(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体医薬品組成物の無菌試験のための方法であって、該方法は：
ａ）ろ過性の医薬品組成物を提供する工程；
ｂ）該医薬品組成物をろ過して、該医薬品組成物のろ取物が堆積した少なくとも３枚のフィルターメンブランを提供する工程；
ｃ）該少なくとも３枚のフィルターメンブランを、固体培地へ置いて、少なくとも３つのろ取物培養物を産生する工程；
ｄ）
ｉ）少なくとも１つのろ取物培養物を好気性条件下において２０℃〜２５℃で；
ｉｉ）少なくとも１つのろ取物培養物を好気性条件下において３０℃〜３５℃で；および
iii)少なくとも１つのろ取物培養物を嫌気性条件下において３０℃〜３５℃で、
培養する工程であって、ただし、該ろ取物培養物のいずれも１３日間より長い期間培養しない、工程；ならびに
ｅ）フィルターメンブランにおける生存微生物細胞、ミクロコロニーまたはコロニーを検出する工程であって、ここで該フィルターメンブランにおける生存微生物細胞、ミクロコロニーまたはコロニーの存在は、該医薬品組成物における生存微生物の存在を示す、工程、を含む方法。
【請求項２】
工程ｂ）が、前記医薬品組成物をろ過した後に、洗浄溶液をろ過する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記フィルターメンブランが、ポリフッ化ビニリデンメンブラン、グラスファイバーメンブラン、ポリカーボネートメンブラン、ポリエチレンテレフタラートメンブラン、混合セルロースエステル（酢酸セルロースおよび硝酸セルロース）、ホスホセルロースメンブラン、ＤＥＡＥメンブラン、ナイロンメッシュメンブラン、またはポリテトラフルオロエチレン（ｐｏｌｙｔｅｔｒａｆｌｕｒｏｅｔｈｙｌｅｎｅ）メンブランである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記フィルターメンブランが０．４５μｍの孔径を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記固体培地が、ＦＴＭ−Ａ（１．０７５％の寒天を含む液状チオグリコール酸培地（最終的な濃度））、ＢＨＩ（ブレインハートインフュージョン寒天培地）、Ｄｉｆｃｏ  ｂｒｅｗｅｒ嫌気性寒天培地、Ｒ２Ａ寒天培地、Ｓｃｈａｅｄｌｅｒ血液寒天培地、Ｃａｓｏ−寒天培地ＩＣＲ（トリプティックソイ寒天培地）、Ｃｏｌｕｍｂｉａ寒天培地５％血液、およびＣＤＣ嫌気性血液寒天培地からなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
工程d)において、前記ろ取物培養物を、検出可能な量のATPの産生に十分な期間、培養する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ろ取物培養物を、２日間〜７日間の期間、培養する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
工程e)において、生存微生物細胞、ミクロコロニー、またはコロニーを、発光アッセイを用いて検出する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記発光アッセイが、前記フィルターメンブランにおける生存微生物細胞、ミクロコロニー、またはコロニーによって産生されるアデノシン３リン酸（ＡＴＰ）を検出する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記発光アッセイが、ルシフェラーゼアッセイを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記発光アッセイが、プローブおよび微生物に対して内因性である核酸の間に形成される核酸ハイブリダイゼーション産物を検出する、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記発光アッセイが、ペルオキシダーゼ反応を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
発光を、電荷結合素子カメラおよび画像分析ソフトウェアを用いて検出する、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記生存微生物細胞、生存微生物ミクロコロニー、または生存微生物コロニーを数える、請求項８〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記医薬品組成物が、液体組成物である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記液体組成物が、非経口組成物、経口組成物、鼻用組成物、または眼用組成物である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記液体組成物が、ワクチンである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記ワクチンが、炭疽ワクチン;結核ワクチン;ボレリア症ワクチン;ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドワクチン;ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドおよび百日咳ワクチン;ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドおよび無細胞百日咳（ｐｅｒｕｓｓｉｓ）ワクチン;ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドおよび無細胞百日咳およびインフルエンザ菌ｂ型結合型ワクチン;ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドおよび無細胞百日咳およびインフルエンザ菌ｂ型結合型およびポリオウイルス不活化ワクチン;Ａ型肝炎ウイルスワクチン;Ａ型肝炎ウイルスおよびB型肝炎ウイルスワクチン;B型肝炎ウイルスワクチン;ヘリコバクターピロリワクチン;インフルエンザ菌ｂ型ワクチン;インフルエンザウイルスワクチン;ポリオウイルスワクチン;髄膜炎菌（ナイセリア・メニンギティディス）ワクチン;麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、風疹ウイルスワクチン;麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、風疹ウイルスおよび水痘ウイルスワクチン;肺炎球菌（ストレプトコッカス・ニューモニエ）ワクチン;狂犬病ワクチン;呼吸器合胞体ウイルスワクチン;天然痘ワクチン;トキソプラズマ症（トキソプラズマ・ゴンディ（ｔｏｘｏｐｌａｓｍ  ｇｏｎｄｉｉ））ワクチン;腸チフス（サルモネラ・チフィ）ワクチン;結核（マイコバクテリウム・ツベルクローシス）ワクチン;および水痘（水痘、水痘帯状疱疹ウイルス）ワクチンからなる群より選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ワクチンが、鳥インフルエンザワクチンまたはブタインフルエンザワクチンである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
液体医薬品組成物の無菌試験のための方法であって、該方法は：
ａ）ろ過性の医薬品組成物を提供する工程；
ｂ）該医薬品組成物をろ過して、該医薬品組成物のろ取物が堆積した少なくとも３枚のフィルターメンブランを提供する工程；
ｃ）該少なくとも３枚のフィルターメンブランを固体培地へ置いて、少なくとも３つのろ取物培養物を産生する工程；
ｄ）
ｉ）少なくとも１つのろ取物培養物を好気性条件下において２０℃〜２５℃で；
ｉｉ）少なくとも１つのろ取物培養物を好気性条件下において３０℃〜３５℃で；および
ｉｉｉ）少なくとも１つのろ取物培養物を嫌気性条件下において３０℃〜３５℃で、
培養する工程であって、ただし、該ろ取物培養物のいずれも１３日間より長い期間培養しない、工程；ならびに
ｅ）該フィルターメンブランにおいてアデノシン３リン酸（ＡＴＰ）を検出する工程であって、ここでフィルターメンブランにおけるＡＴＰの存在は、該医薬品組成物中の生存微生物の存在を示す、工程、を含む方法。
【請求項２１】
無菌医薬品組成物を調製するための方法であって、該医薬品組成物は、生存微生物についてスクリーニングされ、無菌性が、以下：
ａ）ろ過性の医薬品組成物を提供する工程；
ｂ）該医薬品組成物をろ過して、該医薬品組成物のろ取物が堆積した少なくとも３枚のフィルターメンブランを提供する工程；
ｃ）該少なくとも３枚のフィルターメンブランを、固体培地へ置いて、少なくとも３つのろ取物培養物を産生する工程；
ｄ）
ｉ）少なくとも１つのろ取物培養物を好気性条件下において２０℃〜２５℃で；
ｉｉ）少なくとも１つのろ取物培養物を好気性条件下において３０℃〜３５℃で；および
iii)少なくとも１つのろ取物培養物を嫌気性条件下において３０℃〜３５℃で、
培養する工程であって、ただし、該ろ取物培養物のいずれも１３日間より長い期間培養しない、工程；ならびに
ｅ）
（ｉ）フィルターメンブランにおける生存微生物細胞、ミクロコロニーまたはコロニーを検出する工程であって、ここで該フィルターメンブランにおける生存微生物細胞、ミクロコロニーまたはコロニーの存在は、該医薬品組成物における生存微生物の存在を示す、工程、あるいは
（ｉｉ）該フィルターメンブランにおけるアデノシン３リン酸（ＡＴＰ）を検出する工程であって、ここでフィルターメンブランにおけるＡＴＰの存在は、該医薬品組成物中の生存微生物の存在を示す、工程
を含む、該医薬品組成物中の生存微生物を検出するための方法を使用して確認される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２００９年５月４日に出願された米国仮出願第６１／１７５，２７１号の利益を主張する。上記出願の教示全体は、参考として本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
米国における連邦規制および他の国における同様の規制は、医薬品製品が実質的に細菌および真菌のような微生物を含まないことを保証するための無菌試験を必要とする。３つの一般的な方法、直接転移無菌試験、メンブランろ過無菌試験および製品フラッシュ無菌試験を使用して、そのような無菌試験を行なっている。伝統的な無菌試験を、２つの液体栄養培地（２０℃〜２５℃でインキュベートしたトリプティックソイブロス（ＴＢＳ）および３０℃〜３５℃でインキュベートしたチオグリコール酸栄養培地（ＦＴＭ））、およびすすぎ洗い用流体を用いて行い、そして１４日間のインキュベーション時間を必要とする（例えばＵＳＰ＜７１＞「Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ  Ｔｅｓｔｓ」、Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ  Ｆｏｒｕｍ．ＵＳＰ３０−ＮＦ２５からＦｉｒｓｔ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．まで、ＥＰ２．１．６「Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ」（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｉｅａ  ２．１．６「Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ」ＥＰ第６版（２００７））および他の関連する薬局方を参照のこと）。液状チオグリコール酸培地（ＦＴＭ）は、２相を含む−液体培地の下部の相は嫌気性相であり、上部相は好気性インキュベーションのための酸素を含む。
