(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＡＬＲ２の機能を調節する作用剤を識別する方法であって：ａ）  ニューロペプチドＱポリペプチドのＧＡＬＲ２ポリペプチドへの相互作用を許容する条件下で、候補調節剤の存在下及び非存在下にて、ＧＡＬＲ２ポリペプチドをニューロペプチドＱポリペプチドと接触させる工程；及びｂ）  ＧＡＬＲ２ポリペプチドのニューロペプチドＱポリペプチドへの相互作用を測定する工程であって、候補調節剤非存在下での相互作用に対する、候補調節剤存在下での相互作用の増大又は減少が、候補調節剤をＧＡＬＲ２の機能を調節する作用剤として識別する上記工程、を含む上記方法。
【請求項２】
ＧＡＬＲ２の機能を調節する作用剤を識別する方法であって：ａ）  ニューロペプチドＱポリペプチドのＧＡＬＲ２ポリペプチドへの相互作用を許容する条件下で、候補調節剤の存在下及び非存在下にて、ＧＡＬＲ２ポリペプチドをニューロペプチドＱポリペプチドに接触させる工程；及びｂ）  ＧＡＬＲ２ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する工程であって、候補調節剤非存在下における活性に対する、候補調節剤の存在下における活性の変化が、候補調節剤をＧＡＬＲ２の機能を調節する作用剤として識別する上記工程、を含む上記方法。
【請求項３】
ＧＡＬＲ２の機能を調節する作用剤を識別する方法であって：ａ）  ＧＡＬＲ２ポリペプチドを候補調節剤と接触させる工程；ｂ）  候補調節剤の存在下で、ＧＡＬＲ２ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する工程；及びｃ）  候補調節剤の存在下で測定した活性を、ＧＡＬＲ２ポリペプチドがニューロペプチドＱポリペプチドと接触するサンプル内で測定した活性と比較する工程であって、候補調節剤の存在下で測定した活性の量が、ＥＣ50で存在するニューロペプチドＱポリペプチドにより引き起こされる量の少なくとも５０％である場合に、当該候補調節剤をＧＡＬＲ２の機能を調節する作用剤として識別する上記工程、を含む上記方法。
【請求項４】
ＧＡＬＲ２の機能を調節する当該作用剤がサンプル中に存在する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
当該測定が、標識置換、表面プラズモン共鳴、蛍光共鳴エネルギー転移、蛍光消光及び蛍光偏光から選択される方法を用いて行われる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
当該ＧＡＬＲ２ポリペプチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２であり、かつ当該ニューロペプチドＱポリペプチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５であり、そして当該ニューロペプチドＱポリペプチドが当該ＧＡＬＲ２ポリペプチドに特異的に結合する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
当該ＧＡＬＲ２ポリペプチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８及びＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０から成る群より選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
当該ニューロペプチドＱポリペプチド配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１３、ＳＥＱ  ＩＤ
Ｎｏ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１５、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１から成る群より選択される、請求項１〜５又は７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
当該ニューロペプチドＱポリペプチド配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１３、ＳＥＱ  ＩＤ
Ｎｏ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１５及びＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１６から成る群より選択される、請求項１〜５又は７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
当該ニューロペプチドＱポリペプチドが検出可能に標識された、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
当該ＧＡＬＲ２ポリペプチドが細胞内又は細胞上で発現する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
当該ＧＡＬＲ２ポリペプチドが細胞膜内に存在する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
当該細胞が、ＣＯＳ−７−細胞、ＣＨＯ細胞、Ｕ２ＯＳ細胞、ＬＭ（ＴＫ−）細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ＨＥＫ細胞、Ｋ−５６２細胞及び１３２１Ｎ１星状細胞種細胞から成る群より選択される、請求項１１又は１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
当該ＧＡＬＲ２ポリペプチドが、合成リポソーム又はウイルス誘発性発芽膜上又はそれらの内部に存在する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
当該方法が、さらにＧα１６の存在下で行われる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
当該作用剤が、ペプチド、ポリペプチド、抗体又はその抗原結合フラグメント、脂質、炭水化物、核酸及び有機低分子から成る群より選択される、請求項１〜１５のいずれか１項
に記載の方法。
【請求項１７】
シグナル伝達活性を測定する工程が、グアニンヌクレオチドの結合又は交換、アデニルシクラーゼ活性、ｃＡＭＰ、ベータ−アレスチン１の移動、ベータ−アレスチン２の移動、プロテインキナーゼＣ活性、ホスファチジルイノシトールの分解、ジアシルグリセロール、イノシトール三リン酸、細胞内カルシウム、アラキドン酸、ＭＡＰキナーゼ活性、チロシンキナーゼ活性又はレポーター遺伝子発現の測定を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野
本発明は、Ｇタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）、ＧＡＬＲ２の新規なリガンドとしてのニューロペプチドＱ（Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ  Ｑ）の同定及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
Ｇタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）は、細胞内のシグナルの伝達を担うタンパク質である。通常、ＧＰＣＲは、７つの膜貫通部位を有する。リガンドがＧＰＣＲの部分又は断片に結合すると、シグナルが細胞内で伝達され、細胞の生物学的又は生理学的特性又は挙動の変化を引き起こす。Ｇ−タンパク質、エフェクター（細胞内酵素及びＧ−タンパク質により調節されるチャンネル）及びベーターアレスチンと共に、ＧＰＣＲは、細胞内二次メッセンジャーの状態を細胞外入力と結び付けるシグナル伝達系モジュールの構成要素である。ＧＰＣＲ遺伝子及び遺伝子産物は、様々な生理学的プロセスを調節することができ、そして疾患の潜在的な原因となる。ＧＰＣＲは、中枢神経系及び末梢生理学的プロセスの両方に対して重要であると思われる。ＧＰＣＲスーパーファミリーは、５つのファミリーに代表される：ファミリーＩ、ロドプシン及びベータ２−アドレナリンレセプターに代表されるレセプターで、現在、２００を超えるユニークなメンバーにより代表される；ファミリーＩＩ、副甲状腺ホルモン／カルシトニン／セクレチンレセプターファミリー；ファミリーＩＩＩ、メタボトロピックグルタミン酸レセプターファミリー；ファミリーＩＶ、ｃＡＭＰレセプターファミリー、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍの走化性及び成長に重要；及びファミリーＶ、ＳＴＥ２等の真菌類の接合フェロモンレセプター。Ｇタンパク質は、グアニンヌクレオチドに結合する、アルファ、ベータ及びガンマサブユニットから構成されるヘテロ３量体タンパク質のファミリーの代表である。通常、これらのタンパク質は、シグナル伝達のために細胞表面レセプター（７つの膜貫通部位を含むレセプター）に結合する。実際、ＧＰＣＲへのリガンドの結合に続き、コンフォメーションの変化がＧタンパク質に伝えられ、それは、アルファ−サブユニットに結合したＧＤＰ分子のＧＴＰ分子への変換及びアルファ−サブユニットのベータ／ガンマ−サブユニットからのかい離を引き起こす。アルファ、ベータ／ガンマ−サブユニットのＧＴＰ−結合形態は、典型的には、エフェクター調節部分として機能し、ｃＡＭＰ（例えば、アデニルシクラーゼの活性化により）、ジアシルグリセロール又はイノシトールリン酸等の２次メッセンジャーの生成に導く。
【０００３】
現在、機能が特定されていない既知のＧＰＣＲは、薬剤の作用及び開発の主要ターゲットを構成している。潜在的な予防及び治療特性を有する、新しいアゴニスト及びアンタゴニストのスクリーニングに使用することができる新規なＧＰＣＲを同定するための努力が続けられている。嗅覚レセプターを除外しても、今日までに、３００を超えるＧＰＣＲがクローニングされた。メカニズムから言えば、全臨床関連薬剤のおよそ５０−６０％が、様々なＧＰＣＲの機能を調節することにより作用する。
【０００４】
分子クローニングは、少なくとも３つのヒトガラニン（ｇａｌａｎｉｎ）レセプターサブタイプの存在を明らかにした（Ｈａｂｅｒｔ−Ｏｒｔｏｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：９７８０−９７８３、１９９４；Ｂｕｒｇｅｖｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ６：３３−４１、１９９５；Ｈｏｗａｒｄら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｓ．  ４０５：２８５−２９０、１９９７；Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７２：２４６１２−２４６１６、１９９７；Ｗａｎｇら、Ｍｏｌ．Ｐｈ
ａｒｍａｃｏｌ．  ５２：３３７−３４３、１９９７；Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７２：３１９４９−３１９５３、１９９７；Ａｈｍａｄら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ８６３：１０８−１１９、１９９８；Ｂｌｏｏｍｑｕｉｓｔら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．  ２４３：４７４−４７９、１９９８；Ｋｏｌａｋｏｗｓｋｉら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．  ７１：２２３９−２２５１、１９９８；Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７３：２３３２１−２３３２６、１９９８）。ガラニンレセプター２、別名ＧＡＬＲ２（ＳＥＱ  ＮＯ：１（ヒトポリヌクレオチド配列、図１）；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２（ヒトアミノ酸配列、図２）；ＳＥＱ  ＮＯ：３（マウスポリヌクレオチド配列、図３）；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４（マウスアミノ酸配列、図４）；ＳＥＱ  ＮＯ：５（ラットポリヌクレオチド配列、図５）；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６（ラットアミノ酸配列、図６）；ＳＥＱ  ＮＯ：７（アカゲザルポリヌクレオチド配列、図７）；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８（アカゲザルアミノ酸配列、図８）；ＳＥＱ  ＮＯ：９（チンパンジーポリヌクレオチド配列、図９）及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０（チンパンジーアミノ酸配列、図１０））はＧＰＣＲとして記述され、ガラニンレセプター１（ＧＡＬＲ１）及びガラニンレセプター３（ＧＡＬＲ３）と共に、３つのガラニンレセプターのうちの１つである。
【０００５】
ＧＡＬＲ２はラット視床下部抽出物から単離された（Ｈｏｗａｒｄら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｓ．  ４０５：２８５−２９０、１９９７；Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７２：２４６１２−２４６１６、１９９７；Ｗａｎｇら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ５２：３３７−３４３、１９９７）。このレセプターは、Ｇｉ／Ｇｏ、Ｇｑ／Ｇ１１又はＧ１２  Ｇ−タンパク質タイプと結合し、このことは、ガラニンレセプターのこのサブタイプが、刺激又は阻害効果を仲介し得ることを意味する。ＧＡＬＲ２はＣＮＳ内に広く分布するが、ＧＡＬＲ１の分布とは異なる。ラットにおいては、後根神経節（ＤＲＧ）が最も高いレベルのＧＡＬＲ２を発現するが（Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌら、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．  ４０９：４６９−４８１、１９９９；Ｗａｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｋｒａｕｓｅ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ９５：２６５−２７１、２０００）、ラットの青斑核（ＬＣ）及び背側縫線核（ＤＲＮ）領域においては、低レベルのＧＡＬＲ２  ｍＲＮＡが検出された（Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌら、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．  ４０９：４６９−４８１、１９９９）。マウスＧＡＬＲ２については、マウス脳においての報告はあるが、ＤＲＮにおいての報告は無い（Ｈａｗｅｓら、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．  ４７９：４１０−４２３、２００４）。
【０００６】
２９個のアミノ酸からなり、Ｃ末端がアミド化された神経ペプチド、ガラニンが最初に単離されたのは、ブタの腸管からであり（Ｔａｔｅｍｏｔｏら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  １６４：１２４−１２８、１９８３）、中枢及び末梢神経系の両方において広く発現している。ヒトでは、ガラニンは３０個のアミノ酸を有し、Ｃ−末端はアミド化されていない。ガラニンは、多くの古典的な神経伝達物質の放出を減少させることにより、シナプス伝達に対して強い阻害作用を有する（Ｆｉｓｏｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８４：７３３９−７３４３、１９８７；Ｍｉｓａｎｅ  ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  １０：１２３０−１２４０、１９９８；Ｐｉｅｒｉｂｏｎｅら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ６４：８６１−８７６、１９９５；Ｈｏｋｆｅｌｔら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ８６３：２５２−２６３、１９９８；Ｋｉｎｎｅｙら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  １８：３４８９−３５００、１９９８；Ｚｉｎｉら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ２４５：１−７、１９９３）。これらの阻害作用は種々の生理的効果を引き起こし、そのような生理的効果には、作業記憶障害（Ｍａｓｔｒｏｐａｏｌｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：９８４１−９８４５、１９９８）、長期増強（ＬＴＰ）の障害（Ｓａｋｕｒａｉら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．  ２１２：２１−２４、１９９６）及びｃＡＭＰ応答配列結合（ＣＲＥＢ）のリン酸化（Ｋｉｎｎｅｙら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅａｒｎ．Ｍｅｍ．  ９２：４２９−４３８
、２００９）、てんかん発作に対する素因の減少を伴う海馬興奮性の減少（Ｍａｚａｒａｔｉら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．  ５８９：１６４−１６６、１９９２）；及び無傷動物及び神経損傷後の侵害刺激反応の著しい阻害（Ｗｉｅｓｅｎｆｅｌｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９、３：３３４−３３３７、１９９２）が含まれる。ガラニンのこれらの神経調節作用は、長い間、神経系におけるこのペプチドの主要な役割であると考えられてきた。訓練に先だってガラニンをげっ歯類に脳室内投与すると、空間学習及び受動回避を含む広い範囲の仕事において成績が損なわれたことから（Ｃｒａｗｌｅｙ、Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．ＬｉｆｅＳｃｉ．  ６５：１８３６−１８４１、２００８）、ガラニンが、短期作業記憶及び長期連合記憶処理に関与することが示された。
【０００７】
神経細胞系の多くに対する損傷が、ｍＲＮＡ及びペプチドレベルの双方においてガラニンの発現を顕著に誘発することを示す大量の証拠がある。そのような精神的障害の研究の例には、末梢神経軸索切断に続くＤＲＧにおける（Ｈｏｋｆｅｌｔら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．  ８３：２１７−２２０、１９８７）、脳下垂体除去後の視床下部の巨大細胞分泌性ニューロンにおける（Ｖｉｌｌａｒら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ３６：１８１−１９９、１９９０）、前頭頭頂皮質除去後の背側縫線核（ＤＲ）及び視床における（Ｃｏｒｔｅｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７：７７４２−７７４６、１９９０）、内嗅皮質損傷後の海馬の分子層における（Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．  ２６６：４１−４４、１９９９）及び海馬采脳弓束離断（ｆｉｍｂｒｉａ  ｆｏｒｎｉｘ  ｂｕｎｄｌｅ  ｔｒａｎｓｅｃｔｉｏｎ）後の内側中隔（ＭＳ）及び垂直脚対角帯（ｖｅｒｔｉｃａｌ  ｌｉｍｂ  ｄｉａｇｏｎａｌ−ｂａｎｄ）（ｖｄＢ）における（Ｂｒｅｃｈｔら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．  ４８：７−１６、１９９７）、ガラニンの上方制御（ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）が含まれる。これらの研究により、多くの研究者が、ガラニンは、その古典的な神経調節効果に加えて、細胞の生存及び増殖を促進する役割を担っているものと推測するに至った。うつ病患者においてガラニンのレベルは変化する（Ｗｅｒｎｅｒ  ａｎｄ  Ｃｏｖｅｎａｓ、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１２０：４５５−７０、２０１０）。
【０００８】
ガラニンのＧＡＬＲ１及びＧＡＬＲ３レセプターへの結合が、アデニルシクラーゼを阻害することが示されており（Ｗａｎｇ及びＧｕｓｔａｆｓｏｎ、Ｄｒｕｇ  Ｎｅｗｓ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．  １１：４５８−６８、１９９８；Ｈａｂｅｒｔ−Ｏｒｔｏｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．  ９１：９７８０−９７８３、１９９４；Ｓｍｉｔｈ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７３：２３３２１−２３３２６、１９９８）、これは、阻害性Ｇｉ及び／又はＧｏタンパク質と共役することによる。対照的に、ガラニンによるＧＡＬＲ２の活性化は、Ｇｉ及び／又はＧｏタンパク質と共役することによりｃＡＭＰの放出を阻害し、Ｇｑと共役することによりホスホリパーゼＣ及びプロテインキナーゼＣ活性を刺激し、ひいては細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）カスケードを活性化し、そして、Ｇ１２タンパク質と共役することによりＲｈｏを活性化する（Ｆａｔｈｉら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｍｏｌ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．  ５１：４９−５９、１９９７；Ｈｏｗａｒｄら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ４０５：２８５−２９０、１９９７；Ｗａｎｇら、Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５２：３３７−３４３．１９９７；Ｗｉｔｔａｕら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９：４１９９−４２０９、２０００）。
【０００９】
レセプターサブタイプ特異的抗血清が存在しないこと及びレセプターサブタイプ特異的なガラニンリガンドの不足が、各レセプターの機能的役割の解析を妨害している。
【００１０】
ＧＡＬＲ２の活性化は、頭頸部扁平上皮細胞癌（ＨＮＳＣＣ）において細胞停止及びアポトーシスを誘導する（Ｋａｎａｚａｗａら、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｔａｒｇｅｔｓ．  １４：２８９−３０２、２０１０）。
【００１１】
ＷＯ０２／０９６９３４は、てんかんで起こるような痙攣発作の治療に使用し得る一群のガラニンアゴニスト化合物を開示する。このような化合物は、ＣＮＳ損傷に対して又は開心手術において無酸素性脳障害を予防するために使用できることが言及されている。Ｗｕらは、「ｇａｌｎｏｎ」と呼ばれる、ＷＯ０２／０９６９３４でクレームされた化合物の１つについての情報を公表した（Ｗｕら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ４８２：１３３−１３７、２００３）。Ｇａｌｎｏｎは、ＧＡＬＲ１とＧＡＬＲ２の両方を同等に活性化し、これらに対してアゴニスト活性を有する。てんかん、オピオイド依存及び摂食行動の研究におけるｇａｌｎｏｎの使用が、異なる著者により論じられている（Ｓａａｒら、（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９９：７１３６−７１４１、２００２）、Ｚａｃｈａｒｉｏｕら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００：９０２８−９０３３、２００３）及びＡｂｒａｍｏｖら、（Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ  ３８：５５−６１、２００３））。
【００１２】
重要な点は、現在のところ、ペプチド性のガラニンレセプターリガンドのレセプター選択性が懸念材料であることである。イン  ヴィトロ研究により、Ｍ６１７（ガラニン（１−１３）−Ｇｌｎ１４−ブラジキニン（２−９）−アミド）が、ＧＡＬＲ２と比べてＧＡＬＲ１に対して２５−倍のサブタイプ特異性を有し、一方、Ｍ８７１（ガラニン−（２-１３）−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−（Ｐｒｏ）３−（Ａｌａ−Ｌｅｕ）２−Ａｌａ−アミド）は、ＧＡＬＲ１よりも３２倍高い親和性でＧＡＬＲ２に結合することが示された（Ｍａｚａｒａｔｉら、Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ．３１８：７００−７０８、２００６）。イン  ヴィトロ及びイン  ヴィヴォ研究の双方が、Ｍ６１７はＧＡＬＲ１アゴニストとして作用し、Ｍ８７１はＧＡＬＲ２アンタゴニストとして作用するという見地を支持している（Ｍａｚａｒａｔｉら、Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ．３１８：７００−７０８、２００６）。ガラニン（２−１２）、すなわちＡＲ−Ｍ１８９６は、最初に、ナノモルレベルの親和性を有するＧＡＬＲ２選択的アゴニストとして記述された（Ｌｉｕら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  ９８：９９６０−９９６４、２００１）。しかし、その後、ＧＡＬＲ３レセプターを発現する組み換えＣＨＯ及びＣＯＳ−７細胞株において、ＡＲ−Ｍ１８９６が、マイクロモルレベル以下の親和性でＧＡＬＲ３レセプターに結合することが示された（Ｌｕら、Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ．  ３９：１４３−１４６、２００５）。従って、機能的な結果を解釈するときには、このリガンドのＧＡＬＲ３レセプターへの結合も考慮に入れることが重要である。ＡＲ−Ｍ１８９６のＤＲ内への注入は、海馬におけるセロトニン（５−ＨＴ）の放出を増大させた（Ｍａｚａｒａｔｉら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  ９５：１４９５−１５０３、２００５）。従って、ＤＲにおけるＧＡＬＲ２レセプターは、セロトニン作動性ニューロンの発火率と５−ＨＴの放出を増大させることが推定され、この作用は、ＧＡＬＲ２と共役する細胞内シグナル伝達カスケードと合致する（Ｗａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７：６７１１−６７１７、１９９８；Ｂｒａｎｃｈｅｋら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ  ２１：１０９−１１７、２０００；Ｌｕら、Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ．  ３９：１４３−１４６、２００５）。興味深いことに、抗うつ剤として普通に用いられる選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）であるフルオキセチンの長期投与は、ＤＲにおいて、ＧＡＬＲ２を上方制御するが、ＧＡＬＲ１は上方制御しない（Ｌｕら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０２：８７４−８７９、２００５）。Ｌｕらが示唆したように、ＧＡＬＲ２が実際にセロトニン作動性伝達を増強するならば、フルオキセチンのこの作用は、その抗うつ効果のメカニズムの１つかもしれない。ＧＡＬＲ２サブタイプは、神経伝達物質の放出に対するガラニン興奮作用を仲介するので（Ｂｒａｎｃｈｅｋら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ  ２１：１０９−１１７、２０００）、イン  ヴィヴォにおいて、ＡＲ−Ｍ１８９６は主としてＧＡＬＲ２レセプターアゴニストとして作用することは十分考えられる。
