(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子量が２８０，０００以上、３４０，０００以下であり、マンノースとキシロースの構成比がキシロース１モルに対してマンノース１．５モル以上、２．５モル以下である、担子菌由来のキシロマンナンであることを特徴とする氷結晶化阻害剤。
【請求項２】
担子菌が、エノキタケ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ種）、ハタケシメジ（Ｌｙｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｄｅｃａｓｔｅｓ種）、エリンギ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｅｒｙｎｇｉｉ種）、ホンシメジ（Ｌｙｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｓｈｉｍｅｊｉ種）、ナメコ（Ｐｈｏｌｉｏｔａ  ｎａｍｅｋｏ種）、またはその類縁品種もしくは改良品種である請求項１に記載の氷結晶化阻害剤。
【請求項３】
担子菌が、エノキタケ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ種）またはその類縁品種もしくは改良品種である請求項１に記載の氷結晶化阻害剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の氷結晶化阻害剤を含むことを特徴とする氷結晶化阻害用組成物。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載の氷結晶化阻害剤を含むことを特徴とする食品。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれかに記載の氷結晶化阻害剤を含むことを特徴とする生体試料保護剤。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれかに記載の氷結晶化阻害剤を含むことを特徴とする化粧品。
【請求項８】
分子量が２８０，０００以上、３４０，０００以下であり、マンノースとキシロースの構成比がキシロース１モルに対してマンノース１．５モル以上、２．５モル以下である、担子菌由来のキシロマンナンの、水を含む液体の氷結晶化を阻害するための使用。
【請求項９】
水を含む液体の氷結晶化を阻害するための方法であって、当該液体に分子量が２８０，０００以上、３４０，０００以下であり、マンノースとキシロースの構成比がキシロース１モルに対してマンノース１．５モル以上、２．５モル以下である、担子菌由来のキシロマンナンを添加する工程を含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、担子菌由来の氷結晶化阻害剤、当該氷結晶化阻害剤へ特異的に反応する抗体、並びに氷結晶化阻害剤を含む組成物、食品、生体試料保護剤および化粧品に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
低温下で棲息する生物は、氷結晶化阻害タンパク質（ａｎｔｉｆｒｅｅｚｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ，以下、「ＡＦＰ」と略記する）などの氷結晶化阻害物質を生産し、細胞の凍結から身を守る手段として利用していることが知られている。ＡＦＰは、熱ヒステリシス、水溶液の凍結の抑制、氷結晶形状制御といった作用を有するタンパク質であり、例えば、魚類、昆虫、植物、菌類、微生物などから見出されている。【０００３】
これまで見出されている魚類、昆虫類、微生物由来のＡＦＰとしては、カジカ科の魚類に由来するもの、ゴミムシダマシの幼虫などの昆虫類に由来するもの、フラボバクテリウム属などの微生物に由来するもの等があり、これらは高い氷結晶化阻害活性を有する（特許文献１〜３）。また、植物由来のＡＦＰとしては、例えば、冬ライ麦やニンジン由来のものが知られている（非特許文献１〜２）。【０００４】
その他に、菌類由来のＡＦＰとして、例えばイシカリガマノホタケや南極エノキタケ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ  ＫＵＡＦ−１）などの担子菌類に由来するものが知られている（特許文献４〜５）。【０００５】
近年は、上記の性質を工業的に利用し、ＡＦＰをアイスクリームなどの冷凍菓子製品や冷凍食品の品質維持のために用いる試みがなされている（特許文献６〜７）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００４−８３５４６号公報
【特許文献２】特表２００２−５０７８８９号公報
【特許文献３】特開２００４−１６１７６１号公報
【特許文献４】特開２００４−２４２３７号公報
【特許文献５】特開２００４−２７５００８号公報
【特許文献６】国際公開第９２／２２５８１号パンフレット
【特許文献７】国際公開第９４／０３６１７号パンフレット
