(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１０℃から３０℃の低い温度における洗剤への適用においてタンパク質性物質を修飾、分解または除去するセリンプロテアーゼ活性を有し、配列番号：１０に定義されている成熟Ｔｒ  Ｐｒｂ１酵素と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする真菌セリンプロテアーゼ酵素。
【請求項２】
洗剤添加物として適用することができることを特徴とする、請求項１に記載の真菌セリンプロテアーゼ酵素。
【請求項３】
糸状菌トリコデルマ(Trichoderma)から得ることができることを特徴とする、請求項１または２に記載の真菌セリンプロテアーゼ酵素。
【請求項４】
セリンプロテアーゼ活性を有し、配列番号：１０のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１から３のいずれかに記載の真菌セリンプロテアーゼ酵素。
【請求項５】
成熟形態が２０から３５ｋＤａの分子量を有することを特徴とする、請求項１から４のいずれかに記載の真菌セリンプロテアーゼ酵素。
【請求項６】
１５分の反応時間および基質としてカゼインを使用するｐＨ９での該酵素の最適温度が３０℃から７０℃であることを特徴とする、請求項１から５のいずれかに記載の真菌セリンプロテアーゼ酵素。
【請求項７】
少なくともｐＨ６からｐＨ１１のｐＨ範囲で、１５分の反応時間および基質としてカゼインを使用して５０℃で最適ｐＨを有することを特徴とする、請求項１から６のいずれかに記載の真菌セリンプロテアーゼ酵素。
【請求項８】
配列番号：１０に特徴付けられるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１から７のいずれかに記載の真菌セリンプロテアーゼ酵素。
【請求項９】
配列番号：９のヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子によってコードされることを特徴とする、請求項１から８のいずれかに記載の真菌セリンプロテアーゼ酵素。
【請求項１０】
受託番号ＤＳＭ２２６３５の下に寄託されている大腸菌ＲＦ８０５２が保持するプラスミドｐＡＬＫ２６５０に含まれる配列番号：５のポリヌクレオチド配列によってコードされることを特徴とする、請求項１から９のいずれかに記載の真菌セリンプロテアーゼ酵素。
【請求項１１】
適当な宿主におけるセリンプロテアーゼをコードする遺伝子の発現を指示することができる調節配列に作動可能に連結した請求項１から１０のいずれかに記載の真菌セリンプロテアーゼ酵素をコードする核酸分子を含む組換え発現ベクターから生産されることを特徴とする、請求項１から１０のいずれかに記載の真菌セリンプロテアーゼ酵素を生産する方法。
【請求項１２】
異種宿主において生産されることを特徴とする、請求項１１に記載の真菌セリンプロテアーゼ酵素を生産する方法。
【請求項１３】
微生物宿主において生産されることを特徴とする、請求項１１から１２のいずれかに記載の真菌セリンプロテアーゼ酵素を生産する方法。
【請求項１４】
トリコデルマ(Trichoderma)、アスペルギルス(Aspergillus)、フザリウム(Fusarium)、フミコーラ(Humicola)、クリソスポリウム(Chrysosporium)、アカパンカビ(Neurospora)、クモノスカビ(Rhizopus)、ペニシリウム(Penicillium)またはモルティエラ(Mortiriella)属の宿主において生産されることを特徴とする、請求項１１から１３のいずれかに記載の真菌セリンプロテアーゼ酵素を生産する方法。
【請求項１５】
トリコデルマまたはアスペルギルスにおいて生産されることを特徴とする、請求項１４に記載の真菌セリンプロテアーゼ酵素を生産する方法。
【請求項１６】
トリコデルマ・リーゼイ(T. reesei)において生産されることを特徴とする、請求項１５に記載の真菌セリンプロテアーゼ酵素を生産する方法。
【請求項１７】
（ａ）セリンプロテアーゼ活性を有し、配列番号：１０において記載されているアミノ酸配列と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子；
（ｂ）配列番号：９において記載されているポリヌクレオチド配列を含む核酸分子；
（ｃ）受託番号ＤＳＭ２２６３５の下に寄託されている大腸菌ＲＦ８０５２が保持するプラスミドｐＡＬＫ２６５０に含まれる配列番号：５のポリヌクレオチド配列のコード配列を含む核酸分子；
（ｄ）遺伝子コードの縮重によって、（ｂ）または（ｃ）の核酸分子のポリヌクレオチド配列と異なるポリヌクレオチド配列を含む核酸分子
からなる群から選択される１０℃から３０℃の低い温度における洗剤への適用においてタンパク質性物質を修飾、分解または除去するセリンプロテアーゼ活性を有する真菌セリンプロテアーゼ酵素をコードする単離された核酸分子。
【請求項１８】
真菌セリンプロテアーゼ酵素が洗剤添加物として適用することができることを特徴とする、請求項１７に記載の単離された核酸分子。
【請求項１９】
適当な宿主におけるセリンプロテアーゼをコードする遺伝子の発現を指示することができる調節配列に作動可能に連結した請求項１７に記載の核酸分子を含む組換え発現ベクター。
【請求項２０】
請求項１９に記載の組換え発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２１】
微生物宿主であることを特徴とする、請求項２０に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
糸状菌であることを特徴とする、請求項２０または２１に記載の宿主細胞。
【請求項２３】
トリコデルマ、アスペルギルス、フザリウム、フミコーラ、クリソスポリウム、アカパンカビ、クモノスカビ、ペニシリウムまたはモルティエラ属であることを特徴とする、請求項２０から２２のいずれかに記載の宿主細胞。
【請求項２４】
トリコデルマまたはアスペルギルスであることを特徴とする、請求項２３に記載の宿主細胞。
【請求項２５】
トリコデルマ・リーゼイであることを特徴とする、請求項２４に記載の宿主細胞。
【請求項２６】
セリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドを生産する方法であって、請求項２０から２５のいずれかに記載の宿主細胞を培養する工程、および該ポリペプチドを回収する工程を含む方法。
【請求項２７】
請求項２０から２５のいずれかに記載の宿主細胞を培養する工程、および該細胞から該ポリペプチドを回収するか、または該培養培地から該細胞を分離して上清を得る工程を含む酵素調製物を得るための方法。
【請求項２８】
請求項１から１０のいずれかに記載のセリンプロテアーゼ酵素を含む酵素調製物。
【請求項２９】
プロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼまたはオキシダーゼの群から選択される他の酵素を、メディエーターと共にまたはメディエーターなしで含むことを特徴とする、請求項２８に記載の酵素調製物。
【請求項３０】
安定剤、バッファー、界面活性剤、ビルダー、漂白剤、メディエーター、防食剤、再付着防止剤、腐食剤、研磨剤、光学的光沢剤、色素、顔料、および防腐剤の群から選択される適当な添加物を含むことを特徴とする、請求項２８から２９のいずれかに記載の酵素調製物。
【請求項３１】
液体、粉末または粒状の形態であることを特徴とする、請求項２８から３０のいずれかに記載の酵素調製物。
【請求項３２】
洗剤のための、繊維を処理するための、羊毛を処理するための、髪を処理するための、革を処理するための、食物または飼料を処理するための、またはタンパク質性物質の修飾、分解または除去のための、請求項１から１０のいずれかに記載のセリンプロテアーゼ酵素または請求項２８から３１のいずれかに記載の酵素調製物の使用。
【請求項３３】
洗剤添加物としての、請求項１から１０のいずれかに記載のセリンプロテアーゼ酵素または請求項２８から３１のいずれかに記載の酵素調製物の使用。
【請求項３４】
液体洗剤における請求項３３に記載の使用。
【請求項３５】
粉末洗剤における請求項３３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、該酵素の能力が低い温度または中程度の温度範囲で有利である、種々の産業適用、特に洗濯用および食器洗い洗剤(detergent)において有用である真菌セリンプロテアーゼ酵素に関する。本発明は、該酵素をコードする単離された核酸分子、組換えベクター、該酵素を生産するための宿主細胞、該酵素を含む酵素組成物ならびにこのような組成物を調製するための方法に関する。本発明は、また、該酵素の種々の使用または該酵素を含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
微生物細胞外プロテアーゼは、全世界の産業的酵素売買の３分の１以上という大部分を占める（Cherry and Fidantsef, 2003）。市販のプロテアーゼの約９０％は、洗剤酵素である（Guptaら、2002）。他の適用は、例えば、食物、飼料、革、医薬、診断、廃棄物管理および銀回収を含む。
【０００３】
現在使用されている市販の界面活性剤調製物は、バチルス種起源のアルカリ性セリンプロテアーゼを含む（Maurer, 2004）。温度、酸化剤および種々の洗浄条件に対して改良された触媒効率および／またはより良い安定性を有するバチルス酵素の変異体は、部位特異的および／またはランダム変異誘発を介して開発されている。市販のプロテアーゼの例は、例えば、サブチリシン  Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ（Ａｌｃａｌａｓｅ（登録商標）、Novozymes, DK）、サブチリシン  ３０９（Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標）、Novozymes, DK）、サブチリシン  １４７（Ｅｓｐｅｒａｓｅ（登録商標）、Novozymes, DK）、Ｋａｎｎａｓｅ（登録商標）（Novozymes, DK）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標）（Genencor Inc., USA）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標）Ｏｘ（Genencor Inc., USA）、Ｐｒｏｐｅｒａｓｅ（登録商標）（Genencor Inc., USA）ならびにＢＬＡＰ  ＳおよびＸシリーズ（Henkel, DE）である。
【０００４】
アルカリ性セリンプロテアーゼ遺伝子および酵素（ＥＣ  ３．４．２１）は、また、酵母菌および糸状菌(filamentous fungi)を含む真核生物由来であることによって特徴付けられている。真菌セリンプロテアーゼの使用は、いくつかの特許出願から知られている。例えば、米国特許第３，６５２，３９９号およびＥＰ５１９２２９（Takeda Chemical Industries, Ltd., JP）は、洗剤および他の洗浄剤組成物の製剤化において有用なフザリウム(Fusarium)（テレオモルフ）またはジベレラ(Gibberella)（アナモルフ）属、特にフザリウム種Ｓ−１９−５（ＡＴＣＣ  ２０１９２、ＩＦＯ  ８８８４）、フザリウム・オキシスポルム(oxysporum) フザリウム種リニ(lini)（ＩＦＯ  ５８８０）またはジベレラ・サンビネッティ(saubinetti)（ＡＴＣＣ  ２０１９３、ＩＦＯ６６０８）由来のアルカリプロテアーゼを記載している。ＷＯ１９９４０２５５８３（NovoNordisk A/S, DK）は、フザリウム種、特にフザリウム・オキシスポルムの株（ＤＳＭ  ２６７２）から誘導できる活性なトリプシン様プロテアーゼ酵素、およびそれをコードするＤＮＡ配列を記載している。フザリウム種ＢＬＢ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０４９３）由来の新規プロテアーゼのアミノ酸配列は、ＷＯ２００６１０１１４０（SODX Co. Ltd, Nakamura）に記載されている。このような洗剤組成物は、ＷＯ１９９２００３５２９およびＷＯ１９９２００５２３９（NovoNordisk A/S, DK）に記載されている酵素を安定させるために可逆性プロテアーゼ阻害剤をさらに含んでもよく、またはプロテアーゼの触媒的に活性なアミノ酸配列は、ＷＯ１９９７０２８２４３（NovoNordisk A/S, DK）に記載されているセルロース結合ドメインを含む配列に連結され得る。
【０００５】
セリンプロテアーゼは、単独で、または他の加水分解酵素と組み合わせて使用され得る。例えば、ＷＯ８８／０３９４６およびＷＯ８９／０４３６１（Novo Industri A/S, DK）は、プロテアーゼおよびリパーゼを含む酵素的な洗剤添加物および洗剤組成物を記載しており、ここで、真菌プロテアーゼはフザリウム、特にフザリウム・オキシスポルムまたはフザリウム・ソラニ(solani)に由来する。ＷＯ１９９７００２７５３（NovoNordisk A/S, DK）は、プロテアーゼおよびリパーゼのこのような組合せを用いて、汚れた処理装置を穏やかに清浄するための方法を記載している。セルラーゼおよびプロテアーゼ、特に洗剤添加物または組成物としてのフザリウム種ＤＳＭ  ２６７２由来のトリプシン様プロテアーゼの組合せは、ＷＯ１９９２０１８５９９（NovoNordisk A/S, DK）に記載されている。
【０００６】
トリコデルマ種は多種多様のプロテアーゼを分泌することが記載されている（Kredicsら、2005に記載されている）。しかしながら、それらのほんのわずかだけが特徴付けられている。バイオコントロール(biocontrol)株  トリコデルマ・ハルジアナム（トリコデルマ・アトロビリデとして後に再分類され単離）からのセリンプロテアーゼをコードする遺伝子、ｐｒｂ１の単離は、Geremiaら、(1993)に記載されている。トリコデルマ・アトロビリデ  ｐｒｂ１遺伝子配列を、トリコデルマ・ハマツム(T. hamatum)およびトリコデルマ・ハルジアナム由来のｐｒｂ１遺伝子（Steyaertら、2004）ならびにトリコデルマ・ヴィレンス(T. virens)由来のｔｖｓｐ１遺伝子(Pozoら、2004)のクローニングにおいて使用した。成熟トリコデルマ・アトロビリデＰＲＢ１およびトリコデルマ・ヴィレンスＴＶＳＰ１タンパク質は、それぞれ８．９８および９．２のｐＩ、２９ｋＤａの分子量を有することが予期された。それらは、いくつかのサブチリシン様セリンプロテアーゼと相同性を示し、セリンプロテアーゼのファミリーＳ８に割り当てた。ＴｒｉｃｈｏＥＳＴアプローチ（Suarezら、2007）は、プロテアーゼのＳ８Ａサブファミリーに属するバイオコントロール菌  トリコデルマ・ハルジアナム  ＣＥＣＴ  ２４１３由来の４つの新規セリンプロテアーゼＰ５４３１（ＡＭ２９４９７５）、Ｐ７１２９（ＡＭ２９６４８２）、Ｐ８０４８（ＡＭ２９４９７８）およびＰ１０２６１（ＡＭ２９４９８０）を示した。トリコデルマ・リーゼイ  ゲノムプロジェクトは、異なる型のプロテアーゼをコードするいくつかの遺伝子の存在を証明した（Martinezら、2008;http://genome.jgi-psf.org/Trire2/Trire2.home.html）。ｐｒｂ１遺伝子に対するホモログは、ＩＤ  １２１４９５を有するタンパク質をコードする。
【０００７】
上記トリコデルマ  セリンプロテアーゼの特徴付けは、候補バイオコントロール遺伝子および改善された市販のバイオコントロール剤の同定のための道を開くことが示唆されている。他のバイオテクノロジープロセスにおけるこれらの適用は、試験されていない。トリコデルマ・コニンギ(T. koningii)のアルカリ性セリンプロテアーゼは、グルタルアルデヒドでの架橋が温度およびｐＨの広範な範囲にわたって洗剤による阻害に抵抗性がある安定な酵素調製物をもたらすため、洗剤産業において適用できることが示唆されている（Manonmani and Joseph, 1993）。しかしながら、該酵素は、８５ｋＤａという高い分子量によって、Ｐｒｂ１−型プロテアーゼと異なる。トリコデルマ種、例えば、トリコデルマ・リーゼイ  ＱＭ９４１４は、２５ｋＤａの分子量および７．３のｐＩ、ならびにｐＨ８および５０℃で最大活性を有するファミリーＳ１のトリプシン様プロテアーゼも分泌することが知られている（Dienesら、2007）。ＥＰ  １３４７０４５  Ａ１は、トリコデルマ・ハルジアナム由来のファミリーＳ１  セリンプロテアーゼを記載している。トリコデルマ・リーゼイ  ＱＭ６ａ由来の酸プロテアーゼＮＳＰ２４およびＮＳＰ２５の核酸およびアミノ酸配列は、ＷＯ２００６０７３８３９に記載されている。組換え的に生産されたＮＳＰ２４は、例えば、食物および飼料の製造ならびに洗剤における有用性を有する。
【０００８】
また、真菌種、例えば、トリチラキウム(Tritirachium)およびコニディオボルス(Conidiobolus)由来のアルカリプロテアーゼが報告されている（Anwar and Saleemuddin, 1998、参照）。
【０００９】
社会経済の挑戦および政府規制は、洗剤産業に、少量で使用でき、したがってほとんど環境廃棄物を残さない優しい化学物質の使用だけでなく、エネルギー節約の必要性をも含む多数の環境局面を考慮するよう強要している。洗剤酵素、特にプロテアーゼは、洗剤組成物における重要な成分である。洗浄温度を低下させることによるエネルギーの節約の必要性があり、また、高い温度に耐えることができない合成繊維の使用が増加しており、現在のライフスタイルは顧客の習慣を変化させ、低い温度において有効である新しい酵素に対する要求を生じている。
【００１０】
種々の微生物由来のセリンプロテアーゼ、例えば、放線菌(actinomycete)ノカルジオプシス・ダソンヴィレィ(Nocardiopsis dassonvillei)（ＥＰ  ０２９０５６７、Novo Nordisk A/S, DK）および真菌ペシロミセス・マルクアンディ(Paecilomyces marquandii)（ＥＰ  ０２９０５６９、Novo Nordisk A/S, DK）由来の低温アルカリプロテアーゼならびにトリプシンおよびキモトリプシン様活性の耐冷性トリコデルマ単離物（Antalら、2000）が、多数の特許公報、論評および論文に公開されている事実にもかかわらず、特に低い温度または中程度の温度範囲においてタンパク質性物質の修飾、分解および除去において適当かつ有効であり、非常に様々な特性を有する洗剤の存在下で安定である代替セリンプロテアーゼのかなりの必要性が未だ存在する。
【００１１】