【００１３】
ペプチドホルモン又は神経ペプチドは、約３から５０残基に渡るアミノ酸鎖である。過去３０年間に、１００以上の小ペプチドが発見された（Ｈｏｋｆｅｌｔら、Ｌａｎｃｅｔ
Ｎｅｕｒｏｌ．  ２：４６３−４７２、２００３）。最初の神経ペプチドである物質Ｐは、１９３１年にＶｏｎ  ＥｕｌｅｒとＧａｄｄｕｍによって同定されたが、その正確な化学構造は１９７１年まで記述されなかった（Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔ．Ｎｅｗ．Ｂｉｏｌ．  ２３２：８６−８７、１９７１）。それらは大きなタンパク質（プレプロホルモン）内で見出され、成熟ホルモンの産生は通常特異的な法則に従う。プレプロホルモンは分泌ホルモンであり、プロセッシング及び分泌のために、そのタンパク質をゴルジ複合体から分泌胞内に輸送するのに必要なシグナル配列を有する。分泌胞において、分泌シグナルが除去され、プロホルモンとなる。神経ペプチドは合成され、そしてニューロンから中枢神経系（ＣＮＳ）及び末梢神経系（ＰＮＳ）へ放出され、それらはほとんど常に古典的な神経伝達物質と共存する（Ｈｏｋｆｅｌｔら、Ｎａｔｕｒｅ  ２８４：５２５−５２１、１９８０）。
【００１４】
神経ペプチドは、神経伝達物質、ホルモン及び成長因子として機能することができ、それらの作用はＧＰＣＲによって仲介される。
【００１５】
概して、ホルモンは、１対の塩基性残基、すなわち、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ａｒｇ又はＬｙｓ−Ｌｙｓ（切断部位）によって包囲され、この塩基性残基対はホルモンのすぐ隣に見出される。これらの二重塩基性残基はプロセッシング酵素の認識部位として作用し、プロセッシング酵素は通常セリンプロテアーゼであり、プロホルモンを切断して、活性（成熟）ペプチドを遊離する。多くの場合、１つの前駆タンパク質内に２以上の活性タンパク質が存在する。神経ペプチドのもう１つの共通の特徴は、Ｃ−末端に（通常のカルボキシル基の代わりに）アミド基が存在することであり、これは酵素的分解からの保護を提供し、かつ生物活性に必要である。多くの証拠は、神経系が、例えば、ストレス、精神的外傷を与えるような出来事、損傷又は薬物濫用にさらされた際に、神経ペプチドが特に重要であることを示しており、共発現する神経伝達物質の活性を調節する（Ｈｏｋｆｅｌｔら、Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ．  ２：４６３−４７２、２００３）。神経ペプチドの結合親和性は通常、ナノモルの範囲であり、それは、古典的な神経伝達物質よりも１０００倍以上高い。結果的に、神経ペプチドレセプターの選択性は高いため、調節剤の薬理的な介在により副作用が生じる可能性はより少ない。これらの特徴並びに多くの神経ペプチド及び神経ペプチドレセプターにより、ＣＮＳ疾患の治療に対する新しい薬剤ターゲットの発見の機会がもたらされる。
【００１６】
多くの神経ペプチドは、抗うつ薬の開発の潜在的ターゲットとして同定された。例えば、ノイロキニン１アンタゴニストは、大うつ病性障害に対し、ＳＳＲＩと同程度に効果的であることが報告されている（Ｋｒａｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：１６４０−１６４５、１９９８）。気分の調節及び不安に関連する他の神経ペプチドには、例えば、神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）、腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＦ）、ノシセプチン及びガラニンがある。
【００１７】
ニューロペプチドＱ、別名Ｓｐｅｘｉｎは、Ｍｉｒａｂｅａｕらにより最近発見されたホルモンである（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、１７：３２０−３２７、２００７）。著者らは、新しいペプチドホルモンを同定するために、いくつかのペプチドホルモン配列の特徴を集約したアルゴリズム探索に基づいてＨｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖ  Ｍｏｄｅｌ（ＨＭＭ）を開発した。予見されたニューロペプチドＱが平滑筋の収縮性を緩和することができるかどうかを試験するために、Ｍｉｒａｂｅａｕらは、胃外植片収縮性アッセイ（ｓｔｏｍａｃｈ  ｅｘｐｌａｎｔｓ  ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｉｔｙ  ａｓｓａｙ）において、合成アミド化ニューロペプチドＱ、ＮＷＴＰＱＡＭＬＹＬＫＧＡＱ−アミドについて試験を行った。ニューロペプチドＱは、０．７５μＭのＥＣ５０にて、胃の筋肉の収縮を用量依
存的に誘発した。
【００１８】
Ｈｓｕｅｈらにより、類似の配列を持つペプチドが発見され、コスメディンＢと命名された（ＵＳ２００５０２２１３５９）。コスメディンＢによる腹腔内処置により、胃内容排出活性が用量依存的に抑えられた。ラットの回腸組織片（ｉｌｅａｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ｓｔｒｉｐｓ）を用いた器官収縮アッセイにおいては、コスメディンＢと共にインキュベーションを行うと、濃度依存的な筋収縮が起こった。正規化処理（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）により、コスメディンＢによって誘発される収縮の大きさは、５−メチルフルメチド刺激ムスカリンレセプターにより介在される収縮に匹敵することが示された。
【発明の概要】
【００１９】
本発明は、ＧＰＣＲスーパーファミリーに属するＧＡＬＲ２レセプターのリガンドとしてのニューロペプチドＱの同定に関する。本発明は、ＧＡＬＲ２レセプターの活性を調節する作用剤のスクリーニングアッセイの基礎としての、ＧＡＬＲ２ポリペプチドとニューロペプチドＱとの相互作用の使用を包含する。本発明はまた、ＧＡＬＲ２／ニューロペプチドＱ相互作用を基礎とした診断アッセイ、並びに診断及びスクリーニングアッセイを行うためのキットを包含する。
【００２０】
本発明の種々の態様を以下に記述する：
１）  本発明は、ＧＡＬＲ２の機能を調節する作用剤を識別する方法に関し、当該方法は：ａ）  ニューロペプチドＱポリペプチドのＧＡＬＲ２ポリペプチドへの相互作用を許容する条件下で、候補調節剤の存在下及び非存在下にて、ＧＡＬＲ２ポリペプチドをニューロペプチドＱポリペプチドと接触させる工程；及びｂ）  ＧＡＬＲ２ポリペプチドのニューロペプチドＱポリペプチドへの相互作用を測定する工程であって、候補調節剤非存在下での相互作用に対する、候補調節剤存在下での相互作用の増大又は減少が、候補調節剤をＧＡＬＲ２の機能を調節する作用剤として識別する上記工程、を含む。
【００２１】
２）  本発明のさらなる態様は、サンプル中の、ＧＡＬＲ２の機能を調節する作用剤の存在を検出する方法に関し、当該方法は、ａ）  ニューロペプチドＱポリペプチドのＧＡＬＲ２ポリペプチドへの相互作用を許容する条件下で、サンプルの存在下及び非存在下にて、ＧＡＬＲ２ポリペプチドをニューロペプチドＱポリペプチドと接触させる工程；及びｂ）  ＧＡＬＲ２ポリペプチドのニューロペプチドＱポリペプチドへの相互作用を測定する工程であって、サンプル非存在下での相互作用に対する、サンプル存在下での相互作用の増大又は減少が、サンプル中のＧＡＬＲ２の機能を調節する作用剤の存在を示す上記工程、を含む。
【００２２】
３）  本発明のさらなる態様は、ＧＡＬＲ２の機能を調節する作用剤を識別する方法に関し、当該方法は：ａ）  ニューロペプチドＱポリペプチドのＧＡＬＲ２ポリペプチドへの相互作用を許容する条件下で、候補調節剤の存在下及び非存在下にて、ＧＡＬＲ２ポリペプチドをニューロペプチドＱポリペプチドに接触させる工程；及びｂ）  ＧＡＬＲ２ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する工程であって、候補調節剤非存在下における活性に対する、候補調節剤の存在下における活性の変化が、候補調節剤をＧＡＬＲ２の機能を調節する作用剤として識別する上記工程、を含む。
【００２３】
４）  本発明のさらなる態様は、サンプル中の、ＧＡＬＲ２の機能を調節する作用剤の存在を検出する方法に関し、当該方法は：ａ）  ニューロペプチドＱポリペプチドのＧＡＬＲ２ポリペプチドへの相互作用を許容する条件下で、サンプルの存在下及び非存在下にて、ＧＡＬＲ２ポリペプチドをニューロペプチドＱポリペプチドと接触させる工程；ｂ）
ＧＡＬＲ２ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する工程；及びｃ）  ＧＡＬＲ２及
びニューロペプチドＱポリペプチドを含み、サンプルを含まない反応において測定した活性の量を、ＧＡＬＲ２、ニューロペプチドＱポリペプチド及びサンプルを含む反応において測定した活性の量と比較する工程であって、サンプル非存在下における活性に対する、サンプル存在下における活性の変化が、サンプル中のＧＡＬＲ２の機能を調節する作用剤の存在を示す上記工程、を含む。
【００２４】
５）  本発明のさらなる態様は、ＧＡＬＲ２ポリペプチドのシグナル伝達を減少させる作用剤を識別する方法に関し、当該方法は：ａ）  ニューロペプチドＱポリペプチドのＧＡＬＲ２ポリペプチドへの相互作用を許容する条件下で、候補調節剤の存在下及び非存在下にて、ＧＡＬＲ２ポリペプチドをニューロペプチドＱポリペプチドと接触させる工程；ｂ）  候補調節剤の存在下及び非存在下にて、ＧＡＬＲ２ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する工程；及びｃ）  候補調節剤の存在下で測定した活性を、候補調節剤の非存在下で測定した活性と比較する工程であって、候補調節剤の非存在下における活性に対する、候補調節剤の存在下における活性の減少が、候補調節剤をＧＡＬＲ２ポリペプチドのシグナル伝達を減少させる作用剤として識別する上記工程、を含む。
【００２５】
６）  本発明のさらなる態様は、当該作用剤がアンタゴニストである、態様１）〜５）のいずれか１つに従う方法に関する。
【００２６】
７）  本発明のさらなる態様は、ＧＡＬＲ２の機能を調節する作用剤を識別する方法に関し、当該方法は：ａ）  ＧＡＬＲ２ポリペプチドを候補調節剤と接触させる工程；ｂ）
候補調節剤の存在下で、ＧＡＬＲ２ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する工程；及びｃ）  候補調節剤の存在下で測定した活性を、ＧＡＬＲ２ポリペプチドをニューロペプチドＱポリペプチドと接触させるサンプル内で測定した活性と比較する工程であって、候補調節剤の存在下で測定した活性の量が、ＥＣ５０で存在するニューロペプチドＱポリペプチドにより引き起こされる量の少なくとも５０％である場合に、当該候補調節剤をＧＡＬＲ２の機能を調節する作用剤として識別する上記工程、を含む。
【００２７】
８）  本発明のさらなる態様は、サンプル中の、ＧＡＬＲ２の機能を調節する作用剤の存在を検出する方法に関し、当該方法は：ａ）  ＧＡＬＲ２ポリペプチドをサンプルと接触させる工程；ｂ）  サンプルの存在下でＧＡＬＲ２ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する工程；及びｃ）  サンプルの存在下で測定した活性を、ＧＡＬＲ２ポリペプチドがニューロペプチドＱポリペプチドと接触する反応において測定した活性と比較する工程であって、サンプルの存在下で測定した活性の量が、ＥＣ５０で存在するニューロペプチドＱポリペプチドにより引き起こされる量の少なくとも２０％である場合に、ＧＡＬＲ２の機能を調節する作用剤が検出される上記工程、を含む。
【００２８】
９）  本発明のさらなる態様は、ＧＡＬＲ２ポリペプチドのシグナル伝達を増強する作用剤を識別する方法に関し、当該方法は：ａ）  ＧＡＬＲ２ポリペプチドを候補調節剤と接触させる工程；ｂ）  候補調節剤の存在下でＧＡＬＲ２ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する工程；及びｃ）  候補調節剤の存在下で測定した活性を、ＧＡＬＲ２ポリペプチドがニューロペプチドＱポリペプチドと接触する反応において測定した活性と比較する工程であって、候補調節剤の存在下で測定した活性の量が、ＥＣ５０で存在するニューロペプチドＱポリペプチドにより引き起こされる量の少なくとも１０％である場合に、当該候補調節剤をＧＡＬＲ２のシグナル伝達を増強する作用剤として識別する上記工程、を含む。
【００２９】
１０）  本発明のさらなる態様は、当該ニューロペプチドＱポリペプチドが、そのＥＣ５０付近で（そして好ましくはそのＥＣ５０で）存在する、態様７）〜９）のいずれか１つに従う方法に関する。
【００３０】
１１）  本発明のさらなる態様は、当該作用剤がアゴニストである、態様７）〜１０）のいずれか１つに従う方法に関する。
【００３１】
１２）  本発明のさらなる態様は、ＧＡＬＲ２の機能を調節する当該作用剤がサンプル中に存在する、態様１）〜１１）のいずれか１つに従う方法に関する。
【００３２】
１３）  態様１）〜１２）のいずれか１つに従う好ましい態様において、当該測定は、標識置換（ｌａｂｅｌ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）、蛍光共鳴エネルギー転移（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）、蛍光消光（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）及び蛍光偏光（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）（好ましくは標識置換、蛍光共鳴エネルギー転移及び蛍光偏光から、そしてより好ましくは標識置換及び蛍光共鳴エネルギー転移から）から選択される方法を用いて行われる。
【００３３】
１４）  本発明のさらなる態様は、当該ＧＡＬＲ２ポリペプチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２であり、かつ当該ニューロペプチドＱポリペプチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５であり（そして好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３、ＳＥＱであり）、そして当該ニューロペプチドＱポリペプチドが当該ＧＡＬＲ２ポリペプチドに特異的に結合する、態様１）〜１３）のいずれか１つに従う方法に関する。
【００３４】
１５）  本発明のさらなる態様は、当該ＧＡＬＲ２ポリペプチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８及びＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０から成る群より選択される、態様１）〜１３）のいずれか１つに従う方法に関する。
【００３５】
１６）  本発明のさらなる態様は、当該ＧＡＬＲ２ポリペプチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２である、態様１）〜１４）のいずれか１つに従う方法に関する。
【００３６】
１７）  本発明のさらなる態様は、当該ＧＡＬＲ２ポリペプチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４である、態様１）〜１３）のいずれか１つに従う方法に関する。
【００３７】
１８）  本発明のさらなる態様は、当該ＧＡＬＲ２ポリペプチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６である、態様１）〜１３）のいずれか１つに従う方法に関する。
【００３８】
１９）  本発明のさらなる態様は、当該ＧＡＬＲ２ポリペプチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８である、態様１）〜１３）のいずれか１つに従う方法に関する。
【００３９】
２０）  本発明のさらなる態様は、当該ＧＡＬＲ２ポリペプチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０である、態様１）〜１３）のいずれか１つに従う方法に関する。
【００４０】
２１）  本発明のさらなる態様は、当該ニューロペプチドＱポリペプチド配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１５、ＳＥＱ
ＩＤ  Ｎｏ：１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５、ＳＥＱ  ＩＤ
ＮＯ：２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎ
Ｏ：３２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１から成る群より選択される、態様１）〜１３）又は１５）〜２０）のいずれか１つに従う方法に関する。
【００４１】
２２）  本発明のさらなる態様は、当該ニューロペプチドＱポリペプチド配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５及びＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６から成る群より選択される（そして好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３及びＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４より選択され、そして最も好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３である）、態様１）〜２０）のいずれか１つに従う方法に関する。
【００４２】
２３）  本発明のさらなる態様は、当該ニューロペプチドＱポリペプチド配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４の少なくとも１０個のアミノ酸を含むフラグメントである、態様１）〜１３）又は１５）〜２０）のいずれか１つに従う方法に関する。
【００４３】
２４）  本発明のさらなる態様は、当該ニューロペプチドＱポリペプチド配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１より（好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０より）選択される、態様２３）に従う方法に関する。
【００４４】
２５）  本発明のさらなる態様は、当該ニューロペプチドＱポリペプチド配列がＳＥＱ
ＩＤ  Ｎｏ．２２である、態様２３）に従う方法に関する。
【００４５】
２６）  本発明のさらなる態様は、当該ニューロペプチドＱポリペプチド配列が、１個のアミノ酸がアラニンにより置換されたＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４である、態様１）〜１３）又は１５）〜２０）のいずれか１つに従う方法に関する。
【００４６】
２７）  本発明のさらなる態様は、当該ニューロペプチドＱポリペプチド配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５、ＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２より（好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１より）選択される、態様２６）に従う方法に関する。
【００４７】
２８）  本発明のさらなる態様は、当該ニューロペプチドＱポリペプチド配列が、１個のアミノ酸がプロリンにより置換されたＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４である、態様１）〜１３）又は１５）〜２０）のいずれか１つに従う方法に関する。
【００４８】
２９）  本発明のさらなる態様は、当該ニューロペプチドＱポリペプチド配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５、ＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：３６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１より（好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１より）選択される、態様２８）に従う方法に関する。
【００４９】
３０）  本発明のさらなる態様は、当該ニューロペプチドＱポリペプチドが、当該ＧＡ
ＬＲ２ポリペプチドに特異的に結合する、態様１）〜２９）のいずれか１つに従う方法に関する。
【００５０】
３１）  本発明の好ましい態様は、ニューロペプチドＱポリペプチドが検出可能に標識された、態様１）〜３０）のいずれか１つに従う方法に関する。当該ニューロペプチドＱポリペプチドは、放射性同位体、蛍光体、蛍光消光剤、酵素、アフィニティー・タグ及びエピトープタグから成る群より（好ましくは、放射性同位体、蛍光体及びエピトープタグから成る群より、そしてより好ましくは、放射性同位体及び蛍光体から成る群より）選択される種で検出可能に標識されることが好ましい。
【００５１】
３２）  本発明のさらなる態様は、当該ＧＡＬＲ２ポリペプチドが細胞内又は細胞上で発現する、態様１）〜３１）のいずれか１つに従う方法に関する。
【００５２】
３３）  本発明のさらなる態様は、当該接触が、当該ＧＡＬＲ２ポリペプチドを発現する細胞内又は細胞上で行われる、態様１）〜３２）のいずれか１つに従う方法に関する。
【００５３】
３４）  本発明のさらなる態様は、当該ＧＡＬＲ２ポリペプチドが細胞膜内に存在する、態様１）〜３１）のいずれか１つに従う方法に関する。
【００５４】
３５）  本発明のさらなる態様は、当該細胞が、ＣＯＳ−７−細胞、ＣＨＯ細胞、Ｕ２ＯＳ細胞、ＬＭ（ＴＫ−）細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ＨＥＫ細胞、Ｋ−５６２細胞及び１３２１Ｎ１星状細胞種細胞から成る群より選択される、態様３２）〜３４）のいずれか１つに従う方法に関する。
【００５５】
３６）  本発明のさらなる態様は、当該ＧＡＬＲ２ポリペプチドが、合成リポソーム又はウイルス誘発性発芽膜上又はそれらの内部（そして好ましくはウイルス誘発性発芽膜上又はそれらの内部）に存在する、態様１）〜３１）のいずれか１つに従う方法に関する。
【００５６】
３７）  本発明のさらなる態様は、当該接触が、ＧＡＬＲ２ポリペプチドを含有する合成リポソーム（Ｔａｊｉｂら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１８：６４９−６５４、２０００）又はウイルス誘発性発芽膜上又はそれらの内部で行われる、態様１）〜３１）又は３６）のいずれか１つに従う方法に関する。
【００５７】
３８）  本発明のさらなる態様は、当該方法が、さらにＧα１６の存在下で行われる、態様１）〜３７）のいずれか１つに従う方法に関する。
【００５８】
３９）  本発明のさらなる態様は、当該方法が、ＧＡＬＲ２ポリペプチドを発現する細胞からの膜画分を用いて行われる、態様１）〜３８）のいずれか１つに従う方法に関する。
【００５９】
４０）  本発明のさらなる態様は、作用剤が、ペプチド、ポリペプチド、抗体又はその抗原結合フラグメント、脂質、炭水化物、核酸及び有機低分子から成る群より、好ましくはペプチド、ポリペプチド、抗体又はその抗原結合フラグメント及び有機低分子から成る群より、そしてより好ましくはペプチド、ポリペプチド及び有機低分子から成る群より選択される、態様１）〜３９）のいずれか１つに従う方法に関する。最も好ましくは、作用剤は有機低分子である。
【００６０】
４１）  本発明のさらなる態様は、当該ＧＡＬＲ２ポリペプチドへの結合の測定が、２次メッセンジャーのレベルの変化の検出を含む、態様１）〜４０）のいずれか１つに従う方法に関する。
【００６１】
４２）  本発明のさらなる態様は、ＧＡＬＲ２ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する工程が、２次メッセンジャーのレベルの変化の検出を含む、態様１）〜４０）のいずれか１つに従う方法に関する。
【００６２】
４３）  本発明のさらなる態様は、シグナル伝達活性を測定する工程が、グアニンヌクレオチドの結合又は交換、アデニルシクラーゼ活性、ｃＡＭＰ、ベータ−アレスチン１の移動、ベータ−アレスチン２の移動、プロテインキナーゼＣ活性、ホスファチジルイノシトールの分解、ジアシルグリセロール、イノシトール三リン酸、細胞内カルシウム、アラキドン酸、ＭＡＰキナーゼ活性、チロシンキナーゼ活性又はレポーター遺伝子発現の測定を含む、態様１）〜４２）のいずれか１つに従う方法に関する。
【００６３】
４４）  好ましい態様において、態様４３）に従うシグナル伝達活性の測定は、ベータ−アレスチンアッセイ（ｂｅｔａ−ａｒｒｅｓｔｉｎ−ｂａｓｅｄ  ａｓｓａｙ）の使用を含む。
【００６４】
４５）  別の好ましい態様において、態様４３）に従うシグナル伝達活性の測定は、ＦＬＩＰＲアッセイ又はイクオリンアッセイ、そして好ましくはイクオリンアッセイの使用を含む。
【００６５】
４６）  本発明のさらなる態様は、ＧＡＬＲ２シグナル伝達の異常により特徴づけられる疾患又は障害を診断する方法に関し、当該方法は：ａ）  組織サンプルを、ニューロペプチドＱポリペプチドに特異的な抗体に接触させる工程；ｂ）  抗体の組織サンプルへの結合を検出する工程；及びｃ）  工程（ｂ）で検出された結合を標準と比較する工程であって、標準に対する結合性の違いがＧＡＬＲ２の異常により特徴づけられる疾患又は障害の診断である上記工程を含む。