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Plant Physiology（プラント・フィジオロジー），第１１９巻，第１３６１〜１３６９頁（１９９９年）
【非特許文献２】Biochem．J．（バイオケミカル・ジャーナル），第３４０巻，第３８５〜３９１頁（１９９９年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、魚類由来のＡＦＰは臭気を完全に取り除くことが難しい。また、昆虫や微生物は食品原料とし難いことから、昆虫や微生物由来のＡＦＰは食品への使用には適していない。【０００９】
一方、植物は食品原料として利用されていることから、植物由来のＡＦＰは食品での使用が期待されている。しかし、その氷への結合能力が他のＡＦＰと比較して弱いことや熱に対する安定性が十分でないといった理由から、工業化はほとんど実現していない。【００１０】
そこで、本発明の解決課題は、実用にかなう優れた氷結晶化阻害活性を有し、食品製造に利用できる安全な工程で効率良く安定的に製造することが可能な氷結晶化阻害剤を提供することにある。また、本発明は、当該氷結晶化阻害剤へ特異的に反応する抗体、並びに当該氷結晶化阻害剤を含む組成物、食品、生体試料保護剤および化粧品を提供することも目的とする。さらに本発明は、水を含む液体の氷結晶化を阻害するための担子菌由来の多糖類の使用と、水を含む液体の氷結晶化を阻害するための方法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行なった。その結果、高い氷結晶化阻害活性を有し、かつ安定供給可能で工業的に応用可能な非タンパク質型の氷結晶化阻害物質を担子菌から新たに見出し、本願発明を完成させるに至った。【００１２】
本発明に係る抗体は、上記氷結晶化阻害剤と特異的に反応することを特徴とする。【００１３】
本発明に係る組成物、食品、低温保護剤および化粧品は、上記本発明に係る氷結晶化阻害剤を含むことを特徴とする。【００１４】
本発明に係る担子菌由来の多糖類は、水を含む液体の氷結晶化を阻害するために用いる。また、本発明に係る水を含む液体の氷結晶化を阻害するための方法は、当該液体に担子菌由来の多糖類を添加する工程を含むことを特徴とする。【００１５】
上記多糖類としては、マンノースとキシロースを含むもの、また、ガラクトース、マンノース、キシロース、グルコース、ラムノース、またはこれら２以上からなるものを挙げることができる。より具体的には、キシロマンナンを挙げることができる。キシロマンナンとしては、具体的には、それを構成するマンノースとキシロースの構成比が、キシロース１モルに対してマンノース１．５モル以上、２．５モル以下であるものや、分子量が２８０，０００以上、３４０，０００以下であるものを挙げることができる。【００１６】
本発明の氷結晶化阻害剤を産生する担子菌としては、エノキタケ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ種）、ハタケシメジ（Ｌｙｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｄｅｃａｓｔｅｓ種）、エリンギ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｅｒｙｎｇｉｉ種）、ホンシメジ（Ｌｙｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｓｈｉｍｅｊｉ種）、ナメコ（Ｐｈｏｌｉｏｔａ  ｎａｍｅｋｏ種）、並びにその類縁品種および改良品種を挙げることができ、特に好ましくはエノキタケ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ種）並びにその類縁品種および改良品種を挙げることができる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明に係る氷結晶化阻害剤は、食用にもされている担子菌から容易に得ることができ、且つ多糖類であることから、生体にとって非常に安全である。また、担子菌由来のものであることから安定供給が可能である。さらに、本発明に係る氷結晶化阻害剤は、実用にかなう優れた氷結晶化阻害活性を有する。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明に係る氷結晶化阻害剤は、担子菌由来の多糖類からなる。
【００１９】
本発明に係る氷結晶化阻害剤は、氷結晶の結晶面に結合するなどして氷結晶の成長を阻害する機能を有する多糖類であり、熱ヒステリシスの測定、氷結晶構造の観察、氷結晶化阻害の測定など、公知の何れかの方法により定義される氷結晶化阻害活性を有する多糖類を意味する。
【００２０】
熱ヒステリシスとは、氷結晶化阻害剤を含む水溶液中で平衡融点以下の温度であっても氷が成長できない温度域をいい、氷が水溶液中で成長を開始する温度を凝固点と定義すれば、熱ヒステリシスは平衡融点と凝固点の差として検出される。
【００２１】
本発明に係る氷結晶化阻害剤は、多糖類である。多糖類とは、通常、１０個以上の単糖がグリコシド結合により直鎖状または分枝鎖状に重合したものをいう。
【００２２】
