徴とする。さらに、ストレプトコッカスディスガラクティエＩＤ9103菌株は、高分子のヒアルロン酸を優れた生産効率で生産することを特徴とする。
【００１９】
ストレプトコッカスディスガラクティエＩＤ9103菌株は、牛の糞便から分離された微生物の内、ヒアルロン酸を生産する菌株を分離し、突然変異を誘発してヒアルロン酸分解酵素を生産せず、非溶血性であることを選別した新規の微生物である。
【００２０】
前記ストレプトコッカスディスガラクティエＩＤ9103菌株は、Bergey's  manualによる同定実験でストレプトコッカス属微生物であることが確認され、Api20  strep  kitを利用した同定からストレプトコッカスディスガラクティエ(dysgalactiae)であることが確認され、ストレプトコッカスディスガラクティエＩＤ9103（Streptococcus  dysgalactiae  ID9103)と命名し、2010年12月02日付で微生物資源センター(www.kctc.re.kr)に寄託した（寄託番号:KCTC-11818BP)。
【００２１】
本発明は、ストレプトコッカスディスガラクティエＩＤ9103菌株を炭素源及び窒素源を含む培地で培養する段階を含むヒアルロン酸生産方法を提供する。
【００２２】
前記ストレプトコッカスディスガラクティエＩＤ9103菌株は、一般的なストレプトコッカス属微生物の培養法により培養することができる。培養培地は炭素源及び窒素源を含む培地でもあって、アミノ酸が追加されることもある。
【００２３】
本発明の培養方法は特に限定はされず、例えば、回分式、流加式、連続式培養でもある。本発明の培養方法は好ましくは、流加式培養方法でもある。前記流加式培養で流加式で供給される培地構成成分は、窒素源又は窒素源及び炭素源でもあって、より好ましくは前記窒素源はカゼイン酵素分解物であり、前記炭素源はブドウ糖である。
【００２４】
炭素源は公知の微生物培養に使用される炭素源であれば如何なるものでも良く、好ましくはブドウ糖、果糖、麦芽糖、乳糖、ガラクトース、グリセロール及びこれらの混合物からなる群より選ばれるものでもある。より好ましくはブドウ糖である。
【００２５】
窒素源は公知の微生物培養に使用される窒素源であれば如何なるものでも良く、好ましくは、酵母エキス、カゼインペプトン、カゼイン酸分解物、カゼイン酵素分解物、バクトペプトン、カジトン、ネオペプトン及びこれらの混合物からなる群より選ばれるものでもある。より好ましくは酵母エキス及びカゼイン酵素分解物の混合物である。
【００２６】
前記カゼイン酵素分解物は、カゼインを酵素で分解することを意味し、例えば、トリプトン、トリプトンティー、トリプトンエキス、ビビエルバイオセートペプトン、ディフコカゼインダイゼスト、バクトカジトン、ビビエルトリプティカゼペプトン、バクトトリプトン、バイテクトリプトン、アンジアミンエイ、エンジアミンエエエス、エンジアミンイケイシ、エンジアミンエルコンセントレーション、エンジケース、エンジケースエム、エンジケースエムイ、エンジケースプラス、エンジケースティティ、ペプチカーゼ、トリプトンユエスピ、膵液分解カゼインコーテックス、膵液分解カゼイン、酵素分解カゼインコーシャ、トリプトンブイでもある。
【００２７】
前記カゼイン酸分解物は、カゼイン酸加水分解物、ビビエルエシディカーゼペプトン、バクトカザミノアシド、バクトカザミノアシドテクニカル、アミカーゼ、ハイケースアミノ、ハイケーエム、ハイケースエスエフ、酸分解カゼインでもある。
【００２８】
本発明の培地はさらに、アミノ酸を追加して含め得る。追加されるアミノ酸はその種類に制限は無く、好ましくはグルタミン、リシン、システイン、アルギニン、メチオニン、アスパラギン酸、グリシン及びこれらの混合物からなる群より選ばれるものでもある。より好ましくはリシンである。
【００２９】
より好ましくは、本発明の培地組成物は窒素源であって、カゼイン酵素分解物及びアミノ酸としてリシンを含むものでもある。カゼイン酵素分解物とリシンを共に添加した培養培地で培養する場合、本発明の菌株によるヒアルロン酸生産はその生産量が増加し、極めて高い平均分子量を有するヒアルロン酸が生産される特徴がある。
【００３０】
前記カゼイン酵素分解物及びリシンの濃度は特に制限はされず、カゼイン酵素分解物は0.5%(w/v)乃至3%(w/v)の濃度で含まれ、リシンは0.015%(w/v)乃至0.6%(w/v)の濃度で含まれることが好ましい。
【００３１】
ストレプトコッカスディスガラクティエＩＤ9103菌株は、1000万Da以上の平均分子量を有する超高分子ヒアルロン酸を9g/L以上の高い収率で生産することができる。
【００３２】
本発明は、ストレプトコッカス属微生物を、ネオペプトン、カゼインペプトン及びカゼイン酵素分解物からなる群より選ばれた窒素源、及びグルタミン、システイン及びリシンからなる群より選ばれたアミノ酸を含む培地で培養する段階を含むヒアルロン酸の分子量を調節する方法を提供する。