【００６６】
４７）  本発明のさらなる態様は、ＧＡＬＲ２シグナル伝達の異常により特徴づけられる疾患又は障害を診断する方法に関し、当該方法は：ａ）  組織サンプルを、ＧＡＬＲ２ポリペプチドに特異的な抗体及びニューロペプチドＱポリペプチドに特異的な抗体に接触させる工程；ｂ）  抗体の組織サンプルへの結合を検出する工程；及びｃ）  工程（ｂ）で検出された結合を標準と比較する工程であって、標準に対する、いずれかの抗体又は両方の抗体の結合性の違いがＧＡＬＲ２の異常により特徴づけられる疾患又は障害の診断である上記工程を含む。
【００６７】
４８）  本発明のさらなる態様は、ＧＡＬＲ２シグナル伝達の異常により特徴づけられる疾患又は障害を診断する方法に関し、当該方法は：ａ）  組織サンプルから核酸を単離する工程；ｂ）  核酸を鋳型として用いてニューロペプチドＱポリヌクレオチドを増幅する工程；及びｃ）  工程（ｂ）で生成した増幅されたニューロペプチドＱポリヌクレオチドの量を標準と比較する工程であって、標準に対する、増幅されたニューロペプチドＱポリヌクレオチドの量の違いが、ＧＡＬＲ２の異常により特徴づけられる疾患又は障害の診断である上記工程、を含む。好ましい態様において、増幅工程はＲＴ／ＰＣＲを含む。別の好ましい態様において、当該量を比較する工程は、マイクロアレイ試験内において行われる。
【００６８】
４９）  本発明のさらなる態様は、ＧＡＬＲ２シグナル伝達の異常により特徴づけられる疾患又は障害を診断する方法に関し、当該方法は：ａ）  組織サンプルから核酸を単離する工程；ｂ）  核酸を鋳型として用いてニューロペプチドＱポリヌクレオチドを増幅する工程；及びｃ）  工程（ｂ）で生成した増幅されたニューロペプチドＱポリヌクレオチドの配列を標準と比較する工程であって、標準に対する配列における違いが、ＧＡＬＲ２
の異常により特徴づけられる疾患又は障害の診断である上記工程、を含む。好ましい態様において、増幅工程はＲＴ／ＰＣＲを含む。別の好ましい態様において、標準はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１である。別の好ましい態様において、配列を比較する当該工程はミニ配列分析を含む。別の好ましい態様において、配列を比較する当該工程は、マイクロアレイ試験内において行われる。
【００６９】
５０）  本発明のさらなる態様は、単離したＧＡＬＲ２ポリペプチド及び単離したニューロペプチドＱポリペプチドを含む組成物に関する。
【００７０】
５１）  本発明のさらなる態様は、単離したＧＡＬＲ２ポリペプチド及びその包装材を含む、ＧＡＬＲ２シグナル伝達を調節する作用剤のスクリーニング又はＧＡＬＲ２ポリペプチドの異常により特徴づけられる疾患又は障害の診断のためのキット（そして特に、ＧＡＬＲ２シグナル伝達を調節する作用剤のスクリーニングのためのキット）に関する。好ましい態様において、当該キットはさらにニューロペプチドＱポリペプチドを含む。
【００７１】
本発明に従う診断用キットは、例えば、組織サンプル又は組織サンプルから調製した抽出物が、上昇したニューロペプチドＱ又はＧＡＬＲ２のレベル又は活性を有するか否かの決定を可能にする。当該キットはまた、ＧＡＬＲ２又はニューロペプチドＱポリペプチドをコードする遺伝子における突然変異の識別及びＧＡＬＲ２又はニューロペプチドＱポリペプチドをコードする核酸のレベルの異常の検出を可能にするものであってもよい。
【００７２】
類似の組織サンプル又は類似の組織サンプルから調製した抽出物から一般的に観察されるレベルと比較して、組織サンプル又は組織サンプルから調製した抽出物において、レベルが１０％以上上昇する場合には、ニューロペプチドＱ又はＧＡＬＲ２は「上昇したレベル」を有する。
【００７３】
一般的に観察されるレベルと比較して、レベルが１０％以上増大又は減少する場合には、ＧＡＬＲ２又はニューロペプチドＱポリペプチドをコードする核酸は「異常なレベル」を有する。
【００７４】
５２）  本発明のさらなる態様は、ＧＡＬＲ２ポリペプチドをコードする単離したポリヌクレオチド及びその包装材を含む、ＧＡＬＲ２シグナル伝達を調節する作用剤のスクリーニング又はＧＡＬＲ２ポリペプチドの異常により特徴づけられる疾患又は障害の診断のためのキット（そして特に、ＧＡＬＲ２シグナル伝達を調節する作用剤のスクリーニングのためのキット）に関する。好ましい態様において、当該キットはさらに、ニューロペプチドＱポリペプチドをコードする単離したポリヌクレオチドを含む。
【００７５】
５３）  本発明のさらなる態様は、ＧＡＬＲ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドでトランスフォームされた細胞及び及びその包装材を含む、ＧＡＬＲ２シグナル伝達を調節する作用剤のスクリーニング又はＧＡＬＲ２ポリペプチドの異常により特徴づけられる疾患又は障害の診断のためのキット（そして特に、ＧＡＬＲ２シグナル伝達を調節する作用剤のスクリーニングのためのキット）に関する。好ましい態様において、当該キットはさらに、ニューロペプチドＱポリペプチドをコードする単離したポリヌクレオチド又はニューロペプチドＱポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する細胞を含む。
【００７６】
本明細書で使用する「ＧＡＬＲ２ポリペプチド」という用語は、下記の２つの本質的な特性を有するポリペプチドを意味する：１）  ＧＡＬＲ２ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ
ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０（そして特に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）に対し、少な
くとも７０％のアミノ酸相同性、そして好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、そして特に１００％のアミノ酸相同性を有し；そして２）  ＧＡＬＲ２ポリペプチドはＧＡＬＲ２活性を有する、すなわち、当該ポリペプチドは、ニューロペプチドＱポリペプチド又はその機能的フラグメントに反応する。最適な場合には、「ＧＡＬＲ２ポリペプチド」はまた、本明細書で定義したＧＡＬＲ２シグナル伝達活性を有する。
【００７７】
本明細書で使用する「ＧＡＬＲ２ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書で定義したＧＡＬＲ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。
【００７８】
本明細書で使用する「ＧＡＬＲ２活性」という用語は、ＧＡＬＲ２ポリペプチドによる、ニューロペプチドＱポリペプチド又はその機能性フラグメントの特異的結合を意味する。
【００７９】
本明細書で使用する「ＧＡＬＲ２シグナル伝達活性」という用語は、ＧＡＬＲ２ポリペプチドによるシグナル伝達の開始又は伝播を意味する。ＧＡＬＲ２シグナル伝達活性は、下記の１又は２以上をアッセイすることにより、シグナル伝達カスケードの検出可能な工程を計測することによりモニターされる：Ｇタンパク質上のＧＴＰ交換に対するＧＤＰの刺激；ベータ−アレスチン１の移動；ベータ−アレスチン２の移動；アデニルシクラーゼ活性の変化；プロテインキナーゼＣの調節；（２次メッセンジャー、ジアシルグリセロール及びイノシトール三リン酸を生成する）ホスファチジルイノシトールの分解；細胞内カルシウムの流動；ＭＡＰキナーゼの活性化；チロシンキナーゼの調節；遺伝子の調節又はレポーター遺伝子活性。測定可能な活性が、下記のＧＡＬＲ２活性のアッセイのいずれかに関して、ニューロペプチドＱポリペプチドの実質的非存在下で得られたベースラインから１０％以上上がり又は下がった場合に、シグナル伝達カスケードにおける検出可能な工程が開始され又は増幅されたと考える。測定可能な活性は、例えばベータ−アレスチンの移動の測定におけるように、直接測定することができる。あるいは、測定可能な活性は、（例えば、レポーター遺伝子アッセイにより）間接的に定量化することができる。
【００８０】
本明細書で使用する「検出可能な工程」という用語は、例えば、２次メッセンジャーの測定又は修飾（例えばリン酸化）タンパク質の検出により直接的に、あるいは、例えばその工程の下流の効果をモニターすることにより間接的に測定することができる工程を意味する。例えば、アデニルシクラーゼの活性化によりｃＡＭＰが生成する。アデニルシクラーゼの活性は、例えば、その試験においてｃＡＭＰの産生をモニターするアッセイにより直接的に、あるいはｃＡＭＰの実際のレベルの計測により間接的に計測することができる。
【００８１】
本明細書で使用する「単離された」という用語は、その組成において、異なる性質を有する共雑分子を５０（重量）％未満、好ましくは４０％未満、より好ましくは２０％未満、そして最も好ましくは２％未満含む、分子、例えばポリペプチド又はポリヌクレオチドの集合を意味する。「単離された」という用語がＧＡＬＲ２ポリペプチドに適用される場合には、その語は、特に、脂質膜に結合し又は脂質膜に組み込まれたＧＡＬＲ２ポリペプチドをも包含することを意味する。
【００８２】
本明細書で使用する「ニューロペプチドＱポリペプチド」という用語は、ＳＥＱ  ＩＤ
ＮＯ：２の配列を有するＧＡＬＲ２ポリペプチドに特異的に結合し、かつ／又はそのシグナル伝達活性を活性化するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６で表されるポリペプチドに対して（特に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３で表されるポリペプチドに対して）、少なくとも３１％の相同性、そして好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％、最
も好ましくは少なくとも９５％、そして特に１００％の相同性を有するポリペプチドを意味する。「ニューロペプチドＱポリペプチド」はまた、上記の定義に合致するポリペプチドのフラグメントであって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の全長ポリペプチドの結合活性及び／又はシグナル伝達活性のレベルの少なくとも１０％（好ましくは、少なくとも５０％）を保持する当該フラグメントをも意味する。得られたポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３で表される全長ポリペプチドの結合活性及び／又はシグナル伝達活性のレベルの少なくとも１０％（好ましくは、少なくとも５０％）を保持する限り、ニューロペプチドＱポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６（特に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）に対して、付加、挿入、欠失又は置換を含むことができる。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４に対するニューロペプチドＱポリペプチドのフラグメントの例は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２のポリペプチドである。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４に対する置換を含むニューロペプチドＱポリペプチドの例は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３、ＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：２４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２、ＳＥＱ  ＩＤ
ＮＯ：３３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１のポリペプチドである。
【００８３】
「特異的に結合する」という用語は、ニューロペプチドＱポリペプチドが５００ｎＭ以下のＥＣ５０又はＫｄを有することを意味する。
【００８４】
ＧＡＬＲ２に結合し、かつ／又はＧＡＬＲ２のシグナル伝達活性を活性化するために必要な配列に加えて、切断型ニューロペプチドＱポリペプチドを含むニューロペプチドＱポリペプチドは、例えば、ニューロペプチドＱポリペプチド融合タンパク質におけるように、付加的な配列を含むことができる。融合のパートナーの非限定的な例は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質、アルカリホスファターゼ、チオレドキシン、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ヒスチジンタグ（例えば、６Ｘ以上のＨｉｓ）又はエピトープタグ（例えば、ＨＡ−タグ、Ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ）を含む。
【００８５】
本明細書で使用する「ニューロペプチドＱポリヌクレオチド」という用語は、本明細書で定義したニューロペプチドＱポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はその相補体を意味する。「ニューロペプチドＱポリヌクレオチド」は、切断型又は修飾ニューロペプチドＱをコードするポリヌクレオチド配列であってもよい。
【００８６】
本発明はまた、上記の方法により識別され又は検出される作用剤にも関する。加えて、本発明は、当該作用剤を含む組成物に関する。
【００８７】
本発明はさらに、本発明に従う作用剤又は組成物の、ＧＡＬＲ２−関連疾患又はＧＡＬＲ２−関連障害の予防又は治療のための医薬の製造のための使用を意図する。
【００８８】
−ここで、当該ＧＡＬＲ２−関連疾患又はＧＡＬＲ２−関連障害は、中枢神経系（ＣＮＳ）障害から成る群より選択される。ＣＮＳ障害は、中枢神経系の障害並びに末梢神経系の障害を含む。ＣＮＳ障害は、脳損傷、脳血管疾患及びそれらの影響、パーキンソン病、皮質基底核変性症、運動ニューロン疾患、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を含む痴呆、多発性硬化症、外傷性脳損傷、脳卒中、脳卒中後障害、ポスト外傷性脳損傷及び小血管性脳
血管疾患を包含するが、これらに限定されるものではない。アルツハイマー病、血管性痴呆、レビー小体型認知症、クロモソーム第１７染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型痴呆、ピック病を含む前頭側頭型痴呆、進行性核性麻痺、皮質基底核変性症、ハンチントン病、視床変性症、クロイツフェルト−ヤコブ痴呆、ＨＩＶ痴呆、痴呆を伴う精神分裂病及びコルサコフ精神病等の痴呆もまた、ＣＮＳ障害と考えられる。同様に、軽度の認知障害、加齢関連性記憶障害、加齢関連性認知機能低下、血管性認知障害、注意欠陥障害、注意欠陥多動性障害及び学習障害を伴う小児における記憶障害等の認知関連障害もまた、ＣＮＳ障害と考えられる。この定義の意味において、疼痛もまたＣＮＳ障害と考えられる。疼痛は、多発性硬化症、脊髄損傷、坐骨神経痛、腰椎術後疼痛症候群、外傷性脳損傷、てんかん、パーキンソン病、脳卒中後障害及び脳及び脊髄の血管性病変（例えば、梗塞、脳溢血、血管奇形）等のＣＮＳ障害と関連付けることができる。非中枢神経障害性疼痛は、乳房切除後疼痛と関連するもの、幻肢感、反射性交感神経性ジストロフィー（ＲＳＤ）、三叉神経性ジアラジオキュロパシー（ｔｒｉｇｅｍｉｎａｌ  ｎｅｕｒａｌｇｉａｒａｄｉｏｃｕｌｏｐａｔｈｙ）、術後疼痛、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ関連疼痛、癌疼痛、代謝性神経障害（例えば、糖尿病性神経障害、結合組織疾患に二次的な脈管神経障害）、例えば、肺癌、又は白血病、又はリンパ腫、又は前立腺癌、結腸癌若しくは胃癌に関連する腫瘍随伴症多発性神経障害、三叉神経痛、頭蓋神経痛およびヘルペス後神経痛を含む。末梢神経損傷に関連する疼痛、中心性疼痛（すなわち、脳虚血による）及び様々な慢性疼痛、すなわち、腰痛、背部疼痛（腰部疼痛）、炎症性及び／又はリウマチ性疼痛。頭痛（例えば、前兆のある偏頭痛、前兆のない偏頭痛、及びその他の偏頭痛障害）、一過性及び慢性緊張性頭痛、緊張性様頭痛、群発性頭痛並びに慢性発作性片側頭痛もまたＣＮＳ障害である。膵炎、腸膀胱炎（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｃｙｓｔｉｔｉｓ）、月経困難症、過敏性腸症候群、クローン病、胆石疝痛、尿管疝痛、心筋梗塞等の内臓疼痛及び骨盤腔疼痛症候群、例えば、外陰部痛、精巣痛、尿道症候群及びプロタトジニア（ｐｒｏｔａｔｏｄｙｎｉａ）もまたＣＮＳ障害である。また、急性疼痛、例えば術後疼痛及び外傷後疼痛も神経系の障害であると考えられる。
【００８９】
−ここで、当該ＧＡＬＲ２−関連疾患又はＧＡＬＲ２−関連障害はさらに、ＧＡＬＲ２異常と関連する神経及び精神障害から成る群より選択され、下記の状態又は疾患の１又は２以上を含む：例えば、心臓バイパス手術及び移植後の脳障害、脳卒中、脳虚血、脊髄損傷、頭部外傷、周産期低酸素症、心停止、低血糖症性神経損傷、（ＡＩＤＳ−誘発認知症を含む）認知症、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症、眼損傷、網膜症、認知障害、突発性および薬物誘発性パーキンソン病、筋肉痙攣及び振戦を含む筋肉痙攣に関連する障害、てんかん、痙攣、（偏頭痛様頭痛（ｍｉｇｒａｉｎｅ  ｈｅａｄａｃｈｅ）を含む）偏頭痛、尿失禁、物質耐性、物質離脱（例えば、あへん剤、ニコチン、タバコ製品、アルコール、ベンゾジアゼピン、コカイン、鎮静剤、睡眠薬等の物質を含む）、精神病、統合失調症、（全般性不安障害、パニック障害及び強迫性障害を含む）不安、（うつ病、躁病、双極性障害を含む）気分障害、三叉神経症、難聴、耳鳴り、眼の黄斑変性、嘔吐、脳浮腫、（急性及び慢性状態、激痛、軟治性疼痛、神経障害性疼痛及び外傷後痛を含む）疼痛、遅発性ジスキネジア、（睡眠発作を含む）睡眠障害、注意欠陥／多動性障害及び行為障害等の急性神経及び精神障害。
【００９０】
−ここで、当該ＧＡＬＲ２−関連疾患又はＧＡＬＲ２−関連障害はさらに、不安障害、精神障害、人格障害、物質関連障害、摂食障害、気分障害、偏頭痛、てんかん又は痙攣性疾患、小児期障害、認知障害、神経変性、神経毒性及び虚血から成る群より選択される。
【００９１】
−好ましくは、不安障害は、広場恐怖、全般性不安障害（ＧＡＤ）、強迫性障害（ＯＣＤ）、パニック障害、外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、社会恐怖及びその他の恐怖症の群より選択される。
【００９２】
−好ましくは、精神障害は、統合失調症、妄想性障害、統合失調感情障害、統合失調性障害及び物質誘発精神障害の群より選択される。
【００９３】
−好ましくは、人格障害は、強迫性人格障害及び統合失調症、統合失調型障害の群より選択される。
【００９４】
−好ましくは、物質関連障害は、アルコール濫用、アルコール依存、アルコール離脱、アルコール離脱せん妄、アルコール誘発精神障害、アンフェタミン依存、アンフェタミン離脱、コカイン依存、コカイン離脱、ニコチン依存、ニコチン離脱、オピオイド依存及びオピオイド離脱の群より選択される。
【００９５】
−好ましくは、摂食障害は、神経性拒食症及び神経性過食症の群より選択される。
【００９６】
−好ましくは、気分障害は、双極性障害（Ｉ及びＩＩ）、循環病、うつ病、気分変調性障害、大うつ病性障害及び物質誘発気分障害の群より選択される。
【００９７】
−ここで、当該ＧＡＬＲ２−関連疾患又はＧＡＬＲ２−関連障害はさらに、偏頭痛からなる群より選択される。
【００９８】
−ここで、当該ＧＡＬＲ２−関連疾患又はＧＡＬＲ２−関連障害はさらに、非痙攣性全般てんかん、全般痙攣性てんかん、小発作痙攣重積状態、大発作痙攣重積状態、意識障害を伴う又は伴わない部分てんかん、小児痙攣、持続性部分てんかん及びその他の形態のてんかんの群より選択されるてんかん又は痙攣性疾患からなる群より選択される。
【００９９】
−ここで、当該ＧＡＬＲ２−関連疾患又はＧＡＬＲ２−関連障害はさらに、注意欠陥／多動性障害からなる群より選択される。
【０１００】
−ここで、当該ＧＡＬＲ２−関連疾患又はＧＡＬＲ２−関連障害はさらに、せん妄、薬物誘発性持続性せん妄、認知症、ＨＩＶ疾患起因認知症、ハンチントン病起因認知症、パーキンソン病起因認知症、アルツハイマー型認知症、薬物誘発性持続性認知症及び軽度認知機能障害からなる群より選択される。上記の疾患のうち不安、統合失調症、偏頭痛、うつ病及びてんかんの治療が特に重要である。
【０１０１】
−ここで、当該ＧＡＬＲ２−関連疾患又はＧＡＬＲ２−関連障害はさらに、心血管障害からなる群より選択される。
【０１０２】
心血管障害は、（心臓を含む）心血管系統の１又は２以上の病的状態及び依存性組織の疾患を意味する。心血管系統の病的状態及び依存性組織の疾患は、突発性心筋症、糖尿病性心筋症を含む代謝性心筋症、アルコール性心筋症、薬剤誘発性心筋症、虚血性心筋症及び高血圧性心筋症等の心筋の障害（心筋症又は心筋炎）；大動脈、冠動脈、頸動脈、脳動脈、腎動脈、腸骨動脈、大腿動脈、膝窩動脈等の主要血管のアテローム性疾患（大血管性疾患）；網膜細動脈、糸球体細動脈、神経栄養血管、心細動脈、及び目、腎臓、心臓及び中枢及び末梢神経系の関連する毛細血管等の細血管の中毒性、薬剤誘発性及び（高血圧性及び／又は糖尿病性疾患を含む）代謝疾患（微小血管障害）；並びに大動脈、冠動脈、頸動脈、脳動脈、腎動脈、腸骨動脈、大腿動脈、膝窩動脈等の主要血管のアテローム病変のプラーク破裂を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１０３】
−ここで、当該ＧＡＬＲ２−関連疾患又はＧＡＬＲ２−関連障害はさらに、神経炎症からなる群より選択される。
【０１０４】
神経炎症は、細胞情報伝達分子の産生、グリア（グリア、グリア）の活性化経路及び反応の活性化、炎症促進性サイトカイン又はケモカイン、アストロサイトの活性化経路及び反応の活性化、ミクログリアの活性化経路及び反応の活性化、一酸化窒素合成酵素の産生及び一酸化窒素の蓄積、急性期タンパク質、シナプトフィジン及びシナプス後肥厚部タンパク９５（ＰＳＤ−９５）の喪失、補体カスケードの構成要素、シナプス機能の喪失又は減少、プロテインキナーゼ活性（例えば、細胞死関連プロテインキナーゼ活性）、行動障害、細胞損傷（例えば、神経細胞損傷）、細胞死（例えば、神経細胞死）及び／又はアミロイド班のアミロイドβ沈着等の酸化ストレス関連反応を意味する。
【０１０５】
−ここで、当該ＧＡＬＲ２−関連疾患又はＧＡＬＲ２−関連障害はさらに、癌、腫瘍転移、卵巣及び子宮腫瘍から成る群より選択される。
【０１０６】
本発明はさらに、本発明に従う作用剤又は組成物の、ニューロペプチドＱポリペプチド−関連疾患又はニューロペプチドＱポリペプチド−関連障害の予防又は治療のための医薬の製造のための使用を意図する。
【０１０７】
−ここで、当該ニューロペプチドＱ−関連疾患又はニューロペプチドＱ−関連障害は、中枢神経系（ＣＮＳ）障害から成る群より選択される。ＣＮＳ障害は、中枢神経系の障害並びに末梢神経系の障害を含む。ＣＮＳ障害は、脳損傷、脳血管疾患及びそれらの影響、パーキンソン病、皮質基底核変性症、運動ニューロン疾患、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を含む痴呆、多発性硬化症、外傷性脳損傷、脳卒中、脳卒中後障害、ポスト外傷性脳損傷及び小血管性脳血管疾患を包含するが、これらに限定されるものではない。アルツハイマー病、血管性痴呆、レビー小体型認知症、クロモソーム第１７染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型痴呆、ピック病を含む前頭側頭型痴呆、進行性核性麻痺、皮質基底核変性症、ハンチントン病、視床変性症、クロイツフェルト−ヤコブ痴呆、ＨＩＶ痴呆、痴呆を伴う精神分裂病及びコルサコフ精神病等の痴呆もまた、ＣＮＳ障害と考えられる。同様に、軽度の認知障害、加齢関連性記憶障害、加齢関連性認知機能低下、血管性認知障害、注意欠陥障害、注意欠陥多動性障害及び学習障害を伴う小児における記憶障害等の認知関連障害もまた、ＣＮＳ障害と考えられる。この定義の意味において、疼痛もまたＣＮＳ障害と考えられる。疼痛は、多発性硬化症、脊髄損傷、坐骨神経痛、腰椎術後疼痛症候群、外傷性脳損傷、てんかん、パーキンソン病、脳卒中後障害及び脳及び脊髄の血管性病変（例えば、梗塞、脳溢血、血管奇形）等のＣＮＳ障害と関連付けることができる。非中枢神経障害性疼痛は、乳房切除後疼痛と関連するもの、幻肢感、反射性交感神経性ジストロフィー（ＲＳＤ）、三叉神経性ジアラジオキュロパシー（ｔｒｉｇｅｍｉｎａｌ  ｎｅｕｒａｌｇｉａｒａｄｉｏｃｕｌｏｐａｔｈｙ）、術後疼痛、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ関連疼痛、癌疼痛、代謝性神経障害（例えば、糖尿病性神経障害、結合組織疾患に二次的な脈管神経障害）、例えば、肺癌、又は白血病、又はリンパ腫、又は前立腺癌、結腸癌若しくは胃癌に関連する腫瘍随伴症多発性神経障害、三叉神経痛、頭蓋神経痛およびヘルペス後神経痛を含む。末梢神経損傷に関連する疼痛、中心性疼痛（すなわち、脳虚血による）及び様々な慢性疼痛、すなわち、腰痛、背部疼痛（腰部疼痛）、炎症性及び／又はリウマチ性疼痛。頭痛（例えば、前兆のある偏頭痛、前兆のない偏頭痛、及びその他の偏頭痛障害）、一過性及び慢性緊張性頭痛、緊張性様頭痛、群発性頭痛並びに慢性発作性片側頭痛もまたＣＮＳ障害である。膵炎、腸膀胱炎（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｃｙｓｔｉｔｉｓ）、月経困難症、過敏性腸症候群、クローン病、胆石疝痛、尿管疝痛、心筋梗塞等の内臓疼痛及び骨盤腔疼痛症候群、例えば、外陰部痛、精巣痛、尿道症候群及びプロタトジニア（ｐｒｏｔａｔｏｄｙｎｉａ）もまたＣＮＳ障害である。また、急性疼痛、例えば術後疼痛及び外傷後疼痛も神経系の障害であると考えられる。
【０１０８】
ここで、当該ニューロペプチドＱ−関連疾患又はニューロペプチドＱ−関連障害はさらに、ＧＡＬＲ２異常と関連する神経及び精神障害から成る群より選択され、下記の状態又
は疾患の１又は２以上を含む：例えば、心臓バイパス手術及び移植後の脳障害、卒中、脳虚血、脊髄損傷、頭部外傷、周産期低酸素症、心停止、低血糖症性神経損傷，（ＡＩＤＳ−誘発認知症を含む）認知症、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症、眼損傷、網膜症、認知障害、突発性および薬物誘発性パーキンソン病、筋肉痙攣及び振戦を含む筋肉痙攣に関連する障害、てんかん、痙攣、（偏頭痛様頭痛（ｍｉｇｒａｉｎｅ  ｈｅａｄａｃｈｅ）を含む）偏頭痛、尿失禁、物質耐性、物質離脱（例えば、あへん剤、ニコチン、タバコ製品、アルコール、ベンゾジアゼピン、コカイン、鎮静剤、睡眠薬等の物質を含む）、精神病、統合失調症、（全般性不安障害、パニック障害及び強迫性障害を含む）不安、（うつ病、躁病、双極性障害を含む）気分障害、三叉神経症、難聴、耳鳴り、眼の黄斑変性、嘔吐、脳浮腫、（急性及び慢性状態、激痛、軟治性疼痛、神経障害性疼痛及び外傷後痛を含む）疼痛、遅発性ジスキネジア、（睡眠発作を含む）睡眠障害、注意欠陥／多動性障害及び行為障害等の急性神経及び精神障害。
【０１０９】