【０００３】
一般的に、メンブランろ過法を用いて医薬品製品の無菌性を試験するために、液体の、乳化した、または溶解した医薬品または医療製品（例えば活性成分、非経口処方物、点眼薬、鼻腔内スプレー等）を、孔径０．４５ミクロンのメンブランを通してろ過し、そしてそのメンブランを適当な試験培地（ＦＴＭおよびＴＳＢ）へ移し、そして１４日間インキュベートする。もし微生物が培養物中で増殖するなら、その医薬品製品は無菌ではなく、そして微生物学的同定のためにサンプルを取り得る。インキュベーションのために、およびまた培養物中で増殖する生物についての微生物学的同定のために多くの時間を要することは、不利益であり、かつその必要のある患者に対する医薬品製品の利用可能性を制限し得る。例えば、医療危機の場合に、１４日間のインキュベーション期間を必要とする現在の無菌試験は、その危機を抑制または終息させ得る薬剤またはワクチンの利用可能性を遅延し得る。従って、迅速な無菌試験法のニーズが存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、ａ）ろ過性の医薬品組成物を提供する工程；ｂ）その医薬品組成物をろ過して、その医薬品組成物のろ取物（ｆｉｌｔｒａｎｄ）が堆積した少なくとも３枚のフィルターメンブランを提供する工程；ｃ）その少なくとも３枚のフィルターメンブランを、固体培地へ置いて、少なくとも３つのろ取物培養物（ｆｉｌｔｒａｎｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ）を産生する工程；ｄ）そのろ取物培養物を約１３日間より長い期間培養しないという条件で、ｉ）少なくとも１つのろ取物培養物を好気性条件下において２０℃〜２５℃で；ｉｉ）少なくとも１つのろ取物培養物を好気性条件下において３０℃〜３５℃で；および少なくとも１つのろ取物培養物を嫌気性条件下において３０℃〜３５℃で培養する工程；およびｅ）メンブランにおいて生存微生物細胞、ミクロコロニーまたはコロニーを検出する工程であって、ここでメンブランにおける生存微生物細胞、ミクロコロニーまたはコロニーの存在は、その医薬品組成物における生存微生物の存在を示す工程、を含む、医薬品組成物において生存微生物を検出するための方法に関連する。
【０００５】
本方法はさらに、その医薬品組成物をろ過した後に、洗浄溶液をろ過する工程を含み得る。
【０００６】
いくつかの実施態様において、そのメンブランは、ポリフッ化ビニリデンメンブラン、グラスファイバーメンブラン、ポリカーボネートメンブラン、ポリエチレンテレフタラートメンブラン、混合セルロースエステル（酢酸セルロースおよび硝酸セルロース）、ホスホセルロースメンブラン、ＤＥＡＥメンブラン、ナイロンメッシュメンブラン、またはポリテトラフルオロエチレン（ｐｏｌｙｔｅｔｒａｆｌｕｒｏｅｔｈｙｌｅｎｅ）メンブランである。好ましくは、そのメンブランは約０．４５μｍの孔径を有する。
【０００７】
その固体培地を、ＦＴＭ−Ａ（１．０７５％の寒天を含む液状チオグリコール酸培地（最終濃度））、ＢＨＩ（ブレインハートインフュージョン寒天培地）、Ｄｉｆｃｏ  ｂｒｅｗｅｒ嫌気性寒天培地、Ｒ２Ａ寒天培地、Ｓｃｈａｅｄｌｅｒ血液寒天培地、Ｃａｓｏ−寒天培地ＩＣＲ（トリプティックソイ寒天培地）、Ｃｏｌｕｍｂｉａ寒天培地５％血液、およびＣＤＣ嫌気性血液寒天培地から成る群から選択され得る。
【０００８】
いくつかの実施態様において、本方法は、約２から約７日間の期間、ろ取物培養物を培養する工程を含み得る。
【０００９】
いくつかの実施態様において、生存微生物細胞、ミクロコロニー、またはコロニーを、メンブランにおいて生存微生物細胞、ミクロコロニー、またはコロニーが産生するアデノシン３リン酸（ＡＴＰ）を検出する生物発光アッセイのような、発光アッセイを用いて検出する。その発光アッセイは、ルシフェラーゼアッセイを含み得る。
【００１０】
いくつかの実施態様において、その発光アッセイはプローブおよび微生物に対して内因性である核酸の間に形成される核酸ハイブリダイゼーション産物を検出する。その発光アッセイは、ペルオキシダーゼ反応を含み得る。
【００１１】
いくつかの実施態様において、その発光を、電荷結合素子カメラおよび画像分析ソフトウェアを用いて検出し得る。いくつかの実施態様において、生存微生物細胞、生存微生物ミクロコロニー、または生存微生物コロニーの数を、定量または測定し得る。
【００１２】
いくつかの実施態様において、その医薬品組成物は、液体組成物である。その液体組成物は、非経口組成物、経口組成物、鼻用組成物、眼用組成物、またはワクチンであり得る。
【００１３】
本発明はまた、ａ）ろ過性の医薬品組成物を提供する工程；ｂ）その医薬品組成物をろ過して、医薬品組成物のろ取物が堆積した少なくとも３枚のフィルターメンブランを提供する工程；ｃ）少なくとも３枚のフィルターメンブランを固体培地へ置いて、少なくとも３つのろ取物培養物を産生する工程；ｄ）そのろ取物培養物を約１３日間より長い期間培養しないという条件で、ｉ）少なくとも１つのろ取物培養物を好気性条件下において２０℃〜２５℃で；ｉｉ）少なくとも１つのろ取物培養物を好気性条件下において３０℃〜３５℃で；およびｉｉｉ）少なくとも１つのろ取物培養物を嫌気性条件下において３０℃〜３５℃で培養する工程；およびｅ）メンブランにおいてアデノシン３リン酸（ＡＴＰ）を検出する工程であって、ここでメンブランにおけるＡＴＰの存在は、その医薬品組成物における生存微生物の存在を示す工程、を含む、医薬品組成物において生存微生物を検出するための方法に関連する。
本願は一実施形態において例えば以下の項目を提供する：
（項目１）
医薬品組成物中の生存微生物を検出するための方法であって、該方法は：
ａ）ろ過性の医薬品組成物を提供する工程；
ｂ）該医薬品組成物をろ過して、該医薬品組成物のろ取物が堆積した少なくとも３枚のフィルターメンブランを提供する工程；
ｃ）該少なくとも３枚のフィルターメンブランを、固体培地へ置いて、少なくとも３つのろ取物培養物を産生する工程；
ｄ）
ｉ）少なくとも１つのろ取物培養物を好気性条件下において２０℃〜２５℃で；
ｉｉ）少なくとも１つのろ取物培養物を好気性条件下において３０℃〜３５℃で；および
iii)少なくとも１つのろ取物培養物を嫌気性条件下において３０℃〜３５℃で、
培養する工程であって、ただし、該ろ取物培養物のいずれも約１３日間より長い期間培養しない、工程；ならびに
ｅ）メンブランにおける生存微生物細胞、ミクロコロニーまたはコロニーを検出する工程であって、ここで該メンブランにおける生存微生物細胞、ミクロコロニーまたはコロニーの存在は、該医薬品組成物における生存微生物の存在を示す、工程、を含む方法。
（項目２）
工程ｂ）が、前記医薬品組成物をろ過した後に、洗浄溶液をろ過する工程をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記メンブランが、ポリフッ化ビニリデンメンブラン、グラスファイバーメンブラン、ポリカーボネートメンブラン、ポリエチレンテレフタラートメンブラン、混合セルロースエステル（酢酸セルロースおよび硝酸セルロース）、ホスホセルロースメンブラン、ＤＥＡＥメンブラン、ナイロンメッシュメンブラン、またはポリテトラフルオロエチレン（ｐｏｌｙｔｅｔｒａｆｌｕｒｏｅｔｈｙｌｅｎｅ）メンブランである、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記メンブランが約０．４５μｍの孔径を有する、前述の項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
前記固体培地が、ＦＴＭ−Ａ（１．０７５％の寒天を含む液状チオグリコール酸培地（最終的な濃度））、ＢＨＩ（ブレインハートインフュージョン寒天培地）、Ｄｉｆｃｏ  ｂｒｅｗｅｒ嫌気性寒天培地、Ｒ２Ａ寒天培地、Ｓｃｈａｅｄｌｅｒ血液寒天培地、Ｃａｓｏ−寒天培地ＩＣＲ（トリプティックソイ寒天培地）、Ｃｏｌｕｍｂｉａ寒天培地５％血液、およびＣＤＣ嫌気性血液寒天培地からなる群より選択される、前述の項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
工程d)において、前記ろ取物培養物を、検出可能な量のATPの産生に十分な期間、培養する、前述の項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記ろ取物培養物を、約２日間〜約７日間の期間、培養する、項目６に記載の方法。
（項目８）
工程e)において、生存微生物細胞、ミクロコロニー、またはコロニーを、発光アッセイを用いて検出する、前述の項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記発光アッセイが、前記メンブランにおける生存微生物細胞、ミクロコロニー、またはコロニーによって産生されるアデノシン３リン酸（ＡＴＰ）を検出する、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記発光アッセイが、ルシフェラーゼアッセイを含む、項目８に記載の方法。
（項目１１）
前記発光アッセイが、プローブおよび微生物に対して内因性である核酸の間に形成される核酸ハイブリダイゼーション産物を検出する、項目８に記載の方法。
（項目１２）
前記発光アッセイが、ペルオキシダーゼ反応を含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
発光を、電荷結合素子カメラおよび画像分析ソフトウェアを用いて検出する、項目８〜１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記生存微生物細胞、生存微生物ミクロコロニー、または生存微生物コロニーを数える、項目８〜１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記医薬品組成物が、液体組成物である、前述の項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記液体組成物が、非経口組成物、経口組成物、鼻用組成物、または眼用組成物である、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記液体組成物が、ワクチンである、項目１５に記載の方法。
（項目１８）