洗剤産業は、新規製品を顧客の習慣および要求、新規織物製品および新規洗浄機の特性に適合において大幅に進歩している。洗剤産業および政府規制の様々な全ての要求を満たすために、洗剤組成物用の新規セリンプロテアーゼ成分は、広範なｐＨおよび温度範囲において役割を成し遂げることができるべきであり、種々の異なる洗剤と組み合わせて機械的および化学的介入を含む種々の条件下で安定性を維持することができるべきである。また、セリンプロテアーゼは高収率において生産することができ、発酵培養液および菌糸から容易な分離によりコスト的に有効に下流処理できることが望ましい。
【発明の概要】
【００１２】
発明の概要
本発明の目的は、広範な基質特異性を示し、広範なｐＨ範囲で活性であり、広範な温度最適条件を有する、すなわち低い温度および中程度の温度の両方で機能する真菌起源のセリンプロテアーゼを提供することである。洗濯用および食器用洗剤のためのセリンプロテアーゼは、洗剤の存在下でも安定であるか、または洗剤と適合性であるべきである。特に、本発明の目的は、現在市販の酵素調製物よりも低い温度で洗濯物および食器の洗浄における汚れを含むタンパク質性物質を有効に除去し、それによりエネルギーを節約することができるセリンプロテアーゼを提供することである。真菌セリンプロテアーゼは、真菌宿主において高収率で生産することができ、その下流処理、例えば、発酵培養液および菌糸の分離は実施することが容易である。
【００１３】
本発明は、低い温度または中程度の温度範囲でタンパク質性物質の修飾、分解または除去において適用できる真菌セリンプロテアーゼ酵素に関する。該酵素は、セリンプロテアーゼ活性を有し、配列番号：１０に定義されている成熟Ｔｒ  Ｐｒｂ１酵素または同様の特性を有するその変異体のアミノ酸配列を含む。好ましくは、該酵素は、洗剤添加物として適用することができる。
【００１４】
本発明の酵素は、糸状菌トリコデルマから、さらに好ましくはトリコデルマ・リーゼイから、より好ましくはトリコデルマ・リーゼイ  ＱＭ６ａ株（ＡＴＣＣ  １３６３１、ＣＢＳ  ３８３．７８、ＩＭＩ  １９２６５４、ＩＭＩ  ４５５４８およびＴ．Ｖ．  Ｂ１１７）から得ることができる。好ましくは、該酵素は、セリンプロテアーゼ活性を有し、配列番号：１０に定義されている成熟Ｔｒ  Ｐｒｂ１酵素のアミノ酸配列を含む。
【００１５】
本発明の酵素は、２５から３５ｋＤａの分子量を有する。該酵素は、ｐＨ９で３０℃から７０℃の範囲の最適温度を有する。該酵素は、５０℃で少なくともｐＨ６からｐＨ１１のｐＨ範囲で最適ｐＨを有する。温度および最適ｐＨは、１５分の反応時間および基質としてカゼインを使用して決定した。本発明のセリンプロテアーゼは、洗剤の存在下で１０℃から６０℃でタンパク質性の汚点を修飾、分解または除去することができる。
【００１６】
該酵素は、配列番号：１０に定義されている成熟Ｔｒ  Ｐｒｂ１酵素のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド配列によってコードされる。好ましくは、該成熟酵素は、配列番号：９のヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子によってコードされる。
【００１７】
本発明の真菌セリンプロテアーゼ酵素は、受入番号ＤＳＭ２２６３５の下に大腸菌ＲＦ８０５２において寄託されている配列番号：５のヌクレオチド配列を含むプラスミドｐＡＬＫ２６５０に含まれている単離されたポリヌクレオチド配列によってコードされる。プラスミドｐＡＬＫ２６５０は、全長真菌セリンプロテアーゼ酵素をコードするポリヌクレオチド配列を含む。
【００１８】
該真菌セリンプロテアーゼ酵素は、適当な宿主におけるセリンプロテアーゼをコードする遺伝子の発現を指示することができる調節配列に作動可能に連結した本発明の真菌セリンプロテアーゼをコードする核酸分子を含む組換え発現ベクターから生産される。適当な宿主は、異種宿主、好ましくはトリコデルマ(Trichoderma)、アスペルギルス(Aspergillus)、フザリウム(Fusarium)、フミコーラ(Humicola)、クリソスポリウム(Chrysosporium)、アカパンカビ(Neurospora)、クモノスカビ(Rhizopus)、ペニシリウム(Penicillium)およびモルティエラ(Mortiriella)属の微生物宿主を含む。
【００１９】
好ましくは、該酵素は、トリコデルマまたはアスペルギルス、より好ましくはトリコデルマ・リーゼイ(T. reesei)において生産される。
【００２０】
本発明は、また、
（ａ）セリンプロテアーゼ活性を有し、配列番号：１０において記載されているアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは同様の特性を有するその変異体をコードする核酸分子；
（ｂ）配列番号：９において記載されているポリヌクレオチド配列を含む核酸分子；
（ｃ）ＤＳＭ２２６３５に含まれる配列番号：５のポリヌクレオチド配列のコード配列を含む核酸分子；
（ｄ）遺伝子コードの縮重によって、（ｂ）または（ｃ）の核酸分子のポリヌクレオチド配列と異なるポリヌクレオチド配列を含む核酸分子
からなる群から選択される低い温度または中程度の温度範囲でタンパク質性物質の修飾、分解または除去において適用できる真菌セリンプロテアーゼ酵素をコードする単離された核酸分子に関する。
【００２１】
本発明は、適当な宿主における該セリンプロテアーゼをコードする遺伝子の発現を指示することができる調節配列に作動可能に連結した本発明のヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターにさらに関する。
【００２２】
本発明は、また、上記組換え発現ベクターを含む宿主細胞に関する。好ましくは、該宿主細胞は、微生物宿主、例えば、糸状菌である。好ましい宿主は、トリコデルマ、アスペルギルス、フザリウム、フミコーラ、クリソスポリウム、アカパンカビ、クモノスカビ、ペニシリウムおよびモルティエラ属である。より好ましくは、該宿主は、トリコデルマまたはアスペルギルス、さらに好ましくは糸状菌トリコデルマ・リーゼイである。該宿主は、本発明のヌクレオチド配列と同種または異種であり得る。
【００２３】
本発明は、セリンプロテアーゼ活性を有する本発明のポリペプチドを生産する方法であって、本発明の宿主細胞を培養する工程、該ポリペプチドを回収する工程を含む方法に関する。また、本発明の核酸配列によってコードされ、上記方法により得ることができるセリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドも本発明の範囲内である。
【００２４】
本発明は、酵素調製物を得るための方法であって、本発明の宿主細胞を培養し、該細胞から本発明のポリペプチドを回収するか、または該培養培地から該細胞を分離して上清を得る工程を含む方法に関する。また、上記方法により得ることができる酵素調製物も本発明の範囲内である。
【００２５】
本発明は、本発明のセリンプロテアーゼ酵素を含む酵素調製物に関する。
【００２６】
本発明の酵素調製物は、プロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼまたはオキシダーゼの群から選択される他の酵素をメディエーターと共にまたはメディエーターなしで、ならびに安定剤、バッファー、界面活性剤、漂白剤、メディエーター、防食剤、ビルダー、再付着防止剤、光学的光沢剤、色素、顔料、腐食剤、研磨剤および防腐剤などの群から選択される適当な添加物をさらに含み得る。
【００２７】
生産宿主の消費された培養培地はそれ自体使用することができ、または該宿主細胞を除去してもよく、および／または濃縮、濾過または分画してもよい。それは、また、乾燥させてもよい。本発明の酵素調製物は、液体、粉末または粒状の形態であり得る。
【００２８】
また、洗剤のための、繊維を処理するための、羊毛を処理するための、髪を処理するための、革を処理するための、食物または飼料を処理するための、またはタンパク質性物質の修飾、分解または除去を含むあらゆる用途のための本発明のセリンプロテアーゼ酵素または酵素調製物の使用も本発明の範囲内である。特に、該酵素または酵素調製物は、液体洗剤および粉末洗剤における洗剤添加物として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１−１】図１は、トリコデルマ・リーゼイ  ＱＭ６ａ  ｐｒｂ１（Ｔｒ  ｐｒｂ１）遺伝子のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。推定シグナルペプチドは、小文字であり、下線が引かれている。推定プロ配列およびプロ配列の推定アミノ酸は小文字である。成熟ヌクレオチド配列は、大文字である。イントロン配列は、小文字のイタリック体であり、ヌクレオチド配列下で点線によりマークされている。終始コドンは、配列下のアステリスクにより示されている。図１Ａは、Ｔｒ  ｐｒｂ１遺伝子のＡＴＧ開始コドンからＴＣＣコドン（ヌクレオチド１から１２００）のヌクレオチド配列、Ｔｒ  Ｐｒｂ１  タンパク質のＭｅｔ１からＳｅｒ３５３のアミノ酸配列をコードする配列領域を示す。
【図１−２】図１Ｂは、Ｔｒ  ｐｒｂ１遺伝子のＡＴＧコドンからＴＡＡ終始コドン（ヌクレオチド１２０１から１３７１）のヌクレオチド配列、Ｔｒ  Ｐｒｂ１  タンパク質のＭｅｔ３５４からＡｌａ４０９のアミノ酸配列をコードする配列領域を示す。
【図２−１】図２は、フザリウム・グラミネアラム(Fusarium graminearum)  ＡＬＫＯ１７２６  Ｆｇ  ｐｒｔＳ８Ａ遺伝子のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。シグナルＰ  Ｖ３．０  プログラムにより分析された推定シグナルペプチドは、小文字であり、下線が引かれている。推定プロ配列およびプロ配列の推定アミノ酸は小文字である。成熟ヌクレオチド配列は、大文字である。推定イントロン配列の位置は、小文字のイタリック体であり、ヌクレオチド配列下で点線によりマークされている。終始コドンは、配列下のアステリスクにより示されている。図２Ａは、Ｆｇ  ｐｒｔ８Ａ遺伝子のヌクレオチド１から１１４０のヌクレオチド配列、Ｆｇ＿ＡＬＫＯ１７２６タンパク質のＭｅｔ１からＶａｌ３６１のアミノ酸配列をコードする配列領域を示す。
【図２−２】図２Ｂは、Ｆｇ  ｐｒｔ８Ａ遺伝子のヌクレオチド１１４１から１２９２のヌクレオチド配列、Ｆｇ＿ＡＬＫＯ１７２６タンパク質のＡｌａ３６２からＴｈｒ４１１のアミノ酸配列をコードする配列領域を示す。
【図３】図３は、トリコデルマ・リーゼイにおいてＴｒ  ｐｒｂ１遺伝子を発現するために使用されるカセット（ｐＡＬＫ２７０１由来の８７６２ｂｐのＮｏｔＩフラグメント）を概略的に示す。カセットにおけるｐｒｂ１遺伝子の３’末端にｃｂｈ１ターミネーターを融合するために使用されるリンカーの位置および制限酵素認識部位の選択を示す。
【図４】図４は、トリコデルマ・リーゼイにおいてＦｇ  ｐｒｔＳ８Ａ遺伝子を発現するために使用されるカセット（ｐＡＬＫ２７０８由来の８６８３ｂｐのＮｏｔＩフラグメント）を概略的に示す。カセットにおけるｐｒｂ１遺伝子の３’末端にｃｂｈ１ターミネーターを融合するために使用されるリンカーの位置および制限酵素認識部位の選択を示す。
【図５】図５は、１５分の反応時間および基質としてカゼインを使用してｐＨ９でアッセイされた組換えタンパク質トリコデルマ・リーゼイ  Ｐｒｂ１（Ｔｒ  Ｐｒｂ１）およびフザリウム・グラミネアラム(F. graminearum)  Ｆｇ＿ＡＬＫＯ１７２６の温度プロフィールを示す。データ点は３つの異なる測定の平均である。図５Ａは、Ｔｒ  Ｐｒｂ１アッセイからの結果を示す。図５Ｂは、Ｆｇ＿ＡＬＫＯ１７２６アッセイからの結果を示す。
【図６】図６は、組換えＴｒ  Ｐｒｂ１およびＦｇ＿ＡＬＫＯ１７２６タンパク質の活性におけるｐＨの影響を示す。使用されるバッファーは４０ｍＭのＢｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎバッファーであり、カゼインは基質として使用され、反応時間は１５分であり、反応温度は５０℃であった。データ点は３つの異なる測定の平均である。図６Ａは、Ｔｒ  Ｐｒｂ１アッセイからの結果を示す。図６Ｂは、Ｆｇ＿ＡＬＫＯ１７２６アッセイからの結果を示す。
【００３０】
【図７−１】図７は、異なる温度（ｐＨ９、６０分）で血液／ミルク／インク汚点（Ａｒｔ  １１７、ＥＭＰＡ）での組換えタンパク質Ｔｒ  Ｐｒｂ１およびＦｇ＿ＡＬＫＯ１７２９の能力を示す。市販の調製物  Ｓａｖｉｎａｓｅ  Ｕｌｔｒａ（登録商標）  １６Ｌ（Novozymes A/S, DK）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標）  ４０００Ｌ（Genencor Inc., USA）およびＰｒｏｐｅｒａｓｅ（登録商標）  ４０００Ｅ（Genencor Inc., USA）を比較のために使用した。ΔＬ＊（デルタＬ＊）＝酵素処理された織物の明度Ｌ＊−バッファーのみで処理された織物の明度Ｌ＊（酵素ブランク）。図７Ａは、１０℃での組換えタンパク質Ｔｒ  Ｐｒｂ１および市販のプロテアーゼ調製物の能力を示す。図７Ｂは、２０℃での組換えタンパク質Ｔｒ  Ｐｒｂ１およびＦｇ＿ＡＬＫＯ１７２９ならびに市販のプロテアーゼ調製物の能力を示す。
【図７−２】図７Ｃは、３０℃での組換えタンパク質Ｔｒ  Ｐｒｂ１およびＦｇ＿ＡＬＫＯ１７２９ならびに市販のプロテアーゼ調製物の能力を示す。図７Ｄは、４０℃での組換えタンパク質Ｔｒ  Ｐｒｂ１およびＦｇ＿ＡＬＫＯ１７２９ならびに市販のプロテアーゼ調製物の能力を示す。
【図７−３】図７Ｅは、５０℃での組換えタンパク質Ｔｒ  Ｐｒｂ１および市販のプロテアーゼ調製物の能力を示す。図７Ｆは、６０℃での組換えタンパク質Ｔｒ  Ｐｒｂ１および市販のプロテアーゼ調製物の能力を示す。
【図８】図８は、３０℃で血液／ミルク／インク汚点（Ａｒｔ  １１７、ＥＭＰＡ）および異なる液体洗剤での組換えタンパク質Ｔｒ  Ｐｒｂ１およびＦｇ＿ＡＬＫＯ１７２９の能力を示す。市販の調製物およびＰｒｏｐｅｒａｓｅ（登録商標）  ４０００Ｅ（Genencor Inc., USA）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標）  ４０００ＬおよびＳａｖｉｎａｓｅ（登録商標）  Ｕｌｔｒａ  １６Ｌを比較のために使用した。ΔＬ＊（デルタＬ＊）＝酵素処理された織物の明度Ｌ＊−酵素なしで処理された織物の明度Ｌ＊。図８Ａは、３．３ｇ／ｌの濃度およびｐＨ約７．９でＡｒｉｅｌ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  （Procter & Gamble, UK）での能力を示す。図８Ｂは、３．３ｇ／ｌの濃度およびｐＨ約８．２でＥｒｉｓａｎ（Farmos, Finland）での能力を示す。
【図９−１】図９は、３０℃で異なる洗剤濃度で、ならびに１０℃および２０℃で洗剤濃度３．３ｇ／ｌで色付き織物用の液体ベース洗剤（表２）で血液／ミルク／インク汚点（Ａｒｔ  １１７、ＥＭＰＡ）での組換えタンパク質Ｔｒ  Ｐｒｂ１およびＦｇ＿ＡＬＫＯ１７２９の能力を示す。市販の調製物Ｐｒｏｐｅｒａｓｅ（登録商標）  ４０００Ｅ、Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標）  ４０００ＬおよびＳａｖｉｎａｓｅ（登録商標）  Ｕｌｔｒａ  １６Ｌを比較のために使用した。ΔＬ＊（デルタＬ＊）＝酵素処理された織物の明度Ｌ＊−酵素なしで処理された織物の明度Ｌ＊。図９Ａは、５ｇ／ｌの濃度およびｐＨ約７．５で液体ベース洗剤で３０℃での能力を示す。図９Ｂは、３．３ｇ／ｌの濃度およびｐＨ約７．４で液体ベース洗剤で３０℃での能力を示す。
【図９−２】図９Ｃは、１ｇ／ｌの濃度およびｐＨ約７．３で液体ベース洗剤で３０℃での能力を示す。図９Ｄは、３．３ｇ／ｌの濃度で液体ベース洗剤で２０℃での能力を示す。
【図９−３】図９Ｅは、３．３ｇ／ｌの濃度で液体ベース洗剤で１０℃での能力を示す。
【図１０−１】図１０は、４０−５０℃およびｐＨ約１０で粉末洗剤（Ａｒｔ．  ６０１、ＥＭＰＡ）の存在下で血液／ミルク／インク汚点（Ａｒｔ．  １１７、ＥＭＰＡ）での組換えタンパク質Ｔｒ  Ｐｒｂ１およびＦｇ＿ＡＬＫＯ１７２９の能力を示す。市販の調製物Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標）  ４０００ＬおよびＰｒｏｐｅｒａｓｅ（登録商標）  ４０００Ｅを比較のために使用した。ΔＬ＊（デルタＬ＊）＝酵素処理された織物の明度Ｌ＊−酵素なしで処理された織物の明度Ｌ＊。図１０Ａは４０℃での能力を示す。
【図１０−２】図１０Ｂは５０℃での能力を示す。
【００３１】
【図１１−１】図１１は、洗浄時間１５分で３０℃でフルスケール試験における異なる汚点（ＥＭＰＡおよびＣＦＴから）および色付き織物用の液体ベース洗剤での組換えタンパク質  Ｔｒ  Ｐｒｂ１の能力を示す。市販の調製物  Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標）  ４０００Ｌを比較のために使用した。ΔＬ＊（デルタＬ＊）＝酵素処理された織物の明度Ｌ＊−酵素なしで処理された織物の明度Ｌ＊。図１１Ａは、血液／ミルク／インク／ＰＥ＋ＣＯ（Ａｒｔ．  １１７、ＥＭＰＡ）における能力を示す。
【図１１−２】図１１Ｂは、血液／ミルク／インク／ＰＥ＋ＣＯ（Ａｒｔ．  １１６、ＥＭＰＡ）における能力を示す。図１１Ｃは、血液／ミルク／インク／ＰＥ＋ＣＯ（ＣＦＴ／  ＰＣ−０５−０１４）における能力を示す。
【図１１−３】図１１Ｄは、血液／ミルク／インク／ＣＯ（ＣＦＴ／  Ｃ−０５−０５９ｂ）における能力を示す。図１１Ｅは、ココア（Ａｒｔ．  １１２、ＥＭＰＡ）における能力を示す。
【図１１−４】図１１Ｆは、チョコレート／ミルク／顔料（ＣＦＴ／Ｃ−０３−０３０）における能力を示す。図１１Ｇは、落花生油／ミルク（ＣＦＴ／Ｃ−１０−１８６ｂ）における能力を示す。
【図１１−５】図１１Ｈは、草（ＣＦＴ／ＣＳ−０８−０６９）における能力を示す。図１１Ｉは、卵黄／顔料（ＣＦＴ／ＣＳ−３８−０１０）における能力を示す。
【図１２】図１２は、酵素投与量がタンパク質の量として計算されたとき、洗浄時間１５分で３０℃でフルスケール試験における異なる汚点および色付き織物用の液体ベース洗剤での組換えタンパク質  Ｔｒ  Ｐｒｂ１の能力を示す。市販の調製物  Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標）  ４０００Ｌ  を比較のために使用した。ΔＬ＊（デルタＬ＊）＝酵素処理された織物の明度Ｌ＊−酵素なしで処理された織物の明度Ｌ＊。図１２Ａは、血液／ミルク／インク／ＰＥ＋ＣＯ（Ａｒｔ．  １１７、ＥＭＰＡ）における能力を示す。図１２Ｂは、草（ＣＦＴ／ＣＳ−０８−０６９）における能力を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