−ここで、当該ニューロペプチドＱ−関連疾患又はニューロペプチドＱ−関連障害はさらに、不安障害、精神障害、人格障害、物質関連障害、摂食障害、気分障害、偏頭痛、てんかん又は痙攣性疾患、小児期障害、認知障害、神経変性、神経毒性及び虚血から成る群より選択される。
【０１１０】
−好ましくは、不安障害は、広場恐怖、全般性不安障害（ＧＡＤ）、強迫性障害（ＯＣＤ）、パニック障害、外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、社会恐怖及びその他の恐怖症の群から選択される。
【０１１１】
−好ましくは、精神障害は、統合失調症、妄想性障害、統合失調感情障害、統合失調性障害及び物質誘発精神障害の群から選択される。
【０１１２】
−好ましくは、人格障害は、強迫性人格障害及び統合失調症、統合失調型障害の群から選択される。
【０１１３】
−好ましくは、物質関連障害は、アルコール濫用、アルコール依存、アルコール離脱、アルコール離脱せん妄、アルコール誘発精神障害、アンフェタミン依存、アンフェタミン離脱、コカイン依存、コカイン離脱、ニコチン依存、ニコチン離脱、オピオイド依存及びオピオイド離脱の群から選択される。
【０１１４】
−好ましくは、摂食障害は、神経性拒食症及び神経性過食症の群より選択される。
【０１１５】
−好ましくは、気分障害は、双極性障害（Ｉ及びＩＩ）、循環病、うつ病、気分変調性障害、大うつ病性障害及び物質誘発気分障害の群より選択される。
【０１１６】
−ここで、当該ニューロペプチドＱ−関連疾患又はニューロペプチドＱ−関連障害はさらに、偏頭痛から成る群より選択される。
【０１１７】
−ここで、当該ニューロペプチドＱ−関連疾患又はニューロペプチドＱ−関連障害はさらに、非痙攣性全般てんかん、全般痙攣性てんかん、小発作痙攣重積状態、大発作痙攣重積状態、意識障害を伴う又は伴わない部分てんかん、小児痙攣、持続性部分てんかん及びその他の形態のてんかんの群より選択されるてんかん又は痙攣性疾患からなる群より選択される。
【０１１８】
−ここで、当該ニューロペプチドＱ−関連疾患又はニューロペプチドＱ−関連障害はさらに、注意欠陥／多動性障害から成る群より選択される。
【０１１９】
−ここで、当該ニューロペプチドＱ−関連疾患又はニューロペプチドＱ−関連障害はさらに、せん妄、薬物誘発性持続性せん妄、認知症、ＨＩＶ疾患起因認知症、ハンチントン病起因認知症、パーキンソン病起因認知症、アルツハイマー型認知症、薬物誘発性持続性認知症及び軽度認知機能障害から成る群より選択される。上記の疾患のうち、不安、統合失調症、偏頭痛、うつ病及びてんかんの治療が特に重要である。
【０１２０】
―ここで、当該ニューロペプチドＱ−関連疾患又はニューロペプチドＱ−関連障害はさらに、心血管障害から成る群より選択される。
【０１２１】
心血管障害は、（心臓を含む）心血管系統の１又は２以上の病的状態及び依存性組織の疾患を意味する。心血管系統の病的状態及び依存性組織の疾患は、突発性心筋症、糖尿病性心筋症を含む代謝性心筋症、アルコール性心筋症、薬剤誘発性心筋症、虚血性心筋症及び高血圧性心筋症等の心筋の障害（心筋症又は心筋炎）；大動脈、冠動脈、頸動脈、脳動脈、腎動脈、腸骨動脈、大腿動脈、膝窩動脈等の主要血管のアテローム性疾患（大血管性疾患）；網膜細動脈、糸球体細動脈、神経栄養血管、心細動脈、及び目、腎臓、心臓及び中枢及び末梢神経系の関連する毛細血管等の細血管の中毒性、薬剤誘発性及び（高血圧性及び／又は糖尿病性疾患を含む）代謝疾患（微小血管障害）；並びに大動脈、冠動脈、頸動脈、脳動脈、腎動脈、腸骨動脈、大腿動脈、膝窩動脈等の主要血管のアテローム病変のプラーク破裂を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１２２】
―ここで、当該ニューロペプチドＱ−関連疾患又はニューロペプチドＱ−関連障害はさらに、神経炎症から成る群より選択される。
【０１２３】
神経炎症は、細胞情報伝達分子の産生、グリア（グリア、グリア）の活性化経路及び反応の活性化、炎症促進性サイトカイン又はケモカイン、アストロサイトの活性化経路及び反応の活性化、ミクログリアの活性化経路及び反応の活性化、一酸化窒素合成酵素の産生及び一酸化窒素の蓄積、急性期タンパク質、シナプトフィジン及びシナプス後肥厚部タンパク９５（ＰＳＤ−９５）の喪失、補体カスケードの構成要素、シナプス機能の喪失又は減少、プロテインキナーゼ活性（例えば、細胞死関連プロテインキナーゼ活性）、行動障害、細胞損傷（例えば、神経細胞損傷）、細胞死（例えば、神経細胞死）及び／又はアミロイド班のアミロイドβ沈着等の酸化ストレス関連反応を意味する。
【０１２４】
−ここで、当該ニューロペプチドＱ−関連疾患又はニューロペプチドＱ−関連障害はさらに、癌、腫瘍転移、卵巣及び子宮腫瘍から成る群より選択される。
【０１２５】
−本発明はまた、医薬の製造のための、本発明の切断型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）及び／又は修飾ニューロペプチドＱポリペプチド又は全長ニューロペプチドＱポリペプチドの使用に関する。
【０１２６】
−当該医薬は、ＧＡＬＲ２−関連疾患又はＧＡＬＲ２−関連障害の治療に適用してもよく、当該ＧＡＬＲ２−関連疾患又はＧＡＬＲ２−関連障害は、本明細書の上記部分に定義した群から優先的に選択される。
【０１２７】
−当該医薬は、ニューロペプチドＱポリペプチド−関連疾患又はニューロペプチドＱポリペプチド−関連障害の治療に適用してもよく；当該ニューロペプチドＱポリペプチド−関連疾患又はニューロペプチドＱポリペプチド−関連障害は、本明細書の上記部分に定義した群から優先的に選択される。
【０１２８】
−本明細書で使用する「候補化合物」及び「候補調節剤」という用語は、ＧＡＬＲ２ポリペプチドへのリガンドの結合を調節する能力又はＧＡＬＲ２ポリペプチドの活性を調節
する能力について評価を行う化合物又は組成物を意味する。候補調節剤は、例えば、低分子化合物、動物、植物、細菌又は真菌細胞の抽出物中並びにかかる細胞からの調整培地に含まれる化合物を包含する天然又は合成化合物でありえる。好ましくは、候補調節剤は、天然又は合成化合物であり得、特に有機低分子化合物である。
【０１２９】
−本明細書で使用する「低分子」という用語は、３０００ダルトン未満、好ましくは１５００未満、さらにより好ましくは１０００未満、そして最も好ましくは６００ダルトン未満の分子量を有する化合物を意味する。「有機低分子」は、炭素を含む低分子化合物である。
【０１３０】
−本明細書で使用する「結合性の変化」又は「活性の変化」という用語及び「結合性の差」又は「活性の差」という同義語は、記載されたアッセイにおける、結合性又はシグナル伝達活性の少なくとも１０％の増大又は減少を意味する。
【０１３１】
−本明細書で使用する「ニューロペプチドＱポリペプチドのＧＡＬＲ２への結合を許容する条件」という用語は、例えば、温度、塩濃度、ｐＨ及びタンパク質濃度の条件等、その条件下でニューロペプチドＱポリペプチドがＧＡＬＲ２に結合する条件を意味する。正確な結合条件は、例えば、そのアッセイが生きた細胞を用いるか、細胞の膜画分のみを用いるか、又は細胞のタンパク質画分のみを用いるか等のアッセイの性質により変わる。
【０１３２】
−本明細書で使用する「ニューロペプチドＱポリペプチドのＧＡＬＲ２ポリペプチドへの相互作用を許容する条件」という用語は、例えば、温度、塩濃度、ｐＨ及びタンパク質濃度の条件等、その条件下でニューロペプチドＱポリペプチドがＧＡＬＲ２に結合する条件を意味する。正確な結合条件は、例えば、そのアッセイが生きた細胞を用いるか、細胞の膜画分のみを用いるか、又は細胞のタンパク質画分のみを用いるか等のアッセイの性質により変わる。
【０１３３】
−本明細書で使用する「サンプル」という用語は、ＧＡＬＲ２ポリペプチドへの結合又はＧＡＬＲ２ポリペプチドのシグナル伝達活性を調節する主体の存在について試験を行う分子のソース（ｓｏｕｒｃｅ）を意味する。
【０１３４】
−サンプルは、環境サンプル、動物、植物、酵母若しくは細菌細胞又は組織の天然抽出物、臨床サンプル、合成サンプル又は組み換え細胞若しくは発酵プロセスからの調整培地でありえる。「組織サンプル」という用語は、ＧＡＬＲ２ポリペプチド、ニューロペプチドＱポリペプチド、ＧＡＬＲ２又はニューロペプチドＱポリペプチドをコードする核酸又はリガンド結合性及び／又はＧＡＬＲ２ポリペプチドの活性を調節する主体の存在、量、質又は活性について試験を行う組織を意味する。
【０１３５】
−本明細書で使用する「組織」という用語は、生物内で特定の機能を行う細胞の集合体を意味する。本明細書で使用する「組織」という用語は、特定の生理学的領域からの細胞素材を意味する。特定の組織の細胞は、幾つかの異なるタイプの細胞を含むことができる。その非限定的な例は脳組織であり、これはさらにニューロン及びグリア細胞、並びに毛細管内皮細胞及び血液細胞を含み、これらはすべてその組織セクション又はサンプルに含まれる。固体組織に加えて、「組織」という用語は、血液などの非固体組織を包含することを意図している。
【０１３６】
−本明細書で使用する「膜画分」という用語は、ＧＡＬＲ２ポリペプチドを含む細胞脂質膜の調製物を意味する。本明細書でこの用語が使用される場合には、「膜画分」は、非膜関連細胞成分の少なくとも一部（すなわち、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも６０％、そして最も好ましくは少なくとも９０％）が
除かれている点で細胞ホモジネートと区別される。「膜関連」という用語は、脂質膜に組み込まれているか、又は脂質膜に組み込まれている成分と物理的に関連を有する細胞成分を意味する。
【０１３７】
−本明細書で使用する「２次メッセンジャー」という用語は、ＧＰＣＲからのシグナルの伝達に関与するＧタンパク質共役レセプターの活性化により生成され又はその濃度の変化が引き起こされる分子を意味する。２次メッセンジャーの非限定的な例は、ｃＡＭＰ、ジアシルグリセロール、イノシトール三リン酸及び細胞内カルシウムを含む。「２次メッセンジャーのレベルの変化」という用語は、候補調節剤の非存在下で行われたアッセイにおける検出量に対する、その２次メッセンジャーの検出レベルにおける少なくとも１０％の増大又は減少を意味する。
【０１３８】
−本明細書で使用する「イクオリンアッセイ（ａｅｑｕｏｒｉｎ−ｂａｓｅｄ  ａｓｓａｙ）」という用語は、活性化ＧＰＣＲにより引き起こされる細胞内カルシウムの流れを測定する、ＧＰＣＲ活性についてのアッセイを意味し、細胞内カルシウムの流れは、細胞内で発現したイクオリンの蛍光により測定される。
【０１３９】
−本明細書で使用する「結合」という用語は、リガンド（例えば、ニューロペプチドＱポリペプチド）のレセプター（例えば、ＧＡＬＲ２）との物理的な結合を意味する。本明細書でこの用語が使用される場合には、結合が５００ｎＭ以下のＥＣ５０又はＫｄで起こるならば、それは「特異的」である。
【０１４０】
−本明細書で使用する「ＥＣ５０」という用語は、ニューロペプチドＱポリペプチド又は他のリガンドの結合及びＧＡＬＲ２ポリペプチドの機能的活性を含む、得られた活性が、同じアッセイを用いて測定可能なそのＧＡＬＲ２活性の最大値の５０％である作用剤の濃度を意味する。別の表現をすれば、「ＥＣ５０」は、１００％の活性を、アゴニストをさらに添加しても増大しない活性の量に設定した場合の、５０％の活性を与える作用剤の濃度である。「ニューロペプチドＱポリペプチドのＥＣ５０」は、ニューロペプチドＱポリペプチドの性質によって変化することに留意すべきであり；例えば、変異ニューロペプチドＱポリペプチド（すなわち、挿入、欠失、置換又はヒト以外の種からのニューロペプチドＱポリペプチド分子を含む他のポリペプチドとの融合、及び上記のニューロペプチドＱポリペプチドの定義を充足するそれらの変異型）は、野生型ニューロペプチドＱポリペプチドに比べ、より高い、より低い又は同等のＥＣ５０値を持ちえる。従って、ニューロペプチドＱポリペプチド変異配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２の野生型ニューロペプチドＱポリペプチドと異なる場合には、当業者は、その変異型のＥＣ５０を従来の方法に従って決定することができる。あるニューロペプチドＱポリペプチドのＥＣ５０は、少なくともＧＡＬＲ２応答を飽和させるか又は最大値まで上昇させる量のニューロペプチドＱポリペプチドの存在下で、一定量のＧＡＬＲ２ポリペプチドの活性についてアッセイを行い、次いで測定されたＧＡＬＲ２活性をニューロペプチドＱポリペプチドの濃度に対してプロットすることにより測定される。
【０１４１】
−本明細書で使用する「ＩＣ５０」という用語は、ＧＡＬＲ２レセプターの最大活性を５０％減少させるアンタゴニスト又はインバースアゴニストの濃度である。
【０１４２】
−本明細書で使用する「Ｋｄ」という用語は、解離定数を意味する。解離定数は、特定のタンパク質の結合部位の半分が占められている状態におけるリガンドの濃度に相当するモル濃度（Ｍ）、すなわち、リガンドが結合しているタンパク質の濃度が、リガンドが結合していないタンパク質の濃度と等しい状態のリガンドの濃度である。
【０１４３】
−本明細書で使用する「検出可能に標識された」という用語は、分子の特性、例えば、
容易に検出できる官能基（標識）を組み込む構造的な修飾を有するニューロペプチドＱポリペプチド又は他のＧＡＬＲ２リガンドを意味する。検出可能な標識は、蛍光性化合物、同位体標識化合物、化学発光化合物、量子ドット（ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔ）標識、ビオチン、酵素、高電子密度試薬（ｅｌｅｃｔｒｏｎ−ｄｅｎｓｅ  ｒｅａｇｅｎｔｓ）及び抗血清又はモノクロナル抗体が入手できるハプテン又はタンパク質を含むが、これらに限定されるものではない。様々な検出方法は、分光的、光化学的、放射化学的、生化学的、免疫化学的又は化学的手段を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１４４】
−本明細書で使用する「アフィニティータグ（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｔａｇ）」という用語は、標識された分子に、その標識に結合する試薬によって特異的に結合される能力を付与する、目的の分子に結合した標識（例えば、ニューロペプチドＱポリペプチド又は他のＧＡＬＲ２リガンド）を意味する。アフィニティータグは、（「エピトープタグ」として知られる）抗体に対するエピトープ、ビオチン、６Ｘ  Ｈｉｓ及びＧＳＴを含むが、これらに限定されるものではない。アフィニティータグは、標識種の精製並びに検出に用いることができる。
【０１４５】
−本明細書で使用する「結合の減少」という用語は、ＧＡＬＲ２の既知又は被疑調節剤を用いたアッセイで検出される結合量における、その既知又は被疑調節剤を欠いたそのアッセイで検出される結合量に対する、少なくとも１０％の減少を意味する。
【０１４６】
−本明細書で使用する「供給する」という用語は、医薬又は作用剤について使用する場合には、アッセイ混合物への又は培養中の細胞への医薬又は作用剤の添加を意味する。この用語はまた、医薬又は作用剤の動物への投与をも意味する。かかる投与は、例えば、（適宜な担体、例えば、無菌生理食塩水又は水中での）注射により又は吸入により、又は経口、経皮、直腸、膣又は薬剤投与の他の通常のルートによるものでありえる。
【０１４７】
−本明細書で使用する「効果的な量」という用語は、本明細書で定義するＧＡＬＲ２活性の変化（すなわち、ＧＡＬＲ２活性の少なくとも１０％の増大又は減少）を引き起こす医薬又はＧＡＬＲ２調節剤の量を意味する。
【０１４８】
−本明細書で使用する「標準」という用語は、ＧＡＬＲ２又はニューロペプチドＱポリペプチド活性の異常により特徴づけられる疾患又は障害の影響を受けていない個体から取られたサンプルを意味する。「標準」は、ＧＡＬＲ２又はニューロペプチドＱポリペプチド又はｍＲＮＡレベル及び質（すなわち、変異体対野生型）の比較のための、並びにＧＡＬＲ２活性の比較のための対照として使用される。
【０１４９】
−本明細書で使用する「増幅する」という用語は、核酸配列に適用される場合には、核酸配列の１又は２以上のコピーが鋳型核酸から生成する工程を意味する。「増幅」の好ましい方法は、ＰＣＲ又はＲＴ／ＰＣＲである。
【０１５０】
−本明細書で使用する「実質的非存在」という用語は、ＧＰＣＲ機能を、本明細書に開示され又は当該技術分野で知られたアッセイによる測定で、少なくとも１０％活性化又は阻害するのに必要なレベル未満の活性化又は阻害因子のレベルを意味する。
【０１５１】
−本明細書で使用する「Ｇタンパク質共役レセプター」又は「ＧＰＣＲ」という用語は、７つのアルファヘリックス膜貫通部位を有する膜結合ポリペプチドを意味する。機能的ＧＰＣＲはリガンド又はアゴニストと結合し、そしてまたＧ−タンパク質とも結合して活性化する。
【０１５２】
−ＧＡＬＲ２はＧＰＣＲである。
【０１５３】
−本明細書で使用する「ＧＡＬＲ２ポリペプチドの機能を調節する作用剤」という用語は、ＧＡＬＲ２活性を増強し又は減少させる分子又は化合物であり、ニューロペプチドＱポリペプチド又は他のアゴニストの結合性を変える分子又は化合物及び／又はＧＡＬＲ２下流のシグナル伝達活性を変える分子又は化合物を含む。
【０１５４】
−本明細書で使用する「トランスジェニック動物」という用語は、いずれかの動物、好ましくは非ヒト哺乳類、鳥、魚又は両生類であって、その動物の細胞の１又は２以上が、当該技術分野でよく知られたトランスジェニック技術等の人工的な介入により導入された異種核酸を含む、上記動物を意味する。核酸は、マイクロインジェクション又は組み換えウイルスによる感染等の計画的な遺伝子操作による細胞の前駆体への導入により、細胞に直接的に又は間接的に導入される。遺伝子操作の語は古典的な交雑育種又は体外受精を含まず、むしろ組み換えＤＮＡ分子の導入に向けられている。この分子は染色体内に組み込まれてもよく、又は染色体外複製ＤＮＡであってもよい。本明細書に記載する典型的なトランスジェニック動物において、導入遺伝子は、細胞に、１又は２以上の対象ポリペプチド、例えばアゴニスト又はアンタゴニスト形態のいずれかの組み換え形態を発現させる。しかし、例えば、後に記載するＦＬＰ又はＣＲＥリコンビナーゼ依存コンストラクト等の、組み換え遺伝子が発現していないトランスジェニック動物もまた意図されている。さらに、「トランスジェニック動物」はまた、組み換え及びアンチセンス技術の双方を含む人為的な介入により、１又は２以上の遺伝子の遺伝子破壊が引き起こされたこれらの組み換え動物も包含する。
【０１５５】
−本明細書で使用する「抗体」という用語は、従来の免疫グロブリン分子並びに主題のポリペプチドの１つに対して特異的に反応性を有するそのフラグメントである。抗体は従来の技術を用いて断片化することができ、そしてそのフラグメントは、全抗体について後に記載するものと同じ方法で、その有用性についてスクリーニングすることができる。例えば、Ｆ（ａｂ）２フラグメントは、抗体をペプシンで処理することにより生成させることができる。得られるＦ（ａｂ）２フラグメントは、ジスルフィド架橋を還元することができ、Ｆａｂフラグメントを生成する。さらに、本発明の抗体は、二重特異性、単鎖並びにキメラ及びその抗体の少なくとも１つのＣＤＲ領域により付与されたポリペプチドに対するアフィニティを有するヒト化分子を包含することを意図している。好ましい態様において、抗体はさらに、検出を可能にする結合標識を有する（例えば、標識は、放射性同位体、蛍光性化合物、化学発光性化合物、酵素又は酵素補因子でありえる）。
【０１５６】
−本明細書で使用する「ヌル突然変異」という用語は、ポリペプチドをコードする染色体配列を、そのポリペプチドが発現しないように変える挿入、欠失又は置換を意味する。
【０１５７】
温度に関して使用されていない場合には、数値「Ｘ」の前に置かれる「約」という用語は、本出願において、Ｘ−１０％ＸからＸ＋１０％Ｘの間、好ましくはＸ−５％ＸからＸ＋５％Ｘの間を表す。温度の特定の場合には、温度「Ｙ」の前に置かれる「約」（あるいは「およそ」）という用語は、この出願において、Ｙ−１０℃からＹ＋１０℃の間、好ましくはＹ−５℃からＹ＋５℃の間を表す。
【図面の簡単な説明】
【０１５８】
【図１】図１は、ヒトＧＡＬＲ２レセプターをコードする領域のｃＤＮＡ（ＳＥＱ  ＮＯ：１）を示す。
【図２】図２は、ヒトＧＡＬＲ２のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を示す。
【図３】図３は、マウスＧＡＬＲ２レセプターをコードする領域のｃＤＮＡ（ＳＥＱ  ＮＯ：３）を示す。
【図４】図４は、マウスＧＡＬＲ２のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）を示す。
【図５】図５は、ラットＧＡＬＲ２レセプターをコードする領域のｃＤＮＡ（ＳＥＱ  ＮＯ：５）を示す。
【図６】図６は、ラットＧＡＬＲ２のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）を示す。
【図７】図７は、アカゲザルＧＡＬＲ２レセプターをコードする領域のｃＤＮＡ（ＳＥＱ  ＮＯ：７）を示す。
【図８】図８は、アカゲザルＧＡＬＲ２のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）を示す。
【図９】図９は、チンパンジーＧＡＬＲ２レセプターをコードする領域のｃＤＮＡ（ＳＥＱ  ＮＯ：９）を示す。
【図１０】図１０は、チンパンジーＧＡＬＲ２のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）を示す。
【図１１】図１１は、ヒトプレプロ（Ｐｒｅｐｒｏ）ニューロペプチドＱをコードする領域のｃＤＮＡ（ＳＥＱ  ＮＯ：１１）を示す。
【図１２】図１２は、ヒトプレプロニューロペプチドＱのアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）を示す。
【図１３】図１３は、ヒトニューロペプチドＱのアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）を示す。
【図１４】図１４は、ヒトニューロペプチドＱ−グリシンのアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）を示す。
【図１５】図１５は、ラットニューロペプチドＱのアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）を示す。
【図１６】図１６は、ヒトプロニューロペプチドＱ（３６−５８）のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）を示す。
【図１７】図１７は、ヒトプロニューロペプチドＱ（７３−１１６）のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）を示す。
【図１８】図１８は、切断型ヒトニューロペプチドＱのアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）を示す。
【図１９】図１９は、切断型ヒトニューロペプチドＱのアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）を示す。
【図２０】図２０は、切断型ヒトニューロペプチドＱのアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）を示す。
【図２１】図２１は、切断型ヒトニューロペプチドＱのアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）を示す。
【図２２】図２２は、切断型ヒトニューロペプチドＱ−グリシンのアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）を示す。
【図２３】図２３は、アラニンによる置換を有するヒトニューロペプチドＱ−グリシンのアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）を示す。
【図２４】図２４は、アラニンによる置換を有するヒトニューロペプチドＱ−グリシンのアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）を示す。
【図２５】図２５は、アラニンによる置換を有するヒトニューロペプチドＱ−グリシンのアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）を示す。
【図２６】図２６は、アラニンによる置換を有するヒトニューロペプチドＱ−グリシンのアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）を示す。
【図２７】図２７は、アラニンによる置換を有するヒトニューロペプチドＱ−グリシンのアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）を示す。
【図２８】図２８は、アラニンによる置換を有するヒトニューロペプチドＱ−グリシンのアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）を示す。
【図２９】図２９は、アラニンによる置換を有するヒトニューロペプチドＱ−グリシンのアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）を示す。
【図３０】図３０は、アラニンによる置換を有するヒトニューロペプチドＱ−グリシンのアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）を示す。
【図３１】図３１は、アラニンによる置換を有するヒトニューロペプチドＱ−グリシンのアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１）を示す。
【図３２】図３２は、アラニンによる置換を有するヒトニューロペプチドＱ−グリシンのアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２）を示す。
【図３３】図３３は、プロリンによる置換を有するヒトニューロペプチドＱ−グリシンのアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）を示す。
【図３４】図３４は、プロリンによる置換を有するヒトニューロペプチドＱ−グリシンのアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）を示す。
【図３５】図３５は、プロリンによる置換を有するヒトニューロペプチドＱ−グリシンのアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）を示す。
【図３６】図３６は、プロリンによる置換を有するヒトニューロペプチドＱ−グリシンのアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）を示す。
【図３７】図３７は、プロリンによる置換を有するヒトニューロペプチドＱ−グリシンのアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７）を示す。
【図３８】図３８は、プロリンによる置換を有するヒトニューロペプチドＱ−グリシンのアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）を示す。
【図３９】図３９は、プロリンによる置換を有するヒトニューロペプチドＱ−グリシンのアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）を示す。