【００３３】
前記ストレプトコッカス属微生物はヒアルロン酸を生産し、ストレプトコッカス属に属する微生物であればどのようなものでも可能であって、好ましくはストレプトコッカスディスガラクティエ菌株でもあり、より好ましくはストレプトコッカスディスガラクティエＩＤ9103菌株でもある。
【００３４】
前記分子量はヒアルロン酸平均分子量を意味し、前記調節は窒素源及びアミノ酸の種類を変更して特定範囲の分子量を有するヒアルロン酸を生産することを意味する。前記ヒアルロン酸の分子量範囲は特に限定はされないが、好ましくは600万Da乃至700万Da、700万Da乃至800万Da、800万Da乃至900万Da、900万Da乃至1100万Daである。
【００３５】
本発明の生産方法によれば、ストレプトコッカスディスガラクティエＩＤ9103菌株を利用して、必要に応じて600万Da以上の多様な平均分子量を有する超高分子ヒアルロン酸を高い収率で生産することができる。
【００３６】
具体的には、本発明の菌株をネオペプトン及びグルタミン、又はカゼインペプトン及びシステインを含む培地で培養する場合、600万Da乃至700万Daの平均分子量を有するヒアルロン酸を生産することができ、カゼイン酵素分解物及びグルタミン又はカゼインペプトン及びリシンを含む培地で培養する場合、700万Da乃至800万Daの平均分子量を有するヒアルロン酸を生産することができ、カゼイン酵素分解物及びリシンを含む培地で培養する場合、800万Da乃至900万Daの平均分子量を有するヒアルロン酸を生産することができ、カゼイン酵素分解物及びリシンを含む培地で培養するものの、前記カゼイン酵素分解物を流加式で供給する方法で培養する場合、900万Da乃至1100万Daの平均分子量を有するヒアルロン酸を生産することができる。
【００３７】
本発明に記載された平均分子量は全て重量平均分子量である。
【００３８】
このような本発明の効果は本発明の一実施例によく記述されている。
【００３９】
本発明の一実施例では、全国10余個所の畜舎から採取した約500余個のサンプルを3.7%ブレインハートインヒュージョン個体培地に塗抹して、粘液性物質が生産されるコロニーを分離し、顕微鏡で連鎖構造の球菌を選別して、グラム染色法でグラム陽性菌を選別した。選別された菌株を培養して、カバーゾル方法と、濁度分析法でヒアルロン酸を生産する菌株を分離した。分離された菌株を、突然変異を誘発してヒアルロニターゼ酵素を発現せず、溶血性が無い菌株を分離した。その結果、ストレプトコッカスディスガラクティエＩＤ9103菌株が、ヒアルロニターゼ酵素発現及び溶血性が現れず、ヒアルロン酸生産能が優れたことを確認し、これを同定した結果、ストレプトコッカス属ディスガラクティエであることを確認して、2010年12月02日付で生物資源センター(KCTC)に寄託番号KCTC11818BPで寄託完了した。
【００４０】
本発明の一実施例では、既存のストレプトコッカスディスガラクティエと、本発明の菌株を同一条件で培養してヒアルロン酸生産率及び粘度を測定した。その結果、本発明の菌株は、既存の菌株に比べてヒアルロン酸生産能力が20%以上向上され、粘度も既存の菌株に比べて遥かに高く、高分子のヒアルロン酸を効率的に生産する菌株であることを確認した。
【００４１】
本発明の他の一実施例では、ストレプトコッカスディスガラクティエＩＤ9103菌株のヒアルロン酸生産能を高め得る培養条件を確立した。酵母エキスの濃度別、アミノ酸の種類及び濃度別、窒素源の種類及び濃度別に、ヒアルロン酸生産能力及び培養液の粘度を測定して、生産能力が優れて高分子のヒアルロン酸が生産される培地構成を選別し、これらを組合わせた培養試験を通じて最適な培養条件を確立した。具体的には、酵母エキスの組成が0.75%の時、ヒアルロン酸の生産が増加し、ヒアルロン酸の平均分子量が増加することを確認し、リシン、システイン、アルギニン又はメチオニンが使用される場合、高分子のヒアルロン酸が生産されることを確認し、窒素源でカゼイン酸分解物、カゼイン酵素分解物又はネオペプチンが使用される場合、高分子のヒアルロン酸が生産されることを確認した。
【００４２】
本発明の他の一実施例では、ストレプトコッカスディスガラクティエＩＤ9103菌株を、前記見いだされた多様な培養条件の組合せを通じて、600万、700万又は800万Daの分子量を有する多様な高分子ヒアルロン酸を生産できることを確認した。これで本発明の菌株及び培養方法により、目的に適う多様な高分子ヒアルロン酸を高効率で生産できることを確認した。
【００４３】
本発明の他の一実施例では、カゼイン酵素分解物とリシンが使用される培地組成で培養する場合、ヒアルロン酸の生産量が増加し、生産されるヒアルロン酸の平均分子量が顕著に高くなることを確認して、その適正濃度を試験した結果、カゼイン酵素分解物が0.5%(w/v)乃至3%(w/v)の濃度で含まれ、リシンが0.015%(w/v)乃至0.6%(w/v)の濃度で含まれる場合、800万Da以上の平均分子量を有するヒアルロン酸が高効率で生産されることを確認した。