配列表
配列番号：１  Ｐｒｂ１プロテアーゼをコードするトリコデルマ・リーゼイ  ＱＭ６ａ  ｐｒｂ１遺伝子（Ｊｏｉｎｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  トリコデルマ・リーゼイ  ゲノム、ｖ．２．０においてタンパク質  ＩＤ  １２１４９５）のクローニングおよびｃｂｈ１プロモーターへのそれの融合（正確な融合）のために使用される５’−ＰＣＲプライマー  ＰＲＯ２１３の配列。
配列番号：２  Ｐｒｂ１  プロテアーゼをコードするトリコデルマ・リーゼイ  ＱＭ６ａ  ｐｒｂ１遺伝子（Ｊｏｉｎｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  トリコデルマ・リーゼイ  ゲノム、ｖ．２．０においてタンパク質  ＩＤ  １２１４９５）のクローニングおよびｃｂｈ１ターミネーターへのそれの融合（リンカーを介して）のために使用される３’−ＰＣＲプライマー  ＰＲＯ２１４の配列。
配列番号：３  フザリウム・グラミネアラム  ＡＬＫＯ１７２６  プロテアーゼのクローニングおよびｃｂｈ１プロモーターへのそれの融合（正確な融合）のために使用される５’−ＰＣＲプライマー  ＰＲＯ２４５の配列。
配列番号：４  フザリウム・グラミネアラム  ＡＬＫＯ１７２６プロテアーゼのクローニングおよびｃｂｈ１ターミネーターへのそれの融合（リンカーを介して）のために使用される３’−ＰＣＲプライマー  ＰＲＯ２４６の配列。
配列番号：５  Ｐｒｂ１  プロテアーゼ（ＩＤ  １２１４９５）をコードする全長トリコデルマ・リーゼイ  ＱＭ６ａ  プロテアーゼ遺伝子  ｐｒｂ１（Ｔｒ  ｐｒｂ１）のヌクレオチド配列。
【００３３】
配列番号：６  Ｍｅｔ１からＡｌａ４０９のアミノ酸を含む全長トリコデルマ・リーゼイ  ＱＭ６ａ  プロテアーゼ  Ｐｒｂ１（Ｔｒ  Ｐｒｂ１）の推定アミノ酸配列
配列番号：７  トリコデルマ・リーゼイ  Ｐｒｂ１  プロテアーゼのプロ酵素形態のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列。
配列番号：８  全長プロテアーゼのＡｌａ２１からＡｌａ４０９のアミノ酸を含むトリコデルマ・リーゼイ  Ｐｒｂ１  プロテアーゼのプロ酵素形態のアミノ酸配列。
配列番号：９  トリコデルマ・リーゼイ  Ｐｒｂ１  プロテアーゼの成熟形態のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列。
配列番号：１０  全長酵素のＡｌａ１２１からＡｌａ４０９のアミノ酸を含むトリコデルマ・リーゼイ  Ｐｒｂ１  プロテアーゼの成熟形態のアミノ酸配列。
【００３４】
配列番号：１１  全長フザリウム・グラミネアラム  ＡＬＫＯ１７２６  プロテアーゼ遺伝子  Ｆｇ  ｐｒｔＳ８Ａのヌクレオチド配列。
配列番号：１２  Ｍｅｔ１からＴｈｒ４１１のアミノ酸を含む全長フザリウム・グラミネアラム  ＡＬＫＯ１７２６  プロテアーゼ（Ｆｇ＿ＡＬＫＯ１７２６）の推定アミノ酸配列。
配列番号：１３  フザリウム・グラミネアラム  ＡＬＫＯ１７２６  プロテアーゼのプロ酵素形態のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列。
配列番号：１４  全長プロテアーゼのＡｌａ２１からＴｈｒ４１１のアミノ酸を含むフザリウム・グラミネアラム  ＡＬＫＯ１７２６  プロテアーゼのプロ酵素形態のアミノ酸配列。
配列番号：１５  フザリウム・グラミネアラム  ＡＬＫＯ１７２６  プロテアーゼの成熟形態のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列。
配列番号：１６  全長酵素のＡｌａ１２３からＴｈｒ４１１のアミノ酸を含むフザリウム・グラミネアラム  ＡＬＫＯ１７２６  プロテアーゼの成熟形態のアミノ酸配列。
【００３５】
寄託
フザリウム・グラミネアラムＡＬＫＯ１７２６は、２００９年６月３日にＵｐｐｓａｌａｌａａｎ  ８、３５０８  ＡＤ、Ｕｔｒｅｃｈｔ、ｔｈｅ  ＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓでＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  Ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓで寄託され、受入番号ＣＢＳ１２４６９７を割り当てられた。
【００３６】
プラスミドｐＡＬＫ２６５０を含む大腸菌株ＲＦ８０５２は、２００９年６月３日にＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ  （ＤＳＭＺ）、Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｓｓｅ  ７  ｂ、Ｄ−３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙで寄託され、受入番号ＤＳＭ２２６３５を割り当てられた。
【００３７】
プラスミドｐＡＬＫ２７０７を含む大腸菌株ＲＦ８０９８は、２００９年６月３日にＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ  （ＤＳＭＺ）、Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｓｓｅ  ７  Ｂ、Ｄ−３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙで寄託され、受入番号ＤＳＭ２２６３６を割り当てられた。
【００３８】
詳細な説明
本発明は、広範な基質特異性を示し、高いｐＨ範囲で活性であり、広範な温度最適条件、すなわち低い温度および中程度の温度の両方で良い能力を有する真菌起源のセリンプロテアーゼを提供する。該酵素は、典型的な洗剤組成物に耐え、洗剤溶液において低い酵素レベルで有効であって、洗剤適用に理想的である。特に、該セリンプロテアーゼは低い温度、１０℃以下でさえ活性であり、好ましい範囲は１０℃から６０℃である。したがって、本発明は、低い温度または中程度の温度範囲での能力が望ましい洗剤における使用および他の産業適用のための代替セリンプロテアーゼを提供する。該真菌セリンプロテアーゼは、高収率の真菌宿主およびその下流処理、例えば、容易に行われる発酵培養液および菌糸の分離において生産することができる。
【００３９】
本発明との関連において、「セリンプロテアーゼ」または「セリンエンドペプチダーゼ」または「セリンエンドプロテイナーゼ」は、International Union of Biochemistry and Molecular Biologyの命名法によってＥＣ  ３．４．２１として分類される酵素である。セリンプロテアーゼは、単細胞および複合生物の両方において見出される。構造的類似性に基づいて、セリンプロテアーゼは、同様のアミノ酸配列および三次元構造でファミリーおよびサブファミリーにさらにサブグループ化される少なくとも６つのクラン(clan)（ＳＡ、ＳＢ、ＳＣ、ＳＥ、ＳＦおよびＳＧ；Ｓはセリンプロテアーゼを示す）にグループ化されている（例えば、セリンプロテアーゼホームページ  http://www.biochem.wustl.edu/~protease/, Department of Biochemistry and Molecular Biophysics, Washington University of Medicine, St. Louis, MO, USA、参照）。これらのタンパク質加水分解酵素または分解酵素は、活性部位における求核セリン基の存在により特徴付けられ、主要なクランＳＡおよびＳＢのプロテアーゼは、また、セリンと共に触媒トライアド(triad)を形成する重要なアスパラギン酸およびヒスチジン残基を有することにより区別される。該酵素は、開裂部位の周囲のアミノ酸残基に基づいてポリペプチド鎖の異なる領域を標的とする。
【００４０】
本発明のセリンプロテアーゼは、「サブチリシン様セリンプロテアーゼ」または「サブチラーゼ」からなるファミリー８であるクランＳＢに属する。バチルス・アミロリケファシエンス(B.amyloliquifaciens)、バチルス・リケニフォルミス(B.licheniformis)およびバチルス・サブティリス(B.subtilis)のような種々のバチルス種により示される（Raoら、1998）セリンプロテアーゼのクラスは、芳香族性または疎水性残基、例えば、チロシン、フェニルアラニンおよびロイシンに特異的である。
【００４１】
本発明において使用される「セリンプロテアーゼ活性」なる用語は、基質、例えば、カゼイン、ヘモグロビン、ケラチンおよびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むタンパク質における加水分解活性を示す。タンパク質分解活性を分析するための方法は、文献においてよく知られており、例えば、Guptaら、(2002)において言及されている。
【００４２】
プロテアーゼは、特定の阻害剤のグループを使用して分類することができる。種々の「セリンプロテアーゼ阻害剤」のグループは、合成化学阻害剤および天然タンパク質阻害剤を含む。１つのグループの天然阻害剤は、セルピン（セリンプロテアーゼ阻害剤から省略された）、例えば、アンチトロンビンおよびアルファ１−アンチトリプシンである。人工合成阻害剤は、３，４−ジクロロイソクマリン（３，４−ＤＣＩ）、ジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＦＰ）、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）およびトシル−Ｌ−リジンクロロメチルケトン（ＴＬＣＫ）を含む。いくつかのセリンプロテアーゼは、活性部位付近のシステイン残基の存在によって、チオール試薬、例えば、ｐ−クロロ水銀安息香酸（ＰＣＭＢ）により阻害される。したがって、セリンプロテアーゼ活性は、適当な条件下でセリンプロテアーゼの特定の阻害剤の存在または非存在下で、特定の基質の開裂に基づくアッセイまたは基質を含む任意のタンパク質を使用するアッセイにおいて測定することができる。
【００４３】
該セリンプロテアーゼは、プレプロ酵素の形態における不活性な「酵素前駆体」または「酵素前駆体」として合成され、これはシグナル配列（分泌シグナルペプチドまたはプレペプチド）およびプロ配列（プロペプチド）の除去により活性化され、該酵素の活性な成熟形態を生じる（Chen and Inouye, 2008）。この活性化プロセスはプロテアーゼの作用と関連し、セリンプロテアーゼの限定された自己消化または自己触媒プロセスをもたらし得る。プロ配列は、例えば、生産の翻訳後段階中または消費された培養培地中または培養培地もしくは酵素調製物の保存中に開裂され得る。プロ酵素の活性化は、また、不活性なプロ酵素を活性な成熟酵素に変換することができるタンパク質分解酵素を宿主生物を培養する培養培地に加えることにより、または培養プロセス後に該タンパク質分解酵素を培養上清に加えることにより成し遂げられ得る。該酵素の短縮は、また、例えば、該ポリペプチドをコードする遺伝子で生産宿主を形質転換する前に切断することにより成し遂げることができる。
【００４４】
「成熟」なる用語は、シグナル配列およびプロペプチドの除去後に、酵素または触媒活性のために重要なアミノ酸を含む酵素の形態を意味する。糸状菌において、それは、培養培地に分泌される天然形態である。
【００４５】
プロテアーゼ活性を生じることができる微生物株を異なる基質についてスクリーニングすることができる。選択された株は適当な培地上で培養し、単離または精製のために十分な量の興味あるセリンプロテアーゼを生産し、その特性をさらに特徴付けることができる。あるいは、種々の生物におけるセリンプロテアーゼをコードする遺伝子を単離し、該遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を本実施例において単離され特徴付けられたセリンプロテアーゼのアミノ酸配列と比較することができる。
【００４６】
本発明のセリンプロテアーゼ酵素は、糸状菌および酵母菌を含む真菌、例えば、トリコデルマ属由来であり得る。真菌アルカリプロテアーゼは、微生物非含有酵素または酵素組成物を生産するための下流処理の容易さのため、細菌プロテアーゼに有利である。菌糸体は、酵素の精製の前に濾過技術を介して容易に除去することができる。
【００４７】
天然または組換えセリンプロテアーゼは、酵素化学の慣用の方法、例えば、塩調製、限外ろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過および疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用することにより精製することができる。精製は、タンパク質定量、酵素活性アッセイおよびＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によりモニタリングすることができる。種々の温度およびｐＨ値での精製された酵素の酵素活性および安定性ならびに分子量および等電点を、決定することができる。
【００４８】
２つの組換えセリンプロテアーゼの精製は、実施例３において証明されている。トリコデルマ・リーゼイ  ＱＭ６ａおよびフザリウム・グラミネアラム  ＡＬＫＯ１７２６の濾液され脱塩された培養上清をＱ  セファロース  ＦＦカラムに適用した。流入画分をＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００  ＧＬカラムに適用した。精製は、実施例２ｃおよび８に記載されているカゼインでの活性アッセイにしたがった。当然、本明細書に記載されている方法の代わりに、または、該方法に加えて他の既知の精製方法を使用することにより、本発明の酵素を分離することができる。組換えセリンプロテアーゼを実施例３において記載されているとおりにｐＨおよび温度プロフィールの特徴付けのために使用した。
【００４９】
最適ｐＨの決定は、タンパク質基質の活性にしたがって、異なるｐＨ値で適当なバッファーで実施することができる。セリンプロテアーゼは、一般的に中性またはアルカリ性ｐＨで、ｐＨ７から１１の最適条件で活性であり、広範な基質特異性を有する。「アルカリ性セリンプロテアーゼ」は、ｐＨ９からｐＨ１１またはさらにｐＨ１０から１２．５で活性および安定であり（Shimogakiら、1991）、約ｐＨ９で等電点を有する酵素を意味する。
【００５０】
セリンプロテアーゼの最適温度は、実施例２ｃ、３または８において記載されている基質としてカゼインを使用することによるか、または文献（Guptaら、2002）に記載されている他の基質およびバッファー系を使用することにより異なる温度で適当なバッファー中で決定することができる。天然セリンプロテアーゼの温度最適条件は、約６０℃である（Raoら、1998）。
【００５１】
ｐＩは、ポリアクリルアミド、デンプンまたはアガロースから成る固定化されたｐＨ勾配ゲルにおける等電点電気泳動、またはアミノ酸配列からｐＩを概算することにより、例えば、ＥｘＰＡＳｙサーバー（http://expasy.org/tools/pi_tool.html; Gasteigerら、2003）のｐＩ／ＭＷツールを使用することにより決定することができる。
【００５２】
精製されたセリンプロテアーゼの分子量は、質量分析により、またはＬａｅｍｍｌｉ（１９７０）にしたがってＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて決定することができる。分子量は、また、酵素のアミノ酸配列から予測することができる。成熟セリンプロテアーゼまたは成熟セセリンプロテアーゼ酵素は、一般的に２０から３５ｋＤａ、一般的に約２５から３０ｋＤａの分子量を有する（Raoら、1998）。精製されたプロテアーゼのＮ−末端ならびに内部ペプチドは、エドマン分解化学（Edman and Begg, 1967）にしたがって、または文献に記載されている他の方法により配列決定することができる。
【００５３】
プロテアーゼ活性は、一般的に可溶性基質の分解に基づく。洗剤適用において、プロテアーゼは、少なくとも部分的に不溶性である物質において作用しなければならない。したがって、洗剤プロテアーゼのための重要なパラメーターは、これらの不溶性フラグメントに吸着し、加水分解する能力である。
【００５４】
洗剤プロテアーゼの選択のための別の重要なパラメーターは、その等電点またはｐＩ値である。洗剤プロテアーゼは、機能する洗剤溶液のｐＨ値が酵素に対するｐＩ値とほぼ同じであるとき、最もよい。
【００５５】
本発明において、「洗剤の存在下で良い能力」は、本発明の真菌セリンプロテアーゼの場合において、酵素または該酵素を含む調製物が、現在販売されている多数の市販のサブチリシンよりも低い温度で機能することを意味する。言い換えれば、「良い能力」は、酵素が低い温度から中程度の温度範囲でタンパク質性の汚点または物質を分解または除去することができるが、現在市販の製品、例えば、市販の酵素生成物Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標）  ４０００Ｌ  （Genencor Inc., USA）またはＳａｖｉｎａｓｅ（登録商標）(Novozymes A/S, DK)よりも低い温度範囲（１０−３０℃）でとりわけ良い能力を有することを意味する。例えば、ｐＨを修飾すること、適当な特性を有する洗剤を選択すること、酵素保護剤を含むこと、および洗浄条件をコントロールすることにより、本発明のセリンプロテアーゼの活性は１０℃と低い温度で維持され得る。
【００５６】
「洗剤」なる表現は、清浄を助けるか、または清浄特性を有することが意図される物質または材料を意味するために使用される。「洗浄力」なる用語は、清浄特性の存在または程度を示す。清浄特性の程度は、固体、不水溶性担体、例えば、織物繊維またはガラスに結合した異なるタンパク質性の、もしくはタンパク質を含む基質物質または汚点もしくは汚点混合物において試験することができる。典型的な「タンパク質性の」は、血液、ミルク、インク、卵、草およびソースを含む。試験目的のためのタンパク質性の汚点の混合物は、市販されている。洗剤酵素の機能は、タンパク質含有汚点を分解および除去することである。試験結果は、洗浄試験において使用される汚点の型、洗剤の組成物ならびに織物の性質および状態に依存する（Maurer, 2004）。
【００５７】