【図４０】図４０は、プロリンによる置換を有するヒトニューロペプチドＱ−グリシンのアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）を示す。
【図４１】図４１は、プロリンによる置換を有するヒトニューロペプチドＱ−グリシンのアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）を示す。
【図４２】図４２は、異なる種からのプレプロニューロペプチドＱのアラインメントを示す。
【図４３】図４３は、異なる種からのプレプロニューロペプチドＱのアラインメントを示す。
【図４４】図４４は、異なる種からのプレプロニューロペプチドＱのアラインメントを示す。
【図４５】図４５は、異なる種からのプレプロニューロペプチドＱのアラインメントを示す。
【図４６】図４６は、異なる種からのプレプロニューロペプチドＱのアラインメントを示す。
【図４７】図４７は、異なる種からのプレプロニューロペプチドＱのアラインメントを示す。
【図４８】図４８は、ガラニンのＧＡＬＲ２への結合阻害に対するニューロペプチドＱポリペプチドの効果を示す。
【図４９】図４９は、ＧＡＬＲ２による細胞内カルシウムの放出に対するニューロペプチドＱポリペプチドの効果を示す。
【図５０】図５０は、ＧＡＬＲ２によるｃＡＭＰ放出の阻害に対するニューロペプチドＱポリペプチドの効果を示す。
【図５１】図５１は、ＧＡＬＲ２によるイノシトールリン酸放出に対するニューロペプチドＱポリペプチドの効果を示す。
【図５２】図５２は、ＧＡＬＲ２によるＧＴＰ−γ−Ｓの結合に対するニューロペプチドＱポリペプチドの効果を示す。
【図５３】図５３は、ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ技術を用いた、ＧＡＬＲ２によるベータ−アレスチン２の移動に対するニューロペプチドＱポリペプチドの効果を示す。
【図５４】図５４は、Ｔａｎｇｏ技術を用いた、ＧＡＬＲ２によるベータ−アレスチン２の移動に対するニューロペプチドＱポリペプチドの効果を示す。
【図５５】図５５は、ＧＡＬＲ２によるカルシウムの放出に対するヒトニューロペプチドＱ−グリシンポリペプチド、ラットニューロペプチドＱポリペプチド、ヒトプロニューロペプチドＱ（３６−５８）ポリペプチド及びヒトプロニューロペプチドＱ（７３−１１６）ポリペプチドの効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１５９】
本発明の詳細な記述
本発明は、ＧＡＬＲ２  ＧＰＣＲのリガンドとしてのニューロペプチドＱポリペプチドの識別に関する。これらのリガンド−レセプター相互作用は、内在リガンドのＧＡＬＲ２との相互作用を調節する作用剤のスクリーニングアッセイに有用である。既知のニューロペプチドＱポリペプチド及びそれらのレセプターとの相互作用もまた、異常なレセプター活性に関連する状態の診断のためのツールを提供する。
【０１６０】
Ｉ．  ＧＡＬＲ２の活性を調節する作用剤の識別のためのアッセイ
ＧＡＬＲ２の活性を調節する作用剤は、レセプターのニューロペプチドＱポリペプチドとの相互作用を利用する多くの方法において識別することができる。例えば、ＧＡＬＲ２／ニューロペプチドＱポリペプチド相互作用をｉｎ  ｖｉｔｒｏ、培養細胞上で又はｉｎ  ｖｉｖｏで再構成する能力は、結合を阻害する作用剤の識別のためのターゲットを提供する。相互作用の遮断に基づくアッセイは、かかる分子のライブラリー又は集合から、有機低分子等の作用剤を識別できる。あるいは、かかるアッセイは、天然資源からのサンプル又は抽出物、例えば、植物、真菌若しくは細菌抽出物中の、又はヒトの組織サンプル（例えば、腫瘍組織）中の作用剤を識別することができる。１つの側面において、抽出物は、例えば、ニューロペプチドＱポリペプチド自体の変異を含む、変異核酸、ペプチド又はポリペプチドのライブラリーを発現する細胞から作ることができる。
【０１６１】
次いで、ＧＡＬＲ２／ニューロペプチドＱポリペプチド相互作用の調節剤は、レセプターを介した下流のシグナル伝達を測定する結合性アッセイ（ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙ）又は機能性アッセイ（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｓｓａｙ）を用いてスクリーニングすることができる。結合性アッセイ（ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙ）及び機能性アッセイの双方とも、ニューロペプチドＱポリペプチドを用いて検証される。
【０１６２】
ＧＡＬＲ２機能を調節する作用剤を識別するための、ＧＡＬＲ２／ニューロペプチドＱポリペプチド相互作用をより直接的に使用する別のアプローチは、候補作用剤又は候補調節剤により誘導されるＧＡＬＲ２下流シグナル伝達の変化を測定する。これらの機能性アッセイは、単離細胞膜核分中又は表面にレセプターを発現する細胞上で行うことができる。
【０１６３】
以下の記述は、ＧＡＬＲ２とニューロペプチドＱポリペプチドの相互作用に基づく結合性及び機能性アッセイの双方の方法を提供する。
【０１６４】
Ａ．  ＧＡＬＲ２ポリペプチド
ＧＡＬＲ２とニューロペプチドＱポリペプチドの相互作用を用いるアッセイは、ＧＡＬＲ２ポリペプチド源を必要とする。ヒトＧＡＬＲ２のポリヌクレオチドとポリペプチド配列は、本明細書において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１及び２として表される。マウスＧＡＬＲ２のポリヌクレオチドとポリペプチド配列は、本明細書において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３及び４として表される。ラットＧＡＬＲ２のポリヌクレオチドとポリペプチド配列は、本明細書において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５及び６として表される。アカゲザルＧＡＬＲ２のポリヌクレオチドとポリペプチド配列は、本明細書において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：
７及び８として表される。チンパンジーＧＡＬＲ２のポリヌクレオチドとポリペプチド配列は、本明細書において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９及び１０として表される。
【０１６５】
ＧＡＬＲ２ポリペプチド配列はまた、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔデータベースに、寄託番号Ｏ４３６０３、Ａ５ＪＵＵ４及びＱ３２ＭＮ８で記録されている。関連配列は、ヒトＧＡＬＲ２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＯ．ＮＰ  ＮＰ００３８４８（ポリペプチド配列）及びＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＯ．ＡＦ０４０６３０（ヌクレオチド配列））、マウスＧＡＬＲ２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＯ．ＡＦ０４２７８４（ヌクレオチド配列）及びＳｗｉｓｓｐｒｏｔ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＯ．Ｏ８８８５４（ポリペプチド配列））、ラットＧＡＬＲ２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＯ．ＡＦ０１０３１８（ヌクレオチド配列）及びＳｗｉｓｓｐｒｏｔ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＯ．Ｏ０８７２６（ポリペプチド配列））、アカゲザル（Ｅｎｓｅｍｂｌ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＯ．ＥＮＳＭＭＵＴ００００００１２４２２（ヌクレオチド配列）及びＥｎｓｅｍｂｌ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＯ．  ＥＮＳＭＭＵＰ００００００１１６５１（ポリペプチド配列））及びチンパンジー（Ｅｎｓｅｍｂｌ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＯ．ＥＮＳＰＴＲＴ００００００１７７３９（ヌクレオチド配列）及びＥｎｓｅｍｂｌ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＯ．ＥＮＳＰＴＲＰ００００００１６４３５（ポリペプチド配列））のものを含む。
【０１６６】
当業者は、既知の配列に基づいてデザインしたプライマー又はプローブを用いて、基本的なＰＣＲ及び分子クローン技術を介して、そのタンパク質をコードするｍＲＮＡを含むサンプルからのＧＡＬＲ２配列を容易に増幅することができる。
【０１６７】
組み換えポリペプチドの発現は、当該技術分野においてよく知られている。当業者は、本発明の有用なＧＡＬＲ２ポリペプチドの真核又は前核細胞内での発現のためのベクター及び発現制御配列を容易に選択することができる。
【０１６８】
結合性又はシグナル伝達機能を持つためには、ＧＡＬＲ２は、細胞膜又は界面活性剤様の合成リポソームに結合していなければならない。細胞膜画分を調製する方法は当業者によく知られており、例えば、Ｈｕｂｂａｒｄ及びＣｏｈｎ（Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、６４：４６１−４７９、１９７５）によって報告された方法である。ＧＡＬＲ２を含有する膜を製造するためには、かかる技術を、内因的に（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｌｙ）又は組み換えによりＧＡＬＲ２を発現する細胞に適用するだけでよい。あるいは、膜遊離ＧＡＬＲ２は、ポリペプチドの界面活性剤溶液の希釈により、膜調製物中に組み込むことができる（例えば、Ｓａｌａｍｏｎら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．、７１：２８３−２９４、１９９６）。
【０１６９】
Ｂ．  ニューロペプチドＱポリペプチド
ヒトプレプロニューロペプチドＱのポリヌクレオチド配列は、本明細書において、ＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：１１として表される。ヒトプレプロニューロペプチドＱのポリペプチド配列は、本明細書において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２として表される。ヒトニューロペプチドＱのポリペプチド配列は、本明細書において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３として表される。
【０１７０】
ヒトプレプロニューロペプチドＱのポリペプチド配列はまた、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔデータベースに寄託番号Ｑ９ＢＴ５６にて記録されている。ヒトのポリヌクレオチド配列はまた、寄託番号ＢＣ００４３３６．１にて記録されている。関連ポリペプチド配列は、図４２〜４７においてＥｎｓｅｍｂｌ寄託番号及び配列として記述した異なる種からの配列が含まれる。
【０１７１】
ＧＡＬＲ２と同様に、ニューロペプチドＱポリヌクレオチドは、既知の配列を増幅プライマー又はプローブとして用いて、標準的なＰＣＲ及び分子クローニング技術を介してクローンすることができる。同様に、クローンされたニューロペプチドＱポリペプチドは、当該技術分野で知られているように、真核又は前核細胞中で発現することができる。非限定的な例として、哺乳類ニューロペプチドＱ発現ベクター系は、（Ｍｉｓｈｉｚｕｍａ及びＮａｇａｔａ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１８：５３２２、１９９０により記載された）ヒトＥＦｌａのプロモーター、ポリリンカー、ＥＣＭＶ配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ、Ｇｈａｔｔａｓらにより記載、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１１：５８４８−５８５９、１９９１）及びＳＶ４０ポリシグナルが続くネオマイシン耐性遺伝子を含むバイシストロン性発現ベクターを含むことができる。ニューロペプチドＱポリペプチドはまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写及び翻訳を介して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現させることもできる。
【０１７２】
さらに、そのアッセイ又は技術において望ましい場合には、本発明のニューロペプチドＱポリペプチドは、融合タンパク質又はタグ結合タンパク質として製造することができる。ニューロペプチドＱポリペプチドの精製又は検出を容易にするために、例えば、全長ニューロペプチドＱポリペプチド又はその一部（すなわち、少なくとも１０アミノ酸、好ましくは、少なくとも１３アミノ酸以上で、全長ニューロペプチドＱポリペプチドより１アミノ酸少ないものまで）を、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ又は６Ｘ−Ｈｉｓペプチドに融合することができる。タグ結合又は融合タンパク質の製造のための方法又はベクターは、当業者によく知られており、かかる融合又はタグ結合タンパク質を単離し検出する方法も同様である。
【０１７３】
ニューロペプチドＱポリペプチド及び特に切断形態はまた、当該技術分野で知られているように、化学合成により製造することもできる。
【０１７４】
組み換えニューロペプチドＱポリペプチドは、精製して用いることができる。あるいは、ニューロペプチドＱをトランスフェクトした細胞からの調整培地を使用できる。本発明において、その結合性又は機能性アッセイに必要なニューロペプチドＱの量は、アッセイによって変わる。タグ結合ニューロペプチドＱポリペプチドのＧＡＬＲ２に対するアフィニティー及びＥＣ５０値は、全長野生型ニューロペプチドＱポリペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ
ＮＯ：１２、１３又は１４）に比べて変わるかもしれず、従って、そのアッセイに必要な量は、野生型の値に対して調整することができる。そのアッセイにおいて必要な場合には、ニューロペプチドＱポリペプチドは、合成の間に、培地中で、放射標識されたアミノ酸、例えば、３５Ｓ−Ｍｅｔ等の３５Ｓ−標識アミノ酸、１４Ｃ−Ｌｅｕ等の１４Ｃ−標識アミノ酸、３Ｈ−標識（トリチウム標識した）アミノ酸又は適宜な他のアミノ酸、を取り込ませることによって標識することができる。化学標識の方法は、当該技術分野で知られている。
【０１７５】
蛍光標識はまた、標準的標識技術を用いて、ニューロペプチドＱポリペプチド又は他のＧＡＬＲ２リガンドに結合することができる。
【０１７６】
Ｃ．  ＧＡＬＲ２活性の調節剤を識別するためのアッセイ
ＧＡＬＲ２レセプターのリガンドとしてのニューロペプチドＱポリペプチドの識別は、レセプター活性のアゴニスト、アンタゴニスト及びインバースアゴニストを識別するためのスクリーニングアッセイを可能にする。スクリーニングアッセイには２つの一般的なアプローチがある。
【０１７７】
１）  ＧＡＬＲ２を発現する細胞、かかる細胞からの膜抽出物又はＧＡＬＲ２を含有す
る固定化脂質膜を、標識ニューロペプチドＱポリペプチド及び候補化合物に暴露するリガンド結合アッセイ。インキュベーションに続いて、反応混合物を、標識ニューロペプチドＱポリペプチドのＧＡＬＲ２レセプターへの特異的結合について計測する。標識ニューロペプチドＱポリペプチドに干渉するか又はそれを置換する化合物は、ＧＡＬＲ２活性のアゴニスト、アンタゴニスト又はインバースアゴニストでありえる。これらのカテゴリーのいずれが適合するかを確かめるためには、陽性化合物に対して機能性分析を行うことができる。
【０１７８】
２）  ＧＡＬＲ２のシグナル伝達活性を測定する機能性アッセイ。ａ）  アゴニストのスクリーニングについては、ＧＡＬＲ２を発現する細胞又はそれから調製した膜を、候補化合物と共にインキュベートし、そしてＧＡＬＲ２のシグナル伝達活性を測定する。アッセイは、アゴニストとしてのニューロペプチドＱポリペプチドを用いて検証し、レセプター活性を調節する化合物によって誘起された活性を、ニューロペプチドＱポリペプチドによって誘起された活性と比較する。アゴニスト又は部分的アゴニストが存在する場合、アゴニスト又は部分的アゴニストは、野生型ヒトニューロペプチドＱポリペプチド（ＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：１２、１３又は１４）の最大活性の少なくとも１０％に相当する最大生物学的活性を持ち、そして好ましくは、５０％、７５％、１００％又はそれ以上の活性を持ち、野生型ヒトニューロペプチドＱポリペプチドよりも２−倍、５−倍、１０−倍又はそれ以上の高い活性を有する場合も含まれる。ｂ）  アンタゴニスト又はインバースアゴニストのスクリーニングについては、ＧＡＬＲ２を発現する細胞又はそれから単離した膜を、ニューロペプチドＱポリペプチドの存在下にて、候補化合物の存在下又は非存在下で、シグナル伝達活性についてアッセイする。アンタゴニスト又はインバースアゴニストは、アンタゴニスト又はインバースアゴニストを欠いた反応に比べ、ニューロペプチドＱポリペプチド−刺激レセプター活性のレベルを少なくとも１０％減少させる。ｃ）  インバースアゴニストスクリーニングについては、恒常的なＧＡＬＲ２活性を発現する細胞又はそれから単離した膜を、候補化合物の存在下及び非存在下にて、レセプター活性を測定する機能性アッセイにおいて使用することができる。インバースアゴニストは、レセプターの恒常的な活性を少なくとも１０％減少させる化合物である。ＧＡＬＲ２の過剰発現（すなわち、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞において自然に発現されるレベルに対し、ＧＡＬＲ２ポリペプチドの５倍以上過剰な発現）は、恒常的な活性化につながるかもしれない。ＧＡＬＲ２は、強い構成的プロモーター（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、例えば、ＣＭＶ  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒの制御下に置くことにより過剰発現させることができる。あるいは、保存ＧＰＣＲアミノ酸又はアミノ酸部位の特定の突然変異は、恒常的な活性を導く傾向がある（Ｋｊｅｌｓｂｅｒｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７：１４３０−１４３３、１９９２；ＭｃＷｈｉｎｎｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７５：２０８７−２０９７、２０００；Ｒｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８：１６４８３−１６４８７，１９９３；及びＰａｒｍａら、Ｎａｔｕｒｅ、３６５：６４９−６５１、１９９３）。
【０１７９】
リガンド結合及び置換アッセイ（ｌｉｇａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｓｓａｙ）：ニューロペプチドＱポリペプチドのＧＡＬＲ２への結合を阻害する化合物をスクリーニングするためには、細胞上で発現するＧＡＬＲ２ポリペプチド又はレセプターポリペプチドを含む単離した膜を、ニューロペプチドＱポリペプチドと共に使用することができる。結合又はニューロペプチドＱポリペプチドの置換のみを測定するアッセイで識別された場合には、化合物は、それらがアゴニスト、アンタゴニスト又はインバースアゴニストのいずれとして作用するのかを決めるために、機能性試験に付されなければならない。
【０１８０】
置換実験については、ＧＡＬＲ２ポリペプチドを発現する細胞を、候補調節剤の濃度上昇の存在下又は非存在下で、標識ニューロペプチドＱポリペプチドと共に結合バッファー
中でインキュベートする。アッセイを検証し較正するためには、非標識ニューロペプチドＱポリペプチドの濃度上昇を用いた対照競合反応を行うことができる。インキュベーション後、細胞をよく洗い、そして結合している標識ニューロペプチドＱポリペプチドを、その標識について適宜な方法で測定する（例えば、シンチレーション計測、酵素アッセイ、蛍光等）。候補調節剤存在下における、結合した標識ニューロペプチドＱポリペプチドの量の少なくとも１０％の減少は、候補調節剤による結合の置換を示す。標識ニューロペプチドＱポリペプチドの５０％を置換する場合（準飽和（ｓｕｂ−ｓａｔｕｒａｔｉｎｇ）ニューロペプチドＱポリペプチド用量）には、候補調節剤は、本明細書に記載した本アッセイ又は他のアッセイにおいて、特異的に結合すると考えられる。
【０１８１】
あるいは、結合又は結合の置換は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）でモニターすることができる。表面プラズモン共鳴アッセイは、ニューロペプチドＱポリペプチドの、水相からの、センサー上の膜内に固定化されたＧＡＬＲ２ポリペプチドへの結合又は結合の喪失により引き起こされる、固定化センサー近傍の質量の変化により、２つの分子の間の結合を測定する定量的方法として使用することができる。この質量変化は、ニューロペプチドＱポリペプチド又は候補調節剤の注入又は除去後に、時間に対する共鳴単位（ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｕｎｉｔｓ）として計測され、そして例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ）を用いて測定することができる。ＧＡＬＲ２は、Ｓａｌａｍｏｎらによって記述された方法（Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ．７１：２８３−２９４；Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．、８０：１５５７−１５６７、２００１；Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．、２４：２１３−２１９、１９９９）に従って、薄層脂質膜中のセンサーチップ（例えば、リサーチグレードＣＭ５チップ；Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ）上に固定化することができる。Ｓａｒｒｉｏらは、チップ上の脂質層中に固定化したクラスＡのＧＰＣＲ
Ａ（１）アデノシンレセプターに対するリガンドの結合を検出するためにＳＰＲを使用することができることを示した。当業者は、Ｓａｒｒｉｏらにより報告された条件（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、２０：５１６４−５１７４、２０００）を出発点として用いて、ＳＰＲアッセイにおける、ニューロペプチドＱポリペプチドのＧＡＬＲ２への結合の条件を微調整することができる。
【０１８２】
ＳＰＲは、結合の調節剤について、少なくとも２つの方法でアッセイを行うことができる。第一に、ニューロペプチドＱポリペプチドを、固定化ＧＡＬＲ２ポリペプチドに予め結合させ、次いで、１０μｌ／ｍｉｎの流速及び１ｎＭから１００μＭの範囲の濃度で候補調節剤を注入することができる。結合ニューロペプチドＱポリペプチドの置換は定量化でき、調節剤の結合の検出を可能にする。あるいは、膜結合ＧＡＬＲ２ポリペプチドを候補調節剤と予めインキュベートし、そしてニューロペプチドＱポリペプチドと接触させる。調節剤に予め暴露されていないチップ上の結合に対する、調節剤に暴露されたＧＡＬＲ２へのニューロペプチドＱポリペプチドの結合の違いが結合性を示す。いずれのアッセイにおいても、候補調節剤非存在下におけるニューロペプチドＱポリペプチドの結合量に対する、候補調節剤存在下におけるニューロペプチドＱポリペプチドの結合量の１０％以上の減少は、候補調節剤が、ＧＡＬＲ２とニューロペプチドＱポリペプチドの相互作用を阻害することを示す。
【０１８３】
ニューロペプチドＱポリペプチドのＧＡＬＲ２への結合の阻害を測定する別の方法は、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を用いる。ＦＲＥＴは、蛍光供与体（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｄｏｎｏｒ）（Ｄ）の発光スペクトルが蛍光受容体（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｃｅｐｔｏｒ）（Ａ）の励起スペクトルと重複する場合に、互いに近接した（通常、＜１００オングストロームの距離）ＤとＡの間で起こる量子力学的現象である。試験を行う分子、例えば、ニューロペプチドＱポリペプチド及びＧＡＬＲ２ポリペプチドを、供与体及び受容体蛍光体の相補的ペアで標識する。ＧＡＬＲ２−ニューロペプチドＱポリペプチド相互作用により密接に結合している間は、供与体蛍光体の励起に伴って発光
される蛍光は、ポリペプチドが結合していない場合にその励起波長に反応して発光された蛍光とは異なる波長を有し、各波長での発光強度の測定により、非結合ポリペプチドに対する結合ポリペプチドの定量化を可能にする。ポリペプチドを標識する蛍光体の供与体：受容体ペアは、当業者によく知られている。Ｃｙａｎ  ＦＰ（ＣＦＰ、供与体（Ｄ））及びＹｅｌｌｏｗ  ＦＰ（ＹＦＰ、受容体（Ａ））として知られるＡ．ｖｉｃｔｏｒｉａ  ＧＦＰの変異体は、特に有用である。ＧＦＰ変異体は、タンパク質−タンパク質相互作用を測定するためのＦＲＥＴスキームのＤ−Ａペアとして供するために、結合ペアのそれぞれのメンバーを用いて融合タンパク質として作ることができる。融合体としてのＧＦＰ変異体の発現のためのベクターは、当該技術分野で知られている。例として、ＣＦＰ−ニューロペプチドＱポリペプチド融合体とＹＦＰ−ＧＡＬＲ２融合体を作ることができる。標識ニューロペプチドＱポリペプチドとＧＡＬＲ２タンパク質の混合物への候補調節剤の添加は、候補調節剤を欠いたサンプルと比べて、例えば、ＹＦＰ蛍光の減少により裏付けられるエネルギー転移の阻害を引き起こす。
【０１８４】
ＧＡＬＲ２−ニューロペプチドＱポリペプチド相互作用の検出のためのＦＲＥＴを用いたアッセイにおいて、候補調節剤を欠いたサンプルと比べた、候補調節剤を含むサンプル中における受容体波長での蛍光発光強度の１０％以上の減少は、候補調節剤がＧＡＬＲ２−ニューロペプチドＱポリペプチド相互作用を阻害することを示す。
【０１８５】
ＦＲＥＴの変法は、分子相互作用をモニターするために蛍光消光を使用する：相互作用するペアの一方の分子を蛍光体で標識し、そして他方を、近接状態になった場合に蛍光体の蛍光を消光する分子で標識することができる。励起に伴う蛍光の変化は、蛍光体を結合した分子：消光体ペアの結合の変化を示す。一般的に、標識ＧＡＬＲ２ポリペプチドの蛍光の増大は、消光体を保持するニューロペプチドＱポリペプチドが置換されたことを示す。消光アッセイについては、候補調節剤を欠いたサンプルと比べた、候補調節剤を含むサンプル中における蛍光発光強度の１０％以上の増大は、候補調節剤がＧＡＬＲ２−ニューロペプチドＱポリペプチド相互作用を阻害することを示す。