前記ワクチンが、炭疽ワクチン;結核ワクチン;ボレリア症ワクチン;ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドワクチン;ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドおよび百日咳ワクチン;ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドおよび無細胞百日咳（ｐｅｒｕｓｓｉｓ）ワクチン;ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドおよび無細胞百日咳およびインフルエンザ菌ｂ型結合型ワクチン;ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドおよび無細胞百日咳およびインフルエンザ菌ｂ型結合型およびポリオウイルス不活化ワクチン;Ａ型肝炎ウイルスワクチン;Ａ型肝炎ウイルスおよびB型肝炎ウイルスワクチン;B型肝炎ウイルスワクチン;ヘリコバクターピロリワクチン;インフルエンザ菌ｂ型ワクチン;インフルエンザウイルスワクチン;ポリオウイルスワクチン;髄膜炎菌（ナイセリア・メニンギティディス）ワクチン;麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、風疹ウイルスワクチン;麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、風疹ウイルスおよび水痘ウイルスワクチン;肺炎球菌（ストレプトコッカス・ニューモニエ）ワクチン;狂犬病ワクチン;呼吸器合胞体ウイルスワクチン;天然痘ワクチン;トキソプラズマ症（トキソプラズマ・ゴンディ（ｔｏｘｏｐｌａｓｍ  ｇｏｎｄｉｉ））ワクチン;腸チフス（サルモネラ・チフィ）ワクチン;結核（マイコバクテリウム・ツベルクローシス）ワクチン;および水痘（水痘、水痘帯状疱疹ウイルス）ワクチンからなる群より選択される、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記ワクチンが、鳥インフルエンザワクチンまたはブタインフルエンザワクチンである、項目１７に記載の方法。
（項目２０）
医薬品組成物中の生存微生物を検出するための方法であって、該方法は：
ａ）ろ過性の医薬品組成物を提供する工程；
ｂ）該医薬品組成物をろ過して、該医薬品組成物のろ取物が堆積した少なくとも３枚のメンブランを提供する工程；
ｃ）該少なくとも３枚のフィルター/メンブランを固体培地へ置いて、少なくとも３つのろ取物培養物を産生する工程；
ｄ）
ｉ）少なくとも１つのろ取物培養物を好気性条件下において２０℃〜２５℃で；
ｉｉ）少なくとも１つのろ取物培養物を好気性条件下において３０℃〜３５℃で；および
ｉｉｉ）少なくとも１つのろ取物培養物を嫌気性条件下において３０℃〜３５℃で、
培養する工程であって、ただし、該ろ取物培養物のいずれも約１３日間より長い期間培養しない、工程；ならびに
ｅ）該メンブランにおいてアデノシン３リン酸（ＡＴＰ）を検出する工程であって、ここでメンブランにおけるＡＴＰの存在は、該医薬品組成物中の生存微生物の存在を示す、工程、を含む方法。
（項目２１）
生存微生物についてスクリーニングされ、無菌性が、前述の項目のいずれか一項に記載の方法を使用して確認される、無菌医薬品組成物。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、１０分の時間枠にわたるＭ．ｏｓｌｏｅｎｓｉｓのＵＶ処理の結果を示すグラフである。４日間のインキュベーション後に存在するコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を示す。そのグラフは、４分後にＣＦＵの５０％以上の減少を示す（３回の実施）。
【図２】図２は、１０分の時間枠にわたるＥ．ｃｏｌｉの熱処理の結果を示すグラフである。３日間のインキュベーション後のコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を示す。そのグラフは、３分後にＣＦＵの５０％以上の減少を示す（３回の実施）。
【図３】図３は、１０分の時間枠にわたる非経口製剤処理の結果を示すグラフである。５日間のインキュベーション後のコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を示す。そのグラフは、２分後にＣＦＵの５０％以上の減少を示す（３回の実施）。
【図４】図４Ａは、３分間７０℃で熱処理したＭ．ｌｕｔｅｕｓ細胞の顕微鏡写真である。図４Ｂは、トリプティックソイ寒天培地にまいて３０℃〜３５℃で３日間インキュベーションした後の未処理のＭ．ｌｕｔｅｕｓ細胞の顕微鏡写真である。
【図５】図５は、未処理Ｅ．ｃｏｌｉ培養物、熱処理Ｅ．ｃｏｌｉ、ＵＶ処理Ｅ．ｃｏｌｉおよびＶｏｌｔａｒｅｎ処理Ｅ．ｃｏｌｉの吸光度データを示すグラフである。
【図６】図６は、未処理Ｅ．ｃｏｌｉ培養物、熱処理Ｅ．ｃｏｌｉ、ＵＶ処理Ｅ．ｃｏｌｉおよびＶｏｌｔａｒｅｎ処理Ｅ．ｃｏｌｉの吸光度データを示すグラフである。
【図７】図７は、未処理のＥ．ｃｏｌｉ増殖曲線および熱処理Ｅ．ｃｏｌｉ増殖曲線の比較を示すグラフである。３時間の過程で、Ｅ．ｃｏｌｉ培養物は０．２３１３の傾きを有し、次いで未処理の培養物の正常な傾きに戻る。
【図８】図８は、未処理のＳ．ａｕｒｅｕｓの増殖曲線および熱処理Ｓ．ａｕｒｅｕｓ増殖曲線の比較を示すグラフである。４時間の過程で、ストレスをかけたＳ．ａｕｒｅｕｓ培養物は、０．１０７０の傾きを有し、次いで未処理の培養物の正常な傾きに戻る（４時間後、０．４０３４）。
【図９】図９は、未処理のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖曲線および熱処理Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ増殖曲線の比較を示すグラフである。８時間超の過程で、ストレスをかけたＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ培養物は０．０４１９の傾きを有する。
【図１０】図１０は、未処理のＢ．ｐｕｍｉｌｕｓ増殖曲線および飢餓状態のＢ．ｐｕｍｉｌｕｓ増殖曲線の比較を示すグラフである。細胞は２〜８℃で７日間の栄養素欠乏を経験した。５時間の過程で、ストレスをかけたＢ．ｐｕｍｉｌｕｓ培養物は、−０．００５６の傾きを有し、次いで未処理の培養物の正常な傾きに戻る。
【図１１】図１１は、Ｓｃｈａｅｄｌｅｒ血液寒天培地のバックグラウンドテストの結果を示す顕微鏡写真である。ＭＩＬＬＩＦＬＥＸ  ＲａｐｉｄメンブランＭＸＨＶＷＰ１２４を、３０℃〜３５℃で５日間、ＭＩＬＬＩＦＬＥＸカセットにおいてＳｃｈａｅｄｌｅｒ血液寒天培地上でインキュベートした。図１１Ａは、ＭＩＬＬＩＦＬＥＸ  Ｒａｐｉｄ画像を示し、この場合はそのメンブランを１００ｍｌの流体Ａですすぎ洗いした。図１１Ｂは、１００ｍｌの流体Ｄですすぎ洗いしたメンブランを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、１４日間のインキュベーション期間が必要な従来の試験よりも迅速な無菌試験の方法に関連する。本方法は、液体医薬品組成物（例えば溶液、懸濁液、エマルション、非経口組成物、経口組成物、鼻用組成物、眼用組成物、ワクチン）のような、ろ過性の液体組成物の迅速な無菌試験に特によく適合する。一般的に、本方法は、フィルターメンブランを通して医薬品組成物をろ過する工程を含み、次いでそのフィルターメンブランを固体培地に移し、そしてメンブラン上の生存微生物が増殖する、または十分な量の生体分子、例えばアデノシン３リン酸を産生することを可能にするために十分な時間、適当な増殖条件下でインキュベートして、微生物の検出を可能にする（例えば６時間、１２時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日）。
【００１６】
１つの局面において、本発明は、医薬品組成物において生存微生物を検出するための方法である。その方法は、医薬品組成物（例えば液体医薬品組成物）を、フィルターメンブランを通してろ過して、医薬品組成物のろ取物、および医薬品組成物に存在し得るあらゆる生存微生物が堆積した、１枚超の（例えば少なくとも３枚の）フィルターメンブランを提供する工程を含む。所望の場合、次いで、洗浄溶液をろ過し、例えば増殖阻害剤、代謝阻害剤、または検出阻害剤をメンブランから洗い流し、そしてそれによってろ取物中の微生物の検出を促進することができる。ろ取物を含むフィルターメンブランを、固体培地に置いて、少なくとも３つのろ取物培養物を産生する。次いでそのろ取物培養物を、３つの異なる条件下：２０℃〜２５℃における好気性条件、３０℃〜３５℃における好気性条件、および３０℃〜３５℃における嫌気性条件において、フィルターメンブランに存在する生存微生物が増殖する、または十分な量の生体分子、例えばアデノシン３リン酸を産生するために十分な培養期間培養して、微生物の検出を可能にする。一般的に、そのろ取物培養物を、約１３日以下の期間培養する、および好ましくは実質的に１３日より短い期間培養する。次いで、そのろ取物培養物を、あらゆる適当な方法を用いて、メンブランにおける生存微生物細胞、ミクロコロニーまたはコロニーの存在に関して評価する。フィルターメンブランにおける生存微生物細胞、ミクロコロニーまたはコロニーの存在は、その医薬品組成物における生存微生物の存在を示す。
【００１７】
本発明の１つの局面において、ろ過性医薬品組成物を提供する工程、その組成物をろ過してろ取物が堆積した少なくとも３枚のフィルターメンブランを提供する工程、その３枚のメンブランを固体培地に置いて、３つのろ取物培養物を産生する工程、約１３日以下の培養期間、最初のろ取物培養物を、２０℃〜２５℃において好気性条件下で培養する工程、２番目のろ取物培養物を、３０℃〜３５℃において好気性条件下で培養する工程、および３番目のろ取物培養物を３０℃〜３５℃において嫌気性条件下で培養する工程、およびメンブランにおいてアデノシン３リン酸（ＡＴＰ）を検出する工程を含む、医薬品組成物において生存微生物を検出するための方法が提供される。フィルターメンブランにおけるＡＴＰの存在は、その医薬品組成物における生存微生物の存在を示す。
【００１８】