多糖類は、１種の単糖から構成される単純多糖であるホモ多糖類と、２種以上の単糖から構成される複合多糖であるヘテロ多糖類に分類される。ホモ多糖類としては、例えば、アミロースやアミロペクチンなどのデンプン；グリコーゲン；セルロース；グルカン；キシラン；マンナンなどが挙げられる。ヘテロ多糖類としては、例えば、ヒアルロン酸、ヘパリン、キシロマンナン、キシログルカン、グルコマンナンなどを挙げることができる。
【００２３】
本発明に係る担子菌由来の多糖類は、特に限定されるものではないが、例えば、マンノースとキシロースを含むもの、また、ガラクトース、マンノース、キシロース、グルコース、ラムノース、またはこれら２以上からなるものを挙げることができる。本発明に係る担子菌由来の多糖類は、好ましくはヘテロ多糖類であり、より好ましくはキシロマンナンである。キシロマンナンは、α−１，３−マンノースで構成されるマンナン主鎖に、側鎖として１分子ずつのキシロースが１，４−結合を介して結合したヘテロ多糖類の総称である。但し、本発明に係るキシロマンナンは、マンノースとキシロースのみから構成されるものに限られず、キシロース以外に他の糖を側鎖として有してもよい。
【００２４】
本発明において、キシロマンナンを構成するマンノースとキシロースの構成比は特に制限されないが、例えば、キシロース１モルに対してマンノース１．５モル以上、２．５モル以下が好ましく、１．７モル以上、２．３モル以下がより好ましく、１．９モル以上、２．１モル以下がさらに好ましく、約２モルが特に好ましい。
【００２５】
本発明に係る氷結晶化阻害物質の分子量は、特に限定されるものではないが、例えば、ゲル濾過クロマトグラフィーにて測定した平均分子量で１００，０００以上、１，０００，０００以下が好ましい。当該平均分子量としては、１５０，０００以上がより好ましく、２００，０００以上がさらに好ましく、２４０，０００以上がさらに好ましく、２８０，０００以上が特に好ましく、また、５００，０００以下がより好ましく、４００，０００以下がさらに好ましく、３７０，０００以下がさらに好ましく、３４０，０００以下が特に好ましい。
【００２６】
本発明に係る氷結晶化阻害剤は担子菌由来のものであるので、担子菌から製造することができる。以下、本発明に係る氷結晶化阻害剤の製造方法につき説明する。
【００２７】
（１）  培養工程
本発明に係る氷結晶化阻害剤は、市販の担子菌や採取された担子菌から製造してもよい。しかし、特に工業的に大量生産する場合には、担子菌を培養する方が効率的である。即ち、本発明に係る氷結晶化阻害剤を得るに当たっては、任意に担子菌を培養してもよい。
【００２８】
本発明に係る氷結晶化阻害剤を産生する担子菌としては、ハラタケ目に属するものを挙げることができる。ハラタケ目に属する担子菌としては、例えば、ヌメリガサ科、キシメジ科、テングタケ科、ハラタケ科、ヒトヨタケ科、モエギタケ科、フウセンタケ科、イグチ科、ベニタケ科、サルノコシカケ科、ヒラタケ科に属するものが挙げられる。
【００２９】
ヌメリガサ科に属する担子菌としては、ヤギタケ等が挙げられる。キシメジ科に属する担子菌としては、キシメジ、ムラサキシメジ、オシロイシメジ、カクミノシメジ、シャカシメジ、ハルシメジ、ハタケシメジ、ブナシメジ、ホンシメジ、オオホウライタケ、スギヒラタケ、ハリガネオチバタケ、キツネタケ、ナラタケ、ムキタケ、マツタケ、シロマツタケモドキ、シイタケ、エノキタケ等が；テングタケ科に属する担子菌としては、タマゴタケ、カバイロツルタケ等が；ハラタケ科に属する担子菌としては、ハラタケ、シロオオハラタケ等が；ヒトヨタケ科に属する担子菌としてはヒトヨタケ等が；モエギタケ科に属する担子菌としてはナメコ等が；フウセンタケ科に属する担子菌としてはショウゲンジ等が；イグチ科に属する担子菌としてはヤマドリタケ等が；ベニタケ科に属する担子菌としてはアイタケ等が；サルノコシカケ科に属する担子菌としてはマイタケ等が；ヒラタケ科に属する担子菌としてはエリンギ等が挙げられる。
【００３０】
本発明に係る氷結晶化阻害剤は、特に限定されるものではないが、例えば、エノキタケ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ種）、ハタケシメジ（Ｌｙｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｄｅｃａｓｔｅｓ種）、エリンギ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｅｒｙｎｇｉｉ種）、ホンシメジ（Ｌｙｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｓｈｉｍｅｊｉ種）、ナメコ（Ｐｈｏｌｉｏｔａ  ｎａｍｅｋｏ種）から好適に得ることができ、より好ましくはエノキタケから得ることができる。
【００３１】
上記エノキタケでも、人工的に栽培した白色かつもやし状の市販エノキタケ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ種）が好ましい。かかる市販エノキタケは、一般に食用とされており、容易に入手可能であり、担子菌類の単位重量当たりから得られる抽出物が有する氷結晶化阻害活性が優れている点で、より好ましい。