本出願の文脈において「低い温度」なる用語は、実験にしたがって多数の現在利用できる酵素調製物、特に洗剤酵素調製物の能力に最適でない１０℃から３０℃の温度範囲を意味する。「中程度の温度」なる用語により、３０℃から６０℃の温度範囲を意味する。
【００５８】
「低い温度または中程度の温度範囲で適用できる」なる用語は、酵素が低い温度または中程度の温度範囲（１０℃から６０℃）で有効に機能することが望ましい産業適用を含む。このような適用は、食物、飼料および革産業、医薬、診断、廃棄物管理および銀回収におけるそれらの使用を含む。本明細書における意味として、これらの適用は、植物病原性真菌および線虫の生物学的コントロールにおけるバイオコントロール剤としての本発明のセリンプロテアーゼ酵素の使用を排除する。
【００５９】
本発明の１つの好ましい態様において、真菌セリンプロテアーゼ酵素は、低い温度または中程度の温度で酵素の能力が望ましい適用におけるタンパク質性物質の修飾、分解または除去において適用できる、または有用であるポリペプチドである。該真菌セリンプロテアーゼは、セリンプロテアーゼ活性を有し、配列番号：１０のアミノ酸配列を有するＴｒ  Ｐｒｂ１の成熟酵素を含み、低い温度または中程度の温度で物質を含むタンパク質を修飾、分解または除去することができる。成熟酵素は、シグナル配列またはプレペプチドおよびプロ配列またはプロペプチドを欠く。本発明の成熟セリンプロテアーゼは、配列番号：６に特徴付けられる全長プロテアーゼのアミノ酸Ａｌａ１２１からＡｌａ４０９を含む。したがって、また、シグナル配列（プレペプチド）およびプロペプチドおよび成熟酵素を含む配列番号：６を有する全長Ｔｒ  Ｐｒｂ１酵素ならびにシグナル配列（プレペプチド）を欠いているが、プロペプチドおよび成熟酵素を含む、したがって配列番号：８を有するプロ酵素も本発明の範囲内である。
【００６０】
配列番号：１０のアミノ酸配列の天然変異体は、また、本発明の文脈において含まれる。これらの変異体は、例えば、異種宿主生物におけるタンパク質の生産の結果として、欠失、置換、挿入、付加またはその組合せによるアミノ酸配列における１つ以上の位置の変化を引き起こし得る、アミノ酸配列におけるわずかな変化を含む。しかしながら、これらの変異体は、分子の生物学的機能を変化しない。したがって、変異体は、特性、すなわち特徴および活性において配列番号：１０のアミノ酸配列を有するセリンプロテアーゼと同様である。
【００６１】
「同一性」なる用語は、本明細書において、ほぼ同じ量のアミノ酸を有する対応する配列領域内で互いに比較される２つのアミノ酸配列間の同一性を意味する。例えば、２つのアミノ酸配列の全長または成熟配列の同一性が比較され得る。配列の同一性は、マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ、ギャップオープン：１０、ギャップ伸長：０．５を使用するＣｌｕｓｔａｌＷ  アラインメント（例えば、www.ebi.ac.uk/Tools/Clustalw）を使用することにより測定され得る。２つの配列の同一性は、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは９６％、さらに好ましくは９７％、さらに好ましくは９８％、およびより好ましくは９９％と高い。
【００６２】
好ましくは、本発明の真菌セリンプロテアーゼは、洗剤添加物として適用することができる。
【００６３】
本発明のセリンプロテアーゼは、トリコデルマ属、さらに好ましくはトリコデルマ・リーゼイ、より好ましくはトリコデルマ・リーゼイ  ＱＭ６ａ株（ＡＴＣＣ  １３６３１、ＣＢＳ  ３８３．７８、ＩＭＩ  １９２６５４、ＩＭＩ  ４５５４８およびＴ．Ｖ．  Ｂ１１７）由来の単離されたセリンプロテアーゼであるＴｒ  Ｐｒｂ１を示し、セリンエンドプロテイナーゼのファミリー８であるクランＳＢのメンバーである。
【００６４】
本発明の好ましい態様は、セリンプロテアーゼ活性を有し、配列番号：１０のアミノ酸配列を有するＴｒ  Ｐｒｂ１の成熟酵素を含む真菌セリンプロテアーゼである。
【００６５】
本発明は、成熟形態が２０から３５ｋＤａ、好ましくは２５から３３ｋＤａ、さらに好ましくは２８から３０ｋＤａの分子量または分子重量を有する真菌セリンプロテアーゼ酵素に関する。最も好ましいＭＷは、ＥｘＰＡＳｙ  ｓｅｒｖｅｒでのＣｏｍｐｕｔｅ  ｐＩ／ＭＷツールを使用することにより得られる成熟ポリペプチドに対して２９ｋＤａであるＴｒ  Ｐｒｂ１の予測される分子量である（Gasteigerら、2003）。
【００６６】
本発明の酵素は、広範な温度範囲でタンパク質性物質の分解において有効である。該酵素の最適温度は、実施例３において記載されている１５分の反応時間および基質としてカゼインを使用するｐＨ９で測定されるとき、３０℃から７０℃（最大活性の約２０％）、好ましくは４０℃から６０℃（最大活性の少なくとも約４０％）、さらに好ましくは５０℃から６０℃（最大活性の少なくとも７０％）、より好ましくは５０℃（Ｔｒ  Ｐｒｂ１の最大活性）である。
【００６７】
本発明の１つの好ましい態様において、真菌セリンプロテアーゼ酵素は、実施例２ｃおよび実施例３または８において記載されている１５分の反応時間および基質としてカゼインを使用する５０℃でｐＨ６からｐＨ１０のｐＨ範囲で最大活性の２０％を越えるものを示す少なくともｐＨ６からｐＨ１１のｐＨ範囲で最適ｐＨを有する。特に、最適ｐＨは、ｐＨ６からｐＨ１０（最大活性の少なくとも約９０％）である。
【００６８】
本発明の真菌セリンプロテアーゼは洗剤の存在下で良い能力を有する、すなわち低い（１０℃から３０℃）から中程度の温度（３０℃から６０℃）範囲、具体的には、現在市販の製品、例えば、市販の酵素生成物Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標）  ４０００ＬおよびＰｒｏｐｅｒａｓｅ（登録商標）  ４０００Ｅ（Genencor Inc., USA）、ならびにＳａｖｉｎａｓｅ（登録商標）(Novozyme A/S, DK)よりも低い温度範囲で、洗剤の存在下でタンパク質性の汚点または物質を修飾、分解または除去することができる。洗浄条件ならびに洗剤中の補助成分および添加物に依存して、本発明の酵素は、１０℃から６０℃で、好ましくは５０℃以下で機能する。Ｔｒ  Ｐｒｂ１酵素は、また、４５℃以下、４０℃以下、３５℃以下、３０℃以下、２５℃以下、２０℃以下、１５℃以下、または１０℃以下の温度において機能する。
【００６９】
洗剤の存在下、本発明の真菌セリンプロテアーゼは、上記定義されているとおり１０℃から６０℃で機能し、特に、該真菌セリンプロテアーゼ  Ｔｒ  Ｐｒｂ１は、≦３０℃で洗剤中で良い能力を有する。実施例５から７において比較実験を記載しており、図７から１２から、デルタＬ＊として測定される、異なる織物材料における異なる汚点の強度に対して様々な処理に暴露された、様々な条件下での真菌セリンプロテアーゼ  Ｔｒ  Ｐｒｂ１の能力は、市販の製品、Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標）  Ｕｌｔｒａ  １６Ｌ（Novozymes A/S, DK）、Ｐｒｏｐｅｒａｓｅ（登録商標）  ４０００ＥおよびＰｕｒａｆｅｃｔ（登録商標）  ４０００Ｌ（Genencor Inc, USA）の能力よりもはるかに良いことが明らかである。製造業者によると、Ｐｒｏｐｅｒａｓｅ（登録商標）は、低い温度洗浄条件に対して適当なアルカリプロテアーゼである。
【００７０】
該実験結果から、本発明の真菌セリンプロテアーゼは、洗剤の顧客および洗剤産業および洗浄機を提供する産業の非常に様々な要求を満足させることができ、将来の規制および顧客の習慣の要求に非常に適合していると結論づけることができる。
【００７１】
本発明のセリンプロテアーゼ酵素は、推定アミノ酸配列から推定されるとおり、ｐＩ８．７からｐＩ９．４、好ましくはｐＩ８．８からｐＩ９．３であるｐＩを有する。本発明のＴｒ  Ｐｒｂ１酵素の推定ｐＩはｐＩ８．９である。
【００７２】
１つの好ましい態様において、本発明の真菌セリンプロテアーゼ酵素は、配列番号：１０に特徴付けられるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは同様の特性を有するその変異体をコードする単離された核酸分子によってコードされる。
【００７３】
本発明のセリンプロテアーゼをコードするｃＤＮＡまたはゲノム遺伝子の単離は、ＰＣＲおよび同種セリンプロテアーゼの既知のヌクレオチドまたはアミノ酸配列に基づいて設計されたプライマーを使用して実施され得る。また、精製された酵素または上記オリゴヌクレオチドを使用することにより得られたＰＣＲ産物のＮ−末端またはトリプシンペプチドのアミノ酸配列において合成されたオリゴヌクレオチドを、本発明のセリンプロテアーゼをコードするｃＤＮＡまたはゲノム遺伝子の単離においてプローブとして使用することができる。セリンプロテアーゼクローンは、また、酵素に対して特異的な基質を含むプレートにおける活性に基づいて、またはセリンプロテアーゼに対して特異的な抗体を使用することによりスクリーニングされ得る。
【００７４】
本発明において、Ｔｒ  ｐｒｂ１遺伝子は、ＰＣＲ、および、実施例１ｂにおいて記載されている、ＤＯＥ  Ｊｏｉｎｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（トリコデルマ・リーゼイ  ＱＭ６ａ  ゲノム配列  ｖ２．０、http://genome.jgi-psf.org/cgi-bin/dispGeneModel?db=Trire2&id121495）により公開されているｐｒｂ１遺伝子の配列（遺伝子ＩＤ  １２１４９５）にしたがって設計されたプライマーを使用して単離された。標準分子生物学方法、例えば、分子生物学ハンドブック、例えば、Sambrook and Russell, 2001において記載されている方法を、宿主生物のｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの単離において使用することができる。
【００７５】
ポリヌクレオチド配列をＰＣＲにより製造されたＤＮＡプローブを使用して単離する場合、１００−２００以上のヌクレオチドからなるＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションは、通常、「高ストリンジェンシー」条件で、すなわち完全ハイブリッドの計算される融解温度（Ｔｍ）未満の２０−２５℃である温度でのハイブリダイゼーションを行う（Ｔｍは、Bolton and McCarthy (1962)にしたがって計算される）。通常、プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションは、少なくとも６５℃で６×ＳＳＣ（または６×ＳＳＰＥ）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬、０．５％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの変性された、断片化されたサケ精子ＤＮＡ中で行われる。５０％のホルムアミドの添加は、プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション温度を４２℃まで下げる。洗浄は、低い塩濃度、例えば、２×ＳＳＣ−０．５％のＳＤＳ（ｗ／ｖ）で１５分間、室温（ＲＴ）で、次に２×ＳＳＣ−０．１％のＳＤＳ（ｗ／ｖ）でＲＴで、最後に０．１×ＳＳＣ−０．１％のＳＤＳ（ｗ／ｖ）で少なくとも６５℃で行われる。
【００７６】
したがって、酵素の成熟形態に加えてプレペプチド（シグナル配列）およびプロペプチドを含む本発明の全長セリンプロテアーゼのアミノ酸配列をコードする核酸分子によってコードされ、アミノ酸配列が配列番号：６に特徴付けられるポリペプチド配列は、本発明の範囲内である。
【００７７】
また、酵素の成熟形態に加えてプロペプチドを含む本発明のセリンプロテアーゼ酵素のプロペプチドをコードする核酸分子によってコードされ、アミノ酸配列が配列番号：８に特徴付けられるポリペプチド配列も、本発明の範囲内である。
【００７８】
本発明の１つの好ましい態様は、配列番号：９を有するＴｒ  Ｐｒｂ１  セリンプロテアーゼの成熟形態をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子によってコードされる真菌セリンプロテアーゼ酵素である。
【００７９】
したがって、本発明のＴｒ  Ｐｒｂ１ポリペプチドは、酵素に対する「コード配列」を含む配列番号：５のヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされる。「コード配列」なる表現は、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）から始まり、翻訳終始コドン（ＴＡＡ、タグまたはＴＧＡ）で停止するヌクレオチド配列を意味し、イントロン配列を含み得る。翻訳された全長ポリペプチドは通常メチオニンで開始する。本発明の真菌セリンプロテアーゼ酵素は、また、Ｔｒ  Ｐｒｂ１  プロ酵素形態をコードする配列番号：７のヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされ得る。
【００８０】
本発明の１つの好ましい態様において、真菌セリンプロテアーゼ酵素は、受入番号ＤＳＭ２２６３５の下にＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  （ＤＳＭＺ）で寄託された、大腸菌ＲＦ８０５２において配列番号：５のヌクレオチド配列を含むプラスミドｐＡＬＫ２６５０に含まれる単離されたポリヌクレオチド配列によってコードされる。
【００８１】
本発明の１つの態様は、適当な宿主における該セリンプロテアーゼをコードする遺伝子の発現を指示することができる調節配列に作動可能に連結した上記特徴付けられた真菌セリンプロテアーゼ酵素をコードする、核酸分子を含む組換え発現ベクターから生産されるセリンプロテアーゼ酵素である。該組換え発現ベクターの構築および該ベクターの使用は、実施例２に詳細に記載されている。
【００８２】
真菌セリンプロテアーゼ酵素の生産のために適当な宿主は、同種または異種宿主、例えば、細菌、酵母菌および真菌を含む微生物宿主である。糸状菌、例えば、トリコデルマ、アスペルギルス、フザリウム、フミコーラ、クリソスポリウム、アカパンカビ、クモノスカビ、ペニシリウムおよびモルティエラは、酵素生成物の下流処理および回収の容易さにより好ましい生産宿主である。適当な宿主は、トリコデルマ・リーゼイ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリザエ、アスペルギルス・ソーエ、アスペルギルス・アワモリまたはアスペルギルス・ジャポニクス、フザリウム・ベネナツムまたはフザリウム・オキシスポルム、フミコーラ・インソレンスまたはフミコーラ・ラヌギノサ、ニューロスポラ・クラッサおよびクリソスポリウム・ルクノウェンセのような種を含み、これらのいくつかは例えば、市販の酵素のＡＭＦＥＰ  ２００７リスト（http://www.amfep.org/list.html）において酵素生産宿主生物として挙げられている。より好ましくは、該酵素は、属トリコデルマまたはアスペルギルス、例えば、トリコデルマ・リーゼイまたはアスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリザエまたはアスペルギルス・アワモリの糸状菌宿主において生産される。本発明の最も好ましい態様において、真菌セリンプロテアーゼ酵素は、トリコデルマ・リーゼイにおいて生産される。
【００８３】
本発明は、また、
（ａ）セリンプロテアーゼ活性を有し、配列番号：１０において記載されているアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは同様の特性を有するその変異体をコードする核酸分子；
（ｂ）配列番号：９において記載されているポリヌクレオチド配列を含む核酸分子；
（ｃ）ＤＳＭ２２６３５に含まれる配列番号：５のポリヌクレオチド配列のコード配列を含む核酸分子；
（ｄ）遺伝子コードの縮重によって、（ｂ）から（ｃ）の核酸分子のポリヌクレオチド配列と異なるポリヌクレオチド配列を含む核酸分子
からなる群から選択される低い温度または中程度の温度範囲でタンパク質性物質の修飾、分解または除去において適用できる真菌セリンプロテアーゼ酵素をコードする単離された核酸分子に関する。
【００８４】
本発明の核酸分子はＲＮＡまたはＤＮＡであってよく、ＤＮＡはゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを構成し得る。
【００８５】
標準分子生物学方法は、本発明の真菌セリンプロテアーゼをコードするポリヌクレオチド配列の単離および酵素処理、例えば、ゲノムおよびプラスミドＤＮＡの単離、ＤＮＡフラグメントを生産するためのＤＮＡの消化、配列決定、大腸菌形質転換などにおいて使用することができる。基本的な方法は、標準分子生物学ハンドブック、例えば、Sambrook and Russell, 2001に記載されている。
【００８６】
Ｔｒ  Ｐｒｂ１ポリペプチドをコードする全長Ｔｒ  ｐｒｂ１遺伝子の単離は、実施例１に記載されている。簡潔には、該遺伝子を、ＰＣＲおよびＤＯＥ  Ｊｏｉｎｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｓｔｒｉｔｕｔｅ（トリコデルマ・リーゼイ  ＱＭ６ａ  ゲノム配列  ｖ２．０、http://genome.jgi-psf.org/cgi-bin/dispGeneModel?db=Trire2&id121495）により公開されているｐｒｂ１遺伝子の配列（ｇｅｎｅ  ＩＤ  １２１４９５）にしたがって設計されたプライマーを使用して単離した。全長Ｔｒ  ｐｒｂ１遺伝子は、受入番号ＤＳＭ２２６３５の下にＤＳＭＺカルチャー・コレクションに大腸菌において寄託されているプラスミドｐＡＬＫ２６５０に含まれていた。セリンプロテアーゼの推定アミノ酸配列をＤＮＡ配列から分析した。
【００８７】