広い範囲の微生物を、本発明を用いて検出し得る（例えば酵母およびカビ、グラム陽性胞子形成細菌、グラム陰性細菌、グラム陽性球菌およびグラム陽性桿菌（好気性および嫌気性微生物の両方））。ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）株を検出するために、およびまた製造設備を汚染し得る環境微生物を検出するために、本方法を使用し得る。例えば、本明細書中で記載されるように、本方法を、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ  ＡＴＣＣ１６４０４（以前はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒとして公知であった）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＡＴＣＣ６６３３、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ  ＡＴＣＣ１０２３１、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ  ＡＴＣＣ１１４３７、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＡＴＣＣ９０２７、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ６５３８、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ８７３９、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  Ｉｗｏｆｆｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｉｄｒｉｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ；Ｋｏｃｕｒｉａ  ｓｐｅｚ．、Ｋｏｃｕｒｉａ  ｒｈｉｚｏｐｈｉｌｉａ（以前はＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓとして公知であった）、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｏｓｌｏｅｎｓｉｓ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐｅｚ．、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｗａｒｎｅｒｉを検出するために使用し得る。
【００１９】
一般的に、その医薬品組成物（例えば液体医薬品組成物）を、真空または陽圧を用いるような、圧力下の滅菌または無菌技術を用いて、無菌フィルターメンブランを通してろ過する。あらゆる適当なフィルターメンブランおよびろ過装置を使用し得る。適当なフィルターメンブランの例は、例えばポリフッ化ビニリデンメンブラン、グラスファイバーメンブラン、ポリカーボネートメンブラン、ポリエチレンテレフタラート（ｔｒｅｐｈｔｈａｌａｔｅ）メンブラン、混合セルロースエステル（酢酸セルロースおよび硝酸セルロース）、ホスホセルロースメンブラン、ＤＥＡＥメンブラン、ナイロンメッシュメンブラン、またはポリテトラフルオロエチレン（ｐｏｌｙｔｅｔｒａｆｌｕｒｏｅｔｈｙｌｅｎｅ）メンブランを含む。好ましくは、そのメンブランはＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）でできている。本請求される発明において使用するために適当なフィルターメンブランは、約０．１ミクロン（μｍ）から約２０ミクロン、約０．１ミクロンから約１５ミクロン、０．１ミクロンから約１２ミクロン、０．１ミクロンから約１０ミクロン、０．１ミクロンから約８ミクロン、０．１ミクロンから約６ミクロン、０．１ミクロンから約５ミクロン、０．４ミクロン−１２ミクロン、０．４ミクロン−１０ミクロン、０．４ミクロン−８ミクロン、０．４ミクロン−６ミクロン、約０．２２ミクロン、または約０．４５ミクロンの孔径のような、医薬品組成物に存在し得る微生物を保持するために十分小さい孔径を有する。好ましくは、そのメンブランフィルターは、約０．４５ミクロンの孔径を有する。
【００２０】
一般的に、ろ取物を含む少なくとも３枚のフィルターメンブランを調製する。医薬品組成物の３つの別々のサンプルを、３枚の別々のフィルターメンブランを通してろ過することによってこれを達成し得る。これをまた、医薬品組成物ろ取物を含む１枚のフィルターメンブランを調製し、そして滅菌または無菌技術を用いて、そのフィルターを３つの部分（例えばほぼ同じサイズの３つの部分）に切断または分割することによって達成し得る。医薬品組成物ろ取物を含むそのフィルターメンブランを、次いで適当な固体培地へ置いて、ろ取物培養物を産生する。
【００２１】
検出される望ましい微生物の増殖および／または代謝を支援する、適当な固体培地および培養条件を選択し得る。例えば、本明細書中で記載および例示されたように、培地をスクリーニングすることによって、これを達成し得る。好ましくは、本方法において使用されるその固体培地は、好気性および嫌気性培養条件下で、広い範囲の微生物の増殖を支援する。所望の場合、１つ超の固体培地を使用し得る。例えば、酵母、カビおよび好気性細菌の増殖のための、液体トリプティックソイブロスと同等の、またはそれより良い最初の培地を使用し得る；嫌気性微生物の増殖のための、液状チオグリコール酸培地の嫌気性相と同等の、またはそれより良い２番目の固体培地を選択し得る；そして好気性微生物の増殖のための、液状チオグリコール酸培地の好気性相と同等の、またはそれより良い３番目の固体培地を選択し得る。好ましくは、好気性および嫌気性条件下の両方で、単一の固体培地を使用する。本発明で使用し得る適当な固体培地は、例えばＦＴＭ−Ａ（１．０７５％の寒天（最終濃度）を含む液状チオグリコール酸培地）、ＢＨＩ（ブレインハートインフュージョン寒天培地）、Ｄｉｆｃｏ  Ｂｒｅｗｅｒ嫌気性寒天培地、Ｒ２Ａ寒天培地、Ｓｃｈａｅｄｌｅｒ血液寒天培地、Ｃａｓｏ−寒天培地ＩＣＲ（トリプティックソイ寒天培地）、Ｃｏｌｕｍｂｉａ寒天培地５％血液またはＣＤＣ嫌気性血液寒天培地を含む。Ｓｃｈａｅｄｌｅｒ血液寒天培地は、本方法で使用するために特に好ましい固体培地である。
【００２２】
好ましい固体培地は、本明細書中で記載されたような、「ストレスをかけた」および「ストレスをかけていない」微生物の増殖および／または代謝を支援するために適当である。微生物は、医薬品組成物の製造の間のような、プロセス化学反応（ｐｒｏｃｅｓｓ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）の間に、ストレス、例えば低浸透圧または高浸透圧ストレス、照射（ＵＶ光、ガンマ線照射、マイクロ波のような）、超音波、熱、低温または化学的ストレス（例えば塩素または医薬品製剤によって引き起こされる）を経験し得るので、これは望ましい。
【００２３】
ろ取物培養物を、メンブラン上の生存微生物が、増殖してミクロコロニーまたはコロニーを生じる、または十分な量の生体分子、例えばアデノシン３リン酸を産生することを可能にするために十分な期間、適当な増殖条件下でインキュベート（すなわち培養）して、微生物の検出を可能にする。一般的に、１つのろ取物培養物を、３０℃〜３５℃において好気性条件下でインキュベートし、２番目のろ取物培養物を、３０℃〜３５℃において嫌気性条件下でインキュベートし、そして３番目のろ取物培養物を２０℃〜２５℃において好気性条件下でインキュベートする。
【００２４】
いくつかの実施態様において、そのろ取物培養物を、生存微生物が、少なくとも約２００アトモルのＡＴＰ、少なくとも約２００フェムトモルのＡＴＰ、少なくとも約２００ピコモルのＡＴＰ、または少なくとも約２００ナノモルのＡＴＰのような、検出可能な量のＡＴＰを産生することを可能にするために十分な期間培養する。培養期間は、約２から約７日、約２から約８日、約２から約９日、約２から約１０日、約２から約１１日、約２から約１２日、約２から約１３日、約６時間、約１２時間、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、または約６日であり得る。個々のろ取物培養物それぞれのインキュベーション期間は、適切に変動させ得、そして全てのろ取物培養物を同じ長さの時間培養する必要はない。好ましいインキュベーション時間は、検出する微生物に基づいて変動する。
【００２５】
ろ取物培養物のインキュベーション後にフィルターメンブランに存在する、生存微生物細胞、ミクロコロニー、またはコロニーを、視覚的検査によって、または好ましくは適当なアッセイを用いることによるなど、あらゆる適当な方法を用いて検出し得る。例えば、生存微生物細胞、ミクロコロニー、またはコロニーを検出するために、発光アッセイ（例えばルシフェラーゼアッセイ）を使用し得る。発光を検出するために、電荷結合素子カメラ、画像処理装置、および／または画像分析ソフトウェアのような、あらゆる適当な方法またはシステムを使用し得る。好都合なことに、画像分析ソフトウェアを、生存微生物細胞、生存微生物ミクロコロニー、または生存微生物コロニーの数を定量または測定するために使用し得る。いくつかの実施態様において、ルシフェラーゼアッセイのような発光アッセイを、フィルターメンブラン上の生存微生物細胞、ミクロコロニー、またはコロニーによって産生されたアデノシン３リン酸（ＡＴＰ）を検出するために使用する。例えば、ＡＴＰ放出試薬および生物発光薬剤（例えばルシフェラーゼおよびルシフェリンを含む試薬）をフィルターメンブランに適用し、そしてもし生存細胞がＡＴＰを産生するなら発光が生じる。発光によってＡＴＰを検出するために適当な試薬は、当該分野で周知であり、そして市販で入手可能である（例えばＭＩＬＬＩＦＬＥＸ迅速試薬キット；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）。
【００２６】
ろ取物培養物のインキュベーション後にフィルターメンブランに存在する生存微生物細胞、ミクロコロニーまたはコロニーをまた、例えば微生物に対して内因性である核酸にハイブリダイズするプローブのハイブリダイゼーションを検出する発光アッセイを用いて検出し得る。その発光アッセイは、ペルオキシダーゼ反応または他の適当な反応を含み得る。ペルオキシダーゼおよび他の酵素の活性によって発光を生じさせるために適当な試薬は周知であり、そして市販で入手可能である。
【００２７】
約１０−１００個の酵母細胞または約１０００個の細菌細胞の検出を可能にするアッセイおよび検出システムを使用し得る。好ましくは、単一の細胞または約１００個と少ない細胞の検出を可能にするアッセイおよび検出システムを使用する。例えば、微生物によって産生されるＡＴＰを検出することによって、これを達成し得る。例えば、市販で入手可能なＡＴＰ生物発光アッセイを、市販で入手可能な電荷結合素子カメラ、画像処理装置および画像分析ソフトウェア（ＭＩＬＬＩＦＬＥＸ迅速微生物検出および計数システム；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）と組み合わせて使用した場合に、約１個の酵母またはカビ細胞または約１００個の細菌細胞と同等である、約２００アトモルのＡＴＰを検出するために使用し得る。
【００２８】
本明細書中で記載した検出方法は、液体医薬品組成物のような、ろ過性の組成物の無菌性を評価するためによく適している。液体組成物は、水性組成物、懸濁液およびエマルションを含む。その液体医薬品組成物は、例えば非経口組成物、経口組成物、鼻用組成物、または眼用組成物を含む、医薬品使用のために適当なあらゆる液体であり得る。その液体組成物は、ワクチンであり得る。
【００２９】