【００３２】
なお、上記担子菌の類縁品種および改良品種も、適宜使用することができる。
【００３３】
本発明において「類縁品種」とは、例えば、科の類縁品種は同じ属に属する菌類でも学術上の分類において近い品種をいい、具体的な菌株の類縁品種は同じ科に属する菌株でも学術上の分類において近い品種をいう。また、「改良品種」とは、人為的な選択、交雑、突然変異、遺伝子組み換えなどにより改良した菌類をいうものとする。
【００３４】
本発明で用いられる担子菌を培養する方法としては、特に限定されるものではなく、固体培養法や液体培養法など公知の方法を用いて行うことができる。例えば固体培養法においては、バガス、小麦ふすま、米糠などの植物繊維質原料を含有する固体培地に菌糸体を接種して、これを培養することにより菌糸体や子実体を得ることができる。また、液体培養法は、菌株が資化し得るのに必要な炭素源、窒素源、無機物、その他必要な栄養素を含んだ培地に菌糸体を接種し、公知の振とう培養、通気攪拌培養または置地培養などにより行うことができる。
【００３５】
培養温度や培養期間などの培養条件は適宜調整すればよいが、培養は低温下で行うことが好ましい。比較的低温で担子菌を培養する、即ち低温馴化することにより、氷結晶化阻害剤を誘導することができる。培養温度としては、例えば、２５℃以下が好ましく、２０℃以下がより好ましい。一方、氷点未満では液体培地が凍結するおそれがあるため、０℃以上とすることが好ましい。
【００３６】
培養期間は特に制限されないが、３日以上行うことが好ましく、より好ましくは１週間以上、さらに好ましくは２週間以上、特に好ましくは１ヶ月以上である。また、培養期間の上限も特に制限されないが、担子菌がコンフルエントな状態となるまでや、培地中の氷結晶化阻害剤の濃度がそれ以上向上しなくなるまでとすればよく、例えば、好ましくは６ヶ月以下、より好ましくは５ヶ月以下、さらに好ましくは４ヶ月以下、特に好ましくは３ヶ月以下である。
【００３７】
（２）  抽出工程
本発明に係る氷結晶化阻害剤は、抽出などにより担子菌から精製することができる。例えば、上記の担子菌よりアルカリ水溶液中で加熱抽出処理する方法が挙げられる。
【００３８】
本発明で用いられる担子菌の部位は特に限定されず、例えば菌糸体、子実体のいずれも用いることができる。なお、これらはひとつの部位のみを用いることもできるし、複数の部位を併用することも可能である。
【００３９】
本発明に係る氷結晶化阻害剤の抽出に処する担子菌の形態としては、生の状態のもの、その破砕物、その磨砕物、その乾燥物および乾燥粉砕物を用いることができ、また生の状態の担子菌としては、上記の培養方法などにより得られる菌糸体培養物から分離した菌糸体の他に、菌糸体培養物そのものを用いることもできる。
【００４０】
任意に上記のような処理を行った担子菌にアルカリ水溶液を加えて加熱抽出処理することにより、本発明に係る氷結晶化阻害剤を得ることができる。
【００４１】
アルカリ水溶液の調製に供されるアルカリ物質としては、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、炭酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、重炭酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、ピロリン酸ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸三ナトリウム、リン酸三カリウム、焼成カルシウムなどを用いることができ、その使用に際しては単独もしくは２種以上の混合物として用いることができる。
【００４２】
アルカリ水溶液の濃度は、多糖類の種類などに応じて適宜調整すればよいが、例えば、０．１ｗ／ｖ％以上が好ましく、より好ましくは１．０ｗ／ｖ％以上、さらに好ましくは２．０ｗ／ｖ％以上、さらに好ましくは５．０ｗ／ｖ％以上、さらに好ましくは１０．０ｗ／ｖ％以上、さらに好ましくは１５．０ｗ／ｖ％以上、特に好ましくは２０．０ｗ／ｖ％以上であり、また、５０ｗ／ｖ％以下が好ましく、より好ましくは３０ｗ／ｖ％以下、さらに好ましくは２５ｗ／ｖ％以下である。０．１ｗ／ｖ％より低濃度では目的とする氷結晶化阻害剤の抽出効率が不十分であり、また５０ｗ／ｖ％より高濃度ではコスト面や安全面に問題があり不適である。
【００４３】
加熱抽出処理の温度としては、７０℃以上が好ましく、より好ましくは８０℃以上、さらに好ましくは９０℃以上、最も好ましくは略１００℃である。加熱抽出処理の方法としては、例えば、アルカリ水溶液を加えた後にこれを所定の温度まで加熱しながら抽出してもよいし、予め所定の温度に加温したアルカリ水溶液を加えてこれを保温した状態で抽出してもよい。
【００４４】
より具体的には、担子菌の乾燥粉砕物に２５ｗ／ｖ％水酸化カリウム水溶液を加え、１００℃にて２〜３時間抽出し、濾過または遠心分離することにより抽出液を得て、これを氷結晶化阻害剤として用いることができる。さらに抽出残渣に対して同様の抽出処理を繰り返し行い、得られた抽出液をまとめて、これを氷結晶化阻害剤として用いてもよい。