全長トリコデルマ・リーゼイ  セリンプロテアーゼ  Ｔｒ  ｐｒｂ１のヌクレオチド配列（配列番号：５）および推定配列（配列番号：６）を図１Ａ−Ｂに記載する。該遺伝子の長さは１３７１ｂｐ（終始コドンを含む）である。２つの推定イントロンは、それぞれ６８および７３ｂｐの長さを有することを見出した。推定タンパク質配列は、２０個のアミノ酸の予測されるシグナル配列（シグナルＰ  Ｖ３．０；Nielsenら、1997およびNielsen and Krogh, 1998）およびＡｌａ２１からＡｌａ１２１のプロペプチドを含む４０９個のアミノ酸からなる。予測される分子量は成熟ポリペプチドに対して２９ｋＤａであり、予測されるｐＩは８．９４であった。これらの予測は、ＥｘＰＡＳｙサーバーでのＣｏｍｐｕｔｅ  ｐＩ／ＭＷツール（Gasteigerら、2003）を使用して作成された。推定アミノ酸配列は、２つの起こりうるＮ−グリコシル化部位（Ａｓｎ２５２およびＡｓｎ３９６）を含んだが、ＣＢＳ  Ｓｅｒｖｅｒ  ＮｅｔＮＧｌｙｃ  Ｖ１．０によると、Ａｓｎ２５２の１つの部位のみが有望である。公開されているプロテアーゼ配列に対する相同性を、ＮＣＢＩ（全米バイオテクノロジー情報センター）でのＢＬＡＳＴＰ  プログラム、バージョン２．２．２１を使用して検索した（Altschulら、1990）。同種配列の対応する領域に対する成熟Ｔｒ  Ｐｒｂ１配列の同一性値を、ＣｌｕｓｔａｌＷ  アラインメント（Ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＳＵＭ、ギャップオープン：１０、ギャップ伸長：０．５（例えば、www.ebi.ac.uk/Tools/Clustalw）を使用することにより得た。
【００８８】
本発明のセリンプロテアーゼＴｒ  Ｐｒｂ１は、トリコデルマ・ハマツム由来のアルカリプロテアーゼ（ＡＡＰ１５０４４；Steyaertら、2004）、ヒポクレア・リクシイ(Hypocrea lixii)由来のセリンエンドペプチダーゼ（テレオモルフ  トリコデルマ・ハルジアナム；ＣＡＬ２５５８０；Suarezら、2007）、トリコデルマ・アトロビリデ由来のアルカリ性プロテイナーゼ（ＡＬＰ＿ＴＲＩＡＴ；Geremiaら、1993）およびヒポクレア・ビレン(Hypocrea virens)由来の細胞外セリンプロテアーゼ  Ｔｖｓｐ１（AAO63588; Pozoら、2004）と非常に高い相同性（９２−９３％の同一性）を示した。Ｔｒ  Ｐｒｂ１成熟アミノ酸配列とＡＬＰ  プロテアーゼ（ＥＭＢＬ  受入番号  Ｍ８７５１６；Geremiaら、1993；ＵＳ６０／８１８，９１０（Catalyst Bioscience Inc.）において配列番号：３１３のアミノ酸配列として記載されている）の対応する領域との同一性は、９２％であった。
【００８９】
したがって、配列番号：１０に特徴付けられるＴｒ  Ｐｒｂ１  酵素の成熟形態のアミノ酸配列、すなわち配列番号：６の全長セリンプロテアーゼのＡｌａ１２１からＡｌａ４０９のアミノ酸を含む真菌セリンプロテアーゼ酵素またはポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド配列または単離された核酸分子は、本発明の範囲内である。
【００９０】
また、配列番号：１０のアミノ酸配列の天然変異体をコードする単離されたポリヌクレオチド配列を含む。これらの変異体は、欠失、置換、挿入、付加またはそれらの組合せによるアミノ酸配列において少しの変化、例えば、アミノ酸配列において１個以上の位置における変化を含む。しかしながら、これらの変異体は、分子の生物学的機能を変化させない。したがって、該変異体は、特性、すなわち配列番号：１０のアミノ酸配列を有するセリンプロテアーゼの特徴および活性を有する。２つのアミノ酸配列間の同一性は、ほぼ同じ量のアミノ酸を有する対応する配列領域内で互いに比較され得る。例えば、２つのアミノ酸配列の全長または成熟配列の同一性が比較され得る。配列の同一性は、マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ、ギャップオープン：１０、ギャップ伸長：０．５を使用するＣｌｕｓｔａｌＷ  アラインメント（例えば、www.ebi.ac.uk/Tools/Clustalw）を使用することにより測定され得る。２つの配列の同一性は、高い、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは９６％、さらに好ましくは９７％、さらに好ましくは９８％、より好ましくは９９％である。
【００９１】
単離されたポリヌクレオチド配列または単離された核酸分子は、好ましくは配列番号：９に定義されているポリヌクレオチド配列、すなわち配列番号：１０の成熟Ｔｒ  Ｐｒｂ１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む。
【００９２】
本発明の単離された核酸分子は、全長Ｔｒ  ｐｒｂ１遺伝子のヌクレオチド配列を有するＤＳＭ２２６３５に含まれる配列番号：５のポリヌクレオチド配列のコード配列を含む分子であり得る。
【００９３】
本発明の核酸分子は、また、上記に特徴付けられるヌクレオチド配列の類似体であり得る。「縮重」は、１つ以上のヌクレオチドまたはコドンが異なっているが、本発明の組換えプロテアーゼをコードするヌクレオチド配列の類似体を意味する。
【００９４】
したがって、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９において記載されているヌクレオチド配列およびそれらの類似体を含む単離された核酸分子は、本発明の範囲内である。
【００９５】
本発明の１つの好ましい態様において、単離された核酸分子は、洗剤添加物として使用するための真菌セリンプロテアーゼをコードする。
【００９６】
本発明は、また、適当な原核生物または真核生物宿主において選択されたセリンプロテアーゼをコードする核酸配列を増殖または発現させるために使用することができる組換え発現ベクターまたは組換え発現構築物に関する。組換え発現ベクターは、適当な宿主においてセリンプロテアーゼのコード配列の発現および分泌を促進または駆動するＤＮＡまたは核酸配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター（転写および翻訳終結シグナルを含む）、および該セリンプロテアーゼをコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結したシグナル配列を含む。発現ベクターは、形質転換体株の選択のためのマーカー遺伝子をさらに含み得るか、または選択マーカーは、共形質転換により別のベクター構築物において宿主に導入され得る。該調節配列は生産生物と同種または異種であってよく、または、それらはセリンプロテアーゼをコードする遺伝子が単離される生物由来であり得る。
【００９７】
糸状菌宿主において本発明のセリンプロテアーゼを発現するためのプロモーターの例は、アスペルギルス・オリザエ  ＴＡＫＡアミラーゼ、アルカリプロテアーゼ  ＡＬＰおよびトリオースリン酸イソメラーゼ、リゾプス・ミエハイ  リパーゼ、アスペルギルス・ニガーまたはアスペルギルス・アワモリ  グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、フザリウム・オキシスポルム  トリプシン様プロテアーゼ、クリソスポリウム・ルクノウェンセ  セロビオヒドロラーゼ１プロモーター、トリコデルマ・リーゼイ  セロビオヒドロラーゼＩ（Ｃｅｌ７Ａ）などのプロモーターである。
【００９８】
酵母菌において、例えば、サッカロミセス・セレビシエ  エノラーゼ（ＥＮＯ−１）、ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２）および３−ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーターを、発現を提供するために使用することができる。
【００９９】
細菌宿主において本発明のセリンプロテアーゼの転写を駆動するためのプロモーター配列の例は、大腸菌のｌａｃオペロンのプロモーター、ストレプトマイセス・セリカラー  アガラーゼｄａｇＡのプロモーター、バチルス・リケニフォルミス  アルファ−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）のプロモーター、バチルス・ステアロサーモフィルス  マルトース生成アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）のプロモーター、バチルス・サブティリス  ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子のプロモーターなどである。
【０１００】
適当なターミネーターは、上記遺伝子のもの、または宿主株において機能的である他の特徴付けられたあらゆるターミネーター配列を含む。
【０１０１】
適当な形質転換または選択マーカーは、宿主の欠損を補うもの、例えば、バチルス・サブティリスまたはバチルス・リケニフォルミス由来のｄａｌ遺伝子またはアスペルギルス  ａｍｄＳおよびｎｉａＤを含む。選択は、また、抗生物質耐性、例えば、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、フレオマイシンまたはハイグロマイシン耐性を与えるマーカーに基づき得る。
【０１０２】
本発明のセリンプロテアーゼの細胞外分泌が好ましい。したがって、組換えベクターは、選択された宿主において分泌を促進する配列を含む。本発明のセリンプロテアーゼのシグナル配列またはプレ配列またはプレペプチドは、組換え発現ベクターに含まれていてもよく、または、天然シグナル配列は、選択された宿主において分泌を促進することができる別のシグナル配列で置換され得る。したがって、選択されたシグナル配列は、発現宿主に対して同種または異種であり得る。
【０１０３】
適当なシグナル配列の例は、真菌または酵母菌生物のもの、例えば、よく発現される遺伝子由来のシグナル配列である。このようなシグナル配列は、文献からよく知られている。
【０１０４】
組換えベクターは、安定な発現をもたらすために宿主染色体ＤＮＡへのベクターの統合を促進する配列をさらに含み得る。
【０１０５】
本発明のＴｒ  Ｐｒｂ１プロテアーゼは、実施例１に記載されているトリコデルマ・リーゼイ  ｃｂｈ１（ｃｅｌ７Ａ）プロモーター由来のシグナル配列で発現した。トリコデルマ・リーゼイ宿主を形質転換するために使用された発現構築物は、また、形質転換されていない細胞から形質転換体を選択するためにｃｂｈ１ターミネーターおよびａｍｄＳマーカーを含んだ。
【０１０６】
本発明は、また、上記組換え発現ベクターを含む宿主細胞に関する。真菌セリンプロテアーゼ酵素の生産のための適当な宿主は、同種または異種宿主、例えば、細菌、酵母菌および真菌を含む微生物宿主である。植物または哺乳動物細胞における生産系も可能である。
【０１０７】
糸状菌、例えば、トリコデルマ、アスペルギルス、フザリウム、フミコーラ、クリソスポリウム、アカパンカビ、クモノスカビ、ペニシリウムおよびモルティエラは、酵素生成物の下流処理および回収の容易さによって好ましい生産宿主である。適当な発現および生産宿主系は、例えば、糸状菌宿主トリコデルマ・リーゼイ（ＥＰ２４４２３４）、またはアスペルギルス生産系、例えば、アスペルギルス・オリザエまたはアスペルギルス・ニガー（ＷＯ９７０８３２５、ＵＳ５，８４３，７４５、ＵＳ５，７７０，４１８）、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・ソーエおよびアスペルギルス・ジャポニクス型株のために開発された生産系、またはフザリウム、例えば、フザリウム・オキシスポルム（Malardierら、1989）またはフザリウム・ベネナツム、およびアカパンカビ、リゾプス・ミエハイ、モルティエラ・アルピナ、フミコーラ・ラヌギノサまたはフミコーラ・インソレンスまたはクリソスポリウム・ルクノウェンセ（ＵＳ６，５７３，０８６）のために開発された生産系である。酵母菌のために開発された適当な生産系は、サッカロミセス、シゾサッカロミセスまたはメタノール資化酵母のために開発された系である。細菌のために開発された適当な生産系は、バチルス、例えば、バチルス・サブティリス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・アミロリクエファシエンス、大腸菌、または放線菌のストレプトマイのために開発された生産系である。好ましくは、本発明のセリンプロテアーゼは、属トリコデルマまたはアスペルギルス、例えば、トリコデルマ・リーゼイ、またはアスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリザエ、アスペルギルス・ソーエ、アスペルギルス・アワモリまたはアスペルギルス・ジャポニクス型株の糸状菌宿主において生産される。本発明の最も好ましい態様において、真菌セリンプロテアーゼ酵素は、トリコデルマ・リーゼイにおいて生産される。
【０１０８】
宿主は、１つ以上の宿主プロテアーゼの不活性化または除去のいずれかによる、例えば、このような同質または同種プロテアーゼをコードする遺伝子の欠失によるプロテアーゼの除去により同質プロテアーゼを含まなくてもよい。
【０１０９】
本発明は、また、低い温度または中程度の温度での酵素の能力が、好ましくは洗剤添加物としての使用のために好ましい、産業適用においてタンパク質性物質を修飾、分解または除去するために使用するためのポリペプチドを生産するための方法であって、該ポリペプチドはセリンプロテアーゼ活性を有し、該方法は、適当な条件下で本発明のセリンプロテアーゼに対する組換え発現ベクターを有する天然または組換え宿主細胞を培養する工程、所望により該酵素を単離する工程を含む方法に関する。生産培地は、宿主生物を増殖するために適当であり、効率的な発現のための誘導物質を含む培地であり得る。適当な培地は、文献からよく知られている。
【０１１０】
本発明は、好ましくは洗剤添加物として使用するための、低い温度または中程度の温度での適用においてタンパク質性物質を修飾、分解または除去するために使用するためのＴｒ  Ｐｒｂ１  ポリペプチドであって、本発明の核酸分子によってコードされ、上記方法により得ることができるセリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドに関する。好ましくは、該ポリペプチドは、本発明のセリンプロテアーゼに対する組換え発現ベクターを有する宿主細胞を培養することにより得られる組換えプロテアーゼ酵素である。
【０１１１】
本発明の組換え酵素は、２５から３５ｋＤａの分子量を有する。該酵素は、ｐＨ９で３０℃から７０℃の範囲で最適温度を有する。該酵素は、５０℃で少なくともｐＨ６からｐＨ１１のｐＨ範囲で最適ｐＨを有する。最適温度およびｐＨは、１５分の反応時間および基質としてカゼインを使用して決定された。本発明のセリンプロテアーゼは、１０℃から６０℃で洗剤の存在下でタンパク質性の汚点を修飾、分解または除去することができる。
【０１１２】
本発明は、好ましくは洗剤添加物として使用するための、低い温度または中程度の温度での適用においてタンパク質性物質を修飾、分解または除去するために使用するためのポリペプチドを含む酵素調製物を得るための方法であって、該ポリペプチドはセリンプロテアーゼ活性を有し、該方法は、本発明の発現ベクターを有する宿主細胞を培養し、該ポリペプチドを該細胞から回収するか、または培養培地から該細胞を分離して、セリンプロテアーゼ活性を有する上清を得るのいずれかの工程を含む方法にさらに関する。
【０１１３】
本発明は、また、好ましくは洗剤添加物として使用するための、低い温度または中程度の温度での適用においてタンパク質性物質を修飾、分解または除去するために使用するための酵素調製物であって、上記特徴付けられたセリンプロテアーゼ酵素を含む酵素調製物に関する。該酵素調製物または組成物は、セリンプロテアーゼ活性を有し、本発明の方法により得ることができる。好ましくは、該酵素組成物は、本発明の組換え発現ベクターを有する宿主細胞を培養することにより得られる組換えセリンプロテアーゼを含む。
【０１１４】
該酵素調製物は、本発明のセリンプロテアーゼに加えて、異なる型の酵素、例えば、別のプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、キシラナーゼおよび／またはオキシダーゼ、例えば、ラッカーゼまたはペルオキシダーゼをメディエーターと共にまたはメディエーターなしでさらに含み得る。これらの酵素は、処理されるべき材料に存在する炭水化物および油または脂肪を除去することにより、本発明のセリンプロテアーゼの能力を増強することが予期される。該酵素は、宿主株により生産される天然または組換え酵素であり得、または生産プロセス後に培養上清に加えられ得る。
【０１１５】
該酵素調製物は、界面活性剤または表面活性剤、バッファー、防食剤、安定剤、漂白剤、メディエーター、ビルダー、腐食剤、研磨剤および防腐剤、光学的光沢剤、再付着防止剤、色素、顔料などの群から選択される適当な添加物をさらに含み得る。
【０１１６】
界面活性剤は、油脂を乳状化すること、および表面を湿らせることにおいて有用である。界面活性剤は、非イオン、例えば、半極性および／または陰イオンおよび／または陽イオンおよび／または双性イオンであり得る。
【０１１７】
バッファーは、ｐＨを調節するか、または他の成分の能力または安定性に影響するように酵素調製物に加えられ得る。
【０１１８】
適当な安定剤は、ポリオール、例えば、プロピレングリコールまたはグリセロール、糖または糖アルコール、乳酸、ホウ酸またはホウ酸誘導体、ペプチドなどを含む。
【０１１９】
漂白剤は、有機化合物を酸化および分解するために使用される。適当な化学漂白系の例は、過酸発生漂白剤アクチベーター、例えば、テトラアセチルエチレンジアミン、またはあるいはペルオキシ酸塩、例えば、アミド、イミドまたはスルホン型と共に、またはこれらなしで、Ｈ２Ｏ２供給源、例えば、過ホウ酸塩または過炭酸塩である。化学酸化剤は、酸化酵素、例えば、ラッカーゼまたはペルオキシダーゼを使用することにより部分的または完全に置き換えられ得る。多数のラッカーゼは、メディエーターの非存在下で有効に機能しない。
【０１２０】
ビルダーまたは錯化剤は、物質、例えば、ゼオライト、二リン酸塩、三リン酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などを含む。酵素調製物は、１つ以上のポリマー、例えば、カルボキシメチルセルロース、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）などをさらに含み得る。また、軟化剤、腐食剤、他の成分の損傷を防止するための防腐剤、研磨剤および起泡性および粘性を修飾する物質を加えることができる。
【０１２１】
本発明の１つの好ましい態様において、該酵素調製物は、液体、粉末または粒状の形態である。
【０１２２】