【０１８６】
表面プラズモン共鳴及びＦＲＥＴ法に加えて、蛍光偏光測定は、タンパク質−タンパク質結合を定量化するのに有用である。蛍光タグを付された分子の蛍光偏光値は、回転相関時間（ｔｈｅ  ｒｏｔａｔｉｏｎａｌ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ）又は反転速度（ｔｕｍｂｌｉｎｇ  ｒａｔｅ）に依存する。蛍光標識されたニューロペプチドＱポリペプチドと結合するＧＡＬＲ２により形成された複合体等のタンパク質複合体は、複合体ではない標識ニューロペプチドＱポリペプチドよりも高い偏光値を有する。ＧＡＬＲ２−ニューロペプチドＱポリペプチド相互作用の候補阻害剤を含ませることにより、もしその候補阻害剤が、ＧＡＬＲ２のニューロペプチドＱポリペプチドとの相互作用を撹乱し又は阻害するならば、候補阻害剤を欠いた混合物と比較して、蛍光偏光が減少する。蛍光偏光は、ポリペプチド又はタンパク質複合体の形成を撹乱する小分子の識別に好適である。候補調節剤を欠いたサンプルの蛍光偏光に比べた、候補調節剤を含むサンプルにおける蛍光偏光の１０％以上の減少は、候補調節剤がＧＡＬＲ２−ニューロペプチドＱポリペプチド相互作用を阻害することを示す。
【０１８７】
ＧＡＬＲ２−ニューロペプチドＱポリペプチド相互作用をモニターする別の代替法は、バイオセンサーアッセイを使用する。
【０１８８】
ＩＣＳバイオセンサーは、ＡＭＢＲＩ（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）によって記述されている。この技術において、ＧＡＬＲ２及びニューロペプチドＱポリペプチド等のマクロ分子の会合は、懸架した膜二重層中のグラミシジン促進イオンチャンネルの閉鎖と結び付いており、従って、バイオセンサーの（インピーダンスと類似する）アドミッタンスの測
定可能な変化と関連付けられる。このアプローチは、６桁を超えるアドミッタンスの変化において直線的であり、小分子コンビナトリアルライブラリの大規模なハイスループットスクリーニング（ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）に理想的である。候補調節剤を欠いたサンプルのアドミッタンスに比べた、候補調節剤を含むサンプルにおけるアドミッタンスの１０％以上の変化（増大又は減少）は、候補調節剤が、ＧＡＬＲ２とニューロペプチドＱポリペプチドの相互作用を阻害することを示す。
【０１８９】
タンパク質−タンパク質相互作用のアッセイにおいては、相互作用の調節剤は、必ずしもタンパク質の物理的に相互作用する部位と直接的に相互作用する必要はなくてもよいということに留意することが重要である。調節剤が、タンパク質−タンパク質相互作用の部位から除かれた部位で相互作用し、例えば、ＧＡＬＲ２ポリペプチドのコンフォメーションの変化を引き起こすこともありえる。それでもやはり、このように作用する調節剤（アンタゴニスト又はアゴニスト）は、ＧＡＬＲ２の活性を調節する作用剤として重要である。
【０１９０】
記載した結合性アッセイのいずれもが、ＧＡＬＲ２レセプター分子に結合し、又はニューロペプチドＱポリペプチドのレセプターへの結合に影響を与えるサンプル、例えば組織サンプル中の作用剤の存在を決定するのに用いることができる。そのために、ＧＡＬＲ２ポリペプチドを、サンプルの存在下又は非存在下でニューロペプチドＱポリペプチド又は別のリガンドと反応させ、そしてニューロペプチドＱポリペプチド又はリガンドの結合を、使用する結合性アッセイに適した方法で測定する。ニューロペプチドＱポリペプチド又は他のリガンドの結合の１０％以上の減少は、サンプルが、ＧＡＬＲ２又はリガンドのレセプターポリペプチドへの結合を調節する作用剤を含むことを示す。
【０１９１】
レセプター活性の機能性アッセイ
ｉ．  ＧＴＰアーゼ／ＧＴＰ結合性アッセイ：
ＧＡＬＲ２等のＧＰＣＲに関しては、レセプター活性は、そのレセプターを有する細胞膜によるＧＴＰ結合により測定される。Ｔｒａｙｎｏｒ及びＮａｈｏｒｓｋｉにより記述された方法（Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、４７：８４８−８５４、１９９５）においては、標識されたＧＴＰの結合を測定することにより、膜に結合したＧ−タンパク質を本質的に測定する。ＧＴＰ結合性アッセイでは、レセプターを発現する細胞から単離した膜は、それ自体３５Ｓ−ＧＴＰ−ガンマ−Ｓ及びＧＤＰを含むバッファー中でインキュベートしてもよい。インキュベーションの後、非結合標識ＧＴＰをろ過により除く。Ｇタンパク質に結合した標識ＧＴＰを、液体シンチレーション計測により測定する。
【０１９２】
ニューロペプチドＱポリペプチド−誘導ＧＡＬＲ２活性の調節について試験するために、ＧＡＬＲ２ポリペプチドを発現する細胞から調製した膜を、ニューロペプチドＱポリペプチドと混合し、そしてＧＡＬＲ２活性の候補調節剤の存在下及び非存在下にて、ＧＴＰ結合アッセイを行う。候補調節剤を含むこの種のアッセイにおける、シンチレーション計測により測定された標識ＧＴＰ結合の、調節剤を含まないアッセイに比べた１０％以上の減少は、候補調節剤がＧＡＬＲ２活性を阻害することを示す。
【０１９３】
アゴニストとして作用する化合物を識別するために、類似のＧＴＰ−結合性アッセイをニューロペプチドＱポリペプチド無しで行うことができる。この場合、ニューロペプチドＱポリペプチド−刺激ＧＴＰ結合を標準として用いる。化合物が１０μＭ以下で存在するときに、ニューロペプチドＱポリペプチドにより誘導されるＧＴＰ結合のレベルの少なくとも５０％を誘導する場合に、その化合物はアゴニストと考えられ、そして、ニューロペプチドＱポリペプチドにより誘導されるレベルと同じか又はより高いレベルを誘導することが好ましい。
【０１９４】
ＧＴＰアーゼ活性は、ＧＡＬＲ２ポリペプチドを含む膜をガンマ−３２Ｐ−ＧＴＰとインキュベートすることにより測定される。活性ＧＴＰアーゼは、標識を無機リン酸として放出し、それは、分離後、シンチレーション計数により検出される。候補化合物の非特異的効果を除外するために、対照は、ＧＡＬＲ２を発現しない細胞（モック−感染）から単離された膜を用いたアッセイを含む。
【０１９５】
ＧＡＬＲ２−調節ＧＴＰアーゼ活性に対する候補調節剤の効果についてアッセイするために、膜サンプルを、調節剤の存在下又は非存在下でニューロペプチドＱポリペプチドとインキュベートし、次いでＧＴＰアーゼアッセイを行う。調節剤を含まないサンプルと比べた、ＧＴＰ結合又はＧＴＰアーゼ活性のレベルの１０％以上の変化（増大又は減少）は、候補調節剤によるＧＡＬＲ２の調節を示す。
【０１９６】
ｉｉ．  下流経路活性化アッセイ：
ａ．  カルシウム流動−イクオリン−アッセイ：
イクオリンアッセイは、ＧＰＣＲの活性化により誘導された細胞内カルシウム放出に対するミトコンドリアのアポイクオリンの応答を利用する（Ｓｔａｂｌｅｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５２：１１５−１２６、１９９７；Ｄｅｔｈｅｕｘら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９２  １５０１−１５０８、２０００）。要約すると、ＧＡＬＲ２−発現クローンを、ミトコンドリアのアポイクオリンとＧα１６を同時発現するようにトランスフェクトする。細胞をセレンテラジンＨ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）とインキュベートし、洗浄し（例えば、ＤＭＥＭ−Ｆ１２培養培地中で）、そして所定の濃度にて再懸濁する（例えば、約０．５×１０６細胞／ｍｌ）。次いで、細胞をニューロペプチドＱペプチドと混合し、そしてイクオリンによる光照射をルミノメーターで記録する。結果を相対発光量（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｕｎｉｔｓ）（ＲＬＵ）として表す。候補化合物の非特異的効果を除外するために、対照は、ＧＡＬＲ２を発現しない細胞（モック−感染）から単離された膜を用いたアッセイを含む。
【０１９７】
ＧＡＬＲ２ポリペプチドを発現し、候補調節剤で処理した細胞のサンプルにおいて、ＧＡＬＲ２ポリペプチドを発現するが、候補調節剤で処理しなかった細胞のサンプルに比べ又はＧＡＬＲ２ポリペプチドを発現しないが（モック−感染細胞）、候補調節剤で処理した細胞のサンプルに比べて、光強度が１０％以上増大又は減少した場合には、イクオリン活性又は細胞内カルシウムレベルは「変化」する。
【０１９８】
ニューロペプチドＱポリペプチドの非存在下で行う場合には、このアッセイは、ＧＡＬＲ２活性のアゴニストを識別するために使用することができる。このアッセイをニューロペプチドＱポリペプチドの存在下で行う場合には、アンタゴニスト又はアロステリック調節剤のアッセイに用いることができる。
【０１９９】
ｂ．  アデニルシクラーゼアッセイ：
アデニルシクラーゼ活性のアッセイは、Ｋｅｎｉｍｅｒ＆Ｎｉｒｅｎｂｅｒｇ（Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２０：５８５−５９１、１９８１）に記載されている。
【０２００】
本発明によれば、ＧＡＬＲ２活性の候補調節剤で処理した細胞から得たサンプルにおいて、候補調節剤で処理しない細胞の類似のサンプルと比較して、又はＧＡＬＲ２ポリペプチドを発現しないが（モック−感染細胞）、候補調節剤で処理した細胞のサンプルと比較して、１０％以上増大又は減少する場合には、アデニルシクラーゼ活性は「変化」する。
【０２０１】
ｃ．  ｃＡＭＰアッセイ：
細胞内又は細胞外ｃＡＭＰは、ｃＡＭＰラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又はｃＡＭＰ結合タンパク質又はｃＡＭＰ結合抗体を用いて、当該技術分野において広く知られた方法
に従って測定される。例えば、Ｈｏｒｔｏｎ及びＢａｘｅｎｄａｌｅ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４１：９１−１０５、１９９５）は、ｃＡＭＰ測定に対するＲＩＡアッセイを記述する。ｃＡＭＰを測定するための多くのキットが市販されている。幾つかの候補調節剤に有りえる非特異的効果を除外するために、対照反応はモック感染細胞の抽出物を用いて行うべきである。
【０２０２】
ＧＡＬＲ２ポリペプチドを発現し、ＧＡＬＲ２活性の候補調節剤で処理した細胞において（又はかかる細胞の抽出物において）、Ｈｏｒｔｏｎ及びＢａｘｅｎｄａｌｅ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４１：９１−１０５、１９９５）のＲＩＡ−ベースアッセイを用いて検出されたｃＡＭＰのレベルが、候補調節剤で処理しない類似の細胞におけるｃＡＭＰレベルと比べて、少なくとも１０％増大又は減少する場合には、ｃＡＭＰのレベルは「変化」する。
【０２０３】
ｄ．  リン脂質の分解、ジアシルグリセロール及びイノシトール三リン酸の産生：
リン脂質の分解を活性化するレセプターは、リン脂質の分解及び結果としての２次メッセンジャー、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）及び／又はイノシトール三リン酸（ＩＰ３）の生成をモニターすることにより、ＧＡＬＲ２の既知の又は被疑調節剤の活性の変化についてモニターできる。これらの生成物の各々を測定する方法は、Ｉａｎ  Ｍ．Ｂｉｒｄ．Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、１９９８により編集されたＰｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓに記載されている。ホスファチジルイノシトールの分解のアッセイについても記載するＲｕｄｏｌｐｈら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４：１１８２４−１１８３１、１９９９）も参照されたい。アッセイは、候補調節剤の存在下又は非存在下で、ニューロペプチドＱポリペプチドで処理し又は処理しないＧＡＬＲ２を発現する細胞又は細胞抽出物を用いて行うべきである。幾つかの候補調節剤に有りえる非特異的効果を除外するために、対照反応はモック感染細胞又はそれらの抽出物を用いて行うべきである。
【０２０４】
本発明によれば、ＧＡＬＲ２ポリペプチドを発現しかつ候補調節剤で処理した細胞からのサンプルにおいて、候補調節剤で処理しないＧＡＬＲ２ポリペプチド発現細胞からのサンプルにおいて観察されるレベルに比べて、少なくとも１０％増大又は減少する場合には、ホスファチジルイノシトールの分解及びＤＡＧ及び／又はＩＰ３レベルは「変化」する。
【０２０５】
ｅ．  ＰＫＣ活性化アッセイ：
成長因子レセプターチロシンキナーゼは、リン脂質−及びカルシウム−依存プロテインキナーゼのファミリーであるプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性化が関与する経路を介してシグナル伝達を行う傾向がある。ＰＫＣの活性化は、最終的には、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｍｙｃ及びｃ−ｊｕｎを含む数々のプロトオンコジーン転写因子をコードする遺伝子、プロテアーゼ、Ｉ型コラゲナーゼ及びプラスミノーゲン活性化因子阻害因子を含むプロテアーゼ阻害因子並びに細胞内接着分子Ｉ（ＩＣＡＭ  Ｉ）を含む接着分子の転写に帰結する。ＰＫＣによって誘導された遺伝子産物の増大を検出するためにデザインされたアッセイは、ＰＫＣの活性化、そしてそれによってレセプター活性をモニターするために用いることができる。加えて、ＰＫＣを介してシグナルを伝達するレセプターの活性は、ＰＫＣの活性化による遺伝子の活性化のための制御配列によって主導されるレポーター遺伝子コンストラクトを通じてモニターすることができる。このタイプのレポーター遺伝子−ベースのアッセイについて、以下により詳細に議論する。ＰＫＣ活性のより直接的な測定については、Ｋｉｋｋａｗａら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５７：１３３４１、１９８２）の方法を用いることができる。このアッセイは、ＰＫＣの基質ペプチドのリン酸化を測定するもので、基質ペプチドは、その後、ホスフォセルロースろ紙への結合により分離される。このＰＫＣアッセイ系は、精製したキナーゼの活性又は粗細胞抽出物の活性を測定
するために使用できる。
【０２０６】
可能なアッセイの１つにおいて、基質は、ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質タンパク質（ＭＡＲＣＫＳ）由来のペプチドＡｃ−ＦＫＫＳＦＫＬ−ＮＨ２である。このペプチドの酵素のＫｍは約５０μＭである。当該技術分野で知られる他の塩基性のプロテインキナーゼＣ−選択性ペプチドを、それらのＫｍの少なくとも２〜３倍の濃度にて使用することもできる。アッセイに必要な補助因子は、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、ＡＴＰ、ホスファチジルセリン及びジアシルグリセロールを含む。ユーザーの意図により、アッセイは、存在するＰＫＣの量（活性化条件）又は存在する活性ＰＫＣの量（非活性化条件）を決定するために行うことができる。本発明のほとんどの目的に対しては、活性化しえるＰＫＣを測定するよりも、単離した場合にサンプル中で活性なＰＫＣを測定するような非活性化条件が使用される。非活性化条件において、ＥＧＴＡを選択するアッセイでは塩化カルシウムは省略される。アッセイは、ＨＥＰＥＳ、ＤＴＴ、ＭｇＣｌ２、ＡＴＰ、ガンマ−３２Ｐ−ＡＴＰ、ペプチド基質、ホスファチジルセリン／ジアシルグリセロール膜及び塩化カルシウム（又はＥＧＴＡ）を含む混合物中で行われる。反応は、適宜な温度（例えば、約３０℃）にて適宜な時間（例えば、約５−１０分）行い、次いでＡＴＰ及びＥＤＴＡを添加して反応を止める。
【０２０７】
反応を止めた後、各反応液の一部をＷｈａｔｍａｎ  Ｐ８１リン酸セルロースフィルター上にスポットし、次いで、希釈リン酸、そして最後に９５％ＥｔＯＨで洗浄する。
【０２０８】
結合した放射活性をシンチレーション計数で測定する。標識ＡＴＰの比活性（ｃｐｍ／ｎｍｏｌ）を、反応液のサンプルをＰ８１ペーパー上にスポットし、そして洗浄することなく計測することにより決定する。ＰＫＣ活性の単位は、１分当たりに転移したｐｈｏｓｐｈａｔｅのｎｍｏｌ数と定義される。
【０２０９】
あるいは、アッセイは、ＰａｎＶｅｒａにより販売されるプロテインキナーゼＣアッセイキットを用いて行うことができる。
【０２１０】
アッセイは、候補調節剤の存在下又は非存在下にて、ニューロペプチドＱポリペプチドで処理し又は処理しない、ＧＡＬＲ２ポリペプチドを発現する細胞からの抽出物について行ってもよい。幾つかの候補調節剤に有りえる非特異的効果を除外するために、対照反応はモック感染細胞又はそれらの抽出物を用いて行うべきである。
【０２１１】
本発明によれば、ＧＡＬＲ２を発現し、かつ候補調節剤で処理した細胞からの抽出物において、候補調節剤で処理しない細胞からの類似のサンプルで行った反応に比べて、上記のいずれかのアッセイにより測定したＰＫＣの単位が、少なくとも１０％増大又は減少する場合は、ＰＫＣ活性は候補調節剤により「変化」する。
【０２１２】
ｆ．  キナーゼアッセイ：
マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼ活性は、市販の幾つかのキット、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓにより販売されるｐ３８ＭＡＰキナーゼアッセイキット（Ｃａｔ♯９８２０）又はＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓにより販売されるＦｌａｓｈＰｌａｔｅ  ＭＡＰキナーゼアッセイのいずれかを用いてアッセイすることができる。
【０２１３】
ＧＡＬＲ２ポリペプチドを発現し、候補調節剤で処理した細胞からのサンプルにおいて、候補調節剤で処理しない類似の細胞からのサンプルにおけるＭＡＰキナーゼ活性に比べて、活性のレベルが１０％以上増大又は減少する場合は、ＭＡＰキナーゼ活性は「変化」する。
【０２１４】
既知の合成又は天然チロシンキナーゼ基質及び標識ｐｈｏｓｐｈａｔｅを用いたチロシンキナーゼ活性の直接的なアッセイはよく知られており、他のタイプのキナーゼアッセイ（例えば、Ｓｅｒ／Ｔｈｒキナーゼ）と類似である。キナーゼアッセイは、ＧＡＬＲ２ポリペプチドを発現し、候補調節剤の存在下又は非存在下にて、ニューロペプチドＱポリペプチドで処理し又は処理しない細胞からの精製キナーゼ及び粗抽出物の双方で行うことができる。幾つかの候補調節剤に有りえる非特異的効果を除外するために、対照反応はモック感染細胞又はそれらの抽出物を用いて行うべきである。基質は、全長タンパク質又は基質を代理する合成ペプチドのいずれであってもよい。Ｐｉｎｎａ＆Ｒｕｚｚｅｎｅ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．  １３１４：１９１−２２５、１９９６）は、キナーゼ活性の測定に有用な多くのリン酸化基質部位を挙げている。多くのキナーゼ基質ペプチドは市販されている。特に有用なのは、市販の「Ｓｒｃ−関連ペプチド」ＲＲＬＩＥＤＡＥＹＡＡＲＧであり、これは、多くのレセプター及び非レセプターチロシンキナーゼの基質である。下記のアッセイはペプチド基質のフィルターへの結合を必要とするので、ペプチド基質は、結合を促進するために正味の正電荷を持つべきである。
【０２１５】
一般的に、ペプチド基質は、少なくとも２つの塩基性残基と遊離アミノ末端を持つ。
【０２１６】
一般に、アッセイは、キナーゼバッファー（ＢＳＡ、トリス−Ｃｌ、ＭｇＣｌ２；アッセイを行うキナーゼによって、ＭｇＣｌ２の代わりに又はそれに加えて、ＭｎＣｌ２を用いることができる。）、ＡＴＰ、３２Ｐ−ＡＴＰ、ペプチド基質、試験を行うキナーゼを含む細胞抽出物（キナーゼアッセイに用いる細胞抽出物は、オルトバナジン酸ナトリウム等のホスファターゼ阻害剤を含むべきである。）及びＨ２Ｏを含む適宜な体積で行われる。反応は約３０℃で行われ、そして細胞抽出物の添加により開始される。
【０２１７】
キナーゼ反応は３０秒から約３０分行い、次いで希釈、冷トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を添加する。サンプルを小型遠心機で回転し、そして上清画分をＷｈａｔｍａｎ  Ｐ８１リン酸セルロース円形フィルターにスポットする。フィルターは希釈リン酸、次いでアセトンで洗浄する。フィルターを乾燥し、そして取り込まれた３２Ｐをシンチレーション計数により測定する。キナーゼ反応液中のＡＴＰの比活性（例えば、ｃｐｍ／ｐｍｏｌで）を、反応液の少量のサンプルをＰ８１円形フィルター上にスポットし、洗浄することなく直接計数することにより測定する。次いで、キナーゼ反応液において得られた分当たりの計数（ｃｐｍ）（ブランクを差し引く。）を比活性で割って、反応において転移したｐｈｏｓｐｈａｔｅのモル数を決定する。
【０２１８】
ＧＡＬＲ２ポリペプチドを発現し、候補調節剤で処理した細胞からのサンプルにおいて、候補調節剤で処理しない類似の細胞からのサンプルにおけるキナーゼ活性と比べて、キナーゼ活性のレベルが１０％以上増大又は減少する場合に、チロシンキナーゼ活性は「変化」する。
【０２１９】
ｇ．  下流経路活性化の転写レポーター：
アゴニストのレセプター、例えばＧＡＬＲ２、の結合により開始された細胞内シグナルは、細胞内事象のカスケードを始動させ、それは、最終的に、１又は２以上の遺伝子の転写又は翻訳の急速かつ検出可能な変化を引き起こす。従って、レセプターの活性は、ＧＡＬＲ２活性化に応答する制御配列により主導されるレポーター遺伝子の発現を測定することによりモニターできる。
【０２２０】
本明細書で使用する「プロモーター」は、遺伝子発現のレセプター−介在制御に必要な転写制御要素を意味し、基本的なプロモーターのみならず、レセプター−制御発現に必要ないかなるエンハンサー又は転写因子結合部位をも含む。
【０２２１】
アゴニストの結合により生じる細胞内シグナルに応答し、そして選択されたプロモーターを、その転写、翻訳又は最終的な活性を容易に検出しかつ測定できるレポーター遺伝子に作動的につなげるプロモーターを選択することにより、転写ベースのレポーターアッセイは、そのレセプターが活性化されるか否かの指標を迅速に与える。
【０２２２】
ルシフェラーゼ、ＣＡＴ、ＧＦＰ、ベータ−ラクタマーゼ又はベータ−ガラクトシダーゼ等のレポーター遺伝子は、これらの産物の検出に対するアッセイと同様に、当業者によく知られている。
【０２２３】
レセプター活性のモニターに特によく適合する遺伝子は、迅速に；一般的には、レセプターとエフェクタータンパク質又はリガンドの間の数分の接触の間に誘導される「即初期」遺伝子である。即初期遺伝子の転写の誘導は、新しい制御タンパク質の合成を必要としない。リガンドの結合に対する急速な応答に加えて、レポーターコンストラクトを作成するために有用な好ましい遺伝子の特徴は、静止期（ｑｕｉｅｓｃｅｎｔ）細胞における低い又は検出不可能な発現；遷移的かつ新しいタンパク質の合成と独立した誘導；転写のその後のｓｈｕｔ−ｏｆｆが新しいタンパク質合成を必要とすること；そしてこれらの遺伝子から転写されたｍＲＮＡが短い半減期を有すること、を含む。転写制御要素が有用なものであるためには、これらの特性のすべてを有することが好ましいが、必須ではない。
【０２２４】
多くの異なる刺激に応答する遺伝子の例は、ｃ−ｆｏｓプロトオンコジーンである。ｃ−ｆｏｓ遺伝子は、成長因子、ホルモン、分化特異剤（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｇｅｎｔｓ）、ストレス及び細胞表面タンパク質の他の既知の誘導剤により、タンパク質−合成−依存的に活性化される。ｃ−ｆｏｓ発現の誘導は、極端に速く、しばしばレセプター刺激から数分以内でおこる。この特徴は、レセプター活性化のレポータとしての使用にとって特に魅力的なｃ−ｆｏｓ調節領域をつくる。
【０２２５】
転写因子ＣＲＥＢ（環状ＡＭＰ応答要素結合タンパク質）は、名前が意味するように、細胞内ＡＭＰのレベルに応答する。従って、ｃＡＭＰレベルの調節を介してシグナルを伝達するレセプターの活性化は、転写因子の結合又はＣＲＥＢ結合要素（ＣＲＥ又はｃＡＭＰ応答要素と称される）に連結するレポータ遺伝子の発現のいずれかを測定することによりモニターすることができる。ＣＲＥＢ結合活性に応答するレポーターコンストラクトは、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，９１９、６４９に記載されている。
【０２２６】
他のプロモーター及び転写コントロール要素は、ｃ−ｆｏｓ要素及びＣＲＥＢ応答コンストラクトに加えて、血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）遺伝子プロモーター（ｃＡＭＰ応答；Ｆｉｎｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８５：６６６２−６６６６、１９８８）；ソマトスタチン遺伝子プロモーター（ｃＡＭＰ応答；Ｍｏｎｔｍｉｎｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８．３：６６８２−６６８６、１９８６）；プロエンケファリンプロモーター（ｃＡＭＰ、ニコチン性アゴニスト及びホルボールエステルに応答；Ｃｏｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ、３２３：３５３−３５６、１９８６）；ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）遺伝子プロモーター（ｃＡＭＰ応答；Ｓｈｏｒｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６１：９７２１−９７２６、１９８６）を含む。
【０２２７】
ＧＰＣＲ活性の変化に応答する転写制御要素のさらなる例は、ＡＰ−１転写因子に応答するもの及びＮＦ−ｋＢ活性に応答するものが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０２２８】
プロモーターコンストラクトは、そのコンストラクトでトランスフェクトしたＧＡＬＲ
２発現細胞をニューロペプチドＱポリペプチドに暴露することによって試験されるべきである。ニューロペプチドＱポリペプチドに応答するレポーターの発現の少なくとも２倍の増加は、そのレポータがＧＡＬＲ２活性の指標であることを示す。
【０２２９】
ＧＡＬＲ２活性をニューロペプチドＱポリペプチド−応答転写レポーターコンストラクトと共にアッセイするには、ＧＡＬＲ２ポリペプチドを安定に発現する細胞を、コンストラクトで安定にトランスフェクトする。アゴニストのスクリーニングを行うには、細胞を未処理で放置するか、候補調節剤に暴露するか又はニューロペプチドＱポリペプチドに暴露し、そしてレポーターの発現を測定する。ニューロペプチドＱポリペプチド−処理培養を、既知のアゴニストにより誘導された転写のレベルの標準として用いる。候補調節剤存在下における、レポーターの発現の少なくとも２０％の増大は、候補がＧＡＬＲ２活性の調節剤であることを示す。アゴニストは、少なくとも２０％、そして好ましくはニューロペプチドＱポリペプチドと同量以上のレポーターの発現を誘導する。細胞が、ニューロペプチドＱポリペプチド又は別のアゴニストの非存在下にて、レポーターの基礎的活性が上昇するようなレベルでＧＡＬＲ２ポリペプチドを発現する場合には、このアプローチは、インバースアゴニストをスクリーニングするために用いることもできる。候補調節剤存在下における、その非存在の場合と比べた、レポーター活性の１０％以上の減少は、その化合物がインバースアゴニストであることを示す。