【００４４】
本発明の他の一実施例では、流加式培養(Fed-batch  culture)方法で培養して、前記カゼイン酵素分解物及び基本培地組成物であるブドウ糖の供給方式を流加式にした場合、1,000万Da以上の平均分子量を有する超高分子ヒアルロン酸が9.0g/L以上の極めて高効率で生産されることを確認した。
【発明の効果】
【００４５】
本発明は、高分子のヒアルロン酸を高収率で生産するストレプトコッカス属菌株及びこれを利用したヒアルロン酸の生産方法を提供する。本発明の菌株は、付加価値が高い超高分子ヒアルロン酸を高収率で生産することができ、本発明の生産方法によれば培地の組成によって多様な超高分子ヒアルロン酸を生産することができて、最高1,000万Da以上の平均分子量を有する超高分子ヒアルロン酸を生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１は、Api  kitで確認したストレプトコッカスディスガラクティエＩＤ9103菌株の同定結果である。
【図２】図２は、添加されるアミノ酸の種類及び濃度により生産されるヒアルロン酸の生産量、培養液の粘度及び菌体量を示したグラフである。
【図３】図３は、添加されるペプトン類の種類及び濃度により生産されるヒアルロン酸の生産量、培養液の粘度及び菌体量を示したグラフである。
【図４】図４は、1t発酵槽でカゼイン酵素分解物及びリシンが添加された培養培地でストレプトコッカスディスガラクティエＩＤ9103菌株を培養した結果、生産される時間別ヒアルロン酸の生産量、培養液の粘度及び菌体量を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。
【００４８】
ただし、下記実施例は本発明を例示するのみであり、本発明の内容は下記実施例に限定されるものではない。
【００４９】
実施例１．
ストレプトコッカスディスガラクティエＩＤ9103の選別
１−１．ヒアルロン酸生産ストレプトコッカス属菌株の確保
ヒアルロン酸を生産するストレプトコッカス属の場合、ブレインハートインヒュージョン(Brain  heart  infusion)培地(Calf  brains,  infusion  0.77%,  beef  hearts,  infusion  0.98%,  proteose  peptone  1%,  dextrose  0.2%,  NaCl  0.5%,  Disodium  phosphate  0.25%;  BD社、米国）でよく育ち、単一コロニー分離をする場合、ヒアルロン酸を生産することにより、普通のコロニーより滑らかで粘り気のあるコロニーを形成するようになる。全国10余箇所の畜舎で採取した約500個のサンプルを、１個の固体培地当り約200個ほどのコロニーが育つように希釈して、3.7%ブレインハートインヒュージョン固体培地に塗抹して、目視で粘液性物質が生産されることを確認できるコロニーを選り抜いた。
【００５０】
分離された菌株の形態学的観察確認のため、ブレインハートインインヒュージョン固体培地でコロニーに分離するため、塗抹して37℃培養器で培養した。コロニーが形成されるとスライドガラス（slide  glass）の上に滅菌された蒸留水を一滴落として、一つのコロニーを滅菌された爪楊枝の先に付けて蒸留水に溶かした。カバーガラス（Cover  glass）を覆い、顕微鏡で400倍に拡大して菌を観察し、ストレプトコッカス属のように連鎖鎖構造を有する球菌を選別した。
【００５１】
グラム陽性であるストレプトコッカス属を選別するために、グラム染色法を通じて、前記のような方法でスライドガラスにサンプルを準備してランプの上で軽く焼いて、スライドガラスに菌を付着させた。染色剤で染色後１分ほど過ぎた後に、水で染色剤を洗浄した。水気が去った後、鉱油を一滴落としてcover  glassで覆い顕微鏡で観察した。紫色に染色されるのがグラム陽性菌で、この方法を利用して適合菌株候補を選別した。
【００５２】
それぞれの菌株が生産する粘性物質が、HAであるか否かを確認するために、HA生産を確認した。HA生産を確認する時には、カルバゾール（carbazole）反応とCTAB(cetyltrimethyl-ammonium  bromide)反応を利用した。カルバゾール反応は硫酸でHAを分解して造られたグルクロン酸の量を測定する方法である。カルバゾール反応によるHA生産を確認した後、CTAB反応を通じてHA生産を確認した。CTABは、粘膜（mucous  membrane）を破壊して不透明にする。HAは粘性物質であるので、CTABにより破壊されて、不溶性の複合体（insoluble  complex）を造り不透明になる。カルバゾール反応には他の糖で造られるグルクロン酸も測定されるので、培養液の状態によっては、実際のHAよりも多い量で測定されることもあり得る短所がある。CTABは、HAにのみ反応して測定することができ、簡単かつ短時間でHA生産を確認することができる。カルバゾール反応を通じてHAを含む多糖を生産する菌株を選別して、その中にCTAB反応を利用してHAを生産する菌株を選別することができた。