適当なワクチンは、例えば炭疽ワクチン（ＡＮＴ）、カルメットゲラン桿菌ワクチン（ＢＣＧ）、ボレリア症ワクチン外側表面プロテインＡワクチン（ＢＯＲｏｓｐＡ）、ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドワクチン（ＤＴ）、ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドおよび百日咳ワクチン（ＤＴＰ）、小児用のジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドおよび無細胞百日咳ワクチン（ＤＴＰａ）、成人用のジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドおよび無細胞百日咳（ｐｅｒｕｓｓｉｓ）ワクチン（ＤｒＴＰａｒ）、ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドおよび無細胞百日咳およびインフルエンザ菌ｂ型結合型ワクチン（ＤＴＰａ−ＨＩＢ）、ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドおよび無細胞百日咳およびインフルエンザ菌ｂ型結合型およびポリオウイルス不活化ワクチン（ＤＴＰａ−ＨＩＢ−ＩＰＶ）、Ａ型肝炎ウイルスワクチン（ＨＡＶ）、Ａ型肝炎ウイルスおよびＢ型肝炎ウイルスワクチン（ＨＡＶ−ＨＢＶ）、Ｂ型肝炎ウイルスワクチン（ＨＢＶ）、ヘリコバクターピロリワクチン（ＨＥＬ）、インフルエンザ菌ｂ型ワクチン（ＨＩＢ）、インフルエンザ菌ｂ型結合型ワクチン（ＨＩＢｃｎ）、インフルエンザ菌ｂ型多糖類ワクチン（ＨＩＢｐｓ）、インフルエンザ菌ｂ型ワクチン（ジフテリアＣＲＲＭ１９７タンパク質結合型、ジフテリアＣＲＭ１９７毒素タンパク質に結合したオリゴ糖；ＨＩＢ−ＨｂＯＣ）、鳥インフルエンザ（例えばＨ５Ｎ１、Ｈ１Ｎ３）およびブタインフルエンザ（例えばＨ１Ｎ１）のワクチンを含むインフルエンザウイルスワクチン（ＩＮＦ）、インフルエンザウイルス弱毒化生ワクチン（ＩＮＦａ）、インフルエンザウイルス弱毒化生ワクチン鼻腔内（ＩＮＦａｎ）、インフルエンザウイルス不活化ワクチン（ＩＮＦｉ）、インフルエンザウイルス不活化ワクチンビリオン成分（ｓｐｌｉｔ  ｖｉｒｉｏｎ）（ＩＮＦｓ）、インフルエンザウイルス不活化ワクチンビリオン成分ＡおよびＢ型三価（ＩＮＦｓ−ＡＢ３）、インフルエンザウイルスワクチンビリオン全体（ＩＮＦｗ）、ポリオウイルス不活化ワクチン（ＩＰＶ）、髄膜炎菌（ナイセリア・メニンギティディス）ワクチン（ＭＥＮ）、髄膜炎菌（ナイセリア・メニンギティディス）結合型ワクチン（ＭＥＮｃｎ）、髄膜炎菌（ナイセリア・メニンギティディス）結合型ワクチン血清型Ａ、Ｃ（ＭＥＮｃｎ−ＡＣ）、髄膜炎菌（ナイセリア・メニンギティディス）多糖類ワクチン血清型Ａ、Ｃ、Ｙ、Ｗ−１３５（ＭＥＮｐｓ−ＡＳＹＷ）、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、風疹ウイルスワクチン（ＭＭＲ）、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、風疹ウイルスおよび水痘ウイルスワクチン（ＭＭＲ−ＶＡＲ）、ポリオウイルス弱毒化生経口三価ワクチン（ＯＰＶ）、肺炎球菌（ストレプトコッカス・ニューモニエ）ワクチン（ＰＮＵ）、肺炎球菌（ストレプトコッカス・ニューモニエ）結合型ワクチン７価（ＰＮＵｃｎ−７）、肺炎球菌（ストレプトコッカス・ニューモニエ）多糖類２３価ワクチン（ＰＮＵｐｓ−２３）、ポリオウイルスワクチン（ＰＯＬ）、狂犬病ワクチン（ＲＡＢ）、狂犬病ワクチンヒト二倍体細胞培養（ＲＡＢ−ＨＤＣＶ）、狂犬病ワクチン精製ニ���トリ胚細胞培養（ＲＡＢ−ＰＣＥＣ）、呼吸器合胞体ウイルスワクチン（ＲＳＶ）、天然痘ワクチン（ＳＭＡ）、天然痘（ワクシニアウイルス）ワクチン（ＳＭＡｖａｃ）、破傷風トキソイドおよびジフテリアトキソイド（成人のための低減した抗原量）ワクチン（Ｔｄ）、トキソプラズマ症（トキソプラズマ・ゴンディ（ｔｏｘｏｐｌａｓｍ  ｇｏｎｄｉｉ））ワクチン（ＴＯＸ）、腸チフス（サルモネラ・チフィ）ワクチン（ＴＰＤ）、腸チフス（サルモネラ・チフィ）ワクチン弱毒化生経口Ｔｙ２１ａ株（ＴＰＤａ）、腸チフス（サルモネラ・チフィ）ワクチン熱およびフェノール不活化乾燥（ＴＰＤ−ＨＰ）、腸チフス（サルモネラ・チフィ）ワクチンＶｉ莢膜多糖類（ＴＰＤ−Ｖｉ）、ＢＣＧではない結核（マイコバクテリウム・ツベルクローシス）ワクチン（ＴＵＢ）、水痘（ｖａｒｉｃｅｌｌａ）（水痘（ｃｈｉｃｈｅｎｐｏｘ）、水痘帯状疱疹ウイルス）ワクチン（ＶＡＲ）を含む。
【００３０】
適当な非経口組成物は、例えばアデノシン、アルプロスタジル、硫酸アミカシン、アジスロマイシン、ブレオマイシン、セフトリアキソン、シプロフロキサシン、シスプラチン、ダカルバジン、ダウノルビシンＨＣｌ、メシル酸デフェロキサミン、酢酸デスモプレシン、ジルチアゼム、ジピリダモール、ドキソルビシン、エナラプリラート、エピルビシン、エポプロステノールナトリウム、フルコナゾール、リン酸フルダラビン、リン酸フルダラビン、フルマゼニル、グラニセトロンＨＣｌ、イダルビシンＨＣｌ、イホスファミド、イリノテカンＨＣｌ、ロイコボリンカルシウム、酢酸ロイプロリド、レボカルニチン、酢酸メドロキシプロゲステロン、メスナ、酢酸メチルプレドニゾロン、メトクロプラミド、ミトザントロン、ナルブフィンＨＣｌ、酒石酸水素ノルエピネフリン、酢酸オクトレオチド、オンダンセトロン、オキサリプラチン、オキシトシン、パクリタキセル、パミドロン酸二ナトリウム、臭化パンクロニウム、臭化フェニレフリン、フェニレフリンＨＣｌ、プロメタジンＨＣｌ、プロポフォール、臭化ロクロニウム、スルファメトキサゾール、コハク酸スマトリプタン、硫酸テルブタリン（ｔｅｂｕｔａｌｉｎｅ）、シピオン酸テストステロン、トブラマイシン、臭化ベクロニウム、硫酸ビンクリスチン、酒石酸ビノレルビン、およびストレプトゾシン滅菌粉末を含む。
【００３１】
適当な経口組成物は、例えばアセトアミノフェンおよびリン酸コデイン錠剤、アセトアミノフェンアセタゾラミド錠剤、アシクロビルカプセル、アミロライドＨＣｌ、アミオダロンＨＣｌ、ベシル酸アムロジピンおよびベナゼプリルカプセル、ベシル酸アムロジピン錠剤、アモキシシリンおよびクラブラン酸カリウム、アモキシシリン、アナグレリド、デソゲストレルおよびエチニルエストラジオール錠剤、アスピリン、アテノロール、レボノルゲストレルおよびエチニルエストラジオール錠剤、アジスロマイシン、バクロフェン、ベナゼプリルＨＣｌ、ベンゾナテート、メシル酸ベンズトロピン、吉草酸ベタメタゾン（ｂｅｔｈａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、ジプロピオン酸ベタメタゾン、塩化ベタネコール、ビカルタミド、フマル酸ビソプロロール、ブプロプリオンＨＣｌ、ブデソニド吸入懸濁液、ブメタニド、ブプロピオンＨＣｌ、カベルゴリン、ｃａｌｃａｒｂ６００、カルシトリオール、クエン酸カルシウム錠剤、ノルエチンドロン錠剤、カプトプリルおよびヒドロクロロチアジド錠剤、カプトプリル、カルバマゼピン、カルベジロール、セファクロル、セファドロキシル、セフジニル、セフプロジル、セファレキシン、セルタジェン（ｃｅｒｔａｇｅｎ）、セチリジン（ｃｅｒｔｉｒｉｚｉｎｅ）ＨＣｌ、クロルジアゼポキシドＨＣｌ、マレイン酸クロルフェニラミン、クロルゾキサゾン、コリノイド（ｃｈｏｌｉｎｏｉｄ）、シロスタゾール、シメチジンＨＣｌ、シメチジン（ｃｉｍｅｔｉｎｅ）、シプロフロキサシン、シタロプラム、イソトレチノイン、クラリスロマイシン、フマル酸クレマスチン、クリンダマイシン、クエン酸クロミフェン、クロミプラミンＨＣｌ、クロナゼパム、クロトリマゾール、クロザピン、クロモリンナトリウム、シクロベンザプリンＨＣｌ、シクロスポリン、シプロヘプタジンＨＣｌ、ダナゾール、デメクロサイクリンＨＣｌ、酢酸デスモプレシン、デクスメチルフェニデートＨＣｌ、硫酸デキストロアンフェタミン、ジアゼパム、ジクロフェナクカリウム、ジクロキサシリン、ジダノシン、ジルチアゼム（ｄｉｔｉａｚｅｍ）ＨＣｌ、ジフェンヒドラミンＨＣｌ、ジピリダモール、リン酸ジソピラミド、ジバルプロエクスナトリウム、ドルゾラミドＨＣｌ、メシル酸ドキサゾシン、マレイン酸エナラプリル、カルバマゼピン、エスタゾラム、エストラジオール、エストロピペート、エタンブトールＨＣｌ、エトスクシミド、エトドラク、ファムシクロビル、ファモチジン、硫酸鉄（II）（ｆｅｒｒｏｕｓ  ｓｕｌｆ）、硫酸第一鉄、フェキソフェナジンＨＣｌ、フィナステリド、酢酸フレカイニド、フルコナゾール、酢酸フルドロコルチゾン、フルオシノニド、フルオキセチン、フルルビプロフェン、フルタミド、フルボキサミン、ホシノプリルナトリウム、フロセミド、ガバペンチン、臭化水素酸ガランタミン、ゲムフィブロジル、グリメピリド、グリピジド、硫酸グルコサミン、グリブリド、ハロペリドール、ヒドララジンＨＣｌ、ヒドロクロロチアジド、酒石酸水素ヒドロコドン（ｈｙｄｒｏｃｏｎｄｏｎｅ）、硫酸ヒドロキシクロロキン、ヒドロキシウレア、ヒドロキシジンＨＣｌ、パモ酸ヒドロキシジン、インドメタシン、イソニアジド、ケトコナゾール、ケトプロフェン、ケ��ロラクトロメタミン、ラベタロールＨＣｌ、ラモトリジン、ランソプラゾール、レフルノミド、ロイコボリンカルシウム、レベチラセタム、リドカインＨＣｌ、リシノプリル、ロペラミドＨＣｌ、ロラゼパム、ロサルタンカリウム、ロバスタチン、メベンダゾール、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、メロキシカム、メペリジンＨＣｌ、メルカプトプリン、メサラミン、メトホルミンＨＣｌ、メトトレキサート、メチルドパ、メチルプレドニゾロン、メトクロプラミド、酒石酸メトプロロール、メトロニダゾール、メトロニダゾール、メキシレチン、ミノサイクリンＨＣｌ、ミルタザピン、ミソプロストール、モエキシプリル（ｍｏｅｉｐｒｉｌ）ＨＣｌ、ムピロシン、ミコフェノール酸モフェチル、ナブメトン、ナドロール、ナルトレキソンＨＣｌ、ナプロキセン、ネファゾドン（ｎｅｆａｚｏｎｅ）ＨＣｌ、硫酸ネオマイシン、ナイアシン、ニフェジピン、ニモジピン、ニザチジン、酢酸ノルエチンドロン、ノルトリプチリンＨＣｌ、ナイスタチン、オフロキサシン、オメプラゾール、オンダンセトロンＨＣｌ、オキサプロジン、オキサゼパム、塩化オキシブチニン、オキシコドン、オキシコドンＨＣｌ、パントプラゾールナトリウム、パロキセチン、ペニシリンＶカリウム、ペントキシフィリン、フェニルジェシク（ｐｈｅｎｙｌｇｅｓｉｃ）、ピロキシカム、二塩酸プラミペキソール、プラバスタチンナトリウム、プラゾシンＨＣｌ、プレドニゾロン、マレイン酸プロクロルペラジン、プロパフェノンＨＣｌ、プロポキシフェンＨＣｌ、プロプラノロールＨＣｌ、プロトリプチリンＨＣｌ、キナプリル、硫酸キニジン、ラミプリル、ラニチジンＨＣｌ、リバビリン、リスペリドン、ロピニロールＨＣｌ、センナ−Ｓ、センナゲン（ｓｅｎｎａｇｅｎ）、硝酸銀、シンバスタチン、ソタロールＨＣｌ、スクラルファート、クエン酸タモキシフェン、タムスロシンＨＣｌ、テラゾシン（ｔｅｒｚｏｓｉｎ）ＨＣｌ、テルビナフィンＨＣｌ、テトラサイクリンＨＣｌ、テオフィリン、チクロピジンＨＣｌ、トルメチンナトリウム、トピラマート、トルセミド、トラマドールＨＣｌ、トランドラプリル、トラゾドンＨＣｌ、トレチノイン、ウルソジオール、バルプロ酸、ベンラファキシンＨＣｌ、ベラパミルＨＣｌ、ワルファリンナトリウム、ザレプロン、および酒石酸ゾルピデムを含む。