【００４５】
（３）  精製工程
上記により得られた抽出液は、そのまま用いてもよいが、中和や透析などの周知の方法によりアルカリ物質を除去し、アルカリ物質を除去した後の抽出液、その濃縮液、その乾燥物および乾燥粉砕物を氷結晶化阻害剤として用いるのが好ましい。
【００４６】
上記のようにして得られた氷結晶化阻害剤は、必要に応じてさらに精製を行ってもよい。例えば、デカンテーション、濾過、遠心分離などを好適に組み合わせて夾雑成分を除去してもよい。また例えば、塩析や有機溶媒による沈殿や、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、ゲル濾過、低速冷却装置を用いた氷への結合などによる精製、透析や限外濾過などによる濃縮を好適に組み合わせて行ってもよい。
【００４７】
（４）  製剤化
さらに必要に応じて、本発明に係る氷結晶化阻害剤は、粉末状または顆粒状など任意の形態に固形化してもよい。固形化の方法はとくに限定されないが、例えば、上記の抽出物を噴霧乾燥や凍結乾燥などの常法に従って粉末化する方法や、抽出物を賦形剤に吸着、担持させて粉末または顆粒状に固形化する方法などを挙げることができる。これらの操作は当業者に公知のものであり、用途に応じて適宜選択して用いることができる。
【００４８】
本発明に係る氷結晶化阻害剤は、氷結晶の結晶面に結合して氷結晶の成長を抑制する。また、その結合は、氷結晶への自由水の更なる結合を阻止することによって、氷の再結晶化を阻害する。
【００４９】
本発明の氷結晶化阻害剤の氷結晶化阻害活性の測定方法は、その種類や用いた担子菌の種類などに応じて適宜適したものを用いる。例えば、熱ヒステリシスの測定、氷結晶構造の観察、氷結晶化阻害の測定などの公知の方法にて行うことができ、何れかの方法で氷結晶化阻害活性の向上が認められる場合は、本発明範囲に含まれるものとする。
【００５０】
例えば、氷結晶化阻害活性の測定は、ショ糖を３０ｗ／ｖ％含む氷結晶化阻害剤水溶液を−４０℃に冷却した後に−６℃まで温度を上げ、顕微鏡により観察した氷結晶の平均面積を測定することにより行うことができる。氷結晶化阻害活性が強いほどこの氷結晶の平均面積は小さくなることから、その平均値を、対照であるショ糖の３０ｗ／ｖ％水溶液を同様に測定して得られる氷結晶の平均面積で除して得られる数値を指標として、氷結晶化阻害剤の氷結晶化阻害活性を定量的に評価することができる。なお、かかる値はＲＩ値と呼ばれる。例えば、対照に比べ、氷結晶化阻害剤を添加したときに氷結晶の成長が少しでも阻害されれば、氷結晶化阻害活性を有すると判断する。
【００５１】
本発明に係る氷結晶化阻害剤は、水が氷結晶化することで障害が生じる様々な分野において、この障害を抑制する目的で利用可能である。例えば、食品分野、機械分野、土木分野、化粧品分野、生体材料を用いる医療分野などで利用可能である。
【００５２】
食品分野では、食品に含まれる水の氷結晶化を抑制することで、当該食品の味の劣化などを防ぐことができる。例えば、澱粉老化を防止したり、食品中の水が氷結晶化して、タンパク質や油脂成分などを物理的に圧迫し、その構造を変化させることによる味や品質などの劣化を、抑制したりすることにより、冷凍食品などの品質の改善が可能になる。
【００５３】
機械分野、土木分野では、機械の可動部、道路、地盤などの凍結防止剤として利用できる。
【００５４】
化粧品分野では、化粧品の品質の劣化などを防ぐための添加剤として利用できる。例えば、油脂成分を含む化粧品を凍結させると、当該化粧品に含まれる水が氷結晶化し、当該油脂成分を物理的に圧迫してその構造を壊すことがあり、品質と使用感が劣化する。本発明に係る氷結晶化阻害剤を用いれば、水の氷結晶化を防ぐことで油脂成分の構造が保持されるため、品質の劣化などを抑制することができる。
【００５５】
医療分野では、生体試料を凍結保存する際の保護剤として用いることができる。例えば、細胞、血液、臓器などの生体試料を従来公知の保存液に入れて凍結保存すると、保存液中の水分が凍結して氷結晶を生じ、かかる氷結晶により生体試料が損傷することがある。しかし、本発明に係る氷結晶化阻害剤を添加すれば、氷結晶の発生や成長を抑制することができるので、生体試料を氷結晶による損傷から保護することができる。
【００５６】
本発明の氷結晶化阻害剤の形態は、その用途に応じて様々であり、そのまま、溶液、濃縮液、懸濁液、凍結乾燥物、粉末、顆粒、錠剤などであってもよい。また、賦形剤などと混合した組成物とすることもできる。
【００５７】
また、本発明に係る抗体は、上記氷結晶化阻害剤と特異的に反応し、結合するものであり、担子菌またはその培養液における当該氷結晶化阻害剤の有無を試験したり、担子菌の培養液などから氷結晶化阻害活性を有する多糖類を特定したりするために用いることができる。
【００５８】
本発明に係る抗体の調製は常法に従えばよい。例えば、上記氷結晶化阻害剤を用いてマウスやラット等を免疫し、その抗体産生細胞や脾細胞と骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを得る。このハイブリドーマをクローニングし、上記氷結晶化阻害剤へ特異的に反応する抗体を産生しているクローンをスクリーニングする。このクローンを培養し、分泌されるモノクローナル抗体を精製すればよい。