【００５３】
カルバゾール反応は、ウロン酸（uronic  acid）を定量できる方法である。ヒアルロン酸の構成物質の内の一つがグルクロン酸（glucuronic  acid）であるので、反応により濃い紫色に変り定量することができた。カルバゾール反応は、サンプル1mlを0.025M(in  H2  SO4)のナトリウムテトラ硼酸塩デカ水化物(sodium  tetraborate  decahydrate)5mlに入れ、よく掻き混ぜて10分間水に沸かして、氷冷させ、0.1%(in  Ethanol)カルバゾールを200ul添加して、よく掻き混ぜて10分間水に沸かし、525nmで吸光度を測定した。CTAB反応は、1/10に希釈された培養液を0.03%  SDS  solutionに1/2に再び希釈した後、200ulをacetic  acid  buffer(sodium  acetate  1.55%,acetic  acid  0.063%,NaCl  0.88%)200ulと混ぜて、37℃で30分間反応後、CTAB溶液を800ul添加して、600nmで吸光度を測定した。
【００５４】
１−２．ヒアルロニダーゼ活性が無い非溶血性突然変異菌株の確保
前記実施例１−１で選ばれたヒアルロン酸を生産する菌株を、3.7%ブレインハートインヒュージョン50ml液体培地で24時間37℃で振盪培養した。OD(600nm)が0.3の培養液にN-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine(NTG)処理を行い、37℃で１時間撹拌して死滅率95%の条件を決定した。10mg/mlのNTGで処理された培養液を4000rpmの回転速度で10分間遠心分離して菌体を回収し、50mM  Tris-maleate  buffer(pH8.0)で３回洗浄した。このように突然変異が誘導された胞子を滅菌された生理食塩水で102〜104個／mlになるように希釈後、5%sheep  bloodが含まれたブレインハートインヒュージョン固体培地に塗抹して37℃で培養させ、赤血球を破壊させたクリアゾーンがない非溶血性コロニーを選択した。しかし、溶血性が再発される虞を勘案してこのような非溶血性コロニーに対するNTG突然変異を繰返して行い、継代培養で溶血性を示さないコロニーを選定した。
【００５５】
確保された非溶血性菌株の内、ヒアルロニダーゼ酵素が発現されないコロニーの選別は、前記実施例１−１のCTAB反応を利用して選別した。確保した非溶血性菌株を0.1%ヒアルロン酸を添加したブレインハートインヒュージョン固体培地で１日間培養して、その上層に10%CTABを追加した。
【００５６】
ヒアルロニダーゼ活性が無いコロニーの内、周辺にクリアゾーンがないストレプトコッカスディスガラクティエＩＤ9103を選別した。
【００５７】
１−３．選別菌株の同定
Bergey's  manualにおける生化学的特性と比べて、ストレプトコッカス属であることを確認するために、同定実験で酵母エキスとペプトンを使用した基本培地に生化学的特性を究明するに必要な糖やアミノ酸を入れて色相の変化を観察した。追加して入れた培地源はinulin,lactose,mannitol,raffinose,ribose,salicin,solbitol,trehalose,arginine,esculin,hippurateであり、brompcresol  purple(BCP)を入れて接種していない対照群と色相変化を観察した。BCPの色は中性で紫色で、酸性では黄色、塩基性では赤色を示した。菌を接種する前の培地は中性で紫色を示した。
【００５８】
実験の結果、ストレプトコッカスディスガラクティエＩＤ9103菌株は、Bergey's  manualと比較して、表１の通り、ストレプトコッカス属ディスガラクティエと極めて類似した結果を得た。
【００５９】
【表１】
0005977356.tif 000002
【００６０】