本発明の真菌セリンプロテアーゼは、他のプロテアーゼ、特にアルカリプロテアーゼと同様に、洗剤、タンパク質、醸造、食肉、写真、革、乳業および医薬産業において使用され得る（Kalisz, 1988; Raoら、1998）。例えば、それは、繊維性タンパク質廃棄物（例えば、角、羽、爪および髪）を有用なバイオマス、タンパク質濃縮物またはアミノ酸に変換する化学物質の代替物として使用され得る（Anwar and Saleemuddin, 1998）。本発明の真菌セリンプロテアーゼの使用は、他の酵素と同様に、革の質を改善すること、および還元環境汚染を減少すること、ならびにエネルギーを節約することにおける成功を証明することができ、それは、ペプチドの合成およびＤ，Ｌ−アミノ酸の混合物の分離において有用であり得る。火傷および創傷の処置における広範な薬効範囲の抗生物質と組み合わせられたサブチリシンは、医薬産業におけるセリンプロテアーゼの使用の一例であり、したがって、本発明の真菌セリンプロテアーゼは、また、このような使用を見出し得、また、アルカリプロテアーゼのように、外科的器具の血液の除去およびコンタクトレンズまたは義歯の清浄において適用でき得る。コニディオボルス・コロナトゥス由来のアルカリプロテアーゼのように、本発明の真菌セリンプロテアーゼは、動物細胞培養においてトリプシンの代わりに使用され得る。本発明のプロテアーゼは、また、膜の清浄および生物膜の破壊において使用することができる。ベーキングにおいて、該プロテアーゼは、例えば、グルテンネットワークの破壊および食物タンパク質、例えば、ミルク中のタンパク質の加水分解における他の食物適用において使用することができる。それらは、また、例えば、酵母菌を処理すること、溶かすこと（動物の骨からさらなるタンパク質を抽出すること）、新規風味を創造すること、苦味を減少させること、乳化性を変化させること、生物活性ペプチドを産生すること、およびタンパク質のアレルギー誘発性を減少させるにおいて使用することができる。基質は、動物、植物および微生物タンパク質を含む。
【０１２３】
洗剤産業、特に洗濯洗剤産業は、高いｐＨ範囲で活性なプロテアーゼの１つの重要な消費者として現れている（Anwar and Saleemuddin, 1998）。理想的な洗剤プロテアーゼは、食物、草、血液および他の体の分泌物による多種多様の汚点の除去を容易にするように広範な基質特異性を有するべきである。それは、洗剤溶液のｐＨおよびイオン強度、洗浄温度およびｐＨにおいて活性であり、機械処理ならびに洗剤に加えられたキレート化剤および酸化剤に耐えるべきである。プロテアーゼのｐＩは、洗剤溶液のｐＨ付近であるべきである。現在のエネルギー危機および省エネルギーの意識によって、現在、より低い温度でプロテアーゼを使用するのが望ましい。
【０１２４】
本発明は、また、洗剤のための、織物繊維を処理するための、羊毛を処理するための、髪を処理するための、革を処理するための、飼料または食物を処理するための、または、タンパク質性物質の修飾、分解または除去にかかわるあらゆる適用のための、セリンプロテアーゼ酵素または酵素調製物の使用に関する。
【０１２５】
したがって、本発明の１つの好ましい態様は、洗濯洗剤および自動食器洗浄組成物を含む食器洗浄組成物のために有用な洗剤添加物として上記特徴付けられたセリンプロテアーゼ酵素の使用である。
【０１２６】
洗剤は、清浄を助けるか、または清浄特性を有することが意図される物質または材料である。「洗浄力」なる用語は、清浄特性の存在または程度を示す。清浄特性の程度は、固体、不水溶性担体、例えば、織物繊維またはガラスに結合した異なるタンパク質性の、もしくはタンパク質を含む基質物質または汚点もしくは汚点混合物において試験することができる。典型的なタンパク質性物質は、血液、ミルク、インク、卵、草およびソースを含む。試験目的のためのタンパク質性の汚点の混合物は、市販されている。洗剤酵素の機能は、タンパク質含有汚点を分解および除去することである。試験結果は、洗浄試験において使用される汚点の型、洗剤の組成物ならびに織物の性質および状態に依存する（Maurer, 2004）。
【０１２７】
一般的に、プロテアーゼまたは洗浄能力は、汚点物質、例えば、人為的に汚した布きれ(swatch)または試験布における明るさの可視および測定可能な増加または色の変化を意味する「汚点除去効率」または「汚点除去効果」または「清浄特性の程度」として測定される。明るさおよび明度の変化は、例えば、実施例４から７に記載されているＬ＊ａ＊ｂ＊色空間座標を使用して分光光度計で反射率として色を測定することにより測定することができる。プロテアーゼ能力を示すタンパク質性の汚点の退色または除去（汚点除去効率）は、例えば、酵素処理された織物の明度Ｌ＊  マイナス  酵素（酵素ブランクまたはコントロール）を含まない洗浄溶液（バッファーまたは洗剤溶液）で処理された織物の明度Ｌ＊を意味するΔＬ＊として計算される。洗剤の存在は、汚点の除去における酵素の能力を改善し得る。
【０１２８】
本発明のセリンプロテアーゼは、中性およびアルカリ性ｐＨの条件下で、さらに異なる組成物を有する洗剤の非存在または存在下で、種々の種類のタンパク質性の汚点を分解する（実施例４から７に示されているとおり）。該プロテアーゼは、広範な温度範囲、特に低い温度範囲、例えば、１０℃から３０℃でもタンパク質性物質を分解することができる（実施例４、図７）。
【０１２９】
異なる液体洗剤での実施例５に示されるとおり、本発明のＴｒ  Ｐｒｂ１  セリンプロテアーゼは、低い洗浄温度で市販のプロテアーゼ調製物  Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標）  Ｕｌｔｒａ  １６Ｌ、Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標）  ４０００ＬおよびＰｒｏｐｅｒａｓｅ（登録商標）  ４０００Ｅよりもかなり良く、血液／ミルク／インク汚点を除去した。図８は、Ａｒｉｅｌ  ＳｅｎｓｉｔｉｖｅおよびＥｒｉｓａｎ洗剤での結果を示す。図９Ａ−Ｃは、３０℃で異なる用量のベース洗剤での結果を示し、９Ｄ−Ｅは、１０℃および２０℃で３．３ｇ／ｌの洗剤濃度での結果を示す。該酵素調製物を活性単位として投与した
【０１３０】
Ｔｒ  Ｐｒｂ１  プロテアーゼの能力を、また、実施例６に記載されているとおり、４０℃および５０℃で約ｐＨ１０で洗剤粉末において試験した。ポリエステル−綿材料における血液／ミルク／インク標準汚点の除去における酵素の能力をアッセイした。それぞれの酵素調製物を活性単位（μｍｏｌチロシン／分／容量）として投与した。図１０に示されているとおり、本発明のＴｒ  Ｐｒｂ１プロテアーゼは、また、非常にアルカリ性の条件で粉末洗剤に対して適当である。
【０１３１】
トリコデルマ・リーゼイにおいて生産される組換えＴｒ  Ｐｒｂ１酵素調製物の能力を、３０℃で洗浄機でフルスケールにおける液体ベース洗剤の存在下で試験した（実施例７）。副作用を試験するための９つの異なるプロテアーゼ感受性トレーサーは、表５に記載されており、方法条件は、表６に記載されている。試験において使用された酵素用量を、酵素活性および酵素タンパク質の量の両方として計算した。図１１Ａ−Ｉに記載されている結果は、低い温度および短周期洗浄（１５分）でのＴｒ  Ｐｒｂ１の能力が、酵素が活性として投与されたとき、市販のプロテアーゼ調製物Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標）  ４０００Ｌと比較して、全ての試験された汚点でかなり高かったことを示す。また、用量を加えられたタンパク質の量として計算したとき（図１２）、汚点除去効率はＰｕｒａｆｅｃｔ（登録商標）  ４０００Ｌと同程度か、またはわずかに良かった。
【０１３２】
本発明の好ましい態様において、本発明の真菌セリンプロテアーゼは、実施例５から７に示されている液体洗剤および粉末洗剤に有用である。本発明の酵素調製物の酵素は、手動または電動洗濯における使用のために製剤化され得るか、または家庭の硬表面清浄または好ましくは、手動または電動食器洗における使用のために製剤化され得る。
【０１３３】
本明細書は、また、受入番号ＣＢＳ１２４６９７の下にCentraalbureau voor Schimmelculturesで寄託されている株から得ることができるフザリウム・グラミネアラム  ＡＬＫＯ１７２６由来の真菌セリンプロテアーゼを記載している。
【０１３４】
Ｆｇ＿ＡＬＫＯ１７２６酵素の最適温度は、実施例２ｃ、３および８において記載されている１５分の反応時間および基質としてカゼインを使用するｐＨ９で測定されるとき、３０℃から６０℃（５０℃での最大活性の少なくとも３０％）、４０℃から６０℃（最大活性の少なくとも約４０％）、または５０℃（Ｆｇ＿ＡＬＫＯ１７２６の最大活性）であった。
【０１３５】
Ｆｇ＿ＡＬＫＯ１７２６  セリンプロテアーゼ酵素は、実施例２ｃおよび実施例３および８において記載されている１５分の反応時間および基質としてカゼインを使用する５０℃でｐＨ９で最大活性の少なくとも５０％を示す少なくともｐＨ６からｐＨ１１のｐＨ範囲で最適ｐＨを有する。最大活性の少なくとも約６０％は、ｐＨ７からｐＨ１０で示した。本発明のＦｇ＿ＡＬＫＯ１７２６酵素の予測されるｐＩはｐＩ９．３であった。
【０１３６】
洗剤の存在下で、Ｆｇ＿ＡＬＫＯ１７２６酵素は、１０℃から６０℃で、好ましくは５０℃以下で機能した。該酵素は、また、４５℃以下、４０℃以下、３５℃以下、または３０℃以下の温度でも機能する。
【０１３７】
フザリウム・グラミネアラム  セリンプロテアーゼは、配列番号：１６に定義されている成熟Ｆｇ＿ＡＬＫＯ１７２６酵素のアミノ酸配列を含む。成熟セリンプロテアーゼは、配列番号：１２において特徴付けられる全長プロテアーゼのＡｌａ１２３からＡｌａ４１１のアミノ酸を含む。Ｆｇ＿ＡＬＫＯ１７２６  プロテアーゼのプロ酵素形態のアミノ酸配列は、配列番号：１４において定義される。
【０１３８】
Ｆｇ＿ＡＬＫＯ１７２６  セリンプロテアーゼ酵素は、Ｆｇ＿ＡＬＫＯ１７２６全長酵素（配列番号：１２）をコードする配列番号：１１のヌクレオチド配列、またはＦｇ＿ＡＬＫＯ１７２６プロ酵素形態（配列番号：１４）をコードする配列番号：１３のヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされるか、またはそれは、成熟Ｆｇ＿ＡＬＫＯ１７２６ポリペプチド（配列番号：１６）をコードする配列番号：１５のヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされ得る。
【０１３９】
Ｆｇ＿ＡＬＫＯ１７２６  セリンプロテアーゼをコードするＦｇ  ｐｒｔＳ８Ａ遺伝子を、ＰＣＲおよび実施例１に記載されている配列ＸＭ＿３８３４９１に特異的なプライマーにより単離した。全長Ｆｇ  ｐｒｔＳ８Ａ遺伝子は、受入番号ＤＳＭ２２６３６の下にＤＳＭＺカルチャー・コレクションに大腸菌ＲＦ８０９８において寄託されているプラスミドｐＡＬＫ２７０７に含まれていた。セリンプロテアーゼの推定アミノ酸配列をＤＮＡ配列から分析した。
【０１４０】
全長Ｆｇ  ｐｒｔＳ８Ａのヌクレオチド配列（配列番号：１１）および推定配列（配列番号：１２）を図２Ａ−Ｂに記載する。該遺伝子の長さは１２９２ｂｐ（終始コドンを含む）である。１つの推定イントロンは、５６ｂｐの長さを有することを見出した。推定タンパク質配列は、２０個のアミノ酸の予測されるシグナル配列（シグナルＰ  Ｖ３．０；Nielsenら、1997およびNielsen and Krogh, 1998）およびＡｌａ２１からＡｌａ１２３のプロペプチドを含む４１１個のアミノ酸からなる。予測される分子量は成熟ポリペプチドに対して２９ｋＤａであり、予測されるｐＩは９．３０であった。これらの予測は、ＥｘＰＡＳｙサーバーでのＣｏｍｐｕｔｅ  ｐＩ／ＭＷツール（Gasteigerら、2003）を使用して作成された。推定アミノ酸配列は、３つの起こりうるＮ−グリコシル化部位（Ａｓｎ７７、Ａｓｎ２５４およびＡｓｎ３９８）を含んだが、ＣＢＳ  Ｓｅｒｖｅｒ  ＮｅｔＮＧｌｙｃ  Ｖ１．０によると、Ａｓｎ７７（プロ配列に位置する）の１つの部位のみが有望である。公開されているプロテアーゼ配列に対する相同性を、ＮＣＢＩ（全米バイオテクノロジー情報センター）でのＢＬＡＳＴＰ  プログラム、バージョン２．２．２１を使用して検索した（Altschulら、1990）。同種配列の対応する領域に対する成熟  Ｆｇ＿ＡＬＫＯ１７２６配列の同一性値を、ＣｌｕｓｔａｌＷ  アラインメント（Ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＳＵＭ、ギャップオープン：１０、ギャップ伸長：０．５（例えば、www.ebi.ac.uk/Tools/Clustalw）を使用することにより得た。
【０１４１】
ジベレラ・ゼアエ  仮想的タンパク質ＸＰ＿３８３４９１とＦｇ＿ＡＬＫＯ１７２６配列の同一性は９９％であった。成熟ポリペプチドのアミノ酸配列における２つの違いは、アミノ酸１８８がＦｇ＿ＡＬＫＯ１７２６においてＳｅｒおよびＸＰ＿３８３４９１においてＡｌａであり、アミノ酸２８９がＦｇ＿ＡＬＫＯ１７２６においてＰｈｅおよびＸＰ＿３８３４９１においてＬｅｕであることを見出した。Ｆｇ＿ＡＬＫＯ１７２６成熟配列は、トリコデルマ・ハマツム由来のアルカリプロテアーゼ（ＡＡＰ１５０４４；Steyaertら、2004）、ヒポクレア・リクシイ由来のセリンエンドペプチダーゼ（テレオモルフ  トリコデルマ・ハルジアナム；ＣＡＬ２５５８０；Suarezら、2007）、トリコデルマ・アトロビリデ由来のアルカリ性プロテイナーゼ（ＡＬＰ＿ＴＲＩＡＴ；Geremiaら、1993）およびヒポクレア・ビレン由来の細胞外セリンプロテアーゼ  Ｔｖｓｐ１（AAO63588; Pozoら、2004）と７２から７８％の同一性を示した。Ｆｇ＿ＡＬＫＯ１７２６成熟アミノ酸配列とＡＬＰプロテアーゼ（ＥＭＢＬ  受入番号  Ｍ８７５１６；Geremiaら、1993；ＵＳ６０／８１８，９１０（Catalyst Bioscience Inc.）において配列番号：３１３のアミノ酸配列として記載されている）の対応する領域との同一性は、７６％であった。Ｔｒ  Ｐｒｂ１とＦｇ＿ＡＬＫＯ１７２６成熟配列の同一性は７６％であった。
【０１４２】
Ｆｇ＿ＡＬＫＯ１７２６プロテアーゼを含む酵素調製物を、実施例２において記載されているトリコデルマ・リーゼイ  ｃｂｈ１（ｃｅｌ７Ａ）プロモーターのコントロール下でトリコデルマ・リーゼイにおいて生産した。実験室規模バイオリアクター培養から消費された培養培地を、界面活性剤を用いるか、または用いない洗濯洗浄におけるＦｇ＿ＡＬＫＯ１７２６の能力の試験において使用した。実施例４−６において示されているとおり、異なる試験条件下で、Ｆｇ＿ＡＬＫＯ１７２６  セリンプロテアーゼ調製物の能力は、市販のプロテアーゼ調製物  Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標）Ｕｌｔｒａ  １６Ｌ、Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標）４０００ＬまたはＰｒｏｐｅｒａｓｅ（登録商標）４０００Ｅと同程度か、またはわずかに良かった。しかしながら、汚点除去効果は、本発明のＴｒ  Ｐｒｂ１セリンプロテアーゼを含む酵素調製物よりも低かった。
【実施例】
【０１４３】
実施例１．トリコデルマ・リーゼイ  ＱＭ６ａ  ｐｒｂ１（Ｔｒ  ｐｒｂ１）およびフザリウム・グラミネアラム  ＡＬＫＯ１７２６  Ｆｇ  ｐｒｔＳ８Ａ  プロテアーゼ遺伝子のクローニング
（ａ）ＤＮＡの単離および使用される分子生物学方法
標準分子生物学方法を、ＤＮＡの単離および酵素処理（例えば、プラスミドＤＮＡの単離、ＤＮＡフラグメントを生産するためのＤＮＡの消化）、大腸菌形質転換、配列決定などにおいて使用した。使用される基本的な方法は、酵素、試薬もしくはキット製造業者により記載されているか、または標準分子生物学ハンドブック、例えば、Sambrook and Russell (2001)に記載されているとおりであった。トリコデルマ・リーゼイ  ＱＭ６ａおよびフザリウム・グラミネアラム  ＡＬＫＯ１７２６からのゲノムＤＮＡの単離は、Raeder and Broda (1985)に記載されているとおりに行った。フェノール抽出段階は、ＰｈａｓｅＬｏｃｋチューブ(Eppendorf, Germany)を使用して行った。
【０１４４】
（ｂ）遺伝子クローニングのためのオリゴヌクレオチドプライマー
Ｔｒ  ｐｒｂ１およびＦｇ  ｐｒｔＳ８Ａ遺伝子を、鋳型としてトリコデルマ・リーゼイ  ＱＭ６ａおよびフザリウム・グラミネアラム  ＡＬＫＯ１７２６のゲノムＤＮＡ調製物を使用してＰＣＲによりクローニングした。Ｔｒ  ｐｒｂ１遺伝子をクローニングするためのＰＣＲプライマーを、ＤＯＥ  Ｊｏｉｎｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにより公開されているｐｒｂ１の配列（ＩＤ  １２１４９５）にしたがって設計した（トリコデルマ・リーゼイ  ＱＭ６ａ  Ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｖ２．０、http://genome.jgi-psf.org/Trire2/Trire2.home.html）。Ｆｇ  ｐｒｔＳ８Ａ遺伝子をクローニングするためのＰＣＲプライマーを、ＥＭＢＬデータベースに以前に公開されている配列ＸＭ＿３８３４９１にしたがって設計し、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｚｅａｅ  ＰＨ−１（アナモルフ：フザリウム・グラミネアラム）から得た。ＸＭ＿３８３４９１は、仮想的タンパク質ＥＡＡ７１０５９をコードする部分的ｍＲＮＡとしてデータベースに挙げられている。Ｔｒ  ｐｒｂ１およびＦｇ  ｐｒｔＳ８Ａ遺伝子のクローニングにおいて使用されるプライマーの配列は表１に示されている。５’−ＰＣＲプライマー  ＰＲＯ２１３およびＰＲＯ２４５は、それぞれ、Ｔｒ  ｐｒｂ１およびＦｇ  ｐｒｔＳ８Ａ遺伝子配列（それぞれＡＴＧを含む２６および２７ヌクレオチド）の最初に融合したｃｂｈ１プロモーター配列の末端（ＳａｃＩＩサイトから）を含む（５’から３’方向）。加えて、プライマーは、ＳａｃＩＩサイトからＰＣＲ産物の開裂を保証し、全長ｃｂｈ１プロモーターのＳａｃＩＩサイトへの遺伝子の正確な融合を可能にするために、５’末端に３つ（ＰＲＯ２１３）または２つ（ＰＲＯ２４５）のさらなるヌクレオチドを含んだ。３’−ＰＣＲプライマーＰＲＯ２１４およびＰＲＯ２４６は、（５’から３’方向）、それぞれＢａｍＨＩサイトおよびＴｒ  ｐｒｂ１およびＦｇ  ｐｒｔＳ８Ａ遺伝子の末端を含んだ（それぞれ、終始コドンを含む２６または２５ヌクレオチド）。加えて、リンカーを介してｃｂｈ１ターミネーターに遺伝子を融合することにおいて使用されるＢａｍＨＩサイトから開裂を保証するために、５’末端にＰＲＯ２１４は３つ、ＰＲＯ２４６は２つのさらなるヌクレオチドを含んだ。
表１．Ｔｒ  ｐｒｂ１およびＦｇ  ｐｒｔＳ８Ａ遺伝子のクローニングにおけるＰＣＲプライマーとして使用したオリゴヌクレオチド（配列番号：１−４）。プライマー、それらの対応する配列番号、および配列（５’→３’）を示す。Ｔｒ  ｐｒｂ１およびＦｇ  ｐｒｔＳ８Ａ遺伝子由来の配列は太字である。