【００３２】
適当な鼻用組成物は、例えば鼻腔内スプレー、抗片頭痛薬、ペプチド薬剤（ホルモン治療）、麻酔薬、制吐薬、鎮静薬、塩酸アゼラスチン、塩酸オキシメタゾリン、塩酸フェニレフリン（ｐｈｅｙｎｙｌｅｐｈｒｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、食塩水溶液、フロ酸モメタゾン、ブデソニド、臭化イプラトロピウム、およびクロモリンナトリウム鼻腔内スプレーを含む。
【００３３】
適当な眼用組成物は、例えばリドカイン、プロパラカイン、テトラカイン、ケトロラクトロメタミン眼用溶液、ケトロラクトロメタミン、ナファゾリン眼用、ブリモニジン、アジスロマイシン、ベシル酸ベポタスチン、ベシフロキサシン、ベタキソン、コソプト、ジフルプレドナート（ｄｉｆｌｕｐｒｅｄａｔｅ）、ロテマックス、ラニビズマブ、ビマトプロスト、ペガプタニブ、オフロキサシン、デサメタゾン、レボフロキサシン、ウノプロストンイソプロピル眼用溶液、シクロスポリン眼用エマルション、サラジェン、トラボプロスト眼用溶液、バルガンシクロビルＨＣｌ、ビロプティック、シドホビル、ベルテポルフィン、ビトラサート（ｖｉｔｒａｓｅｒｔ）、ビトラベン（ｖｉｔｒａｖｅｎｅ）、およびフマル酸ケトチフェン眼用溶液を含む。
【００３４】
本明細書中で記載された方法を、あらゆる適当な機器または装置を用いて行い得、そして手動または自動で行い得る。１つの好ましい局面において、その方法を、市販で入手可能なＭＩＬＬＩＦＬＥＸ迅速微生物検出システムを用いて行い、それはサンプル調製ステーション、自動スプレーステーション、検出タワー、画像分析機、ＣＣＤカメラおよびソフトウェアを含むコンピューターを含む（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）。
【００３５】
別の局面において、本発明は、本明細書中で記載された方法を用いて生存微生物に関してスクリーニングされた、滅菌医薬品組成物（例えばワクチン、眼用組成物、鼻用組成物、経口組成物、非経口組成物）である。
【実施例】
【００３６】
例示
ＡＴＣＣ株および生産場所（表面または生産者接触プレート、バイオバーデンおよび無菌試験からの混入）からの環境株の凍結コレクションの作成
凍結乾燥培養物（ＡＴＣＣ株）、または直接プレート（環境単離物）に由来する、微生物を液体トリプティックソイブロスまたは固体培地（例えばＳａｂｏｕｒａｕｄデキストロース寒天培地）で、適切な期間培養した。各株の遺伝子型同定を、ＭｉｃｒｏＳｅｑ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓを用いて行った。次いで培養物を８００×Ｇで２０〜３０分間遠心分離し、そしてペレットを保護培地（１５％のグリセリンを含むＯｘｏｉｄ−ＣＭ６７）に再懸濁した。その培養物を希釈し、ＣＦＵ（コロニー形成単位）を固体培地でチェックし、そして２ｍｌのＮｕｎｃ  ＣｒｙｏｔｕｂｅＴＭバイアルに満たし、−８０℃で保存した。表１は、使用した微生物の完全なリストを示す。
【００３７】
【表１】
0005881599.tif 000002
Ａ．ストレス因子研究
それぞれ１〜１０分間、ＵＶ光（２４０〜２５０μＷ／ｃｍ２）、熱（５０〜７０℃の水浴）のいずれかを適用することによって、または微生物を希釈系列の非経口製剤中でインキュベートすることによって、ストレスを誘起し、アリコートを毎分取った。ストレスを１００ＣＦＵより下の範囲の試験微生物の流体懸濁液に直接適用した。ストレスの影響を、プレートカウント法およびＯＤ測定を用いて決定した、ＣＦＵの減少によってモニターした。
【００３８】
プレートカウント：ストレスをかけた微生物を、トリプティックソイ寒天培地にまき、各分のアリコートをプレーティングすることによって、ストレスの様々な影響をモニターした（ストレスを１〜１０分間適用し、アリコートを毎分取った）。結果を、２〜７日後に計測した（株に依存して、例えばＥ．ｃｏｌｉおよびＡ．ｎｉｇｅｒは最後の２日後に計測したが、Ｐ．ａｃｎｅｓはインキュベーション６日後より前には計測できなかった）。最初に播種した量のＣＦＵの５０％超の減少を引き起こすために必要な正確な時間を測定した。
【００３９】
ＯＤ測定（λ＝６００ｎｍ）：試験微生物の一晩培養したものを、まずストレスをかけ（≧５０％低減研究において決定されたストレスパラメーターを適用した）、トリプティックソイブロスまたは液状チオグリコール酸培地に播種し（約３〜４×１０６ＣＦＵ／ｍｌ）、そして８時間までの時間枠にわたって分析した（各時間に吸光度を測定するためにアリコートを取った）。インキュベーションを振とうテーブル上で行った（好気性株のみ）。ストレスをかけた培養物を、ストレスをかけていない培養物と比較した。
【００４０】
ストレス因子研究５０％低減の結果
２２個の株からのそれぞれの微生物に関して、３つのストレスパラメーターを試験した。最初に播種したＣＦＵの量の５０％超の減少を引き起こすために必要である、各ストレス因子の正確なパラメーター（１分間および１０分間の間）を測定した。試験した３つのストレスパラメーターは、ＵＶ光、熱および非経口適用のための非経口製剤中における微生物のインキュベーションであった。例えば、熱は、細胞膜に損傷を引き起こし、ＲＮＡは変性し、そしてこれはいくつかの細胞の死を引き起こす。ＵＶ照射は、変異およびＤＮＡ複製の停止を引き起こす（Ｍ．Ｓｔｒｕｓ、Ｒｏｃｚ  Ｐａｎｓｔｗ  Ｚａｋｌ  Ｈｉｇ．４８（３）：２６３−２６８（１９９７））。
【００４１】
非経口製剤の適用は、微生物細胞における化学的ストレスを引き起こす−非経口製剤の抗菌特性が長い間知られている。図１−３は、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｏｓｌｏｅｎｓｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉおよびＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  Ｉｗｏｆｆｉｉに関して得られたデータの例を示す。２２個の微生物の株のそれぞれに関して、最初の接種材料を≧５０％低減させるために必要なストレスパラメーターを見出した。
【００４２】
いくつかの場合において、コロニーの形態の変化（コロニーはよりゆっくり増殖するが、後に正常なコロニーサイズを回復する）が観察された。例えば、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓは、コロニーサイズの減少を示した［図４ａおよび４ｂ］。
【００４３】
迅速無菌試験の培地評価のために、広い範囲の微生物を使用することだけでなく、これらの微生物を、ストレスをかけた状態で使用することも重要であった。非経口製剤によって引き起こされる化学的ストレス、およびＵＶ光の適用によって引き起こされる照射ストレスなどの、いくつかのストレス因子は、播種された微生物の量を減少させた。対照的に、熱処理は、試験した微生物のいくつかにおいて、最初に増殖速度の低減を引き起こした。熱損傷細胞は、回復するために３から４時間の時間がかかることが既に報告された−これは本研究において確認された（Ｍ．Ｗａｒｓｅｃｋ、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２６：９１９−９２２（１９７３））。胞子形成細菌は、ストレスに対して広い抵抗性を示すので、熱ストレスは胞子形成細菌には有用でなく、他のストレスパラメーターも可能性がない（Ｐ．Ｓｅｔｌｏｗ、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１０１（３）：５１４−５２５  Ｒｅｖｉｅｗ（２００６））。例えばＢ．ｐｕｍｉｌｕｓを、照射指標細菌として使用する（Ｊ．Ｗｏｎｇ、ＰＤＡ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．５８（１）：６−１４（２００４））。胞子形成細菌の場合、異なる「ストレス」因子を使用した−これらは、栄養素の欠乏によってストレスを受け、そして従ってより高い胞子含有量が誘導された。
【００４４】
続く栄養培地評価および統計分析によって、Ｓｃｈａｅｄｌｅｒ血液寒天培地が、無菌試験において使用するために最もよい固体培地であることが明らかになった。２０℃〜２５℃および３０℃〜３５℃における好気性インキュベーションの間の差を分析するためのｔ−検定は、その温度の間に有意差が存在することを示した。４０例のうち１１例においてその差が有意であったので、迅速無菌試験において両方のインキュベーション温度を検証することが必要である。
【００４５】
ＯＤ測定
≧５０％低減研究において決定されたストレスパラメーターを、試験した各株に適用した。ストレスをかけた接種材料を常にストレスをかけていない接種材料と比較した。微生物（最初の接種材料として約３〜４×１０６ＣＦＵ／ｍｌ）を、トリプティックソイブロスまたは液状チオグリコール酸培地のいずれかにおいてインキュベートし、そして３０℃〜３５℃で振とうテーブルにおいてインキュベートした（好気性株のみ）。各時間でアリコートを取り、そして吸光度（λ＝６００ｎｍ）を測定した。異なる処理をした（未処理、熱処理、ＵＶ光で処理した、非経口製剤中に希釈した、５０％低減実験に使用した時間／パラメーター）接種材料に関して得られたデータは、ＯＤ測定データの通常プロットにおいてわずかに異なる増殖曲線を示した［図５］。
【００４６】
データを対数でプロットすること［図６］により、Ｅ．ｃｏｌｉの増殖曲線に対する熱処理の影響が示され、そしてそのデータを接種材料の量と関わらないものにする。接種材料の量を正確に制御することが容易ではないので、対数プロットはこれを利点として有する。細菌培養物にＵＶ光、または非経口製剤処理のいずれかによってストレスをかけた場合に、観察された増殖において実際の差異はない（５０％低減実験において決定されたパラメーターによって）。
【００４７】
傾きの比較により、熱処理（５０％低減実験において決定されたパラメーター）のみが、微生物の増殖速度に影響を有すること、そして微生物が実際のストレスを示したことが示される。ＵＶ光および非経口製剤中での希釈（いずれも「殺菌因子」であり、そして「ストレス因子」ではない）は、培地評価の間使用しなかった。増殖速度に対するストレスは、直線を適用することによって、および傾きを比較することによって最も良く詳細に示される。選択した範囲で全ての微生物株に関して、増殖の傾きの低減が示された。本明細書中で示される例は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、およびＢ．ｐｕｍｉｌｕｓである。Ｅ．ｃｏｌｉの場合、増殖の傾きは約３時間低減されたが、このことは、この微生物が回復するために約３時間必要とすることを意味する［図７］。