前記実施例１−２で選別されたストレプトコッカスディスガラクティエＩＤ9103菌株をapi  kitを利用して菌株を同定した。ストレプトコッカスを同定する時に使用されるApi20  strep  kit(Biomereieux社、フランス）を使用して、製造社のマニュアルに従って同定した。固体培地の上で十分に菌株を綿棒を利用してsuspension  medium  2mlに溶かして、4McFarland濁度以上に造り、接種液を準備した。ストリップは、順にVP,HIP,ESC,PYRA,aGAL,βGUR,βGAL,PAL,AP,ADH,RIB,ARA,MAN,SOR,LAC,TRE,RAF,AMD,GLYGの総20個のキュプローで構成され、それぞれ別の反応をする。VPからLAPまでは接種液を100ulずつ分注し、残りはGP  medium  2mlに500ul混ぜて100ulずつ分注した。ADHとGLYGには鉱油を添加した。４時間培養後、VPにはVP1とVP2を１滴ずつ、HIPにはNIN試薬２滴、PYRAからLAPまではZYM  A,ZYM  B試薬を１滴ずつ入れて10分後に結果を確認し、その他のキュプルは24時間後にもう１度結果を判定した。
【００６１】
その結果、図１に示した通り、ストレプトコッカスディスガラクティエＩＤ9103は、ストレプトコッカス属ディスガラクティエ(dysgalactiae)であることが確認された。前記のストレプトコッカスディスガラクティエＩＤ9103は、2010年12月02日付で生物資源センター(KCTC)に寄託番号KCTC11818BPで寄託完了した。
【００６２】
実施例２．
高分子ヒアルロン酸生産のための基本培養条件試験及び生産量比較実験
２−１．基本培養条件試験
-72℃の冷凍機で保管されたストレプトコッカスディスガラクティエＩＤ9103菌株培養液4mlを急速解凍させ、5.2%ブレインハートインヒュージョン固体培地に塗抹して、37℃で24時間培養後、横ｘ縦１cm2の面積で生育されたコロニーを切出して、3%トッドヒュイトブロス(Todd-Hewitt  broth)滅菌液体培地（heart,  infusion  0.31%,neopeptone  2%,dextropse  0.2%,NaCl  0.2%,Disodium  phosphate  0.04%,sodium  cabonate;BD社、米国）40mlに接種した。
【００６３】
37℃、120rpmで振盪培養した40mlを１次種菌培養液に使用した。対数増殖期段階である６時間培養状態で、無菌的に１次種菌液を3%トッドヒューイトブロス滅菌液体培地(40ml,pH7.8)３個に接種した。培養条件は37℃、120rpmで、20時間以上無菌的に培養することにより、２次種菌培養液に使用した。この際、終了した２次種菌培養液は、6.4±0.2のpH状態を維持しており、OD(600nm)は0.35±0.05でなければならない。２次種菌培養液120mlを本培養培地に接種して40時間以上培養することにより、発酵槽インペラーの回転速度、培養温度、培地組成によるヒアルロン酸の生産量の差を観察し、以降、ヒアルロン酸の生産性増大のための条件を決定した。以上の培養工程は全ての実施例で同一に適用した。
【００６４】
ヒアルロン酸を最適に生産するための本培養培地決定試験は、SL発酵槽で3.5L培養液条件で実施した。培養条件は、ブドウ糖6%(w/v)、酵母エキス0.5%(w/v)、カゼインペプトン2%(w/v)、グルタミン0.06%(w/v)、グルコン酸ナトリウム0.1%(w/v)、蓚酸0.02(w/v)、硫酸マグネシウム0.15(w/v)、リン酸一水素二カリウム0.25%(w/v)、塩化ナトリウム0.5%(w/v)、アセト酸ナトリウム0.5%(w/v)、塩化二鉄0.007%(w/v)、アンモニウムモリブテン0.05%(w/v)、培養条件はpH7.0、34℃の条件を基本にした。
【００６５】
本発明で培養液内に存在するヒアルロン酸濃度は、カバゾール方法(T.Jung-Min,Carbohyd.Polym.,2009,78,633-634)と濁度分析法(S.Jung-Min,Carbohyd.Polym.,2009,78,633-634)で二重の確認をした。
【００６６】
粘度分析は、BrookfieldのLVDV-1(Brookfield、米国）を使用して測定し、spindle  No  S31,RPM  3.0,sample温度は25℃の条件で、資料を分析して粘度（ｃP)を測定した。
【００６７】
菌体量は、適切な温度（培養液の1/10)で希釈された培養液を200ulずつ96well  microplateに注入して、600nm波長でMulti-detection  microplate  reader(BioTek,米国)で吸光度を測定した。
【００６８】
発酵槽インペラーの回転速度は、重要である。なぜなら、このインペラーが、酸素と栄養分が培地全体に満遍なく混ざるようにして、菌の成長のための役割を果たすからである。回転速度を100乃至500rpmまで設定した時、ID9103の培養結果は、表２の通りである。
【００６９】
各インペラーの回転速度のヒアルロン酸の生産量と菌体量が類似しているにも拘らず、粘度が高くなったことから、インペラーの回転速度の遅いことが分子量向上に役立つことを確認したので、以下の実施例の試験で、発酵槽のインペラーの回転速度は100rpmにした。