【表１】
0006054741.tif 000002
【０１４５】
（ｃ）ＰＣＲ反応
トリコデルマ・リーゼイ  ＱＭ６ａおよびフザリウム・グラミネアラム  ＡＬＫＯ１７２６（ＣＢＳ  １２４６９７）ゲノムＤＮＡをＰＣＲ反応における鋳型として使用した。ＰＣＲ反応混合物は、１ＸＰｈｕｓｉｏｎ  ＨＦ  バッファー（Finnzymes, Finland）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、０．５ｍＭのそれぞれのプライマーおよび０．５単位のＰｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（Finnzymes, Finland）および約０．５−１ｍｇのゲノムＤＮＡ／５０μｌ反応容量を含んだ。ＰＣＲ反応の条件は以下のとおりである：３０秒９８℃最初の変性、次に１０秒９８℃、３０秒４９．４、５４．７および６０．２℃（Ｔｒ  ｐｒｂ１）または５４．４、５９．５および６４．８℃（Ｆｇ  ｐｒｔＳ８Ａ）アニーリング、１分７２℃伸長を２５サイクルならびに７２℃７分最終伸長。それぞれ〜１．４および〜１．３ｋｂの（公開されている配列に基づく計算にしたがって）予期されたサイズを有するＤＮＡ産物を、プライマー組合せＰＲＯ２１３（配列番号：１）とＰＲＯ２１４（配列番号：２）およびＰＲＯ２４５（配列番号：３）とＰＲＯ２４６（配列番号：４）を使用する反応から得た。ＤＮＡ産物をＰＣＲ反応混合物から単離し、精製した。それらをＳａｃＩＩおよびＢａｍＨＩを使用して開裂し、ＳａｃＩＩおよびＢａｍＨＩで開裂されたｐＡＬＫ１９１０ベクターにライゲートした。ｐＡＬＫ１９１０は、ｃｂｈ１プロモーターおよびターミネーターに対する遺伝子のライゲーション（〜０．６ｋｂ、ＳＴＯＰからＡｖａＩＩサイト）を可能にする〜２．２ｋｂのｃｂｈ１プロモーター（ＳａｃＩＩサイトに対する）およびリンカー（例えば、ＢａｍＨＩサイトを含む）を含む。２つの別々のトリコデルマ・リーゼイＰＣＲ反応からの産物を配列決定し、互いにおよびＤＯＥ  Ｊｏｉｎｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにより公開されている配列と同一であることを見出した。また、２つの別々のフザリウム・グラミネアラム  ＰＣＲ反応からの産物を配列決定し、互いに同一であることを見出した。ｃｂｈ１プロモーターおよびターミネーターに融合されたＴｒ  ｐｒｂ１およびＦｇ  ｐｒｔＳ８Ａ遺伝子を含むプラスミドをそれぞれｐＡＬＫ２６５０およびｐＡＬＫ２７０７と命名した。プラスミドｐＡＬＫ２６５０およびｐＡＬＫ２７０７を含む大腸菌株ＲＦ８０５２およびＲＦ８０９８を、それぞれ受入番号ＤＳＭ２２６３５およびＤＳＭ２２６３６の下にＤＳＭコレクションに寄託した。発現カセットｐＡＬＫ２７０１（Ｔｒ  ｐｒｂ１）およびｐＡＬＫ２７０８（Ｆｇ  ｐｒｔＳ８Ａ）を、実施例２に記載されているとおり、これらのプラスミドからさらに構築した。
【０１４６】
（ｄ）Ｔｒ  Ｐｒｂ１およびＦｇ＿ＡＬＫＯ１７２６  プロテアーゼをコードする遺伝子ならびに推定アミノ酸配列の特徴付け
Ｔｒ  ｐｒｂ１配列（配列番号：５）および推定アミノ酸配列（配列番号：６）は、図１Ａ−Ｂに示されている。遺伝子の長さは１３７１ｂｐである（終始コドンを含む）。該遺伝子は、６８および７３ｂｐの２つのイントロンを含む。推定アミノ酸配列は、２０個のアミノ酸の予測されるシグナル配列を含む４０９個のアミノ酸からなる（http://genome.jgi-psf.org/Trire2/Trire2.home.htmlおよびシグナルＰ  Ｖ３．０；Nielsenら、1997およびNielsen and Krogh, 1998）。予測される分子量は、成熟ポリペプチドに対して２９０６２．２１Ｄａであり、予測されるｐＩは８．９４であった。これらの予測は、ＥｘＰＡＳｙサーバーでのＣｏｍｐｕｔｅ  ｐＩ／ＭＷツールを使用して行った（Gasteigerら、2003）。推定アミノ酸配列は、アミノ酸位置Ａｓｎ２５２およびＡｓｎ３９６での２つの可能性のあるＮ−グリコシル化部位を含むが（図１）、ＣＢＳ  Ｓｅｒｖｅｒ  ＮｅｔＮＧｌｙｃ  Ｖ１．０によると、可能性のあるＮ−グリコシル化部位として位置Ａｓｎ２５２での部位のみを予測する。
【０１４７】
Ｆｇ  ｐｒｔＳ８Ａ配列（配列番号：１１）および推定アミノ酸配列（配列番号：１２）は、図２Ａ−Ｂに示されている。遺伝子の長さは１２９２ｂｐである（終始コドンを含む）。該遺伝子は、５６ｂｐの１つの推定イントロンを含む（Gurrら、1987によると、真菌イントロンのものによる５’および３’境界配列）。推定アミノ酸配列は、２０個のアミノ酸の予測されるシグナル配列を含む４１１個のアミノ酸からなる（シグナルＰ  Ｖ３．０；Nielsenら、1997およびNielsen and Krogh, 1998）。予測される分子量は、成熟ポリペプチドに対して２８９３５．９８Ｄａであり、予測されるｐＩは９．３０であった。これらの予測は、ＥｘＰＡＳｙサーバーでのＣｏｍｐｕｔｅ  ｐＩ／ＭＷツールを使用して行った（Gasteigerら、2003）。推定アミノ酸配列は、アミノ酸位置Ａｓｎ７７、Ａｓｎ２５４およびＡｓｎ３９８での３つの可能性のあるＮ−グリコシル化部位を含むが（図２）、ＣＢＳ  Ｓｅｒｖｅｒ  ＮｅｔＮＧｌｙｃ  Ｖ１．０によると、可能性のあるＮ−グリコシル化部位として位置Ａｓｎ７７での部位のみを予測する。
【０１４８】
（ｅ）相同性、同一性およびアラインメント試験
公開されているプロテアーゼ配列（ＷＧＳプロジェクトからの環境サンプルを除く非冗長  ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ＋ＰＤＢ＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ＋ＰＩＲ＋ＰＲＦ）と成熟Ｔｒ  Ｐｒｂ１およびＦｇ＿ＡＬＫＯ１７２６タンパク質をコードする配列の相同性を、ＮＣＢＩの（全米バイオテクノロジー情報センター）タンパク質ＢＬＡＳＴＸ  プログラム  バージョン２．２．２１をデフォルトセッティング（Altschulら、1990）で使用して検索した（Altschulら、1990）。Ｔｒ  Ｐｒｂ１に対して非常に高い相同性（９２−９３％）は、以下のとおりであった：トリコデルマ・ハルジアナム(harzianum)由来のアルカリ性プロテイナーゼ（ＡＡＰ１５０４４；Steyaertら、2004）、ヒポクレア・リクシイ(Hypocrea lixii)由来のセリンエンドペプチダーゼ（トリコデルマ・ハルジアナム(harzianum)；ＣＡＬ２５５８０；Suarezら、2007）、トリコデルマ・アトロビリデ由来のアルカリ性プロテイナーゼ（ＡＬＰ＿ＴＲＩＡＴ；Geremiaら、1993）およびヒポクレア・ビレン由来の細胞外セリンプロテアーゼＴｖｓｐ１（ＡＡＯ６３５８８；Pozoら、2004）。ジベレラ・ゼアエ（フザリウム・グラミネアラム）ＸＰ＿３８３４９１配列由来の仮想的タンパク質とＦｇ＿ＡＬＫＯ１７２６の同一性は、９９％であった。２つのみの違いを上記２つの成熟アミノ酸配列のアミノ酸配列において検出した（アミノ酸１８８は、Ｆｇ＿ＡＬＫＯ１７２６においてＳｅｒおよびＸＰ＿３８３４９１においてＡｌａであり、アミノ酸２８９は、Ｆｇ＿ＡＬＫＯ１７２６においてＰｈｅおよびＸＰ＿３８３４９１においてＬｅｕである）。Ｆｇ＿ＡＬＫＯ１７２６に対する次の密接なホモログは、Ｔｒ  Ｐｒｂ１ホモログであることを見出した（上記参照）。これらの配列に関してＦｇ＿ＡＬＫＯ１７２６成熟配列の同一性は、７４から７８％であった。また、相同性は、配列番号：３１３として特許出願ＵＳ６０／８１８，９１０（Catalyst Bioscience Inc.）に含まれている配列に見出された。Ｆｅ＿ＲＦ６３１８配列を上記同種配列とアラインした。成熟配列領域およびＣｌｕｓｔａｌＷ  アラインメント（www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw；Ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＳＵＭ、ギャップオープン：１０、ギャップ伸長：０．５）を使用することにより得られるＴｒ  ＰｒｂおよびＦｇ＿ＡＬＫＯ１７２６とこの配列の同一性値は、９２％（Ｔｒ  Ｐｒｂ１）および７６％（Ｆｇ＿ＡＬＫＯ１７２６）であった。Ｔｒ  Ｐｒｂ１とＦｇ＿ＡＬＫＯ１７２６の同一性は、上記ＣｌｕｓｔａｌＷ  アラインメントを使用して７６％であった。
【０１４９】
実施例２．トリコデルマ・リーゼイにおける組換えＴｒ  Ｐｒｂ１およびＦｇ＿ＡＬＫＯ１７２６プロテアーゼの生産
（ａ）発現カセットの調製およびトリコデルマ・リーゼイへのそれらの形質転換
発現プラスミドｐＡＬＫ２７０１（Ｔｒ  ｐｒｂ１）およびｐＡＬＫ２７０８（Ｆｇ  ｐｒｔＳ８Ａ）を、トリコデルマ・リーゼイにおける組換えＴｒ  Ｐｒｂ１およびＦｇ＿ＡＬＫＯ１７２６タンパク質の生産のために、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）マーカー遺伝子をプラスミドｐＡＬＫ２６５０およびｐＡＬＫ２７０７（実施例１ｃ）にそれぞれライゲートすることにより構築した。ａｍｄＳマーカーをｃｂｈ１ターミネーター後に発現構築物にライゲートした。類似の構築物は、例えば、Paloheimoら、(2003)に記載されている。発現カセットｐＡＬＫ２７０１およびｐＡＬＫ２７０８（図３および４）において、自らのシグナル配列を有するＴｒ  ｐｒｂ１およびＦｇ  ｐｒｔＳ８Ａ遺伝子をＰＣＲによりトリコデルマ・リーゼイ  ｃｂｈ１（ｃｅｌ７Ａ）プロモーターに正確に融合する。遺伝子の３’末端をＰＣＲにおいて終始コドン後に創造されたＢａｍＨＩ部位を使用してｃｂｈ１ターミネーターに融合する。これは、ｃｂｈ１ターミネーター配列前に、構築物中の元のターミネーターに置かれていない。〜８．７ｋｂの直線的発現カセット（図３および４に示されている）は、ＮｏｔＩ消化を使用するベクター骨格から単離され、トリコデルマ・リーゼイ  プロトプラストを形質転換するために使用した。使用された宿主株は、４つの主要なトリコデルマ・リーゼイ  セルラーゼ（ＣＢＨＩ、ＣＢＨＩＩ、ＥＧＩおよびＥＧＩＩ）のいずれも生産しない。形質転換を、Karhunenら、(1993)に記載されている修飾でPenttilaら、(1987)のとおりに行った。形質転換体を単一の分生子を介して選択プレート上で精製し、ＰＤ上でそれらを胞子形成した。
【０１５０】
（ｂ）振とうフラスコおよび実験室規模バイオリアクターにおけるプロテアーゼ生産
形質転換体の選択を、ＰＤスラントから５％のＫＨ２ＰＯ４でｐＨ６．０で緩衝された５０ｍｌの複合ラクトースをベースとしたセルラーゼ誘導培地（Joutsjokiら、1993）を含む振とうフラスコに植菌した。形質転換体のプロテアーゼ生産を、７日間３０℃で２５０ｒｐｍで培養後に培養上清から分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて、Ｔｒ  Ｐｒｂ１および組換えＦｇ＿ＡＬＫＯ１７２６プロテアーゼの予測された分子量に対応する約２９ｋＤａの主要なタンパク質バンドを、消費された培養上清から検出した。プロテアーゼ活性を、実施例２ｃまたは８に記載されている基質としてカゼインを使用して培養上清からアッセイした。宿主と比較して明らかに増加したプロテアーゼ活性を検出した。発現カセットの真菌ゲノムへの統合を、いくつかのゲノム消化物を含み、それぞれの発現カセットをプローブとして使用したサザンブロット分析を使用することにより、選択された形質転換体から確認した。
【０１５１】
振とうフラスコ培養において非常に良いプロテアーゼ活性を生産するトリコデルマ・リーゼイ形質転換体を、実験室規模バイオリアクターにおける培養のために選択した。セルラーゼ誘導複合培地を培養において使用した。培養から得られた消費された培養培地を適用試験（実施例４−７）において、およびＴｒ  Ｐｒｂ１および組換えＦｇ＿ＡＬＫＯ１７２６プロテアーゼの精製およびさらなる特徴付けのための出発物質として使用した。
【０１５２】
（ｃ）プロテアーゼ活性アッセイ
プロテアーゼ活性を、カゼイン  Ｆｏｌｉｎ−Ｃｉｏｃａｌｔｅａｕ方法によりアッセイした。プロテアーゼによるカゼイン分解速度を、時間の関数として酸−可溶性フラグメントの放出の分光光度のモニタリングにより測定した。アッセイにおいて使用されるカゼイン基質は、以下のとおりに調製した：６ｇのＣａｓｅｉｎ  Ｈａｍｍｅｒｓｔｅｉｎ  Ｇｒａｄｅ  ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、ＬＬＣ（１０１２８９）を５００ｍｌの１００ｍＭのＴｒｉｓ、２０μＭのＣａＣｌ２、７μＭのＭｇＣｌ２、２５μＭのＮａＨＣＯ３に溶解した。基質溶液のｐＨをＨＣｌで９．０に調節した。酵素反応を、１０００ｍｌの蒸留水中に０．１１ＭのＴＣＡ、０．２２Ｍの酢酸ナトリウム、０．３３Ｍの酢酸、０．５ＭのＮａ２ＣＯ３を含むＴＣＡ溶液を使用して停止した。アッセイにおいて使用されるＦｏｌｉｎ試薬を、２５ｍｌの２ＮのＦｏｌｉｎ−Ｃｉｏｃａｌｔｅｕのフェノール試薬（ＳＩＧＭＡ、Ｆ  ９２５２）を１００ｍｌに蒸留水により希釈することにより調製した。最初に所定の温度で５分間２．５ｍｌの基質溶液をインキュベートすることにより反応を開始し、その後、０．５ｍｌの酵素溶液を加え、反応を１５分（温度またはｐＨプロフィールの決定のために）または３０分間行った。１５分または３０分反応後に、２．５ｍｌの反応停止溶液を加え、内容物を混合し、３０分室温で放置した。チューブを４０００ｒｐｍで１０分間遠心した（Hettich Rotanta 460）。１ｍｌの透明な上清をピペットに取り、２．５ｍｌの０．５ＭのＮａ２ＣＯ３および０．５ｍｌの希釈されたＦｏｌｉｎ試薬と混合した。５分（色発生）待った後、混合物の吸光度（色）を酵素ブランクに対して６６０ｎｍで測定した。酵素ブランクを次のとおりに調製した：０．５ｍｌの酵素溶液を２．５ｍｌの停止溶液および２．５ｍｌの基質と混合し、混合物を所定の温度で１５分または３０分間インキュベートした。酵素活性の１単位を、１μｇチロシン／ｍｌ（またはｇ）反応混合物／分に対応する酸可溶性タンパク質加水分解産物を遊離させる酵素量として定義した。
【０１５３】
実施例３．組換えＴｒ  Ｐｒｂ１およびＦｇ＿ＡＬＫＯ１７２６プロテアーゼの精製および特徴付け
細胞および固体を、３０分、５００００ｇで＋４℃で遠心分離（Sorvall RC6 plus）により、発酵から得られた消費された培養培地（実施例２）から除去した。１５ｍｌの上清をプロテアーゼの精製のために使用した。全ての精製工程は寒い部屋で行った。遠心分離後、サンプルを０．４４μｍのフィルター（MILLEX HV Millipore）を介して濾過し、２０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．８で平衡にしたＨｉＰｒｅｐ  ２６／１０  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  カラム（GE Healthcare）に付した。ゲル濾過されたサンプルを、２０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．８で平衡にした２０ｍＬのＱセファロース  ＦＦ  カラム（GE Healthcare）に付した。タンパク質分解活性を有する流入画分をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  遠心濾過機  １００００  ＭＷＣＯ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃縮した。濃縮されたサンプルをＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００  ＧＬ  カラム（GE Healthcare）に付し、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ  ｐＨ６，８で溶離した。画分を含むプロテアーゼを合わせ、ｐＨおよび温度プロフィールの特徴付けのために使用した。
【０１５４】
温度プロフィール
Ｔｒ  Ｐｒｂ１およびＦｇ＿ＡＬＫＯ１７２６プロテアーゼに対する温度プロフィールを、１５分の反応時間を使用して実施例２ｃまたは８に記載されているアッセイおよび０．１１ＭのＴＣＡ停止溶液を使用することにより、ｐＨ９で分析した。結果は図５Ａ（Ｔｒ  Ｐｒｂ１）および５Ｂ（Ｆｇ＿ＡＬＫＯ１７２６）に示されている。両方のプロテアーゼは、約５０℃で最適温度を有する。
【０１５５】
ｐＨプロフィール
プロテアーゼのｐＨプロフィールを、実施例２ｃまたは８に記載されているとおり基質としてカゼインおよび１５分の反応時間を使用して５０℃で決定した。反応のｐＨを４０ｍＭのＢｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎバッファーを使用してｐＨ６−１２に調節した。０．１１ＭのＴＣＡ停止溶液は、０．２２Ｍの酢酸ナトリウムおよび０．３３Ｍの酢酸を含んだ。結果は図６Ａ（Ｔｒ  Ｐｒｂ１）および６Ｂ（Ｆｇ＿ＡＬＫＯ１７２６）に示されている。両方のプロテアーゼは、広範なｐＨ領域において活性であった。Ｔｒ  Ｐｒｂ１は、ｐＨ６からｐＨ１０で８５％を越える相対活性を示す。Ｔｒ  Ｐｒｂ１の最適ｐＨは広範であり、測定において使用される条件下でｐＨ６からｐＨ９の最大活性の少なくとも９５％を有する。
【０１５６】
実施例４．異なる温度でｐＨ９バッファーでの組換えタンパク質Ｔｒ  Ｐｒｂ１およびＦｇ＿ＡＬＫＯ１７２６の能力
トリコデルマにおいて生産された組換えタンパク質Ｔｒ  Ｐｒｂ１およびＦｇ＿ＡＬＫＯ１７２６（実施例２に記載されている）を、それぞれ１０−６０℃または２０−４０℃の温度で血液／ミルク／インク標準汚点（Ａｒｔ．１１７、ポリエステル＋綿、EMPA Testmaterialen AG, Switzerland）を除去する能力について試験した。市販のプロテアーゼ調製物Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標）  Ｕｌｔｒａ  １６  Ｌ（Novozymes）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標）  ４０００  Ｌ（Genencor International）およびＰｒｏｐｅｒａｓｅ（登録商標）  ４０００  Ｅ（Genencor International）および酵素なしの処理（コントロール）を比較のために使用した。汚れた織物を、最初に、１．５ｃｍ×１．５ｃｍの布きれ(swatch)に切り、角を切ることにより丸くした。一片をマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ  １５０２００）のウェルに置いた。２ｃｍの直径を有するそれぞれのウェルに、グリシン−ＮａＯＨバッファー  ｐＨ９中の１．５ｍｌの酵素希釈物を、織物の上に加えた。それぞれの酵素を、１．５ｍｌのバッファーあたり０、０．２、０．４、０．８、１．６、４および８活性単位（μｍｏｌチロシン／分）で投与した。活性を、実施例２（ｃ）または８に記載されている３０分の反応時間を使用して測定した。測定はｐＨ８．５および０．１１ＭのＴＣＡを含む停止溶液で行った。希釈されたＦｏｌｉｎ試薬の添加後に色発生のために１０分インキュベーションの時間を使用した。サンプルを有するマイクロタイタープレートを、１０−６０℃／２０−４０℃で６０分１２５ｒｐｍで水平震盪器においてインキュベートした。その後、布きれを流水（約洗浄温度）下で注意深く濯ぎ、日光に対して保護された格子上で屋内空気で一晩乾燥させた。