【０２３０】
アンタゴニストをスクリーニングするためには、ＧＡＬＲ２を発現し、レポーターコンストラクト細胞を担持する細胞を、候補調節剤の存在下及び非存在下にて、ニューロペプチドＱポリペプチド（又は別のアゴニスト）に暴露する。候補調節剤存在下における、候補調節剤の非存在の場合と比べた、レポーター発現の１０％以上の減少は、その候補がＧＡＬＲ２活性の調節剤であることを示す。
【０２３１】
転写アッセイのための対照は、ＧＡＬＲ２を発現するが、レポーターコンストラクトを担持しない細胞並びにプロモーターの無いレポーターコンストラクトを有する細胞を含む。ＧＡＬＲ２−制御転写調節剤として識別された化合物については、それらの活性の特異性及びスペクトラムを決定するために、それらが、他の制御配列により又は他のレセプターにより主導される転写に影響を与えるか否かを測定するための分析も行うべきである。
【０２３２】
転写レポーターアッセイ及びほとんどの細胞ベースのアッセイは、ＧＡＬＲ２活性の調節剤について、タンパク質の発現ライブラリーをスクリーニングするのに好適である。ライブラリーは、例えば、天然のソース、例えば、植物、動物、細菌等からのｃＤＮＡライブラリーであってもよく、又は１又は２以上のポリペプチドの突然変異型をランダムに又は体系的に発現するライブラリーであってもよい。ＧＡＬＲ２のスクリーニングに用いる異なるライブラリーにおいて、ウイルスベクター中のゲノムライブラリーを、１つの細胞又は組織のｍＲＮＡ  ｃｏｎｔｅｎｔを発現させるために用いることもできる。
【０２３３】
ＧＴＰ−結合、ＧＴＰアーゼ、アデニル酸シクラーゼ、ｃＡＭＰ、リン脂質−分解、ＤＡＧ、ＩＰ３、ＰＫＣ、キナーゼ及び転写レポーターアッセイを含むレセプター活性のアッセイのいずれもが、サンプル、例えば組織サンプル中の、ＧＡＬＲ２レセプター分子の活性に影響を与える作用剤の存在を測定するために用いることができる。そのためには、ＧＡＬＲ２ポリペプチドを、サンプル又はサンプルの抽出物の存在下及び非存在下にて、活性についてアッセイを行う。サンプル又は抽出物の存在下における、サンプルの非存在下と比べたＧＡＬＲ２活性の増大は、サンプルがレセプター活性のアゴニストを含むことを示す。ニューロペプチドＱポリペプチド又は別のアゴニスト及びサンプルの存在下における、ニューロペプチドＱポリペプチドのみが存在する場合のレセプター活性に比べたレセプター活性の減少は、サンプルがＧＡＬＲ２活性のアンタゴニストを含むことを示す。所望ならば、次いで、サンプルを分画し、さらに試験を行い、アゴニスト又はアンタゴニ
ストを単離又は精製することができる。サンプルが調節剤を含んでいると言うために必要な、測定した活性の増大又は減少の量は、用いたアッセイのタイプに依存する。一般的に、サンプルの非存在下で行ったアッセイに比べた１０％以上の変化（増大又は減少）は、サンプル中の調節剤の存在を示す。好ましくは、アゴニストは、ニューロペプチドＱポリペプチドの少なくとも２０％、そして好ましくは７５％又は１００％以上、例えば、２−倍、５−倍、１０−倍以上のレセプターの活性化を刺激する。
【０２３４】
他の機能性アッセイは、例えば、マイクロフィジオメーター又はバイオセンサーアッセイ（Ｈａｆｎｅｒ、Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．、１５：１４９−１５８、２０００）を含む。
【０２３５】
ＩＩ．  ＧＡＬＲ２とニューロペプチドＱポリペプチドの相互作用に基づく診断アッセイ：
ＧＰＣＲシグナル伝達異常は、多くの疾患及び障害の病理の進行において重要である。ＧＡＬＲ２は、免疫不全症ウイルスのコレセプターとして作用し、免疫プロセス、障害又は疾患において役割を担うことが示された。ＧＡＬＲ２の発現パターンはまた、このレセプターが他の疾患、障害又はプロセスにおいて役割を担っている可能性を示唆するが、当該ＧＡＬＲ２−関連疾患又はＧＡＬＲ２−関連障害は前記の通りである。
【０２３６】
ＧＡＬＲ２のニューロペプチドＱポリペプチドとの相互作用は、ＧＡＬＲ２シグナル伝達が関与する疾患、障害又はプロセスの診断又はモニターのためのアッセイの基礎として使うことができる。
【０２３７】
ＧＡＬＲ２−関連疾患、障害又はプロセスの診断アッセイは、いくつかの異なる形態を有しえる。
【０２３８】
第一に、診断アッセイは、組織サンプル中のＧＡＬＲ２及び／又はニューロペプチドＱポリペプチド又は遺伝子の量を測定することができる。これらのポリペプチドのいずれか一方又は双方をコードするｍＲＮＡの量を測定するアッセイもまた、このカテゴリーに適合する。
【０２３９】
第二に、アッセイは、レセプター又はリガンドの質を評価することができる。例えば、ある固体が、ＧＡＬＲ２又はニューロペプチドＱポリペプチドのいずれか又は双方の突然変異又は変異型を発現するか否かを測定するアッセイは、診断に用いることができる。
【０２４０】
第三に、ＧＡＬＲ２ポリペプチドの１又は２以上の活性を測定するアッセイは、診断に用いることができる。
【０２４１】
従って、本発明は、ＧＡＬＲ２−関連疾患、障害又はプロセスの診断アッセイに関する。ＧＡＬＲ２−関連疾患、ＧＡＬＲ２−関連障害又はＧＡＬＲ２−関連プロセスは、前記した群からの一部であってもよい。
【０２４２】
本発明はまた、当該ニューロペプチドＱポリペプチド−関連疾患又はニューロペプチドＱポリペプチド−関連障害が前記した通りである、ニューロペプチドＱポリペプチド−関連疾患、障害又はプロセスの診断アッセイにも関する。
【０２４３】
この方法によれば、当該ニューロペプチドＱポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６（特に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）で表されるポリペプチドに対して、少なくとも３１％の相同性、そして好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％、
最も好ましくは少なくとも９５％、そして特に１００％の相同性を有するポリペプチドであってもよく；かつ、当該ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の配列を持つＧＡＬＲ２ポリペプチドに特異的に結合し、そしてそのシグナル伝達活性を活性化する。あるいは、当該ニューロペプチドＱポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、ＳＥＱ  ＩＤ
ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６（特に、ＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：１３）の全長ポリペプチドのフラグメントであって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の全長ポリペプチドの結合活性及び／又はシグナル伝達活性化のレベルの少なくとも１０％（好ましくは少なくとも５０％）を保持する当該フラグメントであってもよい。本発明によれば、当該ニューロペプチドＱポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６（特に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）に対し１又は２以上の付加、挿入、欠失又は置換を含んでもよい。当該ニューロペプチドＱポリペプチドは、追加の配列を含んでニューロペプチドＱ融合タンパク質を形成してもよく、当該追加の配列は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質、アルカリホスファターゼ、チオレドキシン、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ヒスチジンタグ（例えば、６Ｘ以上のＨｉｓ）又はエピトープタグ（例えば、ＨＡタグ、Ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ）配列から成る群より選択してもよい。
【０２４４】
Ａ．  ＧＡＬＲ２又はニューロペプチドＱポリペプチドの量を測定するアッセイ
レセプター又はそのリガンドの異常なレベルがサンプル中に存在するか否かを測定するために、ＧＡＬＲ２及びニューロペプチドＱポリペプチドレベルを測定し、標準と比較することができ、そのいずれもが、ＧＡＬＲ２シグナル伝達の障害の可能性を示す。ポリペプチドレベルは、例えば、そのポリペプチドに特異的な抗体を用いて、免疫組織化学により測定される。ＧＡＬＲ２活性により特徴づけられる疾患又は障害を患うと疑われる個体から単離したサンプルを、ＧＡＬＲ２又はニューロペプチドＱポリペプチドの抗体と接触させ、そして抗体の結合を、当該技術分野で知られているように（例えば、二次抗体と複合した酵素の活性の測定により）測定する。
【０２４５】
ＧＡＬＲ２及び／又はニューロペプチドＱポリペプチドレベルの測定に対する別のアプローチは、影響を受けた組織からの細胞のフローサイトメトリー分析を用いる。ＧＡＬＲ２又はニューロペプチドＱポリペプチドに特異的な抗体の蛍光標識を含むフローサイトメトリーの方法は、当業者によく知られている。他のアプローチは、ラジオイムノアッセイアッセイ又はＥＬＩＳＡを含む。これらのそれぞれに対する方法も当業者によく知られている。
【０２４６】
検出した結合の量を、健常な個体からの、又は影響を受けた個体の影響を受けていない又は影響の少ない（好ましくは影響を受けていない）部位からの類似の組織のサンプルにおける結合と比較する。標準と比べた１０％以上の増大は、ＧＡＬＲ２の異常により特徴づけられる疾患又は障害と診断される。
【０２４７】
ＧＡＬＲ２及びニューロペプチドＱポリペプチドの発現はまた、組織のサンプル中の当該ポリペプチドのいずれか又は双方をコードするｍＲＮＡの量を決定することによっても測定することができる。ｍＲＮＡは、定量的又は準定量的ＰＣＲによって定量することができる。「定量的」増幅の方法は、当業者によく知られており、そしてＧＡＬＲ２及びニューロペプチドＱポリペプチドの双方の増幅のためのプライマー配列を本明細書に開示する。通常の定量的ＰＣＲ法は、同じプライマーを用いて制御配列の既知の量を同時に共増幅（ｃｏ−ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ）することを含む。
【０２４８】
これにより、ＰＣＲ反応を較正するために用いることができる内部標準が得られる。定量的ＰＣＲについての詳細なプロトコルは、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ａ  Ｇｕｉｄ
ｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｉｎｎｉｓら、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．、（１９９０）中に記載されており、これは、参考文献として本明細書に取り込まれる。健常な個体からの同様の組織のサンプル中の、又は影響を受けた個体の影響を受けていない部位からの組織のサンプル中の発現量と比較した、サンプル中のＧＡＬＲ２又はニューロペプチドＱポリペプチドをコードするｍＲＮＡの量の１０％以上の増大は、ＧＡＬＲ２シグナル伝達の異常により特徴づけられる疾患又は障害であると診断される。
【０２４９】
Ｂ．  定性的アッセイ
ＧＡＬＲ２ポリペプチド又はそれをコードするｍＲＮＡが野生型であるか否かを評価するアッセイは、診断に用いることができる。
【０２５０】
ＧＡＬＲ２又はニューロペプチドＱポリペプチドの異常により特徴づけられる疾患又は障害をこのように診断するために、サンプルから単離したＲＮＡを、ニューロペプチドＱポリペプチド及び／又はＧＡＬＲ２のＰＣＲ増幅の鋳型として用いる。増幅した配列を、標準的な方法を用いて直接シークエンスするか、又はベクター中にクローンし、シークエンスする。野生型ＧＡＬＲ２又はニューロペプチドＱポリペプチドの配列に対する、１又は２以上のコードされたアミノ酸を変える配列中の違いは、ＧＡＬＲ２シグナル伝達の異常により特徴づけられる疾患又は障害の診断となりえる。コードされた配列の変化がサンプル中で同定される場合には、変異レセプター又はリガンドを発現させ、そしてその活性を野生型ＧＡＬＲ２又はニューロペプチドＱポリペプチドのものと比較することは有用でありえる。他の利点に加えて、このアプローチにより、恒常的に活性な突然変異体及びヌル突然変異体を含む新規な突然変異体が得られる。
【０２５１】
標準的なシークエンス法に加え、例えば、野生型と変異配列を区別するｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎｓのハイブリッド形成（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を用いて、特定の突然変異体の存在について増幅配列をアッセイすることができる。１個のヌクレオチドほどの小さな変化に基づいて区別を行うハイブリッド形成アッセイは、当業者によく知られている。あるいは、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  ＵＳ５，８８８，８１９、ＵＳ６，００４，７４４及びＵＳ６，０１３，４３１に記載されたものを含む、多くの「ミニシークエンス（ｍｉｎｉｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）」アッセイのいずれかを行うことができる。当該技術分野で知られるこれらのアッセイ及び他のアッセイにより、そのサンプル中における、既知の多形性を有する核酸の存在を測定することができる。
【０２５２】
所望であれば、アレイ又はマイクロアレイ−ベースの方法を用いて、ＧＡＬＲ２又はニューロペプチドＱポリペプチド配列における突然変異の発現又は存在を分析することもできる。核酸の発現をミニシークエンスし、定量するためのアレイ−ベースの方法は当業者によく知られている。
【０２５３】
Ｃ．  機能性アッセイ
ＧＡＬＲ２シグナル伝達の異常により特徴づけられる疾患又は障害の診断は、機能性アッセイを用いて行うこともできる。それを行うためには、組織サンプルから調製した細胞膜又は抽出物を、本明細書に記載したようなＧＡＬＲ２活性のアッセイに用いる（例えば、リガンド結合アッセイ、ＧＴＰ−結合アッセイ、ＧＴＰアーゼアッセイ、アデニル酸シクラーゼアッセイ、ｃＡＭＰアッセイ、リン脂質の分解、ＤＡＧ若しくはＩＰ３アッセイ、ＰＫＣ活性化アッセイ又はキナーゼアッセイ）。検出した活性を、健常な個体又は影響を受けた個体の影響を受けていない部位から得た標準サンプル中のものと比較する。代替法として、サンプル又はサンプル抽出物をＧＡＬＲ２を発現する細胞に適用し、次いで標準サンプルと比較したＧＡＬＲ２シグナル伝達活性を測定することができる。これらのアッセイのいずれかにおいて測定した活性における、標準の活性に対する１０％以上の違い
は、ＧＡＬＲ２シグナル伝達の異常により特徴づけられる疾患又は障害と診断される。
【０２５４】
本発明に従う、細胞中のＧＡＬＲ２活性の調節
ＧＡＬＲ２のリガンドとしてのニューロペプチドＱポリペプチドの同定により、細胞内でＧＡＬＲ２ポリペプチドの活性を調節する方法が得られる。ＧＡＬＲ２ポリペプチドの機能を調節する作用剤をその細胞に与えることにより、細胞内のＧＡＬＲ２活性は調節される。この調節は、さらなる調節剤の識別のためのアッセイの一部として培養細胞中で、又は例えば、ヒトを含む動物中で行うことができる。作用剤には、本明細書で定義したニューロペプチドＱポリペプチド並びに本明細書に記載したスクリーニング方法を用いて識別されたさらなる調節剤が含まれる。
【０２５５】
作用剤は、培養細胞に添加することにより細胞に与えることができる。与える量は、その作用剤の相同性及びそれを与える目的に応じて変わる。例えば、ＧＡＬＲ２活性のアンタゴニストを識別するための培養アッセイにおいては、好ましくは、レセプターを最大値の半分活性化するニューロペプチドＱポリペプチドの量（例えば、約ＥＣ５０）を、好ましくはレセプターの飽和に必要な用量を超えることなく、添加する。この用量は、ニューロペプチドＱポリペプチドのさらなる添加がＧＡＬＲ２活性にさらなる効果を及ぼさない点を測定するために、ニューロペプチドＱポリペプチドの量を設定する（ｔｉｔｒａｔｉｎｇ）ことにより決定することができる。
【０２５６】
ＧＡＬＲ２活性の調節剤を、疾患又は障害の治療のために動物に投与する場合には、投与量は、望まれる結果に基づいて当業者が調整することができる。１又は２以上の測定可能な病理的側面（例えば、腫瘍細胞の増殖、炎症性細胞の蓄積）が、治療前の値と比較して少なくとも１０％変わる場合には、成功裏な治療が達成されている。
【０２５７】
本発明の有用な候補調節剤
候補調節剤は、いかなる大きさ又は起源の合成又は天然化合物のライブラリーからもスクリーニングすることができる。莫大な数の方法が、現在、糖類、ペプチド、脂質、炭水化物及び核酸ベースの化合物のランダム及び指向性合成（ｒａｎｄｏｍ  ａｎｄ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）に用いられている。有機低分子のライブラリーを含む、異なる大きさの合成化合物ライブラリーは、よく知られたコンビナトリアル又はパラレル化学技術を用いて調製してもよく、又は多くの企業から市販されている。あるいは、細菌、真菌、植物及び動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリーは、多くの企業から入手可能であるか、又は当業者によく知られた方法により容易に製造できる。加えて、天然又は合成的に製造されたライブラリー及び化合物は、従来の化学的、物理的及び生化学的手段を用いて容易に修飾される。
【０２５８】
前記したように、候補調節剤は、既知のポリペプチド（例えば、ニューロペプチドＱポリペプチド、抗体）又は核酸ライブラリーにおいてコードされる核酸（例えば、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒｓ））の変異体であってもよい。ライブラリーでトランスフォームされた細胞（例えば、細菌、酵母又はより高等な真核細胞）は、増殖させ、そして抽出物として調製し、次いでＧＡＬＲ２結合性アッセイ又はＧＡＬＲ２活性の機能性アッセイに適用される。
【０２５９】
本発明の有用な抗体
本発明は、ＧＡＬＲ２及びニューロペプチドＱポリペプチドの抗体を提供する。抗体は、当該技術分野で知られた標準的なプロトコル（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｅｄ．  ｂｙ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ：１９８８）を見よ。）を用いて作成することができる。マウス、ハムスター又はウサギ等の哺乳動物は、ペプチドの免疫原
性フォーム（例えば、抗体反応を誘起できるＧＡＬＲ２又はニューロペプチドＱポリペプチド又は抗原性フラグメント又は本明細書に前記した融合タンパク質）を用いて免疫できる。抗体を生成させるための免疫原は、ポリペプチド（例えば、単離した組み換えポリペプチド又は合成ペプチド）をアジュバントと混合することにより調製できる。あるいは、ＧＡＬＲ２又はニューロペプチドＱポリペプチド又はペプチドは、より大きな免疫原性タンパク質との融合タンパク質として製造される。ポリペプチドは、キーホールリンペットヘモシニアン（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）等の他のより大きな免疫原性タンパク質に共有結合させることもできる。あるいは、Ｃｏｓｔａｇｌｉｏｌａら（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１０５：８０３−８１１、２０００）に記載されているように、ＧＡＬＲ２若しくはニューロペプチドＱポリペプチド又はこれらのタンパク質のフラグメントをコードするプラスミド又はウイルスベクターを、ポリペプチドを発現させ、そして動物中で免疫反応を起こすために用いることもできる。抗体を生成させるためには、典型的には、免疫原を、ウサギ、ヒツジ又はマウス等の実験動物の皮内、皮下又は筋肉内に投与する。上記の抗体に加えて、単鎖抗体等の遺伝子改変した抗体誘導体を製造することができる。
【０２６０】
免疫化の進展は、血漿又は血清中の抗体の力価を検出することによりモニターできる。抗体のレベルを評価するために、免疫原を抗原として用いた標準的なＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー又は他の免疫アッセイを使うこともできる。抗体調製物は、単に、免疫化した動物からの血清であってもよく、又は、所望であれば、例えば、固定化免疫原を用いたアフィニティ・クロマトグラフィーにより、ポリクロナル抗体を血清から単離することができる。
【０２６１】
モノクロナル抗体を作るためには、抗体−産生脾細胞を免疫化した動物よりハーヴェストし、そして標準的な体細胞融合法により、ミエローマ細胞のような不死化した（ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｉｎｇ）細胞と融合して、ハイブリドーマ細胞を得る。かかる技術は当業者によく知られており、そして、例えば、ハイブリドーマ技術（ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎにより最初に開発された、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５−４９７、１９７５））、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂａｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、４：７２、１９８３）及びヒトモノクロナル抗体を製造するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．ｐｐ．７７−９６、１９８５）を包含する。ハイブリドーマ細胞は、ニューロペプチドＱポリペプチド又はＧＡＬＲ２ペプチド又はポリペプチドと特異的に反応する抗体の産生について、免疫化学的にスクリーニングすることができ、そして、モノクロナル抗体は、かかるハイブリドーマ細胞を含む培養の培地から単離される。
【０２６２】
本発明の有用なトランスジェニック動物
ＧＡＬＲ２又はニューロペプチドＱポリペプチド又はその変異体を発現するトランスジェニック動物は、ＧＡＬＲ２を介したシグナル伝達の研究並びにＧＡＬＲ２の活性を調節する薬剤又は作用剤の研究に有用である。トランスジェニック動物は少なくとも１つの外来遺伝子を含む非ヒト動物であり、その外来遺伝子はトランスジーンと呼ばれ、トランスジェニック動物の遺伝物質の一部である。好ましくは、トランスジーンは動物の生殖細胞系に含まれ、その動物の子孫に伝えられることができる。トランスジーンを動物の遺伝物質中に導入するためには多くの技術を用いることができ、そのような技術には、トランスジーンの受精卵の前核へのマイクロインジェクション及び胚性幹細胞の操作（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．ＵＳ４，８７３，１９１；Ｐａｌｍｉｔｅｒ  ａｎｄ  Ｂｒｉｎｓｔｅｒ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．、２０：４６５−４９９、１９８６；フランス特許出願ＦＲ２５９３８２７）が含まれるが、それらに限定されるものではない。トランスジェニック動物は、そのすべての細胞内にトランスジーンを担持でき、又は遺伝的にモザイ
クでありえる。
【０２６３】
従来の遺伝子導入法によれば、正常な又は修飾した遺伝子の追加のコピーを、接合子（ｚｙｇｏｔｅ）の雄性前核中に注入し、そして受容体（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）マウスのゲノムＤＮＡ中に取り込ませる。トランスジーンは、確立されたトランスジェニック株内で、メンデル則に従って伝えられる。トランスジーンは恒常的に発現され、又は組織特異的に若しくは外因性の薬剤に反応して発現され、例えば、１つのトランスジーンを発現するテトラサイクリンＡトランスジェニック動物は、２番目のトランスジーンを発現する２番目のトランスジェニック動物と交配させることができ、それらの子孫は両方のトランスジーンを担持し、そして発現する。
【０２６４】
ノックアウト動物
ＧＡＬＲ２又はニューロペプチドＱポリペプチド又は変異体のいずれかをコードする染色体配列中にホモ接合型欠失（ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ）を有する動物は、レセプター及びリガンドの機能を研究するために有用でありえる。さらに、特定の生理学的及び／又は病理学的過程におけるＧＡＬＲ２／ニューロペプチドＱポリペプチドの同定は特に重要である。
【０２６５】
ｉ．  標準的ノックアウト動物
ノックアウト動物は、相同的組み換えを用いて遺伝子欠失を創る方法により製造することができる。この技術は、胚に由来し、培養で維持され、そしてホストの胚盤胞に導入された場合に、動物のすべての組織の形成に関与する能力を有する胚性幹（ＥＳ）細胞の開発に基づく。ノックアウト動物は、相同的組み換えをＥＳ細胞中の特定のターゲット遺伝子に向け、それによりヌル対立遺伝子を作ることにより製造される。ノックアウト動物を作る技術は、十分に記載されている（例えば、Ｈｕｓｚａｒら、Ｃｅｌｌ、８８：１３１、１９９７；及びＯｈｋｉ−Ｈａｍａｚａｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ、３９０：１６５、１９９７を見よ。）。当業者は、遺伝子標的コンストラクトを作成するために、（本明細書に記載され、そして当該技術分野で知られた）ＧＡＬＲ２及びニューロペプチドＱの配列を用いて、ホモ接合ＧＡＬＲ２又はニューロペプチドＱポリペプチドノックアウト動物（例えば、マウス）を作ることができる。
【０２６６】
ｉｉ．  組織特異的ノックアウト
部位指定相同的組み換え（ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）の方法は、バクテリオファージＰ１、部位特異的リコンビナーゼＣｒｅに基づく、部位特異的組み換えのためのシステムの開発によって改善されてきた。バクテリオファージＰ１からのＣｒｅ−ｌｏｘＰ部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼは、特定の組織又は成長段階に限定した遺伝子のノックアウトを作成するために、トランスジェニックマウスアッセイにおいて使用される。全体的な遺伝子ノックアウトに対し、部位に限定された遺伝的欠失は、フェノタイプを特定の細胞／組織にわりあてることができるという利点がある。Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系においては、１番目のトランスジェニックマウス株は、ｌｏｘＰ部位を、興味の対象である遺伝子の１又は２以上のエクソンに並べて配置するように設計する。このいわゆる「ｆｌｏｘｅｄ遺伝子」のホモ接合体を、細胞／組織型転写プロモーターの制御下でＣｒｅ遺伝子を発現する２番目のトランスジェニックマウスと交配させる。次いで、Ｃｒｅタンパク質がｌｏｘＰ認識配列の間のＤＮＡを切除し、そして標的遺伝子機能を効果的に除去する。現在では、例えば、哺乳動物組織特異的遺伝子の誘導的不活性化を含む、この方法の多くのｉｎ  ｖｉｖｏの実例がある（Ｗａｇｎｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５：４３２３、１９９７）。従って、当業者は、ＧＡＬＲ２又はニューロペプチドＱが、選択した組織又は細胞型内で組織特異的に除去されたノックアウト動物を作ることができる。