【００７０】
【表２】
0005977356.tif 000003
【００７１】
２−２．ヒアルロン酸生産量比較実験
既存のストレプトコッカスディスガラクティエ菌株と、ストレプトコッカスディスガラクティエＩＤ9103菌株を同一条件で培養してヒアルロン酸生産量を比較した。
【００７２】
培地組成及び培養条件は、実施例２−１と同一にし、インペラー速度は100rpmにして実験した。
【００７３】
その結果、表３に示した通り、本発明の菌株は、既存の菌株に比べて同一条件でヒアルロン酸の生産量が20%以上向上し、特に粘度が既存の菌株に比べて遥かに高いことを確認し、本発明の菌株が、高分子のヒアルロン酸を効率的に生産する菌株であることを確認した。
【００７４】
【表３】
0005977356.tif 000004
【００７５】
実施例３．
酵母エキスの濃度調節による高分子ヒアルロン酸生産性
前記実施例２で決定された培養条件と培地組成を基本にして、酵母エキスの濃度を異にして培養した。窒素源は微生物の代謝において重要な役割をし、ヒアルロン酸の生産にも影響を及ぼすものと知られている。窒素源に使用される酵母エキスの濃度が、ヒアルロン酸の生産性にも寄与するものと考えられる。
【００７６】
その結果、表４に示した通り、既存の0.5%(w/v)酵母エキスの条件と比べた時、2%(w/v)酵母エキスの条件で粘度が0.5%(w/v)酵母エキス条件より高いことを確認した。酵母エキスの濃度を高めることが高分子ヒアルロン酸に適合することを確認して、以下の実施例の試験では、酵母エキスの濃度を2%(w/v)にして使用した。
【００７７】
【表４】
0005977356.tif 000005
【００７８】
実施例４．
アミノ酸がヒアルロン酸生産に及ぼす影響
実施例３まで決定された培養条件と培地組成を基本に、さまざまなアミノ酸が高分子ヒアルロン酸生産にどのような影響を及ぼすかを確認した。使用したアミノ酸は表５に記述した。既存のグルタミンは表５のアミノ酸に変更した。
【００７９】
その結果、表５に示した通り、リシン、システイン又はアルギニン又はメチオニンに変更した群の場合、ヒアルロン酸の生産が8g/Lを上回り、リシン、システイン、アルギニン又はメチオニンに変更した群は、対照群に比べて優れたことを確認した。特にリシンに変更した群は粘度が  4,230ｃPで対照群に比べて高くなったことを確認した。
【００８０】
【表５】
0005977356.tif 000006
【００８１】
実施例５．
アミノ酸の濃度がヒアルロン酸生産に及ぼす影響
実施例４で粘度が高かったリシン、システイン、アルギニン、メチオニンの培地適正濃度を確認するために、それぞれのアミノ酸を多様な濃度で添加して培養後、ヒアルロン酸の濃度、菌体量、培養液の粘度などを測定した。
【００８２】
その結果、表６及び図２に示した通り、４種類のアミノ酸は、0.03%(w/v)の濃度の時、粘度が他の濃度条件に比べて高いことを確認した。リシンとステインはそれぞれ4230cP、4160cPで、異なる濃度条件に比べて高い粘度を示した。アルギニンとメチオニンの粘度は4000cPに及ばないが、既存の条件より高い粘度である3890cP、3940cPを示した。この濃度の条件で、約8g/Lという他の濃度に比べて高いヒアルロン酸生産を示した。
【００８３】
以下、実施例の実験において、アミノ酸濃度を0.03%(w/v)にした。
【００８４】
【表６】
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【００８５】
実施例６．
ペプトン類培地源の種類がヒアルロン酸生産に及ぼす影響
実施例３で決定された培養条件と培地組成を基本にして、窒素源に使用される既存のカゼインペプトンを他のペプトン類培地源に代えて高分子ヒアルロン酸生産ができるか否かを確認した。使用したペプトン類は表７に記述し、1%(w/v）濃度で処理した。
【００８６】
その結果、表７に示した通り、カゼインペプトンに比べてカゼイン酸分解物、カゼイン酵素分解物、ネオペプトンが粘度面で上昇した結果を示すことを確認した。特に、カゼイン酵素分解物は4590ｃPの粘度を示し、高分子ヒアルロン酸生産に肯定的な期待をすることができる。
【００８７】
【表７】
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【００８８】
実施例７．
ペプトン類培地源の濃度がヒアルロン酸生産に及ぼす影響
実施例６の結果から粘度が高かったカゼイン酸分解物、カゼイン酵素分解物、ネオペプトンの適正濃度を確認するために、それぞれの窒素源を多様な濃度で添加して培養し、ヒアルロン酸の濃度、菌体量、培養液の粘度などを測定した。
【００８９】