【００５９】
上記のとおり、本発明に係る担子菌由来の多糖類は、水を含む液体の氷結晶化を阻害するために用いることができる。また、本発明に係る水を含む液体の氷結晶化阻害方法は、当該液体に担子菌由来の多糖類を添加する工程を含むことを特徴とする。
【００６０】
本発明において、その氷結晶化を阻害すべき液体は、溶媒として水を含むものであれば特に制限されず、例えば、水自体、溶質が溶解している水溶液、不溶成分が分散している懸濁液を挙げることができる。また、氷結晶化を阻害すべき液体は、氷結晶化が問題となるものであれば、水混和性の有機溶媒を含んでいてもよい。かかる水混和性有機溶媒としては、例えば、エタノールなどのアルコール類やエチレングリコールなどのグリコール類などを挙げることができる。
【００６１】
本発明に係る担子菌由来の多糖類により液体の氷結晶化を阻害する場合、多糖類の添加量は、液体に含まれる溶質の濃度や凝固点などに応じて適宜調整すればよいが、例えば、糖濃度で０．０５μｇ／ｍｌ以上、１０ｍｇ／ｍｌ以下程度とすることができる。当該濃度が０．０５μｇ／ｍｌ以上であれば、液体の氷結晶化をより確実に抑制することができる。一方、当該濃度が高過ぎると効果が飽和する場合があるので、当該濃度としては１０ｍｇ／ｍｌ以下が好適である。当該濃度としては、０．１μｇ／ｍｌ以上がより好ましく、０．５μｇ／ｍｌ以上がさらに好ましく、また、１ｍｇ／ｍｌ以下がより好ましく、４００μｇ／ｍｌ以下がさらに好ましく、２００μｇ／ｍｌ以下が特に好ましい。
【００６２】
本発明方法には、氷結晶化を阻害すべき液体へ本発明多糖類を意識的に添加する場合の他、本発明多糖類が氷結晶化を阻害すべき液体へ結果的に混合される場合が含まれるものとする。例えば、道路などへ本発明多糖類を散布し、当該多糖類が夜露と接触して溶解し、道路などの凍結が抑制される場合も、本発明範囲に含まれる。
【実施例】
【００６３】
以下に実施例を示し、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。【００６４】
実施例１
５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌのＹＧ培地（０．２５％酵母エキスと１％グルコースを含む，ｐＨ６．０）を入れ、市販のエノキタケ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ種）の菌糸を植菌した。１２０ｒｐｍ、１８℃で１週間回転培養を行い、さらに４℃で１週間低温馴化培養を行った。【００６５】
低温馴化後のエノキタケ菌糸を洗浄し、凍結乾燥することにより得られた乾燥エノキタケ菌糸（５０ｇ）に水（５００ｍｌ）を加え、１００℃で６時間加熱した。次いで、固形分を濾別した。得られた残渣に対して同様の熱水処理を３回繰り返し、残渣（３４．４ｇ）を回収した。【００６６】
次に、熱水処理後の上記残渣（３４．４ｇ）に２ｗ／ｖ％水酸化カリウム水溶液（５００ｍｌ）を加え、１００℃で２．５時間加熱した（以下、「２％ＫＯＨ処理」とする）。固形分を濾別し、得られた残渣に対して同様の２％ＫＯＨ処理を３回繰り返した。得られた残渣に２５ｗ／ｖ％水酸化カリウム水溶液（５００ｍｌ）を加え、１００℃で２．５時間加熱した（以下、「２５％ＫＯＨ処理」とする）。処理後の残渣に対して同様の２５％ＫＯＨ処理を３回繰り返し、各抽出液を回収し、混合した。【００６７】
得られた溶液をエバポレーターで濃縮し、濃縮後の溶液に対して３倍体積量のエタノールを添加した。エタノール添加により生じた沈殿物を水に懸濁し、酢酸水溶液で中和した後、水で４８時間透析した。これを凍結した後、４℃の条件下にてゆっくりと融解し、生じた沈殿物を遠心分離により分離、回収した。【００６８】
得られた沈殿物をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、４０℃にて４８時間処理した後の上清を回収し、凍結乾燥によりＤＭＳＯを除去することにより、キシロマンナン画分（０．１６４ｇ）を得た。得られたキシロマンナン画分を水（４６ｍｌ）に溶解し、糖濃度とタンパク質濃度をそれぞれフェノール硫酸法とビシンコニン酸法（ＢＣＡ法）にて測定したところ、それぞれ６．３μｇ／ｍｌ、４．４μｇ／ｍｌであった。【００６９】
実施例２
実施例１で得られたキシロマンナン画分の水溶液を、その糖濃度が１．０μｇ／ｍｌとなるように希釈し（タンパク質濃度０．７μｇ／ｍｌ）、氷結晶化阻害活性を測定した。具体的には、先ず、当該希釈溶液にショ糖を３０ｗ／ｖ％の割合で添加した。冷却調節機能が付いたステージを有する顕微鏡下、当該溶液を−４０℃に冷却した後に−６℃まで温度を上げて氷結晶を溶かし、−６℃を保った状態で３０分間観察したときに認められる氷結晶の面積を測定することにより行った。氷結晶化阻害活性が強いほどこの氷結晶の平均面積は小さくなることから、この平均面積を、対照としてショ糖の３０ｗ／ｖ％水溶液を同様に測定して得られる氷結晶の平均面積で除して得られる数値（ＲＩ値）を指標として氷結晶化阻害活性を定量的に評価したところ、ＲＩ値は０．２５であった。なお、ＲＩ値が１．０より小さいほど、氷結晶化阻害活性が強いことを意味する。【００７０】