【００４８】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓは、４時間の時間枠にわたって増殖の傾きの低減を示す［図８］。
【００４９】
酵母Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓは、さらにより長いストレスの持続を示した。増殖の傾きは８時間超低減したままであり、一晩でストレスを受けた培養物は正常な増殖の傾きを回復した［図９］。
【００５０】
グラム陽性胞子形成細菌に関して、熱ストレスは可能性がない。他のストレス因子、ＵＶ光および非経口製剤中の希釈は、その微生物にストレスの影響を示さなかったので、胞子形成細菌に対する別のストレスを見出さなければならなかった。バチルス属およびクロストリジウム属に関して、細菌懸濁液中でより高い胞子含有量が誘起された。そしてそのＯＤ測定を行った［図１０］。この胞子形成は、栄養素の欠乏、および過剰増殖した微生物培養物を６日間超２〜８℃に保存することによって達成された。
【００５１】
全ての微生物を、記載した方式で試験した。３つの場合においてのみ困難が観察された。カビＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓは、液体培地中で菌糸体として増殖し、従って正確なＯＤ測定は不可能であった。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓおよび全ての試験した微生物に関してデータが利用できるので、ＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓが同じ方式でふるまうということを推定するのみでよい。従って、試験したパラメーターを培地評価のために取り入れる。他の場合において、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ（この株はＦＴＭにおいてより良く増殖する）に関して、プレートカウントによって決定された≧５０％低減についてのパラメーターは、ＯＤ測定実験において再現することができなかった。≧５０％低減実験のパラメーターと比較して、長い時間枠の間にストレスを除いた場合にのみ、増殖におけるタイムラグが観察された。Ｐ．ａｃｎｅｓはおそらく、より高い酸素ストレスのために、ＯＤ測定において異なる結果を示した。ＯＤ測定のために、アリコートを毎時間取り、Ｐ．ａｃｎｅｓにとって一定の酸素ストレスを引き起こした。ストレス因子研究から得られたデータを表２にまとめる。
【００５２】
【表２】
0005881599.tif 000003
従って、ストレスパラメーターの熱および栄養素の欠乏を、培地評価において使用した。選択したストレス因子は、滅菌製剤の生産プロセスにおいておそらく存在するストレスに類似する。
【００５３】
Ｂ．増殖促進研究
試験する培地に、約１０〜１００ＣＦＵの量で微生物（ストレスをかけた状態、およびストレスをかけていない状態）を播種した。その実験を、各インキュベーションパラメーター（インキュベーションパラメーターは２０℃〜２５℃および３０℃〜３５℃好気性インキュベーション、３０℃〜３５℃嫌気性インキュベーションである）に関して５回の反復結果を用いて行った。インキュベーションの２−７日後に、結果を視覚的に計測した。得られた生データを、各微生物に関して６つの群に群分けした：
１．２０℃〜２５℃好気性インキュベーション−ストレスをかけた微生物
２．２０℃〜２５℃好気性インキュベーション−ストレスをかけていない微生物
３．３０℃〜３５℃好気性インキュベーション−ストレスをかけた微生物
４．３０℃〜３５℃好気性インキュベーション−ストレスをかけていない微生物
５．３０℃〜３５℃嫌気性インキュベーション−ストレスをかけた微生物
６．３０℃〜３５℃嫌気性インキュベーション−ストレスをかけていない微生物
テストした栄養培地を、亜群に群分けする。
【００５４】
予備セレクションのための固体栄養培地のリスト（ストレスをかけていない１０個の株による増殖促進試験）
・ＦＴＭ−Ａ（さらに１０ｇ／Ｌの寒天を含み、最終濃度が１．０７５％の寒天になる、液状チオグリコール酸培地）、Ａｍｉｍｅｄ、Ａｌｌｓｃｈｗｉｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ
・ＢＨＩ（ブレインハートインフュージョン寒天培地）、γ線照射、ｈｅｉｐｈａ、Ｅｐｐｅｌｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ
・Ｄｉｆｃｏ  Ｂｒｅｗｅｒ嫌気性寒天培地、γ線照射、ｈｅｉｐｈａ、Ｅｐｐｅｌｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ
・Ｒ２Ａ寒天培地、Ｏｘｏｉｄ，Ｇｒｅａｔ  Ｂｒｉｔａｉｎ
・Ｓｃｈａｅｄｌｅｒ血液寒天培地、γ線照射、ｈｅｉｐｈａ、Ｅｐｐｅｌｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ
・Ｃａｓｏ−寒天培地ＩＣＲ（トリプティックソイ寒天培地）、γ線照射、ｈｅｉｐｈａ、Ｅｐｐｅｌｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ
・Ｃｏｌｕｍｂｉａ寒天培地５％血液、ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、Ｆｒａｎｃｅ
・ＣＤＣ嫌気性血液寒天培地、γ線照射、ｈｅｉｐｈａ、Ｅｐｐｅｌｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ  。
【００５５】
最終的な研究のための固体栄養培地のリスト（ストレスをかけていない状態、およびストレスをかけた状態の２２個の株による増殖促進試験）
・Ｄｉｆｃｏ  Ｂｒｅｗｅｒ嫌気性寒天培地、γ線照射、ｈｅｉｐｈａ、Ｅｐｐｅｌｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ
・Ｓｃｈａｅｄｌｅｒ血液寒天培地、γ線照射、ｈｅｉｐｈａ、Ｅｐｐｅｌｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ
・Ｃａｓｏ−寒天培地ＩＣＲ（トリプティックソイ寒天培地）、γ線照射、ｈｅｉｐｈａ、Ｅｐｐｅｌｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ
・ＣＤＣ嫌気性血液寒天培地、γ線照射、ｈｅｉｐｈａ、Ｅｐｐｅｌｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ
全てのγ線照射培地を、照射プロセスを維持するように補充した。
【００５６】
栄養培地の評価
栄養培地評価研究を、２つの部分で行った：最初の予備セレクション（ストレスをかけていない１０個の株による増殖促進試験、８個の寒天培地での試験）により４つの培地への削減がもたらされたが、それはこれらの培地のみをより綿密に検討することを意味した。ＦＴＭ−Ａ寒天培地、ブレインハートインフュージョン寒天培地、Ｒ２Ａ寒天培地およびＣｏｌｕｍｂｉａ寒天培地５％血液を、この予備セレクションで除外した。
【００５７】
栄養培地の評価において、次の４つの培地を詳細に試験した：トリプティックソイ寒天培地、ＣＤＣ嫌気性血液寒天培地、Ｓｃｈａｅｄｌｅｒ血液寒天培地およびＤｉｆｃｏ  Ｂｒｅｗｅｒ嫌気性寒天培地。ストレスをかけた状態、およびストレスをかけていない状態の両方で播種した２２個の株のそれぞれに関して、得られたデータを群分けし、そしてＡＮＯＶＡを用いて統計解析した。３つのインキュベーションパラメーター、２０℃〜２５℃および３０℃〜３５℃好気性インキュベーションおよび３０℃〜３５℃嫌気性インキュベーション、および各微生物に対する２つの異なるストレス状態（ストレスをかけたおよびストレスをかけていない）により、各微生物に関して６つの群が形成される（×２２個の株）。これらの群のそれぞれのＡＮＯＶＡを行い、良好な増殖促進特性のクレジットを、各寒天培地の２２微生物に関してまとめた。もしそれが最も高いカウントを達成したなら、１クレジットをその群／寒天培地に与えた。この最も高いカウントの寒天培地と有意差を有さない群／寒天培地も１クレジットを得た。
【００５８】
２０℃〜２５℃好気性インキュベーション群では、Ｓｃｈａｅｄｌｅｒ血液寒天培地が３０クレジットを集め、ＣＤＣ嫌気性血液寒天培地は２７クレジット、トリプティックソイ寒天培地は２４、およびＤｉｆｃｏ  Ｂｒｅｗｅｒ嫌気性寒天培地は１７クレジットを集めた［表３Ａおよび３Ｂ］。Ｐ．ａｃｎｅｓおよびＣｌ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓは好気的に増殖しないので、クレジットを集めなかった。ストレスをかけたＡ．ｎｉｇｅｒ、Ｂ．ｐｕｍｉｌｉｓ、Ｂ．ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓおよびＢ．ｉｄｒｉｅｎｓｉｓは、全ての試験した寒天培地における低いカウント（０−５ＣＦＵ）のために０クレジットであった。
【００５９】
【表３Ａ】
0005881599.tif 000004
【００６０】
【表３Ｂ】
0005881599.tif 000005
３０℃〜３５℃好気性インキュベーション群において、Ｓｃｈａｅｄｌｅｒ血液寒天培地は２８クレジットを集め、トリプティックソイ寒天培地は２８クレジットを集め、ＣＤＣ嫌気性血液寒天培地は２７クレジット、およびＤｉｆｃｏ  Ｂｒｅｗｅｒ嫌気性寒天培地は２４クレジットを集めた［表４Ａおよび４Ｂ］。Ｐ．ａｃｎｅｓおよびＣｌ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓは好気的に増殖しないので、クレジットを集めなかった。ストレスをかけたＢ．ｉｄｒｉｅｎｓｉｓおよびＭ．ｏｓｌｏｅｎｓｉｓは、低いカウント（０〜５ＣＦＵ）のために０クレジットであった。
【００６１】
【表４Ａ】
0005881599.tif 000006
【００６２】
【表４Ｂ】
0005881599.tif 000007
３０℃〜３５℃嫌気性インキュベーション群において、ＣＤＣ嫌気性血液寒天培地は２５クレジットを集め、Ｓｃｈａｅｄｌｅｒ血液寒天培地は２５クレジット、トリプティックソイ寒天培地は２１クレジット、そしてＤｉｆｃｏ  Ｂｒｅｗｅｒ嫌気性寒天培地は１７クレジットを集めた［表５Ａおよび５Ｂ］。ストレスをかけたＢ．ｉｄｒｉｅｎｓｉｓは、低いカウント（０〜５ＣＦＵ）のために０クレジットであった。
【００６３】
【表５Ａ】
0005881599.tif 000008
【００６４】
【表５Ｂ】
0005881599.tif 000009