その結果、表８及び図３に示した通り、カゼイン酵素分解物は1%(w/v)で最も高い粘度を示し、カゼイン酸分解物とネオペプトンは1.5%(w/v)の濃度で粘度が最も高いことを確認した。カゼイン酵素分解物は8.2g/L、4590ｃP、ネオペプトンは8.0g/L、4140ｃPで生産量と粘度が高かった。カゼイン酸分解物は8.1g/Lで高い生産を示したが、粘度は3980ｃPで4000ｃPには及ばなかった。以下、実施例の実験では現在の結果を基にカゼイン酵素分解物は1%(w/v)、カゼイン酸分解物とネオペプトンは1.5%(w/v)の濃度を固定的に使用した。
【００９０】
【表８】
0005977356.tif 000009
【００９１】
実施例８．
ペプトン類及びアミノ酸の組合せによるヒアルロン酸生産性比較
実施例４及び実施例５で確保したアミノ酸と、実施例６及び実施例７で確保したペプトン類の組合せを利用して、ヒアルロン酸生産に及ぼす影響を確認した。表９の通り、ペプトン類とアミノ酸を組合せた培地組成物で、ストレプトコッカスディスガラクティエＩＤ9103を培養してヒアルロン酸を生産した。
【００９２】
その結果、それぞれペプトン類培地源とアミノ酸の組合せによるヒアルロン酸濃度は、大部分が約8g/Lであった。粘度はカゼイン酵素分解物との組合せがよい結果を示した。特にカゼイン酵素分解物-リシンの組合せは、8.3g/Lの高いヒアルロン酸濃度を記録し、実施例７のカゼイン酵素分解物の4590ｃPより730ｃP増加した5320ｃPを示しており、高分子ヒアルロン酸生産の可能性を確認することができた。
【００９３】
【表９】
0005977356.tif 000010
【００９４】
実施例９．
ペプトン類培地源のfed-batchがヒアルロン酸生産に及ぼす影響
実施例８までの結果から確保したカゼイン酵素分解物-リシンの組合せの条件に、カゼイン酵素分解物を流加式で供給して、ヒアルロン酸生産に及ぼす影響を確認した。処理時間と最終濃度2%に合わせて追加した濃度は表９に記述した。最終的に投与されるカゼイン酵素分解物の濃度は2%で全て同一であるが、未処理は、初期に2%を全部入れたもので、例えば、処理時間８時間、処理濃度0.5%群は、培養開始の際1.5%のカゼイン酵素分解物を入れて培養８時間目に0.5%を追加したものである。
【００９５】
その結果、表10に示した通り、24時間に1.0%を追加した条件で約7g/Lの生産量を示し、粘度も未処理の条件より1500ｃP増加した6620ｃPを示しており、高分子ヒアルロン酸生産の可能性を確認することができた。８時間と36時間に追加した場合は、粘度値が大きく増加しないので、既存の条件に比べ大きな効果がないことが確認された。
【００９６】
【表１０】
0005977356.tif 000011
【００９７】
実施例10．
ブドウ糖のfed-batchがヒアルロン酸生産に及ぼす影響
実施例９までの結果から確保したカゼイン酵素分解物-リシンの組合せの条件に、ブドウ糖をfed-batchしてヒアルロン酸生産に及ぼす影響を確認した。追加時間と最終濃度6%に合わせて追加した濃度は表11に記述した。
【００９８】
24時間に１%を追加した条件で9g/Lを上回る生産量を示し、これに比例して粘度も6800ｃPが確保され、高分子ヒアルロン酸の生産増大の可能性を確認することができた。
【００９９】
【表１１】
0005977356.tif 000012
【０１００】
実施例11．
ペプトン類培地源とブドウ糖のfed-batchがヒアルロン酸生産に及ぼす影響
実施例９と実施例10における結果を利用して、カゼイン酵素分解物を最終2%の濃度で24時間に1%fed-batchし、ブドウ糖を最終6%の濃度で24時間に1%fed-batchして、ヒアルロン酸生産に及ぼす影響を確認した。
【０１０１】
その結果、ヒアルロン酸は9.103g/L生産し、粘度は7200ｃPに確認され、ペプトン類培地源とブドウ糖のfed-batchを通じて、高分子ヒアルロン酸生産と生産量増大の可能性を確認することができた。
【０１０２】
実施例12．
75Lでの各培養物のヒアルロン酸生産性と平均分子量分析の結果
実施例11までの結果から、粘度が高く高分子ヒアルロン酸生産に適合した条件で、75L発酵槽で培養して生産性を確認し、分子量をHPLCで分析した。培養条件と培地組成は以前の実施例で使用した条件で培養した。
【０１０３】
ヒアルロン酸の平均分子量は、ゲルろ過クロマトグラフィー方法(Narlin  B.  Beaty  et  al.Anal.Biochem.,1985,147,387-395)で求めた。分析条件は下記の通りである。カラムはToyo  Soda  TSK  gelG6000PWXLを使用し、移動相は150mM  NaCl,3mM  Na2HPO4(pH7.0)、0.02%  NaN2である。Detectionは、refrative  index  detector(Shodex;Showa  Denko  K.K.日本）を使用して、標準物質はPolyethylene  oxideを分子量別に2mg/ml濃度に調剤して使用した。