【０１５７】
汚点除去効果を、Ｌ＊ａ＊ｂ＊  色空間座標（ｉｌｌｕｍｉｎａｎｔ  Ｄ６５／２°）を使用してＭｉｎｏｌｔａ  ＣＭ  ２５００  分光光度計で反射率として色を測定することにより評価した。布きれの両サイドの色を、処理後に測定した。それぞれの値は、織物の両サイドから測定された少なくとも２つのパラレルな織物サンプルの平均であった。プロテアーゼ能力を示す血液／ミルク／インク汚点の退色（汚点除去効率）を、酵素処理された織物の明度Ｌ＊  マイナス  酵素なし（酵素ブランク、コントロール）の洗浄溶液（バッファー）で処理された織物の明度Ｌ＊を意味するΔＬ＊として計算した。
【０１５８】
結果は、図７Ａ−Ｆに示されている。Ｔｒ  Ｐｒｂ１プロテアーゼ調製物は、市販のプロテアーゼ調製物Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標）  Ｕｌｔｒａ  １６Ｌ、Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標）  ４０００ＬおよびＰｒｏｐｅｒａｓｅ（登録商標）  ４０００Ｅと比較して、ｐＨ９バッファー中で１０から６０℃の全温度範囲、とりわけ１０−３０℃のような低い洗浄温度で高い汚点除去能力を示した。Ｆｇ＿ＡＬＫＯ１７２６プロテアーゼ調製物は、２０−４０℃でプロテアーゼ調製物Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標）  Ｕｌｔｒａ  １６ＬおよびＰｕｒａｆｅｃｔ（登録商標）  ４０００Ｌよりもわずかに良かった。
【０１５９】
実施例５．低い温度での異なる液体洗剤との組換えタンパク質Ｔｒ  Ｐｒｂ１およびＦｇ＿ＡＬＫＯ１７２６の能力
トリコデルマにおいて生産された組換えタンパク質Ｔｒ  Ｐｒｂ１およびＦｇ＿ＡＬＫＯ１７２６（実施例２に記載されている）を、３０℃で異なる液体洗剤を含む血液／ミルク／インク標準汚点（Ａｒｔ．１１７、綿＋ポリエステル、ＥＭＰＡ）を除去する能力について試験した。２５％の洗浄活性な物質、ポリオールおよびポリマーを含む色付き織物用の液体ベース洗剤（ｐＨ＞８．０）（表２）を、１−５ｇ／ｌの濃度で使用し、酵素を含まない市販の洗剤Ａｒｉｅｌ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ（ｐＨ＞８．０、Procter & Gamble, UK、表３）およびＥｒｉｓａｎ（ｐＨ＞９．０、Farmos, Finland、表４）を３．３ｇ／ｌの濃度で使用した。市販のプロテアーゼ調製物Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標）  Ｕｌｔｒａ  １６Ｌ、Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標）  ４０００Ｌ、Ｐｒｏｐｅｒａｓｅ（登録商標）  ４０００Ｅおよび酵素なしの処理（コントロール）を比較のために使用した。Ｔｒ  Ｐｒｂ１を、また、１０および２０℃でベース洗剤（３．３ｇ／ｌ）を使用して試験した。それぞれの酵素を１ｍｌの洗浄液あたり０、０．２、０．４、０．８、１．６、４および８活性単位（μｍｏｌチロシン／分）で投与した。活性を、実施例４に記載されているとおりに測定した。それぞれの実験において、洗浄溶液あたりの市販の酵素の少なくとも２つの用量は、洗剤酵素に対する典型的な経済的使用レベルである洗剤の重量当たり約０．２−０．５％の酵素調製物の用量と等しかった。
表２．色付き織物用の液体ベース洗剤の組成
【表２】
0006054741.tif 000003
表３．Ａｒｉｅｌ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅの組成
【表３】
0006054741.tif 000004
表４．デリケートなおよび色付き織物用のＥｒｉｓａｎ洗剤の組成
【表４】
0006054741.tif 000005
１、３．３または５ｇの量の液体洗剤を１リットルの水道水（ｄＨ≦４）に溶解し、磁気撹拌棒でよく混合し、３０℃に加減した。洗浄液におけるｐＨは、洗剤濃度に依存して、ベース洗剤で約７．３−７．５またはＡｒｉｅｌで約７．９およびＥｒｉｓａｎで約８．２であった。汚れた織物を実施例４に記載されているように一片に切った。布きれをマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ  １５０２００）のウェルに置き、水中（６０μｌ未満）に洗剤および酵素希釈物を含む１．５ｍｌの洗浄液を、織物の上に加えた。サンプルを有するプレートを、３０℃で６０分１２５ｒｐｍで水平震盪器においてインキュベートした。その後、布きれを流水（約洗浄温度）下で注意深く／完全に濯ぎ、日光に対して保護された格子上で屋内空気で一晩乾燥させた。ベース洗剤での試験を、また、３．３ｇ／ｌの洗剤濃度を使用して、１０℃および２０℃で同じ方法で行った。
【０１６０】
処理後の布きれの色を、Ｌ＊ａ＊ｂ＊  色空間座標を使用してＭｉｎｏｌｔａ  ＣＭ  ２５００  分光光度計で測定し、汚点除去効果を実施例４に記載されているΔＬ＊として計算した。酵素なしの処理（酵素ブランク）のために、対応する洗剤溶液を洗浄溶液として使用した。
【０１６１】
３０℃でＡｒｉｅｌ  ＳｅｎｓｉｔｉｖｅおよびＥｒｉｓａｎで得られる結果を図８ＡおよびＢに示す。３０℃で異なる洗剤濃度を使用して色付き織物に対するベース洗剤で得られた結果を図９Ａ−Ｃに示し、１０℃および２０℃で３．３ｇ／ｌの洗剤濃度で得られた結果を図９ＤおよびＥに示す。血液／ミルク／インク汚点におけるＴｒ  Ｐｒｂ１の効率は、同じ量の活性を投与したとき、３０℃で全ての洗剤および全ての洗剤濃度で市販の調製物Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標）  Ｕｌｔｒａ  １６Ｌ、Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標）  ４０００ＬおよびＰｒｏｐｅｒａｓｅ（登録商標）  ４０００Ｅと比較してかなり高かった。Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標）  ４０００ＬおよびＰｒｏｐｅｒａｓｅ（登録商標）  ４０００Ｅと比較してＴｒ  Ｐｒｂ１の能力は、非常に低い温度（１０℃および２０℃）でとりわけ顕著に高かった。これらの試験の結果は、Ｔｒ  Ｐｒｂ１プロテアーゼが低い洗浄温度で液体洗剤と共に優れた能力を有することを示す。また、Ｆｇ＿ＡＬＫＯ１７２６調製物は、３０℃で少なくとも上記市販のプロテアーゼ調製物と同程度に良かった。
【０１６２】
実施例６．４０−５０℃およびｐＨ１０での洗剤粉末との組換えタンパク質Ｔｒ  Ｐｒｂ１およびＦｇ＿ＡＬＫＯ１７２６の能力
トリコデルマにおいて生産された組換えタンパク質Ｔｒ  Ｐｒｂ１およびＦｇ＿ＡＬＫＯ１７２６調製物（実施例２に記載されている）を、４０℃および５０℃（ｐＨ約１０）で参照洗剤を含むリン酸塩の存在下で血液／ミルク／インク標準汚点を除去する能力について試験した。標準汚点Ａｒｔ．１１７（血液／ミルク／インク、ポリエステル＋綿、ＥＭＰＡ）を試験物質として使用した。市販のプロテアーゼ  Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標）  ４０００Ｌ、Ｐｒｏｐｅｒａｓｅ（登録商標）  ４０００Ｅおよび酵素なしの処理（コントロール）を、比較のために使用した。それぞれの酵素を、１ｍｌの洗浄溶液あたり０、０．２、０．４、０．８、１．６、４および８活性単位（μｍｏｌチロシン／分）で投与した。活性を、実施例４に記載されているとおりに測定した。
【０１６３】
光学的光沢剤（Ａｒｔ．  ６０１、ＥＭＰＡ）なしでＥＣＥ  参照洗剤  ７７を含む３．３ｇの量のリン酸塩を、１リットルの水道水（ｄＨ≦４）に溶解し、磁気撹拌棒でよく混合し、４０℃／５０℃に加減した。汚れた織物を実施例４に記載されているように一片に切った。布きれをマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ  １５０２００）のウェルに置き、水中（６０μｌ未満）に洗剤および酵素希釈物を含む１．５ｍｌの洗浄液を、織物の上に加えた。サンプルを有するプレートを、４０℃／５０℃で６０分１２５ｒｐｍで水平震盪器においてインキュベートした。その後、布きれを流水（約４５℃）下で注意深く／完全に濯ぎ、日光に対して保護された格子上で屋内空気で一晩乾燥させた。
【０１６４】
処理後の布きれの色を、Ｌ＊ａ＊ｂ＊  色空間座標を使用してＭｉｎｏｌｔａ  ＣＭ  ２５００  分光光度計で測定し、汚点除去効果を実施例４に記載されているΔＬ＊として計算した。酵素なしの処理（酵素ブランク）のために、洗剤溶液を洗浄液として使用した。
【０１６５】
結果（図１０ＡおよびＢ）は、プロテアーゼＴｒ  Ｐｒｂ１およびＦｇ＿ＡＬＫＯ１７２６が、また、非常にアルカリ性条件で粉末洗剤と共に適当であることを示した。
【０１６６】
実施例７．３０℃でのフルスケール試験における液体中の洗濯洗剤中の組換えタンパク質  Ｔｒ  Ｐｒｂ１の能力の評価
トリコデルマにおいて生産された組換えタンパク質  Ｔｒ  Ｐｒｂ１調製物（実施例２に記載されている）の能力を、３０℃で短い洗浄時間（１５分）を使用して洗濯機におけるフルスケールでの液体洗剤中で試験し、市販のプロテアーゼ調製物Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標）  ４０００Ｌおよび酵素なしの洗剤での処理と比較した。実施例８に記載されている色付き織物用の液体ベース洗剤および９つの異なるプロテアーゼ感受性トレーサー（表５）を使用した。トレーサーはＥＭＰＡ  Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｅｎ  ＡＧ、Ｓｗｉｚｅｒｌａｎｄ  ＣＦＴ（Center For Testmaterials BV, The Netherlands）由来であった。汚れた布きれ、約１０ｃｍ×１０ｃｍを枕カバーに縫いつけた。方法パラメーターおよび条件は、表６に記載されている。試験において使用された酵素用量を、酵素活性（１ｍｌ洗浄液あたり約０−１４活性単位）およびタンパク質量（１リットル洗浄液あたり約０−４ｍｇ）の両方として計算した。Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標）  ４０００Ｌを、洗剤重量の０．５、０．７５および１％で投与した。プロテアーゼ活性を、実施例４に記載されているとおりに測定した。酵素調製物由来のタンパク質の量を、標準としてウシガンマグロブリン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用するＢｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイ（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA）により測定した。
【０１６７】
温度を４０℃の代わりに３０℃にすることを除いて、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  標準  ＥＮ  ＩＳＯ  ６３３０：２０００に記載されているＮｏ．５Ａとの同様の洗浄手順を使用した。プロテアーゼ感受性布きれを日光に対して保護された格子上で屋内空気で一晩乾燥させ、充填物質を回転乾燥させた。
表５．試験において使用されたプロテアーゼ感受性トレーサー
【表５】
0006054741.tif 000006
表６．方法パラメーターおよび条件
【表６】
0006054741.tif 000007
【０１６８】
汚点除去効果を、Ｌ＊ａ＊ｂ＊  色空間座標（ｉｌｌｕｍｉｎａｎｔ  Ｄ６５／２°）を使用してＭｉｎｏｌｔａ  ＣＭ  ２５００  分光光度計で反射率として色を測定することにより評価した。布きれの両サイドの色を、処理後に測定した。それぞれの値は約１２の測定の平均であった（それぞれのサイドから６つ）。ＥＭＰＡの汚点において、値は２つの布きれの測定の平均値であった。プロテアーゼ能力を示す汚点の退色（汚点除去効率）を、酵素処理された織物の明度Ｌ＊  マイナス  洗剤のみで処理された織物の明度Ｌ＊を意味するΔＬ＊として計算した。処理前の汚れた布きれの色も測定したが、布きれが均質であったため、その値は計算に含まなかった（全ての汚点でＬ＊値＜０．２単位の標準偏差値）。
【０１６９】
結果は、図１１Ａ−Ｉに示されている。低い温度および短周期洗浄（１５分）でのＴｒ  Ｐｒｂ１の能力は、プロテアーゼが活性量として投与されたとき、市販のプロテアーゼ調製物Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標）  ４０００Ｌと比較して、全ての試験された汚点でかなり高かった。また、用量を加えられたタンパク質の量として計算したとき（図１２ＡおよびＢ）、全タンパク質の測定が最適化されていない発酵から得られたＴｒ  Ｐｒｂ１調製物に有利でないにもかかわらず、Ｔｒ  Ｐｒｂ１の汚点除去効率はＰｕｒａｆｅｃｔ（登録商標）  ４０００Ｌと同程度か、またはわずかに良かった。
【０１７０】
酵素用量がＴｒ  Ｐｒｂ１に対して約２単位およびＰｕｒａｆｅｃｔ（登録商標）  ４０００Ｌに対して約１４単位の１ｍｌあたりの活性単位に対応する、１リットルの洗浄溶液あたり１．９ｍｇのタンパク質であるとき、Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標）  ４０００Ｌと比較して同様の、またはわずかに良い汚点除去効率が、より長い洗浄時間（６０分）を使用するＴｒ  Ｐｒｂ１でも得られた。
【０１７１】
実施例８．プロテアーゼ活性アッセイＩＩ
プロテアーゼ活性を基質としてカゼインを使用するカゼインＦｏｌｉｎ−Ｃｉｏｃａｌｔｅａｕ方法によりアッセイした。プロテアーゼによるカゼイン分解速度を、時間の関数として酸−可溶性フラグメントの放出の分光光度のモニタリングにより測定した。アッセイにおいて使用されるカゼイン基質は、以下のとおりに調製した：６ｇのＣａｓｅｉｎ  Ｈａｍｍｅｒｓｔｅｉｎ  Ｇｒａｄｅ  ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、ＬＬＣ（１０１２８９）を５００ｍｌの３０ｍＭのＴｒｉｓ、２．０ｍＭのＣａＣｌ２、０．７ｍＭのＭｇＣｌ２、２．５ｍＭのＮａＨＣＯ３に溶解した。基質溶液のｐＨを８．５に調節した。酵素反応を、０．１１ＭのＴＣＡ溶液を使用して停止した。アッセイにおいて使用されるＦｏｌｉｎ試薬を、２５ｍｌの２ＮのＦｏｌｉｎ−Ｃｉｏｃａｌｔｅｕのフェノール試薬（ＳＩＧＭＡ、Ｆ  ９２５２）を１００ｍｌに蒸留水により希釈することにより調製した。最初に５０℃で５分間２．５ｍｌの基質溶液をインキュベートすることにより反応を開始し、その後、０．５ｍｌの酵素溶液を加え、反応を１５分（温度およびｐＨプロフィールの決定のため）または３０分間行った。１５分または３０分反応後に、２．５ｍｌの反応停止溶液を加え、内容物を混合し、３０分室温で放置した。チューブを４０００ｒｐｍで１０分間遠心した（Hettich Rotanta 460）。１ｍｌの透明な上清を２．５ｍｌの０．５ＭのＮａ２ＣＯ３および０．５ｍｌの希釈されたＦｏｌｉｎ試薬と混合した。少なくとも５分（色発生）待った後、混合物の吸光度（色）を酵素ブランクに対して６６０ｎｍで測定した。酵素ブランクを次のとおりに調製した：０．５ｍｌの酵素溶液を２．５ｍｌの停止溶液および２．５ｍｌの基質と混合し、混合物を５０℃で１５分または３０分間インキュベートした。酵素活性の１単位を、１μｇチロシン／ｍｌ（またはｇ）反応混合物／分に対応する酸可溶性タンパク質加水分解産物を遊離させる酵素量として定義した。
【０１７２】
参考文献
【表７】
0006054741.tif 000008
【０１７３】
【表８】
0006054741.tif 000009
【０１７４】
【表９】
0006054741.tif 000010
【０１７５】
【表１０】
0006054741.tif 000011
【０１７６】
【表１１】
0006054741.tif 000012
【０１７７】
【表１２】
0006054741.tif 000013
【図１Ａ】
0006054741.tif 000014
【図１Ｂ】
0006054741.tif 000015
【図２Ａ】
0006054741.tif 000016
【図２Ｂ】
0006054741.tif 000017
【図３】
0006054741.tif 000018
【図４】
0006054741.tif 000019
【図５】
0006054741.tif 000020
【図６】
0006054741.tif 000021
【図７−１】
0006054741.tif 000022
【図７−２】
0006054741.tif 000023
【図７−３】
0006054741.tif 000024
【図８】
0006054741.tif 000025
【図９−１】
0006054741.tif 000026
【図９−２】
0006054741.tif 000027
【図９−３】
0006054741.tif 000028
【図１０−１】
0006054741.tif 000029
【図１０−２】
0006054741.tif 000030
【図１１−１】
0006054741.tif 000031
【図１１−２】
0006054741.tif 000032
【図１１−３】
0006054741.tif 000033
【図１１−４】
0006054741.tif 000034
【図１１−５】
0006054741.tif 000035
【図１２】
0006054741.tif 000036
【配列表】
0006054741000001.app