【０２６７】
本発明に従う有用なキット
本発明は、ＧＡＬＲ２活性の調節剤のスクリーニングに有用なキットを提供する。加えて、本発明は、ＧＡＬＲ２シグナル伝達の異常により特徴づけられる疾患又は障害の診断に有用なキットを提供する。本発明に従う有用なキットは、（例えば、単離した膜上、ＧＡＬＲ２を発現する細胞又はＳＰＲチップ上等、膜−又は細胞−結合ＧＡＬＲ２ポリペプチドを含む）単離したＧＡＬＲ２ポリペプチド及び単離したニューロペプチドＱポリペプチドを含むことができる。
【０２６８】
キットは、ＧＡＬＲ２に特異的な抗体及び／又はニューロペプチドＱポリペプチドの抗体を含むこともできる。
【０２６９】
あるいは又は加えて、キットは、ＧＡＬＲ２ポリペプチドを発現するようにトランスフォームした細胞及び／又はニューロペプチドＱポリペプチドを発現するようにトランスフォームした細胞を含むことができる。さらなる態様において、本発明に従うキットは、ＧＡＬＲ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及び／又はニューロペプチドＱポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。なおさらなる態様において、本発明に従うキットは、以下に記載するように、ＧＡＬＲ２又はニューロペプチドＱの増幅に有用な特異的なプライマーを含んでもよい。本発明に従うすべてのキットは、上記のアイテム又はアイテムの組み合わせ及びそれらのための包装材を含む。キットは使用説明書を含んでもよい。
【０２７０】
本キットによれば、当該ニューロペプチドＱポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６（特に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）で表されるポリペプチドに対して、少なくとも３１％の相同性、そして好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも９５％、そして特に１００％の相同性を持つポリペプチドであってもよく、当該ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の配列を持つＧＡＬＲ２ポリペプチドに特異的に結合し、かつそのシグナル伝達活性を活性化する。あるいは、当該ニューロペプチドＱポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６（特に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）の全長ポリペプチドのフラグメントであって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の全長ポリペプチドの結合活性及び／又はシグナル伝達活性化のレベルの少なくとも１０％（好ましくは少なくとも５０％）を保持する当該フラグメントであってもよい。本発明によれば、当該ニューロペプチドＱポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６（特に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）に対し、１又は２以上の付加、挿入、欠失又は置換を含んでもよい。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４に対するニューロペプチドＱポリペプチドのフラグメントの例は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２のポリペプチドである。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４に対して置換を含むニューロペプチドＱポリペプチドの例は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１、ＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：３２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１のポリペプチドである。当該ニューロペプチドＱポリペプチドは追加の配列を含んでニューロペプチドＱ融合タンパク質を形成してもよく、当該追加の配列は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質、アルカリホスファターゼ、チオレドキシン、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ヒスチジンタグ（例
えば、６Ｘ以上のＨｉｓ）又はエピトープタグ（例えば、ＨＡ−タグ、Ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ）配列から成る群より選択してもよい。
【０２７１】
生物学的アッセイ
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ
ニューロペプチドＱポリペプチドによるヒトＧＡＬＲ２レセプター活性の調節を、下記の実験方法に従って測定する。
【０２７２】
実験方法：
放射性リガンド結合アッセイ：
ＧＡＬＲ２への競合結合アッセイは、結合バッファー（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のプロテアーゼフリーＢＳＡ）、ヒトＧＡＬＲ２膜（タンパク質０．５μｇ／チューブ）、［１２５Ｉ］ガラニン（最終濃度、１，３ｎＭ）を含むポリエチレンＭｉｎｉＳｏｒｐチューブ（Ｎｕｎｃ）内で行う。低濃度から高濃度までの候補調節剤又はニューロペプチドＱポリペプチドを添加する。サンプルを、０．１ｍｌの最終体積で、２５℃にて６０ｍｉｎインキュベートし、次いで、多層膜フィルター（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｆｉｌｔｅｒ）（Ｌｉｎｃａ  Ｌａｍｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ、テルアビブ、イスラエル）を用い、０．５％ＰＥＩ中に少なくとも１ｈ前もって浸したＧＦ／Ｃフィルター上でろ過する。フィルターを、４ｍｌの氷冷洗浄バッファー（結合バッファーと同じ組成）で３回洗浄し、乾燥し、ガンマカウンターで計測する。
【０２７３】
イクオリンアッセイ：
抗生物質を含まない培養培地中で対数増殖期中期（ｍｉｄ−ｌｏｇ  ｐｈａｓｅ）まで増殖した、ミトコンドリアアポイクオリン、Ｇα１６及び組み換えヒトＧＡＬＲ２レセプターを共発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を、ＰＢＳ−ＥＤＴＡを用いて剥がし、遠心分離し、アッセイバッファー（ＨＥＰＥＳを含み、フェノールレッドを含まず、プロテアーゼフリーのＢＳＡを０．１％含むＤＭＥＭ／ＨＡＭ’ｓ  Ｆ１２）に、１×１０６細胞／ｍｌで再懸濁する。細胞を、セレンテラジンＨと共に、室温で少なくとも４ｈインキュベートする。試験の各日に、ニューロペプチドＱポリペプチドを試験してアッセイの成績を評価し、ＥＣ５０を決定する。アゴニストの試験については、９６−ウェルプレート内で、５０μｌの細胞懸濁液を５０μｌの候補調節剤又はニューロペプチドＱポリペプチドと混合する。放射された光を、Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  ６０００（ＦＤＳＳ６０００）ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを用いて記録する。アンタゴニストの試験については、１００μｌのニューロペプチドＱポリペプチドを、そのＥＣ８０にて、細胞と候補調節剤の混合物に注入し、次いで、最初の注入後１５ｍｉｎインキュベートする。放射された光を、Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  ６０００（ＦＤＳＳ６０００）ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを用いて記録する。候補調節剤のアゴニスト活性は、ニューロペプチドＱポリペプチドのＥＣ１００濃度における活性の百分率で表す。候補調節剤のアンタゴニスト活性は、ＥＣ８０濃度におけるニューロペプチドＱポリペプチド活性の阻害の百分率で表す。
【０２７４】
ＦＬＩＰＲアッセイ：
培養培地中で対数増殖期中期まで増殖した、Ｇα１６及び組み換えヒトＧＡＬＲ２レセプターを共発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞をＰＢＳ−ＥＤＴＡで剥がし、遠心分離し、細胞培養培地（ＨＥＰＥＳ、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清を含むＨＡＭ‘ｓＦ１２）に再懸濁し、３８４−ウェルＦＬＩＰＲプレート中に、各ウェル当たり１５’０００細胞を播く。３７℃／５％ＣＯ２加湿インキュベーター内で一晩インキュベートした後、培地を廃棄し、（フェノールレッドを含まず、ＨＥＰＥＳ、Ｆｌｕｏ４−ＡＭ及びプロベネシドを含
むＤＭＥＭ）染色溶液で置換する。３７℃／５％ＣＯ２加湿インキュベーター内で１時間インキュベートした後、染色溶液をアッセイ培地（フェノールレッドを含まないＨＢＳＳ／ＤＭＥＭ）で置換した。ニューロペプチドＱを含むペプチドは、それらの標的であるＧＡＬＲ２に結合した後の細胞内カルシウムの放出における成績について評価するために試験される。放射された蛍光をＦＬＩＰＲテトラを用いて記録する。アンタゴニストの試験については、１００μｌのニューロペプチドＱポリペプチドを、そのＥＣ８０にて、細胞と候補調節剤の混合物に注入し、次いで、最初の注入後１５ｍｉｎインキュベートする。放射された蛍光をＦＬＩＰＲテトラを用いて記録する。候補調節剤のアゴニスト活性は、ニューロペプチドＱポリペプチドのＥＣ１００濃度における活性の百分率で表す。候補調節剤のアンタゴニスト活性は、ＥＣ８０濃度におけるニューロペプチドＱポリペプチド活性の阻害の百分率で表す。
【０２７５】
ｃＡＭＰ  ＨＴＲＦアッセイ
試験に先だって、抗生物質を含まない培地中で増殖させたヒト組み換えＧＡＬＲ２レセプターを発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を、ＰＢＳ−ＥＤＴＡ（５ｍＭのＥＤＴＡ）で静かにフラッシュすることにより剥がし、遠心分離により回収し、アッセイバッファー（ＫＲＨ：５ｍＭのＫＣｌ、１．２５ｍＭのＭｇＳＯ４、１２４ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１３．３ｍＭのグルコース、１．２５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１．４５ｍＭのＣａＣｌ２、０．５ｇ／ｌのＢＳＡ）に再懸濁する。ニューロペプチドＱポリペプチドに対して容量反応曲線を作成する。アゴニストの試験（９６ウェル）については：１２μｌの細胞を低濃度から高濃度までの候補調節剤６μｌ及び６μｌのホルスコリンと混合し、次いで、室温で３０ｍｉｎインキュベートする。溶解バッファー（ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）を添加し、１時間インキュベートした後、ＨＴＲＦキットを用い、製造業者の仕様書に従ってｃＡＭＰ濃度を推定する。アンタゴニストの試験（９６ウェル）については：１２μｌの細胞を、低濃度から高濃度までの候補調節剤６μｌと混合し、次いで、１０ｍｉｎインキュベートする。その後、ホルスコリンとニューロペプチドＱポリペプチドの混合物６μｌを、最終濃度が先述のＥＣ８０に対応するするように添加する。次いで、プレートを室温で３０ｍｉｎインキュベートする。溶解バッファーを添加し、１時間インキュベートした後、ＨＴＲＦキットを用い、製造業者の仕様書に従ってｃＡＭＰ濃度を推定する。
【０２７６】
ＩＰ１  ＨＴＲＦアッセイ
抗生物質を含まない培養培地中で対数増殖期中期まで増殖した、ヒト組み換えＧＡＬＲ２レセプターを発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を、ＰＢＳ−ＥＤＴＡを用いて剥がし、遠心分離し、抗生物質バッファーを含まない培地中に再懸濁する。２０，０００個の細胞を９６ウェルプレート中に分配し、５％ＣＯ２下、３７℃にて一晩インキュベートする。アゴニストの試験については、培地を除き、２０μｌのアッセイバッファーに加えて、２０μｌの候補調節剤又はニューロペプチドＱポリペプチドを各ウェルに添加する。プレートを、５％ＣＯ２下、３７℃にて６０ｍｉｎインキュベートする。次いで、ＩＰ１−Ｄ２試薬と抗ＩＰ１クリプテート（ａｎｔｉ−ＩＰ１  ｃｒｙｐｔａｔｅ）試薬をウェルに添加し、製造業者の推奨に従って、ＩＰ１濃度を測定する。アンタゴニストの試験については、２０μｌの候補調節剤又は対照アンタゴニストを添加し、プレートを、５％のＣＯ２を含む９５％の空気の加湿雰囲気下、３７℃にて１５ｍｉｎインキュベートし、次いで、２０μｌのニューロペプチドＱポリペプチドを、最終濃度が先述のＥＣ８０に対応するするように添加する。プレートを、５％ＣＯ２下、３７℃にて６０ｍｉｎインキュベートする。次いで、ＩＰ１−Ｄ２試薬と抗ＩＰ１クリプテートをウェルに添加し、製造業者の推奨に従って、ＩＰ１濃度を測定する。
【０２７７】
ＧＴＰ−γ−Ｓシンチレーション近傍アッセイ（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ａｓｓａｙ）
アッセイバッファーは、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４；２００ｍＭのＮａＣｌ、
１０μｇ／ｍｌのサポニン、１ｍＭのＭｇＣｌ２及び０．１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡからなる。組み換えヒトＧＡＬＲ２レセプターを発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞から、膜を調製する。膜抽出物をアイスの上で融かし、アッセイバッファーで希釈し、アイスの上に保つ。ＧＤＰを、アッセイバッファーで、１μＭの最終濃度に希釈する。ＰＶＴ−ＷＧＡ  Ｂｅａｄｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＲＰＮＱ００１）を、アッセイバッファーで、５０ｍｇ／ｍｌ（０．５ｍｇ／１０μｌ）に希釈する。ＧＴＰ−γ−３５Ｓ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＮＥＧ０３０Ｘ）を、アッセイバッファーで０．１ｎＭに希釈する。アゴニストの試験については、膜（１２．５μｌ）をＧＤＰ（１２．５μｌ）と混合する。並行して、反応を開始する直前に、ＧＴＰ−γ−３５Ｓ（１２．５μｌ）をｂｅａｄｓ（１２．５μｌ）と混合する。以下の試薬をＯｐｔｉｐｌａｔｅ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）のウェルに連続的に添加する：５０μｌの候補調節剤又はニューロペプチドＱポリペプチドリガンド、２５μｌの膜：ＧＤＰミックス及び２５μｌのＧＴＰ−γ−３５Ｓ：ビーズミックス。プレートをトップシールで覆い、オービタルシェイカー上で２ｍｉｎ混合し、次いで、室温にて１時間インキュベートする。次いで、プレートを２０００ｒｐｍにて１０ｍｉｎ遠心し、室温にて１時間インキュベートし、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＴｏｐＣｏｕｎｔリーダーを用いて、各ウェル当たり１ｍｉｎ計測する。
【０２７８】
ＴＡＮＧＯ（登録商標）β−アレスチンアッセイ
ＴＡＮＧＯ  ＧＡＬＲ２細胞を、ＰＢＳ−ＥＤＴＡ（５ｍＭ  ＥＤＴＡ）を用いて静かにフラッシュすることにより剥がし、遠心分離により回収し、アッセイバッファー（１０％のチャコールデキストラン処理ＦＢＳを含むＤＭＥＭ，０．１ｍＭのＮＥＡＡ、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン）中に、３１２，５００細胞／ｍｌの密度で再懸濁する。３２μｌの細胞懸濁液（１０，０００細胞）を、ブラッククリアボトム（ｂｌａｃｋ  ｃｌｅａｒ−ｂｏｔｔｏｍ）３８４−ウェル培養プレートのウェルに添加する。アゴニストの試験については、０．５％のＤＭＳＯを含むアッセイバッファーで５倍に濃縮したニューロペプチドＱポリペプチド又は候補調節剤８μｌを、培養プレートのウェルに添加する。アンタゴニストの試験については、０．５％のＤＭＳＯを含むアッセイバッファーで１０倍に濃縮した候補調節剤４μｌを、培養プレートのウェルに添加する。室温で３０分間インキュベートした後、０．５％のＤＭＳＯを含むアッセイバッファーで１０倍に濃縮したニューロペプチドＱポリペプチド４μｌを、最終濃度が先述のＥＣ８０に対応するするように添加する。次いで、プレートを、３７℃／５％ＣＯ２の加湿インキュベーター内で１６時間インキュベートする。
【０２７９】
データの読み取りのために、６倍に濃縮したＬｉｖｅＢｌａｚｅｒＴＭ−ＦＲＥＴ  Ｂ／Ｇ（ＣＣＦ４−ＡＭ）基質ミックスを調製し、８μｌを培養プレートの各ウェルに添加する。暗室内で室温にて２時間インキュベートした後、青色（励起光４０９／４２０ｎｍ、蛍光４６０／４４０ｎｍ）及び緑色（励起光４０９／４２０ｎｍ、蛍光５３０／５３０ｎｍ）の蛍光を測定する。背景蛍光（細胞を含まない対照用ウェル）を差し引き、青色／緑色蛍光比を、各ウェルについて計算する。候補調節剤のアゴニスト活性は、ニューロペプチドＱポリペプチドのＥＣ１００濃度における活性の百分率で表す。候補調節剤のアンタゴニスト活性は、ＥＣ８０濃度におけるニューロペプチドＱポリペプチド活性の阻害の百分率で表す。
【０２８０】
ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ  ベータ−アレスチン２アッセイ：
組み換えヒトＧＡＬＲ２レセプター及びベータ−アレスチン２（ＣＨＯ−Ｋ１−ｈＧＡＬＲ２−ベータ−アレスチン２）を発現する細胞を、３８４−ウェル組織培養プレート中に、２０．０００細胞／ウェルの密度、２５μｌの細胞培養培地（キット中のＯＣＣ２培地）体積にて、ＯＣＣ２培地（Ｐ／Ｎ３０−４０９）中にプレートした。細胞をマイクロプレート中にシードした後、試験前に、それらを３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベー
タ内に２４時間置いた。ＯＣＣ２培地を廃棄し、そして各ウェル当たり２０μｌのＨＢＳＳ  １Ｘ（Ｇｉｂｃｏ、１４０６５）、２０ｍＭＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ、１６５３０）、０．１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ、Ａ３８０３）、ｐＨ７．４で置き換えた。候補調節剤のストック溶液をＤＭＳＯ中に１０ｍＭの濃度で調製し、そしてＨＢＳＳ１Ｘ（Ｇｉｂｃｏ、１４０６５）、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ、１６５３０）、０．１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ、Ａ３８０３）、ｐＨ７．４で、活性化用量反応曲線に必要な濃度に段階希釈した。ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ  ｅＸｐｒｅｓｓ細胞をインキュベータから除き、化合物プレートから５μｌを移した。３７℃にて９０分間インキュベートした。インキュベーションの間、各３８４ウェルプレート用の検出試薬の検量線用溶液を、下記の試薬を混合することにより調製した：細胞アッセイバッファー（１９部）、基質試薬１（５部）及び基質２（１部）。調製した検出試薬をウェル当たり１２．５μｌ添加し、そして室温（２３℃）で９０分間インキュベートした。サンプルを、標準蛍光プレートリーダー（Ｆｌｕｏｓｔａｒ）にて、下記の条件下で読んだ：測定インターバル（ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｉｎｔｅｒｖａｌ）：０．１秒、ｉｎｔｅｒｖａｌ  ｔｉｍｅ：０．１秒、インターバル数（ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｖａｌ）：１、ゲイン：自動調整、発光フィルター：レンズ。生データをＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｓｏｆｔｗａｒｅで分析して、曲線を作成し、そしてＥＣ５０を算出した。
【０２８１】
ＧＡＬＲ２レセプターに関し、ニューロペプチドＱポリペプチドのアゴニスト活性（ＥＣ５０値）を表１に示す。
【０２８２】
【表１】
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【０２８３】
【表２】
0005940541.tif 000003
【０２８４】
【表３】
0005940541.tif 000004
【０２８５】
略語
ＡＴＰ：                  アデノシン三リン酸
ＢＳＡ：                  ウシ血清アルブミン
ｃＡＭＰ：                環状アデノシン一リン酸
ＣＡＴ：                  クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
ＣＤＲ：                  相補性決定領域
ＣＮＳ                    中枢神経系
ＣＰＭ                    分当たりの計数
ＣＲＥ：                  ｃＡＭＰ応答配列
ＣＲＥ：                  環化組み換え（Ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）
ＣＲＦ                    副腎皮質刺激ホルモン放出因子
ＤＡＧ：                  ジアシルグリセロール
ＤＭＥＭ：                ダルベッコ修正イーグル培地
ＤＭＳＯ：                ジメチルスルホキシド
ＤＲ：                    背側縫線
ＤＲＮ：                  背側縫線核
ＤＴＴ：                  ジチオスレイトール
ＥＤＴＡ：                エチレンジアミン四酢酸
ＥＧＴＡ：                エチレングリコール−ビス（ベータ−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸
ＥＬＩＳＡ：              酵素免疫測定法
ＦＢＳ：                  ウシ胎児血清
ＦＬＩＰＲ：              蛍光イメージングプレートリーダー
ＦＬＰ：                  フリッパーゼ組み換え酵素（ＦＬｉＰｐａｓｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ  Ｅｎｚｙｍｅ）
ＦＲＥＴ：                蛍光エネルギー転移
ＧＡＬＲ１：              Ｇａｌａｎｉｎレセプター１
ＧＡＬＲ２：              Ｇａｌａｎｉｎレセプター２
ＧＡＬＲ３：              Ｇａｌａｎｉｎレセプター３
ＧＤＰ：                  グアノシン二リン酸
ＧＦＰ：                  緑色蛍光タンパク質
ＧＰＣＲ：                Ｇタンパク質共役レセプター
ＧＴＰ：                  グアノシン三リン酸
ＨＢＳＳ：                ハンクス平衡塩類溶液
ＨＥＰＥＳ：              ４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸
ＨＩＶ：                  ヒト免疫不全症ウイルス
ＨＴＲＦ：                均一時間分解蛍光測定（Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｔｉｍｅ
Ｒｅｓｏｌｖｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）
ｉｃｖ：                  脳室内
ＫＲＨ：                  Ｋｒｅｂｓ-Ｒｉｎｇｅｒ−Ｈｅｐｅｓ
ＮＥＡＡ：                非必須アミノ酸
ＮＰＱ：                  ニューロペプチドＱ
Ｋｄ：                    解離の平衡定数
ＬＣ：                    青斑核
ＭＡＰ（ｋｉｎａｓｅ）：  マイトジェン活性化タンパク質（キナーゼ）
ＰＢＳ：                  リン酸緩衝生理食塩水
ＰＣＲ：                  ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＥＩ：                  ポリエチレンイミン
ＰＮＳ                    末梢神経系
ＲＴ／ＰＣＲ：            逆転写酵素／ポリメラーゼ連鎖反応
ＲＬＵ                    相対発光量（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｕｎｉｔｓ
【図１】
0005940541.tif 000005
【図２】
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【図３】
0005940541.tif 000007
【図４】
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【図５】
0005940541.tif 000009
【図６】
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【図７】
0005940541.tif 000011
【図８】
0005940541.tif 000012
【図９】
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【図１０】
0005940541.tif 000014
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
0005940541.tif 000030
【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【配列表】
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