【０１０４】
その結果は、表12に示した通りである。
【０１０５】
カゼイン酵素分解物-リシンの組合せによる条件での培養により生産されたヒアルロン酸の平均分子量は800万Da以上であり、特にカゼイン酵素分解物24時間1%fed-batch、リシンとブドウ糖24時間1%fed-batchの条件での培養の分子量は約1000万であって、基本培地培養物の約590万Daより約400万Daほど上回ることを示している。これにより本発明の生産方法は、極めて高い分子量のヒアルロン酸を生産できることを確認した。生産性は、約9g/Lであった。
【０１０６】
この他にも本発明の生産方法により、600万、650万、700万、750万、800万、900万、1000万Daなど、多様な平均分子量を有するヒアルロン酸を高い生産性で生産が可能であることを確認した。
【０１０７】
具体的には、基本培地でカゼインペプトンをネオペプトンに代えるか、アミノ酸をシステインに変更する場合、600万乃至700万Daの平均分子量を有するヒアルロン酸を生産し、基本培地でカゼインペプトンをカゼイン酵素分解物に代えるか、又はアミノ酸をリシンに変更する場合、700万乃至800万Daの平均分子量を有するヒアルロン酸を生産し、基本培地でカゼインペプトンをカゼイン酵素分解物に代えて、アミノ酸をリシンに変更する場合、800万乃至900万Daの平均分子量を有するヒアルロン酸を生産し、基本培地でカゼインペプトンをカゼイン酵素分解物に代えて、アミノ酸をリシンに変更して前記カゼインペプトンを流加式で追加する場合、900万乃至1100万Daの平均分子量を有するヒアルロン酸を生産した。
【０１０８】
前記基本培地は、実施例２に記載された通り、ブドウ糖、酵母エキス、カゼインペプトン、グルタミン、グルコン酸ナトリウム、蓚酸、硫酸マグネシウム、リン酸二水素カリウム、塩化ナトリウム、アセト酸ナトリウム、塩化二鉄、アンモニウムモリブテンで構成された培地を意味する。
【０１０９】
【表１２】
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【０１１０】
実施例13．
ストレプトコッカスディスガラクティエＩＤ9103のヒアルロン酸生産のための1t培養工程
前記実施例12までの実験で、確保された情報を基に1t発酵槽でヒアルロン酸を生産した。具体的な条件は下記の通りである。
【０１１１】
-20℃の冷凍機で保管されたストレプトコッカスディスガラクティエＩＤ9103菌株培養液を3%トッドヘヴィットブロス滅菌液体培地800ml(pH7.8)で37℃で６時間培養し、これを3%トドヘヴィットブロス滅菌液体培地20Lで37℃で20時間以上培養した。前記培養が終了した培養液は、6.0のpH状態を維持しており、600nmで測定された培養液のODは0.35であった。これを6%(w/v)ブドウ糖、2%(w/v)酵母エキス、2%(w/v)カゼイン酵素分解物、0.1%(w/v)リシン、0.1%(w/v)グルコン酸ナトリウム、0.02%(w/v)蓚酸、0.15%(w/v)硫酸マグネシウム、0.25%(w/v)リン酸一水素二カリウム、0.5%(w/v)塩化ナトリウム、0.5%(w/v)アセト酸ナトリウム、0.007%(w/v)塩化二鉄、0.05%(w/v)アンモニウムモリブテンを溶解させた500L滅菌培地に接種して発酵槽で培養した。培養条件は34℃、300rpm、0.5vvm、pH7として培養した。
【０１１２】
1t発酵槽で培養した結果、図４に示した通り、培養48時間目にヒアルロン酸最大生産性(10.2g/L)を示した。
【０１１３】
培養後、ヒアルロン酸平均分子量を測定した結果、1t発酵槽で最適の培養条件を設定することより、平均分子量は約1050万Daとなり、75L発酵槽で示した平均分子量1010万Daより約40万Da高い分子量を示すことを確認した。
【産業上の利用可能性】
【０１１４】
以上説明した通り、本発明は、高分子ヒアルロン酸を高収率で生産するストレプトコッカス属菌株及びこれを利用したヒアルロン酸生産方法を提供する。本発明の菌株は、付加価値の高い超高分子ヒアルロン酸を高い収率で生産することができ、本発明の生産方法によれば、培地組成によって多様な超高分子ヒアルロン酸を生産することができ、最高1000万Da以上の平均分子量を有する超高分子ヒアルロン酸を生産することもできて、産業上の利用可能性が高い。
【０１１５】
[受託番号]
寄託機関名：韓国生命工学研究院
受託番号  ：KCTC11818BP
受託日付  ：2010年12月02日
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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