実施例３
乾燥エノキタケ菌糸を０．４６ｇ用いた以外は実施例１と同様の方法にて、キシロマンナン画分１．５ｍｇを精製した。得られたキシロマンナン画分を、０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、得られた水溶液（２００μｌ，糖濃度３．９ｍｇ／ｍｌ，タンパク質濃度１７μｇ／ｍｌ）を試料としてゲル濾過カラム（東ソー社製，ＴＳＫ−ｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷXL，２１．５ｍｍＩ．Ｄ．×３０ｃｍ）にチャージし、４℃の温度条件下で上記リン酸緩衝液を流速２．０ｍｌ／ｍｉｎの条件で流して非吸着画分を溶出させ、吸収波長２１５ｎｍ、２８０ｎｍにて検出した。【００７１】
ゲル濾過による非吸着画分において、分子量約３１０，０００に単一のピークが確認された。この画分を回収し、上記実施例２と同様にして、氷結晶化阻害活性を確認した。【００７２】
実施例４
実施例３で得られた精製サンプルを、アセトニトリルを７ｖ／ｖ％含有する０．２Ｍホウ酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．９）に溶解した。得られた水溶液（５０μｌ，精製サンプル１．０μｇ）を試料として、糖組成分析用カラム（生化学工業社製，Ｈｏｎｅｎｐａｋ  Ｃ１８，２１．５ｍｍＩ．Ｄ．×３０ｃｍ）にチャージし、３０℃の温度条件下、上記ホウ酸カリウム緩衝液を溶離液として流速１．０ｍｌ／ｍｉｎの条件で溶出させ、励起波長３０５ｎｍ、蛍光波長３６０ｎｍにて検出した。また標準物質として、マンノース、グルコース、キシロース（各１．５ｎｍｏｌ）を同条件にて溶出させた。得られたピークの保持時間と蛍光強度より、精製サンプルの糖組成（モル比）はマンノース：キシロース＝２：１であることが確認された。【００７３】
実施例５
市販のハタケシメジ（Ｌｙｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｄｅｃａｓｔｅｓ種）子実体を凍結乾燥した。得られた乾燥ハタケシメジ子実体（０．２ｇ）に１５ｗ／ｖ％水酸化カリウム水溶液（１０ｍｌ）を添加し、１００℃で２．５時間加熱処理した。次いで、１０，０００×ｇで２０分間遠心分離することにより粗抽出液を得た。【００７４】
実施例１と同様の方法で得られた粗抽出液をエタノールで処理し、生じた沈殿物を回収した。得られた沈殿物を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解して、エタノール回収画分とした。【００７５】
実施例６
実施例５と同様の方法で、市販のエリンギ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｅｒｙｎｇｉｉ種）子実体よりエタノール回収画分を得た。【００７６】
実施例７
実施例５と同様の方法で、市販のホンシメジ（Ｌｙｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｓｈｉｍｅｊｉ種）子実体よりエタノール回収画分を得た。【００７７】
実施例８
実施例５と同様の方法で、市販のナメコ（Ｐｈｏｌｉｏｔａ  ｎａｍｅｋｏ種）子実体よりエタノール回収画分を得た。【００７８】
実施例９
実施例５〜８で得られた担子菌のエタノール回収画分を、それぞれ糖濃度が１．０μｇ／ｍｌとなるよう水で希釈し、実施例２と同様の方法により氷結晶化阻害活性を測定した。結果を表１に示す。【００７９】
【表１】
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【００８０】
実施例１０
実施例５で得られたハタケシメジのエタノール回収画分を、実施例３と同様の方法によりゲル濾過クロマトグラフィーにより分画し、分子量約４６７，０００のピークを示すフラクションを画分した。得られた画分の糖濃度を５．０ｍｇ／ｍｌに調整し、実施例２と同様の方法により氷結晶化阻害活性を測定したところ、ＲＩ値は０．２９であった。【００８１】
実施例１１
実施例１０で得られた精製サンプルについて、実施例４と同様の方法により糖組成を分析した。その結果、得られたピークの保持時間より、精製サンプルは、ガラクトース、マンノース、キシロース、グルコース、ラムノースからなる多糖であることが確認された。【００８２】
実施例１２
実施例１と同様の方法により、エノキタケ菌糸を凍結乾燥した。得られた乾燥エノキタケ菌糸（２０．０ｇ）に熱水処理を３回繰り返した後、２．０ｗ／ｖ％水酸化カリウム水溶液（２００ｍｌ）を添加し、１００℃で２．５時間加熱処理した。次いで、１０，０００×ｇで２０分間遠心分離することにより粗抽出液を得た。得られた粗抽出液を凍結乾燥することにより、粗キシロマンナン画分（２．０５ｇ）を得た。【００８３】
実施例１３  冷凍タコ焼き