それらのデータは、Ｓｃｈａｅｄｌｅｒ血液寒天培地が、好気性条件で最もよい増殖促進特性を有しており、嫌気性条件においてＳｃｈａｅｄｌｅｒ血液寒天培地はＣＤＣ嫌気性血液寒天培地と同じ量のクレジットを得たことを示している。従って、２２個の試験株のために、および３つの試験したインキュベーションパラメーターのために適当な寒天培地としてＳｃｈａｅｄｌｅｒ血液寒天培地を選択した。Ｓｃｈａｅｄｌｅｒ血液寒天培地（１３）の組成（ｈｅｉｐｈａ、Ｅｐｐｅｌｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙによって改変された）は以下のとおりである：カゼインペプトン１０ｇ、大豆フラワーペプトン１ｇ、肉ペプトン２ｇ、肉抽出物（ｅｘａｃｔ）１ｇ、酵母抽出物５ｇ、グルコース２ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、リン酸水素二カリウム２．５ｇ、寒天細菌学的グレード１４ｇ、ヒツジ血液５０ｍｌ、アミノ酸、緩衝剤、ヘミン、ビタミンＫ、ガンマ線照射：９〜２０ｋＧｙ。
【００６５】
２０℃〜２５℃および３０℃〜３５℃における好気性インキュベーションの間の差
インキュベーション温度２０℃〜２５℃および３０℃〜３５℃（好気性インキュベーション）の間に有意差が存在するかどうかを示すために、栄養培地評価からのデータを用いてｔ−検定を行った。
【００６６】
ストレスをかけた状態、およびストレスをかけていない状態の両方で全ての好気性微生物（Ｃｌ．ｓｐｏｒｕｇｅｌｏｅｓおよびＰ．ａｃｎｅｓを除く）から成る４０個の群についてｔ−検定を行った。４０個の群のうち１１個の群において有意差が生じた。２０℃〜２５℃の群と比較して、インキュベーションパラメーター３０℃〜３５℃は５回、より高い量のコロニー形成単位（同じ接種材料に由来する）を示した。２０℃〜２５℃群は、６つの場合においてより高い値を生じた。ｔ−検定はその温度の間に有意差が存在することを示した。４０例のうち１１例においてその差が有意であったので、迅速無菌試験において両方のインキュベーション温度を検証することが必要である。これらの結果は、従来の無菌試験だけでなく、本迅速無菌試験に関しても、両方のインキュベーション温度の重要性を強調する。
【００６７】
データの統計解析
生データの統計解析のために、Ｍｉｎｉｔａｂ（登録商標）  Ｒｅｌｅａｓｅ  １４．２０  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅにおいて実行する以下の方法を使用した。
【００６８】
ＡＮＯＶＡ（分散分析）は平均値を比較する。ＡＮＯＶＡは、反応変数および１つ以上の独立変数の間（群間）の関係を調査およびモデリングするために使用するので、回帰分析と同様である。それは仮説検定を用い、これは帰無仮説を検定することを意味する。ＡＮＯＶＡはｐ値を生じる。ｐ値は、第１種過誤を起こす可能性を表わすか、またはそれが真である場合には帰無仮説を否定する。カットオフ値は０．０５である−ｐ値が９５％の信頼限界に対応する０．０５より低い場合には帰無仮説が否定される。
【００６９】
ＡＮＯＶＡ分析を使用する必要条件は：
・４つの亜群（栄養培地）の正規分布、ｐ値≧０．０５
・Ｂａｒｔｌｅｔｔ’ｓ  Ｔｅｓｔを用いた等分散の検定：ｐ値≧０．０５、および
・Ｌｅｖｅｎｅ’ｓ  Ｔｅｓｔ：ｐ値≧０．０５。
【００７０】
ＡＮＯＶＡのｐ値≧０．０５は、亜群／寒天培地の間に有意差は存在しないことを意味し、ｐ値＜０．０５は、亜群／寒天培地の間に有意差が存在することを意味する。最も高い平均値に対して有意差を示さない全ての寒天培地（最も高い平均値を有するものを含む）を、１クレジットと評価した。最も高い平均値に対して有意差を示した寒天培地には、クレジットを与えなかった。Ｄｉｘｏｎ’ｓ  Ｔｅｓｔを用いて、域外値分析を行った（Ｗ．Ｊ．Ｄｉｘｏｎ、Ａｎｎ．Ｍａｔｈ．Ｓｔａｔｉｓｔ．２１：４８８−５０６（１９５０）；Ｗ．Ｊ．Ｄｉｘｏｎ、Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ．９：７４−８９（１９５３）；ＵＳＰ＜１０１０＞「Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｄａｔａ−ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」、Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ  Ｆｏｒｕｍ．ＵＳＰ３０−ＮＦからＳｅｃｏｎｄ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．）。このために、試験中の観察のセットを含むＮ値を、昇順に配置した：Ｘ１＜Ｘ２＜・・・＜ＸＮ。次いで統計実験Ｑ値（Ｑｅｘｐ）を計算した。これは、疑わしい値の範囲で割った、疑わしい値のその最も近い値からの差として定義される比である（Ｑ：棄却商（ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ  ｑｕｏｔｉｅｎｔ））。従って、ｘ１またはＸＮ（潜在的な域外値として）を試験するために、以下のＱｅｘｐ値を使用した：
得られたＱｅｘｐ値を、表において見出される棄却Ｑ値（Ｑｃｒｉｔ）と比較した。もしＱｅｘｐ＞Ｑｃｒｉｔなら、疑わしい値を域外値として特徴付けすることができ、そしてそれを拒絶し得る。もしそうでなければ、その疑わしい値を保持し、そして続く計算の全てにおいて使用しなければならない。ＡＮＯＶＡを実施し得る他の方法は、以下のものである：正規分布に従わない、そして他の亜群より有意に低い亜群（群内の４つの栄養培地）を、それらはＡＮＯＶＡに不適切であるので除外した。もし群内の亜群のＣＦＵ値が低すぎたなら（０〜５ＣＦＵ）、４かける０クレジット（４  ｔｉｍｅｓ  ０  ｃｒｅｄｉｔｓ）の最終結果を与えた。全ての他の場合において、再テストを行わなければならなかった。ｔ−検定（Ｍｉｎｉｔａｂ（登録商標）  Ｒｅｌｅａｓｅ  １４．２０  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅも用いる）を用いて、２つのサンプルの平均値を比較する；ｔ−検定は、データ中の偏差（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）と関連して２つの平均値の間の実際の差を比較する（平均値の間の差の標準偏差として表す）。
【００７１】
Ｃ．Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｌｌｉｆｌｅｘ（登録商標）  Ｒａｐｉｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍの一般的な説明
試験中のサンプル（膜における微生物の適切な分布を保証するために、１００ｍｌのすすぎ洗い用流体中で希釈された）を、Ｍｉｌｌｉｆｌｅｘ（Ｍｉｆｌｉｆｌｅｘ）（登録商標）  ＰＬＵＳポンプを用いて、Ｍｉｌｌｉｆｌｅｘ（登録商標）Ｒａｐｉｄフィルターでろ過し、可能性のある混入物は、フィルターメンブランにおいてトラップされる（孔径：０．４５μｍ）。
【００７２】
ろ過後、フィルターを、Ｍｉｌｌｉｆｌｅｘ（登録商標）システムを用いて固体栄養培地に適用し、ここでその滅菌Ｍｉｌｌｉｆｌｅｘ（登録商標）フィルターは、Ｍｉｌｌｉｆｌｅｘ（登録商標）カセット上でカチッとはまり、そして漏斗がはずれる。このメンブランを栄養培地に移動するＭｉｌｌｉｆｌｅｘ（登録商標）システムのために、メンブランの取り扱いによる２次混入のリスクは低い、または無い。カセットはきつく閉じられているので、インキュベーションの間の２次混入のリスクは低い。フィルターをＭｉｌｌｉｆｌｅｘ（登録商標）カセットでインキュベートすることによって、潜在的な混入物（複数可）のミクロコロニーへの増殖が起こり得る。インキュベーション時間の終わりに、フィルターをＭｉｌｌｉｆｌｅｘ（登録商標）カセットから分離し、そして層状フローフード内のＡｕｔｏｓｐｒａｙ  Ｓｔａｔｉｏｎに適用する。Ｍｉｌｌｉｆｌｅｘ（登録商標）  Ｒａｐｉｄにおける検出のために、ミクロコロニーは一定のサイズ（約１０〜１００個の酵母細胞、１０００個の細菌細胞）を有さなければならないので、インキュベーション後の工程は、２次的混入に関して重要な工程ではない。もし環境微生物または操作者由来の微生物が、インキュベーション後の工程の間にメンブランに加わるとしても、インキュベーションの欠如、そして従って検出のために必要な一定の量のＡＴＰの欠如のために、それは検出されない。
【００７３】
ＡｕｔｏＳｐｒａｙ  Ｓｔａｔｉｏｎは、ＡＴＰ放出薬剤、およびその後生物発光試薬をメンブランにスプレーする。
【００７４】
ここで示した反応化学が、Ｍｉｌｌｉｆｌｅｘ（登録商標）  Ｒａｐｉｄ検出の基礎である（Ｗ．Ｄ．ＭｃＥｌｒｏｙ、Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５：１１９−１６６（１９６３））。
【００７５】
ルシフェリン（ｌｕｃｉｆｅｒａｎ）＋ＡＴＰ  ルシフェラーゼ、Ｍｇ２＋  →  オキシルシフェリン＋ＡＭＰ＋ｈｖ（λ＝５６２ｎｍ）
（Ｍｇ２＋はマグネシウム、ＡＴＰはアデノシン３リン酸、ＡＭＰはアデノシン１リン酸、ｈｖは放出された光子、λは波長を意味する）  。
【００７６】
放出された光子を最大限捕捉するために、Ａｕｔｏｓｐｒａｙ  Ｓｔａｔｉｏｎから、Ｍｉｌｌｉｆｌｅｘ（登録商標）  Ｒａｐｉｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｔｏｗｅｒへのスプレーしたメンブランの迅速な移動が必要である。可能な光シグナルを、ＣＣＤカメラ（電荷結合素子）で検出し、そしてＭｉｌｌｉｆｌｅｘ（登録商標）、Ｒａｐｉｄソフトウェアのアルゴリズムがミクロコロニーの量を計算する。
【００７７】
Ｍｉｌｌｉｆｌｅｘ（登録商標）  Ｒａｐｉｄ検出において生物発光バックグラウンドはない
Ｍｉｌｌｉｆｌｅｘ（登録商標）  Ｒａｐｉｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍにおいて、Ｓｃｈａｅｄｌｅｒ血液寒天培地を使用するので、この培地が生物発光バックグラウンドを生じるかどうかを決定するために試験を行った。このために、培地のカセットを、１００ｍｌの流体Ａまたは流体Ｄのいずれかですすぎ洗いした、ＭＸＨＶＷＰ１２４メンブラン（ポリフッ化ビニリデンメンブラン、孔径０．４５μｍ）とインキュベートした。インキュベーション温度は３０℃〜３５℃であり、５日間インキュベートした。図１１は、Ｓｃｈａｅｄｌｅｒ血液寒天培地由来の生物発光バックグラウンドはないことを示し、このことは、ガンマ線照射した栄養培地に妨害するＡＴＰは残っていないことを意味する。Ｓｃｈａｅｄｌｅｒ血液寒天培地は、Ｍｉｌｌｉｆｌｅｘ（登録商標）  Ｒａｐｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍにおいて使用するために適当である。
【００７８】
本明細書中で引用された全ての文書の教示全体は、これによって本明細書中で参考文献に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図４】
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【図１１】
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