表２の配合に従って、実施例１２で得られた粗キシロマンナン画分の水溶液を市販のタコ焼き粉と混合し、家庭用タコ焼き器を用いてたこ焼きを得た。得られたタコ焼きを、業務用急速冷凍機を用いて−２０℃で凍結した。また、比較のために、粗キシロマンナン画分を用いない以外は同様にタコ焼きを作り、冷凍した。なお、上記各粗キシロマンナン画分の濃度は、そのタンパク質濃度としてそれぞれ１０μｇ／ｍｌと５０μｇ／ｍｌである。【００８４】
【表２】
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【００８５】
得られた冷凍タコ焼きを１週間保存した後に常温で解凍し、半分に切断し、切断面を観察した。その結果、粗キシロマンナン画分を含まないタコ焼きでは凍結と解凍により劣化が起こり、表面と内部との間に隙間が生じていた。一方、粗キシロマンナン画分を添加したタコ焼きでは表面と内部との分離が無く、凍結前の状態が維持されていた。このように本発明に係る氷結晶化阻害剤を用いれば、食品を冷凍してもその品質を維持できることが証明された。【００８６】
実施例１４  冷凍蒸し卵黄
実施例１２で得られた粗キシロマンナン画分を卵黄に混合した。その際、粗キシロマンナン画分の量は、そのタンパク質濃度が５０μｇ／ｍｌとなるよう調整した。得られた卵黄をウォーターオーブン（ＳＨＡＲＰ社製，ヘルシオ  ＡＸ−ＭＸ１−Ｒ）を用いて１５分間蒸し、蒸し卵黄を作った。次いで、得られた蒸し卵黄を、業務用急速冷凍機を用いて−２０℃で凍結した。また、比較のために、粗キシロマンナン画分を用いない以外は同様に蒸し卵黄を作り、冷凍した。【００８７】
得られた各蒸し卵黄を１週間保存した後に常温で解凍し、外観と食感を比較した。その結果、粗キシロマンナン画分を含まない蒸し卵黄では凍結と解凍により表面が荒れており、食感も非常にパサパサしたものとなってしまっていた。一方、粗キシロマンナン画分を添加した蒸し卵黄は表面がきめ細かいままであり、食感にも弾力とみずみずしさが感じられ、凍結前の状態が維持されていた。このように本発明に係る氷結晶化阻害剤を用いれば、食品を冷凍してもその品質を維持できることが実証された。【００８８】
実施例１５  凍結細胞の保護
チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）を定法（Theodore T. PUCKら，The Journal lf Experimental Medicine, vol.108, pp.945- (1958)）に従って継代培養した後、トリプシン処理により剥離し、遠心分離により回収した。回収した細胞に培地を加え、再度遠心分離してトリプシンを除去した。得られた細胞を細胞凍結保存液（日本全薬工業社製，セルバンカー）に懸濁した。この懸濁液に、実施例１と同様の方法で得られた精製キシロマンナン画分を添加し、ピペットを用いて十分に混合した。当該懸濁液における精製キシロマンナン画分の濃度は、そのタンパク質濃度としてそれぞれ２０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌおよび２００μｇ／ｍｌとした。得られた細胞液をセラムチューブに１ｍｌずつ分注し、−８０℃のディープフリーザーで凍結した。【００８９】
また、比較のために、上記と同様にして回収したＣＨＯ細胞を１０ｖ／ｖ％ＤＭＳＯ溶液に懸濁し、ピペットを用いて十分に混合した後、得られた細胞液をセラムチューブに１ｍｌずつ分注し、−８０℃のディープフリーザーで凍結した。【００９０】
さらに、比較のために、上記と同様にして回収したＣＨＯ細胞を、キシロマンナンを含まない細胞凍結保存液（日本全薬工業社製，セルバンカー）に懸濁し、ピペットを用いて十分に混合した後、得られた細胞液をセラムチューブに１ｍｌずつ分注し、−８０℃のディープフリーザーで凍結した。【００９１】
上記で得られた細胞凍結保存液を冷凍庫中で２日間凍結保存した。次いで、冷凍庫からセラムチューブを取り出し、速やかに３７℃のウォーターバスに浸漬して解凍した。解凍後、培地（１０ｍｌ）へ細胞を速やかに懸濁し、遠心分離した。回収された細胞を培地（１ｍｌ）へ再度懸濁した。得られた細胞懸濁液に含まれる死細胞を、トリパンブルーで選択的に染色した。赤血球計算板を用いて生細胞と死細胞を計数し、細胞の生存率を算出した。結果を表３に示す。【００９２】
【表３】
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【００９３】
表３に示す結果のとおり、ＤＭＳＯ溶液に懸濁した細胞は、凍結によりおよそ８５％が死滅した。細胞を長期にわたり凍結保存できるとうたわれている細胞凍結保存液を用いた場合、細胞の生存率は向上したものの、８３．２％にとどまった。一方、本発明に係る氷結晶化阻害剤であるキシロマンナン画分を細胞凍結保存液に添加した場合には、細胞生存率が顕著に向上し、ほぼ１００％となった。以上の結果から、本発明に係る氷結晶化阻害剤が生体試料の保護剤として非常に有用であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明に係る氷結晶化阻害剤を食品に添加することにより、食品の品質維持などに役立てることができる。また、臓器、細胞、血液（血小板）などの生体試料の凍結保存における保護剤や、皮膚を低温から保護したり、低温安定性に優れるといった特性を有する化粧品にも有効に用いることができる。